(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中の少なくとも２種の物質を互いに分離するための不連続密度勾配遠心分離法であって、当該方法が、順次
（ｉ）高密度遠心分離媒体とサンプルを混合して特定の密度の混合物を得るステップと、
（ｉｉ）ａ）分離すべき物質又は溶質を含むサンプルと上記高密度遠心分離媒体との上記混合物であって、分離すべき目的の物質又は溶質の密度よりも高い特定の密度を有する混合物を遠沈管の底部に置き、ｂ）ａ）の混合物の上に低密度溶液を置くステップと、
（ｉｉｉ）上記サンプル中の目的の物質又は溶質が上記低密度溶液に浮遊し、上記サンプル中の他の物質が底部の高密度媒体に留まるように、所定の遠心力下で上記遠沈管を遠心分離するステップと、
（ｉｖ）目的の物質又は溶質を個別に回収するステップと
を含んでおり、上記遠心分離媒体がコロイド密度勾配媒体であり、上記低密度溶液がコロイド密度勾配媒体ではない、方法。
【請求項２】
ａ）の混合物の密度よりも密度の低いコロイド密度勾配遠心分離媒体をａ）の混合物とｂ）の低密度溶液の間に置く、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記ｂ）の溶液が水溶液である、請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項４】
上記コロイド密度勾配媒体が平均粒径２〜４０ｎｍの粒子の懸濁液を含む、請求項１乃至請求項３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
上記コロイド密度勾配媒体が水和径１０〜３０ｎｍの粒子の懸濁液を含む、請求項１乃至請求項３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ステップ（ｉｖ）の後に下相を回収し、再懸濁させて所定の密度の第２の混合物とし、この第２の混合物を用いてステップ（ｉ）〜（ｉｖ）を繰り返し、ステップ（ｉ）〜（ｉｖ）を繰り返す際の第２の混合物の密度及び／又は遠心力がいずれも前回のステップ（ｉ）〜（ｉｖ）の場合と異なる、請求項１乃至請求項５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
目的物質の性質に応じてステップ（ｉｉ）〜（ｉｖ）を何回か繰り返す、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
１種以上の目的物質の分離を可能とするために、遠心分離工程中の遠心力とコロイド媒体の所定の密度の組合せがステップ（ｉ）〜（ｉｖ）の各回ごとに選択される、請求項６又は請求項７に記載の方法。
【請求項９】
分離する目的物質が細胞、微生物、ウイルス及びその画分、核酸並びにタンパク質である、請求項１乃至請求項８のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明はサンプル中の少なくとも2種の物質を分離するための不連続密度勾配遠心分離の方法およびキットに関する。本方法およびキットでは、コロイド密度媒体と低密度溶液を用いる。
【０００２】
（発明の背景）
基礎研究、ならびに診断および臨床応用においても細胞や細胞成分の分離は重要な手段である。例えば、細胞や微生物は互いに、また種々のサンプル(例えば、臨床サンプル、工業サンプル、食品サンプル、環境サンプルおよび法医学サンプル)から、例えば培養、接種、細胞融合、臨床治療および生化学分析に、サンプルの活性の阻害または分離プロセスで付加された活性の阻害により干渉されずに使用できるように分離する必要がある場合が多い。これらの阻害活性は例えば内在する抗体、プロテアーゼ、ヌクレアーゼ、内毒素および抗生物質でありうる。細菌やウイルスなどの微生物は真核生物の遺伝子配列と類似の遺伝子配列を含むので、サンプル中にこれら両者が同時に存在している場合には誤った結果につながることがある。
【０００３】
上記のような分離の問題を解決するため、示差遠心分離、濾過、アフィニティー精製、および選択培養培地が使用されてきた。低分子量(Nycodenzなど)およびコロイド型(BactXtractor, Percoll, PureSperm)双方の密度媒体も用いられてきた。公知の方法の多くは、連続密度勾配で遠心分離した後に用いた密度媒体中での固有の成分の密度に基づいて分離する。これらのプロセスは勾配全体に、従って目的の画分にも、望まない物質が分布するという欠点を持つ。
【０００４】
従来の不連続密度勾配遠心分離では、サンプルをその密度媒体にのせ、目的の画分を生じた下相の底部から回収する。遠心分離は角度遠心分離機で行われ、これは細菌、またはその他目的の細胞もしくは画分がそれらの密度レベルまで沈降する間に遠沈管の壁に当たった場合に損傷を受けることがあり、これは細菌の死およびそのDNA/RNA内容物の漏出を招く。サンプルをコロイド媒体にのせる場合には下相が汚染する危険性がある。この汚染は一部は壁の影響によるものであり（すなわち、サンプルが管壁をつたって流れ落ち、下相と混ざる）、また一部はは特に最初のサンプル添加が速すぎて下相と混合してしまうことによる。遠心分離後の求める画分を上相から吸引して回収するか(パスツールピペットまたはカニューレを用いる)、上相を吸引した後に回収するかに関わらず、この手法は目的画分の再汚染をもたらす。前者の場合、パスツールピペットまたはカニューレを経て上相から下相へ微細量の材料が移る。後者場合、上相の材料が管の内壁に保持されている液体に存在している限り完全には除去できないので汚染が起こる。この液体は上相を吸引する際に下へ流れ、上相が除かれるとこの液体が下相を汚染する。この種の沈降分離に伴うもう1つの欠点は上相と下相の間の境界でプラグ(物理的バリア)を形成する材料を含むサンプルの収率が悪くなるということで、これは細胞／細菌が下方への沈降を妨げるためである。様々な密度勾配媒体のもう1つの欠点はその固有の毒性にあり、これは多くの適用で極めて望ましくないことである。
【０００５】
FR 2561256では、密度勾配でフローテーション超遠心分離を用いて抗原核粒子などの生物粒子を精製する方法が記載されている。より具体的には、サンプルを予め作製した密度勾配の上層に置き、次に上層のサンプルを回収することを考慮して遠心分離するが、一方、夾雑物などはこの勾配の下層へ移動している。この精製プロセスの前には、サンプルを濃縮および予備精製する必要がある。この密度勾配は低分子化合物、すなわち塩化セシウムによって提供される。このプロセスで遠心分離中に必要とされるg力(g-forces)は少なくとも20000xgである。この高いg力は勾配の性質に起因するものであり、勾配溶液の沈降は塩の拡散によって生じる沈降方向とは反対の方向に溶質分子を拡散させることでバランスする。塩勾配はコロイドシリカなどの他の勾配ほど正確な値で設定することが容易でないことが示されている。従って、FR 2561256で示唆された勾配は時間が経つにつれ不安定となる。さらにまた、CsClなどの小分子によって生じる浸透圧はある種の材料には有害であったり、また、生物材料と相互作用してサンプルの本来の特徴に影響を及ぼしたりする場合がある。従って、この種の方法は細胞などのデリケートな生物構造の分離には適当でない。
【０００６】
最後に、非イオン勾配媒体、例えばスクロース勾配も分離用として提案されているが、スクロースなどの糖類の性質は上記で論じた塩と同様であるので、これらの方法には上記と同種の欠点、すなわち時間とともに境界がどんどん拡散する不安定勾配、微生物、細胞などに有害な浸透圧といった欠点を必然的に伴う。
【０００７】
（発明の概要）
本発明の1つの目的は、新しい原理、すなわち1回以上の遠心分離工程の後に目的物質を浮遊させることによる新規な不連続密度勾配遠心分離法を提供することで上記の1以上の欠点を回避することにある。
【０００８】
本発明のさらなる目的は、先行技術の方法よりも目的物質の汚染の危険が少ない、不連続密度勾配遠心分離法を提供することにある。これは多段階法によって達成され、遠心分離サンプルの下層部分に対して、密度とg力が異なること以外は請求項１に記載されたものと同じ一連の混合および遠心分離を繰り返す工程を1回以上行う。この下層部分にさらなる処理を行うので、実質的にサンプルにステップ間でピペット操作は必要なくなり、通常の汚染経路が断たれる。さらにまた、この新規な多段階法は、1シリーズの工程をそれぞれそのサンプル中に存在することが分かっている、または存在すると予測される物質を特異的に分離する条件で行えるように計画できることから、先行技術に比べて優れた柔軟性をもたらす。
(図面の簡単な説明)
図１は、4回の遠心分離工程を用いる、本発明の方法の実施原理を示した模式図である。
【０００９】
（発明の詳細な説明）
よって、第1の態様では、本発明はサンプル中の少なくとも2種の物質を互いに分離するための不連続密度勾配遠心分離法を提供する。本方法は
(i)a)高密度コロイド遠心分離媒体と物質を含むサンプルの第1の混合物(なお、この混合物では密度が定義されている)を遠沈管の底部に、
b)a)の混合物の上に低密度の溶液を置き、
(ii)上記サンプル中の目的の物質または溶質を低密度溶液に浮遊させ、上記サンプル中の他方の物質を底部の高密度媒体に留まらせるように、特定のg力下で上記管を遠心分離し、
(iii)目的物質を個別に回収する
ステップを特徴とし、この遠心分離媒体がコロイド密度勾配媒体であって、それぞれの層に不連続勾配が提供される。
【００１０】
上記のように、上記の一連のステップ(i)〜(iii)を所定密度の第2、第3、第4などの混合物を含めて1回、2回、3回または何回でも繰り返し、第2、第3、第4その他のg力で遠心分離することができる。当業者ならばサンプルから分離しようとする物質の密度を基に、g力と密度の適当な組合せを選択することができる。このようなg力の体系的変動は先行技術では密度勾配遠心分離に関しては示唆されていない。また、本発明に従って設計された方法は本発明が有用である広範なサンプルに適用される先行技術の方法の結果よりも優れた純度を提供しうることから、この目的でコロイド遠心分離媒体を用いる利点はまったく予期されなかったものである。
【００１１】
ある実施形態では、a)の混合物よりも密度の低いコロイド密度勾配遠心分離媒体がa)の混合物とb)の低密度溶液の間に置かれる。これにより混合サンプルと低密度溶液の間に付加的なバリアが設けられ、分離後の回収が改良され、容易になる。本明細書において「不連続」とは、例えば遠沈管で、異なる密度の溶液の連続的重層をさす。
【００１２】
遠心分離媒体のコロイド的性質が本発明の本質的な特徴であり、密度勾配の安定性が極めて向上されていることなどの利点が得られる。本発明に従って用いられる遠心分離媒体はコロイドシリカに基づく材料など、重い媒体でなければならない。この媒体は不活性であり、塩の存在下でオートクレーブ可能であって、内毒素レベルが低いか含まず、浸透圧ができる限り低く、好ましくは20mOsm/kg未満、高濃度(>1.3g/ml;RG)下で塩が低粘度(<5cP)でなければならない。適当な媒体の典型例の1つに、ReadyGrade(登録商標)(一般にRGと呼ばれ、Amersham Biosciences, Uppsala, Swedenから入手できる)がある。あるいは、Nyacolなどの商業ソースからシリカ粒子を購入し、使用者が周知の技術に従ってシラン化することもできる。この媒体の独自の特性により、分離後も物質の本来の特徴を保持することが可能となる。この媒体に関してさらに詳しいことは以下に示される。このように本発明の方法はコストをかなりの程度まで引き下げることができるので先行技術に比べて有利である。
【００１３】
b)の溶液は好ましくはバッファー溶液などの水溶液である。a)の密度は分離する目的物質の密度よりも高い。本明細書において当業者ならば、「低密度」と「高密度」とは互いに対して用いられるものであり、他のいずれかの密度と比べるものではない。例示的な密度は以下に示されている。
【００１４】
本発明の方法では、後にどの物質を求めるのか、またはどの夾雑物を除くのかによってステップ(i)〜(iii)を1回以上繰り返す。遠心分離工程のg力とコロイド媒体の密度は分離する物質によって異なる。分離する目的物質としては細胞、微生物、ウイルスおよびその画分、核酸ならびにいずれかのタンパク質がある。遠心分離前にサンプルは、適当な密度にするために媒体と混合処理する。サンプルは、生物サンプル(例えば細胞、血液など)、糞便(例えばサルモネラ菌などの食品中毒試験のため)、食料品、環境分析に有用なサンプル(例えば疑わしい汚染または遺伝子操作生物)など、事実上どんな起源のものであってもよい。従って、本方法の大きな利点は先行技術よりずっと複雑なサンプルに適用できるということである。本発明は臨床分析、法医学、通常試験などその他多くの広範な分野で適用可能である。本方法が特に有利であるいくつかの具体的分野が本明細書の最後の段落に記載されている。
【００１５】
本方法のもう1つの実施形態によれば、類似密度の2種の物質の分離を向上させるために目的物質を遠心分離前に誘導体化する。この一例として、適当な密度のビーズにmAbを被覆したものなど、高密度または低密度粒子と結合したアフィニティー試薬で目的物質を処理することがある。
【００１６】
ある特定の実施形態では、上記の方法は、サンプル中のX精子とY精子細胞など異なる細胞種を、それらの浮遊密度、形状、透過性、移動性および／または密度勾配媒体での粘度に基づき、遠心分離によって互いに分離することに特に採用される。本方法は以下の
A)遠沈管に
上記細胞の密度に近い密度を有するように選択される密度勾配媒体と
精液サンプル
を入れ、
B)上記の管を遠心分離して上記の媒体中でそれら細胞種の互いの分離を達成し、さらに
C)分離した細胞を回収する
ステップを含む。
【００１７】
本実施形態で用いられる密度媒体がX精子とY精子の分離のための上記の種の勾配を形成しうるいずれの密度媒体であってもよいとしても、好ましい媒体は上記の種のコロイド密度媒体である。
【００１８】
サンプルは上記媒体の上層に置けばよいが、所望によりステップA)の上記媒体は上記サンプルを上記遠沈管に加える前に遠心分離して密度勾配を形成してもよい。この勾配は極めて平坦または実質的に平面であること、すなわち遠沈管の少なくとも勾配の中央では非常に小さな密度差を含んでいることが好ましい。
【００１９】
この実施形態では、勾配は不連続、連続、または一定の密度によって表されるものなど、種々の形態であってよい。密度が連続的である場合、終端部では急勾配となり、中央部では多少平坦となる。この勾配がX精子とY精子がそれぞれ少なくとも70%以上、好ましくは100%に濃縮される画分を回収可能となるはずであることを意味する必要分離条件を与えることが重要である。
【００２０】
所望により精液サンプルは分離前に精製する。この精製は不連続遠心分離など、望ましいいずれの方法であってもよい。
【００２１】
サンプルがウシである場合、上記の密度はX精子およびY精子細胞の密度に近いもの、すなわち約1.120g/mLとする。ヒト細胞に関してこれに相当する値も実質的に同じである。これらの密度は以下実施例の部分に記載されている実験条件下で適用できる。本発明はヒトX精子およびY精子細胞がそれぞれ1.185g/mLを中心とする密度を有する場合の遠心分離に関するものではない。
【００２２】
上記の方法では、例えばpH、サンプルの伝導率および／または媒体を変更することでX精子およびY精子細胞の密度を操作することによって分離を向上させることができる。この操作にはX精子およびY精子細胞の膨潤も含まれうる。
【００２３】
上記で定義されたような密度勾配でXおよびY細胞を互いに分離する上記遠心分離はすべて、勾配溶液、勾配形状、遠心分離ローター、遠心分離時間、既知粘度でのg力、浸透圧および濃度レベルの選択によって行われる。
【００２４】
本発明はまた、上記の分離方法であって、上記サンプルを上記媒体と混合してX精子およびY精子細胞の密度に近いサンプル-媒体混合物密度を達成する方法に関する。この場合、分離は主として等密度遠分離によって達成される。従って、本発明のこの態様で得られる分離パターンは優先的に精子細胞の種々の浮遊密度に基づくものである。
【００２５】
第2の態様では、本発明はサンプル中の少なくとも2種の物質を密度勾配遠心分離によって分離するキットであって、
a)特定密度の混合物サンプルを得るためにサンプルと混合するコロイドサンプル混合媒体、および
(b)混合物サンプルよりも低密度の媒体
を含むキットを提供する。好ましくはb)の媒体はバッファー溶液などの水溶液である。好ましい実施形態によれば、このキットは上記サンプル混合媒体よりも若干密度の低いさらなるコロイド密度媒体を含む。このサンプル混合媒体の密度は1.5g/mlである。
【００２６】
もう1つの実施形態では、このキットは適当な密度のビーズにmAbを被覆したものなど、高密度または低密度粒子と結合した1以上のアフィニティー試薬を含む。このコロイド密度勾配媒体は平均粒径2〜40nm、好ましくは水和径10〜30nmの粒子の懸濁液を含む。好ましくは、この粒子は誘導体化シリカ粒子であり、より好ましくはシラン化シリカ粒子である。
【００２７】
（図面の詳細な説明）
図1は本発明の方法の実施原理を示した模式図である。この図面で示される例では、4回の遠心分離が行われた。遠心分離回数およびg力は分離する物質の性質によって異なる。
【００２８】
【実施例】
以下、本発明を下記の実施例により説明するが、これらは添付のクレームで定義される本発明の範囲を限定するものではない。
【００２９】
非限定一般例の説明：
密度1.057g/mlとなるようにRG(本発明のコロイド媒体の一例)と混合したサンプルを遠沈管の底に入れ、所望により密度1.030g/mlのRGを重層し、この上層に0.150MのNaCl溶液を加える。その後この管を10,000xgで1〜5分遠心分離する(図1の1)。得られた下層を密度1.200g/mlとなるようにRGに再懸濁させて混合し、新しい遠沈管の底に入れ、所望により密度1.090g/mlのPGを重層し、この上層に0.150MのNaCl溶液を加える。次にこの管を1,000xgで1〜5分遠心分離する。最上層においてサンプルから細胞および原生動物を回収する(図1の2)。得られた下層を再懸濁させて新しい遠沈管へ移し、所望により密度1.130g/mlのRGを重層し、この上層に0.150MのNaCl溶液を加える。次にこの管を10,000xgで1〜5分遠心分離する。ここで最上層においてサンプルから細菌を回収する(図1の3)。得られた下層を再懸濁させて新しい遠沈管へ移し、所望により密度1.130g/mlのRGを重層し、この上層に0.150MのNaCl溶液を加える。次にこの管を50,000xgで1〜5分遠心分離する。ここで最上層においてサンプルからウイルスを回収する(図1の4)。
【００３０】
既知の技術とは対照的に、RGと混合したサンプルを遠沈管の底に置くことで、他の溶液の上層に不均一なサンプル溶液を重層することに伴うあらゆる汚染問題が避けられる。
【００３１】
本発明の新規な方法によれば、ステップ1でサンプル母液中の低密度材料が浮遊する(図1)。これは細胞／微生物が形成しうるプラグを経て沈降させる必要がなくなる上に、その密度ゆえに(p>1.057)細胞／微生物がこのステップで下層に留まることを意味する。従って、遠心分離による平均静水圧は先行技術の場合よりも高くなる。これはサンプルが管の底にある場合には、サンプルを上層に添加する場合に比べて回転中心からの距離が長くなるためである。このことは先行技術に比べて本発明を用いた場合に収量増に寄与する。
【００３２】
ステップ2、3および4(図1)では、望む細胞、細菌およびウイルスを下層サンプル相から浮遊させ、便宜には最上層から回収する。これによりサンプル相の操作が全て避けられることから、例えばサンプル溶液に由来する阻害活性などを伴う再汚染がなくなる。
【００３３】
毎回の遠心分離工程で細胞／微生物を含有するサンプルを遠沈管の底に入れるので、細胞／微生物が管の壁や底に付着することが避けられる。これにより先行技術に比べて細胞の損傷頻度が引き下げられ、収量が増加する。
【００３４】
この新規な方法で、不連続密度遠心分離によってウイルスを精製することも可能となった。先行技術では密度媒体で極めて大きなコロイド粒子を用いてきた。この粒子はウイルスを沈降／浮遊させるのに必要とされる高いg力でウイルス粒子と同じくすぐさま沈降し、これにより相の境界を散逸させるものであった。また、この既知の密度媒体の密度は、サンプルと媒体をこの分離に必要な1.200g/mlの密度で混合させるには低すぎるものであった。
【００３５】
以下の実施例は本発明を例示するものであって、限定するものではない。
実施例１-ミンチ肉における大腸菌(E. coli)の検出
近隣で購入したミンチ肉10gに、90mlの0.15M NaClを加えた後、サンプルをホモジナイズした。50μlの0.15M NaCl中、種々の量の大腸菌(104、103、102、101)をそれぞれ0.5gのホモジナイズサンプル(=スパイクサンプル)および0.45mlの0.15M NaCl(=対照)と混合した。このスパイクサンプルを、食品マトリクスに対して細菌の結合が起こるように使用前30分間放置した。スパイクサンプルおよび対応する対照をスラリーとし、85μlのRGと混合して最終密度1.057g/mlとした。この混合物を遠沈管(1.5ml)の底に移し、密度1.030g/mlのRG溶液0.5mlを重層し、この上層に0.15M NaCl溶液0.2mlを重層した。次に、卓上遠心分離機にて10,000xgで1分間遠心分離を行った。その後、この下層をシリンジ(これによりまず、ミンチ肉マトリクスによって形成されたピペットで吸引できないプラグにカニューレを通す)へ吸引し、新しい管へ移した。目に見えるペレットがない場合でも微量のペレット材料(細菌が結合している)を得るために、シリンジへ抜き取る前の残り100μlを再懸濁させた。このようにして得られた下層を585μlのRGと混合して密度1.200g/mlとし、次に密度1.090g/mlのRG溶液0.2mlを重層し、この上層に0.15M NaCl溶液0.1mlを加えた。これを1,000xgで1分間遠心分離した。上層をパスツールピペットで吸引廃棄し、次に下層を再懸濁させ、新しい管へ移し、密度1.130g/mlのRG溶液0.2mlと0.15M NaCl溶液0.1mlを重層した。次に、10,000xgで1分間遠心分離した。上層をオートピペットで75μlずつ3画分に分けた後、分析した。
【００３６】
先行技術との比較のため、スパイクサンプルおよび対照はそれぞれ0.6mlのPercoll(登録商標)溶液(密度1.057, 0.15M NaCl中, pH7.40)の上層、および0.6mlのBacXtractor(ρ=1.057, 0.15M NaCl, pH7.40)の上層へ置いた。次に、これらのサンプルを10,000xgで遠心分離した。各サンプルおよび対照から下層の下から100μlをシリンジへ抜き取って分析した。培養により大腸菌の量を求めるため、種々のサンプルからの種々の希釈液2x10μlをプレートに拡げた。一晩インキュベーションした後、コロニーを手で計数し、量の算出を行った。DNA技術による大腸菌の検出のため、各サンプルから10mlをPCR試験に用いた。
【００３７】
本発明の方法によれば、スパイクサンプルの収率は2種の既存の技術の50〜80%に比べ、80〜100%であった。対照の収率はサンプルに比べ各場合で若干低かった。この現象はこれまでにも報告されており、ミンチ肉に内在する菌叢がサンプル中に加えられた細菌をまとうといった保護効果によるものである可能性が高い。
【００３８】
PCR技術によれば、本発明の方法を用いた場合では反応管当たり1.3cfu(10cfu/0.5gホモジネートサンプル; 200cfu/gミンチ肉)といった少量の大腸菌が検出できたが、密度勾配遠心分離の先行技術法を用いた場合では1回の分析当たり10cfu(100cfu/0.5gホモジネートサンプル; 2,000cfu/gミンチ肉)までの大腸菌しか検出できなかった。直接分析ではいずれも陽性反応を示さなかった。対照では、いずれの技術を用いた場合も反応管当たり1.3cfuの大腸菌が検出できた。
【００３９】
実施例２-糞便中の大腸菌の検出
10gのヒト糞便に90mlの0.15M NaClを加え、このサンプルをホモジナイズした。50μlの0.15M NaCl中、種々の量の大腸菌(104、103、102、101)をそれぞれ0.5gのホモジナイズサンプル(=スパイクサンプル)および0.45mlの0.15M NaCl(=対照)と混合した。このスパイクサンプルを、食品マトリクスに対して細菌の結合が起こるように使用前30分間放置した。スパイクサンプルおよび対応する対照をスラリーとし、85μlのRGと混合して最終密度1.057g/mlとした。この混合物を遠沈管(1.5ml)の底に移し、密度1.030g/mlのRG溶液0.5mlを重層し、上層に0.15M NaCl溶液0.2mlを重層した。次に、卓上遠心分離機にて10,000xgで1分間遠心分離を行った。その後、この下層をシリンジ(これによりまず、ミンチ肉マトリクスによって形成されたピペットで吸引できないプラグにカニューレを通す)へ吸引し、新しい管へ移した。小ペレットが見られない場合でもペレット材料(細菌が結合している)を得るために、シリンジへ抜き取る前の残り100μlを再懸濁させた。このようにして得られた下層を585μlのRGと混合して密度1.200g/mlとし、次に密度1.090g/mlのRG溶液0.2mlを重層し、この上層に0.15M NaCl溶液0.1mlを加えた。次にこれを1,000xgで1分間遠心分離した。上層をパスツールピペットで吸引廃棄し、次に下層を再懸濁させ、新しい管へ移し、密度1.130g/mlのRG溶液0.2mlと0.15M NaCl溶液0.1mlを重層した。次に、10,000xgで1分間遠心分離した。上層をオートピペットで75μlずつ3画分に分けた後、分析した。
【００４０】
先行技術との比較のため、スパイクサンプルおよび対照はそれぞれ0.6mlのPercoll(登録商標)溶液(密度1.057, 0.15M NaCl中, pH7.40)の上層、および0.6mlのBacXtractor(ρ=1.057, 0.15M NaCl, pH7.40)の上層へ置いた。次に、これらのサンプルを10,000xgで遠心分離した。各サンプルおよび対照から下層の下から100μlをシリンジへ抜き取って分析した。培養により大腸菌の量を求めるため、種々のサンプルからの種々の希釈液2x10μlをプレートに拡げた。一晩インキュベーションした後、コロニーを手で計数し、量の算出を行った。DNA技術による大腸菌の検出のため、各サンプルから10mlをPCR試験に用いた。
【００４１】
本発明の方法によれば、スパイクサンプルの収率は2種の既存の技術の50〜80%に比べ、80〜100%であった。対照の収率はサンプルに比べ各場合で若干低かった。この現象はこれまでにも報告されており、糞便サンプルに内在する菌叢がサンプル中に加えられた細菌をまとうといった保護効果によるものである可能性が高い。
【００４２】
PCR技術によれば、本発明の方法を用いた場合では反応管当たり1.3cfu(10cfu/0.5gホモジネートサンプル; 200cfu/g糞便)といった少量の大腸菌が検出できたが、密度勾配遠心分離の先行技術法を用いた場合では1回の分析当たり10cfu(100cfu/0.5gホモジネートサンプル; 2,000cfu/g糞便)まで低い大腸菌しか検出できなかった。直接分析ではいずれも陽性反応を示さなかった。対照では、いずれの技術を用いた場合も反応管当たり1.3cfuの大腸菌が検出できた。
【００４３】
実施例３-土壌中の大腸菌の検出
10gの堆肥土壌に90mlの0.15M NaClを加えた後、このサンプルをホモジナイズした。新規の本技術によって分析するため、50μlの0.15M NaCl中、種々の量の大腸菌(104、103、102、101)をそれぞれ0.5gのホモジナイズサンプル(=スパイクサンプル)および0.45mlの0.15M NaCl(=対照)と混合した。先行技術との比較に有用なサンプルを得るため、ホモジネートサンプルをまず60分間放置して沈降させ、次に上層の液体を用いて上記のようなスパイクサンプルを作製した。このスパイクサンプルを、サンプルマトリクスに対して細菌の結合が起こるように使用前30分間放置した。スパイクサンプルおよび対応する対照をスラリーとし、85μlのRGと混合して最終密度1.057g/mlとした。この混合物を遠沈管(1.5ml)の底に移し、密度1.030g/mlのRG溶液0.5mlを重層し、この上層に0.15M NaCl溶液0.2mlを重層した。次に、卓上遠心分離機にて10,000xgで1分間遠心分離を行った。この下層をパスツールピペットで吸引廃棄した。多量のペレットが形成されたが、全てのペレット材料(細菌が結合している)を得るために、下相を再懸濁させた後に新しい管へ移した。このようにして得られた下層を585μlのRGと混合して密度1.200g/mlとし、次に密度1.090g/mlのRG溶液0.2mlを重層し、この上層に0.15M NaCl溶液0.1mlを加えた。次に1,000xgで1分間遠心分離を行った。上層をパスツールピペットで吸引廃棄し、次にペレットを含む下層を再懸濁させ、新しい管へ移し、密度1.130g/mlのRG溶液0.2mlと0.15M NaCl溶液0.1mlを重層した。次に、10,000xgで1分間遠心分離を行った。上層をオートピペットで75μlずつ3画分に分けた後、分析した。
【００４４】
先行技術との比較のため、特に調製したスパイクサンプルおよび対照はそれぞれ0.6mlのPercoll(登録商標)溶液(密度1.057, 0.15M NaCl中, pH7.40)の上層、および0.6mlのBacXtractor(ρ=1.057, 0.15M NaCl, pH7.40)の上層へ置いた。次に、これらのサンプルを10,000xgで遠心分離した。上相を吸引廃棄した後、下相を100μlが残るまで吸引した。生じたペレットの上部の液体(60μl)を吸引して分析した。
【００４５】
養により大腸菌の量を求めるため、種々のサンプルからの種々の希釈液2x10μlをプレートに拡げた。一晩インキュベーションした後、コロニーを手で計数し、量の算出を行った。DNA技術による大腸菌の検出のため、各サンプルから10mlをPCR試験に用いた。
【００４６】
この新規な方法によれば、スパイクサンプルの収率は2種の既存の技術の10〜20%に比べ、80〜100%であった。対照の収率はサンプルに比べ各場合で若干低かった。この現象はこれまでにも報告されており、土壌サンプルに内在する菌叢がサンプル中に加えられた細菌をまとうといった保護効果によるものである可能性が高い。
【００４７】
PCR技術によれば、本発明の方法を用いた場合では反応管当たり1.3cfu(10cfu/0.5gホモジネートサンプル; 200cfu/g土壌)といった少量の大腸菌が検出できたが、密度勾配遠心分離の先行技術法を用いた場合では1回の分析当たり10cfu(1,000cfu/0.5gホモジネートサンプル; 20,000cfu/g土壌)まで低い大腸菌しか検出できなかった。直接分析ではいずれも陽性反応を示さなかった。対照では、いずれの技術を用いた場合も反応管当たり1.3cfuの大腸菌が検出できた。
【００４８】
実施例４-ウシ精液における細菌およびウイルスからの精子の精製
健康な雄牛からの新鮮な精液を0.15M NaClで1:10希釈した後、各々約107個の精子を含む0.45mlずつ16画分に分けた。50μlの0.15M NaCl中それぞれ種々の量のBVDV(ウシウイルス下痢ウイルス; 106、105、104)およびカンピロバクター・フェツス(Campylobacter fetus)(106、105、104)を12の管に加え、4つの管には対照として50μlの0.15M NaClを加えた。
【００４９】
スパイクサンプル(6管)および対照(2管)に85μlのRGを加えて最終密度1.057g/mlとした。この混合物を遠沈管(3.0ml)の底に移し、密度1.130g/mlのRG溶液0.5mlを重層し、上層に0.15M NaCl溶液0.5mlを重層した。次に、スイングアウトローターにて10,000xgで1分間遠心分離を行った。上層をパスツールピペットで吸引廃棄した。下層を再懸濁させ、新しい管へ移し、585μlのRGと混合して密度1.200g/mlとし、密度1.090g/mlのRG溶液0.5mlを重層し、この上層に0.15M NaCl溶液0.5mlを重層した。次に1,000xgで1分間遠心分離を行った。上層をパスツールピペットで吸引廃棄し、次に下相を再懸濁させ、新しい管へ移し、密度1.130g/mlのRG溶液0.5mlと0.15M NaCl溶液0.5mlを重層した。次に、1,000xgで1分間遠心分離を行った。管の上層からオートピペットで300μlずつ4画分および0.5mlずつ2画分を回収した。これらの画分を精子、BVDBおよびカンピロバクター・フェツスに関して分析した。
【００５０】
先行技術と比較するため、それぞれSpermXtractor80% 0.5mlおよび40% 0.5mlからなる不連続勾配の上層へそれぞれサンプル(6管)および対照(2管)をのせた。次にこれらのサンプルを400xgで10分間遠心分離した。これらの勾配を上部からパスツールピペットで6画分(上相、第一境界、第二相、第二境界、第三相およびペレット)に分けた。これらの画分を精子、BVDBおよびカンピロバクター・フェツスに関して分析した。
【００５１】
培養によりカンピロバクター・フェツスの量を求めるため、種々のサンプルからの種々の希釈液2x10μlをプレートに拡げた。一晩インキュベーションした後、コロニーを手で計数し、そのレベルの算出を行った。免疫学的技術によるBVDVの検出では、各サンプルから10μlをELISA試験に用いた。
【００５２】
新規な技術では、スパイクサンプルからの上の3つの精子含有画分ではカンピロバクター・フェツスもBVDVも検出されなかった。これに対し、下の精子を含まない画分ではBVDVおよびカンピロバクター・フェツスが検出された。対照ではこれらの因子は陰性であった。
【００５３】
先行技術を用いたところ、最上層画分に微生物の大部分が留まってはいるが、完全精子を豊富に含む画分を含め、全てのスパイクサンプル画分に検出可能な量のBVDVおよびカンピロバクター・フェツスが存在していた。対照ではこれらの因子は陰性であった。
【００５４】
本発明のさらなる応用
本発明の方法はまた、例えば発酵プロセスの酵素画分中の細菌含量を調べるためにも使用できる。もう1つの例としては、食料品からの溶解物質(毒素、抗生物質、ホルモン)の精製が挙げられる。適切な層を吸引した後、GC-MS、ELISA、Dip-Stickなどによって分析を行う。
【００５５】
さらなる例としては、遠心分離前にサンプルを適当な密度のmAb被覆ビーズと混合し、分離後にGC-MS、ELISA、Dip-Stickなどによって分析することによる、食料品からの溶解物質(毒素、抗生物質、ホルモン)の精製が挙げられる。本発明はまた、犯罪捜査／法医学で、例えば血痕からのDNAの精製、または掃除機に吸い込まれたサンプルからの細胞／DNAの精製にも使用できる。もう1つの例として、しみ／臨床サンプルからの精子／DNAの精製が挙げられる。本発明はまた、分析および／または分取目的での核酸およびタンパク質の精製にも有用である。
【００５６】
本発明によって得られる分離物質の格段の純度により、ほとんどのDNAおよびRNAの精製においてそうであるが、高い純度が要求されるあらゆる適用に特に有利なものとなる。本方法を適宜設計すれば、リボゾームその他の細胞成分であっても真の溶液として得ることができる。また、このようなサンプルについては最初の工程が溶解であるPCRを行うのが通例であることから、その後の取扱にも有利である。
【００５７】
本発明はまた、死細胞から生細胞を分離するためにも使用でき、この場合、細胞が死滅する際に特性が変化するため細胞種は同じであってもよい。より具体的には本方法は、活性細胞と不活性細胞の識別に使用できる。細胞に生存力があるがもう培養不能であるという場合、その時点でこのような細胞を死細胞から分離することができる。これに関しては、生細胞の密度は絶対的な値でなく、浸透圧(塩レベル)など、その環境によって異なるということが極めて重要ななところである。よって、環境を適宜操作することにより生細胞の密度は変化させることができるが、死細胞はその密度を維持することから、本方法を容易に適用することができる。
【００５８】
本方法の予期されない使用として、屠殺場で一般に用いられるスワブ試験の分析におけるものがある。本方法は事前の濃縮工程なしにこのようなスワブ試験に適用できる。これによりこのようなサンプルで迅速かつコスト効率のよい方法で病原体を検出することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  4回の遠心分離工程を用いる、本発明の方法の実施原理を示した模式図である。
【図２】  4回の遠心分離工程を用いる、本発明の方法の実施原理を示した模式図である（図１の続き）。
【図１】
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【図２】
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