(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも２つの機能的な異種の組み換えポリペプチドを有し、その少なくとも１つが担体結合形でＳ−レイヤー構造ポリペプチドとの融合物として存在し、ポリペプチドがそれぞれ異なる細胞区画に局在しており、かつ前記Ｓ−レイヤー構造ポリペプチドが、バシラス ステアロサーモフィルスＰＶ７２のｓｂｓＡ遺伝子又はｓｂｓＢ遺伝子によってコードされる宿主細胞。
【請求項２】
グラム陰性細菌細胞である、請求項１記載の細胞。
【請求項３】
区画を細胞質、細胞質膜の外側及び内側、ペリプラズム間隙及び外膜の外側及び内側から選択する、請求項１又は２記載の細胞。
【請求項４】
真核細胞である、請求項１記載の細胞。
【請求項５】
区画を細胞質、細胞質膜の外側及び内側及び細胞小器官から選択する、請求項１又は４記載の細胞。
【請求項６】
組み換えポリペプチドの幾つかが担体結合形で存在する、請求項１から５までのいずれか１項記載の細胞。
【請求項７】
担体に結合された別のポリペプチドが、Ｓ−レイヤー構造の形、膜に結合されたポリペプチドの形で、および／または組み換えファージ構造の構成要素として存在する、請求項１から６までのいずれか１項記載の細胞。
【請求項８】
組み換えポリペプチドを、酵素、サイトカイン、抗体に結合するタンパク質、ＤＮＡに結合するエピトープ、抗原、アレルゲン及び免疫原エピトープ及びストレプトアビジンから選択する、請求項１から７までのいずれか１項記載の宿主細胞。
【請求項９】
組み換えポリペプチドが酵素である、請求項１から８までのいずれか１項記載の細胞。
【請求項１０】
酵素が多段階の酵素反応を触媒する、請求項９記載の宿主細胞。
【請求項１１】
酵素が、ポリヒドロキシアルカノエートの合成を触媒する、請求項９又は１０記載の宿主細胞。
【請求項１２】
担体結合形の少なくとも２つの機能的な組み換えポリペプチドを有する、請求項１から１１までのいずれか１項記載のグラム陰性細菌から得られる組み換え細菌ゴースト。
【請求項１３】
請求項１から１１までのいずれか１項記載の宿主細胞の製造方法において、
（ａ）異種の組み換えポリペプチドをコードする少なくとも２つの核酸で形質転換された宿主細胞を調製し、その際、前記の核酸の少なくとも１つは、異種の組み換えポリペプチドの発現を担体結合形でＳ−レイヤー構造ポリペプチドとの融合物として可能にするためにＳ−レイヤー構造ポリペプチドをコードする配列とカップリングされており、前記ポリペプチドはそれぞれ宿主細胞の異なる細胞区画に局在しており、
（ｂ）核酸を発現させ、かつ該核酸によってコードされるポリペプチドを機能的な形で発生させるような条件下で宿主細胞を培養する
ことを特徴とする、宿主細胞の製造方法。
【請求項１４】
請求項１から１１までのいずれか１項記載の細胞又は請求項１２記載のゴーストの、ワクチン又はアジュバントとしての使用。
【請求項１５】
請求項１から１１までのいずれか１項記載の宿主細胞又は請求項１２記載のゴーストの、酵素リアクターとしての使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、少なくとも２つの機能的な組み換えポリペプチドを、有利にはそれぞれ異なる細胞区画、例えば細胞質ゾル、細胞質膜、ペリプラズム及び外膜中に含有し、その少なくとも１つは担体結合形で存在する宿主細胞並びにそれらの製造方法に関する。本発明による細胞は、幾つかの酵素の区画化（Kompartimentierung）が有利又は必要である酵素反応カスケードの実施のためのバイオリアクターとして特に適当である。
【０００２】
生きている細胞を“酵素リアクター”として生物学的物質、例えばポリヒドロキシ脂肪酸の製造のために使用することは、バイオテクノロジー工業のために高い意義がある。このために外来遺伝子を宿主細胞に導入し、発現させ、こうして組み換え酵素を有し、所望の生成物を合成できる宿主細胞が得られることは公知である。しかしながら公知の方法の欠点は、宿主細胞中に外来遺伝子の発現によって産生される酵素は安定でなく、殆ど活性でないか、または極めて少量が存在するに過ぎないことにあった。また１つの段階の基質又は生成物が別の段階で悪影響を及ぼすことがある多段階の反応を実施することにおいて特に困難を伴っていた。
【０００３】
本発明の課題は、従来の技術の問題を少なくとも部分的に排除し、かつ機能的な組み換えポリペプチドを安定に提示し、かつ特に多段階の酵素反応を実施できる宿主細胞を調製することである。
【０００４】
前記課題は少なくとも２つの機能的な組み換えポリペプチドを有し、その少なくとも１つが担体結合形で存在する宿主細胞の調製によって解決される。
【０００５】
意想外にも細胞、例えばグラム陰性細菌細胞又は真核細胞の、有利には種々の区画において異種ポリペプチドの担体結合された組み換え発現は、異種のポリペプチドを機能的（すなわち免疫学的又は／及び生物学的に、例えば酵素学的に活性な）な形において安定に提示させると認められた。宿主細胞がグラム陰性細菌細胞である場合、細胞区画は、有利には細胞質ゾル、細胞質膜（外側及び内側）、ペリプラズム間隙及び外膜（外側及び内側）から選択できる。宿主細胞が真核細胞である場合、細胞区画は、有利には細胞質ゾル、細胞質膜（外側及び内側）及び細胞小器官、例えばゴルジ、リソソーム、ミトコンドリア、葉緑体、液胞又は小胞体から選択できる。
【０００６】
宿主細胞中に存在する機能的組み換えタンパク質は、有利には協同的である、すなわち、これらのタンパク質は、例えば多段階反応カスケードで酵素として共通の免疫学的機能および／または生物学的機能を果たす。
【０００７】
機能的組み換えポリペプチドの少なくとも１つ、有利には幾つかは、担体結合形で、例えば融合ポリペプチドの形で存在し、かつ少なくとも１つの機能的ドメイン及び少なくとも１つの担体ドメインを有する。担体に結合されたポリペプチドの有利な形は、Ｓ−レイヤー構造（Ｓ−レイヤー担体ドメインとの融合ポリペプチド）、膜に結合されたポリペプチド（膜に組み入れられる担体ドメインとの融合ポリペプチド）および／または組み換えファージ構造の構成要素である。細胞質ゾルから細胞の別の区画への機能的ポリペプチドの移出が望ましい場合、発現はそれぞれ望ましい細胞区画への移出を可能にする適当なターゲティングドメインと一緒に実施する。ターゲティングドメインのための例は、膜を通過して浸出を可能にするシグナルペプチド配列および／またはヘルパー配列である。
【０００８】
本発明の有利な態様においては、担体結合ポリペプチドの少なくとも１つは、組み換えＳ−レイヤー構造として存在している。Ｓ−レイヤーは結晶性の細菌細胞表面タンパク質であり、これらは同一の自己組織性の単位から構成されている。微生物からの種々のＳ−レイヤー遺伝子のための遺伝的データ及び配列情報は、例えばペイレット他（Peyret et al）（Mol. Microbiol. 9(1993), 97-109）で挙げられている。これらのデータは明らかに参照されたものとする。
【０００９】
有利なＳ−レイヤー遺伝子は、Ｂ．ステアロサーモフィルスＰＶ７２のｓｂｓＡ遺伝子及びｓｂｓＢ遺伝子である。これらの遺伝子の配列は、例えば国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ９７／００４３２号に挙げられている。そこには、グラム陰性宿主細胞の細胞質での組み換えＳ−レイヤー−融合タンパク質の製造も開示している。国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ９８／０４７２３号は、他方でグラム陰性細菌細胞又は真核細胞の種々の区画における組み換えＳ−レイヤータンパク質の製造を記載している。組み換えＳ−レイヤー遺伝子の構築並びに適当な発現構築物の作成に関しては、前記の２つの国際出願に明確に指示されている。しかしながら、そこには２つの異なる機能的組み換えポリペプチドの同時発現への示唆は見られない。
【００１０】
意想外にも、幾つかの組み換えＳ−レイヤータンパク質を、場合により他の異種タンパク質と組合せて、特にグラム陰性細菌細胞及び真核細胞の宿主細胞の、例えば種々の区画において同時におよび／または連続的に同時発現できることが確認された。
【００１１】
成熟ＳｂｓＡタンパク質をコードする遺伝子のヌクレオチド配列は位置９１〜３６８４によって配列番号１中に挙げられる。属するアミノ酸配列は配列番号２に表されている。成熟ＳｂｓＢタンパク質をコードする遺伝子のヌクレオチド配列は配列番号３中に位置９４〜２７６３によって挙げられる。属するアミノ酸配列は配列番号４に表されている。
【００１２】
第１の有利な態様（ｓｂｓＡ）において、機能的ポリペプチドの担体ドメインをコードする核酸は、
（ｉ）配列番号１中の位置９１〜３６８４によって示されるヌクレオチド配列を有する核酸、
（ｉｉ）（ｉ）からの核酸の１つに遺伝コードの縮重の範囲内で相応するヌクレオチド配列を有する核酸、及び
（ｉｉｉ）（ｉ）および／または（ｉｉ）からの核酸とストリンジェントな条件下にハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する核酸
から選択される。
【００１３】
第２の有利な態様（ｓｂｓＢ）において、機能的ポリペプチドの担体ドメインをコードする核酸は、
（ｉ）配列番号３中の位置９４〜２７６３によって示されるヌクレオチド配列を有する核酸、
（ｉｉ）（ｉ）からの核酸の１つが遺伝コードの縮重の範囲内で相応するヌクレオチド配列を有する核酸、及び
（ｉｉｉ）（ｉ）および／または（ｉｉ）からの核酸とストリンジェントな条件下にハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する核酸
から選択される。
【００１４】
本発明の意味における概念“ストリンジェントなハイブリダイゼーション”とは、水性の低塩バッファー（例えば０．２×ＳＳＣ）中で５５℃、有利には６０℃での洗浄後にもなおもハイブリダイゼーションが惹起されることと解されるべきである（Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning. A Laboratory Manualも参照のこと）。
【００１５】
ｓｂｓＡ遺伝子中のペプチド又はポリペプチドをコードする配列のための挿入部位としては、有利には配列番号１に示されるヌクレオチド配列の位置２００〜３６００の間の領域である。特に有利な挿入部位は、位置５８５のＮｒｕＩ切断部位、位置８８１のＰｖｕＩＩ切断部位、位置９２０のＳｎａＢ−Ｉ切断部位、位置２５０７のＰｖｕＩＩ切断部位及び位置２６５２のＰｖｕＩＩ切断部位である（ＰＣＴ／ＥＰ９７／００４３２号）。更に有利な挿入部位は、位置５６２、位置１０８７、位置１８１３、位置１９４７、位置２２９５、位置２６５２、位置３０４６、位置３４８４及び位置３５９４である。それぞれの挙げられる位置は第１の挿入のヌクレオチドに関連する。
【００１６】
ｓｂｓＢ遺伝子中の挿入部位として、有利には配列番号３で示されるヌクレオチド配列の位置２００〜２６００の間の領域である。特に有利な挿入部位は、位置４１０（コドン１３６）、位置４８４（コドン１６１／１６２）及び位置１５８３（コドン５２８／５２９）である（ＰＣＴ／ＥＰ９７／００４３２号）。更に有利な挿入部位は、位置５９８、位置１０１２、位置１４３５、位置１８０８及び位置２３０１であり、その際、それぞれ挙げられる位置は第１の挿入のヌクレオチドに関連している。
【００１７】
択一的又は付加的に、担体結合ポリペプチドは別の形においても、例えば組み換えファージ構造、例えばφＸ１７４又はφＣＨ１の構成要素として製造することができる。
【００１８】
なお、担体に結合されるポリペプチドの製造の他の可能性は、膜に組み入れられるドメインとの融合ポリペプチドとしての合成であるので、それぞれ所望の場所（それぞれの選択された膜の外側もしくは内側）に機能的ポリペプチドは局在している。
【００１９】
原核性のグラム陰性宿主細胞の外膜中に組み入れる場合には、ナイセリア（Neisseria）又はヘモフィルス（Haemophilus）からのＩｇＡプロテアーゼのＣ−末端ドメインを担体配列として使用する（Klauser et al., J. Mol. Bio. 234 (1993), 579-593）。更に適当な担体ドメイン配列は、ＯｍｐＡ配列又はＬａｍＢ配列もしくはそれらの一部（...）である。
【００２０】
グラム陰性の原核性の宿主細胞の細胞質膜中に組み入れる場合、有利にはα−ヘリックス構造を有する、疎水性の溶解作用を有さない膜に組み入れられるタンパク質ドメインを使用する。かかる膜に組み入れられるタンパク質ドメインをコードするＤＮＡ配列の例は、欧州特許０５１６６５５号に記載されている。
【００２１】
グラム陰性の原核性細胞のペリプラズム中に分泌させる場合、例えばｍａｌＥシグナルペプチド配列を使用することができる。ペリプラズムに分泌をもたらす別の配列は、例えばブロンデル及びベドウエル（Blondel und Bedouelle）（Eur. J. Biochem 193(1990), 325-330）、アジプコンクイ他（AdipConquy et al）（Protein Eng. 8 (1995), 859-863）、ウェラー他（Weller et al）（Eur. J. Biochem. 236 (1996), 34-39）並びにドゥブロイル他（Dubreuil et al）（FEMS Immunol. Med. Microbiol. 13 (1996), 317-323）に記載されている。
【００２２】
真核細胞における細胞質膜又は細胞器官中での発現のために、シグナルペプチドとして葉緑体における輸送のためのプラストシアニンのＮ−末端トランジットペプチド（Weisbeek et al., J. Cell. Sci. Suppl. 11(1989), 199-223）、ミトコンドリアにおける輸送のためのミトコンドリアルシグナルペプチド（Skerjanc, Biochem. Cell. Biol. 68(1990), 9-16）、液胞における輸送のためのターゲティング配列（Vitale und Chrispeels, Bioessays 14(1992), 151-160）、細胞膜、サイトプラズマ及びゴルジ装置のためのターゲティング配列（Stanley, Mol. Membr. Biol. 13(1996), 19-27）、小胞体のためのリテンションシグナル（Retentionssignal）（Lencer et al., J.Cell. Biol. 131(1995), 951-962）及びゴルジ装置又は原形質膜のための輸送配列（Rambourg et al., Anat. Res. 245(1996), 447-458）が知られている。
【００２３】
シグナルペプチドをコードする断片の他に、外来ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、他のタンパク質ドメインをコードする１つ以上の他の断片を有している。かかる断片は、有利にはシグナルペプチドをコードする断片及び外来ペプチドをコードする断片の間に配置されている。有利には、該断片はグラム陰性細菌又は真核生物由来の分泌ポリペプチド又はその一部をコードしている。かかる核酸断片のための有利な例は、マルトース結合タンパク質をコードするｍａｌＥ遺伝子である。
【００２４】
外来ポリペプチドは、有利にはＤＮＡに結合するエピトープ、抗原、アレルゲン又は免疫原エピトープ、金属に結合するエピトープ、ストレプトアビジン、酵素、サイトカイン又は抗体に結合するタンパク質から選択される。
【００２５】
有利な例はストレプトアビジンであり、これは例えば外膜に組み入れた後に、ビオチン化試薬のカップリングのために適当である。
【００２６】
他の有利な例は抗原、アレルゲン又は免疫原エピトープ、例えば病原性微生物、例えば細菌、菌類、寄生虫など及びウイルスからのエピトープ、又は植物からのエピトープまたは個体固有の物質、例えばサイトカイン並びにトキシン、特にエンドトキシンに対するエピトープである。免疫原エピトープのための特に有利な例は、ウイルス、例えばヘルペスウイルス、例えばヘルペスウイルス１からのエピトープ、例えば糖タンパク質Δ、ヘルペスウイルス６又は仮性狂犬病ウイルスからのエピトープ（Lomniczi et al., J. Virol. 49(1984),970-979）、特に遺伝子ｇＢ、ｇＣおよび／またはｇＤからのエピトープ、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）からのエピトープ、特にＶＰ１、ＶＰ２および／またはＶＰ３をコードする遺伝子断片からのエピトープ、フラビウイルスからのエピトープ又はフィロウイルス、例えばエボラウイルス、マールブルクウイルス又はラッサウイルスからのエピトープである。免疫原エピトープは、抗体に媒介される免疫反応の発生を促進し、又は／かつ、例えばＴ−細胞の刺激による細胞性免疫反応の発生を促進するように選択される。適当なアレルゲンエピトープのための例は、シラカバ花粉アレルゲン、例えばＢｅｔｖＩ（Ebner et al., J. Immunol. 150(1993) 1047-1054）。更に特に有利には、血清又は他の体液から個体特有の物質又は異種個体の物質、例えばサイトカイン又はトキシンを結合し、中から選別することができる抗原エピトープである。そのようなエピトープはサイトカイン受容体又はトキシン受容体の構成要素又はサイトカイン又はトキシンに対する抗体の構成要素を含んでいてよい。
【００２７】
グリコシル化部位を有する免疫原および／または抗原のエピトープを有する改変された外来ポリペプチド、例えばＳ−レイヤータンパク質は、有利には真核性の宿主細胞中で製造され、ここでグルコシル化することができる。その際、天然のＳ−レイヤー配列をグリコシル化することもできる。Ｓ−レイヤー遺伝子ｓｂｓＡ中の潜在的なＮ−グリコシル化部位のための例は、アミノ酸位置２６、位置２８５、位置３４３、位置３８４、位置３８７、位置３８８、位置４１８、位置４２１、位置４８３、位置６５３、位置６７５、位置９０２、位置９２４、位置１０４８、位置１０５８、位置１１１８、位置１１５４、位置１１６１である。ｓｂｓＢ遺伝子において、潜在的なＮ−グリコシル化は位置１５５、位置１８４、位置２１３、位置３０２、位置３０３、位置４００、位置４６３、位置６０６、位置７５５、位置９１５で行われてよい。ｓｂｓＡ遺伝子の他の可能な改変は、アミド化、カゼインキナーゼＩＩによるリン酸化、プロテインキナーゼＣによるＮ−ミリストイル化及びリン酸化を含む。ｓｂｓＢ遺伝子の他の可能な改変は、ｃＡＭＰ依存性及びｃＧＭＰ依存性のプロテインキナーゼによるリン酸化、カゼインキナーゼＩＩによるリン酸化、プロテインキナーゼＣによるＮ−ミリストイル化、リン酸化並びにフィブロネクチン受容体への（配列ＲＧＤを介して）付加を含む。
【００２８】
同様に、有利には外来ポリペプチドとして、サイトカイン、例えばインターロイキン、インターフェロン又は腫瘍壊死因子が有利である。これらの分子は、例えば免疫原エピトープと組み合わせてワクチンの製造のために使用することもできる。更に、抗体に結合するタンパク質は、有利には例えばプロテインＡ又はプロテインＧであり、又はＤＮＡおよび／または金属に結合するエピトープに関しては、ロイシンジッパー、亜鉛フィンガーなどである。
【００２９】
組み換えポリペプチド酵素、特に多段階の酵素反応を触媒する酵素である。特定の例は、ポリヒドロキシアルカノエートの合成のための酵素、例えばポリヒドロキシ酪酸シンターゼ（Lubitz und Resch, DE4417169A1; Slater, S.C., Voige W. H., Dennis, A. E. J. Bacteriol. (1988), 170:4431）である。
【００３０】
本発明の他の対象は、少なくとも２つの機能的な組み換えポリペプチドを担体結合形で有する本発明によるグラム陰性の宿主細胞から得られる組み換え細菌ゴーストである。
【００３１】
適当な“細菌ゴースト”の製造は、例えば国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ９１／００９６７号に記載されており、該方法はこれをもって引用されたものとする。そこには、改変された細菌が開示されており、該細菌は、グラム陰性細菌を溶解作用を有するバクテリオファージ由来の膜タンパク質の遺伝子で、溶解作用を有するトキシン遊離タンパク質の遺伝子で、又は溶解性タンパク質をコードするそれらの一部の配列を有する遺伝子で形質転換し、細菌を培養し、該溶解遺伝子を発現させ、かつ得られた細菌ゴーストを培養培地から単離することによって得られる。
【００３２】
これらの細菌の膜上に、例えば欧州特許０５１６６５５号に記載されるように組み換えタンパク質は結合しており、該タンパク質は組み換えＤＮＡをグラム陰性細菌中で発現させることによって得られる。該組み換えＤＮＡは、疎水性で、溶解作用を有さず、α−ヘリックス構造を有し、かつＮ−末端及びＣ−末端に以前から２〜３０個の任意のアミノ酸がフランキングしていてよい１４〜２０個のアミノ酸からなる膜に組み入れられるタンパク質ドメインをコードする第１のＤＮＡ配列を含む。第１のＤＮＡ配列と、所望の組み換えタンパク質をコードするＤＮＡ配列とは、機能的な結合にある。更にグラム陰性細菌は、第１及び第２のＤＮＡ配列とは別のコントロール下にあり、かつバクテリオファージ由来の溶解作用を有する膜タンパク質又は溶解作用を有するトキシン遊離タンパク質又はそれらの溶解作用部分をコードする第３のＤＮＡ配列を有する。そのような組み換えグラム陰性細菌の発現及び溶解によって、いわゆる“細菌ゴースト”が得られ、これらは表面に結合した免疫原エピトープを有するインタクトな表面構造を有する。
【００３３】
本発明による宿主細胞の製造は、有利には
（ａ）組み換えポリペプチドをコードする少なくとも２つの核酸で形質転換された宿主細胞を調製し、その際、その核酸の少なくとも１つを、組み換えポリペプチドを担体結合形で発現を可能にするために担体ドメインをコードする配列とカップリングさせており、
（ｂ）核酸を発現させ、かつそれにコードされるポリペプチドを機能的な形で発生させるような条件下に培養する
方法によって実施する。
【００３４】
有利には、組み換えポリペプチドをコードする核酸は更に、組み換えポリペプチドをそれぞれ宿主細胞の種々の区画に局在させる配列と機能的にカップリングさせる。
【００３５】
組み換えタンパク質を、担体結合形で改変されたＳ−レイヤーとして発現させる場合、更に改変されていないＳ−レイヤータンパク質をコードする遺伝子を細胞中で発現させてもよい。この場合、改変されたＳ−レイヤータンパク質は、改変されていないＳ−レイヤータンパク質とコンパチブルなＳ−レイヤー構造を形成する。本発明による方法の前記の態様のための例は、４つのＳ−レイヤー遺伝子で形質転換されているＥ．ｃｏｌｉ細胞である。これらに関しては、２つの天然のｓｂｓＡ又はｓｂｓＢ遺伝子であり、かつ他方で両者とも組み換えのｓｂｓＡ遺伝子又はｓｂｓＢ遺伝子である。
【００３６】
組み換えポリペプチドをコードする核酸は、有利には核酸の少なくとも１つのコピーを有する組み換えベクター上に存在する。ベクターとしては、慣用の原核性又は真核性の染色体又は染色体外ベクターを使用してよい。かかるベクターの例は、前記のようなＳａｍｂｒｏｏｋ他に記載されている。これらのベクターは組み換えポリペプチドをコードする核酸を、それぞれの宿主細胞に活性の発現制御配列と機能的にカップリングされて有する。特に有利には発現制御配列は、制御可能なプロモーターを含む。適当な原核性プロモーターの例は、ｔａｃ−プロモーター、ｌａｃ−プロモーター、ｔｒｐ−プロモーター又はλ−プロモーターである。適当な真核性プロモーターの例は、ＳＶ４０プロモーター、ＣＭＶプロモーター又はメタロチオネインプロモーターである。少なくとも２つの、異種ポリペプチドをコードする核酸の発現のために、特に有利には２つの異なる制御可能なプロモーター、例えば前記のような２種の異なる温度感受性のλ−プロモーターが使用される。
【００３７】
組み換え宿主細胞（生きている宿主細胞又はゴースト）は、多くの使用のために適当である。ワクチン又はアジュバントとしての使用が有利であり、その際、この場合、病原性および／または個体特有の免疫刺激性ポリペプチド、例えばサイトカインの免疫原エピトープを含む組み換えポリペプチドが使用される。
【００３８】
本発明による宿主細胞および／または細菌ゴーストを酵素リアクターとして使用することが特に有利である。
【００３９】
更に本発明を以下の実施例及び図面によって説明する。
【００４０】
配列番号１はＢ．ステアロサーモフィルスのＳ−レイヤー遺伝子ｓｂｓＡのコーディング断片の全体のヌクレオチド配列を示している。
【００４１】
配列番号２は配列番号１の配列に由来するアミノ酸配列を示している。
【００４２】
配列番号３はＢ．ステアロサーモフィルスのＳ−レイヤー遺伝子ｓｂｓＢのコーディング断片の全体のヌクレオチド配列を示している。
【００４３】
配列番号４は配列番号３の配列に由来するアミノ酸配列を示している。
【００４４】
図１はグラム陰性の細菌細胞の種々の区画における異種ポリペプチドの局在のための可能性に関する図を示している。
【００４５】
（ａ）グラム陰性細菌細胞は、細胞質（ｃｙ）、内膜（ｉｍ）、ペリプラズム（ｐｐ）及び外膜（ｏｍ）から構成されている。
【００４６】
（ｂ）異種ポリペプチドは、適当なターゲティング配列とのカップリングによってペリプラズム中に移出される（ｐｅ）。
【００４７】
（ｃ）内膜の内側に、異種ポリペプチドを留められる（ｍａｅ）。
【００４８】
（ｄ）ペリプラズム中に異種ポリペプチドを組み換えＳ−レイヤーの形で固定できる（ｓｉｅ）。
【００４９】
（ｅ）１つだけでなく、幾つかの種の組み換え異種ポリペプチドをＳ−レイヤーとしてペリプラズム中に固定できる。
【００５０】
図２は、種々の異種ポリペプチド（例えば酵素）を種々の区画に有する本発明による組み換え細菌細胞の図を示している。
【００５１】
実施例
１．細菌株、培地及びプラスミド
株バシラス ステアロサーモフィルスＰＶ７２のグラム陰性細菌を５８℃でＳＶＩＩＩ培地（Bartelmus und Perschak, Z.Zuckerind. 7(1957), 276-281）中で培養した。Ｅ．ｃｏｌｉ細菌をＬＢ培地中で培養した（前記のSambrook et al., (1989)）。形質転換体の選択のためにアンピシリンを最終濃度１００μｇ／ｍｌで培地に添加した。プラスミドｐＰＬｃＡＴ１０（λｐＬ、ｂｌａ，ｃｏｌＥ１）（Stanssens et al., Gene 36(1985), 211-223）をクローニングベクターとして使用した。
【００５２】
２．ＤＮＡ断片の操作
ＤＮＡの制限分析、アガロースゲル電気泳動及びＤＮＡ断片のクローニングを前記のＳａｍｂｒｏｏｋ他（１９８９）に記載される標準的方法で実施した。
【００５３】
コンピテント細胞の形質転換をＢｉｏ−Ｒａｄのジーンパルサー（Genepulser）（Bio-Rad Laboratories, Richmond, Kalif., USA）を使用して製造者のプロトコールに従ってエレクトロポレーションによって実施した。
【００５４】
プラスミドＤＮＡをビルンボイム及びドリー（Birnboim und Doly）の方法（Nucleic Acids Res. 7(1979), 1513-1523）に従って単離した。染色体ＤＮＡをアウスベル他（Ausubel et al）（Current Protocols in Molecular Biology(1987), New York, John Wiley）に記載の方法によって単離した。
【００５５】
制限エンドヌクレアーゼ及び他の酵素をベーリンガー マンハイム（New Englend Biolabs）又はストラタジーン（Stratagene）から入手し、製造者の指示に従って使用した。
【００５６】
３．ＤＮＡ−配列決定
ＤＮＡ分子の配列分析をサンガー他（Sanger et al）のジデオキシチェーンターミネーション法に従って実施した。ｓｂｓＡ遺伝子の配列決定のために使用されるプライマーを既に公表されているｓｂｓＡ配列（Kuen et al., Gene 145(1994), 115-120）をベースとして構築した。
【００５７】
４．ｓｂｓＡのＰＣＲ増幅
ｓｂｓＡ遺伝子のＰＣＲ増幅をＰＣＴ／ＥＰ９８／０４７２３号の例４に従って実施した。
【００５８】
ＰＣＲ増幅産物を０．８％のアガロースゲル上でゲル電気泳動によって分離し、かつジーンクリーン（Gene Clean）のシステム（BIO101 La Jolla, Kalif., USA）を使用してクローニングのために精製した。
【００５９】
５．ｓｂｓＡ遺伝子のクローニング
５．１  細胞質の発現ベクター
ＰＣＲによって得られた３．７９ｋｂ長を有するｓｂｓＡ遺伝子を精製し、制限エンドヌクレアーゼＸｂａＩ及びＢａｍＨＩを使用して分解した。得られたＸｂａＩ−ＢａｍＨＩ断片をベクターｐＰＬｃＡＴ１０の相応の制限部位に、ｓｂｓＡ遺伝子が下流に位置するｐＬプロモーターの転写制御下にあるようにクローニングした。ｓｂｓＡ配列のＡＴＧ開始コドンを前記のクローニング手順によって再現した。クローニングされたｓｂｓＡ配列はｓｂｓＡのＮ−末端シグナル配列を有し、かつ転写ターミネーターの２０ｎｔ後で終わっている。得られるベクターをｐＢＫ４と呼称する。
【００６０】
５．２  ペリプラズムの発現ベクター
ｓｂｓＡ遺伝子を市販のプラスミドｐＭＡＬ−Ｐ２（New England Biolabs）のポリリンカー中にシグナル配列を有さず、かつ３′−末端に終止コドンを有するようにクローニングした。得られたプラスミドｐＭＡＬ−Ａはｔａｃ−プロモーターのコントロール下に、シグナル配列を含むｍａｌＥ遺伝子並びにシグナル配列を有さないｓｂｓＡ遺伝子を含む融合遺伝子を有する。両者のドメインの間に、Ｘａ因子開裂部位が配置されている。
【００６１】
６．Ｅ．ｃｏｌｉのサイトプラズマ及びペリプラズム中でのｓｂｓＡ遺伝子の組み換え同時発現
ｐＢＫ４及びｐＭＡＬ−Ａで同時形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１２細胞を２８℃で光学密度ＯＤ６００が０．３に達するまで培養した。次いでｓｂｓＡのサイトプラズマの発現を２８℃の培養温度を４２℃に高めることによって誘導した。ｓｂｓＡのペリプラズマの発現を１ｍＭのｌａｃ−インデューサーのＩＰＴＧを添加することによって誘導した。１．５ｍｌのアリコートをｓｂｓＡ発現の誘導の前もしくはその１、２、３及び５時間後に採取した。コントロールとしてＥ．ｃｏｌｉ ｐｏｐ２１３５／ｐＰＬｃＡＴ１０（同一の条件下に培養した）及びＢ．ステアロサーモフィルスＰＶ７２を使用した。
【００６２】
全ての試料からの培養上清及び細胞抽出物をＳ−レイヤータンパク質の発現に関してＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタン−イムノブロッティングによって調査した。
【００６３】
ウェスタンブロットのためにタンパク質をニトロセルロースメンブレン上にトランスファーし、ウサギからのＳｂｓＡに対するポリクローナル抗血清と一緒にインキュベートした。抗血清の製造方法は、エゲルゼール他（Egelseer et al）(J. Bacteriol. 177(1995), 1444-1451）に記載されている。結合したＳｂｓＡ特異抗体の検出のために、ヤギ抗ウサギＩｇＧ及びアルカリ性ホスファターゼからなる複合体を使用した。
【００６４】
同時形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ細胞からの細胞質の抽出において、野生型のＳｂｓＡタンパク質とほぼ同一の分子量を有する更なる強いタンパク質バンドが見られた。
【００６５】
ｐＭＡＬ−Ａで形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α細胞（前記のHanahan(1983)）の粗抽出物の分析は、約１７０ｋＤａの分子量を有するＭａｌＥ−ＳｂｓＡ融合ポリペプチドの発現を冷間浸透ショック法（Neu und Heppel, J. Biol. Chem. 240(1965); 3685-3692）によって発生した細胞抽出物のペリプラズムフラクション中で示す。
【００６６】
７．細胞質及びペリプラズマ中でのＳｂｓＢタンパク質の同時発現
ｓｂｓＢ遺伝子を、例５及び例６に記載のようにプラスミドｐＭＡＬ−Ｐ２及びｐＰＬｃＡＴ１０にクローニングした。そうしてプラスミドｐＭＡＬ−Ｂ及びｐＢＫ６が得られた。
【００６７】
プラスミドｐＭＡＬ−Ｂ及びｐＢＫ６で形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ細胞においてＳｂｓＢタンパク質の存在が細胞質及びペリプラズム中で検出された。
【００６８】
８．Ｅ．ｃｏｌｉの細胞質膜中に固定化されたＰＨＢの合成
ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）は細菌の貯蔵物質であり、これらは天然の生産者においてリン、硫黄又は酸素、十分に存在するＣ−源の制限のために形成される。これらは、ヒドロキシ脂肪酸のエステル化されたモノマーからなり、ヒドロキシル基の位置及び側鎖長に応じて異なる水不溶性ポリマーを形成する。最も重要なＰＨＡはポリ（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレート（Ｐ（３−ＨＢ））であり、これは（Ｒ）−３−ヒドロキシ酪酸からなる非分枝鎖状のホモポリマーＰ（３−ＨＢ）である。
【００６９】
グラム陰性の条件的化学合成無機栄養生物の水素細菌のラルストニア オイトロファ（Ralstonia eutropha）において、ＰＨＢ合成のためにはたらく遺伝子ｐｈｂＡ、ｐｈｂＢ及びｐｈｂＣは１つのオペロン（ｐｈｂＣＡＢ）中に組織されている（Schubert et al., J.Bacteriol(1988), 170:5837）。遺伝子のオープンリーディングフレーム並びに翻訳領域のヌクレオチド配列は公表されている（Steinbuechel, A. Polyhydroxy alcanoic acids, in: Biomaterials(1991), 123-213）。
【００７０】
ＰＨＢシンターゼの構造／機能関係の研究の範囲内において、種々の挿入突然変異体及び欠失突然変異体並びに融合タンパク質を作成し、かつ酵素活性における変化を測定した（Kalousek, S. Dissertation, Universitaet Wien(1993)）。融合タンパク質のために、Ｐ（３−ＨＢ）シンターゼ（５９０の内の５８８アミノ酸）及びファージＭＳ２の溶解タンパク質のＣ−末端配列からなる膜アンカーからなる遺伝子を有するプラスミドｐＰＨＢ−Ｌは前記の研究に由来する。固体培地＋１％のグルコース上で増殖した細胞はｐＰＨＢ−Ｌの発現においてＰ（３−ＨＢ）グラニュールを６０％（ｗ／ｗ）にまで蓄積する。
【００７１】
膜に留まったＰＨＢ−シンターゼは従って酵素的に完全に機能することができる。
【００７２】
９．細菌中のプラスミドからの（２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸）レダクターゼの組み換え発現並びに細菌のＳ−レイヤーにおけるそれ自体の固定
細菌株における組み換えプラスミドの発現によって、該細菌株はＤ−グルコースから単一の工程で（一回発酵）で直接２−ＫＬＧを製造する可能性を獲得するべきである。そのために、２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸（２，５−ＤＫＧ）を製造する株中で２−ＫＬＧへの還元のために必要な酵素（コリネバクテリウムｓｐ．ＡＴＴＣ．３１０９０からの２，５−ＤＫＧレダクターゼ）をクローニングした。
【００７３】
表面層（Surface-Layer）遺伝子（ｓｂｓＡ）をコードするベクターｐＳＬの使用によって、２，５−ＤＫＧレダクターゼの安定性は高まった。Ｓ−レイヤータンパク質（ＳｂｓＡ）はその際に２，５−ＤＫＧレダクターゼのための基質として役立った。２，５−ＤＫＧレダクターゼをｓｂｓＡ遺伝子内部の４つの異なる部位に挿入することによって、自己組織化生成物を形成可能な組み換えタンパク質が見いだされた。
【００７４】
このために、ｓｂｓＡ−２，５ｄｋｇレダクターゼ融合遺伝子を製造した。これらは、ｓｂｓＡ遺伝子の４つの異なる部位（位置５８１、８８１、９１６及び２６４９）に２，５−ｄｋｇ遺伝子を有する。宿主細胞としては、Ｅ．ｃｏｌｉｐｏｐ２１３５が使用された。正確なクローニングを、挿入遺伝子及び隣接領域の配列分析によって調査した。融合タンパク質の安定発現はＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロット分析によって示すことができた。Ｅ．ｃｏｌｉ中での効果的な発現の後に、該プラスミドをペクトバクテリウム シプリペディイ（Pectobacterium cypripedii）ＨａＰ０１に形質転換した。
【００７５】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロットによって、Ｐ．シプリペディイＨａＰ０１中でＳｂｓＡ−２，５−ＤＫＧレダクターゼ融合タンパク質の安定発現が検出された。
【００７６】
１０．Ｓ−レイヤーに固定化された他の酵素
ｓｂｓＡ遺伝子に、酵素ルシフェラーゼ（遺伝子ｌｕｘＡ及びｌｕｘＢ）及び緑色蛍光タンパク質（ｇｆｐ）を融合させ、こうして光もしくは蛍光を発生させた。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１はグラム陰性の細菌細胞の種々の区画における異種ポリペプチドの局在のための可能性に関する図を示している。
【図２】  図２は、種々の異種ポリペプチドを種々の区画に有する本発明による組み換え細菌細胞の図を示している。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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