(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
モルビリウイルス属に属するウイルスのＰ蛋白質に由来する蛋白質であって、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質の４３９位またはその相同な位置のロイシンがプロリンである蛋白質をコードする、ウイルスに温度感受性の形質を導入するために用いるＤＮＡ。
【請求項２】
該蛋白質が、麻疹ウイルスのＰ蛋白質に由来する蛋白質である、請求項１に記載のＤＮＡ。
【請求項３】
該蛋白質が、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質の４３９位のロイシンがプロリンである蛋白質である、請求項２に記載のＤＮＡ。
【請求項４】
該蛋白質が、さらに下記（ａ）および／または（ｂ）である蛋白質である、請求項２または３に記載のＤＮＡ：
（ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質の１１０位またはその相同な位置のアスパラギン酸がチロシンである；
（ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質の２７５位またはその相同な位置のシステインがチロシンである。
【請求項５】
該蛋白質が、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質の４３９位のロイシンがプロリンであり、１１０位のアスパラギン酸がチロシンであり、及び２７５位のシステインがチロシンである、請求項４に記載のＤＮＡ。
【請求項６】
請求項１から５のいずれかに記載のＤＮＡによりコードされる蛋白質。
【請求項７】
請求項１から５のいずれかに記載のＤＮＡを含むベクター。
【請求項８】
温度感受性の形質を導入した麻疹ウイルスを再構成するために用いる、請求項７に記載のベクター。
【請求項９】
モルビリウイルス属に属するウイルスに温度感受性の形質を導入する方法であって、該ウイルスのＰ蛋白質において、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質の４３９位またはその相同な位置のロイシンのプロリンへの変異を導入することを特徴とする方法。
【請求項１０】
ウイルスが麻疹ウイルスである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記蛋白質において、さらに下記（ａ）および／または（ｂ）に記載のアミノ酸の変異を導入することを特徴とする、請求項１０に記載の方法：
（ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質の１１０位またはその相同な位置のアスパラギン酸のチロシンへの変異；
（ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質の２７５位またはその相同な位置のシステインのチロシンへの変異。
【請求項１２】
前記蛋白質において、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質の４３９位のロイシンのプロリンへの変異、１１０位のアスパラギン酸のチロシンへの変異、及び２７５位のシステインのチロシンへの変異を導入することを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項９から１２のいずれかに記載の方法により温度感受性の形質を導入することを特徴とする、温度感受性の形質を導入したウイルスの製造方法。
【請求項１４】
麻疹ウイルスのＰ蛋白質において、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質の４３９位またはその相同な位置のロイシンのプロリンへの変異、１１０位またはその相同な位置のアスパラギン酸のチロシンへの変異、及び２７５位またはその相同な位置のシステインのチロシンへの変異を導入することを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記蛋白質において、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質の４３９位のロイシンのプロリンへの変異、１１０位のアスパラギン酸のチロシンへの変異、及び２７５位のシステインのチロシンへの変異を導入することを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、モルビリウイルス由来Ｐ蛋白質の位置特異的な変異により温度感受性を制御する方法に関する。本発明によるＰ蛋白質は、ウイルスの弱毒化に有用である。
背景技術
モルビリウイルス（Ｍｏｒｂｉｌｌｉｖｉｒｕｓ）属は、モノネガウイルス目パラミキソウイルス科の下位に位置する一属であり、麻疹ウイルスを初めとする多くの病原性ウイルスが含まれている。麻疹ウイルスは、急性の発疹性疾患である「ハシカ」の原因ウイルスである。麻疹ウイルスは広く小児に感染し、発熱、発疹、咳などの症状を示す。時に、麻疹脳炎、麻疹肺炎などの重篤な合併症を引き起こし、死にいたらしめる事もある。又、ごく稀に、感染治癒後にも持続感染し、予後不良の脳炎、亜急性硬化性全脳炎（ＳＳＰＥ）をおこす。唯一有効な予防手段は弱毒麻疹ウイルスワクチンの予防接種である。
弱毒麻疹ウイルスワクチンの１つであるＡＩＫ−Ｃ株は、麻疹ウイルスＥｄｍｏｎｓｔｏｎ株を羊の腎臓細胞、鶏胚細胞に継代する事によって得られたウイルス株である。ＡＩＫ−Ｃ株は、抗体獲得率と安全性に優れ、国際的にも高い評価を得ている。この弱毒生麻疹ワクチンの普及に伴って麻疹罹患者は著明に減少している。一般に、ワクチンの抗体獲得率と安全性とは相反する特性である。したがって、両者をともに高い水準で維持することは容易ではない。そのため、ＡＩＫ−Ｃ株における弱毒化のメカニズムを他の株やウイルスに応用できれば、弱毒化ワクチンの開発において有用である。
ＡＩＫ−Ｃ株は３２℃でよく増殖するが、３９℃での増殖が極めて低い事（ｔｓ；温度感受性）が知られている（ＳＡＳＡＫＩ，Ｋ．，Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌｉｖｅ  ＡＩＫ  ｍｅａｓｌｅｓ  ｖａｃｃｉｎｅ．Ｉ  Ａｄａｐｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆｕｒｔｈｅｒ  ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ  ＡＩＫ  ｍｅａｓｌｅｓ  ｖｉｒｕｓ（ｔｈｅ  ｓｔｒａｉｎ  ＡＩＫ−Ｌ３３）ｔｏ  ｃｈｉｃｋ  ｅｍｂｒｙｏ  ｃｅｌｌｓ．Ｋｉａｓａｔｏ  Ａｒｃｈ．ｏｆ  Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，４７，１−１２，１９７４）。しかし、このウイルスの温度感受性が、どのようなメカニズムによりもたらされているのかは未だ不明である。
発明の開示
本発明は、その形質として温度感受性を導入するために用いるＤＮＡを提供することを課題とする。また本発明は、ウイルスのＰ蛋白質の特定の部位を変異させてウイルスに温度感受性の形質を導入する方法、およびＰ蛋白質の特定の部位の変異により温度感受性の形質を持ったウイルス提供することを課題とする。本発明の方法により製造された温度感受性の形質を導入したウイルスは、弱毒ウイルスとしてワクチン製造などに有用である。
本発明者らは、ある種のウイルス蛋白質の変異が温度感受性を制御しているのであれば、その変異を同定し、変異蛋白質を有するウイルスを作製することにより、ウイルスの増殖や毒性を制御することができると考えた。そこで本発明者らは、麻疹ウイルス温度感受性ワクチン株であるＡＩＫ−Ｃ株と、その親株で非温度感受性株であるＥｄｍｏｎｓｔｏｎ株のＮ、Ｐ、Ｌ遺伝子を用いて、モルビリウイルス属のウイルスの温度感受性に関与している遺伝子の検索を行った。その結果、本発明者らは、Ｐ遺伝子が温度感受性に関与していることを突きとめた。
次に、Ｅｄｍｏｎｓｔｏｎ株またはＡＩＫ−Ｃ株のＰ遺伝子にアミノ酸の置換を導入し、それらのＰ遺伝子が温度感受性に及ぼす影響を調べた。その結果、Ｐ蛋白質の４３９位のアミノ酸が、温度感受性と密接に関与することを見出した。高温でも増殖可能なＥｄｍｏｎｓｔｏｎ株では、Ｐ蛋白質の４３９位はロイシンになっている。そして本発明者らは、複数の部位に変異を有するＰ蛋白質のうち、４３９位がＥｄｍｏｎｓｔｏｎ株と同じロイシンである変異体は、Ｅｄｍｏｎｓｔｏｎ株のＰ蛋白質と同等のウイルスの増殖能を示すが、このアミノ酸を変異させる事によって、温度感受性の形質を導入することに成功した。このように、本発明はＰ蛋白質の４３９位のアミノ酸と温度感受性との関係を初めて開示するものである。
本発明者らは以上の知見に基づき、ウイルスのＰ蛋白質の４３９位のアミノ酸を改変することにより、ウイルスに温度感受性の形質を導入することが可能であることを見出した。温度感受性の形質を導入したウイルスは、宿主における増殖と拡散が困難となり、弱毒化が達成される。これまで、ワクチン開発に有用な弱毒化ウイルスの単離はウイルス変異株のスクリーニングに頼っており、効率が低く時間を要するものであった。本発明により、任意のウイルスを容易に弱毒化することが可能になる。
本発明者らは、また、Ｐ蛋白質の４３９位のアミノ酸以外にも、１１０位のアミノ酸および２７５位のアミノ酸も、温度感受性に関与していることを見出した。従って、これらのアミノ酸を変異させることによっても、温度感受性の形質を導入することが可能となる。
すなわち本発明は、温度感受性の形質を導入するために用いるＤＮＡ、ウイルスのＰ蛋白質の特定のアミノ酸を変異させてウイルスの温度感受性の形質を導入する方法、およびＰ蛋白質の特定の部位の変異により温度感受性の形質を導入したウイルスに関し、より具体的には以下の各発明に関する。
〔１〕モルビリウイルス属に属するウイルスのＰ蛋白質に由来する蛋白質であって、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質の４３９位またはその相同な位置のアミノ酸がロイシン以外のアミノ酸である蛋白質をコードする、ウイルスに温度感受性の形質を導入するために用いるＤＮＡ。
〔２〕配列番号：２に記載のアミノ酸配列と少なくとも４０％の同一性を有する蛋白質であって、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質の４３９位またはその相同な位置のアミノ酸がロイシン以外のアミノ酸である蛋白質をコードする、ウイルスに温度感受性の形質を導入するために用いるＤＮＡ。
〔３〕前記ロイシン以外のアミノ酸がプロリンである、〔１〕または〔２〕に記載のＤＮＡ。
〔４〕麻疹ウイルス由来の蛋白質をコードする、〔１〕から〔３〕のいずれかに記載のＤＮＡ。
〔５〕ＤＮＡが、さらに下記（ａ）および／または（ｂ）である蛋白質をコードする、〔４〕に記載のＤＮＡ。
（ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質の１１０位またはその相同な位置のアミノ酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸である蛋白質。
（ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質の２７５位またはその相同な位置のアミノ酸がシステイン以外のアミノ酸である蛋白質。
〔６〕前記アスパラギン酸以外のアミノ酸および／またはシステイン以外のアミノ酸がチロシンである、〔５〕に記載のＤＮＡ。
〔７〕〔１〕から〔６〕のいずれかに記載のＤＮＡによりコードされる蛋白質。
〔８〕〔１〕から〔６〕のいずれかに記載のＤＮＡを含むベクター。
〔９〕温度感受性の形質を導入した麻疹ウイルスを再構成するために用いる、〔８〕に記載のベクター。
〔１０〕モルビリウイルス属に属するウイルスに温度感受性の形質を導入する方法であって、該ウイルスのＰ蛋白質において、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質の４３９位またはその相同な位置のアミノ酸に変異を導入することを特徴とする方法。
〔１１〕配列番号：２に記載のアミノ酸配列と少なくとも４０％の同一性を有する蛋白質を有するウイルスに温度感受性の形質を導入する方法であって、該蛋白質において、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質の４３９位またはその相同な位置のアミノ酸に変異を導入することを特徴とする方法。
〔１２〕前記４３９位またはその相同な位置のアミノ酸をプロリンに置換することを特徴とする、〔１０〕または〔１１〕に記載の方法。
〔１３〕ウイルスが麻疹ウイルスである、〔１０〕から〔１２〕のいずれかに記載の方法。
〔１４〕前記蛋白質において、さらに下記（ａ）および／または（ｂ）に記載のアミノ酸に変異を導入することを特徴とする、〔１３〕に記載の方法。
（ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質の１１０位またはその相同な位置のアミノ酸。
（ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質の２７５位またはその相同な位置のアミノ酸。
〔１５〕前記１１０位および／または２７５位、あるいはそれらの相同な位置のアミノをチロシンに置換することを特徴とする、〔１４〕に記載の方法。
〔１６〕〔１０〕から〔１５〕のいずれかに記載の方法により得ることができる、温度感受性の形質を導入したウイルス。
〔１７〕弱毒ウイルスである、〔１６〕に記載のウイルス。
〔１８〕〔１６〕または〔１７〕に記載のウイルスを含む医薬組成物、および
〔１９〕ワクチンとして用いる、〔１８〕に記載の医薬組成物。
あるいは本発明は、モルビリウイルス属に属するウイルスのＰ蛋白質に由来する蛋白質であって、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質の４３９位またはその相同な位置のアミノ酸がロイシン以外のアミノ酸である蛋白質をコードするＤＮＡの、温度感受性の形質を導入したウイルスの製造方法における使用に関する。また本発明は、配列番号：２に記載のアミノ酸配列と少なくとも４０％の同一性を有する蛋白質であって、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質の４３９位またはその相同な位置のアミノ酸がロイシン以外のアミノ酸である蛋白質をコードするＤＮＡの、温度感受性の形質を導入したウイルスの製造におけるＤＮＡの使用に関する。更に本発明は、これらＤＮＡを含むベクターの、温度感受性の形質を導入した麻疹ウイルスの再構成における使用に関する。
本発明は、温度感受性の形質を導入するために用いるＤＮＡに関する。本発明のＤＮＡは、モルビリウイルス属に属するウイルスのＰ蛋白質に由来する蛋白質であって、麻疹ウイルスＥｄｍｏｎｓｔｏｎ株のＰ蛋白質（配列番号：２）の４３９位またはその相同な位置のアミノ酸がロイシン以外のアミノ酸である蛋白質をコードするＤＮＡが含まれる。また、本発明のＤＮＡには、Ｅｄｍｏｎｓｔｏｎ株のＰ蛋白質のアミノ酸配列（配列番号：２）と少なくとも４０％の同一性を有する蛋白質であって、Ｅｄｍｏｎｓｔｏｎ株のＰ蛋白質の４３９位またはその相同な位置のアミノ酸がロイシン以外のアミノ酸である蛋白質をコードするＤＮＡが含まれる。配列番号：２に示すアミノ酸配列との同一性は、望ましくは６０％以上、より望ましくは８０％以上とする。アミノ酸配列の同一性は、Ｇｅｎｅｔｙｘ−Ｍａｃ  Ｖｅｒ．１０（ソフトウエア開発株式会社）を使用した３Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅｒｓｏｎ法によって決定することができる。
モルビリウイルスに属するウイルスとしては、例えば、麻疹ウイルス（Ｍｅａｓｌｅｓ  ｖｉｒｕｓ）、犬ジステンパーウイルス（Ｃａｎｉｎｅ  ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ  ｖｉｒｕｓ）、アザラシジステンパーウイルス（Ｐｈｏｃｉｄ  ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ  ｖｉｒｕｓ）、リンダーペストウイルス（Ｒｉｎｄｅｒｐｅｓｔ  ｖｉｒｕｓ）などが挙げられる。
本発明において、配列番号：２に示すアミノ酸配列と少なくとも４０％の同一性を有するアミノ酸配列からなる蛋白質は、配列番号：２に示すアミノ酸配列からなる蛋白質と類似の構造を持つ。したがって、その４３９位に相同な位置にあるロイシンは、配列番号：２における４３９位のロイシンと同様に温度感受性の表現型に重大な影響を与えると考えることができる。またモルビリウイルス属に属するウイルスは、分類学的に近縁のウイルスであることから、そのＰ蛋白質の構造は保存されている。したがって、やはり配列番号：２における４３９位に相同な位置のロイシンは、温度感受性の表現型に重大な影響を与えると考えることができる。モルビリウイルス属に属するウイルスのＰ蛋白質のアミノ酸配列を比較した結果を図８に示す。このようにして、各ウイルスのＰ蛋白質を構成するアミノ酸配列中の、４３９位に相当するアミノ酸を明らかにすることができる。
本発明において温度感受性の形質を導入されたか否かは、例えば、目的の蛋白を持つウイルス（Ｐ蛋白質の４３９位と相同な位置がロイシン以外である）が、４３９位と相同な位置にロイシンを有する対照蛋白を持つウイルスが生育可能なある温度において有意な生育不良性を示し、しかもそれより低いある別の温度では該対照蛋白を持つウイルスと同等の生育を示すことによって判定される。あるいは該目的の蛋白を持つウイルスが該対照蛋白を持つウイルスと比較して、その至適生育温度が有意に低下していれば、そのウイルスは温度感受性であると判定される。より具体的には例えば宿主の体温において対照蛋白を持つウイルス株より生育不良性を示せば温度感受性であると判定される。
また、本発明において「温度感受性の導入」には、温度感受性の付加的な導入も含まれる。すなわち、もともと温度感受性であるウイルスにおいて、さらにその温度感受性が上昇したウイルスも、本発明において温度感受性の形質を導入したウイルスに含まれる。例えば、Ｐ蛋白質の４３９位と相同な位置がロイシン以外であるウイルスと、ロイシンである対照ウイルスにおいて、ある生育温度での両者のウイルスの生育の違いに比べ、それより高い別の生育温度で、Ｐ蛋白質の４３９位と相同な位置がロイシン以外であるウイルスの生育が対照ウイルスに比べ有意に低ければ、そのウイルスは温度感受性が導入されたと言える。また、至適生育温度が有意に低下していることにより判定することもできる。
ウイルスの生育は、ウイルス感染細胞内あるいはその培養上清中のウイルス量を経時的に算定する事で測定できる。ウイルス量の算定には麻疹ウイルスのように適当な感受性細胞に細胞変性、壊死（ＣＰＥ；ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ  ｅｆｆｅｃｔ）を生ずるウイルスでは、主にプラーク（ｐｌａｑｕｅ）法とＴＣＩＤ５０法を用いる。プラーク法は３５ｍｍシャーレ、又は６穴プレートに単層培養細胞を用意し、そこに１０倍段階希釈したウイルスを接種し、寒天を重層して培養した後、ニュートラルレッドで生体染色する。生きている細胞は赤く染まり、ウイルス感染により変性、壊死した細胞は染色されず白い斑点（プラーク）として観察される。数十〜百のプラークが出現しているシャーレのプラーク数を数え、原液中のウイルス量（ＰＦＵ；ｐｌａｑｕｅ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔ／ｍｌ）を計算する。ＴＣＩＤ５０法は９６穴プレート等に単層細胞を用意する。１０倍段階希釈ウイルス液を調製し、各希釈液を一希釈に付４〜６穴の細胞に接種する。数日間培養後、ＣＰＥの出現を確認する。ウイルス量の算出（ＴＣＩＤ５０値）にはＲｅｅｄ  ａｎｄ  Ｍｕｅｎｃｈ法を用いる（Ｒｅｅｄ，Ｌ  ａｎｄ  Ｍｕｅｎｃｈ，Ｈ．，Ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇ  ｆｉｆｔｙ  ｐｅｒ  ｃｅｎｔ  ｅｎｄｐｏｉｎｔｓ．，Ａｍ．Ｊ．Ｈｙｇ．，２７，４９３（１９３８））ことができる。
温度感受性の形質を導入することによりウイルスの生育能が低下すると、その結果として弱毒化が達成される。一方で本発明に基づけばわずか１アミノ酸の変異によって弱毒化がもたらされるため、抗原としての構造は維持される。したがって、抗体獲得率を高い水準に保ちながら、弱毒化が効果的に達成されるのである。
麻疹ウイルスＥｄｍｏｎｓｔｏｎ株のＰ蛋白質のアミノ酸配列、および該蛋白質をコードするｃＤＮＡ配列を、それぞれ配列番号：２および１に示す。対象とする蛋白質において、Ｅｄｍｏｎｓｔｏｎ株のＰ蛋白質の４３９位のアミノ酸と相同な位置は、相互のアミノ酸配列を比較することにより決定することができる。対象蛋白質における当該位置は、必ずしも４３９位である必要はない。例えば、Ｅｄｍｏｎｓｔｏｎ株のＰ蛋白質に対して１または複数のアミノ酸が付加、挿入、および／または欠失したような構造からなる蛋白質の場合は、４３９位以外の位置である可能性がある。このような蛋白質について、Ｅｄｍｏｎｓｔｏｎ株のＰ蛋白質の４３９位のアミノ酸と相同な位置を決定するには、相互のアミノ酸をなるべく一致させ、かつ性質の似たアミノ酸をなるべく一致させるように両者のアミノ酸配列に適宜ギャップを挿入してアミノ酸配列を並列（アライメント）させる。これにより、Ｅｄｍｏｎｓｔｏｎ株のＰ蛋白質の４３９位に相同な位置が、対象とする蛋白質でいずれの位置に相当するのかを決定することができる。このような手法は当業者にとっては周知であり、市販または公開されているコンピュータソフトウェア、例えば解析ソフトＧＥＮＥＴＹＸ−ＭＡＣ  ＶＥＲ．１０（ソフトウエア株式会社）等を用いて容易に行うことができる。
対象とする蛋白質において、Ｅｄｍｏｎｓｔｏｎ株Ｐ蛋白質の４３９位に相当する位置がロイシン以外のアミノ酸である蛋白質をコードするＤＮＡは、本発明の温度感受性の形質を導入するために用いられる。ＤＮＡの由来に特に制限はなく、天然のＤＮＡであっても、人為的または自発的に変異が導入されたＤＮＡであってもよい。また、人工的にデザインされた配列からなるＤＮＡであってもよい。
本発明のＤＮＡは、例えば、公知のハイブリダイゼーション技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ）．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ．）を利用して調製することができる。ＤＮＡの単離には、ポリメラーゼ連鎖反応技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ）．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ．）を利用することもできる。
即ち、当業者においては、ハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法により、ウイルス由来のＤＮＡなどをスクリーニングしＤＮＡを単離することができる。ハイブリダイゼーション法に必要なプローブや、ＰＣＲ法に必要なプライマーの塩基配列は、例えばＥｄｍｏｎｓｔｏｎ株Ｐ蛋白質のｃＤＮＡ配列（配列番号：１）に基づいて設計することができる。単離したＤＮＡがコードするアミノ酸配列におけるＥｄｍｏｎｓｔｏｎ株Ｐ蛋白質の４３９位のアミノ酸と相同な位置を同定して、その位置がロイシン以外のアミノ酸である蛋白質をコードするＤＮＡを調製することは容易になし得ることである。
得られたＤＮＡを適宜改変することにより、該ＤＮＡがコードする蛋白質におけるＥｄｍｏｎｓｔｏｎ株Ｐ蛋白質の４３９位に相当するアミノ酸が、ロイシン以外の所望のアミノ酸となるようにすることができる。あるいはこのロイシンを欠失（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）する変異を導入することも、本発明に含まれる。どのアミノ酸に置換するかは、適宜選択することが可能と考えられる。実施例に記載したように、Ｅｄｍｏｎｓｔｏｎ株Ｐ蛋白質の４３９位のアミノ酸と相同な位置のアミノ酸をプロリンに置換した蛋白質は、ウイルスに温度感受性の形質を与えた。従って、Ｅｄｍｏｎｓｔｏｎ株Ｐ蛋白質の４３９位のアミノ酸と相同な位置のアミノ酸をプロリンに改変されている蛋白質をコードするＤＮＡは、本発明において好適に用いられる。
また、本発明によりＰ蛋白質のこの位置のアミノ酸は温度感受性の表現型に重大な影響を与えることが判明した。従って、該当する位置がロイシン以外のアミノ酸である場合に、このアミノ酸をさらに別のアミノ酸に変異させれば、温度感受性をより上昇させたり、逆に上昇の程度を減少させたりすることが可能である。なお、本発明における温度感受性の上昇、あるいは温度感受性の形質の導入には、すべての温度範囲においてＰ蛋白質の機能が完全に失活している場合も含まれる。
アミノ酸に変異を導入する方法はよく知られている。例えば、変異ウイルスを含むウイルスライブラリーや、変異Ｐ蛋白質をコードするＤＮＡライブラリー等を作製し、望みのアミノ酸配列をコードするＤＮＡをスクリーニングすることによって単離することができる。あるいは変異の入ったウイルスを自然界からスクリーニングすることもできる。更に、公知の遺伝子工学的技術を用いて、部位特異的に変異を導入することも可能である。部位特異的に変異を導入するためには、例えば、ＳＯＥ（ｓｐｌｉｃｉｎｇ−ｂｙ−ｏｖｅｒｌａｐ−ｅｘｔｅｎｔｉｏｎ）−ＰＣＲ法（Ｈｏ，Ｓ．Ｎ．，Ｈｕｎｔ，Ｈ．Ｄ．，Ｈｏｒｔｏｎ，Ｒ．Ｍ．，Ｐｕｌｌｅｎ，Ｊ．Ｋ．，ａｎｄ  Ｐｅａｓｅ，Ｌ．Ｒ．（１９８９）．Ｇｅｎｅ  ７７，５１−５９）、Ｋｕｎｋｅｌ法（Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．（１９８５）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ；８２（２）：４８８−９２）法を用いることができる。
また本発明においては、Ｐ蛋白質の４３９位に相当する部位がロイシン以外のアミノ酸である限り、それ以外の部位を変異させても構わない。実施例に示されるように、例えばＥｄｍｏｎｓｔｏｎ株のＰ蛋白質（配列番号：２）において１１０位のアスパラギン酸をチロシンに置換することにより、温度感受性が上昇することが判明した（図５および６；ｐＣＩＰ００５）。また、例えば２７５位のシステインをチロシンに置換した場合も、温度感受性が上昇した（図５および６；ｐＣＩＰ００３）。これらの事実は、１１０位および２７５位のアミノ酸の変異が、ウイルスの温度感受性を上昇させることを示している。従って、Ｐ蛋白質の４３９位に相当する部位がロイシン以外のアミノ酸であって、かつ１１０位に相当するアミノ酸および／または２７５位に相当するアミノ酸が、それぞれアスパラギン酸以外のアミノ酸および／またはシステイン以外のアミノ酸である蛋白質をコードするＤＮＡは、より効果的に温度感受性の形質を導入するために好適である。１１０位および／または２７５位に相当するアミノ酸は、好ましくはチロシンとすることができる。天然のウイルスにおいて、１１０位および／または２７５位に相当するアミノ酸がチロシンである場合は、この位置のアミノ酸はそのままにして、本発明による温度感受性の導入に用いることができるし、また、この位置のアミノ酸を、例えばアスパラギン酸などに変異させることにより、温度感受性の程度を緩和させることも可能である。
また、本発明のＤＮＡには、例えば、Ｅｄｍｏｎｓｔｏｎ株のＰ蛋白質（配列番号：２）において４３９位がロイシン以外であり、４３９位のアミノ酸以外の１または複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加された蛋白質をコードするＤＮＡが含まれる。モルビリウイルスに属するウイルスから得たＤＮＡがコードするＰ蛋白質のアミノ酸を人為的に改変するのであれば、改変されるアミノ酸の数は、通常、４３９位に相当するアミノ酸以外のアミノ酸において、１０アミノ酸以内、好ましくは５アミノ酸以内、さらに好ましくは３アミノ酸以内である。このようなアミノ酸の改変は、例えばＰ蛋白質のさらなる温度感受性の上昇を目的として、また、制限酵素部位の導入などＤＮＡの操作性の向上を目的として、さらに、Ｐ蛋白質が持つ温度感受性以外の性質の改変を目的として行われ得る。また、蛋白質のアミノ酸の変異は自然界においても生じうる。
一般に蛋白質の性質をできるだけ損なわないようにするためには、置換されるアミノ酸は、置換前のアミノ酸と似た性質を有するアミノ酸であることが好ましいと考えられる。例えば、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐは、共に非極性アミノ酸に分類されるため、互いに似た性質を有すると考えられる。また、非荷電性としては、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎが挙げられる。また、酸性アミノ酸としては、ＡｓｐおよびＧｌｕが挙げられる。また、塩基性アミノ酸としては、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓが挙げられる。
また、本発明は、本発明のＤＮＡによりコードされる蛋白質に関する。本発明の蛋白質を用いて、ウイルスに温度感受性の形質を導入することができる。本発明の蛋白質は、これをコードするＤＮＡを適当な発現ベクターに挿入し、宿主細胞に導入することにより発現させることができる。麻疹ウイルスなどにおいては、本発明の蛋白質をコードするＤＮＡを含むベクターから、温度感受性の形質を導入したウイルスを再構成させることができる。麻疹ウイルスをｃＤＮＡから再構成させる方法は、Ｒａｄｅｃｋｅ（Ｒａｄｅｃｋｅ  Ｆ，Ｓｐｉｅｌｈｏｆｅｒ  Ｐ，Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  Ｈ，Ｋａｅｌｉｎ  Ｋ，Ｈｕｂｅｒ  Ｍ，Ｄｏｔｓｃｈ  Ｃ，Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｅｎ  Ｇ，Ｂｉｌｌｅｔｅｒ  ＭＡ．（１９９５）ＥＭＢＯ  Ｊ；１４（２３）：５７７３−８４）の方法、およびＳｃｈｎｅｉｄｅｒ（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  Ｈ，Ｓｐｉｅｌｈｏｆｅｒ，Ｐ．，Ｋａｅｌｉｎ，Ｋ．，Ｄｏｔｓｃｈ，Ｃ．，Ｒａｄｅｃｋｅ，Ｆ．，Ｓｕｔｔｅｒ，Ｇ．，ａｎｄ  Ｂｉｌｌｅｔｅｒ，Ｍ．Ａ．（１９９７）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．６４（１）：５７−６４）の方法が報告されている。これらの方法によれば、麻疹ウイルスのＮ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、Ｈ、およびＬ蛋白質をコードするＤＮＡから、麻疹ウイルスを再生することができる。従って、このＰ蛋白質をコードするＤＮＡとして、本発明のＤＮＡを用いれば、温度感受性の形質を導入した麻疹ウイルスを再構成させることができる。すなわち、Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、Ｈ、およびＬ蛋白質をコードするＤＮＡを転写させることにより、その転写産物は麻疹ウイルスのゲノムＲＮＡとして機能し、Ｎ、Ｐ、およびＬ蛋白質の存在下で麻疹ウイルス粒子が形成される。得られたウイルスは、適当な宿主に感染させることによって、さらに増幅することができる。
麻疹ウイルス以外のモルビリウイルスの再構成法としては、Ｂａｒｏｎら（Ｂａｒｏｎ，Ｍ．Ｄ．，ａｎｄ  Ｂａｒｒｅｔｔ，Ｔ．（１９９７）．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ；７１（２）：１２６５−７１）の方法、および甲斐ら（甲斐智恵子、三浦竜一、清水房子、佐藤宏樹、藤田賢太郎、畠間真一、大橋謙司朗、上間匡、高橋英司、第４７回日本ウイルス学会学術集会抄録集（１９９９）ｐ２８９、Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ法を用いた組み換えイヌジステンパーウイルスの作製）の方法、さらには特許ＷＯ９７／１６５３８が知られている。
本発明に加えて、ウイルスのＦ蛋白質に変異を与えることによって、温度感受性の形質の導入とともに、細胞融合能の低下をウイルスに導入することができる。本発明者らは、モルビリウイルスのＦ蛋白質において、麻疹ウイルスＥｄｍｏｎｓｔｏｎ株Ｆ蛋白質の２７８位またはその相同な位置のアミノ酸がフェニルアラニン以外のアミノ酸である蛋白質を用いることによって細胞融合能の低下を導入することもできることを明らかにしている。この知見を本発明に組み合わせることにより、温度感受性とともに細胞融合能についても変異をもたらし、より安全性に優れたワクチン製剤を提供することができる。
又、Ｐ蛋白の４３９位、またはそれに相同する位置のアミノ酸がロイシン以外のアミノ酸である蛋白質、及びＦ蛋白の２７８位またはそれに相同する位置のアミノ酸がフェニルアラニン以外のアミノ酸である蛋白質をコードするＤＮＡを含むベクターに、抗原性の異なる麻疹ウイルスの蛋白質をコードするＤＮＡ、例えば感染防御に最も関連するＨ蛋白を発現する遺伝子を組み込んで、宿主細胞に導入し、ウイルスを再構成させることによって、異なる抗原性をもつ安全で優れたワクチン製剤を提供することが可能になる。
加えて本発明は、ウイルスに温度感受性の形質を導入する方法に関する。本発明の方法は、モルビリウイルス属に属するウイルスのＰ蛋白質、またはＥｄｍｏｎｓｔｏｎ株のＰ蛋白質のアミノ酸配列と少なくとも４０％の同一性を有する蛋白質において、麻疹ウイルスＥｄｍｏｎｓｔｏｎ株のＰ蛋白質（配列番号：２）の４３９位またはそれとに相同な位置のアミノ酸に変異を導入することを特徴とする。導入する変異に特に制限はないが、例えばプロリンに置換する変異が挙げられる。本発明によって得られるウイルスは、上記に記載した方法よりウイルスの温度感受性を比較することができる。
前記蛋白質において、さらに、麻疹ウイルスＥｄｍｏｎｓｔｏｎ株のＰ蛋白質（配列番号：２）の１１０位および／または２７５位、またはそれらと相同な位置のアミノ酸に変異を導入し、ウイルスの温度感受性の形質をさらに付加的に導入することができる。これらの位置のアミノ酸は、例えばチロシンに置換することができる。
これにより得ることができる、温度感受性の形質を導入したウイルスは、宿主内での増殖、拡散能が低下するため毒性が少ない。これらのウイルスは安全な生ワクチンの製造のために極めて有用である。本発明によれば、どのようなウイルス株に対しても、そのＰ蛋白質を遺伝子工学的に改変して弱毒化することが可能である。本発明のウイルスをワクチンなどの医薬組成物として使用する場合は、ウイルス自体を医薬として使用する以外に、公知の薬学的処方を適用して製剤化されうる。例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤などと適宜組み合わせて製剤化して投与することが考えられる。ワクチンとして使用する場合は、適宜アジュバントと組み合わせて投与することができる。患者への投与は、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射などのほか、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、経皮的、または経口的に当業者に公知の方法により行いうる。投与量は、患者の体重や年齢、投与方法、使用目的などにより変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。
一般に麻疹ワクチン株ウイルスは、日本においては、厚生省が許可したＳＰＦ設備で生産された発育卵から調製したニワトリ胚培養細胞に接種して培養する。培養後、微生物迷入否定試験に合格したワクチン液に安定剤を加えて精製してワクチン原液を得る。ワクチン原液は−８０℃に保存されるとともに、安全性と有効性について検定する。検定に合格したワクチン原液を最終バルクとしてプールする。これをワクチン製剤として、数度の国家検定と自家検定に合格したものが最終製品として販売される。
また、本発明のウイルスは、遺伝子治療用のベクターとしても利用できる。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
［実施例１］  麻疹ウイルスＡＩＫ−Ｃ株の温度感受性に関与する遺伝子の同定
麻疹ウイルスＥｄｍｏｎｓｔｏｎ株由来のｃＤＮＡを用いて、Ｒｅｎｉｌｌａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓルシフェラーゼをレポーター遺伝子に持つミニゲノムＲＮＡ合成用鋳型ＤＮＡを構築した。このミニゲノム転写用ＤＮＡは、麻疹ウイルスのｌｅａｄｅｒ配列、Ｎ遺伝子上流の非翻訳配列、Ｒｅｎｉｌｌａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓルシフェラーゼ遺伝子、Ｌ遺伝子下流の非翻訳配列、およびｔｒａｉｌｅｒ配列を持ち１，１５２塩基から成る。ｔｒａｉｌｅｒ配列の下流にはＴ７プロモーター配列を、ｌｅａｄｅｒ配列上流にはリボザイム配列を持ち、それらはＴ７  ＲＮＡポリメラーゼによりｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ法でミニゲノムＲＮＡを合成した時、ミニゲノムＲＮＡの両末端が、麻疹ウイルスゲノムＲＮＡの両末端を正確に再現するように配置した（図１）。
麻疹ウイルス、Ｅｄｍｏｎｓｔｏｎ株、ＡＩＫ−Ｃ株由来のＮ，Ｐ，Ｌ遺伝子をクローニングし、Ｔ７プロモーターの下流にＩＲＥＳ構造を持つプラスミド、ｐＣＩＴＥ−４ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ，ＵＳＡ）にクローニングし、それぞれをｐＣＩＮ０１（Ｅｄｍｏｎｓｔｏｎ  Ｎ蛋白発現）、ｐＣＩＰ００１（Ｅｄｍｏｎｓｔｏｎ  Ｐ蛋白発現）、ｐＣＩＬ０１（Ｅｄｍｏｎｓｔｏｎ  Ｌ蛋白発現）、ｐＣＩＡＮ０１（ＡＩＫ−Ｃ  Ｎ蛋白発現）、ｐＣＩＡＰ００１（ＡＩＫ−Ｃ  Ｐ蛋白発現）、ｐＣＩＡＬ０１（ＡＩＫ−Ｃ  Ｌ蛋白発現）とした。
ＨｅＬａ細胞を１２穴プレートに用意し、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを発現するワクシニアウイルス、ｖＴＦ７−３をｍ．ｏ．ｉ＝３で感染させた後、麻疹ウイルスＮ、Ｐ、Ｌ蛋白を発現する上記ヘルパープラスミドと、合成したミニゲノムＲＮＡをコトランスフェクションした。４０時間培養後、細胞を洗浄、溶解し、細胞抽出液を回収した。この抽出液中のルシフェラーゼ活性を計測した（図２）。
Ｅｄｍｏｎｓｔｏｎ株、ＡＩＫ−Ｃ株由来のＮ、Ｐ、Ｌ蛋白発現プラスミドを組み合わせて、３２．５℃または３７℃でミニゲノム転写、複製系を用い、ルシフェラーゼの発現量を観察した。その結果、ＡＩＫ−ＣのＰ遺伝子を含む系は３７℃ではルシフェラーゼの発現がみられず、ＡＩＫ−ＣのＰ遺伝子が温度感受性に関与している事が示された（図３）。
［実施例２］  ＡＩＫ−Ｃ株の温度感受性に関するＰ蛋白上のアミノ酸変異の同定
ＡＩＫ−Ｃ株とＥｄｍｏｎｓｔｏｎ株のＰ蛋白およびＣ蛋白質上にみられるアミノ酸変異を、それぞれの塩基配列より類推した。Ｅｄｍｏｎｓｔｏｎ株のＰ蛋白質およびＣ蛋白質をコードするｃＤＮＡの塩基配列を配列番号：１に、該ｃＤＮＡによりコードされるＰ蛋白質およびＣ蛋白質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号：２および配列番号：３に示す。また、ＡＩＫ−Ｃ株のＰ蛋白質およびＣ蛋白質をコードするｃＤＮＡの塩基配列を配列番号：４に、該ｃＤＮＡによりコードされるＰ蛋白質およびＣ蛋白質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号：５および配列番号：６に示す。Ｐ蛋白上には１１０番目アミノ酸（Ｅｄｍｏｎｓｔｏｎ；Ｄ−−−ＡＩＫ；Ｙ）、２７５番目アミノ酸（Ｅｄｍｏｎｓｔｏｎ；Ｃ−−−ＡＩＫ；Ｙ）、４３９番目アミノ酸（Ｅｄｍｏｎｓｔｏｎ；Ｌ−−−ＡＩＫ；Ｐ）、また、Ｐ遺伝子上に存在するもう一つの蛋白であるＣ蛋白上の１３４番目アミノ酸（Ｅｄｍｏｎｓｔｏｎ；Ｓ−−−ＡＩＫ；Ｙ）に違いが見いだされた（図４）。
Ｐ蛋白質に見られた変異の部位を入れ替えた８つのキメラプラスミドｐＣＩＰ００２，ｐＣＩＰ００３，ｐＣＩＯ００４，ｐＣＩＰ００５，ｐＣＩＡＰ００２，ｐＣＩＡＰ００３，ｐＣＩＡＰ００４，ｐＣＩＡＰ００５を構築した（図５）。
これらのキメラプラスミドを用いて、ｐＣＩＮ０１，ｐＣＩＬ０１プラスミドとともにミニゲノム転写、複製系を上記と同様にして行った。ｐＣＩＰ００２を用いた時、３７℃におけるルシフェラーゼの発現がみられず、又、逆にｐＣＩＡＰ００２を用いた時、３７℃においてルシフェラーゼの発現がみられた。このことよりＡＩＫ−Ｃ  Ｐ蛋白上の４３９番目アミノ酸（プロリン；Ｐ）が温度感受性に関与していると考えられた（図６）。又、ｐＣＩＰ００５においては、３７℃ではやや発現の抑制がみられ、ｐＣＩＡＰ００５においては、弱いルシフェラーゼの発現が観察されたことから、１１０番目アミノ酸（チロシン；Ｙ）も温度感受性に関与していると考えられた。また、ｐＣＩＰ００３においては、３７℃ではやや発現の抑制がみられ、ｐＣＩＡＰ００３においては、弱いルシフェラーゼの発現が観察されたことより２７５番目アミノ酸（チロシン；Ｙ）も、温度感受性に関与していると考えられる。
［実施例３］  感染性クローンによるアミノ酸置換と温度感受性の関係
リバースジェネティクスを用いてＡＩＫ−Ｃ株の全ｃＤＮＡを基盤に以下の変異を入れた組換え麻疹ウイルス（ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｃｌｏｎｅｓ）を作成した。
▲１▼Ｐ遺伝子がＡＩＫ−Ｃのもの（ＡＩＫ−Ｐ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｃｌｏｎｅ）。
▲２▼Ｐ遺伝子（Ｐ蛋白）だけをＥｄｍｏｎｓｔｏｎ株Ｐ遺伝子（Ｐ蛋白）にかえたもの（Ｅｄｍ−Ｐ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｃｌｏｎｅ）。
▲３▼Ｐ遺伝子（Ｐ蛋白）の４３９番目のアミノ酸だけをロイシン（Ｅｄｍｏｎｓｔｏｎ  Ｐ蛋白４３９アミノ酸）に置換し、他はすべてＡＩＫ−Ｃのもの（ＡＩＫ／Ｅｄｍ−Ｐ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｃｌｏｎｅ）
▲４▼▲２▼のＰ蛋白の４３９番目のアミノ酸だけをプロリン（ＡＩＫ−Ｃ  Ｐ蛋白４３９アミノ酸）に代えたもの（Ｅｄｍ／ＡＩＫ−Ｐ  ｉｎｆｅｃｔｏｉｕｓ  ｃｌｏｎｅ）。
Ｖｅｒｏ細胞に各ウイルスをｍｏｉ＝０．０５で感染させ、３２．５℃、３７℃、３９℃の各温度で培養し、細胞内のウイルス価のタイムコースをとった。すなわち、細胞内の２４、４８、７２、９６時間後のウイルス量を測定するため、各時間ごとにプレートよりウイルス感染Ｖｅｒｏ細胞を培養液ごと回収し、一度遠心して培養上清をとりのぞき、０．５ｍｌの新鮮な培養液に再懸濁した。超音波破砕機で細胞を破壊後、再度遠心し上清を回収した。９６穴プレートにＢ９５ａ細胞を培養し、回収した上清から調整した１０倍段階希釈ウイルス液、０．２５μｌを一希釈に付き、４穴づつ接種した。３２．５℃で７日間培養後、ＣＰＥの出現を観察し、Ｒｅｅｄ  ａｎｄ  Ｍｕｅｎｃｈ法で回収したウイルス原液１ｍｌ中のウイルス量（ＴＣＩＤ  ５０／ｍｌ）を計算した（Ｒｅｅｄ，Ｌ  ａｎｄ  Ｍｕｅｎｃｈ，Ｈ．，Ａｓｉｍｐｌｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇ  ｆｉｆｔｙ  ｐｅｒ  ｃｅｎｔ  ｅｎｄｐｏｉｎｔｓ．，Ａｍ．Ｊ．Ｈｙｇ．，２７，４９３（１９３８））。
実験の結果、３２．５℃ではいずれのＰ遺伝子を用いた場合も、ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｃｌｏｎｅウイルスはほぼ同程度の生育が観察された。また、３７℃では▲１▼のＡＩＫ−Ｐ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｃｌｏｎｅウイルスは生育しなかった。これに対して、４３９番目のアミノ酸をロイシンにしたＥｄｍ／ＡＩＫ−Ｐ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｃｌｏｎｅ（▲３▼）は３７℃でも生育した（図７）。  この結果から４３９番目のアミノ酸（ロイシン）に変異を導入する事により温度感受性の形質を導入できる事が判明した。一方、Ｐ遺伝子をＥｄｍｏｎｓｔｏｎ−Ｐに入れ替えたＥｄｍ−Ｐ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｃｌｏｎｅ（▲２▼）は３７℃で生育し、３９℃でも弱い生育を示した。またＥｄｍ−Ｐ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｃｌｏｎｅの４３９番目のアミノ酸（ロイシン）をプロリンにかえたＡＩＫ／Ｅｄｍ−Ｐ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｃｌｏｎｅは３７℃で生育するが３９℃では生育できないことからＰ蛋白質における４３９位以外の部位の変異も温度感受性に関連していることが示された。Ｐ蛋白質の４３９番目のアミノ酸以外には１１０番目アミノ酸；Ｙが温度感受性に関与している可能性が推測される。また、２７５番目アミノ酸；Ｙも温度感受性に関与していることが推測される。さらにＰ遺伝子にコードされているＣ蛋白質の１３４番目アミノ酸；Ｙも温度感受性に関与していると推測される。
産業上の利用の可能性
本発明により、温度感受性ウイルスを製造するために用いるＤＮＡ、ウイルスのＰ蛋白質の特定の部位を変異させてウイルスに温度感受性の形質を導入する方法、およびＰ蛋白質の特定の部位の変異により温度感受性の形質を導入したウイルスが提供された。本発明により、弱毒化ウイルスを容易に作り出すことができる。これにより、新たに出現してくる新型ウイルスに対する生ワクチンを迅速に開発することが可能になる。
特にモルビリウイルス属には麻疹ウイルスの他、犬ジステンパーウイルス、アザラシジステンパーウイルス、リンダーペストウイルスのような病原ウイルスが多く含まれる。したがって、モルビリウイルス属のウイルスを最小限の変異で弱毒化しうる本発明の方法は、ワクチン開発において大変有用である。
【配列表】
0004638110.tif 000002
0004638110.tif 000003
0004638110.tif 000004
0004638110.tif 000005
0004638110.tif 000006
0004638110.tif 000007
0004638110.tif 000008
0004638110.tif 000009
0004638110.tif 000010
0004638110.tif 000011
0004638110.tif 000012
0004638110.tif 000013
0004638110.tif 000014
0004638110.tif 000015
【図面の簡単な説明】
図１は、ミニゲノムＲＮＡ合成用の鋳型ｃＤＮＡの構造を示す図である。
図２は、ワクシニアウイルスｖＴＦ７−３を用いたミニゲノム系の実験手順を示す図である。
図３は、Ｅｄｍｏｎｓｔｏｎ株およびＡＩＫ−Ｃ株に由来するＮ、Ｐ、およびＬ蛋白質を発現するプラスミドを様々に組み合わせたミニゲノム系におけるルシフェラーゼの発現を示す図である。
図４は、ＡＩＫ−Ｃ株とＥｄｍｏｎｓｔｏｎ株のＰ蛋白質およびＣ蛋白質にみられるアミノ酸変異を示す図である。
図５は、様々なＰ発現プラスミドの構造を示す図である。
図６は、図５に示したＰ発現プラスミドを用いたミニゲノム系におけるルシフェラーゼの発現を示す図である。
図７は、様々なＰ発現プラスミドを用いて麻疹ウイルスを再構成し、各温度における生育を調べた結果を示す図である。
図８は、モルビリウイルス属に属するウイルスのＰ蛋白質のアミノ酸配列を比較した結果である。４３９位に相同な位置をボックスで示した。上から順に、ＡＩＫ−Ｃ株、Ｅｄｍｏｎｓｔｏｎ株、犬ジステンパーウイルス（Ｃａｎｉｎｅ  ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ  ｖｉｒｕｓ）、アザラシジステンパーウイルス（Ｐｈｏｃｉｄ  ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ  ｖｉｒｕｓ）、およびリンダーペストウイルス（Ｒｉｎｄｅｒｐｅｓｔ  ｖｉｒｕｓ）のＰ蛋白質のアミノ酸配列を示す。
【図１】
0004638110.tif 000016
【図２】
0004638110.tif 000017
【図３】
0004638110.tif 000018
【図４】
0004638110.tif 000019
【図５】
0004638110.tif 000020
【図６】
0004638110.tif 000021
【図７】
0004638110.tif 000022
【図８】
0004638110.tif 000023