(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌患者から採取した腫瘍組織の細胞のＣＤＫ１の活性値と発現量との比（ＣＤＫ１比活性）及びＣＤＫ２の活性値と発現量との比（ＣＤＫ２比活性）の比を、所定の閾値と比較することにより、癌の再発のしやすさを試験する方法。
【請求項２】
前記ＣＤＫ１比活性及びＣＤＫ２比活性の比を、前記閾値と比較することにより、癌の再発のしやすさについて、少なくともハイリスクおよびローリスクのうちの一の試験結果を得る請求項１に記載の方法。
【請求項３】
癌患者から採取した腫瘍組織の細胞のＣＤＫ１の活性値と発現量との比（ＣＤＫ１比活性）及びＣＤＫ２の活性値と発現量との比（ＣＤＫ２比活性）の比を、所定の閾値と比較することにより、前記細胞の抗癌剤に対する感受性を試験する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サイクリン依存性キナーゼ１（ＣＤＫ１）およびサイクリン依存性キナーゼ２（ＣＤＫ）の比活性に基づいて、癌の再発のしやすさを試験する方法、並びに、ＣＤＫ１およびＣＤＫ２の比活性に基づいて、抗癌剤に対する感受性を試験する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、臨床で行われている癌診断としては、血清中の腫瘍マーカーを調べる血清診断、生検（バイオプシイ）による組織診、細胞診がある。【０００３】
腫瘍マーカーとは、個体の発生、成熟の過程で発現されなくなった遺伝子が腫瘍細胞において発現したことによるタンパク、糖タンパク、脂質等の物質であり、血清診断は、腫瘍マーカーを検出することにより腫瘍の病期、悪性度を判定している。しかしながら、現在用いられている腫瘍マーカーの多くは、癌特異性がそれ程高くない。また、早期癌では発現量が微量であることから診断感度が低い。このような理由から、腫瘍マーカーによる癌診断の信頼性は、医療現場ではそれ程、高くないのが現状である。【０００４】
一方、組織診、細胞診は、病理医及びセルスクリーナーが、採取された生体組織切片、細胞を染色後、顕微鏡観察し、その形態、染色の様子から、自らの経験に基づいて判定する診断方法である。しかし、染色方法が医療機関により区々であり、また最終的判定は観察者個々人が自らの経験に基づくことから、中分化型、ステージ１といった微妙な段階では、確定診断が難しく、治療の選択を誤って、重篤な癌の進行を招く例も珍しくない。【０００５】
このような状況に鑑み、診断方法を画一化する方法として、ＴＮＭ分類が考案され、世界的に流用されつつある。癌のＴＮＭ分類は、国際対癌連合（ＵＩＣＣ）が採用する悪性腫瘍の進展度を表す方法で、「Ｔ」は原発腫瘍の大きさ、Ｎはリンパ転移のレベル、Ｍは遠隔転移を示している。そして、Ｔについて、進展度を１（腫瘍が組織内に限局している程度）〜４（組織外への腫瘍形成があらわれる程度）に分類し、Ｎについて、進展度を、０（局所リンパ節転移認められない）〜３（リンパ節転移を組織学的に認められる）に分類し、Ｍについて進展度を、０（遠隔転移なし）〜１（遠隔転移）に分類している。Ｔ、Ｍ、Ｎのいずれにおいても数値が大きい程、予後が低く、悪性度が高い癌である。【０００６】
このようなＴＭＮ分類は治療法の決定や予後判定に有用であるとして、一般に使用されているが、ＴＮＭ分類により早期癌であると判断された患者においても、乳癌の場合、約１０〜２０％の患者が５年以内に遠隔転移による再発を起こし、死亡するのが現状であり、臨床上の大きな問題点となっている。また、ＴＭＮ分類に基づく判定は、診断時での病態を把握することはできても、予後を正確に予測するまにでは至っていない。【０００７】
上記診断方法の他に、癌組織では、３倍体、４倍体といった倍数体の細胞が多く存在することに着目して、蛍光標示式細胞ソーター（ＦＡＣＳ）を用いてＤＮＡ含量を測定し、その測定結果から癌の悪性度を診断する方法がある。しかしながら、採取した組織をＦＡＣＳにかけるためには、単細胞にばらばらにする必要があるが、生検試料を単細胞の集団にすることは、一般に容易でなく、熟練した技術を要する。このような理由から、ＦＡＣＳを用いた癌診断の医療現場での実用化は、現在のところ難しいと考えられている。【０００８】
以上のような実情から、単細胞化という面倒な試料調製を要求しない方法で、且つ臨床現場において、個々人の判断や医療機関の判定方法の差によるばらつきが少なく、確定診断に至ることができる診断方法の確立が望まれている。【０００９】
近年、診断医によるバラツキが少ない癌の画一的診断方法として、装置を用いた分子診断が期待されている。【００１０】
分子診断としては、ＤＮＡチップを用いて、遺伝子転写物の発現について、標準との比較結果から、癌の悪性度を判定する方法がある。しかしながら、単なる転写物の発現は、生体内で発現されるタンパク質発現との相関性がそれ程高くないことから、臨床現場では、その有効性が疑問視されている。【００１１】
一方、生体で発現されるタンパク質に基づく分子診断の開発検討も進められている。
例えば、特許文献１に、試料のＣＤＫ１及びＣＤＫ４の発現量、さらには必要に応じてｐ５３の突然変異状態を指標とする診断方法が提案されている。また、特許文献２では、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、サイクリン依存性キナーゼインヒビター（ＣＤＫインヒビター）の過剰発現を指標とする癌及び前癌状態の診断方法が提案されている。【００１２】
サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）の発現は、増殖因子によって増殖が誘導される細胞において高いことが知られているものの、一般には細胞内で一定量存在していて、リン酸化等の活性化をうけ、サイクリン分子と結合してＣＤＫとサイクリンの複合体となることにより、ＣＤＫの種類に応じた細胞周期の特定段階で活性を示している。また、ＣＤＫインヒビターがＣＤＫ及び／又はサイクリン・ＣＤＫ複合体に結合して、ＣＤＫ活性を阻害することも知られている。このように、実際の細胞周期の調節は複雑であることから、単なるＣＤＫ、サイクリン、ＣＤＫインヒビターの発現量に基づく判定では、細胞周期の調節状態の指標としては不十分である。【００１３】
特許文献３では、サイクリンとの結合、阻害因子の影響を考慮し、ＣＤＫの活性を癌の悪性度の指標とする診断方法、及び放射性物質を用いずにＣＤＫ活性を測定する方法が開示されている。しかしながら、当該方法で測定される活性に関するデータでは、現在、臨床現場で行われている癌診断の代用となる程の診断精度が得られていない。【００１４】
また、抗癌剤治療の有効性の指標として、腫瘍細胞の抗癌剤感受性をインビトロで知りたい場合がある。インビトロでの腫瘍細胞の抗癌剤等の薬剤感受性試験としては、例えば、ＭＴＴアッセイ法とＤＩＳＣ法が知られている。ＭＴＴアッセイ法とは、ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）が生細胞に取り込まれたときはミトコンドリア内に存在する還元酵素（コハク酸デヒドロゲナーゼ）により開裂できるが、死細胞ではＭＴＴを開裂できないことを利用したもので、ＭＴＴ及び測定対象となる薬剤添加のもとに、３時間癌細胞を培養し、吸光度（コハク酸デヒドロゲナーゼ活性）を測定して、生細胞数を定量化する方法である。この方法では、実際の抗癌剤治療による再発の有無と照合した場合、正答率（正確度）は８０％と報告されており、そのうちインビトロでの判定が抗癌剤感受性（陽性予測）で、実際の抗癌剤治療で再発しなかったもの（陽性予測率）の正答は６８％であったと報告されている（非特許文献１）。【００１５】
ＤＩＳＣ法は、癌細胞を４日間、抗癌剤に接触させた後、死細胞をｆａｓｔ  ｇｒｅｅｎで染色し、生細胞をヘマトキシリンエオジンで染色することにより識別し、癌細胞の生死を判定する方法である。正答率（正確度）は８２．７％であり、陽性予測率の正答は６２．５％であると報告されている（非特許文献１）。【００１６】
上記いずれの方法も、陽性予測率については７０％未満であり、抗癌剤治療に踏み切るか否かの判断指標としては不十分である。【００１７】
【特許文献１】特表２００２−５０４６８３号
【特許文献２】特表２００２−５１９６８１号
【特許文献３】特開２００２−３３５９９７号
【非特許文献１】Ｗｅｉｓｅｎｔｈａｌ，Ｌ．Ｍ．ａｎｄ  Ｎｙｇｒｅｎ．Ｐ（２００２）Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｓｔａｔｕｓ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｄｒｕｇ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｅｓｔｉｎｇ（ＣＣＤＲＴ）、ｈｔｔｐ：／／ｗｅｉｓｅｎｔｈａｌ．ｏｒｇ／ｏｎｃｏｌ＿ｔ．ｈｔｍ
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
本発明は、以上のような事情に鑑みてなされたものであり、その目的は、臨床における癌の再発のしやすさの試験を行なうものであり、さらには医療機関や個々人による診断のばらつきをなくし、正確かつ安定に判定し得る癌の再発のしやすさを試験する方法を提供することにある。
【００１９】
さらに、抗癌剤に対する感受性の試験について、抗癌剤治療などの薬剤治療に踏み切るか否かの判断指標として利用できるように、従来の薬剤感受性試験よりも精度の高い抗癌剤に対する感受性を試験する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
本発明の方法は、癌患者から採取した腫瘍組織の細胞のＣＤＫ１の活性値と発現量との比（ＣＤＫ１比活性）及びＣＤＫ２の活性値と発現量との比（ＣＤＫ２比活性）の比を、所定の閾値と比較することにより、癌の再発のしやすさを試験する方法である。
【００２９】
本発明の方法は、癌患者から採取した腫瘍組織の細胞のＣＤＫ１の活性値と発現量との比（ＣＤＫ１比活性）及びＣＤＫ２の活性値と発現量との比（ＣＤＫ２比活性）の比を、所定の閾値と比較することにより、前記細胞の抗癌剤に対する感受性を試験する方法である。
【００３３】
尚、本明細書にいうＣＤＫプロファイルとは、ある細胞が有する少なくとも１種類のＣＤＫの活性値と発現量との比（例えば比活性）及び／又は複数のＣＤＫの活性値、発現量より計算される数値（例えば、第１ＣＤＫの活性値と発現量との比（Ａ１）と、第２ＣＤＫの活性値と発現量との比（Ａ２）との比（例えば、Ａ１／Ａ２又はＡ２／Ａ１）など）を含む情報のことである。【００３４】
また、本明細書にいうサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）の比活性とは、所定量の酵素あたりの酵素活性をいい、下記式で求められる値である。
ＣＤＫ比活性＝ＣＤＫ活性値／ＣＤＫ発現量
式中、ＣＤＫ活性値とは、リン酸化された基質量に基づく単位で、実際の細胞含有試料の測定値と標準品の活性値から求められる値（相対活性値）である。また、ＣＤＫ発現量とは、実際の細胞含有試料に存在しているＣＤＫの量（分子個数単位）をいう。【００３５】
さらに、本発明にいう転移しやすさとは、癌細胞が原発巣から遠隔組織に移動し、転移巣を構築する確率の高さをいう。確率の高い癌細胞の生物学的特徴（転移のしやすさ）は浸潤能、移動能で示されることが知られている。【００３６】
再発しやすさとは、ある分類（例えばステージ分類）に従って分類された癌患者群の再発の頻度をいう。例えば、ステージＩＩＩは、再発率５０％であり、ステージＩＩ(再発率２０％）に比して再発しやすい。【００３７】
予後の悪さとは、ある分類（例えばステージ分類）に従って分類された癌患者群の５年もしくは１０年以内の死亡の頻度をいう。例えば、ステージＩＩＩは、死亡率５０％であり、ステージＩＩ（死亡率２０％）に比較して死亡しやすく、予後が悪いとされる。
【発明の効果】
【００３８】
本発明の哺乳動物細胞の性質の判定方法は、比活性を指標とすることにより、測定試料の調製方法による誤差、バラツキを回避できる。また、本発明において判定指標として用いられる、２種のＣＤＫの比活性を参酌したＣＤＫ比活性プロファイル、特に２種のＣＤＫの比活性の比は、細胞周期に存在する細胞存在割合、異数媒体性などの癌をはじめとする性質と相関性が高いので、信頼性の高い分子診断が可能となる。さらに、細胞周期に基づく指標を用いていることから、現在の細胞の生物学的性格、性状だけでなく、臨床的性格の判定（代表的には悪性度）、抗癌剤等の薬剤、外部刺激に対する感受性若しくは耐性の判定も可能である。特に感受性の判定については、感受性（陽性）との判断について正答率が高いので、抗癌剤治療に踏み切るといった判断指標として優れている。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】細胞周期を説明するための図である。
【図２】各種培養細胞のＤＮＡ含量の測定結果を示す図である。
【図３】ＤＮＡ含量データの結果を説明するための図である。
【図４】各種培養細胞のＳ期の存在比率を示すグラフである。
【図５】各種培養細胞のＣＤＫ１比活性及びＣＤＫ２比活性の測定結果を示すグラフである。
【図６】乳癌患者由来組織のうちローリスクと判定された検体のＣＤＫ比活性プロファイルを示す図である。
【図７】乳癌患者由来組織のうちハイリスクと判定された検体のＣＤＫ比活性プロファイルを示す図である。
【図８】乳癌患者Ａ〜ＩのＣＤＫ１比活性及びＣＤＫ２比活性の測定結果を示すグラフである。乳癌患者Ａ〜Ｉは、抗癌剤ドセタキセルの投与治療を受け、投与後の腫瘍のサイズの変化が調べられた。
【図９】乳癌患者Ｊ〜ＰのＣＤＫ１比活性及びＣＤＫ２比活性の測定結果を示すグラフである。乳癌患者Ｊ〜Ｐは、抗癌剤パクリタキセルの投与治療を受け、投与後の腫瘍のサイズの変化が調べられた。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４０】
本発明の哺乳動物細胞の性質を判定する判定方法は、哺乳動物細胞の２種以上のサイクリン依存性キナーゼの発現量及び活性値を測定し、第１のサイクリン依存性キナーゼの活性値と発現量との比及び第２のサイクリン依存性キナーゼの活性値と発現量との比を含むＣＤＫプロファイルに基づいて、該哺乳動物細胞の性質を判定する方法である。腫瘍細胞を含む組織に本発明の判定方法を適用することにより、腫瘍細胞の性質、癌の悪性度を診断することができる。【００４１】
本発明の判定方法が対象とする哺乳動物は特に限定しないが、本発明の判定方法は、ヒト、特に臨床状態、より具体的には癌についての状態の判定が求められているヒトに有用である。【００４２】
本発明の方法が対象とする細胞は、哺乳動物の生体組織、すなわち繊維性結合組織、軟骨組織、骨組織、血液、リンパ等の支持組織；上皮組織；筋組織；神経組織を構成する細胞であればよいが、特に個体としての調和を破り、増殖の制御機構に異常を来している組織の腫瘍細胞のように、病理的情報を得たい細胞に好適である。例えば、乳、肺、肝臓、胃、大腸、膵臓、皮膚、子宮、精巣、卵巣、甲状腺、副甲状腺、リンパ系統、骨髄などの位置にできる腫瘍の細胞が好適な対象となる。【００４３】
これらの細胞は、該当する生体組織から直接採取した細胞であってもよいし、尿、喀痰などの生体からの排出物から分離して得られた細胞であってもよいし、継代培養された培養細胞であってもよい。癌に関する情報を得たい場合には、腫瘍組織から採取した細胞が好ましく用いられる。【００４４】
判定する哺乳動物細胞の性質には、測定対象となる細胞の増殖能、悪性度が含まれる。細胞の増殖能とは、細胞の増殖活性レベルで、増殖の制御機構に異常を来しているか否か（癌化の有無）、さらには異数倍体性などに関する情報が該当する。細胞の悪性度とは、具体的には、転移のしやすさ、再発のしやすさ、予後の悪さなどが挙げられる。【００４５】
ここで、再発とは、悪性腫瘍を摘出するために臓器を部分切除した後、残存臓器に同じ悪性腫瘍が再現する場合、及び原発巣から腫瘍細胞が分離して遠隔組織（遠隔臓器）へ運ばれ、そこで自立的に増殖する場合（転移再発）をいう。一般に５年以内に再発が認められる場合に「再発しやすい」という。また、ステージ分類ではステージＩＩＩは再発率５０％であり、ステージＩＩ（再発率２０％）に比して再発しやすい。予後とは、疾病の経過及び終末を予知することで、５年又は１０年後の死亡率が高い程予後は悪く、例えばステージＩＩＩは死亡率５０％で、ステージＩＩ（死亡率２０％）より予後が悪い。【００４６】
サイクリン依存性キナーゼとは、サイクリンと結合して活性化される酵素群の総称で、その種類に応じて、細胞周期の特定時期で機能している。また、ＣＤＫインヒビターとは、サイクリン・ＣＤＫ複合体に結合し、その活性を阻害する因子群の総称である。【００４７】
ここで、細胞が増殖を開始し、ＤＮＡ複製、染色体の分配、核分裂、細胞質分裂などの事象を経て、２つの娘細胞となって出発点に戻るまでのサイクルである細胞周期は、図１に示すように、Ｇ１期、Ｓ期、Ｇ２期、Ｍ期の４期に分けられる。Ｓ期はＤＮＡの複製期であり、Ｍ期は分裂期である。Ｇ１期は有糸分裂の完了からＤＮＡ合成の開始までの間で、Ｍ期にはいるための準備点検期である。Ｇ１期にある臨界点（動物細胞ではＲ点）をすぎると、細胞周期は始動し、通常途中でとまることなく、一巡する。Ｇ２期は、ＤＮＡ合成の終了から有糸分裂の開始の間である。細胞周期の主なチェックポイントは、Ｇ１期からＳ期にはいる直前、Ｇ２期から有糸分裂への入り口である。特にＧ１期チェックポイントはＳ期開始の引き金をひくため、重要である。Ｇ１期のある点をすぎると、細胞は増殖シグナルがなくなっても、増殖を停止することなく、Ｓ→Ｇ２→Ｍ→Ｇ１と細胞周期を進行させるからである。尚、増殖を停止した細胞で、Ｇ１期のＤＮＡ含量をもった休止期（Ｇ０）があり、細胞周期からはずれた状態にある。増殖誘導により細胞周期内のＧ１期よりやや長い時間の後にＳ期へ進行することができる。【００４８】
本発明の方法で用いられるサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）は、ＣＤＫ１、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、サイクリンＡ依存性キナーゼ、サイクリンＢ依存性キナーゼ、及びサイクリンＤ依存性キナーゼからなる群より選ばれることが好ましい。サイクリンＡ依存性キナーゼとは、サイクリンＡと結合して活性を示すＣＤＫのことで、現在判明しているところでは、ＣＤＫ１及びＣＤＫ２の双方をいう。またサイクリンＢ依存性キナーゼとはサイクリンＢと結合して活性を示すＣＤＫのことで、現在判明しているところではＣＤＫ１が該当する。サイクリンＤ依存性キナーゼとはサイクリンＤと結合して活性を示すＣＤＫのことで、現在判明しているところではＣＤＫ４及びＣＤＫ６の双方が該当する。【００４９】
これらのＣＤＫは、現在判明しているところ、表１に示すように、それぞれ対応するサイクリンと結合したサイクリン・ＣＤＫ複合体（以下「活性型ＣＤＫ」ということがある）となって、表１に示すような細胞周期の特定時期を活性化している。例えば、ＣＤＫ１はサイクリンＡ又はＢと、ＣＤＫ２はサイクリンＡ又はＥと、ＣＤＫ４及びＣＤＫ６はサイクリンＤ１、Ｄ２、又はＤ３と結合して活性型となる。一方、ＣＤＫ活性は表１に示すようなＣＤＫインヒビターによって活性が阻害されることもある。例えば、ｐ２１はＣＤＫ１，２を阻害、ｐ２７はＣＤＫ２，４，６を阻害、ｐ１６がＣＤＫ４，６を阻害する。【００５０】
【表１】
0004787153.tif 000002
【００５１】
上記ＣＤＫのうち、２種類以上のＣＤＫの発現量と活性値を測定し、各ＣＤＫにおけるこれらの比（すなわち、下記式で表されるＣＤＫ比活性またはその逆数）を求めて、ＣＤＫプロファイルを得る。
ＣＤＫの比活性＝ＣＤＫ活性値／ＣＤＫ発現量【００５２】
従って、ＣＤＫプロファイルとしては、具体的には、例えば、ＣＤＫ比活性を含むプロファイル（ＣＤＫ比活性プロファイル）やＣＤＫ比活性の逆数を含むプロファイル（ＣＤＫ比活性の逆数プロファイル）などが挙げられる。【００５３】
ＣＤＫ活性値とは、特定のサイクリンと結合して、どれだけの基質（例えば、活性型ＣＤＫ１、活性型ＣＤＫ２はヒストンＨ１、活性型ＣＤＫ４及び活性型ＣＤＫ６はＲｂ（網膜芽細胞腫タンパク、Ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｐｒｏｔｅｉｎ））をリン酸化するかというキナーゼ活性のレベル（単位をＵ（ユニット）で現す）をいい、従来より公知の酵素活性測定方法で測定できる。具体的には、測定試料の細胞溶解液から活性型ＣＤＫを含む試料を調製し、３２Ｐ標識したＡＴＰ（γ−〔３２Ｐ〕−ＡＴＰ）を用いて、基質タンパク質に３２Ｐを取り込ませ、標識されたリン酸化基質の標識量を測定し、標準品で作成された検量線をもとに定量する方法がある。また放射性物質の標識を用いない方法としては、特開２００２−３３５９９７号に開示の方法が挙げられる。この方法は、測定試料の細胞可溶化液から、目的の活性型ＣＤＫを含む試料を調製し、アデノシン５’−Ｏ−（３−チオトリホスフェート）（ＡＴＰ−γＳ）と基質を反応させて、該基質タンパク質のセリン又はスレオニン残基にモノチオリン酸基を導入し、導入されたモノチオリン酸基の硫黄原子に標識蛍光物質又は標識酵素を結合させることによって基質タンパク質を標識し、標識されたチオリン酸基質の標識量（標識蛍光物質を用いた場合には蛍光量）を測定し、標準品で作成された検量線に基づいて定量する方法である。【００５４】
活性測定に供する試料は、測定対象となる細胞の可溶化液から目的のＣＤＫを特異的に採取することにより調製する。この場合、目的のＣＤＫに特異的な抗ＣＤＫ抗体を用いて調製してもよいし、特定のサイクリン依存性キナーゼ（例えばサイクリンＡ依存性キナーゼ、サイクリンＢ依存性キナーゼ、サイクリンＥ依存性キナーゼ）活性測定の場合には、抗サイクリン抗体を用いて調製する。いずれの場合も活性型ＣＤＫ以外のＣＤＫが試料に含まれることになる。例えばサイクリン・ＣＤＫ複合体にＣＤＫインヒビターが結合した複合体も含まれる。また、抗ＣＤＫ抗体を用いた場合には、ＣＤＫ単体、ＣＤＫとサイクリン及び／又はＣＤＫインヒビターの複合体、ＣＤＫとその他の化合物との複合体などが含まれる。従って、活性値は、活性型、不活性型、各種競合反応が混在する状態下で、リン酸化された基質の単位（Ｕ）として測定される。【００５５】
ＣＤＫ発現量とは、細胞可溶化液から測定される目的のＣＤＫ量（分子個数に対応する単位）であって、タンパク質混合物から目的のタンパク質量を測定する従来公知の方法で測定できる。例えば、ＥＬＩＳＡ法、ウェスタンブロット法などを使用してもよいし、特開２００３−１３０８７１号に開示の方法で測定することもできる。目的のタンパク質（ＣＤＫ）は、特異的抗体を用いて捕捉すればよい。例えば、抗ＣＤＫ１抗体を用いることにより、細胞内に存在するＣＤＫ１のすべて（ＣＤＫ単体、ＣＤＫとサイクリン及び／又はＣＤＫインヒビターの複合体、ＣＤＫとその他の化合物との複合体を含む）を捕捉できる。【００５６】
従って、上記式により算出される比活性は、細胞に存在しているＣＤＫのうち、活性を示すＣＤＫの割合に相当し、判定対象である動物細胞の増殖状態に基づくＣＤＫ活性レベルといえる。このようにして求められるＣＤＫ比活性は、測定試料調製方法に依存しない。測定試料調製方法、特に生検材料から調製される測定試料（細胞可溶化液）は、実際に採取された組織中に含まれる非細胞性組織、例えば細胞外基質の多寡による影響をうけやすいことから、このような影響を控除した比活性又はその逆数を用いる意義は大きく、従来の単なる活性値と比べて、臨床的性格との相関性が高い。【００５７】
２種類以上のＣＤＫ比活性又はその逆数を含むＣＤＫプロファイルを知ることにより、いずれのＣＤＫ活性が優位になっているかを知ることができ、これにより細胞周期のいずれの時期にある細胞割合がどの程度であるか、あるいはいずれの時期の細胞割合が優勢かなどを知ることができる。
以下、ＣＤＫ比活性を含むＣＤＫ比活性プロファイルを中心に、本発明の方法を説明する。【００５８】
比活性を測定するＣＤＫの種類は、知りたい性質の種類に応じて適宜選択すればよい。一般に、癌細胞は正常な増殖制御を逸脱して増殖が活発に行われていることから、Ｓ期、Ｇ２期にある細胞割合が多いと考えられ、このような場合に癌化していると考えられる。また、このような癌は、進行が早く、悪性であるといえる。さらに、異数媒体性は、異常なＭ期を経過したか、又はＭ期を経ずにＧ１期へ進んで、Ｓ期にはいったときに起ると考えられているため、Ｍ期に存在する細胞割合が少ないことも悪性であるといえる。従って、第１のサイクリン依存性キナーゼとしてＣＤＫ１、第２のサイクリン依存性キナーゼとしてＣＤＫ２を使用し、ＣＤＫ１比活性の大きさに従い群に分類し、類似したＣＤＫ１比活性を持つ群の中ではＣＤＫ２比活性値がＳ期の細胞比率を反映する値となる。Ｓ期にある細胞が多い場合、当該細胞が構成細胞となっている組織が臨床的に悪性、すなわち転移しやすい予後の悪い悪性の癌であると判定することができる。【００５９】
尚、ＣＤＫの種類、判明している作用から、２種類以上のＣＤＫ比活性を含むＣＤＫ比活性プロファイルにより細胞周期の特定時期の存在割合を推測し、細胞の悪性度を判定してもよいし、予め対応する正常組織細胞を標準細胞として測定した２種類以上のＣＤＫの比活性プロファイルを求め、正常細胞との比較から悪性度を判定してもよい。【００６０】
ＣＤＫ比活性プロファイルとして、２種類のサイクリン依存性キナーゼの比活性の比を採用することが好ましい。この場合、２種類のサイクリン依存性キナーゼの比活性の比を、該比に対応する所定の閾値と比較することにより、細胞の性質を判定する。【００６１】
本発明の細胞の性質判定方法で用いられる閾値は、測定対象の細胞の種類、判定項目により適宜決められる。閾値の設定は、対象となる項目に関する多数の細胞、個体のデータベースと、当該細胞のＣＤＫ比活性のデータベースとから、該当項目に対してボーダーとなる比活性の比の値を選択すればよい。例えば、癌の悪性度について病理医の判定が既知の複数の患者から採取された腫瘍細胞について、相関性があるとされる２種類のＣＤＫの比活性の比をそれぞれ求め、求められた比を小さい順に並べて集団を２等分できる中央値を閾値とすることができる。【００６２】
本発明の判定方法は、細胞の増殖能、悪性度といった性質だけでなく、細胞の刺激物質に対する感受性についても適用できる。例えば、近年指摘されている、患者の遺伝的体質による抗癌剤等の薬物の効き方の違いが、細胞の刺激物質に対する感受性の違いに起因する。つまり、細胞が本来もっている性質には、刺激物質に対して感受性か非感受性であるかといった性質も含まれ、２種類のＣＤＫの比活性の比は、刺激物質に対する感受性とも関連している。従って、本発明の哺乳動物細胞の感受性判定方法は、第１のＣＤＫの発現量と活性値との比及び第２のＣＤＫの発現量と活性値との比を含むＣＤＫプロファイルに基づいて、前記細胞の刺激物質に対する感受性を判定する方法である。前記ＣＤＫプロファイルとしては、ＣＤＫ比活性を含むプロファイル（ＣＤＫ比活性プロファイル）やＣＤＫ比活性の逆数を含むプロファイル（ＣＤＫ比活性の逆数プロファイル）などがある。ＣＤＫ比活性プロファイルを用いる態様としては、例えば、第１のサイクリン依存性キナーゼの比活性と第２のサイクリン依存性キナーゼの比活性との比を、所定の閾値と比較することにより、該細胞の刺激物質に対する感受性を判定する方法がある。【００６３】
刺激物質としては、増殖因子、抗癌剤、及び変異原性物質からなる群より選ばれる。刺激物質の種類に応じて、判定する内容、感受性の内容は異なる。例えば、抗癌剤に対しては効き方の有無、変異原性物質や増殖因子に対しては応答性の有無などを判定することになる。【００６４】
本発明の細胞の感受性判定方法で判定の基準となる閾値は、刺激物質の種類により適宜設定される。閾値の設定は、予めストックされている細胞の判定指標となるＣＤＫの比活性の値と、これらの細胞の刺激物質に対する感受性の有無に関するデータとの相関性を調べ、感受性と非感受性の境界となる閾値が選ばれる。閾値の設定は、実際に刺激物質に曝された患者集団を、当該刺激物質に対する感受性群と非感受性群とに分別し、別途測定された２種類のＣＤＫの比活性の比との関係に基づいて行なってもよいし、種々の腫瘍細胞の培養細胞を、刺激物質で刺激し、その増殖レベルや刺激物質に対する応答レベルを測定して、感受性群と非感受性群とに分別し、別途測定された２種類のＣＤＫ比活性の比との関係に基づいて設定してもよい。【００６５】
測定対象となる細胞の種類、あるいは刺激物質の種類によっては、判定のための一方又は双方のＣＤＫ比活性の値自体が大変小さい場合や、逆に一方又は双方の比活性値が大変大きくて、比活性の比の値が閾値とはかけはなれた値となる場合がある。また、該当刺激物質に対して非感受性と判断されるような細胞には、測定項目となるＣＤＫの比活性値自体が大変小さい場合がある。このような場合、比活性値の比で判断するだけでなく、判定に用いるＣＤＫの比活性値の大小も考慮して刺激物質の感受性を判定することが好ましい。具体的には、比活性値自体についても、判定指標となる閾値を設定し、当該閾値との比較結果を加味して判定する。【００６６】
刺激物質の感受性の判定にあたり、ＣＤＫ比活性値及びＣＤＫ比活性の比それぞれを指標として閾値と比べる場合、これらの比較の順番については特に限定しないが、刺激物質の種類、細胞の種類に応じて、適宜取り扱いを決めることが好ましい。例えば、まず比活性値を閾値と比較して明らかに感受性又は非感受性と判断できるものについて判定した後、残りの細胞について、比活性の比について該当する閾値と比較して判定してもよい。あるいは、測定対象となる細胞が、一方若しくは双方の比活性値の大変小さい細胞又は一方若しくは双方の比活性値の大変大きい細胞である場合、まずＣＤＫの比活性の比について該当する閾値と比較して感受性か非感受性かを判定した後、一方若しくは双方の比活性値が大変大きい細胞又は一方若しくは双方の比活性値が大変小さい細胞についてのみ、比活性値自体を該当する閾値と比較して感受性か非感受性かを判定しなおすことによって、比活性の比とこれに該当する閾値との比較に基づいた判定結果を修正してもよい。【００６７】
尚、比活性値は、活性及び発現量の測定方法、測定に使用する抗体の種類等によって異なる。従って、本発明の判定方法で閾値との比較に基づいて判定する方法については、閾値を設定するときのデータベース作製時の比活性の測定方法と、判定対象となる細胞の比活性の測定方法とは一致させておく必要がある。
【実施例】
【００６８】
はじめに下記実施例で用いた測定試料の調製方法及びＣＤＫ比活性、ＣＤＫ発現量の測定方法について説明する。
〔測定用試料の調製〕
測定しようとする生体試料として、外科的に採取した各組織（２ｍｍ３）又は表２に示す腫瘍の培養細胞を用いた。【００６９】
【表２】
0004787153.tif 000003
【００７０】
生体試料を、０．１ｗ／ｖ％ノニデットＰ−４０（ＮＰ−４０）（カルビオケム社製）、５０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ７．４）、５ｍＭのＥＤＴＡ、５０ｍＭのフッ化ナトリウム、１ｍＭのオルトバナジン酸ナトリウム及び１００μｌ／ｍｌのプロテアーゼ阻害剤カクテル（シグマ社）を含む溶解緩衝液中で、氷浴中で２３Ｇ針をつけた５ｍｌのシリンジで１０回吸引排出を繰り返し、細胞溶解液を調製した。培養細胞については、１×１０７細胞／５ｍｌとなるように調製した。
不溶物を１５０００ｒｐｍで５分間、４℃で遠心除去し、上清（細胞可溶化液）を、測定用試料とした。【００７１】
〔ＣＤＫ活性の測定〕
上記で調製した試料から、１．５ｍｌ容量のエッペンドルフチューブに、５００μｌの溶解緩衝液中に溶解物の全タンパク質量が１００μｇとなる量を加えてサンプルを調製した。
活性測定しようとするＣＤＫに特異的抗体（サンタクルズバイオテクノロジー社のポリクローナル抗ＣＤＫ１抗体又はポリクローナル抗ＣＤＫ２抗体）２μｇ及び２０μｌのプロテインＡをコートしたセファロースビーズ（バイオラッド社製）を、上記サンプルに加えて４℃で１時間反応させた後、ビーズを緩衝液（０．１％ＮＰ−４０、５０ｍＭのトリス塩酸、ｐＨ７．０）で３回洗浄し、１５μｌのキナーゼ緩衝液中に再懸濁させて、目的のＣＤＫ含有試料が結合したビーズを含む試料を得た。【００７２】
この試料は、ＣＤＫ単体、サイクリン結合した活性型ＣＤＫ、活性型ＣＤＫとＣＤＫインヒビターの複合体、ＣＤＫとＣＤＫインヒビターの複合体の全て（以下、これらを区別しないときは「ＣＤＫ群」という）が捕捉され、ビーズに結合している。このようなＣＤＫ群の活性を、下記方法により測定した。【００７３】
ＣＤＫ１及びＣＤＫ２に対応する基質であるヒストンＨ１（アップステイトバイオテクノロジー製）１０μｇ、５ｍＭのアデノシン５’−Ｏ−（８−チオ３リン酸）（ＡＴＰ−γＳ、シグマ社製）、及び緩衝液（２０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．４）、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）を含む基質溶液を調製し、この基質溶液を上記ＣＤＫ試料液に加えて５０μｌとし、３７℃で１０分間振とうしてインキュベートした。下記式に示すように、基質のセリン又はスレオニン残基が、活性型ＣＤＫによりリン酸化され、モノチオリン酸化基質が得られる。【００７４】
【化１】
0004787153.tif 000004
【００７５】
反応後、１０００ｒｐｍで１０秒間遠心して、ビーズを沈殿させ、モノチオリン酸を溶解した上澄み液３０μｌを採取した。この上澄み液１８μｌに、１５０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ９．２、５ｍＭのＥＤＴＡを含む結合緩衝液１５μｌを加えた。さらに、１０ｍＭのヨードアセチルフルオロセイン溶液（１００ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）中で暗所において９０分間室温にてインキュベートすることにより、モノチオリン酸化基質のチオリン酸中の硫黄を蛍光標識した。ヨードアセチルフルオロセインとチオリン酸との反応の停止は、６−メルカプトエタノールの添加により行った。【００７６】
蛍光標識されたチオリン酸化基質０．４μｇを、スロットブロッターを用いてＰＶＤＦ膜上に添加し、吸引した。得られた膜を１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で３０分間ブロックし、アビジン−ＦＩＴＣ（ベクター製）を３７℃で１時間反応させた。その後、膜を５０ｍＭ  ＴＢＳ（２５ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ）で１０分間３回洗浄した。洗浄後、膜上のイメージを蛍光イメージアナライザー（バイオラッド社製）により分析した。活性は、検量線に基づいて算出した。【００７７】
尚、検量線は、Ｋ−５６２慢性骨髄性白血病細胞に含まれる目的の活性型ＣＤＫのみを含む濃度の異なる溶液を用いて、ＣＤＫ活性を測定することにより作成した。
従って、測定されるＣＤＫ活性１Ｕは、Ｋ−５６２細胞の総タンパク質１μｇのときの酵素活性（一定量の基質を変化させる酵素量）と同等の活性を示す酵素量をいう。【００７８】
〔ＣＤＫ発現量の測定〕
ＴＢＳ（２５ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ）に浸漬して初期化したＰＶＤＦメンブレン（ミリポア社製）をセットしたスロットブロッターの各ウェル（２×２×３ｍｍ、許容量１００μｌ）に、上記で調製した細胞可溶化液を５０μｌずつ注入した。各ウェルには、タンパク質が総量で５〜１５μｇずつ含まれている。【００７９】
注入後、ウェルの底面、すなわちメンブレンの裏面から負圧約２００ｍｍＨｇで約１５秒間吸引し、膜に試料を吸着させた。【００８０】
次いで、試料に特異的に結合するウサギ抗ＣＤＫ１抗体又はウサギ抗ＣＤＫ２抗体（一次抗体）の溶液を、各ウェルに注入し、室温で約３０分間静置した後、ウェル底面から負圧５００ｍｍＨｇで約１５秒間吸引して、次いで、ＴＢＳ（２５ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ）で洗浄した。【００８１】
次に、ビオチン化した抗ウサギ抗体（二次抗体）の溶液を各ウェルに注入し、室温で約３０分間静置した後、ウェル底面から負圧５００ｍｍＨｇで約１５秒間吸引して、その後、ＴＢＳ（２５ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ）で洗浄した。【００８２】
ＦＩＴＣ標識ストレプトアビジン試薬を４０μｌずつ注入し、約３０分間室温で静置して、二次抗体をＦＩＴＣで標識した。ウェル底面から負圧５００ｍｍＨｇで約１５秒間吸引して、その後、ＴＢＳ（２５ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ）で洗浄した。【００８３】
ＰＶＤＦメンブレンをプレートからとりはずし、蒸留水で洗浄し、２０％メタノールに５分間浸漬した。その後、約１５分間室温で乾燥させた後、膜に吸着されたタンパク質の蛍光強度を、イメージアナライザ（バイオラッド社）によって分析、測定し、予め作成した検量線をもとに、ＦＩＴＣ標識されたタンパク質（ＣＤＫ１又はＣＤＫ２）を定量（ＣＤＫ個数に対応する量を標準タンパク質の重量（ｍｇ）で換算）した。このようにして測定されるＣＤＫ量は、細胞中に存在しているＣＤＫ群（ＣＤＫ単体、ＣＤＫとサイクリン及び／又はＣＤＫインヒビターの複合体、ＣＤＫとその他の化合物との複合体など）の総量である。【００８４】
尚、検量線は、０．００５％のＮＰ−４０及び５０μｇ／ｍｌのＢＳＡを含むＴＢＳ中に、５種類の濃度の純品の組換えＣＤＫタンパク質の溶液を、上記と同様に処理したウェルに５０μｌずつ注入し、上記と同様の方法でＦＩＴＣ標識し、蛍光強度を測定して、蛍光強度と量の関係を表すことにより標準曲線を作成した。【００８５】
〔ＣＤＫ比活性の算出〕
上記で測定したＣＤＫ活性及びＣＤＫ発現量の測定値から、下記式により、ＣＤＫ比活性（ｍＵ／ｎｇ又はＵ／ｎｇ）を算出した。
ＣＤＫ比活性＝ＣＤＫ活性値／ＣＤＫ発現量【００８６】
〔実施例１：各種癌細胞の性質〕
各種癌細胞の病理的性格を知るために、表２に示した培養細胞について、ＤＮＡ含量及びＣＤＫ比活性を調べた。【００８７】
（１）ＤＮＡ含量
目的とする細胞をトリプシン／ＥＤＴＡ処理によって分散後、ＰＢＳで２回洗浄し、１００×ｇ、４℃、５分間遠心によって細胞（２×１０５〜１×１０６細胞）を回収した。回収された細胞をボルテックスミキサーで攪拌しながら、予め−２０℃に冷却した７０％エタノール１ｍｌを徐々に加えて細胞固定を行い、４℃又は−２０℃で、２時間以上反応させた。細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、２０Ｋユニット／ｍｌのＲＮａｓｅ〔シグマ社）、５０μｇ／ｍｌプロピジウムイオダイド（ＰＩ）、１ｍｇ／ｍｌグルコース／ＰＢＳを加え、細胞を十分に分散させ、室温で１時間反応させて、ＤＮＡをＰＩで蛍光染色した。染色後、３５ｍｍナイロンメッシュ（ＦＡＬＣＯＮ）でゴミを取り除き、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（ＢＤ）で励起波長４８８／５３６ｎｍ、６１７ｎｍ蛍光を測定し、解析を行った。【００８８】
各測定結果を図２に示す。図２において、縦軸は蛍光強度で細胞数に相当し、横軸はＤＮＡ含量である。【００８９】
動物細胞のＤＮＡ含量と細胞数の関係は、一般に図３に示されるように細胞周期に連動している。図２の測定結果に基づいて、ＭｏｄＦｉｔ（ベリティソフトウェアーハウス社製）を用いて、Ｓ期及びＧ１期の細胞の存在比率を調べ、その結果を図４に示す。
図２及び図４から、ＫＡＴＯＩＩＩ、Ｋ５６２、Ｃｏｌｏ２０５細胞については、Ｓ期存在割合が高く、またＫＡＴＯＩＩＩ、Ｃｏｌｏ２０５、ＨｅＬａ細胞については異数倍体性（特にａｎｅｕｐｌｏｉｄｙ）が見られた。【００９０】
（２）ＣＤＫ比活性
表２に示す培養細胞について、上記測定用試料の調製方法に基づいて調製した測定試料について、上記測定方法に従って、ＣＤＫ１及びＣＤＫ２の活性、発現量を測定し、それぞれの比活性を求めた。結果を図５に示す。【００９１】
図５中、細い黒棒はＣＤＫ２比活性であり、太い白棒はＣＤＫ１比活性を示し、左縦軸はＣＤＫ１比活性、右縦軸はＣＤＫ２比活性を示している。【００９２】
ＣＤＫ１比活性値の大きさに着目すると、ＣＤＫ１比活性が比較的低い群（ＫＡＴＯＩＩＩ、Ｋ−５６２、Ｃｏｌｏ２０５、ＨｅＬａ、ＭＣＦ−７細胞）と比較的高い群（ＳＷ４８０、ＳＫＢｒ３、Ｔ４７Ｄ）に大別される。そして、それぞれの群において、ＣＤＫ２比活性の大きさが、ＤＮＡ含量の測定から得られるＳ期にある細胞割合の多さと対応していることがわかる。つまり、単にＣＤＫ２比活性値の大きさだけではＳ期の存在割合と対応させることができないが、まずＣＤＫ１比活性値に基づく群分けを行った後であればＣＤＫ２比活性値の大きさを細胞悪性と関連づけることができる。【００９３】
〔実施例２：生検試料についての病理医の判定とＣＤＫ比活性プロファイルとの関係〕
実際の癌組織から採取した生検試料について、手術後５年間の遠隔転移による再発と、上記方法で測定したＣＤＫ１比活性及びＣＤＫ２比活性に基づくＣＤＫ比活性プロファイルとの関係を調べた。【００９４】
（１）病理医の判定
実際の乳癌患者７７人（Ｎｏ．１〜７７）の生検試料についての、病理医の判定結果（ＴＮＭ分類、リンパ節転移の状態、癌組織の大きさ、術後５年間の再発の有無、再発場所）を表３及び表４に示す。７７人は、いずれも早期乳癌（ＳｔａｇｅＩ又はＩＩＡ）である。【００９５】
表３中、「ＬＮ」は、手術時のリンパ節転移の状態を示し、「ａ」は所属リンパ節に転移が認められなかったもの、「ｂ」は所属リンパ節のうち１〜３個に転移が認められたもの、「ｃ」は所属リンパ節のうち４個以上に転移が認められなかったものに分類される。「Ｔ」は手術時の原発巣のサイズを示し、腫瘍径２ｃｍ以下を「ａ」、腫瘍径２ｃｍ〜５ｃｍを「ｂ」、腫瘍径５ｃｍ以上を「ｃ」で示す。【００９６】
（２）閾値の設定
乳癌患者１２６名から採取した生検試料から、上記方法に従って測定用試料を調製し、ＣＤＫ１比活性、ＣＤＫ２比活性を測定した。測定した癌集団（癌患者１２６名分）のＣＤＫ２比活性／ＣＤＫ１比活性を低い方から順に並べ、集団を６３対６３に分けることができる値を、比の閾値とした。閾値は４６であり、ＣＤＫ２比活性値／ＣＤＫ１比活性値を比が閾値（４６）より小さい場合を再発リスクが低い（ローリスク）と判定し、ＣＤＫ２比活性／ＣＤＫ１比活性を比が閾値（４６）以上の場合を再発リスクが高い（ハイリスク）と判定する。【００９７】
（３）ＣＤＫ比活性プロファイリングによる悪性度判定
患者７７名から採取した生検試料から、上記方法に従って測定用試料を調製し、ＣＤＫ１比活性、ＣＤＫ２比活性を測定した。測定した癌集団（癌患者７７名分）について、（２）で設定した閾値に従って、ハイリスク集団とローリスク集団に分類した。比活性プロファイルによる判定結果を、病理医の判定結果とともに表３及び表４に示す。【００９８】
また、各患者（横軸）に対するＣＤＫ１比活性及びＣＤＫ２比活性を縦軸とするＣＤＫ比活性プロファイルのグラフ作成にあたり、ＣＤＫ２比活性のスケールをＣＤＫ比活性のほぼ４６倍のスケールとして、ＣＤＫ比活性プロファイルの結果を示すグラフを作成した。ローリスク群に判定された患者Ｎｏ．１〜４２のＣＤＫプロファイルの結果を図６、ハイリスク群に判定された患者Ｎｏ．４３〜７７のＣＤＫプロファイルの結果を図７に示す。【００９９】
【表３】
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【０１００】
【表４】
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【０１０１】
表４、図６、図７で示すように、悪性度が悪くないといわれる早期乳ガン患者７７例中３５例（Ｎｏ．４３〜７７）がＣＤＫ比活性プロファイリングにおいてハイリスクと判定され、そのうちの１２例（Ｎｏ．６６〜７７）が術後５年間で再発を起こした。一方、ＣＤＫ比活性プロファイリングにおいてローリスクと判定された４２例中の再発は０例であった。このように、ＣＤＫ１比活性値とＣＤＫ２比活性値を比較するだけでなく、両者の比（本実施例ではＣＤＫ２比活性／ＣＤＫ１比活性）を考慮して、乳癌患者由来組織をプロファイリングした場合、ＣＤＫ１比活性が低く、ＣＤＫ２比活性が大きいときには、癌の悪性度が高いことがわかる。逆に、ＣＤＫ２比活性が低く、ＣＤＫ１比活性が大きいときには、癌の悪性度が低いことがわかる。換言すると、ＣＤＫ２比活性が同程度に高くても（例えばＮｏ．３８とＮｏ．６７）、ＣＤＫ１比活性が相対的に大きい癌は、悪性度が低いといえる。
また、より具体的には予め定めた所定の閾値と比較し、その比較結果から、癌の性質、悪性度を知ることができる。【０１０２】
〔実施例３：抗癌剤ドセタキセルに対する感受性〕
（１）閾値の設定及び判定基準
タキサン系抗癌剤治療した乳癌患者１０００検体の、抗癌剤治療前に採取した乳癌組織を用いて、上記方法に従って測定試料を調製し、ＣＤＫ１及びＣＤＫ２それぞれについて、活性及び発現量を測定して、比活性を算出した。一方、これらの乳癌患者にタキサン系抗癌剤投与を行なった結果、腫瘍が縮小した場合と腫瘍が縮小しなかった場合に分類し、腫瘍サイズの縮小群と非縮小群を分類できるようにＣＤＫ２比活性／ＣＤＫ１比活性（比の閾値）を設定した。比活性の比の閾値は１６となった。【０１０３】
また、ＣＤＫ１比活性値又はＣＤＫ２比活性値が極端に大きい場合又は極端に小さい場合に、ＣＤＫ１比活性値又はＣＤＫ２比活性値に基づいて腫瘍サイズの縮小群と非縮小群を分類できるように、閾値を設定した。ＣＤＫ１比活性値の閾値は２０となり、ＣＤＫ２比活性値の閾値は５００及び１００００となった。【０１０４】
判定は、次のように行なった。まずＣＤＫ１比活性及びＣＤＫ２比活性の値を閾値と比較し、ＣＤＫ１比活性値が２０未満（ＣＤＫ１比活性値＜２０）で且つＣＤＫ２比活性値が５００未満（ＣＤＫ２比活性値＜５００）の場合を非感受性と判定し、非感受性予測グループに分類される。一方、ＣＤＫ２比活性値が１００００超（ＣＤＫ１比活性値＞１００００）の場合には感受性と判定し、感受性予測グループに分類される。
次いで、上記判定で非感受性群にも感受性群にも分類されなかったものについて、ＣＤＫ２比活性／ＣＤＫ１比活性を閾値（１６）と比較し、前記比の値が１６以上の場合を感受性群、１６未満の場合を非感受性群と判定する。【０１０５】
尚、本実施例では、ＣＤＫ１比活性値が０（ＣＤＫ１比活性値＝０）となり、且つＣＤＫ２比活性値が５００以上１００００以下（５００≦ＣＤＫ２比活性値≦１００００）であった場合、ＣＤＫ２比活性／ＣＤＫ１比活性を便宜上無限大として判定した。つまり、この場合、比活性の比の閾値１６以上であるため、感受性として判定した。【０１０６】
（２）ＣＤＫ比活性プロファイルと感受性予測
抗癌剤治療を行なっていない乳癌患者Ａ〜Ｉから採取した乳癌組織を用いて、上記方法に従って測定試料を調製し、ＣＤＫ１及びＣＤＫ２それぞれについて、活性及びＣＤＫ発現量を測定して、比活性を算出した。
９名の乳癌患者（Ａ〜Ｉ）のＣＤＫ１、ＣＤＫ２比活性の値、及びＣＤＫ２比活性／ＣＤＫ１比活性の比に基づいて、（１）で設定した閾値と比較し、感受性群及び非感受性群に分類した。また、患者Ａ〜Ｉ（横軸）に対して、ＣＤＫ１比活性及びＣＤＫ２比活性（縦軸）の関係を示すＣＤＫ比活性プロファイルを図８に示す。ここで、ＣＤＫ２比活性の縦軸スケールは、ＣＤＫ１比活性の縦軸スケールの１６倍に設定した。【０１０７】
上記閾値に従って、患者Ａ〜Ｉのドセタキセル感受性と予測判定されるグループと非感受性と予測判定されるグループに分類した結果は下記のようになる。
ドセタキセル非感受性予測グループ：患者Ａ，Ｂ，Ｃ
ドセタキセル感受性予測グループ：  患者Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｉ【０１０８】
（３）抗癌剤ドセタキセルの治療効果
上記乳癌患者Ａ〜Ｉについて、抗癌剤ドセタキセル（アベンティス社製）を、１回あたり６０ｍｇ／ｍ２（体表面積）として、３〜４週間間隔で４回投与した。投与後、腫瘍のサイズが縮小していたかどうかを調べた。【０１０９】
腫瘍が縮小したか否かの判断は、病理医の触診により、Ｔｈｅｒａｓｓｅ  Ｐ，Ａｒｂｕｃｋ  ＳＧ、Ｅｉｓｅｎｈａｕｅｒ  ＥＡ，Ｗａｎｄｅｒｓ  Ｊ，Ｋａｐｌａｎ  ＲＳ，Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ  Ｌ，Ｖｅｒｗｅｉｊ  Ｊ，Ｖａｎ  Ｇｌａｂｂｅｋｅ  Ｍ，ｖａｎ  Ｏｏｓｔｅｒｏｍ  ＡＴ，Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ  ＭＣ，ａｎｄ  Ｇｗｙｔｈｅｒ  ＳＧ：Ｎｅｗ  ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｔｏ  ｅｖａｌｕａｔｅ  ｔｈｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｉｎ  ｓｏｌｉｄ  ｔｕｍｏｒｓ．Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ  ２０００；９２：２０５−２１６に記載された判定基準に基づいて、「Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ」及び「Ｐａｒｔｉａｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ」と判定された場合を腫瘍縮小と判断し、「Ｓｔａｂｌｅ  Ｄｉｓｅａｓｅ」及び「Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  Ｄｉｓｅａｓｅ」と判定された場合を腫瘍非縮小と判断した。【０１１０】
腫瘍縮小と判断されなかった患者：Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ
腫瘍が縮小したと判断された患者：Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｉ
９名中８名の患者について、予測判定結果と一致し、特に実際の治療効果が認められる場合（陽性予測率）については、１００％一致していた。【０１１１】
〔実施例４：抗癌剤パクリタキセルに対する感受性〕
（１）閾値の設定及び判定基準
実施例３で設定した閾値及び判定基準を援用した。【０１１２】
（２）ＣＤＫ比活性プロファイルと感受性予測
抗癌剤治療を行なっていない乳癌患者Ｊ〜Ｐから採取した乳癌組織を用いて、上記方法に従って測定試料を調製し、ＣＤＫ１及びＣＤＫ２それぞれについて、活性及び発現量を測定して、比活性を算出した。
７名の乳癌患者（Ｊ〜Ｐ）のＣＤＫ１、ＣＤＫ２比活性の値、及びＣＤＫ２比活性値／ＣＤＫ１比活性値の比に基づいて、（１）で設定した閾値と比較し、感受性群及び非感受性群に分類した。また、患者Ｊ〜Ｐ（横軸）に対して、ＣＤＫ１比活性及びＣＤＫ２比活性（縦軸）の関係を示すＣＤＫ比活性プロファイルを図９に示す。ここで、ＣＤＫ２比活性の縦軸スケールは、ＣＤＫ１比活性の縦軸スケールの１６倍に設定した。【０１１３】
上記閾値に従って、患者Ｊ〜Ｐのパクリタキセル感受性と予測判定されるグループと非感受性と予測判定されるグループに分類した結果は下記のようになる。
パクリタキセル非感受性予測グループ：患者Ｊ，Ｋ
パクリタキセル感受性予測グループ：患者Ｌ，Ｍ，Ｎ，Ｏ，Ｐ【０１１４】
（３）抗癌剤パクリタキセルの治療効果
上記乳癌患者Ａ〜Ｉについて、抗癌剤パクリタキセル（ブリストル製薬社製）を、８０ｍｇ／ｍ２（体表面積）で週１回投与し、これを１２週間続けた後、腫瘍のサイズが縮小していたかどうかを調べた。腫瘍サイズが縮小したか否かの判断は、ドセタキセルの場合と同様の基準に基づいて行なった。【０１１５】
判断結果は、下記のようになった。
腫瘍縮小しなかった患者：Ｊ
腫瘍が縮小した患者：Ｋ，Ｌ，Ｍ，Ｎ，Ｏ，Ｐ
８名中７名の患者について、予測判定結果と実際に抗癌剤治療による判断結果が一致し（正確度：８７．５％）、本発明の方法で陽性と判定した患者については１００％腫瘍縮小が認められた。
【産業上の利用可能性】
【０１１６】
本発明の判定方法に基づく細胞の性格、特に癌の悪性度に関する判定結果は、医療現場における臨床医の判定結果との相関性が高いので、癌などの細胞増殖調節機能障害に起因する病気の確定診断として適用可能である。また、ヒトの病気だけでなく、各種哺乳動物細胞の増殖機能調節障害に関する研究に利用できる。【０１１７】
さらに、本発明の刺激物質に対する動物細胞の感受性の判定方法は、抗癌剤、増殖因子、変異原性物質といった各種薬剤、薬物に対する細胞増殖の影響の有無を調べる方法として利用でき、特に癌細胞の種類による抗癌剤等の薬剤の効き方、個体の差異による抗癌剤等の薬剤の効き方の判定に利用することができる。これにより、抗癌剤治療を選択することが有効であるか否かを、実際に患者に投与する前に予測することができるので、本発明の感受性の判定方法を、適格な治療方法の選択指標として利用できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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