(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロテアーゼ又は活性化後のその前駆体を決定する方法であって、サンプルを前記プロテアーゼのターゲットと共にインキュベーションすること、前記ターゲットのタンパク質分解的開裂を決定すること、及びそれから得られたデータを前記プロテアーゼを決定するために相関付けることを含み、前記ターゲットが前記プロテアーゼによって開裂可能である活性化部位を含む改変されたプロカスパーゼである、方法。
【請求項２】
前記改変されたプロカスパーゼのタンパク質分解的開裂がプロカスパーゼを活性化し、そして該生じた活性が前記活性化されたプロカスパーゼの適切な基質を使用して決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記サンプルが、生物学的液体、それの画分、生物学的組織、それの抽出物、そのような抽出物の画分、イン  ビトロ(in vitro)若しくはイン  ビボ(in vivo)で成長する細胞、組織又は有機体によってコンディションされた培養培地、そのような培養培地の抽出物、及びそのような培養培地の画分からなる群から選択される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記プロテアーゼが、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパルチルプロテアーゼ及びメタロプロテアーゼから成る群から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記プロテアーゼが、アグリカナーゼ(ADAM TS4)、ADAM TS1、TACE、BACE、BACE 1、BACE  2、HIVプロテアーゼ及びC型肝炎プロテアーゼから成る群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記改変されたプロカスパーゼが、プロカスパーゼの活性化部位を、決定されるべきプロテアーゼによって開裂可能である活性化部位によって置換することによって、プロカスパーゼから得られる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記改変されたプロカスパーゼが、プロカスパーゼの活性化部位を除去し、そして決定されるべきプロテアーゼによって開裂可能である活性化部位を挿入する（除去位置と同じ位置にであるとは限られない）ことによって、プロカスパーゼから得られる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記改変されたプロカスパーゼが、プロカスパーゼの活性化部位を変更し、それをその天然の基質に対して不活性にし、そして決定されるべきプロテアーゼによって開裂可能である活性化部位を挿入する（上記と同じ位置にであるとは限られない）ことによって、プロカスパーゼから得られる、請求項６又は７に記載の方法。
【請求項９】
前記改変されたプロカスパーゼが、プロカスパーゼ-1、プロカスパーゼ-3、プロカスパーゼ-7、プロカスパーゼ-8、プロカスパーゼ-9及びプロカスパーゼ-10から成る群から選択される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記改変されたプロカスパーゼが、プロカスパーゼ-3又はプロカスパーゼ-7であり、及びプロカスパーゼ-3又はプロカスパーゼ-7における前記改変が、配列GSDMELPLPRNITEGE^ARGSVILTVKPIFEEF、GSPLAQA^VRSSSRSG及びGSKTEEISEVNL^DAEFRHDSの群から選択された配列による、野生型プロカスパーゼ-3中のD175又は野生型プロカスパーゼ-7中のD198の置換である（ここで前記記号^は、生理学的ターゲット中の開裂部位を示す）、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記適切な基質が、アミノ酸配列AspGluValAsp-pNA(pNAはp-ニトロアニリドである)を含む化合物である、請求項２〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
改変されていないプロカスパーゼを開裂し且つ活性化するプロテアーゼと異なるプロテアーゼによって開裂可能であるところの認識部位をプロカスパーゼに備えることによって、プロカスパーゼから得られる改変されたプロカスパーゼ。
【請求項１３】
前記認識部位が、改変されていないプロカスパーゼを活性化するプロテアーゼと異なるプロテアーゼによって開裂可能な活性化部位であり、前記活性化部位が前記プロカスパーゼのオリジナルの活性化部位を置換する、請求項１２に記載の改変されたプロカスパーゼ。
【請求項１４】
プロカスパーゼ-3又はプロ-カスパーゼ-7から得られる、請求項１３に記載の改変されたプロカスパーゼ。
【請求項１５】
サンプル中のプロテアーゼ又は活性化後のその前駆体を決定するためのキットであって、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の改変されたプロカスパーゼを含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サンプル中のタンパク質分解酵素の活性を決定すること又は定量化することの分野にあり、そしてそれ故に使用されるべき基質並びにその為のアッセイ工程及びアッセイキット及び装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質分解酵素すなわちプロテアーゼは、タンパク質又はペプチド中のペプチド結合の加水分解を触媒する。これら酵素が、ウィルスからヒトに至るまで自然に広く生じ、そして多くの種々の機能を有する。それらは、有機体のレベルでの消化工程(消化管酵素、例えば、トリプシン、キモトリプシン及びペプシン)並びに個々の細胞のレベルでの消化工程(リソソーム酵素、例えばカテプシン)の両方に関係する。
【０００３】
それらは、微生物及び多細胞性有機体における細胞の両方の移動及び浸潤に役割を果たす。後者では、それらは成長及び展開(例えば、プラスミン、プラスミノーゲン活性化因子及びマトリックスメタロプロテアーゼ)に関係する。これら明らかな分解工程の他に、タンパク質分解酵素は、調節ネットワーク、例えば血液凝固、線維素溶解、血圧調節、及びプロホルモン並びに生長因子処理に重大な役割を果たす。つい最近、プロテアーゼが細胞内信号伝達及びプログラムされた細胞死(アポトーシス)に重大な役割を果たすことが見つけられた。これら(病態)生理学的機能とは別に、タンパク質分解酵素は、例えば医薬合成から食品（例えば、チーズ）の調製に亘るバイオテクノロジーにおいて並びに一般的及び特定的使用のための洗剤において大規模に、益々使用されている。プロテアーゼは、医薬品そら自身(例えば、血栓溶解剤としてのプラスミノーゲン活性化因子)として使用されることができ、又は薬のターゲット(例えば、HIVプロテアーゼ及びアンジオテンシン転化酵素)でありうる。
【０００４】
全てのタンパク質分解酵素は同じ基本反応を触媒する：
0004708326.tif 000002
すなわち、ペプチド結合は、穏やかな条件下、典型的にpH 5〜8の間及び温度25〜40℃の間で加水分解される。酵素なしでは、はるかに厳しい条件、例えば6 M塩酸中の煮沸が要求される。ペプチド結合の酵素的加水分解と非酵素的加水分解との間の相違は条件の問題だけでなく、酵素的工程が非酵素的加水分解よりもはるかに速いことができ、そして一般にはるかにより選択的である。
【０００５】
混合物内の１つの特定のタンパク質のみが加水分解され、及び時々１つのそのようなタンパク質内の１つの特定のペプチド結合のみが攻撃される例が知られている。効率性及び選択性におけるこの莫大な改善の背後の一般的なメカニズムは、触媒工程に直接的に関係する2〜3個のアミノ酸残基を典型的に含む活性部位、並びに基質又はペプチド結合認識に貢献し、従って酵素への特異性を与える追加的な、しばしばより拡張された基質認識部位を酵素が含むことである。
【０００６】
既知のタンパク質分解酵素はほとんどすべて、触媒機構及び触媒に含まれるアミノ酸残基に基づき４つの異なるクラスに分類されうる(表１)。
【０００７】
各クラス内で、異なる基質特異性及び特性を有する複数の酵素がある。多くのタンパク質分解酵素は、不活性なプロ酵素又はチモーゲン形態で合成される。活性化（不活性なプロ酵素形態の活性なタンパク質分解酵素への転化）は、殆どの場合それ自体タンパク質分解工程である。このようにして、血液凝固及びアポトーシスで生じるタンパク質分解カスケードのようなタンパク質分解カスケードに必須である正の又は負のフィードバック調節が生じうる。
【０００８】
多くの(病態)生理学的工程におけるそれらの関与により、タンパク質分解酵素は多くの疾病に役割を果たし、そして或るタンパク質分解酵素の活性の測定が診断、予後又は続く治療に重要でありうる(表２を参照)。様々な疾病における薬としてプロテアーゼ活性を妨げる化合物の使用が増加している(例えば、抗凝固剤、HIV薬剤)。
【０００９】
臨床的に重要なタンパク質分解酵素の活性測定が一般に使用される。特に、凝固及び線維素溶解カスケードに関係する多くのキー酵素について、アッセイが臨床的実務で日々使用される。
【００１０】
その天然の基質を使用してプロテアーゼの活性を測定することは、必ずしも可能でなく又は日常の用途に適切でない、手がこんでいる、複雑な若しくは非特異的なアッセイを結果する。ペプチド合成の開発は、タンパク質分解酵素のための基質として合成ペプチド(誘導体)の使用をもたらした。特に、多くのセリンプロテアーゼのために、発色性又は蛍光性ペプチド基質が開発されている。これら基質はしばしば商業的に入手可能であり、そして完全なアッセイキットの基礎を形成する。セリンプロテアーゼが、加水分解されるべき結合へのC-末端である配列を認識しない故に、これら酵素のためのそのような基質の開発は比較的容易である。このC末端部分は、p-ニトロのアニリン(pNA)、β-ナフチルアミン(βNA)、アミノメチルクマリン(AMC)又は7-アミノ-4-トリフルオロメチルクマリン(AFC)のような発色性又は蛍光性脱離基によって置換されうる。この原理に、多くの商業的に入手可能な基質及びアッセイキットが基づき、そしてこれら方法を含むアッセイが容易に自動化されうる。
【００１１】
多くの場合、これらペプチド基質で得られた特異性及び感度が、生物学的液体又は組織抽出物中のタンパク質分解酵素の生理学的に関連した濃度の検出及び定量化を可能にするのに十分である。時々、該感度は、プラスミノーゲン活性化因子(Drapier等、(1979年) Biochimie、第61巻、第463〜471頁)に記載されたように、2つの組み合わせられた反応を用いることによってさらに増加されうる。類似の方法がまた、システインプロテアーゼの活性の測定のために使用されうる。近年、多くのペプチド基質が、アポトーシスに関係するシステインプロテアーゼのカスパーゼファミリーのために開発されている。
【００１２】
メタロプロテアーゼ及びアスパラギン酸プロテアーゼの活性の測定は、より困難である。セリンプロテアーゼ及びシステインプロテアーゼと異なり、これら酵素は、開裂されるべき結合の両側のアミノ酸配列(P3-P2-P1^P1'-P2'-P3')(図１)を認識する。
【００１３】
従って、非ペプチド結合が開裂される基質、例えばセリンプロテアーゼ又はシステインプロテアーゼの決定のために使用される発色性又は蛍光性基質は、メタロプロテアーゼ又はアスパルチルプロテアーゼの決定のために用いられえない。
【００１４】
３個の異なるタイプの合成ペプチド基質が、これら酵素の測定のために使用されるために現在存在する：(1)プロテアーゼのための必要な認識配列のみを含むペプチド。この場合、加水分解に引き続き、HPLC又は質量分析のような物理化学的技術が行われる；(2)加水分解部位で等価な硫黄含有ペプチド結合を含むペプチド。チオレート基のその後の分離は、発色試薬によって監視される；(3)認識配列の他にまた、消光(quenching)基と一緒に潜在的な蛍光性基を含むペプチド。両方の基が極めて接近している場合、蛍光が消される。開裂可能なペプチド結合の加水分解後、蛍光基及びクエンチャーは分離され、そして蛍光が観察される。原理(1)に基づくアッセイは、一般に手がこんでいて、セットアップすることが困難であり、特殊な技能及び設備を要求し、自動化することが困難であり、及び動的な様式(kinetic fashion)で容易に実行されえない。原理(2)及び(3)に基づくアッセイは使用されているが、制限された感度及び特異性を有する。
【００１５】
数年前に、プロテアーゼ活性を検出するための新規な原理が開発された(欧州公開特許公報EP 691 409号を参照)。この原理では、プロ酵素の正常な活性化認識配列はそれが選択されたプロテアーゼによって開裂されうるように置換される又は適応される様な様式で、修飾されたプロ酵素が使用される。この配列の開裂は、慣用の基質を使用して検出されうる活性な酵素を生じる(図２)。この原理のための非常に適切なプロ酵素は、セリンプロテアーゼファミリーのプロ酵素及び特にプロウロキナーゼである。プロ酵素としてのプロウロキナーゼに基づき、多くのマトリックス−メタロプロテアーゼ(MMP)、グランザイムB、様々なカテプシンなどのためのアッセイが開発されている。２段階反応の関与の故に、ng/ml又はpg/mlレベルでさえも測定する非常に敏感なアッセイが開発されている。プロウロキナーゼに基づく基質の第１のセットは、活性化部位に対する４つのアミノ酸残基N末端を、ターゲットプロテアーゼにより認識しうる且つ開裂しうる４つの残基認識配列によって典型的に置換することによって得られた。このアプローチは、多くのプロテアーゼ、例えばMMP、グランザイムB及びカテプシンについて十分に働いた。
【００１６】
幾つかの酵素、例えばTNFα転化酵素  TACE(ADAM-17)及びアグリカナーゼ(ADAM TS4)について、このアプローチ(図３Ａ、４Ａ)は非常に非効率的な基質という結果であった。はるかによい基質が、より長い認識配列の導入によって得られることができた。天然のドメイン基質N末端からプロウロキナーゼ活性化部位への完全なドメインの導入(図３Ｂ、４Ｂ)は、はるかによりよいプロウロキナーゼ基質を生じた。このアプローチは、アグリカナーゼ(ADAM TS4)及びTNFα転化酵素  TACE(ADAM-17)のための比較的効率的な基質を生じた(図３Ｃ、４Ｃ)。
【００１７】
検出酵素としてのセリンプロテアーゼの使用は、或る有利点、例えば活性化された酵素の容易な検出、プロ酵素の安定性、及び特別な目的のために最適化を可能にする多くのありうる候補酵素の入手性を有する。1つの主な制限が発見され、開裂部位のC末端部分におけるアミノ酸配列は、自由に選択されることができないが、セリンプロテアーゼにしっかりとリンクされた構造的及び力学的制限に基づく制限を有する。これら制限の故に、多くの興味深いプロテアーゼのための効率的な基質の開発が達成困難であるとわかった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
本発明では、我々は、セリンプロテアーゼに典型的な制約によって制限されない且つ原則として任意のターゲットプロテアーゼのための基質の開発を可能にする改変（以下「変性」ともいう）されたプロ酵素技術の重要な改良を記載する。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明は、プロテアーゼ又は活性化後のその前駆体を決定する改善された方法であって、サンプルを前記プロテアーゼのターゲットと共にインキュベーションすること、前記ターゲットのタンパク質分解的開裂を決定すること、及びそれから得られたデータを該プロテアーゼを決定するために相関付けることを含み、前記ターゲットが前記プロテアーゼによって開裂可能である活性化部位を含む変性されたプロカスパーゼである前記方法を提供する。前記変性されたプロカスパーゼのタンパク質分解的開裂がプロカスパーゼを活性化し、そして該生じた活性が前記活性化されたプロカスパーゼの適切な基質を使用して決定される。
【００２０】
該サンプルは、生物学的液体、それの画分、生物学的組織、それの抽出物、前記抽出物の画分、イン  ビトロ(in vitro)若しくはイン  ビボ(in vivo)で成長する細胞、組織又は有機体によってコンディションされた培養培地、そのような培養培地の抽出物、及びそのような培養培地の画分から成る群から選択されうる。有機体及び／又は細胞は、任意の起源、例えばウィルス、細菌、カビ(酵母を含む)及び動物でありうる。本発明は、哺乳類（特にヒト）から得られるサンプル（例えば、体液又は細胞抽出物から）で非常によく適用可能である。
【００２１】
アッセイされるべきプロテアーゼは任意のプロテアーゼであることができるが、好ましくは、プロテアーゼは、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパルチルプロテアーゼ及びメタロプロテアーゼから成る群から選択され、そしてより好ましくは、それは、アグリカナーゼ(ADAM TS4)、ADAM TS1、TACE(ADAM-17)、BACE、BACE 1、BACE2、HIVプロテアーゼ及びC型肝炎プロテアーゼから成る群から選択される。測定することが恐らく興味深くありうるプロテアーゼの完全でない一覧が、表２で見つけられうる。
【００２２】
変性されたプロカスパーゼは、プロカスパーゼの活性化部位を、決定されるべきプロテアーゼによって開裂可能である活性化部位によって置換することによって、例えばプロカスパーゼの活性化部位を除去し、そして決定されるべきプロテアーゼによって開裂可能である活性化部位を挿入する（除去位置と同じ位置にであるとは限られない）ことによって、プロカスパーゼから得られうる。代替的に、変性されたプロカスパーゼが、プロカスパーゼの活性化部位を変更し、それをその天然の基質に対して不活性にし、そして決定されるべきプロテアーゼによって開裂可能である活性化部位を挿入する（上記と同じ位置にであるとは限られない）ことによって、プロカスパーゼから得られる。変性されたプロカスパーゼが、好ましくはプロカスパーゼ-1、プロカスパーゼ-3、プロカスパーゼ-7、プロカスパーゼ-8、プロカスパーゼ-9及びプロカスパーゼ-10から成る群から選択される。
【００２３】
特に有用である本発明の１つの実施態様は、前記変性されたプロカスパーゼが、プロカスパーゼ-3又はプロ-カスパーゼ-7であり、及びプロカスパーゼ-3又はプロカスパーゼ-7における前記変性が、アグリカンからのアグリカナーゼ認識配列(GSDMELPLPRNITEGE^ARGSVILTVKPIFEEF)、TNFαからのTACE認識配列(GSPLAQA^VRSSSRSG)又はβ-アミロイド前駆体タンパク質からのBACE認識配列(GSKTEEISEVNL^DAEFRHDS)に類似する配列の群から選択される配列による、野生型プロカスパーゼ-3中のD175又は野生型のプロカスパーゼ-7中のD198の置換である（ここで前記記号^は、生理学的ターゲット中の開裂部位を示す）ところの方法である。
【００２４】
カスパーゼ基質は、カスパーゼによって開裂可能であり且つ開裂後に容易に検出されうる部分をさらに有するところのアミノ酸配列を含む化合物である。そのような基質の例が表４にまとめられており、そして幾つかの既知のカスパーゼ基質の配列が表５に示される。好ましくは、アミノ酸配列AspGluValAsp-pNA（pNAはp-ニトロアニリドである）を含む化合物である。
【００２５】
本発明はまた、変性されたプロカスパーゼそれ自身、より詳細には、変性されていないプロカスパーゼを活性化するプロテアーゼと異なるプロテアーゼによって開裂可能である変性された活性化部位によって、プロカスパーゼの天然の活性化部位を置換すること若しくはプロカスパーゼの天然の活性化部位の領域におけるアミノ酸配列を置換することによって、又は代替的に、プロカスパーゼの天然の配列中にそのような変性された活性化部位を挿入することによってプロカスパーゼから得られる変性されたプロカスパーゼを提供する。
【００２６】
好ましくは、変性されたプロカスパーゼは、プロカスパーゼ-3又はプロカスパーゼ-7から得られる。
【００２７】
本発明は、サンプル中のプロテアーゼ又は活性化後のその前駆体を決定するためのキットであって、そのようなキットの通常の構成物、例えば、活性化されたプロカスパーゼのための基質、バッファ溶液、標準調製物、洗浄剤、特定の抗体、マイクロタイタープレート及び使用のための指示書と一緒に、本明細書で定義された変性されたプロカスパーゼを含むキットをさらに提供する。他の実施態様では、本発明は、サンプル中のプロテアーゼ又は活性化後のその前駆体を決定するための装置であって、本明細書で定義された変性されたプロカスパーゼを含む装置を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
図１  プロテアーゼによる基質認識の一般的概念概略図。；基質の転化の原因であるタンパク質分解酵素はアミノ酸残基s3、s2、s1、s1'、s2'及びs3'を含み、それは示された実施例においてアミノ酸残基P3、P2、P1、P1'、P2'及びP3'の認識に関係し、それは基質の開裂認識部位を形成する；プロテアーゼ作用は、残基p1とp1'の間のペプチド結合の開裂を生じる。
【００２９】
図２  プロテアーゼアッセイの原理の略図。決定されるべきプロテアーゼは、プロ酵素を活性な酵素に転化する。活性な酵素は次に、基質の検出可能な生成物への転化によって測定される。プロ酵素転化反応及び基質転化（検出）反応は、１回のインキュベーション工程で同時に実行されうる、又は２回の引き続くインキュベーションで実行されうる。
【００３０】
図３Ａ  TNFα転化酵素(TACE)のための短い認識及び活性化部位を有する変性されたプロウロキナーゼターゲット基質の構造。
図３Ｂ  TNFαの完全ドメインに基づく拡張されたTNFα転化酵素(TACE)認識及び開裂部位を有する変性されたプロウロキナーゼの構築及び構造。プロウロキナーゼからの残基5〜158が、プレプロTNFαからの残基57〜76によって置換された。
図３Ｃ  拡張されたTACE認識部位を有する変性されたプロウロキナーゼを使用するTACE検出のデモンストレーション。図３Ｂに記載されたおよそ0.6μg/mlの変性されたプロウロキナーゼを含む培養培地(100μl)が、抗ウロキナーゼ抗体でコーティングされたマイクロタイタープレート上で、2〜24時間、4〜37℃でインキュベーションされた。引き続き、該プレートは洗浄され、そして100μlの50 mM TrisHCl(pH 7.6)、1.5 mM NaCl、0.5 mM CaCl2、1μM ZnCl2及び示された、精製されたTACE中の0.8 mMのウロキナーゼ基質pyroGlu-Gly-Arg-pNAが添加された。吸光度が、37℃での様々なインキュベーション時間後に、405 nmで測定された。活性は、1000＊ΔA405を、インキュベーション時間（時間で）の二乗で割算して表された。
【００３１】
図４Ａ  アグリカナーゼ(ADAM TS4)のための短い認識部位を有する変性されたプロウロキナーゼの構造。
図４Ｂ  アグリカンの完全なIgDドメインに基づく拡張されたアグリカナーゼ(ADAM TS4)認識及び開裂部位を有する変性されたプロウロキナーゼの構築及び構造。プロウロキナーゼからの残基1〜158が、アグリカンからの残基350〜392によって置換された。
図４Ｃ  拡張されたアグリカナーゼ認識部位を有する変性されたプロウロキナーゼを使用する、アグリカナーゼの検出。図３Ｃに記載された反応条件、およそ3μg/ml(実線、黒棒)又は30μg/ml(点線、白棒)）の変性されたプロウロキナーゼのいずれかが使用された。アグリカナーゼ活性は、キレート剤  EDTA及び特定のメタロプロテアーゼ阻害剤  Batimastat (BB94) (Brown P. D.、1994年、Clinical trials of a low molecular weight matrix metalloproteinase inhibitor in cancer、Ann N Y Acad Sci.、第6巻；第732巻：第217〜21頁) によって阻害されえた。
【００３２】
図５  プロカスパーゼの構造の略図。プロカスパーゼは、プロドメイン、大サブユニット、リンカー及び小サブユニットから成る単一鎖ポリペプチドである。活性化を結果する重要な工程は二量体化であり、それはリンカー領域中の開裂によって開始されうる。プロドメインの開裂は、さほど必須でないと思われる。リンカー領域は、種々のプロカスパーゼ間でサイズにおいて色々であり、且つ長さにおいて１残基のように短くありうる。活性化を結果する開裂部位はそれ自身、カスパーゼによって開裂されうる。これは、活性化反応のカスケードを生じる。自動活性化が頻繁に生じる。該図は、Cohen, G. M.、 Biochem J.、(1997年) 第326巻、第1〜16頁からである。
【００３３】
図６  活性化配列への様々な配列C末端を有する変異体ウロキナーゼ調製物の活性。
【００３４】
図７Ａ  変性されたプロカスパーゼ-3分子の容易な構築及び発現のためのカセット発現ベクターの構築。
図７Ｂ  図７Ａのカセットベクター及び一組の特異的オリゴヌクレオチドリンカーを使用する、TACEのための認識／開裂部位を有する変性されたプロカスパーゼ-3のための発現ベクターの構造。
【００３５】
図８  細菌の、発現された、変性されたプロカスパーゼ-3のNiキレートカラムでの精製。
【００３６】
図９  細菌の抽出物並びにプロカスパーゼ-3及びプロカスパーゼ-7の変性されたバージョンの精製された画分のSDS PAGE。レーン１及びレーン１０は分子量マーカー(Rainbow marker、Amersham Biosciences)を含み、レーン２〜８はTACEによって認識可能な活性化配列を有する変性されたプロカスパーゼ-7をコードする発現プラスミド（以下、Qz7.2TACEと示される（実施例３を参照））で形質転換され、IPTG無し（レーン２、４、６）、有り（レーン３、５、７）で、90分（レーン２、３）、180分（レーン４、５）、及び270分（レーン６、７）で収穫された細菌からの抽出物である。レーン９は、Niキレートカラムでの精製後の、45分＋IPTGで、変性されていない野生株プロカスパーゼ-3を発現するQz3株の対照抽出物である。
【００３７】
図１０  ターゲットとしてアグリカナーゼ認識配列を有する変性されたプロカスパーゼ-3を使用するアグリカナーゼアッセイの時間及び濃度依存性。
【００３８】
図１１  ターゲットとしてTACE認識配列を有する変性されたプロカスパーゼ-3を使用するTACE活性アッセイの時間及び濃度依存性。
【００３９】
図１２  ターゲットとして変性されたプロカスパーゼ-3を使用するBACEアッセイの時間及び濃度依存性。
【００４０】
図１３  マイクロタイタープレートにコーティングされた特異的モノクロナール抗体にTACEを捕捉した後に、ターゲットとしてTACE認識配列を有する変性されたプロカスパーゼ-3を使用するTACE活性アッセイの時間及び濃度依存性。
【００４１】
本発明は、バイオテクノロジー的に又は(病態)生理学的に興味深い工程を含む触媒的に活性なプロテアーゼを決定するために使用されうる。「プロテアーゼを決定する」とは、定性的分析、すなわちプロテアーゼの存在、特にその活性を検出すること、及び定量的分析、すなわちサンプル中に存在するプロテアーゼ活性を定量化することの両方を意味する。
【００４２】
興味深いプロテアーゼの例が、表２に与えられている。この表は、確立された臨床的又はバイオテクノロジー的関連性を有するプロテアーゼ、並びに現在の知識に基づいた関連した(病態)生理学的工程に関係されうるプロテアーゼを含む。本発明は４つの既知のプロテアーゼファミリー全てのメンバー、すなわちセリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ及びアスパルチルプロテアーゼをアッセイするために適している方法を開示する。既存の技術とは対照的に、本発明は、任意のターゲット認識配列を有するプロテアーゼをアッセイするための方法を開示する。多くの場合、プロテアーゼは、触媒的に活性な形態において生物学的液体中に生じないが、不活性なチモーゲン又はプロ酵素形態で生じる。そのような場合、活性な形態への転化が、測定前に要求される。チモーゲンに依存して、活性なプロテアーゼへの転化は、制限されたタンパク質分解、或る化学物質を用いた処理又は熱若しくは例えばドデシル硫酸ナトリウムの適用による穏和な変性によって達成されうる。本発明に基づく方法は、非常に敏感且つ特異的であることができ、そして一般に入手可能な実験室設備を使用して、自動化に容易に適応されうる。本発明は、バイオテクノロジー、動物又はヒトの健康研究室及び病院、並びに臨床の研究所及び製薬の探索研究所において最も適用可能であるように見える。他の適用は、製薬の又は食品加工の産業における品質管理でありうる。
【００４３】
本発明は、アッセイされる必要のあるプロテアーゼのためのターゲット基質としてプロ酵素を使用し、それは１以上の特定のタンパク質分解的事象によって活性な酵素に転化されることができ、引き続き該活性な酵素の活性が従来技術で知られている標準の技術を使用して検出される(図２)。より特に、本発明はプロ酵素の選択に関する。多くのプロ酵素が、特定のプロテアーゼのためのアッセイの修正及び開発のための基礎として選択されうるが、ほとんどのプロ酵素は、変性されうる配列及びその結果測定されうるプロテアーゼにおけるある制限を有する。本発明では、我々が、これら制限を有しないプロ酵素の特定のグループに基づく改善された方法、従って、その基質選好性とは関係なく事実上任意のプロテアーゼのためのアッセイ開発を可能にする方法を記載する。
【００４４】
現在の方法論は、セリンプロテアーゼファミリーに属するプロ酵素にほとんど基づくが、このファミリーに確かに制限されない。セリンプロテアーゼファミリーの最も知られたプロテアーゼの活性化認識部位は、ある類似性を示す。活性化部位のN末端側での配列は非常に可変であるけれども、活性化部位のC末端側での配列は、セリンプロテアーゼファミリーに属する多くのプロ酵素において大きい程度の類似性を有する(表３)。荷電したアミノ酸残基は、位置P1'又はP2'で耐えられないように見える。その上、脂肪族のアミノ酸側鎖について非常に強い選好性が生じるように見える。なぜならば、ほぼ専らIle、Val、Leu又はAla残基が多くのセリンプロテアーゼにおいてこれら位置で生じるからである。位置P3'及びP4'でも、Glyのような小さく、荷電していないアミノ酸残基に対する非常に強い選好性を有する配列変化において厳しい制限が存在するように見える。配列における該制限は、プロ酵素のこのファミリーの活性化の機構に密接に結びつけられているように見える。
【００４５】
本発明は、変性されたプロカスパーゼがプロテアーゼのためのターゲット基質として使用するために理想的な候補であることを開示する。プロカスパーゼはアポトーシス（制御された細胞死）に関係するシステインプロテアーゼプロ酵素のファミリーである(図５)。カスパーゼは、一つの活性なカスパーゼが（他の）プロカスパーゼを活性することができて、細胞死を生じる細胞内の反応の鎖を生じるカスケードを形成する。その上、多くのカスパーゼは、それらプロ酵素形態の自触媒的活性化を示す。カスパーゼは、非常に特異的なプロテアーゼである。それらは、Glu又はAspのように幾つかの負に荷電されたアミノ酸残基を有する配列を認識し、そしてそのような配列のＣ末端を開裂する。カスパーゼファミリー内の典型的な認識配列が、表４にまとめられている。他のカスパーゼの基質配列とかなりの重なりがあるけれども、カスパーゼファミリーの各メンバーは、ある配列に対するある選好性を有する。多くのプロカスパーゼ（全部ではないとしても）の活性化配列が、１以上の活性なカスパーゼによってそれ自身開裂されうる配列である。アポトーシスにおけるそれらの関与の故に、例えば癌のような多くの疾病におそらく関与する工程、カスパーゼによって開裂可能な多くのペプチド基質、及び着色した又は蛍光性基の解放を生じることが開発されており、そして商業的に入手可能である(表５)。
【００４６】
本発明では、プロカスパーゼの通常の活性化領域における、アッセイされるべき必要のあるプロテアーゼのための新規な、自然に生じないターゲット開裂部位の導入が、選ばれたプロテアーゼによって開裂され且つ活性化されうる変性されたプロカスパーゼを生じることが開示される。したがって、そのような変性されたプロカスパーゼは、様々なプロテアーゼのためのアッセイを開発するために検出酵素としての使用に理想的に適している。新規な、自然に生じない開裂部位が、従来技術のセリンプロテアーゼについて見られるような制限なしに、長さ及び実際のアミノ酸配列をかなり変えるために選択されうることがまた示される。しかしながら、変性されたプロカスパーゼがなおその正常なタンパク質分解の活性を発揮することができる活性なカスパーゼへと活性化されうるようになお注意が取られるべきであることが提示された。該変性がカスパーゼの機能をそのままにしておくかどうかの決定は、当業者の技術内に十分ある。
【００４７】
本発明はまた、現在の方法論を用いてこれまでに検出可能でない又は大きな困難性若しくは低い効率性で検出しうるプロテアーゼを検出するために使用されうるところの変性されたプロテアーゼを開示する。好ましくは、プロカスパーゼの変性は、例えば他のカスパーゼファミリーメンバーによる通常の活性化反応又は自動活性化が妨げられるようなものである。正常な活性化配列の変更によって又は完全な除去によってでさえこれは達成されうる。選択されたプロテアーゼによって認識可能な且つ開裂可能な新規なターゲット活性化配列は、通常の活性化配列を置換しうるが、またプロカスパーゼ配列中の他のどこかに導入されうる。変性されたプロカスパーゼの開裂が活性なカスパーゼの形成をなお生じるように注意が取られるべきであるけれども、ターゲット配列の挿入のための部位は重要でない。重ねて、そのような活性が保持されるかどうかをチェックすること及び挿入部位を適合化することは、当業者の範囲内に十分ある。
【００４８】
活性化部位の近くでの変性とは別に、特別の用途のための活性化後に形成されたプロカスパーゼ又はカスパーゼの特性を改善することに向けられた他の２次的変性が含まれうる。有用な２次的変性は以下を含む：プロカスパーゼ又は活性化されたカスパーゼの(温度の)安定性を増加する、他の、非ターゲットプロテアーゼへの耐性を与える、自然に生じる又は合成の阻害剤への耐性を与える、或る抗体又はリガンドへの反応性を与える、活性化された形態の発現及び／又は精製を支援する、又は活性を増加する又はプロ形態の活性を減少する変更。一般に、しかしいつもではなく、そのような２次的変性は、カスパーゼの他の部分にあり、そして活性部分の近くにないだろう。１より多い新規な活性化部位を導入し、従って異なる基質特異性を有する様々なプロテアーゼのために使用されうるターゲット基質を生じることがまた可能である。
【００４９】
カスパーゼファミリーの多くのメンバーが、プロテアーゼのためのターゲットとして使用されるための変性のために潜在的に適している。カスパーゼ-3及びカスパーゼ-7は非常に安定であり且つ既存の方法論によって生成することが容易で或る故に、特にこれら２つのカスパーゼが非常に適している。また、プロカスパーゼ-3及び-7の活性化は、活性化領域におけるタンパク質分解的開裂に非常に依存するように見える。その上、これらカスパーゼのための非常に効率的な基質が存在する(表５)。カスパーゼ活性の検出のために、これら基質は、テストにおいて使用されるカスパーゼによって認識され且つ開裂されるアミノ酸配列を有するべきである(表４は、多くの既知の配列及び認識するカスパーゼを示す)。最も好ましくは、アミノ酸配列DEVD(asp-glu-val-asp)が使用される。その上、該開裂された基質は、検出のためのシグナルを与えなければならない。これは例えば、パラニトロアニリド、7-アミノ-4-トリフルオロメチルクマリン、アミノメチルクマリン、又は何らかの他の色、蛍光若しくは発光を生成する化合物を、カスパーゼによって認識されるペプチド配列のＣ末端に直接的にリンクすることによって達成されうる。次に、これら化合物は、カスパーゼ作用の結果として試験溶液中で遊離型となるだろう。そしてこれら化合物の存在は、例えば分光分析法、蛍光分析法又は発光分析法によって定量的に検出されうる。カスパーゼによる開裂後に定性的又は定量的シグナルを与える他の実施態様は、従来技術で知られており、且つ当業者によって本発明のアッセイに容易に備えられうる。そのような実施態様は、例えば、カスパーゼの活性な型を特異的に認識する抗体及びカスパーゼ作用を検出することの細胞のアッセイを使用しうる。
【００５０】
既知のプロカスパーゼ内にプロテアーゼのための新規な、望まれるターゲット特異性を与える新規なアミノ酸配列を導入するために、当業者に知られているいくつかの方法論が行われうる。特に、組み換えDNA技術が、魅力的な選択であるように見える。特定のプロカスパーゼをコードするcDNA配列が利用可能であるべきである。そのような配列は知られており、そして公に利用可能なデータベースから得られうる。そのようなcDNAは、既存の技術、例えば既知の配列の支援を用いて考案されたプライマーを使用して逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応によって、適切な細胞株又は組織から分離されたmRNAから得られうる。特定のcDNA配列を得るための多くの代替手順が、従来技術で知られている。コード配列は、タンパク質内に後の発現を改善するために、及び発現後に該生じるプロカスパーゼの活性化特異性を変更することを目的とする変更の後の導入を容易にするために適応されうる。また、適切なプロモーター及び他の調節配列が、従来技術で知られているように追加されなければならない。コード配列又は変更されたコード配列は、発現のための細胞システム内への導入を可能にするために、ベクター、例えばプラスミド又はウィルス内に導入される。発現は、真核の動物細胞若しくは酵母発現システムにおいて又は原核細菌発現システムにおいて一般に実行されうる。これらシステムは従来技術で知られており、そして多くの場合、商業的形態で入手可能である。発現工程後に、発現されたタンパク質を細胞から自由にするための又はそれを培養培地から分離するための手続が一般に要求される。たぶん、該発現されたタンパク質の更なる精製が要求されるだろう。これら工程のための多くの手続きが、従来技術で知られている。
【００５１】
プロカスパーゼの天然の、変性されていないコード配列を含む発現プラスミドが構築される場合、適切な変性が、部位特異的変異導入の既知の方法又はポリメラーゼ連鎖反応を含むより新規な方法のいずれかによって追加されうる。該発現されたタンパク質中の新規な活性化部位をコードする配列において異なる多くの異なるコード配列の構築を容易にするために、コード配列中に幾つかの追加の変異を導入し、制限部位間で合成のオリゴヌクレオチドの導入による容易且つ迅速な方法で活性化部位中に多くの種々の変性を導入するために使用されうるこれら新規な制限部位を導出することが便利かもしれない。これら追加の変異は、所謂サイレント変異（アミノ酸配列を変更しない）であるか、又はタンパク質配列を変更するがタンパク質機能に対する悪影響を有しない変更でありうる。新しく導入された制限部位及び引き続くオリゴ挿入を使用するこの手法の更なる有利点は、ポリメラーゼ連鎖反応に基づく方法中に生じうる２次的な望まれない変異に対するより低い機会である。同じようにして、プロカスパーゼの特性を改善するための更なる変性が導入されうる。そのような変性されたプロカスパーゼは、１又は多くの決定を実行するために全ての必要な材料を含むアッセイキットの一部であるうる。典型的に、そのようなキットは、変性されたプロカスパーゼ、カスパーゼ活性を検出するための適切な基質、測定されるべきプロテアーゼを定量するための適切な標準調製物、及びバッファ溶液を調製するための材料の十分な量を含む。その上、キットはまた、特定のプロテアーゼ、妨害プロテアーゼ又はプロテアーゼの特定の結合の活性の特異的クエンチングによるアッセイの特異性を増加するために、アッセイされるべきプロテアーゼを認識する特異的な抗体を含む。キットはまた、１以上のアッセイプレート（例えば、通常の96ウェル、384ウェル又は1536ウェルフォーマットで）を含んでよい。輸送及び保管中の安定性を増加させるために、変性されたプロカスパーゼへ安定剤を添加することは有利であるかもしれない。そのような安定剤は、アルブミン又はゼラチンのような他のタンパク質、マンニトールのような炭水化物、抗酸化剤、洗浄剤又は他の有機化学物質でありうる。その上、無機塩がまた、安定性に有益な効果を有しうる。最も便利なことに、変性されたプロカスパーゼは、凍結乾燥された形態で存在し、そして使用の直前にバッファ又は水を加えることによってもどされなければならない。加えて、いかにして決定を実行するか、サンプルを調製するか及び活性を計算するかの記載が含まれる。従来技術で知られているように特異性を増加させる他の可能性は、免疫捕捉手順を使用することである：第１に、測定されるべきプロテアーゼが、特異的な固定化された（モノ−又はポリクロナール）抗体を使用して捕捉され、引き続き該捕捉されたプロテアーゼの活性の測定が行われる。代替的に、キット又は装置は、乾燥形態で存在する全ての必要な試薬が材料のストリップ(strip)又はドット(dot)上で固定化されている「計深棒(dipstick)」型であってよい。以下の実施例は、本発明の単なる例であり、本発明の適用又は範囲を決して制限しない。
実施例
【実施例１】
【００５２】
検出酵素としてのセリンプロテアーゼのプロ酵素の制限
この実施例では、検出酵素としてセリンプロテアーゼファミリーのプロ酵素を使用することの制限が示される。セリンプロテアーゼファミリーのプロ酵素（例えば、プロウロキナーゼ）は、プロテアーゼの活性を測定するための検出酵素としてその使用のために多くの適切な特性を有する：セリンプロテアーゼの活性な型は、発色性又は蛍光性ペプチド基質で容易に測定される；プロ酵素と活性な酵素との間の活性における相違は一般に高い；酵素は一般に安定であり、そして非常に特異的でありうる。検出酵素としてセリンプロテアーゼファミリーメンバーを使用することの主な欠点は、活性化配列のC末端部分における配列制限である。活性化配列の開裂に起因する新しく形成されたN末端は、活性な酵素の生成に必須の役割を果たす。多くのセリンプロテアーゼファミリーメンバー(表２)からのこれら配列の比較は、この領域における強い相同性を明らかにし、機能への関与を示唆する。この領域における配列における柔軟性は、プロウロキナーゼについてより詳細に調査された。ヒトプロウロキナーゼをコードする完全cDNAは、真核細胞中のタンパク質の発現を可能にする発現ベクター内にクローニングされた(欧州公開特許公報EP 691 409)。プライマー 5'-ACC ATC GAt AAC CAG CCC TGG-3'及び 5'-CCG CCTcga gGT CTT TTG GCC-3'(変異は小文字で示される)を使用するポリメラーゼ連鎖反応を用いて、活性化部位をコードする領域に隣接して２つの新規な、ユニークな制限部位 ClaI及びXhoIが導入された。該生じたプラスミドベクターは、ClaI及びXhoIを有するプラスミドを切断し、そして要求される突然変異されたアミノ酸配列をコードする２つの部分的に相補的なオリゴヌクレオチドの挿入及びライゲーションによって、種々の活性化部位を有するプロウロキナーゼ分子をコードする様々なプロウロキナーゼコード配列を構築するために使用された。様々な発現プラスミドの構築のために使用されたオリグヌクレオチド対が、表６にまとめられる。新しく構築されたプラスミドはCHO細胞内にトランスフェクションされ、そして一時的にトランスフェクションされた細胞からの培地が集められた。コンディションされた培地におけるプロウロキナーゼ変異体の濃度が、分子のプロテアーゼドメインを認識するELISAによって決定され、従って全ての変異体について類似の応答を保証する。プロウロキナーゼ変異体は、プロウロキナーゼ及び活性なウロキナーゼの両者を認識し且つ後者の活性を阻害しない又はプロ酵素型の活性型への転化を妨害する抗体でコーティングされたプレートに免疫捕捉された。続いて、プロウロキナーゼ変異体はプラスミンで活性化され、そしてプレートの洗浄後に、該生じたウロキナーゼ活性が、バッファ及びpyro-Glu-Gly-Arg-pNA(S2444、商業的に入手可能なウロキナーゼ基質)の添加によって決定された。図６にまとめられた結果は、P1'位置におけるIle、Leu又はVal残基が必須であることを示す。P2'位置で、脂肪族残基についての強い優先性が存在するだけでなく他の残基が許容されるが、強く減少された活性を導く。P3'及びP4'でのGlyの存在が重要に見える。これら結果から、P1'-P4'配列における変化の可能性が非常に制限され、直接活性化方法を使用してP1'-P4'領域における上記された抑制と相容性のない認識配列を有するそれらプロテアーゼ���ための検出酵素としてプロウロキナーゼ及びセリンプロテアーゼファミリーの他のメンバーを使用することの不可能性を生じることが結論づけられうる。
【実施例２】
【００５３】
アグリカナーゼ又はTACE特異的な開裂部位を有する変性されたプロカスパーゼ-3の調製
Niキレートクロマトグラフィーを使用する迅速な精製を可能にするHis-tagをコードする配列及び大腸菌における発現を可能にする調節配列を有する発現ベクター内にクローニングされたカスパーゼ-3をコードするcDNAが、ATCCから得られた。このプラスミドは、活性化配列における変性を有する様々なカスパーゼ-3変異体をコードする類似のプラスミドの構築のための基礎として使用された。変異体の迅速な構築を可能にするために、２つの新規なサイレント制限部位がPCRによって導入された(図７Ａ)。BamHI及びEcoRIで消化後に、一つの新規なコード配列が、２つのオリゴヌクレオチドを使用して導入されうる。検出酵素としてのカスパーゼ-3の能力を試験するために、アグリカナーゼ(ADAM TS-4)及びTNFα転化酵素(TACE＼ADAM17)のための活性化配列をコードする２つの異なる配列夫々が、適切なオリゴヌクレオチドを使用して導入された(図７Ｂ及び表７)。アグリカナーゼ及びTACEのいずれも、プロウロキナーゼ誘導された基質を使用して測定できない又は非常に低い効率で測定できた。該生じたプラスミドは、大腸菌(B121 (DE3) pLys株)を形質転換するために使用された。培養物は、OD 0.45〜0.7に成長され、30℃に冷却され、そして1 mM IPTGで誘発された。30℃で振とう45分後に、細胞が遠心分離され(10分間、6000 rpm(約 5000 x g)、4℃で)、そして直接的に使用されるか又は-20℃で冷凍保存された。細菌のペレットは、溶菌バッファ(50 mM Tris HCl(pH 8.0)、300mM NaCl、10 mMイミダゾール)及びBugbuster（商標）(Novagen)と混合され、30分間撹拌しながら4℃でインキュベーションされ、そして6000 rpm(約5000 x g)で、10分間、4℃で遠心分離された。上清がニッケルセファロース（Amersham Biosciences)カラム（オリジナルの培養体積の30〜50 mlについて2 mlカラム体積）上にもたらされ、引き続き50 mlのTrisHCl (pH 8.0)、300 mM NaCl、20 mMイミダゾール（洗浄バッファ）の20カラム体積で洗浄され、そして溶出バッファ(50 mM TrisHCl (pH8.0)、300 mM NaCl、250 mMイミダゾール)で溶出された。ピーク画分が、10 mM TrisHCl (pH7.0)、1.5 mM NaCl、0.01 % (v/v) BRIJ 35バッファで平衡化されたPD-10カラム(Amersham Biosciences)を使用して脱塩された（図８）。
【実施例３】
【００５４】
変性されたプロカスパーゼ-7の調製
実施例２のプロカスパーゼ-3について記載されたと同じように、cDNA及びプロカスパーゼ-7の変異体をコードする発現ベクターが構築され、TACE及びアグリカナーゼのための活性化配列を有するプロカスパーゼ-7の変異体をコードする配列を含む。新規の活性化配列を導入するためのオリゴヌクレオチドは、プロカスパーゼ-3変異体のために使用されるのとまさに同じ物だった(表７を参照)。プロカスパーゼ-7変異体の形質転換、発現及び精製が、実施例２におけるプロカスパーゼ-3変異体について記載されたように実行された。
【実施例４】
【００５５】
変性されたプロカスパーゼの特徴付け
ゲル電気泳動は、全てのカスパーゼ変異体が単一鎖32 kD型で主にあったことを示した(図９)。カスパーゼ活性は次のように測定された：アグリカナーゼ又はTACE特異的開裂部位（実施例２及び表７を参照）を有する精製された、変性されたカスパーゼ-3又は-7の10μl (1〜100 ng)が、60μlのアッセイバッファ(50 mM TrisHCl (pH 7.6)、1.5 mM NaCl、0.5 mM CaCl2、1μM ZnCl2、0.01% (v/v) BRIJ 35)及び10 μlの精製されたアグリカナーゼ(ADAM TS-4)又はTACE (ADAM-17)と混合された。室温で一晩インキュベーション後、10 μlの100 mM DTT及び10 μlの8 mM DEVD-pNA(BioSource)が添加され、そして湿ったチャンバー内での、37℃で0〜6時間のインキュベーション後にA405が測定された。アッセイが、96ウェル平底ポリスチレンマイクロタイタープレートで実行され、そして吸光度測定が、Titertek Multiskan(商標)プレートリーダで実行された。汚染する活性型の少量の存在によって多分引き起こされるプロカスパーゼ-3及び-7変異体における低いバックグラウンド活性が検出された。様々なプロカスパーゼ変異体をそれら個々のターゲット酵素と共にインキュベーションすると、カスパーゼ活性の明らかな増加が観察された。
【実施例５】
【００５６】
変性されたプロカスパーゼを使用する、アグリカナーゼ活性の決定
アグリカナーゼを開裂可能な活性化配列を有するプロカスパーゼ-3又は-7を使用する、アグリカナーゼ活性の検出のためのプロトコル(実施例２及び表７を参照)。該検出は２段階で実行され、第１段階では、プロカスパーゼ変異体が、そのターゲット酵素と共にインキュベーションされ、そして第２段階では、活性なカスパーゼ変異体に転化されたプロカスパーゼ変異体の量が、カスパーゼ基質とのインキュベーションによって検出される。96ウェルマイクロタイタープレートのウェルが、プロカスパーゼ-3又は-7変異体の10μl (1〜100 ng)及び60 μlアッセイバッファ(50 mM TrisHCl、1.5 mM NaCl、0.5 mM CaCl2、1 μM ZnCl2 0.01% (v/v) BRIJ35)で満たされた。示されたアッセイバッファ中に希釈された10μlアグリカナーゼが添加された。37℃で一晩インキュベーション後、水中の100 mM DTTの10μl及び8 mM DEVD-pNA(BioSource)の10μｌが添加された。該プレートは、0〜6時間、湿ったチャンバー内において37℃でインキュベーションされ、そしてA405が、TitertekMultiskanプレートリーダを使用して、等間隔後に測定された。各酵素濃度について、吸光度変化がインキュベーション時間に対してプロットされた(図１０Ａ)。これらカーブの傾斜は、アグリカナーゼ濃度に対してプロットされた(図１０Ｂ)。
【実施例６】
【００５７】
変性されたプロカスパーゼを使用する、TNFα転化酵素活性の決定
アグリカナーゼについて記載された(実施例５)のと同様に、適切なプロカスパーゼ-3及び-7変異体が、実施例５に記載されたそれに類似のプロトコルを使用して、精製されたTACEと共にインキュベーションされた。結果が、図１１Ａ、Ｂに示される。
【実施例７】
【００５８】
変性されたプロカスパーゼを使用する、β-アミロイド転化酵素(BACE-1)の決定
アグリカナーゼ及びTACEについて記載されたのと同様に、β-アミロイド転化酵素(BACE-1)によって開裂可能な配列を含むプロカスパーゼ-3変異体が生成された(表７及び図７Ａ、Ｂを参照)。BACE-1特異的開裂を有する精製された、変性されたカスパーゼ-3の10μlが、300μlの10 mM酢酸ナトリウム(pH 5.1)、1.5 mM NaCl、0.01%(v/v) BRIJ35及び10μlのBACE-1酵素と混合された。室温で一晩活性化後に、10μlの100 mM DTT、10μlの8 mM DEVD-pNA(BioSource)及び30μlの100 mM Tris HCl (pH8.0)、1.5 mM NaCl、0.01% (v/v) BRIJ 35が添加され、そして、湿ったチャンバー内での、37℃でインキュベーションの0〜6時間後に等間隔でA405が測定された。アッセイが96ウェル平底ポリスチレンマイクロタイタープレートで実行され、そして吸光度測定がTitertek Multiskan(商標)プレートリーダで実行された。BACE-1活性の検出についての結果が、図１２Ａ、Ｂに示された。
【実施例８】
【００５９】
TACEのための免疫捕捉(immuno-capture)アッセイ
いくつかのプロテアーゼ又は用途について、免疫捕捉フォーマットを有することが役に立つ。そのようなフォーマットでは、検出されるべきプロテアーゼ（様々な妨害化合物、例えば塩類、他のプロテアーゼ、プロテアーゼ阻害剤などの存在下において低濃度で生物学的サンプル中に一般に存在する）は、例えばターゲットプロテアーゼを特異的に認識し且つ結合する抗体でコーティングされたマイクロタイタープレートを使用して、生物学的サンプルから特異的に除去される。ターゲットプロテアーゼのプレートへの結合後、妨害物質を含むサンプルが除去され、そして該プレートが必要であれば洗浄されることができ、そして精製された成分を有する明らかに定義された溶液が添加されうる。そのようなアプローチは幾つかの有利点を有し、そして重複する基質特異性を有する密接に関連付けられたプロテアーゼ、例えば、MMPファミリーのプロテアーゼの検出のために頻繁に使用される。
【００６０】
マイクロタイタープレート(Costar EIA/RIA 8ウェル平底)は、炭酸ナトリウムバッファ(pH 9.6)中で、4℃で一晩、10μg/mlのヤギ抗マウスIgG及び2μg/mlの、TACEを認識するマウスモノクロナール抗体の、ウェル当り100 μlでコーティングされる。0.01 Mのリン酸ナトリウム(pH 7.0)、0.15 M NaCl(0.05%(v/v))で４回洗浄後、該プレートは免疫捕捉プレートとして使用される。TACEを含むサンプルは、プレート内にピペットで移され、そして一晩、4℃でインキュベーションされる。捕捉後、該プレートは空にされ、そして洗浄され、引き続き10μl (1〜100 ng)のTACE開裂部位を有するプロカスパーゼ-3変異体（表７を参照）及び60μlのアッセイバッファで満たされ、そして2時間、37℃でインキュベーションされた。その後、DEVD-pNAが添加され、そして再び37℃でインキュエーションされ、吸光度が、0〜6時間のインキュベーション後に測定される。吸光度対インキュベーション時間のプロット及び吸光度対TACE濃度が、図１３Ａ、Ｂに示される。
【００６１】
【表１】
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【表２】
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【表３】
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【表４】
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【表５】
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【表６】
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【表７】
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該示されたオリゴヌクレオチド対がBamHl内にライゲーションされ、そしてEcoRlがプロカスパーゼ-3又はプロカスパーゼ-7発現ベクターを切断して、ADAM TS4、TACE及びBACEのための開裂／活性化部位を有するプロカスパーゼ変異体をコードする発現ベクターを得た。該タンパク質の認識配列がオリゴヌクレオチドの上に太字で示され、開裂部位が^で示される。図７をまた参照。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】プロテアーゼによる基質認識の一般的概念概略図である。
【図２】プロテアーゼアッセイの原理の略図である。
【図３Ａ】TNFα転化酵素(TACE)のための短い認識及び活性化部位を有する変性されたプロウロキナーゼターゲット基質の構造を示す。
【図３Ｂ】TNFαの完全ドメインに基づく拡張されたTNFα転化酵素(TACE)認識及び開裂部位を有する変性されたプロウロキナーゼの構築及び構造を示す。
【図３Ｃ】拡張されたTACE認識部位を有する変性されたプロウロキナーゼを使用するTACE検出のデモンストレーションを示す。
【図４Ａ】アグリカナーゼ(ADAM TS4)のための短い認識部位を有する変性されたプロウロキナーゼの構造を示す。
【図４Ｂ】アグリカンの完全なIgDドメインに基づく拡張されたアグリカナーゼ(ADAM TS4)認識及び開裂部位を有する変性されたプロウロキナーゼの構築及び構造を示す。
【図４Ｃ】拡張されたアグリカナーゼ認識部位を有する変性されたプロウロキナーゼを使用する、アグリカナーゼの検出を示す。
【図５】プロカスパーゼの構造の略図である。
【図６】活性化配列への様々な配列C末端を有する変異体ウロキナーゼ調製物の活性を示す。
【図７Ａ】変性されたプロカスパーゼ-3分子の容易な構築及び発現のためのカセット発現ベクターの構築を示す。
【図７Ｂ】図７Ａのカセットベクター及び一組の特異的オリゴヌクレオチドリンカーを使用する、TACEのための認識／開裂部位を有する変性されたプロカスパーゼ-3のための発現ベクターの構造を示す。
【図８】細菌の、発現された、変性されたプロカスパーゼ-3のNiキレートカラムでの精製。
【図９】細菌の抽出物の並びにプロカスパーゼ-3及びプロカスパーゼ-7の変性されたバージョンの精製された画分SDS PAGE。
【図１０】ターゲットとしてアグリカナーゼ認識配列を有する変性されたプロカスパーゼ-3を使用するアグリカナーゼアッセイの時間及び濃度依存性を示す。
【図１１】ターゲットとしてTACE認識配列を有する変性されたプロカスパーゼ-3を使用するTACE活性アッセイの時間及び濃度依存性を示す。
【図１２】ターゲットとして変性されたプロカスパーゼ-3を使用するBACEアッセイの時間及び濃度依存性を示す。
【図１３】マイクロタイタープレートにコーティングされた特異的モノクロナール抗体にTACEを捕捉した後に、ターゲットとしてTACE認識配列を有する変性されたプロカスパーゼ-3を使用するTACE活性アッセイの時間及び濃度依存性を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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