(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
弱塩基性薬物をリポゾームに負荷する方法において、外部溶液よりも高濃度で２価金属イオンの塩を含んで成る媒体を封入したリポゾームを、弱塩基性薬物及びイオン運搬体を含んで成る外部溶液と共にインキュベートして、薬物が負荷されたリポゾームを生成せしめることを含んで成る方法。
【請求項２】
前記外部溶液がさらにキレート剤を含んで成る、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記インキュベーションを停止し、そして前記薬物が負荷されたリポゾームを単離することをさらに含んで成る、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記２価金属イオンが、Mn++，Mg++，Ca++，Fe++及びBa++から成る群から選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記イオン運搬体が、A23187、Ｘ537A、イオノマイシン及び４Br-A2387から成る群から選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記イオン運搬体が約10ng〜約2000ng／μmol脂質の量で存在する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記イオン運搬体が約100ng〜約500ng／μmol脂質の量で存在する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記キレート剤が前記外部溶液中に、約１mM〜約50mMの濃度で存在する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記キレート剤が存在し、そしてそれがEDTA，EGTA及びQUIN-2から成る群から選択される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記弱塩基性薬物が、ミトキサントロン、エピルビシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、リドカイン、クロロプロマジン、シプロフロキサシン、ジブカイン、プロプラノロール、チモロール、キニジン、ピロカルピン、フィソスチグミン、ドーパミン、セロトニン、イミブラミン、ジフェンヒドラミン、キニン、クロロキン、キナクリン及びコデインから成る群から選択される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記弱塩基性薬物がシプロフロキサシン、ドキソルビシン、ビンクリスチン及びエピルビシンから成る群から選択される、請求項１〜10のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記外部溶液が約5.0〜6.5のpHを有し、前記薬物がシプロフロキサシンであり、前記２価金属イオンがMn++であり、前記イオン運搬体がA23187であり、前記リポゾームがスフィンゴミエリン及びコレステロールから本質上成る脂質二重層を含んで成り、そして前記キレート剤が存在し、そしてそれがEDTAである、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記外部溶液が約6.0〜7.5のpHを有し、前記薬物がビンクリスチンであり、前記２価金属がMn++であり、前記イオン運搬体がA23187であり、前記リポゾームがスフィンゴミエリン及びコレステロールから本質上成る脂質二重層を含んで成り、そして前記キレート剤が存在し、そしてそれがEDTAである、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記の単離が、前記薬物が負荷されたリポゾームから前記イオン運搬体を除去することをさらに含んで成る、請求項３に記載の方法。
【請求項１５】
弱塩基性薬物をリポゾームに負荷する方法において、外部溶液より高濃度で１価金属イオンの塩を含んで成る媒体を封入したリポゾームを、弱塩基性薬物及びイオン運搬体を含んで成る外部溶液と共にインキュベートして、薬物が負荷されたリポゾームを生成せしめることを含んで成り、前記イオン運搬体が前記外部媒体中に約0.1ng〜約2000ng／μmol脂質の量で存在することを特徴とする方法。
【請求項１６】
前記イオン運搬体が前記外部媒体中に最初に約0.1ng〜約100ng／μmol脂質の量で存在する、請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
前記イオン運搬体が前記外部媒体中に最初に約0.5ng〜約5.0ng／μmol脂質の量で存在する、請求項15又は16に記載の方法。
【請求項１８】
前記インキュベーションを停止し、そして薬物が負荷されたリポゾームを単離することをさらに含んで成る、請求項15〜17のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記１価金属イオンがＫ+及びNa+から成る群から選択される、請求項15〜18のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記イオン運搬体が、ニゲリシン、モネンシン及びジアネマイシンから成る群から選択される、請求項15〜19のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記塩基性薬物が、ミトキサントロン、エピルビシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、リドカイン、クロロプロマジン、シプロフロキサシン、ジブカイン、プロプラノロール、チモロール、キニジン、ピロカルビン、フィソスチグミン、ドーパミン、セロトニン、イミプラミン、ジフェンヒドラミン、キニン、クロロキン、キナクリン及びコデインから成る群から選択される、請求項15〜20のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記塩基性薬物がシプロフロキサシン、ドキソルビシン、ビンクリスチン及びエピルビシンから成る群から選択される、請求項15〜21のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記外部溶液が約5.0〜6.5のpHを有し、前記薬物がシプロフロキサシンであり、前記１価金属イオンがＫ+であり、前記イオン運搬体がニゲリシンであり、そして前記リポゾームがスピグノミエリン及びコレステロールから本質上成る脂肪二重層を含んで成る、請求項15に記載の方法。
【請求項２４】
前記外部溶液が約5.0〜6.5のpHを有し、前記１価金属イオンがＫ+であり、前記イオン運搬体がニゲリシンでありそして前記リポゾームがスフィンゴミエリン及びコレステロールから本質上成る脂質二重層を含んで成る、請求項15に記載の方法。
【請求項２５】
前記の単離が、前記薬物が負荷されたリポゾームから前記イオン運搬体を、ゲル排除クロマトグラフィーにより除去することをさらに含んで成る、請求項18に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、療法剤を封入したリポゾームの製造方法に関する。このリポゾームはさらに該療法剤を特定の組織に選択的に供給するための標的化成分を有する。
発明の背景
リポゾーム、又は脂質小胞は、多くの種々の医薬製剤の療法活性を改良し、そして安全性を高めることができる認められた薬物投与系である。医学的治療において有用であるためには、リポゾームは、効果的な薬物対脂質比、及び実用的な製品寿命を有すべきであり、そして再現性の良い製造が可能であるべきである。高い薬剤対脂質比は患者への非医薬的脂質の負荷を減少せしめ、そしてさらに製造コストを下げる。医薬成分のロスが少ないからである。
リポゾーム担体系（小胞）は、水性コアーの周囲に同心円的に配置された１又は複数の脂質二重層の微視的球体である。この小胞は、親脂性部分と疎水性部分とのユニークな組合せのため、親水性療法剤及び疎水性療法剤の両者のため担体として適当であることが示されている。脂質二重層の構造は動物細胞を囲む膜に類似しており、そして脂質の疎水性部分が二重層の中に向き、他方親水性基は内部の又は外部の水性相に向くように配置された両親媒性脂質の結果である。
医薬用途のためのリポゾーム製剤は、小胞の形成の前に薬物と脂質とを一緒にすることにより、又は脂質小胞が形成された後にそれに薬物を負荷する（loading）ことにより製造することができる。患者への投与の後、リポゾームは、投与経路、小胞の組成及び小胞のサイズに依存して、体内に分散し、その中の細胞と相互作用する。電荷、化学特性、及び保護ポリマー又は標的化成分の小胞表面への含有のすべてが患者中でのリポゾームの挙動を変える。
医薬用途のためのリポゾーム製剤の開発における初期の先駆的研究にも拘らず、医薬を投与するためのリポゾームのさらなる開発は、製造工程での薬物の封入及び治療中での小胞からの放出の両方に関し問題点を呈している。
薬物の封入については、薬物と脂質の両者の最初の化学的一体性を維持しながら薬物対脂質比が可及的に高くなるように、捕捉効率を向上させる必要が存在する。従って、薬物負荷（loading）工程は穏和であるべきであり、そして脂質、リポゾーム又は薬物を激しい条件、例えば極端なpH、高温又はこれらの両方にさらすべきではない。一担、患者への投与が行われれば、薬物の放出は１つの要素である。リポゾームからの医薬の早い放出は、リポゾーム小胞担体の使用において求められる生物分配（biodistribution）の利益を低下せしめる。従って、医薬の負荷（loading）を最適にし、そして脂質小胞からの医薬の放出速度を低下せしめる努力が続けられている。臨床用途のためには、リポゾーム製剤は、製剤化された状態で又は混合前キットの状態で、輸送及び貯蔵を可能にするように安定に存在することが可能であるべきである。
ある種の弱酸及び弱塩基の薬物負荷に対して経膜pH勾配（ΔpH）が影響を与える可能性は長い間認識されている。例えば、Jacobs Quant.Biol. 8: 30-39（1940）, Chapperら、Regulation of Metabolic Processes in Mitochondria, Tagerら編、Elsevierアムステルダム、pp.293-316（1966），Crofts, J.Biol.Cherm. 242: 3352-3359（1967）, Crofts, Regulatory Functions of Biological Membranes, Jarnefelt編、Elsevier Pablishing Co.,アムステルダム、pp.247-263（1968）, Rottenberg, Bioenergetics 7: 61-74（1975）、及びRottenberg, Methods in Enzymol. 55: 547-569（1979）を参照のこと。この挙動は、荷電した形態の不透過性とは対称的に上記の分子の中性形態の高い透過性から生ずる。従って、ΔpH（内部が酸性）を示す生物膜又は小胞を横切って中性アミン（例えばアンモニア）が拡散すれば、プロトン化し、そしてそれ故に小胞内部に捕捉されるであろう。最近の研究は、リポゾームに封入された製剤中での有意に低下した毒性及び同じか又は増加した効力を示す抗癌剤ドキソルビシン（doxorubicin）及びビンクリスチン（vincristine）を含む。例えば、Mayerら、Cancer Res. 49: 5922-5930（1989）, Mayerら、Cancer Letters 53: 183-190（1990）, Mayerら、J.Liposome Res. 1: 463-480（1990）, Harriganら、Biochim.Biophys.Acta. 1149: 329-338（1993）, Bomanら、Biochem.Biophys.Acta. 1152: 253-258（1993）, Bomanら、Cancer Res. 54: 2830-2833（1994）、及びBomanら、J.Liposome Research 5: 523-541（1995）を参照のこと。しばらくの間、ドキソルビシンの封入は薬剤の毒性（特に急性心臓毒性）を低下せしめることが認識されているが、しかし最近まで、製剤のほとんどが低い封入レベル及び貧弱な保持性を有する受動封入法によっていた。ある値のΔpHを示す前形成されたLUVへの薬物の添加を含む遠隔負荷法（remote-loading methods）の開発が、改良された保持性を有する有意に高い薬物対脂質（Ｄ／Ｌ）比をもたらす、封入効率の増加の達成を可能にした。この基本的遠隔負荷技法は、酸性緩衝液（典型的には約pH4.0）での押出し（extrusion）によるLUVの形成、及びそれに続く、中性緩衝液中で平衡化されたセファデックスG-50のカラム上でのpHグラジエントの形成を含む。このアプローチは今臨床試験されているドキソルビシン及びビンクリスチンの両者の製剤化を導いた。Chonnら、Current Opinion in Biotechnology 6: 698-708（1995）、及びBomanら、Liposomes in Biomedical Applications, Shek編、Harwood Academic Publishers、シンガポール、85-103頁（1995）を参照のこと。
あいにく、すべての薬物がこの方法を用いて効率的に負荷され得るわけではない。例えば、抗生物質シプロフロキサシン（ciprofloxacin）は中性pH付近で低い溶解性を示し、このことがある条件下で低い捕捉値を導く。Hopeら、Liposomes in Biomedical Applications, Shek編、Harwood Academic Publishers、シンガポール、121-134頁（1995）を参照のこと。
関連する研究において、他の者はドキソルビシン及び抗生物質シプロフロキサシンが、硫酸アンモニウムの膜慣通グラジエントを示すLUV中に負荷され得ることを示した。Haranら、Biochim.Biophys.Acad. 1151: 201-215（1993）、及びLasicら、Biochem.Biophys.Acta. 1239: 145-156（1995）を参照のこと。硫酸アンモニウムを含有する小胞は、ある量の中性アンモニアが漏出するとき、pHグラジエントを自然に形成し、会合した（associated）プロトンを小胞内に残す。薬物の取り込みは内部pHの上昇を惹起し、さらなる内部アンモニアのロスと連動する。すなわち、アンモニアグラジエントは薬物の取り込みのためのpHグラジエントの発生の手段である。この技法の利点は、穏和な条件の使用に存する。小胞の内部は緩衝化されていないので、薬物の取り込み後のpHは標準的技法（Hopeら、Liposomes in Biomedical Applications（Shek, P.N.編）, Harwood Academic Publishers、シンガポール、121-134頁（1995）を参照のこと）におけるより高く、これはpH感受性薬物及びある種の脂質にとって有利な点であろう。
従来技術において必要なことは、製造が容易であり、療法剤の適当な保持をもたらし、そして高い薬物対脂質比を提供する療法剤の安定なリポゾーム製剤の製造のための新規な方法である。全く驚くべきことに、本発明は上記の及び他の要求を満たす。
発明の要約
本発明は、電気的に中性の輸送系を用いて弱塩基性薬物をリポゾームに負荷するための方法を提供することである。
１つの観点において、このリポゾーム負荷法は２価金属イオンの塩を含んで成る封入された媒体を有するリポゾームを使用する。弱塩基性薬物の取り込みは、前記のリポゾームを外部溶液と共にインキュベートすることにより達成され、この外部溶液は、薬物、及びリポゾーム２重層を通して２個のプロトンのための１つの２価金属イオンの電気的に中性な効果を行うことができるイオン運搬体（イオンポーレ；ionophore）を含んで成る。好ましくは、前記弱塩基性薬物を含有する外部媒体は、外部媒体に放出されるすべての金属イオンを配位する（coordinate）キレート剤をさらに含有するであろう。
本発明の他の観点において、１価金属イオンの塩を含んで成る媒体を封入したリポゾームを、弱塩基性薬物及びイオン運搬体（イオノポーレ）を含んで成る外部溶液と共にインキュベートし、薬物が負荷されたリポゾームを形成することを特徴とする方法を提供する。本発明のこの観点において、イオン運搬体（イオノポーレ）は、脂質μmol当り約0.1ng〜約2000ngの初期量で外部媒体中に存在する。
他の観点において、本発明は、前記の方法により製造される組成物を提供する。幾つかの好ましい態様において、イオン運搬体（イオノポーレ）はゲル排除クロマトグラフィー又は塩析により組成物から除去される。
【図面の簡単な説明】
図１は、シプロフロキサシン及びビンクリスチンの化学構造、並びにそれらの会合（associated）pH価を示す。
図２は、Mn++／A23187系についての、リポゾームへの療法剤のイオン運搬体（イオノポーレ）−依存性負荷を示す。黒丸がMg2+イオンを示す。
図３は、300mM K2SO4を含有する、100nm DSPC／Chol LUV中へのシプロフロキサシンの取り込みに対するニゲリシン（nigericin）濃度の効果を示す（図３Ａ）。ニゲリシンは１μｇ／μmol脂質（●）又は0.01ng／μmol脂質（■）で存在する。矢印で示すニゲリシンの添加の前には薬物の取り込みは生じない。最初のＤ／Ｌ比は0.3であり、そして取り込み温度は60℃であった。図３Ｂは、600mM K2SO4を含有する、100nm DSPC／Chol LUVへのシプロフロキサシンの取り込みに対するニゲリシン濃度の効果を示す。ニゲリシンは、0.1μｇ／μmol脂質（◆）、１ng／μmol脂質（■）、又は0.1ng／μmol脂質（●、点線）で存在した。矢印で示すニゲリシンの添加の前には薬物の取り込みは生じなかった。初期Ｄ／Ｌ比は0.3〜0.37であり、そして取り込み温度は60℃であった。
図４は、300mM K2SO4を含有する、100nm SPM／Chol LUVへのシプロフロキサシンの取り込みに対する外部pHの効果を示す。60℃での取り込みについては、ニゲリシンが１ng／μmol脂質で存在し、そして外部媒体は300mMシュークロース、15mM EDTA、pH6.2であった（■）。70℃での取り込みについては、ニゲリシンは0.5ng／μmol脂質で存在し、そして外部媒体は300mMシュークロース、15mM EDTA、pH5.5であった（●）。ニゲリシンは０時で添加した。初期Ｄ／Ｌ比は0.2であった。
図５は、300mM K2SO4を含有する、100nm SPM／Chol LUVへのビンクリスチンの取り込みに対する外部pHの効果を示す。外部媒体は300mMシュークロース（およそpH＝６）（■）又は20mM HEPES、300mMシュークロース、pH7.5（●）であった。ニゲリシンはｔ＝12分で添加し、そして１ng／μmol脂質で存在した。取り込み温度は60℃であり、そして初期Ｄ／Ｌ比は0.05（重量／重量）であった。
図６は、300mM MnSO4を含有する、100nm DSPC／Chol LUV（図６Ａ）又は100nm SPM／Chol LUV（図６Ｂ）へのシプロフロキサシンの取り込みに対する外部EDTAの効果を示す。図６Ａにおいて、外部媒体は300mMシュークロース、３mM EDTA（■）又は300mMシュークロース（●）であった。A23187（0.1μｇ／μｍ脂質）の添加を矢印で示す。取り込み温度は60℃であり、そして初期Ｄ／Ｌ比は0.35（mol：mol）であった。図６Ｂにおいて、外部媒体は300mMシュークロース、15mM EDTA、pH5.9（■）；300mMシュークロース、15mM EDTA、pH4.4（●）；又は300mMシュークロース（▲）であった。A32187（0.1μｇ／μmol脂質）は０時に添加された。取り込み温度は60℃であり、そして初期Ｄ／Ｌ比は0.2（mol：mol）であった。
図７は、300mM MgSO4を含有する、100nm SPM／Chol LUVへのシプロフロキサシンの取り込みに対する外部pH及びイオン運搬体（イオノポーレ）濃度の効果を示す。0.1μｇ  A23187／μmol脂質については、外部媒体は20mM HEPES、300mMシュークロース、15mM EDTA、pH7.0（■）；300mMシュークロース、15mM EDTA、pH7.0（◆）；300mMシュークロース、15mM EDTA、pH5.9（▲）；300mMシュークロース、15mM EDTA、pH4.4（●）；又は20mM HEPES、300mMシュークロース、15mM EDTA、pH6.0（○）であった。0.5μｇ  A23187／μmol脂質については、外部媒体は20mM HEPES、300mMシュークロース、15mM EDTA、pH6.0（□）であった。
図８は、300mM MnSO4を含有する、100nm SPM／Chol LUVへのビンクリスチンの取り込みに対する外部pH及びEDTAの効果を示す。外部媒体は20mM HEPES、300mMシュークロース、３mM EDTA、pH7.5（■）；300mMシュークロース、３mM EDTA（◆）；又は20mM HEPES、300mMシュークロース、pH7.5（●）であった。取り込み温度は60℃であり、そして初期Ｄ／Ｌ比は0.05（重量／重量）であった。
図９は、60℃での100nm SPM／Chol LUVへのシプロフロキサシン（図９Ａ）及びビンクリスチン（図９Ｂ）の取り込み、及び37℃にて50％マウス血清の存在下での持続を示す。図９Ａにおいて、取り込み実験は、イオン運搬体（イオノポーレ）／内部塩の次の組合わせについて行われた：A23187／MnSO4（●）、A23187／MgSO4（■）、ニゲリシン／K2SO4（◆）、及びニゲリシン／Ｋ2−酒石酸塩（◇）。矢印はマウス血清の添加（最終濃度50％）及びサンプルの37℃への移行を示す。図９Ｂにおいて、取り込み実験はイオン運搬体（イオノポーレ）／内部塩の次の組合わせについて行われた：A23187／MnSO4（■）、ニゲリシン／K2SO4（◆）、ニゲリシン／KH2PO4（●）、ニゲリシン／K2SO4（pHi＝7.4、pHo＝6.0）（◇）、及びニゲリシン／Ｋ2−酒石酸塩（pHi＝7.4、pHo＝6.0）（△）。最後の２つの調製物については、内部pH及び外部pH（それぞれpHi及びpHo）の両方を取り込みに先立って調整し、そして外部溶液は20mM MES、300mMシュークロース、pH6.0であった。すべての場合、内部塩は300mMで存在した。矢印はマウス血清（最終濃度50％）の添加及びサンプルの37℃への移行を示す。
図10は、薬物の取り込みにより測定した場合の、SPM／Chol LUVからのニゲリシンの除去を示す。図10Ａは、60℃でのシプロフロキサシンの取り込みに対するスピンカラムの効果を示す。取り込みは、１ng／μmol脂質のニゲリシン濃度での300mM K2SO4を含有するLUV（■）、又はニゲリシンと共に60℃にて５分間インキュベートし、そして次に薬物の添加の前にスピンカラムを通過させたLUV（●）についてモニターした。図10Ｂは、60℃及び65℃でのイオン運搬体（イオノポーレ）及びアミン法によるビンクリスチンの取り込みに対する透析の効果を示す。
図11は、100mM SPM／Chol(55／45mol％）LUVでのシプロフロキサシン（図11Ａ）及びビンクリスチン（図11Ｂ）のイン−ビボ持続を示す。薬物対脂質比は、300mMメチルアンモニウムサルフェート（●）、300mM MnSO4／A23187（■）又は300mM K2SO4／ニゲリシン（▲）を含有するリポゾーム性シプロフロキサミン（Ａ）、あるいは300mMクエン酸塩（pH4.0）（●）又は300mM MnSO4／A23187（■）を含有するリポゾーム性ビンクリスチン（Ｂ）の、マウスへのi.v.投与の後に測定した。シプロフロキサシンは0.2（mol：mol）のＤ／Ｌ比で封入され、そしてトレーサーとして〔14C〕CIPROを用いて測定された。ビンクリスチンは0.05（重量：重量）比で封入され、そしてトレーサーとして〔3Ｈ〕ビンクリスチンを用いて測定された。脂質は、トレーサーとして〔14Ｃ〕コレステリルヘキサデシルエーテルを用いて測定された。持続％は、ｔ時におけるＤ／Ｌ比を、最初に測定されたＤ／Ｌ比で割ったものとして定義される。
発明の詳細な説明
目  次
Ｉ．用語解説
II．一般…リポゾームの製造
III．イオン運搬体（イオノポーレ）−介在負荷
IV．医薬製剤
Ｖ．リポゾームの投与
VI．実施例
VII．結  論
Ｉ．用語解説
略語及び定義
本明細書において次の略語が使用される。
CHE：コレステロールヘキサデシルエーテル
Chol：コレステロール
CIPRO：シプロフロキサシン（ciprofloxacin）
EDTA：エチレンジアミン四酢酸
EGTA：エチレンビス（オキシエチレンニトリロ）四酢酸
Ｄ／Ｌ：薬物対脂質の比
DOX：ドキソルビシン（doxorubicin）
DSPC：ジステアロイルホスフェチジルコリン
LUV：大形単層小胞（large unilamellar vesicles）
NIG：ニゲリシン（nigericin）
POPC：パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン
SPM：スフィンゴミエリン
RT：室温
TBE：トリス−硼酸塩−EDTA（８mMのTris−硼酸塩、２mMのEDTA）
HEPES：４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸
PBS：リン酸緩衝化塩溶液
VINC：ビンクリスチン（vincristine）
本明細書において使用する場合、「イオン運搬体」（イオノポーレ；ionophore）なる語は、金属カチオンと共に錯体を形成し、そして該カチオンが脂質二重層を通過するのを助け、同時に反対方向へのＨ+の輸送を助ける化合物を意味する。本発明のための適当なイオン運搬体の例には、ニゲリシン、モネンシン（monensin）、A23187，4-BrA23187、イオノマイシン（ionomycin）及びX-537Aが含まれる。
本明細書において使用する場合、「キレート剤」（chelating agent）なる語は、脂質二重層を通過しない金属カチオンと共に錯体を形成する化合物を意味する。適当なキレート剤の例には、EDTA，EGTA及びQUIN-2が含まれる。
本明細書において使用する場合、「弱塩基性薬物」なる語は、一級、二級又は三級アミン官能基を含有する療法剤を意味する。弱塩基性薬物の例には、シプロフロキサシン、ミトキサントロン（mitoxantrone）、エピルビシン（epirubicin）、ダウノルビシン（daunorubicin）、ドキソルビシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン（vinblastine）、リドカイン（lidocaine）、クロロプロマジン（chlorpromazine）、ディブカイン（dibucaine）、プロプラノロール（propranolol）、チモロール（timolol）、キニジン（quinidine）、ピロカルピン（pilocarpine）、フィソスチグミン（physostigmine）、ドーパミン、セロトニン、イミプラミン（imipramine）、ジフェンヒドラミン（diphenhydramine）、キニン（quinine）、クロロキン、キナクリン及びコデインが含まれる。
「脂質」なる用語は、脂質物質の疎水性部分が二重膜の内側に向き、親水性部分が水性相に向くように二重層をもたらすあらゆる適当な物質を意味する。両親媒性脂質は主たる（primary）脂質小胞構造要素として必要である。親水性特性はホスファト基、カルボキシル基、スルファト基、アミノ基、スルヒドリル基、ニトロ基、又は他の類似の基の存在により生ずる。疎水性は、限定的ではないが例えば、長鎖飽和又は不飽和脂肪族炭化水素基、あるいは１又は複数の芳香族基、脂環族基又は複素環基により置換された上記のごとき基を含有することにより付与され得る。好ましい両親媒性化合物は、ホスホグリセライド類及びスフィンゴリピド類であり、その代表的な例にはホスアチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスフェチジルセリン、ホスフェチジルイノシトール、ホスファチジン酸、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン、リソホスファチジルコリン、リソホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン又はジリルオイルホスファチジルコリンが含まれる。リンを欠く他の化合物、例えばスフィンゴリピド及びグリコスフィンゴリピド類も脂質として定義される群に属する。さらに、上記の両親媒性脂質は、トリプシグリセロール（triacyglycerol）類及びステロール類を含めての他の脂質と混合することができる。
II．一般…リポゾームの製造
本発明において使用されるリポゾームは、標準的小胞形成性脂質から形成され、この脂質には中性又は負に荷電したリン脂質及びステロール、例えばコレステロールが含まれる。脂質の選択は一般に、例えばリポゾームのサイズ、及び血流中でのリポゾームの安定性を考慮して定められる。
典型的には、リポゾーム中の主たる脂質成分はホスファチジルコリンである。多様な鎖長及び飽和度を有する種々のアシル鎖基を有するホスファチジルコリンが入手可能であり、あるいは周知の技法により単離又は合成され得る。一般に、特に、フィルター除菌のためにリポゾームが約0.3ミクロンより小さいサイズにされなければならない場合、飽和度の低いホスファチジルコリンがより一層容易にサイズ調整可能である。Ｃ14〜Ｃ22の範囲の炭素鎖長を有する飽和脂肪酸を含有するホスファチジルコリンが好ましい。モノ−又はジ−飽和脂肪酸、並びに、飽和脂肪酸と不飽和脂肪酸との混合を含むホスファチジルコリンも使用され得る。他の脂質には、脂肪酸がエステル結合を介してではなくエーテル結合を介してグリセロールに結合しているリン脂質が含まれる。本発明において有用なリポゾームはまた、コリン以外の頭基（head group）、例えばエタノールアミン、セリン、グリセロール及びイノシトールを有するスフィンゴミエリン又はリン脂質から構成され得る。好ましいリポゾームは、ステロール、好ましくはコレステロールを、0.1〜1.0（コレステロール：リン脂質）のモル比で含むであろう。最も好ましいリポゾーム組成は、ジステアロイルホスファチジルコリン／コレステロール、ジパルミトイルホスファチジルコリン／コレステロール、及びスフィンゴミエリン／コレステロールである。リポゾームのサイズ調整及びフィルター除菌のために使用される方法を後記する。
例えば、Szokaら、Ann.Rev.Biophys.Bioeng. 9: 467（1980）；米国特許No. 4,235,871、No. 5,501,728、及びNo. 4,837,028；Liposomes, Marc.J.Osto編、Marcel Dekker社、ニューヨーク、1983, Chlapter 1；並びにHopeら、Chem.Phys.Lip. 40: 89（1986）に記載されているように、リポゾームの製造のために種々の方法が利用可能であり、上記の文献の記載を引用により本明細書に組み入れる。１つの方法は、不均一なサイズの多層小胞を生成する。この方法においては、小胞形成性脂質が適当な有機溶剤又は溶剤系に溶解され、そして真空下で又は不活性ガスのもとで乾燥され、薄い脂質フィルムが形成される。あるいは、脂質が適当な溶剤、例えば三級ブタノールに溶解され、そして次に凍結乾燥されて、そしてより容易に水和される粉状形のより均一な脂質混合物が形成される。このフィルム又は粉末を１価又は２価金属イオンの水性緩衝化溶液で覆い、そして15〜60分間にわたって撹拌しながら水和させる。生ずる多層小胞のサイズ分布は、より激しい撹拌条件下で脂質を水和することにより、又はデオキシコレートのごとき溶解性洗剤を添加することにより、小サイズの方向にシフトさせることができる。
リポゾームのサイズを所望のサイズに調整するために幾つかの技法を用いることができる。１つのサイズ調整法が米国特許No. 4,737,323に記載されており、この記載を引用によりこと明細書に組み入れる。リポゾーム懸濁液を浴により又はプローブソニケーションにより音波処理することにより、約0.05ミクロンより小さいサイズの小形の単層小胞への漸進的なサイズの減少が生ずる。均質化（ホモゲナイゼーション）は、大形リポゾームを小形リポゾームにする剪断エネルギーに頼る他の方法である。典型的な均質化法においては、多層小胞は、選択されたリポゾームサイズ、典型的には約0.1〜0.5ミクロンの間のサイズ、が観察されるまで、標準的乳剤ホモジナイザーを通して再循環される。両方法において、粒子サイズ分布は常用のレーザービーム粒子サイズ判別法によりモニターすることができる。
小孔ポリカーボネート膜又は不対称セラミック膜を通してのリポゾームの押出しも、リポゾームのサイズを比較的によく定義されたサイズ分布に小さくする有効な方法である。典型的には、所望のリポゾームサイズ分布が達成されるまで、懸濁液を膜を通して１回又は複数回循環させる。リポゾームを段々小さい孔を有する膜を通して押出すことにより、リポゾームサイズを漸進的に小さくすることができる。本発明において使用するため、約0.05ミクロン〜約0.15ミクロンのサイズを有するリポゾームが好ましい。
前記のごとく、本発明は、電気的に中性の輸送系を用いて薬物をリポゾームに負荷する方法を提供する。この方法においては、まず、種々の封入された媒体及び外部媒体を有するリポゾームが製造される。より具体的には、１個又は２個の金属イオンの溶液を封入したリポゾームが調製される。典型的なリポゾーム調製技法（上記参照のこと）においては、この溶液はリポゾームが形成された時それを包囲し、そしてそのため、リポゾームの最初の外部媒体は封入された溶液と同じ組成を有する。外部溶液の置換は、種々の方法により、例えばリポゾーム調製物を第二の水性緩衝液により平衡化されたゲル濾過カラムに通すことにより、あるいは遠心分離、透析又は関連技法により、達成することができる。
適当な内部媒体及び外部媒体を有するリポゾームが一旦形成されれば、薬物をリポゾームに負荷する工程は、リポゾームを、封入されている金属塩を脂質二重膜を通して輸送することができるイオン運搬体及び薬物と共にインキュベートする段階に進む。
III．イオン運搬体（イオノポーレ）−介在負荷
イオン運搬体−依存性薬剤取り込みの背後にある一般原理を図２に示す。高濃度の金属イオン、例えばＫ+又はMg2+を捕捉した大形の単層小胞（LUV）が形成され、そして外部金属イオンの除去によりイオン勾配が達成される（図２、上部及び中央の図）。外部媒体に薬物が添加され、そして金属イオンの外側への輸送とＨ+の内側への移動を生じさせるイオン運搬体の添加により取り込みが開始される。これは、一過性のpHグラジエント（内側が酸性）を作り出し、このことが弱い塩基特性を有する化合物、例えば薬物シプロトロキサシン（CIPRO）及びビンクリスチン（VINC）の取り込みをもたらす。イオン運搬体ニゲリシンはＨ+とＫ+との１対１交換を促進し、他方A23187はあらゆるＭ2+（Ｍ＝Ca，Mn，Mg，Fe又はBa）につき２個のＨ+を輸送する。いずれの方法も電気的中性（electroneutral）である。
一般原理は簡単であるが、最適な薬物の取込みを達成するためには多くのパラメーターを変化させることができる。これらには脂質濃度、内部塩濃度、イオン運搬体対脂質比、並びに内部溶液及び外部溶液のpHが含まれる。さらに、２価カチオンを用いる系は、外部溶液中の金属イオンの有効濃度を低下させることにより取り込みを駆動するために外部キレーターの添加により改良することができる（図２、下部）。
（ａ）薬物の負荷
１つの観点において、本発明はリポゾームに弱塩基性薬物を負荷するための方法を提供し、この方法は、２価金属イオンの塩を含んで成る媒体を封入したリポゾームを、弱塩基性薬剤及びイオン運搬体を含んで成る外部溶液と共にインキュベートして薬物が負荷されたリポゾームを形成することを含んで成る。
すでに検討したように、本発明において使用されるリポゾームは種々の脂質小胞のいずれであってもよく、例えば大形単層小胞（LUV）、中形又は小形単層小胞（それぞれMUV及びSUV）、並びに多層小胞（MLV）である。好ましくは、リポゾームはLUVである。リポゾームは形成され、又はある場合には、塩として存在する２価金属イオンの溶液を用いて再水和される。
２価金属イオンを用いる薬物負荷の概念はほとんどあらゆる２価金属イオンに適用することができるが、本発明のこと観点のために特に適当なものには、Mn2+，Mg2+及びCa2+が含まれる。あるいは、２価金属イオンの塩は種々の塩のいずれであってもよい。好ましくは、塩は医薬として許容される塩であって、水性媒体中に可溶性の塩、又はTHFもしくはDMFのごとき可溶化有機溶剤を部分的に含有する水性媒体中に可溶性の塩である。適当な塩の例は、塩酸塩、硫酸塩、酢酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、及びリン酸塩である。好ましくは、使用される塩は硫酸塩である。リポゾームの封入された媒体中に存在する２価金属イオン塩の濃度もまた、薬物の負荷の速度及び程度に影響するであろう。典型的には、２価金属イオンは約50mM〜約１Ｍ、好ましくは約100mM〜約800mM、そしてさらに好ましくは約250mM〜約650mMの量で存在するであろう。
２価金属イオンを含有する媒体を封入したリポゾームが一旦形成された後、脂質二重層をまたいでグラジエントが達成される。２価金属イオンを実質的に欠く媒体により外部媒体を置き換えることにより、又は外部媒体を希釈して２価金属イオンの濃度を低下させることにより、又は透析により、前記のグラジエントを達成することができる。いずれにしても、外部媒体中よりも小胞の内部により高濃度の金属イオンが存在するように、脂質二重層をまたいでグラジエントを達成するのが目的である。
金属イオングラジエントが達成された後（又はグラジエントの達成と同時に）、弱塩基性薬物が外部媒体に添加される。弱塩基性薬物は、一級、二級又は三級アミン官能基を有する種々の療法剤又は診断剤のいずれであってもよい。適当な弱塩基性薬物の例には、シプロフロキサシン、ミトキサントロン、エピルビシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、リドカイン、クロロプロマジン、ジブカイン、プロプラノロール、チモロール、キニジン、ピロカルピン、フィゾステイグミン、ドーパミン、セロトニン、イミプラミン、ジフェンヒドラミン、キニン、クロロキン、ニナクリン及びコデインが含まれる。当業者は、他の弱塩基性薬物を同じ有効性をもってリポゾームに負荷することができると予想するであろう。さらに、本発明の方法は、弱塩基性診断剤の負荷にも同様に適用することができる。
リポゾームへの薬物の負荷は、外部媒体への適当なイオン運搬体の導入の後に開始される。本発明において有用なイオン運搬体は、水素イオンの内側方向への動きと交換して、脂質小胞からの金属イオンの電気的に中性な輸送を促進するものである。２価金属イオンのために有用なイオン運搬体の例には、A23187、イオノマイシン及びX-537Aが含まれる。イオン運搬体X-537A（Lasalocid）はAldrich Chemical Co.（ミルウォーキー，ウイスコンシン州，米国）から入手可能であり、又は米国特許No. 3,715,372に記載されている方法により製造することができ、この特許の開示を引用により本明細書に組み入れる。イオン運搬体A23187はSigma Chemical Co.から入手可能である。使用されるイオン運搬体の量は典型的にはリポゾーム組成物の性質及びタイプに依存し、そして約10ng／μmol脂質〜約2000ng／μmol脂質であろう。好ましくは、イオン運搬体の量は約100〜約500ng／μｍ脂質である。
前記のごとく、薬物は、イオン運搬体により促進される水素と金属イオンとの電気的に中性の交換の結果として達成される一過性のpHグラジエントに応答して、リポゾームに負荷される。この負荷過程は周囲温度において起こるであろうが、例えば40℃〜約75℃、好ましくは約50℃〜約65℃の上昇した温度において行うこともできる。
１つの実施態様においては、外部溶液はさらに、２価基がリポゾームに逆行するのを防止するために機能するキレート剤を含んで成ることができる。適当なキレート剤には、例えばEDTA，EGTA及びQUIN-2が含まれる。好ましくは、外部溶液に存在するキレート剤の量は約0.5mM〜300mM、さらに好ましくは約1.0mM〜約50mMである。
本発明は、弱塩基性薬物をリポゾームに負荷するためのさらなる方法を提供する。これらの方法においては、１価金属イオンの塩を含んで成る媒体を封入したリポゾームが、弱塩基性薬物及びイオン運搬体を含んで成る外部溶液中でインキュベートされる。これらの方法において有用なイオン運搬体もまた電気的に中性であるが、しかし１価金属イオンに対して特異的であり、そして約0.1ng〜約2000nm／μmol脂質、好ましくは約0.1ng〜約100ng／μmol脂質、そしてさらに好ましくは約0.5ng〜約5.0ng／μmol脂質の量で存在する。１価金属イオンに対して特異的なイオン運搬体の例には、ニゲリシン、モネンシン（monensin）、ジアネマイシン（dianemycin）が含まれる。本発明のこの観点の他の特徴及び好ましい条件は、一般的に、２価金属イオンを用いる方法について前に記載した通りである。
１価法又は２価法のいずれかにより薬物がリポゾームに負荷された後、組成物を直接使用することができ、あるいは負荷されていない薬物及びイオン運搬体を除去するために、組成物をさらに処理することができる。リポゾーム組成物からイオン運搬体を除去するために多くの方法が利用でき、これには、例えばゲル排除クロマトグラフィー、透析、又はバイオビーズ（biobeads）による処理が含まれる。好ましくは、イオン運搬体はリポゾーム組成物からゲル排除クロマトグラフィーを用いて除去される。
IV．医薬製剤
上記の方法により製造されたリポゾーム組成物は、単独で、又は投与経路及び標準的医薬慣行に従って選択された生理的に許容されるキャリヤー（例えば生理食塩水又はリン酸緩衝液）と混合して投与することができる。一般に、医薬として許容されるキャリヤーとして生理食塩水が使用される。例の適当なキャリヤーには、例えば水、緩衝化水、0.4％食塩水、0.3％グリシン、及びその他の物、例えば安定性増強のための糖タンパク質、例えばアルブミン、リポプロテイン、グロブリン等が含まれる。食塩又は他の塩含有キャリヤーを含んで成る組成物において、キャリヤーは好ましくはリポゾームの形成の後に添加される。すなわち、リポゾームが形成され、そして適当な薬物が負荷された後に、リポゾームが医薬として許容されるキャリヤー、例えば生理食塩水中に希釈される。これらの組成物は、常用の周知の除菌法により除菌することができる。得られる水溶液は使用のために包装され、又は無菌条件下で濾過されそして凍結乾燥され、凍結乾燥された調製物は投与に先立って無菌水溶液と一緒にされる。組成物はまた、生理的条件に近ずけるために必要な場合には、医薬として許容される補助物質、例えばpH調整及び緩衝化剤、浸透圧調整剤等、例えば酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム等を含有することができる。さらに、組成物は、貯蔵中の遊離基及び脂質過酸化損傷に対して脂質を保護する脂質保護剤を含めることができる。親油性遊離基減衰剤（quencher）、例えばα−トコフェロール及び水溶性鉄特異的キレーター、例えばフェリオキサミンが適当である。
医薬製剤中のリポゾームの濃度は、約0.05％未満から２〜５％又はそれ以上、例えば10〜30重量％まで、大きく異ることができ、そして選択された特定の使用態様に依存して、主として流体体積、粘度等により選択される。例えば、治療に関連する流体負荷を軽減するために濃度を上げることができる。あるいは、刺激性脂質から構成されたリポゾームは、適用部位での炎症を軽減するために濃度を低下させるように希釈され得る。投与されるリポゾームの量は使用される特定の薬物、治療される疾患の状態、及び医師の判断に依存するであろうが、一般に約５mg〜50mg／kg体重、好ましくは約0.1〜５mg／kg体重である。
ポリエチレングリコール（PEG）で修飾したリン脂質、PEG−セラミド、又はガングリオサイドＧM1−修飾脂質をリポゾームに含めるのもしばしば好ましい。このような成分の添加がリポゾームの凝集を防止し、そして循環寿命を延長しそして負荷されたリポゾームの標的組織への供給を増加するための手段を提供する。典型的には、リポゾーム中のPEG−修飾リン脂質、PEG−セラミド又はＧM1−修飾脂質の濃度は約１〜15％である。
リポゾームの全荷電は、血液からのリポゾームのクリアランスにおける重要な決定因子である。荷電したリポゾームは典型的には細網内皮系（reticuloendothelial system）により一層速く摂取され（Juliano, Biochem.Biophys.Res. Commun. 63: 651（1975））、そしてそのために血流中でのより短い半減期を有する。延長された循環半減期を有するリポゾームは典型的には療法用途及びある種の診断用途のために好ましい。例えば、血流中で８，12〜24時間保持されるリポゾームは特に好ましい。
これらの使用の他の例において、薬物を負荷されたリポゾームは、例えば、ゲル、油、乳剤等の広範囲の局所投与形に導入される。例えば、薬物が負荷されたリポゾームを含有する懸濁液は、局所投与用クリーム、ペースト、軟骨、ゲル、ローション等として製剤化されそして投与され得る。
本発明はまた、キットの形態でリポゾーム組成物を提供する。キットは典型的には、該キットの種々の要素を保持する区画された容器から構成される。キットは本発明の組成物を、好ましくは脱水された形態で、それらの再水和及び投与のための指示書と共に含むであろう。他の態様において、薬物負荷リポゾームはリポゾームの表面に付加された標的化成分を含むであろう。標的化成分（例えば、抗体、蛋白質）を脂質（例えば本発明の粒子において使用されるもの）に付加する方法は当業界において知られている。
薬物負荷リポゾーム製剤の投与量は、薬物対脂質比、並びに年令、体重及び患者の状態に基く医師による決定に依存するであろう。
Ｖ．リポゾームの投与
療法剤がリポゾームに「負荷」された後、この組合せ物は種々の技法で患者に投与される。
好ましくは、医薬組成物は、非経腸的に、すなわち動脈中に、静脈中に、腹腔中に、皮下に、又は筋肉中に投与される。さらに好ましくは、医薬組成物は静脈中に又は腹腔中にボルス（bolus）注射される。例えば、Rahmanら、米国特許No. 3,993,754；Sears、米国特許No. 4,145,410；Papahadjopoulosら、米国特許No. 4,235,871；Schneider、米国特許No. 4,224,179；Lenkら、米国特許No. 4,522,803；及びFountainら、米国特許No. 4,588,578を参照のこと。この用途のために適当な特定の製剤はRemington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company、フィラデルフィア、PA，17th ed（1985）に見られる。典型的には、薬剤は許容されるキャリヤー、好ましくは水性キャリヤーに懸濁したリポゾームの溶液から成る。種々の水性キャリヤー、例えば水、緩衝化水、0.9％等張塩水等を使用することができる。これらの組成物は常用の周知の除菌技法により除菌され、又は無菌濾過される。得られた水性溶液は、そのまま使用のために包装され、又は凍結乾燥され、凍結乾燥された製剤は投与に先立って無菌水溶液と一緒にされる。組成物は、生理的条件に近付けるために必要な医薬として許容される補助物質、例えばpH調整及び緩衝化剤、浸透圧調整剤、湿潤剤、及びその他、例えば酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミンオレエート等を含有することができる。
リポゾーム製剤の投与量は、薬物対脂質比、並びに患者の年令、体重及び状態に基く医師による決定に依存するであろう。
本発明の方法は種々の宿主において実施される。好ましい宿主には哺乳類種、例えばヒト、ヒト以外の霊長類、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ等が含まれる。
他の方法において、医薬製剤は、組織への調製物の直接適用により標的組織と接触される。適用は、局所、「開放」又は「閉鎖」法であることができる。「局所」とは、環境に暴露された組織、例えば皮膚、口腔咽頭（oropharynx）、外耳道などへの、医薬製剤の直接適用を意味する。「開放」法は、患者の皮膚を切開し、そして医薬製剤が適用される下部組織を直接見ることを含む方法である。これは一般に外科的方法、例えば肺に接近するための胸部切開、腹部内臓に接近するための開腹術、又は他の標的組織への直接的外科処置により達成される。「閉鎖」法は、内部標的組織が直接可視化されず、皮膚の小さい傷を通して挿入具を介して接近する侵襲的方法である。例えば、製剤は針洗浄により腹膜に投与される。同様に、医薬製剤は、腰穿刺の間の注入、及びそれに続く脊椎麻酔又は脊髄のメトラジミド造影のために一般に行われる患者の適当な位置定めにより、髄膜又は脊髄に投与され得る。あるいは、製剤は内視鏡を通して投与され得る。
リポゾームの表面にさらに標的化抗体を有する本発明の組成物は、ある種の悪性疾患、例えば腹腔及び転位障害を介して、一般にくも膜又は軟脳膜に付着しそして脊髄の圧縮を迫るくも膜下空間に転移した卵巣腺癌の治療のために特に有用である。乳腺癌は一般にこのような転移形で存在する。
VI．実施例
後記の実施例において、実施例１〜４は前形成されたリポゾームへの、シプロフロキサシン及びビンクリスチンのイオン運搬体（イオノポーレ）−介在取り込みを例示する。実施例５はリポゾーム組成物の安定性を例示する。実施例６は薬物が負荷された組成物からのイオン運搬体の除去を示し、そして実施例６は幾つかの薬理動態データを提示する。
材  料
DSPCはNorthern Lipids, Inc（バンクーバ，B.C.，カナダ）から入手した。卵SPM、コレステロール、ニゲリシン及びA23187はSigma Chemical Co.（セントルイス，ミズリー，米国）から入手した。ビンクリスチン硫酸塩はEli Lilly Canada Inc.（Scarborouth，オンタリオ，カナダ）又はPharmacia, Inc（Kalamazoo，ミシガン，米国）から入手し、そして〔3Ｈ〕ビンクリスチンはAmersham（Oakville，オンタリオ，カナダ）から得た。シプロフロキサシン及び〔14Ｃ〕シプロフロキサシンはBayer（Etobioke，オンタリオ，カナダ）から提供された。〔3H〕CHE及び〔14C〕CHEはDupont New England Nuclear（ボストン，マサツーセッツ，米国）から入手した。正常マウス血清はCedar Lane Laboratories（サンフランシスコ，カリホルニア，米国）から入手した。実施例において使用される他のすべての化学物質及びすべての溶剤はHPLCグレードであった。
方  法
脂質小胞の調製
痕跡量の〔14C〕CHE又は〔3H〕CHEを含有する、DSPC／Chol及びSPM／Chol（55：45のmol：mol比）脂質混合物をｔ−ブタノールからの凍結乾燥により調製した。脂質フィルムを選択された塩の中で水和し、そして液体窒素と60℃の水とを用いて５サイクルの凍結−解凍にかけた。各解凍と凍結サイクルとの間に脂質をはげしくボルテックス撹拌した。0.1μｍの孔サイズを有するポリカーボネートフィルターを有して、高圧（300〜400psi）のもとで60℃にて脂質エマルジョンを押出すことによりLUVを調製した（Hopeら、Biochim.Biophys.Acta 812: 55-65（1985））。脂質を、K2SO4，KH2PO4，K2HPO4、酒石酸カリウム塩、CaCl2，MnSO4及びMgSO4を含めての種々の塩溶液により水和した。塩濃度は300mM又は（少数のケースについては）600mMであり、幾つかの実験においてはpHを通常６〜7.5の範囲に調整した。
金属カチオングラジエントの形成
300mMシュークロース（しばしば、緩衝化されたもの）により平衡化されたセファデックスG-50のカラム（1.5×10cm）を用いての溶剤交換により、膜中塩グラジエントを示すLUVを調製した。塩グラジエントはまた、１mLの使い捨てシリンジに平衡化されたG-50ゲルが充填されているスピンカラム（Pick, Arch.Biochem.Biophys, 212: 186-194（1981））を用いての760×ｇでの遠心によるゲルクロマトグラフィーによっても達成された。グラジエントを確立するため、LUVの50〜100μＬのアリコートを各スピンカラムに適用し、卓上遠心分離機により760×ｇにて２分間遠心した。少数の例においては、グラジエントは透析により形成した。
マウス血清に応答しての薬物の漏出
イン−ビボでのLUVからの薬物の可能性ある漏出のモデルを構成するため、イン−ビトロ測定を用いてイオン運搬体系からの種々の薬物の漏出の量的比較を行った。この測定においては、同体積のリポゾーム薬物製剤とマウス血清とを試験管中で混合し、そして37℃にてインキュベートする。LUVからの薬物の漏出をスピンカラム分析のためのアリコートの採取により測定する。
薬物及び脂質の測定
シプロフロキサシンの濃度は、小胞を破壊し、そして薬物をBligh and byer抽出法により可溶化した後に、275nmの吸光度を測定することにより決定した。Hopeら、Liposomes in Biomedical Applications, Shekら、Hormood Academic Publishers，シンガポール、121-134頁（1995）を参照のこと。ビンクリスチンの濃度は、295nmにて80％エタノールでの吸光度を測定することにより決定した（Maddenら、Chem.Phys.Lipids, 53: 37-46（1990）。〔14C〕CIPROは非放射性CIPROにより希釈し、そして液体シンチレーション計数及び吸光分光法はより比放射能を測定した。〔3H〕VINCの比放射能は同様にして測定した。〔14C〕CIPROを用いる実験のため、脂質混合物を痕跡量の〔3H〕CHEを用いてラベルした。〔3H〕VINCの取り込みのため、脂質を〔14C〕CHEによりラベルした。脂質の比放射能は、脂質のシンチレーション計数及びリン酸塩の測定を通してのリン脂質の定量により決定した。Fiskeら、J.Biol.Chem. 66: 375-400（1925）を参照のこと。すべての取り込み実験のため、Ｄ／Ｌ比は二重ラベル脂質シンチレーション計数により決定した。これらは、化学的及び分光測光的測定法により得られたＤ／Ｌ比と比較し、同一であることが見出された。
A23187の蛍光測定
SPM／Chol LUV中のA23187の量は、432nmの放射波長でのイオン運搬体の蛍光強度の測定、及びそれに続くリポゾーム製剤の可溶化及び放出された２価カチオンの錯化により決定した。要約すれば、LUV／A23187のアリコート（５μmolの全脂質に相当する）を333mM EDTA溶液（３μｌ）と混合し、そしてエタノール：メタノール（70：30のｖ：ｖ）により容量を１mLにした。サンプルを透明になるまでボルテックス撹拌し、そして蛍光強度を測定した。エタノール／メタノール（70：30のｖ：ｖ）から成りそして５mMの全脂質を含有する溶液１mlに既知量のA23187を添加することにより検量標準を調製した。
イン−ビボ薬理動態
SPM／Chol小胞（100nm）を使用した（55：45のモル％）。小胞を300mM K2SO4溶液又は300mM MnSO4溶液中に調製し、そして外部媒体を一夜の透析により、300mMシュークロース、20mM HEPES（pH7.0）と交換した。シプロフロキサシンを、薬物対脂質比0.2（mol：mol）において負荷した。ビンクリスチンは、0.05：１（wt：wt）のＤ／Ｌ比で負荷した。薬物の取り込みは次のようにして達成した。リポゾームのアリコートにニゲリシン（１ng／μmol脂質）又はA23187（0.1ng／μmol脂質）を、適当量の薬物と共に加えた。A23187実験についてはEDTAが外部媒体に30mMで存在した。得られた溶液を60℃にて、シプロフロキサシンについては30分間、ビンクリスチンについては15分間加熱した。
各サンプルを300mMシュークロースにより希釈し、マウスでの薬物投与量がシプロフロキサシンについては15mg／kg、ビンクリスチンについては２mg／kgになるようにした。各マウスに全容量200μＬを側尾を通して注射した。シプロフロキサシンの研究のためにはICRマウスを使用し、そしてビンクリスチンの研究のためにはBDF1マウスを使用した。種々の時点においてマウスを麻酔し、そして心臓穿刺により血液を集めた。血液は500×ｇにてすぐに遠心し、そして脂質及び薬物の測定のために血漿を集めた。
実施例１
この実施例は、イオン運搬体ニゲリシンの存在下でのカルシウムイオングラジエントに応答してのシプロフロキサシンの取り込みを例示する。
リポゾームを、上記の一般的方法に記載したようにして調製した。シプロフロキサシンの取り込みは60℃にて、５mMの全脂質濃度（１mLの体積）で行った。初期Ｄ／Ｌ比は0.2又は0.3（mol：mol）のいずれかであった。LUV及び薬物を一緒にし、そして60℃にて15分間インキュベートした。初期Ｄ／Ｌ比の測定のためにアリコート（100μＬ）を採取し、そしてイオン運搬体の添加前の取り込みを評価するために更なるアリコート（50〜100μＬ）をスピンカラムに通した。ニゲリシン（エタノール中、約５μＬ）を懸濁液に加えて所望の濃度（1.0ng／μｍ脂質〜1.0μｇ／μmol脂質）にした。薬物の取り込みを経時的にモニターするため、アリコートを採取し、そしてスピンカラムに適用した。
300mM K2SO4を含有する100nm DSPC／Chol（55：45）LUVへのCIPROの取り込みを図３Ａに示す。外部溶剤は300mMシュークロース（pH調整せず）であった。Ｋ+グラジエントのみに応答しては薬物の取り込みはほとんど又は全く起こらなかったが、１μｇ／μmol脂質の濃度でのニゲリシンの添加（矢印で示す）後の５分間以内に80％の取り込みが観察された。この工程は極めて迅速であり、数分間以内に高い捕捉レベルをもたらし、60℃にて３時間を超えて卓越した保持が観察された。観察された取り込みは、600mMへの内部塩濃度の上昇により影響されなかった（図３Ｂ）。
図３Ａにおいて観察される迅速な取り込みは、イオン運搬体のレベルが必要以上に高かったことを示唆した。そこで、NIGレベルの低下の効果を300mM及び600mM K2SO4において試験した。レベルを105の係数をもって低下させた場合（１μｇ NIG／μmol脂質から0.01ng NIG／μmol脂質）、80分後にわずか12％の取り込みが観察された（図３Ａ）。600mM K2SO4を含有するLUVについては、イオン運搬体を10の係数をもって減少させた場合（0.1μｇ NIG／μmol脂質に）、又は103の係数をもって（１ng NIG／μmol脂質に）減少させた場合でも、取り込みの変化は観察されなかった（図３Ｂ）。しかしながら、104倍の減少はCIPROの取り込み速度の有意な低下をもらたし（図３Ｂ）、80％以上の取り込みレベルを得るのに45分間以上を要した。従って、合理的な時間内に最適な負荷レベルを得るためには、約１ng／μmol脂質のNIG濃度が理想的であることが見出された。適切な条件下（下記参照のこと）で、これは0.5ng NIG／μmol脂質に減少し得る。
上記の最初の実験はDSPC／Chol LUVを用いて行われ、組成物は高度に規則的な（そして、それ故に比較的不透過性の）安定な小胞をもたらした。これらの小胞はまた、VINC及びDOXの製造においても使用された（Mayerら、Cancer Res. 49: 5922-5930（1989）；Mayerら、J.Liposome Res. 1: 463-480（1980）；Bomanら、Biochim.Biophys.Acta 1152: 253-258（1993）；及びBomanら、Cancer Res. 54: 2830-2833（1994）を参照のこと）。最近、標準的pHグラジエント遠隔負荷技術と組合わせてSPM／Chol（55：45）LUVを用いて卓越したVINC製剤が達成された（Bomanら、J.Liposome Research 5: 523-541（1995）、及びWebbら、Brit.J.Cancer 72: 896-904（1995）を参照のこと）。イオン運搬体法を用いて容認できる取り込みが達成され得るか否かを試験するため、ニゲリシン及びA23187の両方を用いて100nm SPM／Chol LUVへのCIPRO（及びVINC）の取り込みを試験した。第一の動機が薬理学的可能性を有する製剤を達成することであったので、できるだけ100％に近い取り込みレベルを得ることが重要であった。従って、初期Ｄ／Ｌ比は0.3から0.2に低下させた。
300mMシュークロースの外部媒体中、300mM K2SO4（pH7.4）を含有する100nm SPM／Chol LUVについて、初期Ｄ／Ｌ＝0.2、１ng NIG／μmol脂質において、CIPROのわずか60％の取り込みが観察された（表１）。これは、外部媒体としてのHEPES−緩衝化シュークロース（300mMシュークロース中20mM HEPES、pH7.0）の使用により80％に改善され、内部pHをpH6.1に低下させた場合、更なる限界的増加（85〜90％の取り込み）が観察された。従って、SPM含有小胞はDSPC含有小胞に近似する取り込み％値を示す。
図４に示すように、外部pHを低下させることによってもCIPROの取り込みの有意な改良が観察された。HEPES−緩衝化シュークロース（pH6.2）が外部媒体に存在した場合、60℃にて60分間に100％の取り込みが達成された（１ng NIG／pmol脂質について）。イオン運搬体の濃度を0.5ng NIG／μmol脂質（外部pH5.5）に低下せしめた時、70℃において同じ結果が得られたが、100％の取り込みを達成するために90分間が必要であった（図４）。これらの結果の要約を表１に示す。
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実施例２
この実施例はカリウムイオングラジエントを含むSPM／Chol又はDSPC／Cholリポゾームへのビンクリスチンのニゲリシン介在取り込みを例示する。
300mM K2SO4を含有するSPM／Chol LUVへのVINCの取り込みを、シプロフロキサシンについて前記したようにして60℃にて行った。結果を図５に示す。CIPROを用いたときと同様に、ニゲリシンの添加（矢印）の前には取り込みは観察されなかった。外部HEPES緩衝化シュークロース（pH7.5）の存在下で、取り込みは低く（わずか60％）、75分間にわたる保持は不良であった。これは、外部溶剤が300mMシュークロースの場合大きく改善され、90％近い封入と卓越した保持をもたらした。300mM K2SO4（pH7.4）で調製されたLUVについて、外部pH６（20mM HEPES、300mMシュークロース；又は20mM MES、300mMシュークロース）を用いて、さらなる改善（93〜95％）が得られた（図９Ｂ）。
300mM KH2PO4を含有する100nm SPM／Chol LUVについてVINCの合理的な封入（80％）が観察されたが、300mM K2HPO4中で調製されたLUVについてはそうではなかった（＜５％）（表２）。後者の場合、プロトンのニゲリシン依存性内側移動がリン酸緩衝液（pH７近く）を形成し、pHグラジエントの形成を阻止したと予想される。
Ｋ2−酒石酸塩の膜をまたいでのグラジエントに応答してのVINCの取り込みもDSPC／Chol LUVにおいて試験した（表２）。内部塩として300mM Ｋ2−酒石酸塩、及び外部媒体としてHEPES−緩衝化シュークロース（pH5.3〜6.3）を用いて、60℃にて15分間以内に85〜90％の取り込みが得られた。イオン運搬体の濃度は１ng NIG／μmol脂質であった。これらの条件下で、〔14Ｃ〕メチルアミンを用いて測定して（Harriganら、Biophys.J. 63: 1336-1345（1992）を参照のこと）2.3のΔpHが薬物の取り込み後に観察された。これはDeamer及び協同研究者の以前のデーターと一致しており、彼らは、関連する小胞膜をまたいでニゲリシンが2.2ユニットのpHグラジエントを生成し得たことを見出していた。Deamerら、Biochim.Biophys.Acta 274: 323-335（1972）を参照のこと。
Ｋ2−酒石酸塩に応答してのVINCの取り込みもまた、SPM／Chol LUVにおいて試験され、70％の取り込みをもたらした（図９Ｂ及び表２）。
Ｋ2−酒石酸塩系について外部pHはNaOHではなくアルギニンを用いて調整され、NaOHの使用は低い取り込みレベルをもたらしたことに注目するのが重要である。ニゲリシンはNa+に対して比較的高い親和性を有し、そして外部媒体中のNa+イオンの存在が、誘導されたpHグラジエントを打ち消すように働く。これらの結果の要約を表２に示す。
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実施例３
この実施例は、２価金属イオンが封入されたリポゾームへのCIPROのイオン運搬体−介在取り込みの例を示す。
カルボキシルイオン運搬体A23187は、特異性Mn2+＞Ca2+＞Mg2+及びそれぞれ210：2.6：１の相対結合親和性をもって、膜をまたいで２価カチオンを輸送する。Pressma, Ann.Rev.Biochem. 45: 501-530（1976）を参照のこと。Ca2+の塩のほとんどが水溶液に溶解せず、主たる例外（CaCCl2）はHClの高い膜溶解性によるものであり、これは誘導されたpHグラジエントのロスに寄与する。プロトン小胞内部に輸送される場合、HClが形成され、これは小胞から拡散し、これによりpHグラジエントが低下し又は破壊される。１つの解決策は硫酸塩のごとく膜不透過性アニオンとの塩の使用である。この場合、300mM CaCl2を含有する100nm DSPC／Chol LUVを用いて幾らかのCIPROの取り込み（40％）が観察されたが、取り込みの30分以内に薬物の有意な漏れが始まった（表３）。外部キレーターを使用すれば良善が観察されようが、Cl-の存在がなおグラジエントを打ち消し、そして薬物のロスを導くであろう。Mn2+及びMg2+の塩も試験し、そしてA23187に対する有意に高い相対結合親和性に照らして、Mn2+に特に注意をはらった。
図６は、300mM MnSO4のグラジエントに応答してのCIPROの取り込みを詳細に記載する。イオン運搬体及び外部EDTAの両者の結果を、60℃でのDSPC／Chol（55：45）LUVへのCIPRO（初期Ｄ／Ｌ＝0.35）の取り込みについて図６Ａに示す。外部媒体中300mMシュークロースを用いて２個のサンプルを調製し、１つのサンプルはさらに３mM EDTAを含有した。時間＝０分において、LUVとCIPROとを一緒にし、そして60℃の水浴中に入れた。MnSO4の溶液は酸性（pH３〜４）であり、A23187の添加に先立って幾らかの取り込みが観察されると予想された。45分において、EDTAを含まないサンプルにおいて約35％の取り込みが観察され、そしてEDTAを含有するサンプルにおいて約18％の取り込みが観察された。後者の場合、EDTAが外部温度を低下せしめ、そしてそれ故にΔpHを低下せしめ、これがより低い取り込みをもたらす（下記のごとく、取り込みもpH依存的である）。これらの値はおそらく、イオン運搬体なしで観察される最大取り込みに近いであろう。５分間のインキュベーションを含む第２の試行が同様の取り込みを示したからである。ｔ＝47分において、A23187を0.1μｇ／μmol脂質の最終濃度に添加した（矢印）。外部EDTAの不存在下では、約55％への更なる少しの取り込みが生じ、これは３時間にわたり安定であった。外部EDTAの存在下では、最終レベル＞90％へのCIROの更なる取り込みが40分間にわたって生じた。これは、初期Ｄ／Ｌを0.27に低下せしめることにより95％に増加した（表３）。従って、内部酸性塩溶液をもって開始した場合でも、容認される取り込み値を得るにはイオン運搬体が必要である。さらに、取り込みを最大にするためには、EDTAのごとき外部キレーターが必須である。これはまたMn2+：Mg2+「サイクリング」、すなわち膜表面に接触した外部Mn2+の逆輸送がプロトンの輸送を上まわることを防止するためにも必要であろう。外部EDTAの必要性はまた、大きなMn2+グラジエントが存在するにも拘らず、封入されたMn2+の１／２より少ない量が、A23187の存在下でPOPC小胞から放出されるという観察と一致する（Erdanlら、Biophys.J. 66: 1678-1693（1994））。
SPM／Chol（55：45）から構成されたLUVへのCIPROの取り込みを図６Ｂに示す。これらの実験のため、Ｄ／Ｌ比は0.2に低下させ、そして外部EDTAを15mMに増加した。上記のごとく、EDTAの不存在下では低い（30％）取り込みが観察された。しかしながら、EDTAの存在下でさえ、最終取り込みレベルは外部pHに依存した。外部pH＝4.4においてわずか80％の取り込みが観察されたが、これは外部pH＝5.9において98〜100％に増加した。従って、ニゲリシン及びA29187のいずれを介してもCIPROの取り込みのための最適pHは約pH６のようである。
CIPROの合理的な〜卓越した取り込みはまた、図７に示すように、MgSO4のグラジエントに応答しても生ずる。内部塩は300mM MgSO4（pH6.5）であり、そして外部媒体は15mM EDTAを含有する300mMシュークロースであった。脂質組成、取り込み温度、及びA23187の濃度は図6Bの通りであった。外部pH＝4.4でわずか20％、外部pH＝5.9で約75％、及び外部pH＝6.0（20mM HEPES＋シュークロース−EDTA）で86％の取り込みが観察された。pH5.9に比べてpH6.0で観察された高い取り込みは、HEPES緩衝液の存在によるものである。外部pH＝7.0について、80％の取り込みレベルが観察された。しかしながら、6.0の外部pHでのA23187濃度の５倍の増加（0.5μｇ／μmol脂質への）が97％の封入をもたらした。これらの結果を表３に要約する。
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実施例４
この実施例は、Mg2+を含有するリポゾームへのVINCのイオン運搬体−介在取り込みを記載する。
SPM／Chol LUVと共にMn2+／A23187を用いて卓越した取り込み及び保持を得ることができる。HEPES−緩衝化シュークロース（pH7.5）の外部媒体中にEDTAが存在しない場合には５％未満の取り込みが観察された。３mM EDTAの存在下で（外部pH＝7.5）、１時間以内に95％を超える取り込みが観察された。しかしながら、300mMシュークロース／３mM EDTAを使用する場合、より低い外部pHにおいて非常に不良の取り込み（40％）が観察された。これらの結果の要約を表４に示す。
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実施例５
この実施例は、マウス血清に対する本発明のリポゾーム組成物の安定性を示す。
マウス血清に応答してのLUVからCIPRO及びVINCの放出
種々のリポゾーム系の相対的保持特性を評価するために、マウス血清を用いるイン−ビトロ漏出測定を設計した。この測定は非常に簡単であり、この測定においては、同体積のマウス血清とLUV（薬物が負荷されている）を37℃でインキュベートし、そして次にアリコートをスピンカラムに適用してＤ／Ｌ比を経時変化を定量する。血清のこの量は、ある種の薬物の急速で且つほとんど完全な漏出のために十分である。しかしながら、イン−ビドでの漏出は一般にさらに非常に低い速度で起こる。この測定法を用いて得られた結果は透析を含む他の方法からのものと異るが、しかし異るサンプル間で観察される相対的な相違は、使用される方法とは無関係に類似していることが見出された。従って、この簡単な測定法はイン−ビボ試験に先立って製剤をスクリーニングするのに有用である。
37℃にて50％マウス血清中でのインキュベーションによるSPM／Chol LUVからのCIPROの放出を図９Ａに示す。Mn2+／A23187系において薬物の最良の保持（２時間後60％保持）が観察され、次にMg2+／A23187系（35％）、最後にＫ+／ニゲリシン系である。ニゲリシンを含有するLUVからの物質の非常に急速なロスは、逆輸送を生じさせそしてpHグラジエントを低下又は破壊するＫ+が血清中に高濃度に存在するためであろう。
37℃にて50％マウス血清中でのインキュベーションによるSPM／Chol LUVからのVINCの放出を図９Ｂに示す。CIPROと同様に、Ｋ+／ニゲリシン系に比べてMn2+／A23187系について、良好な薬物保持が観察される。Ｋ／ニゲリシン系においては、リン酸塩又は酒石酸塩を用いて、あるいは外部pH＝６において硫酸塩を用いて、より良い結果が観察された。Mn2+／A23187系を用いて観察された保持は、メチルアンモニウムサルフェートを用いて負荷されたLUVについて観察されたそれと類似していた（データーは示さない）。
実施例６
この実施例は、負荷されたリポゾームからのイオン運搬体の除去方法を例示する。
薬物の取り込み及び投与の後、LUV中のイオン運搬体の存在は２つの理由により不利である可能性がある。第１に、Na+及びＫ+のごときイオンの高い血清濃度が、誘導されたpHグラジエントのロスにより逆輸送を生じさせる可能性がある。第２に幾つかのイオン運搬体は毒性物質である。蛍光測定法を用いて、SPM／Cholの製剤中のA23187の濃度を、種々の処理の後に定量することができる（このデーターは後で検討する）。ニゲリシンについては、スピンカラム又は透析を用いてニゲリシンの濃度の低下の可能性を、LUVサンプルの種々の処理の後にCIPROの取り込みを試験することにより評価した。これらの研究は、イオン運搬体は小胞間で交換され、そしてそれ故に脂質二重層から除去され得るであろうという知識により促進された。Erdahlら、Biophys.J. 66: 1678-1693（1994）を参照のこと。
負荷に先立って、ニゲリシン担持小胞をスピンカラムに通すことによる薬物の取り込みに対する効果を図10に示す。イオン運搬体（１ng／μmol脂質）及び薬物（Ｄ／Ｌ＝0.2）を、イオングラジエントの確立の後同時に添加した場合、30分間以内に80％の封入が観察された。しかしながら、薬物の添加に先立ってLUVサンプルをG-50スピンカラムに通した場合、取り込みの速度は有意に低下し、そして類似の取り込みレベルを達成するための時間は４の係数をもって延長された。この取り込み曲線の形は70℃にて0.5ng NIG／μmol脂質について観察されたそれと近似しており、そして有意の比率のニゲリシンが除去されたことを示している。ニゲリシンを担持するLUVがまず透析（３時間）にかけられた場合、又はそれらが第二のスピンカラムに通された場合、類似の取り込みが観察され、更なるニゲリシンがほとんど又は全く除去されなかったことが示唆された。興味あることには、正常のLUV及びニゲリシンが負荷されたLUVからのCIPROのイン−ビトロ漏出は同一であることが見出された（データーは示していない）。
スピンカラムを用いての小胞からのニゲリシンの除去の部分的成功は、より強い手段を用いてイオン運搬体の濃度をより大きく低下せしめることができることを示した。すなわち、ニゲリシンのアリコート（１ng NIG／μmol脂質）を、300mM KH2PO4を含有するSPM／Chol LUVに添加し、そして温度を５分間60℃に上げることによりニゲリシンと脂質との会合を確実にした。次にサンプルを室温にて300mMシュークロースに対して20時間十分に透析し、次にVINCによる薬物負荷に先立って、アリコートをスピンカラムに通した（図10Ｂ）。十分な透析にもかかわらず、１時間目のVINCの取り込みは（60％）は、単一のスピンカラムを用いてCIPROについて得られたそれ（図10Ａ）によりもわずかに低いだけであった。
これらの結果は小胞からのイオン運搬体のロスによりうまく説明されるが、小胞の内容物が透析中に漏出したならば、やはり取り込みの低下が観察されるであろう。そうでないことを確認するため、同じ条件に付された、エチルアンモニウムサルフェート及びアミルアンモニウムサルフェートを含有するLUVに対して、対照取り込み実験を行った。薬物の取り込み及び保持を惹起するこれらのアミンは80〜95％の封入をもたらした。さらに、その結果は、1.5×10cmのG-50カラム上でアミングラジエントを新たに調製したサンプルと同じであった。このことは、透析中のアミンのロスは無視できることを示し、そしてより低い膜透過性を有するＫ+イオンのロスを否定する。総合的に考えて、これらの結果は、ニゲリシンはLUVから部分的に除去され得るが、完全な除去は行い得ないであろうことを示唆している。
上記のごとく、種々の精製手順の後に残留する量の測定を可能にする蛍光測定を用いて、LUV中のA23187の濃度を定量することができる。最初にA23187を0.1μｇ／μmol脂質の濃度で含有するSPM／Chol LUVについての結果を表５に示す。サンプル１（Ｓ１）について、146ngのA23187をLUVに加え、そして123ngが上記測定法により測定された。LUVをセファデックスG-50カラムに通し、300mMシュークロースで溶出した後（Ｓ２）、残留レベルはバックグラウンドより下であった。同様に、300mMシュークロースに対する透析（Ｓ３）、又はSM-2バイオビーズによる処理（Ｓ４）はA23187の濃度をバックグラウンドレベルより下に低下させた。Ｓ４への既知量のイオン運搬体の添加はLUVの予想された濃度をもたらした。この結果は、ニゲリシンについて観察された不完全な除去とは異り、A23187はLUVから効果的に除去され得ることを示している。これらの結果は下記に示すイン−ビボ研究のために有意義である。
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実施例７
リポゾームCIPRO及びVINCのイン−ビボ薬理動態
SPM／Chol LUVに負荷されたCIPRO及びVINCの薬理動態を図11に示す。各薬物は幾つかの方法で負荷し、そして０時においてマウスに注射した。示された時点でサンプルを採取し、そして回収されたLUVのＤ／Ｌ比を測定した。CIPRO（図11Ａ）については、A23187系がK2SO4／ニゲリシンに勝っており、そしてメチルアンモニウムサルフェートを含有するLUVと類似していた。LUVからのCIPROの放出の半減期は、メチルアンモニウムサルフェート、A23187及びニゲリシンについてそれぞれ6.8時間、5.6時間及び1.1時間であった。循環中のCIPROの半減期を試験した場合、その値はそれぞれ3.5時間、3.1時間及び0.7時間であった。VINC（図11Ｂ）については、A23187を用いて負荷されたLUVについて観察された保持は、300mMクエン酸塩（pH4.0）を用いて負荷されたLUVに匹敵した。この場合、LUVからのVINCの放出の半減期（初期Ｄ／Ｌ比の変化に基く）は、クエン酸塩及びA23187について、それぞれ20.9時間及び10.1時間であり、そして循環中のVINCの半減期はそれぞれ8.5時間及び16.0時間であった。薬剤漏出の半減期は２の係数をもって異るが、VINCの循環半減期の相違は大きくない。これは、２つの系により達成され得る効果が匹敵することを示唆する。
VII．結  論
本明細書は記載されるすべての刊行物、特許及び特許出願は、各刊行物、特許又は特許出願が具体的に及び細別的に引用により本明細書に組み入れられる旨記載されたのと同じ程度に、本明細書に引用により組み入れられる。
前記の発明は、理解を明瞭にする目的で例示及び実施例により幾分詳細に記載したが、請求の範囲の範囲内において、変化及び変法を行うことができることは言うまでもない。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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