(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
反復染色体核酸配列のハイブリダイゼーションを妨げるが、特徴的染色体核酸配列のハイブリダイゼーションを可能にする方法において、
前記反復核酸配列に対して相補的である核酸配列を付与する工程であって、前記相補的な核酸配列または前記反復核酸配列またはその両方は架橋剤で標識され、該架橋剤は、相補的な核酸配列が反復核酸配列にハイブリダイゼーションした場合、相補的な核酸配列を反復核酸配列に架橋することが可能である、核酸配列を付与する工程と、
次いで、特徴的核酸配列の存在下、反復核酸配列をその相補的な核酸配列にハイブリダイゼーションさせて、反復核酸配列の相補的な核酸配列を架橋する工程とを含み、
これらの工程によって、架橋された反復核酸配列はさらなるハイブリダイゼーションが妨げられ、特徴的核酸配列をハイブリダイゼーションさせることができることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記相補的な核酸配列は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＰＮＡであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記反復核酸配列はＤＮＡであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
少なくとも２つの反復核酸配列が、架橋剤によって相補的な核酸配列にハイブリダイズされ、架橋されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記架橋剤は遷移金属を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記遷移金属は白金であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記架橋剤は（ｔｒａｎｓ）−ジクロロジアンミン白金であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
反復染色体核酸配列のハイブリダイゼーションを妨げるが、特徴的染色体核酸配列のハイブリダイゼーションを可能にする方法において、
反復核酸配列に対して相補的である核酸配列であって、相補的な核酸配列が反復核酸配列にハイブリダイゼーションした場合、相補的な核酸配列を反復核酸配列に架橋し得る架橋剤で標識される核酸配列を付与する工程と；
特徴的核酸配列の存在下、反復核酸配列をその相補的な核酸配列にハイブリダイゼーションさせて、相補的な核酸配列を反復核酸配列に架橋する工程とを含み、
これらの工程によって、架橋された反復核酸配列はさらなるハイブリダイゼーションが妨げられ、特徴的核酸配列をハイブリダイゼーションさせることができることを特徴とする方法。
【請求項９】
前記相補的な核酸配列は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＰＮＡであることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記反復核酸配列はＤＮＡであることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
少なくとも２つの反復核酸配列が相補的な核酸配列にハイブリダイズされることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記架橋剤は遷移金属を含むことを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
前記遷移金属は白金であることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
前記架橋剤は（ｔｒａｎｓ）−ジクロロジアンミン白金であることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１５】
１本鎖の特徴的染色体ＤＮＡ配列の数を１本鎖の反復染色体ＤＮＡ配列に対して増幅させる方法において、
反復ＤＮＡ配列に対して相補的である核酸配列を付与する工程であって、前記相補的な核酸配列または前記反復ＤＮＡ配列またはその両方は架橋剤で標識され、該架橋剤は、相補的な核酸配列が反復ＤＮＡ配列にハイブリダイゼーションした場合、反復ＤＮＡ配列の相補的な核酸配列を架橋可能である、核酸配列を付与する工程と；
次いで、特徴的ＤＮＡ配列の存在下、反復ＤＮＡ配列をその相補的な核酸配列にハイブリダイゼーションさせて、相補的な核酸配列を反復ＤＮＡ配列に架橋する工程とを含み、
これらの工程によって、架橋された反復ＤＮＡ配列はさらなるハイブリダイゼーションおよび／または増幅が妨げられ、そして１本鎖の特徴的ＤＮＡ配列の数が１本鎖の反復ＤＮＡ配列に対して増幅させられることを特徴とする方法。
【請求項１６】
前記相補的な核酸配列は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＰＮＡであることを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
少なくとも２つの反復核酸配列が、架橋剤によって相補的な核酸配列にハイブリダイズされ、架橋されることを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記架橋剤は遷移金属を含むことを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記遷移金属は白金であることを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記架橋剤は（ｔｒａｎｓ）−ジクロロジアンミン白金であることを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
特徴的染色体核酸配列を反復染色体核酸配列の存在下で選択的に複製する方法において、
反復核酸配列に対して相補的である核酸配列であって、相補的な核酸配列が反復核酸配列にハイブリダイゼーションした場合、相補的な核酸配列を反復核酸配列に架橋し得る架橋剤で標識される核酸配列を付与する工程と；
反復核酸配列をその相補的な核酸配列にハイブリダイゼーションさせて、反復核酸配列の相補的な核酸配列を架橋する工程と；
その相補的な核酸配列にハイブリダイゼーションした反復核酸配列の存在下、特徴的核酸配列を選択的に複製する工程とを含むことを特徴とする方法。
【請求項２２】
前記相補的な核酸配列は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＰＮＡであることを特徴とする、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記反復核酸配列はＤＮＡであることを特徴とする、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
少なくとも２つの反復核酸配列が相補的な核酸配列にハイブリダイズされることを特徴とする、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記架橋剤は遷移金属を含むことを特徴とする、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
前記遷移金属は白金であることを特徴とする、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
前記架橋剤は（ｔｒａｎｓ）−ジクロロジアンミン白金であることを特徴とする、請求項２１に記載の方法。
【請求項２８】
特徴的染色体核酸配列を標識するが、反復染色体核酸配列のハイブリダイゼーションまたは複製を妨げる方法において、
特徴的核酸配列の存在下、反復核酸配列に対して相補的である核酸配列をハイブリダイズする工程と；
相補的な配列と反復核酸配列との間で形成され、生じた複合体を架橋剤で架橋し、それにより、反復核酸配列のハイブリダイズまたは複製を妨げる工程と；
特徴的核酸配列を標識する工程とを含む方法。
【請求項２９】
前記相補的な領域または前記反復核酸配列またはその両方が、ハイブリダイズ工程の前に架橋剤で架橋されることを特徴とする、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記相補的な核酸配列は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＰＮＡであることを特徴とする、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記反復核酸配列はＤＮＡであることを特徴とする、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
少なくとも２つの反復核酸配列が、架橋剤によって相補的な核酸配列にハイブリダイズされ、架橋されることを特徴とする、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
前記架橋剤は遷移金属を含むことを特徴とする、請求項２８に記載の方法。
【請求項３４】
前記遷移金属は白金であることを特徴とする、請求項２８に記載の方法。
【請求項３５】
前記架橋剤は（ｔｒａｎｓ）−ジクロロジアンミン白金であることを特徴とする、請求項２８に記載の方法。
【請求項３６】
請求項２８に記載される方法で得ることができる標識された増幅配列の集合体を含む核酸検出用プローブであって、
前記標識された増幅配列の集合体が、比例的な標識（ratio labelling）を２元的な標識（binary labelling）と組合せることによって生じる、少なくとも２つの色からなる組で標識された少なくとも２つの生物有機分子の組を含み、
前記組合せの識別可能な色の総数が、２つの蛍光体が１つの標的について同時に使用される場合には少なくとも、下記の式Ｉに従って計算することができるプローブ：
Ｉ：色の数＝（ｎ＋（（ｒｘｎ！）／（２ｘ（ｎ−２）！）））ｘ２ｍ
式中、ｎは、比例的な標識に使用される蛍光体の数であり、ｍは、同じ標的を２元的に標識するために使用される蛍光体の数であり、ｒは、比例的な標識によって分離される割合の数であり、
２＜ｎ＜∞、
０＜ｒ＜∞、
０＜ｍ＜∞。
【請求項３７】
前記生物有機分子の少なくとも１つは、核酸、タンパク質、炭水化物および／または脂質を含む、請求項３６に記載のプローブ。
【請求項３８】
少なくとも１つの染色体またはその一部の配列を同時に同定するための、請求項３６または３７に記載の少なくとも１つのプローブの使用であって、新規な蛍光体を、プローブの第１の組の比例的な標識のために使用される蛍光体の第１の組に加えることと、プローブの第２の組を標識することとを含む、プローブの使用。
【請求項３９】
染色体またはその一部を検出するための、請求項３６または３７に記載されるプローブ。
【請求項４０】
請求項３６または３７に記載される少なくとも１つのプローブを含む、核酸検出のためのキット。
【請求項４１】
請求項３８に記載される使用を実施するためのキットにおいて、請求項３６または３７に記載の少なくとも１つのプローブを含むキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は核酸の架橋およびその利用の分野にある。さらに詳しくは、本発明は、核酸における選択された鎖間架橋の作製方法およびその利用に関する。発明の重要な１つの側面は、増幅反応における特定の核酸の選択的増幅のために選択された鎖間架橋を利用することに関する。
【０００２】
（発明の背景）
核酸の架橋活性を持つ多数の異なった化合物が同定されている。核酸の架橋は、癌などの増殖性疾患への介入において治療目的のために最も一般に利用されている。ほとんどの架橋剤は、極めて特異的な方法で、かつ、核酸の特異的な場所で核酸を架橋する。しかしながら、ほとんどの核酸においてこのような特異的な場所の頻度は極めて高いので、架橋は核酸分子全体にわたって効果的に提供される。癌への介入においてこのような架橋化合物を利用する場合、このいわゆる明らかに無作為の架橋活性によってある種の治療効果が妨げられることはない。しかしながら、増殖が妨害されるべき細胞の核酸にのみ架橋が適用されることが理想的であろう。たとえば、前記細胞の形質転換に関与する核酸、すなわち、癌遺伝子または癌遺伝子のＲＮＡに対してのみ架橋を適用することにより。そのような特異性は現在の架橋法では可能ではなかった。架橋剤の明らかに無作為の架橋活性は、さらに特異的な架橋を必要とするアッセイにおけるこれらの化合物の利用も妨げている。本発明は、１つの側面では、核酸の選択された領域において架橋を作製する方法を提供する。前記方法は、１つの側面では、ハイブリッド形成または増幅またはその両方の工程を含むが、これに限定されない工程に、核酸の特定の領域が関与するのを少なくとも一部妨げるために用いてもよい。選択された鎖間架橋を作製する前記方法は、１つの側面では、反復配列の少なくとも一部を欠損するプローブを作製する工程で使用される。そのようなプローブは、たとえば、細胞遺伝学分野における染色体ペインティング法での核酸の検出に有用である。
【０００３】
蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイズ（ＦＩＳＨ）法の導入によって細胞遺伝学は著しく変化を遂げた。ヒトにおけるＦＩＳＨ法による核型分析は複雑な染色体の再構成を解明するのに上手く適用されている。染色体の多色ＦＩＳＨ解析は必ずしも染色体全体のペインティングの利用に限定されない。最近、特定の染色体の（亜）テロメア領域を特異的に認識し、精神遅滞において頻繁に生じる潜在転座を検出するための多色ＦＩＳＨ形式に適用されているプローブのセットが作製されている。
【０００４】
２４本のヒト染色体の選択的な染色は現在、５つの識別可能な蛍光団によって標識されるプローブの２成分組合せを介して達成される（Ｓｃｈｒｏｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６；  Ｓｐｅｉｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）。
【０００５】
このいわゆる組合せ標識（多重ＦＩＳＨとも呼ばれる）では、異なった蛍光団（ｋ）を用いた識別可能な標的（ｎ）の数はｎ＝２k−１色である。従って５つの蛍光団では２４本の染色体を認識するのに十分な最大３１色が可能となるが、たとえば、染色体内の再構成を検出するためにｐ腕およびｑ腕特異的なプローブの利用を探索するには不十分である。
【０００６】
従って、染色体の多色ＦＩＳＨ解析は、今までに報告されている２７を超える、同時に認識可能な標的の数を増やす方法から直接的に恩恵を受けている（Ｎｅｄｅｒｌｏｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２；  Ｄａｕｗｅｒｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２；  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｅｇａｔｏｒ，１９９７）。さらにさらに高いＦＩＳＨの多重性が、比率標識によって達成可能である。任意のプローブが、異なった蛍光標識を伴ったプローブの混合物で構成されるこの方法は大きな可能性を有している。説明したように、三原色、青、緑および赤で構成することができる認識可能な色の数を考慮してもよい。実際にはしかし、比率標識は組合せ標識よりも相当に複雑である。比率標識されたプローブで染色された染色体の認識は『色のある、なし』判定（２成分法のような）ではなく、色の正確な測定を必要とする。
【０００７】
（発明の要約）
本発明は核酸の選択的な架橋のための方法を提供する。核酸の具体的な領域を選択することができ、選択されない領域ではごく少ない、または検出不能な『１つの特異的な』架橋によって特異的に架橋することができる。該方法は、潜在的に増幅可能な配列のプールから選択された特定配列の増幅のために、１つの非限定的適用において利用される。該方法は、選択された配列がハイブリッド形成反応への関与を少なくとも部分的に妨げられる核酸の検出のためのプローブを調製するためにもう１つの非限定的適用において利用される。１つの側面では、発明は、染色体またはその一部を検出するためのプローブの作製方法を提供する。そのようなプローブの１つの非限定的実施例では、前記プローブは、発明のＣＯＢＲＡ技法の１つの側面によって標識される。
【０００８】
（発明の詳細な説明）
１つの実施態様では、発明は、相補的な１本鎖核酸とハイブリッド形成する１本鎖核酸またはその機能的類似体を含み、前記核酸または前記相補的核酸またはその双方が架橋剤を含む、核酸において選択された鎖間架橋を作製する方法を提供する。発明の好ましい実施態様では、前記１本鎖核酸または前記相補的１本鎖核酸のみが架橋剤を含む。前記核酸、好ましくは前記相補的核酸は、核酸の機能的類似体であってもよい。そのような類似体の１つはペプチド核酸（ＰＮＡ）を含む。発明の好ましい実施態様では、前記核酸または前記相補的核酸またはその双方はＤＮＡである。核酸領域を選択する好ましい原理は、前記領域に相補的な１またはそれより多くの核酸とのハイブリッド形成を介する。架橋は架橋剤を介して提供されてもよい。架橋は、核酸に対して１またはそれより多くの相補的な核酸をハイブリッド形成すること、それによって架橋のために領域を選択すること、および前記核酸と架橋剤を接触させることによってによって提供されてもよい。選択された２本鎖領域が架橋されるが、選択されない１本鎖領域は架橋されない。一部の目的では、選択的に架橋された核酸を使用する前に、過剰な架橋剤および／または２本鎖中間体に寄与しない架橋剤（または反応中間体）を除くことができ、または不活性化することができる。
【０００９】
好ましくは、２本鎖核酸を架橋し、１本鎖核酸においてはごく少ないまたは検出できない架橋活性を有する架橋剤を使用する。別の方法では、選択された領域への前記相補的核酸のハイブリッド形成後、直ちに選択された領域の架橋が達成されるハイブリッド形成の前に、架橋剤が、１またはそれより多くの相補的核酸に結合する。好ましくは、架橋剤の架橋活性は、核酸が１本鎖の形状であるときは低く、核酸が２本鎖の形状であるときは高い。
【００１０】
核酸の領域は、前記核酸の１本鎖形状に相補的な核酸を加え、ハイブリッド形成を実行することによって架橋のために選択してもよい。しかしながら、相補的領域は、前記核酸が１本鎖であり、ハイブリッド形成できるようになったのち、互いにハイブリッド形成が誘導されるという核酸における前記相補的領域を上手く利用してもよい。この場合に限定されないが、この場合特に、ハイブリッド形成の条件を変えることによって様々な領域の選択を変化させることができる。前述の方法の組合せを用いることによっても、架橋のために領域を選択してもよい。たとえば、相補的核酸の添加によってある領域を選択してもよく、また、核酸内の相補的領域のハイブリッド形成を介して別の領域、または同一の領域を選択してもよい。
【００１１】
相補的核酸が、核酸において選択された領域に相補的である配列を含むのは当然必須である。しかしながら、相補的核酸における全配列が実際に、核酸において選択された領域に相補的である必要はない。前記相補的核酸における余分の配列は、それらが前記相補的核酸の主要な機能、すなわち、選択された領域にハイブリッド形成することを妨げない限り、具体的な目的にとって有用な可能性があり、便宜上単に存在してもよい。
【００１２】
架橋のレベルおよび架橋の性質によって、選択された核酸領域と相補的核酸との間の架橋の密着性が決定する。架橋の必要とされる密着性は、発明の具体的な適用によって変化する。選択された架橋が選択的に架橋された２本鎖核酸の変性を妨げるために行われるような適用では、結合の密着性は、架橋しない場合、選択された領域の変性を可能にするような条件において少なくとも部分的に変性を妨げるために十分高くすべきである。
【００１３】
発明の１つの実施態様では、架橋剤は、遷移金属、好ましくは、２本鎖核酸を架橋することが可能であるプラチナを含む。本実施態様の好ましい側面では、架橋剤は、（トランス）−ジクロロジアミンプラチナを含む。
【００１４】
トランス−ジクロロジアミンプラチナ（ＩＩ）（トランス−ＤＤＰ）は、ＤＮＡ鎖の中で隣接する塩基残基間で鎖内架橋を形成することができる（Ｃｏｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８０）。２つのグアニン（Ｇ）残基間、Ｇとシトシン（Ｃ）残基の間、またはＧと少なくとも１つの残基で隔てられたシトシン（Ｃ）残基の間の鎖内架橋が、最も好ましいものである（Ｅａｓｔｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８；Ｐｉｎｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５；Ｌｅｐｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７）。トランス−ＤＤＰと中間にある１つの塩基で隔てられた２つのＧ残基の間の１，３−鎖内架橋は、１本鎖オリゴヌクレオチド内部で安定である。プラチナと反応したオリゴヌクレオチドがその相補的鎖にハイブリッド形成するやいなや、１，３−鎖内架橋が再構成して鎖間架橋を形成する（Ｄａｌｂｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）。核酸配列のプールの中で特定の核酸配列を選択的に架橋する戦略にトランス−ＤＤＰのこの鎖間架橋効果を利用することができる。
【００１５】
発明の１つの適用において、選択された鎖間架橋は、形質転換された細胞のＤＮＡまたは形質転換の過程にある細胞のＤＮＡに存在する癌遺伝子に提供される。この適用において、前記選択された鎖間架橋は、前記癌遺伝子の複製および／または転写を少なくとも部分的に妨害するために提供される。前記適用は、癌の治療または予防に有用である可能性がある。
【００１６】
発明のもう１つの適用では、反復染色体核酸配列（以下、単に選択された配列または選択された核酸配列ということもある）または相補的核酸または双方が架橋剤を含み、架橋が前記選択された配列のさらなるハイブリッド形成および／または複製を妨害する、少なくとも１つの前記選択された１本鎖と前記相補的１本鎖核酸がハイブリッド形成することを含む、核酸配列における選択された配列の選択された鎖間架橋に関する方法が提供される。発明のもう１つの適用では、選択された領域の増幅を阻止するために、核酸における反復配列が選択的に架橋される。
【００１７】
染色体ペインティング法に関しては、染色体に特異的なＤＮＡがプローブとして使用される。このプローブは、フローソーティングまたは微小切片によって単離される具体的な染色体のＤＮＡに関して、限定されないが、ＤＯＰ−ＰＣＲのような増幅に基づいたＰＣＲを行うことにより一般に得られる。染色体ＤＮＡは、テロメアＤＮＡ、動原体反復、ＬＩＮＥ、ＳＩＮＥおよびＶＮＴＲのような多数の反復配列を含有する。ＤＯＰ−ＰＣＲの間に、このような反復配列も増幅され、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成実験では、それらによってあらゆる染色体の差次的標識が創られる。通常、反復配列のプールから成る反復ＤＮＡをハイブリッド形成混合物に添加することによって、このバックグランド標識を防ぐ。しかしながら、バックグランドは完全には落ちず、プローブのシグナルも減少するので、この目的のために反復ＤＮＡを用いる手法は理想的ではない。
【００１８】
ハイブリッド形成の間に阻止が必要であることを回避するためには、プローブＤＮＡにおける反復配列の存在を排除することが望ましい。消去法によって反復配列を除く方法は公知である（Ｃｒａｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。消去法は、プローブの追加的操作を必要とし、再現するのが容易でないので好まれない。申し分なく低いレベルの反復配列を持ったプローブを作製する現法の問題は、プローブ作製中に反復配列も作製されるということである。プローブにおいて反復配列が作製されるので、そのハイブリッド形成を排除する、またはそれらをプローブから除くという対策が取られてきた。前述したように、このような対策はさらに問題である。発明の方法によって、我々は、作製される反復配列を防ぐ、またはその量を減らすような条件下でプローブを作製するプローブ作製の新しいアプローチを設計した。この方法によって、（ほとんどの目的に）直接使用することができる、反復配列の混入が少ないプローブが出来た。しかしながら、反復配列をさらに除くことが望ましい場合、発明の方法を介して作製したプローブは、開始するための反復配列がすでに少し汚染されているので、反復配列作戦のハイブリッド形成を続いて防ぐための、またはプローブから反復配列を除くためのより良い基質を提示する。
【００１９】
以下は発明の側面の非限定的実施例であり、低い量の反復配列を持つプローブを設計する作戦が説明されている。フローソーティングまたは微小切片によって単離された染色体ＤＮＡの変性プライマーによってＤＯＰ−ＰＣＲを行う。ＤＯＰ−ＰＣＲの間に、反復配列は、このような配列に相補的であるトランス−ＤＤＰ標識されたヌクレオチド配列によって架橋され、前記ヌクレオチド配列は好ましくは、１またはそれより多いトランス−ＤＤＰ標識されたオリゴヌクレオチド配列である。
【００２０】
トランス−ＤＤＰ標識ヌクレオチド配列の標的に対するハイブリッド形成によて、選択された反復領域に対するヌクレオチド配列の安定的な鎖間架橋が生じる。３’ヒドロキシ基を欠くようにこのような配列を修飾して、従ってポリメラーゼによりプライマーとして機能するヌクレオチド配列を無効にしてもよい。従って、架橋されたヌクレオチド配列の位置で増幅は阻止され、選択された反復配列を含有しない阻止されていない配列は選択的に増幅される。結果として、反復核酸をハイブリッド形成混合物に添加することなく、増幅産物を直接、染色体プリンティング法のプローブとして使用することができる。
【００２１】
別の方法として、十分に反復配列の存在が減少しているために、ハイブリッド形成混合物に加える必要がある反復核酸が少なく、それによって反復核酸の存在下でプローブの性能を十分に改善する。
【００２２】
特異的配列の増幅阻止は、その他のＰＣＲ適用またはｉｎ  ｖｉｔｒｏの転写アッセイにも使用することができる。その上、ＤＮＡまたはＲＮＡとその標的との結合の安定性を高める必要があるあらゆる状況で、たとえばトランス−ＤＤＰを介した選択的架橋は適用される。アンチセンス技法において、選択的に架橋されたアンチセンス・オリゴヌクレオチドの存在によって特定のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳は妨害される。トランス−ＤＤＰはこのようなオリゴとｍＲＮＡとの安定な結合を創ることができる。対照的に、ｍＲＮＡの２次構造を安定化することによって翻訳を高めることもトランス−ＤＤＰにより可能である。
【００２３】
発明の１つの側面では、鎖間架橋を伴った核酸プローブにおいて選択的領域を提供することを介して、選択的配列、好ましくは反復配列が少なくとも部分的にプローブとして機能することを妨げられる（すなわち、プローブの存在の検出のための標識を伴った核酸）プローブの作製方法が提供される。前記プローブは、核酸プローブがプローブの存在を検出するのに使用される適用、たとえば、これには限定されないが、マイクロアレイ、サザンブロット、ノーザンブロット、染色体プリンティングなどで使用されてもよい。選択された配列がプローブとして機能することを妨げられるプローブの利点は、当業者には明らかであり、前記プローブの改善された特異性が挙げられるが、これに限定されない。
【００２４】
発明の１つの側面では、増幅可能な配列のサブセットの増幅を少なくとも部分的に減らす、または阻止するために選択された鎖間架橋を提供すること、および増幅可能な配列のプールを増幅反応の対象とすることを含む、前記プールからの特定の増幅可能な配列を選択的に増幅する方法が提供される。発明の好ましい側面では、増幅可能な配列のプールは染色体に存在する配列から選択される。好ましくは、増幅可能な配列のプールは染色体の一部の配列から選択される。
【００２５】
選択された増幅中に生産される断片の回収を核酸配列の検出のためのプローブとして使用することができる。プローブは従来の技法で標識してもよいし、またはプローブは、ＵＬＳ、記載されている（ＷＯ  ９２／０１６９９、ＷＯ  ９６／３５６９６、ＷＯ  ９８／１５５６４、及びＷＯ  ９８／４５３０４）ような一般的な結合系を介して標識してもよい。染色体全体からの配列からプローブを作製する場合、染色体全体を染色するのに該プローブを用いてもよい。同様に、染色体の一部からの配列からプローブが作製される場合、前記染色体の一部を染色するのに該プローブを用いてもよい。
【００２６】
そのような標識された染色体またはその一部は、染色体および／または細胞のタイピングまたは疾患の同定に用いてもよい。
【００２７】
発明の１つの側面では、ＣＯＢＲＡ（２成分比率を組合せた標識）と呼ばれる生体有機分子の特別な標識法を提供する。ＣＯＢＲＡは２成分標識と比率標識の戦略的な組合せに基づく。
【００２８】
非限定的適用では、既存の技法に基づいて、２４、４８、９６またはそれより多くのＦＩＳＨ多重度を達成するために技法を使用し、技法は良好なデジタル式蛍光顕微鏡のみを必要とする。
【００２９】
１つの側面では、ＣＯＢＲＡは、たとえば細胞遺伝学における核酸の検出において使用するのに識別可能な色の数を増やすために、組合せ（すなわち、２成分）標識およびいわゆる比率標識を利用する。ＣＯＢＲＡ標識は、核酸、タンパク質、脂質および／または炭水化物のような生体有機分子の標識および／または検出のために使用することができる。２つの蛍光団が特定の色を産出するために使用されるような方法で多数のスペクトルに分離される蛍光団が比率標識に用いられる。これが３つの蛍光団に適用され、蛍光団の各対が５色を生じる場合、合計１２色が達成される（図１の下方の三角形）。  ニックトランスレーション、ランダムプライム標識、ＰＣＲ標識および／または化学標識のような方法を用いて、この１次プローブのセットが直接蛍光的に標識される。別の標的を認識する１２の２次プローブのセットも、全く同じ、しかしさらに蛍光団を加えて標識される。１つの実施例では、前記蛍光団は、ハプテン、たとえば、ビオチンまたはジゴキシゲニンである。このハプテンは、比率標識に使用された３つの１次蛍光団とはスペクトルによって良好に識別可能な第４の蛍光標識で標識されたアビジンまたは抗体を用いて発色させる。従って、たった４つの蛍光団を用いて、１２のセットは倍化されて２４色となり（図１の真ん中の２つの三角形）、それは、２４本のヒト染色体の染色を達成する今までに報告されていない１つの蛍光団である。余分な『遊離』の蛍光団は、第２の２成分標識を探索する、この工程を繰り返すのに使用してもよく、再び達成可能な色の数の倍化を生じる（４８色となる）（図１の上方の三角形）。
【００３０】
３つより多くの蛍光団を用いること、またはさらに多くの比率を識別することのどちらかによって元になる三角形で１２より多くの１次色を産出すれば、明らかに、色の数ではさらに強い増加さえ達成可能である。
【００３１】
少なくとも、標識当り２つの蛍光団を同時に使用する場合、達成可能なＣＯＢＲＡの色の総数は数学的には以下のように記載することができる。比率標識にｎ個の蛍光色素を用いるとし、非限定例として、標識当りそのような蛍光色素の２つだけを同時に使用するとして、一方、さらに、ｍ個の蛍光色素が同一標識に対して２成分的に標識されうるとし、比率標識の比率がｒであるとすると、識別できる異なった色の数は以下の式で示される：
式Ｉ：
色の数＝（ｎ＋（（ｒｘｎ！）／（２ｘ（ｎ−２）！）））ｘ２m
式中、ｎは２以上、ｒは０以上、ｍは０以上である。
【００３２】
１つの局面において、本発明は、式Ｉに従って蛍光色素を混合することによる、プローブを標識するために好適なＣＯＢＲＡと呼ばれる色の作製方法を提供する。この場合、ｎは、比例的な標識に使用される蛍光色素の数であり、そしてこの非限定的な例では、そのような蛍光色素の２つだけが１つの標的に対して同時に使用され、ｍは、その同じ標識を２元的に標識するために使用される蛍光色素の数であり、ｒは、比例的な標識によって分離され得る割合の数である。
【００３３】
当業者は、明らかに、ＣＯＢＲＡにおいて使用される好適な蛍光体を選ぶことができる。当業者は、明らかに、比例的な標識における蛍光体の好適な割合を選ぶことができる。
【００３４】
ＣＯＢＲＡの１つの実施形態において、標識するために使用される蛍光色素は、ＤＥＡＣ、Ｃｙ３、フルオレセイン、リサミン（Ｌｉｓｓａｍｉｎｅ）TMなどの群から選択することができる。
【００３５】
本明細書中で使用されている遷移金属という用語は、元素周期律表のＶＩＩＩ族の金属を意味する。架橋において使用される好ましい遷移金属は白金である。１つの局面において、本発明は、核酸内の少なくとも１つの選択された配列に鎖間架橋をもたらす方法を提供する。この方法は、少なくとも１つの選択された１本鎖配列を相補的な１本鎖核酸とハイブリダイゼーションされることを含み、前記の選択された配列または前記の相補的な核酸またはその両方は架橋剤を含む。本発明の好ましい実施形態において、前記の選択された鎖間架橋は、前記の選択された核酸のさらなるハイブリダイゼーションおよび／または複製を妨げる。
【００３６】
別の局面において、本発明は、プローブにおける少なくとも１つの選択された配列が、前記の選択された配列に鎖間架橋がもたらされることによってプローブとして機能することを少なくとも部分的に妨げるプローブの作製方法を提供する。好ましくは、前記の選択された配列は、少なくとも１つの反復配列を含む。
【００３７】
本発明の１つの局面において、特定の増幅可能な配列を増幅可能な配列集合体から選択的に増幅する方法が提供される。この方法は、増幅可能な配列の部分集合体の増幅量を低下させるために提供される選択された鎖間架橋を有する核酸またはプローブを作製すること、および前記集合体を増幅反応に供することを含む。
【００３８】
好ましくは、１本鎖核酸は、ハイブリダイゼーションして架橋した相補的な１本鎖核酸のプライマー伸長機能を好ましくは３’−ヒドロキシ基の修飾により損なうことによって前記増幅に加わることを妨げられる。
【００３９】
好ましくは、増幅可能な配列の前記集合体は、染色体に存在する配列から選択される。
【００４０】
増幅後、前記増幅物は、標識したときにプローブとして特に使用され得る増幅された配列の回収が行われる。増幅可能な配列のそのような集合体が染色体に存在する配列から選択された場合、そのようなプローブは、染色体標識の調製において使用することができる。
【００４１】
本発明の好ましい実施形態において、ＣＯＢＲＡと呼ばれる方法が、少なくとも２つの生物有機分子からなる組を少なくとも２つの色からなる組で標識するために使用される。この方法は、色の前記組を、比例的な標識を２元的な標識と組合わせて行うによって作製することを含む。ＣＯＢＲＡの１つの実施形態において、２つの蛍光体が１つの標的について同時に使用される場合には少なくとも、前記組合せの識別可能な色の総数は式Ｉに従って計算することができる。
色の数＝（ｎ＋（（ｒｘｎ！）／（２ｘ（ｎ−２）！）））ｘ２m
式中、ｎは、比例的な標識に使用される蛍光体の数であり、ただし、非限定的な例において、そのような蛍光色素の２つだけが１つの標的について同時に使用され、ｍは、その同じ標的を２元的に標識するために使用される蛍光体の数であり、ｒは、比例的な標識によって分離され得る割合の数であり、
２＜ｎ＜∞、
０＜ｒ＜∞、
０＜ｍ＜∞。
【００４２】
ＣＯＢＲＡの好ましい実施形態において、前記生物有機分子の少なくとも１つは、核酸、タンパク質、炭水化物および／または脂質を含む。
【００４３】
本発明の別の局面において、少なくとも１つの染色体またはその一部の配列が、好ましくは本発明の方法に従って調製された少なくとも１つのプローブを使用することによって同時に同定される方法が提供される。この場合、前記のプローブは、比例的な標識によって得ることができる同定可能な標識の数を倍増させるＣＯＢＲＡ法に従って標識される。この方法は、新規な蛍光体を、プローブの第１の組を比例的に標識するために使用される蛍光体の第１の組に加えること、およびプローブの第２の組を標識することを含む。
【００４４】
本発明の１つの実施形態において、染色体またはその一部の改善された検出のために必要なプローブが提供される。別の実施形態において、本発明により、選択された鎖間架橋の使用が、特定の増幅可能な配列の増幅産物の量を低下させるために提供される。
【００４５】
別の実施形態において、本発明は、少なくとも１つの染色体をタイプ決定することによる疾患の同定を提供する。この場合、少なくとも１つの染色体が、本発明の方法に従って調製された少なくとも１つのプローブで標識される。本発明のさらに別の局面において、本発明の方法で得ることができる少なくとも１つのプローブを含む核酸検出キットが提供される。
【００４６】
さらに別の局面において、本発明は、ＣＯＢＲＡ法で標識された少なくとも１つのプローブを含む、本発明の方法を実施するためのキットを提供する。
【００４７】
さらに別の局面において、本発明は、好ましくは１本鎖核酸に結合する架橋剤を少なくとも含む、本発明によるプローブの作製キットを提供する。
【００４８】
本発明はさらに、増幅配列の集合体またはプローブを少なくとも含む核酸検出キットを提供する。本発明はさらに、核酸の選択的な架橋を行うためのキットで、好ましくは１本鎖核酸に結合する架橋剤を少なくとも含むキットを提供する。
【００４９】
本発明はまた、架橋剤によって架橋される少なくとも２つの部分を含む分子を提供する。この場合、前記架橋剤は遷移金属を含み、好ましくは白金を含み、少なくとも２つの前記部分はタンパク質を含む。そのような分子は、例えば、タンパク質を、タンパク質を含む標識を含むＵＬＳで標識される。好ましくは、前記分子は少なくとも２つの異なるタンパク質を含む。
【００５０】
本明細書中で使用されている用語「鎖間架橋」は、２本鎖核酸の変性傾向を低下させる架橋剤と２本鎖核酸との物理的結合をいう。鎖間架橋により２本鎖核酸の２つの相補的な鎖が物理的に結合することは好ましいが、しかし必須ではない。
【００５１】
本明細書中で使用されている用語「物理的結合」は、共有結合または非共有結合である。
【００５２】
本明細書中で使用されているように、プローブは、前記プローブの検出を容易にする標識で好ましくは標識される少なくとも２つの異なる配列を含む核酸配列の集合体として定義される。前記プローブは、例えば、核酸配列の検出のために直接使用することができ、あるいは前記プローブは、例えば、核酸配列の検出に先立って、本発明の方法に従って操作することができる。
【００５３】
核酸に関連して本明細書中で使用されている用語「相補的」は機能的に使用され、相補的な核酸に対する核酸の相同性が十分に大きく、所望するストリンジェントなハイブリダイゼーション条件または非ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件のもとで相補的な核酸が核酸にハイブリダイゼーションできることを意味する。この機能的な定義は、本発明を実施する際に利用することができる種々の異なるハイブリダイゼーション条件を可能にするために必要である。機能的な定義の必要性を例示する１つの非限定的な例は、核酸内に数回反復しているが、その反復領域がその正確なヌクレオチド配列においてわずかに変化している特異的な領域を架橋することである。
【００５４】
１つの領域に対して完全に相補的であるヌクレオチド配列を選ぶことは、前記ヌクレオチド配列が反復領域の配列に対して完全に相同的ではないことを自動的に意味する。しかし、前記反復配列の配列が相違することにより、選ばれたハイブリダイゼーション条件のもとで、前記反復配列と選ばれた配列とのハイブリダイゼーションが妨げられない場合、選ばれた配列は反復領域内の配列に対して機能的に相同的（すなわち、相補的）である。
【００５５】
実施例１
ｔｒａｎｓ−ＤＤＰで標識された反復ＤＮＡによる反復ＤＮＡのハイブリダイゼーションの阻止
中期染色体を有する２枚のスライドガラスをＣｙ３−ＵＬＳ標識の反復ＤＮＡとハイブリダイゼーションする。１枚目のスライドガラスを未標識の反復ＤＮＡとプレハイブリダイゼーションする。２枚目のスライドガラスをｔｒａｎｓ−ＤＤＰ標識の反復ＤＮＡとプレハイブリダイゼーションする。
【００５６】
ｔｒａｎｓ−ＤＤＰで標識された反復ＤＮＡのその標的に対するハイブリダイゼーションによって安定な鎖間結合が形成されるので、２枚目のスライドガラスでは、Ｃｙ３−ＵＬＳで標識されたＤＮＡのハイブリダイゼーションが妨げられる。したがって、染色体に対するＣｙ３シグナルは、２枚目のスライドガラスでは、１枚目のスライドガラスよりもはるかに小さくなる（詳細については表１を参照のこと）。
【００５７】
スライドガラス１，２および３はコントロール用のスライドガラスである。１：０の数字は、ｔｒａｎｓ−ＤＤＰの量に関する反復ＤＮＡの量の割合を表す。スライドガラス２および３の場合、ｔｒａｎｓ−ＤＤＰは使用されず、架橋は形成されなかった。したがって、得られた結果は、参照値として見なければならない。スライドガラス４および５の結果は、反復ＤＮＡがｔｒａｎｓ−ＤＤＰで過剰に標識され、その結果として、ハイブリダイゼーションの阻止がより困難になったことを示している（１：２の割合）。ｔｒａｎｓ−ＤＤＰの飽和していない標識が、スライドガラス８および９において示されている。最も良い結果が１：１の割合で得られた。
【００５８】
実施例２
ｔｒａｎｓ−ＤＤＰで標識されたジデオキシプライマーによるＰＣＲ時の特異的な配列の増幅阻止
２つのＰＣＲ反応を平行して行った。第１の反応において、ＰＣＲを、２つの配列特異的プライマー（プライマーＡおよびプライマーＢ）を用いてプラスミドＤＮＡに対して行う。この反応により、所定の長さの増幅産物が得られる。第２の反応において、同一のＰＣＲを行う。しかし、反応混合物に、２つのｔｒａｎｓ−ＤＤＰ標識オリゴヌクレオチドをも加える。このオリゴヌクレオチドはその３’末端にジデオキシヌクレオチド有し、プライマーＡおよびＢによって増幅され得る領域内の配列に対して相補的である。この第２の反応は、増幅がｔｒａｎｓ−ＤＤＰ標識のオリゴヌクレオチドによって阻止さるために生成物をもたらさない。
【００５９】
実施例３
ＤＯＰ−ＰＣＲ時の反復配列のブロッキング
ＤＯＰ−ＰＣＲを行う。この場合、反復配列の増幅が、３’ヒドロキシ基を有さず、いくつかの反復配列に対して相補的であるｔｒａｎｓ−ＤＤＰ標識のヌクレオチド配列を加えることによって阻止される。増幅産物を用いて、中期染色体に対するインサイチュハイブリダイゼーション実験を行う。非ブロッキングの増幅産物と比較して、このプローブは、標的でない染色体に対してかなり小さいバックグラウンドをもたらす。
【００６０】
実施例４
ａ．比例的な標識に必要な２つの蛍光色素（ｎ＝２）、割合なし（ｒ＝０）、および２元的な標識なし（ｍ＝０）は、予想されるように２つの色が生じる。
ｂ．比例的な標識に必要な３つの蛍光色素（ｎ＝３）、３つの割合（ｒ＝３）、および１つの２元的な標識（ｍ＝１）は、２４色が生じる（本論文で実証される状況）。
ｃ．割合の数をｒ＝４に増大し、比例的な標識に必要な蛍光色素の数を４つに増大すると、２８色が生じる。
ｄ．それぞれの２元的な蛍光色素は色の数を倍増させる。すなわち、５６（１つの場合）または１１２（２つの場合）に倍増させる。
【００６１】
この概念の原理は、比例的な標識（１次蛍光体としてのフルオレセイン、リサミンおよびＣｙ５、ならびにコンビナトリアル標識としてのＤＥＡＣ）、ならびに化学的な標識を使用するプローブに対する色コードの直接的な結合を達成するためにプローブの酵素的標識およびプローブ混合を使用して２４個のヒト染色体で実証されている。後者の場合、ＤＥＡＣ、Ｃｙ３およびＣｙ５は１次蛍光体として作用し、フルオレセインまたは誘導体は２元的な標識として使用された。
【００６２】
手順
ヒト染色体の多色ＦＩＳＨ染色
ヒト中期染色体の調製をＷｉｅｇａｎｔ他によって記載されているように行った。正常なヒト個体ならびにインビトロ培養されたＪＶＭ−２細胞から得られた染色体を使用した。すべての染色体に対するプローブをＣｙｔｏｃｅｌｌ（英国）から得た。すべてのプローブＤＮＡをＤＯＰ−ＰＣＲによって増幅して、２４個のヒト染色体のすべてに対する１組の標識プローブを作製した。
【００６３】
プローブの酵素的標識
すべてのプローブを、フルオレセイン−ｄＵＴＰ、ジゴキシゲニン−ｄＵＴＰ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ドイツ）、リサミン−ｄＵＴＰ（ＮＥＮ  ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、米国）またはＣｙ５−ｄＵＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ、英国）を使用してＰＣＲまたはニックトランスレーションのいずれかで標識ｄＵＴＰを取込ませることによって蛍光標識した。ジゴキシゲニンで標識されたプローブは、ジエチルアミノクマリン（ＤＥＡＣ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、米国）を使用して間接的に検出された。
【００６４】
ＵＬＳ（ユニバーサル結合システム）を使用するプローブの化学的標識
ジゴキシゲニン−ＵＬＳ（ｄｉｇ−ＵＬＳ）で標識されたプローブを明らかにするために、ＤＥＡＣ−ＵＬＳ、Ｃｙ３−ＵＬＳおよびＣｙ５−ＵＬＳを１次蛍光体として選び、そしてフルオレセインをコンビナトリアル第４標識として選んだ。下記の方法を使用して、ＵＬＳで標識されたプローブの組を標識して分離した：
【００６５】
最初に、染色体２，４，６，８，１０，１２，１４，１６，１８，２０，２２およびＸに対する染色体特異的標識プローブ（１００〜４００ｎｇ）を、製造者の説明書に従ってｄｉｇ−ＵＬＳを用いて１つの反応で標識した。その後、このプローブ組を製造者の説明書に従ってＱｉａｇｅｎクイックスピンカラム（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ、米国）で精製した。標識されたプローブ混合物を、１００μｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ（ｐＨ８．５）を使用してＱｉａｇｅｎカラムから溶出した。
【００６６】
次に、すべての染色体特異的染色プローブを、表２に従って、１００μｌの水の最終容量においてＤＥＡＣ−ＵＬＳ（２６．７μＭ）、Ｃｙ３−ＵＬＳ（２０μＭ）およびＣｙ５−ＵＬＳ（１３．３μＭ）を使用して、３０μｌの列記されたＵＬＳ化合物（またはその混合物）を１ｍｇの染色体特異的標識プローブＤＮＡ（すべてＣｙｔｏｃｅｌｌから得られる）と混合することによって蛍光標識した。プローブが２つの異なるＵＬＳ化合物の混合物で標識される場合、ＵＬＳ化合物を、所望する割合で最初に混合し、その後、プローブＤＮＡを加えた。６５℃で１５分間インキュベーションした後、標識されたプローブをＱｉａｇｅｎクイックスピンカラム（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ、米国）で精製した。標識されたプローブを、１００μｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ（ｐＨ８．５）を使用してＱｉａｇｅｎカラムから溶出した。ハイブリダイゼーションする前に、蛍光ＵＬＳ標識プローブを、表２の右欄に示されている量で、最初の工程からのｄｉｇ−ＵＬＳ標識されたプローブ混合物の１００μｌと一緒にした。次いで、このプローブ混合物を１０ｘ過剰の低分子量サカナ精子ＤＮＡ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）および３ｘ過剰のヒトＣoｔ１−ＤＮＡ（Ｇｉｂｃｏ、ＢＲＬ）の存在下でエタノール沈殿した（反復配列を抑制する代わりの方法は下記に示される）。その後、プローブ混合物を１０μｌの５０％脱イオン化ホルムアミド、２ｘＳＳＣ、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７）、１０％デキストラン硫酸に溶解した。プローブ混合物のこの１０μｌをハイブリダイゼーション溶液として使用した。
【００６７】
ヒト中期染色体のＦＩＳＨ染色：
中期染色体を有するスライドガラスをＷｉｅｇａｎｔ他に従ってＲＮａｓｅＡおよびペプシンで前処理した。染色体調製物を、ホットプレートで、６０％ホルムアミド、２ｘＳＳＣ（ｐＨ７）において８０℃で９０秒間インキュベーションすることによって変性させた。カバーガラスを除いた後、スライドガラスをエタノール系列で脱水し、風乾した。次いで、１０μｌのハイブリダイゼーション混合物を１８ｘ１８ｍｍのカバーガラス下で加え、ゴムセメントで封じ、ハイブリダイゼーションを恒湿容器において３７℃で１２０時間行った。ハイブリダイゼーション混合物には、５０％ホルムアミド、２ｘＳＳＣ、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７）、１０％デキストラン硫酸、１００ｎｇ〜５００ｎｇのそれぞれのＤＥＡＣ標識プローブ、Ｃｙ３標識プローブおよびＣｙ５標識プローブ（単標識プローブおよび比例的標識プローブの両方）（表２参照）、１００ｎｇ〜４００ｎｇの各ｄｉｇ−ＵＬＳ標識プローブ、３ｘ過剰のヒトＣoｔ１−ＤＮＡ、および１０ｘ過剰の低分子量サカナ精子ＤＮＡが１０μｌに含まれた。加える前に、プローブを８０℃で１０分間変性し、その後、３７℃で６０分間インキュベーションして、３倍過剰のＣoｔ１−ＤＮＡとプレアニーリングさせた。
【００６８】
２ｘＳＳＣ／０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０において３７℃で１０分間のハイブリダイゼーション後の洗浄を行った後、カバーガラスを除くために、スライドガラスを、４４℃において、５０％ホルムアミド、２ｘＳＳＣ（ｐＨ７）で５分間、２回洗浄した。この後、６０℃において０．１ｘＳＳＣで２回の洗浄（それぞれ５分）を行い、そしてＲＴにおいてＴＮＴ（０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０）で５分間洗浄した。ＤＩＧ−ＵＬＳ標識されたプローブを、ジゴキシンに対するマウスモノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ）を用い、その後、ウサギ抗マウス抗体結合ＦＩＴＣ（Ｓｉｇｍａ）を用いて検出した。
【００６９】
染色体をＤＡＰＩで対比染色した。スライドガラスをＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（酵素的に標識されたプローブを使用した場合）またはＣｉｔｉｆｌｕｏｒ（Ａｇａｒ、Ｓｔａｎｓｔｅｄ、英国）（化学的に標識されたプローブを使用した場合）に包埋し、その後、顕微鏡評価した。
【００７０】
デジタル画像化顕微鏡
デジタル蛍光画像化を、１００Ｗの水銀アーク灯と、ＨＱ−ＦＩＴＣフィルター、Ｐｉｎｋｅｌ組＋ＳＰ５７０フィルター、ＨＱ−Ｃｙ３フィルター、ＨＱ−Ｃｙ５フィルターおよびＤＥＡＣフィルター（Ｃｈｒｏｍａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）をそれぞれ使用して、ＤＥＡＣ、フルオレセイン、Ｃｙ３およびＣｙ５を可視化するための励起フィルターおよび発光フィルターを有するコンピューター制御のフィルター盤とを備えたＬｅｉｃａ  ＤＭ−ＲＸＡエピ蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ、Ｗｅｔｚｌａｒ、ドイツ）を使用して行った。ＤＡＰＩを、ブロックＡを使用してＵＶ光で励起した。６３ｘの対物鏡（Ｎ．Ａ．  １．３２、ＰＬ  ＡＰＯ、Ｌｅｉｃａ）を使用した。
【００７１】
画像取得および分析をＣｙｔｏｖｉｓｉｏｎワークステーション（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｉｍａｇｉｎｇ、Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ、英国）で行った。このシステムは、Ｃｏｏｌｖｉｅｗカメラ（Ｐｈｏｔｏｎｉｃ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）に接続されたＰＣ（Ｐｅｎｔｉｕｍ１３３ＭＨｚプロセッサー、２４Ｍｂ  Ｒａｍ、２．１Ｇｂディスクおよび１７”ディスプレー）からなる。カメラは熱電冷却を有し、これにより約３０秒までの積算をチップ上で行うことができる。画像は、８ビットの７６８ｘ５１２画像形式で数値化される。
【００７２】
画像取得を前記のように行った。染色体をＤＡＰＩ画像の閾値処理により対話的にセグメント化した。セグメント化画像を着色画像用のマスクとして使用した。これは、比例的に標識された蛍光色素と相応する３つの画像（ＤＥＡＣに対する緑、Ｃｙ３に対する赤、およびＣｙ５に対する青）と、フルオレセイン画像とから構成された。この手順は３色の閾値処理を必要としないことに留意されたい。第４のフルオレセイン画像を２値的に評価した。すなわち、フルオレセインの蛍光を有する染色体またはフルオレセインの蛍光を有しない染色体を区別した。これはＤＡＰＩマスク内に位置する画素に対するフルオレセイン画像のヒストグラムにおいて最適な閾値を見出すことによって行われた。典型的には、２つのガウス分布が、フルオレセイン陽性染色体およびフルオレセイン陰性染色体に対応して認められた。
【００７３】
分類を２段階で行った。染色体の分類を、偶発的な転座を検出するために画素分類に従った。染色体の分類は、図１に示されているように、各染色体の色モード値、例えば、色三角形の１つにおけるその位置（２元的標識を有するものあるいは２元的標識を有しないもの）に主に基づいた。したがって、すべての染色体クラスの理論的な予想比例色に対する１つの染色体の測定された色モード値の最短距離が計算された。非特異的な蛍光の寄与を補償するために、そして方法の確実性を増大させるために、理論的な予想色値を、１つだけの比例色を有する染色体の測定されたモード値によって形成される三角形にひずませた。色モード値に加えて、染色体の長さもまた分類のために使用した。理論的には、染色体の色値は元のプローブ割合に相応するはずである。しかし、実際には、多数の中期染色体が分類者の訓練のために使用された場合、より確実な方法が得られる。対象物を分類した後、染色体内の各画素を、測定された染色体クラスに対する最短距離に基づいて分類した。各画素の２元的（第４の色）の情報を使用して、どの色三角形の距離計算を行うべきかを決定した。分類色を割り当てることはかなり有用であり、予想されるが、現在のソフトウエアでは実施されなかった。
【００７４】
最後に、カリオグラムを、上記に記載されているように、比例色を示す染色体分類に基づいて作製した。仮の色が、それぞれの異なる染色体画素の対応する染色体クラスに割り当てられたカリオグラムを、染色体転座の対話式による検出が容易になるように作製した。必要な場合には、ＤＡＰＩバンド形成画像を比較のために使用した。
【００７５】
結果
４つの蛍光体を使用する２４色のＣＯＢＲＡ染色法を、正常な染色体および異常な染色体に適用した。プローブを標識する最適な条件、およびプローブ組の最終的な組成は、いくつかのプローブは他のプローブよりも良好に作用するという事実のために若干の微調整を必要とした。典型的には、あまり機能しないＦＩＳＨプローブは、他のプローブとの色の重なりを最小限にするような色の組合せをもたらした。
【００７６】
最適な染色結果が、延長したハイブリダイゼーション時間（５日）で得られたが、多くの場合、３日で十分であった。反復配列の抑制が、染色体の選択的な染色に必須であることが見出された。
【００７７】
図２は、２４個の染色体が色空間をどのように占めているかを示している。典型的には、特定の染色体画像において、シグナル強度は、ＦＩＳＨ強度が局所的に異なるために比較的大きな変化を示した。しかし、特徴的な色は、３Ｄ色空間において規定された角度でクラスターを形成するには十分に一定していた（図２）。いくつかの染色体クラスターは重なりを示したが、それらは、上記に記載された手順を使用して自動的に分類するためには十分に分離された。
【００７８】
図３は、実際の染色体画像と得られたカリオグラムとを示す。積算時間は、使用された蛍光体に依存して変化し、０．５秒〜２０秒の範囲であった。Ｃｏｂｒａ取得および分析手順の全体は、典型的には約１分を要した。
【００７９】
ＪＶＭ細胞株において示されるように異常な染色体に適用された場合、Ｃｏｂｒａにより、異常な染色体を容易に検出することができた（図４）。ＵＬＳ法において必須なものは、原理的には、各プローブ分子が、混合することを不用にする比例コードを含有するということである。ＤＥＡＣ、Ｃｙ３およびＣｙ５の比例的な標識は優れた性能を示し、２元的なフルオレセイン標識と十分に組合わせることができる。これらのプローブを用いて得られた結果を図５に示す。
【００８０】
ＣＯＢＲＡの確実性は、ギムザバンド形成染色体およびＦＩＳＨ染色染色体の両方の自動分析の場合には当てはまるように、得られた中期染色体の性状に依存した。良好な性状のスライドガラスは、自動的に分類することができる良好なシグナル対ノイズ比の画像を常にもたらし、これに対して、染色性状が低下するにつれて、使用者の介入が増大した。
【００８１】
Ｃｏｂｒａの原理は、比例的な標識および２元的な標識の利点を併せ持つ。それは、２つの蛍光体の様々な割合を作製するために「決定」するだけであるが、２元的な決定のみを必要とする間接的に標識されたハプテンを導入することによって色の数を倍増させる可能性を利用する。示されているように、この方法は実施可能であり、４つの蛍光体のみを使用して２４個のヒト染色体を同定することができる。
【００８２】
この方法のすべての可能性はまだ調べられていない。これまで、標識用プローブのみがＣｏｂｒａにおいて使用された。暴露時間が短いことを考慮すれば、本発明者らは、ＹＡＣまたはＰＡＣなどの他のタイプのプローブが類似する方法で使用できることを確信する。
【００８３】
数式が示しているように、色の数は、より多くの色素、またはより多くの割合が原色セットに使用された場合に特に増大する。割合が６または７である２つの色素を区別することが可能であることが示されている。
【００８４】
そのような方法は、化学的な標識が使用された場合に最も良く達成可能である。ＵＬＳは、性状が制御された標識用プローブの大量生産に好都合である。これに関連して、蛍光体の効率的に使用に関するＣＯＢＲＡ法は、ＭＦＩＳＨ多様性のさらなる増大に大きく寄与し、それにより細胞遺伝学におけるさらなる利用に寄与し得る。
【００８５】
実施例５
異なるＨＰＶタイプ間の交差ハイブリダイゼーションの防止。
背景：ＫＲＥＡＴＥＣＨのＨＰＶタイプ決定用プローブ３１，３３は、ＣａＳｋｉ細胞に対して、弱いが、明かなハイブリダイゼーションシグナルをもたらす。ＣａＳｋｉ細胞はＨＰＶ１６である。ｔｒａｎｓ−ＤＤＰの使用により、この望ましくないハイブリダイゼーションを防止することができるか？
スキーム：一方でＨＰＶ１６と、もう一方でＨＰＶ３１およびＨＰＶ３３との間での相同的な配列を選択する。これらの配列をｔｒａｎｓ−ＤＤＰで標識し、ハイブリダイゼーション後にこれらの配列を不可逆的に架橋する。残存する配列はＨＰＶ３１および／またはＨＰＶ３３に特異的である。ＣａＳｋｉ細胞でこのＤＩＧ−ＵＬＳ標識の残存部分とのハイブリダイゼーションを行った後では、ハイブリダイゼーションは予想されない。
【００８６】
実施例６
フィルターハイブリダイゼーションにおけるｔｒａｎｓ−ＤＤＰの使用
背景：最終結果の理解を困難にする配列間のハイブリダイゼーションの防止。例えば、１コピーのシグナルをマスクする（例えば、イントロンにおける）反復配列。あるいは、時期特異的な特徴的配列に好都合な時期特異的なｃＤＮＡライブラリーにおける一般的に存在する配列の抑制（はサブトラクティブハイブリダイゼーションと比較され得る）。
【００８７】
スキーム：ＨＰＶ１６をｐＳＰ６４をクローン化する。プラスミドから挿入物を除く制限酵素で消化した後、両方のフラグメントをアガロースゲルで分離し、フィルターメンブランにブロットする。プローブとして、プラスミドおよび挿入物をＤＩＧ−ＵＬＳで標識する。これをそのとおりに使用した場合、２つのバンド（すなわち、ＨＶＰ１６およびｐＳＰ６４のバンド）がハイブリダイゼーションの後に得られる。しかし、ｔｒａｎｓ−ＤＤＰで標識されたｐＳＰ６４  ＤＮＡを加えることにより、ｐＳＰ６４の配列は不可逆的に架橋され、変性させた後でさえも、その後のハイブリダイゼーションにはもはや関与し得ない。このようなハイブリダイゼーションの結果として、１つの優勢なバンドのみが、すなわち、ＨＰＶ１６に特異的な配列が予想される（これは理想的な場合である）。
この本実施例は、溶液における相同的な配列の架橋を記載している。システムを逆にし、ｔｒａｎｓ−ＤＤＰ  ｐＳＰ６４とのマトリックスハイブリダイゼーションを最初に行い、続いて、ＤＩＧ−ＵＬＳ  ｐＳＰ６４／ＨＰＶ１６ハイブリダイゼーションをフィルターから除いた後、匹敵し得る結果が得られる。
【００８８】
実施例７
本実施例において、Ｃｏｂｒａ原理の一局面が、ｍＦＩＳＨを使用する適用においてＴＲＡＮＳ−ＵＬＳ標識プローブを用いて実施される。
【００８９】
ヒトの第４染色体または第２０染色体に特異的なプローブを作製するために、ＤＯＰ−ＰＣＲを、ヒト染色体の多色ＦＩＳＨ染色において記載された手順に従ってヒトの第４染色体または第２０染色体の調製物に対して行う。この場合、反復配列の増幅が、３’ヒドロキシ基を有さず、かついくつかの反復配列に対して相補的であるｔｒａｎｓ−ＤＤＰ標識ヌクレオチド配列を加えることによって阻止される。第４染色体に特異的なプローブは、ＵＬＳを使用するプローブの化学的な標識において記載されている手順に従って、ＤＥＡＣ−ＵＬＳおよびＣｙ３−ＵＬＳ（５０：５０）で比例的に標識された。第２０染色体に特異的なプローブは、ＵＬＳを使用するプローブの化学的な標識において記載されている手順に従って、ＤＥＡＣ−ＵＬＳおよびＣｙ３−ＵＬＳ（５０：５０）で比例的に標識され、かつフルオレセインでコンビナトリアル的に標識された。
【００９０】
ＪＶＭ−２細胞の中的染色体展開物を有するスライドガラスを調製し、ヒト中期染色体のＦＩＳＨ染色において記載されている手順に従ってＦＩＳＨ染色した。結果を、画像化顕微鏡のところで記載された手順に従って可視化した。
【００９１】
ｔｒａｎｓ−ＵＬＳプローブを使用したとき、最適な染色結果が、例えば、実施例４における非ｔｒａｎｓ−ＵＬＳプローブと比較して、驚くべきほど短いハイブリダイゼーション時間の後で得られた。一晩のハイブリダイゼーションが、多くの場合、染色には十分であった。これに対して、実施例４の場合のようにｔｒａｎｓ−ＵＬＳでないＦＩＳＨ技術を使用して最適な結果を得るためには、５日のハイブリダイゼーション時間が最適である。ｃｏｂｒａ標識は、プローブとの一晩のハイブリダイゼーションの後で、ＪＶＭ−２細胞の中期展開物における第４染色体および第２０染色体の明瞭で確かなタイプ決定を可能にした。
【００９２】
実施例８：ｔｒａｎｓ−ＤＤＰで標識された反復ＤＮＡによる蛍光体標識の反復ＤＮＡのハイブリダイゼーションの阻止
本実施例において、本発明者らは、本質的には、実施例１に記載される実験を繰り返した。フルオレセイン−ＵＬＳで標識されたヒト第１染色体特異的プローブをヒトの中期染色体展開物に対してインサイチュハイブリダイゼーションした。当業者には、このタイプのプローブが、染色体に特異的でない反復配列を含むことは明かである。これらの配列のハイブリダイゼーションは、多くの場合、過剰の非標識のヒトＣoｔ１  ＤＮＡを加えることによって妨げられた。この場合、ｔｒａｎｓ−ＤＤＰで標識された反復ＤＮＡ配列が、染色体特異的プローブに存在する染色体非特異的な反復配列のハイブリダイゼーションを抑制するために使用される。１枚を除くすべてのスライドガラスを変性し、ｔｒａｎｓ−ＤＤＰ標識のヒト反復ＤＮＡとプレインキュベーションした。反復ＤＮＡ：ｔｒａｎｓ−ＤＤＰの比は表１に示されている。続いて、１枚を除くすべてのスライドガラスを変性し、フルオレセイン−ＵＬＳ標識のプローブをすべてのスライドガラスに加えた。ｔｒａｎｓ−ＤＤＰ標識された反復ＤＮＡとその標的とのハイブリダイゼーションは安定な鎖間結合をもたらし、フルオレセイン−ＵＬＳ標識されたＤＮＡのハイブリダイゼーションを妨げた。したがって、染色体上におけるフルオレセインのシグナル強度が低下する（詳細については表１を参照のこと）。スライドガラス１，２および３はコントロール用スライドガラスである。スライドガラス２および３の場合、ｔｒａｎｓ−ＤＤＰは使用されず、架橋は形成されなかった。したがって、得られた結果は参照値として見なさなければならない。スライドガラス４および５の結果は、反復ＤＮＡがｔｒａｎｓ−ＤＤＰで過剰に標識され、その結果として、ハイブリダイゼーションの阻止がより困難になったことを示している（１：２の割合）。ｔｒａｎｓ−ＤＤＰが飽和していない標識がスライドガラス８および９で示されている。最良の結果が１：１の割合で得られた（スライドガラス６）。ＵＬＳプローブの標識およびインサイチュハイブリダイゼーションに関する実験的な細部については実施例４を参照のこと。
【００９３】
実施例９：ｔｒａｎｓ−ＤＤＰで標識されたプライマーによるＰＣＲ時の特異的配列の増幅阻止
本実施例において、本発明者らは、本質的には、実施例２に記載される実験を繰り返した。ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タイプ１６のプライマーであるＨＰＶｆｏｒ（５′−ＴＣＡＡＡＡＧＣＣＡＣＴＧＴＧＴＣＣＴＧ−３′）およびＨＰＶｒｅｖ（５′−ＡＡＣＣＡＣＣＣＣＣＡＣＴＴＣＣＡＣ−３′）により、９４５ｂｐのフラグメントがポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）において得られた。４つの内部プライマーを設計した：プライマーＴＵ１６ｆｏｒ１（５′−ＡＧＡＧＣＴＧＣＡＡＡＡＡＧＧＡＧＡＴＴＡＴＴＴＧＡＡＡＧＣＧＡ−３′）、プライマーＴＵ１６ｆｏｒ２（５′−ＡＧＡＧＡＣＡＡＣＴＧＡＴＣＴＣＴＡＣＴＧＴＴＡＴＧＡＧＣＡ−３′）、プライマーＴＵ１６ｒｅｖ１（５′−ＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＴＡＡＡＣＡＡＣＧＣＡＴＧＴＧＣＴＧＴＣ−３′）、およびプライマーＴＵ１６ｒｅｖ２（５′−ＣＧＴＧＴＧＴＧＣＴＴＴＧＴＡＣＧＣＣＡＣＡＡＣＣＧＡＡＧＣＧＴＡＧＡＧＴ−３′）。これらの内部プライマーをまとめた（それぞれ０．１２５μｇ／μｌ）。このプライマー混合物を、標準的なＵＬＳ標識プロトコルに従って、１μｇのプライマーあたり５０ｎｇのｔｒａｎｓ−ＵＬＳで標識した。次に、オリゴヌクレオチド混合物を、遊離のｔｒａｎｓ−ＵＬＳを除くためにカラム精製した。全ゲノムＨＰＶ１６  ＤＮＡ（最終的に４０ｎｇ）を、６ｘＳＳＣの溶液において、ｔｒａｎｓ−ＵＬＳ標識された内部プライマー（最終的に１２０ｎｇ〜１６０ｎｇ）と混合した。この溶液を変性し、６０℃で１時間インキュベーションした。この工程をさらに２回繰り返し、その後、カラム精製を行った。続いて、ＰＣＲ増幅を下記のように行った：ＰＣＲ緩衝液、ＨＰＶｆｏｒプライマーおよびＨＰＶｒｅｖプライマー（それぞれ１０μＭ）、ｄＮＴＰｓ（それぞれ２．５ｍＭ）およびＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（５ユニット）からなるＰＣＲマスター混合物を、（ｉ）ＨＰＶ１６ゲノムＤＮＡのみ、（ｉｉ）ＨＰＶ１６  ＤＮＡおよび内部プライマー、または（ｉｉｉ）ｔｒａｎｓ−ＵＬＳ標識された内部プライマーで架橋されたＨＰＶ１６  ＤＮＡのいずれかを含有する０．５ｍｌのＰＣＲチューブに加えた。ＰＣＲプロフィルは、９５℃で２分間、９５℃で４５秒間；５７℃で４５秒間；７２℃で１分間の２３サイクル、および９５℃で４５秒間；５７℃で４５秒間；７２℃で１５分間の１サイクルであった。１０μｌの各ＰＣＲ増幅混合物を１％アガロースゲルで泳動した（図６参照）。レーン１は９４５ｂｐのフラグメントを示す（上記参照）。９４５ｂｐフラグメントの生成は、内部プライマーをＰＣＲ混合物に加えたときに減少した（レーン２）。ｔｒａｎｓ−ＵＬＳ標識された内部プライマーを使用した場合、９４５ｂｐのＰＣＲフラグメントは増幅されなかった。内部プライマーの不可逆的な架橋は、ＤＮＡポリメラーゼによる鎖延長を阻止し、９４５ｂｐのフラグメントにおける位置を十分に明らかにした。同様の結果を、ｔｒａｎｓ−ＵＬＳで標識されたジデオキシ内部プライマーを使用したときに得ることができる。
【００９４】
実施例１０：ＤＯＰ−ＰＣＲ時の反復配列の阻止およびインサイチュハイブリダイゼーションにおけるそのようなプローブの使用
本実施例において、本発明者らは、本質的には、実施例３に記載される実験を繰り返した。ヒトＣoｔ１  ＤＮＡを下記のプロトコルに従ってｄｄＡＴＰで末端標識した：５０μｇのＣoｔ１  ＤＮＡを９０℃で１０分間変性し、ＴｄＴ緩衝液、ｄｄＡＴＰおよびＴｄＴ（ターミナルトランスフェラーゼ）と混合した。この混合物を３７℃で一晩インキュベーションして、エタノール沈殿した。次に、３′−ｄｄＡＴＰ  ヒトＣoｔ１  ＤＮＡを架橋剤ｔｒａｎｓ−ＵＬＳで標識した。５μｇのＤＮＡを様々な量のｔｒａｎｓ−ＵＬＳと混合して、８５℃で３０分間インキュベーションし、カラム精製した。最良の結果が、３′−ｄｄＡＴＰヒトＣoｔ１  ＤＮＡ：ｔｒａｎｓ−ＵＬＳの比が１：０．３の場合に得られた。このサンプルのＦＩＳＨ結果を下記に示す。ヒト第１染色体を標識するプローブを、ｔｒａｎｓ−ＵＬＳで標識された３′−ｄｄＡＴＰヒトＣoｔ１  ＤＮＡ（１０倍過剰）と混合して、変性し、６５℃で一晩ハイブリダイゼーションして鎖間架橋を形成させた。次に、少量のこのサンプルを、２回の連続したＰＣＲにおいてＰＣＲ増幅し、精製して、標準的な手順に従ってＣｙ３−ＵＬＳですべて標識した。このようにして作製された第１染色体プローブは、高頻度反復配列（この特定の実施例では、ヒトのＣoｔ１  ＤＮＡ相同的配列）が除かれる。このタイプのプローブは、インサイチュハイブリダイゼーション実験におけるこれらの反復の交差ハイブリダイゼーションを抑制するためのヒトＣoｔ１  ＤＮＡの使用が不用になる。反復を含まないＣｙ３−ＵＬＳ標識のヒト第１染色体プローブの適用性がＦＩＳＨにおいて明らかにされた。インサイチュハイブリダイゼーションは、本質的には、実施例４および／または実施例１２に記載されているのと同じである。結果を図７に示す。染色体に特異的でない交差ハイブリダイゼーションが、高頻度反復配列を除かない第１染色体プローブを、ヒトＣoｔ１  ＤＮＡを加えることなく使用したときに大きな程度で認められた（図７Ａ）。５倍過剰のヒトＣoｔ１  ＤＮＡを加えると、染色体に特異的でない交差ハイブリダイゼーションはほとんどが抑制された。ヒト第１染色体を明瞭に同定することができる（図７Ｂ）。染色体に特異的でない交差ハイブリダイゼーションの抑制が、大量の抑制因子ＤＮＡ（この場合では、ヒトＣoｔ１  ＤＮＡ）を必要とすることなく、本発明に記載されたプローブを用いて得られた。第１染色体を、反復を除いたｔｒａｎｓ−ＵＬＳ処理の第１染色体特異的なプローブを使用したときに明瞭に同定することができる（図７Ｃ）。
【００９５】
実施例１１：異なるヒトパピローマウイルスタイプ間の交差ハイブリダイゼーションの防止
本実施例において、本発明者らは、本質的には、実施例５に記載される実験を繰り返した。いくつかのヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タイプは、そのヌクレオチド配列の間に大きな同一性を示す。例えば、ＨＰＶ１８およびＨＰＶ４５のゲノムは７９．７％の同一性を示す。ＨＰＶ１８に相同的な配列を含まないＨＰＶ４５に特異的なプローブを、架橋剤の使用により作製することができる。ＨＰＶ４５の全ゲノムＤＮＡを、標準的なＵＬＳ標識手順に従ってＤＩＧ−ＵＬＳで標識した。ＨＰＶ１８の全ゲノムＤＮＡを超音波処理し、ビオチンの末端標識を行い、ＤＮＡ：ｔｒａｎｓ−ＵＬＳ比が１：１でｔｒａｎｓ−ＤＤＰを用いて標識した。標識されたＤＮＡをカラム精製し、下記にスキームに従って混合した。
チューブ１：ＤＩＧ−ＵＬＳ標識ＨＰＶ４５＋未標識ＨＰＶ１８（超音波処理）チューブ２：ＤＩＧ−ＵＬＳ標識ＨＰＶ４５＋ビオチン化およびｔｒａｎｓ−ＤＤＰ標識のＨＰＶ１８。
ＨＰＶ４５：ＨＰＶ１８の比は両方のチューブにおいて１：１０であった。これらのＤＮＡを、６ｘＳＳＣ（最終濃度）の溶液に溶解した後、変性して、６５℃で５時間インキュベーションした。ストレプトアビンコーティングの磁気ビーズをこれらのチューブに加え、ビオチン化ＤＮＡを溶液から除いた。その結果、チューブ２は、ＨＰＶ１８に相同的な配列が除かれたＤＩＧ−ＵＬＳ標識のＨＰＶ４５  ＤＮＡを主に含む。プローブを変性して、２５ｎｇ／ｍｌの最終濃度でＤＩＧＥＡＳＹＨＹＢ溶液と混合した。ＨＰＶ４５およびＨＰＶ１８のゲノムＤＮＡを、１０００ｐｇ〜０．１ｐｇの範囲の濃度でナイロンメンブラン細片にスポットブロッティングした。プローブ混合物を標的細片に加え、４２℃で一晩ハイブリダイゼーションさせた。結果を図８に示す。ＤＩＧ−ＵＬＳで標識されたＨＰＶ４５プローブは、非標識の相同的なＨＰＶ１８  ＤＮＡの存在に関わりなく自身にハイブリダイゼーションする（レーン１）。ＤＩＧ−ＵＬＳで標識されたＨＰＶ４５の特徴的な配列は、ＨＰＶ４５の全ゲノムＤＮＡにハイブリダイゼーションするが、そのシグナルは、プローブサイズが小さくなったためにあまり強くない（レーン２）。ＤＩＧ−ＵＬＳ  ＨＰＶ４５の標識された特徴的な配列は、本実験で使用された条件のもとではＨＰＶ１８の全ゲノムＤＮＡにハイブリダイゼーションしない（レーン３）。
【００９６】
実施例１２：フィルターハイブリダイゼーションにおけるｔｒａｎｓ−ＤＤＰの使用
本実施例において、本発明者らは、本質的には、実施例６に記載される実験を繰り返した。５つのオリゴヌクレオチドのカクテルを、標準的なＵＬＳ標識手順に従って１μｇのＤＮＡあたり０．０５μｇのｔｒａｎｓ−ＵＬＳで標識した。次に、ｔｒａｎｓ−ＵＬＳで標識されたオリゴのカクテルを、相補的なビオチン−ＵＬＳ標識オリゴヌクレオチド（２５ｎｇ）のカクテルと６５℃で一晩プレハイブリダイゼーションした。ｔｒａｎｓ−ＵＬＳで標識されたオリゴのカクテルを、それぞれ、５倍過剰または１０倍過剰で加えた。変性させた後、これらの混合物を、ビオチン標識した相補的オリゴヌクレオチドの２５ｎｇ／ｍｌの最終濃度でＤＩＧＥＡＳＹＨＹＢ緩衝液に加えた。これらの混合物を、１００００ｐｇから１ｐｇの範囲の様々な量でナイロン細片上にスポットされた５つのオリゴヌクレオチドのカクテルに３７℃で６時間ハイブリダイゼーションさせた。ハイブリダイゼーションを、アルカリホスファターゼで標識されたストレプトアビジンを使用し、その後の化学的発光検出により可視化した。結果を図９に示す。下記のサンプルはコントロールとして使用した：（ｉ）ｔｒａｎｓ−ＵＬＳで標識されたオリゴヌクレオチドのカクテルとインキュベーションしなかったビオチン標識の相補的なオリゴヌクレオチドのカクテル（レーン１）、および（ｉｉ）５倍過剰および１０倍過剰のオリゴヌクレオチドのカクテル（ｔｒａｎｓ−ＵＬＳなし）とプレインキュベーションしたビオチン標識の相補的なオリゴヌクレオチドのカクテル（それぞれ、レーン２および４）。レーン３およびレーン５は架橋化合物の効果を明瞭に示している。ハイブリダイゼーションシグナルは非常に弱く、コントロールと比較してあまり大きくない。
【００９７】
実施例１３：２元的で比例的な混合標識
本実施例において、本発明者らは、本質的には、実施例４に記載される実験を繰り返した。
ａ．比例的な標識に必要な２つの蛍光色素（ｎ＝２）、割合なし（ｒ＝０）、および２元的な標識なし（ｍ＝０）は、予想されるように２つの色が生じる。
ｂ．比例的な標識に必要な３つの蛍光色素（ｎ＝３）、３つの割合（ｒ＝３）、および１つの２元的な標識（ｍ＝１）は、２４色が生じる（本論文で実証される状況）。
ｃ．割合の数をｒ＝４に増し、比例的な標識に必要な蛍光色素の数を４つに増すと、２８色が生じる。
ｄ．それぞれの２元的な蛍光色素は色の数を倍増させる。すなわち、５６（１つの場合）または１１２（２つの場合）に倍増させる。
【００９８】
この概念の原理は、比例的な標識（１次蛍光体としてのフルオレセイン、リサミンおよびＣｙ５、ならびにコンビナトリアル標識としてのＤＥＡＣ）、ならびに化学的な標識を使用するプローブに対する色コードの直接的な結合を達成するためにプローブの酵素的標識およびプローブ混合を使用して２４個のヒト染色体で実証されている。後者の場合、ＤＥＡＣ、Ｃｙ３およびＣｙ５は１次蛍光体として作用し、フルオレセインまたは誘導体は２元的な標識として使用された。
【００９９】
手順：
Ｉ．ヒト染色体の多色ＦＩＳＨ染色
ヒト中期染色体の調製をＷｉｅｇａｎｔ他（１９９３）によって記載されているように行った。正常なヒト個体ならびにインビトロ培養されたＪＶＭ−２細胞から得られた染色体を使用した。すべての染色体に対するプローブをＣｙｔｏｃｅｌｌ（英国）から得た。すべてのプローブＤＮＡをＤＯＰ−ＰＣＲによって増幅して、２４個のヒト染色体のすべてに対する１組の標識プローブを作製した。
【０１００】
ＩＩ．プローブの酵素的標識
すべてのプローブを、フルオレセイン−ｄＵＴＰ、ジゴキシゲニン−ｄＵＴＰ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ドイツ）、リサミン−ｄＵＴＰ（ＮＥＮ  ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、米国）またはＣｙ５−ｄＵＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ、英国）を使用してＰＣＲまたはニックトランスレーションのいずれかで標識ｄＵＴＰを取込ませることによって蛍光標識した。ジゴキシゲニンで標識されたプローブは、ジエンチルアミノクマリン（ＤＥＡＣ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、米国）を使用して間接的に検出された。
【０１０１】
ＩＩＩ．ＵＬＳ（ユニバーサル結合システム）を使用するプローブの化学的標識
ジゴキシゲニン−ＵＬＳ（ＤＩＧ−ＵＬＳ）で標識されたプローブを明らかにするために、ＤＥＡＣ−ＵＬＳ、Ｃｙ３−ＵＬＳおよびＣｙ５−ＵＬＳを１次蛍光体として選び、そしてフルオレセインをコンビナトリアル第４標識として選んだ。下記の方法を使用して、ＵＬＳで標識されたプローブの組を標識して分離した：
最初に、染色体２，４，６，８，１０，１２，１４，１６，１８，２０，２２およびＸに対する染色体特異的標識プローブ（１００〜４００ｎｇ）を、製造者の説明書に従ってＤＩＧ−ＵＬＳを用いて１つの反応で標識した。その後、このプローブ組を製造者の説明書に従ってＱｉａｇｅｎクイックスピンカラム（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ、米国）で精製した。標識されたプローブ混合物を、１００μｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ（ｐＨ８．５）を使用してＱｉａｇｅｎカラムから溶出した。
【０１０２】
次に、すべての染色体特異的染色プローブを、表２に従って、１００μｌの水の最終容量においてＤＥＡＣ−ＵＬＳ（２６．７μＭ）、Ｃｙ３−ＵＬＳ（２０μＭ）およびＣｙ５−ＵＬＳ（１３．３μＭ）を使用して、３０μｌの列記されたＵＬＳ化合物（またはその混合物）を１ｍｇの染色体特異的標識プローブＤＮＡと混合することによって蛍光標識した。プローブが２つの異なるＵＬＳ化合物の混合物で標識される場合、ＵＬＳ化合物を、所望する割合で最初に混合し、その後、プローブＤＮＡを加えた。６５℃で１５分間インキュベーションした後、標識されたプローブをＱｉａｇｅｎクイックスピンカラム（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ、米国）で精製した。標識されたプローブを、１００μｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ（ｐＨ８．５）を使用してＱｉａｇｅｎカラムから溶出した。ハイブリダイゼーションする前に、蛍光ＵＬＳ標識プローブを、表２の右欄に示されている量で、最初の工程からのＤＩＧ−ＵＬＳ標識されたプローブ混合物の１００μｌと一緒にした。次いで、このプローブ混合物を、１０ｘ過剰の低分子量サカナ精子ＤＮＡ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）および３ｘ過剰のヒトＣoｔ１  ＤＮＡ（Ｇｉｂｃｏ、ＢＲＬ）の存在下でエタノール沈殿した。その後、プローブ混合物を１０μｌの５０％脱イオン化ホルムアミド、２ｘＳＳＣ、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７）、１０％デキストラン硫酸に溶解した。プローブ混合物のこの１０μｌをハイブリダイゼーション溶液として使用した。
【０１０３】
ＩＶ．ヒト中期染色体のＦＩＳＨ染色
中期染色体を有するスライドガラスをＷｉｅｇａｎｔ他（１９９１）に従ってＲＮａｓｅＡおよびペプシンで前処理した。染色体調製物を、ホットプレートで、６０％ホルムアミド、２ｘＳＳＣ（ｐＨ７）において８０℃で９０秒間インキュベーションすることによって変性した。カバーガラスを除いた後、スライドガラスをエタノール系列で脱水し、風乾した。次いで、１０μｌのハイブリダイゼーション混合物を１８ｘ１８ｍｍのカバーガラス下で加え、ゴムセメントで封じ、ハイブリダイゼーションを恒湿容器において３７℃で１２０時間行った。ハイブリダイゼーション混合物には、５０％ホルムアミド、２ｘＳＳＣ、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７）、１０％デキストラン硫酸、１００ｎｇ〜５００ｎｇのそれぞれのＤＥＡＣ標識プローブ、Ｃｙ３標識プローブおよびＣｙ５標識プローブ（単標識プローブおよび比例的標識プローブの両方）（表２参照）、１００ｎｇ〜４００ｎｇの各ＤＩＧ−ＵＬＳ標識プローブ、３ｘ過剰のヒトＣoｔ１  ＤＮＡ、および１０ｘ過剰の低分子量サカナ精子ＤＮＡが１０μｌに含まれた。加える前に、プローブを８０℃で１０分間変性し、その後、３７℃で６０分間インキュベーションして、３倍過剰のＣoｔ１  ＤＮＡとプレアニーリングさせた。
【０１０４】
２ｘＳＳＣ／０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０において３７℃で１０分間のハイブリダイゼーション後の洗浄を行った後、カバーガラスを除くために、スライドガラスを、４４℃において、５０％ホルムアミド、２ｘＳＳＣ（ｐＨ７）で５分間、２回洗浄した。この後、６０℃において０．１ｘＳＳＣで２回の洗浄（それぞれ５分）を行い、そしてＲＴにおいてＴＮＴ（０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０）で５分間洗浄した。ＤＩＧ−ＵＬＳ標識されたプローブを、ジゴキシンに対するマウスモノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ）を用い、その後、ウサギ抗マウス抗体結合ＦＩＴＣ（Ｓｉｇｍａ）を用いて検出した。
染色体をＤＡＰＩで対比染色した。スライドガラスをＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（酵素的に標識されたプローブを使用した場合）またはＣｉｔｉｆｌｕｏｒ（Ａｇａｒ、Ｓｔａｎｓｔｅｄ、英国）（化学的に標識されたプローブを使用した場合）に包埋し、その後、顕微鏡評価した。
【０１０５】
Ｖ．デジタル画像化顕微鏡
デジタル蛍光画像化を、１００Ｗの水銀アーク灯と、ＨＱ−ＦＩＴＣフィルター、Ｐｉｎｋｅｌ組＋ＳＰ５７０フィルター、ＨＱ−Ｃｙ３フィルター、ＨＱ−Ｃｙ５フィルターおよびＤＥＡＣフィルター（Ｃｈｒｏｍａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）をそれぞれ使用して、ＤＥＡＣ、フルオレセイン、Ｃｙ３およびＣｙ５を可視化するための励起フィルターおよび発光フィルターを有するコンピューター制御のフィルター盤とを備えたＬｅｉｃａ  ＤＭ−ＲＸＡエピ蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ、Ｗｅｔｚｌａｒ、ドイツ）を使用して行った。ＤＡＰＩを、ブロックＡを使用してＵＶ光で励起した。６３ｘの対物鏡（Ｎ．Ａ．１．  ３２、ＰＬ  ＡＰＯ、Ｌｅｉｃａ）を使用した。
【０１０６】
画像取得および分析をＣｙｔｏｖｉｓｉｏｎワークステーション（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｉｍａｇｉｎｇ、Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ、英国）で行った。このシステムは、Ｃｏｏｌｖｉｅｗカメラ（Ｐｈｏｔｏｎｉｃ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）に接続されたＰＣ（Ｐｅｎｔｉｕｍ１３３ＭＨｚプロセッサー、２４Ｍｂ  Ｒａｍ、２．１Ｇｂディスクおよび１７”ディスプレー）からなる。カメラは熱電冷却を有し、これにより約３０秒までの積算をチップ上で行うことができる。画像は、８ビットの７６８ｘ５１２画像形式で数値化される。
【０１０７】
染色体をＤＡＰＩ画像の閾値処理により対話的にセグメント化した。セグメント化画像を着色画像用のマスクとして使用した。これは、比例的に標識された蛍光色素と相応する３つの画像（ＤＥＡＣに対する緑、Ｃｙ３に対する赤、およびＣｙ５に対する青）と、フルオレセイン画像とから構成された。この手順は３色の閾値処理を必要としないことに留意されたい。第４のフルオレセイン画像を２値的に評価した。すなわち、フルオレセインの蛍光を有する染色体またはフルオレセインの蛍光を有しない染色体を区別した。これは、ＤＡＰＩマスク内に位置する画素に対するフルオレセイン画像のヒストグラムにおいて最適な閾値を見出すことによって行った。典型的には、２つのガウス分布が、フルオレセイン陽性染色体およびフルオレセイン陰性染色体に対応して認められた。
【０１０８】
分類を２段階で行った。染色体の分類を、偶発的な転座を検出するために画素分類に従った。染色体の分類は、図１に示されているように、各染色体の色モード値、例えば、色三角形の１つにおけるその位置（２元的標識を有するものあるいは２元的標識を有しないもの）に主に基づいた。したがって、すべての染色体クラスの理論的な予想比例色に対する１つの染色体の測定された色モード値の最短距離が計算された。非特異的な蛍光の寄与を補償するために、そして方法の確実性を増大させるために、理論的な予想色値を、１つだけの比例色を有する染色体の測定されたモード値によって形成される三角形にひずませた。色モード値に加えて、染色体の長さもまた分類のために使用した。理論的には、染色体の色値は、元のプローブ割合に相応するはずである。しかし、実際には、多数の中期染色体が分類者の訓練のために使用された場合、より確実な方法が得られる。対象物を分類した後、染色体内の各画素を、測定された染色体クラスに対する最短距離に基づいて分類した。各画素の２元的（第４の色）の情報を使用して、どの色三角形の距離計算を行うべきかを決定した。分類色を割り当てることはかなり有用であり、予想されるが、現在のソフトウエアでは実施されなかった。
【０１０９】
最後に、カリオグラムを、上記に記載されているように、比例色を示す染色体分類に基づいて作製した。仮の色が、それぞれの異なる染色体画素の対応する染色体クラスに割り当てられたカリオグラムを、染色体転座の対話式による検出が容易になるように作製した。必要な場合には、ＤＡＰＩバンド形成画像を比較のために使用した。
【０１１０】
結果：
４つの蛍光体を使用する２４色のＣＯＢＲＡ染色法を、正常な染色体および異常な染色体に適用した。プローブを標識する最適な条件、およびプローブ組の最終的な組成は、いくつかのプローブは他のプローブよりも良好に作用するという事実のために若干の微調整を必要とした。典型的には、あまり機能しないＦＩＳＨプローブは、他のプローブとの色の重なりを最小限にするような色の組合せをもたらした。
【０１１１】
最適な染色結果が、延長したハイブリダイゼーション時間（５日）で得られたが、多くの場合、３日で十分であった。反復配列の抑制が、染色体の選択的な染色に必須であることが見出された。
【０１１２】
図２は、２４個の染色体が色空間をどのように占めているかを示している。典型的には、特定の染色体画像において、シグナル強度は、ＦＩＳＨ強度が局所的に異なるために比較的大きな変化を示した。しかし、特徴的な色は、３Ｄ色空間において規定された角度でクラスターを形成するには十分に一定していた（図２）。いくつかの染色体クラスターは重なりを示したが、それらは、上記に記載された手順を使用して自動的に分類するためには十分に分離された。
【０１１３】
図３は、実際の染色体画像と得られたカリオグラムとを示す。積算時間は、使用された蛍光体に依存して変化し、０．５秒〜２０秒の範囲であった。Ｃｏｂｒａ取得および分析手順の全体は、典型的には約１分を要した。
【０１１４】
ＪＶＭ細胞株において示されるように異常な染色体に適用された場合、ＣＯＢＲＡにより、異常な染色体を容易に検出することができた（図４）。ＵＬＳ法において必須なものは、原理的には、各プローブ分子が、混合することを不用にする比例コードを含有するということである。ＤＥＡＣ、Ｃｙ３およびＣｙ５の比例的な標識は優れた性能を示し、２元的なフルオレセイン標識と十分に組合わせることができる。これらのプローブを用いて得られた結果を図５に示す。
【０１１５】
ＣＯＢＲＡの確実性は、ギムザバンド形成染色体およびＦＩＳＨ染色染色体の両方の自動分析の場合に当てはまるように、得られた中期染色体の性状に依存した。良好な性状のスライドガラスは、自動的に分類することができる良好なシグナル対ノイズ比の画像を常にもたらし、これに対して、染色性状が低下するにつれて、使用者の介入が増大した。
【０１１６】
ＣＯＢＲＡの原理は、比例的な標識および２元的な標識の利点を併せ持つ。それは、２つの蛍光体の様々な割合を作製するために「決定」するだけであるが、２元的な決定のみを必要とする間接的に標識されたハプテンを導入することによって色の数を倍増させる可能性を利用する。示されているように、この方法は実施可能であり、４つの蛍光体のみを使用して２４個のヒト染色体を同定することができる。
【０１１７】
この方法のすべての可能性はまだ調べられていない。これまで、標識用プローブのみがＣＯＢＲＡにおいて使用された。暴露時間が短いことを考慮すれば、本発明者らは、ＹＡＣまたはＰＡＣなどの他のタイプのプローブが類似する方法で使用できることを確信する。
【０１１８】
数式が示しているように、色の数は、より多くの色素、またはより多くの割合が原色セットに使用された場合に特に増大する。割合が６または７である２つの色素を区別することが可能であることが示されている。
【０１１９】
そのような方法は、化学的な標識が使用された場合に最も良く達成可能である。ＵＬＳは、性状が制御された標識用プローブの大量生産に好都合である。これに関連して、蛍光体の効率的に使用に関するＣＯＢＲＡ法は、ＭＦＩＳＨ多様性のさらなる増大に大きく寄与し、それにより細胞遺伝学におけるさらなる利用に寄与し得る。
【０１２０】
実施例１４：反復を含まない染色体全域プローブを用いたＣＯＢＲＡ
本実施例において、ＣＯＢＲＡ原理の一局面が、ｍＦＩＳＨ適用においてｔｒａｎｓ−ＵＬＳ標識のプローブを用いて実施される。本実施例において、本発明者らは、本質的には、実施例７に記載された実験を繰り返した。
【０１２１】
反復配列を除いたヒトの第１染色体および第８染色体に特異的なプローブを作製するために、ＤＯＰ−ＰＣＲを、実施例２に記載されている手順に従ってヒトの第１染色体調製物および第８染色体調製物に対して行った。
【０１２２】
反復配列の増幅が、３’ヒドロキシ基を有さないｔｒａｎｓ−ＤＤＰ標識の相補的な反復ヌクレオチド配列によって阻止された。プローブの標識は、実施例４におけるＵＬＳを使用するプローブの化学的な標識において記載されているとおりであった。第８染色体に特異的なプローブはＣｙ３−ＵＬＳおよびＣｙ５−ＵＬＳ（５０：５０）で比例的に標識され、かつｄＧＲＥＥＮ−ＵＬＳでコンビナトリアル標識された。第１染色体に特異的なプローブはＣｙ３−ＵＬＳおよびＣｙ５−ＵＬＳ（５０：５０）で比例的に標識された。
【０１２３】
中期染色体展開物を有するスライドガラスを調製し、実施例４におけるヒト中期染色体のＦＩＳＨ染色に記載されている手順に従ってＦＩＳＨ染色した。結果を図１０に示す。
【０１２４】
ｔｒａｎｓ−ＵＬＳプローブを使用した場合、最適な染色結果が、例えば実施例４における非ｔｒａｎｓ−ＵＬＳプローブと比較して、驚くべきほど短いハイブリダイゼーション時間の後で得られた。
【０１２５】
一晩のハイブリダイゼーションは、多くの場合、染色に十分であったが、これに対して、実施例４の場合のように、非ｔｒａｎｓ−ＵＬＳによるＦＩＳＨ技術の場合には、数日のハイブリダイゼーション時間が最適である。ＣＯＢＲＡ標識は、プローブとの一晩のハイブリダイゼーションの後に中期展開物における第１染色体および第８染色体の明瞭で確かなタイプ決定を可能にした。
【０１２６】
実施例１５：ＣＯＢＲＡに基づくタンパク質の標識
核酸のＣＯＢＲＡ標識および検出と類似して、ＣＯＢＲＡ法は、利用できる標識の数が（調べようとするタンパク質の数よりも少ない）限られる場合でさえ、多くのタンパク質を同時に検出できる可能性を提供する。生物有機分子を標識する際のＵＬＳ標識技術の適用性が広いことは重要である。本実施例は、タンパク質を標識する際にＵＬＳ標識が問題なく使用されることを明らかにし、そしてタンパク質をＣＯＢＲＡ標識して検出することを原理的に示している。
【０１２７】
本実施例において検出しようとするタンパク質はアビジンおよびウシ血清タンパク質（ＢＳＡ）である。
これらの２つのタンパク質を、生理学的条件の水溶液においてＵＬＳ標識で単標識および多重標識した。
【０１２８】
タンパク質が標識される標識は、Ｆｌｕ−ＵＬＳ（フルオレセイン）、ＤＮＰ−ＵＬＳ（ジニトロフェノール）およびＤＩＧ−ＵＬＳ（ジゴキシゲニン）である。比例的な標識に使用される標識はＦｌｕおよびＤＮＰであった。ジゴキシゲニンは２元的な標識であった。
様々な標識溶液の作製を下記にように行った。
【０１２９】
ＵＬＳ自体によるタンパク質を標識することに関するコントロールとして役に立つアビジンまたはＢＳＡを単標識する場合、標識は、Ｆｌｕ−ＵＬＳ、ＤＮＰ−ＵＬＳまたはＤＩＧ−ＵＬＳのいずれかの１ｍｇ／ｍｌからなった。
【０１３０】
比例的な標識の場合、標識は、１：１の比で混合されたＦｌｕ−ＵＬＳおよびＤＮＰ−ＵＬＳからなった。
比例的−２元的な混合標識の場合、標識混合物は、等モル量の比例的な標識＋２元的な標識（ＤＩＧ−ＵＬＳ）からなった。
【０１３１】
タンパク質を下記の記載に従って標識とインキュベーションした。
各タンパク質（０．５ＰＢＳにおいて２μｇ／μｌ）を、５０μｌのタンパク質溶液を、０．５ｘＰＢＳにおいて下記の標識が１ｍｇ／ｍｌの保存溶液の５０μｌと混合することによって標識した：
・Ｆｌｕ−ＵＬＳ、ＤＮＰ−ＵＬＳまたはＤＩＧ−ＵＬＳのいずれかの１つの標識
・比例的な標識（Ｆｌｕ−ＵＬＳ：ＤＮＰ−ＵＬＳ）
・比例的−２元的な標識（Ｆｌｕ−ＵＬＳ：ＤＮＰ−ＵＬＳ＋ＤＩＧ−ＵＬＳ）
標識を３７℃で１時間行った。ＵＬＳで標識されたタンパク質をニトロセルロースメンブラン上にスポットした。標識されたタンパク質を含有する溶液を数枚の細片にスポットした（スポットあたり１ｕｌ）。次に、スポットを風乾し、続いてフィルターを、製造者の説明書に従って、マレイン酸緩衝液におけるブロッキング液（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍの１ｘブロッキング培地、カタログ番号：１５８５７６２）中で１５分間ブロッキングした。次に、フィルターを、同じブロッキング液、１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ、およびアルカリホスファターゼ（ＡＰ）標識抗体を含む溶液中でインキュベーションした。使用した抗体は、アルカリホスファターゼで標識されたジゴキシゲニン特異的抗体（ヒツジ抗ジゴキシゲニン−ＡＰ；１：５０００；Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ  １０９３２７４）、ジニトロフェノール特異的抗体（ウサギ抗ＤＮＰ−ＡＰ；１：１０００；Ｓｉｇｍａ  Ｄ５１０３）、およびフルオレセイン特異的抗体（ヒツジ抗フルオレセイン−ＡＰ、１：５０００；Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ  １４２６３３８）である。このインキュベーションを室温で３０分間行った。次に、フィルターをＴＮＴ緩衝液で５分間３回洗浄し、その後、水でそれぞれ２分間２回洗浄した。ＡＰに関するＮＢＴ／ＢＣＩＰ検出システムを製造者の説明書に従って適用した。ＡＰ反応を暗所において室温で１６時間行った。フィルターをＴＥ緩衝液で１５分間１回洗浄することによって、反応を停止させた。
【０１３２】
結果を表３に示す。
表３の列１〜４に一緒にされているＡｖ−Ｆｌｕ欄は、Ｆｌｕ−ＵＬＳで標識され、ＡＰ標識抗体で検出されたアビジンの結果を示している。それらのスポットのみが、ＡＰ抗Ｆｌｕが存在する場合に明かな陽性シグナルを示した。このことは、アビジンがＦｌｕ−ＵＬＳで問題なく標識されたことを実証している。
【０１３３】
まとめると、そして同様な様式で、表３は、アビジンおよびＢＳＡはともに、上記に記載されているように異なる標識で標識できることを示している。また、これらのタンパク質は、様々なＵＬＳ標識で同時に標識することができる。本実施例では、この２つのタンパク質を、その比例的な標識だけに基づいて互いに区別することができない（表３、列３および７）。
１つのタンパク質を２元的な様式で標識することにより、この２つのタンパク質を区別することができるようになった（表３、列４および９）。
【０１３４】
表３は、両方のタンパク質が異なるＵＬＳ標識で標識することができること、およびＣＯＢＲＡ標識をタンパク質に問題なく適用できることを示している。
【０１３５】
あるいは、ＣＯＢＲＡの原理に従って標的されたタンパク質の同時検出が、標識に特異的な検出システムを使用することによって可能になり得る。ＣＯＢＲＡ標識の原理は標的分子のタイプに依存しないことに留意されたい。
【表１】
0004838937.tif 000002
【表２】
0004838937.tif 000003
【表３】
0004838937.tif 000004
0004838937.tif 000005
【図面の簡単な説明】
【図１】  ＣＯＢＲＡの原理を示す図である。１２の比例的な色の第１の組は、独立した２元的な標識が導入される毎に倍になり、その結果、１個のハプテンの場合には２４色は生じ、２個のハプテンの場合には４８色が生じる。
【図２】  ＣＯＢＲＡ原理を使用してヒト染色体が２４色で染色されたことを示す図である。
２４個の染色体のそれぞれについて、蛍光強度を三次元の色空間においてプロットした。それぞれの着色ドットは、特定の染色体の画像点（画素）の測定された色強度を表す。
（ａ）：２元的なＤＥＡＣ標識を伴わない３つの原色（フルオレセイン、リサミン、Ｃｙ５）；
（ｂ）：２元的なＤＥＡＣ標識を伴う３つの原色（同上）。
図１は、この図に示される測定データの等しいｘ値、ｙ値、ｚ値で認められる２ｘ１２クラスターの概略的な上面図であることに留意すること。
【図３】  ２４色でＣＯＢＲＡにより標識された正常なヒト染色体を示す図である（図２と同じデータ）。
（ａ）比例的な標識において使用された３つの１次色素から得られる画像（１２色）；
（ｂ）同じ中期細胞のＤＥＡＣ像；
（ｃ）像（ａ）および（ｂ）の組合せから得られるカリオグラムおよび自動分類
【図４】  転座ｔ（１１，１４）、ｔ（３，８）およびｔ（１，１５）を示すＪＶＭ細胞株（Ｂ前リンパ球白血病）に適用されたＣＯＢＲＡ（２４色）を示す図である。
【図５】  化学的な標識（ＵＬＳシステム）を使用して得られた比例的標識の結果を示す図である。蛍光色素ＤＥＡＣ、Ｃｙ３およびＣｙ５を比例的な標識の１次標識として使用した。１２個のプローブのＤＩＧ−ＵＬＳ標識された第２の組が、フルオレセイン標識の免疫結合体を使用して間接的に明らかにされた。
（ａ）比例的な標識に使用される３つの１次色から得られる像（１２色）；
（ｂ）２元的な（第４）標識の像（フルオレセイン、しかし青色の偽色で示される）；
（ｃ）染色体のフルオレセイン陽性組およびフルオレセイン陰性組を同定するために閾値処理された像（ｂ）；ＤＥＡＣは、この場合（ＵＬＳによる）直接的なプローブ標識として使用され、これに対して、図２，３および４では、（免疫結合体としての）２元的な標識として使用されていることに留意すること。
【図６】  内部のｔｒａｎｓ−ＵＬＳ標識オリゴヌクレオチドによるＰＣＲの阻止を示す図である。順方向プライマーおよび逆方向プライマーを用いたＤＮＡフラグメントのＰＣＲ（レーン１）が、標的ＤＮＡを４つの内部オリゴヌクレオチドでプレハイブリダイゼーションすることによって阻害され（レーン２）、内部オリゴヌクレオチドがｔｒａｎｓ−ＵＬＳで標識された場合には完全に阻止された（レーン３）。
【図７】  反復を含まないヒト第１染色体特異的プローブを用いたＦＩＳＨを示す図である。図７Ａは、ヒト第１染色体プローブを用いたヒト中期展開物プローブのＦＩＳＨ像を示す。ヒトＣoｔ１  ＤＮＡを使用しなかった。第１染色体の同定を困難にするヒトゲノムの片方に存在する他の染色体が非特異的に大きく染色されていることに注意すること。第１染色体特異的プローブに存在する反復配列の低下した非特異的な交差ハイブリダイゼーションが、５倍過剰のヒトＣoｔ１  ＤＮＡでプローブを（３７℃で１時間）プレアニーリングすることによって得られた。第１染色体を容易に同定することができる（図７Ｂ）。ｔｒａｎｓ−ＵＬＳの使用により高頻度反復配列が除かれた第１染色体特異的標識プローブは、ヒトゲノムの片方に存在する他の染色体の中で、ヒトＣoｔ１  ＤＮＡを使用することなく第１染色体の確かな同定を可能にした。
【図８】  ｔｒａｎｓ−ＵＬＳ技術を使用する、ＨＰＶ４５プローブにおけるＨＰＶ１８を除いた相同的配列のフィルターハイブリダイゼーション分析を示す図である。ビオチン末端標識およびｔｒａｎｓ−ＵＬＳ標識を行った超音波処理ＨＰＶ１８  ＤＮＡを、ＤＩＧ−ＵＬＳ標識のＨＰＶ４５  ＤＮＡと前もって結合させる。その後、ビオチン標識のＨＰＶ１８−ＨＰＶ４５ハイブリッドを、ストレプトアビジン磁気ビーズを使用してプローブ混合物から除く。ハイブリダイゼーションの検出を、αＤＩＧ−ＡＰ抗体をＣＤＰ−ＳｔａｒTMと組合わせて使用して行う。
レーン１：スポットされたゲノムＨＰＶ４５における、非標識の超音波処理ＨＰＶ１８  ＤＮＡと前もって結合させたＤＩＧ−ＵＬＳ標識のＨＰＶ４５プローブのハイブリダイゼーション；
レーン２：スポットされたゲノムＨＰＶ４５における、ビオチン末端標識およびｔｒａｎｓ−ＵＬＳ標識を行ったＨＰＶ１８と前もって結合させたＤＩＧ−ＵＬＳ標識のＨＰＶ４５プローブのハイブリダイゼーション；
レーン３：スポットされたゲノムＨＰＶ１８における、ビオチン末端標識およびｔｒａｎｓ−ＵＬＳ標識を行ったＨＰＶ１８と前もって結合させたＤＩＧ−ＵＬＳ標識のＨＰＶ４５プローブのハイブリダイゼーション。
【図９】  ビオチン化した相補的なオリゴヌクレオチドを用いたオリゴヌクレオチド混合物プローブのフィルターハイブリダイゼーション分析を示す図である。
レーン１：スポットされたオリゴヌクレオチドに対してハイブリダイゼーションさせたビオチン標識の相補的なオリゴヌクレオチド混合物；
レーン２：５倍過剰のオリゴヌクレオチドと前もって結合させ、かつスポットされたオリゴヌクレオチドに対してハイブリダイゼーションさせたビオチン標識の相補的なオリゴヌクレオチド混合物；
レーン３：５倍過剰のｔｒａｎｓ−ＵＬＳ標識されたオリゴヌクレオチドと前もって結合させ、かつスポットされたオリゴヌクレオチドに対してハイブリダイゼーションさせたビオチン標識の相補的なオリゴヌクレオチド混合物；
レーン４：１０倍過剰のオリゴヌクレオチドと前もって結合させ、かつスポットされたオリゴヌクレオチドに対してハイブリダイゼーションさせたビオチン標識の相補的なオリゴヌクレオチド混合物；
レーン５：１０倍過剰のｔｒａｎｓ−ＵＬＳ標識されたオリゴヌクレオチドと前もって結合させ、かつスポットされたオリゴヌクレオチドに対してハイブリダイゼーションさせたビオチン標識の相補的なオリゴヌクレオチド混合物；
【図１０】  反復を含まない染色体全域プローブによるＣＯＢＲＡを示す図である。反復配列を除き、本発明に従ってＣＯＢＲＡ標識された第１染色体および第８染色体に特異的なヒト染色体標識は、ヒト中期染色体展開物に対するプローブであった。ヒトＣoｔ１  ＤＮＡを使用しなかった。第１染色体および第８染色体をＣｙ３−ＵＬＳおよびＣｙ５−ＵＬＳで比例的に標識したが、第１染色体のみを２元的に標識した（ｄＧＲＥＥＮ−ＵＬＳ）。この２つの染色体は同じ比例的な標識（Ｃｙ３およびＣｙ５）および割合（５０：５０）を有するが、２元的な標識により、この２つの染色体を互いに識別することが可能になった。
【図１】
0004838937.tif 000006
【図２】
0004838937.tif 000007
【図３】
0004838937.tif 000008
【図４】
0004838937.tif 000009
【図５】
0004838937.tif 000010
【図６】
0004838937.tif 000011
【図７】
0004838937.tif 000012
【図８】
0004838937.tif 000013
【図９】
0004838937.tif 000014
【図１０】
0004838937.tif 000015