(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：１３で示される配列またはその相補鎖に対して、少なくとも９０％の相同性を示し、アモルファ−４，１１−ジエンシンターゼ活性をもつポリペプチドをコードする単離ＤＮＡ。
【請求項２】
配列番号：１３で示される配列またはその相補鎖に対して、少なくとも９５％の相同性を示す請求項１に記載のＤＮＡ。
【請求項３】
アモルファ−４，１１−ジエン産生植物から単離されたことを特徴とする請求項１または２に記載のＤＮＡ。
【請求項４】
宿主細胞の形質転換またはトランスフェクションにおける請求項１〜３のいずれか１つに記載のＤＮＡの使用。
【請求項５】
適当な転写開始および終結配列に機能的に連結する請求項１〜３のいずれか１つに記載のＤＮＡを含むＤＮＡ構築物。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれか１つに記載のＤＮＡまたは請求項５に記載のＤＮＡ構築物を含む微生物宿主細胞。
【請求項７】
細胞が、細菌細胞である請求項６に記載の微生物宿主細胞。
【請求項８】
細胞が、酵母細胞である請求項６に記載の微生物宿主細胞。
【請求項９】
酵母細胞が、サッカロミセス・セレビシアエまたはピヒア・パストリス細胞である請求項８に記載の酵母宿主細胞。
【請求項１０】
細胞が、油性酵母細胞である請求項８に記載の酵母宿主細胞。
【請求項１１】
油性酵母細胞が、ヤロウィア・リポリチカ細胞である請求項１０に記載の酵母宿主細胞。
【請求項１２】
ａ）クソニンジンまたはViguiera oblongifoliaから葉を得；
ｂ）クソニンジンまたはViguiera oblongifoliaからの葉を含むスラリーを調製し；
ｃ）スラリーからポリペプチドを単離することによって、クソニンジンまたはViguiera oblongifoliaからポリペプチドを単離することによって得られる、配列番号：１４で示されるアミノ酸配列を示し、アモルファ−４，１１−ジエンシンターゼ活性をもつ単離ポリペプチド単離ポリペプチド。
【請求項１３】
請求項６、７および８〜１１のいずれか１つに記載の適当な宿主細胞において、請求項１〜３のいずれか１つに記載のＤＮＡを発現することによって得られる、アモルファ−４，１１−ジエンシンターゼ活性をもつ組換えポリペプチド。
【請求項１４】
アモルファジエンの製造方法であって、
ａ）請求項１２または１３に記載のポリペプチドを得；次いで、ｂ）インキュベーション培地中、アモルファジエンを製造するのに十分な適当な温度および適当な時間にて、ファルネシルピロホスフェート（ＦＰＰ）の存在下に請求項１２または１３に記載のポリペプチドをインキュベートする；
ことを特徴とする方法。
【請求項１５】
アモルファジエンの製造方法であって、
ａ）請求項１〜３のいずれか１つに記載のＤＮＡまたは請求項５に記載の構築物で、適当な宿主細胞をトランスフェクトまたは形質転換して、アモルファ−４，１１−ジエンシンターゼの発現レベルが、非トランスジェニック宿主細胞における発現レベルよりも高いトランスジェニック宿主細胞を得；次いで
ｂ）ファルネシルピロホスフェート（ＦＰＰ）の存在下に該ＤＮＡを発現させて、アモルファジエンを形成する；
ことを特徴とする方法。
【請求項１６】
アルテミシニンの製造方法であって、
ａ）請求項１２または１３に記載のポリペプチドを得；次いで、ｂ）インキュベーション培地中、アルテミシニンを製造するのに十分な適当な温度および適当な時間にて、ファルネシルピロホスフェート（ＦＰＰ）およびアモルファ−４，１１−ジエンをアルテミシニンにさらに変換するシトクロムＰ−４５０触媒酵素の存在下に請求項１２または１３に記載のポリペプチドをインキュベートする；
ことを特徴とする方法。
【請求項１７】
アルテミシニンの製造方法であって、
ａ）請求項１〜３のいずれか１つに記載のＤＮＡまたは請求項５に記載の構築物で、適当な宿主細胞をトランスフェクトまたは形質転換して、アモルファ−４，１１−ジエンをアルテミシニンにさらに変換するＰ−４５０触媒酵素をコードするＤＮＡを含み、トランスジェニック宿主細胞におけるアモルファ−４，１１−ジエンの発現レベルが、非トランスジェニック宿主細胞における発現レベルよりも高いトランスジェニック宿主細胞を得；次いで
ｂ）ファルネシルピロホスフェート（ＦＰＰ）の存在下に該ＤＮＡを発現させる；
ことを特徴とする方法。
【請求項１８】
ゲノム内に、対応する非トランスジェニック細菌または酵母細胞に存在するよりも多くの請求項１〜３のいずれか１つに記載のＤＮＡのコピーを内包するトランスジェニック細菌または酵母細胞。
【請求項１９】
細胞が、大腸菌の細菌細胞である請求項１８に記載のトランスジェニック細胞。
【請求項２０】
細胞が、酵母サッカロミセス・セレビシアエ細胞である請求項１８に記載のトランスジェニック細胞。
【請求項２１】
細胞が、油性酵母細胞である請求項１８に記載のトランスジェニック細胞。
【請求項２２】
油性酵母細胞が、酵母ヤロウィア・リポリチカ細胞である請求項２１に記載のトランスジェニック油性酵母細胞。
【請求項２３】
ＤＮＡが、Artemisia annua（クソニンジン）またはViguiera oblongifoliaから単離されたことを特徴とする請求項３に記載のＤＮＡ。
【請求項２４】
細菌細胞が、大腸菌細胞である請求項７に記載の微生物宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡ配列、この配列によってコードされるポリペプチド、ならびにアモルファジエンの産生における該ＤＮＡ配列およびポリペプチドの使用に関する。
ヒトマラリアは、８５％が熱帯熱マラリア原虫によってひき起こされる、一般に発生する広くはびこる感染性疾患である。この寄生虫は、最も致死性の高い種類のマラリアである熱帯熱マラリアの原因である。毎年、マラリアは、１億人以上の人々に臨床的疾病（重篤であることが多い）をひき起こし、最終的には１００万人以上が死亡する。世界人口の約４０％が、マラリア感染の危険にさらされている（世界保健機関による評価）。
【０００２】
マラリアは、従来、キニン、クロロキン、メフロキン、およびプリマキンといったようなキノリン、ならびに抗フォレートで治療されている。残念なことに、ほとんどの熱帯熱マラリア原虫が、クロロキンに対する耐性をもつようになてきており、メフロキンおよびハロファントリンに対する耐性をもつようになってきているものもある。このように、耐性のある寄生虫に対して感受性をもつ抗マラリア薬が、緊急に必要である。アルテミシニンならびにその半合成誘導体を有望な候補としてここに挙げる。
【０００３】
アルテミシニン（図１）、[３Ｒ−(３α,５ａβ,６β,８ａβ,９α,１２β,１２ａＲ＊)]−オクタヒドロ−３,６,９−トリメチル−３,１２−エポキシ−１２Ｈ−ピラノ[４,３−ｊ]−１,２−ベンゾジオキセピン−１０(３Ｈ)−オン（分子量２８２．３５；アルテアヌイン，キンガオス（quinghaosu）またはＱＨＳとも呼ばれる）は、植物アルテミシア・アヌア  Ｌ．（和名：クソニンジン）の空気中で生長する部分から単離されるセスキテルペンラクトンである。
クソニンジンはまた、quinghao（中国語）、一年生または甘ヨモギ、あるいはスイートアニーとしても知られており、アジアに自生する一年生の草本植物である。Asteraceae科のメンバーであるクソニンジンは、AsteroideaeのAnthemideae連に属し、２．０ｍ以上の高さに達することも多い背の高い草本植物である。通例、交互に分枝する枝をもつ一本の茎からなる。芳香性の葉は、深く分裂し、２．５から５ｃｍの長さである。アルテミシニンは、天然のものでは、乾燥重量に対して０．０１〜０．６％の濃度で、２次代謝産物として主に葉で産生される。アルテミシニンは、カワラニンジンを例外として、クソニンジンに特有の物質である。本発明で用いるクソニンジンは、ベトナム産のものである。
【０００４】
植物中に低濃度でしか存在しないことから、アルテミシニンは薬物としては比較的高価なものとなっている。したがって、現在の研究は、有機合成によって大規模でアルテミシニンを生産することを目指している。しかし、アルテミシニンは、７個のキラル炭素原子からなるので、理論的に２７＝１２８個の異性体を形成することが可能であり、そのうちのただ１つが求めるアルテミシニンである。アルテミシニンのこの複雑な構造ゆえに、この化合物の有機合成は、商業的観点からは、有益なものであるとはいえない。
アルテミシニンの生合成経路の遺伝子工作によって、植物中に高濃度のアルテミシニンを生じさせることができる。アルテミシニンの生合成に干渉することができるようにするには、生合成経路を完全または部分的に知らねばならない。完全な生合成経路を解明するための企てがこれまでに幾つか行われている。しかし、今日でも、正確な経路の多くの部分が未知のままである。
【０００５】
本発明に到る研究では、これまでに公開されていない独特の経路が発見されている。この経路は、特に、アルテミシニン先駆体であるアモルファ−４,１１−ジエン（１β,６β,７β,１０αＨ−アモルファ−４，１１−ジエン）およびジヒドロアルテアヌイン酸のヒドロペルオキシドの形成を含むものである。クソニンジン中に見出されたこれらの先駆体は、過去に文献に記載されていないものである。
文献から、テルペンシクラーゼ（シンターゼ）が、テルペノイド生合成で重要な役割を演じると思われる分枝点酵素であることが公知である。したがって、本発明のための作業仮説は、このような分枝点酵素（テルペンシクラーゼ）の過剰発現が、有機体におけるテルペノイド産生を増加させるというものである。このようなアプローチの成功に影響を及ぼす因子は、アルテミシニンの場合、アルテミシニンに到る連続した生合成ステップの数および性質である。図２は、本発明者らによって仮定されたアルテミシニンの生合成経路を示す。この経路は、３つの部分に分けられる。
【０００６】
第１の部分（パートＩ）は、テルペノイド経路を表す。この経路は、一般的経路である。たとえば、ファルネシルジホスフェート（ファルネシルピロホスフェート）（ＦＰＰ）は、すべての生きている有機体に存在し、多数の１次および２次代謝産物の先駆体である。ＦＰＰがすべてのセスキテルペンの先駆体であることがわかっている。したがって、定義によって、ＦＰＰはアルテミシニンの先駆体である。
パートＩＩは、一般的先駆体であるＦＰＰが環化することによって特異性の高い先駆体であるアモルファ−４，１１−ジエン（アモルファジエンとも呼ばれる）（アルテミシニンの第１先駆体）になることを表す。この経路では、アモルファジエンシンターゼが分枝点酵素であり、アルテミシニンの生合成経路におけるキーポジションである。
パートＩＩＩでは、ジヒドロアルテアヌイン酸（ＤＨＡＡ）（ジヒドロアルテミシン酸とも呼ばれる）が、光酸化的に変換されて、そのヒドロペルオキシドになる（ＤＨＡＡ−ＯＯＨ）。このＤＨＡＡのヒドロペルオキシドは、自発的に酸化されて、アルテミシニンになる。経路のこの部分には、酵素は関与せず、したがって、経路のこの部分に関与する遺伝子の過剰発現によってアルテミシニン産生を変更することは不可能である。
【０００７】
おそらく、シトクロムＰ−４５０触媒酵素およびエノエートレダクターゼが、パートＩＩとパートＩＩＩの間の遷移状態である、アモルファジエンからＤＨＡＡへの変換に関与している（図３参照）。植物において、経路のこの部分の中間体は知られていないかまたは検出可能な量で存在しない（蓄積されない）ので（アルテミシン酸または４,１１（１３）−アモルファジエン−１２−酸とも呼ばれるアルテアヌイン酸以外は）、これらの先駆体は非常にすばやくＤＨＡＡに変換されると考えられる。経路のこの部分において律速段階は、なさそうである。
これらのすべての局面を考慮に入れて、本発明者らは、遺伝子的干渉によって変更される最も論理にかなうステップは、アモルファジエンシンターゼによるＦＰＰからアモルファジエンへの変換（環化）であるという結論に達した。
【０００８】
したがって、本発明の目的は、アルテミシニンが、少なくとも一部が生物学的な手段を介して得られる方法を提供することである。
この目的は、図１２に示されるＤＮＡ配列に対して、少なくとも７０％の相同性を示し、酵素アモルファジエンシンターゼの生物学的活性をもつポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を準備することによって達成される。
酵素アモルファジエンシンターゼの生物学的活性は、一般的先駆体であるファルネシルピロホスフェート（ＦＰＰ）から特異的アルテミシニン先駆体であるアモルファ−４，１１−ジエン（クソニンジンではさらにアルテミシニンへ変換される）への変換に関係する。本発明の適当な遺伝子は、遺伝子の発現産物を、ＦＰＰからアモルファ−４，１１−ジエンへ転換するその能力についてテストすることによって選択することができる。
【０００９】
本発明のＤＮＡ配列で適当な宿主細胞を形質転換することによって、ファルネシルピロホスフェート（ＦＰＰ）から特異性の高い先駆体であるアモルファジエンへの変換を増進するか、あるいは当該有機体においてこの変換ルートが天然に存在しない場合は誘発することができる。後者の場合、有機体は、ＦＰＰを含むかまたは酸性することができる必要がある。適当な宿主細胞は、たとえば、大腸菌などの細菌細胞、サッカロミセス・セレビシアエまたはピヒア・パストリスなどの酵母および特にヤロウィア・リポリチカなどの油性酵母、あるいはクソニンジンの細胞などの植物細胞である。
数種の植物は、多量のＦＰＰを産生する能力があり、アモルファジエン産生のための可能性を有する有機体となる。
【００１０】
ヤロウィア・リポチカおよびクリプトコッカス・クルバタスといったような可能性を有する油性酵母宿主細胞は、油性ボディに約５０％まで貯蔵用炭水化物を蓄積する能力をもち、多量のテルペンを産生する有機体として非常に興味深い候補となる。本発明にしたがって、高レベルのテルペン蓄積を得るための方法は、たとえば、アモルファ−４，１１−ジエンの形成のために、代謝の流れの方向を変えるという手段である。
Shimadaらによって行われた、イソプレノイド経路の代謝工作を介して食物酵母カンジダ・ウチリスによるカロテノイド産生を増加するというアプローチ（Appl.Environ.Microbiol.、６４、２６７６−２６８０（１９９８））への類似性において、先駆体供給の増進ならびに酵母細胞中のアモルファジエンの蓄積を獲得するためのアモルファ−４，１１−ジエンシンターゼ過剰発現を得るための、本発明の標的遺伝子は、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ、破壊）、ヒドロキシ−メチル−グルタリルＣｏＡレダクターゼ（ＨＭＧＲ、過剰発現）およびスクアレンシンターゼ（ＳＱＳ、破壊）である。数個の発現システム（たとえば、Mullerら、Yeast、１４、１２６７−１２８３（１９９８）；Parkら、The Journal of Biological Chemistry、２７２、６８７６−６８８１（１９９７）；Tharaudら、Gene、１２１、１１１−１１９（１９９２））および形質転換システム（たとえば、Chenら、Appl.Microbiol.Biotechnol.、４８、２３２−２３５（１９９７））は、ヤロウィア・リポチカについては文献において公知であり、ヤロウィア・リポチカにおける先に言及した標的遺伝子の形質転換および発現は、重大な技術的問題がなく、可能である。
【００１１】
さらに本発明の酵素（実施例１に単離を記載）またはを発現している本発明のＤＮＡ配列を含む形質転換細胞（大腸菌など）（実施例３および４に記載）を含む培養培地に、ＦＰＰを加えることによって、ＦＰＰはアモルファジエンに変換される。次いで、アモルファジエンを出発物質として用い、アルテミシニンを産生することができる。
本発明のアモルファジエンシンターゼの発現の結果としてアモルファジエンが産生される形質転換細胞は、音波処理などにより破壊された形状あるいは無傷の細胞のいずれかにおいて、アモルファジエン源として用いることができる。
テルペンシクラーゼが律速段階であると予測されるので、クソニンジンにおけるアモルファジエンシンターゼをコードする遺伝子の過剰発現は、アルテミシニン産生を増進するだろう。
【００１２】
本研究の結果から（仮定アルテミシニンの生合成経路）、アモルファジエンシンターゼが無い場所に１つの主要な律速段階が存在することが明らかである。アモルファジエンシンターゼをコードする遺伝子の過剰発現は、クソニンジンにおけるアルテミシニンの産生を増進することができる。
ＦＰＰの環化産物であるアルテミシニンの第１の特異的先駆体の化学構造は、文献に公知ではなかった。クソニンジン中のこのような化合物をこれまでにだれも検出していない。ＤＨＡＡおよびアルテアヌイン酸（図３）の構造に基いて、この環化産物に適当な構造を予測することは可能であるにもかかわらないが。この方法において予測される構造は、４,１１−アモルファジエンとして文献に公知の化合物に一致する（J.D.ConnellyおよびR.A.Hill「Dictionary of terpenoids」、Chappuman&Hill、ロンドン、イギリス）（図４参照）。Viguiera oblongifoliaから単離されたこの化合物は、Bohlmannらによって不正確な名称であるカンジダ−４,１１−ジエンとして先に記載されている（Phytochemistry、２３（５）、１１８３−１１８４（１９８４））。アルテアヌイン酸（クソニンジンから単離）から出発して、アモルファジエンを合成することができた。この方法で得られたアモルファジエンは、Bohlmannらによって記載されたアモルファジエンと同一の化学および物理的性質をもち、このスタンダードを用いて、クソニンジンのテルペン抽出液中のアモルファジエンの存在が示された。
【００１３】
本発明の別の目的は、酵素アモルファジエンシンターゼの生物学的活性をもつポリペプチドを提供することであり、実施例１に記載の方法で得ることができる。このポリペプチドを用いて、ＦＰＰをアモルファジエンに変換することができ、次いで、アモルファジエンをアルテミシニンに変換することができる。さらにアモルファジエンをアルテミシニンに変換するのに必要な酵素を含む植物においてポリペプチドアモルファジエンシンターゼが発現される場合にはインプランタで、あるいは、ＦＰＰおよびポリペプチド（単離体または細胞における発現産物として）をインキュベーション混合物中で一緒にする場合にはインビトロで変換を行うことができる。
【００１４】
先駆体として本発明のＤＮＡ配列で形質転換された適当な宿主有機体によって産生されたアモルファジエンは、続いて化学的に変換してジヒドロアルテアヌイン酸にすることができる。ジヒドロアルテアヌイン酸は、それ自体を用いるか、またはアルテミシニンの産生に用いることができる。
アモルファジエンからジヒドロアルテアヌイン酸への化学的変換（図１５）は、ＢＨ３によるアモルファジエンのエナンチオ選択的，立体選択的および位置選択的（抗−マルコウニコフ）ハイドロボレーションから出発して、トリアルキルボランを得、次いで、トリアルキルボランをＮａＯＨ／Ｈ２Ｏ２で酸化してアルコールを得る（Advanced Organic Chemistry、Jerry March、第４版、Wiley、１９９２）。ＰＤＣでアルコールを緩やかに酸化すると酸第２の二重結合に影響を及ぼすことなくが得られる(図１５)（Organic Synthesis、M.B.Smith、第１版，McGraw-Hill、１９９４）。
【００１５】
ファルネシルジホスフェートの生合成経路に関与する酵素をコードする多くの遺伝子は、クローニングされており、文献に記載されている。たとえば、クソニンジンについては、ファルネシルジホスフェートシンターゼをコードする遺伝子の配列が文献に記載されている（Y.Matsushita、W-K.KangおよびV.Charwood、Gene、１７２（１９９６）２０７−２０９）。有機体においてアモルファジエン産生を誘発または増進するための別のアプローチは、クソニンジンなどの有機体を本発明ＤＮＡ配列およびファルネシルジホスフェートの生合成に関与する１個または２個以上の遺伝子で同時に形質転換することである。アモルファジエンシンターゼとファルネシルジホスフェートシンターゼの融合タンパク質の発現を本明細書に例示する。アモルファジエンなどの（セスキ）テルペンは、食品および香料工業において風味料または芳香料化合物としても知られている。さらに、テルペンは、植物による昆虫の誘引または拒絶といったような植物−昆虫相互作用においても役割を演じる。さらに、クソニンジンにおいてアモルファジエンからアルテミシニンへの代謝経路における中間体であるジヒドロアルテアヌイン酸は、抗酸化剤としても用いることができる。
【００１６】
本発明ＤＮＡ配列の過剰発現または本発明ポリペプチド（アモルファジエンシンターゼ）の使用によって得られたアモルファジエンもこれらの目的に適用することができる。
本発明に用いることができる植物は、すでにアルテミシニンを産生している植物が好ましい。クソニンジンはアルテミシニンに到る経路の残りの部分を含んでいるので、最良の例は、この種の植物である。しかし、本発明は、植物において、前述したように風味料または芳香料化合物もしくは殺生物剤として用いることができ、あるいは化学的または微生物、酵母または植物細胞を用いる生物変換によりアルテミシニンに変換することができる、アモルファジエンの産生にも用いることができる。
【００１７】
アモルファジエンの産生に用いることができる植物としては、すでに基本的な経路をおよび利用可能な貯蔵室をもっていることから、すでにセスキテルペンを産生している植物が好ましく、あるいは誘導（エリシテーション）によってセスキテルペンの生合成を誘発しうる植物が好ましい。本発明方法は、慣例の技術を介して、キャラウェイ属、ニガナ属、ニンジン属、ビャクシン属、カミツレ属、アキノノゲシ属、パチュリー属およびベチベル属などの種、およびトウガラシ属、ワタ属、トマト属、タバコ属、アワガエリ属、ナス属およびニレ属などの誘発可能な（誘導により）セスキテルペノイドフェイトアレクシンを産生する種といったような多くの種の植物に容易に適用することができる。しかし、大豆、ヒマワリおよびナタネなどの普通の農作穀類も本発明を適用する興味深い候補である。
本発明を以下の実施例によってさらに詳しく説明するが、それらに限定されるものではない。実施例においては、後述する図面を参照されたい。
【００１８】
（実施例）
実施例１
アモルファジエンシンターゼによるファルネシルピロホスフェートからアモルファジエンへの変換
Ａ．クソニンジンからのアモルファジエンシンターゼの単離、部分的精製および同定
酵素の単離およびアッセイの準備中、すべての操作は氷上または４℃にて行う。温室栽培のクソニンジンの新鮮な葉を凍結したもの１０ｇを、１ｇのポリビニルポリピロリドン（ＰＶＰＰ）と精製海砂のスパチュラチップでスラリー化した、２５ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ５．５）、２０％（ｖ／ｖ）グリセロール、２５ｍＭアスコルビン酸ナトリウム、２５ｍＭ ＮａＨＳＯ３、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２および５ｍＭ ＤＴＴを含む予め冷却した緩衝液（緩衝液Ａ）４０ｍｌを入れた予め冷却した乳鉢と乳棒ですりつぶす。ポリスチレン樹脂（アンバーライトＸＡＤ−４、セルバ）１０ｇを加え、スラリーを１０分間注意深く攪拌し、次いで、チーズクロスで濾過する。濾液を２００００ｇで９０分間遠心分離する。上清のサブサンプル３ｍｌを、１５ｍＭ ＭＯＰＳＯ（ｐＨ７．０）、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール、１ｍＭアスコルビン酸ナトリウム、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２および２ｍＭ ＤＴＴを含む緩衝液（緩衝液Ｂ）に脱塩し、酵素アッセイ／生成物同定に用いる（後記Ｂ参照）。
【００１９】
残りの上清を、緩衝液Ａで数回濯いでおいた、１２．５ｇのＤＥＡＥを入れた陰イオン交換器（ワットマンＤＥ−５２）に加え、注意深く１０分間攪拌する。１８０００ｇで２０分間遠心分離した後、上清をデカントし、ＤＥ−５２ペレットを捨てる。（ＮＨ４）２ＳＯ４を加えて上清中のタンパク質を沈澱させ、最終濃度を７０％にし、注意深く３０分間攪拌し、ついで、２００００ｇで１０分間遠心分離する。得られるペレットを緩衝液Ａ６ｍｌに再懸濁し、緩衝液Ｂに脱塩する。グリセロールを３０％（ｖ／ｖ）まで加えた後、この酵素調製物を液体窒素で凍結し、活性を失わないように−８０℃にて貯蔵する。この酵素調製物０．５ｍｌを、アスコルビン酸ナトリウムを含まず、０．１％Tween−２０を含む緩衝液Ｂで予め平衡化したMono−Ｑカラム（ＨＲ５／５、ファルマシア・バイオテック）に適用する。同じ緩衝液中で、０−２．０ＭのＫＣｌ勾配にて酵素を溶離する。酵素活性の決定のために、エッペンドルフ管を用い、０．７５ｍｌフラクション５０μｌを緩衝液Ｂで２倍に希釈し、２０μＭ[３Ｈ]ＦＰＰを加える。反応混合物の上にヘキサン１ｍｌを重ね、揮発性生成物を閉じ込め、内容物を混合する。３０℃で３０分間インキュベートした後、バイアルを激しく混合し、短時間遠心分離して、層を分離する。ヘキサン相の一部（７５μｌ）を、シリカゲル４０ｍｇを含む新しいエッペンッドルフ管（０．０３５−０．０７ｍｍ、孔径６ｎｍ、ヤンセン・キミカ）に移し、ホスホヒドロラーゼによって生成したテルペンを結合し、混合および遠心分離後、ヘキサン層５００μｌを除去し、アルティマ・ゴールド・カクテル（パッカード）４．５ｍｌを用いて液体シンチレーションカウントを行う。活性フラクションを合わせ、アッセイを行って生成物の同一性を決定する（後記参照）。Mono−Ｑステップの後、すべての他のＦＰＰ−変換活性から酵素が分離される。この酵素調製物を用いて、分子量およびＫｍといったような酵素特性の測定を行う。分子量はサイズ排除クロマトグラフィーを用いて決定する。Mono−Ｑ溶離液２００μｌをスーパーデックス７５（Ｈ／Ｒ１０／３０、ファルマシア・ビオテック）に入れ、Mono−Ｑで用いたのと同じ緩衝液で溶離する。希釈しない溶離液を用いる以外は、Mono−Ｑの場合と同様にして、フラクション０．５ｍｌ中の活性を決定する。カラムはシトクロームＣ、リボヌクレアーゼＡ、α−キモトリプシノーゲン、オボアルブミンおよびＢＳＡ（すべてシグマ）で較正する。概算された分子量は５６ｋＤａである（図１６）５倍および１０倍に希釈したMono−Ｑ溶離酵素調製物および濃度範囲０．２５−１００μＭの[３Ｈ]−ＦＰＰを用いて、酵素動態を決定する。アモルファジエンシンターゼのＫｍは、０．６μＭである。
【００２０】
Ｂ．生成物同一性の決定
生成物同一性を決定するために、酵素調製物１ｍｌに、２０μＭの[３Ｈ]−ＦＰＰ（アマーシャム；放射−ＧＣ分析用）または５０μＭの非標識ＦＰＰ（シグマ；ＧＣ−ＭＳ分析用）を加える。揮発性生成物を閉じ込めるために再蒸留したペンタン１ｍｌで覆い、管を注意深く混合し、３０℃で１時間インキュベートする。沸騰させたサンプルをコントロールとして用いる。アッセイに続いて、管を激しく混合する。有機層を除去し、無水ＭｇＳＯ４を重ねた酸化アルミニウムのショートカラムを通す。分析物を、これも酸化アルミニウムカラムを通した別のジエチルエーテル１ｍｌで抽出し、カラムをジエチルエーテル１．５ｍｌで洗浄する。ＧＣ分析のために、合わせたペンタン／ジエチルエーテル混合物を窒素気流下でゆっくりと濃縮する。
【００２１】
ＲＡＧＡ−９０放射活性検出器を備えたカルロ−エルバ４１６０シリーズガスクロマトグラフ装置（Raytest、Straubenhardt、ドイツ）で放射−ＧＬＣを行う。カラムから溶出するサンプル成分は、８００℃にてプラチナチップを充填した変換反応器を通すことによって、放射活性測定の前に定量的に減少する。サンプル１μｌを冷オンカラムモードで注入する。カラムは、０．２５μｍのポリエチレングリコールフィルム（EconoCap ＥＣ−ＷＡＸ、オールテック・アソシエイツ）で被覆され、１．２ｍｌ／分のＨｅ−流で作動する焼結シリカキャピラリー（３０ｍ×０．３２ｍｍ i.d.）である。オーブンの温度は、７０℃で５分間、次いで、５℃／分の傾斜で２１０℃まで、そして最後に５分間というプログラムにする。保持時間およびピーク同一性を決定する（レファレンススタンダードとともに放射活性を共溶離する）ために、約２０％のカラム流出液をアジャスタブルスプリッターでＦＩＤのために分ける（温度２７０℃）。残りを変換反応器および放射検出器に割り当てる。反応器に入れる前に３ｍｌ／分でＨ２を流し、放射活性検出器（５ｍｌの計数管）に入れる前に反応停止ガスとしてＣＨ４を流し、総流量を３６ｍｌ／分にする。主要[３Ｈ]標識生成物は、アモルファジエンレファレンススタンダードとともに共溶離される（保持時間１４分）（図５Ｂ）。第２の放射標識生成物は、非特異的ホスホヒドロラーゼ活性の産物であるファルネソールである。Mono−Ｑステップの後、すべての他のＦＰＰ−変換活性から酵素が分離される（図５Ｃ）。この酵素調製物を用いて、分子量およびＫｍなどの酵素特性の測定を行う。
【００２２】
ＨＰ５８９０シリーズＩＩ ＧＣおよびＨＰ−５ＭＳまたはＨＰ−Innowaxカラム（両者とも３０ｍ×０．２５ｍｍ i.d.、０．２５μＭ df）を備えたＨＰ５９７２Ａ質量選択検出器（ヒューレット−パッカード）を用いて、ＧＣ−ＭＳ分析を行う。オーブンの温度は、初期温度７０℃で１分間、次いで、５℃／分の傾斜で２１０℃まで、そして最後に５分間というプログラムにする。注入口（スプリットレスモード）、インターフェースおよびＭＳ源の温度は、それぞれ、１７５、２９０および１８０℃であり、Ｈｅ吸い込み口圧は、電圧コントロールによって制御し、一定のカラム流量１．０ｍｌ／分にする。イオン化ポテンシャルは、７０ｅＶにセットし、走査は３０−２５０ａｍｕ行う。（ＮＨ４）２ＳＯ４沈澱酵素調製物は内因性のセスキテルペンを含まない。２つの異なるカラムにおける、この酵素調製物によってＦＰＰから産生したセスキテルペン生成物のＧＣ−ＭＳ分析から、主要生成物が、半合成アモルファジエンと同じマススペクトルおよび保持時間をもつことことが示される（図６）。
【００２３】
実施例２
アモルファジエンシンターゼをコードする遺伝子の単離および特徴決定
Ａ．転写の誘発
図２のパートＩＩＩに示すように、ＤＨＡＡは、光酸化的に、ＤＨＡＡ−ＯＯＨに変換される。この反応において、活性型の酸素（一重項Ｏ２）をＤＨＡＡに加える。ＤＨＡＡは、活性酸素のスカベンジャーである抗酸化剤の役割を演じる。アルテミシニンは、活性酸素が貯蔵される、この反応の安定な最終産物である。ストレス条件下（光ストレス、凍結、渇水または機械的損傷など）においては、酸素の活性種が植物中に形成される。この活性酸素に対し、一般に植物は、抗酸化物質を産生する。クソニンジンは、この活性酸素の放出に対し、抗酸化物質としてＤＨＡＡを産生すると考えられる。クソニンジンをストレス条件に置くことによって、アモルファジエンシンターゼをコードする遺伝子の転写が誘発される。この状況を達成するために、空調室内条件下（２３℃、湿度９０％、３０００ルクス）で生長したクソニンジンを、約湿度３０％（渇水ストレス）および６０００ルクス（光ストレス）、３０℃にて１時間置くことによって、ストレス条件を与える。
【００２４】
Ｂ．全ＲＮＡの単離
ストレス誘発植物（実施例２のＡ）の全ＲＮＡを、Verwoerdらの方法（Nucleic Acid Research、１７（６）、２３６２（１９８９））によって、新鮮な葉から単離する。ＤＮアーゼＩ（デオキシリボヌクレアーゼＩ、ＲＮアーゼなし）を用いて、ＲＮＡ単離物からＤＮＡを除去する。７０℃に１５分間曝すことによって、ＤＮアーゼＩを不活化する。
【００２５】
Ｃ．ｃＤＮＡ合成
全ＲＮＡ５μｇ、オリゴ（ｄＴ）１２ ０．２μｇ、それぞれ０．５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰ、１０ｍＭのＤＴＴ、２Ｕのリボヌクレアーゼインヒビター（ギブコ ＢＲＬ）、第１ストランド合成緩衝液（プロメガ）を含む反応物２０μｌにおいて逆転写反応を行い、２００Ｕのモロニーマウス白血球ウイルス（Ｍ−ＭＬＶ）逆転写酵素ＲＮアーゼＨマイナス（プロメガ）で触媒する。
【００２６】
Ｄ．ＰＣＲ−に基くプローブ生成
テルペノイド合成の配列の比較に基いて、２つの保存領域のために、２つの縮重したプライマーを設計する。センスプライマー（プライマーＡ）の配列は、５'−ＧＡ（Ｃ／Ｔ）  ＧＡ（Ｇ／Ａ）  ＡＡ（Ｃ／Ｔ）  ＧＧＩ  ＡＡ（Ｇ／Ａ）  ＴＴ（Ｃ／Ｔ）  ＡＡ（Ｇ／Ａ)  ＧＡ−３'であり、アンチセンスプライマー（プライマーＢ）の配列は、５'−ＣＣ  （Ｇ／Ａ）ＴＡ  ＩＧＣ  （Ｇ／Ａ）ＴＣ  （Ｇ／Ａ）ＡＡ  ＩＧＴ  （Ｇ／Ａ）ＴＣ  （Ｇ／Ａ）ＴＣ−３'である。各０．５μＭのこれら２つのプライマー、０．２ｍＭのｄＮＴＰ、１ＵのスーパーＴａｇポリメラーゼ／１ｘＰＣＲ緩衝液（ＨＴバイオテクノロジー・リミテッド、ケンブリッジ、イギリス）および２μｌのｃＤＮＡを含む合計量１００μｌにおいてＰＣＲを行う。サーモサイクラー（ＰＴＣ１５０、ＭＪ−リサーチ）中、９５℃にて変性１分、４０℃にてアニーリング１分、７２℃にて伸長１５秒のサイクルを４０サイクル行う。アガロースゲル電気泳動から、ＰＣＲ産物が、約５５０ｂｐ（５３８ｂｐ）単一の特定のＰＣＲ産物であることがわかる。このような特定の増幅産物は、ストレス誘発植物から単離されたＲＮＡから得られるｃＤＮＡを用いる場合のみに得られる。ＰＣＲ産物は、ＤＮＡポリメラーゼＩラージフラグメント（クレノー）、ゲル濾過およびＳｍａＩ切断ｐＧＥＭ ７Ｚｆ（＋）（ストラタジーン）用いることによって平滑末端になり（図７）、この構築物で大腸菌ＤＨ５α（ギブコＢＲＬ）を形質転換する。８個の独立した形質転換物の挿入体の配列決定を行うと、それらはすべて図８に示す配列と同じ配列をもっている。
【００２７】
Ｅ．ｃＤＮＡライブラリーの構築
RiboClone（登録商標）ｃＤＮＡ合成システム（プロメガ）に類似のシステムで、ｃＤＮＡの第２ストランドの合成を行う。以下の配列：
５'−ｐＧＴＣＧＡＣＧＣＧＧＣＣＧＣＧ−３'
３'−ＣＡＧＣＴＧＣＧＣＣＧＧＣＧＣＴＴＡＡ−ＯＨ−５'
をもつ、ＥｃｏＲＩ（ＮｏｔＩ）アダプター(ギブコＢＲＬ)とライゲートした後、二本鎖ＤＮＡを、λＥｘＣｅｌｌＥｃｏＲＩ／ＣＩＰ（ファルマシア・バイオテック）にライゲートする。ｃＤＮＡライブラリーをパッケージングおよびプレーティングするために、Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ（登録商標）ラムダパッケージングキット（ファルマシア・バイオテック）を用いる。非増幅ライブラリーの力価は、１．２×１０６プラーク形成ユニットである。
【００２８】
Ｆ．ライブラリーのスクリーニング
ライブラリースクリーニングを行うために、２００ｎｇのＰＣＲ増幅プローブ（図８）をゲル濾過し、使用説明書にしたがって、[α−３２Ｐ]でランダムに標識し（ランダムプライムドＤＮＡラベリングキット、ベーリンガー・マンハイム・ビオキミカ）、大腸菌ＮＭ５２２にプレーティングされたｃＤＮＡライブラリーの１０４個のプラークのレプリカフィルターのスクリーニングに用いる。１Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳおよび１０％ＰＥＧ（５０００−７０００）中、６８℃にて１６時間ハイブリダイゼーションを行う。０．１％ＳＤＳを含む２ｘＳＳＣで５０℃にて１０分間の洗浄を２回行い、−７０℃にてフジＸ線フィルムを１６時間感光させる。第２および第３ラウンドのハイブリダイゼーションを行うことによって、ポジティブシグナルが得られるクローンを単離する。使用説明書（ファルマシア・バイオテック）にしたがって、大腸菌ＮＰ６６（ファルマシア・バイオテック）をポジティブクローンでトランスフェクトすることにより、プラスミドリリース（図９）が得られる。これらのポジティブクローンの配列決定により、図１０に示される配列が得られる。
【００２９】
実施例３
大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）におけるアモルファジエンシンターゼをコードする遺伝子の発現
機能的発現のために、ｃＤＮＡクローンを、発現ベクターｐＥＴ １１ｄ（ストラタジーン）にフレーム内サブクローニングする。サブクローニングのための適当な制限サイトを導入するために、センスプライマー（プライマーＣ）：５'−ＧＴＣＧＡＣＡＡＡＣＣＡＴＧＧＣＡＣＴＴＡＣＡＧＡＡ−３'（出発コドンＡＴＧにＮｃｏＩサイトを導入）およびアンチセンスプライマー（プライマーＤ）：５'−ＧＧＡＴＧＧＡＴＣＣＴＣＡＴＡＴＡＣＴＣＡＴＡＧＧＡＴＡＡＡＣＧ−３'（終止コドンＡＴＧにＢａｍＨＩサイトを導入）を用い、ＰＣＲで遺伝子を増幅する。ＰＣＲ反応は、標準条件下で行う。ＢａｍＨＩおよびＮｃｏＩで切断した後、ＰＣＲ産物（図１２）と発現ベクターｐＥＴ １１ｄをゲル精製し、ライゲートし、図１１に示す構築物を得る。
【００３０】
発現を得るために、この遺伝子構築物（図１１）、ネガティブコントロールとしてインサートを含まないｐＥＴ １１ｄ、ポジティブコントロールとしてタバコ５−エピ−アリストロケンシンターゼ（ＴＥＡＳ）遺伝子[Backら、Archives of Biochemistry and Biophysics、３１５（２）、５２７−５３２（１９９４）；Facchini＆Chappell、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、８９、１１０８８−１１０９２（１９９２）；Back＆Chappell、The Journal of Biological Chemistry、２７０、７３７５−７３８１（１９９５）]を含むｐＥＴ １１ｄを用いて、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ストラタジーン）を形質転換し、３７℃にて、アンピシリンを加えたＬＢ寒天プレートで一夜増殖させる。アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を加えたＬＢ培地５０ｍｌの培養物および０．２５ｍＭのイソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ（ＩＰＴＧ）を一夜培養物にＡ６００＝０．５まで植え込み、２７℃にて３時間増殖させる。２０００ｇで８分間遠心分離することにより、細胞を集め、アッセイ緩衝液２ｍｌに再懸濁する。再懸濁細胞の１ｍｌのアリコートに対し、氷上にて、３０秒の間隔を空けて５秒間ずつ４回音波処理を行い、マイクロ遠心管に入れて４℃にて１３０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を用いて、シクラーゼ酵素活性決定およびＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動を行う。
大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）におけるアモルファジエンシンターゼ遺伝子−ｐＥＴ １１ｄ構築物（図１１）の発現により、図１３のレーン５〜１０に示される約５０〜６０ｋＤａのタンパク質が得られる。これは、５６ｋＤａであると決定されているクソニンジンから単離されたアモルファジエンシンターゼ（図１６）の大きさに一致する。
【００３１】
実施例４
大腸菌に発現したアモルファジエンシンターゼによるＦＰＰからアモルファジエンへの変換
音波処理した細胞の上清以外にも、無傷の細胞も用いて、ＦＰＰアッセイを行う。前記と同様に、ＦＰＰアッセイ、ＧＣ−ＲＡＧＡおよびＧＣ−ＭＳ分析を行う。図１４および１４Ａは、それぞれ、無傷の細胞および音波処理した形質転換細胞の上清を用いたアッセイのＧＣ−ＲＡＧＡクロマトグラムを示している。両方のアッセイにおいてアモルファジエンが産生される。これらのアッセイ産物のＧＣ−ＭＳによる同定を行うと、純度スコア９９％（最大スコア）のレファレンスアモルファジエンのマススペクトルと同一のマススペクトルが得られる。これらのスペクトルは図６に示すスペクトルと同一である。ポジティブおよびネガティブコントロールで行ったアッセイではアモルファジエンは見出されない。
【００３２】
実施例５
トランスジェニックタバコにおけるアモルファ−４，１１−ジエンシンターゼの発現
植物細胞にＤＮＡを導入する方法は数多く存在する。ＤＮＡを植物細胞に導入することができる適当な方法として、アゴロバクテリウム感染、またはプロトプラストのＰＥＧ−媒介形質転換[Omirullerら、Plant Molecular Biology、２１、４１５−４２８（１９９３）]もしくは電気穿孔、ＤＮＡをコーティングしたマイクロプロジェクティルの加速による（マイクロプロジェクティルボンバードメントなど）マイクロインジェクションといったようなＤＮＡの直接デリバリーが挙げられる。
セスキテルペンシクラーゼ遺伝子を用いるクソニンジンおよびタバコのアグロバクテリウム・ツメファシエンス媒介形質転換が、文献に記載されているので[Vergauweら、Plant Cell Report、１５、９２９−９３３（１９９６）；HohnおよびOhlrogge、Plant Physiol.、９７、４６０−４６２（１９９１）]、アグロバクテリウムが媒介するアモルファジエンシンターゼコーディング遺伝子を含む発現ユニット（カセット）のデリバリーが合理的アプローチであると思われる。
タバコおよび／またはクソニンジンに対し、適当なプロモーター（カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーターなど）の後ろにあり、適当なターモネーター（ノパリンシンターゼ転写ターミネーター（nos-tail）など）の上流にある発現カセットに組み入れたアモルファジエンシンターゼコーディング遺伝子をトランスファーするのに適したバイナリーベクター系は幾つか存在する。
【００３３】
実施例３と同様に、センスプライマー（プライマーＧ）：５'−ＧＡ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＡＴＧ  ＴＣＡ  ＣＴＴ  ＡＣＡ  ＧＡＡ−３'（出発コドンＡＴＧの前にＢａｍＨＩサイトを導入）およびアンチセンスプライマー（プライマーＨ）：５'−ＡＴ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＴＣＡ  ＴＡＴ  ＡＣＴ  ＣＡＴ  ＡＧＧ  Ａ−３'（終止コドンＴＧＡのすぐ後にＢａｍＨＩサイトを導入）を用いることによって、サブクローニングのための適当な制限サイトを導入する。ＢａｍＨＩで切断した後、ＰＣＲ産物と植物発現カセットｐＬＶ３９９をゲル精製し、ライゲートして、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターとノパリンシンターゼ転写ターミネーターをもつアモルファ−４，１１−ジエンシンターゼをコードする遺伝子を得る。植物発現カセットｐＬＶ３９９は、マルチプルクローニングサイト（ポリリンカー）が、ユニークサイトが隣接したnos-tail（ターミネーター）に結合したＣａＭＶ３５ＳプロモーターＢａｍＨＩ；プロモーターより下流のＥｃｏＲＩ、ＫｐｎＩ、ＸｈｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩサイト；およびターミネーターより上流のＥｃｏＲＩ、ＸｈｏＩ、ＰｓｔＩ、ＳｐｈＩ、ＫｐｎＩおよびＨｉｎｄＩＩＩサイトによって置き換えられる、ｐＵＣ１９ベクター[Yanisch−Perron，C.ら、Gene、３３、１０３−１１９（１９８５）]である。ｐＬＶ３９９中のアモルファ−４，１１−ジエンコーディング遺伝子の方向性は、ＰｓｔＩとＮｄｅＩを用いる制限分析によってチェックする。ＫｐｎＩでこの構築物を部分的に切断した後、３５Ｓプロモーターおよびｎｏｓターミネーターが隣接するアモルファ−４，１１−ジエンコーディング遺伝子をＫｐｎＩ切断バイナリーベクターｐＣＧＮ１５４８にライゲートする。
【００３４】
アグロバクテリウム・ツメファシエンスに対する組換えバイナリーベクターを起動させるために、組換えバイナリーベクターをもつ大腸菌（ＤＨ５α）およびアグロバクテリウム・ツメファシエンスＬＢＡ４４０４に対する組換えバイナリーベクターを起動させるためのプラスミドｐＲＫ２０１３をもつヘルパー大腸菌を用いて、トリペアレンタルメイティング操作を行う。
この形質転換したアグロバクテリウム菌株を用いて、標的植物の外植片の形質転換を行う。耐性マーカー（カナマイシン耐性、バイナリープラスミドＴ−ＤＮＡボーダーの間に存在）を有する形質転換組織のみが、選択可能な（カナマイシン含有）再生培地で再生される（Rogers，SG、Fraley，RT、Methods Enzymol（１９８６）１１８：６２７−６４０）。
形質転換組織から再生した植物は、ＧＣ−ＭＳ分析から確認されるように、アモルファジエンが存在しており、アモルファジエンシンターゼ遺伝子を発現している。
【００３５】
実施例６
クソニンジンによるアモルファジエンからアルテミシニン（ＤＨＡＡ）への変換
このアッセイは、Koeppら[The Journal of Biological Chemistry、２７０、８６８６−８６９０（１９９５）]に記載の方法に準じて行う。放射性（３Ｈ標識）アモルファジエンをクソニンジンのリーフディスクに付与する。クソニンジンのリーフディスクにアモルファジエンを浸透させるために、放射性アモルファジエンは、たとえばシクロデキストリンとの複合体にすることによって水溶性にすることができる。放射性アモルファジエンは、形質転換された大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（クソニンジンのクローニングされたアモルファジエンシンセターゼ遺伝子をもつ）でＦＰＰ−アッセイを行うことによって得られる。このアッセイで作成された産物の同定は、放射−ＧＣ分析によって行う。予想される中間体であるアルテアヌイン酸（ＡＡ）、ジヒドロアルテアヌイン酸（ＤＨＡＡ）および最終産物であるアルテミシニンはすべてレファレンスとして用いる。
【００３６】
α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリンおよび部分的に３Ｈ標識されたアモルファ−４，１１−ジエンの混合物（モル比５：５：５：１）（２０μＭ）を調製し、クソニンジンのリーフディスクをこの混合物中でインキュベートする。１２０時間インキュベートした後、実施例１のＢと同様の方法での放射−ＧＣによって、アルテミシン酸およびジヒドロアルテミシン酸が検出される。
【００３７】
実施例７
トランスジェニッククソニンジンにおけるアモルファ−４，１１−ジエンシンターゼの発現およびアルテミシニンの産生
実施例５の記載にしたがって、形質転換したクソニンジンを作成する。
クソニンジンを再生するには、カルス、苗条および根用の培地は、修飾ビタミン（Duchefa Biochemie、ハールレム、オランダ）を含むMurasigeおよびSkoogのマイクロおよびマクロエレメント、４％（ｗ／ｖ）スクロース、０．１ｍｇ／Ｌのインドール−３−酢酸（ＩＡＡ）、０．１ｍｇ／Ｌの６−ベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）および０．８％（ｗ／ｖ）寒天（植物寒天、Duchefa Biochemie、ハールレム、オランダ）からなる。寒天培地に植える前に、ＮａＯＨでｐＨを５．７に調節する。１バールにて２０分間オートクレーブ処理する。この培地にて、形質転換した外植片を再生し、完全再生植物にする。
再生植物には、酵素アモルファ−４，１１−ジエンシンターゼが過剰発現しており、非形質転換植物において天然に産生されるよりも高い濃度でアルテミシン酸、ジヒドロアルテミシン酸およびアルテミシニンが産生される。
【００３８】
実施例８
サッカロミセス・セレビシアエおよびピヒア・パストリスにおけるアモルファ−４，１１−ジエンシンターゼ遺伝子の発現
機能的発現のために、誘発可能な発現ベクターｐＹＥＳ２（エピソームベクター、インビトロゲン）および構成発現ベクター（遺伝子構築物をゲノムに組込む）ｐＧＡＰＺ Ａ（インビトロゲン）に、ｃＤＮＡクローンをサブクローニングする。サブクローニングに適した制限サイトを導入するために、センスプライマー（プライマーＥ）：５'−ＣＧＡ  ＧＡＡ  ＴＴＣ  ＡＴＧ  ＴＣＡ  ＣＴＴ  ＡＣＡ  Ｇ−３'（出発コドンＡＴＧの前にＥｃｏＲＩサイトを導入する）およびアンチセンスプライマー（プライマーＦ）：５'−ＧＧＡＴ  ＣＴＣ  ＧＡＧ  ＴＣＡ  ＴＡＴ  ＡＣＴ  ＣＡＴ−３'（終止コドンＴＧＡのすぐ後ろにＢａｍＨＩサイトを導入する）を用いるＰＣＲによって遺伝子を増幅する。ＰＣＲ産物は、実施例３の記載に準じて、ｐＹＥＳ２およびｐＧＡＰＺ Ａにサブクローニングする。
サッカロミセス・セレビシアエには、サッカロミセス・セレビシアエEasyComp（商標）形質転換キット（インビトロゲン）を用い、ピヒア・パストリスには、ピヒア・パストリスEasyComp（商標）形質転換キット（インビトロゲン）を用い、得られた遺伝子構築物で、それぞれサッカロミセス・セレビシアエおよびピヒア・パストリスを形質転換する。すべての形質転換は、使用説明書にしたがって行う。増殖、選択および誘発も、使用説明書にしたがって行う。実施例３の記載と同様にして、酵母細胞の採集および音波処理を行う。
アモルファ−４，１１−ジエンシンターゼ遺伝子が発現する酵母細胞抽出物にＦＰＰアッセイでは、実施例４と同じＧＣ−ＲＡＧＡおよびＧＣ−ＭＳクロマトグラムが得られる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  アルテミシニンの構造式。
【図２】  クソニンジンにおけるアルテミシニンの仮定生合成経路。
【図３】  図２のパートＩＩとＩＩＩの間の遷移：クソニンジンにおけるアモルファジエンからジヒドロアルテアヌイン酸への仮定の変換。
【図４】  アモルファ−４，１１−ジエンの構造式。
【図５】  [３Ｈ]−ＦＰＰ−アッセイの放射−ガスクロマトグラム。Ａ．アモルファジエンのフレームイオン化検出（ＦＩＤ）シグナル（レファレンス）。
Ｂ．粗酵素抽出物によって得られた３Ｈで標識したアッセイ産物アモルファジエン（保持時間１４分）およびファルネソール（特異的ホスホヒドロラーゼ活性の産物として；保持時間２８分）の放射シグナル。Ｃ．Mono−Ｑ精製酵素抽出物によって得られた３Ｈで標識したアッセイ産物アモルファジエンの放射シグナル。
【図６】  レファレンスアモルファジエンとクソニンジンから精製されたテルペンシクラーゼ（シンターゼ）を用いるＦＰＰアッセイのマススペクトルの比較。この比較から、同一性の最大スコアに匹敵する９９％という優れたスコアが得られた。
【図７】  ＰＣＲによって生成され、ｐＧＥＭ ７Ｚｆ＋へクローニングされたプローブ。
【図８】  プライマーＡおよびＢを用いたＰＣＲによって生成されたプローブ（５３８ｂｐ）の核酸配列および演繹されたアミノ酸配列。
【図９】  誘発クソニンジンのｃＤＮＡライブラリーから単離されたポジティブクローンの放出プラスミド。
【図１０】  誘発クソニンジンのｃＤＮＡライブラリーから単離されたポジティブクローン（アモルファジエンシンターゼをコードする遺伝子）の核酸配列および演繹されたアミノ酸配列。該配列には、ＥｃｏＲＩ（Ｎｏｔ）アダプター（ギブコＢＲＬ）が隣接する。
【図１１】  発現ベクターｐＥＴ １１ｄのＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩサイトでクローニングされたアモルファジエンシンターゼをコードする遺伝子の出発および終止コドン（それぞれＮｃｏＩとＢａｍＨＩサイトが隣接する）の間の部分。
【図１２】  プライマーＣおよびＤを用いたＰＣＲによって得られたアモルファジエンシンターゼをコードする遺伝子の出発および終止コドン（それぞれＮｃｏＩとＢａｍＨＩサイトが隣接する）の間の核酸配列および演繹されたアミノ酸配列。
【図１３】  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル：レーン１および２は、それぞれｐＥＴ １１ｄのペレットと上清を示す（ネガティブコントロール）；レーン３および４は、ｐＥＴ １１ｄにおけるタバコ５−エピ−アリストロケンシンターゼ（ＴＥＡＳ）遺伝子のペレットと上清を示す（ポジティブコントロール）；レーン５、７、９および６、８、１０はそれぞれ、ｐＥＴ １１ｄにおけるアモルファジエンシンターゼのペレットと上清を示す。すべての構築物は、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）内で発現させた。ｐＥＴ １１ｄにおけるＴＥＡＳおよびｐＥＴ １１ｄにおけるアモルファジエンのペレットフラクションのレーンは、ネガティブコントロールｐＥＴ １１ｄには存在しなかった明瞭なスポットを示す。Ｍｗは、低分子量マーカー（ファルマシア・ビオテック）である。
【図１４】  Ａ．アモルファ−４，１１−ジエンおよびファルネソールのフレームイオン化検出（ＦＩＤ）シグナル（レファレンス）；Ｂ．発現ベクターｐＥＴ １１ｄにおけるアモルファジエンシンターゼをコードする遺伝子で形質転換された無傷のＢＬ２１（ＤＥ３）細胞の[３Ｈ]−ＦＰＰ−アッセイの放射−ガスクロマトグラム；Ｃ．発現ベクターｐＥＴ １１ｄにおけるアモルファジエンシンターゼをコードする遺伝子で形質転換された音波処理されたＢＬ２１（ＤＥ３）細胞の上清の[３Ｈ]−ＦＰＰ−アッセイの放射−ガスクロマトグラム。
【図１５】  先駆体としてアモルファ−４，１１−ジエンを用いるジヒドロアルテアヌイン酸の仮定の化学合成。反応は、ＢＨ３によるエナンチオ−、立体−および位置選択的（抗−マルコウニコフ）ハイドロボレーション、次いで、アルコールが得られる、ＮａＯＨ／Ｈ２Ｏ２による形成されたトリアルキルボランの酸化からなる。ＰＤＣ（ピリジニウムジクロメート）でアルコールを緩やかに酸化すると第２の二重結合に影響を及ぼすことなく酸が得られる。
【図１６】  サイズ排除クロマトグラフィー（ゲル濾過）によってアモルファ−４，１１−ジエンの分子量の決定。−＊−は活性曲線；−黒三角−は分子量マーカー；−は分子量目盛り線。
【図１】
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【図４】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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