(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者に投与するための、ＭＸ−ＤＴＰＡが共有結合された抗ＣＤ２０抗体を１１１Ｉｎで放射標識する方法であって、
（ｉ）前記抗ＣＤ２０抗体を、１１１Ｉｎを含有する溶液と混合して混合物を形成することと；
（ｉｉ）適切な温度で３０分間、前記混合物をインキュベートして放射標識された前記抗体を形成し、該放射標識された抗体は、さらなる精製なしに前記患者に直接投与できるように９５％を超える放射線取込み率を有することと；
（ｉｉｉ）前記放射標識された抗体を、前記患者に投与するための適切な濃度にまで調合用緩衝液で希釈することと
を備えた方法。
【請求項２】
前記抗ＣＤ２０抗体が、キメラ抗ＣＤ２０抗体を含んでなる請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記抗ＣＤ２０抗体が、ヒトＣＤ２０抗原に特異的なマウスモノクローナル抗体２Ｂ８である請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記１１１Ｉｎを含有する溶液が、前記抗ＣＤ２０抗体と混合される前に、３〜５のｐＨになるように調整される請求項１〜３の何れか１項に記載の方法。
【請求項５】
ｐＨが低金属酢酸ナトリウム溶液で調整される請求項４に記載の方法。
【請求項６】
酢酸ナトリウム溶液が１０〜１０００ｍＭの濃度である請求項５に記載の方法。
【請求項７】
使用される１１１Ｉｎの容積量が、４〜６ｍＣｉを標識時の放射能濃度で除したものである請求項１〜６の何れか１項に記載の方法。
【請求項８】
使用される１１１Ｉｎの容積量が、５．５ｍＣｉを標識時の放射能濃度で除したものである請求項７に記載の方法。
【請求項９】
０．５〜３０ｍｇ／ｍＬの濃度の前記抗ＣＤ２０抗体１ｍＬが、１１１Ｉｎを含有する溶液と混合される請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記調合用緩衝液が、１０ｍＬ〜５０ｍＬの総最終容量になるのに必要な量で加えられる請求項１〜９の何れか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記調合用緩衝液が、生理的食塩水、放射線保護剤、及び未接合キレート物質を含有する請求項１〜１０の何れか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記放射線保護剤が、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、アスコルビン酸塩、アスコルビン酸、フェノール、亜硫酸塩、グルタチオン、システイン、ゲンチジン酸、ニコチン酸、アスコルビン酸パルミテート、ＨＯＰ（：Ｏ）Ｈ２、グリセロール、ホルムアルデヒド・スルホキシル酸ナトリウム、Ｎａ２Ｓ２０５、Ｎａ２Ｓ２０３、及びＳ０２からなる群から選択される請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記放射線保護剤がＨＳＡである請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＨＳＡが１〜２５％（ｗ／ｖ）の濃度である請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＨＳＡの濃度が７．５％（ｗ／ｖ）の濃度である請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記放射線保護剤がアスコルビン酸塩である請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記アスコルビン酸塩が１〜１００ｍｇ／ｍＬである請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記未接合キレート物質がＤＴＰＡ又はＥＤＴＡである請求項１１に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＤＴＰＡの濃度が１〜１００ｍｇ／ｍＬである請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ＭＸ−ＤＴＰＡが共有結合され且つ放射標識された抗ＣＤ２０抗体がその標的細胞に結合する結合パーセントを決定するための結合アッセイであって、
（ｉ）請求項１の方法に従ってＭＸ−ＤＴＰＡが共有結合された抗ＣＤ２０抗体を放射標識し、放射標識された前記抗ＣＤ２０抗体を製造することと；
（ｉｉ）少なくとも１つの放射標識された前記抗ＣＤ２０抗体のアリコットを、少なくとも１つのＣＤ２０陽性細胞のアリコットと混合し、インキュベートすることと；
（ｉｉｉ）対照として、少なくとも１つの工程（ｉｉ）のアリコットと同じ放射標識された前記抗ＣＤ２０抗体のアリコットを、工程（ｉｉ）のＣＤ２０陽性細胞のアリコットと同じ容量の少なくとも１つの希釈緩衝液のアリコットと混合し、インキュベートすることと；
（ｉｖ）遠心によって前記細胞を沈降させることと；
（ｖ）沈降された細胞と対照の上清中の放射能を測定することと；
（ｖｉ）細胞上清中の放射能の量を対照中の放射能の量と比較することと
を備えた結合アッセイ。
【請求項２１】
前記抗ＣＤ２０抗体が、ヒトＣＤ２０抗原に特異的なマウスモノクローナル抗体２Ｂ８である請求項２０に記載の結合アッセイ。
【請求項２２】
前記ＣＤ２０陽性細胞がＳＢ細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ１２０）である請求項２０に記載の結合アッセイ。
【請求項２３】
請求項２０〜２２の何れか１項に記載の結合アッセイであって、さらに
（ｉ）少なくとも１つの放射標識された前記抗ＣＤ２０抗体のアリコットと少なくとも１つのＣＤ２０陰性細胞のアリコットを混合することと；
（ｉｉ）遠心によって前記ＣＤ２０陰性細胞を沈降させることと；
（ｉｉｉ）前記ＣＤ２０陰性の沈降された細胞の上清中の放射能を測定することと；
（ｉｖ）前記ＣＤ２０陰性細胞上清中の放射能の量を、前記ＣＤ２０陽性細胞上清と対照の上清中の放射能の量と比較することと
を備えた結合アッセイ。
【請求項２４】
前記ＣＤ２０陰性細胞がＨＳＢ細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ１２０．１）である請求項２３に記載の結合アッセイ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の背景】
１．発明の分野
本発明は、腫瘍及び腫瘍細胞を治療／画像化するための、治療用抗体の臨床的な効力をテストするための抗体結合アッセイ及び放射標識キット、凍結乾燥された細胞調製物、試薬、並びにプロトコールに関する。具体的には、本発明のキットは、Ｂ細胞表面抗原ＢＰ３５（ＣＤ２０）を標的とすることによって、Ｂ細胞性リンパ腫の治療及び画像化に使用されるであろう放射標識された抗体接合体（ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を作成し、評価するために使用される。
【０００２】
２．技術の背景
各文献又は特許出願が明確且つ個別に参考文献として組み込まれる旨の表示がなされていなくても、全ての文献及び特許出願は、等しく参考文献として本明細書に組み込まれる。
【０００３】
脊椎動物（例えば、ヒト、類人猿、サルなどを含む霊長類）の免疫系は、脊椎動物の宿主に侵入する外来微生物（「抗原」）を正確且つ特異的に認識し、このような外来微生物に特異的に結合し、このような外来微生物を除去／死滅させるように進化した数多くの臓器及び細胞種からなる。他の細胞種とともに、リンパ球は、免疫系にとって不可欠である。リンパ球は、胸腺、脾臓、及び骨髄（成体）で産生され、ヒト（成人）の循環系に存在する総白血球の約３０％を占める。
【０００４】
リンパ球には、Ｔ細胞とＢ細胞という２つの主要な亜集団が存在する。Ｔ細胞は、細胞媒介性免疫に必要とされるのに対して、Ｂ細胞は、抗体の産生（液性免疫）に必要とされる。しかしながら、Ｔ細胞とＢ細胞は、典型的な免疫応答において、相互依存的であると考えられている。抗原提示細胞の表面上に存在する主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）糖タンパク質に結合した抗原の断片に、Ｔ細胞受容体が結合すると、Ｔ細胞が活性化される。このような活性化は、基本的に、Ｂ細胞を分化させ、抗原に対する抗体（免疫グロブリン）を産生するように刺激する生物的伝達物質（インターロイキン）の放出を引き起こす。
【０００５】
宿主内の各Ｂ細胞は、その表面上に異なる抗体を発現しているため、あるＢ細胞は、ある抗原に特異的な抗体を発現するのに対し、別のＢ細胞は異なる抗原に特異的な抗体を発現するであろう。従って、Ｂ細胞は極めて多様であり、この多様性が、免疫系にとって不可欠である。ヒトでは、各Ｂ細胞は、多数の抗体分子（すなわち、約１０７〜１０８）を産生することができる。このような抗体の産生は、最も典型的には、外来抗原が中和されたときに停止する（又は著しく減少する）。しかしながら、時には、ある種のＢ細胞の増殖は、衰えないことがある。このような増殖は、「Ｂ細胞性リンパ腫」と称されるガンをもたらし得る。
【０００６】
Ｔ細胞とＢ細胞は何れも、分化と同定のための「マーカー」として利用できる細胞表面タンパク質を備える。このようなヒトＢ細胞のマーカーの１つが、ヒトＢリンパ球限定分化抗原Ｂｐ３５であり、「ＣＤ２０」と称される。ＣＤ２０は、プレＢ細胞の成長の初期に発現され、形質細胞の分化まで残存する。具体的には、ＣＤ２０分子は、細胞周期の開始と分化に必要とされる活性化プロセス中の工程を制御するかもしれず、通常は、新生物性（腫瘍）Ｂ細胞上に極めて高いレベルで発現されている。ＣＤ２０は、定義上、「正常な」Ｂ細胞と「悪性の」Ｂ細胞、すなわち、その衰えない増殖がＢ細胞性リンパ腫をもたらし得るＢ細胞の両者に存在する。このため、ＣＤ２０表面抗原は、Ｂ細胞性リンパ腫の「ターゲッティング」の候補として役立つ可能性を有している。
【０００７】
基本的に、このようなターゲッティングは、以下のように一般化することができる。例えば、患者に、Ｂ細胞のＣＤ２０表面抗原に特異的な抗体を注射する。これらの抗ＣＤ２０抗体は、（見かけ上）正常なＢ細胞と悪性Ｂ細胞の両者のＣＤ２０細胞表面抗原に特異的に結合する。ＣＤ２０表面抗原に結合した抗ＣＤ２０抗体は、新生物性Ｂ細胞の破壊と喪失をもたらし得る。さらに、腫瘍を破壊する能力を有する化学物質又は放射性標識を抗ＣＤ２０抗体に接合し、このような物質が、例えば、新生物性Ｂ細胞に特異的に「送達される」ようにすることもできる。アプローチにかかわらず、主要な最終目標は、腫瘍を破壊することである。具体的なアプローチは、利用される抗ＣＤ２０抗体によって決せられるため、ＣＤ２０抗原にターゲッティングするのに使用できるアプローチは、かなり多様であり得る。
【０００８】
例えば、ＣＤ２０表面抗原のこのようなターゲッティングの試みが報告されている。報告によれば、Ｂ細胞性リンパ腫患者への連続的な静脈内注入によって、マウスのモノクローナル抗体１１５（抗ＣＤ２０抗体）が投与された。報告によれば、循環する腫瘍細胞を枯渇するには、極めて高レベル（＞２グラム）の１Ｆ５が必要とされ、結果は、「一過性」のものであると記載されている。Ｐｒｅｓｓら、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  １Ｆ５（Ａｎｔｉ−ＣＤ２０）  Ｓｅｒｏｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｂ−Ｃｅｌｌ  Ｌｙｍｐｈｏｍａｓ」Ｂｌｏｏｄ  ６９／２：５８４―５９１（１９８７）。
【０００９】
このアプローチに伴い得る問題点は、非ヒトモノクローナル抗体（例えば、マウスのモノクローナル抗体）は、典型的には、ヒトのエフェクターとしての機能性を欠いている、すなわち、とりわけ、抗体依存性の細胞毒性又はＦｃ受容体を介した食作用を通じて、補体依存性のヒト標的細胞の溶解を媒介することはできない。さらに、非ヒトモノクローナル抗体は、ヒト宿主によって外来タンパク質として認識され得るので、このような外来抗体の反復投与によって、有害な過敏症反応をもたらす免疫応答の誘導が引き起こされ得る。マウスをベースとするモノクローナル抗体の場合、これは、しばしば、ヒト抗マウス抗体応答、又は「ＨＡＭＡ」応答と称される。さらに、これらの「外来」抗体は、宿主の免疫系によって攻撃され得ることがあり、実際には、それらの標的部位に到達する前に中和されてしまう。
【００１０】
リンパ球とリンパ腫細胞は、本来的に、放射線療法に感受性がある。それ故、Ｂ細胞性の悪性腫瘍は、幾つかの理由で、放射免疫療法（ＲＩＴ）の魅力的な目標である。放射標識された抗体の電離放射線を局所的に照射することにより、抗原に結合した抗体の近くに存在する、標的抗原（例えば、ＣＤ２０）を有する又は有しない細胞を死滅させ得る。透過性放射線、すなわち、β放出体は、巨大な腫瘍又は多血管新生腫瘍において、抗体への接近が制限されるという問題を回避し得る。それ故、必要とされる抗体の総量を減らすことができる。放射性核種は、細胞の修復機構によって、細胞を生存し続けさせることができない程度まで、細胞のＤＮＡを損傷することができる放射性粒子を放出する。それ故、標的細胞が腫瘍であれば、放射性標識は、腫瘍細胞を有益に死滅させる。放射標識された抗体には、当然、患者（すなわち、骨髄移植があり得る）と医療従事者（すなわち、放射能を扱うときに、高度の注意が必要）の両者にとって、用心が必要とされ得る放射性物質の使用が含まれる。
【００１１】
それ故、マウスのモノクローナル抗体がＢ細胞性の疾患を治療する能力を改善するアプローチは、標識又は毒素が、腫瘍部位に局在化するように抗体に放射性標識を接合することであった。毒素（すなわち、ドキソルビシン又はマイトマイシンＣのような化学療法剤）も、抗体に接合されてきた。例えば、ＰＣＴ公開された出願ＷＯ９２／０７４６６（１９９２年５月１４日公開）を参照。
【００１２】
「キメラ」抗体、すなわち、２以上の異なる種（例えば、マウスとヒト）由来の部分を備えた抗体が、「接合」抗体の代替物として開発されてきた。マウス／ヒトのキメラ抗体が作成され、元のマウス抗体の結合特性と、ヒトの定常領域が有するエフェクター機能を発揮することが示されている。例えば、Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特許第４，８１６，５６７号；  Ｓｈｏｅｍａｋｅｒら、米国特許第４，９７８，７４５号；  Ｂｅａｖｅｒｓら、米国特許第４，９７５，３６９号；  及び  Ｂｏｓｓら、米国特許第４，８１６，３９７号を参照（これらは、全て、参考文献として本明細書に組み込まれる）。一般的には、これらのキメラ抗体は、既存のマウスハイブリドーマから抽出されたＤＮＡからゲノム遺伝子ライブラリーを調製することによって構築される。Ｎｉｓｈｉｍｕｒａら、（１９８７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４７：  ９９９。続いて、正しい抗体断片の再配列パターンを示している、重鎖と軽鎖の両者からの可変領域遺伝子を該ライブラリーからスクリーニングする。次に、適切な重鎖又は軽鎖ヒト定常領域遺伝子のクローニングされたカセットを含有する発現ベクター中に、クローニングした前記可変領域遺伝子を連結する。続いて、選択した細胞株、通常はマウスの骨髄腫株の中でキメラ遺伝子を発現させる。
【００１３】
例えば、Ｌｉｕ，  Ａ．Ｙらの「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｍｏｕｓｅ−Ｈｕｍａｎ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｏ  ＣＤ２０  ｗｉｔｈ  Ｐｏｔｅｎｔ  Ｆｃ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ」，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎ．  １３９／１０：３５２１−３５２６  （１９８７）は、ＣＤ２０抗原に対して誘導されたマウス／ヒトキメラ抗体を記載している。ＰＣＴ公開番号第ＷＯ  ８８／０４９３６号も参照。しかしながら、前記参考文献には、Ｂ細胞性疾患の治療にＬｉｕのキメラ抗体を使用できること、その効力、又は実用性に関する情報が全く提供されていない。
【００１４】
インビトロ機能アッセイ（例えば、補体依存性溶解（ＣＤＣ）；抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）など）は、本来的に、ある抗体が、特異的な抗原を発現している標的細胞をインビボで破壊又は除去する能力を予測することができないことに留意しなければならない。例えば、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，  Ｒ．Ｄらの「Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｍｏｕｓｅ−ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉ−ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｈａｔ  ｍｅｄｉａｔｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ａｎｔｉ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ」  Ｈｕｍ．  Ａｎｔｉｂｏｄ．  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，  ２：８４−９３  （１９９１）  （ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｍｏｕｓｅ−ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｈａｖｉｎｇ  ｕｎｄｅｔｅｃｔａｂｌｅ  ＡＤＣＣ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）を参照。それ故、抗体の潜在的な治療的効力は、インビボでの実験操作によらなければ、真に評価することはできない。
【００１５】
この目的で、同時係属出願第０８／４７５，８１３，  ０８／４７５，８１５及び０８／４７８，９６７号（その全体が参考文献として本明細書に組み込まれる）は、治療用抗体の投与前に、Ｂ細胞性リンパ腫を診断用に「画像化」するための放射標識された抗ＣＤ２０接合体を開示している。「Ｉｎ２Ｂ８」接合体は、二価のキレート物質、すなわち、１−イソチオシアナートベンジル−３−メチル−ＤＴＰＡと１−メチル−３−イソチオサナートベンジル−ＤＴＰＡが１：１で混合されたＭＸ−ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン五酢酸）を介して、インジウム［１１１］（１１１Ｉｎ）に付着された、ヒトＣＤ２０抗原に特異的なマウスモノクローナル抗体２Ｂ８を有する。インジウム［１１１］は、γ放射線を放出し、画像化剤としての重要な用途があるので、診断用の放射性核種として選択される。
【００１６】
キレート物質及びキレート物質接合体に関する特許が、本分野において公知である。例えば、Ｇａｎｓｏｗの米国特許第４，８３１，１７５号は、多置換されたジエチレントリアミン五酢酸キレート及び該キレートを含有するタンパク質接合体、並びにそれらの調製法に関する。Ｇａｎｓｏｗの米国特許第５，０９９，０６９、５，２４６，６９２、５，２８６，８５０、及び５，１２４，４７１号も、多置換されたＤＴＰＡキレートに関する。これらの特許は、その全体が本明細書に組み込まれる。
【００１７】
出願第０８／４７５，８１３、０８／４７５，８１５、及び０８／４７８，９６７号で、キレート生成を促進するために使用された特別な二価のキレート物質は、三価の金属に高い親和性を有しており、腫瘍対非腫瘍比が増加し、骨による摂取が減少し、且つ標的部位、すなわちＢ細胞性リンパ腫部位における放射性核種のインビボでの保持が大きいので選択された。しかしながら、他の二価のキレート物質も本分野において公知であり、同じく、腫瘍の治療において有益であり得る。
【００１８】
出願第０８／４７５，８１３、０８／４７５，８１５、及び０８／４７８，９６７号には、Ｂ細胞性リンパ腫及び腫瘍細胞を標的とし、破壊するための放射標識された治療用抗体も開示されている。特に、Ｙ２Ｂ８接合体は、同じ二価のキレート物質を介して、イットリウム［９０］（９０Ｙ）に付着された同じ抗ヒトＣＤ２０マウスモノクローナル抗体２Ｂ８を含んでいる。この放射性核種は、幾つかの理由で、治療用に選択された。６４時間という９０Ｙの半減期は、腫瘍による抗体の蓄積を可能とするのに十分長く、例えば１３１Ｉとは異なり、その崩壊中にγ線の放射を全く伴わず、細胞の直径の１００〜１０００の範囲を有する純粋な高エネルギーのβ放出体である。最小限の量の透過性放射線によって、９０Ｙ標識された抗体の外来投与が可能となる。さらに、細胞を死滅させるには、標識された抗体の取り込みは必要とされず、電離放射線を局所的に放出すれば、標的抗原を欠いた隣接する腫瘍細胞にとっても致死的なはずである。
【００１９】
放射性核種９０Ｙは、同じ二価のキレート物質分子であるＭＸ−ＤＴＰＡを用いて２Ｂ８抗体に付着されたので、Ｙ２Ｂ８接合体は、上記したのと同じ利点（例えば、標的部位（腫瘍）での放射性核種の保持の増加）を有している。しかしながら、１１１Ｉｎとは異なり、γ線の放射を伴わないために、画像化する目的で使用することはできない。このため、腫瘍を縮小するために、治療用のキメラ抗体又は９０Ｙ標識抗体を投与する前及び／又は後に、腫瘍の位置及び相対的なサイズを決定するために、１１１Ｉｎのような診断用の「画像化」放射性核種を使用することができる。さらに、インジウム標識された抗体は、線量的な評価を行うことも可能にする。
【００２０】
意図する抗体の用途に応じて、すなわち、診断用又は治療用の試薬として、他の放射性標識が本分野で公知であり、類似の目的のために使用されている。例えば、臨床診断で使用されている放射性核種には、１１１Ｉｎのほか、１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、９９Ｔｃ、６７Ｇａが含まれる。標的化された免疫療法で使用し得るために、抗体も様々な放射性核種で標識されてきた（Ｐｅｉｒｅｒｓｚ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８７）  Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ６５：  １１１  １２５）。これらの放射性核種には、９０Ｙのほか、１８８Ｒｅと１８６Ｒｅが含まれ、より少ない程度で、１９９Ａｕと６７Ｃｕが含まれる。Ｉ−［１３１］も、治療目的で使用されている。米国特許第５，４６０，７８５号は、このような放射性同位体を列記しており、本明細書に参考文献として組み込まれる。
【００２１】
同時係属出願第０８／４７５，８１３，  ０８／４７５，８１５及び０８／４７８，９６７号に報告されているように、未標識のキメラ抗ＣＤ２０抗体のみならず、放射標識されたＹ２Ｂ８接合体の投与も、Ｂ細胞リンパ球芽性腫瘍を有するマウスで、顕著な腫瘍な減少をもたらした。さらに、そこで報告されているヒトの臨床試験は、キメラ抗ＣＤ２０抗体を注入されたリンパ腫患者で、顕著なＢ細胞の喪失を示した。実際に、キメラ２Ｂ８は、最近、Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）の名で、本邦で最初にＦＤＡによって承認された抗ガン性モノクローナル抗体であると伝えられた。このように、少なくとも１つのキメラ抗ＣＤ２０抗体が、Ｂ細胞性リンパ腫の治療に効力を有することが実証されている。
【００２２】
さらに、米国特許出願第０８／４７５，８１３号（本明細書に参考文献として組み込まれる）は、Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）（インジウムとイットリウムの両者で、又はインジウム若しくはイットリウムの何れかで標識された、キメラ抗ＣＤ２０マウスモノクローナル抗体）の連続投与を開示している。これらの併用療法（ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｒｅｇｉｍｅｎ）に使用される放射標識された抗体はマウスの抗体であるが、最初にキメラ抗ＣＤ２０抗体で処置することにより、Ｂ細胞の集団が十分に消失するため、ＨＡＭＡ応答が減少し、それにより、併用治療及び診断法が促進される。
【００２３】
このように、併用免疫療法において、マウスの抗体には、診断試薬としての用途を見出し得るであろう。さらに、米国出願第０８／４７５，８１３号には、治療的有効量のイットリウム標識された抗ＣＤ２０抗体に続く、Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）の投与は、（ａ）キメラ抗ＣＤ２０抗体によって除去されない任意の残存する末梢血Ｂ細胞を除去し、（ｂ）リンパ節からＢ細胞の消失を開始し、又は（ｃ）他の組織からＢ細胞の消失を開始するのに十分であることが示された。
【００２４】
このため、ガンの治療用抗体への放射標識の接合は、このような抗体の潜在的な治療的効力を評価し、治療の進行をモニターするための診断用試薬を作成し、キメラ抗体の最初の腫瘍殺傷能力を増大させるために使用し得るさらなる治療用試薬を考案するために使用し得る価値ある臨床用ツールを提供する。非ホジキンリンパ腫の治療で抗ＣＤ２０抗体の有効性が証明され、放射能に対するリンパ球の感受性が知られているので、放射性標識で容易に修飾することができ、臨床の現場で患者に直接投与し得るこのような治療用抗体が、キットの形で商業的に入手できるようになれば、非常に有用であろう。
【００２５】
抗体を放射標識するための方法及び試薬が多数存在するが、従来技術に欠けているのは、これらの試薬を容易に製造し、放射性標識の顕著な崩壊又は放射性標識による抗体の顕著な破壊が生じる前に患者に投与できるように、臨床の現場にこれらの試薬を置くための便利な手段である。この価値ある技術を商業化するためのこのような便利な手段がないのは、幾つかの公知の標識プロトコールによって実証されたように、取り込み効率が不良であり、放射標識操作後に試薬をカラム精製する必要があることによるものであり得る。このようなキットの開発の遅れは、これまで、その後の精製が不要な効率的に標識された生成物を作るために使用できる純粋な市販の放射性同位体が入手しにくかったことにもよるであろう。あるいは、一般的に、このようなキットが入手できない理由は、おそらく、ヒトの患者のリンパ腫の治療でＴｉｔｕｘａｎ（登録商標）が達成した承認又は効力の何れかを達成することができる抗体が実際に存在しなかったことである。
【００２６】
例えば、米国特許出願第４，６３６，３８０号（参考文献として本明細書に組み込まれる）に記載されているように、科学業界では、放射性薬物を臨床的に利用できるようにするためには、長く、退屈な分離及び精製過程を経なければならないと一般に考えられている。実際に、患者に遊離の放射性標識を注射することは望ましくないであろう。さらなる精製工程が必要であるために、とりわけ、彼ら自身の治療剤を精製するための装置も時間も持たない医師にとっては、臨床の現場で抗体を放射標識する過程は不可能なものとなる。
【００２７】
さらに、放射標識されたタンパク質、特に、タンパク質の近くに結合される時間が長くなるほど、抗体に損傷を引き起こす傾向がある９０Ｙのような放射線分解性の同位体で標識されたタンパク質は、本来的に不安定であり得る。続いて、このような放射線分解によって、放射性標識の喪失及び／又は標的抗原への結合の減少によって、治療の効率が不確実になり、変性したタンパク質に対する望ましくない免疫応答が引き起こされるかもしれない。しかも、現場で抗体を標識し、精製するための施設がなければ、臨床医は、既に標識された治療用抗体を注文するか、あるいは、関連施設のように現場とは別の場所で標識し、標識後に患者に投与するために輸送するほかない。このような操作は全て、標識と投与の間に貴重な時間を費やすことによって、治療剤が不安定となる原因となり、臨床の現場での放射性標識キットの有用性を実際に減少させる。
【００２８】
他の者は、抗体の分離精製工程がなくて済むほど十分に熟達した抗体放射標識キットの開発を試みたが不成功に終わっている。例えば、Ｃｙｔｏｇｅｎは、最近、腫瘍関連糖タンパク質ＴＡＧ−７２に対するマウスモノクローナル抗体を放射標識するための市販のキットを発売した。しかしながら、Ｃｙｔｏｇｅｎの抗体は、さらなる濾過工程によって、その後除去しなければならない粒状物が保存中に発生する傾向があるために、キットに適用するのには、特に適していない。さらに、Ｃｙｔｏｇｅｎの抗体は、ＨＡＭＡ応答によって、患者に有害な反応を引き起こした。
【００２９】
別の者は、精製工程が別個に必要とされない点で、キットフォーマットに適するであろう放射標識プロトコールを開発したと主張している（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８７）  Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｂａｔｃｈ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＴＰＡ−ｌａｂｅｌｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｋｉｔｓ  ｆｏｒ  ｒｏｕｔｉｎｅ  ｕｓｅ  ｉｎ  １１１Ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｓｃｉｎｔｏｇｒａｐｈｙ．  Ｎｕｃ．  Ｍｅｄ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  ８：  ３４７−３５６；  Ｃｈｉｎｏｌ  ａｎｄ  Ｈｎａｔｏｗｉｃｈ  （１９８７）  Ｇｅｎｅｒａｔｏｒ−ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｙｔｔｒｉｕｍ−［９０］  ｆｏｒ  ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．  Ｊ．  Ｎｕｃｌ．  Ｍｅｄ．  ２８（９）：  １４６５−１４７０）。しかしながら、このようなプロトコールは、少なくとも９５％の取り込み効率をもたらす、本発明者らが本明細書に開示したプロトコールを用いて達成した取り込みレベルを達成することができなかった。このようなレベルの取り込みは、放射能の取り込みが低いために、患者に遊離の標識が注射されない点で、このようなレベルの取り込みによって、安全性の増加という利点がさらに得られる。
【００３０】
本発明のキットに含まれるプロトコールによれば、約半時間、又は標識によっては、僅か５分で実施し得る迅速な標識が可能となる。さらに、本発明のキットプロトコールは、９５％以上の標識効率を有するため、さらなる精製が不要である。さらなる精製が不要であることによって、抗体を標識した治療目的のために、放射性標識の半減期と抗体の完全性が保たれる。
【００３１】
本出願は、再現性のある、確実、且つ便利な態様で、診断用及び治療用抗体を放射標識し、患者に投与し得る便利なキット及び方法を開示する。本発明のキットによって、抗体を放射標識する工程は、面倒が省け、苦労の要らない標準化された工程となり、患者の治療用プロトコールを著しく容易にする。本キットは、治療剤又は診断剤を標識し、投与するための至適パラメーターが決定されて、商品のコストが減少する点で、従来技術に比べて有利である。本明細書に記載したキットは、特定の標識の至適パラメーターを与えるので、特定の標識に対してデザインされたキットを使用すれば、すなわち、ある標識に対して不適切なキットが使用されたときに起こる分解（ｃａｎｎｉｂａｌｉｚａｔｉｏｎ）が最小になるであろう。このような分解の回避によって、最適な標識効率がもたらされる。さらに、無菌、発熱物質検査、及び標識後の試薬の精製が不要となるので、各キットとともに含まれるプロトコール及び無菌で、発熱物質が存在しない成分によって、工程がさらに扱いやすいものとなる。
【００３２】
【発明の概要】
本発明は、患者への投与の前に、診断用又は治療用抗体を放射標識するためのキットであって、少なくとも、（１）キレート物質が結合された抗体を含有するバイアルと、（２）放射標識された抗体を安定化し、投与するための調合用緩衝液（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ）を含有するバイアルと、（３）抗体を放射標識するための説明書とを備え、前記キットの説明書に従って、前記バイアル成分が十分な純度と活性の放射標識と混合されたときに、前記患者への投与の前に前記標識された抗体のさらなる精製を要しない量と濃度で前記バイアル成分が与えられているキットを包含する。さらに、前記キットの説明書に従い、且つ十分な純度と活性の放射性同位体で標識したときには、このような同位体の取り込みは、９５％を超えるレベル、さらには９８％以上に達し得る。
【００３３】
前記キットに含まれる抗体は、最も好ましくは抗ＣＤ２０抗体である。前記抗体は、二価のキレート物質に結合された形態で与えられる。好ましくは、前記抗体は、ＭＸ−ＤＴＰＡに接合されるが、フェニル又はベンジルが接合されたＤＴＰＡ、シクロヘキシル−ＤＴＰＡ、ＥＤＴＡ誘導体、及びＤＯＴＡのような他のキレート物質も使用し得る。本発明のキレート物質は、少なくとも二価である任意のキレート物質、すなわち、少なくとも２つの結合部位（金属イオンをキレートする少なくとも１つの部位とタンパク質リガンドに結合するための少なくとも１つの部位）を有する任意のキレート物質であり得る。
【００３４】
使用する抗体に応じて、接合抗体は、典型的には、０．５〜３０ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは２ｍｇ／ｍＬの濃度で与えられる。接合抗体の容量は、放射性標識に応じた至適標識に必要とされる濃度及び量に依存するであろう。しかしながら、前記接合抗体は、全容量が無菌の注射器と無菌手法を用いて反応バイアルに添加されるであろう容量と濃度で与えられるべきである。これによって、再現性が増し、使用が容易になるであろう。本明細書に開示されたキットの試薬は全て無菌で、且つ発熱物質を含まず、抗体検査から直接投与に進む上で、平易且つ迅速なように特別にデザインされている。幾つかの標識を用いれば、標識効率を調べる必要もないかもしれない。
【００３５】
前記キットの特に有用な成分は、放射線分解の影響に対して安定化し、前記放射標識された接合抗体を患者に投与するための調合用緩衝液である。調合用緩衝液は、標識された抗体のための希釈剤（ｄｉｌｕｅｎｔ）と投与緩衝液の両者の役割を果たす薬学的に許容される担体である。患者に治療用又は診断用抗体を投与するために、任意の薬学的に許容される希釈剤を使用し得るが、本発明の調合用緩衝液は、とりわけ、放射標識された抗体を投与するのに適している。
【００３６】
例えば、本発明の調合用緩衝液は、イトッリウムによる放射線分解と、これより程度は低いが、インジウムによる放射線分解を最小化する、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）又はアスコルビン酸塩のような放射線保護剤（ｒａｄｉｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）を含む。本分野では、他の放射線保護剤、すなわちフリーラジカルスカベンジャー（アスコルビン酸、フェノール、亜硫酸塩、グルタチオン、システイン、ゲンチジン酸、ニコチン酸、アスコルビン酸パルミテート、ＨＯＰ（：Ｏ）Ｈ２、グリセロール、ホルムアルデヒド・スルホキシル酸ナトリウム、Ｎａ２Ｓ２０５、Ｎａ２Ｓ２０３、及びＳ０２など）が公知であり、同様に、本発明の調合用緩衝液に使用することができる。
【００３７】
放射線保護剤は、一般的には、放射線分解から抗体を保護するために調合用緩衝液中で用いられているが、反応緩衝液中にも放射線保護剤を含ませることによって、さらなる保護を与えることも可能であり得ることに留意しなければならない。以前は、標識工程を妨害するであろう金属の存在のために、すなわちＨＳＡを用いてこのようなことは行われてこなかった。しかしながら、ＨＳＡを反応緩衝液にも含有せしめ得るように、キレート樹脂を用いてＨＳＡを「浄化する」ことが可能かもしれない。アスコルビン酸塩又は他の放射線保護剤も、混在する金属を除去するための処置が必要かもしれない。
【００３８】
本発明の調合用緩衝液は、過剰な未接合キレート物質も含む。未接合キレート物質を含有させる目的は、該キレート物質が、患者の中に存在するタンパク質に結合していない全ての放射標識を除去し、放射標識を排出することによって、患者の骨による、「骨に集まる（ｂｏｎｅ−ｓｅｅｋｉｎｇ）」同位体、すなわち９０Ｙの取り込みを減少させることである。例えば、前記キットの抗体をＤＴＰＡキレート物質に接合すると、過剰なＤＴＰＡ又は他の任意のキレート物質を前記調合用緩衝液に含有させ得る。前記調合用緩衝液も、好ましくは、全内容物を反応バイアルに移せる容量で与えられる。正確な容量を測定して移し替える必要がないので、上述のように、これによって、使用の容易さと再現性が上昇する。
【００３９】
好ましい調合用緩衝液は、リン酸緩衝化又は生理的食塩水、ヒト血清アルブミン、及びＤＴＰＡを含む。前記ヒト血清アルブミンは、好ましくは、約１〜２５％（ｗ／ｖ）の濃度であり、より好ましくは、約７．５％（ｗ／ｖ）の濃度である。ＤＴＰＡの濃度は、好ましくは、約１ｍＭである。アスコルビン酸塩は、ヒト血清アルブミンの代替物として使用することができ、患者の安全を損なわずに、さらに幅広い範囲の濃度を使用し得るが、典型的には、約１〜１００ｍｇ／ｍＬの濃度で使用される。
【００４０】
放射標識キットの抗体は、本発明の方法に従って、二価のキレート物質を介して、選択した放射性同位体で容易に標識される。この点でさらに簡易にするために、本発明のキットは、放射性同位体溶液のｐＨを調整するための緩衝液を含有するバイアルと、標識を行い、続いて、調合用緩衝液中に最終的な放射標識された抗体を再懸濁するための無菌のガラス反応バイアルを含んでもよい。
【００４１】
典型的には、１０ｍＬの反応バイアルで十分であるが、５〜２０ｍＬを入れることができるバイアルも使用し得る。前記緩衝液は、好ましくは１０〜１０００ｍＭ、最も好ましくは５０ｍＭの濃度の低金属の酢酸ナトリウム溶液である。
【００４２】
本発明のあるキットは、ＭＸ−ＤＴＰＡ接合抗体２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡを含む。２Ｂ８は、リンパ腫患者に投与したときに、Ｂ細胞を消失せしめることが示された抗ＣＤ２０抗体である。しかしながら、他の抗ＣＤ２０抗体又はＤＴＰＡ若しくは他の多価のキレート物質に接合された他の任意の抗体の放射標識に対して、本発明の放射標識キットを最適化し得ることが、当業者には明らかなはずである。本発明の好ましいキットは、少なくとも（１）溶液中の、又は凍結乾燥された（再構成を要する）ＭＸ−ＤＴＰＡが接合された２Ｂ８抗体を含有するバイアルと；（２）患者に放射標識された抗体を投与するための調合用緩衝液を含有するバイアルとを含み得る。好ましいキットは、（３）同位体のｐＨを調整するための緩衝液、及び（４）反応バイアルも含有するであろう。あるいは、より好ましくは、前記緩衝液を反応バイアル中に与えることにより、緩衝液を測定し、移し替える工程が省略され、キット成分の簡易さ、一定性、及び無菌性が増大する。しかしながら、まず同位体バイアルに緩衝液を加えた後、緩衝化された同位体が反応バイアルに移されるという他の態様も想定される。この場合には、前記反応バイアルには、必要な抗体容量を与えることができるであろう。あるいは、同位体／緩衝液バイアルは、すなわち、給者のバイアルに直接添加した抗体接合体を収容するのに十分な大きさを有するように作成してもよい。これによって、反応バイアルが不要となるであろう。
【００４３】
上述のように、反応バイアル自体が、必要な容量の接合抗体（すなわち、１１１Ｉｎ及び９０Ｙの場合、それぞれ１又は１．５ｍＬ）を含有するという別の好ましいキットの配置も包含される。前記抗体は、特定の所望の同位体に応じた、適切な放射標識ｐＨ（すなわち、１１１Ｉｎの場合ｐＨ３〜６、９０Ｙの場合ｐＨ３〜５）を与える緩衝液中に与えられ得る。同位体に応じて、異なる緩衝液を使用し得る（すなわち、９０Ｙの場合酢酸ナトリウム、１１１Ｉｎの場合クエン酸ナトリウム）。緩衝液のｐＨと組成も、標識すべき結合リガンドの性状に応じて、変化し得る（すなわち、標識するペプチドは、３未満のｐＨの使用を許容し得る）。続いて、原則的には、調合用緩衝液と同様に、前記同位体は直接反応バイアルに移されるであろう。キットの使用が２つの移し替え工程に限定されることによって、再現性と簡便さがさらに増大し、キット成分の操作中に、無菌状態が汚染される機会をさらに減少させるであろう。
【００４４】
本発明の放射標識キットは、さらに、放射性同位体のバイアルを備えてもよく、あるいは放射性同位体は、適切な業者から別個に注文してもよい。本発明の好ましい放射性同位体は、ＨＣｌ中の塩化１１１インジウム及び塩化９０イットリウムであるが、開示した方法は、これらの同位体に限定されるものではない。
【００４５】
すなわち、米国特許第４，６３４，５８６，  ５，４６０，７８５、及び５，７６６，５７１号（参考文献として本明細書に組み込まれる）に記載されているように、画像化に応用されてきた他の放射性核種が、本分野において公知である。これらの目的又はその他の目的に適した他の放射性同位体、すなわち、抗体を接合するために使用したキレート物質に応じてα放出体を使用し得るが、Ｂ細胞腫瘍を画像化するには、インジウム−［１１１］が特に有利であり、放射治療剤としては、９０Ｙのようなβ放出体が特に有用である。
【００４６】
米国特許出願第０８／４７５，８１３号に開示されている併用治療法の効果が証明されたのであれば、さらなるキットの態様は、放射標識された抗ＣＤ２０抗体の前又は後に投与すべきキメラ抗体、すなわちＲｉｔｕｘａｎ（登録商標）のバイアルを別に含んでもよいであろう。放射標識された抗体の前に、キメラ抗体を投与するときには、マウスの抗ＣＤ２０抗体の投与に応じて、一般的に起こり得るＨＡＭＡ応答が著しく減少するかもしれず、それによって、放射標識されたマウスの抗体の治療的な利用性が増大する。さらに、循環するＢ細胞を除去するためにキメラ抗ＣＤ２０を用いるときには、その後に、１１１Ｉｎで標識された抗体で得られる診断画像がずっと明瞭となり得る。
【００４７】
併用治療法において、診断用の放射標識された抗体と治療用の放射標識された抗体の両者を一緒に使用し得ることも明らかなはずである。この点、診断用抗体は、治療用抗体の前又は後の何れかに、治療前又は後に腫瘍のサイズを可視化するために使用し得る。この場合には、本発明のキットは、使用すべき特定の放射性同位体で放射標識されている抗体の至適ｐＨ要求性に従って特別に調合された別の、おそらくは色分けされた緩衝液のバイアルを含み得る。このような系によって、各標識に対して適切な緩衝液が使用されることが保証され、臨床医は、あたかも２つのキットを購入したかのように、２つの抗体を同じ容易さで放射標識することが可能となろう。このようなキットは、事実上、２つの放射標識キットの成分を１つにする。
【００４８】
本発明の放射標識キットの成分は、抗体投与の前に、無菌性が容易に維持され、さらなる緩衝液又は溶媒がほとんど不要であるように、適切な濃度とｐＨで与えられる。しかしながら、試薬の中には、現場で調製し、無菌化し、無菌性について検査し得るものもあることが、当業者には明らかなはずである。このように、消費者の予算と選択に応じて、本発明のキットの変形が想定される。
【００４９】
本発明の放射標識キットは、患者に投与するためのキレート物質が接合された抗体（ｃｈｅｌａｔｏｒ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）を放射標識する方法で使用され得る。本発明によれば、このような方法は、一般的には、（１）キレート物質が接合された抗体を、放射性同位体を含有する溶液と混合することと；（２）適切な温度で、適切な時間、混合物をインキュベートすることと；（３）前記放射標識された抗体が、さらなる精製なしに患者に直接投与できるように、適切な濃度になるまで、前記標識された抗体を調合用緩衝液で希釈することとを備える。
【００５０】
最も好ましくは、前記抗体は、抗ＣＤ２０抗体であり、とりわけ、抗ＣＤ２０抗体は２Ｂ８であり得る。前記抗体は、任意の適切なキレート物質、すなわち、ＭＸ−ＤＴＰＡ、ＣＨＸ−ＤＴＰＡ、フェニル−又はベンジル−ＤＴＰＡ、ＤＯＴＡ、ＥＤＴＡ誘導体などに接合され得る。ＭＸ−ＤＴＰＡが好ましい。抗体の接合を実施する方法は、本分野において公知である（Ｋｏｚａｋ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８９）；  Ｍｉｒｚａｄｅｈ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９０），  Ｂｒａｃｈｂｉｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８６））。
【００５１】
本発明者らは、キレート物質が接合された抗体を放射標識する前記方法は、キレート物質が接合された抗体と放射標識を混合する前に、放射標識を含有する溶液が、約３．０〜６．０、さらに好ましくは４．２のｐＨに調整されると最も効率がよいことを見出した。ｐＨを調整するには、低金属の酢酸ナトリウムが特に好ましいが、他の緩衝液を使用してもよい。好ましくは、酢酸ナトリウムの濃度は、約１０〜１０００ｍＭの濃度であり、より好ましくは５０ｍＭの濃度である。
【００５２】
放射性同位体が、塩化１１１インジウムの場合には、単回投与量を調製するために使用すべき１１１Ｉｎの容積量（ｖｏｌｕｍｅ  ｑｕａｎｔｉｔｙ）は、典型的には、約５．５ｍＣｉを標識時の放射能濃度で除したものである。患者に投与するためには、１１１Ｉｎの典型的な診断用線量は、約２〜１０ｍＣｉである。ｐＨを調整するために使用される酢酸ナトリウムの量は、酢酸ナトリウムの濃度と同位体キャリアー溶液に応じて変わり、それ故、極めて幅が広いものであり得る。酢酸ナトリウムの濃度が５０ｍＭであるときには、ｐＨを調整するのに必要とされる量は、典型的には、使用される塩化１１１インジウムの容積量の約１．２倍であるが、さらに多い容量を使用してもよい。ＨＣｌに対する酢酸ナトリウムの比率が重要なものであり、使用する酢酸ナトリウムの量は緩衝液中のＨＣｌの量と濃度に応じて変化するであろうということを理解しなければならない。続いて、約２ｍｇ／ｍＬの濃度のキレート物質が接合された抗体約１ｍＬを、放射標識酢酸塩溶液と混合し、この混合物を約３０分間、又は抗体の最適な標識を達成するのに十分な時間、インキュベートする。このような時間は、約３０秒から約６０分の範囲であり得る。続いて、約１０ｍＬの総最終用量を達成するのに必要な量の調合用緩衝液を加える。
【００５３】
抗体を標識するのに必要な最適な時間は、用いた抗体、特定の放射標識、及び特定の接合体に応じて変化し得る。放射標識に割り当てられる時間の最適化に内在する要因は、標識すべき試薬の抗体に対するキレート物質の比率である。例えば、抗体に対するキレート物質の比率は、治療的に有用なレベルの取り込み（すなわち、放射性同位体に応じて、９０〜９５％）が得られる程度に十分高くなければならないが、抗体の構造的な完全さ又は免疫的な反応性が損なわれるほど高すぎてもいけない。これには、接合されたキレート物質のレベルをより低く、且つ標識時間をより長くし得る場合がある、ある種の釣り合いをとるための工程が必要である。
【００５４】
例えば、２Ｂ８とＭＸ−ＤＴＰＡの場合、抗体に対するキレート物質のモル比が僅かに約１ 1/2〜１モル比であれば、９０Ｙでは５分以内で、１１１Ｉｎでは約３０分で標識が完了し、所望のレベルの放射能の取り込みが達成され得ることが発見された。所望のレベルの放射能の取り込みが達成されるので、それ故、抗体に対するキレート物質の比率を増加させる必要はなかった。また、抗体の免疫反応性をもたらし得るので、接合されるキレート物質の量を増やすことは有利ではなかった。このようなパラメーターは、本発明に記載されているようなキットをデザインするために、他の抗体についても経験的に決定することができる。
【００５５】
放射性同位体が塩化９０イットリウムであるときには、単回投与量を調製するのに使用される塩化９０イットリウムの容積量は、典型的には、標識時の放射能濃度で約１０〜５０ｍＣｉを除したものにわたり、好ましくは約４５ｍＣｉを除したものである。ｐＨを調整するために使用される酢酸ナトリウムの量は、酢酸ナトリウムの濃度と同位体キャリアーの濃度に応じて変わり、それ故、非常に幅広いものであり得る。酢酸ナトリウムの濃度が５０ｍＭであるときには、９０Ｙは５０ｍＭのＨＣｌ中に与えられ、ｐＨを調整するのに必要な量は、典型的には、使用される塩化９０イットリウムの容積量の約１．２倍である。続いて、約２ｍｇ／ｍＬの濃度のキレート物質が接合された抗体約１．５ｍＬを、放射標識酢酸塩溶液と混合し、約５分間、又は抗体の最適な標識を達成するのに十分な時間、インキュベートする。このような時間は、約３０秒から約６０分の範囲であり得る。約１０ｍＬの総最終容量を達成するのに必要な量の調合用緩衝液を加える。
【００５６】
好ましくは、本発明の放射標識法は、本明細書に記載された放射標識キットを用いて行われる。しかしながら、好ましい成分と条件は、本発明の方法を実施するための許容されるガイドラインにすぎず、適当な最適化によって、幾分変化させてもよいことが、当業者には明らかなはずである。好ましい条件とは異なるが、該方法の目的をなお達し得る条件は、本発明の範囲にあると考えられる。
【００５７】
本発明の放射標識キットは、放射標識後に、抗体の結合親和性を簡便に確認するのに適した試薬とともに供給してもよい。このような場合には、本発明のキットは、患者に該抗体を投与する前に、その標的細胞への放射標識された抗体の結合のパーセントを決定するためにも使用され得る。本発明者らは、開示されている本結合アッセイキットは、精製された抗原が入手できない任意の抗体の親和性を一般的に調べるのに有用であり得ることも見出した。従って、前記結合アッセイの成分は、独立したキットとして販売してもよい。
【００５８】
一般的には、結合アッセイ及び放射標識キットは、（１）少なくとも１つの、前記キット中の抗体によって認識される抗原を発現する凍結乾燥された細胞のバイアル；（２）キレート物質が接合された抗体を含有するバイアル；（３）調合用緩衝液を含有するバイアル；及び（４）抗体を放射標識するための説明書を備え、前記放射標識された抗体は、その後の精製を必要とせずに、患者に直接投与され得る。放射標識キットについて上記したように、該キットも、放射性同位体のｐＨを調整するための緩衝液を含有するバイアル、及び無菌のガラス反応バイアルも備え得る。好ましくは、前記緩衝液は、約１０〜１０００ｍＭの濃度の低金属の酢酸ナトリウム溶液であり、前記ガラス反応バイアルは、少なくとも５ｍＬの容量を収容する。前記抗体は、好ましくは、抗ＣＤ２０抗体であり、前記キレート物質は、好ましくは、ＭＸ  ＤＴＰＡである。他のキレート物質は、前に記載したとおりに使用し得る。好ましい接合抗体は、２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡであるが、キレート物質が接合された任意の抗体を標識し、その親和性を評価してもよい。調合用緩衝液は、上述のように放射線保護剤と未接合のキレート物質を含むリン酸緩衝化された生理的食塩水であり、放射性同位体は含有されていても、いなくてもよいが、好ましくは塩化１１１インジウム又は塩化９０イットリウムである。キレート物質に応じて、他の放射性同位体を使用してもよい。
【００５９】
結合アッセイ／放射標識キットと上記放射標識キットとの差異は、抗体の親和性を調べるための基質標的としての役割を果たす抗原陽性細胞が含まれることである。抗原がＣＤ２０のときには、好ましいＣＤ２０陽性細胞は、ＳＢ細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ１２０）であるが、任意のＣＤ２０陽性細胞を使用し得る。結合アッセイと放射標識キットは、さらに、ネガティブコントロールとして使用するために、抗原陰性細胞を含んでもよい。好ましいＣＤ２０陰性細胞は、ＨＳＢ細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ１２０．１）であるが、任意のＣＤ２０陰性細胞を使用し得る。
【００６０】
もちろん、放射標識と結合アッセイを組み合わせたキットは、併用治療法を実施するために、又は診断像を得る前に、末梢Ｂ細胞を除去するために、標識すべき抗体に加えて、キメラ抗ＣＤ２０抗体のバイアルをさらに備えてもよい。このような別の抗体は、好ましくはＲｉｔｕｘａｎ（登録商標）であるが、腫瘍細胞の死滅をもたらすことが示された任意の抗体であり得る。実際に、併用治療法が同じタイプの細胞、すなわち、Ｂ細胞性リンパ腫を標的とする役割を果たす限り、２つの異なる種類の抗体、すなわち２つの異なるＢ細胞抗原に対して誘導された抗体を１つのキットに組み合わせてもよい。
【００６１】
キットの前記成分が他の抗体を標識するために使用され得るのと同様に、標的抗原に応じて、抗体の親和性を調べるための他の細胞を調製し得る。しかしながら、抗Ｄ２０抗体の場合には、本発明の結合アッセイ及び放射標識キットは、標的細胞が凍結乾燥された形態で与えられる点で、商業的な状況にとりわけ適している。これにより、抗体の効力の確認を簡易且つ系統的に進めることが可能になり、組織培養の設備の維持に伴う面倒と支出が不要となる。凍結乾燥された細胞は、一般的には、本発明の方法のバイアル当たり０．５〜５００×１０６細胞のアリコット中に供給される。
【００６２】
ある施設では、既に放射標識された抗体を注文するほうが好ましいことがあり得るが、この場合、このような施設には、標的に対する親和性が確実に抗体に保持されるようにするための結合アッセイ試薬が望まれるかもしれない。この場合には、本発明は、その標的細胞への放射標識された前記抗体の結合のパーセントを決定するための結合アッセイキットも提供する。このようなキットは、少なくとも１つの固定され、及び／又は凍結乾燥された抗原陽性細胞のバイアルを含み、必要に応じて、結合アッセイ及び放射標識キットについて上述したような抗原陰性細胞を含有し得る。さらに、このようなキットの変形は、拮抗アッセイを介して、消費者の抗体の結合特異性を確認するための未標識の対照抗体を含み得ることが明らかなはずである。
【００６３】
同じく、抗原がＣＤ２０の場合には、ＣＤ２０陽性細胞は好ましくはＳＢ細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ１２０）であり、ＣＤ２０陰性細胞は好ましくはＨＳＢ細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ１２０．１）であり、０．５〜５０×１０６細胞のアリコット中に凍結乾燥された形態で与えられる。この場合、前記抗体は、好ましくは、１１１Ｉｎ又は９０Ｙで標識された２Ｂ８のＭＸ  ＤＴＰＡ接合体である。
【００６４】
本明細書に開示されたさらなるキットの態様に関しては、さらなる精製工程が必要でなく、放射標識された抗体を患者に直接投与し得るために、貴重な時間を節約し、抗体の安定性を増加させ得ることが、本発明の放射標識キットと方法の利点の１つであることが強調されなければならない。それ故、臨床医が、投与の前に、放射標識された抗体の結合特異性と親和性を調べ、又は確認することが望ましいかもしれず、抗体の安定性と放射線分解の阻害が具体的な関心事であれば（すなわち、イットリウムを用いた場合のように）、このような試験は、特定の放射性同位体なしに行い得ることが強調される。結合親和性と特異性が試験され得るキットの態様を提供することによって、本発明者らは、本発明の方法又はキットにこのような試験が絶対に必要であることを示唆するものではない。このような抗体の有効性を試験するためのオプションは、純粋に、臨床医が任意に行うものである。
【００６５】
本発明者らは、本発明の結合アッセイキット用の固定され、凍結乾燥された細胞を調製するのに使用された方法は、市販のキット用の細胞を調製するのにとりわけ適していることも見出した。細胞は、構造／安定性を向上させるために、凍結乾燥の前に固定してもよい。特に、本発明の細胞は、抗体結合アッセイに使用したときに、高い再現性を示す。
【００６６】
とりわけ、本発明は、（１）遠心によって、０．５〜２×１０６細胞／ｍＬの細胞密度で細胞を採集することと；（２）平行塩類溶液、すなわちＨＢＳＳ中で少なくとも１回細胞を洗浄し；（３）担体タンパク質と少なくとも１種類の糖を含有する平行塩類溶液を含む凍結乾燥緩衝液中に、沈降した細胞を再懸濁することと；（４）微量遠心管又はガラスバイアル中に再懸濁した細胞のアリコットを分配することと；（５）１２〜９６時間、より好ましくは２４〜７２時間、約３０〜６０ミリトルで凍結乾燥することとを備えた凍結乾燥された細胞の調製法を含む。該方法は、とりわけ、前記細胞がＳＢ細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ１２０）又はＨＳＢ細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ１２０．１）である凍結乾燥された細胞を調製するのに特に適しているが、他の細胞種に対しても同様に適用することができる。
【００６７】
好ましくは、前記緩衝液は、一般的には、担体タンパク質として１％（ｗ／ｖ）の濃度のウシ血清アルブミンと１０％の濃度のマンニトールを含有する。しかしながら、他の担体タンパク質、すなわちＨＳＡ、及び他の糖も使用できると考えられる。細胞は、約１３００ｒｐｍの速度での遠心によって採集され、塩溶液ＨＢＳＳ（Ｈａｎｋの平行塩溶液）が加えられる。細胞は、一般的には、５０×１０６細胞／ｍＬの濃度で再懸濁される。
【００６８】
しかしながら、当業者であれば、上記の条件は、細胞の生存性を著しく損なうことなく、若干の変更を加え得ることが明らかなはずである。さらに上記の条件には、より大量の細胞用の工程、例えば、細胞を凍結乾燥用緩衝液中に交換するための接線（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ）フローダイアフィルトレーションを最適化するようにデザインされたさらなる操作を補充し得る。
【００６９】
本発明の結合アッセイキットは、放射標識された抗体の結合親和性を評価するためのアッセイで使用し得る。このようなアッセイも、本発明の主題である。その標的細胞への放射標識された抗体の結合のパーセントを決定するための結合アッセイは、一般的には、以下の工程：（１）少なくとも１つの放射標識された抗体のアリコットを、少なくとも１つの抗原陽性細胞のアリコットと混合することと；（２）対照として、少なくとも１つの工程（１）のアリコットと同じ放射標識された抗体のアリコットを、工程（１）の抗原陽性細胞のアリコットと同じ容量の少なくとも１つの希釈緩衝液のアリコットと混合することと；（３）遠心によって細胞を沈降させることと；（４）沈降された細胞と対照の上清中の放射能を測定することと；（５）細胞上清中の放射能の量を対照中の放射能の量と比較することとを備える。
【００７０】
本発明の放射標識キットが、必要に応じて、塩化１１１インジウム又は塩化９０イットリウムを含有するのと同じく、本発明の結合アッセイは、典型的には、１１１Ｉｎ又は９０Ｙで標識された抗体を用いて行われる。１１１Ｉｎが放射性標識の場合には、アッセイチューブ中の放射能は、ガンマカウンターを用いて測定される。９０Ｙが標識の場合には、放射能はシンチレーションカウンターを用いて測定されるが、ガンマカウンターを使用することもできる。
【００７１】
本発明の結合アッセイについては、好ましい抗体は抗ＣＤ２０抗体であり、抗ＣＤ２０抗体は、好ましくは２Ｂ８であり、２Ｂ８抗体は、本発明の放射標識キットを用いて標識される。しかしながら、特定の抗原を発現している細胞を入手できれば、任意の放射標識された抗体を試験し得る。ＣＤ２０が抗原であるときには、前記アッセイを行うための好ましい細胞はＳＢ細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ１２０）であるが、該アッセイを至適化し、任意の放射標識された抗体と適切な標的細胞を用いて実施してもよい。
【００７２】
該アッセイに使用される希釈緩衝液は、抗体の結合を維持しなければならず（すなわち、生理的緩衝液）、おそらくは、細胞への非特異的結合を最小にするために、例えば、担体タンパク質、例えばＢＳＡを含有するであろう。希釈緩衝液を入れたチューブは対照としての役割を果たすが、抗原陰性細胞を用いることによって、さらなる対照を該アッセイに含めてもよい。この場合には、結合アッセイは、さらに以下のステップ：（１）少なくとも１つの放射標識された抗体のアリコットを、少なくとも１つの抗原陰性細胞のアリコットと混合し、インキュベートすることと；（２）遠心によって抗原陰性細胞を沈降させることと；（４）沈降された抗原陰性細胞の上清中の放射能を測定することと；（５）抗原陰性細胞上清中の放射能の量を、抗原陽性細胞上清と対照の上清中の放射能の量と比較することとを備える。このチューブから得られた放射能を、希釈緩衝液の対照と比較することは、抗原陽性細胞への非特異的な結合の量の測定として役立つであろう。ＣＤ２０が抗原であるときには、ＣＤ２０陽性細胞はＳＢ細胞であり、ＣＤ２０陰性細胞は、好ましくはＨＳＢ細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ１２０．１）である。
【００７３】
上述のように、本発明の凍結乾燥された細胞は、放射標識された抗体の結合効力を調べるための単純で、効率的、且つ再現性のある標準を提供する。それ故、本発明の結合アッセイは、好ましくは、本発明の結合アッセイキット中に含まれる凍結乾燥された細胞を用いて行われる。加えて、本発明の放射標識アッセイは、本発明の結合アッセイと組み合わせてもよく、ここで、抗体は、まず、本発明に記載されているように、キレート物質が接合された抗体を標識する前記方法によってまず標識される。最も好ましくは、本発明の結合アッセイは、本明細書に記載された結合アッセイ及び放射標識キットのうちの１つを用いて行われる。
【００７４】
抗体の親和性が調べられ、又は確認されるべきであるが、放射標識が付着していない例が幾つか存在し得る。例えば、ある種の状況（すなわち、トラブルシューティング）下では、放射標識する前に、抗体の結合親和性を調べることが有利であり得る。このような場合には、本発明は、（１）同じ抗原に対して特異的な公知の抗体を用いて、ルテニウム標識された対照抗体を調製することと；（２）固定された濃度の標的細胞及び微量のルテニウム標識された抗体とともに、増加する量の被検抗体と増加する量の未標識対照抗体をインキュベートすることと（ここで、各別の濃度の被検抗体と各別の濃度の対照抗体は、それぞれ別々のチューブに入れられている）；（３）ＯＲＩＧＥＮ機器を用いた相対的な電気化学発光（ＥＣＬ）に基づいて、各反応チューブ中の結合量を測定することと；（４）前記被検抗体の平均親和値を算出することを備えた、標的細胞への被検抗体の親和性を評価するための拮抗結合アッセイも包含する。平均親和性値は、Ｍｕｌｌｅｒの方法（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  （１９８０）  ３４：３４５）又は他の任意の適切な方法を用いて、ＥＣ５０値と濃度既知のトレース抗体から算出し得る。このアッセイは、放射標識された抗体、又はそれに対する抗原を精製することができず、抗原源として細胞が必要である抗体の親和性を調べるためにも使用し得ることに留意しなければならない。本発明の固定され、凍結乾燥された細胞は、標的細胞として使用し得る。
【００７５】
抗ＣＤ２０抗体の親和性を調べるために本発明の拮抗結合アッセイを行うときには、対照抗体は２Ｂ８、又は他の任意の未接合の抗ＣＤ２０抗体であり得る。前記対照抗体は、キレート物質に接合された抗体であり得る。前記被検抗体も、前記対照抗体のキレート物質接合体であり得る。あるいは、被検抗体は、２Ｂ８と比較した、ＣＤ２０に対するその結合親和性が興味の対象となっている別の抗ＣＤ２０抗体であり得る。しかしながら、前記アッセイは、適切な標的細胞が利用できる限り、他の特異性を有する抗体を用いた用途に適合させ得る。
【００７６】
本発明の拮抗結合アッセイでは、好ましい標的細胞は、ＣＤ２０陽性細胞であり、より好ましくは、ＳＢ細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ１２０）、より好ましくは、本発明の方法によって調製された、再懸濁された凍結乾燥ＳＢ細胞である。他の方法を用いて凍結乾燥された細胞又は固定された細胞も使用し得る。ルテニウムで標識された抗体は、典型的には、ルテニウム（ＩＩ）トリス−バイピリジン（ｂｙｐｙｒｉｄｉｎｅ）キレート物質（ＴＡＧ−ＮＨＳ）のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルとともに、対照抗体をインキュベートすることを備えた工程によって調製されるが、他の公知の抗体標識法も想定される。標識するためには、対照抗体とＴＡＧ−ＮＨＳは、好ましくは、約１：１５のモル比でインキュベートされる。本発明のこれらの側面及び他の側面は、以下の図面、例、及び本発明の記載を参照することによって、明確に理解されるであろう。
【００７７】
【発明の記述】
＜定義＞
特に明記していなければ、本明細書で使用する全ての技術的及び科学的用語は、当業者によって一般的に理解されるのと同一の意味を有する。本発明を実施又は試行する上で、本明細書に記載された方法と類似又は均等な任意の方法及び物質を使用することができるが、好ましい方法と物質が記載されている。本発明のために、以下の用語を以下に定義する。
【００７８】
低金属−放射能の取り込みに影響を与えないレベルまで、金属の混入が減少するように処理された試薬を指す。
【００７９】
抗原陽性−本発明の抗体が結合できるように、本発明のある抗体によって認識される抗原を発現していることを意味する。
【００８０】
％放射能取り込み−最初に反応に加えられた放射性標識の総量に対する、抗体に接合された放射標識反応からの放射標識の量を指す。
【００８１】
％結合−特異的又は非特異的に、標的抗原に結合するサンプルからの抗体の量を指す。
【００８２】
％免疫反応性又は結合特異性−特異的に標的抗原に結合する抗体サンプルの量を指す。
【００８３】
診断用抗体−腫瘍及び抗原陽性細胞の診断的画像化を行い得る１１１Ｉのような放射標識に接合された抗体を指す。
【００８４】
治療用抗体−ターゲッティングされた抗原に結合したときに、細胞を死滅させ得る（９０Ｙのような）α又はβ放出体に接合された抗体を指す。
【００８５】
＜発明の説明＞
マウスモノクローナル抗ＣＤ２０抗体２Ｂ８、接合２Ｂ８、
１１１Ｉｎ及び９０Ｙ標識２Ｂ８の前臨床開発
Ｉ．  マウスモノクローナル抗ＣＤ２０抗体２Ｂ８、接合２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡ、１１１Ｉｎ標識された２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡ、及びＨＰＬＣ精製された９０Ｙ−ＭＸ−ＤＴＰＡを開発するための物質と方法
Ａ．物質
１．細胞
ヒト細胞ＳＢとＨＳＢは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから取得し、１０％のウシ胎児血清を含有するＲＰＭＩ−１６４０中で培養した。ＣＤ２０陽性細胞株は、急性リンパ球芽性白血病患者の末梢血バフィーコートに由来するＢリンパ芽球腫細胞株である（１）。抗原陰性細胞株ＨＳＢは、新生仔シリアンハムスターに誘導した腫瘍から発育されたＴリンパ芽球腫細胞株である（２）。マウスの骨髄腫細胞株ＳＰ２／０は、同様に、１０％のウシ胎児血清を含有するＲＰＭＩ−１６４０中で飼養した。
【００８６】
２．抗体
抗ＣＤ２０抗体Ｂ１及びＬｅｕ１６は、それぞれ、Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ及びＢｅｃｔｏｎ／Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎから購入した。１２５Ｉ標識したヤギの抗マウスＩｇＧとヤギの抗ヒトＩｇＧ抗体は、ＩＣＮから取得した。ヤギのＦ（ａｂ’）２抗マウスＩｇＧは、Ｃａｐｐｅｌから取得した。
【００８７】
３．試薬
フロイントの完全及び不完全アジュバントは、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙから購入した。ポリエチレングリコール、ＨＡＴ濃縮液、及びＨＴ濃縮液は全て、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍから取得した。フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）は、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙから購入した。塩化インジウム−［１１１］及び塩化９０イットリウムは、Ａｍｅｒｓｈａｍ又はＮＥＮ  Ｄｕｐｏｎｔから購入した。塩化イットリウム−［８９］は、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙから購入した。他の全ての試薬は、標準的な入手源から取得した。
【００８８】
接合及び放射標識プロトコールに使用した試薬には、放射標識工程中に放射性同位体と拮抗し得る重金属イオンの混入を除去するために処理を施した。試薬は、典型的には、溶液をＣｈｅｌｅｘ１００イオン交換樹脂（ＢｉｏＲａｄ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）のカラムに通過させることによって、又は調製した溶液にＣｈｅｌｅｘ１００を加えるバッチ処理によって処理した。
【００８９】
全ての調製及び希釈には、低金属含有水（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ精製された水か、洗浄用水（ＷＦＩｒ）の何れか）を使用した。無金属溶液を無菌濾過し、無菌のプラスチック容器に集めた。
【００９０】
Ｂ．方法
１．ＲＩＡによる２Ｂ８ハイブリドーマ上清の調製とスクリーニング
フロイントの完全アジュバントを含有するＰＢＳに懸濁された２千万のＳＢ細胞で、１０匹のＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫した。該細胞を、該動物の複数の部位に、皮下及び腹腔内に投与した。２週間の休止期間後、マウスに対して、フロイントの不完全アジュバント中に乳化したＳＢ細胞の２度目の投与を行った。
【００９１】
ＰＢＳに懸濁したＳＢ細胞を用いて、毎週のスケジュールで、その後の免疫強化を行った。マウスには、６週〜４月の間、免役した。
【００９２】
頸椎脱臼によって一度に２匹の動物を屠殺し、マウスの骨髄腫ＳＰ２／０と融合させるためにそれらの脾臓を取り出した。放射標識されたＣｏｕｌｔｅｒのＢ１抗ＣＤ２０抗体のヒトＳＢ細胞への結合を有効に阻害する免疫後血清の能力に基づいて、動物を選別した。各融合の３日前に、選択した動物に、ＰＢＳ中の２千万のＳＢ細胞を最後に１度静脈内（尾静脈）注射した。屠殺時には、無菌条件下で脾臓を取り出し、５：１（脾臓細胞：ＳＰ２／０）の比率で、脾臓細胞をＳＰ２／０細胞と融合させた。組織培養液中で、融合細胞を洗浄し、ＨＡＴ選択培地を含有する９６ウェルプレート中に分配した。１０〜１４日後に、ＣｏｕｌｔｅｒのＢ１抗体を用いた阻害放射線免疫検定によって、ハイブリドーマをスクリーニングした。
【００９３】
抗ＣＤ２０抗体を分泌するハイブリッドのスクリーニングは、確立された放射線免疫検定法を用いて行った。要約すれば、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって、ＣｏｕｌｔｅｒのＢ１抗ＣＤ２０抗体を精製した。Ｉｏｄｏｂｅａｄｓ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）の存在下での短時間の酸化後に、製造者の手順に従って、精製した抗体５０μｇを１２５Ｉに結合した。ａｍｂｅｒｌｉｔｅ樹脂上で放射標識された抗体を脱塩し、希釈緩衝液（０．２％のゼラチン、０．０２％のアジ化ナトリウム、及び１．０％のＢＳＡを含有するＰＢＳ、ｐＨ７．４）中に保存した。テストウェルからのハイブリドーマ上清５０μＬ及び５０μＬの希釈緩衝液中に懸濁された１００，０００のＳＢ細胞とともに、予めブロックしたフィルターアッセイプレート（ブロッキング緩衝液：１０％ＦＢＳを含有する希釈緩衝液）の各ウェルに、１０ｎｇの放射標識された抗体を加えた。室温で１時間、懸濁液をインキュベートした。Ｖ＆Ｐ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃの真空マニフォールド上で、洗浄緩衝液（０．２％のゼラチン及び０．０２％のアジ化ナトリウムを含有するＰＢＳ、ｐＨ７．４）を用いて、プレートを完全に洗浄し、捕捉されたＳＢ細胞を含有するフィルターのボトムをガンマカウンターに移した。ＨＡＴ培地と標識されたＢ１抗体のみを含有するウェルをバックグラウンド対照として使用し、ＳＢ細胞を含有する同一のウェルをポジティブコントロールとして使用した。阻害対照は、放射標識されたＢ１と２μｇ〜２ｎｇにわたる様々な量の未標識のＢ１抗体を含有していた。
【００９４】
２．フローサイトメトリー実験
ａ．細胞株
２Ｂ８ハイブリドーマの培養物から得られた上清を用いて、予備的なフローサイトメトリー実験を行った。１時間、室温で、１００μＬのハイブリドーマ上清をＳＢ細胞とインキュベートした；続いて、２次抗体（ヤギＦ（ａｂ’）２抗マウスＩｇＧ；Ｃａｐｐｅｌ）（１／４００希釈して使用）を加え、暗所で１時間インキュベーションを続けた。細胞を５回洗浄した。対照は、自己蛍光が測定される細胞のみ（１次抗体又は２次抗体を含まない）、非特異的結合を測定するだけの２次抗体を有する細胞、ＣＤ２０集団の対照用の、市販のフルオレセインイソチオシアネート接合Ｂ１（Ｂ１−ＦＩＴＣ）を含有していた。
【００９５】
幾つかの実験では、アミノ基のフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）との反応を介して、精製した２Ｂ８抗体にフルオレセインを結合した。簡潔に述べれば、ｐＨ９．５の０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液中で、１５０〜２００μｇ  ＦＩＴＣ／ｍｇタンパク質とともに、２Ｂ８抗体（１．２ｍｇ／ｍＬ）をインキュベートした。室温で２時間、該溶液をインキュベートし、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラムで、生じた２Ｂ８−ＦＩＴＣ接合体を精製した。これらの研究に使用したＢ１及びＬｅｕ１６のような他の試薬は、Ｃｏｕｌｔｅｒ又はＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎから直接、フルオレセイン接合体として購入した。
【００９６】
分析すべき細胞を採集し、０．２％のＢＳＡと０．１％のアジ化ナトリウムを含有するＰＢＳで３回洗浄した。９０％を超える生存率を要求しながら、トリパンブルー排除によって生存率を測定した。９６ウェルＵ字底プレートのウェル当たり５０μＬを加えて、細胞の濃度を３百万／ｍＬに調整した。適切なウェルに１次抗体（５０μＬ）を加え、室温で３０分〜１時間、混合物をインキュベートした；続いて、２００μＬ／ウェルの、０．２％のＢＳＡと０．０２％のアジ化ナトリウムを含有するＰＢＳを用いて、細胞を５回洗浄した。Ｓｏｒｖａｌｌ遠心装置中で、１時間、１３００ＲＰＭでプレート中の細胞を遠心し、穏やかにプレートを「はじく」ことによって、上清を除去した。必要であれば、２次抗体を加え、暗所において、室温でさらに３０分〜１時間、インキュベートした；その後、上記のようにウェルを洗浄した。最後に、２００μＬの固定用緩衝液（１％のパラホルムアルデヒドを含有する０．１５Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ７．４）を各サンプルに加え、処理した細胞を、分析のために１２×７５ｍｍチューブに移した。
【００９７】
ｂ．カニクイザルの全血
血漿を除去した後、遠心及びＨＢＳＳ中での再懸濁により、細胞を２回洗浄した。ウシ胎児血清（２ｍＬ）を加え、細胞を再懸濁した。続いて、６、１５ｍＬの各円錐状遠心チューブに、１００μＬの再懸濁した細胞を分配した。蛍光標識されたモノクローナル抗体を以下のように加えた：
チューブ１：マウス抗ＣＤ２−ＦＩＴＣ（ＡＭＡＣ）、２．５μｇ／ｍＬ、５μｇ；
チューブ２：ヤギ抗ヒトＩＧＭ−ＦＩＴＣ（Ｆｉｓｈｅｒ）、２．５μｇ／ｍＬ、５μｇ；
チューブ３：ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＲＰＥ（Ｆｉｓｈｅｒ）、２．５μｇ／ｍＬ、５μｇ；
チューブ４：ヤギ抗ヒトＩｇＭ−ＦＩＴＣ  ＋ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＲＰＥ（ａｂｓｏｒｂｅｄ）、２．５μｇ／ｍＬ、５μｇ；
チューブ５：抗ヒトＣＤ２０−ＦＩＴＣ（ａｎｔｉ−Ｌｅｕ  １６、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、５μｇ；
チューブ６：細胞のみ（自己蛍光）
２分間、１５００ｒｐｍで標識された抗体と細胞を遠心して、細胞と抗体を混合した後、６つのサンプルを全て氷上に置き、３０分間インキュベートした。続いて、氷からチューブを取り出し、溶解緩衝液（予め３７℃に加温）を加えて、１２ｍＬの容量にした。続いて、室温で１５分間サンプルをインキュベートし、５分間、４℃、１５００ｒｐｍで遠心し、上清を除去した。続いて、標識緩衝液（１％のＢＳＡと０．０５％のアジ化ナトリウムを含有するＰＢＳ）で、細胞沈降物を２回洗浄した。
【００９８】
続いて、０．５ｍＬ／チューブの固定用緩衝液（１％のパラホルムアルデヒドを含有する０．１５Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ７．４）を加えることによって細胞を固定し、Ｃａｌｉｂｒｉｔｅビーズによる自動補償とプレキャリブレーションを用いて、Ｂｅｃｔｏｎ  ＤｉｃｋｉｎｓｏｎのＦＡＣＳｃａｎ装置上で分析した。ＦＬ１モードで、フルオレセインからの緑色蛍光を測定し、ＦＬ２モードでフィコエリトリンからの赤色蛍光を測定した。データは、対数型で表した。まず、ドットプロットビットマップ中の前方対直角の光散乱によって、生きたリンパ球の集団を同定した。続いて、他の全ての事象をゲーティングアウトすることによって、全てのリンパ球集団を単離した。その後の蛍光測定は、ゲーティングされた領域内に生じた特異的な事象のみを反映した。
【００９９】
高用量の薬理学／毒性学試験については、各カクニイザルに対して、研究前のリンパ球のレベルを決定し、ベースライン値として使用した。Ｔ及びＢ細胞のパーセントとＴ：Ｂ比を算出し、消失の参照として用いた。研究前のＢ細胞集団は、Ｌｅｕ１６と抗ヒトＩｇＭ抗体を用いて数えた。
【０１００】
２Ｂ８をサルに投与した後、ＣＤ抗原が２Ｂ８で飽和したときに、ヤギ抗ヒトＩｇＭ−ＦＩＴＣ、抗マウスＩｇＧ−ＲＰＥ、及びこれら２つのマーカーを含有する二重染色集団を用いて、総集団中のＢ細胞のパーセントを概算した。二重染色集団は、動物の末梢血から全ての２Ｂ８が除去されるまで、定量用に使用した。総リンパ球集団中のＴ細胞のパーセントは、抗ＣＤ２−ＦＩＴＣを用いて推定した。データは、各サンプルを用いて３回、１００００の事象に対して測定を平均した。続いて、各ケースにおいて、総リンパ球集団内のＴ及びＢ細胞亜集団を数えて、表記の各血液サンプルから得られた細胞を評定した。Ｔ：Ｂ比も調べた。Ｂ細胞の消失は、各サルの元のＢ細胞レベルに対するＢ細胞の減少のパーセントとして算出した。
【０１０１】
３．ＣＤ２０の放射性ヨウ素化及び免疫沈降
１２５ＩとＩｏｄｏｂｅａｄｓ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）による表面ヨウ素化の後に、１億のＳＢ細胞を２つの等しい部分に分けた。上清の放射能レベルがバックグラウンドに戻るまで、遠心によって、細胞を繰り返し洗浄した。２つの標識されたＢ細胞のサンプルのうちの何れかに、１００μｇの２Ｂ８又はＢ１（Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）抗体を加えた。抗体とＳＢ細胞を一晩インキュベートした後、結合していない抗体が全て除去されるまで、遠心によって、３回洗浄した。続いて、結合した２Ｂ８とＢ１を含有する細胞沈降物を溶解し、０．１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０中の１％  ＮＰ−４０界面活性剤を添加することによって抽出した後、室温で１時間インキュベートした。微量遠心管の中で、高速度で３０分間、抽出物を遠心し、上清を新しいチューブに移した。タンパク質Ａセファロース（３００μＬ）を各チューブに加え、遠心によって樹脂を沈降させた。続いて、タンパク質Ａ−セファロースを２０回洗浄して、非特異的に結合したヨウ素化されたタンパク質を除去した。ビーズ対上清の放射能比が１００の値に達した時点で、ＳＤＳ  ＰＡＧＥサンプル緩衝液を用いて沈降物を抽出し、沸騰するまで加熱した。冷却後、約１５、０００ｃｐｍの各抽出物を、１０％ポリアクリルアミドゲルのウェルに加えた。予め染色された低分子量の標準（ＢｉｏＲａｄ  Ｉｎｃ．）を別のウェルに加え、分子量を推測するために使用した。電気泳動によってタンパク質を分離し、ゲルを乾燥させ、−７０℃で２４時間Ｘ線フィルムのシーツに暴露した；続いて、フィルムを展開し、分析した。
【０１０２】
４．２Ｂ８結合のスキャッチャード分析
スキャッチャード分析によって、精製された２Ｂ８の見かけの親和性を評価した。Ｉｏｄｏｂｅａｄｓの存在下で、１２５Ｉとの反応によって、放射標識された２Ｂ８を調製した。遊離のヨウ素を除去した後、放射標識された抗体を、５０００ｎｇ／ウェルから３５ｎｇ／ウェルにわたる様々な濃度で、２つずつ、１０、０００のＳＢ細胞とともにインキュベートした。細胞に結合している抗体の量は、１２５Ｉ標識された２Ｂ８の比活性から算出した。結合した抗体のモル濃度に対して結合／遊離抗体の比率をプロットし、Ｘ及びＹ軸切片の比から見かけの親和定数を決定した。
【０１０３】
５．２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡの調製
ａ．ＭＸ−ＤＴＰＡの入手源
幾つかの前臨床実験では、炭素１４標識された１−イソチオシアナートベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、国立保健研究所のＯｔｔｏ  Ｇａｎｓｏｗ博士から乾燥した固体として譲り受け、４℃で遮光しながら乾燥保存した。該キレートのストック溶液はＭｉｌｌｉ−Ｑ水中に調製し、放射能を評価し、化合物の比活性を用いることによって濃度を決定した。ストック溶液は、一般に２〜５ｍＭであり、ポリプロピレンチューブの中に−７０℃で保存した。他の研究では、ＭＸ−ＤＴＰＡはＣｏｕｌｔｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙから、水中の二ナトリウム塩として取得し、−７０℃で保存した。
【０１０４】
ｂ．無金属条件の維持
無金属試薬の使用に加えて、全ての試薬の取扱いは、金属の混入の可能性が最小になるように行った。可能なときには、フラスコ、ビーカー、及び目盛り付きのシリンダーのようなポリプロピレンのプラスチック容器を用いた。使用前に、これらをＡｌｃｏｎｏｘで洗浄し、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水で徹底的にリンスした。さらに、少量を正確に扱うために、無金属のピペットチップ（ＢｉｏＲａｄ）を用いた。より大量の試薬を扱うためには、無菌のプラスチック血清ピペット（１〜２５ｍＬのサイズのものを利用し得る）を用いた。反応は、ネジ蓋付きのポリプロピレン微量遠心管（Ｓａｒｄｓｔｅｄｔ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ；１．５ｍＬの容量）又はポリプロピレン円錐チューブ（Ｃｏｓｔａｒ；１５ｍＬ及び５０μＬ）の中で、簡便に行った。透析チュービングを扱うときには、予めＭｉｌｌｉ−Ｑ水でリンスした使い捨ての手術用手袋を着用した。
【０１０５】
ｃ．抗体の調製
まず、プロテインＡとＱＡＥクロマトグラフィーによって、腹水からマウス抗ＣＤ２０抗体２Ｂ８を精製した。後の実験のために、同じ精製過程を用いて、中空繊維のバイオリアクター上清から２Ｂ８を精製した。中空繊維由来の抗体は、商業化のために、今では、例２に記載されたＣＨＯ由来の抗体に置き換えられた。
【０１０６】
１５０ｍＭのＮａＣｌを含有する無金属の５０ｍＭのビシン−ＮａＯＨ、ｐＨ８．６中に移し、透析又は緩衝液交換の繰り返しを用いることによって、接合のために抗体を調製した。幾つかの研究では、緩衝液の交換は、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ  ３０（Ａｍｉｃｏｎ）スピンフィルター（３０，０００Ｄ  ＭＷＣＯ）を用いた限外濾過を繰り返し使用して行った。一般的には、フィルターユニットに５０〜２００μＬのタンパク質（１０ｍｇ／ｍＬ）を加え、２ｍＬのビシン緩衝液を加えた。Ｓｏｒｖａｌ  ＳＳ−３４ローター中、６０００ｒｐｍで４５分間、４℃でフィルターを遠心した。残留容量は、約５０〜１００μＬであった。この工程は、同じフィルターを用いて２回繰り返した。残留液をポリプロピレンの１．５ｍＬネジ蓋付きチューブに移し、タンパク質をアッセイし、１０．０ｍｇ／ｍＬになるように希釈して、接合に使用するまで、４℃で保存した。幾つかの実験では、上記と同じプロトコールを用いて、１５０ｍＭのＮａＣｌと０．０５％のアジ化ナトリウムを含有する５０ｍＭのクエン酸ナトリウム、ｐＨ５．５に、タンパク質を移した。
【０１０７】
ｄ．接合プロトコール
２Ｂ８のＭＸ−ＤＴＰＡとの接合は、室温でポリプロピレンチューブ中において行った。凍結したＭＸ−ＤＴＰＡのストック溶液は、使用直前に溶かした。典型的には、１０ｍｇ／ｍＬの抗体５０〜２００μＬを、４：１のキレート対タンパク質のモル比でキレートと反応させた。キレートストック溶液を加え、穏やかに混合することによって反応を開始した。一晩（一般的には、１４〜２０時間）、室温で接合を進行させた。未反応のキレートは、上記のように、０．０５％のアジ化ナトリウムを含有する無金属の通常の生理的食塩水（０．９％ｗ／ｖ）中への透析又は限外濾過の反復によって接合体から除去した。タンパク質濃度を１０ｍｇ／ｍＬに調整し、放射標識されるまで、ポリプロピレンチューブ中に４℃で保存した。
【０１０８】
ｅ．キレートの取り込みの測定
キレートの取り込みは、シンチレーションカウンター及び精製された接合体で得られた値と炭素［１４］標識されたキレートの比活性の比較によって測定した。Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙから取得した非放射性キレートを使用する後の研究のために、濃度及び比活性が既知の９０Ｙの過剰な放射能キャリアー溶液と前記接合体をインキュベートすることによって、キレートの取り込みを評価した。
【０１０９】
簡単に述べれば、無金属の０．０５ＮのＨＣｌ（ここに、キャリアーなしの９０Ｙ（塩化物塩）が加えられた）中に濃度既知の塩化イットリウムのストック溶液を調製した。液体シンチレーションカウンターによって、この溶液のアリコットを分析し、この試薬の正確な比活性を決定した。典型的には２モル／モル抗体で、抗体に付着されると予測されるキレートのモル数の３倍に等しい容量の塩化イットリウム試薬をポリプロピレンチューブに加え、２Ｍの酢酸ナトリウムを用いて、４．０〜４．５になるようにｐＨを調整した。続いて、接合抗体を加え、室温で１５〜３０分、混合物をインキュベートした。１ｍＭの最終濃度になるように２０ｍＭのＥＤＴＡを加え、２Ｍの酢酸ナトリウムで溶液のｐＨが約６になるように溶液のｐＨを調整することによって反応を停止させた。
【０１１０】
５分のインキュベーションの後、下記のように、高性能サイズ排除クロマトグラフィーによって、全容量を精製した。溶出されたタンパク質を含有する画分を合わせ、タンパク質濃度を測定し、アリコットの放射能をアッセイした。キレートの取り込みは、塩化９０イットリウム調製物の比活性とタンパク質濃度を用いて算出した。
【０１１１】
ｆ．２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡの免疫反応性
ホールセルＥＬＩＳＡを用いて、接合された２Ｂ８の免疫反応性を評価した。遠心によって、中間対数相のＳＢ細胞を培養から採集し、１×ＨＢＳＳで２回洗浄した。１〜２×１０＠細胞を／ｍＬになるように、ＨＢＳＳ中に細胞を希釈し、５０、０００〜１００、０００細胞／ウェルで、９６ウェルのポリスチレンマイクロタイタープレート中に分取した。４０〜４５℃で２時間、真空下でプレートを乾燥させ、細胞をプラスチックに固定した。使用するまで、該プレートは、−２０℃で乾燥して保存した。アッセイのために、使用直前にプレートを室温まで加温した後、１％のＢＳＡを含有する１×ＰＢＳ、ｐＨ７．２〜７．４でブロックした（２時間）。１×ＰＢＳ／１％ＢＳＡ中にアッセイ用サンプルを希釈し、プレートに加え、同じ緩衝液中に系列希釈した。室温で１時間プレートをインキュベートした後、１×ＰＢＳでプレートを３回洗浄した。２次抗体（ヤギ抗マウスＩｇＧ１特異的ＨＲＰ接合体）（５０μＬ）をウェルに加え（１×ＰＢＳ／１％ＢＳＡ中に１：１５００希釈）、室温で１時間インキュベートした。１×ＰＢＳでプレートを４回洗浄した後、ＡＢＴＳ基質溶液（０．０１％のＡＴＢＳと０．００１％のＨ２Ｏ２を含有する５０ｍＭのクエン酸ナトリウム、ｐＨ４．５）を加えた。１５〜３０分のインキュベーションの後、プレートを４０５ｎｍで読み取った。非特異的結合をモニターするために、アッセイには抗原陰性ＨＳＢ細胞を含めた。接合体の免疫反応性は、各希釈因子に対して吸光度値をプロットし、同じプレート上で試験したネイティブ抗体（１００％の免疫反応性に相当する）を用いて得た値と比較することによって算出した。滴定プロフィールの線形部分上の幾つかの値を比較し、平均値を決定した。
【０１１２】
ｇ．ネイティブ２Ｂ８と２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡのインビトロでの安定性
抗体及び接合抗体を１２週にわたってこのように評価するために、通常の生理的食塩水又は１０ｍＭのグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ６．８を含有する通常の生理的食塩水の何れかに、２Ｂ８抗体と２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡのアリコットを調合した。２組のサンプルを、４℃と３０℃の両者でインキュベートし、以下の方法：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元及び非還元の両者）、ＳＢ（抗原陽性）又はＨＳＢ（抗原陰性）細胞を捕捉物（ｃａｐｔｕｒｅ）として使用したホールセル酵素免疫検定による免疫反応性、等電点ゲル電気泳動（ｐＨ域、３〜１０）を用いて、サンプルを毎週アッセイした。さらに、第４、８、及び１２週目に、接合体を９０Ｙで放射標識することによって、接合体の放射標識効率を評価し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとオートラジオグラフ分析によって産物を分析した。最後に、別の研究で、４及び３０℃で１０週間インキュベートした２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡのアリコットを１１１Ｉｎで放射標識し、下記のように、ＢＡＬＢ／ｃマウスでの生体分布研究で評価した。
【０１１３】
ｈ．免疫組織学的研究
アセトンで固定したヒト組織の切片を用いて、ＩＭＰＡＴＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓにより、ネイティブと接合（２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡ）抗体の両者による免疫組織学的研究を行った。プロテインＡとＱセファロースクロマトグラフィーにより、中空繊維バイオリアクター上清から抗体を精製した。臨床グレードの接合体は、上述のプロトコールに従って、Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙから得たＭＸ−ＤＴＰＡを用いて調製した。
【０１１４】
ｉ．放射標識された２Ｂ８−ＭＸ  ＤＴＰＡのインビトロ免疫反応性
幾つかの実験では、未標識の２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡに対して使用したホールセルＥＬＩＳＡプロトコールを用いた。後の実験では、Ｌｉｎｄｍｏによって記載されたホールセル結合アッセイ（３）の修正バージョンを用いて、１１１Ｉｎ及び９０Ｙ標識された接合体（各々ＩＤＥＣ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓか、あるいはＭＰＩ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，  Ｉｎｃ．）の免疫反応性を決定した。簡潔に述べれば、濃度が増加する中間対数相の抗原陽性ＳＢ細胞又は抗原陰性ＨＳＢ細胞［希釈緩衝液（１％ＢＳＡ、０．１％ゼラチン、及び０．０２％アジ化ナトリウムを含有するＰＢＳ、ｐＨ７．４）中、２０〜３０×１０６細胞／ｍＬ］中に、２０〜３０×１０６細胞／ｍＬ）を２組ずつのチューブに加えた。希釈用緩衝液により、１〜５ｎｇ／ｍＬの最終抗体濃度になるように、放射標識された接合体を希釈し、０．３５ｍＬを各チューブに加えた。室温での７５〜９０分のインキュベーション時間後に、遠心によって細胞を沈降させ、上清を集めた。ガンマ又はシンチレーションカウンターを用いて、上清画分中に残存する放射能を測定した。データは、細胞数／チューブの逆数に対し、加えた総放射能を細胞に付着した放射能によって除した商としてデータをプロットした。ｙ軸切片は、このため、免疫反応性のある割合を表している。
【０１１５】
ｊ．ヒト血清中の放射標識された２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡのインビトロでの安定性
ヒト血清中、３７℃で、９６時間インキュベートすることによって、１１１Ｉｎ及び９０Ｙ標識された２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡのインビトロでの安定性を評価した。接合抗体を調製し、上記のように、１１１Ｉｎ（「ミックス＆シュートプロトコール」）又は９０Ｙで放射標識した。１１１Ｉｎ及び９０Ｙ標識された接合体の比活性は、それぞれ、２．５及び１４．６ｍＣｉ／ｍｇであった；７５ｍｇ／ｍＬのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）と１ｍＭのＤＴＰＡ（イットリウム標識された接合体）を含有する緩衝液又は５０ｍｇ／ｍＬのＨＳＡ（インジウム標識された接合体）を含有する緩衝液中に、放射標識された接合体を懸濁した。正常なヒト血清（非加熱−非活性化）で、放射標識された接合体を１：１０に希釈し、無菌のキャップされたチューブの中に、アリコットを無菌的に置いた；続いて、９６時間まで、これらのチューブを３７℃でインキュベートした。選択した時点で、接合体のサンプルを取り出し、４〜２０％のグラジエントゲル中の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥの後にオートラジオグラフィー、及び簡易薄層クロマトグラフィーによって分析した。
【０１１６】
ｋ．臨床的に調合された１１１Ｉｎ−２Ｂ８―ＭＸ−ＤＴＰＡのインビトロでの安定性
２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡ接合体を１１１Ｉｎで放射標識し、ＨＰＬＣ精製をせずに使用した（「ミックス＆シュート」プロトコール）。放射標識された抗体をＰＢＳ中に希釈し、５０ｍｇ／ｍＬの最終濃度になるようにヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を加えた。調合した放射標識された接合体の比活性は、２．２ｍＣｉ／ｍｇであった。続いて、調合された接合体を４℃で４８時間インキュベートし、４〜２０％のグラジエントゲル中の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用した後にオートラジオグラフィー、及び簡易薄層クロマトグラフィーによって、０、２４時間、及び４８時間の時点でアリコットを分析した。各時点での免疫反応性は、上記セクション１に記載したホールセル懸濁アッセイを用いて評価した。
【０１１７】
ｌ．臨床的に調合された９０Ｙ−２Ｂ８―ＭＸ−ＤＴＰＡのインビトロでの安定性
２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡ接合体を９０Ｙで放射標識し、１×ＰＢＳを溶出緩衝液として用いたＨＰＬＣでのサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。放射標識された接合体の画分をプールし、それぞれ、７５ｍｇ／ｍＬ及び１ｍＭの最終濃度になるように、ヒト血清アルブミンとＤＴＰＡを加えた。調合した放射標識された接合体の比活性は、１４．６ｍＣｉ／ｍｇであった。続いて、調合した接合体を４℃で４８時間インキュベートし、４〜２０％のグラジエントゲル中の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用した後にオートラジオグラフィー、及び簡易薄層クロマトグラフィーによって、０、２４時間、及び４８時間の時点でアリコットを分析した。各時点での免疫反応性は、上記セクション１に記載したホールセル懸濁アッセイを用いて評価した。
【０１１８】
２．動物実験
ａ．２Ｂ８を用いた霊長類高用量薬理学／毒性学試験
Ｗｈｉｔｅ  Ｓａｎｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＣｅｎｔｅｒのＧＬＰ規則に従って実施した高用量の薬理学試験で、抗体２Ｂ８を評価した（研究番号９２０１１１）。
【０１１９】
成体のＭａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ（カニクイザル）を用いた；各試験群は、雄１匹と雌１匹からなった。合計７回、４８時間おきに抗体を静脈内注射した。試験は、５つのグループ：第１グループ（生理的食塩水）；第２グループ（０．６ｍｇ／ｋｇ）；第３グループ（２．５ｍｇ／ｋｇ）；第４グループ（１０ｍｇ／ｋｇ）；第５グループ（第０日のみに、１０ｍｇ／ｋｇ）からなった。
【０１２０】
試験を開始する前に、１０匹の動物全てから血液を採取し、試薬のバックグラウンドと最初のＢ細胞集団を測定するために用いた。以降の血液サンプルは全て、各抗体投与の前に採取した。完全な検死と組織病理学のために、１３日目に、第３及び４グループを屠殺した。
【０１２１】
第０、１、３、７、１３、２１、３７、及び５２日に、第１、２、及び５グループの動物から採血した；ヘパリン処理されたチューブに約５ｍＬの全血を吸引した。全血を４℃に保ち、２４時間以内に分析した。各動物から得た血液を２０００ｒｐｍで、５分間遠心し、ＲＩＡによる血清２Ｂ８レベルのアッセイのために、上清の血漿を取り除いた（具体的なアッセイ法についてはＲＩＡの手順を参照）。ＰＢＬとＲＢＣを含有する沈降した物体はＦＡＣＳ分析のために、ＦＣＳ中に再懸濁した。
【０１２２】
ｂ．２Ｂ８と２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡを用いた薬物動態学的研究
カニクイザル中での２Ｂ８の平均血清β半減期は、第５グループの動物（上記）を用いて決定した。２．０μｇ／ｍＬになるように、１０ｍＭのホウ酸緩衝液、ｐＨ９．６中に、ヤギ抗マウスＩｇＧ１（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を希釈し、９６ウェルのプレートの各ウェルに５０μＬを加えた。４℃で一晩、又は室温で２時間、該抗体をプレートに結合させた。１５０μＬ／ウェルの１％ＢＳＡ含有ＰＢＳにより、３０分間、室温で各プレートをブロックした。蒸留水でプレートを洗浄し、まず１：１００に希釈した後、段階的に１：２に希釈した各ウェルに、血清又は血漿サンプルを３つずつ加えた。予め採血した血清に、精製された２Ｂ８を加え、０．５ｍｇ／ｍＬから始まる標準曲線として使用するために希釈した；サンプルを１：１００に希釈した後に、他のサンプルと同様に、系列希釈した。１時間室温でプレートをインキュベートし、蒸留水で４回洗浄した。続いて、１：４０００の希釈で、２次試薬（ヤギ抗マウスＩｇＧ１−ＨＲＰＯ）を加え、室温でさらに１時間インキュベートした。再度、プレートを蒸留水で洗浄し、過酸化水素を含有する、０．１ｍＬのペルオキシダーゼ基質を加えた。反応から２０分間、呈色させた；続いて、マイクロプレートＥＬＩＳＡリーダーを用いて、４０５ｎｍの吸光度を測定した。結果は、μｇ抗体／ｍＬ血清でプロットした。
【０１２３】
さらに、ＢＡＬＢ／ｃマウスで、２Ｂ８と２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡのβｔ１／２値を決定した。１×ＰＢＳ、ｐＨ７．４／１０％グリセロール中、−７０℃で保存した未接合の２Ｂ８を融解し、０．５ｍｇ／ｍＬに希釈し、無菌濾過した。標準的であるが、炭素［１４］標識されたキレートを用いたプロトコールに従って、接合抗体を調製した。キレートの取り込みは、１．５モル／モル抗体であった。正常な生理的食塩水（０．９％）中に、０．５ｍｇ／ｍＬになるように、精製された接合体を希釈し、滅菌濾過し、使用するまで、ネイティブの抗体とともに４℃で保存した。
【０１２４】
６〜８週齢のマウスに、２５０μｇ／ｍＬの濃度で、１００μＬの精製された２Ｂ８抗体を注射した。続いて、０〜２６４時間にわたる様々な時点に、後眼窩穿刺によってマウスから採血し、抗原陽性Ｂ細胞株ＳＢを捕捉物として使用したホールセル酵素免疫検定によって、ネイティブ及び接合２Ｂ８抗体の存在についてそれらの血清を分析した。得られたデータは、時間に対して２Ｂ８又は２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡの濃度としてプロットした；これらの結果から、線形回帰プロットが得られ、勾配はβｔ１／２値を決定するために使用した。
【０１２５】
ｃ．カニクイザルにおける［８９］−Ｙ−２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡの薬理学／毒性学試験
イットリウム−［８９］を有する２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡは、ＨＰＬＣ精製を使用しなかったことを除いて、９０Ｙの挿入について記載したプロトコールを用いて調製した。７５ｍｇ／ｍＬのＨＳＡと１ｍＭのＤＴＰＡを含有する１×ＰＢＳ中に、非放射性の、金属を有する接合体を調合し、Ｗｈｉｔｅ  Ｓａｎｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒにおいて、ＧＬＰ研究番号９２０６１１で計測した。４つの各グループには、雄１匹と雌１匹のサルが含まれた。動物には、合計７回、４８時間おきに、以下の量の薬物：第１グループ（生理的食塩水）；第２グループ（０．００３ｍｇ／ｋｇ）；第３グループ（０．０３ｍｇ／ｋｇ）；第４グループ（０．３ｍｇ／ｋｇ）を静脈内注射した。試験中、体重と温度、食物と水の消費、排泄、血清の化学、血液学、尿分析、及び身体的検査を測定することによって、動物を評価した。第１〜４グループの動物から、第０、２、７、１０、及び１４日目に、注射に先立って採血し、ＦＡＣＳ分析によって、循環するＢ細胞のレベルについて血液を分析した。
【０１２６】
ｄ．放射標識された２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡの生体分布
予備的実験では、６〜８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスでの組織生体分布について、１１１Ｉｎ標識された２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡを評価した。放射標識された接合体は、上記の「ミックス＆シュート」プロトコールに従って、臨床グレードの２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡを用いて調製した。接合体の比活性は２．３ｍＣｉ／ｍｇであり、５０ｍｇ／ｍＬのＨＳＡを含有するＰＢＳ、ｐＨ７．４の中に接合体を調合した。マウスの腹腔内に、１００μＬの１１１Ｉｎ標識された２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡ（約２１μＣｉ）を静脈内注射し、頸椎脱臼によって、０、２４、４８、及び７２時間目に、３匹のマウスからなるグループを屠殺した。屠殺後、尾、心臓、肺、肝臓、腎臓、脾臓、筋肉、及び大腿骨を取り出し、洗浄し、秤量した；血液のサンプルも分析のために採取した。ガンマカウンターによって、各試料に含まれる放射能を測定し、続いて、グラム組織当たりのパーセント投与線量を決定した。各臓器に付着した血液によってもたらされる活性の寄与を差し引くことは試みなかった。
【０１２７】
別のプロトコールでは、両調製物ともに、２．１ｍＣｉ／ｍｇの比活性になるように、４℃及び３０℃で１０週間インキュベートした２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡのアリコットを１１１Ｉｎで放射標識した。続いて、これらの接合体は、上記のように、マウスでの生体分布研究で使用した。
【０１２８】
線量測定のために、２．３ｍＣｉ／ｍｇの比活性になるように、２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡを１１１Ｉｎで放射標識し、約１．１μＣｉを２０匹の各ＢＡＬＢ／ｃマウスに注射した。続いて、それぞれ５匹のマウスからなるグループを、１、２４、４８、及び７２時間目に屠殺し、それらの臓器を取り出し、分析のために調製した。さらに、皮膚、筋肉、及び骨の一部を取り出し、分析のために処理した；尿と糞も集め、２４〜７２時間の時点で分析した。
【０１２９】
同様のアプローチを用いて、２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡを９０Ｙでも放射標識し、
７２時間にわたって、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける、その生物学的な分布を評価した。ＨＰＬＣサイズ排除クロマトグラフィーによる精製に続いて、５匹のマウスからなる４つのグループそれぞれに、約１μＣｉの臨床的に調合された接合体（比活性：１２．２ｍＣｉ／ｍｇ）を静脈内に注射した；続いて、１、２４、４８、及び７２時間目にグループを屠殺して、上記のように、それらの臓器と組織を分析した。各組織の試料に伴った放射能は、ガンマシンチレーションカウンターで制動放射エネルギーを測定することによって決定した。続いて、グラム組織当たりのパーセント投与線量又は臓器当たりのパーセント投与線量として、活性値を表した。表面の血液を除去するために、臓器及び他の組織は、繰り返しリンスしたが、臓器は潅流しなかった。このように、内部に含まれる血液によってもたらされる活性の寄与は、臓器の活性値から差し引かなかった。
【０１３０】
ｅ．１１１Ｉｎ標識された２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡの腫瘍分布
放射標識された２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡの分布を、ＲａｍｏｓのＢ細胞腫瘍を有する胸腺欠損マウスにおいて決定した。６〜８週齢の胸腺欠損マウスに、胸腺欠損マウスでの増殖に予め適合された１．２×１０７のＲａｍｏｓ腫瘍細胞を含有する０．１ｍＬのＲＰＭＩ−１６４０を皮下注射（左後ろの脇腹）した。２週以内に腫瘍が発生し、重量は０．０７〜１．１ｇにわたった。マウスの静脈内に１００μＬの１１１Ｉｎで標識された２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡ（１６．７μＣｉ）を注射し、頸椎脱臼によって、０、２４、４８、及び７２時間に３匹のマウスからなるグループを屠殺した。屠殺後、尾、心臓、肺、肝臓、腎臓、脾臓、筋肉、大腿骨、及び腫瘍を取り出し、洗浄し、秤量した；血液のサンプルも分析のために採取した。ガンマカウンターによって、各試料に伴われる放射能を測定し、グラム組織当たりのパーセント投与線量を決定した。
【０１３１】
３．線量測定の計算
１１１Ｉｎ又は９０Ｙで標識された２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡの何れかを投与したＢＡＬＢ／ｃマウスを用いて得られた生体分布データ（表１〜４及び５〜８）を使用して、核医学協会のＭｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ｄｏｓｅ  （ＭＩＲＤ）  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって正式に承認されたアプローチを用い、７０Ｋｇの患者に投与された１．０ｍＣｉの線量から吸収される放射線量の概算値を計算した。前記放射標識された接合体の生物学的半減期は、各放射性免疫接合体の生体分布データから決定された臓器値当たりの投与線量から決定した。幾つかの組織、例えば、血液については、放射性接合体の生物学的な崩壊が、これらのコンパートメントから指数的に崩壊する２コンパートメントモデルに従うと仮定した。７２時間の生体分布研究を通じて、その活性レベルが概ね一定を保ったその他の組織、例えば肝臓については、生物学的半減期が極めて長いと仮定し、１０００時間の値を割り当てた。
【０１３２】
【表１】
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【表２】
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【表３】
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【表４】
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【表５】
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【表６】
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【表７】
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【表８】
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同様に、指数崩壊のｔ１／２を計算するための標準的な式を用いて、他の生物学的半減期の値を割り当て、又は計算した。これらの値を決定すると、これらの表の上に記載された式（出力変数）を用いて、各放射標識された接合体に対して、表９及び１０に列記されたＴｕｅ、Ｔｅｌ、Ｔｅ２、Ａ１、Ａ２、及びＡに対する変数が決定された。これらの値は、続く表に示された値と同様に、カリフォルニア州９２１６１、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＶＡ医療センター、核医学施設、Ｍｒ．Ｐｈｉｌｌｉｐ  Ｌ．  Ｈａｇａｎ，  ＭＳによって、Ｓｙｍｐｈｏｎｙ  ｓｐｒｅａｄｓｈｅｅｔ（Ｌｏｔｕｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｃｏｒｐ．）中に書かれたプログラムを用いて計算された。
【０１３３】
【表９−１】
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【０１３４】
【表９−２】
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【０１３５】
【表１０−１】
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【０１３６】
【表１０−２】
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表９と１０の総累積活性（Ａ）値とＭＩＲＤ  Ｐａｍｐｈｌｅｔ  Ｎｕｍｂｅｒ  １１に与えられているＳ値（表１１及び１２、並びに１３及び１４）を用いて、列記した組織に対して、各放射標識された接合体につき、放射能吸収線量の推定値を決定した（表１５、１６、１７、及び１８）。表１９に記載されたインジウム標識接合体に対する概略の放射線量の推定値を決定する際には、ある臓器の自己線量に、隣接する臓器又は組織の活性によって生じた吸収線量を加算した。しかしながら、イットリウム標識した接合体に割り当てられた放射線量の推測値を算出する際には（表２０）、前記値のうちのあるものは、列記された組織（例えば、副腎）に存在しない。これは、放出された１３粒子の路程が、放出されたｇ粒子の路程に比べて短く、このため、隣接する組織からの活性の寄与が無視でき、これらの組織に対する主要な生体分布データがないことによるものである。
【０１３７】
【表１１−１】
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【０１３８】
【表１１−２】
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【０１３９】
【表１１−３】
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【０１４０】
【表１２−１】
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【０１４１】
【表１２−２】
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【０１４２】
【表１３−１】
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【０１４３】
【表１３−２】
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【０１４４】
【表１４−１】
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【０１４５】
【表１４−２】
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【０１４６】
【表１５−１】
0004704570.tif 000023
【０１４７】
【表１５−２】
0004704570.tif 000024
【０１４８】
【表１５−３】
0004704570.tif 000025
【０１４９】
【表１６−１】
0004704570.tif 000026
【０１５０】
【表１６−２】
0004704570.tif 000027
【０１５１】
【表１６−３】
0004704570.tif 000028
【０１５２】
【表１６−４】
0004704570.tif 000029
【０１５３】
【表１７−１】
0004704570.tif 000030
【０１５４】
【表１７−２】
0004704570.tif 000031
【０１５５】
【表１７−３】
0004704570.tif 000032
【０１５６】
【表１７−４】
0004704570.tif 000033
【０１５７】
【表１８−１】
0004704570.tif 000034
【０１５８】
【表１８−２】
0004704570.tif 000035
【０１５９】
【表１８−３】
0004704570.tif 000036
【表１９】
0004704570.tif 000037
【表２０】
0004704570.tif 000038
１．ＩＩ．結果
Ａ．２Ｂ８と２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡを用いたインビトロ実験
１．抗ＣＤ２０抗体２Ｂ８の作成と特性決定
合計９つの融合によって、放射標識されたＣｏｕｌｔｅｒのＢ１抗体と有効に競合する抗体を産生する３つのハイブリドーマが得られた。それぞれのケースで、ハイブリドーマは、２４ウェルのプレート中に増殖された。融合３及び４から単離された最初の２つの抗体のイソタイプを決定し、何れもＩｇＭと同定した。融合５で作られる第３の抗体は２Ｂ８と名付けられ、ＩｇＧ１κイソタイプであることが決定され、持続研究のために選択した。クローン２Ｂ８．Ｈｌｌを増殖させ、液体窒素中で、長期間保存した。クローン２Ｂ８．Ｈｌｌ．Ｇ３、さらにクローン２Ｂ８．クローンＨｌｌ．Ｇ３．Ｇ作成するために、クローン２Ｂ８．Ｈｌｌをサブクローニングした。さらなる研究のために、このクローンを増殖させ、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって抗体を精製した。
【０１６０】
未標識の２Ｂ８、Ｂ１、及びＬｅｕ１６、並びに放射標識されたＣｏｕｌｔｅｒのＢ１を用いた拮抗アッセイによって、同じ濃度のＢ１とＬｅｕ１６の何れよりも効率的に、２Ｂ８が、ＣＤ２０へのＢ１の結合を阻害できることが実証された（図１）。ＦＩＴＣ接合２Ｂ８、ネイティブＢ１、及び無関係の抗体ＵＰＣ−１０、及びＳ−００３（それぞれ、ＩｇＧ２ａ及び１イソタイプ）を用いた拮抗研究において、同様の結果が得られた（データは示さず）。
【０１６１】
２Ｂ８とＢ１抗体による細胞のＣＤ２０抗原への直接的な結合は、ＣＤ２０抗原陽性ＳＢ細胞とＣＤ２０抗原陰性ＨＳＢ細胞を用いたＦＡＣＳ分析によって比較した。図２に示された結果は、同じような量の抗体であれば、Ｂ１より２Ｂ８のほうが多くＳＢ細胞に結合したことを示している。ＳＢ細胞への有意な結合は、無関係な抗体では全く観察されなかった。ＨＳＢ細胞を用いると、何れの試薬についても、バックグラウンド蛍光しか観察されなかった。これらの結果は、２Ｂ８のＣＤ２０抗原との相互作用の特異性を確認し、２Ｂ８が、Ｂ１に比べて、細胞表面の抗原に対して高い親和性を有するかもしれないということを示唆している。
【０１６２】
２Ｂ８の見かけの親和性を決定するために、１２５Ｉで精製された抗体を放射標識し、濃度が増加する標識抗体を抗原陽性ＳＢ細胞とともにインキュベートした；細胞に付随する放射能は、１時間のインキュベーション期間後に決定した（図３）。この結果は、２Ｂ８抗体が、４．３×１０−９Ｍの見かけの親和定数でＣＤ２０抗原に結合することを示唆している。
【０１６３】
ヒトの正常な末梢血リンパ球を用いたフローサイトメトリー実験は、２Ｂ８がＢ細胞に特異的で、他の種類のリンパ球（例えば、Ｔ細胞、単球、マクロファージ）とは反応しないことが示された。同じヒトリンパ球の集団を用いて、ＦＩＴＣ標識された２Ｂ８を、Ｂ１−ＦＩＴＣ及びＬｅｕ１６−ＦＩＴＣと比較した。表２１に示された結果は、２Ｂ８が約１４％の末梢血リンパ球と反応したのに対して、Ｌｅｕ１６では約１２％、Ｂ１では１１％が反応したことを示している。別のＢリンパ球マーカー（ＣＤ−１９）に基づいたリンパ球の集団は、１１〜１４の間であった。最後に、ヒトの末梢血リンパ球を２Ｂ８及びＢ１又はＬｅｕ１６の何れかとインキュベートした後、ＣＤ１９マーカー（Ｂｅｃｔｏｎ／Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で対比染色を行うと、２Ｂ８ではＢリンパ球の二重染色集団が９％であったが、Ｂ１又はＬｅｕ１６では１０％であった。これらの結果は、これらの試薬が類似していることを確認している。
【０１６４】
【表２１】
0004704570.tif 000039
２Ｂ８又はＢ１の何れかによる放射標識された細胞のＣＤ２０抗原の免疫沈降によって、約３３及び３５ＫＤの分子量を有する、区別できない２本のタンパク種の沈降が得られた（データは示さず）。
【０１６５】
２．２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡの作成と特性決定
２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡ接合体は、前記抗体を４：１モル過剰のイソチオシアナートベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸と反応させることによって作成された（４）。典型的には、１モルの２Ｂ８抗体当たり、１〜２ｍｏｌのＭＸ−ＤＴＰＡキレートが導入された。図４に記載された結果に示されているように、２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡ接合体は、ネイティブと接合２Ｂ８抗体は何れも、実質的に同一のＢ１阻害プロフィールを示されているように、見かけ上、ネイティブ２Ｂ８と比べて、免疫反応性が全く喪失していなかった；２Ｂ８及び２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡのＩＣ５０値は、それぞれ、約３〜４μｇ／ｍＬであった。これらの結果は、ＳＢ細胞を用いて行ったホールセル放射線免疫検定で、１２５Ｉで標識されたＢ１抗体を用いて得られた。１２５Ｉ標識２Ｂ８のＳＢ細胞への結合の阻害剤として、２Ｂ８又は２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡを用いても、同様の結果が得られた；２Ｂ８とそのＭＸ−ＤＴＰＡ接合体は何れも、約３〜４μｇ／ｍＬの濃度で、ＳＢ細胞への１２５Ｉ−２Ｂ８の結合を阻害した（データは示さず）。
【０１６６】
ネイティブの２Ｂ８抗体と２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡ接合体のインビトロでの安定性を評価するために、通常の生理的食塩水又は１０ｍＭのグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ  ６．８を含有する生理的食塩水の中のサンプルを、４℃と３０℃で、１２週間インキュベートし、以下のアッセイ：ホールセル酵素免疫検定による免疫反応性、還元及び非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及び等電点ゲル電気泳動を用いて、アリコットを毎週アッセイした。免疫反応性アッセイが、何れの温度でインキュベートした抗体サンプルによる抗原認識についても喪失を検出しなかったのに対して（図５）、該抗体に対する等電点電気泳動の範囲（ゼロ週でｐＨ７．３０〜８．４０）は、４℃で安定であり、６週後には、３０℃で、０．２ｐＨ単位の減少を示した（表２２）。しかしながら、該アッセイの実験誤差の限界なので、この結果は不確実かもしれない。
【０１６７】
【表２２】
0004704570.tif 000040
最後に、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いると、３０℃で、抗体サンプルは、１週後に高分子量の凝集を示した（表２３）。ゲルの濃度測定分析によって、該凝集物が、サンプルの８〜１７％に相当することが示された（表２３）。しかしながら、これらのサンプルを還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析すると、高分子量種の痕跡は見出されず、共有結合の抗体凝集物が３０℃で形成されることを示唆している。ここでも、免疫反応性の喪失は観察されなかった。
【０１６８】
【表２３】
0004704570.tif 000041
この安定性試験の間、９０Ｙを用いて、４℃及び３０℃でインキュベートされた２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡのサンプルの放射性金属の取り込みについても調べた。４、８、及び１２週目にアッセイしたサンプルは、インキュベーション温度にかかわらず、９０％を超える９０Ｙを取り込んだ。
【０１６９】
最後に、別の実験では、４℃及び３０℃で１０週間インキュベートされた２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡのアリコットを１１１Ｉｎで放射標識し、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるそれらの組織生体分布を評価した。両インキュベーション温度からの接合体は、類似の生体分布をもたらした（データは示さず）。さらに、得られた結果は、４℃で保存した１１１Ｉｎ標識された接合体を用いて、ＢＡＬＢ／ｃマウスで得られた生体分布の結果と同様であった（以下参照）。
【０１７０】
１１１Ｉｎと９０Ｙの両者の放射標識プロトコールは、再現性があることが見出された。典型的には、１１１Ｉｎでは９５％を超える放射能の取り込みが、９０Ｙでは９０％を超える放射能の取り込みが得られた。１１１Ｉｎと９０Ｙ標識された接合体の比活性は、それぞれ、一般的には、２〜３及び１０〜１５ｍＣｉ／ｍｇ抗体の範囲であった。１１１Ｉｎと９０Ｙ放射標識プロトコールの最初の開発においては、ＨＰＬＣゲル浸透クロマトグラフィーを用いて、複合体を形成していない放射性同位体を、放射標識された２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡから除去した。この同位体で（９５％を超える）高い放射能の取り込みが得られたので、後の実験では、インジウム標識された接合体のＨＰＬＣ精製は省略した。
【０１７１】
１１１Ｉｎ及び９０Ｙ標識された２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡの調製物の免疫反応性は、Ｌｉｎｄｍｏの方法によって分析した（３）。１１１Ｉｎ標識された２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡは、１００％免疫反応性を有することが見出され（図６）、９０Ｙ標識された接合体は６０％が免疫反応性を有していると決定された（データは示さず）。
【０１７２】
３．１１１Ｉｎ及び９０Ｙ標識された２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡの特性決定
９０Ｙ標識された接合体を用いた予備的実験によって、１０ｍＣｉ／ｍｇ抗体を超える比活性で、著しい抗体の崩壊と免疫反応性の喪失が起こることが実証された。それ故、放射線分解の影響を最小にするための調合を開発した。数多くの低分子量フリーラジカルスカベンジャーを評価し、有効であることを見出したが、抗体の完全性と免疫反応性を保持するには、高濃度のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）最も有効であった（図７〜９）。
【０１７３】
７５ｍｇ／ｍＬのＨＳＡを含有する１×ＰＢＳ、ｐＨ７．４の中で、９０Ｙ標識された抗体を調合した。抗体から失われ得る全ての９０Ｙが確実にキレートされるように、最終濃度が１ｍＭになるように、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）も加えた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥとオートラジオグラフィーを用いて、１４．６ｍＣｉ／ｍｇの比活性まで放射標識された２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡの崩壊を、０及び４８時間に評価した。図８と９は、４℃で４８時間にわたってインキュベートしたときに、放射標識された抗体が、有意な崩壊を示さなかったことを示している。簡易薄層クロマトグラフィーを用いた分析によって、４８時間のインキュベーション中に、９０Ｙの喪失は２％未満であることが示された（表２４）。免疫反応性は、６０％でも比較的一定であった（表２４）。
【０１７４】
【表２４】
0004704570.tif 000042
１１１Ｉｎ標識接合体を用いた調合実験も行った；比活性は２．２ｍＣｉ／ｍｇであった。５０ｍｇ／ｍＬのＨＳＡを含有する１×ＰＢＳ、ｐＨ７．４の中で、放射標識された抗体を評価した。図１０は、ゼロ及び４８時間インキュベートしたサンプルのオートラジオグラムの写真を示している；オートラジオグラムの濃度測定分析は、実験期間中に、放射標識された抗体が崩壊しなかったことを示している（図１１、１２）。該サンプルの簡易薄層クロマトグラフィー分析は、１１１Ｉｎが全く失われていないことを実証し（表２５）、さらに、免疫反応性は、ほぼ１００％維持されていた（表２５）。
【０１７５】
【表２５】
0004704570.tif 000043
臨床的に調合され、１４．６ｍＣｉ／ｍｇの比活性になるように、９０Ｙで放射標識した２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡの調製物を、ヒトの血清中、３７℃で９６時間インキュベートし、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥとオートラジオグラフィーによって分析すると、インキュベーション期間中に、４％未満の放射性同位体が失われていた。ゼロ時と９６時間でのオートラジオグラムの濃度測定スキャンによって、放射標識された接合体に有意な崩壊がないことが示された（図１３〜１５）。これらの結果は、分析用薄層クロマトグラフィーによる、ゼロ時と９６時間のサンプルの分析によって支持された（表２６）。これらの結果を総合すると、イットリウム標識された接合体は、本研究で使用した条件下では安定であることが示唆される。１１１Ｉｎ標識された２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡ接合体を用いても、同様の結果が得られた（図１６〜１８）。
【０１７６】
【表２６】
0004704570.tif 000044
Ｂ．動物実験
１．２Ｂ８及び２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡを用いた高用量薬理学／毒性学試験
Ｗｈｉｔｅ  Ｓａｎｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒで実施したＧＬＰ試験（研究番号９２０１１１）では、カニクイザルに、様々な用量の２Ｂ８を静脈内投与した。各新しい注射の前に血液サンプルを採取し、リンパ球の集団をフローサイトメトリーで評価するために、血液を処理した（表２７）。
【０１７７】
【表２７−１】
0004704570.tif 000045
【０１７８】
【表２７−２】
0004704570.tif 000046
【０１７９】
【表２７−３】
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本研究中又は本研究後に調べた何れの臨床的パラメーターにも、抗ＣＤ２０抗体２Ｂ８の投与に関連した有意な薬理学的毒性効果は見られなかった。同様に、グループ３と４の動物から得られた様々な組織病理学用の標本の分析中にも、異常は見られなかった。
【０１８０】
試験期間は１４日であり、研究中に、以下のカテゴリー：臨床的な観察、体重、体温、食物と水の摂取、糞の排泄、血清の化学、血液学、尿分析、及び身体的検査について動物を調べた。さらに、０、１、７、及び１３日目に、各グループの動物から採血し、血清の抗体（２Ｂ８）レベルとＴ及びＢ細胞レベルについて血液を分析した。１３日目に、第３及び４グループの動物を屠殺し、試料調製後に、光学顕微鏡によって、選択した組織を調べた。調べた組織は、心臓、脾臓、肝臓、腎臓、肺、大脳皮質、脊髄、リンパ節、胃、回腸、結腸、骨格筋、精巣／卵巣、膵臓、及び骨髄であった。
【０１８１】
循環するＴ及びＢ細胞のレベルについて、処置した動物から得た血液を分析すると、第２〜５グループの動物が、１３日を通じて、５０％を超える循環Ｂ細胞の喪失を示した（図１９）；抗体の投与は、Ｔ細胞のレベルに全く影響を与えなかった（データは示さず）。２Ｂ８を与えたグループは全て、血漿中に、Ｂ細胞の飽和と過剰な抗体を示した（示さず）。１０．０ｍｇ／Ｋｇ用量の２Ｂ８を単回投与した第５グループの動物も、他のグループの動物で観察されたものと同じ循環Ｂ細胞レベルの減少を示した。
【０１８２】
第１、２、及び５グループの動物は、５２日にわたって調べた（図２０）。グループ２の動物１匹（ＰＲＯ８０４）とグループ５の動物１匹（ＰＲＯ７１６）を除いて、３８日までに、Ｂ細胞のレベルは、正常の７０％を超えるまで回復した。これらの動物における循環Ｂ細胞のレベルは、５２日後にも、正常レベルの約４０％に留まった。
【０１８３】
本研究に加えて、Ｗｈｉｔｅ  Ｓａｎｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒで実施したＧＬＰ試験（研究番号９２０６１１）では、カニクイザルで８９Ｙ−２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡの薬理学的毒性効果を評価した。非放射性の８９Ｙとともに、臨床グレードの接合体をロードした。７５ｍｇ／ｍＬのヒト血清アルブミンと１ｍＭのＤＴＰＡを含有するＰＢＳ、ｐＨ６．８中に、イットリウムを有する接合体を調合し（臨床用調合）、方法の部に記載したように、静脈内投与した。
【０１８４】
図２１の結果に示されているように、投与した線量にかかわらず、８９Ｙ標識された２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡは、影響を有するとしても、これらの動物の循環Ｂ細胞に対してごく僅かな影響しか有していなかった。さらに、リンパ球が一般に消失（２０〜４３％）したこと以外は、血清の化学、尿分析、体重と体温を含む、調べた全ての臨床パラメーターには、有意な異常は見られなかった。
【０１８５】
２．２Ｂ８と２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡを用いた薬物動態学的研究
上述のように、ＧＬＰ試験の第５グループの動物には、１０．０ｍｇ／ｋｇの２Ｂ８を単回投与した。データの線形回帰分析は、約４．５日のβｔ１／２値で、これらのサルの循環系からネイティブの抗体が除去されたことを示唆している。ＢＡＬＢ／ｃマウスを用いた類似の研究では、線形回帰分析（示さず）によって、ネイティブと接合２Ｂ８のβｔ１／２値は８．７５日であることが決定された（図２２）。これらの結果は、２Ｂ８の接合が、ＢＡＬＢ／ｃマウからの２Ｂ８のクリアランスに影響を与えないことを示唆している。
【０１８６】
３．放射標識された２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡを用いた生体分布及び腫瘍分布研究
上記の予備的生体分布実験に基づき（セクション２ｄ）、２．３ｍＣｉ／ｍｇの比活性になるように、接合２Ｂ８を１１１Ｉｎで放射標識し、それぞれ２０匹のＢＡＬＢ／ｃマウスに、約１．１μＣｉを注射し、放射標識された物質の生体分布を決定した。続いて、１、２４、４８、及び７２時間に、５匹のマウスからなる各グループを屠殺し、それらの臓器と皮膚、筋肉、及び骨の一部を取り出し、分析のために処理した。さらに尿と糞を集め、２４〜７２時間の時点で分析した。血液中の放射能レベルは、１時間目における４０．３％の投与線量／グラムから、７２時間目には、１８．９％に落ちた（表１〜４；図２３）。心臓、腎臓、筋肉、及び脾臓の値は、実験を通じて、０．７〜９．８％の範囲に留まった。肺に存在する放射能のレベルは、１時間目の１４．２％から７２時間目には７．６％に減少した；同様に、グラム当たりの各肝臓の投与線量の値は、１０．３％と９．９％であった。これらのデータは、１１１Ｉｎ−２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡの放射能吸収線量の概算値を測定する際に使用した（表１９）。
【０１８７】
１２．２ｍＣｉ／ｍｇ抗体の比活性を有する９０Ｙ標識された接合体の生体分布をＢＡＬＢ／ｃマウスで評価した。９０％を超える放射能の取り込みが得られ、放射標識された抗体をＨＰＬＣによって精製した。７２時間にわたって、主要な臓器、並びに皮膚、筋肉、骨、尿、及び糞における放射能の組織蓄積を調べ、パーセント投与線量／グラム組織として表した。表５〜８及び図２４に示された結果は、血液に付随する放射能のレベルが、１時間の時点での約３９．２％の投与線量／グラムから、７２時間後には約１５．４％に減少しているのに対して；尾、心臓、腎臓、筋肉、及び脾臓に付随する放射能のレベルは、１０．２％以下で、実験を通じて、かなり一定であったことを実証している。重要なことに、骨に含まれる放射能は、１時間の時点での４．４％の投与線量／グラム骨から、７２時間での３．２％までの範囲にあった。総合すると、これらの結果は、遊離のイットリウムは、接合体にほとんど不随しておらず、研究の間に、遊離の放射性金属はほとんど放出されなかったことを示唆している。これらのデータは、９０Ｙ−２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡの放射能吸収線量の推測値を決定する際に用いた（表２０）。
【０１８８】
腫瘍分布研究のために、２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡを調製し、２．７ｍＣｉ／ｍｇの比活性になるように、１１１Ｉｎで標識した。続いて、ＲａｍｏｓのＢ細胞腫瘍を有する１２匹の胸腺欠損マウスそれぞれに、１００μＬの標識された接合体（約２４μＣｉ）を注射した。腫瘍の重量は、０．１〜１．０ｇの範囲であった。注射から０、２４、４８、及び７２時間の時点で、後眼窩穿刺によって５０μＬの血液を採取し、頸椎脱臼によってマウスを屠殺し、尾、心臓、肺、肝臓、腎臓、脾臓、筋肉、大腿骨、及び腫瘍を取り出した。組織の処理と秤量後に、ガンマカウンターを用いて、各組織試料に含まれる放射能を測定し、値をパーセント投与線量／グラムとして表した。
【０１８９】
結果（図２５）は、１１１Ｉｎ−２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡの腫瘍濃度が、実験の間を通じて着実に増加したことを示している。投与した線量の１３％が、７２時間後に腫瘍の中に蓄積した。対照的に、血液のレベルは、実験中に、ゼロ時の３０％以上から７２時間で１３％に減少した。（筋肉を除く）他の全ての組織は、実験の終了までに、１．３〜６．０％の投与線量／グラム組織を含有していた；筋肉組織は、約１３％の投与線量／グラムを含有していた。
【０１９０】
Ｃ．線量測定
正常なＢＡＬＢ／ｃマウスでの生体分布研究から得られ、インジウム標識された接合体とイットリウム標識された接合体のそれぞれについて表１９及び２０に示されている線量測定データの要約は、投与線量のｍＣｉ当たりについて比較すると、文献のデータと一致しており（５）、２Ｂ８のイットリウム及びインジウム標識接合体がともに、リンパ腫患者で臨床的な効力を安全に示し得ることを示唆している。
【０１９１】
Ｄ．毒性学
１．２Ｂ８：単回投与の一般安全性試験
マウスとモルモットに、２Ｂ８を単回腹腔内投与し（それぞれ、０．５ｍＬ又は５．０ｍＬ）、７日間観察した。明白な毒性の徴候は検出されなかった。
【０１９２】
２．２Ｂ８及び２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡ：ヒトの組織を用いた免疫組織学検査
アセトンで固定した３２の異なるヒト組織の群を用いて、マウスのモノクローナル抗体２Ｂ８の組織反応性を調べた。抗体２Ｂ８は、極めて限局した組織分布のパターンを有する抗ＣＤ２０抗原と反応し、造血系由来のものを含むリンパ系組織中の細胞のサブセット中にしか観察されない。
【０１９３】
リンパ節では、胚中心中の増殖性細胞に加えて、成熟した皮質Ｂリンパ球の集団に免疫反応性が観察された。陽性反応は、末梢血、扁桃腺のＢ細胞領域、白脾髄、及び胸腺に見出される髄性リンパ球の４０〜７０％に陽性の反応が見られた陽性の反応は、大腸の固有層（パイヤーの斑；Ｐａｙｅｒ‘ｓ  Ｐａｔｃｈｅｓ）の濾胞にも見られた。最後に、膀胱、乳房、子宮頸管、食道、肺、耳下腺、前立腺、小腸、及び胃を含む様々な臓器の間質の中の凝集又は散乱したリンパ球細胞も、抗体２Ｂ８で陽性であった。
【０１９４】
様々な臓器の重層上皮及び扁平上皮と同様に、全ての単層上皮細胞は、反応性がないことが見出された。同じく、脳、脊髄、及び末梢神経を含む神経外胚葉細胞でも反応性は見られなかった。骨格及び平滑筋細胞、繊維芽細胞、内皮細胞、及び多形核炎症細胞のような間葉成分も陰性であった。
【０１９５】
２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡ接合体の組織反応性は、アセトンで固定された１６のヒト組織群を用いて調べた。ネイティブの抗体で以前に実証されたように、２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡ接合体は、極めて限局された分布パターンを示すＣＤ２０抗原を認識し、リンパ球由来の細胞のサブセット上だけに見出された。リンパ節では、免疫反応性は、Ｂ細胞の集団で観察された。白脾髄と胸腺の髄質リンパ球には、強い反応性が見られた。膀胱、心臓、大腸、肝臓、肺、及び子宮でも散在するリンパ球に免疫反応性が観察され、これらの組織に存在する炎症細胞の存在によるものであった。ネイティブの抗体で述べたように（上記）、神経外胚葉細胞又は間葉成分にも反応性は観察されなかった。
【０１９６】
ＩＩＩ．考察
同じ表記のクローンによって産生されるマウスのモノクローナル抗ＣＤ２０抗体２Ｂ８は、ＣＤ２０抗原に特異性があることが知られている抗体との拮抗とスキャッチャード分析によって測定したところによれば、Ｂ１抗体で観察された親和性よりも高いかもしれない親和性を、Ｂ細胞のＣＤ２０抗原に対して示す。さらに、両抗体は、３３及び３５ＫＤの相対分子量を有する２重線を沈降させたので、免疫沈降データは、２Ｂ８によって沈降した抗原は、Ｂ１によって沈降されたものと同じ抗原と思われることを示唆している。末梢血リンパ球に対する２Ｂ８抗体の特異性の細胞蛍光分析は、該抗体がＢ細胞と特異的に反応し、Ｔ細胞又は他の種類のリンパ球と反応性を示さないことを実証している。最後に、予備的な安定性データは、該抗体が、３０℃で１２週間、免疫反応性を失わず、安定であることを示唆している。
【０１９７】
２Ｂ８抗体をメチルベンジルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）に接合しても、ネイティブの抗体と比較して、実質的に免疫反応性が減少しないことが観察された。さらに、１１１Ｉｎ又は９０Ｙの何れかで該接合体を放射標識すると、それぞれ、１００％及び６０％の免疫反応性を有する標識された接合体が得られた。３７℃で９６時間、ヒト血清中でインキュベートした１１１Ｉｎ又は９０Ｙ標識された接合体の安定性試験は、該試験中に放射性金属の喪失が無視できることを示し、該接合体を臨床に用いたときに、該接合体が安定であることを示唆している。
【０１９８】
インジウム標識された２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡの調製物を用いた胸腺欠損マウスでの腫瘍分布研究によって、他の組織に異常な蓄積をせずに、実験の間、腫瘍細胞に結合する接合体の量が増加することが実証された。さらに、生体分布から線量測定の測定値が得られた。さらに、生体分布実験から得られた線量測定の推測値は、文献に公表されたデータと一致している。最後に、ネイティブ及び接合抗体を用いたヒト組織の交叉反応実験は、両抗体が極めて限局した組織分布を有する抗原を認識し、造血系由来のものを含むリンパ系組織中の細胞のサブセットのみと反応することを示した。総合すると、これらの結果は、接合が抗体の組織特異性を変化させず、放射標識された接合体がインビボで安定であり、胸腺欠損マウスに実験的に作った腫瘍の表面に存在するＣＤ２０抗原を認識することを示唆している。
【０１９９】
高用量の薬理学／毒性学試験で２Ｂ８を使用したときには、該抗体は、本研究中又は本研究後の何れかに調べた何れのパラメーターにも、有意な薬理学的毒性効果を与えなかった。同様に、光学顕微鏡によって調べた様々な組織病理用の標本の分析中にも、異常は見られなかった。驚くべきことに、用いた全ての用量の抗体が、循環するＢ細胞を顕著に消失させた。しかしながら、循環するＢ細胞のレベルは、抗体の投与を一旦中止すると、ほぼ正常なレベルに戻った。単回投与のサルのグループ（第５グループ）では、ネイティブの抗体は、約４．５日の見かけのβｔ１／２値で、循環系から除去された。予想できたように、ＢＡＬＢ／ｃマウスで、この薬物動態学的研究を行うと、２Ｂ８抗体は、８．７５日のβｔ１／２値で除去された。このように、これらのデータを総合すると、ネイティブの抗体も、放射標識された接合体に付加して投与すると、幾らかの臨床的な効果を与え得ることが示唆される。
【０２００】
我々のデータ全体は、高親和性の２Ｂ８抗体とそのＭＸ−ＤＴＰＡ接合体が、限局したパターンのヒト組織の反応性を示すことを示している。さらに、霊長類では、ネイティブの抗体は毒性がなく、Ｂ細胞を一過性に喪失させる。しかしながら、一旦抗体を循環系から取り除くと、Ｂ細胞のレベルは、かなり迅速に復活する。さらに、インジウム及びイットリウム標識された２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡ接合体は、ヒトの血清中で長い間インキュベートしている間にも放射性金属は全く喪失せず、インビトロでは安定であるように見えた。最後に、ＢＡＬＢ／ｃマウスでの９０Ｙ又は１１１Ｉｎ標識された２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡの生体分布から得られた放射線量の推測値は、ｍＣｉの投与線量当たりでは、これらの同位体で放射標識した接合抗共有イディオタイプ抗体を用いたヒトの臨床試験で得られた線量の推測値と一致している。
【０２０１】
ＩＶ．９０Ｙ−２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡを調製するための「ミックス＆シュート」放射標識プロトコールの前臨床開発の概要
Ａ．序論
再発したＢ細胞リンパ腫を治療するための第Ｉ相臨床試験で、９０Ｙ標識されたマウスのモノクローナル抗ＣＤ２０抗体（２Ｂ８）を評価した。イットリウム標識された抗体を調製するために使用されていた元のプロトコールは、調合と患者への投与の前に、タンパク質に結合していない放射性同位体を除去するための高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）工程を使用していた。残念なことに、この工程は非常に時間がかかり、抗体が放射性同位体に対して保護されていない状態に長い間暴露されることになる。これにより、抗体の放射線分解が増加し、それに伴って、免疫反応性が減少する。さらには、該工程には手がかかるので、放射線製薬局で１日に１投与量を超えて調製することが困難である。工程を簡易化することによって、ＮＩＰＩ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓを放射線製薬局として用いる代わりに、臨床現場での実行が促進されるであろう。
【０２０２】
従って、高い放射能の取り込みと改善された免疫反応性の保持を維持しながら、ＨＰＬＣ精製が不要である、「ミックス＆シュート」法と称される改訂された放射標識操作を開発した。マウスでの生体分布研究に加えて、インビトロでの安定性試験も、「ミックス＆シュート」法を用いて調製した放射標識抗体が、現在のＨＰＬＣ工程を用いて作成したものと同等であることが示された。これらの前臨床試験の結果は、臨床試験での使用に適した９０Ｙ標識された２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡを調製するために、この新しい「ミックス＆シュート」プロトコールを使用できることを示している。
【０２０３】
Ｂ．物質と方法
物質
１．細胞
ヒトリンパ球芽性細胞株ＳＢ（ＣＤ２０陽性）とＨＳＢ（ＣＤ２０陰性）は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから取得し、１０％のウシ胎児血清を含有し、グルタミンが補充されたＲＰＭＩ−１６４０中で培養した。
【０２０４】
２．抗体
２Ｂ８抗体は、以前ＩＮＤ（ＢＢ−ＩＮＤ  ４８５０／４８５１）に記載したプロトコールを用いて、中空繊維のバイオリアクター上清から、製造部が精製した。
【０２０５】
３．他の試薬
塩化イットリウム−［９０］は、Ａｍｅｒｓｈａｍから取得した。他の試薬は全て、以下に示した添付の報告書に記載されている入手源から取得した。放射標識プロトコールに用いた試薬には、放射標識工程中に放射性同位体と競合し得る重金属イオンの混入を除去する処理を行った（方法の部、参照）。試薬は、ＧＭＰ条件下で、確立されたＢａｔｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｒｅｃｏｒｄｓに従って、ＩＤＥＣの製造部が作成した。
【０２０６】
方法
１．２Ｂ８−Ｄ４Ｘ−ＤＴＰＡの調製
水中の二ナトリウム塩として、Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙから臨床グレードのＭＸ−ＤＴＰＡを取得し、−７０℃で保存した。接合体（２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、製造部が調製した。これらの研究では、ロットが異なる２つの接合体を用いた；何れも、１０ｍｇ／ｍＬで、通常の生理的食塩水中に与えられた。滅菌された２ｍＬのポリプロピレン注射器の中に接合体を詰め、２〜８℃で保存した。
【０２０７】
２．無金属条件の維持
全ての試薬の取扱いは、金属の混入の可能性が最小になるように行った。可能なときには、フラスコ、ビーカー、及び目盛り付きのシリンダーのようなポリプロピレン又はポリスチレンのプラスチック容器を用いた。使用前に、これらをＡｌｃｏｎｏｘで洗浄し、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ又は洗浄用水（ＷＦＩｒ）で徹底的にリンスした。少量を正確に扱うために、無金属のピペットチップ（ＢｉｏＲａｄ）を用いた。より大量の試薬を扱うためには、無菌のプラスチック血清ピペットを用いた。反応は、ネジ蓋付きの１．８ｍＬのポリプロピレン製微量遠心管の中で、簡便に行った。
【０２０８】
３．放射能の取り込みの測定
放射能の取り込みは、ＳＯＰ  ＳＰ−１３−００８に従い、簡易薄層クロマトグラフィー（ＩＴＬＣ）を用いて３重に（ｔｒｉｐｌｉａｔｅ）測定した。一般的には、該プロトコールは以下のとおりであった。１ｍＭのＤＴＰＡ又は５ｍＭのＥＤＴＡを含有する１×ＰＢＳで、放射標識された接合体を１：２０に希釈した後、ＩＴＬＣ  ＳＧ紙（Ｇｅｌｍａｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）の１×５ｃｍ片の一端から１．５ｃｍに１μＬを滴下した。メタノール：水（１：１；ｖ／ｖ）中の１０％の酢酸アンモニウムを用いて紙を展開した。前記片を乾燥させ、横半分に切断し、シンチレーションカウンターによって、各部分に含まれる放射能を測定した。各片の下半分に含まれる放射能（タンパク質に含まれる放射能）は、上半分と下半分の両者の値を加えることによって求めた総放射能のパーセントとして表した。
【０２０９】
４．イットリウム−［９０］−標識された２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡのための「ミックス＆シュート」プロトコール
０．０４ＭのＨＣｌ中のＡｍｅｒｅｓｈａｍから購入したキャリアーなしの塩化９０イットリウムで抗体を放射標識した。放射性同位体のアリコット（１０〜２０ｍＣｉ／ｍｇ抗体）をポリプロピレンチューブに移し、０．０２×容量の無金属の２Ｍ酢酸ナトリウムを加えて、溶液のｐＨを３．６に調節した。すぐに、２Ｂ８−ＮａＤＴＰＡ（０．３ｍｇ；１０．０ｍｇ／ｍＬ、通常の生理的食塩水中）を加え、溶液を穏やかに混合した。溶液のｐＨが３．８〜４．１であることを確認するためにｐＨ紙でチェックし、５分間インキュベートした。７５ｍｇ／ｍＬのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）と１ｍＭのジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）を加えた１×ＰＢＳを含有する別のポリプロピレンチューブに反応混合物を移し、穏やかに混合することによって反応を停止させた。放射標識された抗体を２〜８℃で保存した。
【０２１０】
放射標識された接合体の適切なアリコットの放射能を測定することによって、比活性を決定した。この値を、２８０ｎｍの吸光度によって測定したカウンターの効率（接合体のタンパク質濃度に関連する）について補正し、ｍＣｉ／ｍｇタンパク質として表した。
【０２１１】
５．イットリウム−［９０］−２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡのインビトロでの免疫反応性
Ｌｉｎｄｍｏによって記載されたホールセル結合アッセイの改良版に基づいたＳＯＰ＃ＳＰ１３−００９を用いて、９０Ｙ標識された接合体の免疫反応性を測定した。濃度が増加する対数相のＣＤ２０陽性ＳＢ細胞又はＣＤ２０陰性ＨＳＢ細胞を、１．５ｍＬのポリプロピレンチューブ２組に加えた；細胞の最終容量は０．４０ｍＬ。放射標識された接合体を、１〜２．５ｎｇ／ｍＬの最終抗体濃度になるように希釈し、０．３５ｍＬを各チューブに加えた。９０分インキュベートした後、遠心によって細胞を沈降させ、上清を集めた。上清画分に残存する放射能をシンチレーションカウンターで測定した。データは、細胞数／チューブの逆数に対し、加えた総放射能を細胞に付着した放射能によって除した商として、データをプロットした。ｙ軸切片は、免疫反応性のある割合を表している。
【０２１２】
６．臨床的に調合されたイットリウム−［９０］−２Ｂ８―ＭＸ−ＤＴＰＡのインビトロでの安定性
２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡ接合体を９０Ｙで放射標識し、上記の「ミックス＆シュート」プロトコールで記載したように調合した。２つのロットの放射標識接合体を調製した；一方のロットは、放射能の取り込みの安定性を評価するために使用し、他方のロットは、免疫反応性の保持を評価するために使用した。４℃で４８時間、調合した接合体をインキュベートし、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥとオートラジオグラフィーを用いて、０、２４時間、及び４８時間の時点でアリコットを分析した。各時点での免疫反応性は、上記アッセイを用いて評価した。
【０２１３】
７．ヒト血清中でのイットリウム−［９０］−２Ｂ８―ＮＴＸ−ＤＴＰＡのインビトロでの安定性
ヒト血清中、３７℃で７２時間までインキュベートすることによって、９０Ｙ標識された２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡの安定性を評価した。上記のように、イットリウム−［９０］で接合抗体を放射標識し、上記のように調合した。正常なヒト血清（非加熱−非活性化）で、放射標識された接合体を１：１０に希釈し、分取した試料をプラスチックチューブ中で、３７℃でインキュベートした。選択した時点で、サンプルを取り出し、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥとオートラジオグラフィーによって分析した。
【０２１４】
８．イットリウム−［９０］−２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡの生体分布
８〜１０週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスでの、イットリウム−［９０］標識された２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡの組織生体分布について調べた。上述のように、放射標識された接合体を調製し、調合した。５μＣｉの９０Ｙ標識された２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡをマウスに静脈内注射し、５匹のマウスからなるグループを１、２４、４８、及び７２時間に屠殺した。屠殺後、尾、心臓、肺、肝臓、腎臓、脾臓、筋肉、及び大腿骨を取り出し、洗浄し、秤量した；血液と皮膚のサンプルも分析のために採取した。ガンマカウンターを用いた制動放射を測定することによって、各組織試料に含まれる放射能を測定し、グラム組織当たりのパーセント投与線量と臓器当たりのパーセント投与線量を決定した。
【０２１５】
９．線量測定
９０Ｙ標識された２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡを投与したマウスを用いて取得した生体分布データを使用して、７０Ｋｇの患者に投与した１．０ｍＣｉの線量から吸収される放射線量の推測値を計算した。推測値は、核医学協会のＭｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ｄｏｓｅ  （ＭＩＲＤ）  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって採用された方法に従って求めた。これらの計算は、カリフォルニア州９２１６１、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＶＡ医療センター、核医学施設、Ｍｒ．Ｐｈｉｌｌｉｐ  Ｌ．  Ｈａｇａｎによって行われた。
【０２１６】
１０．臨床的線量のイットリウム−［９０］−２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡを調製するためのプロトコールのバリデーション
（「Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  "Ｍｉｘ−ａｎｄ−Ｓｈｏｏｔ"  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｄｏｓｅｓ  ｏｆ  ９０Ｙ−２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡ；  ａｕｔｈｏｒ，  Ｐ．  Ｃｈｉｎｎ；  ｄａｔｅｄ  Ａｐｒｉｌ  ２２，  １９９４」と題されたＲｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｒ＆Ｄ  ｒｅｐｏｒｔ）。
【０２１７】
Ｃ．結果
１．「ミックス＆シュート」プロトコールを用いたイットリウム−［９０］標識された−２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡの調製
２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡと９０Ｙとの放射標識反応の速度論を調べるための予備的な実験によって、５〜１０分の反応時間に、ｐＨ３．６〜４．０で、９５％の放射性同位体が取り込まれることが示された。続いて、スケールアッププロトコールのためのバリデーション試験で、この放射能の取り込み（９５．７％±１．７％）の再現性を確認した（「Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  "Ｍｉｘ−ａｎｄ−Ｓｈｏｏｔ"  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｄｏｓｅｓ  ｏｆ  ９０Ｙ−２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡ；  ａｕｔｈｏｒ，  Ｐ．  Ｃｈｉｎｎ；  ｄａｔｅｄ  Ａｐｒｉｌ  ２２，  １９９４」と題されたＲｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｒ＆Ｄ  ｒｅｐｏｒｔ）。この「ミックス＆シュート」プロトコールを用いた９０Ｙ標識された２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡの調製によって、ＨＰＬＣ法（ＢＢ−ＩＮＤ  ４８５０／４８５１参照）で作成したものと同等の産物が得られた。放射標識プロトコールは、典型的には、１０〜１５ｍＣｉ／ｍｇ抗体にわたる比活性で再現性があることが分かった。
【０２１８】
このプロトコールを用いて調製した、９０Ｙ標識された２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡの免疫反応性は、ＨＰＬＣプロトコールに対するバリデーションの実施で観察された５５〜６０％と比べて、典型的には、７０％を超えた（図２６）。この差は、おそらく、「ミックス＆シュート」プロトコールでインキュベート時間が減少したために、放射線分解の影響が減少したことによるものであろう。この結果は、以下に論述されているように、典型的なものであり、臨床的線量の放射標識された接合体を調製するためのスケールアッププロトコールのバリデーションの実施のうちの代表的なものであった。
【０２１９】
２．９０Ｙ標識された２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡのインビトロでの安定性
ＨＰＬＣ法を用いて調製した保護されていない９０Ｙ標識された抗体接合体を用いた予備的実験によって、放射線分解がかなりの抗体の崩壊を引き起こし、免疫反応性が失われることが実証された。それ故、放射線分解の影響を最小にするための調合用緩衝液を開発した。ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）は、放射線分解による抗体の崩壊を最小限に抑えるのに有効であることが示された。放射線分解を最小にする該調合の効力を確認するために、「ミックス＆シュート」法で調製した放射標識された接合体を用いて、評価を行った。７５ｍｇ／ｍＬのＨＳＡと１ｍＭのＤＴＰＡを含有する１×ＰＢＳ、ｐＨ７．４の中で９０Ｙ標識された抗体（１４．５ｍＣｉ／ｍｇ抗体の比活性になるように放射標識されている）を調合した。０、２４、及び４８時間の時点で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとオートラジオグラフィーを用いて、２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡ接合体の崩壊を調べた。図２、３、及び４は、４℃でインキュベートしたときに、放射標識された接合体が、４８時間にわたって、有意な崩壊を示さなかったことを示している。簡易薄層クロマトグラフィー分析によって、４８時間のインキュベーション中に、９０Ｙは喪失されないことが示された。免疫反応性は、６０％でも比較的一定であった（表２４）。これらの結果は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／オートラジオグラフィー分析によって確認された（表２８）。免疫反応性も比較的一定であり、８８％を超えていた（表２９）。
【０２２０】
【表２８】
0004704570.tif 000048
【表２９】
0004704570.tif 000049
１５．７ｍＣｉ／ｍｇの比活性で、臨床的に調合された９０Ｙ標識−２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡを、ヒト血清中、３７℃で７２時間インキュベートした。非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥとオートラジオグラフィーによって分析されたサンプル（図３０）は、インキュベーション中に放射性同位体を失わなかった（表３０）。ゼロ時と７２時間の時点でのオートラジオグラムの濃度測定スキャンは、放射標識された接合体の有意な崩壊を示した（図３１及び３２）。これらの結果は、薄層クロマトグラフィー分析によって確認された（表３０）。本研究で使用した抗体への放射能の取り込みは、標識プロトコールのバリデーション試験で得られたものよりも低かったことに留意しなければならない。放射能の取り込みがこのように低かったのは、当該放射標識抗体の調製に用いた塩化イットリウムのバッチの品質が低下していたことによった。放射能の取り込みが低かったことは、「ミックス＆シュート」法で調製したイットリウム標識された接合体が、これらのインキュベーション条件下で安定であるという結論を変えるものではなかった。
【０２２１】
【表３０】
0004704570.tif 000050
＠表３０脚注
簡易薄層クロマトグラフィー片とＳＤＳ−ＰＡＧＥ／オートラジオグラフィーを用いて、表記の時点で、９０Ｙ標識−２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡ（比活性１５．７ｍＣｉ／ｍｇ）を含有するヒトの血清サンプルのタンパク質に結合していない９０Ｙを分析した。
【０２２２】
３．イットリウム−［９０］−２Ｂ８―ＮＴＸ−ＤＴＰＡを用いた生体分布研究
１１．５ｍＣｉ／ｍｇ抗体の比活性と９５％を超える放射能の取り込みを有する９０Ｙ標識された接合体の生体分布をＢＡＬＢ／ｃマウスで調べた。主要な臓器、皮膚、筋肉、骨、尿、及び糞の組織への放射能の蓄積を、７２時間にわたって調べ、グラム組織当たりのパーセント投与線量と臓器当たりのパーセント投与線量として表した。表３１〜３４及び図３３に示された結果は、血液に含まれる放射能のレベルが、１時間での約４３％投与線量／グラム（％ＩＤ／ｇ）から、７２時間後に約１６％に減少した；２４時間以降には、心臓、腎臓、及び脾臓に含まれる放射能のレベルは４〜８％で、かなり一定であった。肺と肝臓については、放射能は１時間での１０〜１２％から７２時間での８〜１０％に減少した。皮膚では、放射能は、２４〜７２時間にわたって、約３％と比較的一定であった。胃腸管の放射能は、２４時間〜７２時間にわたり、０．５〜１％で一定であった。筋肉の放射能は、研究期間中、約０．６％を維持した。大腿骨（骨）による放射能の取り込みは、全ての時点で、４％未満に留まり、接合体調製物中の遊離のイットリウム量が無視し得るものであり、本研究の間に、遊離の放射性金属は殆ど放出されないことを示している。
【０２２３】
【表３１】
0004704570.tif 000051
【表３２】
0004704570.tif 000052
【表３３】
0004704570.tif 000053
【表３４】
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４．線量測定
マウスの生体分布データ（表３１〜３４の％ＩＤ／臓器値）を用いて、９０Ｙ標識された接合体について算出された「標準的な」７０Ｋｇのヒトに対する放射能吸収線量が表３５に示されている。これらの結果は、以前、ＨＰＬＣ放射標識法を用いて調製した９０Ｙ標識された２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡを使用して得られた結果と同等である。
【０２２４】
【表３５】
0004704570.tif 000055
５．臨床的線量のイットリウム−［９０］−２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡを調製するためのプロトコールのバリデーション
ＭＩＰ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ社で、合計１０のバリデーションロットを調製した。各ロットに対する試験の結果が表３６にまとめられている。各試験結果の平均値を計算し、適当な場合には、標準偏差を明記した。異なる標識時間による工程の変動を評価するために、ロット１〜８は、１０分の標識時間を用いて調製し、ロット９と１０は、５分の反応時間を用いて調製した。１０個のバリデーションロットの試験結果に基づき、放出特性を確定した。放出特性は、表３７にまとめられている。
【０２２５】
【表３６】
0004704570.tif 000056
【表３７】
0004704570.tif 000057
＠＠「ミックス＆シュート」を用いて調製した９０Ｙ標識された２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡの１０個のバリデーションロットに対するアッセイ結果
％免疫反応性
内毒素（Ｅｕ／ｍＬ）
％放射能取り込み
抗体濃度（ｍｇ／ｍＬ）
放射能（ｍＣｉ／ｍＬ）
比活性（ｍＣｉ／ｍｇ）
Ｄ．考察
９０Ｙ標識された２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡを調製するための従来の放射標識プロトコールは、タンパク質に結合していない９０Ｙを調製から除去するために、非常に手間と時間がかかるＨＰＬＣ精製工程を利用していた。この工程を簡易化し、臨床の現場でより使いやすくするために、ＨＰＬＣ工程を省略することを目指し、「ミックス＆シュート」プロトコールと名付けられたプロトコールを採択するに至った。最終的な目標は、接合体への同位体の放射能の取り込みが極めて高くなることによって、精製工程が不要となる放射標識条件を見出すことであった。５〜１０分のインキュベーションにより、ｐＨ３．６で、９５％を超える放射能の取り込みが得られ得ることが見出された。このプロトコールのさらなる利点は、おそらくは、放射線分解に対して保護を与えるヒト血清アルブミンを添加する前に、高エネルギーの放射性同位体への抗体の暴露時間が短くなるために、免疫反応性（＞７０％）の保持が増加することであった。この免疫反応性の保持は、ＨＰＬＣ法を用いたときに以前観察されたものより優れている。
【０２２６】
調合用緩衝液（７５ｍｇ／ｍＬのヒト血清アルブミンと１ｍＭのＤＴＰＡを含有する１×ＰＢＳ）中、４℃で、４８時間までインキュベートし、「ミックス＆シュート」プロトコールを用いて調製した９０Ｙ標識された接合体による安定性試験によって、放射性同位体が失われず、免疫反応性が完全に保持されることが示された。ヒト血清を用いて、３７℃で７２時間行った安定性試験も、最小限の放射性同位体が失われるにすぎないことを示した。これらの安定性の結果は、ＨＰＬＣプロトコールを用いて放射標識された接合体を用いたときに、以前みられたものと同等である。
【０２２７】
「ミックス＆シュート」法を用いて調製した９０Ｙ標識された接合体を用いたＢＡＬＢ／ｃマウスでの生体分布は、異常な組織への蓄積がないことを示した。これらの結果は、放射標識された抗体が有意に変化せず、抗体のインビボ特性に劇的に影響を与えなかったことを示唆していた。また、これらの結果は、ＨＰＬＣ放射標識法を用いて調製した放射標識接合体で以前得られた結果（ＢＢ−ＩＮＤ４８５０／４８５１参照）と同等である。
【０２２８】
マウスの生体分布データから計算された、「標準的な」７０Ｋｇのヒトに対する線量測定の推測値は、ＨＰＬＣ操作を用いて放射標識された接合体で得られた結果（ＢＢ−ＩＮＤ４８５０／４８５１参照）と一致している。さらに、線量測定の結果は、投与線量ｍＣｉ当たりで比較すると、進行中の臨床試験（ＩＤＥＣ研究番号１３１５）に参加した患者で得られた結果と同等である。本研究の６人の患者では、全身、心臓、肝臓、及び脾臓の平均値（ｒａｄｓ±ＳＤ）は、それぞれ、１．４０±０．５７、１０．５０±４．６８、９．８９±８．９１、及び９．７５±６．００であった。
【０２２９】
臨床グレードの９０Ｙ−２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡを調製するための「ミックス＆シュート」標識プロトコールを実施する前に、本プロトコールの再現性を評価することが必要であった。それ故、ロットの異なる塩化９０イットリウムを用いて、１０個のバリデーションロットを調製した。調製した１０個のロットに対して、「ミックス＆シュート」法を用いて得られた免疫反応性の値は、平均が７４．５％、中央値が７２．１％で、６０．６％〜９３．３％のレンジであった。この免疫反応性の保持は、以前に、現行のＨＰＬＣ法を用いて得られた約６０％（５４．９％〜６５．１％のレンジ；６０．２％の平均）よりも、有意に優れている。１０個のロットに対する平均放射能の取り込みは、９５．７％（９３．５％〜９７．５％のレンジ）であった。この値は、以前に、ＨＰＬＣで得られたもの（９１．７％〜９３．７％のレンジ、９３．１％の平均）と同等である。内毒素、抗体濃度、放射能濃度、比活性、総バイアル放射能、総タンパク質濃度、ｐＨ、及び無菌性の結果も、１０個のロットで同等であった。総合すると、これらの結果は、「ミックス＆シュート」法の再現性を確認した。さらに、我々は、５及び１０分間、反応を行うことによって、異なる標識時間による反応の変動を調べた。２つの反応時間には有意な差異は見られなかったので、最後のプロトコールでは、より短いインキュベート時間が使用することに決定した。
【０２３０】
Ｅ．総括
我々は、現在使用されている、タンパク質に結合していない放射性同位体を除去するための高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）工程が不要となる、臨床的な線量の９０Ｙ標識された２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡを調製するための「ミックス＆シュート」法と称される標識操作を開発した。この簡易化されたプロトコールによれば、高レベルの放射性同位体の取り込み（＞９５％）と改善された免疫反応性の保持（＞７０％）を維持しつつ、この手間のかかる精製工程が省略される。放射性同位体と免疫反応性の保持に基づき、４℃で４８時間インキュベートしたときに、臨床的に調合された放射標識接合体はインビトロで安定であることが明らかとなった。さらに、放射標識された接合体は、ヒトの血清中、３７℃で７２時間インキュベートしたときも安定であった。ＢＬＡＢ／ｃマウスでの生体分布研究によって、骨を含む組織に異常な蓄積がないことが実証された。「標準的な」７０Ｋｇのヒトへの放射線の吸収線量の推定値は、９０Ｙ標識された２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡを用いた進行中の臨床試験で得られたものと同等であった。これらの研究の結果によって、「ミックス＆シュート」プロトコールを用いて作成した９０Ｙ標識された２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡが、従来のＨＰＬＣ法を用いて調製したものと同等であることが示された。臨床グレードの放射標識された接合体を調製するためのスケールアッププロトコールのバリデーションによって、本方法に再現性があり、その産物は、現行のＨＰＬＣ法を用いて作成されたものと同等であることが示された。これらの前臨床試験の結果は、この新しい「ミックス＆シュート」プロトコールが、臨床試験での使用に適した９０Ｙ標識された２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡを調製するのに使用することができることを示している。
【０２３１】
【好ましい実施態様の詳細な説明】
例１．放射能の取り込み−キットとアッセイ
Ｉ．概要
本発明の目的の１つは、１１１Ｉｎ及び９０Ｙ標識された２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡ（それぞれ、Ｉｎ２Ｂ８及びＹ２Ｂ８）を調製するための放射標識キットのプロトコールを考案し、臨床用産物の放出の規格を確立することであった。該放射標識キットのプロトコールは、放射能の取り込み及び抗原陽性ＳＢ細胞への結合に関して再現性を有し、放射標識キットが臨床試験に使用するのに適していることを示している。放射能の取り込みと結合に対するＩｎ２Ｂ８とＹ２Ｂ８の放出の規格は、それぞれ９５％以上及び７０％以上で確率されることが推奨される。
【０２３２】
ＩＩ．序論
９０Ｙ標識されたマウスのモノクローナル抗ＣＤ２０抗体（Ｙ２Ｂ８）は、現在、再発したＢ細胞リンパ腫を治療するための臨床試験で評価されている。イットリウム同位体は、ガンマ成分を欠くので、画像化システムには適していない。それ故、腫瘍の分布と、イットリウム標識した治療剤による治療の前又は後の患者における線量測定とを調べるためには、１１１Ｉｎ標識された２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡ（Ｉｎ２Ｂ８）が使用されるであろう。現在Ｙ２Ｂ８とＩｎ２Ｂ８の調製に使用されているプロトコールは、「ミックス＆シュート」法と呼ばれ、臨床試験に適した放射標識抗体が得られる。しかしながら、標識工程の単純化は、臨床現場での投薬の調製をはかどらせるであろう。
【０２３３】
新規放射標識キットは、好ましくは、４つの成分：１）低金属の通常の生理的食塩水中に２ｍｇ／ｍＬの２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡ、２）放射性同位体溶液を適切な標識ｐＨに調製するために使用される５０ｍＭの酢酸ナトリウム、３）調合用緩衝液（７．５％のヒト血清アルブミンと１ｍＭのＤＴＰＡを含有する１×ＰＢＳ、ｐＨ７．４、４）空の１０ｍＬガラスバイアル（反応バイアル）から構成される。全ての成分は、無菌で、発熱物質がないことが検査される。
【０２３４】
この報告は、使用が簡便且つ容易で、９５％以上の放射能が取り込まれ、抗原陽性細胞への結合が許容可能に保持された放射標識抗体を作出する該放射標識キットのバリデーションをまとめたものである。臨床用の産物には、放出試験の規格が推奨される。
【０２３５】
ＩＩＩ．放射能を取り込むための物質と方法
Ａ．放射標識キット中の試薬
１．  ２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡ、ＩＤＥＣ；Ｌｏｔ＃０８２３９５ＲＭ２
２．  ５０ｍＭの酢酸ナトリウム、低金属、ＩＤＥＣ；Ｌｏｔ＃０８２３９５ＲＭ３
３．  調合用緩衝液（７．５％（ｗ／ｖ）のヒト血清アルブミンと１ｍＭのＤＴＰＡを含有する１×ＰＢＳ、ｐＨ７．４）、ＩＤＥＣ；Ｌｏｔ＃０８２３９５ＲＭ１
４．  反応バイアル、１０ｍＬ、ＩＤＥＣ
Ｂ．物質と装置
１．  Ｂｉｏｄｅｘ  Ｔｅｃ−Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒａｄｉｏｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、Ｃａｔ．＃１５１−７７０
２．  手袋：粉末なし
３．  無菌ポリプロピレン注射器
４．  無菌注射針
５．  封栓付きの小チューブ；１．５ｍＬ
Ｃ．方法
１．放射標識キットを用いたＹ２Ｂ８とＩｎ２Ｂ８の調製
キットの試薬を調製し、ガラスの隔壁（ｓｅｐｔｕｍ）バイアル中に充填した。無菌注射用水（ＷＦＩ）でＩ型のホウケイ酸バイアル（２又は１０ｍＬ）をリンスし、充填前に加圧滅菌した。無菌ＷＦＩでブチルラバーの隔壁をリンスし、使用前に加圧滅菌した。手で試薬を充填し、クラス１００室の中で圧着し、ＵＳＰの方法を用いて発熱物質と無菌性を調べた。
【０２３６】
ａ．Ｉｎ２Ｂ８の調製
＜添加する試薬＞：
１．  インジウム−［１１１］：塩化物塩、キャリアーなし、ＨＣｌ中
注意：
１．  全ての工程は、好ましくは、無菌手法を用いて実施する。
【０２３７】
２．  放射標識キットの成分は、使用前に、室温に戻すべきである。
【０２３８】
３．  最終産物は、以下の完成工程９から８時間以内に患者に投与すべきである。Ｉｎ２Ｂ８放射標識プロトコール
＜操作＞
１．反応バイアルに加えるべき１１１ＩｎＣｌ３の容量は、以下のように計算した：
ａ．放射標識時の放射能濃度（ｍＣｉ／ｍＬ）：
Ｃ０＝キャリブレーション時の放射能濃度（製造者の分析証明書参照）
Δｔ＝時間の変化（正の数はキャリブレーション後、負の数はキャリブレーション前）。
【０２３９】
標識時の放射能濃度＝Ｃ０／ｅ０．００１０３（Δｔ）
ｂ．反応バイアルに加えるべき１１１ＩｎＣｌ３の容量：
５．５ｍＣｉ／標識時の放射線濃度＝反応バイアルに加える容量
２．反応バイアルに加えるべき５０ｍＭ  酢酸ナトリウムの容量は、以下のように計算した：
加えた１１１ＩｎＣｌ３の容量（工程１ｂ）×（１．２）
＝加えるべき５０ｍＭ  酢酸ナトリウムの容量
３．反応バイアルの隔壁と５０ｍＭの酢酸ナトリウムのバイアルをアルコールで拭いた。１ｃｃの注器を用いて、計算した容量の５０ｍＭ  酢酸ナトリウム（工程２）を反応バイアルに移した。
【０２４０】
４．１１１ＩｎＣｌ３源の隔壁をアルコールで拭いた。無菌の０．２μｍフィルターを取り付けた針で、バイアルに穴を開けた。１ｃｃの無菌注射器を用いて、必要な容量（工程１ｂ）の１１１ＩｎＣｌ３を反応バイアルに移した。数回逆さにして、バイアルを混合した。
【０２４１】
５．２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡバイアルの隔壁をアルコールで拭いた。１ｃｃのシリンジを用いて、１．０ｍＬの２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡをゆっくりと反応バイアルに移した。数回逆さにして、バイアルを混合した。
【０２４２】
６．室温で３０分±５分、反応を進行させた。
【０２４３】
７．反応混合液の総容量は、加えた１１１ＩｎＣｌ３の容量（工程４）と、加えた５０ｍＭ  酢酸ナトリウムの容量（工程３）と、加えた２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡの容量（工程５）とを加算することによって算出した。
【０２４４】
８．１０ｍＬの最終容量を得るために、反応バイアルに加えるべき調合用緩衝液の容量は、１０から工程７で計算した総量を差し引くことによって計算した。
【０２４５】
９．調合用緩衝液のバイアルをアルコールで拭き、バイアルに穴を開けた。調合用緩衝液の粘度のために、０．２μｍの注射器フィルターを取り付けた針を用いて、反応バイアルに穴を開けた。適切なゲージの針を取り付けた１０ｃｃの無菌注射器を用いて、工程８で計算した容量の調合用緩衝液を反応バイアルに移した。反応バイアルから通気針を除去し、数回逆さにして、バイアルを混合した（最終産物）。「放射能取り込みアッセイ」を行う少なくとも５分前に、このバイアルをインキュベートした。溶液の色は琥珀色で、バイアルは一杯となっており、調合用緩衝液を加えたことが確認される。
【０２４６】
１０．１１１Ｉｎ測定用の適切な装置を用いて、最終産物バイアルの総放射能を測定した。
【０２４７】
１１．「結合アッセイ」と「放射能取り込みアッセイ」のために、２〜８℃で、すぐに最終産物を保存した。
【０２４８】
ｂ．Ｙ２Ｂ８の調製
添加する試薬：
１．  イットリウム−［９０］：塩化物塩、キャリアーなし、ＨＣｌ中
注意：
１．  全ての工程は、無菌手法を用いて実施すべきである。
【０２４９】
２．  放射標識キットの成分は、使用前に、室温に戻すべきである。
【０２５０】
３．  最終産物は、以下の完成工程８から８時間以内に患者に投与すべきである。Ｙ２Ｂ８放射標識プロトコール
１．反応バイアルに加えるべき９０ＹＣｌ３の容量は、以下のように計算した：
ａ．放射標識時の放射能濃度（ｍＣｉ／ｍＬ）：
Ｃ０＝キャリブレーション時の放射能濃度（製造者の分析証明書参照）
Δｔ＝時間の変化（正の数はキャリブレーション後、負の数はキャリブレーション前）。
【０２５１】
標識時の放射能濃度＝Ｃ０／ｅ０．００１０８（Δｔ）
ｂ．反応バイアルに加えるべき９０ＹＣｌ３の容量：
４５ｍＣｉ／標識時の放射能濃度＝反応バイアルに加える容量
２．反応バイアルに加えるべき５０ｍＭ  酢酸ナトリウムの容量は、以下のように計算した：
ａ．０．０４０ＭのＨＣｌ中の９０ＹＣｌ３（Ａｍｅｒｓｈａｍ）ついては：
９０ＹＣｌ３の容量（工程１ｂ）×（０．８）＝加えるべき酢酸ナトリウムの容量
ｂ．０．０５０ＭのＨＣｌ中の９０ＹＣｌ３（Ｎｏｒｄｉｏｎ）ついては：９０ＹＣｌ３の容量（工程１ｂ）×（１．０）＝加えるべき酢酸ナトリウムの容量
３．反応バイアルの隔壁と酢酸ナトリウムのバイアルをアルコールで拭いた。１ｃｃの注射器を用いて、計算した容量（工程１ａ又は工程１ｂ）の５０ｍＭ  酢酸ナトリウム（工程２）を反応バイアルに移した。数回逆さにして、バイアルを混合した。
【０２５２】
４．９０ＹＣｌ３源バイアルの隔壁をアルコールで拭いた。無菌の０．２μｍフィルターを取り付けた針で、バイアルに穴を開けた。１ｃｃの無菌注射器を用いて、必要な容量（工程１ｂ）の９０ＩｎＣｌ３を反応バイアルに移した。数回逆さにして、バイアルを混合した。
【０２５３】
５．２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡバイアルの隔壁をアルコールで拭いた。３ｃｃの無菌シリンジを用いて、１．５ｍＬの２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡを反応バイアルに移した。数回逆さにして、バイアルを混合した。
【０２５４】
６．反応混合液の総容量は、加えた塩化Ｙ−９０の量（工程４）と、加えた５０ｍＭ  酢酸ナトリウムの容量（工程３）と、加えた２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡの量（工程５）とを加算することによって算出した。
【０２５５】
７．１０ｍＬの最終容量を得るために、反応バイアルに加えるべき調合用緩衝液の容量は、１０から工程６で計算した総反応量を差し引くことによって計算した。
【０２５６】
８．調合用緩衝液のバイアルをアルコールで拭いた。調合用緩衝液の粘度のために、０．２０μｍの注射器フィルターを取り付けた針を用いて、反応バイアルに穴を開けた。適切なゲージの針を取り付けた１０ｃｃの無菌針を用いて、工程７で計算した容量の調合用緩衝液を反応バイアルに移した。反応バイアルから通気針を除去し、数回逆さにして、バイアルを混合した（最終産物）。「放射能取り込みアッセイ」を行う少なくとも５分前に、このバイアルをインキュベートした。溶液の色は琥珀色で、反応バイアルは一杯となっていることにより、調合用緩衝液を加えたことが確認される。
【０２５７】
９．９０Ｙ測定用の適切な装置を用いて、最終産物バイアルの総放射能を測定した。
【０２５８】
１０．患者への投与のために必要となるまで、２〜８℃で、すぐに最終産物を保存した。
【０２５９】
１１．免疫反応性試験：
１ｍＬの注射器を用いて、反応バイアルから無菌的に０．１ｍＬを取り出し、別の１．５ｍＬのネジ蓋付きチューブに移した。「結合アッセイ」と「放射能取り込みアッセイ」のために、２〜８℃で、すぐにチューブを保存した。
【０２６０】
放射標識キットのプロトコールのバリデーションは、ＩＤＥＣ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ＭＤ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃｅｎｔｅｒ（Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）、Ｍａｙｏ  Ｃｌｉｎｉｃ（Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＭＮ）、及びＣｉｔｙ  ｏｆ  Ｈｏｐｅ（Ｄｕａｒｔｅ，ＣＡ）で行った。臨床グレードの２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡを含む全てのキット成分は、ＧＭＰ条件（連邦規則に基づく適正製造基準）下で、ＩＤＥＣ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓによって調製され、無菌で、発熱物質がないことを確認した。
【０２６１】
７．５％（ｗ／ｖ）のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ；臨床グレード；Ｂａｘｔｅｒ−Ｈｙｌａｎｄ）と１ｍＭのＤＴＰＡを含有する１×ＰＢＳを用いて、放射標識された抗体を調合した。各バリデーションロットに対して行った放出試験の結果は以下に記載されている。
【０２６２】
５人の操作者によって、Ｉｎ２Ｂ８とＹ２Ｂ８それぞれの６つのバリデーションロットが調製された。これらのロットは以下のように表記し、以下の施設で実施した。
【０２６３】
Ｉｎ２Ｂ８：
＃１：ＩＤＥＣ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ
＃２：ＩＤＥＣ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ
＃３：ＩＤＥＣ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ
＃４：ＭＤ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃｅｎｔｅｒ
＃５：Ｍａｙｏ  Ｃｌｉｎｉｃ
＃６：Ｃｉｔｙ  ｏｆ  Ｈｏｐｅ
Ｙ２Ｂ８：
＃１：ＩＤＥＣ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ
＃２：ＩＤＥＣ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ
＃３：ＩＤＥＣ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ
＃４：ＭＤ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃｅｎｔｅｒ
＃５：Ｍａｙｏ  Ｃｌｉｎｉｃ
＃６：Ｃｉｔｙ  ｏｆ  Ｈｏｐｅ
２．凍結乾燥されたＳＢ及びＨＳＢの調製
ヒト細胞株ＳＢ（ＣＤ２０陽性）とＨＳＢ（ＣＤ２０陰性）は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから取得し、１０％のウシ胎児血清を含有し、２％のグルタミンが補充されたＲＰＭＩ−１６４０を用いて、Ｔフラスコ中で培養した。培養は、３７℃、５％ＣＯ２に維持した。典型的には、１日おきに細胞を１：２に分割し、０．５〜２．５×１０６細胞／ｍＬと８０％を超える生存率で採集した。血球計を用いて細胞の濃度を測定し、トリパンブルーの排除によって生存率を決定した。
【０２６４】
遠心（Ｓｏｒｖａｌｌ遠心中で、１３００ｒｐｍ）によって、室温で、０．５〜２×１０６細胞／ｍＬの細胞密度で細胞を採集し、１×ＨＢＳＳで２回洗浄した。１％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミンと１０％（ｗ／ｖ）のマンニトールを含有する１×ＨＢＳＳ（凍結乾燥緩衝液）中に、５０×１０６細胞／ｍＬになるように沈降した細胞を再懸濁し、ｏリングのパッキングを有する１．５ｍＬのポリプロピレン微量遠心管の中に０．５ｍＬを分配して、−７０℃で保存し、３０〜６０ミリトルで、一晩凍結乾燥した。凍結乾燥した細胞のチューブを２〜８℃で乾燥保存し、アッセイ用の無菌水の中に再構成した；微量遠心管中の凍結乾燥した細胞のチューブを乾燥剤とともに保存した。
【０２６５】
３．分析アッセイ
Ｉｎ２Ｂ８とＹ２Ｂ８のバリデーションロットを検査するために使用した分析法を以下に記載する。以下のアッセイは、各バリデーションロットに対して実施した。
【０２６６】
１．凍結乾燥したＳＢ細胞を用いた結合アッセイ
２．Ｂｉｏｄｅｘ  Ｋｉｔを用いたＹ２Ｂ８／Ｉｎ２Ｂ８放射能取り込みアッセイ
ａ．結合アッセイ
それぞれ、以下のＩｎ２Ｂ８とＹ２Ｂ８用プロトコールに従って、凍結乾燥されたＣＤ２０陽性細胞を用いて、各操作者によってパーセント結合を評価した。これらのアッセイは、放射標識された抗体が、なおＣＤ２０を抗原として認識するかどうかを確認する迅速且つ効率的な方法を与える。１つの診療機関では、ＣＤ２０陰性のＨＳＢ細胞についても調べた。凍結乾燥した細胞を上記の方法、「凍結乾燥したＳＢ及びＨＳＢ細胞の調製」に従って調製し、保存した。
【０２６７】
ｉ．Ｉｎ２Ｂ８の結合アッセイ
添加する試薬：
１．インジウム−［１１１］−２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡ
２．凍結乾燥したＳＢ細胞；２５×１０６細胞／チューブを含有する３つのチューブ
３．凍結乾燥したＨＳＢ細胞；２５×１０６細胞／チューブを含有する３つのチューブ
４．洗浄用の無菌水又は注射用の無菌水
５．希釈用緩衝液（１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と０．０２％のアジ化ナトリウムを含有する１×ＰＢＳ、ｐＨ７．２〜７．４）、０．２μｍのフィルターで濾過し、室温で保存
６．放射能をカウントするためのガラス又はプラスチックの試験チューブ
操作：
アッセイのセットアップ（非放射能部分）
１．凍結乾燥した細胞ＳＢ及びＨＳＢ細胞の３つのチューブを得た。
【０２６８】
２．０．５０ｍＬの容量のＳＷＦＩ（ｓｔｅｒｉｌｅ  ｗａｔｅｒ  ｆｏｒ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）を各チューブに加え、均一な懸濁液が得られるまでチューブをボルテックスした。
【０２６９】
３．４つの空の１．５ｍＬ微量遠心管。この遠心管のうちの３つには、０．５０ｍＬの希釈用緩衝液を加え、細胞のない対照とした。
【０２７０】
４．残りの１．５ｍＬ微量遠心管に、０．９９ｍＬの希釈用緩衝液を加えた；この遠心管を１：１００で標識した。
【０２７１】
５．５０ｍＬのキャップ付き無菌ポリプロピレンチューブを取得し、該チューブに１０ｍＬの希釈用緩衝液を加えた。
【０２７２】
アッセイのセットアップ（放射能部分）
１．２〜８℃で保存された放射標識した抗体を取得した。
【０２７３】
２．Ｐ２０を用いて０．０１ｍＬの容量を取り出し、０．９９ｍＬの希釈用緩衝液を含有する１．５ｍＬの微量遠心管に添加した（１：１００の希釈）。チップをリンスし、チューブを穏やかにボルテックスして混合した。
【０２７４】
３．１：１００希釈のチューブから、Ｐ２００を用いて０．２０ｍＬの容量を取り出し、１０ｍＬの希釈用緩衝液を含有する円錐チューブに添加した。チューブを完全に混合した。
【０２７５】
アッセイのプロトコール
１．全てのチューブに、０．５０ｍＬの容量の希釈した１１１Ｉｎ２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡを添加した。
【０２７６】
２．全てのチューブのキャップをしっかりと締め、チューブを６０分間連続して混合した。
【０２７７】
３．室温での６０分のインキュベーション後に、最小２０００ｇで５分間、全てのチューブを遠心した。
【０２７８】
４．計測装置に適したチューブに、０．７５ｍＬの容量の各上清を移した。
【０２７９】
５．バックグラウンドに対して調整し、ガンマカウンターを用いて、チューブの中の放射能をカウントした。
【０２８０】
ｉｉ．Ｙ２Ｂ８の結合アッセイ
添加する試薬：
１．９０Ｙ２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡ
２．凍結乾燥したＳＢ細胞；
３．洗浄用の無菌水又は注射用の無菌水
４．希釈用緩衝液（１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と０．０２％のアジ化ナトリウムを含有する１×ＰＢＳ、ｐＨ７．２〜７．４）
操作：
放射標識された抗体サンプルの調製
１．２〜８℃で保存された放射標識した抗体を取得した。
【０２８１】
２．Ｐ２０を用いて１０μＬの容量を取り出し、９９０μＬの希釈用緩衝液を含有する１．５ｍＬの微量遠心管に添加した（１：１００の希釈）。チップをリンスし、チューブを微かにボルテックスした。
【０２８２】
３．５０ｍＬのキャップ付き無菌ポリプロピレンチューブを取得し、１０ｍＬの血清ピペットを用いて、該チューブに１０ｍＬの希釈用緩衝液を加えた。
【０２８３】
４．１：１００希釈のチューブから、Ｐ２００を用いて３５μＬの容量を取り出し、１０ｍＬの希釈用緩衝液を含有する円錐チューブに添加した。完全に混合した。
【０２８４】
凍結乾燥された細胞の調製：
１．３つのチューブの凍結乾燥されたＳＢ細胞を得た。
【０２８５】
２．各チューブに０．５ｍＬの容量のＳＷＦＩを添加し、単一の細胞懸濁液が得られるまでチューブをボルテックスした。
【０２８６】
３．３つの空の１．５ｍＬ微量遠心管を得た；この遠心管のうちの３つには、０．５ｍＬの希釈用緩衝液を加え、細胞のない対照とした。
【０２８７】
アッセイのプロトコール
１．０．５ｍＬの容量の希釈した９０Ｙ２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡを各チューブに加えた。
【０２８８】
２．キャップがしっかり締められていることを確かめた後、エンドオーバーミキサーの上に、チューブを４５分間置いた。
【０２８９】
３．４５分室温でインキュベートした後、５分間の微量遠心によって、細胞を沈降させた。
【０２９０】
４．０．８ｍＬの容量の上清をシンチレーションバイアルに移した。
【０２９１】
５．シンチレーションカクテルを各バイアルに加えた。
【０２９２】
６．バックグラウンドに対して調整し、シンチレーションカウンターを用いて、各バイアル中の放射能の量を測定した。
【０２９３】
ｂ．放射能の取り込みアッセイ
放射能の取り込みのパーセントは、以下のプロトコールに従い、Ｂｉｏｄｅｘ  Ｔｅｃ−Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒａｉｏｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ  Ｋｉｔを用いた簡易薄層クロマトグラフィー（ＩＴＬＣ）によって測定した。
【０２９４】
添加する物質と装置：
１．１１１Ｉｎ又は９０Ｙで放射標識された２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡ
２．放射性ＴＬＣ片をカウントするためのチューブ
３．鋏
４．無菌注射器、１ｃｃ
５．無菌針、２６Ｇ
６．ガンマカウンター又はシンチレーションカウンター
７．ピペッッター
操作：
１．まず、Ｂｉｏｄｅｘ  Ｏｐｅｒａｔｉｏｎ  Ｍａｎｕａｌ全体を読む
２．キットの説明書に従って、各放射標識された３組ずつのサンプルを検査した；バイアル当たり１つの片を展開した。
【０２９５】
３．クロマトグラフィー片上の放射標識されたサンプルをスポットするために、ピペッターを使用して開始線上に１μＬを滴下した。あるいは、無菌の１ｃｃ注射器に付けられた２６Ｇの針から小滴を１つ滴下させてもよい。
【０２９６】
４．バックグラウンドに対して調整された適当なカウンター（すなわち、１１１Ｉｎの場合ガンマカウンター、９０Ｙの場合シンチレーションカウンター）を用いて、各断片の活性をカウントした。
【０２９７】
５．放射標識された抗体のパーセントを計算するためのＢｉｏｄｅｘの説明書に従った。
【０２９８】
ＩＶ．結果
Ｉｎ２Ｂ８又はＹ２Ｂ８の各バリデーションロットに対する試験の結果が、表３８と３９にまとめられている。
【０２９９】
【表３８】
0004704570.tif 000058
【表３９】
0004704570.tif 000059
Ｖ．考察と結論
現行のＩｎ２Ｂ８及びＹ２Ｂ８の放射標識法を簡易化するために、４成分のキットを開発した。注射器を用いて正確な容量を移すことができるように、酢酸ナトリウムの濃度と２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡを、それぞれ、５０ｍＭと２ｍｇ／ｍＬに減らした。キットの成分は全て、好ましくは、ガラス隔壁バイアルに充填し、放出前に、ＩＤＥＣによって無菌性と発熱物質について検査し、これにより、臨床の現場でこれらのテストを行う必要をなくした。現場では、全ての試薬の取扱いは、無菌の注射器と針を用いて行う。それ故、放射線製薬局の環境で通例見られる無菌手法を固守すれば、調合した放射標識抗体は、患者への投与に適するものとなる。
【０３００】
ロットが異なる各放射性同位体を用いた幾つかのバリデーションを実施することによって、Ｉｎ２Ｂ８とＹ２Ｂ８用の放射標識プロトコールの再現性と耐久性を調べた。調製した６つのＩｎ２Ｂ８のバリデーションロットでは、結合は、８２．１％〜８６．８％の範囲で、平均は８５．１％であり；放射能の取り込み値は、約９９％（９８．３％〜９９．４％の範囲）であった。調製した６つのＹ２Ｂ８のバリデーションロットでは、得られたパーセント結合は、７８．６％〜８７．０％の範囲で、平均は８２．３％であった。Ｙ２Ｂ８の放射能の取り込み値は、平均９８．８％（９６．３％〜９９．５％の範囲）であった。総合すると、これらの結果は、Ｉｎ２Ｂ８とＹ２Ｂ８の両者を調製するための放射標識キット法の再現性と耐久性を確認している。これらのバリデーションの結果に基づけば、放射能の取り込みと結合の放出規格は、Ｉｎ２Ｂ８とＹ２Ｂ８の両者について、それぞれ９５％以上と７０％以上に確立することが推奨される。
【０３０１】
さらに、使用の容易性が増加し、調製時のミスの可能性が減少するので、凍結乾燥されたＣＤ２０陽性細胞を用いたパーセント結合と放射能の取り込みは、臨床の現場で、Ｉｎ２Ｂ８とＹ２Ｂ８を放出検査するために使用することが推奨される。
【０３０２】
要約すれば、これらの結果は、前記放射標識キットを用いて調製したＩｎ２Ｂ８とＹ２Ｂ８は、臨床の現場での使用に適していることを示している。さらに、何れの放射標識抗体についても、５人の異なる操作者による数個のバリデーションの実施結果を反映して、放出の規格が確立されている。
【０３０３】
例２．放射能の取り込みと結合−キットとアッセイ
Ｉ．概要
２Ｂ８と名付けられたマウスの抗ＣＤ２０モノクローナル抗体をＣＨＯ細胞にクローニングして、高発現の細胞株を得た。ＣＤ２０陽性のヒト細胞に対するＣＨＯ由来の抗体の特異性を、ＦＡＣＳ分析と拮抗結合によって実証した。ヒトＴ細胞に対しては、無視できる結合が観察された。ＣＤ２０陽性細胞に対する抗体の親和性は、拮抗結合アッセイを用いて、１．３×１０−１０Ｍであることが決定された。該抗体をキレート剤ＭＸ−ＤＴＰＡと反応させて、免疫反応性を殆ど失わずに、接合体２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡを形成させた（親和性の値は、４．４×１０−１０Ｍであった）。１１１Ｉｎの放射能の取り込みを測定することによって決定したところ、最適なキレート物質の接合は、８時間の反応後に得られた。２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡの放射標識プロトコールを、ｐＨとインキュベーション時間に関して、９０Ｙ又は１１１Ｉｎに対し最適化し、最大の放射能の取り込み（９５％以上）と免疫反応性の維持（７０％以上）を確保した。ＣＨＯ由来の２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡを用いて臨床試験で調製したＩｎ２Ｂ８とＹ２Ｂ８の放出特性は、放射能の取り込み（９５％以上）と凍結乾燥され、再構成されたＣＤ２０陽性のヒト細胞への結合（７０％以上）が推奨された。総合すれば、これらの結果は、ＣＨＯ由来の２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡが臨床試験での使用に適していることを示している。
【０３０４】
ＩＩ．序論
中空繊維のバイオリアクター中で、前に使用した２Ｂ８抗体を作成した。この抗体の製造コストを減らすために、これをＣＨＯ細胞でクローニングし、発現させて、高発現の産生細胞株を得た。本例は、ＣＨＯ由来の２Ｂ８抗体、接合抗体（２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡ）、及び臨床用放射標識キットプロトコールを用いて調製した９０Ｙと１１１Ｉｎ標識された抗体産物のインビトロでの特性決定の結果を記載している。
【０３０５】
ＩＩＩ．物質と方法
Ａ．試薬
ヒト細胞株ＳＢ（ＣＤ２０陽性）とＨＳＢ（ＣＤ２０陰性）は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから取得し、１０％のウシ胎児血清を含有し、２％のグルタミンが補充されたＲＰＭＩ−１６４０を用いて、Ｔフラスコ中で培養した。培養は、３７℃、５％ＣＯ２に維持した。典型的には、１日おきに細胞を１：２に分割し、０．５〜２．５×１０６細胞／ｍＬと８０％を超える生存率で採集した。血球計を用いて細胞の濃度を測定し、トリパンブルーの排除によって生存率を決定した。細胞のロットについての具体的な情報は、ノートブック＃１５５３と「Ｃｅｌｌ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｌｏｇｂｏｏｋ  １９９５＆１９９６」と題されたＲｏｎ  Ｍｏｒｅｎａ著作のバインダーに記録する。
【０３０６】
ＣＨＯ由来の２Ｂ８は、ＩＤＥＣの製造施設において、ＧＭＰ条件下で作成した。抗体は、低金属の通常の生理的食塩水中に、１１．５ｍｇ／ｍＬで調合した。抗体は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって均一であることが決定された。２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡは、ＣＨＯ由来の２Ｂ８から、ＰＳＢＲ−０４３に従ったＧＭＰ条件下で作成し、低金属の生理的食塩水中に２ｍｇ／ｍＬで調合した（Ｌｏｔ＃０１６５Ａと０１６５Ｂ）。
【０３０７】
薬学的グレード塩化１１１インジウムは、Ａｍｅｒｓｈａｍ（Ｕ．Ｋ．）又はＣｙｃｌｏｔｒｏｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｉｎｃ．（Ｃｏｒａｌ  Ｇａｂｌｅｓ，ＦＬ）から購入した。塩化イットリウム［９０］は、Ａｍｅｒｓｈａｍ（Ｕ．Ｋ．）、Ｎｏｒｄｉｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｋａｎａｔｔａ、Ｃａｎａｄａ）、又はＰａｃｉｆｉｃ  Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｒｉｃｈｌａｎｄ、ＷＡ）から取得した。ＧＭＰの下で調製されたＭＸ−ＤＴＰＡは、Ｈａｕｓｅｒ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｂｏｕｌｄｅｒ、ＣＯ）から取得した。臨床グレードのカルシウム三ナトリウムジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）は、Ｈｅｙｌ（Ｂｅｒｌｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から取得した。ＴＡＧ−ＮＨＳは、ＩＧＥＮ  Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から取得した。マウスの抗ＣＤ１９ビーズは、Ｄｙｎａｌ  Ｉｎｃ．（Ｌａｋｅ  Ｓｕｃｃｅｓｓ、ＮＹ）から購入した。ヤギの抗マウスＦＩＴＣ標識Ｆ（ａｂ’）２は、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈから購入した。
【０３０８】
混入している重金属の除去を必要とする試薬は、溶液をカラムに通すことによって、Ｃｈｅｌｅｘ１００（ＢｉｏＲａｄ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）又はＣｈｅｌａｔｉｎｇ  Ｃｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）でバッチ処理した。無菌洗浄用水（ＳＷＦＩｒ）で、低金属のストック溶液を希釈した。溶液は、無菌のプラスチック容器中に保存した。
【０３０９】
本方法の添加試薬を以下に記載する。
【０３１０】
Ｂ．物質と装置
１．Ｏｒｉｇｅｎ  Ａｎａｌｙｚｅｒ；ＩＧＥＮ  Ｉｎｃ．モデル＃１１００−１０００；ＩＤＥＣ  ＃１４９２
２．Ｔｏｐ−Ｃｏｕｎｔシンチレーションカウンター；Ｐａｃｋａｒｄ、モデル＃Ａ９９１２；ＩＤＥＣ＃１３２９
３．ガンマカウンター；Ｉｓｏｄａｔａ、Ｍｏｄｅｌ＃２０−１０；ＩＤＥＣ＃０６２８
４．Ｔｅｃ−Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒａｄｉｏｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ  Ｋｉｔ、Ｂｉｏｄｅｘ、Ｍｏｄｅｌ＃１５１−７７０
５．凍結乾燥機；Ｖｉｒｔｉｓ、Ｍｏｄｅｌ  Ｆｒｅｅｚｅｍｏｂｉｌｅ；ＩＤＥＣ＃０４５８
本方法のための添加物質と装置を記載する。
【０３１１】
Ｃ．方法
１．凍結乾燥されたＳＢ及びＨＳＢ細胞の調製
上述のように細胞を培養し、
遠心（Ｓｏｒｖａｌｌ遠心中で、１３００ｒｐｍ）によって、室温で、０．５〜２×１０６細胞／ｍＬの細胞密度で細胞を採集し、１×ＨＢＳＳで２回洗浄した。１％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と１０％（ｗ／ｖ）のマンニトールを含有する１×ＨＢＳＳ（凍結乾燥緩衝液）中に、５０×１０６細胞／ｍＬになるように沈降した細胞を再懸濁し、ｏリングのパッキングを有する１．５ｍＬのポリプロピレン微量遠心管の中に０．５ｍＬを分配して、−７０℃で保存し、３０〜６０ミリトルで、一晩凍結乾燥した。凍結乾燥した細胞のチューブを２〜８℃で乾燥保存し、アッセイ用の無菌水の中に再構成した；微量遠心管中の凍結乾燥した細胞のチューブを乾燥剤とともに保存した。
【０３１２】
２．ＦＡＣＳ結合分析
フローサイトメトリーによって、ヒトＢ細胞への抗体の直接的な結合を測定した。１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含有する１×ＰＢＳ、ｐＨ７．２（結合緩衝液）中、３０分間、氷上で、５×１０６のＣＤ２０陽性（ＳＢ）又はＣＤ２０陰性（ＨＳＢ）細胞とともに、濃度が増加する抗体をインキュベートした。遠心によって細胞を洗浄し、結合緩衝液中に再懸濁し、ＦＩＴＣ標識ヤギの抗マウスＦ（ａｂ’）２とともに、３０分間、氷上でインキュベートした。２次試薬とのインキュベーション後に、遠心によって細胞を洗浄し、１．１％（ｖ／ｖ）のホルムアルデヒドを含有する１×ＰＢＳ中に再懸濁して細胞を固定した。平均蛍光強度は、フローサイトメトリーを用いて測定した。
【０３１３】
３．拮抗結合アッセイ
２Ｂ８と２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡの免疫反応性は、ＯＲＩＧＥＮ電気化学発光法（Ｌｅｌａｎｄ  ａｎｄ  Ｐｏｗｅｌｌ）を用いてＣＤ２０陽性のＳＢ細胞への拮抗結合によって測定した。対数相のＳＢ細胞を培養から採集し、１×ＨＢＳＳで２回洗浄した。１％の（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンを含有する１×ＰＢＳ  ｐＨ７．２の中に、細胞を希釈した。幾つかの実験では、無菌水での再構成後に、凍結乾燥した細胞を使用した。
【０３１４】
ルテニウム標識されたトレーサー抗体は、１×ＰＢＳ、ｐＨ７．２中で、１５：１（ＴＡＧ−ＮＨＳ対抗体）のモル比で、ルテニウム（ＩＩ）トリス−ビピリジンキレート物質（ＴＡＧ−ＮＨＳ）のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルとともに、ＣＨＯ由来の２Ｂ８（ｌｏｔ＃１６５）をインキュベートすることによって調製された。遮光しながら、室温で１時間インキュベートした後に、グリシンで１０分間、反応を停止させた。１×ＰＢＳで平衡化されたＰｈａｒｍａｃｉａのＰＤ−１０カラムを用いたサイズ排除クロマトグラフィーによって、未反応のＴＡＧを除去した。Ｂｒａｄｆｏｒｄのタンパク質アッセイを用いて、タンパク質の濃度を測定した。ＴＡＧの取り込みは、４５５ｎｍの吸光度を測定することによって決定した。タンパク質に対するＴＡＧのモル比は、３．０であると計算された。
【０３１５】
アッセイは、１２×７５ｍｍのポリプロピレンチューブの中で行った。０．０８μｇ／ｍＬのＡＧ標識されたＣＨＯ  ２Ｂ８、０．０８ｍｇ／ｍＬの抗ＣＤ１９ビーズ、及び１６７，０００細胞／ｍＬとともに、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含有する１×ＰＢＳ、ｐＨ７．２の中で、様々な濃度の拮抗する抗体（０．００２〜１７μｇ／ｍＬ）をインキュベートした。軌道状に混合しながら、室温で３時間インキュベートした後、ＯＲＩＧＥＮ装置を用いて、相対電気化学発光（ＥＣＬ）を測定した。２組ずつの試料に対して平均ＥＣＬ値を求め、Ｋａｌｅｉｄａｇｒａｐｈソフトウェアを用いて、拮抗する抗体濃度に対してプロットした。幾つかの実験では、パーセント阻害をプロットした。拮抗曲線をフィッティングし、以下の４パラメータープログラムを用いて、ＥＣ５０値（最大結合の５０％を与える抗体濃度）を決定した。
【０３１６】
ｙ＝（（ｍ１−ｍ４）／（１＋（ｍ０／ｍ３）＾ｍ２））＋ｍ４；ｍ１＝；ｍ２＝；ｍ３＝；ｍ４＝
ｍ０＝独立変数
ｍ１＝相対ＥＣＬ単位でのゼロシグナル応答
ｍ２＝曲率パラメーター
ｍ３＝ＥＣ５０（μｇ／ｍＬ）
ｍ４＝相対ＥＣＬ単位での最大シグナル応答
平均親和性値はＥＣ５０値と濃度既知のトレース抗体から、Ｍｕｌｌｅｒの方法を用いて計算した。
【０３１７】
４．２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡの調製
乾燥した粉末（遊離の酸）として、キレート物質１−イソチオシアナートベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）を得、−２０℃又は−７０℃で乾燥保存した。１／１０容量の５０ｍＭホウ酸ナトリウム、ｐＨ８．６を加えることによって、低金属の通常の生理的食塩水中の約３ｍｇのＣＨＯ  ２Ｂ８抗体をｐＨ８．６に調整した。５０ｍＭのホウ酸ナトリウム、ｐＨ８．６の中に溶解したＭＸ−ＤＴＰＡを加えることにより、４：１（ＭＸ−ＤＴＰＡ対タンパク質）のモル比で、１０〜１１ｍｇ／ｍＬの抗体をインキュベートした。室温でのインキュベーション（２〜２４時間）後に、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ  ３０スピンフィルターを用いて、低金属の通常の生理的食塩水の中で限外濾過を繰り返すことによって、接合体から未反応のキレート物質を除去した。
【０３１８】
５．Ｉｎ２Ｂ８とＹ２Ｂ８の調製
本明細書に記載した放射標識キットプロトコールを用いてＩｎ２Ｂ８を調製した。３ｍＣｉ／ｍｇの比活性で抗体を標識し、０．２ｍｇ／ｍＬになるように調合した。簡潔に述べれば、無金属の微量遠心管に０．５〜２ｍＣｉの塩化１１１インジウムを移し、１．２×容量の低金属の５０ｍＭ  酢酸ナトリウムを用いて、約ｐＨ４．２に調整した。２ｍｇ／ｍＬの２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡを酢酸インジウム溶液に加え、室温で３０分間インキュベートした後、７．５％（ｗ／ｖ）のヒト血清アルブミンと１ｍＭのＤＴＰＡを含有する１×ＰＢＳ、ｐＨ７．２中に、０．２ｍｇ／ｍＬになるように、標識抗体を調合した（ＨＳＡの最終濃度は４〜６％）。全てのサンプルは３組ずつ、放射能の取り込みについて検査した；値は、９５％を超えていた。
【０３１９】
例１に記載した放射標識キットプロトコールの小規模バージョンを用いて、Ｙ２Ｂ８も調製した。１５ｍＣｉ／ｍｇの比活性に抗体を標識し、０．３ｍｇ／ｍＬになるように調合した。簡潔に述べれば、無金属の微量遠心管に０．５〜２ｍＣｉの塩化９０イットリウムを移し、１．２×容量の低金属の５０ｍＭ  酢酸ナトリウムを用いて、約ｐＨ４．２に調整した。２ｍｇ／ｍＬの２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡを酢酸９０イットリウム溶液に加え、室温で５分間インキュベートした後、７．５％（ｗ／ｖ）のヒト血清アルブミンと１ｍＭのＤＴＰＡを含有する１×ＰＢＳ、ｐＨ７．２中に、０．３ｍｇ／ｍＬになるように標識抗体を調合した（ＨＳＡの最終濃度は４〜６％）。全てのサンプルは３組ずつ、放射能の取り込みについて検査した；値は、９５％を超えていた。
【０３２０】
最終放射標識産物の放射能濃度は、反応混合物に加えた放射能の量に基づき、放射性同位体の分析証明書を参照して計算した。反応停止した反応混合物の抗体濃度は、加えた既知量の抗体から計算した。
【０３２１】
放射能の取り込みと結合に対するｐＨの影響を評価する放射標識速度論の研究のために、様々な量の低金属の５０ｍＭ  酢酸ナトリウムを加えることによって（放射性同位体溶液の容量の０．８〜２．２倍）、反応混合物のｐＨを調整した。
【０３２２】
６．Ｉｎ２Ｂ８とＹ２Ｂ８の放射能の取り込みの測定
Ｂｉｏｄｅｘ製の市販のキット（Ｔｅｃ−Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒａｄｉｏｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ  Ｋｉｔ；例１参照）を用いて、最終産物又はインキュベーションサンプル中の接合体に含まれる放射能の量（放射能の取り込み）を測定した。一般的には、マイクロピペッターを用いて、２又は３組ずつの被検サンプル１μＬを加え、Ｂｉｏｄｅｘの添付指示書に従って展開した。下記のように、Ｉｓｏｄａｔａガンマカウンター又はＰａｃｋａｒｄ  Ｔｏｐ  Ｃｏｕｎｔ  シンチレーションカウンターを用いて、ガラスチューブの中で、片の半分の放射能をカウントした。放射標識の取り込みは、片の上半分の放射能の量を上半分と下半分の両者に存在する総放射能で除することによって計算した。この値をパーセントで表し、平均値を求めた。
【０３２３】
７．Ｉｎ２Ｂ８とＹ２Ｂ８の免疫反応性の測定
免疫反応性は、Ｌｉｎｄｍｏらの方法を用いて、例１で上述したように評価した。
【０３２４】
８．Ｉｎ２Ｂ８とＹ２Ｂ８に対する直接結合アッセイ
それぞれ、Ｉｎ２Ｂ８とＹ２Ｂ８に対するＣＤ２０陽性ＳＢ細胞への結合を測定するために、本明細書に記載したのと同じプロトコールを用いた。Ｉｎ２Ｂ８とＹ２Ｂ８は、上述のように調製し、調合した。アッセイのために、それぞれ、４０ｎｇ／ｍＬと１１ｎｇ／ｍＬになるように、アッセイ希釈緩衝液（１％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する１×ＰＢＳ、ｐＨ７．２）でＩｎ２Ｂ８又はＹ２Ｂ８のサンプルを希釈した。
【０３２５】
３７℃、５％ＣＯ２で、１０％のウシ胎児血清を補充したＲＰＭＩ−１６４０の中に抗原陽性（ＳＢ）及び抗原陰性（ＨＳＢ）細胞を維持した。遠心（Ｓｏｒｖａｌｌ遠心中で、１３００ｒｐｍ）によって、室温で、０．５〜２×１０６細胞／ｍＬの細胞密度で細胞（トリパンブルー排除で測定したときに９０％を超える生存率）を採集し、５０ｍＬの１×ＨＢＳＳで２回洗浄した。１％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と１０％（ｗ／ｖ）のマンニトールを含有する予め冷却した１×ＨＢＳＳ（凍結乾燥緩衝液）中に、５０×１０６細胞／ｍＬになるように沈降した細胞を再懸濁した。ｏリングのパッキングを有する１．５ｍＬのポリプロピレン微量遠心管の中に、細胞懸濁液を５０×１０６細胞／ｍＬに分配して（０．５ｍＬ／遠心管）、３０〜６０ミリトルで、一晩凍結乾燥した。凍結乾燥した細胞を２〜８℃で乾燥保存し、アッセイ用の無菌水の中に再構成した。
【０３２６】
無菌水を用いて、５０×１０６細胞／ｍＬになるように、１．５ｍＬのポリプロピレンチューブ中の凍結乾燥されたＳＢ及びＨＳＢ細胞を再構成した。希釈したＩｎ２Ｂ８又はＹ２Ｂ８を３組ずつ細胞に加え、エンド−オーバー−エンドで混合しながら、室温で４５〜６０分間、それぞれインキュベートした。インキュベーション後に、遠心によって細胞を沈降させ、Ｉｓｏｄａｔａガンマカウンター又はＰａｃｋａｒｄ  Ｔｏｐ  Ｃｏｕｎｔ  シンチレーションカウンター中でサンプルをカウントすることによって、以下に記載されているように、細胞に結合した放射能を測定した。細胞に結合した放射能（Ｂ）は、加えた総放射能から未結合の放射能（上清）を差し引くことによって計算した。総放射能は、細胞のないチューブでカウントされた放射能から決定した。結合したカウントを総カウントのパーセントとして表すことによって、パーセント結合を計算した。
【０３２７】
９．放射能の測定
Ｉｓｏｄａｔａガンマカウンターを用いて、放射能取り込みのサンプルを１分間カウントした。該カウンターは、１００〜５００ＫｅＶのエネルギーウインドウにセットし、１１１Ｉｎを用いたサンプルに対して、使用直前に、バックグラウンドをゼロに調整した。ＩＴＬＣ片の上に滴下した９０Ｙを計数するためにも、Ｉｓｏｄａｔａガンマカウンターを用いた。
【０３２８】
制動放射を検出するためのエネルギーウインドウは、１００〜１０００ＫｅＶであった。
【０３２９】
結合アッセイのために、９０Ｙのサンプルを２４ウェルのプレートとＭｉｃｒｏＳｃｉｎｔ  ４０カクテルに移し、最小及び最大エネルギー設定を用いて、Ｐａｃｋａｒｄ  Ｔｏｐ  Ｃｏｕｎｔ中で１分間カウントした。インジウム−［１１１］のサンプルは、Ｉｓｏｄａｔａガンマカウンターを用いて、１分間カウントした。該カウンターは、１００〜５００ＫｅＶのエネルギーウインドウにセットし、使用直前にバックグラウンドをゼロに調整した。
【０３３０】
１０．臨床的線量のＩｎ２Ｂ８とＹ２Ｂ８放出特性
本発明に従って調製し、ＧＭＰ条件下で充填された２つのロットの臨床グレードの２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡ（ロット＃０２１９と０２２０）を用いて、Ｉｎ２Ｂ８とＹ２Ｂ８のそれぞれにつき６つの線量を調製することによって、放射能の取り込みとＣＤ２０陽性細胞への結合の放出特性を確立した。放出アッセイは、上述のように行った。
【０３３１】
ＩＶ．結果
Ａ．ＣＨＯ由来の２Ｂ８の特性決定
フローサイトメトリー分析を用いて、ＣＨＯ  ２Ｂ８が、ＣＤ２０陰性のＨＳＢ細胞には結合せずに、ＣＤ２０陽性のＳＢ細胞に直接結合することが実証された（図３４）。無関係なイソタイプ（γ１κ）抗体（Ｓ００４）では、ＳＢ又はＨＳＢ細胞への有意な結合は見られなかった。
【０３３２】
ＯＲＩＧＥＮ化学発光検出システムを用いた拮抗アッセイで、ＣＤ２０陽性細胞へのＣＨＯ  ２Ｂ８の結合を調べた。ルテニウム標識されたＣＨＯ  ２Ｂ８トレーサーの存在下で、増加する量の抗体とともに、凍結乾燥され、再構成された抗原陽性ＳＢ細胞をインキュベートした。結果は、中空繊維バイオリアクター由来の抗体（２Ｂ８−４９）と同程度に、ＣＨＯ  ２Ｂ８はＣＳ２０陽性細胞への結合を阻害することを示した（図３５）。グラフからＥＣ５０値を求め、平均親和性値を計算するためにＭｕｌｌｅｒ（１９８０）の方法を用いた。ＣＨＯ  ２Ｂ８に対する親和性は、１．３×１０−１０Ｍと決定された；中空繊維のバイオリアクター由来の２Ｂ８抗体の親和性値は２．５×１０−１０Ｍであった。無関係なイソタイプの抗体Ｓ００４との拮抗の欠如によって実証されたように、非特異的結合は無視できた。
【０３３３】
Ｂ．ＣＨＯ由来の２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡの特性決定
以前特性決定した２Ｂ８−４９に使用したのと同様のプロトコールを用いて、２Ｂ８接合体（２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡ）を調製した。約３ｍｇの抗体と、抗体に対して４：１のモル比のキレート物質を用いて、反応を実施した。ＣＤ２０陽性細胞への許容可能な結合の保持と高い１１１Ｉｎの放射能取り込みを与える反応時間を決定するために、２、４、８、１７、及び２４時間のインキュベーション時間を調べた。ＣＨＯ  ２Ｂ８とＣＨＯ  ２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡ接合体を比較する８〜２４時間反応した拮抗結合曲線は類似しており、接合工程は、ＣＤ２０抗原への抗体の結合を著しく変化させないことを示している（図３６）。グラフから決定したＥＣ値を用いると（図３６）、未接合及び接合抗体の親和定数は、２．３×１０−１０Ｍ〜５．９×１０−１０Ｍの範囲にあった（表４０）。
【０３３４】
放射能の取り込みは、８〜２４時間の接合時間の間、９５％を超えていた（表３０）。
【０３３５】
【表４０】
0004704570.tif 000060
Ｃ．ＣＨＯ由来の２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡから調製したＩｎ２Ｂ８とＹ２Ｂ８の特性決定
中空繊維のバイオリアクター由来の抗体について、先に記載した小規模放射標識キットプロトコール（例１）を用いて、インジウム−［１１１］−標識されたＣＨＯ  ２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡ（Ｉｎ２Ｂ８）を調製した。簡潔に述べれば、表記のｐＨで、酢酸１１１インジウムとともに、室温で３０分間、接合抗体（ＣＨＯ由来の２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡ；ロット＃０１６５Ａ）をインキュベートした。反応混合物は、７．５％（ｗ／ｖ）のヒト血清アルブミンと１ｍＭのＤＴＰＡを含有するＰＢＳ、ｐＨ７．２を用いて調合した。簡易薄層クロマトグラフィーを用いて、調合したＩｎ２Ｂ８のサンプルの放射能の取り込みをアッセイした。ＣＤ２０陽性細胞へのＩｎ２Ｂ８の結合は、凍結乾燥され、再構成されたＳＢ細胞を用いて測定した。比較のために、ハイブリドーマによって産生された抗体（２Ｂ８−４９）から調製した接合体を、ｐＨ４．２で３０分間、酢酸１１１インジウムとともにインキュベートした（該抗体に対して以前確立した条件）。
【０３３６】
ＣＤ２０陽性細胞への結合の保持を最大とし、高い放射能の取り込みを与える標識条件を決定するために、速度論実験を行った（表４１と４２）。ｐＨ４．２で、酢酸１１１インジウムとともに、接合抗体（ＣＨＯ由来の２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡ）を表記の時間室温でインキュベートした（表４２）。
【０３３７】
【表４１】
0004704570.tif 000061
【表４２】
0004704570.tif 000062
結果は、ｐＨ３．０〜４．６と３０分のインキュベーション時間にわたって、約８４％の結合を維持しながら、９７％を超える放射性同位体の取り込みが達成されることを実証した。１５〜４５分のインキュベーション時間とｐＨ２．９〜４．６での反応にわたって、放射能の取り込みと結合値は不変であった（表４２）。結果は、２Ｂ８−４９抗体を用いて得られたものと同等であった（表４１と４２）。
【０３３８】
接合抗体（ＣＨＯ由来の２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡ）を酢酸９０イットリウムとともに、表記のｐＨで、５分間室温でインキュベートすることによって、イットリウム−［９０］標識された抗体を調製した。７．５％（ｗ／ｖ）のヒト血清アルブミンと１ｍＭのＤＴＰＡを含有するＰＢＳ、ｐＨ７．２の中で、反応混合物を調合した。調合したＹ２Ｂ８のサンプルの放射能の取り込みは、簡易薄層クロマトグラフィーを用いてアッセイした。ＣＤ２０陽性の細胞へのＹ２Ｂ８の結合は、凍結乾燥され、再構成されたＳＢ細胞を用いて測定した。比較のために、ハイブリドーマによって産生された抗体（２Ｂ８−４９）から調製した接合体を、ｐＨ４．２で５分間、酢酸９０イットリウムとともにインキュベートした（該抗体に対して既に確立された条件）。
【０３３９】
９０Ｙ標識された抗体（Ｙ２Ｂ８）の調製を評価するために、類似の速度論実験を行った。ｐＨ３．９〜４．７の範囲、５分のインキュベーション時間での放射標識反応では、放射能の取り込みは９６％を超え、ＣＤ２０陽性細胞への結合の保持は８０％を超えていた（表４３）。３、５、及び１０分のインキュベーション時間、ｐＨ２．９〜４．６の範囲についても、同様の結果が得られた（表４４）。続いて、接合抗体（ＣＨＯ由来の２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡ）を、ｐＨ４．２で表記の時間、酢酸９０イットリウムとともに、室温でインキュベートした（表４４）。結果は、２Ｂ８−４９抗体を用いたものと同等であった（表４３と４４）。
【０３４０】
【表４３】
0004704570.tif 000063
【表４４】
0004704570.tif 000064
Ｌｉｎｄｍｏらの方法を用いて、ＣＨＯ  ２Ｂ８から調製したＩｎ２Ｂ８とＹ２Ｂ８に対する免疫反応性を決定した。抗原過剰の条件下で、一定量のＩｎ２Ｂ８又はＹ２Ｂ８とともに、増加する量の採取直後のＣＤ２０陽性ＳＢ細胞をインキュベートした。結合データの逆数プロット分析によって、Ｉｎ２Ｂ８とＹ２Ｂ８に対して、それぞれ、８０．６％と７２．２％の免疫反応性が測定された（図３７と３８）。
【０３４１】
Ｄ．ＣＨＯ由来のＩｎ２Ｂ８とＹ２Ｂ８の放出特性
Ｉｎ２Ｂ８とＹ２Ｂ８のそれぞれにつき６つのロットを調製するために、２つのロットの臨床グレードのＩｎ２Ｂ８／Ｙ２Ｂ８放射標識キットを用いた。Ｉｎ２Ｂ８とＹ２Ｂ８は、現在臨床試験で使用されている小規模バージョンの放射標識プロトコールを用いて調製した。放射標識された２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡの各ロットの放射能取り込みとＣＤ２０陽性（ＳＢ）及びＣＤ２０陰性（ＨＳＢ）ヒト細胞への結合について調べた。これらの結果は、表４５と４６にまとめられている。調製した６つのロットのＩｎ２Ｂ８では、放射能の取り込みは９８．９〜９９．３％の範囲にあり、平均は９９．１％であった。ＣＤ２０陽性細胞への結合は８１．９〜８５．１％の範囲にあり、平均は８３．６％であった；ＣＤ２０陰性細胞への結合は４％未満であった。調製した６つのロットのＹ２Ｂ８では、放射能の取り込みは９７．４〜９８．７％の範囲にあり、平均は９８．２％であった。ＣＤ２０陽性細胞への結合は８１．４〜８２．７％の範囲にあり、平均は８１．９％であった；ＣＤ２０陰性細胞への結合は８％未満であった。
【０３４２】
【表４５】
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【表４６】
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Ｖ．考察と結論
ＣＨＯ細胞中にクローニングされ、発現された抗ＣＤ２０マウスモノクローナル抗体（２Ｂ８）（ＣＨＯ由来の２Ｂ８）は、ＦＡＣＳ及び拮抗結合分析によって、ＣＤ２０陽性ヒト細胞に対する特異性を維持していることが示された。ヒトＴ細胞への結合は最小であった。ヒトＣＤ２０陽性細胞に対する抗体の親和性は、拮抗結合アッセイを用いて、１．３×１０−１０Ｍであると決定された。同じアッセイを用いて、中空繊維バイオリアクター由来の２Ｂ８抗体は、２．５×１０−１０Ｍの親和性値を与えた。
【０３４３】
ＣＨＯ  ２Ｂ８抗体をＭＸ−ＤＴＰＡと反応させて、適切な免疫反応性を保持させながら、接合体２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡを形成させた。１１１Ｉｎを用いて放射能の取り込みを測定することによって、最適なキレート物質の取り込みを測定し、室温で８時間インキュベートした後に最適な取り込みが得られた。最大の放射能の取り込みと免疫反応性の保持を確保するために、９０Ｙ又は１１１Ｉｎに対して、ｐＨとインキュベーション時間に関して、２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡ接合体に対する放射標識プロトコールを最適化した。
【０３４４】
Ｉｎ２Ｂ８とＹ２Ｂ８の数個の調製物の結果は、臨床的線量を調製するために使用される放射標識プロトコールの再現性を実証している。これらの放射標識結果に基づけば、放射能取り込みに対する放出特性と凍結乾燥されたＣＤ２０陽性細胞を用いた結合は、それぞれ９５％以上と７０％に確定されることが示唆される。総合すれば、これらの結果は、ＣＨＯ由来の２Ｂ８と中空繊維由来の２Ｂ８−４９の同等性と、ＣＨＯ由来の２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡを臨床試験に使用する適切性を実証している。
【０３４５】
最後に、本発明は、タンパク質に結合しなかった放射性同位体を除去するために現在使用されている高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）工程が不要となる、臨床的線量の放射標識抗体を調製するための「ミックス＆シュート」法と称される標識操作を開示している。簡易化された該プロトコールによれば、高レベルの放射性同位体の取り込み（＞９５％）と向上した免疫反応性の保持（＞７０％）を維持しながら、この手間のかかる精製工程が省略できる。放射性同位体と免疫反応性の保持に基づき、４℃で４８時間インキュベートしたときに、臨床的に調合された放射標識接合体は、インビトロで安定であることが明らかとなった。さらに、ヒト血清中で、３７℃で７２時間インキュベートしたときにも、放射標識された接合体は安定であった。ＢＡＬＢ／ｃマウスでの生体分布研究によって、異常な組織への蓄積がなく、骨にも有意に蓄積しないことが実証された。「標準的な」７０Ｋｇのヒトについての放射線吸収線量の推測値は、９０Ｙ標識された２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡを用いた進行中の臨床試験で得られたものと同等であった。これらの研究の結果によって、「ミックス＆シュート」プロトコールを用いて作成された９０Ｙ標識２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡが、従来のＨＰＬＣ法を用いて調製したものと同等であることが示された。臨床グレードの放射標識接合体を調製するためのスケールアッププロトコールのバリデーションは、該方法には再現性があり、その産物は、現行のＨＰＬＣ法を用いて作成されたものと同等であることを示した。これらの前臨床試験の結果は、臨床試験での試験に適した９０Ｙ標識された２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡを調製するために、この新しい「ミックス＆シュート」プロトコールを使用できることを示している。
【０３４６】
【参考文献】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  １２５Ｉ標識されたＢ１を用いた放射線免疫検定法（ＲＩＡ）での直接的な競合によって、ネイティブ２Ｂ８の免疫反応性を、市販の抗ＣＤ２０抗体Ｂ１（Ｃｏｕｌｔｅｒ）及びＬｅｕ  １６  （Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）と比較した。Ｖ＆Ｐフィルタープレートの各ウェルに、抗原陽性ＳＢ細胞（１００，０００）を添加した。１０ｎｇの放射標識されたＢ１を、様々な濃度の標識されていない競合と混合し、混合物を細胞に加えた。抗体を該細胞とともに、１時間、室温でインキュベートした。測定は、三重に行った。
続いて、ウェルを洗浄、乾燥し、フィルターに付着している放射能を測定した。示されているデータは、バックグラウンドの放射能に対して補正されており、三重測定の平均である。
【図２】  増加する濃度の未接合２Ｂ８のヒトＢ細胞（ＳＢ）への結合を、ＦＡＣＳ分析を用いて分析した。市販の抗ＣＤ２０モノクローナル抗体（Ｂ１）及び、２つの無関係なイソタイプの抗体と比較を行った。ヤギの抗マウスＩｇＧ−ＦＩＴＣ  Ｆ（ａｂ）’２を２次試薬として用いた。結果は、２Ｂ８がＣＤ２０抗原に特異的であり、Ｂ１より多い結合を示すことを示している。
【図３】  ヒトＢ細胞（ＳＢ）を、増加する量の１２５Ｉ標識された２Ｂ８とインキュベートした。３つの試料を１時間インキュベートし、細胞を集めるために濾過した後、細胞に結合した放射能を測定した。スキャッチャード分析によって、４．３×１０−９Ｍの見かけの親和定数が算出された。
【図４】  ネイティブ２Ｂ８、２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡ、及びＢ１の免疫反応性。Ｂ１抗体は、方法の部に記載したとおりに、放射標識した。１０ｎｇの放射標識されたＢ１を、増加する濃度の拮抗物質と混合し、それぞれ１００，０００の抗原陽性ＳＢ細胞を含有するＶ＆Ｐフィルタープレートのウェルに、該混合物を加えた。全ての測定は、三重に行った。室温で１時間のインキュベーションの後、ウェルを徹底的に洗浄した。続いて、フィルターを乾燥し、付着した放射能をガンマカウンターで測定した。全ての値は、バックグラウンドに対して補正した。示した値は、三重測定の平均である。
【図５Ａ】  １０ｍｇ／ｍＬの最終濃度で、通常の生理的食塩水、又は１０ｍＭのグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ  ６．８を含有する通常の生理的食塩水の中に抗体２Ｂ８を調合した。続いて、ネジ蓋付きのバイアルの中に、２組ずつのサンプルを入れ、バイアルに窒素を吹き付けた後、蓋をした。続いて、該サンプルを４℃又は３０℃で１２週間インキュベートした。サンプルの免疫反応性を毎週評価した。
１２週の研究期間を通じて、何れの２Ｂ８サンプルにも、免疫反応性の喪失は観察されなかった。１週目（図５Ａ）、６週目（図５Ｂ）、及び１２週目（図５Ｃ）の免疫反応性が図示されている。
【図５Ｂ】  １０ｍｇ／ｍＬの最終濃度で、通常の生理的食塩水、又は１０ｍＭのグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ  ６．８を含有する通常の生理的食塩水の中に抗体２Ｂ８を調合した。続いて、ネジ蓋付きのバイアルの中に、２組ずつのサンプルを入れ、バイアルに窒素を吹き付けた後、蓋をした。続いて、該サンプルを４℃又は３０℃で１２週間インキュベートした。サンプルの免疫反応性を毎週評価した。
１２週の研究期間を通じて、何れの２Ｂ８サンプルにも、免疫反応性の喪失は観察されなかった。１週目（図５Ａ）、６週目（図５Ｂ）、及び１２週目（図５Ｃ）の免疫反応性が図示されている。
【図５Ｃ】  １０ｍｇ／ｍＬの最終濃度で、通常の生理的食塩水、又は１０ｍＭのグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ  ６．８を含有する通常の生理的食塩水の中に抗体２Ｂ８を調合した。続いて、ネジ蓋付きのバイアルの中に、２組ずつのサンプルを入れ、バイアルに窒素を吹き付けた後、蓋をした。続いて、該サンプルを４℃又は３０℃で１２週間インキュベートした。サンプルの免疫反応性を毎週評価した。
１２週の研究期間を通じて、何れの２Ｂ８サンプルにも、免疫反応性の喪失は観察されなかった。１週目（図５Ａ）、６週目（図５Ｂ）、及び１２週目（図５Ｃ）の免疫反応性が図示されている。
【図６Ａ】  ５０  ｍｇ／ｍＬのヒト血清アルブミンを含有するＰＢＳ、ｐＨ  ７．４中でインキュベートした、１１１Ｉｎ標識された２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡの免疫反応性を測定するための結合アッセイ（４８時間インキュベート）。図６Ａ）  増加する容量のＳＢ細胞（２０×１０６細胞／ｍＬ）とともに、一定量の放射標識された抗体（５ｎｇ／ｍＬ）をインキュベートした。加えた細胞懸濁液の容量に対して、細胞に結合した放射能の量（ｃｐｍ）をプロットした。
【図６Ｂ】  図６Ｂ）  結合した放射能に対する加えた総放射能（ＡＴ／Ｂ）をプロットした。線形外挿によって、ｙ切片（０．９９７）を算出した。ｙ切片の逆数×１００によって、無限過剰の抗原における１００％の免疫反応値が得られた。
【図７】  ７５ｍｇ／ｍＬのヒト血清アルブミンと１ｍＭのＤＴＰＡを含有するＰＢＳ、ｐＨ７．４中、４℃でインキュベートした、９０Ｙ標識された２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析から得られたオートラジオグラム。表記の時点で、非還元条件、変性条件（ＳＤＳ）を用いて、４〜２０％のトリス−グリシンゲル上にサンプルを電気泳動した。５μＬ（レーン１、２）１０μＬのサンプル（レーン５、６）をロードした。約１５分間、室温で、該ゲルをＸ線フィルムに暴露し、写真を撮った。
【図８】  ７５ｍｇ／ｍＬのヒト血清アルブミンと１ｍＭのＤＴＰＡを含有するＰＢＳ、ｐＨ７．４中、４℃でインキュベートした、９０Ｙ標識された２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析から得られたゼロ時のオートラジオグラムの濃度測定スキャン。非還元条件を用いて、４〜２０％のトリス−グリシンゲル上にサンプルを電気泳動した。
サンプルは、２つのウェルに５μＬ、１０μＬ、及び２０μＬずつロードした。約１５分間、室温で、ゲルをＸ線フィルムに暴露し、濃度計を用いてレーンのうちの１つをスキャンした。放射標識された接合体ピーク（＃２）の相対面積は９６．２％であった。
【図９】  ７５ｍｇ／ｍＬのヒト血清アルブミンと１ｍＭのＤＴＰＡを含有するＰＢＳ、ｐＨ７．４中、４℃でインキュベートした、９０Ｙ標識された２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析から得られた４８時間の時点でのオートラジオグラムの濃度測定スキャン。非還元条件を用いて、４〜２０％のトリス−グリシンゲル上にサンプルを電気泳動した。
サンプルは、２つのウェルに５μＬ、１０μＬ、及び２０μＬずつロードした。約１５分間、室温で、ゲルをＸ線フィルムに暴露し、濃度計を用いてレーンのうちの１つをスキャンした。放射標識された接合体ピーク（＃２）の相対面積は９５．５％であった。
【図１０】  ５０ｍｇ／ｍＬのヒト血清アルブミンを含有するＰＢＳ、ｐＨ７．４中、４℃でインキュベートした、１１１Ｉｎ標識された２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析から得られたオートラジオグラム。表記の時点で、非還元条件を用いて、４〜２０％のトリス−グリシンゲル上にサンプルを電気泳動した。５μＬ（レーン１、２）、１０μＬ（レーン３、４）、及び２０μＬ（レーン５、６）のサンプルをロードした。約１５分間、室温で、該ゲルをＸ線フィルムに暴露し、写真を撮った。（注：４８時間のオートラジオグラムは、ゼロ時のオートラジオグラムと比べて、より強いシグナルを与える増感紙を用いて得た）。
【図１１】  ５０ｍｇ／ｍＬのヒト血清アルブミンを含有するＰＢＳ、ｐＨ７．４中、４℃でインキュベートした、１１１Ｉｎ標識された２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析から得られたゼロ時のオートラジオグラムの濃度測定スキャン。非還元条件下で、４〜２０％のトリス−グリシンゲル上にサンプルを電気泳動した。サンプルは、２つのウェルに５μＬ、１０μＬ、及び２０μＬずつロードした。約１５分間、室温で、ゲルをＸ線フィルムに暴露し、濃度計を用いてレーンのうちの１つをスキャンした。放射標識された接合体ピーク（＃３）の相対面積は９５．９％であった。
【図１２】  ５０ｍｇ／ｍＬのヒト血清アルブミンを含有するＰＢＳ、ｐＨ７．４中、４℃でインキュベートした、１１１Ｉｎ標識された２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析から得られた４８時間の時点でのオートラジオグラムの濃度測定スキャン。非還元条件下で、４〜２０％のトリス−グリシンゲル上にサンプルを電気泳動した。サンプルは、２つのウェルに５μＬ、１０μＬ、及び２０μＬずつロードした。約１５分間、室温で、ゲルをＸ線フィルムに暴露し、濃度計を用いてレーンのうちの１つをスキャンした。放射標識された接合体の相対面積は９７．０％であった（ピーク＃２、３、及び４を合わせた面積）。
【図１３】  ヒト血清中、３７℃でインキュベートした、９０Ｙ標識された２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析から得られたオートラジオグラム。表記の時点で、非還元条件を用いて、４〜２０％のトリス−グリシンゲル上にサンプルを電気泳動した。５μＬ（レーン１、２）、１０μＬ（レーン３、４）、及び２０μＬ（レーン５、６）のサンプルをロードした。約１５分間、室温で、該ゲルをＸ線フィルムに暴露し、写真を撮った。
【図１４】  ヒト血清中、３７℃でインキュベートした、９０Ｙ標識された２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析から得られたゼロ時のオートラジオグラムの濃度測定スキャン。非還元条件を用いて、４〜２０％のトリス−グリシンゲル上にサンプルを電気泳動した。サンプルは、２つのウェルに５μＬ、１０μＬ、及び２０μＬずつロードした。約１５分間、室温で、ゲルをＸ線フィルムに暴露し、濃度計を用いてレーンのうちの１つをスキャンした。放射標識された接合体ピーク（＃２）の相対面積は９７．９％であった。
【図１５】  ヒト血清中、３７℃でインキュベートした、９０Ｙ標識された２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析から得られた９８時間の時点でのオートラジオグラムの濃度測定スキャン。非還元条件を用いて、４〜２０％のトリス−グリシンゲル上にサンプルを電気泳動した。サンプルは、２つのウェルに５μＬ、１０μＬ、及び２０μＬずつロードした。約１５分間、室温で、ゲルをＸ線フィルムに暴露し、濃度計を用いてレーンのうちの１つをスキャンした。放射標識された接合体ピーク（＃２）の相対面積は９４．７％であった。
【図１６】  ヒト血清中、３７℃でインキュベートした、１１１Ｉｎ標識された２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析から得られたオートラジオグラム。表記の時点で、非還元条件を用いて、４〜２０％のトリス−グリシンゲル上にサンプルを電気泳動した。５μＬ（レーン１、２）、１０μＬ（レーン３、４）、及び２０μＬ（レーン５、６）のサンプルをロードした。約１６〜２０時間、室温で、該ゲルをＸ線フィルムに暴露し、写真を撮った。
【図１７】  ヒト血清中、３７℃でインキュベートした、１１１Ｉｎ標識された２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析から得られたゼロ時のオートラジオグラムの濃度測定スキャン。非還元条件を用いて、４〜２０％のトリス−グリシンゲル上にサンプルを電気泳動した。サンプルは、２つのウェルに５μＬ、１０μＬ、及び２０μＬずつロードした。約１６〜２０時間、室温で、ゲルをＸ線フィルムに暴露し、濃度計を用いてレーンのうちの１つをスキャンした。放射標識された接合体ピーク（＃３）の相対面積は９５．３％であった。
【図１８】  ヒト血清中、３７℃でインキュベートした、１１１Ｉｎ標識された２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析から得られた９６時間の時点でのオートラジオグラムの濃度測定スキャン。非還元条件を用いて、４〜２０％のトリス−グリシンゲル上にサンプルを電気泳動した。サンプルは、２つのウェルに５μＬ、１０μＬ、及び２０μＬずつロードした。約１６〜２０時間、室温で、ゲルをＸ線フィルムに暴露し、濃度計を用いてレーンのうちの１つをスキャンした。放射標識された接合体ピーク（＃３）の相対面積は９４．０％であった。
【図１９】  カニクイザルに、合計７回、４８時間おきに静脈内注射した；投与した量が示されている。抗ＣＤ２（Ｔ細胞）、抗Ｍｏ−ＩｇＧ  （２Ｂ８）、抗ＣＤ２０  （Ｌｅｕ  １６）、及び抗ヒトＩｇＧ（Ｂ細胞）を用いたＦＡＣＳ分析によって、循環するＴ細胞及びＢ細胞のレベルを測定した。循環するＴ細胞のレベルには、全く影響が観られなかった（第５グループには、単回投与を行った）。
【図２０】  図１９の簡単な記述に記載されている蛍光標識された抗体を用いたＦＡＣＳ分析によって、２Ｂ８を与えた動物における循環するＢ細胞レベルの回復を追跡した。１３日目に屠殺したので、第３及び４グループの動物はモニターしなかった。
【図２１】  臨床品質の２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡを用いて調製された８９Ｙ−２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡを、カニクイザルの静脈内に注射した。動物には、合計７回、上記の量を４８時間毎に与えた。第０、２、７、１０、及び１４日目に、サルから採血し、血清化学血液学及び循環するＢ細胞のレベルを計測した（１０日目の血清は、Ｂ細胞の含量を分析しなかった）。第２グループの１個体を除く全ての動物で総白血球の総数が減少したこと以外は、本研究の間に、顕著な異常は見られなかった。
【図２２Ａ】  ゼロ日目に、１０ｍｇ／ｋｇの単回注射を行った後のＥＬＩＳＡによって、カニクイザルからのマウス抗ＣＤ２０抗体２Ｂ８のクリアランスを測定した。パネルＡに示されているように、抗体は、約４．５日のβｔ１／２値を示した。
【図２２Ｂ】  ＢＡＬＢ／ｃマウスの循環からの２Ｂ８抗体及びそのＭＸ−ＤＴＰＡ接合体のクリアランスが、パネルＢに示されている。２５μｇのネイティブ又は接合された２Ｂ８をマウスに静脈内注射し、注射後２６４時間までの様々な時点に血液サンプルを採取した。続いて、ＳＢ細胞を捕捉剤として使用した酵素免疫検定によって、血清を分析した。ネイティブの抗体と接合抗体は、ともに８．７５日のクリアランス値を示した。
【図２３】  ２０匹のＢＡＬＢ／ｃマウスに、それぞれ、５０ｍｇ／ｍＬのＨＳＡを含有するＰＢＳ、ｐＨ７．４中で調合された、１．１μＣｉの放射標識された接合体（１００μＬ）を注射した。それぞれ５匹のマウスのグループを、１、２４、４８、及び７２時間目に屠殺した後、血液と様々な組織を調製し、含まれている放射能を分析した。
【図２４】  ２０匹のＢＡＬＢ／ｃマウスに、それぞれ、７５ｍｇ／ｍＬのヒト血清アルブミンと１ｍＭのＭＤＰＡを含有する１×ＰＢＳ、ｐＨ７．４中で調合された、約１．０μＣｉ（１００μＬ中）の放射標識された接合体を静脈内注射した。それぞれ５匹のマウスのグループを、１、２４、４８、及び７２時間目に屠殺した後、それらの血液と様々な組織を調製し、含まれている放射能を分析した。
【図２５】  ＲａｍｏｓのＢ細胞腫瘍を有する胸腺欠損マウスに、２４μＣｉの１１１Ｉｎ−２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡを静脈内注射し、３匹のマウスからなる各グループを、０、２４、４８、及び７２時間目に屠殺した。組織を調製し、含まれる放射能を測定した後、グラム組織当たりの注射したパーセントの用量の値を決定し、示されているようにプロットした。
【図２６Ａ】  ５０〜７５ｍｇ／ｍＬのヒト血清アルブミンを含有するＰＢＳ、ｐＨ  ７．４の中でインキュベートした、「ミックス＆シュート（ｍｉｘ−＆−ｓｈｏｏｔ）」９０Ｙ標識された２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡの免疫反応性を測定するための結合アッセイ（４８時間インキュベート）。パネルＡ）  増加する量のＳＢ細胞とともに、一定量の９０Ｙ標識された抗体（約１ｎｇ／ｍＬ）をインキュベートした。細胞の濃度に対して、細胞に結合した放射能の量（ｃｐｍ）をプロットした。
【図２６Ｂ】  パネルＢ）  結合した放射能に対する加えた９０Ｙ総放射能（ＡＴ／Ｂ）をプロットした。線形外挿によって、ｙ切片（１．１３９）を算出した。ｙ切片の逆数×１００によって、無限過剰の抗原における８７．９％の免疫反応値が得られた。ＣＤ２０陰性細胞（ＨＳＢ）を用いると、結合が観察されなかった。
【図２７】７５ｍｇ／ｍＬのヒト血清アルブミンと１ｍＭのＤＴＰＡを含有するＰＢＳ、ｐＨ７．４中、４℃でインキュベートした、９０Ｙ標識された２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析から得られたオートラジオグラム。表記の時点で、非還元条件、変性条件（ＳＤＳ）を用いて、４〜２０％のトリス−グリシンゲル上にサンプルを電気泳動した。５μＬ（レーン１、２）、１０μＬ（レーン５、６）のサンプルをロードした。約１５分間、室温で、該ゲルをＸ線フィルムに暴露し、写真を撮った。
【図２８】  ７５ｍｇ／ｍＬのヒト血清アルブミン及び１ｍＭのＤＴＰＡを含有するＰＢＳ、ｐＨ７．４中、４℃でインキュベートした、９０Ｙ標識された２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析から得られたゼロ時のオートラジオグラムの濃度測定スキャン。非還元条件を用いて、４〜２０％のトリス−グリシンゲル上にサンプルを電気泳動した。サンプルは、２つのウェルに５μＬ、１０μＬ、及び２０μＬずつロードした。約１５分間、室温で、ゲルをＸ線フィルムに暴露し、濃度計を用いてレーンのうちの１つをスキャンした。放射標識された接合体ピーク（＃２）の相対面積は９６．１％であった。
【図２９】  ７５ｍｇ／ｍＬのヒト血清アルブミンと１ｍＭのＤＴＰＡを含有するＰＢＳ、ｐＨ７．４中、４℃でインキュベートした、９０Ｙ標識された２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析から得られた４８時間の時点でのオートラジオグラムの濃度測定スキャン。非還元条件を用いて、４〜２０％のトリス−グリシンゲル上にサンプルを電気泳動した。サンプルは、２つのウェルに５μＬ、１０μＬ、及び２０μＬずつロードした。約１５分間、室温で、ゲルをＸ線フィルムに暴露し、濃度計を用いてレーンのうちの１つをスキャンした。放射標識された接合体ピーク（＃２）の相対面積は９４．１％であった。
【図３０】  ヒト血清中、３７℃でインキュベートした、「ミックス＆シュート」９０Ｙ標識された２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析から得られたオートラジオグラム。表記の時点で、非還元条件を用いて、４〜２０％のトリス−グリシンゲル上にサンプルを電気泳動した。５μＬ（レーン１、２）、１０μＬ（レーン３、４）、及び２０μＬ（レーン５、６）のサンプルをロードした。約１５分間、室温で、該ゲルをＸ線フィルムに暴露し、写真を撮った。
【図３１】  ヒト血清中、３７℃でインキュベートした、「ミックス＆シュート」９０Ｙ標識された２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析から得られたゼロ時のオートラジオグラムの濃度測定スキャン。非還元条件を用いて、４〜２０％のトリス−グリシンゲル上にサンプルを電気泳動した。サンプルは、２つのウェルに５μＬ、１０μＬ、及び２０μＬずつロードした。約１５分間、室温で、ゲルをＸ線フィルムに暴露し、濃度計を用いてレーンのうちの１つをスキャンした。放射標識された接合体ピーク（＃２）の相対面積は８９．１％であった。
【図３２】  ヒト血清中、３７℃でインキュベートした、「ミックス＆シュート」９０Ｙ標識された２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析から得られた７２時間の時点でのオートラジオグラムの濃度測定スキャン。非還元条件を用いて、４〜２０％のトリス−グリシンゲル上にサンプルを電気泳動した。サンプルは、２つのウェルに５μＬ、１０μＬ、及び２０μＬずつロードした。約１５分間、室温で、ゲルをＸ線フィルムに暴露し、濃度計を用いてレーンのうちの１つをスキャンした。放射標識された接合体ピーク（＃２）の相対面積は８８．８％であった。
【図３３】  ２０匹のＢＡＬＢ／ｃマウスに、それぞれ、７５ｍｇ／ｍＬのヒト血清アルブミンと１ｍＭのＤＴＰＡを含有する１×ＰＢＳ、ｐＨ７．４中で調合された、５μＣｉの９０Ｙ放射標識された２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡを静脈内注射した。それぞれ５匹のマウスのグループを、１、２４、４８、及び７２時間目に屠殺した後、それらの血液と様々な組織を調製し、含まれている放射能を分析した。
【図３４】  増加する量のＣＨＯ由来の標識された２Ｂ８抗体を、一定の濃度の採集した直後のＣＤ２０陽性Ｂ細胞（ＳＢ）又はＣＤ２０陰性Ｔ細胞（ＨＳＢ）とともにインキュベートした。本明細書に記載されているように、ヤギの抗マウスＩｇＧ−ＦＩＴＣ  Ｆ（ａｂ）’２を用いたＦＡＣＳ分析を用いて、細胞に結合している抗体を定量した。無関係なイソタイプ抗体（Ｓ００４）に対して比較を行った。ＣＨＯ由来の２Ｂ８抗体のみが、ＣＤ２０陽性ＳＢ細胞に対して、何らかの確認し得る結合を示した。
【図３５】  ＯＲＩＧＥＮアッセイでの直接的な拮抗によって、ＣＨＯ由来の２Ｂ８の免疫反応性を、ハイブリドーマ細胞株中で産生された２Ｂ８−４９親抗体と比較した。増加する量の抗体を、一定濃度のＣＤ２０陽性Ｂ細胞（ＳＢ）と微量のルテニウム標識されたＣＨＯ２Ｂ８とともにインキュベートした。室温で３時間インキュベートした後、物質と方法に記載されているように、ＯＲＩＧＥＮ装置を用いて、結合（相対電気化学発光（ＥＣＬ）として表されている）を測定した。値は、二重の測定値の平均を表している。ＣＨＯ  ２Ｂ８及び２Ｂ８−４９に対する平均親和定数は、それぞれ、１．３×１０−１０Ｍ及び２．５×１０−１０Ｍと算出された。比較のために、無関係のイソタイプ抗体（Ｓ００４）を含めた。
【図３６】  ＯＲＩＧＥＮアッセイでの直接的な競合によって、ＣＨＯ由来の２Ｂ８から調製した２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡ接合体の結合を、未接合の抗体と比較した。未反応のキレートを除去する８、１７、及び２４時間前に、２Ｂ８をＭＸ−ＤＴＰＡとインキュベートすることによって、接合体を調製した。結合を評価するために、抗体を、一定濃度のＣＤ２０陽性Ｂ細胞（ＳＢ）と微量のルテニウム標識されたＣＨＯ  ２Ｂ８とともにインキュベートした。室温で３時間インキュベートした後、物質と方法に記載されているように、ＯＲＩＧＥＮ装置を用いて、結合（相対電気化学発光（ＥＣＬ）として表された）を測定した。値は、二重の測定値の平均を表している。接合体調製物は、未接合の２Ｂ８抗体と比較して、同様の結合を示した。
【図３７Ａ】  Ａ）  ＳＢ細胞を洗浄し、９０×１０６細胞／ｍＬになるように、希釈緩衝液（１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンを含有する１×ＰＢＳ、ｐＨ  ７．４）で再懸濁した。増加する濃度の細胞を、２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡロット０１６５Ａを用いて調製した７．５ｎｇ／ｍＬのＩｎ２Ｂ８とともに３時間インキュベートした。
【図３７Ｂ】  Ｂ）  細胞濃度ｖｓ．結合した放射能／総放射能（Ｂ／ＡＴ）の二重逆数プロット。免疫反応性は、１／ｙ切片×１００として算出した。免疫反応性及び相関係数（Ｒ）の値は、それぞれ、８０．６％と０．９８１であった。
【図３８Ａ】  Ａ）  ＳＢ細胞を洗浄し、９０×１０６細胞／ｍＬになるように、希釈緩衝液（１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンを含有する１×ＰＢＳ、ｐＨ  ７．４）で洗浄し、再懸濁した。増加する濃度の細胞を、２Ｂ８−ＭＸ−ＤＴＰＡロット＃０１６５Ａを用いて調製した２ｎｇ／ｍＬのＹ２Ｂ８とともに３時間インキュベートした。
【図３８Ｂ】  Ｂ）  細胞濃度ｖｓ．結合した放射能／総放射能（Ｂ／ＡＴ）の二重逆数プロット。免疫反応性は、１／ｙ切片×１００として算出した。免疫反応性及び相関係数（Ｒ）値は、それぞれ、７２．２％と０．９９９であった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７Ａ】
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【図３７Ｂ】
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【図３８Ａ】
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【図３８Ｂ】
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