(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子：
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）配列番号２において一又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ塩ストレス耐性タンパク質活性を有するタンパク質。
【請求項２】
以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡからなる遺伝子：
（ａ）配列番号１の塩基配列のうち第１５３番目のヌクレオチドから第４７６番目のヌクレオチドの領域の塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号１の塩基配列のうち第１５３番目のヌクレオチドから第４７６番目のヌクレオチドの領域の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ塩ストレス耐性タンパク質活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は塩ストレス耐性タンパク質をコードする遺伝子に関する。更に詳しくは本発明は海水産の緑藻クラミドモナス由来の塩ストレス耐性タンパク質をコードする新規遺伝子に関する。
【０００２】
【従来の技術】
高い塩濃度の環境においても生育することができる性質を塩ストレス耐性という。塩ストレス耐性に関与する遺伝子が存在することが従来より知られている。塩ストレス耐性を有する生物から塩ストレス耐性に関与する遺伝子を単離同定し、その遺伝子を用いて農作物などの有用植物に塩ストレス耐性を付与することも知られている。
【０００３】
例えば酵母からはＨＡＬ１遺伝子と呼ばれる塩ストレス耐性遺伝子が同定されており、この遺伝子をトマトに導入してトマトに塩ストレス耐性を付与することに成功している（C. Gisbert等、Plant Physiology ２０００年５月第１２３巻第３９３−４０２頁）。
【０００４】
一方、クラミドモナス（Chlamydomonas）は遺伝学の実験材料として用いられる単細胞の緑藻類である。クラミドモナスの多くは淡水産であるが、海水中に生育するものもある。海水中に生育するクラミドモナスは塩ストレス耐性を有するので塩ストレス耐性に関与する遺伝子を有すると予測される。本発明者らはこれまでに海水産クラミドモナスから塩ストレス耐性に関与する遺伝子をいくつか単離している（H. Miyasaka等、World Journal of Microbiology and Biotechnology 16:23-29, 2000年、S. Tanaka等、Current Microbiology 42:173-177, 2001年）。しかしこれらの遺伝子は全て公知の遺伝子の同族体であり、海水産クラミドモナスから塩ストレス耐性に関与する新規の遺伝子を単離同定したという報告は現在に至るまで存在しない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、海水産クラミドモナス由来の塩ストレス耐性に関与する新規の遺伝子を提供することにある。かかる遺伝子は農作物などの有用植物に塩ストレス耐性を付与するために用いることができる。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明によれば、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子が提供される：
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）配列番号２において一又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ塩ストレス耐性タンパク質活性を有するタンパク質。
【０００７】
本発明によれば、以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡからなる遺伝子も提供される：
（ａ）配列番号１の塩基配列のうち第１５３番目のヌクレオチドから第４７６番目のヌクレオチドの領域の塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列番号１の塩基配列のうち第１５３番目のヌクレオチドから第４７６番目のヌクレオチドの領域の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ塩ストレス耐性タンパク質活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【０００８】
【発明の実施の形態】
用語の定義
本明細書において用いる用語「塩ストレス耐性タンパク質」は、それが発現されている生物に塩ストレス耐性を付与する機能を有するタンパク質を意味する。なお、塩ストレス耐性とは上述の通り高い塩濃度の環境においても生育することができる性質を意味する。
【０００９】
本明細書において用いる用語「ストリンジェントな条件」は、ある塩基配列と８０％以上、好ましくは９０％以上の相同性を有するＤＮＡのみが特異的にハイブリダイズする条件をいう。ストリンジェントな条件はハイブリダイゼーション溶液の塩濃度、温度等を調節することにより作り出すことができる。
【００１０】
本発明の遺伝子の単離及び同定
本発明の遺伝子は海産性緑藻クラミドモナスＷ８０株から単離同定することができる。クラミドモナスＷ８０株は日本国近畿地方の沿岸で採集されたものであり、特許生物寄託センター［日本国茨城県つくば市東１−１−１  中央第６（郵便番号３０５−８５６６）］にＦＥＲＭ  Ｐ−１８４７４として寄託されている。
【００１１】
クラミドモナスＷ８０株から本発明の遺伝子を単離同定するには、塩ストレス耐性を指標とする。まずクラミドモナスＷ８０株を培養し、そこからｍＲＮＡを分離精製する。次にｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、適当なベクターを用いてｃＤＮＡライブラリーを構築する。そしてベクターライブラリーで淡水性宿主微生物、例えばラン藻を形質転換し、形質転換体を作成する。この形質転換体をＮａＣｌを含むアガロースプレート上で培養すると、クラミドモナスＷ８０株由来の塩ストレス耐性遺伝子を導入された微生物のコロニーだけが出現するので、コロニーを分離してプラスミドＤＮＡを抽出し、ＤＮＡ塩基配列を決定する。
【００１２】
このようにして決定されたＤＮＡ塩基配列が塩ストレス耐性タンパク質をコードする遺伝子であるかどうかは、決定されたＤＮＡ塩基配列から推定されるタンパク質のアミノ酸配列や親水性・疎水性プロットを既知の塩ストレス耐性タンパク質のアミノ酸配列や親水性・疎水性プロットと比較することによって確認できる。
【００１３】
また、このようにして解析された塩ストレス耐性タンパク質をコードする遺伝子が新規な遺伝子であるかどうかは、前記遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列と既知の塩ストレス耐性タンパク質のアミノ酸配列の相同性の大小によって判断することができる。一般的に相同性が６０％以下であれば新規な遺伝子と判断してよい。
【００１４】
本発明においてはクラミドモナスＷ８０株より配列表の配列番号１で表される塩基配列を有するｃＤＮＡが単離同定された。このうち、第１５３番目のヌクレオチドから第４７６番目のヌクレオチドの領域がタンパク質をコードする遺伝子であった。この遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列は配列番号２に表されている。
【００１５】
配列番号２において一又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ塩ストレス耐性タンパク質活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、又は配列番号１の塩基配列のうち第１５３番目のヌクレオチドから第４７６番目のヌクレオチドの領域の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ塩ストレス耐性タンパク質活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子も本発明の遺伝子に包含される。遺伝子の塩基配列の一部に変異が生じたり、またその結果として遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列の一部に変異が生じても、機能的には同等のタンパク質を生ずることが多いからである。
【００１６】
配列番号２において一又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ塩ストレス耐性タンパク質活性を有するタンパク質をコードする遺伝子は、例えばサイトダイレクテドミュータジェネシスキット（宝酒造）や、QuickChange Site-DirectedMutagenesis Kit（STRATAGENE製）等の市販キットを用いてＤＮＡ塩基配列を置換することにより得ることができる。
得られた遺伝子が塩ストレス耐性タンパク質活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であるかどうかは、得られた遺伝子を淡水性宿主微生物、例えばラン藻に導入し、形質転換体をＮａＣｌを含むアガロースプレート上で培養し、コロニーが出現するかどうかにより確認する。
【００１７】
配列番号１の塩基配列のうち第１５３番目のヌクレオチドから第４７６番目のヌクレオチドの領域の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ塩ストレス耐性タンパク質活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子は、配列番号１の塩基配列のうち第１５３番目のヌクレオチドから第４７６番目のヌクレオチドの領域の塩基配列又はその一部をプローブとしてコロニー又はプラークハイブリダイゼーションを行うことにより得ることができる。
【００１８】
先ず目的の遺伝子源から得たＤＮＡ（染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡ）のライブラリーを作製する。そのライブラリーをプレート上で培養し、生育したコロニー等をニトロセルロース等の膜に移し取り、変性処理によりＤＮＡを膜に固定する。この膜を３２Ｐ等で標識したプローブ（配列番号１の塩基配列のうち第１５３番目のヌクレオチドから第４７６番目のヌクレオチドの領域の塩基配列又はその一部）を含む溶液中で保温し、膜上のＤＮＡとプローブとの間でハイブリダイゼーションを行う。ハイブリダイゼーションはストリンジェントな条件下、例えば６×ＳＳＣ、１％  ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ、５×デンハルツを含む溶液中で６５℃で２０時間行う。ハイブリダイゼーション後、非特異的に吸着したプローブを洗い流し、オートラジオグラフィー等によりプローブとハイブリッド形成したクローンを同定する。この操作をハイブリッド形成したクローンが単一になるまで繰り返す。こうして得られたクローンの中には目的の遺伝子が挿入されている。
得られた遺伝子が塩ストレス耐性タンパク質活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であるかどうかは、得られた遺伝子を淡水性宿主微生物、例えばラン藻に導入し、形質転換体をＮａＣｌを含むアガロースプレート上で培養し、コロニーが出現するかどうかにより確認する。
【００１９】
このようにして得られた遺伝子は配列番号１の塩基配列のうち第１５３番目のヌクレオチドから第４７６番目のヌクレオチドの領域の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ塩ストレス耐性タンパク質活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子である。かかる遺伝子は同時に配列番号２において一つ以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ塩ストレス耐性タンパク質活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であることが多い。このことは得られた遺伝子の塩基配列を決定し、アミノ酸配列に置換して配列番号２のアミノ酸配列と比較することによって確認することができる。
【００２０】
本発明の遺伝子の利用方法
上述のようにして得られた本発明の遺伝子は農作物などの有用植物に導入してこれらの植物に塩ストレス耐性を付与するために用いることができる。本発明の遺伝子を植物に導入するには、従来公知の外来遺伝子の導入方法を用いることができる。これらの方法にはアグロバクテリウム（Agrobacterium）属細菌を用いる方法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法、マイクロインジェクション法などがあるが、アグロバクテリウム属細菌を用いる方法が確実さの点で好ましい。アグロバクテリウム属細菌を用いた形質転換法としては、リーフディスク法及びプロトプラスト法（大野哮司（１９８６）ベクターの開発−Ｔｉプラスミド、現代化学増刊５「植物バイオテクノロジー」、山田泰之、岡田吉美編、ｐ．１９７−２１３）の第２０７〜２１２頁、及び参考文献２（内宮博文（１９８９）トランスジェニック植物、「植物遺伝情報の交換」、秀潤社、岡田吉美ら編ｐ２６１−２７６）が周知である。このようにして得られた形質転換植物が本発明の遺伝子を発現しているかどうかは形質転換植物に塩ストレスを与えてその生育を調べることにより確認することができる。
【００２１】
かかる形質転換植物は本発明の遺伝子が導入されているので塩ストレス耐性を有する。特に、形質転換植物として農作物を選べば農作物に塩ストレス耐性を付与することができ、塩害に対して強い農作物を提供することができる。
【００２２】
【実施例】
本発明を以下の実施例によって更に説明する。なお、実施例の記載は純粋に発明の理解のためのみに挙げるものであり、本発明はこれによっては何ら限定されるものではない。
【００２３】
実施例１：本発明の遺伝子の単離同定
クラミドモナスＷ８０株の培養
クラミドモナスＷ８０株は５ｍＭのＮＨ４Ｃｌが添加された改良されたオカモト培地（ｐＨ８．０）で培養した。７００ｍｌの扁平培養びんを用い、その中に３００−５００ｍｌの培地を入れた。クラミドモナス培養物は蛍光灯で１７５μＥ／ｍ２の照度で連続的に照明し、１分間当たり２００ｍｌの空気を給気した。
【００２４】
ｐＡＱ−ＥＸ１ベクターを用いたクラミドモナスＷ８０株のｃＤＮＡライブラリーの作成
（１）ｍＲＮＡの分離
クラミドモナスＷ８０株の細胞からChomczynski等（Analytical Biochemistry 162（1987）第156頁−第159頁）の方法に従ってトータルＲＮＡを抽出した。次にオリゴｄＴクロマトグラフィー（Maniatis等、1982 Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory. ISBN No. 0-879689-309-6）によってポリ（Ａ）＋ＲＮＡを精製した。
【００２５】
（２）ｃＤＮＡ合成
精製したポリ（Ａ）＋ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。
ｃＤＮＡ合成には市販のZAP cDNA Synthesis Kit(Stratagene, La Jolla CA, USA)を用いたが、ｐＡＱ−ＥＸ１ベクターのBamHI,Pst Iサイトにクローニングするために、ｃＤＮＡ合成反応用のオリゴｄＴプライマーは、キットに添付のXhoIサイト（下線部）を持つ
【化１】
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（配列番号３）の代わりに、BamHIサイト（二重下線部）を持つ
【化２】
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（配列番号４）を用いた。
またアダプターは、キットに添付のEcoRIアダプター
【化３】
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（それぞれ配列番号５及び６）に代えて以下のPst Iアダプターを用いた（それぞれ配列番号７及び８）。
【化４】
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【００２６】
（３）ライゲーションとライブラリーの増幅
合成したｃＤＮＡ（約０．３ｐｍｏｌ）を制限酵素BamHI,Pst I処理したｐＡＱ−ＥＸ１ベクター（約０．０３ｐｍｏｌ）にライゲーション(TAKARA Ligation Kit ver.2)した。
ライゲーション反応液１μｌを用いて、コンピテント大腸菌細胞(TAKARA, E. coli HB101Electro-cell)５０μｌを形質転換し、これをカルベニシリン（Ｃｂ；５０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ寒天培地に播いて、約１２０万個のコロニーを得た。
大腸菌を生じた寒天培地上に液体のＬＢ−Ｃｂ培地を加えて大腸菌を懸濁化し（総量４００ｍｌ）、これを１リッターの三角フラスコで３７℃、２５０ｒｐｍでＯＤ６００が０．７から１．０になるまで培養した。
培養液から定法に従ってプラスミドを分離し（収量２．６ｍｇ）、ライブラリーストックとした。
【００２７】
淡水産ラン藻シネココックス（Synechococcus)sp. ＰＣＣ７９４２の形質転換
ラン藻の形質転換はVan den Hondel等（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 1570,1980年）及びGolden等（J. Bacteriol. 158, 36, 1984年）に記載の条件を以下のように改良して行った：指数関数的に増殖しているＰＣＣ７９４２細胞を遠心分離し、培地で一回洗浄し、約１×１０８細胞／ｍｌとなるように培地中に再懸濁した。１ｍｌのサンプルを１μｇのプラスミドＤＮＡと３０℃の暗黒条件下で一晩（１２−１８時間）インキュベートした。
【００２８】
塩ストレス耐性遺伝子の単離
インキュベート後のサンプル０．１ｍｌ（これは形質転換されたSynecococcus sp. ＰＣＣ７９４２の細胞約１×１０７個を含む）を０．５％の寒天を含む培地５ｍｌ中に懸濁し、ＮａＣｌ  １．５％を含むＢＧ１１−Ｃｂ（４μｇ／ｍｌ）プレートに播種して連続照明下で約２週間培養した。生じた塩ストレス耐性のコロニーから定法に従ってプラスミドを分離し、両側からＤＮＡ塩基配列を決定した。
【００２９】
塩ストレス耐性遺伝子の同定
決定されたＤＮＡ塩基配列は配列表の配列番号１に表わされる通りであった。このうちタンパク質をコードする遺伝子の部分は第１５３番目のヌクレオチドから第４７６番目のヌクレオチドの領域の塩基配列であった。まず配列番号１の塩基配列のうち第１５３番目のヌクレオチドから第４７６番目のヌクレオチドの領域の塩基配列の相同性検索をＦＡＳＴＡプログラムでＤＮＡ  Database of Japan（ＤＤＢＪ）（リリースＮｏ．４６）を用いて行ったところ、トウモロコシｌｅａ３遺伝子に対してＤＮＡ塩基配列レベルで５６％（２８４塩基のオーバーラップ、e-value＝０．０５６）の相同性を有していた。トウモロコシｌｅａ３遺伝子は従来から塩ストレス耐性、乾燥ストレス耐性遺伝子として知られているLate Embryogenesis Abundant Protein（ｌｅａタンパク質）の中のタイプ３（ｌｅａ３）に属する遺伝子である。次に配列番号１の塩基配列のうち第１５３番目のヌクレオチドから第４７６番目のヌクレオチドの領域の塩基配列がコードするタンパク質のアミノ酸配列をイネ、トウモロコシ、コムギ、シロイヌナズナ、及びコウヤワラビのタイプ３のＬＥＡタンパク質のアミノ配列とアライメントすると、両者は部分的に類似していた（図１）。またこのタンパク質の親水性・疎水性プロットをとったところ、親水性が高く、この点でもタイプ３のＬＥＡタンパク質と類似していた（図２）。従ってこの遺伝子は塩ストレス耐性遺伝子であると示唆された。しかしアミノ酸全体では既知のＬＥＡ３タンパク質との相同性は３０％以下（最大でコムギのＬＥＡ３タンパク質と２７％の相同性を示す）であり、新規な遺伝子と判断された。
【００３０】
実施例２：本発明の遺伝子の発現の確認
（１）方法
実施例１で塩基配列決定された遺伝子を含むｐＡＱ−ＥＸ１プラスミドを導入した淡水産ラン藻Synechococcus sp. ＰＣＣ７９４２の耐塩性試験を行った。コントロールとしてはｐＡＱ−ＥＸ１プラスミドのみを導入したSynechococcus sp. ＰＣＣ７９４２を用いた。０，０．５，１．０，１．５，２．０，２，５％のＮａＣｌを含むＢＧ１１−Ｃｂ（４μｇ／ｍｌ）プレートをそれぞれ２組準備し、上述の２種類のラン藻をそれぞれ播種し、連続照明下で約２週間培養した。
【００３１】
（２）結果
コントロールのラン藻はＮａＣｌ濃度１％ですでに増殖が阻害された。これに対し、実施例１で塩基配列決定された遺伝子を含むｐＡＱ−ＥＸ１プラスミドを導入したラン藻はＮａＣｌ濃度２％まで増殖し、プレート全体が薄緑色となった。
【００３２】
【発明の効果】
本発明によれば海水産緑藻クラミドモナスＷ８０株由来の新規の塩ストレス耐性遺伝子の塩基配列が提供される。この遺伝子は農作物等の有用植物に導入して塩ストレス耐性を付与するのに利用することができる。
【００３３】
【配列表】
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配列表フリーテキスト
配列番号３はプライマーの配列である。
配列番号４はプライマーの配列である。
配列番号５はアダプターの配列である。
配列番号６はアダプターの配列である。
配列番号７はアダプターの配列である。
配列番号８はアダプターの配列である。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列とタイプ３のＬＥＡタンパク質のアミノ酸配列のアライメント結果を示す。最上列の７９４２ＮａＣｌが本発明の遺伝子に相当する。枠で囲んだ部分が類似している部分である。
【図２】本発明の遺伝子がコードするタンパク質の親水性・疎水性プロットを示す。
【図１】
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【図２】
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