(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の（Ａ）から（Ｃ）
（Ａ）配列番号１の第３２位から第４９４位で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質；
（Ｂ）配列番号１の第３２位から第４９４位において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列からなる蛋白質；または
（Ｃ）配列番号１の第３２位から第４９４位のアミノ酸と少なくとも９０％のアミノ酸残基が一致する蛋白質
のいずれかの蛋白質中の、少なくとも１ヶ所の糖鎖付加部位のアミノ酸配列において、糖鎖が付加されないようにアミノ酸が置換されていることにより、糖鎖付加部位の少なくとも一ヶ所の糖鎖が欠損している蛋白質であって、前記蛋白質はＮ末端ヘアピンドメインとそれに続く４つのクリングルドメインを有し、かつｃ−Ｍｅｔ／ＨＧＦ受容体を介するＨＧＦの作用に対するアンタゴニスト活性を有するとともに血管新生抑制作用を有することを特徴とする糖鎖欠損型ＨＧＦの部分蛋白質。
【請求項２】
アミノ酸の置換が、次の（ａ）から（ｄ）の少なくとも一つであることを特徴とする請求項１記載の糖鎖欠損型ＨＧＦの部分蛋白質；
（ａ）アミノ酸配列がＡｓｎ−Ｘ−ＳｅｒまたはＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ（ＸはＰｒｏ以外のアミノ酸を示す）で示されるＮ−結合型糖鎖付加のコンセンサス配列のうち、少なくとも一つのコンセンサス配列のＡｓｎが他のアミノ酸に置換されている；
（ｂ）アミノ酸配列がＡｓｎ−Ｘ−ＳｅｒまたはＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ（ＸはＰｒｏ以外のアミノ酸を示す）で示されるＮ−結合型糖鎖付加のコンセンサス配列のうち、一つのコンセンサス配列のＳｅｒまたはＴｈｒ、あるいは２以上のコンセンサス配列のＳｅｒまたは／およびＴｈｒが他のアミノ酸に置換されている；
（ｃ）アミノ酸配列がＡｓｎ−Ｘ−ＳｅｒまたはＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ（ＸはＰｒｏ以外のアミノ酸を示す）で示されるＮ−結合型糖鎖付加のコンセンサス配列のうち、少なくとも一つのコンセンサス配列のＸがＰｒｏに置換されている；または
（ｄ）Ｏ−結合型糖鎖付加を受けるＳｅｒまたはＴｈｒのうち、少なくとも一つのＳｅｒまたはＴｈｒが他のアミノ酸に置換されている。
【請求項３】
アミノ酸の置換が、次の（ａ）から（ｃ）の少なくとも一つであることを特徴とする請求項１記載の糖鎖欠損型ＨＧＦの部分蛋白質；
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の第２９４位または／および第２９６位のアミノ酸が他のアミノ酸に、または／および第２９５位のアミノ酸がＰｒｏに置換されていることによって第２９４位に糖鎖が付加されていない；
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の第４０２位または／および第４０４位のアミノ酸が他のアミノ酸に、または／および第４０３位のアミノ酸がＰｒｏに置換されていることによって第４０２位に糖鎖が付加されていない；または
（ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の第４７６位のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されていることによって第４７６位に糖鎖が付加されていない。
【請求項４】
配列番号１で示されるアミノ酸配列の第１６２位から第１６６位のアミノ酸が欠失していることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の糖鎖欠損型ＨＧＦの部分蛋白質。
【請求項５】
配列番号１で示されるアミノ酸配列の第４７９位から第４９４位のアミノ酸が欠失していることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の糖鎖欠損型ＨＧＦの部分蛋白質。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載の糖鎖欠損型ＨＧＦの部分蛋白質をコードする塩基配列からなるＤＮＡ。
【請求項７】
請求項６記載のＤＮＡを組み込んだベクター。
【請求項８】
請求項７記載のベクターを細胞に導入し、該細胞を培養し、該細胞内もしくは該細胞の培養液中に糖鎖欠損型ＨＧＦの部分蛋白質を産生せしめ、該細胞内もしくは該細胞の培養液中から糖鎖欠損型ＨＧＦの部分蛋白質を採取し精製することを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の糖鎖欠損型ＨＧＦの部分蛋白質の製造法。
【請求項９】
細胞が真核細胞である請求項８に記載の糖鎖欠損型ＨＧＦの部分蛋白質の製造法。
【請求項１０】
真核細胞が酵母または昆虫細胞である請求項９記載の糖鎖欠損型ＨＧＦの部分蛋白質の製造法。
【請求項１１】
請求項７記載のベクターを昆虫個体に導入し、昆虫個体中に糖鎖欠損型ＨＧＦの部分蛋白質を産生せしめ、該昆虫個体から糖鎖欠損型ＨＧＦの部分蛋白質を採取し精製することを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の糖鎖欠損型ＨＧＦの部分蛋白質の製造法。
【請求項１２】
請求項７記載のベクターを糖鎖付加能のない細胞に導入し、該細胞を培養し、該細胞内もしくは該細胞の培養液中に糖鎖欠損型ＨＧＦの部分蛋白質を産生せしめ、該細胞内もしくは該細胞の培養液中から糖鎖欠損型ＨＧＦの部分蛋白質を採取し精製することを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の糖鎖欠損型ＨＧＦの部分蛋白質の製造法。
【請求項１３】
請求項１〜５のいずれかに記載の糖鎖欠損型ＨＧＦの部分蛋白質を有効成分とする医薬。
【請求項１４】
血管新生抑制剤である請求項１３記載の医薬。
【請求項１５】
ｃ−Ｍｅｔ／ＨＧＦ受容体を介するＨＧＦの作用に対するアンタゴニストである請求項１３記載の医薬。
【請求項１６】
腫瘍の浸潤、成長または転移抑制剤である請求項１３〜１５のいずれかに記載の医薬。
【請求項１７】
アポトーシス誘導剤である請求項１３〜１５のいずれかに記載の医薬。
【請求項１８】
感染症の予防または／および治療剤である請求項１３記載の医薬。
【請求項１９】
マラリアまたはリステリアによって引き起こされる感染症である請求項１８記載の医薬。
【請求項２０】
請求項６記載のＤＮＡを含む遺伝子治療薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌または過剰な血管新生による疾患を予防・治療するためのＨＧＦ（肝細胞増殖因子）の部分蛋白質の改変体に関する。より詳細には、糖鎖を欠損させることによって改変したＨＧＦの部分蛋白質に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌の治療には、外科的療法、化学療法、放射線療法、あるいはこれらを組み合わせた集学的療法等が行われているが、画期的な制癌法の確立には未だ至っていない。原発腫瘍は外科的療法によって取り除くことが可能であるが、膵臓癌や肺癌のように転移しやすい癌では、原発腫瘍のサイズがたとえ小さい場合であっても、発見された際にはすでに目に見えない小さな転移癌を形成していることが多く、これらを外科的に取り除くことは困難である。また、抗癌剤を用いる化学療法や放射線療法では、原発腫瘍が一時的に小さくなったとしても、耐性癌の再発や、生き残った癌の転移を防ぐことは難しい。また、抗癌剤や放射線治療は、癌細胞だけではなく正常細胞をも殺す結果、激しい副作用を伴うことにより、患者の生活の質や免疫力を低下させる。このように、癌転移を効果的に阻止する方法がないのが現状であり、癌転移の阻止に有効な薬剤の開発が切望されている。
【０００３】
癌転移の機構に関しては過去に多くの研究が行われている。癌の多くは上皮組織で発生し、癌細胞が原発腫瘍から離脱し、上皮組織を区切っている基底膜を破り、周囲の組織へ浸潤し、血管やリンパ管に侵入して血液やリンパ液の流れによって遠隔の組織に運ばれ、再び血管やリンパ管から血管新生を伴いながら組織に浸潤・成長し、転移が成立する。
癌転移を抑制するためには、これらの各プロセスのいずれかを阻止すればよいと考えられ、癌転移抑制剤としては、例えば、転移先の血管内皮細胞との接着を抑制する物質（非特許文献１参照。）、血管新生阻害剤（非特許文献２参照。）、癌細胞の浸潤を抑制する物質（特許文献１参照。）、基底膜分解酵素の阻害物質（特許文献２、非特許文献３参照。）等が挙げられる。
【０００４】
最近、癌治療に関し、腫瘍休眠療法が注目を浴びている。腫瘍休眠療法とは、血管新生阻害剤を用いて、癌細胞を休眠状態にするものである。血管新生阻害剤は、癌細胞を直接殺傷するのではなく、血管新生を阻害することにより、癌細胞の成長に必要な栄養、酸素の供給経路を絶ち、アポトーシスを誘導し、癌細胞を休眠状態にする。血管新生阻害剤としては、アンジオスタチン（非特許文献２参照。）、エンドスタチン（非特許文献４参照。）等が知られている。
【０００５】
血管新生は、既存血管の毛細血管増殖により生じる。血管新生は胚発生、創傷治癒、及び組織又は臓器再生等の多数の生理学的プロセスに不可欠である一方、腫瘍成長等の病態や、転移腫瘍部位では、異常な血管新生が生じる。腫瘍血管新生の開始は、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ），塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、ＨＧＦ（ＨＧＦ；Hepatocyte  growth  factor）等によって誘発されることが知られている。
ＨＧＦは、このような血管新生作用に加えて、マイトゲン活性、モートゲン活性、モルフォゲン活性を有し、本来は生体の自然治癒力を支える再生因子として働いている。ＨＧＦの多彩な作用は、ＨＧＦが標的細胞上のｃ−Ｍｅｔ／ＨＧＦ受容体に結合することで発揮されることが知られている。ｃ−Ｍｅｔ／ＨＧＦ受容体は、癌細胞においてしばしば過剰に発現していることが知られており（非特許文献５〜７参照。）、ＨＧＦは腫瘍細胞に対しては浸潤・転移を誘発する（非特許文献８参照。）。癌細胞は、癌細胞をとりまく間質細胞との相互作用により、生体のもつＨＧＦの作用を利用しながら、浸潤、転移を誘発する（非特許文献８、９参照。）。したがって、ＨＧＦが腫瘍細胞のｃ−Ｍｅｔ／ＨＧＦ受容体に結合することを阻害することができれば、腫瘍の浸潤、転移を抑制することができると考えられる。
【０００６】
ＮＫ４は、ＨＧＦのα鎖のＮ末端ヘアピンドメインと４つのクリングルドメインからなる蛋白質である。ＮＫ４は、ｃ−Ｍｅｔ／ＨＧＦ受容体に結合し、ＨＧＦのアンタゴニストとして作用する（非特許文献１０，１１参照。）。ＮＫ４は、ＨＧＦアンタゴニスト活性により腫瘍の浸潤、転移を抑制することが知られている。さらに、ＮＫ４は、ＨＧＦアンタゴニスト活性とは別のメカニズムによって、ＨＧＦだけではなく、ＶＥＧＦやｂＦＧＦによる血管新生をも抑制することが知られている（非特許文献１２参照。）。このように、ＮＫ４はＨＧＦアンタゴニスト活性と血管新生阻害作用を同時に有する２機能性分子であり、ＮＫ４は新しい抗癌剤としての利用が期待されている。
【０００７】
また、ＮＫ４は血管新生阻害作用に基づいて、血管異常増殖に起因する種々の疾患、例えばリウマチ性関節炎，糖尿病性網膜症，未熟児網膜症，老人黄班部変性，創傷治癒時の過剰瘢痕形成等の予防又は治療剤としての利用も期待できる。上述のごとく、血管新生は正常な状態においては組織の代謝を維持し、生体の機能的恒常性を保持するのに不可欠であるが、異常な血管新生は炎症性疾患を含む種々の疾患に関係していることが知られている。例えば、増殖性糖尿病、尋常性乾癬、リウマチ性関節炎、糖尿病性網膜症、老人黄班部変性，創傷治癒時の過剰瘢痕形成等の疾患及び固形腫瘍の転移や再発は、血管、特に末梢毛細血管の異常増殖に起因することが報告されている（非特許文献１３、１４参照。）。これらの疾患に対する予防又は治療剤として、血管新生阻害作用を有するＮＫ４は有望である。
【０００８】
さらに、ＮＫ４は、リステリアやマラリアの感染予防薬・治療薬としての用途も期待できる。リステリア菌はヒトに感染する際、ｃ−Ｍｅｔ／ＨＧＦ受容体を感染の足場としている（非特許文献１５参照。）ことや、マラリア原虫の感染では、ｃ−Ｍｅｔ／ＨＧＦ受容体をＨＧＦが活性化することが感染の初期の機構に必須である（非特許文献１６参照。）ことが知られている。従って、ＨＧＦアンタゴニストであるＮＫ４はこれらの感染症に対して、予防・治療の効果を示すと考えられる。
【０００９】
以上のように多種の疾患の予防・治療に効果を発揮するＮＫ４蛋白質を医薬製剤として用いるためには、遺伝子工学的手法により細胞を用いて大量に生産する必要がある。従来、ＮＫ４はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞等の動物細胞を用いて生産できることが知られている（特許文献３参照。）が、一般にＣＨＯ細胞等の動物細胞を用いて蛋白質を生産する方法はコストが高く、引いては薬価の上昇につながることが考えられる。
【００１０】
安価に蛋白質を組換え生産する方法としては、大腸菌等の原核生物に目的遺伝子を導入して発現させる方法が知られている（非特許文献１７参照。）。しかし、大腸菌等の原核生物で生産した組換え蛋白質には糖鎖が付加されないという問題がある。これは、大腸菌等の原核生物には糖鎖生合成の場である小胞体およびゴルジ体が存在しないからである。
【００１１】
動物細胞内での蛋白質への糖鎖付加および糖鎖の修飾は、ＤＮＡあるいは蛋白質の生合成の場合とは異なり、鋳型によらない翻訳後修飾（post-translational  modification）である。この翻訳後修飾は小胞体およびゴルジ体と呼ばれる細胞内小器官に局在する数多くの糖鎖生合成関連酵素が介在する複雑な機構を通して行われる。すなわち、特定の単糖と、その結合様式に特異的な酵素（糖加水分解酵素および糖転移酵素）の連携による複雑な生合成経路に従って、単糖が順次切り取られたり付加されたりしながら、所定の糖鎖構造が得られるように糖鎖が伸長されていく（非特許文献１８参照。）。このようにして蛋白質に付加される糖鎖は高等生物の生命現象全般に深く関わっていることが知られている（非特許文献１９，２０参照。）。
【００１２】
ヒト体内の蛋白質の半数以上は糖鎖が付加された糖蛋白質として存在することが知られており（非特許文献２１参照。）、本来糖鎖の付加された形で存在する糖蛋白質を糖鎖のない状態にすると、活性を失うことが懸念される。例えば、赤血球造血ホルモンとして知られるエリスロポチンでは糖鎖を除去すると薬効を失ってしまうことが知られている（非特許文献２２参照。）。
【００１３】
蛋白質を安価に生産できる宿主で糖鎖付加の能力を有する細胞としては酵母が知られている（非特許文献２３〜２５参照。）。酵母は真核生物であり、小胞体およびゴルジ体を有しているため、糖鎖生合成機構が備わっている。しかし、酵母の糖鎖生合成機構は動物細胞とは大きく異なっているため、糖鎖付加部位を有する蛋白質を酵母で生産すると、酵母型の糖鎖が付加されることになる。酵母の糖鎖構造はヒトその他の哺乳動物の糖鎖構造とは大きく異なっており（非特許文献２６参照。）、このような組換え蛋白質はヒトその他の哺乳動物に対して抗原性を示すのでヒトおよび動物の医薬品として用いることはできない。
【００１４】
また、昆虫細胞も糖鎖付加能を有する宿主であって、比較的安価に蛋白質を生産することができるが、昆虫細胞の糖鎖構造もヒト型の糖鎖構造とは異なり（非特許文献２７参照。）、ヒトその他の哺乳動物に対して抗原性を示す可能性がある。
そこで、酵母や昆虫細胞等を用いて生産した蛋白質から糖鎖を除去するか、もしくは蛋白質分子中の糖鎖付加部位に変異が導入されるようにした遺伝子を酵母や昆虫細胞等に導入することで、糖鎖付加のない蛋白質をつくることが考えられる。しかし、上述のように、本来糖鎖の付加された形で存在する蛋白質を糖鎖のない状態にすると、活性を失うことが懸念される。
【００１５】
ＮＫ４はＨＧＦα鎖の断片であり、ＨＧＦα鎖の３ヶ所の糖鎖付加部位（非特許文献２８、２９参照。）を含んでいるが、ＮＫ４から糖鎖を除去した場合にＮＫ４が活性を有するかどうかについては全く知られていない。
【特許文献１】特開平３−３１２１４号公報
【特許文献２】特開平５−１９４４１４号公報
【特許文献３】特開２００３−２５０５４９号公報
【非特許文献１】イワモト・ワイ（Ｉｗａｍｏｔｏ．Ｙ）ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、１９８７年、ｐ．１１３２−１１３４
【非特許文献２】カオ・ワイ（Ｃａｏ．Ｙ）ら、ザ・ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲイション（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ）、１９８８年、第１０１巻、ｐ．１０５５−１０６３
【非特許文献３】イリムラ・ティー（Ｉｒｉｍｕｒａ．Ｔ）ら、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、１９８９年、第２５巻、ｐ．５３２２−５３２８
【非特許文献４】ブレジンガー・ピー（Ｂｌｅｚｉｎｇｅｒ．Ｐ）ら、ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．）、１９９９年、第１７巻、ｐ．３４３−３４８
【非特許文献５】ディー・レンゾー（Ｄｉ．  Ｒｅｎｚｏ）ら、オンコジーン（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ）、１９９１年、第６巻、ｐ．１９９７−２００３
【非特許文献６】ディー・レンゾー（Ｄｉ．  Ｒｅｎｚｏ）ら、キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ）、１９９５年、第５５巻、ｐ．１１２９−１１３８
【非特許文献７】ナカジマ・エム（Ｎａｋａｊｉｍａ．Ｍ）ら、キャンサー（Ｃａｎｃｅｒ）、１９９９年、第８５巻、ｐ．１８９４−１９０２（１９９９）
【非特許文献８】ジアング・ワイ・ジー（Ｊｉａｎｇ．Ｗ．Ｇ）ら、クリティカル・レビュー・イン・オンコロジー／ヘマトロジー（Ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  ｏｎｃｏｌｏｇｙ／ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ）、１９９９年、第２９巻、ｐ．２０９−２４８
【非特許文献９】ナカムラ・ティー（Ｎａｋａｍｕｒａ．Ｔ）ら、キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ）、１９９７年、第５７巻、ｐ．３３０５−３３１３
【非特許文献１０】ダテ・ケー（Ｄａｔｅ．Ｋ）ら、エフ・イー・ビー・エス・レターズ（ＦＥＢＳ  ｌｅｔｔｅｒｓ）、１９９７年、第４２０巻、ｐ．１−６
【非特許文献１１】ダテ・ケー（Ｄａｔｅ．Ｋ）ら、オンコジーン（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ）、１９９８年、第１７巻、ｐ．３０４５−３０５４
【非特許文献１２】クバ・ケー（Ｋｕｂａ．Ｋ）ら、キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ）、２０００年、第６０巻、ｐ．６７３７−６７４３
【非特許文献１３】ポルベリーニ・ピー・ジェイ（Ｐｏｌｖｅｒｉｎｉ  ＰＪ．）、クリティカル・レヴューズ・イン・オーラル・バイオロジー・アンド・メディシン（Ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  ｏｒａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、１９９５年、第６巻（３号）、ｐ．２３０−２４７
【非特許文献１４】フォルクマン・ジェイ（Ｆｏｒｋｍａｎ  Ｊ．）、ネイチャー・メディシン（Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、１９９５年、第１巻（１号）、ｐ．２７−３１
【非特許文献１５】シェーン・ワイ（Ｓｈｅｎ，Ｙ．）ら、セル（Ｃｅｌｌ）、２０００年、第１０３巻、ｐ．５０１−５１０
【非特許文献１６】キャロロ・エム（Ｃａｒｒｏｌｏ，Ｍ．）ら、ネイチャー・メディシン（Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ）、２００３年、第９巻、ｐ．１３６３−１３６９
【非特許文献１７】スワーツ・ジェイ・アール（Ｓｗａｒｔｓ，Ｊ．Ｒ．）、カレント・オピニオン・イン・バイオテクノロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、２００１年、第１２巻、ｐ．１９５−２０１
【非特許文献１８】コーンフェルド・アール（Ｋｏｒｎｆｅｌｄ，Ｒ．）他１名、アニュアル・レビュー・オブ・バイオケミストリー（Ａｎｎｕａｌ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、１９８５年、第５４巻、ｐ．６３１−６６４
【非特許文献１９】コバタ・エー（Ｋｏｂａｔａ，Ａ．）、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、１９９２年、第２０９巻、ｐ．４８３−５０１
【非特許文献２０】バーキ・エー（Ｖａｒｋｉ，Ａ）、グリコバイオロジー（Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ）、１９９３年、第３巻、ｐ．９７−１３０
【非特許文献２１】グーチー・シー・エフ（Ｇｏｏｃｈｅｅ，Ｃ．Ｆ．）ら、バイオテクノロジー（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｇｙ）、１９９１年、第９巻、ｐ．１３４７−１３５５
【非特許文献２２】タケウチ・エム（Ｔａｋｅｕｃｈｉ，Ｍ．）他１名、グリコバイオロジー（Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ）、１９９１年、第１巻、ｐ．３３７−３４６
【非特許文献２３】ウィスマン・エー（Ｗｉｓｅｍａｎ  Ａ．）、エンデボーア（Ｅｎｄｅａｖｏｕｒ）、１９９６年、第２０巻、ｐ．１３０−１３２
【非特許文献２４】ラッセル・シー（Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｃ．）ら、オーストラリアン・ジャーナル・オブ・バイオテクノロジー（Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．）、１９９１年、第５巻、ｐ．４８−５５
【非特許文献２５】ブックホルツ・アール・ジー（Ｂｕｃｋｈｏｌｚ，Ｒ．Ｇ）他１名、バイオテクノロジー（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、１９９１年、第９巻、ｐ．１０６７−１０７２
【非特許文献２６】ジェミリ・ティー・アール（Ｇｅｍｍｉｌｌ，Ｔ．Ｒ．）他１名、バイオチミカ・エト・バイオフィジカ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  ａｃｔａ）、１９９９年、第１４２６巻、ｐ．２２７−２３７
【非特許文献２７】アルトマン・エフ（Ａｌｔｍａｎｎ，Ｆ．）ら、グリココンジュゲイト・ジャーナル（Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｊｏｕｒｎａｌ）、１９９９年、第１６巻、ｐ．１０９−１２３
【非特許文献２８】ハラ・エイチ（Ｈａｒａ，Ｈ．）ら、ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、１９９３年、第１１４巻、ｐ．７６−８２
【非特許文献２９】シミズ・エヌ（Ｓｈｉｍｉｚｕ，Ｎ．）ら、バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ）、１９９２年、第１８９巻、ｐ．１３２９−１３３５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明の課題は、ＨＧＦの部分蛋白質、特にＨＧＦα鎖および、α鎖分子内断片の糖鎖を欠損させた改変体およびその製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明者らは上記課題を解決すべくＮＫ４蛋白質の糖鎖機能に関する研究を鋭意重ねた結果、ＮＫ４蛋白質の糖鎖を除去してもＮＫ４の機能が保持されることを見出した。ＨＧＦアンタゴニスト活性と血管新生阻害作用とを同時に有する２機能性分子であるＮＫ４蛋白質が、糖鎖を除去してもこれらの機能を保持していることは全く予想外のことであった。以上の発見に基づき、本発明者らはさらに研究を進め本発明の完成に至った。
【００１８】
すなわち、本発明は、
（１）  ＨＧＦα鎖の糖鎖付加部位の少なくとも一ヶ所の糖鎖が欠損し、次の（ａ）から（ｃ）のいずれかの蛋白質であって、前記蛋白質はＮ末端ヘアピンドメインとそれに続く４つのクリングルドメインを有し、かつｃ−Ｍｅｔ／ＨＧＦ受容体を介するＨＧＦの作用に対するアンタゴニスト活性を有するとともに血管新生抑制作用を有することを特徴とする糖鎖欠損型ＨＧＦの部分蛋白質；
（ａ）配列番号１の第３２位から第４９４位で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質；
（ｂ）配列番号１の第３２位から第４９４位において、１〜３０個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を有する蛋白質；または
（ｃ）配列番号１の第３２位から第４９４位のアミノ酸と少なくとも８０％以上の相同性を有する蛋白質、
（２）  蛋白質の少なくとも１ヶ所の糖鎖付加部位のアミノ酸配列において、糖鎖が付加されないようにアミノ酸が置換されている上記（１）記載の糖鎖欠損型ＨＧＦの部分蛋白質、
（３）  アミノ酸の置換が、次の（ａ）から（ｄ）の少なくとも一つであることを特徴とする上記（２）記載の糖鎖欠損型ＨＧＦの部分蛋白質；
（ａ）アミノ酸配列がＡｓｎ−Ｘ−ＳｅｒまたはＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ（ＸはＰｒｏ以外のアミノ酸を示す）で示されるＮ−結合型糖鎖付加のコンセンサス配列のうち、少なくとも一つのコンセンサス配列のＡｓｎが他のアミノ酸に置換されている；
（ｂ）アミノ酸配列がＡｓｎ−Ｘ−ＳｅｒまたはＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ（ＸはＰｒｏ以外のアミノ酸を示す）で示されるＮ−結合型糖鎖付加のコンセンサス配列のうち、一つのコンセンサス配列のＳｅｒまたはＴｈｒ、あるいは２以上のコンセンサス配列のＳｅｒまたは／およびＴｈｒが他のアミノ酸に置換されている；
（ｃ）アミノ酸配列がＡｓｎ−Ｘ−ＳｅｒまたはＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ（ＸはＰｒｏ以外のアミノ酸を示す）で示されるＮ−結合型糖鎖付加のコンセンサス配列のうち、少なくとも一つのコンセンサス配列のＸがＰｒｏに置換されている；または
（ｄ）Ｏ−結合型糖鎖付加を受けるＳｅｒまたはＴｈｒのうち、少なくとも一つのＳｅｒまたはＴｈｒが他のアミノ酸に置換されている、
（４）  アミノ酸の置換が、次の（ａ）から（ｄ）の少なくとも一つであることを特徴とする上記（２）記載の糖鎖欠損型ＨＧＦの部分蛋白質；
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の第２９４位または／および第２９６位のアミノ酸が他のアミノ酸に、または／および第２９５位のアミノ酸がＰｒｏに置換されていることによって第２９４位に糖鎖が付加されていない；
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の第４０２位または／および第４０４位のアミノ酸が他のアミノ酸に、または／および第４０３位のアミノ酸がＰｒｏに置換されていることによって第４０２位に糖鎖が付加されていない；または
（ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列の第４７６位のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されていることによって第４７６位に糖鎖が付加されていない、
（５）  配列番号１で示されるアミノ酸配列の第１６２位から第１６６位のアミノ酸が欠失していることを特徴とする上記（１）〜（４）のいずれかに記載の糖鎖欠損型ＨＧＦの部分蛋白質、および
（６）  配列番号１で示されるアミノ酸配列の第４７９位から第４９４位のアミノ酸が欠失していることを特徴とする上記（１）〜（５）のいずれかに記載の糖鎖欠損型ＨＧＦの部分蛋白質、
に関する。
【００１９】
また、本発明は、
（７）  上記（１）〜（６）のいずれかに記載の糖鎖欠損型ＨＧＦの部分蛋白質をコードする塩基配列からなるＤＮＡ、
（８）  上記（７）記載のＤＮＡを組み込んだベクター、
（９）  上記（８）記載のベクターを細胞に導入し、該細胞を培養し、該細胞内もしくは該細胞の培養液中に糖鎖欠損型ＨＧＦの部分蛋白質を産生せしめ、該細胞内もしくは該細胞の培養液中から糖鎖欠損型ＨＧＦの部分蛋白質を採取し精製することを特徴とする上記（１）〜（６）のいずれかに記載の糖鎖欠損型ＨＧＦの部分蛋白質の製造法、
（１０）  細胞が真核細胞である上記（９）に記載の糖鎖欠損型ＨＧＦの部分蛋白質の製造法、
（１１）  真核細胞が酵母または昆虫細胞である上記（１０）記載の糖鎖欠損型ＨＧＦの部分蛋白質の製造法、
（１２）  上記（８）記載のベクターを昆虫個体に導入し、昆虫個体中に糖鎖欠損型ＨＧＦの部分蛋白質を産生せしめ、該昆虫個体から糖鎖欠損型ＨＧＦの部分蛋白質を採取し精製することを特徴とする上記（１）〜（６）のいずれかに記載の糖鎖欠損型ＨＧＦの部分蛋白質の製造法、
（１３）  糖鎖を有するＨＧＦの部分蛋白質を酵素で処理することによって糖鎖を全部または部分的に除去し、該酵素反応液から糖鎖欠損型ＨＧＦの部分蛋白質を採取し精製することを特徴とする上記（１）〜（６）のいずれかに記載の糖鎖欠損型ＨＧＦの部分蛋白質の製造法、
（１４）  糖鎖を有するＨＧＦの部分蛋白質をコードする塩基配列を有するＤＮＡを組み込んだベクターまたは上記（８）記載のベクターを糖鎖付加能のない細胞に導入し、該細胞を培養し、該細胞内もしくは該細胞の培養液中に糖鎖欠損型ＨＧＦの部分蛋白質を産生せしめ、該細胞内もしくは該細胞の培養液中から糖鎖欠損型ＨＧＦの部分蛋白質を採取し精製することを特徴とする上記（１）〜（６）のいずれかに記載の糖鎖欠損型ＨＧＦの部分蛋白質の製造法、
（１５）  糖鎖を有するＨＧＦの部分蛋白質をコードする塩基配列を有するＤＮＡまたは上記（７）に記載のＤＮＡを鋳型として無細胞蛋白質合成システムによって糖鎖欠損型ＨＧＦの部分蛋白質を合成し、該合成反応液から糖鎖欠損型ＨＧＦの部分蛋白質を採取し精製することを特徴とする上記（１）〜（６）のいずれかに記載の糖鎖欠損型ＨＧＦの部分蛋白質の製造法、
（１６）  ＨＧＦの糖鎖付加部位の全部または少なくとも一ヶ所において糖鎖を欠損するＨＧＦをプロテアーゼで処理するかまたは化学的な処理によって限定分解し、該処理液から糖鎖欠損型ＨＧＦの部分蛋白質を採取し精製することを特徴とする上記（１）〜（６）のいずれかに記載の糖鎖欠損型ＨＧＦの部分蛋白質の製造法、および
（１７）  プロテアーゼがエラスターゼであることを特徴とする上記（１６）記載の製造法、
に関する。
【００２０】
また、本発明は、
（１８）  上記（１）〜（６）のいずれかに記載の糖鎖欠損型ＨＧＦの部分蛋白質を有効成分とする医薬、
（１９）  血管新生抑制剤である上記（１８）記載の医薬、
（２０）  ｃ−Ｍｅｔ／ＨＧＦ受容体を介するＨＧＦの作用に対するアンタゴニストである上記（１８）記載の医薬、
（２１）  腫瘍の浸潤、成長または転移抑制剤である上記（１８）〜（２０）のいずれかに記載の医薬、
（２２）  アポトーシス誘導剤である上記（１８）〜（２０）のいずれかに記載の医薬、
（２３）  感染症の予防または／および治療剤である上記（２０）記載の医薬、
（２４）  マラリアまたはリステリア原虫によって引き起こされる感染症である上記（２３）記載の医薬、および
（２５）  上記（７）記載のＤＮＡを含む遺伝子治療薬、
に関する。
さらに、本発明は、血管新生抑制などのための医薬製剤の製造のための糖鎖欠損型ＨＧＦの部分蛋白質の使用、糖鎖欠損型ＨＧＦの部分蛋白質を有効成分とする医薬を患者に投与することにより血管新生などを予防、治療する方法に関する。また、本発明は、血管新生抑制などのための遺伝子治療薬の製造のための糖鎖欠損型ＨＧＦの部分蛋白質をコードするＤＮＡの使用、糖鎖欠損型ＨＧＦの部分蛋白質をコードするＤＮＡを含む遺伝子治療薬を患者に投与することにより血管新生などを予防、治療する方法に関する。
【発明の効果】
【００２１】
本発明の糖鎖欠損型ＨＧＦの部分蛋白質（以下、糖鎖欠損型ＨＧＦの部分蛋白質と略称する。）は、酵母や昆虫細胞での生産が可能であるため、糖鎖欠損型ＨＧＦの部分蛋白質を安価に生産することができる。特に、糖鎖欠損型ＮＫ４を安価に生産することが可能になる事の意義が大きい。
本発明の糖鎖欠損型ＨＧＦの部分蛋白質（例えば糖鎖欠損型ＮＫ４）は、ＨＧＦアンタゴニスト活性および血管新生抑制作用等において糖鎖を有するＨＧＦの部分蛋白質（例えばＮＫ４）と同等の活性を有するので、糖鎖を有するＨＧＦの部分蛋白質（例えばＮＫ４）の代替品となり得る。従って、本発明の糖鎖欠損型ＨＧＦ部分蛋白質は、腫瘍の浸潤抑制、成長抑制、転移抑制、アポトーシス誘導または／および血管新生抑制等に用いることができる。また、本発明の糖鎖欠損型ＨＧＦの部分蛋白質をコードするＤＮＡを含む医薬は遺伝子治療薬として用いることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明において「糖鎖欠損型ＨＧＦの部分蛋白質」とは、ＨＧＦα鎖の糖鎖付加部位の全部または少なくとも一ヶ所、好ましくは全ての糖鎖が欠損しているＨＧＦの部分蛋白質をいう。「ＨＧＦの部分蛋白質」は、ヒトおよび哺乳動物（例えば、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ等）の、例えば配列番号１の第３２位から第４９４位で示されるアミノ酸配列を有し、Ｎ末端ヘアピンドメインとそれに続く４つのクリングルドメイン構造を有するＨＧＦα鎖蛋白質、および少なくとも前記Ｎ末端ヘアピンドメインとそれに続く４つのクリングルドメインを有するＨＧＦの分子内断片の蛋白質、好ましくはＨＧＦα鎖の分子内断片の蛋白質をいう。ＨＧＦα鎖の分子内断片の蛋白質としては、ＨＧＦα鎖（例えば配列番号１の第３２位から第４９４位）において、１〜３０個、好ましくは１〜２５個、より好ましくは１〜２１個のアミノ酸が欠失した蛋白質が挙げられる。具体的には、例えば配列番号１で示されるアミノ酸配列のうち第１６２位から第１６６位が欠失した、配列番号２の第３２位から第４８９位で示される５アミノ酸欠失型ＨＧＦα鎖が挙げられる。また、例えば配列番号１の第３２位から第４７８位までのアミノ酸配列で示されるＮＫ４（配列番号１で示されるアミノ酸配列の第４７９位から第４９４位のアミノ酸が欠失したもの。）、および、例えば配列番号２の第３２位から第４７３位までのアミノ酸配列で示されるＮＫ４（配列番号２で示されるアミノ酸配列の第４７４位から第４８９位のアミノ酸が欠失したもの。）等が挙げられる。
また、本発明の糖鎖欠損型ＨＧＦの部分蛋白質において、ＨＧＦα鎖（例えば配列番号１の第３２位から第４９４位）のアミノ酸配列のうち１〜３０個、好ましくは１〜２５個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を有する蛋白質とは、遺伝子工学的手法または／および突然変異等によりアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入された蛋白質をいう。具体的には、上記したＨＧＦα鎖の分子内断片の蛋白質、ＨＧＦα鎖のＮ末側または／およびＣ末側にアミノ酸が付加された蛋白質、または／および、遺伝子工学的手法によりＨＧＦα鎖の糖鎖付加部位のアミノ酸配列のアミノ酸が、糖鎖が付加しないよう欠失、置換、付加または挿入等された蛋白質をいう。また、特異的突然変異誘発法等の周知の技術的方法によりアミノ酸が欠失、置換、付加または挿入等された蛋白質、および天然に生じうる程度の数（１〜数個）のアミノ酸が、欠失、置換、付加または挿入等された蛋白質も含まれる。
また、糖鎖欠損型ＨＧＦの部分蛋白質において、ＨＧＦα鎖のアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上の相同性を有する蛋白質も含まれる。本発明において「相同性」とは、蛋白質の一次構造を比較し、配列間において各々の配列を構成するアミノ酸残基の一致の程度の意味である。
また、蛋白質のＮ末端アミノ酸として修飾アミノ酸残基ピログルタミン酸を有するものも本発明の糖鎖欠損型ＨＧＦの部分蛋白質に包含される。
また、本発明の糖鎖欠損型ＨＧＦの部分蛋白質は、ｃ−Ｍｅｔ／ＨＧＦ受容体を介するＨＧＦの作用に対するアンタゴニスト活性を有するとともに血管新生抑制作用を有する蛋白質である。ｃ−Ｍｅｔ／ＨＧＦ受容体を介するＨＧＦの作用としては、ｃ−Ｍｅｔ／ＨＧＦレセプターのチロシンリン酸化作用、モートゲン活性（ｍｏｔｏｇｅｎｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）、マイトゲン活性（ｍｉｔｏｇｅｎｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）及びモルフォゲン活性（ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）を挙げることができる（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，Ｋ．  ａｎｄ  Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｔ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９９７年、第２３９巻、ｐ．６３９−６４４）。血管新生抑制作用とは、血管の新生を抑制する作用であればその機序の別を問うものではないが、好適にはＨＧＦ、ＦＧＦ、ＶＥＧＦが関与する血管新生を抑制する作用を意味する。
【００２３】
ＨＧＦの部分蛋白質の糖鎖の欠損は、好ましくはＨＧＦα鎖の糖鎖付加部位の少なくとも一ヶ所において糖鎖が付加されないようにアミノ酸配列のアミノ酸が欠失、置換、付加するように塩基配列に変異を導入することにより生じさせることができるが、糖鎖を有するＨＧＦの部分蛋白質を酵素で処理することによって生じさせる場合も含まれる。
【００２４】
ＨＧＦα鎖の糖鎖付加部位の少なくとも一ヶ所において糖鎖が付加されないようにＨＧＦの部分蛋白質の遺伝子に変異を導入する方法としては、欠損させたい糖鎖の付加部位のアミノ酸配列に対応する塩基配列に変異を導入するのがよい。蛋白質に糖鎖が付加する場合、糖鎖にはＮ−結合型糖鎖とＯ−結合型糖鎖があるので、それぞれについて次のような変異を導入する。
Ｎ−結合型糖鎖にはコンセンサス配列〔Ａｓｎ−Ｘ−ＳｅｒまたはＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ（Ｘはプロリン以外のアミノ酸を示す。）〕が知られている。コンセンサス配列が存在するときにはＡｓｎに糖鎖が結合する（Ｋｏｂａｔａ，Ａ．、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９９２年、第２０９巻、ｐ．４８３−５０１）。このため、コンセンサス配列中のＡｓｎを他のアミノ酸（例えば、Ｇｌｎなど）に変換するか、あるいは、ＳｅｒまたはＴｈｒを他のアミノ酸（例えば、Ｇｌｙ、Ａｌａなど）に変換するように塩基配列に変異を導入することで、該当部位のＮ−結合型糖鎖を欠損させることができる。この場合、変換に用いるアミノ酸は、上記コンセンサス配列の前後のアミノ酸配列と新たなコンセンサス配列を形成しないアミノ酸を適宜選択するのが好ましい。また、コンセンサス配列中のＸの部位にプロリンが導入されるように塩基配列に変異を導入してもよい。
Ｏ−結合型糖鎖にはコンセンサス配列は存在しないが、Ｏ−結合型糖鎖では、ＳｅｒかＴｈｒの水酸基に糖鎖が付加するので、Ｏ−結合型糖鎖付加を受ける部位のＳｅｒまたはＴｈｒを他のアミノ酸（例えば、Ｇｌｙなど）に変換するように塩基配列に変異を導入することで該当部位の糖鎖を欠損させることができる。この場合、変換に用いるアミノ酸は、該アミノ酸の前後のアミノ酸配列と上記コンセンサス配列を形成しないアミノ酸を適宜選択するのが好ましい。
【００２５】
糖鎖欠損型ＨＧＦの部分蛋白質の糖鎖欠損部位は、ＨＧＦの部分蛋白質の糖鎖付加部位に一致し、例えば配列番号１の第３２位から第４７８位で示されるアミノ酸配列を有するヒトＨＧＦのα鎖の分子内断片の部分蛋白質であるＮＫ４においては、配列番号１の第２９４位のＡｓｎ（Ｎ−結合型）、第４０２位のＡｓｎ（Ｎ−結合型）、第４７６位のＴｈｒ（Ｏ−結合型）である。また、配列番号２の第３２位から第４７３位で示されるアミノ酸配列を有する５アミノ酸欠失型ヒトＨＧＦのα鎖の分子内断片であるＮＫ４（以下、５アミノ酸欠失型ＮＫ４と略記する。）における糖鎖付加部位は、配列番号２の第２８９位のＡｓｎ（Ｎ−結合型）、第３９７位のＡｓｎ（Ｎ−結合型）、第４７１位のＴｈｒ（Ｏ−結合型）である。また上記ＮＫ４の上記コンセンサス配列は、配列番号１で示されるアミノ酸配列の第２９４位から第２９６位、第４０２位から第４０４位に存在し、５アミノ酸欠失型ＮＫ４では、配列番号２で示されるアミノ酸配列の第２８９位から第２９１位、第３９７位から第３９９位に存在する。
【００２６】
塩基配列に変異を導入する方法としては、例えばＮＫ４をコードするＤＮＡに変異を導入する場合、変異を導入したい部分に対応する変異プライマーを合成し、クンケル法等の既知の技術を用いて行うことができる。また、市販の変異導入キット等を用いるとより簡便に変異を導入することができる。また、ＮＫ４の公知の塩基配列情報から、変異を導入したい部分の塩基配列を改変し、従来公知の方法を用いて化学合成によりＤＮＡを製造することもできる。化学合成法としては、例えば、フォスフォアミダイト法を利用したＤＮＡ合成機ｍｏｄｅｌ  ３９２（パーキン・エルマー株式会社製）等のＤＮＡ合成機で化学合成する方法が挙げられる。
ＨＧＦα鎖の部分蛋白質、例えばＮＫ４をコードするＤＮＡは、例えば、特開２００３−２５０５４９号公報に記載の方法または記載の方法に準じて得ることができる。例えば、公知のＨＧＦの塩基配列に基づいたプライマーを調製し、ヒトの組織又は細胞に含まれるＨＧＦｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡあるいはｃＤＮＡライブラリーから選択したＨＧＦｃＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ法を用いてＤＮＡの増幅を行い、ＮＫ４をコードするＤＮＡを取得することができる。また、ヒトの組織又は細胞に含まれるｍＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲ法によってｃＤＮＡ増幅することもできる。また、上記化学合成により得ることもできる。
糖鎖欠損型ＨＧＦの部分蛋白質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを含有するプラスミドやファージ等の組換ベクターから、制限酵素によって該ＤＮＡを切り出し、糖鎖欠損型ＨＧＦの部分蛋白質の発現に適したベクターのプロモーターの下流に制限酵素とＤＮＡリガーゼを用いて再結合して組換発現ベクターを作製することが出来る。より詳しくは、転写の下流方向に順番に、必要により（１）プロモーター、（２）リボソーム結合部位、（３）開始コドン、（４）本発明の糖鎖欠損型ＨＧＦの部分蛋白質をコードする塩基配列を含有するＤＮＡ、（５）終止コドン、（６）ターミネーターを含むように構築される。
【００２７】
なお、糖鎖欠損型ＨＧＦの部分蛋白質をコードする塩基配列の前に分泌シグナル配列を組み込むことにより、糖鎖欠損型ＨＧＦの部分蛋白質を細胞外に分泌することができる。シグナル配列は好ましくは宿主細胞により認識され、かつ、プロセシングされるものである。例えば宿主がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属である場合は、ＰｈｏＡのシグナル配列、ＯｍｐＡのシグナル配列等が、宿主がＢａｃｉｌｌｕｓ属である場合は、α−アミラーゼのシグナル配列、サブチリシンのシグナル配列等が、宿主が酵母である場合は、ＭＦαのシグナル配列、ＳＵＣ２のシグナル配列等が、宿主が哺乳動物細胞である場合には、ＨＧＦのシグナル配列、インシュリンのシグナル配列、α−インターフェロンのシグナル配列等がそれぞれ利用できる。ヒトＨＧＦの部分蛋白質においては、特に、ヒトＨＧＦのシグナル配列を利用するのが好ましい。具体的には、例えば配列番号１の第１位から第３１位で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列がシグナル配列に相当する。
【００２８】
上記ＤＮＡには、上記糖鎖付加部位の塩基配列に変異が導入された糖鎖欠損型ＨＧＦの部分蛋白質配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡだけでなく、（ａ）前記糖鎖欠損型ＨＧＦの部分蛋白質配列をコードする塩基配列の塩基の１もしくは数個の塩基が欠失、置換、付加もしくは挿入された塩基配列を有し、かつＨＧＦアンタゴニスト活性および血管新生抑制作用を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、（ｂ）前記糖鎖欠損型ＨＧＦの部分蛋白質配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＨＧＦアンタゴニスト活性および血管新生抑制作用を有する蛋白質をコードする塩基配列からなるＤＮＡ、または（ｃ）前記糖鎖欠損型ＨＧＦの部分蛋白質配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡと少なくとも８０％以上の相同性を有し、かつＨＧＦアンタゴニスト活性および血管新生抑制作用を有する蛋白質をコードする塩基配列からなるＤＮＡも包含するものである。
上記塩基配列について、「１もしくは数個の塩基が欠失、置換、付加もしくは挿入」というときは、部位特異的突然変異誘発法等の周知の技術的方法により、または天然に生じうる程度の数（１〜数個）の塩基が、欠失、置換、付加または挿入等されていることを意味する。
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとは、上記ＤＮＡをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味する。
ストリンジェントな条件とは、例えば、塩濃度、０．１〜２倍程度の濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウムよりなる。）、温度約６５℃程度でのハイブリダイズ条件をいう。
相同性を有するＤＮＡとは、ハイストリンジェントな条件において、少なくとも約８０％以上の相同性を有するＤＮＡ、好ましくは約８５％以上の相同性を有するＤＮＡ、より好ましくは約９０％以上の相同性を有するＤＮＡをいう。なお、ハイストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が約１９〜４０ｍＭ程度、好ましくは約１９〜２０ｍＭ程度で、温度が約５０〜７０℃程度、好ましくは約６０〜６５℃程度の条件をいう。特に、ナトリウム濃度が約１９ｍＭで温度が約６５℃程度の場合が最も好ましい条件である。
【００２９】
本発明で用いることが出来るベクターとしては、大腸菌を宿主とする場合はｐＢＲ３２２，ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９（東洋紡）等のプラスミドを、枯草菌を宿主とする場合はｐＵＢ１１０（シグマ社）等のプラスミドを、酵母を宿主とする場合はｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＲＢ１５（ＡＴＣＣ３７０６２）等のプラスミドを用いることができる。動物細胞用の発現ベクターとしては、ｐＣＡＧＧＳおよびｐＣＸＮ２（Ｎｉｗａ，Ｈ．，Ｙａｍａｍｕｒａ，Ｋ．ａｎｄ  Ｍｉｙａｚａｋｉ，Ｊ．、Ｇｅｎｅ、１９９１年、第１０８巻、ｐ．１９３−２００、特開平０３‐１６８０８７）、ｐｃＤＬ-ＳＲα（Ｔａｋｅｂｅ，Ｙ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１９８８年、第８巻、ｐ．４６６−４７２）等が挙げられる。その他、バクテリオファージλｇｔ１０、λｇｔ１１（ストラタジーン社）、ウイルスＳＶ４０（ＢＲＬ社）、ＢＰＶ（ＡＴＣＣ  ＶＲ−７０３）、レトロウイルスの遺伝子由来のベクター等が列挙できるが宿主内で複製・増幅可能なベクターであれば特に限定はない。
【００３０】
プロモーターおよびターミネーターに関しても、目的とする糖鎖欠損型ＨＧＦの部分蛋白質をコードする塩基配列の発現に用いられる宿主に対応したものであれば特に限定はない。プロモーターの例としては、宿主が大腸菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーター等が挙げられ、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター等が挙げられる。動物細胞を宿主として用いる場合は、ラウス肉腫ウイルス（ウイルスＲＳＶ）、ＭＰＳＶ、ポリオマーウイルス、鶏頭ウイルス、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス（CＭＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、ワクシニアウイルス等のウイルスゲノムから得られるプロモーター、メロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター等が挙げられる。また、高等哺乳動物宿主を用いる際には、好ましくは、ベクターにエンハンサーを導入する。エンハンサーを導入することにより転写が増大する。エンハンサーとしては、ＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルスの初期プロモーター／エンハンサー、ポリオマーエンハンサー、アデノウイルスのエンハンサー等が挙げられる。またターミネーターとしては、宿主が大腸菌の場合、ｔｒｐターミネーター、１ｐｐターミネーター等を、宿主が枯草菌の場合、ａｍｙＦターミネーター等を、宿主が酵母の場合、ＣＹＣ１ターミネーター等を、宿主が動物細胞の場合、ＳＶ４０ターミネーター、ＨＳＶ１ＴＫターミネーター等を例示することが出来る。これらのプロモーターとターミネーターは用いる宿主に応じて適宜に組み合わされる。
【００３１】
宿主として用いることのできる細胞としては、特に制限はなく、動物、植物、昆虫、真核微生物等の真核細胞、および原核微生物等の原核細胞が挙げられる。これらの細胞は個体を形成していてもよく、動物個体、植物個体、昆虫個体を宿主としてもよい。真核細胞では、付着性細胞、浮遊性細胞の何れも使用でき、例えばＨＧＦの部分蛋白質を細胞内に生産蓄積する真核細胞でもよく、あるいはＨＧＦの部分蛋白質を細胞外に分泌生産する真核細胞でもよい。動物細胞では、例えばＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスター卵巣細胞）、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、マウスＣ１２７細胞およびＨｅｌａ細胞等が挙げられる。植物細胞では、例えばイネ、タバコおよびシロイヌナズナ等を挙げることができ、昆虫細胞では、例えばＳｆ９やＳｆ２１等の細胞を挙げることができる。昆虫個体では例えばカイコを挙げることができる。真核微生物ではＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｂｏｉｄｉｎｉｉ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ等の酵母、あるいはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属およびＭｕｃｏｒ属等の糸状菌を挙げることができる。原核微生物では、大腸菌および枯草菌等が挙げられ、これらのうち、原核生物の細胞では、糖鎖付加能がないため、糖鎖付加型のＨＧＦの部分蛋白質をコードする発現ベクターを導入してもよい。好ましくは、酵母、昆虫細胞または昆虫個体である。
【００３２】
糖鎖欠損型ＨＧＦの部分蛋白質発現ベクターは、コンピテント細胞法(Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９７０年，第５３巻，ｐ．１５４)、プロトプラスト法(Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９７８年、第７５巻、ｐ．１９２９）、リン酸カルシウム法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８３年，第２２１巻，ｐ．５５１）、ＤＥＡＥデキストラン法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８２年，第２１５巻，ｐ．１６６）、電気パルス法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８４年，第８１巻，ｐ．７１６１）、インビトロパッケージング法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９７５年，第７２巻，ｐ．５８１）、ウイルスベクター法（Ｃｅｌｌ，１９８４年，第３７巻，ｐ．１０５３）、またはマイクロインジェクション法（Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅｓ．，１９８４年，第１５３巻，ｐ．３４７）等によって宿主に導入され、形質転換体が作製される。
【００３３】
得られた形質転換体は、目的とする糖鎖欠損型ＨＧＦの部分蛋白質を産生させるためにその宿主に応じた適切な培地中で培養される。培地中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物、ビタミン、血清および薬剤等が含有される。培地の例としては、形質転換体の宿主が大腸菌の場合、ＬＢ培地（日水製薬）、Ｍ９培地（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７２年、ｐ．４３１）等が挙げられ、宿主が酵母の場合はＹＥＰＤ培地（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｖｏｌ．１，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７９年、ｐ．１１７）等を挙げられる。宿主が動物細胞の場合、２０％以下のウシ胎児血清を含有するＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地（日水製薬）等を挙げることが出来る。形質転換体の培養は、通常２０℃〜４５℃、ｐＨは５〜８の範囲で行われ、必要に応じて通気、撹拌が行われる。また、宿主が接着性の動物細胞等の場合は、ガラスビーズ、コラーゲンビーズ、あるいはアセチルセルロースフォローファイバー等の担体が用いられる。これら以外の培地組成あるいは培養条件下でも形質転換体が生育すれば実施でき、これらに限定されるものではない。
【００３４】
培養においては、培養液中にプロテアーゼインヒビターを添加すると糖鎖欠損型ＨＧＦの部分蛋白質の分解を抑制でき、糖鎖欠損型ＨＧＦの部分蛋白質の生産性向上につながる。添加するプロテアーゼインヒビターとしては、ベンズアミジン、アプロチニン、ロイペプチン、アンチパイン、キモスタチン、ペプスタチンＡ、フェニルメタンスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、エチレンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ）等が挙げられる。
【００３５】
このようにして形質転換体の培養上清中または形質転換体中に生成した糖鎖欠損型ＨＧＦの部分蛋白質は、公知の塩析法、溶媒沈殿法、透析法、限外濾過法、ゲル電気泳動法、あるいはゲル濾過クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、逆相クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィ等を組み合わせて分離採取し精製することが出来る。特に、硫酸アンモニウムによる塩析法、Ｓ−セファロースイオンクロマトグラフィ、ヘパリンセファロースアフィニティクロマトグラフィ、およびフェニルセファロース逆相クロマトグラフィの組み合せ、あるいは硫酸アンモニウムによる塩析法、Ｓ−セファロースイオンクロマトグラフィ、および抗ＨＧＦ抗体セファロースアフィニティクロマトグラフィの組み合わせ等が好ましく有効な精製法である。
【００３６】
また、本発明の糖鎖欠損型ＨＧＦの部分蛋白質は、従来の既知の方法により糖鎖が付加したＨＧＦの部分蛋白質を得た後、糖鎖を除去する酵素で該ＨＧＦの部分蛋白質を処理することでも得られる。糖鎖を除去する酵素としては、Ｎ−結合型糖鎖の除去の目的ではグリコペプチダーゼＦ、グリコペプチダーゼＡ等を使用することができる。Ｏ−結合型糖鎖の除去は、シアリダーゼ、フコシダーゼ、Ｏ−グリカナーゼ等の組み合わせによって達成される。この際、反応液中にプロテアーゼインヒビターを添加することが望ましい。添加するプロテアーゼインヒビターとしては、ベンズアミジン、アプロチニン、ロイペプチン、アンチパイン、キモスタチン、ペプスタチンＡ、フェニルメタンスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、エチレンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ）等が挙げられる。酵素処理によって糖鎖除去がなされたＨＧＦの部分蛋白質は、本発明の糖鎖欠損型ＨＧＦの部分蛋白質として採取し上述の精製法によって精製することができる。
【００３７】
さらに、本発明の糖鎖欠損型ＨＧＦの部分蛋白質は、無細胞蛋白質合成システムを利用して得ることもできる。無細胞蛋白質合成システムとは、大腸菌、ウサギ網状赤血球細胞、小麦胚芽等から調製した細胞抽出液を用いるか、あるいは細胞抽出液中に含まれる蛋白質合成因子群を利用して、目的蛋白質をコードするＤＮＡあるいはｍＲＮＡを鋳型として、生細胞を用いずに蛋白質合成を行う方法をいう。細胞抽出液にはリボソーム、ｔＲＮＡ、翻訳因子等の蛋白質合成に必要な分子群が含まれているため、これにＡＴＰやＧＴＰ等のエネルギー源および基質となるアミノ酸を添加すると、蛋白質が合成される。細胞抽出液の代わりに、細胞抽出液中に含まれる蛋白質合成因子群を混合して用いてもよい。無細胞蛋白質合成システムでは、小胞体やゴルジ体が含まれないため、糖鎖付加部位を有するＨＧＦの部分蛋白質をコードするＤＮＡあるいはｍＲＮＡを鋳型として、糖鎖の欠損した糖鎖欠損型ＨＧＦの部分蛋白質を生産することができる。また、糖鎖付加部位に変異を導入したＤＮＡあるいはｍＲＮＡを用いることもできる。
反応液中にプロテアーゼインヒビターを添加することもできる。添加するプロテアーゼインヒビターとしては、ベンズアミジン、アプロチニン、ロイペプチン、アンチパイン、キモスタチン、ペプスタチンＡ、フェニルメタンスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、エチレンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ）等が挙げられる。無細胞蛋白質合成反応液中に合成された糖鎖欠損型ＨＧＦの部分蛋白質は、採取し上述の精製法によって精製することができる。
【００３８】
また、本発明の糖鎖欠損型ＨＧＦの部分蛋白質は、糖鎖を欠損するＨＧＦをプロテアーゼで消化するか、または化学的な処理によって特異的に切断することによっても製造できる。このために用いられるＨＧＦは、既に公知のＨＧＦの遺伝子配列等に基づいて、糖鎖付加部位に変異を導入したものが使用できる。ＨＧＦの酵素分解は、例えばエラスターゼ、ＨＧＦアクティベータ、ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクティベータ、マトリプターゼ等の特異的なプロテアーゼを用いてＨＧＦを消化することにより行うことができる。生じた糖鎖欠損型ＨＧＦの部分蛋白質は、採取し上述の精製法によって精製することができる。
【００３９】
上記のようにして得られる本発明の糖鎖欠損型ＨＧＦの部分蛋白質は、ｃ−Ｍｅｔ／ＨＧＦ受容体を介するＨＧＦの作用に対するアンタゴニスト活性を有するとともに、血管新生抑制作用において糖鎖付加型ＨＧＦの部分蛋白質と同等の活性を有している。
【００４０】
本発明の糖鎖欠損型ＨＧＦの部分蛋白質は医薬として有効であり、一般的な医療製剤の形態で用いられる。本発明の糖鎖欠損型ＨＧＦの部分蛋白質を有効成分として含有する医薬製剤は、種々の製剤形態（例えば、液剤、固形剤、カプセル剤等）をとりうるが、一般的には有効成分である糖鎖欠損型ＨＧＦの部分蛋白質のみ又はそれと製薬学的に許容される担体と共に注射剤、吸入剤、坐剤又は経口剤とされるが、注射剤が好適である。当該注射剤は常法により調製することができ、例えば、糖鎖欠損型ＨＧＦの部分蛋白質および製薬学的に許容される担体を適切な溶剤（例えば、滅菌精製水、緩衝液、生理食塩水等）に溶解した後、フィルター等で濾過して滅菌し、次いで無菌的な容器に充填することにより調製することができる。注射剤中の糖鎖欠損型ＨＧＦの部分蛋白質含量としては、通常０．０００２〜３（Ｗ／Ｖ％）程度、好ましくは０．００１〜２（Ｗ／Ｖ％）程度に調整される。また、経口薬としては、例えば、錠剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、軟又は硬カプセル剤、液剤、乳剤、懸濁剤、シロップ剤等の剤形に製剤化され、これらの製剤は製剤化の常法に準じて調製することができる。坐剤も慣用の基剤（例えば、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチン、マクロゴール、ウィテップゾル等）を用いた製剤上の常法によって調製することができる。また、吸入剤も製剤上の常套手段に準じて調製することができる。製剤中の糖鎖欠損型ＨＧＦの部分蛋白質含量は、剤形、適用疾患等に応じて適宜調整することができる。
【００４１】
本発明の糖鎖欠損型ＨＧＦの部分蛋白質の医薬製剤の製剤化に際して、安定化剤が添加されることが好ましい。安定化剤としては、例えば、アルブミン、グロブリン、ゼラチン、アラニン、グリシン、マンニトール、グルコース、デキストラン、ソルビトール、エチレングリコール等が挙げられる。さらに、本発明の医薬製剤は製剤化に必要な他の添加物、例えば、溶剤（例えば、生理食塩液、滅菌精製水、注射用水等）、賦形剤（例えば、果糖、Ｄ−ソルビトール、ブドウ糖、デンプン、結晶セルロース、デキストリン等）、結合剤（例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴム等）、溶解補助剤（例えば、ラウロマクロゴール、ポリソルベート８０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０、アラビアゴム、安息香酸ナトリウム等）、酸化防止剤（例えば、Ｌ−アスコルビン酸、トコフェロール、エデト酸ナトリウム等）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカイン等）、等張化剤（例えば、塩化ナトリウム、ブドウ糖、Ｄ−マンニトール、グルセリン等）、緩衝剤（例えば、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸、酢酸ナトリウム、乳酸、リン酸水素ナトリウム等）、増粘剤（アラビアゴム、カルメロース、ポピドン、メチルセルロース等）、保存剤（例えば、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル、クロロブタノール、ベンジルアルコール、塩化ベンザルコニウム等）、ｐＨ調整剤（塩酸、水酸化ナトリウム、クエン酸、酢酸等）等を含んでいてもよい。
液状製剤とした場合は凍結保存、または凍結乾燥等により水分を除去して保存するのが望ましい。凍結乾燥製剤は、用時に注射用蒸留水等を加え、再溶解して使用される。
また、経口剤とする場合には、顆粒、錠剤等は、腸溶性コーティング剤（例えば酢酸フタル酸セルロース、メタアクリル酸コポリマー、ヒドロキシプロピルセルロースフタレート、カルボキシメチルエチルセルロース等）等で剤皮を施されるのが好ましく、カプセル剤では、腸溶性カプセル剤とされるのが好ましい。
【００４２】
本発明の製剤は、その製剤形態に応じた適当な投与経路により投与され得る。例えば、注射剤の形態にして静脈、動脈、皮下、筋肉内等に投与することができる。その投与量は、患者の疾患、症状、年齢、体重等により適宜調整されるが、例えば、成人に対し、通常糖鎖欠損型ＨＧＦの部分蛋白質（例えば、糖鎖欠損型ＮＫ４）として０．０１ｍｇ〜５００ｍｇ、好ましくは０．０５ｍｇ〜１００ｍｇであり、これを１日１回ないし数回に分けて投与するのが適当である。
【００４３】
本発明の糖鎖欠損型ＨＧＦの部分蛋白質は、腫瘍の浸潤抑制、成長抑制、転移抑制、アポトーシス誘導または／および血管新生抑制に使用することができる。従って、本発明の糖鎖欠損型ＨＧＦの部分蛋白質を含有する医薬は、癌または／および血管新生による疾患の予防・治療剤、および癌の転移防止剤として使用することができる。
対象疾患の癌としては、例えば、肺癌、卵巣癌、膵臓癌、胃癌、胆嚢癌、腎臓癌、前立腺癌、乳癌、食道癌、肝臓癌、口腔癌、結腸癌、大腸癌、子宮癌、胆管癌、膵島細胞癌、副腎皮質癌、膀胱癌、精巣癌、睾丸腫瘍、甲状腺癌、皮膚癌、悪性カルチノイド腫瘍、悪性黒色腫、骨肉腫、軟部組織肉腫、神経芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、網膜芽細胞腫、メラノーマ、グリオーマ等が挙げられるが、なかでも卵巣癌、膵臓癌、胃癌、胆嚢癌、腎臓癌、前立腺癌、乳癌、食道癌、肝臓癌、口腔癌、結腸癌、大腸癌、肉腫、メラノーマ又はグリオーマが好ましく、特に、卵巣癌、膵臓癌、胃癌、胆嚢癌が好ましい。
【００４４】
また、本発明の糖鎖欠損型ＨＧＦの部分蛋白質を含有する医薬は、他の抗腫瘍剤等と組み合わせて用いることができる。他の抗腫瘍剤としては、例えば、アルキル化剤（例えばナイトロジェンマスタード、メルファラン、シクロホスファミド、クロラムブシル、チオテパ、ディブロモマンニトール、ディブロモダルシトール、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、ニムスチンハイドロクロライド、クロロゾトシン、ラニムスチン、ブスルファン、プロカルバジン等）、各種代謝拮抗剤（例えば６−メルカプトプリン、アザチオプリン、６−チオグアニン、チオイノシン、フルオロウラシル、テガフール、カルモフール、ドキシフルリジン、ブロクスウリジン、シタラビン、エノシタビン、メトトレキサート、トリメトレキサート等）、抗腫瘍抗生物質（例えばダウノルビシン、アクラルビシン、ドキソルビシン、アクチノマイシンＤ、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、ペプロマイシン等）、その他の抗腫瘍剤（例えば、シスプラチン、カルボプラチン、タモキシフェン、Ｌ−アスパラギナーゼ、アセブラトン、シゾフィラン、ピシバニール、ウベニメクス、クレスチン等）、抗腫瘍性植物成分（カンプトテシン、ビンデシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン等）、ＢＲＭ（生物学的応答性制御物質；例えば腫瘍壊死因子、インドメタシン等）、細胞接着阻害剤（例えばＲＧＤ配列を有する物質等）、マトリックス・メタロプロテアーゼ阻害剤（例えば、マリマスタット、バチマスタット等）、ホルモン（例えばヒドロコルチゾン、デキサメタゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、プラステロン、ベタメタゾン、トリアムシノロン、オキシメトロン、ナンドロロン、メテノロン、ホスフェストロール、エチニルエストラジオール、クロルマジノン、メドロキシプロゲステロン等）、ビタミン（例えばトコフェロール等）、抗生物質（例えばアンピシリン、スルベニシリン、セファレキシン、セファロジン、トブラマイシン、クロラルフェニコール、塩酸テトラサイクリン、キタセマイシン、塩酸リンコマイシン等）又は化学療法剤（例えばスルファメチゾール、スルファモノメトキシン、エノキサシン、ノルフロキサシン、オフロキサシン、キノキサシン等）等が挙げられる。さらに、本発明の糖鎖欠損型ＨＧＦの部分蛋白質を含有する医薬は、外科的療法や放射線療法と組み合わせて用いることもできる。従って、本発明の糖鎖欠損型ＨＧＦの部分蛋白質を含有する医薬は、他の抗腫瘍剤等または／および外科的療法や放射線療法と組み合わせた腫瘍の浸潤抑制、成長抑制、転移抑制、アポトーシス誘導または／および血管新生抑制に使用することができる。
【００４５】
本発明の糖鎖欠損型ＨＧＦの部分蛋白質を含有する医薬を、血管新生による疾患の予防・治療剤として用いる場合の、血管新生による疾患としては、例えば、リウマチ性関節炎、乾癬、オスラー−ウェバー（Ｏｓｌｅｒ−Ｗｅｂｂｅｒ）症候群、心筋の脈管形成、末梢血管拡張症、血友病性関節炎、眼の脈管形成疾患（例えば、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、老人黄班部変性、角膜移植拒絶、血管新生緑内障、水晶体後線維増殖症、又はペルオーシス等）、血管線維腫、良性腫瘍（例えば、血管腫、聴神経腫、神経線維腫、トラコーマ、化膿性肉芽腫等）、白血病を含む造血器腫瘍、固形腫瘍、腫瘍転移、創傷肉芽形成等が挙げられる。
【００４６】
また、本発明の糖鎖欠損型ＨＧＦの部分蛋白質を含有する医薬は、内皮細胞の過度若しくは異常な刺激によって生じる疾患の予防又は治療に広く適用することができる。かかる疾患としては、特に制限はないが、具体的には、例えば腸管癒着、クローン病、アテローム硬化症、強皮症、例えばケロイド等の過剰瘢痕形成等を挙げることができる。さらに本発明の糖鎖欠損型ＨＧＦの部分蛋白質、特に糖鎖欠損したＮＫ４を含有する医薬は、胚着床に必要な血管新生を妨げることに基づく受胎調節剤として有用であり、また病的な結果としてネコのひっかき疾患（ｃａｔ  ｓｃｒａｔｃｈ  ｄｉｓｅａｓｅ）や潰瘍といった脈管形成を伴う疾患の予防剤又は治療剤として有用である。
さらに、糖鎖欠損型ＨＧＦの部分蛋白質は、リステリア、マラリア等の感染症に対しても、予防薬・治療薬として使用することができる。
本発明の糖鎖欠損型ＨＧＦの部分蛋白質をコードする塩基配列は遺伝子治療薬としても用いることができる。遺伝子治療の対象疾患は上述の疾患が挙げられる。
【００４７】
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定されるものではない。
なお、実施例で使用する各略号の意味は、次のとおりである。
ＨＧＦ：肝細胞増殖因子
ｂＦＧＦ：塩基性線維芽細胞増殖因子
ＬＢ：Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ
Ａｍｐ：アンピシリン
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ：ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
Ｔｗｅｅｎ８０：ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート
【実施例１】
【００４８】
配列番号３に示される５アミノ酸欠失型ＮＫ４をコードする塩基配列をｐＣＡＧＧＳベクターに組み込んだ。得られたベクターをｐＣＡＧＧＳ−ＮＫ４と称する。
ＮＫ４蛋白質に存在する３箇所の糖鎖付加部位（配列番号２の２８９位、３９７位、４７１位）に変異を導入するため、表１に示す３種類の変異プライマー（５’−リン酸化）を合成し、ｐＣＡＧＧＳ−ＮＫ４ベクターをテンプレートとして変異導入を実施した。この変異の導入により、５アミノ酸欠失型ＮＫ４のアミノ酸配列のうち、Ａｓｎ２８９、Ａｓｎ３９７はＧｌｎに、Ｔｈｒ４７１はＧｌｙに置換される。変異導入後の全アミノ酸配を配列番号４に示す。変異導入にはＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社のＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｍｕｌｔｉ  Ｋｉｔを利用した。
【表１】
0004716741.tif 000002
【００４９】
変異の導入されたベクターはＥ．ｃｏｌｉ  ＸＬ１０  Ｇｏｌｄのコンピテントセルにｔｒａｎｓｆｏｒｍし、ＬＢ／Ａｍｐプレート上でＡｍｐ耐性コロニーをピックアップした。得られた各クローンからプラスミドを抽出し、ＮＫ４のコード部分について塩基配列を解析することによって、目的のクローンをスクリーニングした。ＮＫ４をコードする塩基配列の３箇所に目的の変異が導入され、また他の変異がないことが確認できたベクターを選択し、以後の実験に用いた。得られた変異ベクターはｐＣＡＧＧＳ−ＮＫ４−ＮＧと称する。
【００５０】
次に、ｐＣＡＧＧＳ−ＮＫ４−ＮＧをＣＯＳ−７細胞にトランスフェクトした。ＣＯＳ−７細胞はダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）に牛胎児血清（ＦＣＳ）を１０％添加して培養した。細胞はトランスフェクションの直前に無血清ＤＭＥＭ培地に交換した。トランスフェクションはＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ  ２０００（インビトロジェン株式会社）を用いてリポフェクション法によって行った。トランスフェクションの６時間後、１％ＦＣＳ、５ｍＭベンズアミジンを含むＤＭＥＭに培地交換し、その際にヘパリンを１μｇ／ｍＬとなるように添加した。２４時間後に培養液上清を０．２２μｍフィルターで濾過して回収した後、新しい培地（１％ＦＣＳ、１μｇ／ｍＬヘパリン、５ｍＭベンズアミジンを含むＤＭＥＭ）に交換してさらに２４時間培養した。２４時間後に再び培養液上清を同様に回収した。回収した培養液上清は採取し精製に供するまで−８０℃で保存した。培溶液中に分泌された糖鎖欠損型ＮＫ４の濃度はＥＬＩＳＡによって分析した。
【００５１】
上記の培地を解凍し、混合して再度０．２２μｍフィルターで濾過した後、５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、０．０１％Ｔｗｅｅｎ  ８０、０．３Ｍ塩化ナトリウムで平衡化したＨｉＴｒａｐヘパリン（Ｂｅｄ  ｖｏｌｕｍｅ：５ｍＬ）（アマシャムバイオサイエンス株式会社）に１ｍＬ／ｍｉｎの流速で添加した。カラムを５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、０．０１％Ｔｗｅｅｎ  ８０、０．３Ｍ塩化ナトリウムで洗浄後、ＮａＣｌ濃度を２Ｍまで上昇させることによって糖鎖欠損型ＮＫ４を溶出させた。溶出は１ｍＬ／ｍｉｎの流速で行い、２．５ｍＬ／ｔｕｂｅで分画した。糖鎖欠損型ＮＫ４の存在する画分を回収し、限外濾過によって５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、０．０１％Ｔｗｅｅｎ  ８０、０．３Ｍ塩化ナトリウムにｂｕｆｆｅｒ交換した。これを同ｂｕｆｆｅｒで平衡化したＭｉｎｉ  Ｓカラム（Ｂｅｄ  ｖｏｌｕｍｅ：０．８ｍＬ）（アマシャムバイオサイエンス株式会社）に０．４ｍＬ／ｍｉｎの流速で添加した。カラムを５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ  ８０、０．３Ｍ塩化ナトリウムで洗浄後、ＮａＣｌ濃度を１Ｍまで上昇させることによって糖鎖欠損型ＮＫ４を溶出させた。溶出は０．４ｍＬ／ｍｉｎの流速で行い、０．４ｍＬ／ｔｕｂｅで分画した。糖鎖欠損型ＮＫ４の存在する画分を回収し、採取し精製状態をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認した。
また、特開２００３−２５０５４９記載の方法に従ってＣＨＯ細胞によってＮＫ４蛋白質を調製した（糖鎖付加型ＮＫ４と称する）。
糖鎖付加型ＮＫ４および糖鎖欠損型ＮＫ４蛋白質を還元処理してＳＤＳ−ＰＡＧＥによって泳動した後、ゲルを銀染色した結果を図１に示す。糖鎖付加型ＮＫ４のバンドは分子量６７ｋＤａに対応する位置に認められた。糖鎖欠損型ＮＫ４では、糖鎖を欠損する分子量に対応する位置（ＮＫ４蛋白質本体の分子量５１ｋＤａ）にバンドがシフトしていた。
【実施例２】
【００５２】
ＭＤＣＫ−３Ｂ細胞をＤＭＥＭ培地（１０％ＦＣＳを含む）に懸濁して９６ｗｅｌｌプレートに５０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように播き、ここにＨＧＦを３０ｐＭの濃度になるように添加した。この際、同時に糖鎖付加型ＮＫ４または糖鎖欠損型ＮＫ４を３ｎＭまたは３０ｎＭまたは８５ｎＭの濃度となるように添加し、３７℃で２０時間培養した後、ｓｃａｔｔｅｒの程度を顕微鏡で観察した（図２）。ＭＤＣＫ−３Ｂ細胞の通常の形態は図２Ａに示す通りであるが、ＨＧＦを添加して培養すると細胞が分散する（図２Ｂ）。ＨＧＦと同時に糖鎖付加型ＮＫ４を加えた場合は、細胞の分散が抑制されており、糖鎖付加型ＮＫ４の濃度が高くなるほど細胞分散が抑制されていた（図２Ｃ、Ｄ、Ｅ）。また、糖鎖欠損型ＮＫ４は、糖鎖付加型ＮＫ４と同程度にＭＤＣＫ−３Ｂ細胞の分散を抑制した（図２Ｇ、Ｈ、Ｉ）。すなわち、糖鎖欠損型ＮＫ４は糖鎖付加型ＮＫ４と同程度のＨＧＦアンタゴニスト活性を有した。なお、ＨＧＦを添加しない場合は、糖鎖付加型ＮＫ４または糖鎖欠損型ＮＫ４を加えてもＭＤＣＫ−３Ｂ細胞に変化はない（図２Ｆ、Ｊ）。
【実施例３】
【００５３】
ヒト臍帯静脈血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）をＭＤＣＢ１３１培地（５％ＦＣＳを含む）に懸濁して９６ｗｅｌｌプレートに２０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播き、ｂＦＧＦを加えない状態で２４時間培養した。その後、新しいＭＤＣＢ１３１培地（５％ＦＣＳを含む）に交換すると同時にｂＦＧＦを３ｎｇ／ｍＬとなるように添加し、７２時間培養した。この際、ｂＦＧＦを添加するのと同時に糖鎖付加型ＮＫ４または糖鎖欠損型ＮＫ４を３０ｎＭまたは８５ｎＭの濃度となるように添加した。培養７２時間後のＨＵＶＥＣの細胞数を計測し、糖鎖付加型ＮＫ４または糖鎖欠損型ＮＫ４によるＨＵＶＥＣの増殖抑制効果を比較した（図３）。糖鎖付加型ＮＫ４または糖鎖欠損型ＮＫ４を加えない場合は、ｂＦＧＦの作用によってＨＵＶＥＣが増殖し、細胞数が増加していた。ｂＦＧＦと同時に糖鎖付加型ＮＫ４を加えた場合は、ＨＵＶＥＣの増殖が抑制されており、糖鎖付加型ＮＫ４の濃度が高くなるほどＨＵＶＥＣの増殖が抑制されていた。また、糖鎖欠損型ＮＫ４は、糖鎖付加型ＮＫ４と同程度にＨＵＶＥＣの増殖を抑制した。すなわち、糖鎖欠損型ＮＫ４は糖鎖付加型ＮＫ４と同程度の血管新生抑制作用を有した。
【実施例４】
【００５４】
糖鎖付加型ＮＫ４および糖鎖欠損型ＮＫ４の癌細胞に対する浸潤抑制作用を調べるため、ヒト胆嚢癌細胞（ＧＢ−ｄ１）をＤＭＥＭ  培地（１０％ＦＣＳを含む）に懸濁して、マトリゲルチャンバー（ＢＤ  ＢＩＯＣＯＡＴ  Ｍａｔｒｉｇｅｌ  ｃｈａｍｂｅｒ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）内に添加した（１５０００ｃｅｌｌｓ／チャンバー）。チャンバーを２４ｗｅｌｌプレートにセットし、チャンバーの外側にＤＭＥＭ培地（１０％ＦＣＳを含む）を加えた。また、チャンバーの外側のＤＭＥＭ培地にはＨＧＦを１１０ｐＭの濃度になるように添加した。この際、チャンバーの外側のＤＭＥＭ培地に同時に糖鎖付加型ＮＫ４または糖鎖欠損型ＮＫ４を１ｎＭまたは１１ｎＭまたは８５ｎＭの濃度となるように添加し、３７℃で２４時間培養した。その後、チャンバーの外側に浸潤したＧｂ−ｄ１細胞の数を計測した。ＨＧＦのみを添加した場合の浸潤細胞数を１００とし、チャンバー外に浸潤した癌細胞数を相対値で示した（図４）。マトリゲルは基底膜を模しており、チャンバー外に添加したＨＧＦの作用により、チャンバー内の癌細胞はチャンバー外に浸潤する。糖鎖付加型ＮＫ４または糖鎖欠損型ＮＫ４を加えない場合は、ＨＧＦの浸潤誘導作用によって多数の癌細胞がチャンバーの外側に浸潤していた。ＨＧＦと同時に糖鎖付加型ＮＫ４を加えた場合は、癌細胞の浸潤が抑制されており、糖鎖付加型ＮＫ４の濃度が高くなるほど浸潤が抑制されていた。また、糖鎖欠損型ＮＫ４は、糖鎖付加型ＮＫ４と同程度にＧＢ−ｄ１細胞の浸潤を抑制した。
【実施例５】
【００５５】
配列番号４の第３２位〜４７３位で示される糖鎖欠損型ＮＫ４（５アミノ酸欠失型）の成熟ポリペプチドをコードするＤＮＡ断片は、実施例１に記載したｐＣＡＧＧＳ−ＮＫ４−ＮＧを鋳型として使用し、ＰＣＲによって調製した。この際、該ＤＮＡ配列の両端にＮｏｔＩ制限酵素部位を含む配列を付加した。該ＤＮＡ断片を、ＮｏｔＩで消化した後、酵母発現用ｐＰＩＣ９Ｋベクター（インビトロジェン社製）のＮｏｔＩ制限酵素部位に挿入した。ｐＰＩＣ９Ｋベクターでは、外来遺伝子はＡＯＸ１プロモーターによってドライブされ、遺伝子産物はα−ファクター分泌シグナルによって宿主細胞から分泌される。構築されたベクターは、ｐＰＩＣ９Ｋ−ＮＫ４−ＮＧと称する。次いで、ベクターをＳａｃＩ消化によって直鎖化した後、エレクトロポレーション法によりメタノール資化性酵母ピキア・パストリスＫＭ７１（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＫＭ  ７１；インビトロジェン社製）のスフェロプラストに導入した。形質転換された細胞はヒスチジンを含まない寒天培地で培養することにより選択した。ピキア・パストリスＫＭ７１株は、ヒスチジン合成に関与するヒスチジノールデヒドロゲナーゼをコードするｈｉｓ４遺伝子に変異を有するため、ヒスチジンの添加がなければ成長できない。そのためＨｉｓ４遺伝子を含むｐＰＩＣ９Ｋベクターが導入された形質転換細胞のみがヒスチジンを含まない平板培地で成長できる。このようにして２００個のＨｉｓ＋形質転換株を選択した。次いで、ジェネティシン（ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ）耐性クローンをＨｉｓ＋形質転換細胞から選択した。ｐＰＩＣ９Ｋベクターは、ピキア酵母にジェネティシン耐性を与えるカナマイシン耐性遺伝子を含んでいる。ジェネティシン耐性の度合いは、組み込まれたカナマイシン耐性遺伝子の数によって異なる。そのため、高濃度のジェネティシンに耐性を示す形質転換細胞は、該ベクターのコピーが複数組み込まれており、それにより組換えタンパク質を高発現する。糖鎖欠損型ＮＫ４産生のために、４ｍｇ／ｍＬのジェネティシンに耐性を示すクローン（ＫＭ７１−４−４８）を使用した。ＫＭ７１−４−４８クローンは、ＢＭＧＹ培地［１％酵母エキス、２％ペプトン、１００ｍＭ  リン酸カリウム（ｐＨ６）、１．３４％  ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ、０．００００４％ビオチン、１％グリセロール］５ｍＬで、３０°Ｃにて、１日振盪培養し、培養後の細胞は、遠心分離により回収した。次いで、回収した細胞を、組換え体の発現を誘導するためにＢＭＭＹ培地（１％酵母エキス、２％ペプトン、１００ｍＭ  リン酸カリウム（ｐＨ６）、１．３４％  ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ、０．００００４％ビオチン、０．５％メタノール）１ｍＬに接種し、３０°Ｃにて、５日間振盪培養した。メタノールは、２４時間毎に最終濃度が０．５％となるよう補給した。５日後、培地に分泌された糖鎖欠損型ＮＫ４を分析した。抗ヒトＨＧＦポリクロナール抗体を用いたウェスタンブロットにおいて、培養培地の糖鎖欠損型ＮＫ４のバンドは、糖鎖を欠損する分子量に対応する分子量５１ｋＤａの位置に検出された（図５）。培養培地中の糖鎖欠損型ＮＫ４の濃度は、ＥＬＩＳＡの結果、２μｇ／ｍＬであった。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
本発明の糖鎖欠損型ＨＧＦの部分蛋白質は、糖鎖が付加したＨＧＦの部分蛋白質の代替ＨＧＦの部分蛋白質として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】図１は糖鎖付加型ＮＫ４および糖鎖欠損型ＮＫ４のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析結果を示す図である。
【図２】図２はＨＧＦによる細胞遊走をＮＫ４が抑制する作用について、糖鎖付加型ＮＫ４と糖鎖欠損型ＮＫ４で比較した図である。
【図３】図３はｂＦＧＦによる血管内皮細胞の増殖をＮＫ４が抑制する作用について、糖鎖付加型ＮＫ４と糖鎖欠損型ＮＫ４で比較した図である。
【図４】図４は癌細胞の浸潤をＮＫ４が抑制する作用について、糖鎖付加型ＮＫ４と糖鎖欠損型ＮＫ４で比較した図である。
【図５】図５は糖鎖付加型ＮＫ４及びピキア・パストリスによって産生された糖鎖欠損型ＮＫ４のウェスタンブロット分析の結果を示す図である。
【図５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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