(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
センス側の塩基配列が、少なくとも５’‐ｕｇａｇｇａｕｃｕａａｃｃｕｇｕｇｇａ−３’からなる塩基配列を有し、１９〜２５塩基対の長さであるＪＣウイルスのＶＰ−１をコードする遺伝子に対する短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、又は当該ｓｉＲＮＡのセンス配列及びアンチセンス配列をコードする塩基配列の間にヘアピンループ構造を形成できる塩基配列が設けられた当該ｓｉＲＮＡを形成し得る遺伝子、及び製薬学的に許容される担体を含有してなるＪＣウイルス感染症の治療のための医薬組成物。
【請求項２】
ＪＣウイルス感染症が、進行性多巣性白質脳症である請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
遺伝子が、プロモーターを含有するものである請求項１又は２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）又は当該ｓｉＲＮＡを形成し得る遺伝子が、当該遺伝子を生体内に導入するためのベクターに組み込まれている請求項１〜３のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項５】
ベクターが、プラスミド又はウイルスである請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
医薬組成物が、細胞へのＲＮＡや遺伝子の導入を促進する物質を、さらに含有するものである請求項１〜５のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項７】
少なくとも５’‐ｔｇａｇｇａｔｃｔａａｃｃｔｇｔｇｇａ−３’の塩基配列及びその相補配列を有し、１９〜２５塩基の長さからなるポリヌクレオチド。
【請求項８】
ポリヌクレオチドが、２本鎖のＲＮＡである請求項７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９】
２本鎖のＲＮＡの両方の３’末端側に塩基対を形成していない２塩基を有する請求項８に記載のポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＪＣウイルスのＶＰ−１をコードする遺伝子に対する短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を用いるＲＮＡｉ法によるＪＣウイルス感染細胞に対する治療のための医薬組成物、そのための有効成分であるポリヌクレオチドを提供するものである。本発明は、ＪＣウイルスのＶＰ−１をコードする遺伝子に対する短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）又は当該ｓｉＲＮＡを形成し得る遺伝子、及び製薬学的に許容される担体を含有してなるＪＣウイルス感染症の治療のための医薬組成物、そのためのポリヌクレオチド、それらの製造のための使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＪＣウイルス（ＪＣＶ）はヒト大脳に脱髄病変を生じる進行性多巣性白質脳症（progressive multifocal leukoencephalopathy：ＰＭＬ）の原因ウイルスである。ＪＣウイルスはポリオーマウイルス属に属する２本鎖環状ＤＮＡウイルスであり、幼・小児期に過半数の人が感染し一生の持続感染を起こす。通常は７０％以上の健常人の尿路系に不顕性感染しているが、健常人で発症に至ることは極めてまれなことであった。しかし、宿主が後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ：Acquired immunodeficiency syndrome）などにより免疫不全状態に陥ると脳に移行し、オリゴデンドログリアに感染し増殖することで致死的な脱髄を起こす。また、ミエリン生成細胞である希突起膠細胞 (oligodendrocytes)が損傷を受けることも報告されている。さらに、最近では痴呆症の原因の一部としてＪＣＶとの関係も指摘されてきている。【０００３】
１９８４年にフリスク (Frisque)らはＰＭＬ患者の脳組織よりＪＣウイルス（Mad-1株）を分離し（非特許文献１参照）、その後、ＪＣウイルスの感染について抗ＪＣウイルス抗体を用いる抗原の検出や、免疫組織染色法などの各種の診断法が開発されてきている（非特許文献２参照）。例えば、ＪＣウイルス粒子の製造方法及びＪＣウイルス外郭蛋白の製造方法に関するもの（特許文献１参照）、ＪＣウイルスのＶＰ−１タンパク質を抗原とする抗ＪＣウイルス抗体による診断法（特許文献２〜４参照）などについての特許出願がなされている。
また、ＰＭＬの治療法については、現在の段階では未だ有効な臨床的な治療法は確立されていない。ＰＭＬの治療法については、ＡＭＰＡ受容体又はカイニン酸受容体が関与する疾患の治療剤としてのピリダジノンおよびトリアジノン化合物類を使用する方法（特許文献５参照）、及び、１，２−ジヒドロピリジン化合物類を使用する方法（特許文献６参照）などが提案されているが、有効な治療薬は未だ開発されていないのが現状である。また、シトシンアラビノサイド（cytosine arabinoside）やシドフォビル（cidofovir）による治療は、ＰＭＬに罹った個体での有効性を証明することに失敗している。ＤＮＡトポイソメラーゼを阻害してインビトロでＪＣウイルスの複製を遮断するトポテカン（topotecan）による治験が現在進行中である。
さらに、本発明者らは、ＪＣウイルスの増殖を阻止する目的としてＪＣウイルスが有する遺伝子のうちで最も小さな遺伝子であるアグノ（ａｇｎｏ）タンパク質のアミノ酸配列を変異させてこの遺伝子の発現を停止させると、ＪＣウイルスの増殖が阻止されることを見出してきている（特許文献７参照）。【０００４】
一方、近年になって、特定の遺伝子の発現を抑制する手法のひとつとしてＲＮＡｉ（RNA interference）法が開発されてきた。ＲＮＡｉは、もともと２本鎖ＲＮＡの導入により、それと相同なＲＮＡの発現が強力に抑制されるという生命現象として１９９８年に発見されたものであり、この現象を利用して２本鎖ＲＮＡ（dsRNA）の導入により標的とする特定の遺伝子の発現を抑制する方法である。細胞に導入された長い（数百塩基対）ｄｓＲＮＡは、Ｄｉｃｅｒという２本鎖ＲＮＡ（dsRNA）を特異的に切断するＲＮａｓｅIII様の酵素により分解されて、２１〜２５塩基対程度の短いｄｓＲＮＡ（これを、small interfering RNA（ｓｉＲＮＡ）と呼ぶ。）を生成する。このｓｉＲＮＡが１本鎖の解離し、解離した１本鎖のｓｉＲＮＡが複合体ＲＩＳＣ（RNA-induced silencing complex）として標的のｍＲＮＡを特異的に認識して切断することにとり、当該ｍＲＮＡの発現が抑制されることになる。ＲＮＡｉ法としては、ｄｓＲＮＡの導入に代えて、ｓｉＲＮＡを導入することも行われている。
ｓｉＲＮＡ（small interfering RNA）によるＲＮＡｉ法が、細胞やウイルスの遺伝子発現を抑制するアプローチとして現在広く使用されるようになってきている（非特許文献３参照）。ｓｉＲＮＡｓをウイルスと同時にあるいは事前に投与することによってウイルスの感染を防げることが数々の研究によって示されている（非特許文献４参照）が、細胞や組織でいったん確立した感染をＲＮＡｉによって除去することは実証されていない。【０００５】
【特許文献１】特開平０９−２２４６５８号
【特許文献２】特開平０９−０６７３９７号
【特許文献３】特表２０００−５００９７３号
【特許文献４】特開２００３−０６１６９３号
【特許文献５】再公表公報ＷＯ０２／０２２５８７号
【特許文献６】再公表公報ＷＯ０１／０９６３０８号
【特許文献７】特開２００３−１６０５１０号
【非特許文献１】Frisque,R.J. et al., J. Virol., 51, 458-469, 1984
【非特許文献１】E.O.Major, et al., Clin. Microbiol. Rev., 5, 49-73, 1992
【非特許文献３】Gitlin L., et al., Nature, vol.418, pp.430-434, 2002
【非特許文献４】Andino R., Nature Biotechnol., vol.21, pp.629-630, 2003
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、ＪＣウイルスのＶＰ−１の発現を抑制し、ＪＣウイルスの増殖を抑制することによりＪＣウイルス感染症、例えば進行性多巣性白質脳症（progressive multifocal leukoencephalopathy：ＰＭＬ）を治療するための医薬組成物、そのためのポリヌクレオチド、及びその使用を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、ＪＣウイルスの増殖を抑制するために、アグノタンパク質（Agnoprotein）の発現を抑制すればよいことを報告してきた（特許文献７参照）が、そのためにはアグノタンパク質をコードする遺伝子（ａｇｎｏ遺伝子）の塩基配列を改変するなど、煩雑な操作を必要としていた。そこで、簡便な手法でＪＣウイルスの増殖を抑制できる手法を検討してきたところ、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）法により感染後の細胞においても短い干渉ＲＮＡ（small interfering RNA:ｓｉＲＮＡ）を感染細胞に導入することにより、当該細胞における感染を治療することができることを実証することに成功し、ＪＣウイルスの感染細胞における治療剤として短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）が有効であることを見出した。【０００８】
即ち、本発明は、ＪＣウイルスのＶＰ−１をコードする遺伝子に対する短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）又は当該ｓｉＲＮＡを形成し得る遺伝子、及び製薬学的に許容される担体を含有してなるＪＣウイルス感染症の治療のための医薬組成物に関する。
また、本発明は、前記本発明の医薬組成物の有効成分となる短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）又は当該ｓｉＲＮＡを形成し得る遺伝子であるポリヌクレオチド、より詳細には、ＤＮＡの配列として表記したときに少なくとも５’‐ｔｇａｇｇａｔｃｔａａｃｃｔｇｔｇｇａ−３’の塩基配列若しくはその相補配列又は対応するＲＮＡの配列を有する、４０塩基以下の長さからなるポリヌクレオチドに関する。
さらに、本発明は、前記した本発明のポリヌクレオチドの使用に関する。より詳細には、本発明の使用は、ＪＣウイルス感染症を治療するための、ＪＣウイルスのＶＰ−１をコードする遺伝子に対する短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）又は当該ｓｉＲＮＡを形成し得る遺伝子の使用、及び、ＪＣウイルスのＶＰ−１をコードする遺伝子に対する短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）又は当該ｓｉＲＮＡを形成し得る遺伝子、及び製薬学的に許容される担体を含有してなるＪＣウイルス感染症の治療のための医薬組成物の製造のための、ＪＣウイルスのＶＰ−１をコードする遺伝子に対する短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）又は当該ｓｉＲＮＡを形成し得る遺伝子の使用に関する。【０００９】
さらに、本発明は、ＪＣウイルス感染症の患者に、ＪＣウイルスのＶＰ−１をコードする遺伝子に対する短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）又は当該ｓｉＲＮＡを形成し得る遺伝子、及び製薬学的に許容される担体を含有してなるＪＣウイルス感染症の治療のための医薬組成物の有効量を投与することからなるＪＣウイルス感染症、例えば進行性多巣性白質脳症（progressive multifocal leukoencephalopathy：ＰＭＬ）を治療する方法に関する。
また、本発明は、ＪＣウイルスに感染した細胞又は生体に、ＪＣウイルスのＶＰ−１をコードする遺伝子に対する短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）又は当該ｓｉＲＮＡを形成し得る遺伝子を導入することからなるＪＣウイルスの増殖を抑制する方法に関する。【００１０】
ＪＣウイルスは、５，１３０ｂｐの２本鎖環状ＤＮＡを有するウイルスで、複製開始起点の塩基を１番（ｎｔ．１）とした場合、ＶＰ−１遺伝子はｎｔ．１４６９−２５３３にコードされ、ＶＰ−１は２５４個のアミノ酸からなるタンパク質である（Frisque,R.J., et al., J. Virol. 51 (2), 458-469 (1984)）。ＶＰ−１をコードする遺伝子の塩基配列を配列表の配列番号１に示し、ＶＰ−１のアミノ酸配列を配列番号２に示す。また、ＶＰ−１は、ＪＣウイルスの後期ｍＲＮＡのひとつであるアグノタンパク質及びＶＰ−１をコードするｍＲＮＡにより、アグノタンパク質と同じｍＲＮＡにコードされている。このｍＲＮＡの塩基配列を配列番号３に示す。【００１１】
本発明におけるＪＣウイルスのＶＰ−１をコードする遺伝子に対する短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）としては、ＶＰ−１をコードする遺伝子から転写されて生成されるｍＲＮＡの塩基配列（センス配列）と相同な連続した少なくとも１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上、より好ましくは１９塩基以上の塩基配列を有する１５〜４０塩基、好ましくは１５〜３０塩基、１５〜２５塩基、又は１９〜２５塩基の長さを有し、全長において少なくとも９０％以上、好ましくは１００％の相同性を有する２本鎖ＲＮＡである。このようなｓｉＲＮＡの塩基配列は、ＶＰ−１遺伝子のｍＲＮＡの翻訳領域又は非翻訳領域のどの部分から選択してもよいが、好ましくは翻訳領域から選択され、またｓｉＲＮＡの全体のＧＣ含量が７０％以下、好ましくは３０〜７０％、３０〜６０％程度となるように選択されるのが好ましい。好ましい塩基配列としては、センス側の配列として、
５’‐ｕｇａｇｇａｕｃｕａａｃｃｕｇｕｇｇａ−３’、
からなるＲＮＡが挙げられる。
本発明における短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、３’末端に５塩基以下、好ましくは２塩基からなる塩基対を形成しない塩基が存在していることが好ましい。このような塩基対を形成しない塩基の配列としては、例えばｕｇ−３’、ｕｕ−３’、ｔｇ−３’、ｔｔ−３’などの配列が挙げられるが、これに限定されるものではない。このような塩基対を形成しない塩基が存在している好ましい例としては、センス側の配列として、
５’‐ｕｇａｇｇａｕｃｕａａｃｃｕｇｕｇｇａ−ｄｔ−ｄｔ−３’、
（式中、ｄｔは塩基対を形成しない塩基を示す。）
からなるＲＮＡが挙げられるが、これに限定されるものではない。【００１２】
本発明における短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）としては、前記してきた塩基配列を有するＲＮＡと、その相補鎖からなる２本鎖ＲＮＡが挙げられるが、ヘアピンループ型の構造をとることにより、前記した１５〜４０塩基、好ましくは１５〜３０塩基、１５〜２５塩基、又は１９〜２５塩基の長さの部分が２本鎖となるような構造であってもよい。この場合におけるヘアピンループのループ部分の塩基配列としては、ループを形成することができる配列であれば特に制限はない。
また、本発明は、ＤＮＡの配列として表記したときに少なくとも５’‐ｔｇａｇｇａｔｃｔａａｃｃｔｇｔｇｇａ−３’の塩基配列若しくはその相補配列又は対応するＲＮＡの配列を有する、４０塩基以下の長さからなるポリヌクレオチドを提供するものであり、当該ポリヌクレオチドは、ＤＮＡであってもよいし、ＲＮＡであってもよく、さらに２本鎖のＲＮＡであってもよい。これらのポリヌクレオチドは、３’末端に５塩基以下、好ましくは２塩基からなる塩基対を形成しない塩基が存在していることが好ましい。
これらの本発明のポリヌクレオチドは、人工的に合成したものであってもよいし、生体内や細胞内で発現させたものであってもよい。【００１３】
本発明におけるＪＣウイルスのＶＰ−１をコードする遺伝子（ＶＰ−１遺伝子）に対する短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を形成し得る遺伝子としては、生体内において前記した短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）のセンス鎖からなるＲＮＡ及びアンチセンス鎖からなるＲＮＡを生成させることができ、これらからなる２本鎖ＲＮＡを形成することができるものであれば特に制限はない。例えば、前記したＲＮＡを細胞内で発現することができる遺伝子、好ましくはＤＮＡである。このような遺伝子としては、センス鎖のＲＮＡを発現できる遺伝子とアンチセンス鎖のＲＮＡを発現できる遺伝子との組み合わせからなる遺伝子が挙げられる。各々の遺伝子のプロモーターは同じ条件で発現するものであってもよいし、異なる条件で発現でするプロモーターであってもよい。
また、前記したヘアピンループ型の構造をとるＲＮＡを発現させる場合には、ヘアピンループ型の構造をとるＲＮＡの全長を発現することができる遺伝子、例えば、プロモーターの下流側にセンス鎖のＲＮＡをコードする配列、ループ部分をコードする配列、アンチセンス鎖のＲＮＡをコードする配列、ポリＴストレッチ配列、及びストップコドンからなる塩基配列を有する遺伝子を用いることができる。
本発明の短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を形成し得る遺伝子におけるプロモーターとしては、恒常的に発現するためのプロモーターであってもよいし、特定の条件下で発現するためのプロモーターであってもよい。例えば、ＲＮＡポリメラーゼIII（ｐｏｌIII）プロモーター（Brummerlkamp,T.R., et al., Science, 297, 1352-1354, 2002）、Ｕ６プロモーター（a) Lee NS. et al., Nature Biotech. 20, 500-505, 2002；b) Miyagishi M. & Taira K., Nature Biotech. 20, 497-500, 2002；c) Paul CP. et al., Nature Biotech. 20, 505-508, 2002）、Ｈ１プロモーター（Brummelkamp TR et al: Science 296, 550-553, 2002）、ｔＲＮＡプロモーター（Oshima K., et al., Cancer Research 63, 6809-6814, 15, 2003）などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。【００１４】
前記してきた本発明の短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）又は当該ｓｉＲＮＡを形成し得る遺伝子を、生体内や細胞内に導入する方法としては、公知の各種の手法を採用することができる。例えば、センス鎖及びアンチセンス鎖のそれぞれの１本鎖ＲＮＡを直接導入する方法や、環状ＲＮＡとして導入する方法、またＤＮＡの場合には公知の遺伝子導入法、例えば、プラスミドやウイルスなどのベクター、例えばレンチウイルスベクター（Rubinson, D.A. et al., Nature Genet. 33, 401-406, 2003）などを使用する方法などを採用することができる。したがって、本発明の医薬組成物における短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）又は当該ｓｉＲＮＡを形成し得る遺伝子としては、単にこれらのポリヌクレオチドそのものだけでなく、これらのポリヌクレオチドを含有する遺伝子導入用の遺伝子、例えば、これらのポリヌクレオチが生体内に導入するためのベクターに組み込まれている遺伝子などのすべての態様の遺伝子を包含するものである。【００１５】
本発明は、ＪＣウイルス感染症の治療、即ちＪＣウイルスに既に感染した細胞においても、ＪＣウイルスのＶＰ−１をコードする遺伝子（ＶＰ−１遺伝子）に対する短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を用いるＲＮＡｉ法が有効であることという技術的思想に基づくものであり、既存のＲＮＡｉ法の応用を本発明の具体的な適用に応用可能であることは当業者が容易には理解されるところである。例えば、
ＷＯ００／６３３６４号（特表２００２−５４２２６３号）には、各種のウイルスに対するアンチセンスの適用やＲＮＡｉ法の適用が開示されており、この記載を参照して本明細書に取り込む。また、ＷＯ０１／０９２５１３号（特表２００３−５３５５８３号）には、ＲＮＡｉ法に随伴する因子類の操作によりＲＮＡｉ媒介遺伝子サイレンシングを増強するための改良法が開示されており、この記載を参照して本明細書に取り込む。【００１６】
本発明の医薬組成物は、前記してきた短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）又は当該ｓｉＲＮＡを形成し得る遺伝子を単独で使用する場合も包含しているが、医薬組成物を形成するための製薬学的に許容される担体をさらに含有しているものも包含している。本発明の製薬学的に許容される担体としては、本発明の短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）又は当該ｓｉＲＮＡを形成し得る遺伝子を生体に投与又は導入するための処方をなすものであり、生理学的に無害で不活性なものが挙げられる。このような担体としては、例えば、殺菌水、生理食塩水、リン酸緩衝液、エタノール、グリセリン、ショ糖、乳糖などが挙げられるが、これに限定されるものではない。また、本発明の医薬組成物は、薬学上許容可能なその他の任意の成分、例えば、溶解補助剤などの各種の補助剤、安定剤、ｐＨ調節剤、及び他の活性成分などが含まれていてもよい。
さらに、本発明の医薬組成物には、細胞へのＲＮＡや遺伝子の導入を促進する物質、例えば、局所麻酔剤、リポソームなどの脂質、ポリリジンなどのポリカチオン、カチオン性界面活性剤などをさらに含有することもできる。【００１７】
本発明の医薬組成物の具体的な処方としては、投与するＲＮＡ分子やＤＮＡ分子の形態や、患者の状態にもよるが、注射剤、外用剤、坐剤などの各種の剤型とすることができ、溶液状、乳化状、ゲル状、ゾル状などの各種の製薬形態をとることができる。
本発明の医薬組成物の投与量、投与間隔などは、患者の性別、年齢、体重、及び病態などの各種条件等に応じて適宜設定される。好ましい投与量としては、ＶＰ−１遺伝子のｍＲＮＡ１個当たり１〜１０個、好ましくは３〜６個程度のｓｉＲＮＡが導入される量が上げられる。【００１８】
本発明の医薬組成物は、ＪＣウイルスの増殖を抑制し、ＪＣウイルス感染症を治療することができる。本発明のＪＣウイルス感染症としては、進行性多巣性白質脳症、特にヒト進行性多巣性白質脳症、痴呆症などのＪＣウイルスの感染に起因する各種の疾患が挙げられる。本発明の医薬組成物は、ＪＣウイルスに感染している細胞、哺乳動物由来の細胞、ヒト細胞、又は哺乳動物などの動物やヒトに投与される。【００１９】
また、本発明は、ＪＣウイルス感染症を治療するための、前記してきた本発明のＪＣウイルスのＶＰ−１をコードする遺伝子に対する短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）又は当該ｓｉＲＮＡを形成し得る遺伝子の使用、及び本発明の医薬組成物の製造のための、ＪＣウイルスのＶＰ−１をコードする遺伝子に対する短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）又は当該ｓｉＲＮＡを形成し得る遺伝子の使用を提供するものである。【００２０】
次に、本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの具体的な説明に限定されるものではない。
本発明者らは、ＪＣウイルス感染細胞でのＪＣウイルスの増殖の阻害を試験するために、３つの異なるＪＣウイルスタンパク質を標的としたｓｉＲＮＡを設計した。即ち、ＪＣウイルスのＶＰ−１タンパク質をコードする遺伝子（ＶＰ−１遺伝子）を標的とするＶＰ２７４及びＶＰ６９１、アグノタンパク質をコードする遺伝子（ａｇｎｏ遺伝子）を標的とするＡｇ１２２及びＡｇ１４７、並びにラージＴ抗原（Large T antigen; T-Ag）をコードする遺伝子を標的とするＬＴ７８及びＬＴ１３４を設計した。これらの２本鎖のＲＮＡはそれぞれの３’−末端に２個の非対の塩基を有している。【００２１】
これらのｓｉＲＮＡを次に示す。
Ａｇ１２２：  センス鎖            5'-GGUGAAGACAGUGUAGACG-dTdG-3'
アンチセンス鎖   3'-dGdT-CCACUUCUGUCACAUCUGC-5'
Ａｇ１４７：  センス鎖            5'-AAAGACAGAGACACAGUGG-dTdT-3'
アンチセンス鎖   3'-dTdT-UUUCUGUCUCUGUGUCACC-5'
ＶＰ２７４：  センス鎖            5'-UGAGGAUCUAACCUGUGGA-dTdT-3'
アンチセンス鎖   3'-dTdT-ACUCCUAGAUUGGACACCU-5'
ＶＰ６９１：  センス鎖            5'-UACUGCCACAACAGUGCUG-dTdT-3'
アンチセンス鎖   3'-dTdT-AUGACGGUGUUGUCACGAC-5'
ＬＴ７８  ：  センス鎖            5'-UUCCUGUCAUGAGAAAAGC-dTdG-3'
アンチセンス鎖   3'-dGdT-AAGGACAGUACUCUUUUCG-5'
ＬＴ１３４：  センス鎖            5'-GGUGGGGACGAAGACAAGA-dTdT-3'
アンチセンス鎖   3'-dTdT-CCACCCCUGCUUCUGUUCU-5'【００２２】
ＪＣウイルスの早期ｍＲＮＡ類および後期ｍＲＮＡ類は、選択的スプライシングにより生成され、主な後期ｍＲＮＡの二つの主要な型は、アグノタンパク質及びＶＰ−１をコードするｍＲＮＡと、アグノタンパク質、ＶＰ−２及びＶＰ−３をコードするｍＲＮＡである。主な早期ｍＲＮＡとしてはスプライシングによる異型として翻訳されるスモールｔ抗原とラージＴ抗原（Ｔ−Ａｇ）をコードするｍＲＮＡである。これらのｍＲＮＡと前記してきたｓｉＲＮＡの関係を図１に示す。図１の上段はラージＴ抗原又はスモールｔ抗原（small t antigen）をコードする早期ｍＲＮＡ（Early mRNA）を示し、図１の下段はアグノタンパク質及びＶＰ−１をコードするｍＲＮＡと、アグノタンパク質、ＶＰ−２及びＶＰ−３をコードするｍＲＮＡの後期ｍＲＮＡ（Late mRNA）を示す。図１中の矢印は、前記した本発明で設計されたｓｉＲＮＡの標的となるウイルスＲＮＡ類の領域を示す。【００２３】
ＪＣウイルス（Ｍａｄ−１／ＳＶＥΔ株、赤血球凝集活性が細胞３×１０５個あたり１０２４単位）をＳＶＧ−Ａ（ＳＶ４０形質転換ヒト胎児グリア）細胞に接種し、接種４日後に、ＪＣウイルスに特異的なそれぞれのｓｉＲＮＡをリポフェクション法により導入した。ｓｉＲＮＡ導入後におけるＪＣウイルスのＶＰ−１及びアグノタンパク質に対するイムノブロッティングを行った。最初にＪＣウイルスを感染させた後のＪＣウイルスタンパク質の発現と感染後の経過日数の関係を観察した。結果を図２に図面に代わる写真で示す。図２の横方向は、ＪＣウイルス感染後からの経過日数（dpi:days post infection）を示し、図２の上段はＶＰ−１を示し、下段はアグノタンパク質を示す。この結果、ＶＰ−１やアグノタンパク質などのＪＣウイルスの後期に発現するタンパク質は、ＪＣウイルス感染から２日後（２ｄｐｉ）からイムノブロッティングによって検出され、導入４日後（４ｄｐｉ）では大量に検出された（図２参照）。【００２４】
そこで、ウイルスの接種から４日後及び６日後のそれぞれの時点で、リポフェクタミン２０００（インビトロジェン社）を用いてＳＶＧ−Ａ細胞へ各ｓｉＲＮＡ（１２０ｐｍｏｌ／細胞６×１０４個）を導入した。約８０％のＳＶＧ−Ａ細胞において、フルオレセイン色素結合Ａｇ１２２ｓｉＲＮＡを導入することに成功した（ここでは、データは示していない。）。
２回目のｓｉＲＮＡの導入（ウイルス接種から６日後）から４８時間後での、それぞれのｓｉＲＮＡ導入細胞におけるＪＣウイルスのアグノタンパク質、ＶＰ−１、及びＳＶ４０ラージＴ抗原の発現量を、アグノタンパク質、ＶＰ−１に関しては本発明者らが作製した特異抗体を、ラージＴ抗原に関してはＡｂ−２（オンコジーンリサーチプロダクト社）を用いて、イムノブロッティングを行った。対照として、哺乳動物細胞には存在しないスクランブル配列を持つｓｉＲＮＡ（ダーマコン社）を導入した細胞を用いた。結果を図３に図面に代わる写真で示す。図３の横方向は導入したｓｉＲＮＡを示し、縦方向はタンパク質の種類を示す。下段のアクチンは、陽性コントロールである。
また、ラミンＡ／Ｃ（LaminA/C）特異的ｓｉＲＮＡ、または、６０pmol／ウェルもしくは１２０pmol／ウェルのＡｇ１２２ｓｉＲＮＡを導入したＪＣウイルス感染細胞での、ラミンＡ／Ｃ（LaminA/C）、ＬＴ、ＶＰ−１、アグノタンパク質、及びアクチンのそれぞれのタンパク質に対するイムノブロッティングを行った。コントロール（Cont）として、細胞に疑似物質を導入したものを用いた。結果を図４に図面に代わる写真で示す。図４の横方向は、導入したｓｉＲＮＡを示し（Ａｇ１２２の左側は６０pmol／ウェルの場合を示し、右側は１２０pmol／ウェルの場合を示す。）、縦方向は各タンパク質の種類を示す。下段のアクチンは陽性コントロールである。【００２５】
この結果、Ａｇ１２２、Ａｇ１４７又はＶＰ２７４を導入した細胞では、ウイルスの蛋白質の顕著な減少が示された（図３参照）。また、Ａｇ１２２は、アグノタンパク質の発現だけでなくＶＰ−１の発現をも用量依存的に阻害したが、ラージＴ抗原、ラミンＡ／Ｃ（LaminA/C）又はアクチンの発現量には影響しなかった（図３及び図４参照）。さらに、ＶＰ２７４は、ＶＰ−１だけでなくアグノタンパク質の発現も抑制することが示された（図３参照）。
ＳＶ４０ラージＴ抗原の抗体は、ＳＶ４０形質転換細胞において、ＪＣウイルスのラージＴ抗原とＳＶ４０のラージＴ抗原（これらの２つのタンパク質はアミノ酸配列で７０％以上の相同性を有する）を区別することができない。そこで本発明者らは、ＬＴ７８とＬＴ１３４のＪＣウイルスのラージＴ抗原発現に対する効果を、逆転写反応（ＲＴ）−ＰＣＲで評価した。その結果、どちらのｓｉＲＮＡを細胞に導入しても、ＪＣウイルスのラージＴ抗原のｍＲＮＡの発現量は影響を受けなかった（ここではデータは示していない。）。【００２６】
次に、ＪＣウイルス感染細胞におけるＡｇ１２２及びＶＰ２７４の効果を、間接蛍光抗体免疫染色を用いて試験した。ｓｉＲＮＡ導入の４８時間後、メタノールで固定した細胞をＶＰ−１又はアグノタンパク質の抗体で処理し、次にアレクサフルオル４８８（Alexa Fluor 488）の結合した抗ウサギ二次抗体（モレキュラープローブ社）で処理した。ＶＰ−１又はアグノタンパク質に陽性である細胞は共焦点レーザー顕微鏡（オリンパス社）で可視化され、６フィールドで計測された。アグノタンパク質又はＶＰ−１陽性である細胞の割合を間接蛍光抗体免疫染色により測定した結果を図５にグラフで示す。図５の左側はアグノタンパク質の場合であり、右側はＶＰ−１の場合を示す。各グラフの縦軸は、それぞれのタンパク質の陽性を示した細胞の、スクランブルｓｉＲＮＡが導入された細胞に対する割合（％ of sc）を示し、各グラフの左側の黒抜き部分はスクランブルｓｉＲＮＡを導入した場合を示し、その右側の灰色部分はＡｇ１２２が導入された場合を示し、その右側の灰色部分はＶＰ２７４が導入された場合を示し、右側の白抜き部分はＡｇ１２２及びＶＰ２７４の両者が導入された場合を示す。各データは少なくとも３回の独立した試験での平均値±標準偏差である。図５のグラフ中の＊＊印は、Ｐ＜０．０２（スチューデントのｔ検定）で有意差があることを示す。
この結果、アグノタンパク質陽性細胞の割合は、スクランブルｓｉＲＮＡを導入された細胞の値と比べ、Ａｇ１２２が導入された細胞、Ｖｐ２７４が導入された細胞、及びその両方のｓｉＲＮＡが導入された細胞において有意に減少していた（図５参照）。同様に、ＶＰ−１陽性細胞の割合は、Ａｇ１２２が導入された細胞、ＶＰ２７４が導入された細胞、及びＡｇ１２２とＶＰ２７４の両方が導入された細胞において有意に減少した。【００２７】
そこで、Ａｇ１２２若しくはＶＰ２７４、又はその両方のｓｉＲＮＡが導入された細胞でのアグノタンパク質及びＶＰ−１のそれぞれの発現の阻害を、イムノブロッティングにより確認することにした。それぞれのｓｉＲＮＡが導入されたＪＣウイルス感染細胞での、ＶＰ−１、アグノタンパク質およびアクチンの発現に対するイムノブロッティングの結果を図６に図面に代わる写真で示す。また、アグノタンパク質とＶＰ−１のシグナルをイメージアナライザーにより定量化し、スクランブルｓｉＲＮＡが導入された細胞での値に対する割合（％）をグラフ化して図７に示す。図６の横方向は導入したｓｉＲＮＡを示し、縦方向はタンパク質を示す。アクチンは陽性コントロールである。図７の左側はアグノタンパク質の場合であり、右側はＶＰ−１の場合を示す。各グラフの縦軸は、それぞれのタンパク質の陽性を示した細胞の、スクランブルｓｉＲＮＡが導入された細胞に対する割合（％ of sc）を示し、各グラフの左側の黒抜き部分はスクランブルｓｉＲＮＡを導入した場合を示し、その右側の斜線部分はＡｇ１２２が導入された場合を示し、その右側の灰色部分はＶＰ２７４が導入された場合を示し、右側の白抜き部分はＡｇ１２２及びＶＰ２７４の両者が導入された場合を示す。
この結果、ウイルスの蛋白質の発現を阻害する程度は、Ａｇ１２２とＶＰ２７４を組み合わせによるものと、それぞれのｓｉＲＮＡ単独によるものとで、有意な差はなかった。これは、Ａｇ１２２もしくはＶｐ２７４のいずれかによって引き起こされるアグノタンパク質及びＶＰ１の発現の阻害は、これらの蛋白質の双方をコードするポリシストロン性後期ｍＲＮＡが、それぞれのｓｉＲＮＡにより減少したことによるものと考えられる。【００２８】
ｓｉＲＮＡはそれと相同な配列を持つｍＲＮＡを標的とし、その分解を引き起こすと考えられている。そこで、ＪＣウイルスのｍＲＮＡの量に対するＡｇ１２２及びＶＰ２７４の効果を試験した。ｓｉＲＮＡを導入して１２もしくは２４時間後の細胞から全ＲＮＡを抽出し、ＤＮａｓｅＩで処理をした後、スーパースクリプトファーストストランド合成システム（Superscript first-strand synthesis system（インビトロジェン社））で逆転写してＧｅｎｅＡｍｐ５７００（アプライドバイオシステムズ社）を用いて、リアルタイムでの定量的ＰＣＲを行った。それぞれのウイルスにおけるｍＲＮＡの量は、同じサンプル中のβ−アクチンのｍＲＮＡの量により規格した。データは、スクランブルｓｉＲＮＡ（コントロール）が導入されたＪＣウイルス感染細胞での標準化された値に対する割合（％）として表わし、少なくとも３回の独立した試験での平均値±標準偏差である。この結果を図８にグラフ化して示す。図８の左側はアグノタンパク質の１２時間及び２４時間後の場合であり、右側はＶＰ−１の１２時間及び２４時間後の場合を示す。各グラフの縦軸は、それぞれのタンパク質のｍＲＮＡの量の、スクランブルｓｉＲＮＡが導入された細胞に対する割合（％ of sc）を示し、各グラフの左側の黒抜き部分はスクランブルｓｉＲＮＡを導入した場合を示し、その右側の斜線部分はＡｇ１２２が導入された場合を示し、その右側の灰色部分はＶＰ２７４が導入された場合を示し、右側の白抜き部分はＡｇ１２２及びＶＰ２７４の両者が導入された場合を示す。図８中の＊印はＰ＜０．０５で、＊＊印はＰ＜０．０２で有意差があることを示す。【００２９】
この結果、アグノタンパク質とＶＰ−１のｍＲＮＡの発現量は、Ａｇ１２２若しくはＶＰ２７４、又はその両方のｓｉＲＮＡｓが導入されたＪＣウイルス感染細胞で有意に減少していた（図８参照）。しかしながら、ウイルスのｍＲＮＡ量の減少は、それがコードするタンパク質の発現量の減少ほど大きなものではなかった（図５及び図８参照）。
そこで、（１）ＲＴ−ＰＣＲ反応前に逆転写酵素反応なしでＤＮａｓｅＩ処理をし、また（２）逆転写酵素反応の前にＲＮａｓｅＡ処理をすることによって、ＲＴ−ＰＣＲサンプル中にウイルスのＤＮＡが混入してくる可能性を無くした実験を行った。この両方の処理によって、ＲＴ−ＰＣＲのシグナルが失われたが、これはＲＴ−ＰＣＲサンプル中にウイルスのＤＮＡの混入がないことが示されたことになる。ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ；RNA-induced silencing complex）に結合し、ＲＩＳＣを介する配列特異的なｍＲＮＡの切断を誘起することが知られているが、このプロセスの詳細なメカニズムは未解明なままである。ＪＣウイルスの特異的なｓｉＲＮＡｓの効果の大きさが、ウイルスＲＮＡに対する効果とウイルスタンパク質に対する効果とで異なったことの説明のひとつとしては、ｓｉＲＮＡと結合した標的ＲＮＡが、切断される前にＲＴ−ＰＣＲによって検出されたということである。【００３０】
ＪＣウイルスの増殖に対するＲＮＡｉ法の効果を試験するために、ＪＣウイルス感染ＳＶＧ−Ａ細胞の赤血球凝集活性をｓｉＲＮＡ導入３６時間後に測定した。ＪＣウイルス感染細胞にそれぞれのｓｉＲＮＡを導入した３６時間後のＪＣウイルス感染細胞から調製した抽出物について赤血球凝固活性（ＨＡ）を分析した。データは、細胞抽出物２５μＬあたりの赤血球凝固活性力価として表し、少なくとも３回の独立した試験での平均値±標準偏差である。結果を図９にグラフ化して示す。図９の縦軸は細胞抽出物２５μＬあたりの赤血球凝固活性力価（HA titer/25μL）を示し、グラフの左側の黒抜き部分はスクランブルｓｉＲＮＡを導入した場合を示し、その右側の斜線部分はＡｇ１２２が導入された場合を示し、その右側の灰色部分はＶＰ２７４が導入された場合を示し、右側の白抜き部分はＡｇ１２２及びＶＰ２７４の両者が導入された場合を示す。図９中の＊＊印はＰ＜０．０２で有意差があることを示す。
この結果、Ａｇ１２２若しくはＶＰ２７４、又はその両方のｓｉＲＮＡｓを導入した細胞の赤血球凝集活性は、スクランブルｓｉＲＮＡを導入した細胞と比較してそれぞれ、６．７％、９．３％、４．１％であった（図９参照）。このように、アグノタンパク質又はＶＰ−１を標的とするｓｉＲＮＡは、感染細胞でのＪＣウイルス増殖を大きく阻害した。【００３１】
以上のことから、ＪＣウイルスに既に感染した細胞でのＪＣウイルスの増殖を、ＲＮＡｉ法によって顕著に阻害することができることを本発明者が初めて実証し、確認することができた。この結果は、ＰＭＬの治療に対する新しいアプローチの開発に重要な意味を持つものであり、ＰＭＬに対するＲＮＡｉ法に基づいた抗ウイルス戦略を適用するには、中枢神経系へのｓｉＲＮＡの効果的かつ特異的なデリバリーが極めて有効な手段であることを明らかにするものである。
ＪＣウイルス感染ＳＶＧ細胞においてＪＣウイルスのアグノタンパク質及びＶＰ−１をコードしているｍＲＮＡに特異的なｓｉＲＮＡを用いてウイルスのタンパク質の発現を抑制することが可能であり、ＪＣウイルス感染価も顕著に低下した。ウイルス感染が成立した後のウイルスの増殖の抑制が可能であることは、実際のウイルス感染症の治療を開発してゆく上で極めて有用であり、これによりウイルスの感染による各種の感染症、例えばＰＭＬや痴呆症の治療が可能となる。
【発明の効果】
【００３２】
本発明は、ｓｉＲＮＡという極めて短い２本鎖ＲＮＡの導入という簡便な手法により、ＪＣウイルスに感染した後の細胞におけるＪＣウイルスの増殖を抑制することができ、当該ウイルスの感染による各種の疾患の治療が可能となった。また、本発明は、ＪＣウイルスに感染した後の細胞におけるＪＣウイルスの増殖を抑制するための極めて有効な塩基配列を有するポリヌクレオチド、及び当該ポリヌクレオチドからなるｓｉＲＮＡを提供するものである。さらに、本発明のｓｉＲＮＡはＪＣウイルスの後期ｍＲＮＡにおけるアグノタンパク質及びＶＰ−１をコードするｍＲＮＡの発現を抑制することができ、両方のタンパク質の発現を同時に抑制することができることから、極めて有効なウイルス増殖抑制剤を提供するものでもある。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】図１は、ＪＣウイルスの主な早期ｍＲＮＡ（Early mRNA）及び後期ｍＲＮＡ（Late mRNA）と本発明のｓｉＲＮＡ（図１中の矢印）との関係を示したものである。
【図２】図２は、ＪＣウイルス感染後におけるＪＣウイルスのＶＰ−１及びアグノタンパク質に対するイムノブロッティングを行った結果を示す図面に代わる写真である。図２の横方向は、ＪＣウイルス感染からの経過日数（dpi:days post infection）を示し、図２の上段はＶＰ−１を示し、下段はアグノタンパク質を示す。
【図３】図３は、２回目のｓｉＲＮＡの導入（ウイルス接種から６日後）から４８時間後での、それぞれのｓｉＲＮＡ導入細胞におけるＪＣウイルスのアグノタンパク質、ＶＰ−１、及びＳＶ４０ラージＴ抗原の発現量を、イムノブロッティングを行った結果を示す図面に代わる写真である。図３の横方向は導入したｓｉＲＮＡを示し、縦方向はタンパク質の種類を示す。下段のアクチンは、陽性コントロールである。
【図４】図４は、ラミンＡ／Ｃ（LaminA/C）特異的ｓｉＲＮＡ、または、６０pmol／ウェルもしくは１２０pmol／ウェルのＡｇ１２２ｓｉＲＮＡを導入したＪＣウイルス感染細胞での、ラミンＡ／Ｃ（LaminA/C）、ＬＴ、ＶＰ−１、アグノタンパク質、及びアクチンのそれぞれのタンパク質に対するイムノブロッティングを行った結果を示す図面に代わる写真である。図４の横方向は、導入したｓｉＲＮＡを示し（Ａｇ１２２の左側は６０pmol／ウェルの場合を示し、右側は１２０pmol／ウェルの場合を示す。）、縦方向は各タンパク質の種類を示す。下段のアクチンは陽性コントロールである。
【図５】図５は、アグノタンパク質又はＶＰ−１陽性である細胞の割合を間接蛍光抗体免疫染色により測定した結果を示すグラフである。図５の左側はアグノタンパク質の場合であり、右側はＶＰ−１の場合を示す。各グラフの縦軸は、それぞれのタンパク質の陽性を示した細胞の、スクランブルｓｉＲＮＡが導入された細胞に対する割合（％ of sc）を示し、各グラフの左側の黒抜き部分はスクランブルｓｉＲＮＡを導入した場合を示し、その右側の灰色部分はＡｇ１２２が導入された場合を示し、その右側の灰色部分はＶＰ２７４が導入された場合を示し、右側の白抜き部分はＡｇ１２２及びＶＰ２７４の両者が導入された場合を示す。各データは少なくとも３回の独立した試験での平均値±標準偏差である。図５のグラフ中の＊＊印は、Ｐ＜０．０２（スチューデントのｔ検定）で有意差があることを示す。
【図６】図６は、Ａｇ１２２若しくはＶＰ２７４、又はその両方のｓｉＲＮＡが導入された細胞でのアグノタンパク質及びＶＰ−１のそれぞれの発現の阻害を、イムノブロッティングした結果を示す図面に代わる写真である。図６の横方向は導入したｓｉＲＮＡを示し、縦方向はタンパク質を示す。アクチンは陽性コントロールである。
【図７】図７は、Ａｇ１２２若しくはＶＰ２７４、又はその両方のｓｉＲＮＡが導入された細胞でのアグノタンパク質及びＶＰ−１のそれぞれの発現の阻害を、イムノブロッティングした結果のアグノタンパク質とＶＰ−１のシグナルをイメージアナライザーにより定量化して、スクランブルｓｉＲＮＡが導入された細胞での値に対する割合（％）をグラフ化したものである。図７の左側はアグノタンパク質の場合であり、右側はＶＰ−１の場合を示す。各グラフの縦軸は、それぞれのタンパク質の陽性を示した細胞の、スクランブルｓｉＲＮＡが導入された細胞に対する割合（％ of sc）を示し、各グラフの左側の黒抜き部分はスクランブルｓｉＲＮＡを導入した場合を示し、その右側の斜線部分はＡｇ１２２が導入された場合を示し、その右側の灰色部分はＶＰ２７４が導入された場合を示し、右側の白抜き部分はＡｇ１２２及びＶＰ２７４の両者が導入された場合を示す。
【図８】図８は、ＪＣウイルス感染細胞に各ｓｉＲＮＡｓを導入して、１２時間及び２４時間経過後のＪＣウイルス感染細胞から全ＲＮＡを抽出し、アグノタンパク質及びＶＰ−１のｍＲＮＡに対する定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析を行った結果を示すグラフである。図８の左側はアグノタンパク質の１２時間及び２４時間後の場合であり、右側はＶＰ−１の１２時間及び２４時間後の場合を示す。各グラフの縦軸は、それぞれのタンパク質のｍＲＮＡの量の、スクランブルｓｉＲＮＡが導入された細胞に対する割合（％ of sc）を示し、各グラフの左側の黒抜き部分はスクランブルｓｉＲＮＡを導入した場合を示し、その右側の斜線部分はＡｇ１２２が導入された場合を示し、その右側の灰色部分はＶＰ２７４が導入された場合を示し、右側の白抜き部分はＡｇ１２２及びＶＰ２７４の両者が導入された場合を示す。図８中の＊印はＰ＜０．０５で、＊＊印はＰ＜０．０２で有意差があることを示す。
【図９】図９は、ＪＣウイルス感染細胞にそれぞれのｓｉＲＮＡを導入した３６時間後のＪＣウイルス感染細胞から調製した抽出物について赤血球凝固活性（ＨＡ）を分析した結果をグラフ化したものである。図９の縦軸は細胞抽出物２５μＬあたりの赤血球凝固活性力価（HA titer/25μL）を示し、グラフの左側の黒抜き部分はスクランブルｓｉＲＮＡを導入した場合を示し、その右側の斜線部分はＡｇ１２２が導入された場合を示し、その右側の灰色部分はＶＰ２７４が導入された場合を示し、右側の白抜き部分はＡｇ１２２及びＶＰ２７４の両者が導入された場合を示す。図９中の＊＊印はＰ＜０．０２で有意差があることを示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３４】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００３５】
ｓｉＲＮＡの構築
以下に示す各センス鎖及びアンチセンス鎖となるＲＮＡを２’−ＡＣＥ−ＲＮＡ合成法（2'-acetoxyethoxy-methyl ether RNA synthesis）により合成し、それぞれのセンス鎖及びアンチセンス鎖から目的のｓｉＲＮＡを合成した。
Ａｇ１２２：  センス鎖            5'-GGUGAAGACAGUGUAGACG-dTdG-3'
アンチセンス鎖   5'-CGUCUACACUGUCUUCACC-dTdG-3'
Ａｇ１４７：  センス鎖            5'-AAAGACAGAGACACAGUGG-dTdT-3'
アンチセンス鎖   5'-CCACUGUGUCUCUGUCUUU-dTdT-3'
ＶＰ２７４：  センス鎖            5'-UGAGGAUCUAACCUGUGGA-dTdT-3'
アンチセンス鎖   5'-UCCACAGGUUAGAUCCUCA-dTdT-3'
ＶＰ６９１：  センス鎖            5'-UACUGCCACAACAGUGCUG-dTdT-3'
アンチセンス鎖   5'-CAGCACUGUUGUGGCAGUA-dTdT-3'
ＬＴ７８  ：  センス鎖            5'-UUCCUGUCAUGAGAAAAGC-dTdG-3'
アンチセンス鎖   5'-GCUUUUCUCAUGACAGGAA-dTdG-3'
ＬＴ１３４：  センス鎖            5'-GGUGGGGACGAAGACAAGA-dTdT-3'
アンチセンス鎖   5'-UCUUGUCUUCGUCCCCACC-dTdT-3'
【実施例２】
【００３６】
ＪＣウイルス感染後のＪＣウイルスタンパク質の発現に対するイムノブロッティング
ＳＶＧ−Ａ（ＳＶ４０形質転換ヒト胎児グリア）細胞に、ＪＣウイルス（Ｍａｄ−１／ＳＶＥΔ株、赤血球凝集活性が細胞３×１０５個あたり１０２４単位）を接種した。
感染直後、感染２日後、３日後、４日後にＪＣウイルス後期タンパク質としてアグノタンパク質及びＶＰ−１を、抗アグノタンパク質抗体又は抗ＶＰ−１抗体を用いたイムノブロッティングを行った。
結果を図２に示す。
【実施例３】
【００３７】
ＪＣウイルス感染細胞への各種ｓｉＲＮＡの導入によるＪＣウイルスのタンパク質の発現に対するイムノブロッティング
実施例１で製造した各種のｓｉＲＮＡをＪＣウイルス感染細胞へ導入した。導入２日後（ウイルス接種から６日後）、再度同じｓｉＲＮＡを導入し、２回目のｓｉＲＮＡの導入から４８時間後に、それぞれのｓｉＲＮＡ導入細胞におけるＪＣウイルスのアグノタンパク質、ＶＰ−１、及びＳＶ４０ラージＴ抗原の発現量を、それぞれの特異的な抗体を用いてイムノブロッティングを行った。対照として、スクランブル配列を持つｓｉＲＮＡ（ダーマコン社）を導入した細胞を用いた。
結果を図３に示す。
【実施例４】
【００３８】
Ａｇ１２２ｓｉＲＮＡによるタンパク質の発現の抑制
ラミンＡ／Ｃ（LaminA/C）特異的ｓｉＲＮＡ（ダーマコン社）（６０pmol／ウェル）、及びＡｇ１２２を６０pmol／ウェル又は１２０pmol／ウェルのＡｇ１２２ｓｉＲＮＡをＪＣウイルス感染細胞へ導入した。それぞれのｓｉＲＮＡの導入から４８時間後に、それぞれのｓｉＲＮＡ導入細胞におけるＪＣウイルスのアグノタンパク質、ＶＰ−１、及びＳＶ４０ラージＴ抗原の発現量を、それぞれの特異的な抗体を用いてイムノブロッティングを行った。対照（Cont）として、細胞に形質導入試薬のみを導入したものを用いた。
結果を図４に示す。
【実施例５】
【００３９】
ＪＣウイルス感染細胞におけるＡｇ１２２及びＶＰ２７４の間接蛍光抗体免疫染色
実施例２と同様にして、Ａｇ１２２（１２０pmol／ウェル）、ＶＰ２７４（１２０pmol／ウェル）、並びにＡｇ１２２及びＶＰ２７４（それぞれ６０pmol／ウェル）をＪＣウイルス感染細胞へ導入した。ｓｉＲＮＡの導入から４８時間後に、それぞれのｓｉＲＮＡが導入されたＪＣウイルス感染細胞をメタノールで固定し、当該細胞をＶＰ−１又はアグノタンパク質の抗体で処理し、次にアレクサフルオル４８８（Alexa Fluor 488）の結合した抗ウサギ二次抗体（モレキュラープローブ社）で処理した。ＶＰ−１又はアグノタンパク質に陽性である細胞は共焦点レーザー顕微鏡（オリンパス社）で可視化され、６フィールドで計測した。
結果を図５にグラフで示す。
【実施例６】
【００４０】
Ａｇ１２２若しくはＶＰ２７４、又はその両方のｓｉＲＮＡが導入されたＪＣウイルス感染細胞でのアグノタンパク質及びＶＰ−１のそれぞれの発現に対するイムノブロッティング
実施例２と同様にして、Ａｇ１２２（１２０pmol／ウェル）、ＶＰ２７４（１２０pmol／ウェル）、並びにＡｇ１２２及びＶＰ２７４（それぞれ６０pmol／ウェル）をＪＣウイルス感染細胞へ導入した。ｓｉＲＮＡの導入から４８時間後に、それぞれのｓｉＲＮＡが導入されたＪＣウイルス感染細胞での、ＶＰ−１、アグノタンパク質およびアクチンの発現に対するイムノブロッティングを行った。
結果を図６に示す。【００４１】
また、アグノタンパク質とＶＰ−１のシグナルをイメージアナライザーにより定量化し、スクランブルｓｉＲＮＡが導入された細胞での値に対する割合（％）をグラフ化して図７に示す。
【実施例７】
【００４２】
ＪＣウイルスのｍＲＮＡの発現量に対するＡｇ１２２及びＶＰ２７４の効果試験
Ａｇ１２２（１２０pmol／ウェル）、ＶＰ２７４（１２０pmol／ウェル）、並びにＡｇ１２２及びＶＰ２７４（それぞれ６０pmol／ウェル）をＪＣウイルス感染細胞へ導入した。それぞれのｓｉＲＮＡを導入して１２時間後、２４時間後の細胞から全ＲＮＡを抽出し、ＤＮａｓｅＩで処理をした後、スーパースクリプトファーストストランド合成システム（インビトロジェン社）で逆転写して、ＧｅｎｅＡｍｐ５７００（アプライドバイオシステムズ社）を用いて、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行った。それぞれのウイルスにおけるｍＲＮＡの量は、同じサンプル中のβ−アクチンのｍＲＮＡの量により規格した。データは、スクランブルｓｉＲＮＡ（コントロール）が導入されたＪＣウイルス感染細胞での標準化された値に対する割合（％）として表わした。
この結果を図８にグラフ化して示す。
【実施例８】
【００４３】
ｓｉＲＮＡが導入されたＪＣウイルス感染ＳＶＧ−Ａ細胞でのＪＣウイルスの赤血球凝集活性
Ａｇ１２２（１２０pmol／ウェル）、ＶＰ２７４（１２０pmol／ウェル）、並びにＡｇ１２２及びＶＰ２７４（それぞれ６０pmol／ウェル）をＪＣウイルス感染細胞へ導入した。それぞれのｓｉＲＮＡを導入して３６時間後に細胞を回収し、１ｍＭトリス−ＨＣｌ，０．２％ＢＳＡ（ｐＨ７．５）で細胞を溶解し、０．０５Ｕ／ｍｌノイラミニダーゼで３７℃で一晩処理して、５６℃で３０分で不活化した後に、遠心分離を行い、上清をウイルス抽出液として用いた。このようにして得られたウイルス抽出液２５μＬを用いてヘマグルチネーションアッセイ法によりウイルス抽出液の赤血球凝集活性を測定した。
結果を図９にグラフ化して示す。
【産業上の利用可能性】
【００４４】
本発明は、有効な治療方法が開発されていないＪＣウイルスに起因する進行性多巣性白質脳症（progressive multifocal leukoencephalopathy：ＰＭＬ）や痴呆症などの疾患に有効な医薬組成物、及びその有効成分となるポリヌクレオチドを提供するものであり、疾患の治療薬や、ＪＣウイルスの増殖抑制剤として産業上、極めて有用なものである。
【配列表フリーテキスト】
【００４５】
配列番号１：ＶＰ−１をコードするＤＮＡの塩基配列
配列番号２：ＶＰ−１のアミノ酸配列
配列番号３：アグノタンパク質及びＶＰ−１をコードする後期ｍＲＮＡの塩基配列
配列番号４：ＶＰ２７４ｓｉＲＮＡのセンス鎖の塩基配列
5'‐UGAGGAUCUAACCUGUGGA-dTdT-3'
【図１】
0004672654.tif 000002
【図２】
0004672654.tif 000003
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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