(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸をハイブリダイズする方法であって、以下の工程を有する、
（ａ）第１の核酸と第２の核酸を提供する、
（ｂ）前記両核酸をハイブリダイゼーション条件下でインキュベートする、そして
（ｃ）ハイブリダイズした核酸を同定する、
ここで、前記両核酸の少なくとも一つは、浅溝バインダ（ＭＧＢ）−オリゴヌクレオチド共役物である、
ここで、前記浅溝バインダは、約１０３Ｍ−１以上の会合定数で二本鎖核酸の浅溝に非挿入的に結合する、分子量が約１５０〜約２０００ダルトンの分子であり、
ここで、前記ＭＧＢ−オリゴヌクレオチド共役物が、蛍光標識と蛍光標識の放出をクエンチする物質の双方を有する、方法。
【請求項２】
前記蛍光標識と、この蛍光標識の放出をクエンチする前記物質との間の空間関係を変化させる工程を有する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ハイブリダイゼーション後にプローブから標識を解離させる工程を有する請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記標識の解離は、エキソヌクレアーゼ加水分解によって起こる請求項３に記載の方法。
【請求項５】
１以上のプローブが使用される請求項１に記載の方法。
【請求項６】
第１プローブと第２プローブが使用される請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記第１プローブは、蛍光ドナーであり、前記第２プローブは蛍光アクセプターであり、更に、前記蛍光ドナーの放出波長は、前記蛍光アクセプターの吸収波長とオーバラップしている請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ＭＧＢ−オリゴヌクレオチド共役物は、フリーな３´ヒドロキシル基を有するポリメラ−ゼ連鎖増幅反応のプライマーであって、増幅反応によって解離した蛍光標識を検出する請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記プライマーを重合化酵素によって伸長する工程を有する請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記重合化酵素は、熱安定性酵素である請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
プライマー伸長の方法であって、以下の工程を有する、
（ａ）標的配列を含むサンプルを提供する、
（ｂ）前記標的配列の領域に対して相補的な単数又は複数のオリゴヌクレオチドプライマーを提供する、
（ｃ）重合化酵素とヌクレオチド基質とを提供する、そして、
（ｄ）前記サンプルを、前記オリゴヌクレオチドプライマー、前記酵素及び前記基質を重合化に適した条件下でインキュベートする、
ここで、前記プライマーの内の少なくとも一つはＭＧＢ−オリゴヌクレオチド共役物であり、
ここで、浅溝バインダが、約１０３Ｍ−１以上の会合定数で二本鎖核酸の浅溝に非挿入的に結合する、分子量が約１５０〜約２０００ダルトンの分子であり、
ここで、前記ＭＧＢ−オリゴヌクレオチド共役物が、蛍光標識と蛍光標識の放出をクエンチする物質の双方を有する、方法。
【請求項１２】
増幅反応である請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記増幅反応は、ポリメラーゼ連鎖反応である請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
単一ヌクレオチドが異なるポリヌクレオチド間を識別する方法であって、該方法は以下の工程を有する、
（ａ）標的配列を有するポリヌクレオチドを提供する、
（ｂ）少なくとも二つのＭＧＢ−オリゴヌクレオチド共役物を提供する、
ここで、少なくとも二つのＭＧＢ−オリゴヌクレオチド共役物の内一つは、前記標的核酸に対して完全に相補的な配列を有し、少なくとももう一つの他の前記ＭＧＢ−オリゴヌクレオチド共役物は、標的核酸と単一塩基不一致を有しており、それぞれが、蛍光標識と蛍光標識の放出をクエンチする物質の双方を有し、
ここで、浅溝バインダが、約１０３Ｍ−１以上の会合定数で二本鎖核酸の浅溝に非挿入的に結合する、分子量が約１５０〜約２０００ダルトンの分子である、
（ｃ）前記ＭＧＢ−オリゴヌクレオチド共役物のそれぞれを、ハイブリダイゼーション条件下で前記ポリヌクレオチドとそれぞれインキュベートする、そして
（ｄ）前記ＭＧＢ−オリゴヌクレオチド共役物と前記ポリヌクレオチド間のハイブリダイゼーション強度を測定する、方法。
【請求項１５】
単一ヌクレオチドが異なるポリヌクレオチド間を識別する方法であって、該方法は以下の工程を有する、
（ａ）所定の配列の浅溝バインダ（ＭＧＢ）−オリゴヌクレオチド共役物を提供する、
ここで、浅溝バインダが、約１０３Ｍ−１以上の会合定数で二本鎖核酸の浅溝に非挿入的に結合する、分子量が約１５０〜約２０００ダルトンの分子であり、
ここで、ＭＧＢ−オリゴヌクレオチド共役物が、蛍光標識と蛍光標識の放出をクエンチする物質の双方を有する、
（ｂ）それぞれが標的配列を有する少なくとも二つのポリヌクレオチドを提供する、これらポリヌクレオチドの一つは、前記ＭＧＢ−オリゴヌクレオチド共役物に対して完全に相補的な標的配列を有し、前記ポリヌクレオチドの少なくとももう一つは前記ＭＧＢ−オリゴヌクレオチド共役物に対する単一ヌクレオチド不一致を有する標的配列を有する、
（ｃ）前記ＭＧＢ−オリゴヌクレオチド共役物のそれぞれを、ハイブリダイゼーション条件下で前記ポリヌクレオチドとそれぞれインキュベートする、そして
（ｄ）前記各ＭＧＢ−オリゴヌクレオチド共役物と前記ポリヌクレオチド間のハイブリダイゼーション強度を測定する、方法。
【請求項１６】
それぞれが標的核酸上の近傍位置にハイブリダイズされた二つ以上のオリゴヌクレオチドを連結する方法であって、以下の工程を有する、
（ａ）標的配列を有するサンプルを提供する、
（ｂ）前記標的配列上の近傍位置に対して相補的な少なくとも二つのオリゴヌクレオチドを提供する、
（ｃ）前記サンプルと前記オリゴヌクレオチドとをライゲーションに適した条件下でインキュベートする、そして
（ｄ）連結された核酸を同定する、
ここで、前記オリゴヌクレオチドの内の少なくとも一つはＭＧＢ−オリゴヌクレオチド共役物であり、
ここで、浅溝バインダが、約１０３Ｍ−１以上の会合定数で二本鎖核酸の浅溝に非挿入的に結合する、分子量が約１５０〜約２０００ダルトンの分子であり、
ここで、ＭＧＢ−オリゴヌクレオチド共役物が、蛍光標識と蛍光標識の放出をクエンチする物質の双方を有する、方法。
【請求項１７】
不一致識別に使用されるオリゴヌクレオチドプローブであって、前記プローブが５´末端と３´末端を有し、更に、単数又は複数の検出可能標識とを有しているものにおいて、前記プローブは、蛍光標識と蛍光標識の放出をクエンチする物質の双方を有するＭＧＢ−オリゴヌクレオチド共役物であり、
ここで、浅溝バインダが、約１０３Ｍ−１以上の会合定数で二本鎖核酸の浅溝に非挿入的に結合する、分子量が約１５０〜約２０００ダルトンの分子であって、１，２−ジヒドロ−（３Ｈ）−ピロロ［３，２−ｅ］インドール−７−カルボキシレートのマルティマー、又はＮ−メチルピロール−４−カルボックス−２−アミドのマルティマーである、プローブ。
【請求項１８】
前記標識は、フルオレセインである請求項１７に記載のプローブ。
【請求項１９】
前記標識は、シアニンである請求項１７に記載のプローブ。
【請求項２０】
前記標識は、ローダミンである請求項１７に記載のプローブ。
【請求項２１】
前記ＭＧＢは、前記オリゴヌクレオチド５´末端に位置する請求項１７に記載のプローブ。
【請求項２２】
前記ＭＧＢは、前記オリゴヌクレオチド３´末端に位置する請求項１７に記載のプローブ。
【請求項２３】
前記標識は、前記オリゴヌクレオチド５´末端に位置する請求項１７に記載のプローブ。
【請求項２４】
前記標識は、前記オリゴヌクレオチド３´末端に位置する請求項１７に記載のプローブ。
【請求項２５】
前記ＭＢＧは、１，２−ジヒドロ−（３Ｈ）−ピロロ［３，２−ｅ］インドール−７−カルボキシレートのトリマー（ＣＤＰＩ３）と、Ｎ−メチルピロール−４−カルボックス−２−アミドのペンタマー（ＭＰＣ５）から成るグループから選択される、請求項１７に記載のプローブ。
【請求項２６】
複数の蛍光標識を有する請求項１７に記載のプローブ。
【請求項２７】
前記蛍光標識の一つの放出波長は、前記蛍光標識の他の一つの吸収波長とオーバラップする請求項２６に記載のプローブ。
【請求項２８】
前記クエンチする物質は、テトラメチルローダミンである請求項１７に記載のプローブ。
【請求項２９】
プライマーとして使用されるＭＧＢ−オリゴヌクレオチド共役物であって、５´末端と３´末端とを有するものにおいて、前記３´末端は重合化酵素によって伸長可能であり、
ここで、浅溝バインダが、約１０３Ｍ−１以上の会合定数で二本鎖核酸の浅溝に非挿入的に結合する、分子量が約１５０〜約２０００ダルトンの分子であって、１，２−ジヒドロ−（３Ｈ）−ピロロ［３，２−ｅ］インドール−７−カルボキシレートのマルティマー、又はＮ−メチルピロール−４−カルボックス−２−アミドのマルティマーであり、
ここで、ＭＧＢ−オリゴヌクレオチド共役物が、蛍光標識と蛍光標識の放出をクエンチする物質の双方を有する、プライマー。
【請求項３０】
前記３´末端は、フリーな３´ヒドロキシル基である請求項２９に記載のプライマー。
【請求項３１】
重合化酵素によって伸長されている請求項２９に記載のプライマー。
【請求項３２】
ｃＤＮＡ分子の合成中に伸長されている請求項３１に記載のプライマー。
【請求項３３】
増幅反応中に伸長されている請求項３１に記載のプライマー。
【請求項３４】
イノシンがグアノシンに置換されている請求項１７に記載のプローブ。
【請求項３５】
６−アミノ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４（５Ｈ）−オンがグアニンに置換されている請求項１７に記載のプローブ。
【請求項３６】
４−アミノ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンがアデニンに置換されている請求項１７に記載のプローブ。
【請求項３７】
１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４（５Ｈ）−６（７Ｈ）−ジオンがアデニンに置換されている請求項１７に記載のプローブ。
【請求項３８】
イノシンが、グアノシンに置換されている請求項２９に記載のプライマー。
【請求項３９】
６−アミノ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４（５Ｈ）−オンが、グアニンに置換されている請求項２９に記載のプライマー。
【請求項４０】
４−アミノ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンが、アデニンに置換されている請求項２９に記載のプライマー。
【請求項４１】
１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４（５Ｈ）−６（７Ｈ）−ジオンがアデニンに置換されている請求項２９に記載のプライマー。
【請求項４２】
請求項１７に記載のプローブを有する組成物。
【請求項４３】
請求項２９に記載のプライマーを有する組成物。
【請求項４４】
前記プローブは、その長さが２０ヌクレオチド以下である請求項１７に記載のプローブ。
【請求項４５】
前記プライマーは、その長さが２０ヌクレオチド以下である請求項２９に記載のプライマー。
【請求項４６】
請求項２９〜３３、及び３８〜４１のいずれか一項に記載の単数又は複数のプライマーを有する増幅用キット。
【請求項４７】
請求項１７〜２８、及び３４〜３７のいずれか一項に記載の単数又は複数のプローブを有するハイブリダイゼーション分析用キット。
【請求項４８】
請求項１７〜２８、及び３４〜３７のいずれか一項に記載の単数又は複数のプローブを有する加水分解可能プローブアッセイ用キット。
【請求項４９】
請求項１７〜２８、及び３４〜３７のいずれか一項に記載の単数又は複数のプローブを有する単一ヌクレオチド不一致検出用キット。
【請求項５０】
請求項２９〜３３、及び３８〜４１のいずれか一項に記載の単数又は複数のプライマーを有する単一ヌクレオチド不一致検出用キット。
【請求項５１】
請求項１７〜２８、及び３４〜３７のいずれか一項に記載の単数又は複数のプローブを有するヌクレオチド配列分析用キット。
【請求項５２】
請求項２９〜３３、及び３８〜４１のいずれか一項に記載の単数又は複数のプライマーを有するヌクレオチド配列分析用キット。
【請求項５３】
プライマー依存ヌクレオチド配列分析の方法であって、ＭＧＢ−オリゴヌクレオチド共役物がプライマーとして提供され、
ここで、前記プライマーの３´末端が使用され、前記プライマーの３´末端が重合化酵素によって伸長可能であり、
ここで、浅溝バインダが、約１０３Ｍ−１以上の会合定数で二本鎖核酸の浅溝に非挿入的に結合する、分子量が約１５０〜約２０００ダルトンの分子であり、
ここで、ＭＧＢ−オリゴヌクレオチド共役物が、蛍光標識と蛍光標識の放出をクエンチする物質の双方を有する、方法。
【請求項５４】
ポリヌクレオチドの配列を決定する方法であって、以下の工程を有する、
（ａ）異なる配列のオリゴヌクレオチドプローブのアレイを提供する、
（ｂ）前記ポリヌクレオチドと前記アレイをハイブリダイゼーション条件下でインキュベートする、そして
（ｃ）前記ポリヌクレオチドが前記アレイ中のどの前記オリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズするかを判定する、
ここで、オリゴヌクレオチドプローブの単数又は複数は、蛍光標識と蛍光標識の放出をクエンチする物質の双方を有するＭＧＢ−オリゴヌクレオチド共役物を有し、
ここで、浅溝バインダが、約１０３Ｍ−１以上の会合定数で二本鎖核酸の浅溝に非挿入的に結合する、分子量が約１５０〜約２０００ダルトンの分子である、方法。
【請求項５５】
遺伝子発現を検査する方法であって、以下の工程を有する、
（ａ）配列の異なるオリゴヌクレオチドプローブのアレイを提供する、
（ｂ）ポリヌクレオチドのポピュレーションを前記アレイとハイブリダイゼーション条件下でインキュベートする、そして
（ｃ）前記ポピュレーションが前記アレイ中のどの前記オリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズするかを判定する、
ここで、前記オリゴヌクレオチドプローブの内の単数又は複数は、蛍光標識と蛍光標識の放出をクエンチする物質の双方を有するＭＧＢ−オリゴヌクレオチド共役物を有し、
ここで、浅溝バインダが、約１０３Ｍ−１以上の会合定数で二本鎖核酸の浅溝に非挿入的に結合する、分子量が約１５０〜約２０００ダルトンの分子である、方法。
【請求項５６】
対象遺伝子中の単数又は複数の変異を同定する方法であって、以下の工程を有する、
（ａ）配列の異なるオリゴヌクレオチドプローブのアレイを提供する、
（ｂ）ポリヌクレオチドサンプルを前記アレイとハイブリダイゼーション条件下でインキュベートする、そして
（ｃ）前記ポリヌクレオチドが前記アレイ中のどのオリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズするかを判定する、
ここで、前記オリゴヌクレオチドプローブの内の単数又は複数は、蛍光標識と蛍光標識の放出をクエンチする物質の双方を有するＭＧＢ−オリゴヌクレオチド共役物を有し、
ここで、浅溝バインダが、約１０３Ｍ−１以上の会合定数で二本鎖核酸の浅溝に非挿入的に結合する、分子量が約１５０〜約２０００ダルトンの分子である、方法。
【請求項５７】
ハイブリダイズした核酸の溶解温度は、塩基組成から独立している請求項１に記載の方法。
【請求項５８】
ハイブリダイズした核酸の溶解温度は、前記ハイブリダイズした核酸の長さに主として依存する請求項５６に記載の方法。
【請求項５９】
標的核酸にハイブリダイズしてハイブリッドを形成するＭＧＢ−オリゴヌクレオチド共役物であって、前記ハイブリッドの溶解温度は塩基組成から独立しており、
ここで、浅溝バインダが、約１０３Ｍ−１以上の会合定数で二本鎖核酸の浅溝に非挿入的に結合する、分子量が約１５０〜約２０００ダルトンの分子であり、
ここで、ＭＧＢ−オリゴヌクレオチド共役物が、蛍光標識と蛍光標識の放出をクエンチする物質の双方を有する、ＭＧＢ−オリゴヌクレオチド共役物。
【請求項６０】
ｃＤＮＡ合成の方法であって、前記方法は、
（ａ）ｍＲＮＡ鋳型、及びプライマーとしてＭＧＢ−オリゴヌクレオチド共役物が提供され、ここで、浅溝バインダが、約１０３Ｍ−１以上の会合定数で二本鎖核酸の浅溝に非挿入的に結合する、分子量が約１５０〜約２０００ダルトンの分子であり、
ここで、ＭＧＢ−オリゴヌクレオチド共役物が、蛍光標識と蛍光標識の放出をクエンチする物質の双方を有する、
（ｂ）重合化酵素とヌクレオチド基質を提供する、
（ｃ）ｃＤＮＡ分子の合成において十分な条件下においてプライマーを伸長する、方法。
【請求項６１】
ポリヌクレオチド中の標的配列を検出する方法であって、前記ポリヌクレオチドは、前記標的配列を含まない複数のポリヌクレオチドの混合物中に存在し、前記標的配列は、非標的ポリヌクレオチド中の単数又は複数の配列と、一つのヌクレオチドだけが異なるものにおいて、前記方法は以下の工程を有する、
（ａ）蛍光標識と蛍光標識の放出をクエンチする物質の双方を有する浅溝バインダ（ＭＧＢ）−オリゴヌクレオチド共役物を提供する、
ここで、浅溝バインダが、約１０３Ｍ−１以上の会合定数で二本鎖核酸の浅溝に非挿入的に結合する、分子量が約１５０〜約２０００ダルトンの分子であり、
ここで、前記オリゴヌクレオチドの配列は前記標的配列に対して完全に相補的である、
（ｂ）前記ＭＧＢ−オリゴヌクレオチド共役物と前記混合物とをハイブリダイゼーション条件下でインキュベートする、そして
（ｃ）前記ＭＧＢ−オリゴヌクレオチド共役物に選好的にハイブリダイズするポリヌクレオチドを検出する、これによって、前記ＭＧＢ−オリゴヌクレオチド共役物に選好的にハイブリダイズするポリヌクレオチドは、前記標的配列を含む、方法。
【請求項６２】
前記ポリヌクレオチドは、ＤＮＡである請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記ポリヌクレオチドは、コード化領域である請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記ポリヌクレオチドは、非コード化領域である請求項６２に記載の方法。
【請求項６５】
前記ポリヌクレオチドは、変異配列である請求項６２に記載の方法。
【請求項６６】
前記標的配列は、多型配列の対立遺伝子を有する請求項６２に記載の方法。
【請求項６７】
前記混合物中の前記ポリヌクレオチドは、前記多型配列の異なる対立遺伝子を有する請求項６６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は、分子生物学に関する。詳しくは、本発明は、プライマー又はハイブリダイゼーションプローブとしてオリゴヌクレオチドを利用するアッセイの分野に関する。
【０００２】
背景
近代生物学に於ける多くの分析、診断及び実験システムに於いて、オリゴヌクレオチドは、それらがそのオリゴヌクレオチドに対して相補的な核酸配列とベース対を形成する（即ち、ハイブリダイズ）ことを必要とする処置に使用されている。このハイブリダイゼーションプロセスは、核酸分子中の配列を直接的に検出する（即ち、プロービング）ため、特定の配列での合成を開始する（即ち、プライミング）ため、又は、プライマー伸長を抑制することによって合成を阻止する（即ち、クランピング）、ために使用することができる。これらすべての処置に於いて、その技術は、そのデュプレックス（ｄｕｐｌｅｘ）が、二つのストランドがその長さの有意な部分に渡って相補的である場合にのみ形成されるという原理に依る核酸デュプレックス（又はハイブリッド）の形成に依存している。相補性は、アデニン−チミン、アデニン−ウラシル、及びグアニン−シトシンという塩基対のみが、水素結合を形成し、その二本鎖デュプレックスに対する配列特異性を提供するように、それら二つのストランドのヌクレオチドベース間に特異的水素結合が形成されることによって判定される。オリゴヌクレオチドと別の核酸分子との間に形成されるデュプレックスに於いて、そのデュプレックスの安定性は、その長さと、その特異的（即ち、Ａ−Ｔ，Ａ−Ｕ及びＧ−Ｃ）水素結合塩基対の数と、その塩基組成（グアニン−シトシン対アデニン−チミンの比、又はアデニン−ウラシル塩基対）との関数である。というのは、グアニン−シトシン対は、アデニン−チミン対や、又はアデニン−ウラシル対よりもデュプレックスの安定性に大きく貢献するからである。
【０００３】
通常、デュプレックスの相対的安定性は、そのデュプレックスのストランドが分離するまで、デュプレックスを溶液中で加熱することによって、実験的に、判定される。デュプレックスの量的安定性は、一般的に「溶解温度」又はＴｍとして知られている、その塩基対の半分が分解した温度、によって表わされる。実際には、これは、通常、温度を上昇させながら、核酸の溶液の紫外線吸収をモニタし、前記Ｔｍを、２６０ｎｍでの最大吸収量の半分での温度として（なぜらなば、２６０ｎｍでの吸収量の増加が、デュプレックスの二つのストランドの分解に伴うので）示すことによって行われる。
【０００４】
本質的に、標的核酸配列の分析に関連するすべての処置には、既知の配列（プローブ）の相補体がサンプル中に存在するか否かを直接判定するため、又は、特定の配列からの合成（プライム）を開始するため、にハイブリダイゼーション工程を必要とする。このハイブリダイゼーション工程の特異性の制御は、正確な核酸の解析が成功するための鍵となる。大半のケースに於いて、プローブ又はプライマーの配列とその標的の配列との間の正確な一致が必要とされる。それにも拘わらず、いくつかの場合に於いては、分析アプローチには、完全に一致しないデュプレックス中でのプローブ又はプライマーの安定化が必要である。従って、一方に於いて完全に一致したデュプレックスのみを得ることが可能で、かつ、別の条件下に於いては、不一致デュプレックスを安定化させることが可能な、ハイブリダイゼーション処置を制御するために使用可能な技術及び材料によって、オリゴヌクレオチドの使用が拡大され、現在に於いて非常に困難な又は信頼性の低い分析及び実験手順が可能となるであろう。
【０００５】
たとえば、多くの分析手順に於いては、それを更に研究可能とするために、ＤＮＡ又はＲＮＡ配列を増幅又はラベル化するための手段としてプライマー伸長を必要とする。たとえば、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）他，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＯＩＮＧ；Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）を参照。これらの手順には、非限定的に、サンガー法に基づくチェイン−ターミネーションシーケンシング（サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）他，（１９７７）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７４：５４６３−５４６７）、ＤＮＡ又はＲＮＡ配列のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅（米国特許４，６８３，２０２；４，６８３，１９５及び４，８００，１５９；ムリス（Ｍｕｌｌｉｓ）及びファローナ（Ｆａｌｏｏｎａ）；Ｍｅｔｈ，Ｅｎｚｙｍｏｌ．，第１５５巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７，ｐｐ．３３５−５０；及びサカイ（Ｓａｋａｉ）他（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：１３５０−１３５４），ｃＤＮＡ分析（ルージオン（Ｒｏｕｇｅｏｎ）他（１９７５）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２：２３６５−２３７８）、及び、とりわけ、「ディファレンシャルディスプレイ」（リャン（Ｌｉａｎｇ）他（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５７；９６７−９７１）、ｍＲＮＡインデキシング（カトウ（Ｋａｔｏ）他（１９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４：２９４）及び遺伝子ハンティング（トゥン（Ｔｕｎｇ）他（１９８９）Ｉｎ  Ｅｒｌｉｃｈ，Ｈ．Ａ．（ｅｄ）ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．９９−１０４）等の特定の目的のためのこれらの手順の組み合わせ、が含まれる。
【０００６】
これらの手順は、それぞれ、その３’末端から合成が開始されるオリゴヌクレオチドプライマーの、標的配列に対するハイブリダイゼーションを必要とする。オリゴヌクレオチドがプライマーとして作用する能力は、それがそのテンプレート、特にその３’末端、と形成するデュプレックスの安定性に依存する。オリゴヌクレオチドが固有かつ特異的なプライマーとして作用する能力は、それがその完全な相補体と形成するデュプレックスの安定性、その反対に、単数又は複数の非相補的（即ち、不一致）塩基対を含むデュプレックスの安定性の欠如、とに依存している。現在のプライミング法は、伸長のために必要又は好適な温度に於いて安定的なデュプレックスを形成するのに十分な長さのオリゴヌクレオチドの使用に依存している。しかしながら、長いオリゴヌクレオチドは、短いオリゴヌクレオチドよりも不一致対合の可能性が高い。更に、特定の情報によって、長いオリゴヌクレオチドの使用が制限される可能性もある。
【０００７】
一例を挙げると、オリゴヌクレオチドを使用する多くの方法は、しばしば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づく、なんらかのタイプの増幅技術を利用している。たとえば、米国特許４，６８３，１９５；４，６８３，２０２及び４，８００，１５９号を参照。ＰＣＲは、分子生物学に於いて極めて強力な道具であるが、或る種の要因によってその万能性は制限されている。ＰＣＲは、複数サイクルのＤＮＡ変性を使用するので、通常、高温が必要であり、各サイクルに於いて新鮮な重合化酵素を供給する手間を省くために好熱性重合化酵素を使用する。しかしながら、好熱性ポリメラーゼの反応に最適で変性のために必要とされる高温では、約２０ヌクレオチド（２０量体）よりも短いオリゴヌクレオチドは、ポリメラーゼ触媒伸長のためのプライマーとして作用するのに十分安定的なハイブリッドを形成しない。その結果、現在のＰＣＲに基づく方法は、一般に、ＰＣＲに一般に使用される温度とストリンジェンシーとに於いて安定的なハイブリッドを形成するのに少なくとも２０ヌクレオチドの長さのプライマーを必要としている。サカイ（Ｓａｋａｉ）（１９８９）  Ｉｎ  Ｅｒｌｉｃｈ，Ｈ．Ａ．（ｅｄ．），ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．７−１６。
【０００８】
別の例では、ｍＲＮＡ「インデキシング」は、メッセンジャＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子の３’末端から、又はそのｍＲＮＡから作られたｃＤＮＡからのプライミングを必要としている。カトウ（Ｋａｔｏ）他，前出。この技術は、それぞれが、追加的に、オリゴＡの５’側のオリゴＡ配列の近傍に１から約３つのヌクレオチドの伸長を含む、オリゴ−ｄＴ含有プライマーのそれぞれ別々のポピュレーションを使用する。その目的は、各ｍＲＮＡ（オリゴＡ配列によって決まる）の３’末端に対応し、但し別々のポピュレーションに分離される、前記オリゴＡの上流側位置１ないし（約）３に於ける特定の塩基によって決まる、ＤＮＡの特定のセグメントの合成を起させることにある。もしも、それぞれのプライマーが、別々の反応に使用されるならば、ｃＤＮＡの別々のポピュレーションが発生し、そのそれぞれは前記全ｍＲＮＡのサブセットである。これらは、細胞発現を分析するのに使用することができる。この手順は、通常、それぞれの反応に第２プライマーを含ませることによって、ＰＣＲと組み合わされる。この方法の実用性は、第１プライマーを安定化させるために、オリゴＡに対して相補的な、十分な長さのオリゴチミジレートを使用する必要性によって限定されている。これによって、プライマーの３’末端の前記１−３の特定塩基内においてその不一致が安定化される可能性がある。プライマーとテンプレートのポピュレーションに於いて、これらの不一致によって、不適切なプライムの合成が許容され、従って、ｃＤＮＡ分子をミスリードして、ｍＲＮＡが不正確にインデキシングされる。或いは、いくつかのプライマーは、プライム効率的合成にとっての安定性が不十分で、それらが作り出す伸長生成物が、そのポピュレーションにおいて表現不十分となり、ここでも、対応のｍＲＮＡが不正確にインデキシングされる。ＰＣＲに一般に使用される高温で安定的で、しかも、完全なデュプレックスのみを形成する（即ち、不一致をプライミングしない）短いプライマーによって、この技術の有用性が増大するであろう。
【０００９】
遺伝子ハンティングやディファレンシャルディスプレイ等の重要で新しい技術も、短いプライマーの使用の恩恵を受けるであろう。いくつかの場合に於いて、これの方法にとって短いプライマーは必須である。遺伝子ハンティングに於いて、増幅された転写物のファミリは、保存ペプチドモチーフを特定する短い縮重配列を共有しており、このプライミング配列は、必然的にその長さが制限されている。トゥン（Ｔｕｎｇ）他，前出，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．９９−１０４。ディファレンシャルディスプレイに於いては、転写物プールの完全な表示が求められ、これは、最適には、６量体でプライミングすることによって達成される。そのように短いプライマーを使用することの非実用性によって、長い縮重ＯＤＮを使用することが必要となる。リャン（Ｌｉａｎｇ）他，前出。しかしながら、長い縮重ＯＤＮによっては、ｍＲＮＡポピュレーションの複雑性の正確な表示が提供されないかもしれない。なぜなら、プライミングミスによって、非特異的産物が作り出される可能性があり、また、プライマーの非効率的なハイブリダイゼーションによつて、或る種の転写体が表示不足となる可能性があるからである。ブックナー（Ｂｕｃｈｎｅｒ）他（１９９５）Ｓｔａｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．８：１２−１４。ウイルス診断に対する長いオリゴヌクレオチドの適用は限定されている。なぜなら、複数の株からの一つの共通の配列の増幅が、ゲノム可変性の存在によって複雑化される可能性があるからである。スミッツ（Ｓｍｉｔｓ）他（１９９２）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７３：３２６３−３２６８。ここでも、短いプライマーが望ましい。なぜなら、プライミングのために短いプライミングを使用すればするほど、それがゲノム可変性によって特徴付けられる領域を含む可能性が低くなるからである。
【００１０】
プライミングに加えて、いくつかの技術では、核酸配列をプローブするためにオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションが使用される。一般に、これらのアッセイは、それらプローブが標的配列と完全に一致したデュプレックスを形成することを必要とする。これらのアッセイは、通常、以下の三つのスキームの内の一つに基づいている。即ち、１）そのプローブ又は標的がラベル化され（たとえば、放射性同位元素、蛍光色素、又は反応性組成物によって）、その核酸がハイブリダイゼーション後にハイブリダイゼーション条件下に置かれ、ハイブリダイズされなかったラベル化物質が除去され、残りのラベルが数量化される。２）そのプローブが特異的にラベル化され、ハイブリダイゼーション条件下で標的ＤＮＡと置かれ、ハイブリダイゼーション後、そのハイブリダイズしたプローブは、デュプレックス−特異的ヌクレアーゼに対する感受性（たとえば、米国特許５，２１０，０１５）、３）色素とデュプレックスＤＮＡとの相互作用によって発生する蛍光（ウィットワー（Ｗｉｔｔｗｅｒ）他（１９９７）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ２２：１３０−１３８）、又は、ハイブリダイゼーションの結果、プローブの伸長によるクエンチングダイ（ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ  ｄｙｅ）からの蛍光団の分離、等のそのプローブを含むデュプレックスに固有の特性によって検出される。
【００１１】
正確なデュプレックスと単数又は複数の不一致塩基対を含むデュプレックスとの間の識別性を高めるために、これらすべてのタイプの核酸ハイブリッド検出システムに於いて実質的に使用可能な方法は、特異的核酸配列決定に於ける非常に有用な道具となり、臨床診断、遺伝学的研究及び法廷用の実験室分析において価値あるものとなることは明白であろう。
【００１２】
たとえば、多くの疾患は、既知の先天性多型及び変異と関連している。これらの多くは、一つのヌクレオチド変化に依るものであり、有用なものとなるためには、ハイブリッド形成に基づく遺伝学的アッセイは、すべての塩基対が一致したハイブリッドと、一つの不一致を有するハイブリッドとを識別可能なものでなければならない。一塩基多型と呼ばれるヒトＤＮＡ配列中のある種のポイントに於ける一塩基差異のグループが、安定的な先天的遺伝子マーカであるとされている（シェッファー（Ｓｃｈａｅｆｆｅｒ）他（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１６：３３）。これらのマーカは、先祖と関連付け可能であり、いくつかの場合に於いては、り(罹)病性又は化学物質や薬剤、等の環境要因に対する反応と関連付け可能である。これらの多型は、理論的には、手間のかかる遺伝子配列決定によって発見することが可能であるが、表現型と関連する遺伝マーカとしての、たとえば、医療又は研究に於ける、その利用によって、何百という個人からのＤＮＡを分析することが可能なスクリーニング又はタイピングシステムが必要とされる。このプロセスは、ＤＮＡシーケンシングの現在の方法によって容易に適応されないであろう。このように一塩基多型分析は、ハイブリダイゼーション等のプロセスによって、ＤＮＡ配列中の一つの塩基差を区別するための信頼性の高い方法が必要とされている付加的な分野である。
【００１３】
オリゴヌクレオチドプライミングを使用するその他様々なアッセイが知られている。これらは、非限定的に、伸長生成物にハイブリダイズされたプローブからラベルを放出するポリメラーゼ酵素のヌクレアーゼ活動を利用するアッセイ（たとえば、米国特許５，２１０，０１５を参照）、標的核酸の部位に隣接する２つ以上のオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションによって、たとえば、蛍光共鳴エネルギ転移、等のオリゴヌクレオチド間の相互反応が発生するアッセイ、を含む。たとえば、スタヴリアノポウロス（Ｓｔａｖｒｉａｎｏｐｏｕｌｏｓ）他，米国特許４，８６８，１０３とヘラー（Ｈｅｌｌｅｒ）他，ヨーロッパ特許公報０７０，６８５を参照。これらの方法も、効率的なハイブリダイゼーションおよび／又はプライミングのために使用可能なオリゴヌクレオチドの長さによって制限されている。従って、より短いオリゴヌクレオチドを使用することが可能であることは、これらの方法において有用であり、事実、標的核酸に対するオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを使用するすべての用途に於いて有用であろう。
【００１４】
有効なプライミング能力を保持しながら、ハイブリッド安定性を改善することを目的として、短いオリゴヌクレオチドの化学的改変が試みられてきた。Ｎ３’−Ｐ５’ フォスフォルアミデート（ｐｈｏｓｐｈｒａｍｉｄａｔｅｓ）（グリヤズノフ（Ｇｒｙａｚｎｏｖ）他（１９９４）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６：３１４３−３１４４）とペプチド（ニールセン（Ｎｉｅｌｓｅｎ）他（１９９４）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．５：３−７）又はグアニジン（デンプシー（Ｄｅｍｐｃｙ）他（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２：６０９７−６１０１）結合等のある種の化学的改変は、ハイブリッド安定性を高めるものであることが示されている。しかしながら、そのように改変されたオリゴヌクレオチドは、３’−ＯＨ基を有さない為、伸長不能であって、従って、プライマーとして作用することはできない。そのプライマー伸長を可能にする能力についてまだ調べられていないその他のハイブリッド安定化改変は、２’−改変糖（モニア（Ｍｏｎｉａ）他（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１４５１４−１４５２２；スプロート（Ｓｐｒｏａｔ）他（１９９３）Ｉｎ  Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ  Ｌｅｂｌｅｕ．Ｂ（ｅｄｓ）、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，ｐｐ．３５２−３６２）、共役挿入剤（アッセリーヌ（Ａｓｓｅｌｉｎｅ）他（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８１：３２９７−３３０１）、及び、２−アミノアデニン（ラム（Ｌａｍｍ）他（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：３１９３−３１９８）又はＣ５プロピニルピリミジン（ワーグナー（Ｗａｇｎｅｒ）他（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ２６０：１５１０−１５１３）等の置換塩基である。従って、その改変がオリゴヌクレオチドのプライマーとして作用する能力の障害とならないように、より安定的なハイブリッドを形成するように短いオリゴヌクレオチドを改変する方法に対する必要性が存在している。
【００１５】
オリゴヌクレオチドをプローブ及びプライマーとして使用することのもう一つの問題点は、オリゴヌクレオチドプローブおよび／又はプライマーを使用した一つのヌクレオチド不一致の識別等の、特異性を得ることの困難性である。多くの場合に於いて、一つのヌクレオチドが相違する標的配列を識別することが必要であり、いくつかの場合に於いては、それをオリゴヌクレオチドを使用して行うことが望ましい。即ち、それに対してその全長に渡って相補的な標的配列に対してハイブリダイズ可能であるが（完全ハイブリッド又は完全一致）、同一のストリンジェント条件下に於いては、一つのヌクレオチド残基に於いて前記オリゴヌクレオチドと非相補的である（単一ヌクレオチド不一致）標的配列に対してハイブリダイズしない、所与のオリゴヌクレオチドを得ることが有用であろう。残念ながら、この種の単一ヌクレオチド不一致識別は、かなり短い（たとえば２０量体未満）オリゴヌクレオチドを使用した場合にのみ可能である。そのような短いオリゴヌクレオチドを使用することの欠点は、それらは、たとえ完全に相補的な配列に対しても弱くしかハイブリダイズせず、従って、低ストリンジェント条件下で使用しなければならないことにある。高ストリンジェント条件下（大半の増幅反応が行われるような）での単一ヌクレオチド不一致識別を達成することが可能でれば、そのうちの僅かを挙げるだけでも、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、一塩基多型分析、機能ゲノム分析（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｇｅｎｏｍｉｃｓ）等の技術に於いて速度と効率の改善が達成されるであろう。
【００１６】
発明の開示
本発明は、複数のヌクレオチド単位、３’末端及び５’末端、と、前記ヌクレオチド又は前記末端の少なくとも一つに対して共役的に付着された浅溝（ｍｉｎｏｒ  ｇｒｏｏｖｅ）バインダモイエティ（ｍｏｉｅｔｙ）を有する、共役結合浅溝バインダ（ＭＧＢ）−オリゴヌクレオチド共役物に関する。前記浅溝バインダは、通常、連結基（ｌｉｎｋｉｎｇ  ｇｒｏｕｐ）を介して前記オリゴヌクレオチドに付着している。前記浅溝バインダモイエティは、約１０3Ｍ-1以上の会合定数（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｃｏｎｓｔａｎｔ）で、二本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ又はそのハイブリッドの浅溝に非挿入的に結合する、分子量約１５０ないし約２０００ダルトンの分子のラジカルである。
【００１７】
本発明は、更に、分析、診断、更に、治療（アンチ−センス、抗遺伝子）目的のためのハイブリダイゼーションプローブやプライマーとしての前記ＭＧＢ−オリゴヌクレオチド共役物の利用法にも関する。
【００１８】
今回、浅溝バインダ（ＭＧＢ）のオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）への共役結合によって、そのオリゴヌクレオチドと標的との間に形成されるハイブリッドの安定性が劇的に増大することが発見された。安定性の増大（即ち、ハイブリダイゼーション度の増加）は、同一の長さと配列の非共役結合オリゴヌクレオチドによって形成されるものとの比較に於ける、そのようなＭＧＢ−オリゴヌクレオチド共役物により形成されたハイブリッドデュプレックスの溶解温度（Ｔｍ；その塩基対の半分が分離した温度）の上昇に示される。この効果は、短いオリゴヌクレオチド（たとえば、長さが約２１ヌクレオチド以下）に於いてより顕著であり、これによって、始めて、短いオリゴヌクレオチドを、高ストリンジェント条件下でプローブ及びプライマーとして使用することが可能となった。オリゴヌクレオチドのＭＧＢとの共役結合、及び、それに伴う、ハイブリッド安定性の増加は、この共役結合オリゴヌクレオチドがプライマーとして作用する能力になんら悪影響を与えるものではない。従って、本発明の方法と組成物とを使用することによって、ポリメラーゼ連鎖反応やハイブリダイゼーション可能プローブアッセイ等の、高温と好熱性酵素の使用に依り、一般に高ストリンジェント条件下で行われる、ハイブリダイゼーションが必要な技術に於いて従来必要とされていたよりも短いオリゴヌクレオチドを使用することが可能となった。
【００１９】
デュプレックス安定性の増加に加えて、ＭＧＢ−オリゴヌクレオチド共役物は、低い溶解温度の非共役結合の短いオリゴヌクレオチドの特性である、配列不一致に対する高い感受性を維持している。従って、ＭＧＢに対する共役結合によって、一つのヌクレオチドが相違する配列間を識別する能力を保持しながら、はるかに長いオリゴヌクレオチドの安定特性を備えたハイブリッドを形成する能力をそれらに与えることによって、より特異性の高い非常に短いオリゴヌクレオチド（たとえば、約２１ヌクレオチド以下のヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチド）が提供される。ＭＧＢ−オリゴヌクレオチド共役物を使用することによって、高いストリンジェント条件下で短いオリゴヌクレオチドを使用することが可能となった。
【００２０】
ＭＧＢ−オリゴヌクレオチド共役物をプローブ及びプライマーとして使用することによって、オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを使用する様々なアッセイの速度、感受性、多用性が改善される。このようなアッセイには、非限定的に、単一ヌクレオチド不一致検出、インサイチュハイブリダイゼーション、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ，米国特許４，６８３，２０２；４，６８３，１９５及び４，８００，１５９を参照）、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）ハイブリダイゼーション（フアン（Ｈｕａｎｇ）他（１９９２）Ａｃｔａ  Ｈａｅｍａｔｏｌ．８８：９２−９５）、一塩基多型検出（ミリス（Ｍｕｌｌｉｓ）及びファローナ（Ｆａｌｏｏｎａ）；Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，第１５５巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７，ｐｐ．３３５−５０）、短いタンデムリピート（ｔａｎｄｅｍ  ｒｅｐｅａｔｓ）を使用するマイクロサテライト分析（Ｔａｕｔｚ（１９９３）ｉｎ“ＤＮＡ  Ｆｉｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ；Ｓｔａｔｅ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，”ペナ（Ｐｅｎａ）他，ｅｄ，Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ，Ｂａｓｅｌ，ｐｐ．２１−２８）、ＤＮＡに於ける多型のランダム増幅（ウィリアムズ（Ｗｉｌｌｉａｍｓ）他，Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，第２１８巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９３，ｐｐ．７０４−７４０）、ＤＮＡ増幅フィンガープリンティング（キャタノ‐アノレス（Ｃａｅｔａｎｏ−Ａｎｏｌｌｅｓ）他（１９９１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：５５３−５５７）、蛍光エネルギ転写を使用するアッセイ、ハイブリダイズドオリゴヌクレオチドプローブのエキソヌクレアーゼ介在加水分解によるラベルの放出を使用するアッセイ、二つ以上のオリゴヌクレオチドのライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）を使用するアッセイ、等が含まれる。
【００２１】
ここに記載した、又は後述するすべての特許、特許出願、公報のその全体をここに参考文献として合体させる。
【００２２】
発明を実施する態様
本発明の実施は、特に銘記されない限り、有機化学、生化学、オリゴヌクレオチド合成及び改変、核酸ハイブリダイゼーション、分子生物学、微生物学、遺伝学、組換えＤＮＡ、及び当該技術範囲内に於ける関連分野に於ける従来の技術を使用する。これらの技術は文献に完全に説明されている。たとえば、マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ），フリッチュ（Ｆｒｉｔｓｃｈ）及びサムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ），ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ；Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８２）；サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）他，前出；オースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）他，ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９８７，１９８８，１９８９，１９９０，１９９１，１９９２，１９９３，１９９４，１９９５，１９９６）；Ｇａｉｔ（ｅｄ．），ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥ  ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ；  Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  （１９８４）；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ（ｅｄ．），ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥＳ  ＡＮＤ  ＡＮＡＬＯＧＵＥＳ：Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９１）を参照。
【００２３】
ＭＧＢ−オリゴヌクレオチド共役物の改良されたハイブリダイゼーション及び識別特性
多くのタイプのハイブリダイゼーションアッセイに於いて、プローブオリゴヌクレオチドと、完全又は一部相補的標的配列との間の塩基対形成相互反応は、直接的（ハイブリダイズドプローブを測定することにより）、又は間接的（プローブハイブリダイゼーションに依存するなんらかの事象を測定することにより）に検出される。ハイブリダイゼーションカイネティクス（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｋｉｎｅｔｉｃｓ）を改善（即ち、ハイブリダイゼーションプロセスの加速）、ハイブリダイゼーション反応の均衡を生成物に有利に変更する（即ち、ハイブリッド中のプローブのフラクションの増加）、および／又はより安定的なハイブリッドの形成をもたらす改変によって、より迅速、効率的及び正確なハイブリダイゼーションアッセイが可能となり、ハイブリダイゼーションの効率が増大し、診断や法廷科学等の新しい分野に於けるハイブリダイゼーション技術の使用が容易となるであろう。更に、多くの場合、それぞれのプローブヌクレオチドが、標的中の補足的ヌクレオチドと塩基対を形成している完全なハイブリッド（又は完全一致）と、単数又は複数のプローブヌクレオチドが標的と相補的ではない不完全ハイブリッド又は不一致、とを識別することが可能であるが有利である。たとえば、オリゴヌクレオチド中の一つの塩基が標的配列に対して非相補的である、オリゴヌクレオチドと標的核酸配列との間のハイブリッドは、単一ヌクレオチド不一致と称される。単一ヌクレオチド不一致識別（即ち、完全一致と、単一ヌクレオチド不一致とを区別する能力）は、診断目的のための変異の検出と、診断、治療及び法廷科学用途に於ける対立遺伝子一塩基多型の決定に於いて極めて有用である。これまで、特に高ストリンジェント条件下では、そのような単一ヌクレオチド不一致識別を達成することが困難であった。
【００２４】
本発明は、とりわけ、プローブ及びプライマーとして使用される、改変オリゴヌクレオチドを提供するものである。これらのオリゴヌクレオチドは、浅溝結合モイエティ（ＭＧＢ）の共役付着によって改変されている。具体的ＭＧＢの構造と作成とがここに提供される。第２ポリヌクレオチド中の標的配列に対して相補的な所定の配列を有するＭＧＢオリゴヌクレオチド共役物は、従来技術のオリゴヌクレオチドプローブ及びプライマーと比較して、より大きなハイブリッド強度を有するデュプレックスを形成する。その配列によって、第２ポリヌクレオチド中の標的配列のそれに対する単一ヌクレオチド不一致を有するハイブリッドが形成されるＭＧＢオリゴヌクレオチド共役物は、従来技術のオリゴヌクレオチドプローブ及びプライマーと比較して、完全に一致したデュプレックスからより容易に識別可能なデュプレックスを形成する。
【００２５】
ハイブリッド安定性の増加
二つの核酸間の、ハイブリダイゼーションの強度又は、ハイブリッド安定性は、核酸デュプレックスを、徐々に上昇する温度、又は、徐々に増加する濃度の変性剤に晒すことによって測定することが可能である。紫外線吸収度（塩基対合の測定量）は、温度又は変性剤の濃度の関数として測定される。吸収度は、塩基対が分離し塩基積重ね相互作用（ｂａｓｅ  ｓｔａｃｋｉｎｇ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）が失われた時に増加し、吸収度は、デュプレックスが完全に変成した時に横ばい状態に達する。この種の分析から、複数のハイブリダイゼーション強度測定値を得ることができる。溶解温度（Ｔｍ）は、デュプレックス中の塩基対の半分が分離する温度（又は濃度）として一般に定義される。温度に対する（又は変性剤の濃度又は強度に対する）吸収度の変化が最大となる温度（即ち、ｄＡ／ｄＴが最大となる温度）は、その特定のアミノ酸デュプレックスに対するＴmaxとして知られている。
【００２６】
ＭＧＢオリゴヌクレオチド共役物とその標的配列との間のハイブリダイゼーション強度の増大はいくつかの有利な効果を有する。たとえば、長さが約２１ヌクレオチド以下の短いオリゴヌクレオチドは、一般には、ＰＣＲ等の増幅技術には適していない。なぜなら、それらの技術は短いオリゴヌクレオチドのＴｍよりも高い昇温（通常は７０℃以上）で行われるからである。しかしながら、そのような短いオリゴヌクレオチドにＭＧＢを共役結合させることによって、ＭＧＢオリゴヌクレオチド共役物が、ＰＣＲやその他の増幅技術で使用されているもののような、昇温での特異的、安定的ハイブリダイゼーションを達成するための十分なハイブリッド安定性の増加をもたらす。
【００２７】
ＭＧＢ共役結合によってオリゴヌクレオチドにもたらされるハイブリッド安定性の増加のもう一つの利点は、標的配列に対する単数又は複数の相補配列不一致を含むオリゴヌクレオチドを使用する標的へのハイブリダイゼーションが可能となることである。これにより、一つの所定の配列オリゴヌクレオチドを、遺伝的不均一性を示す標的に対するプライマー又はプローブとして使用することが可能となる。一つの具体例のみを挙げると、ＭＧＢオリゴヌクレオチド共役物は、ＨＩＶの検出のためにオリゴヌクレオチドを利用するアッセイに有用である。ＨＩＶゲノムは、その内の一部によって、抗ウイルス治療に対する抵抗が形成される頻繁な変異事象を経験するので、オリゴヌクレオチドプローブ又はプライマーに対して相補的ウイルスゲノムの領域に存在する変異によって、その変異がオリゴヌクレオチドに基づくアッセイに於いて検出不能となる可能性がある。しかしながら、ＭＧＢオリゴヌクレオチド共役物は、その高いハイブリッド安定性に依り、単数又は複数のヌクレオチド不一致を有するオリゴヌクレオチドでも、特定の標的配列を識別することを可能とし、これによって、標的配列の頻繁な変異傾向によって特徴付けられるシステムに於ける効果的なプローブおよび／又はプライマーとして作用する。更に、その標的領域中の一つ又は少数のヌクレオチドに於ける変化によつて識別される、ウイルスの複数のサブタイプを、一つの配列を有するＭＧＢオリゴヌクレオチド共役物によって検出することができる。
【００２８】
ＭＧＢ共役オリゴヌクレオチドは、非共役オリゴヌクレオチドに対してそのデュプレックス中で安定化されてはいるが、共役オリゴは、適切なストリンジェント条件下に於いて、その配列特異性を維持しており、不一致を識別することが可能である（即ち、完全一致オリゴヌクレオチドによって形成されたデュプレックスの安定性は、オリゴヌクレオチドがＭＧＢに共役結合された場合の不一致デュプレックスのそれよりも、両デュプレックスのＴｍはＭＧＢ共役結合によって高められはするが、遥かに高い。即ち、完全に一致したオリゴヌクレオチドと、一つのヌクレオチドが異なるオリゴヌクレオチドとを比較した場合（特定の標的配列に対して形成されたハイブリッドの強度に於いて）、両オリゴヌクレオチドによって形成されるハイブリッドのＴｍは増加するであろうが、完全一致オリゴヌクレオチドによって形成されたハイブリッドのＴｍは、より大きく増大する。この作用は、短いオリゴヌクレオチド、好ましくは、その長さが２１ヌクレオチド以下のもの、最も好ましくは、その長さが１１ヌクレオチド以下のもの、に於いて特に顕著である。その結果、不一致プローブは、ＭＧＢと共役結合された時により安定したハイブリッドを形成するものではあるが、ＭＧＢオリゴヌクレオチド共役物を使用して、単一ヌクレオチド不一致から完全一致を区別することが可能となるのである。事実、完全一致と単一ヌクレオチド不一致との間のＴｍの差は、ＭＧＢオリゴヌクレオチド共役物がプローブおよび／又はプライマーとして使用された場合に強調される（後述）。
【００２９】
ここに記載されているように、本発明者等は、オリゴヌクレオチドに対するＭＧＢの共役付着によって、たとえば、そのハイブリッドのＴｍの上昇によって測定される、オリゴヌクレオチドによって形成されるハイブリッドの安定性が劇的に増大することについて説明してきた。本発明によって提供される、短いオリゴヌクレオチドに対するハイブリッド安定性の増加によって、その付着したＭＧＢがオリゴヌクレオチドの３’末端をその伸長を阻止しない限りに於いて、ＰＣＲ等のプライマー伸長を使用する様々な手順に於けるプライマーとして有用な短いオリゴヌクレオチドが提供される。ＭＧＢオリゴヌクレオチド共役物が、事実、ポリメラーゼによってその３’末端から伸長可能であることが、ここに示される（たとえば、後述の例１を参照）。従って、それ自身ではかなり不安定なハイブリッドを形成する、非常に短いオリゴヌクレオチド（約２１量体以下）であっても、ＭＧＢに共役結合されることにより、ＰＣＲ等の増幅反応に於けるプライマーとして作用するのに十分安定的な、その標的配列とのハイブリッドを形成することが可能である。
【００３０】
短いオリゴヌクレオチドを、ＰＣＲ等の増幅プロセスのプライマーとして使用することにはいくつかの利点がある。これらの利点は、通常、好熱性酵素を使用した高温で行われる手順に於いては従来得られなかったものである。たとえば、短いオリゴヌクレオチドは製造が容易で低コストである。更に、短いオリゴヌクレオチドによれば、より迅速なハイブリダイゼーション反応速度を得ることができる。更に、ＰＣＲ又は関連のプライミングおよび／又は増幅技術を使用して行われるホモロジー検索を、約２−３コドンのホモロジーの非常に短い領域に基づいて行うことが可能である。このサイズ範囲内では、単一ヌクレオチド不一致識別は、ＭＧＢオリゴヌクレオチド共役物（後述を参照）によって維持され、非常に限定された領域のホモロジーにおける非常に感度の高い検索が可能となる。
【００３１】
不一致識別力の増大
互いに一つのヌクレオチドが異なる二つの配列間を識別することが益々重要となっている。一塩基多型は多くの疾患の分子的基礎を形成し、特定の治療に対する個人の反応を決定するものであり、法廷科学的観点から有用である。一つのヌクレオチドが異なる二つのポリヌクレオチド間を識別可能であることは、ＭＧＢオリゴヌクレオチド共役物の一つの重要で価値ある特性である。ＭＧＢと短い（＜２１量体）オリゴヌクレオチド間の共役物は、短いオリゴヌクレオチドの配列特異性と識別特性とを維持しており、かつ、同時に、より長いオリゴヌクレオチドの安定特性を有するハイブリッドを形成する能力を有する。いかなる特定の理論によっても限定されることを望むものではないが、ＭＧＢオリゴヌクレオチド共役物のこれらの望ましい特性の組み合わせの一つの可能な説明は以下の通りである。各塩基対が、ハイブリッドの安定性に寄与するので、ハイブリッドが短ければ短いほど、個々の塩基対のプローブ−標的ハイブリッドの安定性に対する相対的貢献度は大きくなる。したがって、プローブが短ければ短いほど、その標的と完全一致を形成するプローブと、一つの塩基不一致を有するプローブとの間の安定性の相違は大きくなる。従って、その他すべての条件を同一とすると、オリゴヌクレオチドが短いほど、完全一致と単一ヌクレオチド不一致との間を識別する能力は大きくなる。しかしながら、短いオリゴヌクレオチド（たとえ、その標的と完全一致を形成するものでも）では、ＰＣＲ等の増幅技術に於いて通常使用される昇温で安定的なハイブリッドを形成することはできない。従って、短いオリゴヌクレオチドの潜在的な識別力は、ＰＣＲやそれに関連する増幅法に於いては利用することができない。
【００３２】
ＭＧＢを短いオリゴヌクレオチドに共役結合させることに依る効果の一つは、短いオリゴヌクレオチドを含むハイブリッドの安定性（従って、そのＴｍ）が、熱安定性重合酵素を使用した増幅反応に必要な昇温に於けるオリゴヌクレオチドの使用と両立可能な程度に増大することにある。同時に、短いオリゴヌクレオチドの識別特性（即ち、完全ハイブリッドと単一塩基不一致との間のＴｍの差の強調）は、これらの条件下に於いて前記ＭＧＢオリゴヌクレオチド共役物によって維持されている。たとえば、後述の例２，３及び６を参照。
【００３３】
その他の利点
ハイブリダイゼーションの反応速度は、オリゴヌクレオチドの長さに反比例するので、前記ＭＧＢオリゴヌクレオチド共役物のもう一つの有用な特性は、それらが、より長いオリゴヌクレオチドよりも急速にその標的にアニーリングすることが可能であることにある。ＭＧＢオリゴヌクレオチド共役物のより速い反応速度に結びつくもう一つの要因は、ＭＧＢは、恐らく、ハイブリダイゼーションの核形成部位として作用することである。更に、ＭＧＢによって与えられる結合の追加の自由エネルギが、オリゴヌクレオチドとその標的との間のオフ率（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）を低下させている可能性が非常に高い。その結果、ＭＧＢオリゴヌクレオチド共役物を使用したハイブリダイゼーションアッセイは、それに対応する安定性を有するハイブリッドを形成するより長い非共役結合オリゴヌクレオチドを使用したアッセイよりも迅速に行うことができる。従って、本発明の新規の組成物によって提供されるもう一つの利点は、時間が限られた状況に於いてハイブリダイゼーション分析を行うことが実用的となることにある。一例のみを挙げると、本発明の方法及び組成物を、外科処置に使用して、切除組織の分子特性を調べることが可能であろう。ＭＧＢオリゴヌクレオチド共役物の複数の有利な特性を組み合わせて、外科手術中に切除の程度を案内するべく、切除された組織の一部からとられた細胞中の形質転換した状態（たとえば、ガン遺伝子（ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ）又は腫瘍抑制遺伝子に於ける単一塩基変異）の分子学的特性をテストすることが可能であろう。様々な変異検出技術に於ける本発明の方法及び組成物の使用の記載がここに提供される。
【００３４】
適用例
本発明の方法及び組成物は、別の核酸に対するオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションが利用される、現在使用中及び今後開発される、様々な技術に使用可能である。これらのものとしては、非限定的に、標的核酸に対するオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションが最終到達点である技術、オリゴヌクレオチドをプライマーとして使用し標的核酸をテンプレートとして使用する単数又は複数のポリメラーゼ介在伸長工程の前に、標的核酸に対する単数又は複数のオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションが行われる技術、標的核酸に対するオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを、別のプライマーの伸長を阻止するために使用する技術、標的核酸に対するオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション後に、そのオリゴヌクレオチドを加水分解して取り付けられた標識を解除する技術、そして、二つ又は複数のオリゴヌクレオチドが標的核酸にハイブリダイズされ、それら複数のオリゴヌクレオチド間の相互作用を測定する技術、等がある。オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションの条件、温度、イオン強度、溶剤組成物、等のハイブリダイゼーションの度合い及び特異性に影響する要因は、当業者に周知である。たとえば、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）他，前出；オースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）他，前出；エム・エイ・イニス（Ｍ．Ａ．Ｉｎｎｉｓ）他（ｅｄｓ．）ＰＣＲプロトコル，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，１９９０；ビー・ディ・ヘイムズ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ）他（ｅｄｓ．）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８５；及びファン・ネス（ｖａｎ  Ｎｅｓｓ）他（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：５１４３−５１５１を参照。
【００３５】
ハイブリダイゼーションプローブ
本発明の一態様に於いて、単数又は複数のＭＧＢオリゴヌクレオチド共役物を、プローブ（単数又は複数）と標的核酸との間のハイブリダイゼーションをアッセイすることによって標的核酸を同定するためのプローブとして使用することができる。プローブには、いかなる検出可能な標識によって標識化してもよく、あるいは標識と連動することが可能な反応基を含むことにより、又は、標的へのハイブリダイゼーションの前、又はその後に第２の標識化プローブへのハイブリダイゼーションによって、標識化される能力を有するものとすることができる。核酸プローブのハイブリダイゼーションの条件は当業者に周知である。たとえば、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）他，前出；オースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）他，前出；イニス（Ｉｎｎｉｓ）他，前出、ヘイムズ（Ｈａｍｅｓ）他，前出、ファン・ネス（ｖａｎ  Ｎｅｓｓ）他，前出、を参照。
【００３６】
ハイブリダイゼーションは、当業者に周知の複数の方法のいずれかを使用して、フリープローブからハイブリダイズされたプローブを識別することによってアッセイすることができる（即ち、ハイブリダイズされた核酸を同定することができる）。これらの方法には、非限定的に、直接的又は間接的に（第２の支持体結合プローブへのハイブリダイゼーションによって、或いは、表面結合リガンドとプローブ共役結合リガンドとの間の相互作用により）、支持体に対して標的核酸を付着させ、その後、プローブによって直接又は間接ハイブリダイゼーションを行い、ハイブリダイズされなかったプローブを除去するべく洗浄するもの、ヌクレアーゼ抵抗（ｎｕｃｌｅａｓｅ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）の測定、浮遊密度（ｂｕｏｙａｎｔ  ｄｅｎｓｉｔｙ）測定、核酸デュプレックスに対して特異的な親和法（たとえば、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィ）、同じ標的核酸に対してハイブリダイズされた複数のプローブ間の相互作用、等がある。たとえば、ファルコウ（Ｆａｌｋｏｗ）他，米国特許４，３５８，５３５；アーディア（Ｕｒｄｅａ）他，米国特許４，８６８，１０５及び５，１２４，２４６、フライフェルダー（Ｆｒｅｉｆｅｌｄｅｒ），Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第２版、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，サンフランシスコ，１９８２；サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）他，前出、オースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）他，前出、ヘイムズ（Ｈａｍｅｓ）他，前出、及びその他関連の参考資料を参照。ＭＧＢオリゴヌクレオチド共役物のデュプレックス安定化能力によって、標的核酸中の潜在的に閉鎖性の第２構造を最小限にすることが可能な、よりストリンジェントな条件下に於けるハイブリダイゼーションが可能となる。
【００３７】
増幅プライマー
増幅手順は、標的核酸配列の多くコピーが、連続重合および／又はライゲーションによって、通常は指数関数的に産出されるものである。ＰＣＲ等の多くの増幅反応は、反復プライマー依存重合反応を利用している。プライマーとは、第２のテンプレート核酸にハイブリダイズ可能で、ハイブリダイズされると、その第２核酸をテンプレートとして使用して、重合化酵素によって（ヌクレオチド基質の存在下に於いて）伸長されることが可能な核酸である。重合化酵素としては、非限定的に、ＤＮＡ及びＲＮＡポリメラーゼ及び逆転写酵素、等がある。異なる重合化酵素による重合化に好適な条件は当業者に周知である。たとえば、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）他、前出、オースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）他、前出、イニス（Ｉｎｎｉｓ）他、前出を参照。一般に、重合化酵素によって伸長可能となるためには、プライマーは、ブロックされない３’末端、好ましくは、フリー３’ヒドロキシル基を有さなければならない。増幅反応の生成物は、プライマーが重合化酵素によって伸長された伸長プライマーである。
【００３８】
従って、本発明の一実施例に於いてここに開示されクレームされている方法及び組成物は、ＰＣＲ等の改良された増幅反応に有用である。たとえば、米国特許４，６８３，２０２；４，６８３，１９５及び４，８００，１５９；ムリス（Ｍｕｌｌｉｓ）及びファローナ（Ｆａｌｏｏｎａ）、前出、そしてサイキ（Ｓａｉｋｉ）他、前出、を参照。ＰＣＲの重合化工程は、ＰＣＲの変性工程に必要とされる昇温に依り、非常に一般的には、好熱性バクテリアから単離されたＤＮＡポリメラーゼ等の、熱安定性重合化酵素によって触媒される。前述したように、ＰＣＲの実施に関連する問題の一つは、ＰＣＲが行われる昇温に於いてプライマーとして作用するのに十分なハイブリッド安定性を有する、比較的長いオリゴヌクレオチドプライマーが必要なことである。ＭＧＢオリゴヌクレオチド共役物は、ＰＣＲ等の増幅反応におけるプライマーとして有用である。なぜなら、オリゴヌクレオチドに対するＭＧＢの共役結合によってハイブリッド安定性が増加し、これによつて、有効なプライマー長の下限が大幅に拡大されるからである。更に、ＭＧＢオリゴヌクレオチド共役物は、より短いプライマー長が望ましい特殊なＰＣＲプロトコルに於いても有用である。これらのものとしては、非限定的に、最適プライマー長が１０ヌクレオチド以下であるディファレンシャルディスプレイ、ＤＮＡに於ける多型性のランダム増幅（ＲＡＰＤ）技術及び増幅長多型（ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｌｅｎｇｔｈ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）分析がある。リャン（Ｌｉａｎｇ）他、前出、ウィリアムズ（Ｗｉｌｌｉａｍｓ）他、前出。
【００３９】
本発明によって提供される改善は、ＰＣＲ又は、非限定的に、加水分解可能（ｈｙｄｒｏｌｙｚａｂｌｅ）プローブアッセイ、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯｓ）でのプライミング、フラグメント長多型分析、一塩基多型（ＳＮＰ）分析、マイクロサテライト分析、等、を含む、それに関連の増幅技術が使用されるすべてのタイプのアッセイ又は手順に適用可能である。これら及びその他の技術は、そのうちの少数の用途を挙げると、遺伝子マッピング、疾患関連遺伝子の同定及びスクリーニング、及び薬理遺伝学、に有用である。
【００４０】
標識化プローブを利用したアッセイ；加水分解可能プローブアッセイを含む
ＭＧＢオリゴヌクレオチド共役物のその他の利用法は、標識化プローブが標的および／又は標的の伸長生成物にハイブリダイズされ、そのハイブリダイゼーションの結果として、標識の物理的状態が変化するアッセイに見られる。プローブは、第２の核酸分子中の標的配列にハイブリダイズすることが可能な核酸分子である。たとえば、この種のアッセイの一例として、前記加水分解可能プローブアッセイは、ＤＮＡポリメラーゼ等の多くの重合化酵素は、固有の５’−３’エキソヌクレオリティック（ｅｘｏｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ）活性を有するという事実を利用する。従って、プローブが、重合化のためのテンプレートとして作用することが可能な配列にハイブリダイズされると（たとえば、増幅反応中に、プローブが二つの増幅プライマー間に位置するＤＮＡ領域にハイブリダイズされると）、上流側増幅プライマーで重合化を開始した重合化酵素は、そのプローブをエキソヌクレオリティカルに消化（ｅｘｏｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃａｌｌｙ  ｄｉｇｅｓｔｉｎｇ）することができる。もしもプローブがその標的にハイブリダイズし、このプローブがハイブリダイズされた領域を介して増幅が発生すると、そのようなプローブに付着したいなかる標識も解離される。解離されたラベルは、標識されたプローブから分離され、標識の性質に依存した、当業者に周知の方法により検出される。例えば、放射性標識化されたフラグメントは、薄層クロマトグラフィによって分離され、オートラジオグラフィによって検出可能であり、一方、蛍光標識化されたフラグメントは、適当な放射波長での観察によって、適当な励起波長での照射によって検出可能である。米国特許５，２１０，０１５を参照。
【００４１】
この技術の一つの変形例に於いて、プローブは、蛍光標識と、蛍光標識の蛍光放出を停止させるクエンチング剤、との両方を含む。この場合、前記蛍光標識は、そのクエンチング剤に対する空間関係が、たとえば、蛍光標識のプローブからのエキソヌクレオリティック解離（ｅｘｏｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ  ｒｅｌｅａｓｅ）によって、変化するまでは検出不能である。従って、その標的配列へのハイブリダイゼーションの前に、前記デュアルフルオロホア／クエンチャ標識化プローブは蛍光を発しない。フルオロホア／クエンチャ標識化プローブのハイブリダイゼーション後、それは、上流側プライマーで重合化を開始した重合化酵素のエキソヌクレオリティック活性のための基質となる。プローブのエキソヌクレオリティック崩壊によって、プローブから、従ってクエンチング剤の近傍から、蛍光標識が解離され、適当な励起波長での照射による蛍光信号の検出を可能にする。この方法は、解離された標識は作用されないプローブから分離される必要が無いという利点を有する。複数のアプローチは複数のプローブを利用し、そのそれぞれは、異なる標的配列に対して相補的であり、識別可能な標識を備え、複数の標的配列のアッセイを同時に可能にする。
【００４２】
この方法及びそれに関連の方法に於けるＭＧＢオリゴヌクレオチド共役物の利用によって、これらのアッセイをより高速に、高い感度及び識別力で行うことが可能となる。特に、完全なハイブリッドと、単一塩基不一致を有するハイブリッドとの間の識別を可能にするＭＧＢオリゴヌクレオチド共役物の高い能力によって、一塩基多型の同定等に於いて加水分解可能プローブアッセイを使用することが容易になる。後述する例２及び３は、この種のアッセイに於けるＭＧＢオリゴヌクレオチド共役物の有用性のいくつかの具体例を提供している。当業者に於いては、単一ヌクレオチド不一致を識別機能な、本発明のもののような、組成物及び方法は、複数の不一致を有する配列間を互いに識別することも可能であることは明白であろう。
【００４３】
蛍光エネルギ転移
本発明の更に別の実施例に於いて、ＭＧＢオリゴヌクレオチド共役物は、複数の蛍光標識化プローブを使用する様々な技術に利用可能である。これらのアッセイのいくつかに於いて、蛍光および／又は蛍光標識の特性の変化は、ハイブリダイゼーションをモニタするのに使用される。たとえば、蛍光共鳴エネルギ転移（ＦＲＥＴ）が、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションのインジケータとして使用された。この技術の一実施例に於いて、それぞが別の蛍光標識を含む二つのプローブが使用される。これら標識の一つは、蛍光ドナーであり、他方は蛍光アクセプタであり、蛍光ドナーの放出波長は、蛍光アクセプタの吸収波長とオーバーラップしている。これらのプローブの配列は、標的が存在する場合に、それらが標的核酸の隣接する領域にハイブリダイズし、これによって、蛍光ドナーと蛍光アクセプタとを互いに近接配置させるように選択される。標的核酸の存在時に、前記蛍光ドナーの吸収波長に対応する波長での照射によって、蛍光アクセプタから放出が起こる。これらのタイプのアッセイは、それらは同質アッセイであって、無反応プローブを除去する必要なく、明確な信号を提供する、という利点を有する。その詳細及びその他の具体例については、たとえば、ヨーロッパ特許０７０６８５及びカルデュッロ（Ｃａｒｄｕｌｌｏ）他（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：８７９０-８７９４を参照。本発明の更に別の実施例は、同じ標的核酸にハイブリダイズした二つの異なるオリゴヌクレオチド間の相互作用を測定するこれら及びそれに関連の技術に関するものである。適当な蛍光ドナー／蛍光アクセプタ対の選択は、所与の対について、蛍光ドナーの放出波長が蛍光アクセプタの吸収波長とオーバラップするという原理に基づき、当業者にとって明らかであろう。単塩基不一致を含むハイブリッドから完全ハイブリッドを識別するＭＧＢオリゴヌクレオチド共役物の高い能力によって、一塩基多型等の同定に於いてＦＲＥＴに基づく技術を使用することが容易になる。
【００４４】
蛍光クエンチングを使用するアッセイに於けるＭＧＢオリゴヌクレオチド共役物の利用
本発明の更に別の実施例に於いて、ＭＧＢオリゴヌクレオチド共役物は、蛍光クエンチングの原理を利用うるアッセイに於いて有用である。この種のアッセイの一つのバージョンに於いて、蛍光クエンチングの原理は、上述したように、加水分解可能プローブのそれらと組み合わされる。この場合、オリゴヌクレオチドプローブは、その一つの末端（通常は５’末端）に蛍光標識を有し、その反対側の末端（通常は３’末端）にクエンチング剤を有する。蛍光標識の具体例としては、非限定的に、フルオレセイン及びその誘導体、シアニン、ローダミン、フィコエリトリンがある。クエンチング剤の具体例としては、非限定的に、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）を含むローダミン、及びＵＶ又は可視光を吸収可能な組成物がある。好適な標的は、フルオレセインとその誘導体であり、好適なクエンチング剤は、ローダミン誘導体、特に、ＴＡＭＲＡである。プローブが溶液中で自由である時、又は、その標的にハイブリダイズされた時、適切な励起波長でのフルオロホアの照射によって、オリゴヌクレオチド上に於いてクエンチング剤がフルオロホアに近いことに依り、蛍光放出が起こらない。しかしながら、その標的にハイブリダイズしたプローブが、上流側プライマーで重合化を開始した重合化酵素によって、エキソヌクレオリティック加水分解を受けると、フルオロホアは、オリゴヌクレオチドから解離される。そのオリゴヌクレオチドからの解離後、それは、前記クエンチャの近傍から解離されているので、フルオロホアは適切な波長で励起された時に蛍光発光可能となるであろう。ＭＧＢオリゴヌクレオチド共役物は、単一塩基不一致を含むハイブリッドから完全ハイブリッドを識別するその高い能力によって、一塩基多型等の同定に於けるフルオロホア／クエンチャ組み合わせを含むオリゴヌクレオチドの使用を容易にする。本発明のこの態様に使用されるオリゴヌクレオチドの具体例は、共役結合フルオロホア、共役結合クエンチャ、及び共役結合ＭＧＢが含まれる。この種のアッセイは、特に、臨床用途に於いて、益々重要になりつつある。というのは、それは、その結果をリアルタイムでモニタすることが可能な均質アッセイ（即ち、分析のための生成物分離工程が不要）であるからである。たとえば、ウィットワー（Ｗｉｔｔｗｅｒ）他（１９９７）Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ２２：１３０−１３８を参照。高速の蛍光ベースの分子アッセイは、例えば、リアルタイムな外科的及び治療的用途にも使用される。
【００４５】
蛍光クエンチングの原理を使用するその他のアッセイ、又、それらのアッセイにＭＧＢオリゴヌクレオチド共役物を使用することの利点は、当業者にとって明らかであろう。当業者に於いては、蛍光標識化ＭＧＢオリゴヌクレオチド共役物は、すべてのタイプのハイブリダイゼーションアッセイの実施に於いて、速度、感度、特異性及び識別力に於いて改善をもたらすことが明らかであろう。
【００４６】
ＰＣＲクランピング
ここに記載されるように、ＭＧＢオリゴヌクレオチド共役物（ＭＧＢがオリゴヌクレオチドの５’末端に共役結合された）の、上流側プライマーからの伸長を阻止する能力は、ＭＧＢオリゴヌクレオチド共役物が、ＰＣＲクランピング等の技術に於いて使用可能であり、それらに於いて改善を提供するものであることを示すものである。たとえば、ジョヴァンナンゲリ（Ｇｉｏｖａｎｎａｎｇｅｌｉ）他（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：１００１３−１００１７を参照。オリゴヌクレオチドの５’末端にホスホロチオアートやその他の改変ヌクレオチド間リンクを追加する等の、後述する、ＭＧＢヌクレオチド共役物のその他の改変によって、ＰＣＲクランピング等の技術に於ける本発明の組成物の有用性は更に高まるであろう。
【００４７】
オリゴヌクレオチドライゲーションを利用するアッセイ
ＭＧＢオリゴヌクレオチド共役物は、標的核酸上の隣接する部位に対して相補的な、二つ以上のオリゴヌクレオチドがその標的核酸の隣接部位にハイブリダイズされ、互いに連結されるアッセイに於いて有用である。たとえば、ヨーロッパ特許３２０，３０８、ヨーロッパ特許公報３３６，７３１及び米国特許４，８８３，７５０を参照。ライゲーションのための条件は当業者に周知である。たとえば、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）他、前出、オースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）他、前出、イニス（Ｉｎｎｉｓ）他、前出、を参照。連結された核酸は、たとえば、スターティングオリゴヌクレオチドとの比較に於ける生成物のサイズの増加によって同定可能である。これらのタイプのライゲーションアッセイにより短いオリゴヌクレオチドを使用することが可能であることにより、ホモロジーの短い領域に基づくアッセイに於いて特に有用な、配列のより正確な領域のプローブが可能となる。又、ハイブリダイゼーションアッセイと同様、オリゴヌクレオチドのライゲーションを使用するこれらのタイプのライゲーションアッセイにＭＧＢオリゴヌクレオチド共役物を使用することによって、特にオリゴヌクレオチドライゲーションアッセイに於いて重要であるが、完全ハイブリッドと単一塩基不一致との間のより効率的な識別が可能となる。更に、ライゲーションアッセイは、多くの場合、非常に狭い温度最適範囲を有する。オリゴヌクレオチドのＴｍを上げるＭＧＢ共役物の能力によって、ライゲーションアッセイの温度最適範囲を拡張することが可能である。
【００４８】
ｃＤＮＡ合成
ＭＧＢオリゴヌクレオチド共役物の高い結合親和性によつて、より高いストリンジェント条件下での短いオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションが可能となる。これは、ｍＲＮＡテンプレートからのｃＤＮＡの合成に於いて重要である。ｃＤＮＡ合成は、一般的に行われているように、ｍＲＮＡテンプレートをｃＤＮＡにコピーするために逆転写酵素を利用する。逆転写用のプライマーは、通常は、オリゴデオキシチミジレート（ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｔｈｙｍｉｄｙｌａｔｅ）であり、これは、大半のｍＲＮＡ分子の３’末端に見られるポリアデニレートテール（ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｅ  ｔａｉｌ）に対して相補的である。オリゴデオキシチミデレートとポリアデニレートとの間のハイブリダイゼーションは比較的弱い為、ｃＤＮＡ合成反応は、通常、低ストリンジェント条件下で行う必要がある。しかしながら、そのような条件下では、ｍＲＮＡは、分子間二次構造を容易に得ることが知られており、その構造は逆転写酵素による伸長を阻害し、短く部分的なｃＤＮＡ分子の生成をもたらす。ＭＧＢオリゴヌクレオチド共役物の高いハイブリダイゼーション強度に依り、ｍＲＮＡテンプレート中の二次構造が最小化され、より長いｃＤＮＡ生成物の合成をもたらす、より高いストリンジェント条件下でｃＤＮＡ合成を行うことが可能となる。従って、ＭＧＢオリゴヌクレオチド共役物は、ｃＤＮＡ合成のためのプライマーとして使用されｃＤＮＡ分子の合成に於いて重合化酵素によって伸長される。１つの例として、ＭＧＢに共役しているオリゴデオキシチミデレートは、ｃＤＮＡ合成のためのプライマーとして使用される。オリゴヌクレオチド配列がｍＲＮＡテンプレートの内部領域に対して相補的なＭＧＢオリゴヌクレオチド共役物も、ｃＤＮＡ合成に使用可能である。同様に、ＭＧＢオリゴヌクレオチド共役物は、上述したように、ｃＤＮＡインデキシング等の手順にも使用可能である。従って、本発明の方法及び組成物を使用することによって、従来技術の実施によって得られたものよりも、長いｃＤＮＡ分子を得ることが可能となる。
【００４９】
核酸配列決定システム
本発明の一実施例に於いて、すべての可能なｎ量体オリゴヌクレオチドの集合体（ｎは約１０以下の整数）が、ヌクレオチド配列を決定するための加水分解可能プローブアッセイに使用される。各オリゴヌクレオチドは、別々に標識化され、解離した標識の分析によって、それらオリゴヌクレオチドのどれが標的配列にハイブリダイズしたかが示される。ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドの配列のアライメントによって、ヌクレオチド配列が提供される。
【００５０】
ＭＧＢオリゴヌクレオチド共役物は、又、最初、サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）他、前出によって記載された、チェインターミネーション法及びその派生方法、等のＤＮＡ配列決定のプライマー依存方法においても有用である。チェインターミネーション法にＭＧＢオリゴヌクレオチド共役物を使用することによって、短いプライマーを高いストリンジェント条件下で使用することが可能となり、配列決定中に於いて高い程度に不一致を区別することが可能となる。具体例としては、非限定的に、短いホモロジー領域（約２−３のアミノ酸）を共有する遺伝子の検索、及び、非常に僅かな配列情報しかない領域に於ける配列決定がある。ＭＧＢオリゴヌクレオチド共役物は、そのような短いプライマー配列決定技術に於いて有用である。
【００５１】
オリゴヌクレオチドアレイ
本発明の別実施例に於いて、ＭＧＢオリゴヌクレオチド共役物は、ハイブリダイゼーションと遺伝子発現のアレイベース（ａｒｒａｙ−ｂａｓｅｄ）分析による配列決定等の、オリゴヌクレオチドのアレイを利用する手順に於いても有用である。これらの手順に於いて、公知の異なる配列のオリゴヌクレオチドの整列したアレイ（ｏｒｄｅｒｄ  ａｒｒａｙ）を、単数又は複数のテストポリヌクレオチド、核酸又は核酸ポピュレーションへのハイブリダイゼーションのためのプラットフォームとして使用する。ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドの決定とその公知の配列のアライメントによって、テストポリヌクレオチドの配列を再構築することが可能である。たとえば、米国特許５，４９２，８０６；５，５２５，４６４及びＰＣＴ公報ＷＯ９２／１０５８８及びＷＯ９６／１７９５７を参照。アレイを構築するための材料には、非限定的に、ニトロセルロース、ガラス、シリコーンウエハ、光ファイバ、当業者に公知のもの等のアレイ構築に適したその他の材料が挙げられる。
【００５２】
現在のアレイベース配列決定及び分析方法の大きな問題点は、一つのアレイ内の異なるオリゴヌクレオチドは異なる塩基組成を有するため、それぞが異なるＴｍを有する、ことにある。従って、全部ではなないが、大半のアレイ技術の用途にとって特に重要な、単一塩基不一致を識別する能力を保持しながら、最大の感度を提供するストリンジェント条件を決定することが困難である。アレイベース配列決定及び分析技術にＭＧＢオリゴヌクレオチド共役物を使用することによって、この問題に対する解決が提供される。なぜなら、オリゴヌクレオチドに対するＭＧＢの共役結合によって、そのＴｍは塩基組成から比較的独立したものとなるからである。従って、所与の長さのＭＧＢオリゴヌクレオチド共役物のポピュレーションについて、完全一致のＴｍは、配列に拘わらず比較的狭い温度範囲内に収まる。同時に、単一ヌクレオチド不一致のＴｍは、完全一致のＴｍよりも十分低いものとなる。たとえば、後述の、例５及び６、表１１及び１２を参照。ここには、塩基組成に関連するＴｍの相違が、ＭＧＢオリゴヌクレオチド共役物において最小限にされ、かつ、これら共役物は、その識別能力を保持していることを示すデータが提供されている。このように、全てのオリゴヌクレオチドが同じ長さで、そのＭＧＢ共役物として存在するように構成されたアレイは、そのアレイ中の異なるオリゴヌクレオチド間で最小のＴｍの変化を示し、アレイ全体に対してより均質なハイブリダイゼーション条件を可能としている。これらの技術にＭＧＢオリゴヌクレオチド共役物を使用することのもう一つの利点は、それは、単一ヌクレオチド分解能を保持しながら、より短いオリゴヌクレオチドを、より高い温度（従って、より高いストリンジェンシー）で使用することを可能とすることによって、より高い感度を提供することにある。
【００５３】
アレイ技術に対する本発明の更に別の用途は、特定の細胞又は組織中に於ける遺伝子発現パターンの研究である。この場合、異なる遺伝子に対応するオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドが、表面上に配置され、たとえば、特定の細胞又は組織タイプからの核酸サンプルが、ハイブリダイゼーション条件下でそのアレイとインキュベートされる。ハイブリダイゼーションが発生するそのアレイ上の部位を検出することによって、どのオリゴヌクレオチドがハイブリダイズしたか、従って、そのサンプルが採取された特定細胞又は組織中に於いてどの遺伝子が活性であるか、を判定することができる。
【００５４】
アレイ方法は、野生タイプと変異配列とが表面上の整列アレイ中に配置されている、変異の同定のためにも使用可能である。ポリヌクレオチドサンプルをアレイと共にストリンジェント条件下でハイブリダイゼーションし、そのアレイ中のどのオリゴヌクレオチドがポリヌクレオチドにハイブリダイズするかを判定することによって、どのポリヌクレオチドが野生タイプ又は変異配列を有するか否かを判定することができる。このアレイ技術の適用に於いて、ＭＧＢオリゴヌクレオチド共役物の高い識別能力は特に有用である。
【００５５】
構造的考察
オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、及び核酸という用語は、改変された又は非自然発生のヌクレオチドを含むポリマを有するＤＮＡ又はＲＮＡ（又はその両方）の一本鎖又は二本鎖ポリマ、又は、非限定的に、ペプチド核酸（ニールセン（Ｎｉｅｌｓｅｎ）他（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ２５４：１４９７−１５００；及びデミドフ（Ｄｅｍｉｄｏｖ）他（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９２：２６３７−２６４１）、ビシクロ（ｂｉｃｙｃｌｏ）ＤＮＡオリゴマ（ボッリ（Ｂｏｌｌｉ）他（１９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４：４６６０−４６６７）及びそれらに関連の構造を含むＤＮＡ又はＲＮＡへの安定的な塩基対合可能なその他のタイプのポリマを指すのに相互交換可能に使用される。単数又は複数のＭＧＢモイエティ、および／又は単数又は複数の標識、クエンチング剤、等を、前記オリゴヌクレオチドの５’末端、３’末端、またはその内部に付着させることができる。好適なＭＧＢモイエティは、１，２−ジヒドロ−（３Ｈ）−ピロロ［３，２−ｅ］インドール−７−カルボキシレート及びＮ−メチルピロール−４−カルボックス−２−アミドのマルティマー（ｍｕｌｔｉｍｅｒｓ）を含む。特に好適であるのは、１，２−ジヒドロ−（３Ｈ）−ピロロ［３，２−ｅ］インドール−７−カルボキシレートのトリマー（ＣＤＰＩ3）と、Ｎ−メチルピロール−４−カルボックス−２−アミドのペンタマー（ＭＰＣ5）である。
【００５６】
ピラゾロピリミジン（ＰＣＴ  ＷＯ９０／１４３５３；及び共有の米国特許出願０９／０５４，８３０）、７−デアザプリン及びそそれらの誘導体を含む改変ヌクレオチドが好適であり、その他の改変ヌクレオチドは当業者にとって公知である。オリゴヌクレオチドは天然に得てもよいが、当該技術に於いて周知の方法を使用して化学的に合成されることが好ましい。たとえば、キャルサーズ（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ），米国特許４，４５８，０６６を参照。オリゴヌクレオチドの酵素合成および／又は改変も本発明に含まれる。本発明に於いて好適なものは、一本鎖で、１００ヌクレオチド以下、好ましくは５０ヌクレオチド以下、更に好ましくはは３０ヌクレオチド以下、最も好ましくは２０ヌクレオチド以下の長さを有するＤＮＡオリゴヌクレオチドである。
【００５７】
ＭＧＢオリゴヌクレオチド共役物は、自然発生の塩基、アデニン、シトシン、グアニン、チミン及びウラシル、の他に単数又は複数の改変塩基を有するものとすることができる。改変塩基は、単数又は複数の官能基の追加又は欠如、複素環構造の違い（即ち、炭素の複素原子との置換又はその逆）および／又は、塩基に対する単数又は複数のリンカーアーム構造の付着、によって自然発生塩基と異なるものと考えられる。自然発生塩基、改変塩基及び塩基類似体のすべての互変体が、本発明のＭＧＢオリゴヌクレオチド共役物に於いて有用である。
【００５８】
同様に、ＭＧＢオリゴヌクレオチド共役物のヌクレオチドサブユニットに単数又は複数の改変糖又は糖類似体を含ませてもよい。糖改変としては、非限定的に、糖の２’、３’および／又は４’炭素原子に対する置換基の付着、糖の異なるエピマー形状、グリコシド結合のα又はβ構造の相違、アノマー性の相違、等がある。糖モイエティは、非限定的に、ペントース、デオキシペントース、ヘキソース、デオキシヘキソース、リボース、デオキシリボース、グルコース、アラビノース、ペントフラノース、キシロース、リキソース、及びシクロペンチルが含まれる。
【００５９】
更に、ＭＧＢオリゴヌクレオチド共役物中に、改変されたヌクレオチド間リンクを含ませてもよい。そのような改変リンクには、非限定的に、ペプチド、燐酸塩（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、ホスフォジエステル（ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒ）、ホスホトリエステル（ｐｈｏｓｐｈｏｔｒｉｅｓｔｅｒ）、アルキルリン酸塩（ａｌｋｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、アルカンフォスフォネート（ａｌｋａｎｅｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ）、チオホスファート（ｔｈｉｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、ホスホロチオアート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ）、ホスホロジチオアート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉｔｈｉｏａｔｅ）、メチルホスホネート（ｍｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ）、ホスホルアミデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅ）、置換ホスホルアミデート、等が含まれる。プローブおよび／又はプライマーとして作用するオリゴヌクレオチドに使用可能な、塩基、糖および／又はヌクレオチド間リンクの様々な改変は、当業者にとって自明であろう。
【００６０】
本発明に使用される改変塩基は、更に、非限定的に、共有のＰＣＴ公報ＷＯ９０／１４３５３に開示されている、アデニンとグアニンとのピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン類似体を含む。このタイプの好適な塩基類似体は、グアニン類似体６−アミノ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４（５Ｈ）−オン（６−ａｍｉｎｏ−１Ｈ−ｐｙｒａｚｏｌｏ［３，４−ｄ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ−４（５Ｈ）−ｏｎｅ）（ｐｐＧ）及びアデニン類似体４−アミノ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン（ｐｐＡ）を含む。キサンチン類似体１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４（５Ｈ）−６（７Ｈ）−ジオン（１Ｈ−ｐｙｒａｚｏｌｏ［３，４−ｄ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ−４（５Ｈ）−６（７Ｈ）−ｄｉｏｎｅ）（ｐｐＸ）も使用される。これらの塩基類似体は、オリゴヌクレオチド中に含まれる時、ハイブリダイゼーションを強化し、不一致識別を改善する。共有の同時係属米国特許出願０９／０５４，８３０を参照。後述の例３は、加水分解可能プローブアッセイに使用されるＭＧＢオリゴヌクレオチド共役物中にピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン塩基類似体を含ませることの有利な効果を示している（図４及び５）。本発明に使用される改変塩基は、更に、共有ＰＣＴ公報ＷＯ９７／１２８９６に開示されているように、選択的結合相補的オリゴヌクレオチドに使用されるものを含ませることができる。特に好適なものは、２−アミノアデニン及び２−チオチミン等の浅溝を改変したものである。
【００６１】
ＭＧＢオリゴヌクレオチド共役物は、ＭＧＢ以外に、その他のペンダントモイエティを含むものとすることができる。具体例としては、非限定的に、検出可能標識（本明細書のその他の箇所を参照）、米国特許５，６５９，０２２及びＰＣＴ公報ＷＯ９０／１４３５３，ＷＯ９３／０３７３６，ＷＯ９４／１７０９２及びＷＯ９６／４０７１１に開示されているもののような、架橋剤、米国特許５，４１９，９６６及び５，５１２，６６７に開示されているもののようなテールモイエティ、米国特許５，５７４，１４２に開示されているもののようなペプチドリンカー、米国特許５，６４６，１２６に開示されているもののようなステロール、及びその他の脂肪好性基、当業者に知られているように、挿入剤、レポーター基、親電子基、及びキレート剤、及び当業者に知られているその他のペンダントモイエティが含まれる。
【００６２】
前記ＭＧＢは、オリゴヌクレオチドの一方又は両方の末端に付着させることができる。それに加えて、又は、それに代えて、単数又は複数のＭＧＢを、そのオリゴヌクレオチドの長さに応じて、オリゴヌクレオチドの内部に取り付けることができる。一般に、ＭＧＢをオリゴヌクレオチドのいずれかの末端に共役結合させることによって、最も高い程度のハイブリッド安定性が提供される。なぜなら、オリゴヌクレオチドデュプレックスの溶解は末端で始まるからである。それにも拘わらず、もしオリゴヌクレオチドによって形成されるデュプレックスの両末端が、たとえば、高いＧ＋Ｃ含有率によって、比較的安定的であるならば、オリゴヌクレオチドの内部（たとえばＡ＋Ｔリッチ配列の近く）にＭＧＢを付着させることによっても安定性が増加するであろう。ＭＧＢオリゴヌクレオチド共役物の意図される使用法によつて、共役結合ＭＧＢの位置に制限が課せられる可能性がある。たとえば、もしもオリゴヌクレオチドがプライマーとして使用されるように構成されるならば、３’ヒドロキシ基は、自由で、重合化酵素によって伸長可能なものでなければならない。或いは、標識化５’末端をプロセッシングするオリゴヌクレオチドを必要とするアッセイではＭＧＢの内部又は３’末端付着を必要とするであろう。
【００６３】
ＭＧＢオリゴヌクレオチド共役物内に於けるＭＧＢの位置は、又、そのような共役物の識別特性にも影響を与えるかもしれない。デュプレックス内の非対合領域によって、誤対合塩基（単数又は複数）の近傍の浅溝の形状が変化するであろう。ＭＧＢは、完全一致ＤＮＡデュプレックスの浅溝内に最も良好にフィットするので、浅溝の形状変化をもたらす不一致によつて、ＭＧＢの不一致を含む領域に対する結合強度が低下するであろう。従って、そのようなハイブリッドを安定化させるＭＧＢの能力が低下し、これによって、ＭＧＢオリゴヌクレオチド共役物の完全一致デュプレックスから不一致を識別する能力が増大するであろう。他方、もしも不一致がＭＧＢオリゴヌクレオチド共役物に対して相補的な領域の外側に存在している場合には、同じ長さの、非共役結合オリゴヌクレオチドとＭＧＢ共役結合オリゴヌクレオチドの識別能力はおよそ同じであると予想される。オリゴヌクレオチドプローブが、単一塩基対不一致を識別する能力はその長さに依存するので、短いオリゴヌクレオチドほど不一致の識別に於いて有効である。このコンテクストに於いてＭＧＢオリゴヌクレオチド共役物を使用することの主たる利点は、より識別力が強い、従来技術に使用されているもの（即ち、２０量体又はそれ以下）と比較して遥かに短いオリゴヌクレオチドを、ＭＧＢ共役の顕著な安定化作用によって、使用可能であることにある。
【００６４】
ＭＧＢオリゴヌクレオチド共役物中に於いてグアノシンをイノシンに置換することによって、ハイブリッド安定性を向上させることが可能であることも発見された。なんら特定の理論によって限定されることを望むものではないが、恐らく、イノシン置換によつて、浅溝の部分形状がＭＧＢとの相互作用にとってより好適なものとなり、これによって、ＭＧＢ浅溝相互作用の強度を増大させるものと考えられる。このデュプレックス安定性に対する貢献によって、Ｇ：Ｃ塩基対と比較して弱いＩ：Ｃ塩基対の塩基対合が相殺される。例４は、鎖の一つがイノシン含有オリゴヌクレオチドである、ハイブリッドの増加したＴｍｓを示すデータを提供している。
【００６５】
ここに開示されたものに関連する、その他の浅溝結合モイエティも、ハイブリダイゼーションとオリゴヌクレオチドのプライマー機能を容易にするべく同様に作用するものであることが当業者にとっては自明であろう。
【００６６】
標識
ＭＧＢオリゴヌクレオチド共役物は、核酸化学の技術に於いて知られているすべての標識によって標識化することができる。核酸プローブに使用されるのに適した検出可能標識又はタグは当業者に周知であり、具体的には、非限定的に、放射性同位元素、発色団、フルオロホア、化学発光及び電子発光剤、磁気標識、免疫学的標識、リガンド及び酵素標識、がある。適当な標識として、更に、質量標識（ｍａｓｓ  ｌａｂｅｌｓ）、及び、組み合わせ化学ライブラリの逆重畳（ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎ）に使用されるもの、たとえば、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）、ガスクロマトグラフィ、質量スペクトル分析、等によって認識可能な、ものがある。
【００６７】
プローブ標識化の方法は、当業者にとって周知であり、具体的には、化学的及び酵素的方法がある。たとえば、反応性化学基をオリゴヌクレオチドの特定部位に導入することは当業者に周知である。特定部位に位置する反応性化学基を含むオリゴヌクレオチドは、化学的方法によって標識をプローブに結合させるために、相補的反応基（たとえば、ヌクレオチド反応基を含むオリゴヌクレオチドを電子親和性反応基に取り付けられた標識と反応させることができる）に取り付けられた標識と組み合わせることができる。標識の具体例と標識をオリゴヌクレオチドに取り付けるための具体的な方法は、たとえば、米国特許５，２１０，０１５；Ｋｅｓｓｌｅｒ（ｅｄ．），Ｎｏｎｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ，１９９２；Ｋｒｉｃｋａ（ｅｄ．）Ｎｏｎｉｓｏｔｏｐｉｃ  ＤＮＡ  Ｐｒｏｂｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，１９９２；Ｈｏｗａｒｄ（ｅｄ．）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｎｏｎｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，Ａｐｐｌｅｔｏｎ＆Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，１９９３に開示されている。オリゴヌクレオチドの非特異的化学標識化は、オリゴヌクレオチドを、たとえば、ヌクレオチド塩基の特定の官能基と反応する化学薬品とを組み合わせ、同時又はその後に、そのオリゴヌクレオチドを標識と反応させることに、によって達成することができる。たとえば、ドレイパー（Ｄｒａｐｅｒ）他（１９８０）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１９：１７７４−１７８１を参照。標識のオリゴヌクレオチドへの酵素的導入は、酵素改変又は標識化前駆体を使用したオリゴヌクレオチドの重合化、或いは、既存のオリゴヌクレオチドに標識を酵素的に付加することによって、達成可能である。たとえば、米国特許５，４４９，７６７を参照。改変酵素の具体例としては、非限定的に、ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、ＲＮＡポリメラーゼ、等がある。既存のオリゴヌクレオチドに標識を付加することが可能な酵素の具体例としては、非限定的に、キナーゼ、ターミナルトランスフェラーゼ、リガーゼ、グリコシラーゼ、等がある。
【００６８】
本発明のいくつかの実施例に於いて、蛍光標識（フルオロホア）および／又は蛍光クエンチング剤を有するＭＧＢオリゴヌクレオチド共役物が使用される。一好適実施例に於いて、ＭＧＢオリゴヌクレオチド共役物は、フルオロホアと、クエンチング剤との両方を含有する。蛍光標識としては、非限定的に、フルオロホア、ローダミン、シアニン、フィコエリトリン、その他、当業者に公知のフルオレセインがある。クエンチング剤は、放出された蛍光の量を減少させるべく（即ち、蛍光標識の放出をクエンチする）、フルオロホアによって放出されたエネルギを吸収することが可能な物質である。異なるフルオロホアは、異なるクエンチング剤によってクエンチされる。一般に、特定のフルオロホア／クエンチング剤対のスペクトル特性は、クエンチャの単数又は複数の吸収波長がフルオロホアの単数又は複数の放出波長とオーバラップするものである。好適なフルオロホア／クエンチング剤対は、フルオレセイン／テトラメチルローダミンであり、上述した特性に従い放出及び励起波長を比較することによって、当業者により、その他のフルオロホア／クエンチング剤対を選択することも可能である。
【００６９】
ＰＣＲ等の昇温を使用する増幅アッセイ、又は、好熱性酵素を利用するその他の手順での使用のために、前記標識は、昇温に於いて安定的なものとされる。重合化を含むアッセイのためには、標識は、その重合化酵素の活動の障害とならないものとされる。標識は、オリゴヌクレオチドの５’および／又は３’末端に存在させることができ、および／又は、その内部に存在させることができる。この標識は、前記オリゴヌクレオチドの塩基、糖又は燐酸塩モイエティのいずれか、又は、それ自身がこれらモイエティの一つに付着したなんらかのリンカー基に付着させることができる。
【００７０】
例
例１：ＰＣＲプライマーとしてのＭＧＢオリゴヌクレオチド共役物
この例に於いて、短いオリゴヌクレオチドのハイブリッド安定性を大幅に改善する改変によって、オリゴヌクレオチドがＰＣＲプライマーとして作用することも可能となることを示す。ＣＤＰＩ3：１，２−ジヒドロ−（３Ｈ）−ピロロ［３，２−ｅ］インドール−７−カルボキシレートのトリマーやＣＤＰＩは、抗腫瘍抗生ＣＣ−１０６５のサブユニットの合成非反応性誘導体である（ハーレイ（Ｈｕｒｌｅｙ）他（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２６：８４３−８４４）。このオリゴペプチドは、Ａ−Ｔリッチな二本鎖ＤＮＡの浅溝に対して非常に高い親和性を有するＤＮＡ浅溝バインダ（ＭＧＢ）である。同じ長さの非改変オリゴヌクレオチドと比較して、ＣＤＰＩ3オリゴヌクレオチドは、相補的一本鎖ＤＮＡと非常に安定的で特異的なハイブリッドを形成することが報告されている（ルクタノフ（Ｌｕｋｈｔａｎｏｖ）他（１９９５）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．６：４１８−４２６；アフォニア（Ａｆｏｎｉａ）他（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３：３１９９−３２０４）。この例は、ＣＤＰＩ3との短いオリゴヌクレオチドの共役物がＰＣＲ用の有効なプライマーを形成し、従って、短いプライマーでのプライミングの産出高と正確性を改善するものであることを示すものでる。８量体及びＧ−Ｃリッチ６量体程度の短いオリゴヌクレオチドで、ＭＧＢと共役結合された場合、特異的に増幅反応をプライミングすることが可能である。従って、オリゴヌクレオチドをここに記載の条件下でＭＧＢと共役結合することが、オリゴヌクレオチドの３’末端が重合化酵素によって伸長される能力の障害となることはない。
【００７１】
オリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチド共役物
この研究に使用されたオリゴヌクレオチドは、Ｍ１３ｍｐ１９ゲノムの様々な領域に対して相補的なものであった。オリゴヌクレオチド合成は、その製造業者によって供給された１μｍｏｌ結合プログラムを使用してＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｍｏｄｅｌ３９４ＤＮＡ合成装置によって行われた。ＣＤＰＩ3は、記載されている（ルクタノフ（Ｌｕｋｈｔａｎｏｖ）他，前出）ようにＯＤＮｓの５’末端に合成後に共役結合された。ＯＤＮｓは、１００ｍＭトリエチルアミン酢酸塩（ｐＨ７．５）緩衝液中のアセトニトリル勾配（通常０−４５％）によって溶出された逆相カラム上でのＨＰＬＣによって純化された。非改変ＯＤＮｓの純度は、ポリアクリルアミド８Ｍ尿素ゲルで電気泳動し、その後、銀染色（Ｄａｉｉｃｈｉ）による可視化によって評価された。前記オリゴヌクレオチドＣＤＰＩ3共役物の純度は、上述した分析ＨＰＬＣによって確認された。全てのオリゴヌクレオチド調合物は、純度＞９５％であった。
【００７２】
ＣＤＰＩ3の調合は、ＷＯ９６／３２４９６（反応スキーム１及びそれに付随のテキスト）に記載されており、ＭＧＢオリゴヌクレオチド共役物の形成は、オリゴヌクレオチドを含むＣＤＰＩ3の２，３，５，６−テトラフルオロフェニルエステルを、５’アミノヘキシル燐酸塩エステルとの反応によって行われた（ＷＯ９６／３２４９６の反応スキーム３を参照）。図１は、ＣＤＰＩ3分子と、それを介してそれがオリゴヌクレオチドの５’又は３’末端に取り付けられたリンカーの構造を図示している。この例に使用されたオリゴヌクレオチドの配列は表１に図示されている。
【００７３】
熱変性研究
ＭＧＢオリゴヌクレオチド共役物又は非改変オリゴヌクレオチドと、その相補物との間で形成されるハイブリッドを、ＰＴＰ−６自動多細胞温度プログラマを使用して、ラムダ２Ｓ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）分光測定器上で、１４０ｍＭ  ＫＣｌ，１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2及び２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）中で０．５℃／分の速度で溶解した。各オリゴヌクレオチド（２μＭ）を、十分な相補的オリゴヌクレオチドと混合して１：１の比率とした。溶解の前、サンプルを１００℃で変性し、次に、１０分間かけて開始温度にまで冷却した。これらハイブリッドの溶解温度（Ｔｍ）を、派生最大数から決定し、これらを表１にまとめた。表１の「配列」のカラムに於いて、ＭＧＢは、オリゴヌクレオチドの５’燐酸塩基にエステル化されたヘキシルアミンリンカーを介して共役結合されたＣＤＰＩ3の存在を示す（図１参照）。
【００７４】
【表１】
0004638032.tif 000002
【００７５】
ＰＣＲ反応
全てのＰＣＲ反応は、パーキン−エルマー  シータスＤＮＡサーモサイクラーで行われ、これらには、マグネシウムを含有しないＰＣＲ緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）、１．６ｍＭ  ＭｇＣｌ2，５０μＭ  ｄＮＴＰ，５０ｎＭの各プライマー、０．２μｇ  Ｍ１３ｍｐ１９ＤＮＡ及び１−２ユニットのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）が含まれていた。各反応物の最終容量は、５０μｌであった。標準ＰＣＲプロファイルは以下の通りであった：９４度で３分間、９４℃で１分間を３０サイクル、アニーリング温度で１．５分間、７２℃で３０秒間、最後に、７２℃で５分間、そして４℃でのソーキング。８量体と６量体の場合、ＰＣＲは、８量体プライマーの場合は５５℃、６量体の場合は５０℃の出発アニーリング温度で、タッチダウン式（ドン，アール・エイチ（Ｄｏｎ，Ｒ．Ｈ．）他（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：４００８）に行われた。各後続サイクルは、４１℃（８量体の場合）又は３７度（６量体の場合）に達するまで１℃低いアニーリング温度とし、最後の１５サイクルはこれらの最終温度でアニールされた。タッチダウンＰＣＲによって、短いプライマーを使用した時の生成物の産出高が最大になることが示された（ドン，アール・エイチ（Ｄｏｎ，Ｒ．Ｈ．）他、前出）。１６量体、１２量体及び１０量体の増幅を、２％アガロースゲルでの１０μｌの反応混合物の電気泳動と、臭化エチジウム染色によるバンドの検出によって分析した。８量体と６量体プライマーの増幅は、８％ポリアクリルアミドシーケンシングゲル上での５μｌの反応混合物の電気泳動と銀着色（Ｄａｉｉｃｈｉ）によるバンドの検出によって分析した。
【００７６】
結果
ハイブリッド安定性
表１は、ＭＧＢ−ＯＤＮ共役物と相補的ＯＤＮとによって形成されたデュプレックスの溶解温度（Ｔｍ）を示し、末端共役結合ＣＤＰＩ3の、様々な長さとＧ−Ｃ組成のデュプレックスのデュプレックス安定性に対する効果を示している。１６量体デュプレックスの場合、係留ＭＧＢ（２２℃）に起因するＴｍの最も大きな増加は、前記基が７つのＡ−Ｔ塩基対の連続によってフランクされた場合に得られた（オリゴヌクレオチド１３−Ｃと１３を比較）。この長さのＡ−Ｔリッチな配列は、ＣＤＰＩ3トリペプチドのための良好な結合部位として作用する浅溝を形成する。調べられた全てのハイブリッドの内、オリゴヌクレオチド４−Ｃによって形成された１６量体デュプレックスが、最も高い絶対Ｔｍ（６６℃）を示した。この異常に高いＴｍは、前記係留ＣＤＰＩ3基に隣接する６つのＡ−Ｔ塩基対を含むその他の点ではＧ−Ｃリッチなデュプレックスを反映している。反対に、ＭＧＢ共役結合部位（１２−Ｃ）をフランクするＧ−Ｃリッチ配列を有する１６量体デュプレックスは、非改変デュプレックス（１２）よりも僅かに９℃安定していただけであった。このデュプレックス中のＣＤＰＩ3基は、それほど有利ではないＧ−Ｃリッチ浅溝に結合する。
【００７７】
表１の短いプライマーに関して報告したＴｍは、１６量体について同じ傾向のものである。５’末端でＭＧＢに隣接するＡ−Ｔリッチ領域を有するプライマーは、Ｇ−Ｃリッチ領域を有するものよりも高いＴｍを有しており、それらは、その非共役結合対応物と比較してより大きなＴｍの増加を示した。たとえば、１０量体３−Ｃ及び７−Ｃは、十分に特異的ＰＣＲプライミングのために適切な範囲内である４６−４９℃のＴｍ値を有していた。
【００７８】
プライミング能力
前記ＯＤＮ及びＭＧＢ−ＯＤＮ共役物を、増幅基質（ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）としてＭ１３ｍｐ１９一本鎖ＤＮＡを使用したＰＣＲプライマーとしてテストした。典型的には、同じオリゴヌクレオチドの非改変及びＣＤＰＩ3共役結合バージョンが比較された。これらは、アニーリング温度のみを変化されたＰＣＲプロファイルを使用して、リバースプライマーとして、パラレルにテストされた。ＭＧＢオリゴヌクレオチド共役物を使用した時には、通常よりも低い濃度のプライマー（＜０．１μＭ）を使用した。これによって、ＣＤＰＩ3基の固定作用に依る、これら共役物のＡ−Ｔリッチ配列との擬似相互作用を最小限にした（アフォニア，アイ（Ａｆｏｎｉｎａ，Ｉ）他、前出）。プライマー結合の特異性を確認するために、前記プライマーを、この研究のそれぞれの増幅生成物が、ＤｄｅＩ制限部位を含むように構成した。増幅生成物のサイズの測定に加えて（図２及び３）、選択されたＰＣＲ反応混合物のアリコットを、ＤｄｅＩで処理し、２％アガロースゲルで分析した。全てのケースに於いて、予想された制限フラグメントが得られた。
【００７９】
図２Ａ及び２Ｂは、非改変プライマーと比較して、１６量体ＭＧＢ−ＯＤＮ共役物の改善されたプライミング能力を示している。増幅の条件は、アニーリング温度を除いて同じであった。アニーリング温度は、図２Ａの場合は４５℃、図２Ｂの場合は６８℃であった。これら１６量体オリゴヌクレオチドの全部が低い温度でプライミングしたが（図２Ａ、予想生成物サイズの凡例を参照）、５’−ＣＤＰＩ3基を含むもののみが、より高い温度でプライミングした（図２Ｂ、予想生成物サイズの凡例を参照）。
【００８０】
図２Ｃは、１０ないし１２ヌクレオチド長の短いプライマーに対してＣＤＰＩ3を共役結合することの利点を確認するものである。両共役結合プライマーは、予測される配列を効果的に増幅した（図２Ｃの予想生成物サイズの凡例を参照）。係留ＭＧＢを有さない同じプライマーは、同じ条件下で増幅した時、臭化エチジウム染色によって検出可能な生成物を形成しなかった。
【００８１】
図３は、８量体（図４Ａ）及び６量体（図４Ｂ）程度の短いプライマーの場合でも特異的プライミングが可能であることを示している。１０量体のフォワードプライマーがこれらの反応において使用された。低いレベルの生成物によって、タッチダウンＰＣＲ（Ｄｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，前出）と、銀染色によるバンドの検出が必要であった。各ケースに於いて、予想サイズのバンド（図３Ａ及び３Ｂの予測生成物サイズの凡例を参照）は、逆プライマーがＣＤＰＩ3基に共役結合された時にのみ、観察された。
【００８２】
いかなる特定の理論にも限定されることを望むものではないが、非共役結合オリゴヌクレオチドを含むものとの比較に於ける、ＭＧＢオリゴヌクレオチド共役物を有するハイブリッドの安定性の増加は、デュプレックス領域中の係留ＭＧＢの結合に依るものと思われる。ＭＧＢの結合領域は、恐らく６塩基対の範囲で延出している。重要なことは、プライマー伸長はハイブリッド安定性にのみ依存するものて考えられ、ＭＧＢの存在によって抑制されないので、ＭＧＢ共役結合オリゴヌクレオチドの３’末端が、まだ、重合化酵素によって認識されることである。
【００８３】
例２：ＭＧＢオリゴヌクレオチド共役物の加水分解可能プローブアッセイに於ける使用法
この例に於いて、ＭＧＢの短いオリゴヌクレオチドへの共役結合によって、そのＭＧＢオリゴヌクレオチド共役物が加水分解可能プローブアッセイに使用された場合に、良好なハイブリッド安定性と、完全ハイブリッドと単一塩基不一致との間の良好な識別性とが得られることが示される。ウィットワー（Ｗｉｔｔｗｅｒ）他（１９９７ａ）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ２２：１３０−１３８によって記載された手順を使用した。この方法に於いて、追加的にフロオロホアとクエンチング剤とを含むＭＧＢオリゴヌクレオチド共役物を、加水分解可能プローブアッセイのプローブとして使用した。このタイプのプローブは、予想増幅生成物に対して相補的となるように構成され、フルオロホアがクエンチング剤に近接していることに依り、蛍光を非常に僅かしか、或いは全く放出しない。前記プローブと増幅生成物とのハイブリッドの形成によって、もしもポリメラーゼが上流側プライマーで重合化を開始した場合に、ポリメラーゼプロセッシングデュプレックス特異的エキソヌクレアーゼ活性によるプローブのエキソヌクレオリティック加水分解のための基質である構造を作り出す。前記エキソヌクレアーゼ作用によって、ハイブリダイズされたオリゴヌクレオチド、従って、前記クエンチング剤の近傍、からフルオロホアが放出され、これによって蛍光の増加をもたらす。従って、このアッセイに於いて、蛍光の増加は、前記フルオロホア／クエンチャ標識化ＭＧＢオリゴヌクレオチド共役物プローブと所望の増幅生成物との間のデュプレックス形成に依存する。その詳細については、米国特許５，２１０，０１５；リヴァック（Ｌｉｖａｋ）他（１９９５）ＰＣＲ  Ｍｅｔｈ．Ａｐｐ．４：３５７−３６２；及びハイド（Ｈｅｉｄ）他（１９９６）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．６：９８６−９９４を参照。
【００８４】
フルオロホア（単数又は複数）とクエンチャ（単数又は複数）とを含むＭＧＢオリゴヌクレオチド共役物の合成
ＣＤＰＩ3−ＣＰＧ支持体（スキーム１）
４−［（２−フェニル）−１，３−ジオキソラン−４−イル］−１−ブタノール（４−［（２−Ｐｈｅｎｙｌ）−１，３−ｄｉｏｘｏｌａｎ−４−ｙｌ］−１−ｂｕｔａｎｏｌ）（１）。
乾燥ＤＭＦ（１０ｍＬ）中の１，２，６−トリヒドロキシヘキサン（ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｅ）（１０．０ｇ，７４．６ｍｍｏｌ）とベンザアルデヒドジメチルアセタル（ｂｅｎｚａｌｄｅｈｙｄｅ  ｄｉｍｅｔｈｙｌａｃｅｔａｌ）（１５．０ｇ，９８．７ｍｍｏｌ）との溶液に、アンバーリスト１５（Ａｍｂｅｒｌｙｓｔ  １５）（５．０ｇ）を添加した。この混合物を、５分間１００℃で攪拌し、次に、冷却し濾過した。その濾過物を、濃縮し、得られた残滓を酢酸エチル中で再溶解した。水と塩水とで洗浄した後、前記溶液をＮａ2ＳＯ4上で乾燥させた。溶媒の気化後に得られた粗生成物を、酢酸エチルで溶出しシリカ上でクロマトグラフ化した。適切なフラクションの濃度によって、１１．０ｇ（６６％）のタイトル（ｔｉｔｌｅ）生成物（ジアステレオマーの混合物）が、無色オイル：1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3，３００ＭＨｚ，ｐｐｍ）７．４８（ｍ，２Ｈ），７．３９（ｍ，３Ｈ），５．９２（ｓ，０．４Ｈ），５．８０（ｓ，０．６Ｈ），４．３−４．１（ｍ，２Ｈ），３．６４（ｍ，３Ｈ），１．８−１．４（ｍ，６Ｈ）として得られた。
【００８５】
２−フェニル−４−（４−フタルイミドブタ−１−イル）−１，３−ジオキソラン（２−Ｐｈｅｎｙｌ−４−（４−ｐｈｔａｌｉｍｉｄｏｂｕｔ−１−ｙｌ）−１，３−ｄｉｏｘｏｌａｎｅ）（２）。
４０ｍＬのＴＨＦ中のジエチルアゾジカルボキシレート（８．６ｇ，４９．４ｍｍｏｌ）の溶液を、６０ｍＬのＴＨＦ中の１（１０．０ｇ，４５．０ｍｍｏｌ），トリフェニルホスフィン（１３．０ｇ，４９．５ｍｍｏｌ）及びフタルイミド（ｐｈｔｈａｌｉｍｉｄｅ）（７．３ｇ，４９．７ｍｍｏｌ）の低温（冷浴）溶液にゆっくりと添加した。室温で一晩保持した後、前記溶液を濃縮し、その残滓を、エーテル（〜１５０ｍＬ）で粉末化してトリフェニルホスフィン酸化物を沈殿させ、次に、これを濾過によって除去した。その濾過物を、濃縮して、油状残滓を得て、これを、ヘキサン中の３３％酢酸エチルで溶出しシリカ上でクロマトグラフ化した。純粋生成物フラクションの濃縮、その後の真空下での乾燥によって、所望の生成物が、半固体（ジアステレオマーの混合物）として得られた：1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3，３００ＭＨｚ，ｐｐｍ）７．８５（ｍ，２Ｈ），７．７１（ｍ，２Ｈ），７．４６（ｍ，２Ｈ），７．３６（ｍ，３Ｈ），５．９０（ｓ，０．４Ｈ），５．７８（ｓ．０．６Ｈ），４．３−４．０−（ｍ，２Ｈ），３．６８（ｍ，３Ｈ），１．９−１．３（ｍ，６Ｈ）。
【００８６】
６−［Ｎ−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）アミノ］−（Ｒ，Ｓ）−１，２−ヘキサンジオール（３）。
５０ｍＬのエタノール中の２（１３．５ｇ，３８．５ｍｍｏｌ）の懸濁液を、１．９ｍＬ（３９．１ｍｍｏｌ）ヒドラジン一水化物で処理し、リフラックスで３時間加熱した。この混合物を冷却し、１Ｍ  ＨＣｌでｐＨ３にまで酸化した。形成された沈殿物を、濾過除去し、その濾過物を、エーテルで抽出し、濃縮して半固体物を得た。それを、２−プロパノル中で懸濁し、不溶性無機塩を分離した。濾過後、溶液を真空中で濃縮し、その大半が２−プロパノルによって汚染された所望生成物である５．０ｇのシロップを得た。この材料を、追加の純化無しで、次の反応に使用した。
【００８７】
メタノール（２５ｍＬ）とＣＨ2Ｃｌ2（１０ｍＬ）との混合物中の上記粗アミノジオールの溶液に対して、トリエチルアミン（７ｍＬ）と、その後、９−フルオレニルメチルＮ−スクシンイミジルカルボネート（８．０ｇ，２３．７ｍｍｏｌ）を添加した。１時間の攪拌後、前記反応混合物を酢酸（５ｍＬ）で処理し、過剰トリエチルアミンを中和し、濃縮した。残滓を水で粉末化することによって、白色の固体が得られ、これを、水とエーテルとで洗浄した。真空乾燥によって、５．５ｇ（４０％）の分析的に純粋な生成物が得られた。即ち、1Ｈ  ＮＭＲ（ＯＭＳＯ−ｄ６，３００ＭＨｚ，ｐｐｍ）７．８８（ｄ，２Ｈ），７．６８（ｄ，２Ｈ），７．４１（ｔ，２Ｈ），７．３３（ｔ，２Ｈ），４．４５（ｔ，１Ｈ），４．３７（ｄ，１Ｈ），４．２８（ｄ，２Ｈ），４．２１（ｍ，１Ｈ），３．３５（ｍ，１Ｈ），３．２４（ｍ，２Ｈ），２．９６（ｍ，２Ｈ），１．３９（ｍ，４Ｈ），１．２１（ｍ，２Ｈ）。
【００８８】
６−［Ｎ−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）アミノ−２−０−（４，４’−ジメトキシトリフェニルメチル）−（Ｒ，Ｓ）−１，２−ヘキサンジオール（４）。
２０ｍＬの乾燥ピリジン中の３（２．０ｇ，５．６ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン（０．１ｇ）と４，４’−ジメトキシトリチル塩化物（４．０ｇ，１１．８ｍｍｏｌ）を添加した。２時間の攪拌後、溶液を、濃縮し、その結果得られた油性残滓を酢酸エチル中で再溶解した。溶液を水、塩水で洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥した。溶剤の気化によって、粗生成物が得られ、これを、ヘキサン中の５０％酢酸エチルで溶出してシリカ上でクロマトグラフ化した。前記溶剤の気化後に、黄色のアモルファス固体（２．８ｇ，７９％）としてタイトル生成物が得られた。即ち、（ＣＤＣｌ3，３００ＭＨｚ，ｐｐｍ）７．７７（ｄ，２Ｈ），７．５９（ｄ，２Ｈ），７．５−７．１（ｍ，１７Ｈ），６．８４（ｔ，４Ｈ），４．８０（ｔ，１Ｈ），４．４０（ｄ，２Ｈ），４．２２（ｔ，１Ｈ），３．８０（ｓ，６Ｈ），３．２−３．０（ｍ，４Ｈ），１．６−１．１（ｍ，６Ｈ）。
【００８９】
２，３，５，６−テトラフルオロフェニル６−［Ｎ−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）アミノ］−（Ｒ，Ｓ）−２−（４，４’−ジメトキシトリフェニルメトキシ）−ヘクス−１−イル  ブタンジオエート（２，３，５，６−Ｔｅｔｒａｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ  ６−［Ｎ−（９−ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）ａｍｉｎｏ］−（Ｒ，Ｓ）−２−（４，４’−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙ）−ｈｅｘ−１−ｙｌ  ｂｕｔａｎｅｄｉｏａｔｅ）（５）。
５ｍＬの乾燥ピリジン中の４（１．０ｇ，１．６ｍｍｏｌ）溶液に対して、無水コハク酸（１．０ｇ，１０ｍｍｏｌ）を添加し、その後、１−メチルイミダゾール（０．０２ｍＬ）を添加した。この反応混合物を５５℃で８時間攪拌し、水（１ｍＬ）で処理した。真空下での濃縮によって、ＣＨＣｌ3と冷（ｃｏｌｄ）１０％クエン酸とに区画された（ｐａｒｔｉｔｉｏｎｅｄ）油が得られた。有機相を水で洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥した。溶剤の気化によつて、アモルファス固体（０．９９ｇ）として粗酸が得られ、この材料を、更に純化することなく、次の工程に給した。
【００９０】
５ｍＬの乾燥ＣＨ2Ｃｌ2中の上記酸の溶液に対して、トリエチルアミン（０．２５ｍＬ）と、その後、０．２５ｍＬ（１．４ｍｍｏｌ）の２，３，５，６−テトラフルオロフェニルトリフルオロアセテートを添加した。ギャンパー，エイチ・ビー（Ｇａｍｐｅｒ，Ｈ．Ｂ．）他（１９９３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２１：１４５。室温で１５分間保持した後、前記溶液をシリカゲルカラムに接触させた。前記カラムのヘキサン中の３３％酢酸エチルでの溶出と、純粋生成物フラクションの濃縮によって、白色アモルファス固体として所望のＴＦＰエステル１．０ｇ（７１％）が得られた。即ち、（ＣＤＣｌ3，３００ＭＨｚ，ｐｐｍ），７．７６（ｄ，２Ｈ），７．５８（ｄ，２Ｈ），７．５−７．１（ｍ，１７Ｈ），７．００（ｍ，１Ｈ），６．８４（ｔ，４Ｈ），５．１（ｍ，１Ｈ），４．７９（ｔ，１Ｈ），４．３８（ｄ，２Ｈ），４．２２（ｔ，１Ｈ），３．７８（ｓ，６Ｈ），３．２−２．９（ｍ，６Ｈ），２．８１（ｍ，２Ｈ），１．６１（ｍ，２Ｈ），１．４５（ｍ，２Ｈ），１．２６（ｍ，２Ｈ）。
【００９１】
ＣＰＧ６の作成
２０ｍＬの乾燥ピリジン中の５（０．５ｇ，０．５７ｍｍｏｌ）の溶液に対して、長鎖アミノアルキルＣＰＧ（５００Ａ）（５．０ｇ）、その後、１−メチルイミダゾール（１．０ｍＬ）を添加した。室温で１５時間旋回させた後、懸濁液を無水酢酸（３ｍＬ）で処理して未処理アミノ基をキャップ（ｃａｐ）した。次に、ＣＰＧをＤＭＦ，アセトン、エーテルで洗浄し、乾燥させた。ＣＰＧをＤＭＴｒ含有量に関して分析し（アトキンソン，ティ（Ａｔｋｉｎｓｏｎ，Ｔ．）他（１９８４）Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｂｙ  Ｐｈｏｓｐｈｉｔｅ−Ｔｒｉｅｓｔｅｒ  Ｍｅｔｈｏｄ．Ｉｎ“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ”．（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，Ｅｄ．）ｐｐ．３５−８１．ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ．）、４９μｍｏｌ／ｇのローディング（ｌｏａｄｉｎｇ）を有していることが判った。
【００９２】
ＣＰＧ７の作成
ＣＰＧ６（２．８ｇ）を、２０ｍＬの０．２Ｍ  １，８−ジアゾビシクロ［５．４．０］ウンデク−７−エン（１，５−５）（１，８−ｄｉａｚｏｂｉｃｙｃｌｏ［５．４．０］ｕｎｄｅｃ−７−ｅｎｅ（１，５−５））（ＤＢＵ）で２０分間処理することにより脱保護（ｄｅｐｒｏｔｅｃｔ）した。このＣＰＧを、ＤＭＦとエーテルでよく洗浄し、乾燥し、８ｍＬのＤＭＦ中の、ＣＤＰＩ3−ＴＦＰ（ルクタノフ，イー・エイ（Ｌｕｋｈｔａｎｏｖ，Ｅ．Ａ．）他（１９９５）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，６：４１８）（２００ｍｇ）とＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１ｍＬ）との溶液中で再懸濁させた。３日間の旋回後、前記ＣＰＧをＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、アセトン、エーテルで洗浄し、乾燥した。未反応アミノ基を、１５分間、ピリジン中の１０％無水酢酸の処理によってキャップし、ＣＰＧを、上述したように、洗浄、乾燥した。
【００９３】
スキーム１：ＣＤＰＩ3−ＣＰＧ支持体（下記）の作成
【００９４】
【化１】
0004638032.tif 000003
【００９５】
ＣＤＰＩ3−ＣＰＧ支持体を使用したオリゴヌクレオチド合成（スキーム２）
トリチル−オフ３’−ＣＤＰＩ3オリゴヌクレオチドを、一つの例外、即ち、ＣＤＰＩ3モイエティのヨウ素化を避けるために酸化工程に於いて０．０１Ｍ（標準の０．１Ｍの代りに）ヨウ素溶液を使用した、ことを除いて、製造業者によって供給されたプロトコルに従って、ＡＢＩ３９４上のＣＤＰＩ3−ＣＰＧ支持体上で標準３’−ホスホルアミデートケミストリ（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）を使用して１μｍｏｌスケールで作成した。ＴＡＭＲＡ色素（下記を参照）の合成後導入のためのアミノリンカーを導入するために、保護アミノプロピルｐｐＧとアミノプロピルｐｐＡホスホルアミデートを、それぞれ、標準のグアノシン、又はアデノシンホスホルアミデートの代りに、所望の工程で利用した。共有のＰＣＴ  ＷＯ９０／１４３５３を参照。
【００９６】
スキーム２：ＣＤＰＩ3−ＣＰＧ支持体（下記）を使用した３’−ＣＤＰＩ3の導入
【００９７】
【化２】
0004638032.tif 000004
【００９８】
６−ＦＡＭ及びＴＥＴフルオロホア（スキーム３）の組み込みと共役物の単離
６−ＦＡＭ（６−カルボキシフルオレセイン）又はＴＥＦ（６−カルボキシ−４，７，２’，７’−テトラクロロフルオレセイン）を、製造業者によって供給されたプロトコルに従って、対応の６−ＦＡＭ及びＴＥＴホスホルアミデート（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用した上述の自動化オリゴヌクレオチド合成の最後の工程で導入した。脱保護後、改変ＯＤＮを、ｐＨ７．５（０．１Ｍ  トリエチルアンモニウムアセテート）に緩衝されたアセトニトリル（０−６０％）の勾配で溶出して４．６ｘ２５０ｍｍ，Ｃ−１８カラム（Ｄｙｎａｍａｘ−３００，Ｒａｉｎｉｎ）上での逆相クロマトグラフィによって純化した。所望のフラクションを、ｎ−ブタノールでの抽出によって〜５０μＬの容量に濃縮し、その後、アセトン中のＬｉＣｌＯ4の２％溶液（１．２ｍＬ）によって希釈した。これによって得られた沈殿物を、遠心分離によって収集し、そのペレットを、アセトン（２ｘ１．２ｍＬ）で洗浄し、真空乾燥させた。
【００９９】
スキーム３：６−ＦＡＭ及びＴＥＴホスホルアミデートを使用した５’末端でのフルオロホアの導入（下記）
【０１００】
【化３】
0004638032.tif 000005
【０１０１】
ＴＡＭＲＡ残基の合成後導入（スキーム４）
ＴＡＭＲＡ（テトラメチルローダミン）は、製造業者によって供給されたプロトコルに従って、ＴＡＭＲＡ−Ｎ−ヒドロキシサクシニミドエステル（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）とオリゴヌクレオチドの反応によって上記共役物中に導入された。これらのコンディションの下、ＴＡＭＲＡモイエティは、オリゴヌクレオチド中のｐｐＧ又はｐｐＡ残基に結合したアミノ基に添加された。２つの色素（フルオレセインとＴＡＭＲＡ）によって標識されたＣＤＰＩ3−ＯＤＮ共役物の精製は、２０％ＰＡＧＥの変成によって達成され、所望のバンドは切出され、更に、前記共役物は、３７℃で一晩、０．１Ｍトリエチルアンモニウムアセテート（１０ｍＬ）（ｐＨ７．５）中でゲルスライスをインキュベーションすることによって抽出された。最後に、前記共役物は、上述の逆層ＨＰＬＣによって抽出物から単離された。
【０１０２】
スキーム４：内部ｐｐＧ又はｐｐＡ残基でのＴＡＭＲＡクエンチャの合成後導入（下記）
【０１０３】
【化４】
0004638032.tif 000006
【０１０４】
アッセイ
反応混合物は、４０ｍＭ  ＮａＣｌ，２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ８．９，５ｍＭ  ＭｇＳＯ4，０．０５％（ｗ／ｖ）牛血清アルブミン、４つのｄＮＴＰをそれぞれ１２５μＭ、１ｎｇテンプレート０．５μＭ各プライマー、０．５μＭプローブ（フルオロホア／クエンチャ標識化ＭＧＢオリゴヌクレオチド共役物）及び、反応容積１０μｌ毎に０．５μｌのＴａｑポリメラーゼとを含有していた。４０サイクルの増幅を行った。各サイクルは、変性のために９４℃で０秒（即ち、温度は９４℃に昇温され、その後すぐにアニーリング／伸長温度にまで下げられた）、その後、合成アニーリング／伸長温度で１５秒であった。前記アニーリング／伸長温度は反応物毎に異なり、各ケースについて特定される。
【０１０５】
アッセイは、ウィットワー（Ｗｉｔｔｗｅｒ）他（１９９７ａ）Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２２：１３０−１３８の方法に従って行われ、アイダホテクノロジー（Ｉｄａｈｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）社から市販のライトサイクラー（Ｌｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ）（登録商標）を使用して蛍光測定を行った。ウィットワー（Ｗｉｔｔｗｅｒ）他（１９９７ｂ）Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２２：１７６−１８１。フルオレセイン蛍光を、４８５ｎｍでの励起と、５１８−５３０ｎｍの放出の検出で測定した。
【０１０６】
結果
ＭＧＢ（ＣＤＰＩ3）に共役結合していないもの、又は共役結合しているものの長さの異なるプローブを使用して、様々なアニーリング／伸長温度で実験を行った。全てのプローブは、上述したように、ヘキシリンカーを介して５’末端に共役結合したカルボキシアミドフルオレセインの分子、３’末端に共役結合したテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）の分子とを含有していた。
【０１０７】
完全一致配列と単一ヌクレオチド不一致含有配列との間の、ハイブリダイゼーションに対するＭＧＢ共役結合の効果を、加水分解可能プローブアッセイで１２量体オリゴヌクレオチドについて評価した。各実験に於いて、夫々が異なるプローブを含有する、４つのサンプルを使用した。これらプローブは、標的配列に対して完全に相補的（即ち、完全一致）であるか、若しくは、単一塩基不一致を有しており、後述するように、オリゴヌクレオチドの３’末端にＭＧＢ共役結合を有しているか、もしくはそれを欠如していた。実験は６５℃のアニーリング／伸長温度で行われた。ＭＧＢを含有しないオリゴヌクレオチドは、３０サイクルの増幅を通じてベースラインレベルの蛍光量を提供した。標的に対する完全相補性を有するＭＧＢ共役結合１２量体は、その増幅プロセスの始まりから徐々に増加する蛍光量を示し、第１８サイクルから蛍光量の大幅な増大を示した。単一ヌクレオチド不一致を有するＭＧＢ共役結合１２量体は、ベースラインに近い蛍光量レベルを示し、それらは完全一致配列によって発生されたレベルからはっきりと識別出来るものであった。
【０１０８】
共役結合ＭＧＢ含有、又は非含有１０量体オリゴヌクレオチドの振る舞いも、６５℃のアニーリング／伸長温度で調べた。１０量体の場合、そのバックグランドはより高く、より可変的であった。それにも拘わらず、非共役結合１０量体（完全一致又は単一ヌクレオチド不一致）をアッセイに使用した時にはバックグランドシグナルのみが得られたのに対して、完全相補性を有するＭＧＢ共役結合１０量体を使用して得られた信号は、単一塩基不一致を有するＭＧＢ共役結合１０量体を使用して得られたシグナルから容易に識別可能であった。
【０１０９】
これらの結果から、短いオリゴヌクレオチドに対するＭＧＢの共役結合によって、付着ＭＧＢを有さないオリゴヌクレオチドと比較して、そのような共役結合オリゴヌクレオチドによって形成されたハイブリッドが大きく安定化されることが明白である。尚、全てのケースに於いて、完全相補性プローブと単一塩基不一致を有するプローブとの間のハイブリッド安定性（その後の増幅サイクルでの蛍光量レベルの違いによって判る）の相違は、共役結合ＭＢＧを有するプローブに於いてより顕著であり（非共役結合プローブと比較して）、これはＭＧＢの共役結合が短いオリゴヌクレオチドプローブの識別力を増加させるのに役立つことを示している。
【０１１０】
例３：ヌクレオチド類似体の、ハイブリダイゼーション強度及びＭＧＢオリゴヌクレオチド共役物の識別能力に対する影響
前記共役物が、更に、ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンヌクレオチド類似体も含む場合に、ＭＧＢオリゴヌクレオチド共役物の識別力の更なる増加が得られる。このシステムに於いて、標的配列は、プラスミドｐＳＰ１８９に含まれるＥ．ｃｏｌｉ  ｓｕｐＦ遺伝子に位置する（図４，配列識別番号４０）。パーリス（Ｐａｒｒｉｓ）他（１９９２）Ｇｅｎｅ  １１７：１−５を参照。増幅に使用されるプライマーの結合部位は、プライマー１及びプライマー２として示され、プライマー１は、図４に図示されたものと同一の配列と極性を有し、プライマー２は、図４に図示されたものに対して逆相補的である配列と極性を有する。５’末端がフルオレセインで標識化され、３’末端がＴＡＭＲＡとＣＤＰＩ3とで標識化された１５量体プローブが、図４に示されているように、これらプライマー間の約３７５のヌクレオチド内の領域に対して相補的となるように構成された。このプローブを、図４に図示し、後述するように、それぞれが、前記プローブ配列に対して異なる単一塩基不一致を有する、一連のテンプレートを使用してテストした。
【０１１１】
プライマー配列
フォワード増幅プライマーは次の配列を有している
５’−ＣＴＧＧＧＴＧＡＧＣＡＡＡＡＡＣＡＧＧＡＡＧＧＣ−３ ’ 配列識別番号１４
リバースプライマーは次の配列を有している
５’−ＴＧＴＧＡＴＧＣＴＣＧＴＣＡＧＧＧＧＧＧ −３ ’  配列識別番号１５
プローブの配列
前記１５量体は次の配列を有している
５’−ＧＧＧＴＴＣＣＣＧＡＧＣＧＧＣ  配列識別番号１６
テンプレート配列
【０１１２】
この研究に使用されたプローブに対して相補的な前記テンプレートの１５ヌクレオチド領域を、改変して、図４に図示する一連の点変異を作り出した。これら変異テンプレートのそれぞれを、前記１５量体プローブと別々のアッセイで使用した。テンプレートのこの領域内の変異配列は、次の通りであった。尚、不一致ヌクレオチドは、太文字と下線によって示されている。
５’−ＧＧＧＴＴＣＣＣＧＡＧＣＧＧＣ（完全一致）  配列識別番号１７
５’−ＧＡＧＴＴＣＣＣＧＡＧＣＧＧＣ（３２Ｇ−Ａ不一致）配列識別番号１８
５’−ＧＧＧＴＴＴＣＣＧＡＧＣＧＧＣ（３６Ｃ−Ｔ不一致）配列識別番号１９
５’−ＧＧＧＴＴＧＣＣＧＡＧＣＧＧＣ（３６Ｃ−Ｇ不一致）配列識別番号２０
５’−ＧＧＧＴＴＡＣＣＧＡＧＣＧＧＣ（３６Ｃ−Ａ不一致）配列識別番号２１
５’−ＧＧＧＴＴＣＴＣＧＡＧＣＧＧＣ（３７Ｃ−Ｔ不一致）配列識別番号２２
５’−ＧＧＧＴＴＣＡＣＧＡＧＣＧＧＣ（３７Ｃ−Ａ不一致）配列識別番号２３
５’−ＧＧＧＴＴＣＣＣＣＡＧＣＧＧＣ（３９Ｇ−Ｃ不一致）配列識別番号２４
５’−ＧＧＧＴＴＣＣＣＧＴＧＣＧＧＣ（４０Ａ−Ｔ不一致）配列識別番号２５
５’−ＧＧＧＴＴＣＣＣＧＡＡＣＧＧＣ（４１Ｇ−Ａ不一致）配列識別番号２６
５’−ＧＧＧＴＴＣＣＣＧＡＣＣＧＧＣ（４１Ｇ−Ｃ不一致）配列識別番号２７
５’−ＧＧＧＴＴＣＣＣＧＡＧＣＡＧＣ（４３Ｇ−Ａ不一致）配列識別番号２８
５’−ＧＧＧＴＴＣＣＣＧＡＧＣＴＧＣ（４３Ｇ−Ｔ不一致）配列識別番号２９
５’−ＧＧＧＴＴＣＣＣＧＡＧＣＧＴＣ（４４Ｇ−Ｔ不一致）配列識別番号３０
【０１１３】
前記アッセイは、ウィットワー（Ｗｉｔｔｗｅｒ）（１９９７ａ，ｂ，前出）に従って行われた。図５は、追加的に全てのグアニン残基がグアニン類似体６−アミノ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４（５Ｈ）−オン（ｐｐＧ）によって置換されたＭＧＢ共役結合１５量体が、アニーリング／伸長温度が７５℃で行われるアッセイに使用された場合、単一塩基不一致を有するプローブによるシグナルの発生が、完全に抑制され、完全一致プローブによって発生されるシグナルのレベルに対してなんの影響も無い、ということを示している。
【０１１４】
従って、ＭＧＢ共役結合と、改変ヌクレオチドとの置換と、適切な反応条件との組み合わせによって、完全一致ハイブリッドと単一ヌクレオチド不一致を含むハイブリッドとの間の識別が高いストリンジェンシーで可能となり、短いオリゴヌクレオチドを使用したハイブリダイゼーション反応に於いて、かつてない程度の特異性が可能となるのである。
【０１１５】
例４：塩基組成とオリゴヌクレオチドバックボーンの、ＭＧＢオリゴヌクレオチド共役物のハイブリッド安定性に対する影響
材料及び方法
オリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）の合成
全てのＯＤＮは、製造業者によって供給されたプロトコルに従って、ＡＢＩ３９４合成装置で１μｍｏｌの適当なＣＰＧ支持体から作られた。２’−デオキシリボ及び２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドの保護β−シアノエチルホスホルアミデート、ＣＰＧ支持体、脱ブロック化（ｄｅｂｌｏｃｋｉｎｇ）溶液、キャップ剤、酸化溶液及びテトラゾール溶液は、グレンリサーチ（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）から購入された。５’−アミノヘキシル改変は、Ｎ−（４−モノメトキシトリチル）−６−アミノ−１−ヘキサノールホスホルアミデートリンカー（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して導入された。３’−アミノヘキシル及び３’−ヘキサノール改変は、前述したように作成されたＣＰＧを使用して導入された。ペトリー（Ｐｅｔｒｉｅ）他（１９９２）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．３：８５−８７を参照。プレパレーティブ（ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ）ＨＰＬＣ純化、脱トリチル及びブタノール沈殿物に使用したその他すべての方法は、前述したように行われた。リード（Ｒｅｅｄ）他（１９９１）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．２：２１７−２２５。全ての純化されたオクタヌクレオチドは、０．１Ｍトリエチルアミンアセテート緩衝液中の０−３０％アセトニトリルの勾配で、２ｍｌ／分の流速で２０分間に渡って、Ｃ−１８ＨＰＬＣ（カラム２５０ｘ４．６ｍｍ）によって分析された。ポンプ制御とデータ処理とは、マッキントッシュコンピュータ上のライニンダイナマックス（Ｒａｉｎｉｎ  Ｄｙｎａｍａｘ）クロマトグラフィックソフトウエアパッケージを使用して行われた。ＯＤＮ純度は、ｅＣＡＰTMカートリッジ（Ｂｅｃｋｍａｎ，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）を備えるＰ／ＡＣＥTM２０００シリーズを使用してキャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）によって確認された。前記オクタヌクレオチドは、Ｃ−１８ＨＰＬＣにより＞９５％の純度であり、ＣＧＥ上に一つの大きなピークを示した。記載されているように熱変性研究を行った。ルクタノフ（Ｌｕｋｈｔａｎｏｖ）他（１９９５）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．６：４１８−４２６；ルクタノフ（Ｌｕｋｈｔａｎｏｖ）他（１９９６）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．７：５６４−５６７。これらハイブリッドの溶解温度（Ｔmax値）を、第１導出最大値（Ａ260の時間変化）から判定し、表７−１０に示す。
【０１１６】
ＣＤＰＩ3−テールド（ｔａｉｌｅｄ）ＯＤＮ共役物の合成
１，２−ジヒドロ（３Ｈ）−ピロロ［３，２−ｅ］インドール−７−カルボキシレートトリマー（ＣＤＰＩ3）をＯＤＮに共役結合するための方法は既に公開されている。ルクタノフ（Ｌｕｋｈｔａｎｏｖ）他（１９９５）、前出。全ての（ＣＤＰＩ3）−テールドオクタヌクレオチドは、反応混合物から単離され、そして、必要は場合には、０．１ＭトリエチルアンモニウムアセテートｐＨ７．５中のアセトニトリル（モノ−ＣＤＰＩ3−テールドＯＤＮの場合は０−６０％、ビス−ＣＤＰＩ3−テールドＯＤＮの場合は０−８０％）の勾配を使用して、分析用（４．６ｘ２５０ｎｍ）ＰＬＲＰ−Ｓカラム（Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｌａｂｓ）によって再純化された。前記カラムは、７０−７５℃でインキュベートされた。作成された全てのＯＤＮ−ＣＤＰＩ3共役物は、分析され、記載されているように特徴付けられた。ルクタノフ（Ｌｕｋｈｔａｎｏｖ）他（１９９５）前出。
【０１１７】
オクタヌクレオチドとその誘導体のモル吸光係数
前記オクタヌクレオチドとその誘導体の濃度を、分光測光法によって測定した。非改変オクタデオキシリボヌクレオチドのモル吸光係数は、ヘビ毒ヌクレアーゼによる完全な加水分解の前後にＯＤＮの吸収度を測定することによって測定された。シャバロワ（Ｓｈａｂａｒｏｖａ）他（１９８１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．９：５７４７−５７６１。この値により、既知の特異的活性を有する32Ｐ標識化ＣＤＰＩ3−テールド共役物を作成し、そのε260値を記載のように測定した。ロコフ（Ｌｏｋｈｏｖ）他（１９９２）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．３：４１４−４１９。この研究に使用された全てのオクタデオキシリボヌクレオチドとそのＣＤＰＩ3誘導体のモル吸光係数は、非改変ＯＤＮ，モノ−ＣＤＰＩ3及びジ−ＣＤＰＩ3誘導体の順番に、以下の通りである。ｄ（ｐＴ）8ｐ，６５．８，１１０．１，１７８．１／ｍＭ／ｃｍ；ｄ（ｐＡ）8ｐ，８１．９，１５０．０，２１８．０／ｍＭ／ｃｍ；ｄ（ｐＡｐＧｐＣｐＧｐＧｐＡｐＴｐＧｐ），７４．０，１６２．９，２３０．９／ｍＭ／ｃｍ；ｄ（ｐＣｐＡｐＴｐＣｐＣｐＧｐＣｐＴｐ），６５．０．１３６．９，２０４．９／ｍＭ／ｃｍ。これらの吸光係数を使用して、その他全てのバックボーン改変オクタヌクレオチドとそのＣＤＰＩ3誘導体の濃度を測定した。デオキシイノシン−含有ＯＤＮのε260値を計算するために、４．６／ｍＭ／ｃｍの値とヒポキサンチン基の数との積を、対応のｄＧ−含有ＯＤＮの吸光係数から引いた。
【０１１８】
結果
ＡＴ−リッチデュプレックスに共役結合したＣＤＰＩ3残基
抗生ＣＣ−１０６５（レイノルズ（Ｒｅｙｎｏｌｄｓ）他（１９８５）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２４：６２２８−６２３７）及び、ＣＤＰＩ3を含むその多数の合成誘導体（ボーガー（Ｂｏｇｅｒ）他（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９２：３６４２−３６４９）は、大半のＭＧＢと同様、二本鎖ＤＮＡのＡＴリッチ部位に対する強い親和性を有する。ＣＣ−１０６５は、更に、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド中のＡＴ−リッチ配列に結合し、それをアルキル化する。キム（Ｋｉｍ）他（１９９５）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．５：１４９−１５４。我々は、ＯＤＮ共役結合ＣＤＰＩ3の結合特性は、フリーＣＤＰＩ3について観察されるものと類似しているものと予測した。我々は、以前に、ＣＤＰＩnモイエティを有するオリゴチミジレートのポリアデニル酸への結合について報告した。ルクタノフ（Ｌｕｋｈｔａｎｏｖ）他（１９９５，１９９６）前出。ここで、我々は、より総括的な研究のためのモデルシステムとして短いｄ（ｐＴ）8＊ｄ（ｐＡ）8デュプレックスを使用する。ＣＣ−１０６５−ＤＮＡ複合体（スキャヒル（Ｓｃａｈｉｌｌ）他（１９９０）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２９：２８５２−２８６０）のＮＭＲ分析と、ＡＴリッチＤＮＡデュプレックスに対するＣＤＰＩ3と臭化エチジウムの非競合的結合（ボーガー（Ｂｏｇｅｒ）他（１９９２）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５７：１２７７−１２８４）とは、これらの化合物がＤＮＡ浅溝において５−６塩基対に渡って延出していることを示した。従って、８量体デュプレックスは、前記共役結合ＣＤＰＩ3残基と本研究に使用されるリンカーとを収納するのに十分な長さの二本鎖ＤＮＡである。
【０１１９】
ＤＮＡ，２’−Ｏ−メチルＲＮＡ又はＤＮＡホスホロチオアートバックボーンを有し、その片方又は両方の末端にＣＤＰＩ3残基を有する様々なオクタ−アデニレート及びオクタチミジレート誘導体が準備された。ＣＤＰＩ3と、５’及び３’−テールドＯＤＮ共役物のためのリンカーの構造が図１に示されている。これらの配列から構築された相補的デュプレックスを、溶解し、そのＴmaxデータを表２に示す。複雑なストランドは等モル比でとられたが、全てのケースに於いて単一溶解変化のみが観察され、デュプレックス以外のより高度な構造形成の可能性を完全に排除することはできない。しかしながらｄ（ｐＴ）8＊ポリ（ｄＡ）／ポリ（ｒＡ）について行われた過去の研究によって、ＣＤＰＩ3−テールドＯＤＮがトリプレックス構造を形成する傾向は明らかにされなかった。ルクタノフ（Ｌｕｋｈｔａｎｏｖ）他（１９９５）前出。
【０１２０】
予想通り、両方の鎖にレギュラーＤＮＡバックボーンを有するＡＴデュプレックスについて、最も劇的な安定化が達成された。これらの条件下に於いて弱いｄ（ｐＴ）8＊ｄ（ｐＡ）8複合体のＴmaxは、それらのストランドの一つがＭＧＢに共役結合された後、５３℃から６１℃に増大した。デュプレックス上に於けるＭＧＢの位置決めは、いくらかのストランド特異的効果を与えた。ＣＤＰＩ3モイエティがオクタチミジレートの３’末端にあるか、５’末端にあるかは、デュプレックス安定性に対して大きな影響を与えなかったが（Ｔmax＝５６または５８℃）、オリゴアデニレート配列に共役結合された時には大きな影響を与えた。３’− ＣＤＰＩ3残基を有するオクタ−アデニレートは、最も安定的な相補的複合体を形成し（Ｔmax＝６１℃）、５’−テールド共役物は、このシリーズに於いて最も低い安定性の複合体を形成した（Ｔmax＝５３℃）。
【０１２１】
表３は、末端Ａ−Ｔリッチ配列とのより長いＤＮＡデュプレックスの二つの例を示し、これらも、又、係留ＣＤＰＩ3残基によって安定化された。これらのテトラデカヌクレオチドは、上述したＡ8Ｔ8ホモポリマー配列に対して、混合又は交互ＡＴ配列の領域に於けるＣＤＰＩ3結合の効果をテストするために構成されたものである。これらのＯＤＮの３’末端へのＣＤＰＩ3共役結合は、相補的デュプレックスのＴmax値を２１−２２℃に増大させた。この値は、ｄ（ｐＴ）8＊ｄ（ｐＡ）8デュプレックス（４０−４９℃）について観察されたものの半分ではあるが、ＣＤＰＩ3残基の全体の自由エネルギ寄与は、両ケースに於いて推定され、互いにほほ同等であることが判った。ΔＴmaxの減少が予想された。なぜなら、非改変ヘキサデカヌクレオチドデュプレックス（表３）は、ｄ（ｐＴ）8＊ｄ（ｐＡ）8デュプレックスよりもはるかに安定的であったからである（Ｔmax＝４８−４９対１２−１４℃）。
【０１２２】
ホスホジエステル基をホスホロチオアートによって置換することによるＯＤＮのヌクレアーゼ抵抗の向上は、十分に確立されている。エックスタイン（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ）他（１９７０）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３：５５８−５６４；アガワル（Ａｇａｗａｌ）他（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：７５９５−７５９９。しかしながら、この改変によって、一般的に、ＯＤＮの相補的一本鎖標的に対する親和性は低下する。たとえば、サッグス（Ｓｕｇｇｓ）他（１９８５）Ｎｕｃｅｌｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：５７０７−５７１６；コススティック（Ｃｏｓｓｔｉｃｋ）他（１９８５）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２４：３６３０−３６３８；ラ・プランチェ（ＬａＰｌａｎｃｈｅ）他（１９８６）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：９０８１−９０９３、及びスタイン（Ｓｔｅｉｎ）他（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：３２０９−３２２１を参照。ここで、我々は、そのｄ（ｐＴ）8ストランド又は両方のストランドにホスホロチオアートバックボーンを有するｄ（ｐＴ）8＊ｄ（ｐＡ）8デュプレックスが、大幅に不安定化され、０℃を超えてはなんら溶解変化を示さなかったことを見出した（表２）。ｄ（ｐＡ）8のホスホロチオアート類似体は、非改変ｄ（ｐＴ）8と弱いハイブリッドを形成した（Ｔmax＝８−９℃）。一つのＣＤＰＩ3残基の共役結合によつて、これらすべてのデュプレックスのＴmaxは、３５−５６℃の範囲となり、いくつかのケースに於けるその安定化効果は、類似体非改変複合体のＴmaxを＞４５℃上回るものであった。この知見の意味するものは、燐酸塩酸素原子を硫黄と置換するこによっては、ＣＤＰＩ3モイエティを結合するために最適なものではあっても、ＡＴリッチ領域の浅溝のジオメトリを変化させるものとは考えられない、ということである。
【０１２３】
水溶液中でＡ形状をとり、非常に広い浅溝を有することが知られているＲＮＡ＊ＲＮＡデュプレックスに対して、係留ＣＤＰＩ3は、ほとんどなんの影響も与えない。たとえば、２’−Ｏ−Ｍｅ−ｒ（ｐＴ）8＊２’−Ｏ−Ｍｅ−ｒ（ｐＡ）8デュプレックスのいずれかのストランドの３’末端にＣＤＰＩ3残基を付加することは、４−９℃のＴmaxの中程度の有効な作用を示した。ＲＮＡ＊ＤＮＡハイブリッドのジオメトリは、Ａデュプレックス構造とＢデュプレックス構造との中間であり、ここで研究された２’−Ｏ−Ｍｅ−ＲＮＡ＊ＤＮＡデュプレックスは、いくらかのバックボーンに関する選好性はあるものの、かなりのレベルのＭＧＢによる安定化を示した。２’−Ｏ−Ｍｅ−ＲＮＡストランドにＭＧＢ残基を係留することは、より有効であって、２’−Ｏ−Ｍｅ−ｒ（ｐＴ）8＊ｄ（ｐＡ）8の場合には１８℃、そしてｄ（ｐＴ）8＊２’−Ｏ−Ｍｅ−ｒ（ｐＡ）8デュプレックスの場合には＞２１−２２℃のＴmaxの増加を提供した。これに対して、ＣＤＰＩ3残基がｄ（ｐＡ）8ストランドに結合された場合には、安定性に対する効果はより低いものであることが判った（ΔＴmax＝７℃）。ＣＤＰＩ3−テールドｄ（ｐＴ）8は、オクタデオキシミジレートの５’末端に対するＭＧＢの共役結合によって、２’−Ｏ−Ｍｅ−ｒ（ｐＡ）8とのデュプレックスにおいて＞１９℃の安定化を提供し、これに対して３’−ＣＤＰＩ3はこの複合体の安定性に対してほとんどなんの影響も与えなかった点に於いて、普通ではない。これらのデータが、ポリ（ｒＡ）＊ｄ（ｐＴ）8について得られた過去に報告された結果（ルクタノフ（Ｌｕｋｈｔａｎｏｖ）他（１９９５，１９９６、前出）と非常に良好に一致していることは、ＲＮＡ＊ＤＮＡデュプレックスの浅溝の２’−ＯＨにメチル基を付加することによっては、共役結合ＣＤＰＩ3の結合特性は大きく変化しない、ということを示している。様々なバックボーン構造を有するデュプレックス中のＡＴリッチ部位に結合した非共役結合ＣＣ−１０６５についても類似の結果が得られている。キム（Ｋｉｍ）他（１９９５）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．５：４９−５７。
【０１２４】
【表２】
0004638032.tif 000007
【０１２５】
【表３】
0004638032.tif 000008
【０１２６】
【表４】
0004638032.tif 000009
【０１２７】
ＧＣリッチオクタヌクレオチドデュプレックスに対するＭＧＢ残基付加の影響
Ａ／Ｔ選好性が、ＣＤＰＩオリゴマーを含めて大半のＭＧＢの結合特異性を支配することはよく認識されている。この選好性は、恐らく、溝の疎水性、深さ、狭幅によるものである。これらを合せて、浅溝の三日月形状のＭＧＢ分子の完全な等螺旋（ｉｓｏｈｅｌｉｃａｌ）や、ファンデルワールス（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｗａａｌｓ）適合性が提供される。自由ＣＤＰＩ3は、ポリ（ｄＡ）＊ポリ（ｄＴ）のみならず、低い強度ではあるが、ポリ（ｄＧ）＊ポリ（ｄＣ）にも結合することが示された。ボーガー（Ｂｏｇｅｒ）他（１９９２）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５７：１２７７−１２８４。従って、ＣＤＰＩ3残基が短いＧＣリッチで混合されたデュプレックスを安定化させる能力を調べることに興味が持たれた。表４は、浅溝が改変された、上述したものと同じＧＣリッチオクタヌクレオチドに対するＭＧＢ改変の影響を示している。３’ヘキシルアミノテールを有するテスト配列は、４１℃のデュプレックスＴmaxを提供した。ストランドＡのいずれかの末端に一つのＭＧＢを付加することによって、Ｔmaxは１６−１７℃増加し、これに対してストランドＢに対する付加ではＴmaxの増加は小さかった（ΔＴmax＝４−１１℃）。ストランドＢは、ＣＤＰＩ3共役結合の位置に対する選好性を示し、その３’ＣＤＰＩ3テールド共役物は、その対応の５’ＣＤＰＩ3テールド誘導体よりも（Ｔmax＝４５℃）より安定的なデュプレックス（Ｔmax＝５２℃）を形成した。この作用は、表４に示されたその他全てのデュプレックスに見られ（ストランドＢが２’−Ｏ−メチルバックボーンを有する場合以外）、その理由は、ＭＧＢの共役結合部位の近傍に於けるテスト配列中の二つのＡＴ対によるものである可能性がある。
【０１２８】
両ストランドに２’−Ｏ−メチル改変を加えることによって、２’−デオキシストランドに渡ってＴmaxの２５℃の増加が得られた。これは、従来、安定化改変として示されていたものである。イノウエ（Ｉｎｏｕｅ）他（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：６１３１−６１４８。ストランドＢに係留された一つのＭＧＢでは、Ｔmaxは変化せず、ストランドＡに対する付加では中程度の増加がみられた（ΔＴmax＝２−６℃）。２’−Ｏ−メチル改変を有する一つのストランドと、ＤＮＡバックボーンを有するものとの間のハイブリッドは、非改変ＤＮＡデュプレックス（Ｔmax＝４１℃）と類似し、ストランドＡが２’−Ｏ−メチルである時にはデュプレックス安定性は低く（Ｔmax＝３７℃）、ストランドＢが２’−Ｏ−メチルである時にはデュプレックス安定性は高かった（Ｔmax＝４６℃）。興味深いことに、ＣＤＰＩ3共役結合はこれらデュプレックスの内の前者を不安定化させた。この作用は、ストランドＢ（ＤＮＡストランド）の３’−（Ｔmax＝２９℃）と、５’− ＣＤＰＩ3テールド（Ｔmax＝２０℃）誘導体の両方について観察された。この不安定化作用は、ストランドＢのホスホロチオアート改変によって悪化された。両ケースに於いて、非共役結合対応物の２８℃のＴmaxと比較して、０℃を超える検出可能な溶解変化は検出されなかった。
【０１２９】
前記ＤＮＡ８量体デュプレックスの両バックボーンをすべてのホスホロチオアートリンクに改変することによって、Ｔmaxは１７℃低下した（４１℃から２４℃へ）。ストランドＢに一つのＭＧＢを付加することによつては、Ｔmaxはほとんど変化せず（５’− ＣＤＰＩ3の場合には８℃減少したが）、ストランドＡに対する付加では４−１２℃の中程度の増加が見られた。一般に、ストランドＡ及びＢのホスホロチオアート類似体は、それらの相補的複合体の全部が低いＴmaxを有していることを除いて、ホスフォジエステルＯＤＮについて観察されたものに類似のハイブリダイゼーション特性を示した。
【０１３０】
共役結合ＣＤＰＩ3は、ＧＣリッチＤＮＡデュプレックスを安定化させ、その安定化の度合いは、Ｔmaxの上昇に於いて、ｄ（ｐＴ）8＊ｄ（ｐＡ）8複合体について観察されたものの約半分であった。これに対して、別のタイプの共役結合ＭＧＢ，Ｎ−メチルピロールカルボックスアミド（ＭＰＣ）オリゴマーは、この研究に使用された同じＧＣリッチオクタデオキシリボヌクレオチドデュプレックスを安定化できなかった。シニャコフ（Ｓｉｎｙａｋｏｖ）他（１９９５）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１７：４９９５−４９９６。特定の理論に限定されることを望むものではないが、ＣＤＰＩ3は、それら塩基となんら水素結合を形成せず、従って、その相互作用はファンデルワールス接触又は疎水性力によって駆動されるため、ネトロプシンタイプ（ｎｅｔｒｏｐｓｉｎ-ｔｙｐｅ）のＭＰＣペプチドより、デュプレックスの浅溝の構造に対する感度が低い可能性がある。より狭い浅溝によって、より良好なＣＤＰＩ3結合、従って、より大きなデュプレックス安定化が促進されるかもしれない。
【０１３１】
デオキシグアノシンの代りにデオキシイノシンを含むＣＤＰＩ3共役結合デュプレックス
ネトロプシンとホークスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）３３２５８（４４）について観察されたように、改変ＯＤＮ中のデオキシグアノシン（ｄＧ）をデオキシイノシン（ｄＩ）によって置換することによって浅溝環境を、ＣＤＰＩ3結合のためにより適したものとすることができた。ニールセン（Ｎｉｅｌｓｅｎ）（１９９１）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．２：１−１２；ウォーテル（Ｗａｒｔｅｌｌ）他（１９７４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４９−６７１９−６７３１；マーク（Ｍａｒｃｋ）他（１９８２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１０：６１４７−６１６１；及びムーン（Ｍｏｏｎ）他（１９９６）Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ３８：５９３−６０６。ＧＣリッチデュプレックスのｄＩ含有類似体を作成し、ＭＧＢ補助安定化に関して調べた（表５）。ストランドＡの一つのｄＧをｄＩ残基に置換することによって、Ｔmaxの１０℃の減少が得られた。この複合体のいずれかのストランドの３’末端に一つのＭＧＢを付加すことによって、その親のｄＧ含有複合体よりもＴmaxは７−１３℃高くなった。
【０１３２】
ストランドＢ中に４つのｄＩ残基を有するデュプレックス上の係留ＭＧＢの効果は劇的であった。この改変ストランドＢと、ストランドＡのネイティブ又はｄＩ置換類似体との間に形成されたデュプレックスは、弱いか（ネイティブストランドの場合Ｔmax＝１１℃）か、もしくは存在しなかった（ｄＩ置換ストランドＡの場合）。ストランドＡの３’末端に対するＭＧＢの付加は、Ｔmaxを１１℃から４８℃に上昇させたのに対して、ストランドＢの３’末端に対するＭＧＢの付加は、Ｔmaxを実質的に０℃から４１℃に上昇させた。これらの値は、前記類似体ｄＧ含有ネイティブストランドの安定性に近い、ｄＩ＊ｄＣ塩基対を有するデュプレックスを形成するオリゴヌクレオチドに対するＭＧＢの共役結合によるＴmaxの３７−４８℃の増加を示すものである。このことは、共役結合ＣＤＰＩ3残基が、ｄＩｄＣリッチ配列と、ｄＡｄＴリッチ配列とを共に安定化させることを示すものである。
【０１３３】
二つ以上の共役結合ＣＤＰＩ3残基を有するデュプレックス
二本鎖ＤＮＡの浅溝が二つのＭＧＢ残基を並置非平行方向に結合させる能力が銘記される。クビスタ（Ｋｕｂｉｓｔａ）他（１９８７）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２６：４５４５−４５５３；モハン（Ｍｏｈａｎ）他（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｄｙｎ．９：６９５−７０４；ファガン（Ｆａｇａｎ）他（１９９２）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：１０８０−１０８１；ムルクシッチ（Ｍｒｋｓｉｃｈ）他（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：７５８６−７５９０及びチェン（Ｃｈｅｎ）他（１９９４）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６：６９９５−７００５。デュプレックス浅溝中の二つのＭＧＢモイエティの並置結合によって、調べられた両ストランドに二つのＣＤＰＩ3残基が係留されたすべてのデュプレックスに於いて強い安定化が得られる（表７及び９）。たとえば、一つの共役結合ＣＤＰＩ3残基によって４０−４９℃に既に安定化されている、ｄ（ｐＴ）8＊ｄ（ｐＡ）8デュプレックスを、更に、追加の５−１８℃によって、ｄ（ｐＴ）8＊（ｄＡ）8の７４℃のＴmaxに到達するように安定化させた（表２）。これは、ホスフォジエステルバックボーンを有する短いデュプレックスでは前例がないことである。最大の安定化は、両ストランドの５’又は３’末端を、ＭＧＢによって改変した時に得られ、これらは非平行状態に浅溝に結合するとができた（Ｔmax＝７１及び７４℃）。平行方向は不利であった（Ｔmax＝６３及び６７℃）。これは、一つの非平行方向のみが実験的に観察された「自由」ＭＧＢについての文献データと一致している。モハン（Ｍｏｈａｎ）、前出；ファガン（Ｆａｇａｎ）、前出；ムルクシッチ（Ｍｒｋｓｉｃｈ）、前出、およびアニマティ（Ａｎｉｍａｔｉ）他（１９９５）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３８：１１４０−１１４９。
【０１３４】
この高安定化は、いずれかの配列又はバックボーン改変に依存しているものとは思えなかった。一つが両ストランドのそれぞれに共役結合された、二つのＭＧＢ残基を含むＡＴ及びＧＣリッチデュプレックスはすべて、一つのＣＤＰＩ3テールを有する類似体デュプレックスと比較して、実質的に安定化された（表７及び９）。たとえば、表２は、二つのＣＤＰＩ3残基を有するｄ（ｐＴ）8および／又はｄ（ｐＡ）8のホスホルチオエート類似体によって形成された複合体が、そのホスフォジエステル対応物（Ｔmax＝６３−７４℃）と、同じ範囲（Ｔmax＝５６−７３℃）のＴmaxを示したことを示している。２’−Ｏ−メチル改変を有するデュプレックスの両ストランドにＭＧＢを付加することによって、２１℃安定性が増加した（２０℃から４１℃、表２）。ＧＣリッチデュプレックスの場合、反対側のデュプレックスストランドに第２のＣＤＰＩ3残基を共役結合することによる安定化は、第１のＣＤＰＩ3導入について観察されたものよりも更に大きかった。たとえば、一つのＣＤＰＩ3残基を付着させることによって、ＧＣ  ＤＮＡデュプレックスの安定性は４−１７℃増加させたのに対し、第２ＣＤＰＩ3モイエティの追加はＴmaxの１８−３３℃増加に寄与した。
【０１３５】
表７及び９の複共役結合ＭＧＢを有するデュプレックスのデータは、次の傾向を示している。もしもデュプレックスが、同じストランドの３’末端と５’末端とに係留された二つのＣＤＰＩ3残基を有するならば、対応のモノＣＤＰＩ3テールドデュプレックスに対して安定性に於いてほとんどなんの利点も見られなかった。このことは、短いデュプレックスの浅溝中の同じ部位を占有する二つのＣＤＰＩ3残基間の強い疎水性相互作用を暗示している。更に、両デュプレックスストランドに取り付けられた二つのＭＧＢモイエティ間の追加的結合によって、ハイブリッド安定性が更に大幅に増加するものと考えられる。デュプレックス及びトリプレックス安定性に対するペンダント疎水性基の相互作用の類似的効果が、コレステロール残基に共役結合したＯＤＮにも見られた。グリヤノフ（Ｇｒｙａｚｎｏｖ）他（１９９３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２１：５９０９−５９１５。第３及び第４のＣＤＰＩ3共役結合残基の追加によっては、研究されたＧＣリッチデュプレックスの安定性に対してほとんど影響が無いか、もしくは否定的な影響が見られた（表４）。
【０１３６】
【表５】
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【０１３７】
例５：ＭＧＢオリゴヌクレオチド共役物の塩基組成に対するＴｍの依存の減少
ＭＧＢに共役結合され、Ａ＋Ｔ含有率の異なる短いオリゴヌクレオチドを使用して、ＭＧＢ短オリゴヌクレオチド共役物に対するＴｍにおける塩基組成の影響を調べた（表６）。Ｔｍは、ＰＥＣＳＳソフトウエアパッケージを使用して、ＰＴＰ−６温度コントローラを備えたパーキンエルマーλ２Ｓ  ＵＶ／ＶＩＳ分光計によって測定された。テストされたオリゴヌクレオチドのＡ＋Ｔ含有率は、１２．５％ないし１００％の範囲であり、Ｔｍは、その完全な相補体とのオリゴヌクレオチドのハイブリッドのそれぞれについて測定された。表６に示すように、Ａ＋Ｔ含有率が３７．５％から１００％の８量体ＭＧＢオリゴヌクレオチド共役物は、４５−５４℃の範囲のＴｍを有し、これに対して、類似のＡ＋Ｔ含有率を有する非共役結合８量体のＴｍは３８℃以上の範囲であった。
【０１３８】
その他の実験により、Ａ＋Ｔ含有率が２８％から１００％の７量体オリゴヌクレオチドのＴｍは、僅かに４．４℃以上の範囲で変化した。これらの結果と、表６に示した結果は、ＭＧＢに共役結合された短いオリゴヌクレオチドの場合、Ｔｍは、塩基組成よりも、その長さにより密接に関連しているということを示唆している。
【０１３９】
更に、ＭＧＢ共役結合８量体のＴｍの値の範囲は、１００％Ａ＋Ｔの塩基組成を有するオリゴヌクレオチドの場合が４５℃、から、Ａ＋Ｔ０％の場合は６３℃の範囲である。従って、ＭＧＢ共役結合８量体のＴｍ値は、約１８℃以上である。これに対して、非共役結合８量体（０ないし１００％Ａ＋Ｔ）のＴｍ値は、少なくとも５２℃の範囲である（表６）。従って、そのように短いオリゴヌクレオチドがＭＧＢに共役結合した場合において、異なる塩基組成の短いオリゴヌクレオチド間のＴｍの相違は小さくなるという傾向が存在する。
【０１４０】
例６：ＭＧＢに共役結合された短いオリゴヌクレオチドの不一致識別能力の保持  塩基配列に対するＴｍの依存性は、ＭＧＢに共役結合された短い８量体オリゴヌクレオチドについては抑制されたが、非共役結合オリゴヌクレオチドと比較して、それらの高い識別能力は保持される。表７は、完全一致配列と、それぞれが異なる単一ヌクレオチド不一致を含む、４つのその他の配列とにハイブリダイズされた８量体ＭＧＢ共役結合オリゴヌクレオチドのＴｍ測定の例を示している。完全一致と単一ヌクレオチド不一致との間のＴｍ最小差は１９℃で、その最大差は４１℃である。
【０１４１】
【表６】
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【０１４２】
【表７】
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【０１４３】
以上、本発明を、理解を明瞭にする目的で、図示と具体例によっていくらか詳細に説明したが、当業者に於いては、本発明の精神から離脱することなく、様々な変更及び改変を行うことが可能であることは明らかであろう。従って、以上の説明及び具体例は、本発明の範囲を限定するものと見なされてはならない。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、１，２−ジヒドロ−（３Ｈ）−ピロロ［３，２−ｅ］インドール−７−カルボキシレート、別名ＣＤＰＩ3の構造を図示している。ＣＤＰＩ3のオリゴヌクレオチドの５’及び３’末端への共役結合のために使用されるリンカーの構造も図示されている。
【図２】図２は、ＰＣＲプライマーとしての、非改変オリゴヌクレオチドと、ＭＧＢ−共役１６量体、１２量体、及び１０量体オリゴヌクレオチドとの比較を示している。共役結合オリゴヌクレオチドは、５’−ＣＤＰＩ3モイエティを有していた。図示された対のプライマーを使用して、例１に記載の手順に従って、一本鎖Ｍ１３ｍｐ１９ＤＮＡのセグメントを増幅した。ＰＣＲ生成物をエチジウムブロマイドで染色した２％アガロースゲル上で分析した。
【図２Ａ】図２Ａに於いて、ＭＧＢ−オリゴヌクレオチド共役物（レーン１−４）を、リバースプライマーとして非改変オリゴヌクレオチド（レーン５−８）と比較した。すべてのケースに於いて、オリゴヌクレオチドは１６量体であり、アニーリング温度は４５度であった。プライマーとして使用された特異的なオリゴヌクレオチド対と、その生成物の予想サイズは次の通りであった。レーン１：４−Ｃ及び１（３０７ヌクレオチド）、レーン２：９−Ｃ及び１（２９７ヌクレオチド）、レーン３：１２−Ｃ及び１（２１７ヌクレオチド）、レーン４：１３−Ｃ及び１（１８１ヌクレオチド）、レーン５：４及び１（３０７ヌクレオチド）、レーン６：９及び１（２９７ヌクレオチド）、レーン７：１２及び１（２１７ヌクレオチド）、レーン８：１３及び１（１８１ヌクレオチド）。これらヌクレオチドの構造及び配列と、Ｍ１３ｍｐ１９ゲノム内のその位置については、表１を参照。レーンＭは、分子量マーカであり、そのサイズ（ヌクレオチド単位）は、図の左側に示されている。
【図２Ｂ】図２Ｂに於いて、ＭＧＢ−オリゴヌクレオチド共役物（レーン１−４）を、リバースプライマーとして非改変オリゴヌクレオチド（レーン５−８）と比較した。すべてのケースに於いて、オリゴヌクレオチドは１６量体であり、アニーリング温度は６８度であった。プライマーとして使用された特異的なオリゴヌクレオチド対と、その生成物の予想サイズは次の通りであった。レーン１：４−Ｃ及び１（３０７ヌクレオチド）、レーン２：９−Ｃ及び１（２９７ヌクレオチド）、レーン３：１２−Ｃ及び１（２１７ヌクレオチド）、レーン４：１３−Ｃ及び１（１８１ヌクレオチド）、レーン５：４及び１（３０７ヌクレオチド）、レーン６：９及び１（２９７ヌクレオチド）、レーン７：１２及び１（２１７ヌクレオチド）、レーン８：１３及び１（１８１ヌクレオチド）。これらヌクレオチドの構造及び配列と、Ｍ１３ｍｐ１９ゲノム内のその位置については、表１を参照。レーンＭは、図２Ａと同様、分子量マーカである。
【図２Ｃ】図２Ｃに於いて、１０量体（レーン１：オリゴヌクレオチド３−Ｃ及び７−Ｃ）と１２量体（レーン２：オリゴヌクレオチド６−Ｃ及び２−Ｃ）ＭＧＢ−オリゴヌクレオチド共役物をプライマーとして使用し、アニーリング温度は５５℃であった。予想生成物長は両レーンに於いて３０７ヌクレオチドであった。レーンＭは、図２Ａと同様、分子量マーカである。
【図３】図３は、ＰＣＲプライマーとして、非改変オリゴヌクレオチドと、ＭＧＢ−共役８量体及び６量体オリゴヌクレオチドとの比較を示している。共役結合オリゴヌクレオチドは、５’−ＣＤＰＩ3モイエティを有していた。図示された対のプライマーを使用して、例１に記載のタッチダウンＰＣＲプロトコルを使用して、一本鎖Ｍ１３ｍｐ１９ＤＮＡのセグメントを増幅した。生成物を８％ポリアクリルアミドシークエンシングゲル上で、銀染色によって可視化して分析した。
【図３Ａ】図３Ａに於いて、フォワードプライマーは１０量体であり、リバースプライマーは８量体であり、アニーリング温度は５５℃から４１℃に徐々に低下させた。特異的なプライマー対と、その生成物の予想サイズは次の通りであった。レーン１：１１及び３（２１７ヌクレオチド）、レーン２：８及び３（２９７ヌクレオチド）、レーン３：１１−Ｃ及び３−Ｃ（２１７ヌクレオチド）、レーン４：８−Ｃ及び３−Ｃ（２９７ヌクレオチド）。レーンＭは、ΦＸ１７４ＤＮＡのＨａｅＩＩＩ消化からの分子量マーカであり、そのサイズ（ヌクレオチド単位）を図の右側に示す。
【図３Ｂ】図３Ｂに於いて、フォワードプライマーは１０量体であり、リバースプライマーは６量体であり、アニーリング温度は５０℃から３７℃に徐々に低下させた。特異的なプライマー対と、その生成物の予想サイズは次の通りであった。レーン１：１０−Ｃ及び３−Ｃ（２９５ヌクレオチド）、レーン２：５−Ｃ−及び３−Ｃ（３０５ヌクレオチド）。レーンＭは、図３Ａと同様、ΦＸ１７４ＤＮＡのＨａｅＩＩＩ消化からの分子量マーカである。
【図４】図４は、プラスミドｐＳＰ１８９（配列識別番号４０）中に含まれるＥ．ｃｏｌｉ  ｓｕｐＦ遺伝子のヌクレオチド配列を図示し、増幅プライマー（「プライマー１」及び「プライマー２」として表示）の標的配列と、加水分解可能プローブアッセイに於いて標的として作用した領域（「１５量体」として表示）と、図５に図示する実験のために前記標的配列に導入された単一ヌクレオチド置換（「１５量体」として表示されている領域の下に図示）との位置を示している。
【図５】図５は、ＭＧＢ−共役結合１５量体を使用した加水分解可能プローブアッセイの結果を図示し、ここでは、プローブ中のすべてのグアニン塩基を、グアニン類似体ｐｐＧによって置換した。標的は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｓｕｐＦ遺伝子であった。アニーリング／伸長は、各サイクル２０秒間で７５℃で行われた。
【配列表】
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0004638032.tif 000022
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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