(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Rhizopus azygosporus菌を培地中で培養し、培養物を形成すること、及びキトサン又はキチンを前記培養物から分離することを含むキトサン又はキチンを生産する方法。
【請求項２】
菌細胞を培養物から分離することを更に含み、キトサン又はキチンが前記分離された菌細胞から分離される請求項１の方法。
【請求項３】
前記培地が、５ないし６０ｇ／Ｌのコーンスティープリカーを含有する請求項２の方法。
【請求項４】
前記培地が、３０ｇ／Ｌのコーンスティープリカーを含有する請求項３の方法。
【請求項５】
前記培地が、１０〜１００ｇ／Ｌのグルコース及び０．０１ないし３０ｇ／Ｌの硫酸アンモニウムを更に含有する請求項３の方法。
【請求項６】
前記培地が、３０ｇ／Ｌのコーンスティープリカー、５０ｇ／Ｌのグルコース、及び２．５ｇ／Ｌの硫酸アンモニウムを含有する請求項５の方法。
【請求項７】
前記培地が、５ないし６０ｇ／Ｌのコーンスティープリカー、１０〜１００ｇ／Ｌのグルコース、及び０．０１ないし３０ｇ／Ｌの硫酸アンモニウムを含有する請求項１の方法。
【請求項８】
前記培地が、３０ｇ／Ｌのコーンスティープリカー、５０ｇ／Ｌのグルコース、及び２．５ｇ／Ｌの硫酸アンモニウムを含有する請求項７の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
発明の背景
キチンは、高不溶性の、β−（１，４）−Ｄ−グルコサミンのＮ−アセチル化ポリマーである。キトサンは、酸可溶性の、キチンの脱アセチル化体である。キチン、キトサン及びそれらの誘導体は、粘度調節剤、接着剤、クロマトグラフィー担体、紙増強剤、凝集剤、食品添加物、薬剤及び化粧品製品を含む多くの産業上の適用に用いられている。
【０００２】
キチンは、カニ又はエビ殻の脱石灰化及び脱蛋白質化により製造され得る。キトサンは、その後、熱アルカリ溶液によるキチンの脱アセチル化により得られる。このキトサン生産プロセスは、多くの望ましくない特徴を有する。例えば、高価な熱エネルギー、及び潜在的に健康に有害である苛性アルカリを必要とする。このプロセスは、廃棄物も大量に生産するため、かなりの廃棄コストを必要とする。さらに、エビ又はカニ殻の供給が、季節及び環境要因に高く依存し、予想し得ない生産能力の制限が導かれる。
【０００３】
【課題を解決するための手段】
発明の概要
本発明は、Actinomucor taiwanensis菌及びRhizopus azygosporus菌から、予想外に高収量のキトサン及びキチンが生産され得るという発見に基づくものである。
【０００４】
すなわち、本発明は、（１）Rhizopus azygosporus菌又はActinomucor taiwanensis菌を培地中で培養し、培養物を形成し、及び（２）細胞からキトサン又はキチンを分離することによりキトサン又はキチンを生産する方法を特徴とする。例えば、キトサン及びキチンは、培地から菌細胞を分離し、分離した細胞からキトサン又はキチンを分離することができる。
【０００５】
本発明には、（１）Mucoraceae科の菌を本発明の方法において有用な倍地中で培養し、培養物(culture)を形成し、及び（２）キトサン又はチンを菌培養物から分離することによりキトサン又はキチンを生産する方法も含まれる。
【０００６】
本発明の方法のために有用な培地には、約５ないし６０ｇ／Ｌ（例えば、約３０ｇ／Ｌ）のコーンスティープリカー、約１０〜１００ｇ／Ｌ（例えば、約５０ｇ／Ｌ）のグルコース、約０．０１ないし３０ｇ／Ｌ（例えば、約２．５ｇ／Ｌ）の硫酸アンモニウム又は他の好適な成分が含まれ得る。
【０００７】
本発明の方法は、Rhizopus azygosporus又はActinomucor taiwanensis菌を含有する培養物から驚くべきほどに高収量のキトサン又はキチンの生産量を可能にする。さらに、コーンスティープリカー、グルコース、酵母抽出物及び硫酸アンモニウムを含有する培地は、菌培養物からのキチン及びキトサンの産出を高め得ることが見出された。したがって、本発明の方法は、環境に有害な化学物質又は甲殻類動物収穫の多くの変動に依存することなく、キチン及びキトサンを生産する代替法を提供するものである。
【０００８】
本発明の他の特徴又は利点は、以下の詳細な説明から、さらには、特許請求の範囲からも明らかになるであろう。
【０００９】
【発明の実施の形態】
発明の詳細な説明
本発明は、Mucoraceae科に属する菌培養物からキトサン及びキチンを高収量に生産することに関する。
【００１０】
本発明の方法に有用な、具体的な菌には、Rhizopus azygosporus及びActinomucor taiwanensisが含まれる。これら両者の生物は、中華民国、台湾、Hsinchu 300, Shih-Ping Road, No. 331の食品産業及び研究開発協会（Food Industry and Research Development Institute）、カルチャーコレクション及び研究センター（Culture Collection and Research Center (CCRC)）から、求めに応じて入手可能である。R. azygosporusは、カタログ番号第CCRC31158号として、及びA. taiwanensisは、カタログ番号第CCRC31159号として入手可能である。
【００１１】
菌を培養するための手順は、当技術において周知である。例えば、ＹＭ寒天に菌を植えることができ、菌を植えた寒天は、２５℃ないし３７℃で３ないし６日間培養することができる。菌から得られた胞子を液体中に懸濁し、１０4ないし１０7ｃｆｕ／ｍｌストックを達成する。このストックを発酵培地に直接植える。
【００１２】
発酵培地は、開始ｐＨ３ないし８を有し、１０ないし１００ｇ／Ｌの炭素源（例えば、グルコース、蔗糖、コーンスターチ、糖蜜又は大豆油）、５ないし６０ｇ／Ｌの窒素源（例えば、大豆粉、ペプトン、またはコーンスティープリカー）、０．５ないし２０ｇ／Ｌの酵母抽出物、０．０１ないし３０ｇ／Ｌの（ＮＨ4）2ＳＯ4、０ないし３ｇ／ＬのＫ2ＨＰＯ4、０ないし３ｇ／ＬのＮａＣｌ、０ないし１５ｇ／ＬのＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ及び／又は０ないし０．３ｇ／ＬのＣａＣｌ2を含有することができる。菌は、追加の２ないし４日間発酵培地中で成長することができる。
【００１３】
キトサンは、標準の方法により、菌胞子から分離及び精製することができる。例えば、McGahrenらの、Process Biochem 19:88-90, 1984に記載されるようにして、アルカリ及び酸処理し、キトサンを分離することができる。キトサンを分離するための追加の詳細及び手順は、欧州出願第０５３１９９１  Ａ１；ヨコイらの、J Fermen Bioeng 85:246-249, 1998；米国特許第５，２３２，８４２号；レーン（Rane）らの、Food Biotech 7:11-33, 1993；及びハング（Hang）の、Biotech Lett 12：911−912、1990に見出すことができる。
【００１４】
一般的には、細胞塊を発酵ブロスから分離し、蒸留水で洗浄する。次いで、細胞を０．５ないし２ＮのＮａＯＨで処理し、アルカリ混合物を１２１℃で１５分間インキュベートする。次いで、固形物質を遠心によりペレット化し、蒸留水及びエタノールで洗浄する。洗浄した物質を２％酢酸溶液で処理し、９５℃で１２時間インキュベートする。次いで、得られたスラリーを遠心により分離し、酸可溶性の上澄み（キトサンを含有）、及び酸不溶性の沈殿（キチンを含有）が得られる。
【００１５】
２ＮのＮａＯＨで上澄みのｐＨを１０に調節することにより、キトサンが沈降する。最後に、キトサンを蒸留水で洗浄し、凍結乾燥する。酸不溶性の沈殿も、蒸留水で洗浄し、凍結乾燥する。この酸不溶性及びアルカリ不溶性画分が精製キチンである。
【００１６】
さらに詳細に説明するまでもなく、当業者は、上記開示及び以下の記載に基づいて本発明をその最大限の範囲まで利用し得ると信ずる。以下の例は、本発明を当業者がどのように実施することができるかを単に説明するものであると解されるべきであり、例以外の開示をいかなるようにも制限するものではないと解されるべきである。
【００１７】
以下の例の結果は、表２に要約され、これは、例の後に記載する。
【００１８】
【実施例】
例１
４日斜面培養物からのRhizopus azygosporusの胞子懸濁物を、新鮮な発酵培地１００ｍｌを含有する２５０ｍｌの振盪フラスコへ直接植えた。発酵は、２００ｒｐｍで振盪しながら、２８℃で４８時間行った。培地１リットルあたり、１０ｇの窒素源（大豆粉、ペプトン又はコーンスティープリカー）、２０ｇの炭素源（グルコース又はコーンスターチ）、１ｇの酵母抽出物、５ｇの（ＮＨ4）2ＳＯ4、１ｇのＫ2ＨＰＯ4、１ｇのＮａＣｌ、５ｇのＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ及び０．１ｇのＣａＣｌ2を含有していた。
【００１９】
細胞塊を発酵ブロスから回収し、１ＮのＮａＯＨにより１２１℃で１５分間処理した。アルカリ不溶性物質を２％酢酸中に懸濁し、混合物を９５℃で１２時間インキュベートし、キトサンを可溶化した。酸可溶性上澄みのｐＨを１０に調節することによりキトサンが沈殿した。次いで、キトサンを洗浄し、乾燥させ、秤量した。酸不溶性物質であるキチンも、洗浄し、乾燥させ、秤量した。収量は、培養物１リットルあたりのキチン又はキトサンのグラム数に換算して計算し、結果は表２に示した。キチン及びキトサンの最高収量は、コーンスターチ及びペプトンを含有する培地を用いて達成された。
【００２０】
例２
４日斜面培養物からのActinomucor taiwanensisの胞子懸濁を発酵培地１００ｍｌを含有する２５０ｍｌの振盪フラスコへ直接植えた。発酵、並びにキトサン及びキチンの分離は、例１に記載した通りに行い、結果を表２に示した。コーンスティープリカー及びグルコースを含有する培地を用いることにより、キチン及びキトサンの高い収量を達成した。
【００２１】
例３
上記例１に記載されるようにR. azygosporusを培養し、処理した。ただし、すべての培地は、窒素源としてペプトンを含有し、炭素源としては、グルコース、コーンスターチ、蔗糖、糖蜜及び大豆油の中から変化させた。この例では、コーンスターチの取り込みにより、キトサン及びキチンの両者について０．９ｇ／Ｌの高い収量が導かれる一方で、大豆油の取り込みにより、キチン１．５ｇ／Ｌの最高収量が導かれた（表２）。
【００２２】
例４
上記例２に記載されるようにA. taiwanensisを培養し、処理した。ただし、すべての培地は、窒素源としてコーンスティープリカーを含有し、炭素源は、グルコース、コーンスターチ、蔗糖、糖蜜及び大豆油の中から変化させた。この例では、炭素源としてグルコースを取り込むことにより、キトサン及びキチンの両者について最良の収量が導かれた（表２）。
【００２３】
例５
上記例１に記載されるようにR. azygosporusを培養し、処理した。ただし、各々の培地１リットルあたり３０ｇのコーンスティープリカー、５０ｇのグルコース、２ｇの酵母抽出物、２．５ｇの（ＮＨ4）2ＳＯ4、及び０．０５ｇのＣａＣｌ2を含有していた。この培養により、キトサンについて１．１ｇ／Ｌの高い収量が導かれた（表２）。
【００２４】
例６
上記例２に記載されるようにA. taiwanensisを培養し、処理した。ただし、各々の培地１リットルあたり３０ｇのコーンスティープリカー、５０ｇのグルコース、２ｇの酵母抽出物、２．５ｇの（ＮＨ4）2ＳＯ4、及び０．０５ｇのＣａＣｌ2を含有していた。この培養により、キトサン（１．７ｇ／Ｌ）及びキチン（１．１ｇ／Ｌ）の最高の組み合わせの収量が導かれた（表２）。
【００２５】
例７
例６に記載されるようにA. taiwanensisを培養し、処理した。ただし、ＣａＣｌ2の代わりに、培地１リットルあたり０．５ｇのＫ2ＨＰＯ4が含まれていた。この培養により、キトサンについて１．４ｇ／Ｌの高い収量が導かれた。
【００２６】
【表１】
0004708524.tif 000002
【００２７】
【表２】
0004708524.tif 000003
【００２８】
表２で用いられる略号は、以下の通り：「Ｒ．ａ．」は、Rhizopus azygosporusを意味し；「Ａ．ｔ．」は、Actinomucor taiwanensisを意味し；「Ｓ．Ｍ．」は、大豆粉を意味し；「Ｃ．Ｓ．Ｌ．」は、コーンスティープリカーを意味し；「Ｃ．Ｓ．」は、コーンスターチを意味し；「Ｓ．Ｏ．」は、大豆油を意味する。表２に記載されるすべての培地は、酵母抽出物を含有していた。
【００２９】
上記例１〜７の結果は、（１）A. taiwanensis及びR. azygosporusは、キチン及びキトサンのより優れた生産物であること、並びに（２）コーンスティープリカー、グルコース及び硫酸アンモニウムを含有する培地は、菌によるキチン及びキトサン生産の収量を高め得ることを示している。
【００３０】
他の態様
本発明を、その詳細な説明に関連して説明してきたが、先の記載は、説明することを意図するものであり、添付の特許請求の範囲の範疇により規定される本発明の範疇を制限することを意図するものではないことが理解されるべきである。他の側面、利点及び修飾は、本発明の範疇内である。