(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
歯周炎進行度の指標として、プロテアーゼインヒビターの存在下に、被検唾液中の肝細胞増殖因子濃度を測定することを特徴とする歯周炎患者唾液の検査方法。
【請求項２】
肝細胞増殖因子が、活性型肝細胞増殖因子である請求項１記載の検査方法。
【請求項３】
前記歯周炎進行度の指標が、測定された唾液中の肝細胞増殖因子濃度と相関性を有する、プロービング深さ、４mm以上のプロービングを有する数、６mm以上のプロービングを有する数又はプロービングによる出血部位のパーセンテージを指標とするものである請求項１又は２記載の検査方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は歯周炎の診断に有用な歯周炎患者唾液の判定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
歯周炎の早期診断は、有効な早期治療を可能にし、その結果、病変の重症化及び合併症を防止するうえで有用である。歯周炎のスクリーニングテストが具備すべき条件としては、（１）疾病や異常が精度良く的確に把握できること、（２）簡便で結果が早くわかること、（３）受診者になるべく苦痛を与えないこと、（４）費用が安価であることなどが挙げられている。
【０００３】
歯周炎ポケットからの滲出液には、ハイドロキシプロリン、グリコサミノグリカンなどの細胞組織崩壊マーカーや、プロスタグランディンＥ2、インターロイキン１βなどの炎症メディエータ及びアミノトランスフェラーゼ、コラゲナーゼなどの酵素類が含まれているので、当該滲出液は歯周炎の優れた診断材料であることが知られている（ＣＤＡ  ＪＯＵＲＮＡＬ  ２１巻  ３５−４１頁  １９９３年）。しかしながら、これらの指標では歯周組織特異性が確認できない。また、滲出液を採取して測定に供するための試料に調整するまでには、マウスリンスで唾液を除くことや遠心分離操作などが必要（Ｊ．  Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔ．  Ｒｅｓ  ２５巻  ２５７−２６７頁  １９９０）であり、高価な装置及び複数の操作を要することから、一般歯科診療室や集団検診で行うことが出来る歯周病のスクリーニングテストとしては未だ実用化されていない。
【０００４】
このほかにも、採取した歯周ポケット滲出液の病因微生物を分離して検出する方法や病因微生物由来の酵素活性を測定する方法も報告されている（日本歯周病学会誌  ３２巻  ２４９−２６０頁  １９９０年）が、歯周ポケットからの微生物の採取や酵素活性の測定に時間がかかるという欠点があった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は、歯周ポケット滲出液でなく唾液自体を対象とした新たな歯周炎診断のための手段を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
そこで本発明者らは、唾液中の成分と歯周炎の進行度との関係について種々検討してきたところ、唾液中の肝細胞増殖因子（以下ＨＧＦ）濃度と歯周炎の進行度との間に高い相関性があり、歯周炎が高精度かつ簡便、迅速に診断できることを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
すなわち、本発明は、被検唾液中のＨＧＦ濃度を測定することを特徴とする歯周炎患者唾液の判定方法を提供するものである。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明においては、被検体として唾液を用いる。また、唾液を直接用いてもよいが、唾液を含む洗口液を用いてもよい。歯周ポケット滲出液に含まれている成分が必ずしも唾液中にも含まれているか否か不明であるが、本発明者はＨＧＦが唾液中に存在することを確認し、さらに当液唾液中のＨＧＦ濃度と歯周炎の進行度との相関性を見出した。
【０００９】
用いる唾液の量は、通常０．５〜５．０mL、好ましくは０．５〜１．０mLで十分である。
【００１０】
唾液は、そのままＨＧＦの測定に供してもよいが、市販のＨＧＦ測定用ＥＬＩＳＡキットに付属の緩衝液等を添加して２〜５倍に希釈した液を用いてもよい。さらには、当該希釈液を遠心分離して沈渣を除いた上清を検体とするのがより好ましい。また唾液は、凍結保存したものを融解して用いてもよい。
【００１１】
唾液中のＨＧＦ濃度の測定手段は、特に制限されず、例えば免疫学的測定法、ＨＰＬＣシステム、プロテインチップ+ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳシステムなどが挙げられるが、このうち免疫学的測定法がより好ましい。免疫学的測定法としては、固相化抗ＨＧＦ抗体を用いたＥＬＩＳＡ法がさらに好ましい。市販のＨＧＦ測定用ＥＬＩＳＡキットとして、ヒトＨＧＦ免疫測定キット（Ｒ＆Ｄシステムズ社）を用いることもできる。
【００１２】
ＨＧＦ濃度の測定にあたっては、プロテアーゼインヒビターの存在下に測定するのが、得られた測定値と歯周炎との相関性がより向上するので好ましい。プロテアーゼインヒビターとしては、アプロチニン、ＡＥＢＳＦ、ＮＥＭ、ＥＤＴＡ、Ｅ−６４、ベスタチン、ロイペプチン及びペプスタチンＡから選ばれる１種又は２種以上、特にプロテアーゼインヒビターカクテルＰ８３４０(Sigma社、AEBSF、アプロチニン、ベスタチン、Ｅ−６４、ロイペプチン及びペプスタチンＡの混合物)、プロテアーゼインヒビターカクテルＰ２７１４(Sigma社、AEBSF、アプロチニン、ベスタチン、ＥＤＴＡ、Ｅ−６４、ロイペプチン及びペプスタチンＡの混合物）が挙げられるが、特にこれらのプロテアーゼインヒビターカクテル（Sigma社）が好ましい。これらのプロテアーゼインヒビターの測定系における含有量は、プロテアーゼインヒビターの種類によって異なるが、例えばこれらのプロテアーゼインヒビターカクテル（Sigma社）の場合、１０〜２０Ｕ／mL唾液が好ましい。
【００１３】
また、ＨＧＦの中でも活性型ＨＧＦ濃度を測定するのがより好ましい。活性型ＨＧＦ濃度を測定するには、例えばＨＧＦ「オーツカ」ＥＬＩＳＡキットにより行うのが好ましい。凍結した唾液を融解して使用して活性型ＨＧＦ濃度を測定する場合には、プロテアーゼインヒビターの存在下に測定すると正確な活性型ＨＧＦ濃度が測定でき、特に好ましい。
【００１４】
唾液中のＨＧＦ濃度と、歯周炎患者の臨床パラメータであるプロービング深さ（Proping depth:PD）及び被検者→患者一人あたりの４mm以上のＰＤを有する数、および６mm以上のＰＤを有する数、また患者の最も深いＰＤおよびプロービングによる出血部位のパーセンテージ（ＢＯＰ）とが高い相関性を有している。例えば、ＨＧＦ濃度が高い唾液の患者のＰＤは４mm以上であった。またＨＧＦ濃度の高い唾液のＢＯＰは１０％以上であった。従って、唾液中のＨＧＦ濃度の測定は歯周炎診断に有用である。
【００１５】
【実施例】
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれに何ら限定されるものではない。
【００１６】
実施例１
（１）唾液の採取と前処理
安静時無刺激全唾液を吐唾法により採取する。この唾液を４℃下で遠心分離し、上清を回収する。プロテアーゼインヒビターカクテル（Sigma社）を含む、キットに付属の希釈用緩衝液を等量加えて２倍に希釈する。
【００１７】
（２）ＨＧＦ濃度の測定法
ＨＧＦ測定用ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄシステムズ社製、ヒトＨＧＦ免疫測定キット）を用い、プレートの各ウェルに１５０μLの希釈用緩衝液（ＲＤＩＷ）を加える。次いで５０μLのＨＧＦ標準溶液または唾液サンプルを加え室温で２時間インキュベートする。プレートを４回洗浄する。２００μLのconjugate（酵素抗体）溶液を加えて１．７５時間インキュベートする。プレートを４回洗浄する。２００μLの基質溶液を加えて３０分間反応させる。５０μLの反応停止液を加えた後、マイクロプレートリーダーを用いて４５０nmの波長で吸光度を測定する。検量線から唾液サンプル中のＨＧＦ濃度を求める。
【００１８】
（３）結果
唾液中のＨＧＦ量と４mm以上のＰＤ数とは相関係数ｒ＝０．４２１と有意に相関した（図１）。また６mm以上のＰＤ数とはｒ＝０．５２４、最深ＰＤとはｒ＝０．４９６でいずれも有意に相関した（図２、図３）。さらにプロービングによる出血部位のパーセンテージ（ＢＯＰ）ともｒ＝０．４２２と有意に相関した（図４）。
【００１９】
【発明の効果】
本発明方法によれば、簡便かつ迅速で患者に負担をかけることなく歯周炎の進行度が判定できることから、的確な治療を施すことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】唾液中のＨＧＦ濃度と４mm以上のＰＤの数との相関性を示す図である。
【図２】唾液中のＨＧＦ濃度と６mm以上のＰＤの数との相関性を示す図である。
【図３】唾液中のＨＧＦ濃度と最深ＰＤとの相関性を示す図である。
【図４】唾液中のＨＧＦ濃度とＢＯＰとの相関性を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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