(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物コロニー形成単位の複製物を同時増殖し、得るための方法であって、
ａ）微生物コロニー形成単位を含む接種菌を、ゲル化剤と微生物増殖培地とを含む第１層とゲル化剤を含む第２層とを含み、前記第１層および第２層が互いに分離可能である装置に塗布して接種装置を形成することと、
ｂ）前記接種装置の前記第１層および第２層を接触してゲルを形成することと、
ｃ）少なくとも１つの細胞分裂のために十分な時間にわたり前記接種装置をインキュベートすることと、
ｄ）第１層および第２層を分離して前記微生物コロニー形成単位の複製物を提供することと、
ｅ）前記微生物コロニー形成単位の分離を確認することと、を含む方法。
【請求項２】
前記第１層または第２層が指示薬と対応する誘導物質とをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記方法が少なくとも１つの前記複製物における分子生物学操作を実施することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は分子生物学の分野に関し、特に、組換え微生物を含む微生物の増殖および分析に関わる方法に関する。
【０００２】
食品または他の試料における微生物の検出および計数のための再水和可能なドライフィルム平板培地が記載されている（例えば、米国特許第４，５６５，７８３号）。例えば、病原性Ｅ．ｃｏｌｉの特定の抗原株に対する試験用にドライフィルム平板培地技術が用いられている。例えば、米国特許第５，１３７，８１２号を参照。ドライフィルム培地技術を用いる典型的な装置は、水性試料１ｍｌの添加が可能な冷水可溶性ゲル化システムを含む。このような装置により、適切なインキュべーション条件下に装置内の標的生物の増殖が促進され、また装置内の検出システムも提供され、装置におけるコロニー増殖の視覚化および計数が可能となる。これらの装置は、特定の標的生物または指標生物の検出や計数が食品の品質および／または安全性の指標として役立つ食品加工産業内で特別な有用性を有する。
【０００３】
生物が将来使うためにほとんど貯蔵されていない微生物試験とは対照的に、分子生物学者の間では将来使うためにブロス培地内または半流動培地上に組換え微生物を貯蔵することが一般的である。組換え微生物を一次平板培地から貯蔵培地へ移行する追加のステップが必要であり、多くの場合、貯蔵温度で配置される前に貯蔵培地をインキュべートする追加の増殖期間（１６〜２４時間）が必要である。
【０００４】
培養株貯蔵に用いる際の半流動培地（寒天）の不利な点は、水分がゲルから蒸発する傾向があることである。密閉されていないペトリ皿の場合には、これは結果として寒天の乾燥や培養株の死滅につながる。密閉されたペトリ皿の場合には、これは結果としてプラスチックまたはガラスの皿における水分の濃縮につながり、これが結果として表面または寒天上の水分の拡散および平板上のコロニーの相互汚染につながる。さらに、寒天は表面上に氷晶を発生させる傾向および／または凍結すると分裂する傾向があるため、寒天平板上で培養株を凍結することが不可能である。これらの特徴の両方が、組換え生物の純粋なコロニーを維持しようとする際に望ましくないコロニーの相互汚染の可能性を増大させる。また、組換え生物を平板培養する主要な目的は、一般的に結果として細胞の破壊につながる遺伝子分析を行うことである。したがって、通常、各コロニーを選び、遺伝子分析用のコロニーの残遺物を用いる前にそれをブロス培地または半流動培地において「複製」することが必要である。
【０００５】
本明細書中に記載された発明は、微生物の増殖または貯蔵のための装置に独特の特性を提供するドライフィルム平板培地の新規な調製物に基づくものである。このような調製物を含む装置を開放すると、平板上のコロニー増殖の一部分が両方のフィルムに移行し、各コロニーの２つの複製物を提供する。また、平板上のコロニーは市販のペトリフィルム（Ｐｅｔｒｉｆｉｌｍ）ＴＭ上に増殖するコロニーよりも大きい。これらの特性は、半流動培地上に増殖した細菌コロニーを分析または継代培養することを必要とする分子生物学者や他者にいくつかの利点を提供する。
【０００６】
一態様において、本発明は微生物の増殖または貯蔵のための装置を特徴とする。装置は第１層および第２層を含み、第１層はゲル化剤と微生物増殖培地とを含み、第２層はゲル化剤を含み、装置はさらに指示薬と対応する誘導物質を含み、第１層および第２層は互いに分離可能である。第１層および第２層は再水和可能でありうる。可視微生物コロニーの少なくとも８０％（例えば、８５％または９５％）は分割し、層の分離時に第１層および第２層において複製物を形成することができる。第１層および第２層における複製物は、拡大または非拡大の目視検査により、または遺伝子分析により検出可能である。遺伝子分析による検出として、ハイブリダイゼーション、ポリメラーゼ連鎖反応、プラスミド制限分析、または発現スクリーニング法を挙げることができる。
【０００７】
第１層および第２層における複製物は生存可能である。第１層または第２層のゲル化剤は、グアールガム、キサンタンガム、ローカストビーンガム、ポリビニルアルコール、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ポリビニルピロリドン、ゲランまたは低モノマー含量ポリアクリル酸でありうる。グアールガムが特に有用である。
【０００８】
微生物増殖培地として、イオン性界面活性剤、例えば、デオキシコール酸、胆汁酸塩または硫酸ラウリルもしくは塩など界面活性剤を挙げることができる。第１層として、抗生物質またはアミノ酸欠乏（ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｔｃｙ）など選択可能な薬剤を挙げることができる。指示薬は沈殿性または色素生産性（ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ）でありうる（例えば、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−グルクロン酸、Ｌ−アラニン−５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシルエステル（トリフルオロ酢酸塩）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−ｌ−酢酸塩、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−３−酢酸塩、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトサミニド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル酪酸塩、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシルカプリル酸塩、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−セロビオシド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−α−Ｌ−フコピラノシド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−フコピラノシド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−β−Ｌ−フコピラノシド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−α−Ｄ−グルコピラノシド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−グルコピラノシド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−グルクロン酸（シクロヘキシルアンモニウム塩）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−クルクロン酸（ナトリウム塩）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシルミオ−イノシトール−ｌ−リン酸塩（アンモニウム塩）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−α−Ｄ−マルトトリオース、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシルミリスチン酸塩、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−α−Ｄ−マノピラノシド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−ノナン酸塩、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシルオレイン酸塩、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシルパルミチン酸塩、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシルリン酸塩（ジ｛２−アミノ−２−メチル−１、３−プロパンジオール｝塩）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシルリン酸塩（ジリチウム塩水和物）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシルリン酸塩（ジカリウム塩）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシルリン酸塩（ジナトリウム塩セスキ水和物）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシルリン酸塩（カリウム塩）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシルリン酸塩（ｐ−トルイジン塩）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル硫酸塩（カリウム塩）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル硫酸塩（ｐ−トルイジン塩）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシルトリミジン−３’−リン酸塩（シクロヘキシルアンモニウム塩）または５−ブロモ−４−ク��ロ−３−インドキシル−β−Ｄ−キシロピラノシド）。誘導物質は、１−Ｏ−メチルグルクロン酸、イソプロピル−β−Ｄ−チオグルクロン酸、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド、または１−Ｏ−メチル−β−Ｄ−グルコピラノシドでありうる。指示薬および対応する誘導物質は同じ層にあることができる。
【０００９】
第１層または第２層は接着剤をさらに含むことができる。第１層および第２層は、プラスチック、ガラス、または被覆紙など水不浸透性基材を含むことができる。例えば、水不浸透性基材は、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン（例えば、二軸方向ポリプロピレン）、またはポリエステルでありうる。基材は、第１層および第２層が互いに実質的に対向する折り畳みを有する物質の連続小片を含むことができる。基材は取り外し可能であり、またはヒンジ、クラスプ、グルー、ステープル、またはクランプなどにより互いに持続的に付着することができる。
【００１０】
微生物は、細菌、真菌、酵母菌、ファージ、またはマイコプラズマでありうる。細菌は、好気性、嫌気性または微好気性、およびグラム陰性でありうる。例えば、細菌は、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎｏｓでありうる。
【００１１】
本発明は、微生物コロニー形成単位のレプリカを同時増殖し得るための方法も特徴とする。この方法は、微生物コロニー形成単位を含む接種菌を装置に塗布して接種装置を形成することであり、装置はゲル化剤と微生物増殖培地とを含む第１層およびゲル化剤を含む第２層を含み、第１層および第２層は互いに分離可能であることと；接種装置の第１層および第２層を接触してゲルを形成することと；少なくとも１つの細胞分裂のために十分な時間にわたり接種装置をインキュべートすることと；第１層および第２層を分離して微生物コロニー形成単位のレプリカを提供することと；微生物コロニー形成単位の分離を確認することとを含む。装置は、指示薬と対応する誘導物質とを含むことができる。方法は、複製物の少なくとも１つでの分子生物学操作を実施することをさらに含む。
【００１２】
他に特に規定がなければ、本明細書中で用いられているすべての技術用語および学術用語は、本発明が属する当業者により一般的に理解される同じ意味を有する。本明細書中に記載されたものと同様または同等の方法および材料を用いて本発明を実施することはできるが、適切な方法および材料を以下に記載する。本明細書中で言及されたすべての刊行物、特許出願、特許、および他の引例は、その全体が参考として援用される。抵触の場合には、本明細書は、定義を含めて、対照となる。また、材料、方法、および実施例は例示にすぎず、限定することは意図されていない。
【００１３】
本発明の他の特徴および利点は以下の詳細な説明および請求の範囲から明らかであろう。
【００１４】
装置の構成
本明細書中に記載される「装置」は複数の層を含む。本明細書中で用いられるように、「層」という用語は、固体基材および接着剤、指示薬、誘導物質、栄養素、ゲル化剤、または固体基材を被覆する他の試薬のすべてを含む。図１Ａは、本発明の培地とともに使用するために適切な装置を示している。装置は一般に米国特許第４，５６５，７８３号、第５，０８９，４１３号、第５，２３２，８３８号および第５，６０１，９９８号に記載されているように構成しうる。装置１０は、水不浸透性基材１２など、自己支持固体基材（ｓｅｌｆ−ｓｕｐｐｏｒｔｉｎｇ  ｓｏｌｉｄ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）で製造される第１層を含む。下部基材１２は一般的に、ポリエステル、ポリプロピレン、ポリスチレン、またはガラスなど水を吸収することがない水不浸透性材料から成る比較的堅い材料である。ポリエステルは特に有用な基材である。他の適切な耐水性材料として、「シェラータイプＭＩＬ（Ｓｃｈｏｅｌｌｅｒ  Ｔｙｐｅ  ＭＩＬ）」写真印画紙（シェラー株式会社、プラスキ、ニューヨーク州）など水不浸透性ポリエチレン被覆剤を含有する紙など水透過精基材を含む。一般に、本発明の装置は、コロニーの視認を可能にする透明または半透明である基材を用いて構成される。コロニーの視認が不要である実施態様では、不透明な基材を用いることができる。基材の厚さは、約０．００３インチ乃至０．０２インチでありうる。例えば、ポリエステルフィルムは一般的に厚さが約０．００４乃至約０．００７インチであり、ポリプロピレンフィルムの厚さは約０．００４乃至約０．００８インチであり、ポリエステルフィルムの厚さは約０．０１５インチである。
【００１５】
基材１２の上部表面は培地１４で被覆され、これはさらに乾燥して基材１２上に乾燥培地を提供する。あるいは、粉末として適用しうる培地を保持するために役立つ、接着剤を基材１２上に被覆しうる。接着剤は、被覆基材により視認する場合に基材の表面上に増殖する細菌コロニーの視覚化を可能にするように水和すると十分に透明でなければならない。接着剤は、接着剤に培地を完全に包埋することなく、乾燥培地で基材を均一に被覆される厚さで基材上に被覆もされなければならない。
【００１６】
フォーム中に環状開口部を有するフォームスペーサー１６を基材１２の培地被覆表面に付着することができる。フォームスペーサーは基材１２の周囲を覆い、試料を接種すべき範囲を規定し、基材から試料が漏れるのを防ぐためにも役立つ。環状開口部の直径は変更することができる。例えば、ポリプロピレンフォームウェブは直径２’’〜２３／８’’のダイカット環状穴を有し、同容積の試料（約１ｍｌ）とともに用いることができる。別の実施態様では、装置が試料を含有するフォームスペーサーを含むことはできない。この装置では、試料の量は培地のみの成分により基材上に包含され隔離される。
【００１７】
上部カバーシート２０がフォームスペーサー１６の上部の一端上に配置されている。カバーシート２０は第２層であり、基材上に存在する細菌コロニーの計数を容易にするために透明なフィルムまたはシート材料から成ることが好ましい。また、カバーシート２０は、成分の汚染および劣化のリスクを回避するために細菌および水蒸気に対して不透過性であることが好ましい。カバーシート２０の材料は、増殖すべき微生物の種類に必要な酸素透過量を提供するために選択することができる。例えば、ポリエステルフィルムの酸素透過性は低く（厚さ０．００１’’当り５ｇ／１００平方インチ／２４時間未満）、嫌気性細菌を増殖させるために適しているが、ポリエチレンフィルムの酸素透過性は高く（厚さ０．００１’’当り約５００ｇ／１００平方インチ／２４時間）、好気性細菌を増殖させるために適している。カバーシート２０として使用するための好ましい材料は二軸延伸ポリプロピレンである。カバーシートはゲル化剤を含み、随意的に微生物増殖培地、指示薬、誘導物質、および／または接着剤を含みうる。
【００１８】
上記のことから、第１層および第２層の上部−下部方向性を逆にできることに注意すべきである。
【００１９】
装置の第１層および第２層は取り外し可能であり、またはさまざまな方法により互いに持続的に付着することができる。例えば、ヒンジ、クラスプ、グルー、ステープル、またはクランプを用いて第１層と第２層を互いに付着することができる。一実施態様では、第１層と第２層を互いに付着するために粘着剤が用いられる。
【００２０】
微生物増殖培地
一般に、装置の第１層および第２層は有効な量で、すなわち、それぞれの層の分離時に、可視微生物コロニーのほとんどの部分、好ましくは、少なくとも８０％が装置の両方の層において保持されるようにゲル化剤を含む。換言すれば、可視微生物コロニーの少なくとも８０％が分割し、それぞれの層の分離後に第１層および第２層において複製物を形成する。コロニーを分割し複製物を形成する図１Ｂを参照のこと。例えば、コロニーの少なくとも８５％、９０％、９５％、または９９％が分割し、第１層および第２層において複製物を形成する。ゲル化剤の非限定的な実施例として、グアール、キサンタン、ローカストビーンガム、ポリビニルアルコール、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ポリビニルピロリドン、ゲラン、およびポリアクリル酸（低モノマー含量）が挙げられる。グアールは特に有用なゲル化剤である。ゲル化剤の適切な濃度は、本明細書中に記載された方法を用いて測定することができる。一般に、第１層および第２層におけるゲル化剤の量が異なる装置が製造される。装置は微生物を含有する水性試料を接種され、適切な時間（例えば、１６〜２４時間）にわたりインキュべートされる。装置のそれぞれの層は分離され、第１層および第２層の両方に保持されているコロニーの画分が測定される。
【００２１】
第１層は微生物増殖培地をさらに含む。一部の実施態様では、微生物増殖培地は第１層および第２層の両方にありうる。一般的に、第１層に含まれる基材にゲル化剤および微生物増殖培地がいっしょに添加される。適切な微生物増殖培地は一般的に脱水前の溶液の１％重量／量未満の濃度でゲル化剤を含有する。例えば、脱水前のゲル化剤濃度は、０．４％乃至０．９％重量／量または０．６％乃至０．８％重量／量でありうる。第１層におけるゲル化剤の最終量は、乾燥後の２０ｍｇ乃至１００ｍｇ／２４平方インチである。例えば、第１層におけるゲル化剤の最終量は、３０乃至８０または４０乃至５０ｍｇ／２４平方インチでありうる。第２層におけるゲル化剤の量は一般的に、第１層における量よりも少なくとも５倍多い（例えば、７倍、８倍、９倍、または１０倍）。例えば、第２層におけるゲル化剤の量は、３００乃至５００ｍｇ／２４平方インチまたは４００乃至４５０ｍｇ／２４平方インチでありうる。
【００２２】
本発明の微生物増殖培地は、脱水前の溶液の約０．５％乃至約２％重量／量の濃度で界面活性剤（例えば、イオン性界面活性剤）も含むことができる。界面活性剤の非限定的な実施例として、デオキシコール酸、胆汁酸塩または硫酸ラウリルが挙げられる。
【００２３】
増殖培地の別の成分として、塩化カルシウムや塩化マグネシウムなど塩、選択可能な薬剤、指示薬、および誘導物質が挙げられる。例えば、選択可能な薬剤は、カナマイシン、アンピシリン、カルベニシリン、スペクチノマイシン、ストレプトマイシン、バンコマイシン、テトラサイクリン、またはクロラムフェニコールなど抗生物質でありうる。他の選択可能な薬剤は、特定のアミノ酸の欠乏でありうる。指示薬は沈殿性、色素生産性、または蛍光性および／または蛍光発生性でありうる。適切な蛍光性または蛍光発生性指示薬として、例えば、４−メチルウムベリフェリルリン酸塩（二ナトリウム塩三水和物または遊離酸）、４−メチルウムベリフェリル−ベータ−Ｄ−グルコピラノシド、４−メチルウムベリフェリル−ベータ−Ｄ−グルクロン酸、４−メチルウムベリフェリル−ベータ−Ｄ−ガラクトピラノシド、二酢酸フルオロセイン、またはフルオロセイン抗体抱合体が挙げられる。沈殿性指示薬は、例えば、２，３，５−塩化トリフェニルテトラゾリウムでありうる。色素生産性指示薬は一般的に、微生物による活性化まで、例えば、酵素加水分解または化学結合の削減まで無色である。色素生産性指示薬の非限定的実施例として、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−グルクロン酸、Ｌ−アラニン−５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシルエステル（トリフルオロアセテート塩）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−ｌ−酢酸塩、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−３−酢酸塩、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトサミニド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル酪酸塩、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシルカプリル酸塩、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−セロビオシド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−α−Ｌ−フルコピラノシド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−フルコピラノシド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−β−Ｌ−フルコピラノシド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−α−Ｄ−グルコピラノシド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−グルコピラノシド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−グルクロン酸（シクロへキシルアンモニウム塩）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−グルクロン酸（ナトリウム塩）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシルミオ−イノシトール−ｌ−リン酸塩（アンモニウム塩）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−α−Ｄ−マルトトリオース、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシルミリスチン酸塩、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−α−Ｄ−マノピラノシド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−ノナン酸塩、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシルオレイン酸塩、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシルパルミチン酸塩、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシルリン酸塩（ジ｛２−アミノ−２−メチル−１、３−プロパンジオール｝塩）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシルリン酸塩（ジリチウム塩水和物）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシルリン酸塩（ジカリウム塩）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシルリン酸塩（ジナトリウム塩セスキ水和物）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシルリン酸塩（カリウム塩）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシルリン酸塩（ｐ−トルイジン塩）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル硫酸塩（カリウム塩）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル硫酸塩（ｐ−トルイジン塩）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシルトリミジン−３’−リン酸塩（シクロヘキシルアンモニウム塩）または５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−キシロピラノシドが挙げられる。亜テルル酸ナトリウムも適切な指示薬である。
【００２４】
誘導物質は酵素を刺激して対応する指示薬を分割する。例えば、１−Ｏ−メチルグルクロン酸は、グルコロニダーゼを刺激して５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−グルクロン酸（指示薬）を分割し、着色産物を生成する。他の誘導物質と指示薬のペアとして、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−グルクロン酸、ナトリウム塩または３−インドキシル−β−Ｄ−グルクロン酸、ナトリウム塩およびイソプロピル−β−Ｄ−チオグルクロン酸、ナトリウム塩；５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドまたは−インドキシル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドおよびイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド；および５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−グルコピラノシド、３−インドキシル−β−Ｄ−グルコピラノシドまたは５−ブロモ−６−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−グルコピラノシドおよび１−Ｏ−メチル−β−Ｄ−グルコピラノシドが挙げられる。
【００２５】
本発明の別の実施態様としてラック分化機序が挙げられる。装置は２つの色素生産性指示薬を含むため、β−ガラクトシダーゼ欠乏性コロニーは第１指示薬を活性化し、β−ガラクトシダーゼ生産性コロニーは第２指示薬を活性化することにより、２つの色分化を生じる。
【００２６】
微生物の増殖または貯蔵のための装置の使用
使用時には、所定量の接種菌、一般的には約１ｍｌの接種菌を、カバーシート２０を引き戻し、水性被験試料または水を基材１２の中央に添加することにより、図１Ａに示した装置に添加する。次にカバーシート２０を基材１２上に戻し、接種菌を基材上に均一に広げる。これを行うための便利な道具は、基材１２の特定区域の接種菌を確認するためにも用いられる加重環状テンプレートである。接種菌が基材１２上に接触し広がると、基材１２上の培地は水和し、増殖支持性栄養ゲルを形成する。次に接種装置を所定の時間にわたりインキュべートし、その後に基材上に増殖する多くの細菌コロニーの数を透明なカバーシート２０により計算しうる。
【００２７】
本発明の装置により種々の微生物を増殖または貯蔵することができる。適切な微生物として、細菌、真菌、酵母菌、ファージ、およびマイコプラズマが挙げられる。細菌は、好気性、嫌気性または微好気性、およびグラム陰性でありうる。例えば、細菌は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎｏｓでありうる。本発明の装置において使用される微生物増殖培地は各微生物の特定の必要のために調節することができる。
【００２８】
組換えＤＮＡを含有する微生物を平板培養する現在の技術は、本明細書中に記載された平板培地および方法により改善される。本発明の装置において用いられるゲル化剤と、誘導物質および指示薬を含む微生物増殖培地の独特の調製物は、適切な時間わたるインキュべーション後に、同じ長さのインキュべーション後に現在入手可能な市販のペトリフィルム（Ｐｅｔｒｉｆｉｌｍ）ＴＭプレート（３Ｍ、セントポール、ミネソタ州）上に増殖するコロニーよりも大きな微生物コロニーを提供する。さらに、平板の第１層および第２層の分離時に、微生物コロニーが分割して第１層および第２層において複製物を形成する。したがって、コロニーの一部分が第１層上に保持され、同じコロニーの一部分が第２層上に保持される。各フィルム上のコロニーの部分は生存可能であり、拡大または非拡大目視検査により検出することができる。この特徴は、遺伝子分析または生化学分析を実施すると同時に、貯蔵または将来の分析のためにコロニーの正確な遺伝子複製物を保存する各コロニーの一部分の使用を容易にする。遺伝子分析および生化学分析として、例えば、ハイブリダイゼーション、ポリメラーゼ連鎖反応、プラスミド制限消化分析、ＤＮＡ配列決定、または抗体仲介発現スクリーニングなど発現スクリーニング法を挙げることができる。例えば、１つのフィルム（例えば、第２層）上に保持されたコロニーを用いてコロニーブロッティング法／リフティング法を行い、他のフィルムにおけるコロニー複製物を保持することができる。
【００２９】
したがって、本発明は、微生物コロニー形成単位を同時に増殖し複製することを可能にする。本明細書で用いるように、「コロニー形成単位」は少なくとも１つの細胞を指し、コロニーなど、細胞の集合を含みうる。一般に、コロニー形成単位を含有する接種菌を装置に添加し、第１層と第２層が接触してゲルを形成する。コロニー形成単位は少なくとも１つの細胞分裂を起こすために十分な時間にわたる適切な条件下に増殖し、その後に第１層と第２層が分離して微生物コロニー形成単位のレプリカを提供する。
【００３０】
本発明の装置は、ゲルの脱水、分解、またはコロニーの相互汚染のリスクがない冷蔵庫またはフリーザー内に貯蔵できるという点で寒天平板と付随した問題を回避する。このような特徴は、培地の独特のゲル化特性と結合された密封可能な装置の構成により提供される。したがって、微生物コロニー形成単位は、装置の第１層および第２層を密封することにより保存することができる。一般的に、コロニー形成単位は保存前に少なくとも１つの細胞分裂のために適切な条件下にインキュべートされる。コロニー形成単位は、細胞分裂が抑制される条件下に（例えば、フリーザー内で）貯蔵することにより保存される。
【００３１】
本発明を以下の実施例においてさらに記載するが、これらは請求の範囲に記載された発明の範囲を限定するものではない。
【００３２】
実施例１−コロニー複製および貯蔵装置の組成：Ｇｅｎ−１Ａ平板、Ｇｅｎ−１Ｂ平板、およびＧｅｎ−２平板を、ペトリフィルム（Ｐｅｔｒｉｆｉｌｍ）ＴＭＥ．ｃｏｌｉ算定平板と同様の物品として構成した。例えば、米国特許第４，５６５，７８３号を参照。長方形の平板は、直径２’’の環状平板区域を有する約４’’×３’’であった。用いた被覆されていないフィルムは厚さが約０．４乃至約３ｍｉｌであった。第１層（この場合、上部フィルム）はおよその直径が約０．６ｍｉｌであり、第２または下部層のおよその厚さは約２ｍｍであった。
【００３３】
Ｇｅｎ−１Ａ平板および１Ｂ平板の上部層は、Ｍｅｙｐｒｏｇａｔ  １５０グアールガム（米国特許第４，５６５，７８３号に記載）とＣａｂｏｓｉｌ（２１９ｍｇ／２４平方インチ被覆）の混合物（重量比１０９．５：１）で粉末被覆した、ＲＤ１２７２接着剤（１９５ｍｇ／２００ｃｍ２に被覆した、イソ−オクチルアクリレート：アクリルアミド９６：４）で被覆した二軸延伸ポリプロピレン（ＢＯＰＰ）から成るものであった。被覆後、約１６．７ｍｇグアール／平方インチが認められた。Ｇｅｎ−２平板の上部層は、接着剤層における塩化トリフェニルテトラゾリウムを含めて市販のペトリフィルムＥ．ｃｏｌｉ算定平板（カタログ番号６４１４、３Ｍ社、セントポール、ミネソタ州）と同じ上部層であった。
【００３４】
表１に示した栄養素／阻害剤組成物は被覆され、Ｇｅｎ−１ＡおよびＧｅｎ−２については接着剤被覆紙下部フォルム上で、Ｇｅｎ−１ＢについてはＭｅｌｉｎｅｘポリエステル（デュポン、ウィルミントン、デラウェア州）上で乾燥した。被覆されたブロス混合物の乾燥重量は、３つの平板全てに対して１２．５ｍｇ／平方インチであった。表１に示した調製物はおよそ１ｍｌの微生物の試料を用いて再水和するために考えられたものである。
【００３５】
【表１】
表１
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*重量比６：１：１２．９９で混合。
【００３６】
直径２’’のダイカット環状穴を有するポリスチレンフォームウェブ（接着剤による裏面を厚さ２０ｍｉｌで被覆）を下部フィルムのブロス被覆表面に付着させ、Ｇｅｎ−１Ａ平板、Ｇｅｎ−１Ｂ平板、およびＧｅｎ−２平板において「フォームダム」を形成した。装置を長さ４’’×幅３’’の長方形に切断し、ブロス被覆下部フィルムを露出する直径２’’の穴（長方形の平板におおよそ中心がある）を有した。二重粘着テープ（幅３／８’’）を長方形の３’’の端の１つに貼り、これを用いてグアール被覆上部フィルムをポリスチレンフォームウェブに固定し、平板の構成を完了した。
【００３７】
実施例２．Ｇｅｎ−１Ａ平板の各層から生存可能な細胞の回収：実施例１に記載したように構成された平板にＥ．ｃｏｌｉ株Ｐ１６を接種した。接種菌はコロニーを５ｍｌのトリプシンダイズブロス（Ｒｅｍｅｌ株式会社、レネクサ、カンサス州）に入れ３７℃下に一夜、培養株をインキュべートすることにより調製した。接種菌を１０−８の最終希釈に連続希釈した（１：１００）。市販のＥ．ｃｏｌｉ／大腸菌型算定ぺトリフィルムＴＭ平板を接種するための標準方法に従い２つのＧｅｎ−１Ａ平板のそれぞれに１ｍｌの最終希釈液を接種した。平板は３７℃下に一夜（１８時間）接種した。１３個のコロニーを含有する平板の１つを試験用に用いた。平板を開放し、２つの層を注意深く分離した。各コロニーの部分がそれぞれの層の両方に移行しているのが確認された。それぞれの層をコロニーを上にしてベンチ上に配置した。６個のコロニーを無作為に選択した。個別の滅菌した使い捨て式接種ループ（ディフコ；デトロイト、ミシガン州）を用いてコロニー物質を両方のフィルム上の選択された各コロニーから選んだ。コロニー物質を用いて小点をトリプシンダイズ寒天平板（Ｒｅｍｅｌ）上に接種した。平板を２４時間、３７℃下にインキュべートし、コロニーの増殖について検査した。インキュべーション後、トリプシンダイズ寒天平板上のすべての点は増殖し、平板の両方のフィルムに保持された生存可能な細胞の存在を示した。
【００３８】
実施例３−Ｇｅｎ−１Ｂ平板の各層からの遺伝子物質の回収：実施例１に記載したように構成された平板をこの実施例において用いた。Ｅ．ｃｏｌｉ株ＤＨ５αをすべての実験において用いた。細胞はＣａＣＩ２を用いて適格性に作成し、プラスミドｐｕｃ−ｇｆｐ３で形質転換した。ｐｕｃ−ｇｆｐ３は、緑色蛍光タンパク質をコードする遺伝子を含有するＰｕｃｌ９誘導体である。形質転換および回収後、すべての細胞をアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するバターフィールドの緩衝液（ハーディ・ディアグノスティックス；サンタクララ、カリフォルニア州）中に希釈し、１ｍｌの希釈液をＧｅｎ−１Ｂ平板上に蒔いて培養した。平板を１４乃至１８時間、３７℃下にインキュべートした。装置を開放する前にコロニーを無作為に選択し、上部層および下部層を選択したコロニーの周囲に円でマーキングするとともに、装置を開放した。
【００３９】
プラスミド分離−それぞれの層におけるコロニー複製物からプラスミド標本を作成した。滅菌したつまようじを用いてそれぞれのコロニー複製物からの物質をアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含有する５ｍｌのルリア−ブレタニ（ＬＢ）寒天の中へ移し、攪拌（２００ｒｐｍ）しながら３７℃下に１６時間、増殖させた。平板の上部および下部のフィルムから４種類のコロニーでプラスミド標本を作成した。培養株の吸光度を一夜増殖後にＯＤ６００で測定し、上部および下部のフィルムからの培養株間のい吸光度はほぼ同じであった。Ｗｉｚａｒｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（プロメガ、マジソン、ウィスコンシン州）を用いたアルカリ法により５ｍｌの培養液からＤＮＡを分離した。プラスミドをＥｃｏＲＩで切断し、０．７％アガロースゲルにより電気泳動した。結果は、平板の上部層および下部層における選択されたコロニー複製物のすべてからプラスミドＤＮＡが得られることを示した。
【００４０】
コロニーＰＣＲ−コロニーを選択し、上記のように標識した。それぞれの層の分離後、各コロニーの複製物を２５μｌのＡｍｐｌｉＴａｑゴールドＰＣＲ（ＰＥバイオシステムズ、フォスターシティー、カリフォルニア州）またはＱｉａｇｅｎ  ＰＣＲ  ＭａｓｔｅｒＭｉｘ（Ｑｉａｇｅｎ株式会社、バレンシア、カリフォルニア州）反応混液中に懸濁し、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ９７００サーモサイクラーにおいて４０サイクルのＰＣＲを行った。実験を下部層と上部層の両方からの５個のコロニーで２回反復した。ＰＣＲ後、生成物を０．７％アガロースゲルにより電気泳動した。臭化エチジウム染色は、上部層または下部層からなお５個のコロニーの各々からのＰＣＲによる生成物の量がほぼ同じであることを示した。結果は、同じＰＣＲ増幅生成物が上部層および下部層から取られたコロニー複製物で構成された反応のすべてから得られることも示した。
【００４１】
実施例４−Ｇｅｎ−１Ａ平板、Ｇｅｎ−１Ｂ平板、およびＧｅｎ−２平板の貯蔵の予測的実施例：形質転換したＥ．ｃｏｌｉ細胞がＬＢ寒天平板上および本明細書に記載された平板上に蒔いて培養する。平板を１８時間、３７℃下にインキュべートする。インキュべーション後、平板を再密封可能な（ＺｉｎＬｏｃｋＴＭ）プラスチックバッグ内に配置し、−２０℃下に置く。少なくとも１週間の凍結温度での貯蔵後、平板を冷凍庫から取り出し、室温に温めた。コロニーを滅菌ループでピックアップし、（ａ）コロニーをブロス培地（例えば、ＬＢブロス）へ継代培養するとともに（ｂ）コロニー内の遺伝子物質のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）分析を行う。
【００４２】
コロニーを凍結／融解サイクル中に保存し、クローンの相互汚染を回避する。これにより使用者は、平板が解凍した後にきわめて容易に継代培養するためのコロニーをピックアップすることが可能である。さらに、コロニーは、培地の表面上ではなく、培地内で増殖しているため、コロニー内の遺伝子物質が凍結／融解サイクル中に相互汚染する可能性がほとんどない。
【００４３】
対照的に、表面コロニーの寒天平板の凍結は、寒天表面上の氷晶の蓄積につながる。平板を解凍させると、この表面の水分は隣接コロニーに相互汚染を引き起こし、継代培養株の純度およびＰＣＲまたは他の遺伝子分析のためのコロニーから分離した核酸物質の遺伝子完全性を破壊する。さらに、さらに、寒天が凍結温度で残る時間が長ければ長いほど、ゲルの脱水により寒天内に亀裂が形成する可能性が高まる。これらの亀裂は解凍サイクル中の水分の濃縮および融合のための追加の表面を提供し、これによりコロニーの崩壊および相互汚染の可能性が増大する。
【００４４】
実施例５−コロニーサイズの対する平板組成の影響：この実験の目的は、本明細書中に記載された平板上のプラスミドを有するＥ．ｃｏｌｉ株の増殖を他の市販のドライフィルム培地と比較することであった。インキュべーション後、各平板上の平均コロニーサイズの関数として増殖を比較した。
【００４５】
４．５ｍＬのトリプシンダイズブロス（Ｒｅｍｅｌ株式会社、レネクサ・カンサス州）を含有する管にアンピシリン（シグマ・ケミカル・カンパニー、セントルイス、ミズーリ州、最終濃度５０μｇ／ｍＬ）を添加することにより接種菌を調製した。ｐＧＦＰ３で形質転換したＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ１０Ｂのコロニーを管の中へ接種し、培養株を攪拌せずに３７℃下に一夜インキュべートした。
【００４６】
インキュべーション後、ボルテックス措置により管を混合し、均質の懸濁液を得た。懸濁液を１０−７の最終希釈にバターフィールドの緩衝液（ハーディ・ディアグノスティックス；サンタクララ、カリフォルニア州）中に連続希釈した。
【００４７】
本発明に記載された平板のほかに、以下の市販のぺトリフィルム（Ｐｅｔｒｉｆｉｌｍ）ＴＭ平板を接種した：Ｅ．ｃｏｌｉ算定（ＥＣ）、大腸菌型算定（ＣＣ）、腸内細菌科算定（ＥＢ），急速大腸菌型算定（ＲＣＣ）、および好気性算定（ＡＣ）。平板のすべては３Ｍ社（セントポール、ミネソタ州）から入手可能である。
【００４８】
ペトリフィルム平板製品の挿入物に従い、１．０ｍＬの希釈細胞懸濁液で平板を接種した。ペトリフィルム平板スプレッダーを用いてプレーティング範囲内に接種菌を分布した。
【００４９】
接種平板を８〜１２のスタック内に配置し、１６時間、３７℃下にインキュべートした。インキュべートした平板をヒューレット−パッカード・スキャンジェット６１００Ｃ平台型スキャナーでスキャニングした。「Ｗｉｎｄｏｗｓ  ＮＴ用画像処理」ソフトウェア（ワング・ラボラトリーズ株式会社；ビルリカ、マサチューセッツ州）によりＩＢＭ  ３００ＰＬコンピュータで画像を確認した。画像は１０００％に拡大し、個々のピクセルが確認できるようにした。
【００５０】
コロニーサイズは個々のコロニーの寸法（ピクセル単位）を測定することで推定した。コロニーは、コロニーが青色であったＧｅｎ−１およびＥＣの調製物を除きすべての平板上で赤色であった。ＥＢ平板上のコロニーサイズを測定する場合、コロニー径の一部としてコロニー周囲の気泡は算定しなかった。平均コロニーのピクセル数を計算した（表２）。平板上に黄色のグリッドを載せたコロニーはコロニーサイズの推定用に用いなかった。各分析において用いたコロニーの数が表２に示されている。表２における「＊」は、１６時間のインキュべーション後にＣＣ平板上には視認された小さな酸の区域であるが、その区域の中心におけるコロニーは視認されなかったことを指し、「＊＊」は１６時間のインキュべーション後にＥＣ平板において視認された１つのコロニーのみを指す。このコロニーは黄色のグリッド線の１つの上に重なり、したがって、分析には含まれなかった。
【００５１】
【表２】
表２
0004652651.tif 000003
【００５２】
これらのデータは、Ｇｅｎ−１ＡおよびＧｅｎ−２の調製物の明らかなコロニーサイズが、試験した他のペトリフィルム平板よりも大きいことを示している。Ｇｅｎ−１Ａにおける平均コロニーサイズは試験した平板のすべてのうち最大であった。各平板におけるコロニーの比較的少数は結果として平板上の栄養素に対して競合を示さなくなる。したがって、これらの実験に用いたインキュべーション温度では、コロニーは各調製物において最適に増殖していた。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】  装置の一実施態様を示す概略図である。
【図１Ｂ】  装置の一実施態様および微生物コロニーの分割を示す概略図である。
【図１Ａ】
0004652651.tif 000004
【図１Ｂ】
0004652651.tif 000005