(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式I：
A-(BX'B'-Y)p              (I)
（式中、
Aは、グルタチオン、グルコサミン、システイニルグリシン、システイン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、およびアルギニンからなる群より選択され、選択的に、それぞれの硫黄含有化合物の硫黄原子は酸化されてスルホキシドまたはスルホンを形成してもよく；
Yは、少なくとも1つのアルセノキシド（-As=O）基を含み；
ｐは1〜10の整数であり；
Bは、C1-C5アルキレン、C6-C12アリーレン、またはC2-C5アシルから選択され；
X'は、-O-、-S-、-NR-、-C(O)-、-C(O)O-から選択されるか、または存在せず；
B'は、C1-C5アルキレン、C6-C12アリーレンであるか、または存在せず；
Rは、水素、C1-C5アルキル、C6-C12アリール、またはC2-C5アシルから選択され；
Bおよび/またはB'がアリーレンであるそれぞれの場合について、それぞれのアリーレン環に直接結合している置換基（アルセノキシドを含む）は、パラ、メタ、またはオルトの関係にあってもよく；
それぞれのアルキレン、アリーレン、およびアシルは、水素、C1-C5アルキル、C2-C5アルケニル、C2-C5アルキニル、C3-C10シクロアルキル、C5-C10シクロアルケニル、C6-C12アリール、ハロ、シアノ、シアネート、イソシアネート、OR2a、SR6、ニトロ、アルセノキシド、-S(O)R3、-S(O)2R3、-P(O)R4R4、-N(R'')2、-NRC(O)(CH2)mQ、-C(O)R5、
【化１】
0004707294.tif 000059
【化２】
0004707294.tif 000060
または
【化３】
0004707294.tif 000061
で独立して置換されてもよく；
それぞれのRは、水素、C1-C5アルキル、C6-C12アリール、またはC2-C5アシルから独立して選択され；
R2aは、水素、C1-C5アルキル、C6-C12アリール、-S(O)R3、-S(O)2R3、-P(O)(R4)2、または-C(O)R5から選択され；
それぞれのR3は、水素、C1-C5アルキル、C6-C12アリール、C1-C5アルコキシ、C6-C12アリールオキシ、C1-C5アルキルチオ、またはC6-C12アリールチオから独立して選択され；
それぞれのR4は、水素、C1-C5アルキル、C6-C12アリール、C1-C5アルコキシ、C6-C12アリールオキシ、C1-C5アルキルチオ、C6-C12アリールチオ、ハロ、またはN(R)2から独立して選択され；
それぞれのR5は、水素、C1-C5アルキル、C6-C12アリール、C1-C5アルコキシ、C6-C12アリールオキシ、C1-C5アルキルチオ、C6-C12アリールチオ、OH、SH、またはN(R)2から独立して選択され；
R6は、C1-C5アルキル、C6-C12アリール、C1-C5アルキルチオ、C6-C12アリールチオ、-S(O)R3、-S(O)2R3、または-C(O)R5から選択され；
R''は、前記Rと同じであり；
Qは、ハロゲンおよび-OS(O)2Q1から選択され；Q1は、C1-C4アルキル、C1-C4パーフルオロアルキル、フェニル、p-メチルフェニルから選択され；
mは1〜5であり；
AおよびBX'B'を合わせた炭素原子の合計は6を超える）で表される化合物。
【請求項２】
Aがグルタチオンである、請求項１記載の化合物。
【請求項３】
pが1〜5の整数である、請求項１または２記載の化合物。
【請求項４】
pが1である、請求項３記載の化合物。
【請求項５】
BはC2-C5アシルであり；
X'はNRであり；
B'はフェニレンであり；
RはHであり；
ここで、前記フェニレン環に直接結合している置換基（アルセノキシドを含む）は、パラ、メタ、またはオルトの関係にあってもよい、請求項１記載の化合物。
【請求項６】
式(III)：
【化４】
0004707294.tif 000062
により表され、式中、
R7〜R10は、水素、C1-C5アルキル、C6-C12アリール、ハロゲン、ヒドロキシ、アミノ、ニトロ、カルボキシ、C1-C5アルコキシ、-OS(O)2R3、または-NHC(O)CH2Qからなる群より独立して選択され；Qは、ハロゲン、-OS(O)2CH3、-OS(O)2C6H5、または-OS(O)2-pトリルであり；R3は、水素、C1-C5アルキル、C6-C12アリール、C1-C5アルコキシ、C6-C12アリールオキシ、C1-C5アルキルチオ、またはC6-C12アリールチオから選択される、請求項１〜５のいずれか一項記載の化合物。
【請求項７】
R7〜R10が、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、アミノ、ニトロ、カルボキシ、C1-C5アルコキシ、メチル、エチル、イソプロピル、t-ブチル、フェニル、および-NHC(O)CH2Qからなる群より独立して選択され、Qは、ハロゲン、-OS(O)2CH3、-OS(O)2C6H5、または-OS(O)2-pトリルである、請求項６記載の化合物。
【請求項８】
アルセノキシド（-As=O）基がフェニレン環の4位にある、請求項６または７記載の化合物。
【請求項９】
4-(N-(S-グルタチオニルアセチル)アミノ)フェニルアルセノキシド（GSAO）であり、式V：
【化５】
0004707294.tif 000063
で表される、請求項１〜５のいずれか一項記載の化合物。
【請求項１０】
式VI：
【化６】
0004707294.tif 000064
で表され、Qが任意のハロゲンである、請求項１〜５のいずれか一項記載の化合物。
【請求項１１】
式VII：
【化７】
0004707294.tif 000065
で表され、Gが、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、アミノ、ニトロ、カルボキシ、C1-C5アルコキシ、C1-C5アルキル、およびC6-C12アリール、ならびに-NHC(O)CH2Qからなる群より選択され、Qが、ハロゲン、-OS(O)2CH3、-OS(O)2C6H5、または-OS(O)2-pトリルである、請求項１〜５のいずれか一項記載の化合物。
【請求項１２】
Gが、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、アミノ、ニトロ、カルボキシ、C1-C5アルコキシ、メチル、エチル、イソプロピル、t-ブチル、フェニル、および-NHC(O)CH2Qからなる群より選択され、Qが、ハロゲン、-OS(O)2CH3、-OS(O)2C6H5、または-OS(O)2-pトリルである、請求項１１記載の化合物。
【請求項１３】
Gが、ヒドロキシ、フッ素、アミノ、およびニトロからなる群より選択される、請求項１１または１２記載の化合物。
【請求項１４】
検出基に連結されており、該検出基が、フルオロフォア、ビオチン、放射性核種（radionucleotide)、フルオレセイン、および遷移元素を含む基からなる群より選択される、請求項１〜１３のいずれか一項記載の化合物。
【請求項１５】
検出基がビオチンである、請求項１４記載の化合物。
【請求項１６】
放射性核種が、3H、14C、32P、33P、35S、125I、131I、123I、111In、105Rh、153Sm、67Cu、67Ga、166Ho、177Lu、186Re、188Re、および99mTcからなる群より選択される、請求項１４記載の化合物。
【請求項１７】
放射性核種が3Hまたは14Cからなる群より選択される、請求項１６記載の化合物。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか一項記載の化合物と、薬学的に許容される担体、アジュバント、および/または希釈剤を含む、薬学的組成物。
【請求項１９】
脊椎動物における疾患を治療および/または予防するための薬学的組成物であって、治療有効量の請求項１〜１７のいずれか一項記載の化合物を含む組成物。
【請求項２０】
疾患が細胞増殖性疾患である、請求項１９記載の薬学的組成物。
【請求項２１】
疾患が、血管形成依存性疾患、炎症性疾患および/または自己免疫疾患、血管疾患および血栓症、ウイルス感染、ならびにガンからなる群より選択される、請求項１９または２０記載の薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は、酸化還元活性タンパク質を阻害する能力を有する実質的に細胞膜不透過性の化合物およびこの化合物を合成する方法に関する。特に、本発明は、実質的に細胞膜不透過性の三価有機ヒ素化合物およびこの化合物を合成する方法に関する。本発明はまた、これらの化合物を含む薬学的組成物、ならびに炎症性疾患、自己免疫疾患、血管疾患、血栓症、ウイルス感染、血液学的腫瘍および固形腫瘍を治療する方法に関する。
【０００２】
発明の背景
分泌タンパク質の中には、酸化還元反応（すなわち、アミノ酸間の水素および電子の移動または再編成）を受けるものもある。最もよく関与するアミノ酸はシステインであり、この酸化還元反応は特にシステインチオールを必要とする。システイン残基の酸化還元変化は、ジスルフィド結合の正味の減少、正味の形成、または正味の交換につながり得る。
【０００３】
最近の証拠から、細胞表面タンパク質は、細胞内タンパク質と同様に酸化還元制御されていることが示唆されている。細胞内環境の還元特性は、接近して間隔をおいたジチオールの還元型と酸化型の交換を容易にする（概説については、フパ（Huppa）およびプロエグ（Ploegh)、1998を参照のこと）。対照的に、細胞外環境の酸化特性は、接近して間隔をおいたジチオールの存在を排除すると一般にみなされ、ジチオールは、接近して間隔をおいているのではなくジスルフィド結合または他のチオール化合物との混合ジスルフィドとして存在すると考えられる。接近して間隔をおいたチオールは、還元ジチオールと酸化ジスルフィド結合を交換する能力を有し、従って、酸化還元活性タンパク質の機能に重要である可能性が高い。
【０００４】
三価ヒ素剤は、接近して間隔をおいたチオールと高親和性の環構造を形成する。近接して間隔をおいたジチオールとして、2,3-ジメルカプトプロパノール(DMP)のような化学的に隣接しているチオールならびに折り畳みにより空間的に並置されたチオールが挙げられる（ジャウヒアニネン（Jauhianinen）ら、1988)。エントロピー要因のために、結果として得られる環状ジチオアルシナイト（dithioarsinite）は、三価ヒ素剤およびモノチオールから形成された非環状生成物より非常に安定である（ストクテン（Stockten）およびトンプソン（Thompson)、1946)。ヒ素誘導体は、疾患を治療するための治療剤として過去に用いられていた。しかしながら、ヒ素化合物の本来からある毒性およびその一般的に好ましくない治療指数は、医薬品としての使用を本質的に排除してきた。
【０００５】
結果として、比較的無毒であり、かつ哺乳動物の疾患（特に、急速に増殖する細胞に関連した疾患）の治療に効果的な治療上有効なヒ素化合物の開発が必要とされる。
【０００６】
本発明は、酸化還元活性タンパク質の阻害により細胞機能を破壊する能力を有する化学的部分（例えば、三価ヒ素剤）が、実質的に細胞膜不透過性のペンダント基に結合されている化合物を提供する。本発明は、これらの化合物を含む薬学的組成物、ならびに炎症性疾患、自己免疫疾患、血管疾患、血栓症、ウイルス感染、血液学的腫瘍および固形腫瘍を治療する方法をさらに提供する。
【０００７】
発明の開示
1．三価有機ヒ素誘導体
本発明の第1の態様によれば、式I：
A-(L-Y)p              (I)
の化合物が提供され、式中、
Aは、少なくとも1つの実質的に細胞膜不透過性のペンダント基を含み；
Lは、任意の適切なリンカーおよび/またはスペーサー基を含み；
Yは、少なくとも1つのアルセノキシド（arsenoxide）またはアルセノキシド等価物を含み；
pは1〜10の整数であり；
AおよびLを合わせた炭素原子の合計は6を超える。
【０００８】
以下の特徴は、本発明の第1の態様に関する。
【０００９】
一般的に、Aは親水性である。より一般的には、Aは、生理学的pHで荷電していてもよく、荷電していなくてもよく、中性でもよい。
【００１０】
一般的に、Aは、天然、非天然、および合成のアミノ酸、親水性アミン、ペプチド、ポリペプチド、多糖、検出可能な基、チオール含有タンパク質からなる群より選択されるか、またはその組み合わせである。より一般的に、Aは、グルタチオン、グルコサミン、システイニルグリシン、システイン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニンからなる群より選択され、選択的に、それぞれの硫黄含有化合物の硫黄原子は酸化されてスルホキシドまたはスルホンを形成してもよい。
【００１１】
アミノ酸側鎖は当業者に周知であり、例えば、キング（King）およびスタンスフィールド（Stansfield)、「遺伝学辞典（A Dictionary of Genetics）」第4版、Oxford University Press、1990（この内容は参照として本明細書に組み入れられる）などの標準的な参考文献である教科書に列挙されている。
【００１２】
さらに一般的に、ペンダント基Aは、ビオチン、cy(商標)5.5、またはフルオレセインなどの検出可能な基である。
【００１３】
さらにより一般的に、Aはグルタチオンであり、本発明の一形態において、この化合物は以下の式(II)：
【化２１】
0004707294.tif 000002
で表され、Lは、任意の適切なリンカーおよび/またはスペーサー基を含み、Yは、アルセノキシドまたはアルセノキシド等価物を含む。
【００１４】
一般的に、Yはアルセノキシド基であり、-As=Oで表すことができる。
【００１５】
一般的に、pは1〜8の整数である。より一般的に、1〜5の整数である。さらにより一般的に、pは1〜3の整数である。なおさらにより一般的に、pは1である。
【００１６】
一般的に、Lは、(XBX')nB'に対応する。nは一般的に0〜20の整数であり、より一般的に0〜15の整数であり、さらにより一般的に0〜10の整数であり、さらにより一般的に0〜5の整数である。
【００１７】
さらに本発明の第1の態様によれば、以下は(XBX')nB'に関連する。
【００１８】
一般的に、Xは、-NR、-S(O)-、-S(O)O-、-S(O)2-、-S(O)2O-、-C(O)-、-C(S)-、-C(O)O-、C(S)O-、-C(S)S-、-P(O)(R1)-、および-P(O)(R1)O-からなる群より選択されるか、または存在せず；
Bは、C1-C10アルキレン、C2-C10アルケニレン、C2-C10アルキニレン、C3-C10シクロアルキレン、C5-C10シクロアルケニレン、C3-C10ヘテロシクロアルキレン、C5-C10ヘテロシクロアルケニレン、C6-C12アリーレン、ヘテロアリーレン、およびC2-C10アシルからなる群より選択され；
X'は、-NR-、-O-、-S-、-Se-、-S-S-、S(O)-、-OS(O)-、OS(O)O-、-OS(O)2、-OS(O)2O-、-S(O)O-、-S(O)2-、-S(O)2O-、-OP(O)(R1)-、-OP(O)(R1)O-、-OP(O)(R1)OP(O)(R1)O-、-C(O)-、-C(S)-、-C(O)O-、C(S)O-、-C(S)S-、-P(O)(R1)-、-P(O)(R1)O-、および
【化２２】
0004707294.tif 000003
からなる群より選択されるか、または存在せず；Eは、O、S、Se、NR、またはN(R)2＋であり；
nは0、1、または2であり；
B'は、C1-C10アルキレン、C2-C10アルケニレン、C2-C10アルキニレン、C3-C10シクロアルキレン、C5-C10シクロアルケニレン、C3-C10ヘテロシクロアルキレン、C5-C10ヘテロシクロアルケニレン、C6-C12アリーレン、およびヘテロアリーレンからなる群より選択されるか、または存在せず；それぞれのRは、水素、C1-C10アルキル、C2-C10アルケニル、C2-C10アルキニル、C3-C10シクロアルキル、C5-C10シクロアルケニル、C3-C10ヘテロシクロアルキル、C5-C10ヘテロシクロアルケニル、C6-C12アリール、ヘテロアリール、OR2、およびC2-C10アシルからなる群より独立して選択され；
R'はRと同じであるか、または2個のR'が、これらのR'が結合している窒素原子と共に一体となって、飽和または不飽和の複素環式5員環または6員環を形成してもよく；
それぞれのR1は、水素、C1-C10アルキル、C2-C10アルケニル、C2-C10アルキニル、C3-C10シクロアルキル、C5-C10シクロアルケニル、C3-C10ヘテロシクロアルキル、C5-C10ヘテロシクロアルケニル、C6-C12アリール、ヘテロアリール、ハロ、OR2、およびN(R)2からなる群より独立して選択され；
それぞれのR2は、水素、C1-C10アルキル、C2-C10アルケニル、C2-C10アルキニル、C3-C10シクロアルキル、C5-C10シクロアルケニル、C3-C10ヘテロシクロアルキル、C5-C10ヘテロシクロアルケニル、C6-C12アリール、ヘテロアリール、および-C(O)R5からなる群より独立して選択され；
それぞれのR5は、水素、C1-C10アルキル、C2-C10アルケニル、C2-C10アルキニル、C3-C10シクロアルキル、C5-C10シクロアルケニル、C3-C10ヘテロシクロアルキル、C5-C10ヘテロシクロアルケニル、C6-C12アリール、ヘテロアリール、C1-C10アルコキシ、C3-C10アルケニルオキシ、C3-C10アルキニルオキシ、C3-C10シクロアルキルオキシ、C5-C10シクロアルケニルオキシ、C3-C10ヘテロシクロアルキルオキシ、C5-C10ヘテロシクロアルケニルオキシ、C6-C12アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、C1-C10アルキルチオ、C3-C10アルケニルチオ、C3-C10アルキニルチオ、C3-C10シクロアルキルチオ、C5-C10シクロアルケニルチオ、C3-C10ヘテロシクロアルキルチオ、C5-C10ヘテロシクロアルケニルチオ、C6-C12アリールチオ、ヘテロアリールチオ、OH、SH、およびN(R)2からなる群より独立して選択され；
Bおよび/またはB'がアリーレンであるそれぞれの場合について、それぞれのアリーレン環に直接結合している置換基（アルセノキシドまたはアルセノキシド等価物を含む）は、パラ、メタ、またはオルトの関係にあってもよく；
それぞれのアルキレン、アルケニレン、アルキニレン、シクロアルキレン、シクロアルケニレン、ヘテロシクロアルキレン、ヘテロシクロアルケニレン、アリーレン、ヘテロアリーレン、およびアシルは、水素、C1-C10アルキル、C2-C10アルケニル、C2-C10アルキニル、C3-C10シクロアルキル、C5-C10シクロアルケニル、C3-C10ヘテロシクロアルキル、C5-C10ヘテロシクロアルケニル、C6-C12アリール、ヘテロアリール、シアノ、シアネート、イソシアネート、OR2a、SR6、ニトロ、アルセノキシド、-S(O)R3、-OS(O)R3、-S(O)2R3、-OS(O)2R3、-P(O)R4R4、-OP(O)R4R4、-N(R'')2、-NRC(O)(CH2)mQ、-C(O)R5；
【化２３】
0004707294.tif 000004
、
【化２４】
0004707294.tif 000005
または
【化２５】
0004707294.tif 000006
で独立して置換されてもよく；
R、R1、およびR5は前記で定義された通りであり；
R2aは、水素、C1-C5アルキル、C2-C5アルケニル、C2-C5アルキニル、C3-C10シクロアルキル、C5-C10シクロアルケニル、C6-C12アリール、-S(O)R3、-S(O)2R3、-P(O)(R4)2、N(R)2、および-C(O)R5からなる群より選択され；
それぞれのR3は、水素、C1-C10アルキル、C2-C10アルケニル、C2-C10アルキニル、C3-C10シクロアルキル、C5-C10シクロアルケニル、C3-C10ヘテロシクロアルキル、C5-C10ヘテロシクロアルケニル、C6-C12アリール、ヘテロアリール、C1-C10アルコキシ、C3-C10アルケニルオキシ、C3-C10アルキニルオキシ、C3-C10シクロアルキルオキシ、C5-C10シクロアルケニルオキシ、C3-C10ヘテロシクロアルキルオキシ、C5-C10ヘテロシクロアルケニルオキシ、C6-C12アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、C1-C10アルキルチオ、C3-C10アルケニルチオ、C3-C10アルキニルチオ、C3-C10シクロアルキルチオ、C5-C10シクロアルケニルチオ、C3-C10ヘテロシクロアルキルチオ、C5-C10ヘテロシクロアルケニルチオ、C6-C12アリールチオ、ヘテロアリールチオ、およびN(R)2からなる群より独立して選択され；
それぞれのR4は、水素、C1-C10アルキル、C2-C10アルケニル、C2-C10アルキニル、C3-C10シクロアルキル、C5-C10シクロアルケニル、C3-C10ヘテロシクロアルキル、C5-C10ヘテロシクロアルケニル、C6-C12アリール、ヘテロアリール、C1-C10アルコキシ、C3-C10アルケニルオキシ、C3-C10アルキニルオキシ、C3-C10シクロアルキルオキシ、C5-C10シクロアルケニルオキシ、C3-C10ヘテロシクロアルキルオキシ、C5-C10ヘテロシクロアルケニルオキシ、C6-C12アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、C1-C10アルキルチオ、C3-C10アルケニルチオ、C3-C10アルキニルチオ、C3-C10シクロアルキルチオ、C5-C10シクロアルケニルチオ、C3-C10ヘテロシクロアルキルチオ、C5-C10ヘテロシクロアルケニルチオ、C6-C12アリールチオ、ヘテロアリールチオ、ハロ、およびN(R)2からなる群より独立して選択され；
R6は、C1-C10アルキル、C2-C10アルケニル、C2-C10アルキニル、C3-C10シクロアルキル、C5-C10シクロアルケニル、C3-C10ヘテロシクロアルキル、C5-C10ヘテロシクロアルケニル、C6-C12アリール、ヘテロアリール、C1-C10アルキルチオ、C3-C10アルケニルチオ、C3-C10アルキニルチオ、C3-C10シクロアルキルチオ、C5-C10シクロアルケニルチオ、C3-C10ヘテロシクロアルキルチオ、C5-C10ヘテロシクロアルケニルチオ、C6-C12アリールチオ、ヘテロアリールチオ、-S(O)R3、-S(O)2R3、および-C(O)R5からなる群より選択され；
R''はRと同じであるか、または2個のR''が、これらのR''が結合しているN原子と共に一体となって、飽和、不飽和、または芳香族の複素環式環構造を形成してもよく；
Qは、ハロゲンおよび-OS(O)2Q1から選択され；Q1は、C1-C4アルキル、C1-C4パーフルオロアルキル、フェニル、p-メチルフェニルから選択され；
mは1〜5である。
【００１９】
より一般的に、Xは、-C(O)-、-C(S)-、-C(O)O-、C(S)O-、および-C(S)S-からなる群より選択されるか、または存在せず；
Bは、C1-C5アルキレン、C2-C5アルケニレン、C2-C5アルキニレン、C3-C10シクロアルキレン、C5-C10シクロアルケニレン、C6-C12アリーレン、およびC2-C5アシルからなる群より選択され；
X'は、-O-、-S-、-NR-、-S-S-、-S(O)-、-S(O)2-、-P(O)(R1)-、-OP(O)(R1)-、OP(O)(R1)O-、-OP(O)(R1)OP(O)(R1)O-、-C(O)-、-C(S)-、-C(O)O-、C(S)O-、-C(S)S-、-Se-、
【化２６】
0004707294.tif 000007
からなる群より選択されるか、または存在せず；Eは、O、S、またはN(R)2＋であり；
nは0、1、または2であり；
Bは、C1-C5アルキレン、C2-C5アルケニレン、C2-C5アルキニレン、C3-C10シクロアルキレン、C5-C10シクロアルケニレン、およびC6-C12アリーレンからなる群より選択されるか、または存在せず；
それぞれのRは、水素、C1-C5アルキル、C2-C5アルケニル、C2-C5アルキニル、C3-C10シクロアルキル、C5-C10シクロアルケニル、C6-C12アリール、OR2、およびC2-C10アシルからなる群より独立して選択され；
R'はRと同じであり；
それぞれのR1は、水素、C1-C5アルキル、C2-C5アルケニル、C2-C5アルキニル、C3-C10シクロアルキル、C5-C10シクロアルケニル、C6-C12アリール、ハロ、OR2、およびN(R)2からなる群より独立して選択され；
それぞれのR2は、水素、C1-C5アルキル、C2-C5アルケニル、C2-C5アルキニル、C3-C10シクロアルキル、C5-C10シクロアルケニル、C6-C12アリール、および-C(O)R5からなる群より独立して選択され；
それぞれのR5は、水素、C1-C5アルキル、C2-C5アルケニル、C2-C5アルキニル、C3-C10シクロアルキル、C5-C10シクロアルケニル、C6-C12アリール、C1-C5アルコキシ、C3-C5アルケニルオキシ、C3-C5アルキニルオキシ、C3-C10シクロアルキルオキシ、C5-C10シクロアルケニルオキシ、C6-C12アリールオキシ、C1-C5アルキルチオ、C3-C5アルケニルチオ、C3-C5アルキニルチオ、C3-C10シクロアルキルチオ、C5-C10シクロアルケニルチオ、C6-C12アリールチオ、OH、SH、およびN(R)2からなる群より独立して選択され；
Bおよび/またはB'がアリーレンであるそれぞれの場合について、それぞれのアリーレン環に直接結合している置換基（アルセノキシドまたはアルセノキシド等価物を含む）は、パラ、メタ、またはオルトの関係にあってもよく；
それぞれのアルキレン、アルケニレン、アルキニレン、シクロアルキレン、シクロアルケニレン、アリーレン、およびアシルは、水素、C1-C5アルキル、C2-C5アルケニル、C2-C5アルキニル、C3-C10シクロアルキル、C5-C10シクロアルケニル、C6-C12アリール、シアノ、ハロ、シアネート、イソシアネート、OR2a、SR6、ニトロ、アルセノキシド、-S(O)R3、-OS(O)R3、-S(O)2R3、-OS(O)2R3、-P(O)R4R4、-OP(O)R4R4、-N(R'')2、-NRC(O)(CH2)mQ、-C(O)R5
【化２７】
0004707294.tif 000008
、
【化２８】
0004707294.tif 000009
または
【化２９】
0004707294.tif 000010
で独立して置換されてもよく；
R、R1、およびR5は前記で定義された通りであり；
R2aは、水素、C1-C5アルキル、C2-C5アルケニル、C2-C5アルキニル、C3-C10シクロアルキル、C5-C10シクロアルケニル、C6-C12アリール、-S(O)R3、-S(O)2R3、-P(O)(R4)2、N(R)2、および-C(O)R5からなる群より選択され；
それぞれのR3は、水素、C1-C5アルキル、C2-C5アルケニル、C2-C5アルキニル、C3-C10シクロアルキル、C5-C10シクロアルケニル、C6-C12アリール、C1-C5アルコキシ、C3-C5アルケニルオキシ、C3-C5アルキニルオキシ、C3-C10シクロアルキルオキシ、C5-C10シクロアルケニルオキシ、C6-C12アリールオキシ、C1-C5アルキルチオ、C3-C5アルケニルチオ、C3-C5アルキニルチオ、C3-C10シクロアルキルチオ、C5-C10シクロアルケニルチオ、C6-C12アリールチオ、およびN(R)2からなる群より独立して選択され；
それぞれのR4は、水素、C1-C5アルキル、C2-C5アルケニル、C2-C5アルキニル、C3-C10シクロアルキル、C5-C10シクロアルケニル、C6-C12アリール、C1-C5アルコキシ、C3-C5アルケニルオキシ、C3-C5アルキニルオキシ、C3-C10シクロアルキルオキシ、C5-C10シクロアルケニルオキシ、C6-C12アリールオキシ、C1-C5アルキルチオ、C3-C5アルケニルチオ、C3-C5アルキニルチオ、C3-C5シクロアルキルチオ、C5-C5シクロアルケニルチオ、C6-C12アリールチオ、ハロ、およびN(R)2からなる群より独立して選択され；
R6は、C1-C5アルキル、C2-C5アルケニル、C2-C5アルキニル、C3-C10シクロアルキル、C5-C10シクロアルケニル、C6-C12アリール、C1-C5アルキルチオ、C3-C5アルケニルチオ、C3-C5アルキニルチオ、C3-C10シクロアルキルチオ、C5-C10シクロアルケニルチオ、C6-C12アリールチオ、-S(O)R3、-S(O)2R3、および-C(O)R5からなる群より独立して選択され；
R''はRと同じであり；
Qは、ハロゲンおよび-OS(O)2Q1からなる群より選択され；Q1は、C1-C4アルキル、C1-C4パーフルオロアルキル、フェニル、p-メチルフェニルから選択され；
mは1〜5である。
【００２０】
さらにより一般的に、Xは存在せず；
Bは、C1-C5アルキレン、C6-C12アリーレン、およびC2-C5アシルからなる群より選択され；
X'は、-O-、-S-、-NR-、-S-S-、-S(O)-、-S(O)2-、-P(O)(R1)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(O)O-、C(S)O-、-Se-、および
【化３０】
0004707294.tif 000011
からなる群より選択されるか、または存在せず；Eは、O、S、またはN(R)2＋であり；
nは0、1、または2であり；
B'は、C1-C5アルキレン、C6-C12アリーレンであるか、または存在せず；
それぞれのRは、水素、C1-C5アルキル、C3-C10シクロアルキル、C6-C12アリール、OR2、およびC2-C5アシルからなる群より独立して選択され；
R'はRと同じであり；
それぞれのR1は、水素、C1-C5アルキル、C3-C10シクロアルキル、C6-C12アリール、ハロ、OR2、およびN(R)2からなる群より独立して選択され；
それぞれのR2は、水素、C1-C5アルキル、C3-C10シクロアルキル、C6-C12アリール、および-C(O)R5からなる群より独立して選択され；
それぞれのR5は、水素、C1-C5アルキル、C2-C5アルケニル、C3-C10シクロアルキル、C5-C10シクロアルケニル、C6-C12アリール、C1-C5アルコキシ、C3-C5アルケニルオキシ、C3-C10シクロアルキルオキシ、C5-C10シクロアルケニルオキシ、C6-C12アリールオキシ、C1-C5アルキルチオ、C3-C5アルケニルチオ、C3-C10シクロアルキルチオ、C5-C10シクロアルケニルチオ、C6-C12アリールチオ、OH、SH、およびN(R)2からなる群より独立して選択され；
Bおよび/またはB'がアリーレンであるそれぞれの場合について、それぞれのアリーレン環に直接結合している置換基（アルセノキシドまたはアルセノキシド等価物を含む）は、パラ、メタ、またはオルトの関係にあってもよく；
それぞれのアルキレン、アルケニレン、アルキニレン、シクロアルキレン、シクロアルケニレン、アリーレン、およびアシルは、水素、C1-C5アルキル、C2-C5アルケニル、C2-C5アルキニル、C3-C10シクロアルキル、C5-C10シクロアルケニル、C6-C12アリール、ハロ、シアノ、シアネート、イソシアネート、OR2a、SR6、ニトロ、アルセノキシド、-S(O)R3、-OS(O)R3、-S(O)2R3、-OS(O)2R3、-P(O)R4R4、-OP(O)R4R4、-N(R'')2、-NRC(O)(CH2)mQ、-C(O)R5、
【化３１】
0004707294.tif 000012
、
【化３２】
0004707294.tif 000013
または
【化３３】
0004707294.tif 000014
で独立して置換されてもよく；
R、R1、およびR5は前記で定義された通りであり；
R2aは、水素、C1-C5アルキル、C3-C10シクロアルキル、C6-C12アリール、-S(O)R3、-S(O)2R3、-P(O)(R4)2、および-C(O)R5からなる群より選択され；
それぞれのR3は、水素、C1-C5アルキル、C3-C10シクロアルキル、C6-C12アリール、C1-C5アルコキシ、C3-C10シクロアルキルオキシ、C6-C12アリールオキシ、C1-C5アルキルチオ、C3-C10シクロアルキルチオ、C6-C12アリールチオ、およびN(R)2からなる群より独立して選択され；
それぞれのR4は、水素、C1-C5アルキル、C3-C10シクロアルキル、C6-C12アリール、C1-C5アルコキシ、C3-C10シクロアルキルオキシ、C6-C12アリールオキシ、ハロ、およびN(R)2からなる群より独立して選択され；
R6は、C1-C5アルキル、C3-C10シクロアルキル、C6-C12アリール、C1-C5アルキルチオ、C3-C10シクロアルキルチオ、C6-C12アリールチオ、-S(O)R3、-S(O)2R3、および-C(O)R5からなる群より選択され；
R''はRと同じであり；
Qは、ハロゲンおよび-OS(O)2Q1から選択され；Q1は、C1-C4アルキル、C1-C4パーフルオロアルキル、フェニル、p-メチルフェニルから選択され；
mは1〜5である。
【００２１】
さらにより一般的に、Xは存在せず；
Bは、C1-C5アルキレン、C6-C12アリーレン、およびC2-C5アシルからなる群より選択され；
X'は、-O-、-S-、-NR-、-C(O)-、および-C(O)O-からなる群より選択されるか、または存在せず；
nは1であり；
B'は、C1-C5アルキレン、C6-C12アリーレンであるか、または存在せず；
Rは、水素、C1-C5アルキル、C6-C12アリール、およびC2-C5アシルからなる群より選択され；
Bおよび/またはB'がアリーレンであるそれぞれの場合について、それぞれのアリーレン環に直接結合している置換基（アルセノキシドまたはアルセノキシド等価物を含む）は、パラ、メタ、またはオルトの関係にあってもよく；
それぞれのアルキレン、アリーレン、およびアシルは、水素、C1-C5アルキル、C2-C5アルケニル、C2-C5アルキニル、C3-C10シクロアルキル、C5-C10シクロアルケニル、C6-C12アリール、ハロ、シアノ、シアネート、イソシアネート、OR2a、SR6、ニトロ、アルセノキシド、-S(O)R3、-S(O)2R3、-P(O)R4R4、-N(R'')2、-NRC(O)(CH2)mQ、-C(O)R5、
【化３４】
0004707294.tif 000015
、
【化３５】
0004707294.tif 000016
または
【化３６】
0004707294.tif 000017
で独立して置換されてもよく；
それぞれのRは、水素、C1-C5アルキル、C6-C12アリール、およびC2-C5アシルからなる群より独立して選択され；
R2aは、水素、C1-C5アルキル、C6-C12アリール、-S(O)R3、-S(O)2R3、-P(O)(R4)2、および-C(O)R5からなる群より選択され；
それぞれのR3は、水素、C1-C5アルキル、C6-C12アリール、C1-C5アルコキシ、C6-C12アリールオキシ、C1-C5アルキルチオ、およびC6-C12アリールチオからなる群より独立して選択され；
それぞれのR4は、水素、C1-C5アルキル、C6-C12アリール、C1-C5アルコキシ、C6-C12アリールオキシ、C1-C5アルキルチオ、C6-C12アリールチオ、ハロ、およびN(R)2からなる群より独立して選択され；
それぞれのR5は、水素、C1-C5アルキル、C6-C12アリール、C1-C5アルコキシ、C6-C12アリールオキシ、C1-C5アルキルチオ、C6-C12アリールチオ、OH、SH、およびN(R)2からなる群より独立して選択され；
R6は、C1-C5アルキル、C6-C12アリール、C1-C5アルキルチオ、C6-C12アリールチオ、-S(O)R3、-S(O)2R3、および-C(O)R5からなる群より選択され；
R''は、前記のRと同じであり；
Qは、ハロゲンおよび-OS(O)2Q1から選択され；Q1は、C1-C4アルキル、C1-C4パーフルオロアルキル、フェニル、p-メチルフェニルから選択され；
mは1〜5である。
【００２２】
なおさらにより一般的に、式(III)：
【化３７】
0004707294.tif 000018
により例示されるように、
Xは存在せず；
BはC2-C5アシルであり；
X'はNRであり；
nは1であり；
B'はフェニレンであり；
RはHであり；
フェニレン環に直接結合している置換基は、パラ、メタ、またはオルトの関係にあってもよく；
R7からR10は、水素、C1-C5アルキル、C6-C12アリール、ハロゲン、ヒドロキシ、アミノ、ニトロ、カルボキシ、C1-C5アルコキシ、-OS(O)2R3、および-NHC(O)CH2Qからなる群より独立して選択され；Qは、ハロゲン、-OS(O)2CH3、-OS(O)2C6H5、および-OS(O)2-pトリルであり；R7からR1Oのいずれか1つがC1-C5アルキル、C6-C12アリール、C1-C5アルコキシ、-OS(O)2R3である場合、フェニレンと縮合環を形成することができ；さらに、R7からR10の少なくとも1つがC1-C5アルキル、C6-C12アリール、C1-C5アルコキシ、または-OS(O)2R3である場合、R7からR10の任意の他の少なくとも1つと結合してフェニレンと縮合環を形成することができる。
【００２３】
より一般的に、R7からR10は、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、アミノ、ニトロ、シアノ、カルボキシ、C1-C5アルコキシ、メチル、エチル、イソプロピル、t-ブチル、フェニル、および-NHC(O)CH2Qからなる群より独立して選択され、Qは、ハロゲン、-OS(O)2CH3、-OS(O)2C6H5、および-OS(O)2-pトリルである。
【００２４】
さらに、B'がアリーレンである場合、このアリーレン環に結合している置換基は、一般的に、-As=Oとオルト、メタ、またはパラの関係にある。より一般的に、置換基は、-As=O基とメタまたはパラの関係にある。
【００２５】
より好ましくは、式IV：
【化３８】
0004707294.tif 000019
の化合物4-(N-(S-グルタチオニルアセチル)アミノ)フェニルアルセノキシド（GSAOと省略することができる）が提供される。
【００２６】
式(V)：
【化３９】
0004707294.tif 000020
の化合物もまた本発明により提供される。式中、Qは任意のハロゲンである。例えば、本発明は、化合物3-(N(フルオロアセチル)アミノ)-4-(N-(S-グルタチオニルアセチル)アミノ)フェニルアルセノキシド（GSFAOと省略することができる)、3-(N-(クロロアセチル)アミノ)-4-(N-(S-グルタチオニルアセチル)アミノ)フェニルアルセノキシド（GSCAOと省略することができる)、3-(N-(ブロモアセチル)アミノ)-4-(N-(S-グルタチオニルアセチル)アミノ)フェニルアルセノキシド（GSBAOと省略することができる)、および3-(N-(ヨードアセチル)アミノ)-4-(N-(S-グルタチオニルアセチル)アミノ)フェニルアルセノキシド（GSIAOと省略することができる）を提供する。
【００２７】
本発明の化合物の別の好ましい形態において、式（VI）：
【化４０】
0004707294.tif 000021
の化合物が提供される。式中、Gは、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、アミノ、ニトロ、シアノ、カルボキシ、C1-C5アルコキシ、C1-C5アルキル、およびC6-C12アリール、および-NHC(O)CH2Qからなる群より選択され、Qは、ハロゲン、-OS(O)2CH3、-OS(O)2C6H5、または-OS(O)2-pトリルである。
【００２８】
一般的に、Gは、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、アミノ、ニトロ、カルボキシ、C1-C5アルコキシ、メチル、エチル、イソプロピル、t-ブチル、フェニル、および-NHC(O)CH2Qからなる群より選択され、Qは、ハロゲン、-OS(O)2CH3、-OS(O)2C6H5、および-OS(O)2-pトリルからなる基である。
【００２９】
より一般的に、式VIの化合物において、Gは、ヒドロキシ、フッ素、アミノ、またはニトロである。
【００３０】
一般的に、基Gは、アルセノキシド基とオルト、メタ、またはパラの関係にあり、より一般的に、オルトまたはパラの関係にある。
【００３１】
一般的に、Gおよびヒ素原子が互いにオルトまたはパラの関係にある場合、ヒ素原子の活性は基Gにより改変することができる。例えば、Gが、OH（生理学的pHでイオン化されてO-となる）などの電子供与基である場合、ヒ素原子はジチオールに対して非活性化されているはずであり、そのためより選択的になり、非常に反応性の高いジチオールとだけ反応する。または、GがNO2などの電子吸引基である場合、電子密度はヒ素原子から引き離され、そのため、ヒ素原子は全てのジチオールと反応するようになる。Gの操作により、酸化還元タンパク質の中に、選択的に阻害されるものもあれば、選択的に阻害されないものもあるようにすることができる。
【００３２】
本発明の第2の態様によれば、本発明の第1の態様によって定義され、アルセノキシド(-As=O)がアルセノキシド等価物で置換された化合物が提供される。
【００３３】
アルセノキシド等価物は、ジチオールに対して-As=Oと本質的に同じ親和性を示す任意のジチオール反応性化学種である。一般的に、アルセノキシド等価物として、As、Ge、Sn、およびSb化学種などのジチオール反応性実体が挙げられる。より一般的に、アルセノキシド等価物は-D(Z1)(Z2)で表すことができる。アルセノキシド等価物は、対応するアルセノキシドの活性と同一または実質的に同一の活性を示すと考えられる。
【００３４】
一般的に、式-D(Z1)(Z2)のアルセノキシド等価物について、Dは、例えば、As RSn、Sb、またはRGeであり、Z1およびZ2は不安定な基（すなわち、生理学的条件下で容易に置換される基）である。Z1およびZ2は同一でも異なってもよく、結合していても（ヒ素原子にだけ結合して）互いに独立して存在してもよい。
【００３５】
適切なアルセノキシド等価物として、以下が挙げられる：-D(Z1)(Z2)、Z1およびZ2は、OH、C1-C10アルコキシ、C6-C10アリールオキシ、C1-C10アルキルチオ、C6-C10アリールチオ、C1-C10アルキルセレノ、C6-C10アリールセレノ、F、Cl、Br、およびIからなる群より選択される。
【化４１】
0004707294.tif 000022
式中、E1=E2=O、E1=OおよびE2=S、またはE1=E2=Sであり；MはR'''であり、R''''は、水素、C1-C10アルキル、C6-C12アリール、ハロゲン、C1-C10アルコキシ、C6-C10アリールオキシ、ヒドロキシ、およびカルボキシからなる群より独立して選択され；n=1〜10である。
【００３６】
式D(Z1)(Z2)のアルセノキシド等価物について、DがAsであり、Z1およびZ2がOHである場合、アルセノキシド等価物は、以下に記載のように重合化学種と平衡状態であってもよい。
【式１】
0004707294.tif 000023
【００３７】
前述の平衡に関して、ヒ素は、そのヒドロキシ化学種が対応する重合無水物と平衡状態で存在する多くの元素の1つである(ドーク（Doak）およびフリーダム（Freedman)、1970)。従って、アルセノキシド化合物は低分子量または中分子量の重合体（例えば、n=3〜6）として実際に存在し得る。しかしながら、この脱水反応は可逆的であり、従って、可溶性の重合無水物はアルセノキシド等価物のように挙動すると考えられる（すなわち、単量体-As(OH)2化学種と実質的に同じように、近接して間隔をおいたジチオールに結合すると考えられる）。
【化４２】
0004707294.tif 000024
式中、X3=NH、Y1=O；X3=Y1=O、またはX3=S、Y1=Oであり、R'は、水素、C1-C10アルキル、C6-C12アリール、およびカルボキシからなる群より選択されるか、または20個のアミノ酸側鎖の1つである。
【化４３】
0004707294.tif 000025
【化４４】
0004707294.tif 000026
式中、X3=Y1=O；X3=NH、Y1=O；X3=S、Y1=O；X3=Y1=NH；またはX3=S、Y1=NH；またはX3=S、Y1=NHであり、R11からR14は、水素、C1-C10アルキル、C6-C12アリール、およびCO2Hからなる群より選択される。
【化４５】
0004707294.tif 000027
式中、X3=Y1=O、またはX3=NH、Y1=Oであり；R11からR14は、水素、C1-C10アルキル、C6-C12アリール、ハロゲン、C1-C10アルコキシ、およびCO2Hからなる群より選択される。
【００３８】
一般的に、(XBX')nB'は、本発明の第1の態様に従って前記で定義された通りである。
【００３９】
本発明の化合物は検出基に連結されてもよい。
【００４０】
一般的に、検出基は、化学基（例えば、ビオチン、フルオレセイン、cy(商標)5.5）でもよく、遷移元素を含む基でもよい。
【００４１】
または、検出基は、3H、14C、32P、33P、35S、125I、131I、123I、111In、105Rh、153Sm、67Cu、67Ga、166Ho、177Lu、186Re、188Re、および99mTcなどの放射性核種（radionucleide）である。
【００４２】
より一般的に、放射性核種（radionucleide）検出基は3Hまたは14Cである。
【００４３】
本発明の第3の態様によれば、本発明の第1または第2の態様のいずれか1つの化合物を調製するためのプロセスが提供される。該プロセスは、少なくとも1つの実質的に細胞膜不透過性の基(A)と、少なくとも1つのアルセノキシドまたはアルセノキシド等価物(Y)が結合しているリンカーおよび/またはスペーサー基(XBX')nB'を反応させる段階を含む。
【００４４】
反応の特定の順番は、生成される本発明の特定の化合物によって決まることが当業者に理解されると思われる。
【００４５】
本発明の1つの形態において、一般的に、前記のプロセスは、適切な反応条件下で、グルタチオンと、少なくとも1つのアルセノキシドまたはアルセノキシド等価物(Y)が結合している適切なリンカーおよび/またはスペーサー基(XBX')nB'を反応させる段階を含む。
【００４６】
2．薬学的組成物/治療組成物およびその使用
本発明の第4の態様によれば、本発明の第1または第2の態様のいずれかの化合物と、薬学的に許容される担体、アジュバント、および/または希釈剤を含む薬学的組成物が提供される。
【００４７】
本発明の第5の態様によれば、本発明の第4の態様で定義される薬学的組成物を調製するためのプロセスが提供される。該プロセスは、本発明の第1または第2の態様のいずれかに定義される化合物と薬学的に許容される担体、アジュバントおよび/または希釈剤を混合する段階を含む。
【００４８】
本発明の第6の態様によれば、治療および/または予防を必要とする脊椎動物の疾患を治療および/または予防する方法が提供される。該方法は、本発明の第1もしくは第2の態様のいずれかに定義される治療有効量の化合物を脊椎動物に投与する段階、または本発明の第4の態様で定義される治療有効量の薬学的組成物を投与する段階を含む。
【００４９】
本発明の第7の態様によれば、治療および/または予防を必要とする脊椎動物における疾患の治療および/または予防に用いられる場合の、本発明の第1もしくは第2の態様のいずれかに定義される化合物または第4の態様で定義される薬学的組成物が提供される。
【００５０】
本発明の第8の態様によれば、治療および/または予防を必要とする脊椎動物の疾患を治療および/または予防するための医薬品の調製における、本発明の第1もしくは第2の態様のいずれかに定義される化合物の使用が提供される。
【００５１】
一般的に、本発明の第6、第7、または第8の態様において、本発明の化合物の塩は薬学的に許容される塩であるが、本発明の化合物またはその薬学的に許容される塩の調製に他の塩も使用することができる。
【００５２】
一般的に、本発明の第6、第7、または第8の態様のいずれか1つのために、疾患は細胞増殖性疾患である。
【００５３】
より一般的に、疾患は、血管形成依存性疾患（angiogenesis-dependent disease)、炎症性疾患および/または自己免疫疾患、血管疾患および血栓症、ウイルス感染、ならびにガンからなる群より選択される。
【００５４】
一般的に、本発明の第6、第7、または第8の態様のいずれか1つのために、当業者は、日常的な実験法により、特定の疾患を治療するための本発明の化合物の有効かつ無毒な量を決定することができる。
【００５５】
定義
本明細書において、「含むこと（comprising）」という用語は、「主として含むが、必ずしもそれだけを含むこととは限らない」ことを意味する。さらに、単語「含むこと（comprising）」の語尾変化（例えば、「含む（comprise）」および「含む（comprises）」）は、それに対応して変化した意味を有する。
【００５６】
本明細書において、「アルセノキシド」という用語は基-As=Oを意味する。
【００５７】
本明細書において、-As=Oおよび-As(OH)2と書かれた基は同義語であるとみなされるべきである。
【００５８】
本明細書において、「アルセノキシド等価物」という用語は、ジチオールに対して-As=OまたはAs(OH)2と本質的に同じ親和性を示す任意のジチオール反応性化学種を意味し、この用語は、例えば、遷移元素を含む基ならびに水性媒体（例えば、細胞培養緩衝液および治療されている生物に含まれる液体）に溶解すると-As=Oまたは-As(OH)2に加水分解される任意の三価ヒ素剤を含む。
【００５９】
本明細書で用いられる「ヒ素剤」という用語は、ヒ素を含有する任意の化合物を含む。
【００６０】
本明細書で用いられる「アシル」という用語は、末端カルボニル置換基を有する一価および二価のアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、およびシクロアルケニル部分を含み、結合が炭化水素部分でも、カルボニル部分でも、その両方でも生じてもよい。
【００６１】
本明細書で用いられる「アルキル」という用語は、その意味に、一価の、飽和の、直鎖および分枝鎖の炭化水素ラジカルを含む。
【００６２】
本明細書で用いられる「アルケニル」という用語は、その意味に、少なくとも1つの二重結合を有する、一価の、直鎖および分枝鎖の炭化水素ラジカルを含む。
【００６３】
本明細書で用いられる「アルキニル」という用語は、その意味に、少なくとも1つの三重結合を有する、一価の、直鎖および分枝鎖の炭化水素ラジカルを含む。
【００６４】
本明細書で用いられる「アルキレン」という用語は、その意味に、二価の、飽和の、直鎖炭化水素ラジカルを含む。
【００６５】
本明細書で用いられる「アルケニレン」という用語は、その意味に、少なくとも1つの二重結合を有する、二価の直鎖炭化水素ラジカルを含む。
【００６６】
本明細書で用いられる「アルキニレン」という用語は、その意味に、少なくとも1つの三重結合を有する、二価の直鎖炭化水素ラジカルを含む。
【００６７】
本明細書で用いられる「アリール」という用語は、その意味に、一価の、単一の、多環状の、共役および縮合した芳香族炭化水素ラジカルを含む。
【００６８】
本明細書で用いられる「アリーレン」という用語は、その意味に、二価の、単一の、多環状の、共役および縮合した、芳香族炭化水素ラジカルを含む。
【００６９】
本明細書で用いられる「近接して間隔をおいたジチオール」という用語は、その意味に、化学的に隣接しているチオールならびに分子コンフォメーションにより空間的に並置されたチオールを含む。
【００７０】
本明細書で用いられる「シクロアルキル」という用語は、その意味に、一価の、飽和の、単環式の、二環式の、多環式の、または縮合多環式の炭化水素ラジカルを含む。
【００７１】
本明細書で用いられる「シクロアルキレン」という用語は、その意味に、二価の、飽和の、単環式の、二環式の、多環式の、または縮合多環式の炭化水素ラジカルを含む。
【００７２】
本明細書で用いられる「シクロアルケニル」という用語は、その意味に、少なくとも1つの二重結合を有する、一価の、飽和の、単環式の、二環式の、多環式の、または縮合多環式の炭化水素ラジカルを含む。
【００７３】
本明細書で用いられる「シクロアルケニレン」という用語は、その意味に、少なくとも1つの二重結合を有する、二価の、飽和の、単環式の、二環式の、多環式の、または縮合多環式の炭化水素ラジカルを含む。
【００７４】
本明細書で用いられる「ハロ」という用語は、フッ素、塩素、臭素、およびヨウ素を含む。
【００７５】
本明細書で用いられる「ヘテロアリール」という用語は、その意味に、1〜12個の原子を有し、1〜6個の原子がO、N、およびSから選択されるヘテロ原子である、一価の、単一の、多環状の、共役および縮合した芳香族ラジカルを含む。
【００７６】
本明細書で用いられる「ヘテロアリーレン」という用語は、その意味に、1〜12個の原子を有し、1〜6個の原子がO、N、およびSから選択されるヘテロ原子である、二価の、単一の、多環状の、共役および縮合した芳香族ラジカルを含む。
【００７７】
本明細書で用いられる「ヘテロシクロアルキル」という用語は、その意味に、1〜5個の原子がO、N、またはSから選択されるヘテロ原子である、一価の、飽和の、単環式の、二環式の、多環式の、または縮合したラジカルを含む。
【００７８】
本明細書で用いられる「ヘテロシクロアルキレン」という用語は、その意味に、1〜5個の原子がO、N、またはSから選択されるヘテロ原子である、二価の、飽和の、単環式の、二環式の、多環式の、または縮合多環式のラジカルを含む。
【００７９】
本明細書で用いられる「ヘテロシクロアルケニル」という用語は、その意味に、少なくとも1つの二重結合を有し、1〜5個の原子がO、N、またはSから選択されるヘテロ原子である、一価の、飽和の、単環式の、二環式の、多環式の、または縮合多環式のラジカルを含む。
【００８０】
本明細書で用いられる「ヘテロシクロアルケニレン」という語は、その意味に、少なくとも1つの二重結合を有し、1〜5個の原子がO、N、またはSから選択されるヘテロ原子である、二価の、飽和の、単環式の、二環式の、多環式の、または縮合多環式のラジカルを含む。
【００８１】
本明細書で用いられる「フェニルアルソン酸」という用語は「ベンゼンスルホン酸」と同義であるとみなされるべきである。
【００８２】
本明細書で用いられる「治療有効量」という用語は、その意味に、無毒であるが、望ましい治療効果を生じるのに十分な量の本発明の化合物または組成物を含む。必要とされる正確な量は、治療される種、被験者の年齢および全身状態、治療される疾患の重篤度、投与される特定の薬剤、ならびに投与方法などの要因によって被験者ごとに異なる。従って、正確な「有効量」を特定することは不可能である。しかしながら、どのような場合でも、当業者は日常的な実験法だけを用いて適切な「有効量」を決定することができる。
【００８３】
本明細書で用いられる「遷移元素」という用語は、その意味に、遷移金属、ランタニド、およびアクチニドを含む元素からなる基を含む。
【００８４】
略語
pAA、p-アルサニル酸、4-アミノベンゼンアルソン酸；AspAO、N-(3-(4-アルセノソフェニル（arsenosophenyl）カルバモイルメチルチオ)プロパノイル)-L-アスパラギン酸；BAE、ウシ大動脈内皮；BCE、ウシ毛細血管内皮；BCS、仔ウシ血清；BSA、ウシ血清アルブミン；BRAA、4-(N-(ブロモアセチル)アミノ)フェニルアルソン酸；BRAO、4-(N-(ブロモアセチル)アミノ)-フェニルアルセノキシド；BVS、ウシ血管平滑筋；CAM、ニワトリ漿尿膜；Cys＊AO、N-(3-(4-アルセノソフェニルカルバモイルメチルチオ)プロパノイル)-L-システイン酸；DMEM、ダルベッコ改変イーグル培地；DMP、2,3-ジメルカプトプロパノール；DMSO、ジメチルスルホキシド；DTNB、5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)；DTT、ジチオスレイトール；EDTA、エチレンジアミン四酢酸；FCS、ウシ胎児血清；FGF、線維芽細胞増殖因子；GSAO-F、4-(N-(S-(N-(3-(フルオレセイン-5-カルバモイルメチルチオ)プロパノイル)グルタチオニル)アセチル)アミノ)フェニルアルセノキシド；FXAO、4(N-(6-(フルオレセイン-5-カルボキサミド)ヘキサノイル)アミノ)フェニルアルセノキシドおよび4-(N-(6-(フルオレセイン-6カルボキサミド)ヘキサノイル)アミノ)フェニルアルセノキシドの混合物；GlcAO、N-(3-(4-アルセノソフェニルカルバモイルメチルチオ)プロパノイル)-D-グルコサミン；GluAO、N-(3-(4-アルセノソフェニルカルバモイルメチルチオ)プロパノイル)-L-グルタミン酸；GSAA、4-(N-(S-グルタチオニルアセチル)アミノ)フェニルアルソン酸；GSAO、4-(N-(S-グルタチオニルアセチル)アミノ)フェニルアルセノキシド；GSAO-B、4-(N-(S-(N-(6-(N-(6-(N-(ビオチノイル)アミノ)ヘキサノイル)アミノ)ヘキサノイル)グルタチオニル)アセチル)アミノ)フェニルアルセノキシド；GSH、還元型グルタチオン；HDMVEC、ヒト皮膚微小血管内皮細胞；HEPES、N-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジン-N'-(2-エタンスルホン酸)；HIV、ヒト免疫不全ウイルス；HRP、西洋ワサビペルオキシダーゼ；HUVEC、ヒト臍静脈内皮細胞；Ig、免疫グロブリン；MPB、3-(N-マレイミジルプロピオニル)ビオシチン；PAO、フェニルアルセノキシド；pAPAO、4-アミノフェニルアルセノキシド；PBMC、末梢血単核細胞；PBS、リン酸緩衝食塩水；PDI、プロテインジスルフィドイソメラーゼ；PVDF、フッ化ポリビニルジエチレン；SCID、重症複合免疫不全；SDS-PAGE、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動；SSB、スルホスクシンイミドビオチン；TCR、T細胞受容体；TNB、5-チオ-2-ニトロベンゾエートジアニオン；VEGF、血管内皮細胞増殖因子。
【００８５】
発明を実施する最良の形態
1.三価有機ヒ素誘導体
本発明は、アルセノキシドまたはアルセノキシド等価物部分が少なくとも1つの実質的に細胞膜不透過性のペンダント基に連結された化合物を提供する。このペンダント基は、生理学的pHで荷電しているか、または自然の状態で親水性であることによって実質的に細胞膜不透過性である。さらに、本発明は、スペーサー基を組み込んで、または組み込まないで、少なくとも1つのアルセノキシドまたはアルセノキシド等価物に突出している基が連結された化合物を提供する。
【００８６】
好ましい形態において、本発明の化合物は、ジチオール反応性化合物（例えば、前記で説明された三価ヒ素剤を含む化合物）である。酸化還元活性タンパク質は、酸化還元サイクルを受ける1対またはそれ以上の対の近接して間隔をおいたジチオールにより特徴付けられることが多い。三価ヒ素剤は、近接して間隔をおいたジチオールに対して高い親和性を有し、ジチオアルシン（dithioarsine）誘導体を形成する(アダムス（Adams）ら、1990)。ジチオアルシン誘導体を形成するには2個のモノチオールが必要とされるので、モノチオールは三価ヒ素剤とあまりよく反応しない。このプロセスはエントロピー的に不利であり、通常、第2のモノチオールの結合が立体的に制限される。
【００８７】
本発明の目的に適したペンダント基を構成する実質的に細胞膜不透過性の基の特定の例として、グルタチオンは、哺乳動物細胞により構成的に分泌されるが、これらの細胞に吸収されないトリペプチドである。好ましい態様において、本発明はグルタチオンのこの実質的に細胞膜不透過な特徴を利用して、グルタチオンを、酸化還元活性タンパク質の近接して間隔をおいたジチオールに結合する能力を有するアルセノキシド基の本質的に不活性な担体として用いている。このように、グルタチオンは、アルセノキシド基を哺乳動物細胞表面に送達するが、該部分の細胞への受動的な侵入を実質的に阻害するために本発明で用いられる。
【００８８】
一般式(I-VI)の化合物およびアルセノキシド基(-As=O)がアルセノキシド等価物で置換された化合物は、当技術分野において一般的に周知な方法により調製することができる。式(I-VI)の化合物およびその中間体の合成に適した方法は、例えば、ホウベン-ウエイル（Houben-Weyl)、「有機化学法（Methoden der Organischen Chemie）」；J.マーチ（March)、「上級有機化学（Advanced Organic Chemistry）」、第4版(John Wiley＆Sons,New York,1992)；D.C.リオタ（Liotta）およびM.ボルマー（Volmer）編、「有機合成反応入門（Organic Syntheses Reaction Guide）」(John Wiley＆Sons,Inc.,New York,1991)；R.C.ラロック（Larock)、「包括的有機変換（Comprehensive Organic Transformations）」(VCH,New York,1989)、H.O.ハウス（House)、「現代合成反応（Modern Synthetic Reactions）」第2版(W.A.Benjamin,Inc.,Menlo Park,1972)；N.S.シンプキンス（Simpkins）編「現代100試薬（100 Modern Reagents）」(The Royal Society of Chemistry,London,1989)；A.H.ハインズ（Hains）「有機化合物酸化法（Methods for the Oxidation of Organic Compounds）」(Academic Press,London,1988)、ならびにB.J.ウエイクフィールド（Wakefield）「有機リチウム法（Organolithium Methods）」(Academic Press,London,1988)に記載されている。
【００８９】
本発明の化合物のリンカーの一般的な形成を例示する反応スキームの例を以下のスキームに示す。
【式２】
0004707294.tif 000028
Eは求電子部位を示し；m、nは、0より大きい整数であるか、または0である。
【００９０】
以下のスキームは出発分子RCH2Xを示し、Rは、結合している-CH2X基以外の分子の部分を示す。Xは脱離基（例えば、ハロゲンまたはRSO3-）を示し、求核剤TRnで置換される。求核剤は求電子部位で攻撃し、求核化学種と求電子化学種との新たな共有結合の形成をもたらす。以下のスキームにおいて、メチレン炭素原子は求電子部位であり、全反応は求核置換反応の1つと述べることができる。
【式３】
0004707294.tif 000029
【００９１】
反応(i)〜(iii)に示されるように、前述のスキームには3つの単純なバリエーションがある。この反応において、攻撃求核剤は非荷電分子TRnで表され、脱離基Xを置換し、正電荷（形式的にTに配置した）を有する生成物Aを生じる。この反応の第1の段階(a)は、脱離基Xを置換し、最初にイオン生成物Bを生じ、その後に段階(b)でH＋が失われて、非電荷生成物Cを生じる、攻撃求核剤HTRnを必要とする。この反応においてTRn-を求核剤として用いることで、生成物Cは直接形成される。
【００９２】
3つ全ての反応(i)〜(iii)において、XはX-として失われ、原子Tは孤立電子対を有さなければならない。以下に、反応(i)〜(iii)のそれぞれの一般的な例を示す。反応(iii)は、BRAOおよびGSHからのGSAOの形成に似ていることに留意のこと。
【式４】
0004707294.tif 000030
【式５】
0004707294.tif 000031
【式６】
0004707294.tif 000032
【００９３】
または、この反応は、以下のスキームに示されるように、求核剤と例えば、α,β不飽和ケトン(Z=Oの場合)（または、アルデヒド（Z=OおよびR1=Hの場合））との反応でもよい。例えば、求核剤がTRnである場合、
【式７】
0004707294.tif 000033
求核剤がHTRnである場合、
【式８】
0004707294.tif 000034
求核剤がTRn-である場合、
【式９】
0004707294.tif 000035
Zは、O、S、NR、または＋N(R)(R')からなる群より選択される。
【００９４】
本発明の親水性アミン化合物を調製する一般的な合成経路の代表例を、段階5における試薬がBRAOと例示された以下のスキームに示す：
【式１０】
0004707294.tif 000036
【００９５】
さらにより一般的に、本発明の親水性アミン化合物は、BRAOを用いて例示され、Xがハロゲンまたは他の適切な脱離基である、以下で概説する一般的なスキームに従って調製することができる。
【式１１】
0004707294.tif 000037
【００９６】
前記のスキームに関して、本発明の任意の特定の化合物を合成するために、様々な試薬および反応物を日常的に変更できることが当業者に理解されると思われる。本発明の化合物は保存のために凍結乾燥し、使用前に再構成することができる。
【００９７】
本発明の好ましい化合物の一般的な合成において、グルタチオンとBRAOを、グルタチオンの遊離チオールとアルセノキシドが結合している化学的実体との共有結合の形成に好ましい条件下で反応させることができる。グルタチオンチオールによる求核攻撃を伴う反応には一般的にアルカリ条件が必要とされる。反応性化学種の中には、グルタチオン硫黄原子に求電子攻撃できるものもある；一般的に、これには酸性条件が必要とされるらしい。GSAOおよび対応するアルソン酸化合物GSAAの構造を図1に示す。
【００９８】
一般的に、本発明の化合物は、ジチオールに結合する能力による、酸化還元活性タンパク質の阻害剤である。酸化還元活性タンパク質は、ジスルフィド結合を可逆的に形成することができる近接して間隔をおいた2個のチオールを含有していることがある。これらのタンパク質を本発明の化合物が阻害する提案された形態は、タンパク質の還元形態（ジチオール）へのアルセノキシドまたはアルセノキシド等価物の結合によるものである。このような結合は、生理学的条件下で本質的に不可逆的であってもよく、本質的に可逆的であってもよい。結合が生理学的条件下で本質的に不可逆的である場合、タンパク質のジチオール状態とジスルフィド状態の酸化還元サイクルが恒久的に阻害される（すなわち、不可逆的に不活性化または阻害される）。
【００９９】
または、タンパク質ジチオールへのアルセノキシドまたはアルセノキシド等価物の結合が生理学的条件下で本質的に可逆的である場合、阻害は恒久的でない。従って、本発明の化合物は、(XBX')nB'リンカーまたは実質的に細胞膜不透過性の基Aに結合された、アルキル化剤として作用することができる置換基を有することを含んでもよい。ヒ素基とタンパク質ジチオールとの反応により、アルキル化基はタンパク質の活性部位ジチオールの1つに隣接することができる。次いで、アルキル化基は、ジチオアルシン-タンパク質中間体と反応し、それによりタンパク質を恒久的に阻害し、酸化還元サイクルを妨げることができる。アルキル化による、この形態の不可逆的阻害の一例を図2に示す。(XBX')nB'リンカーまたは実質的に細胞膜不透過性の基Aに結合されたアルキル化剤を有する化合物を、ペンダント基Aがグルタチンである、以下の構造式(VII)および(VIII)に例示する：
【化４６】
0004707294.tif 000038
【化４７】
0004707294.tif 000039
Qは脱離基である。
【０１００】
適切な変更が当業者に明らかである。本発明はまた、任意のイオン化状態（例えば、酸性塩、両性イオン非電荷、両性イオンアニオン、ジアニオン）にある本発明の化合物を提供することが当業者に理解されると思われる。
【０１０１】
本発明はまた、グルタチオンのグルタミルα-アミノ窒素を介して、例えば、検出可能な基（例えば、ビオチン、フルオロフォア、または遷移元素を含む基）で修飾された本発明のさらなる化合物を提供する。例えば、本発明は、以下の式(IX)：
【化４８】
0004707294.tif 000040
のGSAOのビオチン連結誘導体であるGSAO-Bを提供する。n=1または2である。
【０１０２】
GSAO-Bの合成方法を実施例1(c)に示し、図6に図示する。グルタチオンのグルタミルα-アミノ窒素を介して望ましい修飾基を結合することができる本発明の別の好ましい化合物を以下の式(X)：
【化４９】
0004707294.tif 000041
に表す。Rは任意の望ましい修飾基である。
【０１０３】
一般的に、Rは、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、アミノ、ニトロ、カルボキシ、アルコキシ、アルキル、およびアリールからなる群より選択することができる。
【０１０４】
1.1酸化に対する三価ヒ素剤の安定性
アルセノキシド(R-As=O)は、通常、書かれているようなヒ素-酸素二重結合を有さないと示されているが、環状重合体（As-O-As結合を含む）として存在する可能性が高く、または水溶液中で水和物R-As(OH)2、有機アルソン酸（organoarsonous acid）として存在する可能性がさらに高い(ドーク（Doak)およびフリーダム(Freedom)、1970；クノヒ（Knoch）ら、1995)。GSAOおよびBRAOなどの有機ヒ素剤の溶液は酸化により徐々に不活性化される。この酸化は、3種類の方法；アルセノキシドを含む溶液からの溶解O2の除去、これらの溶液のpH低下、または溶液へのグリシン添加により遅くすることができる。グリシンは、三価有機ヒ素剤の保存溶液の酸化を妨げるために日常的に用いられる。5員環ジチオアルソナイト（dithioarsonite）(XI)が形成される2,3-ジメルカプトプロパノールとR-As(OH)2の反応と同様に、グリシンとRAs(OH)2の反応は5員環状1,3,2-オキサザルソリジン（oxazarsolidin）-5-オン(XII)を生じると考えられる。
【化５０】
0004707294.tif 000042
【化５１】
0004707294.tif 000043
【０１０５】
2.疾患の治療および/または予防
本発明の化合物は、脊椎動物の様々な障害および疾患の治療に有用である。一般的に、本発明の第1もしくは第2の態様の化合物または本発明の第4の態様の薬学的製剤は、脊椎動物の様々な障害および疾患の治療に有用である。従って、本発明により、脊椎動物の様々な疾患および障害を治療する方法も提供される。
【０１０６】
一般的に、脊椎動物は、ヒト、非ヒト霊長類、ネズミ、ウシ、ヒツジ、ウマ、ヤギ、ウサギ、鳥類、ネコ、およびイヌからなる群より選択される。より一般的に、脊椎動物は、ヒト、非ヒト霊長類、またなネズミである。さらにより一般的に、脊椎動物はヒトである。
【０１０７】
従って、本発明の化合物は、以下のような広範なカテゴリーに分類することができる障害：血管依存性疾患、細胞増殖性疾患、炎症性疾患、自己免疫疾患、血管疾患、血栓症、ウイルス感染、およびガンの治療に有用であり得る。
【０１０８】
2.1.血管依存性障害の治療および/または予防
より一般的に、本発明の化合物は、血管依存性疾患（例えば、ガン、血管腫、動静脈奇形、関節炎、オスラー・ウェーバー症候群、合併アテローム斑、乾癬、角膜移植片血管新生、化膿性肉芽腫（pyrogenic granuloma)、遅延創傷治癒、水晶体後方線維増殖、糖尿病網膜症、強皮症、肉芽、血管線維腫、血管新生緑内障、トラコーマ、血友病関節症、肥厚性瘢痕、または胃潰瘍）の治療に有用であり得る。
【０１０９】
一般的に、ガンは、発ガン物質による腫瘍（carcinogenic tumor)、上皮に由来する腫瘍（例えば、結腸直腸ガン、乳ガン、肺ガン、頭部および頚部の腫瘍、肝ガン、膵ガン、卵巣ガン、胃ガン、脳ガン、膀胱ガン、前立腺ガン、および尿路/生殖管ガン）；間葉性腫瘍（例えば、肉腫）；ならびに造血腫瘍（例えば、B細胞リンパ腫）からなる群より選択される。
【０１１０】
一般的に、ガンは血液学的腫瘍である。より一般的に、ガンは固形腫瘍である。
【０１１１】
背景として、血管は、2つのプロセス、脈管形成（vasculogenesis）および血管形成(angiogenesis)により発達する（リサウ（Risau)、1997）。脈管形成は胚発生中に起こり、内皮細胞が前駆細胞の種類から生まれるプロセスである。既存の血管からの新しい毛細血管の成長は血管形成と呼ばれ、胚発生中および成人において起こる。
【０１１２】
血管形成はまた腫瘍転移の重要な構成要素である。腫瘍血管は未熟であり、非常に透過性が高く、正常な成熟した血管と比較して基底膜がほとんどなく、細胞間結合複合体が少ない。これらの新しい血管は、腫瘍細胞が原発部位から離れ、血流に入るのに効率的な出口経路を提供する。形成した転移の数は、一般的に、流出した腫瘍細胞の数に比例する。従って、腫瘍における血管形成が減少すると、循環に流出される腫瘍細胞の数および下流に生じる転移の数が減少するはずである。
【０１１３】
腫瘍血管形成のプロセスは複雑である。適切な刺激に反応して内皮細胞の管を取り囲む基底膜が局所的に分解され、これにより、この破壊されたマトリックスの下にある内皮細胞が形状を変え、周囲の腫瘍間質に侵入するように誘発される。侵入した内皮細胞は増殖し、移動性の円柱（migrating column）に発達する。この円柱壁の細胞は増殖するのを止め、形状を変え、互いに接着して、新しい毛細血管の管腔を形成する。最終的に、新しい毛細血管は融合し、輪になって、この領域における栄養分および老廃物の交換を容易にする循環系になる。
【０１１４】
腫瘍血管形成の誘導は、腫瘍細胞と宿主細胞の両方により放出される、いくつかの血管形成分子により媒介される(ハナハン（Hanahan）およびフォルクマン（Folkman)、1996)。内皮細胞の増殖および移動を刺激する多数のタンパク質（上皮増殖因子、アンギオゲニン、エストロゲン、線維芽細胞増殖因子(FGF)、および血管内皮増殖因子(VEGF)を含む）が知られている。抗血管形成因子として、インターフェロン、トロンボスポンジン、血小板第4因子、組織メタロプロテイナーゼ阻害剤-1および-2、インターロイキン12、アンギオスタチン、ならびにエンドスタチンが挙げられる。
【０１１５】
内皮細胞表面上には12kDa〜138kDaの分子量を有する10個の別個のGSAO結合タンパク質があり、これを実施例3(a)および図16に例示する。この発見は、内皮細胞表面がある特定のタンパク質の酸化還元事象を支えていることを示唆している。これらの事象の混乱は、実施例3に一般的に説明されるように、内皮細胞生物学に対して結果（例えば、内皮細胞の増殖に及ぼす影響）をもたらす。より詳細には、実施例3(c)および3(d)ならびに図18〜21は、GSAOが培養内皮細胞の増殖および管形成の選択的な阻害剤であったことを示している。GSAOはまたニワトリ漿尿膜における新血管形成を阻害し（実施例3（o）および図22)、実施例3(f)〜3(i)および図23〜28で説明されるようにマウスにおける腫瘍血管形成および腫瘍増殖の潜在的な阻害剤であった。
【０１１６】
2.2ウイルス感染の治療および/または予防
本発明の化合物はまた、例えば、HTLV-Iなどのオンコウイルスを含むヒトレトロウイルス感染（レトロウイルス科）；HIV-1およびHIV-2を含むレンチウイルス感染の治療もしくは予防；またはシンドビスウイルス感染の治療もしくは予防に用いることができる。
【０１１７】
CD4は内在性膜糖タンパク質であり、免疫系における細胞間相互作用を媒介する免疫グロブリン(Ig)スーパーファミリー受容体の一員である。CD4は、ほとんどの胸腺細胞およびヘルパーT細胞を含む末梢Tリンパ球サブセット上で発現される(フレウリ（Fleury）ら、1991)。CD4は、胸腺発達中にT細胞レパートリーを作り上げ、成熟T細胞およびB細胞の適切な活性化を可能にするのに必要とされる。CD4+T細胞のT細胞受容体(TCR)は、MHCクラスII分子により提示された抗原を認識する。CD4は、MHCクラスIIに結合して、接着分子コリガンドとして、またはTCRとの三重複合体における抗原認識プロセスの一部（コレセプター）としてT細胞反応を高める。
【０１１８】
CD4に対する別のリガンドがHIV-1である。HIV-1は、ウイルス粒子の脂質膜と細胞膜を融合してビリオンコアを細胞質に近づけることによりCD4+細胞に侵入する。HIV-1の融合は、HIV-1エンベロープ糖タンパク質gp120とCD4の相互作用により引き起こされる。ケモカインコレセプターもまたHIV-1の侵入に必要とされる(リットマン（Littman)、1998)。HIV-1は、CD4+Tヘルパー細胞反応を低下させることにより免疫系を傷つける。
【０１１９】
CD4が1つまたはそれ以上の酸化還元活性チオールを含むという証拠は、ナカシマ（Nakashima）ら(1994)により示された。彼らは、遊離チオール間のジスルフィド結合の形成を触媒することができる化合物であるHgCl2がT細胞表面上のCD4を凝集することを観察した。この結果から、HgCl2は、CD4における1つまたはそれ以上の遊離チオールを介してCD4を架橋することが示唆された。
【０１２０】
実施例4（特に、実施例4(d)）および図30〜35で概説されるように、GSAOは細胞表面CD4に結合し、HIVによるCD4+細胞感染の効果的な阻害剤として作用する。
【０１２１】
2.3他の障害の治療および/または予防
本発明の化合物またはその薬学的製剤はまた、炎症性疾患および/または自己免疫疾患の予防および/または治療に用いることができる。炎症性疾患および/または自己免疫疾患の例として以下が挙げられる：慢性関節リウマチ、血清陰性関節炎および他の炎症性関節炎、全身性エリテマトーデス、多発性動脈炎および関連症候群、全身性硬化症、シェーグレン症候群および他の炎症性眼疾患、混合型結合組織病、多発性筋炎および皮膚筋炎、リウマチ性多発性筋痛および巨細胞性動脈炎、炎症性関節病、非炎症性関節症および軟組織リウマチ（soft tissue rheumatism)、疼痛ジストロフィー。
【０１２２】
本発明の化合物は、血管疾患および血栓症の予防または治療に用いることができる。血管疾患および血栓症の例として以下が挙げられる：アテローム性動脈硬化症の進行；脳血管障害（例えば、一過性虚血卒中、完全卒中、および頚動脈手術後の脳血管障害）；急性心筋梗塞（一次および二次）；アンギナ；冠動脈バイパス移植片の閉塞；経皮経管冠動脈形成術後の閉塞；冠動脈ステント術後の閉塞；末梢動脈疾患における血管閉塞；手術後、または妊娠中、または固定中の静脈血栓塞栓症。
【０１２３】
本発明の化合物は、小血管疾患の予防または治療に用いることができる。小血管疾患の例として以下が挙げられる：腎炎；血小板減少性血栓性紫斑病；溶血性尿毒症症候群；胎盤不全、および子癇前症。
【０１２４】
本発明の化合物はまた、血管症候群および骨髄増殖性疾患の予防または治療に用いることができる。
【０１２５】
本発明の化合物はまた、以下の状況：人工/補綴血管シャントおよび移植片；人工心臓弁；心肺バイパス術；血液灌流および血液透析における血栓形成の予防に用いることができる。
【０１２６】
2.4薬学的製剤および/または治療製剤
一般的に、医学的に使用するために、本発明の化合物の塩は薬学的に許容される塩であるが、本発明の化合物またはその薬学的に許容される塩の調製に他の塩も使用することができる。薬学的に許容される塩は、正しい医学的判断（sound medical judgement）の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応などなくヒトおよび下等動物の組織と接触して使用するのに適し、かつ適当な利益/リスク比に見合う塩を意味する。薬学的に許容される塩は当技術分野において周知である。
【０１２７】
例えば、本発明の化合物の適切な薬学的に許容される塩は、薬学的に許容される酸（例えば、塩酸、硫酸、メタンスルホン酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、安息香酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、炭酸、酒石酸、クエン酸）と本発明の化合物を混合することにより調製することができる。従って、本発明の化合物の適切な薬学的に許容される塩として酸添加塩が挙げられる。
【０１２８】
例えば、S.M.ベルゲ（Berge）らは、J.Pharmaceutical Sciences、1977、66：1-19において薬学的に許容される塩について詳細に述べている。塩は、本発明の化合物の最後の単離および精製の間に、または別個に、遊離塩基官能基と適切な有機酸を反応させることにより、インサイチューで調製することができる。代表的な酸添加塩として、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパレート（asparate)、ベンゼンスルホンサン塩、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、ショウノウ酸塩、カンファースルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプトン酸塩、ヘキサン酸、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヨウ化水素酸塩、2-ヒドロキシ-エタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、2-ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチニン酸塩、過硫酸塩、3-フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩などが挙げられる。代表的なアルカリ塩またはアルカリ土類金属塩は、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなど、ならびに無毒のアンモニウム、第四アンモニウム、およびアミンカチオン（アンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エチルアミンを含むが、これに限定されない）を含む。
【０１２９】
本発明の化合物のプロドラッグもまた本発明の範囲内に含まれる。一般的に、プロドラッグは、本明細書に記載のような本発明の必要とされる化合物にインビボで容易に変換される、本発明の化合物の機能的誘導体である。プロドラッグを選択および調製するための一般的な手順は当業者に周知であり、例えば、H.バンドガード（Bundgaard）編、「プロドラッグデザイン（Design of Prodrugs）」、Elsevier、1985に記載されている。
【０１３０】
薬学的組成物の単回投与または複数回投与を行うことができ、用量および投薬パターンが治療を行っている医師により選択される。それとは関係なく、本発明の薬学的組成物は、患者を効果的に治療するのに十分な量の化合物を提供するものとする。
【０１３１】
当業者は、日常的な実験により、本発明の化合物が適用可能な障害および疾患を治療または予防するのに必要とされる本発明の化合物の有効かつ無毒な量を決定することができる。一般的に、有効な投与量は、約0.0001mg〜約1000mg/kg体重/24時間；一般的に、約0.001mg〜約750mg/kg体重/24時間；約0.01mg〜約500mg/kg体重/24時間；約0.1mg〜約500mg/kg体重/24時間；約0.1mg〜約250mg/kg体重/24時間；約1.0mg〜約250mg/kg体重/24時間の範囲であると考えられる。より一般的に、有効な用量の範囲は、約1.0mg〜約200mg/kg体重/24時間；約1.0mg〜約100mg/kg体重/24時間；約1.0mg〜約50mg/kg体重/24時間；約1.0mg〜約25mg/kg体重/24時間；約5.0mg〜約50mg/kg体重/24時間；約5.0mg〜約20mg/kg体重/24時間；約5.0mg〜約15mg/kg体重/24時間の範囲であると考えられる。
【０１３２】
または、有効な投与量は約500mg/m2までであり得る。一般的に、有効な投与量は、約25〜約500mg/m2、好ましくは約25〜約350mg/m2、より好ましくは約25〜約300mg/m2、さらにより好ましくは約25〜約250mg/m2、さらにより好ましくは約50〜約250mg/m2、なおさらにより好ましくは約75〜約150mg/m2の範囲であると考えられる。
【０１３３】
GSAOに関して、有効な投与量は、約0.0001mg〜約100mg GSAO/kg体重/24時間、好ましくは約0.001mg〜約100mg GSAO/kg体重/24時間、より好ましくは約0.01mg〜約50mg GSAO/kg体重/24時間、さらにより好ましくは約0.1mg〜約20mg GSAO/kg体重/24時間、なおさらにより好ましくは約0.1mg〜約10mg GSAO/kg体重/24時間の範囲であると考えられる。一般的に、治療は疾患の期間中に行われる。
【０１３４】
さらに、本発明の化合物の最適量および各投与の間隔が、治療される疾患の特性および程度、投与方法、投与経路、および投与部位、ならびに治療される特定の脊椎動物の特性によって決定されることが当業者に明らかであろう。また、このような最適な条件は従来の技術により決定することができる。
【０１３５】
治療の最適なクール（例えば、規定された日数の間、1日当たりになされる本発明の化合物の投与回数）が、従来の治療クール決定試験を用いて当業者により確かめられることもまた当業者に明らかであろう。
【０１３６】
本発明の化合物は、疾患の治療に用いられた場合、単独で投与することができる。しかしながら、一般的に、化合物は薬学的製剤として投与されることが好ましい。一般的に、本発明の薬学的製剤は当業者に周知の方法に従って調製することができ、従って、薬学的に許容される担体、希釈剤および/またはアジュバントを含んでもよい。
【０１３７】
担体、希釈剤およびアジュバントは、製剤の他の成分との適合性に関して「許容され」なければならず、そのレシピエントに有害な影響を及ぼしてはならない。
【０１３８】
薬学的および獣医学的に許容される担体または希釈剤の例は、脱塩水または蒸留水；食塩水；植物油（例えば、ピーナッツ油、ベニバナ油、オリーブ油、綿実油、トウモロコシ油、ゴマ油（例えば、ピーナッツ油、ベニバナ油、オリーブ油、綿実油、トウモロコシ油、ゴマ油、ラッカセイ油)、またはヤシ油）；シリコーン油（メチルポリシロキサン、フェニルポリシロキサン、およびメチルフェニルポリソルポキサン（methylphenyl polysolpoxane）などのポリシロキサンを含む）；揮発性シリコーン；鉱油（例えば、流動パラフィン、軟パラフィン、またはスクアラン）；セルロース誘導体（例えば、メチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、またはヒドロキシプロピルメチルセルロース；低級アルカノール（例えば、エタノールまたはイソプロパノール）；低級アラルカノール（lower aralkanol）；低級ポリアルキレングリコールまたは低級アルキレングリコール（例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール、プロピレングリコール、1,3-ブチレングリコール、またはグリセリン）；脂肪酸エステル（例えば、パルミチン酸イソプロピル、ミリスチン酸イソプロピル、またはオレイン酸エチル）；ポリビニルピロリドン；寒天；カラゲナン；トラガカントゴムまたはアカシアゴム、およびワセリンである。一般的に、1つまたはそれ以上の担体が組成物の10重量％〜99.9重量％を形成する。
【０１３９】
好ましい形態において、本発明の薬学的組成物は、有効量の本発明の化合物（例えば、GSAO）と実施例5に示される薬学的に許容される担体、希釈剤および/またはアジュバントを含む。
【０１４０】
本発明の薬学的組成物は標準的な経路で投与することができる。一般的に、組成物は、局所経路、経皮経路、腹腔内経路、頭蓋内経路、脳室内経路、脳内経路、膣内経路、子宮内経路、経口経路、直腸経路または非経口経路（例えば、静脈内経路、脊髄内経路、皮下経路、もしくは筋肉内経路）により投与することができる。さらに一般的に、本発明の組成物は、経口摂取に適したカプセルの形をとってもよく、局所投与に適した軟膏、クリーム、またはローションの形をとってもよく、点眼液として送達するのに適した形をとってもよく、吸入（例えば、鼻腔内吸入または経口吸入）による投与に適したエアロゾルの形をとってもよい。
【０１４１】
本発明の薬学的組成物はまたリポソームの形で投与することができる。一般的に、リポソームは、リン脂質または他の脂質物質から誘導され、水性媒体に分散された単層または多層の含水液晶（hydrated liquid crystal）により形成される。リポソームを形成することができる、任意の無毒の、生理学的に許容され、かつ代謝可能な脂質を用いることができる。リポソームの形をとる本発明の製剤は、本発明の化合物に加えて安定化剤、防腐剤、賦形剤などを含んでもよい。好ましい脂質は、天然および合成のリン脂質およびホスファチジルコリン（レシチン）である。リポソームを形成する方法は当技術分野において周知であり、これに関しては、ペルスコット（Prescott）編、「細胞生物学における方法（Methods in Cell Biology）」XIV巻、Academic Press、New York、N.Y.(1976),、33頁（以下参照）を参照のこと（この内容は参照として本明細書に組み入れられる）。
【０１４２】
注射可能な溶液または懸濁液として投与するための無毒の非経口的に許容される希釈剤または担体として、リンガー溶液、等張食塩水、リン酸緩衝食塩水、エタノール、および1,2-プロピレングリコールが挙げられ得る。
【０１４３】
経口使用に適切な担体、希釈剤、賦形剤、およびアジュバントのいくつかの例として、ピーナッツ油、流動パラフィン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、アカシアゴム、トラガカントゴム、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、ゼラチン、およびレシチンが挙げられる。さらに、これらの経口製剤は、適切な着香料および着色剤を含んでもよい。カプセルの形で使用する場合、このカプセルは、カプセルの崩壊を遅らす化合物（例えば、モノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリル）でコーティングすることができる。
【０１４４】
アジュバントとして、一般的に、皮膚軟化薬、乳化剤、増粘剤、防腐剤、殺菌剤、および緩衝剤が挙げられる。
【０１４５】
経口投与のための固形剤形は、ヒトおよび獣医学での薬学的実施に許容される結合剤、甘味剤、崩壊剤、希釈剤、着香料、コーティング剤、防腐剤、潤滑剤、ならびに/または時間遅延剤（time delay agent）を含んでもよい。適切な結合剤として、アカシアゴム、ゼラチン、コーンスターチ、トラガカントゴム、アルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロース、またはポリエチレングリコールが挙げられる。適切な甘味剤として、スクロース、ラクトース、グルコース、アスパルテーム、またはサッカリンが挙げられる。適切な崩壊剤として、コーンスターチ、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ガーゴム、キサンタンゴム、ベントナイト、アルギン酸、または寒天が挙げられる。適切な希釈剤として、ラクトース、ソルビトール、マンニトール、デキストロース、カオリン、セルロース、炭酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、またはリン酸二カルシウム（dicalcium phosphate）が挙げられる。適切な着香料として、ペパーミント油、ウインターグリーン油、サクランボ着香料、オレンジ着香料、またはラズベリー着香料が挙げられる。適切なコーティング剤として、アクリル酸および/もしくはメタクリル酸および/もしくはそのエステルのポリマーもしくはコポリマー、蝋、脂肪アルコール、ゼイン、シェラック、またはグルテンが挙げられる。適切な防腐剤として、安息香酸ナトリウム、ビタミンE、α-トコフェロール、アスコルビン酸、メチルパラベン、プロピルパラベン、または重亜硫酸ナトリウムが挙げられる。適切な潤滑剤として、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、オレイン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、またはタルクが挙げられる。適切な時間遅延剤として、モノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルが挙げられる。
【０１４６】
経口投与用の液状剤形は、前記の薬剤に加えて液状担体を含んでもよい。適切な液状担体として、水、油（例えば、オリーブ油、ピーナッツ油、ゴマ油、ヒマワリ油、ベニバナ油、ラッカセイ油、ヤシ油)、流動パラフィン、エチレングリコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、グリセロール、脂肪アルコール、トリグリセリド、またはその混合物が挙げられる。
【０１４７】
経口投与用の懸濁液は、分散剤および/または懸濁剤をさらに含んでもよい。適切な懸濁剤として、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル-セルロース、ポリビニルピロリドン、アルギン酸ナトリウム、またはアセチルアルコールが挙げられる。適切な分散剤として、レシチン、脂肪酸（例えば、ステアリン酸）のポリオキシエチレンエステル、ポリオキシエチレンソルビトールモノ-またはジ-オレエート、-ステアレート、または-ラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノ-またはジ-オレエート、-ステアレート、または-ラウレートなどが挙げられる。
【０１４８】
経口投与用のエマルジョンは、1つまたはそれ以上の乳化剤をさらに含んでもよい。適切な乳化剤として、前記のような分散剤または天然のゴム（例えば、ガーゴム、アカシアゴム、もしくはトラガカントゴム）が挙げられる。
【０１４９】
本発明の局所製剤は、活性成分と、1つまたはそれ以上の許容される担体および選択的に他の任意の治療成分を含む。
【０１５０】
局所投与に適した製剤として、皮膚を通って治療が必要とされる部位に浸透するのに適した液状製剤または半流動製剤（例えば、リニメント、ローション、クリーム、軟膏、またはパスタ)、および眼、耳、または鼻への投与に適した滴剤が挙げられる。
【０１５１】
本発明に係る滴剤は、滅菌した水性または油性の溶液または懸濁液を含んでもよい。これらの滴剤は、活性成分を、殺菌剤および/または殺真菌剤および/または他の任意の適切な防腐剤の水溶液（選択的に、界面活性剤を含む）に溶解することにより調製することができる。次いで、結果として生じる溶液は濾過により清澄化し、適切な容器に移し、滅菌することができる。滅菌は、90℃〜100℃で30分間オートクレーブもしくは維持するか、または濾過を行い、その後、無菌法で容器に移すことにより達成することができる。滴剤に含めるのに適した殺菌剤および殺真菌剤の例は、硝酸フェニル水銀または酢酸フェニル水銀(0.002％)、塩化ベンザルコニウム(0.01％)、および酢酸クロルヘキシジン(0.01％)である。油性溶液の調製に適した溶媒として、グリセロール、希アルコール、およびプロピレングリコールが挙げられる。
【０１５２】
本発明に係るローションとして、皮膚または眼への適用に適したローションが挙げられる。点眼剤は滅菌水溶液（選択的に殺菌剤を含む）を含んでもよく、滴剤の調製に関する前記方法に類似した方法により調製することができる。皮膚に投与するためのローションまたはリニメントはまた、乾燥を促し、皮膚を冷却する薬剤（例えば、アルコールもしくはアセトン）および/あるいはモイスチャーライザー（例えば、グリセロール）または油（例えば、ヒマシ油もしくはラッカセイ油）を含んでもよい。
【０１５３】
本発明に係るクリーム、軟膏、またはパスタは、外用のための活性成分の半固形製剤である。これらは、細かく分けた形態または粉末形態の活性成分を単独で、または水性液体もしくは非水性液体に溶解した溶液もしくは懸濁液の状態で、油脂性基剤または非油脂性基剤と混合することにより調製することができる。基剤は、炭化水素（例えば、固形パラフィン、軟パラフィン、または流動パラフィン、グリセロール、蜜蝋、金属セッケン）；粘漿剤；天然由来の油（例えば、アーモンド油、トウモロコシ油、ラッカセイ油、ヒマシ油、もしくはオリーブ油）；羊毛脂もしくはその誘導体、またはアルコール（例えば、プロピレングリコールもしくはマクロゴール）と結合した脂肪酸（例えば、ステアリン酸もしくはオレイン酸）を含んでもよい。
【０１５４】
製剤は、陰イオン界面活性剤、陽イオン界面活性剤または非イオン界面活性剤などの任意の適切な界面活性剤（例えば、ソルビタンエステルまたはそのポリオキシエチレン誘導体）を含んでもよい。天然ゴム、セルロース誘導体、または無機物質（例えば、ケイ酸塩のシリカ（silicaceous silica））などの懸濁剤、および他の成分（例えば、ラノリン）もまた含めることができる。
【０１５５】
非経口投与のための組成物は、通常、許容される担体（例えば、水、緩衝水、0.4％食塩水、および0.3％グリシンなど）に溶解された、本発明の化合物またはそのカクテルの溶液を含み、このような溶液は滅菌してあり、粒子状物体を比較的含まない。
【０１５６】
非経口投与可能な組成物を調製する方法は当業者に明らかであり、例えば、参照として本明細書に組み入れられる、「レミントン薬学科学（Remington's Pharmaceutical Science）」、第15版、Mack Publishing Company、Easton、Paでさらに詳細に説明される。
【０１５７】
本発明の薬学的組成物はまたリポソームの形で投与することができる。一般的に、リポソームはリン脂質または他の脂質物質から誘導され、水性媒体に分散された単層または多層の含水液晶により形成される。リポソームを形成することができる、任意の無毒の、生理学的に許容され、かつ代謝可能な脂質を用いることができる。リポソームの形をとる本発明の製剤は、本発明の化合物に加えて安定化剤、防腐剤、賦形剤などを含んでもよい。好ましい脂質は、天然および合成のリン脂質およびホスファチジルコリン（レシチン）である。リポソームを形成する方法は当技術分野において周知であり、これに関しては、ペルスコット（Prescott）編、「細胞生物学における方法」、XIV巻、Academic Press、New York、N.Y.(1976)、33頁（以下参照）を参照のこと（この内容は参照として本明細書に組み入れられる）。
【０１５８】
目的の結果に応じて、本発明の薬学的組成物は、予防的処置および/または治療的処置のために投与することができる。治療的使用において、組成物は、疾患およびその合併症を治癒するか、または少なくとも部分的に阻止するのに十分な量で、既に疾患に罹患している患者に投与される。予防的使用において、化合物またはそのカクテルを含む組成物は、患者の抵抗力を高めるために、まだ疾患状態にない患者に投与される。
【０１５９】
一般的に、本発明の化合物は、手術および/または治療剤（化学療法剤もしくは放射線治療剤を含む）などの他の既知の治療と併用することができる。より一般的に、固形腫瘍の治療に用いられる場合、本発明の化合物は、化学療法剤（例えば、アドリアマイシン、タキソール、フルオロウリシル（fluorouricil)、メルファラン、シスプラチン、α-インターフェロン、COMP(シクロフォスファミド、ビンクリスチン、メトトレキセート、およびプレドニゾン)、エトポシド、mBACOD(メトトレキセート、ブレオマイシン、ドキソルビシン、シクロフォスファミド、ビンクリスチン、およびデキサメタゾン)、PROMACE/MOPP(プレドニゾン、メトトレキセート(w/ロウコビンレスキュー（w/leucovin rescue）)、ドキソルビシン、シクロフォスファミド、タキソール、エトポシド/メクロレタミン、ビンクリスチン、プレドニゾン、およびプロカルバジン)、ビンクリスチン、ビンブラスチン、アンギオインヒビン（angioinhibin)、TNP-470、ペントサンポリサルフェート、血小板第4因子、アンギオスタチン、LM-609、SU-101、CM-101、テクガラン（Techgalan)、サリドマイド、SP-PGなど）と共に投与することができる。他の化学療法剤として、アルキル化剤（例えば、ナイトロジェンマスタード（メクロエタミン（mechloethamine)、メルファラン、クロラムブシル、シクロフォスファミド、およびイホスファミドを含む））；ニトロソ尿素（カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、およびストレプトゾシン（streptozocin）を含む）；スルホン酸アルキル（ブスルファンを含む）；トリアジン（ダカルバジンを含む）；エチエンイミン（ethyenimine）（チオテパおよびヘキサメチルメラミンを含む）；葉酸類似体（メトトレキセートを含む）；ピリミジン類似体（5-フルオロウラシル、シトシンアラビノシドを含む）；プリン類似体（6-メルカプトプリンおよび6-チオグアニンを含む）；抗腫瘍性抗生物質（アクチノマイシンDを含む）；アントラサイクリン（ドキソルビシン、ブレオマイシン、マイトマイシンC、およびミトラマイシンを含む）；ホルモンおよびホルモン拮抗薬（タモキシフェンおよび副腎皮質ホルモン（cortiosteroid）を含む)、ならびに種々の薬剤（シスプラチンおよびブレクイナ（brequinar）を含む）が挙げられる。
【０１６０】
3.溶液中のAsの活性濃度を決定するための一般的なアッセイ法
三価ヒ素剤の活性濃度は、以下の段階を含む以下の一般的な方法により決定することができる：(i)漸増濃度の三価ヒ素剤を含むヒ素溶液を調製する段階；
該ヒ素溶液を既知濃度のジチオールを含む第2の溶液で滴定する段階；
それぞれの溶液に十分な量のジチオール検出試薬を添加する段階；
それぞれのヒ素溶液を分光学的に測定して過剰なジチオールの量を決定する段階；および
該溶液における該三価ヒ素剤の活性濃度を計算する段階。
【０１６１】
一般的に、三価ヒ素剤のアッセイ法は、三価ヒ素剤が近接して間隔をおいたジチオール（例えば、2,3-ジメルカプトプロパノール(DMP)）にしっかりと結合して、遊離チオールが適切な試薬および検出器を用いて測光学的に検出される能力によるものである。三価ヒ素剤の活性濃度は、このヒ素剤をジチオールで滴定し、次いで、溶液中に残っている遊離チオール（すなわち過剰なジチオール）の量を適切な試薬を用いて決定することにより判明される。漸増濃度のヒ素剤を含む溶液を調製し、それぞれの溶液に、ジチオールが最も少ない量のヒ素剤より多いが、最も多い量のヒ素剤より少なくなるように一定量のジチオールを添加する。過剰のジチオールを含む溶液は、適切な試薬が添加されると測光学的に測定可能な色の変化を生じ、適切な波長で吸光度を測定することにより実際のジチオール濃度を決定することができる。過剰のヒ素剤を含む溶液は、全てのチオールがAsに結合されるので色を変えない。結果をプロットすると当量点（ここで、ジチオール濃度＝As濃度）が得られ、全ての溶液に添加されたジチオールの初濃度が既知であるので、Asの活性濃度を決定することができる。
【０１６２】
次に、特定の実施例を参照して本発明をさらに詳細に説明する。実施例は、どのようにも本発明の範囲を制限すると解釈されるべきではない。
【０１６３】
実施例1
本発明の化合物の合成
以下の化学物質を購入し、さらに精製することなく使用した：フェニルアルセノキシド、臭化ブロモアセチル、二酸化硫黄、d6-ジメチルスルホキシド、酸化ジュウテリウム、L-アスパラギン酸、L-グルタミン酸、D-グルコサミン塩酸塩(Aldrich,Castle Hill,NSW)；メタノール、98％硫酸、48％臭化水素酸、37％塩酸(Ajax,Auburn,NSW)；ジクロロメタン、水酸化カリウム、炭酸水素ナトリウム、水酸化ナトリウム(BDH,Kilsyth,VIC)；P-2 Gelエクトラファイン1,800 MWカットオフ(Bio-Rad,Hercules,CA)；2,3-ジメルカプトプロパノール(DMP)、L-システイン酸(Fluka,Castle Hill,NSW)；塩化チオニル(Merck,Darmstadt,Germany)；6,8-チオクト酸、ジチオスレイトール、ジメチルスルホキシド、5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)、エチレンジアミン四酢酸、N-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジン-N'-(2-エタンスルホン酸)、グルタチオン、炭酸ナトリウム、塩化ナトリウム、ヨウ化ナトリウム(Sigma,Castle Hill,NSW)；p-アルサニル酸(Tokyo Kasei Kogyo,Tokyo,Japan)；グリシン(ICN,Aurora,Ohio)。3-(フルオレセイン-5-カルバモイルメチルチオ)プロパン酸,スクシンイミジルエステル(フルオレセイン-5-EX,SE)、6-(フルオレセイン-x-カルボキサミド)ヘキサン酸(混合異性体：x=5または6)、スクシンイミジルエステル(5(6)-SFX)、および6-((6-((ビオチノイル)アミノ)ヘキサノイル)アミノ)ヘキサン酸、スクシンイミジルエステル(ビオチン-XX,SE)をMolecular Probes、Eugene、Oregonから入手した。Cy(商標)5.5一官能性色素をAmersham Pharmacia Biotech,Little Chalfont,Buckinghamshire,UKから入手した。他の全ての試薬は分析グレードの試薬であった。
【０１６４】
計測機器-
1Dおよび2D NMRスペクトルをBruker DPX300核磁気共鳴分光器を用いて得、1Hおよび13Cを、それぞれ300.17MHzおよび75.48MHzで検出した。UV-可視光吸光度を、Molecular Devices Thermomax Plus(Palo Alto,CA)マイクロプレートリーダーで記録した。
【０１６５】
酸性化酸化ジュウテリウムの調製-
新鮮な塩化チオニルを過剰の酸化ジュウテリウムに慎重に添加した。SO2の発生が終わった後、結果として生じた溶液(0.6ml)を、5mm NMRチューブ中のGSAO(約50mg)に添加した。この試料を用いてNMRスペクトルを得た。
【０１６６】
実施例1(a)
4-(N-(S-グルタチオニルアセチル)アミノ)フェニルアルセノキシド(GSAO)の合成
GSAOの全合成を図3に図示する。
【０１６７】
4-(N-(ブロモアセチル)アミノ)フェニルアルソン酸(BRAA)の合成
炭酸ナトリウム(40.14g、378.7mmol)を水(200mL)に添加し、固形物が全て溶解するまで室温で攪拌した。攪拌された炭酸溶液にp-アルサニル酸(29.99g、138.2mmol)を何回かに分けて添加し、さらに水を添加して、溶液の体積を300mLにした。この溶液（pH10〜11）を30分間攪拌し、必要に応じて濾過して溶解していない固形物を除去した後、2〜3時間冷蔵した。溶液を分液漏斗に移し、氷の破片を加えた。臭化ブロモアセチル(15mL、34.76g、172.1mmol)をジクロロメタン(50mL)で希釈し、ジクロロメタン溶液の約半分を冷水溶液に注意深く添加した。過度の圧力上昇を避けるために頻繁に排気しながら、混合物を慎重に振盪した。1〜2分後、二酸化炭素の発生が静まり、さらに激しく振盪を行った。臭化ブロモアセチルの残りの部分を注意深く添加し、この手順を繰り返した。反応が終わった時、溶液はpH7であった。下方のジクロロメタン層を捨て、水層を1Lフラスコに移し、98％硫酸を滴下して注意深く酸性化した。白色生成物の完全な沈殿には、溶液が約pH1になるまで酸を添加することが必要であった。粗生成物を収集し、ポンプで乾燥させ、収率は一般的に50％〜75％であった。
0004707294.tif 000044
【０１６８】
4-(N-(ブロモアセチル)アミノ)フェニルアルセノキシド水和物(BRAO.xH2O)の合成
500mL三ツ口丸底フラスコにBRAA(12.15g、36mmol)を入れた。旋回しながら、固形物をメタノール(75mL)および臭化水素酸(48％、75mL)の混合物に溶解して、透明な黄色溶液を得た。溶液を濾過して、残留固形物を除去した。ヨウ化ナトリウム(0.20g、1.3mmol)を触媒として添加し（このとき溶液の色が濃くなってオレンジブラウンになった)、次いで、攪拌溶液に二酸化硫黄ガスを約2.5時間ゆっくりと（毎秒約2気泡）通した。結果として得られた白色沈殿物をブフナー漏斗を用いて収集して、湿った白色固形物として生成物(17.43g)を得た。固形物の一部(40.7mg)を脱酸素DMSO(800μL)に溶解することで作成された溶液の活性は56mMと決定された（以下を参照のこと）。よって、BRAO.xH2Oの分子量は908.5（すなわち、35重量％BRAOおよび65重量％H2O）である。従って、BRAO生成物の「無水物」量は、17.43gの35％、すなわち6.10g(19mmol、53％収率)である。
0004707294.tif 000045
【０１６９】
4-(N-(S-グルタチオニルアセチル)アミノ)フェニルアルセノキシド(GSAO)の合成
窒素ガス流を数分間通すことによりDMSO(10mL)を脱酸素し、これを用いてBRAO.xH2O(1.00g、2.48mmol活性アルセノキシド)を溶解した。グルタチオン(1.15g、3.74mmol、1.5eq)を0.5M重炭酸緩衝液,pH9.6(35mL)に溶解し、DMSOに溶解したBRAO.xH2Oの溶液に添加した。総体積を0.5M重炭酸緩衝液で50mLにし、この溶液を穏やかに室温で一晩攪拌した。37％塩酸で注意深く中和し、その後、凍結乾燥することにより、白色粉末状生成物が得られた。この生成物は、残留固形物を残さないで水に溶解することができた。結果として得られた溶液の活性アルセノキシド濃度は49.6mMであり、DMP/DTNBアッセイ法（以下を参照のこと）を用いて決定された。
【０１７０】
生成物を、0.10mL/分の流速で、溶離液として20mM Hepes、0.14M NaCl、1mM EDTA（pH7.4）緩衝液を用いた130mLカラムでのゲル濾過(P-2 Gelエクロトラファイン,1.8kDaカットオフ,50g)を用いて精製した。合計144mL（2mLの72画分）を収集し、UV(λ214nm)によりモニターした。4つのピークA、B、C、およびDが分離された。ピークBおよびCはDTNB/DMPアッセイ法（以下を参照のこと）において活性を示し、それぞれ、GSAOおよび未反応BRAOと指定された。ピークAおよびDは、暫定的に、それぞれ、酸化生成物GSAAおよびBRAA（BRAOの酸化生成物）と指定された（以下を参照のこと）。未反応GSHもまた、ピークAに対応する画分中で（DTNBを用いて）検出された。ピークBに対応する画分を混合し、窒素ガスで脱酸素して、GSAO溶液(15mM、約12mL)を得た。
0004707294.tif 000046
【０１７１】
2D NMR分光法も用いてGSAOの構造を確認した。一連の1Hおよび13C NMRスペクトル1H、13C、1H-1H COSY、1H-13C HMQC、および1H-13C HMBCは全て図3に示された構造と一致することが分かった。全てのスペクトルを合わせて考えることにより、全ての炭素原子および置換できない水素原子を疑いなく指定することができた。脂肪族領域を示す、GSAOの1H-13C HMBCスペクトルを拡大したものを図4に示す。1H-13C HMBC技術は、カップリングした1H核および13C核を相関させるが、直接結合した核をフィルタリングする。このことは、2つ、3つ、または（時として）4つの結合により隔てられた1H核および13C核がスペクトルにおけるクロスピークとして現われたことを意味する。図4は、C11がH7（C7に結合したプロトンを意味する）にだけ強くカップリングしている一方、C7がH6に加えてH11に強くカップリングしていることを示している。このことは、GSH硫黄がBRAOにより首尾よくアルキル化されたことを裏付けている。
【０１７２】
実施例1(b)
4-(N-(S-グルタチオニルアセチル)アミノ）フェニルアルソン酸(GSAA)の合成
GSAAの合成を図5に図示する。
【０１７３】
BRAA(1.00g、2.96mmol)およびグルタチオン(1.36g、4.44mmol、1.5eq)を0.5M重炭酸緩衝液（pH9.6）(50mL)に溶解し、溶液を穏やかに室温で一晩攪拌した。凍結乾燥により、固形残留物を残さないで水に自由に溶ける白色粉末状生成物が得られた。生成物を、0.1mL/分の流速で、溶離液として脱イオン水を用いた、Bio-Gel P-2エクストラファイン(BioRad,Hercules,CA)の570mLカラム(2.5×117cm)でのゲル濾過により精製した。生成物(GSAA)が、GSAO精製のピークAに対応する位置でカラムから溶出した。
【０１７４】
実施例1(c)
4-(N-(S-(N-(6-((6-((ビオチノイル)アミノ)ヘキサノイル)アミノ)ヘキサノイル)グルタチオニル)アセチル)-アミノ)フェニルアルセノキシド(GSAO-B)の合成
GSAO-Bの合成を図6に図示する。
【０１７５】
GSAO(0.13g)を0.5M重炭酸ナトリウム緩衝液(5mL、pH8.5)に溶解し、結果として得られた溶液中の活性ヒ素剤の濃度を39mMと決定した。緩衝化ヒ素剤溶液(4.2mL、165μmol活性ヒ素剤を含む)を、DMSO(1mL)に溶解したビオチン-XX,SE(100mg、176μmol)溶液に添加し、混合物を数回逆さにし、次いで、4℃で4時間インキュベートした。グリシン(17.5mg、233μmol)を添加し、混合物を一晩4℃に保った。GSAO-B生成物における三価ヒ素剤の濃度を31mMと決定し、この溶液をさらに改変することなく用いた。
【０１７６】
実施例1(d)
4-(N-(S-(N-(3-(フルオレセイン-5-カルバモイルメチルチオ)プロパノイル）グルタチオニル)アセチル)-アミノ)フェニルアルセノキシド(GSAO-F)の合成
GSAO-Fの合成を図7に図示する。
【０１７７】
Mes緩衝液（pH5.5）(5mM、473μL)に溶解したGSAO(33.8mM)に、DMSO(240μL)に溶解したフルオレセイン-5-EXスクシンイミジルエステル(2.4mg、4.1μmol)の溶液を添加し、混合物を重炭酸緩衝液（pH9）(0.5M、3.287mL)で希釈して、室温で80分間放置した。次いで、この黄色溶液をPBS(4mL)に溶解したグリシン(100mM)で希釈し、室温で一晩放置した。最終溶液は、三価ヒ素剤(2.00mM)およびグリシン(50mM)を含んでいた。
【０１７８】
実施例1(e)
GSAO-Cy(商標)5.5の合成
GSAO-Cy(商標)5.5の合成を図8に図示する。
【０１７９】
重炭酸緩衝液（pH9）(0.5M、968μL)に溶解したCy(商標)5.5(266nmol)の溶液を、Mes緩衝液（pH5.5）（5mM、32μL）に溶解したGSAO(33.8mM)の溶液と混合し、室温で80分間放置した。次いで、青色溶液を、PBS(1mL)に溶解したグリシン(100mM)で希釈し、室温で一晩放置した。最終溶液は、三価ヒ素剤(0.54mM)およびグリシン(50mM)を含んでいた。
【０１８０】
実施例1(f）
4-アミノフェニルアルセノキシド(pAPAO)の合成
pAPAOの合成を図9に図示する。
【０１８１】
臭化水素酸(48％、35mL)を、メタノール(35mL)に溶解したp-アルサニル酸(7.76g、35.8mmol)の懸濁液に攪拌しながら添加した。ヨウ化ナトリウム（約0.05g、0.33mmol）を添加し、次いで、溶液を水浴(室温)に入れた。攪拌溶液に二酸化硫黄を毎秒約2気泡の速度で通した。2時間後、白色沈殿物が形成した。反応を一晩進行させた（この時までに固形物の大部分が再溶解していた）。残っている固形物を収集し、ポンプで乾燥させて3.89gを得た。DMSO(1mL)に溶解したpAPAO(24mg)の溶液を調製し、三価ヒ素剤の活性濃度を決定した（GSAO活性の決定を参照のこと）。これから、生成物は3.57mmolの活性ヒ素剤(10％収率)からなることが分かった。
【０１８２】
実施例1(g)
4-(N-(6-(フルオレセイン-5-カルボキサミド)ヘキサノイル)アミノ)フェニルアルセノキシドおよび4-(N-(6-(フルオレセイン-6-カルボキサミド)ヘキサノイル)アミノ)フェニルアルセノキシド(FXAO)の混合物の合成
FXAOの合成を図9に図示する。
【０１８３】
DMSO(107μL)に溶解した6-(フルオレセイン-5-カルボキサミド)ヘキサン酸、スクシンイミジルエステルおよび6-(フルオレセイン-6-カルボキサミド)ヘキサン酸、スクシンイミジルエステルの混合物(4.9mg、8.29μmol)の混合物の溶液を、DMSO(193μL)に溶解したpAPAO(22mM)に添加した。混合物を0.5M重炭酸緩衝液（pH9）(700μL)で希釈し、次いで、室温で80分間放置した。黄色溶液を、PBS(1mL)に溶解したグリシン(100mM)で希釈し、室温で一晩放置した。最終溶液は、三価ヒ素剤(2.12mM)およびグリシン(50mM)を含んでいた。
【０１８４】
実施例1(h)
3,3'-ジチオビス(プロパン酸)の合成
この合成を図示するスキームを図10に示す。
【０１８５】
炭酸ナトリウム(64.0g、604mmol)を水(300mL)に添加し、固形物が全て溶解するまで溶液を室温で攪拌した。二酸化炭素の発生が過度に激しくならない速度で、攪拌した炭酸溶液に3-メルカプトプロパン酸(50mL、60.9g、574mmol)を滴下した。結果として生じる懸濁液にジクロロメタン(50mL)を添加し、その後、ヨウ素(71.44g、281mmol、0.49eq)を何回かに分けて添加した。ヨウ素を添加する間、激しい二酸化炭素の発生が観察された。混合物を500mL分液漏斗に移し、下方の有機層を捨てた。水層を濾過し、98％硫酸でpH1まで慎重に酸性化した。沈殿物を収集し、ポンプで乾燥させて、生成物(43.4g、72％収率)を得た。
0004707294.tif 000047
【０１８６】
実施例1(i)
3,3'-ジチオビス(プロパン酸、スクシンイミジルエステル)の合成
この合成を図示するスキームを図10に示す。
【０１８７】
室温で攪拌しながら、3,3'-ジチオビス(プロパン酸)(9.5g、45.2mmol)を、アセトン(600mL)およびジクロロメタン(600mL)の混合物に溶解した。この溶液にN-ヒドロキシスクシンイミド(12.68g、110.2mmol、2.44eq)を溶解し、次いで、1,3-ジシクロヘキシルカルボジイミド(25.9g、125.5mmol、2.78eq)を慎重に添加した。混合物を室温で24時間攪拌し、この後、溶液を減圧濾過し、残留固形物を捨てた。減圧下で濾液から溶媒を除去し、油状残渣をジクロロメタン(約200mL)を再溶解した。溶液の体積を減らし(約50mL)、冷却して、無色の結晶固形物として生成物(8.90g、49％収率)を得た。
0004707294.tif 000048
【０１８８】
実施例1(j)
N-(3-メルカプトプロパノイル)-L-アスパラギン酸二ナトリウムのジスルフィドの合成
この合成を図示するスキームを図10に示す。
【０１８９】
L-アスパラギン酸(0.42g、3.16mmol)を炭酸水素ナトリウム(0.50g、5.95mmol、1.9eq)と混合し、次いで、水(1mL)を添加した。炭酸水素ナトリウムは、L-アスパラギン酸に存在する酸性水素（acidic hydrogen）を消滅させるために添加した。二酸化炭素の発生が静まったら、混合物を0.5M重炭酸緩衝液（pH9）(19mL、9.5mmol)で希釈した。旋回しながら固形物を全て溶解し、溶液はpH9であった。攪拌しながら、炭酸水溶液に3,3'-ジチオビス(プロパン酸,スクシンイミジルエステル)(0.247M、DMSOに溶解、5mL、1.24mmol)を滴下した。直ぐに、白色沈殿物が現われたが、激しく振盪すると再溶解した。24時間後（この間、混合物を定期的に振盪した)、ジクロロメタン(1mL)を添加し、再度、混合物を定期的に振盪しながら24時間放置した。32％塩酸滴下により溶液(pH9)をpH7まで酸性化した。無水エタノール(300mL)の攪拌ビーカーに溶液を室温でゆっくりと滴下することにより生成物を沈殿させて、ふわふわした白色沈殿物を得た。沈殿物を濾過により収集し、減圧下で乾燥させて、白色固形物として生成物(0.37g、53％収率)を得た。
0004707294.tif 000049
【０１９０】
実施例1(k)
N-(3-メルカプトプロパノイル)-L-グルタミン酸二ナトリウムのジスルフィドの合成
この合成を図示するスキームを図10に示す。
【０１９１】
使用した手順は、N-(3-メルカプト-プロパノイル)-L-アスパラギン酸二ナトリウムのジスルフィドの手順と同じであり、L-グルタミン酸(0.44g、2.99mmol)および炭酸水素ナトリウム(0.55g、6.55mmol、2.2eq)を用いた。生成物を白色固形物(0.61g、87％収率)として得た。
0004707294.tif 000050
【０１９２】
実施例1(l)
N-(3-メルカプトプロパノイル)-L-システイン酸二ナトリウムのジスルフィドの合成
この合成を図示するスキームを図10に示す。
【０１９３】
使用した手順は、N-(3-メルカプト-プロパノイル)-L-アスパラギン酸二ナトリウムのジスルフィドの手順と同じであり、L-システイン酸(0.59g、3.15mmol)および炭酸水素ナトリウム(0.56g、6.67mmol、2.1eq)を用いた。生成物を白色固形物(0.68g、79％収率)として得た。
0004707294.tif 000051
【０１９４】
実施例1(m)
N-(3-メルカプトプロパノイル)-D-グルコサミン二ナトリウムのジスルフィドの合成
この合成を図示するスキームを図10に示す。
【０１９５】
この手順は、最初に追加の炭酸水素ナトリウムを添加せず、生成物をエタノールの代わりにARアセトン(300mL)で沈殿させた以外は前記のアミノ酸誘導体の手順に従い、D-グルコサミン塩酸塩(0.67g、3.11mmol)を用いた。生成物を白色固形物(0.67g、81％収率)として得た。
0004707294.tif 000052
【０１９６】
実施例1(n)
N-(3-(4-アルセノソフェニルカルバモイルメチルチオ)プロパノイル)-L-アスパラギン酸(AspAO)の合成
DMSOに溶解した70.0mM BRAOの溶液(1.68mL、118μmol)を、0.5M重炭酸緩衝液（pH9）(6.72mL、3.4mmol)に溶解したN-(3-メルカプトプロパノイル)-L-アスパラギン酸二ナトリウムのジスルフィド(0.37g)の溶液と混合した。この溶液に、DMSOに溶解した0.69Mトリフェニルホスフィン(1.1mL、760μmol)を添加した。不溶性トリフェニルホスフィンであると推定された中間沈殿物があった。そこで、DMSO(1mL)を添加し、混合物を十分に振盪し、室温で一晩放置した。混合物を濾過し、32％塩酸を滴下してpH4まで酸性化して、7.5mLの溶液を得た。三価ヒ素の活性濃度は、（BRAOおよびGSAOの活性濃度を決定するのに用いられた同じ方法を用いて）17.5mMであることが分かった。
【０１９７】
実施例1(o)
N-(3-(4-アルセノソフェニルカルバモイルメチルチオ)プロパノイル)-L-グルタミン酸(GluAO)の合成
使用した手順は、N-(3-(4-アルセノソフェニルカルバモイルメチルチオ)プロパノイル)-L-アスパラギン酸の手順と同じであり、DMSOに溶解した70.0mM BRAO 2.63mL(184μmol)、N-(3-メルカプトプロパノイル)-L-グルタミン酸二ナトリウムのジスルフィド(0.61g)、0.5M重炭酸緩衝液（pH9）(10.52mL、5.3mmol)、およびDMSOに溶解した0.69Mトリフェニルホスフィン(1.7mL、1.2mmol)を使用した。この場合、一晩放置する前に、沈殿混合物にDMSO(2mL)を添加した。三価ヒ素の活性濃度は15.4mM（10.3mLの溶液）であった。
【０１９８】
実施例1(p)
N-(3-(4-アルセノソフェニルカルバモイルメチルチオ)プロパノイル)-L-システイン酸(Cys＊AO)の合成
使用した手順は、N-(3-(4-アルセノソフェニルカルバモイルメチルチオ)プロパノイル)-L-グルタミン酸の手順と同じであり、DMSOに溶解した70.0mM BRAO 2.70mL(189μmol)、N-(3-メルカプトプロパノイル)-L-システイン酸二ナトリウムのジスルフィド(0.68g)、0.5M重炭酸緩衝液（pH9）(10.80mL、5.4mmol)、およびDMSOに溶解した0.69Mトリフェニルホスフィン(1.8mL、1.2mmol)を使用した。三価ヒ素の活性濃度は17.5mM（12.3mLの溶液）であった。
【０１９９】
実施例1(q)
N-(3-(4-アルセノソフェニルカルバモイルメチルチオ)プロパノイル)-D-グルコサミン(GlcAO)の合成
使用した手順は、N-(3-(4-アルセノソフェニルカルバモイルメチルチオ)プロパノイル)-L-グルタミン酸の手順と同じであり、DMSOに溶解した70.0mM BRAO 3.00mL(210μmol)、N-(3-メルカプトプロパノイル)-D-グルコサミン二ナトリウムのジスルフィド(0.67g)、0.5M重炭酸緩衝液（pH9）(11.96mL、6.0mmol)、およびDMSOに溶解した0.69Mトリフェニルホスフィン(1.9mL、1.3mmol)を使用した。三価ヒ素の活性濃度は13.5mM(11.0mLの溶液)であった。
【０２００】
実施例2
GSAOのアッセイ法および反応性
実施例2(a)
BRAO、GSAO、およびGSAO-Bのアッセイ法
DMP保存溶液(5μL、50μmol)をDMSO(995μL)に溶解して、50mM DMPの濃度にした。50mM DMP保存溶液(10μL)をpH7.0の緩衝液(0.1M HEPES、0.3M NaCl、1mM EDTA)(990μL)で再度希釈することにより、500μM DMPの使用溶液を得た。次いで、様々な量のヒ素剤を96ウェルマイクロタイタープレート中のDMP使用溶液(10μL)に対して滴定することにより（緩衝液の添加により総体積を195μLにした)、ヒ素剤の活性を決定した。室温で10分間インキュベーションした後（インキュベーションの間、溶液をプレートシェーカー上で攪拌した)、DMSO(1mL)に溶解したDTNB(15mg)の37.9mM保存溶液5μLを添加し、振盪しながらプレートをさらに10分間インキュベートした。TNBジアニオンの形成による412nmでの吸光度を、Molecular Devices Thermomax Plus(Palo Alto,CA)マイクロプレートリーダーを用いて測定した。pH7.0でのTNBジアニオンの吸光係数は、412nmで14,150M-1cm-1である(リドレス（Riddles）ら、1983)。
【０２０１】
GSAOはDMPに結合し、ジチオールとDTNBとの相互作用を妨げたが、GSAOとシステインとのどの相互作用もDTNBに取って代わられた(図11)。この結果は、GSAOのジチオール選択性を裏付けた。
【０２０２】
実施例2(b)
GSAOと合成ジチオール、ペプチドジチオール、およびタンパク質ジチオールとの相互作用
大腸菌（E. coli）で産生された組換えヒトチオレドキシンは、American Diagnostica、Greenwich、CTから入手した。ヘキサペプチドTrpCysGlyProCysLysおよびTrpCysGlyHisCysLysは、Auspep、Parkville、Australiaから入手した。
【０２０３】
前記のDTNBアッセイ法を用いて、チオールの損失から、GSAOのジチオールへの結合を測定した。漸増濃度のGSAO、Iと一定濃度のジチオール[S]Tをインキュベートし、DTNBを用いて残存するジチオールを測定することにより、GSAOのジチオールへの結合の解離定数Kdを決定した。ジチオール濃度はTNB濃度の半分に等しいことに留意のこと。ジチオール.GSAO複合体、SIの濃度は、GSAO総濃度、[I]Tの関数として式1で説明される(ホグ（Hogg）およびジャクソン（Jackson)、1990)。
[SI]=0.5.{([S]T＋x.[I]T＋Kd)-(([S]T＋x.[I]T＋Kd)2-4.[S]T.x.[I]T)0.5}(1)式中、xは、[I]Tと共に掛けるとGSAOの活性濃度が得られる係数である。データを、Kdおよび未知パラメーターxを用いて最小2乗非線形回帰により式1にフィットさせた(サイエンティスト（Scientist）ソフトウェア,Micromath,Salt Lake City,Utah)。xは、試験した全てのジチオールについて1±0.2であった。
【０２０４】
チオレドキシンは、DTNBと反応する5個の接近可能なチオールを含む(ホルムグレン（Holmgren)、1989)。チオレドキシンをGSAOで滴定すると、複合体形成の際に5〜3個のチオールが減少した。漸増濃度のGSAO、Iと一定濃度のチオレドキシンチオール[S]Tをインキュベートし、DTNBを用いて残存するチオール基を測定することにより、GSAOのチオレドキシンへの結合の解離定数Kdを決定した。チオール基の濃度はTNBの濃度と等しいことに留意のこと。チオレドキシンチオール.GSAO複合体、SIの濃度は、GSAO総濃度、[I]Tの関数として式2で説明される。
[S]T=2.[SI]＋2.[S]D＋[S]M  (2a)
[SI]=0.5.{([S]D＋x.[I]D＋Kd)-(([S]D＋x.[I]T＋Kd)2-4.[S]D.x.[I]T)0.5}(2b)式中、[S]Dは、GSAOと複合体を形成するチオレドキシンジチオールの濃度であり、[S]Mは、残存するチオール基の濃度である。データを、Kdおよび未知パラメーターxを用いて最小2乗非線形回帰により式2にフィットさせた(サイエンティストソフトウェア,Micromath,Salt Lake City,Utah)。xは、チオレドキシンについて1.5±0.2であった。
【０２０５】
小さな合成ジチオールであるDMP、6,8-チオクト酸、およびジチオスレイトールはGSAOと高親和性の複合体を形成した(図12A、B、およびC、表1)。GSAOのヒ素を有する環構造の大きさが大きくなるにつれて、GSAOの親和性は減少した。例えば、DMPの2個のチオールは、GSAOヒ素と共に5員環を形成する隣接炭素原子上にある。ジチオールに対するGSAOの親和性は、130nM（5員環とDMPの場合）の解離定数から420nM（7員環とジチオスレイトールの場合）の解離定数に減少した。
【０２０６】
GSAOはまた、ペプチドジチオールとタンパク質ジチオールの両方に高親和性で結合した。2つのペプチドTrpCysGlyProCysLys(ホルムゲン（Holmgren)、1989)およびTrpCysGlyHisCysLys(ギルバート（Gilbert)、1997)は、それぞれ、チオレドキシンおよびPDIの活性部位配列に対応する。両方のペプチドは、約1μMの解離定数でGSAOを結合した(図12DおよびE、表1)。ペプチドとGSAOヒ素との環構造には15個の原子があった。この大きな環構造にかかわらず、GSAO結合の解離定数は、GSAOのジチオスレイトールへの結合の解離定数の2倍しかなかった。この結果は、ペプチドの二次構造が2個のCysチオールを接近させ、この接近により2個のCysチオールが三価ヒ素剤と複合体を形成することができたことを意味した。GSAOは、GSAOのチオレドキシン活性部位ヘキサペプチドへの結合の解離定数（1,420±450nM）より約4倍高い親和性である、370±180nMの解離定数でチオレドキシン活性部位ジチオールに結合した(図12F、表1)。この結果は、チオレドキシンにおける活性部位チオール間の距離がヘキサペプチドにおける距離より短いことを意味した。
【０２０７】
これらの結果を合わせて考えると、GSAOは近接して間隔をおいたチオールを含むタンパク質を選択的に結合することが分かった。細胞表面上のこれらのタンパク質を同定するために、スペーサーアームを介して、GSAOの□-グルタミル残基の第１アミノ基にビオチン部分を結合させた。GSAO-Bのタンパク質への組み込みは、ストレプトアビジン-ペルオキシダーゼを用いてビオチンを測定することにより評価することができた。
【０２０８】
【表１】
合成ジチオールおよびタンパク質ジチオールへのGSAOの結合の解離定数
0004707294.tif 000053
a  GSAOのヒ素を有する環構造における原子の数
b  誤差は1 SDである。
【０２０９】
実施例2(c)
GSAOによるチオレドキシン活性の阻害
チオレドキシンは、フィブロネクチンの70kDa N末端断片における1つまたはそれ以上のタンパク質ジスルフィド結合を還元することが観察された。Hepes緩衝食塩水中で1μM GSAOと1μMチオレドキシンを10分間インキュベートすると、チオレドキシンによるフィブロネクチン断片の還元が約50％阻害されたのに対して、10μM GSAOとインキュベーションすると、チオレドキシン活性が完全に阻害された(図13)。
【０２１０】
実施例2(d)
GSAO-BとPDIおよびチオレドキシンとの相互作用
ヒト組換えPDIおよびチオレドキシンはGSAO-Bを結合した(図14)。組換えヒトプロテインジスルフィドイソメラーゼ(PDI)は大腸菌で産生され、ジャング（Jiang）ら(1999)に従って精製された。この実験において、精製PDI、チオレドキシン、またはネガティブコントロールとしてアルブミンを、PDIおよびチオレドキシンの活性部位ジスルフィドが確実に還元ジチオール状態になるように2倍モル過剰のジチオスレイトールと60分間インキュベートした。次いで、タンパク質を、GSAO-Bと、またはGSAO-Bおよび4倍モル過剰のDMPと30分間インキュベートした。等モルの標識されたタンパク質をSDS-PAGEで分離し、PVDF膜に転写し、ストレプトアビジン-ペルオキシダーゼでブロットして、GSAO-B標識を検出した。試料を、非還元条件下で4〜15％SDS-PAGEで分離し(ラエムリ（Laemmli)、1970)、PVDF膜に転写した。タンパク質を、(2μg/mLで使用した)抗PDIマウスモノクローナル抗体(ジアング（Jiang）ら、1999)を用いてウエスタンブロットにより検出した。ウサギ抗マウス西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗体(Dako Corporation,Carpinteria,CA)を1：2000に希釈して使用した。GSAO-B標識タンパク質を、1：1000に希釈して使用したストレプトアビジン-ペルオキシダーゼ(Amersham,Sydney,NSW)でブロットした。タンパク質を、製造業者の説明書に従って化学ルミネセンス(DuPont NEN,Boston,MA)を用いて視覚化した。化学ルミネセンスフィルムを、GS-700イメージングデンシトメーター（Imaging Densitometer）およびマルチアナリスト（Multi-Analyst）ソフトウェア(Bio-Rad,Hercules,CA)を用いて分析した
【０２１１】
PDIおよびチオレドキシンは両方ともGSAO-Bを取り込んだが、アルブミンは取り込まなかった。図14Bレーン1の上方のMrバンドは、この調製物中の少量の凝集PDIであった(ジャングら、1999)。PDIの標識濃度が、PDIの2個の活性部位ジチオール対チオレドキシンの1個の活性部位ジチオールと一致する、チオレドキシンの約2倍であったことは注目に値する。
【０２１２】
実施例2(e)
内皮細胞の生存率に及ぼす疎水性、親水性、または荷電した三価ヒ素剤の影響の比較
ウシ大動脈内皮(BAE)細胞(ホッチキス（Hotchkiss）ら、1998)を、96ウェルプレートのウェルに一晩播種し、洗浄し、次いで、漸増濃度の膜透過性PAOまたは実質的に膜不透過性のGSAO、AspAO、GluAO、Cys＊AO、GlcAO、もしくはFXAOを含む完全培地とインキュベートした。24時間のインキュベーション後、付着細胞を計数した。
【０２１３】
PAOはBAE細胞に対して非常に毒性であり、生存率に関するIC50は＜0.1μMであった(図15)。GSAO、AspAO、GluAO、Cys＊AO、GlcAO、およびFXAOの生存率IC50は、それぞれ、約100μM、＜1μM、＜10μM、＜10μM、＜1μM、および＞200μMであった(図15)。GSAAは、10mMの濃度までBAEの生存率に有意な影響を及ぼさなかった（示さず）。この結果は、荷電（GSH、Asp、Glu、システイン酸）ペンダント部または親水性（グルコサミン、フルオレセイン-X）突出部（pendant：ペンダント）への三価ヒ素剤の結合による三価ヒ素剤の細胞への侵入の制限が毒性を1/10〜1/2,000未満まで低下させたことを証明した。
【０２１４】
実施例2(f）
GSAOは実質的に膜不透過性である
GSAOは細胞膜を全く横断しない。ヒトT細胞(A3.01)または付着BAE細胞を、50μM GSAOおよび約100,000カウント毎分のトリチウム化GSAOを含む完全培地と1時間または72時間インキュベートした。冷グルタチオンの代わりにグリシン-2-3H-グルタチオン(NEN,Boston,MA)を用いた以外はGSAOについて記載したように正確にトリチウム化GSAOを調製した。細胞を洗浄し、2サイクルの凍結融解により溶解した。サイトゾル成分を分画遠心分離(アウスベル（Ausbel）ら、2000)により収集し、トリチウム化GSAOを測定した。1時間後、T細胞サイトゾルには総トリチウム化GSAOの0.5％だけが、BAEサイトゾルには0.04％が見い出された。さらに、72時間の培養後、GSAOの4.5％しかT細胞膜を貫通しなかった。
【０２１５】
実施例3
血管形成に対するGSAOの効果
実施例3(a)
密接に空間配置されたジチオールを含む内皮細胞表面タンパク質の同定
ヒト臍静脈内皮細胞（HUVEC）（ウォール（Wall）ら、1978）およびヒト皮膚微小血管内皮細胞系列、HMEC-1（アデス（Ades）ら、1992）を、指示されるように収集および培養した。内皮細胞（5×106個）をPBS中5 mMのEDTA溶液を用いて培養フラスコから37℃で分離し、PBSで3回洗浄し、400μMのDMPの非存在下または存在下において100μMのGSAO-Bを含むPBS中に再懸濁し、室温で30分間インキュベートした。細胞を1 mLのPBSで3回洗浄し、0.5 M NaCl、1％ Triton X-100、10μM ロイペプチン、2 mM PMSF（Sigma Chemical Company、St Louis, MO)、5 mM EDTAおよび10μM アプロチニン（Bayer Australia Ltd., Sydney, NSW）を含む、0.2 mLの氷冷50 mM Tris/HCl（pH 8）緩衝液中で再懸濁し、氷上で超音波処理した。ある場合においては、細胞溶解物をストレプトアビジン-アガロース（Sigma Castle Hill, NSW）ビーズ（総体積1 mLの25μLの包装ビーズ）と共に4℃で60分間、回転混合しながらインキュベートした。0.15 M NaClおよび0.05％Triton X-100を含む50 mMのTris/HCl、pH 8緩衝液で結合したタンパク質を5回洗浄し、SDS-PAGEで分離し、PVDF膜に転写し、ウェスタンブロット法によりGSAO-Bで標識されたタンパク質を検出した。
【０２１６】
GSAO-Bを取り込んだタンパク質は内皮細胞表面上には約10個認められた（図16A）。これらのタンパク質の分子量は12 kDaから138 kDaと異なっていた（図16B）。タンパク質の標識強度はかなり異なり、それはGSAOのタンパク質ジチオールに対する親和性における差異を反映していた可能性もあるが、おそらく細胞表面上のその量の多さを反映していた。DMPの存在下においては、有効にGSAO-B の取り込みがなかったため、標識は特異的であった。
【０２１７】
実施例3(b)
PDIは内皮細胞表面上のGSAO-B標識されたタンパク質の1つであった。
DMPの非存在下または存在下においてGSAO-B によりBAE細胞を標識し、溶解し、ビオチン標識されたタンパク質を収集するためストレプトアビジン-アガロースビーズと共にインキュベートした。標識されたタンパク質をビーズから溶離し、SDS-PAGEで分離し、PVDF膜に転写し、抗PDIポリクローナル抗体を用いてブロットした。
【０２１８】
図17に示される結果は、PDIはGSAO-Bを取り込んだ内皮細胞表面上のタンパク質の1つであったことを示している。DMPの存在下においてはPDIの標識はなく、これは図14の結果により支持される。図17のレーン1における高い方のMrバンドは、幾つか凝集したPDIであった（図14Bを参照のこと）。
【０２１９】
実施例3(c)
GSAOによる内皮細胞の増殖阻害
示されるように、BCE（フォルクマン（Folkman）ら、1979)、BAE、BxPC-3（ATCC, Bethesda, MD)、HT1080（ジアング（Jiang）ら、1999)、3T3（ATCC, Bethesda, MD）およびBVSM（ホグ（Hogg）ら、1997）細胞を収集し培養した。細胞（30,000細胞／mLまたは100,000細胞／mLの0.5 mL）を、ゼラチン被覆24ウェル培養プレート（Corning Costar, Corning, NY）に、10％のウシ胎児血清（FCS、Intergen Comp.,Purchase, NY）および1％のグルタミンPen-Strep（GP3、Irvine Scientific, Santa Ana, VA）を含むダルベッコ改変イーグル培地（DMEM, JHR Bioscience, Lenexa, KS）において植え付け、37℃、10％CO2において24時間付着させた。培地をその後、DMEMおよび0〜1 mMのGSAOまたはGSAAを含む1％のGPS、および、BCE細胞については5％の仔ウシ血清（BCS, HyClone, Logan, UT）および1 ng/ｍLのFGF-2（Genzyme, Cambridge, MA）または5％のBCSおよび10 ng/ｍLのVEGF（Genzyme, Cambridge, MA）のいずれかにより、BAE細胞については5％または10％のBCS、BVSM細胞については5％のBCS、およびBxPC-3細胞、HT1080細胞および3T3細胞については5％のFCSにより、置換した。細胞を37℃、10％CO2において0〜72時間培養し、その後トリプシン／EDTA（GibcoBRL, Granc Island, NY）において分散し、Coulter平衡電解質溶液に再懸濁し、Z1Coulter計測装置（Coulter Corp., Miami, FL）を用いて計測した。全ての実験において、1％のGPSおよび、BCE細胞については5％のBCS、BAE細胞およびBVSM細胞については2％のBCS、またはBxPC-3細胞、HT1080細胞および3T3細胞については2％のFCSのいずれかを含有するDMEMを含む、2個の対照ウェルを用いた。これらのウェルは増殖を示さなかった、または限られた増殖のみを示した。
【０２２０】
GSAOは培養中のBCE細胞の増殖を阻害し、生存率を低下させた（図18）。対照的に、GSAAは、増殖に対しては、使用された最高濃度である1 mMにおいても限界効果しか有さず、生存率に対しては有意な効果を示さなかった。GSAOによる増殖の阻害は、細胞が、線維芽細胞増殖因子-2（FGF-2）（図18A）または血管内皮細胞増殖因子（VEGF）（図18B）のいずれに刺激されたかということとは独立していた。FGF-2またはVEGFに反応した増殖の阻害についてのIC50は、各々約0.1μMおよび約0.05μMであった（表2）。GSAOはまた、FGF-2またはVEGFの存在下において、各々約10μMおよび約3μMのIC50でBCE細胞の生存率を低下させた（表2）。GSAOの抗増殖効果対生存率効果は、細胞のコンフルエント培養の生存率を測定することにより分けられた。例えば、図18Cは、BCE細胞のほぼコンフルエントな培養の生存率に対するGSAOの効果を示す。この実験において、72時間の培養後、細胞数には＜10％の増加が認められた。BCE細胞の増殖および生存率に対するGSAOの効果の時間依存性は、図18Dに示される。生存率の低下についてのIC50であったため、10μMのGSAO濃度を選択した（表2）。8時間後生存率に低下は認められなかった。細胞数はその後減少した。
【０２２１】
GSAOはまた、BAE細胞の増殖を阻害し、生存率を低下させた（示さず）。GSAAは増殖または生存率のいずれにも影響を与えなかった。GSAOによる増殖の阻害および生存率の低下についてのIC50値は、BCE細胞についてのものと同じ範囲にあった（表2）。5％のFCSがマイトジェンの場合、BAE細胞の増殖の阻害についてのIC50は約0.02μMであったのに対し、10％のFCSを用いた場合は約0.2μMであったことは注目すべきである。
【０２２２】
GSAOはヒト癌細胞系列のBxPC-3またはHT1080、マウスの3T3線維芽細胞またはウシ脈管平滑筋（BVSM）細胞の増殖に影響を与えなかった（図19）。GSAOは約40μMのIC50で、これらの細胞全ての生存率に影響を与えた（表2）。この値は内皮細胞の生存率の低下についてのIC50より4〜13倍高かった。GSAAは、1 mMの濃度までは、これらの細胞の増殖または生存率に対して有意な効果をもたなかった。
【０２２３】
【表２】
培養細胞の増殖および生存率に対するGSAOの効果
0004707294.tif 000054
a  BCE細胞およびBAE細胞の増殖阻害についてのIC50は、GSAOの非存在下における細胞数から、72時間のインキュベーションにおいて、BAE細胞について5％のBCSを含むウェル、およびBAE細胞について2％のBCSを含むウェル中の細胞数までの、増殖の範囲を半分に減少させたGSAO濃度として計測された（図18の点線）。
b  BCE細胞およびBAE細胞の生存率の低下についてのIC50は、72時間のインキュベーション開始時に細胞が＞90％コンフルエントであった（例えば、図18Cを参照のこと）アッセイ法において細胞数を半分に減少させたGSAO濃度として計測された。他の全ての細胞の生存率の低下についてのIC50は、72時間のインキュベーションにおいて細胞数を半分に減少させたGSAO濃度として計測された。
【０２２４】
GSAOは、12日のヒト骨髄培養アッセイ法において顆粒球／マクロファージコロニー数を約30μMのIC50で減少させた（図20）。GSAAは100μMの濃度までコロニー数に影響を与えなかった。ヒト骨髄細胞（約5×105細胞／ｍL）を20％BCS、5 ng/ｍLのIL-3、および0〜100μMのGSAAまたはGSAOを含むDMEMの半固形寒天培地に加えた。培養は37℃、5％CO2で12日間インキュベーションし、40個またはそれ以上の細胞の集塊をメトカフ（Metcalf、1977）に従い倒立顕微鏡下で計測した。
【０２２５】
これらの知見は、GSAOが増殖する微小血管および肉眼で見える血管の内皮細胞の選択的な阻害剤であることを示した。阻害効果はマイトジェンがFGF-2またはVEGFのいずれかということとは独立していた。GSAOはまた、培養中の内皮細胞の生存率を、時間依存的に低下させた。生存率に対する半最大効果は、他の一次細胞または形質転換細胞の生存率に対する効果よりも少なくとも4倍少なかった。
【０２２６】
実施例3(d)
GSAOによる内皮細胞管形成の阻害
内皮細胞は、細胞外マトリックス調製物、マトリゲル（Matrigel）またはコラーゲンのような3次元マトリックスに植え付けられた場合、管状構造を形成する。管は未熟な血管を表すと考えられる。マトリゲル（100μl、Becton Dickinson, Bedford, MA）を96ウェルプレート（Gibco BRL, Gaithersburg, MD）のウェルに加え、37℃で60分間ゲル化させた。スタサキス（Stathakis）ら（1997）に説明されるように、ヒト皮膚微小血管内皮（HDMVE）細胞を収集し、培養した。30％のプールしたヒト血清、50μg/mLのヘパリン（Heparin）（Sigma, St.Louis, MO)、100μg/mLの内皮細胞増殖補助剤（Gibco BRL, Gaithersburg, MD）および0.1μM、1μMまたは100μMのGSAAまたはGSAOを含む、M199（Gibco BRL, Gaithersburg, MD）培地150μl中のHDMVE細胞（8,000細胞／ウェル）を、マトリゲル上に植え付け、プレートを37℃、5％CO2で18時間インキュベートした。ウェルの位相差顕微鏡写真を収集した。
【０２２７】
GSAOはマトリゲルにおけるHDMVE細胞による管形成を阻害した（図21）。0.1μM濃度において効果は明らかであり、100μMにおいては顕著であった。同じ濃度におけるGSAAは、管形成には明らかな効果を示さなかった。
【０２２８】
実施例3(e)
GSAOによるニワトリ漿尿膜（CAM）血管形成の阻害
ニワトリCAMアッセイ法が、血管形成の阻害の検出および分析に用いられてきた（Nguyenら、1994）。受精した3日齢の白色レグホン卵（Spafas, Norwich CT）を割り、無傷の卵黄をもつ胚を20×100 mmのぺトリ皿に置き、37℃、3％CO2で3日間インキュベートした（フォルクマン（Folkman)、1995）。5μg、10μgまたは50μgのGSAAまたはGSAOのいずれかを含むメチルセルロース（Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ）ディスクをその後、各々の胚のCAMに与え、37℃、3％CO2で48時間インキュベートした。ディスクはテフロンロッド上の0.45％メチルセルロース10μlにおけるGSAAまたはGSAOの脱水により作成された。CAMは実体顕微鏡を用いて観察し、明らかな効果がないことまたは、無血管野により定義されるようなCAMの血管形成の阻害について記録した。ある場合においては、CAM血管に墨汁を注入し、写真撮影した。
【０２２９】
GSAOはCAMにおける血管形成を濃度依存的に阻害した（図22）。血管形成の阻害は、GSAOを含むメチルセルロースペレットの6日目のCAMへの移植48時間後の無血管帯として定義された（図22の左図を参照のこと）。50μg/ペレットまでのGSAAは、CAM血管形成に影響を全く与えなかった。GSAAとGSAOのいずれも、ニワトリ胚の健全さに対し明らかな有害効果を示さなかった。
【０２３０】
実施例3(f)
GSAOによる、マウスにおける腫瘍増殖の阻害
メスの7〜9週齢のSCIDマウスまたはC57BI6/Jマウスを使用した（Massachusetts General Hospital, Boston, MA）。12時間昼夜サイクルでマウスを3〜5群に維持し、随意に動物餌および水を給餌した。SCIDマウスをイソフルランの吸入により麻酔し、背面の皮膚を剃り、エタノールで消毒し、0.2 ｍLのDMEM中2.5×106個のBxPC-3細胞またはHT1080細胞の懸濁液を正中線近位に皮下注射した。0.6〜1.2 cm3量のルイス肺癌を有するC57BI6/Jマウスを死なせ、腫瘍を覆う皮膚をベタジンおよびエタノールで消毒した。腫瘍組織を無菌条件下で切除し、0.9％の生理的食塩水中の腫瘍細胞の懸濁液を、腫瘍組織をふるいおよび一連の継続したより小さな22〜30ゲージの皮下針を通過させることにより作製した。C57BI6/Jマウスを麻酔し、SCIDマウスと同様に調製し、0.2 mL生理的食塩水中のルイス肺癌細胞の懸濁液を正中線近位に皮下注射した。腫瘍を確立させ、約0.1 cm3のサイズまで増殖させ、その後無作為に2群に分けた。腫瘍を2つの直径において測定し、aを最長直径（cm)、bを最短直径（cm）とした、関係式、腫瘍量＝a×b2×0.52を用いて腫瘍量を計測した。動物個体を、100 mMのグリシンを含むPBS 0.2 mL中、1日当たり2 mg/kgまたは10 mg/kg用量のGSAAまたはGSAOのいずれかで処理した。化合物を腫瘍から離れた部位に皮下投与した。腫瘍量および動物個体の体重を3日毎に測定した。動物個体を死なせた際に、腫瘍を切除し、重量を測定した。
【０２３１】
免疫無防備状態のマウスにおける、ヒト膵臓原発性腫瘍の増殖は、GSAOの全身投与により著しく抑制された。1日当たり2 mg/kgのGSAOの皮下投与により、BxPC-3腫瘍の増殖速度に約70％の阻害が生じた（図23A）一方、1日当たり10 mg/kgのGSAOの投与により、腫瘍の増殖速度に＞90％の阻害が生じた（図23BおよびC）。1日当たり2 mg/kgのGSAAの投与によるBxPC-3腫瘍の増殖速度への影響はなかった一方、1日当たり10 mg/kgのGSAAの投与により、賦形剤のみの投与と比較して、腫瘍の増殖速度にわずかな阻害（＜20％）が生じた（示さず）。
【０２３２】
GSAOまたはGSAAのいずれかのマウスへの投与による明らかな有害副作用は認められなかった。実験過程を通して、GSAA投与群およびGSAO投与群の平均マウス体重は、いずれの用量においても同じであった（図24）。図23Bにおいて説明される、実験終了時において、両投与群のマウスを試験した。GSAAまたはGSAOを投与したマウスまたは非投与マウスの間に、肉眼で見える明らかな差異は認められなかった。GSAAまたはGSAOを投与したマウスまたは非投与マウスの心臓、肺、肝臓、腎臓、および脾臓をホルムアルデヒド中に固定し、パラフィンに包埋し、切片化し、ヘマトキシリンおよびエロシンにより染色し、光学顕微鏡により調べた。非投与マウスの器官と比較して、投与マウスの器官のいずれにおいても明らかな形態学的変化は認められなかった（示さず）。
【０２３３】
免疫無防備状態のマウスにおけるヒト線維肉腫原発性腫瘍および、免疫応答性マウスにおけるマウスルイス肺原発性腫瘍の増殖もまた、GSAOの全身投与により抑制された。1日当たり10 mg/kgのGSAOの皮下投与により、線維肉腫（図25A）およびルイス肺癌（図25B）の腫瘍の増殖速度に約70％の阻害が生じた。1日当たり10 mg/kgのGSAAの投与では、賦形剤のみの投与と比較して、C57BI6/Jマウスにおけるルイス肺腫瘍の増殖速度に対する効果は認められなかった（示さず）。
【０２３４】
実施例3(g)
GSAOによる、ヒト膵臓腫瘍における血管形成の阻害
図23Cに示される腫瘍を緩衝ホルムアルデフレッシュ（Buffered Formalde-Fresh）（Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ）中に固定し、パラフィンに包埋し、5 μm厚の切片を切り出し、スライドガラス上に置いた。切片をヘマトキシリンおよびエオシンにより染色し、または、CD31については、PCNAもしくは断片化DNA（TUNEL）により染色した。抗マウスCD31抗体（PharMingen, San Diego, CA）の1：250希釈液と共に、切片を4℃で一晩インキュベートし、引き続き、ビオチン化した抗ラット二次抗体（Vestor, Burlingame, CA）の1：200希釈液とインキュベートした。染色はチラミド増幅（New England Nuclear, Boston, MA）により増強した。PCNAの染色はホルムグレン（Holmgren）ら（1995）により説明されるように実施した一方、断片化DNA のTUNEL標識は、ガブリエリ（Gavrielli）ら（1992）に従って実施した。
【０２３５】
対照群および投与群から、最小および最大のものを含む3つの腫瘍を選択することにより、脈管密度を決定した。新生血管形成が最も活発な領域において、微小血管を計測し、それらの密度を等級付けした（ウィナー（Weidner）ら、1991）。最も活発な新生血管形成の領域を見つけるため、切片を100×倍率下で調べ、3つの異なる視野を400×倍率で微小血管数について計測した。3つの計測のうち最高値をとり、各腫瘍から2つの切片を調べた。400×倍率下で計算された細胞のパーセンテージにより、増殖指数を評価した（Holmgrenら、1995）。2つの別々の切片において、最少1,000個の細胞を計測した。400×倍率下で計算された細胞のパーセンテージにより、アポトーシス指数を評価した。2つの別々の切片において、最少1,500個の細胞を計測した（Holmgrenら、1995）。
【０２３６】
GSAA処理またはGSAO処理した腫瘍のいずれにも、肉眼で見えるまたは顕微鏡的の壊死徴候は認められなかった（示さず）。腫瘍の免疫組織化学的分析により、GSAO処理した腫瘍における血管形成の顕著な減少（p＜0.001）（図26A)、および、腫瘍細胞のアポトーシス指数の増加（p＝0.05）（図26C）が示唆された。GSAA処理した腫瘍およびGSAO処理した腫瘍の増殖指数は同じであった（図26B）。
【０２３７】
実施例3(h)
GSAOの連続腹腔内投与による、ヒト膵臓癌腫瘍の増殖の阻害
皮下のヒトBxPC-3膵臓癌腫瘍をもつSCIDマウスに、14日微小浸透ポンプを腹膜腔において移植した。ポンプは1日当たり10 mg/kgのGSAAまたはGSAOを送達し、14日後に新しいポンプに置き換えられた。BxPC-3腫瘍の増殖速度は、GSAOを投与されたマウスにおいて阻害された（図27）。あるマウスにおいては、腫瘍増殖は約50％遅延し、他の2例のマウスにおいては、完全に停止した。第2のポンプが消耗したとき、増殖停止していた腫瘍の1つがGSAA処理した腫瘍とおよそ同じ速度で増殖し始めた一方、他の腫瘍は完全に寛解した。GSAAを投与されたマウスにおいては、BxPC-3腫瘍の増殖速度に対し、有意な効果はなかった。
【０２３８】
実施例3(i)
GSAOの経口投与による、ヒト膵臓癌およびマウスルイス肺腫瘍の増殖の阻害
皮下のヒト膵臓癌腫瘍をもつSCIDマウス、または皮下のマウスルイス肺腫瘍をもつC57BI6/Jマウスに、1日当たり約10 mg/kgのGSAOまたはGSAAのいずれかを水に入れて給餌した。マウスがGSAOの摂取を開始したときに、膵臓腫瘍の増殖は止まった一方、ルイス肺腫瘍の増殖速度は約50％低下した（図28）。水中に加えたGSAAはいずれの腫瘍の増殖にも有意な効果を示さなかった。
【０２３９】
実施例3(j)
腫瘍の画像化試薬としてのGSAOの使用
蛍光標識したGSAOのインビボにおける分布（図29A）を、腫瘍をもつマウスにおいて測定した。上記に説明されるように、メスの7〜9週齢C57BI6/Jマウスの正中線近位において、皮下にルイス肺癌を確立した。GSAO-Cy5.5（0.1 mL；15 nmol／マウス）を腫瘍から離れた部位に皮下注射した。24時間後、610〜650 nmの光を用いた励起、および700 nmにおける蛍光放射の測定によりマウスを画像化した（ウィスレダー（Weissleder）ら、1999）。
【０２４０】
腫瘍においてはGSAO-Cy5.5の著しい蓄積が認められた（図29B）。重要なのは、マウスのその他の部分においてはGSAO-Cy5.5の明らかな蓄積がなかったことである（示さず）。
【０２４１】
実施例4
HIV感染に対するGSAOの効果
実施例4(a)
細胞表面CD4のMPBによる標識
NIH AIDS研究および対照試薬プログラム（NIH AIDS Research and Reference Reagent Program, Rockville, MA）から、CEM-T4細胞を得た。CEM-T4（Hanks平衡塩類溶液中5×106/mLの1 mL）を、スルフォンコハク酸イミドビオチン（SSB)、3-(N-マレイン酸イミジルプロピオニル)ビオシチン（MPB)、またはGSAO-B（100μM）のいずれかと共に、室温で30分間インキュベートした。SSBはピアス社（Pierce, Rockford, IL）から、一方MPBはモレキュラープローブ社（Molecular Probes, Eugene, OR）から得た。未反応のSSBは、グリシン（200μM）を用いて消光した一方、不反応のMPBは還元型グルタチオン（GSH、200μM）を用いて、室温で30分間消光した。標識した細胞をPBSで2回洗浄し、50 mMのTris-HCl、0.5 MのNaCl、1％（v/v）のTriton X-100、10μMのロイペプチン、10μMのアプロチニン、2 mMのフッ化フェニルメチルスルフォニル、5 mM EDTA（pH8.0）緩衝液の1 mL中、4℃で超音波処理した。ビオチン標識されたタンパク質を単離するため、ストレプトアビジン‐アガロースビーズ（包装ビーズ 25μl）を細胞溶解物と共に、4℃で1時間、旋回盤上でインキュベートした。ストレプトアビジン‐アガロースビーズを50 mM Tris HCl、0.15 M NaCl、0.05％Triton X-100（pH8.0）緩衝液により5回洗浄した。50μlのSDS-Laemmli緩衝液中で2分間沸騰することにより、ビオチン標識されたタンパク質をビーズから解離し、10％SDS-PAGEで分離し、PVDF膜に転写し、CD4モノクローナル抗体、Leu3a（Becton Dickinson, Bedford, MA）を用いたウェスタンブロット法により分析した。ある場合においては、MPBは細胞とのインキュベーション前にGSHにより事前に遮断された。その他の場合においては、DMP（400μM）の存在下でGSAO-Bによって細胞を標識した。
【０２４２】
T細胞表面上のCD4は、CD4機能に重要な酸化還元活性ジスルフィド結合を含むと仮定された。この仮定をテストするために、CD4+T細胞系列、CEM-T4を、スルフォンコハク酸イミドビオチン（SSB)、または3-(N-マレイン酸イミジルプロピオニル)ビオシチニン（MPB）のいずれかにより標識した。SSBは第一アミンを標識する一方、MPBは遊離チオールを標識し、両試薬は膜不透過性である。標識されたタンパク質をストレプトアビジンアガロース上で収集し、SDS-PAGEで分離し、PVDF膜に転写した。標識したCD4を、CD4モノクローナル抗体、Leu3aを用いてブロットすることにより検出した（図30A）。SSB標識したCD4は、総細胞表面CD4の尺度である一方、MPB標識したCD4は還元細胞表面CD4の尺度である。還元型グルタチオン（GSH）によるMPBの事前の遮断は標識を除去したため、MPBを用いた標識はチオール特異的であった。ヒト血液T細胞上のCD4もまた、MPBを用いて標識され、T細胞のマイトジェンの活性化が、遊離チオールを含む細胞表面CD4の分画を増加することが認められた（示さず）。これらの観察は、T細胞活性化がCD4の酸化還元状態を変化させることを示す。
【０２４３】
また、他のIg部分をもつ受容体、Thy-1は、TIB-47細胞系列上のMPBにより標識されなかった（示さず）。さらに、MPBは遊離チオールを含む血清アルブミンを標識したが、遊離チオールを含まない血漿タンパク質プラスミノゲンおよびプロトロンビンは標識しなかった（示さず）。
【０２４４】
MPBのCD4への特異的な取り込みを示すため、T細胞をMPBにより標識し、Leu3aを用いてCD4を免疫沈降した。上記に説明されるように、CEM-T4細胞をMPBにより標識し、Leu3aモノクローナル抗体（5μg/ml）と共に30分間インキュベートし、3回洗浄し、50 mMのTris/HCl、0.5 M NaCl、1％（v/v）Triton X-100、10μMのロイペプチン、10μMのアプロチニン、2 mMのフッ化フェニルメチルスルフォニル、5 mM EDTA、pH8.0緩衝液の1mL中で超音波処理した。12,000 g、30分間の遠心分離により、洗剤不溶性の物質を除去し、1×107個ヤギ抗マウスIgG被覆ダイナビーズ（Dynal, Carlton South, VIC）と共に60分間、上清をインキュベートした。全てのインキュベーションは4℃で行った。ビーズを洗浄し、50μlのSDS-Laemmli緩衝液中でビーズを2分間沸騰することにより、結合したCD4を解離した。CD4を10％SDS-PAGEで分離し、PVDF膜に転写し、ビオチン標識を検出するためストレプトアビジンペルオキシダーゼを用いてブロットした。精製CD4をSDS-PAGEで分離し、PVDF膜に転写し、MPB標識を検出するためストレプトアビジンペルオキシダーゼを用いてブロットした（図30B）。
【０２４５】
実施例4(b)
チオレドキシンを用いた細胞表面CD4の還元
図30において示される標識実験は、細胞表面CD4における3つのジスルフィド結合のうち1つまたはそれ以上は酸化還元活性であることを示す。タンパク質におけるジスルフィド結合の還元／酸化は通常、非常に特異的であり、触媒されないかぎり非常に遅い。CD4 ジスルフィド結合の酸化状態は、CD4+細胞により分泌されるある酵素により制御されると仮定された。チオレドキシンはCD4+Tリンパ球により分泌される（ローセン（Rosen）ら、1995）。チオレドキシン濃度を増加させた、CEM-T4細胞のインキュベーションは、CD4のMPBによる標識の増加に帰結した（図31A）。対照として、酸化還元不活性チオレドキシン突然変異体とのインキュベーションは、MPB標識の増加を引き起こさなかった（図31B）。他のジスルフィド還元酵素であるPDIとCEM-T4細胞のインキュベーションは、CD4のMPBによる標識の増加に帰結しなかった（示さず）。
【０２４６】
実施例4(c)
GSAO-Bを用いた細胞表面CD4の標識
T細胞表面CD4はまたGSAO-Bをも取り込んだ。CEM-T4細胞をGSAO-Bにより標識し、標識されたタンパク質をストレプトアビジンアガロース上で収集し、SDS-PAGEで分離し、PVDF膜に転写した。標識したCD4を、Leu3aモノクローナル抗体を用いてブロットすることにより検出した（図32）。この結果は、CD4の還元形態の2つのチオールは、GSAOの三価ヒ素と錯体を形成するのに十分に近いことを示した。
【０２４７】
実施例4(d)
GSAOによるCD4+細胞のHIV感染の阻害
A3.01ヒトT細胞をGSAOに30分間、その後HTLVIIIBウイルスに2時間曝露し、後に細胞を洗浄し、10日間まで培養した。HTLVIIIBおよびA3.01細胞は、NIH AIDS研究および対照試薬プログラム（NIH AIDS Research and Reference Reagent Program, Rockville, MA）から得た。ウイルスストックを作製し、A3.01細胞およびp24抗原アッセイ法（Coulter, Miami, FL）を用いて感染性力価を決定した。10％ウシ胎児血清を含むRPMI培地において、A3.01細胞を培養した。GSAO（0〜100μM)、GSAA（100μM）またはMPB（100μM）と共に、A3.01細胞を、血清不含培地において37℃で30分間インキュベートした。37℃で2時間、50 TCID50/106細胞においてウイルスを加えた。細胞を3回洗浄し、GSAOまたはGSAA（10μM）を含まない、または含む、完全培地0.25 mL中に再懸濁し、96ウェルの組織培養プレートにおいてインキュベートした。別々の時点においてサンプルを除去し、Coulter HIV-1 p24抗原アッセイ法（Coulter, Miami, FL）を用いてp24抗原についてアッセイした。サンプル採集日に、GSAOまたはGSAA（10μM）を含まないまたは含む新しい培地をウェルに加えた。トリパンブルーによる細胞染色、およびNeubauer血球測定器を用いた計測により、規定時に細胞数および細胞生存率を測定した。細胞生存率は総細胞に対する生きた細胞のパーセンテージとして測定した。
【０２４８】
GSAOはHIVIIIBのT細胞系列A3.01への侵入を阻害した（図33A）。GSAOが半最大効果を示したのは約1μMであった（図33B）。GSAOは、細胞の増殖または細胞生存率に対して、100μM濃度までは効果を示さなかった（図33A）。さらに、10μM のGSAOは、A3.01細胞のHIVIIIB感染を11日間有効に遮断した（図34）。GSAOは細胞増殖に対しては阻害効果が小さく、細胞生存率に対しては効果がなかった（図34）。
【０２４９】
GSAOはまた、末梢血単核細胞（PBMC）の一次HIV単離物による感染を阻害した。一次HIV単離物、HN11、HN68およびHN70は、オーストラリアのウイルス研究センターのハッサン・ナイフ博士（Dr. Hassan Naif, Centre for Virus Research, Westmead Millennium Institute, NSW, Australia）より提供された。クエン酸塩加の新しい血液400 mLから、Ficoll高密度勾配液を用いた分離（Ficoll-Hypaque separation）（Pharmacia Biotech, Upsalla, Sweden）により、PBMCを調製した。血液をPBSで1：2に希釈し、50 mLのファルコン（Falcon）管においてFicoll高密度勾配液上に（35 mLの血液を15 mLのFicoll高密度勾配液上に）重層し、20℃、400 gで20分間遠心分離した。PBMCを収集し、血小板を除くため1,200 rpmで10分間ペレット化し、20％のウマ血清（Gibco, BRL, Gaithersburg, MD)、10μg/mLのフィトヘマグルチニン-M（PHA-M、Boehringer Mannheim Biochemica, Mannheim, Germany）および50 U/mLのインターロイキン-2（Sigma, St.Louis, MO）を含むRPMI中2×106細胞/mLに再懸濁し、5％CO2、37℃で2日間インキュベートした。PBMC（1×106/mL）を、GSAOまたはGSAA（10μM）と共に37℃で30分間、血清不含培地においてインキュベートした。50 TCID50/106細胞において、ウイルスを37℃で2時間加えた。細胞を3回洗浄し、GSAOまたはGSAA（10μM）を含む完全培地0.25 mL中に再懸濁し、96ウェル組織培養プレートにおいてインキュベートした。別々の時点においてサンプルを除去し、p24抗原についてアッセイした。サンプル採集日に、GSAOまたはGSAA（10μM）を含む新しい培地をウェルに加えた。GSAOは3つの異なる一次HIV単離物によるPBMCの感染を7日間遮断した（図35）。GSAOは培養3日後PBMCの増殖を阻害したが、細胞生存率に対する効果は7日間以上なかった（図35）。
【０２５０】
実施例5‐薬学的製剤
本発明の化合物は、薬学的製剤として投与されることが好ましいが、単独で投与できる。局所投与のためには、活性成分は、10重量％程度を含む可能性もあるが、製剤の0.001〜10重量％、より局所的には1〜5重量％を含み得る。
【０２５１】
本明細書において提供される発明の実施の最良の方法に従って、特定的な好ましい本発明の薬学的組成物を以下に略述する。以下は単に製剤の実施例の説明に役立てるもので、本発明の範囲を制限するとは決して解釈されない。
【０２５２】
実施例5(a)‐局所クリーム組成物
局所クリームとしての送達のための典型的な組成物を以下に略述する：
GSAO 1.0 g
Polawax GP 200 25.0 g
脱水ラノリン3.0 g
白ろう 4.5 g
メチルヒドロキシ安息香酸0.1 g
脱イオンおよび滅菌水100.0 gまで
【０２５３】
Polawax、蜜ろうおよびラノリンを共に60℃に加熱し、メチルヒドロキシ安息香酸溶液を加え、高速撹拌を用いて均質化を行う。温度をその後50℃まで下げさせる。本発明の化合物は、GSAOである本実施例においては、その後加えられ、一様に分散し、低速撹拌で組成物を冷却させる。
【０２５４】
実施例5(b)‐局所ローション組成物
局所ローション剤としての送達のための典型的な組成物を以下に略述する：
GSAO 1.2 g
モノラウリン酸ソルビタン 0.8 g
ポリソルベート20 0.7 g
セトステアリルアルコール1.5 g
グリセリン 7.0 g
メチルヒドロキシ安息香酸 0.4 g
滅菌水約100.00 mlまで
【０２５５】
メチルヒドロキシ安息香酸およびグリセリンを70 mlの水に75℃で溶解する。モノラウリン酸ソルビタン、ポリソルベート20およびセトステアリルアルコールを共に75℃で融解し、水溶液に加える。その結果得られる乳濁液を均質化し、連続した撹拌により冷却させ、残りの水に懸濁液としてGSAOを加える。懸濁剤全体が均質化されるまで撹拌する。
【０２５６】
実施例5(c)‐点眼薬組成物
点眼薬としての送達のための典型的な組成物を以下に略述する：
GSAO 0.3 g
メチルヒドロキシ安息香酸 0.005 g
プロピルヒドロキシ安息香酸 0.06 g
精製水 約100.00 mlまで
【０２５７】
メチルヒドロキシ安息香酸およびプロピルヒドロキシ安息香酸を70 mlの精製水に75℃で溶解し、その結果得られる溶液を冷却させる。GSAOをその後加え、膜フィルター（細孔サイズ0.22μm）を通したろ過滅菌により溶液を滅菌し、滅菌容器に無菌的に詰める。
【０２５８】
実施例5(d)‐吸入投与のための組成物
容積20〜30 mlのエーロゾル容器について：ポリソルベート85またはオレイン酸のような潤滑剤0.5〜0.8重量％とGSAO 10 mgの混合物を、フレオンのような噴射剤中に分散し、鼻内または経口吸入投与のいずれかに適切なエーロゾル容器に入れる。
【０２５９】
実施例5(e)‐非経口投与のための組成物
筋内注射のための本発明の薬学的組成物は、1 mLの滅菌緩衝水、および1 mgのGSAOを含むように調製できる。同様に、静脈内注入のための薬学的組成物は、250 mlの滅菌リンガー液、および5 mgのGSAOを含み得る。
【０２６０】
実施例5(f)‐カプセル組成物
カプセル形態におけるGSAOの薬学的組成物は、標準2ピースハードゼラチンカプセルに、パウダー形態の50 mgのGSAO、100 mgのラクトース、35 mgのタルクおよび10 mgのステアリン酸マグネシウムを充填することにより調製できる。
【０２６１】
実施例5(g)‐注射用非経口組成物
注射による投与に適した形態の本発明の薬学的組成物は、1重量％のGSAOを10容積％のプロピレングリコールおよび水中に混合することにより調製できる。溶液はろ過滅菌により滅菌される。
【０２６２】
実施例5(h)‐軟膏組成物
軟膏としての送達のための典型的な組成物は、滑らかかつ均質な製剤を作製するため分散した、1.0 gのGSAOを100.0 gまでの白色軟パラフィンと共に含む。
【０２６３】
産業への適用可能性
本発明は実質的に、酸化還元活性タンパク質の阻害能をもつ細胞膜不透過性化合物に、およびそれらの合成方法に関連する。特に、本発明は実質的に、細胞膜不透過性三価有機ヒ素化合物およびそれらの合成方法に関連する。本発明はまた、薬学的組成物、および炎症性疾患、自己免疫疾患、血管疾患、血栓症、ウイルス感染、および血液学的腫瘍および固形腫瘍の治療方法に関連する。
【０２６４】
参考文献
0004707294.tif 000055
0004707294.tif 000056
0004707294.tif 000057
0004707294.tif 000058
【図面の簡単な説明】
【図１】  GSAOおよびGSAAの構造。
【図２】  最初に、アルセノキシド基とタンパク質ジチオールが結合し、その後、タンパク質の活性部位がアルキル化されることによる、酸化還元活性タンパク質の不可逆的阻害の模式図。
【図３】  GSAOの合成。2D 1H-13C HMBC NMRスペクトルの議論で用いられる立体化学および番号付け方法を示す、GSAOの合成の模式図。
【図４】  GSAO構造の指定。脂肪族領域を示す、DCI/D2OにおけるGSAOのHMBC 1H-13Cスペクトルを拡大したもの。このスペクトルは、横軸および縦軸に沿って対応する1Hおよび13Cシグナルと合致した任意の遠隔異種核(1H-13C)カップリングをクロスピークとして示す。四角で囲んだクロスピークは、C7メチレンとC11メチレンとの間の1H-13Cカップリングに対応し、BRAOによるアルキル化がグルタチオン硫黄原子上で起こったことを裏付けている。「i」と印されたピークおよびクロスピークは不純物によるものである。C9メチレンおよびC2メチンに対応する1バンドクロスピークもまた、HMBCパルスシークエンスによる不完全なフィルタリングのために二重項として観察することができる。
【図５】  GSAAの合成の模式図。
【図６】  GSAO-Bの合成の模式図。
【図７】  GSAO-Fの合成の模式図。
【図８】  GSAO-Cy(商標)5.5の合成の模式図。
【図９】  FXAOの合成。
【図１０】  Aが親水性アミンである本発明の化合物の一般的な合成経路。R-NH2の例として、D-グルコサミン；L-アスパラギン酸；L-グルタミン酸；およびL-システイン酸が挙げられる。
【図１１】  GSAOによるDMPまたはシステインの滴定。DMP(30μMチオールと一致する15μM)またはシステイン(28μM)をGSAO(0〜50μM)と10分間インキュベートした。次いで、DTNB(950μM)を添加し、反応物をさらに10分間インキュベートした。反応物中のチオール濃度を412nmでのTNBジアニオンの吸光度から決定した。GSAOはDMPに結合し、ジチオールとDTNBとの相互作用を妨げたが、GSAOとシステインとのどの相互作用もDTNBに取って代わられた。
【図１２】  GSAOと合成ジチオール、ペプチドジチオール、およびタンパク質ジチオールとの相互作用。DMP(A)(15μM)、6,8-チオクト酸(B)(11M)、ジチオスレイトール(C)(8.5μM)、TrpCysGlyProCysLys(D)(4.6μM)、TrpCysGlyHisCysLys(E)(5.5μM)、またはチオレドキシン(F)(20.6μMチオールと一致する4.1μM)をGSAO(0〜56μM)と10分間インキュベートした。次いで、DTNB(950μM)を添加し、反応物をさらに10分間インキュベートした。反応物中のチオール濃度を412nmでのTNBジアニオンの吸光度から決定した。実線は、データが最小2乗非線形回帰により式1(A〜E)または式2(F)と最もよくフィットしたものを示し、表1のパラメーター推定値を用いて引かれた。A部分の点線は、ジチオールに対するGSAOの無限の親和性を前提とした、シミュレートされた滴定を示している。GSAOは、130nM〜1.4μMの解離定数で、合成ジチオール、ペプチドジチオール、およびタンパク質ジチオールに結合した。
【図１３】  GSAOによるチオレドキシンの阻害。チオレドキシン(1μM)を、20mM Hepes,0.14M NaCl（pH7.4）緩衝液中でGSAO(0μM、1μM、または10μM)と室温で10分間インキュベートした。70kDaフィブロネクチン断片(10μM/mL)を添加し、室温で5分間インキュベートした。MPB(100μM)を用いて反応物を37℃で10分間標識した。MPBを、GSH(200μM)を用いて37℃で10分間、その後、ヨードアセトアミド（400μM）を用いて室温で10分間消滅させた。MPB標識70kDa断片を5〜15％SDS-PAGEで分離し、PVDF膜に転写し、MPBをストレプトアビジンペルオキシダーゼによるブロッティングにより検出した。Mrマーカーの位置を左に示す。
【図１４】  GSAO-BとPDIおよびチオレドキシンとの相互作用。A  GSAO-Bの構造。B  精製ヒト組換えPDI(5μM)、ヒト組換えチオレドキシン(5μM)、またはウシ血清アルブミン(5μM)を、PDIおよびチオレドキシンの1つまたはそれ以上の活性部位ジスルフィドが確実に還元ジチオールの形になるように、ジチオスレイトール(10μM)と室温で60分間インキュベートした。次いで、GSAO-B(100μM)またはGSAO-BおよびDMP(400μM)を添加し、反応物を室温で30分間インキュベートした。標識PDI(レーン1および2)、チオレドキシン(レーン3および4)、ならびにアルブミン(レーン5)(75pmol)を4〜16％SDS-PAGEで分離し、PVDF膜に転写し、ストレプトアビジン-ペルオキシダーゼでブロットして、GSAO-B標識を検出した。Mrマーカーの位置を左に示す。
【図１５】  膜透過性の三価ヒ素剤対実質的に膜不透過性の三価ヒ素剤の細胞傷害影響の比較。BAE細胞(5×103細胞)を96ウェルプレートのウェルに播種し、37℃および5％C02で24時間付着させた。約80％コンフルエントになった細胞をPBSで2回洗浄し、漸増濃度のPAO、GSAO、AspAO、GluAO、Cys＊AO、GlcAO、またはFXAO(0〜0.6mM)を含む完全培地100μlと37℃および5％C02で24時間インキュベートした。次いで、細胞をPBSで2回洗浄して、付着していない細胞を除去し、オリバー（Oliver）ら(1989)により記載されたようにメチレンブルーを用いて付着細胞を計数した。データポイントは、3個のウェルの平均およびSEである。
【図１６】  1つまたはそれ以上の近接して間隔をおいたジチオールを含む内皮細胞表面タンパク質の同定。A  HMEC-1細胞またはHUVE細胞(0.4mL中2×106細胞)の表面を、DMP(400μM)の非存在下(レーン1および3)または存在下(レーン2)で、GSAO-B(100μM)を用いて室温で30分間標識した。内皮細胞を溶解し、両方のインキュベートからの溶解産物を4〜15％SDS-PAGEで分離し、PVDF膜に転写し、ストレプトアビジンペルオキシダーゼでブロットして、GSAO-B標識を検出した。結果は、3×104 HMEC-1細胞(レーン1および2)およびHUVE細胞(レーン3)の標識を示す。Mrマーカーの位置を左に示す。B  表面標識タンパク質(レーン1および3)のデンシトメトリープロフィール。個々のタンパク質の見かけのMrを示す。
【図１７】  PDIは、内皮細胞表面上のGSAO-B標識タンパク質の1つであった。HUVEC(0.75mL中5×106細胞)を、DMP(400μM)の非存在下(レーン1)または存在下(レーン2)で、GSAO-B(100μM)を用いて37℃で30分間標識した。細胞を溶解し、ストレプトアビジン-アガロースビーズとインキュベートして、ビオチン標識タンパク質を収集した。標識タンパク質を4〜15％SDS-PAGEで分離し、PVDF膜に転写し、抗PDIモノクローナル抗体でブロットした。結果は、5×106内皮細胞の標識を示す。Mrマーカーの位置を左に示す。
【図１８】  GSAOによるBCE細胞の増殖阻害および生存率減少。15,000個(AおよびB部分)または50,000個(CおよびD部分)/ウェルのBCE細胞を、ゼラチン化24ウェル培養プレートに播種し、24時間(A、BおよびD部分)または72時間(C部分)付着させた。次いで、培地を、5％BCS、および0〜1mM GSAOまたはGSAA、および1ng/mL FGF-2(A部分)または10ng/mL VEGF(B部分)を含むDMEMで交換した。D部分において、培地は、5％BCS、および1ng/mL FGF-2、および10μM GSAOまたはGSAAを含むDMEMで交換した。C部分において、培地は、5％BCS、および0〜1mM GSAOまたはGSAAを含むDMEMで交換した。細胞を、A、BおよびC部分では72時間、またはD部分では48時間までの別の期間で培養し、次いで、分散させ、計数した。A、BおよびC部分の点線は、全く増殖を示さなかったか限られた増殖を示した、DMEMおよび5％BCSを含む対照ウェルでの細胞数を示す。D部分の点線は、48時間にわたって細胞数の変化を示していない。データポイントおよび誤差は2個のウェルの平均および分布範囲を示す。
【図１９】  非内皮細胞の増殖に及ぼすGSAOの影響。15,000個/ウェルのBxPC-3(A部分)、HT1080(B部分)、3T3(C部分)、またはBVSM(D部分)細胞をゼラチン化24ウェル培養プレートに播種し、24時間付着させた。次いで、培地を、0〜1mM GSAOまたはGSAAならびに5％BCS（D部分）または5％FCS(A、BおよびC部分)を含むDMEMで交換した。細胞を72時間培養し、次いで、分散させ、計数した。点線は、全く増殖を示さなかったか限られた増殖を示した、DMEMならびに2％BCS（D部分）または2％FCS(A、BおよびC部分)を含むコントロールウェルでの細胞数を示す。データポイントおよび誤差は2個のウェルの平均および分布範囲を示す。
【図２０】  骨髄前駆細胞の増殖に及ぼすGSAOの影響。ヒト骨髄細胞を、20％BCS、1ng/mL IL-3、および0〜100μM GSAAまたはGSAOを含む半固形寒天において12日間インキュベートした。40個またはそれ以上の細胞からなる顆粒球/マクロファージコロニーを倒立顕微鏡下で計数した。データポイントおよび誤差は4個の培養物の平均およびSEを示す。
【図２１】  GSAOは、マトリゲル（Matrigel）における内皮細胞の管形成を混乱させる。マトリゲル(100μl)を96ウェルプレートのウェルに添加し、37℃で60分間ゲル化させた。0.1μM、1μM、または100μM GSAAまたはGSAOを含む完全培地中のHDMVE細胞(10,000細胞/ウェル)をマトリゲルに播種し、プレートを5％CO2、37℃でインキュベートした。18時間のインキュベーション後に、位相差顕微鏡写真を撮った。GSAOは、マトリゲルにおけるHDMVE細胞による管形成を混乱させた（下パネル）。影響は0.1μM濃度で識別でき、100μMで著しかった。同濃度のGSAAは、管形成に対して目に見える影響を及ぼさなかった（上パネル）。
【図２２】  GSAOによるCAM血管形成の阻害。3日齢の白色レグホン受精卵の殻を破り、胚をペトリ皿に入れ、3日間インキュベートした。次いで、5μg、10μg、または50μgのGSAAまたはGSAOを含むメチルセルロースディスクを個々の胚のCAMに貼り、48時間インキュベートした。CAMは、はっきりした影響なし、すなわち無血管区画により定められる血管形成阻害についてスコア付けされた。10μgのGSAA(上)またはGSAO(下)を含むディスクとのインキュベーション後のCAMの写真を左側パネルに示す。点線の丸はディスクの位置を示す。右側パネルの棒グラフは、5個の区画のうち、5μg、10μg、または50μg/ペレットのGSAOでの血管形成阻害に陽性であった数を示す。GSAAは、50μg/ペレットまでCAM血管形成を阻害しなかった。
【図２３】  GSAOによるヒト膵臓腫瘍増殖の阻害。BxPC-3腫瘍を7〜9週齢雌SCIDマウスの近位正中線に確立した。腫瘍の体積が約0.1cm3になったら、マウスを無作為化して2群に分け、100mMグリシンを含むPBS 0.2mLに溶解した2mg(A部分)または10mg(B部分)/kg/日の用量のGSAAまたはGSAOで処置した。化合物を腫瘍から離れた部位に皮下投与した。腫瘍体積および動物体重を3日ごとに測定した。2mg/kg/日を用いた処置26日目のGSAO/GSAA腫瘍体積比は0.34であった(A部分)。10mg/kg/日を用いた処置31日目のGSAO/GSAA腫瘍体積比は0.09であった(B部分)。A部分における1群あたりのマウスは4匹であり、B部分では4匹のマウスがGSAAで処置され、5匹がGSAOで処置された。処置31日目での、B部分に記載の実験からのマウスおよび摘出された腫瘍をC部分に示す。データポイントおよび誤差は腫瘍体積の平均およびSEを示す。
【図２４】  GSAOの全身投与はマウス体重に影響を及ぼさなかった。データポイントおよび誤差は、図23に示される実験での動物体重の平均およびSEを示す。
【図２５】  GSAO全身投与後のヒト線維肉腫およびマウスルイス肺腫瘍の増殖阻害。HT1080またはルイス肺腫瘍を、それぞれ、7〜9週齢雌SCIDマウスまたはC57BI6/Jマウスの近位正中線に確立した。腫瘍の体積が約0.1cm3になったら、マウスを無作為化して2群(n=5)に分け、100mMグリシンを含むPBS 0.2mLに溶解した10mg/kg/日の用量のGSAAまたはGSAOで処置した。化合物を腫瘍から離れた部位に皮下投与した。腫瘍体積および動物体重を3日ごとに測定した。処置17日目のGSAO/GSAA HT1080腫瘍体積比は0.29であった(A部分)。処置12日目のGSAO/GSAAルイス肺腫瘍体積比は0.29であった(B部分)。データポイントおよび誤差は腫瘍体積の平均およびSEを示す。
【図２６】  GSAOによるヒト膵臓腫瘍における血管形成の阻害。GSAAおよびGSAOで処置したマウスからの図23のC部分に示したBxPC-3腫瘍の組織学的切片を、血管形成(CD-31)、増殖(PCNA)、およびアポトーシス(TUNEL)について分析した。GSAO処置腫瘍において、血管形成の著しい抑制(A部分、p＜0.001)および腫瘍細胞のアポトーシス指数の増加(C部分、p=0.05)があった。対照的に、GSAA処置腫瘍細胞対GSAO処置腫瘍細胞の増殖指数には有意な違いがなかった(B部分)。
【図２７】  GSAOの連続腹腔内投与によるヒト膵ガン腫瘍増殖の阻害。BxPC-3腫瘍を7〜9週齢雌SCIDマウスの近位正中線に確立した。約0.1gの腫瘍を有するマウスの腹腔に、14日alzetモデル1002微小浸透ポンプ(ALZA Corporation,Palo Alto,CA)を埋め込んだ。このポンプは45mg/mLのGSAAまたはGSAOを含み、10mg/kg/日を送達した。14日後にポンプを交換した。ポンプ期間を陰付きの棒で示す。腫瘍体積および動物体重を3日ごとに測定した。
【図２８】  GSAO経口投与によるヒト膵ガンおよびマウスルイス肺腫瘍増殖の阻害。BxPC-3またはルイス肺腫瘍を、それぞれ、7〜9週齢雌SCIDマウスまたはC57BI6/Jマウスの近位正中線に確立した。約0.5gのBxPC-3腫瘍を有するSCIDマウスまたは約0.1gのルイス肺腫瘍を有するC57BI6/Jマウスを無作為化して2群に分け(BxPC-3についてはn=2、ルイス肺についてはn=3)、GSAAまたはGSAO(0.05mg/mL)をマウスの飲み水に溶解して処置した。マウスは1日に約5mLの水を飲み、従って、約10mg/kg/日のGSAOまたはGSAAを摂取した。GSAOの酸化を最小限にするために、飲み水には100mMグリシンが含まれた。腫瘍体積および動物体重を3日ごとに測定した。データポイントおよび誤差は腫瘍体積の平均およびSEを示す。
【図２９】  固形腫瘍によるGSAO-Cy5.5の選択的取込み。A  GSAO-Cy5.5の構造。B  GSAO-Cy5.5(15nmol)を、近位正中線に約1000mm3の皮下ルイス肺腫瘍を有するC57BI6/Jマウスの側腹部に皮下注射した。24時間後に、マウスの背側を画像化した。画像の面積は、背側の近位正中線の約0.7cm2であり、正常背側および皮下腫瘍の下端を含む。腫瘍にはわずかな濃度のGSAA-Cy5.5があったが、これはGSAO-Cy5.5の蓄積と比較して微々たるものであった（示さず）。
【図３０】  MPBによる細胞表面CD4の標識。A  CEM-T4細胞をSSBまたはMPBで標識した。ビオチン標識タンパク質をストレプトアビジン-アガロースビーズで収集し、10％SDS-PAGEで分離し、CD4モノクローナル抗体、Leu3aを用いてウエスタンブロットした。レーン1は(1×106細胞からの)CEM-T4溶解産物であり、レーン2はSSB標識CEM-T4 CD4であり、一方、レーン3はMPB標識CEM-T4 CD4である。ビオチン標識タンパク質は2×106細胞からのものであった。レーン4は、MPBがCEM-T4細胞とのインキュベーション前にGSHで予めブロックされた(2×106細胞からの)対照実験である。Mrマーカーの位置をkDaで左に示す。B  CEM-T4細胞をMPBで標識し、CD4をLeu3aモノクローナル抗体およびヤギ抗マウスIgGでコーティングされたダイナビーズ（Dynabead）を用いて免疫沈降した。CD4を10％SDS-PAGEで分離し、ストレプトアビジンペルオキシダーゼでブロットして、ビオチン標識を検出した。レーン5は(2×106細胞からの)MPB標識CD4である。レーン6は、MPBがCEM-T4細胞とのインキュベーション前にGSHで予めブロックされた(2×106細胞からの)対照実験である。Mrマーカーの位置をkDaで左に示す。
【図３１】  チオレドキシンによる細胞表面CD4の還元。A  CEM-T4細胞を、漸増濃度のチオレドキシンの非存在下または存在下で37℃で1時間インキュベートし、次いで、MPBで標識した。ビオチン標識タンパク質を5〜15％SDS-PAGEで分離し、Leu3aモノクローナル抗体を用いてウエスタンブロットした。レーン1はCEM-T4溶解産物であり、レーン2〜5は、0μM(レーン2)、0.1μM(レーン3)、1μM(レーン4)、または5μM(レーン5)TrxとインキュベートされたCEM-T4細胞上のMPB標識CD4である。Mrマーカーの位置をkDaで左に示す。B  CEM-T4細胞を、1μMチオレドキシンまたは酸化還元不活性チオレドキシン変異体と37℃で1時間インキュベートした。ビオチン標識タンパク質を5〜15％SDS-PAGEで分離し、Leu3aモノクローナル抗体を用いてウエスタンブロットした。レーン1は未処理CEM-T4細胞であり、一方、レーン2および3は、酸化還元活性チオレドキシンまたは酸化還元不活性チオレドキシンとインキュベートされた細胞である。Mrマーカーの位置をkDaで左に示す。
【図３２】  GSAO-Bによる細胞表面CD4の標識。CEM-T4をMPBまたはGSAO-Bで標識した。ビオチン標識タンパク質をストレプトアビジン-アガロースビーズで収集し、5〜15％SDS-PAGEで分離し、Leu3aモノクローナル抗体を用いてウエスタンブロットした。レーン1はMPB-標識CEM-T4 CD4であり、レーン2はGSAO-B標識CEM-T4 CD4である。レーン3は、400μM DMPの存在下でGSAO-BをCEM-T4細胞とインキュベートした対照実験である。ビオチン標識タンパク質は2×106細胞からのものであった。Mrマーカーの位置をkDaで左に示す。
【図３３】  MPBおよびGSAOによるA3.01細胞へのHIVIIIB侵入の阻害。A  A3.01細胞(1×106/mL)を、GSAA、GSAO、またはMPB(100μM)と37℃で30分間インキュベートし、次いで、HIVIIIB(50TCID50/106細胞)と37℃で2時間インキュベートした。細胞を洗浄し、完全培地において5％CO2および37℃で10日間までインキュベートした。指示された回数で、馴化培地を収集し、p24抗原についてアッセイし、細胞数および細胞生存率を決定した。B  GSAOの濃度依存性。A3.01細胞(1×106/mL)を、GSAO(0〜100μM)と37℃で30分間インキュベートし、次いで、HIVIIIB(50TCID50/106細胞)と37℃で2時間インキュベートした。細胞を洗浄し、完全培地において5％CO2および37℃で3日間インキュベートし、馴化培地を収集し、p24抗原についてアッセイした。
【図３４】  GSAOによるA3.01細胞のHIVIIIB感染の阻害。A3.01細胞(1×106/mL)を、GSAAまたはGSAO(10μM)と37℃で30分間インキュベートし、次いで、HIVIIIB(50TCID50/106細胞)と37℃で2時間インキュベートした。細胞を洗浄し、GSAAまたはGSAO(10μM)を含む完全培地において5％CO2および37℃で10日間までインキュベートした。指示された回数で、馴化培地を収集し、p24抗原についてアッセイし、細胞数および細胞生存率を決定した。
【図３５】  GSAOによるPBMCのHIV感染の阻害。PBMC(1×106/mL)を、GSAAまたはGSAO(10μM)と37℃で30分間インキュベートし、次いで、初代HIV分離株(50TCID50/106細胞のHN11、HN68、またはHN70)と37℃で2時間インキュベートした。細胞を洗浄し、GSAAまたはGSAO(10μM)を含む完全培地において5％CO2および37℃で7日間までインキュベートした。指示された回数で、馴化培地を収集し、p24抗原についてアッセイし、細胞数および細胞生存率を決定した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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