(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Tritirachium属、Amycolatopsis属、及びSaccharothrix属のいずれかに属するポリ乳酸分解酵素産生菌、又は、Tritirachium属、Amycolatopsis属、及びSaccharothrix属のいずれかに属するプロテイナーゼＫ様プロテアーゼ産生菌を培養するための培地に、グリシン残基を含むオリゴペプチド、アラニン残基を含むオリゴペプチド、バリン残基を含むオリゴペプチド、バリン、アラニン、グリシン、ゼラチン、大豆、コラーゲン、エラスチン、ケラチン、及び絹フィブロイン加水分解物からなる群から選択される少なくとも１種の成分を添加する工程、及び
前記工程で得られる培地中で、前記ポリ乳酸分解酵素産生菌、前記プロテイナーゼＫ様プロテアーゼ産生菌、又は、前記ポリ乳酸分解酵素産生菌及び前記プロテイナーゼＫ様プロテアーゼ産生菌を培養する工程、
を含むことを特徴とする、ポリ乳酸分解酵素の製造法。
【請求項２】
Tritirachium属、Amycolatopsis属、及びSaccharothrix属のいずれかに属するポリ乳酸分解酵素産生菌、又は、Tritirachium属、Amycolatopsis属、及びSaccharothrix属のいずれかに属するプロテイナーゼＫ様プロテアーゼ産生菌を培養する培地中に、バリン、アラニン、グリシン、アラニル−アラニンジペプチド、グリシル−アラニンジペプチド、バリル−グリシンジペプチド、グリシル−バリンジペプチド、アラニル−アラニル−アラニントリペプチド、グリシル−グリシル−アラニントリペプチド、グリシル−グリシル−グリシントリペプチド、グリシル−バリル−グリシントリペプチド、ゼラチン、大豆、コラーゲン、エラスチン、ケラチン、絹フィブロイン加水分解物からなる群から選択される少なくとも１種の成分を添加する工程、及び
前記工程で得られる培地中で、前記ポリ乳酸分解酵素産生菌、前記プロテイナーゼＫ様プロテアーゼ産生菌、又は、前記ポリ乳酸分解酵素産生菌及び前記プロテイナーゼＫ様プロテアーゼ産生菌を培養する工程、
を含むことを特徴とする、ポリ乳酸分解酵素の製造法。
【請求項３】
前記培養する工程で得られる培養物からポリ乳酸分解酵素を採取する工程、を更に含むことを特徴とする請求項１又は２に記載のポリ乳酸分解酵素の製造法。
【請求項４】
前記成分の添加量が、前記培地１００ｍｌ当り１ｍｇ〜１０ｇであることを特徴とする請求項１−３に記載のポリ乳酸分解酵素の製造法。
【請求項５】
Tritirachium属、Amycolatopsis属、及びSaccharothrix属のいずれかに属するポリ乳酸分解酵素産生菌、又は、Tritirachium属、Amycolatopsis属、及びSaccharothrix属のいずれかに属するプロテイナーゼＫ様プロテアーゼ産生菌を培養する培地中に、グリシン残基を含むオリゴペプチド、アラニン残基を含むオリゴペプチド、バリン残基を含むオリゴペプチド、バリン、アラニン、グリシン、ゼラチン、大豆、コラーゲン、エラスチン、ケラチン、及び絹フィブロイン加水分解物からなる群から選択される少なくとも１種の成分を添加する工程、及び
前記工程で得られる培地中で、前記ポリ乳酸分解酵素産生菌、前記プロテイナーゼＫ様プロテアーゼ産生菌、又は、前記ポリ乳酸分解酵素産生菌及び前記プロテイナーゼＫ様プロテアーゼ産生菌を培養する工程、
を含むことを特徴とする、プロテイナーゼＫ様プロテアーゼの製造法。
【請求項６】
Tritirachium属、Amycolatopsis属、及びSaccharothrix属のいずれかに属するポリ乳酸分解酵素産生菌、又は、Tritirachium属、Amycolatopsis属、及びSaccharothrix属のいずれかに属するプロテイナーゼＫ様プロテアーゼ産生菌を培養する培地中に、バリン、アラニン、グリシン、アラニル−アラニンジペプチド、グリシル−アラニンジペプチド、バリル−グリシンジペプチド、グリシル−バリンジペプチド、アラニル−アラニル−アラニントリペプチド、グリシル−グリシル−アラニントリペプチド、グリシル−グリシル−グリシントリペプチド、グリシル−バリル−グリシントリペプチド、ゼラチン、大豆、コラーゲン、エラスチン、ケラチン、絹フィブロイン加水分解物からなる群から選択される少なくとも１種の成分を添加する工程、及び
前記工程で得られる培地中で、前記ポリ乳酸分解酵素産生菌、前記プロテイナーゼＫ様プロテアーゼ産生菌、又は、前記ポリ乳酸分解酵素産生菌及び前記プロテイナーゼＫ様プロテアーゼ産生菌を培養する工程、
を含むことを特徴とする、プロテイナーゼＫ様プロテアーゼの製造法。
【請求項７】
前記培養する工程で得られる培養物からプロテイナーゼＫ様プロテアーゼを採取する工程を含むことを特徴とする、請求項４又は５に記載のプロテイナーゼＫ様プロテアーゼの製造法。
【請求項８】
前記成分の添加量が、前記培地１００ｍｌ当り１ｍｇ〜１０ｇであることを特徴とする請求項５−７に記載のプロテイナーゼＫ様プロテアーゼの製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ポリ乳酸分解酵素又はプロテイナーゼＫ様プロテアーゼの製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ポリ乳酸は、乳酸から製造される直鎖脂肪族ポリエステルであり、その乳酸は発酵プロセスによりでんぷんのような再生可能バイオマスから製造されている。そして、ポリ乳酸は、高融点、高透明性及び優れた生体適合性のような特性を持つため、生分解性材料として医療用の縫合糸などとして応用されており、近年、その生産量が急増している。
【０００３】
しかしながら、ポリ乳酸は自然界において分解されるものの、その速度は遅く、さらにポリ乳酸を分解する微生物の分布も限定されている。このため、今後生産量が増加するであろうポリ乳酸を分解する方法の確立が急務である。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
ポリ乳酸の分解方法としては、微生物の産生するポリ乳酸分解酵素を用いて分解する方法が広く研究されているが、未だ現実的に満足な結果が得られていないのが現状である。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
そこで、本発明者は、ポリ乳酸分解酵素産生菌又はプロテイナーゼＫ様プロテアーゼ産生菌によるポリ乳酸分解酵素の産生について詳細に研究し、該産生菌の培地中に、特定のオリゴペプチド、アミノ酸、タンパク質、絹フィブロイン、絹フィブロイン加水分解物などの成分を添加して培養したところ、培地中のポリ乳酸分解酵素の生産量を増強するか、若しくはより活性の高い酵素を生産することを見出し、本発明を完成した。また、Tritirachium album ATCC22563とSaccharothrix waywayandensis JCM9114等がポリ乳酸分解酵素及びプロテイナーゼＫ様プロテアーゼを産生することを見出し、本発明を完成した。
【０００６】
すなわち、本発明は、以下のポリ乳酸分解酵素又はプロテイナーゼＫ様プロテアーゼの製造法を提供するものである。
項１．グリシン残基を含むオリゴペプチド、アラニン残基を含むオリゴペプチド、バリン残基を含むオリゴペプチド、バリン、アラニン、グリシン、ゼラチン、大豆、コラーゲン、エラスチン、ケラチン、絹フィブロイン及び絹フィブロイン加水分解物からなる群から選択される少なくとも１種の存在下でポリ乳酸分解酵素産生菌及び／又はプロテイナーゼＫ様プロテアーゼ産生菌を培養して、培養物からポリ乳酸分解酵素を採取することを特徴とする、ポリ乳酸分解酵素の製造法。
項２．バリン、アラニン、グリシン、アラニル−アラニンジペプチド、グリシル−アラニンジペプチド、バリル−グリシンジペプチド、グリシル−バリンジペプチド、アラニル−アラニル−アラニントリペプチド、グリシル−グリシル−アラニントリペプチド、グリシル−グリシル−グリシントリペプチド、グリシル−バリル−グリシントリペプチド、ゼラチン、大豆、コラーゲン、エラスチン、ケラチン、絹フィブロイン加水分解物からなる群から選択される少なくとも１種の存在下でポリ乳酸分解酵素産生菌及び／又はプロテイナーゼＫ様プロテアーゼ産生菌を培養して、培養物からポリ乳酸分解酵素を採取することを特徴とする、ポリ乳酸分解酵素の製造法。
項３．ポリ乳酸分解酵素産生菌又はプロテイナーゼＫ様プロテアーゼ産生菌がTritirachium属、Amycolatopsis属、Saccharothrix属、Streptomyces属、Bacillus属、Streptoalloteichus属、Kibdelosporangium属、Lentzea属、Saccharomonospora属、Staphylococcus属及びSaccharopolyspora属のいずれかに属する微生物であることを特徴とする項１又は２に記載のポリ乳酸分解酵素の製造法。
項４．グリシン残基を含むオリゴペプチド、アラニン残基を含むオリゴペプチド、バリン残基を含むオリゴペプチド、バリン、アラニン、グリシン、ゼラチン、大豆、コラーゲン、エラスチン、ケラチン、絹フィブロイン及び絹フィブロイン加水分解物からなる群から選択される少なくとも１種の存在下でポリ乳酸分解酵素産生菌及び／又はプロテイナーゼＫ様プロテアーゼ産生菌を培養して、培養物からプロテイナーゼＫ様プロテアーゼを採取することを特徴とする、プロテイナーゼＫ様プロテアーゼの製造法。
項５．バリン、アラニン、グリシン、アラニル−アラニンジペプチド、グリシル−アラニンジペプチド、バリル−グリシンジペプチド、グリシル−バリンジペプチド、アラニル−アラニル−アラニントリペプチド、グリシル−グリシル−アラニントリペプチド、グリシル−グリシル−グリシントリペプチド、グリシル−バリル−グリシントリペプチド、ゼラチン、大豆、コラーゲン、エラスチン、ケラチン、絹フィブロイン加水分解物からなる群から選択される少なくとも１種の存在下でポリ乳酸分解酵素産生菌及び／又はプロテイナーゼＫ様プロテアーゼ産生菌を培養して、培養物からプロテイナーゼＫ様プロテアーゼを採取することを特徴とする、プロテイナーゼＫ様プロテアーゼの製造法。
項６．ポリ乳酸分解酵素産生菌又はプロテイナーゼＫ様プロテアーゼ産生菌がTritirachium属、Amycolatopsis属、Saccharothrix属、Streptomyces属、Bacillus属、Streptoalloteichus属、Kibdelosporangium属、Lentzea属、Saccharomonospora属、Staphylococcus属及びSaccharopolyspora属のいずれかに属する微生物であることを特徴とする項４又は５に記載のプロテイナーゼＫ様プロテアーゼの製造法。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明において、ポリ乳酸とは、ポリマーの主要な構成単位として乳酸を有するポリマーをいい、例えば、ポリL-乳酸やポリD-乳酸等の乳酸ホモポリマー、L-乳酸及びD-乳酸の少なくとも１種とアラニン、グリコール酸、グリコリド、グリシン、ε−カプロラクトン、グルコール、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリビニルアルコール、糖類、多価アルコールの少なくとも１種との乳酸コポリマー、ポリD,L-乳酸などが挙げられる。好ましくは、乳酸ホモポリマー、L-乳酸及びD-乳酸の少なくとも１種とアラニン若しくはグリコリドとの乳酸コポリマー、ポリD,L-乳酸であり、さらに好ましくはL-乳酸及びD-乳酸の少なくとも１種とグリコリドとの乳酸コポリマー、ポリL-乳酸である。ポリ乳酸の数平均分子量は特に制限されないが、好ましくは5000〜1×106、さらに好ましくは50000〜4×105である。ポリ乳酸中の乳酸単位の重量比率は特に制限されないが、好ましくは10％以上、さらに好ましくは30％以上である。
【０００８】
本発明において、ポリ乳酸分解酵素産生菌は、ポリ乳酸分解酵素を生産する菌であれば特に制限されない。例えば、Tritirachium属、Amycolatopsis属、Saccharothrix属、Streptomyces属、Bacillus属、Streptoalloteichus属、Kibdelosporangium属、Lentzea属、Saccharomonospora属、Saccharopolyspora属、Staphylococcus属に属する菌である。好ましくは、Tritirachium属、Amycolatopsis属、Saccharothrix属、Kibdelosporangium属、Lentzea属、Streptomyces属に属する菌があげられ、さらに好ましくは、Tritirachium属、Amycolatopsis属、Saccharothrix属に属する菌があげられる。かかる菌として具体的にはTritirachium album（以下、T. albumとする）、Amycolatopsis orientalis subsp. orientalis（以下、A. orientalisとする）、Saccharothrix waywayandensis（以下、S. waywayandensisとする）をあげることができる。
【０００９】
また、本発明において、プロテイナーゼＫ様プロテアーゼ産生菌は、プロテイナーゼＫまたはプロテイナーゼＫ様プロテアーゼを産生する菌であれば特に制限されない。ここでプロテイナーゼＫ様プロテアーゼとは、例えば、タンパク質をペプチド結合鎖の中ほどから切断するセリンプロテアーゼの一種で、分子量が約２９０００、至適ｐＨが７．５〜１２．０程度、等電点がｐＨ８．９程度のような性質を有するプロテアーゼである。例えば、Tritirachium属、Amycolatopsis属、Saccharothrix属、Streptomyces属、Bacillus属、Streptoalloteichus属、Kibdelosporangium属、Lentzea属、Saccharomonospora属、Saccharopolyspora属、Staphylococcus属に属する菌である。好ましくは、Tritirachium属、Amycolatopsis属、Saccharothrix属、Kibdelosporangium属、Lentzea属、Streptomyces属に属する菌があげられ、さらに好ましくは、Tritirachium属、Amycolatopsis属、Saccharothrix属に属する菌があげられる。かかる菌として具体的にはT. album、A. orientalis、S. waywayandensis等をあげることができる。
【００１０】
上記の産生菌を培養する培地としては、従来から用いられているカビ、放線菌、酵母、細菌用培地等を使用できる。例えば、蒸留水1000ml当たり、酵素エキス100mg、FeSO4・7H2O 10mg、MgSO4・7H2O 200mg、(NH4)2SO4 1000mg、CaCl2・2H2O 20mg、NaCl 100mg、Na2MoO4・2H2O 0.5mg、Na2WO4 0.5mg、MnSO4 0.5mgである。また、水道水1000ml当たり、牛肉エキス100mg、ペプトン100mgのような培地も例示される。
【００１１】
本発明では、上記の培地に、グリシン残基を含むオリゴペプチド、アラニン残基を含むオリゴペプチド、バリン残基を含むオリゴペプチド、バリン、アラニン、グリシン、ゼラチン、大豆、コラーゲン、エラスチン、ケラチン、絹フィブロイン及び絹フィブロイン加水分解物の少なくとも１種の成分が添加される。これらの成分は、ポリ乳酸分解酵素産生菌又はプロテイナーゼＫ様プロテアーゼ産生菌の培地中に存在することによって、ポリ乳酸分解酵素産生菌又はプロテイナーゼＫ様プロテアーゼ産生菌に対してポリ乳酸分解酵素の生産能力を増強するか、若しくはより活性の高い酵素を生産するように作用する。好ましくは、グリシン残基を含むオリゴペプチド、アラニン残基を含むオリゴペプチド、バリン残基を含むオリゴペプチド、バリン、アラニン、グリシン、ゼラチン、大豆、コラーゲン、エラスチン、ケラチン及び絹フィブロイン加水分解物からなる群から選択される少なくとも１種である。さらに好ましくは、バリン、アラニン、グリシン、アラニル−アラニンジペプチド、グリシル−アラニンジペプチド、バリル−グリシンジペプチド、グリシル−バリンジペプチド、アラニル−アラニル−アラニントリペプチド、グリシル−グリシル−アラニントリペプチド、グリシル−グリシル−グリシントリペプチド、グリシル−バリル−グリシントリペプチド、ゼラチン、大豆、コラーゲン、エラスチン、ケラチン、絹フィブロイン加水分解物からなる群から選択される少なくとも１種である。
【００１２】
これらの成分の添加量は、例えば培地100ml当たり１mg〜10ｇ、好ましくは10mg〜３ｇ、さらに好ましくは50mg〜１ｇである。
【００１３】
上記オリゴペプチドとしては、２〜２０個程度のアミノ酸残基で構成され、アミノ酸残基としてグリシン、アラニン、バリンの少なくとも１種を少なくとも１個有するオリゴペプチドを挙げることができる。グリシン残基、アラニン残基及びバリン残基の数、並びにこれらの配列位置や結合態様は特に制限されない。また、好ましいアミノ酸残基の個数は２〜５個である。好ましいオリゴペプチドの具体例としては、アラニル−アラニンジペプチド（以下、(Ala)2とする）、グリシル−アラニンジペプチド（以下、Gly-Alaとする）、バリニル−グリシンジペプチド（以下、Val-Glyとする）、グリシル−バリンジペプチド（以下、Gly-Valとする）、アラニル−アラニル−アラニントリペプチド（以下、(Ala)3とする）、グリシル−グリシル−アラニントリペプチド（以下、(Gly)2-Alaとする）、グリシル−グリシル−グリシントリペプチド（以下、(Gly)3とする）、グリシル−バリニル−グリシントリペプチド（以下、Gly-Val-Glyとする）などが挙げられる。
【００１４】
上記大豆は、大豆を水解、変性したものも包含する。大豆の形態としては様々な形態のものが使用可能である。表面積を大きくする点では粉末状が好ましい。また、経済性や窒素源の観点からは大豆かすが使用される。
【００１５】
上記グリシン、アラニン、バリン、コラーゲン、エラスチン、ケラチンは、特に制限されず、市販のものを使用できる。
【００１６】
上記絹フィブロインは、好ましくは生糸を精練することによりセリシンを除いた不溶性タンパク質である。絹フィブロインの形態は特に制限されず、例えば、繊維状、粉末状、ペレット状、小片状等の形態の絹フィブロインが使用されるが、表面積が大きいため微生物が利用しやすい粉末状の絹フィブロインが好ましく使用される。
【００１７】
上記絹フィブロイン加水分解物は、絹フィブロインを加水分解して得られる、アミノ酸残基の数が２〜５０個、好ましくは２〜２０個、さらに好ましくは２〜５個のペプチドをいう。絹フィブロインの加水分解の方法は、絹フィブロイン加水分解物が得られる限り特に制限されない。例えば、加水分解剤としては、塩酸、硫酸、ヨウ化水素酸、苛性ソーダ、水酸化バリウム等の酸加水分解剤、炭酸ナトリウムなどのアルカリ加水分解剤、トリプリン、キモトリプシン、パンクレアチンなどの加水分解酵素などが使用される。加水分解条件は、特に制限されないが、塩酸を使用する場合、例えば絹フィブロインの１倍量以上の３〜６Ｎ塩酸で１０〜１６０℃で０．１〜２４時間する条件を挙げることができる。また、酵素で処理する場合には、絹フィブロインを可溶化してから酵素処理しても良いし、可溶化せずに酵素処理しても良い。
【００１８】
培養温度は、ポリ乳酸分解酵素が産生される限り特に制限されないが、使用する菌種の生育に適した温度が好ましい。例えば、Tritirachium属に属する微生物の場合、10〜45℃、好ましくは20〜30℃であり、Amycolatopsis属に属する微生物の場合、10〜55℃、好ましくは25〜37℃であり、Saccharothrix属に属する微生物の場合、10〜45℃、好ましくは25〜37℃である。
【００１９】
培地のｐＨは、使用する菌種の生育に適したｐＨが好ましい。例えば、Tritirachium属に属する微生物の場合、4.0〜8.0、好ましくは5.0〜6.0であり、Amycolatopsis属に属する微生物の場合、5.0〜9.0、好ましくは6.5〜7.5であり、Saccharothrix属に属する微生物の場合、5.0〜9.0、好ましくは6.5〜7.5である。
【００２０】
培養時間は、特に制限されず、使用する菌種、菌量、培地等に応じて適宜選択される。例えば１〜14日間、好ましくは２〜10日間である。
【００２１】
また、培養時は、必ずしも必要ではないが、撹拌することが好ましい。さらに培養菌に応じて好気的条件、嫌気的条件が選択される。他の培養条件については、本発明の目的を考慮して適宜選択される。
【００２２】
上述のようにして培養された培養物から酵素を採取する方法としては、例えば常法により培養液を濾過等により菌体を除去し、必要により透析、塩析、イオン交換樹脂によるイオン交換、ゲル濾過、アフィニティクロマトグラフィー等により精製する方法等が挙げられる。
【００２３】
【発明の効果】
本発明によれば、グリシン残基を含むオリゴペプチド、アラニン残基を含むオリゴペプチド、バリン残基を含むオリゴペプチド、バリン、アラニン、グリシン、ゼラチン、大豆、コラーゲン、エラスチン、ケラチン、絹フィブロイン及び絹フィブロイン加水分解物からなる群から選択される少なくとも１種の存在下でポリ乳酸分解酵素産生菌及び／又はプロテイナーゼＫ様プロテアーゼ産生菌を培養することによって、ポリ乳酸分解酵素産生菌又はプロテイナーゼＫ様プロテアーゼ産生菌に対してポリ乳酸分解酵素の生産能力を増強するか、若しくはより活性の高い酵素を生産するように作用する。したがって、この培養の培養物から、より多くの又はより活性の高いポリ乳酸分解酵素を採取することができ、生分解性プラスチックの分解をより環境負荷の低い状態で実現可能である。
【００２４】
【実施例】
ＰＬＡ（ポリL-乳酸）ペレット（ラクティ#1012（数平均分子量（Mn）＝2.8×105））及び市販のＰＬＡブラウンフィルムは島津製作所から入手した。酵素アッセイ用のＰＬＡパウダーは次のようにして作った：５％（wt/vol）クロロホルム溶液を、１Ｌのメタノールに滴下して、繊維状の沈殿物を得た。その繊維を濾過し、１日空気で乾かし、次いで真空下で一晩乾燥した。次にその繊維を液体窒素下、金属製乳鉢中にて低温で寝かせ、次いで真空下８０℃で乾燥させた。
【００２５】
他のポリエステル粉末は、ＰＣＬ（ポリ(e-カプロラクトン）)（ユニオンカーバイド社のトーンP-767-P（Mn＝1.8×104）)、ＰＨＢ（ポリ(β-ヒドロキシブチレート)）（三菱ガスケミカル社製、Mn＝1.5×105）を用いた。ＰＢＳ（ポリ(ブチレンスクシネート)）ペレット（ショウワ高分子社のバイオノル#1020（Mn＝5.8×104）を低温（-160℃〜-140℃）で粉砕して使用した。
【００２６】
大豆は、コーヒー豆を挽く道具で粉末状にした大豆かすを使用した。ゼラチン、コラーゲン、エラスチンは、シグマ社から購入した。ケラチンはカミ商事株式会社から購入した。
【００２７】
蚕の繭から得られる絹フィブロイン粉末はトスコ社から購入し、熱湯で洗浄して水溶性成分を除去した。この絹フィブロイン粉末のアミノ酸分析は、44.6モル％グリシン、29.5モル％アラニン、11.7モル％セリンであった。ウシ頚部靱帯のエラスチンはシグマケミカル社から購入した。全ての粉末サンプルは250μｍメッシュで篩い分けしてから使用した。
【００２８】
絹フィブロイン加水分解物は、絹フィブロインを２０倍量の３Ｎ塩酸で３７℃、４８時間処理し、Dowex-50のカラムクロマトグラフィーで精製したものを使用した。加水分解物の成分は、Gly-Val-Gly、Gly-Val、Val-Gly、Ala、Gly、Ala-Ala、Ala-Ala-Ala、Gly-Gly、Gly-Gly-Alaなどのアミノ酸、オリゴペプチドの混合物であった。
【００２９】
また、実施例において菌株はT. album ATCC22563、A. orientalis IFO12362、S. waywayandensis JCM9114を使用した。
【００３０】
実施例１  T. album ATCC22563によるＰＬＡ分解
以前報告された方法（H. Pranamuda, Y. Tokiwa, Biotechnol. Lett. 1999, 21, 901）によって調製された基本培地及びEbelingら（Eur. J. Biochem. 1974, 47, 91）に記載のプロテアーゼ生産用液体培地をT. album ATCC22563の液体培養に使用した。基本培地の組成は1000ml当たり、酵素エキス100mg、FeSO4・7H2O 10mg、MgSO4・7H2O 200mg、(NH4)2SO4 1000mg、CaCl2・2H2O 20mg、NaCl 100mg、Na2MoO4・2H2O 0.5mg、Na2WO4 0.5mg、MnSO4 0.5mgで、pHは5.4付近である。プロテアーゼ生産用培地の組成は、グルコース1％、カゼインペプトン1％、MgSO4・7H2O 0.01％、CaCl2・H2O 0.005％、KH2PO4 0.28％、Na2HPO4 0.07％で、pHは5.7〜5.9である。
【００３１】
本培養に先立って、100mlの麦芽培地（W. Ebeling, M. Hennrich, M. Klockow, H. Metzt, H. D. Orth, H. Lang, Eur. J. Biochem, 1974, 47, 91）に菌を植え、ロータリーシェーカー（180rpm）で30℃5日間培養することによってシード培養物を調製した。シード培養物の10mlを100mlの培養液を含有する500mlのエルレンマイヤーフラスコ中でインキュベートした。100mgのＰＬＡブラウンフィルム（厚さ約46μｍ）を5％（wt/vol）次亜塩素酸ナトリウムで前もって殺菌し、無菌的に培養液に加えた。また、滅菌の前に0.1％ゼラチンも加えた。フラスコをロータリーシェーカー（180rpm）にて30℃で14日間インキュベートした。なお、各々の培養液についてゼラチンを加えないサンプルでもインキュベートした。
【００３２】
培養液の5mlをとり、水溶性有機炭素濃度（TOC）及びpHを測定した。TOCの測定にはTOC-5000アナライザー（島津製作所）を使用した。TOCは、L-乳酸、乳酸オリゴマー等の分解生成物の蓄積の指標となる。残存フィルムは、クロロホルム100mlで抽出しエバポレーターで乾燥することによって、培養液から直接回収した。フィルム抽出後、培養液中の細胞を遠心分離（4500g、10分）して回収し、105℃で16時間乾燥した。培養液中に含まれるL-乳酸をエンジマティックバイオアナライシスキット（ベーリンガーカンハイム社）で酵素的に分析した。結果を表１に示す。表１中のフィルム減少量の欄から、培地中にゼラチンを添加することによって、培養液がＰＬＡを強く分解することが示されている。したがって、ゼラチンはT. albumのＰＬＡ分解のインデューサーとして有用である。
【００３３】
【表１】
0004729684.tif 000002
【００３４】
実施例２  各種基質に対するT. album ATCC22563培養濾液の分解活性
0.1％ゼラチン含有培地でT. album ATCC22563菌を培養した培養液を濾過し、得られた培養濾液のＰＬＡ、ＰＣＬ、ＰＢＳ、ＰＨＢ、絹フィブロイン及びエラスチンに対する分解活性を測定した。培養濾液を前もって適量の5mMリン酸バッファーで2日間透析し、1mlの培養濾液（タンパク質0.15mg）を、0.1mlの0.5％（wt/vol）オクチル−グルコピラノシド、10mgの基質及び4mlの0.1Mリン酸バッファー（pH7）からなる懸濁液の入った50mlバイアル中に加えた。基質及び培養濾液コントロールとしては、混合物からそれぞれ培養濾液及び基質を取り除いたものを使用した。反応混合物を30℃、12時間でロータリーシェーカー（100rpm）にてインキュベートし、溶液を0.22μmフィルターで濾過し、各サンプルのTOC濃度を測定した。TOC値は、両方のコントロールを控除して得られた。
【００３５】
スクシニル-(L-アラニル-L-アラニル-L-アラニン)p-ニトロアニリド（Suc-(Ala)3-pNA）（シグマケミカル社）に対する酵素活性を、該ニトロアニリドから遊離するp-ニトロアニリン（p-NA）の濃度を測定することによって評価した。1mlの培養濾液及び1.0mMのSuc-(Ala)3-pNAを含有する4mlの0.1Mリン酸バッファー（pH7）の混合物を30℃で10分間インキュベートし、遊離したp-NAを分光光度計（島津UV-VIS）を用いて410nmで10分間モニターした。酵素活性の１ユニットを、Suc-(Ala)3-pNAから1分間に遊離した1.0μモルのp-NAと規定する。
【００３６】
T. albumから得られるプロテイナーゼＫ（E.C. 3.4.21.64）及びブタ膵臓から得られるエラスターゼ（E.C. 3.4.21.36）（共にシグマケミカル社）を、0.1Mリン酸バッファー（pH7）を用いて各々0.001％（wt/vol）の酵素溶液として、上記基質に対する活性を測定し、培養濾液と比較した。結果を表２に示す。培養濾液は、エラスターゼと明らかに異なる基質特異性を示している。また、培養濾液は、基室であるSuc-(Ala)3-pNAや絹フィブロイン、エラスチンと比較するとポリ乳酸に対して特に強い活性を示すことから、プロテイナーゼＫとも異なるＰＬＡ分解酵素を産生していることが示唆される。
【００３７】
【表２】
0004729684.tif 000003
【００３８】
実施例３
表３に示す0.1％（wt/vol）の各種インデューサーを含む培養液でT. album ATCC22563を、ゼラチンを除いた実施例１と同様な培養条件で10日間培養した。0.2mlの培養液及び1.0mMのSuc-(Ala)3-pNAを含有する4mlの0.1Mリン酸バッファー（pH7）の混合物を30℃で10分間インキュベートし、遊離したp-NAを分光光度計（島津UV-VIS）を用いて410nmで測定した。1mlの培養液を、0.1mlの0.5％（wt/vol）オクチル−グルコピラノシド、10mgのＰＬＡ及び4mlの0.1Mリン酸バッファー（pH7）からなる懸濁液の入った50mlバイアル中に加えた。ＰＬＡ基質コントロール及び培養濾液コントロールとしては、混合物からそれぞれ培養濾液及び基質を取り除いたものを使用した。反応混合物を30℃、12時間でロータリーシェーカー（100rpm）にてインキュベートし、溶液を0.22μmフィルターで濾過し、各サンプルのTOC濃度を測定した。TOC値は、両方のコントロールを控除して得られた。評価は、ＰＬＡ分解活性の場合、TOC値が10以上を「＋」、5以下を「−」で示し、Suc-(Ala)3-pNA分解活性の場合、遊離するp-NAが1.1μモル／min（410nmの吸光度が0.020）以上を「＋」、0μモル／min（410nmの吸光度が0.003）以下の場合を「−」で示した。なお、Suc-(Ala)3-pNA分解活性は、プロテイナーゼＫ様プロテアーゼ活性の指標となり、これは以下の実施例においても同様である。
【００３９】
【表３】
0004729684.tif 000004
【００４０】
実施例４
表４、５、６に示す0.1％（wt/vol）の各種インデューサーを含む培養液で菌（T. album ATCC22563、A. orientalis IFO12362、S. waywayandensis JCM9114）を、ゼラチンを除いた実施例１と同様の培養条件で10日間培養した。培養液を濾過し、培養濾液を得た。1.0mMのSuc-(Ala)3-pNAを含有する0.2mlの培養濾液及び4mlの0.1Mリン酸バッファー（pH7）の混合物を30℃で10分間インキュベートし、遊離したp-NAを分光光度計（島津UV-VIS）を用いて410nmで測定した。
【００４１】
【表４】
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【００４２】
【表５】
0004729684.tif 000006
【００４３】
【表６】
0004729684.tif 000007
【００４４】
実施例５
表７、８に示す0.1％（wt/vol）の各種インデューサーを含む培養液で菌（T. album ATCC22563）を、ゼラチンを除いた実施例１と同様の培養条件で10日間培養した。培養液を濾過し、培養濾液を得た。Suc-(Ala)3-pNA分解活性の測定は、実施例３と同様に行った。ＰＬＡ分解活性の測定は次のようにして行った。1mlの培養濾液を、0.1mlの0.5％（wt/vol）オクチル−グルコピラノシド、10mgのＰＬＡ及び4mlの0.1Mリン酸バッファー（pH7）からなる懸濁液の入った50mlバイアル中に加えた。ＰＬＡ基質コントロール及び培養濾液コントロールとしては、混合物からそれぞれ培養濾液及び基質を取り除いたものを使用した。反応混合物を30℃、12時間でロータリーシェーカー（100rpm）にてインキュベートし、溶液を0.22μmフィルターで濾過し、各サンプルのTOC濃度を測定した。TOC値は、両方のコントロールを控除して得られた。タンパク質の測定は、培養濾液をフォーリン−シオカルチュー−フェノール試薬（シグマケミカル社）を用いるローリー法で測定することにより行った。
【００４５】
【表７】
0004729684.tif 000008
【００４６】
【表８】
0004729684.tif 000009
【００４７】
実施例６
表９に示す0.1％（wt/vol）の各種インデューサーを含む培養液で菌（T. album ATCC22563）を、ゼラチンを除いた実施例１と同様の培養条件で10日間培養した。培養液を濾過して得られた培養濾液のpH、タンパク質濃度、TOC、乾燥細胞重量を測定した。
【００４８】
【表９】
0004729684.tif 000010
【００４９】
実施例７
表１０、表１１、表１２に示す0.1％（wt/vol）の各種インデューサーを含む培養液で菌（T. album ATCC22563、A. orientalis IFO12362、S. waywayandensis JCM9114）を、ゼラチンを除いた実施例１と同様の培養条件で10日間培養した。培養液を濾過して得られた培養濾液の1mlを、0.1mlの0.5％（wt/vol）オクチル−グルコピラノシド、10mgのＰＬＡ及び4mlの0.1Mリン酸バッファー（pH7）懸濁液の入った50mlバイアル中に加えた。ＰＬＡ基質コントロール及び培養濾液コントロールとしては、混合物からそれぞれ培養濾液及び基質を取り除いたものを使用した。反応混合物を30℃、12時間でロータリーシェーカー（100rpm）にてインキュベートし、溶液を0.22μmフィルターで濾過し、各サンプルのTOC濃度を測定した。TOC値は、酵素反応値から両方のコントロールを控除して得られた。TOC形成値は、ＰＬＡ酵素分解の指標となる。
【００５０】
【表１０】
0004729684.tif 000011
【００５１】
【表１１】
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【００５２】
【表１２】
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