(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
マウスエナメリン遺伝子の塩基配列（配列番号１）における第6341番目のT塩基に相当する塩基のA塩基への変異によってエナメル質形成異常を呈することを特徴とする、エナメル質形成不全症モデルマウス。
【請求項２】
エナメル質形成異常が、低成熟型のエナメル質形成異常又はエナメル質の欠失である、請求項１に記載のエナメル質形成不全症モデルマウス。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のエナメル質形成不全症モデルマウスを野生型マウスに戻し交配することによって作出したマウス又はその子孫である、エナメル質形成不全症モデルマウス。
【請求項４】
マウスにおけるエナメリン遺伝子の塩基配列（配列番号１）における第6341番目のT塩基に相当する塩基にA塩基の変異を導入し、該マウスにおいて変異型エナメリン遺伝子を発現させ、エナメル質形成異常を呈するマウスを得ることを特徴とする、エナメル質形成不全症モデルマウスの作出方法。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のエナメル質形成不全症モデルマウスを被験因子に暴露し、該被験因子がエナメル質形成異常を改善するかどうかを判定することを含む、エナメル質形成不全症の治療及び／又は予防のための医薬をスクリーニングする方法。
【請求項６】
判定をエナメル質形成不全症モデルマウスの切歯の異常な摩耗及び切歯表面における異常な凹凸からなる群から選ばれる１以上の項目について行う、請求項５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、エナメル質形成不全症モデルマウス及びその作出方法に関する。また本発明は、エナメル質形成不全症の冶療及び／又は予防のための医薬をスクリーニングする方法に関する。
【背景技術】  アメロゲニン、エナメリン及びアメロブラスチンは、エナメル質構成タンパクの主成分として知られる。ヒトにおける遺伝解析では、アメロゲニン及びエナメリンは突然変異と疾患との明らかな関連性があることが報告されている（例えば非特許文献１〜４：Ｒａｊｐａｒ  ＭＨら、Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ．，第１０（１６）巻，ｐ．１６７３−７，２００１年；Ｋｉｄａ  Ｍら、Ｊ  Ｄｅｎｔ  Ｒｅｓ．，第８１（１１）巻，ｐ．７３８−４２，２００２年；Ｍａｒｄｈ  ＣＫら、Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ．，第１１（９）巻，ｐ．１０６９−７４，２００２年；Ｈａｒｔ  ＰＳら、Ａｒｃｈ  Ｏｒａｌ  Ｂｉｏｌ．，第４８（８）巻，ｐ．５８９−９６，２００３年参照）。ただし、遺伝性エナメル質形成不全症における遺伝的又は臨床的な多様性の原因を明らかにするには、モデル動物による実験が不可欠である。ヒトモデルとして用い得るモデル動物の中で、マウスは以下のような利点を持つ：
１）小型で飼育が簡単である
２）ゲノム情報がヒトに次いで充実している
３）遺伝子ターゲティング等による高度な遺伝子操作が可能である
４）多くの遺伝子による作用を研究するための「遺伝的背景」の異なる多様な近交系統がすでに確立されている
よって、実験動物開発の中でもモデルマウスの開発は非常に重要である。
現在のところ、アメロゲニンでは遺伝子ターゲティング法による突然変異マウスが作製されているが（Ｇｉｂｓｏｎ  ＣＷら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．，第２７６（３４）巻，ｐ．３１８７１−５、２００１年（Ｅｐｕｂ  ２００１  Ｊｕｎ  １３）参照）、これは機能欠失の１系統のみである。一方、エナメリン遺伝子に関しては、遺伝子ターゲティング法による突然変異マウス及び自然突然変異ともに未だ報告がない。従って、エナメリン遺伝子の変異によってもたらされる遺伝性エナメル質形成不全症は、モデルとなるエナメリン変異マウスが作出されておらず、エナメリン遺伝子がエナメル質形成において果たす役割、その遺伝的・臨床的な多様性の発生原因、さらには、エナメル質形成不全の治療法等について、実験に基づいた知見を得ることが出来なかった。
【発明の開示】
従って、本発明は、エナメリン質形成異常を示すモデル動物、及び該モデル動物の用途を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、化学変異原ＥＮＵ誘発突然変異によりエナメル質形成異常を示す突然変異マウス（Ｍ１００３９５、Ｍ１００５１４及びＭ１００５２１）を見出し、そのマウスにおける原因遺伝子のマッピングを行ったところ、エナメリン遺伝子上に一塩基変異が認められた。また、前記突然変異マウスを野生型の近交系ＤＢＡ／２Ｊマウスに戻し交配することによって前記突然変異形質を遺伝したマウス又はその子孫をも樹立することにも成功した。本発明はかかる知見により完成されたものである。
すなわち、本発明は、エナメリン遺伝子の変異によってエナメル質形成異常を呈することを特徴とする、エナメル質形成不全症モデルマウスである。
上記エナメル質形成不全症モデルマウスにおいて、エナメリン遺伝子の変異は、好ましくは以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される少なくとも１つの変異である：
（ａ）マウスエナメリン遺伝子の塩基配列（配列番号１）における第６４８９番目の塩基に相当する塩基の変異、又はアミノ酸配列（配列番号２）における第５５番目のアミノ酸に相当するアミノ酸の変異
（ｂ）マウスエナメリン遺伝子の塩基配列（配列番号１）における第６４９５番目の塩基に相当する塩基の変異、又はアミノ酸配列（配列番号２）における第５７番目のアミノ酸に相当するアミノ酸の変異
（ｃ）マウスエナメリン遺伝子の塩基配列（配列番号１）における第６３４１番目の塩基に相当する塩基の変異
また、上記エナメル質形成不全症モデルマウスは、例えば、低石灰化型、低成熟型、及び低形成型のエナメル質形成異常を呈するものである。
上記エナメル質形成不全症モデルマウスとしては、具体的には、突然変異マウスＭ１００３９５、突然変異マウスＭ１００５１４、又は突然変異マウスＭ１００５２１が挙げられる。
本発明はまた、上記エナメル質形成不全症モデルマウスを野生型マウスに戻し交配することによって作出したマウス又はその子孫である、エナメル質形成不全症モデルマウスである。
さらに本発明は、マウスにおけるエナメリン遺伝子に以下からなる群より選択される少なくとも１つの変異を導入し、該マウスにおいて変異型エナメリン遺伝子を発現させることを特徴とする、エナメル質形成不全症モデルマウスの作出方法である：
（ａ）マウスエナメリン遺伝子の塩基配列（配列番号１）における第６４８９番目の塩基に相当する塩基の変異若しくはアミノ酸配列（配列番号２）における第５５番目のアミノ酸に相当するアミノ酸の変異
（ｂ）マウスエナメリン遺伝子の塩基配列（配列番号１）における第６４９５番目の塩基に相当する塩基の変異若しくはアミノ酸配列（配列番号２）における第５７番目のアミノ酸に相当するアミノ酸の変異
（ｃ）マウスエナメリン遺伝子の塩基配列（配列番号１）における第６３４１番目の塩基に相当する塩基の変異
またさらに本発明は、上記エナメル質形成不全症モデルマウスを被験因子に暴露し、該被験因子がエナメル質形成異常を改善するかどうかを判定することを含む、エナメル質形成不全症の治療及び／又は予防のための医薬をスクリーニングする方法である。
上記スクリーニング方法においては、判定を、例えばエナメル質形成不全症モデルマウスの切歯の異常な摩耗及び切歯表面における異常な凹凸からなる群から選ばれる１又は２以上の項目について行うことができる。
【図面の簡単な説明】  図１は、野生型（Ａ）、並びにＭ１００３９５（Ｂ）、Ｍ１００５１４（Ｃ）及びＭ１００５２１（Ｄ）の各突然変異系統の切歯の表現型を示す写真である。Ｂ及びＣにおいては、形成不全型エナメル質形成不全による、エナメル質の障害が見られる。これに対して、Ｄにおいて、粗な切歯表面が示され、かつ咬合部に異常な摩耗が観察される。これはエナメル質が柔らかいことを示す。
図２は、Ｍ１００３９５、Ｍ１００５１４及びＭ１００５２１の遺伝子マッピングを示す図である。上側の図は、Ｍ１００３９５（左）及びＭ１００５１４（右）ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ｐａｎｅｌである。白い四角はＤＢＡ／２Ｊの多型を、黒い四角はＣ５７ＢＬ／６Ｊの多型を示す。組換え体の数は各四角の列の下側に示す。下側は、ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ｐａｎｅｌから作製されたＭ１００３９５（左）、Ｍ１００５１４（中）Ｍ１００５２１（右）の第５染色体遺伝子マップを示す。全ての突然変異はエナメリン（Ｅｎａｍ）及びアメロブラスチン（Ａｍｂｎ）近傍にマップされた。
図３Ａは、Ｍ１００３９５突然変異系統のヘテロ個体におけるエナメリン遺伝子の塩基配列決定によって発見された突然変位部位を示す図である。矢印はＥＮＵによって誘発された変異部位を示す。上図は野生型、下の２つの図はヘテロ接合体の塩基配列を示す。エナメリン遺伝子の６４８９番目のＧがＴへ塩基置換している。
図３Ｂは、Ｍ１００５１４突然変異系統のヘテロ個体におけるエナメリン遺伝子の塩基配列決定によって発見された突然変位部位を示す図である。矢印はＥＮＵによって誘発された変異部位を示す。上図は野生型、下の２つの図はヘテロ接合体の塩基配列を示す。エナメリン遺伝子の６４９５番目のＡがＧへ塩基置換している。
図３Ｃは、Ｍ１００５２１突然変異系統のヘテロ個体におけるエナメリン遺伝子の塩基配列決定によって発見された突然変位部位を示す図である。矢印はＥＮＵによって誘発された変異部位を示す。上図は野生型、下の２つの図はヘテロ接合体の塩基配列を示す。エナメリン遺伝子の６３４１番目のＴがＡへ塩基置換している。
図４は、Ｍ１００５２１系統を用いたエナメリンｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ結果を示す写真である。
発明の実施をするための最良の形態
以下、本発明を詳細に説明する。本願は、２００３年１２月１１日に出願された日本国特許出願第２００３−４１３８２９号の優先権を主張するものであり、上記特許出願の明細書及び／又は図面に記載される内容を包含する。
本発明は、エナメル質形成不全症のモデルマウス（以下、「本モデルマウス」と称する）に関し、エナメリン遺伝子に変異を有することを特徴とするものである。
１．エナメリン遺伝子の変異
本モデルマウスは、エナメリン遺伝子の変異によってエナメル質形成異常を呈することを特徴とする。かかるエナメリン遺伝子の変異としては、以下の（ａ）〜（ｃ）が挙げられ、本モデルマウスはこれらの変異のうち少なくとも１つの変異を有する：
（ａ）マウスエナメリン遺伝子の塩基配列（配列番号１）における第６４８９番目のグアニン（Ｇ）のチミン（Ｔ）への変異、又はアミノ酸配列（配列番号２）における第５５番目のセリン（Ｓ）のイソロイシン（Ｉ）への変異
（ｂ）マウスエナメリン遺伝子の塩基配列（配列番号１）における第６４９５番目のアデニン（Ａ）のグアニン（Ｇ）への変異、又はアミノ酸配列（配列番号２）における第５７番目のグルタミン（Ｅ）のグリシン（Ｇ）への変異
（ｃ）マウスエナメリン遺伝子の塩基配列（配列番号１）における第６３４１番目のチミン（Ｔ）のアデニン（Ａ）への変異
本モデルマウスは、上記の位置における一塩基変異又は一アミノ酸変異を有するものであるが、これは、マウス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）のハツカネズミ種における位置を示すものである。一般的に、遺伝子の配列及び構造、並びにアミノ酸の配列及び構造は、動物種により異なることが知られている。従って、本モデルマウスは、上記の位置の塩基に「相当する塩基の変異」又は上記の位置のアミノ酸に「相当するアミノ酸の変異」を有するものであってもよい。「相当する」塩基又はアミノ酸の位置は、アミノ酸配列の相同性、ペプチドのコンホメーション、塩基配列のアライメントなどによって当業者であれば容易に決定することができる。
ヒト遺伝性エナメル質形成不全症の臨床学的な分類には、以下が含まれる：
（１）低石灰化型（ｈｙｐｏｃａｌｃｉｆｉｅｄ  ｔｙｐｅ）
エナメル質は正常の厚さだが、石灰化が不十分
（２）低成熟型（ｈｙｐｏｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｔｙｐｅ）
エナメル質は正常の厚さだが、表面が粗でありエナメル質が柔らかい
（３）低形成型（ｈｙｐｏｐｌａｓｔｉｃ  ｔｙｐｅ）
エナメル質が薄く、表面ではエナメル質の崩落等がみられる。
従って、本モデルマウスは、上記の低石灰化型、低成熟型、及び低形成型のうち少なくとも１つのエナメル質形成異常を呈することが好ましい。
本発明者らにより作出されたエナメリン遺伝子の異なる位置に変異を有するマウスが、上記ヒト遺伝性エナメル質形成不全症分類のうち２種類（低成熟型、低形成型）を示すことが確認されている。以下に、本発明者らが作出したエナメル質形成不全症モデルマウス系統について説明する。
（ａ）Ｍ１００３９５系統
ＮＣＢＩにて公開されている、マウスエナメリン遺伝子のゲノム配列（ＡＦ３０３７３７；配列番号１）の６４８９番目の塩基が、ＧからＴへ変異している。この変異は、エナメリンタンパク質では、５５番目のアミノ酸のＳからＩへの変異に相当する。このＭ１００３９５系統マウスの歯の表面では、エナメル質の崩落が観察され、低形成型の遺伝性エナメル質形成不全症を呈する。
（ｂ）Ｍ１００５１４系統
ＮＣＢＩにて公開されている、マウスエナメリン遺伝子のゲノム配列（ＡＦ３０３７３７；配列番号１）の６４９５番目の塩基が、ＡからＧへ変異している。この変異は、エナメリンタンパク質では、５７番目のアミノ酸のＥからＧへの変異に相当する。このＭ１００５１４系統マウスの歯の表面では、エナメル質の崩落が観察され、低形成型の遺伝性エナメル質形成不全症を呈する。
（ｃ）Ｍ１００５２１系統
ＮＣＢＩにて公開されている、マウスエナメリン遺伝子のゲノム配列（ＡＦ３０３７３７；配列番号１）の６３４１番目の塩基が、ＴからＡへ変異している。この変異は、転写の際のｍＲＮＡスプライシングにおけるアクセプターシグナル部位に相当する。従って、この変異により、エナメリン遺伝子の転写産物が第４イントロンを含んだままとなり、結果的に第５エクソンでフレームシフトを引き起こし、第５エクソンの途中で停止コドンにより翻訳が止まる。この異常な転写産物は、（おそらくｍＲＮＡナンセンス分解により）ほぼ分解される。よって、この変異は機能欠失型の変異であると結論付けられた。このマウスの歯の表面は粗面であり、咬合部で異常な摩耗を示す。これはエナメル質が正常より柔らかいことを示している。
２．エナメル質形成不全症モデルマウスの作出、維持
本モデルマウスは、例えば、以下の手法により作出、維持することができる。
（１）点突然変異誘発による作出
まず、化学変異剤（ＥＮＵ：Ｎ−エチル−ニトロソ尿素）により精子に点突然変異を誘発した初代（ＧＯ世代）の雄マウスと野生型の雌から生まれた第１世代マウス（Ｇ１）の中から「エナメル質形成異常」を示す表現型により突然変異マウスをスクリーニングする。
次に、この突然変異Ｇ１雄マウス（＋／Ｍ）を野性型の雌（＋／＋）と交配すると、第２世代マウス（Ｇ２）において、野生型（＋／＋）、ヘテロ接合体（＋／Ｍ）が１：１の割合で出現（エナメル質形成異常：正常が１：１に分離）し、変異に遺伝性があることを確認できる。
さらに、Ｇ１雄マウス（＋／Ｍ）とＧ２雌マウス（＋／Ｍ）を交配すると、第３世代マウス（Ｇ３）において、いわゆるメンデルの分離の法則に従い、野生型（＋／＋）、ヘテロ接合体（＋／Ｍ）、ホモ接合体（Ｍ／Ｍ）が、１：２：１の割合で出現（エナメル質形成異常：正常が３：１に分離）することが予想される。
このような戻し交配を１０世代以上繰り返すことにより、単一の遺伝子座だけに変異が認められるコンジェニック系統が樹立できる。
本発明において点突然変異を誘発した雄マウスは上記のような遺伝形式をとることから、本突然変異はエナメリン遺伝子に支配されていることいえる。従って、作出される各世代のヘテロ接合体（＋／Ｍ）マウスは、前記のエナメル質形成異常を示し、かつ致死も認められないので、エナメル質形成不全症モデルマウスとして有用であるとともに、ホモ接合体（Ｍ／Ｍ）マウスの製造の親動物としても利用できる。
また、突然変異Ｇ１雄マウス（＋／Ｍ）の精子を凍結保存しておくことにより、マウスが死滅又は老化などの理由により不妊となっている場合であっても、その凍結精子を用時融解し、未受精卵との体外受精、あるいは培養によって受精胚を作製して偽妊娠雌マウスの子宮に移植することによって産仔を得ることができ、本モデルマウスを維持することが可能である。
本モデルマウスとなる突然変異マウス系統Ｍ１００３９５、Ｍ１００５１４及びＭ１００５２１の精子は、独立行政法人理化学研究所  ゲノム科学総合研究センター（横浜市戸塚区前田町２１４）、及びバイオリソースセンター（つくば市高野台３−１−１）施設において、凍結保存されており、特許後においては希望者に分譲する。
（２）点特異的突然変異導入法による作出
本モデルマウスは、点特異的突然変異導入法を利用することによって、遺伝子工学的手法により作出することも可能である。すなわち、本発明に係るエナメル質形成不全症モデルマウスの作出方法は、マウスにおけるエナメリン遺伝子に上記の少なくとも１つの変異を導入し、該マウスにおいて変異型エナメリン遺伝子を発現させることを含む。
上記のような変異をマウスに導入するには、目的のマウスエナメリン遺伝子をクローニングし、この遺伝子に対し、上記の（ａ）〜（ｃ）のいずれかの変異を導入し、その後、相同組換え法を利用して変異型エナメリン遺伝子を当技術分野で公知のＤＮＡ導入法により染色体上の遺伝子と置換することによって行うことができる。このような操作を行う対象となる動物種は、マウスであれば特に限定されない。またマーカー遺伝子としては、薬剤耐性遺伝子を使用することが好ましく、例えば限定するものではないが、ネオマイシン耐性遺伝子、ガンシクロビル耐性遺伝子等が挙げられる。当技術分野で公知のＤＮＡ導入法としては、限定するものではないが、マイクロインジェクション法、ウイルスベクター法、ＥＳ細胞（胚性幹細胞）法等が挙げられる。
具体的には、次のようにして本モデルマウスを作出する。最初に、操作の対象となるマウスのエナメリン遺伝子のタンパク質翻訳領域（ＯＲＦ）及びその周囲について遺伝子を単離し、この遺伝子に以下の（ａ）〜（ｃ）のうち少なくとも１つの変異を導入する：
（ａ）マウスエナメリン遺伝子の塩基配列（配列番号１）における第６４８９番目の塩基に相当する塩基の変異若しくはアミノ酸配列（配列番号２）における第５５番目のアミノ酸に相当するアミノ酸の変異
（ｂ）マウスエナメリン遺伝子の塩基配列（配列番号１）における第６４９５番目の塩基に相当する塩基の変異若しくはアミノ酸配列（配列番号２）における第５７番目のアミノ酸に相当するアミノ酸の変異
（ｃ）マウスエナメリン遺伝子の塩基配列（配列番号１）における第６３４１番目の塩基に相当する塩基の変異
遺伝子への変異導入手法は当業者に周知であり、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を利用して行うことができる。次に、変異型エナメリン遺伝子を含むＤＮＡをＥＳ細胞に導入し、マーカーを指標にして相同組換えを起こした細胞のコロニーを選別する。例えばネオマイシン耐性遺伝子を用いた場合には、Ｇ４１８薬剤に抵抗性を示す細胞を選別する。選別された変異型エナメリン遺伝子を有するＥＳ細胞を胚盤胞に注入してキメラ胚を作製する。その後、キメラ胚を仮親の子宮に移植し、キメラ動物を生育する。生まれてきたキメラ動物が置換された遺伝子（変異型エナメリン遺伝子）を有するか否かは、例えば尾の先端等を一部切り取って調製したＤＮＡを用いて、例えばＰＣＲ法で確認することが可能である。仔動物のいくつかは破壊された遺伝子を片方の染色体にもつヘテロ接合体（＋／Ｍ）である。従って、これらヘテロ接合体である動物同士を交配することにより、変異型エナメリン遺伝子を両方の染色体上にもつホモ接合体（Ｍ／Ｍ）が得られる。
３．エナメル質形成不全症モデルマウスの用途
本モデルマウスは、エナメル質形成不全症を呈するものであるため、以下の態様で、エナメル質形成不全症のための医薬のスクリーニングに使用することができる。
すなわち、本発明によれば、本発明に係るエナメル質形成不全症モデルマウスを被験因子に暴露し、該被験因子がエナメル質形成異常を改善するかどうかを判定することを含む、エナメル質形成不全症の治療及び／又は予防のための医薬をスクリーニングする方法が提供される。
本発明のスクリーニング方法の対象となる被験因子の種類は特に限定されない。例えば、物質的因子（医薬品、食品など）、環境因子（放射線、紫外線など）が挙げられる。具体的には、天然に生じる分子（例えば、アミノ酸、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、核酸など）；脂質、ステロイド、グリコペプチド、糖タンパク質、プロテオグリカンなど；あるいは天然に生じる分子の合成アナログ又は誘導体（例えば、ペプチド擬態物など）；及び天然に生じない分子（例えば、コンビナトリアルケミストリー技術等を用いて作成した低分子有機化合物）；ならびにそれらの混合物などを挙げることができる。また、被験因子としては単一の被験因子を独立に試験しても、いくつかの候補となる被験因子の混合物（ライブラリーなどを含む）について試験をしてもよい。複数の被験因子を含むライブラリーとしては、合成化合物ライブラリー（コンビナトリアルライブラリーなど）、ペプチドライブラリー（コンビナトリアルライブラリーなど）などが挙げられる。
被験因子の改善効果の判定では、まず本モデルマウスを上記被験因子に暴露する。被験因子の暴露条件は、その因子の種類により異なるが、当業者であれば容易に決定することができる。例えば被験因子として被験因子を投与する場合には、その投与量、投与期間、投与経路などの投与条件は、被験因子の種類の種類などにより異なるが、当業者であれば容易に決定することができる。また、被験因子の効果を、いくつかの条件で検討することも可能である。そのような条件としては、被験因子に暴露する時間又は期間、量（大小）、回数などが挙げられる。例えば、被験因子の希釈系列を作成するなどして複数の投与量を設定することができる。被験因子の投与期間も適宜設定することができるが、例えば、１日から数週間までの期間に渡って投与することができる。本モデルマウスに被験因子を投与する場合の投与経路は特に限定されず、被験因子の種類に応じて経口投与、静脈注射、腹腔内注射、経皮投与、皮下注射等の投与形態を適宜使用することができる。
さらに、複数の因子の相加作用、相乗作用などを検討する場合には、被験因子を組み合わせて用いてもよい。
判定は、ＳＨＩＲＰＡ法（Ｍａｍｍ．Ｇｅｎｏｍｅ（１９９７）８（１０）：７１１−７１３）を改変した、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ＳＨＩＲＰＡ法（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｓｃ．ｒｉｋｅｎ．ｇｏ．ｊｐ／Ｍｏｕｓｅ／Ａｂｏｕｔ  Ｕｓ／ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ．ｈｔｍ）の表現型スクリーニングにおける３７番目の項目に挙げられている「テスト中の歯形態の観察」（Ｔｅｅｔｈ  ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ）を用いて行なうことができる。具体的には、マウス口腔内を目視で検査し、マウス切歯が正常であるか、又は何らかの異常を示すかについて、判定を行う。
本発明のスクリーニング方法の結果、被験因子に暴露した本モデルマウスにおいてエナメル質形成異常の改善が認められる場合の被験因子は、エナメル質形成不全症の治療及び／又は予防のための医薬の候補とすることができる。ここで、エナメル質形成異常の改善は、例えば、エナメル質硬度の回復や、歯表面に変化があったと判断される場合にその被験因子の効果があったと評価することができる。
以上から、本モデルマウスを用いることにより、エナメル質形成異常に関連する疾患を治療又は予防するための医薬又は治療法候補を見出し、あるいは医薬又は治療法の効果を確認することが可能となる。
【実施例】  以下、実施例によって本発明を更に具体的に説明するが、これらの実施例は本発明を限定するものではない。
［実施例１］
（１）ＥＮＵによる突然変異の誘発とエナメル質形成異常の検出
化学変異原ＥＮＵ（Ｎ−エチル−Ｎ−ニトロソ尿素）を、１回あたり５５〜１００ｍｇ／ｋｇ、総量１５０〜２５０ｍｇ／ｋｇを１週間間隔でＣ５７ＢＬ／６Ｊ雄マウス（Ｇ０）に２〜３回腹腔内投与し、突然変異を誘発した。ＥＮＵ投与に関する詳細は、理研ＧＳＣのＷｅｂサイトに記述されている（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｓｃ．ｒｉｋｅｎ．ｇｏ．ｊｐ／Ｍｏｕｓｅ／）。Ｇ０の子孫（Ｇ１）を作出するためにＧ０とＤＢＡ／２Ｊ雌マウスとの交配を実施し、産生されたＧ１を用いて歯形態に関するスクリーニングを行った。
歯形態のスクリーニングは、ＳＨＩＲＰＡ法（Ｍａｍｍ．Ｇｅｎｏｍｅ（１９９７）８（１０）：７１１−７１３）を改変した、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ＳＨＩＲＰＡ法（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｓｃ．ｒｉｋｅｎ．ｇｏ．ｊｐ／Ｍｏｕｓｅ／Ａｂｏｕｔ  Ｕｓ／ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ．ｈｔｍ）の表現型スクリーニングにおける３７番目の項目に挙げられている「テスト中の歯形態の観察」（Ｔｅｅｔｈ  ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ）を用いて行なった（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｓｃ．ｒｉｋｅｎ．ｇｏ．ｊｐ／Ｍｏｕｓｅ／Ａｂｏｕｔ  Ｕｓ／ｓｈｉｒｐａｌｉｓｔ．ｈｔｍ）。
この結果、Ｇ１のＭ１００３９５、Ｍ１００５１４及びＭ１００５２１に歯の形態の異常が観察された（図１のＢ〜Ｄ）。これらの表現型の詳細は以下の通りである。
Ｍ１００３９５は、切歯表面のエナメル質部分に脱落がみられた（図１のＢ）。Ｍ１００５１４もまたＭ１００３９５と全く同一の表現型が得られた（図１のＣ）。これらは明らかに形成不全型（ｈｙｐｏｐｌａｓｔｉｃ  ｔｙｐｅ）のエナメル質形成不全症の症状である。Ｍ１００５２１は切歯の表面が粗であり、咬合面に異常な摩耗が観察された（図１のＤ）。これは、エナメル質が正常よりも柔らかいことを示し、未成熟型（ｈｙｐｏｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｔｙｐｅ）のエナメル質形成不全症の症状である。
得られた歯形態異常マウスは、野生型のＤＢＡ／２Ｊ系統と交配し、それらの子孫（Ｇ２）においても同様の表現型が得られるかどうかを検討した。Ｍ１００３９５、Ｍ１００５１４及びＭ１００５２１から、それぞれ、３９匹、４０匹及び８９匹のＧ２世代マウスを得た。その結果、それぞれ、１６／３９匹、１８／４０匹及び３４／８９匹において、親の歯形態と全く同じ表原型が観察された。すなわち、これらの異常が遺伝性のものであることが確認された。
（２）原因遺伝子のマッピング
全ての個体からＤＮＡを抽出し、全染色体を約１０ｃＭ間隔でカバーできるよう、ＭＩＴデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｇｅｎｏｍｅ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｓｎｐ／ｍｏｕｓｅ／）を用いて、Ｃ５７ＢＬ／６ＪとＤＢＡ／２Ｊの間に多型のあるＳＮＰマーカー７６個を選び出した。プライマーの塩基配列とＰＣＲの条件設定に関する情報もＭＩＴデータベースから得た。アレル判定のためには、ＴａｑＭａｎ  ＭＧＢプローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ）を使用した。
その結果３つの突然変異体全てが、第５染色体のＤ５Ｍｉｔ１１２とＤ５Ｍｉｔ３６１の間にマップされた（図２）。
［実施例２］突然変異の検出
（１）候補遺伝子のＤＮＡ塩基配列決定
Ｄ５Ｍｉｔ１１２とＤ５Ｍｉｔ３６１の間には、エナメル質構成タンパク質をコードする、アメロブラスチン遺伝子及びエナメリン遺伝子が存在することがすでに知られていた。そこで、Ｍ１００３９５、Ｍ１００５１４及びＭ１００５２１のヘテロ接合体において、アメロブラスチン遺伝子及びエナメリン遺伝子の全エクソンの塩基配列決定を行なった。
アメロブラスチンの各エクソンのＰＣＲ増幅には、以下のプライマーを用いた：
第１エクソン
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第２エクソン
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第３エクソン
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第４エクソン
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第５エクソン
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第６エクソン
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第７、８エクソン
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第９エクソン
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第１０エクソン
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エナメリンの各エクソンのＰＣＲ増幅には、以下のプライマーを用いた：
第１エクソン
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第２、３エクソン
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第４、５エクソン
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第６エクソン
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第７エクソン
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第８エクソン
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第９エクソン
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第１０エクソン
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第１１エクソンの５’側
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第１１エクソンの中間部分
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第１１エクソンの３’側
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この結果、３つの突然変異体全てにおいてエナメリン遺伝子内に突然変異が見出された。Ｍ１００３９５では、公開されているエナメリンゲノム配列（ＡＦ３０３７３７，ＮＣＢＩ；配列番号１）の、６４８９番目のＧがＴに変異していた（図３Ａ）。これは、エナメリンタンパク質（配列番号２）では、５５番目のアミノ酸がＳｅｒ（Ｓ）からＩｌｅ（Ｉ）へ変化する。Ｍ１００５１４では、６４９５番目のＡがＧに変異していた（図３Ｂ）。これは、エナメリンタンパク質では、５７番目のアミノ酸がＧｌｕ（Ｅ）からＧｌｙ（Ｇ）へ変化する（図３Ｂ）。これらの変異はエナメリンタンパク質のＮ末端側部分の塩基置換である。Ｍ１００５２１は、６３４１番目のＴがＡに変異していた。これは、第４エクソンのスプライシングドナー部位がＧＴからＧＡへと変化していることを意味する（図３Ｃ）。この変異により、第４イントロンはスプライシングされずに、次の第５エクソンでフレームシフトを引き起こし、第５エクソンの途中で停止コドンにより翻訳されなくなる。エナメリン及びアメロブラスチンの他の部位では、突然変異は検出されなかった。
（２）Ｍ１００５２１の転写産物の解析
３つの突然変異のうち、Ｍ１００５２１のみが異なる表現型を示す。また、この変異のみ変異のタイプが異なる、すなわちアミノ酸の直接変異に寄与するものではない。そこで、Ｍ１００５２１でスプライシング異常が起こっていることを確認するために、ホモ接合体、ヘテロ接合体及び野生型におけるエナメリン遺伝子の逆転者酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）解析を行なった。
エナメリン遺伝子のＭ１００５２１変異の遺伝子型決定には、アリル特異的なゲノムのＰＣＲを用いた。すなわち、野生型のエナメリン遺伝子の検出には、ＴＣＴ  ＣＴＧ  ＣＴＧ  ＣＣＡ  ＴＧＣ  ＣＡＧ  Ｔ（配列番号４３）及びＡＡＴ  ＴＴＴ  ＡＣＣ  ＴＣＣ  ＣＴＴ  ＡＧＴ  ＣＣ（配列番号４４）を、変異型のエナメリン遺伝子（Ｍ１００５２１）の検出には、ＴＣＴ  ＣＴＧ  ＣＴＧ  ＣＣＡ  ＴＧＣ  ＣＡＧ  Ａ（配列番号４５）及びＡＡＴ  ＴＴＴ  ＡＣＣ  ＴＣＣ  ＣＴＴ  ＡＧＴ  ＣＣ（配列番号４４）を用いた。総ＲＮＡは成体（８週齢以降）の下顎を手早く摘出した後、突出した骨突起と切歯を切り取り、これを素早くマイクロチューブ内に入れ、チューブごと液体窒素内で凍結した。さらに凍結したまま、マルチビーズショッカー（安井機械）を用いて粉砕した。総ＲＮＡの抽出には、ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）試薬（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を用い、ｃＤＮＡ特異的なＲＴ−ＰＣＲは、ｍＲＮＡ  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ＰＣＲキットＶｅｒ．１．１（ＴａＫａＲａ）を用いた。ｃＤＮＡの増幅には、第４エクソン内に設定したフォワードプライマーＧＡＴ  ＧＡＧ  ＴＣＴ  ＣＣＴ  ＴＧＴ  ＴＴＴ  ＣＣ（配列番号４６）、及び、第６、７エクソンの境界をまたぐように設定したリバースプライマＡＴＣ  ＡＴＴ  ＧＧＴ  ＧＧＧ  ＧＣＡ  ＴＴＣ  ＡＴ（配列番号４７）を用いた。
この結果を図４に示す。野生型（＋／＋；レーン１）及びヘテロ接合体（＋／−；レーン２）は１５６ｂｐの位置にバンドを示す。一方、ホモ接合体（−／−；レーン３）は、これにイントロン４の長さを足した２６３ｂｐの位置にバンドを示す。またコントロール用のゲノムＤＮＡからはＰＣＲの増幅は見られなかった（レーン４）。これにより、Ｍ１００５２１でスプライシング異常が起こっていることが確認された。また、ホモ接合体ではこのバンドはかなり薄く、ヘテロ接合体ではほとんど検出出来なかった。これは、野生型アリルから転写されるｍＲＮＡ量に比べてＭ１００５２１変異アリルからの転写産物が極端に少ないことを示す。これは、変異アリルからの転写産物が停止コドンを含むため、ナンセンスｍＲＮＡ分解（ｎｏｎｓｅｎｓｅ  ｍＲＮＡ  ｄｅｃａｙ）によって分解されていることを示唆する。このＭ１００５２１アリルは機能欠失型のアリルであり、ホモ個体ではエナメル質が完全に欠失した。これはマウス切歯の萌出以前でも観察された。以上の結果から、エナメリン遺伝子は、エナメル形成初期、及び成熟期の両方で機能しており、初期ではエナメル質形成そのものを支配していること、また成熟期ではエナメル質硬度を正常に保つものと考えられた。
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書中にとり入れるものとする。
【産業上の利用可能性】  本発明によれば、エナメリン遺伝子の変異によりエナメル質形成異常を呈するエナメル質形成不全症モデルマウスが提供される。本発明のモデルマウスは、ヒトエナメル質形成不全症の病態を示すため、かかる疾患の病因の究明と病態の解析、遺伝性研究、エナメル質形成不全症の治療及び／又は予防のための医薬のスクリーニングなどに有用である。
【配列表フリーテキスト】  配列番号３〜４７：合成オリゴヌクレオチド
【図１】
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【図２】
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【図４】
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【配列表】
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