(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫調節剤として使用するためのウシの胆汁から抽出される組成物であって、当該組成物は、
（i）ウシの胆汁と等量のエタノールを混ぜて、胆汁／エタノール溶液を作製すること；
（ii）胆汁／エタノール溶液から胆汁色素およびエタノールを除去して実質的にエタノールを含まない無色の液体を得ること；
（iii）エーテルで無色の液体を抽出して水相を単離すること；および
（iv）水相から残存したエーテルを除去すること
を含む方法により製造され、
ここで、当該組成物は、およそ３０００ダルトン未満の小分子量成分を複数含み、そして、
a）ｉｎ  ｖｉｔｒｏで単球および／またはマクロファージを刺激することにより、一つまたは複数のサイトカインを放出および／または生産することが可能であり；
b）単球および／またはマクロファージを刺激することにより、腫瘍壊死因子をインビトロまたはインビボにおいて生産することができ；
c）ＩＬ−１α，ＩＬ−１β，ＴＮＦ，ＩＬ−６，ＩＬ−８，ＩＬ−４、ＧＭ−ＣＳＦまたはＩＦＮ−ガンマを定量できるほど含まず；
d）悪性マウス腫瘍細胞系列に対して抗増殖効果を持ち；および
e）内毒素でない
という特性を有する、前記組成物。
【請求項２】
請求項１記載の組成物および所望により薬剤的に受容可能な希釈剤またはキャリヤーを含む、免疫反応の刺激を必要とする病気および症状の予防および治療に使用するための薬剤組成物。
【請求項３】
免疫反応の刺激を必要とする患者において病気および症状の予防および治療に使用される請求項１記載の組成物。
【請求項４】
感染性疾患および新生物の患者において治療に使用される請求項１記載の組成物。
【請求項５】
患者の免疫体系を刺激するために使用される請求項１記載の組成物。
【請求項６】
（a）ウシの胆汁とエタノールを混ぜて、胆汁／エタノール溶液を作製すること；（b）胆汁／エタノール溶液から胆汁色素およびエタノールを除去して実質的にエタノールを含まない無色の液体を得ること；（c）エーテルで無色の液体を抽出して水相を単離すること；および（d）水相から残存したエーテルを除去すること；を含む、免疫調節剤組成物を調製するための方法であって、
ここで、免疫調節剤組成物は、i）ｉｎ  ｖｉｔｒｏで単球および／またはマクロファージを刺激することにより、一つまたは複数のサイトカインを放出および／または生産することが可能であり；ii）単球および／またはマクロファージを刺激することにより、腫瘍壊死因子をインビトロまたはインビボにおいて生産することができ；iii）ＩＬ−１α，ＩＬ−１β，ＴＮＦ，ＩＬ−６，ＩＬ−８，ＩＬ−４、ＧＭ−ＣＳＦまたはＩＦＮ−ガンマを定量できるほど含まず；iv）悪性マウス腫瘍細胞系列に対して抗増殖効果を持ち；v）内毒素ではなく；そしてvi）およそ３０００ダルトン未満の小分子量成分を複数含む、
前記方法。
【請求項７】
無色の液体を胆汁／エタノール溶液の元来の量の約８分の１から約１０分の１にまで濃縮することをさらに含む、請求項６記載の方法。
【請求項８】
請求項６または７記載の方法により得られる組成物。
【請求項９】
すい臓癌におかされている患者のすい臓癌の治療に使用される請求項１または８記載の組成物。
【請求項１０】
感染性疾患または腫瘍形成の治療のための、請求項２記載の薬剤組成物。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、免疫調節組成物、該組成物を含む薬剤、並びに動物の治療における該組成物および薬剤の使用に関する。
発明の背景
癌および感染症、例えば、後天性免疫不全症候群（エイズ（ＡＩＤＳ））の予防および治療のための療法は絶えず開発されている。これらの療法のいくつかは、免疫系を治療的に用いることを試みている。一つのアプローチは、免疫系の抗原特異的要素、すなわち抗体およびＴ細胞に基いている。例えば、研究は、外来抗原に対してまたはインターロイキンなどのある種の内因性の化学的メッセンジャーに対してワクチンを生じさせることを目的としてきた。第二のアプローチは、免疫系の非抗原特異的部分からのペプチドおよびタンパク質の単離、クローニング、発現および生産に基いてる。例えば、白血球によって生産されたインターロイキンを含むサイトカイン、および外来抗原を消化するリンパ球およびスカベンジャー細胞を刺激するインターフェロンなどのタンパク質は療法の可能性を与える。
癌の治療は、腫瘍が臨界的寸法に達しないように腫瘍に対する初期免疫応答を増大させことができるならば大きく促進されうる。腫瘍に対する免疫応答を増大させると示唆された計画としては、腫瘍関連抗原に特異的なワクチン；腫瘍細胞の表面上の抗原に対する、例えば、インターロイキン−２受容体に対する単クローン性抗体の使用；抗腫瘍抗体および超抗原を含む二重特異的分子の使用がある。
比較的最近になって、腫瘍壊死因子（「ＴＮＦ」）として知られる生理学的に活性なポリペプチドの役割が、特に、生体の正常組織に対して影響を及ぼすことなく腫瘍の壊死を誘導するその能力に関して研究されてきた。ＴＮＦのアミノ酸配列、並びにＴＮＦをコードするＤＮＡの塩基配列は、米国特許第４，８７９，２２６号明細書に開示されている。
ＴＮＦは腫瘍の壊死を誘導する場合にある役割を有することが分かっているので、インビボでのＴＮＦの生産または生物学的利用能を刺激しうる物質はいずれも、種々の腫瘍状態のための治療として潜在的に有用である。更に、ヒト単球およびマクロファージを刺激してインビトロでＴＮＦを生産しうる物質はいずれも、治療的投与用のＴＮＦ源を与えるための、更には分析および診断目的のための手段として有用である。
胆汁は肝臓によって分泌され且つ胆嚢に貯蔵されるが、正常な肝臓機能によって容易に代謝される薬剤の生物学的利用能を増加させるための（ＷＯ９０／１２５８３号明細書を参照されたい）および哺乳動物における白血球増加症進行を阻害するための（シノダ（Ｓｈｉｎｏｄａ）ら、Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，３０，４４２９〜４４３４（１９８２）参照されたい）胆汁抽出物の使用を含む様々な目的のために研究されてきた。しかしながら、胆汁が、腫瘍性疾患または感染症に関して治療的に有用な組成物の源であると考えられたことはなかった。興味深いことに、英国特許第３３７，７９７号明細書によれば、胆嚢から胆汁を除去し、そして胆嚢が十分に洗浄された後だけを除いて、胆嚢自体を抗癌剤の可能な源として用いることが示唆された。
発明の概要
現在、胆汁はインビトロおよびインビボ両方のＴＮＦ生産を刺激することができる組成物の重要な源であり且つ様々な癌、特に膵臓癌を治療する場合に有効であるということが発見されている。
有用な胆汁組成物は、水溶性または水混和性溶剤による胆汁の抽出によって得られる。そのようにして得られた抽出物は、更に処理して不必要なまたは望ましくない成分をそこから除去することができる。
以下に更に詳細に開示された胆汁抽出法によって得られた生成物は、ＴＮＦ刺激活性を有することが分かっており、そして特に膵臓および他の癌に対する抗癌活性を有すると考えられる。明らかに、このような活性を得るには、そのようにして得られた組成物全部が必要ではないかもしれない。したがって、このようにして得られた生成物を更に分離し、分別しまたは他に処理すること、そしてなお望ましいＴＮＦ刺激および抗癌活性を保持していることは可能である。更に、同様のまたは類似のＴＮＦ刺激および抗癌活性を有する生成物を合成によって得ることが可能であると考えられる。例えば、生成物の成分は、望ましい活性の原因である成分またはその組合せに関して分析することができ、そしてこのような分析に基づいて合成生成物を製造することができると考えられる。
一つの態様において、本発明は、３０００ダルトン未満の低分子量成分を含み且つ以下の性質
（ａ）動物の胆汁から抽出可能である；
（ｂ）インビトロで単球およびマクロファージを刺激することができる；
（ｃ）腫瘍壊死因子生産を調節することができる；
（ｄ）測定可能な量のＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＴＮＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−４、ＧＭ−ＣＳＦまたはＩＦＮ−γを含まない；
（ｅ）悪性マウスハイブリドーマ細胞系において抗増殖作用を有する；
（ｆ）ヒト末梢血単核細胞に対して細胞障害性を示さない；および
（ｇ）内毒素ではない
の内の一つまたはそれ以上を有する免疫調節剤として用いるための組成物に関する。
好ましい実施態様により、組成物はウシの胆汁から抽出され且つ腫瘍壊死因子の放出を刺激することができる。
本発明の組成物は、（ａ）動物、好ましくはウシからの胆汁を、水に可溶性または混和性である溶剤、好ましくはアルコールと、そして好ましくは等容量のアルコールと混合して胆汁／アルーコル溶液を生成し；（ｂ）好ましくはアルコール可溶性部分である該溶液を分離し、そして熱の使用などによって大部分のアルコールを除去することによって、そこから実質的にアルール不含の溶液を単離し；（ｃ）その溶液から胆汁色素を除去して無色液体を得；（ｄ）場合により、該無色液体を処理して、残留するアルコールをほとんど全て除去し；（ｅ）該無色液体をエーテルで抽出し且つ水性相を単離するなどすることによって脂肪有機物質を除去し；そして（ｆ）場合により、水性相から残留エーテルを除去することによって製造することができる。
該組成物は、それをバイアル中に簡単に充填し且つ滅菌することによって、更に修飾することなく用いることができる。該組成物はまた、濃縮した形で用いることができる。好ましい濃縮形は以下のように製造される。工程（ｅ）の前に、無色液体を、場合により胆汁／アルコール溶液の約８分の１容量まで濃縮することができるし且つ工程（ｆ）の後に、水性相を濃縮して、それが胆汁／エタノール溶液の１０分の１容量であるようにすることができる。
本発明は、更に、本発明の新規な組成物を含む薬剤に関する。
更に、本発明は、患者を治療する方法であって、該患者に対して有効量の本発明の組成物を投与することを含む上記方法に関する。また更に、本発明は、免疫応答の調節を必要とする疾患および症状；好ましくは感染症および腫瘍形成の予防および治療における本発明の組成物の使用に関する。
本発明のこれらのおよび他の態様は、以下の詳細な説明および添付図面を論及することによって明らかになる。更に、本明細書中にそのまま援用される各種刊行物を本明細書中で論及する。
【図面の簡単な説明】
本発明の更に詳細を、添付図面で図示された実施例の助けを借りて以下に記載するが、ここにおいて、
図１は、本発明の濃縮組成物のＨＰＬＣプロフィールであり；
図２は、本発明の濃縮組成物のＨＰＬＣプロフィールであり；
図３は、本発明の濃縮組成物のＨＰＬＣプロフィールであり；
図４は、本発明の組成物のＨＰＬＣプロフィールであり；
図５は、本発明の組成物のＨＰＬＣプロフィールであり；
図６は、本発明の組成物のＨＰＬＣプロフィールであり；
図７は、本発明の組成物のＨＰＬＣプロフィールであり；
図８は、ＰＢＭＮでのＴＮＦのＬＰＳ誘導放出に対する組成物の作用を示すグラフであり；
図９は、ＰＢＭＮでのＴＮＦのＬＰＳ誘導放出に対する組成物の作用を示す棒グラフであり；
図１０は、本発明の組成物のＣ18ＲＰ−ＨＰＬＣプロフィールを示し；
図１１は、本発明の組成物の沈降部分のＲＰ−ＨＰＬＣ分析を示し；
図１２は、本発明の組成物の可溶性部分のＲＰ−ＨＰＬＣ分析を示し；
図１３は、本発明の組成物によって治療された膵臓癌患者の診断から得られた生存を示すグラフであり；
図１４は、本発明の組成物によって治療された膵臓癌患者の治療から得られた生存を示すグラフであり；
図１５は、本発明の組成物によって治療された黒色腫患者全員の生存を示すグラフであり；
図１６は、本発明の組成物によって治療された２か所以上の腫瘍部位を有する黒色腫患者の生存を示すグラフであり；
図１７は、本発明の組成物によって治療された３か所以上の腫瘍部位を有する黒色腫患者の生存を示すグラフであり；
図１８は、本発明の組成物全体のＲＰ−ＨＰＬＣプロフィールを示すグラフであり；
図１９は、本発明の組成物の沈降物のＲＰ−ＨＰＬＣプロフィールを示すグラフであり；
図２０は、本発明の組成物の上澄みのＲＰ−ＨＰＬＣプロフィールを示すグラフであり；
図２１は、本発明の組成物のＳＤＳゲルであり；
図２２は、親水性ＨＰＬＣでの本発明の組成物の溶離条件および時間（ａ）並びに本発明の組成物の上澄みの溶離プロフィール（ｂ）を示し；
図２３は、親水性ＨＰＬＣでの本発明の組成物の沈降物の溶離を示し；
図２４は、末梢血単球機能を刺激する場合の本発明の組成物の用量反応を示すグラフであり；そして
図２５は、本発明の組成物による治療前（２５ａ）および治療後（２５ｂ）の悪性黒色腫の写真である。
発明の詳細な説明
前述のように、本発明は、３０００ダルトン未満の低分子量成分を含み且つ以下の性質
（ａ）動物の胆汁から抽出可能である；
（ｂ）インビトロで単球およびマクロファージを刺激することができる；
（ｃ）腫瘍壊死因子生産を調節することができる；
（ｄ）測定可能な量のＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＴＮＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−４、ＧＭ−ＣＳＦまたはＩＦＮ−γを含まない；
（ｅ）悪性マウスハイブリドーマ細胞系において抗増殖作用を有する；
（ｆ）ヒト末梢血単核細胞に対して細胞障害性を示さない；および
（ｇ）内毒素ではない
を有する免疫調節剤として用いるための組成物に関する。
更に詳しくは、研究により、本発明の少なくともいくつかの組成物は正常な単球を刺激して、単球毒性を測定するのに用いられるチャン（Ｃｈａｎｇ）ヘパトーム細胞系に対する細胞障害性をもたらすことが分かった。癌患者（子宮頸癌および卵巣癌）からの単球およびマクロファージもまた、彼等自身の特定の腫瘍細胞を攻撃するおよび破壊する組成物によって刺激されると報告された。
本発明の組成物は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）生産を調節することができる。ウシの胆汁から単離された本発明の好ましい組成物は、生理学的量であると考えられるヒト末梢血単核細胞からのＴＮＦの放出を促進する。ＴＮＦは炎症および抗腫瘍サイトカイン作用のカスケードを開始することが知られているので、好ましい組成物は、ヒト白血球を刺激してＴＮＦ（およびおそらくは他のサイトカイン）を放出させることによってその抗腫瘍作用を働かせうる。したがって、本発明は、更に、腫瘍細胞に対するリンパ球およびマクロファージ細胞障害性を増大させることができる。
本発明の組成物はまた、マウスハイブリドーマ細胞系＃６−１の細胞増殖を阻害することが分かった。マウスハイブリドーマ細胞における組成物の阻害作用は抗増殖活性を示唆する。
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＮ）の生存に対する組成物の作用も検討された。組成物はヒトＰＢＭＮに対して細胞障害性ではないことが分かった。
以下に更に例示されるように、本発明の組成物は、特に下記の特性を有する。
（１）Ｃ18ＲＰ−ＨＰＬＣカラムから初期に溶離される、ＰＢＭＮからのＴＮＦ放出の原因である１種類または複数の成分。
（２）１種類または複数のＴＮＦ放出性成分は、一部分は８０％アセトニトリルによって沈降する。
（３）８０％アセトニトリルによって沈降しない物質は、若干のＴＮＡ放出活性を保持している。
（４）ＲＰ−ＨＰＬＣから同じ初期時間に溶離される、８０％アセトニトリル沈降部分および上澄み部分両方のＴＮＦ放出活性。結果は、組成物中の活性なＴＮＦ放出性成分が、可溶性差を説明するおそらくは若干の微細な分子差を有する同じ分子系列に属することを示唆する。
（５）組成物は、インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）の放出を引き起こし、そしてＩＬ−１β放出の原因である成分はＲＰ−ＨＰＬＣから初期に溶離されて、それが、ＴＮＦを放出する１種類または複数の同一物質であるらしいことが示唆される。
（６）組成物はまた、少量のインターロイキン−２（ＩＬ−２）の放出を引き起こす。
（７）組成物は、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）の放出を引き起こし；８０％アセトニトリル沈降部分は上澄み部分よりも活性である。
（８）ＴＮＦ対ＧＭ−ＣＳＦ放出の比率は約２：１である。
（９）８０％アセトニトリル沈降部分は、上澄み部分中の１種類または複数の成分よりも約３倍多くＴＮＦおよびＧＭ−ＣＳＦを放出する１種類または複数の成分を含む。
（１０）ＲＰ−ＨＰＬＣによって分離された前述の沈降部分および上澄み部分の分析は、沈降および上澄み両方についてＴＮＦ、ＩＬ−１βおよびＧＭ−ＣＳＦの放出活性が初期に溶離されることを示す。しかしながら、上澄みでは若干のＩＬ−１β活性が遅く溶離される。
（１１）組成物中の１種類または複数の同様の分子、すなわち１種類または複数の成分は、ＴＮＦ、ＩＬ−１βおよびＧＭ−ＣＳＦ放出の原因であると考えられる。組成物は多数の異なるサイトカインの放出を刺激するように作用する、或いは、組成物は一つのサイトカインの生産および放出を引き起こし、それが順次に他のサイトカインの生産および放出を刺激するということが可能である。
（１２）沈澱および上澄みを含む組成物の、ＳＤＳゲル電気泳動およびモレキュラーシーブＨＰＬＣによる物理化学的分析は、主成分が２５００ダルトン未満であることを示す。
（１３）親水性（ポリヒドロキシエチル）モレキュラーシーブＨＰＬＣによる追加の物理科学的分離は、組成物中の低分子量の成分を確証する。
（１４）酸加水分解前後のアミノ酸分析はペプチド結合の存在を示唆し、ペプチドの存在が示される。
（１５）ＲＰ−ＨＰＬＣからの活性画分のアミノ酸含量は、高濃度のグルタミン酸／グルタミンおよびグリシンを示す。更に、アスパラギン、トレオニン、セリンおよびアラニンの残基が検出された。
（１６）遊離アミノ酸と考えられる若干の識別されないニンヒドリン陽性残基が存在する。
前述のように、本発明の組成物は、（ａ）動物、好ましくはウシからの胆汁を、等容量のアルコールと混合して胆汁／アルーコル溶液を生成し；（ｂ）実質的にアルール不含の溶液をアルコール可溶性部分から分離し且つ単離し；（ｃ）その溶液から胆汁色素を除去して無色液体を得；（ｄ）該無色液体を処理して、残留するアルコールをほとんど全て除去し；（ｅ）該無色液体をエーテルで抽出し且つ水性相を単離し；そして（ｆ）水性相から残留エーテルを除去することによって製造することができる。
組成物は、胆汁を生産する動物、好ましくは非ヒト動物のいずれの胆汁からも得られる。組成物は、他に対立するものとして一つの種の胆汁から得られた場合、特定の疾患に対して異なる活性を有することがあるので、概して適当な胆汁源は、ウシ、ヒツジおよびブタから得られるものである。大部分の場合、本発明の組成物の製造で用いるために、ウシ、ヒツジおよびブタなどの畜殺された健康な食用動物の胆汁を得ることが実用的である。このようにして集められた胆汁は、畜殺された動物の胆嚢に直接的に由来するべきであるし且つほぼ透明であるべきであり、したがって、胆汁標品の粘液含量は低く且つ膿または血液を実質的に含まないことが示される。
方法の好ましい実施態様においては、ウシ由来の胆汁を用いる。ウシ胆汁は、一つには、各動物から比較的多量に抽出することができるので豊富である。更に、ウシは日常的に畜殺され且つ健康状態に関する管理下で検査されており、したがって、このような動物は、本発明の組成物を製造するための信頼できる源を提供する。更に、ヒトは、ウシ由来の物質に対してアレルギー反応がほとんどないと考えられる。
胆汁を等容量のアルコールと混合して、５０％アルコールである胆汁／アルコール溶液を生成する。アルコールは、脂肪族アルコール、好ましくはメタノール、エタノールまたはプロパノール、最も好ましくはエタノールでありうる。
５０％アルコールに不溶性の物質を実質的に含まない溶液は、遠心分離によって単離することができる。好ましくは、胆汁／アルコール混合物を約１５〜２５℃において３０００〜５０００ＲＰＭ、最も好ましくは４２００ＲＰＭで少なくとも２時間遠心分離する。次に、胆汁／アルコール可溶性部分に含まれるアルコールは、アルコールおよび水の異なる揮発性を利用することにより、慣用法を用いて、すなわち、該部分を適当な温度、例えば８０〜８５℃まで、適当な時間、例えば、最大約１０時間まで加熱して除去することができる。
胆汁色素は、活性炭、ポリアミド微粒子または濾過を用いることによって溶液から除去されて、無色液体を得ることができる。好ましくは、活性炭処理を用いる。溶液が光学濃度および導電率標準を満たすようにその手順を繰り返すことができる。
無色液体を、慣用法を用いて処理して、残留アルコールをほとんど全て除去する。好ましくは、約１．０〜３．５μｍ保留性、最も好ましくは２．５μｍ保留性を有するフィルターを用いて無色液体を濾過する。
次に、無色液体をエーテルによって抽出し、そして水性相を単離する。この工程で用いられるエーテルは、好ましくは、ジメチルエーテル、エチルエーテル、ｎ−プロピルエーテル、イソプロピルエーテルまたはｎ−ブチルエーテル、最も好ましくはエチルエーテルである。
残留エーテルは、例えば、溶液を最大５５℃まで、好ましくは最大約４０℃まで約５〜１５時間、最も好ましくは約１０時間加熱することによって水性相から除去することができる。
組成物は、単純にそれをバイアル中に充填し且つ滅菌することによって更に修飾することなく用いることができる。組成物はまた、濃縮した形で用いることができる。好ましい濃縮形は以下のように製造される。本明細書中上記の工程（ｅ）の前に、場合により、無色液体を、例えば、約８５℃未満の温度まで、好ましくは約６０℃〜７０℃まで加熱することによって胆汁／アルコール溶液の約８分の１容量まで濃縮することができる。工程（ｆ）の後に、水性相を、例えば、約８０〜８５℃まで加熱することによって濃縮して、それが胆汁／エタノール溶液の１０分の１容量であるようにすることができる。
本発明の組成物を製造する好ましい方法においては、集められた胆汁を等容量のエチルアルコールと混合する。次に、胆汁／アルコール混合物を約２０±２℃において約４２００ＲＰＭで少なくとも２  １／２時間遠心分離する。上澄み液をデカントし且つｐＨおよびエタノール含量の検査をする。次に、活性炭を用いて胆汁色素を除去する。次に、処理された胆汁／エタノール溶液の光学濃度（Ｏ．Ｄ．）および導電率を監視する。許容規格外のＯ．Ｄ．レベルおよび導電率レベルは、胆汁／エタノール溶液に、胆汁色素を除去する追加の処理、例えば、再度活性炭を用いる処理を行って規格限界の範囲内の読みを達成することを要求する。
活性炭処理後、２．５μｍ保留性を有するフィルターを介して溶液を濾過し、８５℃未満まで加熱することによってアルコールを蒸発除去し、そして溶液を元の胆汁／エタノール溶液容量の約８分の１まで濃縮する。濃縮された溶液を約２０〜２５℃まで冷却する。次に、この溶液をエチルエーテルと混合し、そしてエーテル相を捨てる。好ましくは、比較的少ない容量、例えば、０．１〜１容量、好ましくは０．２〜０．５容量のエーテルを用い且つ激しく撹拌する。この工程を１回繰り返してよい。水性相を加熱して、例えば、最大５５℃まで約１０時間加熱することによって残留エーテルを除去し、そして更に、約８０〜８５℃まで加熱することによって容量を元の胆汁／エタノール容量の１０分の１まで減少させる。次に、この溶液の外観、生物学的活性並びにエタノールおよびエーテル含量を検査する。
組成物のｐＨは、塩酸（１％）溶液および水酸化ナトリウム（１％溶液）を用いて生理学的ｐＨ、すなわち、７．４〜７．５に調整することができるし、そして緩衝溶液は、慣用法を用いて、第二および第一リン酸ナトリウム塩を緩衝剤として用いて得ることができる。
組成物は、単純にそれをバイアル中に充填し且つ滅菌することによって更に修飾することなく用いることができる。好ましい滅菌法は、オートクレーブの次にインキュベーションを行う３回の滅菌サイクルを組成物に施すことである。
組成物は濃縮した形で用いることができる。濃縮形の製法は上記に記載されている。組成物はまた凍結乾燥することができる。
組成物および濃縮組成物は、外来物質を本質的に含まない、１０ｐｐｍ以下のエタノールおよび５ｐｐｍ以下のエーテルを含む透明な帯黄色溶液である。実施例４で記載のバイオアッセイにおいて、組成物は約１８単位／ｍｌで非増殖性成長を引き起こすことが示された。
本発明の組成物は、上記に概説された方法を用いて、バッチごとに実証された同一性、力価および純度を有する一貫して再現性のある形で製造することができる。同一性および純度は、逆相高速液体クロマトグラフィーを用いて決定される。（実施例１を参照されたい）。本発明の組成物は、逆相ＨＰＬＣでのピークが初期の排除部分において約２７分および３２分で見られる一貫して再現性のあるパターンを有する。高いピークの前、中間および後に、強度が異なる一層小さいピークがある。本発明の濃縮組成物の３ロットのＨＰＬＣ読みを図１〜３で示す。バッチＢ０２１１（図４）、Ｂ０２０９（図５）、Ｂ２９／３００６（図６）およびＢ１５／１６０６（図７）のＲＰ−ＨＰＬＣプロフィールもまた、極めて再現性のあるパターンを示す。組成物は、更に、実施例４で記載のバイオアッセイにおいて約１８単位／ｍｌの非増殖性成長を示す。更に、組成物は、前述の性質、例えば、インビトロで単球およびマクロファージを刺激するそれらの能力等を特徴とする。
本発明の組成物中に存在すると考えられる化合物としては、その源を考慮すると、スルホン化胆汁酸、酸化胆汁酸、他の天然に存在する胆汁酸、並びにそれらのアミノ酸（特に、グリシンおよびタウリン）抱合体およびステロールがある。したがって、本発明の組成物は、式
0004708511.tif 000002
（式中、分子は、例えば、ＡおよびＢ、ＢおよびＣ、またはＣおよびＤ間の結合が単結合または二重結合であってよいように完全に飽和であってよいしまたはなくてよいし、そして
ＸはＨ、ＯＨ、＝ＯまたはＯＳＯ３Ｈであり；そして
Ｙは、
0004708511.tif 000003
であり；そしてここにおいて、
Ｒはアミノ酸残基、例えば、グリシル、グルタミルまたはタウリルなどであり、それによってグリシンまたはタウリン抱合体を形成する）
を有する少なくとも１種類の化合物を含むと考えられる。
特に、本発明の組成物は、有機および無機化合物を含むその成分化合物に関して分析されてきた。このような情報は、質量分析法（ＭＳ）を含む分析化学の標準法を用いて得られた。このような研究結果としては、例えば、コール酸、グリココール酸、デオキシグリココール酸、ウルソデオキシコール酸、硫酸コレステロール、デオキシコール酸、ケノデオキシコール酸およびタウロコール酸を含む、存在すると考えられる特定の胆汁酸化合物の同定がある。
若干の化合物のＯＨおよびＨ２の欠損がＭＳにおいて生じているかどうかまたはこのような化合物のデオキシ、ジデオキシおよび不飽和類似体も初めから存在しているかどうかをＭＳから区別することはできない。これらの化合物はいずれも、アンモニウム、アルキルアンミニウムおよび無機陽イオンの塩として存在することができる。
ＭＳ分析は、更に、ミセルを生成することができるリン脂質、スフィンゴ脂質および関連物質の本組成物中の識別を支持する。存在すると考えられる具体的な化合物としては、
ステアリン酸ＣＨ３（ＣＨ２）16ＣＯＯＨ
パルミチン酸ＣＨ３（ＣＨ２）14ＣＯＯＨ
オレイン酸Ｚ−９オクタデカン酸：
ＣＨ３（ＣＨ２）２ＣＨ＝ＣＨＣＨ２（ＣＨ２）６ＣＯＯＨ
酸化またはヒドロキシル化／不飽和短鎖脂肪酸：
Ｃ６Ｈ８Ｏ３（例えば、ＣＨ３ＣＨ＝ＣＨＣＯＣＨ２ＣＯＯＨまたは２個の二重結合を含むＣ６酸および水酸化物）
酢酸
ステアリン酸ジグリセリド
パルミチン酸ジグリセリド
ステアリン酸、パルミチン酸ジグリセリド
ステアリン酸モノグリセリドホスホコリン（リゾレシチン）
ステアリン酸モノグリセリド
ステアリン酸トリグリセリド
パルミチン酸モノグリセリド
ホスホコリン
ホスホセリン
ホスホスフィンゴシン
ステアリン酸スフィンゴシン
スフィンゴシン
ステアリン酸アミド
ステアリン酸メチルアミド
パルミチン酸アミド
レシチン
シアル酸−グリセロールダイマー
がある。更に、短鎖脂肪酸もまた存在することを示す予備的ＨＰＬＣおよび滴定結果が得られた。
源並びにＭＳおよびＨＰＬＣ分析に由来する情報を考慮して存在すると考えられるリン脂質、スフィンゴ脂質および関連加水分解産物化合物は、式
0004708511.tif 000004
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は異なるかまたは同じであり、そしてＨ、ＣＯＲ４、ＣＨ＝ＣＨ−Ｒ５、Ｘ、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）Ｏ−または−Ｓ（Ｏ）２Ｏ−であり；Ｘは、コリン、エタノールアミン、Ｎ−アルキル化エタノールアミン、セリン、イノシトール、遊離ヒドロキシル含有糖、アミノ糖、スルホン化糖およびシアル酸から成る群より選択され；Ｒ４は、飽和若しくは不飽和の、酸化またはヒドロキシル化されたＣ１−Ｃ30アルキルであり；そしてＲ５はアルキル基またはその酸化および／若しくはヒドロキシル化類似体である）
を有する少なくとも１種類の化合物を含む。
脂肪酸およびそれらの抱合体は、前述の水性抽出物中に塩として存在することができる。このような化合物の溶解度は、混合物の他の成分によっても増加する。包含されたカルボン酸のアミドＲＣＯＮＲ１Ｒ２（式中、Ｒ１およびＲ２は同じであるかまたは異なり、そしてＨまたはアルキルである）もまた存在すると考えられる。
第三のクラスの化合物、すなわち、ムチンおよびプロテオグリカン加水分解産物もまた、組成物の源および前述のそのＭＳ分析を考慮して、存在すると考えられる。このような化合物としては、胆汁からおよび胆嚢壁からのムコタンパク質の加水分解産物、例えば、コンドロイチン４−および６−硫酸、デルマタン硫酸、ヘパリン、硫酸ヘパリン、ヒアルウロン酸およびこれらムチンの加水分解産物（モノマー、ダイマー、オリゴマーおよびポリマー）がある。キチンおよび他のムチンは、同様に加水分解することができ、その加水分解産物としては、
Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、
Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン−４−硫酸、
ガラクトース−６−硫酸、
Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン−６−硫酸、
グルコサミン−６−硫酸、
Ｄ−グルコサミン２−硫酸、
Ｄ−グルコサミン２，３−二硫酸、
Ｄ−ガラクトース−６−硫酸、
グルクロン酸２−硫酸、
Ｎ−アセチルノイラミン酸、
シアル酸、
Ｎ−アセチルコンドロシン、
コンドロイチン−４−硫酸、
コンドロイチン−６−硫酸、
Ｄ−グルコサミン、
Ｄ−ガラクトサミン、
グルクロン酸、
グルコース、
ガラクトース、
マンノース、
フコース、
イズロン酸、
ヘキソース、
ヘキソサミン、
硫酸エステル、
グルクロン酸、
コンドロサミン、
２−アミノ−２−デオキシ−Ｄ−ガラクトース、
セリン、
プロリン、
トレオニン、
アラニングリシンタウリン、
グルタミン酸、
アスパラギン酸、
ヒスチジンおよび
小ペプチド
があると考えられる。
類似の産物は、ケラチン硫酸、デルマタン硫酸などのムチンの加水分解によって得られるであろうし、ダイマー、オリゴマーおよびポリマー中の天然の糖−糖結合は、糖モノマー間または隣接する糖鎖間の橋かけ−Ｏ−Ｓｉ（ＯＨ）２−Ｏ−によって置き換えることができる。
特に、存在すると考えられる具体的なムチンおよびプロテオグリカン加水分解産物化合物としては、
シアル酸およびそれらのモノおよびジアセチル化並びにグリコリル化モノマー；
Ｎ−アセチルノイラミン酸；
ヘキソサミン；
Ｌ−フコース；
ヘキソサミン−ヘキスロン酸（ダイマー）二硫酸；
モノアセチル化されたグルクロン酸またはイズロン酸二硫酸、；
シアル酸−グリセロール（ダイマー）；および
上記モノマーのアセチル化および硫酸化された形のダイマー、トリマー、オリゴマーおよびポリマー
がある。
源および前述のＭＳ分析を考慮して存在すると考えられる第四のクラスの化合物、すなわち、脂溶性ビタミン類としては、例えば、ビタミンＡ、ＤおよびＫ（例えば、Ｄ１、Ｄ３、Ｄ４、Ｋ１、Ｋ２、Ｋ５、Ｋ６、Ｋ７、Ｋ−Ｓ（ＩＩ））並びにビタミンＥ酢酸がある。
特に、存在すると考えられる具体的な脂溶性ビタミン化合物は、ビタミンＡ２、ビタミンＤ１、ルミステロール（そのビタミンＤ１錯体から与えられる）、ビタミンＫ、ビタミンＫ１オキシドおよびビタミンＫ５から成る群の少なくとも１種類を含む。
源および前述のＭＳ分析を考慮すると、種々雑多の有機化合物が存在すると考えられる。このような化合物としては、
ビリルビンおよびそのグルコンウリド抱合体；
ビリベルジンおよびそのグルコンウリド抱合体；
微量のステロイド；
他の血漿溶質、例えば、糖、プリンおよびピリミジン；
種々雑多の食物脂質；および
グルタチオンおよびその加水分解産物
がある。
特に、組成物中に存在すると考えられる具体的な種々雑多の有機化合物は、尿素、メチルアミン、ジメチルアミン、エチルアミン、メチルエチルアミン、ジエチルアミン、ジプロピルアミン、ブチルエチルアミン、アンモニア、コリン、タウリン、グルタミン酸、グリシン、アラニン、ｐ−ｓｅｒ、ｐ−ｅｕ、ｐ−ｅａ、ａｓｐ  ｔｈｒ  ｓｅｒ  ｓａｒ、ａ−ａｂａ、ｃｉｔ、ｖａｌ、ｉｌｅ、ｌｅｕ、Ｂ−ａｌａ、Ｇ−ａｂａ、ＯＨ−ｌｙｓ、ｏｒｎ、ｌｙｓ、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）およびポリエチレングリコールから成る群の少なくとも１種類を含む。
本発明の組成物中に存在するアミン、特に第二アミンは、空気からの酸化窒素を含むことによってニトロソ化合物を生成することがある。Ｎ−オキシドおよびＮ−カルバメート副生成物も含まれることがある。上記のこのアミン系列は、第一、第二および第三アルキルアミン全部を包含するように範囲を拡大されるべきである。
若干の無機元素が、以下のように同定され且つ定量された（ｍｇ／ｌ）。
タングステン          ０．０７
亜鉛                  ０．６６６
リン                  ３７８
カドミウム            ０．０１
コバルト              ０．００８
ニッケル              ０．０２２
バリウム              ０．０３２
鉄                    ０．０２２
マンガン              ０．０３９
クロム                ０．０６０
マグネシウム          ７．４６
アルミニウム          ０．１３６
カルシウム            ５．９７
銅                    ０．０８７
チタン                ０．０１
ストロンチウム        ０．０６０
ナトリウム            ９６００
カリウム              ４８３
塩化物                １５４００
アンモニア            ２１８
バナジウム            １ｐｐｍ
本発明の組成物は、有益な薬理学的性質を有する。特に、本発明の組成物は、抗増殖作用を有し、腫瘍成長をもたらし、そして腫瘍壊死因子の放出をもたらす。該組成物は、有意の毒性を引き起こすことはないが、僅かに一時的な副作用（例えば、僅かな発熱、煩渇、注射部位の痛み）を引き起こすことが分かっている。それらは、更に、有害な免疫学的反応を引き起こすことがある高分子量物質の（すなわち、約５，０００ダルトンを越える）検出可能な成分を含まないことが分かっている。該組成物は、免疫応答の調節を必要とする症状、特に、感染症、腫瘍形成および自己免疫疾患の予防および治療用の薬剤として用いることができる。それらは、白血病、リンパ腫、黒色腫、腺腫、肉腫および癌などの様々な形の腫瘍形成の治療において特に有用でありうる。特に、組成物は、悪性黒色腫、膵臓癌、子宮頸癌、腎臓癌、胃癌、肺癌、直腸癌、乳癌、腸癌、消化器癌、肝臓癌、甲状腺癌、頸癌、子宮頸管、唾液腺癌、脚癌、舌癌、唇癌、胆管癌、骨盤癌、縦隔癌、尿道癌、気管支原性癌、膀胱癌、食道癌および結腸癌、並びに後天性免疫不全症候群（エイズ）のＨＩＶ感染患者に関係した癌の形であるカポージ肉腫を治療するのに有用でありうる。組成物は、他の抗増殖性状態、例えば、関節硬化症およびウイルス感染、特にエイズにも用いることができる。更に、それは、多発性硬化症、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、糖尿病Ｉ型、重症筋無力症、アディソン病、自己免疫溶血性貧血、クローン病、グッドパスチャー症候群、グレーヴズ病、橋本甲状腺炎、特発性血小板減少性紫斑病、悪性貧血、連鎖球菌後糸球体腎炎、乾癬、強皮症、シェーグレン症候群、自発的不妊症および尋常性天疱瘡を含む自己免疫疾患の治療において用いることができる。
本発明の組成物は、慣用法を用いて薬剤に変換することができる。該薬剤は、本発明の組成物を単独でかまたは他の活性物質と一緒に含む。このような薬剤は、経口、非全身的、肛門、非経口、局所、吸入または大脳内用途でありうる。したがって、それらは、丸剤、錠剤、クリーム剤、ゼラチンカプセル剤、カプセル剤、坐剤、軟質ゼラチンカプセル剤、ゲル剤、メンブランズおよびチューベレットなどの固体または半固体である。非経口および大脳内使用には、筋肉内または皮下投与用の形を用いることができるし、或いは注入用または静脈内若しくは大脳内注射用の形を用いることができ、したがって、組成物の液剤として、または前述の使用に適当で且つ体液と相溶性の重量オスモル濃度を有する１種類またはそれ以上の薬学的に許容しうる賦形剤または希釈剤と混合される活性組成物の粉末剤として製造することができる。局所使用には、局所用のクリーム剤若しくは軟膏の形またはスプレー剤の形の製剤を考えることができ；吸入使用には、鼻腔スプレー剤などのスプレー剤の形の製剤を考えることができる。好ましくは、組成物は筋肉内に投与される。
薬剤組成物は、患者に対して投与することができる薬学的に許容しうる組成物の製造のためのそれ自体既知の方法によって、有効量の活性物質が薬学的に許容しうるビヒクルとの混合物で混合されるように製造することができる。適当なビヒクルは、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ′ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（ナック・パブリッシング・カンパニー（Ｎａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ），イーストン，Ｐａ．，米国１９８５年）に記載されている。
これに基いて、薬剤は、排他的ではないが、１種類またはそれ以上の薬学的に許容しうるビヒクルまたは希釈剤と一緒に本発明の組成物を含み、そして適当なｐＨおよび体液と等浸透圧の緩衝溶液中に含まれる。
組成物は、単独でかまたは他の治療薬若しくは他の治療の形と一緒に治療薬として示される。例えば、悪性腫瘍の場合、本発明は、従来は手術可能でなかった腫瘍を外科的に除去するのに適当にすることができる。本発明の組成物および薬剤は、ヒトまたは動物に対して投与するためのものである。
概して、組成物の用量範囲はヒトでの投与用に考えられており、一日に約０．０１〜２０ｍｇ／ｋｇ（体重）、好ましくは約０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくは０．１〜１ｍｇ／ｋｇの薬剤を用いることができる。静脈内投与の場合、用量は一日に約０．１〜５ｍｇ／ｋｇ（体重）であり、そして経口投与の場合、用量は一日に約１〜５ｍｇ／ｋｇ（体重）である。濃縮された組成物を用いる場合、上述の用量の約半分を用いることができる。例えば、筋肉内投与には、一日に約０．２〜１．０ｍｇ／ｋｇ（体重）、好ましくは一日に０．２７５〜０．７５ｍｇ／ｋｇ（体重）の用量を用いることができる。
上述の量から外れること、特に、治療される動物の体重および症状、治療される特別な疾患、投与経路の性状並びに望ましい療法の関数として外れることが必要でありうることは開業医に理解される。更に、動物の種類および薬剤に対するその個体の挙動またはその処方の性状および投与する期間若しくは間隔もまた、上述のものとは異なる量の使用を指示することがある。例えば、多くの場合、上述の最小量未満で処置することで十分でありうるが、他の場合に上述の上限を越える必要がある。大部分の量を投与する場合、これらを当日中の数回の投与に分割することが賢明でありうる。
したがって、本発明は、免疫調節剤組成物を製造する方法であって、（ａ）動物からの胆汁を水溶性溶剤と混合して胆汁／溶剤溶液を生成し；（ｂ）該胆汁／溶剤溶液から溶剤を実質的に含まない水溶液を単離し；そして（ｃ）該実質的に溶剤不含の溶液から胆汁色素を除去して無色液体を得ることを含み、好ましくは、ここにおいて該水溶性溶剤はアルコールであり、そして該動物からの胆汁は等用量のアルコールと混合される上記方法を含む。前述の方法の好ましい態様は、更に、該無色液体を該胆汁／溶剤溶液の元の容量の約８分の１または１０分の１まで更に濃縮することを含む。明らかに、上記方法によって製造された組成物は、本発明の好ましい態様を形成する。
本発明は、更に、分子量が約３０００ダルトン未満の少なくとも１種類の成分を含み、ヒト末梢血単核細胞に対して細胞障害性を示さないし、しかも以下の性質
（ａ）インビトロまたはインビボで単球およびマクロファージを刺激して１種類またはそれ以上のサイトカインを生産することができる；
（ｂ）単球またはマクロファージを刺激してインビトロまたはインビボで腫瘍壊死因子を生産することができる；または
（ｃ）悪性マウスハイブリドーマ細胞系において抗増殖作用を有する
の少なくとも一つを有し；そして
該成分が、内毒素、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＴＮＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＧＭ−ＣＳＦまたはＩＦＮ−γではない、免疫調節剤として用いるための組成物を含む。このような組成物は、動物、好ましくはウシの胆汁からまたは他の源から得ることができる。組成物の好ましい実施態様において、該組成物は、インビトロまたはインビボで、そして最も好ましくはヒトにおいて外因性ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＴＮＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮ−γの不存在下で腫瘍壊死因子生産を刺激する。
本発明の組成物は、更に、該組成物を乾燥させて固体残留物を得、該残留物２グラムをメタノール中１０％濃水酸化アンモニウム溶液２０ｍｌ中に溶解させた場合、および不溶性物質が全て除去された後に、５ｃｍｘ１２．５ｃｍの寸法を有し、６０Ａフラッシュシリカゲル１０２ｇが入っていて、そしてメタノール溶媒溶液中１０％濃水酸化アンモニウムを用いて圧力１０ポンド／平方インチおよび流速１０ｍｌ／分で操作されるメタノールカラム中でのカラムクロマトグラフィーを行うようなカラムクロマトグラフィーによって特徴付けることができる成分を有し、該成分は、全カラム溶離が約１８０〜約２２０ｍｌ、約２２０〜約２６０ｍｌまたは約２６０〜約３００ｍｌである場合に得られる画分でカラムから溶離される。
成分の特性決定は、更に、イオン交換クロマトグラフィーによって達成することができ、該組成物１０ｍｌを、該組成物の該１０ｍｌ中に存在する陰イオンをほとんど全部結合するのに十分な量のバイオラド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）ＡＧ−１水酸化物型樹脂が入っているカラムでの陰イオン交換クロマトグラフィーに供する場合、該成分が、約０．５Ｍ〜約１．５Ｍの緩衝液濃度、好ましくは約１．０Ｍ〜約１．５Ｍの緩衝液濃度、そして最も好ましくは約１．５Ｍの緩衝液濃度での重炭酸アンモニウム緩衝液の段階勾配によってカラムから溶離されるようにする。
成分の特性決定には、逆相（Ｃ１８）ＨＰＬＣを用いることもでき、該組成物を凍結乾燥し且つ水中０．１％ＴＦＡ中に還元した後、２５０ｘ４．６ｍｍの寸法のフェノメネクス（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）ＷＰ６０００９−Ｃ１８カラム中での逆相（Ｃ１８）ＨＰＬＣに供し、ここにおいて水中０．１％ＴＦＡの第一緩衝液はカラムを介して約１０分間流され、次に、アセトニトリル中０．１％ＴＦＡの第二緩衝液の０〜８０％の直線勾配が約５５分間、続いて第二緩衝液の８０％溶液が約５分間、そして第二緩衝液の８０％〜０％勾配が約５分間流され、しかもここにおいて流速は１ｍｌ／分であり且つカラムおよび緩衝液の能力を超過しない場合、該成分は、該還元組成物をカラムに加えた後の約２．４分〜約３．４分の時間にカラムから溶離されるようにする。組成物の成分の特性決定は、更に別の逆相ＨＰＬＣ法でも達成することができ、該組成物を水中０．１％ＴＦＡの第一緩衝液中に透析するかまたは溶解させた後、２５０ｘ４．６ｍｍの寸法のバイオラド・ハイポア（Ｈｉ−ｐｏｒｅ）ＲＰ３１８（Ｃ１８）カラム中での逆相（Ｃ１８）ＨＰＬＣに供し、ここにおいて第一緩衝液はカラムを介して約１０分間流され、次に、アセトニトリル中０．１％ＴＦＡの第二緩衝液の０〜８０％の直線勾配が約５５分間、続いて第二緩衝液の８０％溶液が約５分間、そして第二緩衝液の８０％〜０％勾配が約５分間流され、しかもここにおいて流速は１ｍｌ／分であり且つカラムおよび緩衝液の能力を超過しない場合、該成分は、該透析された組成物をカラムに加えた後の約２分〜約２１．４分の時間に、または約２１．４分〜約２５．６分の時間にカラムから溶離されるようにする。
本発明の組成物は、ＴＬＣによっても特性決定することができ、該組成物を、メタノール中１０％濃水酸化アンモニウム中のシリカゲルプレート上での薄層クロマトグラフィーに供し且つニンヒドリン噴霧によって可視化する場合、ニンヒドリンとの陽性反応は約０．８０〜約０．９０のＲｆ値で起こるようにする。
本発明は、更に、ヒトにおいて腫瘍壊死因子生産を刺激する方法であって、以下の化合物、
（ａ）式
0004708511.tif 000005
（式中、Ａ−Ｂ、Ｂ−ＣおよびＣ−Ｄ間の結合は単結合または二重結合であってよく、そしてＸ＝Ｈ、ＯＨ、＝ＯまたはＯＳＯ３Ｈであり；そして
Ｙ＝
0004708511.tif 000006
であり、ここにおいて、Ｒはアミノ酸残基である）
を有する化合物；
（ｂ）式
（Ｒ１Ｏ）ＣＨ２ＣＨ（ＯＲ２）ＣＨ２（ＯＲ３−Ｘ）または
0004708511.tif 000007
（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、Ｈ、ＣＯＲ４、ＣＨ＝ＣＨ−Ｒ５、Ｘ、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）Ｏ−または−Ｓ（Ｏ）２Ｏ−であり；
Ｘは、コリン、エタノールアミン、Ｎ−アルキル化エタノールアミン、セリン、イノシトール、遊離ヒドロキシル含有糖、アミノ糖、スルホン化糖またはシアル酸であり；そして
Ｒ４は、約Ｃ１〜Ｃ30の炭素鎖を有する飽和若しくは不飽和アルキル基またはその酸化およびヒドロキシル化類似体であり；そして
Ｒ５は、アルキル基またはその酸化およびヒドロキシル化類似体である）
を有する化合物；
（ｃ）ムチン加水分解産物またはプロテオグリカン加水分解産物；または
（ｄ）脂溶性ビタミン
の少なくとも１種類を含む有効量の組成物を投与することを含む上記方法を含む。
好ましくは、本発明の方法の組成物は、タウロコール酸およびその硫酸化誘導体；グリココール酸およびその硫酸化誘導体；スフィンゴシン；ジアシルグリセロール；レシチン；１０糖単位未満長さのオリゴ糖、但し、このオリゴ糖は、シアル酸、フコース、ヘキソサミンまたは硫酸化ヘキソサミンから成る；ビタミンＡ；レチノール酸誘導体；レチノール誘導体；タウリン；並びにグルタミン酸およびその抱合体から成る群より選択される少なくとも１種類の化合物を含む。組成物は、更に、アンモニア；第一アルキルアミン；第二アルキルアミン；第三アルキルアミン；およびカルボン酸Ｒ６ＣＯ２Ｈ（式中、Ｒ６は、飽和または不飽和のＣ１〜Ｃ30アルキル、並びにその酸化および／またはヒドロキシル化誘導体である）から成る群より選択される少なくとも１種類の化合物を含んでいてもよい。
本発明の方法は、更に、タウロコール酸およびその硫酸化誘導体；グリココール酸およびその硫酸化誘導体；スフィンゴシン；ジアシルグリセロール；レシチン；１０糖単位未満長さのオリゴ糖、但し、このオリゴ糖は、シアル酸、フコース、ヘキソサミンまたは硫酸化ヘキソサミンから成る；ビタミンＡ；レチノール酸誘導体；レチノール誘導体；タウリン；並びにグルタミン酸およびその抱合体から成る群より選択される少なくとも１種類の化合物を含む組成物の投与によるＴＮＦ生産の刺激を包含する。
本発明は、更に、膵臓癌を治療する方法であって、該癌を罹患している患者に対して治療的有効量の本発明の組成物を投与することを含む上記方法を提供する。
更に、本発明の形式部分は、（１）スフィンゴシン若しくは塩によって錯化したスフィンゴシンのミセルまたは（２）レチノール酸若しくはその誘導体のミセルを含み、以下の性質
（ａ）インビトロで単球およびマクロファージを刺激して１種類またはそれ以上のサイトカインを生産することができる；
（ｂ）単球またはマクロファージを刺激してインビトロまたはインビボで腫瘍壊死因子を生産することができる；または
（ｃ）悪性マウスハイブリドーマ細胞系において抗増殖作用を有する
の少なくとも一つを有する組成物である。
ミセルは、ジアシルグリセリドまたはレシチンを含んでいてもよく、そして更に、胆汁酸塩、およびアンモニウムまたはアルキルアンモニウムイオン源を含むことができる。
最後に、本発明は、更に、（１）スフィンゴシン、胆汁酸塩、およびアンモニウムまたはアルキルアンモニウムイオン源、（２）胆汁酸塩、スフィンゴシン、ジアシルグリセロール、アンモニウムまたはアルキルアンモニウムイオン源、およびレチノール誘導体、（３）ジアシルグリセリド、レシチンおよび胆汁酸塩、或いは（４）（ａ）ジアシルグリセリド、（ｂ）レシチン、および（ｃ）ムチン加水分解産物またはプロテオグリカン加水分解産物を含み、以下の性質
（ａ）インビトロで単球およびマクロファージを刺激して１種類またはそれ以上のサイトカインを生産することができる；
（ｂ）単球またはマクロファージを刺激してインビトロまたはインビボで腫瘍壊死因子を生産することができる；または
（ｃ）悪性マウスハイブリドーマ細胞系において抗増殖作用を有する
の少なくとも一つを有する組成物を包含する。
以下の非制限実施例は、本発明を例証するものである。
実施例
本発明の組成物の製造
ウシ胆汁は、認可および検閲を受けた屠殺場において食用に畜殺された少なくとも１歳半の健康な家畜群から集める。胆嚢は、検閲済みの畜殺された動物から集められ、胆嚢を肝臓から分離し、そして獣医が検査して、その胆嚢に寄生虫がいないし且つ感染の徴候がなく、したがって胆汁源として用いるのに適当であるということを確認する。
この検査を合格した胆嚢を７０％エタノール溶液で拭いて外側を清潔にし、注射器を挿入して胆汁を取出す。取出され胆汁を獣医が注射器中で目視検査して、それに血液または膿が含まれていないし他の点でも申し分のないことを確認する。申し分のないことが分かった胆汁を、エチルアルコールが入っている目盛付きアンバーボトルに入れる。胆汁は、血液および膿を実質的に含まない帯緑色液である。胆汁を各ボトルに対して、入っているエタノールの量の２倍のボトルに印された量まで入れて、５０％胆汁／エタノール溶液を生成する。５０％胆汁／エタノール溶液は、約５０％／５０％胆汁／エチル溶液中の実質的に外来物質不含の帯緑色液である。更に、それはエチルアルコール米国薬局方ＸＸＩＩ項目Ｂに陽性を示す。これらのボトルに採取日を記したラベルを貼り、ロット番号として役立てる。最低５０頭の動物が各ロットのプールとして用いられる。肝臓、脾臓およびリンパ節部分もまた、胆汁をプールされた動物から集められ、それらの部分の寄生虫または他の疾患を示す徴候の存在を調べる。
次に、胆汁／アルコール混合物を２０＋／−２℃において４２００ＲＰＭで少なくとも２  １／２時間遠心分離する。上澄み液をデカントし、ｐＨおよびエタノール含量を検査する。次に、デカントされた液を活性炭処理する。次に、処理された胆汁／エタノールの光学濃度（「Ｏ．Ｄ．」）および導電率を監視する。
許容規格外のＯ．Ｄ．レベルおよび導電率レベルは、胆汁エタノール溶液を活性炭によって更に処理して、規格限界の範囲内の読みを達成することを要求する。
活性炭処理後、フィルターを介して（例えば、２．５μｍ保留性を有するフィルターを用いて）溶液を濾過し、アルコールを蒸発除去し（例えば、８５℃未満まで加熱することによって）、そして溶液を元の胆汁／エタノール溶液容量の約８分の１まで濃縮する。濃縮された溶液を２０〜２５℃まで冷却する。次に、この溶液をエチルエーテルと混合し、そしてエーテル相を捨てる。この工程を１回繰り返してよい。水性相を加熱して残留エーテルを除去し（例えば、最大５５℃まで約１０時間加熱することによって）、そして更に、約８０〜８５℃まで加熱することによって容量を元の胆汁／エタノール容量の１０分の１まで減少させる。次に、得られた組成物の外観、生物学的活性並びにエタノールおよびエーテル含量を検査する。組成物は、外来物質を本質的に含まない透明な帯黄色溶液であり、そしてそれは１０ｐｐｍ以下のエタノールおよび５ｐｐｍ以下のエーテルを含む。実施例４で記載のバイオアッセイにおいて、非増殖性成長は１８＋／−単位／ｍｌである。
同一性および純度は、逆相高速液体クロマトグラフィーを用いて決定される。力価は、実施例４で記載の抗増殖法を用いて検定される。
本発明の組成物の最初のバッチは、非緩衝液として製造された。引続きのバッチは、塩酸（１％）溶液および水酸化ナトリウム（１％溶液）を用いて組成物のｐＨを約７．４＋／−０．０５に調整し、更には第二および第一リン酸ナトリウム塩を緩衝剤として用いることによって調製された緩衝液として製造された。生物学的負担（ｂｉｏｂｕｒｄｅｎ）低減は、蒸気オートクレーブ中において１０４＋／−２℃で６０分間行われる。大部分の溶液を５ｍｌまたは１０ｍｌ滅菌ボトル中に充填し且つ蓋をする。充填され且つ蓋をされたボトルは、それらを１０４℃＋／−２℃で６０分間オートクレーブ滅菌した後、３５℃で２３＋／−１時間インキュベーションを行う３回の滅菌サイクルに供される。各サイクル（オートクレーブおよびインキュベーション）の間に試料を採取し、生物学的負担について試験する。最後のサイクル後に、ボトルを黒色および白色背景に対して目視検査して、存在するかもしれない任意の粒子を検出する。
検査後、ロットから試料採取し、規格に対する適合について試験する。試験としては、同一性、無菌性、発熱性、内毒素、バイオアッセイ、ＨＰＬＣおよび一般的な安全性がある（表１を参照されたい）。
0004708511.tif 000008
実施例２
本発明の組成物の物理的化学的および生化学的特性
標品の多数の物理化学的特性（導電率、重量オスモル濃度および総固形物）を表２で示す。更に詳しくは、実施例１によって製造された組成物の三つの製造バッチの試験結果を実施した。表２で示された結果は、製造された製品の無菌性、力価および生物学的利用能を実証する。エチルアルコールおよびエチルエーテルが工程内試験としてのみ測定されることは注目される。生物学的活性を決定するための方法の概要を実施例４で提供する。
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物理的および化学的性質、例えば、導電率、重量オスモル濃度および総固形物は、９９％を越える塩の組成物と一致する。組成物中の固形物の１％未満は有機物質であり、脂質は存在せず、約半分が炭水化物であり、そして残りはアミノ酸である。タンパク質およびペプチドが存在する。ＳＤＳゲル電気泳動は、組成物中にはタンパク質よりも多くのペプチドが存在しうることを確証した。高分子量は検出されない。これは、ペプチド薬剤にとって、それが免疫原性ではないと考えられるのでの重要な特徴である。
本発明の組成物のためのＨＰＬＣおよびバイオアッセイ試験法は、非緩衝生成物を用いて開発された。これらの試験を用いて、生成物を緩衝液および濃縮配合物として特性決定する。以下に記載されたＨＰＬＣ結果は、生成物がいずれの提示においても同様であることを示す。バイオアッセイは、濃縮配合物の活性が、元の組成物より２倍半大きいことを示す。したがって、実験で用いられた生成物は同等であると実証された。
本発明の組成物の逆相（Ｃ18）ＨＰＬＣ分析
本発明の組成物は、逆相ＨＰＬＣでのピークが最初に排除部分において、約２７分および３２分で見られる一貫して再現性のあるパターンを有する。高いピークの前、中間および後に、強度が異なる一層小さいピークがある。本発明の濃縮組成物の３ロットのＨＰＬＣ読みを、図１〜３で示す。バッチＢ０２１１（図４）、Ｂ０２０９（図５）、Ｂ２９／３００６（図６）およびＢ１５／１６０６（図７）のＲＰ−ＨＰＬＣプロフィールもまた、極めて再現性のあるパターンを示す。
本発明の組成物を特性決定するためのＲＰ−ＨＰＬＣを以下のように行った。バイオラド・ハイポアＲＰ３１８ガードカラム（Ｃ18）、４．６ｘ３０ｍｍ（バイオラド）およびバイオラド・ハイポアＲＰ３１８（Ｃ18）カラム、４．６ｘ２５０ｍｍを用いた。試料をＨ２Ｏ中の０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡピアス（Ｐｉｅｒｃｅ））（バッファーＡ）中に透析し且つカラムに入れた。バッファーＡを１０分間流した後、バッファーＢ（１００％アセトニトリル中０．１％ＴＦＡ）の０〜８０％直線勾配を５５分間流した。この時間の最後に、８０％バッファーＢを５分間、そしてバッファーＢの８０％〜０％を５分間流した。流速は１．０ｍｌ／分であった。連続実験からの画分を集め且つプールし、そしてスピードバク（Ｓｐｅｅｄｖａｃ）（ＳＶＣ  ２００Ｈ型、サバント・インストゥルメンツ（Ｓａｖａｎｔ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ），ファーミントン，Ｎ．Ｙ．）で濃縮した。
組成物の予備的特性決定
ＨＰＬＣからのピークをタンパク質配列決定用に供した。最初の試料であるＴＦＡ／ＣＨ３ＣＮ中のバッチ０２１０の、ＲＰ−ＨＰＬＣ−３１．００分と称する主要なＨＰＬＣピークは、Ｎ末端配列分析を施された場合にデータを生じることができなかった。結果は、量の問題かまたはＮ末端障害として理解されうる。酸加水分解後のアミノ酸分析によるその画分のタンパク質含量の定量は、配列分析に対して十分な量を供したはずであることを示したが；しかしながら、その組成のために、試料はタンパク質でないかもしれないし、したがってＮ末端障害は問題ではないであろうと考えられた。試料は以下の組成、すなわち、約７０％Ｇｌｘ（グルタミン酸／グルタミン）および約１５％グリシン（Ｇｌｙ）を示した。更に、ＲＰ−ＨＰＬＣからの同等の試料の分析は、同様の結果、すなわち、６８％Ｇｌｘおよび１５％Ｇｌｙを生じた（表３）。更に、未分画物質およびいくつかの他の画分の特性決定は以下を示した。出発物質（３２ｍｇ／ｍｌ）は、アミノ酸組成データと一致するポリグルタミン酸ペプチド／タンパク質を示す配列シグナルを生じた。
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いくつかのＨＰＬＣ画分の分析（表３）は、全部が極めてＧｌｘ（Ｇｌｕ／Ｇｌｎ）（２８〜７０モル％）およびＧｌｙ（１０〜４４モル％）に富むことを示した。しかしながら、それぞれの画分は、他のアミノ酸の相対量においては実際的な相違を示した。
実施例３
組成物の画分の生物学的活性
組成物の画分の生物学的活性を調べた。組成物の生物学的活性は、低分子量成分（ｍ．ｗ．３０００ダルトン未満）に起因すると考えられる。これは、組成物の４画分および未分別組成物の生物学的活性を試験した経験によって決定された。第一画分は、３０００ダルトン未満の分子量のタンパク質およびペプチドを含んでいたが、残りの３画分は、更に大きい分子量のタンパク質およびポリペプチドを含んでいた。全部の画分が更に大きい分子量のタンパク質およびポリペプチドを含んでいた。全画分および未分別組成物は、同様の生物学的活性を実証した。全画分が未分別組成物と同程度に有効であり、しかも全画分の共通の特徴は３０００ダルトンより小さい分子が同様の濃度で存在することであったので、これは、組成物の生物学的活性が３０００ダルトンより小さい分子量の成分によるという結論を導いた。
実施例４
悪性細胞系に対する作用
４種類の悪性細胞系（ダウディ（Ｄａｕｄｉ）−ヒトリンパ腫細胞、ＭＥ−１８０ヒト子宮頸癌細胞、Ｔ−２４−ヒト膀胱癌細胞およびマウスハイブリドーマ細胞＃６−１）の培養物の増殖に対する本発明の組成物の作用を測定した。本発明の組成物は、マウスハイブリドーマ細胞に対して抗増殖作用を有した。実験は、マウスハイブリドーマ細胞における組成物の阻害作用が、殺細胞性よりもむしろ抗増殖性であることを示唆した。
本発明の組成物の再現性のある抗増殖作用に基づくバイオアッセイは、マウスハイブリドーマ細胞モデルにおいて組成物の特性決定を容易にするように設計された。バイオアッセイは以下のように行われた。組成物の生物学的活性をその物理的および化学的性質から単離するために、組成物の重量オスモル濃度およびｐＨを調整して細胞培地のそれと釣合うようにする。等張組成物の１：５〜１：１０，０００の連続希釈を培地中で調製する。ハイブリドーマ細胞試料を明確に定量する。血球計算計を用いて、１００μｌ試料中の細胞を計数する。細胞を遠心分離によって濃縮した後、適当な容量の新鮮な培地を加えることによって細胞濃度を細胞１，０００個／ｍｌ（最終の望ましい濃度の２倍）に調整する。対応する希釈度の組成物（１ｍｌ）と混合されたハイブリドーマ細胞懸濁液（１ｍｌ）を２４ウェルプレート中で、ＣＯ２が６％に調節された湿潤大気中において３７℃でインキュベートする。９６時間後、各ウェルから１００μｌＸ３で試料採取し、そして９６ウェルプレートに入れた。（細胞不含培地１００μｌのブランクを含む。）細胞濃度は、プロメガ・セルタイター（ＰＲＯＭＥＧＡ  ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ）９６TMキットを用いて決定される。細胞濃度は、５９５ｎｍ（６５０ｎｍ基準）で吸光度を読み取ることによって測定され且つエリザ（ＥＬＩＳＡ）プレートリーダーによって記録される。それぞれの検定について、細胞濃度の標準曲線を作成する。対数期増殖における培養細胞を試料採取し、計数し、濃縮し、そして連続希釈で再懸濁させる。各希釈液から１００μｌＸ３で試料採取し、そして９６ウェルプレートに入れた。標準曲線は、ゼロ細胞ブランクおよび６５０ｎｍでのＯＤを引いた後の５９５ｎｍでの「正味」ＯＤに対して細胞濃度をプロットすることによって作成される。未知試料の細胞濃度は補間法によって決定される。
生物学的活性を計算するために、対照（組成物なし）の百分率としての細胞濃度を、（対数および等分目盛での）最終組成物希釈度に対してプロットし、そしてスプライン曲線調整法（Ｓｐｌｉｎｅ  ｃｕｒｖｅ  ｆｉｔｔｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄ）を用いて点によって曲線を合わせる。次に、細胞増殖の５０％阻害に対応する組成物希釈度をマニュアル通りに決定し且つ直接的に組成物の単位に変換する。定義により、組成物１単位は、細胞５００個／ｍｌで播種された３７℃および６％ＣＯ２で９６時間後の細胞系ＨＹＢ  ＃６−１の細胞培養物１ｍｌの増殖を５０％まで阻害する。バイオアッセイでの本発明の組成物の平均活性は１８．２４＋／−１．８２単位／ｍｌである。
実施例５
培養物中のＴおよびＢリンパ球に対する作用
本発明の組成物は、培養物中の正常なＴおよびＢリンパ球に対して無毒性であることが分かっている。ヒトリンパ球の増殖は、組成物存在下および不存在下の注意深く調節された条件下において調べられた。標準濃度のリンパ球を、種々の濃度の組成物が入っているウェル中でインキュベートした。正常なＴおよびＢリンパ球を、臨床的に用いられるのと同様の濃度の組成物と一緒にインキュベートした場合、トリパンブルー排除によって判定される悪影響はなかった。
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＮ）の生存に対する組成物の作用を調べた。この実験では、ＰＢＭＮをプラスチック製マイクロウェルプレート中において種々の容量の組成物および組織培地と一緒に２４時間および４８時間インキュベートした。この時間の最後に、生存している細胞数をトリパンブルー色素排除によって推定した。表４は、生存細胞数が２４時間と更に４８時間で降下したが、しかしながら、組成物存在下または不存在下の生存細胞数には差がなかったことを示している。更に、組成物容量の増加は、生存に対して影響を与えなかった（表４）。したがって、組成物はヒトＰＢＭＮに対して細胞障害性を示さなかった。
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実施例６
組成物のサイトカイン含量
ＴＮＦ−α、ＩＬ−１ａ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮのエリザ検定を本発明の組成物について行った。本発明の組成物は、測定可能な量のサイトカイン（ＴＮＦ、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＧＭ−ＣＳＦおびＩＦＮγ）を含まないということが確認された（表５を参照されたい）。
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実施例７
実施例１で記載の方法にしたがって製造された本発明の組成物の多数のバッチについて、物理的、化学的および生化学的性質を決定した。更に、該バッチの化学組成を決定し且つ該バッチのアミノ酸分析を行った。結果を表６〜８で示す。
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実施例８
単球およびマクロファージの活性化
本発明の組成物は正常な単球を活性化して単球の毒性の測定に用いられるＣｈａｎｇのヘパトーマ細胞系に対して細胞毒性を示すこと、ならびに、癌患者（子宮頸部癌および卵巣癌）の単球およびマクロファージは組成物によって刺激されて患者自身の特定の癌細胞を攻撃破壊することが、研究によって示された。
より詳細には、単球の殺腫瘍性機能を、本発明の組成物存在下で試験し、これらの実験の基本的方法を以下に概説する。
静脈中の血液をヘパリン処理したバキュテイナーチューブ（ｈｅｐａｒｉｎｉｚｅｄ  ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ  ｔｕｂｅ）に集める。血液をハンクス液（Ｈａｎｋｓ  ｂａｌａｎｃｅｄ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（ＨＢＳＳ）中で３：１に希釈して、リンパ球分離培地上に層上に重ね、末梢血液単核細胞（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌｓ）（ＰＢＭＮ）を得るために遠心分離する。遠心分離後、単核細胞層を界面から回収し、培養液で２度洗浄し、単球をラテックス摂取（ｌａｔｅｘ  ｉｎｇｅｓｔｉｏｎ）によって計測した。単球は９６穴のプレートに（３７℃で２時間）粘着させ（次いで２回洗浄す）ることによって単離する。粘着細胞は単球を９０％より多く含むと概算される。粘着細胞を含む穴を、組成物（１１：１０希釈）顆粒細胞マクロファージ刺激因子またはＰＭＡ存在下で一晩インキュベーションする。次いで、粘着細胞を洗浄し、一晩腫瘍細胞と共にインキュベーションする。標準細胞系での研究には、51ＣＲ標識したＣｈａｎｇのヘパトーマ細胞を用いる。その理由は、この細胞系がナチュラルキラー細胞の細胞毒性に非感受性であるためである。これらのヘパトーマ標的腫瘍細胞は粘着細胞単層にエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）の細胞比率が２０：１になるように加える。このＥ：Ｔの比率２０：１は、５：１から３０：１までＥ：Ｔの比率を変化させて作成したカーブのプラトー領域内にこの比率が旨く入るために用いられる。２４時間後、上澄液を集め、51Ｃｒの放出を定量する。％比細胞毒性は以下の式：
％比放出＝（Ｅ−Ｓ）／（Ｔ−Ｓ）×１００
式中、Ｅ＝エフェクター細胞存在下で標的細胞から放出されるＣＰＭ；Ｓ＝エフェクター細胞非存在下で標的細胞から放出されるＣＰＭ；Ｔ＝２％硫酸ドデシルナトリウムで処理した後に標的細胞から放出されるＣＰＭ：
によって計算する。
この処方箋を用いて、本組成物は、健常者ドナーの単球がＣｈａｎｇヘパトーマ細胞系に対して細胞毒性を示す原因になることが見出だされた。次いで、癌患者からの単球およびマクロファージが組成物によって刺激され患者自身の腫瘍を攻撃破壊することができるか否かについて研究した。標準細胞系（Ｃｈａｎｇヘパトーマ細胞）について記載したのと同様の処方箋を用いて、癌患者の単球および／または腹膜マクロファージを単離した。（腹膜マクロファージは腹腔鏡検査時に収集した腹膜液から単離した。）組成物は、子宮頸部癌患者の末梢単球および末梢マクロファージを活性化して、患者自身の腫瘍細胞に対する細胞毒性を生成することが認められた。この効果は、インターフェロンまたはリポ多糖よって生産されるそれに匹敵するかまたはそれに勝っていた。卵巣癌患者の末梢マクロファージもまた、本組成物によって刺激されて、培養液中の卵巣腫瘍細胞を攻撃破壊することが見出だされた。
実施例９
ＴＮＦへの影響
末梢血液単核細胞（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌｓ）（ＰＢＭＮ）から放出されるサイトカインへの本発明の組成物の影響を評価するために研究を行った。ＴＮＦ−α、ＩＬ−１ａ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６，ＩＬ−８、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮに関してＥＬＩＳＡアッセイを行った。
以下の方法を、実施例に記載の研究に用いた。
ＴＮＦの研究では、全血液は、健常な５検体からヘパリン添加バキュテイナーチューブに引き入れた。末梢血液単核細胞（ＰＢＭＮｓ）をフィコールハイパック（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で勾配遠心分離することによって単離した。ＰＢＭＮはリン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）で２度洗浄し、計数し、ＲＰＭＩ１６４０培養液（Ｇｉｂｃｏ  Ｌａｂｓ）中に１０6細胞／０．５ｍｌの濃度になるように再懸濁した。これらの細胞は、２４穴、平底の組織培養プレート（Ｆａｌｃｏｎ，Ｂｅｃｔｏｎ．Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で培養した。ＰＢＭＮ懸濁液から０．５ｍｌを、５０ｎｇのリポ多糖（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）（ＬＰＳ）（大腸菌起源）、１０μｌウシ胎児血清および試験する１０−３００μｌのそれぞれの量の組成物を含む穴に、加えた。組成物の高浸透圧による影響を消すために、蒸留水を用いた組成物の容量の１０％に等しい量を培養穴に加えた。次いで、ＲＰＭＩを用いて全量を１ｍｌ／穴にした。対照として、組成物の代わりにＰＢＳを用いた。細胞は、２、６、２４、４８および７２時間、３７℃、加湿した５％ＣＯ2インキュベーター中て培養した。インキュベーション期間のそれぞれの終りに、細胞を集菌し、細胞を除去した培養液を９０００ｒｐｍで１０分間遠心分離することによって得た。その後、試料は、サイトカインのためのＥＬＩＳＡを行う（２週間以内）まで−７０℃で保存した。
組成物中のタンパク質の概算は、ザピースマイクロビーシーエータンパク質定量技術（ｔｈｅ  Ｐｉｅｒｃｅ  Ｍｉｃｒｏ  ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）（Ｓｍｉｔｈら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９８５，１５０：７６−８５）を用いて行った。１０μｌの組成物試料を蒸留水で１ｍｌにした。また、５種類の濃度のウシ血清アルブミン（０．１５０μｇ／ｍｌ）を作り、標準として用いた。盲検として、０．１Ｎ−ＮａＯＨを用いた。これらの試料のすべてに、ＢＣＡ、２％のビシンコニックアシッド（Ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｃ  Ａｃｉｄ）ナトリウム塩（Ｐｉｅｒｃｅ）、硫酸銅（ＩＩ）４％およびミクロリエージェントＡ（Ｍｉｃｒｏｒｅａｇｅｎｔ  Ａ）（ＮａＣＯ３、ＮａＨＣＯ３、酒酸石ナトリウム／０．２Ｎ−ＮａＯＨ）の混合物を加えた。試料混合物を１時間６０℃でインキュベートし、冷却し、その結果生じた吸光度を吸光度計を用い５６２ｎｍで測定した。次いで、試験試料中のタンパク質量は、プロットした標準曲線と比較して、おおよその計算を行った。組成物のタンパク質濃度は、低いことが分かり、概算すると３２μｇ／ｍｌであった。
上澄液中でのサイトカインの合成は、穴当たり２００および３００μｌの容量の本発明の組成物でヒトＰＢＭＮを刺激した後に測定した。組成物の最初の調製物はサイトカイン生成に刺激効果を示さない（表９）。もし、いくらかの効果があるとしても、サイトカインの生成は、ＰＢＭＮを培養液のみでインキュベートした場合の、恒常的レベル以下であると思われる。
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本発明の組成物がＬＰＳ刺激放出を減少させるか否かを決定するために実験を行った。ＬＰＳは正の刺激剤として用いられ、ＬＰＳによるサイトカイの刺激放出を減少させる組成物の能力をいろいろなサイトカインで比較した（表１０）。組成物は、ＩＬ−１α、ＩＬ−１βおよびＴＮＦを明らかに阻害した。他のサイトカインＩＬ−６，ＩＬ−８，ＩＦＮ−γおよびＧＭ−ＣＳＦへの影響は注目に値するほどではない。しかし、試験した組成物がサイトカインのＬＰＳ刺激放出の効果を増加させる例は認められなかった。
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ＴＮＦのＬＰＳ刺激放出を阻害する本発明の組成物のいろいろな容量での影響を試験した。ＬＰＳで刺激されたＰＢＭＮによるＴＮＦ放出を阻害する組成物の投与量応答曲線を図８に示す。１０μｌの組成物は約１０％阻害し、１００μｌの組成物では、３０％近い阻害に増加した。組成物のもう一つのバッチ（Ｂ０２０１）は、２００、１００および１０μｌでＬＰＳ誘導ＴＮＦ生成をそれぞれ４５、２１、１２％阻害した。
同様に、ＩＬ−１β生成は、投与量に応答する方式で組成物によって阻害された：１００、２５および１０μｌの組成物はそれぞれ１６、１０および９％阻害された。
異なるバッチの組成物を用いて、ＴＮＦのＬＰＳ誘導放出への影響について試験した。要約すると、同じ方法で同じ動物から得られた組成物のバッチでは等しい効果が誘導された。しかし、調整方法を変える、または異なる動物種からの組成物を用いると、異なる影響がみられた。バッチＢ２９／３００６、Ｂ０２１３（Ｂ＝ウシ）およびＣ０２０３（ヤギ）を用いると、ＬＰＳのみによって誘導される以上の強いＴＮＦの放出が誘導された。
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中程度の刺激物質である、バッチＢ１５／１６０６（濃縮組成物）およびＢ２７／２８０６の結果を，表１２に示す。
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表１３は、バッチ０１３／２１０９（ヒツジ）が極微弱の刺激物質であることを示している。
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表１４は、バッチＴ０２０１（サメ）がＬＰＳ誘導ＴＮＦ生成を多くの濃度で阻害することを示している。
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最初に、組成物は、ヒトＰＢＭＮからのＴＮＦのＬＰＳ誘導放出に影響を与えることが示された。従って、次の一連の実験では、ＴＮＦのＬＰＳ誘導放出に及ぼす組成物の時間効果について、試験した（表１５）。ＬＰＳはＴＮＦの放出を刺激した。２時間では、レベルは６９７ｐｇ／ｍｌに上昇し、６時間で約２００６ｐｇ／ｍｌと最高に達した。２４、４８および７２時間では、ＴＮＦの放出は、徐々に低下した。実際、４８および７２時間では、ＴＮＦ放出は、本来の生成レベルをようやく上回った。対照的に、ＴＮＦの放出を強く刺激するバッチ０２１３の組成物は、２および６時間ではＬＰＳのみによって生成する以上のＴＮＦ放出を示さなかった。ＬＰＳは、６時間でＴＮＦの放出がピークに達するのに対して、組成物をＬＰＳと組み合わせた場合は、ＬＰＳの刺激効果が落ち始めた２４時間後に放出のピークが誘導された。ＬＰＳのみの場合と違って、組成物＋ＬＰＳの場合は、ＴＮＦ放出量が段々と落ちる４８および７２時間でさえ、ＴＮＦ放出を刺激し続けた（表１５）。例えば、バッチ０２１３はＴＮＦ放出の刺激物質であった。バッチＢ１５／１６０６は、僅かに穏やかな刺激物質であるが、２および６時間ではＬＰＳが誘導する放出を阻害した。２４時間では、Ｂ１５／１６０６は、ＬＰＳと組み合わせた場合、ＴＮＦ放出の温和な刺激物質であった。４８時間および７２時間では、Ｂ１５／１６０６は、ＬＰＳと組み合わせた場合に、ＴＮＦ放出に温和な刺激効果を持っていた。この様に、バッチＢ１５／１６０６は、二相性の効果を持ち；初期には、ＬＰＳの誘導するＴＮＦ放出を阻害するが、ＬＰＳと組み合わせて大概２４時間では、ＴＮＦ放出に温和な刺激効果を持っていた。この様に、バッチ１５／１６０６は、二相性の効果を持ち；初期にはＬＰＳの誘導するＴＮＦ放出を阻害するが、大概２４時間でＬＰＳと共に、温和にＴＮＦ放出誘導を高める原因となった。
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バッチＲ０２０１は、ＴＮＦのＬＰＳ誘導放出の阻害剤であり、２、６および２４時間ではＴＮＦのＬＰＳ誘導放出の著しい阻害剤であった。４８および７２時間では、ＬＰＳは極微のＴＮＦ放出を誘導し、バッチＲ０２０１もこれらの時間では、極微の正または負の影響を与えた。
正の刺激効果を持つバッチＢ０２０３は、容量を変化させて、次いで時間を変えて試験した。
バッチＢ０２０３は約１００μｌでＴＮＦ放出を最大に刺激した（表１６）。最大効果は、２４時間、容量２００μｌで認められた（表１７）。この様に、組成物は、ＬＰＳ非存在下でも、独力でＴＮＦ放出を刺激することができ、そのＴＮＦ放出曲線は、組成物とＬＰＳを共に用いた時のものと同様であった。組成物それ自身は、ＬＰＳを共に用いた場合の添加効果よりずっと効果の小さいＴＮＦ放出の刺激剤であった。
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要約すれば、組成物の幾つかのバッチは、ヒトＰＢＭＮがＬＰＳで刺激させる時にＴＮＦ放出を阻害することができるという実験結果が導かれた。他のバッチは、部分的にはＬＰＳの誘導するＴＮＦ放出を阻害するが、後半の影響としては温和なＴＮＦ放出を誘導する能力を持つという、二相性の効果が示唆される。第３の調製物はＬＰＳの誘導するＴＮＦ放出に阻害効果を持たなかったが；ある時間には、この調製物は、ＬＰＳよりも、ＴＮＦを放出するヒトＰＢＭＮを刺激することができた。結論として、本発明の組成物は、ＴＮＦ生成を調整することができ、抗腫瘍応答の重要な介在物質である。データを図９および表１８に要約する。
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実施例１０
本実施例は、要約すれば、以下の事：組成物はＴＮＦ−α放出活性を持ち、そのＴＮＦ−α放出活性はエンドトキシンのいかなる混入とも関連がない：事を示している。刺激されたマクロファージが組成物の能力を強化して、ＴＮＦ−αの放出を刺激する。組成物の高浸透圧はＴＮＦ−αの放出活性の原因ではない。組成物のＴＮＦ−αの放出活性は、他の構成成分から、一部分、分離することができる。組成物のＴＮＦ−α放出活性は、Ｃ18ＲＰ−ＨＰＬＣに結合しないかまたは不完全に結合するかのいずれかである。組成物活性の大部分は初期のうちにＲＰ−ＨＰＬＣから溶出される。組成物の活性の２０％に満たない部分が、ＲＰ−ＨＰＬＣ上に保持され後に溶出されるフラクションから回収されうる。ＴＮＦ−α放出活性は、８０％アセトニトリル、有機物含有率の高い緩衝液、によって沈殿する。沈殿した物質は、水性緩衝液中に再構築しＲＰ−ＨＰＬＣで分析した場合、組成物のＲＰ−ＨＰＬＣでの未吸着ピークと顕著な類似性を示す。組成物の活性成分を、本来の物質の約３０％を構成するフラクションに分離し濃縮することが可能である。
Ａ．ポリミキシンおよびＴＮＦ−αの放出
組成物のエンドトキシン効果としてのいかなる可能性を除くために、ポリミキシンを反応体に加えて実験を行った。ポリミキシンは、白血球のエンドトキシンとしての作用を阻害する。表１９は、ポリミキシンがＬＰＳの誘導するＴＮＦ−αの放出を完全に阻害することを示している。ポリミキシンの非存在下では、ＬＰＳは５１７ｐｇ／ｍｌのＴＮＦ−αを誘導するが、これに対してポリミキシン存在下では、１１ｐｇ／ｍｌのＴＮＦ−αが放出される。組成物は、他方では、ポリミキシン存在下で１５９１ｐｇ／ｍｌのＴＮＦ−αを放出する。ポリミキシン非存在下では、ＬＰＳおよび組成物は、刺激剤としての付加的効果より以上の効果を示し、この事は、組成物がマクロファージを刺激する場合により大きな効力で作用することを示唆している。
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Ｂ．逆層高圧液体クロマログラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）フラクションのＴＮＦ放出活性
図１０は、ＴＮＦ放出活性について試験した、組成物、バッチ０２１３および５つの分離フラクションのＣ18ＲＰ−ＨＰＬＣのプロフィールを示している。
最初に、異なるフラクションの効果をポリミキシン存在下で試験した。表２０は、ＲＰ−ＨＰＬＣからの初期の溶出フラクション（２：０５から２１：２０分まで）に検出され得るＴＮＦ−放出活性の大部分が含まれることを示している。しかしながら、この活性は、出発組成物の約５０％のみであった。表２０の右側のカラムは、試料のモル浸透圧を示している。バッチＢ０２１３は３６９であり、高かった。２１分およびそれ以後のフラクションは正常のモル浸透圧をもつが、これに対して、活性を持つ最初のフラクションは、出発物質よりより高い浸透圧であり、組成物中の塩の多くもまた初期に溶出した事を示している。それ故、試料の高浸透圧がＴＮＦ−αの放出を阻害するかあるいは強化するかについて、以下に記載する方法に従って、調べた。
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表２１は、２人の患者についての組成物フラクション１（２：０５−２１：２０）および２（２１：２０−２５：３２）の追加試験を示している。再び、活性の大部分はフラクション１中に回収されたが、フラクション２中にも幾らかの活性があった。しかしながら、フラクション１および２は、組成物の初発活性の約５０％のみであった。
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フラクション中に任意の非特異的活性があるか否かを調べるために、ブランク走行を行って、同位置のフラクションを収集し、濃縮し、試験した。ブランクのフラクションは、実質的にはＴＮＦを放出しなかった。この結果から、カラムまたは緩衝液がＴＮＦ−αの放出活性の一因となることを考慮せずに、ＲＰ−ＨＰＬＣからのフラクションを用いてＴＮＦ−α放出活性を試験出来ることを示唆した。
次に、組成物のフラクションを、ＬＰＳの刺激効果を持つポリミキシンの非存在下で試験した。表２２は、バッチＢ０２１３がＴＮＦ−αの明らかな放出を誘導したことを示している。ＲＰ−ＨＰＬＣからの組成物のフラクションは、溶出時間で示すように、５ピークあった。再び、フラクション１が最も高いＴＮＦ−α放出活性を持っていた。しかしながら、ＬＰＳの刺激効果で、フラクション２から４は幾らかのＴＮＦ−α放出活性を持っていた。フラクション２（２１：２０−２５：３２）は、フラクション１の活性の約２５％の活性を持っており、後のフラクションの活性の２倍の活性を持っていた。
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表２２は、２００μｌの容量を用いて得られた結果を示しているが、表２３は、ポリミキシン非存在下、１００μｌの組成物および１００μｌのそのＲＰ−ＨＰＬＣフラクションを用いてさらに３人の患者について試験して得られた結果を示している。組成物による放出は、２００μｌの組成物を用いた場合より低い（表２２）が、結果は同様であった。フラクション１は、後のフラクション２および３の幾らかの活性を入れるとほとんど大部分の活性を含む。
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Ｃ．組成物によるＴＮＦ放出の浸透圧の影響
本発明の組成物は高浸透圧である。ＴＮＦ−α放出活性に及ぼす組成物の高浸透圧の影響について研究した。組成物は、高浸透圧である点に浸透圧を調整した時でさえ、ＴＮＦ−αの放出を続けることが分かった。
Ｄ．有機溶媒を多く含む溶媒で沈殿させることによる組成物の物理化学的分離
組成物のＴＮＦ−放出活性の大部分はＲＰ−ＨＰＬＣと結合せず、その証拠としてそれはＲＰ−ＨＰＬＣで早く溶出されるので、試料が有機溶媒をおおく含む溶媒中にあり親水性の相互作用を可能にするような、逆層クロマトグラフィー分離の逆の原理に基づくカラムを用いる事にした。この分離技術は、極性の小さい物質に用いられる。しかし、組成物は８０％アセトニトリル中に導いた場合に沈殿を形成した。この様に、幾らかの含量の組成物は、高濃度の有機溶媒を含む緩衝液中で沈殿した。沈殿フラクションと可溶フラクションを分離した。沈殿フラクションと可溶性フラクションの両方を凍結乾燥によって乾燥させた。沈殿フラクションと可溶性フラクションを水溶液中で再構築し、両方をＲＰ−ＨＰＬＣによって分析して、ＴＮＦ−α放出活性について試験した。表２４は、ＴＮＦ−α放出活性の大部分が沈殿した物質の中に含まれることを示している。
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組成物の沈殿物フラクション（図１１）と可溶フラクション（図１２）の両方のＲＰ−ＨＰＬＣ分析は、沈殿物が主に組成物のＲＰ−ＨＰＬＣのフラクション１（図１０）に含まれる物質であり、可溶物質は組成物のＲＰ−ＨＰＬＣの他のフラクション（図１０）を含むことを示している。この様に、２種の異なる方法で、組成物活性はＲＰ−ＨＰＬＣにごく僅か保持されるフラクション中に含まれることが、示された。事実上、沈殿物は、１００μｌおよび２００μｌで試験した場合に、沈殿しなかった組成物と等しい活性を持っていた。
２００μｌの組成物のみが、正常な浸透圧以上であった。当然ながら、組成物の沈殿物及び可溶フラクション（上澄液）は、ＲＰ−ＨＰＬＣによって分離され（図１１および１２）、２つのフラクションに分けられた（ＲＰ−ＨＰＬＣのプロフィールを参照のこと）。フラクション１（２：００−２１：１０分）はＲＰ−ＨＰＬＣによって分離された組成物の同フラクション１に対応し、フラクション２はＲＰ−ＨＰＬＣによって分離された組成物のフラクション２から５に対応した。次いで、単離物は、それらのＴＮＦ−α放出活性について試験した。表２６は、２人の患者について、ＲＰ−ＨＰＬＣ分離後の沈殿物または上澄液のいずれもがいかなるＴＮＦ放出活性をも持たないことを示している。しかし、最初の２人の患者から得られた結果（表２５）から、沈殿物が理想の容量で試験されていないかもしれないという可能性が示唆された。従って、フラクションを２人のさらなる患者について、一つはより低し濃度で、再試験した。表２６は、５０および１００μｌで、沈殿物のフラクション１が最も高い活性を持っていたことを示している。５０μｌでは、５０ｎｇＬＰＳほどのＴＮＦ−αの２倍を放出した。しかし、わずかな活性が上澄液のＲＰ−ＨＰＬＣのフラクション１および２に認められるのと同じぐらい、沈殿物のＲＰ−ＨＰＬＣフラクション２にもまたわずかな放出活性が認められた。
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Ｅ．異なる培養液によって放出されるＴＮＦ−α
ＲＰＭＩ１６４０から１９９培養液に変わった結果としてＴＮＦ−αの放出が低くなることが、培養液１９９およびＲＰＭＩ１６４０中での評価によって認められた（表２７）。結果は、１０から２００ｎｇのＬＰＳが培養液１９９中よりＲＰＭＩ１６４０培養液中でＴＮＦ−αを放出するのにより効果的であることを、示している。おそらく、組成物もまた、ＲＰＭＩ１６４０培地中でより多く放出するであろう。この様に、培養条件はＴＮＦ−α放出程度に影響を及ぼすことができる。
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Ｆ．組成物の浸透圧
表２８は、組成物の異なるバッチの浸透圧を示している。Ｂ０２１３は６７５ｍＯｓｍで中程度に高い。Ｂ０２１３よりさらに良いＴＮＦ放出活性を持つことを示すＢ０２２２（５８１ｍＯｓｍ）は、浸透圧がより低い（５８１ｍＯｓｍ）。フラクションＢ０２２６、ＢＣ１１−０６およびＢＣ１１−０９は、５４０から６０３ｍＯｓｍの範囲である。
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実施例１１
Ａ．本発明の組成物の腫瘍壊死因子（Ｔｕｍｏｒ  Ｎｅｃｒｏｓｉｓ  Ｆａｃｔｏｒ）（ＴＮＦ）放出活性
１．組成物のアセトニトリル沈殿物および上澄液
前述の実施例に示すように、８０％アセトニトリル沈殿物質が本発明の組成物を形成する。沈殿物質および非沈殿（以後、上澄液と呼ぶ）組成物は、ＴＮＦ放出活性がどちらにあるかを決定するためにさらに試験した。
表２９は、組成物のＴＮＦ−放出成分が８０％アセトニトリル、有機溶媒、によって沈殿することを示している。全組成物０．０４ｍｌは約１５ｐｇ／ｍｌのＴＮＦを放出したのに対して、組成物の沈殿したバッチの０．０５ｍｌは５８（Ｂ０２２２）、０（Ｂ０２２１）、および１７（Ｂ０２１３）ｐｇ／ｍｌを放出し、この事は、ＴＮＦ放出成分が８０％アセトニトリル沈殿によって回収されたことを示唆している。沈殿させた組成物は沈殿前の同容量の液体中に再構築した。それ故、０．１ｍｌの沈殿物は０．１ｍｌの全組成物からきており、０．１ｍｌの全組成物に相当する。
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初期の研究では、一般的に、０．１から０．２ｍｌの間の組成物が、ＴＮＦ放出を刺激することに使われた事は注目に値する興味がある。Ｂ０２２２、Ｂ０２２１およびＢ０２１３の沈殿物は、０．１および０．２ｍｌに再構築され、２０５から８２１ｐｇ／ｍｌのＴＮＦを放出した。０．１ｍｌの沈殿物では、バッチＢ０２２２、Ｂ０２２１およびＢ０２１３は、２０５から３６５ｐｇ／ｍｌの間のＴＮＦを放出し、非常に類似したＴＮＦ量は、３種の異なるバッチのＴＮＦ放出活性が一貫していることを示している。
提供者白血球の単独群を用いて、組成物の８０％アセトニトリル沈殿後に残された上澄液を試験した。組成物の全バッチ（Ｂ０２２２およびＢ０２１３）の０．０４ｍｌが、１７５および２３３ｐｇ／ｍｌのＴＮＦを放出したのに対して、０．０５ｍｌの上澄液は、全組成物の活性の約３３％である４２および４１ｐｇ／ｍｌを放出した。８０％アセトニトリルを用いて同じ様式で調製したブランクは、ＴＮＦ放出活性を持たなかった。この様に、沈殿物中のＴＮＦ放出活性は、沈殿物を誘導するために用いた緩衝液中の何等かの残余物質の結果ではなかった。
前述の研究では、沈殿物および上澄液のフラクションを、異なる提供者からの白血球を用いて試験したが、さらに、２つのフラクションを同一の提供者からの白血球を用いて試験して、研究を行った。２つの試験したバッチでは、全組成物０．０４ｍｌは０から４１ｐｇ／ｍｌの間のＴＮＦを放出した。比較すると、組成物の同じバッチの沈殿物０．０５ｍｌは１４１および７４９ｐｇ／ｍｌのＴＮＦを放出し、これに対して０．０５ｍｌの上澄液フラクションは６から５７ｐｇ／ｍｌの間のＴＮＦを放出した。この様に、沈殿物はＴＮＦ放出活性の多くを含んでいた。上澄液フラクションはなお幾らかのＴＮＦ放出活性を持っていたが、それは沈殿物のそれより非常に少なく、全組成物より多くなかった。
２．逆層−ＨＰＬＣで分離された本発明の組成物のフラクション
本発明の沈殿物は多くのＴＮＦ放出活性を含むことが示されたので、沈殿物のプロフィールをＣ18ＲＰ−ＨＰＬＣを用いて実験した。図１８、１９および２０は、それぞれ、全組成物、沈殿物および上澄液のＲＰ−ＨＰＬＣのプロフィールを示している。沈殿物のプロフィールは、主に、全組成物の初期の溶出ピークを示しており（図１９）、これに対して、上澄液のプロフィール（図２０）は初期のピークが強烈でなかったことを除いて全組成物のそれと類似している。
次の一連の実験では、沈殿物および上澄液の活性をＣ18ＲＰ−ＨＰＬＣによって分離した後に評価した。沈殿物および上澄液はＲＰ−ＨＰＬＣから：２から２１分および２１から４６分：の２つのプールとして集めた。ＲＰ−ＨＰＬＣによって分離した全組成物のフラクションの以前の研究では、ＴＮＦ放出活性は、主に２から２０分のフラクションに溶出することが示された。表３０は、全組成物ならびに沈殿物および上澄液のＲＰ−ＨＰＬＣフラクションの試験結果を示している。この詳細な実験では、全組成物の１０μｌのみを使用したため、ＴＮＦを放出しない原因となった。２から２１分の沈殿物のプールはＴＮＦを放出したが、２１から４６分のプールは放出しなかった（表３０）。上澄液の２から２１分のプールもまたＴＮＦ活性を放出したが、２１から４６分のプールは極少量のＴＮＦを放出した（表３０）。この様に、沈殿物および上澄液共に、ＴＨＦ放出活性は、主に、Ｃ18ＲＰ−ＨＰＬＣからの初期の溶出フラクションに残存している。
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結果は、沈殿物および上澄液中のＴＮＦを放出する物質が、恐らく密接に関連した分子であることを示唆しており、もし同一でなければ、例えあるとしても、わずかな違いであり、多分８０％アセトニトリル中での溶解度の違いであろう。
他の実験においては、沈殿物の２つのＲＰ−ＨＰＬＣプールのＴＮＦ−放出活性を、組成物の３つのバッチについて実験した。表３１は、再度、３つの異なるバッチ（Ｂ０２２２、Ｂ０２２１およびＢ０２１３）について、ＴＭＦ放出活性が主に２１分までのプール２にあることを示している。この様に、異なるバッチは一致していた。
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その後の実験では80%アセトニトリルによる沈澱物の、洗浄の効果を調べた。この実験の目的は、TNF放出活性が単なる捕捉ではないことを証明することにある。全組成物0.04mlは325pg/mlのTNFを放出した。沈澱物の2分から24分までのプールは、0.1mlの時に324pg/mlのTNFを放出し、0.05mlの時に3pg/mlを放出した。24分から46分までのプールはTNFを放出しなかった。同様に上清の2分から24分までのプールは、0.1および0.05mlのときにTNFを放出したが、RP-HPLCでの24分から46分までのプールは、TNF放出活性は若干あるがかなり低かった。
組成物のRP-HPLC分離物の処理法が、TNF放出活性の存在の原因になったのではないことを確かめるため、組成物なしで同様の方法で試料調製を行った。PBSおよびH2Oのブランク、これらによる沈澱物および上清のRP-HPLCの特性は、本質的にいかなるピークも含んでいなかった。
同一の提供者の単核球細胞をもちいて、同一の提供者由来の白血球に対して試料を試験した。全組成物および2分から24分までに溶出した沈澱物はTNFを放出したが、PBS、H2OまたはRP-HPLCで分離されたこれらによる沈澱物は、2分から23分までのプール中にTNF放出活性を持たなかった。従って2分から24分までに溶出した沈澱物は、特異的なTNF放出を引き起こしたといえる。
24分から46分までに溶出された組成物の沈澱物プールは、TNFを放出しなかった。対照である水およびPBSはそれぞれ114および40pg/mlの放出を示した。従って24分から46分までの沈澱物プールからは、特異的なTNFの放出はないといえる。
2分から24分までおよび24分から46分までの上清プールは、それぞれ82および68pg/mlのTNFを放出した。RP-HPLCを経た水およびPBSのブランクのプールは、ある程度TNF活性を放出した。2分から25分までおよび25分から46分までの水のプールはそれぞれ149および216pg/mlのTNFを放出し、PBSのプールはそれぞれ0および126pg/mlのＴＮＦを放出した。
従って沈澱および上清画分は、いずれもTNF放出活性を持っている。RP-HPLCによるTNF放出活性の分離において、両者がRP-HPLCから早期に溶出したことで、万一仮に活性のある成分が同一でないとしても、両者は物理的にきわめて類似していると推測される。
表32は、さらに行った試験の結果のまとめを供するものであり、RP-HPLCで分離後の80%アセトニトリルによる沈澱物および上清から、同様の方法で調製したブランク試料の活性を差し引いたものである。
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組成物全体はin vitroで単核球細胞から24時間の時点でTNF、GM-CSF、IL1-βを放出する。80%アセトニトリルによる沈澱物は同様の放出活性を含み、その大部分はRP-HPLCからの早期の画分に溶出する。上清画分は放出活性を保持し、その大部分はRP-HPLCからの早期の画分に溶出する。上清画分は放出活性を保持するが、TNFおよびGM-CSFに対する放出活性は早期に溶出するRP-HPLC画分中にも溶出する。これらの結果は、同じ成分が3種のサイトカインを放出するらしいことを示唆する。GM-CSFとIL-1βに対しては、ある程度の放出活性がRP-HPLCからの遅めの画分中に溶出する事実から、組成物中には単核球細胞に作用してGM-CSFとIL-1βを放出させることができる、もう一つの物質が存在することが示唆される。
物理化学的な解析SDSゲル電気泳動
TNF、GM-CSF、IL-1βを放出させる活性を、80%アセトニトリルにより部分的に沈澱化できること、放出活性の大部分がC18RP-HPLCから早期に溶出することを同定したので、沈澱画分の物理化学的性質を研究し、組成物全体および組成物の上清画分と比較した。
図21は、組成物全体および組成物の沈澱物と上清のSDSゲル電気泳動を示す。3つの場合すべてにおいて、組成物はSDSゲル電気泳動の最先端付近にあり、低分子量であることを示している。標準物質としてもちいた最小のものは14,400ダルトンである。
分子ふるいHPLC
組成物の分子サイズを、分子ふるいHPLCからの溶出時間を決定することによっても調べた。組成物全体および組成物の沈澱物と上清の溶出時間を、標準物質と比較した。3つともすべて、24.5分に溶出するインシュリンより後に溶出した。この場合にも物理化学的な解析は、分子量が2,400ダルトンより小さいことを示している。
親水性（ポリヒドロキシエチル）HPLC
TNF-放出成分は早期に溶出する。従って逆の効果をもつカラムを選択し、親水性カラムに有機溶媒をもちいた。ポリヒドロキシエチルカラムに対する理想的な溶出条件は、80%アセトニトリルである。しかし前の実施例で示したように、調製物中の物質のある程度が、この濃度では沈澱してしまう。結果としてアセトニトリルの濃度を低くし、カラムが主に分子ふるいカラムとして機能するような条件にして、組成物を解析した。図22および23は、上清および沈澱全体の性質を示す。表紙は異なるピークの溶出時間をまとめたものである。これらの溶出時間は、組成物中の活性成分が低分子量であることを示している。
沈澱化した成分のアミノ酸解析と配列決定
2つの試料についてタンパク質解析にかけ、酸加水分解の前後でアミノ酸組成解析を行った。もちいた試料はアセトニトリルによる沈澱物、および沈澱物をRP-HPLCにかけて2〜20分の溶出をプールしたものである。これら2つの試料は、酸加水分解の前後のアミノ酸含量を比較すると、きわめてよく似ていた。しかし（酸加水分解後の）アミノ酸組成及び遊離のアミノ酸含量には明確な違いがあり、ペプチド結合が加水分解されたことを示唆した。これらの試料の組成は、グリシンとグルタミン酸/グルタミンにきわめて富んでいる点が特徴的だった。
前述のことから、活性をもつ成分の少なくとも一つは、タンパク質性であると考えられる。分析の結果、酸加水分解に対して安定であると思われる未同定のニンヒドリン陽性の成分（おそらくアミノ酸化合物と思われるが、他の化合物も反応しているかもしれない）が、潜在的にかなりの量存在することが明らかになった。試料中の1000残基あたりの主要なアミノ酸は、Asx（アスパラギン）143、Thr（トレオニン）31、Glx（グルタミン酸）381、Gly（グリシン）187、Ala（アラニン）170である。
遊離および（酸加水分解で）放出されたアミノ酸との間の比較を行った。この結果1000残基あたり以下のアミノ酸が示された。Asx（アスパラギン）51、トレオニン8.6、セリン18、Glx（グルタミン）375、Pro（プロリン）17、グリシン429、アラニン86である。
遊離/1000の比は以下のとおりである。
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5つの未同定の（ニンヒドリン陽性の）成分がある。きわめて不確かな同定ではこれらはシステイン酸、グルコサミン酸、サルコシンである。メチオニンスルホキシドおよびメチオニンスルホンも含まれるかもしれない。主要な未同定のニンヒドリン成分は、試料中の遊離の成分と思われる。
実施例12
IL-1βおよびIL-8の放出
表33は、本発明の組成物が培養中のヒト単核球細胞を刺激して、IL-1βを放出させること、80%アセトニトリルによる組成物の沈澱が、残りの上清よりも多くのIL-1βを放出させることを示している。組成物全体はIL-8の放出を刺激しないが、画分化した組成物はある程度のIL-8を放出するように思われる。表33に示された結果は、疑似試料によるIL-1βおよびIL-8の放出を差し引いている。
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物理化学的特性
組成物およびその沈澱と上清を、イオン交換HPLCで分離した。AX300（陰イオン交換）クロマトグラフィーおよびCMX300（陽イオン交換）クロマトグラフィーのいずれによっても、成分の明確な分離はなかった。疎水性逆相クロマトグラフィーはピークを分離しなかった。
キャピラリー電気泳動
沈澱物をキャピラリー電気泳動により解析した。高いpHでは、190nmで2つの吸収ピークが観察されたが、200nmでは消失した。214nmのUV吸収には有意なピークはなかった。
遊離のアミノ酸は、誘導体化されていなければ可視化されない。190nmの2つのピークは塩であると思われる。
実施例13
組成物の刺激活性について、以下の3つの指標系で評価した。1）リンパ球のDNA合成の刺激、2）リンパ球を介した細胞毒性機能の誘導、3）単核球/マクロファージを介した細胞毒性機能の誘導。これらの試験をスクリーニングのために選んだのは、これらが悪性腫瘍疾病をもつ患者の様々な臨床上の特質に付随するとされている免疫機能を測定しているからである。これらの免疫機能の指標は、インターフェロンまたはインターロイキン-2といった様々な生体応答改変試薬の処方をうけた癌患者においても変動しうる。最初のスクリーニング操作の結果を、以下に示す。
1）リンパ球のDNA合成の促進：最適促進濃度の植物凝集素（PHA）との比較
刺激剤 1分あたりのカウント
溶媒                            374
PHA                         125,817
組成物（#222）                1,116
組成物（1:10）                1,021
組成物（1:50）                  649
結果:基本的な分裂促進剤であるPHAとは異なり、本組成物はリンパ球を刺激して、幼若化および細胞分裂を進行させることはなかった。
2）リンパ球を介した細胞毒性機能の刺激：最適刺激濃度のインターロイキン-2（IL-2）のとの比較
刺激剤 溶菌単位
溶媒                           30.8
IL-2                          472.5
組成物（原液）                 48.1
組成物（1:10）                 33.3
組成物（1:50）                 44.8
結果：基本的なリンパ球細胞毒性機能の刺激剤であるインターロイキン-2とは異なり、本組成物はリンパ球細胞毒性を誘導しない。
3）本組成物による単核球を介した細胞毒性機能の刺激：ガンマインターフェロンと内毒素（γ-IFN+LPS）の併用との比較
刺激剤 細胞毒性%
（E/T=20/1）
溶媒                            4.3
IFN+LPS                        24.4
組成物（原液）                 19.7
組成物（1:10）                 20.0
組成物（1:50）                 11.5
結果：本組成物は濃度に依存して、末梢血液単核球を刺激して腫瘍殺傷機能を発現させることができる。刺激の規模は、基本的なマクロファージ活性化の組合せであるγ-IFN+LPSによる発現に匹敵する。本組成物がこうしたin vitroの検定において作用する際には、他のマクロファージ活性化因子の場合のように内毒素の添加を必要としないことは、認識するべき重要なことである。本組成物が内毒素の混入を含まないのであれば、このマクロファージ活性化の検定における生理活性は、生物学的に意義のあるものである。
本組成物をもちいた単核球/マクロファージの研究
スクリーニング操作から、本組成物はリンパ球機能は刺激しないが、単核球機能を刺激することが明らかにされたので、その後の研究では、この組成物中の単核球/マクロファージ刺激活性をさらに特徴づけることを目的にした。単核球/マクロファージの腫瘍殺傷機能を刺激する際の、本組成物の濃度応答特性を決定することを目的として、多くの比較実験を行うと同時に、本組成物の異なるバッチを試験した。この研究の主要な力点は、癌患者の異なる解剖構造学上の部位に由来する単核球およびマクロファージにおいて、本組成物が腫瘍殺傷機能を刺激できるかどうかを試験することである。こうした研究を導く中心になる仮説は、いかなる生体刺激因子の治療効力も大部分は、それが腫瘍疾病を含んだ環境において、腫瘍殺傷機能を誘導する能力に依存しているということである。こうした治療効力は腫瘍の微環境において、そこに存在する免疫細胞を直接刺激することで起こりうる。あるいはまたこうした治療効力は、循環している免疫細胞が刺激されて、それによりこうした細胞が腫瘍疾病の部位を目指して到達し、その環境で機能できるようになれば起こりうることである。こうした調査のために以下のものを特にもちいた。1）癌患者および対照被験者由来の末梢血液単核球、2）肺癌患者および対照となる非悪性腫瘍性の肺疾病をもつ患者に由来する肺胞マクロファージ、3）婦人科系悪性腫瘍の患者に由来する腹膜マクロファージ。
1.本組成物の濃度応答および異なるバッチの研究
これらの研究では、本組成物の異なる濃度および異なるバッチの刺激活性を試験するため、末梢血液単核球を特に用いた。試験のために本組成物の3つのバッチが供給された。これらはバッチ番号216、219、222と表記された。本組成物のそれぞれのバッチは、希釈なし（原液）、1:10希釈、1:50希釈の材料をもちいて試験した。結果は図24に図示した。
結果：バッチ#222および216は、単核球の腫瘍殺傷機能を刺激したが、バッチ#219は刺激しなかった。こうした予備調査では#222が216より優れていることが観察された。バッチ#222は無希釈（原液）でも、1:10希釈濃度でも多少弱まるが同等のレベルの腫瘍殺傷機能を刺激し、1:50希釈でも検出可能な活性を刺激するのが観察された。バッチ#216は無希釈（原液）で腫瘍殺傷機能を最高に刺激し、1:10希釈濃度では弱まり、1:50希釈では活性は検出できなかった。上に述べたように、バッチ#219は試験したいかなる濃度においても、単核球の腫瘍殺傷機能を検出可能なほどには誘導できなかった。
2.末梢血液単核球における腫瘍殺傷機能
対照被験者の4つの末梢血液単核球試料について試験を行った。これらの試験では、最適刺激濃度（バッチ#222の1:10希釈）の本組成物および最適刺激濃度のγ-IFN+LPSを利用した。これらの研究の標的細胞は、培養したNK非感受性の細胞系であるチャン（Chang）の肝癌細胞である。
刺激剤 細胞毒性%
（E/T=20/1）
溶媒                        5.4+/-1
γ-IFN+LPS                  18.6+/-4
組成物                      22.3+/-6
子宮頸癌の患者由来の1つの単核球試料についても試験した。患者自身の腫瘍細胞を検定の標的細胞として用いることができるので、この試験は重要である。前と同様にこの試験では、最適刺激濃度（バッチ#222の1:10希釈）の本組成物および最適刺激濃度のγ-IFN+LPSを利用した。実行細胞（エフェクターセル）/標的細胞（ターゲットセル）の比率も15/1に減少させ、患者の腫瘍細胞を温存した。
刺激剤 細胞毒性%
（E/T=20/1）
溶媒                             5.5
γ-IFN+LPS                      14.4
組成物                          20.9
結果：対照被験者由来の末梢血液単核球においては、本組成物により刺激されたチャンの肝癌細胞に対する単核球の腫瘍殺傷機能は、最適刺激濃度のγ-IFN+LPSによる誘導と同等のレベルであるか、これを凌いだ。子宮頸癌の患者由来の末梢血液単核球においては、本組成物により刺激された患者自身の腫瘍細胞に対する単核球の腫瘍殺傷機能は、γ-IFN+LPSによる誘導を30%以上上回るレベルであった。
3.  婦人科系悪性腫瘍の患者に由来する腹膜マクロファージにおける腫瘍殺傷機能
これらの試験は子宮頸癌の患者1名および卵巣癌の患者1名の洗浄液から単離した、腹膜マクロファージ試料について行った。これらの試験は標的細胞と同時に、患者自身の腫瘍細胞も検定にもちいて行った。前と同様に最適刺激濃度（バッチ#222の1:10希釈）の本組成物および最適刺激濃度のγ-IFN+LPSを比較した。実行細胞/標的細胞の比率も15/1に減少させ、患者の腫瘍細胞を温存した。
0004708511.tif 000045
結果：これらの結果は、局所的な腫瘍環境が免疫活性化因子に対する免疫細胞の応答の決定因子でありうるという事実を、浮かび上がらせている。この事例の子宮頸癌では腹膜腔内には悪性腫瘍疾病による病的な兆候は存在せず、自身の腫瘍に対する腫瘍殺傷機能の発達は、γ-IFN+LPSの方が本組成物よりも優れていた。卵巣癌の患者では、腹膜腔内に明らかな腫瘍があった。γ-IFN+LPSに応答した患者自身の腫瘍の殺傷は、たかがしれたものであったが、本組成物に応答したものは、これより優れていた。
4.肺癌患者および対照被験者由来の肺胞マクロファージにおける腫瘍殺傷機能
これらの試験は、非小細胞肺癌患者1名および悪性腫瘍ではない肺疾病の患者3名の気管洗浄液から単離した、肺胞マクロファージについて行った。これらの試験は最適刺激濃度（バッチ#222の1:10希釈）の本組成物および最適刺激濃度のγ-IFN+LPSを利用した。これらの研究の標的細胞はチャンの肝臓癌細胞であり、実行細胞/標的細胞の比率は20/1であった。
0004708511.tif 000046
結果：肺癌患者由来の肺胞マクロファージは、γ-IFN+LPSといった従来のマクロファージ活性化因子に応答した腫瘍殺傷機能の発達が抑えられている。これらの結果は、この観察と合致する。すなわちこれらの結果は、肺癌患者由来の肺胞マクロファージの腫瘍殺傷機能が対照被験者と比較して著しく減少していることを示している。これらの結果はまた、肺癌患者由来の肺胞マクロファージと悪性腫瘍ではない肺疾病の対照被験者の肺胞マクロファージのいずれにおいても、本組成物が腫瘍殺傷機能を活性化しないことを示している。
これらの本組成物の予備的なin vitroの試験は、これがマクロファージ活性化因子であることを示している。提供された物質は、NK非感受性細胞系および単離して間もないヒト腫瘍細胞のいずれに対しても、標準的な細胞毒性検定において腫瘍殺傷活性を誘導できた。誘導された活性はこれらの試験において、濃度依存的であることも見出された。本組成物がin vitroでマクロファージの腫瘍殺傷機能を活性化する能力は、現在入手可能な最も優れた組合せ、すなわちγ-IFN+内毒素に匹敵した。上で述べたように、本組成物が内毒素の非存在下でこのレベルの腫瘍殺傷機能を誘導できる能力は、この物質が内毒素の混入を含まないと仮定すれば、生物学的に重要なものであると考えられる。
他のマクロファージ活性化因子について見出されているのと同様に、本組成物がマクロファージの腫瘍殺傷機能を刺激する活性は、マクロファージの供給源により変化する。本組成物は、通常の供給者においてはγ-IFN+LPSに匹敵し、癌患者の供給者においてはγ-IFN+LPSを凌ぐような末梢血液単核球の優秀な活性化因子であると思われる。悪性腫瘍疾病は単核球の腫瘍殺傷機能の発達に重大な影響をもち、これはもちいる活性化因子に依存する（ブラウンら（Braun et al.）, 1991）。癌患者の単核球において、様々なマクロファージ活性化因子の生理活性を決定する1つの要因は、アラキドン酸代謝および細胞によるプロスタグランジンの分泌に対する活性化因子の感受性である。本組成物のこれらの初期研究から、本化合物により誘導される活性は、プロスタグランジンの阻害効果に対して非感受性であると思われた。本組成物で刺激された癌患者の単核球に対して、プロスタグランジン非感受性が明確に証明されれば、他の多くの生理活性化因子の効果がプロスタグランジンにより制限されているので、これは治療の上で重要なことであると考えられる。2つの標品をもちいた予備実験は、特に悪性腫瘍疾病が腹膜腔内に存在する場合、腹膜マクロファージにおいて本化合物が良い活性をもちうることを示している。
これらの予備的な結果が示すことはまた、様々な婦人科系の悪性腫瘍の患者の腹膜マクロファージの腫瘍殺傷機能を刺激する能力について、様々な活性化因子を比較したときに明らかになる。これらの研究においては、腹膜腔内にある悪性腫瘍疾病の存在が、特定の活性化因子に対する腹膜マクロファージの応答能に影響を与えることが見出された。子宮頸癌の患者では、一般に腹膜腔内には悪性腫瘍疾病は存在せず、従って体内のマクロファージのγ-IFN+LPSに対する応答は正常である。しかし疾病が腹膜腔内に存在すると、卵巣癌の事例と同様に、γ-IFN+LPSへの応答は抑圧される。このことは部分的には、悪性腫瘍疾病の存在時の腹膜マクロファージのアラキドン酸代謝変動に関係している（ブラウンら（Braun et al.）, 1991）。本組成物が卵巣癌患者由来の腹膜マクロファージの、患者自身の腫瘍細胞に対する腫瘍殺傷機能を活性化することが観察された事実はまた、アラキドン酸代謝経路とは無関係な活性化機構を反映しているのかもしれない。
一方において本組成物は、悪性腫瘍疾病が肺に存在するか否かにかかわらず、肺胞マクロファージを明らかに活性化できなかった。肺癌患者由来の肺胞マクロファージは、同一患者の末梢血液単核球や非悪性腫瘍の肺疾病患者由来の肺胞マクロファージのいずれと比較した場合にも、腫瘍殺傷機能の発達は有意に阻害されていることが見出された（シジオピクら（Siziopikou et al.）, 1991）。従ってこの事例において本組成物が活性をもたないのは、驚くにあたらない。
実施例14
本発明の組成物および他のマクロファージ活性化因子に応答した腫瘍殺傷機能の発達を、婦人科系疾病の患者由来の末梢血液単核球および腹膜マクロファージにおいて調査した。より詳細に述べれば、患者の人数は7人であり、3人は良性腫瘍疾病、4人は悪性腫瘍疾病（2人は卵巣癌、1人は子宮内膜症、1人は子宮頸癌である）である。試料は外科手術の際に患者から切離した。末梢血液単核球を含んだ調製物は、ブラウンら（Cancer Immunol. Immunother 32:55-61, 1990）が行った操作をもちいて血液試料から単離し、腹膜マクロファージを含んだ試料はブラウンら（Cancer Research 53:3362, 1993）が行ったように単離した。本発明の組成物（バッチ#222の保存物を1:10希釈したもの）および他の活性化因子、すなわちガンマインターフェロン（100U/ml）、インターロイキン-12（500U/ml）、単核球-CSF（500U/ml）に応答した腫瘍細胞に対する細胞毒性を、ブラウンら（Cancer Immunol. Immunother 32:55-61, 1990）が記した単核球細胞毒性検定をもちいて評価した。
表34に示した結果は、悪性腫瘍および非悪性腫瘍の婦人科系疾病の患者に由来する、末梢血液単核球および腹膜マクロファージのいずれにおいても、本発明の組成物が腫瘍殺傷機能を刺激することを示している。本発明の組成物により誘導される腫瘍細胞毒性は、試験した他の生理刺激因子により誘導される細胞毒性と同等であるかこれを凌いだ。
0004708511.tif 000047
実施例15
本発明および他のマクロファージ活性化因子に応答した、癌患者由来の末梢血液単核球の腫瘍殺傷機能の発達に、プロスタグランジン合成の阻害剤であるインドメタシンが与える効果を調べた。実施例14の悪性腫瘍疾病の患者由来の試料を、実施例14で記載した検定法をもちいて試験した。ただしこの場合は、インドメタシン（最高で5ng/ml）を、本発明の組成物、インターロイキン12（500U/ml）、単核球-CSF（500U/ml）と同時に添加した。
表35に示した結果は、インドメタシンがIFNa、GM-CSF、M-CSFに応答した細胞毒性を向上させることを示している。従ってIFN-γ、GM-CSF、M-CSFに応答した腫瘍殺傷機能の発達は、インドメタシン感受性の機能により制御されているといえる。これに対してホルボールエステル（PNA）、IL-12、本発明の組成物に応答した細胞腫瘍機能の発達は、インドメタシン感受性の機能により制御されなかった。すなわちインドメタシンは本発明の組成物、IL-12、PNAに応答した細胞毒性を向上させなかった。
0004708511.tif 000048
実施例16
インドメタシン存在下での本組成物に応答した腫瘍殺傷機能の発達に、プロスタグランジンE2が与える効果について調べた。被験者の人数は、正常人1名および患者8名（膵臓癌の患者1名、頭および頸部の癌患者2名、子宮内膜症1名、HIV患者4名）である。末梢血液単核球を含んだ調製物を、ブラウンら（Cancer Immunol. Immunother 32:55-61, 1990）が行った操作をもちいて患者の血液試料から単離した。PGE2（108M）の存在下または非存在下で、本発明の組成物（バッチ222の保存物の1:10希釈）およびインドメタシン（最高で5ng/ml）に応答した腫瘍細胞への細胞毒性を、ブラウンら（Cancer Immunol. Immunother 32:55-61, 1990）が記した単核球細胞毒性検定をもちいて評価した。
表36の結果は、病理生理学的なレベル（108M）のPGE2が、本発明の組成物に応答して発達した腫瘍殺傷機能のレベルを抑圧できなかったことを示している。これはγ-インターフェロンで刺激した単核球の腫瘍殺傷機能を、PGE2が抑圧できること（ブラウンら（Braun et. al. Cancer Research 53:3362, 1993）とは対照的である。
0004708511.tif 000049
実施例17
本発明の組成物で刺激した単核球の、自己の腫瘍細胞に対する腫瘍殺傷機能の発達を調査した。6名の患者（卵巣癌3名、子宮内膜癌1名、子宮頸癌1名、ENT癌1名）の血液試料から、ブラウンら（Braun et al.,1990）が行った操作をもちいて、末梢血液単核球を含んだ調製物を単離した。PGE2（108M）の存在下または非存在下で、本発明の組成物（バッチ222の保存物の1:10希釈）およびインドメタシン（最高で5ng/ml）に応答した腫瘍細胞への細胞毒性を、ブラウンら（1990）が記した単核球細胞毒性検定をもちいて評価した。ただしこの場合、チャンの肝臓癌細胞の代わりに、患者自身の腫瘍細胞をもちいた。ブラウンら（1990）が記したように患者の腫瘍細胞をコラゲナーゼおよびDNaseで処理し、単細胞調製物を調製し細胞を標識した。
表37に示した結果は、本発明の組成物が患者自身の単核球を活性化して、患者の腫瘍を殺傷しうることを示している。本発明の組成物は少なくとも、現在もちいられている標準的な生理活性化因子と同等の効果を持っている。
0004708511.tif 000050
実施例14から17の実験結果は、本発明の組成物が、単核球を活性化して腫瘍殺傷機能を発現させること、臨床的背景で現在もちいられている他の活性化因子と少なくとも同等の効果をもつこと、腹膜マクロファージを含んだ血液中で作用すること、患者の免疫抑制の主要な形態の一つであるプロスタグランジンの阻害効果を受けないと思われることを示している。実験データはまた、本組成物の腹膜悪性腫瘍および婦人科系の悪性腫瘍の治療における有用性を支持している。
実施例18
早期毒性の研究
様々な動物種について毒性を研究した。研究は表38にまとめられている。全ての動物について、14日後、21日後、30日後に注射しながら毎日の臨床観察にもとづいて評価を行った。注射を投与した間またはその後の追跡期間（全ての動物について1カ月間、ただしイヌについては4カ月間追跡した）にわたって、好ましくない効果は見られなかった。
0004708511.tif 000051
毒性の研究が組成物の一度の多量な筋肉内投与の効果を決定するためにも行われた。13匹のラットが一度に5ml/kgの組成物の筋肉内投与を受けた。3匹のラットは7日間観察された。10匹のラットは14日間観察され、安楽死および死体解剖の処置がなされた。いずれのグループにおいても毒性の症状は観察されず、死体解剖された動物では顕著な病理学的発見は観察されなかった。これらの観察に基づいて、ラットにおける組成物の筋肉内投与のためのLD50が5ml/kg以上に決定された。表39はこれらの結果を要約している。
0004708511.tif 000052
犬における毒性の試行
オンタリオ獣医科大学によって行われた研究では、組成物は二匹の雑種犬に投与された。その方法が表40に要約されている。どの場合においても、左前脚に一服量が投与され、7日後に二度目の薬が左後脚に投与された。どちらの犬も最初の注射後、14日間観察された。食欲、行動、体温、脈拍数、呼吸数が研究の期間中毎日2度モニターされた。処理を施す前、および最初の注射後の24時間、72時間、7日および14日後に慣例の尿検査、血液学および血清化学の側面が実行された。どの動物もそれぞれの注射に関連した苦痛の兆候は示さなかった。二回目の注射に関連した過敏症の証拠は無かった。薬剤に原因があると思われる物質的および実験室の要因における異常または変化は見られなかった。この薬剤は健康な犬にとって十分に耐えられることが明らかになった。
0004708511.tif 000053
悪性腫瘍による動物の処理
本発明の組成物は同類の動物における様々な悪性腫瘍の処理のために家畜病院で臨床的に利用された。慣例的な治療法では効果がなかった、進行性の新生病にかかった11匹の猫および10匹の犬が、一週一回筋肉内に投与される組成物で処理された。表41は本研究における個々の臨床的事例を要約している。注射回数は単一の筋肉内部位に与えられる7.5mlまでの量で2から69回までに渡っている。毎週の注射の方法によって、それぞれの場合に個々に決定された診断テストで個々の場合の調査および注意深い観察が可能になった。臨床医は過敏症（アナフィラキシー）を含め局所的な刺激も激しいアレルギー反応もないことを観察した。臨床医および動物のオーナーは、どんな全身の拒否反応も観察しなかった。研究者は食欲および活動レベルを改善する僅かな適応、少数の動物での体重の増加、および痛みおよび/または不快感の減少からなるいくつかの臨床学的改良に注目した。
0004708511.tif 000054
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臨床学的結果が以下に要約されている:6匹の動物（3/10の犬および3/11の猫）は完全な反応を経験した。一匹の動物（1/11の猫）は最初の主要な反応を示した。11匹の動物（5/10の犬および6/11の猫）は僅かな部分的反応を経験した。一匹の動物（1/10の犬）は安定のままで、一匹の動物（1/11の猫）は反応しなかった。表42はそれぞれの処理の定義を提供している。動物での臨床的な経験は悪性腫瘍の治療法の構成に有力な役割を示唆している。
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実施例19
予備的な臨床学的試験
治療不能な腫瘍をもつ患者はキログラムあたり0.11mlの実施例1で述べられている方法に従って調製された本発明の組成物で処理された。組成物は3日から5日ごとに筋肉内に投与された。治療された58人の患者のうち、有意な毒性を示すものはまったくなかった。37人の評価できる患者のうち、3人の患者は僅かな反応、即ち25から50パーセントの腫瘍の減少が起こり、5人の患者は期間内に少なくとも8週間の安定した病気にかかった。最も興味深い結果は最も励みになる結果をもつと思われる膵臓腫瘍の患者の中に見られた。7人の患者のうち、1人の患者は11ヶ月もの間病気の安定化が見られた。極度に進行した病気を持つ二番目の患者は4ヶ月間病気の安定化が見られた。膵臓の腫瘍が本発明の組成物の基礎的研究に選ばれたのは、これらの結果に基づいたものである。研究の目的はこのグループの患者達における組成物の安全性および効能を決定することである。
治療は大臀筋に単一の深い筋肉内注射として投与される7.5mlの最少投与量でキログラム当たり0.11mlの本発明の組成物から成る。患者は最初の週は週に3回、そして病気が進行するまでは週に2回治療を受けた。すべてにおいて、22人の患者が本研究に登録されており、すべての患者が毒性の評価をすることができた。ただ17人の患者だけが効能の評価が可能であった。合計570回の注射をし、部分的または全身のどちらかにおいて報告されているどんな種類の毒性もなかった。また他覚的な反応もなかった。しかしながら6人の患者は3ヶ月またはそれ以上の間安定な病気を有していたが、残りの患者は最初の3ヶ月以内に病気が進行した。生存期間の中央値は診断時から8ヶ月であった。最初の注射からの生存期間の中央値は4ヶ月間であった。安定な病状を6ヶ月以上維持した患者が3人いた。75才の1人の男性患者は、本療法から解放した後18ヶ月で肝臓の転位を再発した。彼は進行前の8ヶ月間は、本組成物によって完全に安定な状態のままだった。切除不能な病気を持つ71才の老女は少なくとも10ヶ月間安定しており、フルタイムで働き続けた。治療進行後4ヶ月で局所的に再発した64才の老女は少なくとも8ヶ月間安定だった。
手術不能な膵臓の腫瘍を持ち、組織が病理学的診断用に採取できないために本研究に登録することのできなかった四番目の患者は、組成物のより高い投与量にもかかわらず腫瘍が進行したが、ほとんど1年安定だった。要約すると、本発明の組成物はこの投与スケジュールにおいては膵臓癌に対して毒活性を持っていない。組成物を使うとこの病気をもつ少数の場合において一時的な抗増殖活性が示唆された。
実施例20
膵臓癌の臨床医学的研究
本発明の組成物を使った第２臨床フェーズのテストが生検で計測可能な癌が証明された膵臓癌を持つ患者に対して始められた。組成物は1週間は週に3回、それから病気が進行するまでは週に2回、7.5ml（0.11ml/kg）の筋肉内注射で投与された。研究の詳細は以下に述べられている。
方法
治療は、実施例1で調製された組成物を大臀筋の各側に交互にそれぞれの投与量で臀部深く筋肉内注射される、1回量0.11ml/kg（最少投与量7.5ml）の投与から成る。患者は最初の週に3回の注射、次に腫瘍の進行までは週2回の注射を受けた。
反応は標準的な分類を用いて定義した（Millerら、Cancer 1981; 47: 207-214）。完全な反応（CR）は少なくとも4週間ですべての病気の証拠が完全に消えることと定義された。部分的反応（PR）は少なくとも4週間、新しい病変またはなんらかの傷害の進行なしで、最も大きい測定可能な病変二つの最大のタテ・ヨコ直径の積における50%以上の減少と定義された。進行性の病気は一つまたはそれ以上の測定可能な病変の大きさ、または新たな病変の出現における25%またはそれ以上の増加と定義された。反応または進行性の病気の定義に当てはまらない病気は安定な病気と名付けた。
結果
合計22人の患者が研究に登録されたが、5人の患者は効能の評価ができないと考えられた。完全または部分的な反応は見られなかった。3人の患者は最初の1ヶ月内に病気が進行した。6人の患者は3ヶ月以上（3.5、3.5、5、8、12+、14+）の間病気が安定化した。全グループの生存期間の中央値は診断した日から8ヶ月、および治療の開始から5ヶ月だった。生検で証明された肝臓への転位および37ng/ml（通常<3ng/ml）のCEAを有する1人の患者は、肝臓への転位病変およびCEAの完全な安定化が8ヶ月間見られた。1人は5ヶ月間安定な病状であった。1人は膵臓の層にWhipple式療法の後4ヶ月で病気が再発し、ゆっくりCEAが増大したことを除いて、少なくとも1年間、本発明の組成物によって安定であった。3番目の患者は経皮的なステントを挿入され、腫瘍の進行の証拠が見られないまま少なくとも14ヶ月間フルタイムで働き続けた。
全22人の患者が合計500回以上の注射を受け、毒性の評価が可能であった。薬剤に関連した毒性のいかなる臨床学的または実験的な証拠も誰にも明らかには認められなかった。一般的に病気の活性状態と関連する生活の質に有害な影響を及ぼすことはなかった。全白血球数、リンパ球の絶対数、血清の免疫グロブリンに関する重要な変化は見られなかった。
診断からおよび治療の開始からの生存期間を示す生存曲線がそれぞれ図13および14に示されている。比較のためにGudjonsson（1987）の歴史的な生存曲線が図13に載せてある。比較可能な歴史的生存曲線の別の例はBakkevold、Petterson、ArnesjoおよびEspenhaug（1990）にも見られる。
生存分析の結果が表43に要約されている。診断の平均の生存曲線は281日だった（図13）。生存日数の中央値は182日（約5ヶ月）だった。比較のためにGudjonsson（1987）は、彼の188人の外科患者の平均的生存を、生存日数平均２８０日、中央値１２０日と報告している。治療の開始からの平均の生存期間は166日だった（図14）。中央値は133日（約4ヶ月と1週間）だった。
0004708511.tif 000059
生存期間はそれぞれ少なくとも13回の注射を受けた評価可能な患者の部分集合の中でも評価された。22人の患者のうち14人が評価可能だった。これらの患者（表43）のなかで、診断からの中央値生存日数は219日（約7ヶ月と1週間）だった。治療の開始からでは146日（約5ヶ月）だった。
実施例21
悪性の黒色腫に関する臨床学的試験
進行した悪性の黒色腫は、すべての段階IIIまたはIVの患者、および一次の治療後に起こるすべての局所的または離れた位置への再発を含むように定義された。それによってすべての他の治療が判断される標準的な治療法は、約15%の反応率と報告されているDTIC（ダカルバジン）である。反応の中央値は3-6ヶ月であり、ひどい吐き気および嘔吐、および肝臓静脈の血栓症による急性の肝臓の壊死という死の可能性のある副作用を伴う。この治療法はどんな定義的生存の利点も示せていない。
本研究は進行した悪性の黒色腫の患者に使用したときの本発明の組成物の安全性および効能の決定、および生存および生活の質への効果の決定を行うように実施された。この研究は比較対象を置かない多中心試験であった。
1週間に3回筋肉内に本発明の組成物を7.5ml注射するという投与スケジュールが最初に用いられた。器官および骨髄への毒性が観察されなかった後で、投与のスケジュールは15日の間毎日の注射に増加され、続いて1週間当たり3回の注射が維持された。後にスケジュールの投与量は30日に増加された。治療期間は36週間で後に16週間に減らされた。患者にはその後引き続き投与を受ける選択権が与えられた。
進行した黒色腫の33人の患者には17才から85才までの年齢の研究人数（17人の女性および16人な男性）が含まれた。64%が以前に治療されており、36%が未治療だった。研究の人数に含まれる33人の患者のうち25人が評価可能であった。Karnofskyの行動基準（基準線）は40-100%の範囲で、中央値は80%であった。11人の患者は研究期間の終了時に生存しており、これらのうち5人は治療中であった。
僅かな部分的反応が16/33の患者（48%）に観察された。1人の患者は肺において33%の減少が起こり、6人の患者は痛みが減少し、8人の患者は1ヶ月以上に渡って体重が1000グラム増加した（1000-2600グラムの範囲）。19/33の患者（58%）では安定な状態が観察された（60-170日、中央値77日）。
図15、16および17は歴史的なコントロールと比較した本発明の組成物で治療し、転位/再発の診断からの生存として日数を計測した患者の生存を示している。実線は本発明の組成物で治療した患者に対する生存曲線を示し、破線は歴史的な生存曲線を示している（Balch, C. M.ら、Cutaneous Melanoma、第２版、1992、14および39章、165-187および499-508頁、Lippincott Co.,フィラデルフィア、ペンシルベニア州）。一つから三つ以上の腫瘍部位を持つ患者を含む、本発明の組成物で治療したすべての患者の生存が図15に示されている。二つの腫瘍部位、および三つまたはそれ以上腫瘍部位を持つ患者の生存が、それぞれ図16および17に示されている。
本発明の組成物で治療したすべての患者のグループは、一年後に39%の生存（Kaplan-Meierの評価）だった。すべての進行した悪性の黒色腫（AMM）の患者に対する一年の生存率は歴史的なコントロールでは約11%である（腫瘍部位数に匹敵している）。このグループは歴史的な中央値の89日と比較して315日の中央値の生存であった。
本発明の組成物で治療した患者で二つの腫瘍部位があるものでは、一年後の生存が歴史的なコントロールでの13%と比較して49%であった。このグループは歴史的な中央値の120日と比較して生存の中央値が360日であった。本発明の組成物で治療した患者で三つまたはそれ以上の腫瘍部位があるものでは、一年後の生存が歴史的なコントロールでの0%と比較して31%であった。三つまたはそれ以上の腫瘍を持つグループは歴史的な中央値の60日と比較して生存の中央値が205日であった。
生活の質は体重の増加、行動状態（Karnofsky）、生活の質インデックス（Spitzer）および痛みの尺度（Linear Analogue）によって評価された。時間当たりの体重の増加が表44に示されている。
0004708511.tif 000060
KarnofskyおよびSpitzerの尺度はどちらも自覚的尺度であり、それぞれの個人に大体適合することが分かった。15人の患者はこれらのパラメーターにおいて何の変化も報告しなかった。4人の患者は後で前のレベルに戻るという変動を示した。1人の患者では低下（40-20%）が見られた。
痛みの評価の結果は、6人の患者において4週間後までに痛みが5（可能な最悪値）から2（中程度）または0（痛み無し）までに低下したことを示した。1人の患者は痛みが3から0に低下した。肝臓への転位のある1人の患者は痛みが0に減少し、11ヶ月に渡って安定していた。痛み0の状態で研究に入った9人の患者は研究を通してそのレベルを維持した。5人の患者では痛みの中程度（2ユニット）の増加が見られた。3人の患者では第2または3月の間に一過的な痛みの増加（1から2ユニット）が見られた。
33人に投与された1734回の注射の中で、21人の患者は抗薬反応が見られなかった。12人の患者において14の抗薬反応が報告された。抗薬反応は通常4または8週間で起こり、穏やかまたは一過的であり、最も頻繁なものは低い発熱であった。
歴史的なグループと本発明の組成物で治療したグループとの生存における違いは、本発明の組成物で治療した患者に対しての生存期間の利益を示唆している。癌は19人の患者において安定と思われた。AMMに対して治療したすべての患者は生存のデータに含まれている。21人の以前に治療された患者も含まれている（失敗した以前の治療の乏しい予見のために、多くの臨床学的試験が治療しない患者を必要とする）。腫瘍の重度は高い（82%が一つ以上の転位部位を持つ）。
生存期間および生活の質のデータは、ほとんどの患者が治療から何らかの利益を受けることを示唆している。11人の患者は研究期間の終了時にまだ生存しており、かれら11人のうち5人は治療を継続した。
実施例22
悪性黒色腫での病理学的方法
以下は硬口蓋および歯茎の進行した悪性黒色腫をもつ73才の老女の報告である。図25は顕微鏡下で観察した悪性黒色腫の二つの視野を示している。図25aでは、上から下まで見てみると、ケラチンを伴う上皮層が見られその下で腫瘍細胞がより顕著になり始めている。これらの黒色腫細胞は、豊富な好酸性の細胞質、および多態性の高染色体核を有し、丸または卵型に観察される。これらの細胞は正常な粘膜下組織にとって代わっている。認められる血管は正常と思われ、白血球（多形核および単核の細胞）の存在によって示される炎症性/免疫性の反応は少数である。これは成長している腫瘍細胞の例であり、即ち腫瘍構造はそのまま維持されている。
図25（b）では２ヶ月間組成物で治療した同じ患者の腫瘍組織の例が示されている。上端から始まって下端にいくと、上皮の連続性が壊死的プロセスによって壊されているのが見られる。この壊死は、通常臨界質量に達した腫瘍の中央では起こるものだが、特に悪性黒色腫における周辺部ではまれにしか見られず、したがって宿主の免疫応答が腫瘍に対して攻撃を仕掛けていることのしるしとなる。最初の腫瘍細胞と異なる多数の細胞が写真を通して存在する。これらは典型的な腫瘍構造の破壊において協力する免疫細胞（好中球、リンパ球、マクロファージ）である。血管壁は多数の宿主の免疫細胞が密集して浸潤するようになっている（矢印）。この細胞の浸潤物は次に血管の崩壊を引き起こし、それは順番に腫瘍が栄養および酸素の供給を受けるのを妨げる（乏血性壊死）。患者の組織のスライドに見られる腫瘍の崩壊に貢献するこの免疫応答はTNF（腫瘍壊死因子）によって起こることが知られている報告された変化、および上述した実施例に記載された研究の結果と一致している。
本発明の組成物での治療後のスライド（図25b）に示されている免疫応答は、既知のin vivoの抗腫瘍のTNFの効果と本発明の組成物によるin vitroのTNFの免疫調節とを強く関連付けている。
上述のことから、本発明の特定の具体例が例証のために本文中に記載されているが、様々な修飾が発明の精神および範疇から逸脱しないで行われ得ることが認められよう。よって本発明は請求の範囲以外には限定されない。
実施例23
活性画分の単離
組成物の300mlの試料を温浴の温度が40℃を超えないような回転蒸発器で蒸発して乾燥させた。溶液が蒸発の間に塩基性に保たれていることを確実にするために、蒸発が完了するまで30分ごとに5滴の濃縮した水酸化アンモニウムが組成物に添加された。結果として生じた残渣は11.6gの重量だった。
次にメタノール溶液中の10%濃度の濃縮した水酸化アンモニウム20mlが2gの上記の残渣に添加された。不溶性の物質は濾過して取り除き、濾過物は5cm×12.5cmのカラム内の60オングストロームの101.93gのフラッシュシリカゲルを通してクロマト分離された。使用された溶剤の系はメタノール溶液に溶解させた10%の濃縮した水酸化アンモニウムであった。カラムは10p.s.i.の圧力および11ml/minの流速で通された。100mlの溶媒がカラムを通過した後、12の20ml.の画分が回収された。これらの画分の回収は、カラムを素早く通過している灰色がかった白いバンドの出現と互いに関係がある。
これらの画分の薄層クロマトグラフィー（TLC）がメタノール中の10%水酸化アンモニウムでシリカゲルプレート上で行われ、ニンヒドリンスプレーによって視覚化された。同様のTLCの大略が組み合わされ、回転蒸発器で乾燥した次の画分の組み合わせを生じた。
0004708511.tif 000061
画分５−６，７−８および９−１０はニンヒドリンに対して正の反応を示し、Ｒｆ値は０．８１であった。
実施例２４
実施例２３の画分５−６および９−１０について、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで坑増殖効果（実施例４の手法に従う）およびＴＮＦ刺激（実施例９に従う）を試験した。結果は、以下に示す：
0004708511.tif 000062
従って、画分５−６は坑増殖刺激について活性があり、画分９−１０はＴＮＦ刺激について非常に活性があり、坑増殖刺激についてはゆるやかな活性があった。
実施例２５
画分５−６の試料を、特定の化合物が画分中に存在する可能性を調べるために、エレクトロインパクト質量分析計（ＥＩ  ＭＳ）およびエレクトロスプレイ質量分析計によって解析した。エレクトロスコピーＭＳは、パーキンエルマーのＳｃｉｅｘ  ＡＰＩ−ＩＩＩスペクトロマーにて、溶媒として５％酢酸水溶液を使用した。場合に応じて、溶解を補助するためにメタノールを添加した。直接挿入プローブを使用するＥＩ  ＭＳを、マトリックスとしてグリセロールを使用してＶＧ解析モデルＺＡＢ−ＳＥスペクトロメーターにて行い、およびＤＣＩプローブを使用してクラトスアナリチカルプロファイル質量分析計にて行なう。
スペクトルの結果を再検討したところ、以下の化合物が画分５−６中に存在する可能性が示された：ホスフォコリン、タウロコリン酸、コリン−ステアリン酸ダイグリセライド、ステアリン酸、ステアリン酸ダイグリセライド、パルミン酸−ステアリン酸二グリセリン酸、およびスフィンゴシン−オレイン酸結合物。
実施例２６
組成物１００ｍｌを４ｍｌの１Ｎ  ＨＣｌ溶液で酸性化して、組成物のｐＨが３になるようにした。それから組成物を、ＨＰＬＣ用のジクロロメタン１００ｍｌで３回溶出した。それから、ジクロロメタン画分を少量の無水硫酸ナトリウムと化合させて乾燥させた。それからジクロロメタン溶液を丸底フラスコ中に濾紙を通してろ過滅菌し、ロトバップで乾燥するまで蒸発させて、茶色膜状の物質を０．００４９ｇ回収した。
この膜状物質の０．００１７ｇをｐＨ７の２１４ｐｐｍのＮＨ3・Ｈ2Ｏ溶液に溶解し、実施例４で確立した坑増殖活性を測定した。この測定によって、溶液は坑増殖活性を持ち、その活性は１４ユニット／ｍｇであることがわかった。
実施例２７
実施例２３を以下のように大きなスケールにて繰り返した。１０ｍｌの濃水酸化アンモニウム溶液を組成物９００ｍｌに添加し、生じた溶液を湯浴の温度が４０度を越えないようにしながらロトバップで蒸発させて乾燥した。蒸発のあいだ、溶液がに塩基性を保つようにするために、濃水酸化アンモニウム溶液を５滴ほど、蒸発が終了して残物ができるまで、組成物中に３０分ごとに添加した。
それから、メタノールに溶かした１０％濃水酸化アンモニウム１５０ｍｌを全残物に添加した。溶液を１５分間超音波処理し、溶解しない物質をろ過によって除去した。ろ過した溶液は、３０ｃｍ×１２ｃｍの大きさのカラムにつめた１６９５ｇの６０Ａフラッシュシリカゲルを通してクロマト分離した。使用した溶媒は、メタノールに溶解した１０％濃水酸化アンモニウム溶液である。カラムは６ｐ．ｓ．ｉ．の圧力で通過させ、流速は３０ｍｌ／分であった。カラムを通した結果は、以下の表にまとめる。
0004708511.tif 000063
シリカゲルプレート上で１０％濃水酸化アンモニウム溶液にてＴＬＣを行い、ニンヒドリンスプレーで可視化した。ＴＬＣの結果が似ている画分を集めて、ロトバップで乾燥させて以下のように画分集合物とした。
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１５−１６から３１−３４画分集合物はすべて、ニンヒドリンと正の反応を示し、Ｒｆ値は０．８７であり、この値は実施例２３における活性画分のＲｆ値に非常に近い。画分２４−３０および３１−３４はニンヒドリンとさらに反応を示し、Ｒｆ値は０．８５であった。
実施例２８
画分４−５、１５−１６、および１７−１８について、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで坑増殖効果（実施例４に従う）およびＴＮＦ刺激（実施例９に従う）を試験した。結果は以下に示す：
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従って、画分４−５、１５−１６、および１７−１８は坑増殖活性は持つが、ＴＮＦ刺激活性は示さなかった。上記の画分について成分分析を行なったところ、これらはＮＨ4Ｃｌ濃度が高く、これによってＴＮＦの産生が妨げられていることが示された。
実施例２９
画分１５−１６および２４−３０の試料を透析して、それから実施例２５に記載した方法を用いて質量分析計によって分析した。透析していない画分１７−１８および２４−３０の試料についても、分析を行なった。スペクトルの結果を検討したところ、以下の成分が存在する可能性が示された：グリココリン酸、トリヘキソサミン三量体、およびタウロコリン酸（画分１５−１６）；ステアリン酸、およびヘキソサミン二量体；およびグリココリン酸（画分２４−３０）。
実施例３０
組成物は、以下のように別々の透析チューブを用いて透析した：
組成物１００ｍｌを、分子量１００を境に分離するスペクトラ／プロ（商標）ＣＥメンブレンのチューブのなかに入れた。チューブの端をクリップでシールし、チューブを純水１０ｌ中の撹拌漕の中に置いた。透析は、１日１回透析チューブから１ｍｌの溶液を採取して、１／１０規定の硝酸銀水溶液を３−４滴添加して検査した。塩化物の存在が示されれば、透析は完全ではない。透析が完全でない場合には、漕を新鮮な純水に置き換えた。透析は３−４日で終了した。透析が終了したら、透析した物質をロトバップで乾燥させ、元来の量１ｍｌに対して平均０．３ｍｇの固体が回収された。
それから固体物質の試料を、ＨＰＬＣ用の水に溶解し、シリカゲルプレート上でメタノールに溶解した１０％濃水酸化アンモニウム溶液にてＴＬＣを行い、ニンヒドリンスプレーで可視化した。ニンヒドリンが正の反応を示し、Ｒｆ値は０．８３になった。
実施例３１
実施例３０で得た固体物質の試料は、実施例２５に記載した方法を使用して、質量分析器にて分析した。スペクトルの結果を検討したところ、以下の化合物が存在する可能性が示された：スフィンゴシン−オレイン酸結合物、ジアセチルシアル酸、フコース−ヘキソサミン二量体、デオキシグリココリン酸、タウロコリン酸、シアル酸−フコース二量体、およびジ（フコース）ヘキソアミン三量体。
実施例３２
前述の結果から、組成物中の活性成分は（少なくともＴＮＦα放出測定に基づく場合）、Ｃ１８μボンダパックカラムを用いて逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を行なった後の結合しない画分（初めに流れる部分）に存在することが示された。同様に、Ｃ１８μボンダパックカラムにのせた組成物抽出物のほとんどは（７０％）、初めに流出してしまった。これらの結果は、組成物中の活性成分は非常に極性があるかまたはイオン化性の分子である可能性が示唆された。
上述の結果をさらに調べるために、イオン交換クロマトグラフィーによって活性のある化合物の精製を行なった。負に荷電した活性成分（通常の細胞には坑増殖効果はないが腫瘍細胞に対しては坑増殖効果を保持し、およびＴＮＦαの放出を誘導する活性があることから評価して）が存在するとすれば、陰イオン交換樹脂に結合するであろう。
実験手法
１０ｍｌの全腫瘍抽出物を陰イオン交換クロマトグラフィーカラム（バイオラッド  ＡＧ−１、水酸化物の形態、全樹脂のウエットボリュームは１０ｍｌ（カラムの大きさは１．５ｃｍ×６．０ｃｍ）、ミリポアで脱イオン化した水で平衡化した）上にのせた。使用した樹脂の量は、抽出物中に存在するすべての陰イオンが結合するのに十分であるように計算した。非結合画分を回収し、樹脂への結合が最大になるように再びカラムにのせた。この第二段階で結合しなかった画分を回収して保存した。カラムに残った結合していない物質は、脱イオン化した水（２×２０ｍｌ）で洗浄して除去した。結合した分子は、アンモニア重炭酸塩（ＮＨ4ＨＣＯ3）の濃度勾配によって溶出した（２０ｍｌ／ステップ）。
0004708511.tif 000066
実施例３３
実施例３２の全画分の試料について、それぞれ実施例４および９の手法に従って、坑増殖活性およびＴＮＦ刺激活性を測定した。
結果は以下に示す：
0004708511.tif 000067
活性測定により得た結果は、ＴＮＦ産生刺激は０．６Ｍ，１．０Ｍ，１．５Ｍ画分中に存在することを示している。坑増殖活性は、画分０．４Ｍ（弱い活性）および０．５Ｍ（主な活性画分）中に存在した。
実施例３４
活性画分の薄層クロマトグラフィー分析により、いくつかの化合物の混合物であることが明らかになった。実施例３２の１．０Ｍ画分の試料を、実施例２５に従って質量分析器で分析した。得られたスペクトルを検討したところ、以下の成分が存在する可能性が示唆された：シアル酸−グリセロール二量体、コレステロール硫酸塩、およびタウロコリン酸。
実施例３５
逆相（Ｃ１８）ＨＰＬＣ分析を、（１）フェノメネックスＷＰ６０００９−Ｃ１８カラム、２５０×４．６ｍｍを使用し、（２）試料を凍結乾燥し、それから水に溶解した０．１％トリフロロ酢酸（ＴＦＡ）で再構成し、および（３）再構成した試料１５０μｌをカラムにのせたことを除いては、実施例２の手法に従って、組成物試料について行なった。
再構成した試料をカラムにのせた時間からおよそ２．４０−３．４０分後に溶出した画分も含めて、溶出したさまざまな画分を回収した。
実施例３６
実施例３５のおよそ２．４０−３．４０分に溶出した画分の試料を、実施例９の手法に従ってＴＮＦ刺激活性について３回測定した。以下の結果が得られた。
測定＃        ＴＮＦ刺激−ＬＰＳ
１          ２５９ｐｇ／ｍｌ±１０７ｐｇ／ｍｌ
２          ３１１ｐｇ／ｍｌ±１４ｐｇ／ｍｌ
３          ５７２ｐｇ／ｍｌ±１７６ｐｇ／ｍｌ
実施例３７
実施例３５のおよそ２．４０−３．４０分に溶出した画分の試料を、以下のようにタンデムカラム逆相（Ｃ１８）ＨＰＬＣにかけた。実施例３５のカラムを、フェノメネクス・プライムスフェアＨＣ−Ｃ１８カラム、２５０×４．６ｍｍとタンデムにして使用した。試料を凍結乾燥し、水に溶解した０．１％ＴＦＡ（緩衝液Ａ）で再構成し、１５０μｌの再構成した試料をカラムにのせた。緩衝液Ａを２０分間流出させ、それからアセトニトリルに溶解した０．１％ＴＦＡ（緩衝液Ｂ）を０−８０％の直線勾配をかけて３５分間流出させた。流出の最後に、８０−０％の緩衝液Ｂを５分間流出した。流速は、０．９ｍｌ／分であった。注入してから以下に示すおよその時間において、６つの溶出画分を回収した：
画分＃    時間（分）
１      ５．６−６．２５
２      ６．２５−６．６
３      ６．６−７．１
４      ７．１−８．２
５      ８．８−９．６
６      １４．７−１６
実施例３８
実施例３７の画分１（”１”）の試料および画分２（”２”）の試料を、凍結乾燥し、２１４ｐｐｍのＮＨ3・Ｈ2Ｏで再構成した。それからこれらの再構成した試料について、実施例４の手法に従って坑増殖効果を測定した。以下の結果が得られた：
試料      坑増殖効果
１          １７．８ユニット／ｍｌ
２                ０
実施例４０
実施例３７の６つの画分それぞれの試料を、実施例２５に従って質量分析器によって解析した。６つの画分から得られたスペクトルを検討したところ、以下の成分が存在する可能性が示された：タウロコリン酸、シアル酸−グリセロール二量体、塩化ナトリウム、トリメチルアミン、メチルエチルアミン、およびプロピルアミン。
実施例４１
実施例４の方法に従った坑増殖効果を、以下の３つの試料について測定した：（１）水２ｍｌ中に溶解した１０−１１ｍｇタウロコリン酸；（２）２１４ｐｐｍＮＨ3・Ｈ2Ｏ；および（３）４．０ｍｌの２１４ｐｐｍＮＨ3・Ｈ2Ｏに溶解した０．７ｍｇのタウロコリン酸。試料（１）または試料（２）は、坑増殖効果は検出されなかった。しかし、試料（３）には、１４ユニット／ｍｇの坑増殖効果があった。
この結果は、タウロコリン酸のような胆汁酸は、アンモニウムイオンと結合して、化合物を個々に試験した際には活性を示さないような低い濃度において、坑増殖活性を発揮することを示している。従って、これら２つの化合物の組合せは、おそらく相互作用することによって坑増殖効果に影響する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
0004708511.tif 000090
【図２３】
0004708511.tif 000091
【図２４】
0004708511.tif 000092
【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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