(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
多孔質材に少なくとも一の有機汚染物質を分解することが可能な分解菌Ａと、他の一の有機汚染物質を分解することが可能な分解菌Ｂとを集積させた複合分解菌集積保持担体であり、
分解菌ＡがＦＥＲＭＰ−２０５５７として寄託されたノカルディオイデスエスピーＰＤ６５３の有する菌学的性質の一部又は全部の性質を有するＰＣＮＢ分解菌を含む複合分解菌集積保持担体。
【請求項２】
分解菌Ａが１種以上の共生菌と組み合わされた菌群である請求項１記載の複合分解菌集積保持担体。
【請求項３】
分解菌Ｂがシマジン分解菌である請求項１または請求項２記載の複合分解菌集積保持担体。
【請求項４】
分解菌ＢがＦＥＲＭＰ−１９３９５として寄託されたベータプロテオバクテリアＣＤＢ２１の有する菌学的性質の一部又は全部の性質を有する分解菌を含む請求項１〜請求項３何れか１項記載の複合分解菌集積保持担体。
【請求項５】
分解菌Ｂが１種以上の共生菌と組み合わされた菌群である請求項１〜請求項４何れか１項記載の複合分解菌集積保持担体。
【請求項６】
分解菌ＢがＦＥＲＭＰ−１９３９５として寄託されたベータプロテオバクテリアＣＤＢ２１と共生し、トリアジン系農薬に対する分解能向上に寄与するアルスロバクター属に属する細菌を含む請求項１〜請求項５何れか１項記載の複合分解菌集積保持担体。
【請求項７】
前記細菌がＦＥＲＭＰ−２０３７１として寄託されたアルスロバクターエスピーＣＤ７ｗである請求項６記載の複合分解菌集積保持担体。
【請求項８】
吸着定数が分解菌が生息する土壌の吸着定数よりも数十倍以上で且つ１万倍以下であるか、又は比表面積が５０ｍ２ ／ｇ以上で且つ６００ｍ２ ／ｇ以下である多孔質材を用いた請求項１〜請求項７何れか１項記載の複合分解菌集積保持担体。
【請求項９】
分解菌の定着を可能とするサイズの細孔の細孔全体に対する容積比率が１０％以上である多孔質材を用いた請求項１〜請求項８何れか１項記載の複合分解菌集積保持担体。
【請求項１０】
多孔質材が木質炭化素材である請求項１〜請求項９何れか１項記載の複合分解菌集積保持担体。
【請求項１１】
ＰＣＮＢに対する分解能を有しノカルディオイデス属に属するＦＥＲＭＰ−２０５５７として寄託されたノカルディオイデスエスピーＰＤ６５３である細菌。
【請求項１２】
一の有機汚染物質を分解することが可能な分解菌Ａと他の一の有機汚染物質を分解することが可能な分解菌Ｂを、多孔質材が積層した多孔質材層に接種する工程と、
多孔質材層に、前記一の有機汚染物質のみを炭素源及び窒素源とする無機塩培地Ａと、前記他の一の有機汚染物質のみを炭素源及び窒素源とする無機塩培地Ｂとを添加する際に、前記多孔質材中での分解菌Ａと分解菌Ｂの集積速度に応じて、前記各無機塩培地中の各有機汚染物質濃度を調整して各無機塩培地を添加する工程と、
を実行し、分解菌Ａと分解菌Ｂとを前記多孔質材に集積保持させることを特徴とする請求項１〜請求項１０何れか１項記載の複合分解菌集積保持担体を製造する複合分解菌集積保持担体の製造方法。
【請求項１３】
分解菌Ａと分解菌Ｂとの多孔質材中での集積速度に応じて、各無機塩培地中の各有機汚染物質濃度を調整して各無機塩培地を添加する前記工程において、
前記無機塩培地Ａと前記無機塩培地Ｂの何れか一方を多孔質材層に一度に添加し、前記無機塩培地Ａと前記無機塩培地Ｂの何れか他方を多孔質材層に還流して添加する工程とする請求項１２記載の複合分解菌集積保持担体の製造方法。
【請求項１４】
請求項１〜請求項１０何れか１項記載の複合分解菌集積保持単体を用いることを特徴とする汚染環境の浄化方法。
【請求項１５】
請求項１〜請求項１０何れか１項記載の複合分解菌集積保持担体に対して処理対象水を通し、処理対象水中の有機汚染物質を分解除去する汚染環境の浄化方法。
【請求項１６】
請求項１〜請求項１０何れか１項記載の複合分解菌集積保持担体を処理対象土壌中に混和し、処理対象土壌中の有機汚染物質を分解除去する汚染環境の浄化方法。
【請求項１７】
請求項１〜請求項１０何れか１項記載の複合分解菌集積保持担体を含有してなる汚染環境の浄化装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、農耕地土壌や地下水などに含まれる有機汚染物質の分解除去技術に関し、特に、土壌細菌を利用して、複数の有機汚染物質で汚染されている土壌や地下水などから汚染物質を分解除去する技術及び難分解性の有機汚染物質を分解する技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、農耕地土壌等に広く低濃度で分布しているＰＯＰｓ等の難分解性有機汚染物質の分解除去技術として細菌などの微生物の自然分解能力を利用して汚染土壌などを浄化、無害化するバイオレメディエーション技術が注目されている。しかし、これまでのバイオレメディエーション技術は、細菌などの微生物を有効に活用しようとしても、有機汚染物質を有効に分解する分解菌の発見が困難であったり、発見できたとしてもその微生物独自の生存環境が存在するため、自然のままの状態では分解菌の密度が低く、汚染物質が環境中に残留したり拡散するのを効果的に防止するまでには至らなかった。特に、汚染土壌などへの適用を考えた場合、汚染土壌の理化学性の影響を受けたり、汚染土壌中の原生動物からの捕食などにより、分解菌が死滅してしまう問題があった。そのため、バイオレメディエーション技術の有効活用が叫ばれてはいるが、望まれる程には実現されていないのが実情である。
【０００３】
一方、本発明者らは、所定の吸着定数や比表面積を有する多孔質材が、有機汚染物質の分解菌のすみかとして活用することができることや、特定の種類の分解菌を集積、単離する技術を開発してきた（特許第３０３０３７０号公報：特許文献１、特許第２９０４４３２号公報：特許文献２、再表００／０７８９２３号公報：特許文献３参照）。これらの技術によれば、農薬などに用いられるある種の有機汚染物質を分解することができる分解菌を高密度で集積、純化させることにより、土壌などの環境中に残留するこの有機汚染物質を分解除去することを可能とした。
【特許文献１】特許第３０３０３７０号公報
【特許文献２】特許第２９０４４３２号公報
【特許文献３】再表００／０７８９２３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、土壌汚染、水質汚染などの環境汚染は、複数の有機汚染物質が原因となって汚染されている場合が多く、これらの汚染物質を同時に原位置で分解除去する技術は開発されていない。
【０００５】
また、非常に分解されにくい有機塩素系農薬ＰＣＮＢ（キントゼン；ペンタクロロニトロベンゼン）や、半減期が長くまた土壌吸着係数が低いシマジン（２−クロロ−４，６−ビス（エチルアミノ）−１，３，５−トリアジン）などの土壌汚染や水質汚染の原因物質の一つとなる有機汚染物質の分解は困難であり、より効果的に分解する技術が求められている。
【０００６】
そこで本発明は、複数の有機汚染物質に汚染された環境下にあっても、それらの汚染物質を同時に分解することができる安定性のある複合微生物系を得ることを目的としてなされたものである。
【０００７】
また本発明は、特にＰＣＮＢやシマジンなどの難分解性の有機汚染物質をより効果的に分解することを目的としてなされたものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
この目的を達成するために本発明は、多孔質材に少なくとも一の有機汚染物質を分解することが可能な分解菌Ａと、他の一の有機汚染物質を分解することが可能な分解菌Ｂとを集積させた複合分解菌集積保持担体を提供する。
【０００９】
多孔質材に少なくとも一の有機汚染物質を分解することが可能な分解菌Ａと、他の一の有機汚染物質を分解することが可能な分解菌Ｂとを集積させた複合分解菌集積保持担体であるため、２種以上の有機汚染物質を分解除去することができる。ここで、分解菌Ａと分解菌Ｂは異なる種類の分解菌であることを意味する。一の有機汚染物質を分解することが可能な分解菌Ａや他の一の有機汚染物質を分解することが可能な分解菌Ｂは、単独の分解菌とすることが可能であり、また、１種以上の共生菌と組み合わせた菌群でなるものとすることも可能である。この複合分解菌集積保持担体は、汚染土壌中に混和させることにより、または汚染水を通すことにより、トリアジン系農薬や有機塩素系農薬などの有機汚染物質を分解することができる。
【００１０】
そして、前記分解菌ＡをＰＣＮＢ分解菌とすることができ、また、前記分解菌Ｂをシマジン分解菌とすることができる。このようにすれば、少なくともＰＣＮＢ分解菌若しくはシマジン分解菌の一方、または少なくともその両方を多孔質材中に集積させた複合分解菌集積保持担体とすることができ、処理対象物からＰＣＮＢ若しくはシマジン、またはＰＣＮＢとシマジンの両方を分解することが可能である。
【００１１】
さらに、分解菌ＡをノカルディオイデスエスピーＰＤ６５３（Nocardioides sp.  PD653）（以下「ＰＤ６５３」と略記する場合もある）の有する菌学的性質の一部又は全部の性質を有する細菌を含む分解菌とすることができ、また、分解菌ＢをベータプロテオバクテリアＣＤＢ２１（β-Proteobacteria CDB21）の有する菌学的性質の一部又は全部の性質を有する細菌を含む分解菌とすることができる。このようにすれば、少なくともノカルディオイデスエスピーＰＤ６５３若しくはベータプロテオバクテリアＣＤＢ２１の一方、または少なくともその両方を多孔質材中に集積させた複合分解菌集積保持担体とすることができ、処理対象物からＰＣＮＢ若しくはシマジン、またはＰＣＮＢとシマジンの両方を分解することが可能である。
【００１２】
ここで、分解菌Ａを１種以上の共生菌と組み合わされた菌群とすることができ、また、分解菌Ｂを１種以上の共生菌と組み合わされた菌群とすることができる。すなわち、分解菌Ａや分解菌Ｂが単独の細菌である場合だけでなく、複数の菌類を含んでなる菌群とすることができる。そして、分解菌Ａや分解菌Ｂが共生菌と組み合わされた複合微生物系（コンソーシア）を形成すれば、単なる菌群の混合物ではなく、有機汚染物質の分解、資化、及び生育に必須な栄養因子を互いに補完しあう機能を有し、有機汚染物質に対する分解能を高めることができる。
【００１３】
例えば、分解菌ＡをＰＣＮＢ分解菌ＰＤ３（以下「ＰＤ３」と略記する場合もある）とし、また、分解菌Ｂを、シマジン分解菌ＣＤ７（以下「ＣＤ７」と略記する場合もある）かシマジン分解菌２Ｍｉｘ（以下「２Ｍｉｘ」と略記する場合もある）の何れかとすることができる。ここでＰＤ３とは、ノカルディオイデスエスピーＰＤ６５３、バークホルデリアセパシアＫＴＹＹ９７（Burkholderia  cepacia  KTYY97）（以下「ＫＴＹＹ９７」と略記する場合もある）、及びその他の複数の細菌群を含んでなるコンソーシアであり、ＣＤ７とは、ベータプロテオバクテリアＣＤＢ２１（β-Proteobacteria CDB21）（以下「ＣＤＢ２１」と略記する場合もある）、ブラディリゾビウムジャポニカムＣＳＢ１（Bradyrhizobium  japonicum CSB1）（以下「ＣＳＢ１」と略記する場合もある）、及びアルスロバクターエスピーＣＤ７ｗ（Arthrobacter  sp.  CD7w）（以下「ＣＤ７ｗ」と略記する場合もある）を含んでなるコンソーシアであり、２Ｍｉｘとは、ベータプロテオバクテリアＣＤＢ２１とブラディリゾビウムジャポニカムＣＳＢ１とを含んでなるコンソーシアである。
【００１４】
本発明で用いる多孔質材は、吸着定数が分解菌が生息する土壌の吸着定数よりも数十倍以上で且つ１万倍以下であるか、又は比表面積が５０ｍ２ ／ｇ以上で且つ６００ｍ２ ／ｇ以下である多孔質材とすることができる。多孔質材の吸着定数が分解菌が生息する土壌の吸着定数よりも数十倍以上で且つ１万倍以下であるか、又は比表面積が５０ｍ２ ／ｇ以上で且つ６００ｍ２ ／ｇ以下であれば、分解菌が利用しやすい形態に資化材が吸着されやすく、担体への分解菌の安定的な集積が可能となる。
【００１５】
また、本発明で用いる多孔質材は、分解菌の定着を可能とするサイズの細孔の細孔全体に対する容積比率が１０％以上とすることができる。分解菌の定着を可能とするサイズの細孔の細孔全体に対する容積比率が１０％以上である多孔質材とすれば、分解菌の繁殖が容易で、また、安定的な生育が可能となるからである。この条件を満たすためには、２μｍ〜５０μｍ、より好ましくは５μｍ〜２０μｍの大きさの細孔が容積比率で１０％以上あることが好ましい。
【００１６】
多孔質材は木質炭化素材とすることができる。木質炭化素材とすれば、分解菌が住み着きやすく、安定的な繁殖、生育が可能だからである。
【００１７】
また、本発明は、有機塩素系農薬ＰＣＮＢを効果的に分解する細菌を提供する。この細菌は、ノカルディオイデス属に属する細菌であり、配列番号１に記載の塩基配列を含む１６Ｓ  ｒＲＮＡ（１６ＳリボソームＲＮＡ）遺伝子を有し、独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センターにＦＥＲＭＰ−２０５５７として寄託されたノカルディオイデス属に属するノカルディオイデスエスピーＰＤ６５３や、このノカルディオイデスエスピーＰＤ６５３の有する菌学的性質の一部又は全部の性質を有する細菌を含む。これらの細菌によれば、ＰＣＮＢを実効的に完全分解することができる。
【００１８】
また、本発明は、トリアジン系農薬、特にシマジンを効果的に分解するベータプロテオバクテリアＣＤＢ２１（ＦＥＲＭＰ−１９３９５）と共生する細菌で、トリアジン系農薬、特にシマジンに対する分解能向上に寄与するアルスロバクター属に属する細菌であり、配列番号２に記載の塩基配列を含む１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を有し、独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センターにＦＥＲＭＰ−２０３７１として寄託されたアルスロバクターエスピーＣＤ７ｗや、このアルスロバクターエスピーＣＤ７ｗの有する菌学的性質の一部又は全部の性質を有する細菌を含む。これらの細菌によれば、シマジン分解菌ベータプロテオバクテリアＣＤＢ２１などと共生してコンソーシアとして機能し、多孔質材への親和性を高めて、シマジン分解菌群の多孔質材への集積を高めることができる。これにより、ベータプロテオバクテリアＣＤＢ２１だけの場合に比べてトリアジン系農薬、特にシマジンの分解能を高める事が可能となる。
【００１９】
さらに本発明は、一の有機汚染物質を分解することが可能な分解菌Ａと他の一の有機汚染物質を分解することが可能な分解菌Ｂを、多孔質材が積層した多孔質材層に接種する工程と、多孔質材層に、前記一の有機汚染物質のみを炭素源及び窒素源とする無機塩培地Ａと、前記他の一の有機汚染物質のみを炭素源及び窒素源とする無機塩培地Ｂとを添加する際に、前記多孔質材中での分解菌Ａと分解菌Ｂの集積速度に応じて、前記各無機塩培地中の各有機汚染物質濃度を調整して各無機塩培地を添加する工程と、を実行し、分解菌Ａと分解菌Ｂとを前記多孔質材に集積保持させることを特徴とする複合分解菌集積保持担体の製造方法を提供する。
【００２０】
一の有機汚染物質を分解することが可能な分解菌Ａと他の一の有機汚染物質を分解することが可能な分解菌Ｂを、多孔質材が積層した多孔質材層に接種する工程と、多孔質材層に、前記一の有機汚染物質のみを炭素源及び窒素源とする無機塩培地Ａと、前記他の一の有機汚染物質のみを炭素源及び窒素源とする無機塩培地Ｂとを添加する際に、前記多孔質材中での分解菌Ａと分解菌Ｂの集積速度に応じて、前記各無機塩培地中の各有機汚染物質濃度を調整して各無機塩培地を添加する工程と、を実行し、分解菌Ａと分解菌Ｂとを前記多孔質材に集積保持させることとしたため、分解菌Ａと分解菌Ｂの生育速度が異なっていても、多孔質材中に所要量の分解菌Ａと分解菌Ｂとを担持させることができる。
【００２１】
より具体的には、分解菌Ａと分解菌Ｂとの多孔質材中での集積速度に応じて、各無機塩培地中の各有機汚染物質濃度を調整して各無機塩培地を添加する前記工程について、前記無機塩培地Ａと前記無機塩培地Ｂの何れか一方を多孔質材層に一度に添加し、前記無機塩培地Ａと前記無機塩培地Ｂの何れか他方を多孔質材層に還流して添加する工程とする複合分解菌集積保持担体の製造方法とすることができる。
【００２２】
分解菌Ａと分解菌Ｂとの多孔質材中での集積速度に応じて、各無機塩培地中の各有機汚染物質濃度を調整して各無機塩培地を添加する前記工程について、前記無機塩培地Ａと前記無機塩培地Ｂの何れか一方を多孔質材層に一度に添加し、前記無機塩培地Ａと前記無機塩培地Ｂの何れか他方を多孔質材層に還流して添加したため、例えば、生育の早い分解菌Ｂの資化材となる無機塩培地Ｂは還流液を通じて供給し、生育の遅い分解菌Ａの資化材となる無機塩培地Ａは最初に一度に多孔質材に添加することで、生育の早い分解菌だけがニッチ（分解菌のすみか）を占有することなく、生育の遅い分解菌も十分に繁殖させて生育させることができる。そのため、分解菌Ａと分解菌Ｂの両者を所要量共存させた複合分解菌集積保持担体を得ることができる。なおここで生育速度とは、多孔質材中での菌類の生育や増殖の速度をいうものとする。
【００２３】
そして、前記分解菌ＡをＰＣＮＢ分解菌とすることができ、前記分解菌Ｂをシマジン分解菌とすることができる。このようにすれば、ＰＣＮＢ分解菌とシマジン分解菌の両者を所要量多孔質材中に保持させた複合分解菌集積保持担体とすることができる。
【００２４】
さらに、分解菌ＡをノカルディオイデスエスピーＰＤ６５３の有する菌学的性質の一部又は全部の性質を有する分解菌を含む分解菌とし、分解菌ＢをベータプロテオバクテリアＣＤＢ２１の有する菌学的性質の一部又は全部の性質を有する分解菌を含む分解菌とした複合分解菌集積保持担体の製造方法とすることができる。このようにすれば、ノカルディオイデスエスピーＰＤ６５３の有する菌学的性質の一部又は全部の性質を有する細菌とベータプロテオバクテリアＣＤＢ２１の有する菌学的性質の一部又は全部の性質を有する細菌の両者を必要量多孔質材中に保持させた複合分解菌集積保持担体とすることができる。
【００２５】
ここで、分解菌Ａや分解菌Ｂは、単独の分解菌とすることが可能であり、また、１種以上の共生菌と組み合わされた菌群とすることができる。１種以上の共生菌と組み合わされたコンソーシアを形成すれば、単なる菌群の混合物ではなく、有機汚染物質の分解、資化、及び生育に必須な栄養因子を互いに補完しあう機能を有し、有機汚染物質に対する分解能が高い複合分解菌集積保持担体を製造することができる。
【００２６】
具体的には、例えば、ＰＣＮＢ分解菌がノカルディオイデスエスピーＰＤ６５３とその共生菌であるバークホルデリアセパシアＫＴＹＹ９７、その他の細菌群からなる分解菌であるＰＣＮＢ分解菌ＰＤ３であり、シマジン分解菌がベータプロテオバクテリアＣＤＢ２１とその共生菌であるブラディリゾビウムジャポニカムＣＳＢ１、アルスロバクターエスピーＣＤ７ｗの３種を含む細菌群であるシマジン分解菌ＣＤ７か、または、シマジン分解菌がベータプロテオバクテリアＣＤＢ２１とその共生菌であるブラディリゾビウムジャポニカムＣＳＢ１の２種を含む細菌群であるシマジン分解菌２Ｍｉｘのいずれかであるものとすることができる。
【００２７】
また本発明は、多孔質材に少なくとも一の有機汚染物質を分解する分解菌Ａと、他の一の有機汚染物質を分解する分解菌Ｂとを集積させた複合分解菌集積保持担体を用いることを特徴とする汚染環境の浄化方法を提供する。
【００２８】
多孔質材に少なくとも一の有機汚染物質を分解する分解菌Ａと、他の一の有機汚染物質を分解する分解菌Ｂとを集積させた複合分解菌集積保持担体を用いたため、少なくとも２以上の有機汚染物質の分解除去が可能となり、汚染環境を浄化することができる。
【００２９】
そして、一の有機汚染物質を分解する分解菌ＡをＰＣＮＢ分解菌、他の一の有機汚染物質を分解する分解菌をシマジン分解菌とすることができ、さらに、分解菌ＡがノカルディオイデスエスピーＰＤ６５３や、その細菌の有する菌学的性質の一部又は全部の性質を有する細菌、分解菌ＢがベータプロテオバクテリアＣＤＢ２１や、その細菌の有する菌学的性質の一部又は全部の性質を有する細菌とした汚染環境の浄化方法とすることができる。
【００３０】
また、分解菌Ａを１種以上の共生菌と組み合わされた菌群とすることができ、また、分解菌Ｂを１種以上の共生菌と組み合わされた菌群とした汚染環境の浄化方法とすることができる。すなわち、分解菌Ａや分解菌Ｂが単独の細菌である場合だけでなく、複数の菌類を含んでなる菌群とすることができる。そして、分解菌Ａや分解菌Ｂが共生菌と組み合わされた複合微生物系（コンソーシア）を形成すれば、単なる菌群の混合物ではなく、有機汚染物質の分解、資化、及び生育に必須な栄養因子を互いに補完しあう機能を有し、有機汚染物質に対する分解能を高めた汚染環境の浄化方法とすることができる。
【００３１】
分解菌ＡをＰＣＮＢ分解菌、分解菌Ｂをシマジン分解菌とすれば少なくとも有機汚染物質であるＰＣＮＢとシマジンとを分解することができる。また、分解菌ＡがノカルディオイデスエスピーＰＤ６５３やその細菌の有する菌学的性質の一部又は全部の性質を有する細菌、若しくはＰＣＮＢ分解菌ＰＤ３、分解菌ＢがベータプロテオバクテリアＣＤＢ２１やその細菌の有する菌学的性質の一部又は全部の性質を有する細菌、若しくはシマジン分解菌ＣＤ７や２Ｍｉｘとすれば、ＰＣＮＢとシマジンとをほぼ完全に９０％以上分解できるだけでなく、ＰＣＰ（ペンタクロロフェノール）やＨＣＢ（ヘキサクロロベンゼン）などの有機塩素系汚染物質やアトラジン（２−クロロ−４−エチルアミノ−６−イソプロピルアミノ−１，３，５−トリアジン）などのトリアジン系有機汚染物質をも分解することができる。
【００３２】
さらに本発明は、複合分解菌集積保持担体に対して処理対象水を通し、処理対象水中の有機汚染物質を分解除去する汚染環境の浄化方法を提供する。
【００３３】
複合分解菌集積保持担体に対して、有機汚染物質を含有する処理対象水を通すこととしたため、処理対象水中の有機汚染物質が複合分解菌集積保持担体に集積した分解菌によって分解除去され、処理対象水中の浄化を行うことができる。したがって、処理対象水を複合分解菌集積保持担体に通す簡単な処理を行うだけで汚染された処理対象水を浄化することができる。
【００３４】
さらにまた本発明は、複合分解菌集積保持担体を処理対象土壌中に混和して、処理対象土壌中の有機汚染物質を分解除去する汚染環境の浄化方法を提供する。
【００３５】
複合分解菌集積保持担体を処理対象土壌中に混和したため、雨水などにより土壌中に含まれる有機汚染物質が複合分解菌集積保持担体に運ばれて分解される。そのため、有機汚染物質に汚染された土壌中に複合分解菌集積保持担体を混和するという簡単な処理を行うだけで、汚染土壌中の有機汚染物質を分解除去して汚染土壌を浄化することができる。
【００３６】
そして本発明は、複合分解菌集積保持担体を含有してなる汚染環境の浄化装置を提供する。この汚染環境の浄化装置によれば、複合分解菌集積保持担体を含有するため、有機汚染物質の分解除去を容易に行うことができ、汚染環境を浄化することができる。
【発明の効果】
【００３７】
本発明の複合分解菌集積保持担体によれば、汚染された土壌や地下水などに含まれる複数の有機汚染物質を同時に分解することができ、その分解能力を安定的に持続させることができる。
【００３８】
本発明の細菌によれば、難分解性のＰＣＮＢやシマジンの完全分解に寄与することができる。
【００３９】
本発明の複合分解菌集積保持担体の製造方法によれば、多孔質材に異なる有機汚染物質を分解することが可能な２種類以上の分解菌を集積保持した複合分解菌集積保持担体を簡単に製造することができる。
【００４０】
本発明の汚染環境の浄化方法や汚染環境の浄化装置によれば、複雑な処理工程が不要で簡単に二種以上の有機汚染物質を分解除去して汚染環境を浄化することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４１】
本発明の複合分解菌集積保持担体や細菌について以下に詳しく説明する。本発明でいう「複合分解菌集積保持担体」とは、多孔質材中に分解を目的とする有機汚染物質を分解する２種類以上の分解菌を高密度に集積させたものである。
【００４２】
以下に複合分解菌集積保持担体に用いられる担体と分解菌について説明する。
【００４３】
担体：
【００４４】
有機汚染物質を分解する分解菌を保持する担体となるのは、この分解菌のすみかとなるマイクロハビタットである。マイクロハビタットは、多数の細孔、高い吸着係数を有し、分解菌が入り込むことができる有効表面積の大きな多孔質材を選択することができる。すなわち、比表面積では、好ましくは５０ｍ２／ｇ〜６００ｍ２／ｇであり、細孔の大きさでは、好ましくは２μｍ〜５０μｍ、より好ましくは５μｍ〜２０μｍである。そして、このような大きさの細孔が細孔全体に対して容積比率で１０％以上あることが好ましい。このような多孔質材としては、木質炭化素材などを挙げることができる。本発明者が開発した木質炭化素材Ａ（広葉樹を５００℃で通常焼成した木質炭化素材の５ｍｍ〜１０ｍｍ砕片であり、ｐＨが８、比表面積が１００ｍ２ ／ｇ、直径５μｍ〜２０μｍの細孔の容積が全細孔容積の１０％以上、特許第２９０４４３２号明細書に記載がある）などは優れたマイクロハビタットである。木質炭化素材は２ｍｍ〜１５ｍｍ程度の大きさに砕片化して用いることが好ましい。なお、活性炭のような炭化物は分解菌のすみかとして適切ではなく、一時的には有機汚染物質の吸着が可能であるけれどもすぐに吸着飽和に達してしまい交換の必要性が生じる。そのため、長期間の安定的な使用に耐えうるものではない。
【００４５】
分解菌：
【００４６】
特定の種類の有機汚染物質を分解する分解菌を利用することができる。このような分解菌には遺伝子組み換え技術を利用して得た分解能の増強された分解菌や新たに作出された分解菌を利用することもできるが、組み換え微生物の野外放出の安全性評価に関しては今でも研究や議論が続けられており、パブリックアクセプタンスも得にくい状況にある。
【００４７】
一方、本発明者らの提案している改良した土壌還流法に基づき得られた分解菌を用いることは好ましい。この方法により得られた分解菌は土壌に生息する分解菌であり、安全性に対する問題は少ないからである。改良した土壌還流法は、集積させるべき分解菌が生息する土壌にマイクロハビタットとなる多孔質材を混和させて集積用土壌層を形成し、この分解菌が分解する有機汚染物質のみを炭素源、窒素源とする無機塩培地を所定日数還流させ、次に、この集積用土壌層からマイクロハビタットを取り出し、別に用意したマイクロハビタットに接種してマイクロハビタットだけによる集積用層を形成し、この集積用層に対して改めてこの分解菌が分解する有機汚染物質のみを炭素源、窒素源とする無機塩培地を還流させて、多孔質材中に目的の分解菌を集積させるものである。また、これらの方法以外の方法により土壌より採取された分解菌を用いることも可能である。
【００４８】
改良した土壌還流法に基づいて多孔質材中に集積させた分解菌の単離は、希釈平板法などにより行うことができる。例えば、分解菌が集積済みの多孔質材を粉砕し、リン酸緩衝液で適当に希釈し、所定の有機汚染物質を高濃度に含む寒天培地にこの希釈液を接種して培養する。平板培地中に生じたクリアゾーンから釣菌し、さらに新たな上記寒天培地に接種し培養する。このようにして所望の分解菌コロニーを単離する。
【００４９】
具体的な分解菌として、次の分解菌を挙げることができる。
【００５０】
ＰＣＮＢ分解菌ＰＤ３：  ＰＣＮＢ分解菌ＰＤ３は、ノカルディオイデスエスピーＰＤ６５３（Nocardioides sp.  PD653）と、バークホルデリアセパシアＫＴＹＹ９７（Burkholderia  cepacia  KTYY97）、その他の複数細菌の複合系からなる細菌群である。
【００５１】
ＰＣＮＢ分解菌ＰＤ３からのＰＤ６５３、ＫＴＹＹ９７、その他の細菌群の単離は、ＰＤ３のコロニーから、これをＰＣＮＢを含むＲ２Ａ寒天培地平板に接種し、単コロニー分離を行う一方、得られたコロニーの一部はチューブ培養を行って系統を得る。最後にフラスコ培養して単離する。
【００５２】
ノカルディオイデスエスピーＰＤ６５３は、本発明者らによって発見された新規な細菌であり、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにＦＥＲＭＰ−２０５５７（受領番号ＦＥＲＭＡＰ−２０５５７）として寄託されている。ＰＣＮＢに対する分解能を有し、種の定まっていないノカルディオイデス属に属する。
【００５３】
ＰＤ６５３は次の菌学的性質を有する。培養条件は、Ｒ２Ａ寒天培地、３０℃にて３〜７日、好気培養を行う。形態的特徴は、胞子形成は無く、上記培養３日で直径１．０ｍｍ、淡黄色、円形、半レンズ状隆起状態、全縁スムーズで不透明、バター様の粘稠度を有するコロニーを形成する。変異や培養条件、生理的状態によるコロニー形態の変化は認められない。細胞形態は、大きさ０．７〜０．８×１．０〜１．２μｍ程度の桿菌であり、運動性なし、グラム染色：−である。生理的性質は、カタラーゼ：＋、オキシダーゼ：−、酸／ガス産生（グルコース）：−／−、Ｏ／Ｆテスト（グルコース）：−／−、ＧＣ含量：７０．８％である（＋：陽性、−：陰性）。
【００５４】
ＰＤ６５３菌株の表現形質による分類学的性質に基づき、Bergey’s  Manual  of Systematic  Bacteriology,  Vol.1,  N.R.  Krieg,  J.G.  Holt  (ed.),  Williams  &  Wilkins,  Baltimore  (1984)を参考に分類・同定を行ったが、ＰＤ６５３と類似の性状を示す分類群を絞り込むには至らなかった。
【００５５】
次いで本ＰＤ６５３菌株の１６Ｓ  ｒＲＮＡの部分塩基配列に基づく分子系統解析を行った結果、ＰＤ６５３の１６Ｓ  ｒＲＮＡの塩基配列のうち連続した１４８７塩基を決定し、ＦＡＳＴＡとＢＬＡＳＴを用いてDNAデータベース（GenBank/DDBJ/EMBL）に対して相同性検索をしたところ、種の定まっていないNocardioides  sp.  OS4と最も高い相同性９７．１%を示した。この結果は表現形質による分類学的性質とほぼ矛盾がないことから、ＰＤ６５３をノカルディオイデスエスピー（Nocardioides sp.）と帰属した。上記１４８７塩基を配列番号１とした配列表に示す。
【００５６】
有機汚染物質に対するＰＤ６５３の有する分解能を調べるため、０．０１％トリプトンを含む培地に初期濃度１０ｐｐｍのＰＣＮＢを添加し、ＰＤ６５３を３０℃、暗所、１２０ｒｐｍで振とう培養し、生じた塩素イオン濃度を測定した。ＰＣＮＢが分解されればそれに伴って塩素イオンが生じるので、塩素イオン濃度はＰＣＮＢ分解の尺度となる。この条件で４日間振とう培養したところ、４．５ｐｐｍの塩素イオンが生じた。また、１０ｐｐｍに代えて初期濃度を２５ｐｐｍとしてＰＣＮＢを添加し、同様の条件で１６日間振とう培養したところ、１３．３ｐｐｍの塩素イオンが生じた。このようにＰＤ６５３は、単独でＰＣＮＢに対する分解能を有している。また、ＰＣＮＢに代えて初期濃度５ｐｐｍのＨＣＢを添加して、同様の条件で１６日間振とう培養すると、４．０ｐｐｍの塩素イオンが生じた。このことから、ＰＤ６５３は、単独でＨＣＢに対する分解能も有していることがわかる。
【００５７】
一方、バークホルデリアセパシアＫＴＹＹ９７はＦＥＲＭＰ−１６８０９として寄託された後、国際寄託に移管され、独立行政法人 産業技術総合研究所（旧通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所）にＦＥＲＭＢＰ−６７２１として寄託されている。この細菌に対する詳細は、特許第２９０４４３２号に記載されている。
【００５８】
ＰＣＮＢ分解菌ＰＤ３は、ＰＤ６５３やＫＴＹＹ９７などの複数の細菌が複合してコンソーシアを形成している。多孔質材に、ＰＤ６５３とＫＴＹＹ９７、ＰＤ６５３のみをそれぞれ集積させた分解菌集積保持担体に、初期濃度６ｐｐｍのＰＣＮＢアセトン溶液を加えて、２５℃、暗所、１２０ｒｐｍで振とう培養したときの経過日数ごとの塩素イオン濃度の変化を図１に示した。ＰＤ６５３はＰＣＮＢ分解能を有するが、図１からわかるように、少なくともＫＴＹＹ９７と組み合わせると、ＰＣＮＢがより多く分解することがわかる。
【００５９】
ＰＣＮＢ分解能を有するＰＤ６５３などとともにコンソーシアを構成することができる共生菌としては、ＫＴＹＹ９７の他、メチロバクテリウムエスピーＰ４、ミクロバクテリウムエスピーＰ４２、カウロバクターエスピーＰ４３などが挙げられが、これら以外にも分解菌の生育補助やＰＣＮＢ分解を促進する能力を有する細菌が挙げられる。
【００６０】
上述のＰＣＮＢ分解菌ＰＤ３を構成するＰＤ６５３やＫＴＹＹ９７は、改良した土壌還流法を用いて集積し単離したものであるが、これらに限定されるものではなく、ＰＤ６５３は、ノカルディオイデス属に属する細菌であって、ＰＣＮＢ分解能を有する細菌、または、ＰＤ６５３の菌学的特徴の一部又は全部を有する細菌とすることができ、ＫＴＹＹ９７は、バークホルデリア属に属する細菌であって、ＫＴＹＹ９７の菌学的特徴の一部又は全部を有する細菌とすることができる。
【００６１】
シマジン分解菌ＣＤ７：  シマジン分解菌ＣＤ７は、ベータプロテオバクテリアＣＤＢ２１（β-Proteobacteria CDB21）、ブラディリゾビウムジャポニカムＣＳＢ１（Bradyrhizobium  japonicum CSB1）、アルスロバクターエスピーＣＤ７ｗ（Arthrobacter  sp.  CD7w）の３種複合系からなる細菌群である。
【００６２】
シマジン分解菌ＣＤ７からのＣＤＢ２１、ＣＳＢ１及びＣＤ７ｗの単離は、ＣＤ７のコロニーから、これをシマジンを含むバクトトリプトン寒天培地平板に接種し、単コロニー分離を行う。ＣＤＢ２１、ＣＳＢ１及びＣＤ７ｗは、それぞれ形態の異なる３種のコロニーとして得ることができる。
【００６３】
ベータプロテオバクテリアＣＤＢ２１は、いかなる既知の属種にも帰属しないベータプロテオバクテリアに属する本発明者らによって発見された新規な細菌であり、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにＦＥＲＭＰ−１９３９５として寄託されている。シマジン分解菌ＣＤ７の有するシマジン分解能はＣＤＢ２１のみが保有している。
【００６４】
ブラディリゾビウムジャポニカムＣＳＢ１は、ブラディリゾビウムジャポニカムの範疇に属し、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにＦＥＲＭＰ−１９３９４として寄託された細菌である。
【００６５】
アルスロバクターエスピーＣＤ７ｗも、新規な細菌であり独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにＦＥＲＭＰ−２０３７１（受領番号ＦＥＲＭＡＰ−２０３７１）として寄託された細菌である。
【００６６】
ＣＤ７ｗは、次に示す菌学的性質を示す細菌である。培養条件は、ＮＡ培地、３０℃にて２〜３日、好気培養を行う。形態的特徴は、胞子形成は無く、上記培養２日で直径１〜３ｍｍ、淡黄色、円形、半レンズ状隆起状態、全縁スムーズで不透明、バター様の粘稠度を有するコロニーを形成する。変異や培養条件、生理的状態によるコロニー形態の変化は認められない。細胞形態は、大きさ０．８×１．２μｍ程度の桿菌であり、運動性あり、グラム染色：＋である。生理的性質は、カタラーゼ：＋、オキシダーゼ：−、Ｏ／Ｆテスト：−、硝酸還元：−、ピラジナミダーゼ：＋、ピロリドニルアリルアミダーゼ：−、アルカリフォスファターゼ：−、β−グルクロニダーゼ：−、β−ガラクトシダーゼ：−、Ｎ−アセチル−β−グルコサミニダーゼ：−、エスクリン（グルコシダーゼ）：＋、ウレアーゼ：−、ゼラチンの液化：＋、炭水化物の発酵性はブドウ糖：−、リボース：−、キシロース：−、マンニトール：−、マルトース：−、乳糖：−、白糖：＋、グリコーゲン：−である（＋：陽性、−：陰性）。
【００６７】
CＤ７ｗの表現形質による分類学的性質に基づき、Bergey’s  Manual  of  Systematic  Bacteriology,  Vol.1,  N.R.  Krieg,  J.G.  Holt  (ed.),  Williams  &  Wilkins,  Baltimore  (1984)及びBergey’s  Manual  of  Determinative  Bacteriology  (9th  ed.),  J.G.  Holt,  N.R.  Krieg,  P.H.A.  Sneath,  J.T.  Staley,  S.T.  Williams  (ed.),  Williams  &  Wilkins,  Baltimore  (1994)を参考に分類・同定を行った結果、ＣＤ７ｗはアルスロバクター（Arthrobacter）属と判断された。
【００６８】
また、ＣＤ７ｗについて１６Ｓ  ｒＲＮＡの塩基配列に基づく分子系統解析を行い、ＣＤ７ｗの１６Ｓ  ｒＲＮＡの塩基配列のうち連続した８３１塩基を決定し、ＦＡＳＴＡ及びＢＬＡＳＴを用いてDNAデータベース（GenBank/DDBJ/EMBL）に対して相同性検索をしたところ、種の定まっていないArthrobacter  sp.  Ellin146と最も高い相同性９９．９%を示した。そして、ＣＤ７ｗをアルスロバクターエスピー（Arthrobacter sp.）と帰属した。上記８３１塩基を配列番号２とした配列表に示す。
【００６９】
ＣＤＢ２１、ＣＳＢ１、ＣＤ７ｗの何れも単独ではシマジンを唯一の炭素源、窒素源とする無機塩培地で生育しにくく、明確なコロニーを形成しない。これらの組合せでは、少なくともＣＤＢ２１とＣＳＢ１を組み合わせたときにコロニーが出現する。したがって、シマジン分解菌ＣＤ７は、単なる細菌の混合物ではなく、シマジンの分解、資化と生育に必須な栄養因子を互いに補完しあう機能をもったコンソーシアを形成している。
【００７０】
シマジン分解菌ＣＤ７の多孔質材中の存在を調べると、そのうち、ＣＤ７ｗは、多孔質材の表面にはほとんど存在せず、内部に高度に集積する。そのため、ＣＤ７ｗは、ＣＤＢ２１などとのコンソーシアにおいて、ＣＤＢ２１などだけでは不足する多孔質材への親和性を高め、多孔質材中に高密度で集積する機能を有しているものと考えられる。
【００７１】
シマジン分解能を有するＣＤＢ２１などとともにコンソーシアを構成することができる共生菌としては、ＣＳＢ１などのブラディリゾビウムジャポニカムや、ＣＤ７ｗなどのアルスロバクテリアの他、ロドコッカスロドクラウス、ステノトロフォモナスマルトフィリア、ノカルディオイデスジェンセニ、ノカルディオイデスフルヴス、ノカルディオイデスシンプレックス、シュードモナスエルギノーサなどが挙げられが、これら以外にも分解菌の生育補助やシマジン分解を促進する能力を有する細菌が挙げられる。
【００７２】
上述のシマジン分解菌ＣＤ７を構成するＣＤＢ２１、ＣＳＢ１、ＣＤ７ｗは、改良した土壌還流法を用いて集積し単離したものであるが、これらに限定されるものではなく、ＣＤＢ２１は、ベータプロテオバクテリアに属する細菌であって、シマジン分解能を有する細菌、または、ＣＤＢ２１の菌学的特徴の一部又は全部を有する細菌とすることができ、ＣＳＢ１は、ブラディリゾビウムジャポニカムに属する細菌であって、ＣＳＢ１の菌学的特徴の一部又は全部を有する細菌とすることができ、さらに、ＣＤ７ｗは、アルスロバクターに属する細菌であって、シマジンの分解や共生菌の生育を補助する能力を有し、ＣＤ７ｗの菌学的特徴の一部又は全部を有する細菌とすることができる。
【００７３】
シマジン分解菌２Ｍｉｘ：  シマジン分解菌２Ｍｉｘは、ベータプロテオバクテリアＣＤＢ２１とブラディリゾビウムジャポニカムＣＳＢ１の２種複合系からなる細菌群であり、シマジン分解菌ＣＤ７から、ＣＤ７ｗを欠いたシマジン分解菌である。シマジン分解菌２Ｍｉｘは、ＣＤ７ｗを欠くもののシマジン分解能を有し、シマジン分解菌としての機能を発揮する。
【００７４】
複合分解菌集積保持担体の製造方法：
【００７５】
次に、上記の多孔質材と分解菌を用いた本発明の複合分解菌集積保持担体の製造方法について説明する。例えば図２に示した還流装置１の焼結ガラスフィルター２上に、マイクロハビタットととなる多孔質材３を充てんして滅菌処理を行っておく。この多孔質材３には、集積すべき分解菌のうち生育が遅い分解菌の資化物となる有機汚染物質のみを溶かして添加する。次に、集積すべき一の分解菌と、他の一の分解菌をこの多孔質材３に接種する。その後、集積すべき分解菌のうち生育が早い分解菌の資化物となる有機汚染物質のみを唯一の炭素源、窒素源とする無機塩培地４を適当期間還流する。還流は、多孔質材３が乾くことなく、また無機塩培地４が多孔質材３からあふれることがない程度に、多孔質材３中を定常量の無機塩培地４で循環させるものである。この還流液は１週間に１度程度の頻度で新しいものに交換することが好ましい。また、還流液の交換の際には、生育が遅い分解菌の資化物となる有機汚染物質も還流開始時と同じように多孔質材３に添加する。この有機汚染物質の添加と還流とを繰り返すことで目的の複合分解菌集積保持担体を得る。なお、複合分解菌集積保持担体の製造方法は、本装置を用いて行うものに限定されず、有機汚染物質の添加と還流を繰り返すことができる装置であれば良い。
【００７６】
汚染環境の浄化方法：
【００７７】
有機汚染物質によって汚染された環境を複合分解菌集積保持担体を用いて浄化するには次のような利用法が挙げられる。
【００７８】
汚染土壌における有機汚染物質の除去に関しては、本発明の複合分解菌集積保持担体を汚染土壌中に埋設して混和する利用法がある。土壌中に埋設しておくことで、既に含まれている有機汚染物質は雨水などとともに移動（拡散、移行）して複合分解菌集積保持担体に吸着されるとともに分解菌によって分解される。また、新たに散布等される有機汚染物質も複合分解菌集積保持担体に吸着されて同様に分解され、土壌中への残留や拡散が防止される。この方法によれば、土壌中の有機汚染物質が地下水に混入することも避けられ、地下水汚染の防止も図ることが可能となる。この技術の応用として、環境汚染物質等の存在する表層及び下層土壌への混入、ゴルフ場のグリーン面の下層土壌への混入、産業破棄物処理場の下層土壌への混入、工場等における有機廃液置き場の下層土壌への混入などにより、有機汚染物質の処理を行うことができる。
【００７９】
また、本発明の複合分解菌集積保持担体を通気性のある筐体内に詰め込むなどして担体集積層を形成すれば簡単にバイオリアクターとして、有機汚染物質の分解除去装置とすることができ、該装置を、生活排水路、水田地帯の農業排水路、ゴルフ場の排水路などの水路の一部に設けることにより、水中に溶解、分散した有機汚染物質を分解除去し、汚染環境を浄化することができる。また、流出油汚染などの緊急の場合には本発明の複合分解菌集積保持担体を汚染地帯に直接散布して適用することも考えられる。
【実施例】
【００８０】
以下に実施例を用いて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこの実施例に限定されるものではない。
【００８１】
１．分解菌集積保持担体の製造：
【００８２】
ＰＤ３とＣＤ７が担持された複合分解菌集積保持担体：  マイクロハビタットとなる木質炭化素材Ａ（広葉樹を５００℃で通常焼成した木質炭化素材の５ｍｍ〜１０ｍｍ砕片であり、ｐＨが８、比表面積が１００ｍ２ ／ｇ、直径５μｍ〜２０μｍの細孔の容積が全細孔容積の１０％以上、特許第２９０４４３２号明細書に記載がある）３を図２に示した還流装置１に約７．５ｇ充てんし、超純水で洗浄後滅菌処理を行った。この多孔質材３に３０００ｐｐｍＰＣＮＢアセトン溶液０．５ｍｌを添加後、ＰＣＮＢ分解菌ＰＤ３と、シマジン分解菌ＣＤ７を、２コロニーずつ接種した。そして、５ｐｐｍシマジン無機塩培地(リン酸２アンモニウム，リン酸２カリウム，リン酸１ナトリウム，硫酸マグネシウムなどを含む培液)４３００ｍｌを２５℃で還流した。この還流液は１週間に１度新たなものに交換し、還流液の交換の際には改めて３０００ｐｐｍＰＣＮＢアセトン溶液０．５ｍｌを多孔質材３に添加した。還流は３週間行った。このようにして木質炭化素材Ａ３中にＰＣＮＢ分解菌ＰＤ３とシマジン分解菌ＣＤ７が集積した本発明の複合分解菌集積保持担体を得た。
【００８３】
ＰＣＮＢ分解菌ＰＤ３の資化材となるＰＣＮＢは、アセトンに溶解した全量を最初に多孔質材中に直接添加するのに対し、シマジン分解菌ＣＤ７の資化材となるシマジンは、低濃度（５ｐｐｍ）で無機塩培地に含有させて還流させることで与えている。このように、ＰＣＮＢもシマジンも多孔質材に与える量は同量であるが、その投与法を変えているのは、ＰＣＮＢ分解菌ＰＤ３と、シマジン分解菌ＣＤ７との生育速度が異なるためである。このように資化材の投与法を変えることによって、ＰＣＮＢ分解菌ＰＤ３もシマジン分解菌ＣＤ７も、ともに必要量が木質炭化素材Ａに担持された複合分解菌集積保持担体が得られる。ところが、もし仮に、ＰＣＮＢとシマジンを一度に多孔質材に投与すれば、生育速度の速いシマジン分解菌ＣＤ７が多孔質材を独占し、生育速度の遅いＰＣＮＢ分解菌ＰＤ３の集積がほとんど見られなくなってしまう。シマジンを無機塩培地に溶かして還流させることによって、多孔質材への吸着の速度を制御して、シマジン分解菌ＣＤ７の集積を遅らせているのである。
【００８４】
ＰＤ３と２Ｍｉｘが担持された複合分解菌集積保持担体：  ＰＣＮＢ分解菌ＰＤ３とシマジン分解菌２Ｍｉｘとの複合微生物系が構築された複合分解菌集積保持担体の製造を行った。上記ＰＤ３とＣＤ７の複合分解菌集積保持担体の製造において、ＣＤ７に代えて２Ｍｉｘを用いる以外は同様にして、ＰＤ３と２Ｍｉｘが担持された複合分解菌集積保持担体を得た。
【００８５】
ＰＤ３、ＣＤ７、２Ｍｉｘがそれぞれ単独で担持された分解菌集積保持担体：  ＰＣＮＢ分解菌ＰＤ３、シマジン分解菌ＣＤ７、シマジン分解菌２Ｍｉｘがそれぞれ単独で集積した分解菌集積保持担体（以下「単独区」という。）を製造した。単独区の製造も上記ＰＤ３とＣＤ７の複合分解菌集積保持担体の製造と同様に行うが、多孔質材に接種するのは集積目的の分解菌のみを２コロニーとし、目的の分解菌の資化材のみを提供するようにした。即ち、還流前の３０００ｐｐｍＰＣＮＢアセトン溶液の添加は行わず、ＰＣＮＢ分解菌ＰＤ３の製造の場合はＰＣＮＢ５ｐｐｍ無機塩培地３００ｍｌのみを還流し、シマジン分解菌ＣＤ７や２Ｍｉｘの場合は５ｐｐｍシマジン無機塩培地３００ｍｌのみを還流して分解菌を集積させた。
【００８６】
得られた分解菌集積保持担体に対して以下に示す確認、評価を行った。
【００８７】
２．多孔質材中への分解菌の集積状況の確認〔図３〜図５〕：
【００８８】
多孔質材中への分解菌の集積状況を確認するために、ＰＣＮＢやシマジンの分解産物である塩素イオン濃度の測定を還流の開始から終了までの間で行った。還流日数に対する塩素イオン濃度を図３に示す。一方、ＰＣＮＢ濃度とシマジン濃度の測定も行った。ＰＣＮＢの消失状況を図４に、シマジンの消失状況を図５にそれぞれ示す。ＰＣＮＢとシマジンが完全に分解した場合の塩素イオン濃度は３．９ｐｐｍであることから、図４や図５で示すように、２週間〜３週間も還流を行えばＰＣＮＢやシマジンがほぼ完全に分解していることがわかる。細菌の成育環境や、他の細菌との競合の場合におけるニッチの獲得、共役代謝、共存の可能性などはその細菌固有の問題であるが、ＰＣＮＢ分解菌ＰＤ３やシマジン分解菌ＣＤ７、２Ｍｉｘは、ＰＣＮＢやシマジンを分解するのに十分な程度に多孔質材中に集積していることがわかる。これは、ＰＣＮＢやシマジンの消失状況からも裏付けられる。
【００８９】
３．多孔質材中へ集積した分解菌の菌数の評価〔図６、図７〕：
【００９０】
複合分解菌集積保持担体に集積した分解菌の分解菌数の評価も行った。複合分解菌集積保持担体中に集積する分解菌数の評価は、還流操作終了後の多孔質材を２ｇ取り出し、リン酸緩衝液１８ｍｌを加え、２分間超音波処理して木質炭化素材Ａの表面に付着した分解菌を木質炭化素材Ａから除去し、液から木質炭化素材Ａを取り出して「１０１希釈液」を得る。一方、取り出した木質炭化素材Ａをすりつぶし、粉砕物１．０ｇにリン酸緩衝液９ｍｌを加え、３０分間振とうした後、１分間超音波処理して「１０１希釈液」を得る。各々の１０倍希釈液を適宜さらに希釈して、５段階の希釈液を得る。その各希釈液から１ｍｌずつを取り出し、５ｐｐｍシマジン無機塩培地、５ｐｐｍＰＣＮＢ無機塩培地の入った各試験管５本、合計１０本にそれぞれ加える。そして、これらを２５℃で２週間培養した後、塩素イオン濃度を測定した。０．５ｐｐｍ以上のものを「＋」とし、ＭＰＮ法により、木質炭化素材Ａの表面と内部の分解菌数を各々測定した。
【００９１】
各種分解菌を担持させた各種複合分解菌集積保持担体の表面、内部におけるＰＣＮＢ分解菌の菌数を図６に、シマジン分解菌の菌数を図７にそれぞれ示す。上記測定より、分解菌数レベルは、１０４ＣＦＵ／ｇ乾物〜１０７ＣＦＵ／ｇ乾物であることが分かる。また、各分解菌は、多孔質材表面（素材表面）よりも多孔質材内部（素材内部）の方がより高密度で集積していることがわかる。
【００９２】
４．有機汚染物質に対する分解能の評価（１）〔図８〜図１１〕：
【００９３】
複合分解菌集積保持担体に汚染水を通して浄化する方法を想定し、各種有機汚染物質に対する複合分解菌集積保持担体の分解能を次のようにして評価した。まず、図２で示した還流装置１を用意した。そして、複合分解菌集積保持担体６．２５ｇ（乾物２．５ｇ相当）を還流装置１に充填し、シマジン：５ｐｐｍ、アトラジン：５ｐｐｍ、ＰＣＰ：２．５ｐｐｍ、ＨＣＢ：２．５ｐｐｍを含む無機塩培地１５０ｍｌを還流液として複合分解菌集積保持担体に還流した。還流液は１週おきに交換して合計３週間還流し、還流液中の各種有機汚染物質濃度と塩素イオン濃度を測定することで複合分解菌集積保持担体の有機汚染物質分解能を評価した。
【００９４】
還流日数と塩素イオン濃度との関係を図８に示す。また、還流日数に対するシマジン濃度、アトラジン濃度、ＰＣＰ濃度の関係を図９〜図１１にそれぞれ示す。
【００９５】
ＰＤ３とＣＤ７や２Ｍｉｘの複合系でなる複合分解菌集積保持担体は、各種有機汚染物質の濃度の低下から、シマジン、アトラジン、ＰＣＰが分解されていることがわかる。なお、ＨＣＢについては還流装置１で用いた焼結ガラスフィルター２に吸着されてしまうため、分解能を十分に評価することができなかったが、少なくとも分解能を有していることはわかる。
【００９６】
各種有機汚染物質の濃度の低下から、単独区の場合に比較して複合分解菌集積保持担体の場合の方が、多孔質材中の分解菌数は１／１００〜１／１０程度に減少することがわかる。しかしながら、各種有機汚染物質の分解結果から、有機汚染物質の分解能は十分である。特にＰＤ３とＣＤ７を担持させた複合分解菌集積保持担体（以下「ＰＤ３／ＣＤ７保持担体」ともいう）とＰＤ３と２Ｍｉｘを担持させた複合分解菌集積保持担体（以下「ＰＤ３／２Ｍｉｘ保持担体」ともいう）は、ＰＣＮＢとシマジンを共に９０％以上分解し、ＰＣＮＢとシマジン以外の有機汚染物質であるアトラジンやＰＣＰも９０％以上分解する。
【００９７】
なお、ＰＤ３／２Ｍｉｘ保持担体をＰＤ３／ＣＤ７保持担体と比較すると、塩素イオンの生成量の差から、ＰＤ３／ＣＤ７保持担体の方が、ＰＤ３／２Ｍｉｘ保持担体よりも高密度で分解菌が集積していることがわかる。
【００９８】
５．有機汚染物質に対する分解能の評価（２）〔表１、図１２、図１３〕：
【００９９】
土壌中に複合分解菌集積保持担体を混和して汚染土壌を浄化する方法を想定し、各種有機汚染物質に対する複合分解菌集積保持担体の分解能を上記（１）とは別に評価した。シマジン（ＳＩ）：５ｐｐｍ、アトラジン（ＡＴ）：５ｐｐｍ、ＰＣＰ：５ｐｐｍ、ＨＣＢ：５ｐｐｍを混和した畑土壌８０ｇ（土性：Ｌ、ｐＨ：６．２、Ｔ−Ｃ：０．９％、乾土５９．６ｇ相当）と複合分解菌集積保持担体１５ｇ（乾物６．０ｇ相当）を混和し、カラム（５φ×７．５ｃｍ）に充てんした。２５℃で４週間静置し、その間、１週間に１度１５〜３０ｍｌ散水し、浸透水を採取し、各薬剤濃度を測定した。また、４週間後（試験終了後）の土壌と複合分解菌集積保持担体中の各薬剤濃度と、複合分解菌集積保持担体の表面と内部の各分解菌数を上記の方法と同様にしてＭＰＮ法で測定した。結果を表１、図１２、及び図１３に示す。
【０１００】
【表１】
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【０１０１】
表１からわかるように、ＰＤ３とＣＤ７の複合分解菌集積保持担体、ＰＤ３と２Ｍｉｘの複合分解菌集積保持担体はともに、シマジン、アトラジン、ＰＣＰに対して土壌中で７５％程度の非常に高い分解除去能を示した。しかし、ＨＣＢに対しては５０％程度に低下した。この原因は、ＨＣＢの水溶解度が０．００５ｐｐｍで他の薬剤と比べ極端に低いため、水の移行・拡散に伴って多孔質材に吸着される量が３５％程度低下するため（対照区参照）だと考えられる。また、図１２、図１３から、ＰＣＮＢ分解菌ＰＤ３もシマジン分解菌ＣＤ７も、土壌埋設後の菌数は、土壌に埋設する前に比べて殆ど変化がなく高密度で集積しており、実質的な菌数の減少は起こっていないことがわかる。また、多孔質材表面（素材表面）よりも多孔質材内部（素材内部）の方がより高密度で分解菌が集積していることがわかる。さらに、ＣＤ７ｗを含むＣＤ７を集積させた多孔質材の方が、ＣＤ７ｗを含まない２Ｍｉｘを集積させた多孔質材よりも、多孔質材内部における総菌数が多く、ＣＤ７ｗが多孔質材内部への集積を高めていることがわかる。
【０１０２】
６．多孔質材への分解菌の集積〔図１４〕：
【０１０３】
土壌に混和する前と後とでの各種複合分解菌集積保持担体から、先に示した方法と同様にしてリン酸緩衝液での１０１希釈液とし、菌体および多孔質材を遠心により集めた。多孔質材表面試料はFastDNAkit  (Qbiogene社）を用い、多孔質材内部試料(約０．３ｇ）は１２５μＬのSuperBlock  (PIERCE社)を加えFastDNAkit  for  SOIL  (Qbiogene社）を用いてDNAを抽出した。抽出DNAに対してMuyzer法によりＰＣＲ−ＤＧＧＥを行い、多孔質材への分解菌の集積と変遷を検討・解析した。
【０１０４】
図１４で示すように、ＰＣＲ−ＤＧＧＥにより多孔質材へのＰＣＮＢ分解菌ＰＤ３を構成するＰＤ６５３、シマジン分解菌ＣＤ７を構成するＣＤＢ２１、ＣＳＢ１、ＣＤ７ｗの集積が確認された。ＰＤ６５３の存在比は少ないがＰＣＮＢの分解には十分な量であると考えられる。ＣＤ７ｗは、多孔質材表面には殆ど存在せず、多孔質材内部に高度に集積されていることが明らかとなった。これより、細菌群の多孔質材への親和性を高めているものと考えられる。複合分解菌集積保持担体を土壌に混和する前後で集積した細菌群の構成に変化はなく、土壌細菌の多孔質材への付着、侵入は認められなかった。
【図面の簡単な説明】
【０１０５】
【図１】ＰＣＮＢ分解菌の培養日数と塩素イオン濃度の関係を示すグラフ図である。
【図２】還流装置の外観図である。
【図３】分解菌集積保持担体製造時における還流日数と塩素イオン濃度との関係を示すグラフ図である。
【図４】分解菌集積保持担体製造時における還流日数とＰＣＮＢ濃度との関係を示すグラフ図である。
【図５】分解菌集積保持担体製造時における還流日数とシマジン濃度との関係を示すグラフ図である。
【図６】分解菌集積保持担体に集積したＰＣＮＢ分解菌の菌数を示すグラフ図である。
【図７】分解菌集積保持担体に集積したシマジン分解菌の菌数を示すグラフ図である。
【図８】分解菌集積保持担体に有機汚染物質を還流した際の還流日数と塩素イオン濃度との関係を示すグラフ図である。
【図９】分解菌集積保持担体に有機汚染物質を還流した際の還流日数とシマジン濃度との関係を示すグラフ図である。
【図１０】分解菌集積保持担体に有機汚染物質を還流した際の還流日数とアトラジン濃度との関係を示すグラフ図である。
【図１１】分解菌集積保持担体に有機汚染物質を還流した際の還流日数とＰＣＰ濃度との関係を示すグラフ図である。
【図１２】有機汚染物質分解試験前後のＰＣＮＢ分解菌の菌数を示すグラフ図である。
【図１３】有機汚染物質分解試験前後のシマジン分解菌の菌数を示すグラフ図である。
【図１４】ＰＣＲ−ＤＧＧＥによる複合分解菌集積保持担体中の構成細菌を示す図である。
【符号の説明】
【０１０６】
１    還流装置
２    焼結ガラスフィルター
３    多孔質材
４    無機塩培地（還流液）
Ｐ    ポンプ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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