(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）（ｉ）グリセロール又はジオールデヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子であって、前記グリセロールまたはジオールデヒドラターゼが、dhaB1（配列番号１のヌクレオチド7044-8711）、 dhaB2（配列番号１のヌクレオチド8724-9308）、およびdhaB3（配列番号１のヌクレオチ9311-9736）；dhaB1（GenBank U30903のヌクレオチド3047-4714）、 dhaB2(GenBank U30903のヌクレオチド2450-2890)およびdhaB3（GenBank U30903のヌクレオチド2022-2447)；gldA（GenBank U60992のヌクレオチド121-1788）, gldB（GenBank U60992のヌクレオチド1801-2385）および gldC (GenBank U60992のヌクレオチド2388-2813)；dhaB（GenBank U09771のヌクレオチド8556-10223）, dhaC（GenBank U09771のヌクレオチド10235-10819）およびdhaE (GenBank U09771のヌクレオチド10822-11250); dhaB（GenBank AF051373のヌクレオチド84-1748）、 dhaC（GenBank AF051373のヌクレオチド1779-2318）および dhaE (GenBank AF051373のヌクレオチド2333-2773);またはpduC（GenBank AF026270のヌクレオチド3557-5221）、 pduD（GenBank AF026270のヌクレオチド5232-5906）およびpduE (GenBank AF026270のヌクレオチド5921-6442)によってコードされる配列を有する前記遺伝子；
（ｉｉ）グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子であって、前記グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼがGenBank Z74071x2、Z35169、U321643またはM20938に記載の配列を有する前記遺伝子；
（ｉｉｉ）グリセロール−３−ホスファターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子であって、前記グリセロール−３−ホスファターゼが配列番号５６に記載の配列を有する、前記遺伝子；及び
（ｉｖ）デヒドラターゼ再活性化因子をコードする少なくとも１つの遺伝子であって、前記デヒドラターゼ再活性化因子が、orfX（配列番号１のヌクレオチド4643-4996）およびorfZ（配列番号１の9749-11572)、 orf2b（GenBank U30903のヌクレオチド4762-7115）およびdhaB4 (GenBank U30903のヌクレオチド186-2009)、 orfX（GenBank U09771のヌクレオチド6180-6533）およびorfZ (GenBank U09771のヌクレオチド11261-13072)、 orfX （GenBank AF006034のヌクレオチド1-196）およびorfZ (GenBank AF051373のヌクレオチド2790-4598)、 pduH（GenBank AF026270のヌクレオチド8274-8645）およびpduG (GenBank AF026270のヌクレオチド6452-8284)またはddrB（GenBank AF017781のヌクレオチド2063-2440）およびddrA (GenBank AF017781のヌクレオチド241-2073)によってコードされる配列を有する前記遺伝子、
より成る１組の外因性遺伝子；ならびに
（ｂ）３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドを１，３−プロパンジオールに転換する活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの内因性yqh遺伝子を含む組換えＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）であって、１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードする機能性ｄｈａＴ遺伝子が存在しない、前記組換えＥ．コリ。
【請求項２】
（ａ）（ｉ）少なくとも１コピーのdhaR（配列番号１のヌクレオチド2209-4134）；
（ii）少なくとも１コピーのorfY（配列番号１のヌクレオチド6202-6630の相補配列）；
（iii）少なくとも１コピーのorfX（配列番号１のヌクレオチド4643-4996の相補配列）；
（iv）少なくとも１コピーのorfW（配列番号１のヌクレオチド4112-4642の相補配列）；
(v)少なくとも１コピーのdhaB1（配列番号１のヌクレオチド7044-8711）、dhaB2（配列番号１のヌクレオチド8724-9308）およびdhaB3（配列番号１のヌクレオチド9311-9736）；および、
（vi）少なくとも１コピーのorfZ（配列番号１のヌクレオチド9749-11572）
より成る１組の外因性遺伝子、ならびに
（ｂ）３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドを１，３−プロパンジオールに転換する活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの内因性yqhD遺伝子
を含む組換えＥ．コリであって、１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードする機能性ｄｈａＴ遺伝子が存在しない前記組換えＥ．コリ。
【請求項３】
さらに、各遺伝子が遺伝子を不活性化する突然変異を有する１組の内因性遺伝子を含み、該内因性遺伝子の組が：
（ａ）グリセロールキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするglpK遺伝子；
（ｂ）グリセロールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするgld遺伝子；及び
（ｃ）トリオースリン酸イソメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするtpiA遺伝子から成る請求項２の組換えＥ．コリ。
【請求項４】
適した条件下で請求項１、２または３の組換えＥ．コリを単糖類、オリゴ糖類、多糖類及び１−炭素基質より成る群から選ばれる少なくとも１つの炭 素源と接触させ、それにより１，３−プロパンジオールを生産することを含む、
３−プロパンジオールの生物的生産のための方法。
【請求項５】
適した条件下で
（ａ）（ｉ）グリセロールまたはジオールデヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの外因性遺伝子であって、前記グリセロールまたはジオールデヒドラターゼが、dhaB1（配列番号１のヌクレオチド7044-8711）、 dhaB2（配列番号１のヌクレオチド8724-9308）、およびdhaB3（配列番号１のヌクレオチ9311-9736）；dhaB1（GenBank U30903のヌクレオチド3047-4714）、 dhaB2(GenBank U30903のヌクレオチド2450-2890)およびdhaB3（GenBank U30903のヌクレオチド2022-2447)；gldA（GenBank U60992のヌクレオチド121-1788）, gldB（GenBank U60992のヌクレオチド1801-2385）および gldC (GenBank U60992のヌクレオチド2388-2813)；dhaB（GenBank U09771のヌクレオチド8556-10223）, dhaC（GenBank U09771のヌクレオチド10235-10819）およびdhaE (GenBank U09771のヌクレオチド10822-11250); dhaB（GenBank AF051373のヌクレオチド84-1748）、 dhaC（GenBank AF051373のヌクレオチド1779-2318）および dhaE (GenBank AF051373のヌクレオチド2333-2773);またはpduC（GenBank AF026270のヌクレオチド3557-5221）、 pduD（GenBank AF026270のヌクレオチド5232-5906）およびpduE (GenBank AF026270のヌクレオチド5921-6442)によってコードされる配列を有する前記遺伝子；および、
（ｉｉ）デヒドラターゼ再活性化因子をコードする少なくとも１つの外因性遺伝子であって、前記デヒドラターゼ再活性化因子が、orfX（配列番号１のヌクレオチド4643-4996）およびorfZ（配列番号１の9749-11572)、orf2b（GenBank U30903のヌクレオチド4762-7115）およびdhaB4 (GenBank U30903のヌクレオチド186-2009)、 orfX（GenBank U09771のヌクレオチド6180-6533）およびorfZ (GenBank U09771のヌクレオチド11261-13072)、orfX （GenBank AF006034のヌクレオチド1-196）およびorfZ (GenBank AF051373のヌクレオチド2790-4598)、 pduH（GenBank AF026270のヌクレオチド8274-8645）およびpduG (GenBank AF026270のヌクレオチド6452-8284)またはddrB（GenBank AF017781のヌクレオチド2063-2440）およびddrA (GenBank AF017781のヌクレオチド241-2073)によってコードされる配列を有する、前記遺伝子、
より成る１組の外因性遺伝子；および、
（ｂ）３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドを１，３−プロパンジオールに転換する活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの内因性yqhD遺伝子
を含み、１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードする機能性ｄｈａＴ遺伝子が存在しない組換えＥ．コリを、グリセロール及びジヒドロキシアセトンより成る群から選ばれる少なくとも１つの炭素源と接触させることを含む、
１，３−プロパンジオールの生物的生産方法。
【請求項６】
組換えＥ．コリを第１の炭素源及び第２の炭素源と接触させることを含む１，３−プロパンジオールの生産法であって、前記組換えＥ．コリは：
（ｉ）グリセロールまたはジオールデヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの外因性遺伝子であって、前記グリセロールまたはジオールデヒドラターゼが、dhaB1（配列番号１のヌクレオチド7044-8711）、 dhaB2（配列番号１のヌクレオチド8724-9308）、およびdhaB3（配列番号１のヌクレオチ9311-9736）；dhaB1（GenBank U30903のヌクレオチド3047-4714）、 dhaB2(GenBank U30903のヌクレオチド2450-2890)およびdhaB3（GenBank U30903のヌクレオチド2022-2447)；gldA（GenBank U60992のヌクレオチド121-1788）, gldB（GenBank U60992のヌクレオチド1801-2385）および gldC (GenBank U60992のヌクレオチド2388-2813)；dhaB（GenBank U09771のヌクレオチド8556-10223）, dhaC（GenBank U09771のヌクレオチド10235-10819）およびdhaE (GenBank U09771のヌクレオチド10822-11250); dhaB（GenBank AF051373のヌクレオチド84-1748）、 dhaC（GenBank AF051373のヌクレオチド1779-2318）および dhaE (GenBank AF051373のヌクレオチド2333-2773);またはpduC（GenBank AF026270のヌクレオチド3557-5221）、 pduD（GenBank AF026270のヌクレオチド5232-5906）およびpduE (GenBank AF026270のヌクレオチド5921-6442)によってコードされる配列を有する前記遺伝子；
（ｉｉ）デヒドラターゼ再活性化因子をコードする少なくとも１つの外因性遺伝子であって、前記デヒドラターゼ再活性化因子が、orfX（配列番号１のヌクレオチド4643-4996）およびorfZ（配列番号１の9749-11572)、orf2b（GenBank U30903のヌクレオチド4762-7115）およびdhaB4 (GenBank U30903のヌクレオチド186-2009)、 orfX（GenBank U09771のヌクレオチド6180-6533）およびorfZ (GenBank U09771のヌクレオチド11261-13072)、orfX （GenBank AF006034のヌクレオチド1-196）およびorfZ (GenBank AF051373のヌクレオチド2790-4598)、 pduH（GenBank AF026270のヌクレオチド8274-8645）およびpduG (GenBank AF026270のヌクレオチド6452-8284)またはddrB（GenBank AF017781のヌクレオチド2063-2440）およびddrA (GenBank AF017781のヌクレオチド241-2073)によってコードされる配列を有する、前記遺伝子；
（ｉｉｉ）３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドを１，３−プロパンジオールに転換する活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの内因性yqhD遺伝子を含み、ここで前記組換えＥ．コリ中に１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードする機能性ｄｈａＴ遺伝子は存在せず、且つここで第１の炭素源はグリセロール及びジヒドロキシアセトンより成る群から選ばれ、第２の炭素源は単糖類、オリゴ糖類、多糖類及び１−炭素基質より成る群から選ばれる、前記１，３−プロパンジオールの生産法。
【請求項７】
組換えＥ．コリがさらに
（ａ）グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子であって、前記グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼがGenBank Z74071x2、Z35169、U321643またはM20938に記載の配列を有する前記遺伝子；および
（ｂ）グリセロール−３−ホスファターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子であって、前記グリセロール−３−ホスファターゼが配列番号５６に記載の配列を有する、前記遺伝子
より成る１組の外因性遺伝子を含む請求項６の方法。
【請求項８】
適した条件下に、以下の(i)および(ii)の条件を満たす組換えＥ．コリを少なくとも１つの炭素源と接触させることを含み、前記炭素源は単糖類、オリゴ糖類、多糖類及び１−炭素基質より成る群から選ばれる、１、３−プロパンジオールの生産法：
（i）以下の（Ａ）および（Ｂ）からなる群より選ばれるｄｈａレギュロンを含む；
（Ａ）クレブシエラ・ニューモニアのdhaR（配列番号１のヌクレオチド2209-4134）、orfW（配列番号１のヌクレオチド4112-4642）、orfX（配列番号１のヌクレオチド4643-4996）、orfY（配列番号１のヌクレオチド6202-6630）、dhaB1（配列番号１のヌクレオチド7044-8711）、dhaB2（配列番号１の8724-9308）、 dhaB3（配列番号１のヌクレオチド9311-9736）、およびorfZ（配列番号１のヌクレオチド9749-11572）；および、
（Ｂ）dhaR（GenBank U09771のヌクレオチド3746-5671）、orfW（GenBank U09771のヌクレオチド5649-6179）、orfX（GenBank U09771のヌクレオチド6180-6533）、orfY（GenBank U09771のヌクレオチド7736-8164）、dhaB（GenBank U09771のヌクレオチド8556-10223）、dhaC（GenBank U09771のヌクレオチド10235-10819）、dhaE（GenBank U09771のヌクレオチド10822-11250）およびorfZ（GenBank U09771のヌクレオチド11261-13072）
；且つ
（ii）１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードする機能性ｄｈａＴ遺伝子が欠けている。
【請求項９】
組換えＥ．コリが一組の内因性遺伝子をさらに含み、各遺伝子のそれぞれが前記遺伝子を不活性化する変異を有し、前記内因性遺伝子の組が
（i）グリセロールキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするglpK遺伝子；
（ii）グリセロールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするgld遺伝子；および
（iii）トリオースリン酸イソメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするtpiA遺伝子、
からなる、請求項８の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の分野】
本発明は、１つの微生物による発酵可能な炭素源の１，３−プロパンジオールへの生物的転換（ｂｉｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）法を含む。
【０００２】
【背景】
１，３−プロパンジオールは、ポリエステル繊維の生産ならびにポリウレタン及び環状化合物の製造において利用性を有する可能性のあるモノマーである。
【０００３】
１，３−プロパンジオールへの多様な化学的経路が既知である。例えば触媒上でホスフィン、水、一酸化炭素、水素及び酸の存在下に、エチレンオキシドを１，３−プロパンジオールに転換することができるか、アクロレインの接触液相水和及び続く還元によるか、あるいはグリセロールのような化合物から一酸化炭素及び水素の存在下に、周期表の第ＶＩＩＩ族の原子を有する触媒上で反応させることができる。これらの方法により１，３−プロパンジオールを作ることは可能であるが、それらは高価であり、且つ環境汚染物を含有する廃流を生ぜしめる。
【０００４】
グリセロールの発酵から１，３−プロパンジオールを生産できることは、１世紀を越える以前から既知であった。例えばシトロバクテル（Ｃｙｔｒｏｂａｃｔｅｒ）、クロスツリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、エンテロバクテル（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、イリオバクテル（Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、ラクトバシルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）及びペロバクテル（Ｐｅｌｏｂａｃｔｅｒ）の群において、１，３−プロパンジオールを生産できるバクテリア株が見いだされた。研究されたそれぞれの場合に、グリセロールは２段階の酵素触媒反応系列で１，３−プロパンジオールに転換される。第１段階において、デヒドラターゼが３−ヒドロキシプロピオンアルデヒド（３−ＨＰＡ）及び水へのグリセロールの転換、式１を触媒する。第２段階において、３−ＨＰＡがＮＡＤ+−結合オキシドレダクターゼにより１，３−プロパンジオールに還元される、式２。１，３−プロパンジオールはそれ以上代謝されず、結果として
グリセロール→３−ＨＰＡ＋Ｈ2Ｏ                       （式１）
３−ＨＰＡ＋ＮＡＤＨ＋Ｈ+→１，３−プロパンジオール＋ＮＡＤ+  （式２）
媒体中に堆積する。全体的反応は１還元当量（ａ  ｒｅｄｕｃｉｎｇ  ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）を補因子、還元されたβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオシド（ＮＡＤＨ）の形態で消費し、それはニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ+）に酸化される。
【０００５】
クレブシエラ・ニューモニア（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）、シトロバクテル・フレウンジイ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒｅｕｎｄｉｉ）及びクロスツリジウム・パステウリアヌム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ）においては、グリセロールデヒドラターゼの３つの構造サブユニットをコードする遺伝子（ｄｈａＢ１−３又はｄｈａＢ、Ｃ及びＥ）が特異的１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼをコードする遺伝子（ｄｈａＴ）に隣接して位置している（図１を参照されたい）。これらの微生物の間で遺伝子編成（ｇｅｎｅｔｉｃ  ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）はいくらか異なるが、これらの遺伝子は、ｏｒｆＸ及びｏｒｆＺ（グリセロールデヒドラターゼのためのデヒドラターゼ再活性化因子をコードする遺伝子）ならびにｏｒｆＹ及びｏｒｆＷ（未知の機能の遺伝子）も含む１つの群に集まっている。これらの微生物の特異的１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ（ｄｈａＴ’ｓ）はＩＩＩ型アルコールデヒドロゲナーゼの群に属することが知られており；それぞれ保存されている鉄−結合モチーフを示し、且つ１，３−プロパンジオール及び３−ＨＰＡのＮＡＤ+／ＮＡＤＨ結合相互転換に関する優先性を有する。しかしながら、１，３−プロパンジオール及び３−ＨＰＡのＮＡＤ+／ＮＡＤＨ結合相互転換は、効率の低い速度論的パラメーターとはいえ、デヒドラターゼ酵素に特異的に結合しないアルコールデヒドロゲナーゼによっても触媒される（例えばウマ肝臓及びパン酵母アルコールデヒドロゲナーゼ（Ｅ．Ｃ．１．１．１．１））。グリセロールデヒドラターゼ（Ｅ．Ｃ．４．２．１．３０）及びジオール［１，２−プロパンジオール］デヒドラターゼ（Ｅ．Ｃ．４．２．１．２８）は関連しているが異なる酵素であり、それらは異なる遺伝子によりコードされる。クレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａ）及びサルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）からのジオールデヒドラターゼ遺伝子はグリセロールデヒドラターゼ遺伝子に似ており、ｏｒｆＸ及びｏｒｆＺに類似の遺伝子を含む１つの群に集まっている（Ｄａｎｉｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．２２，５５３（１９９９）；Ｔｏｒａｙａ  ａｎｄ  Ｍｏｒｉ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，３３７２（１９９９）；ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＦ０２６２７０）。
【０００６】
グリセロールからの１，３−プロパンジオールの生産は一般に嫌気性条件下でグリセロールを単独の炭素源として用いて、且つ他の外因性還元当量受容物質の不在下で行われる。これらの条件下で、例えばシトロバクテル、クロスツリジウム及びクレブシエラの株においては、最初にＮＡＤ+−（もしくはＮＡＤＰ+−）結合グリセロールデヒドロゲナーゼによるグリセロールのジヒドロキシアセトン（ＤＨＡ）への酸化、式３を含むグリセロールに関する平行経路が働く。ＤＨＡは、ＤＨＡキナーゼによるジヒドロキシアセトンリン酸（ＤＨＡＰ）へのリン酸化（式４）に続き、
グリセロール＋ＮＡＤ+→ＤＨＡ＋ＮＡＤＨ＋Ｈ+          （式３）
ＤＨＡ＋ＡＴＰ→ＤＨＡＰ＋ＡＤＰ                  （式４）
生合成及び例えば解糖を介するＡＴＰ生成の支持のために利用可能になる。１，３−プロパンジオール経路と対照的に、この経路は細胞に炭素及びエネルギーを与えることができ、ＮＡＤＨを消費するのではなく生産する。
【０００７】
クレブシエラ・ニューモニアエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）及びシトロバクテル・フレウンジイの場合、グリセロールデヒドラターゼ（ｄｈａＢ）、１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ（ｄｈａＴ）、グリセロールデヒドロゲナーゼ（ｄｈａＤ）及びジヒドロキシアセトンキナーゼ（ｄｈａＫ）の機能的に結合した活性をコードする遺伝子はｄｈａレギュロンにより包含されている。ｄｈａレギュロンは、クレブシエラ・ニューモニアエ及びシトロバクテル・フレウンジイの場合、転写アクチベータタンパク質をコードする遺伝子（ｄｈａＲ）も包含している。シトロバクテル及びクレブシエラからのｄｈａレギュロンはエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）において発現され、グルセロールを１，３−プロパンジオールに転換することが示された。
【０００８】
１，３−プロパンジオールの生産のための上記で記載した化学的方法も生物的方法も、工業的規模の生産には十分に適しておらず、それは化学的方法はエネルギー集約的であり、生物的方法は高価な出発材料であるグリセロールからの比較的低い力価に限られるからである。これらの欠点は、低いエネルギー投入及び炭水化物又は糖類のような安価な出発材料を必要とする方法を用いて、あるいはグリセロール法の代謝効率を向上させることにより、克服され得た。いずれの方法の開発も、グリセロールへの糖類の、及び１，３−プロパンジオールへのグリセロールの転換を担う遺伝子機構（ｇｅｎｅｔｉｃ  ｍａｃｈｉｎｅｒｙ）を操作する能力を必要とするであろう。
【０００９】
グリセロールの生産のための生物的方法は既知である。圧倒的大多数のグリセロール生産物質は酵母であるが、いくつかのバクテリア、他の菌・カビ及び藻類も既知である。バクテリア及び酵母の両方はグルコース又は他の炭水化物を解糖又はＥｍｂｄｅｎ  Ｍｅｙｅｒｈｏｆ  Ｐａｒｎａｓ経路におけるフルクトース−１，６−二リン酸経路を介して転換することによってグリセロールを生産するが、ある種の藻類は葉緑体中に溶解した二酸化炭素又は重炭酸塩をカルビンサイクルの３−炭素中間体に転換する。１系列の段階において、３−炭素中間体であるホスホグリセリン酸はグリセルアルデヒド３−リン酸に転換され、それはそのケト異性体であるジヒドロキシアセトンリン酸、そして究極的にはグリセロールに容易に相互転換され得る。
【００１０】
特定的にはバクテリア、バシルス・リチェニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）及びラクトバシルス・リコペルシカ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃａ）がグリセロールを合成し、耐塩性藻類ドゥナリエラ種（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｓｐ．）及びアステロモナス・グラシリス（Ａｓｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）において、高い外部塩濃度に対する保護のためにグリセロール生産が見いだされる。同様に、種々の耐浸透圧性（ｏｓｍｏｔｏｌｅｒａｎｔ）酵母が保護手段としてグリセロールを合成する。サッカロミセスのほとんどの株はアルコール発酵の間にいくらかのグリセロールを生産し、浸透圧ストレスの適用によりこれを生理学的に増加させることができる。本世紀初期に、亜硫酸塩もしくはアルカリのような「ステアリング試薬（ｓｔｅｅｒｉｎｇ  ｒｅａｇｅｎｔｓ）」が加えられたサッカロミセス培養の使用により商業的グリセロール生産が達成された。不活性な錯体の生成を介して、ステアリング試薬はエタノールへのアセトアルデヒドの転換を遮断もしくは阻害し；かくして過剰の還元当量（ＮＡＤＨ）がグリセロールを生産するための還元に利用され得るか、又はそのためにＤＨＡＰに向かって「ステアリングされる」。この方法は亜硫酸塩の故である酵母成長の部分的阻害により制限される。種々の機構により過剰のＮＡＤＨ当量を生ぜしめるアルカリの使用により、この制限を部分的に克服することができる。この実施の場合、アルカリはカニッツァロ不均化を開始させて２当量のアセトアルデヒドからエタノールと酢酸を与える。
【００１１】
グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（ＤＡＲ１、ＧＰＤ１）がＳ．ジアスタチクス（Ｓ．ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）からクローニングされ、配列決定された（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔ．１７６，７０９１−７０９５（１９９４））。ＤＡＲ１遺伝子はシャトルベクター中にクローニングされ、Ｅ．コリを形質転換するために用いられ、そこで発現は活性な酵素を生産した。Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（同上）はＤＡＲ１が細胞の浸透圧環境（ｏｓｍｏｔｉｃ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ）により調節されることを認識したが、組換え微生物における１，３−プロパンジオール生産を増強するためにどのように遺伝子を用い得るかを示唆してはいない。
【００１２】
他のグリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ酵素が単離された：例えばｓｎ−グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼがサッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からクローニングされ、且つ配列決定され（Ｌａｒａｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１０，１１０１（１９９３））、Ａｌｂｅｒｔｙｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４，４１３５（１９９４））はサッカロミセス・セレビシアエからのグリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼをコードするＧＰＤ１のクローニングを記載している。Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（同上）と同様に、Ａｌｂｅｒｔｙｎ  ｅｔ  ａｌ．及びＬａｒａｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．の両方はこの遺伝子の調節の浸透圧−感受性を認識しているが、組換え微生物中での１，３−プロパンジオールの生産においてどのように遺伝子を用い得るかを示唆してはいない。
【００１３】
Ｇ３ＰＤＨの場合と同様に、グリセロール−３−ホスファターゼがサッカロミセス・セレビシアエから単離され、該タンパク質がＧＰＰ１及びＧＰＰ２遺伝子によりコードされることが同定された（Ｎｏｒｂｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１，１３８７５（１９９６））。Ｇ３ＰＤＨをコードする遺伝子と同様に、ＧＰＰ２は浸透圧感受性（ｏｓｍｏｓｅｎｓｉｔｉｖｅ）であると思われる。
【００１４】
グリセロール又はジヒドロキシアセトン以外の発酵可能な炭素源の１，３−プロパンジオールへの１微生物転換（ｓｉｎｇｌｅ  ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ  ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）は望ましいが、そのような試みには克服されるべきかなりの困難があることが実証されている。例えばＧｏｔｔｓｃｈａｌｋ  ｅｔ  ａｌ（ＥＰ  ３７３  ２３０）は、シトロバクテル・フレウンジイ、クロスツリジウム・アウトブチリクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）、クロスツリジウム・ブチリクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）及びクレブシエラ・ニューモニアエを含む１，３−プロパンジオールの生産に有用なほとんどの株の成長がフルクトース又はグルコースのような水素供与体の存在により撹乱されると記載している。グリセロールとフルクトース又はグルコースの共−発酵において１，３−プロパンジオールを生産するラクトバシルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）及びラクトバシルス・ブクネル（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒ）の株は、グリセロールが唯一の炭素源として与えられると成長せず、休止細胞はグルコース又はフルクトースを代謝できることが示されているが、それらは１，３−プロパンジオールを生産しない（Ｖｅｉｇａ  ＤＡ  Ｃｕｎｈａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７４，１０１３（１９９２））。同様に、グリセロール及びアセテートが与えられると１，３−プロパンジオールを生産するイリオバクテル・ポリトロプス（Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒ  ｐｏｌｙｔｒｏｐｕｓ）の株は、フルクトース及びグルコースを含むグリセロール以外の炭素基質から１，３−プロパンジオールを生産しないであろうことが示されている（Ｓｔｅｉｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４０，１３９（１９８４））。最後に、Ｔｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．３４，１４９（１９９２））は、グルセロールデヒドラターゼをコードするｄｈａレギュロンを用いて形質転換された組換えエシェリキア・コリが外因性グルセロールの不在下でグルコース又はキシロースから１，３−プロパンジオールを生産しないことを記載した。
【００１５】
グリセロールからの１，３−プロパンジオールの収率を向上させる試みが報告されており、その試みでは還元当量を与えることができる共−基質、典型的には発酵可能な糖類がプロセス中に含まれる。グリセロール及びグルコースを共−発酵させるシトロバクテル・フレウンジイ及びクレブシエラ・ニューモニアエ  ＤＳＭ  ４２７０の休止細胞に関する収率における向上が特許請求されている（Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋ  ｅｔ  ａｌ．，同上；ならびにＴｒａｎ−Ｄｉｎｈ  ｅｔ  ａｌ．，ＤＥ  ３７３４  ７６４）；しかしグリセロール及びグルコースを共−発酵させるクレブシエラ・ニューモニアエ  ＡＴＣＣ  ２５９５５の成長細胞に関しては特許請求されておらず、それは１，３−プロパンジオールを生産しなかった（Ｉ−Ｔ．Ｔｏｎｇ，Ｐｈ．Ｄ．Ｔｈｅｓｉｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ−Ｍａｄｉｓｏｎ（１９９２））。組換えエシエリキア・コリによるグルセロールとグルコース又はフルクトースの共発酵に関する収率の向上が報告されている；しかしながらグリセロールの不在下で１，３−プロパンジオールは生産されない（Ｔｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，同上）。これらの系においては、１つの微生物が細胞保持又は成長のためのエネルギー及び炭素を与えながらＮＡＤＨ生成の源として炭水化物を用いている。これらの開示は、糖類が１，３−プロパンジオールを生産する炭素の流れに入らないことを示唆している。
【００１６】
しかしながら最近、デヒドラターゼ酵素を発現する１つの微生物によるグリセロール又はジヒドロキシアセトン以外の炭素基質の１，３−プロパンジオールへの転換が記載された（Ｕ．Ｓ．５，６８６，２７６；ＷＯ  ９８２１３３９；ＷＯ  ９９２８４８０；及びＷＯ  ９８２１３４１（ＵＳ  ６０１３４９４））。グリセロール又はグルコースのいずれかからの１，３−プロパンジオールの生産に導く生物的プロセスにおける特別な欠点は、発酵を介して達成される生産物の低い力価であった；かくして水性発酵ブイヨンから１，３−プロパンジオールを得るためのエネルギー−集約的な分離プロセスが必要である。１，３−プロパンジオールへのグリセロールのフェドバッチ（ｆｅｄ  ｂａｔｃｈ）又はバッチ発酵はクロスツリジウム・ブチリクムにより６５ｇ／Ｌ（Ｓａｉｎｔ−Ａｍａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １６，８３１（１９９４））、クロスツリジウム・ブチリクム突然変異株により７１ｇ／Ｌ（Ａｂｂａｄ−Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ，Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６１，４４１３（１９９５））、クレブシエラ・ニューモニアエにより６１ｇ／Ｌ（Ｈｏｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｂｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３３，１２１（１９９０））及びシトロバクテル・フレウンジイにより３５ｇ／Ｌ（Ｈｏｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，同上）の最終的力価に導いた。グリセロール発酵から得られる力価を越えるグルコースの１，３−プロパンジオールへの発酵はまだ開示されたことがない。
【００１７】
解決されるべく残っている問題は、グルコース又は他の糖類のような安価な炭素基質から高い力価で、且つ１つの微生物によって１，３−プロパンジオールを生物的に生産するやり方である。１，３−プロパンジオールの生物的生産は２−段階連続反応のための基質としてグリセロールを必要とし、その反応ではデヒドラターゼ酵素（典型的には補酵素Ｂ12−依存性デヒドラターゼ）がグリセロールを中間体である３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドに転換し、それが次いでＮＡＤＨ−（もしくはＮＡＤＰＨ）依存性オキシドレダクターゼにより１，３−プロパンジオールに還元される。補因子が必要であることの複雑さは、１，３−プロパンジオールの生産のためにこの反応系列を使用する工業的プロセスのために全細胞触媒の使用を必要とする。
【００１８】
【発明の概略】
出願人等は上記の問題を解決し、本発明は以前に得られたより有意に高い力価における、且つ１つの微生物の使用での発酵可能な炭素源の１，３−プロパンジオールへの直接の生物的転換を提供する。モデル基質としてグルコースを用い、モデル宿主としてＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）を用いる。本発明の１つの側面において、１群の遺伝子（デヒドラターゼ活性、デヒドラターゼ再活性化因子、１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ（ｄｈａＴ）、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ及びグリセロール−３−ホスファターゼをコードする遺伝子を含む）を発現する組換えＥ．コリがグリセロールから１，３−プロパンジオールへの発酵の力価に近い力価でグルコースを１，３−プロパンジオールに転換する。
【００１９】
本発明の他の側面において、この組換えＥ．コリ中の機能性ｄｈａＴ遺伝子の除去が、グルコースからの１，３−プロパンジオールの有意により高い力価を生ずる。この予測されなかった力価における増加は経済性の向上及びかくしてグルコースからの１，３−プロパンジオールの生産のための改良法を生ずる。
【００２０】
さらに本発明は、１）グリセロール、２）ジヒドロキシアセトン、３）グリセロールの酸化状態におけるＣ3化合物（例えばグリセロール３−リン酸）あるいは４）ジヒドロキシアセトンの酸化状態におけるＣ3化合物（例えばジヒドロキシアセトンリン酸又はグリセルアルデヒド３−リン酸）に容易に転換されるいずれの炭素基質をも含むように一般的に応用され得る。ｄｈａＴマイナス株における１，３−プロパンジオールの生産は、３−ＨＰＡを１，３−プロパンジオールに転換する非−特異的触媒活性を必要とする。３−ＨＰＡを１，３−プロパンジオールに転換する非−特異的触媒活性を担う単数もしくは複数の酵素及び／又は単数もしくは複数の遺伝子の同定は、広範囲の炭素−含有基質からの基質を用いる広範囲の宿主微生物における１，３−プロパンジオールの生産に導くであろう。３−ＨＰＡを１，３−プロパンジオールに転換するこの非−特異的触媒活性の使用が、増加する力価及び得られる向上した経済性のおかげで、グリセロール又はジヒドロキシアセトンからの１，３−プロパンジオールの生産のための改良法に導くであろうことも予測される。
【００２１】
この活性は、配列番号：５８に示される、あるいは：
（ａ）配列番号：５７のアミノ酸配列のすべて又は実質的部分をコードする単離された核酸フラグメント；
（ｂ）配列番号：５７のアミノ酸配列のすべて又は実質的部分をコードする単離された核酸フラグメントに実質的に類似している単離された核酸フラグメント；
（ｃ）配列番号：５７のアミノ酸配列の少なくとも８０％（ａｔ  ｌｅａｓｔ  ８０％  ｗｉｔｈ）を有する少なくとも３８７個のアミノ酸のポリペプチドをコードする単離された核酸フラグメント；
（ｄ）０．１ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃のハイブリダイジェーション条件下で（ａ）とハイブリダイジェーションし、２ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、及び続いて０．１ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを用いて洗浄された単離された核酸フラグメント；ならびに
（ｄ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）に相補的である単離された核酸フラグメント
より成る群から選ばれる、３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドの１，３−プロパンジオールへの転換のための非−特異的触媒活性をコードする核酸フラグメントとしてＥ．コリから単離された。あるいはまた、非特異的触媒活性は配列番号：５７に示されるポリペプチドにおいて具体化される。
【００２２】
適した調節配列に操作可能に結合された上記の単離された核酸フラグメントを含むキメラ遺伝子を構築することができる。このキメラ遺伝子を用いてシトロバクテル、エンテロバクテル（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、クロスツリジウム、クレブシエラ、アエロバクテル（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、ラクトバシルス、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、サッカロミセス、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、チゴサッカロミセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、デバリオミセス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）、ムコル（Ｍｕｃｏｒ）、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）、メチロバクテル（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、アエロバクテル（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、エシェリキア及びシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）より成る群から選ばれる微生物を形質転換することができる。Ｅ．コリが好ましい宿主である。
【００２３】
従って本発明は：（ａ）グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子；（ｂ）グリセロール−３−ホスファターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子；（ｃ）デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子；（ｄ）デヒドラターゼ再活性化因子をコードする少なくとも１つの遺伝子；（ｅ）３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドを１，３−プロパンジオールに転換するのに十分な非−特異的触媒活性をコードする少なくとも１つの内因性遺伝子を含み、１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼをコードする機能性ｄｈａＴ遺伝子が存在しない１，３−プロパンジオールの生産に有用な組換え微生物を提供する。好ましい態様は、ｄｈａＴ遺伝子が存在しない組換え微生物（好ましくはＥ．コリ）である。場合により組換え微生物は：（ａ）グリセロールキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子；（ｂ）グリセロールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子；（ｃ）トリオースリン酸イソメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子より成る群から選ばれる内因性遺伝子において突然変異（例えば欠失突然変異又は点突然変異）を含んでいることができる。
ヌ  他の態様において、本発明は：（ａ）適した条件下で、ｄｈａレギュロンを含み且つ１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ活性をコードする機能性ｄｈａＴ遺伝子が欠けている組換えＥ．コリを単糖類、オリゴ糖類、多糖類及び１−炭素基質より成る群から選ばれる少なくとも１つの炭素源と接触させ；（ｂ）（ａ）で生産される１，３−プロパンジオールを場合により回収することを含む１，３−プロパンジオールの生産のための方法を含む。
【００２４】
本発明は：（ａ）本発明の組換え微生物を単糖類、オリゴ糖類、多糖類及び１−炭素基質より成る群から選ばれる少なくとも１つの炭素源と接触させ、それにより１，３−プロパンジオールを生産し；（ｂ）（ａ）で生産される１，３−プロパンジオールを場合により回収することを含む、組換え微生物からの１，３−プロパンジオールの生産のための方法も提供する。
【００２５】
同様に、本発明は：
（ａ）（ｉ）デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子；
（ｉｉ）デヒドラターゼ再活性化因子をコードする少なくとも１つの遺伝子；
（ｉｉｉ）３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドを１，３−プロパンジオールに転換するのに十分な非−特異的触媒活性をコードする少なくとも１つの内因性遺伝子
を含み；１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼをコードする機能性ｄｈａＴ遺伝子が存在しない組換え微生物を、グリセロール及びジヒドロキシアセトンより成る群から選ばれる少なくとも１つの炭素源と接触させ、そこにおいて１，３−プロパンジオールを生産し；
（ｂ）（ａ）で生産される１，３−プロパンジオールを場合により回収する
ことを含む、組換え微生物からの１，３−プロパンジオールの生産のための方法を提供することを目的とする。
【００２６】
本発明のさらに別の側面は炭素基質の共−供給を提供する。１，３−プロパンジオールの生産のためのこの態様において、段階は：（ａ）組換えＥ．コリを第１の炭素源及び第２の炭素源と接触させ、該組換えＥ．コリは：（ｉ）デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの外因性遺伝子；（ｉｉ）デヒドラターゼ再活性化因子をコードする少なくとも１つの外因性遺伝子；（ｉｉｉ）３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドを１，３−プロパンジオールに転換するのに十分な非−特異的触媒活性をコードする少なくとも１つの外因性遺伝子を含み、ここで組換えＥ．コリ中に１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ活性をコードする機能性ｄｈａＴ遺伝子は存在せず、且つここで該第１の炭素源はグリセロール及びジヒドロキシアセトンより成る群から選ばれ、該第２の炭素源は単糖類、オリゴ糖類、多糖類及び１−炭素基質より成る群から選ばれ；（ｂ）（ａ）で生産される１，３−プロパンジオールを場合により回収する段階である。共−供給は連続的又は同時であることができる。共−供給の態様において用いられる組換えＥ．コリはさらに：（ａ）（ｉ）グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子；（ｉｉ）グリセロール−３−ホスファターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子；及び（ｉｉｉ）ｄｈａＲ、ｏｒｆＹ、ｏｒｆＸ、ｏｒｆＷ、ｄｈａＢ１、ｄｈａＢ２、ｄｈａＢ３及びｏｒｆＺの遺伝子産物をコードする遺伝子の少なくとも１つのサブセットより成る１組の外因性遺伝子、ならびに（ｂ）各遺伝子が遺伝子を不活性化する突然変異を有し：（ｉ）グリセロールキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子；（ｉｉ）グリセロールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子；及び（ＩＩＩ）トリオースリン酸イソメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子より成る１組の内因性遺伝子を含むことができる。
【００２７】
有用な組換えＥ．コリ株には、（ａ）各遺伝子が遺伝子を不活性化する突然変異を有し：（ｉ）グリセロールキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子；及び（ｉｉ）グリセロールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子より成る２つの内因性遺伝子の１組；（ｂ）グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの外因性遺伝子；（ｃ）グリセロール−３−ホスファターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの外因性遺伝子；ならびに（ｄ）プラスミドｐＫＰ３２を含む組換えＥ．コリ株ＫＬＰ２３ならびに（ａ）各遺伝子が遺伝子を不活性化する突然変異を有し：（ｉ）グリセロールキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子；（ｉｉ）グリセロールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子；及び（ｉｉｉ）トリオースリン酸イソメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子より成る３つの内因性遺伝子の組を含む組換えＥ．コリ株ＲＪ８が含まれる。
【００２８】
他の有用な態様には：（ａ）（ｉ）デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子；（ｉｉ）グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子；（ｉｉｉ）グリセロール−３−ホスファターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子；及び（ｉｖ）デヒドラターゼ再活性化因子をコードする少なくとも１つの遺伝子より成る１組の外因性遺伝子；ならびに（ｂ）３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドを１，３−プロパンジオールに転換する非−特異的触媒活性をコードする少なくとも１つの内因性遺伝子を含む組換えＥ．コリが含まれ、ここで組換えＥ．コリ中には１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ活性をコードする機能性ｄｈａＴ遺伝子が存在しない。
【００２９】
別の態様は：（ａ）（ｉ）グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子；（ｉｉ）グリセロール−３−ホスファターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子；及び（ｉｉｉ）ｄｈａＲ、ｏｒｆＹ、ｏｒｆＸ、ｏｒｆＷ、ｄｈａＢ１、ｄｈａＢ２、ｄｈａＢ３及びｏｒｆＺの遺伝子産物をコードする遺伝子の少なくとも１つのサブセットより成る１組の外因性遺伝子、ならびに（ｂ）３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドを１，３−プロパンジオールに転換する非−特異的触媒活性をコードする少なくとも１つの内因性遺伝子を含む組換えＥ．コリであり、ここで組換えＥ．コリ中には１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ活性をコードする機能性ｄｈａＴ遺伝子が存在しない。この態様は、それぞれの遺伝子が遺伝子を不活性化する突然変異を有する１組の内因性遺伝子をさらに含む組換えＥ．コリを用いる方法も包含し、該組は：（ａ）グリセロールキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子；（ｂ）グリセロールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子；及び（ｃ）トリオースリン酸イソメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子から成る。
【００３０】
この態様はさらに、（ａ）適した条件下で、開示したばかりの（ｉｍｍｅｄｉａｔｅｌｙ  ｄｉｓｃｌｏｓｅｄ）組換えＥ．コリを単糖類、オリゴ糖類、多糖類及び１−炭素基質より成る群から選ばれる少なくとも１つの炭素源と接触させ、それにより１，３−プロパンジオールを生産し；（ｂ）（ａ）で生産される１，３−プロパンジオールを場合により回収することを含む１，３−プロパンジオールの生物的生産のための方法を含む。
【００３１】
ならびに又、（ａ）さらに：（ｉ）デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの外因性遺伝子；（ｉｉ）デヒドラターゼ再活性化因子をコードする少なくとも１つの外因性遺伝子；（ｉｉｉ）３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドを１，３−プロパンジオールに転換する非−特異的触媒活性をコードする少なくとも１つの内因性遺伝子を含む開示したばかりの態様の組換えＥ．コリをグリセロール及びジヒドロキシアセトンより成る群から選ばれる少なくとも１つの炭素源と接触させ、（ｂ）（ａ）で生産される１，３−プロパンジオールを場合により回収することを含む１，３−プロパンジオールの生物的生産のためのさらに別の方法も包含する。
【００３２】
【図面、配列の記載及び生物の寄託の簡単な記述】
本出願の各部を成す下記の詳細な記述、図、付随する配列の記載及び生物の寄託から、本発明をさらに十分に理解することができる。
【００３３】
図１はｄｈａレギュロンサブクローンｐＨＫ２８−２６の配列内の遺伝子編成を表す。
【００３４】
図２は本質的に実施例７に記載するビタミンＢ12の一定の供給を用いた２つの発酵実験の間で比較される細胞外可溶性タンパク質（ｇ／Ｌ）のグラフを表す。実線の１つの場合、用いられた株はＫＬＰ２３／ｐＡＨ４８／ｐＫＰ３２であった。破線の他の場合、用いられた株はＫＬＰ２３／ｐＡＨ４８／ｐＤＴ２９であった。
【００３５】
図３は本質的に実施例７に記載するビタミンＢ12の一定の供給を用いた２つの発酵実験の間で比較される細胞生存率［（生存細胞／ｍＬ）／ＯＤ５５０］のグラフを表す。１つの場合（実線）、用いられた株はＫＬＰ２３／ｐＡＨ４８／ｐＫＰ３２であった。他の場合（破線）、用いられた株はＫＬＰ２３／ｐＡＨ４８／ｐＤＴ２９であった。
【００３６】
図４は本質的に実施例７に記載する、しかしビタミンＢ12又は補酵素Ｂ12の不在下における２つの発酵実験の間で比較されるグルコースからのグリセロールの収率のグラフを表す。１つの場合（実線）、用いられた株はＫＬＰ２３／ｐＡＨ４８／ｐＫＰ３２であった。他の場合（破線）、用いられた株はＫＬＰ２３／ｐＡＨ４８／ｐＤＴ２９であった。
【００３７】
図５は１，３−プロパンジオールへのグルコースの代謝的転換を示す流れ図である。
【００３８】
図６は未変性ゲル（ｎａｔｉｖｅ  ｇｅｌ）上の内因性Ｅ．コリオキシドレダクターゼ活性（非−特異的触媒活性）を示すバンドから抽出される可溶性タンパク質画分を用いた２Ｄ−ＰＡＧＥ膜ブロットである。
【００３９】
６８の配列の記載及び本明細書に添付する配列表は、３７  Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２１−１．８２５（“Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｎｄ／ｏｒ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅｓ−ｔｈｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｒｕｌｅｓ”）に示されている特許出願におけるヌクレオチド及び／又はアミノ酸配列開示を管理している規則に従い、Ｗｏｒｌｄ  Ｉｎｔｅｌｌｅｃｔｕａｌ  Ｐｒｏｐｅｒｔｙ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ（ＷＩＰＯ）  Ｓｔａｎｄａｒｄ  ＳＴ２．５（１９８８）ならびにＥＰＯ及びＰＣＴの配列表条件（Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ＩｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｓのＲｕｌｅｓ  ５．２及び４９．５（ａ−ｂｉｓ）及びＳｅｃｔｉｏｎ  ２０８及びＡｎｎｅｘ  Ｃ）と一致するであろう。配列の記載は、引用することによりその記載事項が本明細書の内容となるＮｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３，３０２１−３０３０（１９８５）及びＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２０９，３４５−３７３（１９８４）に記載されているＩＵＰＡＣ−ＩＹＵＢ標準に準拠して定義されるヌクレオチド配列記号に関する１文字コード及びアミノ酸に関する３文字コードを含有する。
【００４０】
配列番号：１はｐＩＢＩ３１（ＩＢＩ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ，Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ，ＣＴ）中にサブクローニングされ、ｐＨＫ２８−２６と命名されたｐＫＰ１（クレブシエラ・ニューモニアエからのＤＮＡを含有するコスミド）からの１２．１ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩフラグメントから決定されるヌクレオチド配列を含有する。表１がさらに配列番号：１内で同定される遺伝子、対応する塩基対及び関連する機能を詳細に示している。実施例１も参照されたい。
【００４１】
配列番号：５７はｙｑｈＤに関して決定されるヌクレオチド配列を含有する。
【００４２】
出願人等はＢｕｄａｐｅｓｔ  Ｔｒｅａｔｙ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｄｅｐｏｓｉｔ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｕｒｐｏｓｅｓ  ｏｆ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅの協約の下に以下の生物の寄託を行った：
配列番号：５８はＹａｈＤに関して決定されるアミノ酸配列を含有する。
寄託者確認                              国際寄託所
参照（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）              名                寄託の日付
グリセロールデヒドラターゼ酵素を      ATCC 69789 １９９５年４月１８日
コードするクレブシエラゲノムの１部
を含有する形質転換Ｅ．コリＤＨ５α
ジオールデヒドラターゼ酵素を          ATCC 69790 １９９５年４月１８日
コードするクレブシエラゲノムの１部
を含有するコスミドｐＫＰ４を含有する
形質転換Ｅ．コリＤＨ５α
Ｅ．コリＭＳＰ３３．６                ATCC 98598 １９９７年１１月２５日
ｇｌｐＫ突然変異株                    ATCC 98597 １９９７年１１月２５日Ｅ．コリＲＪＦ１０ｍ
寄託物は示した国際寄託所に少なくとも３０年間保持され、それを開示している特許が認可されると公共に利用可能とされるであろう。寄託物の利用可能性は、政府の指令により認可される特許権の減損において本発明を実施する許諾を構成しない。
【００４３】
本明細書で用いられる「ＡＴＣＣ」とは、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  ２０１１０−２２０９  Ｕ．Ｓ．Ａ．にあるＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ国際寄託所を指す。「ＡＴＣＣ番号」は、ＡＴＣＣに寄託した際の培養物への受け入れ番号である。
【００４４】
【発明の詳細な記述】
本発明は発酵可能な炭素源を直接１，３−プロパンジオールに、１つの微生物を用いて生物的に転換するための改良法を提供する。該方法は増加した力価、収率及び細胞生存率ならびに発酵の間の細胞ライシスの減少を特徴とする。
【００４５】
本発明は、１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ（ｄｈａＴ）を含む１，３−プロパンジオール発酵プロセスが培地中における高いレベルの３ＨＰＡ及び他のアルデヒド及びケトンを特徴とし、それが細胞生存率の減少と関連しているという観察に部分的に基づいている。本発明は、モデル宿主であるＥ．コリが、３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドを１，３−プロパンジオールに転換できる内因性非−特異的触媒活性により、３−ＨＰＡを１，３−プロパンジオールに転換できるという予期せぬ発見にも部分的に基づいている。本発明はさらに、この非−特異的触媒活性を含み且つ機能性ｄｈａＴが欠けているＥ．コリ発酵プロセスが発酵の間に細胞生存率の向上を生じ、機能性ｄｈａＴを含む発酵プロセスより高い１，３−プロパンジオールの力価及び／又は収率を与えるという予期せぬ発見に部分的に基づいている。
【００４６】
１つの側面においては、グリセロールがモデル基質であり、宿主微生物は１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ活性がないように野生−型ｄｈａＴにおける突然変異を有しており、且つ３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドを１，３−プロパンジオールに転換するのに十分な非−特異的触媒活性を含んでいる。他の側面においては、グルコースがモデル基質であり、組換えＥ．コリがモデル宿主である。この側面の場合、Ｅ．コリは３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドを１，３−プロパンジオールに転換するのに十分な内因性非−特異的触媒活性を含んでいる。１つの態様の場合、非−特異的触媒活性はアルコールデヒドロゲナーゼである。
【００４７】
１つの側面において、本発明は（ａ）グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子：（ｂ）グリセロール−３−ホスファターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子；（ｃ）デヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子；（ｄ）デヒドラターゼ再活性化因子をコードする少なくとも１つの遺伝子；及び（ｅ）３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドを１，３−プロパンジオールに転換するのに十分な非−特異的触媒活性をコードする少なくとも１つの内因性遺伝子を含む１群の遺伝子を発現する組換えＥ．コリを提供し；この微生物の使用は高い力価でグルコースを１，３−プロパンジオールに転換する。本発明の他の側面において、この組換えＥ．コリ中の機能性ｄｈａＴ遺伝子の除去は、以前に得られたより予期せぬ程高いグルコースからの１，３−プロパンジオールの力価を与える。
【００４８】
本発明は、１つの微生物における発酵可能な炭素源からの１，３−プロパンジオールの生物的生産のための改良法を提供する。本発明の１つの側面において、１，３−プロパンジオールへのグルコースの転換のための改良法は、クレブシエラ・ニューモニアエｄｈａレギュロン遺伝子ｄｈａＲ、ｏｒｆＹ、ｄｈａＴ、ｏｒｆＸ、ｏｒｆＷ、ｄｈａＢ１、ｄｈａＢ２、ｄｈａＢ３及びｏｒｆＺを用いて形質転換された宿主Ｅ．コリを含む組換え微生物の使用により達成され、これらの遺伝子のすべては野生型クレブシエラ・ニューモニアエ中に存在すると同じ遺伝子体制で配置される。発酵プロセスに関して得られる力価は、類似の発酵に関して以前に報告されたいずれの力価よりも有意に高い。この向上は実施例６及び実施例７で記載するプラスミドｐＤＴ２９の使用に頼っている。
【００４９】
本発明の他の側面において、Ｇ３ＰＤＨ、Ｇ３Ｐホスファターゼ、デヒドラターゼ、デヒドラターゼ再活性化因子及び又機能性ｄｈａＴをコードする遺伝子を含有する組換えＥ．コリを用いる方法と比較して、グルコースからの１，３−プロパンジオールの生産のためのさらに改良された方法が、Ｇ３ＰＤＨ、Ｇ３Ｐホスファターゼ、デヒドラターゼ及びデヒドラターゼ再活性化因子をコードする遺伝子を含有する組換えＥ．コリを用いて達成される。劇的に改良された方法は、Ｅ．コリ中に存在する、アルコールデヒドロゲナーゼであると予測される非−特異的触媒活性をコードする内因性遺伝子に頼っている。
【００５０】
該方法における劇的な向上は、実施例７及び９に示す１，３−プロパンジオール力価の向上として明らかである。該方法における向上は、発酵ブイヨン中の細胞外可溶性タンパク質濃度により決定される細胞ライシスの減少としても明らかである。本発明のこの側面を図２に示す。さらに該方法における向上は、発酵の経過に及ぶ長期間の細胞生存率（ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ  ｃｅｌｌ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）として明らかである。本発明のこの側面を図３に示す。さらに本発明における向上は収率の向上としても明らかである。１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ（ｄｈａＴ）を発現するＥ．コリ（例えばプラスミドｐＤＴ２９を用いて形質転換されたＥ．コリＫＬＰ２３）においては、グリセロールは３−ＨＰＡ以外の産物に代謝され得る。まさに対照的に、１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ（ｄｈａＴ）を発現しないＥ．コリ（例えばプラスミドｐＫＰ３２を用いて形質転換されたＥ．コリＫＬＰ２３）においては、グリセロールは３−ＨＰＡ以外の産物に代謝されない。この謎の経路が機能性ｄｈａＴの存在もしくは不在に帰せられ得ることは、図４に示すようなグルコースからのグリセロールのより低い収率により示される。
【００５１】
本明細書で用いられる場合、特許請求の範囲及び明細書の説明のために以下の用語が用いられ得る。
【００５２】
「グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ」及び「Ｇ３ＰＤＨ」は、ジヒドロキシアセトンリン酸（ＤＨＡＰ）のグリセロール−３−リン酸（Ｇ３Ｐ）への転換を触媒する酵素活性を担うポリペプチドを指す。生体内でＧ３ＰＤＨはＮＡＤＨ；ＮＡＤＰＨ；又はＦＡＤ−依存性であることができる。補因子特異的グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼを特定的に指す場合、「ＮＡＤＨ−依存性グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ」、「ＮＡＤＰＨ−依存性グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ」及び「ＦＡＤ−依存性グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ」の用語が用いられるであろう。ＮＡＤＨ−依存性及びＮＡＤＰＨ−依存性グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼがＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨを互換的に用いることができるのが一般に実情なので（例えばｇｐｓＡによりコードされる遺伝子により）、ＮＡＤＨ−依存性及びＮＡＤＰＨ−依存性グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼの用語は互換的に用いられるであろう。ＮＡＤＨ−依存性酵素（Ｅ．Ｃ．１．１．１．８）は例えばＧＰＤ１（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｚ７４０７１ｘ２）又はＧＰＤ２（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｚ３５１６９ｘ１）又はＧＰＤ３（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｇ９８４１８２）又はＤＡＲ１（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｚ７４０７１ｘ２）を含むいくつかの遺伝子によりコードされる。ＮＡＤＰＨ−依存性酵素（ＥＣ  １．１．１．９４）はｇｐｓＡ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｕ３２１６４３、（ｃｄｓ  １９７９１１−１９６８９２）Ｇ４６６７４６及びＬ４５２４６）によりコードされる。ＦＡＤ−依存性酵素（ＥＣ  １．１．９９．５）はＧＵＴ２（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｚ４７０４７ｘ２３）又はｇｌｐＤ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｇ１４７８３８）又はｇｌｐＡＢＣ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｍ２０９３８）によりコードされる（引用することによりその記載事項が本明細書の内容となるＷＯ  ９９２８４８０及びその中の引用文献を参照されたい）。
【００５３】
「グリセロール−３−ホスファターゼ」、「ｓｎ−グリセロール−３−ホスファターゼ」又は「ｄ，ｌ−グリセロールホスファターゼ」及び「Ｇ３Ｐホスファターゼ」という用語は、グリセロール−３−リン酸と水のグリセロールと無機リン酸塩への転換を触媒する酵素活性を担うポリペプチドを指す。Ｇ３Ｐホスファターゼは例えばＧＰＰ１（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｚ４７０４７ｘ１２５）又はＧＰＰ２（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｕ１８８１３ｘ１１）によりコードされる（引用することによりその記載事項が本明細書の内容となるＷＯ  ９９２８４８０及びその中の引用文献を参照されたい）。
【００５４】
「グリセロールキナーゼ」という用語は、グルセロールとＡＴＰのグルセロール−３−リン酸とＡＤＰへの転換を触媒する酵素活性を担うポリペプチドを指す。高−エネルギーリン酸ドナーＡＴＰを生理学的代用物（例えばホスホエノールピルビン酸）により置き換えることができる。グリセロールキナーゼは例えばＧＵＴ１（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｕ１１５８３ｘ１９）及びｇｌｐＫ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｌ１９２０１）によりコードされる（引用することによりその記載事項が本明細書の内容となるＷＯ  ９９２８４８０及びその中の引用文献を参照されたい）。
【００５５】
「グリセロールデヒドロゲナーゼ」という用語は、グリセロールのジヒドロキシアセトンへの（Ｅ．Ｃ．１．１．１．６）又はグリセロールのグリセルアルデヒドへの（Ｅ．Ｃ．１．１．１．７２）の転換を触媒する酵素活性を担うポリペプチドを指す。グリセロールのジヒドロキシアセトンへの転換を触媒する酵素活性を担うポリペプチドは「ジヒドロキシアセトンレダクターゼ」とも言われる。グリセロールデヒドロゲナーゼはＮＡＤＨ（Ｅ．Ｃ．１．１．１．６）、ＮＡＤＰＨ（Ｅ．Ｃ．１．１．１．７２）又は他の補因子（例えばＥ．Ｃ．１．１．９９．２２）に依存性であることができる。ＮＡＤＨ−依存性グリセロールデヒドロゲナーゼは例えばｇｌｄＡ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｕ００００６）によりコードされる（引用することによりその記載事項が本明細書の内容となるＷＯ  ９９２８４８０及びその中の引用文献を参照されたい）。
【００５６】
「デヒドラターゼ酵素」又は「デヒドラターゼ」という用語は、産物３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドへのグリセロール分子の転換を触媒する酵素活性を指す。本発明の目的の場合、デヒドラターゼ酵素はグリセロールデヒドラターゼ（Ｅ．Ｃ．４．２．１．３０）及びジオールデヒドラターゼ（Ｅ．Ｃ．４．２．１．２８）を含み、それぞれグリセロール及び１，２−プロパンジオールの好ましい基質を有する。デヒドラターゼ酵素のための遺伝子はクレブシエラ・ニューモニアエ、シトロバクテル・フレウンジイ、クロスツリジウム・パステウリアヌム、サルモネラ・チフィムリウム及びクレブシエラ・オキシトカにおいて同定されている。それぞれの場合にデヒドラターゼは３つのサブユニット：大もしくは「α」サブユニット、中もしくは「β」サブユニット及び小もしくは「γ」サブユニットから構成されている。文献中で用いられる遺伝子命名法が多様なので、同定を容易にするために比較チャートを表１に示す。遺伝子は例えばＤａｎｉｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．２２，５５３（１９９９））及びＴｏｒａｙａ  ａｎｄ  Ｍｏｒｉ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，３３７２（１９９９））にも記載されている。表１を参照すると、グリセロールデヒドラターゼの大もしくは「α」サブユニットをコードする遺伝子はｄｈａＢ１、ｇｌｄＡ及びｄｈａＢを含み；中もしくは「β」サブユニットをコードする遺伝子はｄｈａＢ２、ｇｌｄＢ及びｄｈａＣを含み；小もしくは「γ」サブユニットをコードする遺伝子はｄｈａＢ３、ｇｌｄＣ及びｄｈａＥを含む。やはり表１を参照すると、ジオールデヒドラターゼの大もしくは「α」サブユニットをコードする遺伝子はｐｄｕＣ及びｐｄｄＡを含み；中もしくは「β」サブユニットをコードする遺伝子はｐｄｕＤ及びｐｄｄＢを含み；小もしくは「γ」サブユニットをコードする遺伝子はｐｄｕＥ及びｐｄｄＣを含む。
【００５７】
【表１】
0004716634.tif 000002
【００５８】
グリセロール及びジオールデヒドラターゼはグリセロール及びいくつかの他の基質による機構に基づく自殺不活性化を受け易い（Ｄａｎｉｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．２２，５５３（１９９９））。「デヒドラターゼ再活性化因子」という用語は、デヒドラターゼ活性の再活性化を担うタンパク質を指す。「デヒドラターゼ再活性化活性」、「デヒドラターゼ活性の再活性化」又は「デヒドラターゼ活性の再生」という用語は、基質への触媒作用のできないデヒドラターゼを基質への触媒作用のできるものに転換する現象あるいはデヒドラターゼの不活性化を阻害する現象あるいは生体内におけるデヒドラターゼ酵素の有効半減期を延長する現象を指す。２つのタンパク質がデヒドラターゼ再活性化因子として含まれるものとして同定されている（引用することによりその記載事項が本明細書の内容となるＷＯ  ９８２１３４１（ＵＳ  ６０１３４９４）及びその中の引用文献；Ｄａｎｉｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，同上；Ｔｏｒａｙａ  ａｎｄ  Ｍｏｒｉ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，３３７２（１９９９）；及びＴｏｂｉｍａｔｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８１，４１１０（１９９９）を参照されたい）。表１を参照すると、タンパク質の１つをコードする遺伝子はｏｒｆＺ、ｄｈａＢ４、ｇｄｒＡ、ｐｄｕＧ及びｄｄｒＡを含む。やはり表１を参照すると、２つのタンパク質の第２のものをコードする遺伝子はｏｒｆＸ、ｏｒｆ２ｂ、ｇｄｒＢ、ｐｄｕＨ及びｄｄｒＢを含む。
【００５９】
「１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ」、「１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼ」又は「ＤｈａＴ」という用語は、３−ＨＰＡと１，３−プロパンジオールの相互転換を触媒することができる酵素活性を担う単数もしくは複数のポリペプチドを指し、但し、そのような活性をコードする単数もしくは複数の遺伝子はその自然の（すなわち野生型の）背景（ｓｅｔｔｉｎｇ）においてデヒドラターゼ酵素に物理的又は転写的に結合していることが見いだされており；例えば該遺伝子はクレブシエラ・ニューモニアエからのｄｈａＴの場合にそうであるようにｄｈａレギュロン内で見いだされる。表１を参照すると、１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼをコードする遺伝子はクレブシエラ・ニューモニアエ、シトロバクテル・フレウンジイ及びクロスツリジウム・パステウリアヌムからのｄｈａＴを含む。これらの遺伝子のそれぞれはＩＩＩ型アルコールデヒドロゲナーゼの群に属するポリペプチドをコードし、保存された鉄−結合モチーフを示し、３−ＨＰＡと１，３−プロパンジオールのＮＡＤ+／ＮＡＤＨ結合相互転換に関する優先性を有する（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｎ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９，２０５０（１９８７）；Ｄａｎｉｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７７，２１５１（１９９５）；及びＬｅｕｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１５４，３３７（１９９７））。類似の物理的性質を有する酵素がラクトバシルス・ブレビス及びラクトバシルス・ブクネリから単離されている（Ｖｅｉｇａ  ｄａ  Ｄｕｎｈａ  ａｎｄ  Ｆｏｓｔｅｒ，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５８，２００５（１９９２））。
【００６０】
「ｄｈａレギュロン」という用語は、デヒドラターゼ活性、再活性化活性及び１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼを含むがこれらに限られない種々の生物学的活性をコードする１組の関連遺伝子又は読取り枠を指す。典型的には、ｄｈａレギュロンは本明細書に記載する読取り枠ｄｈａＲ、ｏｒｆＹ、ｄｈａＴ、ｏｒｆＸ、ｏｒｆＷ、ｄｈａＢ１、ｄｈａＢ２、ｄｈａＢ３及びｏｒｆＺを含む。
【００６１】
「非−特異的触媒活性」という用語は、３−ＨＰＡと１，３−プロパンジオールの相互転換を触媒するのに十分な酵素活性を担う単数もしくは複数のポリペプチドを指し、特に単数もしくは複数の１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼを含む。典型的には、これらの酵素はアルコールデヒドロゲナーゼである。そのような酵素はＮＡＤ+／ＮＡＤＨ以外の補因子を利用することができ、それらにはＦＡＤ又はＦＭＮのようなフラビンが含まれるがこれらに限られない。単数もしくは複数の非−特異的アルコールデヒドロゲナーゼのための単数もしくは複数の遺伝子は、例えば微生物Ｅ．コリＫＬＰ２３内で内因的にコードされ、且つ機能的に発現されることが見いだされる。
【００６２】
「機能」又は「酵素機能」という用語は、特定の化学反応を行うために必要なエネルギーの改変における酵素の触媒活性を指す。そのような活性を、適した条件下で産物又は基質のいずれかの生産が行われ得る平衡における反応に適用し得ることが理解される。
【００６３】
「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は互換的に用いられる。
【００６４】
「炭素基質」及び「炭素源」という用語は、本発明の宿主微生物により代謝され得る炭素源、そして特に単糖類、オリゴ糖類、多糖類及び１−炭素基質又はそれらの混合物より成る群から選ばれる炭素源を指す。
【００６５】
「宿主細胞」又は「宿主微生物」という用語は、異種遺伝子（ｆｏｒｅｉｇｎ  ｏｒ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｇｅｎｅｓ）を受容し、且つこれらの遺伝子を発現して活性な遺伝子産物を生産できる微生物を指す。
【００６６】
「異種遺伝子（ｆｏｒｅｉｇｎ  ｇｅｎｅ）」、「異種ＤＮＡ（ｆｏｒｅｉｇｎ  ＤＮＡ）」、「異種遺伝子（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｇｅｎｅ）及び「異種ＤＮＡ（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ＤＮＡ）」という用語は、種々の手段により宿主微生物内に置かれた、１つの生物にとって自然である（ｎａｔｉｖｅ）遺伝物質を指す。問題の遺伝子は自然に存在する遺伝子、突然変異遺伝子又は合成遺伝子であることができる。
【００６７】
「形質転換」及び「トランスフェクション」という用語は、核酸の導入の後の細胞における新しい遺伝子の獲得を指す。獲得した遺伝子を染色体ＤＮＡ中に組込むか、又は染色体外複製配列として導入することができる。「形質転換細胞」という用語は、形質転換の産物を指す。
【００６８】
「遺伝的に改変された」という用語は、形質転換又は突然変異により遺伝物質を変更するプロセスを指す。
【００６９】
「組換え微生物」及び「形質転換された宿主」という用語は、異種遺伝子又は同種遺伝子（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｇｅｎｅｓ）の余分のコピーを用いて形質転換された微生物を指す。本発明の組換え微生物は、適した炭素基質からの１，３−プロパンジオールの生産のためにグリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ１）、グリセロール−３−ホスファターゼ（ＧＰＰ２）、グリセロールデヒドラターゼ（ｄｈａＢ１、ｄｈａＢ２及びｄｈａＢ３）、デヒドラターゼ再活性化因子（ｏｒｆＺ及びｏｒｆＸ）ならびに場合により１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ（ｄｈａＴ）をコードする異種遺伝子を発現する。好ましい態様は、これらの遺伝子を用いて形質転換されているが機能性ｄｈａＴを欠いているＥ．コリである。開示する遺伝子ならびに特に単数もしくは複数の１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ（ｄｈａＴ）を除く３−ＨＰＡ及び１，３−プロパンジオールの相互転換のための非−特異的触媒活性のための遺伝子を含有するように、Ｅ．コリ以外の宿主微生物を形質転換することもできる。
【００７０】
「遺伝子」は、特定のタンパク質を発現する核酸フラグメントを指し、コード領域に先行する（５’非−コード）及び続く（３’非−コード）調節配列を含む。「自然の」及び「野生−型」という用語は、それ自身の調節配列を有して自然に存在する遺伝子を指す。
【００７１】
「コード（ｅｎｃｏｄｉｎｇ）」及び「コード（ｃｏｄｉｎｇ）」という用語は、遺伝子が転写及び翻訳の機構を介してアミノ酸配列を生産するプロセスを指す。特定のアミノ酸配列をコードするプロセスは、コードされるアミノ酸における変化を引き起こさない塩基の変化を含み得るＤＮＡ配列、あるいは１つもしくはそれより多くのアミノ酸を改変させ得るが、ＤＮＡ配列によりコードされるタンパク質の機能性に影響しない塩基の変化を含むＤＮＡ配列を含むと理解される。従って本発明は特定の代表的配列以上のものを包含すると理解される。
【００７２】
「単離された」という用語は、自然にはそれに伴っている少なくとも１つの成分から取り出されるタンパク質又はＤＮＡ配列を指す。
【００７３】
「単離された核酸分子」は、１本鎖もしくは２本鎖であり、場合により合成の、非−天然の、もしくは改変されたヌクレオチド塩基を含有することができるＲＮＡもしくはＤＮＡのポリマーである。ＤＮＡのポリマーの形態における単離された核酸分子はｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ又は合成ＤＮＡの１つもしくはそれより多いセグメントを含み得る。
【００７４】
「実質的に類似の」は、１つもしくはそれより多くのヌクレオチド塩基における変化が１つもしくはそれより多いアミノ酸の置換を生ずるが、ＤＮＡ配列によりコードされるタンパク質の機能性に影響しない核酸分子を指す。「実質的に類似の」は、１つもしくはそれより多くのヌクレオチド塩基における変化がアンチセンス又は共−抑制法（ｃｏ−ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）により、遺伝子発現の改変を媒介する核酸分子の能力に影響しない核酸分子も指す。「実質的に類似の」は、アンチセンスもしくは共−抑圧法による遺伝子発現の改変あるいは得られるタンパク質分子の機能性の改変を媒介する能力に関連して（ｖｉｓ−ａ−ｖｉｓ）、得られる転写産物の機能性に実質的に影響しない、本発明の核酸分子の修正（例えば１つもしくはそれより多いヌクレオチド塩基の欠失又は挿入）も指す。本発明は特定の代表的配列以上の物を包含する。
【００７５】
例えば与えられる部位において化学的に同等のアミノ酸の生産を生ずるが、コードされるタンパク質の機能性に影響しない遺伝子における改変が普通であることは当該技術分野において周知である。本発明の目的のために、置換を以下の５つの群の１つ内における交換として定義する：
１．小さい脂肪族の、非極性もしくはわずかに極性の残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ（Ｐｒｏ，Ｇｌｙ）；
２．極性の、負に帯電した残基及びそれらのアミド：Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ；
３．極性の、正に帯電した残基：Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ；
４．大きい脂肪族の、非極性残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ（Ｃｙｓ）；及び
５．大きい芳香族残基：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ。
【００７６】
かくして疎水性アミノ酸であるアミノ酸アラニンのためのコドンは別のもっと疎水性の低い残基（例えばグリシン）あるいはもっと疎水性の高い残基（例えばバリン、ロイシンもしくはイソロイシン）をコードするコドンにより置換され得る。同様に、１つの負に帯電した残基の別のもののために代わる置換（例えばグルタミン酸のために代わるアスパラギン酸）あるいは１つの正に帯電した残基の別のものために代わる置換（例えばアルギニンのために代わるリシン）を生ずる変化も機能的に同等の産物を生産すると予測され得る。
【００７７】
多くの場合、タンパク質分子のＮ−末端及びＣ−末端部分の改変を生ずるヌクレオチド変化もタンパク質の活性を改変するとは予測されない。
【００７８】
提案される修正のそれぞれは十分に当該技術分野における日常的熟練の範囲内であり、コードされる産物の生物学的活性の保持の決定もそうである。さらに熟練者には、本発明により包含される実質的に類似の配列が、緊縮条件（０．１ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃ならびに２ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ及び続いて０．１ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを用いる洗浄）下で本明細書に例示する配列とハイブリダイジェーションするそれらの能力によっても定義されることがわかる。本発明の好ましい実質的に類似の核酸フラグメントは、そのＤＮＡ配列が本明細書に報告する核酸フラグメントのＤＮＡ配列と少なくとも８０％同じである核酸フラグメントである。より好ましい核酸フラグメントは、本明細書に報告する核酸フラグメントのＤＮＡ配列と少なくとも９０％同じである。最も好ましいのは、本明細書に報告する核酸フラグメントのＤＮＡ配列と少なくとも９５％同じ核酸フラグメントである。
【００７９】
核酸フラグメントは、１本鎖形態の核酸フラグメントを適した温度及び溶液イオン強度の条件下で他の核酸フラグメントにアニーリングできる場合、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ又はＲＮＡのような別の核酸フラグメントに「ハイブリダイジェーション可能」である。ハイブリダイジェーション及び洗浄条件は周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ（１９８９）、特にその中のＣｈａｐｔｅｒ  １１及びＴａｂｌｅ  １１．１（引用することによりその記載事項全体が本明細書の内容となる）に例示されている。温度及びイオン強度の条件はハイブリダイジェーションの「緊縮性」を決定する。相同核酸に関する予備的スクリーニングのために、５５oのＴｍに対応する、例えば５ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、０．２５％ミルク且つホルムアミドなし；あるいは３０％ホルムアミド、５ＸＳＳＣ、０．５％ＳＤＳの低緊縮性性ハイブリダイジェーション条件を用いることができる。中緊縮性ハイブリダイジェーション条件はもっと高いＴｍ、例えば４０％ホルムアミド及び５Ｘもしくは６ＸＳＳＣに対応する。ハイブリダイジェーションは、２つの核酸が相補配列を含有することを必要とするが、ハイブリダイジェーションの緊縮性に依存して、塩基間のミスマッチが可能である。ハイブリダイジェーションする核酸のための適した緊縮性は、当該技術分野において周知の変数である核酸の長さ及び相補性の程度に依存する。２つのヌクレオチド配列の間の類似性又は相同性の程度が高い程、これらの配列を有する核酸のハイブリッドのためのＴｍの値が大きい。核酸ハイブリダイジェーションの相対的安定性（より高いＴｍに対応する）は以下の順序で低下する：ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡ。長さが１００ヌクレオチドより長いハイブリッドのために、Ｔｍを計算するための式が誘導されている（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，同上，９．５０−９．５１を参照されたい）。比較的短い核酸、すなわちオリゴヌクレオチドを用いるハイブリダイジェーションの場合、ミスマッチの位置がより重要となり、オリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決定する（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，同上，９．５０−９．５１を参照されたい）。１つの態様において、ハイブリダイジェーション可能な核酸のための長さは少なくとも約１０ヌクレオチドである。ハイブリダイジェーション可能な核酸のための好ましい最低の長さは少なくとも約１５ヌクレオチド；より好ましくは少なくとも約２０ヌクレオチドであり；そして最も好ましくは該長さは少なくとも３０ヌクレオチドである。さらに熟練者には、温度及び洗浄溶液塩濃度をプローブの長さのような因子に従って必要通りに調整できることがわかるであろう。
【００８０】
「実質的部分」は、当該技術分野における熟練者による配列の手動の評価又はコンピューター−自動化配列比較及びＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９３）；ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／も参照されたい）のようなアルゴリズムを用いる同定により、ポリペプチド又は遺伝子の推定的同定を与えるのに十分なポリペプチドのアミノ酸配列又は遺伝子のヌクレオチド配列を含むアミノ酸又はヌクレオチド配列を指す。一般に、ポリペプチド又は核酸配列を既知のタンパク質又は遺伝子に相同であると推定的に同定するためには、１０もしくはそれより多い連続アミノ酸又は３０もしくはそれより多いヌクレオチドの配列が必要である。さらにヌクレオチド配列に関し、２０〜３０の連続ヌクレオチドを含む遺伝子−特異的オリゴヌクレオチドプローブを、遺伝子同定の配列−依存的方法（例えばサザンハイブリダイジェーション）及び単離（例えばバクテリアコロニー又はバクテリオファージプラークのその場ハイブリダイジェーション）において用いることができる。さらに、１２〜１５塩基の短いオリゴヌクレオチドをＰＣＲにおける増幅プライマーとして用い、プライマーを含む特定の核酸分子を得ることができる。従って、ヌクレオチド配列の「実質的部分」は、配列を含む核酸分子の特異的同定及び／又は単離を与えるのに十分な配列を含む。本明細書は、１つもしくはそれより多い特定のタンパク質をコードする部分的もしくは完全なアミノ酸及びヌクレオチド配列を記載する。本明細書に報告する配列の恩恵を受ける熟練者は今や、当該技術分野における熟練者に既知の目的のために、開示される配列のすべて又は実質的部分を用いることができる。従って本発明は付随する配列表において報告する完全な配列ならびに上記で限定した配列の実質的部分を含む。
【００８１】
「相補的」という用語は、互いにハイブリダイジェーションすることができるヌクレオチド塩基間の関係を記述する。例えばＤＮＡに関し、アデノシンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。従って本発明は、付随する配列表において報告する完全な配列ならびに実質的に類似の核酸配列に相補的である単離された核酸分子も含む。
【００８２】
当該技術分野において既知の「パーセント同一性」という用語は、配列の比較により決定される２つもしくはそれより多くのポリペプチド配列又は２つもしくはそれより多くのポリヌクレオチド配列の間の関係である。当該技術分野において「同一性」も、場合次第でポリペプチドもしくはポリヌクレオチド配列の列（ｓｔｒｉｎｇｓ）の間の対合により決定されるポリペプチドもしくはポリヌクレオチド配列の間の配列関連性の程度を意味する。「同一性」及び「類似性」は既知の方法により容易に計算することができ、該方法には：Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ；Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，Ｅｄ．；Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ；Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，Ｅｄ．；Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  Ｉ；Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，Ｅｄｓ；Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ；ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ｅｄ．；Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７；及びＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ；Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，Ｅｄｓ．；Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１に記載されている方法が含まれるがこれらに限られない。同一性の決定の好ましい方法は、調べられている配列の間の最大の対合を与えるように設計される。
【００８３】
同一性及び類似性を決定する方法は公共的に入手可能なコンピュータープログラムにおいて系統化されている。２つの配列の間の同一性及び類似性を決定する好ましいコンピュータープログラム法には、ギャップクリエーションペナルティー（ｇａｐ  ｃｒｅａｔｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ）＝１２及びギャップエクステンションペナルティー（ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ）＝４のそれらの標準的デフォールト値を有するＮｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムを用いるＧＣＧプログラムパッケージ中に存在するＧＣＧ  Ｐｉｌｅｕｐプログラム（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：３８７−３９５（１９８４））、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ及びＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４−２４４８（１９８８）が含まれるがこれらに限られない。ＢＬＡＳＴＸプログラムはＮＣＢＩ及び他の供給源から公共的に入手可能である（ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｌ．Ｃｅｎｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｉｎｆ．，Ｎａｔｌ．Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｍｅｄ．（ＮＣＢＩ  ＮＬＭ）ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）；Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ  ａｎｄ  ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：ａ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｐｒｏｇｒａｍｓ”，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２（１９９７））。パーセント同一性の決定のための他の好ましい方法は、Ｊｏｔｕｎ−Ｈｅｉｎアルゴリズムを用いるＤＮＡＳＴＡＲタンパク質整列案の方法による（Ｈｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：６２６−６４５（１９９０））。整列に関するＪｏｔｕｎ−Ｈｅｉｎ法のためのデフォールトパラメーターは：複数の整列の場合、ギャップペナルティー（ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｙ）＝１１、ギャップレングスペナルティー（ｇａｐ  ｌｅｎｇｔｈ  ｐｅｎａｌｔｙ）＝３；対毎の整列の場合、ｋｔｕｐｌｅ＝６である。例えば、参照ヌクレオチド配列への少なくとも例えば９５％の「同一性」を有するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドにより、ポリヌクレオチド配列が参照ヌクレオチド配列の各１００ヌクレオチド当たりに最高で５つの点突然変異を含み得ることを除いて、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が参照配列に同一であることを意味する。言い換えると、参照ヌクレオチド配列に少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るためには、参照配列中のヌクレオチドの最高で５％を欠失させるか、又は他のヌクレオチドで置換することができるか、あるいは参照配列中の合計ヌクレオチドの最高で５％の数のヌクレオチドを参照配列中に挿入することができる。参照配列のこれらの突然変異は、参照ヌクレオチド配列の５’もしくは３’末端位置、あるいはそれらの末端位置の間のどこかに、参照配列内で参照配列中のヌクレオチドの間に個別に、あるいは１つも��くはそれより多い連続した群として散らばって存在することができる。類似して、参照アミノ酸配列に少なくとも例えば９５％の同一性を有するアミノ酸配列を持つポリペプチドにより、ポリペプチド配列が参照アミノ酸の各１００アミノ酸当たりに最高で５つのアミノ酸改変を含み得ることを除いて、ポリペプチドのアミノ酸配列が参照配列に同一であることを意味する。言い換えると、参照アミノ酸配列に少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るためには、参照配列中のアミノ酸残基の最高で５％を欠失させるか、又は他のアミノ酸で置換することができるか、あるいは参照配列中の合計アミノ酸残基の最高で５％の数のアミノ酸を参照配列中に挿入することができる。参照配列のこれらの改変は、参照アミノ酸配列のアミノもしくはカルボキシ末端位置あるいはそれらの末端位置の間のどこかに、参照配列内で参照配列中の残基の間に個別に、又は１つもしくはそれより多い連続した群として散らばって存在することができる。
【００８４】
「同種（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）」という用語は、与えられる宿主細胞において本来の、又は自然に存在するタンパク質又はポリペプチドを指す。本発明は組換えＤＮＡ法を介して同種タンパク質を生産する微生物を含む。
【００８５】
「パーセント相同性」という用語は、ポリペプチド間のアミノ酸配列同一性の程度を指す。第１のアミノ酸配列が第２のアミノ酸配列に同一である場合、第１及び第２のアミノ酸配列は１００％の相同性を示す。２つのポリペプチド間の相同性は、両配列中の与えられる位置において対合するアミノ酸の合計数の一次関数であり、例えば２つの配列の両方におけるアミノ酸の合計数の半分が同じ場合、２つの配列は５０％の相同性を示すと言われる。
【００８６】
「コドン縮重」は、コードされるポリペプチドのアミノ酸配列に影響のないヌクレオチド配列の変動を許す遺伝コードにおける分岐進化（ｄｉｖｅｒｇｅｎｃｅ）を指す。従って本発明は、配列番号：５７に示すアミノ酸配列のすべてもしくは実質的部分をコードするいずれの核酸分子にも関する。熟練者は、与えられるアミノ酸を特定するためのヌクレオチドコドンの使用において特定の宿主細胞により示される「コドン−バイアス」を十分に承知している。従って宿主細胞における発現を向上させるために遺伝子を合成する場合、遺伝子のコドン使用の頻度が宿主細胞の好ましいコドン使用の頻度に近づくように遺伝子を設計するのが望ましい。
【００８７】
得られるタンパク質分子の機能性に実質的に影響しないサイレント変化（ｓｉｌｅｎｔ  ｃｈａｎｇｅｓ）を生ずる配列における欠失、挿入又は置換のような配列への修正も意図されている。例えば遺伝コードの縮重を反映するか、又は与えられる部位において化学的に同等のアミノ酸の生産を生ずる遺伝子配列における改変が意図されている。かくして疎水性アミノ酸であるアミノ酸アラニンのためのコドンを、他の疎水性がより低い残基、例えばグリシン又はより疎水性の残基、例えばバリン、ロイシンもしくはイソロイシンをコードするコドンによって置換することができる。同様に、１つの負に帯電した残基の別のもののために代わる置換、例えばグルタミン酸のために代わるアスパラギン酸の置換、あるいは１つの正に帯電した残基の別のもののために代わる置換、例えばアルギニンのために代わるリシンの置換を生ずる変化も生物学的に同等の産物を生産すると予測される。タンパク質分子のＮ−末端もしくはＣ−末端部分の改変を生ずるヌクレオチド変化もタンパク質の活性を改変するとは予測されない。いくつかの場合には、タンパク質の生物学的活性への改変の影響を研究するために、配列の突然変異体を作るのが実際に望ましいかも知れない。提案される修正のそれぞれは、十分に当該技術分野における日常的熟練の範囲内であり、コードされる産物における生物学的活性の保持の決定もそうである。さらに熟練者には、本発明により包含される配列が緊縮条件（０．１ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃）下で本明細書に例示される配列とハイブリダイジェーションするそれらの能力によっても定義されることがわかる。
【００８８】
「発現」という用語は、遺伝子産物の配列をコードする遺伝子からの遺伝子産物への転写及び翻訳を指す。
【００８９】
「プラスミド」、「ベクター」及び「カセット」という用語は、多くの場合に細胞の中心代謝の一部ではなく、通常は環状２本鎖ＤＮＡ分子の形態にある遺伝子を保有している染色体外要素を指す。そのような要素は、いずれかの源から誘導される１本−もしくは２本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡの線状もしくは環状の自律複製配列、ゲノム組込み配列、ファージ又はヌクレオチド配列であることができ、そこにおいては複数のヌクレオチド配列が適した３’非翻訳配列と共に選ばれた遺伝子産物のためのプロモーターフラグメント及びＤＮＡ配列を細胞中に導入することができる独特の構造に結合もしくは組み合わされている。「形質転換カセット」は、異種遺伝子を含有し且つ異種遺伝子の他に特定の宿主細胞の形質転換を助長する要素を有している特異的（ｓｐｅｃｉｆｉｃ）ベクターを指す。「発現カセット」は、異種遺伝子を含有し且つ異種遺伝子の他に異種宿主におけるその遺伝子の発現の増強を可能にする要素を有している特異的ベクターを指す。
組換え生物の構築
炭素基質の１，３−プロパンジオールへの転換のための酵素的経路をコードするであろう必要な遺伝子を含有する組換え生物を、当該技術分野において周知の方法を用いて構築することができる。グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ１）、グリセロール−３−ホスファターゼ（ＧＰＰ２）、グリセロールデヒドラターゼ（ｄｈａＢ１、ｄｈａＢ２及びｄｈａＢ３）、デヒドラターゼ再活性化因子（ｏｒｆＺ及びｏｒｆＸ）ならびに１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ（ｄｈａＴ）をコードする遺伝子をクレブシエラ又はサッカロミセスのような本来の宿主から単離し、Ｅ．コリＤＨ５α、ＥＣＬ７０７、ＡＡ２００又はＫＬＰ２３のような宿主株の形質転換に用いた。
遺伝子の単離
バクテリアゲノムから所望の遺伝子を得る方法は、分子生物学の分野において普通であり且つ周知である。例えば遺伝子の配列が既知の場合、制限エンドヌクレアーゼ消化により適したゲノムライブラリを作り、所望の遺伝子配列に相補的なプローブを用いてスクリーニングすることができる。配列が単離されたら、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（Ｕ．Ｓ．４，６８３，２０２）のような標準的プライマー指向増幅法（ｐｒｉｍｅｒ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄｓ）を用いてＤＮＡを増幅し、適したベクターを用いる形質転換に適した量のＤＮＡを得ることができる。
【００９０】
あるいは又、ゲノムＤＮＡの大きなセグメント（３５〜４５ｋｂ）がベクター中に詰込まれていることができるコスミドライブラリを作り、適した宿主の形質転換に用いることができる。コスミドベクターは大量のＤＮＡを収容できる点で独特である。一般にコスミドベクターは、異種ＤＮＡの詰込み及び続く環状化に必要なｃｏｓＤＮＡ配列の少なくとも１つのコピーを有する。これらのベクターはｃｏｓ配列の他に、ＣｏｌＥｌのような複製起点及びアンピシリン又はネオマイシンに対して耐性の遺伝子のような薬剤耐性マーカーも含有しているであろう。適したバクテリア宿主の形質転換のためのコスミドベクターの使用法は、引用することによりその記載事項が本明細書の内容となるＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓに十分に記載されている。
【００９１】
典型的には、コスミドをクローニングするために、適した制限エンドヌクレアーゼを用いて異種ＤＮＡを単離し、コスミドベクターのｃｏｓ領域に隣接して連結する。線状化された異種ＤＮＡを含有するコスミドベクターを次いでバクテリオファージのようなＤＮＡ詰込み伝達体と反応させる。詰込みプロセスの間にｃｏｓ部位は切断され、異種ＤＮＡが細菌ウィルス粒子の頭部内に詰込まれる。次いでこれらの粒子を用いてＥ．コリのような適した宿主細胞をトランスフェクションする。細胞中に注入されると、異種ＤＮＡはｃｏｓ付着末端の影響下で環状化する。この方法で異種ＤＮＡの大きなセグメントを導入し、組換え宿主細胞において発現させることができる。
グリセロールデヒドラターゼ（ｄｈａＢ１、ｄｈａＢ２及びｄｈａＢ３）、デヒドラターゼ再活性化因子（ｏｒｆＺ及びｏｒｆＸ）ならびに１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼ（ｄｈａＴ）をコードする遺伝子の単離及びクローニング
本発明の範囲内でコスミドベクター及びコスミド形質転換法を用い、グリセロールを１，３−プロパンジオールに処理（ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）することができる遺伝子を保有していることが既知のバクテリア属から、ゲノムＤＮＡの大きなセグメントをクローニングした。特定的には、Ｋ．ニューモニアエからのゲノムＤＮＡを当該技術分野において周知の方法により単離し、コスミドベクターＳｕｐｅｒｃｏｓ  １中への挿入のために制限酵素Ｓａｕ３Ａを用いて消化し、ＧｉｇａｐａｃｋＩＩ詰込み抽出物を用いて詰込んだ。ベクターの構築に続き、コスミドＤＮＡを用いてＥ．コリＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲ細胞を形質転換した。グリセロールの存在下で細胞を成長させ、１，３−プロパンジオール生成に関して培地を分析することにより、グリセロールを１，３−プロパンジオールに転換する能力に関して形質転換細胞をスクリーニングした。
【００９２】
１，３−プロパンジオール陽性形質転換細胞の２つを分析し、コスミドをｐＫＰ１及びｐＫＰ２と命名した。ＤＮＡ配列決定は、Ｃ．フレウンジイからのグリセロールデヒドラターゼ遺伝子への広範囲の相同性を明らかにし、これらの形質転換細胞がグリセロールデヒドラターゼ遺伝子をコードするＤＮＡを含有することを示した。他の１，３−プロパンジオール陽性形質転換細胞を分析し、コスミドをｐＫＰ４及びｐＫＰ５と命名した。ＤＮＡ配列決定は、これらのコスミドがジオールデヒドラターゼ遺伝子をコードするＤＮＡを保有していることを明らかにした。
【００９３】
本発明はクレブシエラコスミド内からの単離された遺伝子を使用しているが、デヒドラターゼ遺伝子及びデヒドラターゼ再活性化因子遺伝子の代替え的供給源には、これらに限られるわけではないがシトロバクテル、クロスツリジア及びサルモネラが含まれる（表１を参照されたい）。
Ｇ３ＰＤＨ及びＧ３Ｐホスファターゼをコードする遺伝子
本発明は宿主細胞におけるＧ３ＰＤＨ及びＧ３Ｐホスファターゼ活性の発現に適した遺伝子を提供する。
【００９４】
Ｇ３ＰＤＨをコードする遺伝子は既知である。例えばＧＰＤ１はサッカロミセスから単離され、配列番号：５３に示す塩基配列を有しており、配列番号：５４に示すアミノ酸配列をコードする（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，同上）。同様に、ＧＰＤ２によりコードされるＧ３ＰＤＨ活性もサッカロミセスから単離されている（Ｅｒｉｋｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１７，９５（１９９５））。
【００９５】
本発明の目的のために、ＮＡＤＨ−依存性Ｇ３ＰＤＨ活性を担うポリペプチドをコードするいずれの遺伝子も適していることが意図されており、ここでその活性はジヒドロキシアセトンリン酸（ＤＨＡＰ）のグリセロール−３−リン酸（Ｇ３Ｐ）への転換を触媒することができる。さらに、遺伝子ＤＡＲ１、ＧＰＤ１、ＧＰＤ２、ＧＰＤ３及びｇｐｓＡに対応する、ＮＡＤＨ−依存性Ｇ３ＰＤＨ’ｓのアミノ酸配列をコードするいずれの遺伝子も本発明において機能性であろうことが意図されており、ここでそのアミノ酸配列は酵素の機能を改変しないアミノ酸置換、欠失もしくは付加を包含していることができる。熟練者には、他の供給源から単離されるＧ３ＰＤＨをコードする遺伝子も本発明で用いるのに適しているであろうことがわかるであろう。Ｇ３Ｐホスファターゼをコードする遺伝子は既知である。例えばＧＰＰ２はサッカロミセス・セレビシアエから単離され、配列番号：５５により示される塩基配列を有しており、それは配列番号：５６に示されるアミノ酸配列をコードする（Ｎｏｒｂｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１，１３８７５（１９９６））。
【００９６】
本発明の目的のために、Ｇ３Ｐホスファターゼ活性をコードするいずれの遺伝子も方法において用いるのに適しており、ここでその活性はグリセロール−３−リン酸とＨ2Ｏのグリセロールと無機リン酸塩への転換を触媒することができる。さらに、Ｇ３Ｐホスファターゼ酵素の機能を改変しないアミノ酸置換、欠失もしくは付加を包含するアミノ酸配列を含んで、遺伝子ＧＰＰ２及びＧＰＰ１に対応するＧ３Ｐホスファターゼのアミノ酸配列をコードするいずれの遺伝子も本発明において機能性であろう。熟練者には、他の供給源から単離されるＧ３Ｐホスファターゼをコードする遺伝子も本発明で用いるのに適していることがわかるであろう。
宿主細胞
１，３−プロパンジオールの組換え体生産のために適した宿主細胞は原核性又は真核性であることができ、１，３−プロパンジオール経路のための活性な酵素を発現する宿主細胞の能力によってのみ制限されるであろう。適した宿主細胞はバクテリア、例えばシトロバクテル、エンテロバクテル、クロスツリジウム、クレブシエラ、アエロバクテル、ラクトバシルス、アスペルギルス、サッカロミセス、シゾサッカロミセス、チゴサッカロミセス、ピチア、クルイベロミセス、カンジダ、ハンセヌラ、デバリオミセス、ムコル、トルロプシス、メチロバクテル、エシェリキア、サルモネラ、バシルス、ストレプトミセス及びシュードモナスであろう。本発明において好ましいのはＥ．コリ、Ｅ．ブラッタエ（Ｅ．ｂｌａｔｔａｅ）、クレブシエラ、シトロバクテル及びアエロバクテルである。
【００９７】
以下の一般的案を用いることにより、微生物を高力価１，３−プロパンジオール生産者に転換することができる。
【００９８】
１．１〜２Ｍの１，３−プロパンジオールの存在下で毒性量もしくは阻害量の３−ＨＰＡの定常状態濃度を可能にする内因性ｄｈａＴ−様活性の、宿主となる可能性のある生物中における存在を決定する。
【００９９】
２．宿主となる可能性のある生物中にそのような活性が存在したら、この活性を欠失させるか、もしくは不活性化するために適した突然変異誘発を行う。非−機能性もしくは欠失したｄｈａＴ−様活性の確証は、１〜２Ｍの１，３−プロパンジオールの存在下における３−ＨＰＡ堆積がないことにより検出され得る。
【０１００】
３．ａ）グリセロールが炭素源でない場合、グリセロール生産、ｂ）グリセロールデヒドラターゼ及び付随する保持システムのための適した遺伝子ならびにｃ）ｙｑｈＤを発現させる。
【０１０１】
ある微生物に関して払われる必要がある考慮は、１，３−プロパンジオール生産のための条件下における内因性ｄｈａＴ−様酵素の発現もしくは抑制に関してである。これらにはグリセロール、グルコース又は嫌気性（ａｎａｅｒｏｂｉｓｉｓ）の存在も含まれる。
ベクター及び発現カセット
本発明は、Ｇ３ＰＤＨ、Ｇ３Ｐホスファターゼ、デヒドラターゼ及びデヒドラターゼ再活性化因子の適した宿主細胞中へのクローニング、形質転換及び発現に適した多様なベクターならびに形質転換及び発現カセットを提供する。適したベクターは用いられる微生物と適合性のものであろう。例えばバクテリア、ウィルス（例えばバクテリオファージＴ７又はＭ−１３由来ファージ）、コスミド、酵母又は植物から適したベクターを誘導することができる。そのようなベクターを得、用いるための案は当該技術分野における者に既知である（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ−ｖｏｌｕｍｅｓ  １，２，３（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９））。
【０１０２】
典型的には、ベクター又はカセットは適した遺伝子の転写及び翻訳を支配する配列、選択マーカー及び自律複製又は染色体組込みを可能にする配列を含有する。適したベクターは転写開始調節を宿している遺伝子の領域５’及び転写の終結を調節するＤＮＡフラグメントの領域３’を含む。両調節領域が、形質転換される宿主細胞に同種である遺伝子に由来する場合に最も好ましい。そのような調節領域は生産宿主として得られる特定の種に本来の（ｎａｔｉｖｅ）遺伝子に由来する必要はない。
【０１０３】
所望の宿主細胞中におけるＧ３ＰＤＨ及びＧ３Ｐホスファターゼ遺伝子（それぞれＤＡＲ１及びＧＰＰ２）の発現を推進するのに有用な開始調節領域又はプロモーターは多数であり、当該技術分野における熟練者に良く知られている。これらの遺伝子を推進できる実質的にいずれのプロモーターも本発明に適しており、ＣＹＣ１、ＨＩＳ３、ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、ＡＤＨ１、ＰＧＫ、ＰＨＯ５、ＧＡＰＤＨ、ＡＤＣ１、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＥＮＯ及びＴＰＩ（サッカロミセス中における発現に有用）；ＡＯＸ１（ピチア中における発現に有用）；ならびにｌａｃ、ｔｒｐ、λＰL、λＰR、Ｔ７、ｔａｃ及びｔｒｃ（Ｅ．コリ中における発現に有用）が含まれるがこれらに限られない。
【０１０４】
終結調節領域も好ましい宿主に本来の種々の遺伝子に由来し得る。場合により終結部位は不必要であり得る；しかしながら含まれるとしたらそれが最も好ましい。
【０１０５】
本酵素の有効な発現のために、発現が適したメッセンジャーＲＮＡの形成を生ずるように、酵素をコードするＤＮＡを開始コドンを介して選ばれた発現調節領域に操作可能に結合させる。
【０１０６】
本発明において特に有用なのはベクターｐＤＴ２９及びｐＫＰ３２であり、それらはｐＡＨ４８と一緒に用いられるように設計されている。ｐＤＴ２９及びｐＫＰ３２の本質的要素はクレブシエラ・ニューモニアエから単離されたｄｈａレギュロンに由来する。ｐＤＴ２９は、その配列が配列番号：１内に含有されているヌクレオチドである読取り枠ｄｈａＲ、ｏｒｆＹ、ｄｈａＴ、ｏｒｆＸ、ｏｒｆＷ、ｄｈａＢ１、ｄｈａＢ２及びｄｈａＢ３を含有する。ｐＫＰ３２は同じ供給源からの、ｐＤＴ２９上に存在すると同じ読取り枠の組を含有し、ｐＫＰ３２にはｄｈａＴが欠けていることが異なる。ｐＡＨ４８は宿主細胞中にＤＡＲ１及びＧＰＰ２遺伝子を導入するために用いられる伝達体であり、さらに特定的にはサッカロミセス・セレビシアエから単離されるＤＡＲ１及びＧＰＰ２遺伝子を含む。
１，３−プロパンジオールの生産のための適した宿主の形質転換及び遺伝子の発現
適したカセットが構築されると、それらは適した宿主細胞の形質転換に用いられる。Ｇ３ＰＤＨ、Ｇ３Ｐホスファターゼ、デヒドラターゼ及びデヒドラターゼ再活性化因子をコードする遺伝子を含有するカセットの宿主細胞中への導入は既知の方法により、例えば形質転換（例えばカルシウム−透過細胞（ｃａｌｃｉｕｍ−ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚｅｄ  ｃｅｌｌ）、エレクトロポレーションを用いる）により、あるいは組換えファージウィルスを用いるトランスフェクションにより行うことができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，同上）。
【０１０７】
本発明においては、一般的方法及び実施例に十分に記載する通り、カセットを用いてＥ．コリを形質転換した。
突然変異体
本方法が、例示する細胞の他に、１，３−プロパンジオールの生産を増強するように特別に設計された１つもしくは複数の突然変異を有する細胞を利用できるであろうことが意図されている。通常は炭素供給材料を非−生産的経路に転じるか、あるいは有意なカタボライト抑制を示す細胞を、これらの表現型の欠点（ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｉｅｓ）を避けるように突然変異させることができた。例えば多くの野生型細胞は培地中のグルコース及び副産物からのカタボライト抑制を受け易く、グルコース抑制に対して耐性である１，３−プロパンジオール生産の可能なこれらの野生型生物の突然変異株が本発明において特に有用であろうことが意図されている。
【０１０８】
突然変異体を作る方法は当該技術分野において普通且つ周知である。例えば野生型細胞を放射線又は化学的突然変異原のような多様な作因に暴露し、次いで所望の表現型に関してスクリーニングすることができる。放射線を介して突然変異を作る場合、紫外（ＵＶ）又は電離線を用いることができる。遺伝子突然変異のために適した短波ＵＶ波長は２００ｎｍ〜３００ｎｍの範囲内に含まれ、２５４ｎｍが好ましいであろう。この波長内のＵＶ線は主にグアニジン及びシトシンからアデニン及びチミジンまでの核酸配列内で変化を引き起こす。すべての細胞はほとんどのＵＶ誘導突然変異を修復するＤＮＡ修復機構を有しているので、修復プロセスを中断させて有効な突然変異の数を最大にするためにカフェイン及び他の阻害剤のような試薬を加えることができる。３００ｎｍ〜４００ｎｍ領域内の光を用いる長波ＵＶ突然変異も可能であるが、一般にＤＮＡと相互作用するプソラレン染料のような種々の活性化剤と一緒に用いないと短波ＵＶ光程有効でない。  化学的薬剤を用いる突然変異誘発も突然変異体の形成に有効であり、通常用いられる物質には非複製ＤＮＡに影響する化学品、例えばＨＮＯ2及びＮＨ2ＯＨならびに複製ＤＮＡに影響する薬剤、例えばフレームシフト突然変異を引き起こすことで注目され得るアクリジン染料が含まれる。放射線又は化学的薬剤を用いて突然変異体を作るための特定的方法は当該技術分野において十分に実証されている。例えば引用することによりその記載事項が本明細書の内容となるＴｈｏｍａｓ  Ｄ．Ｂｒｏｃｋ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）  Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，Ｍ．Ａ．又はＤｅｓｈｐａｎｄｅ，Ｍｕｋｕｎｄ  Ｖ．，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３６，２２７（１９９２）を参照されたい。
【０１０９】
突然変異誘発が起こった後、所望の表現型を有する突然変異体を種々の方法により選択することができる。所望の産物もしくは中間体を生産する能力に関して突然変異誘発された細胞を選択する場合、ランダムスクリーニングが最も普通である。あるいは又、突然変異誘発された集団を耐性のコロニーのみが成長できる選択培地上で成長させることにより、突然変異体の選択的単離を行うこともできる。突然変異体選択の方法は高度に開発され、且つ工業的微生物学の分野において周知である。例えばＢｒｏｃｋ，同上；ＤｅＭａｎｃｉｌｈａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．１４，３１３（１９８４）を参照されたい。
【０１１０】
望ましくない酵素活性の除去も酵素をコードする遺伝子の破壊により行うことができる。そのような方法は当該技術分野における熟練者に既知であり、実施例４及び実施例８で例示する。
１，３−プロパンジオール生産経路における改変
代表的酵素経路。グルコースからの１，３−プロパンジオールの生産は以下の系列の段階により行われ得る。この系列は当該技術分野における熟練者に既知の複数の経路の代表であり、図５に示されている。１系列の段階においてグルコースが解糖経路の酵素によりジヒドロキシアセトンリン酸（ＤＨＡＰ）と３−ホスホ−グリセルアルデヒド（３−ＰＧ）に転換される。次いでＤＨＡＰのジヒドロキシアセトン（ＤＨＡ）への加水分解及び続く還元あるいはＤＨＡＰのグリセロール３−リン酸（Ｇ３Ｐ）への還元及び続く加水分解によりグリセロールが生成する。加水分解段階は、それらの基質に関して非−特異的であることが知られているいずれかの数の細胞ホスファターゼにより触媒され得るか、あるいは組換えにより活性を宿主中に導入することができる。還元段階はＮＡＤ+（又はＮＡＤＰ+）結合宿主酵素により触媒され得るか、あるいは組換えにより宿主中に活性を導入することができる。ｄｈａレギュロンが式３の可逆的反応を触媒するグリセロールデヒドロゲナーゼ（Ｅ．Ｃ．１．１．１．６）を含有することは注目に値する。
【０１１１】
グリセロール→３−ＨＰＡ＋Ｈ2Ｏ                            （式１）
３−ＨＰＡ＋ＮＡＤＨ＋Ｈ+→１，３−プロパンジオール＋ＮＡＤ+   （式２）
グリセロール＋ＮＡＤ+→ＤＨＡ＋ＮＡＤＨ＋Ｈ+                   （式３）
上記で詳細に記載した通り、グリセロールは中間体３−ヒドロキシプロピオンアルデヒド（３−ＨＰＡ）を介して１，３−プロパンジオールに転換される。中間体３−ＨＰＡは宿主によりコードされ得るか、又は組換えにより宿主中に導入され得るデヒドラターゼ酵素によりグリセロールから生産される、式１。このデヒドラターゼはグリセロールデヒドラターゼ（Ｅ．Ｃ．４．２．１．３０）、ジオールデヒドラターゼ（Ｅ．Ｃ．４．２．１．２８）又はこの変換を触媒することができる他のいずれかの酵素であることができる。グリセロールデヒドラターゼはｄｈａレギュロンによりコードされるが、ジオールデヒドラターゼはコードされない。１，３−プロパンジオールはＮＡＤ+−（もしくはＮＡＤＰ+）結合宿主酵素により３−ＨＰＡから生産されるか、あるいは組換えにより活性を宿主中に導入することができる、式２。１，３−プロパンジオールの生産におけるこの最終的反応は１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼ（Ｅ．Ｃ．１．１．１．２０２）又は他のアルコールデヒドロゲナーゼにより触媒され得る。
炭素チャンネリングに影響する突然変異及び形質転換。１，３−プロパンジオール生産経路における変異を含む多様な突然変異微生物が本発明において有用であろう。例えばトリオースリン酸イソメラーゼ突然変異（ｔｐｉ−）の本発明の微生物中への導入は、炭素チャンネリングにより性能を向上させるための突然変異の利用の例である。トリオースリン酸イソメラーゼはＤＡＨＰの３−ホスホグリセルアルデヒドへの転換を担う酵素であり、そのままではグルコースからグリセロール及び１，３−プロパンジオールへの主経路からの炭素の流れの分岐を許す（図５）。かくして欠失突然変異（ｔｐｉ−）は当該技術分野において記載されている効率を越えて所望の経路の全体的代謝効率を増強する。同様に、１，３−プロパンジオール生産経路の中間体に関する別の経路を遮断する突然変異も本発明にとって有用であろう。例えばグリセロールキナーゼの除去はＧ３Ｐホスファターゼの作用によりＧ３Ｐから生成するグリセロールがＡＴＰを失ってＧ３Ｐに再−転換されるのを妨げる（図５）。又、グリセロールデヒドロゲナーゼ（例えばｇｌｄＡ）の除去は、ＮＡＤＨ−依存性グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼの作用によりＤＨＡＰから生成するグリセロールがジヒドロキシアセトンに転換されるのを妨げる（図５）。突然変異を構造遺伝子に向け、酵素活性の活性を損なうか、もしくは向上させることができるか、あるいはプロモーター領域及びリボソーム結合部位を含むを含む調節遺伝子に向け、酵素活性の発現レベルを調節することができる。
【０１１２】
かくして形質転換及び突然変異を組合わせ、１，３−プロパンジオール生産の増強のために特定の酵素活性を調節することが意図されている。かくして１，３−プロパンジオールの生産を向上させる全細胞触媒の修正を予定する（ａｎｔｉｃｉｐａｔｅ）ことは本発明の範囲内である。
【０１１３】
本発明は、炭素の流れがグルコースからＤＨＡＰ、Ｇ３Ｐ、グリセロール、３−ＨＰＡ及び最終的に１，３−プロパンジオールに動く、糖基質からの１，３−プロパンジオールの生産のための好ましい経路を利用する。本生産株は、炭素の非−生産的化合物への分岐を妨げる種々の欠失突然変異を導入することにより、経路の代謝効率を最大にするように操作されている。上記の通りグリセロールは、グリセロールデヒドロゲナーゼ又はグリセロールキナーゼを介するＤＨＡ又はＧ３Ｐへの変換により、３ＨＰＡへの転換から分岐させられ得る（図５）。従って、本生産株はｇｌｄＡ及びｇｌｐＫ遺伝子における欠失突然変異を含有する。同様に、ＤＨＡＰはトリオースリン酸イソメラーゼによって３−ＰＧに分岐させられ得、かくして本生産微生物はこの遺伝子における欠失突然変異も含有する。本方法にはさらにグリセロールの３ＨＰＡへの転換のためのデヒドラターゼ酵素も導入され、それはｄｈａレギュロンのｏｒｆＸ及びｏｒｆＺによりコードされる再活性化因子と共同して機能する（図５）。３ＨＰＡの１，３−プロパンジオールへの転換は典型的には１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼを介して行われるが、本方法は最終的産物である１，３−プロパンジオールのより高い力価及び収率を与える非−特異的触媒活性を利用する（図５）。そのような方法では、２００ｇ／Ｌの力価が期待される場合に少なくとも１０ｇ／Ｌの１，３−プロパンジオールの力価が達成される。
【０１１４】
あるいは又、１，３−プロパンジオール生産のための改良法は基質としてグリセロール又はジヒドロキシアセトンを利用することができ、その場合経路は最後の３つの基質、グリセロール→３ＨＰＡ→１，３−プロパンジオールのみを含む。そのような方法では、非−特異的触媒活性（アルコールデヒドロゲナーゼであることが予測される）が支持されてオキシドレダクターゼがやはり排除されるが、欠失突然変異の必要は、培養にグリセロールを加えることのエネルギーの考慮により取り消される。そのような方法では、２００ｇ／Ｌの力価が期待される場合に少なくとも７１ｇ／Ｌの１，３−プロパンジオールの力価が達成される。
【０１１５】
同様に、改良された１，３−プロパンジオール生産者を作るために、ｄｈａＴ活性の欠失又は突然変異により修正されている野生型微生物の突然変異体を提供することは、本発明の範囲内である。例えば自然にはｄｈａレギュロンのすべての要素を含有する微生物を操作し、１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ活性をコードするｄｈａＴ遺伝子を不活性化することができる。これらの微生物は、アルコールデヒドロゲナーゼであることが予測される内因性触媒活性の存在により媒介され、１，３−プロパンジオールのより高い収率及び力価を与えるであろうことが予測される。そのような微生物の例にはクレブシエラ種、シトロバクテル種及びクロスツリジウム種が含まれるがこれらに限られない。
培地及び炭素基質
本発明における発酵培地は適した炭素基質を含有しなければならない。適した基質には単糖類、例えばグルコース及びフルクトース、オリゴ糖類、例えばラクトース又はスクロース、多糖類、例えば澱粉又はセルロースあるいはそれらの混合物ならびに再生可能な供給材料、例えばチーズホエー透過物、コーンスティープリカー（ｃｏｒｎｓｔｅｅｐ  ｌｉｑｕｏｒ）、てんさいの糖みつ及び大麦の麦芽からの非精製混合物が含まれ得るがこれらに限られない。さらに炭素基質は１−炭素基質、例えば二酸化炭素又はメタノールであることもでき、それに関しては重要生化学的中間体への代謝的転換が示されている。１炭素源（例えばメタノール、ホルムアルデヒド又はギ酸塩）からのグリセロール生産はメチロトローフイースト（ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｙｅａｓｔｓ）（Ｋ．Ｙａｍａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５３（２），５４１−５４３（１９８９））及びバクテリア（Ｈｕｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２４，４１４８−４１５５（１９８５））において報告されている。これらの微生物はメタンからギ酸塩までの酸化状態における範囲の１炭素化合物を同化し、グリセロールを生産することができる。炭素同化の経路はリブロース一リン酸を介するか、セリンを介するか、あるいはキシルロース−一リン酸を介するものであることができる（Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋ，Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８６））。リブロース一リン酸経路は、６−炭素糖を生成するギ酸塩とリブロース−５−リン酸との縮合を含み、６−炭素糖はフルクトース及び結局は３−炭素産物であるグリセルアルデヒド−３−リン酸となる。同様に、セリン経路は１−炭素化合物をメチレンテトラヒドロフォレートを介して解糖経路中に同化する。
【０１１６】
１及び２炭素基質の他に、メチロトローフ微生物は複数の他の炭素−含有化合物、例えばメチルアミン、グルコサミン及び多様なアミノ酸を代謝活性のために使用することも知られている。例えばメチロトローフ酵母はメチルアミンからの炭素を使用してトレハロース又はグリセロールを生成させることが知られている（Ｂｅｌｌｉｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂ．Ｇｒｏｗｔｈ  Ｃ１  Ｃｏｍｐｄ．，［Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］，７ｔｈ（１９９３），４１５−３２．Ｅｄｉｔｏｒ（ｓ）：Ｍｕｒｒｅｌｌ，Ｊ．Ｃｏｌｌｉｎ；Ｋｅｌｌｙ，Ｄｏｎ  Ｐ．Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：Ｉｎｔｅｒｃｅｐｔ，Ａｎｄｏｖｅｒ，ＵＫ）。同様に、カンジダの種々の種はアラニン又はオレイン酸を代謝するであろう（Ｓｕｌｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１５３（５），４８５−４８９（１９９０））。従って、本発明で使用される炭素の源は多様な炭素−含有基質を含むことができ、微生物又はプロセスの選択のみによって制限されるであろうことが意図されている。
【０１１７】
上記で挙げた炭素基質及びそれらの混合物（共−供給材料）のすべてが本発明において適していることが意図されているが、好ましい炭素基質は、プロセスが内因性グリセロールを生産することを目的としている場合はグルコース、フルクトース、スクロース又はメタノールであり、プロセスがグリセロール又はジヒドロキシアセトン供給材料を予定している場合はグリセロール又はジヒドロキシアセトンである。
【０１１８】
発酵培地は、適した炭素源の他に適した無機物、塩、補因子、緩衝剤及び当該技術分野における熟練者に既知の、培養物の成長及び１，３−プロパンジオール生産のために必要な酵素経路の促進に適した他の成分を含有しなければならない。Ｃｏ（ＩＩ）塩及び／又はビタミンＢ12又はそれらの前駆体が特に注目される。
【０１１９】
アデノシル−コバラミン（補酵素Ｂ12）はデヒドラターゼ活性のために必須の補因子である。補酵素Ｂ12の合成は原核生物、例えばエシェリキア・ブラッタエ、クレブシエラ種、シトロバクテル種及びクロスツリジウム種において見いだされ、そのいくつかは初めから該化合物を合成することができ、他は部分的反応を行うことができる。例えばＥ．コリはコリン環構造を組み立てることができないが、コビンアミドのコリノイドへの転換を触媒することができ、５’−デオキシアデノシル基を導入することができる。かくしてＥ．コリ発酵においては補酵素Ｂ12前駆体、例えばビタミンＢ12を与えることが必要であることが当該技術分野において既知である。
【０１２０】
Ｅ．コリ発酵へのビタミンＢ12添加物は連続的に、一定の速度で、又は細胞塊の生成と符合するように段階的に（ｓｔａｇｅｄ）加えることができるか、あるいは１つの、もしくは複数のボーラス添加物として加えることができる。細胞塊（ＯＤ５５０）に供給されるビタミンＢ12（ｍｇ）の好ましい比率は０．０６〜０．６０である。細胞塊（ＯＤ５５０）に供給されるビタミンＢ12（ｍｇ）の最も好ましい比率は０．１２〜０．４８である。
【０１２１】
本発明の形質転換されたＥ．コリにはビタミンＢ12が加えられるが、初めからＢ12を生合成できる他の微生物も適した生産細胞であり、これらの微生物へのＢ12の添加は不必要であろうことが意図されている。
培養条件：
典型的には、適した培地中において３５℃で細胞を成長させる。本発明における好ましい成長培地は普通の商業的に調製される培地、例えばＬｕｒｉａ  Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）ブイヨン、Ｓａｂｏｕｒａｕｄ  Ｄｅｘｔｒｏｓｅ（ＳＤ）ブイヨン又はＹｅａｓｔ培地（ＹＭ）ブイヨンである。他の限定された（ｄｅｆｉｎｅｄ）、又は合成の成長培地も用いることができ、特定の微生物の成長に適した培地は微生物学又は発酵科学の技術分野における熟練者に既知であろう。カタボライト抑制を直接もしくは間接的に調節することが知られている薬剤、例えばサイクリックアデノシン２’：３’−一リン酸の使用を反応培地中に導入することもできる。同様に、１，３−プロバンジオール生産の増強に導く酵素活性を調節することが知られている薬剤（例えばメチルビオローゲン）の使用を遺伝子操作と一緒に、もしくはその代りに用いることができる。
【０１２２】
発酵のために適したｐＨ範囲はｐＨ５．０〜ｐＨ９．０であり、ｐＨ６．０〜ｐＨ８．０が初期条件として好ましい。
【０１２３】
反応は好気的もしくは嫌気的条件下で行うことができ、嫌気的もしくは微好気的条件が好ましい。
【０１２４】
制限された、もしくは過剰の炭素供給材料、例えばグルコースを用いてフェド−バッチ発酵を行うことができる。
バッチ及び連続発酵：
本プロセスは発酵のバッチ法を用いる。古典的なバッチ発酵は、培地の組成が発酵の開始時に設定され、発酵の間に人工的な改変に合わない閉鎖系である。かくして発酵の開始時に培地に所望の１種もしくは複数種の微生物を接種し、系に何も加えずに発酵を起こさせる。しかしながら、典型的には「バッチ」発酵は炭素源の添加に関するバッチであり、多くの場合、ｐＨ及び酸素濃度のような因子の制御における試みが成される。バッチ系では、系の代謝産物及びバイオマス組成が発酵が止められる時点まで一定に変化する。バッチ培養内では、細胞が静的誘導期を介して高成長対数期に、そして最後に成長速度が減じるか又は止まる定常期に加減する（ｍｏｄｅｒａｔｅ）。処理されないと、定常期における細胞は終局的に死ぬであろう。対数期における細胞は一般に最終的産物もしくは中間体の生産の大部分を担う。
【０１２５】
標準的バッチ系への変法がフェド−バッチ系である。フェド−バッチ発酵法も本発明において適しており、発酵の進行と共に基質を増加させて加えることを除いて、典型的なバッチ系を含んでいる。フェド−バッチ系は、カタボライト抑制が細胞の代謝を阻害する傾向がある場合、及び培地中に限られた量の基質があることが望ましい場合に有用である。フェド−バッチ系における実際の基質濃度の測定は困難であり、従って測定可能な因子、例えばｐＨ、溶解酸素及びＣＯ2のような廃ガスの分圧の変化に基づいて見積もられる。バッチ及びフェド−バッチ発酵は当該技術分野において普通且つ周知であり、Ｂｒｏｃｋ，同上に例を見いだすことができる。
【０１２６】
本発明はバッチ様式で行われるが、該方法を連続発酵法に適応させ得ることが意図されている。連続発酵は、限定された発酵培地がバイオリアクターに連続的に加えられ、等量の条件調節された培地（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ  ｍｅｄｉａ）が処理のために同時に取り出される開放系である。連続発酵は一般に、細胞が主に対数期成長にある一定の高い密度に培養を保持する。
【０１２７】
連続発酵は、細胞成長又は最終的産物濃度に影響する１つの因子もしくはいくつかの因子の調節を可能にする。例えば１つの方法は炭素源又は窒素レベルのような制限栄養素を固定された比率に保持し、他のすべてのパラメーターの加減を許すであろう。他の系では、培地の濁度により測定される細胞濃度を一定に保ちながら、成長に影響する複数の因子を連続的に変えることができる。連続系は定常状態成長条件を保持するように努め、かくして培地が取り出される故の細胞の損失を発酵における細胞成長速度に対して釣り合わせねばならない。連続発酵法のための栄養素及び成長因子の調節の方法ならびに産物生成の速度を最大にするための方法は工業的微生物学の技術分野において周知であり、多様な方法がＢｒｏｃｋ，同上に詳細に記載されている。
【０１２８】
本発明をバッチ、フェド−バッチ又は連続法を用いて実行できること、ならびに発酵のいずれの既知の様式も適していることが意図されている。さらに、細胞を全細胞触媒として基質上に固定化し、１，３−プロパンジオール生産のための発酵条件に供することができることが意図されている。
１，３−プロパンジオールの同定及び精製：
発酵培地からの１，３−プロパンジオールの精製法は当該技術分野において既知である。例えば有機溶媒を用いる抽出、蒸留及びカラムクロマトグラフィーに反応混合物を供することにより、細胞培地からプロパンジオールを得ることができる（Ｕ．Ｓ．５，３５６，８１２）。この方法のために特に優れた有機溶媒はシクロヘキサンである（Ｕ．Ｓ．５，００８，４７３）。
【０１２９】
培地を高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析にかけることにより、１，３−プロパンジオールを直接同定することができる。本発明において好ましいのは、無勾配様式で０．０１Ｎ硫酸の移動相を用いる分析的イオン交換カラム上で発酵培地を分析する方法である。
【０１３０】
【実施例】
一般的方法
リン酸化、連結及び形質転換のための方法は当該技術分野において周知である。以下の実施例において用いるのに適した方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）に見いだされ得る。
【０１３１】
バクテリア培養の保持及び成長に適した材料及び方法は当該技術分野において周知である。以下の実施例において用いるのに適した方法は、Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（Ｐｈｉｌｌｉｐｐ  Ｇｅｒｈａｒｄｔ，Ｒ．Ｇ．Ｅ．Ｍｕｒｒａｙ，Ｒａｌｐｈ  Ｎ．Ｃｏｓｔｉｌｏｗ，Ｅｕｇｅｎｅ  Ｗ．Ｎｅｓｔｅｒ，Ｗｉｌｌｉｓ  Ａ．Ｗｏｏｄ，Ｎｏｅｌ  Ｒ．Ｋｒｉｅｇ  ａｎｄ  Ｇ．Ｂｒｉｇｇｓ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，ｅｄｓ），Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９９４）又はＴｈｏｍａｓ  Ｄ．Ｂｒｏｃｋ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡに見いだされ得る。バクテリア細胞の成長及び保持のために用いられるすべての試薬及び材料は、他にことわらない限りＡｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ），ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）、ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）又はＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から得た。
【０１３２】
略字の意味は以下の通りである：「ｈ」は単数もしくは複数の時（ｈｏｕｒｓ）を意味し、「ｍｉｎ」は単数もしくは複数の分を意味し、「ｓｅｃ」は単数もしくは複数の秒を意味し、「ｄ」は単数もしくは複数の日を意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、５０ａｍｐはｍＬ当たりに５０μｇのアンピシリンを意味し、ＬＢ−５０ａｍｐはｍＬ当たりに５０μｇのアンピシリンを含有するＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉブイヨンを意味する。
【０１３３】
表中で以下の略字を用いる。「Ｃｏｎ．」は転換率であり、「Ｓｅｌ．」は炭素に基づく選択率であり、「ｎｄ」は検出されないである。
【０１３４】
以下の実施例において用いられる、及び構築される株及びベクターを下記のチャートに挙げる：
【０１３５】
【表２】
0004716634.tif 000003
【０１３６】
酵素アッセイ
デヒドラターゼ酵素に関するアッセイ：
グリセロール又は１，２−プロパンジオールを基質として用いて無−細胞抽出物中のデヒドラターゼ活性を決定した。典型的には、フレンチプレス及び続いて細胞デブリスの遠心を用いる細胞破壊により無−細胞抽出物を調製した。アルデヒドのメチルベンゾ−２−チアゾロンヒドラゾンとの反応に基づくアッセイはＦｏｒａｇｅ  ａｎｄ  Ｆｏｓｔｅｒ（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ５６９，２４９（１９７９））に記載されている。
【０１３７】
Ｈｏｎｄａ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１４３，１４５８（１９８０））は、デヒドラターゼの再活性化を測定するアッセイを開示している。デヒドラターゼ活性はトルエン処理された全細胞において、ＡＴＰを用いて、及び用いずに、グリセロール又は１，２−プロパンジオールを基質として用いて決定された。ＡＴＰを添加した産物生成対ＡＴＰを添加しない産物生成の比率により再活性化を決定した。産物生成（グリセロール又は１，２−プロパンジオールを基質として用いる場合のそれぞれ３−ＨＰＡ又はプロビオンアルデヒド）をＨＰＬＣを用いて直接、あるいはメチルベンゾ−２−チアゾロンヒドラゾン試薬を用いて間接的に測定した。あるいは又、ＮＡＤＨ結合アルコールデヒドロゲナーゼを用いるアルデヒドのそのそれぞれのアルコールへの転換をカップリングさせ、ＮＡＤＨの消失を監視することにより、産物生成を決定した。
１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼに関するアッセイ：
１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼと呼ばれることもある１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼの活性を、記載されている通りに（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｎ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９，２０５０（１９８７））、溶液中又はスラブゲル中で無−細胞抽出物に関し、１，３−プロパンジオール及びＮＡＤ+を基質として用いて決定した。あるいは又、ＮＡＤＨの消失により３−ＨＰＡとＮＡＤＨの１，３−プロパンジオールとＮＡＤ+への転換を決定した。スラブゲルアッセイは、サイズ分離のおかげで、１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ（ｄｈａＴ）の活性を非−特異的アルコールデヒドロゲナーゼの活性と分離するという利点の可能性を有する。シトロバクテル・フレンジイ、クレブシエラ・ニューモニアエ及びクロスツリジウム・パステウリアヌムからの１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ（ｄｈａＴ）の本来の分子量は異常に大きく、３３０，０００〜４４０，０００ダルトンの大きさである。ラクトバシルス・ブレビス及びラクトバシルス・ブクネリは、既知の１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ（ｄｈａＴ）の性質に類似の性質を有するデヒドラターゼ関連１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼを含有する。
グリセロール３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性に関するアッセイ：
Ｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５０，７１５３（１９７５））により公開されている方法からの下記で修正する方法を用いた。この方法は、５ｍＭ  ＤＴＴを含む０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．５緩衝液中に０．２ｍＭ  ＮＡＤＨ、２．０ｍＭ  ジヒドロキシアセトンリン酸（ＤＨＡＰ）及び酵素を含有するキュベット中で、１．０ｍＬの合計容積において３０℃で無−細胞抽出物試料をインキュベーションすることを含んだ。最初に酵素とＮＡＤＨの反応のバックグラウンド速度を３４０ｎｍにおいて少なくとも３分間決定した。続いて第２の基質であるＤＨＡＰを加え、時間を経た吸収の変化をさらに少なくとも３分間監視した。総速度からバックグラウンド速度を引き去ることによりＧ３ＰＤＨ活性を限定した。
グリセロール−３−ホスファターゼ活性に関するアッセイ：
ビス−Ｔｒｉｓ又はＭＥＳ及びマグネシウム緩衝液、ｐＨ６．５中で抽出物を有機ホスフェート基質と一緒にインキュベーションすることにより酵素活性に関するアッセイを行った。用いられた基質は１−α−グリセロールリン酸又はｄ，ｌ−α−グリセロールリン酸であった。アッセイにおける試薬の最終的濃度は：緩衝液（２０ｍＭ、ビス−Ｔｒｉｓ又は５０ｍＭ  ＭＥＳ）；ＭｇＣｌ2（１０ｍＭ）；及び基質（２０ｍＭ）である。試料中の合計タンパク質が低く、酸クエンチを用いて可視の沈殿が起こらない場合、キュベット中で簡単に試料をアッセイした。この方法は、２０ｍＭ  基質（５０μＬ、２００ｍＭ）、５０ｍＭ  ＭＥＳ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、ｐＨ６．５緩衝液を含有するキュベット中で酵素試料をインキュベーションすることを含んだ。最終的ホスファターゼアッセイ容積は０．５ｍＬであった。酵素−含有試料を反応混合物に加え；キュベットの内容物を混合し、次いでキュベットをＴ＝３７℃で５〜１２０分間、循環水浴中に入れ、時間の長さは酵素試料におけるホスファターゼ活性が２〜０．０２Ｕ／ｍＬのどの範囲であるかに依存した。酸モリブデート試薬（０．４ｍＬ）の添加により酵素反応をクエンチングした。Ｆｉｓｋｅ  ＳｕｂｂａＲｏｗ試薬（０．１ｍＬ）及び蒸留水（１．５ｍＬ）を加えた後、溶液を混合し、発色させた。完全に発色させるために１０分の後、Ｃａｒｙ  ２１９  ＵＶ／可視分光光度計を用いて試料の吸収を６６０ｎｍで読んだ。無機リン酸塩原液（０．６５ｍＭ）を用い、０．０２６〜０．１３０μモル／ｍＬの範囲の最終的無機リン酸塩濃度を有する６つの標準を調製することにより作られた標準曲線に、放出された無機リン酸塩の量を比較した。
グリセロールキナーゼ活性に関するアッセイ：
適した量の酵素、典型的には無−細胞粗抽出物を、４０ｍＭ  ＡＴＰ、２０ｍＭ  ＭｇＳＯ4、２１ｍＭの均一に13Ｃ標識されたグリセロール（９９％、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）及び０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９を含有する反応混合物に、２５℃で７５分間加えた。13Ｃ−ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ）によりグリセロールのグリセロール３−リン酸への転換を検出した：グリセロール（６３．１１ｐｐｍ，δ，Ｊ＝４１Ｈｚ及び７２．６６ｐｐｍ，ｔ，Ｊ＝４１Ｈｚ）；グリセロール３−リン酸（６２．９３ｐｐｍ，δ，Ｊ＝４１Ｈｚ；６５．３１ｐｐｍ，ｂｒ  ｄ，Ｊ＝４３Ｈｚ；及び７２．６６ｐｐｍ，ｄｔ，Ｊ＝６，４１Ｈｚ）。
ＮＡＤＨ−結合グリセロールデヒドロゲナーゼアッセイ：
Ｅ．コリ株からの無−細胞抽出物中のＮＡＤＨ−結合グリセロールデヒドロゲナーゼ活性（ｇｌｄＡ）を、非−変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動によるタンパク質分離の後に決定した。グリセロールとＮＡＤ+のジヒドロキシアセトンとＮＡＤＨへの転換を、フェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）を媒介物として用い、３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）の濃く着色したホルマザンへの転換とカップリングさせた（Ｔａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１４０，１８２（１９９７））。
【０１３８】
電気泳動は、未変性ゲル（Ｎｏｖｅｘ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡからの８〜１６％  ＴＧ、１．５ｍｍ、１５レーンゲル）を用いて標準的方法により、二重に行われた。５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ又は炭酸カリウム緩衝液、ｐＨ９を用いて１０分間、３回洗浄することにより、残留グリセロールをゲルから除去した。５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ又は炭酸カリウム、ｐＨ９、６０ｍｇ  硫酸アンモニウム、７５ｍｇ  ＮＡＤ+、１．５ｍｇ  ＭＴＴ及び０．５ｍｇ  ＰＭＳを含有する１５ｍＬのアッセイ溶液中で、グリセロール（約０．１６Ｍの最終的濃度）を含む、及び含まない２重のゲルを展開（ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ）した。
【０１３９】
ポリアクリルアミドゲル電気泳動に続き、精製されたＫ．ニューモニアエグリセロールデヒドロゲナーゼ（ｄｈａＤ）に対して誘起されたポリクローナル抗体との反応により、Ｅ．コリ株中のＮＡＤＨ−結合グリセロールデヒドロゲナーゼ活性（ｇｌｄＡ）の存在又は不在も決定した。
１，３−プロパンジオールの単離及び同定：
ＨＰＬＣによりグリセロールの１，３−プロパンジオールへの転換を監視した。分析は標準的方法及びクロマトグラフィーの技術分野における熟練者に利用可能な材料を用いて行われた。１つの適した方法は、ＵＶ（２１０ｎｍ）及びＲＩ検出を用いるＷａｔｅｒｓ  Ｍａｘｉｍａ  ８２０  ＨＰＬＣシステムを使用した。Ｓｈｏｄｅｘ  ＳＨ−１０１１Ｐ  プレカラム（６ｍｍｘ５０ｍｍ）が備えられ、５０℃で温度制御されたＳｈｏｄｅｘ  ＳＨ−１０１１カラム（８ｍｍｘ３００ｍｍ、Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡから購入）上に、移動相として０．０１Ｎ  Ｈ2ＳＯ4を用い、０．５ｍＬ／分の流量で試料を注入した。定量的分析が望まれている場合、外部標準として既知量のトリメチル酢酸を用いて試料を調製した。典型的には、グルコース（ＲＩ検出）、グリセロール、１，３−プロパンジオール（ＲＩ検出）及びトリメチル酢酸（ＵＶ及びＲＩ検出）の保持時間は、それぞれ１５．２７分、２０．６７分、２６．０８分及び３５．０３分であった。
【０１４０】
ＧＣ／ＭＳにより１，３−プロパンジオールの生産を確認した。分析は標準的方法及びＧＣ／ＭＳの技術分野における熟練者に利用可能な材料を用いて行われた。１つの適した方法は、Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ  ５９７１  Ｓｅｒｉｅｓ質量選択的検出器（ＥＩ）及びＨＰ−ＩＮＮＯＷａｘカラム（長さ３０ｍ、内径０．２５ｍｍ、フィルム厚さ０．２５ミクロン）に連結されたＨｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ  ５８９０  Ｓｅｒｉｅｓ  ＩＩガスクロマトグラフを用いた。生成した１，３−プロパンジオールの保持時間及び質量スペクトルを基準の１，３−プロパンジオール（ｍ／ｅ：５７，５８）のそれに比較した。
【０１４１】
ＧＣ／ＭＳのための代わりの方法は試料の誘導体化を含んだ。１．０ｍＬの試料（例えば培養上澄み液）に３０μＬの濃（７０％ｖ／ｖ）過塩素酸を加えた。混合の後、試料を凍結乾燥した。ビス（トリメチルシリル）トリフルオロアセトアミド：ピリジンの１：１混合物（３００μＬ）を凍結乾燥された材料に加え、激しく混合し、６５℃において１時間置いた。遠心により不溶性材料を除いて試料を透明にした。得られる液体は２相に分かれ、その上の方を分析に用いた。試料をＤＢ−５カラム（４８ｍ、内径０．２５ｍｍ、フィルム厚さ０．２５μｍ；Ｊ＆Ｗ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから）上でクロマトグラフィーにかけ、培養上澄み液から得た１，３−プロパンジオール誘導体の保持時間及び質量スペクトルを基準の標準試料から得たそれに比較した。ＴＭＳ−誘導体化１，３−プロパンジオールの質量スペクトルは２０５、１７７、１３０及び１１５ＡＭＵの特徴的イオンを含有する。
細胞ライシス：
発酵ブイヨン中の細胞外可溶性タンパク質濃度を測定することにより、細胞ライシスを見積もった。細胞を分離するために、発酵槽試料を卓上遠心機において遠心した（典型的には、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ，Ｍｏｄｅｌ  ５４１５Ｃ  微量遠心機において１２，０００ｒｐｍで３〜５分）。得られる上澄み液を商業的に入手可能な試薬を用い、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法によってタンパク質濃度に関して分析した（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ，Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）。
生存率：
発酵槽から得た細胞を、非−選択的ＬＢ寒天平板上で、適した希釈において平板培養することにより、細胞生存率を決定した。発酵槽ブイヨンのｍＬ当たりの生存細胞をＯＤ５５０（ＡＵ）で割った比率を用いることにより、発酵槽実験の間で細胞生存率を比較した。
【０１４２】
実施例１
１，３−プロパンジオールの発現のためのコスミドＤＮＡを用いる
Ｅ．コリ宿主細胞のクローニング及び形質転換
培地：
１，３−プロパンジオールを生産する能力に関するバクテリア形質転換細胞のスクリーニングにおいて、合成Ｓ１２培地を用いた。Ｓ１２培地は：１０ｍＭ  硫酸アンモニウム、５０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．０、２ｍＭ  ＭｇＣｌ2、０．７ｍＭ  ＣａＣｌ2、５０μＭ  ＭｎＣｌ2、１μＭ  ＦｅＣｌ3、１μＭ  ＺｎＣｌ、１．７μＭ  ＣｕＳＯ4、２．５μＭ  ＣｏＣｌ2、２．４μＭ  Ｎａ2ＭｏＯ4及び２μＭ  チアミン塩酸塩を含有する。
【０１４３】
成長及び発酵のために用いられる培地Ａは：１０ｍＭ  硫酸アンモニウム；５０ｍＭ  ＭＯＰＳ／ＫＯＨ緩衝液、ｐＨ７．５；５ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．５；２ｍＭ  ＭｇＣｌ2；０．７ｍＭ  ＣａＣｌ2；５０μＭ  ＭｎＣｌ2；１μＭ  ＦｅＣｌ3；１μＭ  ＺｎＣｌ；１．７２μＭ  ＣｕＳＯ4；２．５３μＭ  ＣｏＣｌ2；２．４２μＭ  Ｎａ2ＭｏＯ4；２μＭ  チアミン塩酸塩；０．０１％  酵母抽出物；０．０１％  カザアミノ酸；０．８μｇ／ｍＬ  ビタミンＢ12；及び５０μｇ／ｍＬ  アンピシリンから成る。必要な場合、培地Ａに０．２％のグリセロール又は０．２％のグリセロールと０．２％のＤ−グルコースを補足した。
細胞：
文献でＫ．アエロゲネス（Ｋ．ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）又はアエロバクテル・アエロゲネス（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）としても知られるクレブシエラ・ニューモニアエＥＣＬ２１０６（Ｒｕｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１２４，３４８（１９７５））をＥ．Ｃ．Ｃ．Ｌｉｎ（Ｈａｒｖａｒｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）から入手し、実験室培養として保持した。
【０１４４】
クレブシエラ・ニューモニアエＡＴＣＣ  ２５９５５をＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から購入した。
【０１４５】
Ｅ．コリＤＨ５αをＧｉｂｃｏ／ＢＲＬから購入し、グリセロール又はジオールデヒドラターゼ酵素をコードする遺伝子を含有する、クレブシエラ・ニューモニアエＡＴＣＣ２５９５５から単離されたコスミドＤＮＡを用いて形質転換した。グリセロールデヒドラターゼを含有するコスミドをｐＫＰ１及びｐＫＰ２と同定し、ジオールデヒドラターゼ酵素を含有するコスミドをｐＫＰ４と同定した。形質転換されたＤＨ５α細胞をＤＨ５α−ｐＫＰ１、ＤＨ５α−ｐＫＰ２及びＤＨ５α−ｐＫＰ４と同定した。
【０１４６】
Ｅ．コリＥＣＬ７０７（Ｓｐｒｅｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３５，１２５５（１９８９））をＥ．Ｃ．Ｃ．Ｌｉｎ（Ｈａｒｖａｒｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）から入手し、同様にクレブシエラ・ニューモニアエからのコスミドＤＮＡを用いて形質転換した。これらの形質転換細胞を、グリセロールデヒドラターゼ遺伝子を含有するＥＣＬ７０７−ｐＫＰ１及びＥＣＬ７０７−ｐＫＰ２ならびにジオールデヒドラターゼ遺伝子を含有するＥＣＬ７０７−ｐＫＰ４と同定した。
【０１４７】
ｔｐｉ遺伝子における突然変異を含有するＥ．コリＡＡ２００（Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６２，３２９（１９７０））をＥ．ｃｏｌｉ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｙａｌｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ，ＣＴ）から購入し、クレブシエラコスミドＤＮＡを用いて形質転換し、グリセロールデヒドラターゼ遺伝子を含有する組換え微生物ＡＡ２００−ｐＫＰ１及びＡＡ２００−ｐＫＰ２ならびにジオールデヒドラターゼ遺伝子を含有するＡＡ２００−ｐＫＰ４を得た。
ＤＨ５α：
Ｋ．ニューモニアエＤＮＡを用いてトランスフェクションされたＥ．コリＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲの約１，０００のコロニーを含有する６つの形質転換平板を５ｍＬのＬＢ培地を用いて洗浄し、遠心した。バクテリアをペレット化し、５ｍＬ  ＬＢ培地＋グリセロール中に再懸濁させた。アリコート（５０μＬ）を、０．２％  グリセロール＋ｍＬ当たりに４００ｎｇのビタミンＢ12＋０．００１％  酵母抽出物＋５０ａｍｐを含むＳ１２合成培地を含有する１５ｍＬの管中に接種した。最上まで管を培地で満たし、パラフィルムでくるみ、３０℃でインキュベーションした。４８ｈ後にわずかな濁りが観測された。７８ｈ及び１３２ｈにおいて上記の通りに産物分布に関して分析されたアリコートは１，３−プロパンジオールに関して陽性であり、後者の時点には増加した量の１，３−プロパンジオールを含有した。
【０１４８】
１，３−プロパンジオール生産に関して陽性の試験結果を与えたバクテリアを系列的に希釈し、シングルコロニーを単離するためにＬＢ−５０ａｍｐ平板上に平板培養した。４８のシングルコロニーを単離し、再度１，３−プロパンジオールの生産に関して調べた。６つの独立したクローンからコスミドＤＮＡを単離し、Ｅ．コリ株ＤＨ５α中に形質転換した。形質転換細胞を再度１，３−プロパンジオールの生産に関して調べた。２つの形質転換細胞をさらに特性化し、ＤＨ５α−ｐＫＰ１及びＤＨ５α−ｐＫＰ２と称した。
【０１４９】
ｐＩＢＩ３１（ＩＢＩ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ，Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ，ＣＴ）中にサブクローニングされたｐＫＰ１からの１２．１ｋｂ  ＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩフラグメントを配列決定し、ｐＨＫ２８−２６と命名した（配列番号：１）。配列決定は、グリセロールデヒドラターゼをコードするｄｈａオペロン及び調節に必要な遺伝子の関連する読取り枠の遺伝子座を明らかにした。配列番号：１に言及すると、ジヒドロキシアセトンキナーゼをコードするｄｈａＫ１に関する読取り枠のフラグメントが塩基１−３９９に見いだされ（相補配列（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ））；グリセロールデヒドロゲナーゼをコードする読取り枠ｄｈａＤが塩基１０１０−２１０７に見いだされ；リプレッサーをコードする読取り枠ｄｈａＲが塩基２２０９−４１３４に見いだされ；未知の機能のタンパク質をコードする読取り枠ｏｒｆＷが塩基４１１２−４６４２に見いだされ（相補配列）；デヒドラターゼ再活性化タンパク質をコードする読取り枠ｏｒｆＸが塩基４６４３−４９９６に見いだされ（相補配列）；１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼをコードする読取り枠ｄｈａＴが塩基５０１７−６１８０に見いだされ（相補配列）；未知の機能のタンパク質をコードする読取り枠ｏｒｆＹが塩基６２０２−６６３０に見いだされ（相補配列）；アルファサブユニットグリセロールデヒドラターゼをコードする読取り枠ｄｈａＢ１が塩基７０４４−８７１１に見いだされ；ベータサブユニットグリセロールデヒドラターゼをコードする読取り枠ｄｈａＢ２が塩基８７２４−９３０８に見いだされ；ガンマサブユニットグリセロールデヒドラターゼをコードする読取り枠ｄｈａＢ３が塩基９３１１−９７３６に見いだされ；デヒドラターゼ再活性化タンパク質をコードする読取り枠ｄｈａＢＸが塩基９７４９−１１５７２に見いだされ；グリセロール吸収促進タンパク質をコードするｇｌｐＦに関する読取り枠のフラグメントが塩基１１６２６−１２１４５に見いだされる。
【０１５０】
Ｋ．ニューモニアエからの詰込まれたコスミドＤＮＡを用いてトランスフェクションされたＥ．コリＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲのシングルコロニーを２００μＬのＳ１５培地（硫酸アンモニウム、１０ｍＭ；リン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．０、１ｍＭ；ＭＯＰＳ／ＫＯＨ緩衝液、ｐＨ７．０、５０ｍＭ；ＭｇＣｌ2、２ｍＭ；ＣａＣｌ2、０．７ｍＭ；ＭｎＣｌ2、５０μＭ；ＦｅＣｌ3、１μＭ；ＺｎＣｌ、１μＭ；ＣｕＳＯ4、１．７２μＭ；ＣｏＣｌ2、２．５３μＭ；Ｎａ2ＭｏＯ4、２．４２μＭ；及びチアミン塩酸塩、２μＭ）＋０．２％のグリセロール＋４００ｎｇ／ｍＬのビタミンＢ12＋０．００１％の酵母抽出物＋５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するミクロタイターウェル中に接種した。ミクロタイターウェルの他に、ＬＢ−５０ａｍｐを含有するマスター平板にも接種した。９６ｈ後、１００μＬを採取し、０．２ミクロンナイロン膜フィルターを含有するＲａｉｎｉｎ遠心管中で遠心した。バクテリアを保留し、濾液をＨＰＬＣ分析のために処理した。約２４０のコロニーをスクリーニングした後に１，３−プロパンジオール生産を示す陽性のクローンを同定した。３つの陽性のクローンを同定し、その中の２つをＬＢ−５０ａｍｐ上で成長させ、その中の１つは成長させなかった。ＬＢ−５０ａｍｐ上で成長した２つの陽性のクローンの１つから単離され、１，３−プロパンジオールの生産に関して立証されたシングルコロニーをｐＫＰ４と称した。ｐＫＰ４を含有するＥ．コリ株からコスミドＤＮＡを単離し、Ｅ．コリ株ＤＨ５αを形質転換した。ＤＨ５α−ｐＫＰ４と称される独立した形質転換細胞を１，３−プロパンジオールの生産に関して立証した。
ＥＣＬ７０７：
Ｅ．コリ株ＥＣＬ７０７をｐＫＰ１、ｐＫＰ２、ｐＫＰ４の１つに対応するコスミドＫ．ニューモニアエＤＮＡ又はＳｕｐｅｒｃｏｓベクターのみを用いて形質転換し、それぞれＥＣＬ７０７−ｐＫＰ１、ＥＣＬ７０７−ｐＫＰ２、ＥＣＬ７０７−ｐＫＰ４及びＥＣＬ７０７−ｓｃと命名した。ＥＣＬ７０７は、それぞれＡＴＰ−依存性グリセロールキナーゼ、ＮＡＤ+−結合グリセロールデヒドロゲナーゼ及びホスホエノールピルビン酸−依存性ホスホトランスフェラーゼシステムのジヒドロキシアセトンのための酵素ＩＩをコードするｇｌｐＫ、ｇｌｄ及びｐｔｓＤが欠失している。
【０１５１】
ＬＢ−５０ａｍｐ平板から単離された、それぞれのコスミド形質転換の２０のシングルコロニー及びＳｕｐｅｒｃｏｓベクターのみ（負の対照標準）の形質転換の５つのシングルコロニーをマスターＬＢ−５０ａｍｐ平板に移した。これらの単離物を、それらがデヒドラターゼ活性を含有しているかどうかを決定するために、グリセロールを１，３−プロパンジオールに転換するそれらの能力に関しても調べた。無菌のつまようじを用い、０．２％のグリセロール又は０．２％のグリセロールと０．２％のＤ−グルコースが補足された２００μＬの培地Ａを含有するミクロタイター平板に形質転換細胞を移した。３０℃における４８ｈの間のインキュベーションの後、ミクロタイター平板ウェルの内容物を０．４５ミクロンナイロンフィルターを介して濾過し、ＨＰＬＣによりクロマトグラフィーにかけた。これらの試験の結果を表２に示す。
【０１５２】
【表３】
0004716634.tif 000004
【０１５３】
ＡＡ２００：
Ｅ．コリ株ＡＡ２００をｐＫＰ１、ｐＫＰ２、ｐＫＰ４の１つに対応するコスミドＫ．ニューモニアエＤＮＡ及びＳｕｐｅｒｃｏｓベクターのみを用いて形質転換し、それぞれＡＡ２００−ｐＫＰ１、ＡＡ２００−ｐＫＰ２、ＡＡ２００−ｐＫＰ４及びＡＡ２００−ｓｃと命名した。株ＡＡ２００はトリオースリン酸イソメラーゼが欠失している（ｔｐｉ-）。
【０１５４】
Ｅ．コリ株ＥＣＬ７０７に関して記載した通り、それぞれのコスミド形質転換の２０のシングルコロニー及びエンプティーベクター形質転換の５つのシングルコロニーを単離し、グリセロールを１，３−プロパンジオールに転換するそれらの能力に関して調べた。これらの試験の結果を表３に示す。
【０１５５】
【表４】
0004716634.tif 000005
【０１５６】
実施例２
グルコースからのグリセロールの生産のための
Ｅ．コリＦＭ５のグリセロールキナーゼ突然変異体の操作（ｅｎｇｉ
ｎｅｅｒｉｎｇ）
Ｅ．コリＦＭ５におけるグリセロールキナーゼ遺伝子置換のための組込みプラスミドの構築：
Ｐｕｒｅｇｅｎｅ  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｇｅｎｔｒａ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を用いてＥ．コリＦＭ５（ＡＴＣＣ  ５３９１１）ゲノムＤＮＡを調製した。部分的ｇｌｐＦ及びグリセロールキナーゼ（ｇｌｐＫ）遺伝子を含有する１．０ｋｂのＤＮＡフラグメントをＦＭ５ゲノムＤＮＡから、プライマー配列番号：２及び配列番号：３を用い、ＰＣＲ（Ｍｕｌｌｉｓ  ａｎｄ  Ｆａｌｏｏｎａ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５５，３３５（１９８７））により増幅した。部分的ｇｌｐＫ及びｇｌｐＸ遺伝子を含有する１．１ｋｂのＤＮＡフラグメントをＦＭ５ゲノムＤＮＡから、プライマー配列番号：４及び配列番号：５を用い、ＰＣＲにより増幅した。プライマー配列番号：４中にＭｕｎＩ部位を導入した。プライマー配列番号：４の５’末端はプライマー配列番号：３の逆相補配列であり、続くオーバーラップエクステンションＰＣＲ（ｏｖｅｒｌａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ＰＣＲ）を可能にした。オーバーラップエクステンション法（Ｈｏｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ８，５２８（１９９０））による遺伝子スプライシングを用い、鋳型としての上記の２つのＰＣＲフラグメント及びプライマー配列番号：２及び配列番号：５を用いるＰＣＲによって２．１ｋｂのフラグメントを形成した。このフラグメントは１．５ｋｂのｇｌｐＫ遺伝子の中心領域からの０．８ｋｂの欠失を示した。全体として、このフラグメントはＭｕｎＩクローニング部位（部分的ｇｌｐＫ内）の両側上に１．０ｋｂ及び１．１ｋｂのフランキング領域を有し、相同的組換えによる染色体遺伝子置換を可能にした。
【０１５７】
上記の２．１ｋｂのＰＣＲフラグメントを平滑末端化し（ムングビーンヌクレアーゼ（ｍｕｎｇ  ｂｅａｎ  ｎｕｃｌｅａｓｅ）を用いて）、Ｚｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いてｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔベクター中にクロヘニングし、カナマイシン及びゼオシン耐性遺伝子を含有する５．６ｋｂのプラスミドｐＲＮ１００を得た。バクテリオファージ  Ｐ１  ｌｏｘＰ部位（Ｓｎａｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １６６，１７３（１９９５））によりフランキングされたクロラムフェニコール耐性遺伝子を含有するｐＬｏｘＣａｔ１からの１．２ｋｂのＨｉｎｃＩＩフラグメント（未公開の結果）を用い、プラスミドｐＲＮ１００中のｇｌｐＫフラグメントを、それをＭｕｎＩ−消化された（且つ平滑末端化された）プラスミドｐＲＮ１００に連結することにより分断し、６．９ｋｂのプラスミドｐＲＮ１０１−１を得た。Ｒ６Ｋ起点を含有する３７６ｂｐのフラグメントを、プライマー配列番号：６及び配列番号：７を用いてベクターｐＧＰ７０４（Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｅｋａｌａｎｏｓ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７０，２５７５−２５８３（１９８８））からＰＣＲにより増幅し、平滑末端化し、ｐＲＮ１０１−１からの５．３ｋｂのＡｓｐ７１８−ＡａｔＩＩフラグメント（平滑末端化された）に連結し、カナマイシン及びクロラムフェニコール耐性遺伝子を含有する５．７ｋｂのプラスミドｐＲＮ１０２−１を得た。ｐＲＮ１０２−１の形成のための、Ｒ６Ｋ起点を用いるｐＲＮ１０１−１中のＣｏｌＥ１起点領域の置換は、ほとんどのゼオシン耐性遺伝子の欠失も含んだ。ｐＲＮ１０２−１複製のための宿主は、Ｒ６Ｋ起点の機能のために必要なｐｉｒ遺伝子を含有するＥ．コリＳＹ３２７（Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｅｋａｌａｎｏｓ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７０，２５７５−２５８３（１９８８））であった。
クロラムフェニコール耐性遺伝子分断（ｉｎｔｅｒｒｕｐｔ）を有するグリセロールキナーゼ突然変異体ＲＪＦ１０ｍの操作：
Ｅ．コリＦＭ５を非−複製組込みプラスミドｐＲＮ１０２−１を用いて電気形質転換し（ｅｌｅｃｔｒｏｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ）、クロラムフェニコール−耐性（１２．５μＬ／ｍＬ）及びカナマイシン−感受性（３０μｇ／ｍＬ）である形質転換細胞をさらに１ｍＭのグリセロールを含有するＭ９最少培地上で、グリセロール非−使用（ｎｏｎ−ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ）に関してスクリーニングした。１つのそのような突然変異体、ＲＪＦ１０ｍからのゲノムＤＮＡのＥｃｏＲＩ消化は、サザン分析（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９８，５０３−５１７（１９７５））を介して無損傷のｇｌｐＫ遺伝子を用いて精査すると、それが二重−交差組込み体（ｄｏｕｂｌｅ−ｃｒｏｓｓｏｖｅｒ  ｉｎｔｅｇｒａｎｔ）（ｇｌｐＫ遺伝子置換）であることを示し、それはクロラムフェニコール耐性遺伝子内における追加のＥｃｏＲＩ部位の存在のおかげで、２つの予測される７．９ｋｂ及び２．０ｋｂバンドが観察されたからである。野生型対照標準は１つの予測された９．４ｋｂバンドを与えた。突然変異体ＲＪＦ１０ｍの13ＣＮＭＲ分析は、それが13Ｃ−標識されたグリセロールとＡＴＰをグリセロール−３−リン酸に転換できないことを確証した。このｇｌｐＫ突然変異体をさらに、プライマーの組合わせ、配列番号：８と配列番号：９、配列番号：１０と配列番号：１１及び配列番号：８と配列番号：１１を用いるゲノムＰＣＲにより分析し、それらはそれぞれ予測される２．３ｋｂ、２．４ｋｂ及び４．０ｋｂのＰＣＲフラグメントを与えた。野生型対照標準は、プライマー配列番号：８及び配列番号：１１を用い、予測される３．５ｋｂのバンドを与えた。ｇｌｐＫ突然変異体ＲＪＦ１０ｍをプラスミドｐＡＨ４８を用いて電気形質転換し、グルコースからのグリセロール生産を可能にした。ｇｌｐＫ突然変異体、Ｅ．コリＲＪＦ１０ｍを１９９７年１１月２４日に、Ｂｕｄａｐｅｓｔ条約の協約下に、ＡＴＣＣに寄託した。
クロラムフェニコール耐性遺伝子分断が除去されたグリセロールキナーゼ突然変異体ＲＪＦ１０の操作：
ＹＥＮＢ培地（０．７５％  酵母抽出物、０．８％  栄養ブイヨン）上で３７℃において終夜成長させた後、ＩＰＴＧ−誘導ｌａｃＵＶ５プロモーターの調節下のバクテリオファージＰ１  Ｃｒｅリコンビナーゼ遺伝子、温度−感受性ｐＳＣ１０１レプリコン及びアンピシリン耐性遺伝子を含有するプラスミドｐＪＷ１６８（未公開の結果）を用い、水懸濁液中のＥ．コリＲＪＦ１０ｍを電気形質転換した。ＳＯＣ培地中で３０℃において発芽後成長させ、カルベニシリン（５０μｇ／ｍＬ）及びＩＰＴＧ（１ｍＭ）が補足されたＬＢ寒天培地上で３０℃（ｐＪＷ１６８複製のために許される温度）において、形質転換細胞を選択した。Ｃｒｅリコンビナーゼにより媒介されるｌｏｘＰ部位における組換えを介する染色体クロラムフェニコール耐性遺伝子の切除を可能にするために、カルベニシリン及びＩＰＴＧが補足された新しいＬＢ寒天培地上で３０℃において、プールされたコロニーの２回連続終夜転移を行った（Ｈｏｅｓｓ  ａｎｄ  Ａｂｒｅｍｓｋｉ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８１，３５１−３６２（１９８５））。得られるコロニーをカルベニシリン及びＩＰＴＧが補足されたＬＢ寒天培地ならびにクロラムフェニコール（１２．５μｇ／ｍＬ）が補足されたＬＢ寒天上にレプリカ平板培養し、カルベニシリン−耐性且つクロラムフェニコール−感受性で、マーカー遺伝子の除去を示すコロニーを同定した。１つのそのようなコロニーの終夜３０℃培養物を用い、１０ｍＬのＬＢ培地に接種した。３０℃で０．６ＡＵのＯＤ（６００ｎｍ）まで成長させ、培養物を３７℃で終夜インキュベーションした。いくつかの希釈物をあらかじめ温められたＬＢ寒天培地上で平板培養し、平板を４２℃（ｐＪＷ１６８複製のために許されない温度）で終夜インキュベーションした。得られるコロニーをＬＢ寒天培地及びカルベニシリン（７５μｇ／ｍＬ）が補足されたＬＢ寒天培地上にレプリカ平板培養し、カルベニシリン−感受性であり、プラスミドｐＪＷ１６８の喪失を示すコロニーを同定した。１つのそのようなｇｌｐＫ突然変異体、ＲＪＦ１０をプライマー配列番号：８及び配列番号：１１を用いるゲノムＰＣＲによりさらに分析し、予測される３．０ｋｂバンドを得、マーカー遺伝子の切除を確証した。１ｍＭグリセロールを含有するＭ９最少培地上で成長しないことにより、突然変異体ＲＪＦ１０によるグリセロール非−使用が確証された。ｇｌｐＫ突然変異体ＲＪＦ１０をプラスミドｐＡＨ４８を用いて電気形質転換し、グルコースからのグリセロール生産を可能にした。
【０１５８】
実施例３
ｇｌｄＡ遺伝子ノックウアト（ｋｎｏｃｋｏｕｔ）を有するＥ．コリ株の構築
それぞれ末端Ｓｐｈ１及びＸｂａ１部位が導入されたプライマー配列番号：１２及び配列番号：１３を用いるＰＣＲ（Ｋ．Ｂ．Ｍｕｌｌｉｓ  ａｎｄ  Ｆ．Ａ．Ｆａｌｏｏｎａ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５５，３３５−３５０（１９８７））によりＥ．コリからｇｌｄＡ遺伝子を単離し、ｐＵＣ１８中のＳｐｈ１及びＸｂａ１部位の間にクローニングし（Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ（１９８２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）、ｐＫＰ８を形成した。ｐＫＰ８をｇｌｄＡ遺伝子内のユニークＳａｌ１及びＮｃｏ１部位において切断し、末端をＫｌｅｎｏｗを用いて平滑化し、連結し、ｇｌｄＡの中間における１０９ｂｐの欠失及びユニークＳａｌ１部位の再生を生じ、ｐＫＰ９を形成した。カナマイシン耐性を与える遺伝子（ｋａｎ）を含有し、翻訳開始コドンの上流に約４００ｂｐｓのＤＮＡ及び翻訳停止コドンの下流に約１００ｂｐｓのＤＮＡを含む１．４ｋｂのＤＮＡフラグメントを、末端Ｓａｌ１部位が導入されたプライマー配列番号：１４及び配列番号：１５を用いるＰＣＲによりｐＥＴ−２８ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ）から単離し、ｐＫＰ９のユニークＳａｌ１部位中にサブクローニングし、ｐＫＰ１３を形成した。ｇｌｄＡ翻訳開始コドンの２０４ｂｐｓ下流で始まり、ｇｌｄＡ翻訳停止コドンの１７８ｂｐｓ上流で終わり、ｋａｎ挿入片を含有する２．１ｋｂのＤＮＡフラグメントを、それぞれ末端Ｓｐｈ１及びＸｂａ１部位が導入されたプライマー配列番号：１６及び配列番号：１７を用いるＰＣＲによりｐＫＰ１３から単離し、ｐＭＡＫ７０５（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）中のＳｐｈ１及びＸｂａ１部位の間にサブクローニングし、ｐＭＰ３３を形成した。ｐＭＰ３３を用いてＥ．コリＦＭ５を形質転換し、ｐＭＡＫ７０５複製のために許される温度である３０℃で２０μｇ／ｍＬのｋａｎ上において選択した。２０μｇ／ｍＬのｋａｎが補足された液体培地中で３０℃において、１つのコロニーを終夜拡大させた（ｅｘｐａｎｄｅｄ）。約３２，０００の細胞を２０μｇ／ｍＬのｋａｎ上で平板培養し、ｐＭＡＫ７０５複製のための制限温度である４４℃において１６時間インキュベーションした。４４℃で成長する形質転換細胞は染色体中に組込まれたプラスミドを有し、約０．０００１の頻度で存在する。ＰＣＲ及びサザンブロット（Ｅ．Ｍ．Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９８，５０３−５１７（１９７５））分析を用い、形質転換細胞における染色体組込み結果（ｅｖｅｎｔ）の性質を決定した。ウェスタンブロット分析（Ｔｏｗｂｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７６，４３５０（１９７９））を用い、ｇｌｄＡの産物であるグリセロールデヒドロゲナーゼタンパク質が形質転換細胞中で生産されるかどうかを決定した。活性アッセイを用い、グリセロールデヒドロゲナーゼ活性が形質転換細胞中に残っているかどうかを決定した。フェナジンメトサルフェートを媒介物として用い、グリセロールとＮＡＤ+のジヒドロキシアセトンとＮＡＤＨへの転換をテトラゾリウム色素、ＭＴＴ［３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド］の濃く着色するホルマザンへの転換にカップリングさせることにより、未変性ゲル上でのグリセロールデヒドロゲナーゼバンドにおける活性を決定した。グリセロールデヒドロゲナーゼは３０ｍＭ  硫酸アンモニウム及び１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ９の存在も必要とする（Ｔａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１４０，１８２（１９９７））。分析された８つの形質転換細胞の中で６つがｇｌｄＡノックアウトであると決定された。Ｅ．コリＭＳＰ３３．６を１９９７年１１月２４日に、ブタペスト条約の協約下に、ＡＴＣＣに寄託した。
【０１５９】
実施例４
ｇｌｐＫ及びｇｌｄＡ遺伝子ノックウアトを有するＥ．コリ株の構築
ｇｌｄＡ遺伝子を含有し、翻訳開始コドンの上流に２２８ｂｐｓのＤＮＡ及び翻訳停止コドンの下流に２２０ｂｐｓのＤＮＡを含む１．６ｋｂのＤＮＡフラグメントを、それぞれ末端Ｓｐｈ１及びＸｂａ１部位が導入されたプライマー配列番号：１８及び配列番号：１９を用いるＰＣＲによりＥ．コリから単離し、ｐＵＣ１８のＳｐｈ１及びＸｂａ１部位の間にクローニングし、ｐＱＮ２を形成した。ｐＱＮ２をｇｌｄＡ遺伝子内のユニークＳａｌ１及びＮｃｏ１部位において切断し、末端をＫｌｅｎｏｗを用いて平滑化し、連結し、ｇｌｄＡの中間における１０９ｂｐの欠失及びユニークＳａｌ１部位の再生を生じ、ｐＱＮを形成した。カナマイシン耐性を与える遺伝子（ｋａｎ）を含有し、ｌｏｘＰ部位によりフランキングされた１．２ｋｂのＤＮＡフラグメントをｐＬｏｘＫａｎ２（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）からＳｔｕ１／Ｘｈｏ１フラグメントとして単離し、Ｋｌｅｎｏｗを用いて末端を平滑化し、ｐＱＮ４中に、Ｋｌｅｎｏｗを用いる平滑化の後にＳａｌ１部位においてサブクローニングし、ｐＱＮ８を形成した。Ｒ６Ｋ複製起点を含有する０．４ｋｂのＤＮＡフラグメントを、それぞれ末端Ｓｐｈ１及びＸｂａ１部位が導入されたプライマー配列番号：２０及び配列番号：２１を用いるＰＣＲによりｐＧＰ７０４（Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｅｋａｌａｎｏｓ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７０，２５７５−２５８３（１９８８））から単離し、ｐＱＮ８からのｇｌｄＡ：：ｋａｎカセットを含有する２．８ｋｂのＳｐｈ１／Ｘｂａ１  ＤＮＡフラグメントに連結し、ｐＫＰ２２を形成した。クロラムフェニコール耐性を与える遺伝子（ｃａｍ）を含有し、ｌｏｘＰ部位によりフランキングされた１．０ｋｂのＤＮＡフラグメントを、ｐＬｏｘＣａｔ２（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）からＸｂａ１フラグメントとして単離し、ｐＫＰ２２中にＸｂａ１部位においてサブクローニングし、ｐＫＰ２３を形成した。ｇｌｐＫ−であるＥ．コリ株ＲＪＦ１０（実施例２を参照されたい）をｐＫＰ２３を用いて形質転換し、表現型ｋａｎＲｃａｍＳを有する形質転換細胞を単離し、二重交差組込みを示し、それをサザンブロット分析により確証した。グリセロールデヒドロゲナーゼゲル活性アッセイ（実施例３に記載した通り）は、これらの形質転換細胞中に活性なグリセロールデヒドロゲナーゼが存在しないことを示した。実施例２に記載した通りにＣｒｅ−生産プラスミドｐＪＷ１６８を用いて染色体からｋａｎマーカーを除去し、株ＫＬＰ２３を得た。表現型ｋａｎＳを有するいくつかの単離物はグリセロールデヒドロゲナーゼ活性を示さず、サザンブロット分析はｋａｎマーカーの喪失を確証した。
【０１６０】
実施例５
グリセロール３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＤＡＲ１）及び／又はグリセロール
３−ホスファターゼ（ＧＰＰ２）の発現のためのプラスミド構築及び株構築
グリセロール３−ホスファターゼ（ｇｐｐ２）のための発現カセットの構築：
サッカロミセス・セレビシアエ染色体Ｖラムダクローン６５９２（ＧｅｎＢａｎｋ，受け入れ番号Ｕ１８８１３ｘ１１）をＡＴＣＣから得た。５’末端にＢａｍＨＩ−ＲＢＳ−ＸｂａＩ部位及び３’末端にＳｍａＩ部位が導入された合成プライマー（配列番号：２２及び配列番号：２３）を用いる、標的ＤＮＡとしてのラムダクローンからのクローニングにより、グリセロール３−リン酸ホスファターゼ遺伝子（ＧＰＰ２）をクローニングした。産物をｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）中にＳｒｆＩ部位においてサブクローニングし、ＧＰＰ２を含有するプラスミドｐＡＨ１５を形成した。プラスミドｐＡＨ１５はｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ＋中のｌａｃプロモーターからの発現に関して不活性な配向でＧＰＰ遺伝子を含有する。ＧＰＰ２遺伝子を含有するｐＡＨ１５からのＢａｍＨＩ−ＳｍａＩフラグメントをｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ＋中に挿入し、プラスミドｐＡＨ１９を形成した。ｐＡＨ１９はｌａｃプロモーターからの発現に関して正しい配向でＧＰＰ２遺伝子を含有する。ＧＰＰ２遺伝子を含有するｐＡＨ１９からのＸｂａＩ−ＰｓｔＩフラグメントをｐＰＨＯＸ２中に挿入し、プラスミドｐＡＨ２１を作った。ｐＡＨ２１／ＤＨ５αは発現プラスミドである。
グリセロール３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＤＡＲ１）のための発現カセットの構築：
合成プライマー（配列番号：２４及び配列番号：２５）を用いるゲノムＳ．セレビシアエＤＮＡからのＰＣＲクローニングにより、ＤＡＲ１を単離した。成功したＰＣＲクローニングは、ＤＡＲ１の５’末端にＮｃｏＩ部位を置き、ＮｃｏＩ中のＡＴＧがＤＡＲ１イニシエーターメチオニンである。ＤＡＲ１の３’末端にＢａｍＨＩ部位が翻訳ターミネーターに続いて導入されている。ＰＣＲフラグメントをＮｃｏＩ＋ＢａｍＨＩを用いて消化し、発現プラスミドｐＴｒｃ９９Ａ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）内の同じ部位中にクローニングし、ｐＤＡＲ１Ａを得た。
【０１６１】
ＤＡＲ１の５’末端により良いリボソーム結合部位を作るために、合成プライマー（配列番号：２６と配列番号：２７）のアニーリングにより得たＳｐｅＩ−ＲＢＳ−ＮｃｏＩリンカーをｐＤＡＲ１ＡのＮｃｏＩ部位中に挿入し、ｐＡＨ４０を作った。プラスミドｐＡＨ４０は、ｐＴｒｃ９９Ａ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）のｔｒｃプロモーターからの発現に関して正しい配向で新しいＲＢＳ及びＤＡＲ１遺伝子を含有する。ｐＤＡＲ１ＡからのＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩフラグメント及び合成プライマー（配列番号：２８と配列番号：２９）のアニーリングにより得た第２の組のＳｐｅＩ−ＲＢＳ−ＮｃｏＩリンカーをｐＢＣ−ＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のＳｐｅＩ−ＢａｍＨＩ部位中に挿入し、プラスミドｐＡＨ４２を作った。プラスミドｐＡＨ４２はクロラムフェニコール耐性遺伝子を含有する。
ｄａｒ１及びｇｐｐ２のための発現カセットの構築：
ＤＡＲ１及びＧＰＰ２のための発現カセットを、標準的分子生物学的方法を用い、上記のそれぞれのＤＡＲ１及びＧＰＰ２サブクローンから組み立てた。リボソーム結合部位（ＲＢＳ）及びＧＰＰ２遺伝子を含有するｐＡＨ１９からのＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩフラグメントをｐＡＨ４０中に挿入し、ｐＡＨ４３を作った。ＲＢＳ及びＧＰＰ２遺伝子を含有するｐＡＨ１９からのＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩフラグメントをｐＡＨ４２中に挿入し、ｐＡＨ４５を作った。
【０１６２】
ＧＰＰ２の５’末端におけるリボソーム結合部位を以下の通りに修正した。合成プライマーＧＡＴＣＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＡ（配列番号：３０）をＣＴＡＧＴＣＴＧＴＴＴＣＣＴＧ（配列番号：３１）と、ＧＰＰ２遺伝子を含有するｐＡＨ１９からのＸｂａＩ−ＰｓｔＩフラグメントにアニーリングすることにより得たＢａｍＨＩ−ＲＢＳ−ＳｐｅＩリンカーをｐＡＨ４０のＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩ部位中に挿入し、ｐＡＨ４８を作った。プラスミドｐＡＨ４８は、ｐＴｒｃ９９Ａ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）のｔｒｃプロモーターからの発現に関して正しい配向でＤＡＲ１遺伝子、修正ＲＢＳ及びＧＰＰ２遺伝子を含有する。
Ｅ．コリの形質転換：
本明細書に記載するプラスミドを、標準的な分子生物学的方法を用いてＥ．コリＤＨ５α、ＦＭ５及びＫＬＰ２３中に形質転換した。形質転換細胞をそれらのＤＮＡ  ＲＦＬＰパターンにより実証した。
【０１６３】
実施例６
クレブシエラ・ニューモニアエｄｈａレギュロンからの遺伝子を有する
エシェリキア・コリの形質転換において用いるための発現プラスミドの構築
発現ベクターｐＴａｃＩＱの構築：
ｌａｃＩｑ遺伝子（Ｆａｒａｂａｕｇｈ，Ｎａｔｕｒｅ  ２７４（５６７３），７６５−７６９（１９７８））及びｔａｃプロモーター（Ａｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ２５，１６７−１７８（１９８３））をｐＢＲ３２２（Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ．Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．４３，７７−９０（１９７９））の制限エンドヌクレアーゼ部位ＥｃｏＲＩ中に挿入することにより、Ｅ．コリ発現ベクターｐＴａｃＩＱを調製した。多重クローニング部位（ａ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｓｉｔｅ）及びターミネーター配列（配列番号：３２）がＥｃｏＲＩからＳｐｈＩまでｐＢＲ３２２配列に取って代わる（ｒｅｐｌａｃｅｓ）。
グリセロールデヒドラターゼ遺伝子（ｄｈａＢ１、２、３、Ｘ）のサブクローニング：
５’末端にＥｃｏＲＩ部位及び３’末端にＸｂａＩ部位が導入されたプライマー（配列番号：３３及び配列番号：３４）を用いるＰＣＲにより、ｄｈａＢ３遺伝子のための読取り枠をｐＨＫ２８−２６から増幅した。産物をｐＬｉｔｍｕｓ２９（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）中にサブクローニングし、ｄｈａＢ３を含有するプラスミドｐＤＨＡＢ３を形成した。
【０１６４】
ｐＨＫ２８−２６からのｄｈａＢオペロンのｄｈａＢ１、ｄｈａＢ２、ｄｈａＢ３及びｄｈａＢＸに関する全コード領域を含有する領域を、制限酵素ＫｐｎＩ及びＥｃｏＲＩを用いてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）中にクローニングし、プラスミドｐＭ７を作った。
【０１６５】
ＡｐａＩ及びＸｂａＩを用いるプラスミドｐＭ７の消化によりｄｈａＢＸ遺伝子を除去し、５．９ｋｂフラグメントを精製し、それをプラスミドｐＤＨＡＢ３からの３２５−ｂｐのＡｐａＩ−ＸｂａＩフラグメントと連結し、ｄｈａＢ１、ｄｈａＢ２及びｄｈａＢ３を含有するｐＭ１１を作った。
【０１６６】
５’末端にＨｉｎｄＩＩＩ部位及び共通リボソーム結合部位及び３’末端にＸｂａＩ部位が導入されたプライマー（配列番号：３５及び配列番号：３６）を用いるＰＣＲにより、ｄｈａＢ１遺伝子のための読取り枠をｐＨＫ２８−２６から増幅した。産物をｐＬｉｔｍｕｓ２８（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）中にサブクローニングし、ｄｈａＢ１を含有するプラスミドｐＤＴ１を形成した。
【０１６７】
ｄｈａＢ１遺伝子、ｄｈａＢ２遺伝子及びｄｈａＢ３遺伝子の一部を含有するｐＭ１１からのＮｏｔＩ−ＸｂａＩフラグメントをｐＤＴ１中に挿入し、ｄｈａＢ発現プラスミド、ｐＤＴ２を作った。ｐＤＴ２からのｄｈａＢ（１、２、３）遺伝子を含有するＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩフラグメントをｐＴａｃＩＱ中に挿入し、ｐＤＴ３を作った。
１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼ遺伝子（ｄｈａＴ）のサブクローニング：
１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼ（ｄｈａＴ）遺伝子を含有するｐＨＫ２８−２６のＫｐｎＩ−ＳａｃＩフラグメントをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＫＳ＋中にサブクローニングし、プラスミドｐＡＨ１を作った。鋳型ＤＮＡとしてのｐＡＨ１ならびに５’末端にＸｂａＩ部位及び３’末端にＢａｍＨＩ部位が導入された合成プライマー（配列番号：３７と配列番号：３８）からのＰＣＲにより、ｄｈａＴ遺伝子を増幅した。産物をｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中にＳｒｆＩ部位においてサブクローニングし、ｄｈａＴを含有するプラスミドｐＡＨ４及びｐＡＨ５を形成した。プラスミドｐＡＨ４はｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ中のｌａｃプロモーターからの発現に関して正しい配向でｄｈａＴ遺伝子を含有し、ｐＡＨ５は反対の配向でｄｈａＴ遺伝子を含有する。ｄｈａＴ遺伝子を含有するｐＡＨ４からのＸｂａＩ−ＢａｍＨＩフラクメントをｐＴａｃＩＱ中に挿入し、プラスミドｐＡＨ８を形成した。ＲＢＳ及びｄｈａＴ遺伝子を含有するｐＡＨ８からのＨｉｎｄＩＩ−ＢａｍＨＩフラグメントをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ＋中に挿入し、ｐＡＨ１１を作った。
ｄｈａＴ及びｄｈａＢ（１、２、３）のための発現カセットの構築：
標準的な分子生物学的方法を用い、ｄｈａＴ及びｄｈａＢ（１、２、３）のための発現カセットを前記のそれぞれのｄｈａＢ（１、２、３）及びｄｈａＴサブクローンから組み立てた。ｐＤＴ３からのｄｈａＢ（１、２、３）遺伝子を含有するＳｐｅＩ−ＳａｃＩフラグメントをｐＡＨ１１中にＳｐｅＩ−ＳａｃＩ部位において挿入し、ｐＡＨ２４を作った。制限酵素ＳａｌＩ−ＸｂａＩで消化されたｐＡＨ５中にＳａｌＩ−ＸｂａＩリンカー（配列番号：３９及び配列番号：４０）を挿入し、ｐＤＴ１６を作った。リンカーはＸｂａＩ部位を破壊する。次いでｐＤＴ１６からの１ｋｂのＳａｌＩ−ＭｌｕＩフラグメントをｐＡＨ２４中に挿入し、現存するＳａｌＩ−ＭｌｕＩフラグメントに取って代わらせ、ｐＤＴ１８を作った。ｐＤＴ１８からのＳａｌＩ−ＮｏｔＩフラグメント及びｐＭ７からのＮｏｔＩ−ＸｂａＩフラグメントをｐＣＬ１９２０（配列番号：４１）中に挿入することにより、ｐＤＴ２１を構築した。ストレプトミセスからのグルコースイソメラーゼプロモーター配列（配列番号：４２）をＰＣＲによりクローニングし、ｐＬｉｔｍｕｓ２８のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎＤＩＩＩ部位中に挿入し、ｐＤＴ５を構築した。ｐＤＴ５のＥｃｏＲＩ−ＰｖｕＩＩフラグメントをｐＣＬ１９２０のＥｃｏＲＩ−ＰｖｕＩ部位中に挿入することにより、ｐＣＬ１９２５を構築した。ｐＤＴ２１のＨｉｎＤＩＩＩ−ＭｌｕＩＩフラグメント及びｐＤＴ２１のＭｌｕＩ−ＸｂａＩフラグメントをｐＣＬ１９２５のＨｉｎＤＩＩＩ−ＸｂａＩ部位中にクローニングすることにより、ｐＤＴ２４を構築した。
ｄｈａＴ及びｄｈａＢ（１、２、３、Ｘ）のための発現カセットの構築：
ｐＤＴ１８からのＳａｌＩ−ＮｏｔＩフラグメント及びｐＭ７からのＮｏｔＩ−ＸｂａＩフラグメントをｐＣＬ１９２０（配列番号：４１）中に挿入することにより、ｐＤＴ２１を構築した。ストレプトミセスからのグルコースイソメラーゼプロモーター配列（配列番号：４２）をＰＣＲによりクローニングし、ｐＬｉｔｍｕｓ２８のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎＤＩＩＩ部位中に挿入し、ｐＤＴ５を構築した。ｐＤＴ５のＥｃｏＲＩ−ＰｖｕＩＩフラグメントをｐＣＬ１９２０のＥｃｏＲＩ−ＰｖｕＩ部位中に挿入することにより、ｐＣＬ１９２５を構築した。ｐＤＴ２１のＨｉｎＤＩＩＩ−ＭｌｕＩＩフラグメント及びｐＤＴ２１のＭｌｕＩ−ＸｂａＩフラグメントをｐＣＬ１９２５のＨｉｎＤＩＩＩ−ＸｂａＩ部位中にクローニングすることにより、ｐＤＴ２４を構築した。
ｄｈａＲ、ｏｒｆＹ、ｄｈａＴ、ｏｒｆＸ、ｏｒｆＷ及びｄｈａＢ（１、２、３、Ｘ）のための発現カセットの構築：
ｐＨＫ２８−２６のＳａｃＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントをｐＣＬ１９２５のＳａｃＩ−ＥｃｏＲＩ部位中に挿入することにより、ｐＤＴ２９を構築した。
ｄｈａＲ、ｏｒｆＹ、ｏｒｆＸ、ｏｒｆＷ及びｄｈａＢ（１、２、３、Ｘ）のための発現カセットの構築：
ＰＣＲ−媒介オーバーラップエクステンションとして既知の方法により、遺伝子ｄｈａＴの最初の５つ及び最後の５つのコドン（及び停止コドン）を除くすべてが欠失しているプラスミドｐＤＴ２９の誘導体を構築した。ｐＤＴ２９を鋳型として用い、以下のプライマーを用いて２つの一次ＰＣＲ産物を形成した：
配列番号：４３＝５’ＧＡＣ  ＧＣＡ  ＡＣＡ  ＧＴＡ  ＴＴＣ  ＣＧＴ  ＣＧＣ３’；
配列番号：４４＝５’ＡＴＧ  ＡＧＣ  ＴＡＴ  ＣＧＴ  ＡＴＧ  ＴＴＣ  ＣＧＣ  ＣＡＧ  ＧＣＡ  ＴＴＣ  ＴＧＡ  ＧＴＧ  ＴＴＡ  ＡＣＧ３’；
配列番号：４５＝５’ＧＣＣ  ＴＧＧ  ＣＧＧ  ＡＡＣ  ＡＴＡ  ＣＧＡ  ＴＡＧ  ＣＴＣ  ＡＴＡ  ＡＴＡ  ＴＡＣ３’；
配列番号：４６＝５’ＣＧＧ  ＧＧＣ  ＧＣＴ  ＧＧＧ  ＣＣＡ  ＧＴＡ  ＣＴＧ３’。
【０１６８】
配列番号：４５を配列番号：４６と対にし、９３１ｂｐｓ且つ５’ｄｈａＢ１（ユニークＳｃａＩ部位まで）、ｏｒｆＹのすべて及びｄｈａＴの最初の５つのコドンを含む核酸を包含する産物を形成した。配列番号：４３を配列番号：４４と対にし、１３４８ｂｐｓ且つｄｈａＴの最後の５つのコドン（及び停止コドン）、ｏｒｆＸのすべて、ｏｒｆＷのすべて及び５’ｄｈａＲ（ユニークＳａｐＩ部位まで）を含む核酸を包含する産物を形成した。配列番号：４４の５’末端における１５の塩基は配列番号：４５の１５塩基部分の逆相補配列である尾部を構成する。同様に、配列番号：４５の５’末端における１１の塩基は、配列番号：４４の１１塩基部分の逆相補配列である尾部を構成する。かくして２つの一次ＰＣＲ産物をアニーリング（２６ｂｐ尾部オーバーラップを介する）及びＰＣＲによる伸長（ｅｘｔｅｎｄｉｎｇ）の後に一緒にし、２２５３ｂｐｓの第３の核酸産物を形成した。この第３のＰＣＲ産物をＳａｐＩ及びＳｃａＩを用いて消化し、やはりＳａｐＩ及びＳｃａＩを用いて消化されたｐＤＴ２９中に連結し、プラスミドｐＫＰ３２を形成し、それはｄｈａＴ内における大きな読取り枠内欠失（ｉｎ−ｆｒａｍｅ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ）を除いてｐＤＴ２９と同じである。
【０１６９】
実施例７
Ｅ．コリ株ＫＬＰ２３／ｐＡＨ４８／ｐＤＴ２９を用いるグルコースの
１，３−プロパンジオールへの転換及び
ＫＬＰ２３／ｐＡＨ４８／ｐＫＰ３２を用いる改良法
予備−培養：
ＫＬＰ２３／ｐＡＨ４８／ｐＤＴ２９及びＫＬＰ２３／ｐＡＨ４８／ｐＫＰ３２を発酵槽への播種のために、２００ｍｇ／Ｌのカルベニシリン（もしくはアンピシリン）及び５０ｍｇ／Ｌのスペクチノマイシンを含有する２ＹＴ培地（１０ｇ／Ｌ  酵母抽出物、１６ｇ／Ｌ  トリプトン及び１０ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ）中で予備−培養した。ＫＬＰ２３／ｐＡＨ４８／ｐＫＰ３２は、ｄｈａＴが欠失していることを除いてＫＬＰ２３／ｐＡＨ４８／ｐＤＴ２９と同じである。
【０１７０】
２−ＬのＥｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコにおいて５００ｍＬの培地中で、凍結材料（ｆｒｏｚｅｎ  ｓｔｏｃｋｓ）（凍結保護剤として１０％ＤＭＳＯ）から培養を開始し、２５０ｒｐｍにおける震盪機中で３５℃において、約１．０ＡＵのＯＤ550に達するまで成長させ、発酵槽への播種に用いた。
発酵培地：
以下の成分を発酵槽中で一緒に滅菌した：４５ｇ  ＫＨ2ＰＯ4、１２ｇ  クエン酸、１２ｇ  ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、３０ｇ  酵母抽出物、２．０ｇ  クエン酸第２鉄アンモニウム、消泡剤としての５ｍＬ  Ｍａｚｕ  ＤＦ２０４、１．２ｇ  ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ及び７．３ｍＬ  硫酸。２０〜２８％のＮＨ4ＯＨを用いてｐＨを６．８に上げ、以下の成分を加えた：１．２ｇ  カルベニシリンもしくはアンピシリン、０．３０ｇ  スペクチノマイシン、６０ｍＬの微量栄養素の溶液及びグルコース（６０〜６７重量％供給材料から）。接種の後、容積は６．０Ｌであり、グルコース濃度は１０ｇ／Ｌであった。微量栄養素の溶液は（ｇ／Ｌ）：クエン酸．Ｈ2Ｏ（４．０）、ＭｎＳＯ4・Ｈ2Ｏ（３．０）、ＮａＣｌ（１．０）、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ（０．１０）、ＣｏＣｌ2・６Ｈ2Ｏ（０．１０）、ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ（０．１０）、ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ（０．０１０）、Ｈ3ＢＯ3（０．０１０）及びＮａ2ＭｏＯ4・２Ｈ2Ｏ（０．０１０）を含有した。
発酵成長：
上記の培地を用いて１５Ｌの撹拌されたタンク発酵槽を調製した。温度を３５℃で制御し、アンモニア水（２０〜２８重量％）を用いてｐＨを６．８に調節した。空気流量（１分当たりに６〜１２標準リットルの最小値に設定）及び撹拌機速度（３５０〜６９０ｒｐｍの最小値に設定）に関する初期値は、ＯＵＲ値が約１４０ミリモル／Ｌ／ｈに達したら溶解酸素（ＤＯ）制御が開始されるように設定された。背圧は０．５バールで制御された。ＤＯ制御は１０％に設定された。小さな逸脱を除き、グルコースは６０％もしくは６７％（重量）供給材料を用いて０ｇ／Ｌ〜１０ｇ／Ｌにおいて保持された。下記に記す通りにビタミンＢ12又は補酵素Ｂ12を加えた。
ＫＬＰ２３／ｐＡＨ４８／ｐＤＴ２９を用いる発酵：
Ｅ．コリ株ＫＬＰ２３／ｐＡＨ４８／ｐＤＴ２９を用いるグルコースの１，３−プロパンジオール（１，３−ＰＤ）への転換の代表的な発酵の概略を表４に示す。ビタミンＢ12（０．０７５ｇ／Ｌ、５００ｍＬ）を、接種から３時間後に開始して１６ｍＬ／ｈの速度で供給した。１，３−プロパンジオールの収率は２４重量％（消費されたグルコースのｇ当たりの１，３−プロパンジオールのｇ）であり、６８ｇ／Ｌの１，３−プロパンジオールの力価が得られた。
【０１７１】
【表５】
0004716634.tif 000006
【０１７２】
同じビタミンＢ12供給材料を用い、発酵の時間経過を横切る（ａｃｒｏｓｓ）ビタミンＢ12の２倍濃度の添加又はボーラス添加において類似の結果が得られた。得られた最高の力価は７７ｇ／Ｌであった。
ＫＬＰ２３／ｐＡＨ４８／ｐＫＰ３２を用いる改良された発酵：
Ｅ．コリ株ＫＬＰ２３／ｐＡＨ４８／ｐＫＰ３２を用いるグルコースの１，３−プロパンジオール（１，３−ＰＤ）への転換の代表的な発酵の概略を表５に示す。ビタミンＢ12（０．１５０ｇ／Ｌ、５００ｍＬ）を、接種から３時間後に開始して１６ｍＬ／ｈの速度で供給した。３６ｈ後、２Ｌの発酵ブイヨンをパージし、グルコース供給材料の連続的添加を可能にした。１，３−プロパンジオールの収率は２６重量％（消費されたグルコースのｇ当たりの１，３−プロパンジオールのｇ）であり、１１２ｇ／Ｌの１，３−プロパンジオールの力価が得られた。
【０１７３】
【表６】
0004716634.tif 000007
【０１７４】
同じビタミンＢ12供給材料を用い、発酵の時間経過を横切るビタミンＢ12の半分の濃度の添加又はボーラス添加において類似の結果が得られた。得られた最高の力価は１１４ｇ／Ｌであった。
【０１７５】
実施例８
グルコースからの１，３−プロパンジオールの高められた収率のための
Ｅ．コリＫＬＰ２３のトリオースリン酸イソメラーゼ突然変異体の操作
Ｅ．コリＫＬＰ２３におけるトリオースリン酸イソメラーゼ遺伝子置換のためのプラスミドの構築：
Ｐｕｒｅｇｅｎｅ  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｇｅｎｔｒａ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を用いてＥ．コリＫＬＰ２３ゲノムＤＮＡを調製した。ｃｄｈ及びトリオースリン酸イソメラーゼ（ｔｐｉＡ）遺伝子の３’末端を含有する１．０ｋｂのＤＮＡフラグメントを、プライマー配列番号：４７及び配列番号：４８を用いてＫＬＰ２３ゲノムＤＮＡからＰＣＲ（Ｍｕｌｌｉｓ  ａｎｄ  Ｆａｌｏｏｎａ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５５，３３５−３５０（１９８７））により増幅した。ｔｐｉＡの５’末端、ｙｉｉＱ及びｙｉｉＲ遺伝子の５’末端を含有する１．０ｋｂのＤＮＡフラグメントを、プライマー配列番号：４９及び配列番号：５０を用い、ＫＬＰ２３ゲノムＤＮＡからＰＣＲにより増幅した。プライマー配列番号：４９中にはＳｃａＩ部位が導入された。プライマー配列番号：４９の５’末端はプライマー配列番号：４８の逆相補配列であり、続くオーバーラップエクステンションＰＣＲを可能にした。オーバーラップエクステンション法（Ｈｏｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ８，５２８−５３５（１９９０））による遺伝子切除を用い、鋳型として上記の２つのＰＣＲフラグメント及びプライマー配列番号：４７及び配列番号：５０を用いるＰＣＲにより２．０ｋｂのフラグメントを形成した。このフラグメントは、７６８ｂｐのｔｐｉＡ構造遺伝子の７３％の欠失を示した。全体としてこのフラグメントは（部分的ｔｐｉＡ内の）ＳｃａＩクローニング部位の両側上に１．０ｋｂのフランキング領域を有し、相同的組換えによる染色体遺伝子置換を可能にした。
【０１７６】
上記の平滑末端化された２．０ｋｂのＰＣＲフラグメントを、Ｚｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いてｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔベクター中にクローニングし、カナマイシン及びゼオシン耐性遺伝子を含有する５．５ｋｂのプラスミドｐＲＮ１０６−２を得た。バクテリオファージＰ１  ｌｏｘＰ部位（Ｓｎａｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １６６，１７３−１７４（１９９５））によりフランキングされたクロラムフェニコール−耐性遺伝子を含有するｐＬｏｘＣａｔ１（未公開の結果）からの１．２ｋｂのＨｉｎｃＩＩフラグメントを用い、プラスミドｐＲＮ１０６−２中のｔｐｉＡフラグメントを、それをＳｃａＩ−消化プラスミドｐＲＮ１０６−２に連結することにより分断し、６．８ｋｂのプラスミドｐＲＮ１０７−１を得た。
線状ＤＮＡ形質転換によるトリオースリン酸イソメラーゼ突然変異体ＲＪ８ｍの操作：
鋳型としてｐＲＮ１０７−１ならびにプライマー配列番号：４７及び配列番号：５０を用い、ｔｐｉＡフランキング領域及びｌｏｘＰ−ＣｍＲ−ｌｏｘＰカセットを含有する３．２ｋｂフラグメントをＰＣＲ増幅し、ゲル−抽出した。最高で１μｇのこの３．２ｋｂの線状ＤＮＡフラグメントを用いてＥ．コリＫＬＰ２３を電気形質転換し、クロラムフェニコール−耐性（１２．５μｇ／ｍＬ）且つカナマイシン−感受性（３０μｇ／ｍＬ）である形質転換細胞をＭ９最少培地上で、１ｍＭグルコース上における劣ったグルコース使用に関して、１ｍＭグルコネート上における正常なグルコネート使用に関して、および１ｍＭグルセロール上における宿主ＫＬＰ２３のグリセロール非−使用表現型を確かめるためにさらにスクリーニングした。１つのそのような突然変異体、ＲＪ８ｍからのゲノムＤＮＡのＥｃｏＲＩ消化は、無損傷のｔｐｉＡ遺伝子を用い、サザン分析（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９８，５０３−５１７（１９７５））を介して精査すると、それが二重−交差組込み体（ｔｐｉＡ遺伝子置換）であることを示し、それはクロラムフェニコール耐性遺伝子内における追加のＥｃｏＲＩ部位の存在のおかげで２つの予測される６．６ｋｂ及び３．０ｋｂバンドが観察されるからであった。予測通り、宿主ＫＬＰ２３及び野生−型ＦＭ５対照標準は、それぞれ単独の８．９ｋｂ及び９．４ｋｂバンドを与えた。このｔｐｉＡ突然変異体をプライマー配列番号：５１及び配列番号：５２を用いるゲノムＰＣＲによりさらに分析し、それは予測される４．６ｋｂのＰＣＲフラグメントを与えたが、同じプライマー対に関し、宿主ＫＬＰ２３及び野生−型ＦＭ５株は両方とも予測される３．９ｋｂのＰＣＲフラグメントを与えた。ｔｐｉＡ突然変異体ＲＪ８ｍ及び宿主ＫＬＰ２３からの無−細胞抽出物を、基質としてグリセルアルデヒド３−リン酸を用いてｔｐｉＡ活性に関して調べると、ＲＪ８ｍの場合には活性が観察されなかった。プラスミドｐＡＨ４８を用いてｔｐｉＡ突然変異体ＲＪ８ｍを電気形質転換し、グルコースからのグリセロール生産を可能にし、又、プラスミドｐＡＨ４８とｐＤＴ２９もしくはｐＫＰ３２の両方を用いて電気形質転換し、グルコースからの１，３−プロパンジオール生産を可能にした。ＲＪ８ｍからクロラムフェニコール耐性マーカーを除去してＲＪ８を得た。
【０１７７】
実施例９
Ｅ．コリ株ＲＪ８／ｐＡＨ４８／ｐＤＴ２９を用いる
グルコースの１，３−プロパンジオールへの転換及び
ＲＪ８／ｐＡＨ４８／ｐＫＰ３２を用いる改良法
予備−培養：
実施例７に記載した通り、ＲＪ８／ｐＡＨ４８／ｐＤＴ２９及びＲＪ８／ｐＡＨ４８／ｐＫＰ３２を発酵槽への播種のために予備−培養した。ＲＪ８／ｐＡＨ４８／ｐＫＰ３２は、ｄｈａＴが欠失していることを除いてＲＪ８／ｐＡＨ４８／ｐＤＴ２９と同じである。
発酵槽培地：
発酵槽培地は実施例７に記載した通りであった。
発酵成長：
発酵槽成長は、空気流量（分当たりに５〜６標準リットルの最小値に設定）及び撹拌機速度（３００〜６９０ｒｐｍの最小値に設定）に関する初期値を、ＯＵＲ値が６０〜１００ミリモル／Ｌ／ｈに達したら溶解酸素（ＤＯ）制御が開始されるように設定したことを除いて、実施例７に記載した通りであった。下記に記す通りにビタミンＢ12又は補酵素Ｂ12を加えた。
ＲＪ８／ｐＡＨ４８／ｐＤＴ２９を用いる発酵：
Ｅ．コリ株ＲＪ８／ｐＡＨ４８／ｐＤＴ２９を用いるグルコースの１，３−プロパンジオール（１，３−ＰＤ）への転換の代表的な発酵の概略を表６に示す。ビタミンＢ12は、２、８及び２６ｈにそれぞれ２、１６及び１６ｍｇのボーラス添加として与えた。１，３−プロパンジオールの収率は３５重量％（消費されたグルコースのｇ当たりの１，３−プロパンジオールのｇ）であり、５０．１ｇ／Ｌの１，３−プロパンジオールの力価が得られた。
【０１７８】
【表７】
0004716634.tif 000008
【０１７９】
ＲＪ８／ｐＡＨ４８／ｐＫＰ３２を用いる改良された発酵：
Ｅ．コリ株ＲＪ８／ｐＡＨ４８／ｐＫＰ３２を用いるグルコースの１，３−プロパンジオール（１，３−ＰＤ）への転換の代表的な発酵の概略を表７に示す。ビタミンＢ12は、約２６及び４４時間にそれぞれ４８及び１６ｍｇのボーラス添加として与えた。１，３−プロパンジオールの収率は３４重量％（消費されたグルコースのｇ当たりの１，３−プロパンジオールのｇ）であり、１２９ｇ／Ｌの１，３−プロパンジオールの力価が得られた。
【０１８０】
【表８】
0004716634.tif 000009
【０１８１】
実施例１０
改良された１，３−プロパンジオールプロセスにおける
Ｅ．コリ非−特異的触媒活性（ｙｇｈＤ）の同定
改良された触媒を用いる１，３−プロパンジオール−生産発酵における非−特異的触媒活性の立証：
１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼ活性に関する全細胞アッセイを用い、発酵条件下で、ビタミンＢ12の添加及び３−ヒドロキシプロピオンアルデヒド（３−ＨＰＡ）の生産の後に非−特異的触媒活性がＥ．コリ中に存在するが、前には存在しないことを示した。グリセロール−生産及び１，３−プロバンジオール−生産プラスミド、それぞれｐＡＨ４８及びｐＫＰ３２を含有する組換えＥ．コリ株を１０Ｌの発酵槽において、本質的に実施例７に記載した通りに、しかしビタミンＢ12の不在下で成長させた。タンクが約１００のＯＤ550に達したらビタミンＢ12ボーラス（４８ｍｇ）を加えた。ビタミンＢ12の添加の直前及び２ｈ後に細胞のアリコートをタンクから採取した。遠心により細胞を回収し、新しいタンパク質合成を妨げるために１５０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを含有するＰＢＳ緩衝液中にそれらの最初の容積まで再懸濁させた。最終的容積が、約１０のＯＤ550において５０ｍＬとなるのに適した容積のクロラムフェニコール処理細胞を、反応混合物（１０ｇ／Ｌ  グルコース、１０ｇ／Ｌ  グリセロール、１ｍｇ／Ｌ  補酵素Ｂ12及び１５０μｇ／ｍＬ  クロラムフェニコールを含有するＰＢＳ緩衝液）を含有する２５０ｍＬのバフルドフラスコ（ｂａｆｆｌｅｄ  ｆｌａｓｋｓ）に加えた。光から保護されたフラスコを３５℃で２５０ｒｐｍにおいて震盪させた。時間の経過に及んでＨＰＬＣ分析のためのアリコートを採取した。ビタミンＢ12添加の前もしくは後に発酵槽から回収された細胞を含有するフラスコ中で、３−ＨＰＡの時間−依存的生産が観察された。まさに対照的に、ビタミンＢ12添加の後に発酵槽から回収された細胞を含有するフラスコのみにおいて、有意なレベルの１，３−プロパンジオールが観察された。
無−細胞抽出物中における非−特異的触媒活性の検出：
未変性ゲル活性染色アッセイ（ｎａｔｉｖｅ  ｇｅｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｓｔａｉｎ  ａｓｓａｙ）を用い、無−細胞抽出物中における非−特異的触媒活性を示した。ビタミンＢ12の添加の前及び後に、グリセロール−生産及び１，３−プロパンジオール−生産プラスミド、それぞれｐＡＨ４８及びｐＫＰ３２を含有する組換えＥ．コリ株を用いる代表的な１０−Ｌ発酵から細胞を回収し；フレンチプレスを用いる細胞破壊により無−細胞抽出物を調製した。無−細胞抽出物、純粋なクレブシエラ・ニューモニアエ１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼ（ｄｈａＴ）の試料及び分子量標準を未変性勾配ポリアクリルアミドゲルに適用し、その上で移動させた（ｒｕｎ  ｏｕｔ）。次いでゲルを基質１，３−プロパンジオールとＮＡＤ+又はエタノールとＮＡＤ+に暴露した。予想通り、１，３−プロパンジオールが基質であるゲルにおいては、ＤｈａＴに関する活性染色が観察され、それは未変性ゲル上を約３４０Ｋｄａｌにおいて移動した。この活性は純粋なクレブシエラ・ニューモニアエ１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼが適用されたレーンのみで観察された。対照的に、１，３−プロパンジオールが基質であり、ビタミンＢ12−後無細胞抽出物が適用された場合、約９０Ｋｄａｌにおいて非−特異的触媒活性が観察された。基質としてエタノールが用いられると、ＤｈａＴバンドも非−特異的触媒活性バンドも見えず、ビタミンＢ12添加の前及び後に約１２０Ｋｄａｌにおいて別のバンドが見いだされた。この新しいバンドは、典型的にはすべての生物において見いだされる、基質としてエタノールに対して特異性を有するアルコールデヒドロゲナーゼを示すのが最もありそうなことである。
【０１８２】
タンパク質が酵素アッセイ段階の前に分子量によって分離されるこの未変性ゲルアッセイは、活性が低く、Ｅ．コリに関して十分に特性化され且つすべての生物で見いだされる、基質としてエタノールに対して特異性を有するアルコールデヒドロゲナーゼと活性が異なっているらしい構築物における１，３−プロパンジオールの還元の測定で、より高い感度及び精度を与える。デヒドロゲナーゼアッセイは、デヒドロゲナーゼが１，３−プロパンジオール（又は他のアルコール）からＮＡＤ+への電子の伝達を触媒するという原理で働く。次いでＰＭＳ（フェナジンメトサルフェート）がＮＡＤＨとゲル中で沈殿を形成するテトラゾリウムブロミド色素（ＭＴＴ、３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）の間の電子伝達をカップリングさせる。基質中に数時間から終夜浸した後、ゲルを洗浄して試薬及び可溶性の色素を除去する。ゲル上の活性デヒドロゲナーゼがあるバンドにおいて、不溶性の青い色素が生成する。アッセイの種々の側面がＪｏｈｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｎ（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：２０５０（１９８７））により記載されている。
Ｅ．コリにおける非−特異的触媒活性の精製及び同定：
実施例７のＫＬＰ２３／ｐＡＨ４８／ｐＫＰ３２を用いる改良法で記載した典型的な１，３−プロパンジオール生産実験の最後から収穫した細胞につき、非−特異的触媒活性の大規模な部分的精製を行った。細胞ペレット（１６ｇ）を洗浄し、２０ｍＬ  ５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ緩衝液、ｐＨ７．５中に３回再懸濁させた。音波処理により懸濁液中の細胞をライシスさせた。遠心（１５分、２０，０００ｘｇ、１０℃）により無−細胞抽出物を得、氷上で撹拌しながら２５０ｍｇのプロタミンサルフェートを加えることにより、上澄み液をさらに透明にした。遠心（２０分、２０，０００ｘｇ、１０℃）によって得た上澄み液を、Ｈｅｐｅｓ緩衝液を用いて平衡化されたＳｕｐｅｒｄｅｘR２００分取等級カラム（６ｘ６０ｃｍ）に通過させることにより分別した。１０ｍＬづつの画分を集め、それぞれのアリコートを１０，０００ＭＷカットオフＣｅｎｔｒｉｃｏｎR膜を用いて２５分の１に濃縮してから、未変性ゲル活性染色によりアッセイした。画分１０７−１１２において非−特異的触媒活性が同定され、画分１０８−１０９においてピーク活性が同定された。画分１０８及び１０９のもっと大きなアリコート（７ｍＬづつ）を５０分の１に濃縮し、１２−レーンの未変性ゲルのすべてのレーン上に負荷した。ゲルを半分に切り、半分をデヒドロゲナーゼ活性に関して染色し、そこには暗青色のバンドが現れ、それは非−特異的触媒活性を示した。未染色のゲルを上から下に染色ゲルと並べ、非−特異的触媒活性のバンドに対応するバンドを未染色ゲル上で切った。ゲルのストリップを粉砕し、粉砕された粒子を０．５ｍＬの２Ｄ−負荷緩衝液中に沈め、９５℃に５分間加熱し、遠心してゲル粒子を除去することにより、可溶性タンパク質を抽出した。Ｓｗｉｓｓ  ２Ｄデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｃｈ２ｄ／；Ｔｏｎｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  １９：１９６０−１９７１（１９９８））においてＥ．コリ抽出物の２Ｄ−ＰＡＧＥのために記載されている条件を用い、２−次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動（２Ｄ−ＰＡＧＥ）のために、上澄み液を等電点電気泳動（ＩＥＦ）ストリップ上に負荷した。エレクトロブロッティングによりゲルをＰＶＤＦ膜に移した。コロイドブルー（Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ  ｂｌｕｅ）ゲル染色を用いて膜をタンパク質に関して染色した。非−特異的触媒活性を同定するために用いられた染色されたブロットを図６に示す。アミノ末端ペプチド配列決定のための標準的方法を用いてスポットを同定した。１つのスポット（スポットＡ）のみがオキシドレダクターゼ活性をコードした。スポットＡ（図６）の１９サイクルは、ＦＡＳＴＡ探索機（ｓｅａｒｃｈ  ｔｏｏｌ）により、推定オキシドレダクターゼ活性を有するＥ．コリの読取り枠であるｙｑｈＤのアミノ−末端と１００％の同一性適合（ｉｄｅｎｔｉｔｙ  ｍａｔｃｈ）を与えた。ｙｑｈＤによりコードされるタンパク質に関する完全アミノ酸配列を配列番号：５７に示し；対応するＤＮＡ配列を配列番号：５８に示す。ｙｑｈＤ遺伝子は、おそらくＮＡＤＨ−依存性ブタノールデヒドロゲナーゼ２であるクロスツリジウム中の遺伝子ａｄｈＢに４０％の同一性を有する。Ｅ．���リＫＬＰ２３中のｙｑｈＤの遺伝子破壊：
生化学的アッセイ及びアミノ−末端アミノ酸配列決定は、非−特異的触媒活性がＥ．コリｙｑｈＤ遺伝子によりコードされるかも知れないことを示唆した。未知の機能のこの遺伝子は仮定的オキシドレダクターゼをコードし、ｄｈａＴ遺伝子によりコードされるシトロバクテル・フレウンジイ及びクレブシエラ・ニューモニアエ１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼ中にも見いだされる２つのアルコールデヒドロゲナーゼの特徴（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）を含有する。
【０１８３】
この遺伝子を破壊するために、ｙｑｈＤならびに８３０ｂｐの５’−フランキングＤＮＡ配列及び９０６ｂｐの３’−フランキングＤＮＡ配列をＥ．コリＫＬＰ２３（実施例４）ゲノムＤＮＡから、Ｔａｑポリメラーゼ及び以下のプライマーを用いるＰＣＲにおいて増幅した：
（配列番号：５９）５’−ＧＣＧＧＴＡＣＣＧＴＴＧＣＴＣＧＡＣＧＣＴＣＡＧＧＴＴＴＴＣＧＧ−３’
（配列番号：６０）５’−ＧＣＧＡＧＣＴＣＧＡＣＧＣＴＴＧＣＣＣＴＧＡＴＣＧＡＧＴＴＴＴＧＣ−３’
反応を９４℃で１分間、５０℃で１分間及び７２℃で３分間、３５サイクル行い、続いて７２℃で５分間、最終的伸長を行った。得られる３．７ＫｂのＤＮＡフラグメントを精製し、ＳａｃＩ及びＫｐｎＩで消化し、同様に消化されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＫＳ（＋）（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ）に１６℃で１６ｈ連結した。連結されたＤＮＡを用いてＥ．コリＤＨ５α（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）を形質転換し、Ｘ−ｇａｌ（４０μｇ／ｍＬ）及びアンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）を含有するＬＢ寒天（Ｄｉｆｃｏ）上で白いコロニー色を示す形質転換細胞から期待されるプラスミド、ｐＪＳＰ２９を単離した。プラスミドｐＪＳＰ２９をＡｆｌＩＩ及びＮｄｅＩで消化し、３６３ｂｐのｙｑｈＤ遺伝子及び４６ｂｐの３’−フランキングＤＮＡ配列を含む４０９ｂｐのＤＮＡフラグメントを遊離させた。残る５，３５０ｂｐのＤＮＡフラグメントを精製し、ｐＬｏｘＫａｎ２（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）からのカナマイシン耐性遺伝子を含有する１，３７４ｂｐのＡｆｌＩＩ／ＮｄｅＩ  ＤＮＡフラグメントに１６℃で１６ｈ連結した。連結されたＤＮＡを用いてＥ．コリＤＨ５αを形質転換し、カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を含有するＬＢ寒天培地上で選択された形質転換細胞から期待されるプラスミド、ｐＪＳＰ３２−Ｂｌｕｅを単離した。プラスミドｐＪＳＰ３２−ＢｌｕｅをＫｐｎＩ及びＳａｃＩで消化し、３，８６５ｂｐのｙｑｈＤ破壊カセットを精製し、同様に消化されたｐＧＰ７０４（Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｅｋａｌａｎｏｓ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７０：２５７５−２５８３（１９８８））に１６℃で１６ｈ連結した。連結されたＤＮＡを用いてＥ．コリＳＹ３２７（Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｅｋａｌａｎｏｓ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７０：２５７５−２５８３（１９８８））を形質転換し、カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を含有するＬＢ寒天培地上で選択された形質転換細胞から期待されるプラスミド、ｐＪＳＰ３２を単離した。プラスミドｐＪＳＰ３２をＥ．コリＫＬＰ２３中に形質転換し、形質転換細胞をカナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を含有するＬＢ寒天上で選択した。スクリーニングされた２００のカナマイシン−耐性形質転換細胞の中で、２つが、ｙｑｈＤ破壊カセットによるｙｑｈＤ遺伝子の置換を生ずる二重−交差組換え結果の場合に予測されるアンピシリン−感受性表現型を示した。
【０１８４】
これらの２つの形質転換細胞から単離されるゲノムＤＮＡを鋳型として用い、ならびに以下の組のプライマー対を用いて、ＰＣＲによりｙｑｈＤ遺伝子の破壊を確証した：
１組：
（配列番号：６１）５’−ＧＣＧＡＧＣＴＣＧＡＣＧＣＴＴＧＣＣＣＴＧＡＴＣＧＡＧＴＴＴＴＧＣ−３’
（配列番号：６２）５’−ＣＡＧＣＴＧＧＣＡＡＴＴＣＣＧＧＴＴＣＧ−３’
２組：
（配列番号：６３）５’−ＣＣＣＡＧＣＴＧＧＣＡＡＴＴＣＣＧＧＴＴＣＧＣＴＴＧＣＴＧＴ−３’
（配列番号：６４）５’−ＧＧＣＧＡＣＣＣＧＡＣＧＣＴＣＣＡＧＡＣＧＧＡＡＧＣＴＧＧＴ−３’
３組：
（配列番号：６５）５’−ＣＣＧＣＡＡＧＡＴＴＣＡＣＧＧＡＴＧＣＡＴＣＧＴＧＡＡＧＧＧ−３’
（配列番号：６６）５’−ＣＧＣＣＴＴＣＴＴＧＡＣＧＡＧＴＴＣＴＧＡＧＣＧＧＧＡ−３’
４組：
（配列番号：６７）５’−ＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＡＡＣＡＡＣＴＴＴＡＡＴＣＴＧＣＡＣＡＣ−３’
（配列番号：６８）５’−ＧＴＴＴＧＡＧＧＣＧＴＡＡＡＡＡＧＣＴＴＡＧＣＧＧＧＣＧＧＣ−３’
反応はＥｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｈｅｉｍ）又はＴａｑポリメラーゼを含有するＰｌａｔｉｎｕｍ  ＰＣＲ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ  （Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）を用いて、９４℃で１分間、５０℃で１分間及び７２℃で２分間、３５サイクル行い、続いて７２℃で５分間最終的伸長を行った。得られるＰＣＲ産物を１．０％（ｗ／ｖ）アガロース中におけるゲル電気泳動により分析した。表８にまとめる結果は、両方の形質転換細胞におけるｙｑｈＤ遺伝子の破壊を確証した。
【０１８５】
【表９】
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【０１８６】
ｙｑｈＤ破壊は、４６ｂｐの３’−フランキング遺伝子間ＤＮＡ配列を含むｙｑｈＤの３’末端を欠失させる。欠失は１２１アミノ酸に対応する３６３ｂｐの３’ｙｑｈＤコード配列を除去する。停止コドンは、カナマイシン耐性カセット中の残りのｙｑｈＤコード配列の１５ｂｐ下流に存在する。
【０１８７】
プラスミドｐＡＨ４８及びｐＫＰ３２をＥ．コリＫＬＰ２３（ｙｑｈＤ-）中に共−形質転換し、両方のプラスミドを含有する形質転換細胞をアンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）及びスペクチノマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を含有するＬＢ寒天上で選択した。代表的な形質転換細胞を、ビタミンＢ12の存在下もしくは不在下での１０Ｌの発酵においてグルコースを１，３−プロパンジオールに転換するその能力に関して調べた。
Ｅ．コリ株ＫＬＰ２３／ｐＡＨ４８／ｐＫＰ３２における有意な１，３−プロパンジオール生産にｙｑｈＤが必要であることの立証：
１，３−プロパンジオール生産へのｙｑｈＤ破壊の影響に関して調べるために、Ｅ．コリ株ＫＬＰ２３（ｙｑｈＤ-）／ｐＡＨ４８／ｐＫＰ３２を用い、本質的に実施例７に記載した通りに１，３−プロパンジオールの生産のための発酵を行った。
【０１８８】
非−特異的触媒活性のノックアウト、Ｅ．コリ株ＫＬＰ２３（ｙｑｈＤ-）／ｐＡＨ４８／ｐＫＰ３２を用いる代表的１０−Ｌ発酵を表９に示す。ＯＤ550が３０Ａを越えた時に（１０．４ｈ）ビタミンＢ12を添加するまで、生物は安定して細胞塊及びグリセロールを堆積させた。ビタミンＢ12を１０．４ｈに８ｍｇのボーラス添加として与え、その後ビタミンＢ12を１．３２ｍｈ／ｈの速度で連続的に供給した。Ｂ12の添加に続く４ｈ以内に、グルコース消費が遅くなり、酸素使用速度が低下し、光学濃度におけるさらなる向上はなかった。グルコースの発酵が止まり、タンク中のグルコース濃度が蓄積した。得られた１，３−プロパンジオールの最高の力価は０．４１ｇ／Ｌであった。アンピシリン及びスペクチノマイシンを含有する寒天平板上で細胞の希釈系列を平板培養することにより、生物をその生存率に関して調べた。平板を３０℃のインキュベーター中で２４ｈインキュベーションした。Ｅ．コリＫＬＰ２３（ｙｑｈＤ-）／ｐＡＨ４８／ｐＫＰ３２の発酵からの平板上に生存コロニーはなかった、表１１。
【０１８９】
対照的に、ビタミンＢ12を加えなかった対照標準タンクからの細胞懸濁液は、グルコース供給溶液の完全な添加の故に１０−Ｌタンクが満たされるまで、細胞塊及びグリセロールを生じ続けた（表１０）。この発酵の最後における細胞懸濁液の希釈系列による寒天平板生存率決定は、光学濃度値により見積もられる合計細胞数と一致する生存細胞カウントを示した（表１１）。
【０１９０】
【表１０】
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【０１９１】
【表１１】
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【０１９２】
【表１２】
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【０１９３】
【表１３】
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【０１９４】
【表１４】
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【０１９５】
【表１５】
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【０１９６】
【表１６】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  ｄｈａレギュロンサブクローンｐＨＫ２８−２６の配列内の遺伝子体制。
【図２】  本質的に実施例７に記載するビタミンＢ12の一定の供給を用いた２つの発酵実験の間で比較される細胞外可溶性タンパク質（ｇ／Ｌ）のグラフ。
【図３】  本質的に実施例７に記載するビタミンＢ12の一定の供給を用いた２つの発酵実験の間で比較される細胞生存率［（生存細胞／ｍＬ）／ＯＤ５５０］のグラフ。
【図４】  本質的に実施例７に記載する、しかしビタミンＢ12又は補酵素Ｂ12の不在下における２つの発酵実験の間で比較されるグルコースからのグリセロールの収率のグラフ。
【図５】  １，３−プロパンジオールへのグルコースの代謝的転換を示す流れ図。
【図６】  未変性ゲル上の内因性Ｅ．コリオキシドレダクターゼ活性（非−特異的触媒活性）を示すバンドから抽出される可溶性タンパク質画分を用いた２Ｄ−ＰＡＧＥ膜ブロット。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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