(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
セリシンを有効成分とする、脱水ストレス保護剤であって、
酵素またはタンパク質の凍結による脱水ストレスからの保護に用いられる、脱水ストレス保護剤。
【請求項２】
セリシンが繭又は生糸から抽出した天然セリシンである、請求項１記載の脱水ストレス保護剤。
【請求項３】
セリシンが天然セリシンの加水分解物である、請求項１記載の脱水ストレス保護剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、微生物や植物、動物の細胞、および酵素などを脱水ストレスから保護する脱水ストレス保護剤に関し、特に遺伝子工学や生化学工業、食品工業、医薬品工業等の分野において有用性が高い脱水ストレス保護剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
細胞にとって代表的なストレスである乾燥、低温、冷凍、塩ストレスは細胞内に脱水（水欠乏）状態をもたらすという点で、共通の側面をもっており、脱水（水欠乏）ストレスと呼ばれている。
特に「冷凍」は微生物や細胞、動物組織などの貯蔵・保存など、利用範囲が拡大しつつあるが、その過程で、細胞が脱水ストレスを受けるため、溶解後の生存率が低下するという問題がある。
【０００３】
例えば、優れた系統の微生物や細胞の保存や、特定の遺伝子を導入された大腸菌等の保存は遺伝子工学上重要であり、冷凍・融解後の大腸菌の生存率の向上が課題となっている。
そこで細胞の凍結・融解後の生存率を向上させるため、凍結保護剤を含む溶液で細胞を凍結処理する方法が研究されている。
【０００４】
一般的に用いられているのが、保護成分として動物の血清を１０〜５０％添加した培地を凍結保存用組成物とする方法である。
しかしながら動物血清は極めて高価であり，多種類の細胞株を大量に凍結保存する際の保存コストを上げることになり、血清に代わる添加成分の検討が進められてきた。
そして微生物や細胞の冷凍障害を抑制するのに、グリセロールやビタミンＥ類、メチルセルロース、トレハロースなどが有効であることがわかってきた。しかしながら、これらの方法も生存率の向上や凍結保護剤の嗜好性が合わないなどの問題がある。
また特開平５−１０３５８６号公報にも、魚肉などの冷凍によるタンパク質の変性を抑制するために、重合度３〜１０のオリゴ糖及びその還元物を主成分とする糖質からなる凍結乾燥変性抑制物質を使用することが開示されている。しかしながら、やはり添加した食品の風味を損なってしまい、品質を保持するだけの量を添加することが難しかった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
すなわち本発明は、被添加物の風味を損なうことなく、少量でも保護効果の高い脱水ストレス保護剤を提供しようとするものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
発明者らは、鋭意研究の結果、タンパク質の１つであるセリシン、又はその加水分解物が脱水ストレス保護剤として有効であることを見出し、本発明に至ったものである。
【０００７】
すなわち本発明は、セリシンを有効成分とする脱水ストレス保護剤である。好ましくはセリシンが繭又は生糸から抽出した天然セリシンである。または、セリシンが天然セリシンの加水分解物である。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明で用いるセリシンとしてはカイコ絹糸腺組織内、繭または生糸から取得することができるが、繭または生糸由来の高純度のセリシン（加水分解物を含む）は容易に手にいれることが出来るため、通常好ましく用いられる。
本発明のセリシンは、使用意図に応じて、そのままの固体、または溶媒に溶解して、好適には水に適量を溶解して水溶液として等適宜の形態で用いることができる。
【０００９】
用途としては、遺伝子工学や生化学工業分野、また化粧品、食品、食品添加物、外用薬、医薬部外品、医薬品等に従来の脱水ストレス保護剤と同様に利用可能である。例えば、化粧品、外用薬、医薬部外品等におけるセリシンの添加量は通常０．１〜２０重量％、好ましくは０．５〜５重量％程度である。食品におけるセリシンの添加量は通常０．１〜３０重量％、好ましくは０．５〜１０重量％程度である。ただしセリシンは毒性がなく、また水溶性にも優れるため多量に添加ないし摂取しても特段の問題は生じず、添加量は特に限定されるものではない。
ここが本発明の特徴の１つであるが、セリシンは毒性が無いだけでなく、無味無臭であるために、添加した食品等の風味を損なうことがない。
【００１０】
化粧品や外用薬における剤型としてはクリーム、乳液、ファウンデーション、パック、ローション、ゲル状、溶液状、ステイック状等がある。
【００１１】
またこれらには適宜の成分、例えば油剤、保湿剤、増粘剤、防腐剤、乳化剤、顔料、ｐＨ調製剤、他の薬効成分、紫外線吸収剤、香料等を配合しうる。また医薬品として経口投与することもできる。この場合の投与量も特に制限されないが例えば１０ｍｇ〜１００ｇ／日程度が投与される。
【００１２】
【実施例】
次に、本発明を実施例により具体的に説明する。
【００１３】
（セリシン粉体の製造方法）
生糸からなる絹織物１ｋｇを、０．２％炭酸ナトリウム水（ｐＨ１１〜１２）５０ｌ中で９５℃にて２時間処理し、セリシン加水分解物を抽出した。得られた抽出液を平均孔径０．２μｍのフィルターでろ過し、凝集物を除去した後、ろ液を分画分子量３５００の透析膜を用いて透析し、透過した物質を除去した後、非透過物質を分取することにより、濃度０．２％の無色透明のセリシン加水分解物抽出液を得た。この抽出液をエバポレーターによりセリシン濃度約２％にまで濃縮した後、凍結乾燥を行って、純度９０％以上のセリシン加水分解物固体１００ｇを得た。
【００１４】
【実施例１】
細胞に対するセリシンの凍結保護効果１
大腸菌JM109株を5mlのM9＋2%カザミノ酸液体培地に植菌して、37℃で一晩振盪培養した。
培養液を80μlずつエッペンドルフチューブに分注し、以下のようにセリシン溶液を添加した。対照実験では、滅菌水のみを添加した。
<2%セリシン溶液として冷凍>
培養液            80μl
10%セリシン溶液    20μl（最終濃度２%）
<0.5%セリシン溶液として冷凍>
培養液            80μl
2.5%セリシン溶液  20μl（最終濃度0.5%）
<0 %セリシン溶液として冷凍（コントロール）>
培養液            80μl
滅菌水            20μl
冷凍前（0日目）の生細胞数を測定するため、各サンプル１本ずつを、滅菌水で104,105,106希釈して100μlをLB寒天培地にプレーティングした。
37℃で一晩培養後、生育したコロニー数をカウントした。
各サンプルの残りを-30℃で冷凍した。一日間冷凍後に、室温で10分間静置して解凍し、0日目と同様に、希釈して100μlをLB寒天培地にプレーティングした。
37℃で一晩培養後、生育したコロニー数を測定し、0日目を100%として、細胞の生存率を算出した。結果を図１に示す。
【００１５】
その結果、対照例として滅菌水に懸濁して冷凍処理を行った大腸菌では生存率が１日目で16.7%であったのに対し、最終濃度0.5%となるようにセリシンを添加して冷凍した場合の生存率は43.0%であった。
また、最終濃度2%となるようにセリシンを添加して冷凍した場合の生存率は44.4%であった。
【００１６】
【実施例２】
細胞に対するセリシンの凍結保護効果２
大腸菌JM109株を5mlのM9＋2%カザミノ酸液体培地に植菌して、37℃で一晩振盪培養した。
培養液を100μlずつエッペンドルフチューブに分注し、遠心分離(10,000rpm×3min)により集菌した。
培養上清を除き、菌体を2%セリシン溶液100μl、0.5%セリシン溶液100μl、滅菌水100μlにそれぞれ再懸濁した。
以下、方法Iと同様に、-30℃で５日間冷凍後の生存率を計算した。結果を図２に示す。
【００１７】
その結果、対照例として滅菌水に懸濁して冷凍処理を行った大腸菌では５日目での生存率が25.0%であったのに対し、0.5%セリシン溶液に懸濁して冷凍した場合の生存率は46.3%であった。
また、2%セリシン溶液に懸濁して冷凍した場合の生存率は39.9%であった。
【００１８】
【実施例３】
細胞に対するセリシンの凍結保護効果３
出芽酵母S288C株を5mlのSD液体培地に植菌して30℃で2日間振盪培養した。
培養液を100μlずつエッペンドルフチューブに分注し、遠心分離(6,000rpm×3min)により集菌した。
培養上清を除き、それぞれ2%セリシン溶液100μl、滅菌水100μlに菌体を再懸濁した。
以下、方法Iと同様に、-30℃で５日間冷凍後の生存率を計算した。結果を図３に示す。
【００１９】
その結果、対照例として滅菌水に懸濁して冷凍処理を行った酵母では生存率が５日目で47.7%であったのに対し、0.5%セリシン溶液に懸濁して冷凍した場合の生存率は65.8%であった。
また、2%セリシン溶液に懸濁して冷凍した場合の生存率は88.0%であった。
【００２０】
【実施例４】
酵素に対するセリシンの凍結保護効果１
○LDH凍結保護活性試験
セリシンを用いて、酵素の凍結融解による失活に対する保護活性を測定した。
モデル酵素として乳酸脱水素酵素（LDH）を用いた。乳酸脱水素酵素（LDH）は、解糖系でピルビン酸からL-乳酸を生成することに働く酵素で、凍結に対して感受性であり、凍結融解処理によって失活し易いことが知られている。（K.Goller,E.A.Galinski  Journal  of  Molecular  Catalysis  B:Enzymatic  7(1999)37-45）
乳酸脱水素酵素（LDH）の反応を以下に示す。
（反応）
0004707811.tif 000002
【００２１】
（酵素溶液の調製）
市販のLDH[5,000U/ml]（オリエンタル酵母社製、from  Pig  heart）を、50mMリン酸カリウムバッファーで希釈し、約250unitの酵素溶液を調製した。
調製した酵素溶液を4℃で一晩透析し、市販の酵素液に含まれている硫酸アンモニウム等を完全に除いた。
透析後の酵素溶液を50mMリン酸カリウムバッファーで希釈し、約4unitのLDH溶液を調製した。
【００２２】
（LDH活性測定）
リン酸カリウムバッファーとLDH溶液を混合し、25℃でプレインキュベーション後、Na-PyruvateとNADHを素早く添加して、340nmにおける吸光度の変化を分光光度計[Beckman,DU640]で5分間測定した。
LDH活性測定の反応液組成および分光光度計の測定条件を以下に示す
（反応液組成）
0004707811.tif 000003
（測定条件）
波長;340nm,  光路長；１cm,  温度;25℃
【００２３】
LDHの活性は、NADHの変化量（340nmにおける吸光度変化量）から、以下の計算式により求めた。
（計算式）
(ΔA/min・V・D)/(ε・d・v)  ＝  IU/ml
ΔA/min＝340nmにおける1分間当たりの吸光度変化量
V＝最終液量(3.17ml)
D＝最終希釈率
ε＝340nmにおけるNADHの分子吸光係数（6.3×103 l・mole-1・cm-1）
d＝光路長（1cm）
v＝酵素液量（0.02ml）
【００２４】
（セリシンのLDH凍結保護活性の測定）
前記の方法で調製したLDH溶液[約4unit/ml]に、セリシンを0.01%および0.05%濃度となるように添加した。
比較対照として、蛋白質凍結保護剤として使用されるウシ血清アルブミン（BSA）[Sigma,Albumin  bovine
fraction V]を0.01%および0.1%濃度となるように添加したもの、また、添加しないもの（リン酸カリウムバッファーのみ）のLDH溶液を調製した。
調製したLDH溶液のサンプルを以下にまとめて示す。
LDH[4unit/ml]
LDH[4unit/ml] ＋0.01%セリシン
LDH[4unit/ml] ＋0.05%セリシン
LDH[4unit/ml] ＋0.01%BSA
LDH[4unit/ml] ＋0.05%BSA
【００２５】
次に、調製した各サンプルを、1.5mlテストチューブに100μlずつ分注し、液体窒素で１分間凍結した。その後、30℃で5分間融解させ、前述の方法でLDH活性を測定した。
各サンプルについて、凍結前のLDH活性を100%とし、凍結／融解処理を繰返した後のLDHの残存活性を求めた。結果を図４に示す。
【００２６】
凍結／融解を繰返すことにより、セリシンを添加していないサンプルのLDH残存活性は著しく低下し、８回の凍結融解処理後では約３%となったのに対し、セリシンを添加したものでは約80%の残存活性を有していた。
【００２７】
【発明の効果】
セリシンは、細胞や酵素の凍結時におけるストレスを緩和すのに有効であり、凍結保護剤として種々のものに対してセリシンの優れた冷凍保護活性を利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１の細胞（大腸菌）に対するセリシンの冷凍保護効果を示すグラフである。（グラフ１）
【図２】実施例２の細胞（大腸菌）に対するセリシンの冷凍保護効果を示すグラフである。（グラフ２）
【図３】実施例３の細胞（酵母）に対するセリシンの冷凍保護効果を示すグラフである。（グラフ３）
【図４】実施例４の酵素に対するセリシンの冷凍保護効果を示すグラフである。（グラフ４）
【図１】
0004707811.tif 000004
【図２】
0004707811.tif 000005
【図３】
0004707811.tif 000006
【図４】
0004707811.tif 000007