(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記構造で示される単糖と結合してなるカリックスアレーンと、フラーレンとを含有してなる核酸の光切断用組成物。
【化１】
0004693355.tif 000005
【請求項２】
フラーレンがカリックスアレーンで包接されてなる請求項１記載の組成物。
【請求項３】
フラーレンとカリックスアレーンとのモル比（フラーレン／カリックスアレーン）が１／１〜１／２である請求項１又は２記載の組成物。
【請求項４】
下記構造で示される単糖と結合してなるカリックスアレーンと、フラーレンとを混合する工程を有する核酸の光切断用組成物の製造方法。
【化２】
0004693355.tif 000006
【請求項５】
（ａ）請求項１〜３いずれかに記載の組成物と標的核酸とを合わせる工程、並びに（ｂ）該組成物を可視光に曝露する工程を有する核酸の光切断方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フラーレンを含有してなる核酸の光切断用組成物、その製造方法、並びに該組成物を用いる核酸の光切断方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
フラーレンは可視光により励起可能であることから、その性質の利用が早くから注目されている。しかしながら、フラーレンの水溶化の難しさが大きな障壁となっている。
【０００３】
フラーレンの水溶化方法としてはこれまでに３つの方法が知られている。第１の方法は水溶性置換基をフラーレン表面に直接共有結合させることにより修飾する方法であり、最もよく研究されている（非特許文献１〜５参照）。第２の方法は水溶性高分子を用いてフラーレンを水溶化する方法である（非特許文献６、７参照）。そして、第３の方法はシクロデキストリン（ＣＤ）でフラーレンを包接し錯体を形成する方法である（非特許文献８、９参照）。
【０００４】
しかしながら、上記３つの方法にはそれぞれ欠点が存在する。第１の方法では、水溶性置換基の修飾率が高い場合、フラーレンの二重結合を切断してパイ電子系を崩すためフラーレンが本来持つ電子プールとしての機能の低下を招くことになり、一方、修飾率が低い場合、フラーレン部分での会合が生じてミセルを形成することになり、いずれの場合も光増感剤としての機能が低下する。さらに選択的な位置に置換基を導入することが難しい点も問題である。第２の方法では未修飾のフラーレンを使用するためフラーレンの修飾に伴う問題はないが、フラーレンの会合抑制は不充分である。第３の方法ではフラーレンを未修飾のままその会合をも抑制できるため前記２つの方法に比し有効な方法であるが、ＣＤの選択的化学修飾は非常に難しく、また、化学修飾すると、もはやフラーレンを水溶化できなくなることから、応用範囲が狭いという問題がある。
【非特許文献１】T. D. Ros and M. Prato, Chem. Commun., 663 (1999).
【非特許文献２】Y.-Z. An, C.-H. B. Chen, J. L. Anderson, D. S. Sigman, C. S. Foote and Y. Rubin, Tetrahedron, 52, 5179 (1996).
【非特許文献３】A. S. Boutorin, H. Tokuyama, M. Takasugi, H. Isobe, E. Nakamura and C. Helene, Angew. Chem., Int. Ed. Engl., 33, 2462 (1994).
【非特許文献４】E. Nakamura, H. Tokuyama, S. Yamago, T. Shiraki and Y. Sugiura, Bull. Chem. Soc. Jpn., 69, 2143 (1996).
【非特許文献５】H. Tokuyama, S. Yamago, E. Nakamura, T. Shiraki and Y. Sugiura, J. Am. Chem. Soc., 115, 7918 (1993).
【非特許文献６】Y. N. Yamakoshi, T. Yagami, S. Sueyoshi and N. Miyata, J. Org. Chem., 61, 7236 (1996).
【非特許文献７】Y. N. Yamakoshi, T. Yagami, K. Fukuhara, S. Sueyoshi and N. Miyata, J. Chem. Soc., Chem. Commun., 517 (1994).
【非特許文献８】T. Anderson, K. Nilsson, M. Sundahl, G. Westman and O. Wennerstrom, J. Chem. Soc., Chem. Commun., 604 (1992).
【非特許文献９】Y. N. Yamakoshi, T. Yagami, S. Sueyoshi and N. Miyata, J. Org. Chem., 61, 7236 (1996).
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、水溶化されたフラーレンを含有してなる、標的核酸指向性の核酸の光切断用組成物、その製造方法、並びに該組成物を用いる、効率的な核酸の光切断方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、前記課題を解決すべく鋭意検討した結果、所定の水溶性の標的核酸指向性の分子を結合してなるカリックスアレーン誘導体によりフラーレンとの包接体を形成させることにより、フラーレンを水溶化でき、また、前記分子の作用によりフラーレンを標的核酸に近接でき、さらに可視光を照射することによりフラーレンを活性化すると、フラーレンが直接又は他の物質を活性化することにより間接的に標的核酸を効率よく切断し得ることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、
〔１〕  下記構造で示される単糖と結合してなるカリックスアレーンと、フラーレンとを含有してなる核酸の光切断用組成物、
〔化１〕
0004693355.tif 000002
〔２〕  フラーレンがカリックスアレーンで包接されてなる前記〔１〕記載の組成物、
〔３〕  フラーレンとカリックスアレーンとのモル比（フラーレン／カリックスアレーン）が１／１〜１／２である前記〔１〕又は〔２〕記載の組成物、
〔４〕  下記構造で示される単糖と結合してなるカリックスアレーンと、フラーレンとを混合する工程を有する核酸の光切断用組成物の製造方法、
〔化２〕
0004693355.tif 000003
〔５〕  （ａ）前記〔１〕〜〔３〕いずれかに記載の組成物と標的核酸とを合わせる工程、並びに（ｂ）該組成物を可視光に曝露する工程を有する核酸の光切断方法、
に関する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、可視光を利用して効率的に標的核酸を切断することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本明細書において、「核酸」とはＤＮＡ及びＲＮＡを指し、主として一本鎖及び二本鎖のポリヌクレオチドをいう。「オリゴヌクレオチド」とは少数のヌクレオチドが重合してなるＤＮＡ及びＲＮＡを指し、核酸類似体からなるものをも含む意味で用いられる。
【００１０】
本発明の核酸の光切断用組成物は、非カチオン性であって水溶性の標的核酸指向性分子と結合してなるカリックスアレーンと、フラーレンとを含有してなるものである。該組成物中、フラーレンは、主として該カリックスアレーンで包接されてなるカリックスアレーン包接体の形で水溶化されており、核酸の光切断を行う光触媒として機能する。よって、本発明の組成物は水系における核酸の光切断に好適に用いられる。
【００１１】
本発明の組成物による切断対象たる標的核酸としては、特に限定されるものではない。標的核酸は、例えば、生物から単離されたもの、細胞内に存在するもの、又は合成物であってもよい。標的核酸としては、例えば、癌遺伝子として知られる、K-ras遺伝子（12番染色体）、neu遺伝子（17番染色体）、myc遺伝子（8番染色体）等の変異体、または、癌抑制遺伝子として知られるAPC遺伝子（5番染色体）、DCC遺伝子（18番染色体）、p53遺伝子（17番染色体）、HNPCC遺伝子（2番染色体）等の変異体が挙げられる。ここで、変異体とは、自然突然変異あるいは突然変異誘発処理によって、点変異、欠失、重複、逆位、挿入、転座などにより野生型とは異なる配列を持つDNAをいう。
【００１２】
本発明において使用されるカリックスアレーンとは、複数個のフェノール単位がメチレン基などで結合されてなる、全体として盃（杯）状の形状を有する環状オリゴマーであり、特に限定されるものではないが、例えば、以下の一般式（Ｉ）で表わされる化合物を挙げることができる。一般に、フェノール性水酸基のある側は下端部（Lower rim）、その反対側は上端部（Upper rim）と呼ばれる。このカリックスアレーンは、その上端部が環の大きさに応じて異なるサイズのパイ電子系から成る疎水性の空孔を呈するとともに、下端部のフェノール性水酸基を介していろいろな官能基を導入できるので、各種の機能を発揮する包接化合物として注目されている。
【００１３】
【化１】
0004693355.tif 000004
【００１４】
式（Ｉ）中、ｎ＋ｍは３〜８の整数である。Ｘ１及びＸ２は、それぞれ−ＣＨ２−、−ＣＨ２ＯＣＨ２−、−Ｓ−、又は−Ｓ（＝Ｏ）−を表し、Ｘ１及びＸ２は一般に同一であるが異なっていてもよい。
【００１５】
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ、非カチオン性の親水性官能基を有する置換基又は原子団を表し、同一でも異なっていてもよい。該置換基又は原子団はＯ原子との間にアルキレン（通常、炭素数1〜２０程度）、エステル、エーテル、アミドなどの原子団（例えば、後述のリンカー）を介して結合していてもよい。非カチオン性の親水性官能基を有する置換基又は原子団としては、標的核酸指向性分子として機能する、例えば、糖鎖、オリゴヌクレオチド、抗体、レクチン、生物学的レセプター結合性ペプチドなどが挙げられる。
【００１６】
Ｒ１’及びＲ２’は、それぞれ、水素原子、ハロゲン原子、又は低級アルキル基（一般に炭素数６以下）を表す。Ｒ１’及びＲ２’は、一般に同一であるが、異なっていてもよい。
【００１７】
カリックスアレーンを構成するフェノール単位の数としては、フラーレンの包接を効率的に行わせる観点から、好ましくは３〜８、より好ましくは３〜６である。
【００１８】
カリックスアレーンの合成方法は、特に限定されるものではなく、例えば、C. D. Gutsche, Acc. Chem. Res., 16, 161 (1983); B. Dhawan他, J. Org. Chem., 48, 1536 (1983),; A. Ikeda他, Chem. Commun., 1403 (1999)等を参照することにより合成することができる。また、市販のものが入手可能であれば、それを用いてもよい。
【００１９】
本発明の標的核酸指向性分子は非カチオン性、すなわち、中性又はアニオン性の分子であるが、それは、一般にカチオン性の分子は標的核酸だけでなく正常細胞に対する細胞毒性も高いという理由による。一般にアニオン性の分子は細胞膜を形成しているアニオン性のリン脂質膜への透過性が低いことから、標的核酸が細胞内に存在する場合にフラーレンを該核酸に充分に近接させようとする観点から、好ましくは中性の分子である。
【００２０】
また、本発明の標的核酸指向性分子は、標的核酸に対し直接又は間接的に親和性又は結合性を発揮し得る水溶性の分子である。ここで、「直接的に親和性又は結合性を発揮し得る分子」とは、そのものが標的核酸に対し直接的に親和性又は結合性を発揮し得る分子をいい、例えば、後述の糖鎖、オリゴヌクレオチド等が挙げられる。また、「間接的に親和性又は結合性を発揮し得る分子」とは、必ずしもそのものが標的核酸に対し親和性又は結合性を発揮し得る訳ではないが、標的核酸が存在する細胞環境等に応じて、標的核酸に対し間接的に親和性又は結合性を発揮し得る分子をいい、例えば、後述の抗体、レクチン等が挙げられる。「水溶性の分子」とは水に溶け得る分子をいい、例えば、２５℃で水中に、通常、1×10-6mol/l以上程度、好ましくは1×10-5 mol/l以上の溶解性を示す分子である。
【００２１】
本発明の組成物によれば、前記標的核酸指向性分子の働きにより、フラーレンを少なくとも標的核酸の近位に存在させることができ、従って、標的核酸の切断を非常に効率的に行うことができる。標的核酸に応じて指向性を適宜変えることであらゆる核酸への指向性をフラーレンに付与することができるが、このような指向性の付与は、従来のフラーレンの水溶化方法では実用的に不可能であった。
【００２２】
標的核酸指向性分子としては、特に限定されるものではないが、例えば、糖鎖、オリゴヌクレオチド、抗体、レクチン、生物学的レセプター結合性ペプチド等が挙げられ、中でも、糖鎖、オリゴヌクレオチド、抗体、レクチン、及び生物学的レセプター結合性ペプチドからなる群より選ばれる少なくとも１種が好ましい。
【００２３】
糖鎖としては、カリックスアレーンを水溶化でき、核酸との相互作用性を有するものであれば単糖、少糖、多糖の何れを用いてもかまわないが、中でもEPR効果（Enhanced Permeability and Retention Effect：腫瘍新生血管の透過性の亢進と腫瘍組織における滞留性による効果）も発現可能な分子量のより大きな少糖又は多糖が好ましい。具体的には、例えばグルコース、フルクトース、ガラクトースなどの単糖、単糖を組み合わせた、例えば、マルトース、スクロース、ラクトースを含む２糖〜８糖程度の少糖、シゾフィラン、カードラン、デキストリン、グリコーゲン、キチン、ペクチンなどの多糖が挙げられる。
【００２４】
単糖や少糖類とDNAとの相互作用については、例えば、O. Hayashida, A. Matsuo and Y. Aoyama, Chem. Lett.,272 (2001) に記載されている。一方、多糖であるシゾフィラン、カードランなどがDNAと相互作用することが、例えば、K. Sakurai and S. Shinkai, J. Am. Chem. Soc., 122, 4520 (2000) に記載されている。本発明においては、これらの文献に記載の単糖等も本発明の糖鎖として使用し得る。
【００２５】
オリゴヌクレオチドとしては、例えば、前記癌遺伝子等における任意の遺伝子配列（センス配列）に対するアンチセンス配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。当該オリゴヌクレオチドとしてはセンス配列にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドであれば特に限定されるものではない。
【００２６】
オリゴヌクレオチドはＤＮＡ型であってもＲＮＡ型であってもよいが、安定性がより高いことからＤＮＡ型であるのが好ましい。オリゴヌクレオチドとしてはヌクレオチドが、通常、２〜１００個程度、好ましくは５〜５０個重合してなるものが好ましい。
【００２７】
オリゴヌクオレチドの合成方法としては、特に限定されず、公知のオリゴヌクレオチド合成機を用いたホスホロアミダイト法、ホスホロチオエート法、ホスホトリエステル法等を用いることができる。
【００２８】
また、本発明のオリゴヌクレオチドの安定性や細胞に対する親和性を高めるために、その活性を著しく低下させない範囲で、リン酸エステル基又はリボース部分の水酸基を他の安定な基に置換した誘導体として用いることも可能である。このようなオリゴヌクレオチドの誘導体の具体例としては、リン酸エステル基をチオリン酸エステル基やメチルホスホネート基等で置換したもの、リボース部分の水酸基をメトキシ基やアリロキシ基等のアルコキシ基、アミノ基、又はフッ素原子等で置換したもの等が挙げられる。
【００２９】
本発明のオリゴヌクレオチドには核酸類似体からなるものも含まれるが、センス配列にハイブリダイズし得るものであれば特に限定されるものではない。核酸類似体としては、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）（例えば、P. E. Nielsen, Acc. Chem. Res., 32, 624 (1999) 参照）、オキシペプチド核酸（ＯＰＮＡ)（例えば、M. Kuwahara, M. Arimitsu, M. Shigeyasu, N. Saeki and M. Sisido, J. Am. Chem. Soc., 123, 4653 (2001) 参照）、ペプチドリボ核酸（ＰＲＮＡ）（例えば、T. Wada, N. Minamimoto, Y. Inaki and Y. Inoue, J. Am. Chem. Soc., 122, 6900 (2000) 参照）等が挙げられる。
【００３０】
抗体としては、例えば、前記癌遺伝子から発現され得るタンパク質の全部又は一部、細胞表面上の糖鎖の全部又は一部に対する抗体が挙げられる。抗原であるタンパク質又は糖鎖の全部又は一部に対し免疫学的に結合可能なものであれば抗体のフラグメントも本発明において使用することができる。抗体としては、例えば、中性アミノ酸輸送蛋白（LAT1）抗体、癌関連糖鎖抗原に対する抗体等を挙げることができる。抗体又はそのフラグメントは公知の方法に従って調製することができる（例えば、細胞の分子生物学（第３版）、B. Alberts, D. Bray, J. Lewis, M. Raff, K. Roberts, J. D. Watson著、中村圭子、藤山秋佐夫、松原謙一監訳、株式会社ニュートンプレス（東京）、１８７〜１８８ページ（1995）参照）。抗体はポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。
【００３１】
レクチンとは一般に、糖鎖を認識し各種細胞を凝集させたり、複合糖質と結合し、沈降するもので、免疫反応の産物以外のタンパク質と定義されるタンパク質である。例えば、癌細胞はしばしば細胞表面上の糖鎖の変化を伴うが、当該糖鎖に対するレクチンを用いれば、癌細胞内の標的核酸に対するフラーレンの作用性を高めることができる。レクチンとしては、例えば、二種類のシアル酸結合性レクチン（cSBLとjSBL）を挙げることができる。
【００３２】
生物学的レセプター結合性ペプチドとしては、例えば、標的核酸が含まれる癌細胞にのみ特異的に存在するレセプターに結合し得るペプチド等が挙げられる。かかるペプチドとしては、例えば、腫瘍抗原ペプチドに結合する結合性ペプチドに由来するペプチドが挙げられる。ペプチドは公知の方法に従って合成することができ、所定のレセプターに結合することができるものであれば、特に限定されるものではないが、通常、２〜１００個、好ましくは５〜５０個のアミノ酸からなるものが好ましい。レセプターとペプチドとの結合性については、例えば、表面プラズモン共鳴（SPR）法や水晶発振子マイクロバランス（QCM）法により評価することができる。
【００３３】
標的核酸指向性分子とカリックスアレーンとの結合は、例えば、以下のようにして行うことができる。
【００３４】
該結合の反応条件は標的核酸指向性分子とカリックスアレーンの反応点との反応性に依存するため反応温度や反応時間は特に限定されないが、一般に、標的核酸指向性分子はカリックスアレーンに対してモル比で好ましくは３〜２００倍、より好ましくは３〜１００倍必要であり、両者を溶解させ反応を行わせるための溶媒としては極性溶媒、例えば、水、アルコール、アセトン、アセトニトリル、非プロトン性極性溶媒（THF、DMF、DMSOなど）、これらの混合溶媒を用いることが望ましい。
【００３５】
標的核酸指向性分子とカリックスアレーンとは直接的に結合させてもよく、また、リンカーを挟んで間接的に結合させてもよい。当該リンカーとしては、特に限定されるものではないが、例えば、アルキレン（通常、炭素数１〜２０程度）、エステル、エーテル、アミドなどの原子団等が好適である。リンカーを介在させる場合は、例えば、-(CH2)ｓ-、-CH2COO(CH2)ｓ-1-、-(CH2CH2O)ｓ-、-CH2CONH(CH2)ｓ-1-のような原子団を介して標的核酸指向性分子とカリックスアレーンとを結合させればよい。ｓは好ましくは１〜２０、より好ましくは１〜１０である。
【００３６】
本発明において使用されるフラーレンとはＣ６０に代表されるサッカーボール状分子であり、そのユニークな構造及び物性に由来して、例えば、半導体材料、超伝導材料、光電変換材料等の機能を発揮することが知られている。フラーレンとしてはＣ６０の他、Ｃ７０や更に炭素数の多いフラーレンが知られており、それらを本発明において使用することも可能であるが、立体対称性の分子構造を有しカリックスアレーンで安定に包接され得、実用性にも優れることから、フラーレンとしてはＣ６０が好適に使用される。
【００３７】
フラーレンの合成方法は、特に限定されるものではなく、例えば、フラーレンの化学と物理、篠原久典・齋藤弥八著、名古屋大学出版会（名古屋）、ｐ２９〜３６(1997)等を参照して合成することができる。市販品があれば、それを用いてもよい。本発明の組成物の原料であるフラーレンとしては精製品を使用するのが好ましいが、例えば、フラーレン含有カーボンブラック（Ｃ６０含有量：１〜１５重量％程度）等の混合物を使用してもよい。
【００３８】
前記のような標的核酸指向性分子と結合してなるカリックスアレーンをフラーレンと水中で混合すると、フラーレンがカリックスアレーンで包接され、それによりフラーレンが水溶化する。
【００３９】
フラーレンとカリックスアレーンの錯体（包接体）形成の方法は、好ましくは１／1〜１／２の比で錯体が形成できれば特に限定されないが、以下のようにして作製されるものが好ましい。
【００４０】
即ち、合成したカリックスアレーン誘導体の水溶液にフラーレンの固体を混合した後に、超音波照射及び攪拌を繰り返し、所望により溶け残ったフラーレンを遠心分離及びメンブランフィルターを用いてろ過することにより、カリックスアレーン・フラーレン錯体の水溶液を調製する。
【００４１】
より具体的には、例えばカリックスアレーンとしてホモオキサカリックス[3]アレーンを、フラーレンとしてC60を用いる場合には、先ず、ホモオキサカリックス[3]アレーンを好ましくは1.0×10-7 〜1.0×10-2 mol/l、より好ましくは1.0×10-6〜1.0×10-3 mol/lとなるように、例えば、水、メタノール、エタノール、DMSO等の溶媒、若しくはこれらの混合溶媒に溶解し、該溶液に固体のC60をホモオキサカリックス[3]アレーンに対しモル比で好ましくは0.5〜200倍、より好ましくは1〜100倍添加し、混合する。次いで、該溶液を好ましくは１〜２０日間、より好ましくは２〜１０日間に渡り、好ましくは５〜７０℃、より好ましくは１０〜４０℃で超音波照射と撹拌を行い、錯体形成を行う。さらに、該溶液から不溶物（当該不溶物は溶液に可溶化しなかったC60を含んで成る）を除去する操作を付加的に行ってもよい。
【００４２】
なお、錯体形成を行う方法としては、ここで説明した固−液抽出法の他、例えば、液−液抽出法、高速振動粉砕法等が挙げられるが、中でも固-液抽出法が好ましい。
【００４３】
以上によりフラーレンのカリックスアレーン包接体が得られる。当該包接体におけるフラーレンとカリックスアレーンとのモル比（フラーレン／カリックスアレーン）は、通常、１／１〜ｕ／ｖ（すなわち、カリックスアレーンがミセルを形成すると、フラーレンの塊をカリックスアレーンが複数個で包接する形となる。ｕとしては１, ０００〜５０,０００程度、ｖとしては１, ０００〜５０,０００程度である）程度であるが、当該モル比としては、好ましくは１／１〜１／２、より好ましくは１／２である。かかるモル比は、可視-紫外吸収スペクトルの340 nmの吸光度を測定することにより、吸光係数ε（イプシロン）＝48,700 l/mol・cmを指標として求めることができる。
【００４４】
本発明の組成物はフラーレンのカリックスアレーン包接体のみからなってもよいが、後述するようなその他の成分が含まれていてもよい。本発明の組成物中におけるフラーレンのカリックスアレーン包接体の含有量としては、特に限定されるものではないが、好ましくは１０〜１００重量％、より好ましくは５０〜１００重量％である。
【００４５】
本発明の組成物は核酸の光切断能を有することから、例えば、核酸の光切断実験をイン・ビトロで実施するための試薬等として好適に用いられる。
【００４６】
本発明の組成物を試薬の形態とする場合、フラーレンのカリックスアレーン包接体と、その他の成分、例えば、水、低級アルコール、DMSO等とを、フラーレンのカリックスアレーン包接体が解離しない条件で混合することにより調製することができる。
【００４７】
その他の成分は、例えば、該包接体の調製時にフラーレン及びカリックスアレーンと共に混合するか、又は該包接体を得た後に該包接体と混合すればよい。
【００４８】
以上により、本発明の組成物が得られるが、本発明には、前記したような、前記標的核酸指向性分子と結合してなるカリックスアレーンと、フラーレンとを混合する工程を有する、本発明の組成物の製造方法も包含する。
【００４９】
また、本発明は、（ａ）本発明の組成物と標的核酸とを合わせる工程、並びに（ｂ）該組成物を可視光に曝露する工程を有する核酸の光切断方法を提供する。
【００５０】
工程（ａ）では、本発明の組成物と標的核酸とを、例えば、適宜両者を混合することにより合わせる。標的核酸と混合する本発明の組成物の量としては、フラーレンのカリックスアレーン包接体の量で、標的核酸１００重量部に対して０．１〜１０重量部程度が好適である。
【００５１】
工程（ｂ）では、該組成物を可視光に曝露する。ここで、曝露するとは、該組成物中のフラーレンを励起するに充分な可視光に該組成物を曝すことを意味し、該組成物の可視光への曝露は直接的に行われても間接的に行われてもよい。
【００５２】
可視光の光源としては、例えば、キセノン光源、水銀光源、レーザー光源等が挙げられるが、下記波長及び光量の光を照射できるものであれば、特に限定されない。また、該光の照射波長は、用いるフラーレンの種類によって変化させるのが好ましいが、通常、３００〜８００nm、好ましくは３５０〜７００nmの範囲内で照射すればよい。また、照射光量は、その光源によって異なるが、通常、0.1〜50 mW・ cm-2であり、好ましくは1〜20 mW ・cm-2 である。さらに、照射時間は光源によって異なるが、通常、0.5〜２４時間であり、好ましくは1〜１０時間である。また、曝露は複数回に分けて行っても良い。
【００５３】
標的核酸と前記包接体のカリックスアレーン部位が相互作用する場合には、直接フラーレンと標的核酸が近接し、光照射により活性化されたフラーレンの作用により標的核酸が直接的に切断され、一方、標的核酸近傍にある化合物又は部位と前記包接体のカリックスアレーン部位が相互作用する場合、フラーレンの作用により酸素やNADH−酸素等の電子受容体の活性化を促し、それを介して間接的に標的核酸が切断されると推定される。
【００５４】
本発明の核酸の光切断方法によれば、可視光を利用して効率的に標的核酸を切断することができる。
【実施例】
【００５５】
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はかかる実施例のみに限定されるものではない。
【００５６】
実施例１
図1に示す反応スキームに従って合成した。すなわち、マルトース1水和物(2)を原料として、ヨウ素による酸化反応を介し、脱水反応を経て、ラクトン体(3)を合成した（工程i）（収率56％）。このラクトン体にN-Z-1,3-プロパンジアミンを付加させ(4)（工程ii）、さらに無水酢酸を用いて、糖鎖の水酸基をアセチル化することにより保護し(5)を得た（工程iii）（収率74％）。さらに、パラジウムカーボン触媒存在下、水素ガス中で、Z基を接触還元し、(6)を得た（工程iv）。一方、ホモオキサカリックス[3]アレーンのトリエステル体(7)を原料として、加水分解することで、ホモオキサカリックス[3]アレーン誘導体(8)を得た（工程v）（収率97％）。得られた(6)と(8)をDCC存在下、縮合反応により付加させ、糖修飾ホモオキサカリックス[3]アレーンの前駆体(9)を得た（工程vi）（収率44％）。
【００５７】
糖修飾ホモオキサカリックス[3]アレーン前駆体(9)の帰属：δH/ppm（600MHz, CDCl3, TMS, 25 ℃） 1.12 [9H, s, C(CH3)3], 1.65-1.75 [2H, m, CH2CH2CH2], 1.90, 2.00-2.19 and 2.21 [24H, m, OCH3], 3.19-3.38 [4H, br, CH2CH2CH2], 4.06 and 4.08 [1H, d, d, J = 2.0, 2.0, H-6’A],  4.15 [2H, s, OCH2CO], 4.18-4.24 [2H, m, H-6A+H-5’], 4.26-4.32 [4H, m, H-4+H-6’B+Ar-CH2O], 4.60, 4.61 [1H, d, d, J = 3.2, 3.2 Hz, H-6B], 4.75-7.77 [2H, m, Ar-CH2O], 4.96, 4.98 [1H, d, d, J = 3.8, 3.8 Hz, H-2’], 5.07-5.10 [1H, m, H-4’], 5.17-5.20 [1H, m, H-5], 5.33 [1H, d, J = 3.8, H-1’], 5.39-5.43 [2H, m, H-3’+H-2], 5.56, 5.57 [1H, d, d, J = 5.5, 5.5 Hz, H-3], 6.92 [2H, s, Ar-H], 7.44 [1H, m, J = 6.6, CH2NHCO], 8.04 [1H, m, CH2CONHCH2] ; m/z (ESI-MS LC, ESI+, CHCl3) 2971 [(M+Na)+ = 2971], 1497 [(M+2Na)2+ = 1497] ; 元素分析  実測値：C, 53.99; H, 6.33; N, 2.99, 理論値：C, 54.09; H, 6.25; N, 2.79 (C135H186N6O66・0.5CHCl3として)。
【００５８】
この前駆体をナトリウムメトキシドを用いて、加水分解によりアセチル基の除去を行い、糖鎖を修飾したホモオキサカリックス[3]アレーン(1)を得た（工程vii）（収率93％）。
【００５９】
ホモオキサカリックス[3]アレーンの帰属：δH/ppm（600MHz, CDCl3, TMS, 25 ℃） 1.08 [9H, s, C(CH3)3], 1.80 [2H, m, CH2CH2CH2], 6.96 [2H, s, Ar-H]  ; m/z (ESI-MS LC, ESI+, H2O) 1961 [(M+Na)+ = 1961], 992 [(M+2Na)2+ = 992] ; 元素分析  実測値：C, 52.48; H, 5.99; N, 3.33, 理論値：C, 52.41; H, 5.98; N, 3.13 (C87H138N6O42・6H2Oとして)。
【００６０】
上記方法により合成した糖修飾ホモオキサカリックス[3]アレーンの水溶液（5 ml、1.0×10-4 mol/l）にC60 フラーレンの固体（3.60 mg、5.0×10-6 mol）を混ぜ、超音波照射及び攪拌を繰り返し、溶け残ったフラーレンを遠心分離およびメンブランフィルター(アドバンテック株式会社製、DISMIC-13 cp, Cellulose Acetate, 0.45 μm)を用いてろ過することにより、ホモオキサカリックス[3]アレーン・C60錯体の水溶液を調製した。
【００６１】
実施例２
実施例１で得られたホモオキサカリックス[3]アレーン・C60錯体の水溶液を蒸留水で０．６倍希釈した溶液（100 μl、3.0×10-5mol/l）とColE1 プラスミドDNA（和光純薬製：200μl、 2.0 μg/ml, 4.32×10-6  Da(6646 bp)）を混合し、この水溶液に、30cm離した出力500 W のXeランプ（波長＞360 nm、UV-37光干渉フィルターによる）から光を2時間照射した。
【００６２】
光照射後の溶液から50 μl採取し、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）水溶液（5 ml、111 mg/ml）、ローディングバッファー（Loading buffer） （和光純薬製：5 ml）を加え混合した。この溶液を、アガロース0.30 gにTAE buffer〔トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン (121 g)、氷酢酸 (28.6 ml)、EDTA  (pH 8；50 ml、0.5 mol/l)を蒸留水にて500 mlに希釈しさらに５０倍希釈した溶液〕35 mlを加え、加熱溶解後室温まで放冷し作製したアガロースゲルのサンプルウェルに15 μl注入し、135 Vの電圧をかけ、20分間電気泳動を行った。電気泳動後、臭化エチジウム水溶液(0.5 mg/ml)にゲルを浸し、30分間染色した。
【００６３】
染色したアガロースゲルをプリントグラフ（ATTO、  AE-6910型）の装置内に入れ撮影・画像解析を行うことにより、染色された未切断DNAと切断DNAの比を出し、以下の式：
切断効率（％）＝〔[切断DNA]／（[未切断DNA]＋[切断DNA]）〕×１００
によりDNAの切断効率を算出した。今回用いた条件においては、31%のDNAが切断された。切断効率を求める式中、[ ]はDNA濃度を表す。
【００６４】
比較例１
C60 （1 ml、0.8 mg/ml）のトルエン溶液と、水溶性高分子であるポリビニルピロリドン（PVP） （2 ml、50 mg/ml）のクロロホルム溶液を混合し、溶媒を減圧下留去した。残渣に蒸留水2 mlを加えて再分散し、超音波照射及び攪拌を2日間続け、溶け残ったフラーレンを遠心分離及びメンブランフィルター(アドバンテック株式会社製、DISMIC-13 cp, Cellulose Acetate, 0.45 μm)を用いてろ過することにより、PVP・C60錯体の水溶液を調製した（ここまでの操作は、Y. N. Yamakoshi, T. Yagami, S. Sueyoshi and N. Miyata, J. Org. Chem., 1996, 61, 7236.に従った）。この溶液（C60濃度：2.24×10-4 mol/l）を蒸留水にて7.46倍希釈することにより、実施例２のホモオキサカリックス[3]アレーン・C60錯体水溶液（3.0×10-5mol/l）と同じ濃度とした。
【００６５】
上記の方法で得たPVP・C60錯体によるDNAの切断実験は、実施例２と全く同様の条件で行った。その結果、17%のDNAが切断された。
【００６６】
比較例２
C60 （200 mg、2.78×10-4mol)とγ-CD （1.44 g 、1.11×10-3 mol)を、メノウ乳鉢を用いて褐色になるまで混ぜ合わせ、さらにこの混合物を2個のメノウボール（球直径5 mm）と共にメノウ製の粉砕ジャー（レッチェ（Retsch）製、5 ml）の中に入れ、高速振動粉砕器(レッチェ（Retsch）製、MM200)（30 Hz, 15分間)にて30分間混合した。この混合物に2 mlの水を加え懸濁させ、1時間超音波照射後、溶け残ったフラーレンを遠心分離およびメンブランフィルター(アドバンテック株式会社製、DISMIC-13 cp, Cellulose Acetate, 0.45μm)を用いてろ過することにより、γ-CD・C60錯体の水溶液を調製した（ここまでの操作は、K. Komatsu, K. Fujiwara, Y. Murata and T. Braun, J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1, 2963 (1999) .に従った）。この溶液（C60濃度：3.67×10-4 mol/l）を蒸留水にて12.2倍希釈することにより、実施例２のホモオキサカリックス[3]アレーン・C60錯体水溶液（3.0×10-5mol/l）と同じ濃度とした。
【００６７】
上記の方法で得たγ-CD・C60錯体によるDNAの切断実験は、実施例２と全く同様の条件で行った。その結果、1%のDNAが切断された。
【００６８】
実施例２及び比較例１と２の結果の比較から、本発明の組成物によれば、水溶性高分子又はＣＤを用いてフラーレンを水溶化した場合と比べて非常に高い光切断能が発揮されることが分かる。
【産業上の利用可能性】
【００６９】
本発明の核酸の光切断用組成物は、その核酸の光切断能により、核酸の光切断用試薬として好適に用いられる。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】糖鎖修飾ホモオキサカリックス[3]アレーン合成の反応スキームの一例である。
【図１】
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