(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（II）
【化１】
0004716067.tif 000029
［式（II）中、Ｙ1は疎水性基を示す。]で示されるホスホリルコリン基を有する界面活性剤、ホスホリルコリン基を除くカチオン性基を有する界面活性剤及びＣ−反応性蛋白質に対する抗体を用いて、Ｃ−反応性蛋白質を測定することを特徴とするＣ−反応性蛋白質の測定方法。
【請求項２】
式（II）で表される化合物が、リゾホスファチジルコリンカプロイル、リゾホスファチジルコリンミリストイル、リゾホスファチジルコリンパルミトイル、リゾホスファチジルコリンステアロイル、大豆由来リゾホスファチジルコリン、ホスファチジルコリンジブチロイル、ホスファチジルコリンジカプロイル、ホスホリルコリンオレイルオキシエチルエステル、スフィンゴシルホスホリルコリンから選ばれる１種又は２種以上の化合物であることを特徴とする請求項１記載のＣ−反応性蛋白質の測定方法。
【請求項３】
カチオン性基を有する界面活性剤が、アンモニウム塩の界面活性剤であることを特徴とする請求項１及び２のいずれか１項に記載のＣ−反応性タンパク質の測定方法。
【請求項４】
アンモニウム塩の界面活性剤が、一般式（III）
【化２】
0004716067.tif 000030
［式（III）中、Ｙ2は疎水性基を示し、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3は同一又は異なってもよく、水素、置換もしくは非置換アルキル、又は置換もしくは非置換アルケニルを示し、Ｘ2-は無機性陰イオン又は有機性陰イオンを示す。］で示される化合物である請求項３記載のＣ−反応性蛋白質の測定方法。
【請求項５】
式（III）で表される化合物が、オクタデシルトリメチルアンモニウムクロライド、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムクロライド、テトラデシルトリメチルアンモニウムクロライド、ドデシルトリメチルアンモニウムクロライドから選ばれる１種又は２種以上の化合物であることを特徴とする請求項４記載のＣ−反応性蛋白質の測定方法。
【請求項６】
Ｃ−反応性蛋白質に対する抗体が、水不溶性担体に担持されていることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載のＣ−反応性蛋白質の測定方法。
【請求項７】
不溶性担体が、ポリスチレン系ラテックスであることを特徴とする請求項６記載のＣ−反応性蛋白質の測定方法。
【請求項８】
一般式（II）
【化３】
0004716067.tif 000031
［式（II）中、Ｙ1は疎水性基を示す。]で示されるホスホリルコリン基を有する界面活性剤、ホスホリルコリン基を除くカチオン性基を有する界面活性剤及びＣ−反応性蛋白質に対する抗体を含有することを特徴とするＣ−反応性蛋白質測定用試薬。
【請求項９】
式（II）で表される化合物が、リゾホスファチジルコリンカプロイル、リゾホスファチジルコリンミリストイル、リゾホスファチジルコリンパルミトイル、リゾホスファチジルコリンステアロイル、大豆由来リゾホスファチジルコリン、ホスファチジルコリンジブチロイル、ホスファチジルコリンジカプロイル、ホスホリルコリンオレイルオキシエチルエステル、スフィンゴシルホスホリルコリンから選ばれる１種又は２種以上の化合物であることを特徴とする請求項８記載のＣ−反応性蛋白質測定用試薬。
【請求項１０】
カチオン性基を有する界面活性剤がアンモニウム塩の界面活性剤であることを特徴とする請求項８及び９のいずれか１項に記載のＣ−反応性蛋白質測定用試薬。
【請求項１１】
アンモニウム塩の界面活性剤が、一般式（III）
【化４】
0004716067.tif 000032
［式（III）中、Ｙ2は疎水性基を示し、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3は同一又は異なってもよく、水素、置換もしくは非置換アルキル、又は置換もしくは非置換アルケニルを示し、Ｘ2-は無機性陰イオン又は有機性陰イオンを示す。］で示される化合物であることを特徴とする請求項１０記載のＣ−反応性蛋白質測定用試薬。
【請求項１２】
式（III）で表される化合物が、オクタデシルトリメチルアンモニウムクロライド、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムクロライド、テトラデシルトリメチルアンモニウムクロライド、ドデシルトリメチルアンモニウムクロライドから選ばれる１種又は２種以上の化合物であることを特徴とする請求項１１記載のＣ−反応性蛋白質測定用試薬。
【請求項１３】
Ｃ−反応性蛋白質に対する抗体が、水不溶性担体に担持されていることを特徴とする請求項８〜１２のいずれか１項に記載のＣ−反応性蛋白質測定用試薬。
【請求項１４】
不溶性担体が、ポリスチレン系ラテックスであることを特徴とする請求項１３に記載のＣ−反応性蛋白質測定用試薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、Ｃ−反応性蛋白質測定用試薬及び測定方法、詳しくは、ホスホリルコリン基とカチオン性基とを有する化合物及びＣ−反応性蛋白質に対する抗体を含有するＣ−反応性蛋白質測定用試薬、並びに該試薬を用いてＣ−反応性蛋白質を測定するＣ−反応性蛋白質の測定方法や、ホスホリルコリン基を有する界面活性剤、カチオン性基を有する界面活性剤及びＣ−反応性蛋白質に対する抗体を含有するＣ−反応性蛋白質測定用試薬、並びに該試薬を用いてＣ−反応性蛋白質を測定するＣ−反応性蛋白質の測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
急性相反応物質の一つであるＣ−反応性蛋白質（C-reactive protein）は、各種の感染症、炎症性疾患及び組織破壊をきたす疾患の診断や経過観察のマーカーとして、臨床検査の分野ではよく測定されている項目の一つとなっている。かかるＣ−反応性蛋白質の測定法としては、Ｃ−反応性蛋白質と特異的に結合する抗体もしくは抗血清を用いて、毛細管法、一次元免疫拡散法、免疫比濁法、ラテックス免疫比濁法等で測定する方法が知られている。これらの測定方法は、抗原であるＣ−反応性蛋白質と抗体が結合すると大きな凝集体となることを利用して、この凝集を検出することにより行うものである。
【０００３】
例えば、ラテックス免疫比濁法では、抗体を担持（感作）させた粒径０．１〜１μｍ程度のポリスチレンラテックス等の担体を用い、対応する抗原により抗原抗体反応を起こさせると、反応液中の散乱光は増加し、透過光は減少するので、この変化を吸光度あるいは積分球濁度として検出することによりＣ−反応性蛋白質を測定することができる。しかし、これら抗原抗体反応による凝集を観察する方法においては、プロゾーン現象と呼ばれる問題が生起することも知られている。かかるプロゾーン現象とは、抗原量が抗体量に比して高濃度になるに従い、逆に濁度が減少する現象をいう。この結果、測定すべき試料中に抗原が高濃度に存在するにもかかわらず、抗原が低濃度であるという誤った結果がもたらされることになる。このプロゾーン現象を回避するには、測定すべき試料を希釈するか、あるいは測定に使用する抗体を増加して再度測定を行うこと等が必要であるが、操作が煩雑となる。
【０００４】
ホスホリルコリンはカルシウムイオンの存在下にＣ−反応性蛋白質と特異的に結合し、凝集体を形成することが知られている［J. Immunol., 124, 1396(1980)］。また、Ｃ−反応性蛋白質の精製を、ｐ−ニトロフェニルホスホリルコリンセファロース４Ｂカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより行うことが知られている［検査と技術，24(5), 409(1996)］。そしてまた、Ｃ−反応性蛋白質の定量方法として、ホスファチジルコリン、コレステロール、塩化コリン、カルシウム等を含有する試薬を用いる方法(特開昭５２−１２３２９５号公報)や、ホスホリルコリン基を結合した高分子を含有する試薬を用いる方法、及びホスホリルコリン基を結合した高分子とＣ−反応性蛋白質に対する特異抗体とを含有する試薬を用いる方法（特開昭６２−２５９０６３号公報）が知られている。また、積分球濁度により検出を行うラテックス試薬を用いるＣ−反応性蛋白質の測定方法としては、例えば協和メデックス社のＣ−反応性蛋白質用ラテックス試薬（エクステルＣＲＰ  ＥＬ−１２００用）を用いる方法が知られている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、プロゾーン現象を回避して高濃度のＣ−反応性蛋白質を含む検体を希釈せずに測定する方法及びそれに用いる試薬を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究し、（Ａ）ホスホリルコリン基とカチオン性基とを有する化合物及びＣ−反応性蛋白質に対する抗体を用いると、あるいは、（Ｂ）ホスホリルコリン基を有する界面活性剤、カチオン性基を有する界面活性剤及びＣ−反応性蛋白質に対する抗体を用いると、検体中のＣ−反応性蛋白質を測定しうること、また高濃度のＣ−反応性蛋白質を含む検体であっても、希釈することなくプロゾーン現象を回避して検体中のＣ−反応性蛋白質を測定しうることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち本発明は、一般式（II）
【化７】
0004716067.tif 000002
［式（II）中、Ｙ1は疎水性基を示す。]で示されるホスホリルコリン基を有する界面活性剤、ホスホリルコリン基を除くカチオン性基を有する界面活性剤及びＣ−反応性蛋白質に対する抗体を用いて、Ｃ−反応性蛋白質を測定することを特徴とするＣ−反応性蛋白質の測定方法（請求項１）に関する。
【０００８】
また本発明は、式（II）で表される化合物が、リゾホスファチジルコリンカプロイル、リゾホスファチジルコリンミリストイル、リゾホスファチジルコリンパルミトイル、リゾホスファチジルコリンステアロイル、大豆由来リゾホスファチジルコリン、ホスファチジルコリンジブチロイル、ホスファチジルコリンジカプロイル、ホスホリルコリンオレイルオキシエチルエステル、スフィンゴシルホスホリルコリンから選ばれる１種又は２種以上の化合物であることを特徴とする請求項１記載のＣ−反応性蛋白質の測定方法（請求項２）に関する。
【０００９】
また本発明は、カチオン性基を有する界面活性剤が、アンモニウム塩の界面活性剤であることを特徴とする請求項１及び２のいずれか１項に記載のＣ−反応性タンパク質の測定方法（請求項３）や、アンモニウム塩の界面活性剤が、一般式（III）
【化８】
0004716067.tif 000003
［式（III）中、Ｙ2は疎水性基を示し、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3は同一又は異なってもよく、水素、置換もしくは非置換アルキル、又は置換もしくは非置換アルケニルを示し、Ｘ2-は無機性陰イオン又は有機性陰イオンを示す。］で示される化合物である請求項３記載のＣ−反応性蛋白質の測定方法（請求項４）や、式（III）で表される化合物が、オクタデシルトリメチルアンモニウムクロライド、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムクロライド、テトラデシルトリメチルアンモニウムクロライド、ドデシルトリメチルアンモニウムクロライドから選ばれる１種又は２種以上の化合物であることを特徴とする請求項４記載のＣ−反応性蛋白質の測定方法（請求項５）や、Ｃ−反応性蛋白質に対する抗体が、水不溶性担体に担持されていることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載のＣ−反応性蛋白質の測定方法（請求項６）や、不溶性担体が、ポリスチレン系ラテックスであることを特徴とする請求項６記載のＣ−反応性蛋白質の測定方法（請求項７）に関する。
【００１０】
そしてまた本発明は、一般式（II）
【化９】
0004716067.tif 000004
［式（II）中、Ｙ1は疎水性基を示す。]で示されるホスホリルコリン基を有する界面活性剤、ホスホリルコリン基を除くカチオン性基を有する界面活性剤及びＣ−反応性蛋白質に対する抗体を含有することを特徴とするＣ−反応性蛋白質測定用試薬（請求項８）に関する。
【００１１】
また本発明は、式（II）で表される化合物が、リゾホスファチジルコリンカプロイル、リゾホスファチジルコリンミリストイル、リゾホスファチジルコリンパルミトイル、リゾホスファチジルコリンステアロイル、大豆由来リゾホスファチジルコリン、ホスファチジルコリンジブチロイル、ホスファチジルコリンジカプロイル、ホスホリルコリンオレイルオキシエチルエステル、スフィンゴシルホスホリルコリンから選ばれる１種又は２種以上の化合物であることを特徴とする請求項８記載のＣ−反応性蛋白質測定用試薬（請求項９）や、カチオン性基を有する界面活性剤がアンモニウム塩の界面活性剤であることを特徴とする請求項８及び９のいずれか１項に記載のＣ−反応性蛋白質測定用試薬（請求項１０）アンモニウム塩の界面活性剤が、一般式（III）
【化１０】
0004716067.tif 000005
［式（III）中、Ｙ2は疎水性基を示し、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3は同一又は異なってもよく、水素、置換もしくは非置換アルキル、又は置換もしくは非置換アルケニルを示し、Ｘ2-は無機性陰イオン又は有機性陰イオンを示す。］で示される化合物であることを特徴とする請求項１０記載のＣ−反応性蛋白質測定用試薬（請求項１１）や、式（III）で表される化合物が、オクタデシルトリメチルアンモニウムクロライド、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムクロライド、テトラデシルトリメチルアンモニウムクロライド、ドデシルトリメチルアンモニウムクロライドから選ばれる１種又は２種以上の化合物であることを特徴とする請求項１１記載のＣ−反応性蛋白質測定用試薬（請求項１２）や、Ｃ−反応性蛋白質に対する抗体が、水不溶性担体に担持されていることを特徴とする請求項８〜１２のいずれか１項に記載のＣ−反応性蛋白質測定用試薬（請求項１３）や、不溶性担体が、ポリスチレン系ラテックスであることを特徴とする請求項１３に記載のＣ−反応性蛋白質測定用試薬（請求項１４）に関する。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明のＣ−反応性蛋白質の測定方法は、ホスホリルコリン基とホスホリルコリン基を除くカチオン性基とを有する化合物及びＣ−反応性蛋白質に対する抗体を用いて、Ｃ−反応性蛋白質を測定することを特徴とする測定方法（以下、「本発明のＣ−反応性蛋白質の測定方法（Ａ）」という）と、ホスホリルコリン基を有する界面活性剤、カチオン性基を有する界面活性剤及びＣ−反応性蛋白質に対する抗体を用いて、Ｃ−反応性蛋白質を測定することを特徴とする測定方法（以下、「本発明のＣ−反応性蛋白質の測定方法（Ｂ）」という）から構成され、また、本発明のＣ−反応性蛋白質測定用試薬は、ホスホリルコリン基とホスホリルコリン基を除くカチオン性基とを有する化合物及びＣ−反応性蛋白質に対する抗体を含有することを特徴とする試薬（以下、「本発明のＣ−反応性蛋白質測定用試薬（Ａ）」という）と、ホスホリルコリン基を有する界面活性剤、カチオン性基を有する界面活性剤及びＣ−反応性蛋白質に対する抗体を含有することを特徴とする試薬（以下、「本発明のＣ−反応性蛋白質測定用試薬（Ｂ）」という）から構成される。
【００１３】
本発明のＣ−反応性蛋白質の測定方法（Ａ）やＣ−反応性蛋白質測定用試薬（Ａ）におけるホスホリルコリン基とホスホリルコリン基を除くカチオン性基とを有する化合物としては、少なくとも一対のホスホリルコリン基とホスホリルコリン基を除くカチオン性基とを同一分子内に有する化合物であれば、いかなる化合物でも用いることができるが、ホスホリルコリン基とホスホリルコリン基を除くカチオン性基とを同一分子中に複数有する化合物がプロゾーン現象を充分に回避しうる点からして好ましく、例えば油脂、炭水化物、蛋白質、多糖類、核酸といった天然化合物にこれら二つの基を導入して製造した合成化合物や、合成化合物にこれら二つの基を導入して製造した合成化合物や、これらの基を別々に含有する化合物を合成により結合させて製造した合成化合物等を挙げることができる。また、本発明におけるホスホリルコリン基とホスホリルコリン基を除くカチオン性基とを有する化合物の分子量としては、特に制限されないが、プロゾーン現象を充分に回避しうる点からして５００〜５，０００，０００が好ましく、１，０００〜１，０００，０００がより好ましく、５，０００〜１００，０００が特に好ましい。
【００１４】
上記ホスホリルコリン基とホスホリルコリン基を除くカチオン性基とを有する化合物におけるカチオン性基としては、ホスホリルコリン基を除く正の電荷をもつ基であれば特に制限されるものではないが、一般式（Ｉ）［式（Ｉ）中、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は、同一又は異なってもよく、水素、置換もしくは非置換アルキル、又は置換もしくは非置換アルケニルを示し、Ｘ1-は無機性陰イオン又は有機性陰イオンを示す。］で表されるカチオン性基がプロゾーン現象を充分に回避しうる点からして好ましい。
【００１５】
【化１１】
0004716067.tif 000006
【００１６】
一般式（Ｉ）におけるアルキルとしては、直鎖又は分岐状の、好ましくは炭素数１〜２４のアルキル、より好ましくは炭素数１〜１２のアルキル、特に好ましくは炭素数１〜６のアルキルを挙げることができ、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル等を具体的に例示することができ、また、アルケニルとしては、直鎖又は分岐状の、好ましくは炭素数２〜２４のアルケニル、より好ましくは炭素数２〜１２のアルケニル、特に好ましくは炭素数２〜６のアルケニルを挙げることができ、ビニル、アリル、２−ブテニル、２−ペンテニル、２−ヘキセニル等を具体的に例示することができる。また、置換アルキル及び置換アルケニルの置換基としては、例えばアルコキシ、アルカノイル、アルカノイルオキシ、アルケニルオキシ、アルケノイル、アルケノイルオキシ、アロイル、置換もしくは非置換フェニル、置換もしくは非置換のナフチル等を例示することができ、アルコキシ、アルカノイル及びアルカノイルオキシのアルキル部分はそれぞれ前記のアルキルと同意義である。また、アルケニルオキシ、アルケノイル及びアルケノイルオキシのアルケニル部分はそれぞれ前記のアルケニルと同意義である。アロイルとしては、ベンゾイル、ナフトイル等を挙げることができる。そして、置換フェニル、置換ナフチルの置換基としては、アルキル、アルケニル等を挙げることができ、アルキル、アルケニルはそれぞれ前記アルキル、アルケニルと同意義である。
無機性陰イオンとしては、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素等のハロゲン、硝酸等無機酸の陰イオンなどを挙げることができる。有機性陰イオンとしては、ギ酸、酢酸等の有機カルボン酸イオン等を挙げることができる。
【００１７】
天然化合物や合成化合物にホスホリルコリン基及びカチオン性基を導入する方法としては、従来公知の方法、例えば天然化合物や合成化合物の水酸基、カルボキシル基、アミノ基等の官能基と、ホスホリルコリン基及びカチオン性基を有する化合物に公知の方法により導入した官能基とを反応させる方法を挙げることができ、かかるホスホリルコリン基及びカチオン性基に導入する官能基としては、例えば天然化合物及び合成化合物のもつ上記の官能基と結合するものであればよく、水酸基、アミノ基、カルボキシル基、アルデヒド基等を例示することができる。
【００１８】
ホスホリルコリン基を有する化合物とカチオン性基を有する化合物とを合成により結合させて製造する方法としては特に制限がなく、ホスホリルコリン基を有する化合物及びカチオン性基を有する化合物を単量体として、付加重合等により高分子化させて製造することができる。かかる単量体としては、ホスホリルコリン基とビニル基とを有する化合物及びカチオン性基とビニル基とを有する化合物や、ホスホリルコリン基もしくはカチオン性基を有するジオール化合物及びカチオン性基もしくはホスホリルコリン基を有するジカルボン酸化合物や、ホスホリルコリン基もしくはカチオン性基を有するジアミン化合物及びカチオン性基もしくはホスホリルコリン基を有するジカルボン酸化合物等を例示することができるが、特に、ホスホリルコリン基とビニル基とを有する化合物及びカチオン性基とビニル基とを有する化合物を高分子化させて製造する方法が分子量又は組成比を制御しやすい点で好ましい。
【００１９】
上記ホスホリルコリン基とビニル基とを有する単量体としては、共重合が可能なものであれば特に限定されるものではなく、例えば、２−アクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（以下、ＭＰＣと略す）、２−（メタ）アクリロイルオキシエトキシエチルホスホリルコリン、６−（メタ）アクリロイルオキシヘキシルホスホリルコリン、１０−（メタ）アクリロイルオキシエトキシノニルホスホリルコリン、アリルホスホリルコリン、ブテニルホスホリルコリン、ヘキセニルホスホリルコリン、オクテニルホスホリルコリン、デセニルホスホリルコリン等を具体的に挙げることができる。また、これら単量体は、例えば、特開昭５４−６３２５号公報、特開昭５８−１５４５９１号公報に示された公知の方法等によって製造することができる。
【００２０】
上記カチオン性基とビニル基とを有する単量体としては、ラジカル重合が可能なものであれば特に限定されるものではなく、例えば、［３−（メタクリロイルオキシアミノ）プロピル］トリメチルアンモニウムクロライド、［３−（アクリロイルオキシアミノ）プロピル］トリメチルアンモニウムクロライド、［２−（メタクリロイルオキシ）エチル］トリメチルアンモニウムクロライド、［２−（アクリロイルオキシ）エチル］トリメチルアンモニウムクロライド、２−ヒドロキシ−３−メタクリロイルオキシプロピルトリメチルアンモニウムクロライド（以下、ＱＡと略す）、２−ヒドロキシ−３−アリロイルオキシプロピルトリメチルアンモニウムクロライド等を具体的に挙げることができる。また、これら単量体は、一般試薬として入手することが可能である。
【００２１】
ホスホリルコリン基とビニル基とを有する単量体と、カチオン性基とビニル基とを有する単量体の組合せは特に限定されるものではないが、前述のＭＰＣとＱＡとの組合せがプロゾーン現象を充分に回避しうる点からして好ましい。また、ホスホリルコリン基とビニル基とを有する単量体と、カチオン性基とビニル基とを有する単量体を高分子化させるときには、他のラジカル重合可能なビニル基を有する単量体を混合して用いることもできる。かかる他のラジカル重合可能なビニル基を有する単量体としては、例えば、（メタ）アクリル酸メチル、（メタ）アクリル酸エチル、（メタ）アクリル酸−ｎ−ブチル、（メタ）アクリル酸イソブチル、（メタ）アクリル酸ペンチル、（メタ）アクリル酸ヘキシル、（メタ）アクリル酸ヘプチル、（メタ）アクリル酸オクチル、（メタ）アクリル酸トリデシル、２−ヒドロキシエチルメタクリレート等の（メタ）アクリル酸エステル；スチレン、α−メチルスチレン、メチル核置換スチレン、クロロ置換スチレン等のスチレン系単量体；塩化ビニル、塩化ビニリデン、エチレン、プロピレン、イソブチレン等の置換もしくは非置換の炭化水素系単量体；エチルビニルエーテル、ｎ−ブチルビニルエーテル等のビニルエーテル系単量体等を挙げることができる。
【００２２】
本発明に用いられるホスホリルコリン基とビニル基とを有する単量体、カチオン性基とビニル基とを有する単量体、及び必要に応じて用いられる他のラジカル重合可能なビニル基を有する単量体を含む組成物を重合させる方法としては、例えば、特開平９−３１３２号公報、特開平８−３３３４２１号公報、特開平１１−３５６０５号公報等に記載された公知の重合方法等を挙げることができる。具体的には、重合温度３０〜１５０℃、重合時間２〜７２時間の条件でラジカル重合させる方法等により重合することができる。また、ラジカル重合反応における開始剤としては、２，２′−アゾビス（２−メチルプロピオノアミヂン）二塩酸塩、４，４′−アゾビス（４−シアノ吉草酸）、２，２′−アゾビス［２−（５−メチル−２−イミダゾリン−２−イル）プロパン］二塩酸塩、２，２′−アゾビスイソブチルアミド二水和物、２，２′−アゾビスイソブチロニトリル、過硫酸アンモニウム、過硫酸カリウム、過酸化ベンゾイル、ジイソプロピルペルオキシジカーボネート、ｔｅｒｔ−ブチルペルオキシ−２−エチルヘキサノエート、ｔｅｒｔ−ブチルペルオキシピバレート、ｔｅｒｔ−ブチルペルオキシジイソブチレート、過酸化ラウロイル、アゾビスイソブチロニトリル、２，２′−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）、ｔｅｒｔ−ブチルペルオキシネオデカノエート、又はこれら混合物等を挙げることができる。また、重合溶媒としては、水、エタノール、メタノール、イソプロパノール、ｔｅｒｔ−ブタノール、ベンゼン、トルエン、ジメチルホルムアミド、テトラヒドロフラン、クロロホルム及びこれらの混合物等を例示することができる。
【００２３】
前記ＭＰＣとＱＡとを重合させる際には、重合性などの点から、重合開始剤として２，２′−アゾビス（２−メチルプロピオノアミヂン）二塩酸塩を用いることが好ましく、その使用量としては、単量体成分１００重量部に対して０．０１〜１０重量部が好ましく、０．１〜５重量部がより好ましい。また、ＭＰＣとＱＡの重合溶媒としては、溶解性や重合性などの点から、水、エタノールが特に好ましい。また、重合体の精製は、再沈殿法、透析法、限外濾過法など一般的な精製方法により行うことができる。
【００２４】
本発明で用いられる重合体の分子量は特に限定されないが、好ましくは５００〜５，０００，０００、より好ましくは１，０００〜１，０００，０００、特に好ましくは５，０００〜１００，０００である。この分子量は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）を用いて分析し、ポリエチレングリコール換算した値として示されている。また、ホスホリルコリン基を有する単量体及びカチオン性基を有する単量体を構成単位として含む共重合体中におけるカチオン性基のモル含量率は、ホスホリルコリン基に対し１〜９５％が好ましく、５〜９０％がより好ましく、１０〜３０％が特に好ましい。
【００２５】
本発明のＣ−反応性蛋白質の測定方法(Ａ)やＣ−反応性蛋白質測定用試薬(Ａ)を用いたＣ−反応性蛋白質の測定は、ホスホリルコリン基とカチオン性基とを有する化合物及びＣ−反応性蛋白質に対する抗体を、反応液中でＣ−反応性蛋白質を含む被測定検体と接触させることにより行われる。かかる反応液としては、水性媒体であれば特に制限がないが、緩衝液が好ましい。緩衝液としては、グリシン緩衝液、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液等を例示することができる。また、反応液には、塩化カルシウム等のカルシウムイオンを加えるとプロゾーン回避効果が高まり測定範囲が拡大するので好ましい。カルシウムイオン濃度としては、例えば１〜２０ｍｍｏｌ／Ｌが好ましく、２〜１０ｍｍｏｌ／Ｌがより好ましい。Ｃ−反応性蛋白質測定の反応液中のホスホリルコリン基及びカチオン性基を有する化合物濃度は特に限定されないが、０．０００１〜１重量％が好ましく、０．００５〜０．５重量％がより好ましく、０．０１〜０．１重量％が特に好ましい。ホスホリルコリン基及びカチオン性基を有する重合体は、上記の様に比較的僅かな添加量でもプロゾーン回避及び測定範囲の拡大に効果を発揮する。
【００２６】
本発明のＣ−反応性蛋白質の測定方法(Ｂ)やＣ−反応性蛋白質測定用試薬(Ｂ)におけるホスホリルコリン基を有する界面活性剤としては、ホスホリルコリン基を有し、かつ界面活性を示す物質であればどのような物質をも用いることができるが、一般式（II）［式（II）中、Ｙ1は疎水性基を示す。］で表される界面活性剤がプロゾーン現象を充分に回避しうる点からして好ましい。
【００２７】
【化１２】
0004716067.tif 000007
【００２８】
一般式（II）で表される界面活性剤における疎水性基としては、ホスホリルコリン基の親水性に対し、疎水性を示す基であれば特に制限されるものではないが、炭化水素を基本とする基を挙げることができ、置換もしくは非置換のアルキル、又は置換もしくは非置換のアルケニルを具体的に例示することができる。式（II）におけるアルキルとしては、直鎖又は分岐状の、好ましくは炭素数１〜３０のアルキル、より好ましくは炭素数２〜２４のアルキル、特に好ましくは炭素数３〜２０のアルキルを挙げることができ、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ドデシル、ペンタデシル、エイコシル等を具体的に例示することができ、また、アルケニルとしては、直鎖又は分岐状の、好ましくは炭素数２〜２４のアルケニル、より好ましくは炭素数３〜１２のアルケニル、特に好ましくは炭素数３〜６のアルケニルを挙げることができ、ビニル、アリル、２−ブテニル、２−ペンテニル、２−ヘキセニル等を具体的に例示することができる。また、置換アルキル及び置換アルケニルの置換基としては、アルコキシ、アルカノイル、アルカノイルオキシ、アルケニルオキシ、アルケノイル、アルケノイルオキシ、アロイル、ヒドロキシ、置換もしくは非置換アミノ、置換もしくは非置換フェニル、置換もしくは非置換のナフチル等を例示することができ、アルコキシ、アルカノイル及びアルカノイルオキシのアルキル部分はそれぞれ前記のアルキルと同意義であり、また、アルケニルオキシ、アルケノイル及びアルケノイルオキシのアルケニル部分はそれぞれ前記のアルケニルと同異義である。アロイルとしては、ベンゾイル、ナフトイル等を挙げることができる。そして、置換アミノの置換基としては、アルキル、アルケニル等があげられ、置換フェニルおよび置換ナフチルの置換基としては、ヒドロキシ、アルキル、アルケニル等を挙げることができ、ここで、アルキル、アルケニルはそれぞれ前記アルキル、アルケニルと同意義である。
【００２９】
上記本発明における式（II）で表される界面活性剤としては、疎水性基として、炭素数２〜２４のアルキルもしくはアルケニル（ホスホリルコリン基と該アルキルもしくはアルケニルの間に、オキシメチレニル、オキシエチレニル、オキシプロピレニルを有する場合も含む）、アシル鎖の炭素数が４〜２４の１位もしくは２位のモノグリセリド、同一又は異なっていてもよいアシル鎖の炭素数が４〜２４のジグリセリド、又はスフィンゴシン構造を有する界面活性剤が好ましく、リゾホスファチジルコリンカプロイル、リゾホスファチジルコリンミリストイル、リゾホスファチジルコリンパルミトイル、リゾホスファチジルコリンステアロイル、大豆由来リゾホスファチジルコリンなどのリゾホスファチジルコリン（リゾレシチン）や、ホスファチジルコリンジブチロイル、ホスファチジルコリンジカプロイル等のアシル鎖長の短いホスファチジルコリン、ホスホリルコリンオレイルオキシエチルエステル、スフィンゴシルホスホリルコリン等を具体的に例示することができる。
【００３０】
本発明のＣ−反応性蛋白質の測定方法（Ｂ）やＣ−反応性蛋白質測定用試薬（Ｂ）におけるカチオン性基を有する界面活性剤としては、ホスホリルコリン基を除くカチオン性基を有し、かつ界面活性を示す物質であればどのような物質をも用いることができるが、アンモニウム塩の界面活性剤が好ましく、一般式（III）［式（III）中、Ｙ2は疎水性基を示し、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3は同一又は異なってもよく、水素、置換もしくは非置換アルキル、又は置換もしくは非置換アルケニルを示し、Ｘ2-は無機性陰イオン又は有機性陰イオンを示す。］で表される界面活性剤がプロゾーン現象を充分に回避しうる点からして特に好ましい。
【００３１】
【化１３】
0004716067.tif 000008
【００３２】
一般式（III）における疎水性基Ｙ2としては、カチオン性基の親水性に対し、疎水性を示す基であれば特に制限されるものではないが、炭化水素を基本とする基を挙げることができ、置換もしくは非置換のアルキル、又は置換もしくは非置換のアルケニルを具体的に例示することができ、上記アルキルとしては、直鎖又は分岐状の、好ましくは炭素数１〜３０のアルキル、より好ましくは炭素数２〜２４のアルキル、特に好ましくは炭素数３〜２０のアルキルを挙げることができ、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ドデシル、ペンタデシル、エイコシル等を具体的に例示することができ、また、アルケニルとしては、直鎖又は分岐状の、好ましくは炭素数２〜２４のアルケニル、より好ましくは炭素数３〜１２のアルケニル、特に好ましくは炭素数３〜６のアルケニルを挙げることができ、ビニル、アリル、２−ブテニル、２−ペンテニル、２−ヘキセニル等を具体的に例示することができる。また、置換アルキル及び置換アルケニルの置換基としては、アルコキシ、アルカノイル、アルカノイルオキシ、アルケニルオキシ、アルケノイル、アルケノイルオキシ、アロイル、ヒドロキシ、置換もしくは非置換アミノ、置換もしくは非置換フェニル、置換もしくは非置換のナフチル等を例示することができ、アルコキシ、アルカノイル及びアルカノイルオキシのアルキル部分はそれぞれ前記のアルキルと同意義であり、また、アルケニルオキシ、アルケノイル及びアルケノイルオキシのアルケニル部分はそれぞれ前記のアルケニルと同異義である。アロイルとしては、ベンゾイル、ナフトイル等を挙げることができる。そして、置換アミノの置換基としては、アルキル、アルケニル等があげられ、置換フェニルおよび置換ナフチルの置換基としては、ヒドロキシ、アルキル、アルケニル等を挙げることができ、ここで、アルキル、アルケニルはそれぞれ前記アルキル、アルケニルと同意義である。
【００３３】
Ｒ1、Ｒ2及びＲ3におけるアルキルとしては、直鎖又は分岐状の、好ましくは炭素数１〜１２のアルキル、より好ましくは炭素数１〜６のアルキルを挙げることができ、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル等を具体的に例示することができ、また、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3におけるアルケニルとしては、直鎖または分岐状の、好ましくは炭素数２〜１２のアルケニル、より好ましくは炭素数３〜６のアルケニルを挙げることができ、ビニル、アリル、２−ブテニル、２−ペンテニル、２−ヘキセニル等を具体的に例示することができる。また、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3における置換アルキル及び置換アルケニルの置換基としては、アルコキシ、アルカノイル、アルカノイルオキシ、アルケニルオキシ、アルケノイル、アルケノイルオキシ、アロイル、ヒドロキシ、置換もしくは非置換のアミノ、置換もしくは非置換フェニル、置換もしくは非置換のナフチル等を例示することができ、アルコキシ、アルカノイル及びアルカノイルオキシのアルキル部分はそれぞれ前記のＲ1、Ｒ2及びＲ3のアルキルと同意義であり、また、アルケニルオキシ、アルケノイル及びアルケノイルオキシのアルケニル部分はそれぞれ前記のＲ1、Ｒ2及びＲ3のアルケニルと同意義である。アロイルとしては、ベンゾイル、ナフトイル等を挙げることができる。そして、置換アミノの置換基としては、アルキル、アルケニル等を挙げることができ、置換フェニルおよび置換ナフチルの置換基としては、ヒドロキシ、アルキル、アルケニル等を挙げることができる。ここで、アルキル、アルケニルはそれぞれ前記アルキル、アルケニルと同意義である。
無機性陰イオンとしては、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素等のハロゲン、硝酸等無機酸の陰イオン等を挙げることができる。有機性陰イオンとしては、ギ酸、酢酸等の有機カルボン酸イオン等を挙げることができる。
【００３４】
また、上記カチオン性基を有する界面活性剤としては、オクタデシルトリメチルアンモニウムクロライド、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムクロライド、テトラドデシルトリメチルアンモニウムクロライド、ドデシルトリメチルアンモニウムクロライドなどの長鎖アルキルアンモニウム塩や、ヘキサデシルアミン酢酸塩、オクタデシルアミン塩酸塩などの長鎖アルキルアミン塩や、アルキルピリジニウム塩等を具体的に例示することができる。
【００３５】
ホスホリルコリン基を有する界面活性剤とカチオン性基を有する界面活性剤の組合せは任意であるが、ホスホリルコリン基を有する界面活性剤の疎水性基とカチオン性基を有する界面活性剤の疎水性基の鎖長が同程度のものを用いることがプロゾーン現象を充分に回避しうる点からして好ましい。例えば、前者におけるアシル鎖の炭素数が１６のリゾホスファチジルコリンパルミトイルと、後者におけるアルキル鎖の炭素数が１６のヘキサデシルトリメチルアンモニウムクロライド、あるいは前者におけるアシル鎖の炭素数が１８のリゾホスファチジルコリンステアロイルと、後者におけるアルキル鎖の炭素数が１８のオクタデシルトリメチルアンモニウムクロライド等の組合せが好ましい。
【００３６】
ホスホリルコリン基を有する界面活性剤及びカチオン性基を有する界面活性剤は、Ｃ−反応性蛋白質測定反応液中の濃度が、それぞれ０．０００１〜５重量％、好ましくは０．００１〜１重量％、より好ましくは０．０１〜０．５重量％になる量を用いることが望ましい。また、ホスホリルコリン基を有する界面活性剤とカチオン性基を有する界面活性剤のモル比率は任意であるが、１：１０〜５：１０程度が好ましい。
【００３７】
本発明におけるＣ−反応性蛋白質に対する抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれでもよく、これら抗体としては、市販品又は公知の方法により調製した抗体を用いることができる。また、Ｃ−反応性蛋白質に対する抗体は水不溶性担体に担持（感作）されているものを使用するのが好ましい。水不溶性担体としてはラテックス特にポリスチレン系ラテックスが、抗体を担持させることが容易なことから好ましい。かかる水不溶性担体の粒径としては、０．１〜１μｍのものが好ましい。抗体の水不溶性担体への担持は、公知の感作方法により行うことができる。使用する抗体の濃度については特に制限がないが、単独でＣ−反応性蛋白質を測定できる濃度が好ましい。
【００３８】
本発明のＣ−反応性蛋白質の測定方法（Ａ）は、ホスホリルコリン基とカチオン性基とを有する化合物及びＣ−反応性蛋白質に対する抗体を用いて、Ｃ−反応性蛋白質を測定することを特徴とする抗原抗体反応を利用する測定方法であり、また、本発明のＣ−反応性蛋白質の測定方法（Ｂ）は、ホスホリルコリン基を有する界面活性剤、カチオン性基を有する界面活性剤及びＣ−反応性蛋白質に対する抗体を用いて、Ｃ−反応性蛋白質を測定することを特徴とする抗原抗体反応を利用する測定方法である。これらの抗原抗体反応を利用する測定方法としては、公知の免疫比濁法、ラテックス免疫比濁法、ゼラチン凝集反応、リポソーム免疫測定法、蛍光免疫測定法、酵素免疫測定法等いかなる測定方法も使用できるが、プロゾーン現象を充分に回避しうる点からしてラテックス免疫比濁法が好ましい。ラテックスとしては、ポリスチレン系が好ましく、また該ラテックスの粒径としては、０．１〜１μｍのものが好ましい。これらの方法は、所定量の抗体感作ラテックス懸濁液と所定量の緩衝液及び濃度が既知である標準液又は被測定検体の一定量を加えて充分に攪拌した後、積分球式濁度計を用いて所定時間間隔における濁度変化による積分球式濁度変化量（ΔＩＳＴ値）や、吸光度測定計を用いて所定時間間隔における吸光度変化量（ΔｍＡｂｓ．値）を測定することにより行うことができる。
【００３９】
本発明のＣ−反応性蛋白質測定用試薬（Ａ）は、ホスホリルコリン基とカチオン性基を有する化合物及びＣ−反応性蛋白質に対する抗体を含有することを特徴とし、また、本発明のＣ−反応性蛋白質測定用試薬（Ｂ）は、ホスホリルコリン基を有する界面活性剤、カチオン性基を有する界面活性剤及びＣ−反応性蛋白質に対する抗体を含有することを特徴とするが、これら化合物及び抗体のほか、各種界面活性剤、無機塩類、緩衝液等を含有していてもよい。界面活性剤としては、例えばトリトンＸ−１００、ツイーン２０等を、無機塩としては例えば塩化カルシウムなどのカルシウム塩等を、緩衝液としてはグリシン緩衝液、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液等を、それぞれ例示することができる。Ｃ−反応性蛋白質測定用試薬中の界面活性剤、無機塩類及び緩衝液の含量は、反応液中の濃度がそれぞれ０．００１〜０．１重量％、特に１〜７ｍｍｏｌ／Ｌ、０．１〜１０ｍｍｏｌ／Ｌ及び１０〜２００ｍｍｏｌ／Ｌになる量が好ましい。
【００４０】
以上のように、本発明のＣ−反応性蛋白質の測定方法やＣ−反応性蛋白質測定用試薬を用いるＣ−反応性蛋白質の測定は、Ｃ−反応性蛋白質に対する抗体を用いて、Ｃ−反応性蛋白質を測定するものであるが、これらＣ−反応性蛋白質の測定方法やＣ−反応性蛋白質測定用試薬における抗体を抗原に置換、すなわちＣ−反応性蛋白質に対する抗体を、Ｃ−反応性蛋白質抗原に置換することにより、Ｃ−反応性蛋白質に対する抗体の測定方法やＣ−反応性蛋白質に対する抗体測定用試薬を提供することができる。上記Ｃ−反応性蛋白質抗原としては、Ｃ−反応性蛋白質自体又はＣ−反応性蛋白質のホスホリルコリン結合領域と抗Ｃ−反応性蛋白質のエピトープ部分とを含むペプチドを例示することができる。また、かかるＣ−反応性蛋白質抗原は、Ｃ−反応性蛋白質に対する抗体の場合と同様に、粒径０．１〜１μm程度のポリスチレンラテックス等の担体に担持させて用いることが好ましい。
【００４１】
そして、（ａ）ホスホリルコリン基とカチオン性基とを有する化合物及びＣ−反応性蛋白質抗原を用いるＣ−反応性蛋白質に対する抗体の測定方法や、ホスホリルコリン基とカチオン性基とを有する化合物及びＣ−反応性蛋白質抗原を含有するＣ−反応性蛋白質に対する抗体測定用試薬、あるいは、（ｂ）ホスホリルコリン基を有する界面活性剤、カチオン性基を有する界面活性剤及びＣ−反応性蛋白質抗原を用いるＣ−反応性蛋白質に対する抗体の測定方法や、ホスホリルコリン基を有する界面活性剤、カチオン性基を有する界面活性剤及びＣ−反応性蛋白質抗原を含有するＣ−反応性蛋白質に対する抗体測定用試薬においても、本発明のＣ−反応性蛋白質の測定方法やＣ−反応性蛋白質測定用試薬における場合と同様に、Ｃ−反応性蛋白質に対する抗体測定におけるプロゾーン現象の回避と、測定レンジの拡大ができ、検体中に高濃度のＣ−反応性蛋白質に対する抗体が含まれる場合であっても、検体を希釈することなく原液のまま定量することが可能となる。
【００４２】
【実施例】
以下、本発明を実施例、比較例及び参考例により、更に詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は、かかる実施例等により何ら制限を受けるものではない。
実施例Ａ−１
下記のＣ−反応性蛋白質測定試薬を調製した。
0004716067.tif 000009
【００４３】
比較例Ａ−１
下記のＣ−反応性蛋白質測定試薬を調製した。
0004716067.tif 000010
【００４４】
比較例Ａ−２
下記のＣ−反応性蛋白質測定試薬を調製した。
0004716067.tif 000011
【００４５】
比較例Ａ−３
0004716067.tif 000012
【００４６】
比較例Ａ−４
下記のＣ−反応性蛋白質測定試薬を調製した。
0004716067.tif 000013
【００４７】
実施例Ａ−２
下記のＣ−反応性蛋白質測定試薬を調製した。
0004716067.tif 000014
【００４８】
比較例Ａ−５
下記のＣ−反応性蛋白質測定試薬を調製した。
0004716067.tif 000015
【００４９】
実施例Ａ−３
下記のＣ−反応性蛋白質測定試薬を調製した。
0004716067.tif 000016
【００５０】
実施例Ａ−４
実施例Ａ−１と比較例Ａ−１〜Ａ−３で調製したＣ−反応性蛋白質測定用ラテックス試薬を用いて各濃度のＣ−反応性蛋白質を含む標準血清（０〜１００ｍｇ／ｄＬ）を、積分球濁度方式の専用機ＥＬ−１０６０（協和メデックス社製）で測定を行った。３７℃にて、それぞれ実施例Ａ−１と比較例Ａ−１〜Ａ−３の第１試薬１４８μＬ、第２試薬１５０μＬ、及びＣ−反応性蛋白質標準血清２μＬを混合後、７２秒と６１２秒の間（２３〜５３ポイント）の積分球濁度変化量を測定した。結果を図１に示す。なお図１中、横軸のＣＲＰはＣ−反応性蛋白質の濃度を示し、縦軸のΔＩＳＴは積分球式濁度の変化量を示す。
【００５１】
図１からもわかるように、比較例Ａ−１の試薬を用いて測定した場合（−◆−プロット）、比較例Ａ−２の試薬を用いて測定した場合（−■−プロット）、及び比較例Ａ−３の試薬を用いて測定した場合（−▲−）は、Ｃ−反応性蛋白質が１０ｍｇ／ｄＬ以上の濃度ではプロゾーンとなり、プロゾーン回避の効果は得られなかった。これに対して、実施例Ａ−１の試薬を用いて測定した場合(−●−)、少なくとも１００ｍｇ／ｄＬまでプロゾーンを回避することができた。なお、比較例Ａ−２の第１試薬中のポリマーを１０ｍｇ／Ｌ〜１ｇ／Ｌの特定の濃度にした試薬、及び比較例Ａ−３の第１試薬中のポリマーを１０ｍｇ／Ｌ〜１ｇ／Ｌの特定の濃度にした試薬を使用した場合でも、プロゾーンを回避することはできなかった。また、実施例Ａ−１の第１試薬中のポリマーを５ｍｇ／Ｌの濃度にした試薬も、プロゾーンが回避できることを確認した。
【００５２】
実施例Ａ−５
実施例Ａ−１、比較例Ａ−１及び比較例Ａ−４で調製したＣ−反応性蛋白質測定用ラテックス試薬を用い各濃度のＣ−反応性蛋白質を含む標準血清（０〜１００ｍｇ／ｄＬ）を、積分球濁度方式の専用機ＥＬ−１０６０で測定を行った。３７℃にて、それぞれ実施例Ａ−１、比較例Ａ−１及び比較例Ａ−４の第１試薬１４８μＬ、第２試薬１５０μＬ、及びＣ−反応性蛋白質標準血清２μＬを混合後、７２秒と２１６秒の間（２３〜３１ポイント）の積分球濁度変化量を測定した。結果を図２に示す。なお図２中、横軸のＣＲＰはＣ−反応性蛋白質の濃度を示し、縦軸のΔＩＳＴは積分球式濁度の変化量を示す。
【００５３】
図２からもわかるように、比較例Ａ−１の試薬で測定した場合（−●−プロット）、Ｃ−反応性蛋白質濃度１０ｍｇ／ｄＬ以上ではプロゾーンとなりΔＩＳＴ値は減少した。また、抗体を感作させていないラテックスのみを使用する比較例Ａ−４の試薬で測定した場合（−■−プロット）、ΔＩＳＴ値の増加は認められなかった。一方、実施例Ａ−１の試薬で測定した場合（−▲−プロット）、少なくともＣ−反応性蛋白質濃度１００ｍｇ／ｄＬまでプロゾーン現象が見られずにΔＩＳＴ値は濃度依存的に増加し、測定レンジが拡大した。これらの結果から、本発明の測定方法においては、ホスホリルコリン基とカチオン性基とを有する化合物とＣ−反応性蛋白質との反応による濁度上昇及びＣ−反応性蛋白質抗体とＣ−反応性蛋白質との反応による濁度上昇の相加効果によりプロゾーン現象が回避されたものではなく、Ｃ−反応性蛋白質との反応における、ホスホリルコリン基とカチオン性基とを有する化合物及びＣ−反応性蛋白質抗体の相乗効果によりプロゾーン現象が回避されるものと考えられる。
【００５４】
実施例Ａ−６
実施例Ａ−２及び比較例Ａ−５で調製したＣ−反応性蛋白質測定用ラテックス試薬を用い各濃度のＣ−反応性蛋白質を含む標準血清（０〜１００ｍｇ／ｄＬ）を、積分球濁度方式の専用機ＥＬ−１２００（協和メデックス社製）で測定を行った。３７℃にて、それぞれ実施例２及び比較例５の第１試薬２４８μＬ、第２試薬２５０μＬ、及びＣ−反応性蛋白質標準血清２μＬを混合後、１０８秒と２７０秒の間（６〜１５ポイント）の積分球濁度変化量を測定した。結果を図３に示す。なお図３中、横軸のＣＲＰはＣ−反応性蛋白質の濃度を示し、縦軸のΔＩＳＴは積分球式濁度の変化量を示す。
【００５５】
図３からもわかるように、比較例Ａ−５の試薬で測定した場合（−▲−）、Ｃ−反応性蛋白質が２０ｍｇ／ｄＬ以上の濃度ではプロゾーン現象によりΔＩＳＴ値は減少した。これに対して、実施例Ａ−２の試薬で測定した場合（−●−）、プロゾーンが１００ｍｇ／ｄＬまで回避され、定量性も大幅に向上した。なお、実施例Ａ−２の第１試薬のポリマー濃度を１０ｍｇ／Ｌの濃度とした試薬を用いて同様な効果が認められた。
【００５６】
実施例Ａ−７
実施例Ａ−３及び比較例５で調製したＣ−反応性蛋白質測定用ラテックス試薬を用い各濃度のＣ−反応性蛋白質を含む標準血清（０〜１００ｍｇ／ｄＬ）を、吸光度測定方式の自動分析装置７０７０（日立製作所製）で測定を行った。
３７℃にて、それぞれ実施例Ａ−３及び比較例Ａ−５の第１試薬２２５μＬ、第２試薬７５μＬ、及びＣ−反応性蛋白質標準血清３μＬを混合後１９ポイントと２７ポイントの間の吸光度変化量（波長５７０ｎｍ）を測定した。結果を図４に示す。なお図４中、横軸のＣＲＰはＣ−反応性蛋白質の濃度を示し、縦軸のΔｍＡｂｓ．は吸光度の変化量を示す。図４からもわかるように、比較例Ａ−５の試薬で測定した場合（−▲−）、Ｃ−反応性蛋白質が１０ｍｇ／ｄＬ以上の濃度ではプロゾーンとなり測定値は減少した。これに対して、実施例Ａ−３の試薬で測定した場合（−●−）、プロゾーンが少なくとも１００ｍｇ／ｄＬまで回避され、定量性も大幅に向上した。
【００５７】
実施例Ａ−８
下記のＣ−反応性蛋白質測定試薬を調製した。
0004716067.tif 000017
【００５８】
実施例Ａ−９
下記のＣ−反応性蛋白質測定試薬を調製した。
0004716067.tif 000018
【００５９】
実施例Ａ−１０
実施例Ａ−９及び比較例Ａ−１で調製したＣ−反応性蛋白質測定用ラテックス試薬を用い各濃度のＣ−反応性蛋白質を含む標準血清（０〜１００ｍｇ／ｄＬ）を吸光度測定方式の自動分析装置７０７０（日立製作所製）で測定を行った。３７℃にて、それぞれ実施例Ａ−９及び比較例Ａ−１の第１試薬２２５μＬ、第２試薬７５μＬ、及びＣ−反応性蛋白質標準血清３μＬを混合後１９ポイントと２７ポイントの間の吸光度変化量（波長５７０ｎｍ）を測定した。結果を図５に示す。なお図５中、横軸のＣＲＰはＣ−反応性蛋白質の濃度を示し、縦軸のΔｍＡｂｓ．は吸光度変化量を示す。図５からもわかるように、比較例Ａ−１の試薬で測定した場合（−▲−）、Ｃ−反応性蛋白質が１０ｍｇ／ｄＬ以上の濃度ではプロゾーンとなり測定値は減少した。これに対して、実施例Ａ−９の試薬で測定した場合（−●−）、プロゾーンは少なくとも１００ｍｇ／ｄＬまで回避され、定量性も大幅に向上した。
【００６０】
実施例Ｂ−１
下記のＣ−反応性蛋白質測定試薬を調製した。
0004716067.tif 000019
【００６１】
実施例Ｂ−２
下記のＣ−反応性蛋白質測定試薬を調製した。
0004716067.tif 000020
【００６２】
比較例Ｂ−１
下記のＣ−反応性蛋白質測定試薬を調製した。
0004716067.tif 000021
【００６３】
比較例Ｂ−２
下記のＣ−反応性蛋白質測定試薬を調製した。
0004716067.tif 000022
【００６４】
比較例Ｂ−３
0004716067.tif 000023
【００６５】
比較例Ｂ−４
下記のＣ−反応性蛋白質測定試薬を調製した。
0004716067.tif 000024
【００６６】
実施例Ｂ−３
下記のＣ−反応性蛋白質測定試薬を調製した。
0004716067.tif 000025
【００６７】
比較例Ｂ−５
下記のＣ−反応性蛋白質測定試薬を調製した。
0004716067.tif 000026
【００６８】
実施例Ｂ−４
下記のＣ−反応性蛋白質測定試薬を調製した。
0004716067.tif 000027
【００６９】
実施例Ｂ−５
下記のＣ−反応性蛋白質測定試薬を調製した。
0004716067.tif 000028
【００７０】
実施例Ｂ−６
実施例Ｂ−１〜Ｂ−２及び比較例Ｂ−１〜Ｂ−４で調製したＣ−反応性蛋白質測定用試薬を使用して各濃度のＣ−反応性蛋白質を含む血清溶液（Ｃ−反応性蛋白質濃度：０〜１００ｍｇ／ｄＬ）中のＣ−反応性蛋白質濃度を測定した。３７℃にて、第１試薬１４７μＬ、第２試薬１５０μＬ、及びＣ−反応性蛋白質標準血清３μＬを混合後、積分球濁度測定器ＥＬ−１０６０（協和メデックス社製）にて７２秒と２１６秒の間（２３〜３１ポイント）の積分球濁度変化量を測定した。
【００７１】
結果を図６に示す。なお、図６中、横軸のＣＲＰはＣ−反応性蛋白質の濃度を示し、縦軸のΔＩＳＴは積分球式濁度の変化量を示す。比較例Ｂ−１の試薬を用いて測定した場合（−×−）、Ｃ−反応性蛋白質が１０ｍｇ／ｄＬ以上の濃度ではプロゾーンとなった。また、比較例Ｂ−２の試薬を用いて測定した場合（−■−）、プロゾーンが回避される傾向が見られたが測定レンジの改善は認められなかった。比較例Ｂ−３の試薬を用いて測定した場合（−▲−）、プロゾーン回避の効果は得られなかった。比較例Ｂ−４の試薬を用いて測定した場合（−○−）、全く検出がでなかった。これに対して、実施例Ｂ−１の試薬を用いた場合（−◆−）、測定レンジが大幅に改善された。実施例Ｂ−２の試薬を用いて測定した場合（−●−）、少なくともプロゾーンが１００ｍｇ／ｄＬまで回避されかつ、定量性が大幅に向上した。
【００７２】
実施例Ｂ−７
実施例Ｂ−３及び比較例Ｂ−５で作製したＣ−反応性蛋白質測定用試薬を使用して各濃度のＣ−反応性蛋白質を含む血清溶液（Ｃ−反応性蛋白質濃度：０〜１００ｍｇ／ｄＬ）中のＣ−反応性蛋白質濃度を測定した。３７℃にて、第１試薬２２５μＬ、第２試薬７５μＬ、及びＣ−反応性蛋白質標準血清３μＬを混合後、吸光度測定方式の自動分析装置７０７０（日立社製）にて１９ポイントと２７ポイントの間の吸光度変化量（波長５７０ｎｍ）を測定した。
【００７３】
結果を図７に示す。なお図７中、横軸のＣＲＰはＣ−反応性蛋白質の濃度を示し、縦軸のΔｍＡｂｓ．（５７０ｎｍ）は５７０ｎｍの吸光度の変化量を示す。比較例Ｂ−５の試薬を用いて測定した場合（−▲−）、Ｃ−反応性蛋白質が５ｍｇ／ｄＬ以上の濃度ではプロゾーンとなり吸光度変化量は低下した。これに対して、実施例Ｂ−３の試薬を用いて測定した場合（−●−）、少なくとも１００ｍｇ／ｄＬまで吸光度変化量が低下せず、プロゾーンが回避され、定量性も大幅に向上した。
【００７４】
実施例Ｂ−８
実施例Ｂ−２、実施例Ｂ−４、実施例Ｂ−５及び比較例Ｂ−１で調製したＣ−反応性蛋白質測定用試薬を使用して各濃度のＣ−反応性蛋白質を含む血清溶液（Ｃ−反応性蛋白質濃度：０〜１００ｍｇ／ｄＬ）中のＣ−反応性蛋白質濃度を測定した。３７℃にて、第１試薬２２５μＬ、第２試薬７５μＬ、及びＣ−反応性蛋白質標準血清３μＬを混合後、吸光度測定方式の自動分析装置７０７０（日立社製）にて１９ポイントと２７ポイントの間の吸光度変化量（波長５７０ｎｍ）を測定した。
【００７５】
結果を図８に示す。なお図８中、横軸のＣＲＰはＣ−反応性蛋白質の濃度を示し、縦軸のΔｍＡｂｓ．は吸光度変化量を示す。比較例Ｂ−１の試薬を用いて測定した場合（−◆−）、Ｃ−反応性蛋白質が１０ｍｇ／ｄＬ以上の濃度ではプロゾーンとなり吸光度変化量は低下した。これに対して、実施例Ｂ−２の試薬を用いて測定した場合（−■−）、実施例Ｂ−４の試薬を用いて測定した場合（−▲−）、及び実施例Ｂ−５の試薬を用いて測定した場合（−×−）では、少なくとも１００ｍｇ／ｄＬまで吸光度変化量が低下せず、プロゾーンが回避され、定量性も大幅に向上した。
【００７６】
参考例１  （ＣＲＰ測定用ラテックス試薬の調製）
平均粒径１３０ｎｍのポリスチレンラテックス溶液（協和メデックス社製、１００ｍｇ／ｍＬ）０．８ｍＬとヤギ抗Ｃ−反応性蛋白質ポリクローナル抗体溶液（オリエンタル酵母社製、１０ｍｇ／ｍＬ、５０ｍＭリン酸−ＮａＣｌ  １５０ｍＭ  ｐＨ７．２）１ｍＬとを混合し、３７℃にて３０分間攪拌した。次に、牛血清アルブミン（ＢＳＡ、シグマ社製）溶液１ｍＬ（２０ｍｇ／ｍＬ、５０ｍＭリン酸−ＮａＣｌ  １５０ｍＭ  ｐＨ７．２）を添加して３７℃にて２時間攪拌を行いブロッキング処理を実施した。その後、遠心分離（５０，０００回転、３０分間）によりラテックスをペレット状に沈降させて上清を廃棄した後、３ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを含む５０ｍＭイミダゾール−塩酸溶液（ｐＨ７．８）１０ｍＬを添加し、よく攪拌した後、超音波破砕機により分散処理を行った。上記の操作を３回繰り返して行うことにより過剰に存在する抗体溶液の除去を行った。最終的にはラテックス濃度を１ｍｇ／ｍＬに調整し、Ｃ−反応性蛋白質測定用ラテックス試薬とした。この試薬は４℃で保存した。
【００７７】
参考例２
ヤギ抗Ｃ−反応性蛋白質ポリクローナル抗体を使用することなく、その他は参考例１と同様の方法により、抗Ｃ−反応性蛋白質抗体を含まない対照試薬を調製した。
【００７８】
参考例３
平均粒径２２０ｎｍのポリスチレンラテックス溶液（協和メデックス社製、１００ｍｇ／ｍＬ）０．８ｍＬを用いる以外は、参考例１と同様の方法により、Ｃ−反応性蛋白質測定用ラテックス試薬を調製した。最終濃度も参考例１と同様に１ｍｇ／ｍＬに調整し、４℃で保存した。
【００７９】
参考例４
３７．２ｇの２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（日本油脂社製）、１２．８ｇの２−ヒドロキシ３−メタクリロイルオキシプロピルトリメチルアンモニウムクロライド（日本油脂社製）、０．３ｇの重合開始剤２，２′−アゾビス（２−メチルプロピオノアミヂン）二塩酸塩（和光純薬工業社製「Ｖ−５０」）、重合媒としての水１５０ｇを用い、４時間、７０℃に加温することにより重合反応を行った。重合反応終了後、反応液をアセトン１．５Ｌにゆっくり滴下して、重合物を沈殿させた。沈殿物を濾別、乾燥後、５．０重量％となるよう蒸留水に溶解させた。分子量は、重合体のリン酸緩衝溶液をゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）用いて分析した結果、ポリエチレングリコール換算で重量平均分子量３７，０００であった。本化合物は、ホスホリルコリン基とカチオン基を７：３のモル比で含有する。
【００８０】
参考例５
４５．９ｇの２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（日本油脂社製）、４．１ｇの２−ヒドロキシ３−メタクリロイルオキシプロピルトリメチルアンモニウムクロライド（日本油脂社製）、０．３ｇの重合開始剤２，２′−アゾビス（２−メチルプロピオノアミヂン）二塩酸塩（和光純薬工業社製「Ｖ−５０」）、重合媒としての水１５０ｇを用い、４時間、７０℃に加温することにより重合反応を行った。重合反応終了後、反応液をアセトン１．５Ｌにゆっくり滴下して、重合物を沈殿させた。沈殿物を濾別、乾燥後、５．０重量％となるよう蒸留水に溶解させた。分子量は、重合体のリン酸緩衝溶液をゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）用いて分析した結果、ポリエチレングリコール換算で重量平均分子量３３，０００であった。本化合物は、ホスホリルコリン基とカチオン基を９：１のモル比で含有する。
【００８１】
参考例６
５０．０ｇの２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（日本油脂社製）、０．２４ｇの重合開始剤アゾビスイソブチルニトリル（和光純薬工業社製「ＡＩＢＮ」）、重合媒としてのエタノール１００ｇを用い、４時間、７０℃に加温することにより重合反応を行った。重合反応終了後、反応液をアセトン１．５Ｌにゆっくり滴下して、重合物を沈殿させた。沈殿物を濾別、乾燥後、５．０重量％となるよう蒸留水に溶解させた。分子量は、重合体のリン酸緩衝溶液をゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）用いて分析した結果、ポリエチレングリコール換算で重量平均分子量１０８，０００であった。
【００８２】
参考例７
３５．７ｇの２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（日本油脂社製）、４．３ｇのブチルメタクリレート（和光純薬工業社製）、０．８２ｇの重合開始剤アゾビスイソブチルニトリル（和光純薬工業社製「ＡＩＢＮ」）、重合媒としてのエタノール１６０ｇを用い、４時間、７０℃に加温することにより重合反応を行った。重合反応終了後、反応液をアセトン１．５Ｌにゆっくり滴下して、重合物を沈殿させた。沈殿物を濾別、乾燥後、５．０重量％となるよう蒸留水に溶解させた。分子量は、重合体のリン酸緩衝溶液をゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）用いて分析した結果、ポリエチレングリコール換算で重量平均分子量８７，０００であった。本化合物は、ホスホリルコリン基とブチル基を８：２のモル比で含有する。
【００８３】
参考例８
７４．３ｇの２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（日本油脂社製）、２５．７ｇの２−ヒドロキシ３−メタクリロイルオキシプロピルトリメチルアンモニウムクロライド（日本油脂社製）、０．４５ｇの重合開始剤２，２′−アゾビス（２−メチルプロピオノアミヂン）二塩酸塩（和光純薬工業社製「Ｖ−５０」）、重合媒として水９００ｇを用い、４時間、６０℃に加温することにより重合反応を行った。重合反応終了後、反応液をアセトン１．５Ｌにゆっくり滴下して、重合物を沈殿させた。沈殿物を濾別、乾燥後、５．０重量％となるよう蒸留水に溶解させた。分子量は、重合体のリン酸緩衝溶液をゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）用いて分析した結果、ポリエチレングリコール換算で重量平均分子量１３，０００であった。本化合物は、ホスホリルコリン基とカチオン基を７：３のモル比で含有する。次に、遠心濾過チューブ（限外分子量１０，０００、ミリポア社製）を用いた遠心分離（３，０００×ｇ、３０分）を行い、濾液として得られた分子量１０，０００以下の成分を回収した。
【００８４】
【発明の効果】
本発明のＣ−反応性蛋白質用試薬を用いると、Ｃ−反応性蛋白質測定におけるプロゾーン現象の回避と、測定レンジの拡大ができる。これにより、検体中に高濃度のＣ−反応性蛋白質が含まれる場合であっても、検体を希釈することなく原液のまま定量することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例Ａ−１及び比較例Ａ−１〜Ａ−３の試薬を用い、０〜１００ｍｇ／ｄＬのＣ−反応性蛋白質を測定した結果を示す図である。
【図２】実施例Ａ−１、比較例Ａ−１及び比較例Ａ−４の試薬を用い、０〜１００ｍｇ／ｄＬのＣ−反応性蛋白質を測定した結果を示す図である。
【図３】実施例Ａ−２及び比較例Ａ−５の試薬を用い、０〜１００ｍｇ／ｄＬのＣ−反応性蛋白質を測定した結果を示す図である。
【図４】実施例Ａ−３及び比較例Ａ−５の試薬を用い、０〜１００ｍｇ／ｄＬのＣ−反応性蛋白質を測定した結果を示す図である。
【図５】実施例Ａ−９及び比較例Ａ−１の試薬を用い、０〜１００ｍｇ／ｄＬのＣ−反応性蛋白質を測定した結果を示す図である。
【図６】実施例Ｂ−１及びＢ−２並びに比較例Ｂ−１〜Ｂ−４の試薬を用い、０〜１００ｍｇ／ｄＬのＣ−反応性蛋白質を測定した結果を示す図である。
【図７】実施例Ｂ−３及び比較例Ｂ−５の試薬を用い、０〜１００ｍｇ／ｄＬのＣ−反応性蛋白質を測定した結果を示す図である。
【図８】実施例Ｂ−２、実施例Ｂ−４、実施例Ｂ−５及び比較例Ｂ−１の試薬を用い、０〜１００ｍｇ／ｄＬのＣ−反応性蛋白質を測定した結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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