(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板に標的分子を付着させる方法であって、以下の：
ａ）高分子主鎖と、前記高分子主鎖に結合した標的分子上の官能基と共有結合を形成するよう構成および配置された２超の熱化学的反応性基を含む試薬組成物を提供し、
ｂ）前記基板に前記試薬組成物を被覆および固定化して結合した組成物を形成し、
ｃ）前記結合した組成物により提供される熱化学的反応性基と反応性の１以上の官能基を有する標的分子を含む溶液を提供し、
ｄ）前記基板に前記溶液の１以上の離散した小試料容積のスポットを適用し、そして
ｅ）前記基板に標的分子を付着させるために、前記結合した組成物により提供される熱化学的反応性基に、前記標的分子により提供される官能基との共有結合を形成させること
を含み、
ここで、前記基板に標的分子を付着させるために、前記結合した組成物により提供される熱化学的反応性基に前記標的分子により提供される官能基との共有結合を形成させる工程が、前記結合した試薬に前記標的分子を誘引させるための誘引性基を用いずに、前記結合した組成物により提供される熱化学的反応性基に前記標的分子により提供される官能基との共有結合を形成させることを含む、方法。
【請求項２】
前記標的分子が核酸を含み、前記基板がプラスチック、水素化ケイ素またはオルガノシラン−予備処理ガラスまたはシリコーンスライドを含む、請求項１の方法。
【請求項３】
前記核酸がアミンおよびスルフヒドリル基から成る群から選択される１以上の官能基を含む、請求項２の方法。
【請求項４】
前記試薬組成物により提供される熱化学的反応性基と反応性の１以上の官能基を有する標的分子を提供する工程が、20ナノリットル以下の量の溶液を提供することを含む、請求項１の方法。
【請求項５】
前記試薬組成物が、適切な供給源からのエネルギーの適用時に基板に試薬組成物を付着させるための１以上の光反応性基をさらに含む、請求項１の方法。
【請求項６】
前記熱化学的反応性基および光反応性基が1以上の親水性高分子主鎖に懸垂し、前記光反応性基が光反応性アリールケトンである、請求項１の方法。
【請求項７】
前記光反応性アリールケトンが、各々、別々に、アセトフェノン、ベンゾフェノン、アントラキノン、アントロンおよびアントロン様複素環からなる群から選択される、請求項６の方法。
【請求項８】
前記高分子主鎖がアクリル樹脂、ビニル樹脂、ナイロン樹脂、ポリウレタンおよびポリエーテルからなる群から選択され、前記懸垂熱化学的反応性基が活性化エステル、エポキシド、アズラクトン、活性化ヒドロキシル、アルデヒド、イソシアネート、チオイソシアネート、カルボン酸クロリド、ハロゲン化アルキル、マレイミドおよびα−ヨードアセトアミドからなる群から選択され、そして前記主鎖がアリールケトンを含む１以上の懸垂光反応性基をさらに含む、請求項１の方法。
【請求項９】
プラスチック、水素化ケイ素またはオルガノシラン−予備処理ガラスまたはシリコーンスライドを含む基板に核酸の１以上のマイクロアレイを調製するために用いられる請求項１の方法であって、各マイクロアレイが離散した領域に、0.1フェムトモル〜10ナノモルの量の核酸を含む方法。
【請求項１０】
試料中の標的分子と結合させるための活性化スライドであって、
ａ）基板および
ｂ）前記基板に付着した結合した組成物を含み、前記結合した組成物は２超の熱化学的反応性基を有する高分子主鎖を含み、前記結合した組成物は、前記結合した組成物に標的分子を誘引するための誘引性基を用いずに、標的分子上の官能性基と共有結合を形成するように構成および配置されている活性化スライド。
【請求項１１】
前記活性化スライドが20ナノリットル以下の量で標的分子を含む試料を受け取るように構成および配置されている、請求項１０の活性化スライド。
【請求項１２】
マイクロアレイを二次加工するために適応される請求項１０の活性化スライドであって、前記標的分子が核酸を含み、そして前記基板がプラスチック、水素化ケイ素またはオルガノシラン−予備処理ガラスまたはシリコーンスライドを含む、活性化スライド。
【請求項１３】
前記核酸がアミンおよびスルフヒドリル基から成る群から選択される１以上の官能基を含有する、請求項１２の活性化スライド。
【請求項１４】
請求項１０の活性化スライドであって、前記結合した組成物は試薬組成物と基板との反応生成物を含み、前記試薬組成物は適切な供給源からのエネルギー適用時に基板に試薬組成物を付着するための１以上の光反応性基を含み、前記光反応性基は、試薬組成物を基板に固定化して結合した組成物を形成するものである、活性化スライド。
【請求項１５】
前記試薬組成物が熱化学的反応性基と光反応性基を含み、前記熱化学的反応性基および光反応性基が１以上の親水性高分子主鎖に懸垂し、前記光反応性基が光反応性アリールケトンである、請求項１４の活性化スライド。
【請求項１６】
前記光反応性アリールケトンが、各々、別々に、アセトフェノン、ベンゾフェノン、アントラキノン、アントロンおよびアントロン様複素環からなる群から選択される、請求項１５の活性化スライド。
【請求項１７】
前記高分子主鎖がアクリル樹脂、ビニル樹脂、ナイロン樹脂、ポリウレタンおよびポリエーテルからなる群から選択され、前記懸垂熱化学的反応性基が活性化エステル、エポキシド、アズラクトン、活性化ヒドロキシル、アルデヒド、イソシアネート、チオシアネート、カルボン酸クロリド、ハロゲン化アルキル、マレイミドおよびα−ヨードアセトアミドからなる群から選択され、そして前記主鎖がアリールケトンを含む１以上の懸垂光反応性基をさらに含む、請求項１０の活性化スライド。
【請求項１８】
基板、前記基板上に配列された結合した組成物および前記結合した組成物と共有結合した標的分子を含むマイクロアレイであって、前記マイクロアレイは、以下の
ａ）高分子主鎖および２超の前記主鎖に結合した熱化学的反応性基を含む試薬組成物を提供し、
ｂ）前記基板に前記試薬組成物を被覆および固定化して結合した組成物を形成し、
ｃ）前記結合した試薬組成物により提供される熱化学的反応性基と反応性の１以上の官能基を有する標的分子を含む溶液を提供し、
ｄ）前記基板に前記溶液の１以上の離散した小試料容積のスポットを適用し、そして
ｅ）前記基板に標的分子を付着させるために、前記結合した組成物により提供される熱化学的反応性基に、前記標的分子により提供される対応する官能基との共有結合を形成させること
を含み、
ここで、前記結合した組成物により提供される熱化学的反応性基に前記標的分子により提供される官能基との共有結合を形成させる工程が、前記結合した組成物に前記標的分子を誘引させるための誘引性基を用いずに、前記結合した組成物の熱化学的反応性基に前記標的分子の官能性基との共有結合を形成させることを含む、マイクロアレイ。
【請求項１９】
前記標的分子が核酸を含み、前記基板がプラスチック、水素化ケイ素またはオルガノシラン−予備処理ガラスまたはシリコーンスライドを含む、請求項１８のマイクロアレイ。
【請求項２０】
前記核酸がアミンおよびスルフヒドリル基から成る群から選択される1以上の官能基を含む、請求項１９のマイクロアレイ。
【請求項２１】
20ナノリットル以下の容積の標的分子を含む溶液を受け取るように構成および配置された、請求項２０のマイクロアレイ。
【請求項２２】
適切な供給源からのエネルギーの適用時に表面に試薬組成物を付着させるための１以上の光反応性基をさらに含む、請求項１８のマイクロアレイ。
【請求項２３】
前記熱化学的反応性基および光反応性基が1以上の親水性高分子主鎖に懸垂し、前記光反応性基が光反応性アリールケトンである、請求項２２のマイクロアレイ。
【請求項２４】
前記光反応性アリールケトンが、各々、別々に、アセトフェノン、ベンゾフェノン、アントラキノン、アントロンおよびアントロン様複素環からなる群から選択される、請求項２３のマイクロアレイ。
【請求項２５】
前記高分子主鎖がアクリル樹脂、ビニル樹脂、ナイロン樹脂、ポリウレタンおよびポリエーテルからなる群から選択され、前記懸垂熱化学的反応性基が活性化エステル、エポキシド、アズラクトン、活性化ヒドロキシル、アルデヒド、イソシアネート、イソチオシアネート、チオイソシアネート、カルボン酸クロリド、ハロゲン化アルキル、マレイミドおよびα−ヨードアセトアミドからなる群から選択され、そして前記主鎖がアリールケトンを含む１以上の懸垂光反応性基をさらに含む、請求項１８のマイクロアレイ。
【請求項２６】
プラスチック、水素化ケイ素またはオルガノシラン−予備処理ガラスまたはシリコーンスライドの表面を含み、少なくとも10ヌクレオチドの長さを有する少なくとも100/cm3の離散した核酸を提供し、前記核酸が各々、離散した領域に、0.1フェムトモル〜10ナノモルの限定量でスポットされた、請求項１８のマイクロアレイ。
【請求項２７】
前記領域が一般的に、10ミクロン〜500ミクロンの直径を有する円の形状であって、20ミクロン〜1000ミクロンの中心−中心間隔でアレイの他の領域から分離された、請求項２６のマイクロアレイ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
産業上の利用分野
本発明は、表面にオリゴヌクレオチド（オリゴ）のような標的分子を付着させるための方法、ならびにこのような方法に用いるための組成物に関する。別の局面では、本発明は結果的に生じる被覆された表面それ自体に関する。さらに別の局面では、本発明は、表面に分子を付着させるための光化学的および熱化学的手段の使用に関する。
【０００３】
発明の背景
支持表面上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の固定化は、ＤＮＡベースの検定系の開発において、ならびにＤＮＡ分析のためのマイクロ二次加工アレイの開発を含めたその他の目的のために、重要な局面になってきた（例えば、”Microchip Arrays Put DNA on the Spot”, R. Service, Science 282（5388）:396-399, 16 October 1998；および”Fomenting a Revolution, in Miniature”, I. Amato, Science 282（2358）:402-405, 16 October 1998参照）。
【０００４】
“The Development of Microfabricated Arrays of DNA Sequencing and Analysis”,O’Donnell-Maloney et al., TIBTECH 14:401-407（1996）も参照されたい。一般に、このような手法は、マイクロウエルプレート、管、ビーズ、顕微鏡スライド、シリコンウエファーまたは膜の表面で実施される。あるアプローチは特に、表面への合成オリゴヌクレオチドの終点付着の見込みを可能にするかまたは改良するために開発された。終点付着（即ち、一方または他方の末端ヌクレオチドにより付着される核酸配列を用いる）は、配列の全長がもう一つの核酸配列とのハイブリダイゼーションに利用可能であるために、望ましい。これは、緊縮ハイブリダイゼーション条件下での単一塩基対変化の検出のために特に有益である。
【０００５】
ハイブリダイゼーションは、固体支持体上に固定化されるプローブと塩基対合することにより核酸を測定するために最も日常的に用いられる方法である。増幅技術、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）またはリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）と組合せた場合、ハイブリダイゼーション検定は診断および探究のための強力な道具である。マイクロウエルプレートは特に、相対的に多数の試料を検定するために便利且つ有用である。いくつかの方法が、マイクロウエルプレート上での核酸プローブの固定化のために用いられてきた。これらのいくつかは、ポリスチレンプレート上の非修飾化または修飾化オリゴヌクレオチドの吸着を包含する。
【０００６】
他のものは、共有固定化を包含する。種々の方法が、ハイブリダイゼーション検定の感度を増大するために用いられてきた。高分子捕獲プローブ（標的分子としても知られている）および検出プローブが合成され、107ＤＮＡ分子／mlに下がった感度を得るために用いられてきた。別の方法は、ハイブリダイゼーション検定の感度を増大するために分枝鎖オリゴヌクレオチドを用いた。さらに別の方法は、多段階抗体増強法を用いた。他の種類の核酸プローブ、例えばリボ核酸（ＲＮＡ）、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）およびペプチド核酸（ＰＮＡ）も、診断的用途におけるＰＣＲ生成物のハイブリダイゼーションのためにマイクロウエルプレート上で固定化された。さらに、ＰＣＲプライマーは、固相ＰＣＲのためにマイクロウエルプレート上で固定化された。
【０００７】
ＤＮＡを固定化するための相対的に少数のアプローチが、今日までに、商業的製品へのそれらの方向を見出したに過ぎない。このような一製品は、「ヌクレオリンク（商標）」として知られておりNalge Nune Internationalから入手可能である（例えば、Nunc Tech Note Vol. 3, No.17参照）。この製品においては、ＤＮＡをカルボジイミドと反応させて、５’−ホスフェート基を活性化し、これを次に表面上の官能基と反応させる。このアプローチの欠点は、それがカルボジイミド試薬を付加する余分の工程を必要とし、ならびにＤＮＡの固定化のために５時間の反応時間を要し、そしてそれが単一の種類の基板物質に限定されるという点である。
【０００８】
別の例として、Pierceは、「リアクチ−バインド（商標）ＤＮＡコーティング溶液」（”Instructions-Reacti-Bind（商標） DNA Coating Solution”1/1997参照）として既知の特許されたＤＮＡ固定化製品を近年紹介した。この製品は、ＤＮＡと混合され、ポリスチレンまたはポリプロピレンのような表面に適用される溶液である。一夜のインキュベーション後、溶液を取り出し、表面を緩衝液で洗浄し、乾燥すると、それはハイブリダイゼーションの準備ができている。製品印刷物はそれを実験室で用いられる一般的プラスチック表面すべてに有用であると記載しているが、しかしいくつかの制限を有する。例えば、出願人等は、メーカーの使用説明書を用いて、ポリプロピレン上でのＤＮＡの有用な固定化を実証できなかった。さらに、この製品は、大量のＤＮＡを必要とする。使用説明書は、ＤＮＡは0.5〜5μg/mlの濃度で用いられるべきであると示している。
【０００９】
同様に、Costarは、マイクロウエルプレート中のウエルの表面にＤＮＡを付着させるのに用いるための「ＤＮＡ−バインド（商標）」と呼ばれる製品を販売している（例えば、the DNA-BIND（商標）” Application Guide” 参照）。ＤＮＡ−バインド（商標）プレートの表面は、Ｎ−オキシスクシンイミド（ＮＯＳ）反応性基を含有する非荷電非高分子ヘテロ二官能性試薬で被覆される。この基は、求核性物質、例えば第一級アミンと反応する。ヘテロ二官能性コーティング試薬は、光化学基、ならびにポリスチレンプレートの表面に反応性基を共有結合するスペーサー腕も含有する。その後、アミン修飾されたＤＮＡは、ＮＯＳ表面に共有結合し得る。ＤＮＡは、合成工程中に初期オリゴマーに、または酵素的に予備形成された配列に第一級アミンを付加することにより修飾される。ＤＮＡ−バインド（商標）製品は、ポリスチレンベースであるため、熱サイクルのような高温を要する用途のためには使用が限定される。
【００１０】
これらの種々の製品は、いくつかの目的のために、またはある種の環境下で有用であり得るが、しかしすべて、1以上の欠点および束縛を蒙る傾向がある。特に、それらは、大量のオリゴヌクレオチドを要する傾向があるか、不適当に高いかおよび／または融通性を欠くバックグラウンドノイズレベルを与える。
【００１１】
国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ98/20140（本出願の譲渡人に譲渡された）は、とりわけ、基板の表面への標的分子の付着のための試薬組成物であって、試薬に標的分子を誘引（attract）させるための1以上の基、ならびに誘引された標的分子上の対応する官能基と共有結合を形成するための1以上の熱化学的反応性基を包含する試薬組成物を記載し、特許請求する。任意に、組成物はさらに、表面への組成物の付着に用いるための感光性（photo）基を提供する。例えば一態様では、複数の感光性基および複数の陽イオン性基（第四級アンモニウム基の形態）が親水性ポリマー主鎖に付着される。このポリマーは次に、二次ポリマー主鎖と同時固定化されて、これが、標的分子の固定化のための前記の熱化学的反応性基（例えば、Ｎ−オキシスクシンイミド（ＮＯＳ）基）を提供する。
【００１２】
前記見出しのＰＣＴ出願に記載されているような、誘引性基および熱化学的反応性基を有する試薬組成物は、多数の用途に関して依然として有用で且つ好ましいが、誘引性基はすべての環境下で必要であるわけではない、ということを出願人等は見出している。例えば、マイクロアレイ用の活性化スライドを調製するための適切な一方法は、ＰＣＴ出願に記載された種類（そして特に、誘引性基ならびに光反応性および熱化学的反応性基をともに有するもの）の試薬組成物でスライドを被覆する工程を含む。ポリマーは、光反応性基の活性化と、その後の精密プリント技術を用いた小容積（例えば、数ナノリットル以下）の標的分子（例えば、オリゴヌクレオチド）の適用により、スライドに付着される。
【００１３】
一旦適用されれば、オリゴヌクレオチドを送達するために用いられる溶媒は乾燥され（オリゴヌクレオチドは結合ポリマーに誘引されるので）、そして結合ポリマーとのオリゴヌクレオチドの熱化学的カップリングを可能にするのに適した条件下でスライドはインキュベートされる。しかしながら、その後、任意の非結合オリゴヌクレオチドは、典型的にはスライドから洗い落とされる。しかしながら、スポットから引っ張っていく「彗星効果」として言及される、非結合オリゴヌクレオチドの検出可能な痕跡が時としては留まる、ということを出願人等は見出した。この痕跡は、おそらくは、スポットを取り囲むスライド表面に存在する結合ポリマー内の誘引力のためであり、それはスポットから洗浄されるので、一般的に負に荷電したオリゴヌクレオチドを結びつけるのに役立つ。この痕跡は次に、望ましくない且つ過度の高レベルのバックグラウンドノイズを提供し得る。
【００１４】
このような状況下（例えば、一般的に平坦な表面への直接的な小容積の適用）では、高分子試薬は、好ましくは、このような誘引性基の存在を伴わずに（しかし熱化学的反応性基および任意の感光性基は有する）提供される、ということを出願人等は見出した。この種類の適切な試薬は、前記見出しの同時係属中ＰＣＴ出願に開示されている。このような試薬は、次に、荷電した誘引性基を有する高分子試薬と比較した場合、バックグラウンドの低減、小スポットサイズ（例えば、接触角の増大）のような特性の改良された組合せを提供する方式でオリゴヌクレオチドを被覆するために用い得る。
【００１５】
発明の要約
本発明は、マイクロウエルプレート、管、ビーズ、顕微鏡スライド、シリコンウエファーまたは膜のような基質の表面における標的分子の共有結合のための方法および試薬組成物を提供する。一態様では、方法および組成物は、例えばハイブリダイゼーション検定に用いるための、マイクロウエルプレートのようなプラスチック物質上で核酸プローブを固定化するために用いられる。好ましい態様では、方法および組成物は、顕微鏡スライドおよびその他のプラスチック、水素化ケイ素またはオルガノシラン−予備処置ガラスまたはシリコーンスライド支持体表面により提供されるもののような、実質的に平坦な表面とともに用いるために適応される。試薬組成物は次に、生体分子（例えば、核酸）のような標的分子と共有結合するために用いられ、これは次に、特異的結合反応（例えば核酸をその相補的鎖とハイブリダイズするため）のために用い得る。
【００１６】
支持体表面は種々の物質から調製され、それらの例としては、結晶性熱可塑性樹脂（例えば、高および低密度ポリエチレン、ポリプロピレン、アセタール樹脂、ナイロン樹脂および熱可塑性ポリエステル）ならびに非晶質熱可塑性樹脂（例えば、ポリカーボネートおよびポリ（メチルメタクリレート））からなる群から選択されるプラスチック物質が挙げられるが、これらに限定されない。適切なプラスチックまたはガラス物質は、剛性、靱性、長期変形に対する耐性、応力の放出時の変形からの回復および熱分解に対する耐性のような特性の所望の組合せを提供する。
【００１７】
本発明の試薬組成物は、1以上の熱化学的反応性基（即ち、温度に依存する反応速度を有する基）を含有する。適切な基は、活性化エステル（例えば、ＮＯＳ）、エポキシド、アズラクトン、活性化ヒドロキシルおよびマレイミド基から成る群から選択される。任意におよび好ましくは、組成物は、1以上の光反応性基も含有し得る。さらに、試薬は、熱化学的反応性および／または光反応性基が懸垂し得る1以上の親水性ポリマーを含み得る。光反応性基（あるいは本明細書中で「感光性基」と呼ばれる）は、例えば、光のような適切なエネルギーの適用時に、試薬分子を支持体の表面に付着させるために用い得る。熱化学的反応性基は、次に、標的分子上の適切な且つ相補的な官能基との共有結合を形成するために用い得る。
【００１８】
一般に、試薬分子は、先ず感光性基の活性化により表面に付着され、その後、標的分子（例えばオリゴヌクレオチド）が、結合ポリマーと極めて接近して結合するようにさせるのに適した条件下で、結合試薬と接触させられる。標的分子は、結合試薬の反応性基と標的分子上の適切な官能基との間の反応により結合試薬と熱化学的に結合される。熱化学的反応基およびイオン基は、同一ポリマー上にあるか、または、例えば表面上に同時固定化される異なるポリマー上にあり得る。任意におよび好ましくは、標的分子は、試薬分子の基に作製される官能基を用いて調製されるか、または提供される。例えばそれらの合成中に、官能基、例えばアミンまたはスルフヒドリル基を用いてオリゴヌクレオチドを調製し得る。
【００１９】
本発明はさらに、本明細書中に記載したような試薬を用いて、標的分子、例えばオリゴを表面に付着させる方法を提供する。つぎに本発明は、このような試薬、ならびにこのような表面を提供するような物質（例えばマイクロウエルプレート）によりそれに付着される核酸を有する表面を提供する。さらに別の局面では、本発明は、試薬の熱化学的反応性基（単数または複数）と反応性の1以上の官能基を含有する標的分子と組合せて本発明の試薬（単数または複数）を包含する組成物を提供する。
【００２０】
このような試薬を用いて、捕獲プローブは、そうでない場合にはプローブ（例えば、ポリプロピレンおよびポリビニルクロリド）を吸着しない表面を含めた種々の表面に共有的に固定化される、ということを出願人等は見出した。その結果生じる表面は、ポリスチレンまたはポリカーボネート上に吸着される修飾オリゴヌクレオチドを用いて得られるものに匹敵するかまたはそれより良好なシグナルを提供する。
【００２１】
本発明の固定化試薬および方法は、従来報告されているものより簡単な方式での増幅方法に用いられ、そして求核性物質誘導化核酸の共有的固定化のための改良された表面も提供し得る。増幅法およびハイブリダイゼーション検定のための固定化プローブの他に、本発明の試薬は、固相シーケンシングのための、ならびにＰＣＲおよびその他の増幅技法のためのプライマーを固定化するための改良型核酸固定化を提供し得る。
【００２２】
詳細な説明
本発明の好ましい試薬は、標的分子の対応する官能基との共有結合を形成するために有用な1以上の熱化学的反応性基を保有する親水性主鎖と、表面に試薬を付着させるために有用な1以上の光反応性基とを一緒に含む。
【００２３】
本発明の別の態様では、光反応性基の使用を伴わずに核酸配列を固定化することができる。例えば、接触される物質の表面は、前記のような熱化学的反応性基を有する親水性ポリマーを固定化するために用い得る熱化学的反応性基を伴って提供することができる。例えば、表面は、物質の表面に限定数の反応性アミンを導入するためにアンモニアプラズマで処理し得る。次にこの表面が、熱化学的反応性基（例えばＮＯＳ基）を有する親水性ポリマーで処理される場合には、ポリマーは、表面での対応するアミン基とのＮＯＳ基の反応により固定化される。好ましくは、核酸配列とのカップリングを可能にするのに十分な数のこれらの熱化学的反応性基が固定化後に残存することを保証するために、ポリマー上の反応性基は、表面上の対応する反応性基と比較して過剰に存在する。
【００２４】
理論に縛られるつもりはないが、小スポットサイズならびに低減されたスポットサイズの使用に際して遭遇する速度論および流体動力学に基づいて、オリゴヌクレオチドは、前記の誘引性基を必要とせずに、結合試薬と極めて接近して結合するようになり得る、と思われる。例えばマイクロアレイ表面に捕獲分子（例えば、オリゴヌクレオチドまたはｃＤＮＡ）を付着させるために、マイクロアレイの調製に用いられる場合、このような捕獲分子は一般に、約200μm〜約500μmまでの中心−中心間隔を有してアレイ中にスポットを形成するよう適応されるプリントピンを用いて、約１ナノリットル／スポット未満の容積で表面に送達される。
【００２５】
小容積の場合、プリントされた標的アレイは迅速に乾燥する傾向があり、したがってさらにカップリング速度論および効率に影響を及ぼす。溶液からのならびに被覆されたマイクロプレートウエルの表面のＤＮＡのカップリングとは違って、非常に小さいスポットサイズのアレイにプリントされたオリゴヌクレオチドは、急速に乾燥しがちで、それによりオリゴヌクレオチドが支持体と接触し、カップリングする方式に影響を及ぼすパラメーターを変える。プリントピンの設計および取扱いに加えて、他の因子もスポットサイズ、そして順次、最終的ハイブリダイゼーションシグナル、例えばプリント緩衝液中の塩濃度、塩および湿潤剤の種類；表面の疎水性／親水性特性；オリゴヌクレオチドのサイズおよび／または濃度；ならびに乾燥環境にも影響を及ぼし得る。
【００２６】
本明細書中に記載されているように（例えば、実施例２５、２６および２８）、感光性基および熱化学的反応性基の両方を有する試薬（「フォト−ＰＡ−ポリＮＯＳ」）、ならびにそれらの基を誘引性基と一緒に有する試薬（「フォト−ＰＡ−ポリＮＯＳ／フォト−ＰＡ−ポリクアット」の混合物）のコーティングはともに、アミン修飾化ＤＮＡの有用且つ特異的な固定化を提供した。２つのアプローチ間の選択は、基板の選択に大いに依存している（例えばマイクロウエルに対照するものとして平坦なスライド）。
【００２７】
好ましい態様では、試薬組成物は、その上に光化学的に固定化された試薬組成物を有する活性化スライドを調製するために用い得る。スライドは、安定的に保存され、後日、アミン修飾ＤＮＡを固定化することによりマイクロアレイを調製するために用いられる。捕獲ＤＮＡの表面へのカップリングは、小スポットの形態でＤＮＡ溶液をプリント後、湿潤環境中でｐＨ8〜9で起こる。
【００２８】
本発明の活性化スライドは、製造および加工プロトコール、試薬およびマイクロスポッティングロボット（例えば、Cartesianから入手可能なもの）のような装置、そしてチップマーカーマイクロスポッティング用具（例えば、TeleChem Internationalから入手可能なもの）を用いるマイクロアレイの調製において、慣用的（例えばシリル化）ガラススライドに代わって用いるのに特によく適している。適切なスポッティング装置およびプロトコールは、例えば「アレイイット（ArrayIt）」（商標）チップマーカー３スポッティング用具のように市販されている。この製品は、固体基板当たり62,000という多くの試料を送達するために48のプリントピンを用いている、初期マイクロスポッティング技術の進歩したバージョンを示すといわれている。
【００２９】
このような計器の、慣用的（例えば、ポリ−１−リシン被覆）スライドと組合せた使用は、当業界で周知である（例えば、米国特許第5,087,522号（Brown等）”Methods for Fabricating Microarrays of Biological Samples”参照）（この記載内容およびその中に引用された参考文献は、参照により本明細書中に含まれる）。
【００３０】
例えば、本発明の方法および系は、1以上のマイクロアレイを有する表面を伴う基板、例えばガラススライドを提供するために用い得る。各マイクロアレイは、約1cm2未満の表面積中に、好ましくは少なくとも約100/cm2（そして好ましくは少なくとも約1000/cm2）の離散した標的分子（例えば、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド生体高分子）を提供する。各離散した標的分子は、１）アレイ中の別個の限定位置に配置され、２）少なくとも10サブユニットの長さを有し、３）約0.1フェムトモル〜約10ナノモルの源定量で存在し、そして４）約0.01ナノリットル〜約100ナノリットルの容積範囲の選択された容積で置かれる。アレイ内のこれらの領域（例えば離散したスポット）は、一般的には、約10ミクロン〜500ミクロン（好ましくは約20〜約200ミクロン）の典型的直径を有する円の形状であり得る。その領域は、好ましくは、ほぼ同一距離で（例えば、約20ミクロン〜約1000ミクロンまでの中心−中心間隔で）アレイの他の領域から分離される。各領域が単一の、そして好ましくは異なる分析物特異的試薬（「標的分子」）を含むように、複数の分析物特異的領域を提供し得る。
【００３１】
当業者は、本明細書の説明を読めば、当該標的分子の種類によって適切な試薬を同定し、選択し得る。標的分子としては、プラスミドＤＮＡ、コスミドＤＮＡ、バクテリオファージＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ（例えば、酵母菌、ウイルス、細菌、哺乳類、昆虫のものが挙げられるが、これらに限定されない）、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ＰＮＡおよびオリゴヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３２】
高分子主鎖は、合成または天然のものであり、好ましくはオリゴマー、ホモポリマーからなる群から選択される、ならびに付加または縮合重合により得られるコポリマーである。天然ポリマー、例えば多糖類、ポリペプチドも用い得る。好ましい主鎖は、それらが、前記の方式におけるそれらの使用と一致しないかまたは有害である生物学的機能を提供しないという点で、生物学的に不活性である。
【００３３】
このようなポリマー主鎖としては、アクリル樹脂、例えば、ヒドロキシエチルアクリレート、ヒドロキシエチルメタクリレート、グリセリルアクリレート、グリセリルメタクリレート、アクリルアミドおよびメタクリルアミドから重合されるもの、ビニル樹脂、例えばポリビニルピロリドンおよびポリビニルアルコール、ナイロン樹脂、例えばポリカプロラクタム、ポリラウリルラクタム、ポリヘキサメチレンアジパミドおよびポリヘキサメチレンドデカンジアミド、ポリウレタンならびにポリエーテル（例えば、ポリエチレンオキシド）が挙げられる。
【００３４】
本発明の高分子主鎖は、所望の数および種類の熱化学的反応性基および任意に感光性基を、選択される試薬によって組合せて、保有し得る親水性主鎖を提供するために選択される。高分子主鎖は、表面と熱化学的反応性基との間にスペーサーを提供するためにも選択される。この方式では、試薬は、表面または隣接する試薬分子に結合されて、最適活性を示すのに十分な運動自由度を有する他の基を提供し得る。ポリマー主鎖は、好ましくは親水性（例えば水溶性）であり、ポリアクリルアミドおよびポリビニルピロリドンが特に好ましいポリマーである。
【００３５】
本発明の試薬は、ポリマー主鎖と共有的に結合される1以上の懸垂潜伏性反応性（好ましくは光反応性）基を保有する。光反応性基は本明細書中で定義されており、好ましい基は、それらがこのような特性を保持する条件下で保存されるのに十分に安定である（例えば、米国特許第5,002,582号（この記載内容は、参照により本明細書中に含まれる）参照）。電磁スペクトルの種々の部分に応答する潜伏性反応性基が選択され、スペクトルの紫外および可視部分に応答するもの（本明細書中では「光反応性」と呼ばれる）が、特に好ましい。
【００３６】
光反応性基は、特定の適用外刺激に応答して活性種の生成を経て、その結果、例えば同一のまたは異なる分子により提供されるような隣接化学的構造と共有結合する。光反応性基は、貯蔵条件下では荷電されないそれらの共有結合を保持するが、しかし外部エネルギー源により活性化されると、他の分子との共有結合を形成する分子中の原子の基である。
【００３７】
光反応性基は、活性種、例えばフリーラジカル、そして特に電磁エネルギーの吸収時にニトレン、カルベンおよび励起状態のケトンを生成する。光反応性基は、電磁スペクトルの種々の部分と応答するよう選択され、例えばスペクトルの紫外および可視部分に応答する光反応性基が好ましく、本明細書中では時として、「光化学基」または「感光性基」と呼ばれる。
【００３８】
アセトフェノン、ベンゾフェノン、アントラキノン、アントロンおよびアントロン様複素環（即ち、アントロンの複素環式類似体、例えば10−位置にＮ、ＯまたはＳを有するもの）またはそれらの置換された（例えば、環置換された）誘導体のような光反応性アリールケトンが好ましい。このようなケトンの官能基は、それらが、本明細書中に記載した活性化／不活性化／再活性化周期を容易に受け得るために、好ましい。ベンゾフェノンは、三重項状態への系間交差を経る励起した一重項状態の初期形成に伴って光化学的な励起が可能であるために、特に好ましい光反応性部分である。励起された三重項状態は、水素原子（例えば支持表面からの）の引き抜きにより炭素−水素結合中に挿入し、したがってラジカル対を生成し得る。ラジカル対のその後の衰弱は、新規の炭素−炭素結合の形成をもたらす。反応性結合（例えば、炭素−水素）が結合のために利用可能でない場合には、ベンゾフェノン基の紫外線誘導励起は可逆的で、エネルギー源の除去時に、分子は基底状態のエネルギーレベルに戻る。光活性化が可能なアリールケトン、例えば、ベンゾフェノンおよびアセトフェノンは、これらの基が水中で多再活性化を受けるので特別な重要性を有し、したがってコーティング効能増大を提供する。それゆえ、光反応性アリールケトンが特に好ましい。
【００３９】
アジドは好ましい種類の光反応性基を構成し、その例としては、アリールアジド（Ｃ6Ｒ5Ｎ3）、例えば、フェニルアジド、特に４−フルオロ−３−ニトロフェニルアジド、アシルアジド（−ＣＯ−Ｎ3）、例えば、ベンゾイルアジドおよびｐ−メチルベンゾイルアジド、アジドフォルメート（−Ｏ−ＣＯ−Ｎ3）、例えば、エチルアジドフォルメート、フェニルアジドフォルメート、スルホニルアジド（−ＳＯ2−Ｎ3）、例えば、ベンゼンスルホニルアジド、ならびにホスホリルアジド（（ＲＯ）2ＰＯＮ3）、例えば、ジフェニルホスホリルアジドおよびジエチルホスホリルアジドが挙げられる。ジアゾ化合物は別の種類の光反応性基を構成し、その例としては、ジアゾアルカン（−ＣＨＮ2）、例えば、ジアゾメタンおよびジフェニルジアゾメタン、ジアゾケトン（−ＣＯ−ＣＨＮ2）、例えば、ジアゾアセトフェノンおよび１−トリフルオロメチル−１−ジアゾ−２−ペンタノン、ジアゾアセテート（−Ｏ−ＣＯ−ＣＨＮ2）、例えば、ｔ−ブチルジアゾアセテートおよびフェニルジアゾアセテート、ならびにβ−ケト−α−ジアゾアセテート（−ＣＯ−ＣＮ3−ＣＯ−Ｏ−）、例えば、ｔ−ブチルαジアゾアセトアセテートが挙げられる。
【００４０】
その他の光反応性基としては、ジアジリン（−ＣＨＮ2）、例えば３−トリフルオロメチル−３−フェニルジアジリン、ならびにケテン（−ＣＨ＝Ｃ＝Ｏ）、例えば、ケテンおよびジフェニルケテンが挙げられる。光活性化が可能なアリルケトン、例えばベンゾフェノンおよびアセトフェノンは、これらの基が水中で多再活性化を受けるゆえに特別な重要性を有し、したがってコーティング効能の増大を提供する。
【００４１】
光反応性基の活性化時に、光反応性基の残基を介した共有結合により、試薬分子は互いにおよび／または物質表面に共有的に結合される。光反応性基ならびに活性化時のそれらの残基の例を以下に示す：
光反応性 基 残基官能性
アリールアジド                  アミン          Ｒ−ＮＨ−Ｒ’
アシルアジド                    アミド          Ｒ−ＣＯ−ＮＨ−Ｒ’
アジドホルメート                カルバメート    Ｒ−Ｏ−ＣＯ−ＮＨ−Ｒ’
スルフォニルアジド              スルホンアミド  Ｒ−ＳＯ2−ＮＨ−Ｒ’
ホスホリルアジド                ホスホルアミド  (ＲＯ)2ＰＯ−ＮＨ−Ｒ’
ジアゾアルカン                  新規Ｃ−Ｃ結合
ジアゾケトン                    新規Ｃ−Ｃ結合およびケトン
ジアゾアセテート                新規Ｃ−Ｃ結合およびエステル
β−ケト−α−ジアゾアセテート  新規Ｃ−Ｃ結合およびβーケトエステル
脂肪族アゾ                      新規Ｃ−Ｃ結合
ジアジリン                      新規Ｃ−Ｃ結合
ケテン                          新規Ｃ−Ｃ結合
光活性化ケトン                  新規Ｃ−Ｃ結合およびアルコール
当業者は、本明細書の説明を読めば、適切に誘導された核酸配列の共有固定化を提供するために、適切な熱化学的反応性基を同定し、選択し得る。例えば、アミノ誘導化核酸配列は、活性化エステル、例えばＮＯＳエステルとの共有結合反応を経て、アミド結合基を提供する。同様の活性化エステル、例えば、ｐ−ニトロフェニルおよびペンタフルオルフェニルエステルも、アミン基と結合して、アミド結合を提供する。各々が熱化学的反応性基として役立ち得る多数のその他のアミン反応性官能基、例えばイソシアネート、チオイソシアネート、カルボン酸塩化物、エポキシド、アルデヒド、アルキルハライドおよびスルホネートエステル、例えばメシレート、トシレートおよびトレシレートも当業者は認識し得る。
【００４２】
別の例では、核酸配列は、当業界で周知の技術を用いて、スルフヒドリル基により誘導し得る。対応する熱化学的反応性基は、例えばマレイミド環構造またはα−ヨードアセトアミドである。これらの構造はいずれも、容易に反応して、スルフヒドリル誘導化核酸配列との共有結合を提供する。
【００４３】
本発明の官能化ポリマーは、予備成形ポリマーの適切な誘導化により、さらに好ましくは一組のコモノマーの重合により調製されて、所望の置換パターンを生じる。後者のアプローチは、種々のコモノマーの比率を変えることが容易であるために、そしてポリマー中への組み込みのレベルを制御する能力により、好ましい。これら２つのアプローチの組合せも、最適な構造を提供するために用い得る。
【００４４】
好ましい態様では、例えば、他端の光反応性または熱化学的反応性基とはスペーサー基により分離される分子の一端に重合可能基を有するモノマーが調製される。例えば、重合可能なビニル基、例えばアクリルアミド、アクリレートまたはマレイミドは、短炭化水素スペーサーを介して活性化エステル、例えばＮＯＳエステルと、あるいは光反応性基、例えば置換化ベンゾフェノンと結合し得る。これらの化合物は、当業者に周知の有機合成技法を用いて調製し、精製し得る。ＭＡＰＴＡＣ、Ｎ−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］メタクリルアミド（ＤＭＡＰＭＡ）およびＮ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミド塩酸塩（ＡＰＭＡ）のような所望のモノマーのいくつかは市販されており、これらの化合物は、ポリマーの主鎖と一緒に、それぞれ第四級アンモニウム塩、第三級アミンおよび第一級アミンを提供する。
【００４５】
ポリマーおよびコポリマーは、当業者に周知の技法を用いて、同様に前記のモノマーから調製し得る。好ましくは、これらのモノマーおよびコポリマーは、アゾ開始剤、例えば２，２’−アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）またはペルオキシド、例えば、ベンゾイルペルオキシドを用いて、ビニル基のフリーラジカル重合を受ける。重合のために選択されるモノマーは、最終ポリマー生成物の性質に基づいて選択される。例えば、ＮＯＳ基を含有する光反応性基は光反応性基を含有するモノマーおよび活性化ＮＯＳエステルを含有する二次モノマーから調製される。
【００４６】
最終ポリマーの組成は、重合反応に装填するモノマーのモル比により制御し得る。典型的には、これらの官能化モノマーは、重合反応の総モノマー含量の相対的に低モルパーセンテージで用いられ、残りの組成は、核酸配列に対して光反応性でも熱化学的反応性でもないモノマーで構成される。このようなモノマーの例としては、アクリルアミドおよびＮ−ビニルピロリドンが挙げられるが、これらに限定されない。用いられるモノマーの相対的な反応性に基づいて、主鎖に沿ったモノマーの分布は非常に無作為である。
【００４７】
いくつかの場合、ポリマーの主鎖上の熱化学的反応性基は、重合中に存在する場合には、それ自体、重合可能モノマーとして作用し、したがってポリマーの初期生成後の二次工程において、その基の導入を要する。例えば、主鎖と一緒にマレイミドを有する光反応性ポリマーの調製は、前記の技法を用いて、光反応性基およびアミン基の両方を含有するポリマーを最初に調製し、その後アミン基を、短炭化水素スペーサーにより連結されたマレイミド基およびシアネートを含有するヘテロ二官能性分子と反応させることにより成し遂げられる。広範な種々のこのようなポリマー修飾技法は、当業者に既知の典型的な有機反応を用いて利用可能である。
【００４８】
以下の実施例を参照しながら本発明をさらに説明するが、本発明はこれらに限定されない。本発明の範囲を逸脱しない限り、前記の態様において多数の変更をなし得る、ということは当業者には明らかである。したがって、本発明の範囲は、本出願に記載した態様に限定されるものではなく、特許請求の範囲に記載された態様に、そしてそれらの態様の等価物によってのみ限定される。別記しない限り、パーセンテージはすべて質量を単位にしている。これらの実施例により同定される種々の「化合物」の構造は、下記の表１３中に見出される。ＮＭＲ分析は、別記しない限り、80 Mnz分光計で実施した。
【００４９】
実施例
実施例１
４−ベンゾイルベンゾイルクロリド（ＢＢＡ−Ｃｌ）（化合物Ｉ）の調製
４−ベンゾイル安息香酸（ＢＢＡ）1.0 kg（4.42 mol）を、還流冷却器および頭上攪拌機を装備した乾燥5リットルモートン（Morton）フラスコに添加し、その後645 ml（8.84 mol）の塩化チオニルおよび725 mlのトルエンを添加した。次にジメチルホルムアミド3.5 mlを添加し、混合物を4時間加熱還流した。冷却後、減圧下で溶媒を除去し、残留塩化チオニルを、3 x 500 mlのトルエンを用いた３回の蒸発により除去した。生成物を1:4トルエン：ヘキサンから再結晶化して、真空炉中で乾燥後、988 g（収率91％）を得た。生成物の融点は92〜94℃であった。80 MHzでの核磁気共鳴（ＮＭＲ）分析（1ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ3））は、所望の生成物と一致した。芳香族陽子7.20〜8.25（m,9H）。化学シフト値はすべて、テトラメチルシラン内部標準からのppmでのダウンフィールドである。例えば、実施例３に記載したような光活性化可能ポリマーの合成に用いられるモノマーの調製に用いるために、最終化合物を貯蔵した。
【００５０】
実施例２
Ｎ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミド塩酸塩（ＡＰＭＡ）（化合物ＩＩ）の調製
1000 mlのＣＨ2Ｃｌ2中の１，３−ジアミノプロパン1910 g（25.77 mol）の溶液を、12リットルモートンフラスコに添加し、氷浴中で冷却した。次に250 mlのＣＨ2Ｃｌ2中のｔ−ブチルフェニルカルボネート1000 g（5.15 mol）の溶液を、15℃より低い反応温度を保持する速度で滴加した。添加後、混合物を室温に温め、２時間撹拌した。反応混合物を900 mlのＣＨ2Ｃｌ2および500 gの氷で稀釈し、その後、2500 mlの2.2 NＮａＯＨを添加した。溶液が塩基性であることを保証するための検査後、生成物を分液漏斗に移して、有機層を取り出して、抽出物＃１として取っておいた。次に水性層を3 X 1250 mlのＣＨ2Ｃｌ2で抽出して、各抽出を別々の分画として保持した。次に４つの有機抽出物を、分画＃１から初めて分画＃４まで、0.6NＮａＯＨの単一の1250 ml部分で引き続いて洗浄した。この洗浄操作を、0.6NＮａＯＨの新たな1250 ml部分を用いて２回反復した。次に有機抽出物を併合し、Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥した。溶媒を濾過、蒸発して、恒質量とし、825 gのＮ−モノ−ｔ−ＢＯＣ−１，３−ジアミノプロパンを生成し、これを、さらに精製せずに用いた。
【００５１】
1020 mlのＣＨＣｌ3中の無水メタクリル酸806 g（5.23 mol）の溶液を、頭上攪拌機を装備した12リットルモートンフラスコに入れて、氷浴上で冷却した。フェノチアジン60 mgを開始剤として添加し、その後、825 mlのＣＨＣｌ3中のＮ−モノ−ｔ−ＢＯＣ−１，３−ジアミノプロパン825 g（4.73 mol）を滴加した。常時10℃より低い反応温度を保持するよう、添加速度を制御した。添加完了後、氷浴を取り外し、混合物を一夜撹拌し続けた。生成物を2400 mlの水で稀釈し、分液漏斗に移した。十分混合後、水性層を除去し、有機層を2400 mlの2NＮａＯＨで洗浄して、水性層が塩基性であることを保証した。次に有機層をＮａ2ＳＯ4上で乾燥し、濾過して、乾燥剤を除去した。生成物と溶媒の併合質量が約3000 gになるまで、ＣＨＣｌ3溶媒の一部を減圧下で除去した。次に、11.0リットルのヘキサンを撹拌ＣＨＣｌ3溶液に徐々に添加し、その後4℃で一夜貯蔵することにより、所望の生成物を沈澱させた。濾過により生成物を単離し、固体を、900 mlのヘキサンと150 mlのＣＨＣｌ3の溶媒の組合せを用いて２回すすいだ。固体を十分に乾燥させて、900 gのＮ−［Ｎ’−（ｔ−ブチルオキシカルボニル）−３−アミノプロピル］−メタクリルアミド、融点85.5℃をＤＳＣにより得た。ＮＭＲ分光計での分析は、所望生成物と一致した：1ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）アミドＮＨ6.30-6.80、4.55-5.10（m,2H）、ビニル陽子5.65、5.20（m,2H）、Ｎに隣接するメチレン2.90-3.45（m,4II）、メチル1.95（m,3H）、残りのメチレン1.50-1.90（m,2H）およびｔ−ブチル1.40（s,9H）。
【００５２】
三首２リットル丸底フラスコは、頭上攪拌機および気体散布管を装備した。メタノール700 mlをフラスコに添加し、氷浴上で冷却した。撹拌しながら、ＨＣｌガスを約5リットル／分の速度で合計40分間、溶媒中に発泡させた。指標としてフェノールフタレインを用いて、1NＮａＯＨを用いた滴定により、最終ＨＣｌ／ＭｅＯＨ溶液中のモル濃度を8.5 Mと確定した。 Ｎ−［Ｎ’−（ｔ−ブチルオキシカルボニル）−３−アミノプロピル］−メタクリルアミド900 g（3.71 mol）を、頭上攪拌機および気体出口アダプターを装備した5リットルモートンフラスコに添加し、その後1150 mlのメタノール溶媒を添加した。いくつかの固体が、この溶媒容積でフラスコ中に残存した。フェノチアジン30 mgを開始剤として添加し、その後655 ml（5.57 mol）の8.5MＨＣｌ／ＭｅＯＨ溶液を添加した。気体を発生しながら、固体は徐々に溶解したが、反応は発熱性ではなかった。混合物を室温で一夜撹拌して、完全な反応を保証した。
【００５３】
次に濾過によりあらゆる固体を除去し、さらに30 mgのフェノチアジンを添加した。次に溶媒を減圧下でストリッピングして、その結果生じた固体を、減圧下で蒸発させながら、3 x 1000 mlのイソプロパノールと共沸させた。最後に、生成物を2000 mlの還流イソプロパノール中に溶解させて、4000 mlのエチルアセテートを撹拌しながら徐々に添加した。混合物を徐々に冷却させて、4℃で一夜貯蔵した。濾過により化合物ＩＩを単離し、恒質量まで乾燥させて、ＤＳＣにより124.7℃の融点を有する630 gの収量を得た。ＮＭＲ分光計での分析は、所望生成物と一致した：1ＨＮＭＲ（Ｄ2Ｏ）ビニル陽子5.60、5.30（m,2H）、アミドＮに隣接するメチレン3.30（t,2H）、アミンＮに隣接するメチレン2.95（t,2H）、メチル1.90（m,3H）および残りのメチレン1.65-2.10（m,2H）。例えば、実施例３に記載したような光活性化可能なポリマーの合成に用いられるモノマーの調製に用いるために、最終化合物を貯蔵した。
【００５４】
実施例３
Ｎ−［３−（４−ベンゾイルベンズアミド）プロピル］メタクリルアミド（ＢＢＡ−ＡＰＭＡ）（化合物ＩＩＩ）の調製
実施例２に記載した一般的方法により調製した化合物ＩＩ  120g（0.672 mol）を頭上攪拌機を装備した乾燥２リットル三首丸底フラスコに添加した。フェノチアジン23〜25 mgを開始剤として添加し、その後800 mlのクロロホルムを添加した。懸濁液を氷浴上で10℃より低い温度に冷却し、実施例１に記載した一般的方法により調製した172.5 g（0.705 mol）の化合物Ｉを固体として添加した。次に、50 mlのクロロホルム中のトリエチルアミン207 ml（1.485 mol）を1〜1.5時間に亘って滴加した。氷浴を取り外し、周囲温度での撹拌を2.5時間継続した。次に生成物を600 mlの0.3NＨＣｌおよび2 x 300 mlの0.07NＨＣｌで洗浄した。硫酸ナトリウム上で乾燥後、減圧下でクロロホルムを除去して、重合を防止するために各再結晶化に23〜25 mgのフェノチアジンを用いて、生成物を4:1トルエン：クロロホルムから２回再結晶化した。化合物ＩＩＩの典型的な収率は90％で、融点は147〜151℃であった。 ＮＭＲ分光計での分析は、所望生成物と一致した：1ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）芳香族陽子7.20-7.95（m,9H）、アミドＮＨ6.55（広t, 1H）、ビニル陽子5.65、5.25（m,2H）、アミドＮに隣接するメチレン3.20-3.60（m,4H）、メチル1.95（s,3H）および残りのメチレン1.50-2.00（m,2H）。例えば、実施例９〜１１に記載したような光活性化可能なポリマーの合成に用いるために、最終化合物を貯蔵した。
【００５５】
実施例４
Ｎ−スクシンイミジル６−マレイミドヘキサノエート（ＭＡＬ−ＥＡＣ−ＮＯＳ）（化合物ＩＶ）の調製
以下の方法で官能化したモノマーを調製し、実施例９および１２に記載したように用いて、ポリマーの主鎖上に活性化エステル基を導入した。６−アミノヘキサン酸100 g（0.762 mol）を、頭上攪拌機および乾燥管を装備した三首３リットルフラスコ内の300 mlの酢酸中に溶解させた。無水マレイン酸78.5 g（0.801 mol）を200 mlの酢酸中に溶解し、６−アミノヘキサン酸溶液に添加した。混合物を沸騰水浴上で加熱しながら１時間撹拌して、白色固体を生成させた。室温で一夜冷却後、濾過により固体を収集し、2 x 50 mlのヘキサンですすいだ。乾燥後、（Ｚ）−４−オキソ−５−アザ−２−ウンデセンジオン酸の典型的な収量は158〜165 g（90〜95％）で、融点は160〜165℃であった。ＮＭＲ分光計での分析は、所望生成物と一致した：1ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6）アミド陽子8.65-9.05（m, 1H）、ビニル陽子6.10、6.30（d,2H）、窒素に隣接するメチレン2.85-3.25（m,4H）、カルボニルに隣接するメチレン2.15（t,2H）、および残りのメチレン1.00-1.75（m,6H）。
【００５６】
（Ｚ）−４−オキソ−５−アザ−２−ウンデセンジオン酸150.0 g（0.654 mol）、無水酢酸68 ml（73.5 g,0.721 mol）およびフェノチアジン500 mgを、頭上攪拌機を装備した２リットル三首丸底フラスコに添加した。トリエチルアミン91 ml（0.653 mol）および600 mlのＴＨＦを添加し、混合物を撹拌しながら加熱還流した。合計で4時間の還流後、暗色混合物を60℃より低温に冷却し、3リットルの水中の250 mlの12NＨＣｌの溶液中に注ぎ入れた。混合物を室温で3時間撹拌した後、濾過パッド（セライト545，J.T. Baker, Jackson, TN）を通して濾過して、固体を除去した。濾液を4 x 500 mlのクロロホルムで抽出し、併合抽出物を硫酸ナトリウム上で乾燥させた。重合を防止するために15 mgのフェノチアジンを添加後、減圧下で溶媒を除去した。６−マレイミドヘキサン酸を2:1ヘキサン：クロロホルムから再結晶化して、76〜83 g（55〜60％）の典型的な収量を得た。融点は81〜85℃であった。ＮＭＲ分光計での分析は、所望生成物と一致した：1ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）マレイミド陽子6.55（s,2H）、窒素に隣接するメチレン3.40（t,2H）、カルボニルに隣接するメチレン2.30（t,2H）、および残りのメチレン1.05-1.85（m,6H）。
【００５７】
６−マレイミドヘキサン酸20.0 g（94.7 mol）をアルゴン雰囲気下で100 mlのクロロホルム中に溶解し、その後41 ml（0.47 mol）のオキサリルクロリドを添加した。室温で2時間攪拌後、減圧下で溶媒を除去し、さらに4 x 25 mlのクロロホルムを用いて、残りの過剰のオキサリルクロリドを除去した。酸塩化物を100 mlのクロロホルム中に溶解させて、その後、12 g（0.104 mol）のＮ−ヒドロキシスクシンイミドおよび16 ml（0.114 mol）のトリエチルアミンを添加した。室温で一夜攪拌後、生成物を4 x 100 mlの水で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶媒を除去して、24 gの生成物（82％）を得て、これをさらに精製することなく用いた。 ＮＭＲ分光計での分析は、所望生成物と一致した：1ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）マレイミド陽子6.60（s,2H）、窒素に隣接するメチレン3.45（t,2H）、スクシンイミジル陽子2.80（s,4H）、カルボニルに隣接するメチレン2.55（t,2H）、および残りのメチレン1.15-2.00（m,6H）。例えば、実施例９および１２に記載したような光活性化可能なポリマーの合成に用いるために、最終化合物を貯蔵した。
【００５８】
実施例５
Ｎ−スクシンイミジル６−メタクリルアミドヘキサノエート（ＭＡ−ＥＡＣ−ＮＯＳ）（化合物Ｖ）の調製
以下の方法で官能化モノマーを調製し、実施例１１に記載したように用いて、ポリマーの主鎖上に活性化エステル基を導入した。６−アミノカプロン酸4.00 g（30.5 mmol）を、乾燥管を装備した乾燥した丸底フラスコに入れた。次に無水メタクリル酸5.16 g（33.5 mmol）を添加し、混合物を室温で４時間撹拌した。得られた濃厚な油をヘキサンで3回粉砕して、残りの油をクロロホルムに溶解させた後、硫酸ナトリウム上で乾燥した。濾過および蒸発後、生成物の一部を、クロロホルム溶媒系中の10％メタノールを用いて、シリカゲルフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。適切な分画を併合し、1 mgのフェノチアジンを添加し、減圧下で溶媒を除去した。ＮＭＲ分光計での分析は、所望生成物と一致した：1ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）カルボン酸陽子7.80-8.20（b,1H）、アミド陽子5.80-6.25（b,1H）、ビニル陽子5.20および5.50（m,2H）、窒素に隣接するメチレン3.00-3.45（m,2H）、カルボニルに隣接するメチレン2.30（t,2H）、メチル基1.95（m, 3H）、および残りのメチレン1.10-1.90（m,6H）。
【００５９】
６−メタクリルアミドヘキサン酸3.03 g（15.2 mmol）を30 mlの乾燥クロロホルム中に溶解し、その後1.92 g（16.7 mmol）のＮ−ヒドロキシスクシンイミドおよび6.26 g（30.4 mmol）の１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミドを添加した。反応物を室温で一夜、乾燥した大気中で撹拌した。次に濾過により固体を除去し、一部を、シリカゲルフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。
【００６０】
非極性不純物をクロロホルム溶媒により除去し、その後、クロロホルム溶媒中の10％テトラヒドロフランを用いて所望の生成物を溶離した。適切な分画をプールした。0.2 mgのフェノチアジンを添加し、減圧下で溶媒を蒸発させた。少量の１，３−ジシクロヘキシル尿素を不純物として含有するこの生成物を、さらに精製せずに用いた。ＮＭＲ分光計での分析は、所望生成物と一致した：1ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）アミド陽子5.60-6.10（b,1H）、ビニル陽子5.20および5.50（m,2H）、窒素に隣接するメチレン3.05-3.40（m,2H）、スクシンイミジル陽子2.80（s,4H）、カルボニルに隣接するメチレン2.55（t,2H）、メチル基1.90（m, 3H）、および残りのメチレン1.10-1.90（m,6H）。例えば、実施例１１に記載したような光活性化可能なポリマーの合成に用いるために、最終化合物を貯蔵した。
【００６１】
実施例６
４−ブロモメチルベンゾフェノン（ＢＭＢＰ）（化合物ＶＩ）の調製
４−メチルベンゾフェノン750 g（3.82 mol）を、頭上攪拌機を装備した5リットルモートンフラスコに添加し、2850 mlのベンゼン中に溶解した。次に溶液を加熱還流した後、330 mlのベンゼン中の610 g（3.82 mol）の臭素を滴加した。添加速度は約1.5 ml／分で、フラスコを90ワット（90ジュール/秒）のハロゲンスポットライトで照明して、反応を開始させた。10％デューティ周期（5秒間オン、40秒間オフ）、その後20％デューティ周期（10秒間オン、40秒間オフ）を提供するために、タイマーをランプとともに用いた。添加終了時に、ガスクロマトグラフィーにより生成物を分析し、71％の所望の化合物ＶＩ、8％のジブロモ生成物、および20％の未反応４−メチルベンゾフェノンを含有することが判明した。冷却後、反応混合物を100 mlの水中の10 gの重亜硫酸ナトリウムで洗浄し、その後3 x 200 mlの水で洗浄した。生成物を硫酸ナトリウム上で乾燥し、1:3トルエン：ヘキサンから２回再結晶化した。真空下で乾燥後、635 gの化合物ＶＩを単離した。収率は60％で、融点は112〜114℃であった。ＮＭＲ分光計での分析は、所望の生成物と一致した：1ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）芳香族陽子7.20〜7.80（m,9H）およびベンジル性陽子4.48（s,2H）。実施例7に記載したような光活性化可能な連鎖移動剤の調製に用いるために、最終化合物を貯蔵した。
【００６２】
実施例７
Ｎ−（２−メルカプトエチル）−３，５−ビス−（４−ベンゾイルベンジルオキシ）ベンズアミド（化合物ＶＩＩ）の調製
３，５−ジヒドロキシ安息香酸46.2 g（0.30 mol）を、ソックスレー抽出器および冷却器を装備した250 mlフラスコ中で計量した。メタノール48.6 mlおよび濃硫酸0.8 mlをフラスコに添加し、48 gの３Ａ分子篩をソックスレー抽出器中に置いた。抽出器をメタノールで満たし、混合物を一夜加熱還流した。その結果生じた生成物のガスクロマトグラフィーは、所望のメチルエステルの98％の転化を示した。溶媒を減圧下で除去して、約59 gの粗製生成物を得た。生成物をさらに精製せずにその後の工程に用いた。小試料をＮＭＲのために予め精製しておいた。その結果生じたスペクトルは所望の生成物と一致した：1ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6）芳香族陽子6.75（d,2H）および6.38（t,1H）、ならびにメチルエステル3.75（s,3H）。
【００６３】
前記からの全メチルエステル生成物を、頭上攪拌機および冷却器を装備した２リットルフラスコ中に入れ、その後、実施例６に記載した一般的方法により調製した173.25 g（0.63 mol）の化合物ＶＩ、207 g（1.50 mol）の炭酸カリウムおよび1200 mlのアセトンを添加した。次に、その結果生じた混合物を一夜還流して、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）により示されるような完全な反応を得た。濾過により固体を除去し、アセトンを減圧下で蒸発させて、49 gの粗製生成物を得た。固体を１リットルの水で稀釈し、3 x 1リットルのクロロホルムで抽出した。抽出物をアセトン可溶性分画と併合し、硫酸ナトリウム上で乾燥して、177 gの粗製生成物を得た。その生成物をアセトニトリルから再結晶化して、150.2 gの白色固体を得た。最初の２つの工程に関しては収率は90％であった。生成物の融点は131.5℃（ＤＳＣ）で、ＮＭＲ分光計での分析は、所望の生成物と一致した：1ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）芳香族陽子7.25〜7.80（m,18H）、7.15（d,2H）および6.70（t,1H）、ベンジル性陽子5.05（s,4H）およびメチルエステル3.85（s,3H）。
【００６４】
メチル３，５−ビス（４−ベンゾイルベンジルオキシ）ベンゾエート60.05 g（0.108 mol）を２リットルフラスコに入れ、その後120 mlの水、480 mlのメタノールおよび6.48 g（0.162 mol）の水酸化ナトリウムを添加した。混合物を３時間加熱還流して、エステルの加水分解を完了した。冷却後、減圧下でメタノールを除去し、該酸のナトリウム塩を2400 mlの温水中に溶解させた。濃塩酸を用いて該酸を沈澱させて、濾過し、水で洗浄して、真空炉中で乾燥させて、58.2 gの白色固体（収率99％）を得た。生成物の融点は188.3℃（ＤＳＣ）であり、ＮＭＲ分光計での分析は、所望の生成物と一致した：1ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6）芳香族陽子7.30〜7.80（m,18H）、7.15（d,2H）および6.90（t,1H）、ならびにベンジル性陽子5.22（s,4H）。
【００６５】
３，５−ビス（４−ベンゾイルベンジルオキシ）安息香酸20.0 g（36.86 mmol）を250 mlフラスコに添加し、その後36 mlのトルエン、5.4 ml（74.0 mmol）のチオニルクロリドおよび28μlのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを添加した。混合物を4時間還流して、酸塩化物を生成した。冷却後、溶媒および過剰のチオニルクロリドを減圧下で除去した。残留チオニルクロリドを、各々20 mlのクロロホルムを用いて、さらに４回蒸発させることにより除去した。粗製物質をトルエンから再結晶化して、18.45 gの生成物を収率80％で得た。生成物に関する融点は126.9℃（ＤＳＣ）であり、ＮＭＲ分光計での分析は、所望の生成物と一致した：1ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）芳香族陽子7.30〜7.80（m,18H）、7.25（d,2H）および6.85（t,1H）、ならびにベンジル性陽子5.10（s,4H）。
【００６６】
２−アミノエタンチオール塩酸塩4.19 g（36.7 mmol）を、頭上攪拌機を装備した250mlフラスコに添加し、その後、15 mlのクロロホルムおよび10.64 ml（76.5 mmol）のトリエチルアミンを添加した。氷浴上でアミン溶液を冷却後、50 mlのクロロホルム中の３，５−ビス（４−ベンゾイルベンジルオキシ）ベンゾイルクロリド18.4 g（32.8 mmol）を50分間に亘って滴加した。氷上での冷却を30分間継続し、その後２時間、室温に温めた。生成物を150 mlのクロロホルムで稀釈し、5 x 250 mlの0.1N塩酸で洗浄した。生成物を硫酸ナトリウム上で乾燥し、15:1トルエン：ヘキサンから２回再結晶化して、13.3 gの生成物を収率67％で得た。生成物に関する融点は115.9℃（ＤＳＣ）であり、ＮＭＲ分光計での分析は、所望の生成物と一致した：1ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6）芳香族陽子7.20〜7.80（m,18H）、6.98（d,2H）および6.65（t,1H）、アミドＮＨ6.55（広t,1H）、ベンジル性陽子5.10（s,4H）、アミドＮに隣接するメチレン3.52（q,2H）、ＳＨに隣接するメチレン2.10（q,2H）、ならびにＳＨ1.38（t,1H）。実施例１２に記載したような光活性化可能なポリマーの合成における連鎖移動剤として用いるために、最終化合物を貯蔵した。
【００６７】
実施例８
Ｎ−スクシンイミジル１１−（４−ベンゾイルベンズアミド）ウンデカノエート（ＢＢＡ−ＡＵＤ−ＮＯＳ）（化合物ＶＩＩＩ）の調製
実施例１に記載した一般的方法により調製した化合物Ｉ（50 g, 0.204 mol）を2500 mlのクロロホルム中に溶解し、その後、1500 mlの水中の43.1 g（0.214 mol）の１１−アミノウンデカン酸および60.0 g（1.5 mol）の水酸化ナトリウムの溶液を添加した。混合物を、２つの層が完全に混合したことを保証するために、５リットルモートンフラスコ中で１時間、激しく撹拌した。混合物を250 mlの濃塩酸で酸性にして、さらに30分間撹拌した。有機層を分離し、水性層を3 x 500 mlのクロロホルムで抽出した。併合した有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、蒸発させて、固体を得た。生成物をトルエンから再結晶化して、68.37 g（82％）の１１−（４−ベンゾイルベンズアミド）ウンデカン酸を得た。融点は107〜109℃であった。ＮＭＲ分光計での分析は、所望生成物と一致した：1ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）芳香族陽子7.20-7.80（m,9H）、アミドＮＨ6.30（広t, 1H）、アミドＮに隣接するメチレン3.35（m,2H）、カルボニルに隣接するメチレン2.25（t,2H）、残りのメチレン1.00-1.80（m,16H）。
【００６８】
１１−（４−ベンゾイルベンズアミド）ウンデカン酸60.0 g（0.146 mol）を温めながら、炉乾燥2000 mlフラスコ中の1200 mlの無水１，４−ジオキサン中に溶解させた。室温に冷却後、17.7 g（0.154 mol）のＮ−ヒドロキシスクシンイミドおよび33.2 g（0.161 mol）の１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミドを溶液に添加し、混合物を乾燥大気下で一夜撹拌した。次に、濾過により固体を除去し、フィルターケークを１，４−ジオキサンで洗浄した。次に、真空下で溶媒を除去し、生成物をエタノールから２回再結晶化した。真空炉中で十分に乾燥後、53.89 g（収率73％）の白色固体を得た。融点は97〜99℃であった。 ＮＭＲ分光計での分析は、所望生成物と一致した：1ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）芳香族陽子7.20-7.80（m,9H）、アミドＮＨ6.25（広t, 1H）、アミドＮに隣接するメチレン3.35（m,2H）、スクシンイミジル環上のメチレン2.75（s,4H）、カルボニルに隣接するメチレン2.55（t,2H）、残りのメチレン1.00-1.90（m,16H）。
【００６９】
実施例９
アクリルアミド、ＢＢＡ−ＡＰＭＡおよびＭＡＬ−ＥＡＣ−ＮＯＳのコポリマー（無作為フォトＰＡ−ポリＮＯＳ）（化合物ＩＸ、Ａ−Ｄ）の調製
本発明の光活性化可能なコポリマーを以下の方法で調製した。アクリルアミド4.298 g（60.5 mmol）を57.8 mlのテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中に溶解し、その後、実施例３に記載した一般的方法により調製した0.219 g（0.63 mmol）の化合物ＩＩＩ、実施例４に記載した一般的方法により調製した0.483 g（1.57 mmol）の化合物ＩＶ、0.058 ml（0.39 mmol）のＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）および0.154 g（0.94 mmol）の２，２’−アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）を溶解した。溶液を3分間、ヘリウム散布により脱酸素化して、その後アルゴン散布を３分間実施した。次に密封容器を60℃で一夜加熱して重合を完了した。濾過により固体生成物を単離し、フィルターケークをＴＨＦおよびＣＨＣｌ3で十分にすすいだ。生成物を真空炉中で30℃で乾燥して、5.34 gの白色固体を得た。 ＮＭＲ分析（ＤＭＳＯ−ｄ6）は、2.75 ppmでのＮＯＳ基の存在を確証し、感光性基の担持は、0.118 mmolＢＢＡ／ポリマー1 gであると確定された。ＭＡＬ−ＥＡＣ−ＮＯＳは、この反応では2.5 mol％の重合可能モノマーで構成されており、化合物ＩＸ−Ａを生じた。
【００７０】
前記の手法を、5 mol％化合物ＩＶを有するポリマーを調製するために用いた。アクリルアミド3.849 g（54.1 mmol）を52.9 mlのＴＨＦ中に溶解し、その後、実施例３に記載した一般的方法により調製した0.213 g（0.61 mmol）の化合物ＶＩ、実施例４に記載した一般的方法により調製した0.938 g（3.04 mmol）の化合物ＩＶ、0.053 ml（0.35 mmol）のＴＥＭＥＤおよび0.142 g（0.86 mmol）のＡＩＢＮを溶解した。その結果生じた固体、化合物ＩＸ−Ｂは、前記と同様に単離した場合、4.935 gの生成物を生じ、感光性基の担持は0.101 mmolＢＢＡ／ポリマー1 gであった。
【００７１】
前記の手法を、10 mol％化合物ＩＶを有するポリマーを調製するために用いた。アクリルアミド3.241 g（45.6 mmol）を46.4 mlのＴＨＦ中に溶解し、その後、実施例３に記載した一般的方法により調製した0.179 g（0.51 mmol）の化合物ＩＩＩ、実施例４に記載した一般的方法により調製した1.579 g（5.12 mmol）の化合物ＩＶ、0.047 ml（0.31 mmol）のＴＥＭＥＤおよび0.126 g（0.77 mmol）のＡＩＢＮを溶解した。その結果生じた固体、化合物ＩＸ−Ｃは、前記と同様に単離した場合、4.758 gの生成物を生じ、感光性基の担持は0.098 mmolＢＢＡ／ポリマー1 gであった。
【００７２】
前記と同様の手法を、2.5 mol％化合物ＩＶおよび2 mol％化合物ＩＩＩを有するポリマーを調製するために用いた。アクリルアミド16.43 g（231.5 mmol）、実施例３に記載した一般的方法により調製した化合物ＩＩＩ、1.70 g（4.85 mmol）；実施例４に記載した一般的方法により調製した化合物ＩＶ、1.87 g（6.06 mmol）；およびＴＨＦ（222 ml）を、丸底フラスコ中で、アルゴン散布して、室温で15分間撹拌した。ＴＥＭＥＤ、0.24 ml（2.14 mmol）およびＡＩＢＮ、0.58 g（3.51 mmol）を反応物に添加した。次に、反応物をアルゴン雰囲気下で4時間還流した。その結果生じた固体、化合物ＩＸ−Ｄは、前記と同様に単離した場合、19.4 gの生成物を生じ、感光性基の担持は0.23 mmolＢＢＡ／ポリマー1 gであった。
【００７３】
実施例１０
アクリルアミド、ＢＢＡ−ＡＰＭＡおよび［３−（メタクリロイルアミノ）プロピル］トリメチルアンモニウムクロリドのコポリマー（無作為フォトＰＡ−ポリクアット）（化合物Ｘ、Ａ−Ｂ）の調製
本発明の光活性化可能なコポリマーを以下の方法で調製した。アクリルアミド10.681 g（0.150 mol）を150 mlのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に溶解し、その後、実施例３に記載した一般的方法により調製した0.592 g（1.69 mmol）の化合物ＩＩＩ、7.08 mlの50％水性溶液として送達される3.727 g（16.90 mmol）の［３−（メタクリロイルアミノ）プロピル］トリメチルアンモニウムクロリド（ＭＡＰＴＡＣ）、0.169 ml（1.12 mmol）のＴＥＭＥＤおよび0.333 g（2.03 mmol）のＡＩＢＮを溶解した。溶液を４分間、ヘリウム散布により脱酸素化して、その後アルゴン散布をさらに4分間実施した。次に密封容器を55℃で一夜加熱して重合を完了した。ＤＭＳＯ溶液を水で稀釈し、12,000〜14,000分子量切断管を用いて脱イオン水に対して透析した。その結果生じた溶液の凍結乾燥により、14.21 gの白色固体を得た。 ＮＭＲ分析（Ｄ2Ｏ）は、3.10 ppmでの第四級アンモニウム基上のメチル基の存在を確証し、感光性基の担持は、0.101 mmolＢＢＡ／ポリマー1 gであると確定された。化合物ＩＩＩは、この反応では1 mol％の重合可能なモノマーで構成されており、化合物Ｘ−Ａを生じた。
【００７４】
前記の手法を、2 mol％化合物ＩＩＩを有するポリマーを調製するために用いた。アクリルアミド10.237 g（0.144 mmol）を145 mlのＤＭＳＯ中に溶解し、その後、実施例３に記載した一般的方法により調製した1.148 g（3.277 mmol）の化合物ＩＩＩ、7.23 mlの50％水性溶液として送達される3.807 g（17.24 mmol）のＭＡＰＴＡＣ、0.164 ml（1.09 mmol）のＴＥＭＥＤおよび0.322 g（1.96 mmol）のＡＩＢＮを溶解した。前記と同様に作製して、12.54 gの生成物（化合物Ｘ−Ｂ）を得た。感光性基の担持は0.176 mmolＢＢＡ／ポリマー1 gであった。
【００７５】
実施例１１
アクリルアミド、ＢＢＡ−ＡＰＭＡ、ＭＡ−ＥＡＣ−ＮＯＳおよび［３−（メタクリロイルアミノ）プロピル］トリメチルアンモニウムクロリドのコポリマー（無作為フォトＰＡ−ポリＮＯＳ−ポリクアット）（化合物ＸＩ）の調製
本発明の光活性化可能なコポリマーを以下の方法で調製した。市販の50％水性ＭＡＰＴＡＣ中の水を、クロロホルムとの共沸により除去した。10.88 gのＭＡＰＴＡＣを含有するＭＡＰＴＡＣ水溶液20 mlを20 mlのＤＭＳＯおよび100 mlのクロロホルムで稀釈した。この混合物を、無水硫酸ナトリウムを含有する水より重い液体−液体抽出器中で、合計80分間還流させた。還流中はゆっくり流れる空気流を保持して、モノマーの重合を抑制した。還流終了時に、過剰のクロロホルムを減圧下で除去し、ＭＡＰＴＡＣのＤＭＳＯ溶液を約352 mg/mlの濃度で残した。
【００７６】
アクリルアミド1.7 g（23.90 mmol）を57.7 mlのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に溶解し、その後、実施例３に記載した一般的方法により調製した0.215 g（0.614 mmol）の化合物ＩＩＩ、1.93 ml（0.677 g, 3.067 mmol）の前記ＭＡＰＴＡＣ／ＤＭＳＯ溶液、実施例５に記載した一般的方法により調製した0.91 g（3.068 mmol）の化合物Ｖ、および0.060 g（0.365 mmol）のＡＩＢＮを溶解した。溶液を４分間、ヘリウム散布により脱酸素化して、その後アルゴン散布をさらに4分間実施した。次に密封容器を55℃で一夜加熱して重合を完了した。反応混合物を600 mlのジエチルエーテル中に注ぎ入れることにより、ポリマーを単離した。遠心分離により固体を分離し、生成物を200 mlのジエチルエーテルおよび200 mlのクロロホルムで洗浄した。溶媒を真空下で蒸発させて、3.278 gの生成物を得た。感光性基の担持は0.185 mmolＢＢＡ／ポリマー1 gであった。
【００７７】
実施例１２
Ｎ−（２−メルカプトエチル）−３，５−ビス（４−ベンゾイルベンジルオキシ）ベンズアミドを用いるアクリルアミドおよびＭＡＬ−ＥＡＣ−ＮＯＳのコポリマー（終点ジフォトＰＡ−ポリＮＯＳ）（化合物ＸＩＩ）
本発明の光活性化可能なコポリマーを以下の方法で調製した。アクリルアミド3.16 g（44.5 mmol）を45.0 mlのテトラヒドロフラン中に溶解し、その後、0.164 g（1 mmol）のＡＩＢＮ、0.045 ml（0.30 mmol）のＴＥＭＥＤ、実施例７の一般的方法により調製した0.301 g（0.5 mmol）の化合物ＶＩＩ、および実施例４に記載した一般的方法により調製した1.539 g（5 mmol）の化合物ＩＶを溶解した。溶液を４分間、ヘリウム散布により脱酸素化して、その後アルゴン散布をさらに4分間実施した。次に密封容器を55℃で一夜加熱して重合を完了した。沈澱ポリマーを濾過により単離し、クロロホルムで洗浄した。最終生成物を真空炉中で乾燥して、0.011  mmolＢＢＡ／ポリマー1 gの感光性基の担持を有するポリマー4.727 gを得た。
【００７８】
実施例１３
Ｎ−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］メタクリルアミドおよびＢＢＡ−ＡＰＭＡのコポリマー（無作為フォトポリ第三級アミン）（化合物ＸＩＩＩ）
本発明の光活性化可能なコポリマーを以下の方法で調製した。 Ｎ−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］メタクリルアミド33.93 g（0.2 mol）を273 mlのＤＭＳＯ中に溶解し、その後、16.6 mlの濃ＨＣｌおよび実施例３に記載した一般的方法により調製した6.071 g（17.3 mmol）の化合物ＩＩＩを溶解した。最後に、0.29 ml（1.93 mmol）のＴＥＭＥＤ、0.426 g（2.6 mmol）のＡＩＢＮおよび100 mlの水を反応混合物に添加した。溶液を10分間、ヘリウム散布により脱酸素化して、次にヘッドスペースをアルゴンで充填した。密封容器を55℃で一夜加熱して重合を完了した。次に、生成物を、12,000〜14,000分子量ＣＯ管を用いて、数日間、脱イオン水に対して透析した。透析後、生成物を濾過して、あらゆる固体を除去し、凍結乾燥して、47.27 gの固体生成物を得た。ポリマーは、 0.33 mmolＢＢＡ／ポリマー1 gの感光性基の担持を有することが確定された。
【００７９】
実施例１４
Ｎ−スクシンイミジル５−オキソ−６−アザ−８−ノネノエート（アリル−ＧＬＵ−ＮＯＳ）（化合物ＸＩＶ）の調製
以下の方法で官能性モノマーを調製し、実施例１５に記載するように用いて、ポリマーの主鎖上に活性化エステル基を導入した。無水グルタル酸20 g（0.175 mol）を100 mlクロロホルム中に溶解させた。氷浴を用いて、無水グルタル酸溶液を10℃より低温に冷却した。アリルアミン10 g（0.177 mol）を50 mlクロロホルム中に溶解して、撹拌しながら無水グルタル酸の冷却溶液に添加した。アリルアミンの添加速度は、反応温度を10℃より低温に保持するよう調節した。アリルアミン添加完了後、反応溶液を一夜撹拌しながら室温にした。溶媒除去後、単離した５−オキソ−６−アザ−８−ノネン酸は31.4 g（105％粗製）となった。二重ＤＳＣ融点は35.1℃および44.9℃であった。300 MHzでのＮＭＲ分析は、所望生成物と一致した：1ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）アミド陽子6.19（b,1H）、ビニル陽子5.13、5.81（m,3H）、アミドＮに隣接するメチレン3.85（m,2H）、カルボニルに隣接するメチレン2.29、2.39（t,4H）、および中心メチレン1.9（m,2H）。
【００８０】
５−オキソ−６−アザ−８−ノネン酸20.54 g（0.12 mol）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）15.19 g（0.13 mol）および204 mlのジオキサンを、頭上攪拌器および添加漏斗を装備した１Ｌ三首丸底フラスコ中に入れた。ジシクロヘキシルカルボジイミド（「ＤＣＣ」）29.7 g（0.144 mole）を50 mlジオキサン中に溶解し、添加漏斗に入れた。ＤＣＣ溶液を撹拌しながら酸／ＮＨＳ溶液に20分に亘って添加し、その結果生じた混合物を、一夜、室温に冷却させた。反応混合物をブフナー漏斗で濾過して、ジシクロヘキシル尿素（ＤＣＵ）を除去した。固体を2 x 100 mlジオキサンで洗浄した。溶媒を蒸発させて、41.37 gの残渣を得て、これを4 x 75 mlヘキサンで洗浄した。溶媒を除去後、粗製ＮＯＳエステルの収量は41.19 gであった。粗製ＮＯＳ生成物をトルエンから１回再結晶化して、収率60％を得た。ＤＳＣ融点は90.1℃であった。300 MHzでのＮＭＲ分析は、所望生成物と一致した：1ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）アミド陽子6.02（b,1H）、ビニル陽子5.13、5.80（m,3H）、アミドＮに隣接するメチレン3.88（m,2H）、スクシンイミジル陽子2.83（s,4H）、カルボニルに隣接するメチレン2.31、2.68（t,4H）、および中心メチレン2.08（m,2H）。実施例１５に記載したような光活性化可能なポリマーの合成に用いるために、最終化合物を貯蔵した。
【００８１】
実施例１５
ビニルピロリジノン、ＢＢＡ−ＡＰＭＡおよびアリル−ＧＬＵ−ＮＯＳのコポリマー（無作為フォトＰＶＰ−ポリＮＯＳ）（化合物ＸＶ）の調製
本発明の光活性化可能なコポリマーを以下の方法で調製した。ビニルピロリジノン4.30 g（38.73 mmol）を5.2 mlのＤＭＳＯ中に、実施例３に記載した一般的方法により調製した0.14 g（0.41 mmol）の化合物ＩＩＩ、実施例４に記載した一般的方法により調製した0.55 g（2.06 mmol）の化合物ＸＩＶとともに、0.08 ml（0.49 mmol）のＡＩＢＮおよび0.005 g（0.033 mmol）のＴＥＭＥＤを組合せることにより、溶解した。溶液を3分間、ヘリウム散布により脱酸素化した。ヘッドスペースをアルゴンで置換し、容器を55℃で一夜加熱するために密封した。粘性溶液を15 mlのクロロホルムで稀釈し、次に、200 mlのジエチルエーテル中に注ぎ入れることにより沈澱させた。沈殿物を15 mlのクロロホルム中に溶解し、200 mlのエーテル中に再度沈澱させた。生成物を、真空炉中で30℃で乾燥させて、4.79 gの白色固体を得た。ＮＭＲ分析（ＣＤＣｌ3）は、2.81 ppmでのＮＯＳ基の存在を確証し、感光性基の担持は、1.1 mmolＢＢＡ／ポリマー1 gであると確定された。アリル−ＧＬＵ−ＮＯＳは、この反応では5.0 mol％の重合可能なモノマーで構成されており、化合物ＸＶを生じた。
【００８２】
実施例１６
ポリスチレン（ＰＳ）マイクロウエルプレート上での無作為フォトＰＡ−ポリＮＯＳ（化合物ＩＸ−Ｃ）と無作為フォトＰＡ−ポリＮＯＳ−ポリクアット（化合物ＸＩ）の比較
化合物ＩＸ−Ｃおよび化合物ＸＩを別々に、5 mg/mlで脱イオン水中に溶解させた。別々のウエル中に100μlの化合物ＩＸ−Ｃおよび化合物ＸＩを含有するＰＳプレート（ＰＳ、Medium Bind, Corning Costar, Cambridge, MA）を、Heraeus球（W.C. Heraeus GmbH, Hanau, Federal Republic of Germany）を含有するDymax灯（モデル番号ＰＣ−２、Dymax Corporation, Torrington, CT）で照明した。照明期間は、330〜340 nmの波長範囲で1〜2 mW/cm2の強度で1.5分間であった。次に、コーティング溶液を捨て、ウエルを2時間風乾した。次にプレートをさらに1分間照明した。被覆したプレートをすぐに用いて、2時間までの間密封パウチ中に保存したオリゴヌクレオチドを固定化した。
【００８３】
50塩基オリゴマー（-mer）捕獲プローブ5’−ＮＨ2−GTCTGAGTCGGAGCCAGGGCGGCCGCCAACAGCAGGAGCAGCGTGCACGG-3’（ＩＤ１）（Ｃ−１２スペーサーを含有する５’−アミン改質剤を用いて合成）を、10 pmol/ウエルで、37℃で１時間、50 mMリン酸塩緩衝液、ｐＨ8.5、1 mMＥＤＴＡ中のＰＳウエル中でインキュベートした。5’−ビオチン−CCGTGCACGCTGCTCCTGCTGTTGGCGGCCGCCCTGGCTCCGACTCAGAC-3’（ＩＤ３）検出プローブまたは非相補的5’-ビオチン−CGGTCCATGGAGCAGGAGGGGCCCGAGTATTGGGAGCGGGAGACACAGAA-3’（ＩＤ４）オリゴを用いて、以下のようにハイブリダイゼーションを実施したが、これらはともに、５’−ビオチン修飾を用いて合成された。
【００８４】
固定化捕獲プローブを有するプレートを、マイクロプレートオートウォッシャー（モデルＥＬ403Ｈ、Bio-Tek Instruments, Winooski, VT）を用いて、0.05％トゥイーン20を含有するリン酸塩緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ、10 mMＮａ2ＰＯ4、150 mMＮａＣｌ、ｐＨ7.2）で洗浄した。次に、5 XＳＳＣ（0.75 MＮａＣｌ、0.075 Mクエン酸塩、ｐＨ7.0）、0.1％ラウロイルサルコシン、1％カゼインおよび0.02％ドデシル硫酸ナトリウムからなるハイブリダイゼーション緩衝液を用いて、55℃で30分間、プレートを遮断した。検出プローブを捕獲プローブとハイブリダイズさせた場合、100μl中の50 fmolの検出プローブをウエル当たりで添加し、55℃で1時間インキュベートした。次にプレートを、0.1％ドデシル硫酸ナトリウムを含有する2 xＳＳＣで、55℃で5分間洗浄した。ストレプトアビジンおよびホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＳＡ−ＨＲＰ、Pierce, Rockford, IL）の複合体100μlを0.5μg/mlで添加し、37℃で30分間インキュベートすることにより、結合検出プローブを検定した。次にプレートをＰＢＳ／トゥイーンで洗浄し、その後、ペルオキシダーゼ基質（Ｈ2Ｏ2およびテトラメチルベンジジン、Kirkegard and Perry Laboratories, Gaithersburg, MD）を添加し、マイクロウエルプレート読取り機（モデル3550, Bio-Rad Labs, Cambridge, MA）で655 nmで測定した。10分にプレートを読み取った。
【００８５】
表１に列挙した結果は、化合物ＩＸ−Ｃで被覆したマイクロウエルプレートはアミン誘導化捕獲プローブを有効に固定化しなかったことを示す。しかしながら、コーティング剤として化合物ＸＩを比較すると、有意の結合および良好なハイブリダイゼーションシグナルを提供した。化合物ＩＸ−Ｃ試薬は最も、表面を不動態化し、捕獲オリゴの会合を防止すると思われた。これに対比して、化合物ＸＩを用いた場合、その後ＮＯＳ基と共有結合させ得るイオン相互作用により、オリゴヌクレオチドは表面に誘引された。
【００８６】
【表１】
0004768130.tif 000002
【００８７】
実施例１７
無作為フォトＰＡ−ポリＮＯＳ（化合物ＩＸ−Ｂ）および無作為フォトＰＡ−ポリクアット（化合物Ｘ−Ｂ）の混合物による種々のマイクロウエルプレートの被覆
5 mg/mlの化合物ＩＸ−Ｂおよび0.5 mg/mlの化合物Ｘ−Ｂの混合物を含有する被覆溶液を、脱イオン水中に調製した。実施例１６に記載したように、この混合物を用いて、ポリプロピレン（ＰＰ、Corning Costar, Cambridge, MA）、ＰＳ、ポリカーボネート（ＰＣ、Corning Costar, Cambridge, MA）およびポリビニルクロリド（ＰＶＣ、Dynatech, Chantilly, VA）マルチウエルを処理した。30-mer捕獲オリゴヌクレオチド5’-ＮＨ2−GTCTGAGTCGGAGCCAGGGCGGCCGCCAAC-3’（ＩＤ２）（Ｃ−１２スペーサーを含有する５’−アミン改質剤を用いて合成）を、0.03、0.1、0.3、1、3または10 pmol/ウエルで、４℃で一夜、インキュベートした。相補的ＩＤ３検出オリゴヌクレオチドまたは非相補的ＩＤ４オリゴを用いて、実施例１６に前記したように、ハイブリダイゼーションを実施した。ＰＰプレートは光学的に透明でないため、色原性基板を用いて20分間インキュベーション後、これらのウエルの内容物をＰＳウエルに移した。ＰＳプレート中で、ハイブリダイゼーションシグナルを測定した。他のプレートは、移すことなく、10分で読み取った。シグナルレベルは、異なる物質から作製された異なる形状のマイクロウエルのために、同一基板群内で比較可能であるだけである。表２はハイブリダイゼーションシグナルを列挙し、化合物ＩＸ−Ｂおよび化合物Ｘ−Ｂの混合物で被覆された種々のマイクロウエルプレートに適用されたハイブリダイゼーションシグナルの強度と捕獲プローブの量との間の関係を示す。ＰＰおよびＰＶＣプレート上では、プローブの吸着は非常に低く、高分子試薬による被覆はシグナルを劇的に改良した。シグナルは、被覆ウエルに添加される捕獲プローブの増大に伴って増大したが、しかし約3 pmol／ウエル捕獲ではレベルは水平に戻った。発生したシグナルの量のプラトーは、ハイブリダイゼーションの飽和レベルのためではなかったが、しかしむしろ比色検定における変色反応の限界のためであった。
【００８８】
オリゴヌクレオチド誘導体は、非被覆ＰＳおよびＰＣマイクロウエルプレート上に効率的に吸着し、特異的ハイブリダイゼーションシグナルを生じる。アミン官能化オリゴヌクレオチドは、未知のメカニズムにより、ポリスチレンマイクロウエルプレート上に申し分なく吸着した、とCros等（米国特許第5,510,084号）も報告した。しかしながら、異なるロット間では、非被覆ＰＳプレート上の吸着の量に顕著な変動性が認められる（Chevier et al. FEMS 10:245, 1995）。
【００８９】
【表２】
0004768130.tif 000003
【００９０】
実施例１８
ＰＰおよびＰＶＣマイクロウエルプレート上での終点ジフォトＰＡ−ポリＮＯＳ（化合物ＸＩＩ）および無作為フォトＰＡ−ポリクアット（化合物Ｘ−Ｂ）の評価
0.5 mg/mlの化合物ＸＩＩおよび0.5 mg/mlの化合物Ｘ−Ｂの混合物を含有する被覆溶液を、脱イオン水を用いて調製した。２つの試薬のこの混合物を用いて、実施例１６に記載したものに匹敵する条件下で、ＰＰおよびＰＶＣマイクロウエルプレートを被覆した。0.1 ml中の0.03、0.1、0.3、1、3または10 pmol/ウエルでの30-merＩＤ２捕獲オリゴヌクレオチドを,4℃で一夜インキュベートした。相補的ＩＤ３検出オリゴヌクレオチドまたは非相補的ＩＤ４オリゴを用いて、実施例１６に記載したように、ハイブリダイゼーションを実施した。表３に列挙したハイブリダイゼーションシグナルは、化合物ＸＩＩおよび化合物Ｘ−Ｂの混合物で被覆されたＰＰおよびＰＶＣマイクロウエルプレートに適用されたハイブリダイゼーションシグナルの強度と捕獲プローブの量との間の関係を示す。 シグナルは、被覆ウエルに添加される捕獲オリゴヌクレオチドの増大に伴って増大したが、しかし約１ pmol／ウエル捕獲ではレベルは水平に戻った。シグナル対ノイズ比（相補的対非相補的検出プローブからの）は、被覆ＰＰおよびＰＶＣ表面に関しては、それぞれ26および11という高い値であった。
【００９１】
【表３】
0004768130.tif 000004
【００９２】
実施例１９
無作為フォトＰＡ−ポリクアット（化合物Ｘ−Ｂ）およびＢＢＡ−ＡＵＤ−ＮＯＳ（化合物ＶＩＩＩ）を用いた逐次被覆
脱イオン水中0.1 mg/mlの化合物Ｘ−Ｂを、ＰＰおよびＰＶＣウエル中で20分間インキュベートした。ウエル中の溶液を用いて、1.5分間、実施例１６に前記したようにプレートを照明した。溶液を捨てて、ウエルを乾燥した。イソプロピルアルコール（ＩＰＡ）中0.5 mg/mlの化合物ＶＩＩＩを、化合物Ｘ−Ｂ被覆ウエル中で５分間インキュベートした。次に溶液を除去し、プレートを乾燥し、ウエルを乾燥後、1分間、実施例に記載したように照明した。0.1 ml中の0.03、0.1、0.3、1、3または10 pmol/ウエルでの30-merＩＤ２捕獲オリゴヌクレオチドを,4℃で一夜インキュベートした。相補的ＩＤ３検出オリゴヌクレオチドまたは非相補的ＩＤ４オリゴを用いて、実施例１６に記載したように、ハイブリダイゼーションを実施した。表４はハイブリダイゼーションシグナルを含有し、化合物Ｘ−Ｂで、その後化合物ＶＩＩＩで被覆されたＰＰおよびＰＶＣマイクロウエルプレートに適用されたハイブリダイゼーションシグナルの強度と捕獲プローブの量との間の関係を示す。 シグナルは、被覆ウエルに添加される捕獲プローブの増大に伴って増大したが、しかし約１ pmol／ウエル捕獲オリゴではレベルは水平に戻った。非被覆対照と比較した場合、シグナルは、被覆ＰＰおよびＰＶＣ表面に関しては、それぞれ29-および11-倍までの高い値であった。
【００９３】
【表４】
0004768130.tif 000005
【００９４】
実施例２０
無作為フォトＰＡ−ポリクアット（化合物Ｘ−Ａ）と無作為フォトＰＡ−ポリＮＯＳ（化合物ＩＸ−Ａ）および無作為フォトＰＡ−ポリクアット（化合物Ｘ−Ａ）の混合物との比較
0.5または0.1 mg/mlでの化合物Ｘ−Ａを、ＰＰマイクロウエル中で10分間インキュベートした。次に、実施例１６に記載したようにプレートを照明した。化合物ＩＸ−Ａおよび化合物Ｘ−Ａの混合物を含有する被覆溶液を、脱イオン水中5/0.5 mg/mlおよび0.5/0.1 mg/mlの2つの比の化合物ＩＸ−Ａ／化合物Ｘ−Ａを調製した。溶液をウエル中で10分間インキュベートし、ウエルを、実施例１６と同様に照明した。1 pmol/ウエルでの30-merＩＤ２捕獲オリゴヌクレオチドを、37℃で１時間インキュベートした。相補的ＩＤ３検出オリゴヌクレオチドまたは非相補的ＩＤ４オリゴを用いて、実施例１６に記載したように、ハイブリダイゼーションを実施した。表５に列挙した結果は、化合物ＩＸ−Ａおよび化合物Ｘ−Ａの組合せを含有するコーティングが、化合物Ｘ−Ａコーティング単独の場合と比較して、より高いシグナルを生じたことを示す。
【００９５】
【表５】
0004768130.tif 000006
【００９６】
実施例２１
被覆マイクロウエルプレート上の無作為フォトＰＡ−ポリＮＯＳ（化合物ＩＸ−Ｂ）および無作為フォトＰＡ−ポリクアット（化合物Ｘ−Ｂ）上の非修飾化オリゴヌクレオチド対アミン修飾化オリゴヌクレオチドの比較
化合物ＩＸ−Ｂ（5 mg/ml）および化合物Ｘ−Ｂ（5 mg/ml）の混合物を含有する被覆溶液を、脱イオン水中に調製して、ＰＰ、ＰＳおよびＰＶＣマイクロウエルプレートを被覆した。実施例１６に記載したように、溶液を約10分間インキュベートし、照明した。30-mer捕獲5’-ＮＨ2−TTCTGTGTCTCCCGCTCCCAATACTCGGGC-3’（ＩＤ５）オリゴヌクレオチドを、1 pmol/ウエルで、４℃で一夜、50 mMリン酸塩緩衝液、ｐＨ8.5，１mMＥＤＴＡ中のウエルと結合させた。相補的検出オリゴヌクレオチドＩＤ４または非相補的オリゴヌクレオチドＩＤ３を用いて、実施例１６に前記したようにハイブリダイゼーションを実施した。捕獲オリゴのアミン−官能基の作用を確定するために、非修飾化30-mer捕獲プローブ5’-TTCTGTGTCTCCCGCTCCCAATACTCGGGC-3’（ＩＤ６）（アミン含有せず）も、被覆された表面に添加して、検査した。表６に示した結果は、５’−アミン修飾を含有しないオリゴヌクレオチドを化合物ＩＸ−Ｂ／化合物Ｘ−Ｂ被覆表面上の捕獲プローブとして用いた場合、ハイブリダイゼーションシグナルはアミン修飾を含有する場合より30％低かった、ということを示す。
【００９７】
【表６】
0004768130.tif 000007
【００９８】
実施例２２
無作為フォトＰＡ−ポリＮＯＳ（化合物ＩＸ−Ａ）および無作為フォトＰＡ−ポリクアット（化合物Ｘ−Ａ）で被覆されたマイクロウエルプレート上のオリゴヌクレオチド担持密度
オリゴヌクレオチド担持密度を確定するために、そして比色検定系からの結果を立証するために、放射能標識検定を実施した。この実施例では、実施例１６と同様に、化合物ＩＸ−Ａおよび化合物Ｘ−Ａの組合せ被覆を、ＰＶＣウエルで実施した。ＩＤ２およびＩＤ５30-mer捕獲オリゴヌクレオチドを、被覆ウエル上で固定化した。放射能標識ＩＤ２プローブを用いて、ウエル表面の固定化捕獲オリゴヌクレオチドの担持密度を確定した。ＩＤ２と相補的であるがＩＤ５とは相補的でない放射能標識ＩＤ３検出プローブを用いて、固定化捕獲プローブのハイブリダイゼーション反応を測定した。メーカーの使用説明書にしたがって、オリゴヌクレオチドＩＤ２およびＩＤ３を、末端トランスフェラーゼ（Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN）およびα−32Ｐ−ｄｄＡＴＰ（3000 Ci/mmol, Amersham, Arlington Heights, IL）を用いて、３’末端を放射能標識した。32Ｐ−標識化ＩＤ２ならびに非標識化ＩＤ２およびＩＤ５捕獲プローブを、30 pmol／ウエルで被覆ウエル中で、室温で2.25時間インキュベートした。実施例１６と同様に、プレートを洗浄し、遮断した。
【００９９】
非標識化捕獲プローブを有するウエルを、ハイブリダイゼーション緩衝液中で55℃で1時間、32Ｐ−標識化ＩＤ３検出プローブとハイブリダイズした。32Ｐ−標識化捕獲プローブを含有するウエルを、ＩＤ３プローブを含有しないハイブリダイゼーション緩衝液中でインキュベートした。0.1％ＳＤＳを含有する2 xＳＳＣを用いて、55℃で5分間、３回、そしてＰＢＳ／0.05％トゥイーンで３回洗浄後、プレートを個々のウエルに切断して、テトラヒドロフラン中に溶解させた。Aquasol-2 Fluor（DuPont NEN, Boston, MA）でのシンチレーション計数により、各ウエル中の放射能の量を測定した。表７の結果は、化合物ＩＸ−Ａおよび化合物Ｘ−Ａはともに、捕獲プローブの良好な固定化を生じる必要があったことを示す。さらに、化合物ＩＸ−Ａおよび化合物Ｘ−Ａの濃度増大は、固定化された捕獲オリゴヌクレオチドの量を増大した。検査した最高濃度では、シグナル対ノイズ比は、3000対1より大きかった。
【０１００】
【表７】
0004768130.tif 000008
【０１０１】
実施例２３
無作為フォトＰＡ−ポリ第三アミン（化合物ＸＩＩＩ）、無作為フォトＰＡ−ポリＮＯＳ（化合物ＩＸ−Ａ）、ならびに無作為フォトＰＡ−ポリクＮＯＳ（化合物ＩＸ−Ａ）と無作為フォトＰＡ−ポリ第三アミン（化合物ＸＩＩＩ）の混合物間の比較
脱イオン水中0.02 mg/mlの化合物ＸＩＩＩを、ＰＰマイクロウエルプレート中で10分間インキュベートした。実施例１６に記載したようにウエルを照明した。化合物ＩＸ−Ａを、化合物ＸＩＩＩに関して記載したのと同様に、脱イオン水中に2 mg/mlでＰＰウエル上に被覆した。脱イオン水中の2 mg/mlの化合物ＩＸ−Ａおよび0.02 mg/mlの化合物ＸＩＩＩの混合物を含有する被覆溶液を調製し、化合物ＸＩＩＩに関して記載したように被覆した。5 pmol/ウエルでの30-merＩＤ２捕獲オリゴヌクレオチドを、37℃で１時間、各ウエル中でインキュベートした。相補的ＩＤ３検出オリゴヌクレオチドおよび非相補的ＩＤ４オリゴヌクレオチドを用いて、実施例１６に記載したように、ハイブリダイゼーションを実施した。ペルオキシダーゼ基質を用いた10分間インキュベーション後、各ウエルの内容物をＰＳウエルに移した。表８に列挙した結果は、化合物ＩＸ−Ａおよび化合物ＸＩＩＩの組合せが、化合物ＩＸ−Ａまたは化合物ＸＩＩＩコーティング単独の場合と比較して、より高いシグナルを生じたことを示す。
【０１０２】
【表８】
0004768130.tif 000009
【０１０３】
実施例２４
アミン誘導体化表面上での核酸配列の固定化
以下の方法により、本発明のコポリマーを調製する。アクリルアミド5.686 g（80.0 mmol）を100 mlのＤＭＳＯ中に溶解し、その後、実施例４に記載した一般的方法により調製した3.083 g（10.0 mmol）の化合物ＩＶ、および実施例１１に記載された一般的方法により調製した乾燥ＤＭＳＯ溶液として送達される2.207 g（10.0 mmol）のＭＡＰＴＡＣを溶解した。ＴＥＭＥＤ0.134 ml（0.89 mmol）およびＡＩＢＮ0.197 g（1.20 mmol）を混合物に添加し、系を5分間、ヘリウム散布により脱酸素化して、その後アルゴン散布をさらに5分間実施した。密封容器を55℃で加熱して重合を完了した。反応混合物を800 mlのジエチルエーテルに注ぎ、遠心分離して固体を分離することにより、ポリマーを単離した。生成物を200 mlのジエチルエーテルで、その後200 mlのクロロホルムで洗浄した。ポリマーを真空下で乾燥して、残りの溶媒を除去した。
【０１０４】
メタンおよびアンモニアガスの3:1混合物を用いてプラズマ処理することにより、ポリマー表面を誘導体化する（例えば、米国特許第5,643,580号に記載された一般的方法参照）。メタン（490 SCCM）およびアンモニア（161 SCCM）の混合物を、被覆されるポリマー部分と一緒にプラズマ小室中に導入する。気体を0.2〜0.3 トルに保持し、300〜500ワットグロー放電を小室内に確立する。試料を、これらの条件下で合計3〜5分間処理する。非被覆表面と比較した水接触角の低減により、アミン誘導体化表面の形成を立証する。
【０１０５】
アミン誘導体化表面を、50 mMリン酸塩緩衝液、ｐＨ8.5中の前記のポリマーの10 mg/ml溶液を用いて、室温で10分間インキュベートする。この反応時間後、被覆溶液を除去し、脱イオン水で表面を十分に洗浄し、十分乾燥させる。オリゴマー捕獲プローブの固定化およびハイブリダイゼーションを、実施例１６と同様に実施する。
【０１０６】
実施例２５
フォト−高分子ＮＯＳ被覆化ガラススライド上でのオリゴヌクレオチドの固定化およびハイブリダイゼーション−フォトＰＡポリクアット（化合物Ｘ−Ａ）を用いた場合と用いない場合のコーティングの比較
アセトン中に各々1％の、ｐ−トリルジメチルクロロシラン（Ｔ−シラン）およびＮ−デシルジメチルクロロシラン（Ｄ−シラン、United Chemical Technologies, Bristol, Pennsylvania）の混合物中に1分間浸漬することにより、ソーダ石灰ガラス顕微鏡スライド（Erie Scientific, Portsmouth, New Hampshire）をシラン処理した。風乾後、スライドを炉中で120℃で1時間硬化させた。次にスライドをアセトンで洗浄し、その後ＤＩ水に浸漬した。スライドをさらに炉中で5〜10分間乾燥させた。
【０１０７】
種々の濃度で、そして化合物Ｘ−Ａを用いて、または用いずに、化合物ＩＸ−Ａ、ＩＸ−ＤおよびＸＶをシラン処理スライド上に噴霧し、次に、湿潤し、水で洗浄し、乾燥させながら、これらをDymaxランプ（International Lightラジオメーター上で10 nmバンド通過フィルターを用いて335 nmで測定した場合、25 mjoule/cm2）を用いて照明した。オリゴヌクレオチド溶液を充填した内径0.006”盲端針を配置するためにＸ、Ｙ、Ｚ動作制御機を用いて、オリゴヌクレオチドをスライド上にプリントした。２つのオリゴヌクレオチドを調製スライドに固定化した。一方は３’末端にアミンを、そして５’末端にＣｙ３蛍光タグ（Amersham, Arlington Heights, Illinois）を含有する5’-Cy3-GTCTGAGTCGGAGCCAGGGCGGCCGCCAAC-NH2-3’（ＩＤ７）（アミノ改質剤はＣ１２スペーサーを有する）であり、他方は、５’末端にアミンを含有する5’-NH2-TTCTGTGTCTCCCGCTCCCAATACTCGGGC-3’（ＩＤ５）（アミノ改質剤はＣ１２スペーサーを有する）である。それらを10％硫酸ナトリウムおよび1 mMＥＤＴＡを含有する50 mMリン酸ナトリウム、ｐＨ8.5中に8 pmol/μlの濃度でプリントした。スライドを、75％の相対湿度を保持するために飽和塩化ナトリウムを入れた密封容器中で棚の上に一夜載せた。（ＩＤ７）でプリントされたスライドを次に、ＰＢＳ／0.05％トゥイーン20中で5分間、遮断緩衝液（10 Mmエタノールアミンを含有する0.2 Mトリス）中で50℃で90分間、そして洗浄緩衝液（5 xＳＳＣ、0.1％Ｎ−ラウリルサルコシンおよび0.1％ドデシル硫酸ナトリウム）中で2時間洗浄した。スライドを水で２回洗浄し、遠心分離器で回転させて、乾燥した。次に、General Scanning Scan-Array 3000蛍光スキャナー（Watertown, Massachusetts）を用いてそれらを走査し、その結果生じるスポットの平均強度を測定した。（ＩＤ５）でプリントされたスライドを、ＰＢＳ／0.05％トゥイーン20中で5分間、遮断緩衝液（10 Mmエタノールアミンを含有する0.2 Mトリス）中で50℃で30分間洗浄した。最後に水でスライドを洗浄し、遠心分離器で乾燥した。
【０１０８】
蛍光的標識化相補的オリゴヌクレオチド5’-Cy3-CGGTGGATGGAGCAGGAGGGGCCCGAGTATTGGGAGCGGGAGACACAGAA-3’（ＩＤ８）を、10μlのハイブリダイゼーション溶液（4 xＳＳＣ、0.1％Ｎ−ラウリルサルコシン、2 mg/mlｔＲＮＡ）をスライドに載せ、上にカバーガラスを載せることにより、スライドとハイブリダイズさせた。次にスライドを50℃高湿度（75％）に保持してハイブリダイゼーション溶液が乾燥するのを防止した。次にスライドを4 xＳＳＣ、50℃に予熱した2 xＳＳＣで２分間、2 xＳＳＣで２分間、次に0.1 xＳＳＣで各々２分間を２回ですすいた。スライドを遠心管中で回転乾燥させた。次に、General Scanning蛍光スキャナーを用いて、それらを走査した。その結果生じたスポットの平均強度およびバックグラウンドレベルを測定した。表９に列挙した結果は、化合物Ｘ−Ａを用いないコーティングはわずかに少ないオリゴヌクレオチドを固定化したが、蛍光オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションはわずかに高いシグナルを生じることを示す。その結果生じたバックグラウンドは、化合物Ｘ−Ａを含有しないコーティング上では少ない。ＰＶＰバックグラウンド化合物（即ち、化合物ＸＶ）を含有するポリマーはＤＮＡを固定化するのに有効であり、良好なハイブリダイゼーション結果を生じる、ということも示された。
【０１０９】
【表９】
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【０１１０】
実施例２６
オリゴヌクレオチド検出プローブを用いて被覆されたガラススライド上での固定化ＰＣＲ生成物のハイブリダイゼーション。無作為フォト−ＰＡ−ポリＮＯＳ（化合物ＩＸ−Ａ）、ならびに無作為フォトＰＡ−ポリクＮＯＳ（化合物ＩＸ−Ａ）と無作為フォトＰＡ−ポリクアット（化合物Ｘ−Ａ）の混合物間の比較
実施例２５に記載したように、ガラススライドをオルガノシランで被覆した。水中1.25 mg/mlの化合物ＩＸ−Ａまたは水中1 mg/ml化合物ＩＸ−Ａおよび0.25 mg/ml化合物Ｘ−Ａの混合物を、実施例２５に記載したように、シラン処理ガラススライド上に被覆した。
【０１１１】
β−ガラクトシダーゼからのＰＣＲ生成物は、ATG Laboratories, Inc.（Eden Prairie）により慣例的に調製された。センス鎖上の５’−アミン修飾を有するプライマーおよびアンチセンス鎖上の非修飾化プライマーを用いて、二本鎖ＰＣＲ生成物を0.5および1キロベース（kb）対長で調製した。アミンを含有しない対照ＤＮＡも作製した。80 mMリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ8.5および8％硫酸ナトリウム中の0.2μg/μlの濃度のＤＮＡを、TeleChem International（San Jose, CA）化Ｒのマイクロアレイングスポッティングプリントを用いて、活性化スライド上にプリントした。75％相対湿度を有する密封容器中で室温で一夜、カップリングを進行させた。
【０１１２】
マイクロアレイ上の固定化ＰＣＲ生成物からのシグナルを評価するために、スライドを沸騰水中に2分間入れて、二本鎖ＤＮＡを変性させて、非付着鎖を除去した。次にスライドを、0.1 Mトリス緩衝液、ｐＨ9中の50 mMエタノールアミンとともに50℃で15分間インキュベートして、表面の残留反応性基を遮断した。次にスライドを、カバーグラス下で50℃で15分間、予備ハイブリダイゼーション溶液とともにインキュベートして、非特異的バックグラウンドを低減した。予備ハイブリダイゼーション溶液は、5 XＳＳＣ、5 Xデンハード溶液（各々0.1 mg/mlのウシ血清アルブミン、フィコールおよびＰＶＰ）、0.1 mg/mlサケ精子ＤＮＡおよび0.1％ＳＤＳを含有した。次に、20 fmole/μlの蛍光相補的検出オリゴ5’-Cy3-ACGCCGAGTTAACGCCATCA（ＩＤ９）を用いて、予備ハイブリダイゼーション溶液中で、45℃で一夜、ハイブリダイゼーションを実施した。次に、実施例２５と同様に、スライドを洗浄し、ハイブリダイゼーションシグナルを走査した。
【０１１３】
表10に列挙した結果は、化合物ＩＸ−Ａ、ならびに化合物ＩＸ−Ａ／Ｘ−Ａの混合物で被覆されたガラススライドが匹敵するシグナルを有した、ということを示す。アミン含有ＰＣＲ生成物は、非修飾化ＤＮＡより少なくとも30倍高いハイブリダイゼーションシグナルを有した。非修飾化ＤＮＡに関する低レベルのシグナルは、おそらくは、活性化表面に対する複素環塩基上のアミン間の副反応のためであると思われた。
【０１１４】
【表１０】
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【０１１５】
実施例２７
オリゴヌクレオチド検出プローブを用いて被覆されたガラススライド上での固定化ＰＣＲ生成物のハイブリダイゼーション−SurModicsおよびその他の市販スライド間の比較
ｃＤＮＡからのＰＣＲ生成物は、正に荷電したガラス表面、例えばポリリシンに付着させることができる（DeRisi, et al., Science, 278, 680-686, 1997）。アルデヒド基を有する共有的アプローチは、Schena（Schena et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 10614-10619）により報告されている。本実施例では、ＰＣＲ生成物をそれらの表面に付着させ、ハイブリダイゼーションシグナルを本発明からのコーティングと比較した。SurModicsガラススライドを、実施例２５に記載したように、化合物ＩＸ−Ａおよび化合物Ｘ−Ａの混合物で被覆した。アミン−官能化ＤＮＡを固定化するために反応性アルデヒド基を有するシリル化ガラススライドは、CEL Associates, Inc.（Houston, TX）により製造された。ポリリシンガラススライドは、Sigmaから購入した。
【０１１６】
50 mMリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ8.5、1 mMＥＤＴＡおよび3％硫酸ナトリウム中の1.5 pmol/μlのβ−ガラクトシダーゼからの1 kb長のＰＣＲ生成物を、実施例２５に記載した内径0.006”針を用いて、シリル化スライド、ポリリシンスライドおよびSurModics被覆スライド上にプリントした。次に、 SurModicsスライドを75％相対湿度小室で2日間インキュベートして、沸騰水浴中に2分間浸すことにより変性させて、10 mMエタノールアミン、0.2 Mトリス、ｐＨ8.5を用いて、50℃で30分間遮断した。シリル化スライドを、メーカーの示唆通りに、加湿インキュベーター中で4時間インキュベートして、次にホウ水素化ナトリウムで還元した。ポリリシンスライドを、文献に記載されている通りに、ＵＶ架橋し、次に無水コハク酸で遮断した。処理スライドはすべて、4 xＳＳＣ中の20 fmol/μlの相補的検出オリゴヌクレオチドＩＤ９、2mg/mlｔＲＮＡ、0.1％ラウロイルサルコシンとともに、45℃で一夜ハイブリダイズした。実施例２５と同様に、スライドを洗浄し、ハイブリダイゼーションシグナルを走査した。
【０１１７】
結果を以下の表１１に示す。シリル化およびポリリシンスライド上でのアミン修飾化ＤＮＡと非修飾化ＤＮＡとの間にシグナルの差異は認められなかった。SurModicsコーティングのみが、特異的付着はＰＣＲ生成物上に５’−アミンを有するためである、ということを実証した。これは、SurModicsコーティングに関する1 kbまでのＤＮＡの終点付着の証拠を提供する。ポリリシンスライドは、おそらくは表面のＤＮＡのイオンおよび／または非特異的結合のためと思われる、最高のバックグラウンドを有した。
【０１１８】
【表１１】
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【０１１９】
実施例２８
フォト−高分子ＮＯＳ被覆化ガラススライド上のｃＤＮＡ検出プローブを用いたＰＣＲ生成物の固定化およびハイブリダイゼーション
実施例２６に記載したように、２組のスライドを調製した。前方、逆行またはいずれでもない鎖上にアミンを含有する３つのＰＣＲ生成物配列（Ｆ１１，ＸＥＦ、ｄａｆと呼ばれる）（Axys Pharmaceuticals, La Jolla, Californiaにより提供された）を、プリント緩衝液（80 ng/μl）中に溶解し、100℃に加熱し、氷上で冷却して、第二世代Arrayer（Molecular Dynamics, Sunnyvale, California）を用いてスライド上にプリントした。
【０１２０】
実施例２５と同様に一夜インキュベーション後、スライドを沸騰水中に2分間入れて、ＰＢＳ／0.05％トゥイーン20で２回洗浄し、水で2回すすぎ、遮断緩衝液中に50℃で30分間入れた。次にスライドを水ですすぎ、回転乾燥させた。スライドを実施例２６と同様に予備ハイブリダイズして、50％ホルムアミド、5 x ＳＳＣ、0.1％ＳＤＳおよび0.1 mg/mlサケ精子ＤＮＡ中の蛍光的（Ｃｙ３）標識化ｃＤＮＡ（Axys Pharmaceuticals提供）の混合物と、42℃で一夜、ハイブリダイズさせた。この混合物は、３つのＰＣＲ生成物標的の前方鎖に対する相補的プローブを含有した。Ｆ１１プローブを、他の２つの配列と比較して、1〜50,000質量比でスパイクした。ハイブリダイゼーション後、実施例２５と同様に、スライドを洗浄し、走査した。スポットの平均強度を表１２に示す。Ｆ１１プローブを含有しなかったｃＤＮＡプローブ混合物とハイブリダイズさせたスライドは、これらのスポット中にシグナルを示さなかった。結果は、いずれのコーティングの種類も、匹敵するハイブリダイゼーション結果を生じる、ということを示す。化合物Ｘ−Ａを含有するコーティングは、非常に高いバックグラウンドを有した。これは、ＰＣＲ生成物がプリントされた場所に近い領域で特に言えることであった。
【０１２１】
【表１２】
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【０１２２】
表１３：化合物
【０１２３】
【化１】
0004768130.tif 000014
【０１２４】
【化２】
0004768130.tif 000015
【０１２５】
【化３】
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【０１２６】
【化４】
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【０１２７】
【化５】
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【０１２８】
【化６】
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【０１２９】
【化７】
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