(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
３−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｄ−グルコースを構成単位として含有する糖類を有効成分とすることを特徴とする糖質コルチコイドに起因する免疫機能低下の予防または治療剤。
【請求項２】
免疫機能低下が、免疫担当細胞の細胞増殖低下、サイトカイン産生低下および免疫担当細胞のアポトーシスからなる群から選ばれる少なくとも１つであることを特徴とする請求項１記載の予防または治療剤。
【請求項３】
糖類がニゲロオリゴ糖であることを特徴とする請求項１または２に記載の予防または治療剤。
【請求項４】
ニゲロオリゴ糖がニゲロース、ニゲロシルグルコースおよびニゲロシルマルトースからなる群から選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする請求項３記載の予防または治療剤。
【請求項５】
糖質コルチコイドに起因する免疫機能低下の予防または治療剤の製造のための３−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｄ−グルコースを構成単位として含有する糖類の使用。
【請求項６】
免疫機能低下が、免疫担当細胞の細胞増殖低下、サイトカイン産生低下および免疫担当細胞のアポトーシスからなる群から選ばれる少なくとも１つであることを特徴とする請求項５記載の使用。
【請求項７】
糖類がニゲロオリゴ糖であることを特徴とする請求項５または６に記載の使用。
【請求項８】
ニゲロオリゴ糖がニゲロース、ニゲロシルグルコースおよびニゲロシルマルトースからなる群から選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする請求項７記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖類、特に、３−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｄ−グルコースを構成単位として含有する糖類を有効成分とする抗ストレス剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトまたは動物は誰でも少なからずストレスを受けており、このストレスが神経系だけに止まらず、神経系を介して免疫系にも大きな影響を及ぼしている。一般的に、ストレス負荷状態下では、副腎から分泌される糖質コルチコイド等のホルモンが抗ストレスホルモンとして分泌され、気力を高める等の作用をつかさどっている。しかし、その一方で糖質コルチコイドは、免疫担当細胞の増殖能や機能を低下させるとともに、免疫担当細胞のアポトーシスを誘導することや、タンパク分解を促進し合成を阻害する等の生体にとって不利益に働くことが知られている（例えば、非特許文献１、非特許文献２参照）。そのため、ストレス状態が長く続き慢性化すると、糖質コルチコイドが持続的に分泌され、糖質コルチコイドの生体にとっての不利益な作用によって引き起こされる種々の症状、例えば感染防御能の低下、創傷治癒の遅延、代謝障害等のいわゆる慢性ストレスによる２次症状が問題となる【０００３】
ストレスに対しては、抗不安薬、睡眠薬等の薬物が、ストレスに晒されたときの心身の反応を一時的に緩和する有効な手段と考えられている。しかしながら、副作用が無く日常的に連用が可能な抗ストレス薬物は知られていない。例えば、代表的な抗不安薬であるベンゾジアゼピン系の薬物は、意識水準に影響を与えずに、不安・緊張・抑うつおよび筋緊張等を軽減するとされているが、大量投与または連続投与により、痙攣、せん妄等の禁断症状、および眠気、ふらつき、めまい、肝障害、白血球減少症等の副作用が現われることが知られている。また滋養強壮または肉体の疲労回復を目的として、各種の錠剤または飲料が市販されているが、ストレスに対する効果については明確ではないのが現状である。【０００４】
一方、３−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｄ−グルコースを構成単位として含有する糖類を有効成分とする組成物は、免疫賦活剤（特許文献１）、ＮＫ細胞活性化剤（特許文献２）、ＱＯＬ向上剤（特許文献３）、栄養障害による免疫機能低下を抑制する飲食品（特許文献４）等の作用が知られている。しかし、これら文献には、上記糖類が抗ストレス作用を有すること、特にストレスの慢性化による、糖質コルチコイドの影響下で起こる免疫担当細胞の機能低下や免疫担当細胞のアポトーシスに伴う症状を改善または抑制すること等については全く記載されていない。このように、上記糖類は免疫系を刺激することについては知られているが、ストレスに対して、特に慢性ストレスに伴う種々の症状に対してどのような作用をするかは全く知られていない。
【特許文献１】特許第３３９６１２９号公報
【特許文献２】特開２００２−２６５３６６号公報
【特許文献３】特開２００２−２６５３８５号公報
【特許文献４】特開２００２−３２５５５５号公報
【非特許文献１】多田富雄、免疫学イラストレイテッド、  南江堂、２０００年、ｐ．１７８
【非特許文献２】広川勝▲いく▼、神経・内分泌・免疫のクロストーク、学会出版センター、１９９３年、ｐ．１７７−１８５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、医薬として副作用がなく常用でき、また飲食品等としても手軽に摂取できる、抗ストレス剤を提供することを目的とする。より詳細には、慢性化したストレスに伴う種々の症状を抑制または予防する抗ストレス剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、ストレス時に分泌される糖質コルチコイドの種々の作用を指標として、上記課題を解決するため鋭意・検討を行った。糖質コルチコイドとして、デキサメタゾンを用いた。デキサメタゾンは合成糖質コルチコイドではあるが、ストレスに応答して生体内で分泌されるコルチゾール、コルチコステロンやコルチゾン等の生体由来の糖質コルチコイドと同様に、免疫担当細胞の増殖抑制や機能低下、免疫担当細胞によるサイトカイン産生の抑制やアポトーシス誘発などの生体にとっての不利益を招く。例えばＴ細胞やＢ細胞等の免疫担当細胞を含むヒト単核球を用いたインビトロ試験で、３−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｄ−グルコースを構成単位として含有する糖類が、デキサメタゾンによるヒト単核球の細胞増殖の低下およびサイトカイン産生の低下を抑制すること、並びにヒト単核球のアポトーシスを抑制することを知見した。またインビボ試験で、３−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｄ−グルコースを構成単位として含有する糖類が、デキサメタゾンによる免疫担当臓器の胸腺および脾臓の萎縮を抑制し、またサイトカイン産生能の低下を抑制することを知見した。本発明者らは、これら知見に基づきさらに検討を重ねて本発明を完成させるに至った。【０００７】
すなわち、本発明は、
（１）  ３−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｄ−グルコースを構成単位として含有する糖類を有効成分とすることを特徴とする抗ストレス剤、
（２）  ストレスによる免疫機能低下の抑制剤であることを特徴とする上記（１）記載の抗ストレス剤、
（３）  ストレスによる免疫担当細胞の細胞増殖低下の抑制剤であることを特徴とする上記（１）記載の抗ストレス剤、
（４）  ストレスによるサイトカイン産生低下の抑制剤であることを特徴とする上記（１）記載の抗ストレス剤、
（５）  ストレスによる免疫担当細胞のアポトーシスの抑制剤であることを特徴とする上記（１）記載の抗ストレス剤、
（６）  慢性ストレスによる２次症状の改善または／および予防剤であることを特徴とする上記（１）記載の抗ストレス剤、
（７）  慢性ストレスによる２次症状が糖質コルチコイドに起因するものであることを特徴とする上記（６）記載の抗ストレス剤、
（８）  糖類がニゲロオリゴ糖であることを特徴とする上記（１）〜（７）のいずれかに記載の抗ストレス剤、
（９）  ニゲロオリゴ糖がニゲロース、ニゲロシルグルコースおよびニゲロシルマルトースからなる群から選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする上記（８）記載の抗ストレス剤、および
（１０）  飲食品であることを特徴とする上記（１）〜（９）のいずれかに記載の抗ストレス剤、に関する。【０００８】
また、本発明は、
（１１）  ３−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｄ−グルコースを構成単位として含有する糖類の有効量を、哺乳動物に投与又は摂食、あるいは飲食させることを特徴とするストレスの予防又は治療方法、
（１２）  ３−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｄ−グルコースを構成単位として含有する糖類の有効量を、哺乳動物に投与又は摂食、あるいは飲食させることを特徴とするストレスによる免疫機能低下の予防又は治療方法、
（１３）  ３−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｄ−グルコースを構成単位として含有する糖類の有効量を、哺乳動物に投与又は摂食、あるいは飲食させることを特徴とするストレスの予防又は治療方法、
（１４）  ３−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｄ−グルコースを構成単位として含有する糖類の有効量を、哺乳動物に投与又は摂食、あるいは飲食させることを特徴とするストレスによるサイトカイン産生低下の予防又は治療方法、
（１５）  ３−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｄ−グルコースを構成単位として含有する糖類の有効量を、哺乳動物に投与又は摂食、あるいは飲食させることを特徴とするストレスによる免疫担当細胞のアポトーシスの予防又は治療方法、
（１６）  ３−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｄ−グルコースを構成単位として含有する糖類の有効量を、哺乳動物に投与又は摂食、あるいは飲食させることを特徴とする慢性ストレスによる２次症状の予防又は治療方法、
（１７）  慢性ストレスによる２次症状が糖質コルチコイドに起因するものであることを特徴とする上記（１６）記載の予防又は治療方法、
（１８）  糖類がニゲロオリゴ糖であることを特徴とする上記（１１）〜（１７）のいずれかに記載の予防又は治療方法、および
（１９）  ニゲロオリゴ糖がニゲロース、ニゲロシルグルコースおよびニゲロシルマルトースからなる群から選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする上記（１８）記載の予防又は治療方法、関する。【０００９】
さらに、本発明は、
（２０）  ストレスを予防又は治療する医薬又は飲食品の製造のための３−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｄ−グルコースを構成単位として含有する糖類の使用、
（２１）  ストレスの予防又は治療が、ストレスによる免疫機能低下抑制であることを特徴とする上記（２０）記載の使用、
（２２）  ストレスの予防又は治療が、ストレスによる免疫担当細胞の細胞増殖低下抑制であることを特徴とする上記（２０）記載の使用、
（２３）  ストレスの予防又は治療が、ストレスによるサイトカイン産生低下抑制であることを特徴とする上記（２０）記載の使用、
（２４）  ストレスの予防又は治療が、ストレスによる免疫担当細胞のアポトーシス抑制であることを特徴とする上記（２０）記載の使用、
（２５）  ストレスの予防又は治療が、慢性ストレスによる２次症状の改善又は予防であることを特徴とする上記（２０）記載の使用、
（２６）  慢性ストレスによる２次症状が糖質コルチコイドに起因するものであることを特徴とする上記（２５）記載の使用、
（２７）  糖類がニゲロオリゴ糖であることを特徴とする上記（２０）〜（２６）のいずれかに記載の使用、
（２８）  ニゲロオリゴ糖がニゲロース、ニゲロシルグルコースおよびニゲロシルマルトースからなる群から選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする上記（２７）記載の使用、および
（２９）  ３−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｄ−グルコースを構成単位として含有する糖類を含有する組成物を収納したパッケージであって、抗ストレス剤として使用し得るかまたは使用すべきであることを記載したラベルまたは書類を含む商業的パッケージ、
に関する。【００１０】
本発明においてストレスとは、ストレッサー、例えば物理的（高温や騒音等）、化学的（薬害等）、生物的（病気、怪我等）、精神的（人間関係のトラブル等）などにより引き起こされる生物学的な緊張状態の現象をいう。また、上記アポトーシスとは、遺伝子により制御され、核を中心にしておこる一連の形態変化で特徴付けられる細胞死のことをいう。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の抗ストレス剤は一時的または慢性のストレスの緩和に使用することができる。本発明の抗ストレス剤は医薬として副作用がなく常用でき、かつ飲食品等としても手軽に摂取できる。
本発明の抗ストレス剤は、例えばストレスにより免疫機能等が低下するのを抑制することができる。特に本発明の抗ストレス剤は、ストレスが持続する慢性ストレスの場合に好ましく用いることができる。本発明の抗ストレス剤が慢性ストレスの場合に用いられると、例えば慢性ストレスに応答して持続的に分泌される糖質コルチコイド（例、コルチゾール、コルチコステロン、コルチゾン等）などに起因する、例えばサイトカインの産生の低下や免疫担当細胞のアポトーシス、免疫担当臓器の萎縮などを抑制することができる。
本発明の抗ストレス剤は、慢性ストレス時に分泌される糖質コルチコイドの生体にとっての不利益な作用、例えば感染防御能の低下や創傷治癒の遅延または代謝障害等を改善または予防できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明において用いる３−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｄ−グルコースを構成単位として含有する糖類としては、例えば少なくとも１つ以上のα−１，３グルコシド結合を含むグルコース重合度２程度以上のオリゴ糖が挙げられ、好ましくはグルコース重合度２〜１０程度のオリゴ糖、より好ましくは重合度２〜７程度のオリゴ糖であるニゲロオリゴ糖が挙げられ、本発明において好適に用いられる。かかるニゲロオリゴ糖には、α−１，３グルコシド結合のみからなるオリゴ糖の他に、α−１，３グルコシド結合とそれ以外の結合（例えばα−１，１、α−１，２、α−１，４、α−１，６グルコシド結合等）とからなるオリゴ糖等も包含される。中でも、本発明においては、ニゲロオリゴ糖として下記式：【００１３】
【化１】
0004787159.tif 000002
【００１４】
【化２】
0004787159.tif 000003
【００１５】
【化３】
0004787159.tif 000004
で表されるニゲロース、ニゲロシルグルコースまたはニゲロシルマルトース等を用いるのがより好ましい。
上記糖類は、単独で用いても、２種以上を併用または混合して用いてもよい。【００１６】
本発明において用いる３−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｄ−グルコースを構成単位として含有する糖類は、公知の方法に従って容易に製造することができる。具体的には、例えば、本発明において用いる該糖類として好ましいニゲロオリゴ糖は、例えば、微生物の生産する多糖類であるニゲランまたはエルシナン等を基質として、酵素または酸類等を用いて加水分解してニゲロオリゴ糖を製造する方法［Ｍ．Ｓｔａｃｅｙ  ａｎｄ  Ｊ．Ｍ．Ｗｅｂｂｅｒ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｉ，３３９−３４１，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ（１９６２）］、公知のα−グルコシダーゼの糖転移・縮合反応を用いてニゲロースを製造する方法［金谷憲一他，日本農芸化学会誌，５３，３８５−３９０（１９７９）、Ｈ．Ｆｕｊｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５２，１３４５−１３５１（１９８８）等］、澱粉加水分解物にシクロデキストリン生成酵素を作用させてニゲロースを製造する方法（特開平３−２２９５８号公報）、α−１，４グルコシド結合したポリサッカライドまたはオリゴサッカライドを含む基質に、α−１，３グルコシド結合をもたらす糖転移酵素のうち１種または２種以上、具体的にはＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍ属に属しα−１，３結合をもたらす糖転移酵素を生産する真菌、例えばＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ｓｐ．Ｓ４Ｇ１３（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４３７３）を常法に従い培養することによって調製される糖転移酵素を作用させてニゲロオリゴ糖を製造する方法（特開平７−５９５５９号公報）等によって製造することができる。本発明において用いられるニゲロオリゴ糖はいずれの方法で調製されたものでも良く、上記の方法に限定されない。ただし、現在までに知られている方法の中で最も経済的な面で優れていると考えられるのは、上記特開平７−５９５５９号公報に記載された方法であり、本発明においてもその方法に従って調製したニゲロオリゴ糖を使用するのが好ましい。【００１７】
また本発明の抗ストレス剤は、医薬として、種々の剤形に製造し得る。本発明に係る抗ストレス剤は副作用がなく、常用しても問題ないことから、医薬としてのみならず、飲食品として用いることもできる。具体的には、飲食品として、例えば栄養補助食品、調味料、畜肉加工品、水産加工品、農産加工品、ステープル、調味食品、調理済食品、デザート類、乳油製品、菓子またはスナック菓子等の形態で、本発明に係る抗ストレス剤を提供することも可能である。【００１８】
本発明に係る抗ストレス剤は、３−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｄ−グルコースを構成単位として含有する糖類が含有されていることが特長であり、それ以外の成分、例えば自体公知の飲食品あるいは飲食品成分、医薬担体または賦形剤あるいは食品添加物等がさらに含有されていてもよい。かかる他の成分は、特に限定されるものではなく、目的とする医薬又は飲食品の具体的用途に応じて当業者が適宜選択できるが、具体的には、医薬の場合は賦形剤（例．果糖、Ｄ−ソルビトール、ブドウ糖、カルメロース、デンプン、結晶セルロース、乳糖等）、崩壊剤（例．カルメロース、デンプン、結晶セルロース、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース等）、結合剤（例．アラビアゴム、カルメロース、ゼラチン、結晶セルロース、単シロップ、ハチミツ、ヒドロキシプロピルセルロース、ポピドン、メチルセルロース等）、界面活性剤（例．ステアリン酸ポリオキシル４０、ポリソルベート８０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油等）、乳化剤（例．ステアリン酸ポリオキシル４０、セスキオレイン酸ソルビタン、ポリソルベート８０、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウロマクロゴール、アラビアゴム、コレステロール、ステアリン酸、ポピドン、モノステアリン酸グリセリン等）、可塑剤（例．グリセリン、プロピレングリコール、マクロゴール等）、滑沢剤（例．ケイ酸マグネシウム、カルメロース、軽質無水ケイ酸、ステアリン酸、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク等）や糖類（例．白糖、ハチミツ、単シロップ、ブドウ糖等）、ｐＨ調整剤（例．塩酸、クエン酸、炭酸水素ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム等）、防腐剤（例．安息香酸、塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸ブチル、パラオキシ安息香酸プロピル、パラオキシ安息香酸メチル等）、香料（例．ウイキョウ油、オレンジ油、ケイヒ油、チモール、トウヒチンキ、ｄｌ−メントール、ｌ−メントール、ユーカリ油等）もしくは着色料（例．食用赤色２号・３号・４０号・１０２号・１０４号・１０５号・１０６号、食用黄色４号・５号、食用緑色３号，食用青色１号・２号、、二酸化チタン，銅クロロフィリンナトリウム、ウコン、クチナシ、アナトー色素，コウリャン色素等）などが挙げられ、飲食品の場合は各種の栄養素〔例．糖質、脂質、ミネラル（鉄、カルシウム、マグネシウム、亜鉛、クロム、セレン、マンガン、銅、ヨウ素等）、タンパク質、アミノ酸等〕、香料、着色料、酸化防止剤（例．アスコルビン酸、チオ硫酸ナトリウム、トコフェロール、亜硫酸水素ナトリウム）等またはチーズやチョコレート等の風味物質もしくは合成甘味料（例．サッカリンナトリウム、アスパルテーム、アセスルファムカリウム、グリチルリチン酸二ナトリウム等）などが挙げられる。【００１９】
また、本発明の抗ストレス剤は、本発明の目的に反しない限り他の抗ストレス剤、例えば抗不安薬（例．クロルジアゼポキシド、オキサゾラムまたはジアゼパム等）や催眠薬（例．ニトラゼパム、エスタゾラムまたはハロキサゾラム等）またはビタミン剤（例．ビタミンＡ、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ６、ナイアシンアミド、パントテン酸、ビタミンＢ１２、ビタミンＥ、ビオチンまたはビタミンＣ等）などと組み合わせてもよい。【００２０】
本発明に係る抗ストレス剤の剤形については、摂取方法および摂取経路に応じてシロップ剤、散剤、顆粒剤、丸剤、錠剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤等経口用剤、坐剤または注射剤等の種々の形態とすることができるが、経口用剤として使用するのが好ましい。また、本発明の抗ストレス剤が飲食品として用いられる場合には、顆粒、錠剤、錠菓、ガム、キャンディ、ゼリーまたは飲料等の形態で提供されうるが、その形態は上記に限定されない。【００２１】
本発明の抗ストレス剤の摂取量は、摂取する人の性別、年齢、健康状態等によって異なるので一概には言えないが、経口剤の場合、吸収率を考慮して、３−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｄ−グルコースを構成単位として含有する糖類、好ましくはニゲロース、ニゲロシルグルコースおよびニゲロシルマルトースから選ばれる１種類または２種類以上のニゲロオリゴ糖混合物として約４ｍｇ〜４０ｇ程度、好ましくは約１０ｍｇ〜２０ｇ程度、さらに好ましくは約５０ｍｇ〜１０ｇ程度を１日の摂取量となるよう設定するのが望ましい。注射剤または輸液剤等の非経口剤の場合は、有効成分、好ましくはニゲロース、ニゲロシルグルコースおよびニゲロシルマルトースから選ばれる１種類または２種類以上のニゲロオリゴ糖混合物として、約５ｍｇ〜５ｇ程度、好ましくは約２５ｍｇ〜２．５ｇ程度、さらに好ましくは約１００ｍｇ〜１ｇ程度を１日量として投与されるよう設定するのが望ましい。また摂取回数は１日１回であっても、または複数回であってもよい。なお、本明細書において「摂取」という用語には「投与」も含められるものとする。【００２２】
また、本発明は、３−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｄ−グルコースを構成単位として含有する糖類の有効量を、哺乳動物に投与又は摂食、あるいは飲食させることを特徴とする、ストレスの予防又は治療方法、並びにストレスによるサイトカイン産生低下の予防又は治療方法、ストレスによる免疫担当細胞のアポトーシスの予防又は治療方法、或いは慢性ストレスによる２次症状の予防又は治療方法を提供する。
前記糖類の有効量とは、上記抗ストレス剤の糖類の摂取量と同じ量を意味する。
本発明の予防又は治療方法が適用されるストレスとしては、生理学的に動物に有害なストレッサーにより引き起こされる生物学的な緊張状態の現象の一切が包含されるが、特にサイトカイン産生の低下を伴うストレス、免疫担当細胞のアポトーシスを伴うストレス等が挙げられる。
前記サイトカインとしては、例えばインターロイキン１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７、ＴＮＦ（腫瘍壊死因子）−αおよびβ、インターフェロン−α，βおよびγ等が挙げられる。免疫担当細胞としては、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、単球、マクロファージおよび棒状細胞等が挙げられる。
また、慢性ストレスの２次症状としては、感染防御能の低下、創傷治癒の遅延、代謝障害の外、循環器系障害（例．胸苦しさ、動悸、不整脈等）、消化器系障害（例．食欲不振、胃痛、吐き気、胃潰瘍、便秘、下痢）、肩凝り、頭痛、めまい、浮遊感、眼精疲労、全身倦怠感、うつ病等が挙げられる。
本発明の予防又は治療方法は、前記ストレスを緩解し、ストレスに伴うサイトカイン産生の低下を抑制し、免疫応答細胞のアポトーシスを抑制するので、生体防御機構を活性化し、生体内の恒常性を維持できる。【００２３】
本発明の抗ストレス剤は、３−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｄ−グルコースを構成単位として含有する糖類を含有する組成物、例えば上記した製剤または飲食品を自体公知の方法で瓶、プラスチック容器、紙器、ダンボールなどに、また、これらを組み合わせてパッケージされ得る。該パッケージには、ストレスまたは／およびストレスによる２次症状の予防または改善に使用し得るかまたは使用すべきであることを記載、または該記載のラベルを貼付し、あるいは該記載の書類を添付することができる。【００２４】
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
なお、実施例において使用される略号は以下を示す。
ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩溶液
ＣｏｎＡ：コンカナバリンＡ
ＰＨＡ：フィトヘムアグルチニン
ＤＥＸ：デキサメタゾン
ＷＳＴ−１：２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム・モノソディウム塩
１−ｍｅｔｈｏｘｙ  ＰＭＳ：１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムメチルスルフェート
ＩＦＮ−γ：インターフェロン−γ
ＥＬＩＳＡ法：酵素免疫測定法
ＨＲＰ：西洋ワサビペルオキシダーゼ
ＩＬ−４：インターロイキン−４
ＩＬ−１０：インターロイキン−１０
ＩＬ−１２：インターロイキン−１２
ＮＫ細胞：ナチュラルキラー細胞
ＤＮＡ：デオキシリボ核酸
ＬＰＳ：リポポリサッカライド
ＴＮＦ−α：腫瘍壊死因子
【実施例１】
【００２５】
本試験では、ＤＥＸによるヒト単核球細胞の増殖抑制に対するニゲロースの効果を検証した。
成人男子から得た血液をＰＢＳで２倍に希釈した後、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  Ｐｌｕｓ溶液（アマシャム社製）に静かに加えて重層（ＰＢＳ２倍希釈血液：Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  Ｐｌｕｓ溶液＝４：３）し、４００×ｇ、２０℃、４０分間の条件にて遠心分離を行った。中間層に存在する単核球画分を回収し、この単核球画分に単核球画分の１０倍量のＰＢＳで２度洗浄を行った。得られた単核球をＲＰＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯＢＲＬ社製）に懸濁させ末梢血単核球浮遊液を得た。末梢血単核球浮遊液の細胞数を自動血球計測装置（シスメックス株式会社製、ＣＤＡ−５００型）で測定した後、細胞数が２．０×１０６個／ｍＬの濃度になるようにＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁させた。この懸濁液を９６穴組織培養プレートに１穴あたり５０μＬ播種した。播種した懸濁液に、ＲＰＭＩ１６４０培地に溶解したＣｏｎＡあるいはＰＨＡを各々最終濃度２．０μｇ／ｍＬまたは５．０μｇ／ｍＬとなるように１穴あたり５０μＬ添加した。ＣｏｎＡまたはＰＨＡの添加と同時に、ＲＰＭＩ１６４０培地に溶解したＤＥＸおよびニゲロースを各々最終濃度１０ｎＭおよび０μｇ／ｍＬ〜１００μｇ／ｍＬとなるようにそれぞれ１穴あたり５０μＬ添加した。培養プレートは、５％炭酸ガス培養器内で、３７℃にて、２４時間培養した。培養終了４時間前にＷＳＴ−１（株式会社同仁化学研究所製）を１０ｍＭの濃度となるよう０．４ｍＭ  １−ｍｅｔｈｏｘｙ  ＰＭＳ（株式会社同仁化学研究所製）に溶解した液を１穴あたり１０μＬ添加して、培養終了時に測定波長４５０ｎｍ、参照波長６３０ｎｍの吸光度を測定した。結果を表１に示した。【００２６】
【表１】
0004787159.tif 000005
【００２７】
ＷＳＴ−１は生細胞に取り込まれると、細胞内ミトコンドリアの脱水素酵素により還元され、水溶性のホルマザンが生成される。この生成されたホルマザン量は、生細胞の数と比例することから、ホルマザンの吸光度を測定することにより、細胞増殖の指標とすることができる。表１に示したように細胞刺激因子ＣｏｎＡまたはＰＨＡの添加により誘導された単核球細胞増殖が、ＤＥＸ添加により低下したが、ニゲロースの添加によりＤＥＸによる単核球細胞増殖の低下が濃度依存的に顕著に抑制された。
ＣｏｎＡおよびＰＨＡの刺激により誘導される単核球細胞としては免疫に関与する例えばＴ細胞等が挙げられる。上記結果は、ストレス時、特に慢性ストレス時に持続的に分泌される糖質コルチコイドによる免疫に関与する例えばＴ細胞等の細胞増殖の低下をニゲロースが抑制することを示すものである。
【実施例２】
【００２８】
本試験では、ＤＥＸによるサイトカイン産生低下に対するニゲロースの効果を検証した。
（ａ）実施例１と同様に成人男子の血液から単核球を調製し、単核球５．０×１０５個／ｍＬの濃度で培養を開始した。実施例１と同様に培養液に、細胞刺激因子であるＣｏｎＡあるいはＰＨＡをそれぞれ最終濃度が２．０μｇ／ｍＬまたは５．０μｇ／ｍＬとなるよう１穴あたり５０μＬ添加し、サイトカイン産生を誘導した。ＣｏｎＡまたはＰＨＡの添加と同時に、ＤＥＸおよびニゲロースを各々最終濃度が１０ｎＭおよび０μｇ／ｍＬ〜１００μｇ／ｍＬになるようにそれぞれ１穴あたり５０μＬ添加して、５％炭酸ガス培養器内で、３７℃にて、２４時間培養した。培養終了後、培養上清中のＩＦＮ−γ量をＥＬＩＳＡ法により測定した。結果を表２に示した。
ＥＬＩＳＡ法による測定方法は下記のとおりである。
マウス抗ヒトＩＦＮ−γ抗体（Ｅｎｄｏｇｅｎ社製）をホウ酸緩衝液で２μｇ／ｍＬに調製した溶液を９６穴ＥＬＩＳＡプレートに１穴あたり５０μＬ加え、４℃で１日間放置し各穴にマウス抗ヒトＩＦＮ−γ抗体を付着させた。上記培養上清をマウス抗ヒトＩＦＮ−γ抗体を付着させたＥＬＩＳＡプレートに１穴あたり５０μＬ加え室温で９０分間放置し、培養上清中のＩＦＮ−γをプレートに付着したマウス抗ヒトＩＦＮ−γ抗体と結合させた。プレートを洗浄後、ビオチン化標識したマウス抗ヒトＩＦＮ−γ抗体（Ｅｎｄｏｇｅｎ社製）をホウ酸緩衝液で０．５μｇ／ｍＬに調製し、１穴あたり１００μＬ添加し、プレートに付着したマウス抗ヒトＩＦＮ−γ抗体と結合したＩＦＮ−γと結合させた。結合しなかったビオチン化標識したマウス抗ヒトＩＦＮ−γ抗体を洗浄後、ホウ酸緩衝液で１０００倍希釈したＡｖｉｄｉｎ−ＨＲＰ（ＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社製）を１穴あたり１００μＬ加え、ＩＦＮ−γと結合したビオチン化標識マウス抗ヒトＩＦＮ−γ抗体と結合させた。過剰のＡｖｉｄｉｎ−ＨＲＰを洗浄後、過酸化水素０．００６Ｖ／Ｖ％とオルトフェニレンジアミン０．１Ｗ／Ｖ％を含有するリン酸緩衝液を１穴あたり１００μＬ加え、室温で１５分間反応させた後１．５Ｎ硫酸で反応を停止させた。マイクロプレートリーダーで測定波長４９２ｎｍ、参照波長６３０ｎｍの吸光度を測定し、リコンビナントＩＦＮ−γで作成した標準曲線から、培養上清中のＩＦＮ−γの濃度を求めた。【００２９】
【表２】
0004787159.tif 000006
【００３０】
（ｂ）実施例１と同様に成人男子の血液から単核球を調製し、単核球５．０×１０５個／ｍＬの濃度で実施例１と同様に培養を開始した。培養液に細胞刺激因子であるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  Ｌ１３７の加熱死菌体を最終濃度１．０μｇ／ｍＬとなるよう添加した。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  Ｌ１３７の添加と同時に、ＤＥＸおよびニゲロースを最終濃度が各々１０ｎＭおよび０μｇ／ｍＬ〜１００μｇ／ｍＬになるようにそれぞれ１穴あたり５０μＬ添加して、５％炭酸ガス培養器内で３７℃、２４時間培養した。培養終了後、培養上清中のＩＬ−１２およびＩＦＮ−γをＥＬＩＳＡ法により測定した。ＩＦＮ−γについては、実施例２に記載のＥＬＩＳＡ法に基づいて測定した。ＩＬ−１２については、実施例２に記載のＥＬＩＳＡ法のＩＦＮ−γの代わりにＩＬ−１２を用い、他は実施例２に記載のＥＬＩＳＡ法と同様に測定した。結果を表３に示した。【００３１】
【表３】
0004787159.tif 000007
【００３２】
表２および表３に示したように細胞刺激因子の添加により誘導されたＩＬ−１２およびＩＦＮ−γが、ＤＥＸの添加により低下したが、ニゲロースの添加によりＤＥＸ添加によるＩＬ−１２およびＩＦＮ−γの低下が濃度依存的に顕著に抑制された。
ＩＬ−１２は、ＮＫ細胞の活性化等の免疫調節機能に関与するサイトカインであり、またＩＦＮ−γはウイルスに感染した際、生体を守るために体内で作られ、白血球やリンパ球などの免疫に関与してウイルスの増殖を抑える作用を有するサイトカインである。このことは、ストレス時、特に慢性ストレス時に持続的に分泌される糖質コルチコイドによる免疫に関与するサイトカインであるＩＬ−１２やＩＦＮ−γの産生の低下をニゲロースが抑制することを示すものである。
【実施例３】
【００３３】
活性化アポトーシスに対するニゲロースの効果
実施例１と同様に成人男子の血液から単核球を調製し、５．０×１０５個／ｍＬの濃度で実施例１と同様に培養を開始した。培養液に、細胞刺激因子であるＣｏｎＡあるいは溶連菌製剤ＯＫ−４３２（ピシバニール；中外製薬株式会社製）をそれぞれ最終濃度が２．０μｇ／ｍＬまたは１．０μｇ／ｍＬの濃度となるよう添加した。このとき、各培養群にニゲロースを１．０μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬの濃度になるように添加し、いずれの培養群もニゲロース非添加の対照群を設けた。５％炭酸ガス培養器内で、３７℃にて、２４時間培養した。培養終了後アポトーシス細胞のみを特異的に検出できるｓｓＤＮＡ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．製）によりアポトーシス細胞を固定し、ＤＮＡ変性剤処理後、染色し、吸光度（４１５ｎｍ）を測定し、アポトーシスの程度を数値化した。結果を表４に示した。【００３４】
【表４】
0004787159.tif 000008
【００３５】
表４に示したようにニゲロース添加群では、アポトーシスの抑制効果が認められた。
このことは、ストレス時、特に慢性ストレス時に持続的に分泌される糖質コルチコイドによって引き起こされるアポトーシスに対してニゲロースの有用性を示すものである。特にストレスによるアポトーシスの影響を受けやすい高齢者における、ニゲロースの有用性が示唆された。
【実施例４】
【００３６】
ＤＥＸによる胸腺および脾臓萎縮に対するニゲロオリゴ糖の効果
雌性のＢＡＬＢ／ｃマウス（８週齡）を、市販飼料で飼育した群（対照群）、および市販飼料にニゲロオリゴ糖液糖（ニゲロＳ：ニゲロオリゴ糖含有量３０．８重量％；武田食品工業株式会社製）を５重量％の濃度で添加した飼料で飼育した群（ニゲロオリゴ糖群）に分けた。飼育１週目に、対照群およびニゲロオリゴ糖群中の各半数のマウスに対して生理食塩水を、残りの各半数に対してＤＥＸ（２００μｇ／マウス）を腹腔内投与した。その２４時間後に各マウスの胸腺および脾臓を摘出して、摘出した胸腺および脾臓の重量を測定した。結果を表５に示した。【００３７】
【表５】
0004787159.tif 000009
【００３８】
表５に示したように、対照群の脾臓および胸腺重量はＤＥＸの投与により顕著に減少したのに比べて、ニゲロオリゴ糖を摂食したニゲロオリゴ糖群のマウスではＤＥＸによる脾臓および胸腺重量の減少が抑制された。このことは、ストレス時、特に慢性ストレス時に持続的に分泌される糖質コルチコイドによる免疫担当臓器の萎縮に対して、ニゲロオリゴ糖が有用であることを示すものである。
【実施例５】
【００３９】
ＤＥＸによるサイトカイン産生能低下に対するニゲロオリゴ糖の効果
ニゲロオリゴ糖の効果を検証する前に、予備試験として、ＤＥＸによるサイトカイン産生能低下を確認する目的で、１４週齡、雌性のＢＡＬＢ／ｃマウスにＤＥＸ（６０μｇ／マウス）を腹腔内投与した。ＤＥＸ投与前および投与２４時間後にＢＡＬＢ／ｃマウスの脾臓を摘出し、脾臓細胞を常法により調製した。調整した脾臓細胞をＲＰＭＩ１６４０培地に５．０×１０６個／ｍＬの濃度になるように懸濁し、この懸濁液を９６穴組織培養プレートに１穴あたり１００μＬ播種し、さらに、細胞刺激因子である(1)ＰＨＡを最終濃度１２．５μｇ／ｍＬあるいは(2)ＬＰＳを最終濃度２０μｇ／ｍＬになるようにＲＰＭＩ１６４０培地に溶解した溶液を１穴あたり１００μＬ加えた。５％炭酸ガス培養器内で３７℃にて、２４時間培養し、培養上清中のサイトカインの濃度、前記(1)に関してはＩＬ−４およびＩＦＮ−γを、前記(2)に関してはＩＬ−１０およびＴＮＦ−αをＥＬＩＳＡ法により測定した。ＩＦＮ−γについては、実施例２に記載のＥＬＩＳＡ法に基づいて測定した。ＩＬ−４、ＩＬ−１０およびＴＮＦ−αについては、実施例２に記載のＥＬＩＳＡ法のＩＦＮ−γの代わりにＩＬ−４、ＩＬ−１０またはＴＮＦ−αを用い、他は実施例２に記載のＥＬＩＳＡ法と同様に測定した。結果を表６に示した。
ここで、ＤＥＸ投与マウスのサイトカイン産生率（％）を下記式により算出した。
サイトカイン産生率（％）＝（Ａ／Ｂ）×１００
Ａ：ＤＥＸの腹腔内投与２４時間後に摘出した脾臓細胞の培養上清中のサイトカイン濃度
Ｂ：ＤＥＸの腹腔内投与前に摘出した脾臓細胞の培養上清中のサイトカイン濃度
ＤＥＸ投与マウスのサイトカイン産生率を表６に示した。【００４０】
次いで、本試験では、１４週齡、雌性のＢＡＬＢ／ｃマウス(１群６匹)に、飲み水としてイオン交換水あるいはイオン交換水に高純度ニゲロオリゴ糖（ニゲロース１９．８重量％、ニゲロシルグルコースを主体とする３糖画分３６．５重量％、ニゲロシルマルトースを主体とする４糖以上画分４０．２重量％、グルコース３．５重量％）を１Ｗ／Ｖ％の濃度で溶解した水溶液を与え、市販飼料で飼育した。飼育１週目にＤＥＸ（６０μｇ／マウス）を腹腔内投与した。その２４時間後に脾臓を摘出し、予備試験と同条件で脾臓細胞を培養し、培養液の上清中のサイトカイン濃度を測定した。測定値を表６に示した。【００４１】
【表６】
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【００４２】
表６に示したように、予備試験においてＤＥＸの投与によりサイトカインの産生率は顕著に低下することを確認した。このような条件下において、本試験でニゲロオリゴ糖を摂取したマウスのサイトカイン産生量は対照群に比べて明らかに高値を示した。このことは、ストレス時、特に慢性ストレス時に持続的に分泌される糖質コルチコイドによる免疫機能低下に対して、ニゲロオリゴ糖が有用であることを示すものである。
【産業上の利用可能性】
【００４３】
本発明によれば、ストレスによる免疫機能の低下を抑制できるので、本発明の抗ストレス剤は医薬として、また飲食品等として有用である。