(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペルオキシダーゼを基本とするアッセイを行う方法であって、
ペルオキシダーゼ酵素と、下記の化合物：
0004704572.tif 000007

からなる群より選ばれる可溶性ｐ−ヒドロキシフェニル含有基質化合物とを反応させる工程であって、
該基質化合物は、該ペルオキシダーゼ酵素との反応後に不溶性生成物を形成し、
該不溶性生成物は、照射されたときに活性化形態へと転換する
ことを特徴とする工程、
該不溶性生成物に光を照射することにより、該不溶性生成物を活性化形態へと転換する工程、
該活性化形態にある不溶性生成物に第１の波長の光を照射する工程であって、該照射により、該活性化形態にある不溶性生成物が、該第１の波長よりも長い第２の波長の蛍光を発するようにする工程、及び
該第２の波長を検出する工程
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記ペルオキシダーゼ酵素がセイヨウワサビペルオキシダーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記基質化合物の濃度が約１×１０-4Ｍ〜５×１０-2Ｍの範囲にある、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記基質化合物の濃度が約１×１０-3Ｍ〜１×１０-2Ｍの範囲にある、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記不溶性生成物に光を照射することにより、該不溶性生成物を活性化する工程が、該不溶性生成物に約３４０ｎｍ〜約３８０ｎｍの波長を有する光を照射する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記光が約３５０ｎｍ〜約３７０ｎｍの波長を有する、請求項５記載の方法。
【請求項７】
式：
0004704572.tif 000008
で示される構造を有する化合物。
【請求項８】
式：
0004704572.tif 000009
で示される構造を有する化合物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は、永久蛍光アッセイ、特にペルオキシダーゼ活性を通して不溶性生成物を形成する可溶性ｐ−ヒドロキシフェニル含有基質を利用した、ペルオキシダーゼを基本とする蛍光アッセイに関する。
【０００２】
背景技術
セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（ＥＣ  １．１１．１．７）は、免疫学的検出系に対して一般的に使用される酵素標識である。ＨＲＰは２分子の過酸化水素を水及び酸素へ分解する。ＨＲＰは、電子対を過酸化水素へ供与するときにこの反応を開始する。続いてこの酵素は、適切な供与体から電子を引き抜く（酸化する）。
ＨＲＰ及び可溶性蛍光生成物を形成するその他の酵素に対する供与体基質が文献に記載されている。Gross 及び Sizer, J. Biol. Chem., 234: 1611-1614 (1959)は、ペルオキシダーゼによるチラミン及びチロシンの酸化のメカニズムを記載している。彼らは、ペルオキシダーゼとチラミン及びチロシンとの反応生成物は、それぞれジチラミン及びジチロシンであることを見いだした。彼らは分析において、新規な可溶性蛍光物質の存在を証明した。
Guilbaultら, Analytical Chemistry, 40 (8): 1256-1263 (1980)は、酸化酵素の蛍光定量的測定のための新規な基質について記載している。炭水化物の比色測定の感度を改善するための試みにおいて、Guilbaultらは、ガラクトースオキシダーゼ又はグルコースオキシダーゼのいずれかによる炭水化物の酸化と結びついた一連のフェノール系ペルオキシダーゼ基質を評価した。フェノール系基質が選ばれた。なぜなら、フェノール系基質はペルオキシダーゼ及びＨ2Ｏ2と反応したときに蛍光性の液相生成物を形成したからである。最良の基質はｐ−ヒドロキシフェニル酢酸、ホモバニリン酸、チラミン及びチロシンであることが見いだされた。酸化した蛍光生成物の特徴付けにおいて、Guilbaultらは、このグループについての励起範囲は３１５〜３２６ｎｍであり、発光範囲は４１０〜４２５ｎｍであることを報告している。
Zaitsu 及び Ohkura, Analytical Biochemistry, 109: 109-113 (1980)は、セイヨウワサビペルオキシダーゼに対する新規な蛍光発生性基質を報告している。彼らは２５種のｐ−ヒドロキシフェニル又は３−メトキシ−４−ヒドロキシフェニル化合物についてＨＲＰに対する可溶性蛍光発生性基質としての適合性を評価した。彼らは３−（ｐ−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸が最良の基質であると結論付けた。使用した蛍光アッセイについて、励起波長範囲は３１２〜３２０ｎｍであり、発光波長範囲は４００〜４２２ｎｍであった。
非酵素的蛍光検出法がアッセイにおいて使用されてきているが、これらの方法は低感度に悩み、感度が十分であるときは不安定で、結果の達成を許容しない（Raapら, Human Molecular Genetics, 4 (4): 529-534 (1995); Speelら, J. Histochem. Cytochem., 45 (10): 1439-1446 (1997); Chaoら, Cytometry, 23: 48-53 (1996)）。感度を増強させる１つの方法は、酵素的増幅の使用である。ペルオキシダーゼを基本とする固相アッセイでは、反応して不溶性蛍光生成物を形成する可溶性非蛍光基質の欠如により、酵素的増幅は困難である。したがって、増強した感度並びに永久保存及びアッセイ結果の後の使用を許容する、酵素的増幅アッセイにおける基質に対するニーズが存在している。
【０００３】
発明の開示
本発明は、永久性の高度に蛍光性のペルオキシダーゼを基本とするアッセイ法であって、ペルオキシダーゼと可溶性ｐ−ヒドロキシフェニル含有基質とを反応させ、不溶性の蛍光性生成物を形成する工程を含むことを特徴とする方法に関する。
別の態様において本発明は、所望の物質を含むかもしれないサンプル中で前記所望の物質の存在又は不存在を検出するためのペルオキシダーゼを基本とするアッセイであって、ペルオキシダーゼ酵素と可溶性ｐ−ヒドロキシフェニル含有基質とを反応させて、ペルオキシダーゼ活性により不溶性の蛍光性生成物を形成する工程を含むことを特徴とする方法に向けられる。
【０００４】
発明の実施の態様
用語「ペルオキシダーゼを基本とするアッセイ」とは、固相酵素アッセイであって、ペルオキシダーゼ酵素、例えばＨＲＰを、可溶性基質を不溶性生成物へ変換する酵素標識として使用するアッセイを意味する。
用語「不溶性生成物」とは、アッセイ溶液から沈殿して、一般的には表面上に析出する固体を形成する生成物を意味する。典型的な表面には、細胞、組織、ガラス、プラスチック及びケイ素が含まれるが、これらに限定されるものではない。本発明における「不溶性生成物」とは、ある溶媒中では可溶性であるが、本発明の特定のアッセイでは不溶性であることが理解されるだろう。
用語「ｐ−ヒドロキシフェニル含有」とは、構造：
【０００５】
0004704572.tif 000002
【０００６】
（式中、Ｘは置換された脂肪族基である）
を含む化合物を意味する。
より好ましくは、ｐ−ヒドロキシフェニル含有化合物は、構造：
【０００７】
0004704572.tif 000003
【０００８】
（式中、Ｑは直鎖又は分岐鎖のヘテロ原子数１〜１２のアルキル（式中、ヘテロ原子はＣ、Ｎ、Ｏ及びＳのうちの１つ以上である）であり、該ヘテロ原子アルキル鎖を連結する結合は単結合又は二重結合であり、該ヘテロ原子アルキル鎖中の全ての炭素原子は適宜置換基を含んでいてもよく、該置換基は−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ2又は−ＳＨであり、Ｒは−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ2又は−ＣＨ3の中の１つ以上である）を有している。可溶性ｐ−ヒドロキシフェニル含有化合物は、照射したときに高度な蛍光性になる安定な不溶性生成物に変換することができる。
本発明の実施に使用することができるｐ−ヒドロキシフェニル含有基質の例には、
【０００９】
0004704572.tif 000004
【００１０】
（式中、Ｑ−Ｒは、−（ＣＨ2）2ＣＯＮＨ（ＣＨ2）4ＣＨ2ＯＨ、−（ＣＨ2）2ＣＯＮＨ（ＣＨ2）5ＣＨ2ＯＨ、−（ＣＨ2）2ＣＯＮＨ（ＣＨ2）7ＣＯＯＨ、−（ＣＨ2）2ＣＯＯＨ、−ＣＨ2ＣＨ2ＯＨ、−ＣＨ2ＣＨ3、−（ＣＨ2）2ＣＨ2ＯＨ又は−（ＣＨ2）2ＣＨ3である）が含まれる。
本発明の実施に使用することができる好ましいｐ−ヒドロキシフェニル含有基質は、
【００１１】
0004704572.tif 000005
【００１２】
である。
本明細書で使用するとき、用語「置換された脂肪族」は、直鎖又は分岐鎖の炭化水素、例えばアルキル基を含むことができる。アルキル基の代表例はメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、イソブチル、ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ペンチル及びヘキシルである。
用語「照射したときに高度に蛍光性になる」とは、不溶性生成物が後に励起したときに不溶性生成物を高度に蛍光性にする、通常は３００〜４００ｎｍの波長における照射による最初の励起を要求することを意味する。物質が照射により最初に励起されない場合、後述するように蛍光は発生したとしても非常に弱く、ほとんど認識することができない。推論により縛られることを望むものではないが、本発明者等は、活性化が物質の安定又は準安定状態を作り出し、これにより蛍光が増強すると推定している。不溶性生成物の驚くべきかつ予想外の性質は、高分子性、結晶性又はデンドリマー（dendrimer）性の複合体の形成によるものであろう。この生成物は、適切な基質とペルオキシダーゼとの反応により形成することができ、これを使用してタンパク質、核酸又はその他の物質を標識する。
例えば、式：
【００１３】
0004704572.tif 000006
【００１４】
（式中、Ｑ−Ｒは、−（ＣＨ2）2ＣＯＮＨ（ＣＨ2）4ＣＨ2ＯＨ、−（ＣＨ2）2ＣＯＮＨ（ＣＨ2）5ＣＨ2ＯＨ、−（ＣＨ2）2ＣＯＮＨ（ＣＨ2）7ＣＯＯＨ、−（ＣＨ2）2ＣＯＯＨ、−ＣＨ2ＣＨ2ＯＨ、−ＣＨ2ＣＨ3、−（ＣＨ2）2ＣＨ2ＯＨ又は−（ＣＨ2）2ＣＨ3である）で示されるｐ−ヒドロキシフェニル含有基質について、最初の照射波長は４００ｎｍ未満であり、典型的には約３４０〜約３８０ｎｍの範囲にある。好ましくは、照射波長は約３５０〜約３７０ｎｍの範囲にある。その他の照射波長を、使用する特定の基質に依存して用いることができることは明らかである。当業者は、与えられた基質について適切な波長を決定することができるだろう。
最初の照射の後、後に照射をしたとき、生成物は、驚くべきかつ予想外の蛍光励起及び発光特性を示す。予想外の性質とは、生成物が複数の波長において蛍光励起／発光を示すことである。例えば、典型的には低い５００ｎｍ範囲の発光フィルターを用いて観察したとき、生成物は約４９０ｎｍで励起して、高度又は明るい緑色蛍光を生成することができる。更に、典型的には高い５７０ｎｍ範囲の発光フィルターを用いて観察したとき、生成物は約５５０ｎｍで励起して、高度又は明るい赤色蛍光を生成することができる。更に、相伴う発光特性を有する生成物をこれらの波長範囲よりも高い及び低い波長の両方で励起することができる。したがって、多数の励起源及び蛍光フィルターを利用して蛍光を観察することができる。（例えば４９０又は５５０ｎｍ）で蛍光が衰え始めるポイントまで励起した場合、３６０ｎｍ範囲の照射により蛍光は再生する。したがって、本発明の方法は、感受性、安定かつ永久的な蛍光生成物を生成することにより、前記の従来技術の問題を克服する。発光特性もサンプルの自己蛍光の問題を克服する。
本発明の方法は、当業者に周知の慣用技術を用いて、ペルオキシダーゼを酵素標識として使用する、例えばマイクロアレイ、組織化学的アッセイ、核酸アッセイ、イムノアッセイなどのほとんどの固相アッセイについて使用することができる。組織化学的アッセイ又は核酸ハイブリダイゼーション法について、好ましい表面は媒体自体、例えばガラス又はプラスチック製のスライド、膜又はビーズに固定化された動物又は植物細胞及び組織である。
【００１５】
溶液中の基質量は、活性を測定するペルオキシダーゼ酵素の同一性及び濃度に依存してかなりの範囲で変化させることができる。濃度は１×１０-4Ｍ〜５×１０-2Ｍの範囲であることができる。好ましくは、基質は１×１０-3Ｍ〜１×１０-2Ｍの量で存在する。その他の基質濃度を、特定の基質に依存して利用することができることは明らかであり、当業者は適切な基質濃度を確認することができるだろう。
不溶性生成物は、基質溶液と酵素含有サンプルとをインキュベートすることにより形成又は発達する。不溶性生成物への照射、続く励起は、蛍光シグナルの発生にとっての必要条件である。
本発明は、ペルオキシダーゼを基本とするアッセイにおける感度を増強する方法であって、ペルオキシダーゼと本発明の可溶性ｐ−ヒドロキシフェニル含有基質とを反応させて、その後の励起において高度に蛍光性になる永久的不溶性生成物を形成する工程を含むことを特徴とする方法を含んでいる。
驚くべきかつ予想外なことに、ｐ−ヒドロキシフェニル含有基質は蛍光性がないか又は蛍光が弱い不溶性生成物を形成するが、照射後、励起したときには高度かつ明るい蛍光性になることを見いだした。生成物は、高度な化学安定性、光安定性及び蛍光再生性を有している。
別の態様において、本発明はある物質を含むことが疑われるサンプル中の当該物質の存在又は不存在を検出するためのペルオキシダーゼを基本とするアッセイであって、改良点がペルオキシダーゼと可溶性ｐ−ヒドロキシフェニル含有基質とを反応させて、最初の照射後、その後の励起において蛍光性になる不溶性生成物を形成する工程を含んでいることを特徴とするアッセイに向けられる。前記のアッセイは、当業者に周知の慣用技術を使用して行うことができる。本発明を使用して、全てのタイプの抗原又は核酸を検出することができる。
【００１６】
実験データ
実施例１  ｐ−ヒドロキシフェニル含有ＨＲＰ基質を用いた、組織切片における蛍光の検出
パラフィン包埋マウス腸切片を脱パラフィン化（deparaffinize）し、非特異的結合部位をＰＢＳブロッキング緩衝液（ＰＢＳ−ＢＢ）（０．１Ｍ  リン酸緩衝食塩水、ｐＨ７．２、１．０％ウシ血清アルブミン、０．２％脱脂粉乳及び０．３％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）中の３０分間の処理によりブロックした。濃度１０μｇ／ｍｌのセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲートコムギ胚芽アグルチニン（Sigma, St. Louis, MO）のＰＢＳ−ＢＢ溶液を、切片と共に、室温下で１時間インキュベートした。次いで切片をＰＢＳ（５分間の洗浄を３回）及びＴｒｉｓ（０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．５、３分間の洗浄を３回）中で洗浄した。０．００３％のＨ2Ｏ2を含むＮ−（５−ヒドロキシペンチル）−３−（ｐ−ヒドロキシフェニル）プロピオンアミド（ＨＨＰＡ）の１ｍｇ／ｍｌ  Ｔｒｉｓ溶液を、切片へ、室温下で１０分間添加した。次いで切片をＴｒｉｓ（３分間の洗浄を３回）中で洗浄し、Ｔｒｉｓ：グリセロール（１：１）を用いてマウントし、カバーガラスで覆った。切片を、エピフルオレセンス（epifluorescence）及び下記の励起／発光特性（３６０ｎｍ／＞４００ｎｍ（青−白色の蛍光）、４９０ｎｍ／５２０ｎｍ（緑色蛍光）及び５５０ｎｍ／５７０ｎｍ（赤色蛍光））を有するフィルターセットを備えたZeiss Axioskop 顕微鏡で観察した。切片を、Zeiss MC100 カメラシステムで撮影した。
コムギ胚芽アグルチニンは、腸ムチン産生ゴブレット細胞に多量に存在するＮ−アセチルグルコサミン残基に結合する。最初の顕微鏡試験は３６０ｎｍの励起で弱い蛍光シグナルを示したが（図１Ａ、青−白色フィルターセット）、標準の緑色（図１Ｃ）又は赤色（図１Ｅ）フィルターセットで観察したときシグナルはほとんどなかった。顕微鏡の領域（field）を３６０ｎｍで１分間照射し、前記の通りにして再試験した。３６０ｎｍ照射への短時間の曝露の後に蛍光シグナルが劇的かつ予想外に増加した。ゴブレット細胞に局在化する強い蛍光シグナルが、３つのフィルターセット：青−白色（図１Ｂ）、緑色（図１Ｄ）及び赤色（図１Ｆ）を用いて観察された。ＨＲＰをコンジュゲートしたコムギ胚芽アグルチニンとのインキュベートがない場合にはゴブレット細胞特異的シグナルは観察されなかった（データは示さず）。元の倍率は４００×であった。
【００１７】
実施例２  ｐ−ヒドロキシフェニル含有ＨＲＰ基質を用いた改善された蛍光シグナル安定性
パラフィン包埋マウス脳切片を脱パラフィン化し、非特異的結合部位をＰＢＳ−ＢＢ中での３０分間の処理によりブロックした。微小管関連タンパク質−２に対するモノクローナル抗体（Sigma）をＰＢＳ−ＢＢで１：１００，０００に希釈し、切片と共に４℃で一晩インキュベートした。次いで切片をＰＢＳ（５分間の洗浄を３回）で洗浄し、ＰＢＳ−ＢＢで１：１０００に希釈したＨＲＰコンジュゲートロバ抗マウス抗体（Jackson Immunoresearch Laboratories, West Grove, PA）と共に室温下で１時間インキュベートした。次いで切片をＰＢＳ（５分間の洗浄を３回）中で洗浄し、ＴＳＡダイレクトフルオレセインキットを製造者の指示（NEN Life Science Products, Inc., Boston, MA）にしたがい用いて又はＨＨＰＡ（ＴＳＡ増幅希釈物中の１ｍｇ／ｍｌ、１０分間）のいずれかを用いて微小管関連タンパク質−２免疫反応性を局在化させた。次いで切片をＴｒｉｓ（５分間の洗浄を３回）中で洗浄し、Ｔｒｉｓ：グリセロール（１：１）を用いてマウントし、カバーガラスで覆った。
フルオレセイン標識した切片を、４９０ｎｍ／５２０ｎｍに励起／発光ピークを有するフィルターセットを用いて観察した。ＨＨＰＡ標識切片を最初に３６０ｎｍで１分間照射して、沈殿した反応生成物を活性化し、次いで３６０ｎｍ／５２０ｎｍに励起／発光ピークを有するフィルターセットを用いて観察した。切片を連続的な励起の０及び１５分後に観察した。標準的な２秒の曝露を使用した顕微鏡写真を両方の時間時点において撮影し、経時の蛍光強度の変化を評価した。更に両方の時間時点において、ＡＳＡ設定１６００及びＭＣ１００カメラシステム（Zeiss）を使用した標準領域における顕微鏡写真的ドキュメンテーション（documentation）に必要な自動曝露時間を記録することにより、蛍光強度を半定量化した。この測定を使用して、短時間の曝露時間と明るい蛍光とを相関させ、長時間の曝露時間と暗い蛍光とを関連づけた。
ＴＳＡダイレクトフルオレセインと反応させた切片は、強い初期シグナル（図２Ａ）を示し、１５分間の連続的励起で劇的に衰えた（図２Ｂ）。規格ＡＳＡ１６００に必要な時間は０（１．８秒）から１５分（１２．０秒）で６倍以上に増加した。対照的に、ＨＨＰＡ反応スライドへの１５分間の連続的曝露は、蛍光強度の増加を起こした（図２Ｃ、時間０。図２Ｄ、１５分間の励起後。）。１５分間の一定の励起後、標準曝露時間は４．１秒から３．１秒へ減少した。ＨＨＰＡについての著しい蛍光安定性は予想外のものであり、これはほとんどのフルオロホア（fluorophore）を長時間の励起に曝露したときに観察されるシグナルの典型的な損失とは異なるものであった。元の倍率は６００×であった。
前記の図面、検討及び記載は、本発明及びこれのいくつかの態様の一般的原理を説明するものであり、本発明の実施についての限定を意味するものではない。なぜなら、多数の修飾及び改変が当業者にとって容易に明らかであるからである。全ての均等物を含む特許請求の範囲が本発明の範囲を規定する。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１Ａ〜Ｆは、小さいｐ−ヒドロキシフェニル含有ＨＲＰ基質を利用した、組織における蛍光検出を示す写真である。（Ａ）は青−白色フィルターセットを使用した３６０ｎｍ励起による蛍光シグナルを示す写真である。（Ｂ）は青−白色フィルターセットを使用した３６０ｎｍで１分間照射した後の蛍光シグナルを示す写真である。（Ｃ）は緑色フィルターセットを使用した４９０ｎｍでの励起後の蛍光シグナルを示す写真である。（Ｄ）は３６０ｎｍで１分間の照射後に緑色フィルターセットを使用した４９０ｎｍで励起した同一スライドを示す写真である。（Ｅ）は赤色フィルターセットを使用した５５０ｎｍでの励起後の蛍光シグナルを示す写真である。（Ｆ）は３６０ｎｍで１分間の照射後に赤色フィルターセットを使用した５５０ｎｍで励起した図１Ｅに示されるのと同一スライドを示す写真である。
【図２】  図２Ａ〜Ｄは、組織切片を示す写真である。（Ａ）は最初の励起後にＴＳＡダイレクト−フルオレセインと反応させた組織切片である。（Ｂ）は１５分間の連続的励起後の図２Ａと同一の切片である。（Ｃ）は最初の励起後のＨＨＰＡと反応させた組織切片の写真である。（Ｄ）は１５分間の連続的励起後の図２Ｃと同一のスライドである。
【図１Ａ】
0004704572.tif 000010
【図１Ｂ】
0004704572.tif 000011
【図１Ｃ】
0004704572.tif 000012
【図１Ｄ】
0004704572.tif 000013
【図１Ｅ】
0004704572.tif 000014
【図１Ｆ】
0004704572.tif 000015
【図２Ａ】
0004704572.tif 000016
【図２Ｂ】
0004704572.tif 000017
【図２Ｃ】
0004704572.tif 000018
【図２Ｄ】
0004704572.tif 000019