(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的細菌細胞および非標的グラム陰性細菌細胞の混合集団における非標的グラム陰性細菌細胞の増殖を選択的に阻害する方法であって、
（ａ）混合集団と、毒性成分に連結されたキャリア成分を含む選択剤とを接触させる工程であって、選択剤が、切断可能なペプチド結合によって毒性成分に連結されたアミノ酸残基を含み；毒性成分が、１−アミノアルキルホスホン酸またはその塩を含み；選択剤が、非標的細胞内に進入可能であり、同細胞内で切断可能なペプチド結合が切断されて毒性成分を放出し、非標的細胞に対する毒性作用を示すことで、非標的細胞の増殖阻害を生じさせるが、これに対して、選択剤が標的細胞内に毒性濃度にまでは蓄積不可能であり、かつ／または切断可能なペプチド結合は標的細胞内では切断されず、かつ／または毒性成分は、選択剤から放出された場合、標的細胞に対する毒性作用を示さない工程と、
（ｂ）標的細胞の増殖を可能にする条件で細胞を培養する工程とを含む、方法。
【請求項２】
毒性成分が、選択剤から放出されると、大きい電荷密度（すなわち、負のｌｏｇ［オクタノール／水の分配係数］）を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
非標的細胞が、切断可能なペプチド結合を切断可能なペプチダーゼを有し、かつそのようなペプチダーゼが標的細胞には存在しない、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
選択剤がアミノ酸残基および／またはアミノ酸残基アナログを含む、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
毒性成分がＣ１−４アルキル基を含む、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
毒性成分が、アミノエチルホスホン酸またはその塩である、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
キャリア成分が、Ｌ−アラニン残基またはＬ−ピログルタミン酸残基である、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
標的細胞がサルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．）であり、非標的細胞が大腸菌および／または他のコリネ型細菌である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
選択剤は、培地に含まれると、非標的細胞の増殖を阻害するが、ストレス下または非ストレス下のいずれでも標的細胞に対しては本質的に非阻害性である、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
非標的グラム陰性細菌細胞および標的細菌細胞の混合集団において非標的グラム陰性細菌細胞を選択的に阻害するための培地と、請求項１〜９のいずれかに記載の方法を行うための説明書とを含む、請求項１〜９のいずれかに記載の方法に使用されるキットであって、
培地が、毒性成分に連結されたキャリア成分を含む選択剤を含み；
選択剤が、切断可能なペプチド結合を介して毒性成分に連結されたアミノ酸を含み；
毒性成分が、１−アミノアルキルホスホン酸もしくはその塩、または同化合物を調製するための成分を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、混合集団における特定の細胞の増殖を選択的に阻害する方法、その方法において使用される選択培地、およびその方法を行うためのキットに関する。
【０００２】
（発明の背景）
生物学的増殖培地に配合されたとき、特定の生物（特に、特定の細菌）の優先的な増殖（すなわち、選択）を可能にする選択剤が多く知られている。例えば、細菌の形質転換を行うときには、抗生物質耐性遺伝子を形質転換ＤＮＡに含ませ、その後、形質転換細胞および非形質転換細胞の混合集団を関連する抗生物質にさらし、それにより非形質転換細胞の増殖を阻害し、かつ形質転換細胞を選択することがよく知られている。
【０００３】
同様に、感染性疾患の診断の補助として、ヒトまたは動物の被験体から得られたサンプルに存在する細菌の混合集団における特定の生物（例えば、病原体）を選択するために様々な色素物質または塩を使用することが知られている。しかしながら、これらの選択剤は、健全な細胞の増殖を阻害すること（Ｖａｓｓｉｌｉａｄｉｓ他、１９７４、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．３７、４１１〜４１８）、および傷ついた細胞の回復を制限すること（Ｋａｎｇ＆Ｓｉｒａｇｕｓａ、１９９９、Ａｐｐｌ．ａｎｄ  Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６５、５３３４〜５３３７）が知られている。これは非常に大きい欠点である。なぜなら、多くの実際的な適用では、（例えば、食品サンプルから病原体を回収しようとするとき）、（温度またはｐＨなどの）最適でない条件にさらされているために傷害または「ストレス」を受けている生物を回復することが所望されるからである。
【０００４】
Ａｌｌｅｎ他（１９７８、Ｎａｔｕｒｅ、２７２、５６〜５８）は、ホスホノペプチドが抗菌性を有することを開示した。具体的には、化合物Ｌ−アラニル−Ｌ−１−アミノエチルホスホン酸（これは「アラホスフィン」と呼ばれる）が、ペプチドグリカン合成の阻害を生じさせると考えられる適度に強力な抗菌剤であることが明らかにされた。アラホスフィンは、Ｌ−１−アミノエチルホスホン酸（ＡＥＰ）に結合したアラニンのＬ型立体異性体からなる。この場合、アラニンの−ＣＯＯＨ基およびＡＥＰのアミノ基が縮合して、ペプチド結合を形成している。これらの最初の発見は、Ａｔｈｅｒｔｏｎ他（１９７９、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｍｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．１５、６７７〜６８３）およびＡｌｌｅｎ他（１９７９、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｍｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．１６、３０６〜３１３）によってさらに発展させられた。しかし、アラホスフィンは、抗生物質として決して広く採用されず、そして選択剤としての使用についても提案されなかった。特に、抗生物質は、広範囲の細菌を殺すように「広いスペクトル」であることが一般には意図されており、このことは、診断微生物学における選択剤としてのその使用を不可能にしている。
【０００５】
（発明の要約）
第１の局面において、本発明は、標的細胞および非標的細胞の混合集団における非標的細胞の増殖を選択的に阻害する方法を提供する。この方法は、（ａ）混合集団と、切断可能な結合により毒性成分に連結されたキャリア成分を含む選択剤とを接触させる工程であって、選択剤が、切断可能な結合が切断される非標的細胞内に進入可能であり、これにより毒性成分を放出して、非標的細胞の増殖阻害を生じさせる非標的細胞に対する毒性作用を示し、これに対して、選択剤が標的細胞内に進入不可能であり、かつ／または切断可能な結合は標的細胞内では切断されず、かつ／または毒性成分は、選択剤から放出された場合、標的細胞に対する毒性作用を示さない工程と、（ｂ）非阻害細胞の増殖を可能にする条件で細胞を培養する工程とを含む。
【０００６】
細胞は真核生物細胞（例えば、哺乳動物細胞、菌類細胞または酵母細胞）であり得るが、より典型的には細菌細胞である。具体的には、標的細胞および非標的細胞は、通常、ともに細菌を含む。好都合には、標的細胞はグラム陰性生物（例えば、サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．））であり得るし、非標的細胞もまたグラム陰性生物（例えば、大腸菌）を含む。
【０００７】
標的細胞は、典型的には、混合集団の中でその存在を検出することが所望される生物の細胞である。例えば、標的細胞は特定の病原性の種または属であり得るし、（目的とされない）非標的細胞は、混合集団を含有するサンプルが得られた被験体の消化管または皮膚の正常な細菌叢を表す細胞である。あるいは、サンプルは、例えば、ヒトまたは動物が消費する食物または飲料物のサンプルである。典型的には、非標的細胞は、標的細胞よりも多い数で存在し、従って、標的細胞の検出を容易にするように非標的細胞の増殖を選択的に阻害することが望ましい。そうでない場合、非標的細胞が標的細胞よりも速く増殖し、その結果、標的細胞が遮蔽されやすくなる。このことは、標的細胞が傷害またはストレスを受けているかもしれず、そして長くなった誘導期を経ることが考えられるときの予備濃縮のときには特に重要である。これは、予備濃縮のときに、細胞が、食品の製造または調製のときに受けた何らかの傷害を修復するからである。競合相手の集団全体の一部は、予備濃縮培養液に接種されたとき、傷害を全く受けず、誘導期に入らない。これらの細胞は迅速に増殖し、そしてＪａｍｅｓｏｎ効果（Ｊａｍｅｓｏｎ、１９６２、Ｊ．Ｈｙｇｉｅｎｅ  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、６０、１９３〜２０７）として知られている機構によって、標的細胞の増殖を、標的細胞が誘導期を離れ、繁殖を開始しないうちに妨げ得る。このことは、その後の継代培養において標的細胞を検出する可能性を著しく制限し得る。
【０００８】
選択剤の選択性に関して２つ以上の基礎が存在し得ることが前記から明かであり、その１つ以上が特定の選択剤／混合集団の組合せに対して作用し得る。（単独で用いられ得るか、またはより好ましくは、選択性の別の基礎と組み合わせて用いられ得る）選択性の１つの基礎は、選択剤が非標的細胞には蓄積するが、標的細胞には毒性濃度で蓄積しないように、非標的細胞によって選択的に取り込まれるという基礎である。都合のよい選択的な取り込みは、非標的細胞において作用し得るが、標的細胞には存在しない取り込み機構（特に、パーミアーゼなどの取り込み酵素）を使用することによって達成され得る。１つの好都合な実施形態において、選択剤は、ジペプチドまたはトリペプチドまたはオリゴペプチドのパーミアーゼによって非標的細胞内に進入する。従って、選択剤は、望ましくは、非標的細胞における取り込み機構によって効率的にプロセシンングされるキャリア成分を含むことができる。
【０００９】
（単独で用いられ得るか、または異なる基礎と組み合わせて用いられ得る）選択性の別の基礎では、非標的細胞によって切断され得るが、標的細胞では切断され得ない切断可能な結合を有する選択剤の使用が含まれる。好都合には、切断可能な結合の切断は、標的細胞ではなく、非標的細胞が発現する酵素または酵素の組合せによって行われる。
【００１０】
いくつかの実施形態において、切断可能な結合は、望ましくは、標的細胞ではなく、非標的細胞が発現するペプチダーゼ（好ましくは、アミノペプチダーゼ）によって切断され得るペプチド結合を含む。典型的には、ペプチド結合は、アミノ酸またはアミノ酸アナログのα−ＣＯＯＨ基によって形成されるが、ペプチド結合がβ−ＣＯＯＨ基（例えば、アスパラギン酸）またはδ−ＣＯＯＨ基（例えば、グルタミン酸）によって形成され得ることは可能である。
【００１１】
好都合なことではあるが、選択剤は、１つ以上のアミノ酸残基（ヒドロキシプロリンおよびピログルタミン酸などの非通常型のアミノ酸を含む）またはアミノ酸残基アナログを含む。選択剤に含ませるために好適な多数のアミノ酸残基アナログがＡｌｌｅｎ他またはＡｔｈｅｒｔｏｎ他によって記載されている（上記に引用）。
【００１２】
表１には、一部の細菌には存在するが、他の細菌には存在しない酵素で、従って、毒性成分を選択剤から切断し、そして選択剤が標的細胞よりも非標的細胞の増殖阻害を可能にするために好適であり得る多数の酵素が示される。一般には、アミノペプチダーゼがグルコシダーゼよりも好ましく、従って、好ましい選択剤はＬ−アミノ酸残基またはそのアナログを含む。ピロリドニルアリールアミダーゼによって切断され得る選択剤が、（特に、サルモネラ菌を増殖させる選択培地においては）特に好ましい。
【００１３】
【表１】
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【００１４】
毒性成分は、キャリア成分から切断されたときには非標的細胞の内部に留まる傾向を有するか、または非標的細胞が溶解した後では、非標的細胞の溶解した残り部分と共有結合的に結合したままである傾向を有することが一般には好ましい。このようにして、非標的細胞と標的細胞との間での選択性に関する唯一の基礎が、キャリア成分と毒性成分との間における切断可能な結合を切断するそれぞれの能力またはその能力がないこととすれば、（非標的成分の内部でキャリア成分から切断された場合）、毒性成分は細胞外の培地に放出されず、従って、標的細胞に対する毒性作用を何ら発揮しない。あるいは、非標的細胞（またはその使用された残り部分）から放出される場合、毒性成分は、好ましくは、大きい荷電を有するべきであり、これにより、遊離した毒性成分が標的細胞の細胞膜を横断して能動的に進入することが妨げられやすくなる。
【００１５】
従って、好ましい実施形態では、毒性成分は、選択剤が混合集団と接触しているｐＨおよび条件下において大きい電荷密度を有しなければならない（すなわち、大きい荷電を有しなければならない）。これによりまた、毒性成分が非標的細胞の細胞エンベロープの脂質二重層を通って細胞外環境に移動することが妨げられる。
【００１６】
本発明の目的に関して、毒性成分が、Ｍｅｙｌａｎ＆Ｈｏｗａｒｄ（１９９５、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、８４、８３〜９２）の方法によって測定されるような負のｌｏｇ［オクタノール／水の分配係数］を有する場合、毒性成分は大きい電荷密度を有すると見なすことができる。
【００１７】
説明として、溶質の分配係数（ｌｏｇＰ）は、ほとんどの場合、オクタノールと水との混合物を使用して測定される。溶質の濃度が両方の相で測定され、下記の式による数字として表される：ｌｏｇＰ＝ｌｏｇ［（ｘ）（オクタノール）／（ｘ）（水）］（例えば、Ｌｅｏ他、１９７１、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、７１、５２６〜６１６；ＭｅｙｌａｎおよびＨｏｗａｒｄ、１９９５、上記に引用）。
【００１８】
正のＬｏｇＰを有するそのような化合物は、水よりも脂質に溶解しやすく、負のＬｏｇＰを有するそのような化合物は、脂質よりも水に溶解しやすい。
【００１９】
大部分の殺生物剤は正のＬｏｇＰを有しており、これは、殺生物剤が細胞の細胞質膜の機能を破壊することを可能にする膜活性な化合物の必要な性質である。対照的に、負のＬｏｇＰを有するそのような化合物は膜活性ではなく、それらが細胞質膜を横断して細胞質内のその作用部位に達することを妨げる、分子に伴う荷電のために細胞内に進入することが妨げられる。
【００２０】
下記の表２には、様々な毒性成分のｌｏｇ［オクタノール／水の分配係数］が示される。負の値を有する毒性成分が、本発明に従って使用される選択剤に含ませるためには特に好都合である。
【００２１】
【表２】
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【００２２】
ａ、Ｌｅｏ他（１９７１）；ｂ、Ｍｅｙｌａｎ＆Ｈｏｗａｒｄ（１９９５）における方法での計算値。
【００２３】
好ましい毒性成分には、１−アミノアルキル化合物（特に、酸および塩）、特にアミノ低級アルキル化合物（すなわち、Ｃ1-4アルキル基（好ましくは、エチル基）を含む化合物）、特に酸および塩が挙げられる。好ましい毒性成分には、１−アミノエチルホスホン酸（ＡＥＰ）などのアミノアルキルホスホン酸／塩、および１−アミノエチルスルホン酸（ＡＥＳ）などのアミノアルキルスルホン酸／塩が含まれる。これらのアミノアルキル化合物は、アミノ酸とのある程度の構造的類似性を有しており、従って、本発明の目的のために、アミノ酸アナログと見なすことができ、そして選択剤に（好ましくは、ペプチド結合によって）含まれたときにはアミノ酸残基アナログと見なすことができる。実際には、大きい荷電を有するアミノ酸アナログが、一般には、本発明の方法における毒性成分として有用であり得る。有用であり得る他の例には、グルタミンアナログがあり、特に、酵素グルコサミン−６−リン酸シンターゼを阻害するグルタミンアナログがある。好適なアナログには、例えば、英国特許ＧＢ２２８２６０２に開示されるＮ3−（４−メトキシフマルギル）−Ｌ−２，３−ジアミノプロパン酸（ＦＭＤＰと略記される）および関連化合物が含まれる。
【００２４】
好都合には、好ましいアミノアルキル酸／塩の１−アミノ基は、キャリア成分のカルボキシル基に結合させて、ペプチダーゼ（好都合には、アミノペプチダーゼ）によって切断され得るペプチド結合の切断可能な結合を形成させることができる。
【００２５】
代替として、選択剤は、キャリア成分がＮ−糖であるグリコシド（特に、Ｎ−グリコシド）を含むことができる。例えば、好適な選択剤は、α−アミノ基を介してＮ−糖に共有結合的に結合した前記のような１−アミノアルキル化合物（ＡＥＰまたはＡＥＳまたはそれらの塩など）を含むことができる。
【００２６】
いくつかの実施形態において、選択剤はジペプチドまたはトリペプチドまたはオリゴペプチドに類似している。１つの好ましい実施形態において、選択剤はジペプチドに類似しており、この場合、キャリア成分はアミノ酸残基を含み、毒性成分はアミノ酸残基アナログを含む。望ましくは、キャリア成分における１つ以上のアミノ酸残基はＬ型立体異性体である。同様に、毒性成分の好ましいアミノ酸残基アナログはＬ型立体異性体である。
【００２７】
好ましい実施形態において、キャリア成分は、そのＣＯＯＨ基を介するペプチド結合を介してＬ−アラニン残基アナログ（ＡＥＰまたはＡＥＳなど）に望ましくは結合するＬ−アラニン残基を含む。従って、１つの好ましい実施形態において、選択剤は、Ｌ−アラニン残基アナログに連結されたＬ−アラニン残基からなるジペプチドを含む。従って、そのような選択剤はアラニル−アラニンアナログである。そのような実施形態において、酵素Ｌ−アラニルアミノペプチダーゼ（「ＬＡＬＡ」）はＬ−アラニン残基とＬ−アラニン残基アナログとの間のペプチド結合を切断して、毒性作用を発揮するためのＬ−アラニンアナログを放出させることができる。
【００２８】
そのような実施形態は、酵素ＬＡＬＡがすべての細菌によって発現されないので特に好都合であり、従って選択性の基礎として使用することができる。さらに、Ｌ−アラニンアナログは、ペプチドグリカンの合成に関与する酵素の本質的に不可逆的な阻害剤として作用する効果的な増殖阻害剤である。Ｌ−アラニンアナログは、そのような酵素と強固に結合し、その結果、非標的細胞が溶解した後でさえ、遊離の毒性形態で細胞外の環境に放出されない傾向を有する。
【００２９】
従って、本明細書中で使用される用語「アナログ」は、分子がそのアナログである元の分子との適度な構造的類似性を有する分子を示すことが当業者によって理解され、そして、特に、元の分子に対して作用する酵素は、一般に、そのアナログに結合する。しかし、元の分子とアナログとの違いのために、酵素は、この２つを同じようにプロセシングすることができない。例えば、元の分子は酵素の基質であり、酵素触媒反応が生じたら酵素から放出されるが、アナログは、元の分子が受ける酵素触媒反応を必ずしも受けるとは限らず、その結果、酵素に結合したままになり、その強力な阻害剤として作用することがある。
【００３０】
しかし、当業者は、非常に多くの他のペプチダーゼ（特に、アミノペプチダーゼ）が特定の生物群によって発現すること、そして本発明において使用される選択剤が他のアミノ酸残基またはアミノ酸残基アナログを含み得ることを理解する。キャリア成分として含ませるために好適なアミノ酸またはアナログの例には、バリン、プロリンおよびピログルタミン酸（ｐｙｒ）が含まれる。従って、例えば、プロリン−ＡＥＰ、プロリン−ＡＥＳまたはＰｙｒ−ＡＥＰおよびＰｙｒ−ＡＥＳは、本発明において使用される他の好適な選択剤である。
【００３１】
多数の細菌がジペプチドパーミアーゼまたはトリペプチドパーミアーゼまたはオリゴペプチドパーミアーゼを有しており、これらは、ジペプチド選択剤またはトリペプチド選択剤またはオリゴペプチド選択剤の細胞内への進入を促進し、比較的低濃度の選択剤が効果的に使用されることを可能にする。
【００３２】
本発明の方法は、細胞混合集団の一部の阻害を生じさせることが所望される状況のいずれかにおいて適用することができる。例として、下記が挙げられる：臨床サンプルにおける細菌の混合集団内のコリネ型（特に、大腸菌）を選択的に阻害して、（Ｌ−アラニルアミノペプチダーゼ活性を有さず、そして存在しても、典型的には、混合集団の非常に小さい割合を構成するだけである）カンピロバクター属の単離を容易にするようにすること；グラム陰性細菌（特に、コリネ型）を選択的に阻害して、病原性のグラム陽性生物（Ｌ−アラニルアミノペプチダーゼ−ｖｅであるＳｔａｐｈ．ａｕｒｅｕｓなど）の単離を容易にすること；インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）およびパラインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）の存在を臨床サンプルにおいて識別すること（そのような識別は予後および処置に関して意味を有する）を、上記生物の一方の選択的な阻害を生じさせるように選択剤とともに好適な条件でサンプルを培養することによって行うこと（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅは関係するアミノペプチダーゼ活性を有しておらず、これに対して、Ｈ．ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅは、アラホスフィンなどの化合物を切断する関係するアミノペプチダーゼを有する）。
【００３３】
特に好ましい本発明のさらなる具体的な適用は、細菌の混合集団におけるシトロバクター属および他のコリネ型を選択的に阻害して、サルモネラ菌の検出および場合により単離を容易にするようにすることであり、例えば、食品サンプルから、公衆衛生対策において、疾患の診断を助け、そして汚染食物サンプルを特定するようにすることである。そのような実施形態では、ピログルタミン酸に対するペプチド結合を介して連結された毒性成分を含む選択剤を使用することが望ましいと考えられる。これは、本発明者らが、サルモネラ菌は一般にピログルタミルペプチダーゼを有さず、その一方で、そのような酵素がほとんどのコリネ型には存在し、その結果、非標的生物が毒性成分を選択剤から切断することを認めたからである。
【００３４】
従来、サルモネラによる汚染の可能性について食品などのサンプルを試験するときには、２段階のインキュベーションを行うことが通常である。最初の段階において、約２５ｇのサンプルが、通常、２２５ｍｌの予備濃縮培養液に１／１０に希釈され、約１６時間または一晩インキュベーションされる。予備濃縮培養液は、通常、選択剤を何ら含有しない。これは、サンプル中におそらくは存在するサルモネラ属生物は、多くの場合、「ストレス」状態にあるからである（すなわち、温度およびｐＨなどの最適でない条件にさらされているので、弱くなっているからである）。そのような「ストレス」状態では、選択剤の存在は、通常の場合には亜致死的濃度であっても、多くの場合、実際には細胞死を生じさせることがある。
【００３５】
予備濃縮培地でのインキュベーションは、ストレスを受けている細胞を回復させることができる。その後、培養物は、サルモネラ菌を増殖させることができるが、競合するコリネ型生物を阻害する（すなわち、生存細胞数の正味の増大を妨げる）ことができる濃度で選択剤を含有する濃縮培地に、（例えば、１００μｌを１０ｍｌに）さらに希釈される。実際には、ほとんどの従来の選択剤もまたサルモネラ菌の増殖を阻害するが、その阻害は、選択剤が競合生物を阻害するよりも著しく小さい程度である。
【００３６】
本発明の利点の１つは、好ましい実施形態においては、ストレス状態でさえサルモネラ菌に対して実質的に非阻害性である選択剤が使用され得るということである。従って、その存在に関する何らかのアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ、ＰＣＲなど）において陽性の結果をもたらすために必要とされる細胞密度を得るために、（元のサンプルに存在するならば）サルモネラ菌生物について必要とされる最初の培地に選択剤を含めることができ、かつ／または全体の培養時間を短くすることが可能である。これは、サルモネラ菌の増殖が阻害されないからである。これにより、（サンプルを受け取った後）、これまでの場合よりも速く結果を得ることができることが可能になる。
【００３７】
本発明の好ましい実施形態において、選択剤は非標的細胞の阻害を生じさせるが、標的細胞に対しては、標的細胞がストレス状態または非ストレス状態にあるとしても、本質的に非阻害性である。
【００３８】
細菌細胞が好適な増殖培地に置かれたとき、生存細菌細胞の正味の数が増大しないか、またはゆっくり増大するだけである「誘導期」が存在する。誘導期後、培養物は、平均「世代時間」（すなわち、多数の細胞が形成から分裂に進むために要する平均時間）がその最小である指数増殖期に入る。
【００３９】
「本質的に非阻害性」と見なされることの例示として、選択剤が２５％未満（好ましくは２０％未満、より好ましくは１５％未満）の誘導期の増大を生じさせる場合、そして選択剤が指数増殖期中の平均世代時間の２０％未満（好ましくは１０％未満、より好ましくは５％未満）の増大を生じさせる場合、選択剤は、通常、特定の濃度で標的細胞に対して本質的に非阻害性であると見なされる。
【００４０】
当業者は、本発明の第１の局面の方法を行うことにより、選択的な増殖条件で十分に増殖し得る生物の正体に関して結論を下すことができることを理解する。従って、いくつかの実施形態において、本発明は、選択剤を含む培養で増殖し得る標的細胞の生物を同定するさらなる工程を含むことができる。あるいは、またはさらに、本発明の方法は、選択剤を含む培養で増殖し得る標的細胞生物のコロニーを単離する工程を含むことができる。同定および／または単離のそのような方法は、当業者にとっては日常的であり、本発明の一部を形成しない。
【００４１】
第２の局面において、本発明は、非標的細胞および標的細胞の混合集団における非標的細胞を選択的に阻害するための選択培地を提供する。この場合、培地は、切断可能な結合を介して毒性成分に連結されたキャリア成分を含む選択剤を含む。好ましくは、選択剤は上記に定義される通りである。選択培地は液体または固体であってもよく、そして培地に通常的に含まれ得る成分のいずれか、例えば、ペプトン、酵母抽出物、寒天（または他の固化剤）、塩、緩衝剤、指示色素などを含むことができる。
【００４２】
第３の局面において、本発明は、非標的細胞および標的細胞を含む混合集団における非標的細胞を選択的に阻害するためのキットを提供する。この場合、キットは、上記に定義されるような選択剤と、本発明の第１の局面の方法による方法に従った使用に関する説明書とを含む。
【００４３】
好ましい実施形態において、キットは、上記に定義される本発明の第２の局面による培地を含むか、または代替として、本発明による選択培地を調製するための成分を含む。
【００４４】
次に、本発明の様々な局面が、例示的な例として、そして添付された図面を参照してさらに記載される。
【００４５】
図１ｂおよび図１ｃにおいて、Ｒは、とりわけ、アミノ酸残基の側鎖のいずれかであり得る。図１ｂにおいて、ＲがＣＨ3である場合、選択剤はアラホスフィンであり、図１ｃにおける放出されるＬ−アミノ酸はＬ−アラニンである。
【００４６】
（実施例）
下記の実施例では、非常に多くの細菌株が述べられている。文字「ＯＣＣ」は「Ｏｘｏｉｄ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（オキソイド・カルチャー・コレクション）」の略号であり、これらの生物は出願人自身の実験室から得られた。しかし、ほとんどの場合、同一（または少なくとも近い等価な）生物を、下記の表３に示されるように、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（ＮＣＴＣ、Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｉｎｄａｌｅ、Ｌｏｎｄｏｎ）またはＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、米国）またはその他などの公開されているコレクションから得ることができる。いずれの場合でも、これらの生物は単に代表的なサンプルにすぎず、問題としている種の典型的な他の菌株は、本発明を例示する目的のために同様に使用することができる。
【００４７】
【表３】
0004768207.tif 000004
【００４８】
実施例１
多数の実験を、いくつかの細菌の増殖阻害および細胞混合集団における細菌の選択的阻害を明らかにするために行った。実施例１〜５に記載されるこれらの実験において、細菌は、アラホスフィンまたはＡＥＰ（ともにＦｌｕｋａから得られる）が補充された栄養寒天（ＣＭ３）でインキュベーションされた。実験は下記のように行われた。栄養寒天培地をオートクレーブ処理し、冷えたとき（しかし、凝固前）に、ろ過滅菌したアラホスフィンまたはＡＥＰを、１ｍＭ、２ｍＭ、５ｍＭおよび１０ｍＭの最終濃度で加え、そしてこの培地を使用して、平板を作製した。コントロールの平板は、アラホスフィンまたはＡＥＰを含まない栄養寒天を使用して調製された。試験中の生物の１コロニーを１０ｍｌの栄養ブイヨンに接種し、（撹拌することなく）３７℃で４時間インキュベーションした。その後、培養物を（栄養ブイヨンで）１：１０００に希釈し、得られた希釈物を使用して、調製された平板への接種を、１μｌの接種ループから４回の画線とともに「エコノメトリック（ｅｃｏｎｏｍｅｔｒｉｃ）」法の変法（Ｍｏｓｓｅｌ他、１９８３、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．５４、３１３〜３２７）を使用して行った。（混合集団が実施例６〜８のように調製された場合、１μｌのサンプルが別々の培養物の１：１０００希釈物のそれぞれから採取され、その１μｌサンプルを一緒に混合し、これを使用して、前に記載されるように平板に接種した。）
実施例１では、アラホスフィンまたはＡＥＰに対するＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｌｉｓ株ＯＣＣ２１４の感受性が調べられた。結果が図２に示される。図２は、０〜１０ｍＭの濃度のアラホスフィン（白カラム）またはＡＥＰ（斜影カラム）における細菌の増殖を明らかにする画線数を示す棒グラフである。結果は、Ｂ．ｓｕｂｌｉｌｉｓ  ＯＣＣ２１４が５ｍＭ以上の濃度でＡＥＰによって阻害されるが、アラホスフィンに対しては完全に非感受性であり、かつ／またはＡＥＰを放出するためにアラホスフィンを加水分解できないことを示している。この生物はＬＡＬＡ−ｖｅであることが知られており、従って、これらの観測結果は、この生物の知られている特徴と一致する。
【００４９】
実施例２
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  ＯＣＣ１８７０を試験生物として使用して、実施例１を繰り返した。結果が図３に示される。図３では、図２と同じ記号が使用される。Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  ＯＣＣ１８７０は１０ｍＭもの高い濃度でＡＥＰに対して抵抗性であることが見出された。しかし、この生物はＬＡＬＡ＋であることが知られており、そしてアラホスフィンが５ｍＭ以上の濃度で完全に阻害性であることが見出された。このことは、アラホスフィンが細胞によって取り込まれ、加水分解されること、しかしＡＥＰそのものは細胞内に進入できないことを示している。
【００５０】
実施例３
Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ  ＯＣＣ６４０を試験生物として使用して、実施例１を繰り返した。結果が図４に示される。この生物は５ｍＭ以上の濃度でＡＥＰによって完全に阻害されることが見出された。このことは、この生物が、ＡＥＰを受容して輸送する取り込みペプチド（おそらくは、Ｌ−アラニンパーミアーゼ）を発現することを示している。この生物はＬＡＬＡ＋であり、そして２ｍＭ以上の濃度でアラホスフィンによって完全に阻害される。
【００５１】
実施例４
Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ＣＭＣＣ３０７７を試験生物として使用して、実施例１を繰り返した。結果が図５に示される。結果は、実施例２で得られた結果と定性的に類似している。Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ＣＭＣＣ３０７７はＬＡＬＡ＋ｖｅであり、そして２ｍＭ以上の濃度でアラホスフィンによって完全に阻害されるが、１０ｍＭまでの濃度でＡＥＰに対して非感受性である。
【００５２】
実施例５
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ＯＣＣ１０２を試験生物として使用して、実施例１を繰り返した。結果が図６に示される。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＯＣＣ１０２は、試験されたすべての濃度でＡＥＰに対して完全に非感受性であったが、１０ｍＭのアラホスフィンによって完全に阻害された。このことは、この生物がアラホスフィンを取り込み、加水分解することができるが、実施例２〜４で試験された生物より効率が低いことを示している。
【００５３】
実施例６
実施例１を繰り返したが、本実施例では、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ＣＭＣＣ３０７７およびＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＯＣＣ１０２の混合培養物を使用した。ＡＥＰまたはアラホスフィンの存在下での増殖に対する結果が図７および図８にそれぞれ示される。中空の柱はＳ．ａｕｒｅｕｓの増殖を表し、斜線付きの柱はＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの増殖を表す。実施例４および実施例５から予想されるように、いずれの生物も、混合培養ではＡＥＰによって阻害されなかった。アラホスフィンが存在するとき、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの増殖は、１ｍＭを越える濃度で完全に阻害されたが、Ｓ．ａｕｒｅｕｓは１０ｍＭのアラホスフィンによって阻害されただけであった。従って、Ｓ．ａｕｒｅｕｓは容易に増殖するが、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅが阻害される相当のアラホスフィン濃度範囲が存在する。Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ細胞が、細胞内に放出されたＡＥＰの毒性作用のために溶解したとしても、ＡＥＰは、含まれる濃度でＳ．ａｕｒｅｕｓに対して毒性ではない。
【００５４】
実施例７
実施例６を繰り返したが、本実施例では、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＯＣＣ１０２およびＥ．ｆａｅｃａｌｉｓ  ＯＣＣ６０４の混合培養物をＡＥＰまたはアラホスフィンの存在下で使用した。結果が図９および図１０にそれぞれ示される。中空の柱はＳ．ａｕｒｅｕｓの増殖を表し、斜線付きの柱はＥ．ｆａｅｃａｌｉｓの増殖を表す。２ｍＭ以上の濃度のアラホスフィンはＥ．ｆａｅｃａｌｉｓの増殖の完全な阻害を引き起こしたが、Ｓ．ａｕｒｅｕｓは１０ｍＭ以上の濃度で阻害されただけであった。従って、アラホスフィンは、培地に適切な濃度で含まれるときには、サンプル中における腸球菌などの生物の増殖を阻害するために使用することができ、同時に連鎖球菌を増殖させて、検出することができる。
【００５５】
実施例８
実施例６を繰り返したが、本実施例では、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＯＣＣ２１４およびＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ＣＭＣＣ３０７７の混合培養物をＡＥＰまたはアラホスフィンの存在下で使用した。結果が図１１および図１２にそれぞれ示される。中空の柱はＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓの増殖を示し、斜線付きの柱はＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの増殖を表す。図１１は、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅが、試験されたすべての濃度でＡＥＰに対して非感受性であるが、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓは、５ｍＭを越える濃度で、ある程度の感受性を示したことを示している。図１２は、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅが２ｍＭ以上の濃度でアラホスフィンによって完全に阻害されたが、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓはこの濃度範囲でアラホスフィンに対して非感受性であったことを示している。これらの結果より、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅによるアラホスフィンの加水分解は、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓの何らかの阻害を生じさせるために十分な遊離ＡＥＰを生じさせていないことが示される。
【００５６】
上記の実施例はすべて、ペプトンを８ｇ／リットルで含有する栄養寒天を使用して行われた実験に関する。ペプトンは、オリゴペプチドパーミアーゼおよび／またはペプチド遺伝子の発現に影響を及ぼし得るオリゴペプチドを含有する。従って、選択剤がジペプチドもしくはトリペプチドもしくはオリゴペプチドであり、かつ／または切断可能な結合がペプチドを含む場合、選択培地におけるペプトンのタイプおよび／または濃度は、最適な程度の選択性を得るために培地において要求される選択剤の濃度に影響を及ぼし得る。
【００５７】
実施例９
本発明による方法における選択剤として有用であることが証明される他の化合物は、キャリア成分がピログルタミン酸（Ｐｙｒ）（特に、Ｌ−ｐｙｒ）を含む化合物である。好都合には、毒性成分はＡＥＰを含む。そのような選択剤は、「Ｐｙｒａｓｅ」を発現する生物（すなわち、Ｐｙｒ+生物）の増殖を選択的に阻害することができ、その一方で、Ｐｙｒ-ve生物を増殖させることができるはずである。多くのコリネ型（例えば、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｏｒ  ｓｐｐ．、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐｐ．、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｓｐｐ．および大部分のＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｏｒ  ｓｐｐ．）はＰｙｒ+である。従って、例えば、Ｌ−ｐｙｒ−ＡＥＰは、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．を臨床サンプルまたは環境サンプルから単離するときの選択的な予備濃縮段階を容易にする液体培地において、そしてその後の選択的な単離段階に対する固体培地において有用な選択剤であると考えられる。
【００５８】
別の実施形態において、Ｌ−ｐｙｒ−ＡＥＰは、Ｐｙｒ+のコリネ型、腸球菌および多くのＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．を阻害しながら、Ｐｙｒ-veのＬｉｓｔｅｒｉａ  ｓｐｐ．に対する選択的濃縮のために使用することができる。
【００５９】
多数の実験が、本発明のこれらの実施形態を例示するために行われた。
実施例９Ａ
実施例９（Ｐｙｒ−ＡＥＰ）に含まれるデータおよび説明文
本実施例では、サルモネラ属そのものではなく、サルモネラ属に遺伝子型的に類似する生物のＬ−ピログルタミル−Ｌ−アミノエチルホスホナート（Ｐｙｒ−ＡＥＰ）による阻害が明らかにされる。例えば、Ｐｙｒ−ＡＥＰを脱イオン水に溶解し（１４．１ｍｇ／ｍｌ）、ろ過滅菌し、そして溶液の一定量を、オートクレーブ処理されたＬａｂ−Ｌｅｍｃｏ培養液（２０ｇ／ｌ、ｐＨ６．０）に加えて、１４１μｇ／ｍｌの最終濃度を得た。その後、この溶液の一部（３００μｌ）をＢｉｏｓｃｒｅｅｎマイクロタイタープレートのウエルにピペットで移し、そしてＣｉｔｒｏｂａｃｔｏｒ  ｆｒｅｕｎｄｉｉ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｏｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｏｒ  ｃｌｏａｃａｅ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍおよびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎの一晩培養物の１：１０，０００希釈物の３０μｌ量を加えた（このさらなる希釈により、Ｐｙｒ−ＡＥＰの濃度が１２８μｇ／ｍｌに低下したことに留意すること）。その後、プレートにカバーをかぶせ、３７℃でインキュベーションして、生物懸濁物の不透明度を、Ｂｉｏｓｃｒｅｅｎ装置（半自動型微生物学増殖分析計、Ｔｈｅｒｍｏｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ（Ａｓｈｆｏｒｄ、Ｍｉｄｄｌｅｓｅｘ、英国）から入手可能）を使用して測定した。Ｌ−ピログルタミルヒドロラーゼ（これはまたピロリドニルアリールアミダーゼ（Ｅ．Ｃ．３．４．１９．３）とも呼ばれる）を含まないサルモネラ属菌株の増殖はＰｙｒ−ＡＥＳによって阻害されなかったが、この酵素を含む試験されたそれ以外の菌株は阻害された。
【００６０】
結果が図１３に示される。図１３は、時間（時間単位）に対する光学濃度のグラフである。光学濃度の読み取り値は、「広域バンド」（ｗｂ）モードで、すなわち、フィルターを何ら用いない白色光を使用して得られた。
【００６１】
実施例９Ｂ
上記に記載された純粋培養実験に加えて、混合培養実験を行った。
【００６２】
Ｌ−ピログルタミル−Ｌ−アミノエチルホスホナートを、３７℃の水浴において万能試験管に含有される栄養ブイヨンＮｏ．２に加えた（最終濃度＝１２８μｇ／ｍｌ）。Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｏｒ  ｆｒｅｕｎｄｉｉ  ＯＣＣ３７０およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  ＯＣＣ６２６を３７℃において栄養ブイヨンＮｏ．２で一晩増殖させ、Ｍａｘｉｍａｌ  Ｒｅｃｏｖｅｒｙ希釈液で１：１０００に希釈し、そして約１０4ｃｆｕ／ｍｌの最終濃度の各生物が得られるように、一定量を栄養ブイヨンに加えた。様々な間隔でサンプルを採取して、ＸＬＤに広げ、黒色の中心部を有する赤色コロニーの数をサルモネラ属として数え、そして黄色コロニーをシトロバクター属として数えた。
【００６３】
結果が図１４に示される。図１４は、時間（時間単位）に対するＬｏｇ10生存カウント数（ｃｆｕ／ｍｌ）のグラフである。Ｃ．ｆｒｅｕｎｄｉｉに対するプロットはひし形の記号によって示され、Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍに対するプロットは四角によって示される。黒塗り記号および実線はＰｙｒ−ＡＥＰの存在下での結果を示し、中空記号および点線はＰｙｒ−ＡＥＰの非存在下での結果を示す。
【００６４】
グラフは、Ｐｙｒ−ＡＥＰが、サルモネラ属の増殖に対して大きい影響を有していないが、シトロバクター属に対して完全に阻害性であることを明瞭に示している。
【００６５】
実施例１０
Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐｐ．に対するアラホスフィンの活性に関する増殖曲線データが得られた。培養液培養における阻害の速度論を測定することには特に注意が払われた。この実験で使用された培地は、緩衝化ペプトン水、栄養ブイヨンおよびトリプトンダイズ寒天であった。これらの培地は製造者の説明書に従って調製された。
【００６６】
選択剤のＡＥＰ（カタログ番号０６６５５）およびアラホスフィン（カタログ番号０５２６０）はＦｌｕｋａにより供給された。選択剤は水に０．５Ｍの濃度で溶解され、ろ過滅菌され、１００μｌが１０ｍｌの栄養ブイヨンに加えられ、ＡＥＰまたはアラホスフィンがそれぞれ５ｍＭである最終濃度が試験培地において得られた。
【００６７】
Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ＣＭＣＣ３０７７が選ばれたが、これは、この生物が食品からの単離体であり、そしてアラホスフィンおよびＡＥＰを使用して、研究がこの生物で以前に行われていたからである（前記の実施例を参照のこと）。この生物を栄養ブイヨンに接種して、３７℃で一晩インキュベーションした。培養物を希釈して、最終濃度が１ｘ１０5ｃｆｕ／ｍｌ〜１ｘ１０6ｃｆｕ／ｍｌの間にあるように試験培地に接種した。試験培地を３７℃でインキュベーションし、１時間間隔でサンプリングした。培養物を緩衝化ペプトン水で連続希釈して、トリプトンダイズ寒天に接種した。これらのプレートを３７℃で一晩インキュベーションして、総生存数の計数を翌日に行った。
【００６８】
栄養ブイヨンにおける５ｍＭのＡＥＰは、栄養ブイヨンのコントロールと比較したとき、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ＣＭＣＣ３０７７の増殖に対してほとんど効果がなかった。対照的に、アラホスフィンは、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ＣＭＣＣ３０７７の阻害に対して効果的な選択剤であり、４時間の期間内で栄養ブイヨンにおける生存数の２〜３のｌｏｇ減少を生じさせた。
【００６９】
典型的な結果が図１５に示される。図１５は、時間（時間単位）に対する総生存数（ｌｏｇ10ｃｆｕ／ｍｌ）のグラフである。中空のひし形記号は栄養ブイヨンのコントロール培地における結果を示し、黒四角は、５ｍＭのＡＥＰを含有する試験培地の結果を示し、黒三角は、５ｍＭのアラホスフィンを含有する試験培地に対する結果を示す。
【００７０】
この培地で使用されたアラホスフィンの濃度は最適化されなかった。本実施例は、ＡＥＰペプチドが、培養培地の栄養分についてＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．と競合する生物の一部に対して著しい作用を有し得ること、そして基質が加水分解されて、ＡＥＰが培地に放出された場合、ＡＥＰは増殖速度に対して最小限の影響を有することを例示している。
【００７１】
実施例１１
実験を、サルモネラ属菌株ではなく、大腸菌菌株のアラホスフィン（Ａｌａ−ＡＥＰ）による阻害を明らかにするために行った。例えば、Ａｌａ−ＡＥＰを脱イオン水に溶解し（７．０ｍｇ／ｍｌ）、ろ過滅菌し、そして一定量の溶液を、オートクレーブ処理されたＬａｂ−Ｌｅｍｃｏ培養液（２０ｇ／ｌ、ｐＨ５．７）に加えて、７０μｇ／ｍｌの濃度を得た。その後、この溶液の一部（３００μｌ）をＢｉｏｓｃｒｅｅｎマイクロタイタープレートのウエルにピペットで移し、そして一晩培養物の１：１０，０００希釈物の３０μｌ量を加えた（これにより、アラホスフィンの最終濃度は６４μｇ／ｍｌに低下する）。その後、プレートにカバーをかぶせ、３７℃でインキュベーションして、生物懸濁物の不透明度を、Ｂｉｏｓｃｒｅｅｎ装置を使用して測定した。サルモネラ属菌株の増殖は影響を受けなかったが、大腸菌菌株はすべて阻害された。この場合、サルモネラ属は、阻害剤（ｉｎｈｉｂｉｇｅｎ）を取り込み、加水分解することができるが、それは、大腸菌と比較して非常に低下した速度ではあり、その結果、サルモネラ属の増殖が大きく阻害されなかったと考えられる。
【００７２】
典型的な結果が図１６に示される。図１６は、時間（時間単位）に対する光学濃度のグラフである。Ｓ．ｉｎｄｉａｎａ  ＯＣＣ２４１２およびＳ．ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  ＯＣＣ６３４の増殖が十字および丸によりそれぞれ示される。試験された大腸菌の４つの菌株は実験条件で全く増殖しなかった。従って、これらの生物に対するプロットは平坦な実線として現れる。
【００７３】
実施例１２
従来の選択剤は、抗生物質、化学薬品および色素の使用、インキュベーション温度を高くすること、およびｐＨの低下により非標的細菌の増殖を阻害することによって標的微生物（例えば、サルモネラ属）の増殖を効果的に促進する。これらの処理は広く、比較的、非特異的であるため、標的微生物の増殖は負の影響を受けることが多い。すなわち、選択剤は、真に特異的ではなく、標的生物の増殖の著しい阻害を生じさせる。従って、従来の方法では、１６時間〜２４時間のインキュベーション時間が、検出のために標的生物の必要とされる濃度を得るために必要とされ得る。
【００７４】
対照的に、本発明では、標的生物の最適な増殖速度を維持できることが可能になる。このことは、迅速な診断試験を開発する際には非常に好都合である。
【００７５】
下記は、標的微生物（この場合、サルモネラ）に対する新しい選択剤の有利なより低い毒性的性質を例示するための例である。食物からのサルモネラの単離（ＨｕｍｐｈｒｅｙおよびＷｈｉｔｅｈｅａｄ、１９９２、Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｐｏｕｌｔｒｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、３３、７６１〜７６８）において従来から使用されている２つの選択剤（セフスロジンおよびノボビオシン）がアラホスフィンと比較された。すべてを脱イオン水に溶解して、ろ過滅菌し、そして一定量の溶液を、オートクレーブ処理されたＬａｂ−Ｌｅｍｃｏ培養液＋リン酸塩緩衝液（２０ｇ／ｌ、ｐＨ６．０；ａｌａ−ＡＥＰ）または緩衝化ペプトン水（ｐＨ６．８；セフスロジンおよびノボビオシン）のいずれかに加えて、６６μｇ／ｍｌ、１６．５μｇ／ｍｌおよび１１μｇ／ｍｌの最終濃度をそれぞれ得た［異なるｐＨ値は選択剤の異なる至適ｐＨを反映している（ａｌａ−ＡＥＰはまた、続いて、ｐＨ６．８のＢＰＷで使用されたが、類似した結果が得られた）］。その後、一部（３００μｌ）をＢｉｏｓｃｒｅｅｎマイクロタイタープレートのウエルにピペットで移し、そして大腸菌ＯＣＣ２１２９およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  ＯＣＣ７２２の一晩培養物の１：１０，０００希釈物の３０μｌ量を加えた。その後、プレートにカバーをかぶせ、３７℃でインキュベーションして、生物懸濁物の不透明度を、Ｂｉｏｓｃｒｅｅｎ装置を使用して測定した。
【００７６】
典型的な結果が図１７〜図１９に示される。図１７〜図１９は、１５μｇ／ｍｌのセフスロジン（図１７）の存在下（中空記号）および非存在下（黒記号）、１０μｇ／ｍｌのノボビオシン（図１８）の存在下（中空記号）および非存在下（黒記号）、または６０μｇ／ｍｌのアラホスフィン（図１９）の存在下（中空記号）および非存在下（黒記号）におけるＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ（丸）および大腸菌（四角）について時間に対する光学濃度のグラフである。セフスロジンおよびノボビオシンはともにＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍの増殖を著しく阻害していることがこれらの結果から明かである。従って、図１７および図１８において、これらの２つの薬剤の存在下または非存在下におけるＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍの増殖曲線が著しく異なり、そしてそれぞれの場合、１２時間で、大腸菌は、選択剤の存在下でＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍよりも実質的に速く増殖している。対照的に、図１９では、６０μｇ／ｍｌのアラホスフィンの存在下または非存在下におけるＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍの増殖には著しい違いがないことが明かである。さらに、大腸菌の増殖は完全に阻害され、これにより、Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍはその競合相手よりも容易に速く増殖することができる。
【００７７】
実施例１３
ピログルタミル−１−アミノエチルホスホン酸による生物の増殖阻害に影響を及ぼす培地組成が見出された。一般に、より高濃度の短鎖ペプチド（例えば、加水分解カゼイン）を含有する培地は阻害剤の有効性を低下させた。例えば、Ｐｙｒ−ＡＥＰを脱イオン水に溶解し（５１．２ｍｇ／ｍｌ）、ろ過滅菌して、そして一定量の溶液を、オートクレーブ処理された微生物学的ペプトン、カゼイン加水分解物、Ｌａｂ−Ｌｅｍｃｏ培養液およびプロテオースペプトン（２０ｇ／ｌ、ｐＨ７．３）に加えて、１，４７７μｇ／ｍｌ、７３９μｇ／ｍｌ、３６９μｇ／ｍｌおよび１８５μｇ／ｍｌの希釈系列を得た。その後、これらの溶液の一部（３００μｌ）をＢｉｏｓｃｒｅｅｎマイクロタイタープレートのウエルにピペットで移し、そしてＣｉｔｒｏｂａｃｔｏｒ  ｆｒｅｕｎｄｉｉ  ＯＣＣ２６１、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｏｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ  ＯＣＣ７２０、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ  ＯＣＣ７２３およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｖｉｒｃｈｏｗ  ＯＣＣ７０３の一晩培養物の１：１０，０００希釈物の３０μｌ量を加えた。その後、プレートにカバーをかぶせ、３７℃でインキュベーションして、生物懸濁物の不透明度を、Ｂｉｏｓｃｒｅｅｎ装置を使用して測定した。得られた増殖曲線から、ＭＩＣ値が、下記の表４に示されるように得られた。
表４．様々な培地におけるＬ−ピログルタミル−１−アミノエチルホスホン酸ａｅｐ（μｇ／ｍｌ）の最小阻害濃度
【００７８】
【表４】
0004768207.tif 000005
【００７９】
実施例１４
ストレス状態の細胞を回復させることができることの重要性を考慮して、実験を、遊離ＡＥＰがストレス状態の細胞に対して何らかの毒性作用を有しているかどうかを調べるために行った。
【００８０】
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ（ＯＣＣ１７９２）に、Ｓｔｅｐｈｅｎｓ他（１９９７、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏ．８３、４４５〜４５５）のプロトコルに従って２５分間、５１．４℃で熱ストレスを与えた。細胞を７つの異なる蘇生培地で希釈した：ストレス状態の細胞に対して阻害性である高含有量の反応性酸素種を有する酵母抽出物培養液、Ｏｘｙｒａｓｅが補充されたＳＰＲＩＮＴ富化培養液（すなわち、最適化された蘇生培地）、典型的な蘇生性を有するコントロールとしてのＢＰＷ、ストレス状態の細胞に対して阻害性であるＮａＣｌが補充されたＢＰＷ、および３つの異なるレベルのＡＥＰが補充されたＢＰＷ。蘇生は、マイクロタイターＭＰＮ法を使用して定量化された。
【００８１】
典型的な結果が図２０に示される。図２０は、ＢＰＷ単独における増殖に対する、様々な培地におけるストレス状態の細胞の増殖（Ｌｏｇ［ｃｆｕ／ｍｌ］）の違いを示す棒グラフである。このグラフは、ＡＥＰの添加が、熱ストレスを受けたサルモネラの蘇生に大きく影響しなかったことを示している（ＭＰＢ技術の変動性は＋／−０．２５ｌｏｇである）。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】  図１ａは、本発明の方法において使用される好ましい毒性成分（ＡＥＰ）の化学構造を示す。
【図１Ｂ】  図１ｂは、図１ａに例示される毒性成分を含む好ましい選択剤の化学構造を示す。
【図１Ｃ】  図１ｃは、図１ａに示される毒性成分を放出するためのアミノペプチダーゼによる図１ｂに示される選択剤の切断を例示する。
【図２】  図２は、ＡＥＰまたはアラホスフィンの存在下における純粋培養または混合培養での様々な生物の増殖量を示す棒グラフである。
【図３】  図３は、ＡＥＰまたはアラホスフィンの存在下における純粋培養または混合培養での様々な生物の増殖量を示す棒グラフである。
【図４】  図４は、ＡＥＰまたはアラホスフィンの存在下における純粋培養または混合培養での様々な生物の増殖量を示す棒グラフである。
【図５】  図５は、ＡＥＰまたはアラホスフィンの存在下における純粋培養または混合培養での様々な生物の増殖量を示す棒グラフである。
【図６】  図６は、ＡＥＰまたはアラホスフィンの存在下における純粋培養または混合培養での様々な生物の増殖量を示す棒グラフである。
【図７】  図７は、ＡＥＰまたはアラホスフィンの存在下における純粋培養または混合培養での様々な生物の増殖量を示す棒グラフである。
【図８】  図８は、ＡＥＰまたはアラホスフィンの存在下における純粋培養または混合培養での様々な生物の増殖量を示す棒グラフである。
【図９】  図９は、ＡＥＰまたはアラホスフィンの存在下における純粋培養または混合培養での様々な生物の増殖量を示す棒グラフである。
【図１０】  図１０は、ＡＥＰまたはアラホスフィンの存在下における純粋培養または混合培養での様々な生物の増殖量を示す棒グラフである。
【図１１】  図１１は、ＡＥＰまたはアラホスフィンの存在下における純粋培養または混合培養での様々な生物の増殖量を示す棒グラフである。
【図１２】  図１２は、ＡＥＰまたはアラホスフィンの存在下における純粋培養または混合培養での様々な生物の増殖量を示す棒グラフである。
【図１３】  図１３は、様々な条件下における時間（時間）に対する様々な細菌の増殖（光学濃度によって測定）を示す棒グラフである。
【図１４】  図１４は、様々な条件下における時間（時間）に対する様々な細菌の増殖（Ｌｏｇ10［Ｃｆｕ／ｍｌ］によって測定）を示す棒グラフである。
【図１５】  図１５は、様々な条件下における時間（時間）に対する様々な細菌の増殖（Ｌｏｇ10［Ｃｆｕ／ｍｌ］によって測定）を示す棒グラフである。
【図１６】  図１６は、様々な条件下における時間（時間）に対する様々な細菌の増殖（光学濃度によって測定）を示す棒グラフである。
【図１７】  図１７は、様々な条件下における時間（時間）に対する様々な細菌の増殖（光学濃度によって測定）を示す棒グラフである。
【図１８】  図１８は、様々な条件下における時間（時間）に対する様々な細菌の増殖（光学濃度によって測定）を示す棒グラフである。
【図１９】  図１９は、様々な条件下における時間（時間）に対する様々な細菌の増殖（光学濃度によって測定）を示す棒グラフである。
【図２０】  図２０は、熱ストレスを受けたＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ培養物の回復に対する様々な培地の影響を示す棒グラフである。
【図２１】  図２１は、本発明の方法における使用に好適な１つの具体的な選択剤（Ｌ−ピログルタミル−Ｌ−１−アミノエチルホスホン酸）の構造を示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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