(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
バレンセンをクロレラ属に属する単細胞藻類又はその処理物で処理してヌートカトンに変換することによりヌートカトンを製造することを特徴とするヌートカトンの製造方法。
【請求項２】
ヒドロキシバレンセンをクロレラ属に属する単細胞藻類又はその処理物で処理してヌートカトンに変換することによりヌートカトンを製造することを特徴とするヌートカトンの製造方法。
【請求項３】
クロレラ属に属する単細胞藻類がクロレラ・フスカ・バール・バキュオレータ（Chlorella fusca var. vacuolata）である請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項４】
クロレラ属に属する単細胞藻類がクロレラ・ピレノイドーサ（Chlorella pyrenoidosa）である請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項５】
クロレラ・フスカ・バール・バキュオレータがIAM C-28株
（FERM P-18498）である請求項３に記載の製造方法。
【請求項６】
クロレラ・ピレノイドーサがIAM C-101株である請求項４に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、バレンセン又はヒドロキシバレンセンをクロレラ属に属する単細胞藻類又はその処理物で処理してヌートカトンに変換することによりヌートカトンを製造することを特徴とするヌートカトンの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、各種食品材料、食品添加物、飲食品、香粧品類、保健衛生材料等の多様化に伴い、これらに用いる香料として従来にない新しい要望が高まり、嗜好性の高いユニークな香気を有した香料物質の開発が要求されてきている。特に香料の中でも最も需要の高いシトラスフルーツ系香料や食品系香料に関して、安全性の面からも天然化合物若しくは天然化合物由来の物質を原料とし、酵素や培養細胞等による生化学的変換反応によって得られる香料材料の開発が強く望まれていた。
次式
【０００３】
【化１】
0004746224.tif 000002
で表されるヌートカトンは重要な香料材料の一つであるが、天然においては、代表的にはグレープフルーツ油中に約１％以下しか含有されておらず、天然物から得られる精製品は非常に高価である。そこで、製品の安全性や化学合成による反応剤の使用及び大量の溶媒等の廃棄などの製造上の環境保全等を考慮し、天然物を原料とした酵素反応や生物による変換反応を利用して得られるヌートカトンの開発が待ち望まれ、従来から種々の製造方法が検討されている。
また、ヌートカトンは鏡像異性体間でその香気強度が大きく異なっており、天然と同じ絶対構造を有するヌートカトンの価値は非常に高いものである。
【０００４】
このような状況において、従来から天然物であるバレンセンを原料とし、生化学的反応を利用することにより天然物と同じ絶対構造を有するヌートカトンを製造する方法が報告されている。
【０００５】
例えば、バレンセンを原料とし、腸内細菌であるエンテロバクターを用いてヌートカトンを製造する方法（DRAGOCO REP.20巻,251頁,1974年）、バレンセンを原料とし、ロドコッカス属の微生物を用いてヌートカトンを製造する方法（特開平6-303,967号公報）、或いはバレンセンを原料とし、シトラス細胞懸濁培地を用いて生物変換反応によりヌートカトンを製造する方法（Plant Cell Report, ３巻, 37頁,1984年）等が報告されているが、これらの方法によればヌートカトンへの変換効率が低く、工業的に望ましいものとは言い難い。また、最近、ラッカラーゼ触媒酸化や酵素酸化反応によってバレンセンをバレンセンヒドロパーオキサイドへ変換した後、このヒドロパーオキサイドを分解してヌートカトンを得る方法が報告されている（特表平11-501,052号、特開2001-103,989号）が、コストや収率の問題などの点から未だ望ましいものではない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上述した種々の問題点を解決することを目的とし、収率が高く、かつ、光学活性選択性の点からも工業的実用化に適し、さらに安全性や製造上の環境保全をも考慮した、天然物であるバレンセン又はヒドロキシバレンセンからヌートカトンを安価に製造する方法を提供するものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、緑藻植物門緑藻網クロロコッカス目オエキスティス科クロレラ属の単細胞藻類を用いて変換を行うことによって、バレンセン又はヒドロキシバレンセンからヌートカトンを製造することが可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は、バレンセンをクロレラ属に属する単細胞藻類又はその処理物で処理してヌートカトンに変換することによりヌートカトンを製造することを特徴とするヌートカトンの製造方法である。
【０００９】
また、ヒドロキシバレンセンをクロレラ属に属する単細胞藻類又はその処理物で処理してヌートカトンに変換することによりヌートカトンを製造することを特徴とするヌートカトンの製造方法である。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明について更に詳細に説明する。
本発明の製造方法において、基質として用いられるバレンセン又はヒドロキシバレンセンは、グレープフルーツ、オレンジ、バレンシアオレンジ等の柑橘類の精油から単離・精製したものを用いることができるが、特にこれらに限定されるものではない。ヒドロキシバレンセンには二種類のジアステレオマー、２−（Ｓ）−ヒドロキシバレンセン及び２−（Ｒ）−ヒドロキシバレンセンが存在するが、本発明の製造方法にはいずれのヒドロキシバレンセンをも使用することができ、所望によりこれらの混合物を用いてもよい。また、ヒドロキシバレンセンは、上記のような柑橘類からの単離・精製の他に、化学的方法によっても取得され得る。例えば、バレンセンを化学的酸化することにより得ることが可能である。また、例えば、ヌートカトンをNaBH4−CeCl3還元することによって２−（Ｓ）−ヒドロキシバレンセンを得ることができ、さらに、２−（Ｓ）−ヒドロキシバレンセンの光延反応によって２−（Ｒ）−ヒドロキシバレンセンを得ることができる。ただし、これらの方法により入手されるものに限定されるものではない。
バレンセン又はヒドロキシバレンセンの純度は、３０％以上が好ましく、５０％以上が特に好適である。
【００１１】
本発明の方法においては、緑藻植物門緑藻網クロロコッカス目オエキスティス科クロレラ属の単細胞藻類を使用する。該藻類としては、現在２０を超える種が確認されており、本発明の方法ではいずれの藻類も使用可能である。そのうち、特に、クロレラ・フスカ・バール・バキュオレータ（Chlorella fusca var. vacuolata）、クロレラ・ピレノイドーサ（Chlorella pyrenoidosa）、クロレラ・ブルガリス（Chlorella vulgaris）等が望ましい。これらの藻類は自然界にも広く分布しており、自然界より分離取得することが可能であるが、例えば、財団法人応用微生物学研究奨励会から入手可能なクロレラ・フスカ・バール・バキュオレータ IAM C-28株、クロレラ・ピリノイドーサ IAM C-101株が利用でき、クロレラ・フスカ・バール・バキュオレータ IAM C-28株は、日本国茨城県つくば市東1丁目1番地１  中央第６  独立行政法人産業技術研究所  特許生物寄託センターにFERM P-18498という受託番号で寄託されている。
【００１２】
本発明の方法における変換は、これらのクロレラ属の単細胞藻類を用いて行う。該変換は、基本的には、単細胞藻類又はその処理物によって原料のバレンセン又はヒドロキシバレンセンをヌートカトンに変換する方法であれば、特に限定されない。なお、ここで、藻類の処理物とは、該藻類の摩砕物、粗酵素又は精製酵素などの抽出物、培養物、凍結乾燥物、固定化菌体等の該藻類に種々の処理を施したものを意味する。本発明の変換を行う具体的な方法としては、(1)該藻類の培養物にバレンセン又はヒドロキシバレンセンを添加する方法、(2)バレンセン又はヒドロキシバレンセン含有培地で該藻類を培養する方法、(3)該藻類の固定化菌体にバレンセン又はヒドロキシバレンセンを接触させる方法、(4)該藻類の摩砕物にバレンセン又はヒドロキシバレンセンを接触させる方法、(5)該藻類の抽出酵素液にバレンセン又はヒドロキシバレンセンを接触させる方法、等がある。
【００１３】
例えば、該藻類の培養物にバレンセン又はヒドロキシバレンセンを添加する方法は、以下のようにして実施することができる。
培養培地としては、クロレラ属の単細胞藻類が培養可能なものであるならば何ら限定されるものではないが、例えば、Noro培地 (T. Noro, Jpn. J. Phycol., 26, 69-72 (1978))等が用いられる。培養は、０〜１０，０００ルックスの光照射下において行うのが好ましいが、該藻類の増殖が認められる限りは、その光照射条件に限定されるものではない。培養は、静置培養、振盪培養、通気攪拌培養等を行うことができ、培養温度は２０〜３０℃、ｐＨは４〜８が好ましい。このうち、特に好ましくは、２５℃、ｐＨ４〜８である。培養日数は変換に必要な細胞数に至るまでの期間が必要とされ、通常は５〜２０日前後であるが、特にこれに限定されるものではない。
【００１４】
本発明の変換の反応は、上記のように増殖させたクロレラ属の単細胞藻類の培養物に変換の基質となるバレンセン又はヒドロキシバレンセンを添加し、さらなる培養を行うことによって達成することができる。添加するバレンセン又はヒドロキシバレンセンは、その純度や増殖させたクロレラ属の単細胞藻類の種類及びその細胞数によって変化するが、例えば、クロレラ属の単細胞藻類24mg（wet weight）/mlを含む培養物50mlに対し、バレンセン又はヒドロキシバレンセンを100mg以上添加することができる。さらに、界面活性剤等の使用によりその添加量を増やすことも可能である。バレンセン又はヒドロキシバレンセンは、固体又は液体の形状で添加することができ、その添加全量は、一段階又は二段階以上の多段階、もしくは連続的に加えることができる。
【００１５】
変換の反応を行う培養は、静置培養、振盪培養、通気攪拌培養等のいずれの条件下においても実施可能であるが、反応速度の点から振盪培養が好ましく、具体的には0〜100rpmでの実施が適当である。また、反応温度は20〜30℃、ｐＨは４〜８が好ましい。変換の反応は基質バレンセン又はヒドロキシバレンセンの添加とともに開始されるが、その反応時間は、バレンセンの場合には５〜18日、ヒドロキシバレンセンの場合には１〜３日が好ましく、特に、バレンセンでは４〜10日、ヒドロキシバレンセンでは１〜２日が好ましい。
【００１６】
上記のような方法において、クロレラ属に属する単細胞藻類の変換によって得られた反応生成物のヌートカトンは、一般の有機化合物の分離・精製において公知の方法、例えば、濾過、抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィー等の手段、或いはこれらの組み合わせによって培養液から回収、精製することができる。
本発明により得られたヌートカトンは、各種食品、食品添加物、飲食品、香粧品類、保険衛生材料等の香料材料として有用である。
【００１７】
【実施例】
以下に実施例を挙げ、本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。
なお、実施例中において物性の測定に用いた装置は次の通りである。
【００１８】
１）化学純度
ガスクロマトグラフ；HP-5890（Hewlett Packard社製）
カラム；DB-17（0.25ｍｍ×30ｍ）（J&W社製）
注入口温度250℃、昇温プログラムは初期温度50℃から250℃まで5℃/min.,
キャリヤーガスはヘリウム（1ml/min.）で行った。
【００１９】
２）核磁気共鳴スペクトル
1Ｈ−ＮＭＲ；Mercury-300型（300ＭＨｚ）（Varian社製）
13Ｃ−ＮＭＲ；Mercury-300型（75ＭＨｚ）（Varian社製）
３）赤外吸収スペクトル（ＩＲ）
FTIR-410型（日本分光株式会社製）
【００２０】
４）質量スペクトル（ＭＳ）：
質量選択検出器付ガスクロマトグラフ；HP-5890/HP5973（Hewlett Packard社製）
カラム；DB-17（0.25ｍｍ×30ｍ）（J&W社製）
５）旋光度
DIP-1000（日本分光株式会社製）
【００２１】
［実施例１］バレンセンのクロレラ・フスカ・バール・バキュオレータによるヌートカトンへの変換反応（少量培養実験）
表１に示す塩化ナトリウムを除いたNoro培地 （T. Noro, Jpn. J. Phycol., 26, 69-72 (1978)） 50mlを100ml三角フラスコに入れ、滅菌後、クロレラ・フスカ・バール・バキュオレータ IAM C-28株を50mg（wet weight）植菌し、光照射下（約3000 lux）で生育させた。
【００２２】
【表１】
0004746224.tif 000003
【００２３】
7〜10日間回転培養(100rpm)した後、基質であるバレンセン（[α]D20 +96.5゜(c=0.99, CHCl3)は純度95％以上 (GC-MSより)）を約20mg添加した。反応の経時的変化は、24時間ごとに一定量の培養液をエクストレルートに採取し、エーテルにて溶出した後、エーテル抽出物についてGC-MS分析 (Hewlett-Packard capillary GC/MS system, Model HP-5890; DB-17 column)を行うことにより確認した。培養反応18日目に反応を止め、培養液を吸引ろ過によりろ過し、そのろ液にエーテル50mlx2回を加え、スターラーで12時間抽出した。そのエーテル層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、ろ過し、10℃の低温でロータリーエバポレーターを用いて減圧濃縮することによって残査（14mg）が得られた。図１に残査（エーテル抽出物）のＧＣ−ＭＳ分析結果を示す。その結果、61.3％の純度のヌートカトンが得られていることが確認できた。さらにシリカゲルを用いるTLC分取（へキサン−酢酸エチル＝4：1）を行い、純度95％以上のヌートカトン（8.2mg；バレンセンからの収率は38.37％）が得られた。図２にＴＬＣ分取を行って得られたヌートカトンのＧＣ−ＭＳ分析結果を示す。
【００２４】
得られたヌートカトンの比旋光度 （[α]D20 +192.5゜(c=0.41, CHCl3)）は、標品のヌートカトンの比旋光度 （[α]D20 +195.5゜(c=1.5, CHCl3)）と一致した。またMSスペクトル、IRスペクトル、1H NMRスペクトル、13C NMR スペクトルのデータについても図３、図４、図５、図６に示したが、各データは生薬ヤクチから得られた標品のスペクトルデータと完全に一致した。
【００２５】
［実施例２］バレンセンのクロレラ・フスカ・バール・バキュオレータによるヌートカトンへの変換反応（大量培養実験）
クロレラ・フスカ・バール・バキュオレータ IAM C-28株の培養は実施例1と同様な方法で行い、基質であるバレンセンを3.000 g を1.5 Lの培養液に添加し、18日間培養した。その培養ろ液はエーテル（1L）を用いるソックスレー抽出器で連続抽出し、エーテル抽出物（2.0264g；回収率2.0264g／3.000gx100＝約68%）が得られた。そのエーテル抽出物についてGC−MS分析を行い、そのデータを図7に示した。その結果、得られたヌートカトンは62.3％の純度であることがわかった。また、エーテル抽出物の一部 (1.5419 g) をｎ−ヘキサン−エーテル系溶媒で、エーテルの比率を増大しながらシリカゲル (100g; Merck社製70〜230 mesh)カラムクロマトグラフィーに付し、50% ｎ−ヘキサン−50% エーテル系溶媒による溶出を行い、ヌートカトン (581.6 mg；バレンセンからの収率は23.84％) が得られた。なお、純度は図８に示すGC-MS分析の結果、96.67％であった。また、文献値の比旋光度 [α]D20 +195.5゜(c=1.5, CHCl3)であるのに対し、得られたヌートカトンの比旋光度は [α]D20 +191.2゜(c=1.11, CHCl3)であった。
【００２６】
［実施例３］２−（Ｓ）−ヒドロキシバレンセンおよび２−（Ｒ）−ヒドロキシバレンセンのクロレラ・フスカ・バール・バキュオレータによるヌートカトンへの変換反応
２−（Ｓ）−ヒドロキシバレンセン20mgを添加した50ml Noro培地、及び、２−（Ｒ）−ヒドロキシバレンセン20 mgを添加した50ml Noro培地について、各々、実施例１と同様な条件で培養したクロレラ・フスカ・バール・バキュオレータ IAM C-28株を用いて変換を行ったところ、培養後1〜2日目で、100％の変換率で純度95％以上のヌートカトンが得られた。
【００２７】
［実施例４］バレンセンのクロレラ・ピレノイドーサによるヌートカトンへの変換反応（少量培養実験）
前記表１に示す塩化ナトリウムを除いたNoro培地 50mlを100ml三角フラスコに入れ、滅菌後、クロレラ・ピレノイドーサ IAM C-101株を50mg/50ml（wet weight）植菌し、光照射下（約3000 lux）で生育させた。7〜10日間回転培養(100rpm)した後、基質であるバレンセン([α]D20 +96.5゜(c=0.99, CHCl3)は純度95％以上 (GC-MSより))１gを1 L培地に添加した。反応の経時的変化は24時間ごとに２mlの培養液をエクストレルートに採取し、エーテルにて溶出した後、エーテル抽出物のGC-MS分析 (Hewlett-Packard capillary GC/MS system, Model HP-5890; DB-17 column)を行うことにより確認した。培養反応４日目のGC-MSの分析結果により、それぞれ、面積比で52％のヌートカトンが得られた。
【００２８】
【発明の効果】
本発明の方法は、ヌートカトンが公知の従来技術に比べて高収率、高選択的に得られ、工業的に適している。また、本発明の方法は、副生成物の生成も極めて少なく、非常に効率の良い製法である。さらに、本発明の方法によって得られるヌートカトンは、従来の方法によって得られるヌートカトンに比べて純度も高く、香気においても大変優れているので、各種食品、食品添加物、飲食品、香粧品類、保険衛生材料等の香料材料として、幅広い範囲で利用に供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】少量培養実験におけるエーテル抽出物のＧＣ−ＭＳ分析結果を示す図である。
【図２】少量培養実験におけるＴＬＣ分取により得られたヌートカトンのＧＣ−ＭＳ分析結果を示す図である。
【図３Ａ】少量培養実験において得られたヌートカトンのＭＳスペクトルを示す図である。
【図３Ｂ】ヌートカトンの標品のＭＳスペクトルを示す図である。
【図４Ａ】少量培養実験において得られたヌートカトンのＩＲスペクトルを示す図である。
【図４Ｂ】ヌートカトンの標品のＩＲスペクトルを示す図である。
【図５Ａ】少量培養実験において得られたヌートカトンの1Ｈ ＮＭＲスペクトル（CDCl3）を示す図である。
【図５Ｂ】ヌートカトンの標品の1Ｈ ＮＭＲスペクトル（CDCl3）を示す図である。
【図６Ａ】少量培養実験において得られたヌートカトンの13Ｃ ＮＭＲスペクトル（CDCl3）を示す図である。
【図６Ｂ】ヌートカトンの標品の13Ｃ ＮＭＲスペクトル（CDCl3）を示す図である。
【図７】大量培養実験において得られたエーテル抽出物のＧＣ−ＭＳ分析結果を示す図である。
【図８】大量培養実験において得られたシリカゲルカラムクロマトグラフィー溶出物のＧＣ−ＭＳ分析結果を示す図である。
【図１】
0004746224.tif 000004
【図２】
0004746224.tif 000005
【図３Ａ】
0004746224.tif 000006
【図３Ｂ】
0004746224.tif 000007
【図４Ａ】
0004746224.tif 000008
【図４Ｂ】
0004746224.tif 000009
【図５Ａ】
0004746224.tif 000010
【図５Ｂ】
0004746224.tif 000011
【図６Ａ】
0004746224.tif 000012
【図６Ｂ】
0004746224.tif 000013
【図７】
0004746224.tif 000014
【図８】
0004746224.tif 000015