(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
リボ核タンパク質の組換え製造方法であって：（ａ）（ｉ）該リボ核タンパク質のリボ核酸成分をコードする配列番号３または４に記載のヌクレオチド配列を含む第１のDNAおよび（ii）該リボ核タンパク質の配列番号２のアミノ酸残基17-553を含むタンパク質成分をコードする第２のDNAを含有する大腸菌を調製する工程、（ｂ）リボ核タンパク質が生成される条件下でDNA（ｉ）および（ii）を発現させる工程、および（ｃ）該リボ核タンパク質を単離する工程、を含んでなる前記方法。
【請求項２】
配列番号１または２に記載のアミノ酸配列から成るタンパク質を含むリボ核タンパク質を発現させる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
リボ核タンパク質のリボ核酸成分をコードする配列番号３または４に記載のヌクレオチド配列を含む第１のDNAと該リボ核タンパク質の配列番号２のアミノ酸残基17-553を含むタンパク質成分をコードする第２のDNAとを含む核酸構築物。
【請求項４】
（ｉ）リボ核タンパク質のリボ核酸成分をコードする配列番号３または４に記載のヌクレオチド配列を含む第１のDNA、および（ii）該リボ核タンパク質の配列番号２のアミノ酸残基17-553を含むタンパク質成分をコードする第２のDNAを含有する組換え大腸菌。
【請求項５】
請求項１または２に記載の方法を使用して取得することができる組換えリボ核タンパク質。
【請求項６】
自己抗体特異的受容体を用いてサンプル中の自己抗体を検出する方法であって、受容体として請求項５に記載のリボ核タンパク質を使用する上記方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、原核細胞中でのリボ核タンパク質の組換え製造のための方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
自己免疫疾患SLE（全身性エリテマトーデス）の患者の血清中には、SSA60自己抗原などのリボ核タンパク質に対して特異的な抗体が出現することが多い。このSSA60抗原は各種の細胞型の細胞質中および核中に出現するRNA結合性分子である。SSA60抗原は、それぞれ約100塩基の長さで非常に類似した構造を有する、HY1、HY3、HY4またはHY5などのHY-RNAに結合することが多い。多くの真核生物中で検出されたHY-RNA分子は原核生物中には出現しない。
【０００３】
自己免疫疾患、特にSLEを診断するためには、リボ核タンパク質に対する抗体応答の分析が主要な対象となる。なぜならば、自己抗原に対して特異的な抗体の存在は、自己免疫疾患の存在を示し、および／または自己免疫疾患が将来発生する可能性の予後を可能にするからである。
【０００４】
SSA60抗原はよくSSA/Roとも称される。これはサイズが約60 kDのタンパク質である。SSA60抗原は、その配列およびその機能について、SSA52抗原と区別されるが、ある特定のin vivo条件下ではSSA52タンパク質はSSA60タンパク質と会合し得る。
【０００５】
SSA60のcDNAの配列はDeutscherら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,Vol.85(1988),9479-9483に公開されている。HY-RNA群はHendrickら、J.Mol.Biol.1(1981),1138-1149、ならびにWolinら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81(1984),1996-2000、に記載 されている。
【０００６】
以前から、例えばEIA（酵素イムノアッセイ）法を使用する診断法に対して、天然の精製SSA60抗原（例えば Immunovision製のウシ脾臓抗原）およびバキュロウイルス若しくは大腸菌由来の精製組換えSSA60抗原を、RNAを伴わないで使用してきた。これについては、関連する患者の血清すべての免疫学的認識のために、この抗原の三次元構造（折畳み）が最重要である。SSA60抗原のコンホメーションおよび再現性は製造方法に応じて以下のように様々である：
【０００７】
ａ）  SSA60自己抗体の感度については、未変性の(native)精製タンパク質（例えばImmunovision）が重要な標準である。この物質は生理学的（未変性の）コンホメーションを示す。しかし、この抗原を使用する場合、例えば疾患に関係しない天然の自己抗体を検出することによって、偽陽性の結果が発生するおそれがある。その上、精製度の再現性がイムノアフィニティーマトリックスの選択如何によって異なる。
【０００８】
ｂ）  大腸菌から得た組換えタンパク質は、基本的に、変性した、すなわち線状コンホメーションで存在する。なぜならば、大腸菌中ではタンパク質の翻訳後改変が発生しないからである。その結果、患者血清の内、一定の割合のものが検出されない。しかし、疾患に関係する自己抗体の検出は、天然抗原に比較して、より特異的である。この方法によって、良好な再現性および収量を得ることができる。この試験操作では、RNAと会合していない、大腸菌から得た単独の組換えSSA60抗原を使用する。この目的のため、SSA60のcDNAを例えばcDNAバンクから選び出し、クローン化し、上記のDeutscherらのSSA60配列にしたがって調製したプライマーを使用して配列決定する。C.H.A.Veldhofenら、J.Immunol.Methods 151(1992)177-189に、大腸菌中でクローン化して発現させた単独の組換えタンパク質を使用する 、SSA60（RO/SSA）に対する抗体の検出のための定量アッセイの開発について記載されている。しかし、別の試験でSSA60陽性と同定された血清のいくつかがRNAを含まないこうした抗原調製品では検出されないことがわかった。なぜならば、この抗原は変性形態で存在するからである（G.Boireら、Arthritis and Rheumatism,Vol.34 No.6(1991),722-730；B.William St.Clairら、Arthritis and Rheumatism,Vol.37 No.9(1994),1373-1379）。
【０００９】
ｃ）  バキュロウイルスから得た組換えタンパク質は疑似天然SSA60抗原とみなすことができる。なぜならば、この真核発現系においては、タンパク質の生合成中、折畳み（少なくとも必要なジスルフィド架橋）が正しく出現するからである。その免疫学的反応性は未変性の単離されたSSA60抗原に匹敵する。製造についての問題は収率が悪いことと細胞培養に費用がかかることである。良好な試験結果は達成されるが、このプロセスを使用する業務用の診断法のために自己抗原を大量に取得するのは非常に労働集約的であり、また細胞培養の操作に関係する問題がある。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、本発明の目的の１つは、実施が簡単で、診断操作において高い感度と試験の信頼性をもたらす形態のリボ核タンパク質を取得するために用いることができる方法を提供することである。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
この目的は、本発明によれば、リボ核タンパク質の組換え製造方法であって：（ａ）（ｉ）該リボ核タンパク質のリボ核酸成分をコードする少なくとも1種のDNAおよび（ii）該リボ核タンパク質のタンパク質成分をコードする少なくとも1種のDNAを含有する原核宿主細胞を調製する工程、
（ｂ）リボ核タンパク質が生成される条件下でDNA（ｉ）および（ii）を発現させる工程、および
（ｃ）該リボ核タンパク質を単離する工程、
を含んでなる方法によって達成される。
【００１２】
驚くべきことに、原核細胞中でリボ核酸およびタンパク質成分を同時に発現させることによって、リボ核タンパク質を、機能的な、例えば免疫学的に活性な形態で組換え調製することができることが発見された。これによって、簡単で費用対効果に優れたリボ核タンパク質の大量生産が可能になる。タンパク質およびリボ核酸成分は好ましくは会合した形態で取得される。リボ核タンパク質は、未変性の、したがって通常は可溶性の形態で調製することができる。リボ核酸成分を伴わない組換え製造タンパク質による試験では陰性であるSLE患者由来の血清が、本発明にしたがって調製されたリボ核タンパク質によって検出可能であることがわかった。
【００１３】
本発明の方法は、疾患に関連するSSA60自己抗体の検出用の良好な免疫学的反応性を有するSSA60抗原を製造するための、非常に再現性があって費用対効果に優れた方法である。
【００１４】
【発明の実施の形態】
リボ核タンパク質は原核細胞から、または／および細胞を培養するために使用した培地から単離することができる。好ましくはグラム陰性細胞、特に大腸菌が使用される。
【００１５】
リボ核酸成分をコードするDNAおよびタンパク質成分をコードするDNAを原核宿主細胞中の１個のDNA構築物上に導入することができる。しかし、各成分をコードするDNAを別々のDNA構築物上に導入することも可能である。本発明の方法を使用して、そのタンパク質成分および対応する核酸成分を宿主細胞中で都合よく発現させて、任意の所望のリボ核タンパク質を製造することができる。
【００１６】
好ましくは、真核生物、特に哺乳類、そして特に好ましくはヒトのリボ核タンパク質またはその誘導体が製造される。誘導体とは、例えば個々のまたは数個のアミノ酸若しくは核酸塩基の置換、欠失、挿入または／および付加によって、天然形態のものと比較してリボ核酸配列が改変され、および／またはタンパク質配列が改変されているが、会合してリボ核タンパク質を形成するというそれらの成分の能力は維持されているものである。
【００１７】
好ましい実施形態においては、SSA60リボ核タンパク質が発現される。ヒトSSA60抗原は525個（ａ型）および538個（ｂ型）のアミノ酸を有するタンパク質である（Deutscherら、上記参照）。同一の一次転写物を別様にスプライシングすると、この２つの異なる型のSSA60タンパク質が得られる。この２つのタンパク質はアミノ酸515以降が異なっているだけで、アミノ酸１〜514は一定である。本発明の方法を使用して、このアミノ酸１〜514の定常領域ならびに天然型に比較して改変された配列を有するが抗原エピトープ特性は保持しているSSA60タンパク質誘導体を含むSSA60タンパク質を発現させるのが好ましい。
【００１８】
リボ核酸成分は好ましくはHY-RNA、特にHY1、HY3、HY4および／またはHY5であり、最も好ましくはHY3である。これらのHY-RNA分子は非常に類似した二次構造を有する高度に保存された分子である。これらはポリメラーゼIIIによってin vivoで転写され、84〜112ヌクレオチドの間のサイズである。
【００１９】
細胞質RNA、特にヒトRNA、好ましくはHY-RNAは未変性のコンホメーションのSSA60抗原の発現について重要な寄与をする。SSA60抗原は生理学的にはSSB、SSA52およびHY-RNAと会合したリボ核タンパク質粒子（RNP）として存在する。
【００２０】
本発明の別の態様は、タンパク質成分をコードするDNAを含有する領域とリボ核酸成分をコードする領域とを含む核酸構築物に関する。これらのコード領域は好ましくはこれらの成分の原核細胞中での発現を可能にする配列と機能し得る形態で連結されている。構築物は好ましくはSSA60タンパク質またはその誘導体をコードするセグメントを含む領域を含有する。さらに好ましい実施形態においては、構築物はHY-RNAをコードする領域を含有する。SSA60をコ ードする領域およびHY3をコードする領域を含有する構築物が特に好ましい。こうした構築物が発現したとき、その抗原の所望の免疫学的反応性があるコンホメーションを有する、会合したリボ核タンパク質が形成される。リボ核酸成分およびタンパク質成分の発現を同時に誘導することによって、会合を促進することができる。これは、リボ核酸成分のための遺伝子およびタンパク質成分のための遺伝子を同一の調節性発現系、例えばlac発現系の制御下に置くことによって、達成することができる。
【００２１】
本発明のさらに別の態様は、（ｉ）リボ核タンパク質のリボ核酸成分をコードする少なくとも1種のDNA、および（ii）該リボ核タンパク質のタンパク質成分をコードする少なくとも1種のDNA、を含有する組換え原核細胞に関する。これらのコード領域は、細胞内で１個の構築物上に存在してもよく、またはいくつかの構築物上に別個に存在してもよい。コード領域は、染色体外、例えばプラスミド上に、または／および染色体中に配置させることができる。
【００２２】
本発明のさらに別の主題は、上記の方法によって取得することができる組換えリボ核タンパク質である。原核細胞中でのタンパク質およびリボ核酸の同時発現は、グリコシル化されていない、したがって真核宿主細胞中で形成されるリボ核タンパク質とは異なるリボ核タンパク質の形成をもたらす。この組換えリボ核タンパク質のタンパク質成分は好ましくは発現を改善し、または／および精製を助長する異種補助配列を含有する。これらの補助配列に、場合によってプロテアーゼ切断配列を含ませて、生成物を単離した後にこれらを除去できるようにすることもできる。補助配列の例は数個のHis残基を含む配列領域（Hisタグ）である。
【００２３】
本発明のさらに別の主題は、図１に示す配列 SSA60M56を有するSSA60タンパク質である。本発明にしたがうこのSSA60タンパク質は、6個のHis残基の外にタンパク質分解酵素、ウシエンテロキナーゼに対する切断配列DDDKを含有する補助 配列をN-末端に有する。
【００２４】
本発明はさらに、診断方法のための、原核生物から得た組換えリボ核タンパク質の使用に関する。天然の、および特に会合形態のリボ核タンパク質の形成によって、診断方法を改良するために使用することができる抗原を供給することが可能になる。自己免疫疾患、例えばSLEまたはシェーグレン症候群A型の診断のためには、特にHY3をともに含む組換えSSA60リボ核タンパク質またはその誘導体を使用するのが好ましい。
【００２５】
本発明のさらに別の目的は、アナライトに特異的な受容体を使用する、サンプル中のアナライトの検出方法であって、受容体として本明細書に記載するリボ核タンパク質を使用することを特徴とするものである。アナライトは好ましくはリボ核タンパク質に対する抗体、例えば自己免疫疾患において出現するものなどの自己抗体である。好適な試験操作は、
（ａ）リボ核タンパク質でコーティングした固相を調製する工程、
（ｂ）コーティングした固相をサンプルと接触させる工程、および
（ｃ）アナライトとコーティングした固相間の結合を検出する工程
を含む。
【００２６】
固相として特にビーズが使用されるが、その他の固相、例えば反応容器の表面またはバイオチップを使用することもできる。固相はリボ核タンパク質のみでコーティングしてもよく、あるいはこれに加えて別の分子、例えば組換えまたは／および天然抗原若しくは抗原混合物でコーティングしてもよい。固相上に吸着結合若しくは共有結合によってリボ核タンパク質を直接固定化するか、または特異的結合対、特にビオチン／ストレプトアビジンによって間接的に固定化することができる。この場合、固相を最初に特異的結合対の一方のパートナーでコーティングし、その後特異的結合対の第２のパートナーに結合したリボ核タンパク質をこの予備コーティングした固相に適用する。検出は通常の方法、例えば標識した抗体、特にマウス抗ヒトIgG POD（POD＝ペルオキシダーゼ）を使用して実施することができる。マーカー基として、特に電気化学発光標識、蛍光標識、酵素標識、例えばラテックス粒子若しくは金粒子などのゾル粒子および放射性標識を使用する。
【００２７】
【実施例】
実施例１
組換えHY3-SSA60抗原の製造
N-およびC-末端に改変を有し、ベクターによってコードされるアミノ酸をもたない天然のSSA60タンパク質のアミノ酸配列を有する組換えタンパク質の製造を可能にする改変型組換えSSA60タンパク質であって、N-末端のみに切断可能な標識を有する組換えSSA60抗原であるSSA60-M56と命名された抗原を使用した。
【００２８】
HY3は組換えSSA60タンパク質と会合するかまたは結合する短いRNAをコードする。SSA60のHY3との会合はこの抗原のコンホメーションエピトープを誘導し、これはHY3-RNAを含有しないSSA60タンパク質と比較して、異なる免疫学的挙動をもたらす。２つの自己免疫抗原SSBおよびSSA60は同一のRNA分子に結合するが、SSA52はおそらくSSA60タンパク質と直接会合すると思われる。
【００２９】
この場合に使用する組換えヒトSSA60タンパク質はクローン pQE30 HY3 SSA60M56中で翻訳されるｂ型である。これは総計553アミノ酸をコードする。このタンパク質のN-末端の最初の12アミノ酸は発現ベクターによってコードされている。この切断可能な標識は抗原の溶解性を増大させる一群の荷電アミノ酸を含有し、さらにNi NTAによるアフィニティー精製のための一群のHis6個を含有する。
【００３０】
図１に示す組換え抗原 SSA60 M4-C6およびSSA60 M56のアミノ酸配列の比較は 、組換えSSA60抗原のN-末端が MRGSHHHHHHGSMEES...（先に使用するクローンの配列）から MRGSHHHHHHGDDDDKEES...に改変されたことを示している。
【００３１】
プロテアーゼであるウシエンテロキナーゼの切断配列であるDDDK配列を、新しい配列 SSA60 M56中の6 Hisアミノ酸を含有する領域の後に挿入した。これによって、Ni NTAによる抗原の精製後に、MRGSHHHHHHGDDDDKペプチドを除去することが可能になる。この組換え抗原のC-末端は...IRNFTLDMIVD**（先に使用するクローン）から...IRNFTLDMI**に改変された。アスタリスクはタンパク質の末端の反復翻訳停止シグナルの印である。配列....DMIは天然および組換え抗原のC-末端を表す。
【００３２】
HY3は101塩基を有する小さなRNAで、確定された二次構造を有する。SSA60はこの一定の構造の塩基に結合する。ここで使用する配列は先行文献（Wolinら、PNAS USA 81(1984),1996-2000）で発表されたHY3の構造と比較して、RNA（図２参照）のループ2において異なっている。
【００３３】
組換えSSA60タンパク質およびHY3-RNA遺伝子のDNA配列を図３に示す。クローン中の特徴的な制限部位を示す。このため、クローン pQE30 HY3 SSA60 M56のプラスミドDNAの例えばXhoI、BgIIIおよびSacIによる制限切断の結果、187 bp、698 bp、1038 bpおよびベクター（＝3400 bp）の4個のDNA断片が生じる。
【００３４】
実施例２
発現ベクターの構築
3462 bpの小さなプラスミドである発現ベクター pQE30を使用した（Qiagenから入手可能）。この発現ベクターは大腸菌中でのタンパク質の発現のために特別に設計されたものである。このベクターはいくつかのクローニング部位（中でもBamHIおよびHindIII）の前に１個の調節性プロモーター／オペレーターエレメントおよび１個の強力なリボソーム結合部位を含有している。それらは一群の6Hisの下流に存在する。このプロモーター／オペレーターエレメントの制御下にある遺伝子の発現は、所与の細胞密度において、リプレッサーを不活性化しプロモーターを解放するIPTGの添加によって、誘導される。
【００３５】
組換えプラスミド pQE30 HY3 SSA60 M56、クローン4は、大腸菌中で組換えヒト SSA60タンパク質およびHY3-RNAの細胞内共発現をもたらす。これらの成分が一緒になってコンホメーションエピトープを有する複合体を形成する。6HiSを含有するタグによって、金属キレートアフィニティークロマトグラフィーによる抗原の精製が可能になる。複合体のコンホメーションエピトープを維持するために、非変性精製条件が必要である。
【００３６】
発現ベクター pDS56 RBSIIと共存できる、pREP4と称される別のプラスミドによってlacリプレッサーがコードされている。プラスミド pREP4（Qiagen製）はカナマイシン耐性因子を保有するが、一方発現ベクターは抗生物質のアンピシリンに耐性である。
【００３７】
２つの抗生物質、アンピシリンおよびカナマイシンの存在下で培養することによって、pREP4を含む所望のクローン pQE30 HY3 SSA60 M56、クローン4を選別する。
【００３８】
クローン pQE30 HY3 SSA60 M56を製造するため、まず、プライマー HY3FおよびHY3Rを使用し、PCR（ポリメラーゼ連鎖反応）によって、in vitroでHY3-RNAを合成した。これらのプライマーの配列は以下の通りである：
【００３９】
プライマー HY3-SynF：
0004838412.tif 000002
【００４０】
プライマー HY3-SynR：
0004838412.tif 000003
【００４１】
10×Taqバッファー（Pharmacia）10μl、dNTP（1 mM dATP、dCTP、dGTP、dTTP）8μl、プライマー HY3-SynFおよびHY3-SynR（それぞれ 50 pmol/μl）をそれぞれ3μl、H２O 62μlならびにミネラルオイル（Sigma,M-3516）1滴を含有する 100μl PCR反応混合物を5つ調製した。ホットスタートは、10μl（1×Taqバッファー中Pharmacia Taq 5単位およびPfu[Stratagene] 2.5単位）を第１サイクルの60℃にて加えて開始した。以下のプログラムを使用して、Perkin Elmer Cycler 9600中で、DNA増幅を実施した：
【００４２】
１．サイクル 1
- 98℃、30秒
- 60℃、2分
- 72℃、30秒
２．サイクル 2〜6
- 95℃、30秒
- 65℃、20秒
- 72℃、30秒
【００４３】
PCR断片を回収し、制限酵素 XhoIおよびKpnIで切断し、アガロースゲルによって精製し、Bluescript II KSベクター中にクローン化し、これによって、転写研究用に遺伝子HY3を T7ポリメラーゼプロモーターの制御下に置いた。このようにして、クローン pBSII-HY3RNA3-1を生成した。
【００４４】
１個の点突然変異を除いて、遺伝子HY3の予想通りの配列が得られた。これを図２に示す。in vitroで転写したHY3-RNAを使用して、SSA60抗原を復元させ、その結果この抗原の陽性免疫学的反応性が増大した。
【００４５】
天然の配列と比較して余分なアミノ酸を含まない組換えSSA60抗原の合成を可能にするため、SSA60およびHY3の共発現のために使用したSSA60クローン中のベクターにコードされたアミノ酸を除去した。このために、組換えSSA60抗原のN-末端を MRGSHHHHHHGDDDDKEES...に改変した（クローン SSA60-M56）。この場合、SSA60タンパク質はこの配列の最後の3アミノ酸、すなわち EES...から開始し、但し残りのアミノ酸はベクターによってコードされているものである。この配列の改変は、図３に示す SSA60-M56配列の塩基対 506-758に相当する 260 bp断片のPCR反応によって取得した。２つのプライマー、SSA60 M6-NFおよび SSA60 M6-NRevは以下の配列である：
【００４６】
１．SSA60 M6-NF
0004838412.tif 000004
【００４７】
２．SSA60 M6-NRev
0004838412.tif 000005
【００４８】
増幅した260 bpのDNAを切断し、クローン SSA60-M4-C6のEcoRI/HindIII断片と置換した。この新しいクローンの配列を図３に示す。
【００４９】
この組換え抗原のC-末端を...IRNFTLDMIVD**（クローン SSA60 M4-C6）から...IRNFTLDMI**（クローン SSA60 M56）に改変した。この配列の改変は、図３に示す SSA60-M56配列の塩基対 506-758を含む 260 bp断片のPCR反応によって取得した。２つのプライマー、SSA60 M5-CFおよび SSA60 M5-CRevは以下の配列である：
【００５０】
１．SSA60 M5-CF
0004838412.tif 000006
【００５１】
２．SSA60 M5-CRev
0004838412.tif 000007
【００５２】
増幅された1200 bpのDNAを制限酵素 SacIおよびXbaIで切断し、精製した断片をSSA60M4-C6中に挿入して先の断片 SacI-XbaIと置換した（この断片の部位は図３中、塩基対2155のSacIの下流として示される；XbaIはベクター pQE中に位置するので、示していない）。
【００５３】
これらの改変によって得たクローンを pQE30-SSA60-M56#6と命名した。SSA60とM56SSA60M4-CIを区別するため、SSA60抗原の末端のSalI制限部位を除去した。
【００５４】
大腸菌中でHY3およびSSA60を共発現するクローンを合成して、pQE30-HY3-SSA60M56#4と命名した。この目的のため、HY3をクローン pQE30 SSA60M56#6中のSSA60遺伝子の前にクローン化し、遺伝子HY3をSSA60遺伝子のものと同一のプロモーターおよびオペレーターの制御下に置いた。
【００５５】
HY3遺伝子をpQE30のXhoI部位に挿入するため、上記のようにプライマー HYFPQEおよびHYRPQEを使用するPCR改変によって、その配列を改変して調製した。これら２つのプライマーの配列は以下の通りである：
【００５６】
HYFPQE
0004838412.tif 000008
【００５７】
HYRPQE
0004838412.tif 000009
【００５８】
この反応産物を制限酵素XhoIで切断し、クローン pQE30 SSA60 M56 #6のXhoI部位にクローン化し、新しいクローン pQE30-HY3-SSA60M56#4を生成させた。この新しいクローンのDNAおよびタンパク質配列を図３に示す。
【００５９】
実施例３
pQE30-HY3-SSA60M56、クローン4の発現
組換えリボ核タンパク質複合体 HY3-SSA60を過剰発現させるために使用した大腸菌株は XL1 Blueと称される大腸菌 C誘導体（Stratagene）である。組換えHY3-SSA60複合体の過剰発現のため、pREP4を含有するXL1中に pQE30-HY3-SSA60M56#4を含むものの培養物を、アンピシリンおよびカナマイシンを含有する選択TB培地中、28℃で培養する。最大細胞密度の約25％で、1mM IPTGによって組換えタンパク質の転写および翻訳を誘導し、洗浄を28℃で3〜5時間継続する。組換えタンパク質を含有する細菌ペレットを遠心分離によって回収し、この過剰発現された組換え抗原の精製を行うまで、細胞ペレットは凍結保存する。
【００６０】
免疫学的反応性物質の発現の最適化では、特に1.)低温での培養、および2.)変性させない精製プロトコル、の組合せが満足な結果を与えることが示された。
【００６１】
HY3-SSA60抗原の過剰発現をモニターするため、誘導された細菌のタンパク質アリコートをSDSポリアクリルアミドゲル上での電気泳動後に染色した。組換えHY3-SSA60抗原は、予備染色したSeablueマーカー（Novex # LC 5625）と対比させて75 kDの位置に、主要なタンパク質バンドとして移動する。
【００６２】
実施例４
共発現したHY3-RNA-SSA60構築物の未変性精製
１mM PMSF（2-プロパノール中の 0.2 M PMSFから調製）、アプロチニン（水中 10mg/ml）を1gバイオマス当り10μg、ロイペプチン（水中 １mg/ml）を1gバイオマス当り15μg、ペプスタチン（メタノール中 １mg/ml）を1gバイオマス当り15μg、およびリゾチーム（溶菌バッファー中 10mg/ml）を1gバイオマス当り100μl、の混合物を抽出バッファーとして使用した。バイオマス１g／5mlバッファー（10mM Tris、pH 7.0、500mM NaCl、10％グリセロールおよび 0.2% Tween 20を含む）の抽出比率になるように、室温でバッファーを添加した。抽出のため、懸濁液を氷水中、5秒間隔で10分間、超音波処理した。これを4℃、10,000 gで10分間遠心分離した。所望のリボ核タンパク質 HY3-RNA-SSA60は上清に溶液として存在する。上清をSDS-PAGEおよびウエスタンブロットで処理した。その後、10mM TRIS、pH 7.0、500mM NaCl、10％グリセロールおよび 0.2％Tween 20を含むカラム操作用バッファーを使用し、未変性操作条件下で、陽性上清のニッケル精製を実施した。5mM、10mM、20mM、50mMおよび 100mMイミダゾールを含むカラムバッファーで溶離を実施した。溶離画分をSDS-PAGEおよびウエスタンブロットによって分析し、所望のリボ核タンパク質を含有する画分を回収した。
【００６３】
実施例５
診断方法におけるHY3-RNA-SSA60リボ核タンパク質の使用
SSA60の比較実験のために使用したCobas Core 抗SSA60 EIA試験フォーマットを図５に示す。これはコーティングのためにSSA60抗原を使用した以外は、Cobas Core HEp2 ANA EIA（コンビ(combi)試験、図４参照）に関する試験フォーマットと同等である。
【００６４】
１）コーティング
2 mM EDTAおよび0.15 M NaClを含有するリン酸塩バッファー（PBS）中で、室温（RT）で14〜16時間、ガンマ線放射したポリスチレンビーズ（NUNC,Denmark)とともに、SSA60抗原を飽和（最大のSSA60結合容量）までインキュベートした。
【００６５】
ビーズをPBSで3回洗浄した後、2％ BSA／PBS溶液に移し、ふさがれていない結合部位を飽和させた（室温(RT)で2〜3時間）。次にこのSSA60ビーズをRTで2時間、減圧下で乾燥し、特製の乾燥容器（Cobas Core）に移し、使用時まで4℃で保存した。
【００６６】
2）試験操作（Cobas Coreによって自動的に実施するEIA）
血清サンプル 10μl＋希釈剤 250μl＋SSA60ビーズを37℃で15分間インキュベートする。その後、これらを脱イオン水で3回洗浄し、マウス抗ヒトIgGペルオキシダーゼ 250μlとともに37℃で15分間インキュベートする。再び脱イオン水で3回洗浄した後、これらをペルオキシダーゼ基質 TMBとともに37℃で15分間インキュベートする。650 nmでのODを測定することによって、評価を実施した。OD 650の発色シグナルは血清中の特異的抗体濃度に比例する。
【００６７】
3）血清
試験した血清は、一部は市販起源（血清A：BM69660、血清B：BM6020、血清C：BM 7529、血清D：BM69440、血清E：M48/4713）であり、そして一部は臨床起源（血清F：SS12）である。後者はシェーグレン症候群の患者からの非常に希少な血清である。SSA60抗体の反応性を各種の市販の試験（ELISA）で試験した。市販の試験には天然または組換えのいずれかのSSA60抗原を含有させた。コーティングしたImmunovision製の天然のSSA60抗原によって、すべての陽性血清を陽性として検出することができたが、コーティングした大腸菌由来の精製SSA60タンパク質（変性したもの）では、これらのサンプルのいくつかが陰性試験結果を与えた。変性したSSA60の代わりに未変性精製したHY3-RNA-SSA60の使用によって、後者のサンプルは陰性から陽性に転じた。
【００６８】
したがって、この試験において、HY3-RNA-SSA60抗原の所望の反応性が証明された 。
【００６９】
【表１】
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【００７０】
表１は、大腸菌中で組換え産生されたRNAを含まないSSA60、Immunovision製SSA60（ウシ脾臓由来の天然SSA60）および本発明にしたがって製造されたSSA60-hY3を使用して得られた、陽性血清および陰性血清（供血者血清）についての結果を示している。これらの結果は、本発明にしたがって製造されたSSA60-hY3の感度はRNAを含まないSSA60の感度よりもかなり高いことを示している。サンプルは OD650 nm／カットオフ ＜１のとき陰性、OD650 nm／カットオフ ＞１のとき陽性と区分される。表１に示されたように、RNAを含まないSSA60を用いて陰性と区分された陽性血清B（1:10に希釈）、D（1:10に希釈）、E（非希釈および1:10に希釈）ならびに臨床サンプル血清Fは本発明にしたがって製造されたSSA60-hY3を用いては正しく陽性と検出される。
【００７１】
その上、表１の第２部に示すように、本発明にしたがって製造されたSSA60-hY3はRNAを含まないSSA60またはImmunovision製SSA60よりも高度の特異性をも有している。ここでは17の供血者（陰性血清）の結果を列挙している。SSA60ならびにImmunovision製SSA60を用いて、２種の陰性血清（それぞれNo.12および13またはNo.2および15）が陽性に分類されるが、本発明にしたがって製造されたSSA60-hY3を使用した場合、すべての血清が正しく陰性と認識される。
【００７２】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】組換え抗原 SSA60 M4-C6（上部配列）および SSA60 M56（下部配列）のアミノ酸配列を示す図である。
【図２】  Wolinらによって Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81(1984),1996-2000中に公開され たHY3の配列（上部配列）およびクローン HY3-SSA60 M56中で使用された遺伝子 配列（下部配列）の比較を示す図である。点突然変異を太字によって示す。
【図３】  pQE30-HY3-SSA60 M56 #4のDNAおよびアミノ酸配列を示す図である。ここで、HY3遺伝子は２つのXhoI部位の間（bp 232-419）に位置し、一方SSA60 M56はEcoRI部位の下流に位置する（bp 533で翻訳開始）。特徴的な制限部位を示す。下線を付けたアミノ酸はベクターによってコードされ、その他はヒトSSA60配列の部分である。
【図４】コーティングしたビーズによる試験フォーマットを示す図である。ここでは本発明によるリボ核タンパク質の外に、別の検出用分子、例えばHEp2抽出物、SSA52、SSA60、SSB、Sc170、Jo1、CENP-Bまたは／およびdsDNAをビーズに保有させることができる。コーティングしたビーズを次に非希釈サンプル、例えば25μlおよびバッファー、例えば250μlとともに、例えば30分インキュベートする。洗浄ステップ後、検出試薬、例えばマウス抗ヒトIgG PODコンジュゲート250mlを添加し、15分インキュベートする。再度の洗浄ステップ後、TMBによる検出を実施する。
【図５】  SSA60でコーティングしたビーズによる試験フォーマットを示す図である。コーティングしたビーズをサンプルとしての血清 10μlおよびサンプルバッファー250μlとともに15分インキュベートする。洗浄ステップ後、マウス抗ヒトIgG PODコンジュゲート 250μlを添加し、15分インキュベートする。再度の洗浄ステップ後、TMBによる分析を実施する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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