(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞と光増感剤とを接触させること、ウィルス粒子のゲノム内に取り込まれているか、または該ゲノムとは離れているが該ウィルス粒子内に担持されている、導入される分子（移送分子）である核酸分子と該細胞を接触させること、ならびに光増感剤を活性化させるために有効な波長の光で該細胞を照射することを含み、前記ウィルスの担体は、アデノウィルス、アデノ随伴ウィルス、レトロウィルス、レンチウィルス、ヘルペスウィルス、バクテリオファージ、インフルエンザウィルス、センダイウィルス、ワクシニアウィルスまたはバキュロウィルスであることを特徴とする、インビトロまたは生体外（ex vivo）で分子を細胞内に導入する方法。
【請求項２】
前記ウィルスの担体がアデノウィルスであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞が、哺乳類であることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記移送分子は、完全長の遺伝子またはcDNAあるいは同一物をコードする他のDNAまたはそれらの機能的フラグメントを含むことを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記核酸分子は、プロドラッグ活性化酵素、タン白質毒素、アポトーシス誘導タン白質、免疫刺激因子、腫瘍特異抗原、免疫/炎症阻害剤、血管新生阻害剤、血管新生誘導タン白質、血液凝固開始タン白質、細胞内抗体または組換え免疫毒素をコードすることを特徴とする請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記移送分子が、アンチセンスRNA分子、リボザイム、アプタマー、オリゴヌクレオチド、または三重体（triplex）形成オリゴヌクレオチドをコードする核酸分子であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記核酸分子が鎖長20〜10000塩基であることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記移送分子は、ポリヌクレオチドであって、ウィルス由来のあるエレメントを含むウィルスの構築物内に挿入され、該エレメントはウィルス担体の内部に、該構築物が包み込まれることを可能とするのに必要であることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記光増感剤が、細胞内コンパートメントに局在化することを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞内コンパートメントがエンドソームまたはリソソームであることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記光増感剤がウィルス担体とは区別されることを特徴とする請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記光増感剤とウィルス担体が順番に前記細胞と接触することを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記光増感剤が、ジスルホン化メソ−テトラフェニルポルフィリン（TPPS2a）、ジスルホン化アルミニウムフタロシアニン（AlPcS2a）および他の両親媒性光増感剤よりなる群から選択されることを特徴とする請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記光増感剤が5-アミノレブリン酸または5-アミノレブリン酸エステルまたは製薬的に許容されるその塩の化合物であることを特徴とする請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記ウィルスの担体が、該細胞と15分間〜6時間接触させられることを特徴とする請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記光増感剤が照射に先立ち該細胞と4〜24時間接触させられることを特徴とする請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
前記照射段階が1〜10分間であることを特徴とする請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
前記ウィルスの担体が照射の前または照射後に添加されることを特徴とする請求項１〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
前記の光増感剤およびウィルスの担体の一方またはいずれもが１つ以上の担体分子、ターゲティング分子またはベクターに結合しているかまたは付随していることを特徴とする請求項１〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
上記ウィルスの担体は、担体分子に結合しているかまたは付随していることを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記担体分子が、ポリカチオンまたはカチオン性脂質を含むことを特徴とする請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ポリカチオンが、ポリ-L-リジン,ポリ-D-リジンまたはカチオン性デンドリマーであることを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記カチオン性脂質がDOTAPであることを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記担体分子が、リポソームまたは脂質を基礎とする構築物であることを特徴とする請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記リポソームまたは脂質を基礎とする構築物が、少なくとも1種のカチオン性脂質を含む構築物であることを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記分子が導入された該細胞の少なくとも５０％が殺傷されないことを特徴とする請求項１〜２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
ウィルスの担体に付随した移送分子および光増感剤の、細胞を含有する医薬の製造における使用；ここで、該細胞は請求項１〜２６のいずれかの方法によって調製され疾患、障害または感染を治療するためのものであることを特徴とする。
【請求項２８】
ウィルスの担体に付随した移送分子および光増感剤の、疾患、障害または感染を治療するために使用される医薬を製造するための使用；ここで、該移送分子、ウィルスの担体および光増感剤は請求項１〜２６のいずれかで規定されたものであり、該疾患、障害または感染は、患者の細胞を該医薬と接触させ、該光増感剤を活性化させるために有効な波長の光で該細胞を照射することによって予防または治療するものであることを特徴とする。
【請求項２９】
ウィルスの担体に付随した移送分子の、疾患、障害または感染を治療するために使用される医薬を製造するための使用；ここで、該疾患、障害または感染は、患者の細胞を該医薬と接触させ、別途光増感剤と接触させ、該光増感剤を活性化させるために有効な波長の光で該細胞を照射することによって予防または治療するものであり、該移送分子、ウイルスの担体および光増感剤は請求項１〜２６のいずれかで規定されたものであることを特徴とする。
【請求項３０】
光増感剤の、疾患、障害または感染を治療するために使用される医薬を製造するための使用；ここで、該疾患、障害または感染は、患者の細胞を該医薬と接触させ、別途ウィルスの担体に付随した移送分子と接触させ、該光増感剤を活性化させるために有効な波長の光で該細胞を照射することによって予防または治療するものであり、該移送分子、ウイルスの担体および光増感剤は請求項１〜２６のいずれかで規定されたものであることを特徴とする。
【請求項３１】
前記医薬が遺伝子治療に使用するためのものである、請求項２７〜３０のいずれかに記載の使用。
【請求項３２】
前記遺伝子治療が、特定細胞をターゲットとした殺傷、遺伝子発現の標的阻害あるいは患者に不足して補償すべき機能性生成物を発現することができる遺伝子またはその一部を導入することによる付加的治療、または突然変異の修正により達成されることを特徴とする、請求項３１に記載の使用。
【請求項３３】
前記疾患、障害および感染が、ガン、慢性関節リウマチ、関節硬化症、ウィルスおよび他の感染、乾癬、日光角化症、外傷、骨折、小隆起または継承される遺伝的代謝異常であることを特徴とする、請求項２７〜３２のいずれかに記載の使用。
【請求項３４】
前記医薬が１０3〜１０15のウィルス粒子の用量に相当する量でインビボで投与されるものであることを特徴とする、請求項２７〜３３のいずれかに記載の使用。
【請求項３５】
前記ウィルスの担体に付随した移送分子および光増感剤が別個に投与されるものであることを特徴とする、請求項２７〜３４のいずれかに記載の使用。
【請求項３６】
一緒にまたは別個に使用するために組み合わせた調製物としてウィルスの担体に付随した移送分子および光増感剤を含有する、疾患、障害または感染を治療するための製品；ここで、該移送分子、ウイルスの担体および光増感剤は請求項１〜２６のいずれかで規定されたものであり、該疾患、障害または感染は、患者の細胞を該移送分子と接触させ、該光増感剤を活性化させるために有効な波長の光で該細胞を照射することによって予防または治療するものであることを特徴とする。
【請求項３７】
遺伝子治療に使用するための、請求項３６に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光増感剤を使用して分子類を細胞内に導入し、光増感剤を活性化するのに有効な波長の光で細胞を照射する方法に関する。この場合、導入される該分子は、ウィルスの担体、とりわけアデノウィルスの担体に付随している。本発明はさらに遺伝子治療におけるこの方法の使用に関する。
【０００２】
遺伝子治療、すなわち病気と戦うために患者の細胞の遺伝子の改変は、ガン、ウィルスおよび細菌の感染を含む感染性疾患、心血管系疾患、 嚢胞性線維症といった遺伝性障害、免疫系障害および他の多くの病態など様々な病気を治療するために、治療の大きい可能性を秘めていると認識されている。
【０００３】
しかしながら、遺伝子治療の臨床的進歩は、多くの未解決の難問に未だ直面している。その中で最も重要な問題の一つは、インビボで標的細胞に治療用遺伝子を効率的にしかも特異的に送り込むための方法を見出すことである(Verma & Somia, 1997, Nature, vol. 389, 239-242 および Anderson, 1998, Nature vol. 392, 25-30).
遺伝子治療は、多数の異なる可能なアプローチを含むことができ、クローン化ヒト遺伝子または遺伝子セグメント、二本鎖ヒト遺伝子または遺伝子セグメント、他のゲノムおよび生命体からの遺伝子、オリゴヌクレオチドおよび種々の人工的遺伝子またはアンチセンス遺伝子といったそれらのフラグメントの送達を含むことができる。
【０００４】
現行の方法において多くの異なる担体またはベクターは、遺伝子治療において遺伝子転入を実現する際の使用が示唆されている。例えばポリカチオン性化合物、カチオン性脂質およびウィルスのシステムが挙げられているが、それでもインビボの遺伝子治療は、なおほとんど成功を収めていない。現行の方法において知られた多くの欠陥の中で、ベクターの血清中での低い安定性、遺伝子送達の限定された特異性、遺伝子送達の低い効率などである。ウィルス担体の使用は、炎症といった逆効果を招きかねないウィルス要素（elements）の宿主への導入のために、特別の注意を払って進められてきた。そうした逆効果は、他の方法に比して増強された移送によっては帳消しとはされない。
【０００５】
大半の分子は、細胞膜を容易に通過することができない。生きている細胞の細胞質に分子を導入する方法は、技術的に知られており、生物学的プロセスを扱い研究するための有用な手段である。今日、最も一般に利用されている方法の中には、マイクロインジェクション、赤血球ゴースト媒介融合およびリポソーム融合、ピノソームの浸透溶解、スクレープ負荷（scrape loading）、エレクトロポレーション（電気穿孔法）、リン酸カルシウムおよびウィルス媒介トランスフェクションがある。これらの技術は、多くの場合、非実用的で、時間を浪費し、非効率的であるか、あるいは、重大な細胞死を引き起こすこともあるが、培養中の細胞を調べるのに有用である。かくしてこのような技術は、生物学的または医学的研究において、あるいは治療における使用にとって最善のものではない。しばしば充分に効率的ではなく、耐え難い毒性作用があり、あるいは技術上の諸理由で応用できるものでないかも知れない。
【０００６】
ポルフィリンおよび他の多くの光増感化合物が、細胞および組織に対し、細胞毒性作用を引き起こすことがあることはよく知られている。これらの作用は、光増感化合物を光にさらすことにより、毒性となるか、または、細胞膜および細胞構造を含む細胞物質または生体分子にダメージを及ぼす一重項酸素または他の酸化種のような毒性物質を放出するに違いない事実、ならびにこのような細胞または膜のダメージが最終的に細胞を殺すに違いない事実を根拠にしている。これらの作用は、特に腫瘍性疾患を含む、さまざまな異常または疾患の治療に利用されてきた。この治療は、光力学的治療（PDT）と名づけられており、身体の患部に光増感（光化学治療）剤を投与し、次いで、光増感剤を活性化し、これらを細胞毒性型に変換させるために、光活性化光線にさらす段階を含んでおり、このことにより、病変細胞が殺され、あるいはその増殖能力が低減される。光増感剤は、優先的に、あるいは選択的に、所望の標的部位、具体的には腫瘍または他の病変に局在化するであろうことが知られている。
【０００７】
光増感剤の範囲は知られており、例えば、著名なソラーレン、ポルフィリン、クロリンおよびフタロシアニンが挙げられる。このような薬剤は、光に曝された時に毒性となる。
【０００８】
ポルフィリン光増感剤は、毒性酸素種の発生により間接的に作用し、PDTのために特に好ましい候補として認識されている。ポルフィリンは、ヘム合成の際、自然界に生成する前駆体である。特に、ヘムは、酵素フェロケラターゼの作用により、プロトポルフィリン（PpIX）に鉄（Fe3+）が組み込まれたときに造られる。PpIXは、非常に強力な増感剤であるが、ヘムは、光増感作用を有しない。当該分野では、ポルフィリンを主体とした、またはポルフィリン関連のさまざまな光増感剤が知られており、文献に記載されている。
【０００９】
細胞毒性作用は、主に、一重項酸素の形成を通じて媒介される。この反応中間体は、細胞中では存在期間が非常に短い（＜0.04μs）。したがって、PDTの最初の細胞毒性作用は、光照射の間に、一重項酸素（1O）の形成部位の極めて近傍で達成される。1Oは、タンパク質（ヒスチジン、トリプトファン、メチオニン、システイン、チロシン）、DNA（グアニン）、不飽和脂肪酸およびコレステロールと反応し、酸化する。PDTの利点の一つとしては、光に曝されない組織は影響されないまま残ることができることである。すなわち、選択的なPDT効果を得ることができることである。例えば腫瘍細胞などの望まない細胞集団を破壊するための、PDTの利用に関する多くの文献がある。特許文献には、多くの光力学的化合物が、単独に、あるいは、例えば、より細胞特異的な複合体とすべく腫瘍細胞レセプター決定因子に向けられる免疫グロブリンなどの標的試薬との複合体形成も記載されている。ヘマトポルフィリン誘導体のような、ある種の光化学的化合物は、さらに、有害な細胞に局在化する固有の能力を有している。このような方法および化合物は、ノルウェー特許No.173319号、ノルウェー特許出願No.900731号、176645号、176947号、180742号、176786号、301981号、300499号、および891491号に記載されている。したがってこのようなPDT方法は、細胞死に至る細胞構造の破壊に依存している。
【００１０】
他方、WO 96/07432 または同時に係属している出願 WO 00/54802は、必ずしも広範な細胞破壊もしくは細胞死とはならない様式で、細胞の細胞質中へ膜−非透過性分子を導入する機作として、 光線力学効果を使用する方法に関するものである。これらの方法において、内在化される分子および光増感作用化合物は、細胞に対し同時にまたは次々と適用され、次いで光増感化合物および 該分子はエンドサイトーシスされ、あるいは他の方法でエンドソーム、 リソゾームまたは細胞内の膜で仕切られた他のコンパートメント内に転位される。
【００１１】
転位される分子および光増感化合物は、細胞に一緒にまたは順番に(好ましくは別個かつ次々と)適用され、これらはともに細胞により同じ細胞内コンパートメント中に（すなわち同時転位（co-translocated）される）取り込まれる。
【発明の開示】
【００１２】
細胞内に内在化される分子は、光増感化合物を活性化させるのに適切な波長の光に細胞を曝すことにより、放出される。該化合物の活性化は、ここでは細胞内コンパートメント膜の破壊をもたらし、次いで光増感剤と同一のコンパートメント内に局在している該分子が細胞質へ放出されることとなる。この方法は、「光化学的内在化（photochemical internalisation）」またはPCIと表されている。よってこれらの方法の最終段階である細胞を光にさらすことは、問題の分子が光増感剤と同じ細胞内コンパートメントから放出されて細胞質に存在する結果となる。
【００１３】
この技術が有効となるためには、光増感化合物および細胞質中に放出される該分子が、照射が行なわれる際にともに同じ細胞内コンパートメント内に存在することが必須であると信じられた。しかし、その後、細胞の光への被爆が必ずしも最終の段階ではないことを除き、類似のPCI法によって分子が細胞の細胞質中に導入され得ることが見出されている。該方法は光への被爆の際に転位する分子および光増感剤が、同一の細胞内コンパートメント内に局在することに依存しない。
【００１４】
かかる方法において、内在化され、かくして細胞質に送達される分子が細胞と接触することとなる前に、光増感剤が細胞と接触し、さらに照射により活性化されてもよい。よって光への被爆の際に、内在化される分子および光増感剤は必ずしも同じ細胞内コンパートメントに局在している必要はないという事実にもかかわらず、分子は依然細胞に入り、しかも細胞質へ送達される。これらの結果は、同時係属の国際出願 (ノルウェーラジウム病院研究財団（The Norwegian Radium Hospital Research Foundation）の名前で、発明の名称"方法"で2001年11月29日に出願された。)に詳細に記載され、それの一つのコピーは本明細書に補足され、ならびに本明細書に参照により取り込まれる。
【００１５】
驚くべきことに、ウィルスのベクターと組み合わせたPCI技術の使用は、ウィルス媒介の細胞の遺伝子送達を著しく改善したことが今や見出されている。光化学治療は臨床で用いられるため、(Doughertyら, 1998, J. Natl. Cancer Inst, vol. 90,889-905), また一般的には極めて特異的であり、副作用がほとんどないことから、記載された技術は、明らかにインビボ 遺伝子治療の効率および特異性をともに向上させる明らかな可能性を秘めている。
【００１６】
したがって本発明は、分子を細胞内に導入する方法を提供し、該方法は、該細胞と光増感剤とを接触させること、該細胞を導入される（ウィルスの担体と付随した）分子と接触させること、ならびに光増感剤を活性化させるために有効な波長の光で該細胞を照射することを含んでいる。
【００１７】
これらの段階は、最終の結果がウィルス担体および細胞内に導入される分子の細胞による取り込みであり、ならびにその分子の内在化であるならば、任意の適切な順序で行うことができる。ウィルスの担体および光増感剤を除き、本発明の実施では他に何ら分子を必要とされない。
【００１８】
本明細書で使用する用語「細胞」には、昆虫細胞および菌類の細胞 ならびに体細胞および生殖細胞を含むあらゆる真核細胞が含まれる。かくして代表的な 「細胞」として、あらゆるタイプの哺乳類の動物細胞および非哺乳類の動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、菌類細胞、原生動物およびプロトプラスト（protoplasts）および好ましくはヒト、マウス、ネズミ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ウマ、ウシまたはヤギの細胞といった哺乳類の細胞が挙げられる。
【００１９】
本明細書で使用される「内在化」は、ウィルス担体に結合したまま、または結合していなくとも、細胞 (ときに本明細書では、「移送分子」ともいう)内に導入される分子の細胞質への送達をいう。本ケースでは、かくして「内在化（internalisation）」は、必要に応じそのウィルスの担体の全部または一部に付随して、細胞内の/膜結合コンパートメントから細胞質への導入される分子の放出ならびにその後の核への移送の段階も含むものである。本発明の方法に従っていったん内在化すると、その分子は、細胞内に導入されたと見なされる。
【００２０】
細胞内の膜により限定されたコンパートメントは、細胞内にあるコンパートメントであればいずれであってもよい。好ましくは、該コンパートメントは膜性の小胞、特にエンドソームもしくはリソソームであろう。しかし、該細胞内コンパートメントは、ゴルジ装置または小胞体を含むこともできる。
【００２１】
本明細書で使用する「細胞の取り込み」または「転位（translocation）」とは、内在化の諸段階の一つであり、細胞膜の外側の分子または実体は、細胞内に取り込まれ、その結果外側に位置する細胞膜に対して内側に見いだされることをいう。具体的には「エンドサイトーシス」または他の適当な取り込み機構により、例えば細胞内の膜で仕切られたコンパートメント、例えば小胞体、ゴルジ体、リソゾーム、エンドソームなどの内部に、あるいは付随して見出されることである。
【００２２】
細胞内に導入される適当な「分子」には、ウィルスの担体、ウィルスのベクターまたはウィルス粒子と付随することができる任意のものであり、これらは本明細書でときに「移送分子(transfer molecule)」と言及される。
【００２３】
かかる分子は、一般には核酸分子であり、細胞内に導入するため、完全長の遺伝子またはその機能的フラグメントを含んでもよく、あるいは例えば遺伝子の完全なコード配列またはその機能的フラグメントを含むｃＤＮＡであってもよい。代わりに該核酸分子は、アンチセンスRNA 分子、リボザイム（ribozymes）、アプタマー（aptamers）、オリゴヌクレオチドまたは ３重体形成（triplex forming）オリゴヌクレオチドをコードしてもよく、あるいは転写因子、「デコイ（decoy）」DNAなどを含んでもよい。好ましくは それら核酸分子は、10〜30 000塩基の鎖長であり、具体的には20-10 000 塩基の鎖長である。
【００２４】
本明細書で使用する「と付随する」とは、何らかの方法で ウィルスの 担体、ウィルスのベクターまたはウィルス粒子に取り込まれるか、または結びつけられる分子に言及するものであり、具体的には該ウィルス分子のゲノム内に取り込まれているか、または該ゲノムとは離れているが該ウィルス粒子内に担持されている。一般には細胞内に導入される分子は、包みにされるかウィルス粒子内に取り込まれる。すなわち、カプセルにされるか、ウィルスの外被（coat）またはカプシド内に取りまれる。好ましくは 移送される分子は、ポリヌクレオチドであり、好ましくはウィルス由来のあるエレメントを含むウィルスの構築物内に挿入される。そのエレメントはウィルス担体の内部に、該構築物が包み込まれることを可能とするのに必要である。移送される分子は、例えばウィルス担体のゲノムにあるクローニング部位にクローンされてもよい。あるいは、これらの特徴に寄与する2またはそれ以上の別々の分子が、下記のように使用されてもよい。このようなウィルス粒子が選択された結果、該粒子は自発的に該細胞に感染することができてもできなくてもよい。もし該粒子が自発的に細胞に感染することができるのであれば、いったん細胞内に内在化されたなら、該ウィルス粒子は選ばれた結果、該粒子は該細胞から分泌される新規ウィルス一括を複製し、かつ組み立てるために、内因性の細胞装置を利用することができてもできなくてもよい。しかしながら、一般的には遺伝子治療または他のインビボ応用に用いられる場合、安全上の理由から、ウィルス ベクターは通常、不能化される結果、それらは宿主細胞に感染できるが、新しいビリオン（virion）を複製、組み立てることはできない。また新しい細胞に感染し、つまり複製を無能（incompetent）とすることはできない。そうした不能化は、任意の適当な手段で行うことができる。しかし、簡便にはウィルスの複製に必要なウィルス遺伝子のある部分の欠損によるか、所望にによっては、本来の場所に移送されるべき治療の遺伝子を挿入することにより行うことができる。しかしながら、本願に記載された技術はまた複製能力のある（replication-competent）、または複製が制限された（replication-restricted）ウィルス、例えばONYX-15(Khuri F.R.ら,(2000),Nature Med.6,879-885)または単純疱疹ウィルス、Wildnerとその共同研究者により記載されたチミジンキナーゼをコードする複製制限アデノウィルス(Wildner O.ら,(1999)Gene Ther.6,57-62;Wildner O.ら,(1999),Cancer Res.59,410-413)、あるいは例えば、D. Klatzmanにより記載された複製するレトロウィルス(口頭発表および要旨、欧州遺伝子治療学会、第8回大会、Stockholm 7-10 October 2000)などを用いて利用することができる。
【００２５】
細胞内に導入される分子的実体の全体、すなわち、導入される分子を取り込むかカプセル化するウィルス 担体は、本明細書ではときに「移送粒子」と言及される。
【００２６】
一般的には、本発明の方法により細胞内に導入される核酸は、ウィルスにベースをおく構築物部分である。例えばウィルス由来のエレメントを含むウィルス基盤のプラスミドである。そうしたエレメントは、ウィルス担体/ウィルス・カプシド/ウィルス・ベクター内部に、該構築物が包み込まれることを可能とするのに必要である。しかしながら、代わりに導入される核酸は、一つの分子の一部を形成するものでもよく、例えばプラスミドおよび第一分子を収容するウィルス担体の増殖に必要な配列を含む第二の分子が存在してもよい。加えて、もし細胞内の核酸の作用がそれによりコードされるタン白質発現または それから産生されるRNAに依存するなら、その核酸は、高レベルの発現を特定の標的細胞内において確実とするために適当な調節性配列（例えばプロモーター）により好都合に隣接（flank）される。そうした調節性エレメントは、ウィルス類 (例えばサイトメガロウィルスからのCMVプロモーター) または他の適当な生命体に由来してもよい。ならびに該核酸分子によりコードされるタン白質の良好な発現を可能とするウィルス構築物の適当な設計は、当業者にはよく知られている。例えば、組織特異的なまたは調節可能なプロモーターは、組織または疾患特異的な、または調節可能な発現を得るために使用することができる。例えば組織特異的なプロモーター、メラノーマ特異的なチロシナーゼ・プロモーターを用いることができる。テトラサイクリン調節性プロモーター（tetracylin-regulated promoters）といった調節可能性プロモーターはよく知られている。本発明において用い得る、特異的なまたは調節されるプロモーターのさらなる例は、Hart, I. R. (Semin. Oncol., 1996,23,154-158), Miller および Whelan (Hum. Gene  Therapy, 1997), Nettelbeck および Muller (Trends Genet., 2000,16,174-181) および Spear (Anticancer Res., 1998,18, 3223-3231) およびそれらの中にある文献において見出し得る。
【００２７】
移動する分子が付随する「ウィルスの担体」分子は、任意のウィルスの系であり得る。ただし、その系のウィルスの担体が、細胞内に導入される分子と付随するか、それを取り込むかまたはカプセル化ができるものであれば、である。よって、一般に移動する分子は、ウィルスの粒子内またはウィルス・カプシド内に包み込まれ、ならびに「ウィルスの粒子」、「ウィルス・カプシド」および「ウィルスのベクター」といった用語もまた本明細書では「ウィルスの 担体」を意味するように使用される。本明細書で使用されるこれらの用語は、ウィルスを基にしたプラスミドまたはDNAを含まないが、そうしたプラスミドはウィルス性担体を創出するために使用されてもよい。
【００２８】
本発明で使用される適当なウィルス系の例として、アデノウィルス（adenoviruses）およびアデノ随伴ウィルス（adeno-associated viruses）、レトロウィルス（retroviruses）、レンチウィルス（lentiviruses）、ヘルペスウィルス（Herpes viruses）、バクテリオファージ、インフルエンザウィルス、センダイウィルス、ワクシニア（Vaccinia）ウィルスおよびバキュロウィルス（Baculovirus）が挙げられ、好ましくはアデノウィルス、アデノ随伴ウィルス、レトロウィルス、レンチウィルス、バクテリオファージである。アデノウィルスは、本発明の方法における使用に好ましいウィルスの系である。
【００２９】
本発明の使用のために、通常、ウィルスの 担体は自然界にあるウィルスの形態に望ましい性質を加え、病原性または望ましくない副作用をなるべく極小にした改変された形態を形成する。したがってウィルスの担体は、遺伝子治療に決まって使用されるウィルスの変異体であり周知であるが、出所ウィルスからの必須であり、同定できる成分を保持する。
【００３０】
本明細書で使用される「光増感剤」は、光感受性であり光活性化光の適用で、細胞毒性の形態に転換されるか、細胞毒性の種を形成する物質をいう。本発明によって使用される光増感剤（移送される分子とは区別され、しかも好ましくは相違している）は、細胞内コンパートメント、とりわけエンドソームもしくはリソソームに局在化するものであれば何でもよい。そのような光増感剤の範囲は当業界で知られており、WO96／07432を含む文献に記載されている。この点につき、培養細胞のエンドソームもしくはリソソームの位置を突き止めることが示されているジ‐およびテトラスルホン化アルミニウムフタロシアニン（例えばAlPcS2a）、スルホン化テトラフェニルポルフィリン（TPPSn）、ナイルブルー、クロリンｅ6誘導体、ウロポルフィリンI、フィロエリスリン、ヘマトポルフィリンおよびメチレンブルーを挙げることができる。これはほとんどの場合、エンドサイトーシス活性によるものである。よって光増感剤はエンドソームもしくはリソソームのコンパートメント内部に取り込まれる物質が好ましい。しかし他の細胞内コンパートメント、例えば小胞体もしくはゴルジ体に局在する他の光増感剤もまた使用することができる。光化学的処置の作用が細胞の他の成分（すなわち膜で仕切られたコンパートメント以外の成分）に及ぶといった機構が働くことも考えられることである。よって、例えば光化学的処置が細胞内移送または小胞融合にとり重要な分子を破壊することは、あり得ることの一つである。そうした分子は必ずしも膜に仕切られたコンパートメントに存在するとは限らない。
【００３１】
したがって言及すべき適切な光増感剤の種類は、ポルフィリン、ソラーレン（psoralens）、フタロシアニン、プルプリン、クロリン、ベンゾポルフィリン、ナフタロシアニン、陽イオン性色素、テトラサイクリンおよびリソソーム向性の弱塩基またはそれらの誘導体またはそれらの前駆体を含むものである（Bergら、J.Photochemistry and Photobiology,1997,65,403-409）。他の適当な光増感剤として、テキサフィリン（texaphyrins）、フェオフォルビド（pheophorbides）、ポルフィセン（porphycenes）、バクテリオクロリン（bacteriochlorins）、ケトクロリン（ketochlorins）、ヘマトポルフィリン（hematoporphyrin）誘導体、およびそれらの誘導体、５−アミノレブリン酸およびその誘導体により誘導される内因性増感剤、光増感剤間の二量体または共役体などが挙げられる。
【００３２】
上記光増感剤は他の何らかの高分子と共役していない、つまり遊離の形態にあることが好ましい。特に好ましくは、光増感剤は、ウィルス担体とは区別され、すなわち別個の実体物である。しかしながら光増感剤はあるいは後述する担体または他の分子に付随しているか、結合しているかまたは共役（複合化）しているものでもよく、例えばターゲティング 抗体に結合しているか、またはポリリジンといった担体に共役していてもよい。あるいはある状況においては、光増感剤は、直接的にウィルスの担体またその一部（例えばレトロウィルスの包囲脂質膜）に結合しているか、付随しているかまたは共役しているものでもよい。
【００３３】
好ましい光増感剤はTPPS4、TPPS2a、AlPcS2aおよび他の両親媒性光増感剤を含むものである。
【００３４】
好ましい見方から、本発明は光増感剤が５−アミノレブリン酸、５−アミノレブリン酸のエステル、または製薬上許容されるそれらの塩である方法を提供する。上記エステルで、５−アミノ基は置換されていてもいなくてもよく、後者の場合、ＡＬＡエステルである。
【００３５】
さらに具体的には、本発明で使用されるＡＬＡエステルは、５−アミノレブリン酸の任意に置換されていてもよいアルカノールとのエステル、例えばアルキルエステルまたは置換アルキルエステルである。
【００３６】
利便上、使用できるＡＬＡエステルは、式Iの化合物：
R22N-CH2COCH2-CH2CO-OR1              (I)
（式中、R1は、必要に応じてヒドロキシル基、アルコキシ基、アシルオキシ基、アルコキシカルボニルオキシ基、アミノ基、アリール基、オキソ基またはフルオロ基により置換され、ならびに酸素、窒素、イオウ、またはリン原子により任意に介在されていてもよいアルキル基を表し；およびR2は、それぞれ同一でも異なってもよい各々が水素原子またはR1を表す）またはその塩である。
【００３７】
上記置換アルキルR1基は、一置換でも多置換であってもよい。よって適切なR1には、例えば非置換アルキル、アルコキシアルキル、ヒドロキシアルコキシアルキル、ポリヒドロキシアルキル、ヒドロキシポリアルキレンオキシアルキルなどが挙げられる。
【００３８】
本明細書で用いられる「アシル」という用語は、カルボキシレート基およびカルボネート基の両方を含み、したがって、アシルオキシ置換アルキル基として、例えばアルキルカルボニルオキシアルキルが挙げられる。このような基において、任意のアルキレン部分は、好ましくはアルキル基に対して下記で定義した炭素原子の含有量を有する。
【００３９】
好ましいアリール基としては、フェニルおよび単環の５〜７員複素芳香環、特にフェニル基が挙げられ、ならびにそうした基自体が、必要に応じて置換されていてもよい。
【００４０】
代表的な置換アルキル基R1としてアルコキシメチル基、アルコキシエチル基およびアルコキシプロピル基、またはアシロキシメチル基、アシロキシエチル基およびアシロキシプロピル基、例えばピバロイルオキシメチル基が挙げられる。
【００４１】
本発明の光増感剤として用いられる好ましいＡＬＡエステルとして、R1が非置換アルキル基および／または各R2基が水素原子を表すエステルが挙げられる。
【００４２】
本明細書で用いられる「アルキル」という用語は、任意の長鎖または短鎖の、直鎖状または分岐状の脂肪族である飽和または不飽和の炭化水素基を含む。不飽和アルキル基は、モノ不飽和でもポリ不飽和でよく、アルケニル基およびアルキニル基の両者を含む。このような基は最大４０個の原子を含んでよい。しかしながら、最大１０、好ましくは最大８、特に好ましくは最大６、とりわけ好ましくは最大４個の炭素原子を含むアルキル基が望ましい。
【００４３】
本発明で使用される好ましい光増感剤を表すものとして、ALA-メチルエステル、 ALA-エチルエステル、 ALA-プロピルエステル、 ALA-ヘキシルエステル、 ALA- ヘプチルエステルおよび ALA-オクチルエステルおよびそれらの塩が特に言及される。
【００４４】
本発明の方法は、インビトロ、またはインビボ、 全身または局所のその場での処置、 あるいは生体外で処置し、その後該処置細胞を身体に投与するものであってもよい。
【００４５】
本発明の方法の実施について、細胞を光増感剤、および別個にウィルスの担体と「接触させる」段階を好都合な、または所望のやり方で行なってもよい。よって、その接触させる工程が、インビトロで行なわれる場合、該細胞は、便宜上水性の培地、例えば適当な細胞培養培地に維持されていてもよく、適当な時点で、光増感剤またはウィルスの 担体を、適切な条件下、 例えば適当な濃度で適切な長さの時間をかけて単に培地に加えるだけである。
【００４６】
光増感剤は、適当な濃度で適切な長さの時間をかけて、該細胞と接触させる。それら条件は、いつもの技術を用いて当業者により容易に決定されるが、使用する光増感剤および細胞の型に依存するであろう。光増感剤の濃度は、一旦細胞内に取り込まれると（例えばその細胞内コンパートメントの１つ以上の中へ、またはそれと付随する）、照射により活性化され、１以上の細胞構造は破壊され、具体的には１以上の細胞内コンパートメントが溶解され、または破壊されるような濃度でなければならない。
【００４７】
例えば本明細書での実施例で使用される光増感剤は、例えば10〜50μg/ml濃度で使用することができる。一般的にはインビトロでの使用で、その範囲はもっと広く、具体的には0.05〜500μg/mlである。インビボでのヒト治療で光増感剤は、全身投与で0.05-20 mg/kg 体重の範囲で使用することができ、あるいは局所投与については、溶媒中0.1-20％濃度で使用できる。より小さい動物では、濃度範囲は異なり、適宜調節することができる。
【００４８】
細胞と光増感剤とのインキュベーション時間（すなわち「接触」時間）は、数分間から数時間、具体的には48時間またはそれ以上と変わり得る。インキュベーション時間は、光増感剤が適当な細胞により取り込まれるような時間であるべきである。
【００４９】
細胞と光増感剤とのインキュベーションは、必要に応じ細胞が光に曝されるか、または移送分子が添加される前の光増感フリーの培地とのインキュベーション期間があとに続いてもよい。
【００５０】
移送分子は、上記の任意の核酸分子であり得るが、適当な濃度/投与量しかも適当な長さの時間で、ウィルスの担体に付随した細胞と接触させられる。ウィルスの担体の適当な濃度は、問題とする担体の問題の細胞内への取り込み効率ならびに細胞においてあるべき最終濃度に依存して、決定され得る。ウィルスの担体に関連してPCI使用の驚くべき利点の一つは、同じトランスフェクション効率を得るのにウィルス粒子の低い用量を用い得ることである。例えば20倍まで少ないウィルス粒子である。使用されるウィルス担体の適切な用量は、もちろん用いるウィルスのタイプ、さらにインビボでの適用のために投与様式、治療される疾患の種類またはターゲティング・リガンドを使用するか否か（下記を参照）などにも依存するであろう。典型的には非複製性アデノウィルスのベクターの腫瘍内注射に対し、一注射あたり103〜1013プラーク形成単位(pfu、伝染性粒子)が注入されるだろう。これは通常、約105〜1015ウィルス物質性粒子に相当する。これは「通常の」ウィルス調製物では、約1%のウィルス物質性粒子しか感染を引き起こさないからである。複製-コンピーテントウィルスについては、上記よりもっと少ない用量でも有効であり、具体的には103粒子より低い、例えば103〜106、1010または1015 粒子で使用されてもよい。他方、全身投与が使用される場合は、その用量を増すことが必要である。
【００５１】
観察されたさらなる利点は、大幅に改善されたトランスフェクション効能が達成され、トランスフェクションが行なわれている実験で、全細胞の100%までも達成された。既知の方法を用いてもそうしたレベルは、以前では可能ではなく、あるいは法外に高いウィルスの用量が要求された。したがって好ましくは、本発明の方法は全細胞の50%を超えて、とくに好ましくは 75％を超えて、85％または95％のトランスフェクションを達成する。
【００５２】
よって、ウィルスの担体について「トランスフェクション時間」または「細胞への取り込み時間」、すなわち細胞との担体の接触時間として、数分または数時間まであり得る。例えばトランスフェクション時間は、10分から10時間もしくは24時間まで、 例えば 15分から10時間まで、あるいは例えば15分もしくは30分から2、3、4もしくは6時間まで用い得る。増大したトランスフェクション時間は、問題の担体の取り込みの増加となり得る。
【００５３】
ウィルスの担体は、照射の前、後または照射と同時に適用してもよい。照射後に適用される場合、ウィルスの 担体は例えば、 照射後0〜4または0〜24 時間で適用してもよい。具体的には照射後1、2、4、8、10 または12時間より多くてもよい。必要に応じ、細胞は、ウィルスの担体と接触後で、例えば照射前に、具体的には15分〜2時間といった5分を超える時間、例えば30分間、担体フリーの培地へ移してもよい。照射前に適用されると、これは例えば、照射に先立って12時間、例えば照射に先立って15分〜2時間、必要に応じてある間隔で、ウィルスの担体フリーの培地中にあってもよい。
【００５４】
ウィルスの 担体と細胞との接触を通じてトランスフェクションに許される時間は、インビボでの適用において制御することは困難であることが認識されるだろう。しかしながら接触時間は、生体外、インビトロまたはあるタイプの局所投与で実施されるなら、適切な接触および洗浄工程により調整されるかもしれない。
【００５５】
導入される分子に付随した光増感剤およびウィルスの担体は、光処置/照射に先んじて、別個または一緒に細胞へ加えることができる。これは W096/07432、WO00/54802および本出願に付されて同時係属している出願（The Norwegian Radium Hospital Research Foundationの名において2001年11月29日に出願された国際特許出願、名称「方法」）に記載され、あるいはこの同時係属している出願に記載されているように、光増感剤は最初に細胞に加え、次いで照射工程が続き、その後ウィルスの担体の添加とすることもできる。後者の方法において、好ましくは照射は、移送される分子(ここではウィルスの担体)の細胞への取り込みの前に実施される。とくに好ましくは移送される分子は照射後に、具体的には、照射後、0〜4時間で細胞と接触させられる。あるいは細胞は、照射と実質的に同時刻に移送分子と接触させられる。
【００５６】
換言すると、照射に先んじて光増感剤が細胞内コンパートメントに取り込まれることを前提に、照射段階は、ウィルスの担体が任意の細胞内コンパートメント内に細胞取り込みされることに先だち、あるいはそのような細胞取り込みの後に実施することができる。
【００５７】
光増感剤およびウィルスの担体の両者は、光被爆の際に細胞の細胞内コンパートメント内に取り込まれていたならば、ウィルスの担体および光増感剤は、光の被爆のときに同一または異なる細胞内 コンパートメント内に局在していてもよい。細胞に種々の化合物を添加するタイミングについて詳細は先行技術文献、上記のW096/07432 およびWO00/54802または本明細書に付された同時係属出願に記載されている。その内容は本明細書に参照により取り込まれる。
【００５８】
いずれにせよ、ウィルスの 担体が細胞と接触させられ、細胞に取り込まれならびに内在化させる時間枠（time window）は、様々な因子、例えば細胞のタイプ、問題の特定担体、使用される特定の光増感剤および光処置の持続時間などに依存するかもしれない。この時間枠は、必要であれば、特別の条件の組について設定することができ、充分に当業者の範囲内にあるであろう。
【００５９】
ウィルスの担体が投与される時期は、該方法がインビトロまたはインビボで実施されるかによって変化するであろう。インビトロの方法に対し、ウィルスの担体は一般に標的細胞全部と同時に接触させることができる。すなわち投与時間を接触時間と一致させる、例えばもし細胞がインビトロの培養で成育しているのであれば、 該担体を適当な時点で細胞と接触させることは比較的容易である。しかしながらインビボでは、標的細胞をウィルスの担体と接触させる段階は明らかに一層込み入っており、投与様式、ウィルスの担体の種類および標的細胞の場所に依存するであろう。例えば、ウィルスの担体が標的細胞に、例えば注射によって、直接に投与され得る場合には、ウィルスの担体は比較的速やかに、具体的には投与後、数分または数時間のうちに標的細胞(または少なくとも、それらの一部)と接触するに至るであろう。
【００６０】
他方、ウィルスの担体が、遠くの標的に向け、静脈注射で投与されるのであれば、これらの担体は、標的細胞と接触するのにはるかに長い時間を要するかもしれない。例えば、標的細胞に到達するのに、投与後24〜96時間かかるかもしれない。この「行旅時間」は、光増感剤の投与および照射時間に関してウィルスの担体を投与する適切な時間を決定する際に考慮に入れなければならない。もちろん同じ配慮が、光増感剤が投与される時間についても適用される。しかしながら、移送分子のためと異なり、照射の充分前に、この増感剤は投与されるべきであり、それにより照射により該剤は細胞内コンパートメントにとり込まれることが重要である。よって好適には照射の1〜72時間前、具体的には照射の4〜72時間前、例えば4〜 48時間 または4 〜24時間前である。再び、ウィルスの 担体(したがって移送分子類)を細胞と接触させる段階に関連して上で論じたように、照射時点に関連して、光増感剤の投与タイミングは、光増感剤が標的細胞に到達し、それらに取り込まれるのにかかる時間によるであろう。その時間はインビトロまたはインビボで該方法が実施されるか、ならびに投与が標的組織に直接向けられるか、または近接部位であるかに依存して変化するかもしれない。あらゆる場合に、重要なことは、光増感剤は照射が起こる前に標的細胞によってとり込まれているということである。該剤は照射に至るまでに、具体的には1もしくは 4〜72時間、 好ましくは 4 〜24時間、例えば12〜20時間、該細胞とじかに接触したままでいることであり、あるいは具体的には5分間以上、例えば10分間〜8時間、例えば１時間〜4もしくは6時間、該剤フリーの培地 および/または移送分子を含有する培地内において、照射の直前に接触から解除してもよい。
【００６１】
インビボの状況はインビトロよりもさらに複雑であるけれども、本発明の基底にある概念は依然同一であり、すなわち投与回数は、照射が起こる前に光増感剤の適当な量が標的細胞と接触し、とり込まれるようなものでなければならない。 (i)照射の前もしくはその間に、移送分子 (およびそのウィルスの担体)が細胞にとり込まれるか、 または標的細胞と充分な接触の後で、光増感剤と同じまたは異なる細胞内コンパートメントとり込まれるだろう。あるいは(ii) 照射後、移送分子およびその関係するウィルスの担体は、該細胞と細胞内へその取り込みを許容するのに充分な時間、接触している。
【００６２】
必要に応じ、光増感剤は、１つ以上の担体分子、ターゲティング分子またはターゲティング・ベクターに結合しているか、付随するかまたは共役（複合化）していてもよい。これらの分子等は、光増感剤の取り込みを促進し、または増大するように作用することができ、あるいはこれらの実体を特定の細胞タイプ、組織または細胞内コンパートメントに向けるか送達するように作用することができる。担体系の例としてポリリジン(例えばポリ-L-リジンまたはポリ-D-リジン)、ポリエチレンイミンまたはデンドリマー（dendrimers）(例えばカチオン性デンドリマーSuperFect（R）または他のポリカチオン、硫酸デキストラン（dextran sulphate）、またはリポフェクション（lipofection）、DOTAPといった別種カチオン脂質またはDOPEといった「ヘルパー脂質」で編成したカチオン性脂質、リポソーム、再構成したLDL-粒子、立体的に安定化したリポソーム、または例えばアデノウィルス、レンチウィルスおよび他のレトロウィルス、アデノ随伴（adeno associated）ウィルス、バクテリオファージなどといったウィルス系に由来する異なる粒子が挙げられる。これらの担体系は一般に光増感剤の薬剤動態（pharmacokinetics）を改善し、該剤の細胞取り込みを増大させ、ならびに光化学的内在化を達成するのにとりわけ有益である細胞内コンパートメントに光増感剤を向けるようにすることができる。しかしその担体系は、通常、特定細胞(例えばガン細胞)または組織に狙って光増感剤を集中させる能力は有しない。
【００６３】
ウィルスの 担体は1以上の担体分子、ターゲティング分子またはターゲティング・ベクターに結合したり、付随したりまたは共役してもよい。あるいはウィルスの担体粒子表面の修飾のあるものは、本発明の使用にとり有益であり得る。
【００６４】
そのような担体の使用および/または表面修飾から生まれる潜在的な利点として、
(i) 通常は循環時間の増加によるウィルスのベクターの薬物動態および生体内分布における改善;
(ii)ウィルスがその本来のレセプターに結合する能力をカモフラージュして、そのウィルスを他のレセプターに再び差し向けることを可能とすること(および これにより通常では該ウィルスには感染しない組織);
(iii)ウィルスのベクター上に正の表面電荷を与えて、その元の感染機構によるよりもさらに広い範囲の細胞に結合し、ならびに感染することになる
(iv)ウィルス を免疫系から「隠す」こと。
【００６５】
好ましくは、ウィルスの担体は、担体分子、好ましくはポリカチオン(例えばポリリジンまたはSuperFect（R）)またはカチオン性脂質を含む担体に結合したり、付随したりまたは共役している。
【００６６】
この点について使用できる担体の例として、ポリカチオン (Lanuti M.ら (1999), Gene  Ther. 6,1600-1610; Arcasoy S. M.ら (1997), Gene Ther. 4,32-8; Dodds E. ら (1999), J. Neurochem. 72, 2105-2122) およびカチオン性脂質(Clark P. R.ら (1999) Cancer  Gene Ther. 6,437-446)が挙げられる。 この点について使用することが可能な表面修飾の例として: ポリエチレングリコール (Croyle M. A.ら (2000) Hum. Gene Ther. 11,1713-1722)、 およびポリN-（2-ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド(Poly-[N-(2-Hydroxy  propyl)-]methacrylamide)系ポリマー (Seymour, L.ら (2000) J. Gene Med. Suppl. to Vol 2 (5), p. 52) がある。
【００６７】
ウィルスの担体分子(したがって、また移送分子)および/または光増感剤の、特定の細胞タイプまたは組織への特異的または選択的なターゲティングを達成するには、移送分子の所望する細胞または組織中への特定の細胞取り込みを助長するような特定ターゲティング分子に、これらのものが付随するか、または共役することができる。そのようなターゲティング分子は、移送分子および/または光増感剤を、光化学的内在化を達成するのにとりわけ有益である細胞内コンパートメントに差し向けることもできる。
【００６８】
多くの異なるターゲティング 分子を用いることができる。例えばCuriel, D. T. (1999), Ann. New York Acad. Sci. 886,158-171; Bilbao, G.ら (1998), in Gene Therapy of Cancer (Walden ら, eds., Plenum Press, New York), Peng K. W. および Russell S. J. (1999), Curr. Opin. Biotechnol. 10,454-457, Wickham T. J. (2000), Gene Ther. 7,110-114に記載されている。
【００６９】
加えて、特定の担体にそれらを付けなければならないというよりは、 むしろ本発明の方法における使用に向いている光増感剤のあるものは、おのずと特定の組織部位に局在化する性癖を示すことが従来技術上、知られていることに着目することが重要である。例えば、ヘマトポルフィリン誘導体といったある種の光増感剤は、優先的または選択的に腫瘍組織または他の病巣に局在することが知られている。いくつかの他の例はBoyleおよびDolphin (Photochem. Photobiol. 64: 469-485 (1996))に記載されている。このような優先的局在化は本発明の方法の支配下になり得る。
【００７０】
ターゲティング分子は、ウィルスの 担体に、光増感剤にまたは両方に付随し、結合しまたは共役してもよく、ならびに同一または異なる担体またはターゲティング分子を使用してもよい。
【００７１】
上述したこのようなターゲティング分子または担体は、ウィルスの 担体または光増感剤を、特定のとりわけPCIの使用に有益である細胞内コンパートメント、例えば リソソーム またはエンドソームに差し向けるために使用することができる。
【００７２】
細胞内コンパートメントから移送粒子を放出する照射段階が起こるならば、移送分子は細胞の細胞質内においてウィルスの担体と付随して当初はとどまると考えられている。移送粒子が細胞の細胞質中に内在化されると、生起する事象は選ばれたウィルスの担体系に依存するであろう。例えば、アデノウィルスの場合、アデノウィルス粒子(移送分子と付随している)は、通常は核のほうへ遊走するが、その後ウィルスのDNA(ならびにこれより「核酸」移送分子)は、細胞の核内に移行する。いずれにせよ、光化学的内在化およびおそらくウィルスの担体に依存する後続の事象の後に、「核酸」移送分子がウィルス粒子または担体中に取り込まれると、該核酸分子は細胞内の正しい場所に存在するはずであり、よって適切な細胞内プロセッシングが生起し、導入された移送分子がその望みの機能を遂行できるようになる。例えば、移送分子が、望みのタン白質をコードするのであれば、このタン白質の発現に至るプロセッシング段階が求められる。もし移送分子がアンチセンスRNA分子をコードするDNA分子であるならば、DNAからRNAの転写に至るプロセッシング段階が求められ得るなどである。
【００７３】
光増感剤を活性化するための光照射段階は、従来技術上、公知の技術および手順に従って起こしてもよい。例えば、光の波長および強度は使用する光増感剤に応じて選択することができ、好ましくは300-800nm、例えば 500-700 nmの波長で、４０〜２００ジュール／cm2、例えば１００ジュール／cm2の線量レベルで適用される。適切な光源は公知である。
【００７４】
細胞が光により曝される時間および本発明の方法において使用される光線量は変動する。一般に、適切な照射時間および光線量については、光増感剤を含有する細胞内コンパートメントの破壊ならびに後続する移送粒子の細胞質中への取り込み および/または放出を可能とするように、当業者が選択する。移送粒子の細胞質中への内在化の効率は、光への被爆の増加とともに上昇するようである。照射段階の時間の好ましい長さは、光増感剤、標的細胞または組織に蓄積された光増感剤の量および光増感剤の吸収スペクトルと光源の発光スペクトルとの間の重複に依存するものである。一般には、照射段階の時間の長さは、数分間から数時間のオーダーにあり、好ましくは60分間まで、具体的には0.5もしくは1分間から30分間、例えば10分間または15分間まで、あるいは0.5〜3分間または 3 〜10分間、ならびに好ましくはおおよそ7間分、例えば6〜8分間である。適切な光線用量も当業者によって選択され得るが、これもまた、光増感剤、標的細胞または組織に蓄積された光増感剤の量に依存する。例えば、光増感剤のホトフリン（Photofrin）およびプロトポルフィリン前駆体の 5-アミノレブリン酸を使用するガンの光線力学治療に使用される典型的な光線量は、高熱症を避けるために、200 mW/cm2未満のフルエンス範囲で 50〜150 J/cm2の範囲にある。可視スペクトルの赤領域においてより高い吸光係数を有する光増感剤を使用する場合、光線量はずっと低い。しかし、より少なく蓄積された光増感剤を用いる非ガン組織の治療には、必要とされる光の総線量はガン治療用よりもはるかに高い。
【００７５】
本発明の方法は、光化学処置のために、すなわち光増感剤の作用により不可避的に殺細胞が多少生起するであろう。しかし、この細胞死は問題となることはなく、多数の応用について、例えばガン治療のためには、実際には有利であるかもしれない。ある場合には、局所の免疫応答を刺激することにより治療効果を増強するであろう。しかしながら、本発明の方法は、光増感剤の濃度に関連して光量を選択することにより、生存する細胞の比率または割合を調整するように修飾することもできる。またそのような技法は、当業界では公知である。純粋に光化学的処置により誘導された細胞死の量に関係なく、PCI効果が出現するような個体の細胞群のあるものが、純粋な光化学的処置によっては殺されないように光線量を調節することは重要である（もっともそれらの細胞は結果的にPCI効果のために殺されるかもしれない）。
【００７６】
ある応用では、PCI治療後に大多数の生存細胞を保持することが適切であろう。例えば、ある遺伝子治療の方法では、移送核酸分子によりコードされるタン白質の発現をもたらす生存細胞の量が重要である。そのような応用において、複数の細胞または細胞の集団、あるいは実質上すべての細胞、あるいは著しく大多数（具体的には、細胞の少なくとも50％、より好ましくは少なくとも60、70、80もしくは90％）が殺されないですむことが適当である。このことは、もちろん、特にPCIが細胞傷害性の移送分子を導入するために使用され、さらに殺細胞が不利ではない場合には必ずしも望ましくない。しかし細胞毒性効果は、例えば治療遺伝子が本発明の方法によりガン細胞内に内在化させられ、その結果、これらの細胞は、残りのガン細胞を殺傷する局部免疫を誘導する免疫活性物質か、あるいはガン細胞に対し全身的な免疫応答を誘導する免疫活性物質を産生するであろうという遺伝子治療を用いることにより達成することができる。このような場合、明らかにPCI処置後、ある割合の生存細胞が求められる。
【００７７】
ウィルスの担体に付随して移送分子を内在化させるPCI法に関係した有利な点として、
1)移送する分子が、ウィルスの担体に取りこまれ、該担体が標的細胞により取りこまれ得るかぎり、細胞内に導入される分子のサイズに制限を付さない。
2)該方法は、光に曝される部分のみが影響を受ける意味において部位特異的である。
3)ウィルスの担体の内在化は、移送分子が導入される細胞の比率、および/または移送分子の発現レベルに関して、標準的なウィルス感染よりもさらに効率的である。
4)増加した内在化効率のためにウィルスのより低い用量および力価が要求される;
5）腫瘍形成性ではない。
【００７８】
光照射段階の後、移送分子(および そのウィルスの 担体) が細胞に添加される態様では、さらに以下の有利なことがある。
a)移送分子およびそのウィルスの担体に対する光化学的損傷が減少する;
b) 光化学的治療以降に手術と組み合わせて内部病巣のPCI治療の単純化は、病巣を外科的被爆（surgical exposure）、次いでウィルスの担体(およびその関連した移送分子)の腫瘍内注射または他の局所的投与の後に達成できる;
c) 該方法は、照射の時点に関して、処置の正確なタイミング、すなわち細胞により取りこまれる分子を添加するタイミングは、より依存しない。このことは、処置のより大きい「時間枠（time window）」があることを意味する。このことは次の理由から重要である。様々な臨床的状況において治療用分子の取り込みは大幅に変化し、さらにある臨床状況において個々の病巣につきその取り込みを見積もることは困難である。このことから、時間枠をより大きくすることは、大変な利点となるからである;
d)  移送分子の細胞質への急速な転位が起こり、それによりリソソームによる移送分子分解の可能性が実質的に減少する。
【００７９】
本発明の方法は、分子を細胞内に導入するために、リポソーム融合、 リン酸カルシウムトランスフェクションなどといった上記従来技術の代替法として用いることができる。本発明の好ましい態様では、遺伝子治療の目的で細胞内に分子が導入される。
【００８０】
遺伝子治療は、多くの戦略を介して行なわれるが、当業者は、疾患の特定の病因に応じて、それらの中から最も適切なものを選択することができる。一つのアプローチは特定細胞を標的とした殺傷を含むものである。このアプローチは、ガン治療に行きわたっており、標的細胞に向けられ細胞殺傷を引起すように発現する遺伝子を含む。かかる細胞殺傷は、直接的な機構によって起こり得るものである。例えば、導入された遺伝子が、致死的な毒素をコードするか、あるいは後に投与される薬剤による殺傷に対し、ある感受性を細胞に付与するプロドラッグをコードする場合である。あるいはその細胞殺傷は間接的でもあり得る。例えば、免疫刺激遺伝子を標的細胞に対する免疫応答を誘発するか、 または増強するために導入遺伝子として用いることによるか、あるいは外部から加えられた分子との相互作用により細胞死を招くタン白質をコードする遺伝子を用いることによる (具体的には、 GCVを賦活したHSV-tkといったプロドラッグを活性化する酵素をコードする遺伝子)。 適当な自殺遺伝子（suicide genes）、プロドラッグをコードする遺伝子および免疫刺激性の遺伝子は、周知であり技術文献化されている。
【００８１】
さらなるアプローチは、遺伝子発現の阻害の標的化を含む。DNA、 RNAまたはタン白質レベルで遺伝子発現を特異的にブロックする多種多様な技術が、当業者に知られており、これらの技術のいずれも本発明の方法と結び付けて用いることができる。該方法は、遺伝子発現をブロックするための適当な分子ツールを細胞内に導入するために使用され得る。したがって、本発明の好ましい観点において、導入される該分子は、標的細胞におけるあるレベルで遺伝子発現を阻害する機能的生成物を含むか、あるいはそれを転写もしくは発現できるDNA 配列を含む。具体的にはアンチセンス分子、リボザイム、または細胞内抗体を含むか、または発現もしくは転写することによる。
【００８２】
別のアプローチは、遺伝子付加の治療を含む。ある疾患状態がある遺伝子の機能の喪失により引起され、その疾患は正常遺伝子の剰余コピーを患者の適当な細胞内に導入することにより治癒されるような場合である。かくして本発明のさらに好ましい特徴において、 導入される該分子は、患者に不足して補償すべき機能性生成物を発現することができる遺伝子またはその一部である。さらに別のアプローチは、突然変異の修正を標的とすることであり、患者の適切な細胞中にある核酸を導入して、その患者のDNAにおいて疾患の原因となる突然変異を直接修正に導くものである。これを行なう方法は周知であり、技術上記載されている。
【００８３】
本発明の方法に従って、細胞内への核酸/遺伝子の 移送に引き続き、挿入された遺伝子/核酸は、宿主細胞の染色体へ組み入れられるか、または染色体外遺伝因子としてとどまる (すなわちエピソームとしてとどまる)。適切なベクターが選択され、これらの可能性のいずれかを誘導するように設定することができる。
【００８４】
染色体中に組み入れられる導入された遺伝子の利点は、該遺伝子が、細胞分裂の後、染色体の複製により永続して残り（perpetuate）得るということである。娘細胞もまた導入された遺伝子を含むため、その導入遺伝子の長期にわたる安定発現が得られる。結果的に、このアプローチを用いる遺伝子治療は、ある疾患に対する治療の可能性を提供することができる。例えば、活発に分裂している細胞からなる組織において、その狙いは幹細胞 (組織の分化した成熟細胞を生じる、未分化の前駆体細胞の少数集団)を標的とすることでもよい。
【００８５】
しかしながら、染色体への編成は不利な面もあり、充分に記載されているが、具体的には、例えば腫瘍遺伝子の活性化に至る偶発的な組み込み事象により、ガンの進行の危険を伴うものである。
【００８６】
標的細胞が患者から取り出され、インビトロで処置され、次に患者に再び導入されるという生体外遺伝子治療は、組み込みがうまく起こっている細胞を選別する機会を提供する。例えば、細胞をインビトロで増幅し、次に該細胞を患者に戻す前に、新生物の形質転換についての明らかな証拠のために表現型をチェックすることによる。かくして生体外治療は、染色体組み込みが望まれるときには好ましいかもしれない。
【００８７】
あるいは導入される遺伝子/核酸を取り込んでいるベクター系は、細胞に遺伝子を導入して、染色体外遺伝子因子としてとどまり、高レベルで発現できるように設計することができる。その細胞が活発に分裂しているならば、該導入遺伝子は、娘細胞に均等に分割されないために長期の発現は課題となるであろう。結果的には、遺伝子移送を含む処置を繰り返すことが、遺伝的疾患の治療を施すためには必要かもしれない。しかしながら、この点において、反復処置を実施する可能性は、遺伝子（下記参照）のより高い効率で標的化された移送を可能とする、今回のPCIを基礎とする移送の方法とともに増大する。
【００８８】
加えてある場合には、安定な長期発現の必要性はない。例えば、ガンの遺伝子治療は、しばしば殺細胞の観点で遺伝子のガン細胞中への移送および発現を含む。そのような方法では、一旦ガンが除去されたなら治療用遺伝子はもはや必要とされることはない。
【００８９】
上述のように本発明で使用される適切なウィルス系は、アデノウィルスおよびアデノ随伴ウィルス、レトロウィルス、レンチウィルス、ヘルペスウィルス、センダイウィルス、バクテリオファージ、ワクシニアウィルスおよびバキュロウィルスである。レトロウィルスは、染色体DNA中に組み入れることができるという有利な特質を有するが、活発に分裂している細胞だけに感染する。組み入れられたDNAは安定的に伝播し、疾患の永久治癒の可能性を提供する。活発に分裂している細胞だけに感染するという特質は、多くの疾患の治療には不利ではあるけれども、通常は非分裂細胞をも有する組織のガンに対する遺伝子治療には有益である。これは、正常組織の分裂していない細胞には大してリスクがなく、活発に分裂しているガン細胞が選択的に感染し、殺傷されるためである。
【００９０】
アデノ随伴ウィルスは、繁殖性の感染、すなわち子孫のビリオンの産生となる感染のためには、アデノウィルスまたはHSVといったヘルパーウィルスとの同時感染を要求する。しかしながらヘルパーウィルスがなくてもそのDNAの染色体組み入れは起こる。よって、関心をもたれる応用に依存して適切なタイプのアデノ随伴ウィルス  ベクターを選択することができる。
【００９１】
他方アデノウィルスは、非分裂細胞にも感染する。細胞中への進入は、レセプター介在のエンドサイトーシスによって起こり、挿入核酸は核の方へ遊走するが組み入れられないようであり、このため挿入遺伝子の発現は短期間持続するのみである。アデノウィルスベクターは極めて高い力価で製造することができ、典型的には7-8 kbまでのサイズのインサートを受け入れるが、最近のアデノウィルスベクター技術の進歩により、特別に設計されたベクターにおいては約30 kbまでのサイズのインサートの使用を許容する (Kochanek (1999), Hum.Gene Ther. 10,2451-2459)。アデノウィルスは、多数の異なるタイプの細胞に感染することができることから、広範な応用の途が開けて、インビボの遺伝子治療の戦略に使用される人気のあるベクターである。実際、アデノウィルスは、本発明の方法に使用される好ましいウィルスの 担体である。
【００９２】
しかしながら、アデノウィルスは、インビボの遺伝子送達用の最も効率的な ベクター類に入るが、それらの使用は、いくつかの深刻な問題、例えばそのウィルスに対する免疫的反応、一時的な遺伝子発現および標的組織への低い形質導入効率となる良くない組織分布によって複雑になっている。標的細胞へのアデノウィルスにより送達される治療用遺伝子の発現を制限する能力もまた扱いにくいが、不利な副作用を回避するためにはきわめて重要になるかもしれない。例えば、身体の正常細胞、具体的には肝臓といった重要器官において有害な遺伝子産物の発現 (具体的にはガン細胞を殺傷することを意味する) による副作用である。遺伝子治療において他のウィルスの担体の使用にも同様の欠陥がある。
【００９３】
本発明の方法と結びつけた光化学的内在化の使用は、これらの問題のいくつかを改善することができる。最初にPCIの使用は、標的組織における導入遺伝子（transgene）発現の レベルおよび程度を著しく増大することができる (すなわち、導入遺伝子の高レベルの発現をしている細胞をより多数にする)。加えて、PCIはウィルスの感染効率を増大させることが示され、その結果、PCIがない場合に見られる遺伝子の形質導入の同等量を生み出すのに必要とされるウィルスの使用量を著しく低減させる。感染効率（multiplicity of infection；MOI）のより低い値で、PCIにより増強されたウィルス感染のこの効率は、ウィルス透過が低い組織領域におけるウィルスの 形質導入を可能とし、これによりウィルス粒子の受け入れが極めて少ないために通常の感染では有効に形質導入がなされない領域でも形質導入を可能となる。局所投与により組織のウィルス濃度は、その適用位置から距離が離れるにつれ、急速に低下することが想定されるため、このことはウィルスの感染技術において極めて重要な改善である。
【００９４】
ウィルス感染の PCI 誘導による効率上昇についてさらなる利点は、形質導入の効率を維持したまま、より低いウィルス投与量を使用できることであり、このためアデノウィルスおよび他のウィルス介在の遺伝子治療に関係した免疫学的問題が軽減される。最後に光化学的治療は、標的細胞に対する感染の特異性を増大するために使用できる。これは、第一には照射域だけがPCIの対象となるためであり、ならびに第二には光増感剤のあるものが、性癖上好んで疾患領域に蓄積するためである。
【００９５】
治療用遺伝子の活動を、単に光をその疾患域に照らすだけで疾患部位に差し向ける能力は、本発明のきわめて有望な面である。これは、身体の「誤った」場所で該治療用遺伝子が発現することによる望まない副作用を回避することを大いに可能とするものである。遺伝子治療剤のより低い投与量での使用を可能とするPCI の能力は、副作用を低減することにも寄与する。得られる特異性により、アデノウィルスおよび他のウィルスの担体の全身投与が実現可能となることが期待される。さらに上述のように、PCIは標的ベクターと組み合わせることができ、これにより遺伝子送達の特異性をさらに向上させる可能性がある。
【００９６】
前にPCIの応用で論じたように、PCIによるプラスミド/ポリリジン複合体へのトランスフェクション増強効果、ならびにタン白質といった他の分子の送達への増強効果は、エンドサイトーシス小胞の光誘導性崩壊によるものであると信じられている。さらに、理論に拘泥するわけでないが、同様の機構がアデノウィルス介在の遺伝子の形質導入の刺激にも関わっていることは妥当であるようだ。しかしながらプラスミド/ポリリジン複合体およびタン白質といった他の分子とは対照的に、エンドソームからのアデノウィルスの脱出は、効果的な過程であると信じられている。細胞に結合したウィルス粒子の４０％を超えるウィルス粒子が、細胞核に到達することが報告されている(Greber, U.F.ら(1993),Cell 75,477-486;Leopold,P.L.ら(1998),Hum.GeneTher.9,367-378)。したがって、文献に記載されていることからは、PCIは細胞に結合したウィルス粒子全部が核へ移送されることを誘導できるなら、PCIはせいぜいアデノウィルスの遺伝子形質導入の効率を2.5倍上昇させることを予測するであろう。それゆえ、遺伝子形質導入においてPCIにより誘導された増強が20倍を超えて観察されたことは極めて驚くべきことである。この予想外の著しい効果について我々は目下、良い説明を持ち合わせていない。一つの可能性は、PCIを受けたウィルス粒子は、正常の感染におけるウィルスよりも、より高い「本来的な形質導入の効率」を有するかもしれないことである。それは例えばエンドソームからの異なる放出機構によるものである。また正常な感染において、アデノウィルスのエンドソーム放出は、PCIが最高の作用を示す低いMOI(multiplicity of infection)で、低効率であることも考えられる。さらに光化学的処置がウィルス取り込み、核への輸送または導入遺伝子の転写といった他の過程に影響を与えることもあり得る。本発明のさらなる面から、ウィルスの担体および光増感剤に付随した移送分子を含む医薬組成物、好ましくは治療用の医薬組成物が提供される。必要に応じ、上記組成物中の光増感剤もまた、ウィルスの担体分子または他の非ウィルス性の担体分子、例えば上記の分子に付随していてもよい。
【００９７】
好ましくは、そのウィルスの担体自体も1つ以上の担体分子類(好ましくは、ポリカチオンまたはカチオン性脂質)、ターゲティング分子またはターゲティング・ベクターに付いているか、付随しているかあるいは共役していてもよい。所望により、上記のようにウィルスの担体および光増感剤の一方または両方とも、同一または異なるターゲティング分子に付随していてもよい。本組成物は、好ましくは遺伝子治療に使用されるものである。遺伝子治療用に好ましいウィルスの担体分子は、アデノウィルスまたはそれに由来するウィルスの担体である。遺伝子治療にとりわけ好適である病態、疾患および感染として、ガン性の腫瘍、例えば基底細胞ガン、形成異常または他の新生物、慢性関節リウマチ、関節硬化症（artherosclerosis）、ウィルスおよび他の感染、乾癬（psoriasis）、日光角化症（solar keratosis）、外傷治療、骨折治療、嚢胞性線維症（cystic fibrosis）、ゴーリン（Gorlin）症候群、毛細管拡張性運動失調（ataxia telangiectasia）といった小隆起（warts）および継承される遺伝疾患および代謝異常が挙げられる。
【００９８】
遺伝子治療用に移送分子として使用できる好ましい遺伝子は、ヘルペス Simplex チミジンキナーゼまたはシトシンデアミナーゼ といった遺伝子がコードするプロドラッグ活性化酵素; ジフテリア毒素またはゲロニン（gelonin）といったタン白質毒素、 p53またはアポポプチン（apopoptin）といったアポトーシス誘導タン白質; インターロイキン(好ましくはIL-2、 IL-12、 IL-18 )といった免疫刺激因子、腫瘍壊死因子α、ケモカイン、変異ras タン白質または Mart-1といった腫瘍特異抗原; インターロイキン-10、 IL-1  受容体拮抗剤といった免疫/炎症阻害剤または可溶性TNF-レセプター; エンドスタチンといった血管新生阻害剤; 血管内皮増殖因子といった血管新生誘導タン白質; 組織因子といった血液凝固開始タン白質; 細胞内抗体; 組換え免疫毒素; リボザイムまたはアンチセンスRNA分子などである。
【００９９】
したがって本発明のさらなる面から、本明細書で治療、好ましくは遺伝子治療に使用する医薬の製造に記載したようにウィルスの 担体および光増感剤に付随した移送分子の使用を提供する。その使用のため、移送分子に付随している光増感剤およびウィルスは、適当な投与回数を選択することにより患者の細胞もしくは組織と一緒にまたは別個に接触させられる。該細胞は光増感剤を活性化するのに有効な波長の光で上記のように照射される。
【０１００】
本発明の方法を含む治療方法ならびに好ましくは遺伝子治療の方法は、本発明の別の面を形成する。よって本発明は、患者の疾患、 障害または感染を遺伝子治療によって治療するまたは予防する方法を提供する。該遺伝子治療は、移送分子を１以上の細胞中に、インビトロ、インビボまたは生体外で、上記に記載の方法に従って導入することを含み、必要であれば、(すなわち、トランスフェクションがインビトロまたはエックスビボ（ex vivo)で実施される場合） 該患者に該細胞を投与する。
【０１０１】
本明細書で定義される「治療」は、治療前の症状に関して、治療される１以上の疾患、障害または感染の症状を軽減し、緩和しまたは取り除くことをいう。「予防」は、疾患、障害または感染の症状の始まりを遅らせる、または防止することをいう。
【０１０２】
本発明の組成物は、本発明の方法、 好ましくは治療、とりわけ遺伝子治療に使用される方法により細胞に導入される移送分子を含む細胞または細胞集団を含んでもよい。したがって、本発明の別の面から、その中に導入する移送分子を含む細胞または細胞集団を提供し、その細胞は本発明の方法によって得られる。本発明のさらなる面から、治療、とりわけ遺伝子治療に使用される組成物もしくは医薬の製造のためにそうした細胞または細胞集団の使用が提供される。本発明はさらに患者の治療方法を提供する：該患者に本発明の細胞または組成物を投与することを含む。該方法は、遺伝子治療において使用されるのが好ましく、すなわち上記のように細胞内に分子を導入する段階を含み、このようにして調製された細胞を該患者に投与することを含む方法である。
【０１０３】
インビボで、ウィルスの担体、 光増感剤、 移送分子を含む細胞、組成物などのどのような投与様式も、当業界で共通であるか標準であり使用できる。具体的には、筋肉内、皮下、腹腔内、腫瘍内または静脈内注射、注入、吸入（inhalation）または局所投与、身体の内部か外部表面などに対する。インビボでの使用について、本発明は、光増感剤およびウィルスの担体を局在化させる細胞を含む任意の組織、 固形組織ばかりでなく体液の場所を含めて、任意の組織に関して使用することができる。標的細胞により光増感剤が取りこまれ、ならびに光が適切に届き得る限り、あらゆる組織を処置することができる。光の到達に関して、ヒトまたは動物の体の外部表面については、明らかにこのことは問題を何ら提起しない。内部の表面については、例えば光ファイバー装置を用いるといった技術が、内部の多くの表面を有効に照射するために使用することができる。加えて処置すべき必要のある表面を露出させる手術と組み合わせて該処置を行うことができる。
【０１０４】
かくして、本発明の組成物は、１種類以上の製薬的に許容される（すなわち、投与される者に生理的に受容できるばかりでなく、組成物にある他の成分と共存できる）担体または賦型剤を用いて、当業製薬界において公知の技術および操作に従い、従来の任意の方式にて製剤することができる。本組成物の性格、および担体または賦型剤の材料、用量などは、選択ならびに所望する投与経路、処置の目的などに応じて通常の方式で選択することができる。本発明の組成物は、他の適切な作用剤も含んでもよい。例えば、 何らかの治療上の応用およびある投与経路のために、例えばウィルスの担体の組織透過を増大させ得る作用剤、例えばプロテアーゼを使用することは有益であるかもしれない (Kuriyama、N.ら, 2000, Hum. Gene. Ther. 11: 2219- 2230)。
【０１０５】
本組成物は局所的（例えば経腸、頬（buccal）、舌下、歯肉、口蓋の、鼻腔、肺、膣、直腸または眼球からの送達）、経口的または全身的に投与できる。局所用組成物が好ましく、ゲル剤、クリーム剤、軟膏剤(ointments)、スプレー剤、ローション剤、ロウ膏剤(salves)、スティック剤、石鹸剤、散剤、錠剤、フィルム、膣坐剤、エアゾル剤、滴剤、液剤および当該技術分野における従来型製薬形態が挙げられる。
【０１０６】
軟膏剤、ゲル剤およびクリーム剤は、例えば水性基剤または油性基剤を用いて、好適な増粘剤および／またはゲル化剤を添加して処方することができる。ローション剤は、水性または油性基剤を用いて製剤することができ、通常、１種以上の乳化剤、分散剤、懸濁化剤、増粘剤または着色剤を含有する。散剤は、好適な粉末基剤を用いて製剤することができる。滴剤および液剤は、１以上の分散剤、可溶化剤または懸濁化剤をも含む水性または非水性の基剤を用いて製剤することができる。エアゾルスプレー剤は、好適な噴射剤を用いて、加圧包装から放出させるのが都合がよい。
【０１０７】
あるいは、本発明の組成物は、経口的または非経口的投与に適した形態にて提供することができる。したがって、別の製薬形態として、無被覆錠剤または被覆錠剤、カプセル剤、懸濁剤および溶液剤が挙げられ、これらは、活性成分と、必要に応じて従来の１種類以上の不活性な担体および／または希釈剤、例えば、コーンスターチ、ラクトース、スクロース、微晶性セルロース、ステアリン酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、クエン酸、酒石酸、水、水／エタノール、水／グリセロール、水／ソルビトール、水／ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、ステアリルアルコール、カルボキシメチルセルロースまたは硬化脂肪などの脂肪物質またはそれらの好適な混合物とを含有する。
【０１０８】
本発明の組成物は、さらに潤滑剤、保湿剤、乳化剤、懸濁化剤、保存剤、甘味剤、香味剤、吸収促進剤、例えば後述するような表面浸透助剤などをさらに含んでいてもよい。本発明の組成物は、当該技術分野で公知の操作を採用することによって、患者に投与した後に、活性成分の素早い放出、徐々の放出または遅れた放出を与えるように製剤することができる。また、可溶化剤および／または安定化剤、例えばα、β、γおよびHP-βシクロデキストリンなどのシクロデキストリン類（ＣＤ）を用いることもできる。
【０１０９】
本組成物の投与量もまた、定式化された方式で決定することができ、分子の性質、治療目的および患者の年齢、投与様式などに依存する。光増感剤に関しては、照射に基づき膜を破壊する可能性/能力もまた考慮に入れなければならない。しかし一般的には、インビトロ利用のためには、光増感剤の濃度範囲は、0.05-500μg/mlが適当である。ヒトのインビボ処置のためには、光増感剤は、全身的に投与する場合、0.05-20 mg/kg 体重の範囲、あるいは局所投与には溶媒中、0.1-20％が使用される。より小さい動物において、その濃度範囲は異なり、適当に調整することができる。
【０１１０】
インビボでの使用のための最終組成物において、ウィルスの担体に付随した導入分子は、ウィルス粒子の濃度で1ｘ10-9〜50%、具体的には3ｘ10-6〜50%、例えば0.003〜30%、例えば0.2〜10%(w/w)で使用してもよい。ここでw/wは、最終組成物の重量について、導入分子に加え、ウィルスの 担体の重量のことをいう。もし、1mlの注射液を使用するなら、これはおおよそ105〜1015の物質としてのウィルスの粒子の用量に相当する。インビトロの使用には、1〜1x105 ウィルスの粒子、例えば1ｘ103〜1ｘ105が使用されてもよい。
【０１１１】
次に、本発明を添付の図面に関して以下の実施例により詳細に説明するが、これらにより本発明は限定されない。
【実施例１】
【０１１２】
最初の実験において、ヒトWiDr腺癌細胞を、光増感剤AlPcS2a（隣接した環に2つのスルホン酸塩基を有するアルミニウムフタロシアニン）で処置し、β−ガラクトシダーゼ・レポーター遺伝子を含むAdHCMV-lacZアデノウィルスで感染させ、実験手順に記載したように光処理を施した。前記細胞をβ−ガラクトシダーゼ活性について染色し、顕微鏡検査から光処理した細胞の相当部分が導入遺伝子を発現したことが示された（図1D）。一方、非照射のアデノウィルス感染細胞の中では２〜３の陽性細胞を検出しただけであった（図1B）。未処置の試料中（図1A）またはAlPcS2aと光とを受けたがアデノウィルスのない試料（図1C）においては、陽性細胞は見当らなかった。よって、光が誘導した、β−ガラクトシダーゼ発現の観察された増加は、アデノウィルスが送達した導入遺伝子に由来し、内因性β−ガラクトシダーゼ遺伝子からは起こらなかった。
【実施例２】
【０１１３】
定量分析のために、β−ガラクトシダーゼ発現細胞を蛍光性にする基質、フルオレセイン-ジ−β−D−ガラクトピラノシドを使用してフローサイトメトリーを行なった。図2Aからわかるように光化学処置は、アデノウィルス感染HCT116細胞のβ−ガラクトシダーゼ活性を充分に増加させた。よって、β−ガラクトシダーゼ陽性細胞の割合は、普通に感染した細胞（Ad+、S-、0分間光照射）の6.3±0.1％（標準偏差、n=3）から、最善の処置を受けた細胞（Ad+、S+、8分間光照射）の88±17％（n=3）まで増加した。同様に同じ試料について、平均蛍光強度は、52±11％（n=3）相対蛍光単位（RFU）から632±163％（n=3）RFUまで増加した。光化学処置はまた非感染細胞の平均蛍光を6RFUから12RFUまでわずかに増加させた（図2A、一番上の図と一番下の図）。しかしながら、蛍光発光および陽性細胞のレベルが著しく低いことから（Ad-、S+、8分光照射の試料で0.4％）、これはウィルス感染細胞についての結果を解釈することにおいて困難をきたすものではなかった。
【０１１４】
WiDr結腸ガン細胞では、遺伝子形質導入のより高い光依存性の増大すら観察された（図2B）。よって、光照射されたウィルス感染細胞を非照射の細胞と比較すると、β−ガラクトシダーゼ陽性細胞の割合が最大にして22倍増加し、また44倍の平均蛍光強度の増加が見出された。光化学処置のみ（図2B、Ad-、S+、▲）では、陽性細胞の割合に有意の変化はなく、光照射のみでもそうであった（図2B、Ad+、S-、□）。
【０１１５】
フローサイトメトリーの結果を、WiDr細胞からの抽出物について化学ルミネセンスβ-Galレポーター遺伝子アッセイキット（Roche社、Cat. No. 1 758 241）を用いて確認して、光化学処置の結果として30倍のβ−ガラクトシダーゼ活性の増加が示された（非表示）。
【実施例３】
【０１１６】
次に我々は、光化学的に増強された形質導入効率に与えるウィルス投与量の効果を研究した。図3から明らかなように、光化学処置は、テストしたすべてのウィルス投与量で形質導入を増加させた。しかしながら、その効果は低いウィルス投与量（MOI（multiplicity of infection）が1および5）でより著しかった。これらのウィルス量で、MOI 20と50でのそれぞれ約10倍と5倍の増加と比較して、15倍と35倍との間の平均蛍光発光の増加が観察された（図3B）。MOI 5での最適な光投与量（7分）で得られた平均蛍光発光が、MOI 50での光処理せずに観察されたレベルの約2倍であることもわかる（図3A）。同様にMOI 1で光処理により達成されたレベルは、光処理しないMOI 20の場合とほぼ同じである。よって、光化学処置をしない感染と同じ遺伝子形質導入を与えるためには、最適な光化学処置により20倍低いウィルス投与量で充分である。
【０１１７】
この実験においてMOI 50で得られたβ−ガラクトシダーゼ陽性細胞の割合は、非照射の細胞の13±4％（n=3）と比較して、90±3％（n=3）であった。上記のHCT 116細胞についての結果と併せると、これはアデノウィルスPCIにより全細胞集団を形質導入できることを示す。
実験手順
細胞およびアデノウィルス
HCT 116およびWiDrヒト結腸ガン細胞を、米国菌培養収集所（American Type Culture Collection）から得た（それぞれ受託番号CCL-247およびCCL-218）。10％ウシ胎児血清、100U/mlペニシリン、100mg/mlストレプトマイシンおよび2mMグルタミン（すべてGibco BRL, Paisley, 英国）を含むRPMI 1640培地中で37℃、5％CO2雰囲気中で、細胞を培養した。
【０１１８】
ヒト・サイトメガロウイルス  プロモーターにより制御された大腸菌 lacZ遺伝子をコードする組換えアデノウィルスAdHCMV-lacZが、293細胞中のpJM17系を用いた相同組換えによって得られた（Addisonら, 1997, J.Gen.Virol. 78:1653-61）。組換えベクターを、プラーク（plaque）精製し、293細胞中で高タイター（titer）まで成長させ、CsClバンド形成により精製した（Hittら, 1995, Methods Mol. Genet. 7:13-30）。ウィルス溶液は、0.68mMのCaCl2および0.5mMのMgCl2を含むPBS中に、別の実験で用いられたMOIまで希釈した。
光化学処置
穴（well）当たり50,000個の細胞を6穴プレート（Coster,）中に播種し、37℃で一晩培養した。20mg/mlのAlPcS2a（Phorphyrin Products, Logan, UT）を含む培地1mlを添加し、該細胞を18時間37℃で培養し、培地で3回洗浄し、もう3時間37℃で培養した。培地を除去し、AdHCMV-lacZを200μl添加した。30分間37℃で培養した後、培地2mlを添加し、細胞を30分間培養して赤色光（Phillips TL 20W/09, Cinemoid 35フィルター）を通して濾光した, 13.5W/m2の細胞到達光強度を有する）に暴露した。β−ガラクトシダーゼ活性の分析前に該細胞を37℃で2日間培養した。
細胞のX-gal染色
X-gal（5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−β−D−ガラクトピラノシド）染色のために培地を捨て、固定液（0.05％グルタルアルデヒドPBS溶液）1mlを添加し、細胞を室温で15分間培養した。固定液を捨て、細胞をPBS中、室温で3回洗浄した（2回目のリンスは10分間、1回目と3回目を迅速に実施した）。X-gal溶液（5mMのK3Fe(CN)6、5mMのK4Fe(CN)6、1mMのMgCl2、1mg/mLのX-gal）1mlを添加し、細胞を4時間から一晩37℃で培養し、MC100スポットカメラ（Zeiss）を装着したAxiovert A100 顕微鏡（Zeiss）を用いて、顕微鏡検査（倍率：100倍）により観察した。
フローサイトメトリー分析
細胞をトリプシン処理し、遠心分離し、培地25mlに再懸濁し、5分間37℃でインキュベートした。2mMフルオレセイン  ジ−β−D−ガラクトピラノシド（Molecular Probes, Eugene, OR）を25ml添加し、細胞を1分間37℃インキュベートした後、氷冷培養培地450mlを添加して希釈した。サンプルを氷上に30〜60分間保持し、50mmメッシュのナイロンフィルターでろ過し、FACS-Caliburフローサイトメター（Becton Dickinson）中で分析した。各サンプルについて10，000事象を集めた。アルゴンレーザー（15mW, 488nm）を用いて励起させた後、フルオレセインの蛍光は510〜530nmフィルターを通して測定した。前方散乱対側方散乱についてゲーティング（gating）することにより、単一の生存細胞から死滅細胞を識別した。CELLQuestソフトウェア（Becton Dickinson）を用いてデータを分析した。
【実施例４】
【０１１９】
THX細胞のアデノウィルス形質導入に与えるPCIの効果
材料
フルオレセイン  ジ−β−D−ガラクトピラノシド（FDG）をMolecular Probes（F-1179）から購入した。その粉末をDMSO／エタノールの1：1混合液に溶解して20ｍMの保存原液を調製した。混合液を適切な体積の氷冷水に徐々に添加し、8：1：1のH2O／DMSO／エタノール溶液を作製した。
【０１２０】
組換えウィルスAdCA17lacZを編成し、ヒト細胞系列293、Ad E1−形質転換胎性腎細胞系列（10％FCS、100U/mlペニシリン（Gibco-BRL）、0.1mg/mlストレプトマイシン（Gibco-BRL）および2mMグルタミンを補充したMEM F-11培地で維持された）中で増殖させた。
組換えウィルスの作成
ヒトCMVプロモーターの制御下で大腸菌lacZ遺伝子をコードする組換えアデノウィルスAdCA17lacZを、293細胞のpJM17系を用いる相同組換えにより得た（Addisonら, 1997, J. Gen. Virol., 78, 1653-1661）。組換えベクターを、上述したようにプラーク精製し、293細胞中で高タイター（titer）まで成長させ、塩化セシウムバンド形成により精製した（Hittら, 1995, Methods Mol. Genet. 7:15-30）。
細胞の感作
THX細胞（4×105個）を6cmシャーレに接種し、一晩成長させた。約60％集密（confluence）で、成長培地は、20μg/mlAlPcS2aを添加した成長培地2mlで交換し、シャーレをインキュベータに16〜18時間戻して置いた。その後、増感剤を含有する培地を吸い出し、細胞を通常の成長培地で少なくとも4時間培養し、光処理とウィルス感染を施した。
細胞の感染
トリプシン-EDTAを細胞を3つのシャーレから分離するために用い、シャーレの平均細胞数をBurcherチャンバーカウンティングにより計算した。アデノウィルス希釈溶液を、感染する細胞数に応じて0.68mMのCaCl2および0.5mMのMgCl2を有するPBS中に調製した。通常、細胞をm.o.i（multiplicity of infection）1および10で感染させた。
【０１２１】
ウィルスを添加する前に、細胞を赤色光（Phillips TL 20W/09, Cinemoid 35フィルターを通して濾光した, 1.35mW/cm2の細胞到達光強度を有する）に3分間暴露した。その後、培地を吸い出し、200μlのウィルス懸濁液（あるいはウィルスで処置されない対照の場合には0.68mMのCaCl2および0.5mMのMgCl2を有するPBS）を各シャーレに加えた。30分間37℃でのインキュベーション後、5mlの通常の成長培地を加え、細胞を48時間成長させた。
β−ガラクトシダーゼアッセイ
細胞をトリプシン−EDTAにより分離し、成長培地5mlに再懸濁した。5分間1000rpmで遠心分離した後、培地を吸い出し、細胞ペレットを成長培地50μlに再懸濁し、これらを含む試験管を37℃、ウォーターバスに5分間置いた。続いて、37℃まで予備加熱した2mMのFDG溶液50μlを添加し、該試験管をウォーターバスに1分間戻した。最終的に、成長培地900μlを加え、上記試験管を氷上で30〜60分間インキュベートし、上述したようにサンプルをフローサイトメトリーにより分析した。
【０１２２】
THX細胞をAlPcS2a（図4ではPSとして表示）およびアデノウィルス（図4で「ウィルス」として表示）で処置し、「材料および方法」に記載したように3または4分間光に暴露し、β−ガラクトシダーゼ（β-gal）活性についてフローサイトメトリーにより測定した。全β-gal活性をβ-gal陽性細胞およびそれらのβ-gal活性を積分することによって定量化した。β-gal陽性細胞数と平均β-gal活性の両方がPCI処置によって増加した。
【０１２３】
それらの結果は、THX細胞の最少の感染が、細胞がウィルスのみと、またはウィルスおよび光増感剤とともにインキュベートされるときに起こることを示す。しかし光化学処置、すなわち光増感剤への光の添加は、（β-gal活性の増加に示されるように）細胞の形質導入をかなり増強することを示す。
【実施例５】
【０１２４】
アデノウィルス媒介遺伝子形質導入の光化学的刺激
穴（well）当たり5×104 個のTHX細胞を6穴プレートに播種した。翌日、20μg/mlのAlPcS2aを添加し、細胞を18時間37℃でインキュベートした。AlPcS2a添加後のすべての操作を抑制された光の下で実施した。「光照射が前」方策のために、細胞をAlPcS2aから洗浄し、AlPcS2aのない培地で4時間培養した。その後、細胞を光に3分間暴露し、アデノウィルスベクター AdHCMV-lacZ（実施例4ではAdCA17lacZともいう）で、MOI（multiplicity of infection）1で30分間処置した。このベクターはβ−ガラクトシダーゼ・レポーター遺伝子を含む。このβ−ガラクトシダーゼ・レポーター遺伝子の発現は、フローサイトメトリーによって分析することができる（以下を参照）
「光照射が後」方策のために、まずAlPcS2a処置し洗浄した細胞を、アデノウィルスを用いて上記と同じ濃度および同じ時間で処置し、洗浄し、新鮮な培養培地の添加後に光に暴露した。光非照射の細胞を、光照射を除いて同様に処置した。
【０１２５】
処置された細胞を培養培地で1回洗浄し、新鮮な培養培地の添加後に37℃で培養し、次いでさらに分析した。β−ガラクトシダーゼ発現を露光後2日後にフローサイトメトリーによって分析した。ウィルス（AdHCMV-lacZまたはAdCA17lacZのいずれかで言及される）の構築、細胞の処置、光照射およびβ−ガラクトシダーゼ発現の分析についての詳細な方法は実施例４に記載している。
【０１２６】
結果（図5）は、「光照射が前」操作手順（図5の右側の棒で示されているが）を用いた光化学処置が、これらの実験条件下で、β−ガラクトシダーゼ発現細胞の割合を、約6倍；2.5％から15％まで増加させることを示す。
「光照射が前」操作手順を用いた効果は、「光照射が後」方法（図5の左側の棒で示されているが）で得られたものとほぼ等しかったこともわかる。
【実施例６】
【０１２７】
β−ガラクトシダーゼをコードするアデノウィルスを用いるPCI媒介形質導入の結果としてのβ−ガラクトシダーゼ産生の増加
実施例３の「実験手順」に記載したように、細胞を成長させ、AlPcS2aとインキュベートし、AdHCMV-LacZウィルスにより感染させて光照射した。β−ガラクトシダーゼタン白質の産生を測定するために、化学ルミネセンスβ-galレポーター遺伝子アッセイキット（Roche, Cat. No. 1 758 241）をメーカーのプロトコルに従って使用した。簡略に述べると、細胞を予備冷却したPBSで3回洗浄し、細胞溶解試薬1mlを各穴（well）に添加した。30分間室温でのインキュベーション後、細胞抽出物をにエッペンドルフ試験管に移し、4℃で2分間、最大速度で遠心分離し、細胞抽出物（上澄み液）50μlをマイクロタイタープレート（microtiter plate）の穴に移した。そこへ100μlの基質試薬を添加し、該マイクロタイタープレートをホイルで覆い、室温で15分〜1時間穏やかに振盪しながらインキュベートした。その後、マイクロタイタープレートをルミノメーター（Victor2 Wallac 1420 Multilabel Counter）に収め、50μlの開始剤が自動注入された。1秒遅れで、5秒の発光が積算された。β−ガラクトシダーゼの量を、既知量のβ−ガラクトシダーゼを含むサンプルの標準曲線から算出した。
結果
図6は、WiDrヒト結腸ガン細胞のPCI誘導されたアデノウィルス形質導入の後に得ることができるβ−ガラクトシダーゼタン白質産生の増加を示す。
【０１２８】
例えば、最大の光線量でβ−ガラクトシダーゼタン白質産生の約25倍増加が、形質導入された細胞において観察することができることが図6からわかる。これはフローサイトメトリー分析により得られたものと良く一致している（例えば、実施例２および３）。
【実施例７】
【０１２９】
種々の感染効率（MOI）でのWiDr細胞の形質導入に与えるPCIの効果
WiDr細胞を、10％のFCS（ウシ胎仔血清）、ペニシリン／ストレプトマイシンおよびL-グルタミンを補充したRPMI 1640培地中で培養した。抑制された光の中で、該培地を除去し、1μg/mlのTPPS2aを含む培地を添加した。（光から保護された）細胞を37℃で18時間培養した。前記細胞を培地で3回洗浄し、さらに3時間培養した。6穴（well）プレート中にある培地を除去し、200μlのAdHCMV-lacZアデノウィルス溶液を各穴に添加し、細胞を30分間37℃で（光から保護して）インキュベートした。ウィルス 溶液を除去し、細胞を培地で1回洗浄した。培地2mlを添加し、細胞を30分間37℃で（光から保護して）インキュベートした。該細胞のいくらかを青色光に11mW/cm2の細胞到達光強度で90秒暴露した。細胞を2日間（まだ光から保護して）培養し、実施例３の「実験手順」に記載したようにフローサイトメトリーによるβ−ガラクトシダーゼ活性の分析に供した。
結果
図7は、扱えるウィルス投与量を用いる従来の感染ではできない場合でさえも、PCIの使用でもって100％形質導入された細胞を得ることができることを示す。例えば、図7は、WiDr細胞および100 MOIのウィルス用量で、PCIにより100％形質導入が達成され、これに対し従来の感染では、30％を下回る形質導入が得られるだけであることを示す。同様に、MOI 50では90％を超える形質導入がPCI後に達成され、これに対しPCIがない場合20％未満の形質導入しか得られない。
【実施例８】
【０１３０】
A549細胞のアデノウィルス形質導入に与えるPCIの効果
A549細胞を、10％FCS（ウシ胎仔血清）、ペニシリン／ストレプトマイシンおよびL−グルタミンを補充したRPMI 1640培地中で培養した。抑制された光の中で、該培地を除去し、20μg/mlのAlPcS2aを含む培地を添加した。（光から保護された）細胞を37℃で18時間培養した。細胞を培地で3回洗浄し、さらに3時間培養した。培地を除去し、200μlの（MOI 5を与える）AdHCMV-lacZアデノウィルス溶液を各穴（well）に添加し、細胞を30分間37℃で（光から保護して）インキュベートした。ウィルス溶液を除去し、細胞を培地で1回洗浄した。培地2mlを添加し、細胞を30分間37℃で（光から保護して）インキュベートした。該細胞のいくらかを「実験手順」に記載したように赤色光に暴露した。細胞を2日間（まだ光から保護して）培養し、実施例３の「実験手順」に記載したようにフローサイトメトリーによるβ−ガラクトシダーゼ活性の分析に供した。
結果
図8は、PCIがA549ヒト肺ガン細胞のアデノウィルス媒介による遺伝子形質導入を充分に増強できることを示す。例えば「通常の感染」（0分の光照射のA+ S- サンプル）と比較すると、6分の光照射時間を有するPCIは約3％から約33％陽性細胞までと、形質導入された細胞の数を約11倍増加させた。
【実施例９】
【０１３１】
HeLaおよびFmexIII 細胞系の形質導入に与えるPCI効果
HeLa細胞を米国菌培養収集所（American Type Culture Collection）から入手し、ヒトメラノーマFmexIII細胞をノルウェーラジウム病院（Norwegian Radium Hospital）で作成した。細胞を成長させ、光増感剤TPPS2a（1μg/ml）とともに培養し、AdHCMV-lacZアデノウィルス(MOI 5)で感染させ、光照射して実施例7に記載したように分析した。
結果
図9は、PCIがHeLaおよびFmexIII細胞系においても形質導入を増加させることを示す。
【実施例１０】
【０１３２】
ポリ−L−リジン担体と付随したアデノウィルスを用いる形質導入に与えるPCIの効果
WiDr細胞を成長させ、実施例7に記載したように光増感剤TPPS2a（1μg/ml）とともに培養した。ポリ−L−リジン（PLL、MW20700）をSigmaから入手した。ウィルス調製物中のウィルス粒子の濃度をMitterederら（J.Virol.1996 11:7498-7509）に従って、A260を測定することにより決定した。
以下のアデノウィルス／PLL−複合体を作製した：
5PLL/Ad：ウィルス粒子当り5分子のPLL
500PLL/Ad：ウィルス粒子当り500分子のPLL
250PLL/Ad：ウィルス粒子当り250分子のPLL
50PLL/Ad：ウィルス粒子当り50分子のPLL
PLL希釈液をウィルス粒子希釈液に添加した。サンプルを、反転または穏やかなピペットチップ吸引により慎重に混合し、30分間室温でインキュベートした。
【０１３３】
6穴プレート中の培地を除去し、200μlのアデノウィルス溶液またはPLL/Ad溶液を各穴（well）にMOI 5で添加した。細胞を30分間37℃で（光から保護して）インキュベートした。アデノウィルスで感染されていないプレートにはPBS 200μlのみを添加した。溶液200μlを除去し、細胞を培地で1回洗浄した。培地2mlを添加し、細胞を30分間37℃で（光から保護して）インキュベートし、実施例7に記載したように青色光に暴露した。細胞を2日間（まだ光から保護して）培養し、実施例３の「実験手順」に記載したようにフローサイトメトリーによるβ−ガラクトシダーゼ活性の分析をした。
結果
図10は、アデノウィルスが担体ポリ−L−リジン（PLL）と付随している場合にもPCIは作用することを示す。図10からわかるように、PCIのない（すなわち、0分の光線量）感染は、担体としてPLLを用いても用いなくても著しく少ない形質導入（＜5％）を与えた。細胞の光照射がPLLを用いても用いなくても光線量に依存した形質導入の増加を誘導することは明らかである。これは、PCIの効果による。PLLなし（図10の○）で得られた最も高い形質導入効率は37％であったが、PCIとPLLの組み合わせ（図の●）で87％陽性細胞を達成した。この組み合わせは、形質導入された細胞の割合について、同じ条件でPCIのない場合に達成されたものと比較すると、20倍を超える増加を示し、さらに通常の感染（PLLがなく、0分の光照射）と比較すると100倍の増加を示した。よって、PCIは、PLLをコートしたアデノウィルスを用いる形質導入効率を充分に増加させることができ、この組み合わせを用いることによって、コートされていないアデノウィルスとPCIとの組み合わせより、はるかに高い形質導入効率を達成することができる。
【実施例１１】
【０１３４】
ウィルス用担体としてポリ−L−リジンを使用したヒト皮膚繊維芽細胞系のアデノウィルス形質導入に与えるPCIの効果
HF-16ヒト皮膚繊維芽細胞を成長させ、実施例7に記載したように光増感剤TPPS2aで処置した。PLLとウィルスとの複合体（ウィルス粒子当り250分子のPLL）を実施例10に記載したように作製し、該細胞をMOI 5で感染させ、光照射して実施例10に記載したように分析した。
結果
図11は、ヒト皮膚繊維芽細胞系（HF-16）の形質導入に与える、PLLとの組み合わせでPCIを使用することの効果を示す。繊維芽細胞は、アデノウィルス形質導入に対し非常に抵抗的であることが知られており、図11からわかるように、これらの細胞の「通常の」形質導入（□、PLLのない0秒の光照射）は著しく少なく、PCIによりわずかな程度だけ増強される。PLLが担体として使用されると、光処理のない形質導入の効率はわずかに増加する。しかし、この場合、PCIが形質導入を充分に増強させることがわかる。最適条件で、形質導入された細胞が7.5％から44.5％までと、光の誘導による増加が観察された。よって、担体の使用とPCI技術とを組み合わせることは、そうでない場合に形質導入に対して著しく抵抗的である細胞の効率的な形質導入を与えることができる。
【実施例１２】
【０１３５】
ウィルス担体としてポリカチオン性デントリマーSuperFect(R)を用いたアデノウィルス形質導入に与えるPCIの効果
実施例7に記載したように、WiDr細胞を成長させ、光増感剤TPPS2a（1μg/ml）とともに培養した。SuperFect(R)をQIAGENから購入した（3mg/ml）。使用したアデノウィルスはAdHCMV-lacZであった。
【０１３６】
種々のSuperFect(R)濃度でアデノウィルス／SuperFect(R)複合体を、異なる量のSuperFect(R)をアデノウィルス溶液に添加して作製し、30分間室温でインキュベートした。
【０１３７】
6穴プレート中の培地を除去し、200μlのアデノウィルス／SuperFect(R)複合体を、MOI 5のアデノウィルス量で添加した。細胞を30分間37℃で（光から保護して）インキュベートした。溶液200μl を除去し、細胞を培地で1回洗浄した。培地2mlを添加し、細胞を30分間37℃で（光から保護して）インキュベートし、実施例7に記載したように青色光に暴露した。細胞を2日間（まだ光から保護して）培養し、「実験手順」に記載したようにフローサイトメトリーによるβ−ガラクトシダーゼ活性の分析をした。
結果
実施例12では、PCIがPLL以外のウィルス担体を用いても効果的であることを実証する。よって図12に示すように、デンドリマー性ポリカチオンSuperFect(R)を担体として使用すると、その担体が50μg/ml未満の濃度で使用される場合には、PCIはアデノウィルス媒介の遺伝子形質導入を充分に増大させることができる。SuperFect(R)を用いてPCIは、最大限、形質導入された細胞の割合を、「通常の」感染（すなわち、PCIがなく、SuperFect(R)もない）により得られる値のほぼ50倍まで増加させることができた。他方、SuperFect(R)を伴わないPCIは最大12倍の増加を与え、SuperFect(R)のみでは10倍の増加を与えた。
【実施例１３】
【０１３８】
光照射およびアデノウィルス投与のための種々のタイムスケジュール
実施例7に記載したようにHCT 116細胞を成長させ、光増感剤TPPS2aで処置した。該細胞は、Ad-HCMV-LacZアデノウィルス（MOI 5）を用いて、光照射（光増感剤の除去後、常に4時間）の前または後の種々の時点で、30分間感染させた。細胞をさらに2日間（まだ光から保護して）培養し、「実験手順」に記載したようにフローサイトメトリーによるβ−ガラクトシダーゼ活性の分析をした。
結果
図13は、アデノウィルス媒介の遺伝子形質導入へのPCI効果に影響を与える、ウィルス送達に係る光処置のタイミングの効果を示す。ウィルスを光照射前に送達する場合と光照射後に送達する場合の両方において、PCI光照射は、長い時間間隔について効果的であることがわかる（図13）。よって、少なくとも17時間（光照射前4時間でウィルスが与えられる場合から、光照射後13時間でウィルスが与えられる場合まで）の時間枠（time window）がある。この時間枠において、ウィルスを投与することができ、光照射を実施することができる。そして、この時間枠は、形質導入に与えるプラスのPCI効果がまだ維持されるであろう時間枠である。
【０１３９】
このことは、臨床的立場からは極めて重要なことである。なぜなら治療の策定ならびに患者が受けるであろう他の治療、例えば手術手順との調整において少なからぬ融通性を医師に与えるからである。
【実施例１４】
【０１４０】
単純疱疹ウィルス・チミジンキナーゼをコードするアデノウィルスベクターの遺伝子治療効果のPCI増強
HCT 116腺ガン細胞を、HSV-tk遺伝子（AdV-TK）をコードするアデノウィルス遺伝子治療用ベクターで感染させ、次いでPCI処置を施した。感染の条件は「実験手順」に記載（MOI=5）した通りである。感染2日後、種々の濃度のガンシクロビル（ganciclovir：GCV）を添加し、細胞をさらに3日間培養し、MTT法により生存細胞を分析した。この方法は、生存して代謝活性のある細胞中に存在するミトコンドリアのデヒドロゲナーゼ類によって水溶性テトラゾリウム塩（MTT）が水不溶性の紫色ホルマザン生成物に還元されることに基づく。0.25μgのMTTを含む培地1mlを細胞に添加し、次いで4時間インキュベートした（37℃、5％V/V CO2）。得られたホルマザン結晶を、穴（well）当り200μlのイソプロパノール（Sigma, MO, 米国）を添加して溶解した。その溶液を96穴プレートに移した。このプレートは570nmの帯域通過フィルターを用いてMultiskan EXマイクロプレートリーダー（Labsystems, フィンランド）によって読み取られる。
結果
図14からわかるように、光に依存するGCVの毒性効果の増加を、AlPS2a光増感剤、AdV-TKおよびGCVを受けた細胞における3種の異なったGCV投与量について観察することができた。比較において、光増感剤処置のみを受けた対照細胞、光増感剤＋GCVを受けた細胞または光増感剤＋AdX-TKを受けたがGCVを受けていない細胞には、そのような効果は見られなかった。これは、GCV媒介の細胞殺傷の光が誘導した増大は、PCI処置によって誘導された増大TK遺伝子送達によることを示し、このことはGCVプロドラッグの上昇した活性化を導くものである。
【０１４１】
HSV-tk遺伝子／GCVの組み合わせは、臨床におけるガンの遺伝子治療プロトコルにおいて幅広く用いられている。よって本実施例は、ガンの遺伝子治療で用いられる遺伝子の所望する細胞殺傷効果を増大させるためにPCIが使用できることを示す。また、本実施例は、PCIによる遺伝子送達増強の効果がリポーター遺伝子に限定されないことを示す。しかし、ガン細胞において何らかの治療効果をもたらし得るタンパク質をコードする遺伝子にもPCIが使用できることも示す。
【図面の簡単な説明】
【０１４２】
【図１】図1は、光化学的に形質導入されたWiDr細胞のX-gal染色を示す。細胞を、図に示すように、AlPcS2a（S）で処置し、MOI5でAdHCMV-lacZ（Ad）により感染させ、光処理を施した。形質導入されたβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を発現させるために2日間培養した後、該細胞をX-galで染色し、記載したように顕微鏡検査により分析した。前記細胞を以下のように処置した。A．未処置、B．アデノウィルスのみ、C．AlPcS2a＋8分間の光照射、D．AlPcS2a＋アデノウィルス＋8分間の光照射。
【図２】図2は、HCT116細胞（図A）およびWiDr細胞（図B）における、光化学的に増強された形質導入のフローサイトメトリー分析を示す。これらの細胞を、記載したようにAlPcS2a（S）で処置し、MOI5でAdHCMV-lacZ（Ad）により感染させ、光処理を施した。2日後、前記細胞はフルオレセイン−ジ−β−D−ガラクトピラノシドと一緒に充填して、フローサイトメトリーで分析した。図2Aは、HCT116細胞のフローサイトメトリー分析におけるドット・プロットを示す。垂直線の右側の細胞は、アデノウィルス形質導入について陽性とみなした。というのは、非処置の細胞についても（一番上の図）、AlPcS2aと光のみを受けた細胞についても（一番下の図）、この領域に実質的に細胞がないからである。各図には種々の処置が示されている。図2Bは、WiDr細胞について、光投与量の関数として形質導入効率を示す。図2A（（□）Ｓ-、Ad+；（▲）Ｓ+、Ad-；（●）Ｓ+、Ad+；）に記載されたように定義されたβ−ガラクトシダーゼ陽性細胞の％ならびに平均蛍光強度（（○）Ｓ+、Ad+）を記した。バーは、2〜5の別個の実験の平均標準誤差（SEM）を示す。
【図３】図3は、種々のウィルス投与量についてWiDr細胞でのPCI増強された形質導入を示す。細胞を、種々のMOIでAdHCMV-lacZにより感染させ、記載したように光化学的処置を施した。図3Aは、全細胞集団の平均蛍光を示す。前記処置は以下の通りである。塗りつぶしなしのバー：AlPcS2aのみ；対角線の網掛け：MOI=1；灰色：MOI=5；平行線の網掛け：MOI=20；黒：MOI=50。誤差バーは３つの実験のSEMである。図3Bは、全細胞集団のβ−ガラクトシダーゼ活性の増加倍数（fold increase）を示す。記号は図3Aと同じである。誤差バーは3または4つの実験の標準誤差を示す。
【図４】図4は、THX細胞のアデノウィルス形質導入に与える光化学処置の効果を示す。
【図５】図5は、AdHCMV-lacZで感染させたTHX細胞におけるβ−ガラクトシダーゼ発現に及ぼす光化学処置の効果を示す。「光照射が前」方策のために、AlPcS2a−予備処置細胞を3分間の露光の前にAlPcS2aフリーの培地中でもう4時間インキュベートした。光照射に続いて、該細胞を（MOI 1で）AdHCMV-lacZにより30分間37℃で感染させた。その後、培地2mlを加えて細胞を2日間培養し、β−ガラクトシダーゼ発現を分析した。「光照射が後」方策のために、AlPcS2a−処置細胞を、30分間のAdHCMV-lacZによる感染の前にAlPcS2aフリーの培地中で3時間インキュベートした。培地2mlを添加した後、細胞を3分間光照射の前にもう30分間インキュベートし、2日後、β−ガラクトシダーゼ発現を分析した。
【図６】図6は、β−ガラクトシダーゼをコードするアデノウィルスを用いるPCI媒介の形質導入の結果としてのβ−ガラクトシダーゼ産生が、光照射時間の増加とともに増加したことを示す。種々の試料についての処置（＋、−は実施、不実施を示す）および光投与量（光照射の長さ）は、図に示す通りである。Adv：アデノウィルスAdHCMV-LacZ。S：光増感剤AlPcS2a。
【図７】図7は異なった多数の感染でのWiDr細胞の形質導入に与えるPCIの効果を示す。□：光照射なし、■：90秒間光照射。
【図８】図8はA549細胞のアデノウィルス形質導入に与えるPCIの効果を示す。種々の試料についての処置（＋、−は実施、不実施を示す）および光投与量（分で）は、図に示す通りである。A：アデノウィルスAdHCMV-LacZ。S：光増感剤AlPcS2a。
【図９】図9はHeLa細胞系列およびFmexIII細胞系列の形質導入に及ぼすPCIの効果を示す。塗りつぶしなしの棒：光照射なし、黒塗りの棒：90秒光照射。
【図１０】図10はポリ−L−リジン担体と付随したアデノウィルスによるWiDr細胞の形質導入に及ぼすPCIの効果を示す。Adv：アデノウィルスAdHCMV-LacZ。PLL：ポリ−L−リジン。5PLL/Adは、複合体がウィルス粒子１個当たり平均して5つのPLL分子を含むことを意味する。○−Ad MOI 5、■−5 PLL/Ad、●−500 PLL/Ad、□−250 PLL/Ad、▲−50 PLL/Ad。
【図１１】図11は、ウィルス用担体としてポリ−L−リジンを用いた、ヒト皮膚繊維芽細胞系列のアデノウィルス形質導入に及ぼす、種々の光照射時間を使用したPCIの効果を示す。□−MOI 5：非複合化アデノウィルスAdHCMV-LacZ。■−MOI 5/PLL：ウィルス粒子１個当たり250分子のPLLと複合させたAdHCMV-LacZ。
【図１２】図12は、ウィルス担体としてポリカチオン性デンドリマーSuperFect(R)を種々の濃度で用いた、アデノウィルス形質導入に及ぼすPCIの効果を示す。塗りつぶしなしの棒：光照射なし、黒塗りの棒：90秒光照射。
【図１３】図13は、光照射およびアデノウィルス投与の異なるタイムスケジュールの効果を示す。Y軸の左側のタイムポイントは、光照射前に添加されたウィルスを表し、右側のタイムポイントは、光照射後のウィルス添加を表す。■−1分間光照射、□−光照射なし。
【図１４】図14は、種々の光照射時間後に単純疱疹ウィルス（Herpes Simplex Virus）チミジンキナーゼをコードする、アデノウィルスベクター遺伝子治療効果のPCI増強を示す。HSV-tkをコードするアデノウィルスベクターを用いる、PCI誘導遺伝子形質導入の後に、細胞殺傷がガンシクロビルにより実施された。Al：AlPcS2a；Adv-TK：HSV-tkをコードするアデノウィルス；GCV：ガンシクロビル。◆：Alのみ；□：Al＋Adv-TK；△：AL＋10μg/ml（A）、25μg/ml（B）または100μg/ml（C）のGCV；■：AL＋AdV-TK＋10μg/ml（A）、25μg/ml（B）、または100μg/ml（C）のGCV。
【図１】
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【図２−Ａ】
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【図２−Ｂ】
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【図３−Ａ】
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【図３−Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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