(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｖａｌ８−Ｇｌｕ２２−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ（配列番号５）、Ｇｌｙ８−Ｇｌｕ２２−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ（配列番号９）、Ｖａｌ８−Ｇｌｕ２２−ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２（配列番号３２）、Ｖａｌ８−Ｇｌｕ２２−Ｌｙｓ２３−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ（配列番号４８）、またはＶａｌ８−Ｇｌｕ２２−Ａｌａ２７−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ（配列番号５０）からなる群から選ばれるＧＬＰ−１化合物。
【請求項２】
Ｖａｌ８−Ｇｌｕ２２−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ（配列番号５）であるＧＬＰ−１化合物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
グルカゴン様ペプチド1(GLP-1)は、食物消化に反応して小腸のL-細胞により分泌される37アミノ酸ペプチドである。それはインスリン分泌を刺激(インスリノトロピック作用)することにより、細胞によるグルコース取込みと血清グルコースレベルの低下を生じることがわかっている(例えば、Mojsov、S.、Int.J.Peptide Protein Research、40: 333-343(1992)参照)。しかしながら、GLP-1(1-37)は活性が不充分であり、GLP-1より生物学的にはるかに有力なトランケーテッド(truncated)類似体（GLP化合物と呼ぶ）に注目が集まってきている。例としてGLP-1(7-37)、GLP1(7-36)NH2、Gly8-GLP-1(7-37)OH、およびSer34-GLP-1(7-37)OHが含まれる。そのインスリン分泌刺激能により、GLP化合物は糖尿病、肥満、および関連病状の治療剤として大いに有望である。
【０００２】
GLP-1化合物は少なくとも２つの異なる形で存在し得る。第1の形は生理学的に活性であり、生理学的pH(7.4)で容易に水性溶液に溶解する。これに対し、第2の形はほとんどまたはまったくインスリノトロピック活性がなく、pH7.4で水に実質的に不溶性である。残念なことに、不活性形は水性GLP-1溶液を撹拌するか、疎水性表面に暴露するか、または該溶液が大きな空気／水界面を有するとき容易に生じる。不溶形に変換する傾向は市販量の活性GLP-1化合物の生産をかなり複雑にするが、それはポンプを介する混合操作や連続運転はバルク製造工程における共通操作であり、これら操作は撹拌、空気／水界面、そして／または不溶形を生じる疎水性表面との接触を生じるからである。不活性形への変換は貯蔵時または患者に投与後にも生じることがあり、これら化合物の薬剤としての使用をさらに複雑にする。したがって、現在利用可能なGLP-1化合物より容易には不溶形に変換しない生物学的に活性なGLP-1類似体の必要性が大いにある。
【０００３】
１またはそれ以上の以下の位置: 11、12、16、22、23、24、26、27、30、33、34、35、36または37位が修飾されている多くのGLP-1類似体がGLP-1(7-37)OHに比べて著しく低下した凝集傾向を示すことが現在わかっている。
これらの類似体の多くは既知のGLP-1化合物、例えばGLP-1(7-37)OHおよびVal8-GLP-1(7-37)OHに匹敵し、場合によりそれより大きいGLP-1レセプター活性化を保持する。例えば、Val8-Glu22-GLP(7-37)OHの凝集時間は20倍以上大きく、そのGLP-1レセプター活性化はGLP-1(7-37)OHより約25%大きい。これらの発見に基づく新規GLP-1化合物および新規GLP-1化合物を用いる治療方法を本明細書に開示する。
【０００４】
本発明のある態様は、式I(配列番号1):
His-Xaa8-Glu-Gly-Xaa11-Xaa12-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-
Ser-Tyr-Leu-Glu-Xaa22-Xaa23-Xaa24-Ala-Xaa26-Xaa27-Phe-
Ile-Ala-Xaa31-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-R
式I(配列番号1)
で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである
［式中、Xaa8は、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Ser、またはThrである。
Xaa11は、Asp、Glu、Arg、Thr、Ala、Lys、またはHisである。
Xaa12は、His、Trp、Phe、またはTyrである。
Xaa16は、Leu、Ser、Thr、Trp、His、Phe、Asp、Val、Glu、またはAlaである。
Xaa22は、Gly、Asp、Glu、Gln、Asn、Lys、Arg、Cys、またはシステイン酸である。
Xaa23は、His、Asp、Lys、Glu、またはGlnである。
Xaa24は、Glu、His、Ala、またはLysである。
Xaa26は、Asp、Lys、Glu、またはHisである。
Xaa27は、Ala、Glu、His、Phe、Tyr、Trp、Arg、またはLysである。
Xaa30は、Ala、Glu、Asp、Ser、またはHisである。
Xaa33は、Asp、Arg、Val、Lys、Ala、Gly、またはGluである。
Xaa34は、Glu、Lys、またはAspである。
Xaa35は、Thr、Ser、Lys、Arg、Trp、Tyr、Phe、Asp、Gly、Pro、His、またはGluである。
Xaa36は、Arg、Glu、またはHisである。
Rは、Lys、Arg、Thr、Ser、Glu、Asp、Trp、Tyr、Phe、His、-NH2、Gly、Gly-Pro、またはGly-Pro-NH2であるかまたは欠失している（ただし、該ポリペプチドはGLP-1(7-37)OHまたはGLP-1(7-36)-NH2の配列を有さず、該ポリペプチドはGly8-GLP-1(7-37)OH、Gly8-GLP-1(7-36)NH2、Val8-GLP-1(7-37)OH、Val8-GLP-1(7-36)NH2、Leu8-GLP-1(7-37)OH、Leu8-GLP-1(7-36)NH2、Ile8-GLP-1(7-37)OH、Ile8-GLP-1(7-36)NH2、Ser8-GLP-1(7-37)OH、Ser8-GLP-1(7-36)NH2、Thr8-GLP-1(7-37)OH、またはThr8-GLP-1(7-36)NH2、Ala11-Glp-1(7-37)OH、Ala11-Glp-1(7-36)NH2、Ala16-Glp-1(7-37)OH、Ala16-Glp-1(7-36)NH2、Ala27-Glp-1(7-37)OH、Ala27-Glp-1(7-36)NH2、Glu27-Glp-1(7-37)OH、Glu27-Glp-1(7-36)NH2、Ala33-Glp-1(7-37)OH、またはAla33-Glp-1(7-36)NH2ではない）。］。
【０００５】
本発明の別の態様は、式II(配列番号2):
His-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Xaa12-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-
Ser-Tyr-Leu-Glu-Xaa22-Xaa23-Ala-Ala-Xaa26-Glu-Phe-
Ile-Xaa30-Trp-Leu-Val-Lys-Xaa35-Arg-R
式II (配列番号2)
で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである
［式中、Xaa8は、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Ser、またはThrである。
Xaa12は、His、Trp、Phe、またはTyrである。
Xaa16は、Leu、Ser、Thr、Trp、His、Phe、Asp、Val、Glu、またはAlaである。
Xaa22は、Gly、Asp、Glu、Gln、Asn、Lys、Arg、Cys、またはシステイン酸である。
Xaa23は、His、Asp、Lys、Glu、またはGlnである。
Xaa26は、Asp、Lys、Glu、またはHisである。
Xaa30は、Ala、Glu、Asp、Ser、またはHisである。
Xaa35は、Thr、Ser、Lys、Arg、Trp、Tyr、Phe、Asp、Gly、Pro、His、またはGluである。
Rは、Lys、Arg、Thr、Ser、Glu、Asp、Trp、Tyr、Phe、His、-NH2、Gly、Gly-Pro、またはGly-Pro-NH2であるかまたは欠失している（ただし、該ポリペプチドはGLP-1(7-37)OHまたはGLP-1(7-36)-NH2の配列を有さず、該ポリペプチドはGly8-GLP-1(7-37)OH、Gly8-GLP-1(7-36)NH2、Val8-GLP-1(7-37)OH、Val8-GLP-1(7-36)NH2、Leu8-GLP-1(7-37)OH、Leu8-GLP-1(7-36)NH2、Ile8-GLP-1(7-37)OH、Ile8-GLP-1(7-36)NH2、Ser8-GLP-1(7-37)OH、Ser8-GLP-1(7-36)NH2、Thr8-GLP-1(7-37)OH、Thr8-GLP-1(7-36)NH2、Ala16-GLP(7-37)OH、またはAla16-Glp-1(7-36)NH2ではない）。］。
【０００６】
本発明の別の態様は、式III(配列番号3):
His-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-
Tyr-Leu-Glu-Xaa22-Xaa23-Ala-Ala-Lys-Xaa27-Phe-Ile-
Xaa30-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-R
式III(配列番号3)
で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである
［式中、Xaa8は、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Ser、またはThrである。
Xaa22は、Gly、Asp、Glu、Gln、Asn、Lys、Arg、Cys、またはシステイン酸である。
Xaa23は、His、Asp、Lys、Glu、またはGlnである。
Xaa27は、Ala、Glu、His、Phe、Tyr、Trp、Arg、またはLysである。
Xaa30は、Ala、Glu、Asp、Ser、またはHisである。
Rは、Lys、Arg、Thr、Ser、Glu、Asp、Trp、Tyr、Phe、His、-NH2、Gly、Gly-Pro、またはGly-Pro-NH2であるかまたは欠失している（ただし、該ポリペプチドは、GLP-1(7-37)OHまたはGLP-1(7-36)-NH2の配列を有さず、該ポリペプチドは、Gly8-GLP-1(7-37)OH、Gly8-GLP-1(7-36)NH2、Val8-GLP-1(7-37)OH、Val8-GLP-1(7-36)NH2、Leu8-GLP-1(7-37)OH、Leu8-GLP-1(7-36)NH2、Ile8-GLP-1(7-37)OH、Ile8-GLP-1(7-36)NH2、Ser8-GLP-1(7-37)OH、Ser8-GLP-1(7-36)NH2、Thr8-GLP-1(7-37)OH、Thr8-GLP-1(7-36)NH2、Ala16-Glp-1(7-37)OH、Ala16-Glp-1(7-36)NH2、Glu27-Glp-1(7-37)OH、またはGlu27-Glp-1(7-36)NH2ではない）。］。
【０００７】
本発明の別の態様は、式IV(配列番号4):
Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-
Ser-Tyr-Leu-Glu-Xaa22-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-
Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-R
(配列番号4)
で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである
［式中、Xaa7は、L-ヒスチジン、D-ヒスチジン、デスアミノ-ヒスチジン、2-アミノ-ヒスチジン、β-ヒドロキシ-ヒスチジン、ホモヒスチジン、α-フルオロメチル-ヒスチジンまたはα-メチル-ヒスチジンである。
Xaa8は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリンまたはトレオニンである。好ましくは、Xaa8は、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリンまたはトレオニンである。
Xaa22は、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン、リジン、アルギニン、システイン、またはシステイン酸である。
Rは-NH2またはGly(OH)である。］。
【０００８】
本発明の別の態様は、8位にアラニン以外のアミノ酸と22位にグリシン以外のアミノ酸を有するグルカゴン様ペプチド-1(GLP-1)化合物である。
【０００９】
本発明の別の態様は、GLP-1レセプターの刺激を必要とする対象のGLP-1レセプターを刺激する方法である。該方法は、有効量の本明細書に記載のGLP-1化合物または配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4のアミノ酸配列を有するポリペプチドを対象に投与する工程を含む。
【００１０】
本発明のさらに別の態様は、GLP-1レセプターの刺激を必要とする対象のGLP-1レセプターを刺激するのに用いる本明細書に記載のGLP-1化合物または配列番号1、配列番号2、配列番号3、または配列番号4のアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
【００１１】
本発明のGLP-1化合物はGLP-1レセプター活性化能を保持し、さらに、他のGLP-1化合物に比べて凝集傾向が減少している。結果として、これら化合物の溶液は、不溶性の不活性形への変換を最小限にして撹拌することができる。この利点は製造方法を大いに簡単にする。さらに、患者に投与した後にほとんどまたはまったくin vivoで凝集が起きず、これにより活性が増大し、有害反応の可能性を最小限にするものと予想される。さらに、これらGLP-1化合物はジアミノペプチダーゼIV分解に耐性であり、亜鉛と結合するため、in vivoでの作用時間の延長をもたらすものと考えられる。
【００１２】
図1は、Val8-Glu22-GLP-1(7-37)OH(配列番号5)、Val8-Asp22-GLP-1(7-37)OH(配列番号6)、Val8-Arg22-GLP-1(7-37)OH(配列番号7)、およびVal8-Lys22-GLP-1(7-37)OH(配列番号8)のアミノ酸配列を示す。
【００１３】
図2は、Gly8-Glu22-GLP-1(7-37)OH(配列番号9)、Gly8-Asp22-GLP-1(7-37)OH(配列番号10)、Gly8-Arg22-GLP-1(7-37)OH(配列番号11)、およびGly8-Lys22-GLP-1(7-37)OH(配列番号12)のアミノ酸配列を示す。
【００１４】
図3は、Val8-Glu30-GLP-1(7-37)OH(配列番号13)、Gly8-Glu3-GLP-1(7-37)OH(配列番号14)、Val8-His37-GLP-1(7-37)OH(配列番号15)、およびGly8-His37-GLP-1(7-37)OH(配列番号16)のアミノ酸配列を示す。
【００１５】
図4は、Val8-Glu22-Ala27-GLP-1(7-37)OH(配列番号17)、およびVal8-Lys22-Glu23-GLP1(7-37)OH(配列番号18)のアミノ酸配列を示す。
【００１６】
GLP-1化合物は約25〜約39個の天然のまたは非天然のアミノ酸を有するポリペプチドであり、インスリノトロピック活性を有するようにGLP-1(7-37)OHと十分な相同性を有する。非天然のアミノ酸の例には、α-メチルアミノ酸(例えば、α-メチルアラニン)、D-アミノ酸、ヒスチジン様アミノ酸（例えば、2-アミノ-ヒスチジン、β-ヒドロキシ-ヒスチジン、ホモヒスチジン、α-フルオロメチル-ヒスチジンおよびα-メチル-ヒスチジン)、側鎖中に余分なメチレンを有するアミノ酸(「ホモ」アミノ酸)、および側鎖中のカルボン酸官能基がスルホン酸基(例えば、システイン酸)で置換されているアミノ酸が含まれる。しかしながら、好ましくは本発明のGLP-1化合物は、特記しない限り天然のアミノ酸のみを含む。
【００１７】
典型的には、GLP-1化合物はGLP-1(7-37)OHのアミノ酸配列を有するポリペプチド、GLP-1(7-37)OHの類似体、GLP-1(7-37)OHの断片またはGLP-1(7-37)OH類似体の断片を含む。GLP-1(7-37)OHは、配列番号19:
7His-Ala-Glu-10Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-15Asp-Val-Ser-Ser-
Tyr-20Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-25Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-30Ala-
Trp-Leu-Val-Lys-35Gly-Arg-37Gly
(配列番号19)
で示されるアミノ酸配列を有する。
【００１８】
当該分野の習慣により、GLP-1(7-37)OHのアミノ末端を残基番号７に、またカルボキシ末端を番号37に割り当てている。該ポリペプチド中の他のアミノ酸には配列番号19に示すように連続番号を付す。例えば、12位はフェニルアラニンであり、22位はグリシンである。特定しないときは、C-末端は伝統的カルボキシル形である。
【００１９】
「GLP-1断片」は、GLP-1(7-37)OHまたはGLP-1(7-37)OH類似体のN-末端および／またはC-末端から１またはそれ以上のアミノ酸のトランケーション後に得られたポリペプチドである。GLP-1(7-37)OHを説明するのに用いた名称はGLP-1断片に繰り越す。例えば、GLP-1(9-36)OHはN末端から２アミノ酸およびC末端から１アミノ酸をトランケーションして得られたGLP-1断片を表す。該断片中のアミノ酸はGLP-1(7-37)OHの対応するアミノ酸と同じ番号で示される。例えば、GLP-1(9-36)OHのN-末端グルタミン酸は９位であり、GLP-1(7-37)OHと同様、12位をフェニルアラニンが占め、22位をグリシンが占める。
【００２０】
「GLP-1化合物」は、１またはそれ以上のアミノ酸がGLP-1(7-37)OHまたはその断片のN-末端および／またはC-末端に付加されたポリペプチドも含む。このタイプのGLP-1化合物は、約39個までのアミノ酸を有する。「伸張」GLP-1化合物中のアミノ酸はGLP-1(7-37)OH中の対応するアミノ酸と同じ番号で示される。例えば、GLP-1(7-37)OHのN末端に２個のアミノ酸を付加して得られたGLP-1化合物のN末端アミノ酸は５位であり、GLP-1(7-37)OHのC末端に１個のアミノ酸を付加して得られたGLP-1化合物のC末端アミノ酸は38位である。すなわち、これら「伸張」GLP-1化合物の両方では、GLP-1(7-37)OHと同様に12位をフェニルアラニンが占め、22位をグリシンが占める。伸張GLP-1化合物のアミノ酸1-6は、好ましくはGLP-1(1-37)OHの対応する位置のアミノ酸と同じであるかまたはその保存的置換である。伸張GLP-1化合物のアミノ酸38-45は、好ましくはグルカゴンまたはエクセンジン（exendin)-4の対応する位置のアミノ酸と同じであるかまたはその保存的置換である。
【００２１】
「GLP-1類似体」は、該類似体がインスリノトロピック活性を有するようにGLP-1(7-37)OHまたはGLP-1(7-37)OHの断片と十分な相同性を有する。好ましくは、GLP-1類似体は１、２、３、４、または５個のアミノ酸がGLP-1(7-37)OHまたはGLP-1(7-37)OHの断片の対応する位置のアミノ酸と異なるように修飾されたGLP-1(7-37)OHまたはその断片のアミノ酸配列を有する。本明細書でGLP-1化合物を表すのに用いた名称において、置換アミノ酸とその位置を親構造の前に示す。例えば、Glu22-GLP-1(7-37)OHは、GLP-1(7-37)OHの22位に通常みられるグリシンがグルタミン酸で置換されているGLP-1化合物を表し、Val8-Glu22-GLP-1(7-37)OHは、GLP-1(7-37)OHの8位に通常みられるアラニンおよび22位に通常見られるグリシンがそれぞれバリンおよびグルタミン酸で置換されているGLP-1化合物を表す。
【００２２】
GLP-1化合物のN-末端は一般に置換されていないが、アルキル化またはアシル化されていることもあり得る(好ましくはC1-C20)。-NH2、-NHRまたはNRR'でアミド化されるかまたは-OR"でエステル化されたGLP-1(7-37)OHの場合と同様に該C-末端は置換されていないことがあり得る。RおよびR'は、独立してアルキルまたはアシル基(好ましくはC1-C20)である。R"はアルキル(C1-C20)である。GLP-1(7-36)NH2は、「アミド化GLP化合物」の例である。好ましくは、本発明のGLP-1化合物は-NH2で置換されているかまたは置換されていないC末端を有する。
【００２３】
好ましくは本発明のGLP-1化合物には、GLP-1類似体またはGLP-1類似体の断片（ここで、そのような類似体または断片のバックボーンは8位にアラニン以外のアミノ酸を含む(8位類似体)）が含まれる。該バックボーンは、7位にL-ヒスチジン、D-ヒスチジン、またはヒスチジンの修飾形、例えばデスアミノヒスチジン、2-アミノ-ヒスチジン、β-ヒドロキシ-ヒスチジン、ホモヒスチジン、α-フルオロメチル-ヒスチジン、またはα-メチルヒスチジンを含んでいてもよい。これら8位類似体は天然のGLP-1(7-37)OHの対応するアミノ酸と比べて11、12、16、22、23、24、26、27、30、33、34、35、36、および37位に１またはそれ以上のさらなる変化を含むことが好ましい。これら8位類似体は天然のGLP-1(7-37)OHの対応するアミノ酸と比べて12、16、22、23、26、30、35、および37位に１またはそれ以上のさらなる変化を含むことがより好ましい。これら8位類似体は天然のGLP-1(7-37)OHの対応するアミノ酸と比べて22、23、27、30、および37位に１またはそれ以上のさらなる変化を含むことがさらにより好ましい。
【００２４】
これら類似体は天然のGLP-1(7-37)OHの対応するアミノ酸に比べて6またはそれ以下の変化を有することも好ましい。より好ましい類似体は、天然のGLP-1(7-37)OHの対応するアミノ酸と比べて5またはそれ以下の変化を有するかまたは天然のGLP-1(7-37)OHの対応するアミノ酸と比べて4またはそれ以下の変化を有する。これら類似体は天然のGLP-1(7-37)OHの対応するアミノ酸と比べて3またはそれ以下の変化を有することがさらにより好ましい。これら類似体は天然のGLP-1(7-37)OHの対応するアミノ酸と比べて2またはそれ以下の変化を有することが最も好ましい。
【００２５】
これら置換は、GLP-1化合物の凝集および不溶形発生の傾向を減少させることがわかった。本発明のGLP-1化合物は一般に、例えば、実施例3に記載の凝集アッセイにより評価したときGLP-1(7-37)OHより少なくとも約5倍遅く、好ましくは少なくとも20倍遅く、より好ましくは少なくとも40倍遅く、より好ましくは少なくとも約50倍遅く、さらにより好ましくは約60倍遅く、さらにより好ましくは少なくとも約65倍遅く凝集する。好ましくは、本明細書に記載のGLP-1化合物はGLP-1(7-36)NH2またはGLP-1(7-37)OHの類似体である。
【００２６】
好ましい態様において、本発明のGLP-1化合物の22位のアミノ酸は少なくとも２個の炭素原子と極性または荷電官能基を含む側鎖を有する。メチレンおよびカルボキシル炭素を有するアスパラギン酸が含まれる。より好ましくは、22位のアミノ酸の側鎖は、2〜6個の炭素原子および荷電官能基、例えば、カルボン酸、アミン、グアニジノ基またはスルホン酸基を有する直鎖または分岐鎖アルキル基である。すなわち、22位の好ましいアミノ酸の例には、グルタミン酸、アスパラギン酸、アルギニン、およびリジンが含まれる。22位がアスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニンまたはリジンであるときは、8位は好ましくはグリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン(isolecine）、セリン、トレオニンまたはメチオニン、より好ましくはバリンまたはグリシンである。側鎖にスルホン酸基を有するアミノ酸の例はシステイン酸(-NH-CH(CH2SO3)-CO-、「Cya」と略す)。22位がスルホン酸、例えばシステイン酸であるときは、8位は好ましくはグリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン(isolecine）、セリン、トレオニンまたはメチオニン、より好ましくはバリンまたはグリシンである。
【００２７】
別の好ましい態様において、8位のアミノ酸は好ましくはグリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、またはメチオニン、より好ましくはバリンまたはグリシンであり、30位はグルタミン酸、アスパラギン酸、セリン、またはヒスチジン、より好ましくはグルタミン酸（glutamatic acid）である。
【００２８】
別の好ましい態様において、8位のアミノ酸は、好ましくはグリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、またはメチオニン、より好ましくはバリンまたはグリシンであり、37位は、ヒスチジン、リジン、アルギニン、トレオニン、セリン、グルタミン酸、アスパラギン酸、トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン、より好ましくはヒスチジンである。
【００２９】
別の好ましい態様において、8位のアミノ酸は、好ましくはグリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、またはメチオニン、より好ましくはバリンまたはグリシンであり、22位はグルタミン酸、リジン、アスパラギン酸、またはアルギニン、より好ましくはグルタミン酸またはリジンであり、23位はリジン、アルギニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、およびヒスチジン、より好ましくはリジンまたはグルタミン酸である。
【００３０】
別の好ましい態様において、8位のアミノ酸は好ましくはグリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、またはメチオニン、より好ましくはバリンまたはグリシンであり、22位はグルタミン酸、リジン、アスパラギン酸、またはアルギニン、より好ましくはグルタミン酸またはリジンであり、27位はアラニン、リジン、アルギニン、トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン、またはヒスチジン、より好ましくはアラニンである。
【００３１】
別の好ましい態様において、本発明のGLP-1化合物は、天然のGLP-1(7-37)OHの対応する位置のアミノ酸と異なる8位のアミノ酸および11位、12位、16位、22位、23位、24位、26位、27位、30位、33位、34位、35位、36位、および37位からなる群から選ばれる１、２、または３個のアミノ酸を有する。
別の好ましい態様において、本発明のGLP-1化合物は8位の該アミノ酸に加え、天然のGLP-1(7-37)OHの対応する位置のアミノ酸と異なる11位、12位、16位、22位、23位、24位、26位、27位、30位、33位、34位、35位、36位、および37位からなる群から選ばれる１または２個のアミノ酸を有する。
【００３２】
先に記載のごとく、本発明のGLP-1化合物は、8、11、12、16、22、23、24、26、27、30、33、34、35、36、および37位の該アミノ酸に加え、GLP-1(7-37)またはGLP1(7-37)の断片の対応する位置のアミノ酸と異なるアミノ酸を有し得る。 GLP-1(7-37)OHの対応する位置のアミノ酸と異なるGLP化合物中の8、11、12、16、22、23、24、26、27、30、33、34、35、36、および37位のアミノ酸以外のアミノ酸は、好ましくは保存的置換であり、より好ましくは高度に保存的な置換である。
【００３３】
好ましくは、本発明のGLP-1化合物は8および22位の該アミノ酸に加え、GLP-1(7-37)OHまたはGLP-1(7-37)OH断片の対応する位置のアミノ酸と異なる０、１、２または３個のアミノ酸を有する。ある例では、8および22位のアミノ酸に加え、GLP-1化合物の7、21、および27位の１またはそれ以上のアミノ酸がGLP-1(7-37)OHまたはGLP-1(7-37)OH断片の対応するアミノ酸と異なる。
【００３４】
好ましくは、7、8、および22位のみがGLP-1(7-37)OH(またはその断片)の対応する位置のアミノ酸と異なる。減少した凝集特性を有する他の改良されたGLP-1化合物は、これら化合物の22位のグリシンおよび好ましくは8位のアラニンを本明細書に記載の適切なアミノ酸で置換することにより既知の生物学的に活性なGLP-1化合物から得ることができると予期される。既知の生物学的に活性なGLP-1化合物は、Hoffmannらの米国特許5,977,071、Buckleyらの米国特許5,545,618、AdelhorstらのJ.Biol.Chem. 269:6275(1994)に開示されている（これらの内容は本明細書の一部を構成する）。
【００３５】
「保存的（conservative）置換」とは、あるアミノ酸を同じ正味電子荷電およびほぼ同じサイズと形状を有する別のアミノ酸と置換することである。脂肪族または置換脂肪族アミノ酸側鎖を有するアミノ酸は、その側鎖中の異種原子および炭素総数がわずか約４個だけ異なるときほぼ同じサイズを有する。それらは、その側鎖中の枝の数がわずか１つだけ異なるときほぼ同じ形状を有する。その側鎖中にフェニルまたは置換フェニル基を有するアミノ酸は、ほぼ同じサイズと形状を有すると考えられる。以下に５グループのアミノ酸を示す。GLP-1化合物中のアミノ酸を同じグループの別のアミノ酸で置換すると保存的置換が生じる。
【００３６】
グループI: グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、システイン、およびC1-C4脂肪族またはC1-C4ヒドロキシル置換脂肪族側鎖(直鎖または単(モノ)分枝)を有する非天然のアミノ酸。
【００３７】
グループII: グルタミン酸、アスパラギン酸、およびカルボン酸置換C1-C4脂肪族側鎖(非分枝または１分枝点)を有する非天然のアミノ酸。
【００３８】
グループIII: リジン、オルニチン、アルギニン、およびアミンまたはグアニジノ置換C1-C4脂肪族側鎖(非分枝または１分枝点)を有する非天然のアミノ酸。
【００３９】
グループIV: グルタミン、アスパラギン、およびアミド置換C1-C4脂肪族側鎖(非分枝または１分枝点)を有する非天然のアミノ酸。
【００４０】
グループV: フェニルアラニン、フェニルグリシン、チロシン、およびトリプトファン。
特記しない限り、保存的置換は天然のアミノ酸でなされるのが好ましい。
【００４１】
「高度に保存的な置換」は、あるアミノ酸が側鎖に同じ官能基を有し、ほぼ同じサイズと形状を有する別のアミノ酸で置換されていることである。脂肪族または置換脂肪族アミノ酸側鎖を有するアミノ酸は、その側鎖中の異種原子および炭素総数がわずか２個だけ異なるときほぼ同じサイズを有する。それらは側鎖中に同数の分枝を有するときほぼ同じ形状を有する。高度に保存的な置換の例には、ロイシンに対するバリン、セリンに対するトレオニン、グルタミン酸に対するアスパラギン酸、フェニルアラニンに対するフェニルグリシンが含まれる。高度に保存的でない置換の例には、バリンに対するアラニン、セリンに対するアラニン、およびセリンに対するアスパラギン酸が含まれる。
【００４２】
本発明のGLP-1化合物の１例は配列番号1のアミノ酸配列を有するポリペプチドである。好ましい例において、GLP-1化合物はGLP-1(7-37)OHであるが、ただし、Xaa8はGlyまたはValであり、Xaa22はGluまたはLysであり、Xaa23はGluまたはLysである。別の例において、GLP-1化合物はGLP-1(7-37)OHであるが、ただし、Xaa8はGlyまたはValであり、Xaa30はGluである。さらなる例は、GLP-1(7-37)OH（ただし、Xaa8がGlyまたはValであり、Xaa37がHisである）であるGLP-1化合物である。
【００４３】
本発明のGLP-1化合物の別の例は配列番号4のアミノ酸配列を有するポリペプチドである。好ましい例において、配列番号4中のXaa7はL-ヒスチジン、D-ヒスチジン、デスアミノ-ヒスチジン、2アミノ-ヒスチジン、β-ヒドロキシ-ヒスチジン、ホモヒスチジン、α-フルオロメチル-ヒスチジン、およびα-メチル-ヒスチジンであり、Xaa8はグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、またはトレオニン、好ましくはグリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、またはトレオニンであり、Rは-NH2またはGly(OH)であり、Xaa22はリジン、グルタミン酸、アスパラギン酸またはアルギニンである。より好ましい例において、Xaa7はL-ヒスチジンであり、Xaa8はグリシンまたはバリンであり、Xaa22はリジン、グルタミン酸、アスパラギン酸またはアルギニンであり、RはGly(OH)である。あるいはまた、配列番号4中のXaa7、Xaa8、およびRは前記と同意義であり、Xaa22はスルホン酸基、例えばシステイン酸を含む側鎖を有するアミノ酸である。
【００４４】
本発明のGLP-1化合物の別の例において、22位のアミノ酸が C1-C2アルキル側鎖、C1-C2ヒドロキシル化アルキル側鎖、またはC1-C2チオール化アルキル鎖(例えば、システイン)を有するとき、8位のアミノ酸はD-アミノ酸ではなく、グリシン、セリン、トレオニン、システインまたはβ-アラニンの側鎖を有しない。本発明のGLP-1化合物の好ましい例において、22位のアミノ酸がC1-C4アルキル側鎖、C1-C4ヒドロキシル化アルキル側鎖またはC1-C4チオール化アルキル鎖を有するときは、8位のアミノ酸はD-アミノ酸ではなく、グリシン、セリン、トレオニン、システインまたはβ-アラニンの側鎖を有しない。
【００４５】
本発明のGLP-1化合物の別の実施例において、8位のアミノ酸は、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、セリン、トレオニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン、アスパラギン、グルタミン、フェニルアラニン、チロシン、ヒスチジンまたはトリプトファンであり、22位のアミノ酸は、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン、アスパラギン、グルタミンまたはヒスチジンである。
【００４６】
本発明のGLP-1化合物の特定の例には、Glu22-GLP-1(7-37)OH(配列番号20)、Asp22-GLP-1(7-37)OH(配列番号21)、Arg22-GLP-1(7-37)OH(配列番号22)、Lys22-GLP-1(7-37)OH(配列番号23)、Cya22- GLP-1(7-37)OH(配列番号24)、Val8-Glu22-GLP-1(7-37)OH(配列番号5)、Val8-Asp22-GLP-1(7-37)OH(配列番号6)、Val8-Arg22-GLP-1(7-37)OH(配列番号7)、Val8-Lys22-GLP-1(7-37)OH(配列番号8)、Val8-Cya22-GLP-1(7-37)OH(配列番号25)、Gly8-Glu22-GLP-1(7-37)OH(配列番号9)、Gly8-Asp22-GLP-1(7-37)OH(配列番号10)、Gly8-Arg22-GLP-1(7-37)OH(配列番号11)、Gly8-Lys22-GLP-1(7-37)OH(配列番号12)、Gly8-Cya22-GLP-1(7-37)OH(配列番号26)、Glu22-GLP-1(7-36)NH2(配列番号27)、Asp22-GLP-1(7-36)NH2(配列番号28)、Arg22-GLP-1(7-36)NH2(配列番号29)、Lys22-GLP-1(7-36)NH2(配列番号30)、Cya22-GLP-1(7-36)NH2(配列番号31)、Val8-Glu22-GLP-1(7-36)NH2(配列番号32)、Val8-Asp22-GLP-1(7-36)NH2(配列番号33)、Val8-Arg22-GLP-1(7-36)NH2(配列番号34)、Val8-Lys22-GLP-1(7-36)NH2(配列番号35)、Val8-Cya22-GLP-1(7-36)NH2(配列番号36)、Gly8-Glu22-GLP-1(7-36)NH2(配列番号37)、Gly8-Asp22-GLP-1(7-36)NH2(配列番号38)、Gly8-Arg22-GLP-1(7-36)NH2(配列番号39)、Gly8-Lys22-GLP-1(7-36)NH2(配列番号40)、およびGly8-Cya22-GLP-1(7-36)NH2(配列番号41)、Val8-Lys23-GLP-1(7-37)OH(配列番号42)、Val8-Ala27-GLP-1(7-37)OH(配列番号43)、Val8-Glu30-GLP-1(7-37)OH(配列番号44)、Gly8-Glu30-GLP-1(7-37)OH(配列番号45)、Val8-His35-GLP-1(7-37)OH(配列番号46)、Val8-His37-GLP-1(7-37)OH(配列番号47)、Val8-Glu22-Lys23-GLP-1(7-37)OH(配列番号48)、Val8-Glu22-Glu23-GLP-1(7-37)OH(配列番号49)、Val8-Glu22-Ala27-GLP-1(7-37)OH(配列番号50)、Val8-Gly34-Lys35-GLP-1(7-37)OH(配列番号51)、Val8-His37-GLP-1(7-37)OH(配列番号52)、Gly8-His37-GLP-1(7-37)OH(配列番号53)が含まれる。
【００４７】
本明細書で用いている用語「GLP-1化合物」には、本明細書に記載の化合物の医薬的に許容される塩も含まれる。本発明のGLP-1化合物は、十分な酸性基、十分な塩基性基、または両官能基を有し得るので、多くのあらゆる無機塩基、ならびに無機酸および有機酸と反応して塩を形成する。酸付加塩を形成するのに通常用いる酸は無機酸、例えば塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、リン酸など、および有機酸、例えばp-トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、蓚酸、p-ブロモフェニルスルホン酸、炭酸、琥珀酸、クエン酸、安息香酸、酢酸などである。そのような塩の例には、硫酸塩、ピロ硫酸塩、重硫酸塩、亜硫酸塩、重亜硫酸塩、リン酸塩、リン酸一水素塩、リン酸二水素塩、メタリン酸塩、ピロリン酸塩、クロリド、ブロミド、ヨード、酢酸塩、プロピオン酸塩、デカン酸塩、カプリル酸塩、アクリル酸塩、ギ酸塩、イソ酪酸塩、カプロン酸塩、ヘプタン酸塩、プロピオール酸塩、蓚酸塩、マロン酸塩、琥珀酸塩、スベリン酸塩、セバシン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、ブチン-1,4-ジオエート、ヘキシン-1,6-ジオエート、安息香酸塩、クロロ安息香酸塩、メチル安息香酸塩、ジニトロ安息香酸塩、ヒドロキシ安息香酸塩、メトキシ安息香酸塩、フタル酸塩、スルホン酸塩、キシレンスルホン酸塩、フェニル酢酸塩、フェニルプロピオン酸、フェニル酪酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、γ-ヒドロキシ酪酸塩、グリコール酸塩、酒石酸塩、メタンスルホン酸塩、プロパンスルホン酸塩、ナフタレン-1-スルホン酸塩、ナフタレン-2-スルホン酸塩、マンデレートなどが含まれる。
【００４８】
塩基付加塩には、無機塩基、例えば水酸化アンモニウム、炭酸アンモニウムおよび重炭酸アンモニウム、またはアルカリもしくはアルカリ土類金属水酸化物、カーボネートおよびビカーボネートなどが含まれる。すなわち、本発明の塩を製造するのに有用なそのような塩基には、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、炭酸カリウムなどが含まれる。
【００４９】
GLP-1化合物は、種々の疾患および病状を有する対象を治療するのに用いることができる。GLP-1化合物は、本発明のものを含め「GLP-1レセプター」と呼ばれるレセプターに作用することによりその生物学的効果を発揮すると考えられる（Thorrensの米国特許5,670,360参照)。したがって、GLP-1レセプターの刺激またはGLP-1化合物の投与に好都合に反応する病気および／または病状を有する対象を本発明のGLP-1化合物で治療することができる。これら対象は「GLP-1化合物を用いる治療が必要である」かまたは「GLP-1レセプターの刺激が必要」といわれる。インスリン非依存性糖尿病、インスリン依存性糖尿病、卒中(EfendicのWO 00/16797参照)、心筋梗塞(EfendicのWO 98/08531参照)、肥満(EfendicのWO 98/19698参照）、外科手術後の異化変化(Efendicの米国特許6,006,753参照)、機能的消化不良、および過敏性大腸症候群(EfendicのWO 99/64060参照)を有する対象が含まれる。GLP-1化合物での予防的治療が必要な対象、例えば、インスリン非依存性糖尿病を発現する危険性がある対象(WO 00/07617参照)も含まれる。グルコース耐性障害または絶食時グルコース障害の対象、体重が、対象の身長および体格に対する標準体重より約25%以上重い対象、部分膵切除を受けた対象、１またはそれ以上のインスリン非依存性糖尿病の親を持つ対象、妊娠性糖尿病にかかった対象、および急性または慢性膵炎にかかった対象にはインスリン非依存性糖尿病が発生する危険性がある。
【００５０】
GLP-1化合物の「有効量」は、GLP-1レセプターの刺激が必要な対象に投与したときに許容できない副作用を生じることなく所望の治療および／または予防効果を生じる量である。「所望の治療効果」には１またはそれ以上の以下のものが含まれる: 1) 該病気または病状と関連した症状の軽減、2) 該病気または病状と関連した症状の発現遅延、3)該治療を行わない場合に比べて寿命増加、および4) 該治療を行わない場合に比べてクオリティーオブライフの向上。例えば、糖尿病を治療するためのGLP-1化合物の「有効量」は、治療しない場合より大きな血中グルコース濃度調節をもたらすことにより、網膜症、ニューロパシー、または腎臓病のような糖尿病の合併症の発現の遅延をもたらすであろう量である。糖尿病を予防するためのGLP-1化合物の「有効量」は、治療しない場合より抗低血糖剤、例えばスルホニル尿素、チアゾリジンジオン、インスリンおよび／またはビスグアニジンを用いる治療が必要な血中グルコースレベルの上昇の発現を遅らせるであろう量である。
【００５１】
対象に投与するGLP-1化合物の「有効量」は、病気の種類と重症度、および対象の特性、例えば一般健康状態、年齢、性別、体重、および薬剤に対する耐性にも依存するであろう。当業者は、これらおよび他の因子に応じた適切な用量を決定することができるであろう。典型的には、GLP-1化合物の治療的有効量は、成体で約0.01 mg／日〜約1000 mg／日で変化し得る。好ましくは、該用量は約0.1mg／日〜約100mg／日、より好ましくは約1.0mg/日〜約10mg/日で変化する。
【００５２】
本発明のGLP-1化合物は、例えば、経口的、経鼻投与、吸入、または非経口的に投与することができる。非経口的投与は、例えば筋肉内、静脈内、皮下もしくは腹腔内注射のような全身投与を含み得る。GLP-1化合物は、上記病気を治療するための医薬組成物の部分として医薬的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と共に対象に投与することができる。該医薬組成物は、下記のような溶液剤、または非経口的に投与する場合はGLP-1化合物のサスペンジョン剤または二価の金属カチオンと複合体を形成したGLP-1化合物のサスペンジョン剤であり得る。適切な医薬的担体は、ペプチドまたはペプチド誘導体と相互作用しない不活性成分を含んでよい。Remington's Pharmaceutical Sciences、Mack Publishing Company、Easton、PAに記載のような標準的医薬製剤技術を用いてよい。非経口投与に適した医薬的担体には、例えば無菌水、生理食塩水、静菌生理食塩水(約0.9% mg/mlベンジルアルコール含有生理食塩水)、リン酸緩衝生理食塩水、ハンクス溶液、リンゲルラクテートなどを含む。適切な賦形剤の例には、乳糖、デキストロース、ショ糖、トレハロース、ソルビトール、およびマンニトールが含まれる。
【００５３】
「対象」は、哺乳動物、好ましくはヒトであるが、動物、例えばコンパニオンアニマル(例えば、イヌ、ネコなど）、家畜（例えば、乳牛、ヒツジ、ブタ、ウマなど）、および実験動物（例えば、ラット、マウス、モルモットなど）でもあり得る。
【００５４】
本発明のGLP-1化合物は適切な二価金属カチオンと複合体を形成し得る。GLP-1化合物の二価金属複合体は一般的にほぼ生理学的ｐHの水性溶液に不溶性である。したがって、これら複合体をサスペンジョン剤として皮下投与し、in vivoでの放出速度の減少を示すことにより、該化合物の時間作用を延長することができる。適切な二価金属カチオンの例には、Zn++、Mn++、Fe++、Ca++、Co++、Cd++、Ni++などが含まれる。Zn++が好ましい。
【００５５】
本発明のGLP-1化合物と二価金属カチオンの複合体を得るには、GLP-1を金属塩の存在下で適切な緩衝液に溶解する。混合物を周囲温度でインキュベーションして複合体を沈殿させる。適切な緩衝液は、混合物を約3.0〜約9.0の範囲のpHに維持し、複合体形成反応と緩衝しない緩衝液である。例には、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、およびGoodeの緩衝液、例えばHEPES、トリス、およびトリスアセテートが含まれる。適切な金属塩は、金属が複合体の形成に利用可能なものである。適切な亜鉛塩の例には、塩化亜鉛、酢酸亜鉛、酸化亜鉛、および硫酸亜鉛が含まれる。好ましくは、二価金属カチオン塩、例えば塩化亜鉛を過剰に供給してGLP-1化合物の各分子について約50分子までのモル比の二価金属カチオンを提供する。
【００５６】
「インスリノトロピック活性」は、グルコースレベルの上昇に反応してインスリン分泌を刺激し、細胞によるグルコース取込みと血清グルコースレベルの低下を生じることをいう。インスリノトロピック活性は、in vivo実験、およびGLP-1レセプターバインディング活性またはレセプター活性化を測定するin vitroアッセイ、例えば膵アイレット細胞またはインスリノーマ細胞を用いるアッセイ（それぞれGelfandらのEP619,322および米国特許5,120,712に記載）の使用を含む当該分野で知られた方法により評価することができる。これらの内容は本明細書の一部を構成する。
【００５７】
本発明のGLP-1化合物は、固相ペプチド合成技術の標準的方法を用いて製造することができる。ペプチド合成装置は、例えばApplied Biosystems（Foster City CA）から市販されているものを利用可能である。固相合成用の試薬は、例えばMidwest Biotech(Fishers、IN)から市販されているものを利用可能である。固相ペプチド合成装置を製造業者の指示書に従って用い、干渉基をブロックし、反応すべきアミノ酸を保護し、カップリングし、脱カップリングし、非反応アミノ酸をキャッピングすることができる。
【００５８】
典型的には、樹脂上の成長しつつあるペプチド鎖のα-N-カルバモイル保護アミノ酸およびN-末端アミノ酸を、カップリング試薬、例えばジシクロヘキシルカルボジイミドおよび1-ヒドロキシベンゾトリアゾール、および塩基、例えばジイソプロピルエチルアミンの存在下で不活性溶媒、例えばジメチルホルムアミド、N-メチルピロリドンまたは塩化メチレン中、室温でカップリングする。試薬、例えばトリフルオロ酢酸またはピペリジンを用いてα-N-カルバモイル保護基を得られるペプチド樹脂から除去し、該ペプチド鎖に加える次の所望のN-保護アミノ酸とのカップリング反応を反復する。適切なアミン保護基は当該分野でよく知られており、例えば、GreenおよびWuts、「Protecting Groups in Organic Synthesis」、John Wiley and Sons、1991に記載されている（この内容は本明細書の一部を構成する）。例には、t-ブチルオキシカルボニル(tBoc)およびフルオレニルメトキシカルボニル(Fmoc)が含まれる。
【００５９】
該ペプチドは、適切な側鎖保護を有するt-ブトキシカルボニル-またはフルオレニルメトキシカルボニル-α-アミノ酸を用い、標準的自動化固相合成プロトコールを用いても合成される。合成完結後、標準的フッ化水素法を用いて同時に側鎖を脱保護しながらペプチドを固相支持物から開裂させる。次に、0.1%トリフルオロ酢酸(TFA)中のアセトニトリル勾配を用い、Vydac C18カラム逆相クロマトグラフィーを用いて粗ペプチドをさらに精製する。アセトニトリルを除去するために、ペプチドを0.1% TFA、アセトニトリル、および水を含む溶液から凍結乾燥する。分析的逆相クロマトグラフィーにより純度を証明することができる。ペプチドの同一性は質量分析法により証明することができる。ペプチドを中性ｐHの水性緩衝液に可溶化することができる。
【００６０】
以下の実施例により本発明を例示するが、これらは何ら限定を意図するものではない。
【００６１】
実施例1  固相t-Boc化学による本発明のGLP-1化合物の製造
約0.5-0.6グラム(0.38-0.45mmol)Boc Gly-PAM樹脂を標準的60mL反応容器中に入れ、Applied Biosytems ABI430A ペプチド合成装置で二重カップリングを行った。以下の側鎖保護アミノ酸(Bocアミノ酸の2mmolカートリッジ)をMidwest Biotech(Fishers、IN)から得、合成に用いた: Arg-トシル(TOS)、Asp-δ-シクロヘキシルエステル(CHXL)、Glu-δ-シクロヘキシル(cycohexyl)エステル(CHXL)、His-ベンジルオキシメチル(BOM)、Lys-2-クロロベンジルオキシカルボニル(2Cl-Z)、Met-スルホキシド(O)、Ser-O-ベンジルエーテル(OBzl)、Thr-O-ベンジルエーテル(OBzl)、Trp-ホルミル(CHO)、およびTyr-2-ブロモベンジルオキシカルボニル(2Br-Z)、およびBoc Gly PAM樹脂。トリフルオロ酢酸(TFA)、ジイソプロピルエチルアミン(DIEA)、DMF中の0.5Mヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)、およびジクロロメタン中の0.5Mジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)はPE-Applied Biosystems(Foster City、CA)から購入した。ジメチルホルムアミド(DMF-Burdick and Jackson)、およびジクロロメタン(DCM-Mallinkrodt)はMays Chemical Co.(Indianapolis、IN)から購入した。
【００６２】
共にDCCを用いて形成した対称無水物またはHOBtエステルのいずれかを用い標準的二重カップリングを行った。第二セットの二重カップリング(TFA脱保護なし)をTrp31、Thr13、およびThr11に行った。合成完結時にN-末端 Boc基を除去し、ペプチジル樹脂をDMF中の20% ピペリジンで処理してTrp側鎖を脱ホルミル化した。DCMで洗浄後、樹脂をTEFLON反応容器に移し、減圧下で乾燥した。
【００６３】
Metを含有する類似体については、樹脂上還元(on-the-resin reduction)をTFA/10%ジメチルスルフィド(DMS)/2%濃HClを用いて行った。反応容器をHF(フッ化水素酸)装置(Penninsula Laboratories)に取り付けることにより開裂を行った。1ml m-クレゾール／グラム/樹脂を加え、10ml HF(AGA、Indianapolis、INから購入)を予め冷却した容器中で縮合させた。メチオニンが存在するときは1ml DMS／グラム樹脂を加えた。反応液を氷浴中で１時間撹拌し、HFを減圧下で除去した。残渣をエチルエーテルに懸濁し、固体をろ過し、エーテルで洗浄した。各ペプチドを水性酢酸中で抽出し、凍結乾燥するかまたは逆相カラムに直接ロードした。
【００６４】
緩衝液A(水中の0.1%トリフルオロ酢酸、B:アセトニトリル中の0.1%TFA)中の2.2 x 25cm VYDAC C18カラムを用いて精製を行った。280nm(4.0A)のUVでモニターしながら、10ml/分で120分間、20%〜90% Bの勾配をHPLC(Waters)にかけ、１分間の分画を回収した。適切な分画を混合し、凍結し、次いで凍結乾燥した。乾燥生成物をHPLC(0.46 x 15cm METASIL AQ C18)およびMALDI質量分析法により分析した。
【００６５】
実施例2  固相F-Moc化学による本発明のGLP-1化合物の製造
約114mg(50mmol)のFMOC Gly WANG樹脂(NovaBiochem、LaJolla、CAから購入)を、96ウェル反応ブロックの各プログラムウェルに入れ、Advanced ChemTech396ペプチド合成装置を用いて二重カップリングを行った。75mg(50μmol)のRink Amide AM樹脂(NovaBiochem、LaJolla、CA)を用いてC-末端アミドを有する類似体を製造した。
【００６６】
以下のFMOCアミノ酸は、Advanced ChemTech(Louisville、KY)、NovaBiochem(La Jolla、CA)、およびMidwest BioTech(Fishers、IN)から購入した: Arg-2,2,4,6,7-ペンタメチルジヒドロベンゾフラン-5-スルフォニル(Pbf)、Asn-トリチル(Trt)、Asp-β-t-ブチルエステル(tBu)、Glu-δ-t-ブチルエステル(tBu)、Gln-トリチル(Trt)、His-トリチル(Trt)、Lys-t-ブチルオキシカルボニル(Boc)、Ser-t-ブチルエーテル(OtBu)、Thr-t-ブチルエーテル(OtBu)、Trp-t-ブチルオキシカルボニル(Boc)、Tyr-t-ブチルエーテル(OtBu)。
【００６７】
溶媒、ジメチルホルムアミド(DMF-Burdick and Jackson)、N-メチルピロリドン(NMP-Burdick and Jackson)、ジクロロメタン(DCM-Mallinkrodt)はMays Chemical Co.(Indianapolis、IN)から購入した。
ヒドロキシベンゾトリゾール(HOBt)、ジ-イソプロピルカルボジイミド(DIC)、ジ-イソプロピルエチルアミン(DIEA)、およびピペリジン(Pip)は、Aldrich Chemical Co(Milwaukee、WI)から購入した。
【００６８】
すべてのアミノ酸をNMP中の0.45M HOBtに溶解し、20% Pip/DMFを用いて20分間脱保護した後、50分間DIC/HOBt活性化カップリングを行った。脱保護およびカップリング後、各樹脂をDMFで洗浄した。最終カップリングおよび脱保護後、ペプチジル樹脂をDCMで洗浄し、反応ブロック中で減圧乾燥した。
【００６９】
適切に反応／開裂ブロックアセンブリーを用い、2mlの試薬Kを各ウェルに加え、開裂反応液を2時間混合した[試薬K= 0.75gmフェノール、0.5mlチオアニソール、0.25mlエタンジチオール、0.5ml水／10mlトリフルオロ酢酸(TFA)、すべてAldrich Chemical Co.、Milwaukee、WIから購入]。TFAろ液を40mlエチルエーテルに加え、沈渣を2000rpmで2分間遠心した。上清をデカントし、ペレットを40mlエーテルに再度懸濁し、再度遠心し、再度デカントし、窒素下次いで減圧下で乾燥した。
【００７０】
0.3-0.6mgの各生成物を1ml 0.1% TFA/アセトニトリル(ACN)に溶解し、20ulをHPLCで分析した[0.46 x 15cm METASIL AQ C18、1ml/min、45C°、214nM(0.2A)、A=0.1%TFA、B=0.1%TFA/50% ACN。勾配=50%B〜90%B、30分間かけて]。
緩衝液A(水中の0.1%トリフルオロ酢酸、B: アセトニトリル中の0.1%TFA)中の2.2 x 25cm VYDAC C18カラムを用いて精製を行った。20%〜90%Bの勾配を10ml/分で120分間かけてHPLC(Waters)に流し、280nmのUVでモニターしながら(4.0A)1分間分画を回収した。適切な分画を混合し、凍結し、次いで凍結乾燥した。乾燥生成物をHPLC(0.46 x 15 cm METASIL AQ C18)およびMALDI質量分析法で分析した。
【００７１】
実施例3  GLP凝集アッセイ
本発明のGLPペプチドの溶液中で凝集する可能性について分析した。一般的には、溶液中のペプチドを適切な緩衝液中、上昇した温度で撹拌しながら、濁度を350nmで時間の機能として記録した。凝集が発現するまでの時間を測定し、これらストレス条件下における特定GLP分子の凝集可能性を定量した。
【００７２】
プロトコール:
GLP-1化合物を最初にアルカリ条件(pH10.5)下で30分間溶解してあらゆる前凝集物質を溶解した。次に、該溶液をpH 7.4に調整し、ろ過した。具体的には、4 mgの凍結乾燥GLP-1化合物を3mlの10mMリン酸塩（phosphate）/10mMクエン酸塩（citrate）に溶解した。pHを10.0-10.5に調整し、30分間保った。該溶液をHClでpH 7.4に調整し、適切なフィルター、例えばMillex GV シリンジフィルター(Millipore Corporation、Bedford、MA)でろ過した。次に、この溶液を希釈して10mMクエン酸塩、10mMリン酸塩、150mM NaCl中に0.3 mg/mLタンパク質を含む最終試料とした（pH 7.4〜7.5に調整）。試料を水晶キュベット中で37℃でインキュベーションした。5分毎に溶液の濁度をAVIV Model 14DS UV-VIS分光光度計(Lakewood、NJ)を用い350nmで測定した。測定前30秒間および測定中、Starna Cells、Inc.(Atascadero、CA)の磁石撹拌棒を用いて撹拌した。350nmでのODの増加は、GLP-ペプチドの凝集を示す。凝集までの時間をDrake法(Arvinte T、Cudd A、およびDrake AF.(1993)、J.Bio.Chem. 268,6415-6422)に従って前成長期および成長期に対する線形フィットの交点により概算した。
【００７３】
キュベットは実験と実験の間に苛性石鹸溶液(例えばContrad-70)で洗浄した。本発明の多くのGLP-1化合物の結果は、該化合物が凝集するのに必要な時間（時間）で表1に報告する。本発明の化合物は当該分野で知られたGLP-1化合物より凝集時間の大きな増大を示す。
【００７４】
実施例4  本発明GLP-1化合物によるGLP-1レセプターの活性化
本発明のGLP-1化合物のGLP-1レセプター活性化能をGelfandらのEP619,322および米国特許5,120,712にそれぞれ記載されているようなin vitroアッセイを用いて評価した。これら参考文献に記載のすべての内容は本明細書の一部を構成する。GLP-1(7-37)OHの活性との相対的なこれらの化合物の活性を表１に示す。これらの結果からわかるように、本発明のGLP-1化合物の活性は一般にGLP-1(7-37)OHとほぼ同じかまたはそれよりよい。
【００７５】
表１
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【００７６】
0004716641.tif 000003
【００７７】
0004716641.tif 000004
【００７８】
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*30℃で測定した凝集時間
【００７９】
実施例5  GLP-1化合物の亜鉛沈殿
個々のGLP-1化合物は実施例１または２に記載のごとく製造した。3mgの個々の凍結乾燥GLP分子を3mlの 0.1M HEPES緩衝液pH10.5に溶解した。次に、得られた溶液のpHを0.2N NaOHで10.0〜10.5に調整した。該溶液を周囲温度で30分間撹拌し、次いで該溶液を0.2N HClでpH7.4に調整した。該溶液を適切なシリンジフィルター、例えばMillex GVシリンジフィルター(Millipore Corporation、Bedford、MA)でろ過し、GLP-1化合物の濃度を、分光光度計、例えばBeckman DU640を用いて280nmの吸光度を測定することにより見積もった。次に、タンパク質濃度をHEPES（pH7.4）で200μMに調整した。
【００８０】
ろ過したGLP-1溶液(100μl)をELISAプレート(例えばFalcon Microtest(登録商標)96)中で、種々の濃度の塩化亜鉛を含む100μlの0.1M HEPES（pH7.4）で希釈し、種々の濃度の塩化亜鉛と100μM GLP-1化合物を含む溶液200μlを得た。これら溶液を周囲温度(22℃)で18時間インキュベーションし、次いで例えばマイクロプレートアダプターを有するJouan CR412遠心機で遠心した。次に、遠心後の上清150μlをUVリーダブルELISAマイクロタイタープレート(例えばCostar UVプレート)に移し、OD280をマイクロタイターリーダー(例えばMolecular Devices SPECTRAmax PLUS、SOFTmax PRO)で測定した。実験結果を表2に示す。A280値は２回の独立した測定の結果である。
【００８１】
表２
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【００８２】
表２（続き）
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これらの結果は、種々のGLP-1化合物のかなりの部分と複合体を形成し、これら希釈溶液から沈殿させるのに必要な亜鉛は少量だけであることを示す。
【００８３】
等価物
本発明をその好ましい態様に関して詳細に示し、記載したが、添付した請求の範囲に記載した本発明の精神および範囲を離れることなく形態および詳細の種々の変更を行ってよいことを当業者は理解するであろう。当業者はただ日常的実験を用いるだけで、本明細書に具体的に記載した本発明の特定の態様に対する多くの等価物を認識するか、または確認することができるであろう。そのような等価物は本請求の範囲に含まれるものとする。
【図面の簡単な説明】
【図１】  Val8-Glu22-GLP-1(7-37)OH(配列番号5)、Val8-Asp22-GLP-1(7-37)OH(配列番号6)、Val8-Arg22-GLP-1(7-37)OH(配列番号7)、およびVal8-Lys22-GLP-1(7-37)OH(配列番号8)のアミノ酸配列を示す図である。
【図２】  Gly8-Glu22-GLP-1(7-37)OH(配列番号9)、Gly8-Asp22-GLP-1(7-37)OH(配列番号10)、Gly8-Arg22-GLP-1(7-37)OH(配列番号11)、およびGly8-Lys22-GLP-1(7-37)OH(配列番号12)のアミノ酸配列を示す図である。
【図３】  Val8-Glu30-GLP-1(7-37)OH(配列番号13)、Gly8-Glu3-GLP-1(7-37)OH(配列番号14)、Val8-His37-GLP-1(7-37)OH(配列番号15)、およびGly8-His37-GLP-1(7-37)OH(配列番号16)のアミノ酸配列を示す図である。
【図４】  Val8-Glu22-Ala27-GLP-1(7-37)OH(配列番号17)、およびVal8-Lys22-Glu23-GLP1(7-37)OH(配列番号18)のアミノ酸配列を示す図である。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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