(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＶＳＳＰに含まれる１種又は複数のガングリオシドの溶液又は水性分散液を含有し、かつ、免疫アジュバントを含まない、任意の追加の免疫アジュバントなしで皮下投与によって免疫応答を刺激することのできる皮下投与用ワクチン組成物であって、ＶＳＳＰに含まれる上記ガングリオシドがＮ−ＡｃＧＭ３及びＮ−ＧｃＧＭ３から選択される皮下投与用ワクチン組成物。
【請求項２】
ＶＳＳＰに含まれるガングリオシドがＮ−ＡｃＧＭ３である、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項３】
ガングリオシド以外の抗原を含有しない、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項４】
特有の免疫成分としてＮ−ＡｃＧＭ３／ＶＳＳＰ及び／又はＮ−ＧｃＧＭ３／ＶＳＳＰを含有する、請求項１又は３に記載のワクチン組成物。
【請求項５】
特有の成分としてＮ−ＡｃＧＭ３／ＶＳＳＰを含有する、請求項４に記載のワクチン組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、追加のアジュバントなしで自己免疫疾患、感染性疾患、及び腫瘍の免疫治療に有用な、ガングリオシド含有皮下投与用ワクチン組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
長い間、自己免疫疾患及び癌の免疫治療として使用する意図が知られており、たとえば、米国特許第４，９６５，１９８号は、このような疾患の予防及び治療でのガングリオシドＧＭ２の使用を開示している。出願特許ＥＰ−Ａ−６６１０６１及び米国特許第６，１４９，９２１号では、免疫原と免疫アジュバントとにある、ガングリオシドに対する抗体応答を刺激し、又は増大させるためのワクチン組成物が開示されている。
【０００３】
開示されている免疫原は、Ｎ−アセチルＧＭ３ガングリオシド及びＮ−グリコリルＧＭ３ガングリオシド（以下では、（Ｎ−ＡｃＧＭ３）及び（Ｎ−ＧｃＧＭ３））が髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）由来の外膜タンパク質複合体（ＯＭＰ）と結合して構成されるＶＳＳＰ（ｖｅｒｙ  ｓｍａｌｌ  ｓｉｚｅ  ｐｒｏｔｅｏｌｉｐｏｓｏｍｅｓ（非常に小さなサイズのプロテオリポソーム））である。
【０００４】
このような免疫原は、以下では、Ｎ−ＡｃＧＭ３／ＶＳＳＰ及びＮ−ＧｃＧＭ３／ＶＳＳＰと呼ぶが、これらは、非常にサイズが小さく、実際に電子顕微鏡で見ることができず、水溶性であり、浮動能力が高まっている。
【０００５】
ＥＰ−Ａ−６６１０６１及び米国特許第６，１４９，９２１号に記載されているワクチン組成物では、非常によく知られているフロイント完全アジュバントなどのアジュバントの利用が必要であった。
【０００６】
出願特許ＷＯ−Ａ−０２１４５７４６では、（Ａ）免疫原性の弱い１種又は複数の抗原、（Ｂ）ガングリオシド、主としてＮ−ＡｃＧＭ３／ＶＳＳＰ及びＮ−ＧｃＧＭ３／ＶＳＳＰが組み込まれているＶＳＳＰ、及び（Ｃ）結局のところ１種又は複数のアジュバントを含有するワクチン組成物が記載されている。
【０００７】
Ｍｅｌａｎｏｍａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００１年、第１１巻、２１９〜２２７ページに発表されているＣａｒｒ  Ａ．らの論文では、Ｎ−ＡｃＧＭ３ガングリオシド含有ワクチンの、黒色腫Ｂ１６を有するマウスでの抗腫瘍活性が記載されている。
【０００８】
この論文では、免疫アジュバント、特に完全フロイントアジュバント又は不完全フロイント様アジュバントのＭｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ５１の存在の影響も研究されている。ワクチンは筋肉内投与され、明らかになった結果は、フロイント又はＭｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ５１のいずれかのアジュバントを加えたＮ−ＡｃＧＭ３／ＶＳＳＰで免疫感作したマウスが、８週間目にＩｇＭ及びＩｇＧの各抗Ｎ−ＡｃＧＭ３応答を示したことである（表１）。対照的に、アジュバントなしのＮ−ＡｃＧＭ３／ＶＳＳＰワクチンは、何の免疫原性応答も示さなかった（２２３ページ、右欄）。
【０００９】
したがって、従来技術は、ガングリオシドと結合させたＶＳＳＰを含有するワクチンには、アジュバント、主としてフロイント（完全若しくは不完全）又はＭｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ５１を配合すべきであると教示している。
【００１０】
しかし、そのようなアジュバント、特にフロイント完全アジュバントは、非経口投与されると、注射部位の慢性の炎症、結果としての肉芽腫、組織の無菌膿瘍若しくは潰瘍性壊死などのある種の不都合な副作用を引き起こすことは非常によく知られている。Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ５１はより刺激が弱いが、これも若干の炎症性障害を引き起こし得る。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
自己免疫疾患、感染性疾患、及び腫瘍疾患の免疫治療で適用することを考慮に入れると、注射部位での刺激がより弱く、患者にとってそれほど不都合にならないより使用しやすい新しいガングリオシドワクチン組成物を手にすることは非常に望ましいはずである。
【００１２】
本発明の著者らは、ＶＳＳＰを配合したガングリオシド系ワクチンは、皮下投与するとアジュバントなしで使用することができ、一方、関連のある免疫特性は存在したままであることを発見した。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の目的は、免疫アジュバントを含有せず、皮下投与される、ＶＳＳＰに含まれる新規なワクチン組成物、好ましくはＮ−ＡｃＧＭ３／ＶＳＳＰ及びＮ−ＧｃＧＭ３／ＶＳＳＰである。
【００１４】
本発明の目的はまた、免疫アジュバントを含有しないガングリオシドワクチン組成物、好ましくはＮＡｃＧＭ３／ＶＳＳＰ及びＮ−ＧｃＧＭ３／ＶＳＳＰの皮下投与にある、その免疫応答を強化する必要のある患者の治療方法である。
【００１５】
本発明の目的はまた、ガングリオシドとは別の他の抗原性成分、又は他の免疫アジュバントを含有せず、皮下投与がなされる、Ｎ−ＡｃＧＭ３／ＶＳＳＰ及び／又はＮＧｃＧＭ３／ＶＳＳＰの各ワクチン組成物である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明の目的であるワクチン組成物は、追加の免疫アジュバントなしで、皮下投与によって免疫応答を刺激することのできる、１種又は複数のガングリオシドを溶解又は水に分散させ、それを髄膜炎菌のＯＭＰに含めたもの（ＶＳＳＰ）にある。
【００１７】
ＶＳＳＰは、共有結合を必要とせずに、髄膜炎菌の外膜タンパク質複合体と疎水結合した非常に安定なガングリオシドである。このようなガングリオシド−タンパク質系は、ＥＰ−Ａ−６６１０６１及び米国特許第６，１４９，９２１号の特許だけでなく、別の刊行物、たとえば、Ｅｓｔｅｖｅｚら、Ｖａｃｃｉｎｅ、１９９９年、第１８巻（１〜２）：１９０〜１９７ページでも詳述されている。こうした文献には、そのような系を得るための手順も記載されている。
【００１８】
ＶＳＳＰに含まれるガングリオシドの中では、本発明によれば、Ｎ−ＡｃＧＭ３及びＮ−ＧｃＧＭ３が好ましく、Ｎ−ＡｃＧＭ３が特に好ましい。
【００１９】
両方の結合型ガングリオシドの免疫原性、並びに抗癌剤及び獲得免疫の刺激剤としてのその適用についての詳細な記述は、上述の文献及び総説論文：Ｂｉｔｔｏｎ  Ｒ．ら、Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｒｅｐｏｒｔｓ（２００２年）、第９巻、２６７〜２７６ページ、並びに最近の対話（ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ）及び学会、たとえば、２００２年１２月９日にハバナで開催された第６回ラテンアメリカ免疫学会、Ｓａｕｒｅｚ  Ｇ．らの対話「進行性乳癌患者におけるガングリオシド癌ワクチンＮ−アセチル−ＧＭ３／ＶＳＳＰ／Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ／ＳＡ５１の第Ｉ期臨床治験（Ｐｈａｓｅ  Ｉ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒｉａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｖａｃｃｉｎｅ  Ｎ−Ａｃｅｔｉｌ−ＧＭ３／ＶＳＳＰ／Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ５１  ｉｎ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ）」の中に見ることができる。
【００２０】
ガングリオシド以外の抗原性成分を含有しないワクチン組成物は、本発明の好ましい対象であり、特有の免疫原性成分Ｎ−ＡｃＧＭ３（Ｎ−ＡｃＧＭ３／ＶＳＳＰ）及び／又はＮＧｃＧＭ３（Ｎ−ＧｃＧＭ３／ＶＳＳＰ）として含有するものが特に好ましく、ＮＡｃＧＭ３／ＶＳＳＰのみを含有するものが特に好ましい。
【００２１】
本発明が対象とするワクチン組成物は、ＶＳＳＰの溶液又は水性分散液であり、非経口用途向けの医薬中に通常使用される、ポリエチレングリコールなどでよい、非毒性非刺激性の、水と適合性のある他の溶媒を最終的に含有していてよい。
【００２２】
溶液又は水性分散液中の結合型ガングリオシドの濃度は、決定的なものでなく、０．０３％〜３％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．０４％〜２．５％（ｗ／ｖ）の間の範囲でよい。本発明で言及しているワクチンのための皮下投与量の範囲は、５０μｇ〜２．４ｍｇの間、好ましくは２００μｇ〜２ｍｇの間である。
【００２３】
すなわち本発明の対象であるワクチン組成物の本質的な特性は、追加の免疫アジュバントなしで皮下投与されるように設計されていることである。
【００２４】
免疫アジュバントは、ワクチン製剤中に頻繁に使用されている。そうしたアジュバントは、次の異なる方法で免疫作用を与えていた。すなわち、
−注射部位に抗原の付着層を作って、抗原を系統的な形で解放又は放出する。
−マクロファージによって捕らえられやすい油性の微小液滴を形成させて、抗原が脾臓及びリンパ節に到達するのを助ける。
−免疫応答に関与する細胞を直接又は間接的に活性化する。
−最もよく知られている免疫アジュバントは、フロイントの完全及び不完全アジュバント、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ、Ｒｉｂｉアジュバント、Ｈｕｎｔｅｒ’ｓ  ＴｉｔｅｒＭａｘ、アルミニウム塩、Ｇｅｒｂｕアジュバント、ＱＳ−２１などである。
【００２５】
驚くべきことに、また予想外に、本発明の著者らは、ガングリオシド／ＶＳＳＰワクチンを皮下投与すると、アジュバントを完全に省けることを見出した。このことは、従来技術にかかわらず、筋肉内投与をほとんど完全に除外した。
【００２６】
したがって、本発明は、局所的にアジュバントの使用に由来する、言及した炎症性の問題に関係する場合にはほとんどすべて、申し分のない利点となる。これは、効力があり、患者への刺激がより弱い、ガングリオシドによるワクチン接種の簡単な方法である。
【００２７】
以下の実施例に比較実験の詳細を含めて、免疫アジュバントを含有しないワクチン組成物の免疫効力を実証する。
【実施例１】
【００２８】
米国特許第６，１４９，９２１号特許の実施例３に記載の手順を使用して、２．４ｍｇ／ｍＬのＮ−ＡｃＧＭ３／ＶＳＳＰを含有する水性ワクチン組成物を調製した（緩衝液Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）。一分割量のこの免疫原組成物に、同体積のＭｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ５１アジュバントを加えた（Ｓｅｐｐｉｃ  Ｐａｒｉｓ、フランス）。同時に、別の分割量に、同体積の緩衝液Ｔｒｉｓ−ＨＣｌを加えた。次の２種のワクチン組成物を得た。
Ａ：１．２ｍｇ／ｍＬのＮ−ＡｃＧＭ３／ＶＳＳＰを含有する水溶液
Ｂ：１．２ｍｇ／ｍＬのＮ−ＡｃＧＭ３／ＶＳＳＰを含有するＷ／Ｏ乳濁液
【００２９】
体重が１８〜２０ｇの５０匹のＣ５７ＢＬ６雌性マウスを選び、それぞれ１０匹の動物からなる５つの実験群を編制した。
【００３０】
第１群（対照）の動物には、０、１４、２８、及び４２日目に、０．１ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を筋肉内接種した。
【００３１】
第２群の動物には、０、１４、２８、及び４２日目に、０．１ｍＬのワクチン組成物Ｂ（１２０μｇのＮ−ＡｃＧＭ３／ＶＳＳＰ）を筋肉内接種した。
【００３２】
第３群（対照）の動物には、０、１４、２８、及び４２日目に、０．１ｍＬのＰＢＳを皮下接種した。
【００３３】
第４群の動物には、０、１４、２８、及び４２日目に、０．１ｍＬのワクチン組成物Ｂ（１２０μｇのＮ−ＡｃＧＭ３／ＶＳＳＰ）を皮下接種した。
【００３４】
第５群の動物には、０、１４、２８、及び４２日目に、０．１ｍＬのワクチン組成物Ａ（１２０μｇのＮ−ＡｃＧＭ３／ＶＳＳＰ）を皮下接種した。
【００３５】
６３日目に、すべての群のマウスの皮下に５×１０３細胞の黒色腫ＭＢ１６Ｆ１０を植え付けた（０．２ｍＬ）。
【００３６】
動物は０日目から個別に扱い、次のパラメーター、すなわち腫瘍体積、生存度、及び経過期間を週２回測定した。得られた結果は以下のとおりである。
【００３７】
腫瘍体積：
図１に、各実験群の腫瘍成長動力学を示す。Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ（両側）Ｕ検定を使用して、群の対に統計学的有意性があるかどうか、個別に扱った動物の腫瘍植付け後３３日目の腫瘍体積値を評価した。
【００３８】
この統計学的方法は、生物学的事象に関連したデータの自然のばらつきがあるこの種の実験の評価に特に相応しい。
【００３９】
ｐ値は、サンプルから算出した実際の値に関連した確率を表し、帰無仮説を確認する統計量（ｓｔａｄｉｇｒａｐｈ）及び実際のデータによって算出されたα値（有意性）の近似を規定できるようにする（ｐ＞０．０５）。
【００４０】
結果を図１及び表１に示す。
【００４１】
【表１】
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ａ：  第２群対第１群の比較の結果としてのｐ値
ｂ：  第４群対第３群の比較の結果としてのｐ値
ｃ：  第５群対第３群の比較の結果としてのｐ値
【００４２】
図１及び表１から、本発明の対象である組成物を皮下にワクチン接種した第５群のマウスが、他の実験群及び対応する対象と比べて腫瘍体積の有意な増大を示していることがわかる。
【００４３】
生存度
このパラメーターは、ＭＢ１６と同程度に致死的な腫瘍に対して、ワクチン接種が、免疫感作した動物の寿命を延長する能力を評価するものである。このパラメーターは、未処理動物の生存度と比較した日数で測定される。たとえば、有意性では、Ｌｏｇ−Ｒａｎｋ検定を使用している。
【００４４】
得られた値を図２及び表２に示す。表２において、基準群Ｘという句は、各欄と比較される群を意味する。
【００４５】
【表２】
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【００４６】
これらの結果は、本発明の対象の製剤を皮下にワクチン接種した第５群に含めたマウスが、腫瘍接種後最も長い生存を示したことが実証するものであった。
【００４７】
経過期間
経過期間は、接種した瞬間から測定した、各動物の腫瘍がはっきりとわかるようになるのにかかる期間を個々に評価するパラメーターである。表３に結果を示す。
【００４８】
【表３】
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【００４９】
実験を終えた時点で腫瘍ができていなかったマウスについては、経過期間を６０日間とみなした。
【００５０】
経過期間が延長される影響は、癌に対するワクチンにおいて有意差を得るのに非常に望ましいパラメーターであることは明らかであり、表３で観察される結果によれば、本発明の対象であるＶＳＳＰ組成物を皮下にワクチン接種した第５群の動物が、より関連性のある陽性の結果を示した。
【００５１】
腫瘍の退縮
第４及び第５群では、アジュバントを含む又は含まない皮下ワクチン接種に対応して、腫瘍退縮のある動物が観察された。第４群の動物では、接種１９日目には腫瘍が測定可能であり、事実上３５日まで成長がないままであり、陰性であることがわかった。第５群のマウスでは、接種２６日目に触診によって腫瘍の存在が示され、２９日目に陰性であると報告された。
【００５２】
全体としての評価
実験結果は、本発明の対象のワクチン組成物は、ＰＢＳで処理した対象群と比べて有意に生存期間及び経過期間を延長すると同時に腫瘍成長速度を減速させたことが示された。
【００５３】
一方、アジュバントＭｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ５１を含有するワクチン組成物の投与は、筋肉内投与したときに限り防御を示し、皮下投与したときには完全に効力がなかった。
【００５４】
要約すれば、本発明が対象とするワクチン組成物の皮下投与は、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ型のアジュバントを含有するワクチン組成物の筋肉内ワクチン接種で得られた結果よりも優れた結果を示した。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】異なるワクチン処置を施し、悪性腫瘍を接種した５つの群の動物における腫瘍体積の拡大を示すグラフである。
【図２】５つの群の実験動物における生存パラメーターの評価を可能にするグラフである。
【図１】
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【図２】
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