(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ダブルノックアウトにより、ＣＤ９をコードする遺伝子およびＣＤ８１をコードする遺伝子の機能が欠損するＣＤ９／ＣＤ８１二重欠損非ヒト動物からなり、骨形成が阻害された表現形質および慢性閉塞性肺疾患類似の表現形質を有することを特徴とする骨粗鬆症モデル。
【請求項２】
生殖細胞特異的に発現する遺伝子のプロモーターの下流にＣＤ９をコードする遺伝子およびＣＤ８１をコードする遺伝子の少なくともいずれかが導入され、前記生殖細胞においては前記導入されたＣＤ９をコードする遺伝子およびＣＤ８１をコードする遺伝子の少なくともいずれかが機能する請求項１に記載の骨粗鬆症モデル。
【請求項３】
ＣＤ９をコードする遺伝子が下記(ａ)および(ｂ)のいずれかであり、ＣＤ８１をコードする遺伝子が下記(ｃ)および(ｄ)のいずれかである請求項１および請求項２のいずれかに記載の骨粗鬆症モデル。
(ａ)配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ
(ｂ)配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡに相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ
(ｃ)配列番号２に記載の塩基配列からなるＤＮＡ
(ｄ)配列番号２に記載の塩基配列からなるＤＮＡに相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ
【請求項４】
請求項１から３のいずれかに記載の骨粗鬆症モデルの骨形成阻害の程度を測定する工程を含んでなることを特徴とする、該骨粗鬆症モデルの使用方法。
【請求項５】
請求項１から３のいずれかに記載の骨粗鬆症モデルに被験物質に投与し、該被験物質が骨形成阻害を抑制する効果を有するかどうか検定する骨粗鬆症治療薬スクリーニング方法である請求項４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、モデル動物として骨粗鬆症治療薬または慢性閉塞性肺疾患治療薬の開発等に利用できる、ＣＤ９遺伝子およびＣＤ８１遺伝子を欠損した二重欠損非ヒト動物に関する。
【背景技術】  ＣＤ９およびＣＤ８１は、テトラスパニンと呼ばれるタンパク質のファミリーメンバーとして知られている。テトラスパニンはその名が示すとおり、細胞膜を４回貫通する構造を持つスーパーファミリーであり、ほ乳類ではこれまでに約３０のメンバーが知られている。細胞の増殖、運動、融合や癌細胞の浸潤、転移などに関わっているとされているがその機能の詳細は不明であった。しかし最近、ＣＤ８１（例えば非特許文献１参照）やＣＤ９（例えば非特許文献２参照）のノックアウトマウスが作成され、それぞれ抗体・サイトカイン産生の異常と不妊症を示すことから、免疫系や生殖系におけるテトラスパニンの重要性が明らかにされた。
骨粗鬆症は主に閉経後の女性や高齢者に見られる疾患であり、病的骨折や脊椎変形の原因となる。そこで、骨粗鬆症のより有効な治療薬の開発が求められているが、その際の実験モデルとなるモデル動物は少ない。現在骨粗鬆症モデル動物としては、卵巣を摘出したマウスが多用されており、このマウスは、閉経後の女性に多く見られる、エストロゲンの低下による破骨細胞活性亢進型の骨粗鬆症のモデル動物として優れていると考えられている。一方、骨粗鬆症のメカニズムとしては、骨形成に関わる骨芽細胞の活性が低下するいわゆる低回転型のものもあり、このような病態をよく表すモデル動物が求められている。
なお、骨芽細胞による骨形成と前記テトラスパニンとの関係については、その関係は全く不明であった。
一方、閉塞性呼吸機能障害をきたす慢性閉塞性肺疾患（Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅ  Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  Ｄｉｓｅａｓｅ，以下ＣＯＰＤと称することがある）は、胞隔の破壊と気腔の拡大を特徴とする肺気腫と気道分泌物の慢性的な増加を伴う慢性気管支炎とからなるが、しばしばこの両者が混在する。その病態は、喫煙に対する肺への異常な炎症細胞浸潤とタンパク分解酵素の産生である。
ＣＯＰＤは喫煙が発症の大きなリスクファクターであり、その罹患率は世界中で上昇している。ＷＨＯによると、現在ＣＯＰＤは死亡原因の第５位であり、２０２０年には第３位になると予測されている。しかし、ＣＯＰＤの発症メカニズムはまだ明らかではない。また、スモーカーであってもＣＯＰＤを発症するのはその１５−２０％であり、喫煙に対する感受性に個人差があると考えられるが、その科学的な裏付けも十分されていない。
さらに最近、ＣＯＰＤ患者が単に肺のみならず、高率に体重減少や筋力低下、骨粗鬆症などの全身性合併症を併発し、ＡＤＬや呼吸機能の低下を加速することが分かってきた（例えば非特許文献３参照）。ステロイド薬の投与、ビタミンＤ不足、喫煙などがこれら全身性変化の要因と考えられているが、肺外病変の真のメカニズムは不明である。
これまでに肺気腫発症のメカニズム解明や治療法開発のため遺伝子操作マウスが作成され、例えばプロテアーゼの一種であるコラゲナーゼ過剰発現マウスでは肺気腫を生じることが確認されている。ノックアウトマウスとしては、ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄやインテグリンβ６ノックアウトマウスなどでの肺気腫の報告がなされている（例えば非特許文献４および非特許文献５参照）がその数は少なく、またこれらのマウスで骨粗鬆症などの肺外病変を合併するとの報告はない。
【非特許文献１】Ｍａｅｃｋｅｒ  ＨＴ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８５：１５０５−１５１０，１９９７
【非特許文献２】Ｍｉｙａｄｏ  Ｋ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８７：３２１−３２４，２０００
【非特許文献３】Ｂｉｓｋｏｂｉｎｇ  ＤＭ．Ｃｈｅｓｔ  １２１：６０９−６２０，２００２
【非特許文献４】Ｗｅｒｔ  ＳＥ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９７：５９２２−５９７７，２０００
【非特許文献５】Ｍｏｒｒｉｓ  ＤＧ  Ｎａｔｕｒｅ  ４２２：１６９−１７３，２００３
【発明の開示】
本発明は、従来における前記諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、骨粗鬆症および慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の少なくともいずれかの病態をよく表すモデル動物として利用できるＣＤ９／ＣＤ８１二重欠損非ヒト動物、並びに、該非ヒト動物を骨粗鬆症モデル動物およびＣＯＰＤモデル動物の少なくともいずれかとして使用する方法を提供することを目的とする。
発明者らは、テトラスパニンタンパクファミリーのメンバーであるＣＤ９とＣＤ８１の二重欠損マウスを作成し、この変異マウスに骨粗鬆症およびＣＯＰＤが起こるとの知見を得たことにより、本発明に至った。
すなわち本発明の前記課題を解決するための手段は以下の通りである。
＜１＞  少なくとも体細胞において、ＣＤ９をコードする遺伝子およびＣＤ８１をコードする遺伝子の機能が欠損することを特徴とするＣＤ９／ＣＤ８１二重欠損非ヒト動物である。
＜２＞  非ヒト動物が齧歯類動物である前記＜１＞に記載のＣＤ９／ＣＤ８１二重欠損非ヒト動物である。
＜３＞  齧歯類動物がマウスである前記＜２＞に記載のＣＤ９／ＣＤ８１二重欠損非ヒト動物である。
＜４＞  ＣＤ９をコードする遺伝子が下記（ａ）および（ｂ）のいずれかであり、ＣＤ８１をコードする遺伝子が下記（ｃ）および（ｄ）のいずれかである前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載のＣＤ９／ＣＤ８１二重欠損非ヒト動物である。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡに相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ
（ｃ）配列番号２に記載の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）配列番号２に記載の塩基配列からなるＤＮＡに相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ
＜５＞  体細胞および生殖細胞においても、ＣＤ９をコードする遺伝子およびＣＤ８１をコードする遺伝子の機能が欠損する前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載のＣＤ９／ＣＤ８１二重欠損非ヒト動物である。
＜６＞  生殖細胞特異的に発現する遺伝子のプロモーターの下流にＣＤ９をコードする遺伝子およびＣＤ８１をコードする遺伝子の少なくともいずれかが導入され、生殖細胞においてＣＤ９をコードする遺伝子およびＣＤ８１をコードする遺伝子の少なくともいずれかの機能が欠損しない前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載のＣＤ９／ＣＤ８１二重欠損非ヒト動物である。
＜７＞  骨形成が阻害された表現形質および慢性閉塞性肺疾患類似の表現形質の少なくともいずれかを有する前記＜１＞から＜６＞のいずれかに記載のＣＤ９／ＣＤ８１二重欠損非ヒト動物である。
＜８＞  骨粗鬆症モデル動物および慢性閉塞性肺疾患モデル動物の少なくともいずれかである前記＜１＞から＜７＞のいずれかに記載のＣＤ９／ＣＤ８１二重欠損非ヒト動物である。
＜９＞  前記＜１＞から＜７＞のいずれかに記載のＣＤ９／ＣＤ８１二重欠損非ヒト動物の骨形成阻害の程度を測定する工程を含んでなることを特徴とする、該ＣＤ９／ＣＤ８１二重欠損非ヒト動物を骨粗鬆症モデル動物として使用する方法である。
＜１０＞  前記＜１＞から＜７＞のいずれかに記載のＣＤ９／ＣＤ８１二重欠損非ヒト動物に被験物質に投与し、該被験物質が骨形成阻害を抑制する効果を有するかどうか検定する骨粗鬆症治療薬スクリーニング方法である前記＜９＞に記載の方法である。
＜１１＞  前記＜１＞から＜７＞のいずれかに記載のＣＤ９／ＣＤ８１二重欠損非ヒト動物の慢性閉塞性肺疾患類似の表現形質の程度を測定する工程を含んでなることを特徴とする、該ＣＤ９／ＣＤ８１二重欠損非ヒト動物を慢性閉塞性肺疾患モデル動物として使用する方法である。
＜１２＞  前記＜１＞から＜７＞のいずれかに記載のＣＤ９／ＣＤ８１二重欠損非ヒト動物に被験物質に投与し、該被験物質が慢性閉塞性肺疾患を表す表現形質を抑制する効果を有するかどうか検定する慢性閉塞性肺疾患治療薬スクリーニング方法である前記＜１１＞に記載の方法である。
＜１３＞  前記＜１＞に記載のＣＤ９／ＣＤ８１二重欠損非ヒト動物の、骨粗鬆症モデル動物および慢性閉塞性肺疾患モデル動物の少なくともいずれかを製造するための使用である。
【図面の簡単な説明】  図１は、ＣＤ９の全長ＤＮＡ配列を表す。
図２は、ＣＤ８１の全長ＤＮＡ配列を表す。
図３は、ＣＤ９ノックアウトマウス製造のための遺伝子ターゲッティングに関するゲノムＤＮＡ、構築ベクターおよび組換えＤＮＡを表す。
図４は、ＣＤ９サザンブロットの結果を表す。
図５は、ＣＤ９ＰＣＲの結果を表す。
図６は、３０週令の野生型（ｗｉｌｄ）およびＣＤ９／ＣＤ８１二重欠損（ＤＫＯ）マウスの全身骨格のＸ線像である。
図７は、３０週令の野生型（ｗｉｌｄ）およびＣＤ９／ＣＤ８１二重欠損（ＤＫＯ）マウスの大腿骨のＸ線像である。
図８は、３０週令の野生型（ｗｉｌｄ）およびＣＤ９／ＣＤ８１二重欠損（ＤＫＯ）マウスの脊椎のＸ線像である。
図９は、８週令の野生型（ｗｉｌｄ）およびＣＤ９／ＣＤ８１二重欠損（ＤＫＯ）マウスの脛骨近位部における骨組織を、上段がトルイジンブルーおよび下段がＴＲＡＰで染色した結果を表す。
図１０Ａは、８週令の野生型（ｗｉｌｄ）とＣＤ９欠損マウス、ＣＤ８１欠損マウス、ＣＤ９／ＣＤ８１二重欠損（ＤＫＯ）マウス骨のｐＱＣＴ解析結果を表す。
図１０Ｂは、骨量の解析結果を示す。
図１０Ｃは、骨強度の解析結果を示す。
図１１Ａは、８週令の野生型、ＣＤ９欠損（ＣＤ９ＫＯ）マウス、ＣＤ８１欠損（ＣＤ８１ＫＯ）マウス、ＣＤ９／ＣＤ８１ダブルヘテロ（ＣＤ９／ＣＤ８１ＤＨＯ）マウス、ＣＤ９／ＣＤ８１二重欠損ホモ（ＣＤ９／ＣＤ８１ＤＫＯ）マウスの脛骨近位部の形態計測結果のうち、単位骨量を表す。
図１１Ｂは、図１１Ａと同様のマウスの形態計測結果のうち、骨梁幅を表す。
図１１Ｃは、図１１Ａと同様のマウスの形態計測結果のうち、骨梁数を表す。
図１１Ｄは、図１１Ａと同様のマウスの形態計測結果のうち、類骨厚を表す。
図１１Ｅは、図１１Ａと同様のマウスの形態計測結果のうち、類骨面を表す。
図１１Ｆは、図１１Ａと同様のマウスの形態計測結果のうち、骨芽細胞面を表す。
図１１Ｇは、図１１Ａと同様のマウスの形態計測結果のうち、破骨細胞数を表す。
図１１Ｈは、図１１Ａと同様のマウスの形態計測結果のうち、破骨細胞面を表す。
図１２Ａは、８週令の野生型（ｗｉｌｄ）マウス、ＣＤ９欠損（ＣＤ９ＫＯ）マウス、ＣＤ８１欠損（ＣＤ８１ＫＯ）マウスおよびＣＤ９／ＣＤ８１二重欠損（ＤＫＯ）マウスにおけるカルセインアッセイの結果を表す。
図１２Ｂは、カルセインアッセイによる骨形成率を表す。
図１３は、実施例８における、野生型（Ｗｉｌｄ）マウスおよびＣＤ９／ＣＤ８１二重欠損（ＤＫＯ）マウスにおける気腔の拡大と胞隔への炎症細胞浸潤を表す。
図１４は、実施例８における、形態計測による野生型（Ｗｉｌｄ）マウスおよびＣＤ９／ＣＤ８１二重欠損（ＤＫＯ）マウス肺胞腔径の加令変化を表す。
図１５は、実施例８における、野生型（Ｗｉｌｄ）マウスおよびＣＤ９／ＣＤ８１二重欠損マウス（ＤＫＯ）における弾性線維の断裂と杯細胞の過形成を表す。
図１６は、実施例９における、野生型（Ｗｉｌｄ）マウスおよびＣＤ９／ＣＤ８１二重欠損（ＤＫＯ）マウス気管支肺胞洗浄液中のＭＭＰ活性亢進を表す。
図１７は、実施例９における、野生型（Ｗｉｌｄ）マウスおよびＣＤ９／ＣＤ８１二重欠損（ＤＫＯ）マウスの気管支肺胞洗浄液中の細胞数増加を表す。
【発明を実施するための最良の形態】  発明者らは、テトラスパニンタンパクファミリーのメンバーであるＣＤ９とＣＤ８１の二重欠損マウスを初めて作成し、この変異マウスに骨粗鬆症が起こるとの知見を得た。ＣＤ９／ＣＤ８１二重欠損マウスはワイルドタイプマウスに比べ、骨格が小さく脊椎後弯を認め、皮質骨の菲薄化、骨のＸ線透過性亢進が認められた。骨組織の形態学的解析から、破骨細胞の増加と機能低下、骨芽細胞の機能低下が示唆された。また、カルセイン注射により、ＣＤ９／ＣＤ８１二重欠損マウスでの骨形成率はワイルドタイプの６０％に低下していることが明らかとなった。以上から、ＣＤ９／ＣＤ８１二重欠損マウスは低回転型の骨粗鬆症を示し、ヒトの老化の一徴候としての骨粗鬆症のモデルとなることが確認された。
発明者らは、更に、この変異マウスにヒトの慢性閉塞性肺疾患（Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅ  Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  Ｄｉｓｅａｓｅ，ＣＯＰＤ）類似の病態が起こるとの知見を得た。ＣＤ９／ＣＤ８１二重欠損マウス肺を組織学的に解析すると、加齢とともにワイルドタイプマウスに比べ胞隔に多くの炎症細胞が浸潤し、気腔の拡大を認めた。また、胞隔弾性線維の断裂像と気管支粘液産生細胞の過形成像が観察され、ヒトでのＣＯＰＤの病態に矛盾しないものであったため、該ＣＤ９／ＣＤ８１二重欠損マウスはＣＯＰＤのモデルとなることが確認された。
本発明の非ヒト動物は、少なくとも体細胞において、ＣＤ９をコードする遺伝子およびＣＤ８１をコードする遺伝子の機能が欠損する（本明細書中、「ＣＤ９／ＣＤ８１二重欠損」ということがある）。
非ヒト動物は、ヒト以外の動物であれば特に制限はないが、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、イヌ、ヒツジ、ヤギなどの哺乳動物、ニワトリなどの鳥類、マス等の魚類等が挙げられ、哺乳動物であることが好ましく、齧歯類動物であることがより好ましい。中でもマウスはライフサイクルが短く繁殖が容易であり、遺伝子欠損動物の作成技術も確立されている点で特に好ましい。
ここで、「遺伝子の機能が欠損する非ヒト動物」とは、遺伝子に変異を有することにより、該遺伝子の機能が欠損している遺伝子を有する非ヒト動物をいう。機能が欠損した遺伝子としては、変異の無い正常遺伝子と比較して、遺伝子発現が抑制されるか、その遺伝子産物の活性が失われたり低下したりする遺伝子が挙げられる。この要件を具備する限り、変異は欠失のみでなく、付加および置換も含み、変異の部位や長さには制限がない。変異の導入方法としては特に制限はないが、細胞に、標的となる遺伝子の塩基配列に変異を導入したＤＮＡを導入し、相同的組換え体を選択することにより、標的とする遺伝子に突然変異を導入する遺伝子ターゲッティングの手法により行なうことができる。変異を導入するターゲッティングの部位は、プロモータ領域、非翻訳領域、翻訳領域などいずれであってもよい。例えば、遺伝子のプロモータ領域の塩基配列の欠失や置換によって、転写活性が損なわれた変異遺伝子を得ることができる。また、非翻訳領域の塩基配列の欠失や置換によって安定な転写産物が合成されなくなった変異遺伝子を得ることもできる。また、翻訳領域内の塩基配列の欠失や置換によって、遺伝子産物が得られないか、遺伝子産物が得られても、それがタンパク質として正常に機能しない変異遺伝子などを得ることもできる。遺伝子の機能を効率よく完全に欠損させるには、翻訳領域をターゲット部位とすることが好ましい。また、導入される遺伝子には、薬剤に対する耐性遺伝子等、選択マーカーを挿入することが目的の組換え体を容易に選択することができる観点などから好ましい。ここで、ＣＤ９をコードする遺伝子およびＣＤ８１をコードする遺伝子の機能が欠損するとは、ＣＤ９をコードする遺伝子の機能とＣＤ８１をコードする遺伝子の機能とが共に欠損することをいい、主として、いわゆるダブルノックアウトをいう。
また、本発明の非ヒト動物としては、機能が欠損している変異型遺伝子が染色体上でホモの状態で存在しているもの（ホモ接合体）であってもよいし、ヘテロの状態で存在しているもの（ヘテロ接合体）であってもよい。ヘテロ接合体は主にホモ接合体の繁殖のために利用できる。
ここで、ＣＤ９をコードする遺伝子は、サケ（ＡＦ４２７５１９）、ニワトリ（ＡＢ０３２７６７）、マウス（ＮＭ＿００７６５７）、ラット（ＸＭ＿２１６２７９）、ネコ（Ｄ３０７８６）、イヌ（Ｕ１５７９２）、ブタ（ＡＦ５２５０２９）、ウシ（ＮＭ＿１７３９００）、サル（Ｄ１０７２６）およびヒト（ＮＭ＿００１７６９）などに存在することが知られており、ＣＤ８１をコードする遺伝子は、ゼブラフィッシュ（ＮＭ＿１３１５１８）、ニワトリ（ＡＢ１０１６３８）、マウス（ＮＭ＿１３３６５５）、ラット（ＮＭ＿０１３０８７）、サル（ＡＦ１１６６００）およびヒト（ＮＭ＿００４３５６）などに存在することが知られている。なお、括弧内はＧｅｎｂａｎｋのアクセッション番号であり、この番号から、遺伝子の塩基配列情報および該遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列情報にアクセスすることができる。例えば、既報のマウスにおける、ＣＤ９をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号１（図１）、ＣＤ８１をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号２（図２）に記載した。また、マウスのＣＤ９タンパク質のアミノ酸配列を配列番号１０に、ＣＤ８１タンパク質のアミノ酸配列を配列番号１１に示す。
0004696316.tif 000002
また、ＣＤ９をコードする遺伝子およびＣＤ８１をコードする遺伝子は、既報の配列を有するものに限られず、前記以外の動物においても、ＣＤ９をコードする遺伝子は、配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡに相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ、ＣＤ８１をコードする遺伝子は、配列番号２に記載の塩基配列からなるＤＮＡに相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとして存在する。ここで、ストリンジェントな条件の例としては、６５℃  ４ｘ  ＳＳＣにおけるハイブリダイゼーション、次いで６５℃で１時間０．１ｘ  ＳＳＣ中での洗浄などが挙げられる。また、前記以外の動物のＣＤ９をコードする遺伝子としては、配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡがコードするタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１０）において、１若しくは複数、好ましくは１若しくは数個のアミノ酸残基が付加、欠失または置換されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。同様に、前記以外の動物のＣＤ８１をコードする遺伝子としては、配列番号２に記載の塩基配列からなるＤＮＡがコードするタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１１）において、１若しくは数個のアミノ酸残基が付加、欠失または置換されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。
本発明の非ヒト動物は、ＣＤ９をコードする遺伝子およびＣＤ８１をコードする遺伝子の機能が欠損するものであるが、この「機能の欠損」は少なくとも体細胞系において起こっていれば良い。すなわち、該非ヒト動物元来のＣＤ９遺伝子およびＣＤ８１遺伝子の機能が欠損しており、体細胞において通常の条件において発現しないプロモーター下に新たに導入されたＣＤ９をコードする遺伝子および／またはＣＤ８１をコードする遺伝子が存在している場合等であっても本発明から排除されない。生殖細胞に特異的に発現するプロモーター下にＣＤ９やＣＤ８１を導入したトランスジェニックマウスであってもよい。
すなわち、後述するような通常の遺伝子ターゲッティングの手法によれば、生殖細胞を含めた全ての細胞で組換えが起き、全ての細胞で機能を有する標的タンパク質が発現しない非ヒト動物が得られるが、ＣＤ９遺伝子欠損雌マウスは不妊であるため、通常このマウスを得るためにはヘテロ接合体同士の交配、あるいはヘテロ接合体雌とＣＤ９遺伝子欠損雄マウスの交配によって作成する必要がある。また、ＣＤ８１遺伝子欠損雌マウスも出産数が少なく、マウスの系統によっては不妊になることが知られている。したがって、現行の技術で、ＣＤ９／ＣＤ８１二重欠損マウスホモ接合体を作成するためには、ＣＤ９／ＣＤ８１二重欠損雄マウスとＣＤ９／ＣＤ８１二重欠損ヘテロ接合体雌マウスの交配によって得ることが最も効率的であるが、この交配でＣＤ９／ＣＤ８１二重欠損マウスホモ接合体が生まれる確立は２５％であり、実験モデルマウスとして有用なＣＤ９／ＣＤ８１二重欠損マウスホモ接合体を大量に作成するには不利である。ＣＤ９遺伝子欠損雌マウスが不妊である理由は、ＣＤ９が卵細胞に発現しており、精子と受精反応を起こす際に必須であることによる。しかし、ひとたび受精が成立すると、その後の発生過程にＣＤ９は必要でなく、ＣＤ９を持たないマウスにおいても胎仔を出産することが明らかになっている。この知見をもとに、ホモ接合体雌雄間において交配可能であり、ストレイン化可能なように本発明者らが考案した、生殖細胞に特異的に発現するプロモーター下に少なくともＣＤ９を導入した（ＣＤ８１も導入していてもよい）ＣＤ９／ＣＤ８１二重欠損マウスも本発明に含まれる。また、同様に、生殖細胞に特異的に発現するプロモーター下にＣＤ８１を導入したＣＤ９／ＣＤ８１二重欠損マウスも本発明から排除されない。
前記のような生殖細胞に特異的に発現するプロモーター下にＣＤ９等が導入されたＣＤ９／ＣＤ８１二重欠損マウスは、例えば以下のように作製できる。卵細胞特異的に発現する遺伝子であるＺＰ３の遺伝子のプロモーターの下流にＣＤ９構造遺伝子を導入したトランスジェニックマウス（ＴＧＰｚｐ３：：ＣＤ９）を作成し、次に、ＴＧＰｚｐ３：：ＣＤ９とＣＤ９遺伝子欠損マウスを交配させ、ＣＤ９遺伝子は持たないがＰｚｐ３：：ＣＤ９遺伝子を持つマウスを作成したところ、得られたマウスは、卵細胞においてはＣＤ９を発現し、子孫を作ることができた。このように、ＺＰ３のような卵細胞特異的に発現する遺伝子のプロモーターの下流にＣＤ９を遺伝子導入する手法を用いることにより、体細胞ではＣＤ９遺伝子の機能が欠損してＣＤ９が発現せず、ＣＤ９遺伝子欠損マウスの性質を有し、かつ、ホモ接合体雌雄間での交配が可能となり、ＣＤ９遺伝子欠損マウスやＣＤ９／ＣＤ８１二重欠損マウスを大量に作成する上で大変有利である。
このようにして得られたＣＤ９欠損マウスと通常の方法により得られたＣＤ８１欠損マウスとを交配させることにより作成されたＣＤ９／ＣＤ８１二重欠損マウスは、生殖細胞も体細胞も新たに導入されたＣＤ９（ＴＧＰｚｐ３：：ＣＤ９）を有しているが、体細胞においては通常の状態でＣＤ９を発現しないことから、機能を有するＣＤ９を発現するとはいえず、少なくとも、体細胞系において、ＣＤ９欠損が起こっているといえる。したがって、このようなマウスも本発明の範囲に含まれる。
ＣＤ８１欠損雌マウスの不妊傾向もＣＤ８１が受精過程に必要であるからと考えられており、ＣＤ９遺伝子欠損マウスと同様の方法で解決が可能である。このような、ＺＰ３遺伝子プロモーターの下流でＣＤ９、又は、ＣＤ９とＣＤ８１とを発現するＣＤ９／ＣＤ８１二重欠損マウスは、ＣＤ９／ＣＤ８１二重欠損マウスホモ接合体雌雄間での交配が可能となり、モデルマウスとして大量作成が容易である観点から有利である。
本発明のＣＤ９／ＣＤ８１二重欠損動物において、ホモ接合体は、骨形成が阻害された表現形質を有する。骨形成が阻害された表現形質を有するとは、体の少なくとも一部の骨組織において、野生型に比べて、少なくともカルセイン注射により測定される骨形成率の低下および組織形態計測による骨形成パラメーター（類骨厚、類骨面、骨芽細胞面）の減少のいずれかが生じていることをいう。
また、本発明のＣＤ９／ＣＤ８１二重欠損動物において、ホモ接合体は、ヒトのＣＯＰＤに類似の表現形質を有する。ＣＯＰＤに類似の表現形質とは、最も特徴的には、加齢した非ヒト動物の肺の胞隔における炎症細胞の浸潤および気腔の拡大が挙げられる。ＣＤ９／ＣＤ８１二重欠損マウス肺を組織学的に解析すると、加齢とともにワイルドタイプマウスに比べ胞隔に多くの炎症細胞が浸潤し、気腔の拡大が認められる。これらは、ヒトのＣＯＰＤにおける肺気腫の組織学的特徴と一致する。また、胞隔弾性線維の断裂像と気管支粘液産生細胞の過形成像が観察され、ヒトでのＣＯＰＤの病態と矛盾しない。
前記非ヒト動物は、骨粗鬆症モデル動物およびＣＯＰＤモデル動物の少なくともいずれかとなることができる。
該非ヒト動物を骨粗鬆症モデル動物として使用する方法は、前記本発明の非ヒト動物の骨形成阻害を測定する工程を含んでなる。骨形成阻害の測定方法としては、実際の骨量の測定等の他、前記カルセイン注射によるアッセイおよび骨形成パラメーター（類骨厚、類骨面、骨芽細胞面）の組織形態計測や、破骨細胞による骨吸収のパラメータの測定等、骨形成阻害に関連する測定方法であれば、特に制限はなく、公知の測定方法中からの中から適宜選択することができる。
また、前記非ヒト動物を骨粗鬆症モデル動物として使用する方法としては、骨粗鬆症治療薬スクリーニング方法が挙げられる。該非ヒト動物に、薬剤の候補化合物である被験物質を投与し、骨形成阻害の程度を測定し、該被験物質が骨形成阻害を抑制する効果を有するかどうか検定することにより、有効な薬剤をスクリーニングできる。
被験物質の投与形態には特に制限はなく、例えば、経口、注射、塗布等により投与することができる。
該ＣＯＰＤモデル動物として使用する方法は、本発明のＣＤ９／ＣＤ８１二重欠損非ヒト動物の慢性閉塞性肺疾患類似の表現形質の程度を測定する工程を含んでなる。慢性閉塞性肺疾患類似の表現形質の測定方法としては、肺の組織学的解析により、加齢した非ヒト動物の肺における、胞隔における炎症細胞の浸潤および気腔の拡大を解析する方法が挙げられる。また、組織学的解析により、胞隔弾性線維の断裂像や気管支粘液産生細胞の過形成像を解析する方法も挙げられる。更に、本発明の非ヒト動物に認められ、ＣＯＰＤに関与すると考えられる、気管支肺胞洗浄液中のマクロファージの数増加や、マトリックスメタロプロテアーゼ（ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ，ＭＭＰ）活性（特にＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９）の増強を測定する方法も挙げられる。
また、前記非ヒト動物をＣＯＰＤモデル動物として使用する方法としては、慢性閉塞性肺疾患治療薬スクリーニング方法が挙げられる。該非ヒト動物に、薬剤の候補化合物である被験物質を投与し、骨形成阻害の程度を測定し、該被験物質が慢性閉塞性肺疾患を表す表現形質を抑制する効果を有するかどうか検定することにより、有効な薬剤をスクリーニングできる。
ＣＤ９／ＣＤ８１二重欠損非ヒト動物の製法については、特に制限はなく、公知の方法で行うことができるが、マウスに例を挙げると、通常以下のように製造することができる。
ＣＤ９遺伝子を単離して、その一部を遺伝マーカーで置換した変異遺伝子配列を含むターゲッティングベクターを作成する。このターゲッティングベクターをマウス胚性幹細胞（ＥＳ細胞）に導入し、ＣＤ９遺伝子と相同的組換えを起こさせ、遺伝マーカーを指標にして相同的組換えを起こしたＥＳ細胞を取得する。相同的組換えを起こしたマウスＥＳ細胞を受精卵へマイクロインジェクションし、偽妊娠雌マウスの子宮へ移植し、発生さてキメラマウスの成獣を得る。この雄キメラマウスを野生型雌マウスと交配し、毛色等から生殖細胞系にＥＳ細胞由来のＣＤ９欠損遺伝子がとりこまれたキメラマウス個体と野生型とのヘテロ接合体を選択する。ＣＤ８１についても同様にヘテロ接合体を得る。ＣＤ９欠損ヘテロ接合体とＣＤ８１欠損ヘテロ接合体とを交配させて、ＣＤ９／ＣＤ８１二重欠損マウスが得られる。
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これにより本発明の範囲が限定されるものではない。実施例においてすべてのマウスは、大阪大学医学部附属動物実験施設において、特定病原体フリー（ＳＰＦ）の条件下、環境的に調節されたクリーンルーム内で飼育した。ケージ、水ビン、木屑そして餌粒を含めたすべての器具および糧食は、滅菌して用いた。
【実施例１】  ＣＤ９／ＣＤ８１遺伝子２重欠損マウス（ダブルノックアウトマウス）の製造
（ステップ１）  ＣＤ９遺伝子のゲノムＤＮＡクローニングとＣＤ９欠損マウスの作出
マウスＣＤ９に対するゲノムＤＮＡは、マウスＣＤ９のｃＤＮＡ全長（配列番号１）をプローブとして、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社から購入した１２９／ｓｖマウスゲノムファージライブラリーから単離した。およそ９ｘ１０５のファージクローンをプラークハイブリダイゼーションによりスクリーニングし、そして２０個の陽性クローンを得た。これらのクローンがＣＤ９をコードしているか否かを決定するために、ＣＤ９プローブを用いた第２スクリーニングを別個に行った。この結果、すべてのクローンが単一のファージクローン由来のＣＤ９陽性クローンであることがわかった。得られたクローンをいくつかの制限酵素によるゲノムクローンの消化および部分配列決定により、ゲノムクローンの構造地図を作製した（図３）。得られたＣＤ９クローンは、遺伝子の６０ｋｂをカバーし、そしてヒトＣＤ９遺伝子のエクソン１からエクソン６に対応する相同配列を含んでいた。
（ステップ２）ＣＤ９ターゲッティングベクターの構築
ＣＤ９遺伝子のターゲッティングストラテジーを図３に示す。ＣＤ９遺伝子のターゲッティングベクターを作製するために、単離したゲノムクローンの一部を制限酵素により削除し、陽性選択マーカー遺伝子（ｎｅｏ−ｐｏｌｙＡカセット）（ｐｏｌｙＡはポリＡを意味する）を挿入した。
ＣＤ９のターゲッティングベクターの構築は、それぞれエクソン３およびエクソン４のＡｐａＩおよびＢａｍＨＩ部位間の成熟ＣＤ９についての第２膜貫通領域の一部から第４膜貫通領域までを含む約１．３ｋｂのＤＮＡ断片を削除し、そしてｎｅｏ−ｐｏｌｙＡカセットをＤＮＡ断片の代わりに挿入した。さらに陰性マーカーとしてジフテリア毒素Ａ断片遺伝子（ＤＴ）をチミジンキナーゼプロモーター調節下においてベクターの３’末端に挿入した（図３）。５’および３’末端の相同領域は、それぞれ約４ｋｂおよび５ｋｂであった。
（ステップ３）ターゲッティングベクターを導入したＥＳ細胞の作製
本発明において使用するＥＳ細胞は、Ｃ５７ＢＬ６＋ＣＢＡマウスから得られたＴＴ２細胞である。ＴＴ２細胞は、相沢慎一博士（実験医学別冊バイオマニュアルシリーズ８、ジーンターゲティングーＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製，羊土社，１９９５）に記載されているように取得することができる。ＥＳ細胞に対してエレクトロポーレーションを行うことにより、１０７細胞あたり約２０−２５μｇの直鎖化ターゲッティングベクターを導入する。エレクトロポーレーションは例えばＢｉｏ−Ｒａｄ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ中で、２５０Ｖおよび５００μＦで行うことができる。次いで細胞を、ＥＳ培地（２０％ウシ胎児血清（シグマ）、マウス白血病阻止因子（ＬＩＦ  エズグロアムラド社）、ピルビン酸ナトリウム（ナカライテスク）、非必須アミノ酸（和光）、およびベータメルカプトエタノール（ナカライテスク）を添加したＤｕｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅ培地（ナカライテスク）中で、ネオマイシン（２００μｇ／ｍｌ  シグマ）を選択薬剤として用いて選択培養する。薬剤を含む培地は毎日交換する。
ネオマイシン存在下に生育した１１６個のＥＳクローンをプールし、それらからゲノムＤＮＡを単離した。クローンは相同組み換えが起こったかどうかを確認するため、サザンブロットハイブリダイゼーション法によってスクリーニングした。ＡｐａＩ−ＡｐａＩ断片を５’プローブ（図３プローブＡ）として、そしてＸｈｏＩ−ＥｃｏＲＩ断片を３’プローブ（図３プローブＢ）として使用し、ターゲッティングされたＣＤ９遺伝子についてサザンブロットハイブリダイゼーション解析を行った。ＥＳ細胞から得られたゲノムＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩにより消化し、０．５％アガロースゲル上で電気泳動し、そしてナイロンメンブレン（Ａｍａｓｈａｍ）に転写する。ハイブリダイゼーションはハイブリダイゼーションバッファー中（東洋紡）で３２Ｐで標識されたプローブＡおよびＢを用いて６８℃で行う。メンブレンは洗浄後フィルムに感光させ検出した。
サザンハイブリダイゼーションにより、ＣＤ９の野生型アリル由来のバンドに相当する６．４ｋｂ（プローブＡ）および６．８ｋｂ（プローブＢ）のバンド、および変異アレル由来のバンドに相当する７．５ｋｂ（プローブＡ）および５．７ｋｂ（プローブＢ）の予想されるＤＮＡバンドを検出した（図４）。このことはターゲッティングされるＥＳクローン中の野生型アレルのうち１つが、変異遺伝子により正しく置換されていることを示していた。ＣＤ９遺伝子のターゲッティング効率は、６．０％であった。このうちターゲッティングされる遺伝子の生殖系列への導入は、２クローン中２クローンで確認された。
（ステップ４）ＣＤ９遺伝子欠損マウスの作出
ＣＤ９遺伝子をターゲッティングしたＥＳ細胞を、受精胚中に移植した。移植する方法は当業者が適宜改変することができるが、本実施例においては、オリジナルの報告（Ｎａｇｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０，８４２４−８４２８）から改変した、８細胞期胚に対するインジェクション法により、キメラ胚を作製した。すなわち、プラスチックディッシュ上の穴の中で、コンパクションを起こしていない８細胞期の透明帯と割球の間にＥＳ細胞を入れ、そしてＢＢＷ培地またはＭ１６培地中で一晩培養し、その後十分に形成した胞胚を偽妊娠メスマウスの子宮内に移植した（Ｈｏｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｍａｎｉｐｕｒａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏ，ｃｏｌｄｓｐｒｉｎｇ  ｈａｒｂｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｐｒｅｓｓ，１９９４）。インジェクション法において８細胞期胚として使用することができる胚の由来する系統は、純系どうしの交配に由来するものでも純系間での交配に由来するものでもよい。本発明においては、ＩＣＲのＦ１由来の胚を使用することが望ましい。
ＥＳ細胞導入胚由来のオスのキメラマウスが成熟した後、このマウスを純系マウス系統のメスマウスと交配させ、そして次世代産仔の被毛色により、ＥＳ細胞がキメラマウスの生殖系列へ導入されたことを確認するできる。本実施例においては、前述した様に野鼠色（ａｇｏｕｔｉ）系統（ＴＴ２）由来のＥＳ細胞を使用したため、作出したオスのキメラマウスを、黒色であるＣ５７ＢＬ６メスマウスと交配させ、そして次世代産仔の被毛色野鼠色（ａｇｏｕｔｉ）＋黒色（ｂｌａｃｋ）であることにより、ＥＳ細胞がキメラマウスの生殖系列へ導入されたことを確認した。得られたＣＤ９遺伝子欠損マウスヘテロ接合体同士を交配させることにより、目的とするＣＤ９の遺伝子欠損ホモ接合体マウスを得ることができた。
（ステップ５）遺伝子型解析
本実施例で作出されたＣＤ９遺伝子欠損マウスの仔において、ヘテロ接合体は健康で繁殖能力も有していた。ヘテロ接合体同士の交配で得られたマウスにおいて、相同組み換えされたアレルを持つかどうかを尻尾から単離されたＤＮＡを使用したＰＣＲにてスクリーニングを行った。ＰＣＲ反応はプライマー以下の配列番号３から５のものを用いた。
0004696316.tif 000003
配列番号３と配列番号４は欠損したアリル、配列番号４と配列番号５は野生型アリルを検出するために用いた。ＰＣＲ反応バッファーは、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ、０．００１％のＴｗｅｅｎ２０、０．００１％のＮＰ−４０、５０％グリセロール、２５ｍＭ  ＭｇＳＯ４、２ｍＭｄＮＴＰそして１Ｕ／μｌのポリメラーゼ（ＫＯＤＰｌｕｓ  東洋紡）にて行った。ＰＣＲサイクルの条件は、９４℃で１５秒、６２℃で３０秒，６８℃で１分を１サイクルとして３０サイクルの反応を行った。図５に示すようにヘテロ接合体（Ｈ）では組み換えを起こしたアレルと野生型のアレル両方を，ホモ接合体（Ｋ）では組み換えを起こしたアレルのみ持つことが確認された。またホモ接合体はヘテロ接合体同士の交配でメンデル比に従って産まれることを見出した。
（ステップ６）ＣＤ８１ターゲッティングベクターの構築
「Ｍｉｙａｚａｋｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｖｏｌ．１６，ｐｐ４２１７−４２２５」に記載されている方法に従って作製したが、簡単に説明すると、ＣＤ８１遺伝子のターゲッティングベクターを作製するために、単離したゲノムクローンの一部のＤＮＡ断片を制限酵素により削除し、陽性選択マーカー遺伝子（ｎｅｏ−ｐｏｌｙＡカセット）を挿入した。
具体的には、エクソン３からエクソン７のすべてとエクソン８の一部を含む領域、即ち成熟ＣＤ８１についての第２膜貫通領域の一部からＣ末端までを含む約３ｋｂのＤＮＡ断片を制限酵素ＢａｍＨＩで削除し、ｎｅｏ−ｐｏｌｙＡカセットをＤＮＡ断片の代わりに挿入した。（ＣＤ８１のイントロン、エクソン情報としては、アクセッション番号ＡＪ２５１８３５で見ることができる）
ネオマイシン存在下に生育したＥＳクローンをプールし、それらからゲノムＤＮＡを単離した。クローンは相同組み換えが起こったかどうかを確認するため、サザンブロットハイブリダイゼーション法によってスクリーニングした。
（ステップ７）ＣＤ８１遺伝子欠損マウスの作出と遺伝子型解析
ＣＤ８１遺伝子欠損マウスをＣＤ９と同様の方法により作出した。作出されたＣＤ８１遺伝子欠損マウスの仔において、ヘテロ接合体は健康で繁殖能力も有していた。ヘテロ接合体同士の交配で得られたマウスにおいて、相同組み換えされたアレルを持つかどうかを尻尾から単離されたＤＮＡを使用したＰＣＲにてスクリーニングを行った。ＰＣＲ反応はプライマーは以下の配列番号６〜９のものを用いた。
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配列番号６と配列番号７は野生型アリル、配列番号８と配列番号９は欠損したアリルを検出するために使用した。
なお、ＣＤ８１のノックアウトマウスの作成は、非特許文献１で挙げた「Ｍａｅｃｋｅｒ  ＨＴ，Ｌｅｖｙ  Ｓ．  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１９９７  Ａｐｒ  ２１；１８５（８）：１５０５−１０．  Ｎｏｒｍａｌ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｂｕｔ  ｄｅｌａｙｅｄ  ｈｕｍｏｒａｌ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｉｎ  ＣＤ８１−ｎｕｌｌ  ｍｉｃｅ．」や、「Ｔｓｉｔｓｉｋｏｖ  ＥＮ，Ｇｕｔｉｅｒｒｅｚ−Ｒａｍｏｓ  ＪＣ，Ｇｅｈａ  ＲＳ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．１９９７  Ｓｅｐ  ３０；９４（２０）：１０８４４−９．  Ｉｍｐａｉｒｅｄ  ＣＤ１９  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，ｅｎｈａｎｃｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｔｙｐｅ  ＩＩ  Ｔ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｎｔｉｇｅｎ  ａｎｄ  ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂ−１  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ＣＤ８１−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｉｃｅ．」にも記載されている。
（ステップ８）ＣＤ９／ＣＤ８１遺伝子２重欠損マウスの作出
ＣＤ９遺伝子欠損マウス（ヘテロ接合体）とＣＤ８１遺伝子欠損マウス（ヘテロ接合体）を交配させることにより、ＣＤ９／ＣＤ８１遺伝子２重欠損マウスヘテロ接合体を作出した。更に、ＣＤ９／ＣＤ８１遺伝子２重欠損マウスヘテロ接合体雌雄を交配させることにより、ＣＤ９／ＣＤ８１遺伝子２重欠損マウスホモ接合体を作出した。
【実施例２】３０週令マウスの骨Ｘ線撮影を行なった。Ｘ線撮影は、マウスを麻酔した後、ｍｉｃｒｏ−ＦＸ１０００（Ｆｕｊｉ  Ｆｉｌｍ，Ｉｎｃ．）を使用して行った。全身骨格のＸ線像を図６、大腿骨のＸ線像を図７、脊椎のＸ線像を図８に示す。ＣＤ９／ＣＤ８１二重欠損（ＤＫＯ）マウスでは野生型（ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅ）マウスに比べ骨格が小さく、脊椎の後弯が認められた。また、骨のＸ線透過性が亢進しており、骨非薄化が観察された。なお、本実施例および以下の実施例において、ＣＤ９／ＣＤ８１二重欠損マウスは、ホモ接合体を用いた。
【実施例３】  ８週令マウスにて脛骨近位部の組織学的検討を行った。
８週令の野生型とＣＤ９／ＣＤ８１二重欠損マウスの脛骨を９０％エタノールで固定し、非脱灰標本をグリコメタクリレートに包埋した。脛骨近位部３ｍｍ幅のセクションをトルイジンブルー染色またはＴＲＡＰ染色した。
トルイジンブルーによる染色結果を図９上段に、ＴＲＡＰによる染色結果を図９下段に示す。図の左側が野生型、右側がＣＤ９／ＣＤ８１二重欠損マウスであり、図９上段において、Ｂａｒ＝２５０μ、図９下段においてＢａｒ＝１００μｍである。
図９上段において、矢頭は皮質骨を示し、ＣＤ９／ＣＤ８１二重欠損マウスでは、野生型に比べ皮質骨が菲薄化していた。また、ＴＲＡＰ染色では、濃く（実際の写真では赤く）染まっているのが破骨細胞である。
【実施例４】  ８週令の野生型マウス、ＣＤ９／ＣＤ８１二重欠損マウス、ＣＤ９欠損マウスおよびＣＤ８１欠損マウスについて、大腿骨幹部をｐＱＣＴ（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｃｏｍｐｕｔｅｄ  ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）解析により解析した。ｐＱＣＴ解析は、マウス大腿骨を１０％ホルマリンで固定した後、ＸＣＴ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＳＡ（Ｓｔｒａｔｅｃ  Ｍｅｄｉｚｉｎｔｅｃｈｎｉｋ）を用いて測定を行った。骨幹部輪郭をｐＱＣＴソフトウェアアルゴリズムによる自動解析にて決定した。解析結果を図１０Ａ〜Ｃに表す。
ＣＤ９／ＣＤ８１二重欠損（ＷＫＯ）マウスでは野生型マウス、ＣＤ９欠損（ＫＯ）マウスおよびＣＤ８１欠損（ＫＯ）マウスに比べ、骨量の低下、骨強度の低下を認めた。
以上実施例２および４の結果から、ＣＤ９／ＣＤ８１二重欠損マウスでは骨密度が底下していることがわかった。
【実施例５】  ８週令マウスの脛骨近位部の形態計測を行なった。
８週令の野生型（Ｗｉｌｄ）、ＣＤ９欠損（ＣＤ９ＫＯ）マウス、ＣＤ８１欠損（ＣＤ８１ＫＯ）マウス、ＣＤ９／ＣＤ８１ダブルヘテロ（ＣＤ９／ＣＤ８１ＤＨＯ）マウスおよびＣＤ９／ＣＤ８１二重欠損（ＣＤ９／ＣＤ８１ＤＫＯ）マウス、各々３サンプルの脛骨近位部の組織形態計測をＯｓｔｅｏｐｌａｎ  ＩＩ（Ｚｅｉｓｓ）セミオートメーションシステムにより行なった。
測定結果を図１１Ａ〜Ｈに表す。
単位骨量、骨梁幅、骨梁数については、ＣＤ９／ＣＤ８１二重欠損マウスでは、減少は見られず、海綿骨の減少は認めなかった（図９、図１１Ａ〜Ｃ）。
しかし、類骨厚、類骨面、骨芽細胞面については、ＣＤ９／ＣＤ８１二重欠損マウスでは野生型マウス、ＣＤ９欠損マウスおよびＣＤ８１欠損マウスに比べ、有意な減少が認められ、骨芽細胞のマトリックス形成の低下が示唆された（図１１Ｄ〜Ｆ）。
また、破骨細胞数の増加を認めたが、破骨細胞面の有意な減少はなく、破骨細胞の機能低下の可能性が示唆された（図９下段、図１１ＧおよびＨ）。
【実施例６】  次に骨形成と石灰化における骨芽細胞の機能を、８週令マウスにカルセインを腹腔内注入して検討した。
カルセインアッセイは、カルセインが骨形成の過程で骨に取り込まれることを利用して、骨芽細胞による骨形成を測定するときに慣用される確立した手法である。
マウス腹腔内にカルセインを４日間隔で２回注射し、大腿骨の非脱灰標本を作成し石灰化先端部を蛍光顕微鏡にて計測した。蛍光顕微鏡による写真と、Ｏｓｔｅｏｐｌａｎ  ＩＩ（Ｚｅｉｓｓ）セミオートメーションシステムにより算出した骨形成率を図１２Ａ及びＢに表す。
ＣＤ９／ＣＤ８１二重欠損（ＤＫＯ）マウスでは、野生型（ｗｉｌｄ）マウスに比べ２本のバンド間の距離が縮小しており、骨形成率の低下が認められた。ＣＤ９／ＣＤ８１二重欠損マウスの骨形成率は、野生型の約６０％に低下していた。
ＣＤ９／ＣＤ８１二重欠損マウスは膜タンパクの欠損マウスであり、老化に見られる低回転型の骨粗鬆症と似かよった病態を示す。このことから低回転型骨粗鬆症の動物モデルとなることが確認された。
【実施例７】  生殖細胞にのみ発現するＣＤ９遺伝子を有するＣＤ９／ＣＤ８１二重欠損マウスの製造
卵細胞特異的に発現する遺伝子であるＺＰ３を分離し、この遺伝子のプロモーターを含む約６ｋｂの断片の下流にＥｃｏＲＶ部位を人工的に挿入し、このＥｃｏＲＶ部位に平滑末端化したＣＤ９構造遺伝子を挿入したベクターを作成し、この遺伝子を持つトランスジェニックマウス（ＴＧＰｚｐ３：：ＣＤ９）を作成した。
次に、ＴＧＰｚｐ３：：ＣＤ９とＣＤ９遺伝子欠損マウスを交配させ、ＣＤ９遺伝子は持たないがＰｚｐ３：：ＣＤ９遺伝子を持つマウスを作成したところ、得られたマウスは、卵細胞においてはＣＤ９を発現し、ホモ接合体雌雄間での交配が可能で子孫を作ることができた。
このようにして得られたＰｚｐ３：：ＣＤ９遺伝子を有するＣＤ９欠損マウスと通常の方法により得られたＣＤ８１欠損マウスとを交配させ、生殖細胞も体細胞も新たに導入されたＣＤ９（ＴＧＰｚｐ３：：ＣＤ９）を有しているが、体細胞においては通常の状態でＣＤ９を発現しないＣＤ９／ＣＤ８１二重欠損マウスを作成した。
【実施例８】  マウス肺の形態学的解析
マウス肺は２５ｃｍ水柱圧下で１０％ホルマリン固定を行い、パラフィン包埋した後、５μｍ幅のセクションをヘマトキシリン・エオジン染色した。肺胞腔の大きさはＲａｙ（Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １０：２５０１−２５１１，１９９７）らの方法に従い、１０視野以上の肺組織像をＮＩＨ画像プログラムで解析し、Ｃｈｏｒｄ  ｌｅｎｇｔｈの平均値を算出した。１視野につき２００回以上の測定を行い、また野生型（Ｗｉｌｄ）とＣＤ９／ＣＤ８１二重欠損マウス（ＤＫＯ）それぞれ３匹以上解析した。弾性線維と杯細胞の観察には、それぞれＯｒｃｅｉｎによる染色とｐｅｒｉｏｄｉｃ  ａｃｉｄ−Ｓｃｈｉｆｆ（ＰＡＳ）染色を行った。
ヘマトキシリン・エオジン染色の結果から、ＣＤ９／ＣＤ８１二重欠損マウス（ＤＫＯ）の肺を野生型（Ｗｉｌｄ）と比較すると、３週令（３Ｗ）では大きな差は認められないが、１０週令（１０Ｗ）マウスでは肺胞腔の拡大（肺胞構造の破壊）と単核球主体の炎症細胞浸潤を認め、気腫性変化を呈した（図１３）。これらの変化は、同令のＣＤ９ノックアウトマウス、ＣＤ８１ノックマウスではほとんど認めないか、あっても軽度であった（データ掲載せず）。
画像プログラムを用いて組織標本からＣｈｏｒｄ  ｌｅｎｇｔｈ（肺胞腔径）を算出したところ、加齢とともに肺胞腔の拡大が亢進することが確認された（図１４）。
さらに、Ｏｒｃｅｉｎ染色により弾性線維の断裂像を認め、ＰＡＳ染色により粘液産生能を持つ杯細胞（赤色に染色されている）の過形成像が観察され、これらはＣＯＰＤで見られる病理組織に類似していた（図１５）。
これら結果から、ＣＤ９／ＣＤ８１二重欠損マウス（ＤＫＯ）肺はヒトＣＯＰＤ類似の病態を示すことが組織学的に確認された。
【実施例９】  ＭＭＰ活性の測定
無作為に選んだ１０週令のＣＤ９／ＣＤ８１二重欠損マウスと野生型マウスから気管支肺胞洗浄液を回収し、ゲラチンザイモグラムにてＭＭＰ活性を検討した。
気管支肺胞洗浄
マウス肺を１ｍｌの０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳで３回洗浄し回収した。洗浄液中の細胞をサイトスピンスライド上に遠沈し、Ｗｒｉｇｈｔ染色した後、検鏡にて総細胞数、マクロファージ、リンパ球の数を算出した。野生型とＣＤ９／ＣＤ８１二重欠損マウスそれぞれ３匹以上解析した。（図１７）
ゲラチンザイモグラム
１０週令の野生型およびＣＤ９／ＣＤ８１二重欠損マウスから無作為に選んだそれぞれ４匹から気管支肺胞洗浄液上清を回収しＣｅｎｔｒｉｃｏｎ  １０にて１０倍濃縮した。濃縮液を１０％ゲラチンザイモグラムゲルに注入し非還元条件下に電気泳動を行った。クマシーブルーで染色後、脱染しＭＭＰのゲラチン溶解活性を検出した。
この結果、ＣＤ９／ＣＤ８１二重欠損マウス（ＤＫＯ）では、野生型（Ｗｉｌｄ）に比べＭＭＰ−２とＭＭＰ−９活性が亢進していた（図１６）。また、ＣＤ９／ＣＤ８１二重欠損マウスでは、野生型に比べ気管支肺胞洗浄により回収されるＢＡＬＦ中の総細胞数（ＴＣＣ、Ｔｏｔａｌ  ｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔ）が増加しており、その大部分はマクロファージ（Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）であった（図１７）これらのことから、ＣＤ９／ＣＤ８１二重欠損マウス肺では、ＭＭＰ活性が亢進し、マクロファージが増加していることが分かった。この結果は、ＭＭＰ−２活性、ＭＭＰ−９活性、または、マクロファージ増加と、ＣＯＰＤとの関連を示唆するものであり、本発明のＣＤ９／ＣＤ８１二重欠損マウスにおいて、肺のＭＭＰ−２活性、ＭＭＰ−９活性またはマクロファージ増加が、ＣＯＰＤとの関連においてひとつの指標となり得ることを示している。
以上の実施例から、ＣＤ９／ＣＤ８１二重欠損マウスは肺気腫と共に粘液産生細胞の過形成を認め、ヒトでのＣＯＰＤの病理像に合致する肺病変を有する。さらにＣＯＰＤ患者に高率に合併する骨粗鬆症をも示すことから、これまでに報告された遺伝子操作マウスよりもＣＯＰＤの病態をより忠実に反映する疾患モデルと考えられ、骨粗鬆症モデル動物としては勿論のこと、ＣＯＰＤモデル動物としても、治療薬のスクリーニング等に有効である。
【発明の効果】
本発明によると、骨粗鬆症およびＣＯＰＤの病態をよく表しモデル動物として利用できるＣＤ９／ＣＤ８１二重欠損非ヒト動物、並びに、該非ヒト動物を骨粗鬆症モデル動物およびＣＯＰＤモデル動物の少なくともいずれかとして使用する方法を提供することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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