(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴＬＲ４の会合分子であるＭＤ−２をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損したことを特徴とするグラム陰性菌膜成分ＬＰＳ不応答性モデル非ヒト動物。
【請求項２】
非ヒト動物が齧歯目動物であることを特徴とする請求項１記載のグラム陰性菌膜成分ＬＰＳ不応答性モデル非ヒト動物。
【請求項３】
齧歯目動物がマウスであることを特徴とする請求項２記載のグラム陰性菌膜成分ＬＰＳ不応答性モデル非ヒト動物。
【請求項４】
マウスが、ＭＤ−２遺伝子の全部又は一部の遺伝子フラグメントを、ポリＡシグナルとマーカー遺伝子をもつプラスミドに置換してターゲッティングベクターを構築し、該ターゲッティングベクターを線状化した後、胚幹細胞に導入し、ＭＤ−２遺伝子機能を欠損した標的胚幹細胞を、マウスの胚盤胞中にマイクロインジェクションし、キメラマウスを作製し、このキメラマウスと野生型マウスとを交配させてヘテロ接合体マウスを作製し、かかるヘテロ接合体マウスをインタークロスすることによって得られるＭＤ−２ノックアウトマウスであることを特徴とする請求項３記載のグラム陰性菌膜成分ＬＰＳ不応答性モデル非ヒト動物。
【請求項５】
ＭＤ−２遺伝子の第１エクソンをネオマイシン耐性遺伝子で置換し、ジフテリア毒素遺伝子をＭＤ−２遺伝子の３′末端につないで、ターゲッティングベクターを構築したことを特徴とする請求項４記載のグラム陰性菌膜成分ＬＰＳ不応答性モデル非ヒト動物。
【請求項６】
請求項１〜５記載のグラム陰性菌膜成分ＬＰＳ不応答性モデル非ヒト動物に、ヒトＭＤ−２遺伝子の塩基多型を導入し、その応答を測定・評価することを特徴とするグラム陰性菌膜成分ＬＰＳ応答性物質の評価・スクリーニング方法。
【請求項７】
請求項１〜５記載のグラム陰性菌膜成分ＬＰＳ不応答性モデル非ヒト動物に、異種動物のＭＤ−２遺伝子を導入し、該モデル非ヒト動物に被検物質を作用させて、その応答を測定・評価することを特徴とするグラム陰性菌膜成分ＬＰＳ応答性物質の評価・スクリーニング方法。
【請求項８】
異種動物のＭＤ−２遺伝子が、ヒトのＭＤ−２遺伝子であることを特徴とする請求項７記載のグラム陰性菌膜成分ＬＰＳ応答性物質の評価・スクリーニング方法。
【請求項９】
請求項１〜５記載のグラム陰性菌膜成分ＬＰＳ不応答性モデル非ヒト動物に、異種動物のＭＤ−２遺伝子を導入し、該モデル非ヒト動物にエンドトキシンショックを誘発して、その応答を測定・評価することを特徴とする、モデル非ヒト動物を用いた異種動物ＭＤ−２遺伝子の評価法。
【請求項１０】
異種動物のＭＤ−２遺伝子が、ヒトのＭＤ−２遺伝子であることを特徴とする請求項９記載のモデル非ヒト動物を用いた異種動物ＭＤ−２遺伝子の評価法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＴＬＲ４（Toll-like receptor ４）の会合分子であるＭＤ−２をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損したグラム陰性菌膜成分ＬＰＳ不応答性モデル非ヒト動物及びその利用方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＬＰＳ（lipopolysaccharide）はグラム陰性菌細胞壁外葉の主たる構成成分で、免疫担当細胞ばかりでなく、血管内皮細胞、線維芽細胞など様々な細胞の活性化を誘導する。つまり、生体は分子或いは細胞レベルでＬＰＳを認識することによって、グラム陰性菌の侵入を察知している。ＬＰＳを認識しシグナルを伝達する分子は、長い間検索されてきた結果、最近になってようやく明らかにされた。３０年程前に見つかったＣ３Ｈ／ＨｅＪマウスはＬＰＳ低応答性を示すミュータントマウスである。同様なＬＰＳ低応答性を示すマウスとしてＣ５７ＢＬ／１０ＳｃＣｒも報告されていたが、これらのマウスの原因遺伝子がポジショナルクローニングによってＴＬＲ４（Toll-like receptor ４）であると同定された（Poltrak, A. et al., Science, 282, 2085-2088, 1998、Qureshi, S. et al., J. Exp. Med., 189, 615-625, 1999）。
【０００３】
ＴＬＲ４は、ショウジョウバエにおいて真菌を認識し感染防御を誘導する分子Tollのヒト及びマウスホモローグである（Rock, F. L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 588-593, 1998）。長い間探し求められてきたＬＰＳ認識分子は、ハエからヒトにまで保存されている病原体認識分子の１つであることが確認された。しかしながら、ＬＰＳ認識は多くの分子が関与するプロセスで、ＴＬＲ４単独では説明できないことが明らかにされている。本発明者はＴＬＲ４のＬＰＳ認識を制御する分子として、ＲＰ１０５／ＭＤ−１、ＭＤ−２などを報告してきた。
【０００４】
ＬＰＳ認識機構とＴＬＲｓ（Toll-like receptors）の関係についても解明されてきた。ＬＰＳの活性中心はリピドＡと呼ばれ、Ｎアセチルグルコサミン２分子に脂肪酸が結合したものである。リピドＡにコア抗原、さらにＯ抗原とばれる糖類がつながったものがＬＰＳである。ＬＰＳは低い濃度でもマクロファージ、Ｂ細胞、樹状細胞、好中球、血管内皮細胞、線維芽細胞など実に様々な細胞の活性化を誘導する。つまりこれらの細胞はＬＰＳを認識することができる。ＬＰＳ認識機構は多くの分子が関わる複雑なプロセスである（実験医学Vol.19(2001)No.5, P81）。菌体上にあるＬＰＳはまず、血清中のＬＰＳ結合タンパク質（ＬＢＰ）によって外膜から遊離され、もう一つのＬＰＳ結合タンパク質であるＣＤ１４へ単体の形で転送される。（Wright, S. D. et al., Science, 249, 1431-1433, 1990、Pugen, J. et al.,Immunity, 1, 509-516, 1994）。
【０００５】
ＣＤ１４は血清タンパク質として血中に、或いは細胞表面タンパク質として単球、マクロファージ上に存在している。ＣＤ１４／ＬＰＳ複合体はＬＰＳ単独の場合に比べて、１００〜１０，０００分の１の低い濃度で細胞の活性化を誘導する（Wright, S. D., J. Immunol., 155, 6-8, 1995）。しかし、ＣＤ１４は細胞質内ドメインをもたないためにＬＰＳシグナルを細胞内へそれ自身では伝達することができない。そこでＬＰＳシグナルを細胞内へ伝達するための新たなレセプター分子の存在が指摘され、検索が続けられていた。最近ようやくそのＬＰＳレセプターの実体がＴＬＲ４であると同定された。
【０００６】
ハエのTollレセプターは、個体発生の際に腹側への分化誘導シグナルを伝達するレセプター分子として発見されたが、その後真菌感染を察知して感染防御反応を誘導する役割をもっていることが報告された（Lemaitre, B. et al., Cell, 86, 973-983, 1996）。更に、Tollによく似た分子ＴＬＲ（Toll-like receptor）をマウスやヒトももっていることが１９９７年に明らかにされ、その１つであるＴＬＲ４が長い間謎であったＬＰＳ／エンドトキシン認識分子であった。ところが、細胞株を用いた実験で、ＴＬＲ４単独ではＬＰＳを認識できないという結果が報告された。
【０００７】
マウスＩＬ−３依存性細胞株Ｂａ／Ｆ３やヒト腎臓由来２９３細胞株はそれ自身ＬＰＳに応答しないし、これらの細胞にヒトＴＬＲ４を発現させたトランスフェクタントもＬＰＳに対する応答性は認められない。その理由としてＬＰＳ応答にはＴＬＲ４に加えて他の分子が必要である可能性が考えられた。本発明者はＲＰ（radio-protective）１０５の細胞外ドメインのＬＲＲ（leucine-rich repeat）がＴＬＲ４のそれとよく似ていることに注目し、v-myb regulated geneの１つであるＭＤ−１がＲＰ１０５と会合するところから、ＴＬＲ４もＭＤ−１と会合するのではないかと考えた。しかしながら両方の遺伝子を細胞株に発現させ、免疫沈降で共沈降できるかどうかを調べたが有意な会合は検出できなかった。そこで、ＴＬＲ４に会合するＭＤ−１類似分子の存在を想定し、データベースで検索を行い、ヒト妊娠子宮由来の遺伝子を得ることに成功した（Shimazu, R. et al., J. Exo. Med., 189, 1777-1782, 1999、特開平2000−262290号公報）。
【０００８】
この分子はアミノ酸１６０個からなり、ＭＤ−１とアミノ酸で約２３％一致していることから、ＭＤ−２という名前をつけた。ヒトＭＤ−２をマウスＩＬ−３依存性細胞株Ｂａ／Ｆ３に単独で発現させても細胞表面には検出されないが、ＴＬＲ４と共発現させると細胞表面で検出されるようになり、しかもその分布を共焦点レーザー顕微鏡で比較したところほぼ一致していた。さらに、抗ヒトＴＬＲ４モノクローナル抗体（ＨＴＡ１２５）でＴＬＲ４を免疫沈降すると、ＭＤ−２が共沈された。これらの実験結果から、ＲＰ１０５／ＭＤ−１と同様にＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体も細胞表面上に発現していることが確認された。
【０００９】
ＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体によるＬＰＳ認識、シグナル伝達の機構を明らかにするために、ＴＬＲ４のＬＰＳ認識におけるＭＤ−２会合の役割が検討された。
マウスＩＬ−３依存性細胞株Ｂａ／Ｆ３にヒトＴＬＲ４単独、或いはＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体を発現させ、ＬＰＳ刺激によるＮＦ−κＢ活性化を、予めＢａ／Ｆ３細胞株に導入しておいたＮＦ−κＢレポーター遺伝子を用いたルシフェラーゼアッセイで調べた結果、ＴＬＲ４単独ではＬＰＳ刺激によるＮＦ−κＢの活性化は検出されなかったが、ＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体を発現した細胞株はＬＰＳ応答性を示した。そこで、ＭＤ−２を共発現させることによって、獲得されたＬＰＳ応答がＴＬＲ４を介しているかどうかを確認するために、ＴＬＲ４に対するモノクローナル抗体（ＨＴＡ１２５）を加えたところ、ＬＰＳ刺激によるＮＦ−κＢ活性化が特異的に阻害された。（実験医学Vol.19(2001)、No.5、P83）。したがって、ＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体がＬＰＳを認識し、シグナルを伝達していることが明らかになった。
【００１０】
上記するようなこれまでの結果は、全て細胞株を用いた実験であり、正常細胞においてＴＬＲ４／ＭＤ−２の発現やそのＬＰＳ認識について検討する必要があった。本発明者は新たに、マウスＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体を特異的に認識するモノクローナル抗体（ＭＴＳ５１０）の確立に成功した（Akashi, S. et al., J. Immunol., 164, 3471-3475, 2000）。この抗体を用いて腹腔マクロファージを染色したところ、ＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体の発現が確認された。また、ＬＰＳ刺激で誘導される腫瘍壊死因子（tumor necrosis factor：ＴＮＦ）の産生をこの抗体は特異的に抑制した。更に、ＬＰＳで腹腔マクロファージを刺激すると、細胞表面上のＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体の発現が低下した。この発現低下はｎｇ／ｍｌという低濃度のＬＰＳ刺激でもみられるが、ペプチドグリカンなど他の病原体由来の物質による刺激では認められなかった。またＣＤ１４など他の細胞表面分子では同様な発現低下は認められず、ＴＬＲ４／ＭＤ−２に特異的な現象であった（Nomura, F. et al., J. Immunol., 164, 3476-3479, 2000）。
【００１１】
これらの結果から、ＴＬＲ４／ＭＤ−２は正常マクロファージ表面上にも発現しており、ＬＰＳの認識やシグナル伝達を司っていることが明らかとなった。ＴＬＲ４やＭＤ−２はともに広範に発現されており、マクロファージばかりでなく、線維芽細胞や血管内皮細胞など、非免疫担当細胞においてもＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体がＬＰＳ認識にかかわっている可能性がある。
【００１２】
以上のとおり、近年、グラム陰性菌細胞壁外葉の構成成分であるＬＰＳを認識してグラム陰性菌の進入を察知し、応答する機構における、ＴＬＲ４及びその会合分子であるＭＤ−２の役割については、徐々にその解明が進んできた。しかし、これまでの結果は、遺伝子や細胞レベルの実験を主とするものであり、今後は解析の方向として、ＴＬＲ４の病原体認識機構を更に分子レベルで明らかにするとともに、生体レベルの更なる解明が期待されている。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、グラム陰性菌細胞壁外葉の構成成分であるＬＰＳを認識してグラム陰性菌の侵入を察知し、応答する機構の生体レベルでの解明を目的として、該機構関与遺伝子をノックアウトしたモデル非ヒト動物を構築すること、及び該モデル非ヒト動物を用いての異種動物の遺伝子物質の機能の評価や、薬剤開発のための機能活性物質のスクリーニングや、病態解明のための診断を行う方法を提供することにある。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
Toll-like receptor ４（ＴＬＲ４）はグラム陰性菌の膜成分ＬＰＳ（lipopolysaccharide）を認識する。本発明者は、ＴＬＲ４に会合する分子ＭＤ−２を取得し、ＴＬＲ４によるＬＰＳ認識に重要であることを細胞株を用いて解明してきた。今回、上記課題を解決するためにＭＤ−２遺伝子を欠損したマウスを構築し、そのマウスがＬＰＳに全く応答しないことからＭＤ−２が生体レベルでもＬＰＳ応答に必須の分子であることを確認した。本発明は、このマウスのような、非ヒトモデル動物を用いての異種動物の遺伝子物質の機能の評価や、薬剤開発のための機能活性物質のスクリーニングや、病態解明のための診断を行う方法を提供することよりなる。
【００１５】
本発明のＭＤ−２遺伝子を欠損した非ヒトモデル動物は、特にＬＰＳが関与する疾患の解明や治療法の開発に利用できるものである。
即ち、リポ多糖（ＬＰＳ；lipopolysaccharide）はグラム陰性細菌の膜構成成分の一つで強く免疫細胞、血管内皮細胞などを活性化する。その強い活性のために多くの疾患との関連が指摘されている。特に重篤な疾患がエンドトキシンショックである。この疾患はＬＰＳによる免疫系の活性化によってサイトカインが過剰に産生されることが原因で、ショック状態に陥る疾患であり、多くの場合死に至る。多くの疾患で制御しきれなくなった最後に、エンドトキシンショックで死亡することが多く、病院内での死因として重要である。
エンドトキシンショック治療薬の開発は遅れているが、その原因としてＬＰＳの認識機構そのものが明らかになっていなかったことが挙げられる。特に、ＬＰＳを認識し、活性化シグナルを伝達する分子は長い間謎であったが、最近その認識分子の本体がToll-like receptor ４（ＴＬＲ４）と、その細胞外ドメインに会合するＭＤ−２によって構成されるＴＬＲ４／ＭＤ−２であることが明らかになった。
【００１６】
ＭＤ−２分子は、細胞外に分布する分子で、ＴＬＲ４と会合する可能性も指摘されていたが、エンドトキシンショックに対する治療薬開発において、ＴＬＲ４ばかりでなく、ＭＤ−２も標的分子となりうるかどうか、明らかにすることが重要であった。そのためには、生体内でＭＤ−２がＴＬＲ４によるＬＰＳ応答にどれだけ寄与しているか明らかにする必要があった。本発明者は、今回、ＭＤ−２遺伝子改変マウス（ＭＤ−２遺伝子機能欠損（ノックアウト）マウス）を作製し、ＭＤ−２が欠損した状態におけるＬＰＳ応答を調べた。その結果、今までのところ、ＭＤ−２遺伝子機能欠損（ノックアウト）マウスのＬＰＳ応答は完全に欠損していた。また、エンドトキシンショックを誘発しても、ＭＤ−２ノックアウトマウスは抵抗性を示した。この結果はＭＤ−２が生体内でのＴＬＲ４によるＬＰＳ認識、シグナル伝達に必須の分子であると同時に、エンドトキシン疾患の原因でもあることを示している。したがって、ＴＬＲ４と同様にＬＰＳ関連疾患の新規治療薬開発のための標的分子となりうることをＭＤ−２遺伝子機能欠損（ノックアウト）マウスが示したことになる。
【００１７】
本発明の遺伝子改変非ヒトモデル動物は、ＭＤ−２遺伝子機能を欠損させたものであるが、本発明の特徴として、マウスＭＤ−２を標的分子とする利点として最も重要な点はＬＰＳに特異的なことである。ＴＬＲ４あるいはその下流のＭｙＤ８８などのシグナル伝達分子を標的とすると、多のＴＬＲと共通しているため、他のＴＬＲへの影響を考慮する必要がある。その点、ＭＤ−２はＴＬＲ４に特異的であり、ＭＤ−２を標的とする薬剤においては他のＴＬＲへの影響を心配する必要は無い。さらにＭＤ−２はＴＬＲ４と異なり、アミノ酸１６０個と比較的小さく、また分泌タンパク質で膜貫通部位も持たない。そのため構造生物学的解析が比較的容易である。
【００１８】
本発明のＭＤ−２遺伝子機能を欠損させた非ヒトモデル動物は、ペプチドや組換えタンパク質などを薬剤として開発する上で、特に有利である。ＭＤ−２を標的とする薬剤を開発する上で、重要なことはスクリーニングシステムである。例えば、動物実験を行う上で、ＭＤ−２ノックアウトマウスにヒトのＭＤ−２を発現させることで、よりヒトに近い動物実験が可能となる。また、エンドトキシンショックへの感受性に関わるヒトＭＤ−２の１塩基多型（ＳＮＩＰ）機能解析においてもＭＤ−２ノックアウトマウスを利用することができる。ＭＤ−２遺伝子機能を欠損させたノックアウトマウスにいろいろなＳＮＩＰを持つヒトのＭＤ−２を発現させ、エンドトキシンショックを誘発することで、それぞれのＳＮＩＰの評価が可能となる。
このように、本発明のＭＤ−２遺伝子機能を欠損させた非ヒトモデル動物は、ＬＰＳが関与する疾患の診断、治療法の開発に有利に利用することができるものである。
【００１９】
すなわち本発明は、（１）ＴＬＲ４の会合分子であるＭＤ−２をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損したことを特徴とするグラム陰性菌膜成分ＬＰＳ不応答性モデル非ヒト動物や、（２）非ヒト動物が齧歯目動物であることを特徴とする上記（１）記載のグラム陰性菌膜成分ＬＰＳ不応答性モデル非ヒト動物や、（３）齧歯目動物がマウスであることを特徴とする上記（２）記載のグラム陰性菌膜成分ＬＰＳ不応答性モデル非ヒト動物や、（４）マウスが、ＭＤ−２遺伝子の全部又は一部の遺伝子フラグメントを、ポリＡシグナルとマーカー遺伝子をもつプラスミドに置換してターゲッティングベクターを構築し、該ターゲッティングベクターを線状化した後、胚幹細胞に導入し、ＭＤ−２遺伝子機能を欠損した標的胚幹細胞を、マウスの胚盤胞中にマイクロインジェクションし、キメラマウスを作製し、このキメラマウスと野生型マウスとを交配させてヘテロ接合体マウスを作製し、かかるヘテロ接合体マウスをインタークロスすることによって得られるＭＤ−２ノックアウトマウスであることを特徴とする上記（３）記載のグラム陰性菌膜成分ＬＰＳ不応答性モデル非ヒト動物や、（５）ＭＤ−２遺伝子の第１エクソンをネオマイシン耐性遺伝子で置換し、ジフテリア毒素遺伝子をＭＤ−２遺伝子の３′末端につないで、ターゲッティングベクターを構築したことを特徴とする上記（４）記載のグラム陰性菌膜成分ＬＰＳ不応答性モデル非ヒト動物からなる。
【００２０】
また本発明は、（６）上記（１）〜（５）記載のグラム陰性菌膜成分ＬＰＳ不応答性モデル非ヒト動物に、ヒトＭＤ−２遺伝子の塩基多型を導入し、その応答を測定・評価することを特徴とするグラム陰性菌膜成分ＬＰＳ応答性物質の評価・スクリーニング方法や、（７）上記（１）〜（５）記載のグラム陰性菌膜成分ＬＰＳ不応答性モデル非ヒト動物に、異種動物のＭＤ−２遺伝子を導入し、該モデル非ヒト動物に被検物質を作用させて、その応答を測定・評価することを特徴とするグラム陰性菌膜成分ＬＰＳ応答性物質の評価・スクリーニング方法や、（８）異種動物のＭＤ−２遺伝子が、ヒトのＭＤ−２遺伝子であることを特徴とする上記（７）記載のグラム陰性菌膜成分ＬＰＳ応答性物質の評価・スクリーニング方法や、（９）上記（１）〜（５）記載のグラム陰性菌膜成分ＬＰＳ不応答性モデル非ヒト動物に、異種動物のＭＤ−２遺伝子を導入し、該モデル非ヒト動物にエンドトキシンショックを誘発して、その応答を測定・評価することを特徴とする、モデル非ヒト動物を用いた異種動物ＭＤ−２遺伝子の評価法や、（１０）異種動物のＭＤ−２遺伝子が、ヒトのＭＤ−２遺伝子であることを特徴とする上記（９）記載のモデル非ヒト動物を用いた異種動物ＭＤ−２遺伝子の評価法からなる。
【００２１】
【発明の実施の形態】
本発明は、グラム陰性菌の膜成分ＬＰＳ（lipopolysaccharide）を認識するToll-like receptor ４（ＴＬＲ４）の会合分子であるＭＤ−２をコードする遺伝子機能を染色体上で欠損させ、グラム陰性菌膜成分ＬＰＳ不応答性モデル非ヒト動物を構築することよりなる。非ヒト動物としては、齧歯目動物が有利に利用され、該齧歯目動物としては、特にマウスが有利に用いることができる。
ＭＤ−２をコードする遺伝子を取得するには、公知のＭＤ−２遺伝子配列からプローブを作製し、該プローブを用いて、遺伝子ライブラリーからスクリーニングにより、全ＭＤ−２遺伝子或いは一部の遺伝子フラグメントを取得し、用いることが出来る。また、例えば、マウスＭＤ−２遺伝子のように、市販の遺伝子クローン（ゲノムシステムズ社（St. Louis，MO））を用いることもできる。
【００２２】
ＭＤ−２遺伝子機能を欠損した非ヒトモデル動物を構築するには、ＭＤ−２遺伝子の全部又は一部の遺伝子フラグメントを、ポリＡシグナルとマーカー遺伝子をもつプラスミドに置換してターゲッティングベクターを構築し、該ターゲッティングベクターを線状化した後、胚幹細胞に導入し、ＭＤ−２遺伝子機能を欠損した標的胚幹細胞を、非ヒト動物の胚盤胞中にマイクロインジェクションし、キメラ非ヒト動物を作製し、このキメラ非ヒト動物と野生型非ヒト動物とを交配させてヘテロ接合体非ヒト動物を作製し、かかるヘテロ接合体非ヒト動物をインタークロスすることによってＭＤ−２ノックアウト非ヒト動物を得ることよりなる。本発明における実施例においては、ターゲッティングベクターの構築に際し、ＭＤ−２遺伝子の第１エクソンをネオマイシン耐性遺伝子で置換し、ジフテリア毒素遺伝子をＭＤ−２遺伝子の３′末端につないで、ターゲッティングベクターを構築した。
【００２３】
本発明のグラム陰性菌膜成分ＬＰＳ不応答性モデル非ヒト動物の作製方法を、ＭＤ−２遺伝子機能を欠損したノックアウトマウスを例にとって説明する。市販の遺伝子クローン（ゲノムシステムズ社（St. Louis，MO））から入手したＭＤ−２遺伝子クローンをサブクローンし、ＤＮＡシーケンシングにより特定したＭＤ−２遺伝子クローン、を用意する。このＭＤ−２をコードする遺伝子の全部又は一部をネオ遺伝子カセット等に置換し、３′末端側にジフテリアトキシンＡフラグメント（ＤＴ−Ａ）遺伝子や単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子等の遺伝子を導入することによって、ターゲットベクターを作製する。
【００２４】
この作製されたターゲティングベクターを線状化し、エレクトロポレーション（電気穿孔）法等によってＥＳ細胞に導入し、相同的組換えを行い、その相同的組換え体の中から、Ｇ４１８やガンシクロビア（ＧＡＮＣ）等の抗生物質により相同的組換えを起こしたＥＳ細胞を選択する。また、この選択されたＥＳ細胞が目的とする組換え体かどうかをサザンブロット法等により確認することが好ましい。その確認されたＥＳ細胞のクローンをマウスの胚盤胞中にマイクロインジェクションし、かかる胚盤胞を仮親のマウスに戻し、キメラマウスを作製する。このキメラマウスを野生型マウスとインタークロスさせると、ヘテロ接合体マウス（Ｆ１マウス：＋／−）を得ることができ、また、このヘテロ接合体マウスをインタークロスさせることによって、本発明のＭＤ−２ノックアウトマウスを作製することができる。また、ＭＤ−２ノックアウトマウスにおいてＭＤ−２が生起しているかどうかを確認する方法としては、例えば、上記の方法により得られたマウスからＲＮＡを単離してノーザンブロット法等により調べたり、またこのマウスにおけるＭＤ−２の発現をウエスタンブロット法等により調べる方法がある。
【００２５】
また、作出されたＭＤ−２ノックアウトマウスがグラム陰性菌膜成分ＬＰＳ不応答性であることは、例えば、急性反応期タンパク質である血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）の誘導、或いは、ＬＰＳで誘導したエンドトキシンショック下における生存、ＴＮＦやＩＬ６のようなサイトカインの過剰産生の状況を測定することにより確認することができる。
【００２６】
本発明のグラム陰性菌膜成分ＬＰＳ不応答性モデル非ヒト動物は、塩基配列のような被検物の導入や、ペプチドや組み換えタンパク質のような被検物質を作用させて、その応答を測定・評価することにより、ＬＰＳ応答性物質の評価・スクリーニングを行い、ＭＤ−２を標的とする薬剤の開発に用いることが出来る。
また、本発明のグラム陰性菌膜成分ＬＰＳ不応答性モデル非ヒト動物は、ヒトＭＤ−２遺伝子の塩基多型（ＳＮＩＰ）のような、異種動物のＭＤ−２遺伝子を導入し、異種動物を用いて異種動物のＭＤ−２遺伝子の機能解析を行うことができる。例えば、グラム陰性菌膜成分ＬＰＳ不応答性モデルマウスに、いろいろなＳＮＩＰを持つヒトＭＤ−２遺伝子を発現させ、エンドトキシンショックを誘発することで、それぞれのＳＮＩＰの評価が可能となる。
【００２７】
更に、本発明のグラム陰性菌膜成分ＬＰＳ不応答性モデル非ヒト動物は、該動物に、異種動物のＭＤ−２遺伝子を導入し、該モデル非ヒト動物にエンドトキシンショックを誘発して、その応答を測定・評価することことにより異種動物ＭＤ−２遺伝子の診断を行うことができる。例えば、グラム陰性菌膜成分ＬＰＳ不応答性モデルマウスに、ヒトのＭＤ−２遺伝子を導入し、該モデルマウスにエンドトキシンショックを誘発して、その応答を測定・評価することことにより、マウスを用いてヒトＭＤ−２遺伝子の診断を行うことができる。
【００２８】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
［材料と方法］
（試薬、細胞、マウス）
大腸菌由来のリポ多糖（ＬＰＳ）、その活性中心であるリピドＡ（サルモネラ菌由来）、リポタイコ酸（ブドウ球菌由来）はSigma社（St. Louis, MO）製のものを使用した。ブドウ球菌由来のペプチドグリカンはFluka社製のものを使用した。オリゴＤＮＡは北海道システムサイエンス社製のものを使用した。D-GalacosamineはSigma社製のものを使用した。
【００２９】
（ＭＤ−２ノックアウトマウス作製）
ＭＤ−２遺伝子クローンはゲノムシステムズ社（St. Louis, MO）製のものを使用した。その遺伝子の第１エクソンをネオマイシン耐性遺伝子で置換した。ジフテリア毒素遺伝子はＭＤ−２遺伝子の３′末端につないだ。線状にしたＤＮＡをＥ１４由来ＥＳ細胞に導入し、Ｇ４１８耐性で、ジフテリア遺伝子で死ななかったＥＳクローンを得た。そのなかで、ＭＤ−２遺伝子が組み換えられたクローンを１個得た。このクローンを日本ＳＬＣ社に送り、キメラマウス作製を依頼した。そのマウスをＣ５７ＢＬ／６と交配し、ＥＳクローン由来のヘテロ、さらにヘテロ同士の交配によりホモのマウスを得た。
【００３０】
（リバーストランスクリプターゼ−ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ））
骨髄由来マクロファージの全ＲＮＡを和光純薬工業社製のISOGENを用いて抽出し、それからｃＤＮＡを合成した。アクチン、ＭＤ−２、ＴＬＲ４の遺伝子の増幅は以下のプライマーを用いて行った。
プライマーの配列は、次のとおり：
mouse (m) β-actin-sense, 5'-GAGAGGGAAATCGTGCGTGACATC-3'；配列番号１
mβ-actin anti-sense, 5'-GAATGTAGTTTCATGGATGCC-3'；配列番号２
mMD-2 sense, 5'-ATGTTGCCATTT- ATTCTCTTTTCGACG-3'；配列番号３
mMD-2 anti-sense, 5'-ATTGACATCACGGCGGTGAATGATG-3'；配列番号４
mTLR4 sense, 5'-TATCCACTGTAGCATTTCTGATATACC-3'；配列番号５
mTLR4 anti-sense, 5'-CTCTGCTGTTTGCTCAGGATTCGAGGC-3'；配列番号６
【００３１】
（Ｂ細胞精製、活性化）
マウス脾臓Ｂ細胞は、DYNAL社製のDynaビーズに抗ＣＤ４３抗体Ｓ７をつけたものを用いてＴ細胞を除去することで精製した。精製したＢ細胞は９６穴プレートに２×１０5／ウェルで蒔き、ＬＰＳやＲＰ１０５に対する抗体で刺激した。培養３日目にトリチウム標識のサイミジンを加え、６時間皿に培養した後にそのＤＮＡをグラスフィルターに回収し、取り込まれたトリチウムのカウントを測定することで、増殖反応を測定した。
【００３２】
（樹状細胞の誘導、活性化）
骨髄細胞を２４穴プレートに１×１０6／ウェルで蒔き、マウスＧＭ−ＣＳＦ存在下で６日間培養した後に、リピドＡ、ＣｐＧなどで刺激し、サイトカイン産生などを測定した。
【００３３】
（マクロファージの誘導、活性化）
骨髄細胞を１０ｃｍディッシュにＭ−ＣＳＦ存在下で７日間培養した細胞を用いた。細胞を回収した後、リピドＡやＣｐＧで刺激し、サイトカインの産生を測定した。
【００３４】
（サイトカイン産生）
ＥＬＩＳＡ（Enzyme-linked immunoadsorbent assay）はBiosource Internatioinal社製のキットを用いて行った。
【００３５】
（細胞の染色）
細胞は抗体で染色した後にフローサイトメーター（ベクトンディッキンソン社製、FACScan）を用いて解析した。
【００３６】
（胎児由来線維芽細胞の確立とレトロウィルスを用いた遺伝子導入法）
マウス胎児由来線維芽細胞は約１３．５日からの胎児から確立した。レトロウィルスを用いた遺伝子導入にはＰＬＡＴ−Ｅ細胞（東大医科研、北村俊雄先生より分与）にベクターを導入してレトロウィルスの産生を誘導した。産生されたウィルスを胎児由来線維芽細胞に感染させることで、遺伝子を導入した。
【００３７】
（共焦点レーザー顕微鏡を用いた解析）
３．５ｃｍディッシュに蒔いておいた細胞をバッファーで洗い、３．７％ホルムアルデヒドで固定する。その後０．２％のTritonX-100で膜に穴をあけてからフラッグに対するビオチン化抗体とインキュベートする。細胞を洗った後にテキサスレッド標識ストレプトアビジンでフラッグを染色した。ゴルジ体、小胞体を染色するにはBODIPY FL-ceramide、ER-tracker（Molecular Probe社製）をそれぞれ用いた。共焦点レーザーはZeiss社のLSM510を用いた。
【００３８】
［実験結果］
（ＭＤ−２遺伝子改変マウスの作製）
ＭＤ−２の免疫系における役割を明らかにするためにＭＤ−２遺伝子改変マウスを作製した。ＭＤ−２遺伝子の第１エクソンはアミノ末端の３７個のアミノ酸をコードするが、そのエクソンをネオマイシン耐性遺伝子に置き換えた（図１ａ）。ホモのマウスはサザンハイブリダイゼーションで確認し（図１ｂ）、そのマウスの骨髄から誘導したマクロファージでのＭＤ−２ ｍＲＮＡの発現をＲＴ−ＰＣＲで調べても検出されなかった（図１ｃ）。タンパク質の発現はＭＴＳ５１０というモノクローナル抗体で確認した。この抗体はＴＬＲ４に対する抗体であるが、ＴＬＲ４単独には反応せず、ＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体にのみ反応する。この抗体で骨髄由来マクロファージを染色しても発現は検出されなかった（図１ｄ）。ＭＤ−２の発現が欠損していてもＲＰ１０５、ＭＤ−１、ＣＤ１４の発現に異常は認められなかった（図１ｄ）。
ＭＤ−２は神経系や血液系の細胞に、発生初期からその発現が報告されている。ＭＤ−２ノックアウトマウスは健康に生まれ、肉眼的所見、フローサイトメトリーによる所見では特にこれらの臓器に異常は認められなかった。
【００３９】
（ビトロにおけるＢ細胞、マクロファージ、樹状細胞のＬＰＳ応答性）
脾臓からＢ細胞を精製し、リピドＡで刺激し、Ｂ細胞活性化による細胞表面分子ＣＤ８６の発現上昇と増殖反応を調べたところ、野生型のＢ細胞では反応が認められたが、ＭＤ−２欠損Ｂ細胞では全く反応しなかった。ＭＤ−２欠損Ｂ細胞はＴＬＲ９のリガンドであるＣｑＧや抗ＲＰ１０５抗体には問題なく反応した（図２ａ〜ｂ）。
次に骨髄細胞から誘導したマクロファージをリピドＡ、ＴＬＲ２リガンドペプチドグリカン、ＴＬＲ９リガンドＣｑＧで刺激し、サイトカインの産生をＥＬＩＳＡで測定した。ＭＤ−２欠損マクロファージは腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）もＩＬ−６も産生しなかった（図３ａ）。またリポテイコ酸に対してもＭＤ−２欠損マクロファージは反応しなかった。
樹状細胞は自然免疫と獲得免疫の連携に重要な役割を持つ細胞である。骨髄細胞からＧＭ−ＣＳＦで誘導した樹状細胞をリピドＡで刺激した。野生型樹状細胞はＩＬ−１２を産生し、ＣＤ８６やＣＤ４０の発現上昇を示したが、ＭＤ−２欠損樹状細胞はＣｐＧに反応し、リピドＡには反応しなかった（図３ｂ、ｃ）。
【００４０】
（ビボにおけるＬＰＳ応答）
ＣＤ１４はＬＰＳ応答に重要であるが、中にはＴＬＲ４に依存するが、ＣＤ１４には依存しない反応もある。急性反応期タンパク質である血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）の誘導もそのひとつである。そこでＳＡＡの誘導におけるＭＤ−２の役割を調べてみた。ＭＤ−２ノックアウトマウスにＬＰＳを投与し、血中のＳＡＡの濃度を測定したところ、野生型マウスではＳＡＡが誘導されたが、ＭＤ−２ノックアウトマウスでは誘導されなかった（図４ａ）。
【００４１】
次にエンドトキシンショックをＬＰＳで誘導し、ＭＤ−２の役割を調べてみた。ＬＰＳと、その毒性を増幅させるガラクトサミンを同時に投与したところ、野生型マウスはすべて１０時間以内に死亡したが、ＭＤ−２ノックアウトマウスはすべて生き残った（図４ｂ）。エンドトキシンショックによる死亡としてＴＮＦやＩＬ−６などのサイトカインの過剰産生がその一因として挙げられる。そこで、ＬＰＳとガラクトサミン投与後に採血し、血中のサイトカインを測定したところ、野生型ではＴＮＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−１２の産生が誘導されたが、ＭＤ−２ノックアウトマウスでは産生が認められなかった（図４ｃ）。大量のＬＰＳ単独投与でもエンドトキシンショックは誘導されるが、その系でもＭＤ−２ノックアウトマウスは野生型マウスに比べて低反応性を示した（図４ｄ）。
最後にグラム陰性菌ネズミチフス菌の感染実験を行った。野生型マウスに比べてＭＤ−２ノックアウトマウスは細菌感染に対する反応性が低くなり、細菌感染防御機能が低下する結果、ネズミチフス菌の感染により、死亡率が上昇した（図４ｅ）。
【００４２】
（ＴＬＲ４の細胞内分布におけるＭＤ−２の役割）
本発明者は最近ＲＰ１０５の細胞表面への発現にＭＤ−１が必須であることを報告した。ＭＤ−１とＭＤ−２が類似していることを考慮するとＭＤ−２もＴＬＲ４の細胞内での分布に影響している可能性がある。その点を明らかにするために胎児由来線維芽細胞（ＥＦ）細胞を確立し、ＴＬＲ４遺伝子を導入して発現させ、その分布をＴＬＲ４につけておいたＦＬＡＧタグを染色することで調べた（図５；参考写真１参照）。野生型ＥＦ細胞ではＴＬＲ４は細胞内の核周辺と細胞表面に検出された。細胞表面では興味深いことにLeading Edgeと呼ばれる部位にその発現が集中していた。一方ＭＤ−２欠損ＥＦ細胞では細胞表面への発現が認められず、核周辺の細胞内にのみＴＬＲ４が検出された（図５ａ）。細胞内での局在を明らかにするためにゴルジ体、小胞体のマーカーとしてそれぞれセラミド、ＥＲトラッカーによる染色を同時に行ったところ、ＭＤ−２欠損ＥＦ細胞は細胞内のゴルジ体に集積している事が明らかになった（図５ｂ）。これらの結果はＭＤ−２がＴＬＲ４の細胞内における分布の制御に重要な役割をなしていることを示している。
【００４３】
【発明の効果】
グラム陰性菌細胞壁外葉の構成成分であるＬＰＳを認識してグラム陰性菌の侵入を察知し、応答する機構における、ＴＬＲ４及びその会合分子であるＭＤ−２の役割については、徐々にその解明が進んできた。しかし、これまでの結果は、遺伝子や細胞レベルの実験を主とするものであった。本発明においては、グラム陰性菌の侵入を察知し、応答する機構に関与するＭＤ−２遺伝子をノックアウトしたモデル非ヒト動物を構築することに成功し、ＴＬＲ４会合分子であるＭＤ−２の役割について生体レベルでの解明を可能とした。更に、本発明におけるＭＤ−２遺伝子をノックアウトしたモデル非ヒト動物の構築により、該ノックアウト非ヒトモデル動物を用いて、異種動物の遺伝子物質の機能の評価や、薬剤開発のための機能活性物質のスクリーニングや、病態解明のための診断を行う方法の提供を可能とした。本発明のＭＤ−２遺伝子をノックアウトしたモデル非ヒト動物の優れた点として、本発明においてはＭＤ−２を標的分子としたので、例えばＴＬＲ４やその下流のＭｙＤ８８などのシグナル伝達分子を標的とした場合のように他のＴＬＲへの影響を考慮する必要がなく、ＬＰＳに特異的に標的を絞ることができるということである。したがって、本発明のノックアウト非ヒトモデル動物を用いた薬剤の開発に際しても、ＭＤ−２に特異的に作用する薬剤を開発することが可能で、薬剤開発上、有利となる。
【００４４】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施例において、作製したＭＤ−２遺伝子改変マウスの第１エクソン部の遺伝子構造（１ａ）、ホモのマウスのサザンハイブリダイゼーションの確認の結果（１ｂ）、ＭＤ−２ｍＲＮＡの発現をＲＴ−ＰＣＲで調べた結果（１ｃ）、タンパク質の発現をモノクロナール抗体で確認した結果（１ｄ）、ＭＤ−２の発現が欠損した場合の、ＲＰ１０５，ＭＤ−１、ＣＤ１４の発現への影響（１ｄ）を示す図である。
【図２】本発明の実施例において、作製したＭＤ−２遺伝子改変マウスの脾臓から採取したＢ細胞のビトロにおけるＬＰＳ応答を試験した結果を示す図である。
【図３】本発明の実施例において、作製したＭＤ−２遺伝子改変マウスの骨髄細胞から誘導したマクロファージや樹状細胞のＬＰＳ応答を試験した結果を示す図である。
【図４】本発明の実施例において、作製したＭＤ−２遺伝子改変マウスのビボにおけるＬＰＳ応答試験において、ＳＡＡ誘導の結果（４ａ）、ガラクトサミンを投与したエンドトキシンショック付与における生存の結果（４ｂ）、血中のサイトカインを測定した結果（４ｃ）、大量のＬＰＳ単独投与における生存率の野生型マウスとの比較の結果（４ｄ〜ｅ）を示す図である。
【図５】本発明の実施例において、作製したＭＤ−２遺伝子改変マウスから確立した胎児由来線維芽細胞におけるＴＬＲ４の局在を調べた結果である。野生型の線維芽細胞との比較（ａ）およびゴルジ体や小胞体のマーカーとの２重染色を示す（ｂ）図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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