(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌ−バリンをコリネバクテリウム属（Corynebacteriumgenus）に属する微生物により製造する方法において、コリネバクテリウム属に属する微生物中でのジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（ilvD）遺伝子発現を強化すること、およびＬ−イソロイシンの合成に関与する酵素スレオニンデヒドラターゼ（ilvA) の活性をスレオニンデヒドラターゼ（ilvA）遺伝子の欠失により弱めるか又は排除することを特徴とする、上記製造方法。
【請求項２】
更に、コリネバクテリウム属に属する微生物中でのアセトヒドロキシ酸シンターゼ・イソメロリダクターゼ（ilvBNC）遺伝子発現を強化する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（ilvD）遺伝子発現又はアセトヒドロキシ酸シンターゼ・イソメロリダクターゼ・ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（ilvBNCD）遺伝子発現を遺伝子複写数の増加によって強化する、請求項１または２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
遺伝子複写数を増加させるために、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（ilvD）遺伝子又はアセトヒドロキシ酸シンターゼ・イソメロリダクターゼ・ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（ilvBNCD）遺伝子を遺伝子構造中に取り込む、請求項３記載の方法。
【請求項５】
コリネバクテリウム属に属する微生物をジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（ilvD）遺伝子又はアセトヒドロキシ酸シンターゼ・イソメロリダクターゼ・ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（ilvBNCD）遺伝子を有する遺伝子構造で形質転換する、請求項４記載の方法。
【請求項６】
微生物としてコリネバクテリウムグルタミクム（Corynebacterium glutamicum) を使用する、請求項５記載の方法。
【請求項７】
酵素ケトパントアートヒドロキシメチルトランスフェラーゼ(pan B) 及び酵素パントセナートリガーゼ(Pantothenatligase）（pan C)の活性を、ケトパントアートヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（panB）及びパントセナートリガーゼ（panC）遺伝子の欠失により弱めるか又は排除する、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
アセトヒドロキシ酸シンターゼ・イソメロリダクターゼ・ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（ilvBNCD）遺伝子を有する遺伝子構造で形質転換されたコリネバクテリウム属に属する微生物において、酵素ケトパントアートヒドロキシメチルトランスフェラーゼ(pan B) 及び酵素パントセナートリガーゼ（pan C)の活性を、ケトパントアートヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（panB）及びパントセナートリガーゼ（panC）遺伝子の欠失により弱めるか又は除き、そして、Ｌ−イソロイシンの合成に関与する酵素スレオニンデヒドラターゼ（ilv A)の活性をスレオニンデヒドラターゼ（ilvA）遺伝子の欠失により弱めるか又は排除することを特徴とする、上記微生物。
【請求項９】
コリネバクテリウムグルタミクムである、請求項８記載の形質転換された微生物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、請求項１〜１３に記載されたＬ−バリンの微生物による製造方法及び請求項１４〜１７に記載された、上記方法に使用可能な、形質転換された細胞又は微生物に関する。
【０００２】
アミノ酸Ｌ−バリンは、動物飼料、人間の食料及び薬品に使用される、商業上重要な生成物である。したがってＬ−バリンの改良製造方法を提供することに共通の関心が集まっている。
【０００３】
バリンは、化学合成によって又はバイオテクノロジーにより適当な栄養溶液中で適当な微生物の醗酵によって製造することができる。微生物によるバイオテクノロジー製造の利点は、正確な立体異性体形、すなわちＤ−バリン不含のバリンのＬ型の産生にある。
【０００４】
異なる種の微生物、たとえば大腸菌（Escherichia coli),セラチアマルセッセンス(Serratia marcescens),コリネバクテリウムグルタミクム(Corynebacterium glutamicum), ブレビバクテリウムフラバム (Brevibactrium flavum) 又はブレビバクテリウムラクロフェルメンタム (Brevibacterium lactofermentum)はグルコース含有栄養培地中でL-バリンを産生することができる。米国特許第５６５８７６６号明細書に、大腸菌においてアミノアシル−ｔＲＮＡ合成での突然変異によってＬ−バリンの産生を増加させることができることが開示されている。さらに国際特許出願公開（ＷＯ）第９６０６９２６号明細書に、リポン酸栄養要求（Liponsauere-Auxotrophie)によって、大腸菌を用いてＬ−バリンの産生を増加させることができることが開示されている。ヨーロッパ特許公開第０６９４６１４（Ａ１）号公報には、α−ケト酪酸に対して耐性を有し、グルコース含有栄養培地中でＬ−バリン、Ｌ−イソロイシン又はＬ−ロイシンを産生する大腸菌株が記載されている。
【０００５】
ヨーロッパ特許第０４７７０００号明細書に、コリネバクテリウム又はブレビバクテリウムの突然変異生成によって及びバリン耐性への選択によってＬ−バリン産生を改良することができることが開示されている。この明細書中にも、種々のピルバート同族体、たとえばβ−フルオロピルバート、β−クロロピルバート、β−メルカプトピルバート又はトリメチルピルバートに対する耐性への選択によって改良されたＬ−バリン産生を得ることができることが開示されている。Nakayama等(Nakayama 等、1961, J. Gen. Appl. Microbiol. Jpn) から、間接的な突然変異により導かれた栄養要求が改良されたＬ−バリン蓄積を生じることができることは公知である。
【０００６】
更に、ヨーロッパ特許公開第０３５６７３９（Ａ１）号公報に、アセトヒドロキシ酸シンターゼ（ilvBN,図１も参照）をコードするＤＮＡ領域をプラスミドｐＡＪ２２０Ｖ３を用いて増幅する場合、Ｌ−バリンの産生は改善されることが記載されている。
【０００７】
したがって、本発明の課題は、特にコリネ型菌を用いてＬ−バリンを微生物により製造するための新規方法を提供することにある。
【０００８】
この課題は本発明によれば、微生物中でのジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（ilvD-)活性及び（又は）ilvD- 遺伝子発現を強化することによって解決される。この代わりに又はこれと組み合わせて、微生物中でのアセトヒドロキシ酸シンターゼ（ilvBN-) 活性及びイソメロリダクターゼ（ilvC-)活性及び（又は）ilvBNC- 遺伝子発現を強化する。本発明の方法によれば、Ｌ−バリン産生を減少させる物質代謝経路に関与する、少なくとも１種の酵素の活性を弱めるか又は排除する微生物を付加的に使用することができる。したがって本発明の方法の場合、スレオニンデヒドラターゼ（ilvA) 遺伝子の不完全突然変異(Defektmutation)を有する微生物及び（又は）パントセナート合成の遺伝子１個又はそれ以上の不完全突然変異を有する微生物を使用するのが好ましい。
【０００９】
“バリン”又は“Ｌ−バリン”なる用語は、請求される本発明の範囲において遊離酸ばかりでなく、その塩、たとえばそのカルシウム塩、そのナトリウム塩、そのアンモニウム塩又はカリウム塩も意味する。
【００１０】
“強化”なる用語は上記酵素ilvD,ilvB,ilvN及びilvCの細胞内活性の増加を表わす。酵素活性を増加させるために、特に微生物中での内因性活性を高める。酵素活性の増加はたとえば触媒中心の変化によって、基質反応が高められて行われるか又は酵素阻害剤の作用を妨害することで達成される。また増加された酵素活性は、酵素合成の増加によって、たとえば遺伝子増幅によって又はバイオ合成を抑制するファクターの排除によって引き起こすことができる。内因性酵素活性を本発明によれば対応する内因性遺伝子の突然変異によって増加させるのが好ましい。このような突然変異は古典的方法、たとえばＵＶ照射又は突然変異を引き起こす化学物質によって間接的に発生させることができるか又は遺伝子工学法、たとえば欠失、挿入及び（又は）ヌクレオチド交換によって生じる。
【００１１】
遺伝子発現の強化は本発明によれば遺伝子複写数の増加によって行われるのが好ましい。さらに遺伝子１個又はそれ以上を、遺伝子構造中に組み込むか又は好ましくは遺伝子を配置する調節遺伝子配列───これは特に遺伝子発現を強化する────を含むベクター中に組み込む。ついで微生物、好ましくはコリネバクテリウムグルタミクムを対応する遺伝子構造で形質転換させる。
【００１２】
バリンバイオ合成遺伝子ilvDの強化された発現によって、酵素ジヒドロキシ酸ヒドロキシデヒドラターゼをコードするコリネバクテリウムグルタミクムからより一層改良された方法でＬ−バリンが産生されることが確認された。本発明によればこれらの遺伝子の強化された発現と共に、酵素アセトキシヒドロキシ酸シンターゼをコードするilvBN 遺伝子及び酵素イソメロリダクターゼをコードするilvC遺伝子の強化された発現が、コリネバクテリウムグルタミクム中で改良されたＬ−バリン産生を生じさせる。Ｌ−バリン産生の別の改良は、コリネバクテリウムグルタミクム中ですべての上記遺伝子の過発現によって得られる。遺伝子又は遺伝子構造は宿主微生物において種々の複写数を有するプラスミド中に存在するか又は染色体中に組み込まれ、そして増幅されてよい。
【００１３】
遺伝子発現の別の増加は───その代わりに又は遺伝子複写数の増加と組み合わせて────遺伝子発現に積極的に影響を与える調節ファクターの増大によって生じさせることができる。したがって調節因子（element)の増加は転写領域上で行うことができる。その際特別の増大された転写シグナルが使用される。構造遺伝子の上流で見出されるプロモーター領域及び調節領域を突然変異させることができる。同様な方法で、構造遺伝子の上流に組み込まれる発現カセットを生じさせる。誘発可能なプロモターによって発現を醗酵によるＬ−バリン産生の間に更に増加させることができる。しかし、たとえばｍ−ＲＮＡの安定性が改善されるので、それと共に翻訳の増大も可能である。更に、高い活性を有する対応する酵素をコードする遺伝子を使用することができる。あるいは当該遺伝子の過発現を培地組成の変化及び培養操作によって得ることができる。当業者にとって、このことは文献、特にMartin等 (Bio/Technology 5, 137-146 (1987)), Guerrero 等 (Gene 138, 35-41(1994)), Tsuchiya及び Morinaga (Bio/Technology ６, 420-430 (1988)),Eismanns等 (Gene 102, 93-98(1991)), ヨーロッパ特許第０４７２８６９号明細書、米国特許第４６０１８９３号明細書、Schwarzer 及びPuehler (Bio/Technology ９, 84-87 (1991)), Reinscheid 等 (Applied and Enviromental Microbiology 60, 126-132 (1994)), LaBarre等 (Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993))及び国際特許出願（ＷＯ）第９６／１５２４６号明細書から明らかである。
【００１４】
遺伝子発現の増加に関して、同様に上記操作のすべての考えられる組み合わせが可能である。
【００１５】
本発明の方法で使用することができる微生物はグルコース、サッカロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、メラース（Melasse)、デンプン、セルロースから又はグリセリン及びエタノールからＬ−バリンを産生することができる。これはグラム陽性菌、たとえばバチルス属、又はすでに述べたコリネバクテリウム属又はアルスロバクターである。コリネバクテリウム属はすでに種コリネバクテリウムグルタミクムが挙げられ、この種は当業者にその能力に関してアミノ酸を産生することで知られている。この種に野生型株、たとえばＢ．コリネバクテリウムグルタミクムＡＴＣＣ１３０３２、ブレビバクテリウムフラバム（Brevibacterium flavum)ＡＴＣＣ１４０６７、ブレビバクテリウムラクトフェルメンタム  (Brevibacterium lactofermentum) ＡＴＣＣ１３８９６、ブレビバクテリウムチオゲニタリス  (Brevibacterium thiogenitalis)ＡＴＣＣ１９２４０、コリネバクテリウムメラセコラ  (Corynebacterium melassecola) ＡＴＣＣ１７９６５等々が属する。
【００１６】
コリネバクテリウムグルタミクムの遺伝子ilvD又はその他の遺伝子の単離のために、先ず遺伝子バンクに保存する。遺伝子バンクの保存(Anlegen) は一般に公知の手引き書及びハンドブックに開示されている。例としてWinnacker ：Gene and Klone,Eine Einfuerung in die Gentechnologie (出版社Chemie,Weinheim,ドイツ、1990) の手引き書又はSambrook等：Molecular Cloning, A laboratory Mannual ( Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)の手引き書が挙げられる。公知の遺伝子バンクは大腸菌Ｋ−１２株３１１０であり、これはKohara等(Cell 50, 495-508(1987))によれば、λ−ベクター中に保存される。Bathe 等(Molecular and General Genetics, 252:255-265,1996)には、 Cosmidvektors SuperCos I (Wahl 等, 1987, Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 84: 2160-2164) を用いて大腸菌Ｋ−１２  ＮＭ５５４（Raleigh 等, 1988, Nucleic Acids Research 16: 1563-1575) 中に保存されたコリネバクテリウム  グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２の遺伝子バンクが記載されている。大腸菌中にコリネバクテリウム  グルタクムの遺伝子バンクを調製するために、プラスミド、たとえばｐＢＲ３２２（Bolivar, Life Sciences, 25, 807-818(1979))又はｐＵＣ１９(Norrander等、1983, Gene, 26:101-106) を使用することができる。コリネバクテリウム  グルタミクム中にコリネバクテリウム  グルタミクムの遺伝子バンクを調製するために、プラシミド、たとえばｐＪＣ１(Cremer 等,Mol. Gen.Genet. (1990) 220:3221-3229)又はｐＥＣＭ２(Jaeger 等, Bacteriol. (1992) 174: 5462-5465) を使用することができる。宿主として特に制限−及び組み換え欠損のある菌株が適当である。このような例は、Grant 等(Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 87 (1990) 4645-4649)に記載された大腸菌株ＤＨ５αｍｃｒ又はLiebel (FEMS Lett (1989) 65: 299-304) によって単離されたコリネバクテリウム  グルタミクム株Ｒ１２７である。
【００１７】
ついで遺伝子バンクは形質転換（Hanahan, Journal of Molecular Biology 166, 557-580 1983)によって又はエレクトロポレーション(Tauch等, 1994, FEMS Microbiological Letters, 123: 343-347) によって指示菌株中に組み込まれる。指菌示株は、これが関心のある遺伝子中に検出可能な表現型、たとえば栄養要求変異を引き起こす突然変異を有することで優れている。指示菌株又は突然変異体は公表された原産生物（Quelle) 又は菌株コレクションから入手できるか又は場合により調製されなければならない。本発明によれば、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼをコードするilvD遺伝子が欠損してるコリネバクテリウム  グルタミクム突然変異体Ｒ１２７／７を単離する。指示菌株、たとえばilvD突然変異体R127/7を、関心のある遺伝子、たとえばilvD遺伝子を有する組み換えプラスミドを用いて形質転換し、発現させた後、指示菌株は対応する性質、たとえばL-バリン欠乏について原栄養性(prototroph)になる。
【００１８】
このように単離された遺伝子又はＤＮＡフラグメントは、Sanger等(Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 74:5463-5467 1977)に記載された配列の特定化によって特徴づけられる。ついでデータバンク、たとえばGenBank (Benson 等、1998, Nuleic Acids Research, 26:1-7)に保存される公知の遺伝子との同一性の度合を公表された方法で分析することができる（Altschul等、1990, Journal of Molecular Biology 215: 403-410)。
【００１９】
この方法で、遺伝子ilvDをコードする、コリネバクテリウム  グルタミクムのＤＮＡ配列が得られる。これは本発明のＳＥＱＩＤＮＯ１構成要素として示される。更に、上記の方法で存在するＤＮＡ配列から対応する酵素のアミノ酸配列が導かれる。ＳＥＱＩＤＮＯ２においてilvD遺伝子生成物の生じたアミノ酸配列は、すなわちシヒドロキシ酸デヒドラターゼである。
【００２０】
ついでこのように特徴づけられた遺伝子は、単独で又はその他の遺伝子と組合わせて適当な微生物中で発現させることができる。公知の方法は、発現又は過発現すべき遺伝子を、いずれにせよ発現シグナルを供与することができるプラスミドベクターによって増幅させることにある。プラスミドベクターとして対応する微生物中で複製することができるベクターが顧慮される。コリネバクテリウム  グルタミクムに関して、たとえばベクターｐＥＫＥ×１（Eikmanns等、Gene 102: 93-98(1991))又はｐＺ８−１（ヨーロッパ特許第０３７５８８９号明細書）又はｐＥＫＥ×２（Eikmanns等、Microbiology 140: 1817-1828 (1994)) 又はｐＥＣＭ２（Jaeger等、Journal of Bacteriology 174(16):5462-5465 (1992)) が顧慮される。このようなプラスミドの例は、ｐJC1ilvD 、ｐECM ３ilvBNCD 、及びｐJC1ilvBNCDである。このプラスミドは遺伝子ilvD又は遺伝子ilvDと遺伝子ilvB、ilvN及びilvCと共に有する、大腸菌／コリネバクテリウム  グルタミクムペンデルベクター（Pendelvector) である。
【００２１】
更に、本発明者は遺伝子の強化が単独で又は遺伝子ilvB、ilvN及びilvCと組み合わせて、アミノ酸 L- イソロイシンの還元合成を示す微生物中で有利に生じることを見出した。この還元合成はＬ−イソロイシンに特異的な酵素スレオニンデヒドラターゼをコードするｉｌｖＡ遺伝子の欠失によって得ることができる。
【００２２】
欠失を管理された組み換えＤＮＡ技術によって行うことができる。この方法によってたとえばスレオニンデヒドラターゼをコードするｉｌｖＡ遺伝子を染色体中で欠失させることができる。これに適する方法はSchaefer等（Gene(1994)145:69-73)又はLink等(Journal of Bacteriology (1998) 179:6228-6237)に記載されている。遺伝子の一部だけを欠失させるか又はスレオニンデヒドラターゼ遺伝子の突然変異したフラグメントを交換することもできる。欠失によってスレオニンデヒドラターゼ活性の損失が得られる。このような突然変異体の例は、ilvA遺伝子に欠失があるコリネバクテリウムグルタミクム株ＡＴＣＣ１３０３２ΔilvAである。
【００２３】
更に、本発明者は微生物中での遺伝子ilvD、ilvB、ilvN及びilvCの強化がD-パントセナートの減少合成との更なる組み合わせで、好ましくはilvA遺伝子の更なる欠失との組み合わせで、たとえばpanB- 及びpanC- 遺伝子中で欠失させることによってL-バリン産生を有利に生じさせることを見出した。減少されたD −パントセナート合成は、対応するバイオ合成酵素又はその活性の減衰又は排除によって達成することができる。このことに関して、たとえば酵素ケトパントエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（EC２．１．２．１１）、ケトパントエートリダクターゼ、パントセナトリガーゼ（EC６．３．２．１）及びアスパルタートデカルボキシラーゼ（EC４．１．１．１１）が顧慮される。酵素及びその活性を排除又は減衰することができるのは突然変異生成法である。
【００２４】
これには化学試剤、たとえばＮ−メチル−Ｎ−ニトロ−Ｎ−ニトログアニジン又はUV照射を突然変異生成に使用する間接的方法が、同時に引き続きのパントセナートを必要とする所望の微生物の検査と共に含まれる。突然変異誘発又は突然変異体検査のための方法は、一般に公知であり、特にMiller ( A Short Course in Bacterial Genetics, A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria (Cold Spring Harbor Laboratory  Press, 1992)) 又はハンドブック“Manual of Methods for General Bacteriology”der American Society for Bacteriology ( ワシントン D.C. 、USA 、１９８１）に記載されている。
【００２５】
更に、これには直接的組み換えDNA 技術が含まれる。この方法によってたとえばケトパントエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼ、パントセナトリガーゼ、ケトパントイン酸リダクターゼ又はアスパルタートデカルボキシラーゼをコードする遺伝子panB、panC、panE及びpanDを単独で又は一緒に染色体中で欠失させることができる。これに適する方法はSchaefer等 (Gene (1994) 145: 69-73) 又は更にLink等 ( Journal of Bactrioloy (1998) 179: 6228-6237) に記載されている。遺伝子の一部のみが欠失されるか又はケトパントエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼ、パントセナトリガーゼ、ケトパントイン酸リダクターゼ又はアスパルタートデカルボキシラーゼの突然変異されたフラグメントを交換することができる。欠失又は交換によって各酵素活性の欠損又は減少が得られる。このような突然変異生成の例は、panBC オペロン中で欠失があるコリネバクテリウム  グルタミクム ATCC １３０３１ΔpanBC である。
【００２６】
本発明により調製される微生物を、連続的に又は非連続的にバッチ法（バッチ培養）又はフェド・バッチ（流加法）であるいは反復フェド・バッチ法（反復流加法）でＬ−バリン産生のために培養する。公知の培養法についての要約はChmielの手引き書(Bioprozesstechnik 1. Einfuehrung indie Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991) 又はStorhas の手引書 (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/ Wiesbaden, 1994) に記載されている。
【００２７】
使用すべき培地は適当な方法で各微生物の要求をかなえねばならない。種々の微生物の培地の説明は“Manual of Methods for General Bacteriology”der American Society for Bacteriology ( ワシントン D.C. 、USA 、１９８１）に記載されている。炭素源として糖及び炭水化物、たとえばグルコース、サッカロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、メラース、デンプン及びセルロース、油及び脂肪、たとえば大豆油、ひまわり油、落花生油、ヤシ油、脂肪酸、たとえばパルミチン酸、ステアリン酸及びリノール酸、アルコール、たとえばグリセリン及びエタノール及び有機酸、たとえば酢酸を使用することができる。これらの物質は単独で又は混合物として使用することができる。窒素源として有機窒素含有化合物、たとえばペプトン、酵母抽出物、肉抽出物、麦芽抽出物、トウモロコシ源水(Maisquellwasser) 、大豆末及び尿素又は無機化合物、たとえば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウムを使用することができる。窒素源は単独で又は混合物として使用することができる。リン源としてリン酸二水素カリウム又はリン酸水素ジカリウム又は対応するナトリウム含有塩を使用することができる。更に、培地は増殖に不可欠な金属塩、たとえば硫酸マグネシウム又は硫酸鉄を含有しなければならない。最後に、必須の成長促進物質、たとえばアミノ酸及びビタミンを上記物質に加えて使用することができる。上記添加物質を培養液に一度に混合物の形で添加するか又は培養の間適当な方法で添加することができる。
【００２８】
培養液のｐＨ調節に、塩基性化合物、たとえば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア又は酸性化合物、たとえばリン酸又は硫酸を適当な方法で使用する。泡発生の調節に、消泡剤、たとえば脂肪酸ポリグリコールエステルを使用することができる。プラスミドの安定性を維持するために、培地に適当な選択的に作用する物質、たとえば抗生物質を添加することができる。好気性条件を維持するために、酸素又は酸素含有ガス混合物、たとえば空気を培養液中に導入する。培養温度は通常２０℃〜５０℃で、好ましくは２５℃〜４５℃である。培養をＬ−バリンの最大量が産生されるまで続ける。この目的は通常１０時間〜１６０時間以内に達成される。
【００２９】
産生されたＬ−バリンの濃度は公知の方法(Jones及び Gilligan (1983) Journal of Chromatography 266: 471-482)によって測定することができる。
【００３０】
本発明を次の実施例によって詳細に説明する。
【００３１】
例１：コリネバクテリウム  グルタミクムからジヒドロキシ酸デヒドラターゼをコードするilvD遺伝子のクローニング、塩基配列決定及び発現。
【００３２】
１．コリネバクテリウム  グルタミクムのilvD突然変異体の単離
菌株コリネバクテリウム  グルタミクムＲ１２７(Haynes 1989, FEMS Microbiology Letters 61: 329-334)を、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンを用いて突然変異生成させる(Sambrook 等, Molecular cloning. A laboratory manual (1989) Cold Spring Harbour Labaratory Press) 。さらに一晩培養されたコリネバクテリウム  グルタミクム培養液５ｍｌにＮ−メチル−Ｎ−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン２５０μＬ（５ｍｇ／ｍｌジメチルホルムアミド）を添加し、３０分間、３０℃で及び２００Ｕｐｍでインキュベートする(Adelberg 1958,Journal of Bacteriology 175: 5595-5603)。ついで細胞を２回滅菌ＮａＣｌ溶液（０．９％）で洗浄する。寒天１５ｇ／ｌを含有する最小培地プレートＣＧＸＩＩ上にレプリカ平板することによって（Keilhauser等,Journal of Bacteriology 175: 5595-5603)突然変異体を単離し、Ｌ−バリン、Ｌ−イソロイシン及びＬ−ロイシン（各０．１ｇ／ｇ）の添加だけで増殖させる。
【００３３】
ジヒドロキシ酸デヒドラターゼの酵素活性を、この突然変異体の粗製抽出物中で測定する。さらにクローンをＬＢ−培地６０ｍｌ中で培養し、指数増殖期で遠心分離する。細胞ペレットを１回０．０５Ｍリン酸カリルム緩衝液で洗浄し、同一の緩衝液中に再懸濁させる。細胞崩壊を１０分の超音波処理（Branson-Sonifier W-250, Branson Sonic Power Co., Danbury, USA)を用いて行う。ついで細胞破片を１３０００ｒｐｍ及び４℃で３０分の遠心によって分離し、上澄みを粗製抽出物として酵素テストに使用する。酵素テストの反応混合物は、０．２ｍｌの０．２５Ｍトリス／ＨＣｌ（ｐＨ８），０．０５ｍｌの粗製抽出物及び０．１５ｍｌの６５ｍＭα−ジヒドロキシ−β−メチルバレアートを含有する。テスト混合物を３０℃でインキュベートし、１０、２０及び３０分後それぞれ２００μＬのプローブを取り出し、そのケトメチルバレアート濃度をＨＰＬＣ分析器を用いて測定する（Hara等, 1985, Analytica Chimica Acta 172: 167-173)。表１に示すように、株Ｒ１２７／７をジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を示さず、これに対してイソメロリアクターゼ及びアセトヒドロキシ酸シンターゼ活性が分枝状アミノ酸の合成の別の酵素としてさらに存在する。
【００３４】
表１：コリネバクテリウム  グルタミクム株でのバニリンバイオ合成酵素の特異的活性（μｍｏｌ／分及びｍｇ蛋白質）。
【００３５】
0004638048.tif 000002
２．コリネバクテリウム  グルタミクムのilvD遺伝子のクローンニング
コリネバクテリウム  グルタミクムＲ１２７からの染色体ＤＮＡをSchearzer 及びPuehler (Bio/Technology 9 (1990) 84-87) に記載されているように単離する。これを制限酵素Ｓａｕ３Ａ（ベーリンガーマンハイム）を用いて切断し、サッカロース−密度−勾配−遠心法（Sambrook等、Molecular Cloning. A Alaboratory manual (1989) Cold Spring Harbour Labaratory Press)によって分離する。約６〜１０ｋｂのフラグメントサイズ範囲を有する分画をベクターｐＪＣ１（Cremer等, Molecular and General Genetics 220 (1990) 478-480)との連結に使用する。ベクターｐＪＣ１をさらにＢａｍＨＩと連結させ(linearisiert)、脱リンする。その５ｎｇを染色体ＤＮＡの上記分画２０ｎｇと連結させ、それによって突然変異体Ｒ１２７／７をエレクトロポレーション(Haynes und Britz, FEMS Microbiology Letters 61 (1989) 329-334) によって形質転換する。形質転換体をＣＧＸＩＩ寒天プレート上で分枝状アミノ酸無添加で増殖できるその能力についてテストする。５０００以上のテストされた形質転換体のうち、レプリカ平板及び３０℃での２日間のインキュベーションの後、８個のクローンを最小培地プレート上で増殖させる。これらのクローンからプラスミド調製を、Schwarzer 等(Bio/Technology (1990) 9: 84-87)に記載されているように実施する。プラスミドDNA の制限分析から、すべて８個のプラスミドにおいて同一プラスミド（以下ｐRVと呼ぶ。）が含有されることがわかった。プラスミドは４．３ｋｂの挿入体を有し、そしてilvD突然変異体 R127 ／７を相補するその能力について再形質転換することによってテストする。サブクローニングによって、突然変異体 R127 ／７の相補に応答する領域を２．９ScaI／Xhol−フラグメントに制限する（図２）。
【００３６】
３．ilvD遺伝子の塩基配列決定
２．９ScaI／Xhol−フラグメントの核酸配列決定をSanger等のジデオキシ読み終わり法にしたがって行う（Preceeding of the National of Science of the United States of America USA (1977) 74: 5463-5467) 。その際自動読み取り塩基配列決定キットを使用する（Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala,スウェーデン）。ゲル電気泳動分析はAmersham Pharmacia Biotech（Uppsala,スウェーデン）の自動レーザー蛍光塩基配列決定装置（Ａ．Ｌ．Ｆ．）を用いて行われる。得られたヌクレオチド配列をプログラムパケットＨＵＳＡＲ（Release 4.0, EMBL,ケンブリッジ、英国）を用いて分析する。ヌクレオチド配列はＩＤＳＥＱＮＯ１として表わされる。この分析から、ｉｌｖＤ遺伝子と同定され、そして６１２個のアミノ酸から成るポリペプチドをコードする１８３６塩基対の開放型読み枠が確認され、これはＳＥＱＩＤＮＯ２として表わされる。
【００３７】
４．ｉｌｖＤ遺伝子の発現
プラスミドｐＲＶを制限酵素ＳｃａＩ及びＸｈｏｌ（制限酵素の製造元の表示に相当する。）で消化する（ロッシュ、ベーリンガーマンハイム）。ついで２．９ｋｂｉｌｖＤフラグメントをイオン交換カラムを用いて単離する（Quiagen, Hilden)。単離されたフラグメントのXhoI断片の突き出した端(das ueberhaengende Ende) を、クレノーポリメラーゼを用いて補充する。ベクターｐJ Ｃ１（Cremer等, Mol, Gen. Genet (1990) 220: 478-480)をＰｓｔＩ切断し、同様にクレノーポリメラーゼで処理し、ついでフラグメント及びベクターを連結する。連結混合物（Ligartionsansatz) を用いて大腸菌ＤＨ５αｍｃｒ(Grant等,Preceeding of the National of Science of the United States of America USA 87 (1990) 4645-4649) を形質転換する(Hanahan, Journal of Molecular Biology 166 (1983) 557-580)。クローンのプラスミド調製（Sambrook等、Molecular cloning. A Laboratory Manual（１９８９）Cold Spring Harbor Laboratory  Press) によって組換えられたプラスミドｐＪＣ１ilvDを含有するクローンを同定する。このプラスミドを用いてコリネバクテリウム  グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２をエレクトロポラーションによって、たとえばHaynes等(1989, FEMS Microbiol. Lett. 61:329-334)に記載されているように形質転換する。ついでコリネバクテリウム  グルタクムＡＴＣＣ１３０３２ｐＪＣ１及びコリネバクテリウム  グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２ｐＪＣ１ilvDから、ｉｌｖＤによってコードされたジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を測定する。さらに、クローンをＬＢ−培地６０ｍｌで培養し、指数増殖期で遠心分離する。細胞ペレットを１回０．０５Ｍリン酸カリルム緩衝液で洗浄し、同一の緩衝液に再懸濁させる。細胞崩壊を１０分の超音波処理（Branson-Sonifier W-250, Branson Sonic Power Co., Danbury, USA)を用いて行う。ついで細胞破片を１３０００ｒｐｍ及び４℃で３０分の遠心によって分離し、上澄みを粗製抽出物として酵素テストで使用する。酵素テストの反応混合物は、０．２ｍｌの０．２５Ｍトリス／ＨＣｌ（ｐＨ８），０．０５ｍｌの粗製抽出物及び０．１５ｍｌの６５ｍＭα−ジヒドロキシ−β−メチルバレアートを含有する。テスト混合物を３０℃でインキュベートし、１０、２０及び３０分後それぞれ２００μＬのプローブを取り出し、そのケトメチルバレアート濃度をＨＰＬＣ分析器を用いて測定する（Hara等, 1985, Analytica Chimica Acta 172: 167-173)。表２に示すように、株コリネバクテリウム  グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２ｐＪＣ１ilvDはコントロール株に比べて増加されたジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性を示す。
【００３８】
表２：コリネバクテリウム  グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２におけるジヒドロキシ酸デヒドラターゼ活性の特異的活性（μｍｏｌ／分及びｍｇ蛋白質）。
【００３９】
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例２：コリネバクテリウム  グルタミクムのｉｌｖＡ欠失突然変異体の構成
コリネバクテリウム  グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２のｉｌｖＡ遺伝子の内部欠失をSchaefer等(Gene 145: 69-73 (1994))に記載された遺伝子交換システムを用いて実施する。不活性ベクターｐK19 mosacBΔilvAの構成のために、先ずベクターｐBM21(Moeckel等、1994, Molecular Microbiology 13: 833-842) 中のEcoRI フラグメント上に存在するilvA遺伝子から内部２４１ bp BgIII フラグメントを除く。更に、このベクターをBgIII で切断し、ilvA内部 BｇIII フラグメントをアガロースゲル電気泳動によって分離後、再連結させる。ついでこのベクターから不完全なゲルをEcoRI フラグメントとして単離し、EcoRI と連結したベクターｐK19 mosacB（Schaefer、１９９４、Gene 145: 69-73)中に連結させる。得られた不活性ベクターｐK19 mosacBΔilvAを大腸菌Ｓ１７−１中での形質転換によって組み入れ(Hanahan, Journal of Molecular Biology 166 (1983) 557-580)、接合（Konjugation)毎にコリネバクテリウム  グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２に移入させる（Schaefer等、１９９０、Journal of Bacteriology 172: 1663-1666) ）。コリネバクテリウム  グルタミクムのカナマイシン耐性クローンを、不活性ベクターがゲノム中に連結して存在することで得る。ベクターの切り出し(Excision)を選択するために、カナマイシン耐性クローンを寒天１５ｇ／ｌ、２％グルコース／１０％サッカロースを含むサッカロース含有ＬＢ培地（Sambrook等、Molecular cloning. A Laboratory Manual（１９８９）Cold Spring Harbor Laboratory  Press) 上に植菌し、ベクターを第２の組換え発生によって再び失ったコロニーが得られる（Ｊａｅｇｅｒ等、１９９２、Journal of Bacteriology 174: 5462-5465）。２ｍＭＬ−イソロイシンの不在下に又はこれの存在下にあるいは５０μｇ／ｍｌカナマイシンの不在下に又はこれの存在下に最小培地プレート( 寒天１５ｇ／ｌを含有する培地ＣＧＸＩＩ（Keihauer等、Journal of Bacteriology 175 (1993): 5595-5603 ）に過剰に植菌することによって、ベクターの切り出しによってカナマイシンに敏感であり、イソロイシンを栄養要求する３６個のクローンを単離し、そしてその際不完全なｉｌｖＡ遺伝子（ΔｉｌｖＡ−Ａｌｌｅｌ）のみがゲノムに存在する。菌株をＡＴＣＣ１３０３２ΔｉｌｖＡとして表示し、再度使用する。
【００４０】
例３：Ｃ．グルタミクムからパントセナートバイオ合成ｐａｎＢ及びｐａｎＣの遺伝子のクローニング
オペロンのクローニング
Ｃ．グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２の染色体ＤＮＡを単離し、制限エンドヌクレアーゼＳａｕ３Ａを用いて切断する。ゲル電気泳動による分離後、ＤＮＡフラグメントを３〜７又は９〜２０ｋｂの大きさの範囲で抽出し、その後ベクターｐＢＲ３２２の単一ＢａｍＨＩ切断部位に連結させる。挿入体を有するコロニーをそのテトラサイクリン感受性に基づきＬＢプレ−ト上に過植菌した後
テトラサイクリン１０μｇ／ｍｌで単離する。集められた(gepoolten) コロニーからプラスミドを調製することによって（Sambrook等、Molecular cloning. A Laboratory Manual（１９８９）Cold Spring Harbor Laboratory  Press) 、８個のプラスミドプール（それぞれ挿入体サイズ９〜２０ｋｂのプラスミド４００個を有する）及び９個のプラスミドプール（それぞれ挿入体サイズ３〜７ｋｂのプラスミド５００個を有する）を単離する。大腸菌 panB 突然変異体ＳＪ２(Cronan 等, 1982, J. Bacteriol. 149: 916-922) を、これらの遺伝子バンクでエレクトロポラーション（Wehermann 等、1994, Microbilogy 140: 3349-3356) によって形質転換する。形質転換混合物を直接ＣＧＸＩＩ培地（J. Bacteriol. (1993) 175:5595-5603) 上に植菌する。パントセナートを補充することなく増殖することができるクローンからプラスミドＤＮＡを単離し（Sambrook等、１９８９）、再形質転換によって、そのＤ−パントセナート欠乏が確認されたクローン８個が得られる。プラスミド８個を用いて、切断地図化(Restrictionskartierung)を行う。検査されるベクターのうちの一つ（以下ｐＵＲ１と呼ぶ。）は、９．３ｂの挿入体を含有する（図３）。大腸菌 panC 突然変異体ＤＶ３９(Vallari等, 1985, J. Bacteriol. 164: 136-142) の形質転換から、ベクターｐＵＲ１が同様にこの突然変異体のpanC欠失を相補することができることが分かる。挿入体ｐＵＲ１の２．２ｋｂサイズのフラグメントを、Ｓａｎｇｅｒ等のジデオキシ−読み終わり法(Dideoxy-Kettenabbruchnethode)にしたがって塩基配列決定する（Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1997) 74: 5463-5467)。ゲル電気泳動分析はAmersham Pharmacia Biotech（Uppsala,スウェーデン）の自動レーザー蛍光塩基配列決定装置（Ａ．Ｌ．Ｆ．）を用いて行われる。得られたヌクレオチド配列をプログラムパケットＨＵＳＡＲ（Release 4.0, EMBL,ケンブリッジ、英国）を用いて分析する。このヌクレオチド配列はＩＤＳＥＱＮＯ１としても表わされる。この分析は２つの開放型読み枠の同定を明らかにする。開放型読み枠は８１３個の塩基対を包含し、そしてすでに公知の、その他の微生物からのｐａｎＢ遺伝子に対して高い相同性を有する。Ｃ．グルタミクムからのｐａｎＢ遺伝子は２７１個のアミノ酸から成るポリペプチドをコードする（ＳＥＱＩＤＮＯ４参照）。第二の開放型読み枠は、８３７個の塩基対を包含し、そしてすでに公知の、その他の微生物からのｐａｎＣ遺伝子に対して高い相同性を有する。Ｃ．グルタミクムからのｐａｎＣ遺伝子は２７９個のアミノ酸から成るポリペプチドをコードする（ＳＥＱＩＤＮＯ５参照）。
【００４１】
例４：コリネバクテリウム  グルタミクムのｐａｎＢＣ欠失突然変異体の構成
コリネバクテリウム  グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２及びコリネバクテリウム  グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２ΔｉｌｖＡのゲノムｐａｎＢＣフラグメントをSchaefer等（Gene 145: 69-73 (1994)) に記載されている遺伝子交換システムを用いて実施する。欠失ベクターｐＫｍｏｂｓａｃＢΔｐａｎＢＣの構成のために、３．９５ｋｂサイズのＳｓｐＩ／ＳａＩＩフラグメントを、前もってＳｍａＩＩ／ＳａＩＩが切断されているｐＵＣ１８を有するｐａｎＢＣと連結させる。ついで１２９３ｂｐサイズのＥｃｏＲＶ／ＮｒｕＩフラグメントをｐａｎＢＣ遺伝子の重複する領域から制限消化及び再連結によって除く。ｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ中での再クローニングを可能にするために、２個のプライマー
【００４２】
【外１】
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【００４３】
及びポリメラーゼチェイン反応（ＰＣＲ）を用いて欠失されたｐａｎＢＣ領域をｐＵＣ１８中で増幅させて、その末端にＳａＩＩ又はＥｃｏＲＩ切断部位を有する０．５ｋｂΔｐａｎＢＣフラグメントが得られる。ＰＣＲをSambrook等（Molecular cloning. A Laboratory Manual（１９８９）Cold Spring Harbor Laboratory  Press) にしたがって５５℃のアニーリング温度(Annealingtemperatur) で実施する。得られたフラグメントを前もってＥｃｏＲＩ／ＳａＩＩが切断され、そしてアルカリ性ホスファターゼで処理されたベクターｐＫ１９ｍｏｂｓａｃと連結させる。得られた不活性化ベクターｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢΔｐａｎＢＣを形質転換によって大腸菌株Ｓ１７−１に組み入れ(Hanahan, Journal of Molecular Biology 166 (1983) 557-580)、接合（Konjugation)毎にコリネバクテリウム  グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２へ移入させる（Schaefer等、１９９０、Journal of Bacteriology 172: 1663-1666) ）。コリネバクテリウム  グルタミクムのカナマイシン耐性クローンを不活性ベクターがゲノム中に連結して存在することによって得られる。ベクターの切り出しを選択するために、カナマイシン耐性クローンを寒天１５ｇ／ｌ、２％グルコース／１０％サッカロースを含むサッカロース含有ＬＢ培地（Sambrook等、Molecular cloning. A Laboratory Manual（１９８９）Cold Spring Harbor Laboratory  Press) 上に植菌し、ベクターを第２の組換え発生によって再び失ったコロニーが得られる（Ｊａｅｇｅｒ等、１９９２、Journal of Bacteriology 174: 5462-5465）。２ｍＭＬ−イソロイシンの不在下に又はこれの存在下にあるいは５０μｇ／ｍｌカナマイシンの不在下に又はこれの存在下に最小培地プレート( 寒天１５ｇ／ｌを含有する培地ＣＧＸＩＩ（Keihauer等、Journal of Bacteriology 175 (1993): 5595-5603 ）に過剰に植菌することによって３６個のクローンを単離する。これらのクローンはベクターの切り出しによってカナマイシンに敏感であり、イソロイシンを栄養要求し、そしてその際不完全なｐａｎ遺伝子（ΔｐａｎＢＣ−Ａｌｌｅｌ）のみがゲンムに存在する。菌株をＡＴＣＣ１３０３２ΔｐａｎＢＣとして表示する。この例に詳述したのと同一の方法でｐａｎＢＣ欠失をＡＴＣＣ１３０３２ΔｉｌｖＡ中に組み入れて、株ＡＴＣＣ１３０３２ΔｉｌｖＡΔｐａｎＢＣが得られる。
【００４４】
例５：コリネバクテリウム  グルタミクム中で遺伝子ｉｌｖＤ、ｉｌｖＢＮ及びｉｌｖＣの発現。
【００４５】
アセトヒドロキシ酸シンターゼ（ｉｌｖＢＮ）遺伝子及びイソメロリアクターゼ（ｉｌｖＣ）遺伝子（Coedes等, 1992, Gene 112:113-116及びKeilhauser等,Journal of Bacteriology 175: 5595-5603)及びジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（ｉｌｖＤ）（例１）を発現させるためにベクターｐＥＣＭ３中でクローン化する。ベクターｐＥＣＭ３は、カナマイシン耐性である約１ｋｂｐの長さのＢａｍＨＩ／ＢｇＩＩＩＤＮＡフラグメントの欠失によって生じるｐＥＣＭ３の誘導体（Ｊａｅｇｅｒ等、１９９２、Journal of Bacteriology 174: 5462-5465）である。
【００４６】
ベクターｐＫＫ５（Coedes等, 1992, Gene 112:113-116）中には、すでにベクターｐＪＣ１(Cremer 等, 1990, Molecular and Grneral Genetics 220: 478-480)中でクローン化された遺伝子ｉｌｖＢＮＣが存在する。これから５．７ｋｂＸｂａＩｉｌｖＢＮＣフラグメントを単離し、ｉｌｖＤ遺伝子を含有する、ベクターｐＲＶの３．１ｋｂＸｂａＩラグメントをＸｂａＩと連結したベクターｐＥＣＭ３に組み入れる。この際連結混合物を大腸菌ＤＨ５αｍｃｒ中で形質転換する。１個のクローンからプラスミドｐＥＣＭ３ｉｌｖＢＮＣＤが得られる。
【００４７】
エレクトロポラーション（Haynes等、1989, FEMS Microbiol. Lett. 61:329-334) 及びクロランフェニコール耐性（３μｇ／ｍｌ）に対する選択によって、プラスミドｐＥＣＭ３ｉｌｖＢＮＣＤを株ＡＴＣＣ１３０３２ΔｉｌｖＡに組み入れ、そして株ＡＴＣＣ１３０３２ΔｉｌｖＡ／ｐＥＣＭ３ｉｌｖＢＮＣＤが得られる。
【００４８】
例６：種々のコリネバクテリウム  グルタミクム株を用いてL-バリンの産生。
【００４９】
そのバリン産生を調べるために、表４中に記載されている菌株を６０ｍｌの脳−心臓インフージョン培地（Difco Laboratories, Detroit, USA) 中で１４時間、３０℃で予備培養する。ついで細胞を１回０．９％ＮａＣｌ溶液（ｗ／ｖ）で洗浄し、この懸濁液をそれぞれ６０ｍｌのＣｇＸＩＩ培地にＯＤ６００が０．５になるように植菌する。培地はKeihauer等（Journal of Bacteriology 175 (1993): 5595-5603 ）に記載された培地と同一である。しかしΔｉｌｖＡ株の培養のために、さらにこの培地は２５０ｍｇ／ＬのＬ−イソロイシンを含有する。表３に培地を示す。
【００５０】
表３：培地ＣＧＸＩＩの組成
【００５１】
【表３】
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【００５２】
４８時間の培養後、プローブを取り出し、細胞を遠心分離して、上澄みを滅菌する。上澄みのＬ−バリン濃度を高圧液体クロマトグラフィーによってアミノ酸の完全な前カラム誘導化(Vorsaeulenderivatisierung) と同時にｏ−フタジアルデヒドを用いてJones 及びGilligan (J. Chromatogr. 266 (1983) 471-482)に記載されているように測定する。その結果を表４にを示す。
【００５３】
表４：種々のコリネバクテリウム  グルタミクム株を用いるＬ−バリンの産生  。
【００５４】
【表４】
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【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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