(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化１】
0004787449.tif 000019
｛式中、R1およびR2は互に二重結合したＯ、または共にＨ、またはＨおよびＯＨ またはＨおよびＯ−C1〜C4−アルキルであり；
R3およびR4は互に二重結合したＯ、または共にＨ、またはＨおよびＯＨ、またはＨおよびＯ−C1〜C4−アルキルであり；
R8はＨ、ＯＨ、C1〜C4−アルキルおよびＯ−C1〜C4−アルキルから選択され；
R6は、式（II）：
【化２】
0004787449.tif 000020
［式中、R9は水素原子およびグリコシド結合した糖、および式（III）：
【化３】
0004787449.tif 000021
（式中、R10はＨまたはグリコシド結合した糖である）の基から選択される基である］であり；
R6が式（II）の基である場合は、R5は式（II）の炭素原子C9に対する結合であり、R7は水素原子であるか、またはR7は式（II）の炭素原子C9に対する結合であり、そしてR5は水素原子であり；
R6が式（III）の基である場合には、R5およびR7はそれぞれ水素原子であり；
Ａはアミノ酸であり；ｎは２〜１２から選択される整数であり；Ａはそれぞれの他のＡと同種または異種であり；式（Ｉ）のイソインドール環中の窒素原子は (Ａ)n基の第一アミノ酸のＮ−末端アミノ窒素であり；そして(Ａ)nはペプチド鎖を形成する｝
の化合物またはその塩もしくは誘導体。
【請求項２】
式（IV）：
【化４】
0004787449.tif 000022
（式中、R1、R2、R3、R4、R9および (Ａ)nは請求項１において定義した通りである）の請求項１記載の化合物またはその塩もしくは誘導体。
【請求項３】
R1およびR2は互に二重結合したＯであり、R3およびR4は共にＨであり、R9はＨである請求項２記載の化合物またはその塩もしくは誘導体。
【請求項４】
式（Ｖ）：
【化５】
0004787449.tif 000023
（式中、R1、R2、R3、R4、R5、R7、R8、R10および (Ａ)nは請求項１において定義した通りである）の請求項１記載の化合物またはその塩もしくは誘導体。
【請求項５】
(Ａ)nはアミノ酸配列：Met−His−Gln−Pro−His−Gln−Pro−Leu−Pro−Pro（配列番号：１）を有するペプチド鎖（Met基は場合により酸化されスルホキシドを形成する）である請求項１〜４のいずれかに記載の化合物またはその塩もしくは誘導体。
【請求項６】
R9またはR10はアルドヘキソースである請求項１〜５のいずれかに記載の化合物またはその塩もしくは誘導体。
【請求項７】
Memnoniella echinata FH 2272, DSM 13195またはその突然変異体もしくは変異体から選択される真菌を培養培地中、適当な培養条件下に、培養培地中に化合物が出現するまで培養し、ついでその化合物を単離することにより得られる請求項１〜６のいずれかに記載の化合物またはその塩もしくは誘導体。
【請求項８】
化合物を誘導体および生理学的に許容され得る塩から選択される少なくとも１種の化学的形態に変換させることをさらに含む請求項７記載の化合物。
【請求項９】
式（IVb）：
【化６】
0004787449.tif 000024
（式中、(Ａ)nは請求項１に定義した通りである）の請求項１記載の化合物。
【請求項１０】
式（IVa）
【化７】
0004787449.tif 000025
のメムノペプチドＡ、C76H108N16O18Sである請求項１記載の化合物またはその塩または誘導体。
【請求項１１】
グループ (Ａ)nはカゼインのアミノ酸配列の部分からなる請求項１〜１０のいずれかに記載の化合物。
【請求項１２】
(Ａ)nはアミノ酸配列：Met His Gln Pro His Gln Pro Leu Pro Pro（配列番号：１）である請求項１１記載の化合物。
【請求項１３】
メチオニン（Met）は酸化されてスルホキシドを形成している請求項１２記載の化合物。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれかにより定義された少なくとも１種の式（Ｉ）の化合物および許容される担体を含む組成物。
【請求項１５】
組成物は医薬組成物であり、許容される担体は医薬的に許容される担体である請求項１４記載の組成物。
【請求項１６】
請求項１〜１３のいずれかにより定義された式（Ｉ）の化合物またはその塩もしくは誘導体を製造する方法であって、少なくとも１種の炭素原子源および少なくとも１種の窒素原子源を含む栄養培地中、適当な条件下にMemnoniella echinata FH 2272, DSM 13195またはその突然変異体もしくは変異体を少なくとも１種の式（Ｉ）の化合物が栄養培地中に出現するまで培養し、ついでその化合物を単離することからなる方法。
【請求項１７】
化合物を誘導体および生理学的に許容され得る塩から選択される少なくとも１種の化学的形態に変換させることをさらに含む請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
培養は好気条件下に行われる請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
少なくとも１種の窒素原子源はアミノ酸およびペプチドから選択される請求項１６〜１８のいずれかに記載の方法
【請求項２０】
栄養培地は総栄養溶液の重量に対して0.05〜５％の濃度範囲でのカゼインペプトンを含む請求項１６〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
栄養培地はカゼインペプトン、グルコース、コーンスティープ、ならびに痕跡量の塩化カリウム、硫酸マグネシウムおよび硫酸鉄を含む請求項１６〜２０のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【技術分野】
本発明は、Memnoniella echinata FH 2272, DSM 13195の培養培地中発酵により得られる、メムノペプチドと呼ばれる新規なペプチド誘導体、メムノペプチドの製造方法、およびメムノペプチドの医薬としての使用、たとえば心不全の処置用医薬の製造における使用に関する。
【０００２】
【背景技術】
心脈管系疾患は現在もなお、西洋工業国においては死因の第一位にランクされている。これらのかなりの割合が心不全と診断された患者である。心不全は心臓の不適切な機能を意味する疾患として理解される。心臓は哺乳動物の要求に相当する拍出量を産生することができない。心不全は、心臓の急性的または慢性的な無力化状態であり、労作時または休止時においても、代謝に必要な血液の排出または戻ってくる静脈血の取り込みを達成することができない。それはたとえば心拍数、一回拍出量または高血圧のような代償機構がもはや正常な心拍出量を維持するために十分ではない心臓の状態である。心不全には様々な原因がある。たとえば、炎症および変性による心筋の変化、冠状循環障害および心筋梗塞である。心不全は末梢循環の変化、呼吸、腎機能、電解質平衡の障害を招き、また骨格筋系の能力が低下し、最終的には死に至ることが多い。
【０００３】
心不全は一般に高齢で起こる。35〜64歳における住民1000人あたりの発症率は3人であり、６５〜９４歳の年齢群では10／1000である。死亡率は３５〜４４歳の年齢群に比べて７５歳ではほぼファクター２００の増加がみられる。米国における研究では1970年から1983年にかけて死亡率はほぼ一定に維持されている。ドイツ共和国でも同じ数字が推定される。診断後５年以内に５９％を越える患者が死亡している。この統計的な調査は基本的にまたはそれ自体、その集団において心不全がきわめて重要であることを示しているが、また現在、医師によって利用可能な医学的処置が不適当である可能性を確認するものでもある。
【０００４】
現在の処置が不適当であることを考慮し、革新的な心臓の治療薬を導く新しい概念が開発された。心筋および骨格筋が収縮して機械的作業を実施する能力は、（1）収縮構造エレメント（筋原線維）および（2）収縮過程で機械的エネルギーに変換される筋原線維が利用可能な化学的エネルギー（ＡＴＰ）に依存する。収縮過程では筋原線維の短縮化が起こる。これは運動神経のインパルスによって開始され、その作用下に数ミリ秒内に細胞外空間から筋形質空間にカルシウムイオン（Ｃａ2+）が流入し、カルシウムの貯蔵は空になる。心筋不全（心不全）においては、筋原線維内のCa2+濃度は低下する。しかしながら、Ca2+イオンは収縮組織の活性化に不可欠である。要求が上昇すれば、Ca2+は一般に膜Ca2+依存性Mg2+− ATPaseの触媒下に筋小胞体（ＳＲ）に注入される。この酵素はまた、筋小胞体Ca2+ATPase（SERCA2）とも呼ばれる。水分析によれば、Ca2+ATPaseは１０個の膜貫通ヘリックスおよび多くの細胞外ループからなる。サイトゾルの側では、Ca2+およびATPase結合、リン酸化、ならびにモジュレータータンパク質、ホスホランバン（ＰＬＢ）に対するドメインが形成される。後者はSRの膜に局在し、リン酸化されていない状態でSERCA2に対して阻害活性を発揮する五量体タンパク質である。生理学的ストレス下には、PLBのリン酸化が起こり、これはSERCA2のCa2+親和性を増大させ、したがってＳＲにおけるCa2+イオンの輸送率を増大させる。PLB（５２アミノ酸タンパク質）のリン酸化は2つのアミノ酸残基で起こる。すなわち、セリン−16はcAMP−依存性プロテインキナーゼによりリン酸化され、位置17のスレオニンはCa2+カルモジュリン−依存性キナーゼによってリン酸化される。このリン酸化はPLBコンフォーメーションの変化、それによるCa2+のSERCA2親和性の増加を生じる。抗−ＰＬＢ抗体は、ＰＬＢリン酸化作用を開始させ、したがって心臓の収縮能力のレギュレーターとしてのＰＬＢの鍵となる役割が確認される（Phospholamban: Protein Structure, Mechanism of Action and Role in Cardiac Function. H. K. Simmerman & L. R. Jones, Physiological Reviews: Vol.78, No.4, 921ff, 1998）。すなわち、SERCA2の活性化物質は心不全に望ましい影響をもたらすはずである。
【０００５】
驚くべきことに真菌株、Memnoniella echinata FH 2272, DSM 13195の培養液には、心臓および循環に好ましい作用を発揮できる天然物質を含有されることが見出された。単離された活性化合物、メムノペプチドは特異的な構成基からなる天然物質である。これらの構基には、いわゆるポリケチド残基であるテルペンおよび窒素含有基が包含される。
【０００６】
テルペンは、形式的には炭化水素イソプレンの重合生成物と解釈される天然に存在する化合物である。イソプレン基の数によって、モノテルペン（C10）、セスキテルペン（C15）、ジテルペン（C20）等に分類することができる。母体構造から、置換、環化、転位、酸化等によって多くの化合物を形成させることが可能であり、したがって、何千ものテルペンが文献に記載されている。テルペンに由来する窒素含有化合物も報告されているが、これらはアルカロイドと考えられている（たとえば、ゲンチアナアルカロイド）[Rompp Chemie Lexikon (Rompp Chemical Encyclopedia), 9th Edition, Volume 6, 4508ff, Georg Thieme Verlag, Stuttgart/ New York, 1982]。しかしながら、これらのテルペンは、本発明のメムノペプチドとは基本的に相違し、テルペンはそれらが窒素を結合できるポリケチド残基を含まない。
【０００７】
更なる既知の窒素含有テルペンとしては以下を挙げることができる。
−スタキボシン（Stachybocins）（J. Antibiotics, 48: 1306, 1995）
−スタキボトリン（Stachybotrins）（Y. Nozawaら, J. Antibiotics, 50: 635−645, 1997）
−スピロジヒドロベンゾフランラクタム（Spirodihydrobenzofuran lactams）（J. Antibiotics, 49: 13, 1996）
−ナキジキノン（Nakijiquinones）（Tetrahedron, 51: 10867−10874, 1995）
−F1839−A〜Jはポリケチド残基を有する窒素含有テルペンである（日本特許061864133および08283118）。それらはコレステロールエステラーゼ阻害剤である。
【０００８】
これらのテルペン誘導体は、Memnoniella echinata属およびStachybotrys属の様々な株ならびに他の微生物によって合成された。それらは、エンドセリン受容体のアンタゴニスト、ＨＩＶプロテアーゼの阻害剤およびコレステロールエステラーゼ阻害剤、ならびにヘアトニックとして記載されている。イノシトールモノホスファターゼ阻害剤L−671,776は、株Memnoniella echinata ATCC 20928からさらに単離された（Y. K. T. Lamら, J. Antibiotics, 45, pp. 1397−1402, 1992）。
【０００９】
本発明によるメムノペプチドは異なる活性スペクトルを有する。顕著な特徴はそれらのSERCA2に対する活性化作用であり、したがって心不全に対する作用である。
【００１０】
【発明の開示】
したがって、本発明は式（Ｉ）：
【化８】
0004787449.tif 000002
｛式中、R1およびR2は両者で二重結合したO、または共にH、またはHおよびOH、 またはHおよびO−C1〜C4−アルキルであり；
R3およびR4は両者で二重結合したO、または共にH、またはHおよびOH、またはHおよびO−C1〜C4−アルキルであり；
R5はH、 OH、C1〜C4−アルキル、およびO−C1〜C4−アルキルから選択され；
【００１１】
R6は、式（II）：
【化９】
0004787449.tif 000003
［式中、R9はＨおよびグリコシド結合した糖、および式（III）：
【化１０】
0004787449.tif 000004
（式中、R10はHまたはグリコシド結合した糖である）の基から選択される基である］であり；
R6が式（II）の基である場合は、R5は式（II）の炭素原子C9に対する結合であり、R7は水素原子であるか、R7は式（II）の炭素原子C9に対する結合であり、R5は水素原子であり；
R6が式（III）の基である場合には、R5およびR7はそれぞれ水素原子であり；
【００１２】
Aはアミノ酸であり；
nは１〜１２から選択される整数であり；
Aはそれぞれの他のAと同種または異種であり；
式（Ｉ）のイソインドール環中の窒素原子は (Ａ)n基の第一アミノ酸のN−末端アミノ窒素である。
ただし、nが１であり；R1およびR2が両者で二重結合したOであり；R3およびR4が共にHであり； R6が式（II）の基であり；R5が式（II）の基の炭素原子C9に対する結合であり；R7がHであり；R8がHであり；R9がHである場合、AはGlu以外のアミノ酸である] の化合物またはそれらの塩もしくは誘導体に関する。
【００１３】
式（Ｉ）において、(Ａ)nは、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Ser、Thr、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、Asp、His、Glu、Asn、Gln、CysおよびMetから選択される少なくとも1個の天然アミノ酸とすることができる。(Ａ)nは２〜１２個のアミノ酸を有するペプチド鎖であってもよい。一実施態様においては(Ａ)nは１０個のアミノ酸からなる。
【００１４】
C1〜C4−アルキルは１〜４個の炭素原子を有する直鎖状または分岐状アルキル、たとえばメチル、エチル、ｉ−プロピルおよびtert−ブチルである。
【００１５】
糖はヘキソース、たとえばマンノース、グルコースまたはガラクトースのようなアルドヘキソースであり、それらはさらにたとえばC1〜C4−アルキルまたはNH2のような基によって置換されていてもよい。
【００１６】
本発明はさらに、式Iの化合物の、すべての自明の誘導体に関する。誘導体は塩、還元生成物、エステル、エーテル、アセタール、ならびにアミドおよびN−アルキル化生成物、さらにすべての光学鏡像異性体、ジアステレオマーおよびすべての立体異性体である。
【００１７】
一実施態様においては、式（Ｉ）の化合物は式（IV）：
【化１１】
0004787449.tif 000005
（式中、R1、R2、R3、R4、R9および (Ａ)nは上記式（IV）において定義した通りであり、R1およびR2は両者で二重結合したO、R3およびR4は共にHであり、R9はHである）を有する。
【００１８】
一実施態様においては、本発明の化合物は、式（IVa）：
【化１２】
0004787449.tif 000006
のメムノペプチドＡ、C76H108N16O18Sである。この式中、4−メチルおよびメチレン基を有するデカリン構造はテルペン残基であり、置換イソインドール環はケチド残基である。アミノ酸配列：
Met His Gln Pro His Gln Pro Leu Pro Pro（配列番号：１）
はカゼイン配列の部分である。メチオニン（Met）は酸化されてスルホキシドを形成してもよい。
【００１９】
式（IVb）：
【化１３】
0004787449.tif 000007
（式中、(Ａ)nは上に指示した意味を有する）は好ましい立体型である。
【００２０】
本発明の好ましい化合物の物理化学的および分光スペクトル的性質は以下のようにまとめることができる。
0004787449.tif 000008
炭素原子の番号およびそれに伴うNMRシフトは環状セスキテルペンについての番号付け操作に従い分類される。
【００２１】
環状セスキテルペンケトリドの位置の番号付け
【化１４】
0004787449.tif 000009
【００２２】
【表１】
0004787449.tif 000010
【００２３】
【表２】
0004787449.tif 000011
【００２４】
【表３】
0004787449.tif 000012
【００２５】
【表４】
0004787449.tif 000013
【００２６】
【表５】
0004787449.tif 000014
【００２７】
【表６】
0004787449.tif 000015
【００２８】
本発明の一実施態様においては、式（Ｉ）の化合物は、Memnoniella echinata FH 2272, DSM 13195またはその突然変異体もしくは変異体を培養培地中適当な条件下、式(Ｉ)に示される少なくとも１種のメムノペプチドが培養培地中に出現するまで発酵させ、ついでメムノペプチドを単離することにより得られる。
【００２９】
したがって本発明はさらに、式Ｉの化合物を製造する方法において、微生物Memnoniella echinata FH 2272, DSM 13195またはその突然変異体もしくは変異体を培養培地中適当な条件下で、式（Ｉ）の少なくとも１種のメムノペプチドが培養培地中に出現するまで発酵させ、ついでメムノペプチドを単離することによる方法に関する。
【００３０】
一実施態様においては、株FH 2272, DSM 13195, その突然変異体および／または変異体は、少なくとも１種の炭素原子源および少なくとも１種の窒素原子源ならびに任意に慣用の無機塩からなる栄養溶液（培養培地とも呼ぶ）中、培養培地中にメムノペプチドが出現するまで発酵させる。メムノペプチドはついで培養培地から単離し、所望により個々の活性成分に分離し、精製する。一実施態様においては、メムノペプチドは培養培地中に蓄積させ、個々の成分に分離する。
【００３１】
他の実施態様においては、培養培地中に用いられる窒素原子源の少なくとも１種はアミノ酸およびペプチドから選択される。窒素原子源として使用されるアミノ酸およびペプチドは上に定義したグループ (Ａ)nと同種であってもよい。
【００３２】
本発明の方法には実験室的規模（ミリリットルないしリットルの範囲）および工業的規模（立方メーターの規模）を使用することができる。
【００３３】
Memnoniella echinata FH 2272の強力な産生コロニーを増殖させた。単離体は1999年12月14日のブタペスト条約の規定により、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1B, 3300 Brunswick, Germanyに以下の受入番号：Memnoniella echinata FH 2272, DSM 13195で寄託された。
【００３４】
Memnoniella echinata FH 2272, DSM 13195は、緑褐色の菌糸体を有し、Memnoniella 属に特徴的な子柄によって特徴づけられる。
【００３５】
Memnoniella echinata FH 2272, DSM 13195株の変異体および突然変異体もまた、本発明のメムノペプチドの化合物少なくとも１種を合成するために使用できる。このような突然変異体はそれ自体既知の方法により、たとえば物理学的方法、たとえば紫外線もしくはＸ線照射により、または化学的突然変異誘発物質、たとえばメタンスルホン酸エチル（EMS）、２−ヒドロキシ−４−メトキシベンゾフェノン（MOB）もしくはN−メチル−N'−ニトロ−N−ニトロソグアニジン（MNNG）によって製造することができる。可能な変異体には真菌種StachybotrysたとえばStachybotrys atra, Stachybotrys chartarumまたはStachybotrys complementiに密接に関連する種が包含される。
【００３６】
本発明のメムノペプチド少なくとも１種の化合物を合成する突然変異体および変異体のスクリーニングは以下のスキームに従って実施することができる：
−発酵後、菌糸体の分離、
−菌糸体の有機溶媒による抽出、
−固相を使用する培養ろ液からのメムノペプチドの抽出、
−HPLC, DCまたは生物活性試験による分析。
【００３７】
以下に記述する発酵条件はMemnoniella echinata FH 2272の寄託された単離体, DSM 13195ならびに突然変異体および変異体に適用される。
【００３８】
一実施態様においては、少なくとも１種の炭素原子源、窒素原子源としてのカゼインペプトン、および慣用の無機塩からなる栄養溶液においてMemnoniella echinata FH 2272メムノペプチドＡを産生する。一実施態様においては、Memnoniella echinata FH 2272は DSM 13195である。
【００３９】
好気性発酵のために可能な炭素原子源には、同化可能な炭水化物および糖アルコール、たとえばグルコース、ラクトース、スクロース、デンプン、デキストリン、フルクトース、糖蜜、グリセロール、ガラクトースおよびD−マンニトールならびに天然産物含有炭水化物たとえば麦芽エキスが包含される。可能な窒素原子源にはたとえばアミノ酸；ペプチド；タンパク質；アミノ酸、ペプチドおよびタンパク質たとえばカゼイン、ペプトンおよびトリプシンの分解生成物；肉エキス；酵母エキス；ピーナツエキス；種子たとえばトウモロコシ、小麦、大豆および綿の粉砕物；種子含有組成物；アルコール製造の蒸留残留物；肉粉；酵母エキス；アンモニウム塩および硝酸塩が包含される。一実施態様においては、少なくとも１種の窒素原子源は合成によって得られたペプチドおよび生合成により得られたペプチドから選択される。栄養溶液は任意に少なくとも１種の無機塩からなる。一実施態様においては、無機塩は塩化物、炭酸塩、硫酸塩、およびリン酸塩から選択される。硫酸塩およびリン酸塩はアルカリ金属の硫酸塩、アルカリ金属のリン酸塩、アルカリ土類金属の硫酸塩およびアルカリ土類金属のリン酸塩から選択することが可能であり、アルカリ土類金属は鉄、亜鉛、コバルトおよびマンガンから選ばれる。
【００４０】
本発明のメムノペプチドの形成はカゼインペプトンからなる栄養溶液中で進行する。一実施態様においては、栄養溶液はカゼインペプトン約0.05〜５％の範囲の濃度からなる。他の実施態様においては、カゼインペプトン約0.1〜１％の範囲の濃度からなる。さらに他の実施態様においては、カゼインペプトン約0.2〜5％の範囲の濃度からなる。栄養溶液はグルコースから構成されていてもよい。一実施態様においては、グルコース約0.5〜3％の範囲の濃度からなる。栄養溶液はまたコーンスティープから構成されていてもよい。一実施態様においては、コーンスティープは約0.05〜１％の濃度範囲らなる。他の実施態様においては、コーンスティープは約0.1〜５％の範囲の濃度からなる。栄養溶液は塩化カリウム、硫酸マグネシウムおよび硫酸鉄から選ばれる少なくとも１種の成分の痕跡量からなる。
【００４１】
一実施態様においては、栄養溶液はカゼインペプトン、グルコース、コーンスティープならびに痕跡量の塩化カリウム、硫酸マグネシウムおよび硫酸鉄からなる。他の実施態様においては、栄養溶液は、カゼインペプトン約0.05〜5％の範囲の濃度、グルコース約0.5〜3％の範囲の濃度、コーンスティープ約0.05〜1％の範囲の濃度ならびに痕跡量の塩化カリウム、硫酸マグネシウムおよび硫酸鉄からなる。％のデータはそれぞれ全栄養溶液の重量に関して用いられる。
【００４２】
この栄養溶液中において、Memnoniella echinata FH 2272は DSM 13195とすることができるMemnoniella echinataはメムノペプチドの混合物を形成する。栄養溶液の組成に依存して、本発明のメムノペプチド1または2種以上の定量的な比率は変動する。さらに、個々のメムノペプチドの合成、たとえばメムノペプチドが全く、または微生物の検出限界以下のわずかな量しか産生されないかは、メジウムの組成によって制御される。
【００４３】
微生物の培養は好気的に、たとえば、振盪フラスコまたは発酵槽中で振盪または攪拌しながら、所望により、空気または酸素を導入して浸水培養して実施される。それは、約18〜37℃の温度範囲、さらに狭い範囲の約20〜32℃、なおさらに狭い範囲の約25〜30℃で実施することができる。PH範囲は６〜８、たとえば6.5〜7.5でなければならない。一般的には、微生物はこれらの条件下に24〜300時間の期間、さらに一般的には36〜140時間培養される。
【００４４】
培養は多くの工程で実施するのが有利である。すなわち、液体栄養メジウム中少なくとも1回の前培養を行い、ついで実際の製造メジウム、主培養液中に1：10の容量で接種することができる。前培養液は、たとえば栄養溶液中に菌糸体を接種し、それを約36〜120時間たとえば48〜72時間増殖させて得ることができる。菌糸体はたとえば、株を約３〜40日たとえば4〜10日、固体または液体栄養メジウムたとえば麦芽酵母アガールまたは馬鈴薯デキストロースアガー（糸状真菌の標準メジウム、たとえばDifcoから）上で生育させて得られる。
【００４５】
発酵の経過は培養液のpH, 菌糸体の容量ならびにクロマトグラフィー法たとえば薄層クロマトグラフィーもしくは高速液体クロマトグラフィー、または生物活性の試験によってモニタリングすることができる。本発明の化合物は、菌糸体および培養ろ液の両者の中に存在するが、通常、大部分はろ液中に見出される。
【００４６】
以下に記載する単離過程は本発明のメムノペプチドたとえばメムノペプチドＡの精製に有効である。培養メジウムからの本発明のメムノペプチドの単離または精製はその天然物質の化学的、物理学的および生物学的性質を考慮して既知の方法により実施される。培養メジウムまたは個々の単離工程におけるメムノペプチドの濃度を試験するには、たとえばシリカゲル上溶出液としてイソプロパノール／25％強NH3を用いる薄層クロマトグラフィーまたはHPLCを使用することができる。薄層クロマトグラフィー分離における検出はたとえば、発色試薬たとえばクロロスルホン酸／氷酢酸によって実施できる。形成される基質の量を検量溶液と比較するのが有利である。
【００４７】
本発明のメムノペプチドを単離するためには、まず菌糸体を通常の操作を用いて培養基から分離し、ついでメムノペプチドを任意に水混和性有機溶媒を使用して細胞塊から抽出する。有機溶媒相は本発明による天然物質を含有する。それを真空中で任意に濃縮し、残留物を以下に述べるようにしてさらに精製することもできる。一実施態様においては、メムノペプチドは真菌と培養基の混合物に溶媒を加えて培養液から抽出する。
【００４８】
培養ろ液は任意に濃縮菌糸体抽出液と合一し、適当な水非混和性有機溶媒たとえばn−ブタノールで抽出する。ついで有機相を真空中で任意に濃縮する。有用な生成物を脱脂するために、濃縮物を、本発明の化合物はあまり溶けない非極性溶媒たとえばヘキサン、石油エーテルまたはジエチルエーテルで希釈する。この方法においてメムノペプチドは沈殿し、脂溶性の不純物は溶解したままで慣用の固／液相分離によって除去される。
【００４９】
メムノペプチドからなる沈殿を元の容量の１／３０ 水／メタノールに溶解する。この過程で沈殿を完全に溶解し、凍結乾燥する。以下粗製生成物と呼ぶ凍結乾燥物は５〜50％のメムノペプチドからなり、さらに単離のために使用される。
【００５０】
本発明の少なくとも１種のメムノペプチドの更なる精製は適当な材料たとえば分子篩、シリカゲル、アルミナ、イオン交換もしくは吸着樹脂、または逆相（RP）上でのクロマトグラフィーにより実施される。メムノペプチドはこのクロマトグラフィーの補助により分離することができる。メムノペプチドのクロマトグラフィーは緩衝化水溶液または水と有機溶媒の混合物を用いて実施される。
【００５１】
水と有機溶媒の混合物は、すべて水混和性の有機溶媒、たとえばメタノールおよびアセトニトリル、溶媒の濃度5〜80％、さらに一般的には溶媒20〜50％、またはすべて有機溶媒と混和性の緩衝化水溶液と理解すべきである。使用される緩衝液は上述と同一の緩衝液とすることができる。
【００５２】
それらの異なる極性に基づくメムノペプチドの分離は逆相クロマトグラフィーたとえばMCI（登録商標, Mitsubishi, Japanからの吸着樹脂）もしくはAmberlite XAD（登録商標、Toso Haas）またはさらに疎水性物質たとえばRP−8もしくはRP−18相の補助により実施できる。さらに分離は、正常相上クロマトグラフィーたとえばシリカゲル、アルミナ等で行うことができる。
【００５３】
メムノペプチドのクロマトグラフィーは、緩衝化もしくは酸性化水溶液または水溶液とアルコールもしくは他の水混和性有機溶媒の混合物を使用して実施することができる。一実施態様においては、有機溶媒はプロパノールおよびアセトニトリルから選択される。
【００５４】
緩衝化または酸性化水溶液は少なくとも１種の溶液単独または配合物を意味するものと理解すべきである。たとえば、上記の少なくとも１種の溶液は、水、リン酸緩衝液、酢酸アンモニウム、クエン酸緩衝液、および酸から選択することができる。一実施態様においては、クエン酸緩衝液は濃度０〜0.5 Mの範囲である。酸はギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、および本技術分野の熟練者には周知のすべての市販されている酸から選択することができる。一実施態様においては、市販の酸は濃度0〜1％の範囲である。さらに他の実施態様においては、酸の濃度は0.1％である。
【００５５】
クロマトグラフィーは100％の水に始まり100％の有機溶媒で終わる勾配を用いて実施される。少なくとも１種の溶媒が使用される。2種またはそれ以上の溶媒の混合物も使用できる。一実施態様においては、プロパノールおよびアセトニトリルから選択される溶媒20〜50％の直線勾配を流す。
【００５６】
別法としてゲルクロマトグラフィーまたは疎水性相上でのクロマトグラフィー
も使用することができる。
ゲルクロマトグラフィーはポリアクリルアミドまたはコポリマーゲルたとえばBiogel−P2（登録商標、Biorad）またはTSK HW 40（登録商標、Merck, GermanyまたはToso Haas, USA）上で実施することができる。
【００５７】
本発明の化合物の精製にきわめて有効な更なる方法はイオン交換樹脂の使用である。たとえば塩基性メムノペプチドＡは陽イオン交換樹脂たとえばFractogel（登録商標、EMD SO3-）上できわめて有利に単離することができる。pH５〜８たとえばpH6〜7.5の緩衝液が使用できる。溶出は塩の上昇勾配を使用して達成することができる。水に加えて、溶媒として有機溶媒と水性緩衝液の混合物の使用も有利である。有機溶媒の割合は10〜90％たとえば30〜60％とする。
上述のクロマトグラフィー方法の順序は逆転させることも可能である。
【００５８】
メムノペプチドのきわめて有効な更なる精製工程は結晶化である。メムノペプチドは、有機溶媒および水と有機溶媒の混合物中の溶液から結晶化させることができる。結晶化はそれ自体既知の様式により、たとえば飽和メムノペプチド溶液を濃縮または冷却することにより実施できる。
【００５９】
本発明によるメムノペプチドは固体の状態およびpH範囲３〜８たとえば５〜７の溶液中で安定であり、したがって、慣用の医薬製剤中に導入することができる。
【００６０】
窒素含有メムノペプチドの形成には、Memnoniella echinata培養液に所望のアミノ酸またはペプチドを前駆体として添加することが好ましい。5員環ラクタム、通常はイソインドール環系の合成に供給されるアミノ酸およびペプチドのアミノ酸基を結合することはMemnoniella echinataの特徴である。この結合は酸化の経過においてアルデヒド前駆体から、または環開裂型もしくは環状ラクタム型のラクトン酸化段階のいずれかにおいて起こる。このアミンを結合するMemnoniella echinataの能力は全く驚くべきことであり、保護された変換アミン誘導体たとえばアミノ酸およびペプチドのテルペン誘導体を得るために使用することができる。
【００６１】
本発明によるメムノペプチド化合物の１つは、最後に、それらの有用な薬理学的性質により、薬剤として医学および獣医学における使用に適している。
【００６２】
本発明は、したがって、式（Ｉ）の化合物またはそれらの生理学的に許容され得る塩の、心不全の処置および予防用の心臓薬剤の製造における使用に関する。
【００６３】
本発明の化合物はまた、心不全が疾患の一次的または二次的原因である疾患、たとえば循環不全の処置用薬剤の製造に使用することができる。
メムノペプチドの作用機構については不確定であるが、有意な作用が検出されている。
【００６４】
ＰＬＢのリン酸化作用を模倣するSERCA2の活性化物質の検出には、試験物質の存在下におけるイヌ心臓ミクロソームのCa2+ ATPase活性を測定する比色試験を行うことができる。試験は96−ウエルマイクロタイタープレート中で実施される。この酵素はATPから無機リン酸を放出させ、これがモリブデン酸アンモニウムと青色に着色した複合体を形成し、これは分光光度計により620 nmで測定することができる。
【００６５】
メムノペプチドＡは12.5μＭからの濃度でSERCA2を活性化する。
メムノペプチドはさらに、抗微生物活性を有する。したがって本発明は式（Ｉ）の化合物またはその生理学的に耐容性のある塩の、微生物たとえば細菌の感染処置用の薬剤の製造における使用に関する。表３は、一部の選択された細菌におけるメムノペプチドＡの抗菌スペクトルの最小阻止濃度（MIC）を示す。
【００６６】
【表７】
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【００６７】
抗菌作用に加えて、本発明の化合物は弱い抗真菌作用すなわち抗カビ作用、たとえばCandida albicansに対する活性を示す。
【００６８】
さらに本発明の物質はグルコース代謝に重要な酵素、グルコース−6−ホスフェート（G−6−P−TL）に対してある種の好ましい阻害活性を有し、したがって、糖尿病の処置に有用である。たとえば、化合物メムノペプチドＡはG−6−P−TLに対する選択的活性を示し、補酵素G−6−Pホスファターゼは阻害しない。
【００６９】
したがって本発明は式（I）の化合物またはその生理学的に耐容性のある塩の、糖尿病治療のための薬剤の製造における使用に関する。
本発明はまた、本発明のメムノペプチド化合物少なくとも１種の医薬製剤に関する。
【００７０】
本発明のメムノペプチド化合物のうち少なくとも１種は一般的に非希釈の形態でそのまま投与することができる。適当な賦形剤またはビヒクルとの混合物としての使用は本発明の一実施態様である。薬剤に使用できるビヒクルは慣用される製薬上許容され得るビヒクルおよび／または賦形剤である。
【００７１】
一般に、本発明の薬剤は経口的にまたは非経口的に投与されるが、経直腸的に投与することもできる。固体または液体の医薬製剤の形態には、たとえば顆粒剤、散剤、錠剤、コーテイング錠、（マイクロ）カプセル、坐剤、シロップ、乳化液、懸濁剤、エアロゾル、滴下剤またはアンプル中の注射用溶液および活性化合物の放出が保護された製剤であり、この製剤中にはビヒクル、添加物および／または賦形剤たとえば崩壊剤、結合剤、コーティング剤、膨潤剤、グライダントもしくは滑沢剤、フレーバー、甘味剤、または可溶化剤が慣用的に使用される。上述の頻繁に使用されるビヒクルまたは賦形剤には、たとえば炭酸マグネシウム、二酸化チタン、ラクトース、マンニトール、および他の糖、タルク、ラクトタンパク質、ゼラチン、デンプン、ビタミン、セルロースおよびその誘導体、動物油および植物油、ポリエチレングリコールおよび溶媒（たとえば滅菌蒸留水、アルコール、グリセロール、および多価アルコール）が包含される。
【００７２】
経口投与用の用量単位は、放出を遅延させるために、またはより長時間に延長させるため、活性化合物を適当なポリマー、ワックス等で粒子型にコーティングするかまたは包埋してマイクロカプセルに封入することができる。
【００７３】
一実施態様においては、医薬製剤は、各単位用量が本発明のメムノペプチド、少なくとも１種の化合物の特定用量を活性成分として単位用量を製造し、投与される。固体用量単位（たとえば錠剤、カプセル剤および坐剤）の場合、この用量は、約500 mgまで、さらに一般的には約0.1〜200 mgまでとすることが可能であり、アンプル中注射用溶液の場合、一般的には約200 mgまで、通常は1日に約0.5〜100 mgまでとすることができる。
【００７４】
投与される１日用量は一般に、哺乳動物の体重、年齢、性別および状態に依存する。しかしながら、ある種の環境では、高用量または低用量がまた適当である。1日用量の投与は、個々の単位用量の単回投与、または多くの小用量単位により特定の間隔で分割用量を多回投与することによって実施することができる。
【００７５】
本発明の薬剤は、本発明のメムノペプチドの少なくとも１種の化合物を、慣用のビヒクルならびに適宜、添加物および／または賦形剤を使用して適当な投与形態にすることによって製造することができる。
【００７６】
本発明を以下の実施例によってさらに例示する。百分率は重量に基づく。液体の場合の混合比は、他に詳細な説明がない限り容量を意味する。
以下の実施例は本発明の例示を意図するものであって、本発明の範囲を限定するものではない。
【００７７】
【実施例】
実施例１：
Memnoniella echinata FH 2272, DSM 13195のグリセロール培養液の調製
滅菌した300 mLの三角フラスコ中、100 mLの栄養溶液（麦芽エキス2.0％, 酵母エキス0.2％, グルコース1.0％, (NH4)2HPO4 0.05％, pH 6.0）に、株Memnoniella echinata FH 2272, DSM 13195を接種し、回転シェーカー上、25℃, 140 rpmで7日間インキュベートした。ついでこの培養液1.5 mLを80％濃度のグリセロール2.5mLで希釈し、−20℃で保存した。
【００７８】
実施例２：
Memnoniella echinata FH 2272, DSM 13195の培養液または前培養液の三角フラスコにおける調製
以下の栄養溶液すなわちグルコース10ｇ／L, カゼインペプトン5ｇ／L, 液体コーンステフィープ1.7ｇ／Ｌおよび痕跡元素溶液（KCl 10ｇ／Ｌ、  MgSO4×7H2O 10ｇ／Ｌ, FeSO4×7H2O 3.6ｇ／ＬおよびMnSO4×H2O 6ｇ／Ｌ）7 mLを含有する液100 mLを滅菌した300 mLの三角フラスコに取り、傾斜試験管中で増殖させた培養液（同じ栄養溶液、ただし２％寒天を含む）または１mLのグリセロール培養液（実施例１参照）で接種して、シェーカー上、30℃, 180 rpmでインキュベートした。本発明のメムノペプチドのうち少なくとも１種の化合物の最大産生は約20時間後に達成された。10および200 Lのファーメンターの接種には同一栄養溶液からの48〜96時間齢浸水培養液（接種量約10％）で十分である。
【００７９】
実施例３：
メムノペプチドの製造
30 Lのファーメンターを以下の条件で操作した。
栄養溶液：
10ｇ／Ｌのグルコース
0.5ｇ／Ｌのカゼインペプトン
1.7ｇ／Ｌの液体コーンスティープ
7 mLの痕跡元素溶液
pH 6.5（滅菌前）
痕跡元素溶液：KCl 10ｇ／Ｌ,  MgSO4×7H2O 10ｇ／Ｌ, FeSO4×7H2O 3.
6ｇ／ＬおよびMnSO4×H2O 6ｇ／Ｌ
インキュベーション時間：45時間
インキュベーション温度：28℃
攪拌機速度：300 rpm
空気流入：15Ｌ／分
泡の形成はエタノール性ポリオール溶液の反復添加により任意に抑制した。最大産生量は約35〜70時間後に達成された。
【００８０】
実施例４：
Memnoniella echinata FH 2272, DSM 13195の培養液からのメムノペプチド混合物の単離
Memnoniella echinata FH 2272, DSM 13195の発酵完了後、実施例3により得られたファーメンターの培養培地（200 L）を、ろ過補助材（たとえばセライト−登録商標）を加えてろ過し、細胞塊（22 L）を66 Lのメタノールで抽出した。有用な物質を含有するメタノール溶液を約２％のろ過して菌糸体を除去し、真空中で濃縮した。濃縮物を水で希釈し、培養ろ液（180L）とともに、製造用の17 L MCL GEL CHP20Pカラムに適用した。これを水ついで水中60％プロパン−2−オールの勾配で溶出した。カラムの流れ（流速25Ｌ／時）の分画（各10 L）を集め、メムノペプチド含有分画（25％〜30％プロパン−2−オール）を合一した。
【００８１】
真空中で濃縮すると20 Lの褐色溶液が得られた。リン酸カリウム緩衝液でpH 7に平衡化した6 Lの陽イオン交換樹脂、Fractogel（登録商標, EMD SO-3）をカラム（125 mm×500 mm）に充填した。上述の濃縮物20 Lでイオン交換樹脂を負荷したのち、水／メタノール（1：1）10 mMリン酸カリウム緩衝液pH 7, ついで10 mMリン酸カリウム緩衝液pH 7中1M NaClの勾配で溶出した。カラムの流出液、すなわち非結合物質は中性メムノペプチド（49 g）を含有した。カラムからの流速は12Ｌ／時とし、勾配による溶出時の分画を１Ｌずつ集めた。0.75Ｍ NaCl（分画31および32）にメムノペプチドＡが得られた。分画31および32を合わせて、真空中で約500 mLに濃縮した。
【００８２】
実施例５：
ゲルクロマトグラフィーによるメムノペプチドＡの濃縮
実施例4によって得られた生成物8 gを、Fractogel（登録商標）TSK HW−40sを充填した3.9 L容のカラム（幅×高さ=10 cm×50 cm）に適用した。溶出液であるメタノール／水（1：1）を流速20 mL／分でポンプによってカラムに通し、カラムからの流出液を分画（20 mL）ごとに集めた。メムノペプチドＡは主として分画75〜85に見出された。それらを合わせて、真空中でメタノールを除去した。これにより活性化合物の混合物0.9ｇが得られた。
【００８３】
実施例６：
メムノペプチド検出のためのHPLC
以下に記載のシステムは、メムノテルペンたとえば粗混合物または培養液のろ液の純度試験ならびに分離および定量を可能にする。
溶出液：32％アセトニトリル中0.1％トリフルオロ酢酸
カラム：Nucleosil 10018AB 250/4, Macherey−Nagel
流速：10 mL／分
検出：210 nmにおける紫外線吸収
指示した条件において、メムノAは以下の保持時間を有する。
メムノペプチドＡ：7.0分
【００８４】
実施例７：
メムノペプチドＡの精製
実施例5によって単離され、濃縮されたメムノペプチドＡの溶液500 mLを、Nucleosil （登録商標）100−7 Ｃ18ABカラムに適用し、0.05％トリフルオロ酢酸／水中25〜50％アセトニトリルの勾配を用いてクロマトグラフィーに付した。溶出液の流速は50 mL／分、分画サイズは50 mLとした。メムノペプチドＡは分画71〜88に見出された。分画を合わせて0.05％トリフルオロ酢酸中28％アセトニトリルの一定濃度の溶媒で繰り返し精製し、凍結乾燥すると、＞95％の純粋なメムノペプチドC（100 mg）が得られた。
【００８５】
メムノペプチドＡの特性
10μgのメムノペプチドＡを、定沸点塩酸中で加水分解し、アミノ酸アナライザーで検討した。以下の慣用のアミノ酸が見出された。
グルタミン酸              11ｎＭ
プロリン                  22ｎＭ
ヒスチジン                10ｎＭ
ロイシン                  5.6ｎＭ
メチオニンオキシド        5.5ｎＭ
紫外線吸収：λmax 269 nm, 305 nm（肩）
【００８６】
高分解能FABマススペクトルはm/z 1.565.7819 Daに強いＭH+を示し、これは分子量（C75H109N16O18S、モノ同位体）の計算値1565.7827 Daによく一致する。MS/MSフラグメンテーションは式（IVa）に相当する。
【００８７】
0004787449.tif 000017
【００８８】
0004787449.tif 000018