(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１に記載の塩基配列若しくはその相補的塩基配列で表わされるポリヌクレオチド、または配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質をコードするポリヌクレオチド若しくは該ポリヌクレオチドの相補的塩基配列で表わされるポリヌクレオチド。
【請求項２】
配列表の配列番号３若しくは５に記載の塩基配列またはその相補的塩基配列で表わされるポリヌクレオチド、または配列表の配列番号４若しくは６に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質をコードするポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドの相補的塩基配列で表わされるポリヌクレオチド。
【請求項３】
配列表の配列番号３に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、または配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドであって、Ｃｄｃ４２の活性化を促進する蛋白質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項４】
配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドにおいて１乃至数個のヌクレオチドの変異または誘発変異を有するポリヌクレオチドであって、Ｃｄｃ４２の活性化を促進する蛋白質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項５】
配列表の配列番号１に記載の塩基配列に相補的な塩基配列で表わされるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするポリヌクレオチドであって、Ｃｄｃ４２の活性化を促進する蛋白質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項１から５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
【請求項７】
請求項６に記載の組換えベクターにより形質転換されてなる形質転換体。
【請求項８】
請求項６に記載の組換えベクターおよびＣｄｃ４２をコードするポリヌクレオチドを含有する組換えベクターにより形質転換されてなる形質転換体。
【請求項９】
配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質。
【請求項１０】
配列表の配列番号４または６に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質。
【請求項１１】
請求項３から５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質。
【請求項１２】
請求項７または８に記載の形質転換体を培養し、次いで得られた培養物から請求項９から１１のいずれか１項に記載の蛋白質を回収する工程を含む、請求項９から１１のいず
れか１項に記載の蛋白質の製造方法。
【請求項１３】
請求項９から１１のいずれか１項に記載の蛋白質の機能および／または請求項１から５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドの発現を阻害する化合物の同定方法であって、ある化合物と該蛋白質および／または該ポリヌクレオチドとの相互作用を可能にする条件下で、該蛋白質の機能および／または該ポリヌクレオチドの発現の存在、不存在または変化を検出することにより、該化合物が該蛋白質の機能および／または該ポリヌクレオチドの発現を阻害するか否かを判定すること、並びに該タンパク質の機能がＣｄｃ４２の活性化を促進する機能であることを特徴とする同定方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の同定方法であって、請求項９から１１のいずれか１項に記載の蛋白質、請求項１から５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項６に記載の組換えベクター、請求項７または８に記載の形質転換体、および前記蛋白質を特異的に認識する抗体のうち少なくともいずれか１つを用いることを特徴とする同定方法。
【請求項１５】
被検組織がヒト胃腫瘍由来組織であるか否かを判定する方法であって、該被検組織における請求項１から５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドの発現量を測定することを特徴とする方法。
【請求項１６】
被検組織における請求項１から５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドの発現量が、対照であるヒト正常胃由来組織における該ポリヌクレオチドの発現量の４．５倍以上である場合に、被検組織がヒト胃腫瘍由来組織であると判定することを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
請求項９から１１のいずれか１項に記載の蛋白質、請求項１から５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項６に記載の組換えベクター、および請求項７または８に記載の形質転換体のうち少なくともいずれか１つを含んでなる試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、低分子量ＧＴＰ結合蛋白質の１グループであるＲｈｏファミリー蛋白質に対してグアニンヌクレオチド交換因子として作用する蛋白質および該蛋白質をコードするポリヌクレオチドに関する。より詳しくは、Ｒｈｏファミリー低分子量ＧＴＰ結合蛋白質であるＣｄｃ４２と結合する蛋白質、該蛋白質をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有する組換えベクター、該組換えベクターにより形質転換されてなる形質転換体に関する。また、前記蛋白質の製造方法、前記蛋白質に対する抗体に関する。さらに、前記蛋白質の機能および／または前記ポリヌクレオチドの発現を阻害する化合物の同定方法に関する。また、前記ポリヌクレオチドの発現量を測定することを特徴とする胃腫瘍の診断方法に関する。さらに、前記蛋白質の機能阻害剤および／または前記ポリヌクレオチドの発現阻害剤を有効成分として含んでなる胃腫瘍の防止剤および／または治療剤、前記蛋白質の機能阻害剤および／または前記ポリヌクレオチドの発現阻害剤を用いることを特徴とする、胃腫瘍の防止方法および／または治療方法に関する。また、前記蛋白質、前記ポリヌクレオチド、前記組換えベクター、前記形質転換体および前記抗体のうち、少なくともいずれか１つを含んでなる試薬キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｒｈｏファミリー低分子量ＧＴＰ結合蛋白質（以下、単にＲｈｏファミリー蛋白質と称することがある）は低分子量ＧＴＰ結合蛋白質（以下、単に低分子量Ｇ蛋白質と称する）の１グループに属する蛋白質である。低分子量Ｇ蛋白質は、細胞膜受容体と細胞内情報伝達経路に関与する効果器（エフェクター）との間で、シグナルの増幅因子として作用する。また、低分子量Ｇ蛋白質は、グアノシン５´−三リン酸（ＧＴＰ）またはグアノシン５´−二リン酸（ＧＤＰ）と特異的に結合し、結合したＧＴＰをＧＤＰに加水分解する酵素活性をもつ。細胞膜受容体に細胞外情報物質が結合すると、そのシグナルが低分子量Ｇ蛋白質に伝達され、低分子量Ｇ蛋白質に結合しているＧＤＰと細胞内に存在するＧＴＰとの交換反応（以下、ＧＤＰ／ＧＴＰ交換反応と略称する）が起きる。その結果、活性型（ＧＴＰ結合型）低分子量Ｇ蛋白質が生じる。活性型低分子量Ｇ蛋白質は、エフェクターに作用してシグナルを増幅する。その後、活性型低分子量Ｇ蛋白質は、その酵素活性により、結合しているＧＴＰをＧＤＰに加水分解し、それにより不活性化する。このように、低分子量Ｇ蛋白質は、グアニンヌクレオチドの交換により、細胞内情報伝達経路において分子スイッチとして働く。【０００３】
Ｒｈｏファミリー蛋白質として、Ｃｄｃ４２、Ｒａｃ１およびＲｈｏＡ等が知られている。Ｃｄｃ４２は線維芽細胞でフィロポディアの形成を制御している。Ｒａｃ１は、白血球やマクロファージではスーパーオキシドの産生を、線維芽細胞では細胞膜のラッフリングやラメリポディアの形成を制御している。また、Ｃｄｃ４２とＲａｃ１はｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼシグナル伝達経路を活性化し得る。このように、Ｒｈｏファミリー蛋白質は、細胞内情報伝達の制御を介して様々な細胞機能に関与している。Ｒｈｏファミリー蛋白質が関与する細胞機能として、例えば細胞骨格の再構成、細胞接着、遺伝子発現等が知られている。Ｒｈｏファミリー蛋白質を介するこのような作用は、発生時の形態形成、白血球等の遊走、神経突起退縮、および癌細胞の転移や浸潤に働くと考えられる。【０００４】
Ｒｈｏファミリー蛋白質の分子スイッチとしての作用に関与している分子の１つがＲｈｏグアニンヌクレオチド交換因子（Ｒｈｏ  Ｇｕａｎｉｎｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｅｘｃｈａｎｇｅ  Ｆａｃｔｏｒ、以下Ｒｈｏ−ＧＥＦと略称する）である。Ｒｈｏ−ＧＥＦは、Ｒｈｏファミリー蛋白質のＧＤＰ／ＧＴＰ交換反応を促進してＲｈｏファミリー蛋白質の活性化を促進する機能を有する。この機能により、Ｒｈｏ−ＧＥＦは、Ｒｈｏファミリー蛋白質が関与する細胞内情報伝達の制御に重要な役割を担う。以下、ＧＤＰ／ＧＴＰ交換反応を促進する機能をＧＥＦ活性と称することがある。【０００５】
Ｒｈｏ−ＧＥＦには、特徴的ドメイン構造、例えばＤｂｌ相同ドメイン（Ｄｂｌ  Ｈｏｍｏｌｏｇｙ  Ｄｏｍａｉｎ、以下ＤＨドメインと略称する）およびプレックストリン相同ドメイン（Ｐｌｅｃｋｓｔｒｉｎ  Ｈｏｍｏｌｏｇｙ  Ｄｏｍａｉｎ、以下ＰＨドメインと略称する）が存在する。ＤＨ／ＰＨのタンデム構造は、Ｒｈｏ−ＧＥＦに典型的なドメイン構造である。以下、ＤＨドメインおよびＰＨドメインのタンデム構造を、ＤＨ／ＰＨドメインと呼称する。【０００６】
ＤＨ／ＰＨドメインは、Ｒｈｏ−ＧＥＦによるＲｈｏファミリー蛋白質の活性化に寄与する重要なドメインであり、Ｒｈｏ−ＧＥＦの活性ドメインであると考えられている。例えば、Ｒｈｏ−ＧＥＦのプロトタイプであるｐｒｏｔｏ−Ｄｂｌのアミノ酸配列のうち、ＤＨ／ＰＨドメインを含むＣ末端側領域からなる蛋白質が、Ｒｈｏファミリー蛋白質を活性化することが報告されている（非特許文献１）。この報告において、ｐｒｏｔｏ−Ｄｂｌの全長９２５アミノ酸残基からなるアミノ酸配列のうちＮ末端側第１番目から第４９７番目のアミノ酸残基の欠失により生じたＣ末端側領域からなる蛋白質は、Ｒｈｏファミリー蛋白質を活性化し、その結果、細胞形質転換に関与した。このことから、ｐｒｏｔｏ−Ｄｂｌの活性化は腫瘍原性活性化（ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）と考えられている。以下、ｐｒｏｔｏ−ＤｂｌのＣ末端側領域からなるこのような蛋白質をｏｎｃｏｇｅｎｉｃ−Ｄｂｌと呼称する。ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ−Ｄｂｌが、ＲｈｏＡ、Ｃｄｃ４２およびＲａｃ１と結合すること、並びにＣｄｃ４２およびＲｈｏＡに対してＧＥＦ活性を有する一方、Ｒａｃ１にはＧＥＦ活性を示さないことが報告されている（非特許文献２）。【０００７】
ｐｒｏｔｏ−Ｄｂｌのファミリー蛋白質をコードする遺伝子として、例えばｖａｖ（非特許文献３および４）、ｏｓｔ（非特許文献５）、ｌｂｃ（非特許文献６）等が知られている。これら遺伝子は癌に関与する遺伝子である。その他、Ｒｈｏ−ＧＥＦとして作用する蛋白質をコードする遺伝子として、Ｔｒｉｏ（非特許文献７）やｋａｌｉｒｉｎ（非特許文献８）等が報告されている。Ｔｒｉｏは、そのノックアウトマウスにおいて胎仔発生時の骨格筋の異常および脳の構成異常を引き起こす。ｋａｌｉｒｉｎは、神経細胞における神経突起形成に関与する。このように、Ｒｈｏ−ＧＥＦとして作用する蛋白質が関与する細胞機能は各蛋白質ごとに固有であり、また、該蛋白質が活性化するＲｈｏファミリー蛋白質もそれぞれ異なる。【０００８】
以下に本明細書において引用した文献を列記する。
【非特許文献１】ビ（Ｂｉ，Ｆ．）ら、「モレキュラー  アンド  セルラー  バイオロジー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、２００１年、第２１巻、ｐ．１４６３−１４７４。
【非特許文献２】ハート（Ｈａｒｔ，Ｍ．Ｊ．）ら、「ジャーナル  オブ    バイオロジカル  ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、１９９４年、第２６９巻、ｐ．６２−６５。
【非特許文献３】カツァブ（Ｋａｔｚａｖ，Ｓ．）ら、「エンボ  ジャーナル（ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ）」、１９８９年、第８巻、ｐ．２２８３−２２９０。
【非特許文献４】コステロ（Ｃｏｓｔｅｌｌｏ，Ｐ．Ｓ．）ら、「プロシーディングス  オブ  ザ  ナショナル  アカデミー  オブ  サイエンシズ  オブ  ザ  ユナイテッド  ステーツ  オブ  アメリカ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）」、１９９９年、第９６巻、ｐ．３０３５−３０４０。
【非特許文献５】ホリイ（Ｈｏｒｉｉ，Ｙ．）ら「エンボ  ジャーナル（ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ）」、１９９４年、第１３巻、ｐ．４７７６−４７８６。
【非特許文献６】トクソズ（Ｔｏｋｓｏｚ，Ｄ．）ら、「オンコジーン（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ）」、１９９４年、第９巻、ｐ．６２１−６２８。
【非特許文献７】オブリエン（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ，Ｓ．Ｐ．）ら、「プロシーディングス  オブ  ザ  ナショナル  アカデミー  オブ  サイエンシズ  オブ  ザ  ユナイテッド  ステーツ  オブ  アメリカ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）」、２０００年、第９７巻、ｐ．１２０７４−１２０７８。
【非特許文献８】ペンゼス（Ｐｅｎｚｅｓ，Ｐ．）ら、「ジャーナル  オブ  ニューロサイエンス（Ｊｏｕｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ）」、２００１年、第２１巻、ｐ．８４２６−８４３４。
【非特許文献９】サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編、「モレキュラークローニング，ア  ラボラトリーマニュアル  第２版」、１９８９年、コールドスプリングハーバーラボラトリー。
【非特許文献１０】村松正實編、「ラボマニュアル遺伝子工学」、１９８８年、丸善株式会社。
【非特許文献１１】マディン（Ｍａｄｉｎ，Ｋ．）ら、「プロシーディングス  オブ  ザ  ナショナル  アカデミー  オブ  サイエンシズ  オブ  ザ  ユナイテッド  ステーツ  オブ  アメリカ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）」、２０００年、第９７巻、ｐ．５５９−５６４。
【非特許文献１２】ウルマー（Ｕｌｍｅｒ，Ｋ．Ｍ．）、「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、１９８３年、第２１９巻、ｐ．６６６−６７１。
【非特許文献１３】エールリッヒ（Ｅｈｒｌｉｃｈ，Ｈ．Ａ．）編、「ＰＣＲテクノロジー，ＤＮＡ増幅の原理と応用」、１９８９年、ストックトンプレス。
【非特許文献１４】サイキ（Ｓａｉｋｉ，Ｒ．Ｋ．）ら、「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、１９８５年、第２３０巻、ｐ．１３５０−１３５４。
【非特許文献１５】「実験医学」、１９９４年、第１２巻、第６号、ｐ．３５−。
【非特許文献１６】フローマン（Ｆｒｏｈｍａｎ，Ｍ．Ａ．）ら、「プロシーディングス  オブ  ザ  ナショナル  アカデミー  オブ  サイエンシズ  オブ  ザ  ユナイテッド  ステーツ  オブ  アメリカ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）」、１９８８年、第８５巻、第２３号、ｐ．８９９８−９００２。
【非特許文献１７】サンガー（Ｓａｎｇｅｒ，  Ｆ．）ら、「プロシーディングス  オブ  ザ  ナショナル  アカデミー  オブ  サイエンシズ  オブ  ザ  ユナイテッド  ステーツ  オブ  アメリカ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）」、１９７７年、第７４巻、ｐ．５４６３−５４６７。
【非特許文献１８】マキサム（Ｍａｘａｍ  Ａ．Ｍ．）ら、「メソッズ  イン  エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）」、１９８０年、第６５巻、ｐ．４９９−５６０。
【非特許文献１９】オハラ（Ｏｈａｒａ，Ｏ．）ら、「ディーエヌエー  リサーチ（ＤＮＡ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」、１９９７年、第４巻、ｐ．５３−５９。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の課題は、新規なＲｈｏ−ＧＥＦおよび該Ｒｈｏ−ＧＥＦをコードする遺伝子を提供することである。また本発明の課題には、該遺伝子を含有する組換えベクター、該組換えベクターにより形質転換されてなる形質転換体を提供することも含まれる。さらに本発明の課題には、該Ｒｈｏ−ＧＥＦの製造方法および該Ｒｈｏ−ＧＥＦを認識する抗体を提供することも含まれる。また本発明の課題には、該Ｒｈｏ−ＧＥＦの機能および／または該遺伝子の発現を阻害する化合物の同定方法を提供することも含まれる。さらに本発明の課題には、該Ｒｈｏ−ＧＥＦの機能の異常および／または該遺伝子の発現の異常に基づく疾患の防止方法および／または治療方法、並びに該疾患の診断方法、試薬キットを提供することも含まれる。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは上記課題解決のために鋭意努力し、新規Ｒｈｏ−ＧＥＦをコードする遺伝子を見出し、該遺伝子を用いて新規Ｒｈｏ−ＧＥＦを取得することに成功した。そして、該Ｒｈｏ−ＧＥＦのＤＨ／ＰＨドメインを含む部分蛋白質が、Ｒｈｏファミリー蛋白質であるＲｈｏＡ、Ｃｄｃ４２およびＲａｃ１とそれぞれ結合することを実験的に明らかにした。また、該蛋白質がＣｄｃ４２の活性化を促進することを実証した。さらに該Ｒｈｏ−ＧＥＦ遺伝子の組織発現が、ある胃腺癌様腫瘍（Ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｉｄ  ｔｕｍｏｒ）例において正常な胃組織の約５倍、４．５倍以上であることを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて達成した。【００１１】
すなわち、本発明は、配列表の配列番号１に記載の塩基配列若しくはその相補的塩基配列で表わされるポリヌクレオチド、または配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質をコードするポリヌクレオチド若しくは該ポリヌクレオチドの相補的塩基配列で表わされるポリヌクレオチドに関する。【００１２】
また本発明は、配列表の配列番号３若しくは５に記載の塩基配列またはその相補的塩基配列で表わされるポリヌクレオチド、または配列表の配列番号４若しくは６に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質をコードするポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドの相補的塩基配列で表わされるポリヌクレオチドに関する。【００１３】
さらに本発明は、配列表の配列番号３に記載の塩基配列若しくはその相補的塩基配列で表わされるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、または配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質をコードするポリヌクレオチド若しくは該ポリヌクレオチドの相補的塩基配列で表わされるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドであって、Ｃｄｃ４２の活性化を促進する蛋白質をコードするポリヌクレオチドに関する。【００１４】
さらにまた本発明は、前記ポリヌクレオチドの塩基配列と少なくとも約７０％の相同性を有する塩基配列で表わされるポリヌクレオチドであって、Ｃｄｃ４２の活性化を促進する蛋白質をコードするポリヌクレオチドに関する。【００１５】
また本発明は、前記ポリヌクレオチドの塩基配列において、１乃至数個のヌクレオチドの欠失、置換、付加などの変異あるいは誘発変異を有するポリヌクレオチドであって、Ｃｄｃ４２の活性化を促進する蛋白質をコードするポリヌクレオチドに関する。【００１６】
さらに本発明は、前記ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするポリヌクレオチドであって、Ｃｄｃ４２の活性化を促進する蛋白質をコードするポリヌクレオチドに関する。【００１７】
さらにまた本発明は、前記いずれかのポリヌクレオチドを含有する組換えベクターに関する。【００１８】
また本発明は、前記組換えベクターにより形質転換されてなる形質転換体に関する。【００１９】
さらに本発明は、前記組換えベクターおよびＣｄｃ４２をコードするポリヌクレオチドを含有する組換えベクターにより形質転換されてなる形質転換体に関する。【００２０】
さらにまた本発明は、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質に関する。【００２１】
また本発明は、配列表の配列番号４または６に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質に関する。【００２２】
さらに本発明は、前記いずれかのポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質に関する。【００２３】
さらにまた本発明は、前記形質転換体を培養する工程を含む、前記いずれかの蛋白質の製造方法に関する。【００２４】
また本発明は、前記いずれかの蛋白質を認識する抗体に関する。【００２５】
さらに本発明は、前記いずれかの蛋白質の機能および／または前記いずれかのポリヌクレオチドの発現を阻害する化合物の同定方法であって、ある化合物と該蛋白質および／または該ポリヌクレオチドとの相互作用を可能にする条件下で、該機能および／または該発現の存在、不存在または変化を検出することにより、該化合物が該蛋白質の機能および／または該ポリヌクレオチドの発現を阻害するか否かを判定することを特徴とする同定方法に関する。【００２６】
さらにまた本発明は、蛋白質の機能が、Ｃｄｃ４２と結合する機能および／またはＣｄｃ４２の活性化を促進する機能である前記同定方法に関する。【００２７】
また本発明は、前記いずれかの蛋白質の機能および／または前記いずれかのポリヌクレオチドの発現を阻害する化合物の同定方法であって、前記いずれかの蛋白質、前記いずれかのポリヌクレオチド、前記組換えベクター、前記形質転換体および前記抗体のうち少なくともいずれか１つを用いることを特徴とする同定方法に関する。【００２８】
さらに本発明は、蛋白質の機能が、Ｃｄｃ４２と結合する機能および／またはＣｄｃ４２の活性化を促進する機能である前記同定方法に関する。【００２９】
さらにまた本発明は、ヒト胃組織由来の被検組織が、ヒト胃腫瘍由来組織であるか否かを判定する方法であって、該被検組織における前記いずれかのポリヌクレオチドの発現量を測定することを特徴とする判定方法に関する。【００３０】
また本発明は、被検組織における前記いずれかのポリヌクレオチドの発現量が、対照であるヒト正常胃由来組織における該ポリヌクレオチドの発現量の４．５倍以上である場合に、被検組織がヒト胃腫瘍由来組織であると判定することを特徴とする、前記判定方法に関する。【００３１】
さらに本発明は、前記いずれかの蛋白質の機能を阻害する化合物および／または前記いずれかのポリヌクレオチドの発現を阻害する化合物を有効成分として含んでなる胃腫瘍の防止剤および／または治療剤に関する。【００３２】
さらにまた本発明は、前記いずれかの蛋白質の機能を阻害する化合物および／または前記いずれかのポリヌクレオチドの発現を阻害する化合物を用いることを特徴とする胃腫瘍の防止方法および／または治療方法に関する。【００３３】
また本発明は、前記いずれかの蛋白質、前記いずれかのポリヌクレオチド、前記組換えベクター、前記形質転換体および前記抗体のうち少なくともいずれか１つを含んでなる試薬キットに関する。
【発明の効果】
【００３４】
本発明においては、Ｒｈｏファミリー蛋白質に結合する機能を有し、ＧＤＰ／ＧＴＰ交換反応を促進してＲｈｏファミリー蛋白質を活性化し得る新規蛋白質および該蛋白質をコードするポリヌクレオチドを提供できる。本蛋白質は、Ｒｈｏファミリー蛋白質であるＲｈｏＡ、Ｃｄｃ４２およびＲａｃ１とそれぞれ結合する。さらに本蛋白質は、Ｃｄｃ４２の活性化を促進する。本蛋白質およびポリヌクレオチドにより、Ｒｈｏファミリー蛋白質が関与する情報伝達経路および細胞機能の解明とその調節が実施できる。さらに、本蛋白質の機能の異常および／または本ポリヌクレオチド発現の異常に基づく疾患、例えば胃腫瘍の診断、防止および／または治療が実施できる。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】ｃＤＮＡクローンｈｊ０３７９６または該ｃＤＮＡの部分配列からなるＤＮＡであってＤＨ／ＰＨドメインコード領域を含むＤＮＡを用いて構築したベクターを導入した細胞の細胞溶解液において、ｈｊ０３７９６がコードする蛋白質または該蛋白質のＤＨ／ＰＨドメインを含む蛋白質断片（ｈｊ０３７９６ＤＨ／ＰＨ）を示すバンドが、ウエスタンブロッティング法により検出されたこと（それぞれレーン１および４）を説明する図である。ｐｒｏｔｏ−Ｄｂｌ  ＤＨ／ＰＨは陽性コントロールとして用いた（レーン２および５）。ベクターを導入しなかったコントロール細胞から同様の処理により得た蛋白質溶液では、かかるバンドは検出されなかった（レーン３および６）。（実施例２）
【００３６】
【図２】ｃＤＮＡクローンｈｊ０３７９６の部分配列からなるＤＮＡであってＤＨ／ＰＨドメインコード領域を含むＤＮＡと、Ｒａｃ１遺伝子（レーン１）、ＲｈｏＡ遺伝子（レーン２）またはＣｄｃ４２遺伝子（レーン３）とを共発現させた細胞の細胞溶解液において、該ＤＮＡがコードする蛋白質（ｈｊ０３７９６ＤＨ／ＰＨ）とＲａｃ１（レーン１）、ＲｈｏＡ（レーン２）およびＣｄｃ４２（レーン３）との結合を示すバンドが検出されたことを説明する図である（上図）。結合の測定はプルダウン法により行った。陰性コントロールとしてＲｈｏファミリー蛋白質の代わりにＧＳＴ−ｔａｇ融合β−グルクロニダーゼを用いたとき、あるいはＲｈｏファミリー蛋白質遺伝子を発現させなかったときにはかかるバンドは認められなかった（それぞれレーン４および５）。ｐｒｏｔｏ−Ｄｂｌ  ＤＨ／ＰＨは陽性コントロールとして用いた。各細胞溶解液において、ｈｊ０３７９６ＤＨ／ＰＨまたはｐｒｏｔｏ−Ｄｂｌ  ＤＨ／ＰＨの発現量はほぼ同等であった（下図）。（実施例３）
【００３７】
【図３−Ａ】ｈｊ０３７９６ＤＨ／ＰＨとＲｈｏファミリー蛋白質を共発現させた細胞、およびｈｊ０３７９６ＤＨ／ＰＨまたはＲｈｏファミリー蛋白質を発現させた細胞のいずれにおいても、ｈｊ０３７９６ＤＨまたはＲｈｏファミリー蛋白質の発現がほぼ同等であったことを示す図である。図中ＧＥＦとはｈｊ０３７９６ＤＨ／ＰＨを意味し、ＲｈｏとはＲｈｏファミリー蛋白質を意味する。また、黒矢頭はｈｊ０３７９６ＤＨ／ＰＨを、白矢頭はＲｈｏファミリー蛋白質を示す。（実施例４）
【００３８】
【図３−Ｂ】ｈｊ０３７９６ＤＨ／ＰＨとＣｄｃ４２を共発現させた細胞で、Ｃｄｃ４２のみを発現させた細胞と比較して、ＰＡＫ−１に結合する活性型Ｃｄｃ４２が増加したことを示す図である（レーン４）。図中ＧＥＦとはｈｊ０３７９６ＤＨ／ＰＨを意味し、ＲｈｏとはＲｈｏファミリー蛋白質を意味する。また、白矢頭はＲｈｏファミリー蛋白質を示す。（実施例４）
【発明を実施するための最良の形態】
【００３９】
以下、本発明について発明の実施の態様をさらに詳しく説明する。
本明細書においては、単離された完全長ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ；合成完全長ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ；単離されたＤＮＡオリゴヌクレオチド類および／またはＲＮＡオリゴヌクレオチド類；あるいは合成ＤＮＡオリゴヌクレオチド類および／またはＲＮＡオリゴヌクレオチド類を意味する総称的用語として「ポリヌクレオチド」という用語を使用し、ここでそのようなＤＮＡおよび／またはＲＮＡは最小サイズが２ヌクレオチドである。【００４０】
本明細書においては、単離された若しくは合成の完全長蛋白質；単離された若しくは合成の完全長ポリペプチド；または単離された若しくは合成の完全長オリゴペプチドを意味する総称的用語として「蛋白質」という用語を使用し、ここで蛋白質、ポリペプチド若しくはオリゴペプチドは最小サイズが２アミノ酸である。以降、アミノ酸を表記する場合、１文字または３文字にて表記することがある。【００４１】
（ポリヌクレオチド）
本発明の一態様は新規ポリヌクレオチドに関する。本ポリヌクレオチドは、ヒト脳由来長鎖ｃＤＮＡライブラリーから、Ｒｈｏ−ＧＥＦに特徴的なドメインであるＤＨ／ＰＨドメインをコードする領域を有する遺伝子として同定した。ヒト脳由来長鎖ｃＤＮＡライブラリーは、市販のヒト脳、胎児脳および脳海馬由来のｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡを出発原料として常法により構築したｃＤＮＡライブラリーについてｄｂＥＳＴ（ｄａｔａｂａｓｅ  ｏｆ  Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｔａｇｓ）分析によりｃＤＮＡ断片を単離して全塩基配列を決定したｃＤＮＡクローンからなるｃＤＮＡライブラリーである。【００４２】
本発明に係るポリヌクレオチドの具体的態様は、配列表の配列番号１に記載の塩基配列またはその相補的塩基配列で表わされるポリヌクレオチドであり得る。配列番号１に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドは、４９７７ｂｐのポリヌクレオチドであり、１３４０アミノ酸残基（配列番号２）をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む。配列番号１に記載の塩基配列において第６０２番目から第１１２６番目までのヌクレオチドからなる領域は、配列番号２に記載のアミノ酸配列の第９７番目のバリン（Ｖａｌ）から第２７１番目のアスパラギン酸（Ａｓｐ）までの１７５アミノ酸残基からなるＤＨドメインをコードする。配列番号１に記載の塩基配列において第１２０２番目から第１４９５番目までのヌクレオチドからなる領域は、配列番号２に記載のアミノ酸配列の第２９７番目のロイシン（Ｌｅｕ）から第３９４番目のロイシン（Ｌｅｕ）までの９８アミノ酸残基からなるＰＨドメインをコードする。配列番号１に記載の塩基配列において第６０２番目から第１４９５番目までのヌクレオチドからなる領域は、配列番号２に記載のアミノ酸配列の第９７番目のバリン（Ｖａｌ）から第３９４番目のロイシン（Ｌｅｕ）までの２９８アミノ酸残基からなるＤＨ／ＰＨドメインをコードする。本発明の範囲には、配列番号２に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質をコードするポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドの相補的塩基配列で表わされるポリヌクレオチドも包含される。【００４３】
本発明に係るポリヌクレオチドとしてまた、配列番号３若しくは５に記載の塩基配列またはその相補的塩基配列で表わされるポリヌクレオチドが例示できる。配列番号３に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドは、配列番号１に記載の塩基配列の第５８１番目から第１６７５番目までの塩基配列で表わされるポリヌクレオチドである。また、配列番号５に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドは、配列番号３に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドの５´末端にコザックコンセンサス配列（以下、コザックシークエンスと略称する）とメチオニンに対応するコドンとからなるオリゴヌクレオチド（配列番号１９）が付加されたポリヌクレオチドである。配列番号３または５に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドは、Ｒｈｏ−ＧＥＦの活性ドメインであるＤＨ／ＰＨドメインをコードする領域を含む。【００４４】
本発明に係るポリヌクレオチドは、好ましくは、Ｒｈｏファミリー蛋白質の活性化を促進する機能を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドの相補的塩基配列で表わされるポリヌクレオチドである。かかるポリヌクレオチドとして、配列番号５に記載の塩基配列またはその相補的塩基配列で表わされるポリヌクレオチドを好ましく例示できる。配列番号５に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドとＲｈｏファミリー蛋白質をコードする遺伝子とを共に発現させた動物細胞において、Ｒｈｏファミリー蛋白質の活性化が促進された（実施例４参照）。すなわち、配列番号５に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質は、Ｒｈｏファミリー蛋白質の活性化を促進すると考える。配列番号５に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドは、配列番号１に記載の塩基配列の第５８１番目から第１６７５番目までの塩基配列で表わされるポリヌクレオチド（配列番号３）の５´末端にコザックシークエンスとメチオニンに対応するコドンとからなるオリゴヌクレオチド（配列番号１９）が付加されたポリヌクレオチド（配列番号５）である。配列番号５に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質は、配列番号３に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質のＮ末端にメチオニンがペプチド結合により付加された蛋白質である。コザックシークエンスとメチオニンに対応するコドンとからなるオリゴヌクレオチド（配列番号１９）は、配列番号３に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドの発現を目的として付加したオリゴヌクレオチドであり、発現された蛋白質の機能に大きな影響を与えない。したがって、配列番号３に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドは、コザックシークエンスとメチオニンに対応するコドンとからなるオリゴヌクレオチド（配列番号１９）が付加されていないが、Ｒｈｏファミリー蛋白質の活性化を促進する蛋白質をコードすると考える。【００４５】
配列番号３に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドがコードする蛋白質および配列番号５に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質はいずれも、上記のように、Ｒｈｏファミリー蛋白質の活性化を促進する。配列番号３に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質として配列番号４に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質が挙げられる。配列番号５に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質として配列番号６に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質が挙げられる。配列番号４若しくは６に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質をコードするポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドの相補的塩基配列で表わされるポリヌクレオチドも本発明の範囲に包含される。【００４６】
配列番号３に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドがＲｈｏファミリー蛋白質の活性化を促進する蛋白質をコードすると考えられることから、配列番号３に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドも、Ｒｈｏファミリー蛋白質の活性化を促進する蛋白質をコードすると考える。また、配列番号４に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドも、Ｒｈｏファミリー蛋白質の活性化を促進する蛋白質をコードすると考える。配列番号３に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドとして例えば、配列番号１に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドが挙げられる。配列番号１に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドも、Ｒｈｏファミリー蛋白質の活性化を促進する蛋白質をコードすると考える。【００４７】
本発明の範囲には、配列番号３に記載の塩基配列若しくはその相補的塩基配列で表わされるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドまたは配列番号４に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質をコードするポリヌクレオチド若しくは該ポリヌクレオチドの相補的塩基配列で表わされるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドも包含される。好ましくは、このようなポリヌクレオチドであって、Ｒｈｏファミリー蛋白質の活性化を促進する蛋白質をコードするポリヌクレオチドである。さらに好ましくは、該ポリヌクレオチドであって、ＤＨ／ＰＨドメインコード領域を有するポリヌクレオチドである。【００４８】
本発明に係るポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質によって活性化が促進されるＲｈｏファミリー蛋白質として、例えばＣｄｃ４２、ＲｈｏＡおよびＲａｃ１等、より好ましくはＣｄｃ４２が例示できる。Ｒｈｏファミリー蛋白質はこれらに限定されず、本ポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質によって活性化が促進される限りにおいていずれのＲｈｏファミリー蛋白質であってもよい。本ポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質の、Ｒｈｏファミリー蛋白質の活性化に対する促進機能は、例えばエフェクタープルダウン法を使用して測定できる（実施例４参照）。【００４９】
Ｃｄｃ４２、ＲｈｏＡおよびＲａｃ１は、それぞれ配列表の配列番号２１、２３および２５に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質である。Ｃｄｃ４２遺伝子、ＲｈｏＡ遺伝子およびＲａｃ１遺伝子は、それぞれ配列表の配列番号２０、２２および２４に記載の塩基配列で表わされる遺伝子である。Ｃｄｃ４２、ＲｈｏＡおよびＲａｃ１並びにこれらの遺伝子は、上記各配列で表わされるものに限らず、一般的に知られているＣｄｃ４２、ＲｈｏＡおよびＲａｃ１の機能を有する限りにおいて、上記各配列において１乃至数個の変異を有する蛋白質および遺伝子であることができる。また、これらの機能を促進するあるいは欠失させるといった所望の目的のために上記各配列に１乃至数個の変異を導入した変異体を用いることもできる。Ｃｄｃ４２、ＲｈｏＡおよびＲａｃ１の製造は、例えばその遺伝子を含有する組換えベクターを自体公知の遺伝子工学的方法により導入してなる形質転換体を培養すること等により実施できる。【００５０】
本発明に係るポリヌクレオチドの取得は、本発明により開示されたその具体例、例えば配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドについての配列情報に基づいて、公知の遺伝子工学的手法（非特許文献９および１０等を参照）により容易に実施できる。【００５１】
具体的には、本発明に係るポリヌクレオチドの発現が確認されている適当な起源から、常法に従ってｃＤＮＡライブラリーを調製し、該ｃＤＮＡライブラリーから所望のクローンを選択することにより本ポリヌクレオチドを取得できる。ｃＤＮＡの起源として、本ポリヌクレオチドの発現が確認されている各種の細胞や組織、またはこれらに由来する培養細胞、例えばヒトの脳由来の細胞等が例示できる。これら起源からの全ＲＮＡの分離、ｍＲＮＡの分離や精製、ｃＤＮＡの取得とそのクローニング等はいずれも常法に従って実施できる。また、ヒトの脳、胎児脳および脳海馬由来の市販されているｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを構築して用いることもできる。ｃＤＮＡライブラリーから所望のクローンを選択する方法も特に制限されず、慣用の方法を利用できる。例えば、本ポリヌクレオチドに選択的にハイブリダイゼーションするプローブやプライマー等を用いて所望のクローンを選択できる。具体的には、本ポリヌクレオチドに選択的にハイブリダイゼーションするプローブを用いたプラークハイブリダイゼーション法、コロニーハイブリダイゼーション法等やこれらを組合せた方法等を例示できる。ここで用いるプローブとして、本ポリヌクレオチドの配列情報に基づいて化学合成したポリヌクレオチド等が一般的に使用できる。また、既に取得された本ポリヌクレオチドやその部分塩基配列で表わされるポリヌクレオチドも好ましく使用できる。さらに、本ポリヌクレオチドの配列情報に基づき設計したセンスプライマー、アンチセンスプライマーをかかるプローブとして用いることもできる。【００５２】
ｃＤＮＡライブラリーからの所望のクローンの選択は、例えば公知の蛋白質発現系を利用して各クローンについて発現蛋白質の確認を行い、さらに該蛋白質の機能を指標にして実施できる。本ポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質の機能として、例えば、ＲｈｏＡ、Ｃｄｃ４２およびＲａｃ１等のＲｈｏファミリー蛋白質と結合する機能およびＲｈｏファミリー蛋白質の活性化を促進する機能が挙げられる。蛋白質発現系として、自体公知の発現系がいずれも利用できるが、無細胞蛋白質発現系の利用が簡便である（非特許文献１１）。【００５３】
ここで、「Ｒｈｏファミリー蛋白質の活性化」とは、Ｒｈｏファミリー蛋白質に結合したグアノシン５´−二リン酸（ＧＤＰ）をグアノシン５´−三リン酸（ＧＴＰ）に交換する反応を意味する。本反応は、Ｒｈｏファミリー蛋白質からのＧＤＰの解離反応と、その結果生成したヌクレオチドに結合していないＲｈｏファミリー蛋白質へのＧＴＰの結合反応からなる。「Ｒｈｏファミリー蛋白質の活性化の促進」とは、本反応の律速段階であるＲｈｏファミリー蛋白質からのＧＤＰの解離反応を促進することを意味する。【００５４】
本発明に係るポリヌクレオチドの取得にはその他、ポリメラーゼ連鎖反応（以下、ＰＣＲと略称する、非特許文献１２−１４）によるＤＮＡ／ＲＮＡ増幅法が好適に利用できる。ｃＤＮＡライブラリーから全長のｃＤＮＡが得られ難いような場合には、ＲＡＣＥ法（非特許文献１５）、特に５´−ＲＡＣＥ法（非特許文献１６）等の採用が好適である。ＰＣＲに使用するプライマーは、ポリヌクレオチドの塩基配列情報に基づいて適宜設計でき、常法に従って合成により取得できる。増幅させたＤＮＡ／ＲＮＡ断片の単離精製は、常法、例えばゲル電気泳動法等により実施できる。【００５５】
かくして得られるポリヌクレオチドの塩基配列の決定は、常法、例えばジデオキシ法（非特許文献１７）やマキサム−ギルバート法（非特許文献１８）等により、また簡便には市販のシーケンスキット等を用いて実施できる。【００５６】
本発明に係るポリヌクレオチドは上記ポリヌクレオチドに限定されず、上記ポリヌクレオチドと配列相同性を有し、かつＲｈｏファミリー蛋白質の活性化を促進する蛋白質をコードするポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドの相補的塩基配列で表わされるポリヌクレオチドを包含する。配列相同性は、通常、塩基配列の全体で約５０％以上、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上であることが適当である。さらにより好ましくは、ＤＨ／ＰＨドメインコード領域を有するポリヌクレオチドが望ましい。ＤＨ／ＰＨドメインコード領域における配列相同性は約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上であることが適当である。またＤＨ／ＰＨドメインがその機能、例えばＲｈｏファミリー蛋白質の活性化を促進する機能を保持していることがさらに好ましい。【００５７】
本発明に係るポリヌクレオチドには、上記ポリヌクレオチドの塩基配列において１個以上、例えば１〜１００個、好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１０個、特に好ましくは１個乃至数個のヌクレオチドの欠失、置換、付加または挿入といった変異が存する塩基配列またはその相補的塩基配列で表わされるポリヌクレオチドが包含される。変異の程度およびそれらの位置等は、該変異を有するポリヌクレオチドがＲｈｏファミリー蛋白質の活性化を促進する機能を有する蛋白質、より好ましくはＤＨ／ＰＨドメインを有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドである限り特に制限されない。変異を有するポリヌクレオチドは、天然に存在するポリヌクレオチドであってよく、誘発変異を有するポリヌクレオチドであってよい。また、天然由来の遺伝子に基づいて変異を導入して得たポリヌクレオチドであってもよい。変異を導入する方法は自体公知であり、例えば、部位特異的変異導入法、遺伝子相同組換え法、プライマー伸長法またはＰＣＲ等を、単独でまたは適宜組合せて用いることができる。例えば成書に記載の方法（非特許文献９よび１０）に準じて、あるいはそれらの方法を改変して実施することができ、ウルマーの技術（非特許文献１２）を利用することもできる。【００５８】
本発明に係るポリヌクレオチドとしてはまた、上記ポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするポリヌクレオチドを例示できる。ハイブリダイゼーションの条件は、例えば成書に記載の方法（非特許文献９）等に従うことができる。具体的には、「ストリンジェントな条件下」とは、例えば、６×ＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳおよび５０％  ホルムアミドの溶液中で４２℃にて加温した後、０．１×ＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳの溶液中で６８℃にて洗浄する条件をいう。これらポリヌクレオチドは本ポリヌクレオチドにハイブリダイゼーションするポリヌクレオチドであれば相補的配列を有するポリヌクレオチドでなくてもよい。好ましくは、コードする蛋白質がＲｈｏファミリー蛋白質の活性化を促進する機能を有する蛋白質であり、より好ましくはＤＨ／ＰＨドメインを有する蛋白質であることが望ましい。【００５９】
本発明に係るポリヌクレオチドには、上記ポリヌクレオチドの指定された領域に存在する部分塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドが包含される。このようなオリゴヌクレオチドは、その最小単位として好ましくは該領域において連続する５個以上のヌクレオチド、より好ましくは１０個以上、より好ましくは２０個以上のヌクレオチドからなる。これらオリゴヌクレオチドは、本発明に係るポリヌクレオチドの塩基配列情報に従って、所望の配列を設計し、自体公知の化学合成法により製造できる。簡便には、ＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成装置を用いてオリゴヌクレオチドを製造できる。これらオリゴヌクレオチドは、本遺伝子または本遺伝子断片を増幅するためのプライマー、本遺伝子またはその転写産物を検出するためのプローブ等として用いることができる。【００６０】
本発明に係るポリヌクレオチドの指定された領域に存在する部分塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドとして、配列表の配列番号７、８、９または１０に記載の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドを好ましく例示できる。【００６１】
本発明に係るポリヌクレオチドはヒト由来のポリヌクレオチドであるが、本ポリヌクレオチドと配列相同性を有し、Ｒｈｏファミリー蛋白質の活性化を促進する蛋白質をコードするポリヌクレオチド、好ましくはＤＨ／ＰＨドメインコード領域を有するポリヌクレオチドである限りにおいて、哺乳動物由来のポリヌクレオチド、例えばマウス、ウマ、ヒツジ、ウシ、イヌ、サル、ネコ、クマ、ラットまたはウサギ等由来のポリヌクレオチドも本発明に包含される。【００６２】
本発明に係るポリヌクレオチドは、その発現あるいはそれがコードする蛋白質の機能、例えばＲｈｏファミリー蛋白質の活性化を促進する機能が阻害されない限りにおいて、５´末端側や３´末端側に所望の遺伝子が付加されたポリヌクレオチドであってよい。本ポリヌクレオチドに付加することのできる遺伝子は、具体的には例えばグルタチオン  Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、β−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）、ホースラディッシュパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）またはアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）等の酵素類、あるいはＨｉｓ−ｔａｇ、Ｍｙｃ−ｔａｇ、ＨＡ−ｔａｇ、ＦＬＡＧ−ｔａｇまたはＸｐｒｅｓｓ−ｔａｇ等のタグペプチド類等の遺伝子を例示できる。これら遺伝子から選択した１種類または複数種類の遺伝子を組合せて本ポリヌクレオチドに付加できる。これら遺伝子の付加は、慣用の遺伝子工学的手法により行うことができ、遺伝子やｍＲＮＡの検出を容易にするために有用である。【００６３】
（ベクター）
本発明の一態様は、本発明に係るポリヌクレオチドを含有する組換えベクターに関する。本組換えベクターは、本ポリヌクレオチドを適当なベクターＤＮＡに挿入することにより取得できる。【００６４】
ベクターＤＮＡは宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、宿主の種類および使用目的により適宜選択される。ベクターＤＮＡは、天然に存在するＤＮＡを抽出して得られたベクターＤＮＡの他、複製に必要な部分以外のＤＮＡの部分が一部欠落しているベクターＤＮＡでもよい。代表的なベクターＤＮＡとして例えば、プラスミド、バクテリオファージおよびウイルス由来のベクターＤＮＡを挙げられる。プラスミドＤＮＡとして、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミド等を例示できる。バクテリオファージＤＮＡとして、λファージ等が挙げられる。ウイルス由来のベクターＤＮＡとして例えば、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、パポバウイルス、ＳＶ４０、鶏痘ウイルス、および仮性狂犬病ウイルス等の動物ウイルス由来のベクター、あるいはバキュロウイルス等の昆虫ウイルス由来のベクターが挙げられる。その他、トランスポゾン由来、挿入エレメント由来、酵母染色体エレメント由来のベクターＤＮＡ等を例示できる。あるいは、これらを組合せて作成したベクターＤＮＡ、例えばプラスミドおよびバクテリオファージの遺伝学的エレメントを組合せて作成したベクターＤＮＡ（コスミドやファージミド等）を例示できる。【００６５】
ベクターＤＮＡは、発現ベクターやクローニングベクター等、目的に応じていずれも用いることができる。本発明に係るポリヌクレオチドを含有する組換え発現ベクターは、本ポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質の製造に有用である。【００６６】
ベクターＤＮＡには、本発明に係るポリヌクレオチドの機能が発揮されるように該ポリヌクレオチドを組込むことが必要であり、少なくとも本ポリヌクレオチドとプロモーターとをその構成要素とする。これら要素に加えて、所望によりさらに、複製そして制御に関する情報を担持した遺伝子配列を組合せて自体公知の方法によりベクターＤＮＡに組込むことができる。かかる遺伝子配列として、リボソーム結合配列、ターミネーター、シグナル配列、エンハンサー等のシスエレメント、スプライシングシグナル、および選択マーカー（ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等）等を例示できる。これらから選択した１種類または複数種類の遺伝子配列をベクターＤＮＡに組込むことができる。【００６７】
ベクターＤＮＡに本発明に係るポリヌクレオチドを組込む方法は、自体公知の方法を適用できる。例えば、本ポリヌクレオチドを含む遺伝子を適当な制限酵素により処理して特定部位で切断し、次いで同様に処理したベクターＤＮＡと混合し、リガーゼにより再結合する方法が利用できる。あるいは、本ポリヌクレオチドに適当なリンカーをライゲーションし、これを目的に適したベクターのマルチクローニングサイトへ挿入することによっても、所望の組換えベクターが取得できる。【００６８】
（形質転換体）
本発明の一態様は、本発明に係る組換えベクターにより、宿主を形質転換して得られる形質転換体に関する。本発明に係るポリヌクレオチドを含有する組換え発現ベクターを導入した形質転換体は、本ポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質の製造に有用である。本形質転換体には、本ポリヌクレオチド以外の所望の遺伝子を含有するベクターＤＮＡの１種類または複数種類をさらに導入できる。本ポリヌクレオチド以外の所望の遺伝子を含有するベクターＤＮＡとして、例えば、ＲｈｏＡ、Ｒａｃ１またはＣｄｃ４２等のＲｈｏファミリー蛋白質をコードする遺伝子を含有するベクターＤＮＡが挙げられる。本ポリヌクレオチドを含有する発現ベクターとＲｈｏファミリー蛋白質をコードする遺伝子を含有する発現ベクターとにより形質転換して得られる形質転換体は、本ポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質によるＲｈｏファミリー蛋白質の活性化促進を阻害する化合物の同定方法に使用できる。このような形質転換として好ましくは、本発明に係る組換えベクターとＣｄｃ４２をコードするポリヌクレオチドを含有する組換えベクターとにより形質転換して得られる形質転換体が挙げられる。【００６９】
宿主として、原核生物および真核生物のいずれも用いることができる。原核生物として、例えば大腸菌（エシェリヒアコリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ））等のエシェリヒア属、枯草菌等のバシラス属、シュードモナスプチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）等のシュードモナス属、リゾビウムメリロティ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ）等のリゾビウム属に属する細菌が挙げられる。真核生物として、酵母、昆虫細胞および哺乳動物細胞等の動物細胞を例示できる。酵母は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセスポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）等が挙げられる。昆虫細胞は、Ｓｆ９細胞やＳｆ２１細胞等を例示できる。哺乳動物細胞は、サル腎由来細胞（ＣＯＳ細胞、Ｖｅｒｏ細胞等）、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、マウスＬ細胞、ラットＧＨ３細胞、ヒトＦＬ細胞や２９３ＥＢＮＡ細胞等が例示できる。好ましくは哺乳動物細胞を用いる。最も好ましくは、２９３ＥＢＮＡ細胞を用いる。【００７０】
ベクターＤＮＡの宿主細胞への導入は、自体公知の手段が応用され、例えば成書に記載されている標準的な方法（非特許文献９）により実施できる。より好ましい方法として、遺伝子の安定性を考慮するならば染色体内へのインテグレート法が挙げられるが、簡便には核外遺伝子を利用した自律複製系を使用できる。具体的には、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、マイクロインジェクション、陽イオン脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープ負荷（ｓｃｒａｐｅ  ｌｏａｄｉｎｇ）、バリスティック導入（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）および感染等が挙げられる。【００７１】
原核生物を宿主とする場合、組換えベクターが該原核生物中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボゾーム結合配列、本発明に係るポリヌクレオチド、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。細菌を宿主とする場合、プロモーターは大腸菌等の細菌中で発現できるプロモーターであればいずれも利用可能である。例えば、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター等の、大腸菌やファージに由来するプロモーターが用いられる。ｔａｃプロモーター等の人為的に設計改変されたプロモーターを用いてもよい。細菌への組換えベクターの導入方法は、細菌にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されず、いずれも利用可能である。好ましくは例えば、カルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法等を利用できる。【００７２】
哺乳動物細胞を宿主とする場合、組換えベクターが該細胞中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、ＲＮＡスプライス部位、本発明に係るポリヌクレオチド、ポリアデニル化部位、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、所望により複製起点が含まれていてもよい。プロモーターは、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター等が用いられ、また、サイトメガロウイルスの初期遺伝子プロモーター等を用いてもよい。哺乳動物細胞への組換えベクターの導入方法は、好ましくは例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が利用できる。最も好ましくは、リポフェクション法が用いられる。【００７３】
酵母を宿主とする場合、プロモーターは、酵母中で発現できるプロモーターであれば特に限定されず、例えば、ｇａｌ１プロモーター、ｇａｌ１０プロモーター、ヒートショック蛋白質プロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＰＨ０５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ＡＯＸ１プロモーター等が挙げられる。酵母への組換えベクターの導入方法は、酵母にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されず、好ましくは例えば、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等が利用できる。【００７４】
昆虫細胞を宿主とする場合、組換えベクターの導入方法は、好ましくは例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法等が利用できる。【００７５】
（蛋白質）
本発明の一態様は、本発明に係るポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質に関する。【００７６】
本発明に係る蛋白質の具体的態様として、例えば配列番号１に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質が挙げられる。より具体的には、かかる蛋白質として配列番号２に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質を例示できる。本蛋白質において、その第９７番目バリン（Ｖａｌ）から第２７１番目アスパラギン酸（Ａｓｐ）までのアミノ酸配列にＤＨドメインが、第２９７番目ロイシン（Ｌｅｕ）から第３９４番目ロイシン（Ｌｅｕ）までのアミノ酸配列にＰＨドメインが存在する。第９７番目バリン（Ｖａｌ）から第３９４番目ロイシン（Ｌｅｕ）までのアミノ酸配列にＤＨ／ＰＨドメインが存在する。【００７７】
本発明に係る蛋白質としてまた、配列番号３または５に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質が挙げられる。より具体的には、配列番号３に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質として配列番号４に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質を例示できる。また、配列番号５に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質として配列番号６に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質を例示できる。配列番号４に記載のアミノ酸配列は、配列番号２に記載のアミノ酸配列の第９０番目のリジン（Ｌｙｓ）から第４５４番目のロイシン（Ｌｅｕ）までのアミノ酸配列に相当する。また、配列番号６に記載のアミノ酸配列は、配列番号４に記載のアミノ酸配列のＮ末端にメチオニンがペプチド結合により付加されたアミノ酸配列である。すなわち、これら各アミノ酸配列で表わされる蛋白質は、ＤＨ／ＰＨドメインを含んでいる。【００７８】
本発明に係る蛋白質は、好ましくはＲｈｏファミリー蛋白質の活性化を促進する機能を有する蛋白質である。かかる蛋白質として、配列番号５に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質を好ましく例示できる。配列番号５に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドと、ＲｈｏＡ、Ｃｄｃ４２およびＲａｃ１といった各Ｒｈｏファミリー蛋白質をコードする遺伝子とを共に発現させた動物細胞において、該ポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質は各Ｒｈｏファミリー蛋白質と結合することがプルダウン法により判明した（実施例３参照）。また、当該動物細胞において、Ｃｄｃ４２の活性化が促進された（実施例４参照）。これらから、配列番号５に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質は、Ｒｈｏファミリー蛋白質と結合してその活性化を促進すると考える。配列番号５に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質は、配列番号３に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質のＮ末端にメチオニンがペプチド結合により付加された蛋白質である。配列番号５に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質は、配列番号３に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドの発現を目的として該ポリヌクレオチドの５´末端にコザックシークエンスとメチオニンに対応するコドンとからなるオリゴヌクレオチド（配列番号１９）を付加した結果、得られた蛋白質である。付加されたメチオニンは、発現された蛋白質の機能に大きな影響を与えない。したがって、配列番号３に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質は、Ｎ末端のメチオニンが付加されていないが、Ｒｈｏファミリー蛋白質と結合してその活性化を促進すると考える。【００７９】
配列番号３に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質は、上記のように、配列番号５に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質と同様、Ｒｈｏファミリー蛋白質と結合してその活性化を促進すると考えられる。また、これら蛋白質に含まれるＤＨ／ＰＨドメインは、Ｒｈｏファミリー蛋白質の活性化に寄与する重要なドメインであることが知られている。【００８０】
これらから、配列番号３に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質を含有する蛋白質もＲｈｏファミリー蛋白質と結合してその活性化を促進すると考える。かかる蛋白質として、配列番号３に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質が挙げられる。また、配列番号３に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドが配列番号４に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質をコードすることから、配列番号４に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質が同様にかかる蛋白質として例示できる。具体的には、配列番号３に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質として、配列番号１に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質が例示できる。配列番号１に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質として、配列番号２に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質が挙げられる。これら例示した蛋白質はいずれも、Ｒｈｏファミリー蛋白質と結合してその活性化を促進すると考える。【００８１】
本発明の範囲には、配列番号３に記載の塩基配列若しくはその相補的塩基配列で表わされるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドまたは配列番号４に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質をコードするポリヌクレオチド若しくは該ポリヌクレオチドの相補的塩基配列で表わされるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドであって、Ｒｈｏファミリー蛋白質の活性化を促進する蛋白質をコードするポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質も包含される。【００８２】
本発明に係る蛋白質は上記蛋白質に限定されず、本発明に係るポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質であればいずれも本発明の範囲に包含される。好ましくは、本発明に係るポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質であって、Ｒｈｏファミリー蛋白質の活性化を促進する機能を有する蛋白質が望ましい。かかる蛋白質として、例えば、配列番号１に記載の塩基配列またはその相補的塩基配列で表わされるポリヌクレオチド、配列番号２に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質をコードするポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドの相補的塩基配列で表わされるポリヌクレオチド、配列番号３若しくは５に記載の塩基配列またはその相補的塩基配列で表わされるポリヌクレオチド、および配列番号４若しくは６に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質をコードするポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドの相補的塩基配列で表わされるポリヌクレオチドからなる群より選ばれるいずれか１のポリヌクレオチドの塩基配列と少なくとも７０％の相同性を有する塩基配列で表わされるポリヌクレオチドであって、Ｒｈｏファミリー蛋白質の活性化を促進する蛋白質をコードするポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質が挙げられる。また、例えば、上記ポリヌクレオチド群より選ばれるいずれか１のポリヌクレオチドの塩基配列において１乃至数個のヌクレオチドの欠失、置換、付加等の変異あるいは誘発変異を有する塩基配列で表わされるポリヌクレオチドであって、Ｒｈｏファミリー蛋白質の活性化を促進する蛋白質をコードするポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質が挙げられる。さらに、上記ポリヌクレオチド群より選ばれるいずれか１のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするポリヌクレオチドであって、Ｒｈｏファミリー蛋白質の活性化を促進する蛋白質をコードするポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質であってもよい。【００８３】
本発明に係るこのような蛋白質として、より具体的には、配列番号２、４または６に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質と配列相同性を有し、かつＲｈｏファミリー蛋白質の活性化を促進する機能を有する蛋白質が例示できる。配列相同性は、通常、アミノ酸配列の全体で約５０％以上、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上であることが適当である。さらにより好ましくは、ＤＨ／ＰＨドメインを有する蛋白質が望ましい。ＤＨ／ＰＨドメインにおける配列相同性は約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上であることが適当である。またＤＨ／ＰＨドメインがその機能、例えばＲｈｏファミリー蛋白質の活性化を促進する機能を保持していることがさらに好ましい。また、本蛋白質として、配列番号２、４または６に記載のアミノ酸配列において１個以上、例えば１〜１００個、好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１０個、特に好ましくは１個乃至数個のアミノ酸の欠失、置換、付加または挿入といった変異を有するアミノ酸配列で表わされ、かつＲｈｏファミリー蛋白質の活性化を促進する機能を有する蛋白質が例示できる。アミノ酸の変異の程度およびそれらの位置等は、該変異を有する蛋白質が、Ｒｈｏファミリー蛋白質の活性化を促進する機能を有する蛋白質、より好ましくはＤＨ／ＰＨドメインを有する蛋白質である限り特に制限されない。かかる変異を有する蛋白質は、天然において例えば突然変異や翻訳後の修飾等により生じたものであってよく、また天然由来の遺伝子に基づいて変異を導入して得たものであってもよい。変異を導入する方法は自体公知であり、例えば、公知の遺伝子工学的技術を利用して実施できる。変異の導入において、当該蛋白質の基本的な性質（物性、機能、生理活性または免疫学的活性等）を変化させないという観点からは、例えば、同族アミノ酸（極性アミノ酸、非極性アミノ酸、疎水性アミノ酸、親水性アミノ酸、陽性荷電アミノ酸、陰性荷電アミノ酸および芳香族アミノ酸等）の間での相互の置換は容易に想定される。【００８４】
本発明に係る蛋白質にはさらに、上記蛋白質の部分配列で表わされる蛋白質が包含される。例えば、配列番号２、４または６に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質の部分配列で表わされる蛋白質も本発明の範囲に包含される。かかる蛋白質は、その最小単位として好ましくは５個以上、より好ましくは８個以上、さらに好ましくは１２個以上、特に好ましくは１５個以上の連続するアミノ酸で表わされる。【００８５】
本発明に係る蛋白質はヒト由来の蛋白質であるが、本蛋白質と配列相同性を有し、かつＲｈｏファミリー蛋白質の活性化を促進する機能を有する蛋白質、好ましくはＤＨ／ＰＨドメインを有する蛋白質である限りにおいて、哺乳動物由来の蛋白質、例えばマウス、ウマ、ヒツジ、ウシ、イヌ、サル、ネコ、クマ、ラットまたはウサギ等由来の蛋白質も本発明に包含される。【００８６】
本発明に係る蛋白質は、本蛋白質をコードする遺伝子を遺伝子工学的手法で発現させた細胞や生体試料から調製したもの、無細胞系合成産物または化学合成産物であってよく、あるいはこれらからさらに精製されたものであってもよい。また、本蛋白質は、本蛋白質をコードする遺伝子を含む細胞において発現しているものであり得る。該細胞は、本蛋白質をコードする遺伝子を含むベクターをトランスフェクションして得られた形質転換体であり得る。【００８７】
本発明に係る蛋白質はさらに、その構成アミノ基またはカルボキシル基等を、例えばアミド化修飾する等、機能の著しい変更を伴わない限りにおいて改変が可能である。また、Ｎ末端側やＣ末端側に別の蛋白質等を、直接的に、またはリンカーペプチド等を介して間接的に、遺伝子工学的手法等を用いて付加することにより標識化したものであってよい。好ましくは、本蛋白質の基本的な性質が阻害されないような標識化が望ましい。さらに好ましくは、本蛋白質のＲｈｏファミリー蛋白質の活性化促進機能が阻害されないような標識化が好ましい。標識化に用いる物質（標識物質）は、ＧＳＴ、β−Ｇａｌ、ＨＲＰまたはＡＬＰ等の酵素類、Ｈｉｓ−ｔａｇ、Ｍｙｃ−ｔａｇ、ＨＡ−ｔａｇ、ＦＬＡＧ−ｔａｇまたはＸｐｒｅｓｓ−ｔａｇ等のタグペプチド類、フルオレセインイソチオシアネート（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）またはフィコエリスリン（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）等の蛍光物質類、マルトース結合蛋白質、免疫グロブリンのＦｃ断片あるいはビオチン等が例示できるが、これらに限定されない。また、放射性同位元素による標識化も可能である。標識物質は、１種類または複数種類を組合せて本蛋白質に付加できる。これら標識物質自体またはその機能の測定により、本蛋白質を容易に検出または精製可能であり、また、例えば本蛋白質と他の蛋白質との結合の検出や本蛋白質の機能の測定が可能である。【００８８】
（蛋白質の製造方法）
本発明の一態様は、本発明に係る蛋白質の製造方法に関する。本蛋白質は、例えば本蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列情報に基づいて一般的遺伝子工学的手法（非特許文献９、１０、１２および１３等を参照）により取得可能である。例えば、本発明に係るポリヌクレオチドの発現が確認されている各種の細胞や組織、またはこれらに由来する培養細胞から常法に従ってｃＤＮＡライブラリーをまず調製する。次いで、本蛋白質をコードする遺伝子に選択的にハイブリダイゼーションするプライマーを用いて、該ｃＤＮＡライブラリーから本ポリヌクレオチドを増幅する。得られたポリヌクレオチドの発現誘導を公知の遺伝子工学的手法を利用して行うことにより、本蛋白質を取得できる。【００８９】
具体的には例えば、本発明に係る形質転換体を培養し、次いで得られた培養物から本蛋白質を回収することにより、本蛋白質を製造できる。本形質転換体の培養は、各々の宿主に最適な自体公知の培養条件および培養方法で行うことができる。培養は、形質転換体により発現される本蛋白質自体または本蛋白質の機能、例えばＲｈｏファミリー蛋白質の活性化を促進する機能を指標にして実施できる。あるいは、宿主中または宿主外に産生された本蛋白質自体またはその蛋白質量を指標にして培養してもよく、培地中の形質転換体量を指標にして継代培養またはバッチ培養を行ってもよい。【００９０】
本発明に係る蛋白質が形質転換体の細胞内あるいは細胞膜上に発現する場合には、形質転換体を破砕して本蛋白質を抽出する。また、本蛋白質が形質転換体外に分泌される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離処理等により形質転換体を除去した培養液を用いる。【００９１】
本発明に係る蛋白質は、所望により、形質転換体を培養した培養液または形質転換体から、その物理的性質、化学的性質等を利用した各種分離操作方法により分離および／または精製できる。分離および／または精製は、本蛋白質の機能、例えばＲｈｏファミリー蛋白質の活性化を促進する機能を指標にして実施できる。分離操作方法として、例えば硫酸アンモニウム沈殿、限外ろ過、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、透析法等を単独でまたは適宜組合せて用いることができる。好ましくは、本蛋白質のアミノ酸配列情報に基づき、これらに対する特異的抗体を作製し、該抗体を用いて特異的に吸着する方法、例えば該抗体を結合させたカラムを利用するアフィニティクロマトグラフィーを用いることが推奨される。【００９２】
本発明に係る蛋白質はまた、一般的な化学合成法により製造できる。蛋白質の化学合成方法として、例えば、固相合成方法、液相合成方法等が知られているがいずれも利用可能である。かかる蛋白質合成法は、より詳しくは、アミノ酸配列情報に基づいて、各アミノ酸を１個ずつ逐次結合させて鎖を延長させていくいわゆるステップワイズエロンゲーション法と、アミノ酸数個からなるフラグメントを予め合成し、次いで各フラグメントをカップリング反応させるフラグメントコンデンセーション法とを包含する。本蛋白質の合成は、そのいずれによっても行うことができる。上記蛋白質合成法において利用される縮合法も常法に従うことができる。縮合法として、例えば、アジド法、混合酸無水物法、ＤＣＣ法、活性エステル法、酸化還元法、ＤＰＰＡ（ジフェニルホスホリルアジド）法、ＤＣＣ＋添加物（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、Ｎ−ヒドロキシサクシンアミド、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミド等）法、ウッドワード法等が例示できる。化学合成により得られる本蛋白質はさらに、上記のような慣用の各種精製方法により適宜精製を行うことができる。【００９３】
本発明に係る蛋白質の部分配列で表わされる蛋白質は、本蛋白質を適当なペプチダーゼにより切断することによっても得ることができる。【００９４】
（抗体）
本発明の一態様は、本発明に係る蛋白質を認識する抗体に関する。本抗体は、本蛋白質を抗原として用いて作製できる。抗原として、本蛋白質およびその断片のいずれを用いることもできる。断片を用いるときは、該断片は少なくとも８個、好ましくは少なくとも１０個、より好ましくは少なくとも１２個、さらに好ましくは１５個以上のアミノ酸で構成される。本蛋白質に特異的な抗体を作成するためには、本蛋白質に固有なアミノ酸配列からなる領域を抗原として用いることが好ましい。この領域のアミノ酸配列は、必ずしも該蛋白質またはその断片のアミノ酸配列と同一である必要はなく、その立体構造上の外部への露出部位が好ましい。露出部位のアミノ酸配列が一次構造上で不連続であっても、該露出部位について連続的なアミノ酸配列であればよい。本抗体は本蛋白質を特異的に認識する抗体であればいずれであってもよく、特に限定されない。本蛋白質を特異的に認識するとは、本蛋白質を認識する、例えば本蛋白質に結合するが、本蛋白質以外の蛋白質は認識しないか、弱く認識することを意味する。認識の有無は、公知の抗原抗体結合反応により決定できる。【００９５】
抗体の産生には、自体公知の抗体作製法を利用できる。例えば、抗原をアジュバントの存在下または非存在下で、単独でまたは担体に結合して動物に投与し、体液性応答および／または細胞性応答等の免疫誘導を行うことにより抗体が得られる。担体は、それ自体が宿主に対して有害作用を示さずかつ抗原性を増強せしめる限りにおいて、公知の担体をいずれも使用できる。具体的には、セルロース、重合アミノ酸、アルブミンおよびキーホールリンペットヘモシアニン等を例示できる。アジュバントは、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）、フロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）、Ｒｉｂｉ（ＭＰＬ）、Ｒｉｂｉ（ＴＤＭ）、Ｒｉｂｉ（ＭＰＬ＋ＴＤＭ）、百日咳ワクチン（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ  ｖａｃｃｉｎｅ）、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）、アルミニウムアジュバント（ＡＬＵＭ）、およびこれらの組み合わせを例示できる。免疫される動物は、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマ等が好適に用いられる。【００９６】
ポリクローナル抗体は、免疫手段を施された動物の血清から自体公知の抗体回収法により取得できる。好ましい抗体回収手段として免疫アフィニティクロマトグラフィー法が挙げられる。【００９７】
モノクローナル抗体は、免疫手段が施された動物から抗体産生細胞（例えば、脾臓またはリンパ節由来のリンパ球）を回収し、自体公知の永久増殖性細胞（例えば、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８株等のミエローマ株）への形質転換手段を導入することにより生産できる。例えば、抗体産生細胞と永久増殖性細胞とを自体公知の方法で融合させてハイブリドーマを作成してこれをクローン化する。クローン化した種々のハイブリドーマから、本発明に係る蛋白質を特異的に認識する抗体を産生するハイブリドーマを選別し、該ハイブリドーマの培養液から抗体を回収する。【００９８】
本発明に係る蛋白質を認識または結合し得るポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体は、該蛋白質の精製用抗体、試薬または標識マーカー等として利用できる。特に本蛋白質の機能を阻害する抗体は、本蛋白質の機能調節に使用でき、本蛋白質の機能異常や量的異常に起因する各種疾患の解明、防止、改善および／または治療のために有用である。【００９９】
（化合物の同定方法）
本発明の一態様は、本発明に係る蛋白質の機能を阻害する化合物、あるいは本発明に係るポリヌクレオチドの発現を阻害する化合物の同定方法に関する。本同定方法は、本発明に係る蛋白質、ポリヌクレオチド、組換えベクター、形質転換体または抗体のうち少なくともいずれか１種類を用いて、自体公知の医薬品スクリーニングシステムを利用して実施できる。本同定方法は、インビトロまたはインビボで実施されるいずれの方法も包含する。本同定方法により、本蛋白質の立体構造に基づくドラッグデザインによる拮抗剤の選別、蛋白質合成系を利用した遺伝子レベルでの発現の阻害剤の選別、または抗体を利用した抗体認識物質の選別等が実施できる。【０１００】
本発明に係る蛋白質の機能を阻害する化合物の同定方法は、本蛋白質の機能を測定し得る実験系において、本蛋白質と調べようとする化合物（被検化合物）の相互作用を可能にする条件下で、本蛋白質と被検化合物とを共存させてその機能を測定し、次いで、被検化合物の存在下における本蛋白質の機能と、被検化合物の非存在下における本蛋白質の機能とを比較し、本蛋白質の機能の存在、不存在または変化、例えば低減、増加、消失、出現を検出することにより実施可能である。被検化合物の非存在下における本蛋白質の機能と比較して、被検化合物の存在下における本蛋白質の機能が低減または消失する場合、該被検化合物は本蛋白質の機能を阻害すると判定できる。機能の測定は、該機能の直接的な検出により、または例えば機能の指標となるシグナルを実験系に導入して該シグナルを検出することにより実施できる。シグナルは、ＧＳＴ等の酵素類、Ｈｉｓ−ｔａｇ、Ｍｙｃ−ｔａｇ、ＨＡ−ｔａｇ、ＦＬＡＧ−ｔａｇまたはＸｐｒｅｓｓ−ｔａｇ等のタグペプチド類、または蛍光蛋白質等が例示できるが、一般的に化合物の同定方法に用いられている標識物質であればいずれも利用できる。【０１０１】
本発明に係る蛋白質の機能として、例えばＲｈｏファミリー蛋白質の活性化を促進する機能およびＲｈｏファミリー蛋白質と結合する機能が挙げられる。【０１０２】
本発明に係る蛋白質のＲｈｏファミリー蛋白質との結合機能を指標にした同定方法は、例えば、本蛋白質を遺伝子工学的手法により発現させて取得し、被検化合物の存在下または非存在下におけるＲｈｏファミリー蛋白質との結合の検出を行うことにより実施できる。具体的には、例えばＲｈｏファミリー蛋白質を遺伝子工学的手法によりＧＳＴ−ｔａｇ融合蛋白質として発現させ、その後グルタチオンセファロースに結合させ、被検化合物の存在下または非存在下で、本蛋白質と反応させる。グルタチオンセファロースに結合させたＲｈｏファミリー蛋白質に結合する本蛋白質を定量することにより、本蛋白質のＲｈｏファミリー蛋白質との結合機能を阻害する化合物の同定が可能である。被検化合物の非存在下における両蛋白質の結合と比較して、被検化合物の存在下における両蛋白質の結合が低減または消失する場合、該被検化合物は本蛋白質のＲｈｏファミリー蛋白質との結合機能を阻害すると判定できる。本蛋白質の定量は、例えば、本発明に係る抗体を用いて実施できる。抗体は、ＨＲＰやＡＬＰ等の酵素、放射性同位元素、蛍光物質またはビオチン等の標識物質で標識した抗体を用いることができる。あるいは、標識した二次抗体を用いてもよい。本蛋白質として、タグペプチドを融合した蛋白質を用いれば、抗タグ抗体を用いて定量を実施できる。または、本蛋白質を上記酵素、放射性同位元素、蛍光物質、ビオチン等の標識物質で直接標識して用いてもよい。このような場合、標識物質を測定することにより、本蛋白質の定量を実施できる。【０１０３】
より具体的には、本発明に係る蛋白質をコードするポリヌクレオチドとＲｈｏファミリー蛋白質をコードするポリヌクレオチドとを共発現させた適当な細胞を用い、両蛋白質の結合をプルダウン法により検出する実験系（実施例３参照）を用いて、該結合を阻害する化合物を同定できる。【０１０４】
本発明に係る同定方法に、公知のツーハイブリッド（ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ）法を用いることもできる。例えば、本発明に係る蛋白質とＤＮＡ結合蛋白質を融合蛋白質として発現するプラスミド、Ｒｈｏファミリー蛋白質と転写活性化蛋白質を融合蛋白として発現するプラスミド、および適切なプロモーター遺伝子に接続したレポーター遺伝子を含有するプラスミドを、酵母または真核細胞等に導入する。次いで、被検化合物の存在下におけるレポーター遺伝子の発現量と、被検化合物の非存在下におけるレポーター遺伝子の発現量との比較により、本蛋白質とＲｈｏファミリー蛋白質との結合を阻害する化合物の同定を達成できる。被検化合物の非存在下におけるレポーター遺伝子の発現量と比較して、被検化合物の存在下におけるレポーター遺伝子の発現量が減少または消失する場合、該被検化合物は本蛋白質のＲｈｏファミリー蛋白質との結合機能を阻害すると判定できる。レポーター遺伝子は、レポーターアッセイで一般的に用いられている遺伝子をいずれも用いることができるが、ルシフェラーゼ、β−Ｇａｌまたはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ等の酵素活性を有する遺伝子を例示できる。レポーター遺伝子の発現の検出は、その遺伝子産物の活性、例えば、上記例示したレポーター遺伝子の場合は酵素活性を検出することにより実施できる。【０１０５】
本発明に係る蛋白質とＲｈｏファミリー蛋白質との結合を阻害する化合物の同定方法はまた、ビアコアシステム（ＢＩＡＣＯＲＥ  ｓｙｓｔｅｍ）等の表面プラズモン共鳴センサーを用いて実施できる。あるいは、シンチレーションプロキシミティアッセイ法（Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ  ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ  ａｓｓａｙ、ＳＰＡ）や蛍光共鳴エネルギー転移（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ、ＦＲＥＴ）を応用した方法を用いて、本同定方法を実施できる。【０１０６】
本発明に係る蛋白質が有するＲｈｏファミリー蛋白質の活性化促進機能を指標にした同定方法は、例えば、本蛋白質と該蛋白質により活性化が促進されるＲｈｏファミリー蛋白質とを共存させ、活性化されたＲｈｏファミリー蛋白質の量を、被検化合物の存在下または非存在下において測定することにより実施できる。被検化合物の非存在下における活性化されたＲｈｏファミリー蛋白質の量と比較し、被検化合物の存在下における該蛋白質の量が減少する場合、該化合物は、本蛋白質が有するＲｈｏファミリー蛋白質の活性化促進機能を阻害すると判定できる。活性化されたＲｈｏファミリー蛋白質は、該蛋白質に対する抗体等を用いて定量され得る。例えば、活性化されたＲｈｏファミリー蛋白質は、活性化されたＲｈｏファミリー蛋白質には結合するが、活性化されていないＲｈｏファミリー蛋白質には結合しないか弱く結合するエフェクター分子を用いて定量され得る。具体的には、実施例４に示すように、エフェクター分子の活性化されたＲｈｏファミリー蛋白質との結合部位を含む蛋白質にＧＳＴ−ｔａｇを付加した蛋白質と、活性化されたＲｈｏファミリー蛋白質との結合をプルダウン法により検出し、さらに活性化されたＲｈｏファミリー蛋白質の量を電気泳動法およびウエスタンブロット法により測定する。Ｒｈｏファミリー蛋白質によって、活性化された該蛋白質と結合するエフェクター分子は異なる。したがって、用いるＲｈｏファミリー蛋白質の種類により適当なエフェクター分子を選択して用いる。例えば、活性化されたＣｄｃ４２および活性化されたＲａｃ１は、そのエフェクター分子であるＰＡＫ−１に結合することが知られている。また、活性化されたＲｈｏＡは、そのエフェクター分子であるＲｈｏｔｅｋｉｎに結合する。【０１０７】
本発明に係る蛋白質が有するＲｈｏファミリー蛋白質の活性化促進機能を指標にした同定方法はまた、本蛋白質、該蛋白質により活性化が促進されるＲｈｏファミリー蛋白質であって放射性同位元素で標識したＧＤＰと結合しているＲｈｏファミリー蛋白質およびＧＴＰを共存させ、活性化されたＲｈｏファミリー蛋白質の量を被検化合物の存在下または非存在下において測定することにより実施できる。活性化されたＲｈｏファミリー蛋白質は、放射性同位元素で標識したＧＤＰと結合しているＲｈｏファミリー蛋白質の量の減少により定量され得る。【０１０８】
「Ｒｈｏファミリー蛋白質の活性化促進機能を阻害する」とは、本発明に係る蛋白質により促進される、Ｒｈｏファミリー蛋白質の活性化において、該促進を阻害することを意味する。【０１０９】
本発明に係る同定方法において用いるＲｈｏファミリー蛋白質は、本発明に係る蛋白質との結合および本蛋白質による活性化の促進に影響がない限りにおいて、一部を欠損した蛋白質であってよく、あるいは上記のような標識物質が付加された蛋白質であってよい。【０１１０】
本発明に係るポリヌクレオチドの発現を阻害する化合物の同定方法は、本ポリヌクレオチドの発現を測定し得る実験系において、本ポリヌクレオチドと被検化合物の相互作用を可能にする条件下で、本ポリヌクレオチドと被検化合物とを共存させてその発現を測定し、次いで、被検化合物の存在下における本ポリヌクレオチドの発現と、被検化合物の非存在下における本ポリヌクレオチドの発現とを比較し、本ポリヌクレオチドの発現の存在、不存在または変化、例えば低減、増加、消失、出現を検出することにより実施できる。被検化合物の非存在下における本ポリヌクレオチドの発現と比較して、被検化合物の存在下における本ポリヌクレオチドの発現が減少または消失する場合、該被検化合物は本ポリヌクレオチドの発現を阻害すると判定できる。具体的には例えば、本同定方法は、本発明に係る形質転換体を用いて本ポリヌクレオチドを発現させる実験系において、該形質転換体と被検化合物とを接触させた後に、本ポリヌクレオチドの発現を測定することにより実施できる。発現の測定は、簡便には発現される蛋白質の量、あるいは該蛋白質の機能、例えばＲｈｏファミリー蛋白質の活性化を促進する機能を指標にして実施できる。また、例えば発現の指標となるシグナルを実験系に導入して該シグナルを検出することにより、発現の測定を実施できる。シグナルは、ＧＳＴ等の酵素類、Ｈｉｓ−ｔａｇ、Ｍｙｃ−ｔａｇ、ＨＡ−ｔａｇ、ＦＬＡＧ−ｔａｇまたはＸｐｒｅｓｓ−ｔａｇ等のタグペプチド類、または蛍光物質等が例示できる。これらシグナルの検出方法は当業者には周知である。【０１１１】
本発明に係るポリヌクレオチドの発現を阻害する化合物の同定方法はまた、例えば本ポリヌクレオチドを含む遺伝子のプロモーター領域の下流に、該ポリヌクレオチドの代わりにレポーター遺伝子を連結したベクターを作成し、該ベクターを導入した細胞、例えば真核細胞等と被検化合物とを接触させ、レポーター遺伝子の発現の存在、不存在または変化を測定することにより実施できる。レポーター遺伝子は、レポーターアッセイで一般的に用いられている遺伝子をいずれも用いることができるが、ルシフェラーゼ、β−Ｇａｌまたはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ等の酵素活性を有する遺伝子を例示できる。レポーター遺伝子の発現の検出は、その遺伝子産物の活性、例えば、上記に例示したレポーター遺伝子の場合は酵素活性を検出することにより実施できる。【０１１２】
（化合物）
本発明に係る同定方法により得られた化合物は、本発明に係る蛋白質の機能、例えばＲｈｏファミリー蛋白質の活性化を促進する機能の阻害剤や拮抗剤等の候補化合物として利用できる。また、本発明に係るポリヌクレオチドの発現阻害剤の候補化合物として利用できる。これら候補化合物は、その有用性と毒性のバランスを考慮して選別することにより医薬として調製でき、ゆえに本蛋白質の機能の異常および／または本ポリヌクレオチドの発現の異常に起因する各種病的症状の防止効果および／または治療効果を期待できる。また、本発明に係る化合物は、本同定方法以外の方法により得られた化合物であって、本蛋白質の機能を阻害するおよび／または本ポリヌクレオチドの発現を阻害する化合物も含まれる。【０１１３】
（医薬組成物）
本発明の一態様は、本発明に係る蛋白質、ポリペプチド、組換えベクター、形質転換体、抗体、または化合物を有効成分として含み、本蛋白質の機能および／または本ポリペプチドの発現を阻害するまたは拮抗することに基づく医薬または医薬組成物に関する。【０１１４】
本発明に係る医薬は、本発明に係る蛋白質、ポリヌクレオチド、組換えベクター、形質転換体、抗体、または化合物のうち少なくともいずれか１つを有効成分としてその有効量含む医薬となしてもよい。通常は、１種類または２種類以上の医薬用に許容される担体（医薬用担体）を用いて医薬組成物を製造することが好ましい。【０１１５】
本発明に係る医薬組成物中に含まれる有効成分の量は、広範囲から適宜選択される。通常約０．００００１〜７０重量％、好ましくは０．０００１〜５重量％程度の範囲とするのが適当である。【０１１６】
医薬用担体は、医薬組成物の使用形態に応じて通常使用される、充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、滑沢剤等の希釈剤や賦形剤等が例示できる。これらは得られる医薬組成物の使用形態に応じて適宜選択して使用される。【０１１７】
例えば水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトース等が挙げられる。これらは、本発明に係る医薬組成物の使用形態に応じて適宜１種類または２種類以上を組合せて使用される。【０１１８】
所望により、通常の蛋白質製剤に使用され得る各種の成分、例えば安定化剤、殺菌剤、緩衝剤、等張化剤、キレート剤、ｐＨ調整剤、界面活性剤等を適宜使用して医薬組成物を調製することもできる。【０１１９】
安定化剤は、ヒト血清アルブミンや通常のＬ−アミノ酸、糖類、セルロース誘導体等が例示でき、これらは単独でまたは界面活性剤等と組合せて使用できる。特にこの組合せによれば、有効成分の安定性をより向上させ得る場合がある。上記Ｌ−アミノ酸は、特に限定はなく、例えばグリシン、システイン、グルタミン酸等のいずれでもよい。糖類も特に限定はなく、例えばグルコース、マンノース、ガラクトース、果糖等の単糖類、マンニトール、イノシトール、キシリトール等の糖アルコール、ショ糖、マルトース、乳糖等の二糖類、デキストラン、ヒドロキシプロピルスターチ、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸等の多糖類等およびそれらの誘導体等のいずれでもよい。セルロース誘導体も特に限定はなく、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム等のいずれでもよい。【０１２０】
界面活性剤も特に限定はなく、イオン性および非イオン性界面活性剤のいずれも使用できる。これには、例えばポリオキシエチレングリコールソルビタンアルキルエステル系、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系、ソルビタンモノアシルエステル系、脂肪酸グリセリド系等が包含される。【０１２１】
緩衝剤は、ホウ酸、リン酸、酢酸、クエン酸、ε−アミノカプロン酸、グルタミン酸および／またはそれらに対応する塩（例えばそれらのナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ金属塩やアルカリ土類金属塩）等が例示できる。【０１２２】
等張化剤は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、糖類、グリセリン等が例示できる。【０１２３】
キレート剤は、エデト酸ナトリウム、クエン酸等が例示できる。【０１２４】
本発明に係る医薬および医薬組成物は、溶液製剤として使用できる。その他、これを凍結乾燥化し保存し得る状態にした後、用時、水や生埋的食塩水等を含む緩衝液等で溶解して適当な濃度に調製した後に使用することもできる。【０１２５】
本発明に係る医薬および医薬組成物は、本発明に係る蛋白質の機能の異常および／または本ポリヌクレオチドの発現の異常に基づく疾患の防止剤および／または治療剤として使用できる。また、当該疾患の防止方法および／または治療方法に使用できる。【０１２６】
本発明に係る蛋白質の機能および／または本発明に係るポリヌクレオチドの発現の過剰に関連する異常な症状に対しては、例えば本蛋白質の機能および／または本ポリヌクレオチドの発現を阻害する有効量の阻害剤を医薬用担体とともに対象に投与することにより、異常な症状を防止、改善または治療するといった効果を得ることができる。あるいは、内在性の本ポリヌクレオチドの発現を発現ブロック法を用いて阻害することにより同様の効果が得られる。本ポリヌクレオチドの発現の阻害は、例えば本ポリヌクレオチドの部分配列からなるオリゴヌクレオチドをアンチセンスオリゴヌクレオチドとして用いることにより実施できる。アンチセンスオリゴヌクレオチオドとして用いるオリゴヌクレオチオドは、本ポリヌクレオチドの翻訳領域のみでなく、非翻訳領域に対応するものであっても有用である。本ポリヌクレオチドの発現を特異的に阻害するためには、該ポリヌクレオチドに固有な領域の塩基配列を用いることが好ましい。【０１２７】
本発明に係るポリヌクレオチドの一態様である配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドの組織発現は、胃腫瘍の１つである胃腺癌様腫瘍（ｓｔｏｍａｃｈ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｉｄ  ｔｕｍｏｒ）で正常胃組織と比較して約５倍、４．５倍以上高いことが判明した。配列番号１に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質にはＲｈｏ−ＧＥＦの活性ドメインであるＤＨ／ＰＨドメインが存在する。一方、配列番号１に記載の塩基配列の第５８１番目から第１６７５番目までの塩基配列で表わされるポリヌクレオチド（配列番号３）の５´末端にコザックシークエンスとメチオニンに対応するコドンとからなるオリゴヌクレオチド（配列番号１９）が付加されたポリヌクレオチド（配列番号５）は、ＤＨ／ＰＨドメインコード領域を有し、Ｒｈｏファミリー蛋白質をコードする遺伝子と共発現させた動物細胞において、Ｒｈｏファミリー蛋白質と結合しその活性化を促進した。このことから、配列番号５に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質は、Ｒｈｏ−ＧＥＦとして作用すると考えられる。配列番号３に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドの５´末端に付加されたコザックシークエンスとメチオニンに対応するコドンとからなるオリゴヌクレオチド（配列番号１９）は、発現された蛋白質の機能に大きな影響を与えない。したがって、配列番号３に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質も、Ｒｈｏ−ＧＥＦとして作用すると考える。また、配列番号１に記載の塩基配列は配列番号３に記載の塩基配列を含むため、配列番号１に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質も、Ｒｈｏファミリー蛋白質と結合してＲｈｏ−ＧＥＦとして作用すると考えられる。Ｒｈｏ−ＧＥＦとして単離された遺伝子には、ｖａｖ（非特許文献３および４）、ｏｓｔ（非特許文献５）、ｉｂｃ（非特許文献６）等の癌に関与する遺伝子が知られている。これらから、本ポリヌクレオチドの高発現は胃腫瘍に関連すると考える。したがって、本発明に係る医薬および医薬組成物は、胃腫瘍の防止剤および／または治療剤として有用である。さらに、胃腫瘍の防止方法および／または治療方法に使用できる。【０１２８】
本発明に係る医薬および医薬組成物の用量範囲は特に限定されず、含有される成分の有効性、投与形態、投与経路、疾患の種類、対象の性質（体重、年齢、病状および他の医薬の使用の有無等）、および担当医師の判断等に応じて適宜選択される。一般的には適当な用量は、例えば対象の体重１ｋｇあたり約０．０１μｇ〜１００ｍｇ程度、好ましくは約０．１μｇ〜１ｍｇ程度の範囲であることが好ましい。しかしながら、当該分野においてよく知られた最適化のための一般的な常套的実験を用いてこれらの用量の変更を行うことができる。上記投与量は１日１〜数回に分けて投与することができ、数日または数週間に１回の割合で間欠的に投与してもよい。【０１２９】
本発明に係る医薬または医薬組成物を投与するときは、該医薬または医薬組成物を単独で使用してよく、あるいは治療に必要な他の化合物または医薬と共に使用してもよい。【０１３０】
投与経路は、全身投与または局所投与のいずれも選択できる。この場合、疾患、症状等に応じた適当な投与経路を選択する。例えば、非経口経路として、通常の静脈内投与、動脈内投与のほか、皮下、皮内、筋肉内等への投与が挙げられる。あるいは経口経路で投与できる。さらに、経粘膜投与または経皮投与も実施できる。癌疾患に用いる場合は、腫瘍に注射等により直接投与することが好ましい。【０１３１】
投与形態は、各種の形態が治療目的に応じて選択でき、その代表的な例として、錠剤、丸剤、散剤、粉末剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤等の固体投与形態や、水溶液製剤、エタノール溶液製剤、懸濁剤、脂肪乳剤、リポソーム製剤、シクロデキストリン等の包接体、シロップ、エリキシル等の液剤投与形態が含まれる。これらは更に投与経路に応じて経口剤、非経口剤（点滴剤、注射剤）、経鼻剤、吸入剤、経膣剤、坐剤、舌下剤、点眼剤、点耳剤、軟膏剤、クリーム剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤等に分類され、それぞれ通常の方法に従い、調合、成形、調製することができる。【０１３２】
（診断方法）
本発明に係る蛋白質、ポリヌクレオチド、組換えベクター、形質転換体、抗体または化合物は、それ自体を、診断マーカーや診断試薬等の疾患診断手段として使用できる。【０１３３】
本発明によれば、例えば本発明に係るポリヌクレオチドの一部または全部のポリヌクレオチドを利用することにより、個体または各種組織における該ポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを含む遺伝子の異常の有無あるいは発現の有無を特異的に検出できる。本発明に係るポリヌクレオチドの検出により、該ポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを含む遺伝子の量的異常および／または機能異常等に基づく疾患の易罹患性、発症、および／または予後の診断が実施できる。【０１３４】
疾患の診断は、例えば調べようとする試料（被検試料）について、本発明に係るポリヌクレオチドの存在を検出すること、その存在量を決定すること、および／またはその変異を同定することにより実施できる。正常な対照試料との比較において、本ポリヌクレオチドの存在の変化、その量的変化を検出できる。あるいは、正常遺伝子型との比較において本ポリヌクレオチドを公知の手法により増幅した増幅生成物について、例えばサイズ変化を測定することにより、欠失や挿入といった変異を検出できる。また、被検試料から増幅したポリヌクレオチドを、例えば標識した本ポリヌクレオチドとハイブリダイゼーションさせることにより点突然変異を同定できる。かかる変化および変異の検出により、上記診断を実施できる。【０１３５】
本発明は、被検試料中の本発明に係るポリヌクレオチドの定性的または定量的な測定方法、または該ポリヌクレオチドの特定領域における変異の定性的または定量的な測定方法をも提供できる。【０１３６】
配列番号１に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドの組織発現は、胃腫瘍の１つである胃腺癌様腫瘍で正常胃組織と比較して約５倍、４．５倍以上高いことが判明した。また、上述したように、該ポリヌクレオチドの高発現は胃腫瘍に関連すると考えられる。したがって、被検試料中の該ポリヌクレオチドの発現量の増加を検出することにより、該被検試料が胃腫瘍由来の被検試料であるか否かを判定する方法を実施できる。このような判定方法も本発明の範囲に包含される。本判定方法において該ポリヌクレオチドの発現量の増加は、被検試料と正常な対照試料とを比較することにより検出できる。被検試料として、好ましくはヒト胃組織由来の被検組織が挙げられる。対照試料として、好ましくはヒト正常胃由来組織が挙げられる。該ポリヌクレオチドの発現量が対照試料と比較して増加している場合、好ましくは約４．５倍以上、より好ましくは約５倍以上に増加している場合、被検試料がヒト胃腫瘍由来試料であると判定できる。本判定方法はまた、配列番号１に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドの代わりに、該ポリヌクレオチドを除く本発明に係るポリヌクレオチドを用いて実施できる。かかるポリヌクレオチドとして例えば、配列番号３に記載の塩基配列で表わされるポリヌクレオチドが挙げられる。本発明に係るポリヌクレオチドの発現量とは、該ポリヌクレオチドの転写産物の量を意味する。【０１３７】
被検試料は、本発明に係るポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含む遺伝子またはその変異遺伝子の核酸を含む限りにおいて特に制限されず、例えば、細胞、血液、尿、唾液、髄液、組織生検または剖検材料等の生体生物由来の試料を例示できる。あるいは所望により試料から核酸を抽出して核酸試料を調製して用いることもできる。核酸は、ゲノムＤＮＡを検出に直接使用してもよく、あるいは分析前にＰＣＲまたはその他の増幅法を用いることにより酵素的に増幅してもよい。ＲＮＡまたはｃＤＮＡを同様に用いてもよい。核酸試料は、また、標的配列の検出を容易にする種々の方法、例えば変性、制限消化、電気泳動またはドットブロッティング等により調製してもよい。【０１３８】
本発明に係るポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを含む遺伝子の検出には、自体公知の遺伝子検出法がいずれも使用できる。具体的には、プラークハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション、サザンブロット法、ノザンブロット法、ＮＡＳＢＡ法、または逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）等が例示できる。また、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＲＴ−ＰＣＲやｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーション等を利用した細胞レベルでの測定により検出できる。このような遺伝子検出法において、本発明に係るポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含む遺伝子またはその変異遺伝子の同定および／またはその増幅の実施に、本ポリヌクレオチドの部分配列からなるオリゴヌクレオチドであってプローブとしての性質を有するものまたはプライマーとしての性質を有するものが有用である。プローブとしての性質を有するオリゴヌクレオチドとは、本ポリヌクレオチドのみに特異的にハイブリダイゼーションできる該ポリヌクレオチド特有の配列からなるものを意味する。プライマーとしての性質を有するものとは本ポリヌクレオチドのみを特異的に増幅できる該ポリヌクレオチド特有の配列からなるものを意味する。また、増幅できる変異遺伝子を検出する場合には、遺伝子内の変異を有する箇所を含む所定の長さの配列を持つプライマーあるいはプローブを作成して用いる。プローブまたはプライマーとして、塩基配列長が一般的に５乃至５０ヌクレオチド程度であるものが好ましく、１０乃至３５ヌクレオチド程度であるものがより好ましく、１５乃至３０ヌクレオチド程度であるものがさらに好ましい。本発明に係るポリヌクレオチドまたはその断片を増幅するためのプライマー、あるいは本ポリヌクレオチドを検出するためのプローブとして、具体的には、配列番号７、８、９または１０に記載の塩基配列で表わされるオリゴヌクレオチドを好ましく例示できる。プローブは、通常は標識したプローブを用いるが、非標識であってもよい。また、直接的または間接的に標識したリガンドとの特異的結合により検出してもよい。プローブおよびリガンドを標識する方法は、種々の方法が知られており、例えばニックトランスレーション、ランダムプライミングまたはキナーゼ処理を利用する方法等を例示できる。適当な標識物質として、放射性同位体、ビオチン、蛍光物質、化学発光物質、酵素、抗体等が挙げられる。【０１３９】
遺伝子検出法は、ＰＣＲが感度の点から好ましい。ＰＣＲは、本発明に係るポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含む遺伝子またはその変異遺伝子を特異的に増幅できるプライマーを用いる方法である限り、従来公知の方法のいずれも使用できる。例えばＲＴ−ＰＣＲが挙げられるが、その他、当該分野で用いられる種々のＰＣＲの変法を適応できる。【０１４０】
ＰＣＲにより、遺伝子の検出の他に、本発明に係るポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含む遺伝子またはその変異遺伝子のＤＮＡの定量も実施できる。かかる分析方法として、ＭＳＳＡ法等の競合的定量法、または一本鎖ＤＮＡの高次構造の変化に伴う移動度の変化を利用した突然変異検出法として知られるＰＣＲ−ＳＳＣＰ法を例示できる。【０１４１】
本発明によればまた、例えば本発明に係る蛋白質を利用することにより、個体若しくは各種組織における該蛋白質およびその機能の異常の有無を特異的に検出できる。本発明に係る蛋白質およびその機能の異常の検出により、該蛋白質の量的異常および／または機能の異常に基づく疾患の易罹患性、発症、および／または予後の診断を実施できる。【０１４２】
蛋白質の検出による疾患の診断は、例えば被検試料について、該蛋白質の存在を検出すること、その存在量を決定すること、および／またはその変異を検出することにより実施できる。すなわち、本発明に係る蛋白質および／またはその変異体を定量的あるいは定性的に測定する。正常な対照試料との比較において、本蛋白質の存在の変化、その量的変化を検出できる。正常蛋白質との比較において、例えばアミノ酸配列を決定することによりその変異を検出できる。かかる変化および変異の検出により、上記診断を実施できる。被検試料は、本蛋白質および／またはその変異体を含むものである限り特に制限されず、血液、血清、尿、生検組織等の生体生物由来の生物学的試料が例示できる。【０１４３】
本発明に係る蛋白質および変異を有する該蛋白質の測定は、本発明に係る蛋白質、例えば配列表の配列番号２、４または６に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質、または該蛋白質のアミノ酸配列において１若しくは数個乃至複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列で表わされる蛋白質、これらの断片、または該蛋白質やその断片に対する抗体を用いて実施できる。【０１４４】
蛋白質の定量的あるいは定性的な測定は、この分野における慣用技術による蛋白質検出法あるいは定量法を用いて実施できる。例えば、本蛋白質のアミノ酸配列分析により変異蛋白質を検出できる。さらに好ましくは、抗体（ポリクローナルまたはモノクローナル抗体）を用いて、蛋白質の配列の相違、または蛋白質の有無を検出する。【０１４５】
本発明は、被検試料中の本蛋白質の定性的または定量的な測定方法、または該蛋白質の特定領域の変異の定性的または定量的な測定方法を提供できる。【０１４６】
具体的には、被検試料について、本蛋白質に対する特異抗体を用いて免疫沈降を行い、ウェスタンブロット法またはイムノブロット法で本蛋白質の解析を行うことにより、上記検出を実施できる。また、本蛋白質に対する特異抗体を用いて免疫組織化学的技術によりパラフィンまたは凍結組織切片中の本蛋白質を検出できる。【０１４７】
本蛋白質またはその変異体を検出する方法の好ましい具体例として、モノクローナル抗体および／またはポリクローナル抗体を用いるサンドイッチ法を含む、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、放射線免疫検定法（ＲＩＡ）、免疫放射線検定法（ＩＲＭＡ）、および免疫酵素法（ＩＥＭＡ）等が挙げられる。その他、競争結合アッセイ等を利用することもできる。
【０１４８】
本発明に係る蛋白質、ポリヌクレオチド、組換えベクター、形質転換体、および抗体はいずれも、それ自体を単独であるいは組合わせて、試薬等として使用できる。試薬は、本発明に係る蛋白質、ポリヌクレオチド、組換えベクター、形質転換体、および抗体のうちの少なくとも１種類の他に、緩衝液、塩、安定化剤、および／または防腐剤等の物質を含むことができる。なお、製剤化にあたっては、各性質に応じた自体公知の製剤化手段を導入すればよい。該試薬は、例えば、本発明に係る判定方法、化合物の同定方法、あるいは本蛋白質または本ポリヌクレオチドの測定方法に使用できる。該試薬はその他、本発明に係る蛋白質またはポリヌクレオチドが関与する細胞内情報伝達経路の解明、および該蛋白質またはポリヌクレオチドの異常に基づく疾患等に関する基礎的研究等に有用である。【０１４９】
本発明はまた、本発明に係る蛋白質、ポリヌクレオチド、組換えベクター、形質転換体、および抗体のうちの少なくともいずれか１つを含んでなる試薬キットを提供する。試薬キットにはその他、本発明に係る蛋白質やポリヌクレオチドを検出するための標識物質、標識の検出剤、反応希釈液、標準抗体、緩衝液、洗浄剤および反応停止液等、測定の実施に必要とされる物質を含むことができる。標識物質として、上述の蛋白質や放射性同位元素等が挙げられる。標識物質は、予め本発明に係る蛋白質あるいはポリヌクレオチドに付加されていてもよい。本試薬キットは、本発明に係る判定方法、化合物の同定方法、あるいは本蛋白質または本ポリヌクレオチドの測定方法に使用できる。さらに、本試薬キットは、前記測定方法を用いる検査方法に、検査剤並びに検査用キットとして使用できる。また、前記測定方法を用いる診断方法にも、診断剤並びに診断用キットとして使用できる。【０１５０】
以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明する。
【実施例１】
【０１５１】
（ヒト脳由来ｃＤＮＡライブラリーの構築と遺伝子の分取）
ヒトの脳、胎児脳および脳海馬由来のｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製：カタログＮｏ．６５１６−１、６５２５−１および６５７８−１）を出発原料として常法によりｃＤＮＡライブラリーを構築し、ｄｂＥＳＴ分析によりｃＤＮＡ断片を単離してｃＤＮＡクローンの塩基配列を決定した。具体的には、小原らの方法（非特許文献１９）に従って調製した上記ヒト脳由来のｃＤＮＡライブラリーから、約５０，０００個の組換え体をランダムに選択し、このうち約３０，０００個のクローンのｃＤＮＡについて、その５′末端および３′末端の塩基配列を決定した。さらに約１，１００個のクローンを主にインビトロの転写翻訳実験により選択し、それらｃＤＮＡの塩基配列を小原らの方法に従って決定した。【０１５２】
全塩基配列の決定を行ったｃＤＮＡクローンについて、コンピュータプログラムを用いた汎用解析方法によりＯＲＦを予想した。次いで、ＯＲＦ領域についてモチーフドメイン検索を行い、Ｒｈｏ−ＧＥＦの活性ドメインであるＤＨ／ＰＨドメインをコードする領域を含むｃＤＮＡを同定した。【０１５３】
同定したｃＤＮＡクローンｈｊ０３７９６は、全長４９７７ｂｐの新規な塩基配列を有するＤＮＡ（配列番号１）であり、１３４０アミノ酸（配列番号２）をコードするＯＲＦを含む。ＤＨドメインは配列番号２に記載のアミノ酸配列の第９７番目のバリン（Ｖａｌ）から第２７１番目のアスパラギン酸（Ａｓｐ）までの１７５アミノ酸残基からなる。ＰＨドメインは配列番号２に記載のアミノ酸配列の第２９７番目のロイシン（Ｌｅｕ）から第３９４番目のロイシン（Ｌｅｕ）までの９８アミノ酸残基からなる。ＤＨドメインおよびＰＨドメインをコードする領域はそれぞれ、配列番号１に記載の塩基配列の第６０２番目から第１１２６番目のヌクレオチドおよび第１２０２番目から第１４９５番目のヌクレオチドに相当する。
【実施例２】
【０１５４】
（ＤＮＡの発現と精製）
実施例１で同定したクローンｈｊ０３７９６を用いて、該クローンがコードする蛋白質をＦＬＡＧ−ｔａｇ融合蛋白質として２９３ＥＢＮＡ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）で発現させた。また、クローンｈｊ０３７９６がコードする蛋白質の部分配列からなりＤＨ／ＰＨドメインを含む蛋白質を２９３ＥＢＮＡ細胞を用いて発現させた。発現の確認はウエスタンブロット法により行った。【０１５５】
まず、ｈｊ０３７９６遺伝子を含む発現ベクターを構築した。テンプレートとしてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ−ｈｊ０３７９６（ｈｊ０３７９６はｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ＋のＳａｌＩ−ＮｏｔＩサイトに挿入されている：かずさＤＮＡ研究所製）、プライマーとしてＫ０５９９ｓ３（配列番号７）およびａｓＢａｍ１（配列番号８）を用いてｐｆｕ  ｔｕｒｂｏ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）にて遺伝子を増幅した。増幅した遺伝子をＨｉｎｃＩＩ／ＢａｍＨＩで切断して得た遺伝子断片、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ−ｈｊ０３７９６をＳａｌＩ／ＨｉｎｃＩＩで切断した遺伝子断片、およびｐＤｓＲｅｄ２−Ｎ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）をＳａｌＩ／ＢａｍＨＩで切断した遺伝子断片をライゲーションし、コンピテントセルに導入した。次いで、形質転換した大腸菌から精製キットを用いてＤＮＡを精製した。精製ＤＮＡをＳａｌＩ／ＢａｍＨＩで切断して得られたｈｊ０３７９６フラグメントを、ベクターＤＮＡであるｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ５ｂ（ＳＩＧＭＡ社製）のＳａｌＩ／ＢａｍＨＩサイトに挿入し、ｈｊ０３７９６発現ベクターを得た。制限酵素処理を行った塩基配列が正しく挿入されていることは、シーケンスを行なって確認した。シーケンス反応はＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＡＢＩ社製）を、泳動および解析はＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７７を用いて行なった。【０１５６】
次に、ｈｊ０３７９６クローンがコードする全長蛋白質の部分配列からなる蛋白質であってＤＨ／ＰＨドメインを含む蛋白質（以下、ｈｊ０３７９６ＤＨ／ＰＨと称する）を発現させるためのベクターを、ゲートウェイＴＭクローニングテクノロジー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて構築した。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ−ｈｊ０３７９６をテンプレートとし、ｐｆｕ  ｔｕｒｂｏを用いて、ｐｒｏｔｏ−ＤｂｌのＤＨ／ＰＨドメインコード領域と相同性のある領域（配列番号１の第５８１番目から第１６７５番目のヌクレオチドに相当）の５´末端にコザックシークエンスとメチオニンに対応するコドンとからなるオリゴヌクレオチド（配列番号１９）が付加されたポリヌクレオチドを増幅した。その後、増幅産物をＴＯＰＯクローニングシステムを用いた反応にてｐＥＮＴＲ／ＳＤ／Ｄ−ＴＯＰＯに挿入し、エントリーベクターを作製した。増幅反応にはプライマーとして、０３７９６Ｄ／Ｐ−Ｆ１（配列番号９）および０３７９６Ｄ／Ｐ−Ｒ３（配列番号１０）を使用した。次いで、上記エントリーベクターとＣ末端ＦＬＡＧ−ｔａｇ（３×）融合蛋白質発現ベクターを用いて、ＬＲクロナーゼによる組換え反応により、ｈｊ０３７９６ＤＨ／ＰＨをＦＬＡＧ−ｔａｇ（３×）融合蛋白質として発現させるための発現ベクターを作製した。ｈｊ０３７９６のＤＨ／ＰＨドメインコード領域の塩基配列が正しく挿入されていることは、シーケンスを行って確認した。シーケンス反応はＤＹＥｎａｍｉｃ  ＥＴ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を、泳動および解析はＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７７を用いて行なった。【０１５７】
ｈｊ０３７９６ＤＨ／ＰＨの比較対照として、既知Ｒｈｏ−ＧＥＦであるｐｒｏｔｏ−ＤｂｌのＤＨ／ＰＨドメイン（以下、ｐｒｏｔｏ−Ｄｂｌ  ＤＨ／ＰＨと称する）を用いるためにその発現ベクターを構築した。マルチプルティシューｃＤＮＡパネルズ（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  ｃＤＮＡ  Ｐａｎｅｌｓ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）のブレインファーストストランドＤＮＡ（ｂｒａｉｎ  ｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ＤＮＡ）をテンプレートとし、ｐｆｕ  ｔｕｒｂｏを用いてｐｒｏｔｏ−ＤｂｌのＤＨ／ＰＨドメインコード領域（ｐｒｏｔｏ−Ｄｂｌの塩基配列中の開始ＡＴＧコドンより第１４８５番目から第２４２９番目）を増幅した。その後、増幅産物をライゲーション反応にてｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ５ａ（ＳＩＧＭＡ社製）のＢｇｌＩＩ−ＳａｌＩサイトに挿入し、ｐｒｏｔｏ−Ｄｂｌ  ＤＨ／ＰＨをＦＬＡＧ−ｔａｇ融合蛋白質として発現させるための発現ベクターを作製した。増幅反応にはプライマーとして、Ｄ／Ｐ−ｓ１（ＢｇｌＩＩ）（配列番号１１）およびＤ／Ｐ−ａｓ１（ＳａｌＩ）（配列番号１２）を使用した。ｐｒｏｔｏ−ＤｂｌのＤＨ／ＰＨドメインコード領域の塩基配列が正しく挿入されていることをシーケンスにより確認したところ、１塩基が公開配列と異なることが明らかになった。しかし、この１塩基の差異によるアミノ酸置換は認められなかった。具体的には、発現ベクターに挿入されたｐｒｏｔｏ−ＤｂｌのＤＨ／ＰＨドメインコード領域の塩基配列は、ｐｒｏｔｏ−Ｄｂｌの公開配列（アクセッション番号：Ｘ１２５５６）と比較し、その公開配列の開始ＡＴＧコドンより第１９６２番目の塩基であるＴ（チミン）がＡ（アデニン）となった塩基配列である。発現ベクターに挿入されたｐｒｏｔｏ−ＤｂｌのＤＨ／ＰＨドメインコード領域の塩基配列は、ｐｒｏｔｏ−Ｄｂｌの公開配列の開始ＡＴＧコドンより第１４８０番目から第２４３３番目までの塩基配列の５´末端にＡＴＧＧＣＡが付加されている塩基配列である。したがって、発現ベクターに挿入されたｐｒｏｔｏ−ＤｂｌのＤＨ／ＰＨコード領域において、その開始ＡＴＧコドンより第４８９番目の塩基が公開配列の対応する塩基と異なっている。公開配列の開始ＡＴＧコドンより第１９６０番目から第１９６２番目までの塩基はＧＧＴであり、グリシンをコードしている。一方、発現ベクターに挿入されたｐｒｏｔｏ−ＤｂｌのＤＨ／ＰＨコード領域の塩基配列の開始ＡＴＧコドンより第４８７番目から第４８９番目までの塩基はＧＧＡであり、同様にグリシンをコードしている。すなわち、１塩基の差異によるアミノ酸置換は認められなかった。ｐｒｏｔｏ−Ｄｂｌの公開塩基配列および該公開塩基配列にコードされるアミノ酸配列をそれぞれ配列番号２６および２７に示す。配列番号２６に示したｐｒｏｔｏ−Ｄｂｌの塩基配列は、２００５年２月２４日にＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）公開データベースを閲覧したときに公開されていた塩基配列である。【０１５８】
各発現ベクターは、２９３ＥＢＮＡ細胞にリポフェクション法によりトランスフェクションした。すなわち、各発現ベクターを添加した無血清のＤＭＥＭとリポフェクトアミン２０００（ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ２０００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を添加したＤＭＥＭとを混合し、室温で２０分間インキュベーションした。得られた混合液を、前日播種して３７℃にて５％ＣＯ２存在下で培養した２９３ＥＢＮＡ細胞に添加した。遺伝子導入処理した細胞は３７℃にて５％ＣＯ２存在下で２日間インキュベーションした。培養終了後、エチレンジアミン四酢酸を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ−ＥＤＴＡ）にて細胞を洗浄し、プロテアーゼインヒビターカクテル（ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌ、１／１００濃度、ＳＩＧＭＡ社製）１％を含む溶解バッファー（Ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ）にて細胞を溶解して細胞溶解液を調製した。溶解バッファーは、次の組成からなる：２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５；１５０ｍＭ  ＮａＣｌ；１ｍＭ  ＣａＣｌ２；および１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００。【０１５９】
各細胞溶解液は、等量のＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーと混合し、加熱処理（１００℃で５分間）して電気泳動用サンプルを調製した。ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、泳動ゲルをブロッティングバッファーに５分間以上浸して平衡化した後、ＰＶＤＦ膜上に蛋白質をトランスファーした。ブロッティング終了後のＰＶＤＦ膜は、ＴＢＳ−Ｔにブロックエース（大日本製薬株式会社製）を３：１の割合で混合した溶液（ＴＢＳ−Ｔ＋ＢＡ）に４℃で一晩浸してブロッキングした。ブロッキング終了後に、ＰＶＤＦ膜をＴＢＳ−Ｔにて１０分以上振とうしながら１回洗浄した。上記で用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーは、次の組成からなる：１．７％  Ｔｒｉｓ；０．１３Ｍ  ＨＣｌ；２２％  グリセロール；４．６％  ＳＤＳ；および０．２２ｇ／ｍＬ  ブロモフェノールブルー。ブロッティングバッファーは、次の組成からなる：２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ；４０ｍＭ  ε−アミノ−ｎ−カプロン酸；２０％メタノール；および０．０５％  ＳＤＳ。ＴＢＳ−Ｔは、次の組成からなる：１５０ｍＭ  ＮａＣｌ；１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５；および０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０。【０１６０】
抗ＦＬＡＧ  Ｍ２モノクローナル抗体（ＳＩＧＭＡ社製）をＴＢＳ−Ｔ＋ＢＡで１０００倍希釈してＰＶＤＦ膜に添加し、３７℃で１時間以上保温した。その後、ＰＶＤＦ膜をＴＢＳ−Ｔにて３回洗浄し（１回の洗浄に付き１０分以上の振とう）、ＴＢＳ−Ｔ＋ＢＡで１０００倍に希釈したＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を添加して、３７℃で１時間以上保温した。最終的に、ＰＶＤＦ膜をＴＢＳ−Ｔにて３回洗浄した後（１回の洗浄に付き１０分以上の振とう）、ＥＣＬプラスウエスタンブロッティングディテクションシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）により、抗ＦＬＡＧ抗体に反応する発現蛋白質を検出した。化学発光シグナルは検出装置（Ｌｕｍｉｎｏ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ａｎａｌｙｚｅｒ、東洋紡績株式会社製）にて可視化した。【０１６１】
結果を図１に示す。ＦＬＡＧ−ｔａｇ融合蛋白質として発現させたｈｊ０３７９６は、２２０ＫＤａから９７．４ＫＤａの間に単一バンドとして検出された（図１内レーン１）。ｈｊ０３７９６ＤＨ／ＰＨは、抗ＦＬＡＧ抗体により約５０ＫＤａに単一バンドとして検出された（図１内レーン４）。ｈｊ０３７９６がコードする蛋白質（以下、ｈｊ０３７９６蛋白質と称する）およびｈｊ０３７９６ＤＨ／ＰＨの予想分子量はそれぞれ約１５０ＫＤａおよび約４３ＫＤａである。このことから、上記単一バンドは、それぞれｈｊ０３７９６およびｈｊ０３７９６ＤＨ／ＰＨであることが明らかになった。また、ｐｒｏｔｏ−Ｄｂｌ  ＤＨ／ＰＨは、抗ＦＬＡＧ抗体により約４０ＫＤａに単一バンドとして検出された（図１内レーン２およびレーン５）。ベクターを導入しなかったコントロール細胞から同様の処理により得た蛋白質溶液では、かかるバンドはいずれも検出されなかった（レーン３および６）。【０１６２】
かくして、ｈｊ０３７９６蛋白質、ｈｊ０３７９６ＤＨ／ＰＨ、およびｐｒｏｔｏ−Ｄｂｌ  ＤＨ／ＰＨを得ることができた。
【実施例３】
【０１６３】
（Ｒｈｏファミリー蛋白質との結合の検出）
実施例２で構築したｈｊ０３７９６ＤＨ／ＰＨ（Ｃ末端ＦＬＡＧ−ｔａｇ融合蛋白質）発現ベクターを用いて、ｈｊ０３７９６ＤＨ／ＰＨとＲｈｏファミリー蛋白質との結合について、プルダウン法により検討した。【０１６４】
Ｒｈｏファミリー蛋白質として、Ｃｄｃ４２、ＲｈｏＡおよびＲａｃ１を用いた。これら蛋白質をＮ末端ＧＳＴ−ｔａｇ融合蛋白質として発現させるための発現ベクターは後述するように構築した。【０１６５】
陽性コントロールとしてｐｒｏｔｏ−Ｄｂｌ  ＤＨ／ＰＨを用いた。ｐｒｏｔｏ−Ｄｂｌ  ＤＨ／ＰＨ（Ｃ末端ＦＬＡＧ−ｔａｇ融合蛋白質）発現ベクターは実施例２で構築した発現ベクターを用いた。ｐｒｏｔｏ−ＤｂｌはＲｈｏ−ＧＥＦのプロトタイプであり、ｐｒｏｔｏ−Ｄｂｌの活性化はｏｎｃｏｇｅｎｉｃ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎと考えられている。ｐｒｏｔｏ−Ｄｂｌの活性化は、そのアミノ酸配列のＮ末端側（第１番目から第４９７番目のアミノ酸）の欠失により起こる。すなわち、ｐｒｏｔｏ−ＤｂｌのＣ末端側のＤＨ／ＰＨドメインを含む領域（ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ−Ｄｂｌ）がＲｈｏファミリー蛋白質を活性化することが報告されている（非特許文献１）。本実施例において用いたｐｒｏｔｏ−Ｄｂｌ  ＤＨ／ＰＨはｐｒｏｔｏ−Ｄｂｌの第４９４番目から第８１１番目までのアミノ酸を有する欠失変異体であり、ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ−Ｄｂｌより短い配列である。ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ−Ｄｂｌは、Ｃｄｃ４２、ＲｈｏＡおよびＲａｃ１と結合するが、Ｃｄｃ４２およびＲｈｏＡに対してＧＥＦ活性を有する一方、Ｒａｃ１にはＧＥＦ活性を持たないことが報告されている（非特許文献２）。【０１６６】
ｈｊ０３７９６ＤＨ／ＰＨまたはｐｒｏｔｏ−Ｄｂｌ  ＤＨ／ＰＨに結合するＲｈｏファミリー蛋白質の特異性を確認するため、Ｎ末端側にＧＳＴ−ｔａｇを付加したβ−グルクロニダーゼ（Ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ）（以下、ＧＳＴ−ＧＵＳと略称する）を陰性コントロールとして用いた。【０１６７】
ｈｊ０３７９６ＤＨ／ＰＨ発現ベクターまたはｐｒｏｔｏ−Ｄｂｌ  ＤＨ／ＰＨ発現ベクターとＲｈｏファミリー蛋白質発現ベクターとを添加した無血清のＤＭＥＭとＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を添加したＤＭＥＭを混合し、室温で２０分間インキュベーションした。得られた混合液を２９３ＥＢＮＡ細胞に添加した。２９３ＥＢＮＡ細胞は、遺伝子導入の前日に細胞数６．０×１０４／ｗｅｌｌを２４ウエルプレートへ播種し、３７℃にて５％ＣＯ２存在下で一晩培養した後に本実施例で用いた。遺伝子導入処理した細胞は３７℃にて５％ＣＯ２存在下で２日間インキュベーションした。培養終了後、ＰＢＳ−ＥＤＴＡにて細胞を洗浄し、プロテアーゼインヒビターカクテル（ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌ、ＳＩＧＭＡ社製）１％を含む溶解バッファー（組成は実施例２を参照）にて細胞を溶解して細胞溶解液を調製した。【０１６８】
各細胞溶解液について、ｈｊ０３７９６ＤＨ／ＰＨまたはｐｒｏｔｏ−Ｄｂｌ  ＤＨ／ＰＨとＲｈｏファミリー蛋白質との結合をプルダウン法により検出した。各細胞溶解液３００μＬ、溶解バッファーにけん濁した２０μＬのグルタチオンセファロース４Ｂ（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ）および溶解バッファー１００μＬを混合した。各サンプルは、ＭｇＣｌ２およびジチオスレイトール（ＤＴＴ）がそれぞれ最終濃度１ｍＭとなるように調製した。回転盤にて回転させながら４℃で１時間反応させた後に、１ｍＬの冷却した溶解バッファー（ＭｇＣｌ２の最終濃度は１ｍＭ）を用いて遠心処理（１，０００ｒｐｍで４℃にて１５秒間）により３回洗浄した。洗浄後、上清を除去したＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂに、溶解バッファーと等量のＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファー（組成は実施例２を参照）とを混合した溶液を４０μＬ添加してミキサーにて撹拌後、加熱処理（１００℃にて５分間）して電気泳動用サンプルを調製した。ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、ブロッティングバッファー（組成は実施例２を参照）に５分間以上浸して平衡化した泳動ゲルから、ＰＶＤＦ膜上に蛋白質をトランスファーした。ブロッティング終了後のＰＶＤＦ膜は、ＴＢＳ−Ｔ＋ＢＡ（組成は実施例２を参照）に４℃で一晩浸してブロッキングした。ブロッキング終了後に、ＰＶＤＦ膜をＴＢＳ−Ｔ（組成は実施例２を参照）にて洗浄した（１０分以上の振とうを１回）。【０１６９】
抗ＦＬＡＧ  Ｍ２モノクローナル抗体（ＳＩＧＭＡ社製）をＴＢＳ−Ｔ＋ＢＡで１０００倍希釈してＰＶＤＦ膜に添加し、３７℃で１時間以上保温した。その後、ＰＶＤＦ膜をＴＢＳ−Ｔにて３回洗浄し（１回の洗浄に付き１０分以上の振とう）、ＴＢＳ−Ｔ＋ＢＡで１０００倍に希釈したＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を添加して、３７℃で１時間以上保温した。最終的に、ＰＶＤＦ膜をＴＢＳ−Ｔにて３回洗浄した後（１回の洗浄に付き１０分以上の振とう）、ＥＣＬプラスウエスタンブロッティングディテクションシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）により、抗ＦＬＡＧ抗体に反応する発現蛋白質を検出した。化学発光シグナルは検出装置にて可視化した。【０１７０】
抗ＦＬＡＧ抗体にて予想分子量にバンドが検出された場合、ｈｊ０３７９６ＤＨ／ＰＨまたはｐｒｏｔｏ−Ｄｂｌ  ＤＨ／ＰＨはＲｈｏファミリー蛋白質と結合すると判定した。図２に示したように、ｈｊ０３７９６ＤＨ／ＰＨとＲｈｏファミリー蛋白質（Ｒａｃ１、ＲｈｏＡまたはＣｄｃ４２）とを共発現させた細胞から調製した試料ではそれぞれ約５０ＫＤａにｈｊ０３７９６ＤＨ／ＰＨに相当するバンドが検出された（図２の上図、ｈｊ０３７９６ＤＨ／ＰＨのレーン１、２および３）。一方、ｐｒｏｔｏ−Ｄｂｌ  ＤＨ／ＰＨとＲｈｏＡまたはＣｄｃ４２とを共発現させた細胞から調製した試料では、ｐｒｏｔｏ−Ｄｂｌ  ＤＨ／ＰＨに相当する約４０ＫＤａ付近にバンドが検出された（図２の上図、ｐｒｏｔｏ−Ｄｂｌ  ＤＨ／ＰＨのレーン２および３）が、ｐｒｏｔｏ−Ｄｂｌ  ＤＨ／ＰＨとＲａｃ１とを共発現させた細胞から調製した試料ではかかるバンドは検出されなかった（図２の上図、ｐｒｏｔｏ−Ｄｂｌ  ＤＨ／ＰＨのレーン１）。ｈｊ０３７９６ＤＨ／ＰＨおよびｐｒｏｔｏ−Ｄｂｌ  ＤＨ／ＰＨとＧＳＴ−ｔａｇ融合β−グルクロニダーゼとを共発現させた細胞から調製した試料では、かかるバンドは検出されなかった（図２の上図、レーン４）。すなわち、ｈｊ０３７９６ＤＨ／ＰＨおよびｐｒｏｔｏ−Ｄｂｌ  ＤＨ／ＰＨは、ＧＳＴ−ＧＵＳとは結合しなかった、また、Ｒｈｏファミリー蛋白質遺伝子を発現させなかったときにはかかるバンドは認められなかった（レーン５）。各細胞におけるｈｊ０３７９６ＤＨ／ＰＨおよびｐｒｏｔｏ−Ｄｂｌ  ＤＨ／ＰＨの発現量を細胞溶解液を用いて比較したところ、ほぼ同量であった（図２の下図）。【０１７１】
これらから、ｈｊ０３７９６ＤＨ／ＰＨがＣｄｃ４２、ＲｈｏＡまたはＲａｃ１と結合することが判明した。したがって、ｈｊ０３７９６ＤＨ／ＰＨを含むｈｊ０３７９６全長蛋白質は、これらＲｈｏファミリー蛋白質と結合すると考えられ、さらにＲｈｏ−ＧＥＦとしての機能を有する可能性がある。【０１７２】
本実施例で用いたＣｄｃ４２、ＲｈｏＡまたはＲａｃ１をＮ末端ＧＳＴ−ｔａｇ融合蛋白質として発現させるための各発現ベクターは以下のように構築した。
Ｃｄｃ４２、ＲｈｏＡまたはＲａｃ１の発現ベクターはゲートウェイＴＭクローニングテクノロジー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて作製した。まず、Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  ｃＤＮＡ  Ｐａｎｅｌｓ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）のスプリーンファーストストランドＤＮＡ（ｓｐｌｅｅｎ  ｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ＤＮＡ）をテンプレートとして、ｐｆｕ  ｔｕｒｂｏを用いて各Ｒｈｏファミリー蛋白質（Ｃｄｃ４２、ＲｈｏＡおよびＲａｃ１）をコードする遺伝子を増幅した。増幅産物を、ＴＯＰＯ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍを用いた反応にてｐＥＮＴＲ／Ｄに挿入してエントリーベクターを作製した。増幅反応にはプライマーとして、Ｃｄｃ４２遺伝子に対してはＣｄｃ４２−ｓ１（配列番号１３）およびＣｄｃ４２−ａｓ１（配列番号１４）、ＲｈｏＡ遺伝子に対してはＲｈｏＡ−ｓ１（配列番号１５）およびＲｈｏＡ−ａｓ１（配列番号１６）、Ｒａｃ１遺伝子に対してはＲａｃ１−ｓ１（配列番号１７）およびＲａｃ１−ａｓ１（配列番号１８）を使用した。次に、構築したエントリーベクターについて、Ｎ末端ＧＳＴ−ｔａｇ融合蛋白質発現ベクターであるｐＤＥＳＴ２７を用いてＬＲクロナーゼによる組換え反応よりＧＳＴ融合Ｒｈｏファミリー蛋白質発現プラスミドを作製した。各遺伝子のコード領域の塩基配列が正しく挿入されていることをシーケンスを行って確認した。シーケンス反応はＤＹＥｎａｍｉｃ  ＥＴ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を、泳動および解析はＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７７を用いて行なった。
【実施例４】
【０１７３】
（ｈｊ０３７９６ＤＨ／ＰＨによるＣｄｃ４２の活性化促進）
ｈｊ０３７９６ＤＨ／ＰＨのＲｈｏファミリー蛋白質に対するＧＥＦ活性を、実施例２で構築したｈｊ０３７９６ＤＨ／ＰＨ（Ｃ末端ＦＬＡＧ−ｔａｇ融合蛋白質）発現ベクターを用いて、エフェクタープルダウン法により検討した。Ｒｈｏファミリー蛋白質として、Ｃｄｃ４２、ＲｈｏＡおよびＲａｃ１を用いた。これらＲｈｏファミリー蛋白質はいずれもＮ末端３×ＦＬＡＧ−ｔａｇ融合蛋白質として発現させた。【０１７４】
ｈｊ０３７９６ＤＨ／ＰＨ（Ｃ末端ＦＬＡＧ−ｔａｇ融合蛋白質）発現ベクターと上記いずれかのＲｈｏファミリー蛋白質を発現させるための発現ベクターとを、２４ウエルプレートに播種した２９３ＥＢＮＡ細胞に導入した。ベクターの細胞への導入は、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を用いて行った。陰性コントロールとして、細胞に各ベクターを導入せずに、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００のみを添加したものを用いた。遺伝子導入１日後、プロテアーゼインヒビターカクテル（１／１００濃度：ＳＩＧＭＡ社製）を含む溶解バッファーで細胞を溶解して細胞溶解液を調製した。次いで、細胞溶解液をエフェクターベッド（ＵＰＳＴＡＴＥ社製）と４℃で１時間反応させた。エフェクターベッドとして、ＰＡＫ−１またはＲｈｏｔｅｋｉｎの、活性型Ｒｈｏファミリー蛋白質に結合するドメインにＧＳＴ−ｔａｇを付加した蛋白質が結合しているグルタチオンアガロースを用いた。反応させたエフェクターベッドは、溶解バッファーで洗浄し、溶出液（トリス・ＳＤＳ・βメルカプトエタノール処理液：株式会社第一化学社製）で溶出操作を行った。得られた溶出液は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりウエスタンブロッティングに付し、その後、抗ＦＬＡＧ抗体を用いてＦＬＡＧ−ｔａｇ付加蛋白質の検出を実施した。溶解バッファーは次の組成からなる：２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５；１５０ｍＭ  ＮａＣｌ；１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２；１ｍＭ  ＥＤＴＡ；２％  グリセロール；１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００。【０１７５】
ｈｊ０３７９６ＤＨ／ＰＨがＲｈｏファミリー蛋白質に対してＧＥＦ活性を有するならば、ｈｊ０３７９６ＤＨ／ＰＨによりＲｈｏファミリー蛋白質は不活性型（ＧＤＰ結合型）から活性型（ＧＴＰ結合型）に移行する。エフェクターベッドとして使用したＰＡＫ−１は活性型Ｃｄｃ４２および活性型Ｒａｃ１と結合することが知られている。また、Ｒｈｏｔｅｋｉｎは活性型ＲｈｏＡと結合する。したがって、ｈｊ０３７９６ＤＨ／ＰＨがＲｈｏファミリー蛋白質に対してＧＥＦ活性を有するならば、エフェクターベッドに結合するＲｈｏファミリー蛋白質量が増加する。抗ＦＬＡＧ抗体により、ｈｊ０３７９６ＤＨ／ＰＨおよびＲｈｏファミリー蛋白質を共発現させた細胞から得た試料が、Ｒｈｏファミリー蛋白質のみを発現させた細胞から得た試料よりもＲｈｏファミリー蛋白質のバンドが濃く検出される場合、ｈｊ０３７９６ＤＨ／ＰＨはＧＥＦ活性を有すると判定した。【０１７６】
結果を図３−Ａおよび図３−Ｂに示す。図３−Ａは、各細胞溶解液に含まれるＲｈｏファミリー蛋白質および／またはｈｊ０３７９６ＤＨ／ＰＨの発現を抗ＦＬＡＧ抗体により検出した結果を示す。各Ｒｈｏファミリー蛋白質（図中ではＲｈｏと示す）の発現は、ｈｊ０３７９６ＤＨ／ＰＨと共発現させた細胞およびＲｈｏファミリー蛋白質のみを発現させた細胞のいずれにおいても、ほぼ同等であった（図３−Ａのレーン２、４、６、８、１０および１２において白矢頭で示す）。ＲｈｏＡについては複数のバンドが確認された（図３−Ａのレーン６および８）。これは、蛋白質分解酵素による影響であると考えた。また、ｈｊ０３７９６ＤＨ／ＰＨ（図中ではＧＥＦと示す）の発現は、ｈｊ０３７９６ＤＨ／ＰＨのみを発現させた細胞および各Ｒｈｏファミリー蛋白質と共発現させた細胞のいずれにおいても、ほぼ同等であった（図３−Ａのレーン３、４、７、８、１１および１２において黒矢頭で示す）。【０１７７】
図３−Ｂは、上記各細胞溶解液を用いてエフェクタープルダウン法を実施した結果を示す。Ｃｄｃ４２とｈｊ０３７９６ＤＨ／ＰＨ（図中ではＧＥＦと示す）を共発現させた細胞から得た試料（図３−Ｂのレーン４）において、Ｃｄｃ４２のみを発現させた細胞から得た試料（図３−Ｂのレーン２）と比較して、バンドが濃く検出された。すなわち、Ｃｄｃ４２とｈｊ０３７９６ＤＨ／ＰＨを共発現させた細胞では、ＰＡＫ−１に結合する活性型Ｃｄｃ４２が増加した。このことから、ｈｊ０３７９６ＤＨ／ＰＨは、Ｃｄｃ４２に対してＧＥＦ活性を有することが明らかになった。よって、ｈｊ０３７９６ＤＨ／ＰＨを含むｈｊ０３７９６全長蛋白質もＣｄｃ４２に対してＧＥＦ活性を有すると考える。このように、ｈｊ０３７９６は、Ｃｄｃ４２の活性化を促進する機能を有することが判明した。
【産業上の利用可能性】
【０１７８】
本発明に係るポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質はＲｈｏファミリー蛋白質と結合し、さらにＲｈｏファミリー蛋白質の活性化を促進した。本蛋白質およびポリヌクレオチドの利用により、Ｒｈｏファミリー蛋白質が関与する情報伝達経路および細胞機能の解明とその調節、並びに本蛋白質またはポリヌクレオチドの異常に基づく疾患、例えば胃腫瘍の診断、防止および／または治療が可能になる。したがって、本発明は基礎科学分野から医薬開発分野まで広く寄与する有用な発明である。
【配列表フリーテキスト】
【０１７９】
配列番号１：グアニンヌクレオチド交換因子としての機能を有する蛋白質（配列番号２）をコードするポリヌクレオチド。
配列番号１：（６０２）：（１１２６）Ｄｂｌ相同ドメインをコードする領域。
配列番号１：（１２０２）：（１４９５）プレックストリン相同ドメインをコードする領域。
配列番号３：配列番号１の第５８１番目から第１６７５番目までのヌクレオチドからなる部分配列であって、Ｄｂｌ相同ドメインおよびプレックストリン相同ドメインをコードする領域を含むポリヌクレオチドであり、ここで該ポリヌクレオチドは配列番号４に記載のアミノ酸配列をコードする。
配列番号５：５´末端にコザックコンセンサス配列とメチオニンに対応するコドンとを有し、それに続いて、配列番号１の第５８１番目から第１６７５番目までのヌクレオチドからなる部分配列であってＤｂｌ相同ドメインおよびプレックストリン相同ドメインをコードする領域を含む配列を有するポリヌクレオチドであり、ここで該ポリヌクレオチドは配列番号６に記載のアミノ酸配列をコードする。
配列番号５：（１）：（４）コザックコンセンサス配列。
配列番号５：（５）：（７）メチオニンに対応するコドン。
配列番号７：プライマー用に配列番号１の配列に基づいて設計されたポリヌクレオチド。
配列番号８：プライマー用に配列番号１の配列に基づいて設計されたポリヌクレオチド。
配列番号９：プライマー用に配列番号１の配列に基づいて設計されたポリヌクレオチド。
配列番号１０：プライマー用に配列番号１の配列に基づいて設計されたポリヌクレオチド。
配列番号１１：プライマー用にｐｒｏｔｏ−Ｄｂｌの配列に基づいて設計されたポリヌクレオチド。
配列番号１２：プライマー用にｐｒｏｔｏ−Ｄｂｌの配列に基づいて設計されたポリヌクレオチド。
配列番号１３：プライマー用にＣｄｃ４２の配列に基づいて設計されたポリヌクレオチド。
配列番号１４：プライマー用にＣｄｃ４２の配列に基づいて設計されたポリヌクレオチド。
配列番号１５：プライマー用にＲｈｏＡの配列に基づいて設計されたポリヌクレオチド。
配列番号１６：プライマー用にＲｈｏＡの配列に基づいて設計されたポリヌクレオチド。
配列番号１７：プライマー用にＲａｃ１の配列に基づいて設計されたポリヌクレオチド。
配列番号１８：プライマー用にＲａｃ１の配列に基づいて設計されたポリヌクレオチド。
配列番号１９：コザックコンセンサス配列とそれに続くメチオニンに対応するコドンを含む設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号２０：Ｃｄｃ４２遺伝子。
配列番号２１：Ｃｄｃ４２
配列番号２２：ＲｈｏＡ遺伝子
配列番号２３：ＲｈｏＡ
配列番号２４：Ｒａｃ１遺伝子
配列番号２５：Ｒａｃ１
配列番号２６：ｐｒｏｔｏ−Ｄｂｌ（配列番号２７）をコードする遺伝子。
【図１】
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【図２】
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【図３−Ａ】
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【図３−Ｂ】
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【配列表】
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