(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
溶液ハイブリダイゼーションを適用することにより細胞または組織試料中に存在する２種以上の分析物ポリヌクレオチドの量を定量する方法において、以下の連続工程を含むことを特徴とする方法：
（ａ）前もって決定された数の、同定または記録を可能にするために個別のサイズを有する可溶性のプローブポリヌクレオチドを含む、１または複数のプローブのプールを提供する工程、ここで、前もって決定された可溶性プローブの数は各プール当たり２〜５００であり、プローブは測定すべき分析物ポリヌクレオチドに相補的な鎖を有しており、
各プールはその独自の容器に組織化された状態で配置されているものであり、それら容器は分離しているか結合している
（ｂ）標的生物の細胞または組織試料に存在する分析物ポリヌクレオチドに少なくとも１つのアフィニティータグを付加する工程、
（ｃ）工程（ａ）からの可溶性プローブと工程（ｂ）からの分析物ポリヌクレオチドとの間に、ハイブリッドが形成されるように、ハイブリダイゼーション反応を起こさせる工程、
（ｄ）分析物ポリヌクレオチドのアフィニティータグのアフィニティーペアを備えた分離補助手段上に該ハイブリッドを捕獲することにより、工程（ｃ）において形成したハイブリッドを回収する工程、
（ｅ）分離補助手段上に捕獲されたアフィニティータグ付加された試料ポリヌクレオチドおよびアフィニティータグ付加されたハイブリッドを洗浄する工程、
（ｆ）プローブを、ハイブリッドおよび分離補助手段から遊離させる工程、および、
（ｇ）遊離のプローブの量をサイズ分離により記録する工程。
【請求項２】
遊離のプローブのサイズおよび量を質量分析により記録することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
各プローブプールにおける可溶性ポリヌクレオチドプローブが、工程（ｇ）において分離の後の直接記録を可能にするタグを備えていることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
可溶性ポリヌクレオチドプローブが、遊離のポリヌクレオチドプローブの増幅を可能とする２つの末端プライマータグを備えていることを特徴とする請求項１〜３いずれかに記載の方法。
【請求項５】
遊離し、次いで増幅されたポリヌクレオチドプローブのサイズおよび量が質量分析により記録されることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
遊離したポリヌクレオチドプローブがＰＣＲ反応の最中またはその後にトレーサータグ付加され、該トレーサータグ付加が遊離したプローブのサイズおよび量の直接の記録を可能とすることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項７】
ポリヌクレオチドプローブが、ＤＮＡ断片、合成または修飾オリゴヌクレオチドであることを特徴とする、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
トレーサータグが、その蛍光、発光、赤外吸収、電磁気特性、放射能または酵素活性に基づいて、自動または半自動の手段または装置によって記録可能な標識であることを特徴とする、請求項３、４または６に記載の方法。
【請求項９】
蛍光によって記録可能なトレーサータグが、蛍光色素またはフルオロフォアであることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
細胞または組織試料中の分析物ポリヌクレオチドがｍＲＮＡを含むことを特徴とする、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
アフィニティータグとその対応物を含むアフィニティーペアが、ビオチンとアビジン、ビオチンとストレプトアビジン、ヒスチジンオリゴマーと金属キレート、ハプテンと抗体、受容体とリガンド、またはグリカンとレクチンであることを特徴とする、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
分離補助手段が、微小粒子、マイクロビーズ、ラテックス粒子、磁性粒子、針、釘、棒、マイクロウェルおよびアフィニティーカラムからなる固体支持体の群から選択されることを特徴とする、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
可溶性プールがマイクロタイタープレート上のウェルに入れられていることを特徴とする、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
分析物ポリヌクレオチドの量の変動の比較、定量評価が、少なくとも比較すべき各試料当たり１試験キットを含む複数の試験キットのセットを提供することにより行われ、個々の試験キットが、１以上のプローブプールを含み、各プールが個別のサイズのプローブである同一の可溶性ポリヌクレオチドプローブを含むことを特徴とする、請求項１から１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
セットにおける個々の試験キットが、互いに区別できるトレーサータグを備えていることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
各トレーサータグが異なる発光波長で放射する蛍光標識であることを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
溶液ハイブリダイゼーションを適用することにより細胞または組織試料に存在する２種以上の分析物ポリヌクレオチドの量を定量するための試験キットにおいて、試験キットが前もって決定された２〜５００の数の、同定および記録を可能にするために個別のサイズを有し、定量すべき分析物ポリヌクレオチドに相補的な鎖を有する可溶性または可溶化可能なポリヌクレオチドプローブを含む、１または複数のプローブプールを含み、各プールがその独自の容器に組織化されて配置されており、それら容器が分離または結合していることを特徴とする試験キット。
【請求項１８】
該試験キットが、前もって決定された２〜５００の数の、質量分析により同定および記録を可能にするために特定のサイズを有する可溶性または可溶化可能なプローブを含む、１または複数のプローブプールを含むことを特徴とする、請求項１７に記載の試験キット。
【請求項１９】
プローブが、遊離したプローブのサイズおよび量の直接の記録を可能とするトレーサータグを備えていることを特徴とする、請求項１７に記載の試験キット。
【請求項２０】
プローブが、ＰＣＲ−増幅を可能にするために少なくとも２つの末端プライマータグを備えていることを特徴とする、請求項１７〜１９いずれかに記載の試験キット。
【請求項２１】
試験キットが末端プライマータグを有するプローブに加えて、別々のセットのトレーサータグ付加されたプライマーを備えていることを特徴とする、請求項２０に記載の試験キット。
【請求項２２】
トレーサータグが、その蛍光、発光、赤外吸収、電磁気特性、放射能または酵素活性に基づいて、自動または半自動の手段または装置によって記録可能な標識を含むことを特徴とする、請求項１９〜２１のいずれかに記載の試験キット。
【請求項２３】
蛍光により記録可能なトレーサータグが蛍光色素またはフルオロフォアであることを特徴とする、請求項２２に記載の試験キット。
【請求項２４】
少なくとも１つのアフィニティータグおよび／または該アフィニティータグの１つの対応物を備えた分離補助手段を含むことを特徴とする、請求項１７〜２３のいずれかに記載の試験キット。
【請求項２５】
アフィニティータグとその対応物を含むアフィニティーペアが、ビオチンとアビジン、ビオチンとストレプトアビジン、ヒスチジンオリゴマーと金属キレート、ハプテンと抗体、またはグリカンとレクチンであることを特徴とする請求項２４に記載の試験キット。
【請求項２６】
分離補助手段が、微小粒子、マイクロビーズ、ラテックス粒子、磁性粒子、針、釘、棒、マイクロウェルおよびアフィニティーカラムからなる固体支持体の群から選択されることを特徴とする請求項２４に記載の試験キット。
【請求項２７】
ポリヌクレオチドプローブが、ＤＮＡ断片、合成または修飾オリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項１７〜２６のいずれかに記載の試験キット。
【請求項２８】
プローブプールがマイクロタイタープレート上のウェルに入れられていることを特徴とする、請求項１７〜２７のいずれかに記載の試験キット。
【請求項２９】
少なくとも分析物ポリヌクレオチドの量の変動を比較および定量評価するべき各試料について１つである、複数の試験キットのセットを含み、該試験キットが１または複数のプローブプールを含み、そのそれぞれのプールが個別のサイズを有する同一のプローブを含み、各プローブプールは互いに区別可能なトレーサータグを備えていることを特徴とする、請求項１７〜２８のいずれかに記載の試験キット。
【請求項３０】
トレーサータグが異なる発光波長で放射するフルオロフォアであることを特徴とする、請求項２９に記載の試験キット。
【請求項３１】
内在制御機構による、または外部刺激に対する応答としての、細胞または組織試料における分析物ポリヌクレオチド量の変動を評価するための、請求項１７〜３０のいずれかに記載の試験キットの使用。
【請求項３２】
治療様式、疫学的状態、衛生学的状態または微生物集団の効果を評価するための請求項１７〜３０のいずれかに記載の試験キットの使用。
【請求項３３】
内在制御機構による、または外部刺激に対する応答としての、細胞または組織試料における分析物ポリヌクレオチドの量の変動を評価するための、請求項１から１６のいずれかに記載の方法の使用。
【請求項３４】
治療様式、疫学的状態、衛生学的状態または微生物集団の効果を評価するための、請求項１から１６のいずれかに記載の方法の使用。
【請求項３５】
以下の工程を含む、溶液ハイブリダイゼーションを適用することにより細胞または組織試料中に存在する数種のポリヌクレオチドの量を定量する方法であって、同じ試料中に存在する数種のポリヌクレオチドの同時定量のためのものであることを特徴とする方法：
（ａ）同定または記録を可能にするために個別のサイズを有する可溶性のプローブポリヌクレオチドを各プール当たり２〜５００個含む、１または複数のプローブプールを提供する工程、ここで、可溶性プローブポリヌクレオチドは、定量工程（ｆ）の後の直接記録を可能にするためのトレーサータグであるか、または定量工程（ｆ）の後の増幅を可能にするための２つの末端プライマータグであって、増幅中または増幅後にトレーサーをタグ付加される末端プライマータグである、１または複数のタグを備えており、
各プールはその独自の容器に組織化された状態で配置されており、それら容器は分離しているか結合しているものである、
（ｂ）標的生物の細胞または組織試料に存在する分析物ポリヌクレオチドに少なくとも１つのアフィニティータグを付加する工程、
（ｃ）工程（ａ）からの可溶性プローブと工程（ｂ）からの分析物ポリヌクレオチドとの間に、２以上の可溶性ハイブリッドが形成されるように、ハイブリダイゼーション反応を起こさせる工程、
（ｄ）分析物のアフィニティータグのアフィニティーペアを備えた分離補助手段上に該ハイブリッドを捕獲することにより、工程（ｃ）において形成したハイブリッドを回収する工程、
（ｅ）分離補助手段上に捕獲されたアフィニティータグ付加された試料ポリヌクレオチドおよびアフィニティータグ付加されたハイブリッドを洗浄する工程、
（ｆ）タグ付加されたプローブを、ハイブリッドおよび分離補助手段から遊離させる工程、および、
（ｇ）遊離の未増幅または増幅後のトレーサータグ付加されたプローブの量をサイズ分離により記録する工程。
【請求項３６】
溶液ハイブリダイゼーションを適用することにより細胞または組織試料に存在する２種以上の分析物ポリヌクレオチドの量を定量するための試験キットにおいて、複数の異なるポリヌクレオチド分析物の同時定量のために、試験キットが各プール当たり２〜５００の、同定および記録を可能にするためのタグを備え、かつ、個別のサイズを有する可溶性のポリヌクレオチドプローブを含む、１または複数のプローブのプールを含み、各プールがその独自の容器に組織化されて配置されており、それら容器が分離または結合していることを特徴とする試験キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、個別のサイズを有する可溶性ポリヌクレオチドプローブの組織化されたプールを用いて、細胞または組織試料におけるポリヌクレオチドの量またはその量の変化を定量する方法に関する。該定量方法は、例えば、転写プロフィールや発現パターンなどの変動の比較評価を可能とする。本発明はさらに、本発明の方法を行うための手段および試薬を含む試験キットにも関する。該方法および試験キットの様々な診断および生物工学的目的での使用も開示される。
【背景技術】
【０００２】
入手可能な遺伝情報の迅速な増加、およびその分子生物学、保健医療、治療様式、医薬品研究、疫学的研究などに対する影響に対する応答として、今日、遺伝的キー要素の細胞に対する効果およびその生物学的役割および機能に、科学的興味の焦点が向けられている。遺伝学における基本的なキー要素に関する新規な情報の蓄積が減速しているため、その効果および／または生物学的役割の研究に対する期待が増しつつある。
【０００３】
生命プロセスに関し、ゲノム科学、プロテオミクス、トランスクリプトミクスなどにおいて蓄積している情報を数学的に正確な方法で扱う、バイオインフォマティクスは、蓄積した知識の効果と重要性の迅速かつ定量的な評価を可能とする、新規な正確な手段に対する要求を生み出した。コンビナトリアル・ケミストリーは、膨大な量の新規な化合物および既存の化合物の迅速な合成を可能とする。該新規または既存の化合物、またはヒトおよび実験動物を含む生物体の遺伝子発現に対するその他の外部刺激の、効果および潜在的重要性を迅速に評価することが望まれる。換言すると、ゲノム科学、プロテオミクス、トランスクリプトミクスなど、およびコンビナトリアル・ケミストリーにおいて蓄積している情報をバイオインフォマティクスと組み合わせることにより、化合物の効果および生物学的役割を迅速、正確に、そして好ましくは定量的に評価することを可能にするような新規な手段に対する要求が生じた。実際、転写プロフィール化を可能にする技術の周辺にかなりの市場が成長してきた。転写プロフィールは生命科学の多くの分野の基礎研究における科学者にだけでなく、工業的研究および開発においても利用される。ヒトおよび実験動物の遺伝子発現に対する、既知および新規薬剤の効果は、今日医薬および診断産業における必須の知識であるのみならず、バイオテクノロジー産業の別の分野に対しても恩恵を与えるものである。
【０００４】
転写プロフィール化における強力な手段はオリゴマー−チップ技術であり、これは例えば、米国特許第６０４０１３８号、米国特許第５５５６７５２号、米国特許第５７７０７２２号、米国特許第５８０７５２２号、または特許出願ＷＯ２００００３０３７号に開示されている。米国特許第６０４０１３８号には、標的核酸を固定化オリゴヌクレオチドプローブのアレイにハイブリダイズさせることによる、複数の遺伝子発現の同時モニタリングが開示されている。米国特許第５５５６７５２号および米国特許第５７７０７２２号には、固体支持体上の核酸ライブラリーアレイおよびハイブリダイゼーションおよびヌクレアーゼまたはリガーゼ反応の適用による、核酸配列決定および分析方法が記載されている。特許出願ＷＯ２００００３０３７号には、遺伝子機能を決定するためのアレイ上の標的ポリヌクレオチドのスクリーニングが開示されている。米国特許第５８０７５２２号には、分析物特異的試薬を含む一定の分析物アッセイ領域の、マイクロアレイが開示されており、これは、ラージスケールハイブリダイゼーション技術を適用する多くの遺伝子適用にとって有用である。
【０００５】
上記のマイクロアレイ技術に共通の特徴は、プローブ、即ち試薬として用いられるポリヌクレオチド配列が固体担体に固定化または結合されていることである。プローブの固定化は立体障害となり、化学量論的にハイブリダイゼーションが起こるのを妨げ、その結果効率が低くなる。したがって、上記方法は、半定量的でしかなく、二重の標識および比較チェックが要求される。
【０００６】
例えばプローブスポットのにじみによって生じる不充分な識別可能性により、十分に正確にスポットを比較するのがしばしば不可能となる。これはマイクロアレイ技術を適用するための障害とはいえないが、定量的結果が求められる場合にはいまだ問題点が残り、このため実際の試験において多大な重複試験を余儀なくされる。特許出願ＷＯ９８／５１７８９号には、逆転写および増幅によるｍＲＮＡからの細別されたｃＤＮＡライブイラリーの調製について記載されている。該ライブラリーは、新規遺伝子、相互作用タンパク質、潜在的薬物のスクリーニングおよび／または診断に使用される。このシステムはＰＣＲ−技術および異なるプライマーのセットに依存する。該システムにより少量しか存在しない発現の減少した配列の検出が可能となるが、定量の問題が残る。したがって、遺伝的キー要素の生物学的役割を研究するための強力な手段は存在するが、定量的結果を得るという問題がいまだに残っている。さらに従来の技術は、特徴づけされていないゲノムの効果をモニタリングするには十分なものではない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、本発明の主な目的は発現パターンまたは転写プロフィールを、その変動の比較評価を可能にしつつ定量するだけでなく、非常に高感度の試験を提供する方法および試験キットを提供することであり、これによって、これを用いなければ検出限界を下回るような、非常に少量の分析物ポリヌクレオチドの定量が可能となる。本目的は、真の定量的な方法および試験キットを提供することであり、それは答えとして試料中のポリヌクレオチドコピーの量を、例えば評価される試料中に存在するｍＲＮＡのコピー数として与えることが出来、さらに改変することによりその感度をかなり上昇させることが出来る。
【０００８】
本発明の方法および試験キットの利点は、特徴づけされたものだけでなく、特徴づけされていないゲノムについても転写プロフィールまたは発現パターンを評価することが可能であるということである。
【０００９】
本発明のさらなる利点は分析物、即ち分析されるべきポリヌクレオチド調製物の質が重要でないという点である。一般にその不安定性のために特別の処理が必要であることが知られているＲＮＡを、直接定量評価に用いることができる。
【００１０】
試験キットの製造には固定化工程を含める必要がなく、一定の市販の試薬によって、所与の生物における特定の遺伝子サブセットに注目するテーラーメード試験を簡単に行うことが出来る。
【００１１】
本方法は非常に適用しやすいものである。それは完全自動的または半自動的構成において使用できる。工程をいくつかの段階で中止することが出来る。試料および反応産物は十分なデータが集まるまで保存できるし、例えば結果を記録するなど、工程をより簡単に継続することも出来る。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
（発明の概要）
要約すると、本発明はヌクレオチド含有試料中のポリヌクレオチドの量の変化および変動の定量を可能にするものであり、ここで試料は異なる部位または異なる標的生物から異なる時点に採取される。これは生命プロセスおよび同じ細胞または組織に与えられた物理的または化学的刺激の影響を研究する場合に特に有用である。本発明により、いくつかの生物現象の同時比較評価が可能となる。
【００１３】
本発明の方法および試験キットは定量的であるというだけでなく、非常に高感度にすることが可能であり、発現減少したポリヌクレオチド配列の定量的検出が可能である。本発明の方法および試験キットの特徴は、特許請求の範囲において規定される。
【００１４】
（発明の詳細な記載）
本発明において用いる用語は、組換えＤＮＡ技術および核酸ハイブリダイゼーション技術の分野における通常の意味を有する。しかし、本発明においていくつかの用語はより広い意味、あるいはいくらか異なる意味において用いられる。したがって、いくつかの用語を以下により詳細に定義する。
【００１５】
（定義）
「プール」という語は、可溶性または可溶化されたポリヌクレオチドプローブのサブセットまたはライブラリーを意味する。各プールは、任意に決定された数のポリヌクレオチドプローブを含む。任意な数として便宜な数は、例えばおよそ１０のプローブである。しかし本方法は２または３といった少数のプローブでも使用できるが、プローブの便宜な数は各プールにおいて５またはそれ以上のプローブである。数百もの可溶性プローブを含むプールを備えた試験キットを調製でき、本発明の定量または比較方法に使用できる。数千ものプローブを含むプールを調製することも出来るが、十分に満足できる分解能を得るために好ましい上限は、およそ３００−５００種のプローブであるようである。
【００１６】
上記のように、「可溶性または可溶化されたプローブ」は、特定のサイズを有することにより特徴づけられ、これによって質量分析を含む任意の自動または半自動手段または装置により結果を記録する場合に正確な同定が可能となる。可溶性プローブのサイズはおよそ１６ｂｐから数千ヌクレオチドの間の範囲でよい。
【００１７】
プール用の「可溶性プローブ」は、特徴づけされた、部分的に特徴づけされた、または完全に特徴付けされていないポリヌクレオチド配列のライブラリー、例えば、転写プロフィールを決定しようとする標的生物のゲノムからのＤＮＡ−断片から調製すればよい。よく特徴付けされたゲノムの場合、プローブは好ましくは、例えばキャピラリーまたはゲル電気泳動あるいは質量分析を用いてそのサイズまたは質量によってそれらを同定することが出来るように、すべてのプローブ分子が個別の特有のサイズを有するようにプール中に準備するのがよい。あまり特徴付けされていないゲノムのプールでも同様に個別のサイズを有する多数の核酸断片を含むように設計すればよい。しかし、ヌクレオチド断片が特徴づけされていないために、様々な制限酵素での切断により得られるヌクレオチド断片のいくつかが偶然同一のサイズを有してしまうことがある。これはそのプローブはサイズによっては部分的にしか同定できないことを意味する。試験を繰り返すことにより重複はすぐに検出され、１００％の精度で同定できないようなプローブは除去されるか他のより便利なプローブに置換される。完全に特徴づけされていないゲノムであっても、短時間で多くの情報が蓄積され、少なくとも可溶性の組織化されたプールの調製に用いられたゲノム部分は、すぐによく特徴づけされ得る。
【００１８】
「可溶性または可溶化されたポリヌクレオチドプローブ」を含む「可溶性の組織化されたプール」はどのような容器に含まれていてもよく、容器は完全に分離したものでも、非−固定様式または強固な固定様式で、結合したものでもよい。もっとも簡便な形態において組織化されたプールは、例えば試験管やビンなど１または複数の容器を含み、容器は例えば試験管立てなどにおいて非−固定様式で結合したものでよい。強固な固定様式で結合した容器に入れられた組織化されたプールの１つの実践的な例は、マイクロタイタープレートの中または上の区画またはウェルによって提供されるものである。上記のように、可溶性のプールは好ましくは例えばマイクロタイタープレート上のウェルにおけるように、組織化されて配置される。可溶性のプールは各プールおよび該プール中の各ポリヌクレオチドプローブが明らかに区別できるように組織化される。ウェルを有するマイクロタイタープレートが、組織化および多くの組織化されたプールの同時取り扱いを可能にする、典型的な市販の態様である。当然、その他のより簡便な、複数の区画を有するテーラーメードの組織化されたプールを開発、構築することが出来、使用のために適当な標識および説明書を備えていてもよい。
【００１９】
「プローブ」または「プローブのプール」は、可溶性ポリヌクレオチド配列、即ちＤＮＡ断片のセットを意味し、これは好ましくは標的生物のゲノムＤＮＡ配列から得られ、その配列は特徴づけされていても、部分的に特徴づけされていてもよく、あるいは特徴づけされていなくてもよい。プローブは例えば、特徴づけされた、または部分的に特徴づけされた、あるいは特徴づけされていないｍＲＮＡからコピーされたｃＤＮＡとすればよい。該プローブは、制限酵素による切断により、あるいは適当なプライマーを用いたＰＣＲ反応による増幅により、簡単にその個別のサイズを有するものとなる。プローブはまた、モデルとして天然のＤＮＡを用いて調製した合成オリゴマーであってもよい。
【００２０】
上記と違って、区別可能なサイズのランダムな配列を有するＤＮＡプローブも、特異的発現パターンの研究用に調製、使用することができる。当然、オリゴヌクレオチドプローブのセットを合成により調製するとすれば、修飾ポリヌクレオチドプローブを調製してもよく、この場合ヌクレオチド配列の糖リン酸骨格をペプチド結合によって置換することもでき、いわゆるロックされた(locked)ヌクレオシドアナログからなるものとしてもよい。修飾ポリヌクレオチドには例えば、ＷＯ９６／２０２１２号に記載されているペプチド核酸（ＰＮＡ）、またはＷＯ９９／１４２２６号に記載されているロックされた核酸(locked nucleic acid)（ＬＮＡ）が挙げられる。該修飾ポリヌクレオチドプローブを本発明の方法および試験キットに適用することができる。それらはゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡをモデルとして用いてコピーして得られる。安定性の向上など、それらがよりよい特性を有することがよくあり、天然のＤＮＡプローブよりも簡単にトレーサータグを備えることが出来る利点もある。
【００２１】
可溶性プール中のプローブは特定のサイズ、すなわち区別可能な分子量を有することが本発明において必須である。プローブは任意に「タグ」を備え、これは標識またはマーカーを意味し、プローブの検出または記録あるいはプローブの増幅を可能とする。本発明の基本的な態様において、タグはトレーサー、即ちフルオロフォアなどの検出可能または記録可能なマーカーまたは標識である。トレーサータグは、プローブと分析物との間のハイブリダイゼーション反応をトレーサーが破壊するのを防ぐため、好ましくは例えば、末端タグ付加されるなど、プローブの一方の末端に配置される。
【００２２】
定量評価を可能にするだけでなく、さらに感度のよい試験を提供する、本発明のより進歩した態様において、「タグ」は「末端プライマー配列のペア」および任意にトレーサーを含む。プライマータグはプローブの３’末端および５’末端に配置され、アフィニティータグ付加された分析物とハイブリダイズしたプローブの定量的回収の後のプローブの増幅を可能にする。この態様においてプローブに、増幅中または増幅後に任意のトレーサータグを付加してもよい。記録用に質量分析を用いる場合はトレーサーは不要である。
【００２３】
「トレーサータグ」という語は、可視の、あるいは検出可能な標識またはマーカーを意味する。すなわちそれ自体で記録可能であるか、その他の試薬と接触して検出可能または記録可能となるものである。質量分析特性を含む電気化学的または磁気的特性、蛍光、発光、赤外吸収、放射能、または酵素反応によって記録可能なトレーサータグが特に好適であるが、自動的手段または装置によって簡単に記録可能なあらゆるトレーサータグを使用できる。記録用に質量分析を用いる場合はトレーサータグは不要であることに注意すべきである。というのは、その場合プローブはその特定のサイズによって区別可能であるからである。
【００２４】
好適なトレーサータグは、蛍光色素またはフルオロフォアであり、特に異なる発光波長を有するものがよい。該蛍光標識としては例えば、５−（２−（（ヨードアセチル）アミノ）エチル）アミノナフチレン−１−スルホン酸）（１，５−ＩＥＤＡＮＳ）などのチオール反応性蛍光色素、フルオレセイン、ボディピィ(Bodipy)、ＦＴＣ、テキサスレッド(Texas Red)、フィコエリトリン、ローダミン類、カルボキシテトラメチルローダミン、ＤＡＰＩ、インドピラス(indopyras)色素、カスケードブルー(Cascade Blue)、オレゴングリーン(Oregon Green)、エオシン類、エリスロシン(erythrosin)、ピリジルオキサゾール類、ベンズオキサジアゾール類、アミノナフタレン類、ピレン類、マレイミド類、クマリン類、ＭＢＤ、ルシファーイエロー(Lusifer Yellow)、ヨウ化プロピジウム、ポルヒリン類(porhyrins)、ＣＹ３、ＣＹ５、ＣＹ９、ランタニド類、クリプタート類、ランタニドキレート類、または該トレーサー分子の誘導体またはアナログが挙げられる。蛍光ポリヌクレオチドプローブは、特に連続流動システムおよび装置と組み合わされた自動または半自動の結果の記録において有用である。
【００２５】
「分析物」という語は、調査対象または研究対象の細胞または組織試料において一定時間存在するポリヌクレオチド配列、特にメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を意味する。分析物ポリヌクレオチド配列を含む試料調製物を修飾して好適なアフィニティータグを含むようにする。
【００２６】
「アフィニティータグ」という語は、分析物ポリヌクレオチドに備えられる標識またはマーカーであって、その他の物質に対して高いアフィニティーを有するものを意味する。換言すると、アフィニティータグはその対応物またはアフィニティーペアと強い結合を形成する傾向がある。アフィニティーペアの間に形成される強い結合によって、アフィニティーペアが所望の物質の捕獲のための手段として作用することが可能となる。有用なアフィニティーペアは、例えばビオチン−アビジンまたはビオチン−ストレプトアビジンであるが、その他の合成または非合成「アフィニティーペア」または結合物質も用いることができる。好適な「アフィニティーペア」は、受容体とリガンド、抗原と抗体、およびその断片の間に見出すことが出来る。本発明の好適な「アフィニティータグ」には、ビオチン、ヒスチジン、オリゴマー類、ハプテン類、グリカン類などの小分子が含まれ、「アフィニティータグ」の好適な対応物には、アビジン、ストレプトアビジン、金属キレート類、抗体、レクチン類などのより大きい分子が含まれる。
【００２７】
好ましくは分析物ポリヌクレオチドは化学反応によってアフィニティータグ付加され、ここで例えばビオチン残基が研究対象のポリヌクレオチドまたは核酸分子に共有結合し、その結果、修飾ポリヌクレオチド分析物、即ちビオチン化ポリヌクレオチド分析物となる。立体障害によって、トレーサータグ付加されたプローブとポリヌクレオチド分析物との間のハイブリダイゼーション反応が妨げられないように、ポリヌクレオチド分析物にはアフィニティーペアの小さいほうの対応物をタグ付加し、大きいほうの対応物は固体支持体即ち分離補助手段に付着させる。転写プロフィール化に関する研究においては、アフィニティータグ付加された分析物ポリヌクレオチド配列は典型的にはｍＲＮＡ調製物である。アフィニティータグとその対応物またはペアは、いわゆるアフィニティーペアを提供し、これによってアフィニティータグ付加された物質の固体支持体（この場合これは分離補助手段と呼ばれる）による捕獲が可能となる。
【００２８】
「分離補助手段」という語は、好ましくはマイクロビーズ、ラテックス粒子、磁性粒子、針、釘、棒、マイクロウェル、アフィニティーカラムなどの固体支持体を意味し、これは「アフィニティータグ」の対応物またはアフィニティーペアを備えるかあるいはそれらによって被覆される。任意に分離補助手段は例えば、相分離または電気泳動手段などを含んでいてもよく、これはアフィニティータグの対応物の存在に依存する。
【００２９】
「標的生物」という語は、その転写プロフィールまたは発現パターンを決定すべき、あらゆる単細胞または多細胞生物であって、特徴づけされているか、部分的に特徴づけされているか、あるいは特徴づけされていないゲノムを有するものを意味する。単細胞生物には例えばEscherichia coliなどの細菌、例えばSaccharomyces cerevisiaeなどの酵母または糸状菌類などの微生物が含まれる。標的生物は当然、あらゆる植物またはヒトを含む動物からの細胞または組織試料であってよい。E.coli、 S.cerevisiaeおよびヒトのゲノムは、現在ほぼ完全に特徴づけされているゲノムの例である。
【００３０】
（発明の概説）
本発明は細胞または組織試料に存在する様々なポリヌクレオチドの量および内在要因または外部刺激による量の変動を定量する方法に関する。本発明の方法の基本的態様において溶液中でハイブリダイゼーション反応が起こり、形成されたハイブリッドが、アフィニティータグの対応物またはアフィニティーペアを備えているかそれらによって被覆された固体支持体上に捕獲される。該被覆は例えば結合(conjugation)などの化学的手段によって達成される。固体分離補助手段の表面とアフィニティータグの対応物との間のアフィニティーは安定な結合を形成するのに十分である場合がある。既に特徴づけされているか、部分的に特徴づけされているか、または特徴づけされていないプール(ライブラリー）からのトレーサータグ付加された、好ましくは末端にタグ付加されたポリヌクレオチドプローブを、分析すべき試料、即ち分析物から得たアフィニティータグ付加されたポリヌクレオチド配列と接触させる。
【００３１】
１または複数の可溶性プールには、予め決定された、しかし任意の数、好ましくは１０−５００の範囲、さらに好ましくは５０−４００の間、最も好ましくは１００−３００の間の可溶性ポリヌクレオチド配列が備えられ、これらは例えば質量分析による正確な同定を可能にするために個別のサイズを有するものである。可溶性プローブはトレーサータグがなくても同定できるが、タグを備えていてもよく、タグは本発明の基本的態様においては検出可能または記録可能なトレーサーであり、より高感度の評価が可能となる進展した態様においては末端プライマータグのペアであり、これによって増幅反応が可能となり、この間にプローブに、例えばトレーサータグ付加されたプライマーまたは標識ヌクレオチドを用いてトレーサータグが備えることができる。可溶性プールは組織化されて容器に配置され、その容器は分離したものでも、ゆるく結合したものでも取り外し可能なものでもよい。組織化されたプールはより密な構造の中または上に配置されてもよく、ここで容器はマイクロタイタープレート上のウェルのように互いに強固に結合したものでもよい。
【００３２】
本発明の方法において可溶性ポリヌクレオチド配列のプールは、特徴づけされているか、部分的に特徴づけされているかまたは特徴づけされていないゲノムから得られる。一般に、特徴づけされたゲノムにおける各遺伝子に対応する１つのプローブが、その発現の定量に十分である。プールは一般にゲノムインサートの制限酵素断片化によって調製される。インサートは増殖に便利であるためプラスミド内に挿入される。プローブは制限酵素で選択したポリヌクレオチド配列を断片化することによって構築される。したがってプローブの調製の１つの便宜な方法は、プラスミドにポリヌクレオチド配列を挿入し、該プラスミドを増殖させ、そしてインサートを含む該プラスミドを切断する方法である。また、プローブはＰＣＲ反応または増幅を用いてゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーから調製することも出来る。本発明の目的は複数の遺伝子の発現を同時に評価することであるため、各プールは通常複数、好ましくは少なくとも１０、最も好ましくは約１００またはそれ以上のプローブを含むものである。
【００３３】
分析物ポリヌクレオチドが例えば特徴づけされていないゲノムからの発現産物である場合、特徴づけされていないゲノムにおいて定量するべき各遺伝子につき少なくとも１のプローブを用いなければならない。これは、部分的に特徴づけされているか、または特徴づけされていないゲノムからの組織化されたプールは、複数のプラスミド、好ましくは少なくとも２つのプラスミドから調製しなければならないことを意味する。プラスミドのゲノムインサートは好ましくは異なるものがよいが、同じインサートから調製してもよく、この場合、部分的にオーバーラップする配列を含んでいてもよい。同じ配列を含むプラスミドからプローブを作成する場合は、本発明において要求される特定のサイズのプローブを得るために、異なる制限酵素を用いればよい。
【００３４】
研究対象が特徴づけされていないゲノムであって市販の試験キットが入手できない場合は、面倒な調製工程の繰り返しを避け、分析工程に集中できるように、同時に多数のセットの同一の組織化されたプールを調製することが推奨される。これは部分的に特徴づけされているか、または特徴づけされていないゲノムの研究用の市販の試験キットを提供する場合の基本でもある。
【００３５】
本発明の基本的態様において、トレーサーまたはプライマータグ付加されたＤＮＡプローブを、分析すべきＲＮＡ調製物とハイブリダイズさせる。測定すべき細胞または組織試料に存在する分析物ポリヌクレオチド配列またはＲＮＡ分析物を、本質的に公知の方法によって単離する。一般に、細胞または組織試料からの測定すべき分析物ポリヌクレオチドは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である。該分析物に、ビオチン、ヒスチジンオリゴマー、ハプテンまたはグリカンなどの少なくとも１つのアフィニティータグを付加する。分析物ポリヌクレオチド、例えばＲＮＡは好ましくはビオチンで標識する。
【００３６】
このような試薬調製工程の後、プローブと分析物との間のハイブリダイゼーション反応を起こさせる。それにより分子的に正確に定量的に、可溶性プローブとアフィニティータグ付加された分析物との間にハイブリッドが形成される。プール中に存在する異なるプローブの量は既知であり、分析物に比べて各プローブは過剰に存在するので、分析物とプローブとの間のハイブリダイゼーション反応の結果生じるハイブリッドは化学量論に従い、回収されるプローブの量は正確に試料中に存在する分析物ポリヌクレオチドの量に対応することが明らかである。当然、分析物配列は発現したｍＲＮＡ配列である必要はない。本方法によってあらゆる一本鎖配列および二本鎖配列を定量することが出来る。後者の場合、二本鎖分析物を一本鎖に変える変性工程の後に定量できる。
【００３７】
前述のように、溶液中でのハイブリダイゼーションによってＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドが形成される。その後、ハイブリッドは、好ましくはビオチンであるアフィニティータグを有するＲＮＡ分子の補助により、そのアフィニティーペア、例えばアビジンまたはストレプトアビジンへのアフィニティーによって回収される。分離補助手段上に回収されるべきプローブまたはＤＮＡのみがハイブリッド中に存在しているはずである。回収されたハイブリッドを洗浄して過剰のプローブから遊離させる。過剰のプローブにはアフィニティータグ付加された分析物配列にハイブリダイズできなかったプローブが含まれる。そのような場合は、遺伝子がないかまたは発現していないため試料中に分析物配列が存在しなかったといえる。ＲＮＡから分離または遊離した回収されたプローブに、任意にタグを付加してもよい。過剰のアフィニティータグおよび対応するプローブがプール中に存在しなかったためにハイブリダイズすることが出来なかったアフィニティータグ付加された分析物配列は、当然に固体分離補助手段に捕獲されるが、溶出およびその後の分離工程においてハイブリッドから分離させることが出来る。
【００３８】
一般に溶液ハイブリダイゼーションは、ＤＮＡ：ＤＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＰＮＡ：ＤＮＡ、ＰＮＡ：ＲＮＡを含むハイブリッドを形成させるハイブリダイゼーションを引き起こすような条件下で起こる。最も好適な条件は試薬プローブ、分析物などによって変動する。その後、アフィニティータグを有するハイブリッドを、アフィニティータグの対応物またはアフィニティーペアを用いて分離補助手段上にそれらを回収または捕獲することによって単離する。ハイブリッドは収集または回収される。即ちそれはハイブリダイゼーション溶液から除去または分離され、その他の試薬を含まないように洗浄される。アフィニティータグ付加された分析物とハイブリッドを形成しなかったプローブ分子はハイブリダイゼーション溶液または洗浄溶液中に残り、したがってそれは除去される。その結果、細胞または組織試料中に存在する分析物ポリヌクレオチドにハイブリダイズすることの出来たプローブのみ、即ち、試料中に存在する分析物と相補鎖を有するプローブのみが、分離補助手段によって捕獲され、回収および収集される。当然に、プローブの中に相補鎖がなかったアフィニティータグ付加された分析物も分離補助手段に捕獲されるが、これはハイブリダイゼーション工程の化学量論を妨害するものではなく、その後の分析工程を妨害するものでもない。これは例えば、プローブがハイブリッドから単離または遊離する際に破壊または除去すればよい。これは、その特定のサイズによって同定される、自動的または半自動的に検出可能または記録可能な任意のトレーサータグ付加されたプローブは、捕獲または回収されてその後記録のために放出または単離されることを意味する。
【００３９】
試料からのアフィニティータグ付加されたＲＮＡ分析物鎖を含む複合体またはハイブリッドに存在していたＤＮＡプローブのみが分離補助手段表面に回収され、その後記録のために単離される。トレーサータグ付加されたプローブとアフィニティータグ付加された分析物との間に形成されたハイブリッドを回収するために本発明の方法において任意の分離補助手段が必要である。微小粒子、マイクロビーズ、ラテックス粒子、磁性粒子、針、釘、棒、マイクロウェルおよびアフィニティーカラムなどの固体支持体である分離補助手段は、アフィニティータグの対応物またはアフィニティーペアを備えるかそれらによって被覆される。分離補助手段はアフィニティータグの対応物を捕獲するために相分離手段または電気泳動手段を含んでいてもよい。
【００４０】
分離補助手段上に回収されたハイブリッドは次にまず溶出によって該手段から遊離し、その後ハイブリッドの水素結合を破壊し、ハイブリッドから遊離した任意にタグ付加されたプローブを単離し、そのサイズによって分離して定量を可能とする手段によって記録する。単離された各プローブは発現したｍＲＮＡを表すため、発現は分子ベースで定量できる。また、ハイブリッドの結合をまず破壊してその後に固体支持体とプローブを含む溶液を、用いた分離補助手段に依存する適切な方法によって互いに分離してもよい。その後、例えば遠心分離によってプローブをサイズに基づいて分離し、定量を可能にする手段によって記録すればよい。分離補助手段上に精製および単離されたプローブはＮＡＯＨ、ＮＨ４ＯＨまたはホルムアミドなどのポリヌクレオチド鎖間の結合を破壊することが出来る溶液で溶出するとよい。
【００４１】
トレーサータグを有しない場合、プローブを質量分析によって直接記録することが出来る。タグが例えば蛍光物質などのトレーサーである場合もＤＮＡプローブをＲＮＡから分離した際に直接記録することが出来、これはいかなるトレーサータグも有さない。任意にトレーサータグ付加された試薬プローブはその時点では単離された遊離形態で存在し、その量は、それが以前にハイブリダイズしていた分析物核酸の量に正確に対応する。
【００４２】
タグが任意にトレーサータグを有する末端プライマーペアである場合、プローブをＲＮＡからの分離後増幅して、増幅の間または後にトレーサータグを付加してもよい。例えば、任意の増幅サイクル数の後にＤＮＡプローブにトレーサーをタグ付加して記録すればよい。また、トレーサータグを備えた相補的プライマーを付加することによりプローブに増幅中にトレーサータグを付加してもよい。増幅によって他の方法を用いた場合には検出限界以下であるような少量の発現を記録することが可能となる。本発明のこの進展した態様においては、分析物ポリヌクレオチドのより高感度の評価が可能であり、ここでプローブ上のタグは末端プライマー配列である。本発明の基本的態様と同様にして、末端プライマータグ付加されたプローブをアフィニティータグ付加された分析物ポリヌクレオチドにハイブリダイズさせればよい。化学量論的なハイブリダイゼーション反応の後、ハイブリッドは分離補助手段上に捕獲され、プライマータグ付加されたプローブは公知の方法によって回収できる。試料中に存在する分析物ポリヌクレオチドの量に正確に対応する、回収されたプライマーの量は、公知のＰＣＲ技術によって任意の回数増幅させればよい。増幅の後または増幅中にプローブにトレーサーを付加し、プローブの量とサイズを記録すればよい。プライマータグ付加されたプローブの回収は定量的であって分析物分子の数に正確に対応し、プローブが何回増幅されたか、即ち増幅または複製されたかは知ることが出来るので、元の試料中にあった分析物の量を簡単に計算することが出来る。これによって増幅しなければ検出限界以下となって記録できないような分析物ポリヌクレオチドであっても定量評価することが可能となる。したがって、本発明の方法の感度は高度に上昇させることが出来る。これは、例えば臨床試料が組織標本または組織診からのわずかの細胞しか含まない場合など、非常に感度の高い試験が必要な場合に非常に有用である。
【００４３】
したがってアフィニティー選択されたプローブプロフィールは、プローブを例えばキャピラリーまたはゲル電気泳動あるいは質量分析によってそのサイズに基づいて互いに分離した後、高感度の自動定量記録によって評価することが出来る。所与のプールからの所与のサイズのプローブは特定の分析物分子に対応する。したがって、転写プロフィールを非常に正確に導き出すことが出来る。
【００４４】
薬剤、病状を含む内在制御機構による内在変化への応答または外部刺激に対する応答としての、細胞または組織試料に存在する様々なポリヌクレオチドの量の変化の比較定量評価には、少なくとも２つの組織化された可溶性プールが必要であるが、好ましくは試験される試料それぞれにつき少なくとも１つの組織化されたプールが要求される。各プールは同一のポリヌクレオチドプローブを含むが、例えばマイクロタイタープレート上の組織化されたプールは任意に記録可能なトレーサータグを付加される。トレーサータグを用いる場合、発光波長の異なるフルオロフォアなどの区別可能なトレーサーを用いるのが有用である。好適な態様において可溶性プールはマイクロタイタープレート上のものである。各マイクロタイタープレートはそれぞれが特異的な記録可能なトレーサーを有する以外の点では同じものであり、トレーサーがフルオロフォアの場合は好ましくは区別可能な異なる発光波長で放射するものがよい。質量分析を用いるとトレーサータグを用いなくても量の比較が可能であり、記録された結果を計算および比較するためにコンピュータに基づく自動システムを利用できる。
【００４５】
以下の本方法のフローチャートにおいて本発明をどのように実施するかを記載する。
【００４６】
調製工程
工程１−特定のサイズを有する可溶性ＤＮＡプローブの組織化されたプールの調製
ケース１：既知のゲノム（酵母またはヒト）
個々の遺伝子を表すようにＤＮＡ断片を選択し、そのサイズを選択してサイズ分画段階において良好な分解能が得られるようにする。
【００４７】
ケース２：未知のゲノム（糸状菌類、Trichoderma reesei）
サイズが約５０ｋｂの代表的なクローンのセットを、特定の断片のセットを作るために４塩基認識制限エンドヌクレアーゼ部位を認識する好適な制限エンドヌクレアーゼで切断する。ＤＮＡ断片は２つの遺伝子にわたるものでもよく、この場合は２つの分析物ＲＮＡにハイブリダイズする。１つの遺伝子に対していくつかの断片を有するようにしてもよい。同じサイズの異なる断片を用いてもよい。完全にゲノムをカバーするために重複性が要求され、その結果数百もの可溶性ＤＮＡプールが要求される。
【００４８】
工程２−トレーサータグまたはフルオロフォアによるＤＮＡプローブの末端標識
好ましくは２（またはより多くの）セットの区別可能な色素を有するＤＮＡを調製する。これによって例えば病状などの内在機構、または薬剤などの外部刺激による発現パターンまたは転写プロフィールの変動の同時比較研究が可能となる。工程１および２は準備工程であり、商業的価値のある試験キットの基礎となる。多数の実験が可能となるように大量のＤＮＡプールを作るとよい。そうすることによりやや面倒なこの段階を何度も繰り返す必要がなくなる。
【００４９】
分析工程
工程１  一本鎖ポリヌクレオチド分析物の調製
細胞からのＲＮＡの単離は適当な実験条件下で公知の方法（Sambrook, J. et al., Molecular cloning-A laboratory Manual, Second Edition (1989)）を用いて行えばよい。ポリヌクレオチド分析物が二本鎖の場合は、分析物を変性させて本発明の方法に要求される一本鎖配列にする必要がある。
【００５０】
工程２  アフィニティータグ付加した分析物の調製
単離したｍＲＮＡを例えば化学的、非酵素的工程によってビオチン化するなど、アフィニティータグ付加する。光活性化された試薬であるフォトビオチンはこの目的のために便利であり、市販されている。ＲＮＡをＳＤＳなどの強力な界面活性剤中で調製、保存すれば、ＲＮＡはｃＤＮＡへと転写されず、標識のために酵素的に修飾されない。ＲＮＡｓｅはＳＤＳによって阻害されるためインタクトなＲＮＡを単離することが容易となる。しかし断片化はさほどひどくなければ問題ではない。ＲＮＡ断片のサイズは捕獲能力に影響を与えるものではない。
【００５１】
工程３−溶液ハイブリダイゼーション
可溶性のトレーサータグ付加されたプローブ（ＤＮＡ）のそれぞれのプールをアフィニティータグ付加された分析物（ＲＮＡ）調製物のアリコットに接触させる。それぞれのプール区画に準備された小容量の遊離溶液中でハイブリダイゼーションを起こさせる。これによって迅速かつ定量的な反応がもたらされる。
【００５２】
工程４−分離工程
例えばアビジンなどの、ＲＮＡ分子を捕獲するためのアフィニティーペアを備えたマイクロビーズその他の分離補助手段を添加する。遊離のＤＮＡを除くために洗浄する。
【００５３】
工程５−回収段階
ホルムアミドまたはＮａＯＨなどのＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを破壊する溶液で溶出する。必要であれば一本鎖ＤＮＡを沈降させ、洗浄する。一本鎖ＤＮＡを電気泳動緩衝液中に取りだす。溶出物の電気泳動が直接行われ、異なるプローブが同時に記録されるような条件を用いるのが好ましい。
【００５４】
工程６−結果の記録
キャピラリーまたはゲル電気泳動によってＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドから溶出したＤＮＡのサイズと量を測定する。質量分析を用いてもよい。異なる色素で標識したＤＮＡ断片にハイブリダイズさせて電気泳動前にＤＮＡを混合することにより、２つのＲＮＡ調製物における相違が簡単に観察できる。
【００５５】
工程７−結果の解釈
ゲノムが既知の場合（ケース１）転写プロフィールは直接決定できる。ケース２の場合は興味深い挙動を示すすべての断片を、簡単にクローニングして配列決定することができる。
【００５６】
工程８−任意の増幅
非常に高感度のアッセイが要求される場合、試薬ポリヌクレオチド配列、即ち分離補助手段から溶出したトレーサータグ付加されたプローブを、定量選択工程の後にＰＣＲによって増幅すればよい。このアプローチを用いる場合試薬ポリヌクレオチド配列、即ちプローブを、同じプールにおけるすべてのプローブの増幅を可能にするように共通の末端配列を含ませるために、トレーサータグを備えた同じＰＣＲプライマーによって修飾すればよい。
【００５７】
プローブが特定のサイズを有し、そのため質量分析を用いてその質量に基づいて記録できるということにより、本方法をさらに改良することが出来る。トレーサータグの使用を省略することにより、本方法を簡略化でき、高価な記録可能な標識の必要性がなくなる。それ以外は本方法は完全に上記の方法に対応したものとなり、以下の連続する工程を含むものとされる；
（ａ）同定または記録を可能にするように特定のサイズを有する前もって決定された任意の数の可溶性プローブポリヌクレオチド配列を含む、１または複数の組織化されたプールであって、該プールが分離または互いに結合した容器中に組織化されて配置されたものであるプールを提供する工程、
（ｂ）標的生物の細胞または組織試料中に存在する分析物ポリヌクレオチド配列を単離し、該分析物に少なくとも１つのアフィニティータグを付加する工程、
（ｃ）工程（ａ）からの可溶性プローブと、工程（ｂ）からの分析物の間にハイブリダイゼーション反応を起こさせ、可溶性のプローブ：アフィニティータグ付加された分析物−ハイブリッドを形成させる工程、
（ｄ）工程（ｃ）において形成したプローブ：分析物−ハイブリッドを、分析物のアフィニティータグのアフィニティーペアを備えた分離補助手段上で該ハイブリッドを捕獲することによって単離する工程、
（ｅ）分離補助手段からプローブを回収する工程；および、
（ｆ）質量分析によりプローブのサイズと量を記録する工程。
【００５８】
試験キット
本発明は試験キットにも関する。該試験キットは前もって決定された任意の数の可溶性ポリヌクレオチド配列またはプローブを含む１または複数の可溶性の組織化されたプールを含む。プローブは任意にタグ付加され、タグはトレーサータグでも末端プライマータグ配列のペアでもよい。好ましくはトレーサータグは末端標識された検出可能なトレーサータグである。
【００５９】
試験キットは可溶性の組織化されたプールを含み、各プールは複数の、好ましくは１０より多数、最も好ましくは約１００またはそれ以上のプローブを含む。プールは好ましくは例えば試験管、ビンまたはマイクロタイタープレートのウェルまたは区画などの容器に組織化されて配置される。本発明の定量を行うための試験キットは好ましくはマイクロタイタープレートまたは対応するテーラーメード構造のものであるが、試験キットは任意の数の試験管、ビンなどであってもよく、それらは試験管立ておよび／またはその他の強固な構造を含む、ほぼ固定された配置で組織化されたものでもよい。試験キットはあつらえのものでもテーラーメードのものでもよく、使用のために適切な標識および説明書を含めてもよい。
【００６０】
試験キット用の可溶性のポリヌクレオチドプローブのプールはＤＮＡ断片から調製することができる。それは合成オリゴヌクレオチドでも修飾ＤＮＡでもよい。試験キットを特徴づけされたゲノムの研究用に調製する場合、試験キットのプールは好ましくはゲノムにおいて研究しようとする各遺伝子から少なくとも１つのポリヌクレオチド断片（プローブ）を含むのがよい。特徴づけされていないゲノムを研究する場合は、商業的生産などを含むプールの大量調製により、より一般的またはより特異的な研究を可能にするのが好ましい。プールはゲノムの目的部分をプラスミドに挿入することによって調製するのが好ましく、それを便宜に増殖させ、適当な制限酵素で断片化して特定のサイズを有するプローブの所望のプールを提供することが出来る。インサートには任意に所望の制限酵素部位を含めてもよい。また、部分的に特徴づけされているかまたは特徴づけされていないゲノム用の商業用試験キットも本質的に同じようにして提供できる。特徴づけされていないゲノムでさえも本方法により効率的に特徴づけされることに注目されたい。
【００６１】
試薬ポリヌクレオチドプローブが特徴づけされたゲノムからのものである場合、各プローブ分子は所与の遺伝子に対応することが知られており、各プローブはそのサイズおよびプールによって特異的に同定される。したがって転写プロフィールを、個々の遺伝子の発現レベルとして直接的に解釈することが出来る。試薬ポリヌクレオチドプローブがあまり特徴づけされていない場合、例えばそれがゲノムの配列決定がされていない生物由来のものである場合であっても、価値のある結果を得ることが出来る。この場合プローブプールを例えば１０から２００ｋｂの大きなクローンを切断して特定のかなり小さな断片にすることによって作成する。こういった小さな断片を任意に標識して上記のようにプローブとして用いる。この場合転写プロフィールは直接遺伝子を同定するものではないが、所与のプローブ分子に関する定量的かつ差動的なデータを提供する。このデータが入手できれば、興味深い挙動を示すすべての断片をクローニングして配列決定することは容易である。したがって、短時間で多くの情報が効率よく蓄積できる。
【００６２】
好適な態様では試験キットはマイクロタイタープレート上に調製される。本発明の実践的な態様において、酵母からのＤＮＡ断片を含むプールを試験キットの調製用に用いる。各プールが例えば１００−３００のプローブまたは断片を含んでいれば、十分に良好な分解能が得られる。プール中の各プローブが所与の酵母遺伝子を表すとすれば、およそ６３００の酵母遺伝子を単一のマイクロタイタープレート上に搭載でき、さらに多数のコントロールを搭載する余地がある。捕獲されたＤＮＡプローブは、部分的にはそれが属するプールまたはマイクロタイターウェルによって、部分的にはそのサイズによって同定することが出来る。
【００６３】
任意の記録可能なトレーサータグは、蛍光、赤外吸収、電磁気特性、放射能および酵素活性によって検出可能なトレーサーの群から選択するのが好ましい。蛍光によって記録可能な好適なトレーサータグは蛍光色素またはフルオロフォアである。質量分析はもう１つの好適な態様であり、これによってトレーサータグを用いずに記録および定量が可能となる。トレーサータグが好適な態様であってもこれは本発明の方法に必須ではない。本発明による試験キットに必要なことは、可溶性の組織化されたプール中のプローブが特定のサイズを有することのみである。これは任意に、トレーサータグまたは末端プライマータグによってタグ付加されていてもよい。したがってトレーサーを有していなくても、末端プライマータグ付加されたプローブの組織化されたプールにより有用な試験キットが提供される。
【００６４】
もっとも簡単な形態の本発明の試験キットは、特定のサイズを有する可溶性のタグ付加されたプローブの組織化されたプールである。該試験キットはそれだけで完全であるが、任意にトレーサー、アフィニティーペアおよび／または分離補助手段を含んでいてもよいことに注意されたい。しかし、このような補助的試薬は必要条件ではない。本発明の方法を行うためのこのような補助的試薬および手段は、他にも市販されている。したがって、本発明の方法および試験キットは最終消費者の特定の要求に対してテーラーメードのものであり得、特にそれは自動または半自動の扱いに適用できる。
【００６５】
試験キットの製造の態様はしたがって固定化工程を含む必要がなく、所与の生物の特定の遺伝子のサブセットが注目される、テーラーメード試験に簡単に適用できる。試験キットは細胞または組織試料中のポリヌクレオチドを標識するために任意にアフィニティータグを含んでいてもよく、分析物の標識のためのアフィニティータグの対応物を備えているかまたは対応物で被覆された分離補助手段を任意に含んでいてもよい。分析物用のアフィニティータグおよび分離補助手段用の対応物を提供する任意のアフィニティーペアには、例えばビオチンとアビジンまたはストレプトアビジン、ヒスチジンオリゴマーと金属キレート、ハプテンと抗体、またはグリカンとレクチンなどが含まれるがこれらに限定されるものではない。
【００６６】
試験キットに含めてもよいし、別個に提供してもよい任意の分離補助手段は、微小粒子、マイクロビーズ、ラテックス粒子、磁性粒子、針、釘、棒、マイクロウェルまたはアフィニティーカラムからなる固体支持体の群から選択される。分離補助手段は、アフィニティータグの対応物を捕獲するための相分離手段または電気泳動手段を含んでいてもよい。
【００６７】
発現パターンまたは転写プロフィールにおける変動の比較評価のために、同じプローブのセットを有する組織化された複数のプールを提供するとよい。この場合、各組織化されたプールまたは試験キットは任意に、異なるまたは区別可能なトレーサータグを備えていてもよく、ここでタグは好ましくは異なる発光波長で放射するものである。タグが末端プライマータグである場合は、試験キットは同じものになるが、増幅後に回収および／または増幅されたプローブに区別可能なトレーサータグを付加してもよい。
【００６８】
相補的プライマーペアはトレーサータグを備えていてもよく、これによって増幅の際のトレーサータギングが可能となる。こういった補助的試薬は任意に試験キットに含めてもよく、他の商業的または非商業的供給源から得てもよい。試料中のポリヌクレオチド量の変化の簡単な比較評価を可能にするためには、異なる発光波長で放射する異なるまたは区別可能なトレーサータグを備えた試験キットを調製するのがよく、ここで記録は自動的または半自動的装置によって行われる。
【００６９】
薬剤、病状を含む内在変化または外部刺激に対する応答として、細胞または組織試料に存在する様々なポリヌクレオチドの量の変動を比較定量評価するための試験キットは、少なくとも２つの固体支持体またはマイクロタイタープレートを含むのが好ましい。各固体支持体またはマイクロタイタープレートは、同じポリヌクレオチドプローブのプールを備え、任意にトレーサータグを備えているものである。各固体支持体またはマイクロタイタープレートは任意に独自の区別可能なトレーサータグを含み、それによって例えば薬剤処理の前後などの異なる時間に得られた細胞または組織試料を同時に記録することが可能となる。ディファレンシャル転写プロフィール化、即ち２またはそれ以上の分析物ポリヌクレオチド調製物の間の差異の分析は、分析物試料と、異なる、区別可能、自動記録可能なトレーサータグによって末端標識した試薬ポリヌクレオチドプローブとをハイブリダイズさせることによって簡単に記録できる。ハイブリダイゼーション工程後に、異なる試料を任意に混合してその差異を、各ピークにおけるトレーサータグの互いの比を測定することによって直接に観察することが出来る。試験キットは、試験の感度を高めるために、最終工程で得られたトレーサータグ付加されたプローブを増幅する少なくとも１対のプライマーを含むものとしてもよい。
【００７０】
本発明の方法は、内在変化によるかまたは外部または内部刺激に対する応答としての、標的細胞または組織試料中の、特徴づけされているか部分的に特徴づけされているかまたは特徴づけされていない異なるポリヌクレオチドの質または量における変動の定量評価および比較評価に有用である。本方法と試験キットは、治療様式、疫学的状態、衛生学的状態、微生物集団の効果を評価するために利用できる。
【００７１】
本発明のもっとも簡単で安価な形態の試験キットはその他の点では上記の試験キットと同じであるが、前もって決定された任意の数の可溶性ポリヌクレオチド配列プローブを含む１または複数の組織化されたプールを含み、プローブが特定のサイズを有しているため質量分析による同定および記録が可能なものである。プローブは質量分析器または質量分析計などの手段による定量の前に増幅させるために末端プライマータグを備えていてもよい。非標識プローブのプールは独自の容器に組織化されて配置され、それは分離していても結合していてもよい。
【００７２】
本発明の試薬を含む試験キットは好ましくは自動または半自動工程を適用することができるものであり、その１例を図１０のフローシートに示す。自動装置が適合性でなければ、工程は妨害され、試薬はその他の固体支持体へと移動してしまう。第一工程は自動ピペッティング装置中において行うのが好ましく、ここでビオチン標識化試料ＲＮＡは、プール中に特定のサイズのプローブを含む各プールにピペットで分注される。その後、試験キットを凍結乾燥器を用いて乾燥させるとよい。乾燥は、容積における差の影響を除くために行われる。任意に凍結乾燥することにより、作業を続けるのに好適になるまで作業は中止される。
【００７３】
作業を再開して自動ピペッティング装置中のプールに適当なハイブリダイゼーション緩衝液を添加する。プレートを適当な手段、例えば、フィルムまたはホイルで密封して続く工程において蒸発が起こるのを防ぐ。試験キットが適当な熱シーラーを備える場合は、それは自動サーマルブロックの中に配置され、そこではプローブの変性およびハイブリダイゼーションを可能にするための要求に応じて温度を下方制御または上方制御することができる。ハイブリダイゼーション後、プローブ：分析物−ハイブリッドを含有する溶液を磁性粒子処理装置中に入れ、アフィニティー捕獲、洗浄および溶出工程を、ストレプトアビジン／アビジンで被覆された磁性ビーズを、例えば、プログラムされた計画にしたがってKingFisherプレート上で段階的に移動させることによって行う。自動装置が異なるタイプのマイクロタイタープレートを使用するものである場合は、溶出液を任意に新しいプレートに移してもよい。定量的移動のためにウェルを溶出緩衝液ですすぎ、次に混合溶液を凍結乾燥器で蒸発させることにより、試料を保存することができ、記録をより都合のよい時期に行うことが出来る。換言すると、該工程は、定量を行うために様々な時間計画およびプロトコールに簡単に適応させることができる。プローブ断片、サイズスタンダードおよび濃度スタンダードは直接、または便宜の工程の後に、自動分析器に自動的に注入すればよい。プローブ断片に結合した標識の強度は面積として測定できる。既知の量の濃度スタンダードの面積を用いて各プローブ断片の絶対量を測定できる。
【００７４】
本発明の実験計画および一般原理を本発明者らの研究室において利用可能なプラスミドおよびインサートを用いてより詳細に記載する。該プラスミドは例示の目的だけに使用される。本発明は決して該プラスミドに限定されるものではない。実施例において用いられるコンストラクトを、大量利用可能なあらゆるその他のプラスミドまたはインサートで置換することにより、本発明の原理を確認することが出来る。
【００７５】
当業者であれば、簡単に本発明の原理を別の適用例に当てはめることができる。
【実施例１】
【００７６】
定量評価
ベクター部分とインサート部分(ｃＤＮＡ）からなるプラスミド、ｐＡＳ１１を用いたプローブプールの作成
該プラスミドをｐＳＰ７３クローニングベクター(Promega, P2221)および酵母ベクターｐＡＳ４から作成した。これはエンドヌクレアーゼ−５ｃＤＮＡ(Saloheimo, A., et al., Mol. Microbiol. 13, 219-228, 1994)、新規な小さいエンドグルカナーゼ遺伝子、ｅｇ１５（酵母における発現により単離した、Trichoderma reesei由来のもの(Saloheimo, et al., 1994)）を含むものである。ｅｇ１５−ｃＤＮＡをＥｃｏＲＩ−部分的ＸｈｏＩ−消化によってｐＡＳ４から切りだし、末端をＫｌｅｎｏｗ断片(1008404 Boehringer-Mannheim)によって平滑化し、ＳｍａＩ消化したｐＳＰ７３ベクターにライゲーションしてｐＡＳ１１を作成した。ベクターはインビトロ転写用のＴ７プロモーターを含むものであった。該プラスミドを用いてモデル実施例においてＲＮＡを調製した。これらのモデル実施例における工程は、本発明を一般化した方法に記載の主な工程とはいくらか異なるものであった。この実験では以下の工程にしたがった。
【００７７】
調製工程：
工程１−二本鎖ポリヌクレオチドからのプローブの調製
ＤＨ５α細胞中の、アンピシリン耐性遺伝子を含むｐＡＳ１１プラスミドを、１％グルコースおよび０．１ｍｇ／ｌアンピシリンを含むＬＢ溶液中で＋３７℃で一晩培養した。
【００７８】
工程２−プローブポリヌクレオチドの精製および検証
次にプラスミドをQIAGENR(QIAGENR Plasmid Purification Handbook, Nov. 1998)のPlasimid Maxi Protocolにしたがって精製および分析した。
【００７９】
工程３−プラスミドの直鎖化
精製プラスミドをＥｃｏＲＩ消化によって直鎖化し、アガロースゲル電気泳動によって単離し、QIAquickTM Gel Extraction Kit Protocol(QIAquickTM Spin Handbook, Jan. 1999)を用いて抽出および精製した。
【００８０】
工程４−分析物の調製
インサートに対応するＲＮＡを、RiboMAXTM Large Scale RNA Production System-T7 (Promega, P1300)を用いてインビトロで調製し、生じた量をＵＶ吸収によって測定した。
【００８１】
分析工程：
工程１−分析物配列へのアフィニティータグ付加
ＲＮＡを製造業者（VECTOR Laboratories)のプロトコールにしたがってPHOTOPROBER Biotin SP-1000によってアフィニティータグ付加した。
【００８２】
工程２−プローブの断片化
プラスミド試料を制限酵素ＭｓｐＩで切断して２１の断片を得た。そのなかで１０はインサートに、１１はベクターに対応していた。
【００８３】
工程３−トレーサータグによるプローブの末端標識
ＤＮＡ断片をＫｌｅｎｏｗ断片(1008404 Boehringer Mannheim)を用いてFluorescein-12-ddCTP, NEL-400(NENR Life Science Products, Inc)で末端標識した。標識工程が成功したか否かを、ゲル電気泳動ＤＮＡシークエンサーALF DNA Analysis System (Amersham Pharmacia Biotech)でＤＮＡ断片を分析することにより確認した。ここでALFwin Fragment Analyser 1.02 Software Package (Amaersham Pharmacia Baiotech)を用い、そして外部コントロールとしてSizer 50-500、内部コントロールとしてSizer 250（カタログ番号27-4525-01および27-4527-01,Amersham Pharmacia Biotech）を用いた(図８ａおよび８ｂ）。
【００８４】
工程４−溶液ハイブリダイゼーション
ＲＮＡ試料（０．４４ｐｍｏｌ）のアリコットを末端標識したＤＮＡ断片調製物（各断片０．０４４ｐｍｏｌ）のアリコットと、ＲＮＡｓｅを含まない微量遠心チューブ中で混合した。混合物中のＳＤＳ濃度は０．１％に保った。混合物を３Ｍ酢酸ナトリウム（１／１０ｘＶ）および９４％エタノール（２．５ｘＶ）を用いて沈殿させ、ペレットにし（２００００ｘｇ）、７０％ＥｔＯＨで洗浄し、２５μｌのハイブリダイゼーション溶液に溶解した。ハイブリダイゼーション溶液：０．６Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳおよび０．０２％（ｗ／ｖ）フィコール、０．０２％（ｗ／ｖ）ポリビニルピロリドン、０．０２％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（１ｘデンハルト溶液）。混合物を３分間１００℃に加熱した。
【００８５】
工程５−ハイブリダイゼーションに関する任意工程
試料を６５℃で２時間インキュベートし、次に新たなＲＮＡｓｅを含まない微量遠心チューブに移した。インキュベーションチューブを１回、２５μｌのハイブリダイゼーション溶液で流し、同じチューブに洗浄溶液を添加した。
【００８６】
工程６−捕獲工程
FLUORICONTM Avidin-Polystyrene Assay Particles (IDEXX Laboratories, 31-040-1A)の５％（ｗ／ｖ）懸濁液０．５μｌを添加し、インキュベーションを２２℃で３０分間継続した。粒子の懸濁液は洗浄用液中のものであった。洗浄溶液：２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０。
【００８７】
工程７−分離工程
微小粒子を遠心分離（１２０００ｘｇ、２２℃）で回収し、５０℃で２００μｌの０．１ｘＳＳＣ−０．２％ＳＤＳで４回洗浄した（１２０００ｘｇ、４０℃）。
【００８８】
工程８−溶出工程
結合したＤＮＡを２００μｌの５０ｍＭ  ＮａＯＨで溶出し、沈殿、ペレット化し、工程５に記載のように洗浄し、水に溶解した。
【００８９】
工程９−回収段階
溶出したＤＮＡをキャピラリー電気泳動ＤＮＡシークエンサーABI PRISMR 310, Genetic Analyser(Applied Biosystems）または、ゲル電気泳動ＤＮＡシークエンサーALF DNA Analysis System(Amersham Pharmacia Biotech)で分析した。前者の場合、GeneScanR Analysis Software (Applied Biosystems)およびGene Scan-500 Siza Standardおよび既知量の特別注文のシングルサイズスタンダードを用い、後者の場合、ALFwin Fragment Analyser 1.02 Software Package(Amersham Pharmacia Biotech)および外部コントロールSizer 50-500および既知の量の内部コントロールSizer 250（カタログ番号27-4525-01および27-4527-01, Amersham Pharmacia Biotech）を用いた。
【００９０】
工程１０−結果の記録
結果を電気泳動図および図８ｃに示すデータファイルから読み取った。
【００９１】
図８ｂにはすべての断片が比較として示されているが、図８ｂと比較してインサートに対応する断片のみが見られた。定量は、各試料レーンの濃度が既知である、内部標準のピーク面積を用いて計算した。
【実施例２】
【００９２】
誘導の前後の糸状菌Trichoderma reeseiからのＲＮＡの比較、定量評価
この実験では、糸状菌Trichoderma reeseiから単離したＲＮＡを２つの異なる条件、即ち細胞外加水分解酵素での誘導の前後において分析した。実験に用いたTrichoderma reesei株はＱＭ９４１４（VTT's collectionにVTT-D-74075として寄託されている）であり、これを培養してα−ソフォロースで誘導をかけ、収集した。これは、Ilmen, M., Onnela, M.-L., Klemsdal, S., Keranen, S. and Penttila, M. 1996. Fuctional analysis of the cellobiohydrolase I promoter of the filamentous fungus Trichoderma reesei. Mol. Gen. Genet. 253, pp.303-314 に記載のように行った。
【００９３】
菌のトータルＲＮＡをTRIzolR Reagent method (Life Technologies; Gibco BRL)を用いて調製した。さらにポリ（Ａ）＋ＲＮＡをトータルＲＮＡからOligotex mRNA Spin-Column Protocol (QIAGENR OligetexTM Handook August 1998)を用いて単離した。このＲＮＡに上記の実施例１、分析工程１に記載のようにビオチン標識した。プローブＤＮＡ断片は実施例１のものと同じものとした。プラスミド中のインサートは用いた条件で誘導されることが知られているエンドグルカナーゼ加水分解酵素の遺伝子を含んでいた。
【００９４】
実施例１に記載の分析工程１−１０にしたがって実験を行った。
【００９５】
電気泳動図（図９ａおよび９ｂ）はエンドグルカナーゼに対応する断片は、ソフォロースでの細胞外加水分解酵素の誘導後では３倍多量になっていることを示す。
【実施例３】
【００９６】
少量の分析物の定量評価
非常に少量のＲＮＡを検出するために計画された実験においては、プローブの調製工程は以下に示すように実施例１および２のものと異なるものとした。
【００９７】
プローブをＰＣＲ反応で調製した（図５参照）。所与の遺伝子に対応する一本鎖ＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅を特異的に導くように、各プローブ断片について２つの独特の１６−２４ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチド配列を選択した。ＰＣＲプライマーは、５’末端にさらなる１６のヌクレオチド長の配列を含むものとした。この配列はプライマーの半分、即ち、一方へ伸長を引き起こすすべてのプライマーについては同一のものとした。別の配列を、残りの半分のプライマー、即ち、他方へ伸長を引き起こすすべてのプライマーについて同一のものとした。このさらなる２種の１６マーはＰＣＲ増幅によるプローブ調製中にすべてのプローブへと取りこまれた。この場合、プローブはフルオロフォアで標識しなかった。
【００９８】
プローブ分子を作成する調製工程の後、実験を分析部分へと進めた。
工程１−アフィニティータグ付加された分析物の調製
分析物ＲＮＡを単離し、実施例１の分析工程１に記載のようにフォトビオチンでアフィニティータグ付加した。
【００９９】
工程２−溶液中でのハイブリダイゼーション
ＲＮＡ試料を実施例１の分析工程４において記載したように、増幅可能なＤＮＡプローブのプールと混合した。
【０１００】
工程３−溶液中でのハイブリダイゼーション
ＲＮＡ試料−ＤＮＡプローブ混合物を、実施例１の分析工程５において記載したように、ハイブリダイゼーションを可能にする条件下でインキュベートした。
【０１０１】
工程４−捕獲
ビオチン標識したＲＮＡおよびＤＮＡ：ＲＮＡ−ハイブリッドを、実施例１の工程６において記載したように、アビジンで被覆した粒子上に回収した(図６）。
【０１０２】
工程５−溶出
プローブＤＮＡ分子を、実施例１の工程７において記載したように、溶出、沈殿および洗浄した。
【０１０３】
工程６−増幅
プローブの共通末端１６ヌクレオチドに対応するプライマーペアを添加した。プライマー１は標識せず、４ｘｐｍｏｌ／μｌとなるように添加し、プライマー２はフルオロフォアで５’標識して、５０ｐｍｏｌ／μｌとなるように添加した。緩衝液条件は用いるＤＮＡポリメラーゼ（例えば、DeepVentR DNA Polymerase, #M0258L, New England BiolabsR Inc.）の要求に応じて調整した。例えば９４℃１分；５２℃３０秒；７２℃１分の２５サイクルからなるＰＣＲプログラムを用いてプローブを増幅し、蛍光標識を導入した（図７）。
【０１０４】
工程７−過剰のプライマーの分離
過剰のプライマーを例えば減圧マニフォールドMAVM 096 ORによるMillipore Multiscreen96-PCR Filter Plateカタログ番号MANU 030 10を用いて減圧ろ過するか、または例えばQIAquick PCR Purification Kit, 28106などのスピンカラムでのゲルフクロマトグラフィーにかけるか、あるいはエタノールまたはプロパノール沈殿によって除去した。
【０１０５】
工程８−記録
増幅したプローブを実施例１の工程９に記載したようにして電気泳動によって分析した。
【実施例４】
【０１０６】
質量分析を用いた分析
質量分析に用いたプローブは合成オリゴヌクレオチドであり、この実施例では３０塩基対長であった。これらはその配列の違いに起因する分子量の違いによって互いに区別される。プローブのうち４つは実施例１に記載したインビトロ転写したＲＮＡのうち１つのＲＮＡを特異的に検出するように設計したが、４つはコントロールとして用い、このＲＮＡ調製物に対応する配列を有しないものとした。分析工程は以下の通りであった。
【０１０７】
工程１
実施例１に記載した２０μｌの緩衝液中で、オリゴヌクレオチドプローブと実施例１のビオチン標識したＲＮＡ調製物とを混合した。
【０１０８】
工程２
混合物を１００℃で３分、６８℃で４時間インキュベートした。
【０１０９】
工程３
溶液を希釈して４０μｌとし、ＮａＣｌ濃度を１Ｍに調整した後、ストレプトアビジンで被覆した磁性ビーズ(Dynal Dynabeads M280 Streptavidin)を用いてアフィニティー捕獲した。ビーズを０．１５Ｍクエン酸Ｎａ、０．１％ＳＤＳで６８℃で各１５分間、４回洗浄し、続いてＲＮＡｓｅを含まない水でビーズを２回洗浄した。
【０１１０】
工程５
ビーズを室温で２００μｌの１Ｍ  ＮＨ４ＯＨで溶出した。
【０１１１】
工程６
溶出液を凍結乾燥した。
【０１１２】
工程７
凍結乾燥した溶質を１００Ｌの超純水に懸濁した。
【０１１３】
工程８
８つのオリゴヌクレオチドプローブをMALDI-TOF Mass spectrometerで定量した。分子量９３２０．１、９２５１．０、９２４９．０および９２５７．１（これら４つはＲＮＡに対応する）そして８８９３．９、９２４９．０、９２６４．１および９２９６．１（これら４つはネガティブコントロールとして用いる）の８つのオリゴヌクレオチドを上述のようにアフィニティー選択せずに分析したところ、８つのすべての質量が検出された（９２４９．０については１回のみ）。実施例１のビオチン標識ＲＮＡでの選択工程を用いたところ、最初の４つのオリゴヌクレオチドのみが同定された。
【実施例５】
【０１１４】
工程の半自動的実行
上記実施例１および２におけるものと同じプローブとｍＲＮＡ試薬を用いて、図１０にフローシートとして示す半自動的方法を行った。
【０１１５】
工程１−分析集合物およびプレート密封
自動ピペッティング装置を用いて第１にプール中にＤＮＡプローブを混合し、第２にプレートの各ウェルにビオチン標識した試料ＲＮＡを添加する。集合物を凍結乾燥器を用いて乾燥させて容積の影響を排除する。自動ピペッティング装置を用いて集合物を適当なハイブリダイゼーション緩衝液（例えば、０．０６Ｍクエン酸Ｎａ、０．０４Ｍリン酸Ｎａ  ｐＨ７．０、０．６Ｍ  ＮａＣｌ、０．５％ＳＤＳ、２０％ホルムアミド、１ｘデンハルト溶液、デキストラン硫酸２％を含む）に再懸濁する。続く工程での蒸発を避けるためにプレートをフィルムで密封する。例えば、サーマルシーラーでの熱シールまたは接着性ＰＣＲホイルシールなどが利用できる。
【０１１６】
工程２−変性およびハイブリダイゼーション
プレートを例えばサーマルサイクラーなどの自動サーマルブロックに入れ、ここで温度をまず１００℃に上げてプローブの二本鎖を変性させる。次に温度を例えば６８℃といった適当なレベルまで徐々に下げ、プローブＤＮＡと試料ＲＮＡのハイブリダイゼーションを可能とする。
【０１１７】
工程３−アフィニティー捕獲、洗浄および溶出
ハイブリダイゼーション後、例えばKingFischer(ThermoLab-systems)などの磁性粒子処理装置を用いてアフィニティー捕獲、洗浄および溶出工程を行う。これはストレプトアビジン／アビジンで被覆した磁性ビーズを計画されたプロトコールにしたがってKingFischerプレート上を段階的に移動させることによって行う。KingFischerプレート上での各工程用の溶液はあらかじめ特定の場所にピペットで入れておく。
【０１１８】
ハイブリダイゼーション工程後、プレートの内容物をKingFischerプレートの特定の位置へ移す。ウェルをすすぐ際、溶液をＮａＣｌ濃度が１Ｍとなるように調整することによってアフィニティー捕獲に適するようにする。
【０１１９】
工程４−緩衝液調整およびスタンダードの添加
溶出液を新しいプレートに移す（この工程は任意であり、自動装置が異なるタイプのマイクロタイタープレートを用いる場合にのみ行われる）。定量的トランスファー用の溶出緩衝液でウェルをすすぎ、混合溶液を次に凍結乾燥器で蒸発させる。自動ピペッティング装置を用いて乾燥したプローブ断片を次なる分析器に好適な実行溶液（例えば、分析器がABI 3100の場合は水）に再懸濁し、既知の量のサイズ標準および濃度標準を加える。
【０１２０】
工程５−断片のサイズ同定および定量
プローブ断片、サイズ標準および濃度標準を例えばABI3100(Applied Biosystems)またはBaseStation DNA Fragment Analyzer(MJ Research Inc.)などの分析器に自動的に注入する。分析器のソフトウェアを用いて断片のサイズを特定する。プローブ断片に付着している蛍光標識の強度を面積として測定する。既知の量の濃度標準の面積を用いて各プローブ断片の絶対量を測定する。
【図面の簡単な説明】
【０１２１】
【図１】図１は、トレーサータグ付加されたプローブ（Ｐ）の調製方法の概略図である。
【図２Ａ】図２Ａは、トレーサー（星印）タグ付加されたプローブ（Ｐ）とアフィニティーまたはビオチン（Ｂ）タグ付加された一本鎖ＲＮＡ分析物配列との間のハイブリダイゼーション工程と、分析物（Ａ）とプローブ（Ｐ）との間のハイブリッド（Ｈ）形成を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、トレーサー（星印）タグ付加されたプローブ（Ｐ）とアフィニティーまたはビオチン（Ｂ）タグ付加されたニ本鎖ポリヌクレオチドまたはＲＮＡ分析物配列との間のハイブリダイゼーション工程と、分析物（Ａ）とプローブ（Ｐ）との間のハイブリッド（Ｈ）形成を示す。分析物配列と一致しないプローブまたはモル過剰存在するプローブは、溶液中に遊離のまま残る。
【図３Ａ】図３Ａは、アフィニティー(Ｂ)タグ付加されたハイブリッド（Ｈ）の、アフィニティータグ(Ｂ)の対応物で覆われた固体分離補助手段（ＳＡＴ）への捕獲を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、アフィニティー(Ｂ)タグ付加されたハイブリッド（Ｈ）の、アフィニティータグ(Ｂ)の対応物で覆われた固体分離補助手段（ＳＡＴ）への捕獲を示す。アフィニティータグ付加された分析物配列とハイブリダイズしないトレーサータグ付加されたプローブ配列は捕獲されない。当然、分離補助手段（ＳＡＴ）は遊離のアフィニティータグおよびプローブ配列がハイブリダイズしていないアフィニティータグ付加された分析物に結合する。
【図４】図４は、トレーサータグ付加されたプローブ（Ｐ）の固体分離補助手段（ＳＡＴ）からの溶出を用いた放出を示す。アフィニティータグ付加された分析物配列（Ａ）は分離補助手段（ＳＡＴ）とともに残り、トレーサータグ付加されたプローブ（Ｐ）は溶液中に溶出する。
【図５】図５は、さらに１６−マーの同一配列または末端プライマータグ（ＴＰＴ）を有するプライマーによるプローブのＰＣＲ−合成を示す。
【図６】図６は、末端プライマータグ付加されたプローブ（ＴＰＴ−Ｐ）の捕獲を示す：アフィニティー（Ｂ）タグ付加された分析物（Ａ）は分離補助手段（ＳＡＴ）上にある。末端プライマータグ付加されたプローブ（ＴＰＴ−Ｐ）の各終端の末端プラーマーを同様に（Ｐ）として示す。
【図７】図７は、トレーサー（星印）タグ付加されたプライマーを有する溶出した末端プライマータグ付加されたプローブ（ＴＰＴ−Ｐ）のＰＣＲ−増幅を示す。
【図８】図８は、電気泳動図および、実施例１による本発明の定量工程を行って得たデータファイルから記録される結果を示す。
【図８Ａ】図８Ａは、外部標準について記録された結果を示す。
【図８Ｂ】図８Ｂは、ｐＡＳ１１ＭｓｐＩから得たすべてのピークを記録した結果を示す。
【図８Ｃ】図８Ｃは、ｅｇ１５ｍＲＮＡ選択物から記録された結果を示す。
【図９】図９は、電気泳動図および、実施例２による本発明の比較工程を行って得たデータファイルから記録された結果を示す。
【図９Ａ】図９Ａは、誘導条件を用いた場合に得られた結果を示す。
【図９Ｂ】図９Ｂは、非誘導条件下で得られた結果を示す。
【図１０】図１０は、工程の半自動化実行をフローシートとして示す。
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図１０】
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