(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
固体支持体の表面に直接形成されたアミノ基、チオール基およびヒドロキシル基のいずれか１つの基とポリ無水物とが化学結合により固定化され、かつアミノ基を有する分子量２００〜１００００のエチレングリコール化合物およびポリエチレングリコール化合物の少なくとも一方と、前記ポリ無水物とが化学結合により固定化され、アミノ基およびカルボキシル基を表面に有するマイクロアレイ用基板。
【請求項２】
前記ポリエチレングリコール化合物は、星型または直鎖型の分子であることを特徴とする、請求項１に記載のマイクロアレイ用基板。
【請求項３】
前記ポリ無水物は、ポリ（エチレン−アルト−マレイン酸無水物）であることを特徴とする、請求項１または２に記載の基板。
【請求項４】
前記ポリ（エチレン−アルト−マレイン酸無水物）の分子量は、１２８〜１０，０００，０００であることを特徴とする、請求項３に記載のマイクロアレイ用基板。
【請求項５】
前記固体支持体は、シリコン、ガラス及びプラスチック物質からなる群から選択される少なくとも一つからなることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載のマイクロアレイ用基板。
【請求項６】
前記固体支持体は、アミノ基含有化合物でコーティングされることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載のマイクロアレイ用基板。
【請求項７】
前記固体支持体は、ガンマ−アミノプロピルトリエトキシシラン、またはガンマ−アミノプロピルジエトキシシランでコーティングされることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載のマイクロアレイ用基板。
【請求項８】
前記固体支持体は、ガンマ−アミノプロピルトリエトキシシランでコーティングされることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載のマイクロアレイ用基板。
【請求項９】
アミノ基含有化合物を含む表面を有する固体支持体を調製する工程（ａ）と、
前記固体支持体の表面のアミノ基にポリ無水物を化学結合により固定化させる工程（ｂ）と、
前記工程（ｂ）でポリ無水物が固定化された固体支持体に、少なくとも一方の末端にアミノ基を有し、かつ分子量２００〜１００００のエチレングリコール化合物およびポリエチレングリコール化合物の少なくとも一方をコーティングする工程と（ｃ）、
を含むマイクロアレイ用基板の製造方法。
【請求項１０】
前記工程（ｃ）のポリエチレングリコール化合物は、星型または直鎖の分子であることを特徴とする、請求項９に記載のマイクロアレイ用基板の製造方法。
【請求項１１】
前記工程（ｃ）のポリ無水物は、ポリ（エチレン−アルト−マレイン酸無水物）であることを特徴とする、請求項９または１０に記載のマイクロアレイ用基板の製造方法。
【請求項１２】
前記ポリ（エチレン−アルト−マレイン酸無水物）の分子量は、１２８〜１０，０００，０００であることを特徴とする、請求項１１に記載のマイクロアレイ用基板の製造方法。
【請求項１３】
前記固体支持体は、シリコン、ガラス及びプラスチック物質から選択される少なくとも一つであることを特徴とする請求項９〜１２のいずれか１項に記載のマイクロアレイ用基板の製造方法。
【請求項１４】
前記アミノ基含有化合物は、ガンマ−アミノプロピルトリエトキシシラン、またはガンマ−アミノプロピルジエトキシシランであることを特徴とする、請求項９〜１３のいずれか１項に記載のマイクロアレイ用基板の製造方法。
【請求項１５】
請求項１〜８のいずれか１つに記載のマイクロアレイ用基板または請求項９〜１４のいずれか一つの製造方法により得られたマイクロアレイ用基板にプローブ生体分子を固定化したマイクロアレイ。
【請求項１６】
前記プローブ生体分子は、核酸であることを特徴とする請求項１５に記載のマイクロアレイ。
【請求項１７】
請求項１５または１６に記載のマイクロアレイを利用して標的生体分子を分析する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロアレイ用基板及びその製造方法に係り、具体的には、ポリ無水物重合体の表面を有する固体支持体に、官能基が導入されたエチレングリコールまたはポリエチレングリコール化合物がコーティングされたマイクロアレイ用基板及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
マイクロアレイは、特定分子が支持体上に一定の面積に高密度に固定化されていることを称す。このようなマイクロアレイには、ポリヌクレオチドまたは蛋白質マイクロアレイなどが含まれる。「ポリヌクレオチドマイクロアレイ」とは、支持体上にポリヌクレオチドが高密度に固定化されているものであって、前記ポリヌクレオチドは、それぞれ一定の領域に固定化されているマイクロアレイを意味する。このようなマイクロアレイは、当業界に公知のものである。マイクロアレイについては、特許文献１及び２に開示されている。
【０００３】
固体支持体上にポリヌクレオチドの固定化する方式は、支持体上で直接的に合成する方式と、既に合成されたポリヌクレオチドを一定の位置に固定化させる方法（スポッティング法）とが知られている。このようなポリヌクレオチドマイクロアレイの製造方法は、例えば、特許文献２、３及び４に開示されている。ポリヌクレオチドマイクロアレイ及びその製造方法についての前記文献は、援用によって本明細書にその全体として含まれる。また、スポッティング方法が広く使われている。しかし、スポッティング方法は、生体分子を共有的に固体支持体上に固定化するのに使われている。例えば、支持体上の表面をアミノ基のような親核性官能基に活性化させ、それを良い離脱基に活性化されたポリヌクレオチドのような生体分子とカップリング反応させた後、反応しない反応物を除去することによって生体分子を固体支持体上に固定化する過程が広く利用されてきた。
【０００４】
また、ポリエチレングリコールは、親水性化合物としてマイクロアレイに使われた例がある。例えば、特許文献５には、末端にエポキシ基を有する星型のポリエチレングリコール誘導体で構成されるヒドロゲルにプローブポリヌクレオチドを固定化してマイクロアレイを製造する方法が開示されている。
【特許文献１】米国特許第５，４４５，９３４号明細書
【特許文献２】米国特許第５，７４４，３０５号明細書
【特許文献３】米国特許第５，１４３，８５４号明細書
【特許文献４】米国特許第５，４２４，１８６号明細書
【特許文献５】米国特許公開第２００３−０１０８９１７Ａ１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、プローブの固定化効率を向上し、標的生体分子及び蛋白質が支持体上に非特異的に結合することを減少させるマイクロアレイ用基板を提供することである。
【０００６】
本発明の他の目的は、前記マイクロアレイ用基板を製造する方法を提供することである。
【０００７】
本発明のさらに他の目的は、前記マイクロアレイ用基板にプローブ生体分子を固定化させたマイクロアレイ及び前記マイクロアレイを利用して標的生体分子を分析する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記本発明の目的を達成するために、本発明は、官能基を有するエチレングリコール化合物およびポリエチレングリコール化合物の少なくとも一方が、ポリ無水物で修飾された表面を有する固体支持体にコーティングされたマイクロアレイ用基板を提供することである。
【０００９】
前記本発明の他の目的を達成するために、本発明は、アミノ基含有化合物を含む表面を有する固体支持体を調製する工程（ａ）と、
前記固体支持体の表面にポリ無水物を固定化させる工程（ｂ）と、
前記工程（ｂ）でポリ無水物が固定化された固体支持体に、官能基が導入されたエチレングリコール化合物およびポリエチレングリコール化合物の少なくとも一方をコーティングする工程と（ｃ）、を含むマイクロアレイ用基板の製造方法を提供することである。
【００１０】
前記本発明のさらに他の目的を達成するために、本発明は、ポリ無水物重合体の表面を有する固体支持体に、官能基を有するエチレングリコール化合物およびポリエチレングリコール化合物の少なくとも一方がコーティングされたマイクロアレイ用基板にプローブ生体分子を固定化したマイクロアレイ及びこのようなマイクロアレイを利用して生体分子を分析する方法を提供することである。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によるマイクロアレイ用基板を使用すれば、プローブの固定化効率を向上させると同時に、標的生体分子及び蛋白質の非特異的結合を防止し、プローブを基板に固定した後に、後処理工程なしに精製されていないＰＣＲ試料を直接基板に適用できて、工程の単純化を達成することによって低コストでチップを製作し、生体分子を分析しうる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明によるマイクロアレイ用基板は、固体支持体の表面をポリ無水物で修飾させた後、官能基を有するエチレングリコール化合物およびポリエチレングリコール化合物の少なくともいずれか一方にコーティングされるものである。
【００１３】
本発明において、固体支持体の材質は、特別に限定されず、固体相のもので表面を提供できるものならば、何れも含まれる。例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリウレタン、ポリオレフィンのようなプラスチック物質、ガラス、シリコン、シリコンウェーハ及びこれらの改質された基板が含まれうる。
【００１４】
本発明において、前記固体支持体は、アミノ基、チオール基またはヒドロキシ基のような水素結合供与能を有する官能基を有するものであってよく、基板材質の特性上かかる官能基を有しているか、またはコーティングのような化学的または物理的処理によってかかる官能基が導入されてもよい。また、本発明において、前記固体支持体は、アミノ基を有することがより好ましい。
【００１５】
本発明において、固体支持体は、アミノ基、チオール基またはヒドロキシル基などの官能基含有化合物でコーティングされることが望ましく、なかでも、アミノ基含有化合物でコーティングされることがより好ましい。このようなアミノ基としては、ガンマ−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＧＡＰＳ）、ガンマ−アミノプロピルジエトキシシラン（ＧＡＰＤＥＳ）及びアミノへキシル基が含まれうるが、これらの例に限定されるものではない。本発明において、望ましい固体支持体は、ＧＡＰＳでコーティングされたものである。
【００１６】
本発明に係るマイクロアレイ用基板の製造に使用されるポリ無水物としては、ポリ（エチレン−グラフト−マレイン酸無水物）、ポリ（イソブチレン−アルト−マレイン酸無水物）、ポリ［（イソブチレン−アルト−マレミド）−ｃｏ−イソブチレン−アルト−マレイン酸無水物］などがあり、望ましくは、ポリ（エチレン−アルト−マレイン酸無水物）である。ポリ（エチレン−アルト−マレイン酸無水物）の場合、その分子量は、１２８ないし１０，０００，０００であることが望ましく、１００，０００ないし５００，０００であることが最も望ましい。
【００１７】
なお、本明細書におけるポリ無水物の分子量は、重量平均分子量であって、例えば光散乱法、ＴＯＦＦＭＡＳＳなどの質量分析器、液クロマトグラフィー、ｇｅｌ  ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａ．ｐｈｙ，ＧＰＣ，、粘度測定などによって測定できる。
【００１８】
本発明において、ポリ無水物で修飾された固体支持体を、官能基を有する（ポリ）エチレングリコール化合物でコーティングする。ここで、エチレングリコール化合物およびポリエチレングリコール化合物の少なくともいずれか一方（本明細書では（ポリ）エチレングリコール化合物とも称する。）に導入された官能基は、アミノ基、チオール基、アルコール基、エポキシ基またはエステル基であることが望ましく、アミノ基であることがさらに望ましい。
【００１９】
なお、これらの官能基は単独あるいは２種以上の混合物の形態で（ポリ）エチレングリコール化合物に存在してもよい。
【００２０】
また、官能基を有する（ポリ）エチレングリコール化合物には、少なくとも一つの官能基が（ポリ）エチレングリコール内に直接化学結合されていることが好ましい。
【００２１】
また、前記エチレングリコール化合物およびポリエチレングリコール化合物の少なくともいずれか一方の分子量は、６０ないし１０，０００，０００、望ましくは、２００ないし１，０００，０００、さらに望ましくは、２００ないし１０，０００である。
【００２２】
なお、本明細書における（ポリ）エチレングリコール化合物の分子量は、重量平均分子量であって、例えば光散乱法、ＴＯＦＭＡＳＳなどの質量分析器、液クロマトグラフィー、ｇｅｌ  ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａ．ｐｈｙ，ＧＰＣ，、粘度測定などによって測定できる。
【００２３】
また、前記ポリエチレングリコール化合物は、星型または直鎖の分子であることが好ましい。
【００２４】
なお、本明細書における「官能基を有するエチレングリコール化合物」とは、一つのエチレングリコール分子内に２個のヒドロキシル基以外に少なくとも一つの官能基を有するエチレングリコールだけではなく、エチレングリコールの少なくとも一つの水酸基の水素がアミノ基と置換されたものを言う。また、本明細書における「官能基を有するエチレングリコール化合物」とは、ポリエチレングリコール分子内において、少なくとも一つの官能基を有するものをいう。
【００２５】
本発明に係る製造方法は、アミノ基含有化合物を含む表面を有する固体支持体を調整する工程と（ａ）、前記固体支持体の表面にポリ無水物を固定化させる工程と（ｂ）、前記工程（ｂ）でポリ無水物が固定化された固体支持体に、官能基を有するエチレングリコール化合物およびポリエチレングリコール化合物の少なくとも一方をコーティングする工程と（ｃ）、を含むマイクロアレイ用基板の製造方法である。
【００２６】
このような基板を製造するために、まずアミノ基含有化合物（望ましくは、ＧＡＰＳ、ＧＡＰＤＥＳまたはアミノへキシル基であり、最も望ましくは、ＧＡＰＳ）でコーティングされた固体支持体を準備する。この工程は、アミノ基を有する基板を商業的に購入するか、またはコーティングのような化学的または物理的処理によってかかるアミノ基を導入する工程を通じて、前記のような固体支持体を準備しうる。
【００２７】
アミノ基を含有化合物でコーティングされた固体支持体が準備されれば、ポリ無水物（望ましくは、ポリ（エチレン−アルト−マレイン酸無水物））を前記固体支持体の表面に固定化させる（図１参照）。一般的に、前記ポリ無水物は、固体基材の表面に存在するアミン官能基に連結することによって固定化される。すなわち、ポリ無水物とアミノ基含有化合物とを化学反応によって化学結合させることで固定化することが好ましい。
【００２８】
固体支持体の表面にポリ無水物が固定化されれば、アミノ基を有するエチレングリコール化合物およびポリエチレングリコール化合物の少なくともいずれか一方で前記固体基材の表面をコーティングする。この工程で、アミノ基が導入されたエチレングリコール化合物およびポリエチレン化合物の少なくとも一方は、ポリ無水物でコーティングされた固体支持体の表面と反応するが、具体的にポリ無水物中の無水物残基は、エチレングリコール化合物および／またはポリエチレン化合物中のアミノ基と反応して、カルボキシル基を生成させる。その結果、本発明による基板の表面には、多量のエチレングリコールまたはポリエチレングリコール、アミノ基及びカルボキシル基が生成される。アミノ基を有するエチレングリコール化合物およびポリエチレングリコール化合物の少なくともいずれか一方は、当業界に公知の方法で製造されうる。前記エチレングリコール化合物またはポリエチレングリコール化合物の高分子鎖の少なくとも一端にはアミノ基を有することが好ましく、また前記エチレングリコール化合物またはポリエチレングリコール化合物は、可能な限り多くのアミノ基を含むことが望ましい。
【００２９】
また、前記エチレングリコール化合物またはポリエチレングリコール化合物にアミノ基は少なくとも１個含まれていることが好ましく、前記エチレングリコール化合物またはポリエチレングリコール化合物にアミノ基が総て置換されていることが最も好ましい。
【００３０】
上記反応条件は、例えば製造されたアミノ基でコーティングされたシリコンウェーハ基板上の表面をポリ無水物で固定化された基板を、Ｎ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）中の合成されたアミノ残基を含むポリエチレングリコール（２００ｍＭ）と３００ｍＭの水に浸漬して加水分解した後、エタノールとアセトンとで洗浄し乾燥することにより、エチレングリコールに置換されたアミノ基とカルボキシル基が同時にコーティングされた本発明に係るマイクロアレイ用基板を製造する（図４参照）。
【００３１】
前記のように製造されたマイクロアレイ用基板は、その表面にアミノ基が多数存在するためでプローブ生体分子の固定化能力が向上し、また、その表面のエチレングリコール及びカルボキシル基は、混成化反応のｐＨ条件下で固定化されたプローブ外の基板表面に標的生体分子が非特異的に吸着される現象を防止し、蛋白質が基板に非特異的に結合することも防止するため、プローブの固定後、背景遮断工程などの後処理工程や細胞破壊及びＰＣＲ反応以後に精製工程を経ずに分析混成化工程を行えるようになって、全体工程を単純化できて低コストでチップを製作し、生体分子を分析しうる。
【００３２】
さらに、本発明は、前記基板にプローブ生体分子を固定化させたマイクロアレイ及び前記マイクロアレイを利用して標的生体分子を分析する方法に関する。
【００３３】
本発明において、生体分子は、生物から由来する化合物であって、例えば、核酸、蛋白質、多糖類及びそれらの組合わせからなる分子で構成される群から選択されるものであり、望ましくは、核酸である。このような核酸には、ＤＮＡまたはＲＮＡが含まれる。本発明において、固体基板上に固定化される生体分子は、一般的に分析しようとする標的分子と特異的に反応する特性を有していることが一般的である。例えば、前記生体分子が核酸である場合、相補的なヌクレオチド配列を有する標的核酸と混成化反応とを通じて相互反応できる。前記生体分子が蛋白質である場合、抗原及び抗体反応、リガンド及び受容体との間の相互反応、酵素と気質との間の相互反応を通じて相互特異的に相互作用できる。また、前記生体分子が多糖類である場合、多糖類を認知するレクチンのような蛋白質または抗体によって特異的に認知できる。このような生体分子と標的分子の特異的相互作用及びこのような相互作用の結果を検出できる検出システムを利用して、本発明の生体分子を基板上に固定化する方法によって得られる生体分子マイクロアレイを多様な分析に使用できる。
【００３４】
本発明において、固定化に使われる生体分子の濃度は、それぞれの反応条件によって変わり、また、得ようとするデータの種類によって異なりうる。したがって、反応に使われる生体分子の濃度は、特別に制限されるものではない。本発明の一具体例で、生体分子がＤＮＡである場合、２０μＭないし１００μＭの濃度で使われうるが、このような濃度範囲に限定されるものではない。
【００３５】
本発明において、本発明による基板上に生体分子を固定化する方法は、既知のＤＮＡまたは蛋白質のマイクロアレイを製造するために使われる通常の方法によって行われうる。このようなマイクロアレイの製造方法には、一般的に、フォトリソグラフィを利用する方法が知られている。フォトリソグラフィを利用する場合、除去可能な基で保護された単量体が塗布された基板表面上の一定領域をエネルギー源に露出させて保護基を除去し、除去可能な基で保護された単量体をカップリングさせる工程を反復することによって、ポリヌクレオチドのアレイを製造しうる。この場合、ポリヌクレオチドマイクロアレイ上に固定化されるポリヌクレオチドは、単量体を一つずつ延長させる方式で合成するか、または既に合成されたポリヌクレオチドを一定位置に固定化させる方法によって固定化しうる（スポッティング法）。
【実施例】
【００３６】
以下、本発明を実施例を通じてさらに詳細に説明する。
実施例１：本発明による基板及び対照群基板の製造
（１）本発明による基板の製造
（ａ）ＧＡＰＳでコーティングされたシリコン基板表面上にポリ無水物の固定化
本発明による基板を製造するために、まずＧＡＰＳでコーティングされたシリコンウェーハ基板（ＬＧシルトロン、韓国）をＮ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）のうち、２００ｍＭ（反復単位基準）のポリ（エチレン−アルト−マレイン酸無水物）（分子量１００，０００ないし５００，０００）に室温で１時間浸漬した後、アセトン及びエタノールで洗浄し、真空下で乾燥した（図１参照）。
（ｂ）アミノ基が導入されたポリエチレングリコールの製造
ポリエチレングリコールを基本骨格とし、アミノ基を含むポリエチレングリコール化合物を製造したところ、その具体的な製造方法は、図２に示されている。
【００３７】
化学式２の化合物の製造
出発物質である化学式１の化合物であるポリエチレングリコール（ＥＯ／ＯＨ＝１５／４）（１当量）をトリエチルアミン（ＴＥＡ）（５ｇ、６当量）、ＤＭＦ溶媒（２０ｍｌ）及び塩化トシル（ＴｓＣｌ）（７．１ｇ、６当量）の存在下で１２０℃で３時間反応させた後、薄層クロマトグラフィー（Ｔｈｉｎ  Ｌａｙｅｒ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ＴＬＣ）；溶離液の組成：ＣＨＣｌ３のうちの１０％のメタノール）で出発物質であるポリエチレングリコールが全部除去されたことを確認した。
【００３８】
その後、反応溶液を塩化メチレン（１０ｍｌ）で希釈して分液漏斗に移した。その分液漏斗で、水を利用してＤＭＦ及び塩化メチレンを抽出し、回転式蒸発装置を利用して溶媒を除去した後、フラッシュカラムクロマトグラフィー測定を行った。フラッシュカラムクロマトグラフィーは、カラムにシリカゲルを充填させて加圧した後、シリカゲル上に前記溶媒の除去された抽出物をローディングした後、１０％のメタノール／９０％のクロロホルムの溶媒を利用して空気で押し出して行われた。その結果、化学式２の化合物を製造した。
【００３９】
化学式３の化合物の製造
ＤＭＦのうち、化学式２の化合物（１当量）及びアジ化ナトリウム（ＮａＮ３）（１０当量）をＴＥＡ（１０当量）の存在下で１００℃、一晩反応させた後、薄層クロマトグラフィー（溶離液の組成：ＣＨＣｌ３中の８％のメタノール）で化学式２の化合物が除去されたことを確認した。
【００４０】
その後、反応溶液を塩化メチレン（１０ｍｌ）で希釈して分液漏斗に移した。その分液漏斗で、水を利用してＤＭＦ及び塩化メチレンを抽出し、回転式蒸発装置を利用して溶媒を除去した後、前記と同じ方法でフラッシュカラムクロマトグラフィー測定を行って化学式３の化合物を製造した。
【００４１】
化学式４の化合物の製造
メタノール溶媒（２０ｍｌ）及びＰｄ／Ｃ触媒（１０当量）の存在下で、化学式３の化合物（５ｇ）とＨ２とを反応させてアミン残基を含むポリエチレングリコール（化学式４の化合物）を製造した。薄層クロマトグラフィー（溶離液の組成：ＣＨＣｌ３中の８％のメタノール）で化学式３の化合物が除去されたことを確認した（Ｒｆ値が０に落ちる）。
【００４２】
その後、反応溶液をセライトパッドを利用して濾過した後、回転蒸発器で溶媒を除去して化学式４の化合物を製造した。
【００４３】
化学式１ないし４の化合物は、クロロホルム溶媒下でそれぞれブルカー５００ＭＨｚを利用して１Ｈ  ＮＭＲと確認したところ、その結果は、それぞれ図３Ａないし図３Ｄの通りである。
【００４４】
（ｃ）本発明による基板の製造
前記（ａ）で製造されたアミノ基でコーティングされたシリコン基板上の表面をポリ無水物に固定化させた基板を、ＮＭＰ中の前記（ｂ）で製造されたアミノ基を含むポリエチレングリコール（２００ｍＭ）／水（３００ｍＭ）溶液に浸漬して加水分解させた後、エタノール及びアセトンで洗浄して乾燥することによって、ポリエチレングリコールに導入されたアミノ基とカルボキシルとが同時にコーティングされた本発明によるマイクロアレイ用基板を製造した（図４参照）。
【００４５】
（２）対照群基板の準備
以下、実施例では、対照群基板としてＧＡＰＳでコーティングされたシリコン基板を使用した。
【００４６】
実施例２：基板上にプローブＤＮＡを固定化することによってポリヌクレオチドマイクロアレイの製造
前記実施例１で製造された基板上に５’末端が官能基化されたＤＮＡを利用してＤＮＡが前記基板上にスポットのグループに配列されたＤＮＡマイクロアレイを製造した。
【００４７】
まず、スポッティング溶液を製造したが、溶液の組成は、ホルムアミド５０％、ＮａＨＣＯ３（０．１Ｍ、ｐＨ１０）中のポリエチレングリコール（分子量１０，０００）溶液２５％、及び５’末端がアミノ基（ＮＨ２）に官能基化された配列番号：１のポリヌクレオチドプローブ溶液２５％でなされ、ＤＮＡ最終濃度を２０μＭにした。
【００４８】
このように得られた各プローブポリヌクレオチド溶液を前記シリコン基板上にカルテシアン社製のＰｉｘ５５００スポッタを利用してスポッティングし、７０℃の温度、４０％の湿度で１時間恒温恒湿器内で固定化反応を行った。反応が終結された後、前記基板を蒸溜水で洗浄した後、残りのアミノ基を無水コハク酸（遮断剤）で保護した後、エタノールで洗浄した後にスピン乾燥してプローブポリヌクレオチドが固定化されたマイクロアレイを製造し、それを“本発明によるマイクロアレイ１”と命名した。
【００４９】
一方、“対照群マイクロアレイ１”は、前記実施例１（２）で準備されたＧＡＰＳでコーティングされたシリコン基板を使用して、前記と同じ方法を行うことによって製造された。
【００５０】
実施例３：プローブポリヌクレオチドの固定化効率
本実施例では、実施例２で製造された本発明によるマイクロアレイ１を利用して、基板上に固定化されたプローブポリヌクレオチドと標的ＤＮＡとの間の混成化反応を起こし、その結果を検出することによって、本発明の方法によって製作されたマイクロアレイにプローブの固定化効率を確認した。
【００５１】
まず、分析に使われる標的ＤＮＡは、５’末端が−ＮＨ２−Ｃｙ３である配列番号：２のオリゴヌクレオチドを使用した。
【００５２】
１５μｌの標的ＤＮＡ（１００ｐＭ）を１．５ｍＬのチューブに入れて、各１０秒間ボルテキシングし、遠心分離した。
【００５３】
これを９４℃の加熱ブロックで５分間変性させた後、氷に入れた。その後、氷に入れた状態で混成化緩衝溶液（ＮａＨ２ＰＯ４Ｈ２Ｏ  １３８ｇ、ＮａＣｌ  ８７６ｇ、０．５Ｍ  ＥＤＴＡ２００ｍｌ、１０Ｎ  ＮａＯＨ  １００ｍｌの混合液を希釈した溶液）１６μｌを入れて総３２μｌにする。１０秒間ボルテキシングし、１０秒間遠心分離した後、本発明によるマイクロアレイ１及び対照群マイクロアレイ１に４２℃で１時間反応させた。反応後、洗浄液Ｉ（１ＸＳＳＰＥＴ）及び洗浄液ＩＩ（３ＸＳＳＰＥＴ）でそれぞれ５分ずつ洗浄して乾燥した後、Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社のＧｅｎｅＰｉｘ  ４０００Ｂスキャナーで測定してイメージを生成し、ＧｅｎｅＰｉｘプロソフトウェア（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ＵｎｉｏｎＣｉｔｙ，ＣＡ）を利用してイメージ分析を行った。得られたイメージデータと蛍光度データとを図５Ａ及び図５Ｂに示したところ、このような結果は、５３２ｎｍ（ＰＭＴ５６０）で観察された蛍光度を表す。
【００５４】
その結果、本発明によるマイクロアレイ１は、対照群マイクロアレイ１に比べてそのプローブの固定化が３００％以上高く（背景補正前）、背景補正後にも対照群マイクロアレイ１に比べて３０％以上プローブの固定化が向上するということを確認した。
【００５５】
実施例４：本発明による基板の蛋白質結合能の確認
実施例１で製造された本発明による基板及び対照群基板上に、標準蛋白質であるＦＩＴＣ−標識されたＢＳＡ水溶液（１ｍｇ／ｍｌ）５００μＬを添加し、蓋を覆って室温で２分間放置した後、蒸溜水で洗浄して蛍光度を測定した。
【００５６】
Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社のＧｅｎｅＰｉｘ  ４０００Ｂスキャナーを利用して５３２ｎｍ（ＰＭＴ５６０）で測定してイメージを生成し、ＧｅｎｅＰｉｘプロソフトウェア（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ＵｎｉｏｎＣｉｔｙ，ＣＡ）を利用してイメージ分析を行った。その結果は、下記表１及び図６に示した。
【００５７】
【表１】
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【００５８】
前記結果によれば、本発明による基板を利用する場合、蛋白質の非特異的な結合が顕著に減少したところ、対照群基板に比べて９６％以上減少した。
【００５９】
実施例５：後処理不在による標的ＤＮＡの非特異的な結合の確認
プローブを配列番号：１のオリゴヌクレオチドの代わりに、配列番号：３ないし５の３種類のオリゴヌクレオチドを使用するという点、及びプローブを固定化した後に残りのアミノ基を保護するための工程（無水コハク酸（遮断剤）を利用してアミノ基を保護する反応）を行えない点を除いては、実施例２に記載の本発明によるマイクロアレイ１の製造方法と同一に行って“本発明によるマイクロアレイ２”及び“対照群マイクロアレイ２”を製造した。
【００６０】
標的ＤＮＡとしては、呼吸器バクテリアであるステフィロコクスの１６Ｓ  ｒＲＮＡ及び２３Ｓ  ｒＲＮＡに該当する配列を有するように製作された。
【００６１】
１６Ｓ  ｒＲＮＡに該当する標的ＤＮＡは、配列番号：６及び７のオリゴヌクレオチドをそれぞれ順方向及び逆方向プライマーとして使用してＰＣＲを行い、２３Ｓ  ｒＲＮＡに当該標的ＤＮＡは、配列番号：８及び９のオリゴヌクレオチドをそれぞれ順方向及び逆方向プライマーとして使用してＰＣＲを行った。
【００６２】
前記で増幅された標的ＤＮＡは、それぞれ５’末端をＣｙ５と標識した後、精製せずに本発明によるマイクロアレイ２及び対照群マイクロアレイ２に対して混成化反応を行った。混成化反応は、実施例３に記載されたように行った。
【００６３】
前記で製造された本発明によるマイクロアレイ２を混成化工程以前及び以後にそれぞれＡｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社のＧｅｎｅＰｉｘ  ４０００Ｂスキャナーを利用して５３２ｎｍで測定してイメージを生成し、ＧｅｎｅＰｉｘプロソフトウェア（ＡｘｏｎＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ＵｎｉｏｎＣｉｔｙ，ＣＡ）を利用してイメージ分析を行った。その結果は、下記表２及び図７の通りである。
【００６４】
【表２】
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【００６５】
基板上にプローブを固定化した後、基板上に残っているアミノ基を保護せずに混成化反応を行った結果、対照群マイクロアレイ２の場合、自発光が１５０％以上増加した一方、本発明によるマイクロアレイ２を使用した場合、自発光が３０％しか増加していない。
【００６６】
したがって、本発明によるマイクロアレイの場合、プローブを基板に固定した後、基板表面上に露出されている他のアミノ基を保護する後処理工程を行わずともＤＮＡがマイクロアレイ基板に非特異的に結合する現象が顕著に減速したということを確認した。
【００６７】
以上、前述したように、本発明によるマイクロアレイ用基板を使用すれば、標的生体分子及び蛋白質の非特異的結合を顕著に減少させてプローブを基板に固定化した後に、後続工程なしに精製されていないＰＣＲ試料を直接適用できて、工程の単純化を達成できる。
【００６８】
前記では本発明の望ましい実施例を参照して説明したが、当業者は、特許請求の範囲に記載された本発明の思想及び領域から逸脱しない範囲内で本発明を多様に修正及び変更させうるということが分かるであろう。
【産業上の利用可能性】
【００６９】
本発明は、半導体基板関連の技術分野に適用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】ＧＡＰＳがコーティングされた固体支持体にポリ（エチレン−アルト−マレイン酸無水物）を固定化させる反応を示す図面である。
【図２】ポリエチレングリコールにアミノ基を導入する反応を示す図面である。
【図３Ａ】ポリエチレングリコールの表面にアミノ基を導入する反応での開始化合物である化学式１の化合物の１Ｈ  ＮＭＲ結果を示す図面である。
【図３Ｂ】ポリエチレングリコールの表面にアミノ基を導入する反応での中間産物である化学式２の化合物の１Ｈ  ＮＭＲ結果を示す図面である。
【図３Ｃ】ポリエチレングリコールの表面にアミノ基を導入する反応での中間産物である化学式３の化合物の１Ｈ  ＮＭＲ結果を示す図面である。
【図３Ｄ】ポリエチレングリコールの表面にアミノ基を導入する反応での最終産物である化学式４の化合物の１Ｈ  ＮＭＲ結果を示す図面である。
【図４】ポリ（エチレン−アルト−マレイン酸無水物）表面を有する固体支持体に、アミノ基が導入されたポリエチレングリコールがコーティングされる過程を示す図面である。
【図５Ａ】プローブが固定化された対照群マイクロアレイ１及び本発明によるマイクロアレイ１をそれぞれ標的ＤＮＡと混成化させた後、観察された蛍光度データを示す図面である。
【図５Ｂ】プローブが固定化された対照群マイクロアレイ１及び本発明によるマイクロアレイ１をそれぞれ標的ＤＮＡと混成化させた後、観察された蛍光度データを示す図面である（図面の強度は、蛍光度（ＲＦＵ）を意味する）。
【図６】本発明による基板及び対照群基板上にＦＩＴＣが標識されたＢＳＡを適用させた後、観察された蛍光度データを示す図面である。
【図７】プローブ固定化以後、基板上に残っているアミノ基を保護する後処理工程を行わずに対照群マイクロアレイ２及び本発明によるマイクロアレイ２それぞれと、増幅後に精製過程を経ていない標的ＤＮＡ試料との混成化反応以後、観察された蛍光度データを示す図面である。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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