(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
カルボキシル基で官能化した疎水性固相に親和性試薬を固定する方法であって、前記方法が、前記固相を活性化する段階および前記固相に親和性試薬を結合させる段階を含んで成り、前記固相を活性化する段階が、補助活性剤の存在下に、約４〜約６．５のｐＨを有する酸性媒体中で、カルボジイミドとホスフェート緩衝剤との組合せを使用すること、および結合段階が約７．２〜約１０．５のｐＨを有する塩基性媒体中で行われること、を特徴とする方法。
【請求項２】
使用されるカルボジイミドが、ＣＭＣ（Ｎ−シクロヘキシル−Ｎ’−（２−モルホリノエチル）カルボジイミドメチル−ｐ−トルエンスルホネート）およびＥＤＣ（１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド）から成る群から選択される化合物であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
使用される補助活性剤が、ｓ−ＮＨＳ（スルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）、ＨＯＢｔ（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミドから成る群から選択される化合物であることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
使用されるカルボジイミドが、ＣＭＣ（Ｎ−シクロヘキシル−Ｎ’−（２−モルホリノエチル）カルボジイミドメチル−ｐ−トルエンスルホネート）であり、使用される補助活性剤が、ｓ−ＮＨＳ（スルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
カルボジイミドが、ＣＯＯＨ基につき２０〜５０モル当量の量で使用されることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
補助活性剤が、ＣＯＯＨ基につき３〜１０モル当量の量で使用されることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
固相を活性化する段階が、約４〜約６．５のｐＨを有する酸性媒体中で、ＣＯＯＨ基につき３〜１０モル当量のスルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド補助活性剤の存在下に、３０〜２００ｍＭのホスフェート緩衝剤中の、ＣＯＯＨ基につき２０〜５０モル当量のＣＭＣの組合せを使用し、結合が約７．２〜約１０．５のｐＨを有する塩基性媒体中で行われることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
固相を活性化する段階が、ｐＨ６において、ＣＯＯＨ基につき５モル当量のスルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド補助活性剤の存在下に、５０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４ホスフェート緩衝剤中の、ＣＯＯＨ基につき３０モル当量のＣＭＣの組合せを使用し、結合が、ｐＨ８．５の緩衝剤１容量及び前記ホスフェート緩衝剤１容量を含有する媒体中で行われることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
親和性試薬が、アミン基を含有するか、またはアミン基を人為的に付与しうることを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
親和性試薬が、タンパク質、ペプチド、免疫グロブリン、抗原、ハプテン、抗体、酵素、酵素基質、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドから成る群から選択されることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、アナライト検出のためのバイオアッセイに使用しうる疎水性固相に親和性試薬を固定する方法、この方法によって得られる反応性複合体、およびバイオアッセイキットにおける前述の複合体の使用に関する。
【０００２】
（背景技術）
相互親和性を有する試薬を使用する生物学的分析アッセイは、長年にわたって知られている。前述の試薬は、以下に「親和性試薬」または「親和性対試薬」と称する。従って、親和性対の一方を、他方を使用することによって探し、検出する方法が知られている。親和性試薬間の親和性反応を利用するバイオアッセイ、または「アフィニティアッセイ」は、例えば酵素およびその基質を使用する酵素分析、ＢｅｒｓｏｎおよびＹａｌｏｗ（１９５９）の先駆的研究によって開始され、抗体と、対応する抗原またはハプテンとの反応を含む定性または定量イムノアッセイ、最近では、標的オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドと、それと特異的に交雑しうる相補的ヌクレオチドブローブを使用する核酸交雑アッセイを包含する。
【０００３】
１９６０年代以来、得られた遊離複合体と結合複合体との分離を必要とするアフィニティアッセイにおいて、この分離工程を単純化するために、反応性固相（または固体支持体）を使用しようとする努力がなされている。
親和性試薬は、例えばグルタルアルデヒドの補助によって、共有結合によって固相に固定することができる。１９６７年のＣａｔｔおよびＴｒｅｇｅａｒの研究以来、簡単な受動吸着によって固相に親和性試薬を固定することも知られている。
受動吸着による固定は簡単であるという長所を有するが、不適切に固定された試薬を液体媒体に放出する。
【０００４】
固相共有結合は一般に、より高い安定性を有する最終試薬を生成するという長所を有するだけでなく、より高い親和性の試薬を固体支持体に固定させることもできる。現在使用しうる多くの固相共有結合の方法および薬剤が存在する：言及されうる非制限的な例は、例えば、ＤＭＡＰ（ジメチルアミノピリジン）、ＨＯＢｔ（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドまたはｓ−ＮＨＳ（スルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）といった補助活性剤の存在または非存在下での、グルタルアルデヒド、臭化シアンおよびカルボジイミドとの結合であり、これらは当業者によく知られている。
【０００５】
共有結合によって固相に親和性試薬を固定する種々のプロトコルは、１、２または３段階で行われる。１段階結合においては、全ての成分を相互に接触させる。２段階結合は一般に、固体支持体をいわゆる「活性剤」によって活性化し、次に、洗浄して過剰の未反応活性剤を除去し、最後に親和性触媒に接触させる第一段階を含み、第二段階において実際の結合を実施する。
【０００６】
多くの固相または固体支持体が知られており、使用されている：親水性固相（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａによって市販されているＳｅｐｈａｄｅｘ（登録商標））および疎水性固相（例えば、ポリプロピレン、ポリスチレン、ラテックス等）。後者は一般に、例えば、アミン、カルボキシル、トシル、アルデヒド、ヒドロキシル、チオール、クロロメチル、ヒドラジドおよびその他の基といった予めグラフトされた官能基を介する反応を提供する。
【０００７】
カルボキシル基によって官能化された疎水性固相に親和性試薬を共有結合させる種々の方法が提示されている：ＭＥＳ（２−［Ｎ−モルホリノ］エタンスルホン酸）とカルボジイミドの組合せのような、緩衝剤と活性剤の種々の組合せを使用する。言及されうる例は、Ｄ．Ｂａｓｔｏｓ−Ｇｏｎｚａｌｅｚら、Ｊ．ｏｆ  Ｃｏｌｌｏｉｄ  ａｎｄ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１７６，２３２−２３９（１９９５）、またはＣ．Ｂｉｅｎｉａｒｚら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，１９９６，７，８８−９５に記載されている、ＭＥＳおよびＥＤＣ（１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド）の存在下における抗体とカルボンキシル化合物ラテックスとの共有結合である。
【０００８】
しかし、ホスフェート緩衝剤とカルボジイミド（活性剤として）の組合せは、カルボジイミドがホスフェートも活性化し、従って、それらの活性の大部分を失うという短所を有する故に、避けるべきであることが以前から知られている。これは、同時に、不充分な有効性の共有結合、高い割合の受動吸着、および、その結果として得られた生成物の不安定性を生じる（Ｗｏｎｇ，Ｓ、「Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ」、第６章、ｐ．１９６（１９９１）、およびＭ．Ａ．Ｇｉｌｌｅｓら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１８４，２４４−２４８（１９９０））。
【０００９】
Ｂａｎｇｓ（Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｔｅｃｈ．Ｎｏｔｅ  ＃  １３ｃ，Ｃｏｖａｌｅｎｔ  ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ｐ．３）は、水性溶液中でカルボジイミドＥＤＣの補助とともにカルボキシル基によって官能化された疎水性固相を活性化するプロトコルを提示しているが、得られる結果は、結合有効性の見地から、決して満足できるものではない。実際に、結合は量的ではなく、共有結合と比較して受動吸着の割合が高い（下記実施例１参照）。
【００１０】
一般に、カルボキシル基によって官能化された疎水性固相に親和性試薬を固定するために共有結合を使用する全ての先行技術法において、親和性試薬と固相との実際の共有結合は、前述の固相への前述の親和性試薬の受動吸着によるかなりの程度の固定が共存するという好ましくない観察がなされる。言い換えれば、これらの方法は、所望される最大程度の共有結合を得ることができないという短所を有する。受動吸着は、共有結合に有利になるように調節することができないので、これらの方法は、親和性試薬の共有結合固定を最適化することができないか、または再現性のある共有結合を得ることができない。従って、それらは、時間の経過とともに不安定な生成物を生じる。
従って、結合の共有結合性を再現可能に調節し、最適化し、それと共に、同時受動吸着の可能性を最小限にする、カルボキシル基によって官能化された疎水性固相に親和性試薬を固定する方法が求められている。
【００１１】
驚くことに、活性剤としてのカルボジイミドとホスフェート緩衝剤との組合せの補助によって、カルボキシル基で官能化された疎水性固相に親和性試薬を固定する反応の共有結合性を再現可能に調節し、最適化しうることが見い出された。
従って、本発明は、カルボキシル基によって官能化された疎水性固相に親和性試薬を固定する方法に関し、前述の方法が、前述の固相を活性化する段階および固相に親和性試薬を結合させる段階を含んで成り、前述の固相を活性化する段階が、補助活性剤の存在下において、酸性媒体中でカルボジイミドとホスフェート緩衝剤との組合せを使用し、親和性試薬の結合の段階が塩基性媒体中で行われることを特徴とする。
【００１２】
この分野において、およびペプチド合成の分野において、カルボキシル基活性剤として使用されるあらゆるカルボジイミドを、本発明の目的に使用することができる。
カルボジイミドの例は、特に、Ｌｕｎｄｂｌａｄ，Ｒ．Ｌ．ら、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ、第２巻、第４章、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ；Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆ．Ｌ．およびＭａｒｉｏｎ  Ｍｉｋｏｌａｊｃｚｙｋら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、第３７巻、ｐ．２３３−２８４（１９８１）に記載されている。
【００１３】
本発明の活性剤として使用することができるカルボジイミドの例として特にＣＭＣ（Ｎ−シクロヘキシル−Ｎ’−（２−モルホリノエチル）カルボジイミドメチル−ｐ−トルエンスルホネート）およびＥＤＣ（１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド）を挙げることができ、ＣＭＣが特に好ましい。
【００１４】
カルボジイミドは、ＣＯＯＨ基に対して過剰で使用しなければならない。使用される量は、ＣＯＯＨ基につき２０〜５０モル当量であるのが好ましい。
「ホスフェート緩衝剤」は、本発明において、一般に３０〜２００ｍＭの濃度で使用される通常のホスフェート緩衝剤（ナトリウムおよび／またはカリウム）を意味すると理解されるものとし、５０ｍＭのホスフェート緩衝剤が特に好ましい。
【００１５】
この分野で使用されるあらゆる補助活性剤を使用することができる。補助活性剤の例は、特に、Ｓｔａｒｏｓ，Ｊ．Ｖ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２１，３９５０−３９５５（１９８２）；Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎ，Ｍ．Ｊ．ら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１００，１００−１０８（１９７９）；Ａｂｄｅｌｌａ，Ｐ．Ｍ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，８７，７３４−７４２（１９７９）に記載されている。
【００１６】
本発明によって使用しうる補助活性剤のうち、特にｓ−ＮＨＳ（スルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）、ＨＯＢｔ（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミドが使用され、ｓ−ＮＨＳ（スルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）が特に好ましい。
カルボジイミドと同様に、補助活性剤は、ＣＯＯＨ基に対して過剰で使用しなければならない。使用される量は、ＣＯＯＨ基につき３〜１０モル当量であるのが好ましい。
【００１７】
本発明の方法の活性化段階における「酸性媒体」は、約４〜約６．５のｐＨを有する媒体を意味すると理解されるものとし、ｐＨ６が特に好ましく、前述の媒体の酸性性質はホスフェート緩衝剤によって付与される。
本発明の方法の結合段階における「塩基性媒体」は、約７．２〜約１０．５のｐＨを有する媒体を意味すると理解されるものとし、ｐＨ８．５の緩衝剤５０％を含有する媒体が特に好ましい。
【００１８】
媒体の塩基性性質は、適切な一般的な緩衝剤、例えば、ボレート緩衝剤またはホスフェート緩衝剤／ボレート緩衝剤混合物を使用することによって得られる。
従って、本発明の好ましい実施形態において、固相の活性化段階は、約４〜約６．５のｐＨを有する酸性媒体中で、ＣＯＯＨ基につき３〜１０モル当量のスルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド補助活性剤の存在下に、３０〜２００ｍＭのホスフェート緩衝剤中の、ＣＯＯＨ基につき２０〜５０モル当量のＣＭＣの組合せを使用し、結合は約７．２〜約１０．５のｐＨを有する塩基性媒体中で行う。
【００１９】
本発明の特に好ましい実施形態において、固相の活性化段階は、ｐＨ６で、ＣＯＯＨ基につき５モル当量のスルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド補助活性剤の存在下において、５０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４ホスフェート緩衝剤中において、ＣＯＯＨ基につき３０モル当量のＣＭＣの組合せを使用し、結合はｐＨ８．５のボレート緩衝剤５０％を含有する媒体中で行う。
上述の結合条件に関連する活性化パラメーター（カルボジイミド、ホスフェート緩衝剤、補助活性剤および酸性ｐＨ）の適切な組合せは、本発明の方法の実施に重要である。
【００２０】
本発明によって固定しうる親和性試薬は、アミン基を有するか、または人為的にアミン基を付与しうる化合物である。言及されうるそのような親和性試薬の例は、タンパク質、ペプチド、免疫グロブリン、抗原、ハプテン、抗体、酵素、酵素基質、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド等、ならびに当業者に知られている他の生物試薬である。
「疎水性固相」は、本発明の開示において、当分野で一般に使用される疎水性ポリマー、例えば、ポリプロピレンおよびポリスチレンのようなビニル芳香族ポリマー、特にこれらのポリマーのラテックスから成る固相を意味すると理解されるものとする。これらの固相は、当業者によく知られている方法を使用してカルボキシル基によって官能化される。これに関して、例えば、Ｏｔｔｅｗｉｌｌ  Ｒ．Ｈ．ら、Ｋｏｌｌｏｉｄ  Ｚｕ  Ｚ．Ｐｏｌｙｍｅｒｅ，２１５，１６１−１６６（１９６７）の論文を参照することができる。
【００２１】
本発明に使用しうる、カルボキシル基で官能化された疎水性固相の例は、ラテックス粒子、例えば、Ｅｓｔａｐｏｒ（登録商標）（Ｐｒｏｌａｂｏ、フランス）の商品名で知られているラテックス粒子、ＤｙｎａｌからのＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）磁性粒子、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．からのＰｏｌｙｂｅａｄ（登録商標）微小球、およびそれらの相当物等である。
【００２２】
本発明はさらに、本発明の方法によって得られる反応性固体複合体、例えば、イムノアッセイに使用しうる固相／抗原複合体、固相／ハプテン複合体、固相／抗体複合体等、核酸交雑アッセイ、増幅アッセイ等に使用しうる固相／オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド複合体、固相／酵素複合体または固相／酵素基質複合体等にも関する。
【００２３】
本発明はさらに、バイオアッセイ用のキットにおけるこれらの複合体の使用にも関し、非制限的な例は、当業者に知られている定性的または定量的なイムノアッセイ、核酸交雑アッセイ、核酸増幅アッセイ、酵素アッセイ等である。
例示するものにすぎず、どのような方法においても本発明の範囲を限定するものではないと理解すべき下記の実施例によって、本発明がより明確に理解される。
【００２４】
（実施例）
実施例１
カルボキシルビーズへのペプチドの結合
ａ）試薬
ａ１）カルボキシルビーズ
フランスのＰｒｏｌａｂｏによって製造された磁性カルボンキシルラテックスビーズ（参考Ｅｓｔａｐｏｒ  Ｍ１−０７０／６０）を、カルボキシル基を有する疎水性固相として使用した。それらは、ＣＯＯＨ基によって官能化されたポリスチレンおよび酸化鉄の多分散粒子から成る。使用される固相は、下記の特性を有する：平均径（０．８μｍ）、鉄のパーセント（６２％）、官能化度（１５０μｅｑ  ＣＯＯＨ／ｇ）。それは０．１ｇ／ｍＬの水性懸濁液の形態である。
全てのビーズ洗浄工程は下記のように行われる：
各実験において、試験管に存在する磁性ビーズを、磁化支持体を使用して溶液から分離する。上澄みをピペットで除去し、磁性ビーズを、磁化支持体によって各試験管に保持する。新しい溶液または新しい緩衝剤の各添加後に、ビーズを、約１０秒間かき混ぜることによって再懸濁させる。
洗浄は、洗浄溶液の添加、ビーズの再懸濁、および磁化によるこの溶液の除去を含んで成る。
【００２５】
ａ２）ペプチド
下記配列を有する１７個のアミノ酸のペプチドを、この実施例において使用した：ＫＧＳＹＳＶＤＨＦＲＷＧＲＰＶＳＧ−ＮＨ２。
このペプチドは、Ｅ．ＡｔｈｅｒｔｏｎおよびＲ．Ｌ．Ｓｈｅｐｐａｒｄ、「Ｓｏｌｉｄ  ｐｈａｓｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ」、ＩＲＬ  ＰＲＥＳＳ（１９８９）、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、ｐｐ．２５−３４に記載されている方法によって製造した。
使用したホスフェート緩衝液は、ｐＨ６のＫＨ２ＰＯ４５０ｍＭ水溶液であった。
全ての操作を、室温、即ち１９〜２４℃で行った。
【００２６】
ｂ）カルボキシルビーズへのペプチドの固定
ｂ１）カルボキシルビーズへのペプチドの共有結合
ステップ１：カルボキシルビーズの洗浄
試験管中の５０μＬの磁性カルボキシルラテックスビーズを、ｐＨ９の０．１ｍＭ、ＮａＯＨ７５０μＬで２回、二重蒸留水７５０μＬで１回、最後にホスフェート緩衝液７５０μＬで１回、洗浄する。
ステップ２：カルボキシルビーズの活性化
２５０μＬのホスフェート緩衝液、２００μＬ（３０ｅｑ／ＣＯＯＨ基）のＣＭＣ（Ｎ−シクロヘキシル−Ｎ’−（２−モルホリノエチル）カルボジイミドメチル−ｐ−トルエンスルホネート）（Ｆｌｕｋａ）の水溶液、および５０μＬ（５ｅｑ／ＣＯＯＨ）のｓ−ＮＨＳ（スルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）（Ｐｉｅｒｃｅ）の水溶液を、ステップ１で得た洗浄ビーズの残留物に添加する。
反応混合物を、振とうしながら室温で１時間インキュベーションする。次に、ビーズを５００μＬのホスフェート緩衝液で洗浄する。
ステップ３：ビーズへのペプチドの結合
０．２５ｅｑ（ＣＯＯＨ基に基づく）のセクションａ２）に記載したペプチドを含有する、２５０μＬのホスフェート緩衝液、およびｐＨ８．５の２５０μＬの３７．５ｍＭボレート／５０ｍＭＮａＣｌ緩衝液を、ステップ２で得た活性化ビーズの残留物に添加する。
反応混合物を、振とうしながら室温で１時間インキュベーションする。ビーズを磁化によって分離し、上澄みをＨＰＬＣによる測定（下記セクションｃ）参照）のために保持する。洗浄後、ビーズをｐＨ７．４のＰＢＳか、または他の好適な同等の緩衝液中に維持する。
【００２７】
ｂ２）カルボキシルビーズへのペプチドの受動吸着
「受動」型の結合（「受動吸着」とも呼ばれる）を活性剤およひカップリング剤、ＣＭＣおよびｓ−ＮＨＳを除いた上記と全く同じ試薬を使用して行う。「受動」型の結合後、ビーズを磁化によって分離し、上澄みをＨＰＬＣによる測定（セクションｃ）参照）のために保持する。
【００２８】
ｃ）ＨＰＬＣによる共有結合収率の計算および受動結合の測定
結合の後、無極性固定相（Ｃ１８）および極性移動相（勾配：アセトニトリル／０．０８％ＴＦＡ水溶液〜０．１％ＴＦＡ）を有する装置（例えば、Ｗａｔｅｒｓ）での逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を行う。
各結合（共有または受動）の終了時に、セクションｂ１）またはｂ２）で得た３０μＬの上澄みをＨＰＬＣ装置に入れる。
【００２９】
同量の「対照溶液」（即ち、結合に使用したのと同じであるが、磁性ビーズに結合していないペプチド溶液（ｐＨ８．５の２５０μＬ、３７．５ｍＭボレート／５０ｍＭＮａＣｌ緩衝液、および２５０μＬのホスフェート緩衝液中））もＨＰＬＣ装置に入れる。
分で表される時間Ｔの関数としての、２１４ｎｍでの吸収を測定することによって得たＨＰＬＣクロマトグラムを、図１〜３に示す。図１のクロマトグラムは、Ｔ０における対照溶液（磁性ビーズに結合していないアッセイ）を使用して得たピークを示し、前述の溶液は、導入された全量のペプチドを示すことによって基準となる。
【００３０】
図２のクロマトグラムは、セクションｂ１）に記載した共有結合の終了時にＴ０＋１時で採取した上澄みを使用して得たピークを示す。
図３のクロマトグラムは、セクションｂ２）に記載した受動結合の終了時にＴ０＋１時で採取した上澄みを使用して得たピークを示す。
【００３１】
各クロマトグラムについて、ピーク領域をソフトウェアプログラム（例えば、Ｍｉｌｌｅｎｉｕｍソフトウェア）によって集約する。これは、対照溶液に関する領域Ａ０、共有結合に関する領域Ａ１、および「受動型」結合に関する領域Ａ２を測定する。
従って、結合収率は、下記式を使用して、当業者に既知の逆測定（ｂａｃｋ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ）によって求められる：
％共有結合＝［（Ａ０−Ａ１）／Ａ０］×１００
％「受動型」結合＝［（Ａ０−Ａ２）／Ａ０］×１００
【００３２】
ｄ）本発明の結合と先行技術の結合との比較
この試験は、先行技術の３つのプロトコルおよび本発明のプロトコルで行った。カップリング剤および活性剤を使用しない「受動」条件下の結合は、全プロトコルについて平行して行った。共有結合および受動結合の収率を、ｃ）に記載した方法で求めた。
【００３３】
先行技術のプロトコル：
−「Ｂａｎｇｓ」プロトコル、Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｔｅｃｈ，ｎｏｔｅ  ＃１３ｃ、Ｃｏｖａｌｅｎｔ  ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ｐ．３。
【００３４】
ビーズを予備賦活緩衝液（ｐＨ４．５の５０ｍＭホスフェート緩衝液）で洗浄し、次に、少ないパーセント（２０％）の予備賦活緩衝液の存在下にＥＤＣの水溶液で活性化した。結合を、ｐＨ８．５の０．２Ｍボレート緩衝液中で行った。結合後、未反応カルボキシル基をエタノールアミン溶液でブロックした。ビーズを、ＢＳＡ、グリシン、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）洗浄剤およびアジ化ナトリウムを含有する緩衝液中に維持した。
【００３５】
−Ｊ．Ｓａｃｋｒｉｓｏｎプロトコル、ラテックス粒子への共有結合および微小球を使用する診断開発、ラテックスコース、１９９７。
ｐＨ８．５の１０ｍＭボレート緩衝液、ｐＨ５．０の１０ｍＭ酢酸ナトリウム溶液、およびｐＨ１０．２の５０ｍＭジエタノールアミン溶液を使用してビーズを数回洗浄し、次に、ｐＨ１０．２の５０ｍＭジエタノールアミン緩衝液中のＣＭＣの溶液で活性化した。カップリングを、ｐＨ７．４の１００ｍＭホスフェート／１５０ｍＭＮａＣｌ緩衝液中で行った。
【００３６】
−Ｄ．Ｂａｓｔｏｓ−Ｇｏｎｚａｌｅｚら、Ｊ．  ｏｆ  Ｃｏｌｌｏｉｄ  ａｎｄ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１７６，２３２−２３９，１９９５に記載のプロトコル１。
ラテックスビーズをｐＨ５．６の緩衝液（ＭＥＳ）に添加した。カップリングを、弱酸性媒体（ｐＨ５．６のＭＥＳ緩衝液）中で行った。ＥＤＣの水溶液を添加し、次に、試料を室温でインキュベーションした。結合後、過剰のカルボキシル基を、エタノールアミンで処理することによってブロックした。
ＨＰＬＣ測定によって得た結果を、表Ｉにおいて、結合収率（％）、および共有結合と受動結合の差（Δ）で示す。
【００３７】
【表１】
0004746810.tif 000002
【００３８】
先行技術のプロトコルを使用して得た結果と比較して、本発明の結合プロトコルを使用した場合に最良の性能特性が得られる：したがって、本発明の結合プロトコルを使用した場合、共有結合収率は量的（１００％）であり、共有結合と受動結合の差は、２つの形態の結合の差が相対的に小さい先行技術のプロトコルと比較して、かなり大きい。
【００３９】
ｅ）本発明の結合法の再現性
本発明の結合法の再現性を、一方で、全く同一のバッチのビーズへの３つの結合を行い、他方で、異なるバッチのビーズへの結合を行うことによって試験した。セクションｂ１）（上記）に記載したプロトコルによる共有結合、およびセクションｂ２）（上記）に記載したプロトコルによる「受動」型結合を、各実験において平行して行った。結合収率の計算、および受動結合の測定は、上記プロトコルｃ）によって行った。
ＨＰＬＣ測定によって得た結果を、表ＩＩに、結合収率（％）、および共有結合と受動結合の差（Δ）で示す。
【００４０】
【表２】
0004746810.tif 000003
【００４１】
これらの結果は、全く同一のバッチ（バッチ４７７）を使用した場合に再現性が優れていることを示す。異なるバッチ（バッチ５８３）を使用した場合、結合収率は完全に許容されるものであり、第一バッチで得た収率に比較しうるものである。
【００４２】
実施例２
ａ）磁性カルボキシルビーズへのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の結合
１７５μｇのＢＳＡ（Ｐａｎｔｅｘ）を、実施例１のセクションｂ１）に記載した条件下に結合させる。実際の結合反応は、室温において２２時間（１時間の代わりに）行う。
受動吸着は、同じ条件であるが、カップリング剤、ＣＭＣ、および補助活性剤ｓ−ＮＨＳを使用せずに行う。結合後、ビーズを磁化によって分離し、上澄みはＨＰＣＬによる測定のために保持する。
【００４３】
ｂ）本発明のＢＳＡ結合と先行技術の結合との比較
本発明のプロトコルを、先行技術の２つのプロトコル、即ち、「Ｂａｎｇｓ」プロトコルおよび「ラテックスコース」プロトコル（Ｊ．Ｓａｃｋｒｉｓｏｎ）と比較した。
３つのプロトコルを使用した共有結合および受動吸着の収率を、実施例１のセクションｃ）に記載した方法で求めた。
ＨＰＬＣ測定によって得た結果を、表ＩＩＩにおいて、結合収率（％）、および共有結合と受動吸着との差（Δ）で示す。
【００４４】
【表３】
0004746810.tif 000004
【００４５】
結果は、本発明のプロトコルがより高い結合Δ（共有−受動）を与える故に、先行技術のプロトコルと比較してより優れていることを示す。
【００４６】
実施例３
抗ＨＩＶ抗体の検出のための診断試験への適用
下記に示すように、磁性ビーズに固定した捕獲抗原と酵素で標識した抗原の間に抗ＨＩＶ−２特異性抗体を挟む既知のＥＬＩＳＡ試験、即ち、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｍａｒｎｅｓ  ｌａ  Ｃｏｑｕｅｔｔｅ，フランスからカタログ番号３４０２０で入手可能なＡｃｃｅｓｓ（登録商標）ＨＩＶ  １−２  Ｎｅｗ試験において、本発明の方法によって得たビーズを抗ＨＩＶ抗体の検出に使用した。信号の暴露および測定は、化学発光酵素基質を添加し、生じた発光を読み取ることによって行う。
【００４７】
ａ）材料および方法
ａ１）捕獲抗原（ペプチド）
必須免疫優性エピトープ（ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｔ  ｅｐｉｔｏｐｅ）を含有する２７ＡＡのペプチド、即ち、ＨＩＶ−２のｇｐ３６のへプタペプチドＣＡＦＲＱＶＣを、上述のＥ．ＡｔｈｅｒｔｏｎおよびＲ．Ｌ．Ｓｈｅｐｐａｒｄの方法によって合成し、次に、ホモ二官能価試薬ビス（スルホスクシニミル）スベレートの補助によって、共有結合によってＢＳＡに結合させた。得られたＢＳＡ／ＨＩＶ−２ペプチド結合体を以下に「ＢＳＡ／ＨＩＶ−２’」と称する。
【００４８】
ａ２）捕獲抗原の固定
次に、上記ＢＳＡ／ＨＩＶ−２結合体を、本発明の共有結合プロトコルおよび先行技術のプロトコルによって、磁性カルボキシルラテックスビーズ（Ｅｓｔａｐｏｒ）に結合させた。
・１２μｇのＢＳＡ／ＨＩＶ−２結合体を、実施例１ｂ）に記載した方法によって１００μＬのビーズに結合させた。
・１２μｇのＢＳＡ／ＨＩＶ−２結合体を、先行技術の方法（Ｂａｓｔｏｓ−Ｇｏｎｚａｌｅｚのプロトコル１、実施例１ｄ）参照）によって１００μＬのビーズに結合させた。
ＢＳＡ／ＨＩＶ−２ペプチドを有する得られた磁性ビーズを以下に「ＢＳＡ／ＨＩＶ−２ビーズ」と称する。
【００４９】
ａ３）暴露抗原
上記ａ１）で使用したのと同じ、必須免疫優性エピトープを含有する２７ＡＡのペプチド、即ち、ＨＩＶ−２のｇｐ３６のへプタペプチドＣＡＦＲＱＶＣを、ホモ二官能価試薬ビス（スルホスクシニミル）スベレートの補助によって、共有結合によってＢｉｏｚｙｍｅからのアルカリ性ホスファターゼ（以下に「ＡＬＰ」と称する）に結合させた。得られたＨＩＶ−２ペプチド／ＡＬＰ結合体を以下に「ペプチド／ＡＬＰ」と称する。
【００５０】
ａ４）信号の検出
アルカリ性ホスファターゼに特異的なジオキセタンに基づく基質を使用して暴露を得る。信号は、フランスのＢｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手可能なＡｃｃｅｓｓ（登録商標）光度計で読み取る。信号は、ＲＬＵ（相対発光単位）で表される。
【００５１】
ａ５）試料
陰性ヒト血清で稀釈した抗ＨＩＶ−２抗体に陽性のヒト血清（ｑｃ１、ｑｃ２、ｑｃ３）、および抗ＨＩＶ抗体に陰性の血清（Ｃ０）を使用して、アッセイを行った。
【００５２】
ｂ）アッセイプロトコル
２つの系列を、平行して行った。
ｂ１）５０μＬの血清を、本発明の共有結合プロトコルによって得た５０μｇのＢＳＡ／ＨＩＶ−２ビーズ、および３５０μＬのペプチド／ＡＬＰ結合体に接触させた。混合物を３７℃で２０分間インキュベーションし、次に、ビーズを磁化によって分離し、上澄みを除去した。
２００μＬの基質を添加し、３７℃で５分間インキュベーションした。
示度を取り、ＲＬＵを記録した。結果を、「信号／Ｃ０」ＲＬＵ比率として表す（表ＩＶ参照）。
【００５３】
ｂ２）５０μＬの血清を、Ｂａｓｔｏｓ−Ｇｏｎｚａｌｅｚのプロトコル１によって得た５０μｇのＢＳＡ／ＨＩＶ−２ビーズ、および３５０μＬのペプチド／ＡＬＰ結合体に接触させた。
プロトコルの残りは、上記の手順ｂ１）と同じである。
【００５４】
ｃ）結果および先行技術との比較
本発明の結合によって得た結果、およびプロトコル１の結合によって得た結果を、表ＩＶに示す。
【００５５】
【表４】
0004746810.tif 000005
【００５６】
結果は、陽性試料に関して、本発明のプロトコルによって得た「信号／Ｃ０」比率は、先行技術のプロトコル１によって得た比率より顕著に高いことを示している。これは、かなり高い免疫反応性および高い分析感度（ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）を意味し、本発明の結合法は、プロトコル１と比較して最適な共有結合を付与することを極めて明確に示している。
【００５７】
実施例４
本発明のＢＳＡ／ＨＩＶ−２結合体で被覆した磁性カルボキシルラテックスビーズ（ＢＳＡ／ＨＩＶ−２ビーズ）における安定性試験
長期安定性試験（＋４℃において７ヶ月、１２ヶ月、および１８ヶ月）を、実施例３のプロトコルを使用して、ＢＳＡ／ＨＩＶ−２ビーズ（実施例３において初期バッチ４７７のビーズから得たバッチＣ７Ｐ１８４Ａ、上記参照）に関して行った。表Ｖは得られた結果を要約するものであり、バッチは、＋４℃で１８ヶ月において免疫反応性を有意に失わなかったことを示している。下記表Ｖに示す結果において、「信号／Ｃ０」という表現は、表示のために省略形「Ｓ／Ｃ０」で置き換えられている。
【００５８】
【表５】
0004746810.tif 000006
【００５９】
本発明の方法は、経時において高安定性を有する親和性試薬（カルボキシル基によって官能化された疎水性固相に固定されている）の複合体を生じることをこれらの結果は明確に示している。
【００６０】
実施例５
磁性カルボキシルラテックスビーズへの核酸の共有結合
ａ）材料および方法
５×ＳＳＣおよび２×ＳＳＣ緩衝剤を、Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｔ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８２）に記載されている方法によって調製する。
５’位においてアミン基で官能化されたプローブ（ＤＮＡ）は、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒからの市販試薬アミノリンク２を使用して自動合成装置によって得られ、これを以下に５’−ＮＨ２プローブと称する。
【００６１】
使用されるアナライトはＲＮＡまたはＤＮＡである。プローブ結合の性能特性を、ＢｅｃｋｍａｎからのＡｃｃｅｓｓ（登録商標）装置で、サンドイッチ交雑フォーマットにおいて評価した。
アナライト特異的ＤＮＡプローブを、下記ｂ）に記載されるプロトコルによって、磁性粒子に結合させる。それは、アナライトを捕獲する働きをする（捕獲プローブ）。
暴露は、標識されたアナライト特異的検出プローブ（第一プローブと異なる）の補助によって、例えば酵素アルカリ性ホスファターゼを使用して、当業者に既知の方法で行う。
【００６２】
プローブの非放射能標識の例は、フランス特許第７８．１０９７５号、Ｍ．Ｓ．Ｕｒｄｅａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．，２４，１９９１，１９７−２００、またはＲ．Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｐｅｓｃａｄｏｒ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２６，１９８８，１９３４−１９３８に記載されている。
磁性カルボキシルラテックスビーズへの核酸の共有結合の収率は、実施例１のように、ＨＰＬＣによって、核酸に適合させた条件、例えば、固定相（Ｃ１８）および移動相（緩衝剤Ａの勾配：１０−２Ｍトリエチルアンモニウムアセテート、および緩衝剤Ｂ：アセトニトリル／Ａ：９５／５）において、測定される。
【００６３】
ｂ）  磁性カルボキシルラテックスビーズへの５’−ＮＨ２プローブの共有結合２０μｇの５’−ＮＨ２プローブ（即ち、５’位にＮＨ２基を有するプローブ）を、実施例ｂ１）と同じ条件において、２００μＬのＥｓｔａｐｏｒ  Ｍ１−０７０／６０磁性カルボキシルラテックズビーズに結合させる。
次に、ビーズを、５００μＬの５×ＳＳＣ緩衝液で２回および５００μＬの２×ＳＳＣ緩衝液で２回洗浄する。それらを、０．０２％のＮａＮ３を含有する２×ＳＳＣ緩衝液中に維持する。
【００６４】
交雑アッセイ：捕獲および検出プローブとアナライトとの交雑は、別々に（２段階）または同時に（１段階）、特にＬａｎｇｈａｌｅおよびＭａｌｃｏｌｍ，Ｇｅｎｅ，３６，１９８５，２０１−２１０、Ｒａｎｋｉら、Ｇｅｎｅ，２１，１９９３，７７−８５、ＤｕｎｎおよびＨａｓｓｅｌ、Ｃｅｌｌ，１２，１９７７，２３−３６、またはＲａｎｋｉおよびＳｏｄｅｒｌｕｎｄらの米国特許第４４８６５３９号および第４５６３４１９号に記載されている方法の１つによって行うことができる。
【００６５】
当業者は、容易に交雑実験を再現し、本発明の結合法と先行技術の結合法とを比較することができる。言及されうる先行技術の結合方法の例は、よく知られている方法、特に受動吸着または共有結合によって（Ｃｏｏｋら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１６，１９８８，４０７７−４０９５；Ｎａｇａｔａら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，１８３，１９８５，３７９−３８２；Ｍ．Ｌｏｎｇｌａｒｕら、欧州特許４２０２６０Ａ２号；Ｔ．Ｇｉｎｇｅｒａｓら、欧州特許第２７６３０２号；Ｅ．ＫｏｒｎｅｓおよびＬ．Ｍ．Ｋｏｒｎｅｓ，欧州特許第４４６２６０号）、固体支持体に捕獲プローブを固定する方法である。
【図面の簡単な説明】
【図１】  Ｔ０における対照溶液（磁性ビーズに結合していないアッセイ）を使用して得たピークを示すクロマトグラム
【図２】  セクションｂ１）に記載した共有結合の終了時にＴ０＋１時で採取した上澄みを使用して得たピークを示すクロマトグラム
【図３】  セクションｂ２）に記載した受動結合の終了時にＴ０＋１時で採取した上澄みを使用して得たピークを示すクロマトグラム
【図１】
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【図２】
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【図３】
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