(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ワクチンの免疫原性を測定する一つの検定であって、ここでワクチンが、ワクチンの免疫原活性形態と関連する立体配座を持つエピトープと、ワクチンの免疫原不活性形態と関連する立体配座を持つ断片を含み、ここでの方法が、ワクチンの免疫原活性形態と関連する立体配座にあるエピトープと結合できる第１リガンド、およびワクチンの免疫原不活性形態と関連する立体配座にある断片と結合できる第２リガンドに、ワクチンのサンプルを露出し、ワクチンサンプルと結合した第１リガンドの量とワクチンサンプルと結合した第２リガンドの量を測定することを含むことを特徴とする検定。
【請求項２】
請求項１記載の検定であって、ここでワクチンの露出に先立ち、第１リガンドおよび第２リガンドがそれぞれ第１および第２検出可能物質で標識され、またここで、ワクチンの免疫原活性形態と結合する第１リガンドの量と、ワクチンの免疫原不活性形態と結合する第２リガンドの量が、第１および第２リガンドへの露出に際してワクチンサンプルと関連する第１および第２検出可能物質の量を測定することにより決定されることを特徴とする検定。
【請求項３】
請求項２記載の検定であって、ここで第１および第２検出可能物質が、それぞれワクチンの免疫原活性形態およびワクチンの免疫原不活性形態と結合した時に、異なった波長の蛍光を放出し、またここでワクチンと結合する第１リガンドおよび第２リガンドの量の測定が、第１および第２検出可能物質により放出される蛍光を測定することで行われることを特徴とする検定。
【請求項４】
請求項３記載の検定であって、ここでワクチンサンプルがワクチン物質とアジュバントを含むことを特徴とする検定。
【請求項５】
請求項４記載の検定であって、ここでワクチンサンプルが、第１および第２リガンドへの露出に先立ち濾過平板に置かれることを特徴とする検定。
【請求項６】
請求項５記載の検定であって、ここで濾過平板が２個またはそれ以上のウエルを含み、ここでワクチンサンプルが少なくとも１個のウエルに置かれ、またワクチン物質を欠いている対照アジュバントが、ワクチン物質を含まない少なくともも１個のウエルに置かれ、またここで第１および第２の標識リガンドが平板内のウエルに加えられることを特徴とする検定。
【請求項７】
請求項６記載の検定であって、ここでワクチンサンプルを含むウエルが、蛍光物質による放出された光を測定する前に、ワクチン物質と結合しない過剰のリガンドをワクチンサンプルを含むウエルから除去するために、第１および第２リガンドの追加の際に洗浄されることを特徴とする検定。
【請求項８】
請求項１記載の検定であって、ここでワクチンが乳頭腫ウイルスワクチンであることを特徴とする検定。
【請求項９】
請求項８記載の検定であって、ここでワクチンがウイルス様粒子を含むことを特徴とする検定。
【請求項１０】
請求項９記載の検定であって、ここでウイルス様粒子がＬ１タンパク質を含むことを特徴とする検定。
【請求項１１】
請求項９記載の検定であって、ここでウイルス様粒子が、ＨＰＶ−１６を含むことを特徴とする検定。
【請求項１２】
請求項１１記載の検定であって、ここでワクチンの活性形態と関連する立体配座を持つエピトープが、Ｖ５エピトープであることを特徴とする検定。
【請求項１３】
請求項１２記載の検定であって、ここでワクチンの免疫原活性形態と関連する立体配座にあるエピトープと結合できるリガンドが、ＨＰＶ１６．Ｖ５モノクローナル抗体であることを特徴とする検定。
【請求項１４】
請求項１３記載の検定であって、ここでＨＰＶ１６．Ｖ５が、蛍光物質で標識されることを特徴とする検定。
【請求項１５】
請求項１１記載の検定であって、ここでワクチンの不活性形態が、変性Ｌ１タンパク質を含むことを特徴とする検定。
【請求項１６】
請求項１５記載の検定であって、ここで変性Ｌ１タンパク質が、線状Ｌ１タンパク質を含むことを特徴とする検定。
【請求項１７】
請求項１６記載の検定であって、ここでワクチンの免疫原不活性形態と関連する立体配座にあるワクチンと結合できるリガンドが、１８Ａ１モノクローナル抗体を含むことを特徴とする検定。
【請求項１８】
請求項１７記載の検定であって、ここで１８Ａ１が蛍光物質で標識されることを特徴とする検定。
【請求項１９】
請求項１８記載の検定であって、ここで１８Ａ１がＨＰＶ１６．Ｖ５と連係して使用され、ここでＨＰＶ１６．Ｖ５が、１８Ａ１に蛍光物質により放出される光の波長と異なる波長で光を放出する蛍光物質で標識されることを特徴とする検定。
【請求項２０】
請求項９記載の検定であって、ここでウイルス様粒子が、ＨＰＶ−１８を含むことを特徴とする検定。
【請求項２１】
請求項２０記載の検定であって、ここでワクチンの活性形態と関連する立体配座を持つエピトープが、Ｊ４エピトープであることを特徴とする検定。
【請求項２２】
請求項２１記載の検定であって、ここでワクチンの免疫原活性形態と関連する立体配座にあるエピトープと結合できるリガンドが、ＨＰＶ１８．Ｊ４モノクローナル抗体であることを特徴とする検定。
【請求項２３】
請求項２２記載の検定であって、ここでＨＰＶ１８．Ｊ４が、蛍光物質で標識されることを特徴とする検定。
【請求項２４】
請求項２０記載の検定であって、ここでワクチンの不活性形態が、変性Ｌ１タンパク質を含むことを特徴とする検定。
【請求項２５】
請求項２４記載の記載の検定であって、ここで変性Ｌ１タンパク質が線状Ｌ１タンパク質を含むことを特徴とする検定。
【請求項２６】
請求項２５記載の検定であって、ここでワクチンの免疫原不活性形態と関連する立体配座にあるワクチンと結合できるリガンドが、１８Ａ１モノクローナル抗体を含むことを特徴とする検定。
【請求項２７】
請求項２６記載の検定であって、ここで１８Ａ１が、蛍光物質で標識されることを特徴とする検定。
【請求項２８】
請求項２７記載の検定であって、ここで１８Ａ１が、ＨＰＶ１８．Ｊ４と連係して使用され、ここでＨＰＶ１８．Ｊ４が、１８Ａ１に蛍光物質により放出される光の波長と異なる波長で光を放出する蛍光物質で標識されることを特徴とする検定。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の背景】
この出願は、２０００年９月１８日に出願受理されたアメリカ合衆国暫定特許出願番号第６０／２３３，４３９号からの優先権を主張し、その全体は、ここで引用例として組み込まれている。
【０００２】
本発明は、ワクチンの免疫原性の試験管内測定の分野に関する。とりわけ本発明は、ウイルス様粒子に基づくワクチンの免疫原および非免疫原形態の結合性に基づくワクチン免疫原性の測定に関する。
【０００３】
【関連技術の概要】
バルクおよびバイアル瓶保管ワクチン産物の安定性を決定する重要な因子の一つは、免疫原性の測定である。例えば、マウスの免疫化によるＨＰＶ−１６ウイルス様粒子（ＶＬＰｓ）の能力検査は、労働と時間の大きな努力を必要とする。典型的には、調合されたＶＬＰ物質を各種の用量水準でマウスに投与し免疫化した後に、動物が十分な免疫応答を備えることができたかどうかを決定できるまでには、約６週間が必要とされる。この問題がより難しくなるのは、利用されねばならない動物数の故で、各種のアジュバントと賦形剤を試験する時である。開発を能率的にする努力で、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）ベースワクチンの免疫原性を評価できるようにする高速で信頼できる検定を見出すことは望ましいことであろう。
【０００４】
【発明の概要と目的】
本発明の目的は、ワクチンの免疫原性を測定する検定を提供することであり、ここでワクチンは、ワクチンの免疫原活性形態と関連する立体配座を持つエピトープと、ワクチンの免疫原不活性形態と関連する立体配座を持つ断片を含む。この方法は、ワクチンのサンプルを、ワクチンの免疫原活性形態と関連する立体配座にあるエピトープと結合できる第１リガンド、およびワクチンの免疫原不活性形態と関連する立体配座にある断片と結合できる第２リガンドに露出し、次いでワクチンサンプルに結合する第１リガンドの量と、ワクチンサンプルに結合する第２リガンドの量を測定することを含む。望ましくは、第１および第２リガンドは、ワクチンの露出に先立ち、それぞれ第１および第２検出可能物質で各標識され、ここでワクチンの免疫原活性形態と結合する第１リガンドの量と、ワクチンの免疫原不活性形態と結合する第２リガンドの量は、第１および第２リガンドの露出に際し、ワクチンサンプルと、関連する第１および第２検出可能物質の量を測定することにより決定される。もっとも望ましくは、それぞれワクチンの免疫原活性形態およびワクチンの免疫原不活性形態と結合する時に、第１および第２検出可能物質は、異なる波長の蛍光を放出し、またここでワクチンに結合する第１および第２リガンドの量の測定は、第１および第２検出可能物質により放出される蛍光を測定することにより行われる。典型的には、ワクチンサンプルはワクチン物質とアジュバントを含む。
【０００５】
望ましい実施例において、ワクチンサンプルは、第１および第２リガンドへの露出に先立ち、濾過平板内に置かれる。濾過平板は、２個またはそれ以上のウエルを含み、ここでワクチンサンプルは、少なくとも１個のウエルに置かれ、ワクチン物質を欠いている対照アジュバントは、ワクチン物質を含まない少なくとも一つのウエルに置かれ、またここで第１および第２リガンドが、プレート内のウエルに加えられる。ワクチンサンプルを含むウエルは、蛍光物質により放出される光の測定に先立ち、ワクチン物質に結合しない過剰のリガンドをワクチンサンプルを含むウエルから除去するために、第１および第２リガンドの追加の際に洗浄される。
【０００６】
本発明は、乳頭腫ウイルスワクチン、とりわけＬ１タンパク質、より詳細にはＨＰＶ−１６およびＨＰＶ−１８を含むウイルス様粒子に基づく乳頭腫ウイルスワクチンに向けられた免疫原検定の実施にとりわけ適している。
【０００７】
【望ましい実施例の詳細な説明】
本発明は、立体配座および線状エピトープＭａｂ（モノクローナル抗体）結合の組合せが、ワクチンサンプルの変性の相対状態を決定するのに役立ち得るという発見に基礎を置く。本発明は、更に立体配座エピトープの免疫原性結合と中和との相関の発見に基礎を置くものである。これらの発見に基づき、本発明の発展と連係して得られた相関データは、ワクチン開発と品質管理について従来の方法と関連する免疫原性の動物検査の必要性を排除し、またはそれを大幅に少なくするワクチンの免疫原性への代替的ルートを可能にするであろうということが考えられる。
【０００８】
本出願の発明概念は、ワクチン活性またはワクチン不活性に直接相関する各種の立体配座状態で、エピトープまたはワクチン物質の他の断片と特異的に結合するモノクローナル抗体を用いる実施にとりわけ適している。
【０００９】
本発明は、活性または不活性状態と特異的に関連し、また追跡可能物質と結合できる立体配座を持つ１個またはそれ以上の断片を持ついずれかのワクチンの試験と開発を実行できる一方、本発明はウイルス様粒子ベース乳頭腫ウイルスワクチン、とりわけＨＰＶ−１６とＨＰＶ−１８を調べることにより、以下に詳細に記載されるであろう。しかしこれらのワクチンを通じて説明される概念は、前記の仕様に基づく各種の他のワクチンに容易に一般化することができる。
【００１０】
下記の資料は、ここでその全体を引用することでここに取り込まれている。
【００１１】
ホワイト，Ｗ．Ｉ．，ウイルソン，Ｓ．Ｄ．，パーマー−ヒル，Ｆ．Ｊ．，ウッズ，Ｒ．Ｍ．，ギム，Ｓ．Ｊ．，ヒューイット，Ｌ．Ａ．，ゴールドマン，Ｄ．Ｍ．，バーク，Ｓ．Ｊ．，ジェンセン，Ａ．Ｂ．，ケーニッグ，Ｓ．，およびスージック，Ｊ．Ａ．「ヒト乳頭腫ウイルスタイプ１６Ｌ１抗体の中和は主として単一抗原ドメインを標的とする」ウイルス学ジャーナル，１９９９年６月，印刷中。
【００１２】
ローデン，Ｒ．Ｂ．Ｓ．，アームストロング，Ａ．，ヘーデラー，Ｐ．，クリステンセン，Ｎ．Ｄ．，ハバート，Ｎ．Ｌ．，ローウィ，Ｄ．Ｒ．，シラー，Ｊ．Ｔ．，およびカーンバウアー，Ｒ．「ヒト乳頭腫ウイルスタイプ１６変異体依存型中和エピトープの特徴付け」ウイルス学ジャーナル，７１巻：６２４７−５２ページ，１９９７年。
【００１３】
ホワイト，Ｗ．Ｉ．，ウイルソン，Ｓ．Ｄ．，パーマー−ヒル，Ｆ，Ｊ．，ウッズ，Ｒ．Ｍ．，ギム，Ｓ．Ｊ．，ヒューイット，Ｌ．Ａ．，ゴールドマン，Ｄ．Ｍ．，バーク，Ｓ．Ｊ．，ジェンセン，Ａ．Ｂ．，ケーニッグ，Ｓ．，およびスージック，Ｊ．Ａ．「ヒト乳頭腫ウイルスタイプ１６Ｌ１抗体の中和は主として単一抗原ドメインを標的とする」ウイルス学ジャーナル，１９９９年６月，印刷中。
【００１４】
実施例Ａ：ＨＰＶ−１６ベースワクチンの免疫原性を測定するＢ免疫検定
この実施例は、リン酸アルミニウムまたは水酸化アルミニウムアジュバント上でＨＰＶ−１６  ＶＬＰ物質をプローブするために、２個の蛍光標識モノクローナル抗体の結合を測定する抗原性検定に関する。Ｖ５モノクローナル抗体は、免疫原性（３）に必要とされることが示されたＨＰＶ−１６（ＶＬＰ）表面でのＶ５構造性エピトープに指向され、一方１８Ａ１モノクローナル抗体は、分解または変性ＨＰＶ−１６  ＶＬＰｓに主として存在する線状エピトープを認識する。このＳＯＰは、リン酸アルミニウムまたは水酸化アルミニウム粒子に吸着されたＨＰＶ−１６切形ＶＬＰ物質の免疫原性綜合評価に用いられる。
【００１５】
免疫原性のためのＶＬＰ表面でのＶ５構造性エピトープの絶対必要性を提示したホワイト他により実行された実験からの情報を利用して、我々はマウスの生体内免疫原性と相関する検定を構築することができた。各種の発現システムで主要ＨＰＶ−１６キャプシドタンパク質（Ｌ１）を過発現することにより、正しい生化学条件の下で、これらのサブユニットがウイルス様粒子（ＶＬＰｓ）に集合するがことができ、しばしば構造的にも免疫学的にも天然ウイルスに擬態することが示された。多数のモノクローナル抗体はローデン他により同定され、これらの抗体の内２個（ＨＰＶ１６．Ｅ７０およびＨＰＶ１６．Ｖ５）は真正ＨＰＶ−１６ウイルスに対し、ウイルス中和活性を有している。ホワイト他により報告されたように、野生型Ｌ１配列からの３個のアミノ酸の突然変異、それぞれ５０，２６６および３８０の位置でのフェニルアラニンからタイシン、アラニンからトレオニン、リシンからアスパラギンの各変異は、Ｅ７０またはＶ５モノクローナル抗体のいずれかで認識できなかったＶＬＰｓで生じた。またこれらの突然変異より成るＶＬＰｓで免疫化されたマウスは、免疫原性に乏しいことが発見され、また中和抗体の有意な力価を生じなかった。フェニルアラニンの野生型残基に戻るロイシンからの位置５０での単一Ｖ５エピトープアミノ酸の突然変異は、Ｖ５抗体のＶＬＰへの結合の回復だけでなく、野生型生体内Ｌ１配列への類似の抗体応答を誘出するＶＬＰの能力で生じた。
【００１６】
この検定は、アルミニウム粒子にまたは調合されていないバルクＶＬＰｓのいずれかに調合（吸着）されたＨＰＶ−１６  ＶＬＰｓで免疫原エピトープと結合する蛍光標識Ｖ５抗体を利用する。各タイプの調製に対応するために、２個の検定形態が存在する。ＶＬＰｓがリン酸アルミニウム粒子で調合された場合には、Ｖ５濾過平板形態検定は、選択の問題であった。この形態は９６ウエル濾過平板を使用し、これに小量の調合または対照アジュバント物質（ＶＬＰｓなし）が加えられる。濾過平板はマニホールド上に配設され、洗浄および分離ステップを達成するために、ウエル底部にリン酸アルミニウム粒子を蒸着するように、適度の真空が適用される。粒子を１時間胎仔ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で遮断した後に、粒子は洗浄され、蛍光標識Ｖ５または１８Ａ１モノクローナル抗体が加えられた（１８Ａ１抗体は、優先的にＨＰＶ−１６  ＶＬＰの非構造性エピトープを認識する）。平板は次いでシールされ、シェーカーに２時間３７℃で配置される。振動ステップが、懸濁状態でアルミニウム粒子を保持するために含まれ、これにより保温保持の時間を最小にする。短い洗浄ステップの後、物質の最終ペレットが多チャンネルピペットを使用して食塩加リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で再懸濁され、平板は４８５ｎｍの励起と５３０ｎｍの放出で蛍光マイクロプレートリーダーで読みとられた。生成されたＶ５および１８Ａ１信号はバックグラウンド修正され、データは修正信号として、または対照条件信号のパーセントとして表現された。濾過平板検定の導入に先立ち、各相を洗浄し分離するために、微小遠心分離を用いる遠心管ベース検定が行われた。これは濾過平板ヴァージョンで置換され、そのためより大きなサンプル処理量が可能となった。
【００１７】
Ｖ５濾過平板検定（ＤＶ−６３６３，００１版）は、リン酸アルミニウム調合ＨＰＶ−１６  ＶＬＰｓでのＶ５構造エピトープの存在を決定するために、エピトープ特異的モノクローナル抗体（Ｖ５）を使用する。更に物質は、線状エピトープ認識モノクローナル抗体（１８Ａ１）でプローブされ、これは調合ＶＬＰの構造状態についての更なる情報を提供する。この検定は９６ウエル濾過平板を使用し、これに調合または対照アジュバント物質（ＶＬＰｓなし）５０μｌが加えられる。濾過平板はマニホールドに配設され、ウエル底部にリン酸アルミニウム粒子を蒸着するように、適度の真空が適用される。粒子を１時間非特異的タンパク質（ウシ胎仔血清アルブミン）で遮断した後に、粒子はＰＢＳで洗浄され、蛍光標識されたＶ５には１８Ａ１モノクローナル抗体が加えられた。平板はシールされ、平板シェーカーで２時間３７℃で配置された。振動ステップが懸濁状態でアルミニウム粒子を保持するために加えられ、これにより保温保持の時間が最小にされた。短い洗浄ステップの後、物質の最終ペレットが多チャンネルピペットを使用して食塩加リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で再懸濁され、平板は４８５ＥＸ／５３０ＥＭで蛍光マイクロプレートリーダーで読みとられた。生成されたＶ５および１８Ａ１信号はバックグラウンド修正され、データは修正信号として、または対照条件信号のパーセントとして表現された。濾過平板検出の導入に先立ち、初期Ｖ５検定データは、リン酸アルミニウム粒子を洗浄し分離するために、微小遠心分離を用いて微小遠心管ベース検定を使用して生成された。これは濾過平板ヴァージョンで置換され、分析者によるより大きなサンプル数を効果的に試験することが可能となった。
【００１８】
中空繊維リアクターでのモノクローナル抗体の調製
Ｔ−７５フラスコ（Ｖ５）で保持された細胞が遠心分離で収穫され、その細胞型に特異的な新鮮培地に再懸濁された。凍結細胞株（１８Ａ１）は３７℃水で解凍され、２０ｍｌの暖かい培地で希釈され、細胞は１，０００ｘｇ，１０分の遠心分離で収穫された。上澄みは廃棄され、細胞ペレットは新鮮常温培地１０ｍｌに再懸濁され、２５ｍｌ組織培養フラスコで３７℃で一晩培養された。細胞フラスコは毎日検査され、栄養補給または継代培養された。
【００１９】
中空繊維製造業者の指示に従って、約３−５ｘ１０７細胞が遠心分離で収穫され、１６ｍｌ量の新鮮培地に再懸濁され、製造業者の指示に基づき、これまでに培地で馴化された中空繊維カートリッジに接種された。中空繊維システムは、もともと容器で１２５ｍｌの培地と共に供給された。細胞成長は産出される乳酸塩の量を測定することによりモニターされ、１２５ｍｌ容器は、容器培地内の乳酸塩水準がリットル当り１グラムを越えた時に、５００ｍｌおよび１Ｌ容器サイズの新鮮培地で置換された。一般にカートリッジは、１Ｌ培地容器が必要とされた時に、一度収穫することができ、それは典型的にはカートリッジの接種２週後であった。乳酸塩水準は毎日モニターされ、収穫は各培地変更の際に行われた。収穫物質は、２，０００ｘｇで１０分の遠心分離により細胞と破片の清澄化が行われ、生成上澄みは除去され、精製が行われるまで−２０℃で凍結された。各収穫物からのアリコートが、精製に先立ち、ｍＡｂの水準を決定するためにエリザにより分析された。典型的には、各中空繊維リアクターは、第２日目毎に収穫され、生産性をロスすることなく８週にわたり収穫することができた。
【００２０】
濾過平板検定についての我々の経験は、非常に短い時間期間のものが集められたが、それは検定が数ヶ月存在するだけであったためである。しかしその間に、数多くの性能特性と傾向が、方法の最適化とサンプル試験の間に決定された。検定最適化データは、検定がその発端から非常にうまく行われたために、限定されたものとなる。最適化の努力は３個の領域、すなわちサンプル量の減少、反応ウエル当り必要とされる標識抗体量の減少、および異なる遮断試薬の評価である。
【００２１】
第１の組の実験は、調合ＶＬＰ物質の量と、９６ウエル濾過平板での反応ウエル当り追加される標識抗体の量を変えることであった。ＳＢＡＳ４で調合されたＨＰＶ−１６物質は、１０、５、または２．５ｇ／ウエルの濃度の標識Ｖ５または１８Ａ１で、５または２ｇ／ｍｌ（それぞれ１２５または５０ｌ／ウエル）の濃度で試験された。検定はＳＯＰ  ＤＶ−６３６３に記載されたように実行され、但し例外は検定希釈液が更に非特異的マウスＩｇＧの０．１％（ｖ／ｖ）を含んでいたことであった。この実験の結果は表１と表２に要約されている。表１からのデータは、１８Ａ１またはＶ５抗体濃度が２．５μｇ／ウエルであることを示している。表２は、２μｇ／ｍｌのアジュバント物質で同一抗体濃度で生成されたデータを示し、類似の結果を産出する。これらの実験に基づき、ウエル当り試験するアジュバント物質の量は５０μｌ（２μｇ／ウエル）に設定され、標準Ｖ５または１８Ａ１抗体水準は２．５μｇ／ウエルに設定された。この実験で使用されたＶ５および１８Ａ１抗体のアレクサ（Ａｌｅｘａ）−４８８標識水準は、それぞれ４．３と１．１であった。
【００２２】
もとのＶ５管法は、ＢＳＡに加えて、非特異的マウスＩｇＧ２ａを遮断薬として使用した。この第２遮断薬の追加は、ＢＳＡ単独の場合よりも管検定フォーマットでより優れたバックグラウンドを産出することが発見された。この遮断手順は、検定サンプル当り使用されるＡｌＰＯ４と抗体物質の量の抜本的な減少の故で、検定フォーマットが９６ウエル濾過平板に変更された時に再度調査された。表３と表４は、遮断研究についての結果を示し、ＢＳＡ単独、またはＢＳＡと濾過検定で遮断薬と希釈剤として使用される１０μｇ／ｍｌの非特異的マウスＩｇＧ２ａを含む遮断薬の使用を比較する。この研究はＨＰＶ−１６調合抗原と、５０μｌ（２μｇ／ウエル）サンプル量、および２．５μｇ／ウエルの標識抗体量で、このシステムにとって最適であるとこれまでに決められた形で行われた。この研究で使用されたＶ５および１８Ａ１抗体のアレクサ−４８８標識水準は、それぞれ４．３と１．１であった。表３と表４で見られるように、マウスＩｇＧ２ａの除去は、各グループからの複製物の％ＣＶの減少により、また観察される信号／雑音比の増加により、検定性能を事実上改善した。従ってこれらの研究に基づき、非特異的マウスＩｇＧ２ａを濾過平板ベースＶ５検定から省略することが決定された。
【００２３】
この検定システムで観察されたもっとも重要な性能特性は、アレクサ−４８８蛍光染料でのＶ５と１８Ａ１の標識水準であった。もともと我々は、Ｖ５または１８Ａ１の１ｍｇ量を標識し、変化する標識水準を得、それはしばしばキット指示書で言及された４モル最小量以下であった。この故で、またアレクサ−４８８が自己消滅性に比較的無反応であるとの製造業者の品質説明の故で、我々はアレクサ−４８８−ＳＥ（スクシンイミジルエステル）をバルク量で購入し、そのため我々は１個の大量バルク量のＶ５または１８Ａ１抗体を標識することができた。前記の通り我々のバルク標識への努力に続き、ＤＶ−５２０４に記載されたのと基本的に同じ手順が行われ、但し、例外としては１２．５ｍｇのＶ５または１８Ａ１抗体が、販売者により注文包装された抗体とアレクサ−４８８−ＳＥと同じ割合で１個のバルク量に標識されたことが異なっていた。このバルク標識アプローチは、１８Ａ１およびＶ５それぞれのモル当りとり込みの６．７および９．４モルの標識水準を生み出した。
【００２４】
古いバッチ標識試薬に対する同一の濃度での検定にこれらバルク標識試薬を使用するに際して、ＡｌＰＯ４吸着ＨＰＶ−１６  ＶＬＰｓは、低い標識効率を持つ古い試薬が使用された時に観察されたものに比べて、非常に少ない信号を提示したことが発見された。追加の研究において、４０μｇ／ｍｌまたは４μｇ／ｍｌで吸着され（また２μｇ／ウエルおよび０．２μｇ／ウエルで試験され）たＶＬＰｓが、バルクまたはバッチ標識されたＶ５および１８Ａ１調製物で染色された。我々の結果では、より低い標識水準でのＶ５および１８Ａ１が４０μｇ／ｍｌと４μｇ／ｍｌの物質の間で期待された信号の１０倍の低下に近いものがあり、一方高度に標識されたバルクＶ５と１８Ａ１が僅か２−３．５倍の信号変調を有していたことを示した。更により低い標識水準バッチＶ５は、４０μｇ／ｍｌ  ＡｌＰＯ４吸着サンプルをプローブするために使用された時に、バルク標識Ｖ５よりも約７倍高かった。
【００２５】
類似の現象が、バルクおよびバッチ標識１８Ａ１抗体で観察された。このデータは表５で示される。我々の限定された実験から、バルク標識物質で観察された信号減少が蛍光体消滅か、または抗体結合の低下によるものであるかどうかについては明確に決定することはできないが、我々が集めた限定されたデータは、蛍光体の消滅であることを示唆している。もしも結合の低下が信号低下によるものであるとすると、バッチ：バルク信号比で同じような低下を見ることが期待されよう。例えば、Ｖ５でプローブされた４０μｇ／ｍｌの物質での６倍の信号の差が、同じように４μｇ／ｍｌ物質で観察されるに違いない。しかしこの一定の比率は観察されなかったし、それは蛍光消滅が、より高い水準でのＶＬＰ物質がプローブされた時に発生することを示唆している。仮説は、より高いＶＬＰ吸着水準で、より高度に標識されたＶ５抗体が立体的により強制された状態にあり、これがアレクサ−４８８分子をお互いに密に隣接させることを可能にする、ということである。この立体組織が、フルオレセインで報告されたものと同一のやり方で、アレクサ−４８８自己消滅を生じるものである。
【００２６】
アレクサ−４８８標識キット（ＩｇＧを標識するために特異的に設計されたもの）に関して提供された説明書は、ＩｇＧのモル当りアレクサ−４８８の４−９モルの許容カプリング範囲を述べていたけれども、我々の経験では、標識の５．４モル以上の過剰ないずれの水準でも、信号の著しい低下を生じることが示された。これは反応バイアル瓶当り２ｍｇのＩｇＧを標識したバッチ標識実験に基づくものであったが、それは標識キットの供給業者が推薦したタンパク質水準の２倍である。これは５．４モル標識比を生じ、また試験された２ＶＬＰ用量に対し満足すべき信号比である（表５参照）。我々の発見に基づき、我々は、取り込みの範囲を、抗体のモル当り４−９モルの標識から、取り込みの１−５．４モルに変更した。従ってＤＶ−５２０４は最新式に変更されるであろう。
【００２７】
Ｖ５濾過平板法を用いて生成された追加のデータが、表６で示される。図１と図２は、チメロサールありまたはなしでＡｌＰＯ４（ＳＢＡＳ４）に調合された２個のロットのＨＰＶ−１６物質を比較した時に生じたＶ５および１８Ａ１信号を示す。このデータは、チメロサールを含有しない物質と比較した時に、チメロサールを持つ調合物質は４℃で保管されたにも拘らず、Ｖ５結合能力のほぼ完全な低下を受けたことを示している（図１）。更にＶ５結合における低下は、観察された１８Ａ１結合信号の大きな増加により確証されたが（図２）、これはＶＬＰの分解を示唆している。この分解は１８Ａ１モノクローナル抗体が優先的に結合する追加の線状エピトープを露出する。
【００２８】
表６は、未標識抗体（Ｖ５）が濾過平板検定に使用することができるかどうか、従って、商業利用可能なアレクサ−４８８標識抗マウス接合体（モレキュラー・プローブス）で検出されるかどうかを決定する研究に関するデータを提供する。この研究では、調合物質（４０μｇ／ｍｌでのＭＥＤＩ−５０３．１／ＳＢＡＳ４を伴うもの）が、意図的にＶ５エピトープを分解するために、ＲＴで３０分、Ｐ−塩化水銀フェニルスルホン酸（ＰＣＭＰＳ）１ｍＭで処理された。濾過平板検定は、直接標識されたＶ５と１８Ａ１（標準方法）を用いて、また同様に抗マウスアレクサ−４８８接合体で続いて検出された異なる濃度の未標識Ｖ５を用いて行われた。表６で示されたように、２種の方法の間には明らかな相関が存在せず、それは未標識抗体の使用がＶ５濾過平板検定では実行できなかったことを示している。
【００２９】
要約すると、この実施例は詳細なＶ５濾過平板検定と、そのＶＬＰベースワクチンの抗原性を評価する使用法を提供する。
【００３０】
【表１】
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【００３１】
【表２】
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【００３２】
【表３】
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【００３３】
【表４】
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【００３４】
【表５】
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【００３５】
【表６】
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【００３６】
実施例Ｂ：ＨＰＶ−１８ベースワクチンの免疫原性を測定するＢ免疫検定
この実施例はＪ４濾過平板検定に関し、これはＨＰＶ−１８アルミニウム吸着モノバルク（ＡＭＢ）での、また調合物質でのＪ４エピトープの存在を測定する抗原性検定である。Ｊ４モノクローナル抗体は、免疫原性に必要とされるＨＰＶ−１８  ＶＬＰでのＪ４構造性エピトープに指向し、一方１８Ａ１モノクローナル抗体は、分解物質に露出された線状エピトープを認識する。ＶＬＰ物質はリン酸アルミニウム粒子または水酸化アルミニウム粒子のいずれかに吸着することができる。
【００３７】
実施例Ａに記載されたＨＰＶ−１６のために開発された検定に類似したＨＰＶ−１８のための検定を開発する一つの成果として、実験が行なわれ、ここでそれはＡｌＯＨ吸着物質がチメロサールで処理され、いくつかの構造に特異的かつ線状エピトープに特異的モノクローナル抗体で染色された。これはＶ５検定に類似した検定で潜在的に有用であるＨＰＶ−１８  ＶＬＰを除いた抗体をスクリーンするために行なわれた。このアプローチは、試験された４個の構造特異的モノクローナル抗体の内、Ｊ４エピトープだけがチメロサール処理により影響を受けたことを示唆した。構造的モノクローナル抗体Ｒ５は、チメロサール処理の結果、結合では何らの変化も示さなかった。線状エピトープ特異的モノクローナル抗体（１８Ａ１）も、チメロサール処理に応答して劇的な変化を示した。最適化されたＨＰＶ−１８抗原性検定は、Ｊ４および１８Ａ１モノクローナル抗体両方を利用する。Ｊ４検定と平行して行なわれた、続く免疫原性研究は、Ｊ４エピトープが免疫原性を必要としたという仮説を支持した。
【００３８】
Ｊ４濾過平板検定は、水酸化アルミニウムとリン酸アルミニウム調合ＨＰＶ−１８  ＶＬＰｓでの構造的エピトープの存在を決定するために、エピトープ特異的モノクローナル抗体（Ｊ４）を使用する。更に物質は、調合ＶＬＰの構造的状態についての追加の情報を提供するモノクローナル抗体（１８Ａ１）を認識する線状エピトープでプローブされる。この検定は９６ウエル濾過平板を使用し、これに対し２ｇの調合または対照アジュバント物質（ＶＬＰｓなし）が加えられる。濾過平板はマニホールドに配設され、ウエル底部にリン酸アルミニウム粒子を蒸着するように適度の真空が適用される。粒子を１時間非特異的タンパク質（ウシ胎仔血清アルブミン）で遮断した後に、粒子は食塩加リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で洗浄され、またＪ４または１８Ａ１モノクローナル抗体がウエルに加えられる。平板はシールされ、平板シェーカーで１時間３７℃で配置される。振動ステップが懸濁状態でアルミニウム粒子を保存するために使用され、これにより保温時間が最小にされた。保温後に洗浄ステップが行なわれ、蛍光標識ラビット抗マウスＩｇＧがウエルに加えられる。保温と洗浄ステップ後に、物質の最終ペレットが１２チャンネルピペットを使用して食塩加リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で再懸濁され、平板は４８５ＥＸ／５３０ＥＭで蛍光マイクロプレートリーダーで読みとられた。生成されたＪ４および１８Ａ１信号はバックグラウンド修正され、データは修正信号、または対照条件信号のパーセントとして表現された。
【００３９】
タンパク質Ａ／Ｇカラムを用いるＪ４モノクローナル抗体の精製
タンパク質Ａ／Ｇカラムと緩衝液が、使用に先立ち室温まで暖められた。凍結Ｊ４腹水が解凍され、等量のイムノピュアＩｇＧバインディングバッファーで希釈され、前もって１０ｍｌのバインディングバッファーで平衡にされたＡ／Ｇカラムに適用された。サンプルがレジンに入った後、カラムは２０ｍｌのバインディングバッファーで洗浄された。結合ＩｇＧは１０ｍｌのイムノピュアＩｇＧ溶解バッファーで溶離され、０．１分画量の１Ｍトリス，ｐＨ７．５に収集された。カラムは８ｍｌの溶解バッファー、続いていくつかのカラム量のアジ化ナトリウムを含むＰＢＳで再生され、４℃で保管された。精製抗体はセントリプレップ（ＣｅｎｔｒｉＰｒｅｐ）−３０装置を用いて３０分、３，０００ｒｐｍの遠心分離で濃縮された。抗体は次いでアジ化ナトリウム０．０２％を含む４リットルのＰＢＳで一晩４℃で透析された。抗体の濃度は１．４の吸光率でＡ２８０吸光度を使用して決定された。
【００４０】
中空繊維リアクターでの１８Ａ１とＲ５モノクローナル抗体の調製
凍結細胞株が３７℃水浴で急速に解凍され、２０ｍｌの事前に暖められた培地で希釈され、細胞は１，０００ｘｇで１０分遠心分離により収穫された。上澄みは廃棄され、細胞ペレットは１０ｍｌの新鮮培地にゆっくり再懸濁され一晩２５ｍｌ組織培養フラスコで３７℃で培養された。細胞フラスコは毎日試験され、補給または継代培養された。
【００４１】
約３−５ｘ１０７細胞が遠心分離で収穫され１６ｍｌ量の新鮮培地に再懸濁され、前もって３７℃加湿保温器で少なくとも４８時間１００ｍｌの培地で馴化された事前馴化中空繊維カートリッジに接種された。中空繊維システムは、もともと１２５ｍｌの倍地で容器に供給された。細胞成長は産出される乳酸塩の量を測定することによりモニターされ、容器培地の乳酸塩がリットル当り１グラムを越えた時点で、１２５ｍｌ容器は５００ｍｌの新鮮培地と１リットル容器サイズ、それぞれで置換された。一般にカートリッジは、１リットル培地容器が必要とされる毎に収穫できたが、それは一般にカートリッジの接種２週後であった。乳酸塩水準は毎日モニターされ、収穫は各培地変更に際して行なわれた。収穫物質は２，０００ｘｇで１０分遠心分離により細胞と破片が清澄化され、生成上澄みは除去され精製が実行されるまで−２０℃で凍結された。各収穫物からの小さなアリコートが、精製に先立ち産出されるモノクローナル抗体の水準を決定するために、直接エリザ（抗原ダウン）を用いて分析された。典型的には各中空繊維リアクターは、１日おきに収穫され、培養物は生産性の低下なしに最低８週維持することができた。
【００４２】
マクロプレップセラミックヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを使用する１８Ａ１とＲ５モノクローナル抗体の精製
モノクローナル抗体は、セラミックヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを使用して、中空繊維収穫物から精製された。２０グラムのマクロプレップセラミックヒドロキシアパタイト樹脂が再水和され、カラムは製造業者により提供される手順「スラリーパッキングを使用する小カラムのパッキング」に従って注がれた。パックカラムは、フローレート７−１０ｍｌ／分で５ベッド量（〜１００ｍｌ）の１０ｍＭ，ＰＯ４緩衝液，ｐＨ６．８で平衡化された。凍結収穫物質１管（〜３０ｍｌ）で解凍され、０．２ｍが濾過され、脱イオン水で１：４で希釈された。希釈収穫物はカラムにのせられ、２８０ｎｍの紫外線吸光度の流出が安定した基線に戻るまで平衡緩衝液で洗浄された。結合モノクローナル抗体は０−１ＭからのＮａＣｌ勾配（緩衝液Ａ＝１０ｍＭ、ＰＯ４，ｐＨ６．８；緩衝液Ｂ＝１０ｍＭ、ＰＯ４＋１Ｍ、ＮａＣｌ，ｐＨ７．２）を使用して溶離され、典型的な溶離は１８Ａ１に対しては３００−４００ｍＭ、ＮａＣｌの間で発生した。精製抗体は最終タンパク質濃度１−２ｍｇ／ｍｌまで濃縮され、１０，０００ダルトンカットオフ透析管材料を使用して、カルシウムまたはマグネシウムなしでのダルベッコ食塩加リン酸緩衝液（Ｄ−ＰＢＳ）のいくつかの変形物に対して透析された。物質の純度は、毛管ゲル電気泳動（ＣＧＥ）により決定され、絶えず９０％超の純度を有していた。カラムは１００ｍｌの４００ｍＭ，ＰＯ４，ｐＨ６．８、次いで１２０ｍｌの１Ｍ，ＮａＯＨで２ｍｌ／分の減少フローレートで洗浄することにより再生された。カラムは次いで流出ｐＨが６．８と測定されるまで１０ｍｌ／分のフローレートで４００ｍＭ，ＰＯ４，ｐＨ６．８で洗浄された。カラムは最後にアジ化ナトリウム０．０２％を含む１００ｍｌの１０ｍＭ、ＰＯ４，ｐＨ６．８で洗浄され、ＲＴで直立して保管された。
【００４３】
Ｊ４検定は、Ｖ５濾過平板検定で使用されたのと同じサンプルと抗体の濃度を採用した。検定の最適化は最小であったが、これは検定がこれらの条件を使用して効果的に行われたためであった。この方法最適化の主要な焦点は、我々の利用できるいずれかの構造特異的モノクローナル抗体が、免疫原性の予言に使えたかどうかを決定することであった。これまでに我々は、ＨＰＶ−１６免疫原性に必要とされるＶ５エピトープが、有機水銀チメロサールで物質を処理することにより分解されたことを示してきた。更なる実験では、チメロサール処理ＨＰＶ−１６物質が、もはや免疫化マウスでの抗体応答を引き出さなかったことが示された。我々の目標は、我々が接近したいずれかの構造特異的モノクローナル抗体がチメロサール処理ＨＰＶ−１８  ＶＬＰｓとの結合で損失を示したかどうか、およびその結合の損失がマウスでの免疫原性と何らかの関係を持っていたかどうかを見るために、チメロサールを手段として使用することであった。
【００４４】
リン酸アルミニウムに形成されたＨＰＶ−１８物質は、チメロサール１００μｇ／ｍｌまたは２００μｇ／ｍｌのいずれかで、３７℃で６日または１０日処理された。この物質は未処理の対照と共に、Ｊ４およびＲ５構造特異的抗体、同じく１８Ａ１線状エピトープ特異的抗体を使用して、Ｊ４検定で分析された。Ｊ４結合信号は、６日チメロサールで物質を処理した後は減少し、１０日後には完全になくなった（図１および図２）。Ｒ５信号は、チメロサール処理６日後には影響がなく、処理１０日後に僅かばかり減少した。ＨＰＶ−１６反応に類似して、１８Ａ１結合はチメロサール処理後に増加した。この結果は、Ｊ４エピトープが有機水銀分解に感受性であり、また免疫原性研究が確実に開始されることを示唆した。
【００４５】
Ｊ４エピトープが、マウスの免疫原性に必要であったという仮説を支持する最初の組のデータは、加速安定性試験を受けた後で免疫原性試験に失敗した調合ＨＰＶ−１８物質（ロット＃Ｌ９８Ｈ０７４）を試験した後で引き出された（ＳＣＷ９７１巻：５９ページ）。この物質は等濃度で対照物質と比較してみると、低水準のＪ４信号を有していた（ロット＃２０Ａｐｒ９９）。Ｒ５結合信号は影響を受けず、また１８Ａ１結合信号は上昇し、分解を示した（図３参照）。このデータは、Ｊ４エピトープが免疫原性に伴われる、という仮説を支持するものである。
【００４６】
Ｊ４モノクローナル抗体と結合するエピトープが、更に免疫原性に必要とされることを実証するために、チメロサール処理または未処理物質を使用して、マウス免疫化と平行してＪ４検定を行う必要があった。チメロサール分解が温度を上昇させた場合においてもなお数日間を必要とするために、有機水銀ＰＣＭＰＳ（ｐ−クロロ水銀フェニルスルホン酸）がそのＪ４エピトープに対する効果を試験された。この化合物は、チオール基に対する引証された効果では、チメロサールよりずっと優れた特性のある物質であった。ＨＰＶ−１８  ＶＬＰｓは２００μｇ／ｍｌのチメロサールで一晩、または１ｍＭのＰＣＭＰＳで室温で３０分のいずれかで処理された。サンプルすべてはＨＰＶ−１８抗原性（Ｊ４）濾過平板検定で分析された。チメロサール処理物質はＪ４信号を喪失し、未処理対照に比べて１８Ａ１信号を増加させた（図４参照）。ＰＣＭＰＳ処理はＪ４信号を減少させ１８Ａ１信号を増加し（図５参照）、これはチメロサール処理で観察された効果に類似していた。このデータは、ＰＣＭＰＳがチメロサールと同じＪ４エピトープに対する効果を持ち、但し運動量は加速された。
【００４７】
免疫原性におけるＪ４エピトープの役割は、調合されたＨＰＶ−１８物質が２００μｇ／ｍｌのチメロサールで処理され、平行してＪ４および免疫原性検定で試験された。表７で示されるように、２００ｎｇ用量では、血清変換率は、１：２００，４００，または８００の血清希釈ではチメロサール処理物質で僅か４０％であったが、未処理対照では同じ希釈でも１００％であった。チメロサール処理免疫原のＪ４信号は、対照（未処理）信号に標準化した場合には４９％であった。表８は、ＰＣＭＰＳを使用した追加の抗原性／免疫原性の結果を示している。この実験では、ＨＰＶ−１８物質（ＭＥＤＩ−５０４．２，ＭＪＡ  ０２Ｊｕｌ  ９９）は室温で３０分、１ｍＭのＰＣＭＰＳで処理され、次いで分解を止めるために氷中に投入された。これらのサンプルはＪ４抗原性検定を用いて分析され、またマウス当り２μｇおよび０．２μｇの用量でマウスに免疫性を与えた。表８で示されるように、２％のみのＪ４信号を持つ（未処理対照に標準化された）ＰＣＭＰＳ処理物質は、０．２μｇ用量でのいずれの血清希釈でも血清変換を引き出さなかった。能力の大きな損失が同じく２μｇ用量で観察された。Ｒ５信号は僅かばかり減少し、これは分子の何らかの構造的完全性が無傷で残っていることを示唆している。表７および表８で要約された研究は、Ｊ４エピトープが、マウスのＨＰＶ−１８  ＶＬＰ免疫原性（潜在力）に必要であることを強力に示唆している。
【００４８】
【表７】
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【００４９】
【表８】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  モノクローナル抗体１８Ａ１がいかに変性抗原に選択的に結合するかを示す図。
【図２】  ＰＣＡＭＰＳの抗原性に対する効果を示す図。
【図３】  ＰＣＭＰＳの免疫原性に対する影響を示す図。
【図４】  ＳＢＡＳを伴うＡｌＰＯ４に調合されたＨＰＶ−１６物質からのＶ５抗体信号の、チメロサールあり（Ｌ９８Ｈ０７２）およびチメロサールなし（Ｌ９９Ｃ０５８）で調合された物質との比較を示す図。両物質はＶ５濾過平板検定での試験に先立ち、４℃で保管された。その結果は、試験の際のＬ９８Ｈ０７２物質が、同じＶＬＰ濃度（４０μｇ／ｍｌ）での新鮮調合物質と比較した時、Ｖ５信号を殆んど検出できなかったことを示している。
【図５】  ＡｌＰＯ４に調合されたＨＰＶ−１６物質からの１８Ａ１抗体信号（ＩＲＬ＃１８２８）のチメロサールあり（Ｌ９８Ｈ０７２）およびチメロサールなし（Ｌ９９Ｃ０５８）で調合された物質との比較を示す図。両物質はＶ５濾過平板検定での試験に先立ち、４℃で保管された。その結果は、試験の際のＬ９８Ｈ０７２物質が、異常に高い１８Ａ１信号を有し、ＶＬＰの破損を示唆していることを示している。
【図６】  Ｊ４，Ｒ５，および１８Ａ１モノクローナル抗体結合パターンに対するチメロサール処理の効果を示すＪ４濾過平板検定からのデータを示す図。エラーバーは検定での３回のランでの標準エラーを表わしている。
【図７】  チメロサール処理サンプルでＪ４抗体結合の劇的な損失を示す３７℃でのチメロサール処理１０日後のＪ４検定データを示す図。エラーバーは検定での３回のランでの標準エラーを表している。
【図８】  ８ヶ月の加速安定性時点で免疫原性試験を失敗したＪ４濾過平板検定試験ＭＥＤＩ−５１７（ロットＬ９８Ｈ０７４）からの結果を示す図。同じロットから対照物質が留保されなかったので、同じＨＰＶ−１８濃度での追加ロットの物質が調製され、対照として使用された。エラーバーはＪ４検定での３回のランの標準エラーである。
【図９】  Ｊ４濾過平板検定で試験されるＨＰＶ−１８物質のＪ４エピトープに対する、チオール特異的有機水銀ｐ−クロロ水銀フェニルスルホン酸（ＰＣＭＰＳ）の効果を示す図。エラーバーはＪ４検定での３回のランの標準エラーを表す。
【図１０】  ４０℃への温度上昇でのＪ４エピトープに対するチメロサール一晩処理の効果を示す図。Ｊ４エピトープの損失は、３７℃以上の保管条件で非常に加速され、それは同程度の損失を達成するためにほぼ１０日を要した。エラーバーはＪ４検定での３回のランの標準エラーを表わす。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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