(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式
【化１】
0004652577.tif 000006
【化２】
0004652577.tif 000007
（ここで、Ｒは、エチルまたはメチルを示し、Ｘは、−ＯＨまたはＮＨ２を示す。ただし、Ｒ＝メチルのときは、Ｘ≠ＯＨである。）で示される光学活性な３，３，３−トリフルオロ−２−アルキルプロピオン酸誘導体の製造方法であって、一般式
【化３】
0004652577.tif 000008
（ここで、ＲおよびＸは、前記意味を有する）で示されるラセミ体３，３，３−トリフルオロ−２−アルキルプロピオンアミドを、ラセミ体またはその光学活性異性体の１つの形態にある該アミドを唯一の窒素源として利用することが可能な微生物、またはアミドヒドロラーゼ活性を有し、該アミドを加水分解することが可能なポリペプチドのいずれかを用いて転換することを含み、該ポリペプチドは以下から成る群から単離可能であるか、微生物は以下から成る群から選ばれる、製造方法。
クレブシエラオキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａ）ＰＲＳＩ（ＤＳＭ１１００９）、クレブシエラオキシトカＰＲＳＩＫ１７（ＤＳＭ１１６２３）、クレブシエラパンチキュラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐａｎｔｉｃｕｌａ）ＩＤ−６２４（ＤＳＭ１１３５４）、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＩＤ−６２５（ＤＳＭ１１３５５）、ｐＰＲＳ２ａ（ＤＳＭ１１６３５）種を宿す大腸菌ＸＬ−１ブルー（Ｂｌｕｅ）ＭＲＦ’種（登録商標）。
【請求項２】
一般式
【化４】
0004652577.tif 000009
で示される３，３，３−トリフルオロ−２−アルキルプロピオンアミドが、一般式
【化５】
0004652577.tif 000010
で示される３，３，３−トリフルオロ−２−アルキルプロピオノニトリルを鉱酸により加水分解することにより製造されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
利用される鉱酸が、硫酸であることを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項４】
一般式
【化６】
0004652577.tif 000011
（ここで、Ｒは、エチルまたはメチルを示し、Ｘは、−ＯＨまたはＮＨ２を示す。ただし、Ｒ＝メチルのときは、Ｘ≠ＯＨである。）で示される光学活性な３，３，３−トリフルオロ−２−アルキルプロピオン酸誘導体の製造方法であって、
第１の工程において、一般式
【化７】
0004652577.tif 000012
（ＲおよびＸは、前記意味を有する）で示されるラセミ体３，３，３−トリフルオロ−２−アルキルプロピオンアミドを、ラセミ体またはその光学活性異性体の１つの形態にある該アミドを唯一の窒素源として利用することが可能な微生物、またはアミドヒドロラーゼ活性を有し、該アミドを加水分解することが可能なポリペプチドのいずれかを用いて、一般式
【化８】
0004652577.tif 000013
（ここで、ＲおよびＸは、前記意味を有する）で示される光学活性な３，３，３−トリフルオロ−２−アルキルプロピオンアミドへと転換し、その後、第２工程において、既知の方法でこのアミドを、光学活性な３，３，３−トリフルオロ−２−アルキルプロピオン酸誘導体（式ＩＩ）へと加水分解するものであり、該ポリペプチドは以下から成る群から単離可能であるか、微生物は以下から成る群から選ばれる、製造方法。
クレブシエラオキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａ）ＰＲＳＩ（ＤＳＭ１１００９）、クレブシエラオキシトカＰＲＳＩＫ１７（ＤＳＭ１１６２３）、クレブシエラパンチキュラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐａｎｔｉｃｕｌａ）ＩＤ−６２４（ＤＳＭ１１３５４）、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＩＤ−６２５（ＤＳＭ１１３５５）、ｐＰＲＳ２ａ（ＤＳＭ１１６３５）種を宿す大腸菌ＸＬ−１ブルー（Ｂｌｕｅ）ＭＲＦ’種（登録商標）。
【請求項５】
式
【化９】
0004652577.tif 000014
で示される３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−エチルプロピオンアミド。
【請求項６】
（＋）−３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−エチルプロピオン酸。
【請求項７】
（−）−３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−エチルプロピオンアミド。
【請求項８】
（Ｓ−）−３，３，３−トリフルオロ−２−アミノ−２−メチルプロピオンアミド。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、一般式
【化１０】
0004652577.tif 000002
【化１１】
0004652577.tif 000003
で示される光学活性な３，３，３−トリフルオロメチル−２−アルキルプロピオン酸誘導体の新規の製造方法、およびこの化合物類の新規の代表例に関する。
【０００２】
３，３，３−トリフルオロメチル−２−ヒドロキシ−２−エチルプロピオン酸のような３，３，３−トリフルオロメチル−２−アルキルプロピオン酸誘導体は、治療学的アミドを製造するための重要な中間体である（ＥＰ−Ａ０５２４７８１）。
【０００３】
現在に至るまで、３，３，３−トリフルオロメチル−２−アミノ−２−メチルプロピオン酸のような既知の３，３，３−トリフルオロメチル−２−アルキルプロピオン酸誘導体は、アミノアシラーゼを使用し、ラセミ体トリフルオロアセチル−Ｒ（＋）２−トリフルオロメチルアラニンから出発して合成されてきた。この生成物は、この方法においては、低い収率でのみ生成される。
【０００４】
本発明の目的は、所望の生成物が、優れた収率で、また比較的短い反応時間で生成される、光学活性な３，３，３−トリフルオロメチル−２−アルキルプロピオン酸誘導体の製造方法を利用可能にすることであった。
【０００５】
この目的は、請求項１に請求されている方法により達成される。
【０００６】
本発明にしたがうと、３，３，３−トリフルオロメチル−２−アルキルプロピオン酸誘導体は、式
【化１２】
0004652577.tif 000004
（ここで、Ｒは、エチルまたはメチルを示し、Ｘは、−ＯＨまたはＮＨ２を示す。ただし、Ｒ＝メチルのときは、Ｘ≠ＯＨである。）で示されるラセミ体３，３，３−トリフルオロメチル−２−アルキルプロピオンアミドを、ラセミ体またはその光学活性異性体の１つの形態にある該アミドを唯一の窒素源として利用することが可能な微生物、またはアミドヒドロラーゼ活性を有し、該アミドを加水分解することが可能なポリペプチドのいずれかを用いて、転換させることにより製造される。
【０００７】
出発化合物、すなわち一般式ＩＩＩの３，３，３−トリフルオロメチル−２−アルキルプロピオンアミドは、通例の化学的方法を使用して製造され得る。３，３，３−トリフルオロメチル−２−ヒドロキシ−２−エチルプロピオンアミドのような出発化合物は、好ましくは、一般式
【化１３】
0004652577.tif 000005
（ここで、ＲおよびＸは、前記意味を有する）で示される対応する３，３，３−トリフルオロメチル−２−アルキルプロピオノニトリルを、鉱酸により加水分解することにより製造される。
【０００８】
使用される鉱酸は、たとえば、リン酸、塩酸または硫酸といった、当業者にとって通例のものであろう。使用される鉱酸は、好ましくは硫酸である。鉱酸は、好都合には、過剰に用いられ、好ましくはプロピオノニトリル１モルあたり２から４ｍｏｌの量である。
【０００９】
加水分解は、好都合には、２０から１４０℃、好ましくは９０から１２０℃の温度で行われる。
【００１０】
ラセミ体またはその光学活性異性体の１つの形態にある式ＩＩＩのプロピオンアミドを唯一の窒素源として利用することが可能なすべての微生物、およびアミドヒドロラーゼ活性を有し、式ＩＩＩのプロピオンアミドを加水分解することが可能なすべての単離されたポリペプチドが、本発明にしたがうバイオ転換（ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のために使用され得る。この特性を有する微生物およびアミドヒドロラーゼ活性を有するポリペプチド、およびアミドヒドロラーゼをコードする単離され、配列が決定されたＤＮＡフラグメントもまた、すでにＷＯ９８／０１５６８で明らかにされ、記述されている。利用され得る微生物は、ＷＯ９８／０１５６８に記述されているような土壌サンプル、スラッジまたは排水から単離され得る「野生型の菌株」と呼ばれるもの、または上記ＷＯに記述されているような単離されたＤＮＡフラグメントにより転換される「組換え型変異微生物（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｌｙ  ａｌｔｅｒｅｄ  ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）」と呼ばれるものである。バイオ転換は、好都合には、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属の微生物を使用するか、または「組換え型変異微生物」を使用して行われる。好ましく利用されるクレブシエラ属の微生物は、クレブシエラオキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａ）ＰＲＳＩ（ＤＳＭ１１００９）、クレブシエラオキシトカＰＲＳＩＫ１７（ＤＳＭ１１６２３）、クレブシエラパンチキュラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐａｎｔｉｃｕｌａ）ＩＤ−６２４（ＤＳＭ１１３５４）もしくは肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＩＤ−６２５（ＤＳＭ１１３５５）種、またはそれらの機能上同等な変異体および突然変異種である。適した「組換え型変異微生物」の例は、プラスミドｐＰＲＳ１ｂ、ｐＰＲＳ２ａ（ＤＳＭ１１６３５）、ｐＰＲＳ４またはｐＰＲＳ７を宿す各場合の大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＤＨ５および大腸菌ＸＬ−１ブルー（Ｂｌｕｅ）ＭＲＦ種の微生物である。好ましくは、プラスミドｐＰＲＳ７を宿す大腸菌ＸＬ−１ブルーＭＲＦを使用する。名称ＤＳＭ１１００９を有する微生物は、ブタペスト条約にしたがい、１９９６年６月２４日に、ドイツ微生物および細胞培養保存機関（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ）［Ｇｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ］ＧｍｂＨ、マシェロデルヴェグ（Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒｗｅｇ）１ｂ、Ｄ−３８１２４ブロウンシュヴァイグ（Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ）に寄託した。加えて、名称ＤＳＭ１１６２３を有するものは、ブダペスト条約にしたがい、１９９７年６月２０日に、名称ＤＳＭ１１３５４およびＤＳＭ１１３５５を有するものは、１９９６年１２月２７日に、名称ＤＳＭ１１６３５を有するものは、１９９７年６月３０日に同機関に寄託した。
【００１１】
バイオ転換は、微生物が、通例の手法で培養された後、休止細胞（成長することがなく、また、もはや何らかのＣ源またはエネルギー源を必要としない細胞）または成長細胞を使用して行われるであろう。バイオ転換は、好ましくは、休止細胞を使用して行われる。
【００１２】
バイオ転換のために、低分子量のホスフェートバファー、ＨＥＰＥＳバファーまたは鉱物塩媒体といった、当業者にとって、通例である媒体を利用することが可能である。
【００１３】
バイオ転換は、好都合には、その濃度が、１０質量％を、好ましくは２．５質量％を超えないように一度にまたは連続的に、式ＩＩＩの３，３，３−トリフルオロメチル−２−アルキルプロピオンアミドを添加して行われる。媒体のｐＨは、４から１２、好ましくは５から１１の範囲にあり得る。好都合には、バイオ転換は、１０から８０℃、好ましくは１０から５０℃の温度で行われる。１分から数日の通例の転換時間後、一般式ＩおよびＩＩの光学活性な３，３，３−トリフルオロメチル−２−アルキルプロピオン酸誘導体は、抽出のような通例の処理方法を用いて分離され得る。
【００１４】
３，３，３−トリフルオロメチル−２−アミノ−２−メチルプロピオンアミドが、基質として利用されるとき、対応するＲ−酸が、５分以内に生成され、また対応するＳ−アミドは、その後単離され得ることがわかった。
【００１５】
一般式ＩＩＩのラセミ体３，３，３−トリフルオロメチル−２−ヒドロキシ−２−エチルプロピオンアミドおよび対応する（＋）−酸、対応する（−）−アミドおよび（Ｓ）−３，３，３−トリフルオロメチル−２−アミノ−２−メチルプロピオンアミドは、すべて、文献にあらかじめ記述されたことがなく、したがって、本発明の一部を形成する化合物である。
【００１６】
さらに、一般式Ｉの光学活性な３，３，３−トリフルオロメチル−２−アルキルプロピオンアミドは、既知の手段で、一般式ＩＩの光学活性な３，３，３−トリフルオロメチル−２−アルキルプロピオン酸誘導体へと加水分解され得ることがわかった。これに関して、好ましくは、（Ｓ）−３，３，３−トリフルオロメチル−２−アミノ−２−メチルプロピオンアミドを、（Ｓ）−３，３，３−トリフルオロメチル−２−アミノ−２−メチルプロピオン酸へと加水分解する。加水分解は、ＷＯ９８／０１５６８に記述されている加水分解と類似してなされる。この加水分解は、好ましくは、塩基の存在下で、化学的に、またはロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属の微生物を使用して微生物学的に生じる。
【００１７】
実施例１
光学活性な３，３，３−トリフルオロメチル−２−ヒドロキシ−２−エチルプロピオンアミドおよび対応する光学活性プロピオン酸の製造
１．１  ラセミ体３，３，３−トリフルオロメチル−２−ヒドロキシ−２−エチルプロピオンアミドの製造
アルゴン雰囲気下、１００ｍｌフラスコに濃硫酸（１５．３ｇ）を加え、その後、出発化合物３，３，３−トリフルオロメチル−２−ヒドロキシ−２−エチルプロピオノニトリル（フルオルケム（Ｆｌｕｏｒｃｈｅｍ））（８ｇ）を滴下した。この反応混合物を、１１５℃で１５分間加熱し、その後、８℃まで冷却した。その後、蒸留水（２１．８ｇ）をゆっくりと加えた。その後、ジエチルエーテルを加え、全体を２０分間攪拌した。相が分離した後、エーテル相を水（２５ｍｌ）で、次に飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（２５ｍｌ）で、およびもう１度水（２５ｍｌ）で洗浄し、その後、収集し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、ろ過し、真空中で乾燥した。この結果生じた油をｎ−ヘキサンで処理し、一晩中攪拌した。収率４８％に相当する、乾燥した結晶が全部で４．２７ｇ得られた。
【００１８】
１．２  バイオ転換
大腸菌ＸＬ−１−ブルーＭＲＦ／ｐＰＲＳ７細胞は、１００μｇのアンピシリン／ｍｌを含有するＮＹＢ（普通酵母エキスブイヨン（Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｙｅａｓｔ  Ｂｒｏｔｈ））媒体において、光学密度ＯＤ６５０＝４．７４になるまで成長させた。その後、細胞を、ホスフェートバファー（ｐＨ８．０）１００ｍＭで洗浄した。その後、バイオ転換は、０．５％の出発化合物（３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−エチルプロピオンアミド）の濃度で、および光学密度ＯＤ６５０＝１０を有する細胞懸濁液を使用して行った。全体を、１３０ｒｐｍおよび３７℃で攪拌した。バイオ転換は、キラルＧＣ（ｃｈｉｒａｌ  ＧＣ）により測定し、１２５時間後完了した。
【００１９】
Ｓ−アミドから生成したＲ−酸を分離するために、初めに、バイオ転換溶液のｐＨを、３０％ＮａＯＨを用いて７．８から１０．０に調節した。その後、溶液を、酢酸エチル（６００ｍｌ）で抽出し、その後、全体をセライトを通してろ過し、相を分離させた。この結果生じた水相を、３０％ＮａＯＨでｐＨ１０．０に調節し、酢酸エチルでろ過した。その後、相を分離させた。全作業を約３回繰り返した。合わせた抽出物を、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、その後、ロータリーエバポレーターで濃縮した。この結果生じた油を、ヘキサンで処理し、全体を−１８℃まで冷却した。１２時間後、懸濁液をろ過し、ヘキサンで洗浄し、乾燥した。その後、未精製の生成物（約１．８ｇ）を熱トルエン中で再結晶させた後、乾燥した。収率３４．４％に相当し、また９８％より多いエナンチオマー過剰率（ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｉｃ  ｅｘｃｅｓｓ）（ｅｅ）を有する（−）−アミド（メタノール中、αＤ＝−１３．２、ｃ＝３．７５）１．７２ｇが、ベージュ色の固体として得られた。生成した（＋）−酸（メタノール中、αＤ＝＋９．７５、ｃ＝３．３１）を単離するために、３２％ＨＣｌを用いて水相のｐＨを９．４から１．０に調節し、酢酸エチルで２回抽出した。有機相を合わせ、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、その後、ロータリーエバポレーターで濃縮した。その後、トルエン１５ｍｌを残滓に加えた。濃縮後、茶色がかった固体２．１８ｇが得られた。熱トルエン中で再結晶した後、収率３９．１％に相当し、またｅｅ値８５．２％を有するベージュ色の固体１．９７ｇが得られた。この結果を図１に示す。
【００２０】
実施例２
（Ｓ）−３，３，３−トリフルオロメチル−２−アミノ−２−メチルプロピオンアミドの製造
２．１  ラセミ体３，３，３−トリフルオロメチル−２−アミノ−２−メチルプロピオンアミドの製造
製造は、ＥＰ−Ａ０２９８０２９と類似して行った。シアン化カリウム（６６．４ｇ）および蒸留水（５０ｍｌ）を初めに導入し、この懸濁液を０〜５℃まで冷却した。その後、トリフルオロアセトン（１１２．１ｇ）を１．５時間の間に加えた。反応混合物は、ベルゴフ（Ｂｅｒｇｈｏｆ）オートクレーブに移し入れ、約８５℃に加熱した。約１．５時間後、アンモニア溶液（１２４．５ｇ）を滴下し、約７時間、全体を１１０〜１１５℃で加熱した。
【００２１】
この結果生じた茶色の溶液を、ロータリーエバポレーターにおいて６０℃で濃縮し、アモルファスの茶色の塊１８１．４ｇを得た。この生成物を１４０℃／０．１ｍｂａｒで昇華させ、その後、酢酸エチルから再結晶した。収率３％に相当する、白色固体０．６７ｇが得られた。
【００２２】
２．２  バイオ転換
バイオ転換は、大腸菌ＸＬ−１−ブルーＭＲＦ／ｐＰＲＳ７の無細胞（ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ）酵素抽出物を用いて行った。このため、細胞は、１００μｇのアンピシリン／ｍｌを含有するＮＹＢで、光学密度ＯＤ６５０＝３．５９になるまで成長させた。その後、これらを、ホスフェートバファー１００ｍＭ中で洗浄し、続いて、ＯＤ６５０が１９になるまで同バファーに懸濁した。細胞は、フレンチ圧縮機（Ｆｒｅｎｃｈ  ｐｒｅｓｓ）において３回繰り返し処理することにより破砕させた。その後、細胞抽出物を、７５℃で５分間加熱し、細胞の残骸を遠心（２００００×ｇ）により取り除いた。透明な上澄みは、９．７５ｍｇ／ｍｌのたんぱく質濃度を有し、バイオ転換に使用した。このため、４０℃で、０．５％のラセミ体３，３，３−トリフルオロメチル−２−アミノ−２−メチルプロピオンアミドに、ｍｌあたり酵素抽出物０．９ｍｇを加えた。反応は、キラルＧＣにより観察した。転換は、５分後完了した。反応を、同量の酢酸エチルを加えることにより停止し、その後、全体を、酢酸エチルで４回抽出した。（Ｓ）−アミドを分離するために、水相を酢酸エチル２００ｍｌで抽出（４回）し、合わせた抽出物を、ＮａＳＯ４で乾燥し、続いて、４０℃でロータリーエバポレーターにおいて濃縮した。黄色がかった茶色の固体６４０ｍｇが得られた。この固体を酢酸エチル０．５ｇおよびヘキサン（４ｍｌ）から再結晶した。利用したラセミ化合物を基とした収率３８．５％に相当する（Ｓ）−アミド０．５ｇが、得られた。ｅｅ値は、１００であった。
【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明にしたがうラセミ体３，３，３−トリフルオロメチル−２−ヒドロキシ−２−エチルプロピオンアミドのバイオ転換におけるＳ−アミドおよびＲ−アミド濃度の時間変化のグラフ図。
【図１】
0004652577.tif 000015