(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a)配列番号：1で示されるアミノ酸配列中、1-95のアミノ酸配列からなるポリペプチドおよび(b)上記(a)の1-95のアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入
、置換または付加されたアミノ酸配列からなり且つ血小板の産生誘導活性を有するポリペプチドからなる群から選ばれる少なくとも1種を有効成分として含有する医薬組成物。
【請求項２】
(a)配列番号：3で示されるアミノ酸配列中、1-86のアミノ酸配列からなるポリペプチドおよび(b)上記(a)の1-86のアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入
、置換または付加されたアミノ酸配列からなり且つ血小板の産生誘導活性を有するポリペプチドからなる群から選ばれる少なくとも1種を有効成分として含有する医薬組成物。
【請求項３】
請求項1および2に記載のポリペプチドからなる群から選択される少なくとも1種を有効成
分として含有する血小板産生誘導剤。
【請求項４】
請求項1および2に記載のポリペプチドからなる群から選択される少なくとも1種を有効成
分として含有する血小板産生機構を研究するための研究用試薬。
【請求項５】
請求項1および2に記載のポリペプチドからなる群から選択される少なくとも1種の存在下
に骨髄細胞を培養し、産生される血小板を採取することを特徴とする血小板の製造方法。
【請求項６】
請求項1および2に記載のポリペプチドからなる群から選択される少なくとも1種と巨核球
分化誘導因子との存在下にlin-細胞を培養し、産生される血小板を採取することを特徴とする血小板の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血小板産生誘導活性を有するポリペプチドを有効成分とする医薬組成物、上記ポリペプチドを利用した血小板の製造方法、および上記ポリペプチドの発現を誘導する化合物のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
血小板は、出血時の止血に関わる重要な生体成分である。血液中には、血液1 μL当たり約15万〜40万個の血小板が常時生産、分解のバランスのもとに維持されている。しかしながら、種々の原因により血液中の血小板数が1〜5万個程度に減少する場合がある。この場合、全身的に出血傾向となり、歯肉出血、鼻血、血尿、脳出血、内臓出血などに注意を払わなければならない。この血小板の減少状態は、臨床上重大であり、そのような患者では速やかに血液中の血小板量を正常範囲に回復させる処置が要望される。血小板の減少をきたす場合の例としては、がん治療における化学療法剤の投与、血小板減少を伴う疾患、手術、事故などによる出血時などが挙げられる。
【０００３】
このような血小板の減少をきたす場合の処置としては、体外から血小板を補充する方法（血小板輸血）、および生体内における血小板の産生量を上げる方法が考えられる。前者における輸血のための血小板の確保は、当然のことながら人的支援に依存している。後者に関しては、後述するように、直接または間接的に血小板産生を促す種々の物質が報告されている。
【０００４】
血小板は巨核球が胞体突起形成を経て産生されるものであり、該巨核球は造血組織である骨髄において、造血幹細胞から分化成熟した細胞である。上記造血幹細胞から巨核球への分化を促進する物質(巨核球分化誘導因子)および巨核球から直接血小板の産生を誘発する物質(胞体突起形成因子)が、生体内に存在することは知られており、該物質の働きにより生体内の血小板の量が恒常的に保たれている。巨核球分化誘導因子としては、代表的にはトロンボポエチン(Thrombopoietin; TPO)が知られている。該TPOは、造血幹細胞から巨核球への分化を誘導する作用を有しているのみならず、巨核球の生存維持に働くことが知られており、常時血液中に一定量生産され維持されている。また、胞体突起形成因子としては、セルグリシン、アンチスロンビンIIIなどが知られている。これらは、直接巨核球に作用し胞体突起形成を誘導する作用を有すると言われている。
【０００５】
このように、血小板産生を促す種々の物質は既に報告されているが、本発明はこれらの既知物質とは異なる新しい血小板増加作用を有する物質を提供することを目的とする。
【０００６】
一方、ケモカインと呼ばれる一連の生理活性ポリペプチドは、炎症時に種々の組織において発現されることが知られている。該ケモカインは、炎症部位への免疫担当細胞の遊走を誘導する活性(chemotactic activity)を有し、炎症部位の生体防御或いは修復に重要な役割を担っている。ケモカインは、その有するアミノ酸配列から数種のサブファミリーに分けることができる。CCL27（別名CTAC, ILC, ALP, Eskine）は、CCモチーフを特徴とするCCサブファミリーに属するケモカイン中の一つの代表例である。該CCL27は、精巣、心臓、肝臓および皮膚においてその発現が確認されている。また、骨髄中の顆粒球、T細胞、B細胞に対しては遊走活性を示さないことが報告されている。しかし、該CCL27と血小板との関連についての報告は皆無であり、勿論これが血小板産生能を有することは従来知られていない(非特許文献1、2および3参照)。
【非特許文献１】バイオケミカル  アンド  バイオフィジカル  リサーチ  コミュニケイション(Biochemical and Biophysical Research Communication) , 1999年, 258巻, p737-740
【非特許文献２】フェブス  レター(FEBS Letter), 1999年, 460巻, p544-548
【非特許文献３】プロシーデイング  オブ  ナショナル  アカデミー  オブ  サイエンス(Proceedings of National Academy of Science) 1999年, 96巻, p14470-14475
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、血小板の減少を伴う種々の疾患の治療及び予防に、また外傷などによる緊急時の血小板の供給に有効な、生体内における血小板の産生を促す医薬組成物、並びにインビトロ(in vitro)における血小板の製造方法を提供することにある。
【０００８】
また本発明の他の目的は、血小板産生誘導活性を有するポリペプチドを誘導する候補化合物のスクリーニング方法、該スクリーニングのためのキット、血小板産生に係る分子の同定や該分子の作用機構の解明などに有用な試薬を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、鋭意研究の結果、従来ケモカインとして認識されているCCL27が、血小板産生誘導活性を有することを見出した。
【００１０】
本発明は、該知見を基礎として更に研究を重ねた結果完成されたものであり、下記項1-10に示す発明を提供する。
【００１１】
項1．(a)配列番号：1で示されるアミノ酸配列中、1-95のアミノ酸配列からなるポリペプチドおよび(b)上記(a)の1-95のアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列からなり且つ血小板の産生誘導活性を有するポリペプチドからなる群から選ばれる少なくとも1種を有効成分として含有する医薬組成物。
【００１２】
項2．(a)配列番号：3で示されるアミノ酸配列中、1-86のアミノ酸配列からなるポリペプチドおよび(b)上記(a)の1-86のアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列からなり且つ血小板の産生誘導活性を有するポリペプチドからなる群から選ばれる少なくとも1種を有効成分として含有する医薬組成物。
【００１３】
項3．以下の(c)、(d)および(e)のポリヌクレオチドからなるDNA分子の発現物であり且つ血小板産生誘導活性を有する発現物からなる群から選ばれる少なくとも1種の発現物を有効成分として含有する医薬組成物：
(c)配列番号：2で示されるDNA配列のポリヌクレオチド、
(d)上記(c)のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし得且つ血小板の産生誘導活性を有するポリペプチドを発現可能なポリヌクレオチド、
(e)上記(c)のポリヌクレオチドと70％以上相同するDNA配列を有し且つ血小板の産生誘導活性を有するポリペプチドを発現可能なポリヌクレオチド。
【００１４】
項4．以下の(c)、(d)および(e)のポリヌクレオチドからなるDNA分子の発現物であり且つ血小板産生誘導活性を有する発現物からなる群から選ばれる少なくとも1種の発現物を有効成分として含有する医薬組成物：
(c)配列番号：4で示されるDNA配列のポリヌクレオチド、
(d)上記(c)のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし得且つ血小板の産生誘導活性を有するポリペプチドを発現可能なポリヌクレオチド、
(e)上記(c)のポリヌクレオチドと70％以上相同するDNA配列を有し且つ血小板の産生誘導活性を有するポリペプチドを発現可能なポリヌクレオチド。
【００１５】
項5．項1および2に記載のポリペプチド並びに項3および4に記載の発現物からなる群から選択される少なくとも1種を有効成分として含有する血小板産生誘導剤。
【００１６】
項6．項1および2に記載のポリペプチド並びに項3および4に記載の発現物からなる群から選択される少なくとも1種を有効成分として含有する血小板産生機構を研究するための研究用試薬。
【００１７】
項7．項1および2に記載のポリペプチド並びに項3および4に記載の発現物からなる群から選択される少なくとも1種の存在下に骨髄細胞を培養し、産生される血小板を採取することを特徴とする血小板の製造方法。
【００１８】
項8．項1および2に記載のポリペプチド並びに項3および4に記載の発現物からなる群から選択される少なくとも1種と巨核球分化誘導因子との存在下にlin-細胞を培養し、産生される血小板を採取することを特徴とする血小板の製造方法。
【００１９】
項9．項1および2に記載のポリペプチドを産生する能力を有するかもしくは項3および4に記載のポリヌクレオチドを発現可能な細胞を被検化合物の存在下に培養し、培養物中の項1および2に記載のポリペプチドまたは項3および4に記載のポリヌクレオチドの発現物もしくは転写物を検出し、被検化合物の非存在下に培養した同細胞培養物中の同検出値を基準値として、該基準値を上回る検出値を与える被検化合物を血小板産生誘導活性を有するポリペプチドを誘導する候補化合物として選択することを特徴とする血小板産生誘導活性を有するポリペプチドを誘導する候補化合物のスクリーニング方法。
【００２０】
項10．項1および2に記載のポリペプチドを産生する能力を有するかもしくは項3および4に記載のポリヌクレオチドを発現可能な細胞を必須構成成分として含有する、項9に記載の血小板産生誘導活性を有するポリペプチドを誘導する候補化合物をスクリーニングするためのスクリーニングキット。
【００２１】
本明細書におけるアミノ酸、ペプチド、塩基配列、核酸などの略号による表示は、IUPAC-IUBの規定〔IUPAC-IUB Communication on Biological Nomenclature, Eur. J. Biochem., 138: 9 (1984)〕、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作成のためのガイドライン」(特許庁編)および当該分野における慣用記号に従うものとする。
【００２２】
本明細書において遺伝子とは、2本鎖DNAのみならず、それを構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖という各1本鎖DNAを包含する趣旨であり、またその長さに制限されるものではない。従って、本発明の遺伝子(DNA分子)には、特に言及しない限り、ヒトゲノムDNAを含む2本鎖DNAおよびcDNAを含む1本鎖DNA(センス鎖)並びに該センス鎖と相補的な配列を有する1本鎖DNA(アンチセンス鎖)およびそれらの断片のいずれもが含まれる。
【００２３】
また、本明細書において、遺伝子(DNA分子)は、機能領域の別を問うものではなく、発現抑制領域、コード領域、リーダ配列、エキソンおよびイントロンのいずれか少なくともひとつを含むことができる。ポリヌクレオチドには、RNAおよびDNAが含まれる。DNA分子には、cDNA、ゲノムDNAおよび合成DNAが含まれる。特定アミノ酸配列を有するポリペプチドおよびこれをコードするポリヌクレオチドには、それらの断片、同族体、誘導体および変異体が含まれる。
【００２４】
ポリヌクレオチドの変異体(変異体DNA)には、天然に存在するアレル変異体；天然に存在しない変異体；欠失、置換、付加および挿入がなされた変異体などが含まれる。但し、これらの変異体は、変異前のポリヌクレオチドがコードするポリペプチドの機能と実質的に同じ機能を有するポリペプチドをコードするものとする。
【００２５】
ポリペプチドの変異(アミノ酸配列の改変)は、天然において生じるもの、例えば突然変異、翻訳後の修飾などにより生じるものである必要はなく、天然由来の遺伝子(例えば本発明のCCL27遺伝子)を利用して人為的に生じさせたものであってもよい。上記ポリペプチドの変異体は、アレル体、ホモログ、天然の変異体などであって、少なくとも80％、好ましくは95％以上、より好ましくは99％以上が、変異前のポリペプチドと相同するものが含まれる。
【００２６】
前記変異体DNAは、これによりコードされるアミノ酸についてサイレント(変異した核酸配列によってコードされるアミノ酸残基に変化はない)であるかまたは保存的である。保存的なアミノ酸置換の例は次のとおりである。
元のアミノ酸残基          保存的な置換アミノ酸残基
Ala                        Ser
Arg                        Lys
Asn                        Gln, His
Asp                        Glu
Cys                        Ser
Gln                        Asn
Glu                        Asp
Gly                        Pro
His                        AsnまたはGln
Ile                         LeuまたはVal 
Leu                        IleまたはVal
Lys                        Arg, AsnまたはGlu
Met                        LeuまたはIle
Phe                        Met, LeuまたはTyr
Ser                        Thr
Thr                        Ser
Trp                        Tyr
Tyr                        TrpまたはPhe
Val                        IleまたはLeu。
【００２７】
一般にシスティン残基をコードする1またはそれ以上のコドンは、特定のポリペプチドのジスフィド結合に影響を与える。
【００２８】
蛋白の特性に変化を与えると一般的に考えられるアミノ酸残基の置換には、以下のものが含まれる。
a) 親水性残基、例えばSerまたはThrが、疎水性残基、例えばLeu、Ile、Phe、ValまたはAlaに対して置換され得る、
b) CysまたはProは、これら以外の各種アミノ酸残基に対して置換され得る、
c) 電気的陽性側鎖を有するアミノ酸残基、例えばLys、Arg、Hisは、電気的陰性のアミノ酸残基、例えばGluまたはAspによって置換され得る、
d) 非常に大きな側鎖を有するアミノ酸残基、例えばPheは、Glyのような側鎖を有しないアミノ酸残基と置換され得る。
【００２９】
(1)  本発明医薬組成物の有効成分とするポリペプチド
本発明医薬組成物において有効成分とするポリペプチド(および本発明研究用試薬、製造方法およびスクリーニング方法におけるポリペプチド)(以下、単に「本発明ポリペプチド」という)は、(a)配列番号：1で示されるアミノ酸配列中1-95のアミノ酸配列からなるか、或いは(b)上記1-95のアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列からなり且つ血小板産生誘導活性を有するポリペプチドである。
【００３０】
本発明ポリペプチドの代表例としては、後記実施例に示されるマウス由来のCCL27(以下「mCCL27」ということがある)を挙げることができる。該CCL27のDNA配列は、配列番号：2に示す通りであり(全長405 bp)、その蛋白質コード領域(360bp)に該当するアミノ酸配列は、配列番号：1に示すとおり120アミノ酸配列からなる。但し、該アミノ酸配列中、N末端側の25個のアミノ酸配列(-25〜-1)は、シグナルペプチド配列であり、mCCL27の活性本体は、シグナルペプチド配列の切断された残りの95個(1-95)のアミノ酸残基からなる。該mCCL27は、マウスの皮膚、心臓、肝臓、精巣などにその発現が観察されている(非特許文献1など参照)。
【００３１】
本発明ポリペプチドmCCL27のアミノ酸配列は、非特許文献1に記載されている。しかしながら、非特許文献1には、該mCCL27がケモカインとしての作用を有することを報告するものであり、該mCCL27が血小板産生誘導作用を有することに関する記載はない。従来、ケモカインの作用と血小板産生誘導作用との関連についての報告はなく、ケモカインが血小板産生誘導作用を有することを示唆する報告も皆無である。該mCCL27が血小板産生誘導作用を有することは本発明者らが初めて見出したものである。
【００３２】
本発明ポリペプチドには、上述したmCCL27の有するアミノ酸配列(配列番号：1中の1-95アミノ酸配列)と一定の相同性を有するポリペプチドが包含される。
【００３３】
該相同性は、例えば約55％以上であるのがよい。但し、かかる一定の相同性を有するアミノ酸配列のポリペプチドは、配列番号：1で示されるアミノ酸配列のポリペプチドと実質的に同質の血小板産生誘導活性を有する必要がある。ここで、実質的に同質とは、その活性が性質的に(例えば生理化学的にまたは薬理学的に)同じであることを示すものであり、活性の程度や蛋白質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
【００３４】
相同性を有するポリペプチドには、mCCL27とは異なる他の哺乳動物種の細胞に由来するもの、特に単球、マクロファージなどの造血系細胞；B細胞、T細胞などの免疫担当細胞；線維芽細胞などに由来するもの、あるいは皮膚、心臓、肝臓、精巣などの組織を起源とするものが包含される。上記において他の哺乳動物種としては、ヒトが好ましいが、特にこれに限定されず、例えばヒト、ウマ、ヒツジ、ウシ、イヌ、サル、ネコ、クマ、ラット、ウサギなどを例示できる。
【００３５】
相同性を有する本発明ポリペプチドの具体例としては、ヒト由来のCCL27(以下このものを「hCCL27」ということがある)を挙げることができる。hCCL27のDNA配列は、配列番号：4に示す通りであり(全長469 bp)、その蛋白質コード領域(336bp)に該当するアミノ酸配列は、配列番号：3に示すとおり112アミノ酸配列からなる。該アミノ酸配列中、N末端側の26個のアミノ酸配列(-26〜-1)は、シグナルペプチド配列であり、hCCL27の活性本体は、シグナルペプチド配列の切断された残りの86個(1-86)のアミノ酸残基からなる。hCCL27とmCCL27とのアミノ酸配列およびDNA配列における相同性は、アミノ酸配列で約57％、DNA配列で約71％である。
【００３６】
尚、ポリペプチド(またはポリヌクレオチド)の相同性は、配列分析ソフトウェア、例えばFASTAプログラムを使用した測定(Clustal,V., Methods Mol.Biol., 25, 307-318 (1994))によって解析することができる。相同性検索において最も好ましく簡便な方法は、コンピューターにより読取り可能な媒体(例えば、フレキシブルディスク、CD-ROM、ハードディスクドライブ、外部ディスクドライブ、DVDなど)中に配列を記憶させ、次いで記憶された配列を使用して、よく知られた検索手段に従い既知の配列データベースを検索する方法を例示することができる。既知の配列データベースの具体例には、以下のものが含まれる。
・DNA Database of Japan(DDBJ)(http://www.ddbj.nig.ac.jp/);
・Genebank (http://www.ncbi.nlm. nih.gov/web/Genebank/Index.htlm); および
・the European Molecular Biology Laboratory Nucleic Acid Sequence Database (EMBL) (http://www.ebi.ac.uk/ebi docs/embl db.html)。
【００３７】
相同性解析には、多数の検索アルゴリズムが当業者に利用可能である。その一例としては、BLASTプログラムと称されるプログラムが挙げられる。このプログラムには5つのBLAST手段がある。そのうちの3つ(BLASTN、BLASTXおよびTBLASTX)は、ヌクレオチド配列の照会用に設計されたものである。残りの2つ(BLASTPおよびTBLASTN)は、蛋白質配列の照会用に設計されたものである(Coulson, Trends in Biotechnology, 12: 76-80 (1994); Birren, et al., Genome Analysis, 1: 543-559 (1997))。
【００３８】
更に追加的なプログラム、例えば、配列アライメントプログラム、より遠縁の配列を同定するためのプログラムなどが、同定された配列の分析のために当技術分野において利用可能である。
【００３９】
また、本発明ポリペプチドには、前記(b)として示す「上記(a)の1-95のアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換また付加されたアミノ酸配列からなり且つ血小板の産生誘導活性を有するポリペプチド」が包含される。該(b)として示すポリペプチドにおけるアミノ酸の改変、即ち「欠失、挿入、置換または付加」の程度およびそれらの位置は、改変されたアミノ酸配列のポリペプチドが、配列番号：1で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと同質の機能を有する同効物であれば特に制限されない。上記改変の程度は、通常1から数個程度であるのが好ましい。ここで同質とは、上記した意味であり、また機能とは血小板産生誘導活性を意味する。
【００４０】
血小板産生誘導活性とは、血小板産生能を有する細胞に血小板の産生を誘導させる作用をいう。上記血小板産生能を有する細胞には、典型的には骨髄細胞中に存在する巨核球、または骨髄細胞(lin-細胞)中に存在する、巨核球の分化前段階の細胞であって、時間的経過を経れば必然的に巨核球に分化成熟する細胞(幹細胞)が含まれる。また該血小板産生能を有する細胞の範疇には、例えば血小板産生能を有する巨核球系の株化細胞も含まれる。
【００４１】
血小板産生誘導活性は、本発明ポリペプチドの存在下に培養した血小板産生誘導能を有する細胞によって培養液中に産生された血小板を、例えば細胞解析装置により測定することにより求めることができる。
【００４２】
(2)  本発明医薬組成物の有効成分とする発現物
本発明医薬組成物において有効成分とするDNA分子の発現物(および本発明研究用試薬、製造方法およびスクリーニング方法に利用するものを含む)(以下、単に「発現物」という)は、遺伝子産物であり、(c)配列番号：2または4で示されるDNA配列のポリヌクレオチド、(d)上記(c)のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドおよび(e)上記(c)のポリヌクレオチドと70%以上相同するDNA配列を有し且つ血小板産生誘導活性を有するポリペプチドを発現可能なポリヌクレオチドである。
【００４３】
(d)として示す「上記(c)のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし且つ血小板産生誘導活性を有するポリペプチドを発現可能なポリヌクレオチド」における「ストリンジェントな条件」とは、50℃〜60℃において0.1％SDSを含む0.2×SSC中でハイブリダイズし、50℃〜60℃において0.1％SDSを含む1×SSC中での洗浄によっても脱離しない条件をいう。
【００４４】
これらのポリヌクレオチドにおける「血小板産生誘導活性を有するポリペプチドを発現可能な」とは、これらのポリヌクレオチドを挿入した組換え体発現ベクターを保有する形質転換体が、その発現物として本発明ポリペプチド(mCCL27, hCCL27など)を発現することをいう。
【００４５】
(3)本発明医薬組成物および血小板産生誘導剤
本発明医薬組成物は、本発明ポリペプチドまたは本発明発現物(以下、この両者を単に「本発明ポリペプチド」という)をその有効成分とすることに基づいて、例えば血小板の著しく減少することが知られている疾患に対して、体外的に或いは直接生体内で血小板を補充することによって、該疾患の治療および予防(進展防止)効果を発揮する。即ち、本発明医薬組成物は、血小板産生誘導剤として有効である。
【００４６】
該疾患には、例えば再生不良性貧血、急性白血病、慢性白血病の急転期、巨赤芽性貧血、特発性血小板減少性紫斑病(ITP)、全身性エリテマトーデス、薬物投与による血小板減少症、血栓性血小板減少性紫斑病(TTP)、播種性血管内凝固症候群(DIC)、保存血大量輸血、Banti症候群、悪性貧血、肝硬変症、histiocytosis症、Boeck's類肉腫、溶血性尿毒症症候群、放射線障害、骨髄異形症候群、発作性夜間血色素尿症、悪性リンパ腫、骨髄癌転移脾機能亢進症、敗血症、結核症、サルコイドーシス、血管腫などが含まれる。また、本発明医薬組成物は、例えば、抗がん剤などの投薬治療による骨髄抑制の結果生じる血小板の減少状態に対して、更に手術時、事故などによる出血の結果生じる血小板の不足した状態に対して、その改善効果を発揮することができる。
【００４７】
(4)本発明研究用試薬
現在知られている血小板の産生機構は、背景技術の項に記載したとおりである。即ち、血液幹細胞から種々の生理活性蛋白質の作用により分化成熟した巨核球が、胞体突起形成を経て血小板を産生することが知られている。この際、巨核球の分化成熟に関与する分子としては、トロンボポイエチン、SCF（stem cell factor）、IL-3などが知られており、また血小板産生を直接促す分子としてセルグリシン、アンチスロンビンIIIなどの報告がある。しかしながら、血小板減少を伴う疾患における骨髄抑制機構は未だ完全には解明されておらず、これらの疾患における血小板産生機構の異常、該異常と骨髄抑制機構との関連などについての研究、解析は、血小板減少を伴う疾患の治療を行う面でも重要である。
【００４８】
本発明はこのような血小板産生機構を研究するための研究用試薬、即ち本発明ポリペプチドを有効成分として含有する血小板機能を研究するための研究用試薬を提供する。
【００４９】
本発明試薬を利用した血小板産生機構の研究は、例えば以下の如くして実施される。インビトロ骨髄細胞培養系に本発明試薬(本発明ポリペプチド)を添加後、本発明ポリペプチドに対する抗体を用いて本発明ポリペプチドを除去し、得られる培養上清が血小板産生誘導活性を残存していれば、該培養上清中には本発明ポリペプチドの有する血小板産生誘導活性によって液性分子が遊離してきたことが判る。血小板誘導活性を指標にして該液性分子を解析すれば、血小板産生に関わる関連分子を単離することができ、そのような分子が単離できれば、一連の血小板産生機構と該機構に関与していると考えられる分子の解明ができる。
【００５０】
また、本発明ポリペプチドのケモカインとしてのレセプターは、CCR10であることが既に報告されており、血小板産生誘導に関わるシグナル伝達経路も同様のレセプターを介している可能性が高いと考えられる。従って、このレセプターに対する活性を指標として、例えば骨髄細胞群における本発明ポリペプチドの血小板産生に関わる第一ステップとしての標的細胞を予想することができる。即ち、本レセプターを発現する細胞を特定、単離し、該細胞を本発明ポリペプチドの存在下で培養して、発現が変動する遺伝子群を解析することによって、候補遺伝子の絞り込みを行うことができる。さらに、上記絞り込みができれば、健常人および上述した血小板減少に関連する患者にそれぞれ由来する骨髄細胞を比較することによって、血小板産生機構に関与している分子、および該分子の関与する血小板産生機構を予測することができる。また、上記候補遺伝子に対する中和抗体、RNAi、アンチセンスなどを前記培養系に添加することによって血小板産生が抑制されれば、該物質が血小板産生機構に何らかの役割を担っていることが示唆され、また血小板減少を伴う各種疾患の原因物質として該物質を同定することができる。
【００５１】
尚、上述した本発明研究用試薬を利用した培養系での試験において、培養上清中からの液性分子の単離は、常法に従うことができる。例えば、蛋白沈澱剤による処理(塩析法)、透析法、等電点沈殿法、エタノールに代表される有機溶媒沈殿法、限外濾過、等電点電気泳動または分子篩クロマトグラフィー(ゲル濾過)、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーなどのカラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)、これらの組合せなどによって液性分子を単離できる。必要に応じて、純度確認などのためにSDSポリアクリルアミド電気泳動、ポリアクリルアミド電気泳動、キャピラリー電気泳動などを行うこともできる。目的レセプターを発現する細胞の特定および解析には、例えばレセプター結合試験、RT-PCR、ノーザンブロット解析、in situハイブリダイゼーションなどの一般的手法を採用できる。細胞の単離分析には、セルソーター、セルアナライザーなどを適宜使用することができる。また、遺伝子の解析には、DNAチップ、DNA解析装置などを好適に使用することができる。
【００５２】
また、本発明試薬の利用によれば、個体或は組織における本発明ポリペプチドの発現の検出や、該発現のための遺伝子の変異(欠失や点変異)乃至発現異常の検出も可能である。かかる異常分子が同定されれば、血小板減少を伴う疾患における骨髄抑制機構の解明、診断に好適に利用できる。
【００５３】
(5)本発明ポリペプチドをコードする遺伝子
本発明ポリペプチドをコードする遺伝子(以下「本発明遺伝子」という)につき詳述する。
【００５４】
本発明遺伝子は、具体的には配列番号：1で示されるアミノ酸配列をコードする配列番号：2の塩基配列を含む遺伝子、該配列番号：2で示される塩基配列の全部またはその相補鎖を含むポリヌクレオチドからなる遺伝子、配列番号：3で示されるアミノ酸配列をコードする配列番号：4の塩基配列を含む遺伝子、および該配列番号：4で示される塩基配列の全部またはその相補鎖を含むポリヌクレオチドからなる遺伝子として示されるが、特にこれらに限定されることなく、例えば上記特定のアミノ酸配列において一定の改変を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子や、上記特定のアミノ酸配列や塩基配列と一定の相同性を有する遺伝子であってもよい。
【００５５】
前記特定のアミノ酸配列や塩基配列と一定の相同性を有するとは、アミノ酸配列で55％以上、塩基配列で70％以上の相同性を挙げることができる。
【００５６】
本発明遺伝子には、また、配列番号：1または3で示されるアミノ酸配列において1または数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列(改変されたアミノ酸配列)をコードするDNA配列を含む遺伝子が含まれる。上記「アミノ酸の欠失、挿入、置換または付加」の程度およびそれらの位置は、改変された蛋白質が、配列番号：1または3で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと同質の血小板産生誘導活性があれば特に制限されない。
【００５７】
さらに、本発明遺伝子には、例えば配列番号：1に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするDNA配列の相同物も含まれる。上記「相同物」とは、本発明遺伝子と配列相同性を有し、構造的特徴並びに遺伝子発現パターンにおける共通性および生物学的機能の類似性より、ひとつの遺伝子ファミリーと認識される一連の関連遺伝子を意味し、これにはアレル体(対立遺伝子)も当然に含まれる。
【００５８】
アミノ酸配列の改変(変異)などは、天然において、例えば突然変異や翻訳後の修飾などにより生じることもあり、また天然由来の遺伝子(例えば本発明のmCCL27遺伝子)に基づいて人為的に改変することもできる。本発明遺伝子は、このような改変、変異の原因および手段などを問わず、上記特性を有する全ての改変遺伝子を包含する。
【００５９】
上記の人為的手段としては、例えばサイトスペシフィック・ミュータゲネシス〔Methods in Enzymology, 154, 350, 367-382 (1987)；同 100, 468 (1983)；Nucleic Acids Res., 12, 9441 (1984)；続生化学実験講座1「遺伝子研究法II」、日本生化学会編, p105 (1986)〕などの遺伝子工学的手法；リン酸トリエステル法、リン酸アミダイト法などの化学合成手段〔J. Am. Chem. Soc., 89, 4801 (1967); 同91, 3350 (1969); Science, 150, 178 (1968); Tetrahedron Lett., 22, 1859 (1981); 同24, 245 (1983)〕およびそれらの組合せ方法などが例示できる。より具体的には、DNAの合成は、ホスホルアミダイト法またはトリエステル法による化学合成によることもでき、市販されている自動オリゴヌクレオチド合成装置上で行うこともできる。二本鎖断片は、相補鎖を合成し、適当な条件下で該相補鎖を化学合成した一本鎖とアニーリングさせるか、または適当なプライマー配列と共にDNAポリメラーゼを用いて該相補鎖を化学合成した一本鎖に付加するかによって得ることができる。
【００６０】
本発明遺伝子(例えばmCCL27遺伝子)の具体的一態様である配列番号：2で示される塩基配列を有する遺伝子のDNA配列は、配列番号：1で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの各アミノ酸残基をコードする各コドンの一つの組合せ例である。本発明遺伝子は、かかる特定の配列を有するDNA分子に限らず、各アミノ酸残基に対して任意のコドンを組合せ、選択したDNA配列を有する分子であってもよい。コドンの選択は、常法に従うことができ、例えば利用する宿主のコドン使用頻度などを考慮することができる〔Nucleic Acids Res., 9, 43 (1981)〕。
【００６１】
また、本発明遺伝子は、前記のとおり、配列番号：2または4で示されるDNA配列と一定の相同性を有するDNA配列からなるものも包含する。この相同性を有する本発明遺伝子としては、配列番号：2で示される塩基配列と少なくとも70％の同一性を有するポリヌクレオチドおよびその相補鎖を挙げることができる。
【００６２】
(6)本発明遺伝子の製造
本発明遺伝子は、本明細書に開示された本発明遺伝子の具体例についての配列情報に基づいて、一般的遺伝子工学的手法により容易に製造および取得することができる〔Molecular Cloning 2d Ed, Cold Spring Harbor Lab. Press (1989)；続生化学実験講座「遺伝子研究法I、II、III」、日本生化学会編(1986)など参照〕。
【００６３】
該製造は、具体的には、本発明遺伝子が発現される適当な起源より、常法に従ってcDNAライブラリーを調製し、該ライブラリーから本発明遺伝子に特有の適当なプローブや抗体を用いて所望クローンを選択することにより実施できる〔Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 78, 6613 (1981)；Science, 222, 778 (1983)など〕。
【００６４】
上記において、cDNAの起源としては、本発明遺伝子を発現する各種細胞、組織、これらに由来する培養細胞などを例示することができる。これら起源からの全RNAの分離、mRNAの分離および精製、cDNAの取得およびそのクローニングなどは、いずれも常法に従って実施することができる。mRNAまたはcDNAライブラリーは市販されてもおり、本発明遺伝子の製造は、それら市販のmRNAまたはcDNAライブラリー、例えばクローンテック社(Clontech Lab.Inc.)などより市販の各種mRNAまたはcDNAライブラリー、特にヒトリンパ球系細胞または単球、マクロファージ系細胞のmRNAまたはcDNAライブラリーなどを用いて実施することもできる。
【００６５】
cDNAのライブラリーからの本発明遺伝子のスクリーニングは、通常の方法に従うことができる。具体的方法としては、例えばcDNAによって産生される蛋白質に対して、該蛋白質の特異抗体を使用した免疫的スクリーニングにより対応するcDNAクローンを選択する方法、目的のDNA配列に選択的に結合するプローブを用いたプラークハイブリダイゼーション法、コロニーハイブリダイゼーション法など、およびこれらの組合せを例示することができる。
【００６６】
用いられるプローブとしては、本発明遺伝子のDNA配列に関する情報をもとにして化学合成されたDNAなどが一般的であるが、既に取得された本発明遺伝子およびその断片も上記プローブとして有利に利用できる。本発明遺伝子のDNA配列情報に基づき設定したセンス・プライマーおよびアンチセンス・プライマーを、スクリーニング用プローブとして用いることもできる。
【００６７】
プローブとして用いられるヌクレオチドは、配列番号：2または4に対応する部分ヌクレオチドであって、少なくとも15個の連続したDNA、好ましくは少なくとも100個の連続したDNA、より好ましくは少なくとも150個の連続したDNA、更に好ましくは少なくとも200個の連続したDNAを有するものである。前記した本発明遺伝子の製造のための陽性クローン自体もプローブとして用いることができる。
【００６８】
本発明遺伝子の取得に際しては、PCR法〔Science, 230, 1350 (1985)〕によるDNA/RNA増幅法が好適に利用できる。殊に、ライブラリーから全長のcDNAが得難い場合には、RACE法〔Rapid amplification of cDNA ends；実験医学、12(6), 35 (1994)〕、特に5'-RACE法〔M.A. Frohman, etal., Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 8, 8998 (1988)〕などを採用するのが好ましい。
【００６９】
PCR法の実施に用いられるプライマーは、本発明によって明らかにされた本発明遺伝子の配列情報に基づいて適宜設定でき、常法に従って合成できる。尚、PCR法で増幅させたDNA/RNA断片の単離精製は、常法に従い、例えばゲル電気泳動法などによることができる。
【００７０】
上記で得られる本発明遺伝子或いは各種DNA断片は、常法、例えばジデオキシ法〔Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 74, 5463 (1977)〕、マキサム-ギルバート法〔Methods in Enzymology, 65, 499 (1980)〕などに従って、また簡便には市販のシークエンスキットなどを用いて、そのDNA配列を決定することができる。
【００７１】
本発明遺伝子(一部または全部のDNA配列)の利用によれば、個体もしくは各種組織における本発明遺伝子の発現の有無を特異的に検出することができる。この検出は、常法に従って実施できる。該方法には、例えばRT-PCR〔Reverse transcribed-Polymerase chain reaction; E.S. Kawasaki, et al., Amplification of RNA. In PCR Protocol, A Guide to methods and applications, Academic Press, Inc., SanDiego, 21-27 (1991)〕によるRNA増幅、ノーザンブロッティング解析〔Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Lab. (1989)〕、in situ RT-PCR〔Nucl. Acids Res., 21, 3159-3166 (1993)〕、in situハイブリダイゼーションなどを利用した細胞レベルでの測定、およびNASBA法〔Nucleic acid sequence-based amplification, Nature, 350, 91-92 (1991)〕が含まれる。RT-PCRによる検出は特に好適である。
【００７２】
尚、PCR法を採用する検出に用いられるプライマーとしては、本発明遺伝子のみを特異的に増幅できる該遺伝子に特有のものである限り特に制限はない。該プライマーは、本発明遺伝子の配列情報に基いて適宜設定することができる。通常、該プライマーとしては、10-40ヌクレオチド程度、好ましくは20-30ヌクレオチド程度の長さを有する本発明遺伝子の部分配列を用いることができる。本発明遺伝子には、かかる本発明遺伝子を検出するための特異プライマーおよび／または特異プローブとして使用されるDNA断片もまた包含される。
【００７３】
該DNA断片は、配列番号：2で示される塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAとして規定することができる。ここで、ストリンジェントな条件とは、50〜60℃において0.1％SDSを含む0.2×SSC中でハイブリダイズし、プライマーまたはプローブが用いられる通常の条件、具体的には前述したような50〜60℃において0.1%SDSを含む1×SSC中での洗浄によっても脱離しない条件をいう。
【００７４】
(7)本発明ポリペプチドの遺伝子工学的製造
本発明ポリペプチド(本発明発現物を含む、以下同じ)は、本発明により提供される本発明遺伝子の配列情報に基づいて、通常の遺伝子組換え技術〔例えば、Science, 224, 1431 (1984) ; Biochem. Biophys. Res. Comm., 130, 692 (1985)；Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 80, 5990 (1983)など参照〕に従って、該遺伝子の発現物(本発明発現物)またはこれを含む蛋白質として、容易に、大量に且つ安定して製造することができる。より詳細には、所望のポリペプチドをコードする遺伝子が宿主細胞中で発現できる組換えDNA(発現ベクター)を作製し、これを宿主細胞に導入して形質転換し、該形質転換体を培養し、次いで得られる培養物から目的蛋白質を回収することにより、本発明ポリペプチド(本発明発現物)を得ることができる。
【００７５】
宿主細胞としては、原核生物および真核生物のいずれも用いることができる。例えば原核生物の宿主は、大腸菌、枯草菌などの一般的に用いられるもののいずれでもよい。好適には大腸菌、とりわけエシェリヒア・コリ(Escherichia coli)K12株を利用できる。真核生物の宿主細胞には、脊椎動物、酵母などの細胞が含まれる。前者としては、例えばサルの細胞であるCOS細胞〔Cell, 23: 175 (1981)〕、チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞およびそのジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損株〔Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 77: 4216 (1980)〕などが、後者としては、サッカロミセス属酵母細胞などが好適に用いられる。勿論、これらに限定される訳ではない。
【００７６】
原核生物細胞を宿主とする場合は、該宿主細胞中で複製可能なベクターを用いて、このベクター中に本発明遺伝子が発現できるように該遺伝子の上流にプロモーターおよびSD(シャイン・アンド・ダルガーノ)配列、更に蛋白合成開始に必要な開始コドン(例えばATG)を付与した発現プラスミドを好適に利用できる。上記ベクターとしては、一般に大腸菌由来のプラスミド、例えばpBR322、pBR325、pUC12、pUC13などがよく用いられるが、これらに限定されず既知の各種のベクターを利用することができる。大腸菌を利用した発現系に利用される上記ベクターの市販品としては、例えばpGEX-4T(Amersham Pharmacia Biotech社)、pMAL-C2，pMAL-P2(New England Biolabs社)、pET21，pET21/lacq(Invitrogen社)、pBAD/His(Invitrogen社)などを例示できる。
【００７７】
脊椎動物細胞を宿主とする場合の発現ベクターとしては、通常、発現しようとする本発明遺伝子の上流に位置するプロモーター、RNAのスプライス部位、ポリアデニル化部位および転写終了配列を保有するものが挙げられる。該発現ベクターは更に必要により複製起点を有していてもよい。該発現ベクターの具体例としては、例えばSV40の初期プロモーターを保有するpSV2dhfr〔Mol. Cell. Biol., 1: 854 (1981)〕などが例示できる。上記以外にも既知の各種の市販ベクターを用いることができる。動物細胞を利用した発現系に利用されるベクターの市販品としては、例えばpEGFP-N，pEGFP-C(Clontech社)、pIND(Invitrogen社)、pcDNA3.1/His(Invitrogen社)などの動物細胞用ベクター、pFastBac HT(GibcoBRL社)、pAcGHLT(Pharmingen社)、pAc5/V5-His，pMT/V5-His，pMT/Bip/V5-his(以上Invitrogen社)などの昆虫細胞用ベクターなどが挙げられる。
【００７８】
また、酵母細胞を宿主とする場合の発現ベクターの具体例としては、例えば酸性ホスフアターゼ遺伝子に対するプロモーターを有するpAM82〔Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 80: 1 (1983)〕などが例示できる。市販の酵母細胞用発現ベクターには、例えばpPICZ(Invitrogen社)、pPICZα(Invitrogen社)などが包含される。
【００７９】
プロモーターとしても特に限定なく、エッシェリヒア属菌を宿主とする場合は、例えばトリプトファン(trp)プロモーター、lppプロモーター、lacプロモーター、recAプロモーター、PL/PRプロモーターなどを好ましく利用できる。宿主がバチルス属菌である場合は、SP01プロモーター、SP02プロモーター、penPプロモーターなどが好ましい。酵母を宿主とする場合のプロモーターとしては、例えばpH05プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーターなどを好適に利用できる。また、動物細胞を宿主とする場合の好ましいプロモーターとしては、SV40由来のプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、SRαプロモーターなどを例示できる。
【００８０】
尚、本発明遺伝子の発現ベクターとしては、通常の融合蛋白発現ベクターも好ましく利用できる。該ベクターの具体例としては、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)との融合蛋白として発現させるためのpGEX(Promega 社)などを例示できる。
【００８１】
成熟ポリペプチドのコード配列が宿主細胞からのポリペプチドの発現、分泌を助けるポリヌクレオチド配列としては、分泌配列(シグナル配列)、リーダ配列などが知られている。これらの配列には、細菌宿主に対して融合成熟ポリペプチドの精製に使用されるマーカー配列 (ヘキサヒスチジン・タグ、ヒスチジン・タグ)、哺乳動物細胞の場合はヘマグルチニン(HA)・タグが含まれる。本発明ポリペプチド(本発明発現物)は、上記既知のシグナル配列などを有する発現系を利用して製造することもできる。
【００８２】
所望の組換えDNA(発現ベクター)の宿主細胞への導入法およびこれによる形質転換法としては、特に限定されず、一般的な各種方法を採用することができる。
【００８３】
得られる形質転換体は、常法に従い培養でき、該培養により所望のように設計した遺伝子によりコードされる目的蛋白質が、形質転換体の細胞内、細胞外または細胞膜上に発現、生産(蓄積、分泌)される。
【００８４】
該培養に用いられる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種のものを適宜選択して利用できる。培養も宿主細胞の生育に適した条件下で実施することができる。
【００８５】
得られる組換え蛋白質(本発明ポリペプチド、本発明発現物)は、所望により、その物理的性質、化学的性質などを利用した各種の分離操作〔「生化学データーブックII」、1175-1259 頁、第1版第1刷、1980年 6月23日株式会社東京化学同人発行；Biochemistry, 25(25), 8274 (1986); Eur. J. Biochem., 163, 313 (1987)など参照〕により分離、精製できる。
【００８６】
該方法としては、具体的には、通常の再構成処理、蛋白沈澱剤による処理(塩析法)、透析法、等電点沈殿法、エタノールに代表される有機溶媒沈殿法、遠心分離、浸透圧ショック法、超音波破砕、限外濾過、分子篩クロマトグラフィー(ゲル濾過)、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーなどの各種クロマトグラフィーまたは高速液体クロマトグラフィー(HPLC)、或いはこれらの組合せが例示できる。特に好ましい方法としては、本発明ポリペプチドに対する特異的な抗体を結合させたカラムを利用したアフィニティクロマトグラフィーなどを例示することができる。
【００８７】
尚、本発明ポリペプチドをコードする遺伝子の設計に際しては、配列番号：2で示される本発明遺伝子のDNA配列を利用することができる。該遺伝子は、所望により、各アミノ酸残基を示すコドンを適宜選択変更して利用することも可能である。
【００８８】
また、本発明遺伝子によりコードされるアミノ酸配列において、その一部のアミノ酸残基乃至アミノ酸配列を置換、挿入、欠失、付加などにより改変する場合には、例えばサイトスペシフィック・ミュータゲネシスなどの前記した各種方法を採用することができる。
【００８９】
(8)本発明ポリペプチドの化学合成
本発明ポリペプチドは、配列番号：1または3に示すアミノ酸配列情報に従って、一般的な化学合成法により製造することができる。該方法には、通常の液相法および固相法によるペプチド合成法が包含される。
【００９０】
ペプチド合成法は、より詳しくは、アミノ酸配列情報に基づいて、各アミノ酸を1個ずつ逐次結合させて鎖を延長させていく所謂ステップワイズエロンゲーション法と、アミノ酸数個からなるフラグメントを予め合成し、次いで各フラグメントをカップリング反応させるフラグメント・コンデンセーション法とを包含する。本発明ポリペプチドの合成は、そのいずれによってもよい。
【００９１】
ペプチド合成に採用される縮合法も常法に従うことができる。例えばアジド法、混合酸無水物法、DCC法、活性エステル法、酸化還元法、DPPA(ジフェニルホスホリルアジド)法、DCC＋添加物(1-ヒドロキシベンゾトリアゾール、N-ヒドロキシサクシンアミド、N-ヒドロキシ-5-ノルボルネン-2，3-ジカルボキシイミドなど)法、ウッドワード法などに従うことができる。
【００９２】
これら各方法に利用される溶媒も、この種ペプチド縮合反応に使用されることの知られている一般的なものから適宜選択することができる。その例としては、例えばジメチルホルムアミド(DMF)、ジメチルスルホキシド(DMSO)、ヘキサホスホロアミド、ジオキサン、テトラヒドロフラン(THF)、酢酸エチルなどおよびこれらの混合溶媒などを挙げることができる。
【００９３】
尚、上記ペプチド合成反応に際して、反応に関与しないアミノ酸乃至ペプチドにおけるカルボキシル基は、一般にはエステル化により、例えばメチルエステル、エチルエステル、第3級ブチルエステルなどの低級アルキルエステル、例えばベンジルエステル、p-メトキシベンジルエステル、p-ニトロベンジルエステルなどのアラルキルエステルなどとして保護することができる。
【００９４】
また、側鎖に官能基を有するアミノ酸、例えばチロシン残基の水酸基は、アセチル基、ベンジル基、ベンジルオキシカルボニル基、第3級ブチル基などで保護してもよいが、必ずしもかかる保護を行う必要はない。更に、例えばアルギニン残基のグアニジノ基は、ニトロ基、トシル基、p-メトキシベンゼンスルホニル基、メチレン-2-スルホニル基、ベンジルオキシカルボニル基、イソボルニルオキシカルボニル基、アダマンチルオキシカルボニル基などの適当な保護基により保護することができる。
【００９５】
保護基を有するアミノ酸、ペプチドおよび最終的に得られる本発明ポリペプチドにおけるこれら保護基の脱保護反応もまた、慣用される方法、例えば接触還元法や、液体アンモニア／ナトリウム、フッ化水素、臭化水素、塩化水素、トリフルオロ酢酸、酢酸、蟻酸、メタンスルホン酸などを用いる方法などに従って実施することができる。
【００９６】
かくして得られる本発明ポリペプチドは、前記した各種の方法、例えばイオン交換樹脂、分配クロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィー、向流分配法などのペプチド化学の分野で汎用される方法に従って、適宜精製することができる。
【００９７】
(9)本発明ポリペプチドを含む医薬組成物の調製
本発明医薬組成物は、有効成分とする本発明ポリペプチド(例えばCCL27)の有する血小板産生誘導活性に基づいて、血小板の減少を伴う種々の疾患に対して有用である。また、血小板が不足した状態に対する処置にも利用することができる。更に、事故その他による生体損傷時における多量出血によって緊急的に血小板の補充を必要とする場合においても有効に利用することができる。
【００９８】
本発明医薬組成物は、本発明ポリペプチドからなる群から選ばれる少なくとも1種の発現物を有効成分とする。該有効成分とするポリペプチドには、その医薬的に許容される塩も含まれる。該塩には、当業界で周知の方法により調製される、例えばナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、マグネシウム、バリウム、アンモニウムなどの無毒性アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩などが含まれる。更に上記塩には、本発明ポリペプチドと適当な有機酸乃至無機酸との反応による無毒性酸付加塩も包含される。代表的無毒性酸付加塩としては、例えば塩酸塩、塩化水素酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、酢酸塩、蓚酸塩、吉草酸塩、オレイン酸塩、ラウリン酸塩、硼酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、リン酸塩、p-トルエンスルホン酸塩(トシレート)、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、スルホン酸塩、グリコール酸塩、マレイン酸塩、アスコルビン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ナプシレートなどが例示される。
【００９９】
本発明医薬組成物は、本発明ポリペプチドおよびそれらの塩からなる群から選ばれる少なくとも1種を活性成分として、それらの薬学的有効量を、適当な医薬担体乃至希釈剤と共に含有させて医薬製剤形態に調製される。
【０１００】
該医薬製剤の調製に利用される医薬担体としては、製剤形態に応じて通常使用される、充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤などの希釈剤或は賦形剤を例示できる。これらは得られる製剤の投与単位形態に応じて適宜選択使用される。特に好ましい医薬製剤は、通常の蛋白製剤などに使用される各種の成分、例えば安定化剤、殺菌剤、緩衝剤、等張化剤、キレート剤、pH調整剤、界面活性剤などを適宜使用して調製される。
【０１０１】
上記において安定化剤としては、例えばヒト血清アルブミンや通常のL-アミノ酸、糖類、セルロース誘導体などを例示できる。これらは単独でまたは界面活性剤などと組合せて使用できる。特にこの組合せによれば、有効成分の安定性をより向上させ得る場合がある。
【０１０２】
L-アミノ酸としては、特に限定はなく、例えばグリシン、システイン、グルタミン酸などのいずれでもよい。
【０１０３】
糖類としても、特に限定はなく、例えばグルコース、マンノース、ガラクトース、果糖などの単糖類；マンニトール、イノシトール、キシリトールなどの糖アルコール；ショ糖、マルトース、乳糖などの二糖類；デキストラン、ヒドロキシプロピルスターチ、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸などの多糖類などおよびそれらの誘導体などを使用できる。
【０１０４】
界面活性剤としても、特に限定はなく、イオン性および非イオン性界面活性剤のいずれも使用できる。その具体例としては、例えばポリオキシエチレングリコールソルビタンアルキルエステル系、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系、ソルビタンモノアシルエステル系、脂肪酸グリセリド系などを使用できる。
【０１０５】
セルロース誘導体としても、特に限定はなく、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムなどを使用できる。
【０１０６】
上記糖類の添加量は、有効成分1μg当り約0.0001mg程度以上、好ましくは約0.01-10mg程度の範囲とするのが適当である。界面活性剤の添加量は、有効成分1μg当り約0.00001mg程度以上、好ましくは約0.0001-0.01mg程度の範囲とするのが適当である。ヒト血清アルブミンの添加量は、有効成分1μg当り約0.0001mg程度以上、好ましくは約0.001-0.1mg程度の範囲とするのが適当である。L-アミノ酸の添加量は、有効成分1μg当り約0.001-10mg程度とするのが適当である。また、セルロース誘導体の添加量は、有効成分1μg当り約0.00001mg程度以上、好ましくは約0.001-0.1mg程度の範囲とするのが適当である。
【０１０７】
本発明医薬製剤中に含まれる有効成分の量は、広範囲から適宜選択される。通常、製剤中に約0.00001-70重量％、好ましくは0.0001-5重量％程度が含まれる量とするのが適当である。
【０１０８】
本発明医薬製剤中には、また各種の添加剤、例えば緩衝剤、等張化剤、キレート剤などをも添加することができる。緩衝剤としては、ホウ酸、リン酸、酢酸、クエン酸、ε-アミノカプロン酸、グルタミン酸および／またはそれらに対応する塩(例えばそれらのナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ金属塩やアルカリ土類金属塩)などを例示できる。等張化剤としては、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム、糖類、グリセリンなどを例示できる。またキレート剤としては、例えばエデト酸ナトリウム、クエン酸などを例示できる。
【０１０９】
本発明医薬製剤は、溶液製剤として調製できる他に、これを凍結乾燥し保存し得る状態にした後、用時水、生理的食塩水などを含む緩衝液などで溶解して適当な濃度に調製される凍結乾燥剤形態とすることも可能である。
【０１１０】
本発明医薬製剤の投与単位形態は、医療目的に応じて適宜選択できる。その代表例には、錠剤、丸剤、散剤、粉末剤、顆粒剤、カプセル剤などの固体投与形態および溶液、懸濁剤、乳剤、シロップ、エリキシルなどの液剤投与形態が含まれる。これらは更に投与経路に応じて経口剤、非経口剤、経鼻剤、経膣剤、坐剤、舌下剤、軟膏剤、経肺投与剤などに分類され、それぞれ通常の方法に従い、調合、成形乃至調製することができる。
【０１１１】
例えば、錠剤の形態に成形するに際しては、上記製剤担体として例えば乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、尿素、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、ケイ酸、リン酸カリウムなどの賦形剤；水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン溶液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどの結合剤；カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウムなどの崩壊剤；ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリドなどの界面活性剤；白糖、ステアリン、カカオバター、水素添加油などの崩壊抑制剤；第4級アンモニウム塩基、ラウリル硫酸ナトリウムなどの吸収促進剤；グリセリン、デンプンなどの保湿剤、デンプン、乳糖、カオリン、ベントナイト、コロイド状ケイ酸などの吸着剤；精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ酸末、ポリエチレングリコールなどの滑沢剤などを使用できる。
【０１１２】
更に錠剤は必要に応じ通常の剤皮を施した錠剤、例えば糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶被錠、フィルムコーティング錠とすることができ、また二重錠ないしは多層錠とすることもできる。
【０１１３】
丸剤の形態に成形するに際しては、製剤担体として例えばブドウ糖、乳糖、デンプン、カカオ脂、硬化植物油、カオリン、タルクなどの賦形剤；アラビアゴム末、トラガント末、ゼラチン、エタノールなどの結合剤；ラミナラン、カンテンなどの崩壊剤などを使用できる。
【０１１４】
カプセル剤は、常法に従い通常活性成分を上記で例示した各種の製剤担体と混合して硬質ゼラチンカプセル、軟質カプセルなどに充填して調製される。
【０１１５】
経口投与用液体投与形態は、慣用される不活性希釈剤、例えば水、を含む医薬的に許容される溶液、エマルジョン、懸濁液、シロップ、エリキシルなどを包含し、更に湿潤剤、乳剤、懸濁剤などの助剤を含ませることができ、これらは常法に従い調製される。
【０１１６】
非経口投与用の液体投与投与形態、例えば滅菌水性乃至非水性溶液、エマルジョン、懸濁液などへの調製に際しては、希釈剤として例えば水、エチルアルコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルおよびオリーブ油などの植物油などを使用でき、また注入可能な有機エステル類、例えばオレイン酸エチルなどを配合できる。これらには更に通常の溶解補助剤、緩衝剤、湿潤剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤、分散剤などを添加することもできる。滅菌は、例えばバクテリア保留フィルターを通過させる濾過操作、殺菌剤の配合、照射処理および加熱処理などにより実施できる。また、これらは使用直前に滅菌水や適当な滅菌可能媒体に溶解することのできる滅菌固体組成物形態に調製することもできる。
【０１１７】
坐剤や膣投与用製剤の形態に成形するに際しては、製剤担体として、例えばポリエチレングリコール、カカオ脂、高級アルコール、高級アルコールのエステル類、ゼラチンおよび半合成グリセライドなどを使用できる。
【０１１８】
ペースト、クリーム、ゲルなどの軟膏剤の形態に成形するに際しては、希釈剤として、例えば白色ワセリン、パラフイン、グリセリン、セルロース誘導体、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、シリコン、ベントナイトおよびオリーブ油などの植物油などを使用できる。
【０１１９】
経鼻または舌下投与用組成物は、周知の標準賦形剤を用いて、常法に従い調製することができる。
【０１２０】
経肺投与剤は、前述した各種液剤形態の本発明医薬製剤を凍結乾燥により粉末化するか、該工程において必要に応じてアミノ酸、糖などの安定化剤、吸入時の粒子系などを考慮した安定化剤を利用して、通常のこの種経肺投与剤と同様にして調製することができる。
【０１２１】
尚、本発明薬剤中には、必要に応じて着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤などや他の医薬品などを含有させることもできる。
【０１２２】
上記医薬製剤の投与方法は、特に制限がなく、各種製剤形態、患者の年齢、性別その他の条件、疾患の程度などに応じて決定される。例えば錠剤、丸剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤およびカプセル剤は経口投与され、注射剤は単独でまたはブドウ糖やアミノ酸などの通常の補液と混合して静脈内投与され、更に必要に応じ単独で筋肉内、皮内、皮下もしくは腹腔内投与され、坐剤は直腸内投与され、経膣剤は膣内投与され、経鼻剤は鼻腔内投与され、舌下剤は口腔内投与され、経肺投与剤は気管支ないし肺胞内にネブライザーなどを用いて投与され、軟膏剤は経皮的に局所投与される。
【０１２３】
上記医薬製剤中に含有されるべき有効成分の量およびその投与量は、特に限定されず、所望の治療効果、投与法、治療期間、患者の年齢、性別その他の条件などに応じて広範囲より適宜選択される。一般的には、1日当り体重1kg当り、約0.01μg-10mg程度、好ましくは約0.1μg-1mg程度をヒトに投与するのがよく、該製剤は1日に1-数回に分けて投与することができる。
【０１２４】
(10)血小板の製造方法
本発明の血小板の製造方法においては、まず本発明ポリペプチドの存在下に、骨髄細胞を培養する。この培養により骨髄細胞に血小板の産生を誘発させて、培養液中に所望の血小板を産生させる。
【０１２５】
ここで骨髄細胞とは、骨髄腔内に存在する細胞の総称である。具体的には、該骨髄細胞は、造血器官である骨髄本来の造血系細胞(造血幹細胞、該造血幹細胞から種々の分化段階を経て成熟血液細胞へと分化する課程におけるすべての細胞、例えば白血球、赤血球、血小板、単球、好中球、好酸球、好塩基球、リンパ球、T細胞、B細胞など)のみならず、骨髄組織に存在する間葉系細胞およびその幹細胞を包含する。血液細胞は、ミエロイド系細胞としての赤血球、顆粒球、単球/マクロファージ、血小板およびその産生細胞である巨核球を含み、また、リンパ系細胞としてB細胞、T細胞を含んでいる。各成熟細胞は、細胞表面に各細胞特有の分化マーカーを発現しており、幹細胞から分化途上の段階で未だ分化マーカーを発現していない細胞は、一般に「lin-細胞」と呼ばれる。該lin-細胞も当然上記骨髄細胞中に含まれる。
【０１２６】
本発明血小板の製造における骨髄細胞は、上述したように血小板産生細胞である巨核球または分化して巨核球となる幹細胞を含んでいる。本発明方法は、この細胞に本発明ポリペプチドを作用させて、血小板の産生を誘発、産生させるものである。
【０１２７】
また、骨髄細胞は、上記した通りlin-細胞を含むものであるため、該細胞群が存在していれば、必ずしも血小板産生能を有する成熟巨核球が共存している必要はない。但し、このlin-細胞を分化によって巨核球に導くためには、トロンボポエチンなどの巨核球分化誘導因子の存在が必須となる。
【０１２８】
従って、本発明の血小板の製造方法は、本発明ポリペプチドとトロンボポエチンなどの巨核球分化誘導因子との共存下に、lin-細胞を培養する別の態様をも包含する。このlin-細胞の入手方法は、後述するとおりである。
【０１２９】
本発明方法における骨髄細胞は、常法に従って、起源生物から単離することができる。例えばマウスを例にとれば、頚椎脱臼により屠殺した後，大腿骨を摘出し、該大腿骨を消毒用アルコールにて消毒した後、両端を切断する。その一端に培養液を（製造工程に使用する培地としては、通常細胞培養に用いられる培地であればよく、例えば、HBSS[Hank's Balanced Salt Solution] , IMDM, PRMI1640, MEM, BME, 5A, DM120, RITC80-7, F12, L-15, MCDB104などが望ましい）を入れた注射針付シリンジの針を挿入して、培養液を勢いよく骨髄腔内に押し出すことにより、該培養液に随伴させて骨髄細胞を採取することができる。但し、この状態では採取される骨髄細胞中には骨片も混在しているため、該骨髄細胞を上記培地或いは生理食塩水によく懸濁させ、ナイロンメッシュ（例えば100μm径）を通して骨片を除くのが望ましい。上記すべての操作は無菌的に行われるのが望ましい。
【０１３０】
また、本発明におけるlin-細胞の単離は、常法に従って上述した方法によって単離した骨髄細胞から、分化した細胞を除去（分化マーカーを有する細胞を除去）することにより行うことができる。より詳細には、例えば、骨髄細胞に、各成熟血液細胞の各々の分化マーカーに対する抗体を作用させて、成熟血液細胞と該抗体とを結合させた後、該結合体に更に磁気ビーズ結合2次抗体を結合させ、次いで、磁石を用いて結合していない細胞(分化マーカーを有しない細胞、lin-細胞)を単離する。上記操作に使用する抗体としては、例えばマウスにおいては、Bリンパ球に対して抗B220抗体、Tリンパ球に対して抗CD4抗体、抗CD8抗体、顆粒球に対して抗Gr-1抗体、マクロファージに対して抗CD11b抗体、抗F4/80抗体、抗トランスフェリン受容体抗体、赤血球に対して抗TER119抗体などを挙げることができる。磁気ビーズ結合2次抗体としては、例えば、ダイナビーズTM  M-450 (ヒツジ抗マウスIgG抗体でコートされたポリスチレンビーズ、ダイナル(Dynal)社)を例示することができる。
【０１３１】
起源生物は、上記マウスに限らず、例えばヒト、ウマ、ヒツジ、ウシ、イヌ、サル、ネコ、クマ、ラット、ウサギなどであってもよい。これらの内ではヒトが好ましい。ヒトの場合、例えば提供者の腸骨より針刺しにより骨髄細胞を採取することができる。
【０１３２】
本発明の血小板の製造方法において、骨髄細胞乃至lin-細胞としては、上記したように起源生物から単離された細胞(正常細胞)のみならず、株化細胞を使用することも可能である。株化細胞とは、正常巨核球と同様の血小板産生能を有する純化された培養細胞をいう。その具体例としては、MEG-01（入手先: ATCC、Blood, 66, 1384-1392 (1985)）などを挙げることができる。
【０１３３】
骨髄細胞、lin-細胞（株化細胞を含む）の本発明ポリペプチドの存在下における培養は、通常これらの細胞の生育、増殖に適した培地中に、本発明ポリペプチドを10-1000ng/mL程度含有させて、該培地に103〜105個/mL程度の細胞を播種することにより行い得る。
【０１３４】
また、lin-細胞の培養において共存させるトロンボポエチンなどの巨核球分化誘導因子の培地中への添加量は、利用する巨核球分化誘導因子の種類に応じて適宜決定することができる。例えばトロンボポエチンでは約0.001〜10μg/mLの範囲、好適には、約0.01〜1μg/mLの範囲、より好適には約0.1〜1μg /mLの範囲から選択することができる。
【０１３５】
尚、培地中には、必要に応じて、更に細胞(巨核球)の分化に関係する他の生理活性物質、例えばSCF、IL-3などを添加することもできる。これらの生理活性物質を利用する場合、これらは、いずれも生体内で作用し得る既知の濃度範囲で利用することができる。該濃度範囲としては、使用培地における終濃度で、好適には0.1〜10 ng/mL、より好適には1〜5 ng/mLを挙げることができる。
【０１３６】
細胞培養に利用する培地は、通常骨髄細胞、造血系細胞の培養に用いられている各種の培地でよい。該培地の好適な例としては、XVIVO-20 (BioWhittaker; Walkersville, MD, USA), IMDM (Iscove's Modified Dulbecco's Medium),  RPMI1640, MEM, BME (Eagle's Basal Medium), 5A (McCoy's 5A medium), DM120, RITC80-7, F12 (Ham's F12 medium), L-15 (Leubovitz's L-15 Medium), MCDB104などを挙げることができる。
【０１３７】
尚、培養系内には、更に各種動物由来の血清、例えば牛血清、牛胎児血清、ウマ血清などを添加することが望ましい。該血清の濃度は、1-20%の間で状況により適宜選択することができる。好適には約5-20％、より好適には約10-20％の範囲から適宜決定することができる。
【０１３８】
培養温度としては、36-38℃の範囲、好ましくは37℃が採用できる。
【０１３９】
培養時間は、通常1〜7日間、好適には2〜6日間、より好適には3〜4日間とすることができる。
【０１４０】
かくして、培養液中に所望の血小板が産生蓄積される。該血小板は、血小板と他細胞との物理化学的性質、生化学的特徴などの差を利用して、培養液中から分画することができる。より具体的には、遠心分離操作、密度勾配法、ゲルろ過法、フィルター法などにより培養液から分離、回収することができる。培養液中に添加した本発明ポリペプチド、生理活性物質などは、上記遠心分離操作と洗浄操作を繰り返すことによって除去可能である。必要ならば、抗体カラムなどを用いて除去することもできる。
【０１４１】
かくして、回収された血小板は、生体と等張状態において生体内に注入することができる。なお、本発明血小板の製造方法は、得られる血小板が医薬用途に利用されるものであることを考慮して、全工程を通じて無菌的に操作されるのが望ましい。また、得られる血小板は、最終的に無菌ろ過などによって滅菌後、生体内に輸血されるのが望ましい。
【０１４２】
(11)血小板産生誘導活性を有するポリペプチドを誘導する候補化合物のスクリーニング方法およびスクリーニングキット
本スクリーニング方法によってスクリーニングされる候補化合物とは、本発明ポリペプチドの産生を誘導し得る化合物である。本発明はこのような候補化合物をスクリーニングする方法を提供する。
【０１４３】
本スクリーニング方法においては、まず、本発明ポリペプチドを発現可能な細胞を、被検化合物の存在下に培養し、本発明ポリペプチドを検出する。この検出は本発明ポリペプチドの発現レベルを遺伝子レベルもしくは蛋白質レベルで測定することにより行われる。
【０１４４】
ここで使用される細胞としては、本発明ポリペプチドを発現可能なものであれば特に制限はなく、哺乳動物由来の各種細胞、好ましくはヒトまたはマウス由来の細胞を使用することができる。特に、ヒト組織、例えば皮膚、心臓、腎臓、精巣などに由来する細胞は好適である。
【０１４５】
本発明ポリペプチドの発現レベルの測定は、遺伝子レベルでは、本発明ポリペプチドのmRNAレベルの発現を常法に従い、例えばRT-PCR、ドットハイブリダイゼーション、ノーザンブロッテイングなどを用いてモニターすることによって実施できる。RT-PCRにおいて用いられるPCR用プライマーとしては、本発明遺伝子のDNA配列、例えば配列番号：1で示されるDNA配列の配列情報に基づいて設定した任意の位置における任意の部分配列を用いることができる。好ましい部分配列は10-40ヌクレオチド程度、より好ましくは20-30ヌクレオチド程度の長さを有する。尚、RT-PCRにより得られるPCR産物は、ノーザンブロッテイング用プローブとして転用することができる。
【０１４６】
なお、PCR用プライマーとしては、以下に示す配列を有するセンス・プライマーおよびアンチセンス・プライマーを例示することができる。
センス・プライマー:  配列番号：5
アンチセンス・プライマー  配列番号：6
また、発現物(蛋白質)レベルでは、例えばウエスタンブロッテイングを用いて本発明ポリペプチドの発現量(産生量)を求めることができる。更に、蛋白質レベルの測定は、本発明ポリペプチドに対する抗体を利用して、ELISA法、RIA法などに従って実施することもできる。
【０１４７】
本発明方法では、次いで、上記で検出された本発明ポリペプチドの発現レベルを、被検化合物の非存在下に培養した同細胞における本発明ポリペプチドの発現レベル(基準値)と対比して、該発現レベルに上昇が認められる被検化合物を候補化合物として選択する。
【０１４８】
かくして選択される候補化合物は、本発明ポリペプチドを誘導する活性を有するもの、即ち、血小板産生誘導活性を亢進する作用を持つものであり、従って、単独で血小板産生誘導剤乃至増強剤として利用でき、また本発明医薬組成物と組合せて血小板産生誘導増強剤として、医薬品分野で有用であると考えられる。
【０１４９】
本発明は、上述した本発明スクリーニング方法を実施するためのスクリーニングキットをも提供する。
【０１５０】
該スクリーニングキットは、本発明ポリペプチドの産生能を有する細胞をその必須構成成分として含有することが重要であって、他は通常の細胞培養を伴う被検化合物のスクリーニングキットと同様の構成とすることができる。即ち、任意成分として細胞培養液、反応希釈液、遺伝子及び蛋白の検出のための試薬、緩衝液、洗浄液などを含むことができる。また、例えばトロンボポエチンなどの巨核球分化誘導因子、細胞に作用して血小板の産生を誘導させることが知られているその他の生理活性物質、例えばSCF、IL-3などをキットの構成成分とすることも可能である。
【０１５１】
本発明スクリーニングキットの構成の一例としては、(1)皮膚、心臓、腎臓、精巣などの初代培養細胞、(2)これらの細胞を培養するための細胞培養液および(3)PCR用プライマーを含むものを挙げることができる。
【０１５２】
(12)本発明ポリペプチドの相互作用物質など
本発明は、より活性または安定した形態の本発明ポリペプチドの誘導体；またはインビボで本発明ポリペプチドの血小板産生誘導活性を高めるか或いは阻害する薬剤を開発するために、本発明ポリペプチドと相互作用し得る生物学的に活性な他のポリペプチド(構造アナログ、例えば血小板産生誘導活性化剤)；およびそれらの製造法をも提供する。
【０１５３】
構造アナログは、本発明ポリペプチドとの複合体の三次元構造をX線結晶学、コンピューター・モデリングまたはこれらを組み合わせた方法によって決定することができる。また、構造アナログの構造に関する情報は、相同性蛋白質の構造に基づく蛋白質のモデリングによって得ることも可能である。
【０１５４】
活性または安定した形態の本発明ポリペプチドの誘導体を得る方法としては、例えばアラニン・スキャンによって分析する方法を挙げることができる。該方法は、アミノ酸残基をAlaで置換し、ペプチドの活性に対するその影響を測定する方法であり、ペプチドを構成する各アミノ酸残基をこのように分析することによって、当該ペプチドの活性や安定性に重要な役割を担う領域を決定することができる。該方法によって、より活性なまたは安定なポリペプチド誘導体を設計することができる。
【０１５５】
また、機能性アッセイによって選択した標的特異的抗体を単離し、次いでその結晶構造を解析することも可能である。このアプローチにより、続く薬剤の設計の基本となるファーマコア(pharmacore)を得ることができる。
【０１５６】
機能性の薬理学的に活性な抗体に対する抗イディオタイプ抗体を生成させることによって、化学的または生物学的に生成したペプチドのバンクよりペプチドを同定したり単離したりすることが可能である。故に選択されたペプチドもファーマコアとして作用すると予測される。
【０１５７】
上記情報を基に、本発明ポリペプチドの血小板産生誘導活性と従来から知られていた遊走活性との分子構造的関係と両活性の解離、選択性を有する薬剤設計、薬剤開発などを行うことができる。
【０１５８】
本発明ポリペプチドのアミノ酸配列またはDNA配列を基礎として、X線結晶学のような分析研究を行うこともでき、さらに、該X線結晶学に加えてコンピューター・モデリング技術を適応することも可能である。
【０１５９】
本発明では、さらに本発明遺伝子ノックアウト・マウスあるいは変異マウスを作製することによって、本発明ポリペプチドが生体における血小板産生機構にどのように関与しているのかを確認することができる。該方法は、遺伝子の相同組換えを利用して、生物の遺伝情報を意図的に修飾する技術であり、具体的にはマウスの胚性幹細胞(ES細胞)を用いた方法を例示できる(Capecchi, M. R., Science, 244, 1288-1292 (1989))。
【０１６０】
尚、上記変異マウスの作製方法はこの分野の当業者にとって既に通常の技術であり(野田哲生編、実験医学、増刊, 14 (20) (1996)、羊土社)、容易に所望の変異マウスを作製し得る。従って前記技術の適応により、改善された血小板産生誘導活性を有する薬剤を設計・開発することができる。
【発明の効果】
【０１６１】
本発明によれば、血小板産生誘導活性を有するポリペプチドを有効成分とする、血小板減少を伴う各種疾患、手術時、事故などによる出血時などの血小板の不足に対して、血小板を増加させる医薬組成物が提供でき、該組成物は血小板産生誘導剤として有用である。また、本発明によれば、インビトロにおける血小板の製造方法、血小板産生機構を研究するための研究用試薬、血小板産生誘導活性を有するポリペプチドの発現を増加させる化合物のスクリーニング方法などが提供でき、これらは特に医療分野において有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１６２】
以上の本発明を更に詳しく説明するため実施例を挙げる。これらの実施例は、単なる例示目的として記載されており、本発明を限定するものではない。
実施例1
mCCL27による血小板産生誘導作用
この例では、BALB/c系雄性マウスを使用した。図１にその結果を示す各種ケモカインの比較実験のためには、７週齢（21〜26ｇ）で購入し、10週目に使用した。また、図２にその結果を示すCCL27濃度依存性試験用では、７週齢（21〜26ｇ）で購入し、11週目に使用した(いずれも日本チャールズリバーより購入した)。
【０１６３】
マウスを頚椎脱臼により屠殺した後、大腿骨を一匹当たり計2本摘出した。これらの大腿骨を消毒用アルコールにて消毒した後、大腿骨の両端を切断し、その一端にハンクス液(Hanks' Balanced Salt Solution)を入れた23G注射針付シリンジの針を挿入して、該液を骨髄腔内に勢いよく押し出し、他端より骨髄細胞を培養液に随伴させて採取した。その後、得られた骨髄細胞をハンクス液に懸濁させ、100μm孔径のナイロンメッシュを通して混入する骨片を除いて骨髄細胞を調製した。
【０１６４】
得られた骨髄細胞約1.5×107細胞／骨髄(図1に結果を示す各種ケモカインの比較実験のためには、30本(15匹分)を使用した。また、図２に結果を示すCCL27濃度依存性試験用では、20本(10匹分)を使用した)を、適量（懸濁できる位）の0.4% BSA-5mM EDTA/PBS (-) に懸濁させた。懸濁液にラット抗マウスCD4抗体、ラット抗マウスCD8抗体、ラット抗マウスGr-1抗体、ラット抗マウスCD11b抗体、ラット抗マウスMouse Neutrophile Marker抗体、ラット抗マウスF4/80抗体、ラット抗マウスTER119抗体、ラット抗マウスThy1.2抗体、ラット抗マウスB220抗体、ラット抗マウスTransferrin receptor抗体 (ラット抗マウスMouse Neutrophile Marker抗体=CALTAG社、ラット抗マウスF4/80抗体=Serotec社、ラット抗マウスThy1.2抗体およびラット抗マウスB220抗体=CEDERLANE社、その他は全てPharmingen社)を、それぞれ最終濃度2μg/mLになるように加え、氷冷中30分間静置した。その後、細胞を洗浄し、適量の0.4% BSA-5mM EDTA/PBSに懸濁させ、同容量のヒツジ抗ラットIgG-DynabeadsTM M-450(Dynal社)を加え、ローターを用いて穏やかに攪拌した。磁石台を用いて抗体およびビーズの結合していない細胞を回収した。同様の操作を再度繰り返した。この細胞を洗浄後、磁石に装着したLarge Cellカラム(Miltenyi Biotec GmbH社)に細胞を重層し、0.4% BSA-5mM EDTA/PBS (-)でカラムを洗浄した後、通り抜けてきた細胞を回収した。回収した細胞を遠心(270G×5分、4℃)後、10% FBS/IMDM培養液に懸濁させて、lin-細胞を調製した。
【０１６５】
上記で調製したlin-細胞を10%FBS/IMDM培地中に懸濁させ、懸濁物を3×104/100μL/ウエルとなるように96穴プレートに播種した。各ウエルに下記各種のケモカイン(各濃度1μg/mL)(いずれも免疫化学研究所製品)およびトロンボポエチン(TPO, PeproTech社)10ng/mLを加え、これらの存在下に細胞を、温度37℃下に4日間培養した。
<ケモカイン>
・hNAP-2：(neutrophil activating peptide-2)：
別名：PBP，CTAP-III, LA-PF4，β-TG，factor C, CXCL7，
ファミリー：CXCサブファミリー
文献： Oda M, Kurasawa Y, Todokoro K, Nagata Y., "Thrombopoietin-induced CXC chemokines, NAP-2 and PF4, suppress polyploidization and proplatelet formation during megakaryocyte maturation", Genes Cells. 2003 Jan; 8 (1): 9-15.
・mEotaxin：
別名：CCL11，
ファミリー：CCサブファミリー
文献： Menzies-Gow A, Ying S, Sabroe I, Stubbs VL, Soler D, Williams TJ, Kay AB., "Eotaxin (CCL11) and eotaxin-2 (CCL24) induce recruitment of eosinophils, basophils, neutrophils, and macrophages as well as features of early- and late-phase allergic reactions following cutaneous injection in human atopic and nonatopic volunteers", J. Immunol., 2002 Sep 1; 169 (5): 2712-8.
・mMCP-3：（monocyte chemotactic protein-3）：
別名：NC28，CCL7
ファミリー：CCサブファミリー
文献： Dahinden CA, Geiser T, Brunner T, von Tscharner V, Caput D, Ferrara P, Minty A, Baggiolini M., "Monocyte chemotactic protein 3 is a most effective basophil- and eosinophil-activating chemokine", J. Exp. Med., 1994 Feb 1; 179 (2): 751-6.
・mCCL27：
別名：ILC, CTACK，Eskine, ALP，CCL27
ファミリー：CCサブファミリー
文献： Soler D, Humphreys TL, Spinola SM, Campbell JJ., "CCR4 versus CCR10 in human cutaneous TH lymphocyte trafficking", Blood. 2003 Mar 1; 101 (5): 1677-82.
・hENA-78：（epithelial neutrophil activating protein-78）：
別名：CXCL5 
ファミリー：CXCサブファミリー
文献： Koch AE, Kunkel SL, Harlow LA, Mazarakis DD, Haines GK, Burdick MD, Pope RM, Walz A, Strieter RM., "Epithelial neutrophil activating peptide-78: a novel chemotactic cytokine for neutrophils in arthritis", J. Clin. Invest., 1994 Sep; 94 (3): 1012-8.
・hGRO/MGSA：（Growth regulated oncogene/melanoma growth-stimulating activity）：
別名：NAP3，CXCL1
ファミリー： CXCサブファミリー
文献： Jinquan T, Frydenberg J, Mukaida N, Bonde J, Larsen CG, Matsushima K, Thestrup-Pedersen K., "Recombinant human growth-regulated oncogene-alpha induces T lymphocyte chemotaxis. A process regulated via IL-8 receptors by IFN-gamma, TNF-alpha, IL-4, IL-10, and IL-13", J. Immunol., 1995 Dec 1; 155 (11): 5359-68.
・mBLC：（B lymphocyte chemokine）：
別名：BCA-1, CXCL13
ファミリー：CXCサブファミリー
文献： Ishikawa S, Sato T, Abe M, Nagai S, Onai N, Yoneyama H, Zhang Y, Suzuki T, Hashimoto S, Shirai T, Lipp M, Matsushima K., "Aberrant high expression of B lymphocyte chemokine (BLC/CXCL13) by C11b+CD11c+ dendritic cells in murine lupus and preferential chemotaxis of B1 cells towards BLC", J. Exp. Med., 2001 Jun 18; 193 (12): 1393-402.
・hFractalkine：
別名：ABCD-3, CX3CRL1，
ファミリー：CX3Cサブファミリー
文献： Shiraishi K, Fukuda S, Mori T, Matsuda K, Yamaguchi T, Tanikawa C, Ogawa M, Nakamura Y, Arakawa H., "Identification of fractalkine, a CX3C-type chemokine, as a direct target of p53", Cancer Res. 2000 Jul 15; 60 (14): 3722-6.
・mMDC：（macrophage-derived chemokine）：
別名：STCP-1,ABCD-1, CCL22
ファミリー：CCサブファミリー
文献： Godiska R, Chantry D, Raport CJ, Sozzani S, Allavena P, Leviten D, Mantovani A, Gray PW., "Human macrophage-derived chemokine (MDC), a novel chemoattractant for monocytes, monocyte-derived dendritic cells, and natural killer cells", J. Exp. Med., 1997 May 5; 185 (9): 1595-604.
・mExodus-2：
別名：SLC, 6Ckine, TCA4, CCL21
ファミリー：CCサブファミリー
文献： Campbell JJ, Bowman EP, Murphy K, Youngman KR, Siani MA, Thompson DA, Wu L, Zlotnik A, Butcher EC., "6-C-kine (SLC), a lymphocyte adhesion-triggering chemokine expressed by high endothelium, is an agonist for the MIP-3beta receptor CCR7", J. Cell. Biol., 1998 May 18; 141 (4): 1053-9.
培養終了後、各ウエルから細胞をそれぞれ回収し、PE標識抗マウスCD61抗体(ファーミンジェン社)を用いて染色し、染色した細胞を400μL緩衝液(5mM EDTA/0.4%BSAおよびPBS)に懸濁させた後、EPICS XL-MCL（細胞解析装置、ベックマンコールター社製）を用いて懸濁液中の血小板数を測定した。
【０１６６】
尚、コントロールとして、上記においてケモカインを添加することなく、同様にして細胞を培養した群を設けた。
【０１６７】
得られた結果を図1に示す。
【０１６８】
図1はコントロールにおいて求められた血小板数(細胞の血小板産生量)を基準(100)として、各ケモカインを添加して培養した細胞において測定された血小板数の相対値(%)を各ケモカイン毎に示すグラフ（縦軸：コントロールに対する相対％、横軸：各ケモカイン）である。
【０１６９】
図1に示される結果から次のことが明らかである。
【０１７０】
即ち、試験した各種のケモカインの内では特にmCCL27が、コントロールと比較して、有意な血小板産生誘導活性を有することが明らかであり、しかもその活血小板産生量は、コントロールに比して実に1.5倍にも増加することが判明した。
【０１７１】
更に、mCCL27の血小板産生誘導活性の経時変化の観察を以下の通り行った。即ち、上記と同一の培養条件下(mCCL27を1μg/mL濃度で含むウエル中)で細胞を5日間培養し、経時的に細胞を回収し、上記と同様に懸濁処理した後、血小板数を測定した。
【０１７２】
得られた結果を図2に示す。
【０１７３】
図2は、縦軸に血小板数(個)および横軸に培養日数(日)をとり、経時的に求められた血小板数をプロットしたものである。
【０１７４】
図2に示される結果から次のことが明らかである。即ち、血小板産生数は、培養3日以降において、コントロールに比べて有意に増加し、測定日数を経るに従い増加した。
【０１７５】
以上のことから、mCCL27(本発明ポリペプチド)は血小板産生誘導活性を有することが明らかである。
【０１７６】
尚、mCCL27に代えてhCCL27(免疫生物研究所、配列番号：3で示される1-87アミノ酸配列からなるもの)を用いて上記と同一試験を行ったところ、hCCL27もmCCL27と略同様の血小板産生誘導活性を有することが確認された。
【産業上の利用可能性】
【０１７７】
本発明医薬組成物は、血小板減少を伴う各種疾患、手術時、事故などによる出血時の血小板の不足に対して、血小板を増加させる効果を奏するものであり、例えば血小板産生誘導剤として、医療分野において有用である。
【図面の簡単な説明】
【０１７８】
【図１】各種ケモカインの血小板の産生誘導活性を検討した結果を示すグラフである。
【図２】mCCL27の血小板産生に対する経時観察を行った結果を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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