(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
重鎖可変領域がg)〜i)のCDRを有し、かつ軽鎖可変領域がj)〜l)のCDRを有し、
GM1ガングリオシド結合型アミロイドβタンパク質を認識し、アミロイド繊維の形成を抑制する活性を有し、IgG、Fab、Fab'、F(ab')２、scFv、又はdsFv抗体である遺伝子工学的に調製された抗体、
g)配列番号：１に記載されるアミノ酸配列からなるCDR1、
h)配列番号：２に記載されるアミノ酸配列からなるCDR2、
i)配列番号：３に記載されるアミノ酸配列からなるCDR3、
j)配列番号：４に記載されるアミノ酸配列からなるCDR1、
k)配列番号：５に記載されるアミノ酸配列からなるCDR2、
l)配列番号：６に記載されるアミノ酸配列からなるCDR3。
【請求項２】
重鎖可変領域が配列番号：７に記載されるアミノ酸配列からなり、
軽鎖可変領域が配列番号：８に記載されるアミノ酸配列からなる、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
ヒト化抗体である、請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
請求項２に記載される抗体の重鎖可変領域をコードするDNA。
【請求項５】
配列番号：９の塩基配列からなる、請求項４に記載のDNA。
【請求項６】
請求項４又は５に記載のDNAを含む、抗体重鎖をコードするDNA。
【請求項７】
請求項２に記載される抗体の軽鎖可変領域をコードするDNA。
【請求項８】
配列番号：１０の塩基配列からなる、請求項７に記載のDNA。
【請求項９】
請求項７又は８に記載のDNAを含む、抗体軽鎖をコードするDNA。
【請求項１０】
請求項４〜９のいずれかに記載のDNAを発現可能に含有するベクター。
【請求項１１】
請求項４〜６のいずれかに記載のDNA、及び請求項７〜９のいずれかに記載のDNAを発現可能に含有するベクター。
【請求項１２】
請求項１０又は１１に記載のベクターで形質転換された形質転換体。
【請求項１３】
請求項４〜６のいずれかに記載のDNAを発現可能に含有するベクター、及び請求項７〜９のいずれかに記載のDNAを発現可能に含有するベクターで共形質転換された形質転換体。
【請求項１４】
請求項１２又は１３に記載の形質転換体を培養する工程、及び発現された抗体を回収する工程を含む、抗体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、抗体及びそれをコードする遺伝子に関する。詳しくは、アルツハイマー病に関連する抗体及びそれをコードする遺伝子に関する。
背景技術
現在、日本はかつて無いスピードで人口の高齢化が進展しており、それと共に痴呆症患者の数も増えつつある。国立社会保障・人口問題研究所の調査によれば、痴呆症患者数は西暦２０００年には１６５万人、２０１５年には２６４万人に及ぶと見積もられている。これら痴呆性疾患の患者の介護は経済的にも大きな負担となることから、一日も早い有効な治療法の開発が望まれている。
老人性痴呆症のうち、主要なものはアルツハイマー病（ＡＤ）であり、本疾患の病態生理の全体像は依然不明であるが、研究は急速に進展している。アルツハイマー病患者に共通してみられる特徴としては（１）脳の萎縮（２）老人斑と呼ばれる斑状の蓄積物の形成を認めること（３）神経細胞内に繊維状の物質が蓄積した神経原繊維変化、の３つがあり、この３つを認める場合にアルツハイマー病と診断される。しかし、（１）の脳の萎縮を除き老人斑の形成や神経原繊維の変化は外部からの観察によっては知ることができず、このことがアルツハイマー病の診断を困難なものにしている。従って、分子遺伝学的マーカーや生化学的マーカーなど、十分な特異性と感度を持った、アルツハイマー病の診断のための生物学的マーカーの開発が望まれている。
アルツハイマー病の臨床症状である痴呆と密接に結びついているのが神経細胞の脱落であるが、神経細胞の脱落がどの様な理由で起こるかについて、上記の病理変化が重要な手がかりを与える。１９９０年代後半からの研究の進展により、老人斑がアミロイドβタンパク（Ａβ）と呼ばれるペプチドが凝集して沈着したものであることが明らかになった。一方、神経原繊維変化は神経細胞の骨格タンパク質の一つであるｔａｕタンパク質がリン酸化されて細胞内で凝集しているものであることが明らかにされた。
アルツハイマー病には遺伝的要因によって引き起こされる家族性アルツハイマーと、遺伝的背景を持たない孤発性アルツハイマーが知られており、家族性アルツハイマーの原因遺伝子や危険因子が明らかにされつつある。家族性アルツハイマーの原因遺伝子の一つにアミロイド前駆体タンパク質（Ａｍｙｌｏｉｄ  Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ；ＡＰＰ）をコードする遺伝子があり、この遺伝子に突然変異があると必ずアルツハイマー病を引き起こすことが知られている。従って、これら変異体の作用、機能を見出せればアルツハイマー病の発症機構が明らかになると考えられる。家族性アルツハイマーと孤発性アルツハイマーとの間には共通の機構が存在すると予測されるため、家族性アルツハイマー病の発症機構の研究から孤発性アルツハイマーの場合にも適用できる機構が浮かび上がってくると考えられる。
ＡβはＡＰＰからβ及びγセクレターゼによって切り出されるが、Ａβには切断点の違いによりＡβ４０とＡβ４２が存在し、Ａβ４２の方がＡβ４０よりも凝集しやすいこと、また病理学的観察によりＡβ４２が最初に凝集し、このＡβ４２を核としてＡβ４０が凝集して繊維形成が進むという説が提唱されている。最近の本発明者らの研究によれば、ＡＤの脳においてＧＭ１ガングリオシド（ＧＭ１）に結合することによってＡβの沈着が開始するとの知見が得られている（Ｋ．Ｙａｎａｇｉｓａｗａ，Ａ．Ｏｄａｋａ，Ｎ．Ｓｕｚｕｋｉ，Ｙ．Ｉｈａｒａ，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１，１０６２（１９９５）、Ｋ．Ｙａｎａｇｉｓａｗａ，Ｙ．Ｉｈａｒａ，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ａｇｉｎｇ  １９，Ｓ６５（１９９８））。また、本発明者らは、ＧＭ１結合型Ａβを特異的に認識するモノクローナル抗体（４３９６抗体）の作製に成功したことを報告した（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４２０，４３−４６（１９９７））。本発明者らは、ＧＭ１結合型Ａβのユニークな分子特性に基づき、ＡβがＧＭ１への結合によって構造を変化させ、そしてアミロイド繊維形成の種（シード）として働くという仮説を立てた。その後、複数の研究者がｉｎ  ｖｉｔｒｏでの研究を行い、この仮説を支持する結果、即ち、Ａβは膜上においてＧＭ１に特異的に結合すること、ＧＭ１を含有するリポソームの添加によって可溶性のＡβが凝集を開始しアミロイド繊維を形成することが示されている。（Ｊ．ＭｃＬａｕｒｉｎ，Ａ．Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｔｙ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１，２６４８２（１９９６）、Ｐ．Ｃｈｏｏ−Ｓｍｉｔｈ，Ｗ．Ｋ．Ｓｕｒｅｗｉｃｚ，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４０２，９５（１９９７）、Ｐ．Ｃｈｏｏ−Ｓｍｉｔｈ，Ｗ．Ｇａｒｚｏｎ−Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ，Ｃ．Ｇ．Ｇｌｏｂｅ，Ｗ．Ｋ．Ｓｕｔｒｅｗｉｃｚ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２，２２９８７（１９９７）、Ｋ．Ｍａｔｓｕｚａｋｉ，Ｃ．Ｈｏｒｉｋｉｒｉ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３８，４１３７（１９９９）、Ｖ．Ｋｏｐｐａｋａ，Ｐ．Ｈ．Ａｘｅｌｓｅｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３９，１００１１（２０００））。
一方、ＧＭ１とＡβとが複合体を形成する分子メカニズムについて、ＡβのＧＭ１への結合が、結合する膜のコレステロールの濃度に依存していること、即ち、高濃度のコレステロールにより膜上のＧＭ１「クラスター」の形成が促され、これによりＡβとＧＭ１との結合が促進されることが報告されている（Ａ．Ｋａｋｉｏ，Ｓ．Ｎｉｓｈｉｍｏｔｏ，Ｋ．Ｙａｎａｇｉｓａｗａ，Ｙ．Ｋｏｚｕｔｕｍｉ，Ｋ．Ｍａｔｓｕｚａｋｉ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，２７６，２４９８５（２００１））。また、シナプス膜のｅｘｏｆａｃｉａｌ  ｌｅａｆｌｅｔｓにおけるコレステロール濃度は加齢及び／又はアポリポタンパク質Ｅ（Ａｐｏ  Ｅ）の欠乏とともに有意に増加することから（Ｕ．Ｉｇｂａｖｂｏａ，Ｎ．Ａ．Ａｖｄｕｌｏｖ，Ｆ．Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ，Ｗ．Ｇ．Ｗｏｏｄ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．６６，１７１７（１９９６）、Ｕ．Ｉｇｂａｖｂｏａ，Ｎ．Ａ．Ａｖｄｕｌｏｖ，Ｓ．Ｖ．Ｃｈｏｃｈｉｎａ，Ｗ．Ｇ．Ｗｏｏｄ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．６９，１６６１（１９９７））、Ａβは老化脳のシナプス膜においてＧＭ１に結合することが推測された。一方、ＧＭ１及びコレステロールを豊富に含む膜ドメイン（ｒａｆｔｓと呼ばれる）は生理的に多量のＡβを含有し、かつある種の家族性アルツハイマー病モデルマウスにおいて不溶性Ａβを蓄積することから、Ａβはこの膜ドメイン（ｒａｆｔｓ）においてＧＭ１に結合する可能性も推測された（Ｒ．Ｇ．Ｐａｒｔｏｎ，Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．４２，１５５（１９９４）、Ｋ．Ｓｉｍｏｎｓ，Ｅ．Ｉｋｏｎｅｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ３８７，５６９（１９９７）、Ｓ．Ｊ．Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．４，７３０（１９９８）、Ｍ．Ｍｏｒｉｓｈｉｍａ−Ｋａｗａｓｈｉｍａ，Ｙ．Ｉｈａｒａ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３７，１５２７４（１９９８）、Ｎ．Ｓａｗａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５，２７９０１（２０００））。
発明の開示
本発明は以上の背景に鑑みなされたものであり、アルツハイマー病の治療、診断、又は予防に有効な手段を提供することを目的とし、具体的にはアルツハイマー病の治療等に有効な抗体及びこれをコードするＤＮＡ、並びに薬剤のスクリーニング方法、及び薬剤を提供することを目的とする。
まず、本発明者らはＧＭ１結合型Ａβを認識する上記抗体（４３９６抗体）のクラスを同定した。その結果、抗体はＩｇＭクラス、Ｌ鎖はλ鎖であった。次に、Ｈ鎖（重鎖）及びＬ鎖（軽鎖）の可変領域をコードするＤＮＡの配列を決定することを試み、これに成功した。Ｈ鎖及びＬ鎖についてＣＤＲのＤＮＡ配列の同定も併せて行った。続いて、Ｈ鎖可変領域をコードするＤＮＡを合成し、これにマウスＩｇＧ２ａ定常領域をコードするＤＮＡをライゲーションした後、発現ベクターに組み込みＨ鎖発現ベクターを作製した。同様に、Ｌ鎖をコードするＤＮＡを組込んだベクター（Ｌ鎖発現ベクター）を作製した。これらのベクターをＣＨＯ細胞にトランスフェクトして得られた形質転換体の中で抗体産生能の高いものを選択し、その培養上清を回収、精製することにより、４３９６抗体の可変領域を有するＩｇＧ型抗体（以下、「４３９６Ｃ抗体」ともいう）を得ることに成功した。
一方、４３９６Ｃ抗体の免疫学的特性を検討するとともに、当該抗体を用いてＧＭ１によるアミロイド繊維形成開始の基礎にある分子機構を解明することを試みた。まず、ＧＭ１ガングリオシド（以下、略して「ＧＭ１」とも言う）、コレステロール、及びスフィンゴミエリンを含有させた、ｒａｆｔｓと類似する脂質組成のリポソームを作製した。このリポソームを用い、４３９６Ｃ抗体がリポソーム中のＧＭ１と結合したアミロイドβタンパク質（以下、略して「Ａβ」とも言う）を認識するか否かを検討したところ特異的な結合が認められた。そこで、上記リポソームの存在下におけるアミロイド繊維の形成が４３９６Ｃ抗体によって阻害されるか検討したところ、特異的かつ添加量依存的な阻害効果が認められた。他方、公知の他の抗Ａβ抗体を用いて同様の実験を行ったところアミロイド繊維の形成の阻害はみられなかった。また、この他の抗Ａβ抗体は新たに形成されたアミロイド繊維の端に結合することが示された。これらの結果は上記のシーディング仮説を支持するものであり、即ちＧＭ１結合型Ａβ（以下、略して「ＧＭ１−Ａβ」ともいう）はアミロイド繊維形成における種（シード）として機能していることを示すものであった。また、公知の抗Ａβ抗体とは異なり、４３９６Ｃ抗体はこのシードに対して特異的な結合をすることから、４３９６Ｃ抗体における可変領域の構造（即ち、４３９６抗体の可変領域の構造）、特にＣＤＲの構造がアルツハイマー病の診断、治療等に利用できることが見出された。かかる知見から、４３９６Ｃ抗体の可変領域の構造、特にＣＤＲの構造を有するヒト化抗体を作製すれば、極めて有効なアルツハイマー症の診断、治療等が可能になると考えられた。
本発明は以上の知見に基づき完成されたものであり、本発明の第１の局面は次の構成からなる。
［１］  重鎖可変領域がａ）〜ｃ）の少なくとも一つの領域を有し、
ＧＭ１ガングリオシド結合型アミロイドβタンパク質を認識し、アミロイド繊維の形成を抑制する活性を有する抗体、
ａ）配列番号：１に記載されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列の一部を改変したアミノ酸配列からなる第１領域、
ｂ）配列番号：２に記載されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列の一部を改変したアミノ酸配列からなる第２領域、
ｃ）配列番号：３に記載されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列の一部を改変したアミノ酸配列からなる第３領域。
［２］  軽鎖可変領域がｄ）〜ｅ）の少なくとも一つの領域を有し、
ＧＭ１ガングリオシド結合型アミロイドβタンパク質を認識し、アミロイド繊維の形成を抑制する活性を有する抗体、
ｄ）配列番号：４に記載されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列の一部を改変したアミノ酸配列からなる第４領域、
ｅ）配列番号：５に記載されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列の一部を改変したアミノ酸配列からなる第５領域、
ｆ）配列番号：６に記載されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列の一部を改変したアミノ酸配列からなる第６領域。
［３］  重鎖可変領域がｇ）〜ｉ）のＣＤＲを有し、かつ軽鎖可変領域がｊ）〜ｌ）のＣＤＲを有し、
ＧＭ１ガングリオシド結合型アミロイドβタンパク質を認識し、アミロイド繊維の形成を抑制する活性を有する抗体、
ｇ）配列番号：１に記載されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列の一部を改変したアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、
ｈ）配列番号：２に記載されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列の一部を改変したアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、
ｉ）配列番号：３に記載されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列の一部を改変したアミノ酸配列からなるＣＤＲ３、
ｊ）配列番号：４に記載されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列の一部を改変したアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、
ｋ）配列番号：５に記載されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列の一部を改変したアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、
ｌ）配列番号：６に記載されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列の一部を改変したアミノ酸配列からなるＣＤＲ３。
［４］  重鎖可変領域が配列番号：７に記載されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列の一部を改変したアミノ酸配列からなり、
ＧＭ１ガングリオシド結合型アミロイドβタンパク質を認識し、アミロイド繊維の形成を抑制する活性を有する抗体。
［５］  軽鎖可変領域が配列番号：８に記載されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列の一部を改変したアミノ酸配列からなり、
ＧＭ１ガングリオシド結合型アミロイドβタンパク質を認識し、アミロイド繊維の形成を抑制する活性を有する抗体。
［６］  重鎖可変領域が配列番号：７に記載されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列の一部を改変したアミノ酸配列からなり、
軽鎖可変領域が配列番号：８に記載されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列の一部を改変したアミノ酸配列からなり、
ＧＭ１ガングリオシド結合型アミロイドβタンパク質を認識し、アミロイド繊維の形成を抑制する活性を有する抗体。
［７］  ヒト化抗体である、［１］〜［６］のいずれかに記載の抗体。
［８］  Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、又はｄｓＦｖ抗体である、［１］〜［７］のいずれかに記載の抗体。
発明を実施するための最良の形態
本明細書において、アミノ酸配列の一部の改変とは、アミノ酸配列を構成する１〜数個のアミノ酸の欠失、置換、若しくは１〜数個のアミノ酸の付加、挿入、又はこれらの組合せによりアミノ酸配列に変化が生ずることをいう。
本発明の第１の局面は、ＧＭ１ガングリオシド（ＧＭ１）結合型アミロイドβタンパク質（Ａβ）（ＧＭ１−Ａβ）を認識し、アミロイド繊維の形成を抑制する活性を有する抗体に関する。
本発明における抗体には、マウス、ラットなどの非ヒト動物の抗体、一部の領域を他の動物（ヒトを含む）のものに置換したキメラ抗体、ヒト化抗体、及びヒト抗体が含まれる。また、抗体のクラスも特に限定されないが、好ましくはＩｇＧクラスの抗体である。例えば、ヒト抗体のサブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４に属する抗体である。
可変領域には、マウス抗ＧＭ１−Ａβ抗体の可変領域を用いることができる。マウス抗ＧＭ１−Ａβ抗体としては、例えばアルツハイマー病患者の脳から精製されたＧＭ１−Ａβを抗原としてマウスを免疫して得られたマウス抗ＧＭ１−Ａβ抗体（例えば、論文（Ｋ．Ｙａｎａｇｉｓａｗａ，Ｊ．ＭｃＬａｕｒｉｎ，Ｍ．Ｍｉｃｈｉｋａｗａ，Ａ．Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｔｙ，Ｙ．Ｉｈａｒａ，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，４２０，４３，（１９９７））に記載される４３９６抗体）を用いることができる。
重鎖可変領域については、配列番号：１に記載されるアミノ酸配列からなる第１領域、配列番号：２に記載されるアミノ酸配列からなる第２領域、又は配列番号：３に記載されるアミノ酸配列からなる第３領域のいずれか一つ以上の領域を含むことが好ましい。ここでの第１領域、第２領域、及び第３領域は、それぞれ４３９６抗体の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３に相当する。より好ましくは、重鎖可変領域が第１領域〜第３領域の全てを含んで構成される。さらに好ましくは、重鎖可変領域が第１領域をＣＤＲ１、第２領域をＣＤＲ２、第３領域をＣＤＲ３として含んで構成される。
軽鎖可変領域については、配列番号：４に記載されるアミノ酸配列からなる第４領域、配列番号：５に記載されるアミノ酸配列からなる第５領域、又は配列番号：６に記載されるアミノ酸配列からなる第６領域のいずれか一つ以上の領域を含むことが好ましい。ここでの第４領域、第５領域、及び第６領域は、それぞれ４３９６抗体の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３に相当する。より好ましくは、軽鎖可変領域が第４領域〜第６領域の全てを含んで構成される。さらに好ましくは、重鎖可変領域が第４領域をＣＤＲ１、第５領域をＣＤＲ２、第６領域をＣＤＲ３として含んで構成される。
上記第１領域〜第６領域のアミノ酸配列に代えて、各アミノ酸配列の一部を改変したアミノ酸配列をそれぞれ用いることもできる。但し、アミノ酸配列の改変は、本発明の抗体がＧＭ１−Ａβを認識し、アミロイド繊維の形成を抑制する活性を有する範囲に限られる。当該活性を有する限りアミノ酸配列の改変により当該活性が上昇、又は減少してもよい。改変されるアミノ酸の数は、好ましくは全体の３０％以下であり、更に好ましくは全体の２０％以下であり、更に更に好ましくは全体の１０％以下である。
好ましい本発明の抗体の一例として、以下の構成のものを挙げることができる。重鎖可変領域が、ｇ）配列番号：１に記載されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列の一部を改変したアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ｈ）配列番号：２に記載されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列の一部を改変したアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びｉ）配列番号：３に記載されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列の一部を改変したアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を有し、
軽鎖可変領域が、ｊ）配列番号：４に記載されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列の一部を改変したアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、ｋ）配列番号：５に記載されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列の一部を改変したアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及びｌ）配列番号：６に記載されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列の一部を改変したアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を有する抗体である。当該抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列としては、それぞれ配列番号：７及び配列番号：８に記載されるものを例示することができる。この場合において、シグナル部分を除いて構成されるアミノ酸配列を用いることもできる。尚、配列番号：７及び配列番号：８のアミノ酸配列は、それぞれ４３９６抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列に相当する。
本発明の抗体にはヒト化抗体が含まれる。ここでのヒト化抗体とは、ヒトの抗体に構造が類似した抗体のことをいい、抗体の定常領域のみをヒト抗体のものに置換したヒト型キメラ抗体、及び定常領域及び可変領域に存在するＣＤＲ（相補性決定領域）以外の部分をヒト抗体のものに置換したヒト型ＣＤＲ移植（ＣＤＲ−ｇｒａｆｔｅｄ）抗体（Ｐ．Ｔ．Ｊｏｈｏｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１，５２２（１９８６））を含む。
ヒト型キメラ抗体は、例えば上記の重鎖可変領域の構造及び／又は軽鎖可変領域の構造を有する抗体（例えば、４３９６抗体を遺伝子工学的クラススイッチ技術（Ｍ．Ｍ．Ｂｅｎｄｉｎｇ，Ｓ．Ｔ．Ｊｏｎｅｓ，ｉｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｊ．ＭｃＭａｆｆｅｒｔｙ，Ｈ．Ｒ．Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｎ  ａｎｄ  Ｄ．Ｊ．Ｃｈｉｓｗｅｌｌ  Ｅｄｓ．（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９９６），ｐｐ．１４７−１６５）により作製したＩｇＧクラスのマウス抗ＧＭ１−Ａβ抗体（４３９６Ｃ抗体））の定常領域をヒト抗体の定常領域に置換することにより作製することができる。ヒト抗体の定常領域としては公知のものを採用することができる。
以下に、ヒト型キメラ抗体の作製方法の一例を示す。
まず、マウス抗ＧＭ１−Ａβ抗体を産生するハイブリドーマよりｍＲＮＡを抽出し、常法に従ってｃＤＮＡを合成する。合成したｃＤＮＡをベクターに組み込みｃＤＮＡライブラリーを構築する。このｃＤＮＡライブラリーから、Ｈ鎖遺伝子フラグメント及びＬ鎖遺伝子フラグメントをプローブとして用いることにより、Ｈ鎖遺伝子及びＬ鎖遺伝子を含有するベクターを選択する。選択されたベクターの挿入配列のシークエンシングを行うことにより、Ｈ鎖可変領域及びＬ鎖可変領域の遺伝子の配列が決定される。このようにして得られた配列データを基にＨ鎖可変領域をコードするＤＮＡを化学合成、生化学的切断／再結合等により作製する。得られたＨ鎖可変領域をコードするＤＮＡをヒトＨ鎖定常領域をコードするＤＮＡとライゲーションして発現用ベクターに組込むことによりＨ鎖発現ベクターを作製する。発現ベクターとしては、例えばＳＶ４０  ｖｉｒｕｓ  ｂａｓｅｄベクター、ＥＢ  ｖｉｒｕｓ  ｂａｓｅｄベクター、ＢＰＶ（パピローマウイルス）ｂａｓｅｄベクターなどを用いることができるが、これらに限定されるものではない。一方、同様の方法によりＬ鎖発現ベクターを作製する。これらＨ鎖発現ベクター及びＬ鎖発現ベクターにより宿主細胞を共形質転換する。宿主細胞としては、ＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスター卵巣）（Ａ．Ｗｒｉｇｈｔ  ＆  Ｓ．Ｌ．Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０，３３９３−３４０２（１９９８））、ＳＰ２／０細胞（マウスミエローマ）（Ｋ．Ｍｏｔｍａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｐｒｅｖ．５，５１２−５１９（１９９６），Ｒ．Ｐ．Ｊｕｎｇｈａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５０，１４９５−１５０２（１９９０））などが好適に用いられる。また、形質転換にはリポフェクチン法（Ｒ．Ｗ．Ｍａｌｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６，６０７７（１９８９），Ｐ．Ｌ．Ｆｅｌｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４，７４１３（１９８７）、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法（Ｆ．Ｌ．Ｇｒａｈａｍ  ＆  Ａ．Ｊ．ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｅｂ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５２，４５６−４６７（１９７３））、ＤＥＡＥ−Ｄｅｘｔｒａｎ法等が好適に用いられる。
そして、この形質転換体の細胞内又は培養液よりヒト型キメラ抗体が得られる。抗体は、遠心分離、硫安分画、塩析、限外濾過、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィーなどの方法を適宜組み合わせて分離、精製することができる。
一方、ヒト型ＣＤＲ移植抗体は、例えば以下の方法により作製することができる。
まず、上記キメラ抗体の製造方法の欄で述べた方法により、マウス抗ＧＭ１−Ａβ抗体のＨ鎖可変領域及びＬ鎖可変領域のアミノ酸配列及びそれをコードする塩基配列を決定する。併せて各ＣＤＲ領域のアミノ酸配列及び塩基配列を決定する。
具体的なＣＤＲの塩基配列としては、例えば、Ｈ鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３に配列番号：１１、配列番号：１２、及び配列番号：１３に示されるものをそれぞれ用いることができ、Ｌ鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３に配列番号：１４、配列番号：１５、及び配列番号：１６に示されるものをそれぞれ用いることができる。
次に、ＣＤＲ領域を挟んで存在するＦＲ（フレームワーク領域）を選択する。ＦＲの選択には、およそ三つの方法が採用できる。１つめの方法は、ＮＥＷＭ、ＲＥＩなど既に三次元構造の明らかとなったヒト抗体フレームを用いる方法である（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２，３２３−３Ｚ７（１９８８）；Ｔｅｍｐｓｔ，ＰＲ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ７，１５０１−１５０７（１９９４）：Ｅｌｌｉｓ  ＪＨ．ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５５，９２５−９３７（１９９５））。２つめの方法は、データベースにより、目的のマウス抗体可変領域と最も高いホモロジーを持つヒト抗体可変領域を選択し、そのＦＲを用いる方法である（Ｑｕｅｅｎ  Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  ＳｃｉＵＳＡ  ８６，１００２９−１００３３（１９８９）；Ｒｏｚａｋ  ＭＪ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７１，２２６１１−２２６１８（１９９６）；Ｓｈｅａｒｍａｎ  ＣＷ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １４７，４３６６−４３７３（１９９１））。３つめの方法は、ヒト抗体のＦＲで最も共通に用いられるアミノ酸を選択する方法である（Ｓａｔｏ  Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３１，３７１−３８１（１９９４）；Ｋｏｂｉｎｇｅｒ  Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ６，９７１−９８０（１９９３）；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ  ＣＡ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ４，７７３−７８３（１９９１））。本発明ではこれらいずれの方法を用いることもできる。
尚、本発明においては、選択されたヒトＦＲのアミノ酸配列を改変したアミノ酸配列も、最終的に得られるヒト型ＣＤＲ移植抗体がＧＭ１−Ａβを認識し、アミロイド繊維の形成を制御する活性を有する範囲において、ＦＲのアミノ酸配列として利用することができる。特に、選択されたヒトＦＲのアミノ酸の一部をＣＤＲの由来となった抗体のＦＲのアミノ酸に変更した場合、抗体の特性が維持される可能性が高い。改変されるアミノ酸の数は、好ましくはＦＲ全体の３０％以下であり、更に好ましくはＦＲ全体の２０％以下であり、更に更に好ましくはＦＲ全体の１０％以下である。
次に、これらいずれかの方法により選択したＦＲと上記ＣＤＲとを組み合わせることにより、Ｈ鎖可変領域及びＬ鎖可変領域をコードするＤＮＡを設計する。この設計を基にＨ鎖可変領域をコードするＤＮＡとＬ鎖可変領域をコードするＤＮＡを化学合成、生化学的切断／再結合等によりそれぞれ作製する。そして、Ｈ鎖可変領域をコードするＤＮＡをヒト免疫グロブリンＨ鎖定常領域をコードするＤＮＡとともに発現ベクターに組み込みＨ鎖発現ベクターを構築する。同様に、Ｌ鎖可変領域をコードするＤＮＡをヒト免疫グロブリンＬ鎖定常領域をコードするＤＮＡとともに発現ベクターに組み込みＬ鎖発現ベクターを構築する。発現ベクターとしては、例えばＳＶ４０  ｖｉｒｕｓ  ｂａｓｅｄベクター、ＥＢ  ｖｉｒｕｓ  ｂａｓｅｄベクター、ＢＰＶ（パピローマウイルス）ｂａｓｅｄベクターなどを用いることができるが、これらに限定されるものではない。
以上の方法で作製されたＨ鎖発現ベクター及びＬ鎖発現ベクターにより宿主細胞を共形質転換する。宿主細胞としては、ＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスター卵巣）（Ａ．Ｗｒｉｇｈｔ  ＆  Ｓ．Ｌ．Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０，３３９３−３４０２（１９９８））、ＳＰ２／０細胞（マウスミエローマ）（Ｋ．Ｍｏｔｍａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｐｒｅｖ．５，５１２−５１９（１９９６），Ｒ．Ｐ．Ｊｕｎｇｈａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５０，１４９５−１５０２（１９９０））などが好適に用いられる。また、形質転換にはリポフェクチン法（Ｒ．Ｗ．Ｍａｌｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６，６０７７（１９８９），Ｐ．Ｌ．Ｆｅｌｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４，７４１３（１９８７）、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法（Ｆ．Ｌ．Ｇｒａｈａｍ  ＆  Ａ．Ｊ．ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｅｂ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５２，４５６−４６７（１９７３））、ＤＥＡＥ−Ｄｅｘｔｒａｎ法等が好適に用いられる。そして、この形質転換体の細胞内又は培養液よりヒト型ＣＤＲ移植抗体が得られる。抗体は、遠心分離、硫安分画、塩析、限外濾過、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィーなどの方法を適宜組み合わせて分離、精製することができる。
本発明の抗体を基に、又は当該抗体をコードする遺伝子の配列情報を基に抗体断片を作製することができる。抗体断片としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ抗体が挙げられる。
Ｆａｂは、ＩｇＧをシステイン存在下パパイン消化することにより得られる、Ｌ鎖とＨ鎖可変領域、並びにＣＨｌドメイン及びヒンジ部の一部からなるＨ鎖フラグメントとから構成される分子量約５万の断片である。本発明では、上記抗体をパパイン消化することにより得ることができる。また、上記抗体のＨ鎖の一部及びＬ鎖をコードするＤＮＡを適当なベクターに組み込み、当該ベクターを用いて形質転換した形質転換体よりＦａｂを調製することもできる。
Ｆａｂ’は、後述のＦ（ａｂ’）２のＨ鎖間のジスルフィド結合を切断することにより得られる分子量が約５万の断片である。本発明では、上記抗体をペプシン消化し、還元剤を用いてジスルフィド結合を切断することにより得られる。また、Ｆａｂ同様に、Ｆａｂ’をコードするＤＮＡを用いて遺伝子工学的に調製することもできる。
Ｆ（ａｂ’）２は、ＩｇＧをペプシン消化することにより得られる、Ｌ鎖とＨ鎖可変領域、並びにＣＨｌドメイン及びヒンジ部の一部からなるＨ鎖フラグメントとから構成される断片（Ｆａｂ’）がジスルフィド結合で結合した分子量約１０万の断片である。本発明では、上記抗体をペプシン消化することにより得られる。また、Ｆａｂ同様に、Ｆ（ａｂ’）２をコードするＤＮＡを用いて遺伝子工学的に調製することもできる。
ｓｃＦｖは、Ｈ鎖可変領域とＬ鎖可変領域とからなるＦｖを、片方の鎖のＣ末端と他方のＮ末端とを適当なペプチドリンカーで連結し一本鎖化した抗体断片である。ペプチドリンカーとしては、例えば柔軟性の高い（ＧＧＧＧＳ）３などを用いることができる。例えば、上記抗体のＨ鎖可変領域及びＬ鎖可変領域をコードするＤＮＡとペプチドリンカーをコードするＤＮＡを用いてｓｃＦｖ抗体をコードするＤＮＡを構築し、これを適当なベクターに組み込み、当該ベクターを用いて形質転換した形質転換体よりｓｃＦｖを調製することができる。
ｄｓＦｖは、Ｈ鎖可変領域及びＬ鎖可変領域の適切な位置にＣｙｓ残基を導入し、Ｈ鎖可変領域とＬ鎖可変領域とをジスルフィド結合により安定化させたＦｖ断片である。各鎖におけるＣｙｓ残基の導入位置は分子モデリングにより予測される立体構造に基づき決定することができる。本発明では、例えば上記抗体のＨ鎖可変領域及びＬ鎖可変領域のアミノ酸配列から立体構造を予測し、かかる予測に基づき変異を導入したＨ鎖可変領域及びＬ鎖可変領域をそれぞれコードするＤＮＡを構築し、これを適当なベクターに組み込み、そして当該ベクターを用いて形質転換した形質転換体よりｄｓＦｖを調製することができる。
尚、適当なリンカーを用いてｓｃＦｖ抗体、ｄｃＦｖ抗体などを連結させたり、ストレプトアビジンを融合させたりして抗体断片を多量体化することもできる。
本発明の抗体（抗体断片を含む）に低分子化合物、タンパク質、標識物質などを融合又は結合させることにより、融合抗体又は標識化抗体を構成することができる。標識物質としては、１２５Ｉ等の放射性物質、ペルオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミンイソチオシアネート（ＲＩＴＣ）、アルカリホスファターゼ、ビオチンなどを用いることができる。
本発明の第２の局面は、本発明の第１の局面の抗体をコードするＤＮＡに関する。即ち、本発明の第２の局面は、ＧＭ１−Ａβを認識し、アミロイド繊維の形成を抑制する活性を有する抗体のＤＮＡに関し、特に、当該活性を有するヒト型キメラ抗体、ヒト型ＣＤＲ移植抗体をコードするＤＮＡ、及び抗体断片をコードするＤＮＡを含む。また、これらの抗体又は抗体断片のＨ鎖又はＬ鎖をコードするＤＮＡも本発明の一つである。更に、これらの抗体又は抗体断片のＨ鎖可変領域又はＬ鎖可変領域をコードするＤＮＡも本発明の一つである。この場合において、シグナル部分を除いて構成されるＤＮＡであってもよい。具体的なＨ鎖可変領域のＤＮＡ配列としては配列番号：９に示すものが挙げられる。またＬ鎖可変領域のＤＮＡ配列をしては配列番号：１０に示すものが挙げられる。
更には、ＧＭ１−Ａβを認識し、アミロイド繊維の形成を抑制する活性を有する抗体の可変領域ＣＤＲをコードする遺伝子の配列も本発明の一つである。具体的には、配列番号：１に記載されるアミノ酸配列をコードする配列（例えば、配列番号：１１に記載される配列）、配列番号：２に記載されるアミノ酸配列をコードする配列（例えば、配列番号：１２に記載される配列）、配列番号：３に記載されるアミノ酸配列をコードする配列（例えば、配列番号：１３に記載される配列）、配列番号：４に記載されるアミノ酸配列をコードする配列（例えば、配列番号：１４に記載される配列）、配列番号：５に記載されるアミノ酸配列をコードする配列（例えば、配列番号：１５に記載される配列）、又は配列番号：６に記載されるアミノ酸配列をコードする配列（例えば、配列番号：１６に記載される配列）からなるＤＮＡである。以上のＤＮＡは、化学合成、生化学的切断／再結合などにより作製でき、ＧＭ１−Ａβを認識し、アミロイド繊維の形成を抑制する活性を有する抗体、抗体断片の作製等に利用することができる。
本発明のＤＮＡをベクターに組み込み、これを用いて宿主細胞を形質転換することができる。また、本発明のＤＮＡの中で抗体重鎖（又は重鎖可変領域）をコードするＤＮＡを一のベクターに組み込み、他方、抗体軽鎖（又は軽鎖可変領域）をコードするＤＮＡを他のベクターに組み込み、得られた二つの発現ベクターで宿主細胞を共形質転換させることもできる。さらには、本発明のＤＮＡの中で抗体重鎖（又は重鎖可変領域）をコードするＤＮＡ及び抗体軽鎖（又は軽鎖可変領域）をコードするＤＮＡを一のベクターに組み込み、これを用いて宿主細胞を形質転換することもできる。
用いられるベクターの種類は、本発明のＤＮＡを発現可能に組込むことができ、かつ宿主細胞で発現できるものであれば特に限定されない。
宿主細胞としては、使用するベクターにより形質転換されて本発明のＤＮＡを発現できるものであればその種類を問わない。例えば、エッシュリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）等の細菌、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）等の酵母、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等の動物細胞を用いることができる。
形質転換体を培養することにより、形質転換体の細胞内又は培養液中にＧＭ１−Ａβを認識し、アミロイド繊維の形成を抑制する活性を有する抗体又は抗体断片を産生（発現）させることができる。そして産生された抗体（抗体断片を含む）を回収することにより、本発明の第１の局面である抗体を得ることができる。得られた抗体は、遠心分離、硫安分画、塩析、限外濾過、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィーなどの方法を適宜組み合わせて分離、精製することができる。
本発明の抗体が、ＧＭ１−Ａβを認識する活性を有するか否かは、被験対象をＧＭ１−Ａβに接触させ両者の結合性をみることにより確認できる。例えば、ＧＭ１ガングリオシド（ＧＭ１）結合型アミロイドβタンパク質（Ａβ）（ＧＭ１−Ａβ）を含む脂質膜を構成し、これと被験対象との結合性をみる。また、ＧＭ１を含む脂質膜を用意しておき、これにＡβを含む溶液及び被験対象抗体を同時に接触（添加）することにより、被験対象のＧＭ１−Ａβ結合能を調べることもできる。ＧＭ１−Ａβを含む脂質膜は、例えば、ＧＭ１を含む脂質膜にＡβを含む溶液を接触（添加）することにより調製することができる。この場合、ＧＭ１を含む脂質膜とＡβを含む溶液との接触は短時間行われることが好ましく、更に好ましくは両者を瞬間的に接触させる。
ＧＭ１を含む脂質膜としては、ＧＭ１と脂質を成分として含有するものであれば特にその構成は限定されないが、脂質成分としてスフィンゴミエリンを含む脂質膜が好適に用いられる。また、コレステロールをさらに含む脂質膜が好適に用いられる。かかる脂質膜の構成はアミロイド繊維が形成される脳内の神経細胞膜のそれに近く、当該構成の脂質膜を用いることにより生体においてアミロイド繊維の形成を有効に抑制し得る抗体であることの確認が行えることとなる。
ＧＭ１としては、例えば市販のもの（和光純薬工業株式会社、大阪、日本が提供するもの等）を使用することができる。Ａβとしては、例えば、市販のＡβ１−４０（Ｌｏｔ．５０１００１、ペプチド研究所、大阪、日本、Ｌｏｔ．５１９５９９、Ｂａｃｈｅｍ  ＡＧ、スイスなど）などを使用することができる。
ＧＭ１を含む脂質膜はリポソーム状に調製し得る。また、ポリスチレン樹脂、ポリカーボネート樹脂、シリコン樹脂、ナイロン樹脂等の樹脂やガラス等からなるビーズ、マイクロプレート等の不溶性支持体に脂質膜を結合させて使用することもできる。
尚、Ａβの存在下で被験対象とＧＭ１−Ａβの接触を行いアミロイド繊維の形成が抑制されれば、被験対象の抗体がＧＭ１−Ａβに結合し、かつアミロイド繊維の形成を抑制する活性を有することを確認できる。
ＧＭ１−Ａβを含む脂質膜はＧＭ１−Ａβに結合性を有する化合物のスクリーニングにも利用できる。即ち、以下の工程を含むことにより、ＧＭ１−Ａβに結合性を有する化合物のスクリーニング方法を構成できる。
１）ＧＭ１ガングリオシド結合型アミロイドβタンパク質を含む脂質膜に試料を接触させる工程、及び２）前記脂質膜に結合した化合物を回収する工程である。
工程１）においてＧＭ１ガングリオシド結合型アミロイドβタンパク質（ＧＭ１−Ａβ）を含む脂質膜は、リポソーム状又は不溶性支持体（例えばマイクロプレート）に結合された状態で使用される。リポソーム状の脂質膜を用いる場合には、工程２）においてＧＭ１−Ａβに結合した化合物を遠心法で分離し、精製することにより目的の化合物を得ることができる。また、候補化合物が抗体の場合には、ｃａｌｃｅｉｎを内包させたＧＭ１−Ａβ含有のリポソームを工程１）の脂質膜として用い、そして補体の作用を利用することにより、リポソームが破壊されて放出されるｃａｌｃｅｉｎ量を測定して候補化合物のＧＭ１−Ａβ結合活性を測定することができる。一方、不溶性支持体に結合された状態の脂質膜を用いる場合において候補化合物が抗体のときには、ＥＩＡ、ＥＬＩＳＡ等により候補化合物のＧＭ１−Ａβ結合活性を測定することができる。
上記の工程１）に代えて、以下の工程１−１）及び１−２）を行うこともできる。
１−１）ＧＭ１ガングリオシドを含む脂質膜とアミロイドβタンパク質とを接触させ、ＧＭ１ガングリオシド結合型アミロイドβタンパク質を形成する工程、１−２）前記脂質膜に試料を接触させる工程である。
工程１−１）におけるＧＭ１ガングリオシド（ＧＭ１）を含む脂質膜とアミロイドβタンパク質（Ａβ）との接触は、例えば当該脂質膜を分散させた溶液中にＡβを含む溶液を添加することにより行われる。また、固相に固定化した脂質膜（例えば、マイクロプレートに結合した脂質膜）を用い、当該脂質膜にＡβを含む溶液を接触させることによっても行うことができる。
上記の工程１−１）及び１−２）を実質的に同時に行うこともできる。即ち、以下の工程を含むことにより、ＧＭ１−Ａβに結合性を有する化合物のスクリーニング方法を構成できる。
１’）ＧＭ１ガングリオシドを含む脂質膜を含む溶液にアミロイドβタンパク質と試料とを添加する工程である。
以上の工程に加えて、アミロイド繊維の形成が抑制されることを確認する工程（工程３））を行うことにより、スクリーニング方法により選択される化合物がＧＭ１−Ａβに結合性を有し、かつアミロイド繊維の形成を抑制する活性を有することを確認することが可能となる。例えば、回収されたＧＭ１−Ａβ結合活性を有する化合物を、アミロイド繊維が形成される環境下に共存させ、アミロイド繊維形成に対する影響、効果を確認する。また、工程１）又は工程１−２）を行う際、試料とともにＡβを添加し、そしてアミロイド繊維の形成を観察することによっても当該工程３）を行うことができる。
以上のスクリーニング方法により選択された化合物はＧＭ１−Ａβに結合性を有する。従って、ＧＭ１−ＡβにＡβが重合してアミロイド繊維が形成されることを抑制ないし防止することに利用できる。
スクリーニング対象の試料としては、天然又は合成のタンパク質、ペプチド、抗体（本発明の抗体を含む）、細胞抽出液、培養上清などを用いることができる。
本発明の第１の局面における抗体（抗体断片を含む）を利用してＧＭ１−Ａβに結合する活性を有する化合物のスクリーニング方法を構成することができる。即ち、本発明は、以下の工程を含む、ＧＭ１−Ａβに結合する活性を有する化合物のスクリーニング方法も提供する。
ｉ）本発明の第１の局面における抗体又は抗体断片に結合する第１の化合物を選択する工程、及びｉｉ）前記第１の化合物に結合する第２の化合物を選択する工程である。このスクリーニング方法においても、アミロイド繊維の形成が抑制されることを確認する工程を含ませることにより、スクリーニング方法により選択される化合物がＧＭ１−Ａβに結合性を有し、かつアミロイド繊維の形成を抑制する活性を有することを確認することが可能となる。
工程ｉ）では、抗体又は抗体断片と試料との結合性が調べられ、結合性を有する第１の化合物が選択される。ここでの試料には、上述の場合と同様に、天然又は合成のタンパク質、ペプチド、抗体（本発明の抗体を含む）、細胞抽出液、培養上清などを用いることができる。
工程ｉ）において、使用される抗体を固相に固定化しておき、これに試料を接触させることができる。これとは逆に、試料側を固相に固定化しておくこともできる。
使用する抗体を予め標識化しておくことにより選択（検出）の容易化、選択（検出）効率の向上を図ることもできる。標識化には、１２５Ｉ等の放射性物質、ペルオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ等の酵素等を用いることができる。また、使用する抗体を認識する二次抗体を用いて選択（検出）効率の向上を図ることもできる。
本発明の第１の局面における抗体（抗体断片を含む）を、ＧＭ１−Ａβを認識する抗体に結合する化合物のスクリーニング方法に利用することもできる。即ち、以下の工程Ａ）及びＢ）を含む、ＧＭ１−Ａβを認識する抗体に結合する化合物のスクリーニング方法を構成することができる。
Ａ）本発明の抗体に試料を接触させる工程、及び
Ｂ）前記抗体に結合した化合物を回収する工程。
ここでの試料としては、天然又は合成のタンパク質、ペプチド、細胞抽出液、培養上清などが用いられる。
また、以下の工程を含む、ＧＭ１−Ａβを認識する抗体に結合する化合物のスクリーニング方法を構成することもできる。
Ｃ）本発明の抗体の可変領域の立体構造を予測する工程、
Ｄ）前記立体構造に相補的な立体構造を有する化合物を選択する工程。
抗体可変領域の立体構造は、ＮＭＲ（核磁気共鳴）法（Ｗｕｔｈｒｉｃｈ，Ｋ．：ＮＭＲ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８６）、Ｘ線結晶構造解析（Ｂｌｕｎｄｅｌｌ，Ｔ．Ｌ．ａｎｄ  Ｊｏｈｎ，Ｌ．Ｎ．：Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ｐｐ．１−５６５，１９７６、ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ａ．：Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｒｙｓｔａｌｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．１−３７１，１９８２、松島正明ら：蛋白工学研究法，第７章，立体構造解析，廣川書店，東京，１６０−２００，１９９０）等の方法により予測することができる。
工程Ｄ）における候補化合物としては、植物、動物、細菌などから抽出した天然タンパク質、天然ペプチド、天然高分子化合物等の他、合成タンパク質、合成ペプチド、合成高分子化合物、合成低分子化合物等を例示できる。
以上のスクリーニング方法で取得される化合物は抗ＧＭ１−Ａβ抗体に結合する活性を有することから、生体に投与されれば抗ＧＭ１−Ａβ抗体の産生を惹起することができると考えられる。即ち、生体の備える免疫防御機構に作用して抗ＧＭ１−Ａβ抗体を産生させることができ、その結果、この抗体の作用により生体において形成されたＧＭ１−ＡβにＡβが重合してアミロイド繊維が形成されることを抑制することができると考えられる。従って、当該化合物を用いてアルツハイマー病を予防、又は治療することが可能と考えられる。換言すれば、当該化合物を用いることによりアルツハイマー病の予防方法、及び治療方法が提供される。また、当該化合物を有効成分として含有するアルツハイマー病に対する薬剤、即ちワクチン又は治療薬を構成できる。一方、上記のスクリーニング方法等で用いられるＧＭ１−Ａβを含む脂質膜についても抗ＧＭ１−Ａβ抗体に認識されるため、これを生体に投与することにより抗ＧＭ１−Ａβ抗体の産生を惹起する作用を奏することができるものと考えられる。従って、当該脂質膜も同様の目的に使用することが可能といえる。
製剤化する場合には、製剤上許容される他の成分（例えば、生理食塩水、賦形剤、防腐剤、）を含有させることができる。また、種々の形態に製剤化できる。例えば、カプセル剤、シロップ剤、錠剤、顆粒剤などとして調製でき、経口投与、非経口投与（静脈内、動脈内、皮下、筋肉、腹腔内注射など）により適用することができる。
投与量については、症状、患者の年齢、体重などによって異なるが、当業者であれば適宜適当な投与量を選択、設定することが可能である。
一方、本発明の抗体（抗体断片を含む）は、ＧＭ１−Ａβと特異的に結合し、アミロイド繊維の形成を抑制することができるため、アルツハイマー病の診断、予防、治療等に有用である。即ち、本発明の抗体を用いてアルツハイマー病の診断、予防、又は治療を行うことができると考えられる。換言すれば、本発明の抗体を用いることによりアルツハイマー病の診断方法、予防方法、及び治療方法が提供される。また、本発明の抗体を用いてアルツハイマー病に対する薬剤（診断薬、予防薬、又は治療薬）を構成できる。ここで、ヒト化した本発明の抗体を用いれば、ヒトに投与した場合であってもヒトタンパク質と認識されるため循環器系から排除されにくく、またアレルギー反応もおこり難いので、好適な診断薬等として用いることができると考えられる。一方、上記のスクリーニング方法で選択されるＧＭ１−Ａβに結合性を有する化合物もアルツハイマー病の診断方法、予防方法、治療方法に用いることができる。また、当該化合物を用いてアルツハイマー病に対する薬剤（診断薬、予防薬、又は治療薬）を構成することもできる。
本発明の薬剤には、製剤上許容される他の成分（例えば、生理食塩水、賦形剤、防腐剤、）を含有させることができる。また、種々の形態に製剤化できる。例えば、カプセル剤、シロップ剤、錠剤、顆粒剤などとして調製でき、経口投与、非経口投与（静脈内、動脈内、皮下、筋肉、腹腔内注射など）により適用することができる。尚、本発明の抗体を複数組み合わせて薬剤を構成してもよい。
投与量については、症状、患者の年齢、体重などによって異なるが、当業者であれば適宜適当な投与量を選択、設定することが可能である。
［実施例１］  ＩｇＧ型抗体の作製
１−１）可変領域の遺伝子配列の決定
先の論文（Ｋ．Ｙａｎａｇｉｓａｗａ，Ｊ．ＭｃＬａｕｒｉｎ，Ｍ．Ｍｉｃｈｉｋａｗａ，Ａ．Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｔｙ，Ｙ．Ｉｈａｒａ，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，４２０，４３（１９９７））に記載される抗体（４３９６抗体）を産生するハイブリドーマ（以下、「Ａβ１−４２Ｃ」という）の可変領域の遺伝子配列を以下の手順で決定した。尚、Ａβ１−４２Ｃは、脳から精製したＧＭ１−Ａβを免疫源として作製されたハイブリドーマであり、４３９６抗体はＧＭ１−Ａβを特異的に認識するＩｇＭクラスの抗体である。
まず、「ＺＡＰｃＤＮＡキット」（ストラタジーン社）を用いてＡβ１−４２ＣのｃＤＮＡライブラリーを作製した。作製方法はキット中のプロトコールに従った。Ａβ１−４２ＣをＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳで培養し、約３×１０７個の細胞よりポリＡ＋ＲＮＡを調製した。そのポリＡ＋ＲＮＡ  ５μｇより第１鎖ｃＤＮＡを合成した後、第２鎖ｃＤＮＡを合成し、次にリンカー（ＥｃｏＲＩ、ＸｈｏＩサイトをもつ）をライゲーションし、そのｃＤＮＡをキット中の「Ｕｎｉ−ＺＡＰ  ＸＲベクター」のＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩサイトに組み込んだ。次に「ＺＡＰｃＤＮＡ  Ｇｉｇａｐａｃｋ  ＩＩＩ  Ｇｏｌｄ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ」（ストラタジーン社）を用いてベクターをＶＣＭＧ１３ファージにパッケージングした。
そのファージを「ＺＡＰｃＤＮＡ  Ｇｉｇａｐａｃｋ  ＩＩＩ  Ｇｏｌｄ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ」中の大腸菌／ＸＬ−Ｉ  ｂｌｕｅに感染させ、培地上でプラークを形成させた後、以下のようにしてプラークハイブリダイゼーションを行った。プローブは、予めＰＣＲで増殖させたμ鎖遺伝子（Ｈ鎖定常領域）フラグメントとλ鎖遺伝子（Ｌ鎖定常領域）フラグメントを用いた。
プラークを形成させたＮＺＹ培地上に「Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋メンブレン」（アマシャム社）をのせ、プラークをメンブレンに転写させた後、メンブレンを１．５Ｍ  ＮａＣｌ／０．５Ｍ  ＮａＯＨで２分、次に１．５Ｍ  ＮａＣｌ／０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で５分、０．２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）／２×ＳＳＣで３０秒処理し風乾させ「ＥＣＬ  ｄｉｒｅｃｔ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍｓ」（アマシャム社）を用いてＤＮＡプローブをラベルし、そのラベルプローブとメンブレンを４２℃、４時間インキュベートした後、洗浄し、発色基質に浸した。次にそのメンブレンを「Ｈｙｐｅｒ−ｆｉｌｍ  ＥＣＬ」（アマシャム社）に密着させ５分感光した。そのフィルムをもとに培地よりポジティブプラークを単離した。ポジティブファージを選択した後、「Ｕｎｉ−ＺＡＰ  ＸＲベクタークローニングキット」（ストラタジーン社）を用いて、ポジティブファージを該キットに添付の大腸菌／ＳＯＬＲ株に感染させ、ファージ中の「Ｕｎｉ−ＺＡＰ  ＸＲ  ＤＮＡ」から、ファージミドを切り出させた。その大腸菌／ＳＯＬＲ株からファージミドＤＮＡをアルカリＳＤＳ法により精製した。そして、これらファージミドＤＮＡ中のインサートの配列をジデオキシ法により決定した。
その結果、これらのＤＮＡは、それぞれμ鎖遺伝子（Ｈ鎖定常領域）とλ鎖遺伝子（Ｌ鎖定常領域）を含んでいた。そして、各ＤＮＡよりＨ鎖可変領域（ＶＨ）及びＬ鎖可変領域（ＶＬ）の遺伝子配列及びアミノ酸配列が図１及び図２に示されるように決定された。図１及び図２において、ＣＤＲは相補性決定部位（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）を表す。尚、Ｈ鎖可変領域のアミノ酸配列を配列番号：７（１位から１９位までの配列はシグナル配列をコードする）に、該配列をコードする塩基配列を配列番号：９（１位から５７位までの配列はシグナル配列をコードする）に、Ｌ鎖可変領域のアミノ酸配列を配列番号：８（１位から１９位までの配列はシグナル配列をコードする）に、該配列をコードする塩基配列を配列番号：１０（１位から５７位までの配列はシグナル配列をコードする）に示す。また、Ｈ鎖可変領域のＣＤＲ１のアミノ酸配列を配列番号：１に、該配列をコードする塩基配列を配列番号：１１に、ＣＤＲ２のアミノ酸配列を配列番号：２に、該配列をコードする塩基配列を配列番号：１２に、ＣＤＲ３のアミノ酸配列を配列番号：３に、該配列をコードする塩基配列を配列番号：１３に示す。同様に、Ｌ鎖可変領域のＣＤＲ１のアミノ酸配列を配列番号：４に、該配列をコードする塩基配列を配列番号：１４に、ＣＤＲ２のアミノ酸配列を配列番号：５に、該配列をコードする塩基配列を配列番号：１５に、ＣＤＲ３のアミノ酸配列を配列番号：６に、該配列をコードする塩基配列を配列番号：１６に示す
１−２）Ｈ鎖発現ベクター及びＬ鎖発現ベクターの作製
４３９６抗体由来の上記Ｈ鎖可変領域ＤＮＡをマウスＩｇＧ２ａ抗体Ｈ鎖定常領域ＤＮＡとライゲーションし、発現ベクター「ＢＣＭＧＳ  Ｎｅｏベクター」（烏山一「ウシパピローマウイルスベクター」，村松正実および岡山博人編，実験医学別冊遺伝子工学ハンドブック，羊土社，ｐｐ．２９７−２９９（１９９１））（ＸｈｏＩ及びＮｏｔＩで切断）に組み込みＨ鎖発現ベクター（ＢＣＭＧＳｎｅｏ−Ｈ）を構築した（図３（Ａ））。同様に、４３９６抗体由来の上記Ｌ鎖可変領域ＤＮＡをマウスＩｇＧ２ａ抗体Ｌ鎖定常領域ＤＮＡとライゲーションし、発現ベクター「ＢＣＭＧＳ  Ｎｅｏベクター」（ＸｈｏＩ及びＮｏｔＩで切断）に組み込みＬ鎖発現ベクター（ＢＣＭＧＳｎｅｏ−Ｌ）を構築した（図３（Ｂ））。
１−３）トランスフェクション
Ｈ鎖発現ベクター及びＬ鎖発現ベクターをＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞にリポフェクチン法を用いて同時にトランスフェクションし、３７℃で１２時間培養した後９６穴プレートに移植し、Ｇ−４１８  ５００μｇ／ｍｌを含むＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳで選択した。
培養液中のＩｇＧ量は以下のようにして測定した。抗マウスγ鎖（株式会社医学生物学研究所：ｃｏｄｅ  ３０３Ｇ）を１０μｇ／ｍｌにＰＢＳで希釈調製し、ポリスチレン製マイクロプレートに１００μｌ／ウェルずつ分注し、４℃で一晩感作させた。次に、５％ＢＳＡ／５％ショ糖／ＰＢＳを用いて４℃で一晩ブロッキングした。１００μｌのサンプルを３７℃で１時間反応させた後、ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄した。洗浄後、４０００倍希釈したペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ（株式会社医学生物学研究所：ｃｏｄｅ  ３３０）を３７℃で１時間反応させ、ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄後、酵素基質液を１００μｌ分注して室温で１５分反応させた。そして、各ウェルに２Ｎ硫酸を１００μｌずつ分注し、Ａ４９２を測定した。コントロールには、マウス血清（ＩｇＧ量：２００ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、２ｎｇ／ｍｌ、０．２ｎｇ／ｍｌ）を用いた。このようにして、最も発現量の多いクローンを選択し、その培養上清を回収した。回収された培養上清より、ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａアガロースカラムを用いて抗体を精製した。その結果得られた抗体を４３９６Ｃ抗体とした。
［実施例２］  ４３９６Ｃ抗体のＧＭ１−Ａβに対する結合性の検討
ＧＭ１によるアミロイド繊維形成開始の分子機構を解明するために、ＧＭ１を含有するリポソームを用いて動力学的及び形態学的解析を行った。
２−１）Ａβ溶液の調製
合成Ａβ１−４０（Ｌｏｔ．５０１００１、ペプチド研究所、大阪、日本）を最初に０．００２％のアンモニア溶液に約５００μＭとなるように溶解し、１００，０００ｒｐｍで３時間遠心した（ＴＬＡ１２０．０ローター、Ｏｐｔｉｍａ  ＴＬ、ベックマン、カルフォルニア州、米国）。上清の上３分の２を集め、Ａβの濃度を決定した。Ａβ溶液は小分けして使用時まで−８０℃に保存した。使用直前に溶解し、生理的トリス緩衝液（ＴＢＳ：１５０ｍＭ  ＮａＣｌ及び１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４）で適切な濃度に希釈した。
２−２）ＧＭ１含有リポソームの調製
コレステロールとスフィンゴミエリン（シグマ−アルドリッチ、セントルイス、ミズーリー州、米国）及びＧＭ１（和光純薬工業株式会社、大阪、日本）をクロロホルム／メタノール混液（１：１）に２：２：１の割合で１モル濃度に溶解した。この混液を窒素ガスで１時間乾燥し、−４０℃で使用時まで保存した。使用直前に乾燥した脂質混合物をＧＭ１濃度が２．５ｍＭになるようにＴＢＳに再懸濁し、液体窒素を用いて１０回凍結溶解を行った。この脂質懸濁液を１３，０００ｒｐｍで１５分間遠心し（ＭＸ−１６０、ＴＯＭＹ、東京、日本）、沈渣を再度ＧＭ１が同濃度になるようＴＢＳに再懸濁した。最後にこの懸濁液を氷上で５分間マイクロチップ（ＴＰ−０３０、ＴＯＭＹ、東京、日本）を備えた超音波破砕機（ＵＤ−２０１、出力レベル２、ＴＯＭＹ、東京、日本）を用いて超音波処理し、これを３回繰り返した。
２−３）線維形成の核としての繊維状Ａβ（ｆＡβ）の調製
合成されたＡβ１−４０（Ｂａｃｈｅｍ  ＡＧ，スイス、Ｌｏｔ．５１９５９９）を４℃で約５００μＭのアンモニア溶液に短時間ポルテックスすることにより溶解し、インキュベーションバッファー（５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．５；１００ｍＭ  ＮａＣｌ）で５０μＭに希釈した。３７℃で２４時間インキュベートした後、混合液を１．６×１０４ｇ、４℃で３時間遠心した。エッペンドルフチューブ内で、沈渣を０．００５％ＮａＮ３を含む氷冷したインキュベーションバッファーに再懸濁し、マイクロチップ（ＴＰ−０３０、ＴＯＭＹ、東京、日本）を備えた超音波破砕機（ＵＤ−２０１、ＴＯＭＹ、東京、日本）を用いて氷上で超音波処理し、使用時まで４℃で保存した。
２−４）ＴｈＴ（チオフラビンＴ）アッセイ
分光蛍光光度計（ＲＦ−５３００ＰＣ、株式会社島津製作所、京都、日本）を用い、文献（Ｈ．Ｎａｉｋｉ，Ｆ．Ｇｅｊｙｏ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．３０９，３０５（１９９９））に記載される方法に従ってＴｈＴアッセイを行った。まず、２−１）で調製されたＡβ溶液と、２−２）で調製されたＡβ濃度５０μＭのリポソーム（ＧＭ１：Ａβ＝１０：１）又は２−３）で調製された１０μｇ／ｍｌのｆＡβをＰＣＲチューブ（ＥＬＴ−０．５  Ｒｙｏｃｏｕ）中に入れ、Ｄｒｙ  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｕｎｉｔ  Ｉｎｃｕｂａｔｏｒ（ＤＴＵ−ｌＢ、タイテック、越谷、日本）を用いて３７℃でインキュベートした。測定直前に各チューブから５μｌのインキュベーション混液を取り、５μＭのＴｈＴを含む５０ｍＭグリシン−ＮａＯＨバッファー（ｐＨ８．５）９９５μｌに混合した後、アミロイド繊維の至適蛍光（励起波長４５０ｎｍ、蛍光波長４９０ｎｍ）を測定した。測定結果をグラフにまとめたものを図４に示す。図４Ａにおいて、■はＡβ溶液とリポソームとをインキュベーションした場合の蛍光、△はＡβ溶液とｆＡβとをインキュベーションした場合の蛍光である。リポソームとともにインキュベーションした場合には、蛍光がラグフェーズなく直ちに増加し、双曲線的に平衡に達するのがわかる。
尚、リポソームもｆＡβも加えずにインキュベーションをした場合（○）には全く蛍光は増加していない。図４Ｂは、Ｆ（∞）−Ｆ（ｔ）対インキュベーション時間（０〜２４時間）の方対数プロットである。Ｆ（ｔ）は、Ａβをリポソームと共にインキュベートした場合の時間の関数としての蛍光の増加を表しており、Ｆ（∞）は試験的に決定した。直線回帰と相関係数を計算した（ｒ＝０．９９７）。Ｆ（ｔ）がＦ’（ｔ）＝Ｂ−ＣＦ（ｔ）の式で表されること、即ち、一次回帰モデル（参考文献１８参照）に従うことがわかる。このように、リポソームの存在下における繊維形成が一次回帰モデルで進行することが示された。
図４Ｃは、「Ａβを加えて２４時間インキュベートした混液（上段）及びリポソームを加えて９６時間インキュベートした混液（下段）を電子顕微鏡撮影した結果である。これらの結果から、リポソームの存在下において典型的なアミロイド繊維が形成されることがわかる。尚、図４Ｃにおいて横棒は１００ｎｍを表す。
以上の結果より、まず可溶性のＡβが膜状ですばやくＧＭ１に結合し、これによりＧＭ１−Ａβ複合体（ＧＭ１−Ａβ）の形成がなされ、続いてＧＭ１−Ａβがｈｅｒｅｔｏｌｏｇｏｕｓなｓｅｅｄとなり、これに可溶性Ａβが結合すること、及び連続的に伸長する繊維の末端に可溶性Ａβが結合することによりアミロイド繊維の形成が進むことが強く示唆された。
［実施例３］  ４３９６Ｃ抗体のアミロイド繊維形成阻害能の検証
３−１）４３９６Ｃ抗体の結合能の検討
実施例１で調製した４３９６Ｃ抗体がリポソーム中においてＧＭ１と結合したＡβ（ＧＭ１−Ａβ）を特異的に認識するか否かを検討した。まず、実施例２で調製したＧＭ１含有リポソーム又はＧＭ１を欠いたリポソーム（比較対照）を実施例２で調製したＡβ溶液とインキュベーションした。インキュベーション混液は、炭素コートしたｏｒｍｖａｒｎｉｃｋｅｌ  ｇｒｉｄに載せるまで氷上で保存した。１％ウシ血清アルブミンで１２℃、５分間インキュベートすることにより非特異結合をブロッキングした。次に、各ｇｒｉｄを４３９６Ｃ抗体又は４Ｇ８抗体（Ａβを認識する公知の抗体：Ｋ．Ｓ．Ｋｉｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｉｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２，１２１（１９８８））で終濃度２０μｇ／ｍｌ、１２℃、４５分間の条件において処理した。その後、２０分の１に希釈した５ｎｍの金標識抗マウスＩｇＧ（Ｂｒｉｔｉｓｈ  ＢｉｏＣｅｌｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｔｄ．）で１２℃、６０分間処理した。そして、２％の酢酸ウラニウムでネガティブ染色を行った。
図５Ａは、染色像を電子顕微鏡撮影した結果である。左欄はＧＭ１含有リポソーム（ＣＨ：コレステロール、ＳＭ：スフィンゴミエリン、ＧＭ１：ＧＭ１ガングリオシド）とＡβ溶液をインキュベーションしたサンプルを４３９６Ｃ抗体で染色した結果、中央はＧＭ１含有リポソームとＡβ溶液をインキュベーションしたサンプルを４Ｇ８抗体で染色した結果、右欄はＧＭ１を欠くリポソーム（ＣＨ：コレステロール、ＳＭ：スフィンゴミエリン）とＡβ溶液をインキュベーションしたサンプルを４３９６Ｃ抗体で染色した結果である。ＧＭ１含有リポソームは４３９６Ｃ抗体で標識されるが（左欄）、４Ｇ８では標識されない（中央）ことがわかる。また、４３９６Ｃ抗体はＧＭ１を欠いたリポソームを認識しないことがわかる（右欄）。尚、横棒は５０ｎｍを表す。以上の結果より、４３９６Ｃ抗体はリポソーム中に形成されたＧＭ１−Ａβを特異的に認識することが示された。また、良く知られた抗Ａβ抗体の一つである４Ｇ８抗体はＧＭ１−Ａβを認識できないことが示された。
次に、４３９６Ｃ抗体と、ＧＭ１又は可溶性のＡβとの反応性をウエスターンブロットにより検討した。実施例２で調製したＡβ溶液をニトロセルロース膜上にブロット（１ｎｇ）したものを４３９６Ｃ抗体又は４Ｇ８抗体とインキュベーションし、その後上記と同様に標識化することによりＡβと各抗体との反応性を調べた。同様に、ＧＭ１（和光純薬工業株式会社、大阪、日本）に対する４３９６Ｃ抗体の反応性を調べた。比較対照として、４３９６Ｃ抗体の代わりにＰＯＤ標識コレラトキシンサブユニットＢ（ＣＴＸ）（シグマ）をインキュベーションした。図５Ｂにインキュベーション後のメンブレンの状態を示す。４３９６Ｃ抗体は可溶性のＡβともＧＭ１とも全く反応しないことがわかる。
続いて、４３９６Ｃ抗体と凝集性Ａβとの反応性を検討した。アルツハイマー病患者の大脳皮質切片を４％のホルムアルデヒドで固定、パラフィン包埋した後、蟻酸で前処理した。その後、４３９６Ｃ抗体又は４Ｇ８抗体で免疫標識した。図５Ｃに示されるように、４Ｇ８抗体を用いた場合（右欄）は神経斑点が強く免疫染色されたが、４３９６Ｃ抗体を用いた場合（左欄）では全く染色されなかった。尚、矢印は一連の切片の脈管を示す。
以上の一連の結果より、可溶性Ａβから凝集性Ａβへの過渡的な形態であるＡβの中間体はＡβがＧＭ１へ結合することにより生ずることが示されるとともに、４３９６Ｃ抗体は、公知の他の抗Ａβ抗体とは異なり、可溶性のＡβでも凝集性のＡβでもなくＧＭ１に結合した状態のＡβ、即ちＧＭ１−Ａβを特異的に認識するものであることが明らかとなった。
［実施例４］
ＧＭ１含有リポソームの存在下におけるアミロイド繊維の形成が、４３９６Ｃ抗体によって阻害されうるかどうかの検討を試みた。
実施例２で調製したＡβ溶液及びＧＭ１含有リポソーム、並びに４３９６Ｃ抗体を同時にインキュベーションし、アミロイド繊維形成を上記のＴｈＴアッセイにより調べた。比較対照として４３９６Ｃ抗体の代わりに４Ｇ８抗体をインキュベーションした。結果を図６Ａに示す。４３９６Ｃ抗体分子のＡβ分子に対する割合は、０．３：５０（△）、１．３：５０（○）、４：５０（□）である。また、Ａβに対する４Ｇ８抗体分子のＡβ分子に対する割合は４：５０（◇）である。■はいずれの抗体も加えずにインキュベーションを行った場合の結果である。図６Ａに示すように、４３９６ＣはＴｈＴの蛍光の増加を投与量依存的に阻害した。反対に、他の抗Ａβ抗体である４Ｇ８は蛍光の増加を全く阻害しなかった。
図６Ｂは、ＧＭ１含有リポソームの添加に続いて、合成したＡβ１−４０と４Ｇ８の混合物を２４時間同時にインキュベートして免疫電顕を行った結果を示す図である。検体をグリッド上に置き、ウシ血清アルブミンでのブロッキングに続いて金標識抗マウスＩｇＧで直接処理した。尚、横棒は１００ｎｍを表す。この結果から、明らかに４Ｇ８抗体は新たに形成されたアミロイド繊維の端に結合することがわかる。
［実施例５］ヒト型キメラ抗体の作製
５−１）ヒトγ鎖定常領域遺伝子、及びヒトλ鎖定常領域遺伝子の単離
ヒトγ鎖定常領域ＤＮＡ、及びヒトλ鎖定常領域ＤＮＡは、ヒトリンパ球ｃＤＮＡライブラリーより各ＤＮＡの一部に相補的なＤＮＡをテンプレートにして取得される。
５−２）キメラＨ鎖ベクター、及びキメラＬ鎖ベクターの作製
まず、ヒトγ鎖定常領域ＤＮＡと実施例１で得られるマウスＨ鎖可変領域ＤＮＡとをライゲーションし、これを発現ベクター「ＢＣＭＧＳ  Ｎｅｏベクター」（烏山一「ウシパピローマウイルスベクター」，村松正実および岡山博人編，実験医学別冊遺伝子工学ハンドブック，羊土社，ｐｐ．２９７−２９９（１９９１）に組み込みキメラＨ鎖ベクターを作製する。同様に、ヒトλ定常領域ＤＮＡと実施例１で得られるマウスＬ鎖可変領域ＤＮＡとをライゲーションし、これをＢＣＭＧＳ  Ｎｅｏベクターに組み込み、キメラＬ鎖ベクターを作製する。
５−３）トランスフェクション
２種類のベクター（キメラＨ鎖ベクター、キメラＬ鎖ベクター）をＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞にリポフェクチン法を用いて同時にトランスフェクションし、３７℃で所定時間培養した後、９６穴プレートに移植し、ネオマイシン５００μｇ／ｍｌを含むＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳで選択する。
培養液中のＩｇＧ量は以下のようにして測定する。抗ヒトγ鎖（株式会社医学生物学研究所：ｃｏｄｅ  １０３ＡＧ）を１０μｇ／ｍｌにＰＢＳで希釈調製し、ポリスチレン製マイクロプレートに１００μｌ／ウェルずつ分注し、４℃で一晩感作させる。次に、５％ＢＳＡ／５％ショ糖／ＰＢＳを用いて４℃で一晩ブロッキングする。１００μｌのサンプルを３７℃で１時間反応させた後、ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄する。洗浄後、４０００倍希釈したペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ（株式会社医学生物学研究所：ｃｏｄｅ２０８）を３７℃で１時間反応させ、ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄後、酵素基質液を１００μｌ分注して室温で１５分反応させる。そして、各ウェルに２Ｎ硫酸を１００μｌずつ分注し、Ａ４９２を測定する。コントロールには、ヒト血清（ＩｇＧ量：２００ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、２ｎｇ／ｍｌ、０．２ｎｇ／ｍｌ）を用いる。このようにして、最も発現量の多いクローンを選択し、その培養上清を回収する。回収された培養上清より、ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａアガロースカラムを用いて抗体を精製する。
［実施例６］ヒト型ＣＤＲ移植抗体の作製
６−１）ヒト型ＣＤＲ移植抗体の設計
Ｈ鎖及びＬ鎖について、公知のデータベース（例えば、Ｆａｓｔａ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｓｅａｒｃｈ）より４３９６Ｃ抗体のＨ鎖及びＬ鎖とホモロジーの高い配列をそれぞれ選択する。そして、これらの配列のＦＲと４３９６Ｃ抗体のＣＤＲを備える配列を設計する。
６−２）ヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターの作製
６−１）で設計されたＨ鎖可変領域ＤＮＡ及びＬ鎖可変領域ＤＮＡは次のように作製することができる。
最初に、合成ＤＮＡを図７に示すように８本作製した。これら合成ＤＮＡは可変領域の約４００ｂｐをカバーし、且つそれぞれ約２０ｂｐずつオーバーラップするように作製されている。これら合成ＤＮＡ  １０ｐｍｏｌ／１０μｌを１００℃で５分処理した後、急冷し、合成ＤＮＡの１と２、３と４、５と６、７と８をそれぞれ混ぜ、ヒートブロックで６５℃、３０分加熱したのち、１２時間放置し、ゆっくりとアニールさせる。次に、２０ｍＭ  ｄＮＴＰを１μｌ、シーケナーゼ（アマシャム社）１μｌ、５×シーケナーゼバッファー１０μｌを加え、滅菌水で最終的に５０μｌとし、３７℃、１時間インキュベートする。このＤＮＡフラグメント（１−２、３−４、５−６、７−８）を２％アガロースで泳動し、切り出し、３０μｌの滅菌水に溶解する。次に、切り出したＤＮＡフラグメント１−２と３−４、５−６と７−８、それぞれ２μｌに、Ｐｆｕポリメラーゼ１μｌ、ＤＭＳＯ５μｌ、１０×Ｐｆｕバッファー９μｌを加え、滅菌水を加え９０μｌとしたのち、ＰＣＲを９４℃１分、５５℃１分、７２℃２分の条件で６サイクル行う。次に、１０×バッファー１μｌ、２０μＭプライマー（ａとｂ、またはｃとｄ）をそれぞれ５μｌ加え、ＰＣＲをさらに９４℃１分、５５℃１分、７２℃２分で２５サイクル行う。増幅されたＤＮＡフラグメント（１−２−３−４と５−６−７−８）を切り出し、３０μｌの滅菌水に溶解し、それぞれのＤＮＡ２μｌを用いてＰＣＲを前述の条件で６サイクル行い、プライマーｅ、ｆを加えてさらにＰＣＲを前述の条件で２５サイクル行う。得られたＤＮＡフラグメントを切り出し、ｐＴ７ｂｌｕｅＴベクターにクローニングし、配列を確認する。
次に、実施例５と同様に、発現ベクターである「ＢＣＭＧＳ  Ｎｅｏベクター」と、ＰＣＲにて制限酵素サイトを付けた合成Ｈ鎖可変領域ＤＮＡと、ヒトγ鎖ＤＮＡとをライゲーションし、ＣＤＲＨ鎖ベクターを作製する。同様に、合成Ｌ鎖可変領域ＤＮＡとヒトλ鎖ＤＮＡとが組込まれたＣＤＲＬ鎖ベクターを作製する。
６−３）トランスフェクション
ＣＤＲＨ鎖ベクター及びＣＤＲＬ鎖ベクターをＣＨＯ細胞にリポフェクチン法を用いて同時にトランスフェクションし、３７℃、１２時間培養した後、９６穴プレートにまき直し、ネオマイシン５００μｇ／ｍｌを含むＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳで選択する。その後、ＥＬＩＳＡにて最も発現量の多いクローンを選択する。培養上清を回収し、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａアガロースカラムを用いて抗体を精製する。
この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
産業上の利用の可能性
本発明により、これまでに知られているアミロイドβタンパク質に対する抗体とは異なり、可溶性のアミロイドβタンパク質ではなく  ＧＭ１ガングリオシド結合型アミロイドβタンパク質を認識し、アミロイド繊維の形成を抑制する活性を有する抗体の情報（アミノ酸配列、ＤＮＡ配列）が提供される。また、当該活性を有する抗体（抗体断片を含む）が提供される。特に、ＣＤＲの情報を基にヒト化抗体の作製が可能となる。これらの抗体は、アルツハイマー病の診断、予防、治療に有効な手段となる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、ＧＭ１ガングリオシド結合型アミロイドβタンパク質を認識する抗体のＨ鎖可変領域の遺伝子配列及びアミノ酸配列を示す図である。ＣＤＲは相補性決定部位（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）を表す。また、ｓｉｇｎａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅはシグナル部分の配列である。
図２は、ＧＭ１ガングリオシド結合型アミロイドβタンパク質を認識する抗体のＬ鎖可変領域の遺伝子配列及びアミノ酸配列を示す図である。ＣＤＲは相補性決定部位（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）を表す。また、ｓｉｇｎａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅはシグナル部分の配列である。
図３は、実施例１における発現ベクターの構成を示した図である。図３（Ａ）には、Ｈ鎖発現ベクター（ＢＣＭＧＳｎｅｏ−Ｈ）の構成が示される。図３（Ｂ）には、Ｌ鎖発現ベクター（ＢＣＭＧＳｎｅｏ−Ｌ）の構成が示される。
図４は、実施例２におけるＴｈＴアッセイの測定結果をまとめたグラフである。図４Ａにおいて、■はＡβ溶液とリポソームとをインキュベーションした場合の蛍光、△はＡβ溶液とｆＡβとをインキュベーションした場合の蛍光である。リポソームとともにインキュベーションした場合には、蛍光がラグフェーズなく直ちに増加し、双曲線的に平衡に達するのがわかる。リポソームもｆＡβも加えずにインキュベーションをした場合（○）には全く蛍光は増加していない。図４Ｂは、Ｆ（∞）−Ｆ（ｔ）対インキュベーション時間（０〜２４時間）の方対数プロットである。Ｆ（ｔ）は、Ａβをリポソームと共にインキュベートした場合の時間の関数としての蛍光の増加を表しており、Ｆ（∞）は試験的に決定した。図４Ｃは、ｆＡβを加えて２４時間インキュベートした混液（上段）及びリポソームを加えて９６時間インキュベートした混液（下段）を電子顕微鏡撮影した結果の図である。横棒は１００ｎｍを表す。
図５には実施例３の結果が示される。図５Ａは、染色像を電子顕微鏡撮影した結果の図である。左欄はＧＭ１含有リポソーム（ＣＨ：コレステロール、ＳＭ：スフィンゴミエリン、ＧＭ１：ＧＭ１ガングリオシド）とＡβ溶液をインキュベーションしたサンプルを４３９６Ｃ抗体で染色した結果、中央はＧＭ１含有リポソームとＡβ溶液をインキュベーションしたサンプルを４Ｇ８抗体で染色した結果、右欄はＧＭ１を欠くリポソーム（ＣＨ：コレステロール、ＳＭ：スフィンゴミエリン）とＡβ溶液をインキュベーションしたサンプルを４３９６Ｃ抗体で染色した結果である。ＧＭ１含有リポソームは４３９６Ｃ抗体で標識されるが（左欄）、４Ｇ８では標識されない（中央）ことがわかる。また、４３９６Ｃ抗体はＧＭ１を欠いたリポソームを認識しないことがわかる（右欄）。横棒は５０ｎｍを表す。図５Ｂは、４３９６Ｃ抗体と、ＧＭ１又は可溶性のＡβとの反応性をウエスターンブロットにより検討した結果を示す図である。図５Ｃは、４３９６Ｃ抗体と凝集性Ａβとの反応性を検討した結果を示す図である。アルツハイマー病患者の大脳皮質切片をホルムアルデヒド等で処理した後、４３９６Ｃ抗体又は４Ｇ８抗体で免疫標識した結果の図である。４Ｇ８抗体を用いた場合（右）は神経斑点が強く免疫染色されるが、４３９６Ｃ抗体を用いた場合（左）は全く染色されていないことがわかる。矢印は一連の切片の脈管を示す。
図６Ａには、Ａβ溶液、ＧＭ１含有リポソーム、及び４３９６Ｃ抗体を同時にインキュベーションし、アミロイド繊維形成をＴｈＴアッセイにより調べた結果が示される。４３９６Ｃ抗体分子のＡβ分子に対する割合は、０．３：５０（△）、１．３：５０（○）、４：５０（□）である。また、Ａβに対する４Ｇ８抗体分子のＡβ分子に対する割合は４：５０（◇）である。■はいずれの抗体も加えずにインキュベーションを行った場合の結果である。図６Ｂは、ＧＭ１含有リポソームの添加に続いて、合成したＡβ１−４０と４Ｇ８の混合物を２４時間同時にインキュベートして免疫電顕を行った結果を示す図である。金標識抗マウスＩｇＧで標識化を行っている。横棒は１００ｎｍを表す。
図７は、実施例６におけるヒト型ＣＤＲ移植抗体可変領域ＤＮＡの合成方法を模式的に示した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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