(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の成分を含む複数種類の緩衝液に試料を導入し、分離カラムを通過させて、生体液中のアミノ酸類縁物質を検出対象とした生体液分析を行うアミノ酸分析法において、前記試料が導入される緩衝液の所定のリチウムイオン濃度およびｐＨ値を、チロシン（Ｔｙｒ）が溶出される時間までは第１のリチウムイオン濃度を維持し、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）からホモシスチン（Ｈｏｍｏｃｙｓ）が溶出される時間以降に、第１のリチウムイオン濃度よりも高い第２のリチウムイオン濃度にグラジエントで上昇させ、第１のｐＨ値から第２のｐＨ値にグラジエントで低下させる段階を含み、
前記試料が導入される緩衝液のリチウムイオン濃度を、少なくともチロシンが溶出される時間までは０．２５５ｍｏｌ／Ｌ以下とし、フェニルアラニンからホモシスチンが溶出される時間では、緩衝液のリチウムイオン濃度を０．２５５ｍｏｌ／Ｌより大で１．１３ｍｏｌ／Ｌ以下の濃度に上昇させることを特徴とするアミノ酸分析法。
【請求項２】
複数の成分を含む複数種類の緩衝液ごとに設けられたバルブを調整することで混合し、当該混合された緩衝液に試料を導入し、分離カラムを通過させて、生体液アミノ酸類縁物質を検出対象とした生体液分析を行うアミノ酸分析装置において、前記混合液の緩衝液の第１のリチウムイオン濃度及び第１のｐＨ値を、チロシン（Ｔｙｒ）が溶出される時間までは維持し、その後フェニルアラニン（Ｐｈｅ）からホモシスチン（Ｈｏｍｏｃｙｓ）が溶出される時間以降は、緩衝液の所定のリチウムイオン濃度をグラジエントで上昇させ、ｐＨ値をグラジエントで低下させる段階を実行するように前記バルブを制御する分析プログラムを格納する記憶装置と、該プログラムに従って緩衝液の流量調整を行う制御装置とを有し、
前記分析プログラムは、前記混合後の緩衝液のリチウムイオン濃度が、少なくともチロシンが溶出される時間までは、０．２５５ｍｏｌ／Ｌ以下を維持し、且つフェニルアラニンからホモシスチンが溶出される時間では、緩衝液のリチウムイオン濃度が０．２５５ｍｏｌ／Ｌより大で１．１３ｍｏｌ／Ｌ以下に上昇するものであり、前記制御装置は前記分析プログラムに従って前記バルブを制御して緩衝液の流量調整を行うことを特徴とするアミノ酸分析装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、臨床分野に好適なアミノ酸分析方法及び装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
アミノ酸分析計は大別して、蛋白質加水分解物アミノ酸約２０成分を対象とした標準分析と、生体液アミノ酸類縁物質約４０成分またはそれ以上の成分を対象とした生体液分析法を行うものに分類できる。ここでは生体液分析法、すなわち、血清や尿、髄液などの生体液を分析し、これを臨床的に利用して、病気の診断や、治療に役立てることができる分析方法について述べる。
【０００３】
生体液分析法の例としては、特許文献１，２がある。これら従来の生体液分析法は、複数の緩衝液を混合し、混合した緩衝液に試料を添加し、分離カラムを通過させて検出するという一連の分析手法は変わらないが、分離カラムや緩衝液の流速などを工夫することにより、時代と共に分析時間が短縮される傾向にある。
【０００４】
【特許文献１】特開平９−８００３７号公報
【特許文献２】特開２００２−７１６６０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
以下の説明において、分析対象となる生体液試料中のアミノ酸４２種の名称およびその略号は、表１の表記に従った。
【０００６】
【表１】
0004704824.tif 000002
【０００７】
生体液分析法では、現在上記に示したように約４０成分の分析を一斉に行うことが出来る。ところが最近、メタボローム解析の発達により、分析対象試料中の成分を一斉に分析しながら、複数種の成分比率も分析することが、特定の病気に関する研究を行う上で非常に有効であり、臨床分野においてそのような要求が高まりつつある。具体的には、表１注の＊が付されている成分の比率を求めることなどである。また、上記の成分を迅速に分析できることも重要である。
【０００８】
従来の分析プログラムによって得られる分析結果は、４１成分を迅速且つ正確に分析することができるが、ＬｙｓとＯｒｎについてはピークが互いに隣り合い、近接している。動物由来の生体試料には、Ｏｒｎ及びＨｉｓに対してＬｙｓが多量に含まれている場合があるため、従来の分析プログラムを用いて分析すると、これら３成分を同時に分析できないことがある。つまり、従来の分析プログラムは、実際の分析結果については分析者の要求を満足できないことがある。
【０００９】
本発明の目的は、生体液試料の４０種以上のアミノ酸類縁物質を１時間以内で分析することである。また、Ｌｙｓ、ＨｉｓおよびＯｒｎの３成分のピークが重ならないクロマトグラムを得ることである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、カラムの充填剤の検討、及び分離実験を重ねたところ、アミノ酸類縁物質４２成分を一斉に短時間で分析可能な分析法を見出した。
【００１１】
本発明は、複数の成分を含む複数種類の緩衝液に試料を導入し、分離カラムを通過させて、生体液アミノ酸類縁物質を検出対象としたアミノ酸分析法において、前記試料が導入される緩衝液のリチウムイオン濃度およびｐＨ値を、所定の時間維持し、その時間経過後はリチウムイオン濃度を上昇させ、ｐＨ値を低下させることを特徴とするアミノ酸分析法を提供するものである。
【００１２】
本発明はまた、複数の緩衝液を各緩衝液毎に設けられたバルブを調整して混合し、当該混合された緩衝液に試料を導入し、分離カラムを通過させて、生体液アミノ酸類縁物質を検出対象とした生体液分析を行うアミノ酸分析装置において、前記混合後の緩衝液のリチウムイオン濃度が、所定の時間の間維持され、その後緩衝液のリチウムイオン濃度を上昇させ、ｐＨ値を低下させるように前記バルブを制御する分析プログラムを格納する記憶装置と、該プログラムに従って緩衝液の流量調整を行う制御装置とを有することを特徴とするアミノ酸分析装置を提供するものである。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、４０種以上のアミノ酸類縁物質を１時間以内で分析できる。また、液体クロマトグラフィにより、短時間で分析すること、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ｏｒｎの３成分のピークが重なることなく、Ｈｉｓ及びＯｒｎのピークと、Ｌｙｓのピークとの間隔を離すこと、３Ｍｅｈｉｓ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓのピークが互いに重なりにくくなるように、これら３成分の溶出順をＨｉｓ、３Ｍｅｈｉｓ、Ｌｙｓとすることである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、従来例と比較しながら本発明の実施例の詳細を述べる。
【００１５】
本発明の実施形態の例として、複数の成分を含む複数種類の緩衝液に試料を導入し、分離カラムを通過させて、生体液アミノ酸類縁物質を検出対象とした生体液分析を行うアミノ酸分析法において、前記試料が導入される緩衝液のリチウムイオン濃度を、少なくともチロシン（Ｔｙｒ）が溶出される時間までは０．２５５ｍｏｌ／Ｌ以下とし、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）からホモシスチン（Ｈｏｍｏｃｙｓ）が溶出される時間では、緩衝液のリチウムイオン濃度を０．２５５ｍｏｌ／Ｌより大で１．１３ｍｏｌ／Ｌ以下の濃度に上昇させ、ｐＨ値を低下させることを特徴とするアミノ酸分析法が挙げられる。
【００１６】
本発明の他の実施形態として、複数の緩衝液を各緩衝液ごとに設けられたバルブを調整することで混合し、当該混合された緩衝液に試料を導入し、分離カラムを通過させて、生体液アミノ酸類縁物質を検出対象とした生体液分析を行うアミノ酸分析装置において、前記混合後の緩衝液のリチウムイオン濃度が、少なくともＴｙｒが溶出される時間まで０．２５５ｍｏｌ／Ｌ以下（第１のリチウムイオン濃度）であり、且つ、ＰｈｅからＨｏｍｏｃｙｓが溶出される時間では、緩衝液のリチウムイオン濃度が０．２５５ｍｏｌ／Ｌより大で１．１３ｍｏｌ／Ｌ以下（第２のリチウムイオン濃度）に上昇するように前記バルブを制御する分析プログラムを格納する記憶装置と、該プログラムに従って緩衝液の流量調整を行う制御装置とを有することを特徴とするアミノ酸分析装置がある。
【００１７】
更に、本発明の他の実施の形態として、以下のものが例示される。前記生体液アミノ酸類縁物質は所定の４２種類であって、前記アミノ酸分析を１時間以内で完了する。１時間以内の分析は、現在のアミノ酸分析技術において強く望まれている。本発明の実施形態によれば、４２種類のアミノ酸が分離カラムから溶出された後、分離カラムの洗浄、再生を含めても６０分程度で完了することができる。
【００１８】
また、前記アミノ酸類縁物質は、ホスホセリン（Ｐ−Ｓｅｒ）、タウリン（Ｔａｕ）、ホスホエタノールアミン（ＰＥＡ）、ウレア（Ｕｒｅａ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、ハイドロキシプロリン（Ｈｙｐｒｏ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、セリン（Ｓｅｒ）、アスパラギン（ＡｓｐＮＨ２）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、グルタミン（ＧｌｕＮＨ２）、サルコシン（Ｓａｒ）、α−アミノアジピン酸（α−ＡＡＡ）、プロリン（Ｐｒｏ）、グリシン（Ｇｌｙ）、アラニン（Ａｌａ）、シトルリン（Ｃｉｔ）、α−アミノ−ｎ−酪酸（α−ＡＢＡ）、バリン（Ｖａｌ）、シスチン（Ｃｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、シスタチオニン（Ｃｙｓｔｈｉ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、チロシン（Ｔｙｒ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、β−アラニン（β−Ａｌａ）、β−アミノイソ酪酸（β−ＡｉＢＡ）、γ−アミノ−ｎ−酪酸（γ−ＡＢＡ）、エタノールアミン（ＥＯＨＮＨ２）、アンモニア（ＮＨ３）、ハイドロキシリジン（Ｈｙｌｙｓ）、オルニチン（Ｏｒｎ）、１−メチルヒスチジン（１Ｍｅｈｉｓ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、３−メチルヒスチジン（３Ｍｅｈｉｓ）、リジン（Ｌｙｓ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、アンセリン（Ａｎｓ）、カルノシン（Ｃａｒ）、アルギニン（Ａｒｇ）の４２種である。
【００１９】
更に本発明は、液体クロマトグラフィにより複数種の緩衝液を用いて、生体液試料中の４０種以上のアミノ酸を溶出して分析クロマトグラムを作成し、該クロマトグラムを表示装置に表示して、該クロマトグラムを解析して所定のアミノ酸分析を行う方法であって、該表示装置に、３−メチルヒスチジン（３Ｍｅｈｉｓ）、リジン（Ｌｙｓ）およびトリプトファン（Ｔｒｐ）の順で溶出したアミノ酸のクロマトグラムを表示することを特徴とするアミノ酸分析装置を提供する。本発明の実施形態によれば、上記３種のアミノ酸が従来方法とは異なった順序で溶出し、それが相互に明確に分離されているために、アミノ酸分析、例えば各成分の含有比が容易に計算できる。
【００２０】
図２は本発明のアミノ酸分析計の装置構成及び流路説明図である。１〜４はそれぞれ第１〜第４緩衝液、５はカラム再生液である。この中から電磁弁シリーズ６によって何れかの緩衝液が選ばれ、緩衝液ポンプ７によってアンモニアフィルタカラム８、オートサンプラ９によって導入されたアミノ酸試料は分離カラム１０で分離される。ここで分離したアミノ酸は、ニンヒドリンポンプ１２によって送られてきたニンヒドリン試薬１１とミキサ１３で混合し、加熱された反応カラム１４で反応する。反応によって発色したアミノ酸は検出器１５で連続的に検知され、データ処理装置１６によってクロマトグラム及びデータとして出力され、記録、保存される。
【００２１】
制御装置１７は緩衝液容器の電磁弁６Ａ〜６Ｄ、カラム再生液容器の電磁弁６Ｅ，並びにニンヒドリンポンプ１２、オートサンプラ９、緩衝液容器などの温度を制御する手段（図示せず）を制御する。この制御は主として制御装置の記憶装置（図示せず）に格納されたプログラムによって実行される。
【００２２】
【表２】
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【００２３】
第１緩衝液１、第２緩衝液２及びカラム再生液５としては、表２に示す緩衝液を用いた。また、本発明の分析方法では第３緩衝液３及び第４緩衝液４として、表３に示す緩衝液を用いた。ニンヒドリン試薬１１は市販のニンヒドリン試薬Ｌ−８５００セット（和光純薬工業（株）製）を用いた。分離カラム１０にはパックドカラム５．４ｍｍＩＤｘ２５ｍｍｘＴｗｉｎ、充填剤としては、イオン交換樹脂＃２６２３を用いた。
【００２４】
【表３】
0004704824.tif 000004
【００２５】
イオン交換樹脂＃２６２３は高速高分離分析に適した充填剤である。以下、イオン交換樹脂＃２６２３の特徴を示す。高速高分離に適した樹脂の条件は、ポンプの送液速度を上げてもより高い理論段数Ｎを示すことである。また、送液速度が高くなるとカラム圧が上昇することにより、イオン交換樹脂が潰れ、カラムとしての性能が低下することがあるので、送液速度が大きくなってもカラム圧が上昇しにくいという特徴も、高速分析に適している。従って、高速高分離分析に適しているか否かを評価するには、理論段数とカラム圧を同時に考慮する必要がある。
【００２６】
式（１）で示されるセパレーションインピーダンスＥを用いると、カラム圧と理論段数を加味した評価を行うことが可能である。Ｈはカラムの長さを理論段数Ｎで割った値、カラムパーミアビリティＫｖは式（２）で示され、カラムの圧力損失ΔＰ／Ｌに反比例する。従って、理論段数Ｎが大きく、圧力損失ΔＰ／Ｌが小さいほど、つまり、セパレーションインピーダンスＥの値は小さいほど、高速高分離分析に適したイオン交換樹脂であると言える。
【００２７】
【数１】
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【００２８】
＃２６２３及び＃２６２２は平均粒子径が３μｍ、＃２６１７は平均粒子径が５μｍのイオン交換樹脂であり、＃２６２２及び＃２６１７は株式会社日立ハイテクノロジーズが供給している従来のイオン交換樹脂である。これら３種類のイオン交換樹脂を充填したカラムについて、カラムの中を流れる移動相の線速度ｕ０とセパレーションインピーダンスＥとの関係を調べた。図１５はその結果を示したものである。
【００２９】
図１５より、線速度０．００１ｍ／ｓ以下の領域においては＃２６２３のセパレーションインピーダンスＥが最も低い値を示し、線速度０．００１ｍ／ｓにおいては、＃２６２３のＥは＃２６２２及び＃２６１７のＥの半分の値となった。つまり、流速が大きくなるにつれて＃２６２３のセパレーションインピーダンスＥは従来の樹脂のセパレーションインピーダンスＥよりも小さくなる傾向がある。従って、＃２６２３は従来の樹脂よりも高速高分離分析に適していると言える。
【００３０】
次に、図３に示した本発明の分析プログラムについて説明する。「％Ｂ１−％Ｂ５」欄は、それぞれ第１緩衝液１〜カラム再生液５に相当する。時間０で、％Ｂ１−％Ｂ５の欄に１００．０とあるのは相当する電磁弁が１００％開くという意味である。８０と２０は、相当する二つの電磁弁が時間比で８０％と２０％に開く、すなわち８０％と２０％に液が混合するという意味である。さらに時間と共に混合比を変えると、グラジエント混合が可能となる。図２の構成であれば、最大５液までグラジエントができる。
【００３１】
「温度」は、分離カラムの温度プログラムを示す。３８とあるのは次の指定時間まで３８℃一定を保つという意味である。「流量１」は、緩衝液ポンプの流量、「流量２」は、ニンヒドリンポンプの流量である。
【００３２】
「％Ｒ１−％Ｒ３」欄は、ニンヒドリン試薬の混合比である。通常ニンヒドリン試薬は２液に分かれて市販されており、使用時Ｒ１とＲ２は５０％ずつ混合するようになっている。Ｒ３は蒸留水が設置してあり、分析終了時の洗浄などに使用する。
【００３３】
上記のプログラムは本発明によるアミノ酸分析装置の制御装置の記憶部に格納し、このプログラムに従ってアミノ酸分析装置が自動的に緩衝液の供給、停止、置換等を実行する。
【００３４】
図１の（Ａ）に図３の分析プログラムを使用して得られた、本発明の結果である分析クロマトグラムを示す。また比較のため、図１の（Ｂ）に従来の図４の分析プログラムによるクロマトグラムを示す。どちらのクロマトグラムも表１に示すアミノ酸試料を測定したものである。また、図１（Ｃ）は図１（Ａ）のクロマトグラムと図１の（Ｂ）のクロマトグラムのそれぞれ同じ成分のピークを線で結んで表わしたものである。図１から分かるように、図１の（Ｂ）ではＬｙｓとＯｒｎについてはピークが互いに隣り合い、近接している。これに対して図１（Ａ）ではＨｉｓ及びＯｒｎのピークと、Ｌｙｓのピークとは十分に間隔がとれている。
【００３５】
次に、図１（Ａ）に示すように、４２成分の一斉分析を可能にした本発明の緩衝液組成検討過程、及び、分析プログラムの作成過程について述べる。
【００３６】
図５及び図６は、緩衝液のパラメータ（組成）について検討したときの、各成分の保持時間の変化を示したものである。図５は、緩衝液のｐＨを２．８で一定にし、リチウムイオン濃度を変化させたときの、各成分の保持時間を示したものである。図５より、緩衝液のリチウムイオン濃度を１．１３ｍｏｌ／Ｌより大きくすることによって、ＴｒｐがＬｙｓより後に溶出するようになることが分かる。また、緩衝液のリチウムイオン濃度を１．１３ｍｏｌ／Ｌより大きくすることによって、Ｔｒｐと他の成分との分離が良くなることも分かった。図６は、緩衝液のリチウムイオン濃度を１．５ｍｏｌ／Ｌとし、緩衝液のｐＨを変化させたときの、各成分の保持時間の変化を示したものである。図６から、緩衝液のｐＨを３以下にすると、ＴｒｐがＬｙｓより後に溶出するようになることが分かる。また、緩衝液のｐＨを３以下にすると、図６に示す成分の全体的な分離バランスが改善されることも分かった。
【００３７】
図１３は、緩衝液のｐＨを２．８で一定にし、リチウムイオン濃度を０．５７〜１．７０ｍｏｌ／Ｌの間で変化させたときの、３Ｍｅｈｉｓ及びＬｙｓの保持時間を示したものである。図１３より、リチウムイオン濃度が１．４０ｍｏｌ／Ｌより低いときに３Ｍｅｈｉｓ、Ｌｙｓの順に溶出することが分かる。図１４は緩衝液のリチウムイオン濃度を１．１３ｍｏｌ／Ｌで一定にし、ｐＨを変化させたときのＬｙｓ及び３Ｍｅｈｉｓの保持時間を示したものである。図１４より、ｐＨが２．８５以下では３Ｍｅｈｉｓ、Ｌｙｓの順で溶出することが分かる。
【００３８】
本発明においては、緩衝液Ｂ３及びＢ４のリチウムイオン濃度及びｐＨを表３に示すような値にした。Ｂ４のｐＨはクエン酸緩衝液の酸解離定数ｐＫａ１（３．１３）と同等の３．３とした。Ｂ４のリチウムイオン濃度は、Ａｒｇの溶出を早めるために、Ｂ３のリチウムイオン濃度１．１３ｍｏｌ／Ｌよりも大きい、１．３７ｍｏｌ／Ｌとした。
【００３９】
表２に示す第１、第２緩衝液、カラム再生液組成及び、表３に示す第３、第４緩衝液を用いて分析プログラムの検討を行った。以下、その実施例を説明する。
【００４０】
図７は、γ―ＡＢＡ〜ＥＯＨＮＨ２の分析プログラムの３１分から始まるＢ３の０％から１００％までのグラジエント勾配による分離改善の様子を示したものである。Ｂ３混合比の切り替え方を、３１分でステップワイズ（Ｃ）させるよりも、３１分から３５分でグラジエントされる（Ｂ）か、３１分から４０分でグラジエントさせるほうが（Ａ）、γ−ＡＢＡ〜ＥＯＨＮＨ２間の分離バランスが良くなることが分かる。ここで、リチウムイオン濃度の変化を見ると、０．２５５ｍｏｌ／Ｌ→１．１３ｍｏｌ／Ｌである。また、ｐＨの変化を見ると、３．７→２．８となっている。本発明の分析プログラムでは、３１分から３９分で切り替えるようにしている。
【００４１】
図８は、分析プログラムの４８分から５３分の間で、緩衝液Ｂ４＝１００％の場合（Ｂ）と、緩衝液Ｂ４＝６０％かつＢ５＝４０％の場合（Ａ）の分離の状態を示したものである。図８からＢ４＝６０％かつＢ５＝４０％で緩衝液を混合させた方が、Ｔｒｐ〜Ａｎｓ間の分離とＣａｒ〜Ａｒｇ間の分離が良くなることがわかる。これはリチウムイオン濃度とｐＨがＢ４のレベル（Ｌｉ濃度：１．３７ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ：３．３）で一定であるよりも、Ｂ４とＢ５との混合の方（Ｌｉ濃度：１．０２ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ：６．１５）が良いことを示す。本発明の分析プログラムでは、Ａｒｇを測定開始後６０分以内に納めることを考慮し、分析プログラムの４８分から５３分の間で緩衝液の割合をＢ４＝７０％、Ｂ５＝３０％に切り替えるようにしている。
【００４２】
図９は、図８の実験と合わせて検討した、緩衝液Ｂ４＝７０％、Ｂ５＝３０％に切り替える時間を変化させたときの分離改善の様子を示したものである。緩衝液Ｂ４＝７０％、Ｂ５＝３０％に切り替える時間を、５１分とした場合（Ａ）と、４５分とした場合（Ｃ）を見ると、前者は３Ｍｅｈｉｓ〜Ｌｙｓの分離が良くなるが、Ｃａｒ〜Ａｒｇの分離が悪くなり、後者は３Ｍｅｈｉｓ〜Ｌｙｓの分離が悪くなるが、Ｃａｒ〜Ａｒｇの分離が改善されることが分かる。そこで、緩衝液Ｂ４＝７０％、Ｂ５＝３０％に切り替える時間を４８分にすると（Ｂ）、３Ｍｅｈｉｓ〜Ｌｙｓ間、Ｃａｒ〜Ａｒｇ間共に分離のバランスが良くなった。
【００４３】
上記は緩衝液の組成について検討したものであるが、カラム温度についての検討も行ったので図１０に示す。図１０は、カラム温度切り替え開始時間の変更によるＨｏｍｏｃｙｓ〜γ−ＡＢＡ間の分離改善を試みたものである。カラム温度を７０℃にする切り替え開始時間を３２分から２６分に早めていくと、Ｈｏｍｏｃｙｓ〜γ−ＡＢＡ間の分離が改善されることが分かる。カラム温度を７０℃にする切り替え開始時間を早めると、その一方で、Ｌｙｓ〜Ｔｒｐの分離が悪くなる傾向があることを考慮して、本発明の分析プログラムでは、カラム温度を７０℃にする切り替え開始時間を２９分で行うことを採用している。
【００４４】
以上、図５、６に示した緩衝液の塩濃度及びｐＨ、図７〜１０に示した部分分離改善を組み合わせることにより、図３に示す本発明の分析プログラムが求められ、図１（Ａ）の分離結果が実現する。
【００４５】
上記本発明の分析プログラムにおいては、複数の緩衝液を混合し、且つカラム温度を調整しているが、４２成分のピークを上手く分離できた要因としては、先にも述べた通り、リチウムイオン濃度、ｐＨ、カラム温度が大きな要因である。そこで、図１１、図１２に、分析プログラムに沿ったリチウムイオン濃度とｐＨの変化の様子を示す。
【００４６】
図１１は、本発明と従来の分析プログラムにおけるリチウムイオン濃度の変化をグラフ化したものである。実線（Ａ）は図３に示す本発明の分析プログラム、破線（Ｂ）は図４の従来の分析プログラムに対応する。このグラフから分かるように、図１１（Ａ）に示す本発明の分析プログラムにおけるリチウムイオン濃度は、図１１（Ｂ）に示す従来の分析プログラムにおけるリチウムイオン濃度に比べて、塩濃度が０．３ｍｏｌ／Ｌより高くなる時間が遅く、且つグラジエントにより上昇するようになっている。
【００４７】
また図１２は、ｐＨの変化を測定しグラフ化したものである。図１２の（Ａ）は図３に示す本発明の分析プログラムに対応するものであり、図１２の（Ｂ）は図４に示す従来の分析プログラムに対応するものである。分析プログラムにおける３９分以降では、図１２の（Ｂ）についてはｐＨを約４で２０分間一定にしているが、図１２の（Ａ）については一度ｐＨを下げてから、４８分から５３分の間でｐＨを６．２まで上昇させている。
【００４８】
ここで、本発明の分析プログラムについて、図５〜１０に示した部分分離改善を基に、そのポイントを纏めると以下のようになる。
【００４９】
（１）γ−ＡＢＡ〜ＥＯＨＮＨ２間の分離バランスを改善するためには、リチウムイオン濃度を０．２５５ｍｏｌ／Ｌから１．１３ｍｏｌ／Ｌにグラジエントで上昇させ、ｐＨを３．７から２．８にグラジエントで変化させる。尚、このグラジエントを行う時間は、分析プログラムと保持時間のずれを考慮し、ＰｈｅからＨｏｍｏｃｙｓが溶出される時間（保持時間）で行い、且つ、Ｔｙｒが溶出される時間まではリチウムイオン濃度が０．２５５ｍｏｌ／Ｌを超えないようにする。本発明の分析プログラムでは３１分〜３９分の間、即ち３０分経過後となる。
【００５０】
（２）Ｔｒｐ〜Ａｎｓ間の分離とＣａｒ〜Ａｒｇ間の分離を改善するためには、リチウムイオン濃度を１．０２ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨを６．１５とする。本発明の分析プログラムではＢ４とＢ５の混合（Ｂ４比率７０％）で実施する。
【００５１】
また、このリチウムイオン濃度、ｐＨにする時間は、分析プログラムと保持時間のずれを考慮し、１Ｍｅｈｉｓ〜Ｌｙｓが溶出される時間（保持時間）で行うようにする。本発明の分析プログラムでは、４８分〜５３分の間となる。また、このリチウムイオン濃度を１．０２ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨを６．１５とする時間を早めることにより、Ｃａｒ〜Ａｒｇ間の分離を改善することができる。さらに、このリチウムイオン濃度を１．０２ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨを６．１５とする時間を遅くすることにより、３Ｍｅｈｉｓ〜Ｌｙｓ間の分離を改善することができる。
【００５２】
（３）Ｈｏｍｏｃｙｓ〜μ−ＡＢＡ間の分離バランスを改善するためには、カラム温度を７０℃とする時間を調整する。本発明の分析プログラムでは、２９分で５６℃から７０℃へ切り替えている。
【００５３】
尚、本発明の分析プログラムにおける４８分から５３分の間のＢ４とＢ５の混合は、緩衝液を更にもう１種加えることによっても、図１（Ａ）と同等のクロマトグラムを得ることができる。即ち、分析プログラムの４３分においてステップワイズに変化させることにより、Ｂ４比率１００％から、新たな緩衝液（リチウムイオン濃度１．０２ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ６．１５）の比率１００％に切り替え、更に、分析プログラムの５３分でＢ５比率１００％に切り替えるという方法である。
【００５４】
本発明の実施形態における分析プログラムを採用したことによる効果を纏めると以下のようになる。
（１）緩衝液切り替え時間の適正化によって、４２成分を同時に分析した場合でも各成分のピークがバランスよく分離でき、且つ、分析時間も７５分に抑えることが出来た。
（２）これにより、臨床検査で求められる、ハイスループットを実現することが出来た。
（３）分析装置のハードウェアや、分離カラムを変更することは必須ではない。アプリケーションのみの改善によっても、４２成分の分離が実現した。
（４）得られる分析結果ではＬｙｓが３Ｍｅｈｉｓの後に溶出する。これにより、Ｌｙｓが多量に含まれる生体試料を分析した場合でも、分離のバランスが損なわれることが無くなる。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】（Ａ）は本発明の分析プログラムによる４２成分のアミノ酸を分離したクロマトグラム、（Ｂ）は従来の分析プログラムによるクロマトグラムである。
【図２】本発明で使用するアミノ酸分析装置の概略流路図である。
【図３】本発明の分析プログラムである。
【図４】従来の分析プログラムである。
【図５】緩衝液のリチウムイオン濃度（ｐＨは一定）と各成分の保持時間との関係を表すグラフである。
【図６】緩衝液のｐＨ（リチウムイオン濃度は一定）と各成分の保持時間との関係を表すグラフである。
【図７】３１分から始まるＢ３の０％から１００％までのグラジエント勾配による、γ−ＡＢＡ〜ＥＯＨＮＨ２間の分離改善を示す図である。
【図８】４８分から５３分の間で、緩衝液Ｂ４＝１００％の場合（Ｂ）と、緩衝液Ｂ４＝６０％かつＢ５＝４０％の場合（Ａ）の状態を示す図である。
【図９】緩衝液Ｂ４＝７０％、Ｂ５＝３０％に切り替える時間を変化させたときの分離改善の様子を示す図である。
【図１０】カラム温度切り替え開始時間の変更によるＨｏｍｏｃｙｓ〜γ−ＡＢＡ間の分離改善を示す図である。
【図１１】（Ａ）は本発明の分析プログラムのリチウムイオン濃度グラフ、（Ｂ）は従来の分析プログラムのリチウムイオン濃度グラフである。
【図１２】（Ａ）は本発明の分析プログラムのｐＨグラフ、（Ｂ）は従来の分析プログラムのｐＨグラフである。
【図１３】緩衝液のｐＨ（リチウムイオン濃度は１．１３ｍｏｌ／Ｌで一定）と各成分の保持時間との関係を表すグラフである。
【図１４】緩衝液のリチウムイオン濃度（ｐＨは２．８０で一定）と各成分の保持時間との関係を表すグラフである。
【図１５】各イオン交換樹脂についての線速度ｕ０とセパレーションインピーダンスEの関係を示すグラフである。
【符号の説明】
【００５６】
１〜４…緩衝液、５…再生液、６…電磁弁シリーズ、７…緩衝液ポンプ、８…アンモニアフィルタカラム、９…オートサンプラ、１０…分離カラム、１１…ニンヒドリン試薬、１２…ニンヒドリンポンプ、１３…ミキサ、１４…反応カラム、１５…検出器、１６…データ処理装置。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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