(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ)５'ＬＴＲ；および
ｂ)ポリアデニル化シグナルならびに該ポリアデニル化シグナルと操作可能に結合している配列番号１−１１およびその活性断片からなる群から選択される１個またはそれ以上の異種上流エンハンサー(ＵＥ)配列を含む３'ＬＴＲ
を含む、レトロウイルスベクター。
【請求項２】
数個の異種ＵＥ配列を含み、少なくともその二つが同じＵＥに由来する、請求項１に記載のレトロウイルスベクター。
【請求項３】
数個の異種ＵＥ配列を含み、少なくともその二つが異なるＵＥに由来する、請求項１に記載のレトロウイルスベクター。
【請求項４】
数個の内因性ＵＥ配列の付加的複製を含み、少なくともその二つの複製が同一配列を有する、請求項１に記載のレトロウイルスベクター。
【請求項５】
数個の内因性ＵＥ配列の付加的複製を含み、少なくともその二つの複製が異なる配列を有する、請求項１に記載のレトロウイルスベクター。
【請求項６】
該異種ＵＥ配列、または該異種ＵＥ配列の少なくとも一つ、または内因性ＵＥ配列の該付加的複製、または内因性ＵＥ配列の該付加的複製の少なくとも一つが、該３'ＬＴＲにある、請求項１に記載のレトロウイルスベクター。
【請求項７】
該異種ＵＥ配列、または該異種ＵＥ配列の少なくとも一つ、または内因性ＵＥ配列の該付加的複製、または内因性ＵＥ配列の該付加的複製の少なくとも一つが、該３'ＬＴＲのＵ３領域にある、請求項６に記載のレトロウイルスベクター。
【請求項８】
該３'ＬＴＲが機能的Ｕ３プロモーターを有しない、請求項１に記載のレトロウイルスベクター。
【請求項９】
該３'ＬＴＲがＵ３プロモーターの欠失を含む、請求項８に記載のレトロウイルスベクター。
【請求項１０】
該異種ＵＥ配列、または該異種ＵＥ配列の少なくとも一つ、または内因性ＵＥ配列の該付加的複製、または内因性ＵＥ配列の該付加的複製の少なくとも一つが、Ｕ３プロモーター欠失部位にある、請求項９に記載のレトロウイルスベクター。
【請求項１１】
該異種ＵＥ配列または該異種ＵＥ配列の少なくとも一つがウイルスＵＥ配列である、請求項１に記載のレトロウイルスベクター。
【請求項１２】
該ウイルスＵＥ配列がＳＶ４０、カリフラワーモザイクウイルス、ＨＩＶ−１、地リス肝炎ウイルスまたはウマ感染性貧血ウイルスＵＥ配列である、請求項１１に記載のレトロウイルスベクター。
【請求項１３】
該ウイルスＵＥ配列がＡＴＴＴＧＴＧＡまたはＡＴＴＴＧＴＡＡを含むＳＶ４０  ＵＥ配列である、請求項１２に記載のレトロウイルスベクター。
【請求項１４】
該ＳＶ４０  ＵＥ配列がＴＴＴＡＴＴＴＧＴＧＡＡＡＴＴＴＧＴＧＡＴＧＣＴＡＴＴＧＣＴＴＴＡＴＴＴＧＴＡＡ(配列番号１)を含む、請求項１３に記載のレトロウイルスベクター。
【請求項１５】
該異種ＵＥ配列または該異種ＵＥ配列の少なくとも一つが動物ＵＥ配列である、請求項１に記載のレトロウイルスベクター。
【請求項１６】
該動物ＵＥ配列が補体Ｃ２またはラミンＢ２  ＵＥ配列である、請求項１５に記載のレトロウイルスベクター。
【請求項１７】
レンチウイルス配列を含む、請求項１に記載のレトロウイルスベクター。
【請求項１８】
該３'ＬＴＲがさらに追加の内因性ＵＥ配列を含む、請求項１に記載のレトロウイルスベクター。
【請求項１９】
該５'ＬＴＲがＵ３領域に挿入された異種プロモーターを含む、請求項１に記載のレトロウイルスベクター。
【請求項２０】
５'ＬＴＲが内因性Ｕ３プロモーター配列の欠失を含む、請求項１９に記載のレトロウイルスベクター。
【請求項２１】
該５'ＬＴＲの３'下流であり、該３'ＬＴＲの５'上流である異種コード配列を含む、請求項１に記載のレトロウイルスベクター。
【請求項２２】
該異種コード配列が治療的ポリペプチドをコードする、請求項２１に記載のレトロウイルスベクター。
【請求項２３】
該異種コード配列が陰性選択マーカーをコードする、請求項２１に記載のレトロウイルスベクター。
【請求項２４】
請求項１に記載のレトロウイルスベクターを含む、細胞。
【請求項２５】
哺乳類細胞である、請求項２４に記載の細胞。
【請求項２６】
ヒト細胞である、請求項２５に記載の細胞。
【請求項２７】
請求項１に記載のレトロウイルスベクター由来のプロウイルス配列を含む、細胞。
【請求項２８】
哺乳類細胞である、請求項２７に記載の細胞。
【請求項２９】
ヒト細胞である、請求項２８に記載の細胞。
【請求項３０】
細胞がプロデューサー細胞である、請求項２６に記載の細胞により製造された感染性レトロウイルス粒子。
【請求項３１】
細胞における異種コード配列の発現用医薬の製造のための請求項２１に記載のレトロウイルスベクターの使用。
【請求項３２】
異種コード配列が治療的ポリペプチドをコードする、請求項３１に記載の使用。
【請求項３３】
該異種コード配列が陰性選択マーカーをコードする、請求項３１に記載の使用。
【請求項３４】
細胞における異種コード配列の発現用医薬の製造のための請求項２１に記載のレトロウイルスベクターを含む感染性レトロウイルス粒子の使用。
【請求項３５】
異種コード配列が治療的ポリペプチドをコードする、請求項３４に記載の使用。
【請求項３６】
該異種コード配列が陰性選択マーカーをコードする、請求項３４に記載の使用。
【請求項３７】
被験体における異種コード配列の発現用医薬の製造のための請求項２１に記載のレトロウイルスベクターを含む感染性レトロウイルス粒子の使用。
【請求項３８】
異種コード配列が治療的ポリペプチドをコードする、請求項３７に記載の使用。
【請求項３９】
該異種コード配列が陰性選択マーカーをコードする、請求項３８に記載の使用。
【請求項４０】
該被検体が哺乳類である、請求項３９に記載の使用。
【請求項４１】
該被検体がヒトである、請求項４０に記載の使用。
【請求項４２】
被験体における異種コード配列の発現用医薬の製造のための請求項２４に記載の細胞を含む組成物の使用。
【請求項４３】
該被検体が哺乳類である、請求項４２に記載の使用。
【請求項４４】
該被検体がヒトである、請求項４３に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、レトロウイルスベクターに関する。本発明は特に増強された３'転写終結構造を有するレトロウイルスベクターおよび哺乳類細胞および生物において異種コード配列を発現するためにこのようなベクターを使用する方法に関する。
【０００２】
発明の背景
レトロウイルスベクター
レトロウイルスベクターは、現在遺伝子治療プロトコールにおいて最も頻繁に使用されている遺伝子送達媒体の一つである。レトロウイルスベクターの有用性に必須であるのは、ベクターにより保持される種々のレトロウイルス性質である。このような性質は、多くの細胞タイプの優れたトランスフェクションおよび、ベクターによりコードされる遺伝子の長期発現を可能にする宿主細胞染色体へのそれらのゲノムの安定な統合を含む。他の重要な保持される特性は、ベクター粒子から、ウイルス粒子の結合からの、宿主細胞遺伝物質へのそのゲノムの統合を介した、ベクターライフサイクルの最初の段階が、ウイルスタンパク質の新たな合成を必要としないことである。
【０００３】
レトロウイルスベクターの基本要素
野生型レトロウイルスゲノムの主要な性質は図１に要約し、それはオープンリーディングフレームおよびウイルスの長い末端反復(ＬＴＲ)の構造を示す。レトロウイルスベクターは、レトロウイルスベクター由来のゲノムを含む。レトロウイルスベクターの最も単純なタイプは、ウイルス遺伝子をコードする配列(例えば、ｇａｇ、ｅｎｖおよびｐｏｌ)の多くを欠き、パッケージング、逆転写および統合に必要な配列のみを保持する、著しく削減されたレトロウイルスゲノムを有する。削減されたレトロウイルスゲノムは、しばしば、レトロウイルス骨格と呼ばれ、その上に更なる修飾を成し得、それに異種遺伝子および配列を付加してレトロウイルスベクターを形成できる。典型的に、異種遺伝子を、５'ＬＴＲプロモーターがその続く発現を可能にするような方法で骨格に挿入する。プロモーターと操作可能に結合している異種遺伝子を含む発現構築物は、また標的細胞への送達および発現のために骨格に挿入できる。
【０００４】
ウイルス遺伝子のいくつかまたは全てを欠くレトロウイルスベクターは、複製欠損である。このようなベクターを含むウイルス粒子の生成は、トランスで欠損機能を提供する宿主細胞におけるベクター増殖を必要とする。トランス相補性は、宿主細胞を、またレトロウイルスから送達され、欠失ウイルスタンパク質を発現するが、パッケージングシグナルの欠失のためパッケージ化されない、パッケージングヘルパー構築物でトランスフェクトすることを含む種々の方法で達成できる。レトロウイルス製造のこのシステムを図２に説明する。ベクターおよびパッケージングヘルパー構築物の両方がプロデューサー細胞に存在するとき、感染性レトロウイルス粒子が放出され、それはその挿入遺伝子と共にベクターゲノムの送達ができる。遺伝子送達のこの工程は形質導入と呼ぶ。
【０００５】
レンチウイルスベクター
今日まで、臨床的遺伝子治療プロトコールにおいて最も一般に使用されているレトロウイルスは、マウス白血病ウイルス(ＭｕＬＶ)を基にしており、ウイルス粒子内にベクターゲノムを封入する種々のパッケージングシステムが開発されている(Miller, AD. 1997. Development and applications of retroviral vectors. Retroviruses, Ed. Coffin JM, Hughes SH, Varmus HE. CSHL Press, New Yorkにレビュー)。ベクターそれ自体は、全てのウイルス遺伝子が除去され、完全に複製欠損であり、約６−８ｋｂの外来ＤＮＡを受け入れることができる。これらの現在のベクター／パッケージングシステムで患者に課される危険性は最少であり、今日までそれらの使用に関連する毒性または長期問題の報告はない。
【０００６】
しかし、ＭｕＬＶおよびそれ由来のベクターは、分割細胞の感染のみできる。これは、予め統合された核タンパク質複合体が無傷の核膜を通過できないためである。対照的に、原型的レンチウイルスＨＩＶ−１は、無傷の膜が存在する場合でさえ、核輸送の能力を示し、ＨＩＶ−１由来ベクターはしたがって非分割細胞も形質導入できる(Naldini et al., Science 272:263-267 (1996))。ＨＩＶベクターのこの能力は、標的細胞が非分割であり、異種遺伝子の安定な統合が必要であるとき、それらを遺伝子治療の特に魅力的な候補物とする。
【０００７】
レトロウイルス設計および製造システムの改善
上記のレトロウイルスベクター製造システムは機能的であるが、いくつかの方法で不充分である。特に、パッケージングヘルパー構築物におけるベクター配列とウイルス要素の間に残る重複は、感染性複製コンピテントレトロウイルス(ＲＣＲ)を創生する可能性のある組換え事象の著しい危険性が存在することを意味する。このような重複は、ｇａｇ遺伝子の広い配列がパッケージング効率を促進するためにベクターに保持されるために、主に存在する。加えて、ＬＴＲはパッケージングヘルパー構築物に頻繁に残り、プロモーターおよびポリアデニル化配列の両方を提供する。
【０００８】
ＲＣＲ製造の製造の危険性を減少させるために、ベクター設計および製造の種々の改善された試みが開発されている。一つの試みは、パッケージング要素を分け、ｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子をおよびｅｎｖ遺伝子を、個々にパッケージング細胞に導入できる別々のプラスミドにおく。他の試みにおいて、ｅｎｖ介在組換えを、異種エンベロープタンパク質の使用により避け、該異種エンベロープタンパク質のコード配列は親レトロウイルスのゲノムと相同性を有しないが、ベクター粒子内に包含できる(シュードタイピングと呼ぶ工程)。一般に使用される異種エンベロープタンパク質は、水疱性口内炎ウイルスのＧタンパク質であるＶＳＶ  Ｇである(Burns et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 90:8033-8037 (1993))。図３、パネルＡ参照。
【０００９】
更に別の試みにおいて、ＬＴＲ−介在組換えは、パッケージングヘルパー構築物における異種プロモーターおよびポリアデニル化シグナルの使用により減少される。これはまたベクター力価の促進という利点を有する(Soneoka et al., Nucleic Acids Res 25:628-633 (1995))。この試みは、典型的にベクターＬＴＲからの非必須配列の除去、および、適当な場合、欠失配列の異種配列での置換を含む。例えば、ＣＭＶ即時−早期プロモーターのような異種プロモーターを５'Ｕ３プロモーターの置き換えに使用している。他の例において、インテグラーゼ認識配列(即ち、ａｔｔ配列)が保持される限り、３'Ｕ３配列が、自己不活性化(ＳＩＮ)ベクターでのように著しく欠失している(Yu et al., Proc. Natl. Acad. Sci 83:3194-3198 (1986))。図３、パネルＢ参照。
【００１０】
これらの試みは種々のレンチウイルスベースのベクターの開発に使用されており、これは組換え事象に起因する病原性ＲＣＲの可能性のために特別の安全性懸念をもたらす。この試みの生成物の例は、ＣＭＶ駆動ＳＩＮベクター(Ｚufferey et al., J. Virol. 72:9873-9880 (1988))、全ての非必須遺伝子が不活性化または除去された最少パッケージングヘルパー構築物(Zufferey et al., Nat. Biotechnol. 15:871-875 (1997))および、ＶＳＶ  Ｇのような非ＨＩＶ−１エンベロープを含むレトロウイルス粒子を含む。
【００１１】
レトロウイルスベクター統合
レトロウイルスベクターは、そのゲノムを宿主細胞の遺伝物質内に統合する。ウイルスインテグラーゼにより行なわれる、レトロウイルス統合の過程に関して多くのことが知られている。インテグラーゼはＤＮＡプロウイルスのＬＴＲの末端(ａｔｔ部位、図パネル１Ｂ)で配列を認識し、宿主ゲノムに多かれ少なかれ無作為にプロウイルスを挿入するが、ある配列優勢が報告されている(Carteau et al., J. Virol. 72:4005-4014 (1988))。
【００１２】
統合のためのレトロウイルスベクターの能力は諸刃の刃である。一方で、統合プロウイルスの全娘細胞への継代を伴う、ベクターコード遺伝子の安定な長期発現の可能性を可能にする。他方で、ベクター統合が通常のフランキング宿主遺伝子を干渉する。実際、レトロウイルスは、腫瘍形成性形質転換をもたらす能力に基づいて、最初、同定された。干渉の一つのタイプは、読み通し転写による宿主遺伝子の不適当な活性化であり、即ち、ウイルス転写物の係属が３'ＬＴＲ転写終結部位を越え、下流宿主遺伝子配列まで行く。プロウイルスの宿主配列への読み通し転写は、数種のレトロウイルスで観察されている(R. V. Gunataka Microbiol. Rev. 57:511-521 (1993); Bohnlein et al., J. Virol. 63:421-424 (1989); Herman et al., Science 236:845-848 (1997); Iwasaki et al., Genes & Dev. 4.2299-2307 (1990); Cherrington et al. EMBO J. 11:1513-1524 (1992))。最近の証拠は、統合ＨＩＶ−１プロウイルスがまたフランキング宿主細胞配列の読み通し転写を行なうことができることを示す(Dron et al., Arch Virol. 144:19-28 (1999))。
【００１３】
ｍＲＮＡの転写終結
ＲＮＡポリメラーゼＩＩにより転写されたメッセンジャーＲＮＡ(ｍＲＮＡ)の３'末端を、発生期転写物の開裂により創生する。この事象は、ポリアデニル化部位で優勢に起こり、約２５０ヌクレオチドポリ(Ａ)テイルの鋳型非依存的付加に続く(Wahle et al., FEMS Microbiol. Rev. 23:277-295 (1999))。ポリ(Ａ)テイルは、安定性、翻訳効率、および核から細胞質への加工ｍＲＮＡの輸送を含む、ｍＲＮＡ代謝の多くの態様に影響する(Lewis et al., Microbiol Mol Biol Rev. 63:405-445 (1999); Colgan et al., Genes & Dev. 11:2755-2766 (1997); Huang et al., Mol. Cel. Biol. 16:1534-1542 (1996); Sachs et al., J. Biol. Chem. 268:22955-22958 (1993))。強いポリアデニル化シグナルが、インビトロで製造したｍＲＮＡの前駆体開裂のレベルおよびポリ(Ａ)の長さを促進することが観察されている(Lutz et al., Genes & Dev. 10:325-337 (1996))。一つの例において、増加したポリ(Ａ)テイル長は増強されたトランスジーン発現と相関する(Loeb et al., 1999 West Cost Retrovirus Meeting, abstract p57)。
【００１４】
ポリアデニル化シグナル
コアポリアデニル化シグナルは、開裂／ポリアデニル化部位にフランキングな二つの認識要素から成る。非常に保存性のＡＡＵＡＡＡヘキサヌクレオチド要素(Proudfoot et al., Nature 263:211-214 (1976))は、開裂部位の８から３１ヌクレオチド上流に位置し(Chen et al., Nucleic Acid Res. 23:2614-2620 (1995))、乏しい保存性のＧＵ−またはＵ−リッチ(Ｇ／Ｕ−リッチ)下流要素はＡＡＵＡＡＡ要素の１４から７０ヌクレオチド下流に位置する。ｍＲＮＡ転写物の開裂は通常、これらの二つの要素の間のＡ残基、優勢にはＣＡジヌクレオチドの後に起こる(Sheets et al., Nucleic Acid Res. 18:5799-5805 (1990))(図４)。
【００１５】
ポリアデニル化シグナルの増えている数はまた、転写終結を促進するＡＡＵＡＡＡ配列の上流に位置する付加的要素を含むことが示されている(図４)。このような上流エンハンサー(ＵＥ)の初期の例は、ＨＩＶ−１(Valsamakis et al., Mol. Cell. Biol. 12:3699-3705 (1992); Gilmartin et al., EMBO J. 11:4419-4428 (1992)、ウマ感染性貧血ウイルス(Graveley et al., J. Virol. 70:1612-1617 (1996))、サルウイルス４０(ＳＶ４０)(Carswell et al., Mol. Cell. Biol. 9:4248-4258 (1989))、アデノウイルス(Prescott et al., Mol. Cell. Biol. 14:4682-4693 (1994); DeZazzo et al., Mol. Cell. Biol. 9:4951-4961 (1989))、カリフラワーモザイクウイルス(Sanfacon et al., Genes & Dev. 5:141-149 (1991))および地リス肝炎ウイルス(Cherrington et al., J. Virol. 66:7589-7596 (1992))ポリ(Ａ)を含む、種々のウイルスのポリアデニル化シグナルに見られた。より最近、ＵＥはまたヒト補体Ｃ２遺伝子(Moreira et al., EMBO J. 14:3809-3819 (1995): Moreira et al., Genes & Dev. 12:2522-2534 (1998))およびラミンＢ２遺伝子(Brackenridge et al., Nucleic Acid Res. 25:2326-2335 (1997))のような哺乳類遺伝子のポリアデニル化シグナルにおいても同定されている。
【００１６】
一般に、ＵＥはＵ−またはＵＧ−リッチ配列を含むが、異なるＵＥ間で明らかな配列相同性はない(Carswell et al., Mol. Cell. Biol. 9:4248-4258 (1989): R. H. Russnak, Nucleic Acid Res. 19:6449-6456 (1991); Sanfacon et al., Genes & Dev. 5:141-149 (1991); Moreira et al., EMBO J. 14:3809-3819 (1995))(図５)。配列相同性が存在しないにもかかわらず、一定のウイルスＵＥは機能的に交換できるように見える(Russnak et al., Genes & Dev. 4:764-776 (1990); Valsamikis et al., Proc Natl Acad Sci USA, 88:2108-2112 (1991); Graveley et al., J. Virol. 70:1612-1617 (1996))。
【００１７】
ＳＶ４０遅延ポリアデニル化シグナル(ＵＳＥとしても既知)のＵＥは、ＡＡＵＡＡＡ要素の１３−５１ヌクレオチド上流に位置する(図５)(Schek et al., Mol. Cell. Biol. 12:5386-5393 (1992); Lutz et al., Genes & Dev. 8:576-586 (1994); Carswell et al., Mol. Cell. Biol. 9:4248-4258 (1989); Cooke et al., Mol Cell Biol. 19:4971-4979 (1999))。ＵＳＥは、ＵＳＥ変異がインビトロおよびインビボの両方でポリアデニル化効率を７５から８５％まで減少させるため、コアポリアデニル化シグナルの活性の促進に重要な役割を担う(Carswell et al., Mol. Cell. Biol. 9:4248-4258 (1989); Schek et al., Mol. Cell. Biol. 12:5386-5393 (1992))。ＵＳＥ内で、コンセンサス配列ＡＵＵＵＧＵＰｕＡを伴う３つのコアＵリッチ要素が活性要素として同定されている。それらは距離依存的方法で、複数の複製が存在する場合、ポリアデニル化効率に付加的な方法で機能するように見える(Carswell et al., Mol. Cell. Biol. 9:4248-4258 (1989))。地リス肝炎ウイルスポリアデニル化シグナルのＵＥはまたコアポリアデニル化シグナルに配向依存的、付加的な、しかし距離非依存的態様で影響する(R. H. Russnak, Nucleic Acid Res. 19:6449-6456 (1991))。
【００１８】
レトロウイルスポリアデニル化シグナル
レトロウイルス５'および３'ＬＴＲはＲ領域にポリアデニル化シグナルＡＡＵＡＡＡを含み、Ｇ／Ｕリッチ下流要素はＵ５領域に位置し、開裂／ポリアデニル化部位はＲ／Ｕ５境界を定義する(図４)。ＨＩＶ−１において、３ＬＴＲは、ＡＡＵＡＡＡモチーフの７７−９４ヌクレオチド上流の、Ｕ３領域にＵＥ(ＵＨＥとしても既知)を含む(図４、パネルＣおよび図５)。ＵＨＥは３'ＬＴＲポリアデニル化シグナルの加工効率を著しく増加させる(DeZazzo et al. Mol Cell Biol. 12:5555-5562 (1991); Valsamakis et al., Mol Cell Biol. 12:3699-3705 (1992))。ＵＨＥＭと名付けた推定マイナーポリアデニル化エンハンサーはまたＡＡＵＡＡＡモチーフの１４６−１７１ヌクレオチド上流に同定されている(Valsamakis et al., Proc Natl Acad Sci USA, 88:2108-2112 (1991))(図４＆５)。
【００１９】
５'および３'ＬＴＲの両方でのＡＡＵＡＡＡおよびＧ／Ｕリッチ下流要素の存在にもかかわらず、３'ＬＴＲから複製したＨＩＶ−１ポリアデニル化シグナルが優勢に認識される。二つのポリアデニル化シグナルの異なる認識を説明するいくつかの機構が提案されている(Das et al., J. Virol. 73:81-91 (1999); Cherrington et al., J. Virol. 66:7589-7596 (1992); DeZazzo et al., Mol Cell Biol. 12:5555-5562 (1992); J. Cherrington, EMBO J. 11:1513-1524 (1992))。
【００２０】
発明の要約
本発明は、増強された３'転写終結構造を有するレトロウイルスベクターに関する。一つの実施態様において、本発明のレトロウイルスベクターは、３'ＬＴＲポリアデニル化シグナルと操作可能に関連した１個以上の異種上流エンハンサー(ＵＥ)を含む。他の実施態様において、本発明のレトロウイルスは、３'ＬＴＲポリアデニル化シグナルと操作可能に関連した内因性ＵＥ配列の付加的な複製を含む。本発明は、このようなレトロウイルスベクター、そのヌクレオチド配列、このようなベクターにより生成されるウイルス粒子、およびこのようなベクターおよびそのプロウイルス配列を含む細胞を含む組成物を提供する。本発明はまた哺乳類細胞および生物における異種コード配列を発現するためのこのようなレトロウイルスベクターの使用法も提供する。
【００２１】
本発明は、１個以上の異種ＵＥ配列、または１種以上の内因性ＵＳ配列の付加的複製のレトロウイルスへの挿入が、３'ＬＴＲの転写終結効率を増加させ、このような修飾を有するベクターがこのような修飾を有しない以外同一のベクターで製造されるよりも高いベクター力価(即ち、ベクターを含むウイルス粒子の力価)を製造するという驚くべき発見に基づく。いかなる理論にも縛れることを意図しないが、３'ＬＴＲによる転写終結の促進は、ベクターｍＲＮＡの製造、安定性、核輸出および／または翻訳を増加させ、このような増加がプロデューサー細胞におけるより高いベクターＲＮＡ製造および／または遺伝子発現、したがってより高いベクター力価を導くと考えられる。
【００２２】
定義
特記しない限り、以下の単語および用語は、本明細書および特許請求の範囲に関して、以下の意味を有する。
【００２３】
“３'ＬＴＲ”は３'レトロウイルス長い末端反復を意味し、これはその対応する天然(即ち、野生型レトロウイルスに存在する)３'ＬＴＲから、内因性配列の欠失および／または変異および／または異種配列の付加により修飾され得、またはされ得ない。
【００２４】
“５'ＬＴＲ”は５'レトロウイルス長い末端反復を意味し、これはその対応する天然５'ＬＴＲから、内因性配列の欠失および／または変異および／または異種配列の付加により修飾され得、またはされ得ない。
【００２５】
“３'ＬＴＲポリアデニル化シグナル”は、レトロウイルスの３'ＬＴＲに存在するポリアデニル化シグナルを意味する。
【００２６】
“上流エンハンサー”および“ＵＥ”は互換性に使用され、エンハンサーの下流に位置するポリアデニル化シグナルにより転写終結を促進する、種々の真核およびウイルス遺伝子の３'非翻訳領域に存在する制御要素を意味する。ＵＥの例はＳＶ４０遅延ポリアデニル化シグナル(ＵＳＥ)、ＨＩＶ−１  ＬＴＲ(ＵＨＥ)および地リス肝炎ウイルス(ＵＧＥ)に見られる。
【００２７】
“上流エンハンサー配列”および“ＵＥ配列”は互換的に使用され、ＵＥの配列またはその活性セグメントを意味する。ＵＥと同様に、ＵＥの活性セグメントは、シグナルの５'上流に置かれたとき、ポリアデニル化シグナルの転写終結活性を増加させる。ＵＥは配列が重複し得るまたはし得ない多くの活性セグメントを含み得る。
【００２８】
本発明のレトロウイルスベクターの状況で、“異種”ＵＥ配列は、本発明のレトロウイルスが由来するレトロウイルスの天然３'ＬＴＲに存在するものと同一でないＵＥ由来のＵＥ配列である。対照的に、“内因性”ＵＥ配列は、本発明のレトロウイルスベクターが由来するレトロウイルスの天然３'ＬＴＲにおいて、存在する、ＨＩＶ−１のＵＨＥのような、ＵＥ由来のＵＥ配列である。
【００２９】
レトロウイルスの“３'転写終結構造”は、構造の上流から開始する転写の終結を行なう３'ＬＴＲの中のおよび近接する構造を意味する。このような構造は３'ＬＴＲポリアデニル化シグナルを含み、更に、そのシグナルと操作可能に結合した、内因性ＵＥ配列および異種ＵＥ配列を含み得る。
【００３０】
“ポリヌクレオチド”は、交換可能に、二本および一本鎖分子を意味する。特記しない限り、または必要でない限り、本明細書に記載の任意の実施態様は、二本鎖形および二本鎖形を形成することが既知のまたは予測される各相補的一本鎖形の両方を含むポリヌクレオチドである。
【００３１】
“プロデューサー細胞”は、レトロウイルスベクターまたはそのプロウイルス配列を含み、レトロウイルスベクターを含む形質導入粒子を製造する細胞を意味する。レトロウイルスが複製欠損である場合、プロデューサー細胞は、必要な複製機能をトランスで製造することにより、欠損を補う。
【００３２】
“レトロウイルス”はＲＮＡ指向ＤＮＡポリメラーゼ、または“逆転写酵素”を使用し、ウイルスＲＮＡゲノムを二本鎖ＤＮＡ中間体に複製し、それを宿主細胞の染色体ＤＮＡに統合するウイルスのクラスを意味する。レトロウイルスはレンチウイルスを含む。レトロウイルスの例は、モロニーマウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、ハーヴェー肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、脊髄増殖性肉腫ウイルスおよび乳癌ウイルスを含むが、これらに限定されない。レンチウイルスの例は、ヒト免疫不全ウイルス、サル免疫不全ウイルス、ウマ感染性貧血ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス、ビスナウイルスを含む。
【００３３】
“ベクター”は、特記しない限り“レトロウイルスベクター”を意味する。
“レトロウイルスベクターゲノム”は、そのポリヌクレオチドのＲＮＡバージョンがレトロウイルス粒子にパッケージされるのを可能にし、そのパッケージ化ＲＮＡポリヌクレオチドが逆転写され、レトロウイルス粒子内に含まれる逆転写酵素およびインテグラーゼのようなレトロウイルス酵素の作用により宿主細胞染色体に統合されるのに充分である、レトロウイルスゲノム由来の配列を含むポリヌクレオチドを意味する。
【００３４】
“遺伝子”はポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを意味する。
“コード配列”は、ポリペプチド、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムまたは、ｓｎＲＮＡ、ｔＲＮＡおよびｒＲＮＡのような構造ＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを意味する。
【００３５】
本発明のレトロウイルスベクターの状況において、“異種”遺伝子またはコード配列は、本発明のレトロウイルスが由来するレトロウイルスに見られる任意の遺伝子またはコード配列と同一でない遺伝子またはコード配列である。
【００３６】
二つの遺伝子または配列は、各遺伝子または配列におけるヌクレオチドの順番が、任意の付加、欠失または物質置換がなく同じである場合、“同一”である。
【００３７】
ポリヌクレオチドの状況で、“配列”は、配列において互いに隣接する残基がポリヌクレオチドの一次構造において連続している、５'から３'方向のポリヌクレオチドにおけるヌクレオチドの順番である。
【００３８】
“操作可能に結合”は、要素が、それらを予期される方法で操作可能にする関係である、遺伝子要素の並置を意味する。例えば、ＵＥ配列は、同じＤＮＡ分子内のポリアデニル化シグナルと、ＵＥ配列がそのシグナルにより転写終結が促進される場合、操作可能に連結している。同様に、プロモーターは、同じＤＮＡ分子のコード領域と、プロモーターがコード配列の転写を可能にする場合、操作可能に結合している。機能的関係が維持される限り、このような関連要素の間に干渉残基が存在し得る。
【００３９】
図面の簡単な説明
図１.レトロウイルスゲノム構成
パネルＡ.単純Ｃ型レトロウイルスの基本的構成を示す。長い末端反復(ＬＴＲ)は、各々５'および３'ＬＴＲを優勢に使用するプロモーターおよびポリアデニル化配列を含む。完全長およびスプライスした転写物の両方を製造し、これらは３つの主用タンパク質をコードする；ＧａｇおよびＧａｇ−Ｐｏｌは完全長転写物からの翻訳であり、ｅｎｖはスプライスされた転写物からの翻訳物である。完全長転写物はまたＲＮＡゲノムとして働く。ゲノムの５'領域に、ゲノムをウイルス粒子に統合するのに必要なパッケージングシグナル(Ψ)である。ＳＤ、スプライスドナー；ＳＡ、スプライスアクセプター。
パネルＢ.ＬＴＲは、Ｕ３、ＲおよびＵ５と名付けられる３つの領域を含む。プロモーターおよびエンハンサー配列は５'ＬＴＲでのみ活性であり、Ｕ３領域に位置し、一方３'ＬＴＲはＲ／Ｕ５境界を定義する。ＬＴＲの末端のａｔｔ配列は統合に必要である。
【００４０】
図２.複製欠損レトロウイルスベクター粒子の製造
野生型レトロウイルス、パッケージングヘルパー構築物および複製欠損レトロウイルスのゲノムは、各々図面の上段、中段および下段に示すとおりである。パッケージングヘルパー構築物は、全てのウイルスタンパク質を、ウイルスタンパク質をコードしないが、パッケージングおよび統合のための必要なシス要素の全てを保持するベクターゲノムに対してトランスに提供する。パッケージングヘルパー構築物からのパッケージングシグナルの欠失は、ベクター粒子へのその統合を防止する。
【００４１】
図３.レトロウイルスベクター設計の改善
パネルＡ.分けたパッケージングヘルパー構築物。Ｇａｇ−ＰｏｌおよびＥｎｖタンパク質をコードする配列を、二つの異なるプラスミドに分け、異種融合タンパク質(例えばＶＳＶ  Ｇタンパク質の使用により安全性を更に増加させる。発現は、非ＬＴＲプロモーター(例えば、ヒトＣＭＶプロモーター)の使用を介してパッケージングヘルパーから最大化される。
パネルＢ.ＳＩＮベクター。５'ＬＴＲのＵ３プロモーター配列をＣＭＶプロモーターで置き換え、３'ＬＴＲのＵ３プロモーターを欠失により最少にする。逆転写に続いて、欠失Ｕ３配列(△Ｕ３)をプロウイルスの５'および３'ＬＴＲの両方に複製し、統合ベクター５'ＬＴＲからの非常に減少したプロモーター活性をもたらす。これは、自己不活性化(ＳＩＮ)ウイルスの基礎である。
【００４２】
図４.ポリアデニル化シグナル：上流エンハンサー(ＵＥ)の役割
パネルＡ.ポリアデニル化効率のＵＥ仲介促進のモデル。コアポリアデニル化シグナルは二つの要素：ＡＡＵＡＡＡヘキサヌクレオチドおよびＧ／Ｕリッチ要素からなり、これら二つの要素の間で開裂が起こる。
【００４３】
パネルＢ.ＳＶ４０遅延ポリアデニル化シグナルは上流エンハンサー(ＵＥ、ａ／ｋ／ａＵＳＥ)および下流エンハンサー(ＤＳＥ)を含む。４０ヌクレオチド長ＵＳＥは、配列ＡＵＵＧＵＰｕＡを有する３つのほぼ一の要素(矢印)から成る。ＵＳＥはＡＡＵＡＡＡモチーフに対して−１５から−５４ヌクレオチドに位置する。
【００４４】
パネルＣ.完全長ＨＩＶ−１  ＬＴＲの模式的提示である。ＡＡＵＡＡＡ要素は、Ｒ／Ｕ５境界を定義する開裂／ポリアデニル化部位の１９ヌクレオチド上流のＲ領域に位置する。Ｇ／Ｕリッチ配列はＵ５領域に位置する。内因性上流要素(ＵＨＥ)は、ＡＡＵＡＡＡモチーフの７７−９４ヌクレオチド上流のＵ３領域内に位置する。推定マイナー上流要素配列(ＵＨＥＭ)はＡＡＵＡＡＡシグナルの１４６−１７１ヌクレオチド上流に位置する。
【００４５】
パネルＤ.自己不活性化(ＳＩＮ)ＨＩＶ−１  ＬＴＲの模式的提示。ＨＩＶ−１コアポリアデニル化要素およびＵＨＥはＳＩＮ−ＬＴＲにおいて保存され、Ｕ３領域内のプロモーターの３９５ヌクレオチド欠失により創生される。残りのＵ３配列は５'末端に３８ヌクレオチドを含み、それはインテグラーゼ結合部位(ａｔｔ)および２３ヌクレオチド領域を、１８ヌクレオチド長ＵＨＥを含むＵ３の３'境界に含む(図７Ａもまた参照)。
【００４６】
図５.上流エンハンサー(ＵＥ)の例
ヒト免疫不全ウイルスタイプ１ＵＨＥ(配列番号１１)；ＳＶ４０  ＵＳＥ(配列番号１)；ウマ感染性貧血ウイルスＵＥ(配列番号２)；カリフラワーモザイクウイルスＵＥ(配列番号５)；地リス肝炎ウイルスＵＧＥ(配列番号６)；アデノウイルスＬ３  ＵＥ(配列番号８)；ヒト補体Ｃ２  ＵＥ(配列番号９)；ラミンＢ２  ＵＥ(配列番号１０)。各ＵＥの３'末端(枠内に示す)からＡＡＵＡＡＡシグナル(楕円として示す)までの距離を示す。
【００４７】
図６.最少ＳＩＮベクター
ｐＣＳＯはレンチウイルス骨格を含むＳＩＮレトロウイルスベクターである。それはＨＩＶ−１ゲノムの２１００ヌクレオチドを含む。ｐＳＣＯ−ＭＰはｐＳＣＯ由来であり、ＨＩＶ−１配列は８３５ヌクレオチドに減少されている。ＲＲＥ部位を含むｅｎｖ配列が欠失しており、ｇａｇ配列の長さがかなり減少している。全てのスプライス部位が欠失している。ｇａｇの１番目のコドンは停止コドン(Ｌ１３Ｘ)に変異しており、中心ポリプリン・トラクト・セントラル停止配列(ｃＰＰＴ／ＣＴＳ)を挿入し、逆転写の効率を増加させる。これらのベクターのヌクレオチド番号付けは、ｐＮＬ４−３配列に基づく。
【００４８】
図７Ａ＆７Ｂ.増強された転写終結構造を伴うＳＩＮ−ＬＴＲの操作
図７Ａ.ＳＩＮ−ＬＴＲ−ＵＳＥ。ＳＶ４０遅延ポリアデニル化シグナルの構造を黒背景で示す。ＳＩＮ３'ＬＴＲの構造を白背景で示す。４０ヌクレオチドＳＶ４０上流エンハンサー(ＵＳＥ)をａｔｔ部位とＨＩＶ  ＬＴＲ上流エンハンサー(ＵＨＥ)の間に挿入した。
図７Ｂ.操作した転写終結構造を伴うＳＩＮ  ＬＴＲの種々の立体配置の模式的提示。ＳＶ４０遅延ポリアデニル化シグナルの構造を黒背景で示す。ＳＩＮ３'ＬＴＲの構造を白背景で示す。地リス肝炎ウイルスの構造を斜線で示す。構築物ＳＩＮ−ＬＴＲ−ＵＨＥＭ、ＳＩＮ−ＬＴＲ−ＵＳＥＰおよびＳＩＮ−ＬＴＲ−ＵＳＥの構築物は、ＵＳＥ配列の挿入物または内因性推定ＵＥ配列を含む。ＳＩＮ−ＬＴＲ−ＵＨＥＭはマイナーＨＩＶ−１推定ＵＥ(ＵＨＥＭ)の２７ヌクレオチド挿入物を含む(短い黒矢印)。構築物ＳＩＮ−ＬＴＲ−ＵＳＥは、３つの同一ＡＵＵＵＧＵＰｕＡ要素から成る、ＳＶ４０遅延ポリアデニル化シグナル由来の完全４０ヌクレオチド長ＵＳＥを含む(白矢印)。ＳＩＮ−ＬＴＲ−ＵＳＥＰは、二つのＡＵＵＵＧＵＰｕＡ要素を含む、ＵＳＥの２０ヌクレオチドセグメントを含む(白矢印)。構築物ＳＩＮ−ＬＴＲ−ＵＧＥは地リス完全ウイルス由来の完全５６ヌクレオチド長ＵＧＥ配列を含む。楕円はＡＡＵＡＡＡシグナルを意味する。小さい長方形はＧ／Ｕリッチダウンストリーム要素を示す。
【００４９】
図８Ａ＆８Ｂ.転写終結効率の測定
図８Ａ.多シストロン性発現構築物の模式図。
ＣＭＶはサイトメガロウイルスプロモーターを意味する。Ｒ  ｌｕｃはレニラルシフェラーゼコード配列を意味する。ＴＴＳは転写終結構造を意味する。ＩＲＥＳは内部リボザイム挿入部位を意味する。Ｆ  ｌｕｃはホタルルシフェラーゼコード配列を意味する。ＳＶポリ(Ａ)はＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを示す。
図８Ｂ.転写終結活性
図７Ａおよび７Ｂに示す操作した転写終結構造を有するＳＩＮ−ＬＴＲを、各々、多シストロン性発現構築物における二つのルシフェラーゼ遺伝子の間に、ＴＴＳ部位で挿入する。構築物を２９３Ｔ細胞にトランスフェクトし、Ｒ  ｌｕｃおよびＦ  ｌｕｃの発現を測定する。Ｒ  ｌｕｃ／Ｆ  ｌｕｃの比率が修飾ＳＩＮ−ＬＴＲの効率／強度を反映する。
【００５０】
図９.ＲＡａｓｅ保護アッセイによる３'ポリ(Ａ)効率の分析のためのリボプローブの設計。
図は、標準ＳＩＮ−ＬＴＲ(例えば、ベクターｐＣＳＯ、ｐＣＳＯ−ＭＰ)またはＳＩＮ−ＬＴＲ−ＵＳＥ(例えば、ベクターｐＣＳＯ−ＭＰ.ＵＳＥ)のいずれかを含む統合ベクターにおける配列の配置を示す。正常ポリ(Ａ)／開裂部位の位置は３'Ｒ／Ｕ５境界である。特異的リボプローブを、全ＬＴＲ領域、上流ポリプリントラクト(ＰＰＴ)およびＰＰＴに５'の３６ヌクレオチド非関連ヌクレオチドの更なる範囲を含むために、各ベクターのために設計した。予期される保護フラグメントのサイズを示す。３'Ｒ／Ｕ５境界で正確に終結する転写物を、示すように、サイズの差異のために読み通し転写物から区別できる。
【００５１】
図１０.ＵＳＥ配列を含むベクターの力価
ｐＣＳＯ−ＭＰ、ｐＣＯ−ＭＰ.ＵＳＥＰ、ｐＣＳＯ−ＭＰ.ＵＳＥまたはｐＣＳＯ−ＭＰ.ＵＧＥベクターを含むウイルス粒子を、一過性トランスフェクションにより生成し、２９３Ｔ細胞で力価測定した。力価はｍｌ当たりの形質導入単位として示す。
【００５２】
発明の詳細な説明
本発明のレトロウイルスベクター
本発明は、増強された３'転写終結構造を有するレトロウイルスベクターを提供する。本発明のベクターは、５'ＬＴＲ、ポリアデニル化シグナルを含む３'ＬＴＲ、およびパッケージングシグナルを有するレトロウイルスベクターゲノムを含む。レトロウイルスベクターゲノムは、モロニーマウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、ハーヴェー肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、脊髄増殖性肉腫ウイルス、乳癌ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、サル免疫不全ウイルス、ウマ感染性貧血ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス、ビスナウイルスを含むが、これらに限定されない。好ましくは、ベクターは複製欠損のレトロウイルスベクターを含む。典型的に、このような欠損は１個以上のウイルス構造および複製機能(例えば、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ)の変異および／または欠失のためである。したがって、本発明のベクターは当分野で既知の複製欠損レトロウイルスベクターに由来し得る。このようなベクターは：ｐＣＬのようなモロニーマウス白血病ウイルス(Naviaux et al., J Virol. 70:5701-5705 (1996))、Ｇ１ＸｓｖＮＡ(Shubert et al., Curr. Eye Res. 16.656.662 (1997))およびｐＴＩＮ４１４(Cannon et al., J Virol. 70:8234-40 (1996))のようなモロニーマウス白血病ウイルス；およびＲＣＡＳＢＰ−Ｍ２Ｃ(Zheng et al., J Virol. 73:6946-52 (1999))のようなトリ肉腫／白血病ウイルスに基づくレトロウイルスベクターを含むが、これらに限定されない。
【００５３】
より好ましくは、本発明のベクターは：ｐＨＲ'ＣＭＶｌａｃＺ、ｐＨＲ'ＣＭｌａｃＺ  ＳＩＮ１８およびｐＲＲＬＰＧＫ−ＧＦＰ(Zufferey et al., J. Virol. 72:9873-9880 (1998))、ＬＬ−ＣＧ、ＣＬ−ＣＧ、ＬＳ−ＣＧ、ＣＳ−ＣＧおよびＣＬ−Ｇ(Miyoshi et al., J. Virol. 72. 8150-8157 (1998))、ｐＶ６５３ＣＭＶβ−ｇａｌ(Gasmi et al., J Virol 73:1828-1834 (1999))、ｐＴＶ(Iwakuma et al., Virology 261:120-232 (1999))、ｐＨ３Ｚ、ｐＨ４Ｚ、ｐＨ５Ｚ(Kim et al., Virol. 72:811-516))のようなＨＩＶ−１；ＨＩＶ−２(Arya et a., Hum Gene Ther. 9:1371-80 (1998))；ｐＶＧ(Schnell et al., Hum Gene Ther 11:439-47 (2000))のようなサル免疫不全ウイルス；ＦＩＶ−ｇａｌ(Wang et al., J Clin Invest. 104:R55-62 (1999))；、ＰＴＦＩＶ(Johnston et al., J Virol 73:4991-5000 (1999))；ｐＯＮＹ２.１０ｌａｃＺ、ｐＯＮＹ４.０Ｚ(Mitrophanous et al., Gene Ther. 6:1808-18 (1999))のようなウマ感染性貧血ウイルスを含むが、これらに限定されない。
【００５４】
最も好ましくは、本発明のベクターはｐＨＲ'ＣＭＶｌａｃＺ  ＳＩＮ１８(Zufferey et al., J Virol. 72:9873-9880 (1988))、ＬＳ−ＣＧ、ＣＳ−ＣＧ(Miyosih et al., J. Virol. 72. 8150-8157 (1988))、ＳＩＮ−Ｗ−ＰＧＫ(Deglon et al., Hum Gene Ther. 11:179-190 (2000))、ｐＶＧ(Schnell et al., Hum Gene Ther. 11:439-47 (2000))およびｐＴＣ(Iwakuma et al., Virology 261:120-132 (1999))に由来するＳＩＮレンチウイルスベクター由来である。
【００５５】
ベクターの５'ＬＴＲは、非修飾レトロウイルス５ＬＴＲである。すなわち、天然５'ＬＴＲがレトロウイルスにそのまま存在する。好ましい実施態様において、５'ＬＴＲの内因性Ｕ３プロモーターが、変異および／または欠失により不活性化されており、異種プロモーターで置換されている。異種プロモーターの活性は構造的、誘導可能または標的細胞特異的(即ち、発現が１個のまたは数個の特異的細胞タイプに優勢であるか限定され、他の細胞には無いか少ない)であり得る。有用な異種プロモーターは、ＣＭＶ(Miyoshi et al., J. Virol. 72:. 8150-8157 (1988))、ラウス肉腫ウイルスプロモーター(Dull et al., J Virol.72:8463-71 (1998))、テトラサイクリン誘導可能プロモーター(Hwang et al., J. Virol. 71:7128-31 (1997))を含むが、これらに限定されない。
【００５６】
ベクターの３'ＬＴＲは非修飾レトロウイルス３'ＬＴＲであり得る。好ましい実施態様において、３'ＬＴＲのＵ３プロモーターは変異または欠失により不活性化されている。より好ましい実施態様において、このような不活性化はＵ３プロモーターに特異的である。即ち、不活性化は、ａｔｔ配列および任意の内因性ＵＥのような３'ＬＴＲの他の構造に不利に働かない。最も好ましい実施態様において、プロモーターはＨＩＶ−１のｐＮＬ４−３株のほぼ９１１３から９５０６の残基に対応する領域において配列の変異または欠失により不活性化される。
【００５７】
本発明のベクターは、３'ＬＴＲにおけるポリアデニル化シグナルと操作可能に結合した１個以上のＵＥ配列を含み得る、増強された３'転写終結構造を有する。ＵＥ配列は異種ＵＥ配列または３'ＬＴＲに存在し得る任意の内因性ＵＥ配列の付加的複製であり得る。一つの実施態様において、３'転写終結構造は１個以上の異種ＵＥ配列を含む。他の実施態様において、３'転写終結構造は内因性ＵＥ配列の１個または数個の付加的複製を含む。更に別の実施態様において、３'転写終結構造は異種および内因性ＵＥ配列の付加的複製の両方を含む。
【００５８】
本発明のベクターは更に、細菌および酵母のような微生物細胞におけるベクター配列の増幅に使用するための、複製の微生物起点および微生物スクリーニング可能または選択可能マーカーを含み得る。
【００５９】
ＵＥおよびその活性セグメント
本発明のベクターは任意のＵＥを含み得る。好ましくは、ＵＥは真核生物またはウイルス遺伝子由来である。例示的ウイルスＵＥは、ＳＶ４０ウイルス(例えばＵＳＥ)、カリフラワーモザイクウイルス、ＨＩＶ−１(例えばＵＨＥ)、地リス肝炎ウイルス(例えばＵＧＥ)、またはウマ感染性貧血ウイルスＵＥのものを含むが、これらに限定されない(図５参照)。真核生物ＵＥの例は、哺乳類補体Ｃ２およびラミンＢ２遺伝子のものを含むが、これらに限定されない(図５参照)。好ましい実施態様において、レトロウイルスベクターはＳＶ４０由来のＵＳＥまたは地リス肝炎ウイルス由来のＵＧＥを含む。
【００６０】
本発明のベクターはまたＵＥの活性セグメントを含み得る。このようなセグメントは、例えば、転写読み通しアッセイを使用した、慣用の実験により決定し得る。例えば、このようなアッセイは、多シストロン性発現構築物によりコードされる二つのレポーターポリペプチドの相対的発現レベルを測定するためのシステムを含み、ここでレポーターポリペプチドのコード配列は転写終結構造および内部リボソーム挿入配列(ＩＲＥＳ)により分離される。特に、発現構築物は５'から３'方向で以下の要素：宿主細胞中で活性な転写制御要素(例えば、プロモーターまたはエンハンサー)、第１レポーターポリペプチドのコード配列、第１転写終結構造、内部リボソーム挿入配列(ＩＲＥＳ)、第２レポーターのコード配列、および、所望により、第２転写終結構造を含み、ここで、第１転写終結構造はポリアデニル化シグナルを含む。このような構築物の模式図は図８Ａに示す。
【００６１】
構築物において使用する転写終結構造は、真核生物またはウイルス遺伝子の３'非翻訳領域を含み得る。好ましくは、３'非翻訳領域は内因性ポリアデニル化シグナルを含む。一つの実施態様において、転写終結構造はレトロウイルス３'ＬＴＲを含む。好ましい実施態様において、転写終結構造は修飾３'ＬＴＲを含み、ここでＵ３プロモーターは欠失または他の手段により不活性化される。より好ましい実施態様において、転写終結構造は、本発明のベクターに挿入する３'ＬＴＲを含む。
【００６２】
ＵＥセグメントの活性は、それを第１転写終結構造のポリアデニル化シグナルの上流に置き、その位置がその構造を通過する転写読み通しを減少させるかどうかを測定することにより測定し得る。挿入ＵＥセグメントの３'ＬＴＲにおけるポリアデニル化シグナルに対する配向は、ＵＥセグメントが由来する遺伝子におけるポリアデニル化シグナルに対するその配向と同じべきである。
【００６３】
ＵＥセグメントは、第１レポーターポリペプチドのコード配列と第１転写終結構造のポリアデニル化シグナルの間の領域のどこでも挿入し得る。好ましくは、セグメントはポリアデニル化シグナルの１００ヌクレオチドより少ない上流に挿入する。最も好ましくは、セグメントはポリアデニル化シグナルの２０ヌクレオチドより少ない上流に挿入する。
【００６４】
読み通しアッセイは、発現構築物を含むＤＮＡを哺乳類宿主細胞に当分野で既知の任意の方法を使用して送達することにより行ない得る。好ましくは、宿主細胞はレトロウイルスベクターの標的細胞として意図するものと同じ哺乳類種由来である。より好ましくは、宿主細胞はレトロウイルスベクターの標的細胞として意図するものと同じ種および組織タイプ由来である。より好ましくは、宿主細胞はレトロウイルスベクターの標的細胞として意図するものと同じである。
【００６５】
読み通し活性は、両方のポリペプチドをコードするｍＲＮＡと、第１レポーターポリペプチドのみをコードするｍＲＮＡのレベルを比較することにより測定し得る。あるいは、活性は二つのレポーターポリペプチドの相対的レベルの比較により測定できる。
【００６６】
本発明により、ＵＥセグメントは“活性”であり、したがって、３'ＬＴＲポリアデニル化シグナルと操作可能に結合しているとき、それが読み通しを少なくとも約１０％減少させるか、ベクター力価を少なくとも１０％促進する場合、“ＵＥ配列”と見なす。本発明にしたがい、ＵＥ配列は少なくとも５ヌクレオチド長である。
【００６７】
本発明のベクターを含み得るＵＥおよび活性ＵＥセグメント(即ち、集合的にＵＥ配列)の具体的な実施態様は、以下のものを含むが、これらに限定されない：
ａ)配列
ＴＴＴＡＴＴＴＧＴＧＡＡＡＴＴＴＧＴＧＡＴＧＣＴＡＴＴＧＣＴＴＴＡＴＴＴＧＴＡＡ(配列番号１)を含むＳＶ４０由来のＵＥ；およびその全ての活性セグメント。好ましい実施態様において、このようなセグメントはＡＴＴＴＧＴＧＡまたはＡＴＴＴＧＴＡＡを含む。
【００６８】
ｂ)配列
ＴＴＴＧＴＧＡＣＧＣＧＴＴＡＡＧＴＴＣＣＴＧＴＴＴＴＴＡＣＡＧＴＡＴＴＡＴＡＡＧＴＡＣＴＴＧＴＧＴＴＣＴＧＡＣＡＡＴＴ(配列番号２)を含むウマ感染性貧血ウイルスＵＥ；およびその全ての活性セグメント。好ましい実施態様において、このようなセグメントはＴＴＴＧＴまたはＴＧＴＴＴＴＴまたはＴＴＧＴＧＴＴを含む。
【００６９】
ｃ)配列
ＴＧＴＧＴＧＡＧＴＡＧＴＴＣＣＣＡＧＡＴＡＡＧＧＧＡＡＴＴＡＧＧＧＴＴＣＴＴＡＴＡＧＧＧＴＴＴＣＧＣＴＣＡＴＧＴＧＴＴＧＡＧＣＡＴＡＴＡＡＧＡＡＡＣＣＣＴＴＡＧＴＡＴＧＴＡＴＴＴＧＴＡＴＴＴＧＴ(配列番号５)を含むカリフラワーモザイクウイルスＵＥ；およびその全ての活性セグメント。好ましい実施態様において、このようなセグメントはＴＧＴＧＴＧＡＧＴＡＧＴＴ(配列番号３)またはＴＧＴＧＴＴＧまたはＴＴＡＧＴＡＴＧＴＡＴＴＴＧＴＡＴＴＴＧＴＡ(配列番号４)を含む。
【００７０】
ｄ)配列
ＴＣＡＴＧＴＡＴＣＴＴＴＴＴＣＡＣＣＴＧＴＧＣＣＴＴＧＴＴＴＴＴＧＣＣＴＧＴＧＴＴＣＣＡＴＧＴＣＣＴＡＣＴＧＴＴ(配列番号６)を含む地リス肝炎ウイルスＵＥ(ＵＧＥ)；およびその全ての活性セグメント。好ましい実施態様において、このようなセグメントはＴＴＴＴＴ、またはＴＴＧＴＴＴＴＴＧまたはＴＧＴＧＴＴを含む。
【００７１】
ｅ)配列
ＣＣＡＣＴＴＣＴＴＴＴＴＧＴＣＡＣＴＴＧＡＡＡＡＡＣＡＴＧＴＡＡＡＡＡＴＡＡＴＧＴＡＣＴＡＧＧＡＧＡＣＡＣＴＴＴ(配列番号８)を含むアデノウイルスＬ３  ＵＥ；およびその全ての活性セグメント。好ましい実施態様において、このようなセグメントはＴＴＣＴＴＴＴＴＧＴ(配列番号７)を含む。
【００７２】
ｆ)配列
ＣＡＧＣＴＧＣＴＴＴＴＴＧＣＣＴＧＴ(配列番号１１)を含むＨＩＶ−１  ＵＥ(ＵＨＥとしても既知)；およびその全ての活性セグメント。好ましい実施態様において、このようなセグメントはＴＴＴＴＴを含む。
【００７３】
ｇ)配列
ＴＴＧＡＣＴＴＧＡＣＴＣＡＴＧＣＴＴＧＴＴＴＣＡＣＴＴＴＣＡＣＡＴＧＧＡＡＴＴＴＣＣＣＡＧＴＴＡＴＧＡＡＡＴＴ(配列番号９)を含む補体Ｃ２  ＵＥ；およびその全ての活性セグメント。好ましい実施態様において、このようなセグメントはＴＴＧＴＴＴまたはＧＴＴＡＴＧを含む。
【００７４】
ｈ)配列
ＡＴＴＣＧＧＴＴＴＴＴＡＡＧＡＡＧＡＴＧＣＡＴＧＣＣＴＡＡＣＧＴＧＴＴＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＣＡＡＴＧＡＴＴＴＧＴＡＡＴＡＴＡＣＡＴＴＴＴＡＴＧＡＣＴＧＧＡＡＡＣＴＴＴＴＴＴ(配列番号１０)を含むラミンＢ２  ＵＥ；およびその全ての活性セグメント。好ましい実施態様において、このようなセグメントはＴＴＴＴＴ、またはＧＴＧＴＴ、またはＴＴＴＧＴ、またはＴＴＴＴＡＴＧを含む。
【００７５】
ＵＥ配列と３'ＬＴＲポリアデニル化シグナルの操作可能に結合
本発明のベクターは、３'ＬＴＲポリアデニル化シグナルに操作可能に結合した１個または数個のＵＥ配列を含む。特に、操作可能に結合は、ベクター３'ＬＴＲの転写終結因子を促進するＵＥ配列の取り込みを意味する。増強された転写終結を有するベクターは、種々の改善された特性を有し得る。可能性ある改善は、フランキングベクターまたは宿主配列への減少した転写読み通し；ベクターＲＮＡおよび／またはベクターコードポリペプチドの増加した製造；およびプロデューサー細胞における高いベクター力価を含む。本発明により、ＵＥ配列は、取りこみが任意のこれらの特性の約１０％以上の改善に影響する場合、３'ＬＴＲポリアデニル化シグナルと操作可能に結合する。
【００７６】
ＵＥ配列は、シグナルの５'上流であるベクター部位に配列を挿入することにより３'ＬＴＲポリアデニル化シグナルと操作可能に結合し得る。挿入ＵＥ配列のポリアデニル化シグナルに対する配向は、配列が由来する遺伝子におけるポリアデニル化シグナルに対する配向と同じでなければならない。
【００７７】
好ましくは、挿入部位は、対照として非修飾ベクターを使用して、シグナルの約５００ヌクレオチドより少ない上流である。より好ましくは、部位は約１００ヌクレオチドより少ない上流である。より更に好ましくは、部位は約５０ヌクレオチドより少ない上流である。
【００７８】
特に好ましい実施態様において、挿入は３'ＬＴＲのＵ３領域における部位である。更に好ましい実施態様において、このような部位はａｔｔ配列とＵ３領域に存在し得る任意の内因性ＵＥ配列の間である。より更に好ましい実施態様において、ａｔｔ配列と、Ｕ３プロモーター構造のいくつかまたは全てを含むＵＥ配列の間の３'ＬＴＲ配列は欠失し、ＵＥ配列が欠失部位に挿入される。最も好ましい実施態様において、このような欠失は、ＨＩＶ−１のｐＮＬ４−３株の約９１１３から９５０６残基に対応する領域に伸び、ＵＥ配列が欠失部位に挿入される。
【００７９】
複数のＵＥ配列を含むベクター
本発明のベクターは、３'ＬＴＲポリアデニル化シグナルと操作可能に結合した複数のＵＥ配列を含む。本発明は、複数のＵＥ配列の可能性のある組合せ全てを含むベクターを意図する。組み合わせの例は；２個以上の異種ＵＥ配列が同一または同じＵＥ由来である；異なるＵＥに由来する２個以上の異種ＵＥ配列；同じ内因性ＵＥの２個以上の複製、異なる内因性ＵＥ配列の２個以上の複製；１個以上の異種ＵＥ配列と１個以上の内因性ＵＥ配列の付加的複製を含むが、これらに限定されない。
【００８０】
異種遺伝子およびコード配列
本発明のベクターは哺乳類細胞および生物における所望の遺伝子産物の発現に有利に使用し得る。したがって、ベクターは更に１個以上の異種コード配列を含み得、ここでこのような配列はベクターが由来するレトロウイルスゲノム以外の源由来である。
【００８１】
一つの実施態様において、異種コード配列をレトロウイルス骨格に、好ましくは、５'および３'ＬＴＲの間に、それらが５'ＬＴＲプロモーターと操作可能に結合するように挿入する。このような挿入物が異種コード配列を含む多シストロン性ｍＲＮＡの製造を導く場合、また各配列の効率的な翻訳を達成するために各異種コード配列とＩＲＥＳを操作可能に結合するのも有利であり得る。
【００８２】
他の実施態様において、異種コード配列は、個々のプロモーターと各々操作可能に結合し、発現構築物を形成し、このような構築物をレトロウイルス骨格に、好ましくは、５'および３'ＬＴＲの間に挿入する。発現構築物は、構造的、誘導可能、組織特異的、または細胞サイクル特異的であるプロモーターを含み得る。有用なプロモーターの例は、ＳＶ４０プロモーター、ＣＭＶプロモーター、アデノウイルスプロモーター、Ｂ１９パルボウイルスプロモーター、ヒストンプロモーター、ｐｏｌ  IIIプロモーターおよびベータ−アクチンプロモーターを含むが、これらに限定されない。
【００８３】
別種の遺伝子生成物を、本発明のベクターを使用して発現し得る。それらはポリペプチド、構造ＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡおよびリボザイムを含む。一つの実施態様において、本発明のベクターは治療的ポリペプチドをコードする１個以上の異種配列を含み、発現する。治療的ポリペプチドの例は、サイトカイン、成長因子、ホルモン、キナーゼ、レセプター、レセプターリガンド、酵素、抗体ポリペプチド、転写因子、血液因子および前記の任意の人工誘導体を含む。
【００８４】
他の実施態様において、本発明のベクターは陰性選択可能マーカーをコードする１個以上の異種配列を含み、発現する。陰性選択可能マーカーは、宿主細胞を直接的または間接的に阻害するまたは殺す細胞毒素であり得る。“直接”細胞毒素の例は、コレラの活性部分およびボツリヌス毒素を含む。好ましい実施態様において、本発明のベクターは間接細胞毒素をコードする１種以上の異種配列を含み、発現する。間接細胞毒素は、それ自体は毒性ではないが、他の作動物質との相互作用により細胞性阻害を達成する。例は、非毒性であるが、ガンシクロビルのような薬剤を哺乳類細胞を殺す毒性ヌクレオチドに活性化できるＨＳＶ−チミジンキナーゼ(ＴＫ)である。
【００８５】
ベクター粒子
本発明のベクターを含む感染性レトロウイルス粒子は、当分野で既知の方法により製造し得る。例えば、ベクター粒子は、Ｇａｇ／ＰｏｌおよびＥｎｖタンパク質のような必要なレトロウイルス複製機能をトランスで発現するパッケージング細胞をトランスフェクトすることにより製造できる。ＧａｇおよびＰｏｌはウイルス構造をおよび酵素要素を提供し、Ｅｎｖはベクター粒子を標的細胞に向けるために機能する。Ｅｎｖ機能は任意のレトロウイルスまたは、他の包含されたタンパク質(例えば、ＶＳＶ  Ｇタンパク質)または特異的細胞表面レセプターを結合する任意の分子由来の、融合またはスパイクタンパク質を含むことができる。
【００８６】
本発明の感染性ベクター粒子は哺乳類細胞および生物中で異種コード配列の発現に使用し得る。一つの実施態様において、異種コード配列を含む感染性ベクター粒子の有効な投与量を、直接哺乳類生物に投与し、生物内で標的細胞の形質導入を達成する。他の実施態様において、哺乳類細胞を、このようなベクター粒子でインビトロで形質導入し、形質導入細胞をついでインビボで宿主に投与する。好ましくは、本発明の感染性ベクター粒子は、霊長類および霊長類細胞に異種コード配列を発現するために使用する。より好ましくは、本発明のベクター粒子はヒトおよびヒト細胞に異種コード配列を発現するために使用する。
【００８７】
実施例
導入
本実施例は３'ＬＴＲに非常に効率的な転写終結構造を有する新規レトロウイルスベクターの構築を証明する。これは、ＳＶ４０遅延ポリアデニル化シグナルに由来するＵＳＥ配列の、自己不活性化(ＳＩＮ)レンチウイルスベクターの３'ＬＴＲ  Ｕ３領域への挿入により達成された。逆転写の間、３'ＬＴＲ  Ｕ３領域は、両方のＬＴＲに複製され、統合ベクターの５'および３'ＬＴＲの両方がこのＵＳＥ−ＳＩＮ配置となるようにする。新規ＬＴＲ構造を含むベクターは、増強されたポリアデニル化効率、統合プロウイルスからの減少した読み通し転写、および親ＳＩＮレトロウイルスベクターｐＣＳＯ−ＭＰと比較した場合、少なくとも２倍増加したベクター力価を有する。
【００８８】
方法および結果
レトロウイルスベクター
親ＳＩＮベクターｐＣＳＯ−ＭＰは、レンチウイルス骨格を含み、先に記載のものと類似のｐＣＳＯのような関与のＳＩＮベクターよりも改善されている(Miyoshi et al., J. Virol. 72:8250-7 (1988))(図６)。ｐＣＳＯは、ＨＩＶ−１ゲノム配列の２１００ヌクレオチドを含む。ｐＣＳＯ−ＭＰにおいて、ＨＩＶ−１配列は８３５ヌクレオチドまで減少されている。先に記載のＳＩＮベクターと比較したこのベクターの重要な性質は、全てのＨＩＶ−１スプライス部位のおよびｅｎｖ配列の欠失、ｇａｇオープンリーディングフレームの量の著しい減少およびｐＣＳＯ−ＭＰへの中心ポリプリントラクト／中心終結配列(ｃＰＰＴ／ＣＴＳ)の挿入である(図６)。これらの修飾は、ベクターとパッケージング要素をコードする配列の相同配列重複の程度を非常に減少させ、それにより相同組換えを介した複製コンピテントレトロウイルス(ＲＣＲ)の生成の危険性を減少させ、最適ベクター機能は維持されている。種々の転写終結構築物を含むｐＣＳＯ−ＭＰの誘導体が製造され、その特性が試験されている。
【００８９】
転写終結構築物
種々のＵＥ配列で修飾されたＳＩＮ−ＬＴＲを含む数個の転写終結構築物が、標準組換えＤＮＡ法を使用して製造され、試みられている。一つの構築物ＳＩＮ−ＬＴＲ−ＵＳＥは、３つのコアＡＵＵＵＧＵＰｕＡ要素を有するＳＶ４０の完全ＵＳＥを含む４０ヌクレオチド配列を含む。他の構築物ＳＩＮ−ＬＴＲ−ＵＳＥＰは、二つのコア要素のみを含む部分的ＵＳＥを含む。第３の構築物ＳＩＮ−ＬＴＲ−ＵＨＥＭは、配列ＴＴＴＣＣＧＣＴＧＧＧＡＣＴＴＴ(配列番号１２)(ＵＨＥＭ)を有するＨＩＶ−１推定マイナーポリアデニル化エンハンサーを含む。第４の構築物ＳＩＮ−ＬＴＲ−ＵＧＥは地リスＢ型肝炎ウイルス由来の完全５６ヌクレオチド長ＵＧＥ配列を含む。各構築物において、ＵＥ配列は、ｐＣＳＯ−ＭＰの３'ＬＴＲの統合接合部位(Masuda et al., J. Virol. 72:8396-8402 (1998))と内因性ＨＩＶ−１上流エンハンサー(ＵＨＥ)(Valsamakis et al., Mol. Cell Biol. 12:3699-3705 (1992))の間に挿入する。これらの挿入は、ＳＩＮ−ＬＴＲのＵ３領域におけるａｔｔとＵＨＥの結合部におけるＸｈｏ  Ｉ制限部位の操作により促進される。これらの構築物の構造は図７Ａおよび７Ｂに示す。
【００９０】
転写読み通しアッセイ
これらの転写終結構築物の活性は、図８Ａに示す多シストロン性発現カセットに基づく転写読み通しアッセイを使用して評価する。転写終結構築物は二つのレポーター遺伝子、レニラルシフェラーゼ(Ｒ  ｌｕｃ)およびホタルルシフェラーゼ(Ｆ  ｌｕｃ)の間に挿入し、Ｒ  ｌｕｃおよびＦ  ｌｕｃ活性の量を、発現カセットを含むプラスミドの２９３Ｔ細胞へのトランスフェクションに続いて測定する。Ｒ  ｌｕｃおよびＦ  ｌｕｃ活性は、ルシフェラーゼアッセイキット(Promega)を使用して測定する。発現カセット中の内部リボソーム挿入部位(ＩＲＥＳ)配列の存在は、ｍＲＮＡ上で第２コード配列であってさえ、Ｆ  ｌｕｃ発現を可能にする。この配置において、Ｆ  ｌｕｃの発現は転写が挿入構築物により終結する効率と逆相関する。加えて、第１レポーター遺伝子、Ｒ  ｌｕｃの発現レベルはｍＲＮＡの全体的安定性／翻訳可能性を反映し、それはまた挿入構築物の強度により影響される。一緒に考えて、挿入終結構築物のこれら二つの異なる効果は、二つのルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現の比率の変化を組み合わる。構築物の活性は、発現されたＲ  ｌｕｃ：Ｆ  ｌｕｃの比率におけるそれらの効果に基づいて比較できる(即ち、高い比率を有する構築物は、低い比率を有する構築物と比較して増強された終結活性を有する)。
【００９１】
前記のアッセイは、ＳＩＮ−ＬＴＲ−ＵＳＥにおける転写終結構造が、天然ＨＩＶ−１  ＬＴＲまたは既知の最強のシグナルの一つであると考えられる野生型ＳＶ４０遅延ポリアデニル化シグナルよりさえ、強いポリアデニル化シグナルである。完全ＵＳＥの付加はＳＩＮ−ＬＴＲのポリアデニル化強度を約３倍増加させ、一方ＳＩＮ−ＬＴＲ−ＵＳＥＰへの２個のＵＳＥのＡＵＵＵＧＵＰｕＡ要素の付加は、約２倍ポリアデニル化強度を増強する。ＨＩＶ−１推定マイナーエンハンサー(ＳＩＮ−ＬＴＲ−ＵＨＥＭ)の付加はポリアデニル化効率を減少させる。これらの結果を図８に要約する。
【００９２】
ＲＮａｓｅ保護アッセイ
ＲＮａｓｅ保護アッセイを、ＬＴＲに異なる転写終結構造を有する種々のＳＩＮ由来ベクターに関する正確に終結したベクター転写物対読み通し転写物の比率の分析に使用する。標識ＲＮＡプローブを各ベクター３'ＬＴＲ配置(図９)に関して製造し、種々のベクターを含む２９３Ｔ細胞集団におけるベクター由来転写物のプローブに使用する。これらのアッセイは、ベクターｐＣＳＯ−ＭＰにおけるＳＩＮ−ＬＴＲポリアデニル化シグナルが、ほぼ同じ効率で正確にポリアデニル化および読み通し転写物の両方を生成することを示す。対照的に、ＵＳＥまたはＵＳＥＰ要素のＳＩＮ−ＬＴＲへのａｔｔおよびＵＨＥ境界への挿入は、正確なポリアデニル化部位の量を実質的に増加させ、読み通し転写物の量を対応して減少させる。(データは示していない)
【００９３】
ベクター力価
完全および部分的ＵＳＥおよび完全ＵＧＥを、ベクターｐＳＣＯ−ＭＰの３'ＬＴＲに挿入し、ベクターｐＣＳＯ−ＭＰ.ＵＳＥ、ｐＣＳＯ−ＭＰ.ＵＳＥＰおよびｐＣＳＯ−ＭＰ.ＵＧＥをそれぞれ創生する。ベクター粒子は、記載のように、これらのベクターを含むプラスミドと、複製ヘルパープラスミドｐＣＭＶ△Ｒ８.７１およびｐＭＤ.Ｇの２９３Ｔ細胞への共トランスフェクションにより生成する(Naldini et al., Science 272:263-267 (1996))。トランスフェクト細胞から製造したベクター上清は、２９３Ｔ細胞で力価測定する。これらの分析は、ベクターｐＣＳＯ−ＭＰ.ＵＳＥが標準ＳＩＮ−ＬＴＲベクターであるｐＣＳＯ−ＭＰよりも少なくとも２倍高いベクター力価を提供することを示す(図１０)。ベクター力価を増加させる能力は、ベクターｐＣＳＯ−ＭＰ.ＵＳＥ中のＵＧＥが約２倍までベクター力価を増加させるため、ＵＳＥの特性だけではない。ｍＲＮＡの高い定常状態レベルは強いポリアデニル化シグナルによる処理に起因することが知られている。したがって、３'ＳＩＮ−ＬＴＲ−ＵＳＥまたは３'ＳＩＮ−ＬＴＲ−ＵＧＥ配置は、プロデューサー細胞においてベクター転写物に高い安定性を付与し、それは高いベクター力価をもたらす。
【００９４】
本発明は本明細書に記載の具体的実施態様により範囲を限定するものではない。実際、本明細書に記載されたものに加えて種々の修飾が、前記および添付の図面から当業者に明らかとなるであろう。このような修飾は特許請求の範囲の範囲内にあると解釈する。
【００９５】
種々の刊行物を本明細書で引用し、その記載はその全体を出典明示により本明細書に包含させる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  レトロウイルスゲノム構成
パネルＡ.単純Ｃ型レトロウイルスの基本的構成を示す。長い末端反復(ＬＴＲ)は、各々５'および３'ＬＴＲを優勢に使用するプロモーターおよびポリアデニル化配列を含む。完全長およびスプライスした転写物の両方を製造し、これらは３つの主用タンパク質をコードする；ＧａｇおよびＧａｇ−Ｐｏｌは完全長転写物からの翻訳であり、ｅｎｖはスプライスされた転写物からの翻訳物である。完全長転写物はまたＲＮＡゲノムとして働く。ゲノムの５'領域に、ゲノムをウイルス粒子に統合するのに必要なパッケージングシグナル(Ψ)である。ＳＤ、スプライスドナー；ＳＡ、スプライスアクセプター。
パネルＢ.ＬＴＲは、Ｕ３、ＲおよびＵ５と名付けられる３つの領域を含む。プロモーターおよびエンハンサー配列は５'ＬＴＲでのみ活性であり、Ｕ３領域に位置し、一方３'ＬＴＲはＲ／Ｕ５境界を定義する。ＬＴＲの末端のａｔｔ配列は統合に必要である。
【図２】  複製欠損レトロウイルスベクター粒子の製造
野生型レトロウイルス、パッケージングヘルパー構築物および複製欠損レトロウイルスのゲノムは、各々図面の上段、中段および下段に示すとおりである。パッケージングヘルパー構築物は、全てのウイルスタンパク質を、ウイルスタンパク質をコードしないが、パッケージングおよび統合のための必要なシス要素の全てを保持するベクターゲノムに対してトランスに提供する。パッケージングヘルパー構築物からのパッケージングシグナルの欠失は、ベクター粒子へのその統合を防止する。
【図３】  レトロウイルスベクター設計の改善
パネルＡ.分けたパッケージングヘルパー構築物。Ｇａｇ−ＰｏｌおよびＥｎｖタンパク質をコードする配列を、二つの異なるプラスミドに分け、異種融合タンパク質(例えばＶＳＶ  Ｇタンパク質の使用により安全性を更に増加させる。発現は、非ＬＴＲプロモーター(例えば、ヒトＣＭＶプロモーター)の使用を介してパッケージングヘルパーから最大化される。
パネルＢ.ＳＩＮベクター。５'ＬＴＲのＵ３プロモーター配列をＣＭＶプロモーターで置き換え、３'ＬＴＲのＵ３プロモーターを欠失により最少にする。逆転写に続いて、欠失Ｕ３配列(△Ｕ３)をプロウイルスの５'および３'ＬＴＲの両方に複製し、統合ベクター５'ＬＴＲからの非常に減少したプロモーター活性をもたらす。これは、自己不活性化(ＳＩＮ)ウイルスの基礎である。
【図４】  ポリアデニル化シグナル：上流エンハンサー(ＵＥ)の役割
パネルＡ.ポリアデニル化効率のＵＥ仲介促進のモデル。コアポリアデニル化シグナルは二つの要素：ＡＡＵＡＡＡヘキサヌクレオチドおよびＧ／Ｕリッチ要素からなり、これら二つの要素の間で開裂が起こる。
パネルＢ.ＳＶ４０遅延ポリアデニル化シグナルは上流エンハンサー(ＵＥ、ａ／ｋ／ａＵＳＥ)および下流エンハンサー(ＤＳＥ)を含む。４０ヌクレオチド長ＵＳＥは、配列ＡＵＵＧＵＰｕＡを有する３つのほぼ一の要素(矢印)から成る。ＵＳＥはＡＡＵＡＡＡモチーフに対して−１５から−５４ヌクレオチドに位置する。
パネルＣ.完全長ＨＩＶ−１  ＬＴＲの模式的提示である。ＡＡＵＡＡＡ要素は、Ｒ／Ｕ５境界を定義する開裂／ポリアデニル化部位の１９ヌクレオチド上流のＲ領域に位置する。Ｇ／Ｕリッチ配列はＵ５領域に位置する。内因性上流要素(ＵＨＥ)は、ＡＡＵＡＡＡモチーフの７７−９４ヌクレオチド上流のＵ３領域内に位置する。推定マイナー上流要素配列(ＵＨＥＭ)はＡＡＵＡＡＡシグナルの１４６−１７１ヌクレオチド上流に位置する。
パネルＤ.自己不活性化(ＳＩＮ)ＨＩＶ−１  ＬＴＲの模式的提示。ＨＩＶ−１コアポリアデニル化要素およびＵＨＥはＳＩＮ−ＬＴＲにおいて保存され、Ｕ３領域内のプロモーターの３９５ヌクレオチド欠失により創生される。残りのＵ３配列は５'末端に３８ヌクレオチドを含み、それはインテグラーゼ結合部位(ａｔｔ)および２３ヌクレオチド領域を、１８ヌクレオチド長ＵＨＥを含むＵ３の３'境界に含む(図７Ａもまた参照)。
【図５】  上流エンハンサー(ＵＥ)の例
ヒト免疫不全ウイルスタイプ１ＵＨＥ(配列番号１１)；ＳＶ４０  ＵＳＥ(配列番号１)；ウマ感染性貧血ウイルスＵＥ(配列番号２)；カリフラワーモザイクウイルスＵＥ(配列番号５)；地リス肝炎ウイルスＵＧＥ(配列番号６)；アデノウイルスＬ３  ＵＥ(配列番号８)；ヒト補体Ｃ２  ＵＥ(配列番号９)；ラミンＢ２  ＵＥ(配列番号１０)。各ＵＥの３'末端(枠内に示す)からＡＡＵＡＡＡシグナル(楕円として示す)までの距離を示す。
【図６】  最少ＳＩＮベクター
ｐＣＳＯはレンチウイルス骨格を含むＳＩＮレトロウイルスベクターである。それはＨＩＶ−１ゲノムの２１００ヌクレオチドを含む。ｐＳＣＯ−ＭＰはｐＳＣＯ由来であり、ＨＩＶ−１配列は８３５ヌクレオチドに減少されている。ＲＲＥ部位を含むｅｎｖ配列が欠失しており、ｇａｇ配列の長さがかなり減少している。全てのスプライス部位が欠失している。ｇａｇの１番目のコドンは停止コドン(Ｌ１３Ｘ)に変異しており、中心ポリプリン・トラクト・セントラル停止配列(ｃＰＰＴ／ＣＴＳ)を挿入し、逆転写の効率を増加させる。これらのベクターのヌクレオチド番号付けは、ｐＮＬ４−３配列に基づく。
【図７】  増強された転写終結構造を伴うＳＩＮ−ＬＴＲの操作
図７Ａ.ＳＩＮ−ＬＴＲ−ＵＳＥ。ＳＶ４０遅延ポリアデニル化シグナルの構造を黒背景で示す。ＳＩＮ３'ＬＴＲの構造を白背景で示す。４０ヌクレオチドＳＶ４０上流エンハンサー(ＵＳＥ)をａｔｔ部位とＨＩＶ  ＬＴＲ上流エンハンサー(ＵＨＥ)の間に挿入した。
図７Ｂ.操作した転写終結構造を伴うＳＩＮ  ＬＴＲの種々の立体配置の模式的提示。ＳＶ４０遅延ポリアデニル化シグナルの構造を黒背景で示す。ＳＩＮ３'ＬＴＲの構造を白背景で示す。地リス肝炎ウイルスの構造を斜線で示す。構築物ＳＩＮ−ＬＴＲ−ＵＨＥＭ、ＳＩＮ−ＬＴＲ−ＵＳＥＰおよびＳＩＮ−ＬＴＲ−ＵＳＥの構築物は、ＵＳＥ配列の挿入物または内因性推定ＵＥ配列を含む。ＳＩＮ−ＬＴＲ−ＵＨＥＭはマイナーＨＩＶ−１推定ＵＥ(ＵＨＥＭ)の２７ヌクレオチド挿入物を含む(短い黒矢印)。構築物ＳＩＮ−ＬＴＲ−ＵＳＥは、３つの同一ＡＵＵＵＧＵＰｕＡ要素から成る、ＳＶ４０遅延ポリアデニル化シグナル由来の完全４０ヌクレオチド長ＵＳＥを含む(白矢印)。ＳＩＮ−ＬＴＲ−ＵＳＥＰは、二つのＡＵＵＵＧＵＰｕＡ要素を含む、ＵＳＥの２０ヌクレオチドセグメントを含む(白矢印)。構築物ＳＩＮ−ＬＴＲ−ＵＧＥは地リス完全ウイルス由来の完全５６ヌクレオチド長ＵＧＥ配列を含む。楕円はＡＡＵＡＡＡシグナルを意味する。小さい長方形はＧ／Ｕリッチダウンストリーム要素を示す。
【図８】  転写終結効率の測定
図８Ａ.多シストロン性発現構築物の模式図。
ＣＭＶはサイトメガロウイルスプロモーターを意味する。Ｒ  ｌｕｃはレニラルシフェラーゼコード配列を意味する。ＴＴＳは転写終結構造を意味する。ＩＲＥＳは内部リボザイム挿入部位を意味する。Ｆ  ｌｕｃはホタルルシフェラーゼコード配列を意味する。ＳＶポリ(Ａ)はＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを示す。
図８Ｂ.転写終結活性
図７Ａおよび７Ｂに示す操作した転写終結構造を有するＳＩＮ−ＬＴＲを、各々、多シストロン性発現構築物における二つのルシフェラーゼ遺伝子の間に、ＴＴＳ部位で挿入する。構築物を２９３Ｔ細胞にトランスフェクトし、Ｒ  ｌｕｃおよびＦ  ｌｕｃの発現を測定する。Ｒ  ｌｕｃ／Ｆ  ｌｕｃの比率が修飾ＳＩＮ−ＬＴＲの効率／強度を反映する。
【図９】  ＲＡａｓｅ保護アッセイによる３'ポリ(Ａ)効率の分析のためのリボプローブの設計。
図は、標準ＳＩＮ−ＬＴＲ(例えば、ベクターｐＣＳＯ、ｐＣＳＯ−ＭＰ)またはＳＩＮ−ＬＴＲ−ＵＳＥ(例えば、ベクターｐＣＳＯ−ＭＰ.ＵＳＥ)のいずれかを含む統合ベクターにおける配列の配置を示す。正常ポリ(Ａ)／開裂部位の位置は３'Ｒ／Ｕ５境界である。特異的リボプローブを、全ＬＴＲ領域、上流ポリプリントラクト(ＰＰＴ)およびＰＰＴに５'の３６ヌクレオチド非関連ヌクレオチドの更なる範囲のを含むために、各ベクターのために設計した。予期される保護フラグメントのサイズを示す。３'Ｒ／Ｕ５境界で正確に終結する転写物を、示すように、サイズの差異のために読み通し転写物から区別できる。
【図１０】  ＵＳＥ配列を含むベクターの力価
ｐＣＳＯ−ＭＰ、ｐＣＯ−ＭＰ.ＵＳＥＰ、ｐＣＳＯ−ＭＰ.ＵＳＥまたはｐＣＳＯ−ＭＰ.ＵＧＥベクターを含むウイルス粒子を、一過性トランスフェクションにより生成し、２９３Ｔ細胞で力価測定した。力価はｍｌ当たりの形質導入単位として示す。
【図１】
0004708661.tif 000002
【図２】
0004708661.tif 000003
【図３】
0004708661.tif 000004
【図４】
0004708661.tif 000005
【図５】
0004708661.tif 000006
【図６】
0004708661.tif 000007
【図７Ａ】
0004708661.tif 000008
【図７Ｂ】
0004708661.tif 000009
【図８Ａ】
0004708661.tif 000010
【図８Ｂ】
0004708661.tif 000011
【図９】
0004708661.tif 000012
【図１０】
0004708661.tif 000013