(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
へパリン結合、へパリン中和、内皮細胞増殖阻害または抗脈管形成特性のうちの少なくとも１つを有する、ペプチドベースの構築物であって、以下の式：
ＫＬＦＲ（Ｄ−ナフチルアラニン）ＱＡＫ（Ｄ−ナフチルアラニン）
を有する配列からなる、ペプチドベースの構築物。
【請求項２】
ヘパリン中和特性を有する、請求項１に記載の構築物。
【請求項３】
内皮細胞増殖阻害特性を有する、請求項１に記載の構築物。
【請求項４】
抗脈管形成特性を有する、請求項１に記載の構築物。
【請求項５】
外因性ヘパリン化合物を投与された哺乳動物におけるヘパリンを中和するための組成物であって、該外因性ヘパリン化合物の抗凝固効果を中和するに有効な量で、請求項１に記載の構築物を含む、組成物。
【請求項６】
前記哺乳動物の凝固時間が、正常に戻る、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
内皮細胞増殖の阻害を必要とする哺乳動物における該内皮細胞増殖を阻害するための組成物であって、該内皮細胞増殖を阻害するに有効な量で、請求項１に記載の構築物を含む、組成物。
【請求項８】
血管新生を阻害する必要がある哺乳動物において該血管新生を阻害するための組成物であって、該血管新生を阻害するに有効な量で、請求項１に記載の構築物を含む、組成物。
【請求項９】
前記血管新生が、眼においてである、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
へパリン結合、へパリン中和、内皮細胞増殖阻害または抗脈管形成特性を有する、誘導体化されたペプチドベースの構築物であって、以下の式：
Ｒ１−ＫＬＦＲ（Ｄ−ナフチルアラニン）ＱＡＫ（Ｄ−ナフチルアラニン）
を有する配列からなり、ここで、
Ｒ１は、Ｒ２−ＣＨ２−、Ｒ２−ＣＨ２−ＣＯ−、Ｒ２−ＣＯ−、Ｒ２−ＳＯｙ−またはＲ２−ＰＯｚ−のいずれか１つであり；
ここで、ｙ＝０〜３、ｚ＝１〜４であり；
Ｒ２は、少なくとも３つの炭素原子を有する環式分子、少なくとも３つの原子を有する複素環式分子、少なくとも３つの炭素原子を有する官能化された環式分子または少なくとも３つの原子を有する官能化された複素環式分子のうちのいずれか１つである疎水性部分である、誘導体化されたペプチドベースの構築物。
【請求項１１】
ヘパリン中和特性を有する、請求項１０に記載の構築物。
【請求項１２】
内皮細胞増殖阻害特性を有する、請求項１０に記載の構築物。
【請求項１３】
抗脈管形成特性を有する、請求項１０に記載の構築物。
【請求項１４】
外因性ヘパリン化合物を投与された哺乳動物におけるヘパリンを中和するための組成物であって、該外因性ヘパリン化合物の抗凝固効果を中和するに有効な量で、請求項１０に記載の構築物を含む、組成物。
【請求項１５】
前記哺乳動物の凝固時間が、正常に戻る、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
内皮細胞増殖の阻害を必要とする哺乳動物における内皮細胞増殖を阻害するための組成物であって、内皮細胞増殖を阻害するに有効な量で、請求項１０に記載の構築物を含む、組成物。
【請求項１７】
血管新生を阻害する必要がある哺乳動物において血管新生を阻害するための組成物であって、血管新生を阻害するに有効な量で、請求項１０に記載の構築物を含む、組成物。
【請求項１８】
前記血管新生が、眼においてである、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
前記Ｒ２が、（ａ）飽和または部分的もしくは完全に不飽和の、３〜８、好ましくは５または６の炭素原子を含む、必要に応じて置換された炭素環式環；（ｂ）飽和または部分的もしくは完全に不飽和の、３〜８、好ましくは５または６の原子を含む、必要に応じて置換された複素環式環であって、ここで、少なくとも１つの原子が、酸素、窒素または硫黄のうちのいずれか１つであるヘテロ原子である、複素環式環；あるいは（ｃ）必要に応じて置換された二環式環：
【化１】
0004707911.tif 000030
であって、ここで縮合環ＡおよびＢは独立して、飽和または部分的もしくは完全に不飽和の、５員環または６員環であり、そして炭素原子を含み、必要に応じて、酸素、硫黄または窒素から選択される１〜３のヘテロ原子を含み；ここで、１より多くのヘテロ原子が存在する場合、各々は、同じであっても異なっていてもよい、二環式環、のうちのいずれか１つである疎水性部分である、請求項１０に記載の構築物。
【請求項２０】
前記Ｒ２が、ビオチン、２−ビフェニレン、２−アントラキノン、２−ベンゾフラン、２−インドール、１−イソキノリン、ヒドロキシフェニル、２−キノリン、１−［３−（３，４−ジヒドロキシシンナモイル）−１，３，４，５−テトラヒドロキシシクロヘキシル］、１−（３，５−ジクロロ−２−ヒドロキシフェニル）、１−（３，５−ジヨード−２−ヒドロキシフェニル）、１−（３，５−ジニトロ−２−ヒドロキシフェニル）、１−（４−アジド−２−ヒドロキシフェニル）、４−ビフェニル、２−ビフェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、３−アミノ−２−ナフチル、３−クロロ−２−ニトロフェニル、３，４−ジヒドロキシフェニル、３，４，５−トリヒドロキシフェニル、２−クロロ−３−ニトロフェニル、５−アジド−２−ニトロフェニル、３−アミノ−２−ピラジル、２−ベンジルオキシカルボニル−エチル、２−チエニル、２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エチレン、５−ブロモ−３−インドールメチレン、２−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）エチレン、２−（３−クロロフェニル）エチレン、２−ピラジル、４−イミダゾリル、２−イミノ−１−イミダゾリジル、ピリジル、３−ピペリジル、４−ピペリジル、フルオレセイン、２−（４−アミノ−３，５，６−トリクロロ−ピリジル）、３−（２−クロロ−６−フルオロフェニル）−５−メチルイソキサゾリルまたは４−アジド−フェニルのうちのいずれか１つである疎水性部分である、請求項１０に記載の構築物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は、米国特許出願第０９／３４４，２１９号および同第０９／３４４，８２７号（各々１９９９年６月２５日出願）の一部継続出願であり、各々は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、一般に、８〜１５アミノ酸部分を有する低分子ペプチドベースの構築物（誘導体化構築物を含む）に関する。これらの構築物の配列を設計し、そして殺菌性／透過性増大タンパク質（ＢＰＩ）のドメインＩＩから同定し、かつ選択されたアミノ酸の逆部分配列（９９〜８５）に基づいて調製する。本発明はさらに、ヘパリン結合、ヘパリン中和、内皮細胞増殖の阻害および／または血管新生の阻害（例えば、慢性炎症性疾患状態および転移性腫瘍のモデルにおける新生血管形成を含むインビボ新生血管形成の阻害）に起因したこのような構築物の治療的使用に関する。
【０００３】
（発明の背景）
殺菌性／透過性増大タンパク質（ＢＰＩ）は、哺乳動物多形核白血球（ＰＭＮまたは好中球）（これは、侵襲性微生物に対して哺乳動物を防御する際に必要な血球である）の顆粒から単離されたタンパク質である。ヒトＢＰＩは、イオン交換クロマトグラフィー［Ｅｌｓｂａｃｈ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５４：１１０００（１９７９）］またはＥ．ｃｏｌｉアフィニティークロマトグラフィー［Ｗｅｉｓｓら、Ｂｌｏｏｄ，６９：６５２（１９８７）]のいずれかと組合せた酸抽出によって、ＰＭＮから単離され、そしてグラム陰性細菌に対して生物学的活性を有する。ヒトＢＰＩの分子量は、約５５，０００ダルトン（５５ｋＤ）である。ヒトＢＰＩタンパク質全体のアミノ酸配列およびＢＰＩをコードするＤＮＡの核酸配列は、Ｇｒａｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４：９５０５（１９８９）（Ｇｒａｙらにおける図１を参照のこと）に報告されている。このＧｒａｙらのＤＮＡ配列およびアミノ酸配列は、本明細書中で配列番号２７および２８に示される。
【０００４】
ＢＰＩの殺菌効果は、もともと、感受性グラム陰性種に高度に特異的であることが報告されていた。ＢＰＩがグラム陰性細菌を殺傷する正確な機構は、未だ未知であるが、ＢＰＩが、第一に感受性（ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ）グラム陰性細菌の表面に結合するはずであると考えられている。ＢＰＩの細菌とのこの最初の結合は、塩基性（すなわち、正に荷電している）タンパク質であるＢＰＩとリポポリサッカリド（ＬＰＳ）上の負に荷電した部位との間の静電的相互作用を含む。ＬＰＳは、それが刺激する強力な炎症性応答に起因して、「エンドトキシン」とも呼ばれている。ＬＰＳは、最終的に不可逆的なエンドトキシン性ショックを生じ得る、宿主炎症性細胞による媒介物の放出を誘導する。ＢＰＩは、ＬＰＳの最も毒性でかつ最も生物学的に活性な成分である、リピドＡに結合する。
【０００５】
ＢＰＩはまた、ＬＰＳ（ＢＰＩが結合する）のエンドトキシン特性を中和し得る。そのグラム陰性細菌特性、およびＬＰＳに結合しかつこれを中和する能力のために、ＢＰＩは、細菌が宿主外部から感染するか、または細菌が宿主内部から感染する（すなわち、腸管由来）かに拘わらず、グラム陰性細菌に感染することにより開始された疾患および状態（菌血症、エンドトキシン血症および敗血症の状態を含む）に罹患した哺乳動物の処置に利用され得る。ＢＰＩのこれらの特性により、ＢＰＩがこのような治療投与のために特に有用かつ有利になる。
【０００６】
ヒトＢＰＩのアミノ末端部分に対応するタンパク質分解性フラグメントは、ＬＰＳ結合活性およびＬＰＳ中和活性、ならびにＢＰＩホロタンパク質（ｈｏｌｏｐｒｏｔｅｉｎ）の抗菌活性を有する。単離されたヒトＢＰＩのアミノ末端部分とは対称的に、そのカルボキシル末端領域は、ごくわずかに検出可能な抗菌活性およびいくらかのエンドトキシン中和活性を示す（Ｏｏｉら，１９９１，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４：６４９）。１つのＢＰＩアミノ末端フラグメント（「ｒＢＰＩ23」といわれる）（Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏら，１９９２，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６０：４７５４−４７６１を参照のこと）は、２３ｋＤタンパク質として組換え手段により生成され、そして１５１位のバリンがＧＴＣではなくＧＴＧにより特定され、そして残基１８５がリジンではなく（ＡＡＧにより特定される）グルタミン酸（ＧＡＧにより特定される）であることを除いて、Ｇｒａｙら（前出）から引用したヒトＢＰＩホロタンパク質の最初の１９９アミノ酸残基をコードするＤＮＡの発現産物を含む。組換えホロタンパク質（ｒＢＰＩともいわれる）がまた生成され、これらのホロタンパク質は、米国特許第５，１９８，５４１号にもまた示されるｒＢＰＩ23についての記載を除いて、Ｇｒａｙら（前出）から引用した配列番号２７および２８に示される配列を有する。ｒＢＰＩ21またはｒＢＰＩ21ΔｃｙｓまたはｒＢＰＩ（１〜１９３）ａｌａ132と命名されたＮ末端フラグメントアナログは、共有に係る米国特許第５，４２０，０１９号および対応の国際公開ＷＯ９４／１８３２３（ＰＣＴ／ＵＳ９４／０１２３５）（全て本明細書中に参考として援用される）に記載されている。このアナログは、配列番号２７および２８に記載されるＢＰＩホロタンパク質最初の１９３アミノ酸（しかし、ここで残基番号１３２のシステインは、アラニンで置換され、そしてｒＢＰＩ23についての記載は除かれる）を含む。ｒＢＰＩ23ならびにｒＢＰＩ21と命名されたシステイン置換アナログは、ヒト臨床試験に導入された。ｒＢＰＩ23を、エンドトキシンでチャレンジしたヒトに投与した場合に、エンドトキシンに対する前炎症応答が有意に改善された（例えば、全てが本明細書中に参考として援用される、共有に係る米国特許第５，６４３，８７５号および同第５，７５３，６２０号ならびに対応の国際公開ＷＯ９５／１９７８４（ＰＣＴ／ＵＳ９５／０１１５１）を参照のこと）。さらにｒＢＰＩ21を、髄膜炎菌血症および外傷に起因する出血に罹患したヒトに投与した（例えば、全てが本明細書中に参考として援用される、米国特許第５，８８８，９７７号および対応の国際公開ＷＯ９７／４２９６６（ＰＣＴ／ＵＳ９７／０８０１６）ならびに米国特許第５，７５６，４６４号および対応の国際公開ＷＯ９７／４４０５６（ＰＣＴ／ＵＳ９７／０８９４１）を参照のこと）。
【０００７】
他のエンドトキシンを結合し、そして中和するタンパク質およびペプチドは、当該分野で公知である。１つの例は、カブトガニアメーバ様細胞に由来するＬｉｍｕｌｕｓ抗リポポリサッカリド因子（ＬＡＬＦ）（Ｗａｒｒｅｎら，１９９２，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６０：２５０６−２５１３）である。別の例は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｙｘａに由来する環状カチオン性リポペプチド（ポリミキシンＢｌといわれる）である。ポリミキシンＢ１は、６つのα，γ−ジアミノ酪酸残基、１つのＤ−フェニルアラニン、１つのロイシン、１つのスレオニンおよび６−メチルオクタノイル部分から構成され（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ａｎｄ  Ｊａｃｏｂｓ，１９７６，Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ．１３：８１３−８１８）、そしてこれはまた殺菌性である。脂肪酸部分を欠いたポリミキシンアナログもまた公知であり、このアナログは、ＬＰＳ結合能力を保持するが、評価できるほどの殺菌活性はない（Ｄａｎｎｅｒら，１９８９，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３３：１４２８−１４３４）。同様の特性はまた、合成環化ポリミキシンアナログで見出された（Ｒｕｓｔｉｃｉら，１９９３，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９：３６１−３６５）。
【０００８】
公知の抗菌ペプチドとしては、セクロピンおよびマガイニンが挙げられる。セクロピンは、鱗翅目昆虫の血リンパにおいて見出された抗菌ペプチドのファミリーであり（Ｗａｄｅら，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：４７６１−４７６５）、そしてマガイニンは、Ｘｅｎｏｐｕｓ皮膚および胃粘膜において見出された抗菌ペプチドのファミリーである（Ｚａｓｌｏｆｆら，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：９１０−９１３）。これらのペプチドは直鎖状であり、そして約２０〜約４０アミノ酸長の範囲である。ブタ腸粘膜セクロピンＰ１由来のあまり活性でない哺乳動物セクロピンが報告された（Ｂｏｍａｎら，１９９３，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６１：２９７８−２９８４）。これらのセクロピンは、一般に、殺菌活性がマゲイニンより強力であり、かつ哺乳動物細胞傷害性をあまり有しないことが報告されている。セクロピンおよびマガイニンは、連続する両親媒性のαらせん領域（殺菌活性に必要である）により特徴付けられる。今日までに同定されたセクロピンのうち、最も有効なものは、セクロピンＡである。セクロピンＡの最初の１０アミノ酸の配列は、ＢＰＩアミノ酸配列９０〜９９といくらかの相同性を有するが、ＢＰＩアミノ酸配列９０〜９９により特定される荷電アミノ酸および非荷電アミノ酸のモチーフを共有しない。さらに、セクロピンＡの他の２７アミノ酸は、最大殺菌活性に必要であり、そしてこれらの２７アミノ酸は、ＢＰＩと相同性がない。マガイニンは、ＢＰＩアミノ酸９０〜９９と最小の相同性を有する。
【０００９】
本出願の目的であることは、ＢＰＩおよびアニオン性化合物を含む組成物に関するＰＣＴ国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９１／０５７５８［ＷＯ９２／０３５３５］の開示である。この組成物は、（１）殺菌活性がない、および（２）エンドトキシン中和活性を示すといわれる。アニオン性化合物は、好ましくは、血清アルブミンのようなタンパク質であるが、ヘパリンのようなポリサッカリドでもあり得る。さらに、Ｗｅｉｓｓら，１９７５，Ｊ  Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．５５：３３−４２は、ヘパリン硫酸およびＬＰＳが、ＢＰＩの透過性増大活性の発現をブロックすることを開示する。しかし、どの参考文献も、ＢＰＩが実際にヘパリンに結合し、そして／またはヘパリンの生物学的活性を中和することを開示していない。ヘパリン結合は、ヘパリン中和を必ずしも示さない。例えば、ヘパリン結合増殖因子（ＨＢＧＦ）のファミリーは、生物学的応答を誘発する補因子としてヘパリンを必要とする。ＨＢＧＦファミリーの例としては、以下が挙げられる：線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２）および内皮細胞増殖因子（ＥＣＧＦ−１、ＥＣＧＦ−２）。凝固カスケードのプロテアーゼの抗トロンビンＩＩＩ阻害は、活性のためにヘパリンを必要とするヘパリン結合タンパク質の別の例であり、そして明らかにヘパリンを中和しない。ヘパリンを中和しないヘパリン結合タンパク質（例えば、血小板因子ＩＶ、プロタミンおよびトロンボスポンジン）は、一般に、補因子としてヘパリンを用いるヘパリン結合タンパク質により誘導される活性を抑制する。
【００１０】
本出願に対して特に目的であるものは、ＢＰＩタンパク質産物のヘパリン関連活性である、具体的には、ＢＰＩタンパク質産物は、全てが本明細書中に参考として援用される、同一人に譲渡された米国特許第５，３４８，９４２号；同第５，６３９，７２７号；同第５，８０７，８１８号；同第５，８３７，６７８号；同第５，８５４，２１４号および対応の国際公開ＷＯ９４／２０１２８（ＰＣＴ／ＵＳ９４／０２４０１）においてヘパリン結合活性およびヘパリン中和活性を有することが示された。例えば、ｒＢＰＩ23は、ヘパリンに対して高親和性を有することが示され（Ｌｉｔｔｌｅら，１９９４，Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１８６５−１８７２もまた参照のこと）、そしてヘパリンを中和するためにヒトに投与された（例えば、本明細書中に参考として援用される、米国特許第５，３４８，９４２号を参照のこと）。ＢＰＩタンパク質産物のこれらのヘパリン結合活性およびヘパリン中和活性は、ヘパリンの現在の臨床的使用の重要性に起因して重要である。ヘパリンは、外科的手順（例えば、心肺バイパス、心臓カテーテル法および血液透析手順）の間の血液凝固を防止するために、このような手順の間に４００Ｕ／ｋｇまでの用量で同時に投与される。ヘパリンが外科手術の間に抗凝固効果のために投与される場合、通常の凝固機能が回復され得るようにヘパリンの効果が適切に中和されることは、術後治療の重要な局面である。現在、プロタミンを用いて、ヘパリンを中和している。プロタミンは、アルギニンリッチの強塩基性である単純な低分子量タンパク質のクラスである。単独で投与される場合、プロタミン（通常、硫酸プロタミンの形態）は、抗凝固効果を有する。ヘパリンの存在下で投与される場合、安定な複合体を形成し、そして両方の薬物の抗凝固活性が失われる。しかし、プロタミンの重大な低血圧効果およびアナフィラキシー様効果により、その臨床的利用が制限されている。従って、そのヘパリン結合活性およびヘパリン中和活性に起因して、ＢＰＩタンパク質産物は、プロタミンの有用性が制限されている有害な副作用なしで、臨床的状況において、ヘパリン中和におけるプロタミンの基質として潜在的利用性を有する。このようなＢＰＩタンパク質産物のさらなる抗菌効果および抗エンドトキシン効果はまた、プロタミンと比較して、術後のヘパリン中和において有用かつ有利である。
【００１１】
さらに特に目的であることは、ヘパリン結合活性およびヘパリン中和活性に一部起因する血管新生を阻害するＢＰＩタンパク質産物の活性である（例えば、全てが本明細書中に参考として援用される、共有に係る米国特許第５，８０７，８１８号および同第５，８３７，６７８号ならびに対応の国際公開ＷＯ９４／２０１２８（ＰＣＴ／ＵＳ９４／０２４０１）を参照のこと）。血管新生、すなわち、新たな血管の増殖（新生血管形成）は、増殖因子が関与し、その大部分が補因子としてヘパリンを有する複雑な現象である。成人において、脈管形成増殖因子は、血管外傷（創傷治癒）、免疫刺激（自己免疫疾患）、炎症性メディエーター（プロスタグランジン）の結果としてまたは腫瘍細胞から放出される。これらの因子は、ヘパリン依存性レセプター結合機構（Ｙａｙｏｎら，１９９１，Ｃｅｌｌ  ６４：８４１−８４８を参照のこと）を介して内皮細胞の増殖（これは、血管新生に必要である）を誘導する。血管新生はまた、多くの他の病理状態と関連し、これらの病理状態としては、種々の腫瘍の成長、増殖、および転移；糖尿病性網膜症、黄斑変性、水晶体後線維増殖症、血管新生緑内障、乾癬、血管線維腫、免疫および非免疫炎症（慢性関節リウマチを含む）、アテローム硬化斑内の毛細管増殖、血管腫、子宮内膜症およびカポージ肉腫が挙げられる。従って、これらおよび他の例において血管新生を阻害することが望ましく、そしてＢＰＩタンパク質産物のヘパリン結合活性およびヘパリン中和活性（ＢＰＩに由来するかまたはＢＰＩに基づくペプチドを含む）はこの目的に有用である。
【００１２】
ヘパリン結合タンパク質は、少なくとも２つのクラスに入る。第１のクラスは、特異的応答を誘発する際に補因子としてヘパリンを利用するタンパク質からなる。これらのタンパク質としては、ヘパリン依存性増殖因子（例えば、塩基性線維芽細胞増殖因子；酸性線維芽細胞増殖因子および血管内皮細胞増殖因子）が挙げられる。これらのタンパク質は、血管新生において主要な役割を果たす。第２のクラスは、ヘパリン依存性応答を中和するタンパク質を含む。ＢＰＩタンパク質産物（ＢＰＩに由来するペプチドを含む）は、ヘパリン中和剤および抗血管新生薬剤として同定された。いくつかの他のヘパリン中和タンパク質はまた、血管新生を阻害することが公知である。例えば、プロタミンは、腫瘍関連血管新生、その後の腫瘍増殖を阻害することが公知である［Ｆｏｌｋｍａｎら，１９９２，Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ：Ｂａｓｉｃ  Ｐｒｉｎｃｉｐｅｌｅｓ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ，２ｄ  ｅｄ，（Ｇａｌｉｎら，ｅｄｓ．，Ｒｅｖｉｅｗ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．），  Ｃｈ．  ４０，  ｐｐ．  ８２１−８３９］。第２のヘパリン中和タンパク質である血小板因子ＩＶはまた、血管新生を阻害する（すなわち、血管増殖抑制（ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｃ））。別の公知の血管新生インヒビターであるトロンボスポンジンは、塩基性アミノ酸モチーフの代わりに、反復セリン／トリプトファンモチーフに対してヘパリンに結合する（Ｇｕｏら，１９９２，Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１９３４９−１９３５５を参照のこと）。マウスエンドスタチンはまた、ヘパリンを結合し、そして血管新生を阻害することが報告されている（例えば、Ｈｏｈｅｎｅｓｔｅｒら，１９９８，Ｅｍｂｏ  Ｊ．１７：１６５６−１６６４；Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら，１９９７，Ｃｅｌｌ  ８８：２７７−２８５）。
【００１３】
ＢＰＩタンパク質産物の別の利用性は、通常血管新生が付随する慢性炎症に関連する病理状態を含む（例えば、本明細書中に参考として援用される、共有に係る米国特許第５，６３９，７２７号を参照のこと）。慢性炎症状態に関連するヒト疾患の１つの例は、末梢関節の炎症を含む関節炎である。慢性関節リウマチにおいて、炎症は自己免疫であるが、反応性関節炎（ｒｅａｃｔｉｖｅ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）においては、炎症は、化膿性細菌または他の感染因子での滑膜組織の初期感染、続いて感受性個体における無菌慢性炎症（ａｓｅｐｔｉｃ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）と関連すると仮定される。Ｆｏｌｋｍａｎら，１９９２（前出）は、関節における炎症性侵襲により左右される段階から血管新生パンヌスが血管に侵襲し、そして軟骨を破壊し始める後期まで多くの型の関節炎が進行することを記載した。関節における血管新生が疾患または副現象の原因要素であるか否かは明らかでないが、血管新生が慢性関節リウマチにおける滑膜の維持に必要であるという証拠は存在する。１つの公知の血管新生インヒビターであるＡＧＭ１４７０は、関節炎の発症を予防し、そしてコラーゲン誘導性関節炎モデルにおいて確立された関節炎を阻害することが示された（Ｐｅａｃｏｃｋら，１９９２，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５：１１３５−１１３８）。非ステロイド抗炎症薬物であるコルチコステロイドおよび他の治療は、関節炎の軽減のための処置改善を提供したが、関節炎および他の炎症性疾患についてのより有効な治療は当該分野で未だに必要である。
【００１４】
ＢＰＩタンパク質産物（ｒＢＰＩ23およびｒＢＰＩ21を含む）の多くのさらなる有用性は、これらの産物の広範な種々の生物学的活性に起因して記載される。例えば、ＢＰＩタンパク質産物は、全てが本明細書中で参考として援用される、米国特許第５，１９８，５４１号および同第５，５２３，２８８号において記載されるように、グラム陰性細菌に対して殺菌性である。国際公開ＷＯ９４／２０１３０（本明細書中に参考として援用される）は、グラム陰性細菌属であるＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ由来の種での感染（例えば、胃腸）に罹患した被験体をＢＰＩタンパク質産物を用いて処置するための方法を提唱する。ＢＰＩタンパク質産物はまた、全て参考として援用される、米国特許第５，５２３，２８８号および国際公開ＷＯ９５／０８３４４（ＰＣＴ／ＵＳ９４／１１２５５）に記載されるように、グラム陰性細菌感染における抗生物質治療の有効性を増強する。ＢＰＩタンパク質産物はまた、グラム陽性細菌およびマイコプラズマに対して殺菌性であり、そして全て本明細書中に参考として援用される、米国特許第５，５７８，５７２号；同第５，７８３，５６１号および同第６，０５４，４３１号、ならびに国際公開ＷＯ９５／１９１８０（ＰＣＴ／ＵＳ９５／００６５６）に記載されるように、グラム陽性細菌感染における抗生物質の有用性を増強する。ＢＰＩタンパク質産物は、抗真菌活性を示し、そして米国特許第５，６２７，１５３号および国際公開ＷＯ９５／１９１７９（ＰＣＴ／ＵＳ９５／００４９８）に記載されるように、他の抗真菌剤の活性を増強し、そして米国特許第５，８５８，９７４号（全て本明細書中に参考として援用される、米国特許出願第０８／５０４，８４１号の一部継続出願であり、対応の国際公開ＷＯ  ９６／０８５０９（ＰＣＴ／ＵＳ９５／０９２６２）およびＷＯ９７／０４００８  （ＰＣＴ／ＵＳ９６／０３８４５）である）において抗真菌ペプチドについてさらに記載される。ＢＰＩタンパク質産物は、全て参考として援用される、米国特許第５，６４６，１１４号および同第６，０１３，６２９号ならびに国際公開ＷＯ９６／０１６４７（ＰＣＴ／ＵＳ９５／０８６２４）に記載されるように、抗原生動物活性を示す。ＢＰＩタンパク質産物は、全てが本明細書中に参考として援用される、共有に係る米国特許第５，８８８，９７３号およびＷＯ９８／０６４１５（ＰＣＴ／ＵＳ９７／１３８１０）に記載されるように、抗クラミジア活性を示す。最後に、ＢＰＩタンパク質産物は、全て参考として援用される、共有に係る同時係属中の米国特許出願第０８／６２６，６４６号（これは、米国特許出願第０８／２８５，８０３号の継続出願であり、この継続出願は、同第０８／０３１，１４５号の一部継続出願である）および対応の国際公開ＷＯ９４／２０１２９（ＰＣＴ／ＵＳ９４／０２４６３）に記載されるように、抗ミコバクテリア活性を示す。
【００１５】
循環中のエンドトキシンに対するヒトにおけるＢＰＩタンパク質産物の効果（ＴＮＦ、ＩＬ−６およびエンドトキシンに対する効果を含む）は、全てが本明細書中に参考として援用される、米国特許第５，６４３，８７５号；同第５，５７３，６２０号および同第５，９５２，３０２号ならびに対応の国際公開ＷＯ９５／１９７８４（ＰＣＴ／ＵＳ９５／０１１５１）に記載される。
【００１６】
ＢＰＩタンパク質産物はまた、例えば、ヒトにおける髄膜炎菌血症（共有に係る米国特許出願第０８／６４４，２８７号ならびに米国特許第５，８８８，９７７号および同第５，９９０，０８６号、ならびに国際公開ＷＯ９７／４２９６６（ＰＣＴ／ＵＳ９７／０８０１６）に記載される）、ヒトにおける出血性外傷（米国特許第５，７５６，４６４号および同第５，９４５，３９９号、ならびに米国特許出願第０９／２９３，１０７号ならびに対応の国際公開ＷＯ９７／４４０５６（ＰＣＴ／ＵＳ９７／０８９４１）に記載される）、熱傷（米国特許第５，４９４，８９６号に記載される）、虚血／再灌流傷害（米国特許第５，５７８，５６８号および同第６，０１７，８８１号、ならびに米国特許出願第０９／４１６，８２８号に記載される）および肝臓切除（全てが参考として援用される、共有に係る同時係属中の米国特許出願第０９／４６６，４１２号（これは、米国特許出願第０８／５８２，２３０号の継続出願であり、この出願は、米国特許出願第０８／３１８，３５７号の継続出願であり、この継続出願は、米国特許出願第０８／１３２，５１０号の一部継続出願である）および対応の国際公開ＷＯ９５／１０２９７（ＰＣＴ／ＵＳ９４／１１４０４）に記載される）のような特定の疾患状態の処置に有用である。
【００１７】
ＢＰＩタンパク質産物はまた、全てが本明細書中に参考として援用される、米国特許第５，７４１，７７９号および米国特許出願第０９／２９９，３１９号、ならびに対応の国際公開ＷＯ９７／４２９６７（ＰＣＴ／ＵＳ７／０８０１７）に記載されるように、抗血栓方法において有用である。
【００１８】
ＢＰＩタンパク質産物の１つ以上の生物学的活性を有する新たな産物、特に、ヘパリン結合剤およびヘパリン中和剤として使用するための産物、ならびに内皮細胞増殖の阻害および血管新生（通常または病理的）の阻害のための産物が依然として必要である。ペプチドベースの有利な治療産物は、理想的には、血清安定性である小さな活性配列を含む。
【００１９】
（発明の要旨）
本発明は、必要に応じて疎水性部分で誘導体化され、８〜１５個の長さのアミノ酸部分である小さなペプチドベースの構築物の化合物および組成物を提供し、このアミノ酸部分は、ＢＰＩの機能的ドメインＩＩ（アミノ酸６５〜９９）から同定されそして選択される逆部分配列から誘導されるかまたは逆部分配列に基づく配列を有し、そしてＢＰＩのヘパリン関連生物学的活性（例えば、ヘパリン結合、ヘパリン中和、内皮細胞増殖の阻害および／または血管新生の阻害）の少なくとも１つを有する。逆（またはレトロ）配列は、元の配列から反転される（例えば、元の配列がＡ−Ｂ−Ｃの場合、反転した配列は、Ｃ−Ｂ−Ａである）。本明細書中の配列は、従来の様式で（すなわち、Ｎ末端からＣ末端へ（左から右へ））書かれる。本発明に従う、誘導体化された構築物を含むこのようなペプチドベースの構築物は、ＢＰＩのアミノ酸９９〜９２由来のアミノ酸モチーフに基づく最小コア配列からなる逆部分配列を有する。好ましい実施形態において、逆部分配列は、置換された配列（例えば、アミノ酸９９〜９２、９９〜９１、９９〜９０、９９〜８９、９９〜８８、９９〜８７、９９〜８６、または９９〜８５であり、ここで置換は９５および９１である）である。さらに好ましいのは、１つ以上のＤ−アミノ酸部分を有する８〜１５個のアミノ酸部分配列であり；最も好ましい配列においてアミノ酸部分の各々または全ては、Ｄ異性体である。
【００２０】
本発明に従う構築物（または組成物）は、ＢＰＩのヘパリン関連生物学的活性（例えば、ヘパリン結合、ヘパリン中和、内皮細胞増殖阻害、または抗血管形成特性）の少なくとも１つを有する長さ８〜１５個の部分である構築物を含み、そして（ｉ）式：α−χ−χ−α−χ−β−χ−α−Ｒを有する配列または（ｉｉ）式：Ｒ1−α−χ−χ−α−χ−β−χ−α−Ｒを有する誘導体化した配列を含む。
【００２１】
Ｒは、−χ、−χ−α、−χ−α−χ、χ−α−χ−β、−χ−α−χ−β−χ、−χ−α−χ−β−χ−α、−χ−α−χ−β−χ−α−χ、−χ−α−χ−χ−α−χ、−ＮＨ2、−χ−ＮＨ2、−χ−α−ＮＨ2、−χ−α−χ−ＮＨ2、−χ−α−χ−β−ＮＨ2、−χ−α−χ−β−χ−ＮＨ2、−χ−α−χ−β−χ−α−ＮＨ2、−χ−α−χ−β−χ−α−χ−ＮＨ2、または−χ−α−χ−χ−α−χ−ＮＨ2のいずれか１つである部分である。
【００２２】
配列（ｉ）または（ｉｉ）において、本明細書中の他の箇所で使用されるように、αは、リジン、アルギニン、ヒスチジン、オルニチン、ジアミノ酪酸、シトルリン、またはｐ−アミノフェニルアラニンのいずれか１つである親水性の塩基性アミノ酸部分であり；βは、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、ヒドロキシプロリン、または７−ヒドロキシ−テトラヒドロイソキノリンカルボン酸のいずれか１つである親水性の中性アミノ酸部分であり；χは、アラニン、ナフチルアラニン、ビフェニルアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン、グリシン、シクロヘキシルアラニン、アミノ−イソ酪酸、ノルバリン（ｎｏｒｖａｌｉｎｅ）、ノルロイシン、ｔｅｒｔ−ロイシン、テトラヒドロイソキノリンカルボン酸、ピペコリン酸、フェニルグリシン、ホモフェニルアラニン、シクロヘキシルグリシン、デヒドロロイシン、２，２−ジエチルグリシン、１−アミノ−１−シクロペンタンカルボン酸、１−アミノ−１−シクロヘキサンカルボン酸、アミノ−安息香酸、アミノ−ナフトエ酸（ａｍｉｎｏ−ｎａｐｈｔｈｏｉｃ  ａｃｉｄ）、γ−アミノ酪酸、β−アラニン、ジフルオロフェニルアラニン、フルオロフェニルアラニン、ニペコチン酸、α−アミノ酪酸、チエニル−アラニン、またはｔ−ブチルグリシンのいずれか１つである疎水性アミノ酸部分である。
【００２３】
Ｒ1は、Ｒ2−ＣＨ2−、Ｒ2−ＣＨ2−ＣＯ−、Ｒ2−ＣＯ−、Ｒ2−ＳＯy−、またはＲ2−ＰＯz−のいずれか１つであり；
ここで、ｙ＝０〜３；
ｚ＝１〜４であり；
Ｒ2は、少なくとも３個の炭素原子を有する環式分子、少なくとも３個の原子を有する複素環式分子、少なくとも３個の炭素原子を有する官能基化した環式分子、または少なくとも３個の原子を有する官能基化した複素環式分子である疎水性部分である。
【００２４】
本明細書中で使用される場合、Ｒ2は、（ａ）３〜８個、好ましくは５個または６個の炭素原子を含む、飽和または部分的もしくは完全に不飽和の、必要に応じて置換された炭素環式環；（ｂ）３〜８個、好ましくは５個または６個の原子を含む、飽和または部分的もしくは完全に不飽和の、必要に応じて置換された複素環式環であって、ここで、少なくとも１個の原子が、酸素、窒素、または硫黄のいずれか１つであるヘテロ原子である、複素環式環；または（ｃ）必要に応じて置換された以下の二環式環であって：
【００２５】
【化２】
0004707911.tif 000002
【００２６】
ここで縮合環ＡおよびＢは、独立して、飽和または部分的もしくは完全に不飽和の５員環または６員環であり、そして炭素原子および必要に応じて、酸素、硫黄、または窒素から選択される１〜３個のヘテロ原子を含み、ここで１個より多くのヘテロ原子が存在し、各々が同じであってもよいし、異なっていてもよい、二環式環のいずれか１つである疎水性部分である。
【００２７】
本明細書中で使用されるように、置換基Ｒ2は、単環式環または二環式環であり得、炭素環または複素環のいずれかである。二環式Ｒ2基は、２個の脂肪族環、２個の芳香族環、または１個の脂肪族環および１個の芳香族環を含み得る。複素環は、酸素、窒素、または硫黄からなる群から選択される、少なくとも１個でかつ３個までの原子を含み；ここで、１個より多くのヘテロ原子が存在し、各ヘテロ原子は同じであってもよいし、異なっていてもよい。Ｒ2置換基は、飽和または部分的もしくは完全に不飽和の脂肪族（すなわち、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、またはヘテロシクロアルキレニル）であり得るか、または芳香族（すなわち、アリールまたはヘテロアリール）であり得る。Ｒ2置換基は、必要に応じて、１〜３個の部分（例えば、Ｃ1〜6アルキル、ハロ、Ｃ1〜6アルコキシ、アセチル、ヒドロキシなど）で置換され；ここで、１個より多くのヘテロ原子が存在し、各へテロ原子は同じであってもよいし、異なっていてもよい。
【００２８】
本明細書中で使用されるように、そして当該分野で通常使用されるように、用語「アリール」は、単環式または二環式の芳香族基（例えば、フェニルまたはナフチル）として定義され、これは無置換であるかまたは置換され得る。同様に、用語「ヘテロアリール」は、本明細書中で、１個または２個の芳香族環および少なくとも１個の窒素、酸素、または硫黄原子を含む単環式または二環式の環系として定義される。１個より多くのヘテロ原子が存在する場合、各へテロ原子は同じであっても異なっていてもよい。ヘテロアリールは、無置換であるかまたは例えば、１個以上、特に１〜３個の置換基で置換され得る。１個より多くのヘテロ原子が存在する場合、各へテロ原子は、同じであってもよいし、異なっていてもよい。ヘテロアリール基の例として、チエニル、フリル、ピリジル、オキサゾリル、キノリル、イソキノリル、インドリル、トリアゾリル、イソチアゾリル、イソキサゾリル、イミダゾリル、ベンゾチアゾリル、ピラジニル、ピリミジニル、チアゾリル、またはチアジアゾリルが挙げられる。
【００２９】
本明細書中で使用されるように、そして当該分野で通常使用されるように、用語「シクロアルキル」は、環式Ｃ3〜Ｃ8炭化水素基（例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロヘキシル、またはシクロペンチル）として定義される。用語「ヘテロシクロアルキル」は、環が少なくとも１個、好ましくは１〜３個のヘテロ原子を含むことを除いて、同様に定義される。１個より多くのヘテロ原子が存在する場合、各へテロ原子は、同じであってもよいし、異なっていてもよい。ヘテロシクロアルキル環の非限定的例として、１，３−ジオキソラン、２−ピラゾリン、ピラゾリジン、ピロリジン、ピロリン、２Ｈ−ピラン、４Ｈ−ピラン、モルホリン、チオモルホリン、ピペリジン、１，４−ジチアン、および１，４−ジオキサンが挙げられる。用語「シクロアルケニル」および「ヘテロシクロアルケニル」は、環が不飽和であることを除いて、同様に定義される。
【００３０】
例示的な実施形態において、Ｒ2は、ビオチン、２−ビフェニレン、２−アントラキノン、２−ベンゾフラン、２−インドール、１−イソキノリン、ヒドロキシフェニル、２−キノリン、１−［３−（３，４−ジヒドロキシシンナモイル）−１，３，４，５−テトラヒドロキシシクロヘキシル］、１−（３，５−ジクロロ−２−ヒドロキシフェニル）、１−（３，５−ジヨード−２−ヒドロキシフェニル）、１−（３，５−ジニトロ−２−ヒドロキシフェニル）、１−（４−アジド−２−ヒドロキシフェニル）、４−ビフェニル、２−ビフェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、３−アミノ−２−ナフチル、３−クロロ−２−ニトロフェニル、３，４−ジヒドロキシフェニル、３，４，５−トリヒドロキシフェニル、２−クロロ−３−ニトロフェニル、５−アジド−２−ニトロフェニル、３−アミノ−２−ピラジル、２−ベンジルオキシカルボニル−エチル、２−チエニル、２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エチレン、５−ブロモ−３−インドールメチレン、２−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）エチレン、２−（３−クロロフェニル）エチレン、２−ピラジル、４−イミダゾリル、２−イミノ−１−イミダゾリジル、ピリジル、３−ピペリジル、４−ピペリジル、フルオロセイン、２−（４−アミノ−３，５，６−トリクロロ−ピリジル）、３−（２−クロロ−６−フルオロフェニル）−５−メチルイソキサゾリル、または４−アジド−フェニルのいずれか１個である疎水性部分であり得る。
【００３１】
本発明はまた、ペプチド結合によって連続的に結合された８〜１５個のアミノ酸部分の組成物を提供し、この組成物は、１個以上のヘパリン結合特性を有し、（ｉ）式ＫＬＦＲ（ｎａｐｈ−Ａ）ＱＡＲ3を有する配列または（ｉｉ）式Ｒ1ＫＬＦＲ（ｎａｐｈ−Ａ）ＱＡＲ3の誘導体化された配列を含み、
ここで、Ｒ1は、上記の通りであり；そして
ここで、Ｒ3は、Ｋ、Ｋ（ｎａｐｈ−Ａ）、Ｋ（ｎａｐｈ−Ａ）Ｋ、Ｋ（ｎａｐｈ−Ａ）ＫＧ、Ｋ（ｎａｐｈ−Ａ）ＫＧＳ、Ｋ（ｎａｐｈ−Ａ）ＫＧＳＩ、Ｋ（ｎａｐｈ−Ａ）ＫＧＳＩＫまたはＫ（ｎａｐｈ−Ａ）ＫＧＳＩＫＩのいずれか１つであり；
ここで、カルボニル末端基は、アミド化されるかまたはアミド化されず、
そして、必要に応じて、アミノ酸部分の少なくとも１個の保存的置換を含む。好ましくは、組成物は、アミノ酸部分の２個以上の保存的置換を含む。
【００３２】
本発明の構築物または組成物（誘導体化された構築物または組成物を含む）は、好ましくは、第１の２個のアミノ末端アミノ酸部分がＤ−アミノ酸部分であり、そして最後の２個のカルボキシル末端アミノ酸部分がＤ−アミノ酸部分である構築物または組成物を含む。
【００３３】
外因性ヘパリン化合物（ヘパリンまたは低分子量ヘパリンのようなヘパリノイド物質を含む）が投与された哺乳動物においてヘパリンを中和する方法であって、外因性ヘパリン化合物の抗凝固効果を中和するのに有効な量の本発明の組成物を、好ましくは上記哺乳動物の凝固時間を正常に戻すのに有効な量の本発明の組成物を、上記哺乳動物に投与する工程を包含する、方法；内皮細胞増殖を阻害するのに有効な量の本発明の組成物を上記哺乳動物に投与することによって、それを必要とする哺乳動物の内皮細胞増殖を阻害する方法；血管新生（眼の血管新生を含む）を阻害するのに有効な量のこのような組成物を上記哺乳動物に投与することによって、それを必要とする哺乳動物の血管新生を阻害する方法；血管新生に関する障害（慢性関節リウマチまたは反応性関節炎のような慢性炎症性疾患、および腫瘍細胞の成長、増殖または転移を含む）を羅患する哺乳動物を処置する方法もまた、提供される。
【００３４】
このような構築物または組成物（本発明に従って誘導体化された構築物または組成物を含む）のさらなる特性または活性は、ＬＰＳ結合、ＬＰＳ中和、および／または抗菌活性および／またはＢＰＩタンパク質産物の任意の他の以前に公知の活性または特性を含み得る。ＢＰＩの３つの機能性ドメインが以前に報告され、そして以下：約アミノ酸１７から約アミノ酸４５までのＢＰＩのアミノ酸配列を包含するドメインＩ；約アミノ酸６５から約アミノ酸９９までのＢＰＩのアミノ酸配列を包含するドメインＩＩ；約アミノ酸１４２から約アミノ酸１６９までのＢＰＩのアミノ酸配列を包含するドメインＩＩＩを含むが、生物学的に活性な逆（またはレトロ）配列は、以前にドメインＩＩの部分配列に基づいて報告されていない。従って、本発明に従うこのようなペプチドベースの逆（レトロ）配列構築物（これらは、好ましくは選択されたＤ−アミノ酸部分を含む）は、特に治療用薬剤として有用である。
【００３５】
本発明の別の局面は、生物学的活性および少なくとも０．００１％の上皮吸収を有する殺菌性／透過性増大タンパク質（ＢＰＩ）のドメインＩＩから同定かつ選択された配列から誘導されるかまたはこの配列に基づいた誘導体化されたペプチド配列を同定するための方法を提供し、上記方法は、以下：
（ａ）Ｎ末端、Ｃ末端または上記ペプチド配列内の疎水性部分（単数または複数）の共有結合を通してＢＰＩのドメインＩＩの配列、部分配列、逆配列または逆部分配列に基づくペプチド配列を誘導体化する工程；
（ｂ）工程（ａ）で得られた上記誘導体化されたペプチド配列の活性を測定する工程であって、ここで、活性がヘパリン結合、ヘパリン中和、内皮細胞増殖阻害、または抗血管形成のいずれか１つ以上である、工程；
（ｃ）工程（ａ）で得られた上記誘導体化されたペプチド配列の上皮吸収を測定する工程、
を包含する。
【００３６】
特に工程（ａ）における誘導体化に適切なペプチド配列は、生物学的活性を保持するのに必要な最小長さのペプチド（例えば、８〜１５個のアミノ酸部分）である。
【００３７】
このような方法は、少なくとも０．００１％の上皮吸収を有するＢＰＩまたはそのフラグメントから同定されるかまたは選択されたペプチド配列から誘導されるかまたはそのペプチドに基づいた生物学的に活性な誘導体化されたペプチドベースの配列、予防薬剤または治療用薬剤を設計および同定するための方法を包含し、上記方法は、以下：
（ａ）インビトロまたはインビボで活性を示すＢＰＩまたはそのフラグメントのポリペプチド配列から誘導されるかまたはそのポリペプチド配列に基づいた標的ペプチド配列を同定する工程であって、ここで、この活性が、ヘパリン結合、ヘパリン中和、内皮細胞増殖阻害、または抗血管形成のいずれか１つ以上である、工程；
（ｂ）上記標的ペプチド配列内のアミノ酸部分を置換または欠失することによって、最小長さの活性保持ペプチド配列（ＭｉｎＬＡＲＰＳ）のライブラリーを構築する工程；
（ｃ）上記標的ポリペプチド配列の活性の少なくとも１％の活性を保持するのに必要な最小数の残基を決定するために上記ＭｉｎＬＡＲＰＳの活性を測定する工程であって、ここで、この活性が、ヘパリン結合、ヘパリン中和、内皮細胞増殖阻害、または抗血管形成のいずれか１つ以上である、工程；
（ｄ）どのＭｉｎＬＡＲＰＳが少なくとも０．００１％の上皮吸収を保持するかを同定するためにインビボアッセイまたはインビトロアッセイで上記ＭｉｎＬＡＲＰＳの上皮吸収を測定する工程；
（ｅ）Ｎ末端、Ｃ末端または上記ＭｉｎＬＡＲＰＳの配列内で結合した疎水性部分の共有結合を通して、上記ＭｉｎＬＡＲＰＳを化学的に改変することによって誘導体化されたＭｉｎＬＡＲＰＳを合成する工程；
（ｆ）上記誘導体化されたＭｉｎＬＡＲＰＳを用いて工程（ｃ）および（ｄ）を繰り返す工程、
を包含する。
【００３８】
本発明のさらなる局面は、治療における使用のため、および外因性のまたは治療学的に投与されたヘパリン化合物を結合するための医薬の製造のための構築物または組成物の使用のため、またはヘパリン関連もしくはヘパリン媒介状態もしくは疾患を処置するための、本発明の構築物または組成物（本発明に従って誘導体化された構築物または組成物を含む）を含む。
【００３９】
本発明の構築物または組成物、および薬学的に受容可能な賦形剤、希釈剤またはキャリアを含む薬学的組成物もまた、本発明によって考慮される。
【００４０】
（詳細な説明）
本発明は、８〜１５アミノ酸部分の長さであり、ＢＰＩの機能的ドメインＩＩから同定および選択された逆方向の部分配列に由来するかまたはそれに基づく配列を有する、生物学的に活性な新規な化合物（または組成物）を提供する。構築物は、非誘導体化配列および疎水性部分の共有結合によって誘導体化された配列を含む。Ｄ−アミノ酸部分を含む配列を有する構築物が好ましい。Ｄ−アミノ酸部分が、配列の最初の２つのアミノ末端部分および最後の２つのカルボキシ末端部分として配置される配列を有する構築物が最も好ましい。このような構築物は、ヘパリン関連またはヘパリン媒介の障害、疾患、または状態の処置のために特に有用である。本明細書中で使用される場合、「処置」とは、予防的処置および治療的処置の両方を含む。哺乳動物（ヒトを含む）の処置が意図される。
【００４１】
本明細書中で使用される場合、「アミノ酸部分」とは、代表的なアミノ酸化合物および代表的ではないアミノ酸化合物（誘導体化されたアミノ酸およびアミノ酸アナログを含む）を含む。別のアミノ酸への１つのアミノ酸の「保存的」置換は、類似の構造的特性および／または化学的特性を有するアミノ酸の置換であり、そして一般的には、関与する残基の極性、電荷、疎水性、親水性、および／または両親媒性の性質における類似性に基づく。疎水性、極性中性、および極性塩基性のアミノ酸は、α、β、およびχについての上記のアミノ酸を含む。極性酸性アミノ酸は、アスパラギン酸およびグルタミン酸を含む。一般的規則として、置換されたアミノ酸間の類似性が減少するにつれて、その置換が活性に影響を与える可能性は増大する。
【００４２】
本発明の目的のために、用語「機能的ドメイン」は、ＢＰＩの１つ以上の生物学的活性を示すＢＰＩのアミノ酸配列の領域を指定することが意図される。ＢＰＩのこれらの機能的ドメインは、１５マーペプチドおよび他の合成ペプチドと重複する、タンパク質切断フラグメントの活性によって定義された。ドメインＩは、およそアミノ酸１７〜およそアミノ酸４５を含むＢＰＩのアミノ酸配列として定義されている。このドメインに基づく最初のペプチドは、ＬＰＳ−誘導されたＬＡＬ活性の阻害およびヘパリン結合アッセイの両方において中程度に活性であり、そして有意な抗細菌活性を示さなかった。ドメインＩＩは、およそアミノ酸６５〜およそアミノ酸９９を含むＢＰＩのアミノ酸配列として定義されている。このドメインに基づく最初のペプチドは、高いＬＰＳおよびヘパリン結合能力を示し、そして有意な抗細菌活性を示した。ドメインＩＩＩは、およそアミノ酸１４２〜およそアミノ酸１６９を含むＢＰＩのアミノ酸配列として定義されている。このドメインに基づく最初のペプチドは、高いＬＰＳおよびヘパリン結合活性を示し、そして驚くべき抗微生物活性（抗真菌活性および抗細菌（例えば、抗グラム陽性および抗グラム陰性を含む）活性を含む）を示した。
【００４３】
本発明の目的のために、用語「ＢＰＩの生物学的活性」は、ヒト殺菌性／透過性増大（ＢＰＩ）タンパク質産物の１つ以上の生物学的活性または特性を含むが、それらに限定されないことが意図され、これらのタンパク質産物には、例えば、組換えＢＰＩホロタンパク質（例えば、ｒＢＰＩ（配列番号２８））、ＢＰＩのアミノ末端フラグメント（例えば、ｒＢＰＩ23）、および変異を有するＢＰＩのアミノ末端フラグメント（例えば、ｒＢＰ21ΔｃｙｓまたはｒＢＰＩ（１０−１９３）Ｃ１３２Ａ（ｒＢＰＩ（１０−１９３）ａｌａ132とも呼ばれる）であり、そして上記のＢＰＩタンパク質産物の既知の活性の任意の１以上を含むアナログが含まれる。ＢＰＩの活性およびＢＰＩの対応する機能的ドメインを含む対応するペプチドの活性の０．１倍〜１０倍である、本発明の任意のペプチドに基づく構築物の生物学的活性が特に含まれる。用語「ＢＰＩの生物学的活性」は、ヘパリン結合、ヘパリン中和、内皮細胞増殖の阻害、または脈管形成の阻害（例えば、インビボ新生血管形成（転移性腫瘍および慢性炎症疾患状態と関連するような新生血管形成）の阻害）の活性を含むことを意図するがそれらに限定されない。「ＢＰＩの生物学的活性」の定義には、ＬＰＳ結合の活性、ＬＰＳ中和、または抗微生物活性もまた、含まれる。「ＢＰＩの生物学的活性」のこの定義には、ＢＰＩまたはＢＰＩの対応するドメイン全体を含む対応するペプチドの活性とは定性的に異なる生物学的活性（例えば、抗微生物活性）もまた、特に含まれる。例えば、このような定性的な差異は、このペプチドがＢＰＩの対応する機能的ドメインのアミノ酸配列と比較して有効である、細菌または他の微生物のスペクトルの差異を含む。従って、この定義は、抗微生物活性（例えば、抗細菌活性（例えば、グラム陰性細菌、グラム陽性細菌、マイコバクテリア、およびクラミジアに対して）および抗真菌活性（例えば、Ｃａｎｄｉｄａ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ、Ｂａｓｉｄｉｏｂｏｌｕｓ、Ｃｏｎｉｄｉｏｂｏｌｕｓ、Ｒｈｉｚｏｐｈｕｓ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ、Ｍｕｃｏｒ、Ａｂｓｉｄｉａ、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ、Ｓａｋｓｅｎａｅａ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ、Ｅｐｉｄｅｒｍｏｐｈｙｔｏｎ、Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｉｅｓ、Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ、およびＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍに対して））、ならびに抗原生動物活性を含む。
【００４４】
本発明の目的のために、用語「誘導体化された」は、「誘導体化された構築物」または「誘導体化された組成物」の文脈において、疎水性部分に共有結合された配列を含む、ペプチドに基づく構築物または組成物をいう。好ましくは、疎水性部分は、配列のＮ末端に共有結合している。好ましくは、その疎水性部分は、本明細書中で規定されような、Ｒ2である。
【００４５】
誘導体化に適した構築物を含む、ペプチドに基づく構築物は、ヒトＢＰＩの機能的ドメインＩＩからの逆方向の置換部分配列（例えば、アミノ酸９９〜９２、９９〜９１、９９〜８９、９９〜９０、９９〜８８、９９〜８７、９９〜８６、または９９〜８５、ここで置換は７５および９１にある）、好ましくは、Ｄ−アミノ酸部分の配列に由来するか、その配列に基づく配列を含む。本発明に従うこのような構築物の実施形態は、以下の典型的な構築物を含む（アミノ酸についての１文字の略号は、Ｇ．Ｚｕｂａｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（第２版），１９８８（ＭａｃＭｉｌｌｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ：Ｎ．Ｙ．）、３３頁において見出され得る）：
【００４６】
【化３】
0004707911.tif 000003
【００４７】
本明細書中で使用される場合、「ＢＰＩタンパク質産物」は、天然で産生されるかまたは組換え的に産生されたＢＰＩタンパク質；天然の、合成の、および組換え的な、ＢＰＩタンパク質の生物学的に活性なポリペプチドフラグメント；ＢＰＩタンパク質またはそのフラグメントの生物学的に活性なポリペプチド改変体（ハイブリッド融合タンパク質およびダイマーを含む）；ＢＰＩタンパク質またはそのフラグメントもしくは改変体の生物学的に活性なポリペプチドアナログ（システイン置換アナログを含む）；およびＢＰＩ−誘導体化ペプチドを含む。ＢＰＩタンパク質産物は、当該分野で公知の任意の手段によって生成および／または単離され得る。米国特許第５，１９８，５４１号は、組換えＢＰＩホロタンパク質（ｒＢＰＩおよびＢＰＩの組換えフラグメントともいわれる）を含むＢＰＩタンパク質をコードする組換え遺伝子、およびこのタンパク質の発現のための方法を開示する。米国特許第５，４３９，８０７号および対応する国際公開番号ＷＯ  ９３／２３５４０（ＰＣＴ／ＵＳ９３／０４７５２）（これらはすべて、本明細書中に参考として援用される）は、培養中の遺伝的に形質転換された哺乳動物宿主細胞中で発現され、そしてそこから分泌される組換えＢＰＩタンパク質産物の精製のための新規な方法を開示し、そして安定な、均一な薬学的調製物への取り込みのために適切な大量の組換えＢＰＩ産物をいかにして精製し得るかを開示する。
【００４８】
ＢＰＩの生物学的に活性なフラグメント（ＢＰＩフラグメント）は、このフラグメント分子が、ハロタンパク質のアミノ末端のアミノ酸、内部のアミノ酸、および／またはカルボキシ末端のアミノ酸を、ＢＰＩの１つ以上の生物学的活性または免疫学的特性を喪失することなく欠いていること以外は、天然のヒトＢＰＩハロタンパク質と同じかまたは類似のアミノ酸配列を有する生物学的に活性な分子を含む。このようなフラグメントの非限定的な例には、Ｏｏｉら、１９９１、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４：６４９によって記載された約２５ｋＤの天然のヒトＢＰＩのＮ末端フラグメント、およびＧａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏら、１９９２、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６０：４７５４−４７６１において記載され、そしてｒＢＰＩ23ともいわれる、天然ヒトＢＰＩの１〜およそ１９３〜１９９のＮ末端アミノ酸をコードするＤＮＡの組換え発現産物が含まれる。この公報においては、発現ベクターは、１５１位のバリンはＧＴＣではなくＧＴＧで特定され、そして残基１８５は、リジン（ＡＡＧによって特定される）ではなくグルタミン酸（ＧＡＧによって特定される）であること以外は、Ｇｒａｙら、前出の図１に示されるように、３１残基のシグナル配列および成熟ヒトＢＰＩのＮ末端の最初の１９９アミノ酸を有する組換え発現産物（ｒＢＰＩ23）をコードするＤＮＡの供給源として使用されていた。組換えホロタンパク質（ｒＢＰＩ）はまた産生され、このタンパク質は、ｒＢＰＩ23についての例外、および残基４１７がバリン（ＧＴＴによって特定される）ではなくアラニン（ＧＣＴによって特定される）という例外を伴って、Ｇｒａｙら、前出の図１に示されるような配列（配列番号２７および２８）を有する。ＢＰＩの残基１０〜１９３からなるＮ末端フラグメントのアナログは、米国特許第６，０１３，６３１号および対応する国際公開番号ＷＯ  ９９／６６０４４（ＰＣＴ／ＵＳ９９／１３８６０）に記載され、これらは、本明細書中に参考として援用される。他の例には、米国特許第５，４４７，９１３号および対応する国際公開番号ＷＯ  ９５／２４２０９（ＰＣＴ／ＵＳ９５／０３１２５）に記載されるような、ＢＰＩフラグメントのダイマー形態が含まれ、これらは本明細書中に参考として援用される。
【００４９】
ＢＰＩの生物学的に活性な改変体（ＢＰＩ改変体）には、組換えハイブリッド融合タンパク質（このタンパク質には、ＢＰＩホロタンパク質または生物学的に活性なそのフラグメント、および少なくとも１つの他のポリペプチドの少なくとも一部分が含まれる）、ならびにＢＰＩ改変体のダイマー形態が含まれるがこれに限定されない。このようなハイブリッド融合タンパク質およびダイマー形態の例は、米国特許第５，６４３，５７０号および対応する国際公開番号ＷＯ  ９３／２３４３４（ＰＣＴ／ＵＳ９３／０４７５４）に記載され（これらはすべて本明細書中に参考として援用される）、そしてアミノ末端においてＢＰＩタンパク質またはその生物学的に活性なフラグメントを、およびカルボキシ末端において免疫グロブリン重鎖またはその対立遺伝子改変体の少なくとも１つの定常ドメインを含む、ハイブリッド融合タンパク質を含む。
【００５０】
ＢＰＩの生物学的に活性なアナログ（ＢＰＩアナログ）には、１以上のアミノ酸残基が、ＢＰＩの１以上の生物学的活性または免疫学的特性の喪失を伴わずに異なるアミノ酸によって置換されているＢＰＩタンパク質産物が含まれるがこれに限定されない。例えば、米国特許第５，４２０，０１９号および対応する国際公開番号ＷＯ  ９４／１８３２３（ＰＣＴ／ＵＳ９４／０１２３５）（これらは、すべて本明細書中で参考として援用される）は、ＢＰＩおよびＢＰＩのフラグメントのポリペプチドアナログを開示し、ここで、システイン残基が、異なるアミノ酸によって置換されている。本願によって記載される安定なＢＰＩタンパク質産物は、ＢＰＩホロタンパク質のＮ末端アミノ酸のアミノ酸１〜およそ１９３または１９９をコードするＤＮＡの発現産物であるが、ここで、残基番号１３２のシステインは、アラニンで置換されており、そしてこれは、ｒＢＰＩ21ΔｃｙｓまたはｒＢＰＩ21と呼ばれる。ＢＰＩのこのＮ末端アナログ、ｒＢＰＩ21の産生は、Ｈｏｒｗｉｔｚら、１９９６、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、８：２８−４０において記載されている。同様に、１３２位のシステインがアラニンで置換されているＢＰＩの残基１０〜１９３からなるフラグメント（「ｒＢＰＩ（１０−１９３）Ｃ１３２Ａ」または「ｒＢＰＩ（１０−１９３）ａｌａ132」と呼ばれる）は、米国特許第６，０１３，６３１号および対応する国際公開番号ＷＯ  ９９／６６０４４（ＰＣＴ／ＵＳ９９／１３８６０）に記載され、これらは、すべて本明細書中に参考として援用される。他の例には、ＢＰＩアナログのダイマー形態が含まれる；例えば、米国特許第５，４４７，９１３号および対応する国際公開番号ＷＯ  ９５／２４２０９（ＰＣＴ／ＵＳ９５／０３１２５）に記載され、これらは、すべて本明細書中に参考として援用される。
【００５１】
他のＢＰＩタンパク質産物は、合成的手段または組換え的手段によって産生されるＢＰＩに由来するか、またはこのＢＰＩに基づくペプチド（ＢＰＩ由来ペプチド）である。これらは、例えば、以下に記載されているものである：国際公開番号ＷＯ  ９７／０４００８（ＰＣＴ／ＵＳ９６／０３８４５）（これは、米国特許第５，８５８，９７４号に対応する）、および国際公開番号ＷＯ  ９６／０８５０９（ＰＣＴ／ＵＳ９５／０９２６２）（これは、米国特許出願番号０９／３６５，５３９に対応する）、および国際公開番号ＷＯ  ９５／１９３７２（ＰＣＴ／ＵＳ９４／１０４２７）（これは、米国特許第５，６５２，３３２号および同第５，８５６，４３８号に対応する）、および国際公開番号ＷＯ  ９４／２０５３２（ＰＣＴ／ＵＳ９４／０２４６５）（これは、米国特許第５，７６３，５６７号に対応し、米国特許第５，７６３，５６７号は、米国特許第５，７３３，８７３号の継続出願であり、米国特許第５，７３３，８７３号は、米国出願番号０８／１８３，２２２の一部継続出願であり、米国出願番号０８／１８３，２２２は、米国出願番号０８／０９３，２０２の一部継続出願であり（国際公開番号ＷＯ  ９４／２０１２８（ＰＣＴ／ＵＳ９４／０２４０１に対応する）、米国出願番号０８／０９３，２０２は、米国特許第５，３４８，９４２号の一部継続出願である）、ならびに、国際公開番号ＷＯ  ９７／３５００９（ＰＣＴ／ＵＳ９７／０５２８７）（これは、米国特許第５，８５１，８０２号に対応する）。これらは、すべて本明細書中に参考として援用される。
【００５２】
本発明は、新規なペプチドに基づく構築物を定義し、この構築物には、誘導体構築物が含まれ、これは、ＢＰＩタンパク質産物の定義の中に含まれ得る。
【００５３】
ＢＰＩタンパク質産物の投与は、好ましくは、ＢＰＩタンパク質産物および薬学的に受容可能な希釈剤、アジュバント、またはキャリアを含む、薬学的組成物を用いて達成され得る。ＢＰＩタンパク質産物は、既知の界面活性剤または他の治療剤なしで、またはそれらと共に投与され得る。ＢＰＩタンパク質産物（例えば、ｒＢＰＩ23）を含む安定な薬学的組成物は、クエン酸緩衝化生理食塩水（５または２０ｍＭ  クエン酸、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ５．０）中に１ｍｇ／ｍｌの濃度でＢＰＩタンパク質産物を含み、このクエン酸緩衝化生理食塩水には、０．１％重量のポロキサマー１８８（ｐｏｌｏｘａｍｅｒ  １８８）（ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）Ｆ−６８、ＢＡＳＦ  Ｗｙａｎｄｏｔｔｅ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，ＮＪ）および０．００２％重量のポリソルベート８０（ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ  ８０）（ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０，ＩＣＩ  Ａｍｅｒｉｃａｓ  Ｉｎｃ．，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）が含まれる。ＢＰＩタンパク質産物（例えば、ｒＢＰＩ21）を含む別の安定な薬学的組成物は、５ｍＭ  クエン酸、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．２％  ポロキサマー  １８８および０．００２％  ポリソルベート  ８０中に２ｍｇ／ｍｌの濃度でＢＰＩタンパク質産物を含む。このような好ましい組み合わせは、米国特許第５，４８８，０３４号；同第５，６９６，０９０号；同第５，９３２，５４４号；同第５，９５５，４２７号；同第６，０６６，６２０号、および同第６，０５７，２９３号ならびに対応する国際公開番号ＷＯ  ９４／１７８１９（ＰＣＴ／ＵＳ９４／０１２３９）（これらはすべて本明細書中で参考として援用される）において記載されている。米国特許第５，９１２，２２８号（米国特許第５，９１２，２２８号は、今度は、米国出願番号０８／５３０，５９９の一部継続出願であり、米国出願番号０８／５３０，５９９は、今度は、米国出願番号０８／３７２，１０４の一部継続出願である）、および対応する国際公開番号ＷＯ  ９６／２１４３６（ＰＣＴ／ＵＳ９６／０１０９５）（これらのすべては、本明細書中に参考として援用される）において記載されているように、増強された活性を有するＢＰＩタンパク質産物の他のポロキサマー処方物が使用され得る。ペプチドに基づく構築物は、他のＢＰＩタンパク質産物と同様に処方され得るか、あるいは生理食塩水または生理学的緩衝液中で処方され得る。
【００５４】
ＢＰＩタンパク質産物を含む治療組成物（ペプチドに基づく構築物（誘導体化構築物を含む）またはこのような本発明の構築物を含む組成物を含む）は、全身的または局所的に投与され得る。投与の全身的経路には、経口、静脈内、筋肉内、または皮下注射（長期間放出のためのデポーを含む）、眼内および眼球後、鞘内、腹腔内（例えば、腹腔内洗浄）、肺内（粉末薬剤を使用して、またはエーロゾル投与または噴霧する薬剤溶液）、または経皮的を含む。局所的投与には、軟膏、点眼薬、点耳薬、または洗浄液（例えば、創傷の洗浄のための）の形態での投与が含まれる。
【００５５】
非経口的に与えられた場合、ＢＰＩタンパク質産物組成物は、一般的に、１日あたり１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲の用量、好ましくは１日あたり０．１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で注射される。処置は、例えば、１〜３日間の間、１日あたりの同じ用量、減少された用量または増加された用量で、そしてさらに、処置する医師によって決定されるように、連続的な注入または断続的な注射もしくは注入によって継続され得る。
【００５６】
当業者は、良好な医学的な実施および個々の被験体の臨床的状態によって決定されるように、ＢＰＩタンパク質産物（本発明の構築物または組成物を含む）を含む治療組成物についての有効な投薬量および投与レジメンを容易に最適化し得る。
【００５７】
本発明の構築物（誘導体化された構築物を含む）またはこのような構築物を含む組成物は、ＢＰＩ産物が有効であることが公知である治療的用途（上記の用途を含む）のいずれかにおいて使用され得、これらは、少なくとも約０．００１％以上、好ましくは少なくとも約０．０１％、０．１％、１％、１０％、または２０％以上の上皮細胞吸収を有することが予想される。本発明の構築物および組成物（特に誘導体化されたもの）は、必要に応じて、当該分野で公知の任意のアッセイ（実施例６、７、または８に記載されている経口吸収または輸送スクリーニングアッセイを含む）によってそれらの上皮吸収特性について試験され得る。この構築物は、外因性のヘパリンを結合および中和するための方法、内皮細胞増殖を阻害し、内皮細胞増殖と関連する障害を処置するための方法、血管形成を阻害して、そして血管形成に関連するか血管形成を含む障害を処置するための方法において特に有用であるが、ＢＰＩの他の生物学的活性に起因して処置可能な他の疾患または状態（内毒素に関連する感染および障害を含み、本明細書中に記載されているか、またはＢＰＩタンパク質産物に関連する、当該分野で公知の任意の疾患または状態を特に含む）についてもまた有用であり得る。
【００５８】
外因性のヘパリン化合物は、抗凝固が必要とされる外科的処置（例えば、心肺バイパス、心臓カテーテル手術、または血管形成術、および血液透析）の間に一般的に投与される。外因性ヘパリン化合物はまた、血栓症の危険があるか、または血栓症に罹患している患者（例えば、深部静脈血栓症、急性心筋梗塞、発作、または肺動脈塞栓症を罹患している患者）に投与される。
【００５９】
血管形成関連障害は、血管形成が疾患の開始または進行において役割を果たす障害である。血管形成は、以下に例証するように多数の状態に関与し、そして血管形成の阻害は、これらの状態のいずれかを処置する（疾患の進行の阻害ならびに疾患の徴候および症状の改善を含む）ために有効であると予想されている。
【００６０】
これらの治療的用途のいずれかのための医薬の調製における、本発明の構築物および組成物の使用（本発明に従って誘導されるものを含む）もまた、意図される。
【００６１】
新しい脈管の産生が、癌細胞の急速な増殖を支持するために必要であるので、血管新生は、癌状態において非常に重要である。従って、血管新生の阻害は、以下の腫瘍の増殖の低減を含む、成人および小児の腫瘍学における腫瘍退行を促進し得る：固形腫瘍／悪性腫瘍（ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ）、局所的に進行した腫瘍、転移性癌、ヒト軟組織肉腫、リンパ転移を含む癌転移、血球悪性腫瘍、滲出リンパ腫（腹腔ベースのリンパ腫）、肺癌（小細胞癌を含む）、非小細胞癌、乳癌（小細胞癌および腺管癌を含む）、胃腸の癌（胃癌、結腸癌、結腸直腸癌、結腸直腸新形成に関連するポリープ）、膵臓癌、肝臓癌、泌尿器の癌（膀胱癌、前立腺癌を含む）、女性生殖器管の悪性腫瘍（卵巣癌、子宮内膜癌、および卵胞における固形腫瘍を含む）、腎臓癌（腎細胞癌を含む）、脳の癌（内在（ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ）脳腫瘍、神経芽細胞腫、神経膠星状細胞性脳腫瘍、神経膠腫、中枢神経系における転移性腫瘍細胞浸潤を含む）、骨の癌（骨腫を含む）、皮膚癌（悪性黒色腫、ヒト皮膚ケラチノサイトの腫瘍進行、および扁平上皮癌を含む）、血管周囲細胞腫ならびにカポージ肉腫。
【００６２】
血管新生は、以下を含む慢性炎症において役割を果たす：膵臓炎、慢性炎症を伴う皮膚病（乾癬を含む）、肝硬変、ぜん息、多発性硬化症、関節炎（慢性関節リウマチ、反応性関節炎および慢性炎症性関節炎を含む）、自己免疫障害（脈管炎，糸球体腎炎、実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）を含む）、狼瘡、重症筋無力症、潰瘍性大腸炎、クローン病、炎症性腸疾患、血液透析に付随する慢性炎症、顆粒球輸血関連症候群；同種移植および異種移植後の拒絶反応（対宿主性移植片病を含む）；ならびに他の慢性炎症性障害。
【００６３】
眼における血管新生は、以下に関与する：眼の新生血管形成、増殖性網膜症、水晶体後線維増殖、黄斑変性、血管新生緑内障および糖尿病性の眼の疾患（特に、糖尿病性虹彩新生血管形成および網膜症。
【００６４】
冠状動脈アテロームは、脆弱な毛細管ネットワークにより高度に血管化されており、そして高い脈管内圧に曝される場合に、これらの新しく形成された毛細管の破裂は、出血を生じてアテローム硬化性斑および冠状動脈閉塞を引き起こす。従って、血管新生の阻害は、アテローム硬化性斑の増殖を低減し得、そして以下の処置において有用であり得る：アテローム性動脈硬化症、虚血性心臓疾患、心筋梗塞、冠状心臓疾患、再狭窄、特にその後のバルーン血管造影、新内膜（ｎｅｏｉｎｔｉｍａｌ）過形成、脈管内皮における細胞間接合部の分裂、高血圧、血管損傷、動脈虚血、動脈狭窄、末梢血管疾患、発作。
【００６５】
血管新生はまた、女性の生殖周期の間に起こり、そして女性の生殖周期の間の子宮内膜症、子宮フィブロイド、脈管増殖（子宮内微小血管増殖を含む）不全に付随する他の状態に関与する。
【００６６】
血管新生はまた、異常血管増殖（脳動静脈奇形（ＡＶＭ）、血管線維腫（ａｎｇｉｏｆｉｂｌｏｎａ）、および血管腫（ｈｅｍａｎｇｉｏｎａ）を含む）に関与する。
【００６７】
処置される状態に適切な他の治療剤（例えば、血管新生を阻害する他の薬剤または示された場合は癌治療剤）の同時投与もまた意図される。
【００６８】
「共（ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔ）投与」または「同時投与（ｃｏ−ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）」は、本明細書中で使用される場合、共にもしくは組み合わせて、一緒に、または互いに前後して、薬剤を投与することを含む。このＢＰＩタンパク質産物および第２薬剤は、異なる経路により投与され得る。例えば、第２薬剤が、静脈内で、筋肉内で、皮下で、経口で、または腹腔内で投与される一方で、このＢＰＩタンパク質産物は、静脈内で投与され得る。このＢＰＩタンパク質産物および第２薬剤は、同じ静脈内ラインで連続的に与えられ得るし、または異なる静脈内ラインで与えられ得る。あるいは、第２薬剤が、例えば経口で投与される一方、このＢＰＩタンパク質産物は、胃内送達のための特別な形態で投与され得る。処方されたＢＰＩタンパク質産物および第２薬剤は、全ての薬剤が作用の部位で有効な濃度を達成することを可能にするために十分な様式でそれらが与えられる限り、同時にでもまたは連続的にでも投与され得る。
【００６９】
本発明の他の局面および利点は、以下の例示的実施例を考慮して理解される。ここで、実施例１は、ペプチドベースの構築物（誘導体化構築物を含む）の調製および精製を扱う；実施例２は、内皮細胞増殖アッセイにおけるペプチドベースの構築物（誘導体化構築物を含む）のインビトロ活性を扱う；実施例３は、ペプチドベースの構築物（誘導体化構築物を含む）の抗血管新生活性のインビボ試験を扱う；実施例４は、慢性炎症疾患状態のモデルにおける、ペプチドベースの構築物（誘導体化構築物を含む）のインビボ試験を扱う；実施例５は、悪性黒色腫転移モデルにおける、ペプチドベースの構築物（誘導体化構築物を含む）の試験を扱う；実施例６は、経口吸収スクリーニングアッセイにおける、ペプチドベースの構築物（誘導体化構築物を含む）のインビトロ試験を扱う；実施例７は、経口吸収についての、ペプチドベースの構築物（誘導体化構築物を含む）のインビボ試験を扱う；実施例８は、経口活性についての、ペプチドベースの構築物（誘導体化構築物を含む）のインビボ試験を扱う；実施例９は、網膜新生血管形成モデルにおける、ペプチドベースの構築物（誘導体化構築物を含む）のインビトロおよびインビボでの試験を扱う；実施例１０は、ヘパリン中和についてのペプチドベースの構築物（誘導体化構築物を含む）の試験を扱う；そして実施例１１は、ＢＰＩタンパク質産物についてのさらなる活性アッセイにおける、ペプチドベースの構築物（誘導体化構築物を含む）の試験を扱う。
【００７０】
（実施例１）
（ペプチドベース構築物の調製および精製）
この実施例は、本発明に従う、ペプチドベースの構築物（誘導体化構築物を含む）の調製および精製を扱う。
【００７１】
ペプチドベースの構築物は、種々の合成手順に従って調製され得る。例えば、ＢＰＩ由来のペプチドは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．Ｍｏｄｅｌ  ４３２ペプチド合成機を使用して、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，１９６３，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９およびＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９６６，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，３８：１９０５−１９１４の方法に従って、同一人に譲渡された米国特許出願第０８／１８３，２２２号および米国特許第５，７３３，８７２号に記載されるように、固相ペプチド合成により調製されている。
【００７２】
あるいは、ＢＰＩ−誘導ペプチドは、米国特許第５，８５８，９７４号に記載されるように、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣまたはＤＩＰＣＤＩ）／１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）および２−（１−Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサ−フルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）／ＨＯＢｔ／ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）を使用する二重カップリング手順で、１−フルオレニルメチル−オキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）保護ストラテジーを利用して、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｈｅｍｔｅｃｈ（ＡＣＴ−Ｍｏｄｅｌ  ３５７  ＭＰＳ）合成機での固相ペプチド合成を使用して大規模で合成されている。
【００７３】
本発明のペプチドベース構築物の合成において使用される固体支持体は、１％のジビニルベンゼン（ＤＶＢ）架橋および０．５６ミリモル／グラムの置換率を有する４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃ−アミノメチル）−フェノキシ（Ｆｍｏｃ−Ｒｉｎｋアミド）リンカーを含むポリスチレン樹脂であった。０．１グラムと５グラムとの間の出発樹脂のスケールを使用し、そしてこのスケールは、本明細書中に記載される合成ペプチドベース構築物については概して０．２５グラムであった。
【００７４】
このような合成には、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）が主な溶媒であり、ピペリジン／ＤＭＦの５０／５０溶液は、それぞれ１分、５分および１０分の３つの連続的な処理におけるＦｍｏｃ脱保護のために使用された。二重カップリング手順を、各カップリングにおいて４：１のアミノ酸対ペプチド比を使用して、各サイクルで使用した。アミノ酸を０．５ＭのＨＯＢｔのＮ−メチルピロリジノン（ＮＭＰ）溶液に、また０．５Ｍの濃度で溶解した。第１のカップリングについては、（アミノ酸に対して）等モル量の、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＤＩ）のＮＭＰ０．５Ｍ溶液を使用し、そして４５分間反応させた。第２のカップリングは、等容積のＤＩＥＡのＮＭＰ１Ｍ溶液（２：１、ＤＩＥＡ：アミノ酸）と共に、（アミノ酸に対して）等容積のＨＢＴＵのＤＭＦ０．５Ｍ溶液を３０分間使用した。
【００７５】
合成が完了すると、この樹脂をＭｅＯＨで処理し、減圧下で乾燥し、次いで３６：２：１：１の比（容積は樹脂の量に依存する）のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）：チオアニソール：エタンジチオール（ＥＤＴ）：水から構成されるカクテルを使用して２時間（最短で２時間を使用し、各アルギニンについてさらに３０分間を使用するが、３時間は超えない）で切断し、最初の１５分間は氷浴中であった。次いでこれらの溶液を、１０％ＴＦＡ水溶液に溶解し、メチルｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）で３回洗浄し、凍結乾燥した。
【００７６】
選択されたペプチドベースの構築物のアミノ末端は、上記のようなＮ−末端Ｆｍｏｃ保護ストラテジーを使用する固相での合成後に無水酢酸または他の有機カルボン酸で誘導体化され得る。ピペリジンでのＦｍｏｃ除去後かつＴＦＡでのペプチド切断前に、樹脂上のペプチドを、ジメチルホルムアミド中１時間で、２倍モル過剰のジイソプロピルエチルアミンと共に、１０倍モル過剰の無水酢酸または４倍モル過剰の他の有機カルボン酸を用いて誘導体化し得るか、あるいはＮ，Ｎ−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）またはＣＩＰＣＤＩ／１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）および２−（１−Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサ−フルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）／ＨＯＢｔ／ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）を使用する二重カップリング手順を用いて誘導体化し得、そして種々のビルディングブロックのうちの１つを誘導体化のために使用し得た。次いでペプチドを、上記のようなＴＦＡ切断カクテルで樹脂から切断し、そして下記のように精製した。精製されたペプチドの誘導体化（Ｎ−末端アセチル化を含む）を質量分析により評価した。
【００７７】
表Ｉに記載されるペプチドベース構築物の収率は、４．８％〜５７．８％の範囲であった。全てのＨＰＬＣ純度は、概して９０％より高く、そして質量を質量分析により解釈した。
【００７８】
それぞれの新しく合成したペプチドベース構築物の純度分析のために、凍結乾燥したペプチドベース構築物の希釈溶液を調製し、そして１５０ｍｍ×１ｍｍ、５μ粒子、３００ÅポアのＣ−８Ｚｏｒｂａｘカラムを備えたＭｉｃｈｒｏｍ  Ｕｌｔｒａｆａｓｔ  Ｍｉｃｒｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｎａｌｙｚｅｒで分析した。カラムオーブンを４０℃に設定し、流速は１００μＬ／分であり、そして注入容積は、代表的には５〜１０μＬであった。ＨＰＬＣを、移動相Ａとして水中の５％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ、そして移動相Ｂとして８０％アセトニトリル／０．０６５％ＴＦＡを使用して行った。溶離液を、分光光度測定法により２１４ｎｍでモニタリングした。パーセント純度を個々のペプチド構築物のピーク面積から算出した。
【００７９】
選択された構築物を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により、４０×１０ｍｍガードカートリッジおよび４０×１００ｍｍ  Ｐｒｅｐ  ＰａｋからなるＤｅｌｔａ  Ｐａｋ  Ｃ−１８、１５μｍ、３００Åカートリッジカラムを備えたＷａｔｅｒｓ  Ｐｒｅｐ  ＬＣ  ２０００  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｓｙｓｔｅｍ  （Ｗａｔｅｒ  Ｃｏｒｐ．，Ｍｉｌｏｒｄ，ＭＡ）を使用して精製した。このカラムを、２５％緩衝液Ｂで平衡化した（ここでＡ＝５％アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸、そしてＢ＝８０％アセトニトリル／０．０６５％トリフルオロ酢酸）。このようなペプチドベース構築物を緩衝液Ａ中約２０ｍｇ／ｍＬまで溶解し、そして２００〜８００ｍｇを、８〜１７ｍＬ／分で作動するＬＣポンプを通してカラムにアプライした。結合した物質を、３０分あたり経験的に決定した緩衝液Ｂの勾配（例えば、２５〜３５％の緩衝液Ｂ）を用いて、８〜１７ｍＬ／分で溶出した。（いくつかの構築物を、２３〜４３％の緩衝液Ｂ／３０分の勾配で精製し；他の構築物を、種々の勾配（例えば、２５〜４５％、０〜６０％、３０〜７０％、２５〜７５％、３０〜６０％または３５〜７５％の緩衝液Ｂ／３０分）で精製した）。溶離液を、Ｗａｔｅｒｓ  ４９０Ｅ  Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ  Ｍｕｌｔｉｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒで２２０ｎｍおよび／または２８０ｎｍおよび３００ｎｍでモニタリングした。フラクションを集め、そして目的の構築物について、４０℃に維持されたＺｏｒｂａｘ  Ｃ−８、１５０×１ｍｍ、５μｍ、３００Åを備えたＵｌｔｒａｆａｓｔ  Ｍｉｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｍｉｃｈｒｏｍ  ＢｉｏＲｅｓｏｕｒｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ，ＣＡ）でアッセイした。９０％以上の純度で目的の構築物を含むフラクションをプールし、そして乾燥するまで凍結乾燥した。回収した物質の純度を、分析用逆相ＨＰＬＣで決定した。
【００８０】
【表１】
0004707911.tif 000004
0004707911.tif 000005
【００８１】
(a)慣例により、小文字で書かれた（例えば、ｌｙｓ）のアミノ酸部分は、Ｄ−アミノ酸部分を表し、そして大文字で書かれた（例えば、ＬＹＳ）アミノ酸部分は、Ｌ−アミノ酸部分を表す；１つの形態のグリシンしか存在せず（Ｄ，Ｌは無い）、ＧＬＹもしくはＧか、またはｇｌｙもしくはｇとして表され得る。
【００８２】
（実施例２）
（インビトロＨＵＶＥＣアッセイ）
この実施例は、内皮細胞増殖のインビトロアッセイにおけるペプチドベースの構築物（誘導体化構築物を含む）の活性に関する。
【００８３】
手短にいえば、ヒト臍静脈上皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、ＥＧＭ−２培地（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）中で培養し、収集し、そして９６ウェル培養プレート上にプレートした。２４時間静止させた後、細胞を増殖因子の存在下で種々のペプチドベースの構築物と７２時間同時培養し、それらの活性を試験した。細胞増殖を、トリチウム化チミジンのＤＮＡへの組み込みによって定量化し、そして１分あたりの数（ｃｐｍ）において表した。
【００８４】
実験手順の詳細は、以下の通りであった：ＨＵＶＥＣ細胞を、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐ．（Ｂｉｏ  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡの子会社）からのＥＧＭ−２培地［ＥＧＭ−２は、増殖因子（ｈＦＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ、ＩＧＦ−１、ｈＥＧＦ）、アルコルビン酸、ヘパリン、ＧＡ−１０００および２％  ＦＢＳを補充した内皮細胞基本培地−２（ＥＭＢ−２）である］中、コンフルエントになるまで（約４〜７日）Ｔ７５フラスコ中で培養した。細胞を０．０２５％のトリプシン／ＥＤＴＡを用いて５分間トリプシン処理することによって収集した。反応を止めるために、２〜５％のＦＢＳを添加した。細胞を遠心分離し、そしてハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）またはダルベッコのリン酸緩衝化生理食塩水Ｄ−ＰＢＳを用いて３回洗浄した。次いで、ペレットを、０．１％のＦＢＳを補充したＥＢＭ−２中に再懸濁し、そしてＧＡ−１０００を使用した。細胞を計数し、そして細胞懸濁液を０．１％のＦＢＳを有するＥＢＭ−２中に２×１０5／ｍＬにて調製した；細胞を、９６ウェルの平底培養プレート中に０．１ｍＬ／ウェルにて分配した（総量：０．１％  ＦＢＳ−ＥＭＢ−２中に約２０，０００細胞／ウェル）。インキュベーションを、５％  ＣＯ2中で３７℃にて２０〜２４時間続けた。次の日、ペプチドベースの構築物を、９６ウェルプレート中での試験のために調製した。上清を細胞−ウェルから吸引し、２０μＬ／ウェルにてＥＢＭ−２または試験試薬で置換した。次いで、１８０μＬ／ウェルの１．１２％のＦＢＳ−ＧＦＳを添加して、ＥＢＭ−２中に１％  ＦＢＳ−ＧＦＳの最終濃度にした。この吸引および添加を、ウェル毎に行った。3Ｈ−チミジン（１００μＣｉ／ｍＬ）を、１０μＬ／ウェル（１μＣｉ／ウェル、最終）にて添加した。インキュベーションを、３７℃で５％  ＣＯ2下にて７２時間続けた。プレートを収集するために、上清を細胞−ウェルから吸引し、次いで、７５μＬ〜１００μＬ／ウェルの０．０２５％のトリプシン−ＥＤＴＡを添加した。フード中で室温にて８〜１０分間インキュベーションした後、細胞をチェックし、そして１００μＬ／ウェルの２〜５％のＦＢＳ−ＰＢＳを添加して反応を止めた。次いで、プレートを収集し、乾燥し、そしてＩｎｏｔｅｃｈ細胞収穫器（Ｉｎｏｔｅｃｈ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＩＮＢ−３８４，Ｓａｍｐｌｅ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ａｎｄ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｌａｎｓｉｎｇ，ＭＩ）を用いて計数した。
【００８５】
このようなＨＵＶＥＣ増殖アッセイの結果を表ＩＩ中に示す。粗形態（純度＞７３％）中で試験するかまたは精製することによって、本発明に従うペプチドベースの構築物は、ＨＵＶＥＣ増殖を阻害した。
【００８６】
【表２】
0004707911.tif 000006
【００８７】
９−アミノ酸構築物（ＸＭＰ．６２９）を用いる阻害活性は、１５−アミノ酸親構築物（ＸＭＰ．３９４）の阻害活性に類似した。繰り返しの実験（全８回）において、ＸＭＰ．６７９は、３と１０との間の範囲（３＜ｘ＜１０）で一貫してＩＣ50値を示した。精製されたＸＭＰ．６２４、ＸＭＰ．６２５、ＸＭＰ．６２６、ＸＭＰ．６２７、ＸＭＰ．６２９、およびＸＭＰ．６３０を用いるさらなるアッセイにおいて、ＩＣ50値は、表ＩＩ（それぞれ、４．９±０．５、１＜ｘ＜３（７実験）、３＜ｘ＜１０（２実験）、３＜ｘ＜１０（３実験）、３＜ｘ＜１０および＞５０）中に示される値に相当した。
【００８８】
（実施例３）
（インビボＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）血管新生アッセイ）
この実施例は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）を用いる血管新生のインビボアッセイにおけるペプチドベースの構築物（誘導体化構築物を含む）の活性に関する。
【００８９】
これらの実験について、本発明に従うペプチドベースの構築物を、ヘパリンで誘導した血管新生をマウスにおいてインビボで阻害するためのそれらの能力についてアッセイした。基底膜マトリックス（Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｌａｂｗａｒｅ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を、解凍しかつ４℃に維持し、そして血管新生因子を、Ｐａｓｓａｎｉｔｉら、１９９２、Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．６７：５１９−５２８に記載される通りに、概して液体状態のゲルに添加した。ヘパリンナトリウム（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を、無菌ＰＢＳ中で１，２５０〜１０，０００Ｕ／ｍＬの範囲の種々の濃度に溶解し、そして８，０００Ｕ／ｍＬにてこの実験において使用した。ヒト組み換え塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ；Ｓｉｇｍａ）を、ＰＢＳ中の１％  ＢＳＡ中に２５μｇ／ｍＬに再構成した。２．５μＬの溶解したヘパリン溶液および４．０μＬの組み換えｂＦＧＦの１容量を、マウス１注入あたり０．５ｍＬのＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）混合物に添加した。ペプチドベースの構築物を、このＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）混合物に、実験動物あたり１０μＬ／０．５ｍＬのＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）のアリコート中に０．５〜５０μｇ／ｍＬ（最終濃度）の範囲の濃度変化で添加した。１０μＬの無菌ＰＢＳを、コントロール動物に注入されたＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）アリコートにおいてペプチドベースの構築物の代わりに置換した。
【００９０】
６〜８週齢の（ＮＩＨ手引きの下で維持した）雌Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ  Ｂａｒｂｏｒ，ＭＥ）に、上記の通りに調製されたＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）の０．５ｍＬのアリコートを背面正中線の下方で皮下注射した。注射の１０日後、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）ゲルを切除し、そしてドラブキン試薬（Ｓｉｇｍａ）中に置いた。総タンパクおよびヘモグロビン含量を、ゲルの機械的ホモジナイズ化の後、ドラブキン試薬中に貯蔵したゲルについて決定した。ヘモグロビン濃度を、Ｓｉｇｍａ手順＃５２５およびこの手順に使用される試薬（Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）によって供給される）を用いて測定した。所望される場合、総タンパク質レベルを、キット（ＤＣタンパク質アッセイ，Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）において商業上体系化されたマイクロプレートアッセイを用いて決定した。
【００９１】
組織学的染色のために使用されるゲルを、ドラブキン試薬中に置くよりむしろ動物からの切除の後すぐにホルマリン固定化する。ホルマリン固定化したゲルを、凍結切片化のためにＴｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ  Ｏ．Ｃ．Ｔ．化合物（Ｍｉｌｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｌｋｈａｒｔ，ＩＮ）中に包埋する。凍結切片のスライドを、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色する（Ｈｕｍａｓｏｎ，１９７９，Ａｎｉｍａｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，第４版、Ｗ．Ｈ．Ｆｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ，第９章、１１１〜１３１頁に記載されるように）。ペプチドの効果を、添加されたペプチドなしで調製したＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）ゲルスライスに対する血管新生の阻害について、凍結染色された切片の鏡検によって決定する。血管新生阻害の程度を、ＢＰＩペプチド含有スライス中に見出された基準量のヘモグロビンを用いて定量化する。
【００９２】
ゲルあたり１０μｇのペプチド構築物を用いるＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）アッセイの結果を、表ＩＩＩ中に示す。データを、１グループあたり１０匹のマウスを用いて、摘出したゲル（ＩＳＥＭ）からのヘモグロビン濃度の３連の測定の平均として表す。
【００９３】
【表３】
0004707911.tif 000007
【００９４】
ペプチドベースの構築物は、ｂＦＧＦで誘導した血管新生を阻害した。Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）アッセイは、実施例２中に記載されるＨＵＶＥＣアッセイ結果の確証をもたらす。
【００９５】
さらなる実験において、インビボ血管新生アッセイを、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）およびメラノーマ細胞（「メル−ゲル」アッセイ）を用いて開発した。上記で記載されるような雌Ｃ５７Ｂ１／６Ｊマウスを、６〜８週齢にて使用し、そしてＮＩＨ手引きの下で維持した。上記に記載のような、基底膜マトリックス（Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標））を、０．５ｍＬのＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）あたり５０μＬでＢ１６．Ｆ１０悪性メラノーマ細胞に添加する前に４℃にて解凍した。Ｂ１６．Ｆ１０メラノーマ細胞の最終濃度を、１０，０００から１００，０００細胞／０．５ｍＬのＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）まで変化させた。このアッセイについて、５０μＬ（最終濃度は、１．０〜５０．０μｇ／０．５ｍＬのＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）で変化する）でのペプチドベースの構築物を、Ｂ１６．Ｆ１０メラノーマ細胞と予め混合し、そして腹部正中線付近の皮下注射の前にＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）に直接添加する。５０μＬの滅菌ＰＢＳを、コントロール動物に注射されたＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）アリコート中の構築物の代わりに置換する。注射の１０日後、ゲルを摘出し、そして上記のように、ドラブキン試薬（Ｓｉｇｍａ）中に置く。総ヘモグロビン含量を、上記のように、ゲルの機械的ホモジナイズ化の後、ドラブキン試薬中に貯蔵したゲルについて決定する。ヘモグロビン濃度を、上記のように、Ｓｉｇｍａ手順＃５２５およびこの手順において使用される試薬（Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）よって供給される）を用いて測定する。メル−ゲルアッセイからのデータを、１グループあたり１０匹のマウスを用いる、摘出したゲル（ＩＳＥＭ）からのヘモグロビン濃度の３連の測定の平均として表す。
【００９６】
（実施例４）
（慢性炎症性疾患状態モデル：コラーゲン誘導関節炎または反応性関節炎）
この実施例は、ペプチドベースの構築物が関節炎のような慢性炎症性疾患状態におけるそれらの効果のために投与される場合の、ペプチドベースの構築物（誘導体化構築物を含む）のインビボ活性に関する。
【００９７】
コラーゲンで誘導した関節炎モデルについて、関節炎を、Ｓｔｕａｒｔら、１９８２、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．６９：６７３−６８３の方法に従って、尾の基部において、ウシＩＩ型コラーゲンの皮内免疫化によってマウス中で誘導する。一般的に、マウスは、コラーゲン免疫化の２１日後に関節炎症候群を発症し始める。次いで、処置されたマウスの関節炎スコアを、２１〜２５日の各日に、実施例１に従って調製されたペプチドベースの構築物またはコントロールとして緩衝液を尾静脈を介して静脈内注射して処置したマウスについて、１２０日の期間にわたって、盲目的様式で評価する。
【００９８】
詳細には、ウシＩＩ型コラーゲン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ  ＡＬ）を、０日目に尾の基部の皮内注射（０．１ｍｇ／マウス）を介して雄マウス（Ｍｏｕｓｅ／ＤＢＡ／１Ｊ）のグループ（各々は、約２０〜２５ｇの重量）に投与する。ペプチドベースの構築物を、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ６．０）からなる緩衝液中に溶解し、そして種々の濃度での投与のためにＰＢＳ緩衝液で希釈する。ＰＢＳ緩衝液単独（０．１ｍＬ）を、コントロールとして投与する。
【００９９】
コラーゲンで誘導した関節炎モデルをまた使用して、硫酸プロタミンとの比較においてペプチドの能力を評価する。詳細には、ペプチドベースの構築物を、上記のようにＰＢＳ中に溶解し、そして種々の濃度にて投与する。他の試験物質を、以下の投薬量にて投与する：硫酸プロタミン（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）（０．１３ｍｇ／マウス）、タウマチンコントロールタンパク質（０．１２ｍｇ／マウス）、およびＰＢＳ緩衝液（０．１ｍＬ）。マウスのグループに、コラーゲンでの注射後２８〜３２日の各々において尾静脈を介して静脈内注射により試験物質またはコントロール物質を与える。
【０１００】
反応性関節炎モデルについて、ペプチドベースの構築物を投与して、Ｙｏｎｇら、１９８８、Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ４：３０５−３１０の方法に従って、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ反応性関節炎モデルにおける反応性関節炎を処置する。詳細には、ペプチドベースの構築物を、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ  ｃＷＡ  ０：８  Ｔ２を以前に静脈内に注射した（すなわち、Ｙｏｎｇら、前出に従うビルレンスプラスミドを欠く）ＤＢＡ／２Ｊマウスに４×１０8細菌の計算した投薬量にて投与し、マウスにおける非敗血症関節炎を誘導する。マウスの各グループに、尾静脈を介して静脈内注射により試験物質またはコントロール物質を与える。
【０１０１】
Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉは、ライム病および関連する関節炎の原因である病原体であり、そしてそれは、その細胞壁においてＬＰＳ様複合体を所有し、この細胞壁は、Ｅ．ｃｏｌｉ．の細胞壁と異なるが構造的に関連する。Ｌｉｍｕｌｕｓ  Ａｍｏｅｂｏｃｙｔｅ  Ｌｙｓａｔｅ（ＬＡＬ）阻害アッセイにおいてＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ＬＰＳの阻害に対するペプチドベースの構築物の投与の効果を決定する。詳細には、ＬＡＬアッセイを、例えば、２．５μｇ／ｍＬにて投与されたＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ＬＰＳおよび例えば２ｎｇ／ｍＬにて投与されたＥ．ｃｏｌｉ．０１１３  ＬＰＳに対するペプチドベースの構築物の効果を測定することによって実行する。
【０１０２】
（実施例５）
（悪性メラノーマ転移モデル）
この実施例は、インビボの悪性メラノーマ転移モデルにおけるペプチドベースの構築物（誘導体化構築物を含む）の活性に関する。
【０１０３】
これらの実験のために、ペプチドベースの構築物、プロタミンまたは緩衝液コントロールを、マウス悪性メラノーマ転移モデルにおいてそれらの効果を試験するために投与する。詳細には、Ｃ５７ＢＬ６Ｊマウスのグループを、０日目に静脈内注射を介して尾静脈に１０5Ｂ１６．Ｆ１０悪性メラノーマ細胞を接種する。実施例１に従って調製された種々の濃度のペプチドベースの構築物を、１、３、６、８、１０、１３、１５、１７および１９日に試験マウスの尾静脈に投与する。陽性コントロールとしての硫酸プロタミン（０．１３ｍｇ／マウス）または陰性コントロールとしてのＰＢＳ緩衝液（０．１ｍＬ／マウス）を、コントロールマウスのさらなるグループに同様に投与する。この動物を、肺組織の観察のために２０日目に頚部脱臼を介して屠殺するかまたは４０日目まで死亡率について観察するかのいずれかを行う。各肺の葉を、気管を介して肺に３ｍＬの水を注入することによって灌流しかつ膨張させる。次いで、表在性の腫瘍小節を、解剖顕微鏡を用いて計数し、そしてグループあたりに見出された腫瘍の数を、統計学的有意差について分析した。このような分析により、腫瘍の数を有意に減少しかつ生存を有意に延長させる効果を有するそれらの構築物を同定する。
【０１０４】
（実施例６）
（インビトロ経口吸収スクリーニング）
本実施例は、インビトロ輸送スクリーニングアッセイにおいて、ペプチドベースの構築物（誘導体化された構築物を含む）の活性を扱う。
【０１０５】
これらの実験について、ペプチドベースの構築物を、ＭＤＣＫ細胞および／またはＣＡＣＯ−２細胞を使用するインビトロスクリーニングアッセイにおいて、潜在的な経口吸収についてスクリーニングする。手短に言うと、培養したＭａｄｉｎ−Ｄｅｒｂｙイヌ腎臓上皮（ＭＤＣＫ）細胞（ＡＴＣＣ登録番号ＣＣＬ−３４）および／またはＣＡＣＯ−２（ヒト結腸癌）細胞（Ａｕｄｕｓ，Ｋ．Ｌ．ら、１９９０、Ｐｈａｒ．Ｒｅｓ．，７：４３５−４５１）の単層を、コラーゲンコートした透過性フィルター支持体（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）上で増殖させる。これらの細胞をコンフルエントにまで増殖させ、そして分化させる（例えば、ＭＤＣＫ細胞については約３日間またはＣＡＣＯ−２細胞については約２１日間）。これらの単層の完全性を、経上皮（ｔｒａｎｓｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ）抵抗性を測定することによって決定する。これらの細胞を、ＭＤＣＫまたはＣＡＣＯ−２のスクリーニングにおいて２．５時間、その上面側でペプチドベースの構築物と共にインキュベートする。この構築物の経上皮輸送を、それらの細胞の側底面側のインキュベーション培地の定量的ＨＰＬＣ分析によって測定する（順方向（ｆｏｒｗａｒｄ）輸送）。放射性標識したマンニトールおよび／またはコルチゾンを、ポジティブコントロールとして使用する。さらに、この構築物の流出を、これらの細胞の上面側のインキュベーション培地の定量的ＨＰＬＣ分析によって測定する。これは、２．５時間の側底面側の構築物との細胞のインキュベーション後に行う。
【０１０６】
実験手順の詳細は以下のとおりであった：ＭＤＣＫ細胞またはＣＡＣＯ−２細胞を、細胞増殖培地（ＭＤＣＫ細胞については最小必須培地（イーグル）ＧＩＢＣＯ（Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）＃１１０９５−０８０またはＣＡＣＯ−２細胞についてはＤＭＥＭ、ＧＩＢＣＯ＃１１９６５−０５０、高グルコース−５００ｍＬ；ＦＢＳ  １０％（Ｈｙｃｌｏｎｅ）（熱処理した）−５０ｍＬ；Ｌ−グルタミン（２００ｍＭ）ＧＩＢＣＯ＃２５０３０−０１６−５ｍＬ；ＣＡＣＯ−２細胞については、非必須アミノ酸、ＧＩＢＣＯ＃１１１４０−０５０（２００ｍＭ、１００×）−５．５ｍＬ；およびペニシリン／ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）ＧＩＢＣＯ  ＃１５１４０−０１５−５ｍＬ（これらは、濾過しそして４℃で保存した））中のＴ７５組織培養フラスコ中で、約９０％のコンフルエンシーにまで増殖させる。これらの細胞をトリプシン処理し（ＭＤＣＫ細胞については、継代のために、その堅固な粘着性に起因して約２０分間）、そして約３×１０6ＭＤＣＫ細胞／ウェルまたは約３×１０5ＣＡＣＯ−２細胞／ウェルの濃度で、２４．５ｍｍトランスウェル（Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ−ＣＯＬ、＃３２４５、Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｓｔａｒ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）上に播種する。ＭＤＣＫ細胞については、培地を播種後１日で交換し、そしてそのＭＤＣＫ細胞をさらに２日間増殖させる。ＣＡＣＯ−２細胞については、培地を播種後２日毎に交換し、そしてそのＣＡＣＯ−２細胞を合計２１日間まで増殖させる。
【０１０７】
その播種後の日の後に、それらの細胞を、輸送実験のために準備する。細胞に、新鮮な培地を２時間供給し、その後、輸送実験を開始する。次いで、細胞を、輸送培地（ＴＭ：ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）ＧＩＢＣＯ＃１４０２５−０２７（フェノールレッドを含まない）；１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（１Ｍ  ＨＥＰＥＳから）ＧＩＢＣＯ＃１５６３０−０１５（ＮａＯＨでｐＨを７．４に合わせる））で洗浄し、そして新しい６ウェルプレート中に配置する。アッセイのためのペプチドベースの構築物のドナー溶液を、約１００μｇ／ｍＬの濃度で１．５ｍＬ  ＴＭ中に調製する。順方向輸送研究については、これらの１．５ｍＬ構築物溶液を、トランスウェルの上面チャンバに加える。約２．６ｍＬのアクセプター溶液（ＴＭのみ、構築物を含まない）を、側底面チャンバに加える。流出研究については、構築物を含むドナー溶液を、側底面チャンバに加え、そしてアクセプター溶液（ＴＭのみ、構築物を含まない）を、上面チャンバに加える。各構築物を少なくとも３連でアッセイする。
【０１０８】
これらのトランスウェルを、２．５時間、３７℃組織培養インキュベーターに戻す。２．５時間の終了時に、上面溶液および側底面溶液を、１５ｍＬのコニカルチューブ中で、高真空下で別々にフリーズドライ（凍結乾燥）する。次いで、これらのサンプルを、２００μＬ  ＨＰＬＣ緩衝液Ａ（５％  アセトニトリル；９５％  水；０．１％  テトラフルオロ酢酸（ＴＦＡ））中に再懸濁し、そして５０μＬのこの再懸濁サンプルをＨＰＬＣ分析に使用する。
【０１０９】
トリチウム化マンニトール（3Ｈ−マンニトール、１μＣｉ／ｍＬ；Ｄｕｐｏｎｔ  ＮＥＮ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，＃ＮＥＴ−１０１，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）を含む１．５ｍＬ  ＴＭを含む上面コントロールウェルを、トリチウムのカウント／分（ｃｐｍ）について別々に分析し、ＭＤＣＫ細胞単層の完全性を試験する。
【０１１０】
順方向輸送を、上面溶液の開始濃度（約１００μｇ／ｍＬの開始ドナー濃度）に対する、側底面チャンバ中のペプチドベースの構築物（ＨＰＬＣピーク下の面積によって決定する）のパーセンテージとして計算する。流出実験について、その逆の計算（側底面溶液における開始構築物濃度に対する上面チャンバ中のペプチドベースの構築物のパーセンテージ）を行う。このような腸吸収スクリーニングは、潜在的な経口的に利用可能な化合物である構築物を同定する。
【０１１１】
（実施例７）
（インビボ経口吸収スクリーニング）
本実施例は、インビボスクリーニングアッセイにおいて、経口吸収についてのペプチドベースの構築物（誘導体化された構築物を含む）の活性を扱う。このアッセイにおいて、経口栄養法によって構築物をマウスに投与する。
【０１１２】
手短に言うと、構築物の血清濃度を、投与後の種々の時間間隔でＨＰＬＣによって測定する。例えば、構築物を、種々の投薬量（例えば、１０ｍｇ／ｋｇ体重または２０ｍｇ／ｋｇ体重）でマウスに投与し得、そして血清ペプチド濃度を、マウスへの投与後の種々の時間間隔（例えば、１時間、４時間および／または２４時間）で測定する。ＨＰＬＣ分析は、経口投与後に吸収される構築物を同定する。経口利用可能性の増加を示すこのような構築物は、経口投与後に治療的に有効な血清濃度を達成し得る。
【０１１３】
（実施例８）
（経口活性）
本実施例は、インビボ動物モデルにおいて、経口投与時の活性（経口活性）についてのペプチドベースの構築物（誘導体化された構築物を含む）の活性を扱う。
【０１１４】
経口活性を試験するために有用な動物モデルとしては、上記実施例４および５において記載されたモデルが挙げられる。処置を、０．５％デキストロース、または種々の投薬量レベル（例えば、投薬レジメンに従う、１０ｍｇ／ｋｇまたは２０ｍｇ／ｋｇ）の、０．５％デキストロース中の試験ペプチドベース構築物のいずれかの経口栄養法（約４００μｌ）によって開始する。効力についてのモニタリングを、毎日行う。経口活性なペプチドベースの構築物で処置した動物は、デキストロース処置したコントロールと比較して改善を示す。
【０１１５】
（実施例９）
（網膜新生血管形成モデル）
本実施例は、網膜新生血管形成モデルにおけるペプチドベースの構築物（誘導体化された構築物を含む）が投与される場合のそれらの効果についての、それらのインビボ活性を扱う。
【０１１６】
これらの実験において、ペプチドベースの構築物を、網膜色素上皮細胞（ＲＰＥ）、網膜微小血管周囲細胞および網膜内皮細胞のインビトロ増殖および移動に対するＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＩＧＦ−１および馴化培地（低酸素および高血糖）の作用に対する、それらの活性について試験する。効果を、低酸素条件下または高血糖条件下での遺伝子発現に対して評価する。さらなる実験において、このような構築物の効果を、新生児マウスの網膜における低酸素に対する血管新生応答に対してインビボで特徴付ける。
【０１１７】
インビトロ培養実験のために、ウシ網膜由来の網膜微小血管周囲細胞、網膜内皮細胞および網膜色素上皮細胞（ＲＰＥ）を、培養する。ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦおよびＩＧＦ−１によって刺激された場合の増殖および移動に対する、用量応答および時間経過を取る。例えば、ＶＥＧＦによって刺激された場合の網膜内皮細胞増殖は、ＤＮＡ含量（ｎｇ／細胞ウェル）によって測定したときに、５μｇ／ｍＬおよび１５μｇ／ｍＬのＸＭＰ．６７９で阻害された。ＸＭＰ．６７０処理したＶＥＧＦ刺激細胞におけるＤＮＡ含量によって測定したときの細胞増殖は、ＶＥＨＦによって刺激されていない細胞の細胞増殖に匹敵した。さらに、低酸素条件または高血糖条件に曝した培養ＲＰＥ、周囲細胞および内皮細胞から収集した馴化培地を、無血清培地中に収集する。これらの増殖因子および馴化培地の用量応答を決定する場合、個々での、および上記増殖因子との組合せでのペプチドベースの構築物の効果を、増殖および移動アッセイにおいて試験する。
【０１１８】
インビボ実験のために、網膜新生血管形成に対するペプチドベースの構築物の効果を評価するための研究を行う。新生児マウスを、１００％  Ｏ2に長期間曝し、そして取り出す。この増加した酸素供与は、網膜血管構造の発達を遅延させ、その結果、新生児マウスを大気中に戻すときに、網膜は重篤な低酸素状態になり、そしてＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＩＧＦ−１などを含む多くのサイトカインの放出が生じる。網膜新生血管形成は、１００％の動物で生じる。網膜新生血管形成の重篤度を、網膜切片中の内部境界膜に対して内部にある内皮細胞核を計数することによって定量する。ＶＥＧＦおよびＫＤＲの発現を、インサイチュハイブリダイゼーション、ノーザンおよびウエスタンブロット分析によって評価する。網膜全体のチロシンリン酸化パターンもまた、ウエスタンブロット分析によって評価する。網膜新生血管形成を阻害するかまたは減少させるペプチドベースの構築物を同定する。
【０１１９】
（実施例１０）
（ヘパリンの結合および中和）
本実施例は、ペプチドベースの構築物（誘導体化された構築物を含む）のヘパリン結合活性およびヘパリン中和活性を扱う。
【０１２０】
ＣｈｒｏｍｏｓｔｒａｔｅTMアッセイを使用して、ＡＴＩＩＩ／ヘパリン複合体による第Ｘａ因子中和に対する、ペプチドベースの構築物（誘導体化された構築物を含む）の効果および（ポジティブコントロールとしての）硫酸プロタミンの効果を決定した。このアッセイは、ＣｈｒｏｍｏｓｔｒａｔｅTMヘパリン抗第Ｘａ因子アッセイキット（Ｏｒｇａｎｏｎ  Ｔｅｋｎｉｋａ  Ｃｏｒｐ．，Ｄｕｒｈａｍ，Ｎ．Ｃ．）を使用して行った。ヘパリン濃度を変化させ、それによってヘパリン標準曲線を作成した。このアッセイは、インビトロでの抗Ｘａ活性に対するヘパリンの増強効果を測定した。ヘパリンを含む溶液を、過剰の第Ｘａ因子と共にＡＴＩＩＩの存在下でインキュベートし、ＡＴＩＩＩ−ヘパリン−Ｘａ複合体を形成させる。残存するＸａは、その色素生産性基質からのｐ−ニトロアニリン（ｐＮＡ）の放出を触媒する。このｐ−ニトロアニリンの放出は、４０５ｎｍで測定される。吸光度は、サンプル中のヘパリンの濃度に対して逆に比例して得られた。
【０１２１】
このアッセイのための試薬は、以下のように調製する。ヘパリン、ペプチドベースの構築物および硫酸プロタミンのストックは、生理食塩水中に作製する。ストック溶液は、約１ｍｇ／ｍＬ＝１μｇ／μＬである。第Ｘａ因子試薬および基質試薬は、２．０ｍＬの精製水を用いて再構成する。アンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴＩＩＩ）試薬は、１．０ｍＬの精製水を用いて再構成する。このアッセイを、９６ウェルマイクロタイタープレートにおいて行う。アッセイ成分を、以下のように、このマイクロタイターウェルに添加する：１２．５μｌのヘパリン（０〜１０Ｕ／ｍＬ）、２５μｌの構築物または硫酸プロタミン、１２．５μＬのＡＴＩＩＩ（０．５  ＰＥＵ／ｍＬ）、２５μＬのウシ第Ｘａ因子（１４ｎＫａｔ／ｍＬ）、２５μＬの基質（３μモル／ｍＬ）。反応を２０分間進行させ、次いで、２５μＬの０．１Ｍ酢酸を添加する。この着色反応を、４０５ｎｍでマイクロプレートリーダーで定量する。ヘパリンを中和する構築物は、４０５ｎｍでの吸光度における増加を示す。プロタミンをポジティブコントロールとして使用し、その活性を１００％と定める。各ペプチド構築物についてのパーセント（％）ヘパリン中和を、プロタミンによる中和（１００％）に対して計算し、そして表ＩＶに示す。
【０１２２】
【表４】
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【０１２３】
（実施例１１）
（さらなる活性のアッセイ）
本実施例は、ＢＰＩタンパク質産物の活性についての当該分野で公知の種々のアッセイにおいて、ペプチドベースの構築物（誘導体化された構築物を含む）の活性についてのそれらの試験に取り組む。
【０１２４】
ＢＰＩタンパク質産物（ＢＰＩ由来ペプチドを含む）の種々の生物学的活性を試験するために有用なアッセイは、共有に係る米国特許第５，７３３，８７２号；同第５，７６３，５６７号；同第５，６５２，３３２号および同第５，８５６，４３８号ならびに対応ＰＣＴ公開番号ＷＯ９４／２０５３２（ＰＣＴ／ＵＳ／０２４６５）およびＷＯ９５／１９３７２（ＰＣＴ／ＵＳ９４／１０４２７）、および米国特許第５，８５８，９７４号および対応ＰＣＴ公開番号ＷＯ９６／０８５０９（ＰＣＴ／ＵＳ９５／０９２６２）およびＷＯ９７／０４００８（ＰＣＴ／ＵＳ９６／０３８４５）（これらは、本明細書中に参考として援用される）に記載される。これらの活性としては、抗微生物（抗細菌および抗真菌を含む）、ＬＰＳ結合、ＬＰＳ中和、ならびにヘパリン結合およびヘパリン中和のさらなるアッセイが挙げられる。表Ｉに示されるペプチドベースの構築物（誘導体化された構築物を含む）を、Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｊ５および０１１１Ｂ４）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓおよびＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓに対するそれらの抗微生物効果について、ブロスアッセイおよび／または放射状拡散アッセイにおいて試験し（例えば、米国特許第５，８５８，９７４号の実施例２（Ｃａｎｄｉｄａ細胞を用いるブロスアッセイについて、ブロス中に２×１０6細胞／ｍＬに代って５×１０3細胞／ｍＬに希釈したことを除く）ならびに米国特許第５，６５２，３３２号の実施例２および１３（細菌トリプシンソイブロスでのブロスアッセイを、Ｍｕｅｌｌｅｒ  Ｈｉｎｔｏｎの代わりに使用したことを除く）に実質的に従って）、各構築物は、１以上の細菌株および／またはＣａｎｄｉｄａに対する抗微生物活性を示した。試験した最も高い抗微生物活性を有する非誘導体化構築物としては、ＸＭＰ．６２７、ＸＭＰ．６２８、ＸＭＰ．６２９、ＸＭＰ．６５６、ＸＭＰ．６７９、ＸＭＰ．７６０、ＸＭＰ．７６４、ＸＭＰ．７７６およびＸＭＰ．７７８が挙げられた。試験したとき最も高い活性を有する誘導体化構築物としては、ＸＭＰ．６６４およびＸＭＰ．７６７が挙げられた。
【０１２５】
ＬＰＳ中和の他のアッセイにおいて、本発明の例示的な構築物（例えば、ＸＭＰ．６２４、ＸＭＰ．６２５、ＸＭＰ．６２６、、ＸＭＰ．６２８およびＸＭＰ．６２９）は、ＲＡＷ細胞アッセイ（例えば、米国特許第５，８５８，９７４号の実施例７、および米国特許第５，６５３，３３２号の実施例２０Ｄに実質的に従って；他のＬＰＳアッセイとしては、米国特許第５，６５２３３２号の実施例４、２０Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｅ、ＦおよびＧ、２５ならびに２６が挙げられる）において活性を示した。
【０１２６】
インビトロおよびインビボの両方のさらなるヘパリン結合アッセイおよびヘパリン中和アッセイ（例えば、米国特許第５，６５２，３３２号の実施例６、１１、１７および２１が挙げられる）は、ＢＰＩタンパク質産物について記載されており、そして本発明のペプチドベースの構築物を試験するために有用である。
【０１２７】
他のペプチドベースの構築物は、米国特許出願番号０９／３４４，５４１および同時に出願された一部継続出願米国特許出願番号＿［「Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ」、代理人整理番号１１０４５ＵＳ０２（１００−２５７．Ｐ１）］および同時に出願された対応ＰＣＴ出願番号＿に記載され、そしてそれらの全体が参考として本明細書によって援用される。本明細書中に引用される全ての米国特許、米国特許出願、国際ＰＣＴ公開および参考文献は、それらの全体が参考として本明細書によって援用される。上記の本発明の多くの改変および変更は、当業者によって想到されるものと予想される。従って、添付の特許請求の範囲において明らかなような限定のみが、本発明に対して付与されるべきである。
【配列表】
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