(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）炭素数６から２０までの脂肪酸塩；
（ｂ）炭素数６から２０までの脂肪族鎖を有するアルコールまたはアミン化合物；および
（ｃ）二分子膜を形成し得る人工合成脂質またはリン脂質
を膜の構成成分として含む、二分子膜ベシクルであって、
該（ｂ）アルコールまたはアミン化合物が、以下の式Ｉ：
Ｒ１−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２ＯＨ （Ｉ）
（式中、Ｒ１は、炭素数６から２０までのアルキル基、炭素数６から２０までのアルケニル基、または炭素数６から２０までのアルキニル基である）で表される二価アルコールであり、さらに（ｄ）以下の式ＩＩ：
【化１】
0004787818.tif 000027
（式中、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４のうちの１つまたは２つは、メチル基であり、そして残りのＲ２、Ｒ３、およびＲ４は、それぞれ独立して、−ＣＨ２ＣＯＯＣｎＨ２ｎ＋１、−ＣｎＨ２ｎ＋１、または−Ｃ６Ｈ４−ｐ−ＣｎＨ２ｎ＋１であり、ここでｎは６から２０までの整数であり、−ＣｎＨ２ｎ＋１は直鎖状である）で表される３級アミン；
を該膜の構成成分として含む、二分子膜ベシクル。
【請求項２】
前記（ａ）脂肪酸塩と前記（ｂ）アルコールまたはアミン化合物とのモル比が１：１である、請求項１に記載の二分子膜ベシクル。
【請求項３】
前記（ａ）脂肪酸塩と前記（ｂ）アルコールまたはアミン化合物と前記（ｃ）二分子膜を形成し得る人工合成脂質またはリン脂質とのモル比が１：１：１である、請求項１または２に記載の二分子膜ベシクル。
【請求項４】
前記（ｃ）二分子膜を形成し得る人工合成脂質またはリン脂質が、リン脂質である、請求項１から３のいずれかの項に記載の二分子膜ベシクル。
【請求項５】
二分子膜ベシクルの相転移を誘起させる方法であって、該方法が、
二分子膜ベシクルを調製する工程であって、該二分子膜ベシクルが、
（ａ）炭素数６から２０までの脂肪酸塩；
（ｂ）炭素数６から２０までの脂肪族鎖を有するアルコールまたはアミン化合物；および
（ｃ）二分子膜を形成し得る人工合成脂質またはリン脂質；を膜の構成成分として含む、工程；および
該二分子膜ベシクルに脱水縮合剤または脱水縮合剤前駆体を添加する工程；
を含み、そして
該（ｂ）アルコールまたはアミン化合物が、以下の式Ｉ：
Ｒ１−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２ＯＨ （Ｉ）
（式中、Ｒ１は、炭素数６から２０までのアルキル基、炭素数６から２０までのアルケニル基、または炭素数６から２０までのアルキニル基である）で表される二価アルコールである、方法。
【請求項６】
前記二分子膜ベシクルが、さらに（ｄ）以下の式ＩＩ：
【化２】
0004787818.tif 000028
（式中、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４のうちの１つまたは２つは、メチル基であり、そして残りのＲ２、Ｒ３、およびＲ４は、それぞれ独立して、−ＣＨ２ＣＯＯＣｎＨ２ｎ＋１、−ＣｎＨ２ｎ＋１、または−Ｃ６Ｈ４−ｐ−ＣｎＨ２ｎ＋１であり、ここでｎは６から２０までの整数であり、−ＣｎＨ２ｎ＋１は直鎖状である）で表される３級アミンを、前記膜の構成成分として含み、そして
前記脱水縮合剤前駆体が、以下の式ＩＩＩ：
【化３】
0004787818.tif 000029
（式中、Ｒ５およびＲ６は、それぞれ独立して、メチル基、エチル基、炭素数２から５のヒドロキシアルキル基、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＲ７（ここで、ｍは１から１２０までの整数であり、そしてＲ７は、水素原子、メチル基、エチル基、またはプロピル基である）、−（ＣＨ２ＣＨ２ＮＲ８）ｍＨ（ここで、ｍは１から１２０までの整数であり、そしてＲ８は、炭素数が２から５のアルキル基、Ｎ，Ｎ−ジアルキルアミノエチル基、または−ＣＨ２ＣＨ２Ｎ＋（ＣＨ３）３である）、−ＣＨ２ＣＨ２ＳＯ３−、−ＣＨ２ＣＨ２Ｎ＋（ＣＨ３）３、または炭素数６から２０のアルキル基であるが、Ｒ５およびＲ６は同時に炭素数６から２０のアルキル基ではなく、そして；Ｘがハロゲン原子である）で表される、シアヌル酸誘導体である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記式ＩＩＩにおけるＲ５およびＲ６の少なくとも一方がメチル基またはエチル基である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記式ＩＩにおけるｎが１２から１６である、請求項６または７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、水界面での脱水縮合反応により相転移を生じ得る分子集合体およびその相転移方法に関する。より詳細には、リポソームなどの水界面の分子集合体の融合や分裂を誘起させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
分子集合状態の変化を起こすためには、一般的には、界面活性剤の濃度や温度を変化させている。ミセルなどの平衡系においては、異なる種類の界面活性剤を添加すれば、状態変化が速やかに起こる。
【０００３】
一方、リポソームに代表される二分子膜ベシクルのような分散系では、これらを構成している脂質は、比較的安定な状態にあるため、その移動は非常に遅い。これらの集合体の融合や分裂を誘起するために、一般的には、界面の物理的な状態変化を起こしている。この場合、用いる脂質や反応条件などに依存性が高く、制限がある場合が多い。
【０００４】
例えば、ホスファチジルセリンなどから構成されるリポソームは、Ｃａ２＋の添加によって膜融合などの相転移が誘起される（Duzgunesら、Biochemistry，1987年，26巻，8435-8442頁）。これは、Ｃａ２＋によって、電荷の中和、脂質間の架橋、脱水和などが起こり、膜が不安定になるためと考えられる。しかし、この方法は、中性リン脂質のみから構成されるリポソームには適用できない。また、ホスファチジルコリンからなるリポソームに高濃度のポリエチレングリコールを添加することによって、膜融合が起こることが報告されている（Lentzら、Biochemistry，1992年，31巻，2643-2653頁およびYangら、Biophysical Journal，1997年，73巻，277-282頁）。これは、膜の自由水が消失することによって膜が不安定になるために起こる。さらに、ウイルスを利用する膜融合法も提案されている（Blumenthalら、Chemistry and Physics of Lipids，2002年，116巻，39-55頁）。この方法では、膜の外側に、ウイルスに対するレセプターが必要である。電気パルスによる物理的刺激を介する膜融合誘起法（Sugarら、Biophysical Chemistry，1987年，26巻，321頁）あるいは接触させたリポソームにＵＶ光を当てることによる膜融合法（Kulinら、Langmuir，2003年，19巻，8206-8210頁）も報告されている。タンパク質またはペプチドを添加することによって、ｐＨ依存的なプロトン化による高次構造の変化を引き起こし、それによって膜融合を誘起する方法もある（Kimら、Biochemistry，1986年，25巻，7867-7874頁）。
【０００５】
これらの種々の融合方法は、いずれも分子集合体を形成している脂質の物理的状態変化に基づくものであり、融合の前段階で凝集を生じている必要がある。すなわち、単独で分散している場合には、分子集合体の脂質は、全く活性化していない状態にある。
【０００６】
一方、化学反応に基づく膜の相転移、例えば、融合および分裂についての報告がある（Takakuraら、Chemistry Letters，2002年，404-405頁およびToyotaら、Chemistry Letters，2004年，33巻，1442-1443頁）。具体的には、ベシクルの二分子膜中での脱水縮合によるイミン形成およびその加水分解反応により、ベシクルの形態変化が生じ、それによって膜融合および分裂が生じる。例えば、疎水性反応性基（アルデヒド基）を有する両親媒性脂質で形成されたベシクルの分散液中に親水性反応性基（アミノ基）を有する両親媒性脂質のミセルの分散液を加えると、二分子膜中で反応性基間の可逆的な脱水縮合反応によってイミンが生じて、ベシクルが大きくなる（Takakuraら、前出）。また、これらの各反応性基を有する脂質と脱水縮合した両親媒性脂質との存在比に応じて、ベシクルの可逆的な形態変化が観察されている（Toyotaら、前出）。しかし、これらの方法では、ベシクルの二分子膜の状態を制御することはできない。
【０００７】
酵素を用いた生物学的手法によって脂質構造を変化させることによって、融合を起こす方法もある。具体的には、ホスファチジルコリンまたはホスファチジルエタノールアミンをホスホリパーゼＣで（Nieva, J.-L.ら、Biochemistry，1989年，28巻，7364-7367頁）、あるいはスフィンゴミエリンをスフィンゴミエリナーゼで（大木和夫、生物物理，2004年，44巻，161-165頁）それぞれ加水分解することによって、ベシクルの二分子膜を構成しているリン脂質のリン酸基を除去し、それぞれジアシルグリセロールまたはセラミドを生成する方法である。いずれも分子の形が、逆コーン型から極性頭部の分子面積が小さい円柱型へ変化し（臨界充填パラメータが変化し）、曲率が変わって融合が生じる。
【０００８】
生物学的な研究として、膜の融合や分裂を起こす際に、一本鎖のリン脂質をアシル化して二本鎖リン脂質へと変化させる酵素の活性が上昇することが報告されている（Schmidt, A.ら、Nature，1999年，401巻，133-141頁）。すなわち、神経終末のシナプスにおいて、シナプス小胞の再形成の際に、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）アシル基転移酵素が必須であることが示されている。この酵素は、リン酸が結合したモノアシルグリセロール（一本鎖のリン脂質）であるＬＰＡにアシル基を転移して、二本鎖のリン脂質へと変化させる。膜の変化が起きる際にこの反応が行われているため、このような酵素的化学反応による膜の曲率変化が重要であることが示唆されている。
【発明の開示】
【０００９】
本発明は、分子集合体を形成している脂質の化学的変化によって、その物理的性質や形態を変化させ、膜融合などの相転移のタイミングなどを調節することが可能な方法を提供することを目的とする。
【００１０】
本発明の二分子膜ベシクルの相転移を誘起させる方法は、アミンまたはカルボン酸塩の極性頭部を有する界面活性剤を含む分子集合体（リポソーム）中で、化学的にこれらの脱水縮合反応を行うことにより、脂質の臨界充填パラメータを変化させ、その結果、リポソームの二分子膜の曲率が変化し、それによって生じた歪が生じることに基づく。
【００１１】
本発明は、二分子膜ベシクルを提供し、該二分子膜ベシクルは、
（ａ）炭素数６から２０までの脂肪酸塩；
（ｂ）炭素数６から２０までの脂肪族鎖を有するアルコールまたはアミン化合物；および
（ｃ）二分子膜を形成し得る人工合成脂質またはリン脂質
を膜の構成成分として含む。
【００１２】
ある実施態様では、上記（ｂ）アルコールまたはアミン化合物は、以下の式Ｉ：
Ｒ１−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２ＯＨ      （Ｉ）
（式中、Ｒ１は、炭素数６から２０までのアルキル基、炭素数６から２０までのアルケニル基、または炭素数６から２０までのアルキニル基である）で表される二価アルコールである。
【００１３】
より好適な実施態様では、上記二分子膜ベシクルは、さらに（ｄ）以下の式ＩＩ：
【００１４】
【化１】
0004787818.tif 000002
【００１５】
（式中、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４のうちの１つまたは２つは、メチル基であり、そして残りのＲ２、Ｒ３、およびＲ４は、それぞれ独立して、−ＣＨ２ＣＯＯＣｎＨ２ｎ＋１、−ＣｎＨ２ｎ＋１、または−Ｃ６Ｈ４−ｐ−ＣｎＨ２ｎ＋１であり、ここでｎは６から２０までの整数であり、−ＣｎＨ２ｎ＋１は直鎖状である）で表される３級アミン；
を上記膜の構成成分として含む。
【００１６】
１つの実施態様では、上記（ａ）脂肪酸塩と上記（ｂ）アルコールまたはアミン化合物とのモル比は１：１である。
【００１７】
さらなる実施態様では、上記（ａ）脂肪酸塩と上記（ｂ）アルコールまたはアミン化合物と上記（ｃ）二分子膜を形成し得る人工合成脂質またはリン脂質とのモル比は１：１：１である。
【００１８】
ある実施態様では、上記（ｃ）二分子膜を形成し得る人工合成脂質またはリン脂質は、リン脂質である。
【００１９】
本発明はまた、二分子膜ベシクルの相転移を誘起させる方法を提供し、該方法は、
二分子膜ベシクルを調製する工程であって、該二分子膜ベシクルが、
（ａ）炭素数６から２０までの脂肪酸塩；
（ｂ）炭素数６から２０までの脂肪族鎖を有するアルコールまたはアミン化合物；および
（ｃ）二分子膜を形成し得る人工合成脂質またはリン脂質；を膜の構成成分として含む、工程；および
該二分子膜ベシクルに脱水縮合剤または脱水縮合剤前駆体を添加する工程；
を含む。
【００２０】
１つの実施態様では、上記（ｂ）アルコールまたはアミン化合物は、以下の式Ｉ：
Ｒ１−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２ＯＨ      （Ｉ）
（式中、Ｒ１は、炭素数６から２０までのアルキル基、炭素数６から２０までのアルケニル基、または炭素数６から２０までのアルキニル基である）で表される二価アルコールである。
【００２１】
さらなる実施態様では、上記二分子膜ベシクルは、さらに（ｄ）以下の式ＩＩ：
【００２２】
【化２】
0004787818.tif 000003
【００２３】
（式中、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４のうちの１つまたは２つは、メチル基であり、そして残りのＲ２、Ｒ３、およびＲ４は、それぞれ独立して、−ＣＨ２ＣＯＯＣｎＨ２ｎ＋１、−ＣｎＨ２ｎ＋１、または−Ｃ６Ｈ４−ｐ−ＣｎＨ２ｎ＋１であり、ここでｎは６から２０までの整数であり、−ＣｎＨ２ｎ＋１は直鎖状である）で表される３級アミンを、上記膜の構成成分として含み、そして
上記脱水縮合剤前駆体は、以下の式ＩＩＩ：
【００２４】
【化３】
0004787818.tif 000004
【００２５】
（式中、Ｒ５およびＲ６は、それぞれ独立して、メチル基、エチル基、炭素数２から５のヒドロキシアルキル基、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＲ７（ここで、ｍは１から１２０までの整数であり、そしてＲ７は、水素原子、メチル基、エチル基、またはプロピル基である）、−（ＣＨ２ＣＨ２ＮＲ８）ｍＨ（ここで、ｍは１から１２０までの整数であり、そしてＲ８は、炭素数が２から５のアルキル基、Ｎ，Ｎ−ジアルキルアミノエチル基、または−ＣＨ２ＣＨ２Ｎ＋（ＣＨ３）３である）、−ＣＨ２ＣＨ２ＳＯ３−、−ＣＨ２ＣＨ２Ｎ＋（ＣＨ３）３、または炭素数６から２０のアルキル基であるが、Ｒ５およびＲ６は同時に炭素数６から２０のアルキル基ではなく、そして；Ｘがハロゲン原子である）で表される、シアヌル酸誘導体である。
【００２６】
ある実施態様では、上記式ＩＩＩにおけるＲ５およびＲ６の少なくとも一方はメチル基またはエチル基である。
【００２７】
１つの実施態様では、上記式ＩＩにおけるｎは１２から１６である。
【００２８】
本発明の方法によれば、脱水縮合反応を利用して二分子膜ベシクルからなる分子集合体を形成している脂質を化学的に変化させて、その物理的性質や形態を変化させ、膜融合などの相転移のタイミングなどを調節することが可能であり得る。すなわち、二分子膜ベシクルにおいて分子集合体の相転移（融合や分裂）を誘起させることが可能になる。したがって、活性化状態または準安定状態のベシクルを提供し得る。また、本発明の二分子膜ベシクルは、このような相転移を誘起するために好適に使用され得る。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】本発明の原理を説明するための模式図である。
【図２】ＮＢＤ−ＰＥからＲｈ−ＰＥへの蛍光エネルギー転移の蛍光スペクトル図である。
【図３】ＭＬＶ中に生じる擬似セラミドの収量の経時変化を示すグラフである。
【図４】ＳＵＶの膜融合によるＦ値の経時的変化を示すグラフである。
【図５】蛍光希釈法によるＳＵＶ膜融合によるＦ値の経時的変化を示すグラフである。
【図６】ＣＤＭＴ添加前のＳＵＶの電子顕微鏡写真である。
【図７】ＣＤＭＴ添加後のＳＵＶ（ＧＵＶ）の電子顕微鏡写真である。
【図８】メタノールのみの添加後のＳＵＶの電子顕微鏡写真である。
【図９】蛍光希釈法による活性化ＳＵＶと不活性ＳＵＶとの膜融合によるＦ値の経時的変化を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
本発明においては、ベシクルの二分子膜中に導入した適切な両親媒性物質を、脱水縮合剤によって脱水縮合反応させて、二分子膜の状態を変化させることができる。
【００３１】
本発明の原理を、図１に基づいて説明する。一般的な界面活性剤においては、図中の逆三角形のように、電荷を有するアミンやカルボン酸塩は、極性頭部が大きい逆コーン型の界面活性剤である。これらが脱水縮合したセラミドは、この反応の前後で、両親媒性物質のアシル鎖（またはアルキル鎖）の数と極性頭部の電荷や官能基の種類が変化し、例えば、電荷の消失によって極性頭部が小さくなるため、図中の長方形で示すような円柱またはコーン型の脂質となる。そこで、これらのアミンとカルボン酸塩とを含む分子集合体（リポソームなど）中で、これらの化合物の脱水縮合反応を行うと、臨界充填パラメータの増加と膜間の斥力低下とによって膜の曲率の変化などが生じ、これらを緩和するために最終的に膜が融合すると考えられる。具体的には、スフィンゴシンからのセラミド合成が挙げられる。しかし、スフィンゴシンの大量入手は困難なので、好適には、例えば、類似の化合物として図に示すような二価アルコールを用いて、その縮合による擬似セラミド合成によって、上記原理を確認した。
【００３２】
本発明の方法は、脱水縮合によりセラミド類似物質を形成し得る基質に対して幅広く応用可能であると考えられる。このような基質として、両親媒性の多様な脂肪酸塩や１級および２級アミン類が挙げられる。特に、生成物である擬似セラミドの両親媒性を維持するためには、少なくともカルボン酸またはアミンやアルコール化合物のいずれかの極性頭部周辺に、脱水縮合反応するカルボキシル基やアミノ基または水酸基とは別に、親水性官能基が存在していることが好ましい。この親水性官能基としては、水酸基や糖などの中性のものが好ましいが、一般的な界面活性剤の極性頭部である４級アンモニウムイオン、リン酸イオン、スルホン酸イオン、硫酸イオンなどのイオンであってもよい。
【００３３】
以下、本発明について、より詳細に説明する。
【００３４】
本発明は、上記のように、相転移を生じ得る二分子膜ベシクルならびにその相転移方法を提供する。本発明において、「相転移」とは、二分子膜ベシクルの膜の相転移に限定されない。例えば、二分子膜ベシクル膜融合や膜分裂、二分子膜ベシクルから平面二分子膜やミセルへの変化、ミセルから二分子膜ベシクルへの変化など、種々の分子集合相の形態変化を包含する。
【００３５】
本発明の二分子膜ベシクルは、
（ａ）炭素数６から２０までの脂肪酸塩；
（ｂ）炭素数６から２０までの脂肪族鎖を有するアルコールまたはアミン化合物；および
（ｃ）二分子膜を形成し得る人工合成脂質またはリン脂質；を膜の構成成分として含む。
【００３６】
上記（ａ）炭素数６から２０までの脂肪酸塩は、水界面に集積する能力を有する両親媒性の脂肪酸塩であれば、特に限定されない。このような脂肪酸塩としては、好ましくは、長鎖アルキル基のような脂溶性基を有する脂肪酸塩、より好ましくは炭素数約１０から約２０の直鎖、分岐鎖、または環状の脂肪酸塩が挙げられる。具体的には、カプリン酸（デカン酸）、ウンデカン酸、ラウリン酸（ドデシル酸）、ミリスチン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸、オレイン酸、エライジン酸、ペトロセリン酸、リノール酸、α−リノレン酸、γ−リノレン酸、イコサン酸、イコサトリエン酸、アラキドン酸などの塩が挙げられる。これらの塩としては、通常、ナトリウム塩、カリウム塩などが挙げられる。必要に応じて、これらの化合物のカルボキシル基の周辺または近傍に、上記のような親水性官能基を有していてもよい。
【００３７】
上記（ｂ）炭素数６から２０までの脂肪族鎖を有するアルコールまたはアミン化合物は、上記（ａ）脂肪酸塩のカルボキシル基と脱水縮合可能な基（例えば、水酸基やアミノ基）を有し、かつ水界面に集積する能力を有する両親媒性の化合物であれば、特に限定されない。好ましくは、長鎖アルキル基のような脂溶性基を有し、そして脱水縮合可能な基の周辺または近傍に、上記のような親水性官能基を有していることがより好ましい。なお、上記（ａ）脂肪酸塩が、脱水縮合反応するカルボキシル基以外にさらなる親水性官能基を有していない場合は、この（ｂ）の化合物は、極性頭部周辺に、さらに親水性官能基を有していることがより好ましい。
【００３８】
このような化合物の好適な例としては、以下の式Ｉ：
Ｒ１−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２ＯＨ      （Ｉ）
（式中、Ｒ１は、炭素数６から２０までのアルキル基、炭素数６から２０までのアルケニル基、または炭素数６から２０までのアルキニル基である）で表される二価アルコールが挙げられる。この二価アルコールにおいては、アミン部分が脱水縮合可能な基であり、そしてアルコール部分が親水性官能基に相当する。
【００３９】
上記式Ｉで表される（ｂ）二価アルコールにおいて、Ｒ１が、炭素数６から２０までのアルキル基である場合、このアルキル基は、直鎖状、分岐鎖状、または環状であり得る。好ましくは炭素数約１０から約２０の直鎖状である。このようなアルキル基としては、ｎ−デシル、ｎ−ドデシル（ラウリル）、ｎ−ヘキサデシル、ｎ−オクタデシルなどが挙げられる。Ｒ１が、炭素数６から２０までのアルケニル基である場合、このアルケニル基は、直鎖状、分岐鎖状、または環状であり得る。好ましくは炭素数約１０から約２０の直鎖状である。このようなアルケニル基としては、１−デセニル、１−ドデセニル、９−ヘキサデセニル、９−オクタデセニルなどが挙げられる。Ｒ１が、炭素数６から２０までのアルキニル基である場合、このアルキニル基は、直鎖状、分岐鎖状、または環状であり得る。好ましくは炭素数約１０から約２０の直鎖状である。このようなアルキニル基としては、１−デシニル、１−ドデシニル、９−ヘキサデシニル、９−オクタデシニルなどが挙げられる。
【００４０】
上記（ｃ）二分子膜を形成し得る人工合成脂質またはリン脂質は、二分子膜を形成し得る化合物であれば、特に限定されない。
【００４１】
人工合成脂質としては、長鎖ジアルキル化合物、モノアルキル界面活性剤、三本鎖型界面活性剤などが挙げられる。例えば、「リポソーム」、野島庄七ら編，南江堂，1988年，302-309頁に例示されている。一般的には、Ｃ１２〜Ｃ１５の２本の長鎖状アルキル基と親水性官能基（カチオン性、アニオン性、非イオン性など）を同一分子内に有する化合物が好適であり、代表的には、Ｃ１２〜Ｃ１５のジアルキルアンモニウム塩が挙げられる。
【００４２】
リン脂質は、特に限定されず、グリセロリン脂質またはスフィンゴリン脂質のいずれであってもよい。このようなリン脂質としては、ホスファチジルコリン（レシチン）、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、スフィンゴミエリンなどが挙げられる。好適には、ホスファチジルコリンである。
【００４３】
本発明の二分子膜ベシクルは、必要に応じて、膜の構成成分としてさらに、
（ｄ）以下の式ＩＩ：
【００４４】
【化４】
0004787818.tif 000005
【００４５】
（式中、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４のうちの１つまたは２つは、メチル基であり、そして残りのＲ２、Ｒ３、およびＲ４は、それぞれ独立して、−ＣＨ２ＣＯＯＣｎＨ２ｎ＋１、−ＣｎＨ２ｎ＋１、または−Ｃ６Ｈ４−ｐ−ＣｎＨ２ｎ＋１であり、ここでｎは６から２０までの整数であり、−ＣｎＨ２ｎ＋１は直鎖状である）で表される３級アミンを含む。
【００４６】
上記式ＩＩで表される（ｄ）３級アミンのＲ２、Ｒ３、およびＲ４であり得る−ＣＨ２ＣＯＯＣｎＨ２ｎ＋１、−ＣｎＨ２ｎ＋１、または−Ｃ６Ｈ４−ｐ−ＣｎＨ２ｎ＋１において、ｎは６から２０までの整数であり、そして−ＣｎＨ２ｎ＋１は直鎖状である。これらの置換基としては、例えば、ｎ−オクチルオキシカルボニルメチレン、ｎ−デシルオキシカルボニルメチレン、ｎ−ドデシルオキシカルボニルメチレン、ｎ−ヘキサデシルオキシカルボニルメチレン；ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチル、ｎ−ノニル、ｎ−デシル、ｎ−ウンデシル、ｎ−ドデシル、ｎ−トリデシル、ｎ−テトラデシル、ｎ−ペンタデシル、ｎ−ヘキサデシル、ｎ−ヘプタデシル、ｎ−オクタデシル、ｎ−ノナデシル、ｎ−エイコシル；ｐ−（ｎ−ヘキシル）フェニレン、ｐ−（ｎ−オクチル）フェニレン、ｐ−（ｎ−デシル）フェニレン、ｐ−（ｎ−ドデシル）フェニレン、ｐ−（ｎ−テトラデシル）フェニレン、ｐ−（ｎ−ヘキサデシル）フェニレン、ｐ−（ｎ−オクタデシル）フェニレンなどが挙げられる。本発明の二分子膜ベシクルへの導入のしやすさを考慮すると、好ましくは、上記式ＩＩのＲ２、Ｒ３、およびＲ４におけるｎは８から１８、より好ましくは１２から１６である。
【００４７】
上記式ＩＩのＲ２、Ｒ３、およびＲ４について、本発明の方法による脱水縮合の反応性を考慮すると、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４のうちの１つまたは２つは、メチル基であり、そして残りのＲ２、Ｒ３、およびＲ４は、炭素数６から２０の直鎖アルキル基を有する基である。より好ましくは、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４のうちの２つはメチル基である。Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４がすべて炭素数６から２０の直鎖アルキル基を有する基である場合は、反応効率がよくないので、好ましくない。
【００４８】
上記式ＩＩで表される３級アミンを二分子膜ベシクルの膜の構成成分として含む場合は、脱水縮合剤前駆体である、以下で詳述する式ＩＩＩで表されるシアヌル酸誘導体を用いることが好ましい。
【００４９】
本発明の二分子膜ベシクルにおける上記（ａ）〜（ｄ）の割合は、ベシクルが形成され得る限り、特に限定されない。脱水縮合反応の基質である（ａ）脂肪酸塩と（ｂ）アルコールまたはアミン化合物とは、約１：１のモル比であることが好ましい。さらに好ましくは、（ａ）脂肪酸塩と（ｂ）アルコールまたはアミン化合物と（ｃ）人工合成脂質またはリン脂質とのモル比は約１：１：１である。（ｄ）３級アミンは、通常、（ａ）脂肪酸塩１モルに対して０．０１〜１．０モル、好ましくは０．１〜０．５モルの割合で含まれる。
【００５０】
上記（ａ）〜（ｄ）はそれぞれ、単独で用いても、２種以上を混合して用いてもよい。
【００５１】
本発明の二分子膜ベシクルは、必要に応じて、他の界面集積性を有する化合物あるいは界面集積性はないが二分子膜中に含まれ得る化合物を含んでいてもよい。例えば、以下で詳述するように、膜融合を観察するための蛍光物質などが挙げられる。
【００５２】
本発明の二分子膜ベシクルは、多重ラメラベシクル（ＭＬＶ：通常０．２〜５μｍサイズ）または一枚膜ベシクル（ＳＵＶ：１００ｎｍ以下；ＬＵＶおよびＲＥＶ：１００〜１０００ｎｍ；ＧＵＶ：１０００ｎｍ以上）のいずれであってもよい。これらは、当業者が用いる一般的な方法によって製造され得る。例えば、ＭＬＶは、次のように製造され得る：上記（ａ）〜（ｄ）をそれぞれ適切な有機溶媒（例えば、メタノール、クロロホルムなど）に溶解して容器中で混合し、有機溶媒を留去する。次いで、内壁に形成された薄膜を乾燥させた後、適切な水溶液（例えば、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、炭酸緩衝液など）を加え、約３０秒程度の超音波照射によって膨潤させる。さらにボルテックスミキサーなどで攪拌振盪して、薄膜を剥がすことによって、ＭＬＶを懸濁液の状態で得ることができる。ＳＵＶは、例えば、さらに高出力で強力に超音波照射（例えば、氷冷下にて約２０分間）することによってＳＵＶの分散液として得られ得る（超音波処理法）。あるいは、エタノールに溶解した脂質を相転移温度以上で緩衝液中にマイクロシリンジで注入するエタノール注入法、ＭＬＶをフレンチプレスセルに入れて押し出すフレンチプレス法などによっても、ＳＵＶを調製できる。ＬＵＶは、エーテル注入法、界面活性剤法、Ｃａ２＋融合法、凍結−融解法などの当業者が通常用いる方法によって調製される。ＲＥＶは、逆相蒸発法によって得られる。ＧＵＶは、例えば、メチルグルコシドと脂質とのエタノール溶液を多量の緩衝液に対して透析することにより得られる。
【００５３】
本発明の二分子膜ベシクルの相転移（例えば、膜融合）を誘起させる方法は、
上記二分子膜ベシクルを調製する工程；および
該二分子膜ベシクルに脱水縮合剤または脱水縮合剤前駆体を添加する工程、を含む。
【００５４】
上記方法で用いられる脱水縮合剤としては、水溶性の脱水縮合剤あるいは界面集積性の脱水縮合剤または脱水縮合剤前駆体が挙げられる。
【００５５】
水溶性の脱水縮合剤としては、例えば、以下の式ＩＶ：
【００５６】
【化５】
0004787818.tif 000006
【００５７】
（ここで、Ｅは、３級アミノ基を１または２個有する一または二価の有機基であり；ｎは、Ｅが３級アミノ基を１個有するときは１であり、Ｅが３級アミノ基を２個有するときは２であり；Ｒ９およびＲ１０はそれぞれ独立して炭素数１〜４のアルキル基、または炭素数６〜８のアリール基を示し；ａは１または２であり、ｎが１のときは１であり；そして、Ｚ−（ｎ／ａ）は（ｎ／ａ）価のカウンターアニオンを示す）で表される４級アンモニウム塩が挙げられる（ＷＯ００／５３５４４およびKunishimaら、Tetrahedron，2001年，57巻，1551-1558頁参照）。具体的には、４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリウムクロリド（ＤＭＴ−ＭＭ）が挙げられる。
【００５８】
界面集積性の脱水縮合剤としては、以下の式Ｖ：
【００５９】
【化６】
0004787818.tif 000007
【００６０】
（式中、Ｒ５およびＲ６は、それぞれ独立して、メチル基、エチル基、炭素数２から５のヒドロキシアルキル基、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＲ７（ここで、ｍは１から１２０までの整数であり、そしてＲ７は、水素原子、メチル基、エチル基、またはプロピル基である）、−（ＣＨ２ＣＨ２ＮＲ８）ｍＨ（ここで、ｍは１から１２０までの整数であり、そしてＲ８は、炭素数が２から５のアルキル基、Ｎ，Ｎ−ジアルキルアミノエチル基、または−ＣＨ２ＣＨ２Ｎ＋（ＣＨ３）３である）、−ＣＨ２ＣＨ２ＳＯ３−、−ＣＨ２ＣＨ２Ｎ＋（ＣＨ３）３、または炭素数６から２０のアルキル基であるが、Ｒ５およびＲ６は同時に炭素数６から２０のアルキル基ではなく；Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４のうちの１つまたは２つは、メチル基であり、そして残りのＲ２、Ｒ３、およびＲ４は、それぞれ独立して、−ＣＨ２ＣＯＯ−ＣｎＨ２ｎ＋１、−ＣｎＨ２ｎ＋１、または−Ｃ６Ｈ４−ｐ−ＣｎＨ２ｎ＋１であり、ここでｎは６から２０までの整数であり、−ＣｎＨ２ｎ＋１は直鎖状であり；そしてＸ−は、ハロゲン化物イオンである）で表される、１，３，５−トリアジン型化合物が挙げられる。この式Ｖで表される化合物は、以下の式ＩＩＩ：
【００６１】
【化７】
0004787818.tif 000008
【００６２】
（式中、Ｒ５およびＲ６は、それぞれ独立して、メチル基、エチル基、炭素数２から５のヒドロキシアルキル基、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＲ７（ここで、ｍは１から１２０までの整数であり、そしてＲ７は、水素原子、メチル基、エチル基、またはプロピル基である）、−（ＣＨ２ＣＨ２ＮＲ８）ｍＨ（ここで、ｍは１から１２０までの整数であり、そしてＲ８は、炭素数が２から５のアルキル基、Ｎ，Ｎ−ジアルキルアミノエチル基、または−ＣＨ２ＣＨ２Ｎ＋（ＣＨ３）３である）、−ＣＨ２ＣＨ２ＳＯ３−、−ＣＨ２ＣＨ２Ｎ＋（ＣＨ３）３、または炭素数６から２０のアルキル基であるが、Ｒ５およびＲ６は同時に炭素数６から２０のアルキル基ではなく、そして；Ｘがハロゲン原子である）で表される、シアヌル酸誘導体と、以下の式ＩＩ：
【００６３】
【化８】
0004787818.tif 000009
【００６４】
（式中、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は上で定義したとおりである）で表される３級アミンとを、適切な溶媒中で混合することによって得られる。特に、脱水縮合させるべき少なくとも２種類の化合物を混合すると同時に、これらのシアヌル酸誘導体および３級アミンも混合することが好ましい。
【００６５】
脱水縮合剤として、上記式Ｖで表される１，３，５−トリアジン型化合物を直接用いてもよいが、この化合物は上述のようにベシクル調製の際に同時に加えることが好ましいため、融合や相転移を調節することが困難である。そこで、予め（ｄ）３級アミン化合物を膜の構成成分として含むように調製されたベシクルに、脱水縮合剤前駆体であるシアヌル酸誘導体（化合物ＩＩＩ）を添加することが好ましい。この場合、リポソームを調製した後にシアヌル誘導体（化合物ＩＩＩ）を加えることにより、系内（リポソーム界面）で脱水縮合剤（化合物Ｖ）を発生させて、界面の脱水縮合反応を起こすことができる。そのため、目的とする融合や相転移を適切に行うために、より好適である。
【００６６】
上記式ＩＩＩにおいて、Ｒ５およびＲ６が炭素数２から５のヒドロキシアルキル基である場合、このヒドロキシアルキル基は、直鎖状、分岐鎖状、または環状であり得、ヒドロキシ基の位置および数は、特に制限されない。好ましくは、直鎖状であり、そして末端ヒドロキシである。炭素数２から５のヒドロキシアルキル基としては、例えば、２−ヒドロキシエチル、３−ヒドロキシプロピル、４−ヒドロキシブチル、５−ヒドロキシペンチルが挙げられる。
【００６７】
上記式ＩＩＩにおいて、Ｒ５およびＲ６が−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＲ７である場合、ｍは、１から１２０までの整数、好ましくは１から５０までの整数である。Ｒ７は、水素原子、メチル基、エチル基、またはプロピル基である。この場合、Ｒ５およびＲ６の部分の平均分子量は、好ましくは約４５から約５０００まで（ｍが１から１２０に相当）、より好ましくは約４５から約２０００まで（ｍが１から５０に相当）である。
【００６８】
上記式ＩＩＩにおいて、Ｒ５およびＲ６が−（ＣＨ２ＣＨ２ＮＲ８）ｍＨである場合、ｍは、１から１２０までの整数、好ましくは１から５０までの整数である。Ｒ８は、エチル基またはＮ，Ｎ−ジアルキルアミノエチル基であり、該アルキルの炭素数は２から５である。この場合、Ｒ５およびＲ６の部分の平均分子量は、好ましくは約４５から約５０００まで（ｍが１から１２０に相当）、より好ましくは約４５から約２０００まで（ｍが１から５０に相当）である。
【００６９】
上記式ＩＩＩにおいて、Ｒ５およびＲ６が炭素数６から２０のアルキル基である場合、このアルキル基は、直鎖状、分岐鎖状、または環状であり得る。好ましくは直鎖状である。Ｒ５およびＲ６の炭素数６から２０のアルキル基としては、ｎ−ヘキシル、ｎ−ペンチル、ｎ−オクチル、ｎ−ノニル、ｎ−デシル、ｎ−ドデシル、ｎ−ヘキサデシルなどが挙げられる。
【００７０】
上記式ＩＩＩのＲ５およびＲ６について、このシアヌル酸誘導体の水界面への留まりやすさを考慮すると、Ｒ５Ｏ−およびＲ６Ｏ−部分は、親水性を有していることが好ましい。上記のＲ２、Ｒ３、およびＲ４との組み合わせにより異なるが、好ましくは、Ｒ５およびＲ６の少なくとも一方は、メチル基またはエチル基であり、より好ましくは両方ともメチル基である。Ｒ５およびＲ６が同時に炭素数６から２０のアルキル基である場合は、このシアヌル酸誘導体の疎水性が強くなり、水界面に集積しにくくなるため、好ましくない。
【００７１】
このようなシアヌル酸誘導体としては、例えば、２−クロロ−４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン（ＣＤＭＴ）が挙げられる。
【００７２】
上述のように、脱水縮合反応をさせるためには、二分子膜ベシクルの界面への集積性が良好でありかつ界面で脱水縮合剤を発生させることができる点で、二分子膜ベシクルの膜の構成成分として（ｄ）３級アミンを含むベシクルに対して、脱水縮合剤前駆体であるシアヌル酸誘導体（化合物ＩＩＩ）を用いることが特に好ましい。
【００７３】
この工程において、上記の脱水縮合剤または脱水縮合剤前駆体は、（ａ）脂肪酸塩または（ｂ）アルコールまたはアミン化合物に対して１〜１００当量、好ましくは２５〜５０当量用いられる。この工程を行う温度は、目的に応じて適宜決定され、通常は室温で行われる。この工程に要する時間は、ベシクルの膜の構成成分、脱水縮合剤または脱水縮合剤前駆体の量、この工程の実施温度などの種々の要因によって変化し、あるいはこれらの要因によって調節可能である。
【００７４】
この工程において、シアヌル酸誘導体を用いる場合、以下のスキームに示すように、まず、上記式ＩＩＩのシアヌル酸誘導体が添加されることによって、二分子膜ベシクルに存在する（ｄ）３級アミンとともに脱水縮合剤が形成される。次いで、膜中の（ａ）カルボン酸と（ｂ）アミン化合物（二価アルコール）とが脱水縮合して、擬似セラミドが形成される。そのため、上述のように、膜の臨界充填パラメータの増加と膜間の斥力低下とによって膜の曲率の変化などが生じて、膜の融合などの相転移が生じる（図１参照）。
【００７５】
【化９】
0004787818.tif 000010
【００７６】
膜の融合などの相転移を評価および観察するための手段としては、電子顕微鏡による観察、生成した擬似セラミドの定量（例えば、マススペクトルなどによる）、蛍光変化の測定などが挙げられる。蛍光変化の測定の場合、近傍に存在することにより蛍光エネルギー転移が生じるような化合物を、二分子膜の構成成分として導入する。このような化合物としては、例えば、１，２−ジミリスチル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−（７−ニトロ−２−１，３−ベンゾキサジアゾール−４−イル）（ＮＢＤ−ＰＥ）と１，２−ジミリスチル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−（リッサミンローダミンＢスルフォニル）（Ｒｈ−ＰＥ）との組み合わせが挙げられる。前者がエネルギードナーであり、そして後者がエネルギーアクセプターである。図２に示すように、ＮＢＤ−ＰＥとＲｈ−ＰＥとが互いに近傍に存在すると蛍光エネルギー転移が生じる。蛍光変化の評価は、以下の式：
【００７７】
【数１】
0004787818.tif 000011
【００７８】
ａ０＝反応開始時のＮＢＤ−ＰＥの蛍光強度
ａｔ＝任意の時間におけるＮＢＤ−ＰＥの蛍光強度
ｂ０＝反応開始時のＲｈ−ＰＥの蛍光強度
ｂｔ＝任意の時間におけるＲｈ−ＰＥの蛍光強度
により得られる蛍光変化Ｆを用いることができる。例えば、ＮＢＤ−ＰＥおよびＲｈ−ＰＥがそれぞれ別のベシクルに含まれている場合、これらの融合が起こるとＦ値は増大する。逆に、ＮＢＤ−ＰＥとＲｈ−ＰＥとの両方を含むベシクルが、これらを含まないベシクルと融合した場合は、ＮＢＤ−ＰＥとＲｈ−ＰＥとの距離が離れるため、Ｆ値は減少する。
【００７９】
本発明の方法による膜の融合などの相転移は、本発明により提供されるような膜の構成成分として脂肪酸塩とアミンを含みそして脱水縮合によって活性化され得る不安定な二分子膜ベシクル同士の間だけでなく、このような不安定な二分子膜ベシクルと活性化されない安定な二分子膜ベシクルとの間でも生じ得る。さらに、不安定な二分子膜ベシクルと安定な二分子膜ベシクルとの量比、脱水縮合剤または脱水縮合剤前駆体の量などの種々の要因によって、相転移の調節が可能である。
【００８０】
また、本発明の方法によれば、二分子膜ベシクル同士の膜融合を誘起した場合、その内容物も膜の融合とともに漏出（リーキング）することなく融合され得る。
【００８１】
このように、本発明の方法によれば、例えば、細胞と本発明により提供される二分子膜ベシクルとの間での膜融合を誘起し、適切なタイミングでベシクルの内容物を細胞内に送り込むように調節することも可能である。
【実施例】
【００８２】
［製造例１：二価アルコールの合成］
リポソームを構成しそしてリポソームにおいて脱水縮合反応を行うための基質として、以下のスキーム１に示すように、極性基として水酸基を２つ有するアミンである擬似スフィンゴシンを、グリシドールのエポキシドと長鎖１級アミンとを反応させて合成した。
【００８３】
【化１０】
0004787818.tif 000012
【００８４】
［１−１］３−オクチルアミノ−１，２−プロパンジオール（二価アルコール１Ａ）の合成
ｎ−オクチルアミン（３．０ｇ，０．０２３ｍｏｌ）を反応容器に加え、８５℃に加熱した。窒素気流下にてグリシドール（１．５６ｇ，０．０２１ｍｏｌ）を１０分間かけて加え、１時間攪拌した後、反応溶液を真空乾燥させた。得られた残渣を、カラムクロマトグラフィーにかけ、クロロホルム：メタノール＝１：１（トリメチルアミン１％添加）で展開した後、メタノール（トリメチルアミン１％添加）で溶出して分取し、二価アルコール１Ａ（１．０３ｇ，収率２４％）を得た。
【００８５】
無色結晶；融点：５９．５〜６１．５℃。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ０．８７（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，３Ｈ），１．２１−１．３５（ｍ，１０Ｈ），１．４２−１．５１（ｍ，２Ｈ），２．５４−２．７３（ｍ，３Ｈ），２．７９−２．８５（ｍ，１Ｈ），３．５８−３．６５（ｍ，１Ｈ），３．７０−３．７７（ｍ，２Ｈ）；ＩＲ（ＫＢｒ）３３２０，３２７１，２９１９，２８５３ｃｍ−１。
【００８６】
以下の実施例で用いる緩衝液（５ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４，０．１５ＭＮａＣｌ，ｐＨ７．５）に対する二価アルコール１Ａの溶解度は約１０ｍＭであった。
【００８７】
［１−２］３−ドデシルアミノ−１，２−プロパンジオール（二価アルコール１Ｂ）の合成
上記［１−１］の二価アルコール１Ａの合成と同様の方法で合成した（収率３３％）。
【００８８】
無色結晶；融点：７８〜７９℃。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ０．８８（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，３Ｈ），１．２３−１．３３（ｍ，１８Ｈ），１．４２−１．５１（ｍ，２Ｈ），２．５４−２．７３（ｍ，３Ｈ），２．７９−２．８６（ｍ，１Ｈ），３．５９−３．６５（ｍ，１Ｈ），３．７０−３．７７（ｍ，２Ｈ）；ＩＲ（ＫＢｒ）３３２３，３２７２，２９１６，２８４７ｃｍ−１；元素分析：Ｃ１５Ｈ３３ＮＯ２：計算値：Ｈ，１２．８２；Ｃ，６９．４５．実測値：Ｈ，１２．８３；Ｃ，６９．４２。ＥＳＩ−ＭＳ  ｍ／ｚ２６０［（Ｍ＋１）＋，Ｃ１５Ｈ３３Ｏ２Ｎ］。
【００８９】
以下の実施例で用いる緩衝液（５ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４，０．１５Ｍ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．５）に対する二価アルコール１Ｂの溶解度は約０．２ｍＭであった。
【００９０】
［１−３］３−ヘキサデシルアミノ−１，２−プロパンジオール（二価アルコール１Ｃ）の合成
上記［１−１］の二価アルコール１Ａの合成と同様の方法で合成した（収率３４％）。
【００９１】
無色結晶：融点：８６〜８９．５℃。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ０．８７（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，３Ｈ），１．２３−１．３３（ｍ，２６Ｈ），１．４２−１．５２（ｍ，２Ｈ），２．５４−２．７３（ｍ，３Ｈ），２．８０−２．８７（ｍ，１Ｈ），３．５９−３．６６（ｍ，１Ｈ），３．７０−３．７７（ｍ，２Ｈ）；ＩＲ（ＫＢｒ）３３４５，３２７２，２９１８，２８５１ｃｍ−１；元素分析：Ｃ１９Ｈ４１ＮＯ２：計算値：Ｈ，１３．１０；Ｃ，７２．３２．実測値：Ｈ，１３．３４；Ｃ，７２．３０。ＥＳＩ−ＭＳ  ｍ／ｚ３１６［（Ｍ＋１）＋，Ｃ１９Ｈ４１Ｏ２Ｎ］。
【００９２】
［製造例２：擬似セラミドの合成］
リポソームにおける脱水縮合反応による生成物が擬似セラミドであると考えられるため（スキーム２）、これを確認するための標品として、擬似セラミドをKunishimaら、前出に記載の方法に従って合成した。
【００９３】
【化１１】
0004787818.tif 000013
【００９４】
［２−１］３−（Ｎ−ラウロイルドデシルアミノ）−１，２−プロパンジオール（擬似セラミド２Ｂ）の合成
ラウリン酸ナトリウム（０．２５ｇ，１．１３ｍｍｏｌ）を反応容器に加え、メタノール（６ｍＬ）を加えた。さらに、上記［１−２］で得られた二価アルコール１Ｂ（０．２９ｇ，１．１３ｍｍｏｌ）をメタノール（４ｍＬ）に溶かして加えた。さらに、ＤＭＴ−ＭＭ（０．３４ｇ，１．２４ｍｍｏｌ）をメタノール（２ｍＬ）に溶かして加えた後、室温で５時間攪拌した。メタノールをポンプで減圧留去した後、残渣を酢酸エチルおよび蒸留水を用いて抽出した。回収した酢酸エチル層を、飽和炭酸ナトリウムで２回、蒸留水で１回、１Ｍ  ＨＣｌで２回、蒸留水で１回、次いで飽和食塩水で１回洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、減圧下で溶媒を除去した。得られた残渣を、カラムクロマトグラフィーに供し、ヘキサン：酢酸エチル＝１：１で展開した後、ヘキサン：酢酸エチル＝４：６で溶出して分取し、擬似セラミド２Ｂ（０．３３ｇ，収率６５％）を得た。
【００９５】
無色結晶：融点：３５〜３６．５℃。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ０．８８（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，３Ｈ），１．２３−１．３５（ｍ，３４Ｈ），１．５６−１．６６（ｍ，４Ｈ），２．３３（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），３．１７−３．３６（ｍ，２Ｈ），３．３８−３．５９（ｍ，４Ｈ），３．７０−３．８０（１Ｈ）；ＩＲ（ＫＢｒ）３３５４，２９１９，２８５１，１６１３ｃｍ−１；元素分析：Ｃ２７Ｈ５５ＮＯ３：計算値：Ｈ，１２．５５；Ｃ，７３．４１．実測値：Ｈ，１２．７１；Ｃ，７３．１６。ＥＳＩ−ＭＳ  ｍ／ｚ４４２［（Ｍ＋１）＋，Ｃ２７Ｈ５５Ｏ３Ｎ］。
【００９６】
［２−２］３−（Ｎ−オクタノイルオクチルアミノ）−１，２−プロパンジオール（擬似セラミド２Ａ）の合成
上記［２−１］の擬似セラミド２Ｂの合成と同様の方法で合成した（収率５２％）。
【００９７】
無色油状。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ０．８８（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，３Ｈ），０．８９（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，３Ｈ），１．２２−１．３７（ｍ，１８Ｈ），１．５２−１．７０（ｍ，４Ｈ），２．３３（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），３．１８−３．３６（ｍ，２Ｈ），３．３９−３．５９（ｍ，４Ｈ），３．７１−３．７９（ｍ，１Ｈ）；ＩＲ（ｎｅａｔ）３３７８，２９２６，２８５５，１６２０ｃｍ−１；元素分析：Ｃ１９Ｈ３９Ｏ３Ｎ：計算値：Ｈ，１１．９３；Ｃ，６９．２５．実測値：Ｈ，１２．１４；Ｃ，６９．４９。ＥＳＩ−ＭＳ  ｍ／ｚ３３０［（Ｍ＋１）＋，Ｃ１９Ｈ３９Ｏ３Ｎ］。
【００９８】
［製造例３：界面集積性３級アミンの合成］
【００９９】
【化１２】
0004787818.tif 000014
【０１００】
［３−１］Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ−酢酸−１−ドデシルエステル（Ｃ１２−３級アミン）の合成
Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシン塩酸塩（２．２３ｇ、０．０１６  ｍｏｌ）の乾燥Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ；１００ｍＬ）溶液に、１−ドデシルアルコール（２．９８ｇ、０．０１６ｍｏｌ）、トリエチルアミン（１．６２ｇ、０．０１６ｍｏｌ）、および４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）ピリジン（ＤＭＡＰ；０．１９５ｇ、０．００１６ｍｏｌ）を窒素雰囲気下で加えて、０℃に冷却した。次に、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ；３．６３ｇ、０．０１７６ｍｏｌ）の乾燥ＤＭＦ溶液（６０ｍｌ）を０℃で加えた。反応溶液を室温に戻して約１日攪拌した後、ＤＭＦをポンプで減圧留去した。残渣をエーテルおよび飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を用いて溶解し、エーテル層を回収し、水で１回および飽和食塩水で１回洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧下で溶媒を除去した。得られた残渣をカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル：トリエチルアミン＝５０：５０：１）にかけて分取し、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ−酢酸−１−ドデシルエステル（Ｃ１２−３級アミン）を得た（収率４８％、２．１０ｇ）。
【０１０１】
無色液体。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ０．８８（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，３Ｈ），１．２３−１．３１（ｍ，１８Ｈ），１．５９−１．６８（ｍ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，２Ｈ），２．３５（ｓ，６Ｈ），３．１５（ｓ，２Ｈ），４．１２（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ）。ＥＳＩ−ＭＳ  ｍ／ｚ２７２［（Ｍ＋１）＋，Ｃ１６Ｈ３３Ｏ２Ｎ］。ＩＲ（ＫＢｒ）２９２３，１７４９ｃｍ−１。
【０１０２】
［３−２］Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ−酢酸−１−オクチルエステル（Ｃ８−３級アミン）の合成
１−ドデシルアルコールの代わりに１-オクチルアルコールを用いたこと以外は、上記［３−１］と同様にして、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ−酢酸−１−オクチルエステル（Ｃ８−３級アミン）を５９％の収率で得た。
【０１０３】
無色液体。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ０．８８（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，３Ｈ），１．２４−１．３３（ｍ，１０Ｈ），１．５７−１．６６（ｍ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），２．３５（ｓ，６Ｈ），３．１６（ｓ，２Ｈ），４．１２（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ）。ＥＳＩ−ＭＳ  ｍ／ｚ２１６［（Ｍ＋１）＋，Ｃ１２Ｈ２５Ｏ２Ｎ］。ＩＲ（ＫＢｒ）２９２８，１７５３ｃｍ−１。
【０１０４】
［３−３］Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ−酢酸−１−ヘキサデカエステル（Ｃ１６−３級アミン）の合成
１−ドデシルアルコールの代わりにセチルアルコールを用いたこと以外は、上記［３−１］と同様にして、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ−酢酸−１−ヘキサデカエステル（Ｃ１６−３級アミン）を４４％の収率で得た。
【０１０５】
無色液体。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ０．８７（ｔ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，３Ｈ），１．２３−１．３０（ｍ，２６Ｈ），１．５９−１．６８（ｍ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ），２．３５（ｓ，６Ｈ），３．１６（ｓ，２Ｈ），４．１２（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ）。ＥＳＩ−ＭＳ  ｍ／ｚ３２８［（Ｍ＋１）＋，Ｃ２０Ｈ４１Ｏ２Ｎ］。ＩＲ（ＫＢｒ）２９２３，１７４２ｃｍ−１。
【０１０６】
［実施例１：３級アミンを含む多重ラメラベシクル（ＭＬＶ）調製］
文献（「化学と生物  実験ライン２７  リポソームの調製と実験法」，奥直人編，廣川書店，第５章，４３頁）に記載の方法に従って、以下のような方法でＭＬＶを調製した。
【０１０７】
ラウリン酸ナトリウム（メタノール中４５．０ｍＭ，８．７μＬ）、上記［１−２］で合成した二価アルコール１Ｂ（クロロホルム中３８．５ｍＭ，１０．１μＬ）、上記製造例３で合成した３種の３級アミンのいずれか（クロロホルム中３．０５ｍＭ，２５．６μＬ）、およびＬ−α−ホスファチジルコリン（クロロホルム中１２．９ｍＭ，２８．５μＬ）、および蛍光剤であるＮＢＤ−ＰＥ（Avanti Polar Lipids製）（クロロホルム中１．２３ｍＭ，１５．９μＬ）を、２０ｍＬナス型フラスコに加えた。ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を減圧留去し、窒素ガスにより常圧に戻した後、内壁に形成された薄膜を、さらに真空ポンプを用いて室温下にて０．５時間減圧乾燥させた。再び窒素ガスにより常圧に戻し、リン酸緩衝液（５ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４／Ｎａ２ＨＰＯ４，０．１５Ｍ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．５）を６ｍＬ加え、浴槽型超音波発生装置で３０秒間超音波を照射した後、さらにボルテックスミキサー（AS ONE TUBE MIXER MODEL TMFを使用）で２０分間振盪（室温，強度８０％）し、薄膜を剥がした。薄膜を含む分散液を１０ｍＬサンプル瓶に移し替え、ボルテックスミキサーでの振盪（室温，強度３０％）を約半日間行って、３級アミンを含むＮＢＤ−ＰＥ含有ＭＬＶ分散液を得た。
【０１０８】
蛍光剤としてＮＢＤ−ＰＥの代わりにＲｈ−ＰＥ（Avanti Polar Lipids製）（クロロホルム中４．１９ｍＭ，４．７μＬ）を用いること以外は、上記と同様にして、３級アミンを含むＲｈ−ＰＥ含有ＭＬＶ分散液を得た。
【０１０９】
［実施例２：多重ラメラベシクル（ＭＬＶ）調製−２］
上記実施例１のＭＬＶ調製において、２０ｍＬナス型フラスコに、３級アミンを加えなかったこと以外は、上記実施例１と同様にして、３級アミンを含まない種々のＭＬＶ分散液を得た。
【０１１０】
［実施例３：多重ラメラベシクル（ＭＬＶ）を用いた膜融合実験］
上記実施例１で得た３級アミン（Ｃ８またはＣ１６）を含むＭＬＶ分散液を各１ｍＬずつ室温下で混合した。これに、２−クロロ−４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン（ＣＤＭＴ）（１５０ｍＭまたは３００ｍＭ）のメタノール溶液（２１．７μＬ）を加え、室温で静置した。さらに、上記実施例２で得たＭＬＶ分散液に水溶性脱水縮合剤である４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリウムクロリド（ＤＭＴ−ＭＭ）（２２５ｍＭまたは３００ｍＭ）のメタノール溶液（２１．７μＬ）を添加したものも調製した。対照実験としてＣＤＭＴ溶液の代わりに２１．７μＬのメタノールを添加したものを調製した。
【０１１１】
調製した各混合液の経時的蛍光変化を蛍光光度計で測定した。励起波長は４７０ｎｍとした。蛍光変化の尺度として、上述のようにＦ値を用いた。膜融合が起こるとＦ値は増大する（図２を参照）。結果を表１に示す。
【０１１２】
【表１】
0004787818.tif 000015
【０１１３】
表１に示すように、ＣＤＭＴを用いた場合は、いずれも時間とともにＦ値が増大し、膜融合が生じたことがわかる。一方、ＤＭＴ−ＭＭでは、非常にゆっくりと膜融合が生じた。また、縮合剤を加えなかった場合は、蛍光の変化は観察されなかった。
【０１１４】
［実施例４：擬似セラミド２Ｂの定量］
ＭＬＶ融合における擬似セラミドの反応収率と蛍光変化との相関性に関する検討するために、ＭＬＶに生じた擬似セラミドを定量した。
【０１１５】
上記実施例１で得た３級アミン（Ｃ８またはＣ１６）を含むＭＬＶ分散液２ｍＬに、ＣＤＭＴ（メタノール中１５０ｍＭまたは３００ｍＭ，２１．７μＬ）を加え、室温で静置した。上記実施例２で得た３級アミンを含まないＭＬＶ分散液についてもＣＤＭＴ溶液２１．７μＬを加え、同様に静置した。さらに、上記実施例２で得たＭＬＶ分散液にＤＭＴ−ＭＭ（メタノール中３００ｍＭ，２１．７μＬ）を添加したものも調製した。対照実験として、ＣＤＭＴ溶液の代わりに２１．７μＬのメタノールを加え、同様に静置した。任意の時間（２、５、１２、および３６時間）に各ＭＬＶ分散液の一部（５００μＬ）を取り、酢酸アンモニウム（蒸留水中３９０ｍＭ，８．３μＬ）およびＮ−メチルモルホリン（ＮＭＭ）（ＣＤＭＴ添加量に応じて、０μＬ、３．６μＬ、または７．２μＬ）を加え、ボルテックスミキサーで（室温，強度３０％）を１０分間振盪した。次いで、５００μＬの酢酸エチルを加え、ボルテックスミキサーで（室温，強度５０％）１０分間振盪して抽出し、有機層を回収した。得られた有機層５０μＬ、内部標準（擬似セラミド２Ａ）溶液（酢酸エチル中３２．５μＭ，５０μＬ）、酢酸アンモニウム水溶液（１０ｍＭ）／アセトニトリル混液（１：１０（ｖ／ｖ））５００μＬ、および塩化ナトリウム水溶液（１０ｍＭ，３．６μＬ）を混和し、ＥＳＩ−ＭＳ測定により定量を行った。定量ピークは、内部標準および検量物質ともにナトリウム付加ピーク（Ｍ＋２３）である、それぞれｍ／ｚ３５２および４６４を用いた。結果を図３および表２に示す。
【０１１６】
【表２】
0004787818.tif 000016
【０１１７】
３級アミンを含むＭＬＶ分散液にＣＤＭＴを添加した場合は、３級アミンの脂肪鎖の長さに応じた収率で、擬似セラミドが得られた。また、ＣＤＭＴ非添加の場合は、擬似セラミドの生成は認められなかった。一方、ＤＭＴ−ＭＭでは、非常にゆっくりと擬似セラミドが生じた。この結果は、上記実施例３の結果と一致し、したがって、擬似セラミドの生成量と融合との相関性が示された。なお、３級アミンを含まないＭＬＶ分散液にＣＤＭＴを添加した場合は、擬似セラミドの生成は見られなかった。
【０１１８】
［実施例５：ＭＬＶの融合に伴う粒子径の変化］
以下の表３に記載の化合物を用いて上記実施例１に記載の操作に従って、ＭＬＶ分散液を調製した。
【０１１９】
【表３】
0004787818.tif 000017
【０１２０】
調製したＭＬＶ分散液を２ｍＬずつに取り分け、ＣＤＭＴ（メタノール中３００ｍＭ）を５０当量（２１．７μＬ）加えた。対照として、２１．７μＬのメタノールを添加した。各２検体を調製し、１２時間後の粒径を動的光散乱法（ＤＬＳ）により測定した。結果を表４に示す。
【０１２１】
【表４】
0004787818.tif 000018
【０１２２】
ＣＤＭＴを加えた場合は、１２時間経過後に粒子径が増大していたが、ＣＤＭＴを加えない場合は１２時間経過後でもサイズに変化が見られなかった。このことから、ＣＤＭＴを加えた場合に、膜融合が誘起されていることが示された。
【０１２３】
［実施例６：一枚膜ベシクル（ＳＵＶ）の調製］
文献（「化学と生物  実験ライン２７  リポソームの調製と実験法」，奥直人編，廣川書店，第２章，２７頁）に記載の方法に従って、以下のような方法でＳＵＶを調製した。
【０１２４】
ラウリン酸ナトリウム（メタノール中４５．０ｍＭ，５．８μＬ）、二価アルコール１Ｂ（クロロホルム中３８．５ｍＭ，６．８μＬ）、Ｃ１６−３級アミン（クロロホルム中３．０５ｍＭ，１７．０μＬ）、非還元型卵黄レシチン（クロロホルム中１３．０ｍＭ，１９．０μＬ）、および蛍光剤（ＮＢＤ−ＰＥの場合：クロロホルム中１．２３ｍＭ，１０．６μＬ；Ｒｈ−ＰＥの場合：クロロホルム中４．１９ｍＭ，３．１μＬ）を、２０ｍＬナス型フラスコに加え、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を減圧留去した。内壁に形成された薄膜を、さらに真空ポンプを用いて減圧乾燥（室温下，０．５時間）させた。リン酸緩衝液（５ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４／Ｎａ２ＨＰＯ４，０．１５Ｍ  ＮａＣｌ，ｐＨ８．５）を４ｍＬ加え、浴槽型超音波装置で３０秒間超音波処理を行った。次いで、ボルテックスミキサーにより１０分間、強度１００％で攪拌振盪した。次いで、２０ｍＬ試験管に移し替え、プローブ型超音波発生装置（ＴＯＭＹ  ＵＬＴＲＡＳＯＮＩＣ  ＤＩＳＲＵＰＴＯＲ  ＭＯＤＥＬ  ＵＲ−２００Ｐ）を用いて２５Ｗにて２０分間（１分間照射および３０秒間静置を繰り返して、総照射時間を２０分とした）超音波処理（氷冷下）を行って、ＳＵＶ分散液を得た。
【０１２５】
［実施例７：ＳＵＶを用いた膜融合実験］
上記実施例６で得られたＮＢＤ−ＰＥおよびＲｈ−ＰＥを含むＳＵＶ分散液を用いて、上記実施例３のＭＬＶでの膜融合実験と同様に、経時的蛍光変化を測定した。蛍光ピークよりＦ値を求め、ＳＵＶの融合について評価した。結果を図４に示す。グラフからわかるように、ＣＤＭＴを加えた場合のみ、膜融合を示唆する結果が得られた。
【０１２６】
［実施例８：蛍光希釈法によるＳＵＶ膜融合の評価］
上記実施例６に記載のＳＵＶの調製法に準じて、表５に示す組成で蛍光剤を含むＳＵＶ分散液および蛍光剤を含まないＳＵＶ分散液を調製した。
【０１２７】
【表５】
0004787818.tif 000019
【０１２８】
調製した蛍光剤を含むＳＵＶ分散液０．２ｍＬと蛍光剤を含まないＳＵＶ分散液１．８ｍＬとを室温下で混合した。各３検体を調製した。そのうちの各２検体にＣＤＭＴ（メタノール中３００ｍＭ）を１０．８μＬ（２５当量）または２１．７μＬ（５０当量）ずつ加え、室温で静置する。残り１つは対照実験としてメタノールを２１．７μＬ加え、同様に静置し、一定時間毎に蛍光を測定した。結果を図５に示す。
【０１２９】
この実施例８の蛍光希釈法の場合、実施例７の混合法とは異なり、Ｆ値は融合が進行するに従い小さくなる。図５に示すように、ＣＤＭＴを加えた場合のみ蛍光の減弱が見られ、膜融合が誘起されていることが強く示唆された。なお、図５に示すグラフでは、初期状態でＣＤＭＴを加えたものと対照との間に差があるように見える。しかし、これは、ＣＤＭＴの添加後２時間で大きな蛍光変化が見られたことを示しており、反応開始前の蛍光には差はなかった。
【０１３０】
［実施例９：ＳＵＶの融合に伴う粒子径の変化］
脂肪酸塩として、ラウリン酸ナトリウムおよびオレイン酸ナトリウムの２種を用いて実験を行った。
【０１３１】
上記実施例６に記載のＳＵＶの調製法に準じて、表６に示す組成でＳＵＶ分散液を調製した。
【０１３２】
【表６】
0004787818.tif 000020
【０１３３】
調製したＳＵＶ分散液を、０．４５μｍポアフィルターで濾過し、２ｍＬずつ各２検体に分け、一方にはＣＤＭＴ（メタノール中３００ｍＭ）２１．７μＬ（５０当量）を加え、そしてもう一方には対照実験としてメタノールを２１．７μＬ加え、室温で静置した。３時間後の粒径をＤＬＳにより測定した。結果を表７に示す。
【０１３４】
【表７】
0004787818.tif 000021
【０１３５】
いずれも３時間程度で顕著に粒子径が増大した。粒子径の変化より、ラウリン酸では十数個程度、そしてオレイン酸では３０〜４０個程度のＳＵＶが融合していることが示唆された。
【０１３６】
［実施例１０：透過型電子顕微鏡によるＳＵＶの観察］
上記実施例６に記載のＳＵＶの調製法に準じて、表８に示す組成でＳＵＶ分散液を調製した。
【０１３７】
【表８】
0004787818.tif 000022
【０１３８】
調製したＳＵＶ分散液を２００μＬ取り、ＣＤＭＴ（メタノール中３００ｍＭ）４．３μＬを加えて、室温で静置した。対照実験としてＣＤＭＴの代わりにメタノールを４．３μＬ加えて、室温で静置した。静置後のＳＵＶ分散液をキャリアに数滴搭載し、液体窒素で凍結させ、当業者が通常行う凍結割断法によって、電子顕微鏡試料（レプリカ）を調製した（ＪＥＯＬ  ＪＦＤ−９０１０を使用した）。得られた試料を、ＴＥＭ（ＪＥＯＬ  ＪＥＭ−１０１０）で観察した（加速電圧１００ｋｖ）。電子顕微鏡写真を図６〜８に示す。写真中の矢印は、ＳＵＶを示す。
【０１３９】
ＣＤＭＴを加えた場合、粒子径は、ＣＭＤＴ添加前には数十〜約１００ｎｍであったが（図６）、ＣＤＭＴ添加後には１μｍ以上にまで極めて大きくなり、そして粒子数が著しく減少していた（図７）。これは、互いに近接しているＳＵＶ同士が数千個融合し巨大なＧＵＶになったと考えられる。一方、メタノールのみを加えた場合は、１日以上経過しても、粒子径や分布にあまり変化が見られなかった（図８）。
【０１４０】
［実施例１１：活性化ＳＵＶと不活性ＳＵＶとの融合実験］
膜の構成成分として脂肪酸塩とアミンを含みそして脱水縮合によって活性化されるＳＵＶ（以下、活性化ＳＵＶという）および通常のＳＵＶ（以下、不活性ＳＵＶという）について、上記実施例６に記載のＳＵＶの調製法に準じて、以下の表９に示す組成で蛍光剤を含むＳＵＶ分散液および蛍光剤を含まないＳＵＶ分散液をそれぞれ調製した。
【０１４１】
【表９】
0004787818.tif 000023
【０１４２】
上記実施例８に記載の蛍光希釈法に従って、調製した蛍光剤を含むＳＵＶ分散液０．２ｍＬと蛍光剤を含まないＳＵＶ分散液１．８ｍＬとを室温下で混合した。ここで、ＳＵＶの組み合わせは、蛍光剤を含む活性化ＳＵＶと蛍光剤を含まない活性化ＳＵＶとの組み合わせ（ｒｕｎ１）、蛍光剤を含む不活性ＳＵＶと蛍光剤を含まない活性化ＳＵＶとの組み合わせ（ｒｕｎ２）、蛍光剤を含む活性化ＳＵＶと蛍光剤を含まない不活性ＳＵＶとの組み合わせ（ｒｕｎ３）、ならびに蛍光剤を含む不活性ＳＵＶと蛍光剤を含まない不活性ＳＵＶとの組み合わせの４種類とした。次に、ＣＤＭＴ（メタノール中３００ｍＭ）を１５．２μＬ（４．５５μｍｏｌ：ｒｕｎ１の全脂肪酸塩の３５当量）加え、室温で放置して蛍光光度計によりＦ値の経時変化を測定した。結果を図９に示す。
【０１４３】
図９からわかるように、一方が不活性なＳＵＶであってもＦ値が有意に変化した（ｒｕｎ２および３）。同じＳＵＶ同士の融合では、理論上、蛍光変化は起きないので、このＦ値の減少は、活性化ＳＵＶと不活性ＳＵＶとの融合が起きたことを示している。活性化ＳＵＶが少ない場合（ｒｕｎ３）の方がＦ値の変化量が小さいのは、１回の融合によってＳＵＶの不安定性が解消され、それ以上の融合が進行しなくなり、蛍光剤が十分に希釈されなかったためと考えられる。一方、ＳＵＶのうち９０％が活性化ＳＵＶの場合（ｒｕｎ２）は、融合が多段階生じ、蛍光剤が十分に希釈されたため、Ｆ値の変化が大きく現れたと考えられる。
【０１４４】
［実施例１２：融合に伴うＳＵＶ内水相のリーキングの検討］
膜融合をＤＤＳや遺伝子導入などに用いるには、リポソーム内容物がターゲット細胞の内部にうまく導入されなければならない。融合がもし膜の部分的な崩壊を伴う場合、大量の内容物が外部へ漏れ出てしまい、この目的を果たすことができなくなり、その応用性が限られる。そこで、融合の際の内容物のリーキング実験を行った。
【０１４５】
以下に示すカルセイン（Ｃａｌｃｅｉｎ）という蛍光色素は、高濃度では自己消光し蛍光を発しないが、低濃度では蛍光を発する。
【０１４６】
【化１３】
0004787818.tif 000024
【０１４７】
そこで、本実施例では、この性質を利用し、内部（内水相）に予め高濃度のカルセインを入れたリポソームの融合実験を行った。融合に伴って内容物の漏れ出しが起きれば、外水相で希釈されたカルセインの蛍光が現れるが、漏れ出しが起きなければ蛍光は変化しない。
【０１４８】
ＳＵＶの調製は実施例６に記載の方法に従って行った。ただし、リン酸緩衝液（５ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４／Ｎａ２ＨＰＯ４，０．１５Ｍ  ＮａＣｌ，ｐＨ８）にカルセインを入れ（７５ｍＭ）、超音波処理によってＳＵＶとした。ゲル濾過（Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−５０、移動相に同じリン酸緩衝液を使用）によってＳＵＶを分離し、外水相に存在するカルセインを除去し、ＳＵＶ分散液を得た。
【０１４９】
得られたＳＵＶ分散液にＣＤＭＴ（５０当量）を添加後、室温で放置し、一定時間経過後に蛍光（５２０ｎｍ）を測定し（ＦＳ）、直後にＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（１０％，２００μＬ）を添加してＳＵＶを破壊した後、再び蛍光を測定した（ＦＴ）。膜融合を伴わない対照実験は、同じＳＵＶを用いて、ＣＤＭＴを添加せずに、一定時間毎に蛍光を測定し、最後にＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を添加してリポソームを破壊し、蛍光を測定した。以下の式に従って漏出率を算出した。
【０１５０】
【数２】
0004787818.tif 000025
【０１５１】
得られた結果を、以下の表１０に示す。
【０１５２】
【表１０】
0004787818.tif 000026
【０１５３】
表１０からわかるように、ＣＤＭＴを添加して膜融合した場合、融合がほぼ完了する３時間までで漏出率に若干の増加が見られたものの（対照実験が２％に対し、融合した場合には８％）、蛍光強度（ＦＳ）は測定直後にＴｒｉｔｏｎＸ−１００を添加した時の蛍光（ＦＴ）と比べて非常に小さく、内容物がほとんど漏出していないことが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【０１５４】
本発明の方法によれば、脱水縮合反応を利用して分子集合体を形成している脂質を化学的に変化させて、その物理的性質や形態を変化させ、膜融合などの相転移のタイミングなどを調節することが可能であり得る。すなわち、二分子膜ベシクルにおいて分子集合体の相転移を誘起させることが可能になり、リポソームなどの水界面の分子集合体の融合や分裂を誘起できる。また、本発明の二分子膜ベシクルは、活性化状態または準安定状態のベシクルを提供し得る。さらに、リポソームなどの膜融合の際に、その内容物も融合可能である。したがって、本発明の方法および二分子膜ベシクルは、脱水縮合反応を利用する有機合成化学や界面化学の分野、あるいはリポソームなどのベシクルを利用する分野などにおける研究に有用である。また、細胞や細胞内小器官の形成、分解、分裂、または融合などの生物における形態変化に関する研究のためのモデル系として、エンドサイトーシスやエキソサイトーシスを伴う生物学的機構の解明のために、あるいは遺伝子治療やドラッグデリバリーシステムなどの治療医学の開発にも有用である。
【図１】
0004787818.tif 000030
【図２】
0004787818.tif 000031
【図３】
0004787818.tif 000032
【図４】
0004787818.tif 000033
【図５】
0004787818.tif 000034
【図６】
0004787818.tif 000035
【図７】
0004787818.tif 000036
【図８】
0004787818.tif 000037
【図９】
0004787818.tif 000038