(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫療法剤と腫瘍成長制限剤とを含む、哺乳動物の進行したまたは大きい腫瘍の治療のための医薬であって、
前記免疫療法剤は、Ｔ細胞同時刺激性の細胞接着分子（ＣＡＭ）、又はＴ細胞同時刺激性のＣＡＭをコードするＤＮＡを含有する哺乳動物発現ベクターを含み、前記ＣＡＭは、Ｂ７．１であり、前記免疫療法剤は、前記腫瘍成長制限剤と組み合わせて投与され、
前記腫瘍成長制限剤は、酢酸フラボン（ＦＡＡ）、５，６−ジメチルキサンテノン−４−酢酸（ＤＭＸＡＡ）からなる群から選択される
ことを特徴とする医薬。
【請求項２】
別個の容器内に、免疫療法剤および腫瘍成長制限剤を含んでなるキットである、請求項１に記載の医薬。
【請求項３】
哺乳動物がヒトである請求項１又は２に記載の医薬。
【請求項４】
医薬ががんに罹患した被検対象の治療のためのものであり、前記免疫療法剤及び腫瘍成長制限剤が、進行した腫瘍患部または大きい腫瘍患部を根絶するのに両剤で十分な量であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の医薬。
【請求項５】
腫瘍成長制限剤の量は、免疫療法剤と組み合わせて進行した腫瘍患部又は大きい腫瘍患部を根絶するのに十分な量であり、免疫療法剤の投与に続いて、腫瘍成長制限剤が投与されるよう製剤化されている、請求項１〜４のいずれか１項に記載の医薬。
【請求項６】
免疫療法剤の量は、腫瘍成長制限剤と組み合わせて進行した腫瘍患部又は大きい腫瘍患部を根絶するのに十分な量であり、免疫療法剤の投与に続いて、腫瘍成長制限剤が投与されるよう製剤化されている、請求項１〜５のいずれか１項に記載の医薬。
【請求項７】
前記腫瘍成長制限剤が、５，６−ジメチルキサンテノン−４−酢酸（ＤＭＸＡＡ）である請求項１〜６のいずれか１項に記載の医薬。
【請求項８】
前記腫瘍成長制限剤が、酢酸フラボン（ＦＡＡ）である請求項１〜６のいずれか１項に記載の医薬。
【請求項９】
前記腫瘍成長制限剤の投与に先立って、免疫療法剤を投与するように製剤化されている請求項１〜８のいずれか１項に記載の医薬。
【請求項１０】
前記腫瘍成長制限剤の投与の１２〜４８時間前に、免疫療法剤を投与するように製剤化されている請求項９に記載の医薬。
【請求項１１】
前記腫瘍成長制限剤の投与の１２〜２４時間前に、免疫療法剤を投与するように製剤化されている請求項９に記載の医薬。
【請求項１２】
追加の腫瘍成長制限剤をさらに含む請求項１〜１１のいずれか１項に記載の医薬。
【請求項１３】
前記追加の腫瘍成長制限剤が、ＨＩＦ−１のアンチセンスバージョンをコードする発現ベクターを含む請求項１２に記載の医薬。
【請求項１４】
別個の容器内に、免疫療法剤および腫瘍成長制限剤を含み、前記追加の腫瘍成長制限剤がさらに別個の容器内に含まれるキットである、請求項１２又は１３に記載の医薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、癌と闘うために組合わせた治療薬の使用に関する。特に、本発明は、進行癌および大きい腫瘍患部に対して有効な治療薬の組合わせに関する。
【０００２】
発明の背景
進行癌および大きい腫瘍患部は、治療剤よる治療では治りにくい。これらの同じ薬剤が、小さい腫瘍に対して有効な場合もあるが、それらの使用によって、大きい腫瘍を完全に根絶することはない。大きい腫瘍は阻止されずに成長しつづける恐れがあったり、あるいは、再成長が身体の免疫系に認識されない。
【０００３】
さらに、腫瘍は、治療剤の効果および／または身体それ自身の免疫応答を制限する、防御機能および生存機能を獲得する。理由は不明であるが、大きい腫瘍患部は、抗腫瘍細胞障害性Ｔリンパ球応答の発生を減じるか遅らせるかのいずれかであると考えられる。免疫療法においてＴ細胞同時刺激性の細胞接着分子の遺伝子導入は、非常に小さい腫瘍のみに有効であり、且つ弱い抗腫瘍全身性免疫を生じるにすぎない。
【０００４】
本発明の目的は、大きい腫瘍患部の免疫療法に対する抵抗性を少なくとも部分的に克服する、治療に役立つ組合わせを提供すること、または、少なくとも、癌の治療における有用な選択を人々に提供することにある。
【０００５】
発明の概要
従って、第１の態様において、本発明は、進行した腫瘍患部または大きい腫瘍患部の進行を遅延または前記患部の根絶に単独では効果のない免疫療法剤と腫瘍成長制限剤とを、進行したまたは大きい腫瘍患部を有するヒトを含む哺乳動物に一緒に投与することを含む治療方法を提供する。
【０００６】
さらなる態様では、本発明は、存在する進行したまたは大きい腫瘍を根絶するのに両方合わせて有効な量で、免疫療法剤および腫瘍成長制限剤を、上記患者に投与するステップを含む、癌患者を治療する方法を提供する。
【０００７】
さらなる態様において、本発明は、上記免疫療法剤で治療するとき、免疫療法剤と組み合わせて、存在する進行したまたは大きい腫瘍を根絶するのに有効な量の腫瘍成長制限剤を、上記患者に投与するステップを含む、癌患者に存在する腫瘍に対する、免疫療法剤の活性を強化する方法を提供する。
【０００８】
さらなる態様において、本発明は、上記腫瘍成長制限剤をその後投与したとき、上記腫瘍成長制限剤と共同して、存在する進行したまたは大きい腫瘍を根絶するのに役立つ量の免疫療法剤を、上記腫瘍成長制限剤で治療される患者に前投与するステップを含む、癌患者に存在する腫瘍に対する、腫瘍成長制限剤の活性を強化する方法を提供する。
【０００９】
本明細書で使用する用語「免疫療法剤」は、患者に投与したとき、全身性抗腫瘍免疫応答を生じる調製物を意味する。
【００１０】
好ましくは、本調製物は、ＤＮＡを含み、且つ一般には、免疫療法剤は、全身性抗腫瘍免疫応答を引き起こす特性を腫瘍組織に与えるために、１つまたは複数の部位にて腫瘍に注入される製薬上許容できるＤＮＡの調合物である。
【００１１】
本明細書で使用する用語「腫瘍成長制限剤」は、血管形成を阻害または防止することを含む、腫瘍への血流を減少させることにより、患者における腫瘍成長を制限または防止する薬剤を意味する。このような薬剤は、血流減少に加えて、他の抗腫瘍免疫調節活性も有してもよい。
【００１２】
免疫療法剤は、好ましくは、Ｔ細胞同時刺激性の細胞接着分子(ＣＡＭ)をコードするＤＮＡを、さらに好ましくは適当な発現ベクターに、含む。ＣＡＭは、Ｂ７．１、Ｂ７．２または異種（ヒト）形状のインテグリンリガンド、またはそれらの組合わせであることが最も好都合である。
【００１３】
腫瘍成長制限剤は、キサンテノン４酢酸（ＸＡＡ）の類似体または酢酸フラボン（ＦＡＡ）であることが好都合である。ＸＡＡ類似体である５，６−ジメチルキサンテノン−４−酢酸（ＤＭＸＡＡ）が特に好ましい。
【００１４】
あるいは、腫瘍成長制限剤は、低酸素誘導因子−１（hypoxia-inducible factor-1; ＨＩＦ−１）の発現または活性を乱す薬剤であってもよい。これは、アンチセンス療法によって、特にＨＩＦ−１のアンチセンスバージョンをコードする発現ベクターの投与によって便利に実現することができる。
【００１５】
免疫療法剤は、腫瘍成長制限剤の前に投与されることが好ましい。さらに好ましくは、免疫療法剤は、腫瘍成長制限剤投与の１２〜４８時間前に投与される。最も好ましくは、免疫療法剤の投与は、腫瘍成長制限剤投与のおよそ２４時間前に行われる。
【００１６】
好ましい実施形態では、本発明の方法は、追加の腫瘍成長制限剤の投与をさらに含んでもよい。この薬剤は、低酸素誘導因子−１（ＨＩＦ−１）の発現または活性を乱す薬剤であってもよい。これは、アンチセンス療法によって簡便に実現することができる。
【００１７】
さらなる態様において、本発明は、上記免疫療法剤と腫瘍成長制限剤の両者が、別個の容器内に入った化学療法パックを提供する。
【００１８】
さらなる態様において、本発明は、進行したまたは大きい腫瘍に対する免疫療法剤の活性を強化するための医薬調合物における、腫瘍成長制限剤の使用を提供する。
【００１９】
さらなる態様において、本発明は、進行したまたは大きい腫瘍に対する腫瘍成長制限剤の活性を強化するための医薬調合物における、免疫療法剤の使用を提供する。
【００２０】
本発明は大まかに上の通りに説明されるが、当業者は、それに限定されないこと、および上記説明で実施例が提供される実施形態も含むことを理解するであろう。さらに、本発明は、添付の図面を参照することにより、よりよく理解されるであろう。
【００２１】
発明の詳細な説明
上記の通り、おおまかには、本発明は、進行したまたは大きい腫瘍患部を有する患者を治療するための組合わせ療法を提供する。
【００２２】
進行した腫瘍成長は、腫瘍が、身体の全身性抗腫瘍免疫応答に抵抗できる不明のメカニズムを獲得できる能力を伴うことに注目してきた。化学療法剤または癌治療の他の手段を投与することにより、最初は腫瘍成長を退縮させることが可能であるが、身体の免疫応答は、身体から根絶されていなかった腫瘍形成組織の再成長を防止または制限することはできない。
【００２３】
発明者は、進行したまたは大きい腫瘍患部の長期治療に無効であることが以前に証明された免疫療法と化学療法とを併用することにより、腫瘍の退縮は、強い全身性抗腫瘍免疫応答の刺激と組合わせられると判定した。
【００２４】
従って、使用する２つの治療薬は、相乗的に作用して、それぞれの既知の特性から予測される作用を凌ぐ併用効果を提供する。このことは、当然好ましいことであり、免疫療法剤がＴ細胞同時刺激性の細胞接着分子（ＣＡＭ）かまたはインテグリンリガンドをコードするＤＮＡの調製物であり、腫瘍成長制限剤がＤＭＸＡＡ等のキサンテノン４酢酸（ＸＡＡ）の類似体または酢酸フラボン（ＦＡＡ）であるか、低酸素誘導因子−１（ＨＩＦ−１）の活性の発現を乱す薬剤である場合、特に当てはまる。
【００２５】
Ｂ７．１、Ｂ７．２を含むＴ細胞同時刺激性の細胞接着分子（ＣＡＭ）、および異種（ヒト）形状のインテグリンリガンドであるＶＣＡＭ−１、ＭＡｄＣＡＭ−１、およびＩＣＡＭ−１の最適化された遺伝子導入は、確立された小さい腫瘍の迅速且つ完全な拒絶を引き起こすことが証明されている。長期全身性抗腫瘍免疫が、ヒトＥカドヘリン等の他の細胞接着分子は、腫瘍成長を遅らせる弱い能力を有するにすぎない。しかし、ＣＡＭ仲介免疫療法は、小さい腫瘍のみに有効であり、且つ弱い抗腫瘍全身性免疫を引き起こすに過ぎないため、問題が多い。大きい腫瘍患部は、抗腫瘍細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の発生を減じるか遅らせて、腫瘍を免疫療法に対して抵抗性にすることができる。
【００２６】
抗癌薬酢酸フラボン（ＦＡＡ）および５，６−ジメチルキサンテノン−４−酢酸（5,6-dimethylxanthenone-4-acetic acid; ＤＭＸＡＡ）は、投与したとき、腫瘍サイズの初期縮小を引き起こすが、その後、腫瘍は抑制されずに成長し、両試薬は、弱く且つ効果のない抗腫瘍ＣＴＬ応答を生じさせる。ＤＭＸＡＡおよびＦＡＡは、出血性壊死につながる腫瘍血流の減少、ならびにサイトカイン類、一酸化窒素、および活性化ナチュラルキラー細胞を含む多数の免疫調節因子の誘導を含む幾つかの経路を経て、抗腫瘍活性を発揮すると考えられる。しかし、どちらの薬剤も所望の抗腫瘍全身性免疫を生じさせることができず、大きい腫瘍患部に対して無効である。
【００２７】
従って、これらの薬剤の併用投与は、進行したまたは大きい腫瘍を根絶するのにも抗腫瘍全身性免疫を生じさせるのにも有効であるという、発明者の発見は意外であり、癌治療における顕著な進歩を表すものである。
【００２８】
免疫療法剤は、ヒト（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ｕ８２４８３）またはマウス（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ｌ２１２０３）ＭＡｄＣＡＭ−１、ヒトＶＣＡＭ−１（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ｍ６０３３５）、ＩＣＡＭ−１（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ｊ０３１３２）、マウス（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ｘ０６１１５）またはヒト（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ｌ０８５９９）Ｅ−カドヘリン、Ｂ７．１（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＦ０６５８９６）またはＢ７．２（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ｌ２５６０６）をコードするＤＮＡ（通常はｃＤＮＡ）であってもよく、を含んでもよい。このようなｃＤＮＡは合成することができ、または商業的にまたは他のソースから入手してもよい。たとえば、ヒトＶＣＡＭ−１は、Ｒ  ＆  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｂｉｎｇｄｏｎ，ＵＫから入手でき、ヒトＩＣＡＭ−１は、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．（ＨＧＳ）から入手できるが、７．１は、Ｄｒ  Ｐ  Ｌｉｎｓｌｅｙ，Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ−  Ｓｑｕｉｂｂ，Ｓｅａｔｔｌｅ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＵＳＡから提供してもらうことができる。
【００２９】
その他のｃＤＮＡのソースは以下の通りである。
ヒトＭＡｄＣＡＭ−１：ＨＧＳから。
マウスＭＡｄＣＡＭ−１：Ｄｒ  Ｅｕｇｅｎｅ  Ｂｕｔｃｈｅｒ，Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｔａｎｆｏｒｄ，ＵＳＡから。
ヒトＥ−カドヘリン：Ｄｒｓ  Ｒｉｍｍ  ａｎｄ  Ｍｏｒｒｏｗ，Ｙａｌｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ，ＣＴ，ＵＳＡから。
マウスＥ−カドヘリン：ＤｒＭＴａｋｅｉｃｈｉ，ＫｙｏｔｏＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎから。
ヒトＢ７．２：Ｄｒ  Ｇｏｒｄｏｎ  Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｄａｎａ  Ｆａｒｂｅｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＤ，ＵＳＡから。
【００３０】
本発明の好ましい実施形態では、免疫療法剤は、哺乳類発現ベクターの形態で投与される。熟練者に入手可能なこのようなベクターのいずれを選択してもよいが、代表的なベクターとしては、ｐＣＤＮＡ３およびｐＣＤＭ８等の発現プラスミド、ならびにアデノウイルス系ベクターおよびレトロウイルス系ベクター（たとえば、ｐＬＸＳＮおよびｐＬＮＣＸ）などがある。
【００３１】
あるいは、哺乳類発現ベクター以外の他の形態で、免疫療法剤を直接投与してもよい、すなわち、免疫療法剤が遺伝子療法を使用して投与されることは必須ではない。たとえば、細胞表面に付着させることができるＴ細胞同時刺激性のＣＡＭタンパク質を全身投与することが可能である。
【００３２】
腫瘍成長制限剤は、少なくともある程度、腫瘍血流を制限することによって抗腫瘍作用を発揮する、入手可能な薬剤のいずれであってもよい。薬剤は、他の、同様に強力な、免疫調節特性を含む抗腫瘍特性も有してもよい。
【００３３】
本発明の幾つかの好ましい実施形態では、腫瘍成長制限剤は、ＦＡＡか、またはＸＡＡの機能的類似体である。ＤＭＸＡＡが特に好ましい。ＸＡＡの好ましい類似体は、式（Ｉ）：
【化１】
0004638098.tif 000002
で表されるものか、または製薬上許容できる塩またはそのエステルであり、式中、Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は、Ｈ、Ｃl〜Ｃ6アルキル、ハロゲン、ＣＦ3、ＣＮ、ＮＯ2、ＮＨ2、ＯＨ、ＯＲ、ＮＨＣＯＲ、ＮＨＳＯ2Ｒ、ＳＲ、ＳＯ2ＲまたはＮＨＲからなる群からそれぞれ独立に選択され（式中、各Ｒは独立に、ヒドロキシ、アミノおよびメトキシから選択される１つまたは複数の置換基で任意選択的に置換されたＣl〜Ｃ6アルキルである）、またＲ1、Ｒ2およびＲ3は、それぞれ可能な位置１〜８のいずれに存在してもよく、
また、式（Ｉ）の各炭素環式芳香族環において、最高２つのメチン（−ＣＨ＝）基はアザ（−Ｎ＝）基で置き換えられていてもよく、
また、Ｒ1、Ｒ2およびＲ3のうちいずれか２個は、さらに、基−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＝ＣＨ−を一緒に表すことができ、この基が結合する炭素原子または窒素原子と一緒に、縮合した芳香族６員環を形成する。
【００３４】
代わりの好ましい実施形態において、腫瘍成長制限剤は、低酸素誘導因子−１（ＨＩＦ−１）に抗して向けられる薬剤、特にＨＩＦ−１の発現または活性を乱す薬剤である。（ＨＩＦ−１は、低酸素を感知して、腫瘍血管の生成を刺激する低酸素誘導性遺伝子のスイッチを入れるのに関与する転写因子である。）これは、アンチセンス療法によって、特に、ＨＩＦ−１のアンチセンスバージョンをコードする発現ベクターの投与によって、簡便に行うことができる。従って、１つの好ましい実施形態では、本発明の方法は、ＨＩＦ−１のアンチセンスバージョンをコードする発現ベクターの投与と組み合わせた、免疫療法剤Ｂ７．１またはこれをコードする発現ベクターの投与を含む。
【００３５】
使用することが可能な他の腫瘍成長制限剤としては、αｖβ３インテグリンおよび関連タンパク質を標的とする試薬、エンドスタチンタンパク質およびｃＤＮＡ、アンギオスタチンｃＤＮＡ、ＩＬ−１２ｃＤＮＡ、ＶＥＧＦおよびそれらの受容体Ｋｌｋ−ｌおよびＦｌｔ−１を標的とするアンチセンス構築物、アンギオゲニン、ウロキナーゼプラスミノーゲンアクティベーター（ｕＰＡ）およびカルレチクリンなどがある。本発明の方法で使用することができる他の抗血管形成性試薬としては、ＶＨＬキャリアーペプチド、または低酸素誘導性経路を阻害する抗ＨＩＦ  ｓｃＦｖキャリアーペプチド等の細胞透過性タンパク質；または血管形成に必要なインテグリンαｖβ３を減ずるインテグリンβ−３細胞質ドメインキャリアーペプチドなどがある。
【００３６】
免疫療法剤および腫瘍成長制限剤は、当技術分野で既に知られている各薬剤に適した調製物を使用して、適当な剤形で投与することが可能である。投与可能な剤形および必要な投与量は、本発明で使用するために選択された個々の免疫療法剤および腫瘍成長制限剤によって異なる。
【００３７】
たとえば、腫瘍成長制限剤がＤＭＸＡＡであるとき、ＤＭＸＡＡは、最小有効量で投与されることが好ましい。特に好ましい実施形態では、ＤＭＸＡＡは、腫瘍組織に直接注射される。本発明者は、この点に関して、ＤＭＸＡＡを腫瘍に直接注射することにより、必要な有効量を減少できることも分かった。
【００３８】
本出願者は、免疫療法剤および第１の腫瘍成長制限剤に加えて、追加の腫瘍成長制限剤（特に抗血管形成薬）を都合よく投与することにより、付加的な治療効果を提供できることも分かった。たとえば、本発明の１つの好ましい実施形態では、免疫療法剤Ｂ７．１をコードする発現ベクターおよび腫瘍成長制限剤ＤＭＸＡＡの投与をＨＩＦ−１に抗するアンチセンス療法と併用する。
【００３９】
また、腫瘍成長制限剤がＤＭＸＡＡであり、且つ腫瘍に直接注射されるとき、別の毒性の低い抗血管形成試薬を同時に全身的に投与することが好ましい。
【００４０】
次に、説明するための例に過ぎない以下の実験のセクションに関連して、本発明の態様を説明する。
【００４１】
実験
材料および方法
マウスおよび細胞系
６〜９週齢のメスＣ５７１３Ｌ／６マウスは、Ａｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｕｎｉｔ，Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ａｕｃｋｌａｎｄ，Ａｕｃｋｌａｎｄから入手した。ＥＬ−４胸腺リンパ腫およびマウスＬｅｗｉｓ肺癌細胞（ＬＬＣ）（Ｈ−２ｂ）は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から購入した。これらの細胞系を、１０％ウシ胎仔血清、５０Ｕ／ｍｌ  ペニシリン／ストレプトマイシン、Ｌ−グルタミン２ｍＭ、１ｍＭピルベートを加えたＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ    ＢＲＬ）中、３７℃で、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養した。
【００４２】
実験的腫瘍モデル。２×１０5個のＥＬ−４細胞およびＬＬＣ細胞をマウスの左側腹部に皮下注射することによって腫瘍を確立し、２つの直交する直径を測定することにより、成長を決定した。腫瘍が直径１ｃｍを超えたとき、動物倫理承認（Ａｎｉｍａｌ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ａｐｐｒｏｖａｌ）（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ａｕｃｋｌａｎｄ）に従って動物を安楽死させた。ＥＬ−４腫瘍およびＬＬＣ腫瘍は、それぞれ、およそ２１日および１４日後に、直径０．６〜０．９に達した。全ての実験に、治療群当たり５匹または匹の６マウスが含まれ、且つ各実験を少なくとも一度繰返した。
【００４３】
投与ＦＡＡおよびＤＭＸＡＡ類似物。
ＦＡＡは、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ＆  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｄｒｕｇ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ＆  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＵＳＡから寄贈された。ＤＭＸＡＡのナトリウム塩は、Ａｕｃｋｌａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｒｅ，Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ａｕｃｋｌａｎｄで合成された。それぞれ、５％（ｗ／ｖ）重炭酸ナトリウムおよび水に溶解したＦＡＡおよびＤＭＸＡＡの溶液を、各実験用に新たに調製し、光から保護した。０．０１ｍｌ／ｇ体重の容量で、それぞれ、３００ｍｇ／Ｋｇ体重および２５ｍｇ／Ｋｇ体重のＦＡＡおよびＤＭＸＡＡを腹腔内注射した。
【００４４】
Ｂ７．１の遺伝子導入。全長ヒトＶＣＡＭ−１をコードする相補的ＤＮＡは、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｂｉｎｇｄｏｎ，ＵＫから購入し；ヒトＢ７．２（Ｆｒｅｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ，１９９３）は、Ｄｒ  Ｇ．Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｄａｎａ  Ｆａｒｂｅｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＤから提供され；ヒトＩＣＡＭ−１は、Ｄｒ  Ｊ．Ｎｉ，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤにより供与され；マウスＢ７．１（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ，１９９２）は、Ｄｒ  Ｐ．Ｌｉｎｓｌｅｙ，Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ−Ｓｑｕｉｂｂ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡにより提供された。我々は、ヒトＭＡｄＣＡＭ−１  ｃＤＮＡのクローニングおよび特性決定について、先に報告した（Ｌｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ，１９９６）。ＣＡＭ  ｐＣＤＭ８発現ベクターを塩化セシウム勾配遠心分離で作製し、０．０１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００に溶解した５％グルコース溶液で、６００μｇ／ｍｌに希釈した。これらを、１：３（重量：重量）の比率で、ＤＯＴＡＰ陽イオン性リポソーム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）と混合した。腫瘍は、特に記載がなければ、ＤＮＡ（６０μｇ）／リポソーム複合体１００μｌと共に注射した。
【００４５】
Ｂ７．１仲介免疫療法とＦＡＡ／ＤＭＸＡＡ仲介血管系攻撃との併用。直径０．６〜０．９ｃｍの腫瘍を、ＤＮＡ（６０μｇ）／リポソーム複合体１００μｌと共に多数の部位に注射した。２４時間後、上記の通り、ＤＭＸＡＡまたはＦＡＡを腹腔内投与した。ＦＡＡまたはＤＭＸＡＡおよびＢ７．１を投与した６週間後、無腫瘍のままであった処理マウスに、反対側の側腹部（右側腹部）に皮下注射することによって、ＥＬ−４細胞およびＬＬＣ細胞（０．１ｍｌ）を再投与した。
【００４６】
抗腫瘍ＣＴＬ生成の測定。初回遺伝子導入の２１日後および４２日後、および親腫瘍投与の２２日後に、脾細胞を収穫した。この脾細胞を、９６ウェル丸底プレートで、ＥＬ−４標的細胞と共に、段階的Ｅ：Ｔ比で、３７℃にてインキュベートした。４−時間インキュベートした後、上澄５０μｌを回収し、Ｃｙｔｏ  Ｔｏｘ  ９６  Ａｓｓａｙ  キット（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）を使用して、溶解を測定した。非特異的標的用のバックグラウンド対照およびエフェクター細胞溶解を含めた。バックグラウンドを減じた後、式：１００×（実験的−自発的エフェクター−標的自発的標的／最大標的−自発的標的）を使用して、細胞溶解のパーセンテージを算出した。
【００４７】
抗腫瘍ＣＴＬの養子免疫細胞移入。抗腫瘍脾細胞の養子免疫細胞移入は既述の通りであった（Ｋａｎｗａｒ  ｅｔ  ａｌ，１９９９）。簡単に説明すると、治療の２１日後にマウスから得た脾細胞を、１％ＦＣＳを含むＨａｎｋｓ均衡塩溶液に再懸濁し、５μｇ／ｍｌＰＨＡおよび１００Ｕ／ｍｌ組換えマウスＩＬ−２で４〜５日間刺激した。直径０．６ｃｍの腫瘍を担持する動物に、２×１０8個の培養脾細胞の腫瘍内注射と腹腔内注射の両者を行った。
【００４８】
白血球部分集団の枯渇。遺伝子導入の４日前および、その後、隔日に、３００μｇ（０．１ｍｌ）の５３−６．７２（抗ＣＤ８）、Ｇｋ１．５（抗ＣＤ４）、およびＰＫ１３６（抗ＮＫ）ｍＡｂを腹腔内および静脈内注射することにより、マウスからＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞を枯渇させた。ラットＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ）を対照抗体として使用した。抗体は、腹水の硫酸アンモニウム分画であり、ＦＡＣＳ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＆  Ｃｏ．，ＣＡ，ＵＳＡ）染色脾細胞で、少なくとも１：２，０００であると滴定された。個々の白血球部分集団の枯渇は、ＦＡＣＳｃａｎ分析で決定したとき、９０％以上有効であった。マウスＣＤ８（５３−６．７２ｍＡｂ）、ＣＤ４（Ｇｋｌ．５ｍＡｂ）、およびＮＫ細胞（ＰＫ１３６ｍＡｂ）に対するラットハイブリドーマ分泌ｍＡｂは、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡから購入した。
【００４９】
アポトーシス細胞のｉｎ  ｓｉｔｕ枯渇。腫瘍を切除し、ドライアイスで即座に凍結し、−７０℃で保存し、厚さ６μｍの連続切片を作製した。Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙからのｉｎ  ｓｉｔｕアポトーシス検出キットを使用して、ＴＵＮＥＬ染色を実施した。簡単に説明すると、凍結した切片をパラホルムアルデヒド溶液（ＰＢＳ中４％、ｐＨ７．４）で固定し、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００および０．１％クエン酸ナトリウムを含む溶液で透過処理した。洗浄後、これらをＴＵＮＥＬ試薬２０μｌと共に３７℃にて６０分間インキュベートし、蛍光顕微鏡で検査した。壊死細胞とアポトーシスを受けている細胞とを区別するために、幾つかのスライドをヨウ化プロピジウム（ＰＩ；Ｓｉｇｍａ，ＣＡ，ＵＳＡ）で対比染色した。隣接する切片をヘマトキシリン・エオシンで対比染色し、スライドに載せた。アポトーシス細胞または壊死細胞の総数を計数した。アポトーシス指数（ＡＩ）または壊死指数（ＮＩ）は、以下の通りに算出した。ＡＩまたはＮＩ＝アポトーシス細胞または壊死細胞の数×１００／有核細胞総数。
【００５０】
免疫組織学。治療薬および対照の投与後第７日に腫瘍を切除し、ドライアイスで凍結し、イソペンタン中で−７０℃にて保存し、厚さ１０μｍの切片を作製した。切片をポリＬ−リシン−被覆スライドに載せ、メタノール中０．３％Ｈ2Ｏ2中で、スライドを３０分間インキュベートすることにより、内因性ペルオキシダーゼをブロックした。マウス−オン−マウス免疫検出ＡＢＣ  Ｅｌｉｔｅペルオキシダーゼキット（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して、切片をマウス抗Ｈｓｐ７０ｍＡｂ（ＳＰＡ−８１０  抗体；ＳｔｒｅｓｓＧｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｖｉｃｔｏｒｉａ，Ｃａｎａｄａ）で染色した。切片を、ＳＩＧＭＡＦＡＳＴＤＡＢ（３，３’−ジアミノベンジジン四塩酸塩）と金属エンハンサーＣｏＣ１2錠剤で現像し、ヘマトキシリン・エオシンで対比染色した。対照として、一次抗体をラットＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ）と代えた。
【００５１】
統計解析。ｉｎ  ｖｉｖｏで実施した全ての実験を少なくとも一度繰返し、類似した結果が得られた。結果を、平均値＋標準偏差（Ｓ．Ｄ．）として表し、統計学的有意性の評価に、Ｓｔｕｄｅｎｔ'ｓ  ｔ検定を使用した。ｐ＜０．０５の値は、統計学的有意性を示し、ｐ＜０．００１は、極めて有意である結果を示す。
【００５２】
結果
ＣＡＭ遺伝子単一療法は、大きい腫瘍の成長を抑制することができない。マウスに皮下移植されたＥＬ−４細胞（２×１０5）は急速に成長し、４週以内に直径１ｃｍの充実性腫瘍を形成する。先に、我々は、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＶＣＡＭ−１、およびＩＣＡＭ−１  ｃＤＮＡでｉｎ  ｓｉｔｕトランスフェクトされた小さいＥＬ−４腫瘍（直径０．１〜０．３ｃｍ）は成長できず、マウスは、少なくとも２ヶ月間無腫瘍のままであることを証明した（Ｋａｎｗａｒ  ｅｔ  ａｌ，１９９９）。対照的に、図１ａに示す通り、大きい腫瘍（＞０．５ｃｍ）は、Ｂ７．１および幾つかの他の同時刺激性ＣＡＭに応答した治療に反応しない。腫瘍成長は遅れるが、腫瘍は結局抑制されずに成長する。
【００５３】
ＤＭＸＡＡおよびＦＡＡは、大きい腫瘍の成長を抑制できない。大きいＥＬ−４腫瘍（直径０．６〜０．８ｃｍ）を担持するマウスに、最適用量のＤＭＸＡＡおよびＦＡＡを全身性投与すると、著しい腫瘍壊死を伴って（以下参照）、腫瘍サイズは直ちに縮小した（図Ｉｂ）。ＤＭＸＡＡは２つの試薬のうちでより強力であり、３週間にわたって腫瘍を０．１〜０．２に縮小させ、ＦＡＡ投与動物の腫瘍は、直径０．２〜０．４ｃｍに縮小した。しかし、２８日までに、腫瘍は抑制されずに成長しはじめ、第６週の間に、動物を屠殺しなければならなかった。
【００５４】
Ｂ７．１およびＤＭＸＡＡ／ＦＡＡの定期配送による併用療法は、大きい腫瘍を根絶する。死にかけている腫瘍細胞および壊死性腫瘍細胞は、Ｂ７．１を十分に発現することができないため、Ｂ７．１ｐＣＤＭ８発現ベクターとＤＭＸＡＡ／ＦＡＡとの同時投与は、ＣＡＭ仲介抗腫瘍免疫を害する可能性があると、我々は仮説を立てた。この考えは正しいことが判明したため、確立した腫瘍（直径０．６〜０．８ｃｍ）に先ずＢ７．１を投与して抗腫瘍免疫を刺激し、１日後にＤＭＸＡＡおよびＦＡＡを投与して腫瘍成長を遅らせた。明らかに、腫瘍はＢ７．１とＤＭＸＡＡとの組合わせに応答して、大量の壊死を伴って急速に縮小し、治療の第３週までに腫瘍が完全に消失した（図１ｂ）。ＤＭＸＡＡ−Ｂ７．１投与動物の大きい腫瘍は、完全に治癒した皮膚を残して最終的に剥がれ落ちる痂皮を形成して、急速に治癒する創傷の様相を呈した。触知できる繊維性のコアであると考えられるものを残すＢ７．１治療と違って、ＤＭＸＡＡ−Ｂ７．１投与動物の腫瘍部位は完全に治癒した（図１ｃ）。ＦＡＡとＢ７．１との併用で類似した結果が得られたが、腫瘍は６ヶ月まで完全に消失しなかった。
【００５５】
併用療法は、強力で且つ長期の腫瘍特異的細胞障害性Ｔ細胞活性を生じさせる。遺伝子導入の２１日後に、処理マウスから得られた脾細胞の抗腫瘍ＣＴＬ活性は、Ｂ７．１単一療法を受けた動物に対して、Ｂ７．１とＤＭＸＡＡとの組み合わせで治療した動物で有意に（ｐ＜０．００１）増大し、Ｂ７．１とＦＡＡとの組合わせで僅かに増大した（図２ａ）。対照的に、ＤＭＸＡＡおよびＦＡＡのみでは、空のベクターおよびリポソーム対照の場合にみられるものより高くＣＴＬ酸性を増強したものの、非常に劣るエフェクターであった。
【００５６】
先に組合わせ療法で治癒した動物は、モニタリングした４０日間、１×１０7個の親腫瘍細胞というかなりの投与を完全に拒絶した（図１ｂ、表１）。ＤＭＸＡＡ−Ｂ７．１療法もＦＡＡ−Ｂ７．１療法も完全な防護を提供し、強力な全身性抗腫瘍免疫が実現したことを示した。ＤＭＸＡＡ−Ｂ７．１の初回投与の４２日後に、抗腫瘍ＣＴＬ活性は依然として非常に強く、親腫瘍細胞の再投与後、さらに刺激された（図２ａ）。
【００５７】
腫瘍をＢ７．１で治療したマウスからの脾細胞の養子免疫細胞移入により、レシピエントの腫瘍が根絶されることを、我々は以前に報告した（Ｋａｎｗａｒ  ｅｔ  ａｌ，１９９９）。これと一致して、確立されたＥＬ−４腫瘍（直径０．８ｃｍまで）を担持するレシピエントに、Ｂ７．１−ＤＭＸＡＡ投与マウスおよびＢ７．１−ＦＡＡ投与マウスからの脾細胞２×１０8個を養子免疫細胞移入することにより、腫瘍が急速且つ完全に退縮した（図２ｂ）。直径０．８ｃｍより大きい腫瘍は、このような治療に反応しなかった。対照的に、ＤＭＸＡＡまたは空のベクターを投与したマウスからの脾細胞は、検出可能な抗腫瘍活性を全く示さなかった。
【００５８】
白血球エフェクター群の組成。ｉｎ  ｖｉｖｏ抗体ブロッキング試験で、ＤＭＸＡＡ−Ｂ７．１またはＦＡＡ−１３７．１のいずれかの併用療法に応答した腫瘍の一次拒絶は、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞の存在によって非常に左右されるが、ＣＤ４＋Ｔ細胞には部分的に左右されるにすぎないことが明らかにされた。ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞；ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞；またはＣＤ４＋／ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞のいずれかの同時枯渇は、抗腫瘍免疫をひどく害し、急速な腫瘍成長につながる（図３）。
【００５９】
抗腫瘍免疫は腫瘍特異的である。弱い免疫原性ＬＬＣで、上記と類似した結果が得られた。このように、Ｂ７．１−ＤＭＸＡＡ併用療法は、皮下ＬＬＣのマウスを完全に治癒し、また、１×１０5個の親腫瘍細胞投与から全てのマウスを護り、１×１０7個の腫瘍細胞投与からマウスの８０％を護る、抗腫瘍全身性免疫を生じさせた（表１）。しかし、ＥＬ−４腫瘍が治癒したマウスは、１×１０4個のＬＬＣ細胞投与に耐えることはできず、逆に、ＬＬＣが治癒したマウスは、１×１０4個のＥＬ−４細胞投与から護られず、抗腫瘍免疫は腫瘍特異的であることを示した。
【００６０】
遺伝子投与量効果。ＦＡＡもＤＭＸＡＡも、非常に狭い範囲の高用量（２２．５〜２５ｍｇ／Ｋｇ体重）のみが有効であり、且つ毒性に関して許容できる独特の「閾値」挙動を有する（Ｂａｇｕｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ，１９９３；Ｐｅｄｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ，１９９６）。さらに、我々は、Ｂ７．１／ｐＣＤＭ８発現プラスミド６０μｇの遺伝子導入が最適であり、より少量または多量では、効果がはるかに低いという、Ｂ７．１および他の同時刺激性ＣＡＭは、制限的な遺伝子投与量効果を示すことを報告した（Ｋａｎｗａｒ  ｅｔ  ａｌ，１９９９）。遺伝子高投与量が組合わせ療法を害するかどうかを調査するために、腫瘍に様々な量（９０〜１８０μｇ）のＢ７．１／ｐＣＤＭ８プラスミドを注射した後、最適用量のＤＭＸＡＡ（２５ｍｇ／Ｋｇ）を投与した（図４ａ）。全てのマウスは、腫瘍および２×１０5個の親ＥＬ−４細胞投与を急速に拒絶した。従って、広範囲の高用量医療用遺伝子および最適用量のＤＭＸＡＡで、同じ結果が得られた。対照的に、ＤＭＸＡＡ濃度が最適以下であった場合、大量（１８０μｇ）のＢ７．Ｉ／ｐＣＤＭ８発現プラスミドのみが、効果的な抗腫瘍免疫を引き起こすことができるというように、遺伝子投与量効果は明らかに明白である（図４ｂ）。
【００６１】
Ｂ７．１およびＤＭＸＡＡ仲介腫瘍退縮のメカニズム。ＣＡＭ仲介抗腫瘍免疫は、パーフォリンリガンド経路とＦａｓリガンド経路の両者を含むＣＴＬ活性増強を伴い、ＥＬ−４細胞は、免疫が仲介するプログラムされた細胞死を受けるように方向付けされていることが示唆されると、我々は以前に報告した（Ｋａｎｗａｒ  ｅｔ  ａｌ，１９９９）。この考えは、Ｂ７．１遺伝子導入の７、１４、および２１日後に作製された腫瘍切片のＴＵＮＥＬ染色によって確認された。壊死細胞のＤＮＡのみを染色し、壊死細胞とアポトーシス細胞の区別を可能にする、ＰＩで切片を対比染色した。Ｂ７．１免疫療法は、７日に、著しい腫瘍細胞アポトーシス（緑色蛍光）を伴い、遺伝子導入の１４日後にピークとなり、２１日に著しい壊死（橙色の蛍光）に代わった（図５ａ、ｂおよびｆ）。対照的に、アポトーシス細胞は非常に少数しか存在しない、ＤＭＸＡＡ投与マウスからの腫瘍切片では、壊死細胞が優勢であった（図５ｄ）。意外なことに、併用療法は、Ｂ７．１単一療法（図５ｃ）と比べて、アポトーシス細胞の数を増加させたが、ＤＭＸＡＡ単一療法で観察されたものと同程度の壊死が存続していた。壊死およびアポトーシス細胞の兆候を全く示さなかった未治療の腫瘍は存在しなかった（図５ｅ）。
【００６２】
我々は、ＤＭＸＡＡに応答してＣＴＬの生成が少し増加することは、ストレスを受けて死にかけている腫瘍細胞上でアップレギュレートされたヒートショックタンパク質に応答したＣＴＬの発生によって引き起こされた間接的な効果であるという仮説を立てた。事実、ヒートショックタンパク質７０は、血管周囲または血管付近のいずれの腫瘍細胞上でも、一貫してアップレギュレートされていた（図６）。同様に、ｈｓｐ７０は、必ずしも血管付近ではないが、Ｂ７．１で処理された腫瘍でアップレギュレートされていた。対照的に、空のベクターのみで処理された腫瘍では、ｈｓｐ７０発現増大の兆候はなかった。
【００６３】
【表１】
0004638098.tif 000003
【００６４】
アンチセンスＨＩＦ−１αをコードする発現プラスミドの遺伝子導入は、確立された腫瘍の拒絶を誘導する。直径０．１ｃｍのＥＬ−４腫瘍をＣ５７ＢＬ／６マウスで確立し、１００μｇのアンチセンスＨＩＦ−１α  ｐｃＤＮＡ３ＢプラスミドＤＮＡを含むＤＮＡ／リポソームトランスフェクション媒体を注射した。遺伝子導入の２日後に作製した腫瘍切片の免疫組織化学的分析で、アンチセンス療法は、成長している腫瘍で内因的に発現されるＨＩＦ−１をほぼ完全に阻害することが明らかにされた（図９Ａ）。腫瘍成長を、遺伝子導入後４週間モニタリングした（図１０ａ）。成長パターンを、空のベクター対照１００μｇを投与したマウスと比較した。腫瘍は、対照群で急速に成長し、遺伝子導入の１４〜１７日に１ｃｍのサイズに達したが、アンチセンスＨＩＦ−１αプラスミドを投与した腫瘍は、遺伝子導入の１週間以内に、完全且つ急速に退縮した。マウスは、モニタリングしていたさらなる２１日間、無腫瘍のままであった。
【００６５】
アンチセンスＨＩＦ−１α療法は大きい腫瘍を根絶しないが、その成長を遅らせる。
腫瘍は、いったん直径０．３ｃｍに達すると、免疫療法に反応しなくなることを、我々は以前に証明した。大きい腫瘍に対して、アンチセンスＨＩＦ−１α療法が同様に無効であるかどうかを判定するために、直径０．４ｃｍのＥＬ−４腫瘍を確立し、アンチセンスＨＩＦ−１α発現プラスミド１００μｇを投与した。図１０ｂに示す通り、腫瘍成長の有意な（Ｐ＜０．０１）阻害は認められたが、腫瘍を拒絶したマウスはなかった。全ての腫瘍が２週以内に最終的に直径１ｃｍに達し、マウスを安楽死させなければならなかった。
【００６６】
アンチセンスＨＩＦ−１αによる血管攻撃は、Ｂ７−１免疫療法と相乗的に作用して、大きい腫瘍根絶する。ここで、我々は、抗ＨＩＦ−１α試薬が、併用療法におけるＤＭＸＡＡに代わる適当な抗血管形成薬である可能性について考える。既報1の通り、小さい腫瘍（直径０．１ｃｍ）にＢ７−１発現プラスミドを遺伝子導入することにより（図１０ａ）、遺伝子導入の１週以内に腫瘍が根絶された。Ｂ７−１およびアンチセンスＨＩＦ−１αを投与された腫瘍の成長パターンの間に有意差はなかった（Ｐ＞０．０５）。対照的に、大きい腫瘍（直径０．４ｃｍ）は、アンチセンスＨＩＦ−１α療法の場合と同様、治療に応答しなかった（図１０ｂ）。先の研究で報告した通り、Ｂ７−１遺伝子導入により、腫瘍細胞の９０％でＢ７−１が発現したため、Ｂ７−１療法の失敗は、トランスフェクション効率が不十分であった結果ではない。併用療法の場合、直径０．４ｃｍの腫瘍に、Ｂ７−１  １００μｇを含むＤＮＡ／リポソーム複合体を先ず注射し、４８時間後、アンチセンスＨＩＦ−１αプラスミド１００μｇを注射した。組合わせ遺伝子療法により、腫瘍は１０日以内に完全に退縮し、マウスは３週間、無腫瘍のままであった（図１１）。全身性抗腫瘍免疫が生じたかどうかを判定するために、治癒したマウスに１×１０6個の親腫瘍細胞を再投与した。このようなマウスは誘発に抵抗し、少なくとも２ヶ月間、無腫瘍のままであった。
【００６７】
対照として、Ｂ７−１免疫療法を、センス配向でｐｃＤＮＡ３に挿入されたＨＩＦ−１α  ｃＤＮＡ断片をコードする発現プラスミドと併用した。
上記の結果と著しく対照的に、センスＨＩＦ−１αはＢ７−１の治療効果を増強することができず（図１１）、空のベクターを投与された対照マウスと統計学的に（Ｐ＞０．０５）異ならない結果を示した。
【００６８】
アンチセンスＨＩＦ−１α療法は、ＶＥＧＦ発現を阻害し、且つ腫瘍血管の密度を低下させる。ＨＩＦ−１αアンチセンスがＥＬ−４腫瘍細胞におけるＨＩＦ−１αの発現をダウンレギュレートするのであれば、我々は、ＶＥＧＦ等の下流エフェクターの発現が廃止されるのかどうかを判定しようと考えた。ＶＥＧＦの発現は、アンチセンスＨＩＦ−１αに応答して特異的に減少し（図９Ａ、図ｃおよびｄと比較されたい）、結果として、空のベクターによる偽治療と比較して、統計学的に有意な（Ｐ＜０．０１）、３０％の腫瘍血管密度低下を来たした（図９ＢおよびＣ）。さらに、アンチセンスＨＩＦ−１α療法後に存在する腫瘍血管は小さく且つ形成不良であった。
【００６９】
材料および方法
マウスおよび細胞
６〜８週齢のオスＣ５７ＢＬ／６マウスは、Ａｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｕｎｉｔ，Ｆａｃｕｌｔｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ａｕｃｋｌａｎｄ，Ａｕｃｋｌａｎｄ，Ｎｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄから入手した。Ｃ５７ＢＬ／６（Ｈ−２ｂ）起源のＥＬ−４胸腺リンパ腫は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）から購入した。これを、１０％ウシ胎仔血清、５０Ｕ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１ｍＭピルベートを加えたＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）中、３７℃にて培養した。
【００７０】
発現プラスミド
ＨＩＦ−１αの５’末端をコードする３２０ｂｐのｃＤＮＡ断片（ヌクレオチド１５２〜４５４；Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＦ００３６９８）を、鋳型としてのＩＭＡＧＥクローン８５１２３７、および２つのプライマー（５’  ＧＧＧ  ＧＡＴ  ＣＣＴ  ＣＴＧ  ＧＡＣ  ＴＴＧ  ＴＣＴ  ＣＴＴ  ＴＣ３’および５’ＧＧＧ  ＣＴＣ  ＧＡＧ  ＴＡＡ  ＣＴＧ  ＡＴＧ  ＧＴＧ  ＡＧＣ  ＣＴＣ  ３’）を使用して、ＰＣＲで作製した。この断片をｐＧＥＭＴ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）にクローニングし、次いでＢａｍＨＩ部位およびＸｈｏＩ部位にてセンス配向で、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｍｐａｎｙ）にサブクローニングし、ＸｈｏＩ部位およびＢａｍＨＩ部位にてアンチセンス配向でｐｃＤＮＡ３Ｂにクローニングした。ポリリンカーが逆であること以外は、ｐｃＤＮＡ３Ｂ発現ベクターはｐｃＤＮＡ３と同じである（Ｌｅｈｎｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，未発表）。全長マウスＢ７−１をコードする１．２ｋｂのｃＤＮＡ断片を含む発現プラスミドＢ７−１−ｐＣＤＭ８を、Ｄｒ  Ｐ  Ｌｉｎｓｌｅｙ，Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ−Ｓｑｕｉｂｂ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ，ＵＳＡにより提供されたｃＤＮＡクローンから構築した。
【００７１】
発現プラスミドの遺伝子導入および抗腫瘍活性の測定
精製プラスミドを、０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００中５％グルコースの溶液で希釈し、１：３（重量：重量）の比率で、ＤＯＴＡＰ陽イオン性リポソーム（効率のよいトランスフェクション媒体である：Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）と混合した。最終プラスミド濃度は、１ｍｇ／ｍｌであった。２×１０5個のＥＬ−４腫瘍細胞をマウスの右側腹部に注射することによって腫瘍を確立し、２つの直交する直径を測定することにより、成長を決定した。腫瘍が直径１ｃｍを超えたとき、動物倫理承認（Ａｎｉｍａｌ  ＥｔｈｉｃｓＡｐｐｒｏｖａｌ）（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ａｕｃｋｌａｎｄ）に従って動物を屠殺した。腫瘍は、およそ１４〜１８日後に、直径０．１ｃｍおよび０．４ｃｍに達し、発現プラスミド１００μｌ（１００μｇ）を注射した。併用治療の場合、Ｂ７−１／ＤＭＸＡＡ併用療法について上述した通り、試薬は、定期様式で送達した。従って、Ｂ７−１  ｃＤＮＡを先ず注射し、続いて４８時間後にＨＩＦアンチセンス  ｃＤＮＡを注射した。空のベクターは、対照試薬の役割を果たした。腫瘍が消失した３週後、１×１０6個のＥＬ−４細胞を反対の側腹部（左側腹部）に皮下注射することにより、治癒したマウスを再攻撃した。全ての実験は、群あたりマウス６匹を含み、各実験は、少なくとも一度繰返した。結果を、平均値±標準偏差（Ｓ．Ｄ．）表し、統計学的有意性の評価にはＳｔｕｄｅｎｔ'ｓ  ｔ検定を使用した。０．０５未満の値（Ｐ＜０．０５）は統計学的有意性を示す。
【００７２】
免疫組織化学
遺伝子導入の２日後に腫瘍凍結切片（１０μｍ）を作製し、アセトンで処理し、ＰＢＳですすぎ、２％ＢＳＡで２時間ブロックした。切片を、ハムスター抗Ｂ７−１ｍＡｂ（１Ｇ１０，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、マウス抗マウスＨＩＦ−１αｍＡｂ（Ｈ１α６７，Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．，Ｌｉｔｌｅｔｏｎ，ＣＯ，ＵＳＡ）、またはＶＥＧＦに対するウサギポリクローナル抗体（Ａｂ−１，Ｌａｂ  Ｖｉｓｉｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；ＣＡ，ＵＳＡ）のいずれかと共に一晩インキュベートした。続いて、ＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｑｕｉｃｋ  キット（Ｖｅｃｔｏｒ    Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して、適切な二次抗体と共に３０分間インキュベートし、Ｓｉｇｍａ  ＦＡＳＴ  ＤＡＢ（３，３−ジアミノベンジジン四塩酸塩）およびＣｏＣｌ2エンハンサー錠剤（Ｓｉｇｍａ）で現像した。Ｍａｙｅｒのヘマトキシリンで切片を対比染色し、スライドに載せ、顕微鏡で検査した。
【００７３】
血管分布の評価
血管分布の評価方法は、記載33の通りであった。簡単に説明すると、遺伝子導入の４日後に、新たに凍結した腫瘍から１０μｍの切片を切り取った。上述の通り、抗ＣＤ３１抗体、ＭＥＣ１３．３（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）でスライドを免疫染色した。盲目的に選択されたランダムの視野で、抗ＣＤ３１ｍＡｂで染色された血管を計数した。
【００７４】
産業上の応用性
このように、本発明により、出願者は、進行したまたは大きい腫瘍の根絶に関して、以前のアプローチより顕著な進歩を示す癌治療法を提供した。本発明により表される進歩は、腫瘍成長制限剤の投与前に、免疫療法剤が適切な期間投与される場合、特に、目覚しい。この結果、大きい腫瘍患部が完全に根絶され、強力な抗腫瘍全身性免疫が生じる。
【００７５】
当業者は、上記説明が単に例として提供されること、また本発明はそれに限定されないことを理解するであろう。
【００７６】
参考文献
【表２】
0004638098.tif 000004
【００７７】
【表２（つづき）】
0004638098.tif 000005
【００７８】
【表２（つづき）】
0004638098.tif 000006
【００７９】
【表２（つづき）】
0004638098.tif 000007
【００８０】
【表２（つづき）】
0004638098.tif 000008
【図面の簡単な説明】
【図１】  薬剤ＤＭＸＡＡまたはＦＡＡとＢ７．１免疫遺伝子とを併用すると、強力な抗腫瘍全身性免疫を生じさせるが、単一療法は無効である。（Ａ）ＣＡＭ遺伝子導入は、大きい腫瘍の拒絶を引き起こすことはできない。直径０．５ｃｍの確立された腫瘍に、６０μｇのＢ７．１、Ｂ７．２、ＩＣＡＭ−１、ＭＡｄＣＡＭ−１、およびＶＣＡＭ−１  ｃＤＮＡを含むＤＯＴＡＰリポソームを注射した。対照の動物には、６０μｇｏｆ空のｐＣＤＭ８ベクター、またはリポソームを投与した。各ＣＡＭの遺伝子導入は腫瘍成長を遅らせたが、最終的に腫瘍は抑制されずに成長し、動物を安楽死させなければならなかった。（Ｂ）薬剤ＤＭＸＡＡまたはＦＡＡとＢ７．１免疫遺伝子とを併用すると大きい腫瘍を根絶する。０．６〜０．８ｃｍの腫瘍を担持する動物に、０．０１ｍｌ／ｇ体重の容量で、それぞれ、３００ｍｇ／Ｋｇ体重および２５ｍｇ／Ｋｇ体重のＤＭＸＡＡまたはＦＡＡを腹腔内注射した。併用療法を受けた動物の場合、６０μｇのＢ７．１  ｃＤＮＡを含むＤＯＴＡＰリポソームを腫瘍に注射し、ＤＭＸＡＡまたはＦＡＡを２４時間後に投与した。対照の動物には、指示通りに、６０μｇの空のｐＣＤＭ８ベクター、またはリポソームのみを投与した。遺伝子導入後４２日間、腫瘍のサイズ（ｃｍ）をモニタリングした。腫瘍が直径１ｃｍを超えた場合、マウスを安楽死させた（小さい垂直の矢印で示す）。実験は２回繰返した。４２日後、腫瘍が治癒したマウスに１０6個の親腫瘍細胞を再投与し（大きい垂直の矢印）、腫瘍再成長についてマウスをさらに２２日間モニタリングした。（Ｃ）確立され、治療された腫瘍を有するマウスの写真。大きい（０．８ｃｍ）確立されたＥＬ−４腫瘍を担持するマウス、およびＢ７．１およびＤＭＸＡＡの併用治療後８日および２９日に類似したサイズの腫瘍を担持するマウスを示す。
【図２】  Ｂ７．１免疫療法とＤＭＸＡＡ療法を併用するとＣＴＬ活性が増強し、これを養子移入して腫瘍を根絶することができる。（Ａ）異なる治療計画で生じた抗腫瘍ＣＴＬ活性の比較。異なる治療計画の２１日後に、動物から脾細胞を切除し、ＥＬ−４腫瘍細胞に対する細胞障害性活性について試験した。細胞障害性（％）を、様々なエフェクターと標的（Ｅ：Ｔ）との比率に対してプロットした。対照の動物には、空のｐＣＤＭ８ベクターまたはリポソームのみを投与した。挿入図は、親ＥＬ−４腫瘍細胞を再投与後、Ｂ７．１−ＤＭＸＡＡで治療した４２日後、およびさらに２２日後（６４日）に、動物から収穫した脾細胞の細胞障害性活性を示す。（Ｂ）確立された腫瘍の根絶；治療マウスからの抗腫瘍ＣＴＬの養子免疫細胞移入。腫瘍内注射および腹腔内注射によって、治療マウスおよび対照マウスから確立された腫瘍（直径〜０．６ｃｍ）を担持するレシピエントマウスに、脾細胞（２×１０8）を養子移入した。各棒は、マウス５匹または６匹の結果の平均値＋ＳＤを表す。
【図３】  抗腫瘍免疫は、大部分は、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞により仲介される。腫瘍（直径〜０．６ｃｍ）をマウスに確立し、白血球部分集団の併用療法への寄与を抗体遮断で試験した。治療の４日前および実験期間中隔日に、（ａ）ＣＤ４（ＧＫ１．５ｍＡｂ）；（ｂ）ＮＫ細胞（ＰＫ１３６ｍＡｂ）；（ｃ）ＣＤ８（５３−６．７２ｍＡｂ）；（ｄ）ＣＤ８およびＮＫ細胞；（ｅ）ＣＤ４、ＣＤ８、およびＮＫ細胞；および（ｆ）ＣＤ４およびＣＤ８に対するｍＡｂを投与した。各パネル（ａ〜ｆ）は、抗白血球遮断ｍＡｂをラットＩｇＧと代えた対照実験を含んでいた。腫瘍が直径１ｃｍを超えた場合、マウスを屠殺した（垂直の矢印で示す）。各棒は、マウス５匹または６匹の結果の平均値＋ＳＤを表す。
【図４】  併用療法は、効果的な療法に必要な狭い範囲の治療用試薬投与量を不要にする。１７日後、腫瘍（直径〜０．５ｃｍ）を確立し、異なる量のＢ７．１  ｃＤＮＡ（９０〜１８０μｇ）を注射した。２４時間後、２５ｍｇ／Ｋｇ体重（上のパネル）および１８ｍｇ／Ｋｇ体重（下のパネル）のＤＭＸＡＡを腹腔内投与した。各棒は、マウス５匹または６匹の結果の平均値＋ＳＤを表す。
【図５】  Ｂ７．１とＤＭＸＡＡ療法に応答した腫瘍細胞死のメカニズムは異なる。治療の７日後および２１日後に、確立された腫瘍からの切片を作製し、アポトーシス細胞用のＴＵＮＥＬ分析で染色し（緑色蛍光性の細胞は、濃縮され、断片化された核を示す）、また、壊死細胞を明らかにするためにヨウ化プロピジウムで対比染色した（橙色）、×１００。代表的な切片（ａ）Ｂ７．１治療の７日後；（ｂ）Ｂ７．１治療の２１日後；（ｃ）Ｂ７．１−ＤＡＣＣＡＡ併用療法の７日後；（ｄ）ＤＭＸＡＡ投与の７日後；および（ｅ）空の対照ベクター注射の７日後を示す。Ｂ７．１単一療法に応答した腫瘍細胞アポトーシスは、アポトーシス指数（ＡＩ）および壊死指数（ＮＩ）で明らかなように（ｆ）、その後壊死したが、ＤＭＸＡＡ単一療法では、試験したとき、腫瘍細胞アポトーシスによる先行は認められなかった。
【図６】  血管攻撃およびＢ７．１療法は、腫瘍ヒートショックタンパク質のアップレギュレーションを誘導する。（ａ）ＤＭＸＡＡ、×４０；（ｂ）Ｂ７．１−ＤＭＸＡＡ併用、×４０；（ｃ）Ｂ７．１単一療法、×４０、（ｄ）Ｂ７．１−ＤＭＸＡＡ併用、×６０；（ｅ）空のベクター、×６０を投与した７日後の、腫瘍におけるｈｓｐ７０発現の免疫組織化学的検出；および（ｆ）（ｂ）と同様の切片を一次抗体としての対照ラットＩｇＧでも染色した。
【図７】  腫瘍結節１個の治療が、多数の離れた腫瘍結節の根絶につながる。一方の側腹部に大きい腫瘍（直径〜０．５ｃｍ）１個を確立し、直径〜０．２ｃｍの小さい腫瘍４個を他方の側腹部に確立した。大きい腫瘍にＢ７−１ｃＤＮＡ発現プラスミドを遺伝子導入した後の全身性ＤＭＸＡＡ療法は、腫瘍５個全部の拒絶につながった。マウスは、３５日間、無腫瘍のままであった。いかなる理由であれ、注射した腫瘍が、注射しなかった腫瘍結節より大きくないければ、腫瘍成長は遅れただけであった。
【図８】  Ｂ７−１腫瘍内（ＩＴ）注射後の、ＤＭＸＡＡ腫瘍内注射。通常の投与量のＤＭＸＡＡ（２５ｍｇ／ｋｇ）を注射した。対照として、ＤＭＸＡＡの腹腔内（ＩＰ）投与を含めた。白抜きの矢印は、根絶された腫瘍を示し、閉じた矢印は安楽死させた動物を示す。
【図９】  アンチセンスＨＩＦ−１α療法は、ＨＩＦ−１およびＶＥＧＦの発現をダウンレギュレートし、腫瘍血管の形成を阻害する。（Ａ）アンチセンスＨＩＦ−１α療法によるＨＩＦ−１およびＶＥＧＦのダウンレギュレーション。直径０．１ｃｍの腫瘍に、空のベクター（ａ、ｃ）、またはアンチセンスＨＩＦ−１α  ｃＤＮＡ（ｂ、ｄ）のいずれかを含むＤＯＴＡＰリポソームを注射した。遺伝子導入の４日後、ＨＩＦ−１α（ａ、ｂ）、およびＶＥＧＦ（ｃ、ｄ）に対するｍＡｂで褐色に染色した、代表的な腫瘍切片を示す。（Ｂ）アンチセンスＨＩＦ−１α療法は、新しい腫瘍血管の形成を阻止する。（ａ）４日前に、空のベクター（ｐｃＤＮＡ３）またはアンチセンスＨＩＦ−１αのいずれかを注射した４ｃｍの腫瘍から作製した切片を示す。切片内の内皮細胞を抗ＣＤ３１ｍＡｂで染色し、腫瘍血管を明らかにした（例を矢印で示す）。（Ｃ）血管密度の測定。盲目的に選択したランダムな視野で、抗ＣＤ３１ｍＡｂで染色した血管を計数し、腫瘍における平均血管密度を記録した。
【図１０】  アンチセンスＨＩＦ−１α抗血管形成療法を使用する単一療法、およびＢ７−１仲介免疫療法は、小さい腫瘍に有効であるにすぎない。０日に、直径およそ０．１ｃｍ（ａ）および０．４ｃｍ（ｂ）の確立された腫瘍に、Ｂ７−１  ｃＤＮＡ、アンチセンスＨＩＦ−１α  ｃＤＮＡのいずれかを含むＤＯＴＡＰリポソーム（または対照の動物の場合には、空のベクターを）注射した。遺伝子導入後の腫瘍のサイズ（ｃｍ）を記録した。完全な腫瘍退縮を垂直の矢印で示す。腫瘍が直径１ｃｍを超えた場合、マウスを安楽死させた（星印で示す）。
【図１１】  アンチセンスＨＩＦ−１α療法とＢ７．１免疫療法との併用は、大きい腫瘍の急速な拒絶を引き起こす。直径０．４ｃｍの腫瘍に、Ｂ７−１  ＤＮＡを含むＤＯＴＡＰリポソームを注射し、続いて４８時間後、アンチセンス（ａＨＦ）またはセンス（ｓＨＦ）ＨＩＦ−１α  ｃＤＮＡのいずれかを注射した。対照の動物には、空のベクターを注射した。遺伝子導入後の、腫瘍のサイズ（ｃｍ）を記録した。腫瘍が直径１ｃｍを超えた場合、マウスを安楽死させた（星印で示す）。完全な腫瘍退縮を垂直の矢印で示す。治癒したマウスに１×１０6個の親腫瘍細胞を再投与したが、モニタリングした２ヶ月間に、腫瘍は発生しなかった（データ示さず）。
【図１２】  三重治療（ＤＭＸＡＡ＋Ｂ７．１＋アンチセンスＨＩＦ−１療法）と、表示の他の治療方法を使用して得られた結果を示す。三重治療は、腫瘍の最も迅速な根絶を生じさせた。単独で、または互いに一緒に投与した抗血管形成性試薬は有効ではなかった。Ｉ．Ｔ．＝腫瘍内；Ｉ．Ｐ．＝腹腔内．
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５ａ−ｅ】
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【図５ｆ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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