(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
犬腎臓由来細胞であるＭＤＣＫ細胞から誘導した細胞株であって、動物由来の成分なしで培養可能である受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０２２５で寄託された細胞株。
【請求項２】
請求項１の細胞株にウイルスを感染させる工程と、感染した細胞株を培養してウイルスを増殖させる工程とを含むウイルスの生産方法。
【請求項３】
前記感染した細胞株を培養する際の培地は、ＲＰＭＩ  １６４０  培地及び大豆由来ペプトンを含有する培地であって、動物由来の成分を含まない培地である請求項２のウイルスの生産方法。
【請求項４】
前記感染した細胞株を培養する際に浮遊培養法を用いる請求項２又は３のウイルスの生産方法。
【請求項５】
前記ウイルスは、パラミクソウイルス科、オルトミクソウイルス科、ラブドウイルス科、フラビウイルス科、カリシウイルス科、アデノウイルス科、ヘルペスウイルス科及びパルボウイルス科からなる群から選ばれる請求項２〜４のいずれかのウイルスの生産方法。
【請求項６】
前記ウイルスは、犬ジステンパーウイルス、麻疹ウイルス、犬パラインフルエンザウイルス、ＳＶ５ウイルス、インフルエンザウイルス、狂犬病ウイルス、日本脳炎ウイルス、犬カリシウイルス、１型および２型犬アデノウイルス、人アデノウイルス、犬ヘルペスウイルス及び１型と２型犬パルボウイルスからなる群から選ばれる請求項２〜４のいずれかのウイルスの生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、動物由来の成分なしで培養可能な細胞株及びその作出方法に関する。また、本発明は、この細胞株を用いたウイルスの生産方法、診断用抗原の製造方法及びワクチンの製造方法に関する。さらに、本発明は、この細胞株の培養に用いる培地に関する。さらに、本発明は、この細胞株の凍結保存用培地および凍結保存方法に関する。
【背景技術】
【０００２】  動物などの細胞を試験管内で培養する技術は創成されてから半世紀以上経過し、科学技術の進歩に相まって格段の進展をみている。【０００３】  一般に、生きている動物を直接試験した場合は結果の理解は容易であるが、技術的にも経済的にも多くの問題点がある。そこで、動物の一部を取り出し、シャーレや試験管などの人工環境内で細胞が増殖されるようになった。これは、組織培養法又は細胞培養法と呼ばれている。そのような技術は難しくないために、この方法により、医薬品、ワクチン及び診断用抗原などを作成することが可能となった。しかし、動物細胞を生体外で培養するためには、元の生体の環境となるべく同じ条件で培養することが求められる。例えば、無菌状態、温度環境を生体と同じ温度にする等の条件である。【０００４】  さらに、上記の条件を満たしても、細胞の分裂増殖のためには、栄養源として、「細胞成長因子：ｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ」を追加供給する必要があった。細胞成長因子としては、例えば、各種ホルモン、インスリン、プトレシン、線維芽細胞増殖因子が挙げられる。しかし、細胞成長因子は全ての細胞種で解明されたわけではなく、多くの場合「ｕｎｋｎｏｗｎ」な成分を含む。【０００５】  そこで、細胞成長因子の代わりに、その効果が非特異的に期待できる動物血清が用いられる。動物血清の中でも、個体数が多く、安定的に供給可能であるということから牛血清が選択される。さらに、毒性のある蛋白質が少ない胎仔の血清が、頻繁に使われるようになった。科学的研究の場合には、牛が目的外の動物種であっても、牛に由来する蛋白を試験研究材料中に含むことが許される場合がある。しかし、牛由来の蛋白を、医薬品として人及び他の動物種に対して用いると、問題が起こる場合がある。【０００６】  第１の問題はアレルギーに関する。ウシ血清が入っているワクチンや薬剤を、牛以外の人や動物に非経口的に注射した場合、初回では多くは問題にはならない。しかしながら、２回目の注射以降にはアレルギー反応として問題化する場合がある。これは免疫学的に説明される。即ち、動物は初めて暴露した高分子物質（例えば分子量が１０，０００ドルトン以上の蛋白質）には低い反応しか示さず、投与された物質は体内で分解処理されてしまう。しかし、免疫系組織には暴露の記憶が残される。そのため、同じ物質（抗原）の次回以降の暴露時には初回時の記憶免疫細胞が直接反応し、短時間内に初回より強く生体反応が起きてくる。人や動物の個体によっては、これら外から暴露された抗原に対して望ましくない反応をする場合がある。それが典型的にはアレルギー反応と呼ばれる。アレルギー反応により、注射局所の発熱や腫脹、ひどい場合は気管閉塞による呼吸困難、虚脱などのために死亡する。【０００７】  第２番目の問題は、牛血清中に含まれる病原体又は牛血清抗体の混入に関する。例えば、牛に感染するペスチウイルス、レトロウイルス、あるいはマイコプラズマなどの汚染が有名である。最近は、牛海綿状脳症（ｂｏｖｉｎｅ  ｓｐｏｎｇｉｆｏｒｍ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ：ＢＳＥ）、いわゆる「狂牛病」の病原体である異常プリオンの混入が問題となっている。【０００８】  上記の通り、牛血清の使用��は問題点があるのにもかかわらず、特に動物を対象とする獣医療領域で用いられるワクチンの製造には牛血清が世界中で習慣的に使われてきている。【０００９】  しかし、最近になって、牛血清を細胞培養法に用いない試み（無血清培地：ＳＦＭおよび無血清細胞培養法）や、それを用いて牛用の試作ワクチンを作成したという報告が出てきた（Ｍａｋｏｓｃｈｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｂｏｖｉｎｅ  ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １  ａｎｄ  ｂｏｖｉｎｅ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｔｙｐｅ  ３  ｖｉｒｕｓ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ａｒｅ  ｅｆｆｉｃａｃｉｏｕｓ  ａｎｄ  ｓａｆｅ．Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３９：１３９−１４５，２００２）。しかしながら、この文献には、牛以外の動物用のワクチンについては開示されておらず、ましてや犬用のワクチンについては開示されていない。【００１０】  また、ＭＤＣＫ細胞を無血清培地で培養し、インフルエンザウイルスを増殖させたという報告がある（Ｋｅｓｓｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｕｉｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ＭＤＣＫ  ｃｅｌｌｓ  ｇｒｏｗｎ  ｉｎ  ａ  ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ  ｍｅｄｉｕｍ  ｆｏｒ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ｉｎ  Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．，Ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｐｒｅｐａｒｅｄ  ｉｎ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄ．Ｂａｓｅｌ，Ｋａｒｇｅｒ，１９９９，ｖｏｌ．９８，ｐｐ１３−２１．：Ｍｅｒｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎ  ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ．Ｉｎ  Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．，Ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｐｒｅｐａｒｅｄ  ｉｎ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄ．Ｂａｓｅｌ，Ｋａｒｇｅｒ，１９９９，ｖｏｌ．９８，ｐｐ２−３７．：Ｖｏｅｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅａｓｓｏｒｔａｎｔ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ｐｒｏｐａｇａｔｅｄ  ｉｎ  ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ＭＤＣＫ−ＳＦ１  ｃｅｌｌｓ．Ｉｎ  Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．，Ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｐｒｅｐａｒｅｄ  ｉｎ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄ．Ｂａｓｅｌ，Ｋａｒｇｅｒ，１９９９，ｖｏｌ．９８，ｐｐ７７−８７．：Ｖｏｅｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｉｇｈ−ｇｒｏｗｎ  ｒｅａｓｓｏｒｔａｎｔ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｉｎ  ＭＤＣＫ  ｃｅｌｌｓ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｉｎ  ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ  ｍｅｄｉｕｍ．Ｖａｃｃｉｎｅ  １７：１９４２−１９５０，１９９９．：牧角  啓一ら、無血清培養かつ浮遊培養可能な細胞及び当該細胞を用いたワクチン用ウイルスの製造法、再公表特許（Ａ１）、国際公開番号ＷＯ  ０１／０６４８４６、国際公開日２００１．９．７）。しかしながら、これらの文献に開示されている培��は、成分が不明であったり、無血清だが動物由来の成分を含んだりしていた。【００１１】  無血清培地で培養した細胞の簡便な凍結保存法については、ＳＦＭの一つであるＭＤＳＳ２培地（ＡＸＣＥＬＬ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｆ−６９６１０  Ｓａｉｎｔ  Ｇｅｎｉｓ  １’Ａｒｅｎｔｉｅｒｅ）にジメチルスルホキシド（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ：ＤＭＳＯ）を１０％添加して、サル腎臓由来細胞Ｖｅｒｏ細胞とハムスター腎臓由来細胞であるＢＨＫ−２１細胞を凍結保存したことが報告されている（Ｍｅｒｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ  ｆｒｅｅｚｉｎｇ  ｍｅｄｉｕｍ  ｆｏｒ  ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｃｅｌｌｓ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，２３：１８５−１８９，１９９５．）。しかしながら、ＭＤＳＳ２培地には動物蛋白であるカゼイン由来のペプトンが０．３％含まれている。また、ＶＰ−ＳＦＭ培地に１０％の割合でＤＭＳＯを添加した培地が無血清培養した細胞の凍結保存に応用できることが報告されている（Ｐｒｉｃｅ  ａｎｄ  Ｅｖｅｇｅ，Ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ  ｍｅｄｉｕｍ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ａｎｉｍａｌ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｖｉｒｕｓ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ｆｏｃｕｓ，１９：６７−６９，１９９７．）。しかしながら、ＶＰ−ＳＦＭ培地自体の組成が不明である。【００１２】  すなわち、動物由来の成分を含まない培地、動物由来成分を含まない培地で培養される細胞、及び安全なワクチン及び検査試薬等が望まれていた。
【発明の開示】
【００１３】  本発明の一態様は、犬腎臓由来細胞であるＭＤＣＫ細胞から誘導した細胞株であって、動物由来の成分なしで培養可能である細胞株に関する。この細胞株は、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０２２５で寄託された細胞株又はこの細胞株と同等の生物学的性質を有する細胞株であってもよい。
【００１４】  また、本発明の一態様は、ＭＤＣＫ細胞を、血清を含有せず細胞増殖因子を含む培地に順化させる工程と、ＲＰＭＩ  １６４０培地及び大豆由来ペプトンを含有する培地であって、動物由来の成分を含まない培地を用いて培養し、動物由来の成分なしで培養可能である細胞株を作出する工程とを含む細胞株の作出方法に関する。
【００１５】  さらに、本発明の一態様は、細胞株にウイルスを感染させる工程と、感染した細胞株を培養してウイルスを増殖させる工程とを含むウイルスの生産方法に関する。この感染した細胞株を培養する際の培地は、ＲＰＭＩ  １６４０培地及び大豆由来ペプトンを含有する培地であって、動物由来の成分を含まない培地であってもよい。感染した細胞株を培養する際に浮遊培養法を用いてもよい。ウイルスは、パラミクソウイルス科、オルトミクソウイルス科、ラブドウイルス科、フラビウイルス科、カリシウイルス科、アデノウイルス科、ヘルペスウイルス科及びパルボウイルス科からなる群から選ばれるウイルスであってもよい。また、ウイルスは、犬ジステンパーウイルス、麻疹ウイルス、犬パラインフルエンザウイルス、ＳＶ５ウイルス、インフルエンザウイルス、狂犬病ウイルス、日本脳炎ウイルス、犬カリシウイルス、１型および２型犬アデノウイルス、人アデノウイルス、犬ヘルペスウイルス及び１型と２型犬パルボウイルスからなる群から選ばれるウイルスであってもよい。
【００１６】  さらに、本発明の一態様は、上記の方法により生産されたウイルスを用いた診断用抗原の製造方法に関する。
【００１７】  さらに、本発明の一態様は、上記の方法により生産されたウイルスを用いたワクチンの製造方法に関する。
【００１８】  さらに、本発明の一態様は、ＲＰＭＩ  １６４０培地及び大豆由来ペプトンを含有する培地であって、動物由来の成分を含まない培地に関する。
【００１９】  さらに、本発明の一態様は、上記の培地にジメチルスルホキシドを１０重量％加えた細胞凍結保存用培地に関する。
【００２０】  さらに、本発明の一態様は、犬腎臓由来細胞であるＭＤＣＫ細胞から誘導した細胞株であって動物由来の成分なしでも培養可能である細胞株を、上記の細胞凍結保存用培地を用いて凍結保存する工程を含む凍結保存方法に関する。
【００２１】  本発明の一態様によると、ＭＤＣＫ細胞から誘導した細胞株は動物由来の成分なしで培養されるため、これを用いて生産したウイルスを、ワクチン及び検査試薬とした場合には、安全なワクチン及び検査試薬を提供することが可能である。
【００２２】  また、本発明の一態様によると、安価な市販の培地を用いてウイルスを増殖することができるため、これを用いて生産したウイルスをワクチンおよび検査試薬とした場合には、安価なワクチンおよび検査試薬を提供することが可能である。
【００２３】  さらに、本発明の一態様によると、培地は動物由来成分を含まないため、ウイルスを感染させた細胞をこの培地を用いて培養した場合に、安全なワクチン及び検査試薬を提供することが可能である。
【００２４】  さらに、本発明の一態様によると、動物由来成分を含まない培地を用いて細胞を凍結することが可能なため、安全なワクチンおよび検査試薬を提供することが可能である。
【００２５】  なお、本明細書において、「動物由来の成分を含まない」及び「動物由来の成分なし」とは、特に、動物由来の成分であってアレルギーの原因になり得るような蛋白成分を含まないことをいう。アレルギーの原因になり得る成分としては、例えば、動物由来の血清やその一部である血清アルブミン、細胞増殖因子等の動物性蛋白、及び動物に由来する各種添加物（Ｂａｃｔｏ  ｐｅｐｔｏｎｅ、Ｔｒｙｐｔｏｓｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｒｏｔｈ等）が挙げられる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図１は、ＭＤＣＫ−ＳＰ株の細胞を示す写真である。
【図２】図２は、ＲＰＭＩ／ＳＰ培地で培養したＭＤＣＫ−ＳＰ細胞と、７．５％  ＭＥＭで培養したＭＤＣＫ細胞との増殖曲線を示す図である。
【図３】図３は、ＲＰＭＩ／ＳＰ培地とマイクロキャリアビーズを用いて浮遊細胞培養したＭＤＣＫ−ＳＰ細胞を示す写真である。
【図４】図４は、７．５％  ＭＥＭで培養したＭＤＣＫ細胞と、ＲＰＭＩ／ＳＰ培地で培養したＭＤＣＫ−ＳＰ細胞における犬ジステンパーウイルスＳｎｙｄｅｒ  Ｈｉｌｌ株の増殖曲線を示す図である。
【図５】図５は、７．５％  ＭＥＭで培養したＭＤＣＫ細胞と、ＲＰＭＩ／ＳＰ培地で培養したＭＤＣＫ−ＳＰ細胞における犬アデノウイルス１型ＰＲ  １０９株と犬アデノウイルス２型Ｍａｎｈａｔｔａｎ株の増殖曲線を示す図である。
【図６】図６は、７．５％  ＭＥＭで培養したＭＤＣＫ細胞と、ＲＰＭＩ／ＳＰ培地で培養したＭＤＣＫ−ＳＰ細胞における犬パラインフルエンザウイルスＴｓｕｋｕｂａ株の増殖曲線を示す図である。
【図７】図７は、７．５％  ＭＥＭで培養したＭＤＣＫ細胞と、ＲＰＭＩ／ＳＰ培地で培養したＭＤＣＫ−ＳＰ細胞における犬パルボウイルス２型２ｂ抗原型ＭＤ  ９７−０３７株の増殖曲線を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】  まず、犬に用いることのできる、安全かつ有効なワクチンの開発をするため、よりウイルス感染スペクトルの広い犬腎臓細胞系であるＭＤＣＫ細胞を選択した。このＭＤＣＫ細胞は、動物由来の成分を含まない市販の基礎培地、例えば、Ｅａｇｌｅ’ｓ  ＭＥＭ、ＲＰＭＩ  １６４０  Ｍｅｄｉｕｍ、Ｌｅｉｏｖｉｔｚ’ｓ  Ｌ−１５  Ｍｅｄｉｕｍでは牛血清を添加しないと増殖しない。そのため、ＭＤＣＫ細胞を、段階的に順化継代する。【００２８】  ＭＤＣＫ細胞の順化は、まず、無血清であって細胞増殖因子を含む培地により行う。細胞増殖因子としては、上皮細胞増殖因子が好ましく、組み換え上皮細胞増殖因子であってもよい。この様な培地の具体例としては、以下の例には限定されないが、例えば、商品名「Ｏｐｔｉ−Ｐｒｏ  ＳＦＭ」（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  Ｎｏ．１２３０９−０１９）、Ｅａｇｌｅ’ｓ  ＭＥＭの改変培地である商品名「Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ  Ｒｅｄｕｃｅｄ−Ｓｅｒｕｍ  Ｍｅｄｉｕｍ」（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  Ｎｏ．３１９８５）が挙げられる。ＭＤＣＫ細胞の順化は、ＭＤＣＫ細胞の増殖が安定するまで行われる。【００２９】  上記の順化が終了したら、次に、ＲＰＭＩ１６４０培地及び大豆由来ペプトンを含有する培地であって、動物由来の成分を含まない培地（以下、ＲＰＭＩ／ＳＰ培地とする。）を用いて、ＭＤＣＫ細胞を順化させる。大豆由来ペプトンは、非動物性のペプトンであって、蛋白供給源である。培地中の大豆由来ペプトンとしての含有量は、２５０μｇ／ｍｌ〜３０００μｇ／ｍｌが好ましく、５００μｇ／ｍｌ〜１０００μｇ／ｍｌがより好ましく、概して７５０μｇ／ｍｌ程度が特に好ましい。【００３０】  培地中の蛋白含有量は、２０μｇ／ｍｌ以下であることが好ましく、さらに好ましくは１０μｇ／ｍｌ以下であり、特に好ましくは５μｇ／ｍｌ以下である。【００３１】  大豆ペプトンを７５０μｇ／ｍｌになるように含有した場合のＲＰＭＩ／ＳＰ培地の組成は、以下に例示されるが、これに限定されない。【００３２】（ＲＰＭＩ／ＳＰ培地の一例）
・ＲＰＭＩ  １６４０  Ｍｅｄｉｕｍ（ＧＩＢＣＯ、Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  Ｎｏ．２１８７０）
・大豆ペプトン（Ｐｅｐｔｏｎｅ  ｆｒｏｍ  ｓｏｙｂｅａｎ、ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｄｉｇｅｓｔ、Ｆｌｕｋａ、Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  Ｎｏ．８７９７２）１５グラムを１，０００ｍｌ滅菌蒸留水に溶解し、２２０ｎｍフィルターで濾過後、ＲＰＭＩ１６４０培地１００ｍｌ当たり５ｍｌを添加（最終濃度  ７５０μｇ／ｍｌ）
・Ｌ−グルタミンを３００ｍｇ／Ｌになるように添加（最終濃度  ３００μｇ／ｍｌ）
・抗生物質として、ペニシリンＧカリウムを１００Ｕ／ｍｌ、硫酸ストレプトマイシンを１００μｇ／ｍｌ、アンフォテリシンＢを２．５μｇ／ｍｌになるように添加（いずれも最終濃度）
ＭＤＣＫ細胞を、「Ｏｐｔｉ−Ｐｒｏ  ＳＦＭ」培地で２代及び「Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ  Ｒｅｄｕｃｅｄ−Ｓｅｒｕｍ  Ｍｅｄｉｕｍ」培地で３３代継代培養した後、ＲＰＭＩ／ＳＰ培地で２８代継代培養すると、ＲＰＭＩ／ＳＰ培地に対して順化が進み、細胞の増殖が安定した。過去数代に渡って、細胞シートの形成に要する時間と継代間隔が一定になり、５〜７日間隔で４倍に継代された。この新規な細胞株を「ＭＤＣＫ−ＳＰ株」と命名した。さらに、ＲＰＭＩ／ＳＰ培地で４５代まで継代培養すると、ＭＤＣＫ細胞は、無血清培地であるＲＰＭＩ／ＳＰ培地に完全に順化した。これにより、犬腎臓由来細胞であるＭＤＣＫ細胞から誘導した細胞株であって、動物由来成分なしで培養可能である細胞株が樹立された。ＭＤＣＫ−ＳＰ株細胞（ＲＰＭＩ／ＳＰ培地で４５代継代細胞、無血清培地では総計８０代継代細胞）は、２００４年１２月１６日に独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１−１−１）に寄託された（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０３２９）。その後、２００５年２月４日に受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０２２５として、国際寄託に移管された。【００３３】  ＭＤＣＫ−ＳＰ細胞株に、ＭＤＣＫ細胞株に対して感受性のあるウイルスを感染させ、感染した細胞株を培養して増殖させることにより、ウイルスを生産することができる。ウイルスを培養する際の培地は、動物由来の成分を含まない培地が好ましく、上記のＲＰＭＩ／ＳＰ培地がより好ましい。【００３４】  感染した細胞株の培養に、公知の方法を用いることができる。公知の方法としては、例えば、単層培養法および浮遊培養法が挙げられる。【００３５】  単層培養法としては、例えば、容器内面に単層培養させた細胞に、目的とするウイルスを感染させ、静置培養あるいは回転培養することで培養上清中にウイルスを調製することができる。容器としては、例えば、平板培養容器や回転培養瓶が挙げられ、具体的には、例えば、シャーレ、Ｔ−フラスコが挙げられる。容器の基質は、非ガラスが好ましく、プラスチックがより好ましい。【００３６】  浮遊培養法としては、例えば、マイクロキャリアビーズを用いたマイクロキャリア法が挙げられる。マイクロキャリア法としては、例えば、バイオリアクター（培養タンク）内で微小球形粒子（マイクロキャリアビーズ）の表面に細胞を単層に増殖させ、次いで増殖したマイクロキャリアビーズ上の細胞にウイルスを感染させた後、攪拌しながら培養することでその培養液中に目的とするウイルスを調製することができる。マイクロキャリアビーズの材質としては、例えば、セラミックス、デキストラン、ガラス、シリコン、プラスチックおよびポリアクリルアミド製等が挙げられる。市販のビーズとしては、例えば、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製のＣｙｔｏｄｅｘ（商標）１が挙げられる。【００３７】  ＭＤＣＫ−ＳＰ細胞に感受性のあるウイルスとしては、以下の例には限定されないが、ラブドウイルス科、ポックスウイルス科、ピコルナウイルス科、レオウイルス科、アデノウイルス科、カリシウイルス科、アデノウイルス科、パラミクソウイルス科、オルトミクソウイルス科、フラビウイルス科、ヘルペスウイルス科、パルボウイ���ス科が挙げられる。なかでも、増殖が容易な好ましいウイルスとして、パラミクソウイルス科、オルトミクソウイルス科、ラブドウイルス科、フラビウイルス科、カリシウイルス科、アデノウイルス科、ヘルペスウイルス科、及びパルボウイルス科に属するウイルスが挙げられる。好ましいウイルスとして、犬ジステンパーウイルス、麻疹ウイルス、犬パラインフルエンザウイルス、ＳＶ５ウイルス、インフルエンザウイルス、狂犬病ウイルス、日本脳炎ウイルス、犬カリシウイルス、１型および２型犬アデノウイルス、人アデノウイルス、犬ヘルペスウイルス、及び１型と２型犬パルボウイルスがさらに挙げられる。「順化」という、ウイルスを培養細胞に馴らす技法を用いれば、ＭＤＣＫ−ＳＰ細胞の感受性スペクトルは広げることができる。【００３８】  本発明の方法により生産されたウイルスを回収、精製して、ワクチンや診断薬用の抗原物質として使用することができる。ウイルスの回収、精製には、公知の方法を用いることができ、例えば、細胞を凍結溶解することにより細胞を破壊し、融解液を遠心分離して細胞や細胞破壊物を取り除き、上澄液をウイルス液として回収してもよい。【００３９】  ワクチンとする場合には、不活化ワクチンとしても、生ワクチンとしてもよい。不活化ワクチンとする場合は、回収、精製したウイルスをホルマリンなどにより不活化し、不活化したウイルスにアジュバントを添加して製造してもよい。また、生ワクチンの場合は、弱毒化したウイルスを、生産した後、回収・精製し、これにアジュバントを添加して製造してもよい。ワクチン中のウイルスの量は、ワクチンを接種する犬に対して、標的とするウイルスの感染を阻止できる程度の免疫を付与するに十分な量である。一般には、１×１０３．５ＴＣＩＤ５０／ｍｌ〜１×１０５．０ＴＣＩＤ５０／ｍｌ以上のウイルス量である。使用できるアジュバントは、ワクチンを接種する犬に、全身性感染防御免疫や局所感染防御免疫を付与できるアジュバントが挙げられる。【００４０】  感染診断薬とする場合には、上記の様に不活化したウイルスを抗原とするか、もしくはウイルスから単離した抗原をＥＬＩＳＡプレートやニトロセルロース膜などの支持体に固定することにより感染診断薬を調整することができる。そのような感染診断薬は犬の血清中に存在する抗体と結合させた後、西洋ワサビパーオキシダーゼやアルカリ性フォスファターゼなどを結合させた二次抗体との反応及びそれに続く呈色反応などの公知の反応を実施することにより視覚化することができ、各種ウイルスに感染した犬の血中抗体の有無、すなわち感染の有無を検出・確認することができる。【００４１】  細胞を低温保存する場合には、本発明によるＲＰＭＩ／ＳＰ培地にジメチルスルホキシド（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ：ＤＭＳＯ）を加えた培地を用いることができる。ＤＭＳＯは、ＲＰＭＩ／ＳＰ培地中、１０〜２０重量％が好ましく、より好ましくは概して１０重量％程度である。従来は、細胞の低温保存、例えば、−８０℃の電気フリーザーから−１９６℃の液体窒素、には、細胞凍結時の細胞に対する物理化学的な損傷を防ぐため、牛胎児血清及びＤＭＳＯを含む培地を用いていた。これに対して、本発明の細胞凍結保存��培地は、血清のみでなく、動物由来の他の成分を一切含まないので、無血清培地に順化した細胞の低温保存に適している。特に、本発明によるＭＤＣＫ−ＳＰ細胞の細胞凍結用保存培地として好ましい。【００４２】  以下の実施例により、本願発明は、さらに詳細に説明されるが、これら実施例に限定されるものではない。なお、本明細書において「％」は、特に断りのない限り、「重量％」の意味である。【００４３】（実施例１  ＲＰＭＩ／ＳＰ培地を用いたＭＤＣＫ−ＳＰ株の作出）
本実施例で用いた犬腎臓由来細胞であるＭＤＣＫ細胞は、１９５８年９月に、Ｍａｄｉｎ  ＆  Ｄａｒｂｙによって健康正常な雌コッカースパニエルの腎臓から作出された細胞系である。これは、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に登録された細胞（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＣＬ−３４）に由来するものと考えられる。１９７０年代に東京大学農学部獣医畜産学科家畜微生物学教室で本願発明者が研究用に使っており、その後、同細胞は鹿児島大学農学部獣医学科家畜微生物学講座、共立製薬株式会社臨床微生物研究所へと受け継がれてきた。最後者の臨床微生物研究所では１９９５年４月より、Ｅａｇｌｅ’ｓ  ＭＥＭ基礎培地（日水製薬株式会社製、イーグルＭＥＭ培地「ニッスイ（１）」）に、牛胎児血清を７．５％、Ｔｒｙｐｔｏｓｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｒｏｔｈを１０％、およびＬ−グルタミン（０．２９２ｇ／Ｌ）を含み、細菌増殖抑止を目的にペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）、アンフォテリシンＢ（０．２５〜０．５μｇ／ｍｌ）を添加した培地（７．５％  ＭＥＭ）で継代培養してきた。これを親細胞とした。【００４４】  まず順化の最初のステップとして、組換え上皮細胞増殖因子を含む無血清培地、商品名「Ｏｐｔｉ−Ｐｒｏ  ＳＦＭ」（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  Ｎｏ．１２３０９−０１９）で２代継代した後、Ｅａｇｌｅ’ｓ  ＭＥＭの改変培地である商品名「Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ  Ｒｅｄｕｃｅｄ−Ｓｅｒｕｍ  Ｍｅｄｉｕｍ」（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  Ｎｏ．３１９８５）に培養液を交換した。さらにこの培地で、牛胎児血清を一切添加しないで３３代継代培養した。基本的には親細胞と同じ継代条件で細胞を取り扱った。即ち、約７日間隔で、元細胞を４倍に拡大継代した。なお、親細胞も、またそれから誘導した無血清培地順化ＭＤＣＫ細胞も、継代をする場合には、０．２５％トリプシン＋０．０２％ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）溶液にて細胞面を２回洗浄後、３７℃のインキュベーターに静置し、細胞を分散させた。用いたトリプシンは豚膵臓由来のＤＩＦＣＯ  ＴＲＹＰＳＩＮ  ２５０（日本ベクトン・デイッキンソン株式会社）で、滅菌ＰＢＳに溶解後、２２０ｎｍフィルター濾過滅菌した。【００４５】  なお、細胞順化の過程でしばしばみられるように、時に細胞の増殖が遅延した。そこで、その間、１〜２回、培地を新しいものと交換したり、継代倍数を２〜３倍に減弱させたりして、細胞が途切れないようにした。【００４６】  結果として、明らかに「Ｏｐｔｉ−Ｐｒｏ  ＳＦＭ」と「Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ  Ｒｅｄｕｃｅｄ−Ｓｅｒｕｍ  Ｍｅｄｉｕｍ」培地で合計３５代継代培養した効果は認められた。つまり、細胞の増殖が安定してきた。【００４７】  次に、「Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ  Ｒｅｄｕｃｅｄ−Ｓｅｒｕｍ  Ｍｅｄｉｕｍ」にほぼ順化した３３代目の細胞をＥａｇｌｅ’ｓ  ＭＥＭ、ＲＰＭＩ  １６４０  Ｍｅｄｉｕｍ、Ｌｅｉｏｖｉｔｚ’ｓ  Ｌ−１５  Ｍｅｄｉｕｍ、あるいはＭｃＣｏｙｓ  ５Ａ  Ｍｅｄｉｕｍを用いて培養を試みた。その結果、ＭｃＣｏｙｓ  ５Ａ  Ｍｅｄｉｕｍ（ｍｏｄｉｆｉｅｄ）（ＧＩＢＣＯ  Ｂａｓｅ  Ｃ���ｔａｌｏｇｕｅ  Ｎｏ．１２３３０および１６６００）では良好な増殖を示したものの、他の培地では、培養器壁面に付着するが増殖が途中で停止し、細胞シートを形成しなかった。【００４８】  ＭｃＣｏｙｓ  ５Ａ  Ｍｅｄｉｕｍ（ｍｏｄｉｆｉｅｄ）（ＧＩＢＣＯ  Ｂａｓｅ  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  Ｎｏ．１２３３０および１６６００）とその他の基礎培地の成分比較で明らかな相違点は、ＭｃＣｏｙｓ  ５Ａ  Ｍｅｄｉｕｍ（ｍｏｄｉｆｉｅｄ）（ＧＩＢＣＯ  Ｂａｓｅ  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  Ｎｏ．１２３３０および１６６００）にはＢａｃｔｏ−ｐｅｐｔｏｎｅが添加されているか否かであった。なお、Ｂａｃｔｏ−ｐｅｐｔｏｎｅは牛の各種蛋白を酵素消化して得た「栄養源」であるため、本発明の意図に反することから、ＭｃＣｏｙｓ  ５Ａ  Ｍｅｄｉｕｍは比較例である。ＭｃＣｏｙｓ  ５Ａ  Ｍｅｄｉｕｍを用いた増殖が良好だったのは、ＭｃＣｏｙｓ  ５Ａ  Ｍｅｄｉｕｍにだけ添加されている牛蛋白由来酵素消化物であるＢａｃｔｏ−ｐｅｐｔｏｎｅの影響によるものと考えられる。そこで、同様の蛋白供給源である非動物性のペプトンを種々検討した結果、大豆由来ペプトンに到達した。【００４９】  上記の基礎培地、Ｅａｇｌｅ’ｓ  ＭＥＭ、ＲＰＭＩ  １６４０  Ｍｅｄｉｕｍ、およびＬｅｉｏｖｉｔｚ’ｓ  Ｌ−１５  Ｍｅｄｉｕｍの中では、ＲＰＭＩ  １６４０  Ｍｅｄｉｕｍでの増殖が一番優れていた。そこで、ＲＰＭＩ  １６４０  Ｍｅｄｉｕｍを採用し、これに大豆ペプトンを加えて、動物由来蛋白不含培地（ＲＰＭＩ／ＳＰ培地とする。）とした。なお、表１にＲＰＭＩ／ＳＰ培地を示すが、ここに示した培地と添加物は市販品を用いた一例であって、本発明のＲＰＭＩ／ＳＰ培地はこれに限定されない。
【表１】
0004693839.tif 000002
【００５０】  培養に用いた培養器はプラスチック製容器、例えば、２５ｃｍ２Ｔフラスコ、６ｃｍ直径プラスチックシャーレなどの非ガラス製の容器であり、これを用いて無血清培地による培養を開始した結果、本来のＭＤＣＫ細胞の持つ壁面付着性が減弱した。ガラス壁面では付着はするものの細胞の伸展増殖はみられず、細胞塊を形成し細胞シートの形成には至らなかった。従って本発明の全ての過程でプラスチック製培養器を用いた。【００５１】  表１の培地に、「Ｏｐｔｉ−Ｐｒｏ  ＳＦＭ」と「Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ  Ｒｅｄｕｃｅｄ−Ｓｅｒｕｍ  Ｍｅｄｉｕｍ」培地で合計３５代継代培養したＭＤＣＫ細胞を同様に順化継代した。ＲＰＭＩ／ＳＰ培地で２８代継代した時点で、明らかにＲＰＭＩ／ＳＰ培地に対して順化が進み、細胞の増殖が安定してきたことが確認された。即ち、過去数代に渡って、細胞シートの形成に要する時間と継代間隔が一定になり、５〜７日間隔で４倍に継代されるようになった。さらに継代を進め、４５代目で無血清培地であるＲＰＭＩ／ＳＰ培地に完全に順化した。４５代目の細胞株を、新たに誘導された細胞株であるとして、既に述べた通り国際寄託した（ＭＤＣＫ−ＳＰ株）。【００５２】  図１にはＭＤＣＫ−ＳＰ株細胞、４０代目の培養３日目の細胞シートの写真を示す。無固定・無染色で、倒立顕微鏡下で撮影した。細胞はこの後もその数を増加させ、シートを密にしていった。【００５３】  図２にはＲＰＭＩ／ＳＰ培地で４１代目のＭＤＣＫ−ＳＰ細胞の増殖状態を示した。対照とした親細胞は７．５％  ＭＥＭ培地で培養を開始した。共に５．０ｘ１０５／ｍｌの細胞濃度に調整した細胞浮遊液を２５ｃｍ２Ｔフラスコに７．５ｍｌ入れ、閉鎖系で静置培養し、２４時間毎に細胞数を計測した。図２に示したように７日後には、ＭＤＣＫ−ＳＰ細胞は約４倍、親細胞は約５．５倍に増加した。この結果からＭＤＣＫ−ＳＰ細胞は、親細胞であるＭＤＣＫ細胞と同様に増殖に優れていることが分かる。【００５４】  その他のＭＤＣＫ−ＳＰ細胞の性状は次の通りであった。【００５５】  ４４代目のＭＤＣＫ−ＳＰ細胞を大豆ペプトン無添加のＲＰＭＩ  １６４０  Ｍｅｄｉｕｍで培養を試みた。初代は４日後に細胞シートを形成したが、継代すると、網の目状にしか増殖せず、細胞シートを形成しなかったことより、誘導したＭＤＣＫ−ＳＰ株細胞はその増殖にＲＰＭＩ／ＳＰ培地中の大豆ペプトンを必要としていることが再確認された。【００５６】  ＲＰＭＩ／ＳＰ培地の大豆ペプトンの量を２倍および４倍、即ち、１．５ｍｇ／ｍｌ及び３ｍｇ／ｍｌに変更した場合のＭＤＣＫ−ＳＰ細胞の増殖性への影響について、４７代目からのＭＤＣＫ−ＳＰ細胞について調べた。その結果、大豆ペプトンの量を増加させても、ＭＤＣＫ−ＳＰ細胞は同様に増殖した。【００５７】（実施例２  マイクロキャリアビーズを用いた浮遊細胞培養）
ＭＤＣＫ−ＳＰ細胞を、市販のマイクロキャリアビーズを用いて浮遊培養した。【００５８】  市販のマイクロキャリアビーズとして、Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅのＣｙｔｏｄｅｘ（商標）１を用いた。これはデキストランからなる細胞培養専用の球体である。【００５９】  マイクロキャリアビーズを０．３ｇ計量し、Ｃａ＋＋とＭｇ＋＋を含まないリン酸緩衝食塩水で使用説明書通りに活性化した後、オートクレーブで加熱滅菌し、ＲＰＭＩ／ＳＰ培地に置換した。このマイクロキャリアビーズ浮遊液をスピナーフラスコ（Ｗｈｅａｔｏｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，ＮＪ，ＵＳＡ）に移した後、総計１０７個のＭＤＣＫ−ＳＰ細胞（継代５６代目）を５０ｍｌのＲＰＭＩ／ＳＰ培地に浮遊してフラスコに入れ、３７℃で吸着させた。約３時間の間、時々２分間くらい４０ｒｐｍで回転させて、細胞と球体の混和・接触をさせた。その後、さらに５０ｍｌのＲＰＭＩ／ＳＰ培地を加え、計１００ｍｌを、６０ｒｐｍでスピナーを回転させながら培養を開始した。【００６０】  培養開始後、３日間隔で培地を半量づつ交換していったところ、培養開始２０日後の時点で球体の一部に細胞が数個ほど吸着していることが観察され、培地の色も増殖を示唆するように黄変し始めた。その４日後には付着細胞数が増加していることが確認された。図３は培養２７日後の顕微鏡写真である。【００６１】  図３によると、球体表面を細胞が覆っているのが判る。この付着細胞は、前述のトリプシン・ＥＤＴＡ溶液を用いて回収した後、新しいマイクロキャリアビーズと培地に継代可能であった。すなわち、ＭＤＣＫ−ＳＰ細胞とＲＰＭＩ／ＳＰ培地の組み合わせによると、マイクロキャリアビーズを用いた浮遊細胞培養が可能である。【００６２】  マイクロキャリアビーズによる浮遊培養法は、単位容量当たりに産生される細胞数を増加させるために用いる技術である。この培養法により、ＭＤＣＫ／ＳＰ細胞を用いて犬パルボウイルスを増殖してもよい。この培養法は、犬パルボウイルスのように、ウイルスの増殖程度が感染する宿主細胞の増殖能力に依存しているウイルスの産生に極めて有用である。結果として、産生されるウイルス量ははるかに高まることが期待される。例えば、現在市販されている犬用ワクチンの１バイアル（１ｍｌ容量）に含まれる犬パルボウイルスの量は１０５．０〜１０７．０ＴＣＩＤ５０であることから、例えば後に記載の表２に示したシードウイルス液の感染価を得る培養法でも十分にその目的は達成できる。そして、このマイクロキャリアビーズによる浮遊培養法を応用することで、そのような細胞機能依存性ウイルスに特有の問題点を解決することができる。【００６３】（実施例３  無血清シードウイルス液の作成）
実施例３において、現在広く、世界中の飼い犬の予防接種に用いられているワクチンを構成している、犬ジステンパーウイルス、１型と２型の犬アデノウイルス、犬パラインフルエンザウイルス、犬パルボウイルス２型の５種類を用いた。これらのウイルス液のストックはこれまで牛胎児血清やＴｒｙｐｔｏｓｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｒｏｔｈを添加した、例えばＥａｇｌｅ’ｓ  ＭＥＭ培地などの細胞培養内で増殖させている。そのため、無血清培地による細胞培養内でウイルスを増殖させるためにはこれらの牛血清成分などの動物蛋白質を取り除く必要がある。そこで、本実施例において無血清シードウイルス液を作成した。表２には上記のウイルス種のうち、実際に用いたウイルス株名と、それらを用いて作出したシードウイルス液のウイルス力価を示した。
【表２】
0004693839.tif 000003
【００６４】  犬ジステンパーウイルス、１型と２型の犬アデノウイルス、及び犬パラインフルエンザウイルスについては、最初のウイルス液は、ウイルス接種後、親細胞のＭＤＣＫ細胞を牛胎児血清が２％に添加された培地でウイルス増殖を促している。そのため、その上清中には牛血清が２％に、Ｔｒｙｐｔｏｓｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｒｏｔｈが１０％に含まれることから、それらの成分の影響をなくす処置を次の通り試みた。閉鎖系フラスコ内で培養され、細胞シートを形成しているＭＤＣＫ−ＳＰ細胞にウイルス液を接種し、１時間のウイルス吸着後、ウイルス液を吸引除去し、さらにＲＰＭＩ／ＳＰ培地で２回細胞表面を洗浄した。その後、ＲＰＭＩ／ＳＰ培地を加え、３７℃のインキュベーター内で静置培養し、ウイルスの増殖を図った。ウイルスが十分に増殖した、数日から７日後、一度、フラスコごと凍結融解し、融解液は低速遠心により細胞や細胞破砕物を取り除き、上清を第二代ウイルス液とした。この操作を合計２回繰り返した、３代目の培養上清をストックウイルス液として−８０℃フリーザー内に分注保存した。【００６５】  犬パルボウイルス２型については、ＭＤＣＫ−ＳＰ細胞がＲＰＭＩ／ＳＰ培地に浮遊された時点でウイルス接種を行った。そのために、最初のウイルス液には牛胎児血清が７．５％に含有されており、他のウイルス液よりも牛血清の影響が大きい。そこでＭＤＣＫ−ＳＰ細胞をＲＰＭＩ／ＳＰ培地に浮遊させた時点で、培養液の約５％量のウイルス液を加え、３７℃のインキュベーター内で静置培養し、細胞が壁面に接着後の２４時間後に、培養液を吸引除去、細胞面をＲＰＭＩ／ＳＰ培地で一度洗浄後、新しいＲＰＭＩ／ＳＰ培地を加えウイルスの増殖を図った。さらに６日後、感染細胞そのものを、正常のＭＤＣＫ−ＳＰ細胞のトリプシン消化継代操作と同じようにして継代した。この操作を合計２回繰り返した３代目を、一度、フラスコごと凍結融解し、融解液は低速遠心により細胞や細胞破砕物を取り除き、上清をシードウイルス液とした。【００６６】  作出したＲＰＭＩ／ＳＰ培地で培養したＭＤＣＫ−ＳＰ細胞におけるそれぞれのウイルス種の感染価を同じく表２に示す。表２によると、これらの感染価は、親細胞であるＭＤＣＫ細胞で増殖させた場合と比べ同等であることが示された。【００６７】（実施例４  犬ジステンパーウイルス犬由来培養細胞順化株）
１）２５ｃｍ２Ｔフラスコに親細胞であるＭＤＣＫ細胞を７．５％  ＭＥＭ培地で、ＭＤＣＫ−ＳＰ細胞をＲＰＭＩ／ＳＰ培地で培養開始し、シートを形成した培養３日後に細胞数を計測した。【００６８】２）表２に示したストックウイルス液の中の、犬ジステンパーウイルス、Ｓｎｙｄｅｒ  Ｈｉｌｌ株を、それぞれ同じｍ．ｏ．ｉ．（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ；感染の多重性、既知の数の培養細胞に加えた感染性ウイルス粒子数の比率）の０．０１になるようにウイルスを希釈接種した。【００６９】３）３７℃、１時間のウイルス吸着の後、未吸着ウイルスを吸引除去し、７．５％  ＭＥＭあるいはＲＰＭＩ／ＳＰ培地を加え、静置培養した。【００７０】４）その後２４時間間隔で接種後、１，２，３，４，及び７日目にフラスコごと−８０℃フリーザーに凍結保存した。【００７１】５）ウイルス感染価測定に先立ち、凍結しておいたフラスコを室温で融解し、２，５００ｒｐｍ、１０分間の遠心で細胞成分を除去した上清を感染価測定に用いた。【００７２】６）感染価の測定は９６穴マイクロプレートを用いたＭｉｃｒｏ−ｔｉｔｒａｔｉｏｎ法にて行った。即ち、５）で得たウイルス液を７．５％  ＭＥＭ培地で１０倍階段希釈し、各希釈につき４穴に１００μｌづつ加え、さらに総ての穴に１００μｌ細胞浮遊液を加え、軽く混合し、３７℃の５％  炭酸ガスインキュベーター内で静置培養した。【００７３】７）細胞浮遊液は、７．５％  ＭＥＭ培地に１ｘ１０５／ｍｌになるように犬ジステンパーウイルスの細胞側レセプターであるＣａｎｉｎｅ  ＳＬＡＭ（ＣＤ１５０）を発現させたＶｅｒｏ（ＳＬＡＭＶｅｒｏ）細胞（Ｓｅｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｗｉｌｄ  ｓｔｒａｉｎｓ  ｏｆ  ｃａｎｉｎｅ  ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎ  Ｖｅｒｏ  ｃｅｌｌｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｃａｎｉｎｅ  ＳＬＡＭ（ＣＤ１５０）ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ａｄａｐｔａｂｉｌｉｔｙ  ｔｏ  ｍａｒｍｏｓｅｔ  Ｂ９５ａ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７７：９９４３−９９５０，２００３．）を用いた。【００７４】８）ウイルス接種７日後にウイルス変性効果（ＣＰＥ）の有無によって感染価の終末点を算出した。【００７５】  これらの結果を図４に示す。図４には７．５％  ＭＥＭで培養した親細胞ＭＤＣＫ細胞と、発明した動物由来蛋白不含培地で培養したＭＤＣＫ−ＳＰ細胞での犬ジステンパーウイルスＳｎｙｄｅｒ  Ｈｉｌｌ株の増殖曲線を示した。ウイルス接種後翌日より、親細胞ＭＤＣＫ細胞とＭＤＣＫ−ＳＰ細胞、いずれでも感染後２４時間でウイルス産生が開始され、以後増加していった。総てのタイムポイントでＭＤＣＫ−ＳＰ細胞の方が３２倍〜１００倍高いウイルス感染価を示した。【００７６】（実施例５  犬アデノウイルス１型と２型）
実施例４同じ方法で実施したが、相違するのは、
１）用いたウイルス株が、犬アデノウイルス１型（ＣＡＶ−１）はＰＲ  １０９株、犬アデノウイルス２型（ＣＡＶ−２）はＭａｎｈａｔｔａｎ株であること、
２）感染価測定のＭｉｃｒｏ−ｔｉｔｒａｔｉｏｎ法に用いた細胞がＭＤＣＫ細胞であること、
の２点である。【００７７】  これらの結果を図５に示す。図５によると、いずれの培養細胞においても、また両ウイルス株とも、ほとんど同じように増殖した。また、牛血清を添加したこれまでのウイルス培養法と、新しく発明した動物由来蛋白不含培地で培養のＭＤＣＫ−ＳＰ細胞によるウイルス培養法に差は認められず、いずれも優れた感染価を示した。【００７８】（実施例６  犬パラインフルエンザウイルス）
実施例４と同じ方法で実施したが、相違するのは、
１）用いたウイルス株がＴｓｕｋｕｂａ株であること、
２）感染価測定のＭｉｃｒｏ−ｔｉｔｒａｔｉｏｎ法に用いた細胞がＭＤＣＫ細胞であること、
３）感染価測定のＭｉｃｒｏ−ｔｉｔｒａｔｉｏｎ法で用いた、感染価終末点の確定には、各希釈穴の上清中に産生されている血球凝集素の有無で行った。即ち、各穴から５０μｌの上清を取り出し、別に用意した血球凝集反応用マイクロプレートに移し、総ての穴に等量のｐＨ７．０のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）と等量のアカゲザル血球浮遊液を加えた。アカゲザル血球浮遊液は同じＰＢＳに０．７５％の割合で赤血球を浮遊し調整した。よく攪拌後、室温に２時間静置し、凝集の有無にて感染価を算出した。【００７９】以上の３点である。【００８０】  以上の結果を図６に示す。図６によると、牛血清を添加したこれまでのウイルス培養法の方がウイルス増殖のピーク到達まで２４時間ほど速かったが、牛血清を添加したこれまでのウイルス培養法と、新しく発明した動物由来蛋白不含培地で培養したＭＤＣＫ−ＳＰ細胞によるウイルス培養法に、到達したウイルス力価に差は認められなかった。【００８１】（実施例７  犬パルボウイルス２型）
実施例４と同じ方法で実施したが、相違するのは、
１）用いたウイルス株は２ｂ抗原型のＭＤ９７−０３７株であること、
２）ｍ．ｏ．ｉ．が０．０５になるようにストックウイルス液を希釈し、実施例３で説明したように、細胞が培地に浮遊された時点でウイルス接種を行ったこと、
３）感染価測定のＭｉｃｒｏ−ｔｉｔｒａｔｉｏｎ法に用いた細胞がＭＤＣＫ細胞であること、
４）実施例６と同じように、感染価終末点の確定には、各希釈穴の上清中に産生されている血球凝集素の有無で行ったこと、
５）その際に用いたＰＢＳのｐＨは６．８で、４℃で反応させたこと、
以上の５点である。【００８２】  図７にその結果を示す。実施例４〜７の場合のウイルス種と異なり、牛血清を添加したこれまでのウイルス培養法の方が、動物由来蛋白不含培地で培養したＭＤＣＫ−ＳＰ細胞によるウイルス培養法に比して、高いウイルス産生が認められた。しかしながら、図７によると、動物由来蛋白不含培地で培養したＭＤＣＫ−ＳＰ細胞によるウイルス培養法でも、実用上十分なウイルス感染価が示されている。【００８３】  パルボウイルスは一般に、宿主細胞が盛んに分裂増殖する場合、ウイルスの産生量も増えることが知られている。これはウイルスＤＮＡの複製に必要な核酸合成酵素をパルボウイルス自らは持たず、感染した宿主細胞のＤＮＡ合成酵素を借用しているためである。パルボウイルスでは、宿主細胞が盛んに分裂増殖する場合はそのＤＮＡ合成酵素の量も多くなり、複製が促進される。実施例３で行ったようなウイルス感染細胞をトリプシンにより消化分散させて新しい培地に継代する方法では、継代する度にウイルス感染細胞の割合が増え、細胞継代により、宿主細胞も分裂し、よりウイルス複製に好適な環境に変化するため、一定量の培地内により多量にウイルスが産生されると考えられる。一方、本実施例のように、最初にウイルスが細胞に接触感染するだけで、培養器内での細胞増殖に一定の制限がある（即ち、細胞が付着して増殖できる面積が決まっている）場合には、宿主細胞の増殖速度や密度にウイルス産生が直接的に規定されてしまうと考えられる。細胞増殖能（感染価）を高くするのであれば、細胞密度、感染ウイルス量、あるいはウイルス感染細胞の継代などにより、ウイルス増殖法を改変すればよい。【００８４】（実施例８  無血清培地で培養した細胞の簡便な凍結保存法）
ＲＰＭＩ／ＳＰ培地に、ＤＭＳＯ（Ｗａｋｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｌｔｄ．Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  Ｎｏ．０４３−０７２１６）を１０％に含む細胞凍結用培地を調整した。この培地に、ＲＰＭＩ／ＳＰ培地で４４代継代したＭＤＣＫ−ＳＰ細胞を１０６／ｍｌ以上になるように浮遊し、凍結保存用バイアルに１．８ｍｌずつ分注した。正確な細胞数は６．５ｘ１０６／バイアルであった。本バイアルを冷蔵しておいた簡易細胞凍結器「ＢＩＣＥＬＬ（商標）」（Ｎｉｈｏｎ  Ｆｒｅｅｚｅｒ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）に入れ、−８０℃フリーザーで一晩かけて凍結した。その後、液体窒素（液相）に移管した。【００８５】  凍結保存状況の確認のために、４８時間後、定法通り、液体窒素より取り出し、４０℃程度の温湯中で一気に溶解、ＲＰＭＩ／ＳＰ培地１０ｍｌに希釈浮遊させ、低速遠心で細胞を回収した。細胞ペレットを７．５ｍｌのＲＰＭＩ／ＳＰ培地に再浮遊し、２５ｃｍ２のＴフラスコに入れ、３７℃で培養を開始した。【００８６】  培養３日目には細胞シートを形成したので、５日目に４倍量の新しい培地に継代した。継代培養した細胞はやはり３日目に細胞シートを形成し、少なくても顕微鏡下で観察した分には本凍結法による悪影響は認められなかった。以後、非凍結の細胞と同じように継代が可能であった。このことから、本発明のＭＤＣＫ−ＳＰ細胞の凍結に１０％ＤＭＳＯ添加ＲＰＭＩ／ＳＰ培地を用いることが有効であることが確認された。【００８７】  前述したところが、本発明の好ましい実施態様であって、多くの変更及び修正を本発明の精神とにそむくことなく実行できることは当業者によって了解される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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