(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者に投与することによって患者の虚血組織を治療するために使用される、治療上有効な量の単離及び富化されたヒト臍帯血(ＵＣＢ)由来のＣＤ１３３+／ＣＤ３４+内皮生成細胞、並びに単離及び富化されたヒト骨髄由来の間充織幹細胞を含有する医薬配合物。
【請求項２】
虚血組織の治療が、下記を誘導する、請求項１に記載の医薬配合物：
(ａ)血液を虚血組織へ供給する血管の形成；
(ｂ)虚血組織への血流；
(ｃ)虚血組織への酸素供給；又は
(ｄ)これらの組合せ。
【請求項３】
ＣＤ１３３+／ＣＤ３４+内皮生成細胞が、自家性である、請求項１に記載の医薬配合物。
【請求項４】
ＣＤ１３３+／ＣＤ３４+内皮生成細胞が、同種異系である、請求項１に記載の医薬配合物。
【請求項５】
ＣＤ１３３+／ＣＤ３４+内皮生成細胞が、患者とＨＬＡ適合性である、請求項１に記載の医薬配合物。
【請求項６】
内皮生成細胞が、ＣＤ３１+、ＣＤ１４６+、ＶＥ−カドヘリン+又はこれらの組合せである、請求項１に記載の医薬配合物。
【請求項７】
ヒト間充織幹細胞がモノクローナル抗体ＳＨ２、ＳＨ３又はＳＨ４により同定される表面抗原を含む請求項１に記載の医薬配合物。
【請求項８】
ヒト間充織幹細胞が、自家性である、請求項１に記載の医薬配合物。
【請求項９】
ヒト間充織幹細胞が、同種異系である、請求項１に記載の医薬配合物。
【請求項１０】
ヒト間充織幹細胞が、患者とＨＬＡ適合性である、請求項１に記載の医薬配合物。
【請求項１１】
治療上有効な量の富化ヒトＣＤ１３３+／ＣＤ３４+内皮生成細胞が、少なくとも１×１０4のヒト内皮生成細胞を含む、請求項１に記載の医薬配合物。
【請求項１２】
治療上有効な量の富化ヒトＣＤ１３３+／ＣＤ３４+内皮生成細胞が、１×１０4〜５×１０8のヒト内皮生成細胞である、請求項１に記載の医薬配合物。
【請求項１３】
ヒトＣＤ１３３+／ＣＤ３４+内皮生成細胞及びヒト間充織幹細胞は、約５：１〜１：５の比で投与される、請求項１に記載の医薬配合物。
【請求項１４】
前記の患者が、慢性的心筋虚血の治療を必要としている、請求項１に記載の医薬配合物。
【請求項１５】
前記の患者が、脚の虚血、虚血性心筋症、心筋の虚血、脳血管の虚血、腎臓の虚血、肺の虚血及び腸の虚血よりなる群から選択する虚血の治療を必要としている、請求項１に記載の医薬配合物。
【請求項１６】
ヒトＣＤ１３３+／ＣＤ３４+内皮生成細胞は、遺伝的に改変されている、請求項１に記載の医薬配合物。
【請求項１７】
ヒトＣＤ１３３+／ＣＤ３４+内皮生成細胞は、組換えポリペプチドを発現させるように遺伝的に改変されている、請求項１６に記載の医薬配合物。
【請求項１８】
組換えポリペプチドが、ＶＥＧＦ、ＢＦＧＦ、ＳＤＦ、ＣＸＣＲ−４又はＣＸＣＲ−５である、請求項１７に記載の医薬配合物。
【請求項１９】
少なくとも一種の組換えポリペプチドを更に含む、請求項１に記載の医薬配合物。
【請求項２０】
組換えポリペプチドが、ＶＥＧＦ、ＢＦＧＦ、ＳＤＦ、ＣＸＣＲ−４又はＣＸＣＲ−５である、請求項１９に記載の医薬配合物。
【請求項２１】
組換えポリペプチドが、血管形成、脈管形成、又はこれら両者を促進する、請求項１７に記載の医薬配合物。
【請求項２２】
組換えポリペプチドを、成長因子、サイトカイン、ケモカイン又はこれらのレセプターの内から選択する、請求項１７に記載の医薬配合物。
【請求項２３】
下記を含む患者の虚血組織を治療するための医薬配合物：
(ａ)臍帯血から富化したＣＤ１３３+／ＣＤ３４+細胞；
(ｂ)骨髄から富化したモノクローナル抗体ＳＨ２、ＳＨ３又はＳＨ４により同定される表面抗原を含む間充織幹細胞；及び
(ｃ)製薬上許容しうるキャリアー。
【請求項２４】
１０4〜１０9のＣＤ１３３+／ＣＤ３４+細胞を含む、請求項２３に記載の配合物。
【請求項２５】
１０4〜１０9の間充織幹細胞を含む、請求項２３に記載の配合物。
【請求項２６】
カテーテルによる投与のために調製した、請求項２３に記載の配合物。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
アテローム性動脈硬化性心臓血管病は、工業化された西半球における病的状態及び死亡の主たる原因である。冠状動脈疾患(アテローム斑により動脈の内腔が狭くなり、心臓への血流の閉塞を生じる病理学的過程)は、該死亡の約半数を説明する。カテーテルベースの血行再建術又は外科手術ベースの治療アプローチは、大部分の症例において虚血心筋への血流の回復において成功してきたが、これらの治療は、かなりの人数の不完全に血行再建されたままの患者にとっては不十分なものである。治療限界の分岐は、慣用の血行再建術にとって不十分な標的である血管により供給される減少した潅流により危険にさらされた虚血であるが生存可能な心筋の広い領域を有する患者においては、重要でありうる。機械的アプローチ例えば経皮経管心筋血行再建術などを含む別の治療は、有望な結果を生じていない。サイトカイン産生を増大させ、それ故血管形成を促進するアデノウイルスベクターを利用する遺伝子治療は、見込みがあるように見えたが、この治療は、限界を有しており、まだ、これらの患者に対する最適の治療となっていない。それ故、治療のための血管形成は、慢性の心筋虚血の苦しみを回避する方法を発見することを企てる多くの研究者にとって魅力的であり続けている。
【０００２】
四肢のアテローム性動脈硬化は、４０歳を超える患者における四肢の閉塞性動脈疾患の主因である。末梢血管の閉塞性疾患及びその合併症(冒された四肢の潰瘍及び壊死さえも含む)も又、一般的である。経皮経管血管形成術及び大動脈大腿部バイパス手順は、許容しうる罹患率及び死亡リスクと関連しており且つ通常最初は成功するが、これらの介入が長期間有効であることは示されていない。
【０００３】
心筋虚血及び／又は末梢血管の閉塞性疾患の治療法を提供する努力において、今や、遺伝子治療及び側副血管生成を誘導し又は増大させるための成長因子例えば血管内皮成長因子(ＶＥＧＦ)又は塩基性繊維芽細胞成長因子(ｂＦＧＦ)の利用を含む多くの血管形成技術が臨床的に試みられている。最適の治療結果のためには、これらの技術は、患者の循環内の可動性でホルモン応答性の血管内皮細胞の常在性集団の利用可能性に依存する。しかしながら、血管内皮細胞数及び機能の年齢に関連した減少が、成人において認められてきた。特に、血管(中心(即ち、冠動脈)及び末梢の両方)の問題を被ることが最もありそうな高齢の患者においては、ホルモン応答性の内皮細胞の数は減少しており、且つ機能不全の内皮細胞数が増えている。その上、十分な患者由来の応答性細胞の可動化のためのサイトカインの投与は、白血球増加症及び／又はプロ凝固剤過程の活性化に次いで、二次的に、心臓血管の病態生理学を悪化させうる。
【０００４】
それ故、別の治療(内皮前駆細胞(ＥＰＣ)の外的起源を供給する治療)が、虚血を救済するために、閉塞された／狭くなった血管の周囲で脈管形成及び側副血管形成を増大させるための細胞療法に最適でありうる。最近の報告は、成人の骨髄又は末梢血由来の造血幹細胞(ＨＳＣ)を単離し、培養拡大して、外因性細胞媒介の治療による脈管形成における潜在的用途のためにＥＰＣを生成することができることを示している。初期の研究は、自家ＥＰＣの注入後の心臓血管及び末梢血管機能における改善を示している。しかしながら、これらのＥＰＣの効力の初期の研究は、注入される不均一な細胞集団を含んでいたし、如何なる特定の細胞集団が傷害部位に帰って脈管形成を媒介するのか不明である。
【０００５】
幹細胞の患者由来の自家性起源の臨床的利用は、潜在的な有害な同種異系免疫反応性を回避するのに有利であるが；不都合は、患者を、活性な血管病のときに幹細胞収集にかける必要があることを含む。
【０００６】
それ故、未だ、虚血組織における脈管形成を促進しうる、心筋虚血及び末梢血管病の両方の治療様式の開発に対する要求がある。
【発明の開示】
【０００７】
この発明は、虚血の治療を必要とする患者における虚血の治療のための細胞ベースの方法を提供する。幾つかの面において、この発明は、虚血組織への血流を、血管の形成を促進するなどによって(限定はされない)増大させるための治療を提供する。一面において、この発明は、内皮細胞へ分化することができ又は患者の細胞の内皮細胞への分化を促進することのできる細胞の患者への導入を含む治療を提供する。かかる細胞は、幹細胞及び前駆細胞を含む。これらの細胞は、骨髄、抹消血、臍帯細胞から又は他の起源から分離されうる。
【０００８】
この発明の一つの面は、虚血組織の治療を必要とする患者における虚血組織を治療する方法であって、該患者に治療上有効な量の富化ヒト内皮生成細胞及び富化ヒト間充織幹細胞を投与することを含む当該方法を提供する。
【０００９】
この発明の関連する面は、虚血心筋への血流の増大を必要とする患者の虚血心筋への血流を増大させる方法であって、該患者に、治療上有効な量の富化ヒト内皮生成細胞及び富化ヒト間充織幹細胞を投与することを含む当該方法を提供する。
【００１０】
この発明の他の面は、虚血心筋における血管の形成を必要とする患者の虚血心筋における血管の形成を誘導する方法であって、該患者に、治療上有効な量の富化ヒト内皮生成細胞及び富化ヒト間充織幹細胞を含む当該方法を提供する。
【００１１】
この発明の更に別の面は、生存力のある心筋領域を有する虚血心筋への血流の改善を必要とする患者において、生存力のある心筋領域を有する虚血心筋への血流を改善する方法であって、該患者に、臍帯血から単離された治療上有効な量の富化ＣＤ１３３+／ＣＤ３４+内皮前駆細胞を投与することを含み、該ＣＤ１３３+／ＣＤ３４+内皮前駆細胞を、点滴によって、慢性的に完全に閉塞された血管の分布域内の該虚血であるが生存力のある心筋への副行流を与える心外膜血管である冠状動脈に投与すること、及び該ＣＤ１３３+／ＣＤ３４+内皮前駆細胞の投与が、該虚血心筋への改善された血流を生じることを特徴とする、当該方法を提供する。この方法の一具体例は、更に、該患者に、ヒト間充織幹細胞を投与することを含む。
【００１２】
ある面において、この発明は、患者(特に、虚血組織を有する患者)に投与することのできる医薬組成物を提供する。配合物は、内皮生成細胞及び間充織幹細胞を含むことができる。適宜、これらの内皮生成細胞は、臍帯血から富化される。適宜、これらの間充織細胞は、骨髄から富化される。ある好適具体例において、この配合物は、カテーテルにより血管に投与するためにデザインされる。
【００１３】
図面の簡単な説明
図１は、短期内皮駆動培養条件下での臍帯血(ＵＣＢ)由来の内皮前駆細胞ＥＰＣの蛍光細胞化学染色を示している。パネルＡは、アセチル化低密度リポタンパク質(ａｃＬＤＬ)の取り込みを示している。パネルＢは、Ulex europaeus アグルチニン(ＵＥＡ−１)の接着を示している。パネルＣは、ａｃＬＤＬ及びＵＥＡ−１の複合二重染色を示している。イメージは、共集点顕微鏡を利用して、４０倍の倍率で記録した。
図２は、ＵＣＢに由来するＥＰＣのフォン ウィルブランド因子(ｖＷＦ)についての染色を示しており、ＥＰＣの特徴である紡錘様形態をも示している。これらの細胞は、４０倍の倍率を用いる位相差顕微鏡観察を利用して研究された。ブラウン核周囲染色は、核周囲のｖＷＦ粒子と反応する二次抗体に結合させたイムノペルオキシダーゼによるものである。
図３は、ＵＣＢから選択したＣＤ１３３+細胞の表面表現型のフローサイトメトリー分析を示している。ＦＳＣゲインは、非常に小さい細胞のより良い解像度につき増大した。ＣＤ１３３+／ＣＤ３４-細胞(１００)及びＣＤ１３３+／ＣＤ３４+細胞(２００)の別個の集団が同定された。ゲーティングは行なわなかった。
図４は、内皮駆動培養条件における１９日及び１２日の培養後の、ＵＣＢ及びヒトの骨髄(ＢＭ)に由来するＥＰＣ細胞の特徴である内皮細胞の比較のフローサイトメトリー分析を示している。接着性細胞をトリプシン処理して、ＣＤ３４及び内皮特異的マーカーのＶＥ−カドヘリン、ＣＤ１４６及びＣＤ３１につき染色した。染色されなかった対照を黒色で示してある。染色された細胞は、灰色で示してある。
図５は、ＵＣＢ由来の及びＢＭ由来のＥＰＣの、イン・ビボでのマウス後脚虚血モデルへの移植により達成された新血管新生の結果を描いている。ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスは、大腿動脈の結紮と切除を受けてから、生理食塩水、培地又は内皮駆動培養条件下で７日間培養された細胞の注入を受けた。手術後及びその後毎週同じ条件下で、レーザードップラー測定を行なった。描かれているのは、虚血の脚と非虚血の脚の間での潅流速度の比較である。
図６は、外科手術後の２８日目における虚血の後脚の組織学的評価を示している。ＵＣＢ由来のＥＰＣを注入されたマウスの虚血性の後脚は、陽性のＣＤ３１染色を示した(白色の矢印で示してある)。培地のみを注射した対照用マウスは、ＣＤ３１につき陰性であった。
図７は、ＵＣＢからのＣＤ１３３+細胞の単離精製の結果を示している。単核細胞(ＭＮＣ)を、抗ＣＤ１３３結合した磁気ビーズを用いて標識してから、磁気カラム(Miltenyi社製、Automacs)を通して自動化ソーティングを行なった。１つの磁気カラムを通過させた後でのＣＤ１３３+細胞の収率は、日常的に、７５〜８５％の純度で(８３．０２％と示されている)、ＭＮＣ細胞の約０．４％であった。ＣＤ１３３−ＰＥでの染色後に、これらの細胞を、ＰＥ蛍光につきＦＡＣＳソートにかけたところ、９８．８７％の純度を、初期ＭＮＣインプットの０．１％の最終的収率にて生じた。ゲーティングは、行なわなかった。
図８は、精製されたＣＤ１３３+細胞における、造血駆動条件又は内皮駆動条件下での２４時間の培養の後の、ＣＤ４５、ＣＤ３４、ＢＣＬ−２及びｐ２１の差次的発現を示している。これらのパーセンテージは、分析した全細胞に対するものである。
図９は、培養精製ＣＤ１３３+細胞における細胞周期の分析を示している。これらのＣＤ１３３+細胞を、(Ａ)直ちに；(Ｂ)２４時間造血駆動条件下若しくは内皮駆動条件下で培養し；又は(Ｃ)７２時間造血駆動条件下で培養してから、精製して細胞周期のステージにつき分析した。細胞を固定し、透過性にし、ヘキストを用いてＤＮＡを染色して、細胞周期のステージにつき分析した。
図１０は、マウス後脚虚血モデルにおける、精製ＣＤ１３３+細胞に由来するＥＰＣによる新血管新生を描いている。血流を、レーザードップラーにより経時的に測定して、虚血の脚と非虚血の脚の間の比として表した。
図１１は、ヒトの間充織幹細胞(ｈＭＳＣ)数の、ヒトの臍静脈内皮細胞(ＨＵＶＥＣ)により条件付けした培地中でのインキュベーション後の、投与量応答性の有糸分裂による拡大(Ｂ)、及びＨＵＶＥＣ細胞数の、ｈＭＳＣにより条件付けした培地中でのインキュベーション後の、投与量応答性の有糸分裂による拡大(Ｃ)を示している。(Ａ)及び(Ｄ)は、対照用成長曲線である。
図１２は、ｈＭＳＣ(上段)及びＨＵＶＥＣ(下段)のｈＭＳＣ条件付けした培地への移動(左)及びＨＵＶＥＣ(上段)及びｈＭＳＣ(下段)のＨＵＶＥＣ条件付けした培地への移動を示している(右)。
図１３は、ｈＭＳＣが、血管内皮成長因子(ＶＥＧＦ)遺伝子を発現することを示している。ＶＥＧＦファミリーの成長因子のｍＲＮＡの発現は、ＲＴ−ＰＣＲを利用して検出した。特異的プライマーを、ｃＤＮＡに加えてＶＥＧＦファミリー遺伝子を３５サイクルにわたって増幅した。ＰＣＲ産物の変化量を、２％アガロースゲル上で泳動させて、エチジウムブロミド染色を用いて可視化した。ＰＣＲ産物のサイズは、次の通りであった：ＶＥＧＦ−Ａは、５７７ｂｐ、５２６ｂｐ及び４５４ｂｐ；ＶＥＧＦ−Ｂは、３２６ｂｐ及び２２５ｂｐ；ＶＥＧＦ−Ｃは、１８３ｂｐ；ＶＥＧＦ−Ｄは、２２５ｂｐ：そしてＰＩＧＦは、２４８ｂｐ及び１８４ｂｐ。
図１４は、ｈＭＳＣによるＶＥＧＦレセプターｍＲＮＡの発現を示している。全ＲＮＡを特異的プライマーに加えて、ＶＥＧＦレセプター遺伝子をＲＴ−ＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ産物の変化する量を、２％アガロース上で泳動して、エチジウムブロミド染色を利用して可視化した。示したのは、高分子量のＤＮＡマーカー、ＶＥＧＦＲ１(１，０９８ｂｐ)；ＶＥＧＦＲ２(３２６ｂｐ)；ＶＥＧＦＲ３(３８０ｂｐ)；ニューロピリン−１(３７５ｂｐ)及びニューロピリン−２(３０４ｂｐ及び２８９ｂｐ)である。
図１５は、単独培養又は共存培養したｈＭＳＣ及びＨＵＶＥＣにおける活性なＴＧＦ−ｂ１のＥＬＩＳＡ分析を示している。単独培養したｈＭＳＣ及びＨＵＶＥＣは、潜伏的ＴＧＦ−ｂ１タンパク質を分泌する(Ａ)。ｈＭＳＣ及びＨＵＶＥＣの共培養は、活性なＴＧＦ−ｂｌタンパク質を産生する(Ｂ)。
図１６は、ｈＭＳＣが、選択的に、内皮管様構造へ移動することを示している。単独培養のＨＵＶＥＣ(Ａ)は、ビトロゲンゲルの添加によって管様構造を形成するように誘導された(Ｂ)。ＤｉＩ染色したｈＭＳＣを、これらのゲル培養物の上に加えた(Ｃ)。２４時間後に、これらのｈＭＳＣは、内皮細胞管様構造に沿って位置した(Ｄ)。
図１７は、ＵＣＢに由来する精製したＣＤ１３３+細胞及びＣＤ１３３+細胞＋ｈＭＳＣの組合せによる、マウス後脚虚血モデルにおける新血管新生を描いている。血流を、レーザードップラーにより経時的に測定して、虚血脚と非虚血脚の間の比として表した。少数のマウスにおける結果は、ＣＤ１３３+細胞及びｈＭＳＣを外科手術後７日目に受けたマウスにおける、ＣＤ１３３+細胞だけを注入されたマウスと比較しての増大した血流を示している。
図１８は、ベースライン及びＭＮＣの注射後の、ブタの血管造影図の静止したフレームイメージを示している。ＬＡＤ：左前下行動脈、ＬＣｘ：左回旋動脈、Ｄ１：第一斜め分岐。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
Ｉ．概観
この発明は、広く、虚血組織を治療するための細胞ベースの治療に関係する。虚血組織は、該組織への血流を増大させることによって治療することができる。かかる血流の増大は、例えば、その組織へ供給する血管の数を増大させることによって媒介することができる。血管の生成は、２つの主要な過程、血管形成及び脈管形成によって達成される。血管形成は、前に存在するネイティブな血管に由来する完全に分化した内皮細胞からの血管組織の生成を指す。血管形成は、血管内皮成長因子(ＶＥＧＦ)、塩基性繊維芽細胞成長因子(ｂＦＧＦ)及び他のメディエーターを含むサイトカインの複雑なシグナリング機構により誘導される。この過程は、多分、虚血シグナルによって、「活性化された」内皮細胞の、分断された基底膜を通過しての間質への侵入作用によって媒介される。「治療用血管形成」は、遺伝子又は組換え治療に由来するサイトカインを利用して、虚血性の血管の病気を有する患者における副行血管生成を誘導し又は増大させることを指す。
【００１５】
対照的に、脈管形成は、最近まで胎児においてのみ起きると考えられていたが、血管組織の内皮前駆細胞(ＥＰＣ)又は血管芽細胞からのイン・シトゥーでの形成である。共通の先祖、血管芽細胞から生じる血島又は幹細胞のクラスターの形成が、この過程を開始する。これらの島又はクラスターにおいて、抹消に位置するＥＰＣは内皮に成熟するが、中央に位置する造血幹細胞(ＨＳＣ)は、血液細胞を生じさせる。ここで用いる場合、「治療用脈管形成」は、外因性の内皮を生成する細胞の、患者内への患者の細胞への導入による血管組織の新生を指す。
【００１６】
この発明は、一般に、虚血組織への血流を増大させる方法を提供する。一層詳細には、この発明は、虚血組織を治療することを必要とする患者における虚血組織を治療する方法であって、該患者に、治療上有効な量の、富化ヒト内皮生成細胞及び富化ヒト間充織幹細胞を投与することを含む当該方法を提供する。ここで用いる場合、ヒト内皮生成細胞は、ヒトの内皮細胞に分化することのできる細胞を指す。
【００１７】
この発明の関連する面は、虚血心筋への血流を増大させることを必要とする患者の虚血心筋への血流を増大させる方法であって、該患者に、治療上有効な量の富化ヒト内皮生成細胞及び富化ヒト間充織幹細胞を投与することを含む当該方法を提供する。
【００１８】
この発明の他の面は、虚血心筋における血管の形成を誘導することを必要とする患者の虚血心筋における血管の形成を誘導する方法であって、患者に、治療上有効な量の富化ヒト内皮生成細胞及び富化ヒト間充織幹細胞を投与することを含む当該方法を提供する。
【００１９】
この発明の更に別の面は、生存力のある心筋領域を有する虚血心筋への血流を改善することを必要とする患者の生存力のある心筋領域を有する虚血心筋への血流を改善する方法であって、該患者に、治療上有効な量の臍帯血から分離した富化ＣＤ１３３+／ＣＤ３４+内皮前駆細胞を投与することを含み、ＣＤ１３３+／ＣＤ３４+内皮前駆細胞を、該虚血であるが生存力のある心筋(慢性的な完全に閉塞した血管の分布域内)への副行流を与える心外膜血管である冠状動脈への点滴によって投与し且つＣＤ１３３+／ＣＤ３４+内皮前駆細胞の投与が、該虚血心筋への改善された血流を生じる、当該方法を提供する。この方法の一具体例は、更に、該患者に、ヒトの間充織幹細胞を投与することを含む。
【００２０】
ここに記載した方法の一つの好適具体例において、患者は、ヒトである。ここに記載した方法の一具体例において、虚血組織(例えば、制限はしないが、虚血の心筋)の治療は、虚血組織へ血液を供給する血管の形成、虚血組織への血流、虚血組織への酸素供給、又はこれらの組合せを誘導する。
【００２１】
ここに記載した方法の一具体例において、ヒトの内皮生成細胞は、ヒトの内皮前駆細胞である。ここに記載した方法の一具体例において、内皮生成細胞は、骨髄から、末梢血から、又は一層好ましくは臍帯血から単離される。一具体例において、内皮生成細胞例えば内皮前駆細胞は、患者への投与の前に、内皮細胞促進培養条件下で培養拡大される。他の具体例において、内皮生成細胞は、患者への投与の前に、少なくとも２倍に富化される。富化は、一般に、少なくとも幾らかの非内皮生成細胞を、内皮生成細胞と非内皮生成細胞の両方を含む混合物から除去すること、内皮生成細胞をそれらの数を非内皮生成細胞と比較して増大させる培養条件下で増殖させること、又はこれらの組合せにより達成される。ここに記載した方法の一具体例において、これらの内皮生成細胞は、血管芽細胞、造血幹細胞、又は一層好ましくは、内皮前駆細胞である。ここに記載した方法の特別の具体例においては、これらの細胞の組合せを患者に投与する。
【００２２】
ここに記載した方法の具体例において、内皮生成細胞例えば内皮前駆細胞は、ＣＤ３１+、ＣＤ１４６+、ＣＤ１３３+、ＣＤ３４+、ＶＥ−カドヘリン＋又はこれらの組合せである。特別の具体例においては、これらの内皮生成細胞は、ＣＤ１３３+／ＣＤ３４+の内皮前駆細胞である。ここに記載した方法の他の特別の具体例においては、内皮性精細胞例えば内皮前駆細胞は、患者に対して、自家の、同種異系の、又はＨＬＡ適合性の細胞である。
【００２３】
ここに記載した方法の特別の具体例においては、ヒトの間充織幹細胞を、骨髄から又は臍帯血から単離して、それらの患者への投与の前に、培養して拡大することができる。特別の具体例においては、これらの間充織幹細胞を、患者への投与の前に、培養して拡大して、モノクローナル抗体ＳＨ２、ＳＨ３又はＳＨ４により同定される表面抗原を含む細胞を富化させる。
【００２４】
ここに記載した方法の特別の具体例においては、ヒト間充織幹細胞は、患者に対して、自家の、同種異系の、又はＨＬＡ適合性の細胞である。虚血組織で苦しんでいる個人に投与される内皮生成細胞及び／又は間充織幹細胞の数は、虚血の重大さ、虚血である組織の大きさ、及び送達方法によって変化する。ここに記載した方法の一具体例において、治療上有効な量の富化ヒト内皮生成細胞及び富化ヒト間充織幹細胞は、安全で且つ有効な量である。他の特別な具体例においては、各細胞型の量は、少なくとも１×１０4のヒトの内皮生成細胞である。他の具体例において、ここに記載した方法で患者に投与される富化ヒト内皮生成細胞の及び富化ヒト間充織幹細胞の量は、約１０4〜５×１０8細胞である。患者に投与される細胞の量は、投与の方法及び投与の部位に依存する。例えば、治療上有効な細胞の冠状動脈内(又は、腎内又は頚動脈内)注射による投与量は、大腿部内注射の量より少量でよい。富化ヒト内皮生成細胞及び富化ヒト間充織幹細胞の両方を患者に投与する場合は、これらの２種の細胞の比は、例えば、約２０：１〜１：２０、約１０：１〜１：１０、約５：１〜１：５、及び約２：１〜１：２であってよい。
【００２５】
ここに記載した方法の一具体例において、患者への投与は、細胞の患者への点滴を含む。この点滴は、細胞の患者の全身への点滴を含むことができ、又はそれは、細胞の虚血組織への移動を容易にするように、虚血組織の近くにおける細胞の点滴を含むこともできる。この点滴は又、血液を虚血組織に供給する血管において、又は血液を虚血組織から除去する血管において行なうこともできる。ここに記載した方法の特別の具体例においては、細胞の患者への点滴は、骨髄への点滴、動脈内への点滴、筋肉内への点滴、心臓内への点滴、及び冠状動脈内への点滴、静脈内への点滴又は皮内点滴を包含する。ここに記載した方法の一具体例において、ヒトの内皮前駆細胞及びヒトの間充織幹細胞は、少なくとも一の冠状動脈内への点滴によって、患者に投与される。ここに記載した方法の特別の具体例においては、冠状動脈は、慢性的な完全に閉塞した血管の分布において、虚血心筋への副行血流を与える心外膜血管である。
【００２６】
ここに記載した方法の一具体例において、虚血組織に苦しんでいる患者は、慢性的な心筋の虚血を治療する必要がある。他の具体例において、患者は、脚の虚血、虚血性心筋症、心筋の虚血、脳血管の虚血、腎臓の虚血、肺の虚血及び腸の虚血よりなる群から選択する虚血を治療する必要がある。ここに記載した方法は、任意の特定の組織の虚血に限られず、如何なる種類の虚血にも適用される。例えば、ここに記載した方法の一具体例においては、患者は、多数の組織における虚血を被っている。かかる具体例においては、患者の全身への細胞の点滴が行なわれうるが、別法として又は組み合わせて、虚血組織に近い一つ以上の局所的点滴を行なうことができる。ここに記載した方法の一具体例において、虚血の心筋は、生存力のある心筋の領域を含む。
【００２７】
ここに記載した方法の幾つかの具体例において、これらの細胞の患者への投与は、動脈内カテーテル(例えば、制限はしないが、バルーンカテーテル)を利用して行なわれ、又はステントを利用することにより行なわれる。細胞を患者に送達するために現在利用できる任意の方法を利用して、細胞を、ここに記載した方法において、患者に投与することができる。
【００２８】
ここに記載した方法の幾つかの具体例においては、更に少なくとも一の組換えポリペプチド又は少なくとも一の薬物を患者に投与する。一具体例において、この組換えポリペプチドには、成長因子、サイトカイン、又は成長因子、ケモカイン若しくはサイトカインのレセプターが含まれる。好適具体例において、この組換えポリペプチドは、血管形成、脈管形成、又は両方を促進させる。幾つかの具体例においては、この組換えポリペプチドは、増殖、分化又は内皮生成細胞又は間充織幹細胞の虚血組織に局在化し又は虚血組織からの細胞と相互作用する能力を促進する。特別の具体例においては、この組換えポリペプチドには、ＶＥＧＦ、ＢＦＧＦ、ＳＤＦ、ＣＸＣＲ−４又はＣＸＣＲ−５が含まれる。
【００２９】
ここに記載した方法の幾つかの具体例において、内皮生成細胞例えば内皮前駆細胞又は間充織幹細胞、又は両方は、遺伝的に改変される。特別の具体例においては、これらの細胞は、組換えポリペプチドを発現するように遺伝的に改変される。一具体例において、組換えポリペプチドは、成長因子、ケモカイン若しくはサイトカイン、又は成長因子、ケモカイン若しくはサイトカインのレセプターである。他の特別の具体例においては、組換えポリペプチドは、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＳＤＦ、ＣＸＣＲ−４又はＣＸＣＲ−５である。他の具体例において、遺伝的に改変された細胞により発現された組換えペプチドは、内皮生成細胞又は間充織幹細胞の増殖、分化又は虚血組織に局在化する能力を促進する。他の具体例において、この遺伝的改変は、改変された細胞の、虚血組織の部位の細胞と相互作用する能力を増進する。関連する具体例において、これらの内皮生成細胞例えば内皮前駆細胞又は間充織幹細胞又は両方は、非遺伝的に、例えばポリペプチド、抗体又は抗体結合タンパク質によって、患者への投与の前に改変される。幾つかの具体例において、この処理は、改変された細胞の虚血組織への局在化を増大させることを意図している。
【００３０】
ここに記載した方法の幾つかの具体例において、内皮生成細胞は、内皮前駆細胞である。一具体例において、これらの内皮前駆細胞は、ＣＤ１３３+細胞、ＣＤ３４+細胞、一層好ましくはＣＤ１３３+／ＣＤ３４+細胞である。ここに記載した方法の具体例において、これらの内皮生成細胞例えば内皮前駆細胞は、患者への投与の前に、培養にて拡大される。特別の具体例においては、これらの内皮生成細胞は、患者への投与の前に、内皮細胞促進培養条件下で培養して拡大される。
【００３１】
ここに記載した方法の好適具体例において、これらの内皮生成細胞例えば内皮前駆細胞及び間充織幹細胞は、投与の前に富化される。富化とは、細胞の濃度の、他の細胞の濃度と比較しての増大を意味する。富化は、他の種類の細胞を、これらの細胞を含む混合物から、他の細胞を超えるそれらの増殖を改善する条件下で培養することにより、又は一の細胞型を他を超えて富化させるための当分野で公知の任意の方法によって除去することにより達成されうる。幾つかの具体例において、ここに記載した方法で用いる細胞は、少なくとも約２倍、約５倍、約１２倍、約５０倍、約１００倍、約１０００倍、約５０００倍、約１００００倍に、又は約５００００倍まで富化される。
【００３２】
ＩＩ．定義
便宜のために、この明細書、実施例及び添付の請求の範囲で用いたある種の用語を、ここに集めてある。別途規定しない限り、ここで用いるすべての技術用語及び科学用語は、この発明が属する分野の当業者によって通常理解されているのと同じ意味を有する。
【００３３】
ここでは、単数形の語は、一つ又はそれより多く(即ち、少なくとも一つ)を指す。例えば、エレメントは、一つのエレメント又は一つより多くのエレメントを意味する。
【００３４】
用語「含む」は、ここで用いる場合、語句「含む」(これに限られない)を意味するようい用い、これと交換可能に用いる。
【００３５】
用語「又は」は、文脈から明らかに別のものを指す場合以外は、「及び／又は」を意味するように用い、これと交換可能に用いられる。
【００３６】
用語「例えば」は、ここでは、語句「例えば、・・・但し、これらに限られない」を意味するように用いられ、該語句と交換可能に用いられる。
【００３７】
ＩＩＩ．ヒトの内皮生成細胞
ここに記載した方法は、内皮生成細胞(ＥＧＣ)の利用を含む。ＥＧＣは、内皮細胞に分化することのできる任意の細胞を含む。ＥＧＣは、胚性幹細胞、血管芽細胞、多能性幹細胞、造血幹細胞及び内皮前駆細胞を含む。ここに記載した方法の幾つかの具体例において、内皮生成細胞例えば内皮前駆細胞は、造血幹細胞、血管芽細胞又は胚性幹細胞由来の培養において生成される。
【００３８】
ここに記載の心臓血管及び／又は抹消虚血組織の治療用新血管新生のための方法の好適具体例において、内皮生成細胞は、内皮前駆細胞を含む。好適具体例において、外因性ＥＰＣ細胞は、ＣＤ１３３+細胞につき富化される。この細胞表面マーカーＣＤ１３３+は又、ＡＣ１３３としても知られている。ＡＣ１３３は、最近、抹消血、骨髄、胎児肝及び臍帯血由来のＨＳＣのマーカーとして発見された(Gehling等、2000, Blood.95(10): 3106-12；Yin等、1997. Blood 90(12): 5002-12；Buhring等、1999. Ann NY Accad SCI 99 872: 25-39；Majka等、2000. Folia Histochem Cytobiol.38:53-63)。他の具体例において、ＥＰＣは、ＣＤ３４+細胞である。更に別の具体例において、ＥＰＣは、ＣＤ１３３+／ＣＤ３４+細胞である。ＡＣ１３３+造血幹細胞は、これらの細胞は、培養後短期間で内皮細胞に分化することが示されているので、治療用新血管新生に向けた研究において、特に関心のあるものである。
【００３９】
骨髄、抹消血又は臍帯血(ＵＣＢ)は、ＥＰＣを生成することのできるＣＤ１３３+細胞の潜在的起源である。従って、ここに記載した方法で用いるＥＰＣは、これら３つの起源の何れからでも単離することができる。単純な単離技術(新鮮なＵＣＢの４日培養後の接着細胞の収集)は、以前に記載されたように、有意の増殖及びコロニー形成潜在能力を有する細胞集団を生成する(Mandel, D.等、Blood 98(11), 55b. (2001), この内容を、そっくりそのまま、本明細書中に参考として援用する)。
【００４０】
実例の節に記載したデータは、血管内皮培養と一致する、ＵＣＢ由来のＥＰＣ形態学的特長を支持している。血管内皮細胞を拡大するようにデザインされた培地中での短期間の培養の後に、これらの培養された細胞の多くは、ＣＤ３１及びＣＤ１４６(Ｐ１Ｈ１２)を含む内皮細胞に特異的と考えられる表面マーカーを示す。従って、好適具体例において、ここに記載した方法で用いるＥＰＣは、血管内皮細胞を拡大するようにデザインされた培地中での短期間の培養の後にＣＤ３１及びＣＤ１４６(Ｐ１Ｈ１２)を発現する内皮細胞を生じさせる。ここに記載した方法を利用してＥＰＣから得られた細胞の大多数は、エンドサイトーシスによりａｃＬＤＬを取り込み、少数は、レクチン結合を示す(２つの重要な細胞化学的な内皮の特徴)。加えて、培養により拡大されたＵＣＢ ＥＰＣは、フォン・ウィルブランド因子(ｖＷＦ)を生成する。
【００４１】
ここに記載した例は、非選択ＵＣＢ又は成人の骨髄から培養により拡大したＥＰＣの点滴が、後脚血管傷害のＮＯＤ．ＳＣＩＤ研究モデルにおいて血流を増大させる生物学的効果に関して匹敵することを示している。我々は、ＵＣＢ及び骨髄から拡大させたＥＰＣの点滴の両者が、虚血脚において、傷害後１４日以内に血流を有意に増大させることを認めた(細胞点滴は、サイトカイン点滴のみのものを上回る)。このＵＣＢ由来のＥＰＣの生物学的効果は、ＵＣＢ ＥＰＣ細胞点滴が、骨髄由来ＥＰＣにおける観察では、間質成分を含まないという事実からして、注目すべきものである。虚血脚からの組織の組織学的検査は、成熟内皮表面マーカーＣＤ３１を示す細胞の浸潤を示した。従って、出願人は、ＵＣＢを、成人骨髄に由来するものに匹敵するＥＰＣの幹細胞源として同定した。
【００４２】
ＵＣＢと成人骨髄由来ＥＰＣとの比較において、出願人は、類似性を認めたが、表面表現型における有意の差異をも認めた。接着性細胞は、ＣＤ３４及び成熟内皮特異的マーカーのＣＤ１４６(ＭＵＣ１８又はＭＣＡＭ)、ＣＤ３１及びＶＥ−カドヘリンにつき染色された。培養した接着性細胞の６０％より多くが、両幹細胞起源からのＣＤ１４６について陽性であった。ＣＤ３１の発現は、骨髄由来ＥＰＣにおいて、ＵＣＢ由来細胞より一層低かった。ＶＥ−カドヘリンも又、ＵＣＢと比較して一層低いパーセンテージの骨髄細胞で発現された。その上、ＵＣＢ由来のＥＰＣは、骨髄由来のＥＰＣと比較して一層高いＣＤ３４の発現を示した。
【００４３】
ＵＣＢ由来のＥＰＣは、患者の末梢血又は骨髄由来のＥＰＣを利用する既存の治療用脈管形成モデルと比較して、一層長い潜在的寿命及び一層大きい修復性増殖を含むＥＰＣの幹細胞起源として明確な利点を有している。ＥＰＣの幹細胞起源としてのＵＣＢの利用は、適当な培養条件下でＥＰＣに分化することのできる初期ＣＤ１３３+幹細胞の高い含有量、並びに丈夫な増殖能力、低い免疫原性、低い感染性夾雑物(ビリオンを含む)、及びバンクに預けられた無関係のＵＣＢにおける組織適合性遺伝子型の異なる表現を有する「既製の」臨床応用の可能性の故に有利である。
【００４４】
好適具体例において、ＣＤ１３３+ＥＰＣは、好ましくは、臍帯血から分離される。ＣＤ１３３+ＥＰＣは、前述の何れかの起源から、ＣＤ１３３+ＥＰＣの富化集団を生成する任意の方法により単離された単核細胞から正の選択をすることができる。ＣＤ１３３+細胞の迅速な単離のための幾つかの技術例えば白血球フェレーシス、密度勾配分画、免疫選択、差次的接着分離など(これらに限られない)が、周知である。非制限的例として、ＭＮＣを、密度勾配遠心分離によって得て、マグネチックビーズに結合した抗ＣＤ１３３抗体で標識して、一以上の磁気カラムを通過させて正の選択をされたＣＤ１３３+細胞を生成することができる。加えて又は別法として、ＭＮＣは、ＣＤ１３３に対する蛍光抗体で標識して、蛍光活性化セルソーター(ＦＡＣＳ)によりソートしてＣＤ１３３+細胞を得ることができる。得られたＣＤ１３３+細胞の収率及び純度は、これらの細胞を精製するのに用いた起源及び方法に依って変化しうる。標識した細胞を磁気カラムに一回通過させた後で得られる純度は、例えば、７５〜８５％であり、その後のＦＡＣＳの後では、純度は９５〜９９％に増大しうる。
【００４５】
ＣＤ１３３+内皮前駆細胞は、レシピエントに対して、同種異系の、自家の又はＨＬＡ適合性の細胞であってよい。イン・ビボでは、異種の、同種の及び自家のＥＰＣ移植片が活発な血管形成部位又は血管の傷害部位に取り込まれる(即ち、それらは、選択的にかかる位置に移動する)ということが知られている。
【００４６】
選択したＣＤ１３３+ＥＰＣは、投与ステップの前に、内皮細胞を促進する培養条件下で培養して拡大させることができる。或は、骨髄、末梢血又は臍帯血からのＭＮＣを、短期間(例えば、約２４時間)、内皮細胞促進培養条件下で培養し、培養中に、上記のような選択技術によってＣＤ１３３+細胞を選択することができる。ＣＤ１３３+内皮前駆細胞の少なくとも一部分は、ＣＤ３１+及び／又はＣＤ１４６+などの(これらに限られない)成熟内皮細胞のマーカーをも有しうるということは認められる。
【００４７】
内皮細胞の分化を促進するのに適した幾つかの培養培地が、知られている。非制限的例として、Kalka等、(2000) PNAS 97:3422-3427に記載されたそのような一つの適当な培地は、ＥＣ基本培地―２(ＥＢＭ−２)(Clonetics, San Diego) に５％ウシ胎児血清(ＦＢＳ)及び標準的SingleQuot (商標)添加剤(ヒトＶＥＧＦ−１、ヒト塩基性繊維芽細胞成長因子２(ＦＧＦ)、インスリン様成長因子１(ＩＧＦ−１)、ヒドロコーチゾン、アスコルビン酸及びヘパリンを含む)を加えたものである。
【００４８】
ここに記載した方法の一具体例において、ＥＧＣは、患者への投与の前に、遺伝的に、改変される。一具体例において、ＥＧＣは、成長因子、ケモカイン若しくはサイトカイン、又はこれらのレセプターなどの組換えポリペプチドを発現するように遺伝的に改変される。他の具体例においては、組換えペプチドは、ＶＥＧＦ、ＢＦＧＦ、ＳＤＦ、ＣＸＣＲ−４又はＣＸＣＲ−５である。他の具体例においては、遺伝的改変は、血管形成、脈管形成、又は両者を促進する。ＥＧＣは、例えば、この分野で普通に知られている方法を利用して例えばトランスフェクション、トランスフォーメーション又はトランスダクションによって改変することができる(組換え発現ベクターを利用)。このベクターは、染色体ＤＮＡに組み込まれうるし、又は常在性のプラスミドとして、遺伝的に改変されたＥＧＣによって運ばれうる。幾つかの具体例においては、ＥＧＣを遺伝的に改変するためにレトロウイルスを利用する。
【００４９】
ＩＶ．ヒトの間充織幹細胞／間質細胞
この発明の一つの面は、虚血組織を治療することを必要とする患者の虚血組織を治療する方法であって、該患者に、治療上有効な量の富化ヒト内皮生成細胞及び富化ヒト間充織幹細胞を投与することを含む当該方法を提供する。間充織幹細胞は、種々の環境の影響に依って、結合組織の特異的な何れかの種類(即ち、脂肪組織、疎性組織、骨組織、軟骨組織、弾性組織、繊維性結合組織)に分化することのできる骨髄及び末梢血中で見出される形成的な多能性の芽細胞である。間充織幹細胞は又、一般に、「骨髄間質細胞」又は正に「間質細胞」とも呼ばれる。間充織前駆細胞は、間充織幹細胞に由来して、一層限定された分化の潜在能力を有するが、少なくとも２種類の組織に分化することができる(例えば、Minguell等、2001 Exp Biol Med (Maywood);226(6):507-20の図１参照)。ここで用いる場合、用語「間充織幹細胞」は、間充織幹細胞、間充織前駆細胞及び骨髄間質細胞を含む。
【００５０】
出願人は、ｈＭＳＣを分離し、培養して拡大し、そして表現型を特性決定する方法並びにそれらの多くの細胞系統発生の潜在能力及び、血管形成を含む様々な他の発生事象を調節する能力についての広範な研究を前に報告した(Fleming, JE Jr.等、Dev. Dyn. 212, 119-132 (1998); Barry FP等、Biochem. Biophys. Res. Commun. 265, 134-139 (1999))。ｈＭＳＣは、稀である(骨髄の全有核細胞の約０．０１〜０．０００１％)が、出願人は、それらの骨髄からの分離、均質になるまでの他の骨髄細胞からの精製、及びそれらの幹細胞の潜在能力の喪失を伴わない有糸分裂による拡大のための細胞培養方法論を完成させた(Haynesworth SE等、Bone 13, 81-88(1992))。ヒト成体のＭＳＣは、骨髄由来であっても、ＣＤ３４又はＣＤ４５を発現しないが、ＩＬ−６、−７、−８、−１１、−１２、−１４、−１５、Ｍ−ＣＳＦ、ｆｌｔ−３リガンド(ＦＬ)及びＳＣＦを定常状態で発現し、ＩＬ−３及びＴＧＦβは発現しないことが示されている。デキサメタゾンへの暴露は、ＬＩＦ、ＩＬ−６及びＩＬ−１１の低下した発現を生じる(Haynesworth SE等、J. Cell Physiol. 166, 585-592 (1996))。その上、初期血管芽細胞の支持において重要な間質細胞により発現される接着分子には、フィブリン−１及びフィブリン−２、テナシン−Ｃ、間質細胞由来因子１(ＳＤＦ−１)及びＶＩ型コラーゲンが含まれる。
【００５１】
理論に拘束はされないが、ｈＭＳＣは、分泌された可溶性因子及び直接的細胞接触効果によって、血管傷害部位に帰って、初期血管芽細胞と協調して脈管形成を増大させると考えられる。間充織細胞は、内皮細胞の侵食を促進する細胞外マトリクス分解酵素(主に、マトリクスメタロプロテイナーゼ９)を構成的に分泌することが知られている。加えて、間充織細胞は、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＩＬ−８、ＰＤＧＦを含む幾つかのプロ血管形成因子、及び内皮細胞の移動、増殖及び／又は管形成を促進する造血系成長因子を分泌する。
【００５２】
この発明による方法における利用のための間充織幹細胞は、末梢血又は骨髄から分離することができる。ｈＭＳＣを調製する方法は、米国特許第５，４８６，３５９号に記載されている。その上、間充織幹細胞は又、Erices等、2000 Br. J Haematol 109(1): 235-42に記載されたように臍帯血から分離することもできる。ここに記載した方法の好適具体例においては、間充織幹細胞を虚血に苦しんでいる患者の骨髄又は末梢血から分離する場合には、該患者は、この治療のレシピエントとなる。
【００５３】
白血球フェレーシス、密度勾配分画、免疫選択、差次的接着分離などを含む(これらに限られない)間充織幹細胞の迅速な分離のための幾つかの技術が知られている。例えば、免疫選択は、骨髄由来ｈＭＳＣにより発現される表面抗原(即ち、ＳＨ２、ＳＨ３又はＳＨ４)に対して高めたモノクローナル抗体を利用するｈＭＳＣの集団の分離を含むことができる(例えば、米国特許第６，３８７，３６７号に記載されている)。このＳＨ２抗体は、エンドグリン(ＣＤ１０５)に結合するが、ＳＨ３及びＳＨ４は、ＣＤ７３と結合する。更に、これらのモノクローナル抗体は、身体中の起源によらずに、ｈＭＳＣを同定し、定量し、精製するために利用することのできる有効なプローブを与える。ここに記載した方法の一具体例においては、間充織幹細胞を、ＣＤ４５、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ｓｔｒｏ−１、又はこれらの組合せを発現する細胞を富化させるために培養して拡大させる。他の具体例においては、ヒトの間充織幹細胞を、患者に投与する前に、モノクローナル抗体ＳＨ２、ＳＨ３又はＳＨ４により同定される表面抗原を含む細胞を富化させるために培養して拡大させる。ｓｔｒｏ−１抗体は、Gronthos等、1996, J. Hematother. 5: 15-23に記載されている。ヒトの間充織幹細胞を富化させるために利用することのできる更なる細胞表面マーカーは、例えば、Fibbe等、2003. Ann. N.Y. Acad. Sci. 996:235-244の２３７頁の表Ｉに見出すことができる。
【００５４】
この発明による方法における利用のためのｈＭＳＣは、培養培地中に維持することができ、それは、化学的に規定される無血清培地であってよいし又は「完全培地」(例えば、１０％血清を補ったダルベッコ改変イーグル培地(ＤＭＥＭ))であってもよい。適当な化学的に規定される無血清培地は、米国特許第５，９０８，７８２号及びＷＯ９６／３９４８７号に記載されており、完全培地は、米国特許第５，４８６，３５９号に記載されている。化学的に規定される培地には、ヒト血清アルブミン、ヒトＥｘ Ｃｙｔｅリポタンパク質、トランスフェリン、インスリン、ビタミン、必須及び非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、グルタミン及び有糸分裂誘起物質を補った最小必須培地例えばIscove改変ダルベッコ培地(ＩＭＤＭ)が含まれる。これらの培地は、間充織幹細胞の分化を伴わない成長を刺激する。約２週間の培養は、接着性細胞の集団の１０〜１４倍増を生じる。これらの細胞をプレートした後に、３〜４日ごとの培地の交換による非接着細胞の除去は、幹細胞の特性を保持した接着性細胞の高度に純化された培養を生じ、モノクローナル抗体ＳＨ２、ＳＨ３及び／又はＳＨ４により同定されるそれらの細胞表面抗原の発現により同定されて定量されうる。
【００５５】
ここに記載した方法の一具体例において、間充織幹細胞は、患者への投与の前に、遺伝的に改変される。一具体例において、間充織幹細胞は、組換えポリペプチド例えば成長因子、ケモカイン若しくはサイトカイン、又は成長因子、ケモカイン若しくはサイトカインと結合するレセプターを発現するように遺伝的に改変される。他の具体例において、組換えペプチドは、血管内皮成長因子(ＶＥＧＦ)、肝細胞成長因子(ＨＧＦ)、繊維芽細胞成長因子(ＦＧＦ)、間質細胞由来因子１(ＳＤＦ−１)、又はインターロイキン８(ＩＬ−８)である。間充織幹細胞は、例えば、米国特許第５，５９１，６２５号に開示された方法又はＥＧＣについて上記した方法を利用して改変されうる。他の具体例においては、遺伝的改変は、血管形成、脈管形成、又は両者を促進する。更に別の具体例においては、間充織細胞は、それらの心筋細胞への分化を促進するように遺伝的に改変される。この組換えポリペプチドは、例えば、ＶＥＧＦ又はアンギオプロテイン−１であってよい。米国特許公開第２００３／０１４８９５２号は、内皮前駆細胞をリクルートするためのアンギオプロテイン−１の利用を記載している。他の具体例において、この組換えポリペプチドは、白血病阻止因子、ＩＬ−１〜ＩＬ−１３、ＩＬ−１５〜ＩＬ−１７、ＩＬ−１９〜ＩＬ−２２、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(ＧＭ−ＣＳＦ)、顆粒球コロニー刺激因子(Ｇ−ＣＳＦ)、マクロファージコロニー刺激因子(Ｍ−ＣＳＦ)、エリスロポエチン(Ｅｐｏ)、トロンボプロテイン(Ｔｐｏ)、Ｆｌｔ３−リガンド、Ｂ細胞活性化因子、アルテミン、骨形態形成タンパク質因子、上皮成長因子(ＥＧＦ)、グリア細胞由来神経栄養性因子、リンホタクチン、マクロファージ炎症性タンパク質、ミオスタチン、ニュールツリン、神経成長因子、血小板由来成長因子、胎盤成長因子、プレイオトロフィン、幹細胞因子、幹細胞成長因子、トランスフォーミング成長因子、腫瘍壊死因子、血管内皮細胞成長因子、及び繊維芽細胞成長因子、ＦＧＦ−酸性及び塩基性繊維芽細胞成長因子よりなる群から選択される。
【００５６】
ここに記載した方法の他の具体例においては、間充織幹細胞は、患者への移植の前に、それらの虚血組織へのターゲティングを促進するように改変される。特別の具体例においては、これらの細胞は、プロテインＧ及び、虚血性傷害部位に豊富な抗原に結合する抗体により被覆される。
【００５７】
Ｖ．投与方法
ここに記載した方法において、内皮生成細胞例えばＣＤ１３３+ＥＰＣの治療上有効な量及びｈＭＳＣの治療上有効な量は、患者により安全に受容される細胞の最大数から、虚血組織における新たな血管の誘導又は虚血組織への血流の増大に必要とされる細胞の最少数に及びうる。一般に、内皮生成細胞及びｈＭＳＣの各々の治療上有効な量は、少なくとも患者の体重１ｋｇ当たり１×１０4であり、最も一般的には、１ｋｇ当たり、各細胞型の７×１０5より多くは必要でない。ＣＤ１３３+ＥＰＣのｈＭＳＣに対する比は、約５：１〜１：５に及びうる。約１：１の比が、好ましい。ｈＭＳＣが患者に対して自家又はＨＬＡ適合であるのが好ましいが、ｈＭＳＣは、他の個体若しくは種から又は遺伝子工学的に交雑されたドナー系統から分離することができ、或はイン・ビトロ細胞培養から分離することができる。
【００５８】
治療上有効な量のＣＤ１３３+ＥＰＣ及び／又はＭＳＣを、製薬上許容しうるキャリアー又は賦形剤に懸濁させることができる。かかるキャリアーには、基礎培養培地に１％ 血清アルブミンを加えたもの、塩溶液、緩衝塩溶液、デキストロース、水、及びこれらの組合せが含まれるが、これらに限られない。この配合物は、投与方法に適しているべきである。従って、この発明は、ヒトの内皮生成細胞例えばＣＤ１３３+ＥＰＣの、虚血組織を治療することを必要とする患者の虚血組織を治療するための医薬の製造のための利用を提供する。幾つかの具体例において、この医薬は、成長因子、ケモカイン若しくはサイトカインなどの組換えポリペプチドを更に含む。更なる具体例において、これらの医薬は、ｈＭＳＣを含む。これらの医薬の製造に利用する細胞は、ここに記載した方法につき与えた変化の何れかを利用して、単離し、導き又は富化することができる。
【００５９】
好適具体例において、内皮生成細胞ＣＤ１３３+ＥＰＣ及び／又はｈＭＳＣの調製物又は組成物は、日常的手順に従って、ヒトへの静脈投与に適合された医薬組成物として配合される。典型的には、静脈投与用、動脈投与用又は心内投与用組成物は、無菌の等張水性緩衝剤中の溶液である。必要であれば、この組成物は、注射部位の任意の痛みを改善するための局所麻酔剤をも含むことができる。一般に、これらの成分は、別々に又は単位投薬形態に一緒に混合して、例えば、活性剤の量を示す密封した容器例えばアンプル内の低温保存した濃縮物として供給される。組成物を点滴により投与すべき場合には、無菌の医薬等級の水又は塩溶液を含む点滴瓶を利用して投薬することができる。組成物を注射により投与する場合には、注射用の無菌の水又は塩溶液のアンプルを与えて、投与の前に成分を混合することができる。
【００６０】
細胞を患者に投与するための様々な手段は、当業者には、この明細書の故に、明らかとなろう。かかる方法には、患者の標的部位への細胞の注射が含まれる。細胞を、患者への注射による導入又は移植を容易にする送達用デバイスに挿入することができる。かかる送達用デバイスは、細胞及び液体をレシピエント患者の身体に注入するための管(例えば、カテーテル)を含むことができる。好適具体例において、これらの管は、更に、この発明の細胞を患者の所望の位置にに導入することのできる針例えば注射器を有する。好適具体例において、細胞は、カテーテルによる血管への投与のために配合される(ここに、用語「カテーテル」は、物質を血管に送達するための様々な管様システムの何れかを含むことを意図している)。これらの細胞は、送達用に、様々な異なる形態で調製することができる。例えば、これらの細胞は、溶液又はゲルに懸濁させることができる。細胞は、この発明の細胞が生存力を維持する製薬上許容しうるキャリアー又は希釈剤と混合することができる。製薬上許容しうるキャリアー及び希釈剤には、塩溶液、緩衝剤水溶液、溶剤及び／又は分散媒が含まれる。かかるキャリアー及び希釈剤の利用は、当分野では周知である。この溶液は、好ましくは、無菌で流動性であり且つしばしば等張性となる。好ましくは、この溶液は、製造及び貯蔵条件下で安定であり、細菌及びカビなどの微生物の汚染作用に対して、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどの利用により保護されている。
【００６１】
内皮生成細胞例えばＣＤ１３３+ＥＰＣ及びｈＭＳＣの投与方法には、全身への心内、冠動脈内、静脈内又は動脈内注射及び活性な意図された部位の組織への直接的な注射が含まれるが、これらに限られない。この調製物は、任意の都合の良い経路によって、例えば点滴又はボーラス注射によって投与することができ、他の生物学的に活性な薬剤と一緒に投与することができる。投与は、好ましくは、全身投与である。一層好ましくは、投与部位は、活性な意図される部位に近く又は隣接している。患者が広域虚血を患っている場合には、全身投与例えば静脈投与が好ましい。機構に拘束はされないが、内皮生成細胞例えばＣＤ１３３+ＥＰＣ及びｈＭＳＣは、投与されると、傷害により生成された化学走性因子に応答して虚血組織に移動し又は帰る。
【００６２】
一具体例において、内皮生成細胞例えばＣＤ１３３+ＥＰＣは、ｈＭＳＣと同時に投与される。他の具体例においては、ｈＭＳＣは、内皮生成細胞の注射の前又は後に投与される。ＥＧＣ又は間充織幹細胞／間質細胞の投与は、同じ又は異なる投与方法を利用して行なうことができる。例えば、ＥＰＣは、冠動脈内注射によって投与することができるが、間質細胞は、静脈投与されうる。
【００６３】
この発明の方法によって治療することのできる虚血組織には、脚の虚血、心筋虚血(特に、慢性の心筋虚血)、虚血性心筋症、脳血管虚血、腎臓虚血、肺虚血、腸虚血などが含まれるが、これらに限られない。
【００６４】
ここに記載した方法の一具体例においては、組換えポリペプチド又は薬物が、細胞の投与と共に患者に投与される。このポリペプチド又は薬物は、細胞の投与の前に、投与と同時に又は投与後に、患者に投与することができる。一つの好適具体例において、この組換えポリペプチド又は薬物は、血管形成、脈管形成又は両者を促進する。他の具体例において、この組換えポリペプチド又は薬物は、内皮生成細胞若しくは間充織幹細胞又は両者の増殖又は分化を促進する。一具体例において、この組換えポリペプチドは、ＶＥＧＦ、ＢＦＧＦ、ＳＤＦ、ＣＸＣＲ−４若しくはＣＸＣＲ−５、又は虚血組織に対する治療活性を保持したこれらの断片である。
【００６５】
特に、この発明の方法は、ヒトの心筋虚血の治療のための治療用脈管形成に有用である。発明の方法によるＣＤ１３３+ＥＰＣ及びｈＭＳＣの投与は、単独の治療として利用することができ、又は外科的及び／又は内科的療法に対する付加的治療として利用することもできる。例えば、心筋虚血の治療のためのここに記載した方法は、冠動脈バイパス移植又は経皮冠動脈介入と共に利用することができる。ここに記載した方法は、特に、外科治療後に虚血領域の不完全な脈管再生を有し、それ故、虚血であるが生存力のある心筋層領域を有する患者に有効である。この発明の方法による治療用脈管形成の恩恵を有意に受けうる患者は、脈管再生技術の不十分な標的である血管により供給される悪化した潅流により危険にさらされた広い領域の生存力のある心筋層を有する者である。治療用脈管形成法の恩恵を受けることのできる他の患者は、小さい内径の、重篤に広がったアテローム性疾患の血管を有し且つ脈管再生前(特に、バイパス移植前)の者である。それ故、この発明の方法による治療用脈管形成は、特に、慢性の心筋虚血を有する患者に利益をもたらしうる。
【００６６】
これらの幹細胞は、虚血領域に直接注射することができるが、これらの幹細胞は、好ましくは、冠状動脈(好ましくは、心筋虚血の領域に供給する冠状動脈)に点滴される。この患者が虚血心筋層の領域に正常に供給するであろう完全に閉塞した血管を有する場合は、点滴のために選択される冠状動脈は、好ましくは、完全に閉塞した血管の分布において虚血心筋層への副行流を与える心外膜血管である。
【００６７】
ＣＤ１３３+ＥＰＣの治療上有効な量は、患者によって安全に受容される細胞の最大数である。好適な注射の経路は、冠動脈であり、培養においてｈＭＳＣは、最初に単離されたものより大きくなるので、最大投与量は、細胞を点滴する血管のサイズを考慮して、血管が鬱血したり詰まったりしないようにすべきである。虚血心筋層における新しい血管の形成の誘導に必要な細胞の最小数は、過度の実験を行なうことなく、投与量増大研究によって経験的に決定することができる。例えば、かかる投与量増大は、体重１ｋｇ当たり約１０4のＣＤ１３３+ＥＰＣ単独(又は、約１０4／ｋｇのｈＭＳＣとの組合せ)から開始することができよう。
【００６８】
この発明の一つの面は、更に、(ａ)臍帯血から富化させたＣＤ１３３+／ＣＤ３４+細胞；(ｂ)骨髄から富化させたモノクローナル抗体ＳＨ２、ＳＨ３又はＳＨ４により同定される表面抗原を含む間充織幹細胞；及び(ｃ)製薬上許容しうるキャリアーを含む医薬配合物を提供する。幾つかの具体例において、この配合物は、１０4〜１０9のＣＤ１３３+／ＣＤ３４+細胞を含む。他の具体例において、この組成物は、１０4〜１０9の間充織幹細胞を含む。更なる具体例において、この配合物は、カテーテルによる投与用に調製される。
【００６９】
本発明の実施は、適宜、別途指示のない限り、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、ウイルス学、組換えＤＮＡ、及び免疫学の慣用技術を利用する(これらは、当業者の技能のうちにある)。かかる技術は、文献中に記載されている。例えば、Sambrook 及び Russell 著、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第３版(Cold Spring Harbor Laboratory Press: 2001)；論文、Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.)；Harlow 及び Lane著、Using Antibodies, 第２版(Cold Spring Harbor Press, New York, 1999)；Bonifacino, Dasso, Lippincott-Schwartz, Harford 及び Yamada 著、Current Protocols in Cell Biology(John Wiley and Sons, Inc., New York, 1999)を参照されたい。
【００７０】
典型的な具体例
この発明は、今や、一般的に記載されており、下記の実施例を参照することにより、一層容易に理解されよう(これらは、単に、本発明のある面及び具体例の説明目的のために含まれるものであって、この発明を制限することを意図するものではなく、当業者は、上記の教示と以下の実施例から認めるであろうが、他の幹細胞起源及び選択方法、他の培養培地及び培養方法、他の投薬及び治療スケジュール、及び他の動物及び／又はヒトを、制限することなく、請求の範囲に記載したこの発明の範囲から離れずに、利用することができる)。
【実施例】
【００７１】
実施例１
内皮前駆細胞の臍帯血及び成人骨髄からの分離及び特性決定
単核細胞を、臍帯血(ＵＣＢ)又は成人骨髄(ＢＭ)から分離して、内皮前駆細胞(ＥＰＣ)の発生を支持する条件下で短期培養中に置いた。これらの培養から回収された接着性細胞は、ＥＰＣ特性を示すことが、細胞化学、フローサイトメトリー、顕微鏡形態学及び免疫染色を含む多数のイン・ビトロアッセイを利用する分析により見出された。
【００７２】
１）細胞の分離
新鮮なＵＣＢ又はＢＭに由来する単核細胞(ＭＮＣ)を、密度勾配遠心分離を利用して分離した。ＥＰＣ細胞を、Kalka等(2000)PNAS 97: 3422-3427の方法によって、細胞培養にて、分離・拡大した。簡単にいえば、これらのＭＮＣを、ヒトのフィブロネクチンでコートした培養フラスコ上に、４〜６×１０6細胞／ｍｌ(ＵＣＢ ＭＮＣ)又は１〜２×１０6細胞／ｍｌ(ＢＭ ＭＮＣ)の密度で、５％ウシ胎児血清(ＦＢＳ)及び標準的ＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔ(商標)添加剤(ヒトＶＥＧＦ−１、ヒト繊維芽細胞成長因子２(ＦＧＦ)、インスリン様成長因子１(ＩＧＦ−１)、ヒドロコーチゾン、アスコルビン酸及びヘパリン含有)を有するＥＣ基本培地(ＥＢＭ−２)(Clonetics, San Diego)中にプレートした。非接着性細胞は、４日の培養後にリン酸緩衝塩溶液(ＰＢＳ)で洗浄することにより除去して、培地を、その後、４日ごとに交換した。培養の第２週において、これらの接着性細胞は、ＥＰＣの特徴である紡錘様形態をとった。
【００７３】
６〜７日目において、細胞を、トリプシン処理して計数した。ＵＣＢ培養からの接着性細胞の収率は、ＢＭ ＭＮＣで得られた収率２１．５％±３．７％と比較して、平均で、初期ＭＮＣ投入量の２．５％±０．４％であった。
【００７４】
２）ＥＰＣ特性に関する接着性細胞の細胞染色
ａ）成熟内皮細胞の２つの主な細胞化学的染色の特徴は、Ulex europaeus アグルチニン(ＵＥＡ)−１などの特異的レクチンタンパク質の接着、及びアセチル化された低密度リポタンパク質(ａｃＬＤＬ)の取り込みである。接着細胞の蛍光顕微鏡観察を行なって、ＦＩＴＣ標識ＵＥＡ−１(Sigma)と１，１−ジオクタデシル−３，３，３’，３’−テトラメチルインドカーボシアニン(ＤｉＩ)標識ａｃＬＤＬ(Biomedical Technologies, マサチューセッツ、Stoughton在)の二重結合を検出した。
【００７５】
接着性細胞を、先ず、ａｃＬＤＬと３７℃でインキュベートして、１％パラホルムアルデヒドで１０分間固定した。洗浄後、これらの細胞を、ＵＥＡ−１(１０μｇ／ｍｌ)と１時間にわたって反応させた。染色後、試料を、全細胞蛍光を記録するようにセットした共焦点顕微鏡を用いて４０倍で観察した。
【００７６】
図１は、ＵＣＢ由来ＥＰＣの細胞化学的染色を示す蛍光顕微鏡イメージを示している。これらの細胞の大部分がａｃＬＤＬの取り込みを示すということが見出された(Ａ)。一層小さい割合が、ＵＥＡ−１レクチンについて陽性染色を示した(Ｂ)。両細胞化学的染色についての同時複合二重染色の結果をＣに示してある。二重陽性蛍光を示す細胞を、分化中のＥＰＣとして同定した。
【００７７】
ＢＭ及びＵＣＢの両方に由来するＥＰＣ細胞のａｃＬＤＬの取り込み及び形態の比較を測定した。培養の第二週において、両起源からの細胞は、ａｃＬＤＬの取り込みを示し且つ類似の形態的特徴を示した(データは示さない)。
【００７８】
ｂ）フォン・ウィルブランド因子(ｖＷＦ)は、血管内皮細胞及び巨核球により合成されるよく特性決定された多量体の糖タンパク質である。ＵＣＢから培養された接着性細胞はｖＷＦに関して染色された。表面接着細胞を載せたスライドを、室温のアセトンで、１０分間固定して、風乾した。これらの細胞を、次いで、Dako(カリフォルニア、Carpinteria在)から市販されているポリクローナルウサギ抗ヒト第ＶＩＩ因子関連抗原と反応させた。この抗原と結合する細胞の検出を、日常的な西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン−ビオチン技術(ＬＳＡＢ２、Dako社製)及び３，３−ジアミノベンジジン(色原体)を利用して行なった。染色を、位相差顕微鏡によって４０倍の倍率を用いて観察した。
【００７９】
図２に示したように、ＵＣＢから培養された非選択的接着細胞は、別の内皮染色パターンを示した。褐色の核周囲の染色は、核周囲のｖＷＦ粒子と反応する第二抗体に結合されたイムノペルオキシダーゼによるものである。ヒトの臍静脈内皮細胞(ＨＵＶＥＣ)は、陽性対照として染色され、繊維芽細胞は、陰性対照として染色された(データは示さない)。
【００８０】
３）ＵＣＢ由来のＥＰＣ細胞のフローサイトメトリー分析
ａ）ＣＤ１３３+細胞の選択及び表現型決定：
ＵＣＢ由来の５０×１０6のＭＮＣを磁気ビーズ結合した抗ＣＤ１３３抗体(Miltenyl)で標識して、２つの連続する磁気カラムを通して、０．１×１０6の陽性に選択されたＣＤ１３３+細胞を生成した。これらの選択されたＣＤ１３３+細胞を、フローサイトメトリー及びＣＤ３４とＣＤ１３３についての染色により特性決定した。図３は、明確に同定されたＣＤ１３３+／ＣＤ３４-細胞(１００)及びＣＤ１３３+／ＣＤ３４+細胞(２００)の集団を、大きさ(前方散乱、ＦＳＣ)対顆粒化度(屈折度、側方散乱、ＳＳＣ)で示している。ＦＳＣゲインは、非常に小さい細胞のより良い解像度のために増大された。ゲーティングは行なわなかった。
【００８１】
ｂ）ＵＣＢ及びＢＭ由来の非選択ＥＰＣ細胞の表現型決定：
ＵＣＢ細胞を１９日間、ＢＭ細胞を１２日間、ＥＭＢ−２培地中で培養した。接着性細胞をトリプシン処理して、ＣＤ３４及び成熟内皮特異的マーカーのＣＤ１４６(Ｐ１Ｈ１２、ＭＵＣ１８又はＭＣＡＭ)、ＣＤ３１及びヒト血管内皮(ＶＥ)カドヘリンにつき染色した。図４に示したように、培養した接着性細胞の６０％より多くが、ＣＤ１４６陽性であった。ＣＤ３１の発現は、ＵＣＢ由来の細胞における５０％と比較して、ＢＭ由来のＥＰＣでは２５％であった。しかしながら、ＣＤ３１染色は、ＢＭにおいて一層明るかった。ＶＥ−カドヘリンは、ＵＣＢ由来の細胞における２４％と比較して、ＢＭ由来の細胞の１０％において発現された。ＵＣＢ由来のＥＰＣは、ＢＭ由来のＥＰＣの１０％と比較して、細胞の２５％においてＣＤ３４の発現を示した。
【００８２】
まとめると、前述の研究は、非選択ＵＣＢ及びＢＭ細胞が、内皮細胞培養条件下で迅速に増殖して拡大することを示した。これらのＵＣＢ及びＢＭ由来のＥＰＣは、多数の内皮の特徴を示す。
【００８３】
実施例２
ＵＣＢ及びＢＭ由来のＥＰＣのイン・ビボモデルにおける移植
マウス後脚虚血モデルにおける新血管新生のイン・ビボ研究を、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおいて行なった。これらの結果は、ＵＣＢがＥＰＣの最適の起源であることを示している。ＵＣＢは、ＢＭ中に存在する間質エレメントを欠くが、ＵＣＢ由来のＥＰＣは、ＢＭ起源のＥＰＣによるものと同等の生物学的効果をイン・ビボモデルにおいて示した。
【００８４】
１）治療グループ。すべての手順を、Case Western Reserve University's Institutional Animal Care and Use Committee に従って行なった。ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス(１０〜１５週齢、体重２０〜２５グラム)を用いた。外科手術前に、これらのマウスを、セシウム−１３７線源からの２．５Ｇｙで照射して、注射されるヒト細胞の拒絶を一層低下させた。これらのマウスを一晩絶食させたが、水は自由に飲ませた。次いで、それらをケタミンとペントバルビタールの組合せの腹腔内注射により麻酔した。無菌条件下で、右鼠蹊領域に小さい皮膚切開を行なった。右大腿動脈を露出させて、近接する枝と共に結紮して(＃０００シルク使用)、横断切開した。大腿静脈及び大腿神経を結紮しないように、特に注意した。次いで、皮膚切開を、連続縫合様式で閉じた(＃０００シルク使用)。大腿動脈結紮後に、これらのマウスを、４つのグループに分けた。グループ１の動物は、培養７日目に収穫した１×１０6(０．０２ｍｌの培地中)の接着性(ＥＰＣ)ＵＣＢ細胞の心内注射を受けた。グループ２の動物は、培養７日目に収穫した１×１０6の接着性（ＥＰＣ）ＢＭ細胞の心臓内注射を受けた。グループ３及びグループ４の動物は、同様に、０．０２ｍｌの完全ＥＢＭ−２培地又は塩溶液のみをそれぞれ受けた。外科手術及び細胞の注射の直後に、虚血の右脚と操作してない左脚の両方のベースラインの血流を、レーザードップラー流量計(レーザー流量計 ＡＬＦ２１Ｄ、Advance Company LTD, 日本国、東京在)を利用して測定した。レーザードップラー測定を、外科手術後、７日目、１４日目及び２８日目に反復した。虚血脚／健康脚の潅流の比を利用して、３つの研究グループにおける新血管新生を比較した。
【００８５】
２）ＵＣＢ又はＢＭ由来のＥＰＣで処理した動物における潅流比の比較
図５は、虚血脚と非虚血脚の間の潅流比の比較を示している。大腿結紮の直後に、潅流比は、０．０５７±０．０１１(ＥＢＭ−２培地のみを注射された対照用グループ)、０．０２９±０．００７(ＵＣＢ由来のＥＰＣ)及び０．０２０±０．００４(ＢＭ由来のＥＰＣ)であり、すべてのグループにおいて、減少した潅流を示している。１４日後には、ＵＣＢ由来のＥＰＣを受けた研究用グループにおける傷害を受けた脚において、対照用グループと比較して、及びＢＭ由来のＥＰＣグループと対照用グループとの間で、統計的に有意な一層高い血流があった(ｐ＜０．００１)。対照用グループにおける潅流比は、ＵＣＢ由来のＥＰＣを受けたグループにおける比０．４１±０．０３１(ｎ＝２２)(ｐ＝０．０００８)及びＢＭ由来のＥＰＣを受けたグループにおける比０．４８±０．０３９(ｎ＝１４)と比較して、０．２４±０．０３２(ｎ＝１４)の比と低いままであった。１４日目には、ＥＰＣの２つの起源間でこれらの比の有意の差異はなかった(ｐ＝０．１８)。その後の２８日目の時点での測定は、対照用グループと細胞点滴を受けたマウスとを比較したときに、潅流比を等しくする対照用動物におけるドップラー血流における改善の故に、注目すべきものであった。
【００８６】
３）治療グループにおける虚血性後脚の組織学的評価
両後脚の下腿後部筋由来の組織を、２８日目に、組織学的評価のために収穫した。これらの試料は、液体窒素中で凍結され新鮮であり、ホルマリンで固定した。６μｍ厚の凍結切片を、塩溶液でコートしたガラス上に載せて、免疫組織化学的技術を利用して、抗ヒトＣＤ３１抗体を用いる染色により、ヒト細胞から得られたＥＰＣの組込みを同定した。図６に示したように、ＵＣＢ ＥＰＣを注射されたマウスからの試料は、ＣＤ３１についての陽性の染色を示したが、完全なＥＭＢ２倍地を注射された対照用マウスは、示さなかった。すべてのグループの健康な脚は、陽性のＣＤ３１染色を示さなかった(データは示さない)。ＢＭ ＥＰＣを注射されたマウスに由来する試料は、同様の結果を示した(データは示さない)。
【００８７】
実施例３
ＵＣＢからのＣＤ１３３+細胞の選択と精製
ＣＤ１３３+細胞の分離と精製のために、単核細胞を上記のようにＵＣＢから分離して、ＣＤ１３３+結合した磁気ビーズで標識し、その後、磁気カラムを通す自動化ソーティング(Ａｕｔｏｍａｃｓ，Miltenyi)を行なった。これらの標識した細胞を単一のカラムを通すことにより、日常的収率は、元のＭＮＣの０．４％であり、ＣＤ１３３+細胞の純度は、７５〜８５％に及んだ。ＭＮＣの２つの連続する磁気カラムの通過により、純度は、９１．２％ ＣＤ１３３+細胞にまで高められたが、収率は、０．２％に落ちた。更なる精製の試みを、蛍光活性化セルソーティング(ＦＡＣＳ)により行なった。ＣＤ１３３+細胞を、磁気カラムを通過させることにより分離し、ＣＤ１３３−フィコエリトリン(ＰＥ)結合抗体で染色し、更に、ＦＡＣＳにより精製した。図７に示したように、磁気カラム通過の結果生成した純度は、８３．０２％ ＣＤ１３３+細胞であった。ＦＡＣＳ後、純度は、９８．８７％まで増大したが、最終的収率は、初期ＭＮＣ投入量の０．１％であった。
【００８８】
実施例４
精製したＣＤ１３３+細胞の培養−拡大及び特性決定
１）内皮細胞駆動性サイトカイン又は造血細胞駆動性サイトカイン中でのＣＤ１３３+細胞の表面マーカーのフローサイトメトリー分析
実施例３に従って分離した精製ＣＤ１３３+細胞を、造血駆動性サイトカイン又はＣＤ１３３+細胞から内皮細胞を生成させることが報告されているサイトカイン中で培養した(Gehling, U.M.等、Blood 95(10):3106-3112)。簡単にいえば、造血駆動性条件のためには、ＣＤ１３３+細胞を、９６ウェルプレート上に、０．２×１０6細胞／ウェル／条件の濃度でプレートして、培地単独(Iscove's Modified Dulbecco's Medium, IMDM)に２％ＦＢＳを加えたもの、又は造血培養培地(ＩＭＤＭ)、３０％ ＦＢＳ、５０ｎｇ／ｍｌの幹細胞因子(ＳＣＦ)、２０ｎｇ／ｍｌのヒト顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子(ＧＭ−ＣＳＦ)、顆粒球コロニー刺激因子(Ｇ−ＣＳＦ)、インターロイキン−３(ＩＬ−３)、ＩＬ−６、及び３Ｕ／ｍｌのエリスロポエチンの何れかにおいて２４時間にわったてインキュベートした。内皮細胞駆動性条件のためには、０．２×１０6のＣＤ１３３+細胞を同様にプレートして、内皮培養培地(ＩＭＤＭ、１０％ ＦＢＳ、１０％ ウマ血清 １ｍＭ ヒドロコーチゾン、１００ｎｇ／ｍｌの幹細胞成長因子(ＳＣＧＦ)、及び５０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ)中でインキュベートした。２４時間のインキュベーション後に、これらの細胞を、造血表面マーカーＣＤ３４及びＣＤ４５につき並びにＢＣＬ−２及びｐ２１(これらは、それぞれ、細胞周期及びアポトーシスを調節するタンパク質であり、ＨＳＣの運命の調節において一つの役割を演じることが示されている)の発現につき、フローサイトメトリーにより分析した。例えば、ｐ２１cIpI/waf1は、サイクリン依存性キナーゼのインヒビターであり、Ｇ１での細胞周期拘束を媒介する。ｐ２１cIpI/waf1欠乏マウスにおいては、正常のホメオスタシス条件下でのＨＳＣの増大した増殖及び幹細胞プールの消耗があるということが示されており、これは、ｐ２１cIpI/waf1が、ＨＳＣが細胞周期に入るのを制御する分子スイッチでありうることを示唆している。抗アポトーシスタンパク質ＢＣＬ−２の、トランスジェニックマウスの造血コンパートメントにおける過剰発現は、ＨＳＣ数並びにイン・ビトロプレーティング能力を改善し、ＨＳＣを細胞周期の一層静止状態に維持することが示されている。
【００８９】
図８に示したフローサイトメトリーの結果は、全細胞における発現の強度を示している(平均蛍光強度(ＭＦＩ)として又は分析した全細胞のパーセンテージとして表してある)。ＣＤ４５及びＣＤ３４発現は、造血細胞系統特異的なサイトカイン中での培養の２４時間後に強力に増大された。ＣＤ４５発現は、内皮サイトカイン中で失われたが、これは、細胞が、既に造血細胞系統を離れて分化を始めたことを示唆している。ｐ２１及びＢＣＬ−２タンパク質の発現は、造血サイトカイン条件にて増大した。しかしながら、両タンパク質の発現は、内皮サイトカイン条件において有意に低下したが、これは、やはり、２つの細胞集団が、既に異なる遺伝子発現プログラムを開始したことを示唆している。
【００９０】
２）ＵＣＢから新たに分離した又は２４時間培養したＣＤ１３３+細胞における細胞周期の分析
細胞周期のステージを、実施例３におけるように新たに分離したＣＤ１３３+細胞において並びに培地のみの中で、又は上記のように造血若しくは内皮駆動性条件下で２４時間培養し、又は造血条件下で７２時間培養した後のＣＤ１３３+細胞において分析した。細胞を固定し、透過性にして、ＤＮＡをヘキストを用いて標準的条件下で染色し、そして細胞周期のステージにつき分析した。
【００９１】
これらの結果は、図９に示してある。新たに分離したＣＤ１３３+細胞(Ａ)の細胞周期ステージの分析は、９９％の細胞が、Ｇ0期で休止していることを示した。サイトカイン中での培養(Ｂ)の２４時間後には、有意の細胞分裂は、造血又は内皮条件においては、見出されず、この時点では、大多数の細胞(９３〜９４％)は、未だＧ0期にいた。しかしながら、造血条件で７２時間後には、１５％の細胞が、Ｓ期にあり、１１％の細胞が、Ｇ2／Ｍ期にあった。このデータは、上で検討した差次的タンパク質発現が、特異的サイトカイン中でのインキュベーションの２４間後にのみ、差次的遺伝子発現プログラムに沿って進行していたことを示している(この時点では、非常に僅かの細胞しか分裂を生じていなかったが)。それ故、２４時間では、細胞分裂は起きなかったので、造血又は内皮条件で培養された細胞は、事実上、依然として、最初にプレートしたのと同じ細胞である。
【００９２】
実施例５
マウスの後脚傷害モデルにおける、精製ＵＣＢ ＣＤ１３３+細胞由来のＥＰＣによる新血管新生
ＣＤ１３３+を、実施例３に記載したように選択した。選択後に、これらの細胞を実施例４に記載したのと同じ内皮駆動性培養条件下で、９６ウェルプレート中に５０，０００〜７０，０００細胞／ウェルで播種した。７日間の培養後に、細胞を、実施例２に記載した方法により後脚の大腿動脈の結紮を受けたマウスの心内に注射した。細胞収率は、プレートしたＣＤ１３３+細胞の５８〜１３０％に及び、又はＭＮＣの最初の数の０．２６％であった。血流を、ドップラー流量計によって、経時的に測定したが、図１０に示した結果は、傷害脚中と非傷害脚中の経時的な血流の比として表してある。これらの結果は、外科手術の１４日後にＣＤ１３３+細胞を受けたマウスにおける、同日の塩溶液を注射された対照と比較しての増大した血流を示している。もっと後の時点(２８日)での分析は、塩溶液のみを注射された対照用マウスにおけるドップラー流れ測定における有意の改善につき、注目すべきものであった。
【００９３】
実施例６
ヒト間充織幹細胞及びヒト臍静脈内皮細胞は、相互に、有糸分裂による拡大を誘導する
物理的接触にない細胞間の初期の血管形成の相互作用は、可溶性因子により媒介される。ヒトの間充織幹細胞は、骨形成、造血及び破骨細胞形成などの発生過程を支持するための因子を分泌する。これらの過程を調節する多くのサイトカインも又、内皮細胞の成長に影響を与える。下記の実施例は、ｈＭＳＣが、成熟内皮細胞の成長を刺激するタンパク質を分泌することを説明する。これらの実施例は又、成熟内皮細胞に由来する可溶性因子がｈＭＳＣの成長を刺激することをも説明する。
【００９４】
１）ヒトの骨髄由来の間充織幹細胞(ｈＭＳＣ)：分離及び培養による拡大
骨髄を、６人のヒトドナーの腸骨稜から吸引した。ヒトの間充織幹細胞を、以前に報告された方法(Haynesworth, SE等、1992. Bone 13, 81-88)を改変した方法によって精製して培養した。簡単にいえば、骨髄吸引物を、２０ｍｌの注射器から、２５ｍｌの成長培地を含む５０ｍｌの円錐管に移した。成長培地は、スクリーンして選択したロットからの、１０％(ｖ／ｖ)にウシ胎児血清(ＦＢＳ、GIBCO, メリーランド、Gaithersburg在)を補ったダルベッコ改変イーグル培地よりなるものであった。これらの管を、ベックマン卓上遠心器で、ＧＳ−６スウィングローターにて、１，２００ｒｐｍで５分間遠心して、これらの細胞をペレット化した。脂肪層及び上清を、血清学用ピペットで吸引して廃棄した。細胞ペレットを５ｍｌの容積の成長培地に再懸濁させてから、７０％ パーコールの３５ｍｌの勾配の上に移した。これらの試料を、Ｓｏｒｖａｌｌ ＳＳ−３４固定式アングルローターに載せて、Ｓｏｒｖａｌｌ Ｈｉｇｈ Ｓｐｅｅｄ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅにて、４６０ｇで１５分間遠心分離した。約１２ｍｌの低密度画分(プールした密度＝１．０３ｇ／ｍｌ)を、各勾配から集めて、５０ｍｌ三角管に移し、その各々に３０ｍｌの成長培地を加えた。これらの管を、１，２００ｒｐｍで遠心分離して、細胞をペレット化した。これらの上清を捨てて、細胞を、２０ｍｌの成長培地に再懸濁させて、赤血球を４％酢酸で溶解させた後に、血球計算器を用いて計数した。細胞を、７ｍｌ当たり５×１０7細胞の濃度に調節して、１００ｍｌの培養プレートに、プレート当たり７ｍｌで播種した。
【００９５】
これらの細胞を、培養培地中で３７℃で、９５％の空気と５％のＣＯ2を含む加湿大気中で培養し、培地を３〜４日ごとに交換した。一次培養ディッシュが、１０〜１４日目にほぼ集密になったら、それらの細胞を、１ｍＭ ＥＤＴＡを含む０．２５％(ｗ／ｖ)トリプシンを、５分間、３７℃で用いて分離した。トリプシンの酵素活性を、１／２容のウシ血清を加えることにより停止させた。これらの細胞を、計数して、成長培地に再懸濁させた。細胞収率は、最初のＭＮＣの数の約０．２６％であった。
【００９６】
２）条件付け培地での成長アッセイ
ヒトの間充織幹細胞(実施例６のパート１におけるようにして獲得)又はヒト臍静脈内皮細胞(ＨＵＶＥＣ)を３５ｍｍディッシュ中にプレートして、成長培地中にて付着させた。付着後に、これらの細胞を、洗ってから、１２時間、無血清培地中(ｈＭＳＣ)か又は低血清培地中で(ＨＵＶＥＣ)インキュベートして、これらの細胞の細胞質に残っているかもしれない残留血清タンパク質を低減させ、成長位相を同期させた。これらの細胞を、再び洗った後に、それらを、様々な濃度の条件付け培地中で、７２時間(ｈＭＳＣ)又は４８時間(ＨＵＶＥＣ)インキュベートした。細胞を、血球計算器により定量した。
【００９７】
ｈＭＳＣ条件付け培地を生成するために、１００ｍｍプレート中の７５％集密のｈＭＳＣを洗って、低グルコースを含む無血清ダルベッコ改変イーグル培地(ＤＭＥＭ−ＬＧ)中で２４時間インキュベートした。これらのｈＭＳＣを、タイロード平衡化塩溶液で洗ってから、無血清の規定された培地(８０％ Iscove、１２％ ＤＭＥＭ−ＬＧ及び８％ トリ繊維芽細胞基本培地ＭＣＤＢ２０１)を７２時間条件付けした。この条件付け期間後に、この培地を取り出して、遠心分離して細胞残骸を除去した。これらの培地を条件付けした細胞を定量して、条件付けした培地を、細胞数に対して、無血清規定倍位置で１０，０００細胞／ｍｌに希釈することにより標準化した。
【００９８】
条件付けした培地を、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ (３ＫＤａ 分子量(ＭＷ)カットオフ遠心分離装置)をＳｏｒｖａｌｌ遠心器にて、４℃で利用して、２０倍に濃縮した。濃縮された条件付け培地及び濾液(３ＫＤａ ＭＷを超える蛋白質を含まない濃縮ユニットからの流出液)を直ちに使うか又は−２０℃に貯蔵した。この濾液を遠心分離して、細胞残骸を除去してから、２０×条件付け培地を２×(終濃度の２倍)まで希釈するのに利用した。１×条件付け培地を生成するために、新鮮な無血清培地を、必須栄養素を与えるために、１：１の比で加えた。
【００９９】
ＨＵＶＥＣ条件付けした培地を、ｈＭＳＣ条件つけした培地につき上記したように調製した(但し、ＨＵＶＥＣは、１％ ＦＢＳを加えたメディウム１９９中で４８時間成長させた)。濃縮後に、ＨＵＶＥＣ条件付け培地を、上記のように、濾液で２倍まで希釈した。この条件付け培地を、次いで、１％ ＦＢＳを含む新鮮なメディウム１９９で１倍まで希釈した。
【０１００】
３）条件付け培地の、ｈＭＳＣ又はＨＵＶＥＣの有糸分裂による拡大に対する効果
図１１は、ＨＵＶＥＣにより条件付けした培地でのインキュベーション後の、ｈＭＳＣ細胞数の投与量応答性の有糸分裂による拡大(Ｂ)、及びｈＭＳＣにより条件付けした培地でのインキュベーション後の、ＨＵＶＥＣ細胞数の投与量応答性の有糸分裂による拡大(Ｃ)を、それぞれ示している。条件付けした培地(ＣＭ)による成長刺激効果は、煮沸により熱不活性化した条件付けした培地を利用した場合には、明確ではなかった。濾液(３ＫＤａのＭＷカットオフの濃縮ユニットからの流出液)は、何れの細胞型についても、刺激効果を有しなかった。
【０１０１】
すべての図の対照用培地は、合わせた非条件付け培地であった(１：１の比で、細胞型に最も適合された新鮮な最小培地と)。ＨＵＶＥＣ対照用培地の希釈物は、比較的少ないＦＢＳを含んでいるが、１％を超える変動はない。図１１(Ａ)及び(Ｄ)は、対照用成長培地である。
【０１０２】
実施例７
ｈＭＳＣ及びＨＵＶＥＣの化学走性による、条件付け培地中で分泌された因子へ向かう移動
組織は、部分的に、既存の血管から組織への、内皮細胞の化学走性による移動を誘導する因子の放出による新たな脈管構造を必要としている。同様に、新たに形成された脈管構造は、部分的に、それらの、内皮細胞から放出される化学走性因子に応答して新血管の部位に移動する間充織周細胞との相互作用の結果として、成熟して安定化する。以下の実施例は、ｈＭＳＣが、内皮細胞の移動を刺激して周細胞前駆細胞として役立つことができ、内皮細胞により放出される化学走性因子に応答することができることを説明する。ボイデンチャンバーを利用して、他の条件付け培地に分泌された化学走性因子に応答してのｈＭＳＣ及びＨＵＶＥＣの移動を測定した。
【０１０３】
１）ボイデンチャンバーにおける、条件付け培地に向かう化学走性による移動
Ｎｅｕｒｏｐｒｏｂｅ４８ウェルボイデンチャンバーの下側ウェルに、変化する濃度で、実施例６に記載したｈＭＳＣ又はＨＵＶＥＣ条件付け培地を充填した。１％ゼラチンで被覆した５μｍの細孔を有するポリカーボネート膜を、下側ウェルの上に置き、チャンバーを組み立てた。ｈＭＳＣ又はＨＵＶＥＣをペレット化して、徹底的に洗浄した後に、無血清(投与量応答アッセイ用)又は変化する濃度の条件付け培地(チェッカーボードアッセイ)に再懸濁させた。ｈＭＳＣ又はＨＵＶＥＣ細胞懸濁物を、上側ウェルに充填した。これらのチャンバーを、３７℃で、５時間、インキュベートして、細胞の上側ウェルから、膜を通って下側ウェル中の条件付け培地への移動を許した。５時間のインキュベーションの後に、これらのチャンバーを、分解して、膜を回収した。細胞を、その膜の上面からかきとり、膜の細孔内に移動した細胞のみが残った。これらの移動した細胞を、次いで、ホルムアルデヒドにて固定して、クリスタルバイオレットで染色し、そしてスライド上に載せた。スライドを、投与量応答につきスキャンして、オリンパス４８０Ｅ顕微鏡を利用する直接的な細胞計数によって定量した。フィルター上の３つの点の並びは、与えた条件の３つのウェルにおける細胞の移動を表している。
【０１０４】
図１２は、ｈＭＳＣ(上段)及びＨＵＶＥＣ(下段)の、ｈＭＳＣ条件付け培地(左パネル)に向かう移動、及びＨＵＶＥＣ(上段)及びｈＭＳＣ(下段)の、ＨＵＶＥＣ条件付け培地(右パネル)に向かう移動を示している。両細胞型について、最大の移動は、ｈＭＳＣ又はＨＵＶＥＣ条件付け培地のそれぞれの最大濃度(１０×)に対応する膜の左上の角の３つの点において認められた。これらの点(膜に付着した細胞数に直接対応する)の強度は、条件付け培地の濃度が低下すると共に減少し、従って、ｈＭＳＣ及びＨＵＶＥＣの両者のそれぞれの、ＨＵＶＥＣ又はｈＭＳＣ条件付けした培地への投与量依存性の移動を示している。熱変性させた条件付け培地は、負の対照と類似の移動パターンを示した。１０％ ＦＢＳを、正の対照として利用した。
【０１０５】
実施例８
ヒトの間充織幹細胞は、血管内皮成長因子(ＶＥＧＦ)及びＶＥＧＦレセプター遺伝子を発現する。
ＶＥＧＦは、専ら内皮細胞上で見出されたレセプターの内皮細胞特異的リガンドとして記載された。しかしながら、最近の報告は、ヒトの骨髄間質細胞を含む非内皮細胞でのＶＥＧＦレセプターの発現を示している。次の２つの実施例は、ｈＭＳＣも、ＶＥＧＦ成長因子及びレセプターを発現することを示す。
【０１０６】
１）ｈＭＳＣによる成長因子ｍＲＮＡのＶＥＧＦファミリーの発現のＲＴ−ＰＣＲ分析
ＲＴ−ＰＣＲを利用して、ＶＥＧＦファミリーの成長因子の遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ発現を示した。Ｑｕｉａｇｅｎキットを利用して、ペレット化ｈＭＳＣから全ＲＮＡを生成した。ｃＤＮＡ合成キット(Amersham)は、全ＲＮＡからｃＤＮＡを生成した。ｃＤＮＡをＶＥＧＦファミリー遺伝子(ＶＥＧＦ−Ａ、−Ｂ、−Ｃ、−Ｄ及びＰＩＧＦ)に特異的なプライマーと合わせて、Ｒｏｂｏｃｙｃｌｅｒ ４８０ ＰＣＲマシーンにおける増幅のためのＲＴ−ＰＣＲ Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏビーズに加えた。全反応は、同じ３５サイクルの増幅プログラムを、特異的プライマーのためにセットした最適アニーリング温度で利用した。
【０１０７】
２）ＶＥＧＦ ＰＣＲ産物の可視化
ＰＣＲ産物の量を変化させて、２％アガロースゲル上で泳動させて、エチジウムブロミド染色を利用して可視化した。図１３は、次の通りの分離されたＰＣＲ産物の大きさを示している：ＶＥＧＦ−Ａは、５７７ｂｐ、５２６ｂｐ及び４５４ｂｐ；ＶＥＧＦ−Ｂは、３２６ｂｐ及び２２５ｂｐ；ＶＥＧＦ−Ｃは、１８３ｂｐ；ＶＥＧＦ−Ｄは、２２５ｂｐ；そしてＰＩＧＦは、２４８ｂｐ及び１８４ｂｐ。
【０１０８】
３）ｈＭＳＣによるＶＥＧＦレセプターの発現のＲＴ−ＰＣＲ分析
ＲＴ−ＰＣＲ分析を、ＶＥＧＦレセプター１、２及び３、並びにニューロピリン−１及びニューロピリン−２に特異的なプライマーを利用して、実施例９に記載したように行なった。
【０１０９】
４）ＶＥＧＦ ＰＣＲレセプター産物の可視化
可視化を上記のように行なった。図１４は、高分子量ＤＮＡマーカー、ＶＥＧＦＲ１(１，０９８ｂｐ)、ＶＥＧＦＲ２(３２６ｂｐ)、ＶＥＧＦＲ３(３８０ｂｐ)；ニューロピリン−１(３７５ｂｐ)及びニューロピリン−２(３０４ｂｐ及び２８９ｂｐ)を示している。
【０１１０】
実施例９
周細胞前駆細胞と内皮細胞との直接的細胞接触は、ＴＧＦ−β１を活性化する相互作用へと導き、これは、血管形成期を終えて、各細胞型の血管性分化を誘導する。ＴＧＦ−β１は、培養中の殆どの細胞によって潜伏性形態で分泌される。ＴＧＦ−β１の生理学的関連は、その活性の調節である。単一培養における非トランスフォーム細胞での活性ＴＧＦ−β１産生の文献での報告はない。しかしながら、内皮細胞の多能性マウス繊維芽細胞(１０Ｔ１／２細胞)、周細胞との共存培養、又は内皮細胞との共存培養中の平滑筋細胞は、潜伏性ＴＧＦ−β１を、プラスミンによる潜伏性ペプチドのタンパク質分解性開裂を含む機構によって、活性化することが示されている。この実施例は、ｈＭＳＣが、内皮細胞と直接的細胞接触によって相互作用して、鍵となる抗血管形成因子、ＴＧＦ−β１を活性化するということを示す。
【０１１１】
ＥＬＩＳＡ分析を利用して、上記の実施例６に記載したようにして調製した、ｈＭＳＣ及びＨＵＶＥＣの単独培養又は共存培養からの条件付け培地における活性なＴＧＦ−β１タンパク質を検出した。
【０１１２】
図１５(Ａ)は、単独培養におけるｈＭＳＣ及び内皮細胞による潜伏性ＴＧＦ−β１の分泌を示している。予想されるように、活性なＴＧＦ−β１は、単独培養のｈＭＳＣ又はＨＵＶＥＣからの条件付け培地においては、測定不能であった。図１５(Ｂ)は、活性なＴＧＦ−β１がｈＭＳＣ又はＨＵＶＥＣの単独培養では生成されないが、同細胞の共存培養においては検出されたことを示している。
【０１１３】
実施例１０
ｈＭＳＣは、選択的に内皮管様構造に移動する。
証拠は、内皮細胞の管が、周囲の間充織細胞をリクルートして、新たに形成中の血管に向けて移動させて該血管に共存させてそれらを安定化させることを示唆している。３次元のＩ型コラーゲンゲル中の内皮細胞の管は、新規に形成された血管のイン・ビトロ相関物である。上記の実施例で与えたデータは、ｈＭＳＣとＨＵＶＥＣが、化学走性を誘導する分泌タンパク質によって相互作用することを示している。更に、このデータは、ｈＭＳＣが、共存培養中のＨＵＶＥＣと相互作用して、血管成長期を終わらせてある種の繊維芽細胞及び内皮細胞の最終分化を誘導することが示されている抗血管形成因子であるＴＧＦ−β１を活性化するシグナリングを調節することを示している。
【０１１４】
この実施例は、ｈＭＳＣが、内皮細胞管様構造への移動、該構造での共存、及び周細胞への分化を誘導されうることを示す。
【０１１５】
１）管様構造の調製及びｈＭＳＣの移動の可視化
簡単にいえば、ＤｉＩ染色したｈＭＳＣを、内皮細胞管様構造のビトロゲン(Ｉ型コラーゲン)３Ｄゲル培養に加えて、共存を研究した。ＤｉＩは、成体色素である。ＨＵＶＥＣ管様構造の培養を確立するために、ＨＵＶＥＣを、３００，０００細胞／ｍｌで１％ゼラチンでコートした３５ｍｍプレート上にプレートした。付着後に、内皮成長培地を除去して、細胞をタイロード溶液で徹底的に洗った。ビトロゲンゲルの溶液を、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ−ＬＧと１：１の比で、これらの内皮細胞に加えた。ビトロゲン混合物の凝固後に、更なる１ｍｌの内皮成長培地を加えて、培養物を、一晩インキュベートして、管様構造を形成させた。
【０１１６】
ｈＭＳＣをＤｉＩで染色するために、ｈＭＳＣを、５０，０００細胞／ｍｌで３５ｍｍプレート中にプレートした。ｈＭＳＣを、一晩、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ−ＬＧ中でインキュベートして、付着させた。次いで、培養物を、タイロード溶液で洗い、１μｇ／ｍｌ ＤｉＩと合わせた１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ−ＬＧ中で６時間インキュベートした。インキュベーション後に、ｈＭＳＣを徹底的に洗ってから、トリプシン処理して、細胞をプレートから取り出した。これらのｈＭＳＣを、遠心分離によってペレット化してから、３０，０００細胞／ｍｌで、２％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ−ＬＧに再懸濁させた。
【０１１７】
１ｍｌのｈＭＳＣ懸濁液を、ゲル培養中のＨＵＶＥＣ管様構造の上面に加えた。共存は、ｈＭＳＣの３Ｄゲルを通っての、底面近くに位置する管様構造までの移動を必要とした。培養をモニターして、写真撮影を行なった。
【０１１８】
結果は、図１６に示してある。パネルＡにおいて、ＨＵＶＥＣは、典型的な２次元培養であることが示されている。パネルＢは、パネルＡの細胞にビトロゲン３Ｄコラーゲンゲルを加えてから１２時間後に形成された管様構造を示している。内皮の管の広大なネットワークの叢が見られる。パネルＣは、ＤｉＩ染色した３Ｄコラーゲンゲルの表面を横切ってランダムに分布したｈＭＳＣを示している。パネルＤは、ｈＭＳＣの３Ｄコラーゲンゲル中のＨＵＶＥＣへの添加の２４時間後の同じ培養物を示している。これらのｈＭＳＣは、このゲルを通って移動して、選択的に、内皮細胞の管と共存した。結果は、多数のｈＭＳＣ及びＨＵＶＥＣドナーを同じ実験条件で利用して、再現性があった。
【０１１９】
実施例１１
ヒト間充織幹細胞(ｈＭＳＣ)を補ったＵＣＢ ＣＤ１３３+細胞から精製したＥＰＣによるマウス後脚傷害モデルにおける増大された新血管新生
一連の実験を行なって、ＵＣＢ由来のＥＰＣに加えられた間質エレメント(例えば、ｈＭＳＣ)が、マウス後脚虚血モデルにおいて、新血管新生を増大させるかどうかを測定した。
【０１２０】
１）ｈＭＳＣの分離及び培養による拡大
成人の骨髄由来のｈＭＳＣを分離して、実施例６に記載のようにして培養において拡大した。
【０１２１】
２）ＵＣＢ由来のＣＤ１３３+細胞の分離及び培養による拡大
ＵＣＢ由来のＣＤ１３３+細胞を、実施例３に記載のようにして選択した。選択後に、これらの細胞を、５０，０００〜７０，０００細胞／ウェルで、９６ウェルプレートに、実施例４で記載したのと同じ内皮駆動性培養条件下で播種した。細胞収率は、プレートしたＣＤ１３３+細胞の５８〜１３０％に及んだ。
【０１２２】
３）ｈＭＳＣを補った精製したＣＤ１３３+細胞由来のＥＰＣによるマウス後脚傷害モデルにおける新血管新生
７日間の培養の後に、１×１０6のＣＤ１３３+細胞及び１×１０6のｈＭＳＣを、実施例２に記載した方法により、後脚の大腿動脈の結紮を受けたマウスに、同時に、心内注射した。血流を、レーザードップラー流量計により、経時的に測定したが、図１７に示した結果は、傷害脚の血流と非傷害脚の血流との間の経時的な比として表してある。これらの結果は、外科手術の７日後にＣＤ１３３+細胞及びｈＭＳＣ細胞の両方を受けたマウスにおける、ＣＤ１３３+細胞(１４日目)又はｈＭＳＣ細胞のみを点滴されたマウスと比較しての、増大した血流を示している。この結果は、ｈＭＳＣとＣＤ１３３+細胞の同時点滴後の早い時点(７日目)において、改善された血流が達成されたことを示唆している。しかしながら、同時点滴実験において研究されたマウスが少数であることにより、適当な統計的分析を行なうための十分なデータがない。同時のｈＭＳＣ点滴の増大効果は、一層遅い時点では、持続しなかった。
【０１２３】
実施例１２
慢性的冠状動脈虚血の患者におけるＵＣＢ由来のＣＤ１３３+細胞の冠状動脈内点滴
文書に記録された虚血であるが、慢性的に完全に閉塞した血管の分布域内で副行流を与える心外膜血管による供給を受けて生存力のある心筋領域を有する慢性的冠状動脈虚血の患者は、この治療の適格者である。この適格な患者は、カナダ心臓血管学会で規定するクラスＩＩ〜ＩＶの狭心症の過去の経験を報告しなければならない。患者は、経皮的冠動脈介入(ＰＣＩ、例えば、バルーン血管形成術、アテロトミー、又は回転式アテレクトミー)のスケジュールの３０日以内に篩い分けされる。虚血であるが生存力のある心筋領域は、ＰＥＴ走査に加えて、運動／薬理学的核ストレス試験により同定される。左心室の駆出率(＞４５％が、患者の適格性に求められる)及び局所的な壁の動きの心臓エコー検査による評価は、完全な病歴及び身体検査(同時に行う薬物療法、ＥＣＧ、及びベースラインラボラトリーパネル(ＣＢＣ、基本的代謝プロフィル、凝固パネル、急性心筋梗塞パネル)の再検討を含む)と共に初期篩い分けの部分である。冠状動脈血管造影法は、治療プロトコールに好都合な解剖学的構造、ＰＣＩに従順な別の容疑者の血管の十分樹立された副行流により供給される遠位分布域の心外膜動脈の即ち慢性的な完全な閉塞について評価される。
【０１２４】
幹細胞治療に不適格な患者には、枝治療、ＰＣＩ禁忌、心臓カテーテル法、骨髄吸引、を含むＰＣＩに従順な冠動脈病変を有する者、並びに直近の３ヶ月以内に心筋梗塞を有し、文書に記録された出血素質を有し、造血／リンパ系に関連する公知の悪性疾患を有し、虚血のベースラインＥＣＧの解釈を妨げるベースラインＥＣＧ異常を有し、腎不全を含む重い合併症を有し、又は心理的若しくは社会的理由により通院不能であることが予想される者が含まれる。
【０１２５】
一度適格な患者の解剖学的構造が測定されれば、その患者は、カテーテル方ラボラトリーから排除されて、知覚鎮静下で骨髄吸引を受ける。約１５０〜２５０ｍｌの骨髄吸引物を腸骨稜から取り出す。所望の容積を得るためには、多数の穿刺部位が必要とされうる。この骨髄吸引物の容積は、約１０6のＭＮＣを生成する。
【０１２６】
ＣＤ１３３+細胞を、実施例３に記載した方法により、ＣＤ１３３+結合した磁気ビーズで標識し、その後、磁気カラム(Ａｕｔｏｍａｃｓ、Miltenyi)を通す自動化ソーティングを行うことによって、ＭＮＣから分離する。これらの選択したＣＤ１３３+細胞を、次いで、緩衝溶液中で洗浄し、そして５ｍｌの規定食塩水の濃縮溶液中に貯蔵することができる。
【０１２７】
患者が、骨髄吸引から回復する時間を与えられた後で、ＰＣＩを行う。手術介入の心臓病専門医が、ＰＣＩが上首尾であると決定した場合は、患者を約５分間にわたって、任意の合併症について観察する。もしなければ、幹細胞の移植を、一気に完了させる。約１×１０4〜１×１０5のＣＤ１３３+細胞を、点滴用カテーテルによって、慢性的虚血域への大多数の副行血管に供給する心外膜血管に点滴する。今は完全に閉塞状態の血管によって以前供給を受けていた生存力のある心筋への副行血管の源である心外膜冠動脈は、蛍光透視法により同定される。装置を、インデックスＰＣＩのために末梢血管内に置いた導入器シースを通して通過させる。標的親血管に、点滴カテーテルを用いて、大動脈洞内の適当な冠動脈の小口に配置した誘導カテーテルによって、カニューレ挿入する。規定食塩水の５ｍｌの溶液中のＣＤ１３３+細胞を、３分間にわたる手による注射によって点滴する。更なる２ｍｌの規定食塩水を、残留細胞がカテーテルに蓄積するのを防ぐために、幹細胞溶液の直後にカテーテルによって点滴する。
【０１２８】
幹細胞点滴の最後に、血管の選択した冠動脈の血管造影図を行って、ＴＩＭＩ流を評価し、血管壁の完全性を評価する。この患者を、任意の合併症についての手順の後５分間、心臓カテーテル法ラボラトリーにてモニターする。
【０１２９】
次いで、この患者を、モニターセッティングにて、手順後２４時間観察し、ＥＣＧ及び心臓酵素分析を８、１６及び２４時間で得る。
【０１３０】
この患者の臨床的追跡評価を、その後、７、３０、９０、１８０及び３６５日に行う。ＰＣＩ及び幹細胞点滴治療の成功は、運動能力(例えば、数秒間の全運動持続時間、運動持続時間の変化、狭心症の開始時間、１ｍｍＳＴ下降など)の改善；主要な心臓事象(例えば、死亡、血管再生、狭心症、心筋梗塞後の再入院など)；手順後２４時間以内又は２４時間より後の心筋梗塞(例えば、心臓酵素の上昇、ＥＣＧの変化、ニトログリセリンにより軽減されない胸痛などにより測定)；狭心症の改善；二次的入院の長さ；薬物療法の利用の減少；狭心症の主観的改善；左心室の機能及び駆出率(２Ｄ心臓エコー図により測定)；全虚血領域の、核ストレス試験による初期スクリーニング試験と比較しての改善；及び心筋の、ＰＥＴ走査による初期スクリーニング試験と比較しての生存可能域の改善によって測定される。
【０１３１】
実施例１３
慢性冠状動脈虚血の患者へのＵＣＢ由来のＣＤ１３３+細胞及び骨髄由来ｈＭＳＣ細胞の冠状動脈内点滴
患者を、実施例１２に記載したプロトコールに従って選択してモニターする。一度適格患者の解剖学的構造が測定されれば、その患者をカテーテル法ラボラトリーから出して、知覚鎮静下で骨髄吸引を行う。約１５０〜２５０ｍｌの骨髄吸引物を腸骨稜から取り出す。
【０１３２】
自家ｈＭＳＣを、実施例６に記載した方法に従って骨髄吸引物から分離する。ｈＭＳＣの収率は、約１／１０，０００〜１／１００，０００ＭＮＣである。それ故、約３００〜３，０００のｈＭＳＣが、１５０〜２５０ｍｌの骨髄から得られる。約１４日間の培養の後に、ｈＭＳＣの収率は、約１０4〜１０5であり、モノクローナル抗体ＳＨ２により同定された細胞の純度は、９９％以上である。これらのｈＭＳＣは、緩衝溶液中で洗浄して、５ｍｌの規定食塩水の濃縮溶液中に貯蔵することができる。
【０１３３】
ＣＤ１３３+細胞を、臍帯血から、実施例３に記載した方法に従って、ＣＤ１３３+結合した磁気ビーズで標識した後に磁気カラム(Ａｕｔｏｍａｃｓ，Miltenyi)を通す自動化ソーティングを行うことによって分離する。選択されたＣＤ１３３+細胞を、次いで、緩衝溶液中で洗って、５ｍｌの規定食塩水の濃縮溶液中に貯蔵することができる。これらのＣＤ１３３+細胞は、所望であれば、実施例１２に記載した方法に従って、培養中で拡大させることができる。
【０１３４】
ｈＭＳＣ及びＣＤ１３３+細胞が移植に利用可能な場合には、ＰＣＩをその患者について行う。手術介入の心臓病専門医が、ＰＣＩが上首尾と決定した場合には、その患者を、約５分間、任意の合併症について観察する。何もなければ、幹細胞の移植を、一気に完了する。約１×１０4〜１×１０5の単離されたＵＣＢ由来のＣＤ１３３+細胞を、自家のｈＭＳＣと１：１の比で、点滴用カテーテルにより、慢性的虚血域への副行血管の大部分に供給する心外膜血管に点滴する。今は完全に閉塞した血管によって以前供給を受けていた生存力のある心筋への副行血管の源である心外膜冠状動脈は、螢光透視法により同定される。装置を、インデックスＰＣＩのために、末梢血管内に配置した導入器シースを通して通過させる。標的親血管に、点滴用カテーテルを用いて、大動脈洞内の適当な冠動脈の小口に配置した誘導カテーテルによって、カニューレ挿入する。ＣＤ１３３+細胞及び自家のｈＭＳＣ細胞を、規定食塩水の５ｍｌの溶液で、３分間にわたる手作業による注射によって同時に点滴する。更なる２ｍｌの規定食塩水を、残留細胞がカテーテルに蓄積するのを防ぐために、幹細胞溶液の直後にカテーテルによって点滴する。
【０１３５】
幹細胞点滴の最後に、患者の評価と監視を、実施例１２に記載したように行う。
【０１３６】
実施例１３
最近の研究は、始原単核細胞(ＭＮＣ)の冠動脈内注射は、心筋梗塞を患ったことのある患者に利益をもたらしうることを示した(Strauer B.等、2002. Circulation, 1913-1918; Assmus, B.等、Circulation 2002; 106: 3009-3017)。これらの小さい試みにおいて、治療中の患者は、２億４５００万もの多くの細胞を、３〜３．５ｃｃのボーラスの冠動脈内注射(２５×１０6細胞／ｃｃ)によって受けた。これらの細胞注射に関する合併症は、これらの試みの何れにおいても見られなかった。潜在的合併症には、細胞注射時に心筋梗塞を誘発する可能性が含まれる。細胞注射のときのトロンボゲン状態の誘導の可能性に対する理論的考察が与えられなければならない。このトロンボゲン状態は、正にそれらの細胞の性質又は、増大した細胞対血漿容積比による過粘着性又は微小血管を危険にさらすことから生じた遅い冠動脈血流に対して二次的に生じうる。現在まで、この潜在的な重大な合併症を評価する研究はない。自家の骨髄由来のＭＮＣの冠動脈内注射の安全性の閾値を確立するためにデザインした小動物の研究を行った。
【０１３７】
体重約４０〜５０Ｋｇのヨークシャーブタに、自家の骨髄由来のＭＮＣを、血漿１ｃｃ当たり１．５〜５×１０6の細胞の濃度で冠動脈内注射した。このプロトコールを、ヒトの臨床的試みを真似て確立した。大きさ及び、冠動脈潅流カテーテルを利用する接近の容易さに基づいて、細胞注射のために、第１(Ｄ１)又は第２(Ｄ２)の診断分岐を選択した(下記の図１参照)。冠動脈流量(ＴＩＭＩフレームカウントとして測定)を、細胞注射の前後で記録した。これらの分離した単核細胞を、１〜２分にわたって注射した後で、１ｃｃの塩溶液を冠動脈内にフラッシュした。
【０１３８】
これらの動物を７日間追跡して、冠動脈血管造影を繰り返した後に犠牲にした。それらの心臓を取り出して、１０％ホルマリンを含む緩衝規定食塩水を用いて加圧固定した。これらの心臓を、大きい虚血又は梗塞の証拠について視覚的に検査してから、組織学に送った。
【０１３９】
３匹のブタを、梗塞の証拠について試験した。試験した細胞濃度の何れの肉眼的検査又は組織学においても、心筋梗塞の証拠はなかった。試験した最高濃度(血清３ｃｃ当たり１５×１０6細胞)において、細胞点滴の少し後で記録された冠状動脈流(ＴＩＭＩＩ)の有意の減少があった。ＬＡＤ分布並びに標的の斜め血管(Ｄ１)において緩慢な流れが記録された(図１８)。冠動脈流は、約１０分後に回復した。低下した流れを説明する、細胞注射中又はその後の冠動脈痙攣の視覚的証拠はなかった。
【０１４０】
この記載した説明は、この発明を開示するために及び又、当業者がこの発明を実施して利用することが可能となるように、最適モードを含む実施例を利用している。この発明の特許可能な範囲は、請求の範囲によって規定され、当業者に生じる他の例を包含しうる。かかる他の例は、もしそれらが本願の請求の範囲の言葉と異ならない要素を有するか又は本願の請求の範囲の言葉と僅かしか異ならない同等の要素を含むならば、当該請求の範囲内にあるべきものである。
【図面の簡単な説明】
【０１４１】
【図１】短期内皮駆動培養条件下での臍帯血(ＵＣＢ)由来の内皮前駆細胞ＥＰＣの蛍光細胞化学染色を示している図である。
【図２】ＵＣＢに由来するＥＰＣのフォン ウィルブランド因子(ｖＷＦ)についての染色を示した図である。
【図３】ＵＣＢから選択したＣＤ１３３+細胞の表面表現型のフローサイトメトリー分析を示している図である。
【図４】内皮駆動培養条件における１９日及び１２日の培養後の、ＵＣＢ及びヒトの骨髄(ＢＭ)に由来するＥＰＣ細胞の特徴である内皮細胞の比較のフローサイトメトリー分析を示している図である。
【図５】ＵＣＢ由来の及びＢＭ由来のＥＰＣの、イン・ビボでのマウス後脚虚血モデルへの移植により達成された新血管新生の結果を描いている図である。
【図６】外科手術後の２８日目における虚血の後脚の組織学的評価を示している図である。
【図７】ＵＣＢからのＣＤ１３３+細胞の単離精製の結果を示している図である。
【図８】精製されたＣＤ１３３+細胞における、造血駆動条件又は内皮駆動条件下での２４時間の培養の後の、ＣＤ４５、ＣＤ３４、ＢＣＬ−２及びｐ２１の差次的発現を示している図である。
【図９】培養精製ＣＤ１３３+細胞における細胞周期の分析を示している図である。
【図１０】マウス後脚虚血モデルにおける、精製ＣＤ１３３+細胞に由来するＥＰＣによる新血管新生を描いている図である。
【図１１】ヒトの間充織幹細胞(ｈＭＳＣ)数の、ヒトの臍静脈内皮細胞(ＨＵＶＥＣ)により条件付けした培地中でのインキュベーション後の、投与量応答性の有糸分裂による拡大(Ｂ)、及びＨＵＶＥＣ細胞数の、ｈＭＳＣにより条件付けした培地中でのインキュベーション後の、投与量応答性の有糸分裂による拡大(Ｃ)を示している図である。
【図１２】ｈＭＳＣ(上段)及びＨＵＶＥＣ(下段)のｈＭＳＣ条件付けした培地への移動(左)及びＨＵＶＥＣ(上段)及びｈＭＳＣ(下段)のＨＵＶＥＣ条件付けした培地への移動を示している(右)図である。
【図１３】ｈＭＳＣが、血管内皮成長因子(ＶＥＧＦ)遺伝子を発現することを示している図である。
【図１４】ｈＭＳＣによるＶＥＧＦレセプターｍＲＮＡの発現を示している図である。
【図１５】単独培養又は共存培養したｈＭＳＣ及びＨＵＶＥＣにおける活性なＴＧＦ−ｂ１のＥＬＩＳＡ分析を示している図である。
【図１６】ｈＭＳＣが、選択的に、内皮管様構造へ移動することを示している図である。
【図１７】ＵＣＢに由来する精製したＣＤ１３３+細胞及びＣＤ１３３+細胞＋ｈＭＳＣの組合せによる、マウス後脚虚血モデルにおける新血管新生を描いている図である。
【図１８】ベースライン及びＭＮＣの注射後の、ブタの血管造影図の静止したフレームイメージを示している図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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