(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
心筋梗塞を罹患していない対象体の血漿中のセロトニン値と健常体の血漿中のセロトニン値とを比較し、心筋梗塞を罹患していない対象体の血漿中のセロトニン値が健常体の血漿中のセロトニン値と比較して高いか否かを基準として判定する、心筋梗塞を除く心不全症候群の識別方法。
【請求項２】
前記血漿がヒト血漿である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
心筋梗塞を罹患していない対象体の血漿中のセロトニン値と健常体の血漿中のセロトニン値とを比較し、心筋梗塞を罹患していない対象体の血漿中のセロトニン値が健常体の血漿中のセロトニン値と比較して高いか否かを基準として判定することで、心筋梗塞を除く心不全症候群の識別を実施するためのキットであって、コントロール試薬として、健常体の血漿を含む、前記キット。
【請求項４】
セロトニン量を測定するための液体クロマトグラフィー手段を含む、請求項３記載のキット。
【請求項５】
前記血漿がヒト血漿である、請求項３又は４記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液試料中のセロトニン濃度を指標として、心不全症候群患者の識別方法に関する。この方法によれば、心不全症候群患者の病態の詳細を簡易かつ高い信頼性をもって確認することができる。
【背景技術】
【０００２】
心不全とは、心機能の異常によって末梢臓器組織の需要に応じた血液の供給ができなくなったり、臓器間での血液分布の不均等が生じたりした結果生じる臨床的な症候群である。心不全症候群の診断は、問診による臨床症状と心音、胸部Ｘ線、心電図、血液中のＢＮＰ（Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド）などのスクリーニング検査により行われる（岡野嘉明著、「診療群別臨床検査のガイドライン2003〜医療の標準化に向けて〜」p.45-49、事務局編(非特許文献１）；「カレント・メディカル、診断と治療」、第43版、日本語編、日経ＢＰ社、p.313-315及びp.382-393（非特許文献２））。
【０００３】
心不全には種々の原因があるが、その主たるものとして次のものが挙げられる。
・虚血性心疾患：冠動脈の狭窄などにより血液循環不良により生じる。
・２次性心筋症：感染症、免疫疾患などが原因となり、２次的に生じる症例。
・高血圧性心疾患：高血圧により生じる。
これらの原因の特定には、主として心エコーや心臓カテーテル検査が用いられる。また、心筋以外の障害を主体とする心疾患としては、次の３つが挙げられる。
・後天性弁膜症：弁膜の狭窄により生じる。
・先天性弁膜症：心房や心室の中壁欠損などの先天的な異常による。
・肺循環系疾患：血栓性の肺循環閉塞などにより生じる。
【０００４】
このように、心不全はさまざまな原因により生じ、その病態も幅広いため、より詳細な病態の情報を把握して治療方針を立てることが必要である。しかしながら、心不全の原因の特定、治療は難しく、より詳細に病態を知ることのできる方法が望まれている。
【０００５】
心不全の原因や状態の把握は、前述したような様々な方法により行われているが、心電図、心エコー、心臓カテーテル検査などは特別な機器が必要であり時間も要するため、例えばＢＮＰを指標とした血液成分を測定することによる簡便な生化学的方法が望まれている。また、ＢＮＰは、循環血液量の増加や前負荷の上昇、心臓障害などに伴い、主に心臓心室から分泌されるペプチドホルモンであり、心不全の診断に重要であるが、より詳細な病態を把握するためには、ＢＮＰ以外の検査の研究開発が望まれている。
【０００６】
我々は以前に、不安定狭心症などの冠動脈疾患において、血漿中セロトニン濃度値が健常者より高いことを報告した（特開２００２−２７７４６１）。これは、これら冠動脈疾患患者は冠動脈を始め複数の部位に動脈硬化部位を有していると考えられ、この部位で血小板が活性化され、活性化された血小板からセロトニンが放出されることにより、血小板外のセロトニン量を反映する血漿中セロトニン濃度値が高くなると考えている。このように、血漿中セロトニン濃度値と動脈硬化の進展については、関連性が高い。なお、ここでいう血漿とは、血小板を含まない血漿（乏血小板血漿）をさす。しかしながら、心不全症候群は前述したように、冠動脈の狭窄や弁膜症による心機能の低下、血栓性の肺循環閉塞、高血圧などによる血液循環不良により生ずる疾患といった多岐にわたる様々な疾患を含む症候群であり、血小板の活性化との関係が必ずしも明確でない疾患も包含する。
【０００７】
【特許文献１】特開２００２−２７７４６１
【０００８】
【非特許文献１】岡野嘉明著、「診療群別臨床検査のガイドライン2003〜医療の標準化に向けて〜」p.45-49、事務局編
【非特許文献２】「カレント・メディカル、診断と治療」、第43版、日本語編、日経ＢＰ社、p.313-315及びp.382-393
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の課題は、血液検査に基づく簡便かつ信頼性の高い心不全症候群識別方法の提供にある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、心不全症候群に属する様々な疾患に罹った患者の血中セロトニンレベルを測定したところ、驚くべきことに、心不全症候群に罹った対象者においては、血中セロトニンレベルが健常者のそれと比べ、顕著に高いことを見出した。
【００１１】
従って、本発明は、血液試料中のセロトニン値を指標とした心不全症候群の識別方法を提供する。好ましくは、前記血液試料が血漿である。さらに好ましくは、前記血液試料はヒト血液試料である。
【００１２】
好適な観点において、前記心不全症候群の識別は、対象体の血液試料中のセロトニン値と健常体の血液試料中のセロトニン値とを比較し、対象体の血液試料中のセロトニン値が健常体の血液試料中のセロトニン値と比較して高いか否かを基準として判定する。
【００１３】
別の観点において、本発明は血液試料中のセロトニン値を指標として心不全症候群の識別を実施するためのキットも提供する。
かかるキットは、セロトニン量を測定するための手段、例えば液体クロマトグラフィー手段、またはイムノアッセイ手段を含んでよい。好ましくは、かかるキットはコントロ−ル試薬として健常体の血液試料を含む。
【発明の効果】
【００１４】
本発明は、心不全症候群の判定において新たな指標を提供するものである。血中セロトニン濃度値が高いとき、心不全症候群であると判定し、そしてその病態を把握するための情報を提供することが出来る。本発明により、心電図、心エコー、心臓カテーテル検査などのように特別な機器を必要とせず、信頼性の高い心不全症候群の簡易な識別が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明は、血液試料中のセロトニン値を指標とした、心不全症候群の識別方法を提供する。より具体的には、上記心不全症候群の識別は、対象体の血液試料中のセロトニン値と健常体の血液試料中のセロトニン値とを比較し、対象体の血液試料中のセロトニン値が健常体の血液試料中のセロトニン値と比較して、統計学的検定により有為に高いか否かを基準として判定することができる。
【００１６】
心不全とは、本明細書の冒頭においても述べたとおり、心機能の異常によって末梢臓器組織の需要に応じた血液の供給ができなくなったり、臓器間での血液分布の不均等が生じたりした結果生じる臨床的な症候群である。心不全症候群の病因疾患には、心筋障害が主体となる疾患、例えば狭心症、心筋梗塞、虚血性心筋小、拡張型心筋症、拘束型心筋症、肥大型心筋症、高血圧性心筋症、心筋以外の障害が主体となる疾患、例えば僧帽弁疾患、大動脈弁疾患、三尖弁疾患、連合弁膜症、心房／心室中隔欠損、動脈管開存症、ファロー四微症、心膜・心筋炎、収縮性心膜炎、右室異形成症、肺動脈性肺高血圧症などがある（非特許文献１）。本発明は、血中のセロトニン濃度を測定することで、心電図や心臓カテーテルといっためんどうな検査を行うことなく、上記心不全症候群に網羅される疾患の簡易かつ信頼性の高い識別を可能にする。
【００１７】
セロトニンは主に消化管粘膜にある腸クロム親和性細胞で産生され血液中に放出される。血小板自体はセロトニンを産生しないが、血液中のセロトニンを取り込み貯蔵するため、循環血液中の血小板外のセロトニン量を反映した測定を行うには、血液試料は血小板を除いた血漿（乏血小板血漿）又は血清であることが好ましい。本発明の方法においては特に血漿中のセロトニンを指標とするのが好ましい。
【００１８】
また、血液試料中のセロトニン濃度を測定するに当たっては、採血を行った後に血小板中のセロトニンが血液中に放出されるのを抑制することが重要である。血小板中セロトニンの放出は、血小板の活性化（凝固）により引き起こされるから、血小板活性化の中心物質であるカルシウムイオンを捕捉した状態でセロトニン測定を実施したり、又はそのような状態で血液から血漿又は血清試料を調製することが好ましい。例えば、カルシウムイオンを捕捉し、血液の凝固を防止する抗凝固剤を採血試料に添加してよい。抗凝固剤としては、抗凝固効果が高く、取扱いや入手が容易であること以外に、採血した血液をセロトニン以外の血中成分の測定にも供することが可能であることが好ましい。かかる抗凝固剤としては、例えばエチレンジアミン四酢酸（以下ＥＤＴＡと記載する）又はクエン酸を具体的に例示できるが、クエン酸の持つ金属イオンと結合するキレート効果はＥＤＴＡに比べ弱く、血小板の活性化を完全に止められない場合があり、微量ながらセロトニンが放出される可能性があるので、特にＥＤＴＡが好ましい。
【００１９】
かかる特に好ましいＥＤＴＡとしては、ＥＤＴＡ２カリウム２水和物又はＥＤＴＡ２ナトリウムが好ましく、特にＥＤＴＡ２カリウム２水和物は溶解速度が速いという効果もあり、特に好ましい。溶解速度が遅いと、その溶解時、部分的にＥＤＴＡ濃度が高くなるため、血小板にダメージを与える可能性が高まるからである。
【００２０】
抗凝固剤としてＥＤＴＡを血液に加える場合は、血液と混合後の濃度を0.0025〜0.0049mol/Ｌとするのが普通であるが、前記濃度となるようにＥＤＴＡを混合すると試料によっては血漿中セロトニン濃度が高くなる場合がある。これは、前記ＥＤＴＡ濃度では血小板の活性化が完全には抑制されず、血小板から徐々にセロトニンが放出されたことを示すものである。一方、ＥＤＴＡ濃度が高い場合には、浸透圧差により血小板がダメージを受け、血小板中のセロトニンが放出されることがある。従ってセロトニンの測定又は血液からの血漿試料の調製に際しては、0.0074〜0.0148mol/L、好ましくは0.008〜0.014mol/L程度となるようにＥＤＴＡを血液に混合することを例示できる。特に血液からの血漿試料の調製からセロトニンの測定までの全工程を、前記濃度のＥＤＴＡ共存下で実施することが特に好ましい。
【００２１】
セロトニン濃度を液体クロマトグラフィー法（Ｈｉｒｏｗａｔａｒｉ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｌｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，２００４，３７，ｐ１９１；特開２００２−２７７４６１、など）やイムノアッセイ（例えば、ＭＰ  ＢＩＯＭＥＤＩＣＡＬＳ社から市販されているＳｅｒｏｔｏｎｉｎ  ＥＬＩＳＡキット）などの公知の方法により定量することができる。
液体クロマトグラフィー法でセロトニンを測定する場合は、通常、試料中の蛋白質を除去してから測定対象とするのが好ましい。蛋白質の除去は慣用の方法、例えば極端な酸性もしくはアルカリ性への暴露、各種変性剤、例えばトリクロロ酢酸、硫酸アンモニウム、重金属塩、有機溶媒、尿素、塩酸グアニジンの添加による変性・沈殿による除去、あるいは各種ろ過手段、例えばゲルろ過、限外ろ過などにより可能である。イムノアッセイで血漿中のセロトニン量を測定する場合には、試料中の蛋白質を除去する前処理操作を行わなくてもよい。
【００２２】
液体クロマトグラフィー法でセロトニンを測定する場合は、具体的には下記のとおりにして測定できる。
前処理カラムとしては、空カラムにオクタデシル基を有したシリカベースのゲルを充填したものを用いる。分離カラムとしては、空カラムにオクタデシル基を有したシリカベースのゲルを充填したものを用いる。測定試料としては、エチレンジアミン４酢酸２ナトリウム２水和物が例えば３．５mg／mlになるように調製された真空採血管を用い採血を行い、遠心分離（例えば、1000×Ｇ、４℃、３０分）により乏血小板血漿を取得する。取得した血漿にアスコルビン酸を含んだ過塩素酸溶液を混合し、遠心分離により除蛋白を行う。除蛋白した上清試料に過塩素酸ナトリウム＋エチレンジアミン４酢酸２ナトリウム＋酢酸ナトリウムの溶液を混合し、調整する。
【００２３】
前処理カラムに溶離液１（例えば、グリシン＋過塩素酸ナトリウム＋エチレンジアミン４酢酸２ナトリウム＋アジ化ナトリウム、pH３．０）を流しながら、前出した試料を注入し、試料中のセロトニン画分を前処理カラムに吸着させる。７分後に、あらかじめ溶離液２（例えば、酢酸ナトリウム＋硝酸アンモニウム＋エチレンジアミン４酢酸２ナトリウム＋アセトニトリル、pH５．４）を流しておいた分離カラムに、流路を切り替え、前処理カラムを分離カラムの前に接続する。引き続き溶離液２を流し、前処理カラムからセロトニン分画を溶出、分離カラムで溶出したセロトニン画分を分離する。分離し、分離カラムから溶出したセロトニン画分は、次の２つの反応液とオンラインで混合し、蛍光誘導体化し、蛍光検出する。２つの反応液の組成は、例えばベンジルアミン＋エタノールとホウ酸＋フェリシアン化カリウム＋エタノール、pH８．０とすることができる。蛍光検出の波長は例えば、励起波長３４０〜３６０nm、蛍光波長４７０nm以上とすることができる。
【００２４】
本発明の測定対象は主にヒト患者であるが、そのほかの哺乳動物、例えばサル、ネコ、イヌ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギなどの家畜動物、ラット、マウス、モルモットなどの実験動物など、あらゆる温血動物であってよい。
【００２５】
本発明のキットは、血中セロトニンを測定するための手段を含む。セロトニンの測定が液体クロマトグラフィー法による場合、当該液体クロマトグラフィーセット、例えばゲルの充填されたカラム、カラム洗浄液、カラム溶出液など、セロトニンの測定がイムノアッセイの場合、当該イムノアッセイを実施するための一式の試薬を含むものであってよい。また、コントロ−ル試薬として健常体の血液試料を含んでよく、かかるコントロ−ル試薬は複数の健常体に由来する血液試料、例えば血漿を混合したものであってよい。なお、ここでいう健常体とは、心不全症候群に罹っていない健康体を意味する。
【００２６】
本発明を以下の実施例でさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例の態様に限定されるものではない。
【実施例】
【００２７】
実施例１
測定方法としては、特開２００１−０５６３２６号公報の方法を一部改変した液体クロマトグラフィーを用いた。すなわち、前処理カラムとしては、サイズ４．６mmID×３５mmの空カラムにオクタデシル基を有したシリカベースのゲル（東ソー株式会社製）を充填したものを用いた。分離カラムとしては、サイズ４．６mmID×１２０mmの空カラムにオクタデシル基を有したシリカベースのゲル（東ソー株式会社製）を充填したものを用いた。測定試料としては、エチレンジアミン４酢酸２ナトリウム２水和物が３．５mg／mlになるように調製された真空採血管を用い採血を行い、１０００×Ｇ、４℃、３０分の遠心条件で乏血小板血漿を取得した。取得した血漿１００μｌに２００mmol/L濃度のアスコルビン酸を含んだ２４％過塩素酸溶液を４００μｌ混合し、遠心分離により除蛋白を行った。除蛋白した上清試料３５０μｌに２００mmol/L過塩素酸ナトリウム＋１mmol/Lエチレンジアミン４酢酸２ナトリウム＋５０mmol/L酢酸ナトリウムの溶液を３５０μｌ混合し調整した。
【００２８】
前処理カラムに溶離液１（１０mmol/Lグリシン＋１００mmol/L過塩素酸ナトリウム＋３mmol/Lエチレンジアミン４酢酸２ナトリウム＋０．０５％アジ化ナトリウム  pH３．０）を流速１．０ml／minで流しながら、前出した試料を５００μＬ注入し、試料中のセロトニン画分を前処理カラムに吸着させた。７分後に、あらかじめ溶離液２（１０mmol/L酢酸ナトリウム＋１５０mmol/L硝酸アンモニウム＋０．３mmol/Lエチレンジアミン４酢酸２ナトリウム＋２％アセトニトリル  pH５．４）を流速０．７ml／minで流しておいた分離カラムに、流路を切り替え、前処理カラムを分離カラムの前に接続した。引き続き溶離液２を流し、前処理カラムからセロトニン分画を溶出、分離カラムで溶出したセロトニン画分を分離した。分離し、分離カラムから溶出したセロトニン画分は、次の２つの反応液とオンラインで混合し、９０℃、２ｍｉｎ反応させ、蛍光誘導体化し、蛍光検出した。２つの反応液の組成は、５０mmol/Lベンジルアミン＋５０％エタノールと１００mmol/Lホウ酸＋５mmol/Lフェリシアン化カリウム＋５０％エタノール  pH８．０とした。そして、２つの反応液の流速は共に０．２５ml／minとし、蛍光検出の波長は励起波長３４０〜３６０nm、蛍光波長４７０nm以上とした。なお、カラムの洗浄は試料注入開始から、前処理カラムは１８．０から１８．５分までとし、分離カラムは３９から４０分とした。カラムの洗浄液としては、３０mmol/L硝酸アンモニウム＋５０％アセトニトリル  pH４．５とした。
【００２９】
東海大学付属病院の、身体の不調を訴え救急に来院した循環器領域の患者のうち、急性心筋梗塞および急性心筋梗塞の兆候である心電図においてＳＴ上昇の認められた患者を除いた患者群について、心不全の認められた群（男性３名と女性５名）、心不全の認められなかった群（男性３名と女性４名）の２群に分け比較した。また、健常人（男性３４名と女性６名）とも比較した。健常人の血漿中セロトニン値の平均値は４．２pmol／mlであり、標準偏差は２．２pmol／mlであった。患者群についは、個々のデータを表に示した。表中には、血漿中セロトニン値、性別、年齢、採血部位、ＢＮＰの値、診断により鑑別された病名を明記した。そして、Student-Newman-Keulsテストによる、各群間の有為差検定を行った。心不全の認められた群と認められなかった群、心不全の認められた群と健常人の比較において、有為差（Ｐ＜０．０５）が確認された。これは、血漿中セロトニン濃度により、心不全患者の識別ができることを意味する。また、これらのデータは図１に、Ｂｏｘ−ｗｈｉｓｋｅｒ法により図示した。
なお、患者における心不全の有無は、問診による胸痛などの臨床症状により判別した。患者における心不全の臨床症状の確認されなかった男性６７歳（不安定狭心症）、女性８８歳（大動脈弁狭窄症）、男性６８歳（心房細動）、女性６５歳（不安定狭心症）、男性６８歳（異型狭心症）の５名は入院後の検査で心臓に異常が認められるわけであるが、軽度な病態であるので心不全の臨床症状が確認できなかったのである。このような軽度の心臓の異常な病態においては、血漿中セロトニン値が高い値を示さないことがわかる。問診において心不全の臨床症状を示した患者群（心不全あり群）では、健常者に比べても心不全なし群に比べても、血漿中セロトニン値が有意に高い値を示した。これらのことから、心不全の病態が重くなるにつれて、血漿中セロトニン値は、より高い値を示すと言える。
【００３０】
また、２つの患者群において、ＢＮＰと血漿中セロトニン濃度の関連を調べた。図２に示すように、関連性は確認されず、ＢＮＰとは異なる指標となることがわかる。
【００３１】
【表１】
0004693563.tif 000002
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】心不全の認められた群、心不全の認められなかった群、及び、健常者の血漿中セロトニン値を比較した図。
【図２】救急患者症例のＢＮＰと血漿中セロトニン値との比較。
【図１】
0004693563.tif 000003
【図２】
0004693563.tif 000004