(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡ：
（ａ）配列表の配列番号１に示す塩基配列を含むＤＮＡ、
（ｂ）配列表の配列番号１に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、下記式(１)
【化１】
0004746548.tif 000006
で表される（３Ｓ）−１−クロロ−３−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−４−フェニル−２−ブタノンを不斉的に還元して、下記式(２)
【化２】
0004746548.tif 000007
で表される（２Ｒ，３Ｓ）−１−クロロ−３−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−４−フェニル−２−ブタノールを生成する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項２】
以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡ：
（ａ）配列表の配列番号２に示す塩基配列を含むＤＮＡ、
（ｂ）配列表の配列番号２に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、前記式(１)で表される（３Ｓ）−１−クロロ−３−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−４−フェニル−２−ブタノンを不斉的に還元して、前記式(２)で表される（２Ｒ，３Ｓ）−１−クロロ−３−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−４−フェニル−２−ブタノールを生成する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項３】
請求項１又は２記載のＤＮＡにコードされ、かつ、前記式(１)で表される（３Ｓ）−１−クロロ−３−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−４−フェニル−２−ブタノンを不斉的に還元して、前記式(２)で表される（２Ｒ，３Ｓ）−１−クロロ−３−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−４−フェニル−２−ブタノールを生成する活性を有するポリペプチド。
【請求項４】
以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチド：
（ａ）配列表の配列番号３に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｂ）配列表の配列番号３に示すアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、前記式(１)で表される（３Ｓ）−１−クロロ−３−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−４−フェニル−２−ブタノンを不斉的に還元して、前記式(２)で表される（２Ｒ，３Ｓ）−１−クロロ−３−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−４−フェニル−２−ブタノールを生成する活性を有するポリペプチド。
【請求項５】
以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチド：
（ａ）配列表の配列番号４に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｂ）配列表の配列番号４に示すアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、前記式(１)で表される（３Ｓ）−１−クロロ−３−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−４−フェニル−２−ブタノンを不斉的に還元して、前記式(２)で表される（２Ｒ，３Ｓ）−１−クロロ−３−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−４−フェニル−２−ブタノールを生成する活性を有するポリペプチド。
【請求項６】
配列表の配列番号４に示すアミノ酸配列において、以下の１）〜４）のうちの、少なくとも１つの変異を有するポリペプチド：
１）４２番目のアラニンがグリシンに置換されている、
２）４３番目のグルタミン酸がアラニンに置換されている、
３）４６番目のリジンがグルタミン酸に置換されている、
４）４９番目のアスパラギンがリジンに置換されている。
【請求項７】
前記１）〜４）の全ての変異を有する請求項６記載のポリペプチド。
【請求項８】
請求項４〜７のいずれかに記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項９】
請求項１、２、又は８記載のＤＮＡを含むベクター。
【請求項１０】
プラスミドｐＮＴＯＭ３である請求項９記載のベクター。
【請求項１１】
プラスミドｐＮＴＯＭ４である請求項９に記載のベクター。
【請求項１２】
プラスミドｐＮＴＯＭ５である請求項９に記載のベクター。
【請求項１３】
グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡをさらに含む、請求項９に記載のベクター。
【請求項１４】
前記グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドがバシラス・メガテリウム（Bacillus megaterium）由来のグルコース脱水素酵素である、請求項１３記載のベクター。
【請求項１５】
請求項９〜１４のいずれかに記載のベクターにより、宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体。
【請求項１６】
前記宿主細胞が大腸菌である、請求項１５記載の形質転換体。
【請求項１７】
Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＯＭ３）ＦＥＲＭ ＢＰ−１０３６８である、請求項１６記載の形質転換体。
【請求項１８】
Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＯＭ４）ＦＥＲＭ ＢＰ−１０３６９である、請求項１６記載の形質転換体。
【請求項１９】
Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＯＭ５）ＦＥＲＭ ＢＰ−１０３７０である、請求項１６記載の形質転換体。
【請求項２０】
請求項３〜７のいずれかに記載のポリペプチド、または、請求項１５〜１９のいずれかに記載の形質転換体、またはその処理物を、カルボニル基を有する化合物と反応させることを特徴とする光学活性アルコールの製造方法。
【請求項２１】
前記カルボニル基を有する化合物が、前記式(１)で表される（３Ｓ）−１−クロロ−３−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−４−フェニル−２−ブタノンであり、前記光学活性アルコールが、前記式(２)で表される（２Ｒ，３Ｓ）−１−クロロ−３−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−４−フェニル−２−ブタノールである、請求項２０記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、下記式（１）：【０００２】
【化３】
0004746548.tif 000002
【０００３】
で表される（３Ｓ）−１−クロロ−３−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−４−フェニル−２−ブタノンを不斉的に還元して、下記式(２)：【０００４】
【化４】
0004746548.tif 000003
【０００５】
で表される（２Ｒ，３Ｓ）−１−クロロ−３−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−４−フェニル−２−ブタノールを生成する活性を有する微生物より単離された、該活性を有するポリペプチド（カルボニル還元酵素）、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含むベクター、および該ベクターで形質転換された形質転換体に関する。【０００６】
本発明はまた、該ポリペプチド、または、該形質転換体を用いた、光学活性アルコール、とりわけ前記式(２)で表される（２Ｒ，３Ｓ）−１−クロロ−３−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−４−フェニル−２−ブタノールの製造法に関する。【０００７】
（２Ｒ，３Ｓ）−１−クロロ−３−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−４−フェニル−２−ブタノールは、医薬等の合成原料として有用な化合物である。
【背景技術】
【０００８】
（２Ｒ，３Ｓ）−１−クロロ−３−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−４−フェニル−２−ブタノールの製造法としては、アミノ基が保護された（３Ｓ）−１−ハロ−３−アミノ−４−フェニル−２−ブタノン誘導体を、水素化ほう素ナトリウム等の還元剤で化学的に還元する方法が知られている（特許文献１、非特許文献１）。しかし、本方法は比較的高価な還元剤を用いる必要があり、その立体選択性も実用上十分とは言えない。【０００９】
また、微生物を用いる方法として、（３Ｓ）−１−ハロ−３−アミノ−４−フェニル−２−ブタノン誘導体にキャンディダ（Candida）属等に属する微生物を作用させて、（２Ｒ，３Ｓ）−１−ハロ−３−アミノ−４−フェニル−２−ブタノール誘導体を製造する方法（特許文献２）、および、（３Ｓ）−１−ハロ−２−オキソ−３−保護アミノ−４−置換ブタンにロドコッカス（Rhodococcus）属等に属する微生物を接触させて、（２Ｒ，３Ｓ）−１−ハロ−２−ヒドロキシ−３−保護アミノ−４−置換ブタンを製造する方法（特許文献３、非特許文献２）が知られている。しかし、これらの方法では、反応液中に蓄積させることができる生成物の濃度が実用上十分とは言えない。
【特許文献１】特開平２−４２０４８号公報
【特許文献２】特開平９−２８５号公報
【特許文献３】ＷＯ２００２／０１４５２８号公報
【非特許文献１】Tetrahedoron, 50, 6333 (1994)
【非特許文献２】Tetrahedoron:Asymmetry, 14, 3105 (2003)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上記に鑑み、本発明は、（２Ｒ，３Ｓ）−１−クロロ−３−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−４−フェニル−２−ブタノールの製造に有用なポリペプチド、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含むベクター、および該ベクターで形質転換された形質転換体を提供することを課題とする。【００１１】
また、本発明は、該ポリペプチド、または、該形質転換体を用いた、（２Ｒ，３Ｓ）−１−クロロ−３−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−４−フェニル−２−ブタノールを始めとする種々の光学活性アルコールの効率的な製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、（３Ｓ）−１−クロロ−３−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−４−フェニル−２−ブタノンを不斉的に還元し、（２Ｒ，３Ｓ）−１−クロロ−３−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−４−フェニル−２−ブタノールを生成する活性を有する微生物より、該活性を有するポリペプチドを単離した。さらに、該ポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列を明らかにし、これを利用して、該ポリペプチドを高生産する形質転換体を創製することに成功した。そして、該ポリペプチドまたは該形質転換体を利用することにより、（２Ｒ，３Ｓ）−１−クロロ−３−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−４−フェニル−２−ブタノールを始めとする種々の有用な光学活性アルコールを効率良く製造することが可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。【００１３】
即ち、本発明は、（３Ｓ）−１−クロロ−３−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−４−フェニル−２−ブタノンを不斉的に還元して、（２Ｒ，３Ｓ）−１−クロロ−３−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−４−フェニル−２−ブタノールを生成する活性を有するポリペプチドである。【００１４】
また、本発明は、該ポリペプチドをコードするＤＮＡである。また、本発明は、該ＤＮＡを含むベクターである。また、本発明は、該ベクターを含む形質転換体である。さらに、本発明は、該ポリペプチドまたは該形質転換体を用いた、（２Ｒ，３Ｓ）−１−クロロ−３−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−４−フェニル−２−ブタノールを始めとする光学活性アルコールの製造方法である。
【発明の効果】
【００１５】
本発明により、（２Ｒ，３Ｓ）−１−クロロ−３−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−４−フェニル−２−ブタノールを始めとする、有用な光学活性アルコールの実用的な製造方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】組換えベクターｐＮＴＯＭ４Ｇ１の作製法および構造を示す
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、本発明を詳細に説明する。
本明細書において記述されている、（３Ｓ）−１−クロロ−３−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−４−フェニル−２−ブタノンは、例えば、特開昭６２−１２６１５８号公報、または、特開平２−４２０４８号公報に開示された方法により調製できる。また、本明細書において記述されている、ＤＮＡの単離、ベクターの調製、形質転換等の遺伝子操作は、特に明記しない限り、Molecular Cloning 2nd Edition（Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989）等の成書に記載されている方法により実施できる。さらに、本明細書の記述に用いられる％は、特に断りのない限り、％（ｗ／ｖ）を意味する。【００１８】
本発明のポリペプチドは、（３Ｓ）−１−クロロ−３−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−４−フェニル−２−ブタノンを不斉的に還元し、（２Ｒ，３Ｓ）−１−クロロ−３−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−４−フェニル−２−ブタノールを生成する活性を有するポリペプチドである。このようなポリペプチドは、当該活性を有する微生物から単離することができる。【００１９】
本発明のポリペプチドの起源となる微生物は、特に限定されないが、例えばオガタエア（Ogataea）属に属する酵母が挙げられ、特に好ましいものとしてはオガタエア・ミニュータ・バー・ミニュータ（Ogataea minuta var. minuta）ＮＢＲＣ０９７５株を挙げることができる。当該微生物は、独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部 生物遺伝資源部門（ＮＢＲＣ：〒292-0818  千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8）より入手することができる。【００２０】
本発明のポリペプチドの起源となる微生物を培養するための培地としては、その微生物が増殖する限り、通常の、炭素源、窒素源、無機塩類、有機栄養素などを含む液体栄養培地を用いることができる。【００２１】
本発明のポリペプチドの起源となる微生物からの該ポリペプチドの単離は、通常公知の蛋白質精製法を適当に組み合わせて用いることにより実施できる。例えば、以下のように実施できる。【００２２】
まず、当該微生物を適当な培地で培養し、培養液から遠心分離、あるいは、濾過により菌体を集める。得られた菌体を、超音波破砕機、あるいは、グラスビーズ等を用いた物理的手法で破砕した後、遠心分離にて菌体残さを除き、無細胞抽出液を得る。そして、塩析（硫酸アンモニウム沈殿、リン酸ナトリウム沈殿など）、溶媒沈殿（アセトンまたはエタノールなどによる蛋白質分画沈殿法）、透析、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、限外濾過等の手法を単独で、または組み合わせて用いることにより、該無細胞抽出液から、本発明のポリペプチドを単離する。【００２３】
（３Ｓ）−１−クロロ−３−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−４−フェニル−２−ブタノンを還元する活性は、例えば、０．３３％（ｖ／ｖ）のジメチルスルホキシドを含む１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に、０．２ｍＭの基質（３Ｓ）−１−クロロ−３−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−４−フェニル−２−ブタノン、０．２５ｍＭの補酵素ＮＡＤＰＨ、および粗酵素を添加し、３０℃で１分間反応させた際の、波長３４０ｎｍにおける吸光度の減少速度から算出できる。【００２４】
また、上記反応において生成した、（３Ｓ）−１−クロロ−３−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−４−フェニル−２−ブタノールの絶対配置の決定、および、ジアステレオマー過剰率の測定は、高速液体クロマトグラフィー（カラム：ＣＯＳＭＯＳＩＬ  ５Ｃ８−ＭＳ（φ４．６ｍｍ×２５０ｍｍ；ナカライテスク社製）、溶離液：１０ｍＭリン酸水溶液／アセトニトリル＝１／１（ｖ／ｖ）、流速：１ｍｌ／ｍｉｎ、検出：２１０ｎｍ）を用いて実施できる。【００２５】
本発明のＤＮＡは、上述の本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡであり、後述する方法に従って導入された宿主細胞内で該ポリペプチドを発現し得るものであればいかなるものでもよく、任意の非翻訳領域を含んでいてもよい。該ポリペプチドが取得できれば、該ポリペプチドの起源となる微生物より、当業者であれば公知の方法で、このようなＤＮＡを取得できる。例えば、以下に示した方法で取得できる。【００２６】
まず、単離された本発明のポリペプチドを適当なエンドペプチダーゼを用いて消化し、生じたペプチド断片を逆相ＨＰＬＣにより分取する。そして、例えば、ＡＢＩ４９２型プロテインシークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）により、これらのペプチド断片のアミノ酸配列の一部または全部を決定する。【００２７】
このようにして得られたアミノ酸配列情報をもとにして、該ポリペプチドをコードするＤＮＡの一部を増幅するためのＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）プライマーを合成する。次に、通常のＤＮＡ単離法、例えば、Ｖｉｓｓｅｒ等の方法（Appl. Microbiol. Biotechnol., 53, 415 (2000)）により、該ポリペプチドの起源となる微生物の染色体ＤＮＡを調製する。この染色体ＤＮＡを鋳型として、先述のＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲを行い、該ポリペプチドをコードするＤＮＡの一部を増幅し、その塩基配列を決定する。塩基配列の決定は、例えば、 ＡＢＩ３７３Ａ型  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）等を用いて行うことができる。【００２８】
該ポリペプチドをコードするＤＮＡの一部の塩基配列が明らかになれば、例えば、ｉ−ＰＣＲ法（Nucl.Acids Res., 16, 8186 (1988)）によりその全体の配列を決定することができる。【００２９】
このようにして得られる本発明のＤＮＡの例としては、配列表の配列番号１に示す塩基配列を含むＤＮＡ、および、配列表の配列番号２に示す塩基配列を含むＤＮＡを挙げることができる。また、配列表の配列番号１または配列番号２に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、かつ、（３Ｓ）−１−クロロ−３−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−４−フェニル−２−ブタノンを不斉的に還元し、（２Ｒ，３Ｓ）−１−クロロ−３−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−４−フェニル−２−ブタノールを生成する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡも、本発明のＤＮＡに包含される。【００３０】
配列表の配列番号１または配列番号２に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとは、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法、あるいはサザンハイブリダイゼーション法等を実施した際、配列表の配列番号１または配列番号２に示す塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡと特異的にハイブリッドを形成するＤＮＡを言う。【００３１】
ここで、ストリンジェントな条件とは、例えば、７５ｍＭクエン酸三ナトリウム、７５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．５％ドデシル硫酸ナトリウム、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ポリビニルピロリドン、および、０．１％Ｆｉｃｏｌｌ  ４００（アマシャムバイオサイエンス株式会社製）の組成からなる水溶液中、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後に、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、および０．１％ドデシル硫酸ナトリウムの組成からなる水溶液を用いて、６０℃で洗浄が行われる条件を言う。好ましくは、上記条件でハイブリダイゼーションを行った後に、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、および０．１％ドデシル硫酸ナトリウムの組成からなる水溶液を用いて、６５℃で洗浄が行われる条件を表す。より好ましくは、前記と同様にハイブリダイゼーションを行った後に、１．５ｍＭクエン酸三ナトリウム、１５ｍＭ塩化ナトリウム、および０．１％ドデシル硫酸ナトリウムの組成からなる水溶液を用いて、６５℃で洗浄が行われる条件である。【００３２】
本発明のポリペプチドの例としては、配列表の配列番号１に示す塩基配列によってコードされる、配列表の配列番号３に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、および、配列表の配列番号２に示す塩基配列によってコードされる、配列表の配列番号４に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドを挙げることができる。【００３３】
また、これら２種のポリペプチドのいずれかと一定値以上の相同性を有し、かつ、（３Ｓ）−１−クロロ−３−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−４−フェニル−２−ブタノンを不斉的に還元し、（２Ｒ，３Ｓ）−１−クロロ−３−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−４−フェニル−２−ブタノールを生成する活性を有するポリペプチドは、これら２種のポリペプチドと機能的に同等であり、本発明に含まれる。【００３４】
ここで配列の相同性は、例えば、相同性検索プログラムＦＡＳＴＡ（W.R. Pearson & D.J. Lipman; Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 2444-2448 (1988)）を用いて２つのアミノ酸配列を比較解析した場合に、配列全体に対するＩｄｅｎｔｉｔｙの値で表される。配列表の配列番号３または配列番号４に示すポリペプチドと同等なポリペプチドとしては、これら２種のポリペプチドのいずれかとの相同性が、７８％以上（配列番号３のポリペプチドと配列番号４のポリペプチドの相同性が７８％である）、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上であるポリペプチドを挙げることができる。【００３５】
このようなポリペプチドは、例えば、先述の配列表の配列番号１または配列番号２に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを、適当なベクターに連結した後、適当な宿主細胞に導入して発現させることにより得られる。また、例えば、Current Protocols in Molecular Biology（John Wiley and Sons, Inc., 1989）等に記載の公知の方法に従い、配列表の配列番号３または配列番号４に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドに、アミノ酸の置換、挿入、欠失または付加を生じさせることによっても取得できる。【００３６】
後者の手法により取得したポリペプチドの例としては、配列表の配列番号４に示すアミノ酸配列において、４２番目のアラニンをグリシンに、４３番目のグルタミン酸をアラニンに、４６番目のリジンをグルタミン酸に、および／または、４９番目のアスパラギンをリジンに置換して得られるポリペプチドを挙げることができる。これら４つの変異全てを有するポリペプチド（変異ポリペプチド１）を配列表の配列番号１６に、このポリペプチドをコードするＤＮＡ（変異ＤＮＡ１）を配列表の配列番号１５に示した。【００３７】
本発明のＤＮＡを宿主微生物内に導入し、導入された宿主微生物内で発現させるために用いられるベクターは、適当な宿主微生物内で該ＤＮＡがコードする遺伝子を発現できるものであれば特に限定されない。このようなベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、コスミドベクターなどが挙げられ、さらに、他の宿主株との間での遺伝子交換が可能なシャトルベクターも使用できる。【００３８】
このようなベクターは、通常、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｔｕｆＢプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ｐＬプロモーター等の制御因子を含み、本発明のＤＮＡと作動可能に連結された発現単位を含む発現ベクターとして好適に使用できる。例えば、ｐＵＣＮＴ（ＷＯ９４／０３６１３公報）が好適に使用できる。【００３９】
本明細書で用いる用語「制御因子」は、機能的プロモーター及び、任意の関連する転写要素（例えばエンハンサー、ＣＣＡＡＴボックス、ＴＡＴＡボックス、ＳＰＩ部位など）を有する塩基配列をいう。【００４０】
本明細書で用いる用語「作動可能に連結」は、遺伝子の発現を調節するプロモーター、エンハンサー等の種々の調節エレメントと遺伝子が、宿主細胞中で作動し得る状態で連結されることをいう。制御因子のタイプ及び種類が、宿主に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。【００４１】
本発明の発現ベクターとしては、後述する、ｐＵＣＮＴに配列番号１に示すＤＮＡを導入したｐＮＴＯＭ３、配列番号２に示すＤＮＡを導入したｐＮＴＯＭ４、配列番号１５に示すＤＮＡを導入したｐＮＴＯＭ５等を挙げることができる。【００４２】
本発明のＤＮＡを含むベクターを導入する宿主細胞としては、細菌、酵母、糸状菌、植物細胞、動物細胞などが挙げられるが、導入及び／又は培養の容易さから細菌が好ましく、大腸菌が特に好ましい。本発明のＤＮＡを含むベクターは、公知の方法により宿主細胞に導入できる。宿主細胞として大腸菌を用いる場合、例えば、市販のＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）を用いることにより、当該ベクターを宿主細胞に導入できる。【００４３】
本発明の形質転換体としては、後述する、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１に前記ｐＮＴＭＯ３を導入したＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＭＯ３）  ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０３６８、前記ｐＮＴＭＯ４を導入したＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＴＯＭ４）  ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０３６９、前記ｐＮＴＭＯ５を導入したＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＴＯＭ５）  ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０３７０等が挙げられる。これら形質転換体は、それぞれ前記の受託番号にて、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（ＩＰＯＤ：〒305-8566  茨城県つくば市東１−１−１  中央第６）に寄託されている（原寄託日２００４年６月３日の国内寄託株をブダペスト条約に基づく国際寄託へ移管（２００５年７月６日））。【００４４】
本発明のポリペプチドを用いて、カルボニル基を有する化合物を不斉的に還元し、光学活性アルコールを生産する場合、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ等の補酵素が必要となる。しかし、酸化された該補酵素を還元型に変換する能力（以後、補酵素再生能と呼ぶ）を有するポリペプチド、および、当該ポリペプチドの基質となる化合物を、本発明のポリペプチドと共存させて反応を行うことにより、高価な補酵素の使用量を大幅に削減できる。【００４５】
補酵素再生能を有するポリペプチドとしては、例えば、ヒドロゲナーゼ、ギ酸脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、アルデヒド脱水素酵素、グルコース−６−リン酸脱水素およびグルコース脱水素酵素などを使用できる。好適には、グルコース脱水素酵素が使用される。【００４６】
本発明のポリペプチドを用いた、光学活性アルコールの製造は、以下のように実施できる。まず、適当な溶媒中に、基質となるカルボニル基を有する化合物、ＮＡＤＰＨ等の補酵素、および該ポリペプチドを添加し、ｐＨ調整下、攪拌して反応を行う。本発明のポリペプチドと補酵素再生能を有するポリペプチドを組み合わせて反応を行う場合は、上記反応組成に、補酵素再生能を有するポリペプチド（例えば、グルコース脱水素酵素）と、その基質となる化合物（例えば、グルコース）をさらに添加する。【００４７】
反応には水系溶媒を用いてもよいし、水系と有機系の溶媒を混合して用いてもよい。有機系溶媒としては、例えば、トルエン、酢酸エチル、酢酸ｎ−ブチル、ヘキサン、イソプロパノール、ジイソプロピルエーテル、メタノール、アセトン、ジメチルスルホキシド等が挙げられる。反応は１０℃〜７０℃の温度で行われ、反応液のｐＨは４〜１０に維持する。反応は、バッチ方式あるいは連続方式で実施できる。バッチ方式の場合、反応基質は０．１％から７０％（ｗ／ｖ）の仕込み濃度で添加される。基質となるカルボニル基を有する化合物としては、例えば、（３Ｓ）−１−クロロ−３−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−４−フェニル−２−ブタノンが挙げられるが、上述の反応条件において還元され、光学活性アルコールに変換されるものであれば、特に限定されない。【００４８】
本発明のポリペプチドの代わりに、該ポリペプチドをコードするＤＮＡを含む形質転換体またはその処理物を使用しても、同様に反応を行うことができる。また、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ、および、補酵素再生能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの両者を含む形質転換体またはその処理物を使用しても、同様に反応を行うことができる。なお、「形質転換体の処理物」とは、例えば、界面活性剤や有機溶媒で処理した細胞、乾燥細胞、破砕処理した細胞、細胞の粗抽出液等のほか、公知の手段でそれらを固定化したものを意味する。【００４９】
なかでも、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ、および、補酵素再生能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの両者を含む形質転換体またはその処理物を使用した場合には、補酵素を再生するための酵素を別途調製・添加する必要がなく、光学活性アルコールの製造を効率よく行い得る。【００５０】
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ、および、補酵素再生能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの両者を含む形質転換体は、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ、および、補酵素再生能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの両者を、同一のベクターに組み込み、これを宿主細胞に導入することにより得られるほか、これら２種のＤＮＡを不和合性グループの異なる２種のベクターにそれぞれ組み込み、それら２種のベクターを同一の宿主細胞に導入することによっても得られる。【００５１】
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ及び補酵素再生能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの両者が組込まれたベクターとしては、前記発現ベクターｐＮＴＯＭ３、ｐＮＴＯＭ４、及びｐＮＴＯＭ５のそれぞれに、バシラス・メガテリウム由来のグルコース脱水素酵素遺伝子を導入した、ｐＮＴＯＭ３Ｇ１、ｐＮＴＯＭ４Ｇ１、ｐＮＴＯＭ５Ｇ１等が挙げられる。本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ、および、補酵素再生能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの両者を含む形質転換体としては、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１をこれらのベクターで形質転換したＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＴＯＭ３Ｇ１）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＴＯＭ４Ｇ１）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＴＯＭ５Ｇ１）等が挙げられる。【００５２】
形質転換体中の補酵素再生能を有するポリペプチドの活性は、常法により測定することができる。例えば、グルコース脱水素酵素の活性は、１Ｍのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に、１００ｍＭのグルコース、２ｍＭの補酵素ＮＡＤＰまたはＮＡＤ、および酵素を添加し、２５℃で１分間反応させた際の、波長３４０ｎｍにおける吸光度の増加速度から算出できる。【００５３】
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを含む形質転換体の培養は、それが増殖する限り、通常の、炭素源、窒素源、無機塩類、有機栄養素などを含む液体栄養培地を用いて実施できる。【００５４】
反応で生じた光学活性アルコールは、常法により精製できる。例えば、反応で生じた光学活性アルコールが（２Ｒ，３Ｓ）−１−クロロ−３−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−４−フェニル−２−ブタノールである場合、反応液を酢酸エチル、トルエン等の有機溶媒で抽出し、有機溶媒を減圧下で除去する。さらに、晶析またはクロマトグラフィー等の処理を行うことにより、精製できる。【００５５】
（３Ｓ）−１−クロロ−３−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−４−フェニル−２−ブタノンと、（２Ｒ，３Ｓ）−１−クロロ−３−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−４−フェニル−２−ブタノールの定量、および、（２Ｒ，３Ｓ）−１−クロロ−３−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−４−フェニル−２−ブタノールのジアステレオマー過剰率の測定は、高速液体クロマトクロマトグラフィー（カラム：ＣＯＳＭＯＳＩＬ  ５Ｃ８−ＭＳ（φ４．６ｍｍ×２５０ｍｍ；ナカライテスク社製）、溶離液：１０ｍＭリン酸水溶液／アセトニトリル＝１／１、流速：１ｍｌ／ｍｉｎ、検出：２１０ｎｍ）を用いて行うことができる。【００５６】
以上のように、本発明に従えば、本発明のポリペフチドの効率的生産が可能であり、それを利用することにより、（２Ｒ，３Ｓ）−１−クロロ−３−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−４−フェニル−２−ブタノールを始めとする、種々の有用な光学活性アルコールの優れた製造法が提供される。
【実施例】
【００５７】
以下、実施例で本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。なお、以下の実施例において用いた組み換えＤＮＡ技術に関する詳細な操作方法などは、次の成書に記載されている：
Molecular Cloning 2nd Edition（Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989）、
Current Protocols in Molecular Biology（Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience）。【００５８】
（実施例１）ポリペプチドの精製
以下の方法に従って、オガタエア・ミニュータ・バー・ミニュータ（Ogataea minuta var. minuta）ＮＢＲＣ０９７５株より、（３Ｓ）−１−クロロ−３−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−４−フェニル−２−ブタノンを不斉的に還元して（２Ｒ，３Ｓ）−１−クロロ−３−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−４−フェニル−２−ブタノールを生成する活性を有するポリペプチドを単一に精製した。特に断りのない限り、精製操作は４℃で行った。【００５９】
（３Ｓ）−１−クロロ−３−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−４−フェニル−２−ブタノンに対する還元活性は、０．３３％（ｖ／ｖ）のジメチルスルホキシドを含む１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に、基質（３Ｓ）−１−クロロ−３−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−４−フェニル−２−ブタノンを終濃度０．２ｍＭ、補酵素ＮＡＤＰＨを終濃度０．２５ｍＭとなるよう溶解し、さらに粗酵素液を添加して３０℃で１分間反応を行った際の、当該反応液の波長３４０ｎｍにおける吸光度の減少速度から算出した。本反応条件において、１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＰＨをＮＡＤＰに酸化する活性を、１ｕｎｉｔと定義した。【００６０】
（微生物の培養）
３０Ｌジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ社製）に、グルコース５％、ポリペプトン０．５％、イーストエキス０．１％、リン酸水素ニカリウム０．１％、リン酸ニ水素カリウム０．２％、硫酸マグネシウム・七水和物０．０２％、（ｐＨ６．５）からなる液体培地１８Ｌを調製し、１２０℃で２０分間蒸気殺菌をおこなった。【００６１】
この培地に、予め同培地にて前培養しておいたオガタエア・ミニュータ・バー・ミニュータ（Ogataea minuta var. minuta）ＮＢＲＣ０９７５株の培養液を１８０ｍｌ接種し、攪拌回転数２５０ｒｐｍ、通気量５．０ＮＬ／ｍｉｎ、２８℃の条件で、４８時間培養した。【００６２】
（無細胞抽出液の調整）
上記の培養液から遠心分離により菌体を集め、１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）２０００ｍｌを用いて菌体を洗浄し、該菌株の菌体９０７ｇを得た。この菌体を０．１ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）１８００ｍｌに懸濁し、ＵＨ−６００型超音波分散機（ＳＭＴ社製）を用いて菌体を破砕した。この破砕物から遠心分離にて菌体残渣を除き、無細胞抽出液を得た。【００６３】
（硫酸アンモニウム分画）
上記で得た無細胞抽出液のｐＨを、アンモニア水を用いて７．５に調整した後、同ｐＨを維持しながら、４０％飽和となるように硫酸アンモニウムを添加、溶解し、生じた沈殿を遠心分離により除いた。先と同様ｐＨ７．５を維持しながら、この遠心上清に６０％飽和となるようさらに硫酸アンモニウムを添加、溶解し、生じた沈殿を遠心分離により集めた。この沈殿を０．１ｍＭのＤＴＴを含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解した後、同一緩衝液で１夜透析し、活性画分を得た。【００６４】
（ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｃｅｌカラムクロマトグラフィー）
硫酸アンモニウム分画により得られた活性画分を、０．１ｍＭのＤＴＴを含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）にて予め平衡化したＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｃｅｌ（アマシャムバイオサイエンス株式会社製）カラム（φ２９×２９０ｍｍ）に供し、活性画分を吸着させた。同一緩衝液でカラムを洗浄した後、 塩化ナトリウムのリニアグラジエント（０Ｍから１Ｍまで）により活性画分を溶出させた。活性画分を集め、同一緩衝液にて１夜透析を行った。【００６５】
（ＭｏｎｏＱ  ＨＲカラムクロマトグラフィー）
ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｃｅｌカラムクロマトグラフィーにより得られた活性画分を、０．１ｍＭのＤＴＴを含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）にて予め平衡化したＭｏｎｏＱ  ＨＲ  １０／１０カラム（アマシャムバイオサイエンス株式会社製）に供し、活性画分を吸着させた。同一緩衝液でカラムを洗浄した後、 塩化ナトリウムのリニアグラジエント（０Ｍから１Ｍまで）により活性画分を溶出させた。活性画分を集め、同一緩衝液にて１夜透析を行った。【００６６】
（Ｐｈｅｎｙｌ−Ｓｕｐｅｒｏｓｅカラムクロマトグラフィー）
ＭｏｎｏＱ  ＨＲカラムクロマトグラフィーにより得られた活性画分に、終濃度が４Ｍとなるよう塩化ナトリウムを溶解し、４Ｍの塩化ナトリウムと０．１ｍＭのＤＴＴを含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）にて予め平衡化したＰｈｅｎｙｌ−Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  ＨＲ  １０／１０カラム（アマシャムバイオサイエンス株式会社製）に供し、活性画分を吸着させた。同一緩衝液でカラムを洗浄した後、 塩化ナトリウムのリニアグラジエント（４Ｍから０Ｍまで）により活性画分を溶出させた。活性画分を集め、０．１ｍＭのＤＴＴを含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）にて１夜透析を行った。【００６７】
（ＭｏｎｏＱ  ＨＲカラムクロマトグラフィー）
Ｐｈｅｎｙｌ−Ｓｕｐｅｒｏｓｅカラムクロマトグラフィーにより得られた活性画分を、０．１ｍＭのＤＴＴを含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）にて予め平衡化したＭｏｎｏＱ  ＨＲ  ５／５カラム（アマシャムバイオサイエンス株式会社製）に供し、活性画分を吸着させた。同一緩衝液でカラムを洗浄した後、 塩化ナトリウムのリニアグラジエント（０Ｍから１Ｍまで）により活性画分を溶出させた。活性画分を集め、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ  ＹＭ−１０（ミリポア社製）を用いて濃縮した 。【００６８】
（ゲルろ過クロマトグラフィー）
上述のＭｏｎｏＱ  ＨＲカラムクロマトグラフィーにより得られた活性画分を、０．２Ｍの塩化ナトリウムと０．１ｍＭのＤＴＴを含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）にて予め平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ＨＲ  １０／３０カラム（アマシャムバイオサイエンス株式会社製）に供し、同一緩衝液を用いて、０．５ｍｌ／分の流速で活性画分を溶出させた。活性画分を集め、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ  ＹＭ−１０（ミリポア社製）を用いて濃縮した 。さらに、これを、同上緩衝液にて予め平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ＨＲ  １０／３０カラム（アマシャムバイオサイエンス株式会社製）に供し、同上緩衝液を用いて、０．５ｍｌ／分の流速で活性画分を溶出させた。活性画分を集め、ポリペプチドの精製標品とした。【００６９】
（実施例２）  遺伝子のクローニング
（ＰＣＲプライマーの作成）
実施例１で得られた精製ポリペプチドを８Ｍ尿素存在下で変性した後、アクロモバクター由来のリシルエンドペプチダーゼ（和光純薬工業株式会社製）で消化し、得られたペプチド断片のアミノ酸配列をＡＢＩ４９２型プロテインシーケンサー（パーキンエルマー社製）により決定した。このアミノ酸配列から予想されるＤＮＡ配列に基づき、該ポリペプチドをコードする遺伝子の一部をＰＣＲにより増幅するためのプライマー１：５’−acngtntayttyathgcngg−３’（配列表の配列番号５）、および、プライマー２：５’−atnggdatrtcraaytgrtc−３’（配列表の配列番号６）を合成した。【００７０】
（ＰＣＲによる遺伝子の増幅）
実施例１と同様に培養したオガタエア・ミニュータ・バー・ミニュータ（Ogataea minuta var. minuta）ＮＢＲＣ０９７５株の菌体からＶｉｓｓｅｒ等の方法（Appl. Microbiol. Biotechnol., 53, 415 (2000)）に従って染色体ＤＮＡを抽出した。次に、上記で調製したＤＮＡプライマー１および２を用い、得られた染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行ったところ、目的遺伝子の一部と考えられる約７００ｂｐのＤＮＡ断片が増幅された。ＰＣＲは、ＤＮＡポリメラ−ゼとしてＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（タカラバイオ社製）を用いて行い、反応条件はその取り扱い説明書に従った。このＤＮＡ断片を、プラスミドｐＴ７Ｂｌｕｅ  Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）にクローニングし、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）およびＡＢＩ  ３７３Ａ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）を用いてその塩基配列を解析した。その結果、本ＰＣＲにより、塩基配列の異なる２種類のＤＮＡ断片が増幅されていることが判明した。それらの塩基配列を、配列表の配列番号７、および、配列番号８に示した。【００７１】
（ｉ−ＰＣＲ法による目的遺伝子の全長配列の決定）
上記で調製したオガタエア・ミニュータ・バー・ミニュータ（Ogataea minuta var. minuta）ＮＢＲＣ０９７５株の染色体ＤＮＡを、制限酵素ＸｂａＩで完全消化し、得られたＤＮＡ断片の混合物をＴ４リガーゼにより分子内環化させた。これを鋳型として用い、ｉ−ＰＣＲ法（Nucl. Acids Res., 16, 8186 (1988)）により、上述の配列番号７に示す塩基配列を含む遺伝子の全塩基配列を決定した。その結果を、配列表の配列番号１に示した。ｉ−ＰＣＲは、ＤＮＡポリメラ−ゼとしてＴａＫａＲａ  ＬＡ  Ｔａｑ（タカラバイオ社製）を用いて行い、反応条件はその取り扱い説明書に従った。上述の配列番号８に示す塩基配列を含む遺伝子の全塩基配列も、同様の操作で決定し、その結果を配列表の配列番号２に示した。また、配列番号１に示した塩基配列がコードするアミノ酸配列を配列番号３に、配列番号２に示した塩基配列がコードするアミノ酸配列を配列番号４に、それぞれ示した。【００７２】
（実施例３）  発現ベクターの構築
プライマー３：５’−gtgcatatgaccaagactgtttatttca−３’（配列表の配列番号９）と、プライマー４：５’−gtcgaattcttattaaaatggaatgtcgaa−３’（配列表の配列番号１０）を用い、実施例２で得たオガタエア・ミニュータ・バー・ミニュータ（Ogataea minuta var. minuta）ＮＢＲＣ０９７５株の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。その結果、配列表の配列番号２に示す塩基配列からなる遺伝子の開始コドン部分にＮｄｅＩ認識部位が付加され、かつ終始コドンの直後にＥｃｏＲＩ認識部位が付加された二本鎖ＤＮＡを得た。ＰＣＲは、ＤＮＡポリメラ−ゼとしてＴａＫａＲａ  ＬＡ  Ｔａｑ（タカラバイオ社製）を用いて行い、反応条件はその取り扱い説明書に従った。このＤＮＡをＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、プラスミドｐＵＣＮＴ（ＷＯ９４／０３６１３公報）のｌａｃプロモーターの下流のＮｄｅＩ認識部位とＥｃｏＲＩ認識部位の間に挿入し、組換えベクターｐＮＴＯＭ４を構築した。【００７３】
同様に、プライマー５：５’−gtgcatatggctaagactgtctatttca−３’（配列表の配列番号１１）と、プライマー６：５’−gtcgaattcttactagaatggaatgtcaaa−３’（配列表の配列番号１２）を用い、配列表の配列番号１に示す塩基配列からなる遺伝子の開始コドン部分にＮｄｅＩ認識部位が付加され、かつ終始コドンの直後にＥｃｏＲＩ認識部位が付加された、二本鎖ＤＮＡを得た。このＤＮＡを、先と同様、プラスミドｐＵＣＮＴに挿入し、組換えベクターｐＮＴＯＭ３を構築した。【００７４】
（実施例４）  変異遺伝子の作製
Ｍｕｔａｎ−ＳｕｐｅｒＥｘｐｒｅｓｓ  Ｋｍ（タカラバイオ社製）を用いて、その取扱い説明書に記された操作方法に従い、配列表の配列番号２に示した塩基配列からなる遺伝子中の１２５番目のＣをＧに、１２８番目のＡをＣに、１３６番目のＡをＧに、そして、１４７番目のＣをＧに置換した変異遺伝子を作製した。本変異遺伝子は、配列表の配列番号４に示したアミノ酸配列中の、４２番目のアラニンがグリシンに置換され、４３番目のグルタミン酸がアラニンに置換され、４６番目のリジンがグルタミン酸に置換され、４９番目のアスパラギンがリジンに置換されたポリペプチドをコードする。本変異遺伝子の塩基配列を配列表の配列番号１５に、当該遺伝子にコードされる変異ポリペプチドのアミノ酸配列を、配列表の配列番号１６に示す。本変異遺伝子を、実施例３と同様にベクターｐＵＣＮＴに挿入し、組換えベクターｐＮＴＯＭ５を構築した。【００７５】
（実施例５）  グルコース脱水素酵素遺伝子をさらに含む発現ベクターの構築
プライマー７：５’−gccgaattctaaggaggttaacaatgtataaa−３’（配列表の配列番号１３）と、プライマー８：３’−gcggtcgacttatccgcgtcctgcttgg−５’（配列表の配列番号１４）を用い、プラスミドｐＧＤＫ１（Eur. J. Biochem., 186, 389 (1989)）を鋳型としてＰＣＲを行い、バシラス・メガテリウム（Bacillus megaterium）ＩＡＭ１０３０株由来のグルコース脱水素酵素（以後、ＧＤＨと呼ぶ）遺伝子の開始コドンから５塩基上流に大腸菌のリボゾーム結合配列が、さらにその直前にＥｃｏＲＩ切断点が付加され、かつ、終止コドンの直後にＳａｌＩ切断点が付加された、二本鎖ＤＮＡを取得した。【００７６】
得られたＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩで消化し、実施例３および４において構築したｐＮＴＯＭ３、ｐＮＴＯＭ４、および、ｐＮＴＯＭ５のＥｃｏＲＩ、ＳａｌＩ部位にそれぞれ挿入した組み換えプラスミドｐＮＴＯＭ３Ｇ１、ｐＮＴＯＭ４Ｇ１、および、ｐＮＴＯＭ５Ｇ１を構築した。 例として、ｐＮＴＯＭ４Ｇ１の作製法および構造を図１に示す。【００７７】
（実施例６）  形質転換体の作製
実施例３および４で構築した組換えベクターｐＮＴＯＭ３、ｐＮＴＯＭ４、および、ｐＮＴＯＭ５をそれぞれ用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）を形質転換し、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＴＯＭ３）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＴＯＭ４）、および、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＴＯＭ５）を得た。これらの形質転換体は、それぞれ、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０３６８、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０３６９、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０３７０として、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（ＩＰＯＤ）に寄託されている。【００７８】
また、同様に、実施例５で構築した組換えベクターｐＮＴＯＭ３Ｇ１、ｐＮＴＯＭ４Ｇ１、および、ｐＮＴＯＭ５Ｇ１をそれぞれ用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）を形質転換し、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＴＯＭ３Ｇ１）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＴＯＭ４Ｇ１）、および、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＴＯＭ５Ｇ１）を得た。【００７９】
（実施例７）  形質転換体における遺伝子の発現
実施例６で得た６種の形質転換体、および、ベクタープラスミドｐＵＣＮＴを含む形質転換体であるＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＵＣＮＴ）を、２００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２×ＹＴ培地（トリプトン１．６％、イーストエキス１．０％、ＮａＣｌ０．５％、ｐＨ７．０）５０ｍｌに接種し、３７℃で２４時間振盪培養した。遠心分離により菌体を集め、５０ｍｌの１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に懸濁した。これを、ＵＨ−５０型超音波ホモゲナイザー（ＳＭＴ社製）を用いて破砕した後、遠心分離により菌体残渣を除去し、無細胞抽出液を得た。この無細胞抽出液の（３Ｓ）−１−クロロ−３−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−４−フェニル−２−ブタノン還元活性、および、ＧＤＨ活性を測定し、比活性として表したものを、表１に示した。実施例６で得られた６種の形質転換体のいずれにおいても、（３Ｓ）−１−クロロ−３−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−４−フェニル−２−ブタノン還元活性の発現が認められた。また、ＧＤＨ遺伝子を含むＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＴＯＭ３Ｇ１）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＴＯＭ４Ｇ１）、および、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＴＯＭ５Ｇ１）では、ＧＤＨ活性の発現も認められた。（３Ｓ）−１−クロロ−３−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−４−フェニル−２−ブタノン還元活性は、実施例１に記載の方法で測定した。ＧＤＨ活性は、１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に、グルコース０．１Ｍ、補酵素ＮＡＤＰ２ｍＭ、および粗酵素液を添加して２５℃で１分間反応を行い、波長３４０ｎｍにおける吸光度の増加速度より算出した。この反応条件において、１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＰをＮＡＤＰＨに還元する酵素活性を１ｕｎｉｔと定義した。また、無細胞抽出液中の蛋白質濃度は、プロテインアッセイキット（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いて測定した。【００８０】
【表１】
0004746548.tif 000004
【００８１】
（実施例８）  形質転換体を用いた反応
実施例７で調製したＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＴＯＭ３）の無細胞抽出液５０ｍｌに、グルコース脱水素酵素（天野エンザイム社製）２０００Ｕ、グルコース２ｇ、ＮＡＤＰ６ｍｇ、 （３Ｓ）−１−クロロ−３−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−４−フェニル−２−ブタノン２．５ｇを添加し、５Ｍの水酸化ナトリウムの滴下によりｐＨ６．５に調整しつつ、３０℃で２２時間攪拌した。反応終了後、反応液をトルエンで抽出し、脱溶剤した後、抽出物を分析した。その結果、収率８６．３％でジアステレオマー過剰率９６．４％ｄ．ｅ．の（２Ｒ，３Ｓ）−１−クロロ−３−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−４−フェニル−２−ブタノールが得られた。【００８２】
（３Ｓ）−１−クロロ−３−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−４−フェニル−２−ブタノンと（３Ｓ）−１−クロロ−３−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−４−フェニル−２−ブタノールの定量、および、（２Ｒ，３Ｓ）−１−クロロ−３−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−４−フェニル−２−ブタノールのジアステレオマー過剰率の測定は、高速液体クロマトクロマトグラフィー（カラム：ＣＯＳＭＯＳＩＬ  ５Ｃ８−ＭＳ（φ４．６ｍｍ×２５０ｍｍ；ナカライテスク社製）、溶離液：１０ｍＭリン酸水溶液／アセトニトリル＝１／１、流速：１ｍｌ／ｍｉｎ、検出：２１０ｎｍ）で行った。【００８３】
（実施例９）  形質転換体を用いた反応
実施例７で調製したＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＴＯＭ４）の無細胞抽出液２２．５ｍｌに、グルコース脱水素酵素（天野エンザイム社製）１２５０Ｕ、グルコース３ｇ、ＮＡＤＰ４ｍｇ、 （３Ｓ）−１−クロロ−３−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−４−フェニル−２−ブタノン０．２５ｇを添加し、５Ｍの水酸化ナトリウムの滴下によりｐＨ６．５に調整しつつ、３０℃で攪拌した。反応開始から２時間後、４時間後、６時間後に０．２５ｇ、８時間後に１．２５ｇの（３Ｓ）−１−クロロ−３−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−４−フェニル−２−ブタノンを追加し、３１時間反応させた。反応終了後、反応液をトルエンで抽出し、脱溶剤した後、抽出物を実施例８と同様に分析した。その結果、収率９９．０％で、ジアステレオマー過剰率９９．８％ｄ．ｅ．の（２Ｒ，３Ｓ）−１−クロロ−３−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−４−フェニル−２−ブタノールが得られた。【００８４】
（実施例１０）  形質転換体を用いた反応
実施例７と同様に培養したＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＴＯＭ４Ｇ１）の培養液２５ｍｌに、グルコース３ｇ、ＮＡＤＰ３ｍｇ、トルエン０．２５ｍｌ、 （３Ｓ）−１−クロロ−３−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−４−フェニル−２−ブタノン２．５ｇを添加し、５Ｍの水酸化ナトリウムの滴下によりｐＨ６．５に調整しつつ、３０℃で４０時間攪拌した。反応終了後、反応液をトルエンで抽出し、脱溶剤した後、抽出物を実施例８と同様に分析した。その結果、収率９９．１％で、ジアステレオマー過剰率９９．８％ｄ．ｅ．の（２Ｒ，３Ｓ）−１−クロロ−３−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−４−フェニル−２−ブタノールが得られた。【００８５】
（実施例１１）  形質転換体を用いた反応
実施例７と同様に培養したＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＴＯＭ５Ｇ１）の培養液５０ｍｌに、グルコース６ｇ、ＮＡＤＰ１．４ｍｇ、トルエン０．２５ｍｌ、 （３Ｓ）−１−クロロ−３−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−４−フェニル−２−ブタノン２．５ｇを添加し、５Ｍの水酸化ナトリウムの滴下によりｐＨ６．５に調整しつつ、３０℃で攪拌した。反応開始から１時間後に２．５ｇの（３Ｓ）−１−クロロ−３−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−４−フェニル−２−ブタノンを追加し、２０時間反応させた。反応終了後、反応液をトルエンで抽出し、脱溶剤した後、抽出物を実施例８と同様に分析した。その結果、収率９９．６％で、ジアステレオマー過剰率９９．８％ｄ．ｅ．の（２Ｒ，３Ｓ）−１−クロロ−３−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−４−フェニル−２−ブタノールが得られた。【００８６】
（実施例１２）  ポリペプチドの基質特異性
０．３３％（ｖ／ｖ）のジメチルスルフォキシドを含む１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に、基質となるカルボニル化合物を終濃度１ｍＭ、補酵素ＮＡＤＰＨを終濃度０．２５ｍＭとなるようそれぞれ溶解した。これに、実施例７で調製したＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＴＯＭ４）、または、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＴＯＭ３）の無細胞抽出液を添加し、３０℃で１分間反応を行った。当該反応液の波長３４０ｎｍにおける吸光度の減少速度から、各カルボニル化合物に対する還元活性を算出し、これを（３Ｓ）−１−クロロ−３−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−４−フェニル−２−ブタノンに対する活性を１００％とした場合の相対値で表し、表２に示した。当該形質転換体により生産された、配列表の配列番号３および配列番号４に示したアミノ酸配列からなるポリペプチドは、いずれも広範なカルボニル化合物に対して還元活性を示した。【００８７】
【表２】
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【図１】
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【配列表】
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