(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
光学的画像センサーを用いて分析物を検出するためのアレイであって、該アレイは結合体を含み、
該結合体は、ジオール含有ポリマー、直鎖状ポリサッカリド、または分枝状ポリサッカリドに共有結合によって結合された化学物質または生体分子を含み、ここで、該結合体は該光学的画像センサーの表面に結合されており、かつ
該結合体は、該光学的画像センサーの表面上にスポットされている、
ことを特徴とする上記アレイ。
【請求項２】
該結合体は、直鎖状ポリサッカリドに共有結合によって結合された化学物質または生体分子を含む、請求項１に記載のアレイ。
【請求項３】
該分枝状ポリサッカリドは、アミロース、アミロペクチン、グリコゲン、デキストラン、セルロース、キチン、キトサン、ペプチドグリカン、グリコサミノグリカンおよびそれらの混合物からなる群より選択される、請求項１に記載のアレイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、特許協力条約第８条によって、２００１年３月９日に出願された、米国仮特許出願６０／２７４，１７７号の優先権の利益を主張し、この出願は、その全体を参考として本明細書中で援用される。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、分析物の結合体プローブおよび光学的検出に関する。より具体的には、本発明は、センサーのアレイまたは分析物の光学的検出を使用するシステムを形成するために使用される結合体プローブに関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
生体分子および他の分析物は、標的の分析物を結合する、選択的または特異的なプローブのアレイまたはマイクロアレイを使用して、検出され得る。バイオセンサーアレイ技術において、基材またはバイオチップ上にプローブスポットを配置するためのスキームが、開発されてきた。アレイは、遺伝子配列を検出および発見するために、薬物分子候補を選択および試験するために、毒物学的作用または薬理学的作用を調査するために、および他の使用のために使用される。標的は、種々の相互作用のプローブのアレイに結合し得、その相互作用としては、核酸塩基対形成またはハイブリダイゼーション、タンパク質−タンパク質相互作用、タンパク質−リガンド相互作用、酵素−基質相互作用、レセプター−リガンド相互作用、および他の化学反応が挙げられる。
【０００４】
バイオセンサーは、マイクロアレイ形式で、タンパク質または核酸のような生体分子間の膨大な相互作用の同時試験を可能にする。これらバイオセンサーは、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔ由来の膨大な配列情報および他の生物体のゲノム配列由来の膨大な配列情報を使用する、強力なツールを提供する。
【０００５】
分析物種からのシグナルは、一般的に小さく、種々の供給源由来のバックグラウンドシグナルは、測定のＳ／Ｎ比を相対的に小さくする。小さなシグナルは、低いＳ／Ｎ比および分析物の弱い検出に移行する。溶液は、分析物からのシグナルを増強し、検出に固有のＳ／Ｎ比を増加するために存在する。Ｓ／Ｎ比の増加は、分析物に対する検出限界を下げ、より低い濃度での分析物の観測を可能にし、生体分子への適用に対する新しい門戸を開く。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（本発明の要旨）
１つの局面において、本発明は、ポリマーに結合する化学物質または生体分子を含む結合体に関する。１つの実施形態において、このポリマーは、ジオール含有ポリマーである。別の実施形態において、このポリマーは、直鎖ポリサッカリドまたは分枝鎖ポリサッカリドである。このポリマーはまた、直鎖ポリヌクレオチドまたは分枝鎖ポリヌクレオチドであり得る。この化学物質または生体分子は、例えば、オリゴヌクレオチド、タンパク質核酸、タンパク質、抗体または抗体フラグメントであり得る。１つの実施形態において、結合体は、ポリサッカリドを、酸化剤、またはカルボニル化剤、もしくは、例えば、３−マレイミドプロピオン酸（３−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）と反応する工程を含む方法によって調製される。ポリマーへの化学物質または生体分子のカップリングは、光反応性架橋剤、またはヘテロ二官能性光反応性架橋剤を用いてなされ得る。
【０００７】
別の局面において、本発明は、結合体を含むアレイに関する。１つの実施形態において、画像センサーを用いたアレイを使用して分析物を検出する方法が、提供される。このアレイは、画像センサー上または画像センサーに近接する基材上に位置し得る。この画像センサーは、ＣＭＯＳ画像センサーであり得る。この画像センサーおよびアレイは、低光量エンクロージャー内に含まれ得る。
【０００８】
別の局面において、本発明は、アレイを使用して分析物を検出する方法に関する。１つの実施形態において、複数のプローブをポリマーに結合することによって、アレイ上の分析物から生じるシグナルを増加する方法が、提供される。別の実施形態において、分析物のシグナルを統合する工程を含んだ、分析物を検出する方法が、提供される。
【０００９】
別の局面において、本発明は、光学画像センサー、低光量エンクロージャー、および結合体プローブアレイを含むセンサーデバイスに関する。
【００１０】
別の局面において、本発明は、読取り位置および画像センサーを含む携帯型エンクロージャーを含むバイオセンサーシステムに関する。１つの実施形態において、携帯型エンクロージャーは、コネクターで読取り位置に接続され、ここで、携帯型エンクロージャーは、読取り位置から取り外し可能である。別の実施形態において、この読取り位置は、移動式エンクロージャーのホットスワップを提供する。
【００１１】
（発明の詳細な説明）
「アレイ」または「マイクロアレイ」は、直線状または２次元のマトリクスまたは不連続領域のアレイであり、各々は、規定された領域を有し、固体支持体の表面上に形成される。この不連続領域は、重なり合っても、重なり合わなくても良い。マイクロアレイ上の不連続領域の密度は、単一の固相支持体の表面上で検出される標的分子（例えば、ポリヌクレオチド）の総数によって決定される。２つ以上の領域がアレイを形成し得るが、不連続領域の代表的な密度は、少なくとも約５０／ｃｍ２であり、しばしば少なくとも約１００／ｃｍ２であり、よりしばしば少なくとも約５００／ｃｍ２であり、そして時々少なくとも約１，０００／ｃｍ２である。本明細書中で使用される場合、ＤＮＡマイクロアレイは、標的ポリヌクレオチドを増幅またはクローニングするために使用される、チップまたは他の表面上に位置づけられるオリゴヌクレオチドプライマーのアレイである。アレイ中のプライマーの各特定の群の位置が既知であるので、標的ポリヌクレオチドの同一性は、マイクロアレイ上の特定の位置へのそれらの結合に基づいて決定され得る。
【００１２】
用語「標識」または「標識種」は、アッセイサンプルにおける標的ポリヌクレオチドの存在を示す検出可能なシグナルを生成可能な組成物をいう。適切な標識としては、放射性同位元素、ヌクレオチド発色団、酵素、基質、蛍光分子、化学発光部分、磁性粒子、ナノ粒子（例えば、量子ドット）、および生物発光部分が挙げられる。従って、標識は、分光学的手段、光化学的手段、生化学的手段、免疫化学的手段、電子工学的手段、光学的手段または化学的手段によって検出可能な任意の組成物である。
【００１３】
本明細書中で使用される場合、「生物学的サンプル」は、例えば、血液、血漿、血清、脊髄液、リンパ液、皮膚の外部切片、呼吸路の外部切片、腸管路の外部切片、および尿生殖器路の外部切片、涙、唾液、乳汁、（血液細胞を含むがこれに限定されない）細胞、腫瘍、器官、ならびにインビトロの細胞培養物成分のサンプルもまた含むがこれらに限定されない、個体から単離された組織または流体サンプルをいう。
【００１４】
本明細書中で使用される場合、用語「生物学的供給源」は、標的ポリヌクレオチドが由来する供給源をいう。この供給源は、細胞、組織または流体を含むがこれらに限定されない、上に記載されるような「サンプル」の任意の形態であり得る。「異なる生物学的供給源」は、同じ個体の異なる細胞／組織／器官、もしくは同じ種の異なる個体由来の細胞／組織／器官、または異なる種由来の細胞／組織／器官をいう。
【００１５】
「ポリヌクレオチド」とは、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態（リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれか）である。この用語は、分子の一次構造のみをいう。従って、この用語は、二本鎖および一本鎖のＤＮＡおよびＲＮＡ、ならびにＡ型、Ｂ型、Ｈ型およびＺ型ＤＮＡのような形態および三重鎖形態を含む。この用語はまた、公知の型の改変、例えば、当該分野で公知の標識、メチル化、「キャップ」、１つ以上の天然に存在するヌクレオチドのアナログへの置換、ヌクレオチド間改変（例えば、非荷電性結合を有する改変（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなどである）、ペンダント部分を有する改変（例えば、タンパク質（例えば、ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジンなどを含む）、インターカレーター（例えば、アクリジン、ソラレンなどである）を有する改変、キレート剤（例えば、金属、放射性金属などである）を含む改変、アルキル化剤を含む改変、改変された結合を有する改変（例えば、αアノマー核酸などである）のような）のような）、および非改変形態のポリヌクレオチドを含む。
【００１６】
本明細書中で使用される場合、用語、生物学的な「結合パートナー」もしくは「リガンド／アンチリガンド」または「リガンド／アンチリガンド複合体」は、他の分子を特異的に認識（例えば、結合）し、抗原−抗体、レクチン−炭水化物、核酸−核酸、ビオチン−アビジンなどのような結合複合体を形成する分子をいう。生物学的結合パートナーは、単一の分子の対に限定される必要はない。従って、例えば、単一のリガンドが、２つ以上の「アンチリガンド」の統合された作用によって結合され得る。
【００１７】
本明細書中で使用される場合、用語「リガンド」もしくは「分析物」または「マーカー」は、検出される任意の分子をいう。この用語は、リガンドを特異的または非特異的に結合するアンチリガンドとの相互作用を介して、あるいは誘電特性のようなリガンド独特の特性によって検出される。このリガンドは、一般的に、このリガンドのいくつかの部分の認識に起因して、このリガンドに特異的または非特異的に結合する別の分子（すなわち、アンチリガンド）が存在する任意の分子として規定される。例えば、このアンチリガンドは、抗体であり得、そしてリガンドはこの抗体に特異的に結合する抗原のような分子であり得る。この抗原が表面に結合し、抗体が、検出される分子である場合には、本明細書の目的のために、この抗体は、リガンドになり、この抗原は、アンチリガンドである。このリガンドはまた、細胞、細胞膜、細胞小器官およびその合成アナログからなり得る。
【００１８】
本発明を実施するために使用されるリガンドとしては、（抗体／エピトープ複合体を形成する）抗体、抗原、核酸（例えば、天然または合成のＤＮＡ、ＲＮＡ、ＧＤＮＡ、ＨＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡなど）、レクチン、砂糖（例えば、レクチン／砂糖複合体を形成する）糖タンパク質、レセプターおよびこれらの同族のリガンド（例えば、増殖因子およびそれらの関連レセプター、サイトカインおよびそれらの関連レセプター、シグナル伝達レセプターなど）、（天然産物または、コンビナトリアルライブラリーで開発され、保存される、合成アナログのいずれか由来の）薬物候補のような低分子、代謝産物、濫用性薬物およびそれらの代謝副産物、ビタミンのような補酵素ならびに他の天然に存在する化合物および合成化合物（生理学的流体、細胞、細胞性成分（細胞膜および関連する構造）で見られる酸素および他の気体、植物供給源および動物供給源で見られる他の天然産物、ならびに他の部分的または完全な合成産物など）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１９】
本明細書中で使用される場合、用語「結合事象」は、リガンドおよびアンチリガンドのような、少なくとも２つの分子の構造の間の相互作用または結合をいう。この相互作用は、２つの分子構造が、直接的または間接的に、物理的接触をする場合、または２つの構造が物理的に分離されているが、それらの間が電磁気学的に結合される場合、生じ得る。目的の結合事象の例としては、リガンド／レセプター、抗原／抗体、酵素／基質、ＤＮＡ／ＤＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡ、ＲＮＡ／ＲＮＡ、ハイブリッド、核酸ミスマッチ、相補的な核酸および核酸／タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、用語「結合事象」は、シグナル伝達経路に結合する、リガンド、またはアンチリガンド／リガンド複合体のような、本明細書に記載される単一分子または分子構造を称し得る。この場合、シグナル伝達経路は、第２の分子構造である。
【００２０】
本明細書中で使用される場合、用語「リガンド／アンチリガンド複合体」は、アンチリガンドに結合したリガンドをいう。この結合は、特異的でも非特異的でもよく、そして、この結合は、代表的には、共有結合、水素結合、免疫学的結合、Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｗａａｌｓ力、イオン間力、または他の型の結合であり得る。
【００２１】
本明細書中で使用される場合、分子および分子部分の点で用語「結合（ｃｏｕｐｌｉｎｇ）」は、分子の結合または会合をいう。これら結合または会合は、化学反応の結果としての、あるいは直接的または間接的な物理的相互作用、ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｗａａｌｓ相互作用、ロンドン力、または弱い相互作用の結果としての、あるいは磁気相互作用、静電相互作用、もしくは電磁相互作用の結果としての、特異的または非特異的な相互作用のいずれでもよい。
【００２２】
（結合体プローブ）
一般的に、アレイのプローブは、検出される標的分析物を捕捉し、結合する。プローブ捕捉部分または標的結合部分としては、核酸、ポリヌクレオチド、タンパク質、ペプチド核酸、低分子、および広範囲の生体分子が挙げられる。標的結合プローブ部分としては、抗体のエピトープ結合ドメインが挙げられる。
【００２３】
１つの局面において、本発明は、アレイの各点またはスポット内に、増大した数の分析物を包含する。スポット当たりの増大した数の分析物は、より多くの数の分析物部分を捕捉し得る共役プローブの組成物によって、達成される。例えば、ポリサッカリド共役体を含む共役プローブは、増大した分析物部分をマイクロアレイのスポット点に導くために使用される。
【００２４】
１つの実施形態において、結合体は、化学物質または生体分子に結合したポリマーから形成され、ここで、これらの化学物質または生体分子は、プローブを含み、それによって結合体プローブが形成する。このプローブを含む化学物質または生体分子は、共有結合によって、またはイオン相互作用または弱い結合力のような非共有的化学相互作用によってこのポリマーと結合される。このポリマーは、例えば直鎖または分枝鎖ポリサッカリドまたはオリゴサッカライドのような、直鎖ポリマーまたは分枝鎖ポリマーであり得る。
【００２５】
このポリマーは、層、ビーズ、ディスクまたはその混合物の形態で、固体組成物、ゲル組成物またはアモルファス組成物であり得、そして、均質または不均質であり、直鎖または分枝鎖であり、側鎖が分枝しており、分枝櫛形（ｃｏｍｂ）であり、あるいは星状または樹状（ｄｅｎｄｒｉｍｅｒｉｃ）であり得る。ポリマーの分枝は、長鎖分枝または短鎖分枝であり得る。これらのポリマーは、合成的手法によって作製され、または天然に存在する供給源から単離される天然産物として得られ得る。ポリマーの例としては、炭水化物、サッカライド、ホモポリサッカリド、ヘテロポリサッカリド、アガロース、アミロース、アミロペクチン、グリコーゲン、デキストラン、セルロース、キチン、キトサン、ペプチドグリカン、およびグリコサミノグリカンが挙げられる。いくつかの実施形態において、これらのポリマーは、高度に分枝されたデキストランである。さらなる実施形態において、ポリマーは、ヒドロゲルのような水和したデキストランもしくはアガロースであり、またはポリアクリルアミドゲルである。この結合体を作製するために使用されるポリマーの、さらなる例としては、オリゴヌクレオチド、ペプチド、ペプチド核酸、プロテオグリカン、糖タンパク質、および糖脂質が挙げられる。さらなる実施形態において、ポリマーは、抗体または抗体フラグメントであり得る。
【００２６】
結合体を作製するために有用なポリマーのさらなる例としては、ｇｅｍ−ジオール基およびｖｉｃ−ジオール基を有するポリマーのようなジオール含有ポリマーが挙げられる。別の例は、ＲＮＡ中のリン酸ジエステル結合のような、エステル基に近位のヒドロキシル基を有するポリマーである。
【００２７】
ポリマーのさらなる例は、ポリ（Ｔ）、ポリ（Ａ）、またはポリ（Ｕ）のような、合成ポリヌクレオチドまたは天然に存在するポリヌクレオチドである。
【００２８】
別の例は、複数のヒドロキシル基を有するポリマーである。これらのポリマー種の任意の混合物は、本発明の実施形態において使用され得る。
【００２９】
これらの結合体プローブは、化学物質または生体分子をポリマーに結合することによって調製される。共役体を調製する一般的な方法の例は、Ｇｒｅｇ  Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９６）に概説される。いくつかの実施形態において、結合体プローブは、化学物質または生体分子上の官能基または反応性基の、ポリマーとの共役反応によって調製され、これらの官能基または反応性基は、化学物質または生体分子をこのポリマーに結合する。化学物質または生体分子上の官能基または反応性基としては、例えば、アルデヒド基、ヒドロキシル基、アミンまたはアミノ基、カルボキシレート、スルフヒドリル基およびその混合体が挙げられる。
【００３０】
結合体プローブは、化学物質または生体分子をポリマーと結合または反応することによって調製され、ここで、このポリマーは、直接的または、リンカー基を介して間接的に、化学物質または生体分子の官能基または反応性基と結合するための複数の部位を含むように、誘導体化され得る。この誘導体化されたポリマーは、化学物質または生体分子を接着するために使用され得る反応性基を有する。この誘導体化されたポリマーの反応性基は、アルデヒド、ヒドロキシル、アミンまたはアミノ基、カルボキシレート、スルフヒドリル、イソチオシアネート、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ケトン、グリオキサール、エポキシド、オキシラン、イミドエステル、カルボジイミダゾール、アルキルホスフェート、無水物、マレイミド、アジリジン、アクリロイル、フルオロフェニル、ジアゾアセチル、Ｎ−アシルイミダゾール、スクシンイミジルカルボネート、カルボキシメチル基、イソシアネート、ヒドラジド基、アクリルアジド、およびそれらの混合体であり得る。
【００３１】
そのポリマーは、キトサン中に反応性アミン基（例えば、アミノ基）を有し得る。さらなる実施形態において、そのポリマーは、反応性官能基（例えば、スルフェート、カルボキシレート、またはホスフェート基）を有する。スルフェート含有ポリマーの例としては、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、硫酸ヘパリン、および硫酸ケラチンが、挙げられる。カルボキシレート含有ポリマーの例は、シアリン酸誘導体である基を含む多糖、アルドン酸誘導体である基を含む多糖、ウロン酸誘導体である基を含む多糖、オキソアルドン酸誘導体である基を含む多糖、およびアルコルビン酸誘導体である基を含む多糖である。
【００３２】
ホスフェート含有ポリマーの例としては、核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）が挙げられる。これらのポリマーは、二官能性リンカー（例えば、ホモ二官能性リンカー、ヘテロ二官能性リンカー）または多官能性リンカーを使用して、結合体プローブを生成するために化学物質または生体分子と結合され得る。例えは、その結合体プローブは、別のポリヌクレオチドと結合体化されたポリヌクレオチドポリマーであり得る。１つの例において、ＲＮＡは、結合体を生成するために化学物質または生体分子に結合するための、アルデヒド基を提供するように酸化される。
【００３３】
種々の化学物質または生体分子が、種々の標的と結合可能な結合体プローブを提供するために、そのポリマーに結合され得る。換言すると、単一ポリマー鎖が、結合体プローブを提供するために種々の化学物質または生体分子に結合され得る。結合体プローブの混合物が、本発明の一実施形態において使用され得る。
【００３４】
１つの実施形態において、結合体プローブを調製するために、そのポリマーおよび化学物質または生体分子の各々上のアミノ基が、ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）、ジスクシンイミジルタルタレート、またはジスクシンイミジルグルタレートを使用して、連結される。さらなる実施形態において、その化学物質または生体分子のスルフヒドリル基が、Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネートまたはｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを使用して、そのポリマーのアミン基と連結される。別の実施形態において、その化学物質または生体分子のスルフヒドリル基が、４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシル−ヒドラジドまたは３−（２−ピリジルジチオ）プロオピニルヒドラジドを使用して、そのポリマーのアルデヒド基と連結される。さらなる実施形態において、その化学物質または生体分子のスルフヒドリル基が、４−（ｐ−アジドサリチルアミド）ブチルアミンを使用して、そのポリマーのカルボキシレート基と連結される。
【００３５】
そのポリマーおよび化学物質または生体分子の各々上のアミノ基が、さらなる実施形態においては、ヘテロ二官能性架橋剤であるＮ−５−アジド−２−ニトロベンゾイルオキシスクシンイミドまたはＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミジル−４−アジドベンゾエートを使用して、連結され得る。
【００３６】
１つの実施形態において、その結合体化は、そのポリマーのヒドロキシル基をカルボニル化剤（例えば、Ｎ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾール）と反応させて中間体イミダゾリルカルバメートを形成することによって実施され、その中間体イミダゾイルカルバメートは、次いで、Ｎ−求核剤（例えば、アミン）、アミノ含有部分（例えば、ペプチドおよびタンパク質）と反応してＮ−アルキルカルバメート結合を生じ得る。
【００３７】
別の実施形態において、その結合体化は、そのポリマーのヒドロキシル基をＮ，Ｎ’−ジスクシンイミジルカルボネートと反応させ、その後、オリゴヌクレオチド上のアミノ含有部分（例えば、アミノ基）と反応させることによって、実施される。そのアミノ基は、そのオリゴヌクレオチドの末端アミノ基であっても、またはそのオリゴヌクレオチドの末端付近にあってもよい。
【００３８】
その結合体化は、そのポリマーを３−マレイミドプロピオン酸と反応させ、その後、その生成物である誘導体化ポリマーを、オリゴヌクレオチド上のアミノ基と反応させることによって、実施され得る。
【００３９】
別の実施形態において、その結合体化は、ポリマーのヒドロキシル基と、その化学物質または生体分子のアルキルハライド末端基と反応させて、そのプローブ結合体中にエーテル結合を生じさせることによって、実施される。
【００４０】
隣接する炭素原子上にヒドロキシル基を含むポリマー（例えば、糖質または糖タンパク質）は、過酸化ナトリウムと、そのポリマー上にアルデヒド官能基を生成するように反応され得、そのアルデヒド官能基は、化学物質または生体分子に結合させて結合体プローブを調製するために使用され得る。そのポリマー上のアルデヒド官能基と、アミン含有化学物質またはアミン含有生体分子とのその後の反応は、そのポリマーとその分子との間にシッフ塩基結合を生じる。そのシッフ塩基結合は、還元剤（例えば、水素化ホウ素ナトリウムまたはシアノ水素化ホウ素ナトリウム）と、そのポリマーとその化学物質またはその生体分子との間に二級アミン結合または三級アミン結合を生成するように、反応され得る。
【００４１】
さらなる実施形態において、結合体プローブは、光反応性架橋剤を使用して調製される。例えば、そのポリマーおよびその化学物質またはその生体分子の各々上のアミノ基が、光反応性架橋剤とカップリングされ得、それにより、そのポリマーが、連結基を介してその化学物質またはその生体分子とカップリングしている結合体が形成され得る。１つの例において、そのポリマーのアミノ基は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル−４−アジドサリチル酸とカップリングされ得、そしてその化学物質またはその生体分子のアミノ基が、その後、光分解によってカップリングされて、そのポリマーが、連結基を介してその化学物質またはその生体分子とカップリングされている結合体が形成され得る。
【００４２】
別の例において、その化学物質またはその生体分子のスルフヒドリル基が、１−（ｐ−アジドサリチルアミド）−４−（ヨードアセトアミド）ブタンとカップリングされ得、その後、そのポリマーのアミノ基が、光分解によってカップリングされて、そのポリマーが、連結基を介してその化学物質またはその生体分子とカップリングされている結合体が形成され得る。
【００４３】
別の例において、そのポリマーのアルデヒド基が、ｐ−アジドベンゾイルヒドラジドとカップリングされ得、その化学物質または生体分子のアミノ基が、その後、光分解によってカップリングされて、そのポリマーが、連結基を介してその化学物質または生体分子とカップリングされている結合体が形成され得る。
【００４４】
いくつかの実施形態において、アビジン−ビオチン相互作用が、この結合体化反応のために使用される。反応性基（例えば、アミノ、カルボキシレート、スルフヒドリル、およびカルボヒドレート）が、ビオチン化され得る。そのビオチン基が、アビジンまたはストレプトアビジンと結合するために使用され得、そのアビジンまたはストレプトアビジンは、標識を保有し得る。
【００４５】
アレイを作製するためのそのセンサーの表面への結合体プローブのカップリングは、多数の方法で実施され得る。例えば、その表面が、エポキシドで誘導体化され得、そのエポキシドは、その結合体プローブ中の反応性−ＯＨ基または反応性−ＮＨ２−基と反応し得る。別の例において、そのセンサー表面は、ポリ（リジン）で処理され、そして結合体プローブまたはその生体分子が、その表面上にスポットされる。その結合体プローブまたは生体分子を基材（例えば、スライドガラスまたは電子デバイスに近接するパシベーション層）と架橋させるために、必要に応じて、ＵＶ照射が使用され得る。結合体プローブまたはオリゴヌクレオチドが、アルデヒド基、アミン基、またはイソチオシアニド基で誘導体化されているセンサー表面にカップリングされ得る。そのアレイの形成機構は、スポッティング、インクジェットプリンティング、または直接のチップ上合成であり得る。
【００４６】
さらに、そのプローブは、ロボットシステム（例えば、Ｇｅｎｅｔｉｃ  ＭｉｃｒｏＳｙｓｔｅｍｓ（Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ）、ＧｅｎｅＭａｃｈｉｎｅｓ（Ｓａｎ  Ｃａｒｌｏｓ，ＣＡ）またはＣａｒｔｅｓｉａｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）、またはＰａｃｋａｒｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）により製造されるロボットシステム）を使用して、固体支持体に適用され得る。
【００４７】
その検出アレイ層にリガンドを結合することに関与する代表的化学は、一般的に、そのリガンドおよびそのリガンドが結合する任意のアンチリガンドの性質、ならびにそのアッセイにおけるそれらの機能に依存する。その表面上で生じ得る可能な相互作用の型の列挙としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：タンパク質／タンパク質相互作用、ＤＮＡ／タンパク質相互作用、ＲＮＡ／タンパク質相互作用、核酸ハイブリダイゼーション（塩基対ミスマッチ分析を含む）、ＲＮＡ／ＲＮＡ相互作用、ＴＲＮＡ相互作用、酵素／基質系、抗原／抗体相互作用、低分子／タンパク質相互作用、薬物／レセプター相互作用、膜／レセプター相互作用、固相リガンドにおけるコンフォメーション変化、タンパク質／糖質相互作用、および脂質／タンパク質相互作用。
【００４８】
実際の表面化学は、１つの実施形態において、一次結合および二次結合として記載され得る。分子結合のさらなる領域もまた、生じ得る。一次結合は、その検出表面へのアンチリガンドの結合を指し、その結合は、リンカー分子の補助を介してなされ得る。
【００４９】
１つの実施形態において、本発明は、調製された固体支持体を提供し、その固体支持体は、固定されているかまたは固定されていない、別個のオリゴヌクレオチドプローブ群を含む。そのプローブは、例えば、標準的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プローブ選択プログラム（例えば、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから得られるＰｒｏｂｅ３）を使用して、選択または設計され得る。
【００５０】
その固相支持体は、約５〜約１００平方マイクロメートルの領域を提供し得、その領域上に、約１００，０００個までのプローブ群が、所定のパターンに従って別個領域に固定され得る。その調製された固体支持体は、その支持体上の所定の任意の位置での、そのプローブまたはプローブ対の配列についての関連する記録または電子記録を有し得、従って、その支持体上の増幅された標的の位置が、同様に同定され得る。
【００５１】
参照配列の特定の領域に対応する各群内のプローブの数は、そのマイクロアレイでの計画されたその後の増幅反応の必要性によって、決定および制限され得る。従って、例えば、そのマイクロアレイ上の特定の部位でＰＣＲ増幅を実行するために必要であるとみなされるプローブの数は、特に、反応体積および標的テンプレートポリヌクレオチド分子の予定数、ならびに提唱されるＰＣＲサイクル数を考慮すると、どの程度の数のオリゴヌクレオチドプローブコピーが、首尾良い反応を確実にするためにその支持体上の各位置で群として適用されるかを正確に決定するのに役立つ。時に、プローブの量（すなわち、プローブ分子数またはプローブ濃度）は、所定の固体支持体上の各位置で（例えば、標的ポリヌクレオチドの約１００，０００個までの領域を増幅または検出するために、１０００〜１０，０００個、約１００，０００個までのプローブ群を有するＤＮＡマイクロアレイ形式で）ほぼ同じである。
【００５２】
任意の核酸含有プローブが、核酸塩基の微小な欠失、付加、および／または置換を含み得ることが、理解される。
【００５３】
オリゴヌクレオチドプローブは、核酸中に通常見出される天然に存在する複素環式塩基（ウラシル、シトシン、チミン、アデニン、およびグアニン）、ならびに改変塩基および塩基アナログを含む。標的配列へのそのプローブのハイブリダイゼーションと適合性である任意の改変塩基または塩基アナログが、本発明の実施において有用である。
【００５４】
そのポリヌクレオチドプローブの糖部分またはグリコシド部分は、デオキシリボース、リボース、および／またはこれらの糖の改変形態（例えば、２’−Ｏ−アルキルリボース）を含み得る。好ましい実施形態において、その糖部分は、２’−デオキシリボースであるが、標的配列にハイブリダイズするそのプローブの能力と適合性である任意の糖部分が、使用され得る。
【００５５】
１つの実施形態において、そのプローブのヌクレオシド単位は、当該分野で周知であるように、ホスホジエステル骨格により連結される。さらなる実施形態において、ヌクレオチド間結合は、そのプローブの特異的ハイブリダイゼーションと適合性である任意の結合（ホスホロチオエート結合、メチルホスホネート結合、スルファメート結合（例えば、米国特許第５，４７０，９６７号）およびポリアミド結合（すなわち、ペプチド核酸）を含むが、これらに限定されない）を包含し得る。ペプチド核酸は、Ｎｉｅｌｓｅｎら（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１４９７−１５００、米国特許第５，７１４，３３１号、およびＮｉｅｌｓｅｎ（１９９９）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０：７１−７５に記載される。
【００５６】
特定の実施形態において、そのプローブは、キメラ分子であり得；すなわち、１つより多くの型の塩基または糖サブユニットを含み得、そして／またはその結合は、同じプローブ内の１つより多くの型であり得る。
【００５７】
そのプローブは、当該分野で公知であるように、その標的配列へのハイブリダイゼーションを促進する部分（例えば、インターカレート剤および／または副溝結合剤）を含み得る。
【００５８】
塩基、糖、およびヌクレオシド間骨格のバリエーション、ならびにそのプローブ上になんらかのペンダント基が存在することは、配列特異的な様式でそのプローブがその標的配列と結合する能力と、適合性である。多数の構造的改変（既知の改変、および開発される改変の両方）が、これらの結合内で可能である。さらに、そのプローブを形成する種々の複素環式塩基、糖、ヌクレオシド、およびヌクレオチドを調製するための合成法、ならびに特定の所定の配列のオリゴヌクレオチドの調製は、当該分野において十分に発展しており、そして公知である。オリゴヌクレオチド合成のための１つの方法は、米国特許第５，４１９，９６６号の教示を組み込む。
【００５９】
そのオリゴヌクレオチドプローブは、特定のＰＣＲまたはその後の操作（例えば、増幅された標的ポリヌクレオチドの単離）を補助し容易にする、任意の特別のさらなる部分または配列を用いて、設計され得る。例えば、プローブは、その標的配列に対して相補的である配列に加えて、配列を含み得る。そのような配列は、通常は、そのプローブにおいて、標的相補的配列の上流（すなわち、５’側）にある。例えば、１つ以上の制限酵素認識部位を含む配列（いわゆる、「リンカー」または「アダプター」）が、標的相補的配列の上流にプローブ中に存在する場合に、増幅産物のクローニングおよびその後の操作を容易にする。プローブ中に含めるための他の有用な配列としては、配列決定プローブと相補的な配列、およびバクテリオファージＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、および／またはＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼ）のプロモーターを特定する配列が、挙げられる。
【００６０】
本発明の１つの局面において、そのマイクロアレイプローブは、その標的ポリヌクレオチド中の目的領域全体を網羅するためのタイリング（ｔｉｌｉｎｇ）法によって、規定される。例えば、第１のプローブ群は、その群内の各プローブの配列が、目的領域の最も５’側の部分と対応するように設計される；第２のプローブ群は、その第１群からその領域の３’末端の方に１ヌクレオチド分「シフト」された配列を有する；そして第３のプローブ群は、その第２群からその領域の３’末端の方に１ヌクレオチド分「シフト」された配列を有する；などのようである。理論上、そうすると、プローブ群の数は、目的領域中のヌクレオチド数と等しい。当然、その領域の特定の部分に対応する各プローブ群内に、上記のような４つの異なる３’末端を備える、少なくとも４つのプローブセットが存在する。複数の標的ポリヌクレオチドが、本発明に従って検出されるべき場合、特定の標的ポリヌクレオチドに対応する各プローブ群は、そのマイクロアレイの別個領域中に存在する。
【００６１】
（デジタル画像バイオセンサーシステム）
本発明の１つの局面において、バイオセンサーシステムを用いる分析物の検出は、そのアレイに結合した分析物からのシグナルを、より少ないバックグラウンドで、相応して、もっと高いシグナル対ノイズ比で読み出すために使用され得る、デジタル画像または「機械視覚」感知技術を使用することによって、増強される。１つの実施形態において、そのバイオセンサーシステムは、デジタル画像感知技術を使用し、この技術は、ドーターボード上のデジタル画像センサー、結合体プローブのアレイ、そのセンサーに熱冷却を提供し得るそのセンサーのエンクロージャー、ならびに分析物シグナルを積分する方法を含む。
【００６２】
１つの実施形態において、捕捉種（例えば、結合体プローブ）を含むアレイからの光学的シグナルは、デジタル画像センサーを使用して検出される。そのデジタル画像センサーは、光センサー素子のマトリクスを備える。その結合体プローブは、そのデジタル画像センサー上のアレイ中にスポットされ得、そして、そのデジタル画像センサーの表面に、共有結合または非共有結合のいずれかをされ得る。別の実施形態において、そのアレイは、そのデジタル画像センサーに近接して配置され得るスライドガラス上にスポットされる。そのような実施形態において、光ファイバー結合器が、必要に応じて、そのスライドガラスとそのセンサーとの間に配置される。
【００６３】
そのアレイにおける各々の別個のプローブスポットの限局的な領域は、デジタル画像センサー中の個々の光センサー素子の領域よりも大きくあり得る。代表的には、プローブスポットと個々の光センサーとの間に、１対１対応は存在しない。あるいは、そのプローブスポットは、個々の光センサー素子とほぼ同じサイズであり得る。
【００６４】
そのデジタル画像センサーは、１つの実施形態において、相補的金属酸化物半導体（ＣＭＯＳ）画像センサーである。そのＣＭＯＳ画像センサーの各センサーは、光ダイオードセルを備え、その光ダイオードセルは、それ自体のアナログ−デジタル変換器、増幅器、およびレジスタに連結されている。そのＣＭＯＳ画像センサーの最上層は、パシベーション層（これは、実質的に光透過性である二酸化ケイ素であり得る）であり、そのアレイに送達されるべき分析物溶液から半導体回路を保護するための流体バリアとして役立つ。このパシベーション層はまた、伝導性透過性材料であり得る。
【００６５】
１つの局面において、本発明は、検出される種からのシグナルを、デジタル画像センサーを用いてそのシグナルを検出することによって増強することに関し、このデジタル画像センサーにおいて、そのアレイは、デジタル画像センサー上に直接形成されている。１つの実施形態において、分析物の化学発光放射の光学的検出が、デジタル画像センサーの頂部にある薄いバシベーション層上に形成されたアレイを用いて実施される。この実施形態において、シグナルは、そのデジタル画像センサーの光電性素子にそのアレイを接近させることによって、有利に増強される。
【００６６】
本発明の別の局面において、そのセンサーデバイスまたはセンサーシステムは、画像センサー検出器上に衝突するバックグラウンド放射を減少させることによって、分析物アレイの光シグナルの測定のシグナル対ノイズ比の増加を提供する。図１の実施形態において示されるように、エンクロージャー１００が、その光学画像センサーおよびそのアレイを含むように提供される。そのエンクロージャー１００は、頂部シェル（ｓｈｅｌｌ）１６０および底部シェル１８０を備える。この底部シェル１８０は、光学画像センサーのためのプリント回路基板、そのセンサーのための光学的冷却素子を支持し、そしてその頂部シェル１６０を機械的に受容する。図１の実施形態において、その光学画像センサーのためのプリント回路基板が、第２のエンクロージャー１５０内に含まれる。その回路基板および第２のエンクロージャーは、端コネクター３６０に取り付けられている。その頂部シェル１６０は、底部シェル１８０により受容された場合、そのアレイ１２０を密閉して取り囲むバリア２００によって規定される、低光領域３００を提供する。流体が、そのバリア２００により規定されるその低光領域中のそのアレイと接触する。
【００６７】
図２に例示される別の実施形態において、流体侵入口２４０は、底部シェル１８０に提供される。操作の際に、流体は、流体侵入口２４０を介して液体含有標的分子を注入することによってアレイ１２０に負荷される。この流体は、低光量領域３００にプールする。必要に応じて、キャピラリー構造または流体チャネル１０４は、エンクロージャー１００内に形成されて流体侵入口２４０からアレイ１２０に分析物が送達される。流体侵入口２４０は、必要に応じて、隔壁２４４を備え、ここを介して流体が導入される。この隔壁は、流体および光の両方についてのバリアである。
【００６８】
いくつかの代替の実施形態において、例えば、蛍光検出が使用される場合、低光量領域３００に存在する流体を有する必要はない。これらの実施形態において、流体を、流体侵入口２４０で注入して画像センサーの冷却を提供し得る。
【００６９】
図２の実施形態において、任意のレンズが、低光量領域３００に隣接する頂部シェル１６０に提供される。シーラント２６８（例えば、発砲エラストマー）およびｏ−リングはまた、低光量領域３００の封入を補助するために提供される。
【００７０】
エンクロージャー１００は、読取り位置４００に連結され、その結果、アレイは、実質的に重力レベルである。必要に応じて、このエンクロージャーは、読取り位置に付着され得、そして任意の重力方向に操作され得る。これらの任意の実施形態において、流体侵入口およびエンクロージャーは、表面張力、および任意の方向におけるキャピラリー効果によって、分析物アレイシグナルが読み取られ得る程度にまで分析流体を内包し得る。
【００７１】
図１および２の実施形態において例示されるように、光学画像化センサー１４０を支持するプリントされた回路基板３８０は、電気的エッジコネクタ３６０を介して読取り位置４００に電気的に連結される。光学画像化センサー１４０は、安定性および保護のために、エポキシ２４８で確保され得、そして部分的に内包され得る。必要に応じて、底部シェル１８０は、光学画像化センサー１４０の電気的回路にアクセスするための開口部を提供する。
【００７２】
１つの実施形態において、バイオセンサーシステムが、提供され、これは、分析物シグナルを積分して分析物の検出のシグナル対ノイズの比を増加させる。積分は、アレイより生じる光についての検出器のフレーム補正時間を増加させることによって、実施され得る。分析物シグナルを積分するために、データ移入の方法が、ＣＭＯＳ画像化センサーを使用して提供される。典型的なＣＭＯＳ画像化センサーは、迅速なフレーム速度デバイスであり、これは、ビデオカメラ適用において使用され得る。１つの実施形態において、ＣＭＯＳ画像化センサーは、このセンサー上に衝突するアレイシグナルを積分するために、かなり遅いレジームにおいて操作される。この実施形態において、積分されたシグナルは、メモリ内に保存され、この積分は、繰り返され、分析物シグナルの経時的な変化速度が観察される。ＣＭＯＳ画像化センサーのフレーム補正時間は、制御され得、例えば、０時間時に全てのチップ上のレジスターをクリアすることによって分析物検出を積分し得、次いで、固定した期間にわたる分析物放射シグナルを回収し得る。いくつかの実施形態において、画像化センサーの個々の光センサーエレメントは、異なる期間にわたって同時積分を行う。分析物シグナルの積分は、そのシグナル対ノイズの比を増加させ、そして分析物の検出を増強させて、低濃度の分析物の検出を可能にする。
【００７３】
１つの実施形態において、分析物シグナルは、低光量エンクロージャー内のセンサーを冷却することによりＣＭＯＳが増加センサーに固有の「暗電流」ノイズを低減させることによって、増強される。このセンサーは、熱電エレメントによって、ノズル拡張または冷蔵冷却法によって、または冷却された流体中の液浸によって、冷却され得る。ノイズの約２分の１低減は、センサーを７℃まで冷却することによって観察され、そしてセンサーを４℃まで冷却することによって、室温と比較して約１０倍ノイズを低減させる。いくつかの実施形態において、流体（サンプル分子を含んでも含まなくてもよい）が、センサーの冷却を提供するために低光量エンクロージャーに注入される。
【００７４】
（分析物アレイシグナル）
結合体プローブに結合した分析物の光学的検出としては、蛍光法、化学発光法、生物発光法、比色法、吸収法、および量子ドット法による検出が挙げられる。標識種またはシグナル分子は、ポリマーに、結合体プローブのプローブに、または標的混合物中の分析物に付着される。標識種またはシグナル分子の例としては、放射性同位元素、蛍光剤、化学発光剤、ケミルミノフォア（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｏｐｈｏｒｅ）、生物発光剤、酵素、抗体、および粒子（例えば、磁気粒子および量子ドット）が挙げられる。短いアミン誘導性オリゴヌクレオチドに付着した蛍光色素分子が、標識種として使用され得、ここで、アミン基は、結合体のポリマーに結合される。分析物検出に使用されるシグナル分子としては、放射標識、蛍光色素（例えば、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｏｕｒ  ４８８、フルオレセイン、ローダミン、Ｔｅｘａｓ  ｒｅｄ、ローズベンガル（ｒｏｓｅ  ｂｅｎｇａｌ）、ダンシルクロリド、エチジウムブロミド、アミノナフタレン、ピレン、およびポルフィリン）、化学発光系（例えば、ルミノール、ジオキシエタン（ｄｉｏｘｅｔａｎｅ）、アクリジニウムフェニルエステル、およびルテニウム塩）、発色団および比色プローブ（例えば、コロイド金、アゾ色素、キノリン色素およびシアニン色素）が挙げられる。
【００７５】
分析物の検出についての種々のスキームが、Ｍ．ＳｃｈｅｎａおよびＲ．Ｗ．Ｄａｖｉｓ、ＤＮＡ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｍ．Ｓｃｈｅｎａ編、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９９９）に記載されている。
【００７６】
使用される標識種の例としては、アゴニストおよびアンタゴニスト、毒素、エピトープ、ホルモン、抗体、ペプチド、酵素、オリゴヌクレオチド、ペプチド核酸、レクチン、炭水化物、タンパク質および薬物が挙げられる。例えば、ＥＬＩＳＡアッセイで使用される酵素は、蛍光検出について使用され得る。別の例は、蛍光標識されたアビジンまたはストレプトアビジンである。
【００７７】
いくつかの実施形態において、１つより多い型の標識種を使用して、特定の分析物についての１つより多い検出法を提供し得る。結合体プローブのポリマーは、例えば、複数の蛍光標識種および化学発光標識種に結合され得る。上記のように、いくつかの実施形態において、結合体化プローブは、１つより多い標的を結合し得る。よって、いくつかの実施形態において、結合体化プローブのポリマーは、複数の標的結合分子および複数の異なる標識種に結合され得る。
【００７８】
蛍光検出について、アレイスポット励起光は、アレイに隣接する、またはＣＭＯＳセンサーエンクロージャーに隣接するＬＥＤパネルによって提供され得る。蛍光法において、狭いバンドのフィルタを、アレイスポットとフォトダイオードとの間でアレイに隣接して使用して、アレイの読出しシグナルからの励起シグナルを除去し得、そして検出のための放射光を選択し得る。
【００７９】
別の方法において、分析物シグナルは、化学発光の光学的検出によるアレイ情報を提供するために読み出され得る。化学発光は、化学反応により生成される光より生じ、これは、フィルタ（例えば、ＣＭＯＳ画像化センサー）なしに広帯域検出器により検出され得る。アレイスポットからの光は、直接検出され、そしてバックグラウンドシグナルは、主に周囲光および「暗電流」に起因する。分析物は、化学発光タグで誘導体化され得る。例えば、アルカリホスファターゼまたは西洋ワサビペルオキシダーゼが、化学発光検出に使用され得る。検出の効率は、一部、タグを標的へ選択的または特異的に付着する効率に依存する。標識は、酵素検出系、続く化学発光反応（これは、化学結合切断から放出されるエネルギーを比較波長の光子へ変換する）によって認識され得るビオチンまたはジオキシゲニンのいずれかであり得る。結合切断または化学反応より生成される光を安定化させる分子（また、化学発光増幅剤（ｅｎｈａｎｃｅｒ）と呼ばれる）は、化学発光検出に使用され得る。
【００８０】
シグナル分子または色素分子の数  対  プローブ分子の数（これは、結合体プローブまたはポリマーに結合されている）の比は、実質的に変動し得る。いくつかの実施形態において、シグナル分子対プローブ分子の比は、少なくとも３、４または５である。しばしば、シグナル分子対プローブ分子の比は、少なくとも６、７、８または９である。しばしば、シグナル分子対プローブ分子の比は、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００である。シグナル分子とプローブ分子との種々の組合わせを使用して、結合体プローブを形成し得る。
【００８１】
本発明のいくつかの実施形態において、アレイシグナルは、ディジタル画像化センサーによって検出され得る。他の実施形態において、検出は、電荷結合素子（ＣＣＤ）、光電子増倍（ＰＭＴ）またはアバランシェフォトダイオードを用いて達成され得る。この分析物の測定はまた、例えば、電気的コンダクタンス検出による種々のアレイスキームにおいて行われ得る。
【００８２】
本発明の別の局面は、工業分野、環境分野、生物医学分野およびバイオテクノロジー分野における結合体プローブの適用に関する。本発明の結合体プローブは、分析適用または診断適用において使用され得、そして液相、気体相または固相において分析物を検出され得る。結合体プローブは、分析物中または水溶液、非水相もしくはガス相中の有機粒子、無機粒子または周囲粒子を検出するために、バイオセンサーに積分および使用され得る。
【００８３】
増幅または標識された標識ポリヌクレオチドの検出は、標識された配列に使用された方法（例えば、増幅または新たに合成されたＤＮＡ鎖に組み込まれた標識を検出する工程を包含する）によって行われ得る。よって、例えば、蛍光標識または放射標識は、直接検出され得る。他の標識技術は、抗体または他の結合分子（例えば、ストレプトアビジン）によって検出される鎖合成の間に、標識されているかまたは標識分子自体を結合し得るかのいずれかであるＤＮＡに組み込まれる標識（例えば、ビオチンまたはジオキシゲニン）を必要とし得る。例えば、標識分子は、例えば、蛍光分子（例えば、フルオレセインイソチオシアネート、Ｔｅｘａｓ  ｒｅｄおよびローダミン）、または酵素的に活性化可能な分子のいずれかに結合体化された、抗ストレプトアビジン抗体または抗ジオキシゲニン抗体であり得る。たとえ、新たに合成された分子上の標識、そして、この標識が、ＤＮＡに直接であるか、またはＤＮＡを結合する（またはＤＮＡを結合する分子を結合する）分子に結合体化されているとしても、この標識（例えば、蛍光、酵素、化学発光または比色）は、標識に依存して種々の技術（レーザスキャナ、ＣＣＤカメラまたはＸ線フィルムを含む）、または特定の標識を検出するための他の適切な手段によって検出され得る。
【００８４】
標的ポリヌクレオチドは、増幅されたＤＮＡにＰＣＲ増幅の間に組み込まれた標識ヌクレオチド（例えば、直接標識のためのｄＮＴＰ−蛍光標識；間接標識のためのｄＮＴＰ−ビオチンまたはｄＮＴＰ−ジオキシゲニン）を使用することによって検出され得る。間接標識されたＤＮＡについて、検出は、ストレプトアビジンまたは抗ジオキシゲニン抗体と結合体化された、蛍光または他の酵素によって行われる。ＰＣＲ法は、ポリヌクレオチド標的に対して新たに合成された相補体中に組み込まれた標識を検出することによるポリヌクレオチドの検出を、典型的に使用する。この目的のために、合成される場合にＤＮＡに組み込まれ得る任意の標識（例えば、上記のような、フルオロ−ｄＮＴＰ、ビオチン−ｄＮＴＰ、またはジオキシゲニン−ｄＮＴＰ）が、使用され得る。１つ以上の普遍的（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ）プライマーを溶液中で使用して行われるＰＣＲ増幅は、この普遍的プライマーの検出によって固体支持体上での位置で増幅した標的を検出するためのオプションを提供する。よって、１つより多い普遍的プライマーが使用される場合、異なる供給源由来の標的鎖は、固体支持体上で差示的に検出され得る。
【００８５】
適切な蛍光標識のさらなる例としては、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、５，６−カルボキシメチルフルオレセイン、Ｔｅｘａｓ  ｒｅｄ、ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾル−４−イル（ＮＢＤ）、クマリン、ダンシルクロリド、ローダミン、４’−６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ｐｈｅｎｙｌｉｎｏｄｏｌｅ）（ＤＡＰＩ）、ならびにシアニン色素Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５およびＣｙ７が挙げられる。しばしば、蛍光色素は、フルオレセイン（５−カルボキシフルオレセイン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）またはローダミン（５，６−テトラメチルローダミン）である。時折、コンビナトリアル多色（ｍｕｌｔｉｃｏｌｏｒ）コード化についての蛍光標識は、ＦＩＴＣ、およびシアニン色素Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５およびＣｙ７である。これらの蛍光（ｆｌｏｕｒ）についてのそれぞれの最大吸収および最大放射は：ＦＩＴＣ（４９０ｎｍ；５２０ｎｍ）、Ｃｙ３（５５４ｎｍ；５６８ｎｍ）、Ｃｙ３．５（５８１ｎｍ；５８８ｎｍ）、Ｃｙ５（６５２ｎｍ；６７２ｎｍ）、Ｃｙ５．５（６８２ｎｍ；７０３ｎｍ）およびＣｙ７（７５５ｎｍ；７７８ｎｍ）であり、よって同時検出を可能にする。
【００８６】
標識されたヌクレオチドは、時折標識の検出にために使用される。なぜなら、これらは、合成中に直接組み込まれ得るからである。増幅したＤＮＡまたはＲＮＡに組み込まれ得る検出標識の例としては、ヌクレオチドアナログ（例えば、ＢｒｄＵｒｄ（ＨｏｙおよびＳｃｈｉｍｋｅ、Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２９０：２１７−２３０（１９９３））、ＢｒＵＴＰ（Ｗａｎｓｉｃｋら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １２２：２８３−２９３（１９９３））およびビオチンで改変されたヌクレオチド（Ｌａｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：６６３３（１９８１））、または適切なハプテン（例えば、ジオキシゲニン（Ｋｅｒｋｈｏｆ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０５：３５９−３６４（１９９２）））で改変されたヌクレオチドが挙げられる。フルオレセイン標識されたヌクレオチドは、フルオレセイン−イソチオシアネート−ｄＵＴＰ、シアニン−３−ｄＵＴＰおよびシアニン−５−ｄＵＴＰ（Ｙｕら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２２：３２２６−３２３２（１９９４））である。ＤＮＡについての有用なヌクレオチドアナログ検出標識は、ＢｒｄＵｒｄ（ＢＵＤＲ三リン酸、Ｓｉｇｍａ）であり、そしてＲＮＡについての有用なヌクレオチドアナログ検出標識は、ビオチン−１６−ウリジン−５’−三リン酸（Ｂｉｏｔｉｎ−１６−ｄＵＴＰ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｈｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）である。フルオレセイン、Ｃｙ３およびＣｙ５は、直接標識のためにｄＵＴＰに連結され得る。Ｃｙ３．５およびＣｙ７は、ビオチン標識化プローブまたはジオキシゲニン標識化プローブの二次検出のための、アビジンまたは抗ジオキシゲニン結合体として利用可能である。
【００８７】
１つの実施形態において、本発明を使用して、分子構造のシグナル経路への結合を検出する。この実施形態において、シグナルは、シグナル経路に沿って伝播する。シグナルが伝播するにつれて、そのシグナルは、その結合した構造に連結し、そして調節される。調節された応答の分析は、結合を示す。
【００８８】
別の実施形態において、本発明を使用して、二次結合を同定し得る。例えば、一次結合は、伝導性表面に対する抗体の付加であり得る。二次結合は、固定化された抗体と溶液中のその抗原との間の結合を測定することを含み得る。一次結合が以前の段落に記載されるように検出された後に、抗体を含有する溶液が、バイオアッセイデバイスに添加され、そしてその応答が再度測定される。この応答は、一次結合応答に比較される。変化は、結合事象が生じたことを示す。
【００８９】
別の実施形態において、本発明は、アッセイ形式において使用され得る。センサーデバイスまたはバイオセンサー系は、各々が特定の抗リガンドに結合された複数のアドレス可能な部位を有する。デバイスに溶液を送達した後、各部位での結合応答が測定され、そして特徴付けられる。この方のデバイスを使用して、サンプル中の特定の核酸配列の存在を測定および／または同定し得る。アドレス可能な部位の各々で、独特な核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ）配列が、抗リガンドとして付着される。このサンプルへの曝露に際して、相補配列は、適切な部位に結合する。各部位での応答は、配列が結合しているか否かを決定する。このような測定はまた、結合した配列が抗リガンド配列と完全に一致するか否か、または１つまたは複数のミスマッチが存在するか否かを示す。この実施形態をまた使用して、タンパク質、およびタンパク質のクラスを同定し得る。
【００９０】
別の実施形態において、本発明を使用して、引き続いて未知の濃度の特定の分析物またはリガンドを測定するための、標準曲線または力価曲線を生成し得る。例えば、センサーデバイスまたはバイオセンサー系に付着され得る抗体が、使用され得る。このデバイスは、いくつかの異なる濃度のリガンドに曝露され得、そして測定される各濃度に対する応答が測定され得る。このような曲線はまた、用量応答曲線として当業者に公知である。未知のサンプルが、このデバイスに曝露され得、そしてその応答が測定される。その応答を標準曲線と比較して、未知のサンプル中のリガンドの濃度を測定し得る。
【００９１】
しばしば、所定の分子の特定の品質を決定することが、所望され得る。タンパク質がどのクラスに属するのか、または所定の遺伝子もしくは他の核酸配列がどの型の多型であるのかを決定することが、例として挙げられる。これは、多くの方法で行われる。タンパク質は、しばしば、構造的相同性の数および型、またはタンパク質の同一または類似のクラスに見出される特定の下部構造によって分類される。例えば、細胞膜に一般に見出され、そして細胞外環境と細胞内環境との間のシグナル伝達経路を媒介するＧ−タンパク質は、細胞膜を７回貫通する構造を常に有する。このような構造は、Ｇ−タンパク質の視覚的な定義である。他のクラスのタンパク質は、同様な構造相同性を有し、そしてそれ自体、あるクラスのタンパク質を別のクラスのタンパク質から、これらのタンパク質の相同性に基づいて区別し得る任意の方法は、多くの生物医学研究分野における莫大な用途の１つである。所定の分子の誘電体特性がその分子の電荷分布の幾何学によって全体的に決定され、そしてほとんどのタンパク質が独特な構造または幾何学を有する場合、次いで、各タンパク質は、そのタンパク質の誘電体特性を測定することにより独自に決定され得る。よって、単純な誘電サイン（例えば、本発明によって作製される誘導サイン）は、所定のタンパク質を同定するように働き得、そしてさらに、そのタンパク質を、以前から公知のいくつかのクラスのタンパク質に分類することを可能にし得る。さらなる改良点が、所定のタンパク質の特定の下部構造に特異的であるバイオアッセイデバイスにおいて抗リガンドの群を使用することによる分類方法論に加えられ得る。例えば、ドメインのような特定の下部構造に特異的なある群の抗体は、その下部構造の存在または非存在の決定に利用され得る。よって、任意の所定のタンパク質は、特定の下部構造、およびそのタンパク質自体の誘電体特性の、存在および非存在の両方を決定することによって特徴付けられ得る。この分類戦略に対するさらなる改良点は、温度、ｐＨ、イオン強度、および上記した特性に対する他の環境効果を見出すことを含み得る。
【００９２】
核酸はまた、類似のパラダイムに従うことによって特徴付けられ得る。例えば、所与の遺伝子が、特定の塩基対配列を有することが公知であり得る。しばしば、天然に、この配列に小さな変動が存在する。例えば、多くの細胞膜中の塩素イオン輸送チャネルをコードする遺伝子内には、共通の単一塩基対変異または変化が存在する。このような変化は、ヒトにおいて、嚢胞性線維症と呼ばれる疾患を導く。このように、小さな変動に関して所与の核酸配列を特徴付けることは、非常に重要である。このような変動は、しばしば、多型と呼ばれ、そしてこのような多型は、現在、公知の多型のそれぞれに対する相補鎖を形成することによって検出される。任意の所与の遺伝子が数百または数千もの多型のうちのいずれか１つの形態を取り得るので、各多型についての相補鎖を作製することは、しばしば、骨の折れる仕事である。本明細書中に記載される発明を使用して、非相補的な結合またはハイブリダイゼーションは、先のパラグラフに記載された物理的性質と同じ多くの物理的性質を測定することによって検出および区別され得る：ハイブリダイゼーション事象の誘電的性質が、特徴付けられ得、そして公知のデータに関連付けられ得、それによって生じたハイブリダイゼーションの型（完全または不完全のいずれか）を決定し得る。このように、所与の核酸配列によって構成されるアンチリガンド（ａｎｔｉｌｉｇａｎｄ）を用いて、数百の異なる多型（リガンドとして）は、結合事象の特徴付けによって検出され得る。当業者は、さらなる洗練（例えば、ハイブリダイゼーションプロセスを変更するためにストリンジェンシー条件を変更するか、または温度を変更し、そして融点を決定すること）が可能であることを理解し、これが、ハイブリダイゼーションプロセスの性質の別の指標として役立つ。
【００９３】
１つの実施形態において、薬物−レセプター相互作用は、所与の結合事象が、レセプターをオンもしくはオフにするか、またはいくつかの他の形態のアロステリック効果を生じるかを決定するために特徴付けられ得る。例えば、所与のレセプターは、アンチリガンドとして使用され得、そして公知のアゴニストが第１リガンドとして使用され得る。この相互作用は、誘電特性または他の特性に従って特徴付けられる。薬物候補についてスクリーニングされる化合物は、レセプターとのそれらの結合特性について試験され得る。例えば、結合し、そして公知のアゴニストと類似の特性の値を生じる候補は、アゴニストである可能性がより高い。この方法は、任意の型の目的の標的−レセプター結合事象、または他のクラスの結合事象を特徴付けるために使用され得る。
【００９４】
１つの実施形態において、結合体プローブは、ＥＬＩＳＡアッセイと類似のイムノソルベントアッセイ、または免疫ブロットアッセイのための認識系として役立つ。この実施形態の結合体は、ポリマーに結合される抗体を有し、この抗体は、ＥＬＩＳＡアッセイまたは免疫ブロットアッセイの１次抗体である。酵素に結合される２次抗体（着色生成物を形成する反応を触媒する）を使用して、１次抗体、または結合体のいくつかの部分を認識し得る。酵素の基質を使用して、検出のための色を生成し得る。さらなる実施形態において、キットは、アッセイ系のために調製され得、このキットは、例えば、少なくとも１つの認識分子および少なくとも１つのシグナル伝達分子または標識種に結合されるポリサッカリド結合体を使用して組み立てられる。これらの実施形態において、この認識分子は、抗体、または他の化学物質もしくは生体分子であり得る。
【００９５】
（センサーシステム）
１つの実施形態において、図３に示されるように、バイオセンサーシステムは、微光（ｌｏｗ−ｌｉｇｈｔ）エンクロージャー１００内のデジタル画像センサー６００、ハイデータスループット読取り位置４００、および汎用コンピューター７００を備える。読取り位置４００は、ＣＭＯＳデジタル画像センサー６００を含む低光量エンクロージャー１００を挿入するための少なくとも１つのソケットを備え、これによって、センサーエンクロージャーを読取り位置に電気的および機械的に接続する。読取り位置は、例えば、ユニバーサルシリアルバス（ＵＳＢ）４５４を介して、または異なるパラレルポートインターフェースデバイス４５２によってコンピューターに接続され得る。必要に応じて、読取り位置は、Ｅｔｈｅｒｎｅｔ（登録商標）インターフェース４５６を介してコンピューターに接続され得る。このシステムにおいて使用され得る他の接続としては、限定しないが、Ｆｉｒｅｗｉｒｅ、ＳＣＳＩ、およびＰＣＭＣＩＡが挙げられる。代替の実施形態において、コンピューターおよび読取り位置は、ハンドヘルドコンピューター、またはパーソナルデジタルアシスタント（例えば、Ｐａｌｍ  Ｐｉｌｏｔ）によって置換され得る。
【００９６】
図３の実施形態を参照して、読取り位置４００内のマザーボード上のプログラム可能な論理デバイス４６０は、汎用コンピューター７００（例えば、パーソナルコンピューター）にインターフェースされる。プログラム可能な論理デバイス４６０はまた、デジタル画像センサー６００にインターフェースされ、そして画像の開始および終了のシグナルを伝達するデジタル画像センサーからのステータスライン（フレーム、ライン、およびピクセルデータクロックパルスラインを含む）をモニターすることによってデジタル画像センサー分析物データからの読み出しを同期させる。プログラム可能な論理デバイス４６０は、画像センサー６００からローカルＦＩＦＯメモリーへの画像データの流れを管理し、ここで、この画像は、コンピューター７００がデータの移動を要求するまで、保存される。プログラム可能な論理デバイス４６０の代表的なサイクルは、コンピューター７００からのコマンドを受け取り、これによってセンサーは、画像を出力し、その画像を読取り位置４００内のマザーボード上のローカルＦＩＦＯメモリーにキャプチャし、そしてキャプチャされた画像データをコンピューター７００に転送する。グラフィカルユーザーインターフェース（ＧＵＩ）は、コンピューターユーザが、画像キャプチャを要求し、そしてサイクル、スナップショットモードを表示するか、または連続的配列で、ライブビデオモードを要求するための機能を提供する。フィルターおよび画像処理ツールは、ユーザがセンサーを微光条件下で操作し得るように提供される。これらのツールは、センサーからの小さなシグナルをブーストするための画像処理ルーチン、同時に追加される画像に対するソフトウェアルーチン、バックグラウンド画像または「暗色」画像を減算するためのルーチン、およびノイズを濾波するためのルーチンを含む。ＧＵＩはまた、センサーオンチップ設定でユーザーコントロールを与える。これによって、ユーザは、センサーとインタラクトし得、オンチップパラメーター（例えば、積分時間、ゲイン、および類似物）をデジタルコンバーターの範囲に調整する。
【００９７】
図３の実施形態によって例示されるように、読取り位置４００は、画像センサードーターボードおよび低光量エンクロージャー１００を読取り位置４００に接続するために、コネクター３６０を備える。この実施形態の配置の特徴は、光学デジタル画像センサー分析物検出器が読取り位置から容易に機械的に分離される；言い換えると、除去可能であることである。除去可能なデジタル画像センサーは、有利に、デジタル画像センサーの携帯可能性、およびバイオセンサーシステムのハイスループット操作を提供する。操作において、低光量エンクロージャーおよびデジタル画像センサーは、手動またはロボット利用のいずれかで、キューから読取り位置に接続され、そして、分析物を検出した後、低光量エンクロージャーおよびデジタル画像センサーは、手動またはロボット利用のいずれかで、取り外され得る。バイオセンサーシステムのこのプラグアンドプレイ特徴によって、例えば、使い捨て可能なユニットである低光量エンクロージャーおよびデジタル画像センサーを有するバイオセンサーシステムの操作が可能になる。代替の実施形態において、低光量エンクロージャーおよびデジタル画像センサーは、異なるアレイを使用するために再生され得る。操作において、バイオセンサーシステム読取り位置は、ホットスワップ（ｈｏｔ−ｓｗａｐ）能力を備え、ここで、光学画像センサーを含む低光量エンクロージャーは、読取り位置または画像センサーのいずれかの電源供給の電源を断つことなく、読取り位置に接続され得、そして取り外され得る。
【００９８】
読取り位置は、ＵＳＢマイクロコンピューターインターフェースを備える。必要に応じて、ＭＩＣＲＯＳＯＦＴ  ＥＸＴＥＮＤＥＤ  ＣＡＰＡＢＩＬＩＴＩＥＳ  ＰＯＲＴ（ＥＣＰ）インターフェースを備え得、これは、活性なインターフェースを決定するためのユーザ制御スイッチを有する。ＵＳＢケーブルは、読取り位置マザーボードによって使用され得る電源を供給する。ＥＣＰについて、９  ＶＤＣサプライが提供される。手動リセットスイッチは、バイオセンサーマザーボードをリセットするために提供され、そしてプログラム可能な論理デバイスもまた手動でリセットされ得る。
【００９９】
１つの実施形態において、本発明は、時間積分によって分析物シグナル検出を増強する方法である。データスループットおよび標的における分析物パラメーターの測定は、デジタル画像センサーによってアレイから光の検出において固有の信号対雑音によって制限される。信号対雑音は、数ミリ秒間以上、しばしば、約１０ミリ秒〜約２分間、ときどき、約３０ミリ秒〜約１０００ミリ秒間、そしてときどき、約５０ミリ秒〜約６００ミリ秒間、分析物シグナルを積分することによって増加し得る。別の実施形態において、分析物シグナルの時間依存性は、アレイシグナルフレームの配列を保存することによって記録され、ここで、各フレームは、分析物シグナルをある期間積分することによって得られる。
【０１００】
ＵＳＢマイクロコンピューターインターフェースは、画像センサーおよびプログラム可能な論理デバイスのためのマスタークロックを提供する。画像センサー出力は、画像ラインおよびフレームパルスに沿ってピクセルデータを含み、これらは、コネクターを通ってマザーボードに戻され、そしてＦＩＦＯメモリーに送られる。フレームパルスは、ＦＩＦＯポインターをリセットするために使用され、そしてラインパルスは、書き込みがＦＩＦＯについて可能であるので使用される。この配置は、左上ピクセルをＦＩＦＯの位置０（ゼロ）として開始して、ＦＩＦＯにピクセルデータを保存する。
【０１０１】
一旦、画像がＦＩＦＯにあると、２つのインターフェースのうちの１つによって読み出され得る。図３の実施形態を参照して、アレイ画像データがパラレルポート（ＰＰ）４５２に、１つの読み当たり１ピクセルで読み出されるＥＣＰが提供される。読み出しは、ＰＰ４５２が逆の要求を送るとき、開始する。これによって、プログラム可能な論理デバイス４６０が、ＰＰ４５２に対するその出力ドライバーを可能にする。次いで、プログラム可能な論理デバイス４６０は、パー．クロック（ｐｅｒ．ｃｌｏｃｋ）をアサートする。ＰＰ４５２は、パー．アック（ｐｅｒ．ａｃｋ）に応答する。コンピューター７００がピクセルのフレームを読み出すまで、クロックアックシーケンスは続く。プログラム可能な論理デバイス４６０は、ＰＰ４５２データビットゼロをＳＤＡとして使用し、そしてＰＰ４５２データビット１をＩ２ＣバスのＳＣＬとして使用する。
【０１０２】
別の実施形態において、ＦＩＦＯの画像データは、ＵＳＢインターフェースによって読み出される。バイオセンサー操作は、従来のＵＳＢ転送と比較して、連続的なデータ伝達のバンド幅を増加することによって増強される。従来のＵＳＢ転送において、ＦＩＦＯからのデータのパケットが読み出され、ＦＩＦＯが、読み出される次のパケットをロードする時間の間隔が続く。例えば、従来のＵＳＢマイクロコンピューターインターフェースにおいて、６３ピクセルのパケットは、ＦＩＦＯから読み出され、そしてＵＳＢにおけるデータラインのうちの１つを介して送られる。１つの実施形態において、２つの終点が、２つのバッファを確立するためにＦＩＦＯにおいて指定される。操作において、１つのバッファが読み出され、そしてＵＳＢ内のデータラインのうちの１つに伝達され、一方、他のバッファが充填され、それによって、１００％までユニバーサルシリアルバスを使用して転送バンド幅を増加する。第１バッファからのデータ伝達の終わりは、例えば、１個または数個のクロックパルスの直前、第２バッファからのユニバーサルシリアルバスのデータライン上でのデータ伝達の開始の前に生じる。第２バッファからのユニバーサルシリアルバスのデータライン上でのデータ伝達が生じ、一方、同時に、第１バッファにデータをロードする。これらの工程は、転送が必要な全てのデータが送られるまで繰り返され得、これによって、従来のＵＳＢに対して、データ転送速度を増加する。
【０１０３】
以下の実施例は、本発明の実施形態をさらに説明する。これらの実施例は、例示の目的のためだけに与えられ、そして本発明を制限するとは解釈されない。本発明の例示的な実施形態を記述するが、当業者は、これらが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、変更または改変され得ることを認識し、そして添付の特許請求の範囲に記載される本発明の真の範囲内に入る全てのこのような変更、改変、および等価な配置を網羅することが意図される。
【０１０４】
本明細書中で参照される全ての文書、刊行物、学術論文、論文、および特許は、その全体が、具体的に参考として援用される。
【実施例】
【０１０５】
（実施例１）
線状ポリサッカリドデキストラン（Ｓｉｇｍａ）を、脱イオン水中に、１％の最終濃度まで溶解し、次いでオートクレーブした。０．４０ｍｌデキストラン溶液のアリコートを、ロッキングプラットフォームにおいて、室温暗所で、一晩、４４μｌの０．５Ｍ過ヨウ素酸ナトリウムで酸化した。次いで、酸化されたデキストランを０．３Ｍ  ＮａＯＡＣおよび２×ＶｏｌのＥｔＯＨで２回沈殿させることによって洗浄した。ペレットを空気乾燥し、そして０．４ｍｌの５ｍＭ  ＮａＰＯ４緩衝液（ｐＨ７．２）中に再溶解した。
【０１０６】
１μｌの酸化されたデキストランを、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆｆ管において、７μｌの１０ｍＭ  ＮａＣＯ３（ｐＨ９．０）および２μｌのオリゴヌクレオチド（Ｈ２Ｏ中の２μＭ溶液）に添加した。このオリゴヌクレオチドは、２５〜４５マーの長さで変化し、第１級アミンを、合成の間、３’末端または５’末端のいずれかに導入した。この反応を、３７℃の水浴中で、一晩実行した。ＮａＢＨ４を、管に添加し、そして混合物を室温で３０分間さらにインキュベートし、次いで、０．３Ｍ  ＮａＯＡｃおよび２×Ｖｏｌ  のＥｔＯＨで沈殿させた。このペレットをＴＥ緩衝液中に溶解させ、そしてアリコートを１％アガロースゲル上で電気泳動によって分離し、次いで、ＥｔＢｒで染色した。この検出系において、遊離オリゴヌクレオチドは、塩の前面（ｓａｌｔ−ｆｒｏｎｔ）近くに移動し、一方、デキストランに結合したオリゴヌクレオチドは、ずっとより遅く移動した。
【０１０７】
（実施例２）
高分子量分枝ポリサッカリド、グリコーゲン（Ｓｉｇｍａ）およびアミロペクチン（Ｓｉｇｍａ）を使用して、アミン誘導体化オリゴヌクレオチドに結合した。これらのポリマーのジオール基を、ＮａＩＯ４を用いる酸化によってアルデヒド基に変換した。過ヨウ素酸ナトリウムを、それぞれ、グリコーゲンについて２５ｍＭの最終濃度、そしてアミロペクチンについて２０ｍＭの最終濃度まで、０．４ｍｌの１％ポリサッカリド溶液（Ｈ２Ｏ中）に添加した。酸化を、ロッキングプラットフォームにおいて、室温暗所で、一晩続けた。次いで、酸化されたポリサッカリドを、０．３Ｍ  ＮａＯＡｃおよび２×Ｖｏｌ  のＥｔＯＨで２回沈殿させて、過剰のＮａＩＯ４を除去した。空気乾燥後、ペレットを０．４ｍｌの５ｍＭ  ＮａＰＯ４緩衝液（ｐＨ７．２）に溶解した。アミン誘導体化オリゴヌクレオチドのカップリングおよび結合した生成物のゲル−分析を、デキストランについて実施例１に記載される通りに実施した。
【０１０８】
（実施例３）
１０グルコースモノマー当たり１つのオリゴヌクレオチドの結合密度で各グリコーゲン分子に結合される、平均して約１０００オリゴヌクレオチド分子を有する、実施例２の結合体プローブを調製する。
【０１０９】
（実施例４）
５’末端においてアミンで誘導体化され、そして３’末端において、蛍光色素Ｃｙ５で誘導体化された、シグナル伝達分子５’−ＡＣＴＧＣＴ−３’（ＢＰ００１）、および５’末端においてアミン基で誘導体化された、認識プローブ分子オリゴヌクレオチドＡＫＨ１０８
【０１１０】
【化１】
0004672966.tif 000002
を、同じポリサッカリドに結合する。ＡＫＨ１０８は、細菌Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅゲノム由来のプライマー
【０１１１】
【化２】
0004672966.tif 000003
（これは、３−ホスホグリセレートキナーゼをコードする遺伝子内のフラグメントに対応する）を用いて増幅されたＰＣＲ産物にハイブリダイズする。このＰＣＲ産物を、マイクロアレイフォーマットで、ポリ（リジン）で被覆したガラススライド上にスポットする。
【０１１２】
同時架橋のために、０．２ｎｍｏｌのＡＫＨ１０８および２ｎｍｏｌのＢＰ００１を、最終容量１０μｌで、１０ｍＭ  ＮａＣＯ３中の２０ｎｍｏｌの酸化されたグリコーゲンを含む管に添加する。反応を３７℃で一晩実施する。次いで、ＮａＢＨ４を、管に、４ｍＭの最終濃度まで添加し、そして室温でさらに９０分間インキュベートする。最終生成物を、ＥｔＯＨを用いて沈殿させる。遠心分離後、架橋された生成物および遊離のＡＫＨ１０８が、ペレットになり、一方、遊離のＢＰ００１は、上清に残り、捨てられる。ペレットを１０μｌ  ３×ＳＳＰＥ／０．１％ＳＤＳ／１．０ｍｇ／ｍｌＢＳＡ中に溶解させ、そしてマイクロアレイ表面に適用する。室温で５時間のハイブリダイゼーション後、このスライドを、３回、１０μｌの新鮮な０．１×ＳＳＰＥ／０．１％ＳＤＳで洗浄し、そしてレーザースキャナーで走査し、そしてＰＣＲ産物についてのスポットされたパターンを観測する。
【０１１３】
（実施例５）
オリゴヌクレオチド
【０１１４】
【化３】
0004672966.tif 000004
（これは、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｏｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ由来のＲｅｃＡ遺伝子から増幅されたＰＣＲ産物に特異的にハイブリダイズする）を使用して、グリコーゲンおよびアミロペクチンに架橋した。ポリサッカリドを実施例２に記載されるように酸化した。架橋について、２０ｎｍｏｌの酸化された糖および２ｎｍｏｌのアミン誘導体化オリゴヌクレオチドを、１０μｌの最終容量で１０ｍＭ  ＮａＣＯ３緩衝液（ｐＨ９．０）中で混合し、次いで、３７℃で一晩インキュベートした。結合反応の最後に、ＮａＢＨ４を、４ｍＭの最終濃度まで添加し、そして室温でさらに６０分間インキュベートした。最終生成物を、０．３Ｍ  ＮａＯＡｃおよび２×ＶｏｌのＥｔＯＨを用いて沈殿させ、次いで、１０ｍＭ  ＮａＣＯ３（ｐＨ９．０）中に溶解した。架橋されたオリゴヌクレオチドのアリコートを使用して、エポキシ処理したガラススライド上にスポットした。非酸化ポリサッカリドと混合された等量のオリゴヌクレオチドをまた、コントロールとして同じスライド上にスポットした。オンチップハイブリダイゼーションについて、ＲｅｃＡ  ＰＣＲ産物を、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｉｎｃ）で標識し、３×ＳＳＰＥ／０．１％ＳＤＳ／１．０ｍｇ／ｍｌＢＳＡ中に溶解し、そしてガラススライド表面上に塗布した。室温で３時間のハイブリダイゼーションおよび０．１×ＳＳＰＥ／０．１％ＳＤＳでの洗浄後、このスライドを、レーザースキャナーを使用して走査した。グリコーゲンに結合されたオリゴヌクレオチドについてのスポットシグナルは、コントロールの非酸化グリコーゲンスポットに対して５．８６であり、そしてアミロペクチンに結合したオリゴヌクレオチドに対するスポットシグナルは、コントロールの非酸化アミロペクチンに対して５．６３であった。
【０１１５】
（実施例６）
カルボジイミダゾール（ＣＤＩ）活性化について、４μｌの０．５Ｍ  ＣＤＩ（ＤＭＳＯ中）を、ＤＭＳＯ中の１０μｌの０．５％ポリサッカリドおよび６μｌのＤＭＳＯに添加した。反応を、室温で３時間、ときどきボルテックスしながらインキュベートした。次いで、１ｍｌのｎ−ブタノールを各チューブに添加し、ボルテックスにより完全に混合し、そして微量遠心管中で遠心分離した。ブタノールの除去後、ペレットを空気乾燥し、そして１０μｌのＤＭＳＯ中に溶解した。オリゴヌクレオチドカップリングのために、２．２ｎｍｏｌのアミン誘導体化オリゴヌクレオチドを、５μｌの０．５％ＣＤＩ−活性化ポリサッカリドと、２０μｌの最終容量で混合した。反応物を、室温で５日間、ときどきボルテックスしながらインキュベートした。反応の最後に、１μｌの１０％エタノールアミンを添加し、そしてさらに３０分間インキュベートし、次いで、ＥｔＯＨで沈殿させた。次いで、生成物を１０μｌのＴＥ緩衝液中に溶解し、そしてゲル電気泳動によって分析した。
【０１１６】
（実施例７）
ＣＭＯＳ画像センサーを、ハイブリダイゼーションシグナルの直接的なオンチップ（ｏｎ−ｃｈｉｐ）検出のために使用した。
【０１１７】
ＰＢ０３３０単色画像センサー（Ｐｈｏｔｏｂｉｔ）のベアダイを、エッジコネクターでドーターボードに装着した。結合線をエポキシ（Ｅｐｏｘｙ）中に被包し、そして加硫した。ダイ表面を、加圧滅菌したｄＨ２Ｏで３回リンスし、そして風乾した。エポキシで表面を誘導体化するために、メタノール中にある２％（３−グリシドキシプロピル）トリメトキシ−シランの溶液を、このダイ表面に塗布し、そして室温で１０分間インキュベートし、次いで、メタノールで２回洗浄し、そして風乾した。
【０１１８】
４つの異なる捕捉プローブ（５０ｍＭ  ＮａＣＯ３緩衝液中において１００ｐｍｏｌ／ｍｌ、ｐＨ１０．５）を手動で、エポキシ（Ｅｐｏｘｙ）処理したダイ表面上に二連でスポットした。スポットが乾燥した後、この表面を、５０ｍＭ  ＮａＣＯ３（ｐＨ１０．５）中にある１％エタノールアミンで迅速に１回洗浄し、そして室温で１０分間にわたって同じブロッキング溶液中においてインキュベートした。次いで、この表面を、加圧滅菌されたｄＨ２Ｏで４回リンスした。
【０１１９】
オンチップハイブリダイゼーションのために、ダイ表面を、室温で２０分間にわたって３×ＳＳＰＥ／５０％ホルムアミド／１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡと共にインキュベートし、次いで、２０ｍｌの３×ＳＳＰＥ／５０％ホルムアミド／１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ中においてＰＣＲ産物（以下に説明されるように、一端をビオチン標識）でハイブリダイズした（これは、沸騰水浴中で２分間加熱され、そして迅速に４℃で冷却された後）。ハイブリダイゼーションを、加湿チャンバー内において一晩３０℃で実施した。その後、ダイ表面を、０．１×ＳＳＰＥを用いて、室温で４回（各々５分間）洗浄した。ハイブリダイズしたＰＣＲ産物上のビオチンに対して、ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ結合体を結合させるために、ダイ表面をまず、室温で２０分間にわたって、ＴＢＳ中にある１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡと共にインキュベートし、次いで室温で２時間にわたって、ＴＢＳ／１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ中で１：１００に希釈したＡｖｉｄｘ−ＡＰ（Ｔｒｏｐｉｘ）と共にインキュベートした。次いで、ダイ表面を、ＴＢＳを用いて、室温で５回（各々５分間）洗浄した。
【０１２０】
オンチップハイブリダイゼーションシグナルを検出するために、ダイ表面上にＴＢＳを有するドーターボードを、遮光エンクロージャー（ｌｉｇｈｔ−ｐｒｏｏｆ  ｅｎｃｌｏｓｕｒｅ）において、読取り位置（Ｒｅａｄｉｎｇ  Ｓｔａｔｉｏｎ）のコネクターに挿入した。専売ソフトウェアをＰＣで立ち上げて、「暗色画像」（すなわち、バックグラウンド画像、Ｉｄａｒｋ）を読み出した。ドーターボードを読取り位置になお装着したままで、次いで、ＴＢＳを、化学発光基質溶液（これは、製造元の仕様書に従って調製された、ＣＤＰ−ｓｔａｒおよびエンハンサーＥｍｅｒａｌｄ  ＩＩ（両方とも、Ｔｒｏｐｉｘから）を含む）で置き換えた。約０．１秒の積分時間での画像フレーム（Ｉ）を、センサーから読み出した。Ｉ−Ｉｄａｒｋを、実シグナルスナップショット（ｒｅａｌ  ｓｉｇｎａｌ  ｓｎａｐｓｈｏｔ）として処理した。このソフトウェアは、連続処理されたスナップショットを共に加算する組込み型（ｂｕｉｌｔ−ｉｎ）サブルーチンを有し、そして、１つの画像として結果を提示し、これによりさらに、シグナル積分時間を延長する。
【０１２１】
以下のセンサーレジスター設定は、この点で最適であることが見出された：
最大での利得（Ｇａｉｎ）（レジスター５３、および４３〜４６）；１フレームあたり０．１秒での積分時間（レジスター９および１０）；最大でのアナログマイナスオフセット（Ａｎａｌｏｇｕｅ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｏｆｆｓｅｔ）（レジスター３２および５７）；７４での増幅段利得（Ｇａｉｎｓｔａｇｅ）（レジスター６２）。レジスターの静止（ｒｅｓｔ）を、デフォルト設定で残した。
【０１２２】
下記の実験において使用した捕捉プローブおよびＰＣＲプライマーは、以下の通りであった：
【０１２３】
【化４】
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捕捉プローブを、上記のように、酸化されたグリコゲンに架橋した。最終のペレットを、最終濃度１００ピコモル／ｍｌで５０ｍＭ  ＮａＣＯ３（ｐＨ１０．５）中に溶解し、そして以下のパターンにおいて二連で、エポキシ処理されたダイ表面上にスポットした（ここで、１＝Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、２＝Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、３＝Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、４＝Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）。
【０１２４】
【化５】
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図４は、ＣＭＯＳ画像センサーを使用した、ハイブリダイゼーション検出結果を示す。各スポットについての積分時間は、約０．５秒であった。図４における各分析物について、右側の画像はスポットされたアレイを示し、そして左側の画像は検出されたスポットを示す。図４の右側に示されるアレイのスポットは、見栄えの都合から円で描いた。
【図面の簡単な説明】
【０１２５】
【図１】図１は、読取り位置の実施形態に付随する、低光画像センサーエンクロージャーの実施形態を示す。
【図２】図２は、低光量画像センサーエンクロージャーの実施形態の側面図を示す。
【図３】図３は、取り外し可能な光学画像センサーを有するバイオセンサーシステムの実施形態を示す。
【図４】図４は、ＣＭＯＳ画像センサーを使用するアレイプローブスポットシグナルの検出の実施形態を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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