(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
上面と底面をもつ筒状に形成され、内部の底部に固体試料を収容するための反応室を基体内に備えたマイクロ反応装置において、
前記反応室は、
前記上面に配置されて前記反応室内に試薬を導入する少なくとも１個の試薬導入口と、
前記反応室内にバッファ流体を導入する３個以上のバッファ導入口であって、該バッファ導入口は前記上面で前記試薬導入口を取り囲むように配置されているバッファ導入口と、
底隅部に配置されて前記反応室内の液を外部に排出する複数個の液排出口と、
を備えていることを特徴とするマイクロ反応装置。
【請求項２】
バッファ導入口は試薬導入口を中心とする１つの円周上に等間隔に配置されている請求項１に記載のマイクロ反応装置。
【請求項３】
液排出口は３個以上設けられている請求項１又は２に記載のマイクロ反応装置。
【請求項４】
液排出口は前記底隅部に等間隔に配置されている請求項３に記載のマイクロ反応装置。
【請求項５】
反応室は円筒状である請求項１から４のいずれか一項に記載のマイクロ反応装置。
【請求項６】
反応室の底部は、底面と、底面から間隔をもって設けられ試料を保持する底板とからなる二重構造になっており、
前記底板には保持しようとする試料よりも小さい孔が複数あけられ、液排出口が前記底板よりも下側に設けられており、反応室内に導入された試薬とバッファ流体が前記底板の孔を通って液排出口から排出される請求項１から５のいずれか一項に記載のマイクロ反応装置。
【請求項７】
反応室の底部に複数個の試料が保持され、バッファ導入口のそれぞれから導入されるバッファ流体の流量が調整されることにより試薬導入口から導入される試薬の流れ方向が制御されて複数個の試料の一部に選択的に作用させられる請求項１から６のいずれか一項に記載のマイクロ反応装置。
【請求項８】
反応室内に保持される試料は生体細胞である請求項１から７のいずれか一項に記載のマイクロ反応装置。
【請求項９】
バッファ導入口のそれぞれに接続され、導入するバッファ流体の流量を調整することのできるバッファ流体導入機構をさらに備えた請求項１から８のいずれか一項に記載のマイクロ反応装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微小な反応室内に保持された固体試料に試薬を作用させるためのマイクロ反応装置に関し、例えば細胞組織等の生体試料の一部分に選択的に薬剤を導入し、その反応を観察することにより、細胞組織の機能や薬剤の効用を解析するためのマイクロ細胞解析装置などのマイクロ反応装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
これまでに、細胞に薬剤を与え、その反応を測定するための、ＭＥＭＳ（Micro Electro Mechanical System：超小型電気的機械的システム）技術等を用いて作製された微小流体デバイスが報告されている（非特許文献１〜４参照。）。
これらのデバイスを用いることで、少量の細胞の分析や、薬剤のハイスループットスクリーニングを実現することができる。
【０００３】
これら従来のデバイスは２つの種類に分類することができる。一方は非特許文献１，２のような、細胞１個ずつの反応を分析することを目的としたデバイス、他方は非特許文献３，４のような複数の細胞、例えば組織としての機能をもった細胞の反応を分析することを目的としたデバイスである。
【非特許文献１】A. Tixier, et al. Micro Total Analysis Systems 2000, pp123-126 (2000)
【非特許文献２】Kwang-Seok Yun, et al. Micro Total Analysis Systems 2002, pp652-654 (2002)
【非特許文献３】Sensors and Actuators A, Vol.114, pp129_134(2004)
【非特許文献４】Kwang-Seok Yun, et al. Micro Total Analysis Systems 2003, Vol. 1, pp861-864 (2003)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上に述べた従来の２種類の細胞分析用微小流体デバイスは、それぞれ異なった利点と問題点を有する。
まず、１個の細胞の反応を分析することを目的としたデバイスでは、細胞1個に選択的に薬剤を反応させることができる一方で、細胞組織としての機能を解析することができない。例えば、肝細胞等は細胞１個では本来の機能を発現することができないため、実際に生体内で発現している機能を解析することが困難である。
【０００５】
一方、複数の細胞の反応を分析することを目的としたデバイスでは、薬剤を特定の細胞や部位に選択的に反応させることが困難である。反応室に薬液を導入した場合、反応室全体に薬液が行き渡るため、組織全体に薬液が反応することになる。組織としての細胞の反応は、ある細胞が試薬に反応し、その細胞が生成する物質が他の細胞に働きかけ、さらにその細胞が新たな物質を生成するといった、細胞の相互作用が重要とされている。そのため、詳細な細胞組織の機能を解析するためには、その相互作用のパス（道筋）を解明することが重要であり、そのためには、細胞組織のある特定の細胞や部位に、選択的に薬剤を反応させることが必要である。
【０００６】
このような事情は、測定対象が細胞である場合に限らず、他の固体状の試料を対象とする場合に一般に存在する。
そこで本発明は、反応室内の複数の固体試料の一部分に選択的に薬剤を反応させることができるマイクロ反応装置を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明のマイクロ反応装置は、上面と底面をもつ筒状に形成され、内部の底部に固体試料を収容するための反応室を基体内に備えたものであり、反応室は、上面に反応室内に試薬を導入する試薬導入口と反応室内にバッファ流体を導入する複数個のバッファ導入口とを備え、底隅部に反応室内の液を外部に排出する複数個の液排出口を備えていることを特徴とするものである。
【０００８】
試薬導入口は反応室の上面の中央に配置され、バッファ導入口は３個以上が試薬導入口を取り囲むように配置されていることが好ましい。さらに好ましくは、バッファ導入口は試薬導入口を中心とする１つの円周上に等間隔に配置されている。
液排出口も３個以上設けられていることが好ましい。さらに好ましくは、液排出口は反応室底隅部に等間隔に配置されている。
【０００９】
反応室の形状の好ましい一例は円筒状である。
反応室の好ましい一例では、底部は底面と、底面から間隔をもって設けられ試料を保持する底板とからなる二重構造になっており、その底板には保持しようとする試料よりも小さい孔が複数あけられ、液排出口が底板よりも下側に設けられているものである。その場合、反応室内に導入された試薬とバッファ流体が底板の孔を通って液排出口から排出されるようになる。
【００１０】
本発明のマイクロ反応装置の使用方法では、反応室の底部に複数個の試料が保持され、バッファ導入口のそれぞれから導入されるバッファ流体の流量が調整されることにより試薬導入口から導入される試薬の流れ方向が制御されて複数個の試料の一部に選択的に作用させられる。
【００１１】
本発明のマイクロ反応装置で反応室内に保持される試料は、特に限定されるものではないが、好ましい例は生体細胞である。
本発明のマイクロ反応装置は、バッファ導入口のそれぞれに接続され、導入するバッファ流体の流量を調整することのできるバッファ流体導入機構をさらに備えたものとすることもできる。
【００１２】
図１に本発明のマイクロ反応装置の構成を概略的に示す。図１（Ａ）は概略的な透視図、図１（Ｂ）は（Ａ）Ａ−Ａ線位置での断面図である。
反応室２は基体内に上面４と底面をもつ筒状に形成され、内部の底部６に固体試料８を収容する。上面４には反応室２内に試薬を導入する試薬導入口１０と反応室２内にバッファ流体を導入する複数個のバッファ導入口１２が設けられている。さらに反応室上部に分析対象となる試料を導入するための、試料導入口１３が設けられている。底部６にはその隅部に反応室２内の液を外部に排出する複数個の液排出口１４が設けられている。
【００１３】
試薬導入口の数と位置も特に限定されるものではないが、ここでは、上面の中央に1個配置されている。バッファ導入口１２の数と位置は特に限定されるものではないが、ここでは上面の中央に配置された試薬導入口１０を取り囲むように４つのバッファ導入口１２が配置されている。反応室２の底部構造は、これも限定されるものではないが、ここでは底部６は、底面６ａと、底面６ａから間隔をもって設けられ試料８を保持する底板６ｂとからなる二重構造になっており、底板６ｂは保持しようとする試料８よりも小さい孔が複数あけられたメッシュ構造となっており、その上に分析対象となる細胞などの試料８が保持され、反応や培養が行なわれる。液排出口１４は底板６ｂよりも下側に設けられており、反応室２内に導入された試薬とバッファ流体が底板６ｂの孔を通って液排出口１４から排出されるようになっている。
【００１４】
しかしながら、本発明は底板６ｂがなく、試料８が底面６ａ上に保持される反応室のものも含んでいる。
またここでは反応室上部に試料導入口１３を備えているが、分析対象となる試料が試薬導入口１０やバッファ導入口１３よりも小さい物体であれば、予めいずれかの導入口から反応室に導入することが可能であるため、必ずしも試料導入口は必要ではない。
【００１５】
このようなマイクロ反応装置を細胞培養に使用する場合を取り上げると、反応室２内に試料として複数個の細胞８を保持し、試薬導入口１０から試薬を、バッファ導入口１２からバッファ液を同時に導入する。図１（Ｂ）に示されるように、試薬流１０ａはバッファ流１２ａに囲まれた状態で反応室底部６、すなわち分析対象となる細胞８に到達する。試薬流１０ａがバッファ流１２ａに囲まれた状態で流れるため、試薬は反応室２の全体に広がることなく、反応室底部６の一部、すなわち複数の細胞８の一部にのみ試薬流が到達する。
【００１６】
試薬流１０ａの流れの方向は、複数（この場合は４つ）のバッファ導入口１２から導入されるバッファ流１２ａの流量バランスを調節することで制御することができる。
上に述べたように、試薬導入口１０の周囲にバッファ導入口１２を配置し、試薬流１０ａを取り囲むように制御された流量でバッファ流１２ａを流すことで、反応室２内の複数の細胞８のうちの一部分に試薬を反応させることができるようになる。
このような動作は試料が細胞である場合に限らず、他の固体試料である場合でも同様である。
【発明の効果】
【００１７】
本発明のマイクロ反応装置では、反応室の上面に試薬導入口と複数個のバッファ導入口を設け、底隅部に複数個の液排出口を設けたので、反応室内の底部に保持された複数個の固体試料の特定の部位に選択的に試薬を反応させることができるようになる。これにより、例えば細胞組織の特定の部位に薬液を反応させ、その反応を測定することなどができるようになる。
【００１８】
試薬導入口を上面の中央に配置し、３個以上のバッファ導入口を試薬導入口を取り囲むように配置することによりバッファ流による試薬流の方向制御を広い範囲で行なうことができるようになる。
さらにバッファ導入口を試薬導入口を中心とする１つの円周上に等間隔に配置するようにすれば、バッファ流による試薬流の方向制御を広い範囲で均等に行なうことができるようになる。
【００１９】
液排出口も３個以上とすることにより、バッファ流による試薬流の方向制御を広い範囲で行なうことができるようになる。
さらに液排出口を底隅部に等間隔に配置するようにすれば、バッファ流による試薬流の方向制御を広い範囲で均等に行なうことができるようになる。
反応室の形状を円筒状とすれば、バッファ流による試薬流の方向制御が容易になる。
【００２０】
底部構造を、底面と、底面から間隔をもって設けられた孔あき底板とからなる二重構造として試薬とバッファ流体が底板の孔を通って液排出口から排出されるようにすれば、底板上に保持された試料の一部に選択的に試薬を供給するのが容易になり、反応室内での流体試薬の流れの制御性を向上させることができる。
この反応装置にバッファ流体導入機構をさらに備えておけば、この反応装置による反応制御を容易に実施することができるようになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明の実施例を図面に基づいて説明する。
図２に一実施例のマイクロ反応装置を示す。（Ａ）は概略透視図、（Ｂ）は上面図、（Ｃ）は下面図である。
ここでは、試料として細胞を測定するものとする。細胞８に試薬を反応させ、分析をおこなう反応室２は細胞培養室であり、円筒状の形状をしている。反応室２の上面４に試薬導入口１０及びそれを取り囲むように８つのバッファ導入口１２が配置されている。試薬導入口１０は上面４の中央に配置され、８つのバッファ導入口１２は試薬導入口１０を中心とする１つの円周上に等間隔に配置されている。反応室の上部には、分析対象となる試料を導入するための、試料導入口を備えている。
【００２２】
一方、反応室２の底部６には、試薬及びバッファを排出するための８つの液排出口１４が配置されている。液排出口１４は底部６の円形の隅部に沿って等間隔に配置されている。
分析対象となる複数の細胞８は反応室２に導入され、反応室２の底面上に保持されている。
【００２３】
細胞に反応させるための試薬は試薬導入口１０から導入され、同時に各バッファ導入口１２からバッファが導入される。このとき各バッファ導入口１２から供給するバッファ流量バランスを調整することで、反応室２内での試薬の流れの方向を制御することができる。
【００２４】
試薬導入口１０からの試薬導入とバッファ導入口１２からのバッファ導入には、送液ポンプを使用してそれぞれ独立して流量を制御するようにすればよい。また、試薬を収容した容器をチューブを介して試薬導入口１０に接続し、バッファを収容した容器をチューブを介してバッファ導入口１２に接続し、それらの容器を保持する高さを調整することにより流量を制御するようにしてもよい。
【００２５】
試薬導入口１０から導入された試薬はバッファ流に取り囲まれながら、反応室２底面の一部の細胞８に達する。各バッファ流導入口１２からのバッファ流量を制御することで、試薬の流れ方向を制御できるため、結果として、試薬が到達する底面での位置を制御することが可能であり、つまり、ターゲットとする一部の細胞８に選択的に試薬を到達させることができる。
【００２６】
このとき、反応室２から排出される試薬とバッファの流れも試薬流の方向を決定する重要な要素となっている。例えば、液排出口１４が反応室２の底面に1箇所しかない場合、反応室２に導入されたバッファと試薬は必ずその1箇所の液排出口１４へと流れるため、バッファ流量を調整することにより試薬導入口１０から導入される試薬の流れを制御したとしても、結局はその一箇所の液排出口１４に到達してしまう。結果として、バッファ流による試薬流れの制御性が大きく損なわれてしまう。しかしながら、本実施例では、液排出口１４を反応室２の底隅部に放射状に配置することで、このような欠点をなくしている。
【００２７】
図３に、本実施例における試薬導入の様子について、コンピュータ解析を行った結果を示す。コンピュータ解析にはCoventor社の解析ツール、Coventor  Wareを用いた。
解析条件として、試薬にはローダミンＢ水溶液、バッファには純水の物性値を用いた。
【００２８】
（Ａ）は反応室２の外形を示したものであり、各部の寸法の一例を示すと、反応室２は直径が１０００μｍ、高さが１４０μｍの円筒状であり、試薬導入口１０は半径２０μｍ、バッファ導入口１２は半径５０μｍ、試薬導入口１０とバッファ導入口１２の距離は１５０μｍである。
その場合の解析結果を（Ｂ），（Ｃ）に示す。（Ｂ）は反応室２の底面での試薬濃度分布、（Ｃ）は反応室２の断面での試薬濃度分布を示している。
【００２９】
（Ｂ）の結果から、反応室２の底面の一部の領域にのみ試薬が到達していることが分かる。また（Ｃ）の結果から、バッファ流の流量差により試薬流量の流れの方向が反応室２の中央から図で右側に偏っていることが分かる。
これらの結果から、本実施例の反応装置を用いることにより、反応室２の底面の一部分に選択的に試薬を到達させることが可能であることが分かる。
【００３０】
本実施例の反応装置を上に示した寸法で作製し、底面を透明ガラス製として、図４のように、底面側から蛍光顕微鏡（及び共焦点蛍光顕微鏡）２０により観察した。試薬にはローダミンＢ水溶液、バッファには純水を用いた。
【００３１】
底面上における試薬の流れは、図５に示されるようにバッファ流の流量調整により任意の方向に制御することができる。また、深さ方向の試薬の流れも図６に示されるように一方に偏っている。このように、実際に反応装置を作製した結果と図３に示したコンピュータ解析によりシミュレーション結果はよい一致を示している。
【００３２】
図４のような観察系は、例えば細胞によるタンパク質産生の様子を、蛍光異方性を利用して、例えば蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）法や蛍光異方性分析（Fluorescent Anisotropy Analysis）法を利用して、共焦点蛍光顕微鏡によりリアルタイムで観察できる測定装置として利用することができる。
【００３３】
本発明の他の実施例として、上述した構造とは異なった、図７に示すような構造をあげることができる。図７の実施例は、本発明を概略的に示すものとして説明した図１の反応装置の構造である。
図２の実施例と異なる点は、反応室２の底部６が底面６ａと、底面６ａから間隔をもって設けられ細胞などの試料８を保持する底板６ｂとからなる二重構造になっており、底板６ｂは保持しようとする試料８よりも小さい多数の細孔をもつメッシュ構造となっている点である。液排出口１４は底板６ｂの下側に形成されている。
【００３４】
上述した構造は1個の試薬導入口１０を備えているが、さらに他の実施例としては、試薬導入口１０を複数備えることで、複種類の試薬を反応室２に導入することができる。さらには、それぞれの試薬導入口１０の周囲にバッファ導入口１２を配置することで、おのおのの試薬の流れの方向を制御することが可能となる。
【００３５】
この反応装置を細胞培養室として使用すると、反応室２に供給された試薬とバッファは底板６ｂの細孔を通り抜けて、底板６ｂから下側に排出される。分析対象となる試料の細胞８は、培養室底部でメッシュ構造の底板６ｂ上で培養される。この構造を用いることで、試薬とバッファの流れが培養室底面６ａによる影響を受けにくいので、試薬の流れの制御性をより向上させることが可能となる。
【００３６】
次に、図８により図２の実施例の製造方法を説明する。
反応室２、その上面に設けられる試薬導入口１０及びバッファ導入口１２、並びに反応室２の底部に設けられる液排出口１４はシリコン基板にフォトリソグラフイーとＩＣＰ−ＲＩＥ（誘導結合プラズマ型反応性イオンエッチング）により形成する。
（Ａ）厚さが２００μｍのシリコン基板３０を用い、その両面にドライエッチング時のマスクとなるシリコン酸化膜３２を熱酸化により１μｍの厚さに形成する。
【００３７】
（Ｂ）シリコン酸化膜３２上に両面アライナーを用いたフォトリソグラフイーによりレジストパターンを形成し、そのレジストパターンをマスクとしてフッ酸を用いた酸化膜エッチングにより、シリコン酸化膜３２をパターニングする。これにより、シリコン基板３０の上面では試薬導入口及びバッファ導入口形状を決定する酸化膜パターン３２ａ（平面図は図（Ｂ−１）参照。）を形成し、シリコン基板３０の下面では反応室形状及び液排出口１４とそれにつながる流路を形成するための酸化膜パターン３２ｂ（平面図は図（Ｂ−２）参照。）を形成する。
（Ｃ）シリコン基板の下面に両面アライナーを用いたフォトリソグラフイーにより、反応室形状を形成するためのレジストパターン３４（平面図は図（Ｃ−１）参照。）を形成する。
【００３８】
（Ｄ）シリコン基板３０の下面側のフォトレジストパターン３４をマスクにしてシリコン基板３０をＩＣＰ−ＲＩＥを用いて５０μｍの深さにドライエッチングを行ない、反応室２の一部を形成する。
【００３９】
（Ｅ）シリコン基板下面のフォトレジスト３４を、硫酸と過酸化水の混合液で除去したのち、シリコン基板３０の上面及び下面の側の酸化膜パターン３２ａをマスクにして、シリコン基板３０をＩＣＰ−ＲＩＥを用いてドライエッチングし、基板上面には試薬導入口１０及びバッファ導入口１２を、基板下面には液排出口１４を形成する。エッチング深さはそれぞれ５０μｍである。
【００４０】
（Ｆ）シリコン基板３０の両面のシリコン酸化膜３２を除去する。
（Ｇ）このように形成されたシリコン基板３０の下面にガラス基板３６を陽極接合する。シリコン基板と陽極接合するガラス基板としては、パイレックスガラス（登録商標）などのホウケイ酸ガラスが好ましい。
【００４１】
シリコン基板とガラス基板の接合は上の方法に限らない。シリコン基板３０の両面にシリコン酸化膜３２が残っている状態で、又は再度シリコン酸化膜を形成した後に、フッ酸による接合を行うこともできる。この場合のガラス基板は特に種類を限定されるものではなく、石英ガラスなど、種々のガラスを使用することができる。
さらに、接着剤を使用してシリコン基板とガラス基板を接合してもよい。
【００４２】
図７の実施例の反応装置を製造する方法を図９により説明する。
（Ａ）図８の製造方法と同様に、厚さがシリコン基板３０を用い、その両面にドライエッチング時のマスクとなるシリコン酸化膜３２を熱酸化により形成する。
【００４３】
（Ｂ）シリコン酸化膜３２上に両面アライナーを用いたフォトリソグラフイーによりレジストパターンを形成し、そのレジストパターンをマスクとしてフッ酸を用いた酸化膜エッチングにより、シリコン酸化膜３２をパターニングする。これにより、シリコン基板３０の上面では試薬導入口及びバッファ導入口形状を決定する酸化膜パターン３２ａ（平面図は図（Ｂ−１）参照。）を形成し、シリコン基板３０の下面では反応室形状を決定する酸化膜パターン３２ｂ（平面図は図（Ｂ−２）参照。）を形成する。
【００４４】
（Ｃ）上面側及び下面側のシリコン基板３０の酸化膜パターン３２ａをマスクにしてシリコン基板３０をＩＣＰ（誘導結合プラズマ）−ＲＩＥを用いてドライエッチングし、基板上面側には試薬導入口１０及びバッファ導入口１２となる貫通孔を、基板下面側には反応室２を形成する。
【００４５】
（Ｄ）シリコン基板３０の両面のシリコン酸化膜３２を除去する。
（Ｅ）メッシュ構造の底板６ｂと、平坦なガラス基板３６ａを用意しておく。底板６ｂとしては、例えば厚さが１００μｍ程度のガラス基板にドライエッチングにより多数の細孔を形成してメッシュ構造としたものを使用することができる。ガラス基板３６ａにはドライエッチング法により底部となる円形の凹部と、その凹部の周囲に液排出口１４となる溝を形成しておく。その凹部の底面が反応室の底面６ａとなる。
そして、シリコン基板３０の下面に底板６ｂを上に記載した方法により接合する。その後、底板６ｂ上にガラス基板３６ａをその凹部が内側になるように接合する。底板６ｂとガラス基板３６ａの接合は例えばフッ酸を用いて行うことができる。
【００４６】
製造方法で示した寸法や材質は一例であり、これに限定されるものではない。
また上述した実施例では、細胞を分析対象としているが、応用用途としては細胞分析に限ったものではなく、ある特定の部位にのみ流体試薬を反応させることを目的とした用途であれば応用可能である。
【産業上の利用可能性】
【００４７】
本発明は細胞を初めとする種々の固体試料の一部に選択的に試薬を作用させて反応を生じさせる微小な反応装置として利用することができ、例えば細胞培養装置などとして利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】本発明のマイクロ反応装置の構成を概略的に示す図であり、（Ａ）は透視図、（Ｂ）は（Ａ）Ａ−Ａ線位置での断面図である。
【図２】一実施例のマイクロ反応装置を示す図であり、（Ａ）は概略透視図、（Ｂ）は上面図、（Ｃ）は下面図である。
【図３】同実施例における試薬導入の様子のコンピュータ解析を示す図であり、（Ａ）は反応室の外形を示す斜視図、（Ｂ）は反応室の底面での試薬濃度分布、（Ｃ）は反応室の断面での試薬濃度分布を示している。
【図４】同実施例における蛍光顕微鏡及び共焦点蛍光顕微鏡による観察方法を示す断面図である。
【図５】蛍光顕微鏡により底面上における試薬の流れを観察した結果を示す画像である。
【図６】共焦点蛍光顕微鏡により深さ方向の試薬の流れを観察した結果を示す画像である。
【図７】他の実施例のマイクロ反応装置を示す図であり、（Ａ）は概略透視図、（Ｂ）は断面図である。
【図８】図２の実施例のマイクロ反応装置を製造する方法を示す工程端面図である。
【図９】図７の実施例のマイクロ反応装置を製造する方法を示す工程端面図である。
【符号の説明】
【００４９】
２      反応室
４      上面
６      底部
６ａ      底面
６ｂ      底板
８      試料
１０      試薬導入口
１０ａ    試薬流
１２      バッファ導入口
１２ａ    バッファ流
１４      液排出口
【図１】
0004672511.tif 000002
【図２】
0004672511.tif 000003
【図３】
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【図４】
0004672511.tif 000005
【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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