(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
複合コアセルベーションによって油粒子を酵素によってタンパク質カプセル化する方法であって、
ゲル化温度を超える温度で、２種類以上の対立的に荷電した高分子コロイドを用いて複合コアセルベートを形成する工程と；
油を添加して水中の油粒子の粗大エマルジョンを形成する工程、と；
冷却して油粒子の周囲にコロイドシェルを付着させる工程と；及び
該コロイドシェルを酵素によって温度５℃−１０℃で架橋させるために、該水に酵素を添加して、タンパク質カプセル化油粒子を形成する工程と
を含む方法。
【請求項２】
前記コロイドのゲル化点以下の温度に冷却してゲル化が行われる請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ゲル化点が２０℃〜２７℃である請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ゲル化を５℃〜１０℃の温度に冷却して行う請求項２記載の方法。
【請求項５】
冷却の速度が１℃／５分間である、請求項２〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
２０℃〜２７℃のゲル化点温度に冷却する最初の速度が、１℃／５分間であり、その次に温度を急速に５℃〜１０℃に冷却する、請求項２〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
粗大エマルジョンがコロイド及び油から形成され、該粗大エマルジョンの粒子が１００〜２０００ミクロンである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記酵素がトランスグルタミナーゼである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記酵素が天然生成トランスグルタミナーゼ、化学的合成トランスグルタミナーゼ及び組換え的産生トランスグルタミナーゼからなる群から選択されるトランスグルタミナーゼである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記酵素がトランスグルタミナーゼであり、該酵素はキャリヤー中に１重量％〜１０重量％含まれる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記酵素がトランスグルタミナーゼであり、該酵素はキャリヤー中に１重量％〜１０重量％含まれ、前記キャリヤーがデキストリン、カゼイン酸ナトリウム及び糖から成る群から選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記タンパク質カプセル化油粒子が１００ミクロンから３００ミクロンの大きさである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記油がフレーバー油である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記コロイドの１つがゼラチン及び寒天から成る群から選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記コロイドの１つがゼラチンであり、該ゼラチンが１０重量％である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記コロイドの１つがカルボキシメチルセルロース、ヘキサメタリン酸ナトリウム、アラビアゴム、及びこれらの組合せから成る群から選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記コロイドがゼラチン及びカルボキシメチルセルロースである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記コロイドが、１：１／１０比のゼラチンとカルボキシメチルセルロースである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記複合コアセルベートが、粗大エマルジョンを水で希釈することにより形成される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
トランスグルタミナーゼが３未満のｐＨに調節することによって不活化される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
トランスグルタミナーゼがクエン酸によって３未満のｐＨに調節されることによって不活化される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
架橋がｐＨ２からｐＨ１０において行われる、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
架橋がｐＨ７において行われる、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記複合コアセルベートが、粗大エマルジョンを水で希釈することにより形成され、前記コロイドはゼラチンとカルボキシメチルセルロースである工程と、
前記コロイドシェルが５℃〜１０℃の温度で安定化される工程と；
該コロイドシェルが該温度においてｐＨ７でトランスグルタミナーゼによって架橋される工程と
を含む請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
１００ミクロン〜３００ミクロンの粒度を有する、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法の生成物。
【請求項２６】
１００ミクロン〜３００ミクロンの粒度を有し、咀嚼時に破壊することができる、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法の生成物。
【請求項２７】
請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法によって製造されたカプセル化油粒子の食品又は飼料への添加剤としての使用であって、
該カプセル化油粒子がカプセル化フレーバー油粒子である、上記使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は、複合コアセルベーションによる油粒子のタンパク質カプセル化、特に詳しくは、タンパク質カプセル化シェルの酵素的架橋に関する。
【０００２】
【従来の技術】
コアセルベーションは、高分子コロイドの水溶液を２つの液体相に分離するプロセスである。コアセルベートと呼ばれる１つの液体相は、一緒に結合した多くの微細なコロイド富化(colloid-rich)小滴から構成される。平衡液体と呼ばれる、他方の液体相はコアセルベーティング剤(coacervating agent)の水溶液である。
【０００３】
コアセルベートの形成に２種類以上の対立的に荷電した高分子コロイドを用いる場合には、このプロセスは複合コアセルベーションと呼ばれる。正電荷を有するコロイドはゼラチン及び寒天を包含し；負電荷を有するコロイドはカルボキシメチルセルロース及びアラビアゴムを包含する。各コロイドの等電点に依存して、特定のコロイドを対立的に荷電させるために、水による希釈及び／又はｐＨの調節が必要になる可能性がある。これらの反応はいずれのコロイドのゲル化温度をも越える温度で生じなければならず、さもなければ、コロイドは液体相でなくなり、コアセルベーションは生じないであろう。コアセルベーションが油粒子を含有する環境で生ずる場合には、油粒子が成核剤として作用して、タンパク質コロイドが各油粒子の周囲にシェル様構造として付着する。
【０００４】
複合コアセルベーションのプロセスにおける油粒子のカプセル化は先行技術において周知である。米国特許第２，８００，４５７号は油を含有する微視的カプセルと、複合コアセルベーションによるそれらの製造方法とを開示する。米国特許第２，８００，４５７号は水中にコロイドを分散し、油を導入して、エマルジョンを形成し、第２コロイドを水中に分散し、該エマルジョンと混合して、ｐＨを調節し及び／又は水によって希釈して、複合コアセルベートを形成し、これらの全てをコロイドのゲル化温度を越える温度でおこない、次に冷却して、ゲルを形成させ、その後に任意にホルムアルデヒド又は同等物による硬化及び架橋の工程をおこなうことを教示する。１実施態様では、アラビアゴム及びゼラチンを用いて、油核の周囲にコロイド物質のシェル様フィルムを形成する。コアセルベートが形成されたならば、混合物を２５℃を越えない温度に１時間放置すると、この時間後にカプセル形成が完了する。この後に、カプセルを必要に応じて用いるか又はカプセルに任意の硬化工程をおこなうことができる。米国特許第２，８００，４５８号は同様に、油含有マイクロカプセルの製造方法を開示する。米国特許第２，８００，４５８号はコアセルベートを形成するための塩溶液の使用を開示し、米国特許第２，８００，４５７号はコアセルベートを形成するためのｐＨ変化又は水による調節を開示する。
【０００５】
複合コアセルベートのタンパク質シェルの架橋は、架橋を含有するタンパク質が安定な構造であるので、タンパク質カプセル化油を熱安定性にする。油含有カプセルを不可逆的に架橋させるための、例えばホルムアルデヒド又はグルタルアルデヒドのような、公知の化学的架橋剤の使用は先行技術に開示されている。例えばタンニン酸（タンニン）又は硫酸カリウムアルミニウム（明礬）のような、他の架橋剤も同様に公知である。米国特許第２，８００，４５７号と第２，８００，４５８号との両方に開示されている任意の硬化工程は、カプセル材料の懸濁液をｐＨ９〜１１に調節し、０℃〜５℃に冷却し、ホルムアルデヒドを加えることから成る。
【０００６】
ホルムアルデヒドとグルタルアルデヒドとは、効果的な化学的架橋剤であるが、有害である。したがって、このような化学物質を用いて架橋される油カプセルは、哺乳動物の身体内に摂取されるために供給される油に用いることはできない。このことはこのような製品の用途をひどく限定する。
【０００７】
ある一定の天然生成酵素は良好な架橋剤でもある。このような酵素は、タンパク質中のある一定のアミノ酸側鎖間の結合形成を触媒することによって作用する。さらに、これらの酵素は天然生成性であるので、酵素的に架橋されるカプセル化油はホルムアルデヒド及びグルタルアルデヒド架橋に固有な問題を有さず、そのために架橋剤の毒性を心配することなく摂取又は供給されることができる。しかし、架橋は酵素触媒反応であるので、最適の酵素活性のために適当な環境条件が存在しなければならない。
【０００８】
タンパク質架橋を触媒する酵素はトランスグルタミナーゼ（アミンＹ−グルタミルトランスフェラーゼ，ＥＣ２．３．２．１３）である。トランスグルタミナーゼはペプチド中のグルタミン残基のＹ−カルボキサミド基と、種々な第１級アミン、しばしばペプチド結合リシン残基のε−アミノ基との間のアシル転移反応を触媒する。この結果は１つのタンパク質分子中のグルタミン残基と、他のタンパク質分子中のリシン残基との間の結合又は架橋である。最適の活性のために、トランスグルタミナーゼは補因子としての二価金属イオン（通常は、カルシウム又はマグネシウム）と、約７のｐＨとを必要とする。
【０００９】
味の素社の日本特許公報第５−２９２８９９号は、マイクロカプセル製造における架橋剤としてのトランスグルタミナーゼの使用を開示する。しかし、この公報に教示された構造は、当業者によって定義されるような複合コアセルベートであるとは考えられない。これは、むしろ、酵素改変された(enzyme-modified) ゼラチンエマルジョンである。さらに、第５−２９２８９９号公報は高温における架橋を開示する。高温に維持された分子構造及び／又は粒状構造はさらに液状になり、さらに不安定になり、定義されない構造の分子又は粒子の架橋を生じる。味の素の刊行物“味の素社のトランスグルタミナーゼ（ＴＧ）”はｐＨ６〜７及び５０℃の高温におけるトランスグルタミナーゼの最適架橋条件を開示する。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は油粒子を複合コアセルベーションによって酵素的にタンパク質カプセル化する(protein-encapsulating) 方法に関する。この方法によると、複合コアセルベートを最初に形成して、次に個別の油粒子の周囲のタンパク質シェルをゲル化することによって、これを安定化する。安定化されたタンパク質カプセル化粒子のタンパク質シェルを次に酵素によって架橋させて、熱安定性微粒子を形成する。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
この方法はまた、先行技術を凌駕する多くの利点を提供する。この方法は、種々な末端使用のために多様な性質を有する、定義された構造とサイズを有するマイクロカプセルを製造する。例えば、約１００〜約３００ミクロンの範囲のタンパク質カプセル化粒子中に存在するフレーバー油は、咀嚼時に有意なフレーバーバースト(flavor burst)を生じ、食品用途における加工を可能にする両方のための大きさである。３００ミクロンより大きい粒度を形成することもできるが、このような大きい粒度は多くの食品用途において要求される噴霧、押出成形及び他の機械的剪断力に応ずることができるような粒度ではない。さらに、タンパク質カプセル化フレーバー油粒子は熱安定性であり、焼成、フライイング及び電子レンジ加熱(microwaving) に耐えることができる。
【００１２】
本発明の１つの好ましい方法では、油と２種類の対立的に荷電したコロイドのコロイド分散系との間に粗大エマルジョンが最初に形成される。次に、個別の油粒子の周囲のタンパク質シェルによって複合コアセルベートが形成される。個別の粒子を冷却して、周囲のタンパク質シェルをゲル化する。次に、個別の油粒子を囲むタンパク質シェルを低温において酵素的に架橋させて、油のマイクロカプセルを形成する。約２０℃〜約２７℃の低温において、特に５℃〜１０℃の低温において、魚及びビーフのゼラチンのタンパク質シェルの酵素的架橋を達成して、フレーバー油のマイクロカプセルを形成することができることが判明している。さらに、このような低温における架橋反応はｐＨ依存性ではない。したがって、約２から約１０以上までの広いｐＨ範囲が使用可能であり、このことは使用可能である酵素の数と種類とを拡大する。
【００１３】
本発明の好ましい形式では、トランスグルタミナーゼを用いて、タンパク質シェルを約７のｐＨにおいて約５℃〜約１０℃の温度範囲にわたって酵素的に架橋させる。この好ましい操作形式によって、商業的目的に適した加工時間とマイクロカプセル化油の量とに経済的に達することができる。
【００１４】
本発明の目的及び他の利点は以下の図面と、詳細な説明と、実施例とに関連してさらに理解されるであろう。
【００１５】
図１に関して、油１０を少なくとも１種類の正に荷電したタンパク質コロイドと少なくとも１種類の負に荷電したコロイドとのコロイド分散系１２と共に撹拌して、粗大エマルジョンを形成する。好ましい実施態様では、正に荷電したタンパク質コロイドはゼラチン又は寒天のいずれかであり、負に荷電したコロイドはカルボキシメチルセルロース、ヘキサメタリン酸ナトリウム、アラビアゴム又はこれらの組合せのいずれかである。ゼラチンを用いる場合には、１０重量％の量が好ましい。約１００ミクロン〜約２，０００ミクロンの範囲の粒度である粒子の粗大エマルジョンが形成される。
【００１６】
図２に示すように、コロイド／油エマルジョンの水による希釈によって周囲温度において複合コアセルベート１４が形成される。タンパク質コロイドの等電点に依存して、コロイド／油エマルジョンのｐＨ調節を利用して、複合コアセルベートを形成することができる。
【００１７】
複合コアセルベート１４をコロイドのゲル化点以下の温度に冷却する。図３に関して、冷却は、最初にフットボール形状のタンパク質シェル１６中の各油粒子１０の周囲にタンパク質を付着させるために充分な温度に冷却し、次にタンパク質シェル１６を安定化するためにさらに冷却することによって、連続的におこなう。冷却の代替え手段として、タンパク質を変性させて、タンパク質シェル１６を安定化することができる。シェルの安定化は種々な方法で達成することができるが、冷却が好ましく、明確なフットボール形状のタンパク質シェル１６が油１０の周囲に形成される。初期冷却の程度は複合コアセルベート中の特定のタンパク質のゲル化点に依存する。例えば、魚ゼラチンのゲル化点は約２０℃であるが、ビーフゼラチンのゲル化点は約２７℃である。したがって、ゼラチンソースに依存して、初期冷却は２０℃〜２７℃の温度までであると考えられる。初期冷却は約１℃／５分間の速度でおこなわれる。複合コアセルベート１４の周囲にフットボール形状のタンパク質シェル１６を付着させる初期冷却後に、タンパク質カプセル化油粒子１８を約５℃〜１０℃の範囲内の温度にさらに冷却する。これらの粒子をタンパク質シェル１６を安定化するために充分な時間、５℃〜１０℃に維持する。
【００１８】
図４に示すように、冷却したフットボール形状のタンパク質シェル１６を５℃〜１０℃において酵素的に架橋させて、熱安定性タンパク質シェル２０を形成する。トランスグルタミナーゼが好ましい酵素である。この酵素は天然生成ソースから得ることも、化学的に合成することも、組換えＤＮＡ方法を用いて産生することもできる。トランスグルタミナーゼを溶液中の複合コアセルベートに、例えばデキストリン、カゼイン酸ナトリウム又は糖のようなキャリヤーと共に加える。トランスグルタミナーゼの量は約１重量％〜約１０重量％である。キャリヤーの量は約９９重量％〜約９０重量％であることができる。二価金属イオン（好ましくは、カルシウム又はマグネシウム）も補因子として存在する。ごく微量なカルシウムが必要であり、このような量はトランスグルタミナーゼの組織の天然ソース中に通常存在する。或いは、架橋反応を促進するために必要な場合には該イオンを加えることができる。トランスグルタミナーゼはｐＨ７において最適活性を示すので、タンパク質シェル２０を架橋させるために複合コアセルベートを約７のｐＨに調節する。
【００１９】
好ましい実施態様では、図１に関して、ゼラチンとカルボキシメチルセルロースとの（１：０．１の重量比での）分散系１２を撹拌しながら油１０と混合する。生成した乳化油粒子を周囲温度において水で希釈して、図２に示すような、各油粒子の周囲をゼラチンシェルが囲む複合コアセルベート１４を形成する。複合コアセルベート１４の温度を約１℃／５分間の速度で最初に約２０℃〜約２７℃に低下させ、次に迅速に該温度を約５℃〜１０℃に低下させることによって、ゼラチンを安定化して（ゲル化して）、図３に示すように、油１０の周囲にフットボール形状シェル１６を形成させる。各タンパク質カプセル化油粒子１８は約１００〜３００ミクロンである。ゲル化ゼラチンシェルを次に約７のｐＨにおいてトランスグルタミナーゼによって架橋させて、図４に示すような、熱安定性カプセル２０を形成する。次に、カプセル２０をクエン酸によって約３未満のｐＨに調節することによって、トランスグルタミナーゼを不活化する。この不活化工程はカプセル２０の安定性を強化し、貯蔵時にゲル形成を排除する。
【００２０】
【実施例】
実施例１
５０℃に予め加温した脱イオン水を全てのガム／ゼラチン溶液に用いた。カルボキシメチルセルロースナトリウム塩（１．８６３１ｇ）とアラビアゴムＲＣＣ粉末（０．１８６３ｇ）とを水（９１．１０３８ｇ）に、完全に溶解するまで激しく撹拌しながら、加えた。この分散系を３５℃〜４０℃に冷却する。ゼラチン２５０ブルーム型Ａ（１８．６３０６ｇ）を脱イオン水（１６７．６７５８ｇ）と、完全に溶解するまで撹拌しながら、混合し、次に分散系を３５℃〜４０℃に冷却する。このガム分散系を撹拌せずに予備エマルジョンタンク(pre-emulsion tank) に加えて、泡を１５〜２０分間消散させる。必要に応じて、消泡剤を用いることもできる。
【００２１】
５０％ｗ／ｗ水酸化ナトリウム又は５０％ｗ／ｗクエン酸の溶液をカプセル化タンク中の脱イオン水（５５８．９１９６ｇ）に加えて、３５℃〜４０℃に加熱する。予備エマルジョンタンク中で撹拌を再び開始する。望ましいフレーバー油（１４９．０４５１ｇ）を予備エマルジョンタンク中の一緒にしたゼラチン／ガム溶液に徐々に加えて、油小滴が望ましいサイズになるまで混合する。ｐＨをｐＨ５．０〜５．６に調節する。予備エマルジョン混合物をカプセル化タンク中の希釈水に移し、１℃／５分間の速度で２５℃に徐々に冷却する。このバッチを次に２５℃から１０℃に急冷して、水酸化ナトリウムによってｐＨ７に調節する。
【００２２】
デキストリン中１０％活性のトランスグルタミナーゼ（０．２３２８８ｇ）をこのバッチに徐々に加える。このバッチを１０℃において１６時間撹拌する。次に、撹拌を停止して、フローティング(floating)によってカプセルを分離させる。容器の底部から水の約４８〜５０％を排出させた後に、撹拌を再開して、濃縮されたカプセルを再分散させる。１０％ｗ／ｗ安息香酸ナトリウム溶液（１０．２４６９ｇ）を保存剤としてカプセルに加える。完全に混合した後に、バッチを５０％クエン酸によってｐＨ２．７５に調節してから、５〜１０分間混合する。キサンタンガム（０．１％〜０．３％）とプロピレングリコール（０．２％〜０．６％）との溶液を混合カプセルに徐々に加えて、カプセルの粘度を安定化し、調節する。混合は３０分間続ける。
【図面の簡単な説明】
【図１】予備エマルジョンの油粒子とコロイドの１００Ｘ倍率での顕微鏡写真。
【図２】水による希釈によって形成された複合コアセルベートの１００Ｘ倍率での顕微鏡写真。
【図３】複合コアセルベートを約２７℃に徐々に冷却することによって形成されたタンパク質カプセル化油粒子の１００Ｘ倍率での顕微鏡写真。
【図４】約５℃における完成状態での酵素的タンパク質カプセル化油粒子の１００Ｘ倍率での顕微鏡写真。
【符号の説明】
１０  油粒子
１２  コロイド分散系
１４  複合コアセルベート
１６  タンパク質シェル
１８  タンパク質カプセル化油粒子
２０  熱安定性タンパク質シェル
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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