(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゲノムまたはこれらの一部の統合された遺伝的および物理的地図を提供するための方法
であって、該方法は：
（ａ）前記ゲノムまたはこれらの一部に対する少なくとも２つの個々の遺伝マーカーを提供することと；
（ｂ）ＡＦＬＰフィンガープリンティングによって同定される少なくとも１つのＡＦＬＰ断片に前記遺伝マーカーのそれぞれを対応づけることと；
（ｃ）前記ゲノムまたはこれらの一部の断片を含むクローンのライブラリーを提供することと；
（ｄ）多数のプールを作製することと、ここで、それぞれのプールは前記ライブラリーからの多数の個々のクローンを含む；
（ｅ）各々のプールについてＡＦＬＰフィンガープリントを作製することと；
（ｆ）前記多数のプールにおいて、フィンガープリントに（ｂ）で同定されたＡＦＬＰ断片が存在する単数または複数のプールを同定することと；
（ｇ）（ｆ）で同定された前記単数または複数のプールにおける個々のクローンのそれぞれについてＡＦＬＰフィンガープリントを作製して、そのＡＦＬＰフィンガープリントに（ｂ）で同定されたＡＦＬＰ断片を含むクローンを同定することと；
（ｈ）前記フィンガープリンティングのパターンに基づいて、工程（ｇ）で同定された個々のクローンを含むコンティグを作製することと；
（ｉ）少なくとも（ｂ）で同定された第二のＡＦＬＰ断片について工程（ｆ）〜（ｈ）を繰り返すことにより、前記第二のまたはさらなるＡＦＬＰ断片を第二のまたはさらなる遺伝マーカーに対応づけることと；
（ｊ）（ｈ）で得られたコンティグの少なくとも２つを結びつけることにより、
少なくとも２つの遺伝マーカーを含む前記ゲノムまたはこれらの一部の統合された物理的および遺伝的地図を得ること；
の工程を含み、
工程（ｂ）および（ｅ）で使用するＡＦＬＰプライマー対は高選択性であり、工程（ｇ）で使用する前記ＡＦＬＰプライマー対は低選択性であり、高選択性のＡＦＬＰプライマーは低選択性のＡＦＬＰプライマーよりも少なくとも一つ多い選択的なヌクレオチドを含み、前記ＡＦＬＰフィンガープリントを作成するために前記工程（ｇ）で使用する前記ＡＦＬＰプライマーと、前記工程（ｂ）および（ｅ）で前記プールをフィンガープリントするために使用するＡＦＬＰプライマーとが、選択的塩基の数においてのみ異なる方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記工程（ａ）において、前記ゲノムまたはこれらの一部に対する少なくとも２つの個々の遺伝マーカーが、遺伝子地図の形態で提供される方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の方法であって、前記工程（ｃ）におけるライブラリーがＢＡＣおよびＹＡＣからなる群より選択される人工の染色体ライブラリーである方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法であって、前記ゲノムまたはこれらの一部において、工程（ａ）〜（ｇ）をさらなる遺伝マーカーのために繰り返し、工程（ｇ）で得られる前記コンティグを整列させ、それによって統合された物理的および遺伝的地図を得る方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法であって、前記高い選択性のＡＦＬＰプライマーにおいて用いられる塩基と前記低い選択性のＡＦＬＰプライマーにおいて用いられる塩基の数の差が、少なくとも２である方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法であって、前記塩基の数の差が、少なくとも３である方法。
【請求項７】
請求項５に記載の方法であって、前記塩基の数の差が、少なくとも４である方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法であって、前記低い選択性のＡＦＬＰプライマーにおいて用いられる選択的塩基の数が少なくとも０である方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法であって、前記選択的塩基の数が少なくとも１である方法。
【請求項１０】
請求項８に記載の方法であって、前記選択的塩基の数が少なくとも２である方法。
【請求項１１】
請求項８に記載の方法であって、前記選択的塩基の数が少なくとも３である方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法であって、それぞれのプールが、解析される総ゲノム数の多くても０．６ゲノム相当物を含む方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法であって、前記それぞれのプールが、解析される総ゲノム数の多くても０．５ゲノム相当物を含む方法。
【請求項１４】
請求項１２に記載の方法であって、前記それぞれのプールが、解析される総ゲノム数の多くても０．４ゲノム相当物を含む方法。
【請求項１５】
請求項１２に記載の方法であって、前記それぞれのプールが、解析される総ゲノム数の多くても０．３ゲノム相当物を含む方法。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法であって、さらなるプーリング工程をさらに含む方法。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法であって、前記遺伝マーカーが、１００ｋｂにつき少なくとも１つの遺伝マーカーの密度で提供される方法。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法であって、前記コンティグが、アラインメントのために適したコンピュータプログラムを使用してアラインメントされる方法。
【請求項１９】
請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法であって、前記人工染色体ライブラリーが、少なくとも５ゲノム相当物を含む方法。
【請求項２０】
請求項１〜１９のいずれか1項に記載の方法であって、前記人工染色体ライブラリーが、少なくとも７ゲノム相当物を含む方法。
【請求項２１】
遺伝的および物理的ゲノム地図を結び付けるための方法における第一および第二のＡＦＬＰプライマー対の使用であって、前記ＡＦＬＰプライマーが、定常配列および可変配列を含み、前記定常配列がアダプターに結合された制限断片におけるアダプターを認識することができる配列を含み、前記アダプターに結合された制限断片の３’末端に隣接するアダプターのヌクレオチド配列の少なくとも一部にハイブリダイズすることのできるヌクレオチド配列をさらに含み、前記可変配列が、選択的塩基を含み、前記第一のＡＦＬＰプライマー対は高選択性であり、前記第二のＡＦＬＰプライマー対は低選択性であり、高選択性のＡＦＬＰプライマーが、低選択性のＡＦＬＰプライマーよりも少なくとも一つ多い選択的なヌクレオチドを含み、前記低選択性のＡＦＬＰプライマーと前記高選択性のＡＦＬＰプライマーとが、選択的塩基の数においてのみ異なる使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物工学の分野に、より詳細にはゲノムのマッピングの分野に、およびより詳細には、物理的および遺伝マーカーを結びつける分野に、および物理的および遺伝的地図を統合する分野に属する。本発明は、物理的および遺伝的地図の統合のための方法に、より詳細には、統合された遺伝的および物理的地図の高スループットな構築に属する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景  
統合された遺伝的および物理的ゲノム地図は、地図に基づいた遺伝子の単離、比較ゲノム分析のために、およびゲノム・シーケンシング・プロジェクトのためのシーケンスの容易なクローンの供与源として極めて貴重である。ゲノム研究のための種の物理的および遺伝マーカーの統合された地図が利用できることによる効果は、莫大である。統合された地図により、正確かつ迅速な遺伝子マッピングおよび全てのミクロサテライト座位のマッピング、並びにSNAマーカーに基づいた遺伝子操作などのその他の適用が可能になる。様々な複雑さのゲノムの物理的地図を構築するために、種々の方法が開発されてきた。よく特徴づけられたアプローチの一つでは、ゲノムのサブクローンから多数のDNA断片を作製するために制限酵素を使用する（Brenner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. , (1989) , 86, 8902-8906;Geogery et al., Genome Res. (1997), 7, 1162-1168; Marra et al., Genome Res. (1997), 7, 1072-1084）。これらのフィンガープリントを比較して、関連するクローンを同定し、コンティグ内で重複するクローンを構築する。しかし、複雑なゲノムを整理するためのフィンガープリントの有用性は、ゲル間でDNAの移動が異なること、反復DNA配列の存在、珍しい制限酵素部位の分布、および偏ったクローンの提示のために制限されている。さらに、フィンガープリント単独では、その他の方法と組み合わせない限り、ゲノムのクローンを遺伝的地図に直接連結されることはない。従って、最も高い質の複雑なゲノムの物理的地図は、フィンガープリンティングとPCRに基づいた方法またはハイブリダイゼーションに基づいた方法を組み合わせて使用して構築されていた。
【０００３】
選択的な制限断片増幅またはAFLPは、例えば出願人による欧州特許出願0 534858およびUS6,045,994から、またVos et al. Nucleic Acids Research (1995) , 23, 4407-4414による論文から既知であり、参照により本明細書に援用される。一般に、AFLPは、以下の工程を含む：
（a）核酸、特にDNAまたはcDNAを1つまたは複数の特異的な制限酵素で消化して、前記DNAを対応する一連の制限酵素断片に断片化することと；
（b）こうして得られた制限酵素断片を、その一端が制限酵素断片の末端の一方または両方に適合した少なくとも１つの二本鎖合成オリゴヌクレオチド・アダプタとライゲーションすることにより、タグを付けた開始DNAの制限酵素断片を作製することと；
（c）前記タグを付けた制限酵素断片を、ハイブリダイズ条件下で、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーと接触させることと；
（d）前記プライマーがハイブリダイズした開始DNAの制限酵素断片に沿ってハイブリダイズしたプライマーがさらなる伸長を引き起こすように、前記プライマーとハイブリダイズした前記タグを付けた制限酵素断片をPCRまたは同様の技術によって増幅することと；および、
（e）こうして得られた増幅もしくは伸長されたDNA断片を同定し、または回収すること。
【０００４】
次いで、こうして得られた増幅されたDNA断片を、たとえばゲル電気泳動によって解析し、および／または視覚化することができる。これにより、アダプターに連結され、プライマーによって認識され、かつしたがって増幅工程の間に増幅された制限酵素断片に対応する特異的なバンドを示す遺伝子のフィンガープリントがもたらされる。こうして得られたフィンガープリントは、開始DNAの特異的な制限部位パターンの情報、およびしたがって前記DNAが由来する生物体の遺伝子構造の情報を提供する。
【０００５】
従って、前記DNAを同定するために；一定の遺伝子または遺伝形質の存在を表すであろう、特異的な制限部位のパターンの存在、制限断片長多型（RFLP）、および／または特異的な遺伝マーカー（いわゆる「AFLP-マーカー」）についてこれを解析するために；または、同じ目的のために、たとえば得られた結果を、既知の起源または制限パターンのDNA試料、またはその上にあるデータと比較することによって、AFLPを使用することができる。AFLPは、こうして視覚化されたAFLP断片の1つまたは複数によって遺伝マーカーを特徴づけることに非常に適している。
【０００６】
AFLPに使用されるプライマーは、これらがアダプターを認識し、かつポリメラーゼ連鎖反応法の起始点としての役割を果たすことができるものである。この目的のためには、プライマーは、増幅される制限酵素断片の3'末端に隣接したアダプターのヌクレオチド配列（の少なくとも一部）とハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を有していなければならない。また、プライマーは、アダプターに結合した制限酵素断片の3'末端の何らかの相補的塩基とのハイブリダイゼーションのために、これらの配列中に1つまたは複数のさらなる塩基（「選択的な塩基」と呼ばれる）を含むことができる。プライマーは、アダプターにハイブリダイズするプライマーの部分と制限酵素断片にハイブリダイズする選択的塩基との間に位置するように、残りの制限部位にハイブリダイズすることができるセクションを含んでいてもよい。従って、一般に、AFLPプライマーは以下の構造を有する：アダプター相補的な部分−相補的部分を残す制限部位−選択的塩基。アダプター相補的な部分−相補的部分を残す制限部位は、通常、AFLPプライマーの「定常配列」として、および選択的塩基は、「可変配列」として示されている。
【０００７】
混合物中に存在するアダプターに結合された制限酵素断片の全てのうち、選択的塩基に相補的な塩基を含む断片だけがその後に増幅されるので、これらの「選択的な」プライマーの使用により、最終的なフィンガープリント中のバンドの総量が減少され、したがってより明白かつより特異的なフィンガープリントを生じる。また、異なる選択的プライマー（すなわち、異なる可変配列）の使用により、一般に異なるフィンガープリントが提供され、これを同定または解析のためのツールとして使用することもできる。
【０００８】
選択的ヌクレオチドは、定常プライマー配列に隣接して位置するアダプターに結合された制限酵素断片のヌクレオチドに対して相補的である。
【０００９】
選択的ヌクレオチドを含むプライマーは、+Nプライマーとして示され、その中のNは、プライマーの3'末端に存在する選択的ヌクレオチドの数を意味する。Nは、好ましくはA、C、T、またはGの中から選択される。
【００１０】
また、Nは、種々のヌクレオチドの代替物、すなわちACTG-ヌクレオチドの挙動を模倣することができるが、これに加えてACTG-ヌクレオチドと比較して改善されたハイブリダイゼーション能力またはハイブリダイゼーションによって生じる二重鎖の安定性を修飾する能力などのその他の特徴を有する化合物の中から選択されてもよい。これらの例は、ペプチド核酸（PNAs）、ロック核酸（locked nucleic acids:LNA）、イノシンなどがある。2つのプライマーを使用するPCRなど、複数のプライマーで増幅を行うときは、一方または両方のプライマーに選択的ヌクレオチドを備えることができる。選択的ヌクレオチドの数は、種または当業者によって決定可能なその他の詳細に応じて変更してもよい。一般に、選択的ヌクレオチドの数は、10未満であるが、少なくとも5、好ましくは4、より好ましくは3、最も好ましい2であり、特に好ましくは、1つの選択的ヌクレオチドである。
【００１１】
したがって、+1のプライマーは、1つの選択的ヌクレオチドを含み、+2のプライマーは、2つの選択的ヌクレオチドなどを含む。選択的ヌクレオチドを有さないプライマー（すなわち、従来のプライマー）は、+0プライマー（選択的ヌクレオチドの付加なし）として示すことができる。特異的な選択的ヌクレオチドが付加されているときは、これは概念+Aまたは+Cなどによって示される。
【００１２】
制限酵素断片にライゲートされたセット・アダプターを選択的プライマーで増幅することによって、相補的塩基が制限酵素断片の適切な位置に存在することを条件として、アダプターにライゲートされた制限酵素断片のサブセットが得られる。+1のプライマーを使用すると、たとえば増幅された混合物の複雑さ（および視覚化される断片の数）は、非選択的プライマー（+0のプライマ）での増幅と比較して、4倍に減少される。より多くの減少は、複数の選択的ヌクレオチドを有するプライマーを使用して達成することができ、すなわち2つの選択的ヌクレオチドなどによって、当初の複数の配置の多重配給の16倍の減少が得られる。
【００１３】
AFLPは、二重鎖の開始DNAの両方の鎖の増幅をもたらし、AFLPは、都合よく断片の指数関数的な、すなわち一連の2、4、8、16…などの増幅が可能となる。また、AFLPは、解析されるDNA配列についての事前の知識や、適切なプローブについての事前の確認、および／または開始DNAからの遺伝子ライブラリーの構築を必要としない。
【００１４】
AFLP、その利点、その態様、並びにその中で使用される、技術、酵素、アダプター、プライマー、およびさらなる化合物およびツールのさらなる詳細については、EP-0 534 858の、およびVos et al. Nucleic Acids Research (1995) , 23, 4407-4414の参照がなされ、両刊行物は、参照として本明細書に援用される。また、以下の明細書では、他に示さない限り、EP-0534858のパラグラフ5.1に与えられる定義が使用される。
【００１５】
物理的および遺伝的地図の統合のための技術としてのAFLPの潜在性は、以前に認められていた。Klein et al. in Genome Research, (2000), 10, 798-807は、モロコシ属の物理的および遺伝的地図の統合にAFLPの使用を記載していた。Klein et al.の方法は、ライブラリーにおいて全ての個々のBACクローンに+3／+3選択的プライマーを使用してAFLPフィンガープリントを作製することを含む。該方法は、クローンのプールを作製することをさらに含む。また、全ての個々BACのAFLPフィンガープリントの作製と比較して、種々の制限酵素および別のその他の環境を使用しているものの、プールをAFLPフィンガープリンティングによって解析している。種々の酵素の組み合わせの使用は、該方法を困難にさせる。Klein et al.の方法は、実現可能であるが、複雑で、面倒で、いくつかのその他の不利な点を生じる。これらのうちの1つは、該方法が統合された地図上の非多形性マーカーの位置決めに不適当であるということである。
【００１６】
物理的および遺伝的地図の統合のための改善された方法を提供することが、本発明の目的である。AFLPに基づいた改善された方法を提供することは、本発明のさらなる目的である。増大されたマーカー密度によって測定したり、またはより信頼できるコンティグを作製したりするなど、改善された品質の地図を生じる物理的および遺伝的地図の統合のための高スループットな方法を提供することは、本発明のさらなる目的である。
【発明の開示】
【００１７】
本発明の詳細  
本発明は、物理的および遺伝マーカーの統合のための、および物理的および遺伝的地図の統合のための方法に属する。本発明は、当該技術分野においてこれまでに遭遇した問題の多くを克服し、有意な改善および利点を提供し、これらは、本明細書、特許請求の範囲、および実施例を介して明白になるであろう。本方法は、AFLPに基づいており、より詳細には、AFLPにおける選択的プライマーの組み合わせの使用に基づいている。本方法により、遺伝的および物理的地図の統合、並びに物理的および遺伝マーカーの結びつけがなされる。本発明は、さらに、本発明の方法におけるAFLPプライマーの使用に、および一組の構造的に定義されたAFLPプライマーに属する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
発明の詳細な記載  
一つの側面において、本発明は、物理的および遺伝的地図の統合のための方法であって、制限酵素断片、好ましくはAFLP断片を遺伝マーカーと対応づけることと、関心対象のゲノム（の一部）のインサートを含むクローンのライブラリーを提供することと、クローンをプールにプールすることと、および高い選択性のAFLPプライマー対を使用してプールのフィンガープリントをとり、低い選択性のAFLPプライマー対を使用してライブラリーのクローンのフィンガープリントを個々にとることとによる方法に属する。遺伝マーカーに対応づけられた断片に対応する断片を含むプールを同定し、遺伝マーカーに対応づけられた断片に対応する断片を含む個々のクローンを同定して、結びつける。遺伝マーカーに対応づけられた断片を含む個々のクローンのフィンガープリント・パターンから、コンティグを作製する。コンティグを遺伝子地図上の遺伝マーカーに結びつけ、全ての遺伝マーカーについて該過程を繰り返すことにより、統合された物理的および遺伝的地図を提供する。
【００１９】
「高い／低い選択性のプライマー対」の概念は、本明細書に使用されるものとして、フィンガープリンティングのために使用されるAFLPプライマー中の選択的なヌクレオチドの数をいう。したがって、+0/+0プライマー対は、+0／+1プライマー対または+1／+0プライマー対よりも低い選択性である。同様に、+3／+4プライマー対は、+2／+2プライマー対などよりも高い選択性である。
【００２０】
一つの方法では、本発明は、遺伝的および物理的ゲノム地図を結びつけるための方法であって：
（a）好ましくは遺伝子地図の形態で個々の遺伝マーカーを提供することと；
（b）AFLPフィンガープリンティングによって同定される少なくとも１つのAFLP断片によって各々の遺伝マーカーを特徴づけることと；
（c）BACまたはYACなどの人工の染色体ライブラリーを提供することと；
（d）それぞれのプールがライブラリーからの多数の個々のクローンを含む多数のプールを作製することと；
（e）各々のプールについてAFLPフィンガープリントを作製することと；
（f）多数のプールから、少なくとも１つの遺伝マーカーに対応づけられたAFLP断片が個々のプールのフィンガープリントに存在する個々のプールを選択することと；
（g）（f）の下で同定されたプールから個々の人工染色体のAFLPフィンガープリントを作製することと；
（h）工程（g）の個々の人工染色体のフィンガープリントから、遺伝マーカーに対応づけられたAFLP断片がフィンガープリントに存在する個々の人工染色体（群）を選択することと；
（i）工程（h）で同定された個々の人工染色体のコンティグを作製することと；
（j）工程（i）で得られたコンティグを、遺伝子地図上の遺伝マーカーに結びつけることにより、物理的マーカーと遺伝マーカーとの間の連関を得ることと；
（k）全ての遺伝マーカーについて工程（g-j）を繰り返し、得られたコンティグをアラインメントさせることにより、統合された物理的および遺伝的地図を得ることと；
の工程を含み、
工程（b）および（f）で使用したフォワードおよびリバースAFLPプライマーは、それぞれプライマーの3'末端にそれぞれK、Lの選択的なヌクレオチドを含み、工程（d）で使用したフォワードおよびリバースAFLPプライマーは、前記プライマーの3'末端にそれぞれM、Nの選択的なヌクレオチドを含み、K、L、M、Nは、0〜10であって、K+L≧M+Nの整数である方法に属する。
【００２１】
本発明の方法は、柔軟である。柔軟性は、この点で、出発原料をいう。本発明の方法は、いずれの種の全ゲノムから開始してもよいだけでなく、ゲノムの一部またはゲノムもしくは染色体またはこれらの一部の選択された領域だけにも適用できる。
【００２２】
本方法は、個々の遺伝マーカーを使用することによって開始する。これらのマーカーは、遺伝子地図上で統合されていることが好ましいが、これは事前に必要とされない。本発明の方法は、同様に物理的マーカーを遺伝マーカーに結びつけるためにも非常に適しており、その後、物理的マーカーをアラインメントさせて物理地図を形成し、同時に遺伝子地図を提供する。遺伝子地図は、1つの単一の遺伝マーカーだけを含んでもよいが、好ましくは、地図は、2つ以上の遺伝マーカーを含む。各々の遺伝マーカーは、AFLP断片によって、またはAFLP断片の組み合わせによって特徴づけられる。第2の工程は、人工染色体のライブラリーの準備である。ライブラリーは、細菌人工染色体（BAC）ライブラリーであるか、または酵母人工染色体（YAC）に基づいたものであることができる。また、コスミド、PAC、TAC、またはMACに基づいたものなどのその他のライブラリーも可能である。好ましくは、BACライブラリーである。ライブラリーは、好ましくは高品位のものであり、好ましくは大きなインサートサイズのゲノムライブラリーである。これは、個々のBACが調査下のゲノムDNAの大きなインサートを含むことを意味する。好ましい大きなインサートのサイズは、種依存的である。この出願の全体を通じて人工染色体の例としてのBACについての参照がなされる。しかし、本発明は、これに限定されず、その他の人工染色体も本発明の主旨から逸脱することなく使用することができる点に留意されたい。好ましくは、ライブラリーは、少なくとも5、より好ましくは少なくとも7、最も好ましくは少なくとも8のゲノム相当物を含む。特に好ましいは、少なくとも10である。ライブラリーのゲノム相当物の数が多くなれば、生じるコンティグおよび統合された地図の信頼性も高くなる。
【００２３】
ライブラリー中の個々のクローンをプールして、多数の人工染色体またはクローンを含むプールを形成させる。プーリングは、多くの個々のクローンを1つの試料に単純に（たとえば、100クローンを10クローンの10プールに）組み合わせるだけであってもよいが、より精巧なプーリング・ストラテジーを使用してもよい。プール全体のクローンの分布は、好ましくはそれぞれのクローンがプールの少なくとも2つ以上に存在するようにする。プールは、当該技術分野において周知のプーリング・ストラテジーに基づいてなされる。当業者であれば、ゲノムサイズなどの因子に基づいて最適なプーリング・ストラテジーを選択することができる。生じるプーリング・ストラテジーは、状況に依存すると考えられ、これらの例は、3Dプーリング、6D-プーリング、または複合プーリング（complex pooling）などのN-次元のプレート・プーリングである。
【００２４】
各々のプールを、AFLPを使用して、好ましくは高選択性を有するプライマー対でフィンガープリントすることにより、限られた数のバンドまたは断片を含むフィンガープリントを作製する。好ましくは、プールのフィンガープリンティングに使用されるプライマー対は、工程（b）の遺伝マーカーのAFLP断片の特徴を同定するために使用したものと同じプライマー対である。高選択性を有するプライマー対は、低選択性を有するプライマーよりも選択的なヌクレオチド、例えば+3／+3プライマー対または+2／+3プライマー対を含む。
【００２５】
その後、プールのフィンガープリントを、遺伝マーカー（群）に対応づけられた関心対象の断片の有無についてスクリーニングする。所望の断片が存在することが見いだされたプールから、プール内の各々の個のクローンをAFLPを使用してフィンガープリントをとる。個々のクローンは、好ましくは低い選択性を有するプライマー対でフィンガープリントをとることにより、多数のバンドまたは断片を含むフィンガープリントを作製し、これを後で信頼できるコンティグの作製の助けにする。この方法による作製では、好ましくは同じ酵素およびアダプターの組み合わせを使用して、遺伝マーカーのAFLPフィンガープリント、プール、および個々のクローンを得る。好ましくは、プライマーだけが異なり、好ましくは選択的な塩基のみの数および／またはタイプが異なる。低い選択性を有するプライマー対は、例えば+0／+0プライマー対または+1／+0プライマー対である。
【００２６】
ここで、得られた個々のクローンのフィンガープリントを選択工程に供することにより、関心対象の遺伝マーカーに最も結びつけられる可能性が最も高い断片を選択する。これは、所望の断片を含む個々のクローンを、好ましくはインシリコで選択工程に供することによって達成される。
【００２７】
この選択工程では、個々のクローンのフィンガープリント・パターンが比較される。オーバーラップするインサートを有するクローンに由来するフィンガープリント・パターンを比較すると、それぞれのフィンガープリントは、場所、強度、タイプその他が同じ1つまたは複数のバンド／断片を含む（たとえば、図1を参照されたい、バンドは、#、＾$とマークしてある）。オーバーラップするインサートを有さないクローンに由来するフィンガープリント・パターンについては、1つまたは複数のバンドをこのように類似して発現する機会がかなり低い。フィンガープリント・パターンに基づいて、対応づけたクローンのインサートが重複する可能性が高いときは、インシリコでのアラインメントにより、コンティグが作製される。次いで、このコンティグを遺伝マーカーに結びつけて、遺伝マーカーを遺伝子地図上に配置することができる。種々の遺伝マーカーについてこれらの工程を繰り返すことにより、最終的に遺伝子地図上の全てのコンティグの位置を決め、物理的および遺伝的地図を統合させる。
【００２８】
低い選択性を有するプライマーを使用するクローンのフィンガープリンティングの利点は、多くの断片が増幅されるということである。従って、多数の物理的マーカーが同定される。典型的には、+0/+0では、+2／+3の増幅と比較して4〜5倍スコアされる（scorable）断片を生じ、従って4または5倍高い分解能のコンティグを生じる。このような方法で、高い分解能の物理地図が作製される。これは、コンティグの作製に有利であり、これにより、コンティグを作製する際に生じるであろう単集合の数が減少すると考えられる。
【００２９】
「コンティグ」の用語は、本明細書に使用されるものとして、重複するクローン化されたDNA断片から構築された連続的なDNAの配列をいい、以下のThe Encyclopedia of Molecular Biology (1994, Blackwell)に定義がなされている。
【００３０】
一般に、低および高い選択性のプライマーは、フォワードおよびリバースAFLPプライマーが、個々のクローンのフィンガープリンティングにおいて、およびプライマーの3'末端にそれぞれK、Lの選択的なヌクレオチドを含む遺伝マーカーに対応づけられたAFLP断片の同定において使用され、フォワードおよびリバースAFLPプライマーが、プライマーの3'末端にそれぞれM、Nの選択的なヌクレオチドを含むライブラリーからの個々のクローンのフィンガープリンティングに使用され、K、L、M、Nは、0〜10であって、K+L≧M+Nの整数であることで特徴付けられる。したがって、高い選択性のプライマーは、低い選択性のプライマーよりも多くの少なくとも１つの選択的なヌクレオチドを含む。
【００３１】
フィンガープリントのバンド・パターンおよび強度を比較することによってアラインメントを行い、重複するパターンを同定する。重複するパターンを含むクローンをこれに基づいてアラインメントさせることができる。低い選択性のプライマーでAFLPを使用することにより、クローンに存在する物理的マーカーが豊富になり、それ故、これらのアラインメントは、優れた精度で行うことができる。コンティグは、当該技術分野の既知のいずれの手段を使用しても作製することができる。クローンは、FPCなどのこれらの目的のために当該技術分野に周知のソフトウェアを使用してアラインメントすることができる（Soderlund C. , I. Longden, R. Mott, 1997, FPC: a system for building contigs from restriction fingerprinted clones. Comput. Applic. Biosci. 13: 523-535）。このソフトウェアは、10-5〜10-15の間、好ましくは10-6〜10-14の間、より好ましくは10-7〜10-13の間、特に10-8〜10-12の間、より好ましくは10-9〜10-11の間、最も好ましくは10-10のカットオフ・パラメータで本発明の方法に使用することができる。カットオフは、いずれか2つのクローン間でマッチする機会を最大にすることができる確立を表す閾値を表すパラメーターである。許容度は、2つの異なるクローンに由来する2つのバンドが異なるが、依然として同じバンドであるとみなすことができる最大の距離またはバンド幅の程度のパラメーターである。本発明において、許容度は、0（同一の）〜5（0.5塩基対の違い）で評価される。許容度は、可能な限り低い（すなわち、0）ことが好ましいが、実施の際には、3〜4の値（0.3〜0.4塩基対の違い）が許容され、1〜2が好ましい。
【００３２】
次いで、作製されたコンティグを遺伝子地図上の遺伝マーカーに結びつけて、全ての過程を遺伝子地図のその他の遺伝マーカーについて繰り返すことにより、物理地図と遺伝子地図を統合する。
【００３３】
本発明に従った方法は、当該技術分野において開示された方法以上の一定の利点を有する。利点のうちの1つは、低い選択性のプライマー対で個々のクローンをフィンガープリントすることにより、高い分解能を有する統合された地図を生じることである。低い選択性のプライマーでのAFLPの増幅工程により、高い選択性のプライマーでの同様のフィンガープリンティングと比較して、より多くのアダプターに結合された制限酵素断片の増幅を生じ、従ってクローンあたりにより多くの物理的マーカーを生じる。このクローンあたりの物理的マーカーの数の増大により、その後のコンティグの生成もより好品質になり、より多くのクローンを正しくアラインメントさせることができ、物理的および遺伝的地図の統合の改善を生じる。
【００３４】
もう一つの利点は、コンティグの生成の速度にある。本発明の方法では、コンティグが作製される遺伝マーカーのAFLP断片に対応づけられた比較的小さな個々のクローンのセットが選択される。小さなセットでは、より大きなセットを使用する時よりもコンティグの生成が有意に迅速であるという効果がある。遺伝子地図にコンティグを配置した後、配置されたコンティグをアラインメントさせ、遺伝子地図上の遺伝マーカーの位置でアラインメントを検査することによって、より信頼できる統合された地図が得られる。さらなる利点のうちの1つは、相対的な遺伝的距離（一般にセンチモルガンの距離）がここで物理的距離（basepairsにおいて）に変換されることと、たとえば遺伝マーカーの順序を逆転させることによって、またはマーカーの間の距離をより正確に決定することによって、遺伝子地図の修正または増強がもたらされるであろうことである。最も歴然とした利点のうちの1つは、それぞれの工程を確認することができ、訂正することができることである。これは、たとえばゲルでの増幅または検出では所望の品質でない場合に備えて、所望の品質のデータが得られるまで、この工程を直ちに修正することができることを意味する。
【００３５】
当該技術分野において既知の方法を超える本発明の方法の有意な利点は、本方法が非多形的マーカーを検出し、その後に統合された地図にこれらを統合することができることである。本発明の方法に関するもう一つの利点は、物理的マッピング・データの作製および遺伝子地図との結びつけが、（それぞれのマーカーについて別々に）本方法の始まりから直接達成されることである。
【００３６】
一つの態様において、本方法は、物理的および遺伝マーカーを結びつけ、または統合するために使用することもできる。次いで、本方法は：
（a）AFLPフィンガープリンティングによって同定された少なくとも１つのAFLP断片によって遺伝マーカーを特徴づけることと；
（b）BACまたはYACなどの人工染色体ライブラリーを提供することと；
（c）それぞれのプールがライブラリーからの多数の個々のクローンを含む多数のプールを作製することと；
（d）各々のプールについてAFLPフィンガープリントを作製することと；
（f）多数のプールから、遺伝マーカーに対応づけられたAFLP断片が個々プールのフィンガープリントに存在する個々のプールを選択することと；
（g）（f）の下で同定されたプールから個々の人工染色体のAFLPフィンガープリントを作製することと；
（h）工程（g）の個々の人工染色体のフィンガープリントから、遺伝マーカーに対応づけられたAFLP断片がフィンガープリントに存在する個々の人工染色体を選択することと；
（i）工程（h）で同定された個々の人工染色体のコンティグを作製することと；
（j）工程（i）で得られたコンティグを遺伝子地図上の遺伝マーカーに結びつけることにより、物理的マーカーと遺伝マーカーとの間の連関を得ることと；
の工程を含み、
工程（b）および（f）で使用したフォワードおよびリバースAFLPプライマーは、それぞれプライマーの3'末端にそれぞれK、Lの選択的なヌクレオチドを含み、工程（g）で使用したフォワードおよびリバースAFLPプライマーは、前記プライマーの3'末端にそれぞれM、Nの選択的なヌクレオチドを含み、K、L、M、Nは、0〜10であって、K+L≧M+Nの整数である。
【００３７】
この態様において、本発明は、物理的マーカー（の群）と遺伝マーカーを一つに統合するために使用される。全ての利用できる遺伝マーカーについてこれらの工程を繰り返すことにより、完全に統合された地図を構築することができるが、この態様では、これは完全に任意である。
【００３８】
1つの態様において、低い選択性を有するプライマーセットに使用されるヌクレオチドの数の相違は、また、高い選択性のプライマーセットと比較して、（K+L）−（M+N）として示すと、少なくとも1、好ましくは少なくとも2、より好ましくは、少なくとも3で、最も好ましくは少なくとも4である。一つの態様において、低い選択性のプライマーセットに使用される選択的なヌクレオチドの数は、また、M+Nで示すと、少なくとも0、好ましくは少なくとも1、より好ましくは少なくとも2、最も好ましくは少なくとも3である。
【００３９】
本発明の方法に使用される個々のクローンのプールは、好ましくは解析される総ゲノムのうち0.001〜1の間のゲノム相当物、好ましくは0.1〜0.75の間、より好ましくは、0.15〜0.60の間、最も好ましくは0.20〜0.50の間のゲノム相当物を含む。より好ましくは、0.25〜0.35の間、より好ましくは0.4、最も好ましくは0.3である。
【００４０】
一般に、個々のクローンのプールは、これを含むことができるクローンの数に制限される。例外的に大きなゲノム、ライブラリー、または非常に小さなインサートの場合には、これを都合よく導入して、さらなるプーリング工程がなされてもよい。従って、本発明の好ましい態様において、本方法は、さらなるプーリング工程を含む。さらなるプーリング工程により、最初のプーリング工程のプールのフィンガープリンティングのために使用されるものと同じ（高い）選択性を有するプライマーを使用して、フィンガープリントをとることができるプールを生じる。また、中間体選択性のプライマー、すなわちK+L≧P+Q≧M+NのようなK+LとM+Nの間の（P+Q）の多くの選択的なヌクレオチドを有するプライマーを使用することもできる。
【００４１】
別の態様において、低い選択性を有するプライマーを使用してフィンガープリントをとった全ての個々のクローンのコンティグを作製することによって、クローン全体のプールを使用するのを避けることができる。選択的に、個々のクローンの事前の選択は、遺伝マーカーに対応づけられた断片を少なくとも含むクローンでなされる。更に詳細には：低い選択性のプライマーを使用して得られた個々のフィンガープリントを、高い選択性を有するプライマーを使用して同定された遺伝マーカーに対応づけられた（断片）マーカーの存在についてスクリーニングする。この態様は、例えば、より小さなゲノムを調査するとき、またはほんの少数の遺伝マーカーだけを物理的マーカーと統合するときに有利である。このような場合、プーリング工程が現実に必要とされることはない。
【００４２】
AFLPによって利用できる全ての遺伝マーカーを特徴づけるための一つの態様において、異なる遺伝マーカーに対して異なるプライマーおよび／またはプライマー組み合わせを使用することが好ましい。従って、プールのフィンガープリンティングのためのプライマーおよび／またはプライマー組み合わせ、並びに個々のクローンを、次いで適応させることができる。さらに異なる遺伝マーカーに対して異なる酵素の組み合わせを使用することもできる。BACの対応づけられたコンティグは、BACコンティグの重なりおよび同一の物理的マーカーの存在に基づいてアラインメントさせることができる。これは、図3に図式的に示してある。
【００４３】
本発明の方法は、原則として、遺伝マーカーに1つまたは複数の物理的なマーカーを連関させるために、および多数の遺伝マーカーを含む遺伝子地図に物理的マーカーを連関させるために適している。遺伝マーカーは、地図全体に均一に広がっていることが好ましい。遺伝子地図は、当該技術分野において高いマーカー密度を有する遺伝子地図と考えられる地図であることがさらに好ましい。これにより、遺伝子地図に物理的マーカー（のコンティグ）を結びつけることが容易になり、生じる統合された物理的および遺伝的地図の品質および信頼性が高まる。好ましくは、遺伝子地図は、1000kbにつき、好ましくは500kbにつき、より好ましくは200kbにつき、最も好ましくは100kbにつき少なくとも1つの遺伝マーカーの（平均）密度、を有する。特に好ましくは、50kbにつき少なくとも1つの遺伝マーカーの密度を有する遺伝子地図である。
【００４４】
全ての遺伝マーカーがライブラリー中の個々のクローンに由来するコンティグに結びつけられたときに、地図上に配置されてなかったギャップが残ったままであっても、および／またはクローンが残ったままであってもよい。低い選択性のプライマーでの個々のクローンのフィンガープリンティングによって得られる物理的マーカーが密度の増大されることにより、従来の配列ソフトウェアを使用して、並びにBACウォーキングなどの技術を使用して、およびBAC末端配列（end sequence）を使用して、これらのクローンの配置を達成することができる。
【００４５】
もう一つの側面において、本発明は、遺伝的および物理的地図の統合のためのAFLPプライマーの使用に、並びに遺伝的および物理的ゲノム地図を結びつける際のAFLPおよびAFLPプライマーの使用に属する。AFLPおよびAFLPプライマーは、物理的および遺伝的地図の統合のための優れた技術を提供することが証明された。
【００４６】
さらなる側面において、本発明は、遺伝的および物理的ゲノム地図を結びつけるための方法における第1および第2のAFLPプライマー対の使用であって、前記第1のAFLPプライマー対は、前記プライマーの3'末端にそれぞれK、Lの選択的なヌクレオチドを含み、使用される前記第2のAFLPプライマー対は、前記プライマーの3'末端にそれぞれM、Nの選択的なヌクレオチドを含み、K、L、M、Nは、0〜10であって、K+L≧M+Nの整数である使用に属する。
【００４７】
物理的コンティグを遺伝マーカーに結びつけることによって、第1の統合された地図を得ることができる。これに基づいたさらなる遺伝子地図の改善、修正、および洗練は、遺伝マーカーに結びつけられた種々の物理的マーカーのコンティグを作製することによって可能となる。
【００４８】
本発明によれば、配列についての事前の知識を必要とすることなく、あらゆるゲノムの高分解能の統合された遺伝的および物理的地図を構築することができる。本発明によれば、さらに選択的に事前に選択されたあらゆるゲノムの領域の詳細な物理地図の効率的な構築が容易になる。本発明は、統合された遺伝子地図のための、新規のBAC派生マーカー（AFLP）多形性のおよび非多形性の両方の発見がさらに容易になる。
【実施例】
【００４９】
BACライブラリー構築  
BACライブラリーを構築するために、線虫Pristionchus pacificusの高分子量のDNAを使用した。特に、HindIII消化したPristiolichus pacificusのDNAをパルスフィールドゲル電気泳動によって分離し、pIndigoBAC-536ベクターにライゲーションした。ライゲーション産物をエレクトロコンピテントDH10B大腸菌細胞に電気穿孔し、平均インサートのサイズを電場逆転（field inversion）ゲル電気泳動で決定した。Pristionchus pacificus BACライブラリーは、13.500クローンを含み、全てが＞125kbの平均インサート・サイズ以上を有する。推定されるライブラリーのゲノム範囲は、少なくとも7xであると推定され、Pristionchus pacificusの200Mbの総ゲノムサイズと推定される。
【００５０】
BACライブラリーのプーリング  
BACライブラリーのプーリングは、個々の96穴プレートをプールすることによって行った。それぞれの96穴プレートには、クロラムフェニコール選択（12.5mg／ltr）を含む標準的なTY-アガープレート上に播種し、摂氏37度で一晩インキュベートした。朝に、96コロニーを1mlの液体TY培地に再懸濁して、アガープレートから収集した。標準的なミニプレップ法を行い、プールされたBAC DNAをAFLPテンプレート調製のために使用した。
【００５１】
個々のBACおよびBACプールのDNA調製物  
個々のBACからのDNAは、標準的方法に従って調製した（Sambrook, J. , Fritsch, E. F. , and Maniatis, T. , in Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, Vol. 1, 2, 3 (1989) .）。1.5mlのTY培地およびクロラムフェニコール（12.5mg／ltr）選択の一晩の培養により、AFLPテンプレート標品のために十分なDNAを生成した。
【００５２】
個々のBACおよびBACプールのAFLP解析  
個々のBAC DNAのAFLPテンプレート、BACプール、および遺伝的なマッピング集団に使用した2つのドナー親は、酵素の組み合わせとしてHindIIIおよびMseIを使用して、標準的方法（Vos et al. Nucleic Acids Research (1995) , 23, 4407-4414）に従って調製した。
【００５３】
個々のBAC断片の+0／+0増幅のためには、事前の増幅工程を必要としなかった。+0／+0増幅工程は、個々のBAC DNAの1：10希釈されたテンプレートに対して直接行った。増幅された+0／+0の断片は、MegaBACE1000キャピラリー電気泳動法プラットフォームで検出し、大きさを測定した。
【００５４】
BACプールに対するAFLP反応を、それぞれのプライマーに対して1つの選択的なヌクレオチドで事前に+1／+1増幅することによって行った。AFLP反応は、HindIIIプライマーに対して2つの選択的なヌクレオチドを、およびMseIプライマーに対して3つの選択的なヌクレオチドを有するプライマーの組み合わせで行った。
【００５５】
増幅された+2／+3AFLP断片を+0／+0フィンガープリントと同じMegaBACE1000キャピラリー電気泳動法プラットフォームで検出し、大きさを測定した。
【００５６】
AFLPアダプタープライマ（5'-3'）  
BACクローンのフィンガープリントを作製するために以下のプライマーを使用した。
【００５７】
91M35：HindIII-アダプタープライマー・フォワード（5'-3'）：CTCGTAGACTGCGTACC  
91M37：HindE-アダプタープライマー・リバース（5'-3'）：AGCTGGTACGCAGTCTAC  
92A18：MseI-アダプタープライマー・フォワード（5'-3'）：GACGATGAGTCCTGAG  
92A19：  MseI-アダプタープライマー・リバース（5'-3'）：TACTCAGGACTCAT  
非選択的なプライマー配列（5'-3'）  
93Q34：HindIII+0プライマー（5'-3'）：GACTGCGTACCAGCTT  
93E40：  MseI+0プライマー（5'-3'）：GATGAGTCCTGAGTAA  
AFLP選択的なプライマー配列（5'-3'）  
HindIII+2プライマーは、MegaBACEプラットフォームでの検出のためにFAM、JOE、またはNEDでラベルすることができる。  
HindIII+2プライマー（5'-3'）：  
一定の配列：GACTGCGTACCAGCTT選択的なヌクレオチド：
【表１】
0004690307.tif 000002
MseI+3プライマー（5'-3'）：  
一定の配列：GATGAGTCCTGAGTAA  
選択的なヌクレオチド：
【表２】
0004690307.tif 000003
ソフトウェア解析  
全てのMegaBACEトレースは、社内で開発したソフトウェアで解析し、生じるHindIII+0／MseI+0の個々のフィンガープリントのデータセットは、FPCソフトウェアによってプロセスした（Soderlund et al. vide supra）。プールされたBAC DNAおよび遺伝的マッピング集団のドナー親のHindIII+2IMseI+3 AFLPフィンガープリントも、社内のソフトウェアによって解析した。対応する個々のBAC断片のHindIII+0／MseI+0断片に対するHindII+2／MseI+3フィンガープリントの結びつけは、一定のエラー限度内で相当する長さの断片を検索することによってインシリコで行った。コンティグは、10-7〜10-14の間の種々の値にセットしたカットオフ・パラメーターで作製し、生じるコンティグを評価した。許容度は、2〜4にセットした。（すなわち、0.2〜0.4塩基対）。
【００５８】
結果および結論  
遺伝マーカーは、非常に効率的な方法でBACコンティグに結びつけられ、複数の遺伝マーカーが、統合された物理的および遺伝的地図に組み込まれた。本概念は、異なるゲノムサイズを有する種々の種に対して、特異的なゲノム配列についての事前の知識がなくてもうまく適用できる。本方法は、有効な物理的および遺伝的地図の統合を提供し、ゲノム領域に重要な影響を与えるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】物理的および遺伝的地図の統合の概略図を開示する。本方法は、AFLPフィンガープリンティングを使用して遺伝マーカーを同定することによって開始する。この場合、遺伝マーカーは、AFLPフィンガープリンティングでの制限酵素としてHindIIIおよびMseIを、並びにこれらの3'末端に選択的なヌクレオチドとしてATおよびCCAを有するHind+2およびMse+3に高い選択性のプライマーをそれぞれ使用して同定した。遺伝マーカーに対応づけられた、同定されたAFLP断片は、344bpの長さを有する。BACライブラリーは、Zクローンを含んで調製してある。個々のクローンをプールして（プールIは、クローン1、2、および3を含み；IIは、3、5、およびZを含み；並びにIIIは、1、4、および5を含む）、同一の酵素並びに遺伝マーカー（Hind+2（AT）およびMse+3（CCA））の同定に使用した物と同じ選択性を有するプライマーでのAFLPを使用してプールのフィンガープリントをとる。これにより、断片AT/CCA-344（プールIおよびE）を含むプールをポジティブに同定する。関心対象の断片を含むプール（プールIおよびW）に存在するそれぞれのクローン（1、2、3、4、5）から、低い選択性のプライマー、この場合+0／+0を使用してAFLPフィンガープリントを作製する。各々の個々のクローンのフィンガープリントをとり、344塩基対長を有するバンドを同定することができる（2、3、4、5）。これらのバンドは、また、それぞれの末端にAT/CCAの組み合わせ以外のヌクレオチドを含む何らかの断片を含むので、これは、関心対象の遺伝マーカーにあまりよく関連づけられないであろう。344断片を含む個々のフィンガープリントから、最も関心対象のAFLP断片に結びつけられそうなクローンを選択する。この選択工程は、フィンガープリント・パターンの1つまたは複数のバンドの比較に基づく。フィンガープリント中に、より対応するバンドが見いだされると（バンドは、#、$として示してある）、これらのフィンガープリントによりコンティグを形成することができ、したがって、ライブラリーに由来する個々のクローンをアラインメントさせてコンティグを形成する可能性が高くなる。344塩基対の長さを有する断片を含み、かつフィンガープリント・パターンのインシリコ過程に基づいて選択された個々のクローンを、FPCを使用してアラインメントさせてコンティグを形成させる。このコンティグを遺伝子地図上に配置することができる。偽陽性の断片（すなわち、断片AT/CCA-344を含むが、関心対象の遺伝マーカーに結びつけられないもの）は、使用した条件下でコンティグを形成しない。その他の遺伝マーカーについてもこれらの工程を繰り返すことにより、統合された物理的および遺伝的地図を形成することとなる。
【図２】A：矢印によって示した、事前に同定されたAFLP断片の遺伝マーカーの特徴を有するプリスチオンチュス・パシフィカス（Pristionchus pacificus）のBACプールのHindIII+2/MseI+3フィンガープリント。    B：図2Aの対応するポジティブなプールの個々のBACのHindIII+0/MseI+0フィンガープリントおよび特徴的なAFLPバンド（BAC1およびBAC2）の表示。    C：対応するHindIII+0／MseI+0 BACコンティグ並びにBAC1およびBAC2クローンの同定。
【図３】物理的および遺伝的地図の統合のための方法の概略図であって、これにより、異なる遺伝マーカーについての、物理的BACクローンとそれぞれの遺伝マーカーとの間の連関が、BACプールのフィンガープリンティングおよび異なる遺伝マーカーについてのAFLPフィンガープリンティングにおいて異なる制限酵素の組み合わせでの個々のフィンガープリントによって得られる。A、B、およびCは、遺伝マーカーである。RE1およびRE2は、異なる制限酵素の組み合わせ（たとえば、HindIII／MseIおよびEcoRI／MseI）である。1〜8は、BACクローンである。    遺伝マーカーAは、本発明の方法に従ってドナー親（donorparents）、BACプール、および個々のBACのAFLPフィンガープリンティングにおいて酵素の組み合わせRE1を使用して、物理的BACクローン1〜4に結びつけられている。遺伝マーカーOは、同じ酵素の組み合わせRE1を使用してBACクローン6、9、および10にマップされた。遺伝マーカー；TおよびCも同様に酵素の組み合わせRE2を用いてそれぞれBACクローン2、5、8、および1、6、7にマップされた。AおよびBおよびCのそれぞれにおいて、BACクローン1および2が共通して存在することに基づいて、遺伝マーカーBおよびCとは異なる酵素の組み合わせによって同定された遺伝マーカーAは、ここで、共通の統合された地図上に配置することができる。OおよびCのそれぞれにおいて、BACクローン6が共通して存在することに基づいて、遺伝マーカーTは、統合された地図上で遺伝マーカーCに隣接して位置することができ、これにより、異なるAFLP酵素の組み合わせを使用して同定された遺伝マーカーT、A、C、およびOの統合された地図を提供する。
【図１】
0004690307.tif 000004
【図２】
0004690307.tif 000005
【図３】
0004690307.tif 000006