(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスＴＹ２株。
【請求項２】
当該ウイルスの主要な宿主防御抗原部位であるＶＰ２内の超可変領域をコードする遺伝子より配列番号１２及び１３からなるプライマーを用いたＰＣＲ法によって増幅した断片が、TaqＩ及びSspＩにより切断されず、MvaＩにより約５２ｂｐ及び約４２２ｂｐに切断されることを特徴とする請求項１に記載の伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスＴＹ２株。
【請求項３】
当該超可変領域が、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有する請求項１又は２に記載の伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスＴＹ２株。
【請求項４】
当該ＶＰ２が、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する請求項１から３のいずれかに記載の伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスＴＹ２株。
【請求項５】
請求項１から４のいずれかに記載の伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスＴＹ２株由来の継代株であって、当該継代株のＶＰ２のアミノ酸配列において、配列番号１に記載のアミノ酸配列の２８４番目のアラニンに対応するアミノ酸がスレオニンであり、ＶＰ２内の超可変領域が、配列番号４又は配列番号５に記載のアミノ酸配列を有する 継代株。
【請求項６】
当該継代株が鶏胚線維芽細胞（ＣＥＦ）馴化株である請求項５ に記載の継代株。
【請求項７】
当該継代株がＴＹ２−ＣＥＦ１株又はＴＹ２−ＣＥＦ２株である請求項５又は６に記載の継代株。
【請求項８】
請求項１から４のいずれかに記載の伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスＴＹ２株又は請求項５から７のいずれかに記載の継代株を有効成分とする伝染性ファブリキウス嚢病ワクチン。
【請求項９】
請求項１から４のいずれかに記載の伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスＴＹ２株又は請求項５から７のいずれかに記載の継代株を有効成分とし、薬理学的に許容される担体を含む伝染性ファブリキウス嚢病ワクチン組成物。
【請求項１０】
配列番号３に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む、請求項１から４のいずれかに記載の伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスＴＹ２株に由来する遺伝子。
【請求項１１】
配列番号３に記載のアミノ酸配列を有する、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスＴＹ２株のＶＰ２内の超可変領域ペプチド。
【請求項１２】
配列番号１に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む、請求項１から４のいずれかに記載の伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスＴＹ２株に由来する遺伝子。
【請求項１３】
配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスＴＹ２株のＶＰ２ペプチド。
【請求項１４】
配列番号４に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む、請求項５から７のいずれかに記載の伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスＴＹ２株由来継代株に由来する遺伝子。
【請求項１５】
配列番号４に記載のアミノ酸配列を有する、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスＴＹ２株由来継代株のＶＰ２内の超可変領域ペプチド。
【請求項１６】
配列番号５に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む、請求項５から７のいずれかに記載の伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスＴＹ２株由来継代株に由来する遺伝子。
【請求項１７】
配列番号５に記載のアミノ酸配列を有する、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスＴＹ２株由来継代株のＶＰ２内の超可変領域ペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規な鳥類伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス株に関する。さらに詳細には当該新規ウイルス株を利用した伝染性ファブリキウス嚢病のワクチン及びワクチン組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
伝染性ファブリキウス嚢病（Infectious Bursal Disease；以下、「ＩＢＤ」という）は、ＩＢＤウイルスに起因する鶏や七面鳥等の家禽に発症する急性伝染病である。ＩＢＤウイルスはビルナウイルスに属する二本鎖のＲＮＡウイルスである。血清型はタイプ１とタイプ２の２型に分けられ、タイプ１は鶏由来であり鶏に対して病原性をもつが、タイプ２は七面鳥から多く分離される病原性のきわめて弱いウイルスである。ＩＢＤウイルスの遺伝子は、長さ約３.３ｋｂの分節Ａと約２.８ｋｂの分節Ｂを有する。分節Ａは１１０ｋＤの蛋白（ＮＨ２−ＶＰ２−ＶＰ４−ＶＰ３−ＣＯＯＨ）をコードし、このうち構造蛋白であるＶＰ２は主要な宿主防御抗原である。さらに、ＶＰ２内の超可変領域（ＶＰ２中の２０６〜３５０番目のアミノ酸に対応する領域）の変化によってＩＢＤウイルスの抗原性あるいは病原性が変化する。一方、分節Ｂは９０ｋＤの多機能蛋白（ポリメラーゼ）であるＶＰ１をコードする。【０００３】
ファブリキウス嚢（以下、「Ｆ嚢」という）は鳥類の主要リンパ組織の一つで、鶏では生後約１０週齢で最大となり性成熟とともに退縮する。ＩＢＤウイルスはＦ嚢のＢ前駆細胞に強い親和性を示し、感染することにより免疫抑制を起こし、日和見感染やワクチン免疫の不成立の原因となる。生後３〜１２週齢の雛で感受性が高く、ＩＢＤ発症例では元気消失、羽毛逆立て、沈鬱、下痢等の症状を示し重症例では死亡する。病理学的にはＦ嚢の腫大又は萎縮、水腫、黄色化、出血等を認め、また、胸腺の萎縮、骨格筋の出血、脾臓の腫大、白色斑点形成、肝臓の腫大、退色、腎臓の腫大、退色、尿細管の拡張等がみられる。死亡に至らない例でも、他の感染症を併発し、経済的に大きな被害が出る場合がある。【０００４】
ＩＢＤは１９５０年代後半にアメリカ、デラウェア州のガンボロ地方で初めて発生した。日本では１９６０年代前半に初めて報告され、現在では全国的に発生をみる。また、１９９０年の夏以降、各地で従来型ＩＢＤウイルス感染鶏群に比較して非常に高い死亡率（数％から約６０％）で特徴づけられる高度病原性ＩＢＤが大発生し、甚大な被害をもたらした。【０００５】
ＩＢＤは効果的な治療法がないため、ワクチン接種による予防が重要な対処法となっている。一般的なワクチネーション法としては、種鶏に対して不活化ワクチンを投与し雛の移行抗体を高め、さらに、生後約２〜４週齢の雛に対して生ワクチンを投与し抗体価を高める方法がある。【０００６】
ＩＢＤワクチンとしては現在までに種々のものが報告されている。例えば、ＩＢＤウイルス構造蛋白であるＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４蛋白を含むワクチン（特許文献１）、ＩＢＤウイルスのＩＱ株及び９１−６株の不活化ワクチン（特許文献２）、ＩＢＤウイルスのＹＨ−９１−ＣＬＣ株を利用したワクチン（特許文献３）等が報告されている。【０００７】
また、高度病原性ＩＢＤウイルスより弱毒化及び培養細胞馴化された株の超可変領域のアミノ酸に関しては、２７９番目のアミノ酸ではアスパラギン酸がアスパラギンへ、２８４番目のアミノ酸ではアラニンがスレオニンへ変異することが予測されるとの報告がある（非特許文献１）。【０００８】
現在実用化されている生ワクチンは、高度病原性ＩＢＤに対しても有効であるが、近年日本国内ではこれらの生ワクチンを投与しているにもかかわらずＩＢＤの発生がみられる事例が報告されている。【０００９】
【特許文献１】特開平５−１９４５９７号公報
【特許文献２】特開平７−６７６３４号公報
【特許文献３】特開２００１−８６９８３号公報
【非特許文献１】Yamaguchi, T. et al., Virology, 223, pp.219-223 (1996)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
野外では従来のワクチンでは防御できない新しい性状を有する変異ウイルス株が出現するため、そのウイルス株に適した新規な株を使用したワクチンの開発が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、この様な状況から鋭意研究を進めた結果、従来型ワクチンとの抗原性において交差反応性が低いＩＢＤウイルスＴＹ２株を野外から分離し、その性状を確認するとともに、ＴＹ２株を発育鶏卵の漿尿膜（Chorioallantoic membrane；以下、「ＣＡＭ」という）、及び/又は鶏胚で継代することで、雛に対して病原性が低い株、及びその鶏胚線維芽細胞（Chicken embryo fibroblast；以下、「ＣＥＦ」という）に馴化した株の作出に成功した。【００１２】
すなわち本発明は、（１）新規なＩＢＤウイルスＴＹ２株、（２）該ウイルス株の継代株、（３）ＩＢＤウイルスＴＹ２株又は該ウイルス株の継代株を有効成分とするＩＢＤワクチン、（４）ＩＢＤウイルスＴＹ２株又は該ウイルス株の継代株を有効成分とし、薬理学的に許容される担体を含むＩＢＤワクチン組成物、(５)配列番号１に示したアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む遺伝子、(６)配列番号１に示したアミノ酸配列を含むペプチド、（７）配列番号３に示したアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む遺伝子、（８）配列番号３に示したアミノ酸配列を含むペプチド、（９）配列番号４又は配列番号５に示したアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む遺伝子、（１０）配列番号４又は配列番号５に示したアミノ酸配列を含むペプチドに関するものである。
【発明の効果】
【００１３】
ＩＢＤウイルスＴＹ２株又は当該ウイルスの継代株によって、従来のワクチンでは防御できない新しい性状を有するＩＢＤ変異ウイルス株に対して有効なワクチンを得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ＩＢＤウイルス分離のための試験スケジュールの概要を示した図。
【００１５】
【図２】分離された各ＩＢＤウイルス及び既知のＩＢＤウイルス株におけるTaqＩによる遺伝子切断パターンに関する電気泳動の結果を示した写真。Ａ〜Ｃは切断パターンを示す。
【００１６】
【図３】分離された各ＩＢＤウイルス及び既知のＩＢＤウイルス株におけるSspＩによる遺伝子切断パターンに関する電気泳動の結果を示した写真。Ｄ〜Ｅは切断パターンを示す。
【００１７】
【図４】分離された各ＩＢＤウイルス及び既知のＩＢＤウイルス株におけるMvaＩによる遺伝子切断パターンに関する電気泳動の結果を示した写真。Ｆ〜Ｇは切断パターンを示す。
【００１８】
【図５】ＩＢＤウイルスＴＹ２株の卵内接種によるＩＢＤウイルスＫ株に対する中和抗体価（幾何平均値）の推移を示した図。
【００１９】
【図６】ＩＢＤウイルスＴＹ２株及び他のＩＢＤワクチン株とのアミノ酸配列の比較を示した図。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
従来のワクチンでは防御できない新規なＩＢＤウイルスＴＹ２株は、実施例１に記載した方法に準じて野外より分離することが可能である。一般に、農場で飼われている鶏は、ＩＢＤ生ワクチンが接種されているため、接種された生ワクチンと異なる抗原域を有する新規な野外株の感染を受けた場合、当該鶏体内では、新規なウイルスのみならず、生ワクチン接種によるワクチンウイルス株（従来の抗原域を有するウイルス）が混在して増殖する場合があるため、新規なウイルスのみを選択的に分離することは困難である。また、いかなるＩＢＤワクチンによっても免疫されてない非免疫ＳＰＦ鶏を農場に同居させても、従来型ウイルスと新規なウイルスが同時に感染しうるため、上記と同様、新規なウイルスを分離することは困難である。【００２１】
一方、現在使用されているＩＢＤ不活化ワクチンで免疫したＳＰＦ鶏を野外の農場におとり鶏として同居させると、不活化ワクチン株の抗原域と重複する抗原域を有する野外株（従来のワクチンで防御できていた株）は当該おとり鶏体内に侵入しても増殖することはできないが、ワクチン株と抗原域が異なる野外株であれば、鶏体内で増殖させることができる。また、当該おとり鶏は不活化ワクチンを用いて免疫を獲得させていることにより、生ワクチン接種鶏とは異なり、鶏体内でのワクチンウイルス株の増殖も起こらないので、抗原域の異なる野外ウイルス株を分離するのに適している。従って、このような手法を用いることにより従来のワクチンでは防御できない新規なＩＢＤウイルス株を入手することができる。【００２２】
本発明により得られたＩＢＤウイルスＴＹ２株の遺伝子型を、TaqＩ、SspＩ及びMvaＩの３種類の制限酵素を用いた制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）により既知のＩＢＤウイルス株と比較したところ、ＴＹ２株は、TaqＩ及びSspＩにより切断されず、MvaＩにより約５２ｂｐ及び約４２２ｂｐに切断され、既知のＩＢＤウイルス株とは異なる切断パターンを示した（実施例１）。従って、本発明により得られたＩＢＤウイルスＴＹ２株は、既知のＩＢＤウイルス株と明らかに異なる遺伝子型を有することが判明した。【００２３】
ＩＢＤウイルスＴＹ２株の主要な宿主防御抗原部位であるＶＰ２内の超可変領域（２０６〜３５０番目のアミノ酸に対応する配列）のアミノ酸配列を配列番号３に示す。また、当該ＴＹ２株のＶＰ２のアミノ酸配列及び当該アミノ酸配列をコードする塩基配列をそれぞれ配列番号１及び２に示す。【００２４】
本発明により得られたＩＢＤウイルスＴＹ２株のＶＰ２内の超可変領域のアミノ酸配列について既知のＩＢＤウイルス株［Ｋ株（配列番号６）、２２８Ｅ株（配列番号７）、２５１２株（配列番号８）、Ｂｕｒsｉｎｅ２（ルカートＢＰ）株（配列番号９）、Ｄ７８株（配列番号１０）及びＶ８７７株（配列番号１１）］とのホモロジー解析を行ったところ、既知のＩＢＤウイルス株との相同性は最大で９２.４％、最も低いものでは８９.７％であった。【００２５】
本発明により得られたＩＢＤウイルスＴＹ２株の病原性を調べたところ、実施例２に記載のように、臨床症状観察において異常は認められず致死病原性は低かった。しかしながら、ＴＹ２株投与後の剖検による経時的肉眼病変観察において、投与後３日目よりＦ嚢の萎縮が認められ、投与後４日目以降ではＦ嚢対体重比が０.２％以下となり重度であったこと、また投与後３〜５日目までにＦ嚢の膠様化が認められたことなどから、Ｆ嚢に対する病原性は強いことが判明した（実施例２）。【００２６】
本発明により得られたＩＢＤウイルスＴＹ２株の他のＩＢＤウイルス株との交差反応性については、少なくともＫ株との交差反応性の低いことがわかった（実施例３）。【００２７】
本発明により得られたＩＢＤウイルスＴＹ２株は、ＳＰＦ発育鶏卵に卵内接種したときに既知のＩＢＤウイルス株に対する中和抗体価の上昇を示し、高度病原性ＩＢＤウイルスに対する優れた防御能が確認された（実施例４）。【００２８】
また、当該ＴＹ２株を継代培養することにより弱毒化された継代株が得られた。当該継代株は、ＳＰＦ鶏に投与すると、Ｆ嚢の傷害は認められず、Ｆ嚢に対する病原性が軽減されていることがわかった（実施例８）。当該継代株はまた、ＶＰ２のアミノ酸配列において、２８４番目のアミノ酸（アラニン）がスレオニンに置換されていることを特徴とする。さらに、当該継代株は、ＩＢＤウイルスＫ株に対する抗体産生性が確認されており、交差性の低いと考えられる従来型のＩＢＤウイルスに対しても免疫原性を有していることが明らかになった（実施例９）。【００２９】
当該継代株の一例として、ＣＥＦに馴化させたＩＢＤウイルスＴＹ２−ＣＥＦ１株及びＴＹ２−ＣＥＦ２株を挙げるが、これらＴＹ２−ＣＥＦ株のＶＰ２内の超可変領域のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号４及び配列番号５に示す。【００３０】
本発明に係るＩＢＤウイルスＴＹ２株等の遺伝子配列の解析は、通常行われる公知の方法で実施可能である。例えばMolecular Cloning；A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (2001)等に記載の方法に従って行うことができる。【００３１】
本発明におけるワクチンとは、ＩＢＤウイルスＴＹ２株、あるいはＴＹ２株と同等の抗原性を有するＩＢＤウイルス株を培養後不活化して得られる不活化ワクチン、又は、弱毒化した生ウイルスそのものを利用する生ワクチンを意味する。生ワクチンウイルス株は、継代培養等公知の方法（Lukert, P.D., et al. Disease of Poultry, 9th ed., Iowa State Univ. Press, 690-699, 1991）で作出可能であり、例えば発育鶏卵を用いたＣＡＭ継代やＣＥＦで継代することで弱毒化し、さらにプラッククローニング等の方法で、生ワクチンウイルス株を得ることができる。生ワクチンはこの株を発育鶏卵又はＣＥＦ等の培養細胞を用いて培養したものである。不活化ワクチンは加熱、紫外線照射等の物理的処理、ホルマリン、ベータプロピオラクトン等による化学的処理等公知の方法により不活化したものである。さらにまた、ＴＹ２株又は継代株のＶＰ２シークエンスを用いることによりＤＮＡワクチン又はベクターワクチンを構築することも可能である（Tsukamoto. K, et al., Virology, 257, 352-362, 1999 及びSonoda. K, et al., J. of Virology, 74(7), 3217-26, 2000）。【００３２】
本発明に係るワクチンの投与経路としては、経口、点眼、点鼻、筋肉内、静脈内、皮下又は卵内が挙げられる。また、不活化ワクチンとして投与する場合には筋肉内、腹腔内又は皮下への投与が好ましい。この際、ゴマ油、菜種油等の植物油、軽質流動パラフィン等の鉱物オイル、水酸化アルミニウムゲル、リン酸アルミニウムゲル等の公知のアジュバントとともに投与して効果を高めることができる。【００３３】
本発明に係るＩＢＤワクチンを適用する対象動物は、鶏、七面鳥、鶉、家鴨等の家禽である。投与する時期は任意で限定されないが、例えばブロイラー等の肉用鶏の場合には、移行抗体が消失する生後２〜４週齢の雛に生ワクチンを投与することが好ましい。また、採卵鶏あるいは種鶏であれば生ワクチンを生後２〜４週齢、生又は不活化ワクチンを７０日前後に投与する。さらに、不活化ワクチンのオイルアジュバント製剤であれば生後８０日前後に１回、オイル以外の例えば水酸化アルミニウムゲル製剤であれば生後約８０日及び約１１０日の２回投与することが好ましい。【００３４】
本発明に係るＩＢＤウイルスＴＹ２株、及び／又は継代株の培養方法は、特に限定されず公知の方法を用いればよい。その一例を以下に示す。ＩＢＤウイルスＴＹ２株継代株を規定量（例えば１０4.0ＴＣＩＤ50／ｍＬ）になるように維持用培地、あるいはＰＢＳを用いて調製したウイルス液を、常法によりあらかじめ３７℃、５％ＣＯ２存在下で２４〜４８時間培養したＣＥＦ（面積：２５cm２の細胞培養ボトル）に１.０ｍＬ接種する。その後３７℃、５％ＣＯ２存在下で２４〜９６時間培養し、この培養物上清をすべて回収し、４℃で３０００ｒｐｍ、２０分間遠心分離後、上清を回収する。【００３５】
なお、本発明に係るＩＢＤウイルスＴＹ２株及び該ウイルスの継代株は、−８０℃以下で長期間保存可能であって、財団法人化学及血清療法研究所に保管されており、頒布可能な状態にある。
【実施例】
【００３６】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。
《実施例１：コマーシャルブロイラー農場からのＩＢＤウイルスの分離》
実験室内において特定病原体除去（Specific pathogen free；以下、「ＳＰＦ」という）鶏の１及び３週齢時に従来型ＩＢＤウイルス株を用いたＩＢＤ不活化ワクチン（日生研ＩＢＤ不活化ワクチン、日生研株式会社）で免疫して得られた４週齢の高度免疫ＳＰＦ鶏（免疫ＳＰＦ鶏）及び４週齢の無処置ＳＰＦ鶏を、コマーシャルブロイラー農場の２週齢ブロイラーと５週間同居させた。ブロイラー農場ではブロイラーの２、３及び４週齢時に市販のＩＢＤ弱毒生ワクチン（ＩＢＤ生ワクチン“化血研”、財団法人化学及血清療法研究所）を飲水投与した（図１）。【００３７】
免疫ＳＰＦ鶏、無処置ＳＰＦ鶏及びブロイラー鶏を同居後毎週５羽ずつ実験室内に持ち帰り剖検後Ｆ嚢を採材した。採材したＦ嚢を群ごとにプールして１０％Ｆ嚢乳剤を作製し、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅後、TaqＩ、SspＩ及びMvaＩの３種類の制限酵素を用いたＲＦＬＰにより遺伝子型を調べた。ウイルス核酸の抽出はQIAamp Viral RNA Mini Kit（キアゲン株式会社）を用いて行った。採取したＦ嚢乳剤１４０μＬから６０μＬのＲＮＡ抽出液を作製した。このウイルスＲＮＡ抽出液を鋳型としてOneStep RT-PCR Kit（キアゲン株式会社）を利用し、配列番号１２及び１３に示すプライマー（P2.3（5’-CCCAGAGTCTACACCATA-3’）及びRP5.3（5’-TCCTGTTGCCACTCTTTC-3’））を用いてＶＰ２の超可変領域に対してＲＴ−ＰＣＲを実施した。【００３８】
表１に示す逆転写反応液を調製し、５０℃３０分で逆転写反応を行い、次に９４℃４分間の加熱により逆転写酵素を失活させた後、９４℃１分間の熱変性、５２℃１分間のアニーリング、７２℃２分間の伸長反応を２５サイクル実施し、さらに７２℃１０分間の伸長反応を行った。【００３９】
【表１】
0004684223.tif 000002
【００４０】
得られた遺伝子断片について、ＲＦＬＰ解析に十分量の遺伝子断片を確保する目的でさらに同一のプライマーを用いてＰＣＲを実施した。表２に示す反応液を調製し、９４℃４分間の加熱後、９４℃１分間の熱変性、５２℃１分間のアニーリング、７２℃２分間の伸長反応を２５サイクル実施し、さらに７２℃１０分間の伸長反応を行った。１.５％アガロースゲルを用いた電気泳動によりＰＣＲ産物として、目的のＤＮＡ断片が得られているのを確認した。ＲＦＬＰ解析では、このＤＮＡ断片１μLに対し、TaqＩ１μＬ、１０×Ｈバッファー２μＬ、滅菌蒸留水１６μＬで反応液を調製後、６５℃６０分間、SspＩ１μＬ、１０×Ｉバッファー２μＬ、滅菌蒸留水１６μＬで反応液を調製後、３７℃６０分間、さらにMvaＩ１μＬ、１０×Ｋバッファー２μＬ、滅菌蒸留水１６μＬで反応液を調製して３７℃６０分間、それぞれ反応させた後、PAGEL NPG-1020L（アトー株式会社）を用いた電気泳動により切断状況を確認した。【００４１】
【表２】
0004684223.tif 000003
【００４２】
その結果、以下のＡ〜Ｇのパターンに分けることができた。
Ａ：TaqＩにより全く切断されなかったパターン
Ｂ：TaqＩにより約２２３ｂｐ及び約２５１ｂｐに切断されたパターン
Ｃ：TaqＩにより約１００ｂｐ及び約３７４ｂｐに切断されたパターン
Ｄ：SspＩにより全く切断されなかったパターン
Ｅ：SspＩにより約２０１ｂｐ及び約２７３ｂｐに切断されたパターン
Ｆ：MvaＩにより約５２、５９、７０、１３９及び１５４ｂｐに切断されたパターン
Ｇ：MvaＩにより約５２ｂｐ及び約４２２ｂｐに切断されたパターン【００４３】
無処置ＳＰＦ鶏の同居後１週目においてのみ当該農場で使用したＩＢＤ弱毒生ワクチンと同じ遺伝子型（遺伝子切断パターンＩ：Ａ，Ｄ，Ｆ）を検出した他は、免疫ＳＰＦ鶏及び無処置ＳＰＦ鶏では同居後２及び３週目、ブロイラー鶏では同居後２〜４週目に、従来型の弱毒生ワクチン又は高度病原性株とは異なる遺伝子型（遺伝子切断パターンII：Ａ，Ｄ，Ｇ）を検出した（図２〜４、表３及び４）。【００４４】
【表３】
0004684223.tif 000004
1)：同居後週数【００４５】
【表４】
0004684223.tif 000005
1)：同居させたＳＰＦ鶏の週齢
＊：ＩＢＤ弱毒生ワクチン（Ｋ株；遺伝子切断パターンはＩ）を全群に投与【００４６】
《実施例２：ＩＢＤウイルスＴＹ２株のＳＰＦ鶏に対する病原性》
実施例１において、同居後２週目の免疫ＳＰＦ鶏由来１０％Ｆ嚢乳剤を５週齢のＳＰＦ鶏へ経口投与しＦ嚢で２代継代した株をＩＢＤウイルスＴＹ２株とし、本株のＳＰＦ鶏に対する病原性を確認した。ＩＢＤウイルスＴＹ２株（１０4.1ＥＩＤ50／ｍＬ）をＰＢＳで１０倍希釈したものを５週齢ＳＰＦ鶏４０羽に１.０ｍＬ経口投与して投与後３、４、５、７、１０及び１４日目に６羽ずつ剖検を行い、経時的にＦ嚢病変を観察した。未処置対照としてＳＰＦ鶏３６羽を準備し、投与前及びＴＹ２株投与群と同様のスケジュール（投与後４日目は除く）で６羽ずつ剖検した。Ｆ嚢については重量測定し対体重比を算出した。また、組織切片作製用に１０％ホルマリン液で固定してＨＥ染色標本を作製し、病理組織学的検索を実施した。【００４７】
その結果、ＴＹ２株投与後の臨床症状観察において、異常は認められなかった。ＴＹ２株投与後の剖検による経時的肉眼病変観察において、投与後３日目よりＦ嚢の萎縮が認められ、投与後４日目以降ではＦ嚢対体重比が０.２％以下となり重度であった。また、投与後３〜５日目までは、Ｆ嚢の膠様化を認めた（表５）。Ｆ嚢以外の剖検所見では、投与後３〜１０日目まで脾臓の腫大・白斑を認め、投与後４〜１０日目には胸腺の萎縮を認めた。Ｆ嚢の病理組織学的検索では、投与後３日目からリンパ球の減少・消失が中等度に、またリンパ濾胞の小型化が重度にそれぞれ認められた。リンパ濾胞内では偽好酸球を中心とする炎症性細胞の浸潤が軽度にみられ、間質領域では水腫も認められた。投与後７日目では、リンパ球の壊死、濾胞内では大食細胞による貪食像、細網細胞による網眼が顕著にみられ、皮質領域ではリンパ球減少によるひ薄化、及び結合組織の増生が認められた。一方、投与後１４日目では濾胞構造の再構築や活性化した濾胞が認められ、濾胞の回復像は認められるものの、完全に回復した濾胞はほとんど存在せず、完全な回復までには時間がかかるものと推察された。【００４８】
【表５】
0004684223.tif 000006
【００４９】
《実施例３：ＩＢＤウイルスＴＹ２株の他のＩＢＤウイルス株との交差反応性》
ＩＢＤウイルスＴＹ２株の従来型ＩＢＤウイルスであるＫ株（弱毒生ワクチン株）に対する卵内交差中和試験を実施し、従来株に対する交差反応性を検討した。ＴＹ２株抗血清、Ｋ株抗血清、及びＳＰＦ鶏対照血清の各ＰＢＳ５倍希釈液とＩＢＤウイルスＴＹ２株及びＫ株をＰＢＳで１０-1〜１０-4倍まで各１０倍階段希釈した液とをそれぞれ０.６ｍＬずつ等量混合し、３７℃で１時間反応させた（中和反応）。中和反応後の各混合液を０.２ｍＬずつ５個の１１日齢ＳＰＦ発育鶏卵ＣＡＭ上に接種し、接種後１週目に生死確認、さらに生存卵については開卵後胎児の肝臓所見によりウイルス増殖の有無を確認し、ＳＰＦ鶏抗血清と各ウイルス株のタイターを元に、それぞれの中和指数を算出した（表６）。
その結果、ＴＹ２株とＫ株は交差反応性が低いことが示唆された。【００５０】
【表６】
0004684223.tif 000007
a）：ＳＰＦ対照血清と反応させて得られたウイルス含有量（Log２EID50/ｍＬ）
b）：中和指数（Log2EID50/ｍＬ）【００５１】
《実施例４：ＩＢＤウイルスＴＹ２株の卵内接種における免疫原性及び高度病原性ＩＢＤウイルスに対する防御能》
ＩＢＤウイルスＴＹ２株を４週齢ＳＰＦ鶏のＦ嚢で１代継代し、さらに１１日齢ＳＰＦ発育鶏卵のＣＡＭ上接種により４代継代した株を移行抗体陽性鶏（レイヤー）由来の１９日齢発育鶏卵に１０4.0ＥＩＤ50／０.０５ｍＬ／卵で卵内接種した（試験群）。対照には非接種群を準備した。孵化後１０週齢まで毎週各群８羽ずつ剖検して各群のＩＢＤウイルスＫ株に対する中和抗体価を測定するとともに、高度病原性ＩＢＤウイルスに対する防御能を調べる目的で６週及び９週齢時に１０羽ずつ高度病原性ＩＢＤウイルスＫ５３９株で攻撃し、攻撃後４日目までの生死及び生存鶏については剖検によるＦ嚢所見により防御の有無を確認した。【００５２】
その結果、孵化直後は両群ともに高い移行抗体を保有しており、その抗体価は経時的に減少したが、ＴＹ２株を接種した試験群では孵化後５週齢以降に中和抗体価の上昇を認め、孵化後１０週齢まで高値を維持した（図５）。また、６週及び９週齢時のＩＢＤウイルスＫ５３９株による攻撃に対しても試験群では全例防御を示し、高度病原性ＩＢＤウイルスに対する優れた防御能が確認された（表７）。【００５３】
【表７】
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a）：攻撃防御の有無（防御羽数/攻撃羽数）【００５４】
《実施例５：塩基配列の決定》
ＩＢＤウイルスＴＹ２株の遺伝子のうち文節Ａによってコードされる構造蛋白であるＶＰ２の塩基配列は、日立計測器サービス株式会社（茨城県つくば市）又はタカラバイオ株式会社ドラゴンジェノミクスセンター（三重県四日市市）へ依頼し、決定された（配列番号２）。【００５５】
《実施例６：ＩＢＤウイルスＴＹ２株の他のＩＢＤワクチン株とのホモロジー検索》
ホモロジー解析にはＩＢＤウイルスのＶＰ２領域の一部である２０６〜３５０番目のアミノ酸配列（超可変領域）を用いた。既知のＩＢＤワクチン株としてＫ株、２２８Ｅ株、２５１２株、Ｂｕｒsｉｎｅ２株、Ｄ７８株及びＶ８７７株を用いた。それぞれの株の配列はＧＳＤＢ、ＤＤＢＪ、ＥＭＢＬ及びＮＣＢＩのシークエンスデータベース内のアクセッションナンバーより取得した（Ｋ株はタカラバイオ株式会社ドラゴンジェノミクスセンターへ依頼し決定した。２２８Ｅ株はＡＡＭ９０７９２、２５１２株はＡＡＧ５２７６０、Ｂｕｒsｉｎｅ２株はＡＡＭ２１０６４、Ｄ７８株はＣＡＡ７５１８４及びＶ８７７株はＣＡＥ５２９６９）。遺伝情報処理ソフトウェアGENETYX-WIN（商品名；ソフトウェア開発株式会社製）及び核酸配列自動結合ソフトウェアGENETYX-WIN/ATSQ（商品名；ソフトウェア開発株式会社製）を用いてＩＢＤウイルスＴＹ２株の既知ＩＢＤワクチン株とのホモロジー解析を行った。【００５６】
その結果、表８に示すように、従来のワクチン株にあってはＴＹ２株と最も高い相同性を示した場合においてもその相同性は９２.４％であった。また、ＩＢＤウイルスＴＹ２株の他のＩＢＤワクチン株とのアミノ酸配列の比較を図６に示した。なお、図６において、「*」印は比較した全配列にてアミノ酸が一致したことを示し、「.」印はいずれかの配列においてアミノ酸が異なるか、又は欠失していることを示す。【００５７】
【表８】
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※：Ｖ８７７のみ２１１〜３５０番目のアミノ酸での比較【００５８】
《実施例７：ＩＢＤウイルスＴＹ２−ＣＥＦ１株及びＴＹ２−ＣＥＦ２株の作出》
ＩＢＤウイルスＴＹ２株をＳＰＦ鶏由来の１１日齢発育鶏卵のＣＡＭ上に接種し、接種後３〜４日目の２０％ＣＡＭ及び／又は鶏胚乳剤を用いて同様に２０代まで継代し、その２０代目の継代株を８日齢ＳＰＦ鶏卵の卵黄嚢内に接種し、接種後３日目の鶏胚を用いてＣＥＦを培養した。その遠心上清をＣＥＦに接種後５〜７日目に凍結融解を１回実施し、さらにその遠心上清を用いて同様に８代継代したところ、３代目より細胞変性効果が認められＣＥＦに馴化された。このＣＥＦ３代継代株についてＣＥＦを用いた限外希釈法により３代継代してクローニングを行った株をＴＹ２−ＣＥＦ１株とした。【００５９】
また、ＩＢＤウイルスＴＹ２株を約５週齢のＳＰＦ鶏へ経口投与しＦ嚢で１代継代した株をＳＰＦ鶏由来の１１日齢発育鶏卵のＣＡＭ上に接種し、接種後３〜４日目の２０％ＣＡＭ及び／又は鶏胚乳剤を用いて同様に２０代まで継代し、その２０代目の継代株をＣＥＦに接種し、接種後５〜７日目に凍結融解を１回実施し、さらにその遠心上清を用いて同様に１０代継代したところ、９代目より細胞変性効果が認められＣＥＦに馴化された。このＣＥＦ１０代継代株についてＣＥＦを用いた限外希釈法により３代継代してクローニングを行った株をＴＹ２−ＣＥＦ２株とした。【００６０】
また、これら２株のＶＰ２超可変領域のアミノ酸配列を解析したところ、両株ともに２７９番目のアミノ酸（配列番号４及び配列番号５中の７４番目のアミノ酸に相当）はアスパラギンであり、２８４番目のアミノ酸（配列番号４及び配列番号５中の７９番目のアミノ酸に相当）ではアラニンがスレオニンに変異しており、ＣＥＦへの馴化の指標の一つとしている山口らの報告（T. Yamaguchi., et al. Virology, 223, 219-223, 1996）と一致していた。【００６１】
《実施例８：ＩＢＤウイルスＴＹ２−ＣＥＦ１株及びＴＹ２−ＣＥＦ２株のＳＰＦ鶏に対する病原性》
実施例７において作出されたＩＢＤウイルスＴＹ２−ＣＥＦ１株及びＴＹ２−ＣＥＦ２株を１０４ＴＣＩＤ５０／ｍＬずつ約４週齢のＳＰＦ鶏に経口投与し、投与後４日目及び１４日目に８羽ずつ（ＴＹ２−ＣＥＦ１株の１４日目のみ９羽）剖検を行い、Ｆ嚢病変を観察した。未処置対照としてＳＰＦ鶏１８羽を準備し、投与前、投与後４日目及び１４日目に６羽ずつ剖検した。Ｆ嚢については重量測定し対体重比を算出した。【００６２】
その結果を表９に示す。ＩＢＤウイルスＴＹ２−ＣＥＦ１株及びＴＹ２−ＣＥＦ２株投与後の臨床観察において、異常は認められなかった。剖検によるＦ嚢の肉眼病変観察において、投与後４日目ではＴＹ２−ＣＥＦ１株投与群において８羽中１羽にごく軽微な萎縮を認めるのみであった。投与後１４日目ではＴＹ２−ＣＥＦ１株投与群では９羽中１羽、ＴＹ２−ＣＥＦ２株投与後では８羽中５羽に軽度〜中等度の萎縮を認めた。これらの所見は、実施例２におけるＴＹ２株のＦ嚢に対する病原性と比較して明らかに軽減されていた。【００６３】
【表９】
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【００６４】
《実施例９：ＩＢＤウイルスＴＹ２−ＣＥＦ１株及びＴＹ２−ＣＥＦ２株のＳＰＦ鶏に対する抗体産生性》
従来型のＩＢＤウイルスに対する抗体産生性を確認するため、実施例８で用いた投与後１４日目の鶏血清を用いて、ＩＢＤウイルスＫ株に対する中和抗体価を測定した。【００６５】
９６穴プレートに維持用培地を０.０５ｍLずつ分注し、１穴目に５６℃３０分間で非働化した被験血清を０.０５ｍL添加し、１２穴まで２倍階段希釈した。ＩＢＤウイルスＫ株（中和用ウイルス）を維持用培地で２００ＴＣＩＤ５０／０.０５ｍＬになるように希釈し、この中和用ウイルスを０.０５ｍＬずつ添加して３７℃で１時間反応させた（中和反応）。１００万ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製したＣＥ細胞を０.０５ｍＬずつ添加し、１週間培養した。培養終了時に細胞変性効果の出現の有無を確認し、細胞変性効果が出現しなかった最高希釈倍数をその被験血清の中和抗体価とした（表１０）。【００６６】
その結果、表１０に示すように、株ごとの中和抗体価の幾何平均値は、ＩＢＤウイルスＴＹ２−ＣＥＦ１株では２９９倍、ＴＹ２−ＣＥＦ２株では２３５倍であり、両株ともにＩＢＤウイルスＫ株に対する抗体産生性が確認され、交差性の低いと考えられる従来型のＩＢＤウイルスに対しても免疫原性を有していることが明らかになった。【００６７】
【表１０】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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