(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
上流から、
（ａ）タバコ葉緑体由来のｒｂｃＬ遺伝子、
（ｂ）遺伝子組換え体を識別するための遺伝子、その上流にプロモーターおよびその下流にターミネーターを有する識別遺伝子群、
（ｃ）タバコ葉緑体由来のｐｓｂＡプロモーター、
（ｄ）複数の制限酵素部位、２つの制限酵素部位に挟まれたタンパク質をコードする遺伝子を挿入できる挿入部位および該挿入部位の上流にリボゾーム結合部位を有するマルチクローニング領域、
（ｅ）タバコ葉緑体由来のｒｐｓ１６ターミネーター、及び
（ｆ）タバコ葉緑体由来のａｃｃＤ遺伝子
を有することを特徴とするベクター。
【請求項２】
マルチクローニング領域が、タンパク質をコードする遺伝子の翻訳開始点の７〜１１塩基上流にリボゾーム結合部位を有することを特徴とする請求項１に記載のベクター。
【請求項３】
リボゾーム結合部位がＳＤ配列であることを特徴とする請求項１または２に記載のベクター。
【請求項４】
マルチクローニング領域が、配列番号７で表される塩基配列からなることを特徴とする請求項１〜３の何れかに記載のベクター。
【請求項５】
識別遺伝子群のプロモーターがタバコ葉緑体由来のｒｒｎプロモーターであり、識別遺伝子群のターミネーターがタバコ葉緑体由来のｐｓｂＡターミネーターである請求項１〜４の何れかに記載のベクター。
【請求項６】
（ａ）タバコ葉緑体由来のｒｂｃＬ遺伝子が、配列番号８の塩基番号４２３〜１８５６の塩基配列からなる遺伝子である請求項１〜５の何れかに記載のベクター。
【請求項７】
（ｃ）タバコ葉緑体由来のｐｓｂＡプロモーターが、配列番号５の塩基配列からなる遺伝子である請求項１〜６の何れかに記載のベクター。
【請求項８】
（ｄ）タバコ葉緑体由来のｒｐｓ１６ターミネーターが、配列番号６の塩基配列からなる遺伝子である請求項１〜７の何れかに記載のベクター。
【請求項９】
（ｅ）タバコ葉緑体由来のａｃｃＤ遺伝子が、配列番号８の塩基番号２６２４〜３３２８で表される塩基配列からなる遺伝子である請求項１〜８の何れかに記載のベクター。
【請求項１０】
請求項１〜９の何れかに記載のベクターにタンパク質をコードする遺伝子が挿入されている遺伝子組み換え体。
【請求項１１】
請求項１０に記載の遺伝子組み換え体を葉緑体に導入した形質転換葉緑体。
【請求項１２】
葉緑体がタバコ葉緑体である請求項１１に記載の形質転換葉緑体。
【請求項１３】
請求項１１または１２に記載の形質転換葉緑体を有する植物。
【請求項１４】
植物がタバコである請求項１３に記載の植物。
【請求項１５】
請求項１３または１４に記載の植物を生育させ、請求項１〜９の何れかに記載のベクターに挿入された遺伝子がコードするタンパク質を分離するタンパク質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、植物体を用いたタンパク質発現系に関する。
【０００２】
【従来の技術】
医薬品等として利用できる有用タンパク質を遺伝子組換えを利用して大量調製する場合、これまでは大腸菌を用いた系が広く利用されてきた。この場合、発現したタンパク質の精製過程での毒素の混入が考えられたため、このような場合動物細胞の利用が実用化されている。しかしながら動物細胞を利用する際の培養にかかるコストは、大腸菌の場合の数十倍にも及び、このため得られた製品（タンパク質）が高価なものとなっている。この点、植物は光合成により生育するため、エネルギーの投入が少なく、製品（タンパク質）が安価になり得る。実際、遺伝子組換え産物を得るための宿主として、その製品単価を比較した場合、動物細胞、大腸菌、植物体の順に安くなることが試算されている。このため、植物体を用いた有用タンパク質の大量発現系の開発が熱望されていた。
【０００３】
高等植物の葉緑体は、成葉１細胞あたり１００個程度存在し、葉緑体１個あたり１００コピーの葉緑体ゲノム遺伝子が存在する（Bendich, A.J., Why do chloroplasts and mitochondria contain so many copies of their genome? Bioassays, 6, 279-282 (1987)）。このことは、もし１コピーの外来遺伝子を葉緑体ゲノムに挿入した場合、形質転換体においては細胞あたり１万コピー存在することになり、コピー数の多さから高発現が期待できる（Maliga, P., Towards plastid transformation in flowering plants. Trends Biotechnol. 11, 101-107 (1993)）。さらに、葉緑体への遺伝子導入は相同組み換えを利用するため、核への挿入時に見られる位置効果がおこらず、安定した遺伝子発現が行われる。また、葉緑体は母性遺伝をするため、導入した遺伝子の花粉を介した環境への飛散を防ぐことができる等、葉緑体への遺伝子導入は利点が多い（上記文献参照）。
【０００４】
葉緑体形質転換手法を用い、外来タンパク質の過剰発現はこれまでBacillusの作り出す毒素（McBride, K.E., Svab, Z., Schaaf, D.J., Hogan, P.S., Stalker, D.M. and Maliga, P.  Amplification of a chimeric Bacillus gene in chloroplasts leads to an extraordinary level of an insecticidal protein in tobacco.  Bio/technol., 13, 362-365、または、Kota, M., Daniell, H., Varma, S., Garczynski, S.F., Gould, F., and Moar, W.J., Overexpression of the Bacillus thuringiensis (Bt) Cry2Aa2 protein in chloroplasts confers resistance to plants against susceptible and Bt-resistant insects. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 1840-1845 (1999)）、除草剤（Daniell, H., Datta, R., Varma, S., Gray, S., and Lee, S.-B., Containment of herbicide resistance through genetic engineering of the chloroplast genome. Nature Biotechnol. 16, 345-348. (1998)）について試みられているが、これらの場合、形質転換体の選抜のためのaadA遺伝子とのポリシストーニックな遺伝子発現を狙ったため、その発現総量は全可溶画分の６〜７％程度であった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、植物体を用いたタンパク質発現ためのベクターを提供すること目的とする。
本発明は、また、目的タンパク質を葉緑体において高度に発現させることができる発現ベクター、および該発現ベクターを用いて形質転換させた形質転換葉緑体、さらには該形質転換葉緑体を有する植物を提供することを目的とする。さらに、上記発現ベクター作製のために有用なベクターを提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、植物体を用いたタンパク質発現系、とくに葉緑体を用いたタンパク質発現系について鋭意検討した結果、タンパク質をコードする遺伝子の上流にタバコ葉緑体由来のｐｓｂＡプロモーターを導入することにより、導入した上記遺伝子がコードするタンパク質をタバコ葉緑体において高発現させることができるという思いがけない知見を得た。さらに、導入した遺伝子がコードするタンパク質の発現量を増加させるべく検討した結果、タンパク質をコードする遺伝子の翻訳開始点の上流にリボゾーム結合部位を置くことにより導入した遺伝子がコードするタンパク質の発現量がさらに増加するという思いがけない知見を得た。
本発明者らは、植物体でのタンパク質発現系についてさらに検討を重ね、本発明を完成した。
【０００７】
すなわち、本発明は、
（１）（ａ）複数の制限酵素部位、２つの制限酵素部位に挟まれたタンパク質をコードする遺伝子を挿入できる挿入部位および該挿入部位の上流にリボゾーム結合部位を有するマルチクローニング領域と、マルチクローニング領域の上流にプロモーターと、マルチクローニング領域の下流にターミネーターとを有する構築前遺伝子群と、その上流に（ｂ）遺伝子組換え体を識別するための遺伝子、その上流にプロモーターおよびその下流にターミネーターを有する識別遺伝子群とを有することを特徴とするベクター、
（２）構築前遺伝子群のマルチクローニング領域が、タンパク質をコードする遺伝子の翻訳開始点の７〜１１塩基上流にリボゾーム結合部位を有することを特徴とする前記（１）に記載のベクター、
（３）リボゾーム結合部位がＳＤ配列であることを特徴とする前記（１）または（２）に記載のベクター、
（４）構築前遺伝子群のマルチクローニング領域が、配列番号７で表される塩基配列からなることを特徴とする前記（１）〜（３）に記載のベクター、
（５）構築前遺伝子群のプロモーターおよびターミネーターまたは／および識別遺伝子群のプロモーターおよびターミネーターが、葉緑体由来のプロモーターおよびターミネーターであることを特徴とする前記（１）〜（４）に記載のベクター、
（６）葉緑体由来のプロモーターおよびターミネーターが、タバコ葉緑体由来のプロモーターおよびターミネーターであることを特徴とする前記（５）に記載のベクター、
（７）タバコ葉緑体由来のプロモーターが、タバコ葉緑体由来のｐｓｂＡプロモーターまたはｒｒｎプロモーターであることを特徴とする前記（６）に記載のベクター、
（８）タバコ葉緑体由来のターミネーターが、タバコ葉緑体由来のｐｓｂＡターミネーターまたはｒｐｓ１６ターミネーターであることを特徴とする前記（６）または（７）に記載のベクター、
（９）構築前遺伝子群のプロモーターが、タバコ葉緑体由来のｐｓｂＡプロモーターであることを特徴とする前記（６）に記載のベクター、
（１０）構築前遺伝子群のプロモーターがタバコ葉緑体由来のｐｓｂＡプロモーターであり、構築前遺伝子群のターミネーターがタバコ葉緑体由来のｒｐｓ１６ターミネーターであり、識別遺伝子群のプロモーターがタバコ葉緑体由来のｒｒｎプロモーターであり、識別遺伝子群のターミネーターがタバコ葉緑体由来のｐｓｂＡターミネーターである前記（６）に記載のベクター、
（１１）識別遺伝子群の遺伝子組換え体を識別するための遺伝子がスペクチノマイシン耐性遺伝子であることを特徴とする前記（１）〜（１０）に記載のベクター、
（１２）識別遺伝子群の遺伝子組換え体を識別するための遺伝子が配列番号３で表される塩基配列を有するａａｄＡ遺伝子であることを特徴とする前記（１）〜（１０）に記載のベクター、
（１３）ベクターｐＬＤ６（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８２６０）、
（１４）前記（１）〜（１３）に記載のベクターにタンパク質をコードする遺伝子が挿入されている遺伝子組み替え体、
（１５）複数の制限酵素部位を有するポリリンカーと、その上流にタバコ葉緑体由来のｒｂｃＬ遺伝子と、その下流にタバコ葉緑体由来のａｃｃＤ遺伝子を有することを特徴とするベクター、
（１６）ポリリンカーが配列番号９で表される塩基配列からなることを特徴とする前記（１５）に記載のベクター、
（１７）配列番号８の３９６−３３２８に位置する塩基配列からなる遺伝子を有することを特徴とする（１５）または（１６）に記載のベクター、
（１８）ベクターｐＬＤ２００（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８２６１）、
（１９）前記（１４）に記載の遺伝子組換え体の、（ａ）複数の制限酵素部位、タンパク質をコードする遺伝子および該遺伝子の上流にリボゾーム結合部位を有するマルチクローニング領域と、マルチクローニング領域の上流にプロモーターと、マルチクローニング領域の下流にターミネーターとを有する構築遺伝子群と、その上流にある（ｂ）遺伝子組換え体を識別するための遺伝子、その上流にプロモーターおよびその下流にターミネーターを有する識別遺伝子群とが、前記（１５）〜（１８）に記載のベクターに挿入されていることを特徴とする発現ベクター、
（２０）前記（１９）に記載の発現ベクターを葉緑体に導入した形質転換葉緑体、
（２１）葉緑体がタバコ葉緑体である前記（２０）に記載の形質転換葉緑体、
（２２）前記（２０）または（２１）に記載の形質転換葉緑体を有する植物、
（２３）植物がタバコである前記（２２）に記載の植物、
（２４）前記（２２）または（２３）に記載の植物から得られるタンパク質、
（２５）ｐＬＤ６のマルチクローニング領域のＳｐｈＩとＥｃｏＲＩに挟まれた部位に、タンパク質をコードする遺伝子を挿入して遺伝子組換え体を作製し、ついで遺伝子組換え体をクローニングした後、該遺伝子組換え体からＮｏｔＩおよびＳａｌＩを用いて構築遺伝子と識別遺伝子とを有する遺伝子を切り出し、該切り出した遺伝子をｐＬＤ２００のポリリンカーのＮｏｔＩとＳａｌＩに挟まれた部位に挿入することを特徴とする発現ベクターの製造方法、
に関する。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明に係るベクターは、クローニングベクターに、構築前遺伝子群と識別遺伝子群とを挿入することにより作製することができる。
ここで、本発明で用いることができるクローニングベクターは、（ａ）構築前遺伝子群と識別遺伝子群とを挿入することができる制限酵素部位を持ち、（ｂ）宿主細胞に導入することができ、（ｃ）宿主細胞内で増殖する能力をもち、（ｄ）クローニングベクターが導入され形質転換された宿主細胞を特異的に検出することができれば特に限定されず、自体公知のものを用いてよい。具体的には、該クローニングベクターとしては、プラスミド、ファージ、コスミドまたはファージミドなどが挙げられ、より具体的には、大腸菌由来のプラスミド（例えば、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２など）、枯草菌由来のプラスミド（例えば、ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４など）、酵母由来プラスミド（例えば、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５，ｐＹＥＳ２など）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルスなどが挙げられる。また、市販のクローニングベクターを用いてよい。
【０００９】
上記クローニングベクターに挿入する構築前遺伝子群は、マルチクローニング領域と、マルチクローニング領域の上流にあるプロモーターと、マルチクローニング領域の下流にあるターミネーターとを有する。
該マルチクローニング領域は、複数の制限酵素部位と、２つの制限酵素部位に挟まれたタンパク質をコードする遺伝子を挿入する挿入部位と、該挿入部位の上流にリボゾーム結合部位を有する。このように、タンパク質をコードする遺伝子を挿入する挿入部位の上流にリボゾーム結合部位をおくことにより、該タンパク質を高度に発現させることができるという利点がある。該リボゾーム結合部位はタンパク質をコードする遺伝子の翻訳開始点の約７〜１１塩基程度上流にあることがより好ましく、９塩基程度上流にあることがさらに好ましい。
かかるリボゾーム結合部位は、リボゾームが結合できることが知られている自体公知の塩基配列を有していればよいが、ＳＤ配列が好ましい。ＳＤ配列は、Shine-Dalgarno sequenceの略称であり、４〜７個のヌクレオチドからなるセグメントであって、その塩基配列は５'−ＡＧＧＡＧＧＵ−３’の一部または全部である。
該マルチクローニング領域の最も好ましい態様として、配列番号７に記載した塩基配列を有する遺伝子が挙げられる。
【００１０】
上記マルチクローニング領域の上流にあるプロモーターは自体公知のものであってよい。例えば、微生物（エシェリヒア属菌やバチルス属菌などの原核生物、酵母や糸状菌などの真核生物）、植物細胞または動物細胞由来のものが挙げられる。より具体的にはエシェリヒア属菌のｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーターもしくはＴ７プロモーターなど；バチルス属菌のＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーターもしくはｐｅｎＰプロモーターなどが挙げられる。
中でも、該プロモーターとしては、葉緑体由来のプロモーターが好ましく、タバコ葉緑体由来のプロモーターがより好ましく、タバコ葉緑体由来のｐｓｂＡプロモーターが最も好ましい。なお、タバコ葉緑体由来のｐｓｂＡプロモーターの塩基配列を配列番号５に記載した。
【００１１】
上記マルチクローニング領域の下流にあるターミネーターは自体公知のものであってよい。例えば、微生物（エシェリヒア属菌やバチルス属菌などの原核生物、酵母や糸状菌などの真核生物）、植物細胞または動物細胞由来のものが挙げられる。中でも、該ターミネーターとしては、葉緑体由来のターミネーターが好ましく、タバコ葉緑体由来のターミネーターがより好ましく、タバコ葉緑体由来のｒｐｓ１６ターミネーターが最も好ましい。なお、タバコ葉緑体由来のｒｐｓ１６ターミネーターの塩基配列を配列番号６に記載した。
【００１２】
本発明においては、上記クローニングベクターに対し、上記構築前遺伝子群の上流に識別遺伝子群を挿入する。該識別遺伝子群は、遺伝子組換え体を識別するための遺伝子、その上流にあるプロモーターおよびその下流にあるターミネーターを有する。
上記遺伝子組換え体を識別するための遺伝子としては、特に限定されず、自体公知のものを用いてよい。例えば、各種の薬剤耐性遺伝子、または宿主の栄養要求性を相補する遺伝子などが挙げられる。より具体的には、例えば、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子（Ｇ４１８耐性）、クロラムフェニコール耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、ＵＲＡ３遺伝子等が挙げられる。中でも、本発明においてはスペクチノマイシン耐性遺伝子を用いるのが好ましい。なお、該スペクチノマイシン耐性遺伝子であるａａｄＡ遺伝子の塩基配列を配列番号３に記載した。
【００１３】
上記プロモーターおよびターミネーターとしては、上記構築前遺伝子群で用いるプロモーターおよびターミネーターとして列挙したものなど、自体公知のものを用いてよい。中でも、葉緑体由来のプロモーターおよびターミネーターが好ましく、タバコ葉緑体由来のプロモーターおよびターミネーターがより好ましく、タバコ葉緑体由来のｒｒｎプロモーターおよびｐｓｂＡターミネーターが最も好ましい。なお、タバコ葉緑体由来のｒｒｎプロモーターの塩基配列を配列番号２に、タバコ葉緑体由来のｐｓｂＡターミネーターの塩基配列を配列番号４に記載した。
【００１４】
上記ベクターには、タンパク質の発現に有利である１または複数の因子、例えばアクティベーター（例えばトランス作用因子）、シャペロンおよびプロセッシングプロテアーゼをコードする１または複数の核酸配列も含み得る。また、本発明に係る上記ベクターは、選択された宿主細胞内で機能的であるいずれかの因子を有していてもよい。
【００１５】
以上に述べた本発明に係るベクターの最も好ましい態様として、ｐＬＤ６が挙げられる。かかるベクターは、実施例に記載の方法で容易に作製することができる。また、ｐＬＤ６プラスミドは、ブタペスト条約に基づいて、平成１３年３月１９日付けで工業技術院生命工学工業技術研究所、日本国茨城県筑波市東１丁目１番３号（郵便番号３０５−８５６６）に受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１８２６０として寄託されている。
【００１６】
ｐＬＤ６の模式図を図１に示した。またｐＬＤ６の全塩基配列を配列番号１に示した。図１より分かるように、ｐＬＤ６は、（ａ）配列番号７で表される塩基配列を有するマルチクローニング領域と、その上流に配列番号５で表されるタバコ葉緑体由来のｐｓｂＡプロモーター（配列番号１中の３５６９−３７０１に位置する）と、その下流に配列番号６で表されるタバコ葉緑体由来のｒｐｓ１６ターミネーター（配列番号１中の３７５５−３９１３に位置する）とからなる構築前遺伝子群と、その上流に（ｂ）遺伝子組換え体を識別するための遺伝子としての配列番号３で表されるスペクチノマイシン耐性遺伝子であるａａｄＡ遺伝子（配列番号１中の２３６８−３１７３に位置する）と、その上流に配列番号２で表されるタバコ葉緑体由来のｒｒｎプロモーター（配列番号１中の２２２６−２３６８に位置する）と、その下流に配列番号４で表されるタバコ葉緑体由来のｐｓｂＡターミネーター（配列番号１中の３１７５−３５６８に位置する）とを有している。
【００１７】
上記本発明に係るベクターのマルチクローニング領域に、タンパク質をコードする遺伝子を挿入し、遺伝子組換え体を作製する。例えば、ｐＬＤ６ベクター場合は、マルチクローニング領域のＳｐｈＩとＥｃｏＲＩに挟まれた部位にタンパク質をコードする遺伝子を挿入する。ここで、以下、該遺伝子組換え体において、タンパク質をコードする遺伝子を挿入された上記構築前遺伝子群を構築遺伝子群と称する。該タンパク質は、本発明に係る発現系を用いて発現させたいタンパク質であり、その種類は特に限定されない。例えば薬理活性を有するタンパク質、医薬品または工業用材料などとして有用なタンパク質を製造するのに必要な酵素などが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００１８】
ついで、上記遺伝子組換え体を適当な宿主細胞に導入し、かかる宿主細胞を培養して、目的の遺伝子をクローニングする。ここで、目的の遺伝子とは、上記構築遺伝子群および識別遺伝子群である（以下も同様である）。
宿主細胞は、クローニングベクターに応じて適宜選択でき、具体的には、例えばエシェリヒア属菌やバチルス属菌などの原核生物、酵母や糸状菌などの真核生物、植物細胞または動物細胞等が挙げられる。また、宿主細胞の培養条件は、宿主細胞の種類に応じて当業界で通常行われている条件に従えば良い。また、クローニングされた遺伝子に目的の遺伝子がうまく導入されたか否かは、クローニングベクターが有する選択マーカー等に基づき容易に判別することができる。
【００１９】
本発明においては、ついで、上記のようにしてクローニングされた遺伝子から、目的の遺伝子またはそれを含む遺伝子を制限酵素を用いて切り出し、本発明に係るもう一つのベクターに挿入し、発現ベクターを作製する。本発明に係るもう一つのベクターとは、複数の制限酵素部位を有するポリリンカーと、その上流にタバコ葉緑体由来のｒｂｃＬ遺伝子と、その下流にタバコ葉緑体由来のａｃｃＤ遺伝子とを有することを特徴とするベクターである。このようにすることにより、外来のタンパク質をコードする遺伝子が、相同組換えにより宿主細胞の染色体ＤＮＡに組み込まれやすくなり、さらに該タンパク質の発現量が多くなるという利点ある。ここで、ｒｂｃＬ遺伝子のうちの構造遺伝子は配列番号８中の４２３−１８５６に位置する。また、ａｃｃＤ遺伝子のうちの構造遺伝子は配列番号８中の２６２４−３３２８に位置する。
【００２０】
該ベクターのより好ましい態様としては、複数の制限酵素部位を有するポリリンカーと、その上流にタバコ葉緑体由来のｒｂｃＬ遺伝子と、その下流にタバコ葉緑体由来のａｃｃＤ遺伝子とからなる遺伝子が、タバコ葉緑体遺伝子と相同性を有する遺伝子であるベクターが挙げられる。ここで、相同性を有するとは、ハイストリンジェントな条件において、約８０％以上、好ましくは約８５％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有することをいう。なお、ハイストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が約１９〜４０ｍＭ程度、好ましくは約１９〜２０ｍＭ程度で、温度が約５０〜７０℃程度、好ましくは約６０〜６５℃程度の条件をいう。特に、ナトリウム濃度が約１９ｍＭで温度が約６５℃程度の場合が最も好ましい条件である。
上記ベクターのさらに好ましい態様としては、ポリリンカーが配列番号９で表される塩基配列からなるベクターが挙げられる。中でも、配列番号８の３９６−３３２８に位置する塩基配列からなる遺伝子を有するベクターがより好ましい。
【００２１】
上記ベクターは、上述したような自体公知のクローニングベクターに、複数の制限酵素部位を有するポリリンカー、好ましくは配列番号９で表される塩基配列の遺伝子と、その上流にタバコ葉緑体由来のｒｂｃＬ遺伝子と、その下流にタバコ葉緑体由来のａｃｃＤ遺伝子とを挿入することにより得られる。ここで、該ベクターは、複数の制限酵素部位を有するので、上記目的の遺伝子またはそれを含む遺伝子が挿入しやすいという特長がある。
【００２２】
上記ベクターには、タンパク質の発現に有利である１または複数の因子、例えばアクティベーター（例えばトランス作用因子）、シャペロンおよびプロセッシングプロテアーゼをコードする１または複数の核酸配列も含み得る。また、本発明に係る上記ベクターは、選択された宿主細胞内で機能的であるいずれかの因子を有していてもよい。
【００２３】
上記ベクターとして最も好ましい態様として、ｐＬＤ２００が挙げられる。かかるベクターは、実施例に記載の方法で容易に作製することができる。また、ｐＬＤ２００プラスミドは、ブタペスト条約に基づいて、平成１３年３月１９日付けで工業技術院生命工学工業技術研究所、日本国茨城県筑波市東１丁目１番３号（郵便番号３０５−８５６６）に受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１８２６１として寄託されている。
【００２４】
ｐＬＤ２００の模式図を図５に記載した。図５より明らかなように、ｐＬＤ２００は、公知のプラスミドであるｐＵＣ１９（Messing J, Methods in Enzymology, 101: 20 (1983)）に、（ａ）配列番号９で表される塩基配列を有するポリリンカーと、（ｂ）その上流にタバコ葉緑体由来のｒｂｃＬ遺伝子と、（ｃ）その下流にタバコ葉緑体由来のａｃｃＤ遺伝子とが挿入されている。
また、ｐＬＤ２００の全塩基配列を配列番号８に記載した。上記ポリリンカーは配列番号８の２１２５−２１４５に位置する。配列番号８の３９６−２１２４と２１４６−３３２４とに位置する遺伝子がタバコ葉緑体由来の遺伝子であり、その１−３９５と３３２５−５５８１とに位置する遺伝子がｐＵＣ１９由来の遺伝子である。
【００２５】
上記発現ベクターのより好ましい作成方法としては、ｐＬＤ６のマルチクローニング領域のＳｐｈＩとＥｃｏＲＩに挟まれた部位に、タンパク質をコードする遺伝子を挿入して遺伝子組換え体を作製し、ついで遺伝子組換え体をクローニングした後、該遺伝子組換え体からＮｏｔＩおよびＳａｌＩを用いて構築遺伝子と識別遺伝子とを有する遺伝子を切り出し、該切り出した遺伝子をｐＬＤ２００のポリリンカーのＮｏｔＩとＳａｌＩに挟まれた部位に挿入するという方法が挙げられる。
【００２６】
このようにして作製された上記発現ベクターを宿主細胞に導入し、形質転換体を作製する。このとき、宿主細胞としては、植物細胞が好ましく、葉緑体がより好ましく、タバコ葉緑体がさらに好ましい。このように、植物細胞を宿主細胞として用いることにより、上述のように発現したタンパク質の精製過程での毒素の混入を防ぐことができ、また、タンパク質発現のためのコストも安いという利点がある。中でも、葉緑体を宿主細胞として用いることにより、上述のように導入した遺伝子がコードするタンパク質を高発現させることができ、さらに導入した遺伝子の花粉を介した環境への飛散を防ぐことができる等の利点がある。
【００２７】
該発現ベクターの宿主細胞へ導入して形質転換する方法としては、公知方法を用いてよい。例えば、該発現ベクターを金またはタングステンの極めて細かい粒子にまぶし、この該発現ベクターの付着した粒子を火薬または高圧ガスで宿主細胞に打ち込み該発現ベクターを導入するというパーティクルガン法などが挙げられる。中でも、高等植物の葉緑体への遺伝子導入系はパーティクルガンによる手法（Svab, Z., Hajdukiewicz, P., and Maliga, P., Stable transformation of plastids in higher plants. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 8526-8530 (1990)）または、ＰＥＧによる手法（Golds, T., Maliga, P., and Koop, H.-U., Stable plastid transformation in PEG-treated protoplasts of Nicotiana tabacum. Bio/Technol., 11, 95-97 (1993)）を用いるのが好ましい。
【００２８】
本発明に係る上記形質転換葉緑体を有する植物は、自体公知の方法によって得ることができる。ここで、上記植物は特に限定されないが、高等植物が好ましく、タバコがより好ましい。
ついで、該植物をその植物に応じた自体公知の条件で生育させ、該植物体から自体公知の方法によって目的とするタンパク質を精製する。タンパク質の精製は、自体公知の分離・精製方法を適切に組み合わせて行うことができる。これら公知の分離、精製方法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法もしくはＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法；イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法；アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法；逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法；等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
このようにして、例えば薬理活性を有するタンパク質や工業用酵素などの有用タンパク質を大量に製造することができ、かつ大腸菌による発現系のように発現したタンパク質の精製過程で毒素の混入は実質上認められないという利点ある。さらに、動物細胞を用いた発現系よりも、低コスト・低エネルギーで目的のタンパク質を製造できるという利点もある。
【００２９】
なお、上記の遺伝子工学または生物工学の基本操作については、市販の実験書、例えば、１９８２年発行のモレキュラー・クローニング（Molecular Cloning ）コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory ）、１９８９年発行のモレキュラー・クローニング第２版（Molecular Cloning, 2nd ed.）コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory ）等に記載された方法に従って容易に行うことができる。
【００３０】
【実施例】
〔工程１；ｐＬＤ６の作製〕
タバコ葉緑体由来のｐｓｂＡプロモーターの下流に、配列番号７で表される塩基配列からなるマルチクローニング領域を置き、その下流にタバコ葉緑体由来のリボソーマルタンパク質ｒｐｓ１６のターミネーター（Ｔｒｐｓ１６）を配置したプラスミドを構築した。このマルチクローニング領域のうちSphＩ部位のatgを開始コドンになるようにその上流９塩基目にリボソーム結合部位（ＳＤ配列；図１に示した塩基配列の５'末端から数えて１３番目から始まる５ヌクレオチドからなるセグメント）を置いた。これら構築前遺伝子群の上流に葉緑体形質転換体の選抜のための識別遺伝子群（ａａｄＡカセット）を置いた。これら両遺伝子群はNotI-SalIで切り出されるようにした。こうして構築したベクターをｐＬＤ６と名付けた（図１）。
より詳しい構築過程を図７〜９に示す。ｐＬＤ６構築の出発物であるpBluescript II SK(+)（Gene Bank Accession Number：X52328）は、Stratagene社から購入した。また、図８の合成ＤＮＡは、ＤＮＡ合成機ｍｏｄｅｌ ３９２（パーキン・エルマー株式会社製）を用いて化学合成した。
【００３１】
〔工程２；遺伝子組換え体の作製〕
レポーター遺伝子としてＧＦＰを用い（Sidorov, V.A., Kasten, D., Pang, S.-Z., Hajdukiewicz, P.T.J., Staub, J.M., and Nehra, N.S., Stable chloroplast transformation in potato: use of green fluorescent protein as a plastid marker. Plant J, 19, 209-216 (1999)）、該ＧＦＰをコードする遺伝子を、ｐＬＤ６のマルチクローニング領域（図１で塩基配列が記載されている部位）のSphIとEcoRIとで挟まれた部分に挿入した。
かかる遺伝子組換え体を大腸菌の中に導入し、該大腸菌をスペクチノマイシンを添加したＬＢ培地で３７℃下１６時間培養し、かかる遺伝子組換え体が導入された大腸菌を選択した。選択された大腸菌をＬＢ培地で３７℃下１６時間培養し、培養後遠心分離をし、菌体を集菌し、常法にしたがって遺伝子組換え体（プラスミドＤＮＡ）を精製した。なお、ＬＢ培地１Ｌ中の組成は、１０ｇトリプトン、５ｇ酵母エキス、５ｇＮａＣｌである。
【００３２】
〔工程３；ｐＬＤ２００の作製〕
またNotI上流とSalI下流にタバコ葉緑体ゲノムのrbcL遺伝子とaccD遺伝子をふくむタバコ葉緑体遺伝子の相同配列（配列番号８の３９６−３３２８に位置する塩基配列）を導入したベクターpLD200を構築した（図５）。より詳しい構築過程を図６に示す。ｐＬＤ２００構築の出発物であるｐＵＣ１９（Gene Bank Accession Number：L09736）は、Messing J, Methods in Enzymology, 101: 20 (1983)の著者から分譲を受けた。また、図６の合成ＤＮＡは、ＤＮＡ合成機ｍｏｄｅｌ３９２（パーキン・エルマー株式会社製）を用いて化学合成した。
【００３３】
〔工程４；発現ベクターの作製〕
工程２で得られた遺伝子組み替え体（精製ＤＮＡ）を、NotIとSalIで消化した。また、ｐＬＤ２００もNotIとSalIで消化し、ポリリンカー（図６で塩基配列が記載されている部位のうち５'末端から数えて５番目から始まる２１ヌクレオチドからなるセグメント）のNotIとSalIとで挟まれた部分に、前記遺伝子組み替え体（精製ＤＮＡ）のNotIとSalIとの消化物を挿入した。このようにして、本発明に係る発現ベクターを作製した。
【００３４】
〔工程５；形質転換葉緑体の作製〕
得られた発現ベクターを、タバコ葉緑体に導入し、形質転換葉緑体を作製した。タバコ葉緑体形質転換は既知の方法（Svab, Z., Hajdukiewicz, P., and Maliga, P., Stable transformation of plastids in higher plants. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 8526-8530 (1990)）によった。
【００３５】
葉緑体形質転換体の外観は野生種と同様のものだった（図２）が、蛍光顕微鏡下で観察した結果、野生種では見られないＧＦＰ由来の強い蛍光が見られた（図３）。また、この形質転換体からタンパク質を抽出し、SDS-PAGEを行ったところＧＦＰに対応する分子量の濃いバンドが確認された（図４）。このバンドの濃さのデンシトメトリーから、その発現総量は全可溶画分の２０％程度であった。
【００３６】
【発明の効果】
本発明に係る植物体を用いた異種タンパク質の発現系を用いれば、大腸菌を用いた異種タンパク質の発現系の場合とは異なり、発現したタンパク質の精製過程での毒素の混入がないという利点がある。その上、植物は光合成により生育するため植物体育成のためのエネルギーの投入が少なくて済み、その結果として製品（タンパク質）が安価に製造できるという利点がある。
【００３７】
従来の遺伝子組換え技術の懸念として、人工的に操作を加えた遺伝子による環境汚染がある。これは、導入した人工改変遺伝子が交雑、交配等により環境へ拡散していくことに対する懸念である。このため遺伝子組換えの際の生物的封じこめが強調されてきている。本発明においては、好ましい態様として葉緑体へ遺伝子を導入しタンパク質を発現させる。かかる葉緑体への遺伝子導入は、葉緑体遺伝子が母性遺伝することから、自然現象における生物的封じこめにあたり、環境保全の観点からも本発明は有用である。
【００３８】
本発明においては、好ましい態様として上記のように葉緑体へ遺伝子を導入しタンパク質を発現させる。かかる葉緑体の遺伝子発現系は原核細胞型のため、大腸菌原核型微生物からの移行が容易にできる。その結果、現在大腸菌等で行われている異種タンパク質の大量発現系からの移行がすみやかに行えるという利点がある。
【００３９】
本発明に係るタンパク質の発現系は、例えば、医薬品等の生産、工業用酵素類の生産、ポリエステル、生分解性プラスチック、油脂、タンパク質、炭化水素もしくはテルペンの生産、家畜飼料（タンパク質、脂質、炭水化物等の成分調節により、消化、吸収されやすい植物体を作り、これを直接食べさせる）、観葉植物等の品種改良、複合環境ストレス耐性植物の創成などに有用である。
【００４０】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ｐＬＤ６の模式図を示す。Ｐｒｒｎはタバコ葉緑体由来のｒｒｎプロモーターを表す。該ｒｒｎプロモーターは、配列番号２で表される塩基配列を持ち、配列番号１中の２２２６−２３６８に位置する。ａａｄＡはスペクチノマイシン耐性遺伝子を表す。該スペクチノマイシン耐性遺伝子は、配列番号３で表される塩基配列を持ち、配列番号１中の２３６８−３１７３に位置する。ＴｐｓｂＡはタバコ葉緑体由来のｐｓｂＡターミネーターを表す。該ｐｓｂＡターミネーターは配列番号４で表される塩基配列を持ち、配列番号１中の３１７５−３５６８に位置する。ＰｐｓｂＡはタバコ葉緑体由来のｐｓｂＡプロモーターを表す。該ｐｓｂＡプロモーターは配列番号５で表されるで表される塩基配列を持ち、配列番号1中の３５６９−３７０１に位置する。Ｔｒｐｓ１６はタバコ葉緑体由来のｒｐｓ１６ターミネーターを表す。該ｒｐｓ１６ターミネーターは、配列番号６で表される塩基配列を持ち、配列番号１中の３７５５−３９１３に位置する。塩基配列を記載した部位はマルチクローニング領域である。残りの部分（太線の部分）はpBluescript II SK(+)由来の遺伝子である。BglII、SphI、ClaIおよびEcoRIは制限酵素部位を表し、ＳＤはＳＤ配列（図１に示した塩基配列の５'末端から数えて１３番目から始まる５ヌクレオチドからなるセグメント）を表す。
【図２】ＧＦＰ遺伝子が発現している実施例で得られた葉緑体形質転換体を有するタバコの外観を示す。
【図３】ＧＦＰ遺伝子が発現している実施例で得られた葉緑体形質転換体を有するタバコの葉の蛍光像を示す。
【図４】実施例で得られた葉緑体形質転換体を有するタバコからタンパク質を抽出しＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った（パネルＡ）。また、ＧＦＰ遺伝子の導入されていない野生型のタバコを用いて同様にＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った（パネルＢ）。全可溶タンパク質量の５０％をしめるRuBisCO(rbcL+rbcS)に比較しうる量のＧＦＰの蓄積が実施例で得られたＧＦＰ遺伝子導入タバコで観察された。なお、パネルＭは分子量マーカーである。
【図５】ｐＬＤ２００の模式図を示す。ｒｂｃＬはタバコ葉緑体由来のｒｂｃＬ遺伝子を表す。ａｃｃＤはタバコ葉緑体由来のａｃｃＤ遺伝子を表す。塩基配列を記載した部位のうち５'末端から数えて５番目から２１塩基はポリリンカーである。太線の部分はｐＵＣ１９由来の遺伝子である。NotI、NheIおよびSphIは制限酵素部位を表す。
【図６】ｐＬＤ２００の構築過程を示す。
【図７】ｐＬＤ６の構築過程のうち第１過程を示す。
【図８】ｐＬＤ６の構築過程のうち第２過程を示す。
【図９】ｐＬＤ６の構築過程のうち第３過程を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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