(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
肝細胞増殖因子の糖鎖付加部位の全部において糖鎖が欠損しており、糖鎖付加部位の全部において糖鎖が付加されないように、肝細胞増殖因子の各糖鎖付加部位に、次のａ）からｄ）に示される改変の少なくとも一つがなされていることを特徴とする糖鎖欠損型肝細胞増殖因子；
ａ）肝細胞増殖因子のアミノ酸配列中に存在するＡｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ又はＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ（ＸはＰｒｏ以外のアミノ酸を示す。）で示されるＮ−結合型糖鎖付加のコンセンサス配列のＡｓｎが他のアミノ酸残基に置換されている；
ｂ）肝細胞増殖因子のアミノ酸配列中に存在するＡｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ又はＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ（ＸはＰｒｏ以外のアミノ酸を示す。）で示されるＮ−結合型糖鎖付加のコンセンサス配列のＳｅｒ又は／及びＴｈｒが他のアミノ酸残基に置換されている；
ｃ）肝細胞増殖因子のアミノ酸配列中に存在するＡｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ又はＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ（ＸはＰｒｏ以外のアミノ酸を示す。）で示されるＮ−結合型糖鎖付加のコンセンサス配列のＸがＰｒｏに置換されている；又は
ｄ）肝細胞増殖因子のアミノ酸配列中に存在するＯ−結合型糖鎖付加を受けるＳｅｒ又は／及びＴｈｒが他のアミノ酸残基に置換されている。
【請求項２】
肝細胞増殖因子がヒト肝細胞増殖因子であることを特徴とする請求項１に記載の糖鎖欠損型肝細胞増殖因子。
【請求項３】
肝細胞増殖因子がネコ又はイヌ肝細胞増殖因子であることを特徴とする請求項１に記載の糖鎖欠損型肝細胞増殖因子。
【請求項４】
配列番号１に記載のアミノ酸配列をもとに改変される請求項１又は２に記載の糖鎖欠損型肝細胞増殖因子であって、配列番号１中のアミノ酸に対して、次のａ）からｅ）に示される改変の全てがなされていることを特徴とする糖鎖欠損型肝細胞増殖因子；
ａ）第２９４位又は／及び第２９６位のアミノ酸が他のアミノ酸に、又は／及び第２９５位のアミノ酸がＰｒｏに置換されていることによって第２９４位に糖鎖が付加されていない；
ｂ）第４０２位又は／及び第４０４位のアミノ酸が他のアミノ酸に、又は／及び第４０３位のアミノ酸がＰｒｏに置換されていることによって第４０２位に糖鎖が付加されていない；
ｃ）第４７６位のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されていることによって第４７６位に糖鎖が付加されていない；
ｄ）第５６６位又は／及び第５６８位のアミノ酸が他のアミノ酸に、又は／及び第５６７位のアミノ酸がＰｒｏに置換されていることによって第５６６位に糖鎖が付加されていない；又は
ｅ）第６５３位又は／及び第６５５位のアミノ酸が他のアミノ酸に、又は／及び第６５４位のアミノ酸がＰｒｏに置換されていることによって第６５３位に糖鎖が付加されていない。
【請求項５】
配列番号２に記載のアミノ酸配列をもとに改変される請求項１又は２に記載の肝細胞増殖因子であって、配列番号２中のアミノ酸に対して、次のａ）からｅ）に示される改変の全てがなされていることを特徴とする糖鎖欠損型肝細胞増殖因子；
ａ）第２８９位又は／及び第２９１位のアミノ酸が他のアミノ酸に、又は／及び第２９０位のアミノ酸がＰｒｏに置換されていることによって第２８９位に糖鎖が付加されていない；
ｂ）第３９７位又は／及び第３９９位のアミノ酸が他のアミノ酸に、又は／及び第３９８位のアミノ酸がＰｒｏに置換されていることによって第３９７位に糖鎖が付加されていない；
ｃ）第４７１位のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されていることによって第４７１位に糖鎖が付加されていない；
ｄ）第５６１位又は／及び第５６３位のアミノ酸が他のアミノ酸に、又は／及び第５６２位のアミノ酸がＰｒｏに置換されていることによって第５６１位に糖鎖が付加されていない；又は
ｅ）第６４８位又は／及び第６５０位のアミノ酸が他のアミノ酸に、又は／及び第６４９位のアミノ酸がＰｒｏに置換されていることによって第６４８位に糖鎖が付加されていない。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載の糖鎖欠損型肝細胞増殖因子をコードしうる塩基配列からなるＤＮＡ。
【請求項７】
請求項６に記載のＤＮＡを組み込んだベクター。
【請求項８】
請求項７に記載のベクターを細胞に導入し、該細胞を培養し、該細胞内もしくは該細胞の培養液中に糖鎖欠損型肝細胞増殖因子を産生せしめ、該細胞内もしくは該細胞の培養液中から糖鎖欠損型肝細胞増殖因子を精製回収することを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の糖鎖欠損型肝細胞増殖因子の製造法。
【請求項９】
細胞が真核細胞である請求項８に記載の糖鎖欠損型肝細胞増殖因子の製造法。
【請求項１０】
真核細胞が酵母又は昆虫細胞である請求項９に記載の糖鎖欠損型肝細胞増殖因子の製造法。
【請求項１１】
請求項７に記載のベクターを昆虫個体に導入し、昆虫個体中に糖鎖欠損型肝細胞増殖因子を産生せしめ、該昆虫個体から糖鎖欠損型肝細胞増殖因子を精製回収することを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の糖鎖欠損型肝細胞増殖因子の製造法。
【請求項１２】
請求項７に記載のベクターからなる遺伝子を糖鎖付加能のない細胞に導入し、該細胞を培養し、該細胞内もしくは該細胞の培養液中に糖鎖欠損型肝細胞増殖因子を産生せしめ、該細胞内もしくは該細胞の培養液中から糖鎖欠損型肝細胞増殖因子を精製回収することを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の糖鎖欠損型肝細胞増殖因子の製造法。
【請求項１３】
請求項１〜５のいずれかに記載の糖鎖欠損型肝細胞増殖因子を有効成分とする医薬製剤。
【請求項１４】
請求項６に記載のＤＮＡを含む遺伝子治療薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖鎖欠損型肝細胞増殖因子に関する。より詳細には、肝細胞増殖因子の糖鎖を欠損させることによって改変した肝細胞増殖因子に関する。
【背景技術】
【０００２】
肝細胞増殖因子（以下、ＨＧＦともいう。）は肝実質細胞の増殖活性を有する蛋白質であり、異なったアミノ酸配列を有するものが報告されており、その名称はＨＧＦ以外にＳＦ（ｓｃａｔｔｅｒ  ｆａｃｔｏｒ）、ＴＣＦ（Ｔｕｍｏｒ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ｆａｃｔｏｒ）等が使用されている。本発明では、これらの公知の肝実質細胞増殖活性を有する蛋白質をＨＧＦと総称する。ＨＧＦは肝実質細胞の増殖以外にも細胞遊走促進、形態形成促進、血管新生作用、神経保護作用又は抗アポトーシス作用等様々な薬理作用を示す生理活性ペプチドであることが知られている（非特許文献１参照。）。ＨＧＦはその薬理作用から肝硬変治療剤、腎疾患治療剤、上皮細胞増殖促進剤、抗ガン剤、ガン療法用副作用防止剤、肺障害治療剤、胃・十二指腸損傷治療剤、脳神経障害治療剤、免疫抑制副作用防止剤、コラーゲン分解促進剤、軟骨障害治療剤、動脈疾患治療剤、肺線維症治療剤、肝臓疾患治療剤、血液凝固異常治療剤、血漿低蛋白治療剤、創傷治療剤、神経障害改善薬、造血幹細胞増加剤又は育毛促進剤等としての開発が期待されている（例えば特許文献１〜１４参照。）。【０００３】
ＨＧＦは、肝臓、脳、肺臓、骨髄、ひ臓、胎盤又は腎臓等の臓器あるいは血小板や白血球等の血液細胞等から分泌されるが、生体内には極微量にしか存在しないため、ＨＧＦを医薬製剤として用いるためには、遺伝子工学的手法により細胞を用いて大量に生産する必要がある。従来、ＨＧＦはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞等の動物細胞を用いて生産できることが知られている（特許文献１５、１６参照。）。
しかし、一般にＣＨＯ細胞等の動物細胞を用いて蛋白質を生産する方法はコストが高く、引いては薬価の上昇につながることが考えられる。【０００４】
安価に蛋白質を組換え生産する方法としては、大腸菌等の原核生物に目的遺伝子を導入して発現させる方法が知られている（非特許文献２参照。）。しかし、大腸菌等の原核生物で生産した組換え蛋白質には糖鎖が付加されないという問題がある。これは、大腸菌等の原核生物には糖鎖生合成の場である小胞体及びゴルジ体が存在しないからである。【０００５】
動物細胞内での蛋白質への糖鎖付加及び糖鎖の修飾は、ＤＮＡあるいは蛋白質の生合成の場合とは異なり、鋳型によらない翻訳後修飾（ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）である。この翻訳後修飾は小胞体及びゴルジ体と呼ばれる細胞内小器官に局在する数多くの糖鎖生合成関連酵素が介在する複雑な機構を通して行われる。すなわち、特定の単糖と、その結合様式に特異的な酵素（糖加水分解酵素及び糖転移酵素）との連携による複雑な生合成経路に従って、単糖が順次切り取られたり付加されたりしながら、所定の糖鎖構造が得られるように糖鎖が伸長されていく（非特許文献３参照。）。このようにして蛋白質に付加される糖鎖は高等生物の生命現象全般に深く関わっていることが知られている（非特許文献４、５参照。）。【０００６】
ヒト体内の蛋白質の半数以上は糖鎖が付加された糖蛋白質として存在することが知られている（非特許文献６参照。）。
本来糖鎖の付加された形で存在し、活性を有する糖蛋白質を糖鎖のない状態にすると、活性を失うことが懸念される。例えば、赤血球造血ホルモンとして知られるエリスロポチンでは糖鎖を除去すると薬効を失ってしまうことが知られている（非特許文献７参照。）。【０００７】
蛋白質を安価に生産できる宿主で糖鎖付加の能力を有する細胞としては酵母が知られている（非特許文献８〜１０参照。）。酵母は真核生物であり、小胞体及びゴルジ体を有しているため、糖鎖生合成機構が備わっている。しかし、酵母の糖鎖生合成機構は動物細胞とは大きく異なっているため、糖鎖付加部位を有する蛋白質を酵母で生産すると、酵母型の糖鎖が付加されることになる。酵母の糖鎖構造はヒトその他の哺乳動物の糖鎖構造とは大きく異なっていることが知られている（非特許文献１１参照。）。
このため、このような組換え蛋白質はヒトその他の哺乳動物に対して抗原性を示すのでヒト及び動物の医薬品として用いることはできない。【０００８】
また、昆虫細胞も糖鎖付加能を有する宿主であって、比較的安価に蛋白質を生産することができるが、昆虫細胞の糖鎖構造もヒト型の糖鎖構造とは異なることが知られている（非特許文献１２参照。）。
従って、昆虫細胞もヒトその他の哺乳動物に対して抗原性を示す可能性がある。【０００９】
そこで、酵母や昆虫細胞等を用いて生産した蛋白質から糖鎖を除去するか、もしくは蛋白質分子中の糖鎖付加部位に変異が導入されるようにした遺伝子を酵母や昆虫細胞等に導入することで、糖鎖付加のない蛋白質をつくることが考えられる。しかし、上述のように、本来糖鎖の付加された形で存在する蛋白質を糖鎖のない状態にすると、活性を失うことが懸念される。【００１０】
ＨＧＦは５本の糖鎖が付加されている（非特許文献１３、１４参照。）。ＨＧＦの糖鎖を除去した場合の活性への影響については、Ｎ−結合型糖鎖付加の阻害剤であるツニカマイシンをＨＧＦ産生細胞に添加して培養した場合、産生されるＨＧＦが細胞遊走活性を保持しているとの報告がある（論文中ではＨＧＦはＳＦと表されている）（非特許文献１５参照。）。
しかし、この論文では、ツニカマイシン存在下で産生されたＨＧＦの糖鎖がどの程度欠損しているかについての解析がなされておらず、十分な知見を与えるものではない。
また、同論文において、ＨＧＦをＮ−グリカナーゼやＯ−グリカナーゼで処理しても、ＨＧＦが細胞遊走活性を保持しているとの記載があるが、同論文中ではＮ−グリカナーゼ処理したＨＧＦやＯ−グリカナーゼ処理したＨＧＦが、糖鎖を認識するＣｏｎＡカラムに吸着されていることを示している。Ｎ−グリカナーゼ処理したＨＧＦやＯ−グリカナーゼ処理したＨＧＦがＣｏｎＡカラムに吸着されることは、糖鎖の除去が十分になされていないことを意味する。したがって、Ｎ−グリカナーゼ処理したＨＧＦやＯ−グリカナーゼ処理したＨＧＦが細胞遊走活性を保持しているとの記載は、糖鎖を欠損したＨＧＦが細胞遊走活性を保持していると結論づけるものではない。【００１１】
さらに、ＨＧＦは細胞遊走活性に加えて細胞増殖、形態形成促進、血管新生作用、抗細胞死活性又は神経保護作用等多岐にわたる活性を有している（非特許文献１６参照。）。
糖鎖を欠損したＨＧＦが細胞遊走活性を有していても、他の機能も有しているとは言い難い。例えば、ＨＧＦのトランケート型バリアントであるＮＫ２は、細胞遊走活性を有するが、細胞増殖活性は有していない（非特許文献１７参照。）。
このように、ＨＧＦの糖鎖が欠損した場合に、ＨＧＦが多彩な機能を保持しているかどうかは全く不明であった。ＨＧＦは多彩な活性を有することから、生体修復因子と考えられており、ＨＧＦの糖鎖を欠損させても、ＨＧＦの高度な機能に影響がないとは考えられなかった。
【特許文献１】特開平４−１８０２８号公報
【特許文献２】特開平４−４９２４６号公報
【特許文献３】欧州特許出願公開第４９２６１４号明細書
【特許文献４】特開平６−２５０１０号公報
【特許文献５】国際公開第９３／８８２１号パンフレット
【特許文献６】特開平６−１７２２０７号公報
【特許文献７】特開平７−８９８６９号公報
【特許文献８】特開平６−４０９３４号公報
【特許文献９】国際公開第９４／２１６５号パンフレット
【特許文献１０】特開平６−４０９３５号公報
【特許文献１１】特開平６−５６６９２号公報
【特許文献１２】特開平７−４１４２９号公報
【特許文献１３】国際公開第９３／３０６１号パンフレット
【特許文献１４】特開平５−２１３７２１号公報
【特許文献１５】特開平１１−４６９６号公報
【特許文献１６】特開平１０−１９１９９１号公報
【非特許文献１】マツモト・ケー（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，Ｋ）ら、キドニー・インターナショナル（Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）、２００１年、第５９巻、ｐ．２０２３−２０３８
【非特許文献２】スワーツ・ジェイ・アール（Ｓｗａｒｔｓ，Ｊ．Ｒ．）、カレント・オピニオン・イン・バイオテクノロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、２００１年、第１２巻、ｐ．１９５−２０１
【非特許文献３】コーンフェルド・アール（Ｋｏｒｎｆｅｌｄ，Ｒ．）他１名、アニュアル・レビュー・オブ・バイオケミストリー（Ａｎｎｕａｌ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．）、１９８５年、第５４巻、ｐ．６３１−６６４
【非特許文献４】コバタ・エー（Ｋｏｂａｔａ，Ａ．）、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、１９９２年、第２０９巻、ｐ．４８３−５０１
【非特許文献５】バーキ・エー（Ｖａｒｋｉ，Ａ．）、グリコバイオロジー（Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ）、１９９３年、第３巻、ｐ．９７−１３０
【非特許文献６】グーチー・シー・エフ（Ｇｏｏｃｈｅｅ，Ｃ．Ｆ．）ら、バイオテクノロジー（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｇｙ）、１９９１年、第９巻、ｐ．１３４７−１３５５
【非特許文献７】タケウチ・エム（Ｔａｋｅｕｃｈｉ，Ｍ．）他１名、グリコバイオロジー（Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ）、１９９１年、第１巻、ｐ．３３７−３４６
【非特許文献８】ウイスマン・エー（Ｗｉｓｅｍａｎ  Ａ．）、エンデボーア（Ｅｎｄｅａｖｏｕｒ．）、１９９６年、第２０巻、ｐ．１３０−１３２
【非特許文献９】ラッセル・シー（Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｃ．）ら、オーストラリアン・ジャーナル・オブ・バイオテクノロジー（Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、１９９１年、第５巻、ｐ．４８−５５
【非特許文献１０】ブックホルツ・アール・ジー（Ｂｕｃｋｈｏｌｚ，Ｒ．Ｇ．）他１名、バイオテクノロジー（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、１９９１年、第９巻、ｐ．１０６７−１０７２
【非特許文献１１】ゲミル・ティー・アール（Ｇｅｍｍｉｌｌ，Ｔ．Ｒ．）他１名、バイオケミカ・エト・バイオフィジカ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  ａｃｔａ）、１９９９年、第１４２６巻、ｐ．２２７−２３７
【非特許文献１２】アルトマン・エフ（Ａｌｔｍａｎｎ，Ｆ．）ら、グリココンジュゲイト・ジャーナル（Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｊｏｕｒｎａｌ）、１９９９年、第１６巻、ｐ．１０９−１２３
【非特許文献１３】ハラ・エイチ（Ｈａｒａ，Ｈ．）ら、ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、１９９３年、第１１４巻、ｐ．７６−８２
【非特許文献１４】シミズ・エヌ（Ｓｈｉｍｉｚｕ，Ｎ．）ら、バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ）、１９９２年、第１８９巻、ｐ．１３２９−１３３５
【非特許文献１５】ホフマン・アール（Ｈｏｆｍａｎｎ，Ｒ．）ら、バイオケミカ・エト・バイオフィジカ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  ａｃｔａ）、１９９２年、第１１２０巻、ｐ．３４３−３５０
【非特許文献１６】マツモト・ケー（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，Ｋ．）他１名、バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ）、１９９７年、第２３９巻、ｐ．６３９−６４４
【非特許文献１７】ハートマン・ジー（Ｈａｒｔｍａｎｎ，Ｇ．）ら、プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ザ・ユナイテッド・ステート・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）、１９９２年、第８９巻、ｐ．１１５７４−１１５７８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の課題は、ＨＧＦの糖鎖を欠損させた糖鎖欠損型肝細胞増殖因子を提供し、またその製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは上記課題を解決すべくＨＧＦの糖鎖機能に関する研究を鋭意重ねた結果、ＨＧＦの糖鎖を除去してもＨＧＦの機能が保持されることを見出した。ＨＧＦのような高度な機能を有する蛋白質が、糖鎖を除去しても機能を保持していることは全く予想外のことであった。それどころか、糖鎖欠損型ＨＧＦは糖鎖を有するＨＧＦに比べて血中安定性が向上しており、このような事実は全く驚くべき発見であった。以上の発見に基づき、本発明者らはさらに研究をすすめ本発明の完成に至った。
すなわち、本発明は、
（１）  肝細胞増殖因子の糖鎖付加部位の全部又は少なくとも一ヶ所において糖鎖が欠損していることを特徴とする糖鎖欠損型肝細胞増殖因子、
（２）  上記（１）記載の糖鎖欠損型肝細胞増殖因子であって、肝細胞増殖因子の少なくとも１ヶ所の糖鎖付加部位において糖鎖が付加されないようにアミノ酸配列に変異が導入された糖鎖欠損型肝細胞増殖因子、
（３）  肝細胞増殖因子のアミノ酸配列に対して、次のａ）からｄ）に示される改変の少なくとも一つ以上がなされていることを特徴とする上記（２）記載の糖鎖欠損型肝細胞増殖因子；
ａ）肝細胞増殖因子のアミノ酸配列中に存在するＡｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ又はＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ（ＸはＰｒｏ以外のアミノ酸を示す。）で示されるＮ−結合型糖鎖付加のコンセンサス配列のうち、少なくとも一つのコンセンサス配列のＡｓｎが他のアミノ酸残基に置換されている；
ｂ）肝細胞増殖因子のアミノ酸配列中に存在するＡｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ又はＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ（ＸはＰｒｏ以外のアミノ酸を示す。）で示されるＮ−結合型糖鎖付加のコンセンサス配列のうち、一つのコンセンサス配列のＳｅｒ又はＴｈｒ、あるいは２以上のコンセンサス配列のＳｅｒ又は／及びＴｈｒが他のアミノ酸残基に置換されている；
ｃ）肝細胞増殖因子のアミノ酸配列中に存在するＡｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ又はＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ（ＸはＰｒｏ以外のアミノ酸を示す。）で示されるＮ−結合型糖鎖付加のコンセンサス配列のうち、少なくとも一つのコンセンサス配列のＸがＰｒｏに置換されている；又は
ｄ）肝細胞増殖因子のアミノ酸配列中に存在する少なくとも一つのＯ−結合型糖鎖付加を受けるＳｅｒ又は／及びＴｈｒが他のアミノ酸残基に置換されている、
（４）  肝細胞増殖因子がヒト肝細胞増殖因子であることを特徴とする上記（１）から（３）のいずれかに記載の糖鎖欠損型肝細胞増殖因子、
（５）  肝細胞増殖因子がネコ又はイヌ肝細胞増殖因子であることを特徴とする上記（１）から（３）のいずれかに記載の糖鎖欠損型肝細胞増殖因子、
（６）  配列番号１に記載のアミノ酸配列をもとに改変される上記（１）から（４）のいずれかに記載の糖鎖欠損型肝細胞増殖因子であって、配列番号１中のアミノ酸に対して、次のａ）からｅ）に示される改変の少なくとも一つ以上がなされていることを特徴とする糖鎖欠損型肝細胞増殖因子；
ａ）第２９４位又は／及び第２９６位のアミノ酸が他のアミノ酸に、又は／及び第２９５位のアミノ酸がＰｒｏに置換されていることによって第２９４位に糖鎖が付加されていない；
ｂ）第４０２位又は／及び第４０４位のアミノ酸が他のアミノ酸に、又は／及び第４０３位のアミノ酸がＰｒｏに置換されていることによって第４０２位に糖鎖が付加されていない；
ｃ）第４７６位のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されていることによって第４７６位に糖鎖が付加されていない；
ｄ）第５６６位又は／及び第５６８位のアミノ酸が他のアミノ酸に、又は／及び第５６７位のアミノ酸がＰｒｏに置換されていることによって第５６６位に糖鎖が付加されていない；又は
ｅ）第６５３位又は／及び第６５５位のアミノ酸が他のアミノ酸に、又は／及び第６５４位のアミノ酸がＰｒｏに置換されていることによって第６５３位に糖鎖が付加されていない、及び
（７）  配列番号２に記載のアミノ酸配列をもとに改変される上記（１）から（４）のいずれかに記載の肝細胞増殖因子であって、配列番号２中のアミノ酸に対して、次のａ）からｅ）に示される改変の少なくとも一つ以上がなされていることを特徴とする糖鎖欠損型肝細胞増殖因子；
ａ）第２８９位又は／及び第２９１位のアミノ酸が他のアミノ酸に、又は／及び第２９０位のアミノ酸がＰｒｏに置換されていることによって第２８９位に糖鎖が付加されていない；
ｂ）第３９７位又は／及び第３９９位のアミノ酸が他のアミノ酸に、又は／及び第３９８位のアミノ酸がＰｒｏに置換されていることによって第３９７位に糖鎖が付加されていない；
ｃ）第４７１位のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されていることによって第４７１位に糖鎖が付加されていない；
ｄ）第５６１位又は／及び第５６３位のアミノ酸が他のアミノ酸に、又は／及び第５６２位のアミノ酸がＰｒｏに置換されていることによって第５６１位に糖鎖が付加されていない；又は
ｅ）第６４８位又は／及び第６５０位のアミノ酸が他のアミノ酸に、又は／及び第６４９位のアミノ酸がＰｒｏに置換されていることによって第６４８位に糖鎖が付加されていない、
に関する。【００１４】
また、本発明は、
（８）  上記（１）から（７）のいずれかに記載の糖鎖欠損型肝細胞増殖因子をコードしうる塩基配列からなるＤＮＡ、
（９）  上記（８）記載のＤＮＡを組み込んだベクター、
（１０）  上記（９）記載のベクターを細胞に導入し、該細胞を培養し、該細胞内もしくは該細胞の培養液中に糖鎖欠損型肝細胞増殖因子を産生せしめ、該細胞内もしくは該細胞の培養液中から糖鎖欠損型肝細胞増殖因子を精製回収することを特徴とする上記（１）から（７）のいずれかに記載の糖鎖欠損型肝細胞増殖因子の製造法、
（１１）  細胞が真核細胞である上記（１０）記載の糖鎖欠損型肝細胞増殖因子の製造法、
（１２）  真核細胞が酵母又は昆虫細胞である上記（１１）記載の糖鎖欠損型肝細胞増殖因子の製造法、
（１３）  上記（９）記載のベクターを昆虫個体に導入し、昆虫個体中に糖鎖欠損型肝細胞増殖因子を産生せしめ、該昆虫個体から糖鎖欠損型肝細胞増殖因子を精製回収することを特徴とする上記（１）から（７）のいずれかに記載の糖鎖欠損型肝細胞増殖因子の製造法、
（１４）  糖鎖を有する肝細胞増殖因子を酵素で処理することによって糖鎖を全部又は部分的に除去し、該酵素反応液から糖鎖欠損型肝細胞増殖因子を精製回収することを特徴とする上記（１）から（７）のいずれかに記載の糖鎖欠損型肝細胞増殖因子の製造法、
（１５）  糖鎖を有する肝細胞増殖因子をコードする塩基配列を含むＤＮＡを組み込んだベクター又は上記（９）記載のベクターからなる遺伝子を糖鎖付加能のない細胞に導入し、該細胞を培養し、該細胞内もしくは該細胞の培養液中に糖鎖欠損型肝細胞増殖因子を産生せしめ、該細胞内もしくは該細胞の培養液中から糖鎖欠損型肝細胞増殖因子を精製回収することを特徴とする上記（１）から（７）のいずれかに記載の糖鎖欠損型肝細胞増殖因子の製造法、
（１６）  糖鎖を有する肝細胞増殖因子をコードする塩基配列又は上記（８）記載の塩基配列からなる遺伝子を鋳型として無細胞蛋白質合成システムによって糖鎖欠損型肝細胞増殖因子を合成し、該合成反応液から糖鎖欠損型肝細胞増殖因子を精製回収することを特徴とする上記（１）から（７）のいずれかに記載の糖鎖欠損型肝細胞増殖因子の製造法、
（１７）  上記（１）から（７）のいずれかに記載の糖鎖欠損型肝細胞増殖因子を有効成分とする医薬製剤、及び
（１８）  上記（８）記載のＤＮＡを含む遺伝子治療薬、
に関する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の糖鎖欠損型ＨＧＦは、細胞増殖活性、細胞遊走活性又は形態形成活性等において糖鎖を有するＨＧＦと同等の活性を有し、温度安定性も同等であるので、糖鎖を有するＨＧＦの代替品となり得る。従って、本発明の糖鎖欠損型ＨＧＦを有効成分とする医薬製剤は、糖鎖を有するＨＧＦと同様の用途、すなわち、哺乳動物（例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ラット、マウス、ウサギ、ウマ、ウシ、ヒツジ、モルモット等）に対し、肝硬変治療剤、腎疾患治療剤、上皮細胞増殖促進剤、抗ガン剤、ガン療法用副作用防止剤、肺障害治療剤、胃・十二指腸損傷治療剤、脳神経障害治療剤、免疫抑制副作用防止剤、コラーゲン分解促進剤、軟骨障害治療剤、動脈疾患治療剤、肺線維症治療剤、肝臓疾患治療剤、血液凝固異常治療剤、血漿低蛋白治療剤、創傷治療剤、神経障害改善薬、造血幹細胞増加剤又は育毛促進剤等として用いることができる。
また、本発明の糖鎖欠損型ＨＧＦをコードするＤＮＡを含む医薬は、上記疾患の遺伝子治療薬として用いることができる。
また、本発明の糖鎖欠損型ＨＧＦは糖鎖を有するＨＧＦよりも血中安定性が向上しているので、ＨＧＦの投与量を低減することができ、ＨＧＦによる副作用の防止が図れる。
本発明の糖鎖欠損型ＨＧＦは、酵母や昆虫細胞での生産が可能であるため、安価に生産することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】各ＨＧＦのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析結果を示す図である。各ＨＧＦを還元処理して泳動した後、ゲルを銀染色した。
【図２】ＨＧＦの肝実質細胞増殖活性について、ラット肝実質細胞のＤＮＡ合成量を指標として示した図である。
【図３】ＨＧＦの細胞遊走活性について、ＭＤＣＫ細胞の分散の程度によって比較した結果を示す図である。
【図４】ＨＧＦの形態形成活性について、ＭＤＣＫ細胞の管腔形成の程度によって比較した結果を示す図である。
【図５】ＨＧＦの温度安定性を示す図である。３７℃において各ＨＧＦを表示された日数の間インキュベートした。残存活性をラット肝実質細胞のＤＮＡ合成量を指標として測定し、相対値として表した。
【図６】ＨＧＦの血中安定性を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、本発明を詳細に説明する。本発明に係わる糖鎖欠損型ＨＧＦは、糖鎖を有する哺乳動物、例えばヒト、イヌ、ネコ、ラット、マウス、ウサギ、ウマ、ウシ、ヒツジ又はモルモット等のＨＧＦの糖鎖付加部位の全部又は少なくとも１ヶ所の糖鎖が欠損するように、構造が改変されたＨＧＦをいう。
また、本発明の糖鎖欠損型ＨＧＦには、公知のＨＧＦに糖鎖が付加されないように変異が導入されたアミノ酸配列のうち、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を有し、かつＨＧＦ活性を有する蛋白質も含まれる。さらに、本発明の糖鎖欠損型ＨＧＦには、公知のＨＧＦに糖鎖が付加されないように変異が導入されたアミノ酸配列と少なくとも約６０％以上の相同性を有する蛋白質、好ましくは約８０％以上の相同性を有する蛋白質、より好ましくは約９０％以上の相同性を有する蛋白質、さらに好ましくは約９５％以上の相同性を有する蛋白質であって、かつＨＧＦ活性を有する蛋白質も含まれる。
なお、アミノ酸配列について、「１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入」とは、部位特異的突然変異誘発法等の周知の技術的方法により、又は天然に生じうる程度の数が、欠失、置換、付加又は挿入等されていることを意味する。
また、上記アミノ酸配列について「相同」とは、蛋白質の一次構造を比較し、配列間において各々の配列を構成するアミノ酸残基の一致の程度の意味である。
本発明の糖鎖欠損型ＨＧＦは、ＨＧＦの糖鎖付加部位の少なくとも一ヶ所において糖鎖が付加されないように変異を導入したＨＧＦ遺伝子を組み込んだベクターを細胞に導入して得られる。
また、本発明の糖鎖欠損型ＨＧＦは、糖鎖を有するＨＧＦの塩基配列を含むベクターを糖鎖付加能のない細胞に導入して得ることもできる。【００１８】
ＨＧＦの糖鎖付加部位の少なくとも一ヶ所において糖鎖が付加されないようにＨＧＦ遺伝子に変異を導入する方法としては、欠損させたい糖鎖の付加部位のアミノ酸配列に対応する塩基配列に変異を導入するのがよい。蛋白質に糖鎖が付加する場合、糖鎖にはＮ結合型糖鎖とＯ−結合型糖鎖があるので、それぞれについて次のような変異を導入する。
Ｎ−結合型糖鎖にはコンセンサス配列〔Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ又はＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ（Ｘはプロリン以外のアミノ酸を示す。）〕が存在することが知られている。コンセンサス配列が存在するときにはＡｓｎに糖鎖が結合する（Ｋｏｂａｔａ，Ａ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９９２年、第２０９巻、ｐ．４８３−５０１）。このため、コンセンサス配列中のＡｓｎを他のアミノ酸（例えば、Ｇｌｎ等）に変換するか、あるいは、Ｓｅｒ又はＴｈｒを他のアミノ酸（例えば、Ｇｌｙ、Ａｌａ等）に変換するように塩基配列に変異を導入することで、該当部位のＮ−結合型糖鎖を欠損させることができる。この場合、変換に用いるアミノ酸は、上記コンセンサス配列の前後のアミノ酸配列と新たなコンセンサス配列を形成しないアミノ酸を適宜選択するのが好ましい。また、コンセンサス配列中のＸの部位にプロリンが導入されるように塩基配列に変異を導入してもよい。
Ｏ−結合型糖鎖にはコンセンサス配列は存在しないが、Ｏ−結合型糖鎖では、ＳｅｒかＴｈｒの水酸基に糖鎖が付加するので、Ｏ−結合型糖鎖付加を受ける部位のＳｅｒ又はＴｈｒを他のアミノ酸（例えば、Ｇｌｙ等）に変換するように塩基配列に変異を導入することで該当部位の糖鎖を欠損させることができる。この場合、変換に用いるアミノ酸は、該アミノ酸の前後のアミノ酸配列と上記コンセンサス配列を形成しないアミノ酸を適宜選択するのが好ましい。【００１９】
ＨＧＦにおける糖鎖付加部位は、例えばヒトＨＧＦにおいては、配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列の第２９４位のＡｓｎ（Ｎ−結合型糖鎖）、第４０２位のＡｓｎ（Ｎ−結合型糖鎖）、第４７６のＴｈｒ（Ｏ−結合型糖鎖）、第５６６位のＡｓｎ（Ｎ−結合型糖鎖）、第６５３位のＡｓｎ（Ｎ−結合型糖鎖）である。また、配列表の配列番号２で示される５アミノ酸欠失型ヒトＨＧＦにおける糖鎖付加部位は、第２８９位のＡｓｎ（Ｎ−結合型糖鎖）、第３９７位のＡｓｎ（Ｎ−結合型糖鎖）、第４７１のＴｈｒ（Ｏ−結合型糖鎖）、第５６１位のＡｓｎ（Ｎ−結合型糖鎖）、第６４８位のＡｓｎ（Ｎ−結合型糖鎖）である。
また、上記ヒトＨＧＦの上記コンセンサス配列は、配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列の第２９４位から第２９６位、第４０２位から第４０４位、第５６６位から第５６８位、及び第６５３位から第６５５位に存在する。５アミノ酸欠失型ヒトＨＧＦでは、コンセンサス配列は、配列表の配列番号２で示されるアミノ酸配列の第２８９位から第２９１位、第３９７位から第３９９位、第５６１位から第５６３位、及び第６４８位から第６５０位に存在する。【００２０】
ＨＧＦの塩基配列に変異を導入する方法としては、変異を導入したい部分に対応する変異プライマーを合成し、クンケル法等の既知の技術を用いて行うことができる。また、市販の変異導入キット等を用いるとより簡便に変異を導入することができる。
こうして得られた糖鎖欠損型ＨＧＦのアミノ酸配列をコードするＤＮＡあるいは糖鎖を有するＨＧＦのアミノ酸配列をコードするＤＮＡを含有するプラスミドやファージ等の組換ベクターから、制限酵素によって該ＤＮＡを切り出し、糖鎖欠損型ＨＧＦの発現に適したベクターのプロモーターの下流に制限酵素とＤＮＡリガーゼを用いて再結合して組換発現ベクターを作製することが出来る。より詳しくは、転写の下流方向に順番に、必要により（１）プロモーター、（２）リボソーム結合部位、（３）開始コドン、（４）本発明の糖鎖欠損型ＨＧＦをコードする塩基配列を含むＤＮＡ、（５）終止コドン、（６）ターミネーター等を含むように組換発現ベクターが構築される。
上記ＤＮＡには、上記糖鎖付加部位に変異が導入された糖鎖欠損型ＨＧＦをコードする塩基配列からなるＤＮＡだけでなく、（ａ）前記糖鎖欠損型ＨＧＦをコードする塩基配列の塩基の１もしくは数個の塩基が欠失、置換、付加もしくは挿入された塩基配列を有し、かつＨＧＦ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、（ｂ）前記糖鎖欠損型ＨＧＦをコードする塩基配列を有するＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＨＧＦ活性を有する蛋白質をコードする塩基配列からなるＤＮＡ、又は（ｃ）前記糖鎖欠損型ＨＧＦをコードする塩基配列を有するＤＮＡと少なくとも約６０％以上の相同性を有し、かつＨＧＦ活性を有する蛋白質をコードする塩基配列からなるＤＮＡも包含するものである。
上記塩基配列について、「１もしくは数個の塩基が欠失、置換、付加もしくは挿入」というときは、部位特異的突然変異誘発法等の周知の技術的方法により、又は天然に生じうる程度の数の塩基が、欠失、置換、付加又は挿入等されていることを意味する。
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとは、上記ＤＮＡをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味する。
ストリンジェントな条件とは、塩濃度、例えば約０．１〜２倍程度の濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウムよりなる。）、温度約６５℃程度でのハイブリダイズ条件をいう。
相同性を有するＤＮＡとは、ハイストリンジェントな条件において、少なくとも約６０％以上の相同性を有するＤＮＡ、好ましくは約８０％以上の相同性を有するＤＮＡ、より好ましくは、約９０％以上の相同性を有するＤＮＡ、さらに好ましくは約９５％以上の相同性を有するＤＮＡをいう。なお、ハイストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が約１９〜４０ｍＭ程度、好ましくは約１９〜２０ｍＭ程度で、温度が約５０〜７０℃程度、好ましくは約６０〜６５℃程度の条件をいう。特に、ナトリウム濃度が約１９ｍＭで温度が約６５℃程度の場合が最も好ましい条件である。【００２１】
本発明で用いることが出来るベクターとしては、大腸菌を宿主とする場合はｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９（東洋紡績）等のプラスミドを、枯草菌を宿主とする場合はｐＵＢ１１０（シグマ社）等のプラスミドを、酵母を宿主とする場合はｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＲＢ１５（ＡＴＣＣ３７０６２）等のプラスミドを用いることができる。動物細胞用の発現ベクターとしては、ｐＣＡＧＧＳ又はｐＣＸＮ２（Ｎｉｗａ，Ｈ．，Ｙａｍａｍｕｒａ，Ｋ．ａｎｄ  Ｍｉｙａｚａｋｉ，Ｊ．，Ｇｅｎｅ，１９９１年，第１０８巻，ｐ．１９３−２００、特開平０３−１６８０８７）、ｐｃＤＬ−ＳＲα（Ｔａｋｅｂｅ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１９８８年、第８巻、ｐ．４６６−４７２）等が挙げられる。その他、バクテリオファージλｇｔ１０、λｇｔ１１（ストラタジーン社）、ウイルスＳＶ４０（ＢＲＬ社）、ＢＰＶ（ＡＴＣＣ  ＶＲ−７０３）又はレトロウイルスの遺伝子由来のベクター等を列挙できるが、宿主内で複製・増幅可能なベクターであれば特に限定はない。【００２２】
プロモーター又はターミネーターに関しても、糖鎖欠損型ＨＧＦをコードする塩基配列の発現に用いられる宿主に対応したものであれば特に限定はない。プロモーターの例としては、宿主が大腸菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター又はｌｐｐプロモーター等が挙げられ、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター又はＡＤＨプロモーター等が挙げられる。動物細胞を宿主として用いる場合は、ラウス肉腫ウイルス（ウイルスＲＳＶ）、ＭＰＳＶ、ポリオマーウイルス、鶏頭ウイルス、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス（ＳＭＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）又はワクシニアウイルス等のウイルスゲノムから得られるプロモーター、メロチオネインプロモーター又はヒートショックプロモーター等が挙げられる。また、高等哺乳動物宿主を用いる際には、好ましくは、ベクターにエンハンサーを導入する。エンハンサーを導入することにより転写が増大する。エンハンサーとしては、ＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルスの初期プロモーター／エンハンサー、ポリオマーエンハンサー又はアデノウイルスのエンハンサー等が挙げられる。またターミネーターとしては、宿主が大腸菌の場合、ｔｒｐターミネーター又は１ｐｐターミネーター等を、宿主が枯草菌の場合、ａｍｙＦターミネーター等を、宿主が酵母の場合、ＣＹＣ１ターミネーター等を、宿主が動物細胞の場合、ＳＶ４０ターミネーター又はＨＳＶ１ＴＫターミネーター等を例示することが出来る。これらのプロモーターとターミネーターは用いる宿主に応じて適宜組み合わせて用いるのが好ましい。【００２３】
このようにして構築された糖鎖欠損型ＨＧＦ発現ベクターは、コンピテント細胞法（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９７０年、第５３巻、ｐ．１５４）、プロトプラスト法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９７８年、第７５巻、ｐ．１９２９）、リン酸カルシウム法（Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９８３年、第２２１巻、ｐ．５５１）、ＤＥＡＥデキストラン法（Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９８２年、第２１５巻、ｐ．１６６）、電気パルス法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９８４年、第８１巻、ｐ．７１６１）、インビトロパッケージング法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９７５年、第７２巻、ｐ．５８１）、ウイルスベクター法（Ｃｅｌｌ、１９８４年、第３７巻、ｐ．１０５３）、又はマイクロインジェクション法（Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅｓ．、１９８４年、第１５３巻、ｐ．３４７）等によって宿主に導入され、形質転換体が作製される。【００２４】
宿主として用いることのできる細胞としては、特に制限はなく、動物、植物、昆虫、原核微生物又は真核微生物の細胞等が挙げられる。これらの細胞は個体を形成していてもよく、動物個体、植物個体又は昆虫個体を宿主としてもよい。動物細胞では、付着性細胞又は浮遊性細胞の何れも使用でき、糖鎖欠損型ＨＧＦを細胞内に生産蓄積する動物細胞でもよく、あるいは糖鎖欠損型ＨＧＦを細胞外に分泌生産する動物細胞でもよい。例えば、ＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスター卵巣細胞）、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、マウスＣ１２７細胞又はＨｅｌａ細胞等が挙げられる。植物細胞ではイネ、タバコ又はシロイヌナズナ等を挙げることができ、昆虫細胞ではＳｆ９やＳｆ２１等の細胞を挙げることができる。昆虫個体では例えばカイコを挙げることができる。原核微生物では大腸菌又は枯草菌等が挙げられ、真核微生物ではＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｂｏｉｄｉｎｉｉ又はＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ等の酵母あるいはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属又はＭｕｃｏｒ属等の糸状菌を挙げることができる。好ましくは、酵母、昆虫細胞又は昆虫個体である。これらのうち、原核生物の細胞では、糖鎖付加能がないため、野生型の糖鎖を有するＨＧＦ遺伝子を導入してもよい。【００２５】
得られた形質転換体は、目的とする糖鎖欠損型ＨＧＦを産生させるためにその宿主に応じた適切な培地中で培養される。培地中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物、ビタミン、血清及び薬剤等が含有される。培地の例としては、形質転換体の宿主が大腸菌の場合、ＬＢ培地（日水製薬）又はＭ９培地［Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９７２年、ｐ．４３１］等が挙げられ、宿主が酵母の場合はＹＥＰＤ培地（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、第１巻、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９７９年，ｐ．１１７）等が挙げられる。宿主が動物細胞の場合、約２０％以下のウシ胎児血清を含有する改変イーグル培地（ＭＥＭ培地）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ培地）又はＲＰＭＩ１６４０培地（日水製薬）等を挙げることが出来る。形質転換体の培養は、通常約２０℃〜４５℃、ｐＨは約５〜８の範囲で行われ、必要に応じて通気、撹拌が行われる。また、宿主が接着性の動物細胞等の場合は、ガラスビーズ、コラーゲンビーズ、あるいはアセチルセルロースホローファイバー等の担体が用いられる。これら以外の培地組成あるいは培養条件下でも形質転換体が生育すれば、これらに限定されるものではない。【００２６】
このようにして形質転換体の培養上清中又は形質転換体中に生成した糖鎖欠損型ＨＧＦは、公知の塩析法、溶媒沈殿法、透析法、限外濾過法、ゲル電気泳動法、ゲル濾過クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、逆相クロマトグラフィ及びアフィニティクロマトグラフィ等の１種又は２種以上を組み合わせて分離精製することが出来る。特に、精製方法として、硫酸アンモニウムによる塩析法、Ｓ−セファロースイオンクロマトグラフィ、ヘパリンセファロースアフィニティクロマトグラフィ、及びフェニルセファロース逆相クロマトグラフィの組み合せ、あるいは硫酸アンモニウムによる塩析法、Ｓ−セファロースイオンクロマトグラフィ、及び抗ＨＧＦ抗体セファロースアフィニティクロマトグラフィの組み合わせ等が好ましい。【００２７】
また、本発明の糖鎖欠損型ＨＧＦは、従来の既知の方法により糖鎖が付加したＨＧＦを得た後、糖鎖を除去する酵素で該ＨＧＦを処理することでも得られる。糖鎖を除去する酵素としては、Ｎ−結合型糖鎖の除去の目的ではグリコペプチダーゼＦ又はグリコペプチダーゼＡ等を使用することができる。Ｏ−結合型糖鎖の除去は、シアリダーゼ、フコシダーゼ及びＯ−グリカナーゼ等の１種又は２種の組み合わせによって達成される。酵素処理して得られた糖鎖除去ＨＧＦは、本発明の糖鎖欠損型ＨＧＦとして上述の精製法によって精製することができる。【００２８】
さらに、本発明の糖鎖欠損型ＨＧＦは、無細胞蛋白質合成システムを利用して得ることもできる。無細胞蛋白質合成システムとは、大腸菌、ウサギ網状赤血球細胞又は小麦胚芽等から調製した細胞抽出液を用いるか、あるいは細胞抽出液中に含まれる蛋白質合成因子群を利用して、目的蛋白質をコードするＤＮＡあるいはｍＲＮＡを鋳型として、生細胞を用いずに蛋白質合成を行うシステムをいう。細胞抽出液にはリボソーム、ｔＲＮＡ又は翻訳因子等の蛋白質合成に必要な分子群が含まれているため、これにＡＴＰやＧＴＰ等のエネルギー源及び基質となるアミノ酸を添加すると、蛋白質が合成される。細胞抽出液の代わりに、細胞抽出液中に含まれる蛋白質合成因子群を混合して用いてもよい。無細胞蛋白質合成システムでは、小胞体やゴルジ体が含まれないため、糖鎖付加部位を有する糖鎖を有するＨＧＦをコードするＤＮＡあるいはｍＲＮＡを鋳型として、糖鎖の欠損した糖鎖欠損型ＨＧＦを生産することができる。また、糖鎖付加部位に変異を導入したＤＮＡあるいはｍＲＮＡを用いることもできる。無細胞蛋白質合成反応液中において合成された糖鎖欠損型ＨＧＦは、上述の精製法によって精製することができる。【００２９】
上記のようにして得られる本発明の糖鎖欠損型ＨＧＦは、細胞増殖活性、細胞遊走活性又は形態形成活性等において糖鎖を有するＨＧＦと同等の活性を有し、温度安定性においても同等である。一方、本発明の糖鎖欠損型ＨＧＦは糖鎖を有するＨＧＦよりも血中安定性が向上している。【００３０】
本発明に係わる糖鎖欠損型ＨＧＦは、ヒトを含む哺乳動物（例えば、イヌ、ネコ、ラット、マウス、ウサギ、ウマ、ウシ、ヒツジ、モルモット等）に適用できる。
本発明の糖鎖欠損型ＨＧＦを有効成分とする医薬は、野生型の糖鎖が付加されたＨＧＦと同様の用途、例えば肝硬変治療剤、腎疾患治療剤、上皮細胞増殖促進剤、抗ガン剤、ガン療法用副作用防止剤、肺障害治療剤、胃・十二指腸損傷治療剤、脳神経障害治療剤、免疫抑制副作用防止剤、コラーゲン分解促進剤、軟骨障害治療剤、動脈疾患治療剤、肺線維症治療剤、肝臓疾患治療剤、血液凝固異常治療剤、血漿低蛋白治療剤、創傷治療剤、神経障害改善薬、造血幹細胞増加剤又は育毛促進剤等として用いることができる。また、本発明の糖鎖欠損型ＨＧＦをコードするＤＮＡを含む医薬は、上記疾患のための遺伝子治療薬として用いることができる。【００３１】
本発明の糖鎖欠損型ＨＧＦは蛋白質医薬品として有効であり、一般的な医薬製剤の形態で用いられる。本発明の糖鎖欠損型ＨＧＦを有効成分として含有する医薬製剤は、種々の製剤形態（例えば、液剤、固形剤、カプセル剤等）をとりうるが、一般的には有効成分である糖鎖欠損型ＨＧＦと結合性物質のみ、又はそれと慣用の担体と共に注射剤、吸入剤、坐剤又は経口剤とされ、中でも注射剤が好適である。当該注射剤は常法により調製することができ、例えば、糖鎖欠損型ＨＧＦ及び結合性物質を適切な溶剤（例えば、滅菌された水、緩衝液、生理食塩水等）に溶解した後、該溶解物をフィルター等で濾過して滅菌し、次いで無菌的な容器に充填することにより調製することができる。注射剤中の糖鎖欠損型ＨＧＦ含量としては、通常約０．０００２〜３（Ｗ／Ｖ％）程度、好ましくは約０．００１〜２（Ｗ／Ｖ％）程度に調製される。また、経口薬としては、例えば、錠剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、軟又は硬カプセル剤、液剤、乳剤、懸濁剤又は、シロップ剤等の剤形に製剤化され、これらの製剤は製剤化の常法に準じて調製することができる。坐剤も慣用の基剤（例えば、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチン、マクロゴール、ウィテップゾル等）を用いた製剤上の常法によって調製することができる。また、吸入剤も製剤上の常套手段に準じて調製することができる。製剤中の糖鎖欠損型ＨＧＦ含量は、剤形、適用疾患等に応じて適宜調製することができる。【００３２】
本発明の糖鎖欠損型ＨＧＦの医薬製剤の製剤化に際して、安定化剤が添加されることが好ましい。安定化剤としては、例えば、アルブミン、グロブリン、ゼラチン、アラニン、グリシン、マンニトール、グルコース、デキストラン、ソルビトール、エチレングリコール等が挙げられる。さらに、本発明の医薬製剤は製剤化に必要な他の添加物、例えば、溶剤（例えば、生理食塩液、滅菌精製水、注射用水等）、賦形剤（例えば、果糖、Ｄ−ソルビトール、ブドウ糖、デンプン、結晶セルロース、デキストリン等）、結合剤（例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴム等）、溶解補助剤（例えば、ラウロマクロゴール、ポリソルベート８０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０、アラビアゴム、安息香酸ナトリウム等）、酸化防止剤（例えば、Ｌ−アスコルビン酸、トコフェロール、エデト酸ナトリウム等）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカイン等）、等張化剤（例えば、塩化ナトリウム、ブドウ糖、Ｄ−マンニトール、グルセリン等）、緩衝剤（例えば、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸、酢酸ナトリウム、乳酸、リン酸水素ナトリウム等）、増粘剤（アラビアゴム、カルメロース、ポピドン、メチルセルロース等）、保存剤（例えば、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル、クロロブタノール、ベンジルアルコール、塩化ベンザルコニウム等）又はｐＨ調整剤（塩酸、水酸化ナトリウム、クエン酸、酢酸等）などを含んでいてもよい。
液状製剤とした場合は凍結保存、又は凍結乾燥等により水分を除去して保存するのが望ましい。凍結乾燥製剤は、用時に注射用蒸留水等を加え、再溶解して使用される。
また、経口剤とする場合には、顆粒又は錠剤等は、腸溶性コーティング剤（例えば酢酸フタル酸セルロース、メタアクリル酸コポリマー、ヒドロキシプロピルセルロースフタレート、カルボキシメチルエチルセルロース等）などで剤皮を施されるのが好ましく、カプセル剤では、腸溶性カプセル剤とされるのが好ましい。【００３３】
本発明の医薬製剤は、その製剤形態に応じた適当な投与経路により投与され得る。例えば、注射剤の形態にして静脈、動脈、皮下又は筋肉内等に投与することができる。その投与量は、患者の疾患、症状、年齢又は体重等により適宜調整されるが、例えば、成人に対し、通常糖鎖欠損型ＨＧＦとして約０．０１ｍｇ〜５００ｍｇ、好ましくは約０．０５ｍｇ〜１００ｍｇであり、これを１日１回ないし数回に分けて投与するのが適当である。【００３４】
本発明の糖鎖欠損型ＨＧＦをコードする塩基配列を有するＤＮＡは、上記ベクターに組み込まれ、遺伝子治療薬としても用いることができる。
本発明の遺伝子治療薬は、上記の糖鎖欠損型ＨＧＦ遺伝子と遺伝子運搬体との複合体として作製されることが好ましい。遺伝子運搬体としては、ウイルスベクター又はカチオン性遺伝子運搬体等が好ましい。ウイルスベクターでは、例えば、マウス白血病ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ＨＩＶベクター、ヘルペスシンプレックスベクター又はセンダイウイルスベクター等が挙げられる。カチオン性遺伝子運搬体では、例えば、ポリリジン又はポリジアミノ酪酸等のポリアミノ酸、あるいはリポソームやエチレンイミン等のカチオン性合成高分子等の遺伝子と親和性のある物質が挙げられる。【００３５】
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定されるものではない。
なお、実施例で使用する各略号の意味は、次のとおりである。
ＨＧＦ：肝細胞増殖因子
ｄＨＧＦ：５アミノ酸欠失型肝細胞増殖因子
ＬＢ培地：Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地
ＤＭＥＭ培地：ダルベッコ改変イーグル培地
Ａｍｐ：アンピシリン
ＦＣＳ：牛胎児血清
ＮａＣｌ：塩化ナトリウム
ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン
ＰＢＳ：リン酸緩衝食塩水
Ｔｗｅｅｎ８０：ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート
【実施例１】
【００３６】
配列表の配列番号３に示される５アミノ酸欠失型ＨＧＦ（ｄＨＧＦ；野生型ｄＨＧＦということもある。）をコードする塩基配列をｐＣＡＧＧＳベクターに組み込んだ。得られたベクター（以下、野生型ベクターという。）をｐＣＡＧＧＳ−ｄＨＧＦと称する。
ｄＨＧＦ蛋白質に存在する５箇所の糖鎖付加部位（配列表の配列番号２の２８９位、３９７位、４７１位、５６１位、６４８位）に変異を導入するため、表１の５種類の変異プライマー（５’−リン酸化）を合成し、ｐＣＡＧＧＳ−ｄＨＧＦベクターをテンプレートとして変異導入を実施した。この変異により、配列番号２で示されるアミノ酸配列のうち、Ａｓｎ２８９、Ａｓｎ３９７、Ａｓｎ５６１、Ａｓｎ６４８はＧｌｎに、Ｔｈｒ４７１はＧｌｙに置換される。
【表１】
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【００３７】
変異導入にはＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社のＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｍｕｌｔｉ  Ｋｉｔを利用した。変異の導入されたベクター（以下、変異ベクターという。）はＥ．ｃｏｌｉ  ＸＬ１０  Ｇｏｌｄのコンピテント細胞に形質転換し、ＬＢ／Ａｍｐプレート上でＡｍｐ耐性コロニーをピックアップした。得られた各クローンからプラスミドを抽出し、糖鎖欠損型ＨＧＦのコード部分について塩基配列を解析することによって、目的のクローンをスクリーニングした。５箇所に目的の変異が導入され、また他の変異がないことが確認できたベクターを選択し、以後の実験に用いた。得られた変異ベクターはｐＣＡＧＧＳ−ｄＨＧＦ−ＮＧと称する。また、上記１、２、３の３種の変異プライマーを用いて同様の操作を行い、α鎖の３箇所の糖鎖を欠損するように設計した変異ベクターｐＣＡＧＧＳ−ｄＨＧＦ−αＮＧを作製した。さらに、上記３、４の変異プライマーを用いて同様の操作を行い、β鎖の２箇所の糖鎖を欠損するように設計した変異ベクターｐＣＡＧＧＳ−ｄＨＧＦ−βＮＧを作製した。【００３８】
次に、野生型ベクターｐＣＡＧＧＳ−ｄＨＧＦ及び変異ベクターｐＣＡＧＧＳ−ｄＨＧＦ−ＮＧ、ｐＣＡＧＧＳ−ｄＨＧＦ−αＮＧ、ｐＣＡＧＧＳ−ｄＨＧＦ−βＮＧをそれぞれＣＯＳ−７細胞にトランスフェクトした。ＣＯＳ−７細胞はＤＭＥＭ培地に牛胎児血清（ＦＣＳ）を１０％添加して培養した。細胞はトランスフェクションの直前に無血清ＤＭＥＭ培地に交換した。トランスフェクションはリポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてリポフェクション法によって行った。トランスフェクションの６時間後、１％ＦＣＳを含むＤＭＥＭに培地交換し、その際にヘパリンを１μｇ／ｍＬとなるように添加した。これを３日間培養し、野生型ｄＨＧＦ及び糖鎖欠損型ｄＨＧＦを培地中に蓄積させた。３日後に培地を回収して混合し、０．２２μｍフィルターで濾過した後、精製に供するまで−８０℃で保存した。培地中に分泌された野生型ｄＨＧＦ及び糖鎖欠損型ｄＨＧＦの濃度はＥＬＩＳＡによって分析した。【００３９】
上記の培地を解凍し、再度０．２２μｍフィルターで濾過した後、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０、０．３Ｍ  ＮａＣｌで平衡化したＨｉＴｒａｐ  Ｈｅｐａｒｉｎ（Ｂｅｄ  ｖｏｌｕｍｅ：５ｍＬ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に０．６ｍＬ／分の流速で添加した。カラムを５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０、０．３Ｍ  ＮａＣｌで洗浄後、ＮａＣｌ濃度を２Ｍまで上昇させることによって野生型ｄＨＧＦ及び糖鎖欠損型ｄＨＧＦを溶出させた。溶出は１ｍＬ／分の流速で行い、２．５ｍＬ／ｔｕｂｅで分画した。野生型ｄＨＧＦ及び糖鎖欠損型ｄＨＧＦの存在する画分を回収し、限外濾過によって５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０、０．３Ｍ  ＮａＣｌにｂｕｆｆｅｒ交換した。これを同ｂｕｆｆｅｒで平衡化したＭｉｎｉ  Ｓカラム（Ｂｅｄ  ｖｏｌｕｍｅ：０．８ｍＬ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に０．４ｍＬ／分の流速で添加した。カラムを５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０、０．３Ｍ  ＮａＣｌで洗浄後、ＮａＣｌ濃度を１Ｍまで上昇させることによって野生型ｄＨＧＦ及び糖鎖欠損型ｄＨＧＦを溶出させた。溶出は０．４ｍＬ／分の流速で行い、０．４ｍＬ／ｔｕｂｅで分画した。野生型ｄＨＧＦ及び糖鎖欠損型ｄＨＧＦの存在する画分を回収し、精製状態をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認した。【００４０】
野生型ベクターの導入によって得られたｄＨＧＦをＣＯＳ−ｄＨＧＦ−ＷＴ、変異ベクターの導入によって得られた糖鎖欠損型ｄＨＧＦをそれぞれＣＯＳ−ｄＨＧＦ−ＮＧ、ＣＯＳ−ｄＨＧＦ−αＮＧ又はＣＯＳ−ｄＨＧＦ−βＮＧと称する。
また、特開平１０−１９１９９１に記載の方法に従ってＣＨＯ細胞によってもｄＨＧＦ蛋白質を調製した（ＣＨＯ−ｄＨＧＦ−ＷＴと称する）。【００４１】
これらのｄＨＧＦ及び糖鎖欠損型ｄＨＧＦをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって比較した結果を図１に示す。糖鎖欠損型ｄＨＧＦのＣＯＳ−ｄＨＧＦ−ＮＧでは、α鎖及びβ鎖ともに糖鎖を欠損する分子量に対応する位置にバンドがシフトしていることが確認された。糖鎖付加型（野生型）ｄＨＧＦであるＣＯＳ−ｄＨＧＦ−ＷＴとＣＨＯ−ｄＨＧＦ−ＷＴを比較すると、ＣＯＳ−ｄＨＧＦ−ＷＴはＣＨＯ−ｄＨＧＦ−ＷＴより糖鎖付加の程度が少ないが、これは宿主として用いたＣＯＳ細胞とＣＨＯ細胞の糖鎖付加能力の差あるいは精製方法の差によるものと考えられた。α鎖の糖鎖のみを欠損するＣＯＳ−ｄＨＧＦ−αＮＧでは、α鎖のバンドが糖鎖を欠損する分子量に対応する位置にシフトしていることが確認された。β鎖の糖鎖のみを欠損するＣＯＳ−ｄＨＧＦ−βＮＧでは、β鎖のバンドが糖鎖を欠損する分子量に対応する位置にシフトしていることが確認された。
【実施例２】
【００４２】
実施例１で得られた野生型ｄＨＧＦ及び糖鎖欠損型ｄＨＧＦを用いて、ラット肝実質細胞に対する増殖活性を測定した。
ＳＤラット（８週齢、雄）から、コラゲナーゼ灌流法によって肝実質細胞を分離した。得られた肝実質細胞を５％ＦＣＳを含むウィリアムズＥ（ＷＥ）培地に懸濁し、３万個／ｃｍ２の細胞密度で培養ディッシュに播いた。４時間後に培地を除去して新しいＷＥ培地（５％ＦＣＳを含む）４８０μＬに置換し、培養を継続した。さらに２０時間後に野生型ｄＨＧＦ及び糖鎖欠損型ｄＨＧＦを含むサンプル溶液を２０μＬ添加し、培養を継続した。野生型ｄＨＧＦ及び糖鎖欠損型ｄＨＧＦを添加してから２０時間の後、［３Ｈ］チミジン（２５Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を２．５μＣｉ／ｍＬとなるように添加し、さらに培養を６時間継続した。その後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、１０％トリクロロ酢酸を添加して４℃で２０分間静置した。さらに、新しい１０％トリクロロ酢酸に置換して１０分間静置し、次にＨ２Ｏ１ｍＬで洗浄した。これに０．５Ｎ−ＮａＯＨを加えて３７℃で３０分間インキュベートし、細胞を溶解させた。細胞溶解液に１Ｎ−ＨＣｌを加えて中和した。これをセルハーベスターにかけ、細胞溶解物をガラスフィルターに捕集した。フィルターを乾燥させた後、フィルター上に固形シンチレーター（ＭｅｌｔｉＬｅｘ）をのせてホットプレート上で加温し、シンチレーターをフィルター中に溶け込ませた後、β−カウンターによって放射活性を測定した（図２）。放射活性の値は、細胞に取り込まれた［３Ｈ］チミジンの量を表しており、これは細胞増殖に伴うＤＮＡ合成の量を反映している。すなわち、放射活性の値は、細胞増殖活性を反映している。
糖鎖欠損型ｄＨＧＦ（ＣＯＳ−ｄＨＧＦ−ＮＧ）は、野生型ｄＨＧＦ（ＣＯＳ−ｄＨＧＦ−ＷＴ及びＣＨＯ−ｄＨＧＦ−ＷＴ）と同等の肝細胞増殖活性を示した。α鎖の糖鎖を欠損するＣＯＳ−ｄＨＧＦ−αＮＧ及びβ鎖の糖鎖を欠損するＣＯＳ−ｄＨＧＦ−βＮＧも同等の活性を示した。
【実施例３】
【００４３】
ＭＤＣＫ−３Ｂ細胞をＤＭＥＭ（１０％ＦＣＳを含む）に懸濁して２４ｗｅｌｌプレートに１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ（４８０μＬ／ｗｅｌｌ）で播き、ここに野生型ｄＨＧＦ及び糖鎖欠損型ｄＨＧＦを含む被検サンプル２０μＬを添加した。３７℃で２０時間培養した後、ｓｃａｔｔｅｒの有無を顕微鏡で観察した（図３）。
糖鎖欠損型ｄＨＧＦ（ＣＯＳ−ｄＨＧＦ−ＮＧ）は、野生型ｄＨＧＦ（ＣＯＳ−ｄＨＧＦ−ＷＴ及びＣＨＯ−ｄＨＧＦ−ＷＴ）と同等の細胞遊走活性を示した。α鎖の糖鎖を欠損するＣＯＳ−ｄＨＧＦ−αＮＧ及びβ鎖の糖鎖を欠損するＣＯＳ−ｄＨＧＦ−βＮＧも同等の活性を示した。
【実施例４】
【００４４】
ＤＭＥＭ（１０％ＦＣＳを含む）に溶解したコラーゲン溶液（Ｃｅｌｌｍａｔｒｉｘ  Ｉ−Ａ、新田ゼラチン）にＭＤＣＫ−３Ｂ細胞を懸濁して５０００ｃｅｌｌｓ／ｍＬの溶液とし、２４ｗｅｌｌプレートに５００μＬずつ分注した（２５００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）。３７℃で１０分間インキュベートしてコラーゲンをゲル化した後、ＤＭＥＭ（１０％ＦＣＳを含む）を４８０μＬ上層し、ここに野生型ｄＨＧＦ及び糖鎖欠損型ｄＨＧＦを含む被検サンプル２０μＬを添加した。３７℃で６日間培養した後、チューブ形成の状態を顕微鏡で観察した（図４）。
糖鎖欠損型ｄＨＧＦ（ＣＯＳ−ｄＨＧＦ−ＮＧ）は、野生型ｄＨＧＦ（ＣＯＳ−ｄＨＧＦ−ＷＴ及びＣＨＯ−ｄＨＧＦ−ＷＴ）と同等の形態形成活性を示した。α鎖の糖鎖を欠損するＣＯＳ−ｄＨＧＦ−αＮＧ及びβ鎖の糖鎖を欠損するＣＯＳ−ｄＨＧＦ−βＮＧも同等の活性を示した。
【実施例５】
【００４５】
野生型ｄＨＧＦ及び糖鎖欠損型ｄＨＧＦサンプルを５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０、０．３Ｍ  ＮａＣｌで希釈して５０μｇ／ｍＬの濃度に調製し、密封した容器に入れて３７℃で７日間インキュベートした。経日的に一部をサンプリングして、−８０℃に保存した。サンプリングした溶液中の野生型ｄＨＧＦ及び糖鎖欠損型ｄＨＧＦの残存活性を、実施例２と同様にしてラット肝実質細胞におけるＤＮＡ合成を調べることによって評価した。活性測定にあたっては、サンプリングした溶液をＰＢＳ、０．５％ＢＳＡで１２５ｎｇ／ｍＬに希釈した後、その２０μＬを肝細胞の培養液４８０μＬに添加してｆｉｎａｌ  ５ｎｇ／ｍＬとした。
糖鎖欠損型ｄＨＧＦ（ＣＯＳ−ｄＨＧＦ−ＮＧ）は、野生型ｄＨＧＦ（ＣＯＳ−ｄＨＧＦ−ＷＴ及びＣＨＯ−ｄＨＧＦ−ＷＴ）と同等の温度安定性を示した（図５）。α鎖の糖鎖を欠損するＣＯＳ−ｄＨＧＦ−αＮＧ及びβ鎖の糖鎖を欠損するＣＯＳ−ｄＨＧＦ−βＮＧも同等の安定性を示した。
【実施例６】
【００４６】
８０μＬの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０、０．３Ｍ  ＮａＣｌにＮａ１２５Ｉを５０μＣｉ添加し、これにＩＯＤＯ−ＢＥＡＤＳ（ＰＩＥＲＣＥ）を１粒添加して、室温で５分間インキュベートした。ここに５μｇの野生型ｄＨＧＦ及び糖鎖欠損型ｄＨＧＦを含む２０μＬの溶液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０、０．３Ｍ  ＮａＣｌ）を添加し、室温で５分間インキュベートすることによってヨード化反応を行った。チューブから反応液を抜き出すことによってヨード化反応を停止させ、抜き出した反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）カラムによるゲル濾過に供することによって未反応のＮａ１２５Ｉを除去し、１２５Ｉ−ｄＨＧＦを精製した。
５００，０００ｃｐｍの１２５Ｉ−ｄＨＧＦを、０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳで希釈して１００μＬの溶液とした。これをＩＣＲマウス（８週齢、雄）に尾静脈から投与した。投与後、１分、５分、１５分、３０分、６０分、１２０分に血液を採取した。採取した血液から血漿を分離し、ガンマカウンターにて放射活性を測定し野生型ｄＨＧＦ及び糖鎖欠損型ｄＨＧＦの血中安定性を評価した（図６）。
糖鎖欠損型ｄＨＧＦ（ＣＯＳ−ｄＨＧＦ−ＮＧ）は、ＣＨＯ−ｄＨＧＦ−ＷＴに比べて、血中の安定性が向上していた。ＣＯＳ−ｄＨＧＦ−ＷＴはＣＯＳ−ｄＨＧＦ−ＮＧとＣＨＯ−ｄＨＧＦ−ＷＴの中間の安定性を示した。これは、実施例１に示したように、ＣＯＳ−ｄＨＧＦ−ＷＴが糖鎖を部分的に欠損しているためと考えられた。
【産業上の利用可能性】
【００４７】
本発明の糖鎖欠損型ＨＧＦは、糖鎖が付加したＨＧＦの代替ＨＧＦとして有用である。
【図５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【配列表】
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