(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
再配列を増幅できる核酸増幅プライマーのセットであって、前記プライマーのセットは配列番号１４−２１，２３−２８，３０−３３，３５−４１の配列を含む複数の正方向プライマーおよび配列番号３４の配列を含む逆方向プライマーを含む、前記核酸増幅プライマーのセット。
【請求項２】
配列番号４２−４７から選択される配列の一つ以上の正方向プライマーおよび配列番号４８及び４９から選択される配列の一つ以上の逆方向プライマーを含むＶκ−Ｊκ ＩＧＫ再配列を増幅できる核酸増幅プライマーのセットを更に含む、請求項１に記載の核酸増幅プライマーのセット。
【請求項３】
配列番号４２−４７及び５１から選択される配列の一つ以上の正方向プライマーおよび配列番号５０の配列の逆方向プライマーを含むＶκ／イントロン−Ｋｄｅ ＩＧＫ再配列を増幅できる核酸増幅プライマーのセットを更に含む請求項１又は２に記載の核酸増幅プライマーのセット。
【請求項４】
配列番号５２及び５３から選択される配列の一つ以上の正方向プライマーおよび配列番号５４の配列の逆方向プライマーを含むＶλ−Ｊλ ＩＧＬ再配列を増幅できる核酸増幅プライマーのセットを更に含む、請求項１乃至３の何れか１項に記載の核酸増幅プライマーのセット。
【請求項５】
配列番号５５−７７から選択される配列の一つ以上の正方向プライマーおよび配列番号７８−９０から選択される配列の一つ以上の逆方向プライマーを含むＶβ−Ｊβ ＴＣＲＢ再配列を増幅できる核酸増幅プライマーのセットを更に含む、請求項１乃至４の何れか１項に記載の核酸増幅プライマーのセット。
【請求項６】
配列番号９１及び９２から選択される配列の一つ以上の正方向プライマーおよび配列番号７８−９０から選択される配列の一つ以上の逆方向プライマーを含むＤβ−Ｊβ ＴＣＲＢ再配列を増幅できる核酸増幅プライマーのセットを更に含む、請求項１乃至５の何れか１項に記載の核酸増幅プライマーのセット。
【請求項７】
配列番号９３―９６から選択される配列の一つ以上の正方向プライマーおよび配列番号９７及び９８から選択される配列の一つ以上の逆方向プライマーを含むＶγ−Ｊγ ＴＣＲＧ再配列を増幅できる核酸増幅プライマーのセットを更に含む、請求項１乃至６の何れか１項に記載の核酸増幅プライマーのセット。
【請求項８】
配列番号９９―１０４から選択される配列の一つ以上の正方向プライマーおよび配列番号１０５−１０８から選択される配列の一つ以上の逆方向プライマーを含むＶδ−Ｊδ ＴＣＲＤ再配列を増幅できる核酸増幅プライマーのセットを更に含む、請求項１乃至７の何れか１項に記載の核酸増幅プライマーのセット。
【請求項９】
配列番号１０９の配列の正方向プライマーおよび配列番号１１０の配列の逆方向プライマーを含むＤδ−Ｄδ ＴＣＲＤ再配列を増幅できる核酸増幅プライマーのセット更に含む、請求項１乃至８の何れか１項に記載の核酸増幅プライマーのセット。
【請求項１０】
配列番号１０９の配列の正方向プライマーおよび配列番号１０５−１０８から選択される配列の一つ以上の逆方向プライマーを含むＤδ−Ｊδ ＴＣＲＤ再配列を増幅できる核酸増幅プライマーのセットを更に含む、請求項１乃至９の何れか１項に記載の核酸増幅プライマーのセット。
【請求項１１】
配列番号９９―１０４から選択される配列の一つ以上の正方向プライマーおよび配列番号１１０の配列の逆方向プライマーを含むＶδ−Ｄδ ＴＣＲＤ再配列を増幅できる核酸増幅プライマーのセットを更に含む、請求項１乃至１０の何れか１項に記載の核酸増幅プライマーのセット。
【請求項１２】
配列番号１の配列の正方向プライマーおよび配列番号３４の配列の逆方向プライマーを含む染色体転座（１１；１４）（ＢＣＬ１−ＩＧＨ）を増幅できる核酸増幅プライマーのセットを更に含む、請求項１乃至１１の何れか１項に記載の核酸増幅プライマーのセット。
【請求項１３】
配列番号１１１―１２０から選択される配列の一つ以上の正方向プライマーおよび配列番号３４の配列の逆方向プライマーを含む染色体転座t（１４；１８）（ＢＣＬ２−ＩＧＨ）を増幅できる核酸増幅プライマーのセットを更に含む、請求項１乃至１２の何れか１項に記載の核酸増幅プライマーのセット。
【請求項１４】
配列番号１２１及び１２６、１２２及び１２７、１２３及び１２８、１２４及び１２９、１２５及び１３０の配列の一つ以上のプライマーのセットを更に含む、請求項１乃至１３の何れか１項に記載の核酸増幅プライマーのセット。
【請求項１５】
配列番号１、４２-４７, ５１-５３, ５５-７７, ９１-９６, ９９-１０４,１０９及び１１１−１２０の配列を含む正方向プライマー及び配列番号３４, ４８-５０,５４, ７８-９０, ９７, ９８,１０５−１０８及び１１０の配列を含む逆方向プライマーを更に含む、請求項１に記載の核酸増幅プライマーのセット。
【請求項１６】
配列番号１２１-１３０の配列を含むプライマーを更に含む、請求項１５に記載の核酸増幅プライマーのセット。
【請求項１７】
請求項１に記載のプライマーセットを使用する核酸増幅アッセイ。
【請求項１８】
請求項１７に記載の一以上の核酸増幅アッセイにおいて請求項１６に記載のプライマーのセットを使用することを含む、ＤＮＡ再配列の検出法。
【請求項１９】
生物学的サンプルから抽出されたＤＮＡサンプルの質を評価するための請求項１８に記載の方法の使用。
【請求項２０】
微小残存病変（ＭＲＤ）を検出するための、または実時間定量的ＰＣＲによるＭＲＤ検出のために使用されるＰＣＲ標的を同定するための請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
増幅された核酸を、自動高解析ＰＣＲフラグメント分析を使用して検出する請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
Ｖн−Ｊн ＩＧＨ再配列、Ｄн−Ｊн ＩＧＨ再配列、Ｖκ−Ｊκ ＩＧＫ再配列、Ｖκ／イントロン−Ｋｄｅ ＩＧＫ再配列、Ｖλ−Ｊλ ＩＧＬ再配列、Ｖβ−Ｊβ ＴＣＲＢ再配列、Ｄβ−Ｊβ ＴＣＲＢ再配列、Ｖγ−Ｊγ ＴＣＲＧ再配列、Ｖδ−Ｊδ ＴＣＲＤ再配列、Ｄδ−Ｄδ ＴＣＲＤ再配列、Ｄδ−Ｊδ ＴＣＲＤ再配列、Ｖδ−Ｄδ ＴＣＲＤ再配列および／またはｔ（１１；１４）（ＢＣＬ１−ＩＧＨ）およびｔ（１４；１８）（ＢＣＬ２−ＩＧＨ）から選択される少なくとも１つの転座を検出するためのキットであって、請求項１５に記載のプライマーセットを含むキット。
【請求項２３】
請求項１６に記載のプライマーセットを含む、請求項２２
記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特にリンパ球増殖性疾患の早期診断のためのＰＣＲベースのクローン性研究に関するものである。リンパ球増殖性疾患の疑いのある大部分の患者について、免疫組織学検査またはフローサイトメトリー免疫表現型決定によって強化された組織形態学または細胞形態学を用いれば、悪性リンパ球増殖性と反応性リンパ球増殖性とを鑑別することができる。しかし５ないし１０％の症例では診断がかなり困難である。リンパ性悪性腫瘍の診断は、原則的に悪性腫瘍の全細胞が共通のクローンに由来するという事実に基づいたクローン性の評価によって裏付けられる。
【背景技術】
【０００２】
リンパ性悪性腫瘍の大部分はＢ細胞系に属し（９０〜９５％）、ほんの一部がＴ細胞系（５〜７％）またはＮＫ細胞系（＜２％）に属する。急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）は症例の１５ないし２０％がＴ細胞に由来するが、成熟リンパ性白血病および非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）では、皮膚リンパ腫のような特別のサブグループを除けばＴ細胞性悪性腫瘍は比較的稀である（表１）。したがって、リンパ性悪性腫瘍の大部分（＞９８％）は同一に（クローン性に）再配列した免疫グロブリン（Ｉｇ）および／またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子を含み、症例の２５ないし３０％では明確な染色体異常も見いだされており、それらの全てがクローン性のマーカーとして役立つ。１，２
【０００３】
ＩｇおよびＴＣＲ遺伝子座は多くの異なる変異性（Ｖ）、多様性（Ｄ）および結合（Ｊ）遺伝子セグメントを含み、それらは初期のリンパ球分化中に再配列プロセスを受ける。３，４ Ｖ−Ｄ−Ｊ再配列は組換え酵素複合体によって媒介される。この酵素複合体ではＲＡＧ１およびＲＡＧ２蛋白が、Ｖ遺伝子セグメントの下流、Ｄ遺伝子セグメントの両側、およびＪ遺伝子セグメントの上流にある組換えシグナル配列（ＲＳＳ）においてＤＮＡを識別し、切断することによって重要な役割を演ずる（図１）。不適切なＲＳＳは再配列を減らし、または完全に阻止することもある。
【０００４】
再配列プロセスは一般に、Ｉｇ重鎖（ＩＧＨ）、ＴＣＲベータ（ＴＣＲＢ）およびＴＣＲデルタ（ＴＣＲＤ）遺伝子の場合は（図１）、ＤからＪへの再配列から出発し、その後ＶからＤ−Ｊ再配列が続くか、またはＩｇカッパ（ＩＧＫ）、Ｉｇラムダ（ＩＧＬ）、ＴＣＲアルファ（ＴＣＲＡ）およびＴＣＲガンマ（ＴＣＲＧ）遺伝子の場合は、直接ＶからＪへの再配列が再配列プロセスに関係する。再配列遺伝子セグメント間の配列は、ＴＣＲから切り出された環状物またはＢ細胞受容体から切り出された環状物（ＢＲＥＣ）とも呼ばれる環状形切出し生成物の形で除かれるのが普通である（図１）。
【０００５】
初期のリンパ球分化中のＩｇおよびＴＣＲ遺伝子の再配列は一般に階層的序列にしたがう。Ｂ細胞分化中には：最初にＩＧＨ遺伝子が再配列し、その後ＩＧＫが再配列し、おそらくＩｇＨ／κを発現し、または続いてＩＧＫ欠失およびＩＧＬ再配列が起こり、その後ＩｇＨ／λ発現が起こると考えられる。５ これは、実質的に全てのＩｇλ＋Ｂ細胞に単一対立遺伝子または二対立遺伝子ＩＧＫ遺伝子欠失があることを意味する。Ｔ細胞分化中には：最初にＴＣＲＤ遺伝子が再配列し、その後ＴＣＲＧが再配列して多分ＴＣＲγδを発現し、またはさらにＴＣＲＢ再配列およびＴＣＲＤ欠失が続き、その後ＴＣＲＡ再配列が起き、おそらくＴＣＲαβが発現する。リンパ性悪性腫瘍におけるＩｇおよびＴＣＲ遺伝子再配列パターンは上記の階層的序列に沿うのが普通である、但し異常な再配列パターンもあり、特にＡＬＬには認められる。６
【０００６】
Ｖ、Ｄ、およびＪ遺伝子セグメントの多くの異なる組合わせはいわゆる組合わせレパートリをあらわし（表２）、それはＩｇ分子では約２×１０６、ＴＣＲαβ分子では約３×１０６、そしてＴＣＲγδ分子では約５×１０３と推定される。Ｖ、Ｄ、およびＪ遺伝子セグメントの結合部位では、再配列プロセス中にヌクレオチドの欠失およびランダム挿入が起こり、非常に多様な結合領域が生成し、それは＞１０１２と推定されるＩｇおよびＴＣＲ分子の総レパートリに顕著に貢献する。５
【０００７】
成熟Ｂリンパ球は、Ｉｇ分子の親和性成熟に通ずるプロセスである体細胞の過剰突然変異による濾胞中心の抗原認識によって、それらのＩｇレパートリをさらに広げる。体細胞の過剰突然変異はＩＧＨおよびＩｇ軽鎖遺伝子のＶ−（Ｄ−）Ｊエクソンに集中し、単一ヌクレオチド突然変異および時にはヌクレオチドの挿入または欠失にも関係する。体細胞性突然変異のＩｇ遺伝子は濾胞起源の、または二次濾胞起源の成熟Ｂ細胞性悪性腫瘍にも見いだされる。７
【０００８】
機能的に再配列したＩｇおよびＴＣＲ遺伝子はＩｇ、ＴＣＲαβ、またはＴＣＲγδ分子の表面膜発現を起こす。１つのリンパ球または１つのリンパ球クローンによってＩｇまたはＴＣＲ分子の１種類だけが発現するという概念に基づくと、成熟リンパ性悪性腫瘍のクローン的に再配列した遺伝子が蛋白レベルで検出できるかも知れない。反応性（ポリクローナル）Ｂ−リンパ球（正常Ｉｇκ／Ｉｇλ比：０．７−２．８）対 異常（クローン）Ｂ−リンパ球（Ｉｇκ／Ｉｇλ比：＞４．０または＜０．５）を鑑別するために、単一Ｉｇ軽鎖発現（ＩｇκまたはＩｇλ）の検出が長い間使用されてきた。８−１０ 単一Ｉｇ軽鎖発現によれば、成熟Ｂ細胞性悪性腫瘍の大部分（＞９０％）の単一Ｉｇ軽鎖発現は、この悪性腫瘍がクローン起源であることが裏づけられる。
【０００９】
また、種々のＴＣＲ鎖の変異性ドメインに対する多くの種々の抗体の開発は、適切な標準値と比較する際、モノタイプＶβ、ＶγおよびＶδドメインの検出を可能にする。１１−１６ 異なるＶβファミリに対する２０ないし２５の抗体を用いてモノタイプＶβの結果を説明すれば（表２）、臨床的に良性のクローンＴＣＲαβ＋Ｔ細胞増殖（ＣＤ８＋であることが多い）が老人の末梢血液（ＰＢ）に常に見いだされることがわかるはずである。１３，１７ しかしＰＢにおけるこれらのクローンＴ細胞の増殖は比較的サイズが小さく、ＰＢ Ｔリンパ球の４０％未満、＜０．５×１０６／ｍｌＰＢである。１３ このような臨床的に良性のＴ細胞クローンがどの程度リンパ組織にも見いだされるかはまだ不明である。
【００１０】
モノタイプＶγおよびＶδドメイン発現の結果は注意して解釈しなければならない。なぜならば健常者において正常ポリクローンＴＣＲγδ＋Ｔ−リンパ球の大きなフラクションがＶγ９−Ｊγ１．２およびＶδ２−Ｊδ１使用に関して選択されたからである。１８，１９ したがってＰＢ中の高頻度のＶγ９＋／Ｖδ２＋ Ｔ−リンパ球は、絶対数が１ないし２×１０６／ｍｌＰＢでない限り、正常所見とみなさなければならない。大部分のＴＣＲγδ＋Ｔ細胞性悪性腫瘍はＶδ１またはその他の非−Ｖδ２遺伝子セグメントを単一Ｖγドメイン（一般にはＶγ９ではない）と組み合わせて発現する。１５，２０
【００１１】
制限されたＩｇκまたはＩｇλ発現、またはモノタイプＶβ、ＶγまたはＶδ発現の検出は、成熟Ｂ細胞またはＴ細胞性白血病患者のＰＢおよび骨髄（ＢＭ）のフローサイトメトリー研究では比較的容易であるが、正常（反応性）リンパ球と混在するリンパ球増殖性疾患が疑われる組織サンプルではより難しくなるように思われる。
【００１２】
抗体ベースの方法とは異なり、分子技術がクローン性再配列したＩｇ／ＴＣＲ遺伝子並びに明確な染色体異常の検出に広く使用できる。このためには以前はサザンブロット分析が用いられたが、現在は特にＰＣＲ法が使用されている。
【００１３】
広範囲に及ぶ免疫表現型決定にもかかわらず、症例の一部（５ないし１０％）ではリンパ性悪性腫瘍の最終的診断を下すのが困難である。そこで、最終的診断を下すか、または確定するために次のような場合には付加的（分子クローン）診断が必要である：
−形態学的検査および免疫表現型決定が決定的でなく、Ｂ細胞増殖の疑いがある；
−全てにおいてＴ細胞増殖の疑いあり（注意：Ｔ細胞が豊富なＢ−ＮＨＬ）；
−免疫不全患者または移植患者におけるリンパ球増殖；
−一人の患者における２種類のリンパ性悪性腫瘍のクローン関連性の評価、または再発と第二の悪性腫瘍との区別；
−悪性腫瘍を、例えばＩｇ／ＴＣＲ遺伝子再配列パターンまたは特定の染色体異常によってさらに分類する；
−場合によっては、リンパ腫の病期決定。
【００１４】
長い間、サザンブロット分析が分子クローン研究のゴールドスタンダード技術であった。サザンブロット法は制限酵素で消化した後に得られる非胚系（“再配列”）ＤＮＡフラグメントの検出に基づく。よく選択された制限酵素（２ないし１５ｋｂのフラグメントを生成する）および好位置におかれたＤＮＡプローブ（特に下流Ｊセグメントプローブ）は実質的に全てのＩｇおよびＴＣＲ遺伝子再配列並びにＪ遺伝子セグメントに関係する染色体異常を検出することができる。２１−２８ サザンブロット分析はＩｇ／ＴＣＲ遺伝子の再配列の多様性に焦点をおき、したがって組合わせレパートリを利用する。
【００１５】
クローン性を評価するためのサザンブロット法の最適結果は、特にＩＧＨ、ＩＧＫ、およびＴＣＲＢ遺伝子で得られる、なぜならばこれらの遺伝子は広い組合わせレパートリ並びに、単一または２つのＤＮＡプローブで評価できる比較的単純な遺伝子構造を有するからである。２２，２４，２０ ＩＧＬおよびＴＣＲＡ遺伝子はより複雑で、複数組のプローブを必要とする。２５，２６，２９ なおＴＣＲＧおよびＴＣＲＤ遺伝子は制限された組合わせレパートリを有し、それはサザンブロット分析によってモノクローナルおよびポリクローナル性を鑑別するには比較的適さないことを最後に付け加えておく。２０，２１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
サザンブロット分析は高い信頼性を有するにもかかわらず、幾つかの固有の欠点のためにＰＣＲ法に取って代わられつつある。サザンブロット分析は時間がかかり、技術的に要求が厳しく、高品質のＤＮＡを１０ないし２０μｇ必要とし、感度が５ないし１０％に制限されている。２１
【００１７】
再配列したＩｇ／ＴＣＲ遺伝子および染色体異常をＰＣＲ法によって検出する場合、結合領域および切断点融合領域それぞれの対置する両側に適切なプライマーを設計するために、再配列された遺伝子セグメントの正確な知識が必要である。
【００１８】
日常的ＰＣＲベースのクローン研究では、プライマー間の距離は１ｋｂ未満、より好ましくは５００ｂｐ未満である。これは、モノクローナル対ポリクローナルＩｇ／ＴＣＲ遺伝子再配列からのＰＣＲ生成物間を、結合領域の多様性（サイズおよび組成の多様性）に基づいて鑑別するためには特に重要である。これまで、主としてＩＧＨおよびＴＣＲＧ遺伝子再配列がＰＣＲベースのクローン研究に用いられてきたのは、Ｖн−ＪнおよびＶγ−Ｊγ再配列を検出するために必要なプライマーの数が限られるからである。
【００１９】
ＰＣＲ法の主な利点はその速さ、必要なＤＮＡ量が少ないこと、低品質のＤＮＡを使用できること、および１ないし５％という比較的良い感度（ある種の再配列では＜１％でもよい）である。したがって、ＰＣＲ法は少ない生検試料（例えば細針吸引生検など）またはホルムアルデヒド固定パラフィン包埋サンプル（これは一般に低品質のＤＮＡを生成する）の使用が可能である。必要ならば保管されている材料も使用できる。
【００２０】
分子クローン研究は非常に情報豊富であるが、次のような幾つかの制限と落とし穴により、一般的検出法で得られる結果の説明が妨害されるかも知れない。
【００２１】
１．正常なポリクローナル・バックグラウンドに関連する感度の制限
検出限界は適用する方法（サザーンブロット分析またはＰＣＲ法）に応じて、および正常（ポリクローナル）Ｂ−およびＴ−リンパ球の“バックグラウンド”１％から１０％まで（または１５％にまでも）変動する。制限された感度は５ないし１０％未満のクローンリンパ細胞を含む小さいクローン細胞集団の検出を妨害するかも知れない。
【００２２】
２．クローン性は悪性腫瘍と同じではない
クローン性の検出は必ずしも悪性腫瘍の存在を意味しない。幾つかの臨床的に良性の増殖はクローン起源を有する：例えばＣＤ８＋（またはある場合にはＣＤ４＋）Ｔ−リンパ球増加症、良性モノクローナル免疫グロブリン異常症、免疫不全患者のＥＢＶ＋リンパ球増殖の初期（オリゴクローナルであることが多い）、およびリンパ腫様丘疹症のような良性皮膚Ｔ細胞増殖などがある。これは、分子クローン性の研究結果が、常に、臨床的、形態学的および免疫表現型決定の範囲で、すなわち血液学者、細胞形態学研究者、病理学者および免疫学者の密接な協力の下に説明されるべきであることを意味する。
【００２３】
３．ＩｇおよびＴＣＲ遺伝子再配列は系統（ｌｉｎｅａｇｅ）のマーカーではない
最初の仮定とは異なり、ＩｇおよびＴＣＲ遺伝子再配列が必ずしもＢ細胞およびＴ細胞系それぞれに制限されるものでないことが１０年以上前から明らかである。交雑ＴＣＲ遺伝子再配列は未成熟Ｂ細胞性悪性腫瘍、特に前駆体−Ｂ−ＡＬＬ（症例の９０％以上）に比較的頻発するが、３０ 急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）および成熟Ｂ細胞悪性腫瘍もＴＣＲ遺伝子再配列を含むらしい。３１−３３ 低頻度であるとはいえ、交雑Ｉｇ遺伝子再配列はＴ細胞性悪性腫瘍およびＡＭＬにも起こり、主としてＩｇ重鎖（ＩＧＨ）遺伝子座に関係する。３３，３４
実質的に全ての（＞９８％）ＴＣＲαβ＋Ｔ細胞性悪性腫瘍がＴＣＲＧ遺伝子再配列（概して二対立遺伝子）を有し、多くのＴＣＲγδ＋Ｔ細胞性悪性腫瘍がＴＣＲＢ遺伝子再配列を含む。これはＴＣＲＢまたはＴＣＲＧ再配列の検出が、αβまたはγδＴ細胞系統のどちらであるかを指定しないことを意味する。
これらの交雑再配列に加えて、幾つかのリンパ性悪性腫瘍が異常なＩｇ／ＴＣＲ遺伝子再配列パターンを有することが確立された。この情報は前駆体−Ｂ−ＡＬＬおよびＴ−ＡＬＬで得られるが、大部分のその他のリンパ性悪性腫瘍ではまだ得られていない。６
【００２４】
４．偽クローン性およびオリゴクローン性
外観上クローン性または外観上オリゴクローン性のリンパ球集団（偽クローン性）の検出は、制限された組合わせレパートリを有する遺伝子、例えばＴＣＲＧまたはＴＣＲＤを使用しない限り、サザンブロット分析では稀である。これは、例えば抗原で選択されたＴＣＲγδ＋Ｔ−リンパ球から誘導されるＶγ９−Ｊγ１．２またはＶδ２−Ｊδ１再配列をあらわす微弱な再配列バンドを生成するかも知れない。だがこれはサザンブロット分析のよく知られた落とし穴であり、高密度の再配列バンドを生成しない。
【００２５】
ＰＣＲベースのクローン性研究における偽クローン性は識別がより難しい。ＰＣＲの高感度は、被検組織サンプル中の限られた数のＢ細胞またはＴ細胞から誘導されるわずかなＩｇまたはＴＣＲ遺伝子再配列を増幅することができる。特に小針−生検材料中の、または腫瘍負荷の高いＢ−ＮＨＬサンプル中のわずかな反応性（ポリクローナル）Ｔ細胞は（オリゴ）クローナルＰＣＲ生成物を生ずるかも知れない。このようなＰＣＲ生成物の量は限られることが多い。これは特に、ＰＣＲ標的としてＴＣＲＧ遺伝子を使用する場合に見られる。ＰＣＲ分析を２回または３回繰り返し、その後得られたＰＣＲ生成物を混合すると、外観上クローンＰＣＲ生成物が実際に種々のリンパ球から誘導されたものかどうかの解明に役立つはずである。
【００２６】
最後に、反応性リンパ節は、数種の抗原−選択サブクローンが優勢であることによるＩｇ／ＴＣＲレパートリの多様性の減少を示す（オリゴクローナル性）。特に、活性ＥＢＶまたはＣＭＶ感染症患者のリンパ節または血液サンプルは制限されたＴＣＲレパートリまたはＴＣＲ遺伝子オリゴクローナル性を示すことがある。また、移植患者またはヘアリーセル白血病患者などにおける免疫抑制の臨床像は制限されたＴＣＲレパートリーと関連づけられることがよくある。３５ 移植からの回復後および血液病緩解後にはポリクローナルＴＣＲレパートリが回復する。３６，３７
【００２７】
５．偽陽性結果
サザンブロット分析において、偽陽性結果は稀であり、一般には消化不足のチェック、および多型性制限部位の排除によって防止できる。２１
【００２８】
モノクローナルまたはポリクローナルＰＣＲ生成物を鑑別するために得られたＰＣＲ生成物の十分な分析が行われない場合は、偽陽性ＰＣＲ結果は重大な問題を含むことになる。このような鑑別は一本鎖ＤＮＡ高次構造多型（ＳＳＣＰ）分析、３８ 変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法（ＤＧＧＥ）、３９ ヘテロ二本鎖分析（ＨＤ）、４０，４１ または遺伝子走査（ＧＳ）４２，４３ によって実現される。これらの方法は同一結合領域をもつモノクローナル細胞と、高度に多様な結合領域をもつポリクローナル細胞とを区別するために結合領域の多様性を利用するものである。
【００２９】
６．偽陰性結果
Ｊ遺伝子セグメントプローブを使用する場合には偽陰性結果は稀である。それにもかかわらず、幾つかの異常な再配列（通常、非機能性再配列）、例えばＶ−Ｄ再配列またはＪ領域の欠失などが見落とされる。ＩｇおよびＴＣＲ遺伝子のＰＣＲ分析は、使用したＰＣＲプライマーの再配列遺伝子セグメントへの不適当なアニーリングのために生ずる偽陰性結果によって妨害される。この不適当なプライマーアニーリングは２種類の現象によって起きることがある。先ず第一に、異なるＶ、Ｄ、およびＪ遺伝子セグメント全てを正確に検出するには、実際には不可能な多数の異なるプライマーが必要である（表１）。そのため、特定のＶ、Ｄ、およびＪファミリの大部分または全てのメンバーを特異的に認識するファミリプライマーが設計される。或いは、研究下の遺伝子座の実質的に全てのＶおよびＪ遺伝子セグメントを認識すると予想されるコンセンサスプライマーが用いられる。ファミリプライマーおよび特にコンセンサスプライマーは一般的に、該当する遺伝子セグメントの一部には最適であるが、その他の遺伝子セグメントにはより低い相同性（７０ないし８０％）を示す。これは場合によっては偽−陰性結果を招きかねない、特に、多くの異なる遺伝子セグメントを有するＩｇ／ＴＣＲにおいてはこれが言える。ＴＣＲＧおよびＴＣＲＤ遺伝子においては、異なる遺伝子セグメントの数が限られるために、これは些細な問題である。
第二の現象は濾胞性および後濾胞性Ｂ細胞性悪性腫瘍、特にクラス転換したＩＧＨ遺伝子を有するＢ細胞性悪性腫瘍の再配列Ｉｇ遺伝子に体細胞の過剰突然変異が発生することである。
【００３０】
十分な知識および経験は、最初の４つの落とし穴を防ぐことができる。なぜならばこれらは主として説明の問題に関係しているからである。最後の２つの落とし穴は技術的問題に関係する。これらはＰＣＲ生成物分析のために確実な方法を選ぶことによって、およびより良いプライマーセットを設計することによって解決できる。
【００３１】
ここ１０年間のＩｇ／ＴＣＲ遺伝子のサザンブロット分析の最適化により、制限酵素（２から１５ｋｂまでのフラグメント；多型制限部位を避ける）とプローブ（主としてＪ遺伝子セグメントの下流）との信頼できる組合わせを選択できるようになった。サザンブロット分析は強力な“ゴールドスタンダード”技術であるとはいえ、多くの研究所は徐々にサザンブロット分析に代えてＰＣＲ法を用いるようになった。というのは、ＰＣＲ法は迅速で、中程度の品質のＤＮＡを最小量だけ必要とし、全体的に良好な感度を有するからである。
【００３２】
明らかな有益性にもかかわらず、確実なＩｇ／ＴＣＲ研究をするためのサザンブロット分析からＰＣＲ法への切り替えは、次の二つの主要な技術的問題によって妨害されている：
−不適当なプライマーアニーリングによる偽陰性結果；
−モノクローナルおよびポリクローナルＩｇ／ＴＣＲ遺伝子再配列の鑑別が難しい。
【００３３】
幾つかの個々の診断的研究所はＰＣＲベースのクローン性研究の諸問題を解決しようとしたが、信頼できる標準化ＰＣＲプロトコルは得られなかった。これに対して、感度および適用可能性が全て異なる多くの種々のプライマーセットが使用されている。
【課題を解決するための手段】
【００３４】
本発明はここに、実質的に全ての関連するＩｇおよびＴＣＲ遺伝子座およびよく起こる２種類の染色体異常を検出するための、核酸増幅プライマーと標準化ＰＣＲプロトコルとの組を提供する。正方向−および逆方向プライマーを含む本発明によるプライマーセットは、Ｉｇ重鎖遺伝子（ＩＧＨ）、Ｉｇカッパ鎖遺伝子（ＩＧＫ）、Ｉｇラムダ鎖遺伝子（ＩＧＬ）、ＴＣＲベータ遺伝子（ＴＣＲＢ）、ＴＣＲガンマ遺伝子（ＴＣＲＧ）およびＴＣＲデルタ遺伝子（ＴＣＲＤ）のクローン再配列を増幅し、または染色体転座ｔ（１１；１４）（ＢＣＬ１−ＩＧＨ）およびｔ（１４；１８）（ＢＣＬ２−ＩＧＨ）を増幅することができる。本発明のプライマーは完全および不完全再配列の両方を検出することができ、異なるＶ、（Ｄ）、およびＪファミリからの遺伝子セグメントを識別できるようにする。
【００３５】
モノクローナルおよびポリクローナルＩｇ／ＴＣＲ遺伝子再配列を見分けるための本発明による方法に使用できる二方法はヘテロ二本鎖分析および遺伝子走査である。ヘテロ二本鎖分析は二本鎖ＰＣＲ生成物を使用し、結合領域の長さおよび組成を利用し、一方、遺伝子走査では一本鎖ＰＣＲ生成物をその長さのみに応じて、高解析ゲルまたはポリマーにおいて分離する（図２）。
【００３６】
関連する全てのＩｇ／ＴＣＲ遺伝子座、並びにｔ（１１；１４）（ＢＣＬ１−ＩＧＨ）およびｔ（１４；１８）（ＢＣＬ２−ＩＧＨ）のための１０７種類の特異的プライマー、またはそれらの変異体が提供される（図３〜図１１を参照）。用語“変異体”とは、示されるプライマー配列のヌクレオチドから、サイズおよび／または位置が１ないし５ヌクレオチド、より好ましくは１ないし３ヌクレオチド異なるプライマーを言う。この場合前記変異体プライマーのヌクレオチド配列は、標的遺伝子座との多くても２つのミスマッチ、好ましくは多くても１つのミスマッチを含み、最も好ましくはミスマッチを含まないことを条件とする。さらに、変異体プライマーは（差別化）標識プライマー、すなわち分析機器の使用などを含む任意の手段によって同定できる、またはその他の標識から区別できる標識を有するプライマーなどである。差別化できる標識をつけたプライマーの例は、６−ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＴＥＴまたはＮＥＤ色素のような蛍光標識をつけたプライマー類である。本発明の標識プライマーは、ＰＣＲ生成物を検出するための自動高解析ＰＣＲフラグメント分析（ジーンスキャニング・テクノロジー社）に特に好都合に使用できる。以下に例示するように、本発明による差別化標識プライマーは、好ましくは多色遺伝子走査を用いて、ほとんど同じ長さ（サイズ）の異なるＰＣＲ増幅生成物を識別することができる。もちろん、変異体核酸増幅プライマーは、それが（色素標識した）正プライマーであれ、逆プライマーであれ、増幅反応に使用されるその他のいかなる（変異体）正方向および／または逆方向核酸増幅プライマーとは二量体を形成できないはずである。なぜならばこれは標的遺伝子座へのプライマーアニーリングを妨害し、したがって対象とする再配列または転座の増幅を妨害するからである。
【００３７】
一実施形態において、本発明は核酸増幅アッセイ、より好ましくは本発明による少なくとも一組のプライマーを使用するＰＣＲアッセイを提供する。前記ＰＣＲアッセイはシングル（モノプレックス）ＰＣＲでもマルチプレックスＰＣＲでもよい。好ましい実施形態において、例えば２つ以上の正方向プライマー、または３または４つの正方向プライマー、またはそれらの変異体（例えばＶнファミリプライマーなどの“ファミリプライマー”から選択されるものなど）を１つ以上のコンセンサス逆方向プライマー（類）またはその変異体（類）（ＪＨコンセンサスプライマーなど）と共に使用する標準化マルチプレックスＰＣＲアッセイに本発明による一組のプライマーを用いる。本発明のファミリプライマーは、それらが特定ファミリの大部分または全ての遺伝子セグメントを認識するように設計される（表２を参照されたい）。特殊のの実施形態において、１０７全てのプライマーをたった１８本のマルチプレックスＰＣＲチューブに用いる：ＩＧＨのために５本（３×Ｖн−Ｊнおよび２×Ｄн−Ｊн）、ＩＧＫのために２本、ＩＧＬのために１本、ＴＣＲＢのために３本（２×Ｖβ−Ｊβおよび１×Ｄβ−Ｊβ）、ＴＣＲＧのために２本、ＴＣＲＤのために１本、ＢＣＬ２−ＩＧＨのために３本、およびＢＣＬ１−ＩＧＨのために１本（図３〜図１１）。このようなアッセイはクローン再配列および／または染色体異常の評価を可能にする。それはさらに、リンパ球増殖性疾患の検出を可能にする。リンパ球増殖が決定された約９０のサザンブロットについてそれらプライマーのマルチプレックスＰＣＲ試験を行うと、サンプルの９５％以上においてサザンブロットとＰＣＲ結果とが一致することが判明した。
【００３８】
また別の実施形態において、Ｖн−ＪнＩＧＨ再配列、Ｄн−ＪнＩＧＨ再配列、Ｖκ−ＪκＩＧＫ再配列、Ｖκ／イントロン−Ｋｄｅ ＩＧＫ再配列、Ｖλ−Ｊλ ＩＧＬ再配列、Ｖβ−Ｊβ ＴＣＲＢ再配列、Ｄβ−Ｊβ ＴＣＲＢ再配列、Ｖγ−ＪγＴＣＲＧ再配列、Ｖδ−Ｊ δＴＣＲＤ再配列、Ｄδ−Ｊδ ＴＣＲＤ再配列、Ｄδ−Ｄδ ＴＣＲＤ再配列およびＶδ−Ｄδ ＴＣＲＤ再配列からなる群から選択される再配列、好ましくは２つ以上の再配列を、本発明による少なくとも１セットのプライマーを使用して検出する方法が提供される。本発明による少なくとも１組のプライマーを使用してｔ（１１；１４）（ＢＣＬ１−ＩＧＨ）転座またはｔ（１４；１８）（ＢＣＬ２−ＩＧＨ）転座を検出する方法も提供される。さらに、上記の再配列の少なくとも１つおよび少なくとも１つの転座を、ここに提供される少なくとも２セットのプライマーを使用して検出する方法も提供される。
【００３９】
その他の局面において、ヒトＡＦ４遺伝子（エクソン３）、ヒトＡＦ４遺伝子（エクソン１１）、ヒトＰＬＺＦ１遺伝子、ヒトＲＡＧ１遺伝子およびヒトＴＢＸＡＳ１遺伝子からなる群から選択されるヒト遺伝子を増幅できる核酸増幅プライマーの一セットが提供される（図１２を参照されたい）。正方向プライマー（またはその変異体）および逆方向プライマー（またはその変異体）からなるこれら５セットのプライマーの１セット以上を本発明の核酸増幅アッセイに使用して、ヒトＡＦ４遺伝子（エクソン３）、ヒトＡＦ４遺伝子（エクソン１１）、ヒトＰＬＺＦ１遺伝子、ヒトＲＡＧ１遺伝子およびヒトＴＢＸＡＳ１遺伝子からなる群から選択される１つ以上の“標準遺伝子（類）”を検出することができる。このような検出法は、生物学的サンプルから抽出または分離される核酸（ＤＮＡ）サンプル、例えばパラフィン包埋サンプルから抽出されるＤＮＡ、の質（例えば完全性および増幅可能性など）を評価するために有益に使用される（実施例１０を参照されたい）。
【００４０】
本発明の種々のプライマーセットの、クローン再配列および／または染色体異常（転座）を増幅する能力を、多くの異なる種類の悪性リンパ腫（濾胞性リンパ腫、びまん性大Ｂ細胞性リンパ腫、および多発性骨髄腫など）で試験した。１セットのプライマーがクローン再配列および／または染色体転座を評価するために非常に有用であることが判明した。本発明によるマルチプレックス・プライマー・チューブを使用するクローン再配列の検出率はこれまでになく高く、少なくとも９５％であることが明らかにされた。
【００４１】
上記サンプルの使用できるパラフィン包埋組織の平行試験は、これら組織のＤＮＡの質が十分高ければ、非常によく一致する結果をあらわした。これは、少なくとも３００ｂｐのフラグメントは特別に設計された標準遺伝子ＰＣＲで増幅できることを意味する。
【００４２】
本発明により開発されたマルチプレックスＰＣＲアッセイの適用可能性を、リンパ性悪性腫瘍の１タイプにつき５０ないし１００症例のシリーズで評価した。ナショナル・パソロギー・パネル・レビュー（ｎａｔｉｏｎａｌ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ｐａｎｅｌ ｒｅｖｉｅｗ）にしたがい、そして困難な場合はセントラル・パソロギー・パネル・レビュー（ｃｅｎｔｒａｌ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ｐａｎｅｌ ｒｅｖｉｅｗ）にしたがって、含まれる全ての症例を世界保健機構（ＷＨＯ）分類により明らかにした。研究した診断的カテゴリーは次の悪性腫瘍を含む：濾胞性リンパ腫、被膜細胞リンパ腫、辺縁領域リンパ腫、びまん性大Ｂ細胞性リンパ腫、血管免疫芽球性Ｔ細胞性リンパ腫、末梢Ｔ細胞性リンパ腫、および退形成性大細胞性リンパ腫、並びに反応性病巣。それらの結果は、濾胞性リンパ腫およびびまん性大Ｂ細胞性リンパ腫のような体細胞の過剰突然変異を有することがわかっている疾患においてさえも、非常に高レベルのクローン性検出を示す。特に２本のＩＧＨ Ｄн−Ｊнチューブおよび２本のＩＧＫチューブを補充した３本のＩＧＨ Ｖн−Ｊнチューブを使用すると、クローン性Ｉｇ遺伝子再配列の検出が非常に効率的になるようにみえた。この高い効率は、それらＩｇチューブの相補性によって、並びにＤн−ＪнおよびＩＧＫ−Ｋｄｅ再配列が体細胞では突然変異しない（または稀にしか突然変異しない）という事実によって得られる。このような相補性はＴ細胞性悪性腫瘍の場合のＴＣＲＢおよびＴＣＲＧプライマーにも見いだされた。
【００４３】
さらに、異常な交雑再配列のような、興味深くかつ予期されない再配列パターンが認められた。反応性病巣の約１０％にクローン再配列が検出されたことは注目される。これらの反応性リンパ球増殖としては、ＥＢＶ関連リンパ球増殖、およびキャッスルマン病のような異常過形成、並びにＢまたはＴ細胞クローンの疑いのある病巣などがある。
【００４４】
特殊の実施形態において、微小残存病変（ＭＲＤ）を検出する方法が提供される。用語微小残存病変（ＭＲＤ）とは、急性白血病（ＡＬ）の化学療法後に、ある量の残留悪性腫瘍細胞が形態学的に正常な骨髄細胞に依然として存在する状態を意味する。微小残存病変（ＭＲＤ）の検出は、治療中の緩解誘発をより正確に測定するツールである。なぜならば白血病芽細胞を１０−４〜１０−６まで検出できるからである。公知のＰＣＲベースのＭＲＤ分析は被検患者サンプルの〜９０ないし９５％に検出できるクローン抗原受容体再配列を利用する。しかし、ポリクローナル生成物の増幅はＭＲＤ分析には適さない偽陽性ＰＣＲアンプリコンに導くことが多い。本発明は今や、同一に（クローン性に）再配列したＩｇおよびＴＣＲ遺伝子の検出、またはｔ（１１；１４）およびｔ（１４；１８）のような、明確な、よく起こる染色体異常の検出のための方法を提供する。例えば本発明のプライマーセットを用いて検出される再配列および転座は診断時のクローン性のマーカーとして役立つだけでなく、追跡試験時のＭＲＤを検出するためのＰＣＲ標的としても役立つ。
【００４５】
その他の局面において、本発明はＶн−ＪнＩＧＨ再配列、Ｄн−ＪнＩＧＨ再配列、Ｖκ−ＪκＩＧＫ再配列、Ｖκ／イントロン−Ｋｄｅ ＩＧＫ再配列、Ｖλ−Ｊλ ＩＧＬ再配列、Ｖβ−Ｊβ ＴＣＲＢ再配列、Ｄβ−Ｊβ ＴＣＲＢ再配列、Ｖγ−Ｊγ ＴＣＲＧ再配列、Ｖδ−Ｊδ ＴＣＲＤ再配列、Ｄδ−Ｊδ ＴＣＲＤ再配列、Ｄδ−Ｄδ ＴＣＲＤ再配列、Ｖδ−Ｄδ ＴＣＲＤ再配列からなる群から選択される少なくとも１つの再配列および／またはｔ（１１；１４）（ＢＣＬ１−ＩＧＨ）およびｔ（１４；１８）（ＢＣＬ２−ＩＧＨ）から選択される少なくとも１つの転座を検出するための、本発明によるプライマーの少なくとも１セットを含んでなる（診断）キットを提供する。本発明のキットはＰＣＲベースのクローン性診断に非常に適する。任意にこのようなキットは上記のようにヒト“標準遺伝子”を増幅できる少なくとも１セットのプライマーも含む。１セット、好ましくは少なくとも２セット、より好ましくは少なくとも３セットのこれら標準遺伝子プライマーを標準チューブ（Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｔｕｂｅ）に挿入すると、診断すべきＤＮＡサンプル、例えばパラフィン包埋組織から抽出されるＤＮＡの質を推定するのに役立つ。
【００４６】
さらに別の局面において、本発明は同じマルチプレックスＰＣＲチューブのＩｇ／ＴＣＲ遺伝子再配列の種々のタイプを速やかに鑑別する方法を提供する。遺伝子走査では、１本のチューブに複数の異なるフルオロクロム結合プライマーを使用することができる。プライマーのこのような差別的標識化を使用して、異なるタイプのＩｇまたはＴＣＲ遺伝子再配列を特別に区別することができる。
【００４７】
Ｖプライマーの差別的標識化はＩｇ／ＴＣＲ遺伝子再配列のタイプを迅速かつ容易に同定するのに役立つ。上記の同定は微小残存病変のＰＣＲベースの検出に有用である。４４，４５ Ｊプライマーの標識化はＩＧＨ（Ｖн−ＪнまたはＤн−Ｊн）、ＩＧＫ（Ｖκ−Ｊκ）、またはＩＧＬ（Ｖλ−Ｊλ）に関して情報を与えるとはみなされない。ＩＧＫ−Ｋｄｅ再配列を速やかに同定するために、ＫｄｅおよびイントロンＲＳＳプライマーを差別的に標識化することによって、Ｖκ−ＫｄｅとイントロンＲＳＳ−Ｋｄｅ再配列間を区別することが興味深い（図５Ｂを参照されたい）。
【００４８】
最も有益な多色遺伝子走査をＴＣＲ遺伝子再配列のために設計し、異なるタイプのＴＣＲＢ、ＴＣＲＧ、およびＴＣＲＤ遺伝子再配列の迅速な認識を容易にすることができる。例えばＴＣＲＢチューブＡ中のＪβ１およびＪβ２プライマーの差別的標識化（図７Ｂ参照）は、ポリクローナルおよびモノクローナルＶβ−Ｊβ１ 対 Ｖβ−Ｊβ２再配列を容易に同定することができる（図１３Ａ）。Ｊγ１．３／２．３およびＪγ１．１／２．１プライマーの差別的標識化（図８Ｂ）は異なるタイプのＴＣＲＧ遺伝子再配列の同定を容易にする（図１３Ｂ）。ＴＣＲＤチューブ中のＪδプライマー、Ｄδ２プライマー、およびＤδ３プライマーの差別的標識化（図９Ｂ）は大部分の関連するＴＣＲＤ遺伝子再配列、例えばＤδ２−Ｊδ、Ｖδ−Ｊδ、Ｄδ２−Ｄδ３、およびＶδ２−Ｄδ３再配列などの同定を容易にする（図１３Ｃ）。
【００４９】
これらの多色マルチプレックスＰＣＲチューブはＰＣＲベースのクローン性診断の日常的実施において容易かつ簡便であるようにみえる。
【００５０】
図の説明
図１．ＴＣＲＢ遺伝子の連続的再配列段階、転写、および翻訳の略図。この実施例において、先ず最初にＶβ２からＪβ２．３への再配列が起き、その後Ｖβ４からＤβ２−Ｊβ２．３への再配列が起き、Ｖβ４−Ｄβ２−Ｊβ２．３コーディング結合が生成する。再配列したＴＣＲＢ遺伝子は前駆体ｍＲＮＡに転写され、成熟ｍＲＮＡにスプライシングされ、最後にＴＣＲβ蛋白鎖に翻訳される。この組換えプロセス中に形成される２つの染色体外ＴＣＲ切出し円（ＴＲＥＣｓ）も示される；これらはＤ−Ｊシグナル結合およびＶ−Ｄシグナル結合をそれぞれ含む。
【００５１】
図２．再配列したＩｇおよびＴＣＲ遺伝子から得られるＰＣＲ生成物のヘテロ二本鎖分析および遺伝子走査の略図。Ａ．再配列したＩｇおよびＴＣＲ遺伝子（実施例におけるＩＧＨ）はサイズおよびヌクレオチド組成に関して不均一な結合領域を示す。Ｖ、Ｄ、およびＪ遺伝子セグメントの生殖細胞系列ヌクレオチドは大文字で、ランダムに挿入されたヌクレオチドは小文字で示される。結合領域の不均一性をヘテロ二本鎖分析（サイズおよび組成）および遺伝子走査（サイズだけ）に利用して、モノクローナルおよびポリクローナルリンパ性細胞集団から誘導される生成物を区別する。Ｂ．ヘテロ二本鎖分析では、ＰＣＲ生成物は熱変性され（５分間、９４℃）その後急速に冷却され（１時間、４℃）、二本鎖（ホモ−またはヘテロ二本鎖）形成を誘発する。クローンリンパ細胞からなる細胞サンプルでは、再配列したＩＧＨ遺伝子のＰＣＲ生成物は、変性および再変性後にホモ二本鎖を生じ、その一方でポリクローナルリンパ細胞集団を含むサンプルでは一本鎖ＰＣＲフラグメントが主にヘテロ二本鎖を形成する。それが、電気泳動でゆっくり移動するフラグメントのバックグラウンド塗沫になる。Ｃ．遺伝子走査では、再配列したＩＧＨ遺伝子のフルオロクロム標識化ＰＣＲ生成物を変性した後に、生成一本鎖フラグメントの高解析フラグメント分析が行われる。モノクローナル細胞サンプルは同じサイズ（単一ピーク）のＰＣＲ生成物を生ずるが、ポリクローナルサンプルでは多くの異なるＩＧＨ ＰＣＲ生成物が形成され、それは特徴的なガウスのサイズ分布を示す。
【００５２】
図３．ＩＧＨ（Ｖн−Ｊн）再配列のＰＣＲ分析。Ａ．染色体バンド１４ｑ３２．３上のＩＧＨ遺伝子複合体の略図（ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓデータベースから採用）。４６，４７ 再配列可能の非多型性Ｖн遺伝子セグメントだけが青色（機能的Ｖн）または灰色（再配列可能偽遺伝子）で示される。最近発見された（一般的には短縮された）Ｖн偽遺伝子は示されていない。Ｂ．３本のマルチプレックスチューブに合一した、３セットのＶнプライマーと１つのＪнコンセンサスプライマーを有するＩＧＨ Ｖн−Ｊн再配列の略図。ＶнおよびＪнプライマー類の相対的位置はそれらの５’最末端ヌクレオチド上流（−）または含まれるＲＳＳの下流（＋）によって与えられる。プライマー設計のための代表的Ｖнファミリメンバーとして使用されるＶн遺伝子セグメントは括弧内に示される。Ｃ、Ｄ、およびＥ．同じポリクローナルおよびモノクローナル細胞集団のヘテロ二本鎖分析および遺伝子走査；典型的ヘテロ二本鎖の塗沫およびホモ二本鎖バンド（左パネル）および典型的ポリクローナル・ガウス曲線およびモノクローナルピーク（右パネル）を示す。ポリクローナル・ガウス曲線のおおよその分布はｎｔで示される。
【００５３】
図４．ＩＧＨ（Ｄн−Ｊн）再配列のＰＣＲ分析。Ａ．２本のチューブ（ＩＧＨチューブＤおよびＥ）に分割された７ＤＨファミリプライマーおよび１Ｊнコンセンサスプライマーを有するＩＧＨ（Ｄн−Ｊн）再配列の略図。Ｄн７（７−２７）プライマーをその他の６つのＤнプライマーから分離した；というのはＤн７およびＪнコンセンサスプライマーは２１１ｎｔの生殖細胞系列ＰＣＲ生成物を与えるからである。ＤнおよびＪнコンセンサスプライマーの相対的位置はそれらの５’最末端ヌクレオチド上流（−）または含まれるＲＳＳの下流（＋）によって与えられる。プライマー設計のために典型的Ｄнファミリメンバーとして使用されるＤн遺伝子セグメントは括弧内に示される。ＢおよびＣ．同じポリクローナルおよびモノクローナル細胞集団の細胞ヘテロ二本鎖分析（左パネル）および遺伝子走査（右パネル）。ポリクローナルおよびモノクローナルピークのおおよその分布が示される。起こり得るチューブＤのバックグラウンドバンド／ピークは星印で示され、Ｄн−Ｊн再配列の予想範囲外に位置する。チューブＥの生殖細胞系列Ｄн７−Ｊнバンドも星印で示される。
【００５４】
図５．ＩＧＫ遺伝子再配列のＰＣＲ分析。Ａ．染色体２ｐ１１．２上のＩＧＫ遺伝子複合体の略図（ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓデータベースから採用）。４６．４７ 再配列可能の非多型性Ｖκ遺伝子セグメントだけが青色（機能性Ｖκ）および灰色（非機能性Ｖκ）で示される。逆Ｖκ遺伝子セグメントのクラスター（文字Ｄでコードされる）が非逆Ｖκ遺伝子セグメントの〜８００ｋｂ上流に位置する。これら上流のＶκ遺伝子セグメントはそれらの対応する非逆−相対物に対する鏡像として示される。Ｂ．Ｖκ−Ｊκ再配列および２種類のＫｄｅ再配列（Ｖκ−ＫｄｅおよびイントロンＲＳＳ−Ｋｄｅ）の略図。Ｖκ、Ｊκ、ＫｄｅおよびイントロンＲＳＳ（ＩＮＴＲ）プライマーの相対的位置はそれらの５’最末端ヌクレオチド上流（−）または含まれるＲＳＳの下流（＋）によって与えられる。Ｖκ１、Ｖκ２、およびＶκ３ファミリの典型的メンバーとして使用されるＶκ遺伝子は括弧内に示される。Ｖκ４、Ｖκ５およびＶκ７は単一メンバーＶκファミリである。プライマーは２本のチューブに分けられる：ＶκおよびＪκプライマーを有するチューブＡ、およびＶκ、イントロンＲＳＳおよびＫｄｅプライマーを有するチューブＢ。ＣおよびＤ．同じポリクローナルおよびモノクローナル細胞集団のヘテロ二本鎖分析および遺伝子走査：典型的ヘテロ二本鎖塗沫およびホモ二本鎖バンド（左バンド）および典型的ガウス曲線およびモノクローナルピーク（右パネル）を示す。ポリクローナル・ガウス曲線のおおよその位置がｎｔで示される。
【００５５】
図６．ＩＧＬ遺伝子再配列のＰＣＲ分析。Ａ．染色体バンド２２ｑ１１．２上のＩＧＬ遺伝子複合体の略図（ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓデータベースから採用）。４６，４７ 再配列可能の非多型性Ｖλ遺伝子セグメントだけが青色（機能性Ｖλ）または灰色（非機能性Ｖλ）に含まれる。Ｂ．２つのＶλファミリプライマーおよび１つのＪλコンセンサスプライマーを有するＶλ−Ｊλ再配列の略図。Ｖλ１プラスＶλ２のために、およびＶλ３のために２つだけのＶλプライマーを設計した。なぜならばこれら３つのＶλファミリは再配列可能Ｖλ遺伝子セグメントの約７０％をカバーし、全てのＩＧＬ遺伝子再配列の約９０％がＶλ１、Ｖλ２、またはＶλ３遺伝子セグメントを含むからである。４８ ７つのＪλ遺伝子セグメントのうちの５つが再配列できるとはいえ、１つのＪλコンセンサスプライマーだけがＪλ１、Ｊλ２、およびＪλ３のために設計される。なぜならば全てのＩＧＬ遺伝子再配列の９８％がこれら３遺伝子セグメントの１つを含むからである。４９ Ｖλ−Ｊλプライマーの相対的位置はそれらの５’最末端ヌクレオチド上流（−）または含まれるＲＳＳの下流（＋）によって与えられる。Ｃ．同じポリクローナルおよびモノクローナル細胞集団のヘテロ二本鎖分析および遺伝子走査；典型的ヘテロ二本鎖塗沫およびホモ二本鎖バンド（左バンド）およびポリクローナル・ガウス曲線およびモノクローナルピーク（右パネル）を示す。ポリクローナル・ガウス曲線のおおよその位置はｎｔで示される。
【００５６】
図７。ＴＣＲＢ遺伝子再配列のＰＣＲ分析。Ａ．ヒトＴＣＲＢ遺伝子座の略図。上記遺伝子セグメントの名称はアーデン（Ａｒｄｅｎ）らによるものであり５０、ロ−ウエン（Ｒｏｗｅｎ）ら５１およびレフランス（Ｌｅｆｒａｎｃｅ）らによる４５，４７名称を括弧内に記す。数字はインタナショナルＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓデータベースから採用したものである。４６，４７ 再配列可能の非多型性Ｖβ遺伝子セグメントだけは青色（機能性Ｖβ）、半青色／半灰色（多分機能性だが蛋白発言は見いだされない）および灰色（非機能性Ｖβ）に描かれる。Ｂ．Ｖβ−ＪβおよびＤβ−Ｊβ再配列の略図。２３のＶβプライマーおよび１３のＪβプライマーおよび２つのＤβプライマーを３本のチューブに合一した：チューブＡは２３のＶβプライマーおよび９のＪβプライマー、チューブＢは２３のＶβプライマーおよび４つのＪβプライマー、およびチューブＣは２つのＤβプライマーおよび１３のＪβプライマーを有する。２３のＶβプライマーおよび１３のＪβプライマーを整列させ、匹敵するサイズのＰＣＲ生成物を得る（パネルＣおよびＤを参照されたい）。Ｖβプライマーは全てのＶβ遺伝子セグメントの約９０％をカバーする。Ｖβ、ＤβおよびＪβプライマーの相対的位置はそれらの５’最末端ヌクレオチド上流（−）または含まれるＲＳＳの下流（＋）によって与えられる。Ｃ、Ｄ、およびＥ．同じポリクローナルおよびモノクローナル細胞集団のヘテロ二本鎖分析および遺伝子走査；典型的ヘテロ二本鎖塗沫およびホモ二本鎖バンド（左バンド）およびポリクローナル・ガウス曲線およびモノクローナルピーク（右パネル）を示す。ポリクローナル・ガウス曲線のおおよその分布はｎｔで示される。
【００５７】
図８．ＴＣＲＧ遺伝子再配列のＰＣＲ分析。Ａ．染色体バンド７ｐ１４上のヒトＴＣＲＧ遺伝子座の略図。再配列可能のＶγ遺伝子セグメントだけが青色（機能性Ｖγ）または灰色（非機能性Ｖγ）に描かれる。Ｊγ遺伝子セグメントには両方の命名法が用いられる。４６，４７，５２ Ｂ．２本のチューブに分けられた、４Ｖγプライマーおよび２Ｊγプライマーを有するＴＣＲＧ Ｖγ−Ｊγ再配列の略図。ＶγおよびＪγプライマーの相対的位置はそれらの５’最末端ヌクレオチド上流（−）または含まれるＲＳＳの下流（＋）によって示される。ＣおよびＤ．同じポリクローナルおよびモノクローナル細胞集団のヘテロ二本鎖分析および遺伝子走査；典型的ヘテロ二本鎖塗沫およびホモ二本鎖バンド（左パネル）および典型的ポリクローナル・ガウス曲線およびモノクローナル・ピーク（右パネル）を示す。ポリクローナル・ガウス曲線のおおよその分布はｎｔで示される。
【００５８】
図９．ＴＣＲＤ遺伝子再配列のＰＣＲ分析。Ａ．染色体バンド１４ｑ１１．２上のヒトＴＣＲＤ遺伝子座の略図。６種類の“古典的”Ｖｄ遺伝子セグメントが青色で示され、黒色のＶα遺伝子セグメントの間に散らばっている。Ｖδ４、Ｖδ５、およびＶδ６もＶα遺伝子セグメントとして認識されるから、それらのＶα遺伝子コードを括弧内に記す。Ｂ．Ｖδ−Ｊδ、Ｄδ２−Ｊδ、Ｄδ２−Ｄδ３、およびＶδ−Ｄδ３再配列の略図；１本のチューブに全て一緒になった６Ｖδ、４Ｊδ、および２Ｄδプライマー類の位置を示す。Ｖδ、ＤδおよびＪδプライマーの相対的位置はそれらの５’最末端ヌクレオチド上流（−）または含まれるＲＳＳの下流（＋）によって示される。Ｃ．同じポリクローナルおよびモノクローナル細胞集団のヘテロ二本鎖分析（左パネル）および遺伝子走査（右パネル）。ポリクローナル細胞集団はヘテロ二本鎖分析でぼんやりした塗沫を示し、遺伝子走査では複雑な広いピークパターンを示す。モノクローナルバンドおよびピークははっきりと見える。遺伝子走査における種々のタイプの再配列のＰＣＲ生成物のおおよその位置が示される。
【００５９】
図１０．ＢＣＬ１−ＩＧＨ再配列の検出。Ａ．染色体バンド１１ｑ１３上のＣＣＮＤ１遺伝子およびＢＣＬ１切断点領域（ｂｒｅａｋｐｏｉｎｔ ｒｅｇｉｏｎ）ＭＴＣ、並びに染色体バンド１４ｑ３２上のＪн遺伝子セグメントの略図。ＢＣＬ１−ＭＴＣ領域におけるプライマー設計のために、人工的ＢＣＬ１−ＭＴＣ／Ｊн４ 結合配列が構成された（これはＪＶＭ２５３について一部報告された）：ウィリアムズ（Ｗｉｌｌｉａｍｓ）５４によって報告されたように最初の５０−ヌクレオチドをＮＣＢＩに存在するＭＴＣ−配列のヌクレオチド１−４３９（受付番号Ｓ７７０４９５５）に結合した；ＪＶＭ２５３のＮ領域“ＧＣＣＣ”を付加し、その後Ｊн４−Ｊн６ゲノミック領域であるヌクレオチド１９２１−３１８２（受付番号Ｊ００２５６）を付加した。Ｂ．異なるＭＣＬ患者からのＢＣＬ１−ＩＧＨ ＰＣＲ生成物シリーズおよび陽性対照細胞系ＪＶＭ２のアガロースゲル電気泳動。ＰＣＲ生成物はサイズが異なり、ＢＣＬ１−ＭＴＣ切断点の位置が異なることを示す。より低密度のより大きいバンドは、次の下流生殖細胞系列Ｊн遺伝子セグメントに延びるＰＣＲ生成物である。
【００６０】
図１１． ＢＣＬ２−ＩＧＨ再配列のＰＣＲ検出。Ａ．染色体バンド１８ｑ２１上のＢＣＬ２遺伝子の略図。ＢＣＬ２切断点の大部分は次の３領域に集まる：ＭＢＲ、３’ＭＢＲ、およびｍｃｒ。したがって、マルチプレックス・プライマーはこれら３領域の潜在的切断点をカバーするように設計された：２つのＭＢＲプライマー、４つの３’ＭＢＲプライマー、および３つのｍｃｒプライマー。ＢＣＬ２プライマーの相対的位置は、２つのＢＣＬ２−ｍｃｒ プライマーを除いて、それらの５’最末端ヌクレオチド上流（−）またはＢＣＬ２エクソン３の３’末端の下流（＋）によって示される（ＮＣＢＩ受付番号ＡＦ３２５１９４Ｓ１による）；それらの位置はＡＦ２７５８７３配列の最初のヌクレオチドの下流に示される。Ｂ、Ｃ、およびＤ．異なるＦＣＬ患者および数種の陽性対照細胞系（ＤｏＨＨ２、Ｋ２３１、ＯＺ、およびＳＣ１）からのＰＣＲ生成物のアガロースゲル電気泳動。パネルＢおよびＤは同じサンプルを含み、確実に相補性を示し、チューブＣ（ｍｃｒチューブ）が付加価値をもつことを説明している。ＰＣＲ生成物は、ＢＣＬ２切断点の異なる位置に関連して、サイズが異なる。同じレーン上のより低密度のより大きいバンドは、次の下流生殖細胞系列Ｊн遺伝子セグメントまたは次の上流ＢＣＬ２プライマーに延びるＰＣＲ生成物をあらわす。
【００６１】
図１２．ＤＮＡサンプルの増幅可能性および完全性を評価するための標準遺伝子ＰＣＲ。Ａ．６００ｂｐ、４００ｂｐ、３００ｂｐ、２００ｂｐおよび１００ｂｐのＰＣＲ生成物を得るための５つの対照遺伝子のエクソンと５つのプライマーセットの略図。標準遺伝子プライマーの相対的位置が、含まれる標準遺伝子エクソンの５’スプライス部位の５’最末端ヌクレオチド下流によって与えられる。Ｂ．６％ポリアクリルアミドゲルで分離した６ＤＮＡサンプルの標準遺伝子ＰＣＲ生成物。２つの標準サンプルはより高分子量のＤＮＡ（外側のレーン）を含み、４つのＤＮＡサンプルはパラフィン包埋組織サンプルから得られ、ＤＮＡ（ＰＴ−４）の低減した増幅可能性（例えばＧＢＳ−４ ５０ｎｇ 対 ＧＢＳ−４ ５００ｎｇ）または低減した完全性を示した。
【００６２】
図１３．ＴＣＲ遺伝子再配列の迅速かつ容易な同定を促進する多色遺伝子走査。Ａ．Ｊβ１プライマー（ＴＥＴ−標識；緑）およびＪβ２プライマー（ＦＡＭ標識；青）の異なる標識を有するＴＣＲＢチューブＡの２色分析。最上部のパネルは２つのポリクローナルＪβ１およびＪβ２再配列パターン（図７Ｃ参照）をはっきり示し、その他の２パネルはクローンＪβ２再配列を示す。Ｂ．Ｊγ１．３／２．３プライマー（ＦＡＭ−標識；青）およびＪγ１．１／２．１（ＴＥＴ−標識；緑）の異なる標識をつけたＴＣＲＧチューブＡの２色分析。最上部のパネルはポリクローナル再配列パターンをはっきりと示し、その他の２パネルはクローンＪγ１．３／２．３およびクローンＪγ１．１／２．１再配列をそれぞれ示す。Ｃ．Ｊδプライマー（ＦＡＭ−標識；青）、Ｄδ２プライマー（ＨＥＸ標識；緑）およびＤδ３プライマー（ＮＥＤ−標識；黒）の異なる標識をつけたＴＣＲＤ遺伝子再配列の３色分析。ＴＣＲＤチューブ（図９Ｃ）の複雑な再配列パターン内で、３色分析により、Ｖδ−Ｊδ再配列（青いピーク）、Ｄδ２−Ｊδ再配列（青および緑のピーク、２種類のフッ素染色体の移動速度に差があるため、完全な同時移動はしていない）、Ｖδ２−Ｄδ３再配列（黒いピーク）、およびＤδ２−Ｄδ３再配列（同時移動する緑および黒のピーク）を直接検出することができる。
【００６３】
材料および方法
ＰＣＲ標的の選択：相補性を狙う
各リンパ性悪性腫瘍において少なくとも１つのＰＣＲ検出可能クローン性標的の使用可能性を目的とすることにした。成熟Ｂ細胞性悪性腫瘍において、この目的は、特に濾胞性および二次濾胞性Ｂ細胞性悪性腫瘍に見いだされるＩｇ遺伝子における体細胞の過剰突然変異の発生によって妨害されるかも知れない。そのため、ある程度の相補性を有するＰＣＲ標的を含めることにした。
【００６４】
標的選択のために幾つかの関係を利用した：
−ＩＧＨ遺伝子：完全なＶн−Ｊн再配列だけでなく不完全なＤн−Ｊн再配列もＰＣＲ標的として含めた。なぜならばＤн−Ｊн再配列は体細胞の過剰突然変異によって影響を受けないと考えられるからである；
−ＩＧＫおよびＩＧＬ遺伝子：両方のＩｇ軽鎖遺伝子をＰＣＲ標的として含めた。なぜならばこれは各成熟Ｂ細胞性悪性腫瘍におけるＰＣＲ−検出可能Ｉｇ遺伝子再配列を見いだす機会を増やすからである；
−ＩＧＫ遺伝子：Ｖκ−Ｊκ再配列を含めるだけでなく、カッパ欠失要素（Ｋｄｅ）の再配列も含めた。なぜならばそれらは実質的に全てのＩｇλ＋Ｂ細胞悪性腫瘍において、およびＩｇκ＋Ｂ細胞性悪性腫瘍の３分の１において、１つまたは両方の対立遺伝子にあらわれるからであり、Ｋｄｅ再配列は体細胞の過剰突然変異によって影響を受けないと考えられるからである。
−ＴＣＲＢ遺伝子：完全Ｖβ−Ｊβおよび不完全Ｄβ−Ｊβ再配列の両方。なぜならば完全および不完全ＴＣＲＢ遺伝子再配列は全ての成熟ＴＣＲαβ＋Ｔ細胞性悪性腫瘍に、および多くのＴＣＲγδ＋Ｔ細胞性悪性腫瘍にも生じるからである；
−ＴＣＲＧ遺伝子：この典型的ＰＣＲクローン性標的はＴＣＲγδおよびＴＣＲαβ系統の全てのＴ細胞性悪性腫瘍において有用である。
−ＴＣＲＤ遺伝子：これは未成熟Ｔ細胞性悪性腫瘍並びにＴＣＲγδ＋Ｔ細胞性悪性腫瘍における有用な標的である。
−ＴＣＲＡ遺伝子：この遺伝子はＰＣＲ標的としては含めなかった。なぜならば約５０Ｖおよび６１Ｊ遺伝子セグメントとの複合程度が高いからである。さらに、ＴＣＲＡ遺伝子再配列を有する全てのＴ細胞性悪性腫瘍はＴＣＲＢ遺伝子再配列を含み、一般にＴＣＲＧ遺伝子再配列も有する；
−機能性遺伝子セグメント：大部分の疑われるリンパ球増殖は成熟リンパ球に関するものであり、したがってそれらは機能性ＩｇまたはＴＣＲ遺伝子再配列を有する。そこでＴＣＲプライマーの設計は（実質的に）全ての機能性Ｉｇ／ＴＣＲ遺伝子セグメントを含めるようにした。
−明確な染色体異常：ｔ（１１；１４）（ＢＣＬ１−ＩＧＨ）およびｔ（１４；１８）（ＢＣＬ２−ＩＧＨ）を追加的標的として含めた。なぜならばこれら２つの異常はリンパ腫に比較的高頻度でＰＣＲ検出され、被膜細胞リンパ腫（ＭＣＬ）の３０％および濾胞細胞リンパ腫（ＦＣＬ）の６０ないし７０％にそれぞれＰＣＲ検出されるからである。
【００６５】
マルチプレックスＰＣＲのためのプライマーの設計
再配列したＩｇおよびＴＣＲ遺伝子のＶ、Ｄ、およびＪ遺伝子セグメント全ての正確な検出には多くの異なるプライマーが必要である（表２）。幾つかの遺伝子複合体（ＴＣＲＧおよびＴＣＲＤ）ではこれは可能であるが、その他の遺伝子座では実際には異なる遺伝子セグメントの数が多いため、これは不可能である。この問題を解決するために、特定のファミリの大部分または全ての遺伝子セグメントを認識するファミリプライマーを設計することができる（表２）。或いはコンセンサスプライマーを作ることができる。これは含まれている遺伝子セグメントの多くまたは全てに発生する保存配列を認識する。
【００６６】
ファミリプライマーおよびコンセンサスプライマーの設計は、プライマーの限られた数、および全ての関連する遺伝子セグメントとの最大相同性の間でバランスをとる。この研究では、偽陰性結果を生ずるかも知れない不十分なプライマーアニーリングを防ぐために、全ての関連遺伝子セグメント（特に機能性遺伝子セグメント）との最大相同性を目指した。さらに、その他のファミリに交差アニーリングしない特異的ファミリプライマーの設計を目指した。
【００６７】
１つの遺伝子座あたりのＰＣＲチューブの数を制限するために、ＰＣＲプライマーのマルチプレキシングが実際的理由から重要になった。そこで、マルチプレックスＰＣＲチューブに有用なプライマーを設計するための可能性を確実に最大にするために特別の指針を作成した。この目的のために、リクリック博士（ｄｒ．Ｗ．Ｒｙｃｈｌｉｃｋ；モレキュラー・バイオロジー・インサイツ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｉｎｓｉｇｈｔｓ）、カスケード（Ｃａｓｃａｄｅ）、ＣＯ、ＵＳＡ）は彼が特別に採用したＯＬＩＧＯ６．２ソフトウエアプログラムを提供し、最適プライマー設計の指針の作成に協力した。
【００６８】
プライマー設計のための一般的指針は次のようであった。
−パラフィン包埋材料を使用できるように、ＰＣＲのサイズが好ましくは＜３００ｂｐ（好ましくは１００ないし３００ｂｐ）であるようにプライマーの位置を選択しなければならない；
−結合領域への最小距離が好ましくは＞１０−１５ｂｐになるように考慮しなければならない（生殖細胞系列配列からヌクレオチドが欠失しているため、再配列した標的にプライマーの３’末端がアニールできないことによる偽陰性を避けるため）；
−プライマーは長過ぎないことが好ましい（例えば＜２５ヌクレオチド）。
【００６９】
ＯＬＩＧＯ６．２プログラムでプライマーを設計するために下記のパラメーターを使用した：
−プライマーの検索は中程度の厳密さで行わなければならない：
−プライマー効率（ＰＥ）値は好ましくは約４００でなければならない（そのプライマーをその他の遺伝子セグメントのためのコンセンサスプライマーとしても使用しなければならない場合は、＞６３０）；
−上流側／上流側、下流側／下流側または上流側／下流側プライマーの最も安定な３’ダイマーは−４Ｋｃａｌを超えてはならない（中程度の検索法）；最も安定したダイマー全体はあまり重要でない；
−マルチプレックスＰＣＲの観点から、次の指針を考慮した。最もコンセンサスな領域（すなわち共通検索においてプライマー効率が高い）では１つの共通のプライマーを設計しなければならない。その一方で共通性が最も少ない領域（すなわち含まれるべき遺伝子セグメントのためのプライマーのＰＥ値が低い）では個々のプライマー（ファミリまたはメンバー）を設計してその他の遺伝子セグメントへの交差アニーリングを避け、それによって（好ましくない）多重ＰＣＲ生成物を避けなければならない。
【００７０】
ＰＣＲプロトコル
過去の欧州研究者の研究から得られた既存の経験に基づいて、標準ＰＣＲプロトコルを開発した。最初の試験後、合意を得てから、このプロトコルを受け入れることにした。プロトコルは表３にまとめてある。
【００７１】
Ｉｇ／ＴＣＲ遺伝子再配列から得られるＰＣＲ生成物の分析法
Ｉｇ／ＴＣＲ遺伝子再配列から得られるＰＣＲ生成物を分析して、同じ結合領域を有するモノクローナルリンパ細胞と、非常に多様な結合領域を有するポリクローナルリンパ細胞とを区別しなければならない。
【００７２】
参加している研究所の諸経験に基づいて、次の２種類の方法が選択された：ヘテロ二本鎖（ＨＤ）分析および遺伝子走査（ＧＳ）分析。ＨＤ分析は二本鎖ＰＣＲ生成物を使用し、結合領域の長さおよび組成を利用する。他方、ＧＳでは一本鎖ＰＣＲ生成物をそれらの長さのみに応じて、高解析ゲルまたはポリマー中で分離検索する（図２）。
【００７３】
ＰＣＲ生成物のヘテロ二本鎖分析
未標識プライマーで得られたＰＣＲ生成物を高温で変性（約９５℃、５分間）、その後低温にして急速かつランダムに再変生する（好ましくは４℃で１時間）。この強制二本鎖形成はポリクローナルリンパ球増殖の場合は異なる移動速度を有する多くの異なるヘテロ二本鎖を生成するが、モノクローナルリンパ球増殖の場合は同一の速い移動を示すホモ二本鎖が生成する。６％ポリアクリルアミドゲルでこれらのホモ二本鎖を電気泳動すると、予測可能のサイズの単一バンドが生成し、一方ヘテロ二本鎖はより高い位置にスメアを形成する（図２）。ヘテロ二本鎖法は迅速、簡単、安価で（技術的詳細は表４を参照されたい）、検出限界約５％を有する。４０，４１ 検出限界はポリクローナルリンパ球の頻度によって影響を受ける、なぜならば多くのヘテロ二本鎖形成はモノクローナルＰＣＲ生成物も一部消費するからである。４１
【００７４】
ＰＣＲ生成物の遺伝子走査分析
遺伝子走査分析のためのＰＣＲプライマーはフルオロクロムで標識化され、自動検索機器でＰＣＲ生成物を検出する必要がある（図２）。
【００７５】
フルオロクロム標識一本鎖（変性）ＰＣＲ生成物は変性ポリクローナルシークエンシングゲルまたはキャピラリーシークエンシングポリマー中でサイズによって分離され、レーザーによる自動走査で検出される（技術的詳細は表５を参照されたい）。これは多数のピークのガウス分布を生成し、ポリクローナルリンパ球増殖の場合は多くの異なるＰＣＲ生成物をあらわすが、完全にモノクローナルなリンパ球増殖の場合は１種類のＰＣＲ生成物からなる単一ピークを与える（図２）。
【００７６】
遺伝子走査は迅速で比較的簡単であるが、高価な機器を必要とする。遺伝子走査は一般的にヘテロ二本鎖分析より感度が高く、クローンリンパ細胞０．５ないし１％の感度に達することがある。
【００７７】
標準遺伝子およびパラフィン包埋組織
ヨーロッパの幾つかの国では、ＰＣＲベースのクローン性研究など分子診断のための新鮮組織材料が容易には手に入らない。そこで本研究の目的の一つは、パラフィン包埋組織でＰＣＲベースのクローン性研究をするための方法を開発することであった。
【００７８】
パラフィン包埋材料からのＤＮＡの質および増幅可能性を制御するために、特殊のマルチプレックス・標準遺伝子ＰＣＲを開発し、５フラグメント（１００ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐおよび６００ｂｐ）のラダー（階段）を作った。上記の９０症例のうちの４５症例からＤＮＡ抽出のために十分なパラフィン包埋組織が得られた。クローン性診断のための標準遺伝子マルチプレックス・チューブ並びにＩｇ／ＴＣＲ／ＢＣＬ１／ＢＣＬ２マルチプレックス・チューブを用いて、これらＤＮＡサンプルを新鮮ＤＮＡサンプルと平行して試験した（実施例１０参照）。
【実施例１】
【００７９】
完全ＩＧＨ遺伝子再配列：Ｖн−Ｊн
背景
ＩＧＨ遺伝子の機能性再配列は、最初にＤнからＪн、それに続いてＶからＤн−Ｊнの順に生じ、その後、成熟Ｂ細胞の特徴である抗体発現が起きる。ＩＧＨ遺伝子は染色体１４ｑ３２．３の、約１２５０キロベースをカバーする領域に位置する。４６ないし５２の機能性Ｖнセグメント（個々のハプロタイプによる）が同定された。それらは６または７つのＶнサブグループにおけるそれらの相同性によってグループ化できる。さらに、約３０の非機能性Ｖнセグメントが示された。さらに、２７のＤнセグメントおよび６つの機能性Ｊнセグメントが常に見られた（表２および図３Ａ）。５６
【００８０】
Ｖнセグメントは３つのフレームワーク（ＦＲ）と２つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する（図３Ｂ）。種々のＶнセグメントのなかでＦＲはそれらの各類似性によって特徴づけられ、ＣＤＲは同じＶнファミリー内においても非常に異なる。さらにＣＤＲは、これら領域内の多型性を高める胚中心反応の過程で、体細胞の過剰突然変異に対し好ましい標的配列を示す。ＦＲは通常体性突然変異による影響を比較的受けないとはいえ、ヌクレオチド置換はこれらの領域内でも起こることがあり、強い突然変異プロセス下にあるＢ細胞では特に起こり得る。
【００８１】
非常に可変的なＶ−Ｄ−Ｊн領域をＰＣＲによって増幅し、悪性Ｂ細胞性疾患の存在を示唆するクローンＢ細胞集団を検出することができる。ガウス分布で配列した約６０ｂｐのサイズ範囲を有する多くの種々のポリクローナルＰＣＲ生成物とクローンＰＣＲ生成物のサイズおよび組成が同じであることに基づいて、クローンＢ細胞をポリクローナルＢ細胞（すなわち正常または反応性リンパ組織）から区別できる。組織学的切片および細胞懸濁液中のクローンＢ細胞集団を検出するためのＰＣＲベースの戦略は１９世紀の初期にすでに確立されていた。しかし、初期のプロトコルは３つのフレームワーク領域の１つ、主としてＦＲ３に結合できる単一Ｖнコンセンサスプライマーを用いた。このようなコンセンサスプライマーは同じ効率で全てのＶнセグメントを増幅するには適さず、クローン再配列のかなりの数が検出されないという結果を導いた。その上、胚中心反応の過程において導入される体性突然変異はＣＤＲに限らずＦＲにも起きることがあり、それによってプライマーアニーリングを阻害し、よって悪性Ｂ細胞集団があるにもかかわらずクローンＰＣＲが検出されないことになる。これは、通常、体性突然変異を多数含む濾胞性リンパ腫、びまん性大Ｂ細胞性リンパ腫および多発性骨髄腫に特に当てはまる。
【００８２】
ＩＧＨ ＰＣＲの検出率をさらに高めるために、ファミリ−特異的プライマーを設計してコンセンサスプライマーの限界を克服する幾つかの試みがなされた。しかし、これらのファミリ−特異的プライマーは、ほとんどがそれまでのコンセンサスプライマーの配列に基づいている。これらのＰＣＲ戦略は検出率の改善に役立ったとはいえ、体細胞の過剰突然変異に対する感度がより低く、したがって（実質的に）全てのあり得るＶ−Ｄ−Ｊн再配列の増幅を可能にするプライマー系が依然として必要である。
【００８３】
プライマーの設計
本発明の指針により、３つのＶнフレームワーク領域（ＦＲ１、ＦＲ２およびＦＲ３）に対応する３セットのＶнプライマーをＯＬＩＧＯ−６．２プログラムを用いて設計した（図３）。各セットのプライマーは、対応するＶнセグメント（Ｖн１−Ｖн７）にアニールすることができる６または７個のオリゴヌクレオチドからなっており、大部分のＶнセグメントではミスマッチが全くなく、稀に幾つかのＶнセグメントに１個またはせいぜい２個のミスマッチがあるだけであった。ミスマッチがプライマーの５’末端そのものに位置するように設計された。これらのＶнプライマーセットを、６個のＪнセグメントの最も相同性のある３’末端、ＪнＲＳＳの約３５ｂｐ下流にアニールするように設計された単一Ｊнコンセンサスプライマーと組み合わせて使用した。この結果、全てのＪнセグメントが同じ結合効率で検出され、プライマー結合が再配列プロセスの過程における大規模なヌクレオチド欠失による影響を容易には受けないことが確実となる。さらに、ＯＬＩＧＯ−６．２プログラムによって評価したところ、ＶнプライマーとＪнプライマーとの間の交差アニーリングはなかった。
【００８４】
Ｊнプライマーも設計され、その他のＰＣＲ標的、例えば不完全Ｄн−Ｊн再配列並びにｔ（１１；１４）（ＢＣＬ１−ＩＧＨ）およびｔ（１４；１８）（ＢＣＬ２−ＩＧＨ）などの増幅に使用した。これは、同じ標識化Ｊнプライマーを使用するＧＳ分析による種々のＰＣＲ生成物の検出を可能にする。
【００８５】
試験初期の結果
新たに設計されたＶн−Ｊн ＰＣＲの初期試験はＪнプライマーと共に各Ｖнプライマーを個々のＰＣＲに別々に使用することによって行われた。この目的のために、Ｂ細胞系から抽出したＤＮＡ、並びに確実なクローン患者サンプルを使用した。さらに、反応性扁桃から抽出したＤＮＡを逐次希釈することによってクローン再配列の感度を試験した。起こり得る各ＩＧＨ再配列でクローン標準サンプルを使用することはできなかったが、全ての主要Ｖнセグメントおよび数種の、稀に再配列がおきるＶнセグメントは初期試験段階に含まれた。
【００８６】
全てのプライマーセットは高い効率および感度で機能した。予想されたクローンＶн再配列が検出され、感度は最低１％（１０−２）であった。予想されるサイズ範囲内にバックグラウンドはなく、扁桃ＤＮＡの増幅は予想されるガウス分布曲線を与えた。（図３Ｃ、Ｄ、およびＥ）。
【００８７】
これらの結果に基づき、上記Ｖнプライマー類を、３つのフレームワーク領域の１つに特異的な３セットにそれぞれ組合わせ、それを共通のＪнプライマーと共に使用することによって初期プライマー試験の次の相を開始した。結果は単一プライマー対で得られるものと同じであったが、感度はわずかに低かった。その上、予想サイズ範囲内では非特異的生成物は増幅されなかったが、ＦＲ１マルチプレックスＰＣＲにあらわれる３４０ｂｐＰＣＲ生成物は例外であった。このＰＣＲ生成物はＰＣＲに使用するＤＮＡソース（リンパ性および非リンパ性）には無関係に生じた。その一方で、ＤＮＡテンプレートを使用しない場合はＰＣＲ生成物は全く得られなかった。さらに、このアンプリコンはヘテロ二本鎖分析においてのみ検出され、遺伝子走査では検出されなかった。これは、蛍光標識ＪнプライマーがこのＰＣＲ生成物の発生に関係していなかったことを示唆する。このＰＣＲ生成物の配列分析によって、ＦＲ１Ｖн２プライマーと組合わせたＦＲ１Ｖн４プライマーによって増幅されるＶн４フラグメントが明らかになった。前記ＦＲ１Ｖн２プライマーはイントロンＶн４配列に結合することによって下流プライマーとして作用すると思われる。この問題は、それまでのプライマー結合部位の２５ｂｐ上流に位置する新しいＦＲ１Ｖн２プライマーを設計することによって解決できる。
【００８８】
全般的な試験段階の結果
承認されたＩＧＨ ＰＣＲを、サザンブロット法で決定された９０のＤＮＡサンプルに適用した。これらサンプルは十分特徴づけられた症例から得られたものである。全般的な試験段階に参加した１１研究所のうち６研究所はＰＣＲ生成物をＧＳ分析し、５研究所はＨＤ分析を行った。さらに数種のポリクローナル並びにモノクローナルサンプル（細胞系ＤＮＡ）を標準として含めた。これらの症例の４５はＧＳ分析後に主要ＰＣＲ生成物を示し、４０症例はＨＤ検出後に主要ＰＣＲ生成物を示し、モノクローナルＢ細胞集団の存在を示唆した。クローン再配列は４５クローン症例（ＧＳ）のうち３３において全ての３ＦＲプライマーセットで検出でき、残る１２では３ＦＲプライマーセットのうち１つまたは２つのセットで検出できた。大部分の陰性結果は、プライマーアニーリングおよび増幅を阻止するプライマー結合部位における体細胞の過剰突然変異によって起きると結論づけた。
【００８９】
Ｖн−Ｊн ＰＣＲ結果と、サザンブロット結果とを比較すると高度に一致した。サザンブロット分析した、再配列Ｖн遺伝子を有するサンプルの８５％（５５のうち４６）および７６％（５５のうち４２）が、ＧＳ分析およびＨＤ分析によってそれぞれ優勢な増幅生成物を示した。反対に、サザンブロット分析した、生殖細胞系列Ｖн遺伝子を担う２サンプル以外の全てがＧＳおよびＨＤ分析によってポリクローナルパターンを示した。
【００９０】
結論
結論として、クローンＶн−Ｊн再配列を検出するための３種類のマルチプレックスＰＣＲはクローンＢ細胞増殖を確認する新しい確実なアッセイをもたらす。標準化プライマー３つの異なるＦＲにおける標準化プライマー類の組み合わせ使用は、関係するＶн遺伝子セグメントのプライマー結合部位における体細胞の過剰突然変異による偽陰性結果の発生率の減少に役立つ。
【実施例２】
【００９１】
不完全ＩＧＨ遺伝子再配列：Ｄн−Ｊн
背景
染色体１４ｑ３２．３上のＩＧＨ遺伝子座における完全Ｖ−Ｄ−Ｊ再配列の形成は次の２段階で起きる連続的プロセスである：、早期前駆体Ｂ細胞のＤнおよびＪн遺伝子セグメント間に最初の再配列が起き、その後にＶнカップリングが起きるのが一般的である（５７を参照されたい）。多くの明確なＶн遺伝子セグメントおよび６つの機能性Ｊн遺伝子セグメント（実施例１を参照されたい）に加えて、ヒトＩＧＨ遺伝子座は２７のＤн遺伝子セグメントも含む。５８ 配列の相同性に基づき、２７のＤнセグメントを次の７つのファミリにグループ化することができる：Ｄн１（以前はＤＭとして知られていた）、Ｄн２（ＤＬＲ）、Ｄн３（ＤＸＰ）、Ｄн４（ＤＡ）、Ｄн５（ＤＫ）、Ｄн６（ＤＮ）、およびＤн７（ＤＱ５２）；Ｊн領域のすぐ上流の単一Ｄн７−２７セグメントからなる第７ファミリを除いて、全てのファミリが少なくとも４メンバーを含む（図３Ａ）。５８，５９
【００９２】
任意のＤнおよびＪнセグメント間の組換えは不完全Ｄн−Ｊн結合を形成させる。それは骨髄誘導性ＣＤ１０＋／ＣＤ１９−前駆体Ｂ細胞に容易に検出され、６０．６１ したがって未成熟遺伝子型を示す前駆体Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病のサブセット（２０−２５％）にも検出できる。６２ シーケンシングにより、前駆体Ｂ−ＡＬＬにＤн２（Ｄн２−２）、Ｄн３（Ｄн３−９）およびＤн７−２７遺伝子セグメントが優勢であり、確認された全てのセグメントのそれぞれ３６％、３３％および１９％であることが示された。６２
【００９３】
しかし成熟Ｂ細胞性悪性腫瘍においても不完全Ｄн−Ｊн再配列は報告されている。６１，６３ その上、Ｂ−系統悪性腫瘍の最も成熟したタイプと考えることができるＩｇＨ−陰性−多発性骨髄腫のサブセットにおいてさえ、Ｄн−Ｊн結合が認められた。６４ これらのＤн−Ｊн再配列は非コーディング第二対立遺伝子から誘導され、Ｄн１からＤн４までのファミリからのセグメントを含んでいた。６４ 前駆体Ｂ−ＡＬＬおよび多発性骨髄腫におけるＤн−Ｊн結合の説明に基づき、不完全なＤн−Ｊн再配列はその他のタイプのＢ細胞性白血病およびリンパ腫にも存在すると予想される。未成熟Ｔ細胞性悪性腫瘍においてＤн−Ｊнカップリングが交雑再配列として確認された；３４ 興味深いことに、これらはほとんど専ら、より未成熟の非−ＴＣＲαβ＋Ｔ−ＡＬＬサブセットに起こり、より下流のＤн６−１９およびＤн７−２７セグメントを主に含んでいた。後者のセグメントは胎児Ｂ細胞にはしばしば（４０％まで）用いられるが、成Ｂ細胞にはほとんど用いられない。６５，６６ 成人の前駆体および成熟Ｂ細胞は、完全Ｖн−Ｄн−Ｊн再配列の配列からわかるように、主にＤн２およびＤн３ファミリセグメントを使用するようにみえる。５６
【００９４】
種々のタイプの成熟Ｂ細胞性悪性腫瘍における不完全Ｄн−Ｊнカップリングの正確な頻度はほとんど知られていないが、それらが少なくともＶн−Ｊн結合のそれより低いことは明らかである。それにもかかわらず、Ｄн−Ｊн再配列はＰＣＲベースのクローン性評価のために重要な相補的標的である。ＰＣＲ標的としてこのＤн−Ｊн再配列が関与していることが推定されるのは、ＩＧＨ遺伝子座の不完全再配列は体細胞の過剰突然変異を含まないという仮定に基づく。なぜならば体細胞の過剰突然変異があらわれるための重要な必要条件とみなされるＶ遺伝子セグメントのプロモータから出発する転写が起きないからである。６７，６８ 特に、体細胞の過剰突然変異が頻発するようなＢ−系統増殖タイプでは、あり得るＤн−Ｊн組換え生成物のＰＣＲ分析が適切であり、Ｂ細胞クローンを検出する唯一の可能性である場合もある。
【００９５】
プライマーの設計
各Ｄнファミリ内の高度の相同性に基づいて、７つのファミリ特異的Ｄнプライマーを、Ｖн−Ｊн再配列の検出にも用いられるコンセンサスＪнプライマー（実施例１参照）、およびｔ（１１；１４）（ＢＣＬ１−ＩＧＨ）およびｔ（１４；１８）（ＢＣＬ２−ＩＧＨ）（実施例８および９）と共に設計した（図４）。プライマー類の設計は、他のＤнファミリセグメントに対する交差アニーリングが最小であるか、好ましくは全くないようにし、種々のファミリプライマーがＲＳＳ要素に対して明確な位置となるように行われる（図４）。Ｄн−Ｊн結合の予想されるＰＣＲ生成物サイズは１１０−１３０ｂｐ（Ｄн７−Ｊн結合）から３９５−４１５ｂｐ（Ｄн３−Ｊн再配列）までの範囲である。Ｄн７−２７の位置がＪн領域のセグメント類に近いために、２１１ｂｐのＰＣＲ生成物は（および下流Ｊн遺伝子セグメントにプライマーがアニーリングする場合には４１９、１０３１、１４０４、１８０４および２４２０ｂｐのＰＣＲ生成物も）非再配列対立遺伝子から増幅され、ほとんど全てのサンプルにおいて生殖細胞系列のバンドのラダーとして検出されることは注目される。
【００９６】
初期試験段階の結果
個々のＤнプライマーの初期試験のために、十分明確にされたクローンＤн−Ｊн再配列を有する腫瘍負荷の高い前駆体Ｂ−ＡＬＬまたはＴ−ＡＬＬサンプルを使用した。１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２およびＡｍｐｌｉＴａｑ金緩衝液を使用する標準ＰＣＲ条件下で、７つ全てのプライマー組み合わせは、予想サイズ範囲内の生成物長さでクローンＤн−Ｊн標的を検出するようにみえた。そのＤнプライマーの、その他のＤнファミリからの再配列遺伝子セグメントへの交差アニーリングは非常に弱いかまたは全く認められなかった。さらに、健康な標準扁桃またはＭＮＣ ＤＮＡにも正しいサイズ範囲のＰＣＲ生成物が認められた。プライマー類の非特異的アニーリングは、非−テンプレート特異的標準ＤＮＡを用いた場合、ほとんど全てのプライマーセットに認められなかった；Ｄн２／Ｊнプライマーセットの場合に限り、（時には弱い）３４０−３５０ｂｐ生成物がＨｅＬａ ＤＮＡに認められた。その後のシーケンシングによって、この非特異的生成物はＪн４セグメントの上流のＤＮＡ配列へのＤн２プライマーの偽プライミングによるものであることが判明した。しかしこの非特異的生成物のサイズは真のＤн−Ｊн ＰＣＲ生成物のいずれのサイズとも非常に異なるため、新しいＤн２プライマーは設計しないことに決められた。実際には、非特異的３５０ｂｐバンドを、成功するＤＮＡ増幅の内部マーカー、したがってテンプレートＤＮＡの質の内部マーカとして使用でき、十分なクローナルまたはポリクローナルＤн−Ｊнテンプレートが使用できるときには（例えば扁桃ＤＮＡまたは特定の白血病サンプルからのＤＮＡ）ほとんど見えないか微かに見えるが、Ｄн−Ｊн再配列を有するリンパ細胞を少数含むサンプルでは特に強い。
【００９７】
クローンの標準サンプルからのＤＮＡを扁桃ＤＮＡで逐次希釈すると、ＨＤ分析を用いた場合に５％以下の感度になるのが普通である（Ｄн７−Ｊн再配列の場合０．５−１％）；ＧＳ分析における感度は一般的に１−２段階の希釈がより良く、すなわち１％以下である。クローンＤн７−Ｊн標的は〜１０％の感度で検出されるに過ぎない。これは十中八、九、非再配列生殖細胞系列Ｄн７およびＪн遺伝子セグメントを含むＰＣＲアンプリコンにおいてプライマーが消費されるからである。
【００９８】
ＯＬＩＧＯ６．２によるプライマーデザインから示唆されるように、最初のマルチプレックス戦略は種々のＤнプライマーを２本のチューブに分割することであったが、種々のマルチプレックスアプローチを試験した後、Ｄн７プライマー以外の全てのプライマーを１本のマルチプレックスチューブ（ＩＧＨクローン性アッセイのチューブＤ）に合一することに決めた。Ｄн７プライマーは別のチューブ（ＩＧＨクローン性アッセイのチューブＥ）に含まれた。Ｄн７プライマーを除いた理由は、非再配列Ｄн７セグメントを有する対立遺伝子の安易な増幅による複雑な生殖細胞系列パターンであった。この２本のマルチプレックスアプローチを用いても、全てのクローン標準サンプルを検出することができた。マルチプレックス条件下で、これら種々のクローン標的の検出限界は単一アッセイに比べて論理的にはより適切でなく、〜５％（Ｄн３、Ｄн４、およびＤн６）から〜１０％（Ｄн２、およびＤн５）までの範囲であった。使用できるＤн１クローナル標準サンプルでは、〜２０％の感度が観察された；その後の段階では、細胞系ＫＣＡのＤн１−Ｊн再配列がマルチプレックスアッセイで１０％まで検出できることが判明した。チューブＥはＤн７プライマーだけを含むので、このチューブの１０％感度は前記と同じであった。１００ｎｇＤＮＡの逐次希釈でなく５００ｎｇＤＮＡの逐次希釈で行った同じマルチプレックス分析はわずかにより良い感度を示した。扁桃ＤＮＡの代わりにＭＮＣ ＤＮＡを用いて逐次希釈した場合、Ｄн−Ｊн組換えに関するアッセイの検出限界に明らかな影響はなかった。
【００９９】
全般的な試験段階の結果
プライマー設計に関係する３研究所における最初の試験後、開発されたＩＧＨ Ｄн−ＪнマルチプレックスＰＣＲアッセイを、サザンブロット法で確定された９０のサンプルを使用してさらに評価した。全てのサンプルを４研究所ではＨＤ分析で、５研究所ではＧＳ分析で平行して分析した；別の２研究所では全てのサンプルを両方法で分析した。全部をまとめると、１本のチューブのサンプルにつき、全部で６ＨＤ分析結果と７ＧＳ分析結果が得られた。大部分のサンプルで一致した結果（同一結果の出た研究所は＞８０％）が出たにもかかわらず、９研究所でチューブＤに研究所内不一致が示された。その後の分析により、これらが弱いクローン生成物を含む小さいクローンの存在または大きいサイズの生成物（〜３９０以上）のどちらかによって説明できることが判明した。ある場合には生成物は非常に大きく、そのため、それらが上流Ｄн遺伝子セグメント（例えばＮＬ−１２のＤн６−２５―Ｄн１−２６−Ｊн）または下流Ｊн遺伝子セグメント（例えばＰＴ−１４のＤн６−２５−Ｊн４―Ｊн５）からの真の、だが広がったＤн−Ｊн再配列に関係していることがシーケンシング後にはじめて明らかになった。チューブＥを使用してクローン生成物が見いだされた３症例全てにおいて（ＮＬ１７、菌状息肉腫；ＦＲ−１、Ｂ−ＣＬＬ；ＦＲ−５、ＦＣＬ）、結果は研究所間で完全に一致した。
【０１００】
ＨＤおよびＧＳ分析からの結果を評価すると、同一結果を示す研究所の数は一般的にＧＳ分析に比較してＨＤ分析の方がわずかに多いとはいえ、これらは同等であるようにみえた（図４Ｂおよび図Ｃ）。
【０１０１】
Ｊн領域における単一プローブ（ＩＧＨＪ６）とのハイブリダイゼーションはＶн−Ｊн再配列とＤн−Ｊн再配列とを区別できないから、Ｄн−ＪнマルチプレックスＰＣＲの結果をＳＢデータと直接比較することは実質的に不可能である。３サンプルにおいて、Ｖн−ＪнおよびＤн−Ｊн組合わせアッセイのクローン生成物の検出はＳＢ分析のＩＧＨＪ６遺伝子座の構成とはぴったり合わないことが明らかになった。前濾胞性Ｂ細胞性悪性腫瘍にクローンＤн−ＪнＰＣＲ生成物が全く認められなかったことは注目される。対照的に、１１／１６Ｂ−ＣＬＬサンプルおよび１２／２５（後−）濾過性Ｂ細胞性悪性腫瘍サンプルはクローン性再配列Ｄн−ＪнＰＣＲ生成物を含んでいた。Ｔ細胞性悪性腫瘍の１８症例のうち３症例にはクローンＤн−Ｊн再配列が見られた；これらは、ＳＢで検出されるＩＧＨ再配列を有するＴ−ＬＢＬ（ＥＳ−９）および菌状息肉腫（ＮＬ−１７）の症例、およびＳＢ−検出ＩＧＨ再配列のないＴ−ＮＨＬ／ＥＡＴＬ（ＰＴ−４）の症例に関係していた。これは低い（＜１５％）腫瘍負荷のためと考えられる。１５の反応性症例は全てポリクローナルＤн−ＪнＰＣＲ生成物を示した。これはＳＢ結果と一致する。診断が困難なカテゴリーＤでは３サンプル（ＰＴ−１２、ＧＢＳ−１０、およびＧＢＮ−８）がクローンＩＧＨ Ｄн−ＪнＰＣＲ生成物を示した。これは３症例のうち２症例でＳＢデータ並びにＩＧＫ ＰＣＲデータと一致した；別の２サンプル（ＰＴ−６およびＧＢＳ−９）（両方共Ｔ細胞が豊富なＢ−ＮＨＬの症例である）ではクローンＩＧＫおよび／またはＩＧＬ生成物の他にクローンＤн−Ｊн生成物が見いだされたが、ＳＢ分析からはクローン性の証拠はなかった。これはこれらのサンプルではＢ細胞性クローンのサイズが小さいためと説明するのが最良である。
【０１０２】
Ｄн−ＪнＰＣＲ分析の付加的価値を決定するために、これらの結果をＶн−ＪнＰＣＲ分析と比較した。５（ＮＬ−４、ＰＴ−１４、ＧＢＮ−２、ＦＲ−７、ＮＬ−１２）Ｂ細胞性悪性腫瘍においてクローナルＤн−ＪнＰＣＲ生成物が見いだされ、その一方でポリクローナルＶн−ＪнＰＣＲ生成物だけが見いだされた。
【０１０３】
結論
結論として、最初の試験相、および全般的な試験段階に基づくと、Ｄн−ＪнＰＣＲ分析はクローン性評価のために付加的価値を有するようにみえる。ＨＤ分析結果は若干より容易に説明されるとはいえ、ＨＤおよびＧＳ分析は両方共増幅ＰＣＲ生成物の分析に適しており、どちらかが明らかに優れているとは言えない。Ｄн−ＪнＰＣＲ分析の潜在的障害は、プライマーの位置がばらついているため、および上流Ｄнまたは下流Ｊн遺伝子セグメントからの広い増幅のために、予想されるＰＣＲ生成物のサイズが相対的に広い範囲にあることである。これはＧＳ分析には長い移行距離が薦められることを意味する。ＩＧＨ遺伝子座におけるＤн７−２７遺伝子セグメントの注目すべき位置がチューブＥにおいて生殖細胞系列の増幅生成物のラダーをもたらし、クローン生成物がはるかに小さいバンド／ピークとして容易に確認されることを最後につけ加える。
【実施例３】
【０１０４】
ＩＧＫ遺伝子再配列：Ｖκ−Ｊκ、Ｖκ−Ｋｄｅ／イントロンＲＳＳ−Ｋｄｅ
背景
ヒトＩＧＫ軽鎖遺伝子座（染色体２ｐ１１．２）は、７つのＶκ遺伝子ファミリに分類される多くの明確なＶκ遺伝子セグメント、並びにＣκ領域の上流の５つのＪκ遺伝子セグメントを含む。最初、これらのＶκ遺伝子セグメントはザショー（Ｚａｃｈａｕ）らによって記載された名称によってしたがって設計された。６９ 別の名称は、Ｖκ遺伝子セグメントを７つのファミリにグループ化し、ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓデータベースに使用されている。４６ ここでは我々は後者の名称にしたがうことにする。Ｖκ１、Ｖκ２、およびＶκ３ファミリは機能性および偽遺伝子セグメントを含むマルチメンバーファミリであり、その他のファミリは１つの（Ｖκ４、Ｖκ５、Ｖκ７）または２、３のセグメント（Ｖκ６）を含む。７０ 全てのＶκ遺伝子セグメントは２つの大きい二本鎖クラスタ上に散乱し、あるものはすぐ上流で、Ｊκセグメントと同じ方向に、あるものはより遠くに、逆方向に散乱している（図５Ａ）のが注目される。７１ 後者は、遠くのクラスタのＶκ遺伝子を含むＶκ−Ｊκ結合を形成するためにいわゆる逆位再配列が必要であることを意味する。ＶκおよびＪκセグメントに加えて、ＩＧＫ遺伝子座には組換えに関係し得るその他の要素がある。Ｊκ−Ｃκ領域の約２４ｋｂ下流のカッパ欠失要素（Ｋｄｅ）はＶκ遺伝子セグメント（Ｖκ−Ｋｄｅ）に再配列できるが、Ｊκ−Ｃκイントロン中の分離したＲＳＳにも再配列できる（イントロンＲＳＳ−Ｋｄｅ）。２４，７２ 両タイプの再配列は、Ｃκエクソン（イントロンＲＳＳ−Ｋｄｅ再配列）または全Ｊκ−Ｃκ領域（Ｖκ−Ｋｄｅ再配列）どちらかの欠失によって、ＩＧＫ対立遺伝子の機能性不活性化に導く。
【０１０５】
ヒトＩＧＫ組換えは骨髄の前駆体Ｂ細胞において出発するので、ＩＧＫ再配列は前駆体Ｂ細胞性急性白血病にも検出できる（年齢によって、対立遺伝子の３０−４５％）。Ｖκ−Ｊκ結合が存在するとはいえ、これらのＩＧＫ再配列は主としてＫｄｅを含む（対立遺伝子の２５−３５％）組換えに関係する。子供では、前駆体Ｂ−ＡＬＬ Ｖκ−Ｋｄｅ組換えはイントロンＫｄｅに優先し、成人ＡＬＬでは欠失は専らＶκ−Ｋｄｅカップリングに関係する。２４，７３，７４ 慢性Ｂ細胞性白血病ではＩＧＫ再配列はさらに頻発し、全ＩＧＫ対立遺伝子の７５％（Ｉｇκ＋症例）または９５％（Ｉｇλ＋症例）にもなる。定義により、機能性Ｖκ−Ｊκ再配列はＩｇκ＋Ｂ細胞性白血病では少なくとも１つの対立遺伝子に見いだされる；非コーディング第二対立遺伝子は生殖細胞系列の構造であるか、Ｖκ−Ｋｄｅ（対立遺伝子の８％）またはイントロンＲＳＳ−Ｋｄｅ（対立遺伝子の８％）によって不活性化されるかどちらかである。Ｋｄｅ再配列はＩｇλ＋Ｂ細胞性白血病には頻発し（対立遺伝子の〜８５％）、イントロンＲＳＳ−Ｋｄｅ組換えがＶκ−Ｋｄｅ再配列に若干まさる。これは、実質的に全てのＩｇλ＋白血病がＫｄｅ再配列を含み、その一方、潜在的機能性Ｖκ−Ｊκカップリングは比較的稀であることを意味する。２４、７５ 幾つかの研究が、Ｖκ遺伝子セグメント使用が種々の正常および悪性Ｂ細胞集団間でほぼ同一であり、各ファミリ内の使用できる遺伝子セグメントの数を反映することを示した。Ｖκ−Ｊκ並びにＶκ−Ｋｄｅ再配列のどちらにおいても、第一の４ファミリ（Ｖκ１〜Ｖκ−Ｖκ４）からのＶκ遺伝子セグメントが優勢である。Ｖκ２遺伝子の使用は前駆体Ｂ−ＡＬＬの方が、より成熟したＢ細胞性リンパ球増殖または正常Ｂ細胞に比べて高いようにみえる。注目すべきは、遠方の逆位ＶκクラスタがＶκ−Ｊκ再配列には滅多に使用されず、一方Ｖκ偽遺伝子セグメントはＩｇλ＋症例には決して含まれず、また全くないことである。７６ Ｊκ遺伝子セグメント使用についてはほとんど知られていないが、稀少なデータはＪκ１、Ｊκ２およびＪκ４が最もよく使われるＪκ遺伝子セグメントであることを示している。７５
【０１０６】
Ｖκ−Ｊκ再配列は、体細胞の過剰突然変異がＶн−Ｊн標的の増幅を妨害するかも知れないようなＢ細胞増殖型にとっては重要な相補的ＰＣＲ標的であるが、Ｋｄｅを含む組換えはさらにより重要であると考えられる。Ｊκ−Ｃκイントロンにおける介在配列の欠失は、体細胞の過剰突然変異プロセスが起きるために必要と考えられるＩＧＫエンハンサーを除去する。したがってＫｄｅを含む再配列には体細胞の過剰突然変異はないと予想され、したがってかなり容易に増幅されるはずである。
【０１０７】
プライマーの設計
ＯＬＩＧＯ６．２ソフトウエアを使用して、７つのＶκファミリの種々のＶκ遺伝子セグメントを識別する６種類のファミリ特異的Ｖκプライマーを設計した；Ｖκ６ファミリ遺伝子セグメントはＶκ１ファミリプライマーによってカバーされた（図５Ｂ）。比較的大きいＶκ１、Ｖκ２、およびＶκ３ファミリの場合は、機能性Ｖκ遺伝子セグメントだけを考慮した。なぜならば比較的相同性の少ない偽遺伝子セグメントは最適プライマー設計をあまりに複雑にしたからである。ファミリ特異的Ｖκプライマーを設計し、２種類のＪκプライマーの１セット（最初の４ＪκセグメントをカバーするＪκ１−４、および第５のＪκセグメントをカバーするＪκ５）かまたはＫｄｅプライマーと組合わせて使用した（図５Ｂ）。Ｋｄｅ再配列の分析のために、イントロンＲＳＳの上流の配列を認識する付加的正方向プライマーを作った。他のＶκファミリセグメントに対して最小の交差アニーリングを示し、なおマルチプレックス反応に有用であるために、ＲＳＳに対して同様の位置に種々のプライマーを設計することはできなかった（図５Ｂ）。Ｖκ−Ｊκ結合の予想されるＰＣＲ生成物のサイズは〜１１５−１３５ｂｐ（Ｖκ７−Ｊκ結合）から〜２８０−３００ｂｐ（Ｖκ２−Ｊκ再配列）までの範囲である。Ｋｄｅ再配列では、生成物のサイズの範囲は〜１９５−２１５ｂｐ（Ｖκ７−Ｋｄｅ）から〜３６０−３８０ｂｐ（Ｖκ２−Ｋｄｅ）までであり、その一方でイントロンＲＳＳ−Ｋｄｅ生成物は〜２７５−２９５ｂｐである
【０１０８】
初期試験段階の結果
個々のプライマーの初期試験では、数種の細胞系および正確に確定されたクローンＶк−Ｊк、またはＶк−Ｋｄｅ／イントロンＲＳＳ−Ｋｄｅ再配列を有する患者サンプルを使用した。Ｖк−Ｊк結合を有する患者サンプルはほとんどが慢性Ｂ細胞性白血病に関係し、しかも含まれる再配列を容易かつ敏感に検出するためにさらに高腫瘍負荷に基づいて選択された慢性Ｂ細胞性白血病にかっていた。残念なことに、クローン標準サンプルは全てのＶκ−Ｊκ標的には使用できなかった；特に、Ｖκ５、Ｖκ７および／またはＪκ５を含むより稀な再配列型は標準サンプル系列には示されなかった。これらの標的では、およびクローン標準サンプルが使用できる標的でも、正しく予測されたサイズのＰＣＲ生成物が実際認められる、健康な標準扁桃またはＭＮＣ ＤＮＡサンプルが使われた。唯一の例外はＶκ７／Ｊκ５プライマー組合わせであった；Ｖκ７−Ｊκ５結合は正常Ｂ細胞では非常に稀であると考えられており、これらのＰＣＲ生成物は扁桃にはほとんどまたは全く検出されなかった。予測サイズ範囲内の再配列生成物は、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２と、ＡＢＩ金緩衝液かＡＢＩ緩衝液ＩＩのいずれかとを使用する標準的ＰＣＲ条件下で、全てのクローン標準サンプルに検出された。しかし、二、三の症例ではその他のＶκファミリ／Ｊκプライマーのセットで特殊のＶκ−Ｊκ再配列の弱い増幅が認められた；これはＶκ３プライマーが少数のＶκ１遺伝子セグメントにわずかに交差アニーリングするためである。さらに、少数のクローン標準サンプルにおいて、その他のＶκ／ＪκまたはＶκ／ＫｄｅとイントロンＲＳＳ／Ｋｄｅとのプライマーセットで、明らかな付加的クローンＰＣＲ生成物が認められた；大部分のサンプルではこれは２つのＩＧＫ対立遺伝子の完全な構成によって説明できる。この多重クローンＰＣＲ生成物の発生は、主として１つの対立遺伝子上の２つのクローン再配列（Ｖκ−ＪκおよびイントロンＲＳＳ−Ｋｄｅ）の潜在的発生によって起きる、所定の細胞サンプルのＩＧＫ再配列の複雑さを説明するものである。この複雑さはポリクローナル性とモノクローナル性との鑑別を妨害せず、促進するものである。
【０１０９】
非テンプレート特異的標準としてＨｅＬａＤＮＡを使用した際、プライマー類の非特異的アニーリングはＶκ−ＪκおよびＶκ−Ｋｄｅ／イントロンＲＳＳ−Ｋｄｅのいずれでも認められなかった。クローン標準サンプルを扁桃ＤＮＡで逐次希釈すると、ＨＤ分析を用いて、Ｖκ−Ｊκ再配列に関しては５−１０％、Ｖκ−Ｋｄｅ再配列に関しては１−１０％の感度が得られた。一般に、ＧＳ分析における感度はほぼ１希釈段階だけより良い。ごくわずか問題のある標的はイントロンＲＳＳ−Ｋｄｅであり、これは使われた患者サンプル中で１０％の逐次希釈で始めて検出される。これはイントロンＲＳＳ−Ｋｄｅ再配列がＩｇκ＋およびＩｇλ＋扁桃Ｂ細胞の両方のＤＮＡに豊富にあるという事実から生ずると考えられる。
【０１１０】
数種のアプローチ後に選択されたマルチプレックス法は、２本の異なるマルチプレックスＰＣＲ反応チューブからなっていた。Ｖκ−Ｊκチューブ（チューブＡ）において、全てのＶκプライマーは両方のＪκプライマーと結合した、その一方、チューブＢは全てのＶκプライマー プラス イントロンＲＳＳプラスをＫｄｅ逆プライマーと組み合わせて含んでいた（図５Ｂ）。全ての前述のクローン標準サンプルはこの２本のチューブマルチプレックスアプローチによって検出できた。注目すべきは、非−クローン扁桃サンプルにおいて、〜１５０ｂｐｎｏ優勢な見かけ上クローン性バンドがＶκ−ＪκマルチプレックスチューブＡ分析を用いて検出されたことである。ＨＤ分析、特にＧＳ分析において見られたこの生成物の存在は、平均サイズ〜１５０ｂｐの生成物の高頻度の出現に導くＶκ−Ｊκ結合領域の限られた不均一性によって説明できる。さらに、幾つかのサンプルでは、時には弱い４０４ｂｐの非特異的バンドがチューブＢに認められた。Ｖκプライマーをさらに複数のチューブに分割したその他のマルチプレックスアプローチでは感度が平均してわずかにより良かったとはいえ、たった２本のチューブを使って全ての該当するＩＧＫ再配列を分析できることは、最終的には、図５Ｂに与えられているような２−チューブマルチプレックス法を選択する最も重要な理由となった。２−チューブマルチプレックス・アプローチにおける種々のクローン標的の検出限界は、腫瘍負荷の多い情報豊富なサンプルから誘導される大部分のクローンＶκ−Ｊκ再配列（Ｖκ１−Ｊκ４、Ｖκ２−Ｊκ４、Ｖκ３−Ｊκ４）では〜１０％であった；Ｖκ−Ｋｄｅ標的の幾つかは、〜１０％のまだ合理的な感度で検出されたが、Ｖκ２−Ｋｄｅ、Ｖκ５−ＫｄｅおよびイントロンＲＳＳ−Ｋｄｅ標的も含む少数のその他サンプルは１０％より高い検出限界を示した。１００ｎｇでなく５００ｎｇ逐次希釈ＤＮＡの使用でさえ、より良い感度をもたらした、その一方で、ＭＮＣ ＤＮＡ中での逐次希釈はどちらでも検出限界に影響を与えなかった。それにもかかわらず、標準ＤＮＡの水による逐次希釈の検出限界は全て０．５−１％の桁であった。これは選択したマルチプレックスＩＧＫ ＰＣＲアッセイが良いことを示すものである。実際にはリンパ節または末梢血液中の潜在的クローン細胞をポリクローナル細胞のバックグラウンドの下に検出しなければならないことに注目することは重要である。これは、ポリクローナルＢ細胞のバックグラウンドが比較的高いサンプルでは特に、高感度のクローン性検出を妨害する。
【０１１１】
全般的な試験段階の結果
プライマー設計に関係した４研究所における初期試験後、開発されたＩＧＫマルチプレックスＰＣＲアッセイを、９０のサザンブロット確定サンプルを用いてさらに評価した。全てのサンプルはＨＤ（５研究所）およびＧＳ（２研究所）分析で平行して分析された；別の４研究所では全てのサンプルを両方法で分析した。合わせると、１チューブ、１サンプルあたり８つのＨＤおよび５つのＧＳ分析結果が得られた。大部分のサンプルにおいて、研究所の８０％以上が１本または両方のチューブで同一の結果、すなわちクローンバンド／ピークまたはポリクローナル塗沫／曲線をもたらした。しかし、９サンプル（〜１０％）において研究所間で不一致が見つかり、それはこれらサンプルの反復分析後もそのままであった。より詳細な分析から、少なくとも６症例でチューブＡのクローン生成物の約１５０および２００ｂｐサイズが大体同じサイズのポリクローナル生成物から容易に区別できないことがわかった。これは、これらの再配列の比較的制限された結合不均一性によって起こる、特にＶκ−Ｊκ分析に固有の難題である。しかし２サンプルにおいて、実際には矛盾がない両方法でチューブＢから得られた結果が全ての研究所で非常に明らかであった。１サンプル（ＥＳ−８）では約５００ｂｐの大きい生成物が、矛盾した研究所内結果の理由であるように見えた；その後のシーケンシングにより、下流Ｊκセグメントから出発する増幅が伸長Ｖκ１−Ｊκ３−Ｊκ４ＰＣＲ生成物の生成をもたらすことが明らかになった。
【０１１２】
ＨＤおよびＧＳ分析からの結果を評価すると、全般的に同一結果を示す研究所の数がＧＳ分析よりＨＤ分析において若干多いとはいえ、これら２分析法はかなり一致するように見えた（図５Ｃおよび図５Ｄ）。１サンプル（ＧＢＳ−４）において、ＨＤ分析は両方のチューブで明らかな生成物をあらわし、その一方でＧＳ分析はポリクローナル性を示すに過ぎないことは注目される。ＨＤ生成物のクローニングは特殊の（奇妙な）Ｖκ３−Ｖκ５ＰＣＲ生成物を示した、それはその他のどのサンプルにも見いだされなかった；この生成物のＶκ−Ｖκ構造から、それがＧＳ分析の標識Ｊκプライマーで検出されなかった理由が説明された。
【０１１３】
ＰＣＲ結果をＳＢデータと比較すると、前濾胞性Ｂ細胞性悪性腫瘍およびＢ−ＣＬＬサンプルにはＳＢ−ＰＣＲ不一致はあらわれなかった；ＳＢ分析における再配列ＩＧＫバンドの存在と一致して、全てのサンプルはクローンＩＧＫ ＰＣＲ生成物を含んでいた。対照的に、２５の（後−）濾胞性Ｂ細胞性悪性腫瘍サンプルには、クローンＩＧＫ ＰＣＲ生成物はＤＬＣＬの４症例（ＥＳ−５、ＰＴ−１３、ＰＴ−１４、ＦＲ−７）およびＰＣ白血病の１症例（ＮＬ−１９）にはいずれの方法でも認められず、ＤＬＣＬの別の１症例（ＧＢＳ−４、上を参照されたい）ではＧＳ分析においてだけ見られなかった。全ての症例で、これは十中、八、九、体細胞の過剰突然変異によるものである。興味深いことに、ＦＣＬの１症例（ＮＬ−４）においてはクローンＰＣ生成物が見いだされ、その一方でＳＢ分析はＩＧＫ遺伝子の場合に生殖細胞系列バンドをあらわし、ＩＧＨ分析は弱いクローンバンドをあらわした。Ｔ細胞性悪性腫瘍１８症例の全ておよび１５の反応性症例（カテゴリーＣ）の全てにおいて、末梢Ｔ−ＮＨＬの１症例（ＦＲ１０）を除いて、ポリクローナルＩＧＫ ＰＣＲ生成物がＳＢ結果によって見いだされた。クローンＴＣＲおよびＩＧＫ生成物に次いで、このサンプルはＳＢ分析でクローンＩＧＨおよびＩＧＬ ＰＣＲも示したが、ＳＢ分析でクローンＩｇ再配列は示さなかった。これは、このサンプルに小さい付加的Ｂ細胞クローンが存在することを反映するものと考えられる。最後に、診断が難しいカテゴリー（Ｄ）において、２サンプル（ＧＢＳ−１０およびＧＢＮ−８）はＳＢデータと一致してクローンＩＧＫ ＰＣＲ生成物を示した；しかしまた別の２サンプル（ＰＴ−６およびＧＢＳ−９）（両方共Ｔ細胞豊富なＢ−ＮＨＬ症例）では、クローンＩＧＫ ＰＣＲ生成物がクローンＩＧＨおよび／またはＩＧＬ生成物と並んで見いだされた、しかしＳＢ分析ではクローン性の証拠はなかった。この矛盾も、これら２患者サンプルのＢ細胞クローンの小さいサイズによって説明できると考えられる。
【０１１４】
ＩＧＫ遺伝子座を分析することの付加的重要性を確認するために、我々はＩＧＫ ＰＣＲ分析の結果をＩＧＨ ＰＣＲ分析の結果と比較した。クローンＶн−ＪнＰＣＲ生成物が見いだされなかった９サンプル中５サンプル（ＥＳ−２、ＮＬ−４、ＰＴ−８、ＧＢＮ−２、ＥＳ−８）において、ＩＧＫ分析ではクローン生成物が容易に認められた。Ｖн−ＪнおよびＤн−Ｊн分析両方を考慮に入れても、クローンＩｇ ＰＣＲ生成物を検出するこれら症例の３症例において、ＩＧＫ ＰＣＲ分析はＩＧＨ ＰＣＲ分析に相補的であった。
【０１１５】
結論
結論として、初期および全般的な試験段階、並びにリンパ球増加症の病理学的に明確なシリーズにおけるこれらマルチプレックスアッセイの使用による予備的証拠に基づいて、ＩＧＫ遺伝子座のＰＣＲ分析はクローン性検出のために明らかな（追加的）価値を有する。それにもかかわらず、特にチューブＡにおける見かけ上クローンバンドの説明に関しては、固有の制限されたＩＧＫ接合不均一性のために、注意しなければならない。この問題は特にＧＳ分析に明らかなので、ＨＤ分析の方がＧＳ分析よりわずかに好ましい。ただし若干の症例ではＧＳ分析の方が結果を容易に正しく説明することも、付け加えなければならない。もう一つの起こり得る落とし穴は、プライマーの位置のばらつきのため、および下流Ｊκ遺伝子セグメントからの広い増幅のために、予想される再配列ＩＧＫ生成物が比較的広いサイズ範囲をもつことである。これは、ＧＳ分析では長い移動距離が好ましいことを意味する。ＩＧＫ遺伝子座における多重再配列の固有の複雑さと、Ｖκプライマー類の低レベルの交差アニーリングとが一緒になって、場合によってはオリゴクローン性に似た、複数のバンドまたはピークを有するパターンを生成するかも知れないことを最後につけ加える。しかしこれらの考察を考慮すると、２チューブＩＧＫマルチプレックスＰＣＲ系はＰＣＲベースのクローン性診断には貴重である。
【実施例４】
【０１１６】
ＩＧＬ遺伝子再配列
背景
ＩＧＬ遺伝子再配列はＩｇκ＋Ｂ細胞性悪性腫瘍の５ないし１０％および全てのＩｇλ＋Ｂ細胞性悪性腫瘍に存在する。７５ そこでＶλ−Ｊλ再配列は、主として体性突然変異によって起きる偽陰性ＩＧＨ Ｖн−ＪнＰＣＲ結果を補正するために魅力的な、特別のＰＣＲ標的である可能性がある。ＩＧＬ遺伝子座は染色体２２ｑ１１．２上で１Ｍｂに及ぶ。７７−７９ ９００ｋｂにわたって７３−７４Ｖλ遺伝子があり、そのなかで３０−３３は機能性である（図６Ａ）。配列の相同性では、Ｖλ遺伝子は１１ファミリおよび３クラスにグループ化することができる。同じファミリのメンバーは染色体上で集まる傾向がある。ＪλおよびＣλ遺伝子は縦一列に組織化され、ＪλセグメントがＣλ遺伝子に先行する。一般的には７Ｊ−Ｃλ遺伝子セグメントがあり、そのなかでＪ−Ｃλ１、Ｊ−Ｃλ２、Ｊ−Ｃλ３およびＪ−Ｃλ７が機能性であり、４つのＩｇλイソタイプをコードする（図６Ａ）。８０，８１ しかし、Ｊ−Ｃλ遺伝子セグメントの数には多型性変化がある。それは、ある個体ではＣλ２−Ｃλ３領域の増幅によりＪ−Ｃλ遺伝子セグメントを１１まで担うことができるからである。８２，８３
【０１１７】
幾つかの研究は、正常および悪性腫瘍のＢ細胞両方のＩＧＬ遺伝子レパートリが偏っていることを示した。４６，４９，８４，８５例えば正常Ｂ細胞が使用するＶλ遺伝子の９０％以上がＶλ１、Ｖλ２およびＶλ３ファミリに属し、これは機能性遺伝子の６０％を構成する。その上、３つの遺伝子（２−１４、１−４０、２−８）が発現したレパートリの約半分を占める。正常Ｂ細胞はＪ−Ｃλ１、Ｊ−Ｃλ２およびＪ−Ｃλ３遺伝子セグメントを大体等しい割合で使用するが、悪性腫瘍Ｂ細胞は主としてＪ−Ｃλ２およびＪ−Ｃλ３遺伝子セグメントを使用する。４９正常および悪性腫瘍Ｂ細胞両方において、Ｊ−Ｃλ７が使用されることは非常に稀である（１％）。しかしこの後者の知見は正常細胞の単一細胞研究による挑戦を受けた。この研究は再配列の半分以上がＪ−Ｃλ７遺伝子セグメントを使用することを見いだした。８６マウスとは対照的に、ヒトＩＧＬ遺伝子再配列にはエキスヌクレアーゼ活性およびＮヌクレオチド付加によるある種の結合多様性がある。８２，８５−８７それはＩＧＨ遺伝子座のそれよりは遥かに少なく、多数の再配列は生殖細胞系列ＶλおよびＪλ遺伝子セグメントの直接カップリングから生成する。それにもかかわらずＩＧＬ遺伝子座はＢ細胞クローン性研究のためのＩＧＨに対するまた別の相補的遺伝子座であるのかも知れない。
【０１１８】
プライマーの設計
偏ったＶλレパートリを考慮して、我々はＶλ１、Ｖλ２およびＶλ３遺伝子セグメントを使用した再配列だけを増幅することを選択する。Ｖλ１およびＶλ２遺伝子セグメントの両方を認識する単一のコンセンサスプライマー並びにＶλ３プライマーを、同一ファミリのメンバー間で高い相同性をもつ領域に設計した（図６Ｂ）。初期実験は、それらがマルチプレックスにおいても別々に作用することを示した。実際、Ｖλプライマーを別々に使用した際に、あるＶλまたはＶλ２遺伝子にハイブリダイズするＶλ３プライマーの交差アニーリング（またはその逆）を認めることができる；しかしそれはマルチプレックスＰＣＲでは見られなかった。
【０１１９】
単一コンセンサスプライマーがＪλ１、Ｊλ２、およびＪλ３遺伝子セグメントのために設計され、生殖細胞系列の各配列に比較して、その中心部分に一つのミスマッチをあらわした。予備的実験では、完全にマッチしたＪλ１およびＪλ２−Ｊλ３プライマーの組合わせよりもよい結果を与えることが判明した。ある研究が正常Ｂ細胞にＪλ７遺伝子を使用することが多いことを報告したので、８６ 我々もＪλ７特異的プライマーを設計した。種々のポリクローナルＢ細胞サンプルで試験した際、同じサンプルで、Ｊλ１、Ｊλ２−Ｊλ３またはＪλコンセンサスプライマーを使用して行った増幅とは異なり、我々はＨＤ分析でシグナルをほとんど検出できなかった。同様に、モノクローナルB細胞腫瘍のコレクションを分析したときにも、このプライマーでは再配列を検出できなかった。これらの結果並びにその他の文献報告４９に基づいて、我々は未確認の高頻度のＪλ７再配列（単一研究における）８０が技術的落とし穴によって生ずると結論づけ、したがってＪλ７プライマーは含めないことに決めた。そこでクローン性研究においてＩＧＬ遺伝子配列を検出するためのＰＣＲアッセイは、３種類のプライマーを含む単一チューブからなる（図６Ｂ）。この単一チューブは非常に多数の再配列を検出することが期待された。
【０１２０】
初期試験段階の結果
モノクローナルおよびポリクローナルサンプルの一セットで行った初期試験は、ＰＣＲ生成物のＨＤ分析で１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動によってそれらが非常によく区別されることを示した（図６Ｃ）。クローンＩＧＬ再配列はホモ二本鎖領域に見られ、１本また時には２本の比較的弱いバンドがヘテロ二本鎖領域に見られた、一方ポリクローナル再配列はヘテロ二本鎖領域に塗沫として現れた（図６Ｃ）。非特異的バンドは認められなかった。結合領域の制限されたサイズのために、ヘテロ二本鎖を形成せずに単一ポリアクリルアミドゲルを移動させることによってポリクローナル配列をモノクローナル配列から区別することが非常に難しいことは認めなければならない。この線に沿って、ＧＳによるＰＣＲ生成物の分析はあまり簡単でないことがわかった（図６Ｃ）。モノクローナル再配列が明らかに確認される一方、ポリクローナル再配列パターンは限られた結合多様性により、オリゴクローナルな面を有した。特にポリクローナル症例を、ポリクローナルＢ細胞のバックグラウンドにおいて少量のクローンＢ細胞集団を有する症例と区別するには説明が非常に難しかった。そこで我々はＩＧＬ遺伝子再配列を分析するすぐれた方法としてＨＤ分析を推薦する。
【０１２１】
数例で行われたアッセイの感度は、腫瘍ＤＮＡの希釈がＰＢ−ＭＮＣで行われた場合は約５％（２．５％−１０％）、そしてリンパ節ＤＮＡで行われた場合は約１０％（５％−２０％）であることが判明した。
【０１２２】
全般的な試験段階の結果
単一チューブＩＧＬ ＰＣＲアッセイを９０のサザンブロット確定リンパ球増加症のシリーズで評価した。この試験は９研究所で行われ、４研究所はＨＤ分析だけ、１研究所はＧＳ分析だけで、４研究所は両方法を使用して行われた。クローンＩＧＬ遺伝子再配列は１９症例で検出された。そのうち１５症例では９研究所で７０％より多い一致が得られた。４症例では７０％未満の一致が得られた。そのうちの３症例では少量のクローンＩＧＬ遺伝子再配列（ＥＳ−１２、ＧＢ−１０、およびＦＲ−１０）があることによって説明される。第４症例（ＰＴ１１）におけるこの不一致は、特にサザンブロット法ではＩＧＬ遺伝子再配列が検出されなかったため、説明されないままである。初期試験から結論づけられたように、ＧＳ分析の説明はＨＤ分析より難しい、特に少量クローン集団の場合はなおさらである。これら１９のクローンＩＧＬ遺伝子症例のうち、１７例はＢ細胞性増殖であった（１６例は成熟Ｂ細胞および１例は前駆体Ｂ細胞）。１症例（ＥＳ１２）はホジキン病に相当し、もう一つの症例（ＦＲ−１０）はＴ−ＮＨＬに相当した。両方共ごく少量のクローンＩＧＬ遺伝子再配列をもち、ＦＲ−１０はクローンＩＧＫ遺伝子再配列も示した。
【０１２３】
サザンブロットデータの比較は、若干の矛盾を示した。ＰＣＲによるクローンＩＧＬ遺伝子再配列を有する６症例はサザンブロット分析ではポリクローナルとしてあらわれた。それらのうち３症例（ＰＴ−６、ＥＳ−１２、ＦＲ−１０）は、サザンブロット法の感度レベル以下であるらしい少量のクローン集団に関連していた。その他の３症例（ＮＬ−１９、ＥＳ−１、ＰＴ−１１）では、クローン性再配列バンドが、ＩＧＬ遺伝子座のかなり複雑な再配列パターンにより、サザンブロット法で見落とされたのかも知れない。２６，４９ 反対に、ＰＣＲアッセイはサザンブロット分析で２症例（ＣＢＳ−６、ＦＲ−５）に認められたクローン再配列を検出することができなかったかった。しかし、これらは、高度の体細胞の過剰突然変異がＩＧＬ遺伝子プライマーのアニーリングを妨害する可能性のある濾胞性リンパ腫であった。
【０１２４】
結論
結論として、たった３種類のプライマーを含む、ＩＧＬ遺伝子再配列を検出するための単一チューブＰＣＲアッセイ（図６Ｂ）は、大多数のＩＧＬ遺伝子再配列（Ｖλ１、Ｖλ２、およびＶ３遺伝子再配列）を検出することができる。遺伝子走査分析も用いられるとはいえ、ヘテロ二本鎖分析は好ましい分析法であるが、制限された結合多様性によるクローン性の過大解釈を避けるために最大の注意を払うことをすすめる。
【実施例５】
【０１２５】
ＴＣＲＢ遺伝子再配列：Ｖβ−Ｊβ、Ｄβ−Ｊβ
背景
ＴＣＲＢ遺伝子の分子分析はＴ細胞増殖の疑いのあるクローン性を評価するための重要なツールである。ＴＣＲＢ遺伝子再配列はほとんど全ての成熟Ｔ細胞性悪性腫瘍に起きるだけでなく、ＣＤ３陰性Ｔ細胞性急性リンパ芽球性白血病の約８０％、ＣＤ３陽性Ｔ−ＡＬＬの９５−％にも起きる。２６ ＴＣＲＢ再配列はＴ−系列悪性腫瘍に限定されるものではない、なぜならば前駆体−Ｂ−ＡＬＬの約３分の１に再配列したＴＣＲＢ遺伝子が見られるからである。３０ それらの頻度は成熟Ｂ細胞増殖では遥かに低い（０−７％）。２１
【０１２６】
ヒトＴＣＲＢ遺伝子座は染色体７のロング−アーム上、バンド７ｑ３４に位置し、６８５ｋｂの範囲に及ぶ。ＴＣＲＧおよびＴＣＲＤ遺伝子座とは異なり、ＴＣＲＢのＶ領域遺伝子クラスタは遥かに複雑である（図７Ａ）。１ それは約６５Ｖβ遺伝子要素を含む。これには２種類の名称が用いられる：アーデン（Ａｒｄｅｎ）らによってまとめられたものは５０ ウェイ（Ｗｅｉ）らの遺伝子命名法にしたがい８８、Ｖβ遺伝子を３４ファミリに分類している。ローエン（Ｒｏｗｅｎ）らが提案したもう一つの命名法５１は３０のＶβ遺伝子サブグループに分類し、その後ＩＭＧＴ、国際ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓデータベースｈｙｙｐ：／／ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ[レフランス、２００３＃２１２；レフランス、２００３＃２１９]によって採用された。最大のファミリ、Ｖβ５、Ｖβ６、Ｖβ８およびＶβ１３（アーデンの命名）はそれぞれ７、９、５および８メンバーの規模に達した。１２Ｖβファミリはメンバーを１つだけ含む。一般に、上記ファミリは互いにはっきり分けられる。５０ この報告では、我々はアーデンの命名に従う。５０
【０１２７】
Ｖβ遺伝子要素の３９−４７は機能性と定性され、２３ファミリに属する。非機能性Ｖβ要素の７−９はオープン・リーディング・フレームを有するが、スプライス部位、組換えシグナルおよび／または調節要素に変化を有する。１０−１６は偽遺伝子として分類される。染色体９のショート・アーム（９ｐ２１）に局在する６非機能性オーファンＶβ遺伝子が報告された。８９，９０ それらは記録には見いだされない。５０，５１
１つのＶβ遺伝子を除いて全てが２つのＤβ−Ｊβ−Ｃβクラスターの上流に位置する。図７Ａは、Ｄβ遺伝子（Ｄβ１およびＤβ２）、および６（Ｊβ１．１ないしＪβ１．６）および７（Ｊβ２．１ないしＪβ２．７）の機能性Ｊβ遺伝子を含むＪβクラスターが、Ｃβ遺伝子セグメント（Ｃβ１およびＣβ２）の両方に先行することを示している。Ｊβ領域遺伝子座は、配列の類似性によってでなく、それらのゲノムの位置によって２ファミリに分類される。５１，８８，９１
【０１２８】
広い生殖細胞系列コーデド・レパートリのために、ＴＣＲＢ遺伝子再配列の組合わせ多様性はＴＣＲｇおよびＴＣＲＤ再配列に比較して大きい。ＴＣＲβ分子の最初のレパートリは平均３．６（Ｖ−Ｄ結合）および４．６（Ｄ−Ｊ結合）ヌクレオチドの付加と、平均３．６（Ｖ）、３．８（Ｄの５’）、３．７（Ｄの３’）および４．１（Ｊ）ヌクレオチドの欠失とによってさらに広くなる。５１ Ｖ、ＤおよびＪセグメントの結合から生じる完全な過変動性領域は、９または１０のコドンを含むのが特徴である。サイズの変化は限られる；というのは、ＩＧＨ ＣＤＲ３領域の広くて長いレパートリと対照的に、残基の７ないし１２が全機能性再配列の８０％以上を占めるからである。９２
【０１２９】
初期Ｔ細胞発生中、ＴＣＲＢ遺伝子の再配列は連続する二段階からなる：ＤβからＪβへの再配列およびＶβからＤ−Ｊβへの再配列であって、これら２段階間には１または２日の間隔がある。９３ Ｄβ１遺伝子セグメントはＪβ１またはＪβ２遺伝子セグメントのいずれかに結合するが、Ｄβ２遺伝子セグメントは、ＴＣＲＢ遺伝子座におけるその位置のために、一般にはＪβ２遺伝子セグメントだけに結合する。２６，５１ ２つの連続するＴＣＲＢ−Ｊクラスタが存在するため、１つの対立遺伝子に２つの再配列を検出することもできる：すなわちＴＣＲＢ Ｄβ１−Ｊβ１領域における完全または不完全再配列の他に、不完全ＴＣＲＢ Ｄβ２−Ｊβ２再配列も検出できる。１
【０１３０】
ＴＣＲＢ遺伝子再配列において、遺伝子セグメント使用の非ランダム分布が見られる。健常者において末梢血Ｔ細胞レパートリでは、あるＶβファミリは優勢であるが（例えばＶβ１−Ｖβ５）、他は稀に使用されるに過ぎない（例えばＶβ１１、Ｖβ１６、Ｖβ１８、Ｖβ２３）。Ｖβレパートリの平均値は加齢下で安定であるようにみえる、ただしその標準偏差は高齢者では増加する。１３，９４ また、ヒト胸腺では幾つかのＶβ遺伝子セグメントが優勢である：最も優勢な７Ｖβ遺伝子（Ｖβ３−１、Ｖβ４−１、Ｖβ５−１、Ｖβ６−７、Ｖβ７−２、Ｖβ８−２、Ｖβ１３−２）が全機能性ＴＣＲＢレパートリのほぼ半分をカバーしている。９５ Ｊセグメントの発現も均質とはかけはなれている。Ｊβ２ファミリはＪβ１ファミリよりしばしば使用される（ＴＣＲＢ再配列の７２％対２８％）９６ 特に、Ｊβ２．１の割合は予想より高く（２４％）、それに続いてＪβ２．２（１１％）およびＪβ２．３およびＪβ２．５（各１０％）である。９５
【０１３１】
ＴＣＲＢ遺伝子再配列パターンはＴ細胞性悪性腫瘍のカテゴリー間で異なる。完全ＴＣＲＢ Ｖβ−Ｊβ１再配列およびＴＣＲＢ Ｄβ−Ｊβ２クラスタにおける不完全に再配列した対立遺伝子が、ＣＤ３ Ｔ−ＡＬＬおよびＴＣＲγδ＋Ｔ−ＡＬＬに比べてＴＣＲαβ＋Ｔ−ＡＬＬによりしばしば認められ。２８ Ｔ−ＡＬＬグループ全体では、専らＴＣＲＢ Ｄβ−Ｊβ２領域を含む前駆体Ｂ−ＡＬＬにおける交雑ＴＣＲＢ遺伝子再配列とは対照的に、ＴＣＲＢ Ｄβ−Ｊβ１領域が比較的しばしば再配列に関係している。３０，７３
【０１３２】
大部分のＶβドメインに対するモノクローナル抗体の開発はＶβファミリの広がりを確認するのに役立った。１３ しかし遺伝子再配列分析は本質的にはＴ細胞性リンパ球増加症におけるクローン性評価のために重要である。ＴＣＲＤおよびＴＣＲＢＤ座の制限された生殖細胞系コーデドレパートリはＤＮＡベースＰＣＲアプローチを容易にするから、ＴＣＲＧおよびＴＣＲＤ遺伝子再配列の検出のために種々のＰＣＲ法が確立された。９７−９９ それにもかかわらず、ＴＣＲＧの制限された結合多様性は、正常Ｔ細胞において同様な再配列のバックグラウンドを大きく増幅した（実施例６）。他方、ＴＣＲＤ遺伝子は大部分の成熟Ｔ細胞性悪性腫瘍にはない。２１ そこで、ＤＮＡベースのＴＣＲＢ ＰＣＲ法がクローン性評価のために必要である。さらに、ＴＣＲＢ再配列は、リンパ球増殖疾患の追跡試験にとって非常に興味深い。なぜならばＴＣＲＢ再配列の広い組合わせレパートリおよび大きい過変動領域が臨床的に不思議な残留腫瘍細胞の高度に特異的な検出を可能にするからである。しかし、広い生殖細胞系列コーデド・レパートリはＰＣＲアッセイをより難しくする。幾つかの発表されたＰＣＲアプローチはファミリ−またはサブファミリ−特異的プライマーのパネルを使う時間のかかる多重チューブ法を使用する。９６，１００高度に変性したコンセンサスプライマーの使用は、理論的にはそのプライマーが網羅する検出可能再配列の数を制限する、なぜならば全ての可能な再配列を確実に増幅させるのに十分な同一性の単一共通配列がないからである。４２，１０１，１０２ 幾つかの公表されたアッセイは追加的ＰＣＲ反応を必要とするｎｅｓｔｅｄＰＣＲを使用する。４２，１０２ その他のアッセイは必要なプライマーの数を制限するためにＴＣＲＢ Ｖβ−Ｄβ−Ｊβ転写体の分析に焦点をあてている。１５，１００，１０３ しかし、これらｍＲＮＡベースのアプローチの主な欠点は、新鮮または凍結材料が必要であり、ＰＣＲ増幅の前に逆転写工程が必要であることである。
【０１３３】
我々は完全に新しく、便利なＤＮＡベースのＴＣＲＢ ＰＣＲを作り出すことによってこれらの制限を克服しようとした。そして機能性Ｖβ−Ｊβ遺伝子セグメント全てをカバーし、マルチプレックスＰＣＲ反応に適切に組合わせられる多重ＶβおよびＪβプライマーを設計した。その上このアッセイはＨＤおよびＧＳ分析に適用でき、不完全ＴＣＲＢ Ｄβ−Ｊβ再配列も同じＪβプライマーセットで検出できる。交差プライミングによる問題を避けるために、我々は全てのＶβおよびＪβプライマーを各遺伝子セグメントの同じ保存領域で設計することに決めた。
【０１３４】
プライマーの設計
先ず最初に、全部で２３のＶβ、２つのＤβ（Ｄβ１およびＤβ２）および１３のＪβ（Ｊβ１．１ないし１．６およびＪβ２．１ないし２．７）プライマーを各ＶβおよびＪβ遺伝子セグメントの同じ保存領域に位置する全てのＶβおよびＪβプライマーで設計し、その結果マルチプレックス反応における交差アニーリングの効果を無視することができた。その上、稀なポリクローナルＴＣＲＢ Ｖ−Ｊ再配列は、それらが完全にポリクローナルなガウスピークパターンを生成しないとはいえ、クローン再配列と間違えられることはない。なぜならば全ての可能な再配列のＰＣＲ生成物は同じサイズ範囲内に位置するからである。
【０１３５】
プライマーの設計のために、再配列可能の偽遺伝子またはスプライシング部位、組換えシグナルおよび／または調節要素の変化、または保存アミノ酸の変化を有するオープン・リーディング・フレーム遺伝子を出来る限り考慮した。しかし主な目的は機能性Ｖβ遺伝子を全て網羅することであった。各Ｖβプライマーのプライミング効率を全てのＶβ遺伝子で、ＯＬＩＧＯ６．２ソフトウエアを使用してチェックした。この結果、厳密にはＶβファミリ特異的でないプライマーを生成し、その幾つかは１つより多いファミリのＶβ遺伝子セグメントを含んだ（図７Ｂ）。１３Ｊβプライマーは各Ｊβ遺伝子プライマーの同一セグメントにアニーリングするので、二量体化によって、Ｊプライマーを２本のチューブに分割することが必要となった。最初は、次のように４セットのマルチプレックス反応でそれらのプライマーを使用する計画であった：２３全てのＶβプライマーと６つのＪβ１ファミリプライマーとの組み合わせ（２４０−２８５ｂｐ）、２３全てのＶβプライマーと７つのＪβ２ファミリプライマーとの組み合わせ（２４０−２８５ｂｐ）、Ｄβ１（２８０−３２０ｂｐ）と６つのＪβ１プライマーとの組み合わせ、およびＤβ１（２８０−３２０ｂｐ）プラス Ｄβ２（１７０−２１０ｂｐ）と７つのＪβ２ファミリプライマーとの組み合わせ。
【０１３６】
初期試験段階の結果
各可能なプライマー組み合わせの初期モノプレックス試験は、既知のモノクローナルＴＣＲＢ再配列を有するサンプルと、ポリクローナル標準とを使用して行われた。明確なＶβおよびＪβ遺伝子セグメントの使用頻度に応じて、生成物の強度およびシグナルプロフィールに差のある、予想されるサイズ範囲のＰＣＲ生成物を作った。しかし、それらプライマー類をマルチプレックス反応において合一すると、幾つかのＪβ２再配列が特に見落とされ、チューブＢおよびＤに非特異的生成物が認められた。その上、Ｊβ１およびＪβ２プライマー間の交差プライミングが説明の問題を起こした。その結果、Ｊβ２プライミングを再設計しなければならず、異なるチューブのプライマー組合わせを再構成しなければならなかった：Ｊβプライマー類、Ｊβ２．２、２．６および２．７を少し改変し、チューブＡに加えた。プライマー類、Ｊβ２．１、２．３、２．４および２．５の位置を４ｂｐ下流にシフトし、プライマーの二量体化、および残っているＪβプライマーとの交差プライミングを回避した。予想サイズ範囲外の、種々の強度を有する非特異的バンドだけは、特異的テンプレートＤＮＡを使用してチューブＢ（バンド＜１５０ｂｐ、２２１ｂｐ）およびチューブＣ（１２８ｂｐ、３３７ｂｐ）に存続させた。しかし、全ての非特異的増幅生成物はＴＣＲＢ特異的生成物のサイズ範囲外であったため、それらは説明に影響せず、問題ないと考えられた。しかし非特異的テンプレート標準を用いると、チューブＡに１つの付加的な弱い２７３ｂｐの非特異的ピークをＧＳ分析によって見ることができた。この生成物は、ＤＮＡが十分なクローナルまたはポリクローナルＴＣＲＢ再配列を含む場合は完全に抑制さるが、少数のリンパ細胞を含むサンプルではあらわれる。初期試験段階では比較的弱いＶ−Ｄ−Ｊ ＰＣＲ生成物が生成した。そこで我々はＭｇＣｌ２濃度とＴａｑポリメラーゼの量とを高めることによって完全Ｖ−Ｄ−Ｊ再配列のためのＰＣＲ条件を最適化した。高度に精製したプライミングの使用、およびＡＢＩ金緩衝液の代わりにＡＢＩ緩衝液ＩＩを使用することも非常に重要であることがわかった。不完全Ｄβ−Ｊβ再配列を検出するために、全てのＪβプライマー類を、感度または情報を失うことなく、１本のチューブに混合することが最後にできた。したがってマルチプレックス反応の総数を３本のチューブに減らすことができた。
【０１３７】
最終的に承認されたプライマーセットは以下のものである（図７Ｂ）：
チューブＡ： ２３Ｖβプライマー類および９Ｊβプライマー類：Ｊβ１．１−１．６、２．２、２．６および２．７
チューブＢ： ２３Ｖβプライマー類および４Ｊβプライマー類：Ｊβ２．１、２．３、２．４および２．５
チューブＣ： Ｄβ１、Ｄβ２および１３全てのＪβプライマー類。
【０１３８】
チューブＡおよびＣはＪβ１およびＪβ２プライマーを含むので、異なる色素（ＪβではＴＥＴおよびＪβ２．１−２．７プライマーではＦＡＭ）によるＪβ１およびＪβ２プライマーの差別標識化により、チューブＡおよびＣ反応におけるＪβ１またはＪβ２使用をＧＳで区別することができる（図１３Ａを参照されたい）。
【０１３９】
感度試験は、ＭＮＣにクローン性に再配列したＴＣＲＢ遺伝子を有する種々の細胞系および患者サンプルで希釈実験により行われた。単一ＰＣＲ希釈実験は一般的に少なくとも０．１％ないし１％の感度水準に達した。予想通り、マルチプレックス試験では感度が減少した。これはバックグラウンド増幅の増加によるものと考えられる。特にＧＳ分析では、このバックグラウンドが、ＴＣＲＢ ＰＣＲの比較的小さい長さの変動により、説明を妨害した。それにもかかわらず試験した４６の陽性対照のうち４０においてヘテロ二本鎖または遺伝子走査を使用して少なくとも１％ないし１０％の感度に達した（表６）。
【０１４０】
全般的な試験段階の結果
サザンブロット法で確定した９０の悪性および反応性リンパ球増加症のシリーズからのＤＮＡをＴＣＲＢマルチプレックス・プロトコルを用いて分析する研究に、１１のグループが参加した。全サンプルが２研究所ではＨＤにより、６研究所ではＧＳ分析によって分析された。別の３研究所は両方の方法を使用してＰＣＲ分析を行った（図７Ｃ、Ｄ、およびＥ）。この試験相、並びにこれらのＴＣＲＢ ＰＣＲアッセイの使用経験は、一部はすでに初期試験段階に記述したプロトコルに関するいくつかの一般的問題を提起した。１．ＴＣＲＢ ＰＣＲ生成物の制限された長さ変動はポリクローナル・バックグラウンド内のクローンシグナルのＧＳ検出を妨害するかも知れない。２．予想サイズ範囲内のバンド／ピークだけがクローンＴＣＲＢ遺伝子再配列をあらわす。特にチューブＡでは、競合しない状況下で発生するかも知れない非特異的２７３ｂｐピークを明らかにするために、非特異的標準ＤＮＡを含めなければならない。３．良いＰＣＲ結果を得るためには高度に精製されたプライマーおよびＡＢＩ緩衝液ＩＩ（ＡＢＩ金緩衝液でなく）を、そしてＨＤ分析のためには推奨されるＰＣＲ生成物調製プロトコルを使用することが非常に重要である。提示された９０サザンブロット決定症例のうち、２９はモノクローナルＴＣＲＢ再配列に関してＳＢ陽性であった。これらのクローン再配列の２５例（８６％）はＴＣＲＢ ＰＣＲによっても検出された。２３の再配列はＧＳおよびＨＤ分析によって開示され、２つの付加的症例はＨＤだけによって明らかにされた。ＧＳ陰性、ＨＤ陽性症例（ＦＲ−９）は、全般的な試験段階に関係する９研究所のうち４研究所においてＧＳ分析でモノクローナルと説明された（図７Ｃ）。しかし顕著なポリクローナル・バックグラウンドのために、ＧＳパターンの説明はこの特殊の症例では難しかった。その他のＧＳ陰性ＨＤ陽性症例はチューブＣにおいて約４００ｂｐのサイズを有する異型的ＰＣＲ生成物を示した（図７Ｅ）。ＰＣＲ生成物はアガロースゲル分析およびＨＤ分析でははっきりと見えたが、ＧＳによっては見えなかった。このフラグメントのＤＮＡシ−ケンシング後、ＴＣＲＢ Ｄβ１−Ｄβ２増幅産物が同定され、未標識ＰＣＲ生成物を説明した。ＳＢ陽性の４症例（ＮＬ−１５、ＮＬ−１６、ＧＢＮ−２およびＦＲ−６）はＧＳ分析によってもＨＤ分析によっても検出されなかった。彼ら全てが基礎疾患であるＢリンパ球悪性腫瘍をもっていた。この失敗の考えられる原因は、異型的再配列（例えば不完全Ｖβ−Ｄβ再配列）、２９，１０４ 再配列したＶβ遺伝子セグメントの配列変化５１、または特定の再配列に対する感度の不足である。
【０１４１】
サンプルの６２がＳＢによってポリクローナルと考えられた。これらの症例の６１（９８％）ではＰＣＲ結果が少なくとも一つの分析法では一致し、５７症例（９２％）では結果は両方法を用いて一致した。ＨＤおよびＧＳ分析でモノクローナルであることがわかった１つのＳＢ陰性サンプル（ＥＳ−１４）は不完全Ｄβ２−再配列を示した。４サンプルでは不均一な結果が得られた：１サンプルはＧＳによってクローンと考えられたが、ＨＤによってそのＰＣＲ生成物を分析した研究所でクローン性と考えたのは研究所の５０％に過ぎなかった（ＧＢＳ−４）。３サンプルはＨＤ分析だけによって弱いクローンシグナルを発生することがわかった（ＥＳ−６、ＧＢＳ−９およびＤＥ−２）。小さ過ぎてＳＢ分析では検出できなかったＴＣＲＢ再配列サブクローンはより感度の高いＰＣＲ法によって見えるかも知れない。Ｂ細胞性悪性腫瘍において、検出された再配列は残留Ｔ細胞のクローナルまたはオリゴクローナル伸長も示すかも知れない。１０５ この場合はこれらの弱いクローンＰＣＲ生成物はクローン性Ｔ細胞性障害の証拠とみなすべきではない。これは患者のその他の診断テストおよび臨床像の範囲でＰＣＲ結果を説明することの重要性を強調するものである。ＴＣＲＢ再配列の最適ＰＣＲ評価はＨＤおよびＧＳ分析の組合わせ使用によって得られる。感度はポリクローナルサイズ分布に比較したクローンＰＣＲ生成物サイズの関数としての２種類の検出法で異なる：一方でＨＤ分析はポリクローナル・バックグラウンドをクローン生成物から追放し、他方、主なサイズ範囲外のＰＣＲ生成物はより感度の高いＧＳで検出することができる。偽陽性結果のリスクもＨＤおよびＧＳ分析の組合わせ使用で減少する。さらに、未標識プライマーは増幅には関係ないので、ＰＣＲ生成物のＧＳ分析では検出できない幾つかの付加的異型的ＴＣＲＢ Ｄβ１−Ｄβ２再配列を、ＨＤ分析で検出することができる。しかし、概してＧＳ分析は高い腫瘍負荷をもつサンプルではより情報豊富な方法である、というのはモニターの目的に使用できるモノクローナルＰＣＲ生成物の正確なサイズが示され、異なる標識をつけたＪβプライマーがＪβ遺伝子使用に関する付加的情報をもたらすからである。
【０１４２】
結論
結論として、３本チューブＴＣＲＢマルチプレックスＰＣＲ系はＴ細胞増殖が疑われる際のクローン性を評価するための、これまでにない高いクローン性検出率を有する新しい、簡便なアッセイを提供する。
【実施例６】
【０１４３】
ＴＣＲＧ遺伝子再配列
背景
ＴＣＲＧ遺伝子再配列は、リンパ性クローン性のＤＮＡ ＰＣＲ検出のために長い間使用されており、制限されたレパートリー標的の“プロトタイプ（原型）”である。それがクローン性分析の好ましい標的であるのは、それがＴＣＲαβおよびＴＣＲγδ系前駆体の両方において、Ｔリンパ球発生の初期、多分ＴＣＲＤ直後に再配列するからである。１０５ それはＴ−ＡＬＬ、Ｔ−ＬＧＬおよびＴ−ＰＬＬの９０％以上、末梢Ｔ−ＮＨＬおよび菌状息肉症の５０−７５％で再配列するが、真のＮＫ細胞増殖では再配列しない。それはＢ系統ＡＬＬの主要部分でも再配列するが、Ｂ−ＮＨＬではその再配列は遥かに少ない。１，３０，７３ 数種のその他のＩｇ／ＴＣＲ座とは異なり、その完全なゲノム構造は何年も前から知られている。それは限られた数のＶγおよびＪγセグメントを含む。主なＶγ−Ｊγ組み合わせの全ての増幅が、４Ｖγおよび３Ｊγプライマーの限られた数で可能である。
【０１４４】
染色体７ｐ１４上のヒトＴＣＲＧ遺伝子座は１４Ｖγセグメントを含み、そのうち１０だけが再配列を受けることが示された（図８Ａ）。発表されたＶγレパートリーはＶγ遺伝子（Ｖγ２、Ｖγ３、Ｖγ４、Ｖγ５、Ｖγ８およびＶγ９）だけを含むが、再配列はψＶγ７、ψＶγ１０、γψＶγ１１セグメントでも起きる。１０７，１０８ ψＶγＢ（Ｖγ１２としても知られる）１０７ の再配列は非常に例外的であるため、それは診断的ＰＣＲ法には滅多に使用されない。再配列するＶγセグメントはＶγＩファミリ（ＶγｆＩ：Ｖγ２、Ｖγ３、Ｖγ４、Ｖγ５、ψＶγ７およびＶγ８；全体的相同性は９０％より大きく、Ｖγ２とＶγ４との間およびＶγ３とＶγ５との間で最高である）に属するものおよび単一メンバーＶγ９、ψＶγ１０、ψＶγ１１ファミリに属するものにさらに分割される。ＴＣＲＧ遺伝子座は５つのＪγセグメント：Ｊγ１．１（ＪγＰ１）、Ｊγ１．２（ＪγＰ）、Ｊγ１．３（Ｊγ１）、Ｊγ２．１（ＪγＰ２）、Ｊγ２．３（Ｊγ２）を含み、そのうちＪγ３とＪγ２．３とは、Ｊγ１．１とＪγ２．１とのように、非常に相同性である。
１０９
【０１４５】
制限されたＴＣＲＧ生殖細胞系列レパートリーがＰＣＲ増幅を容易にする一方、ＴＣＲＧ再配列の限定的結合多様性がクローナルおよびポリクローナルＰＣＲ生成物間の区別を複雑にする。ＴＣＲＧ遺伝子座はＤセグメントを含まず、比較的限られたヌクレオチド付加を示す。そこで、ＩＧＨおよびＴＣＲＤでは結合長さの変動は約６０ｂｐであるのに対し、ＴＣＲＧ Ｖ−Ｊ結合長さは２０−３０ｂｐだけ変動する。クローンＴＣＲＧ再配列をポリクローナルＴＣＲＧ再配列から区別する能力はポリクローナルレパートリーの複雑さに依って決まる。一般に、ＶγｆＩ−Ｊγ１．３／２．３のような頻出するＶγ−Ｊγ再配列を使用する小さいクローン集団はポリクローナルレパートリーの中に失われるリスクがあり、他方、稀に起こる組合わせはより高感度で検出される。しかし稀なＶγ−Ｊγ再配列を示す特別のポリクローナルＴリンパ球はその種の再配列のためのポリクローナル・バックグラウンドがないためにクローン再配列に間違われるかも知れない。偽陽性のその他の考えられるソースは、“標準的な（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）”ＴＣＲＧ再配列を示すＴリンパ球を発現するＴＣＲγδの存在に起因する。それはＮヌクレオチド付加を示さない。最も一般的に認識されているヒトの標準的ＴＣＲＧ再配列はＶγ９−Ｊγ１．２セグメントを含み、血液Ｔリンパ球の約１％に起きる。１１０，１１１そこで、高解析電気泳動法を使用してＴＣＲＧ ＰＣＲ生成物を分析し、または単なるサイズ以外のクリテリアに基づいてＰＣＲ生成物を分離し、偽陽性結果のリスクを減らすことが極めて重要である。標準的再配列のプロフィールおよびそれらが一般に起きる状況を知ることも重要である。例えば標準的Ｖγ９−Ｊγ１．２再配列は圧倒的に末梢血液に見いだされる。それらはＴＣＲγδ＋Ｔ−リンパ球の蓄積から起きるので、年齢と共に頻度が増加する。１９
【０１４６】
ＴＣＲＤとは異なり、ＴＣＲＧはＴＣＲαβ系統細胞では失われていない。ＴＣＲＧ再配列はＴＣＲαβ系統およびＴＣＲγδ系統前駆体の両方に起きるので、これらの同定によってＴ細胞系の種類を決定することはできない。同様に、ＴＣＲＧ再配列はＢ系統ＡＬＬの６０％に起き３０、このことは未成熟増殖におけるＢ対Ｔ細胞系の評価のためにそれらを使用できないことを意味する。しかしそれらは大部分のＢ−ＮＨＬ１を含む成熟Ｂリンパ球増殖性疾患では頻度は遥かに小さく、したがって臨床的および免疫表現型データと組合わせて使用することによって成熟リンパ球増殖性疾患に関係している系統を決定することができるかも知れない。
【０１４７】
限られた生殖細胞系列レパートリーはサザンブロットまたはＰＣＲ分析によってＶγおよびＪγ使用を決定することができる。ＭＲＤ分析には特異的増幅が必要なので、ＶγおよびＪγ使用の確認は単に学問的に興味深いだけではない。１１２
【０１４８】
我々は最適感度および情報性を維持する最小数のマルチプレックスＴＣＲＧ法を開発し、偽陽性結果のリスクを最小にし、ＨＤ分析またはモノフルオレセントＧＳ法などによる簡単なＶγおよびＪγ同定を可能にすることを企てた。ψＶγＢ（ψＶγ１２）が稀である場合、ψＶγＢ（ψＶγ１２）以外の全ての再配列セグメントを検出するＶγプライマーを含むことを選択した。標準的再配列がクローン生成物として間違って確認されるリスクを減らすために、Ｊγ１．２プライマーを除外した；なぜならばそれは、その他の対立遺伝子上のＴＣＲＧ再配列と関係してリンパ性悪性腫瘍に必ずとは言えないが稀に含まれているからである。１１３
【０１４９】
プライマーの設計
我々は先ず最初に、２つのマルチプレックス反応に使用する３つのＶγプライマーおよび２つのＪγプライマーを次のように作成した：Ｊγ１．３／２．３をＶγ９特異的（１６０−１９０ｂｐ）、ＶγｆＩコンセンサス（２００−２３０ｂｐ）およびＶγ１０／１１コンセンサスプライマー（２２０−２５０ｂｐ）と共に含む１本のチューブ、およびＪγ１．１／２．１をＶγ９特異的（１９０−２２０ｂｐ）、ＶγｆＩコンセンサス（２３０−２６０ｂｐ）およびＶγ１０／１１コンセンサスプライマー（２５０−２８０ｂｐ）と共に含む第二のチューブ。Ｖγの使用はＨＤ分析によりＰＣＲ生成物のサイズによって決定された。Ｊγ１．３とＪγ２．３との区別またはＪγ１．１とＪγ２．１との区別はされなかった。
【０１５０】
初期試験段階の結果
全てのＶγ−Ｊγ組み合わせは、シングルＰＣＲ増幅では予想通りのプロフィールを与えたが、マルチプレックス増幅はより大きいＰＣＲ生成物の競合、より小さいフラグメントの優先的増幅を起こし、幾つかのＶγｆＩおよびＶγ１０／１１再配列の検出に失敗した。これはその後Ｖγ１０／１１コンセンサスとＶγｆＩプライマーとの間の顕著なプライマーダイマー形成によってより複雑になった。異なるサイズのフラグメント間の競合およびプライマーダイマーの形成は両方共、感度および情報性を不十分にしたため、この方法は断念した。
【０１５１】
我々は、最もよく使用されるＶγプライマー（ＶγｆＩおよびＶγ９）を分離し、それらをＶγ１０およびＶγ１１特異的プライマーとそれぞれ組合わせることによって競合を最小にすることを考えた。後者の再配列は稀に使用され、したがって優勢なレパートリに対する競合を最小にする。Ｖγ１０／１１コンセンサスプライマーを、より小さいＰＣＲ生成物を作る２種類の特異的Ｖγプライマーに置き換えた（図８Ｂ）。Ｊγ１．３／２．３およびＪγ１．１／２．１を混合することによって、２−チューブ・マルチプレックスを維持することができた。この２−チューブ・マルチプレックスは、ＨＤ分析によるＶγ使用の生成物サイズ、およびＧＳ分析によるＪγおよびＶγ使用の生成物サイズに基づいてほぼ正確な同定を可能にする。
【０１５２】
４Ｖγおよび２Ｊγプライマーを有するマルチプレックスＴＣＲＧ ＰＣＲチューブの承認されたセットは次のものを含む（図８Ｂ）：
チューブＡ：ＶγｆＩ＋Ｖγ１０＋Ｊγ１．１／２．１＋Ｊγ１．３／２．３
チューブＢ：Ｖγ９＋Ｖγ１１＋Ｊγ１．１／２．１＋Ｊγ１．３／２．３
【０１５３】
プライマーの位置および配列は図８Ｂに示される。これらのプライマーはシングルおよびマルチプレックスＰＣＲフォーマットの両方で満足のいく増幅を与え、実質的に全ての既知Ｖγ−Ｊγ組合わせを検出できた。より大きいＰＣＲフラグメントの競合はもはや見られなかった。ただしＶγ９またはＶγｆＩ再配列の競合が少数集団に存在する場合は、これら競合が若干起きることは避けられなかった。
【０１５４】
検出感度は、ポリクローナルレパートリの複雑さおよびそのポリクローナル・ガウスピークに対するクローン再配列の位置の関数として、１％ないし１０％の間に変動した。１１４ ψＶγ１１再配列の説明は難しい；なぜならば正常なレパートリは著しく制限されており、これらの原始的再配列はサブクローンに存在することが多いからである。
【０１５５】
Ｖγ４セグメントはその他のＶγｆＩメンバーより約４０ｂｐだけ長く、Ｖγ４再配列は生理的および病的リンパ細胞の両方に比較的一般的であるから、ポリクローナルレパートリはより大きいサイズのフラグメントの方に歪められることがあり、クローンＶγ４−Ｊγ１．３／２．３再配列は理論的にＶγｆＩ−Ｊγ１．１／２．１再配列と間違われることがある。異なる標識をつけたＪγプライマー類を使用する場合は、異なるレパートリの接近もＶγおよびＪγの同定を非常により確実にする。例えば、ＴＥＴ−標識Ｊγ１．１／２．１およびＦＡＭ標識Ｊγ１．３／２．３の使用を単一中心において試験し、満足すべき結果を与えることが示された（図１３Ｂ）。しかし、サイズだけに基づいてＧＳ分析によりＶγおよびＪγ使用を推定することは可能である（図８ＣおよびＤ）。
【０１５６】
全般的な試験段階の結果
限られた生殖細胞系列ＴＣＲＧレパートリおよび制限された結合多様性の場合、均一長さの種々様々のＣＤＲ３配列を有する単一ＶγおよびＪγセグメントを使用してＴＣＲＧ再配列を受けた反応性Ｔリンパ球は、ＧＳ分析によって見かけ上クローン集団として移動する。ＨＤ形成はこれらの再配列をより容易に分散させ、それによってリンパ球のクローン性を証拠として、それらの間違った説明を阻止する。これに対してＧＳ分析はＨＤ分析に比較して改善された解析および感度をもたらす。これらの理由で、ＴＣＲＧ再配列の最適評価はＨＤおよびＧＳ分析の両方を必要とする。もしこれが不可能ならば、ＨＤ分析だけがより好ましいと考えられる。なぜならばこれは偽陰性結果のリスクと関連し、他方ＧＳ分析は偽陽性結果のリスクを高めるからである。
【０１５７】
９０症例においてサザンブロット法によって検出された１８のＴＣＲＧ再配列のうち、１６はＰＣＲによっても検出された。ＮＬ−１オリゴクローナル症例においてサザン法によって検出された少数のＶγｆＩ−Ｊγ１．３／２．３再配列は、ＧＳ分析を行っている研究所の一部において、ＰＣＲによってのみ検出された。ＧＢＳ−６に検出された主要Ｖγ９−Ｊγ１．３／２．３再配列は全ての研究所でＨＤおよびＧＳ両方の分析によってポリクローナルであることが判明し、したがって偽陰性結果であると考えられる。
【０１５８】
対立遺伝子の同定の比較は、サザンブロット法によって確認された全ての対立遺伝子で、サイズに基づくＰＣＲ Ｖγ同定およびＪγ同定が一致した結果を与えることを示した。７つの再配列がサザンブロット法によって検出されたが、正確な対立遺伝子の同定はできなかった。これらのうち６つはＪγ１．１／２．１使用によるものであり、このタイプの再配列の検出にはＰＣＲが好ましいことが示唆される。
【０１５９】
７２のサンプルはサザン法によってポリクローナルであると考えられた。これらのうち１６（２２％）はＴＣＲＧ ＰＣＲによって合計２４の再配列を示した。これらのうち、１３（８１％）はＢリンパ球増殖であった。２４のクローン再配列のうち１６再配列は弱く（ｍｉｎｏｒ）、１５再配列が大部分の研究所でＧＳによって検出された。これらの弱い再配列のうち９（３９％）再配列はψＶγ１０セグメントを含み、８（３３％）再配列がＶγ９を含んでいたことは注目に値する。ψＶγ１１再配列は検出されなかった。ψＶγ１０再配列はサザンブロット分析によっては検出されなかった。したがってＰＣＲは、特にＧＳ分析によって、弱いクローンψＶγ１０再配列をより高感度で検出することができた。これらの再配列は、残留性の主にＴＣＲαβ系統、制限されたレパートリを有するＴリンパ球をあらわす（それらが基礎的Ｂリンパ球悪性腫瘍に関係していても、関係していなくても）と考えられる。これらの弱いピークをクローナルＴ細胞性疾患の証拠としてはっきり説明することはできない。これらは、リンパ球クローン性診断の設定においてこの遺伝子座をＰＣＲ標的として使用する前に、ＴＣＲＧ再配列の性質の理解が重要であることを強調するものである。したがって、これらの臨床的情況下ではＴＣＲＧ遺伝子の結果を説明することも極めて重要である。
【０１６０】
結論
結論として、２本のＴＣＲＧマルチプレックス・チューブは大部分のクローンＴＣＲＧ再配列の検出を可能にする。弱いクローンピークの過剰説明による偽陽性結果のリスクの可能性は、ヘテロ二本鎖分析および遺伝子走査の組み合わせ使用によって、またそれらの臨床的情況下で結果を説明することによって最小にすることができる。特に明白なクローン性がψＶγ１０およびψＶγ１１セグメントと関係していた場合にはなおさらである。クローンＴリンパ球増殖性疾患を検出するための、ＴＣＲＢ分析に比較したＴＣＲＧ分析の相対的有益性を将来を見越して研究すべきである。それらは相補的方法であると考えられる。
【実施例７】
【０１６１】
ＴＣＲＤ遺伝子の再配列：Ｖδ−Ｄδ−Ｊδ、Ｄδ−Ｄδ、Ｖδ−Ｄδ、およびＤδ−Ｊδ
背景
ヒトＴＣＲＤ遺伝子座は、ＶαおよびＪα遺伝子セグメント間の染色体１４ｑ１１．２上に位置する。ＴＣＲＤ遺伝子座の主要部分（Ｖδ−Ｄδ−Ｃδ）にはＴＣＲＤ欠失要素、ψＪαおよびδＲＥＣがフランクし、その際欠失要素の相互の再配列、またはＶαからＪαへの遺伝子セグメントの再配列が、中間ＴＣＲＤ遺伝子座の欠失をおこすようになっている（図９Ａ）。生殖細胞系列コーデドＴＣＲＤ遺伝子座は８Ｖδ、４Ｊδ、および３Ｄδ遺伝子セグメントからなり、そのうち８Ｖδ遺伝子セグメントの少なくとも５つはＪα遺伝子セグメントに再配列することもできる。１１５ その他のＶα遺伝子セグメントが稀にＴＣＲＤ遺伝子再配列に用いられることもある。ＴＣＲ遺伝子セグメントのＷＨＯ−ＩＵＩＳ命名法１１６は、主としてまたは専らＴＣＲδ鎖に用いられるＶ遺伝子（そのなかでＴＣＲαまたはＴＣＲδ鎖に使用できるものもある）に対して、異なるナンバリング系を使用する。例えばＴＣＲＤＶ１０１Ｓ１（Ｖδ１）、ＴＣＲＤＶ１０２Ｓ１（Ｖδ２）およびＴＣＲＤＶ１０３Ｓ１（Ｖδ３）はほとんど専らＴＣＲＤ再配列に用いられ、その一方でＴＣＲＤＶ６Ｓ１（Ｖδ４）、ＴＣＲＡＤＶ２１Ｓ１（Ｖδ５）およびＴＣＲＡＤＶ１７Ｓ１（Ｖδ６）はＴＣＲαまたはα鎖に使用できる。ＴＣＲＡＤＶ２８Ｓ１（Ｖδ７）およびＴＣＲＡＤＶ１４Ｓ１（Ｖδ８）がＴＣＲＤ再配列に使用されるのは非常に稀である。
【０１６２】
ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞の生殖細胞系コーデドレパートリはＴＣＲαβ＋Ｔ細胞に比較して小さく、組合わせレパートリは末梢血液および胸腺細胞のＴＣＲγδ＋Ｔ細胞における優先的組換えにより、さらにより制限される。誕生時には、臍帯血ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞のレパートリは広く、特定のＶγ／Ｖδ組合わせの明白な制限または優先的発現はない。しかし子供時代には末梢血ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞レパートリは目立って形を整え、成人ではＶγ９／Ｖδ２細胞が明らかに優勢となる。１１７ 諸研究から、Ｖδ１およびＶδ２レパートリが年齢と共に制限され、血液および腸にオリゴクローナルＶδ１＋およびＶδ２＋細胞が出現することが判明した。ＴＣＲγδ＋細胞はヒトリンパ組織全体に等しく分布するが、特殊の解剖学的部位には特定のＶδセグメントが優先的に発現する。小腸および大腸に発生する大部分の上皮内ＴＣＲγδＴ細胞がＶδ１を発現することは注目すべきである。同様に、正常脾臓ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞によってＶδ１が発現するが、皮膚のＴＣＲγδ＋Ｔ細胞はＶδ２遺伝子を発現する。
【０１６３】
組換えに使用できる少数のＶ、ＤおよびＪ遺伝子セグメントのために潜在的組換え多様性は制限されるとはいえ、ＣＤＲ３または結合多様性は、組換え酵素によってＮ領域、Ｐ領域およびヌクレオチドのランダム欠失が加わることによって広がる。この多様性は、再配列したＴＣＲＤ遺伝子座内の３つまでのＤδセグメントの組換え、したがって４つまでのＮ−領域の組換えによっても広がる。ＴＣＲＤ遺伝子座においてコードされるこの制限された生殖細胞系列多様性と広い結合多様性との組合わせがＰＣＲ分析のための有用な標的を生成し、ＴＣＲＤ組換え事象がＴおよびＢ細胞性急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）においてクローンマーカーとして最も広く用いられてきた。１１９，１２０ ＴＣＲＤ遺伝子座は全てのＴＣＲ遺伝子座のなかで、Ｔ細胞の発生中に最初に再配列した遺伝子座である。その最初の事象はＤδ２−Ｄδ３再配列であり、その後Ｖδ２−（Ｄδ１−Ｄδ２）−Ｄδ３再配列が続き、最後にＶδ−Ｄδ−Ｊδ再配列が起きる。未成熟再配列（Ｖδ２−Ｄδ３またはＤδ２−Ｄδ３）が前駆体Ｂ−ＡＬＬの７０％に起き（したがって系統的に制限されていない）３０、一方では不完全Ｄδ２−Ｊδ１および完全Ｖδ１、Ｖδ２、Ｖδ３ないしＪδ１を含む成熟再配列の優勢がＴ−ＡＬＬに見いだされる。２３，１２１ こうして特定のプライマーセットを使用して、異なるタイプのＡＬＬに対応する異なるタイプの完全および不完全再配列を同定することができる。１２２
【０１６４】
ＴＣＲγδ＋Ｔ−ＡＬＬはＡＬＬの比較的小さいサブグループを形成する。それはＴ−ＡＬＬの１０−１５％、全ＡＬＬのたった２％を占める。Ｖδ１−Ｊδ１再配列がＴＣＲγδ＋Ｔ−ＡＬＬでは優勢である；興味深いことに、Ｖδ１と、Ｊδ１以外のＪδセグメントとの組み合わせは全く見つかっていない。１５，２０ その他の組換えは対立遺伝子の２５％未満に起きる。さらに、Ｖδ１−Ｊδ１−Ｃδ鎖はほとんど常に、Ｊγ−２．３−Ｃγ２に再結合したＶγＩまたはＶγＩＩ遺伝子のどちらかにジスルフィド結合している。このような遺伝子使用はこれら白血病細胞が未成熟胸腺に由来することと一致する。
【０１６５】
大部分のＴ細胞性リンパ腫はＴＣＲαβを発現する一方、小部分はＴＣＲγδを発現し、数種の明らかに異なるものからなる。ＴＣＲγδを発現する末梢Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）は全ＰＴＣＬの８−１３％を構成し、Ｖδ１−Ｊδ１もその他のＶδ−Ｊδ１組換えも証明された。１２３，１２４ 肝脾γδＴ細胞リンパ腫は、Ｖδ１を正常に発現する脾臓ＴＣＲγδＴ細胞から誘導される。それは明白な臨床的病的特徴をあらわす異常な実体であり、遺伝子使用分析によりこれらのリンパ腫と関係するクローンＶδ１−Ｊδ１再配列が示された。１２５ さらに、皮膚ＴＣＲγδ＋Ｔ細胞リンパ腫の稀なタイプがＶδ２を発現し、したがって、皮膚に通常あるＴＣＲγδ＋Ｔ細胞のクローン増殖をあらわすようにみえる。１２６ その他のクローナルＴＣＲγδ増殖はＣＤ３＋ＴＣＲγδ＋大顆粒リンパ球（ＬＧＬ）増殖を含み、それは全てのＣＤ３＋ＬＧＬの約５％を構成し、Ｖδ１−Ｊδ１再配列を示すことも多い。１２７
【０１６６】
ＴＣＲγδのフレームワーク領域に対するモノクローナル抗体の開発、そして最近は特異的Ｖδ遺伝子セグメントに対するモノクローナル抗体の開発が、フローサイトメトリー分析によるＴＣＲγδ＋Ｔ細胞集団の同定を推進したが１５、これらの集団がクローナルまたはポリクローナル伸展を示すかどうかを確認するにはＰＣＲによるクローン性研究が依然として必要である。１２８
【０１６７】
プライマーの設計
８つのＶδ、４つのＪδおよび３つのＤδ遺伝子セグメントからなるＴＣＲＤ遺伝子セグメントは互いにほとんどまたは全く相同性を示さず、したがってその他の遺伝子セグメントとは交差アニールしないセグメント特異的プライマーが設計された。Ｖδ７およびＶδ８遺伝子セグメントの使用は非常に稀なので、これらのセグメントのためのプライマーを含めることは正当化されないと考えたため、プライマー設計のための本発明による一般的指針に沿って、合計１６のプライマーを設計した：６Ｖδ、４Ｊδ、および３Ｄδ遺伝子セグメントの５’および３’（図９Ｂ）。全てのプライマーはマルチプレックスのために任意の組合わせで一緒に設計されたが、元々は、全ての完全Ｖ（Ｄ）Ｊ再配列を増幅する全てのＶおよび全てのＪプライマーを含む１本のチューブ（Ａ）と主な部分的再配列（Ｖδ２−Ｄδ３、Ｄδ２−Ｄδ３およびＤδ２−Ｊδ１）を増幅するＶδ２、Ｄδ２−５’、Ｄδ３−３’およびＪδ１プライマーを含む第二のチューブ（Ｂ）とを有するように計画された。これらのチューブを一緒にすると、既知の再配列の９５％が増幅するはずである。その他のプライマー（Ｄδ１−５’、Ｄδ３−５’、Ｄδ１−３’およびＤδ２−３’）を使用してその他のＤδ−Ｊδ、Ｖδ−ＤδまたはＤδ−Ｄδ再配列を増幅することができるが、常に最適になるようにした。
【０１６８】
初期試験段階の結果
全てのプライマー対の組合わせをポリクローナルＤＮＡ（扁桃およびＭＮＣ）を用いて試験した。大部分は予想したサイズの生成物を与えたが、幾つか（Ｄδ１−５’、Ｄδ１−３’およびＤδ２−３’）はその他のどのプライマーと組み合わせても目に見える生成物を与えなかった。これらのプライマー領域を含む再配列は極めて稀であるらしい、そこでこれらおよびＤδ３−５’をその後の試験から除外した。６主要再配列（Ｖδ１−Ｊδ１、Ｖδ２−Ｊδ１、Ｖδ３−Ｊδ１、Ｄδ２−Ｄδ３、Ｖδ２−Ｄδ３およびＤδ２−Ｊδ１）のためのクローン症例を最初にモノプレックスＰＣＲで、その後マルチプレックスチューブＡおよびＢで試験した（上記参照）。クローンＤＮＡをポリクローナルＤＮＡ（扁桃またはＭＮＣ）で逐次希釈すると、全症例で少なくとも５％の検出感度が示された。しかし、シングルＰＣＲ反応で明らかに検出された二対立遺伝子再配列を有するクローン症例では、第二の、普通はより大きい対立遺伝子はマルチプレクシングで増幅できないことが多かった。その上、クローン症例の別の組を使用して、Ｖδ２−Ｊδ１再配列の幾つかが増幅できないことが判明した。その後多型部位が元のＶδ２プライマーの位置に確認された；１２０ この多型性の頻度は一般的集団では知られていない。そこでこのプライマーをＶδ２遺伝子セグメントの新しい領域に再設計し、再試験したところ、全症例で増幅することが見いだされた。第二の対立遺伝子の増幅に失敗したという問題は、ＭｇＣｌ２濃度を１．５ｍＭから２．０ｍＭに増加することによって克服された。
【０１６９】
我々は２本のチューブを単一のマルチプレックス反応に合一することができるかどうかも試験した。全部で２１の遺伝子再配列を有する１２クローン症例を試験した。１２プライマー（６Ｖδ、４Ｊδ、Ｄδ２−５’およびＤδ３−３’）を含む１本のマルチプレックスチューブをＡＢＩ金緩衝液および２．０ｍＭ ＭｇＣｌ２と共に使用して全ての症例を増幅した。ポリクローナルＭＮＣ ＤＮＡで希釈した際、全ての遺伝子再配列がＨＤ分析により０．５−１０％の感度で実際に検出された（表７）。全てのＴＣＲＤプライマーを１本のチューブに合一することの唯一の問題は全ての増幅において約９０ｂｐに、２本別々のマルチプレックスチューブを使用したときには存在しなかった非特異的バンドが出現することであった。そのバンドはＴＣＲＤ生成物のサイズ範囲外にあり、説明を妨害しなかったので、問題であるとは考えなかった。
【０１７０】
全般的な試験段階の結果
１０の研究所における９０のサザンブロット確定サンプルの試験は、ＴＣＲＤプロトコルに関する幾つかの全般的問題を提起した：
幾つかのＧＳ分析結果の説明が難しかった。ＴＣＲＤ遺伝子座の生成物のサイズ範囲が大きいため、ポリクローナルサンプルでは典型的ガウス分布がない（図９Ｃ参照）。これは多くのサンプルにおけるＴＣＲＤの少ない使用と相俟って、若干の症例においては、あるサンプルがポリクローナルであるかクローンであるかを決定することが難しいことを意味した。ＨＤ分析では同じ問題は起きなかった。そこでＴＣＲＤのためにＧＳ分析を行う際には細心の注意をもって、潜在的問題を心に留めて行うことを薦める。
９０ｂｐの非特異的バンドはある研究所では非常に強かったが、ある研究所ではさほど強くなかった。金緩衝液でなく緩衝剤ＩＩを用いたときにより弱く、ＭｇＣｌ２濃度にも敏感で、ＭｇＣｌ２濃度が高くなるとより強くなるようにみえた。この生成物は現在では配列が決定され、Ｄδ２およびＪδ３プライマーを使用して無関係の遺伝子であることが判明している。
【０１７１】
９０のサザンブロット確定サンプルの全般的試験の結果は、全ての被検ＰＣＲ群の全体的一致率が非常に高い（９５％）ことを示した。９０症例のうち、６症例はＴＣＲＤクローナル再配列がサザンブロット陽性であった。５症例はＰＣＲによってクローンであることが判明した。残る症例（ＤＥ−１０、高腫瘍負荷のＴ−ＡＬＬ）は全ての研究所でポリクローナルであることがわかった。サザンブロット陰性症例８４のうち、７５症例はＰＣＲによってポリクローナルであることがわかり、４症例はクローンであることが判明し、残る５症例はＧＳおよびＨＤ結果間に矛盾を示した。クローン症例のうち、２症例（ＤＥ−２およびＧＢＳ−９）は低腫瘍負荷が予想されるＴ−豊富Ｂ−ＮＨＬであり、したがってこの結果は、サザンブロットよりもＰＣＲに高い感度を有することを反映するらしい。その他の２クローン症例（ＧＢＳ−１５およびＥＳ−７）は高い腫瘍負荷を有した。ＧＳ結果とＨＤ結果との間に矛盾を示した５症例のうち、１症例（ＮＬ−１）は難しいオリゴクローナル症例であり、幾つかのその他の遺伝子座に関して問題を生じた。残る４症例はＨＤ分析ではポリクローナルで、ＧＳ分析ではクローンであることが判明した。これらのうちの３症例（ＮＬ−１３、ＮＬ−１５およびＮＬ−１８）では、これはＨＤ分析に比べてＧＳ分析に対する大きい感度を反映するものらしいが、残る症例（ＰＴ−１、反応性リンパ節）は、幾つかのサンプルにおけるＴＣＲＤ使用のレパートリが限られていることによるＧＳ分析の“偽クローン性”によるものらしい。
【０１７２】
結論
結論として、ＴＣＲＤ遺伝子再配列の検出のために推薦されるプロトコルは、全ての主要なＶδ（Ｄ）Ｊδ、Ｖδ−ＤδおよびＤδ−Ｊδ再配列を検出するために１２プライマーを含む単一チューブアッセイを使用し、その際特異性および検出を確実に最大にするために緩衝剤ＩＩおよび２．０ｍＭ ＭｇＣｌ２を用いることである。好ましい分析法はＨＤであるが、幾つかのサンプルにおけるＴＣＲＤの限られた使用によって起きる偽クローン性の問題を考慮すれば、ＧＳも注意して使用してよい。多色遺伝子走査の使用（図１３Ｃを参照されたい）も、異なるタイプのＡＬＬにおける完全および不完全ＴＣＲＤ遺伝子再配列の種々のタイプの迅速な確認には有用である。これらの制限を留意すれば、ＴＣＲＤは比較的未成熟のＴ細胞性白血病並びにＴＶＲγδ＋Ｔ細胞増殖にとって貴重な標的となり得る。
【実施例８】
【０１７３】
ＢＣＬ１−ＩＧＨ再配列を有するｔ（１１；１４）
背景
ｔ（１１；１４）（ｑ１３；ｑ３２）は被膜細胞性リンパ腫（ＭＣＬ）に特徴的である、なぜならばこの細胞発生性相互転座はＭＣＬ症例の６０−７０％に認められ、その他のＢ細胞性ＮＨＬにはごく散発的に見られるに過ぎないからである。１３０ 切断点領域は最初はツジモトら（１９８３）によってクローン化され、ＢＣＬ１−領域と呼ばれた。１３１しかし、細胞発生性ｔ（１１；１４）を有する二、三症例において、ＢＣＬ１−領域のゲノム切断点が同定された。約７５０ｋｂの１１ｑ１３−ＢＣＬ１領域をカバーするプローブと共にファイバーおよびインタフェースＦＩＳＨを使用して、ほとんど全てのＭＣＬ（３４中３３）に切断点が認められ、全ての切断点がサイクリンＤ１遺伝子の３６０ｋｂ５’の領域に限定された。１３２、１３３ ＭＣＬ症例のほぼ半数（４１％）において、切断点は主要な転座クラスター領域、ＢＣＬ１−ＭＴＣと呼ばれている８５ｂｐ領域内に集まっていた。１３０，１３４，１３５ ＭＣＬの全症例とは言わないまでも大部分の症例で、１４ｑ３２に位置するＩＧＨ座の切断部は、ＩＧＨ−Ｅμエンハンサを染色体１１ｑ１３配列に近接して並べ、それによってサイクリンＤ１遺伝子の転写活性化を起こすＪн遺伝子を含む。１３６ サイクリンＤ１はＣＤＫ４と共にｐＲＢを燐酸化し（そして不活性化し）、細胞周期のＧ１相を通過させる。サイクリンＤ１はＢ−リンパ球および、ＭＣＬ以外のＢ細胞性ＮＨＬではサイレントであり、この転座の存在はサイクリンＤ１発現とよく相関しているので、この遺伝子はＭＣＬにおける生物学的に適切な標的であると考えられる。１３８ サイクリンＤ１の発現および／またはｔ（１１；１４）（ｑ１３；３２）の存在の両方をＮＨＬの鑑別診断の付加的ツールとして用いられる。２ ほとんど全ての切断点を確認するｔ（１１；１４）の存在のためのゴールドスタンダード検出法は、新鮮または凍結材料１３３並びに保存試料に切断点フランキング・プローブを使用するインターフェースＦＩＳＨである。１３７ しかしｔ（１１；１４）のためのＰＣＲベースの検出法は、例えば残留疾患のモニターのために有用であるかも知れない。多くのグループがＢＣＬ１／Ｊн−切断点を検出するためにＰＣＲベースのアッセイを開発した。それらは一般にコンセンサスＪн−プライマーをＢＣＬ１−ＭＴＣ領域のプライマー（全て３９２ｂｐ領域に位置する）と組合わせて使用するものである。５４，５５ ＢＣＬ１−ＭＴＣ領域内の切断部はＭＴＣ領域の２ｋｂ下流まで起き得るが、切断点の大部分は、報告された大部分の３’−プライマー（“プライマーＢ”ｉｎ ５４，１３４）の直ぐ下流の、８５ｂｐセグメントに密に集まっている。このＢＣＬ１−ＭＴＣ領域内の切断部はＭＣＬ症例の１１ｑ１３−ＢＣＬ１領域内の切断点のごく一部であるから、ｔ（１１；１４）のためのＰＣＲベースの戦略はＦＩＳＨと比較して高率の偽陰性結果のために診断能力を著しく低下させる。
【０１７４】
ｔ（１１；１４）（ｑ１３；ｑ３２）は、多発性骨髄腫（２０％）、ＳＬＶＬ（３０％）、Ｂ−ＰＬＬ（３３％）およびＢ−ＣＬＬ（８％）などのその他のＢ細胞性増殖疾患にも認められることが報告された。１３０，１３８，１３９ 幾つかの研究でＢ−ＣＬＬにｔ（１１；１４）が存在する一つの理由は、Ｂ−ＣＬＬの正しくない分類によるらしい。１３０ 骨髄腫では切断点はＭＣＬのそれらとは全く異なる。それは（ｉ）頻度が遥かに低い；（ｉｉ）大部分の切断部がスイッチ−クラス組換え部位を含む；および（ｉｉｉ）全ての試験症例が同じ３６０ｋｂＢＣＬ１−領域に位置するとはいえ、ＢＣＬ１−ＭＴＣ領域内に優先的クラスタリングはないようにみえるからである。他方、切断がある全ての症例においてサイクリンＤ１遺伝子は活性化されている。ＩＧＨ−スイッチ−切断 ｍｙｅｏｖを有する多発性骨髄腫のサブグループでは、１１ｑ１３−ＢＣＬ１領域に付加的領域が含まれることが注目される。１３８
【０１７５】
プライマーの設計
ＢＣＬ１−ＭＴＣ領域（ジーンバンク受付番号Ｓ７７０４９）からの、報告された最も離れた５’−切断点の位置および使用できるヌクレオチド配列に基づき、コンセンサスＪнプライマーに関するプライマー設計プログラムＯＬＩＧＯ６．２を使用してこの切断点の４７２−ｂｐ領域５’にシングルＢＣＬ１プライマー（５’−ＧＧＡＴＡＡＡＧＧＣＧＡＧＧＡＧＣＡＴＡＡ−３’）を設計した。
【０１７６】
初期試験段階の結果
コンセンサスＪн−プライマーと単一ＢＣＬ１−ＭＴＣ−プライマーとの組合わせを使用して、同様なコンセンサスＪн１８−プライマー（１８ｎｔ）およびＢＣＬ１−ＭＴＣ−プライマーとしての５’−ＧＣＡＣＴＧＴＣＴＧＧＡＴＧＣＡＣＣＧＣ−３’を使用する研究所内（ｉｎ−ｈｏｕｓｅ）のＢＣＬ１−／ＪＨ−ＰＣＲであらかじめ陽性と確認されたＭＣＬの小規模患者群（ｎ＝５）で、我々はまず最初に両アッセイを平行して比較した。ＧＳおよび／またはＨＤ分析によるＩｇ／ＴＣＲ遺伝子再配列とは異なり、ＢＣＬ１−ＪＨ ＰＣＲ生成物（ＢＣＬ２−Ｊн生成物のために）を臭化エチジウム染色だけを用いるアガロースゲル電気泳動によって同定する。ＰＣＲ生成物が著しく弱いものを除いて、５つの陽性サンプルおよび２つの陰性サンプルの結果が確認された。ＰＣＲの感度を高めることができるかどうかを評価するために、我々は異なる濃度のＭｇＣｌ２およびプライマーの効果、およびストラタジーン−ロボサイクラ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ−Ｒｏｂｏｃｙｃｌｅｒ）ＰＣＲ機器の種々の温度の効果を測定した（他の全てのＰＣＲはＡＢＩ−４８０またはＡＢＩ−９７００）。最も興味深かったのは、ＭｇＣｌ２濃度のわずかな変化による変動であった。２．０ｍＭでは５５０ｂｐの弱い非特異的生成物が明らかになり、２．５ｍＭ以上ではこの非特異的生成物が非テンプレートＤＮＡ標準を含む全てのＤＮＡで非常に顕著になった。より低濃度では（１．５ｍＭ未満）非特異的フラグメントは認められず、予想された特異的生成物は非常に弱かった。ＢＣＬ１−ＭＴＣ−内部オリゴ−プローブ（５’−ＡＣＣＧＡＡＴＡＴＧＣＡＧＴＧＣＡＧＣ−３’）とのハイブリダイゼーションで、この５５０ｂｐ生成物へのハイブリダイゼーションは示されなかった。各プライマーを用いるＰＣＲはそれぞれＪн−コンセンサスプライマーだけの使用によって５５０ｂｐ生成物を作ることはできないことを明らかにした。あるＭＣＬ症例では、１５０−３５０ｂｐの範囲のＰＣＲ生成物（図１０Ｂ）に加えて、ＢＣＬ２／Ｊнについて記載されたように、下流Ｊн５およびＪн６セグメントにコンセンサスＪн−プライマーがアニーリングすることにより、より大きい特異的ＰＣＲ生成物があらわれることがある。１４０ 初期試験段階から、ＢＣＬ１−ＭＴＣ／Ｊнのための最も適したＰＣＲ条件は次のようである：アニーリング温度６０℃、２．０ｍＭ ＭｇＣｌ２および１０ｐｍｏｌの各プライマー（ＡＢＩ−９７００で３５ＰＣＲサイクル）。
【０１７７】
大規模シリーズの症例でＰＣＲの特異性を評価するために、３研究所で、研究所内のＢＣＬ１／Ｊн−ＰＣＲで陽性と確認された合計２５症例からのＤＮＡおよび１８陰性対照からのＤＮＡでＢＣＬ１−ＭＴＣ／ＪＨ−ＰＣＲが行われた。陰性症例のいずれにもＰＣＲ生成物はあらわれなかったが、陽性症例２５のうち２２が予想されたサイズの生成物を示した。アガロースゲル上に生成物をあらわさなかった３症例では、ＧＳで生成物が検出され、研究所内のＰＣＲに比較して感度がより低いことが示唆される。
【０１７８】
正常扁桃ＤＮＡで希釈したＭＣＬのＤＮＡを増幅することによって、ＰＣＲの感度を評価した。開発したＰＣＲプライマーを使用して１０−３と１０−４との間の感度をアガロースゲル上で観察した。同じサンプルで平行して行われた各自ＰＣＲは少なくとも１０×以上の感度であった。研究所内のＢＣＬ１−ＭＴＣ−オリゴプローブとのハイブリダイゼーションでは両方のＰＣＲが１０〜１００×以上の感度をあらわした。ＢＣＬ１−ＭＴＣ／Ｊн４−切断点５３を有する確立された細胞系ＪＶＭ２（ＤＳＭＺによって入手できる；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｓｍｚ．ｄｅ）のＤＮＡによる希釈を我々の標準的陽性対照として使用する。陰性対照として正常扁桃組織または末梢血液細胞が使用できるが、ほとんど全ての非−ＭＣＬＢ細胞性ＮＨＬは、この異常の発生頻度が非常に低いため、適するはずである。１３０
【０１７９】
全般的な試験段階の結果
ＢＣＬ１−ＭＴＣ領域の切断点の検出に関する研究所間変動を評価するために、１０のグループが、組織学的に確定された悪性腫瘍および反応性リンパ球増加症の９０例のシリーズから得たＤＮＡをＢＣＬ１−ＭＴＣ／Ｊн−ＰＣＲプロトコルを使用する分析研究に参加した。全症例において、サザン−ハイブリダイゼーション法を用いてＩｇおよびＴＣＲ遺伝子座の状態が明らかにされた。９０症例のうち、７症例は組織学的にＭＣＬと特徴づけられた。７症例全てがサザン−ハイブリダイゼーションによってクローンＩＧＨ再配列を有することが判明した。サザン−ハイブリダイゼーションまたはＦＩＳＨのどちらかによる染色体１１ｑ１３のＢＣＬ１−ＭＴＣ−領域内の再配列の評価は、全症例では行われなかった。１０研究所全てで、７ＭＣＬ症例のうち６症例のＰＣＲ生成物が同定された。６研究所において、ＭＣＬ症例のＮＬ−１５に予想された１．８ｋｂＰＣＲ生成物が確認された。この特殊の症例は異常に大きいＰＣＲ生成物（通常１５０から３５０ｂｐまでの範囲）を有する例外的な切断点をもっており、我々の知る限り、３’から最も離れた検出可能のＢＣＬ１−ＭＴＣ−切断点である。６研究所のうち２研究所で、このＰＣＲ生成物が認められたが、最初はその異常なサイズのために非特異的と考えられた。組織学的にＭＣＬと特徴づけられたＥＳ−４では、１０研究所のうち、ＰＣＲ生成物を検出できた研究所はなかった。これはこの症例がＢＣＬ１−ＭＴＣの外側に切断点を有することを示唆する。全般的な試験段階のためにこのシリーズに含まれるＭＣＬ症例は選択されたものであり、したがってＢＣＬ１−ＭＴＣ領域に通常より高い頻度で切断部ををもつことが期待されていることは強調されなければならない。重要なことは、１症例（ＦＲ−１）だけを除いて、組織学的にＢ−ＣＬＬと特徴づけられた１６症例を含む８３例全ての非−ＭＣＬ症例において、ＢＣＬ１−ＭＴＣ／Ｊн−ＰＣＲ生成物がどの研究所でも検出されなかったことである。組織学的にＢ−ＣＬＬと特徴づけられたＦＲ−１症例において、１０研究所中３研究所で、この切断部をもつ細胞の数が低いことを示す生成物が確認された。サザンブロット分析によって確認されたＩＧＨ状態は、このサンプルが、組織検査と一致して、９０％クローンＢ細胞からなることを明らかにした。ＩＧＨおよびＩＧＫのためのＰＣＲベースのＢ細胞クローン性分析（約１％の感度）は単一のクローンを明らかにし、ＩＧＫのサザンブロット分析は単一の主要ＩＧＫ再配列だけを示した。さらに、サイクリンＤ１の発現を検出するノザンブロット分析は過剰発現を示さなかった。全てのこれらデータは、非常に少数（１％未満）のｔ（１１；１４）−陽性細胞が（ｉ）Ｂ−ＣＬＬから誘導されるサブクローンであるか、（ｉｉ）独立的第二のＢ−悪性腫瘍であるかまたは（ｉｉｉ）正常な個体のｔ（１４；１８）−陽性Ｂ細胞について記載されているような正常Ｂ細胞であることを示唆した。１４０ しかし現在この患者の入手し得るデータでは、これらの３つの考え方を判別することはできない。要するに、１０研究所による分析は、ＢＣＬ１−ＭＴＣ／Ｊн−ＰＣＲ法の高い特異性を証明する。
【０１８０】
ＰＣＲの相対的に低い感度のために起こりうる偽陰性症例の存在を評価するために、１研究所ではこれまでに記載した独自のＰＣＲ（約１０倍高い感度を有する）を９０症例全てのＤＮＡで行い、両アッセイのＰＣＲ生成物と、内部−ＢＣＬ１−ＭＴＣオリゴ−プローブとのハイブリッド形成も行った。これは感度をさらに１０−１００倍高めた。この分析はその他の症例ではＰＣＲ生成物をあらわさなかった。
【０１８１】
結論
ＢＣＬ１−ＭＴＣ／ＪнＰＣＲの感度（１０−３ないし１０−４）は、診断症例のＢＣＬ１−ＭＴＣ／Ｊн−切断点を検出するために十分高いと我々は結論づけた。このアプローチの結果は非常に有望であり、共通のアプローチおよび反応条件の決定が誤った結果を最小にすることを示唆する。しかし、ＭＣＬには最大でｔ（１１；１４）切断点が約５０％検出され、診断のためには追加的検出ツールの使用が薦められることに留意しなければならない。
【実施例９】
【０１８２】
ＢＣＬ２−ＩＧＨ再配列を有するｔ（１４；１８）
背景
ｔ（１４；１８）は末梢Ｂ細胞性リンパ球増殖性疾患における最もよく特徴づけられた再発性細胞発生異常の一つである。１４１ 使用した診断試験によると、それは濾胞性リンパ腫の９０％、大細胞Ｂ細胞性リンパ腫の２０％まで検出可能である。１４２ 転座の結果として、１８ｑ３２からのＢＣＬ２遺伝子は、ＩＧＨ座の強いエンハンサ類のコントロール下におかれ、その結果その発現の正常パターンの調節変化が起こる。１４３，１４４ ＢＣＬ２は外側ミトコンドリア膜に位置し、その正常機能はアポトーシスに拮抗し、調節が変化する際には、腫瘍の病因に密接にかかわってくる。１４５−１４８ 病因におけるこの役割の結果として、ｔ（１４；１８）は残留疾患の診断および分子モニタリング両方の理想的標的となる。
【０１８３】
ＩＧＨ遺伝子座は１４ｑ３２．３に位置し、Ｖн領域はテロメアに位置し、Ｄн、Ｊнおよび定常部はより中心に位置する。転写方向はテロメアからセントロメアの方に向かい、エンハンサはＶ領域の５’に、および各定常領域の間に位置する。転座の最も一般的な形はＶＤＪ組換えプロセスを含み、６つの生殖細胞系Ｊн領域の１つはＢＣＬ２に厳密に対置する。大部分のＰＣＲベースの検出法は、転座の大部分を検出するコンセンサスＪнプライマーを利用している。１４９，１５０ ＩＧＨ遺伝子座とは異なり、ＢＣＬ２の切断部のパターンはより複雑である。ＢＣＬ２は染色体１８ｑ２１上にあり、５’→３’がセントロメアからテロメアの方向に向いている。切断点の大部分はエクソン３の３’未翻訳領域に位置する１５０ｂｐＭＢＲ内にある。１５１ その転座の結果として、Ｊн領域の３’に位置するＳμエンハンサは、その調節変化に導くＢＣＬ２遺伝子の極めて近くに位置する。かなり多くの転座が研究されたので、効率的ＰＣＲ検出戦略のために考慮しなければならないその他の多数の切断点領域があることが明らかになった。さらに別の切断点領域、３．８ｋｂの領域を含む３’ＭＢＲサブクラスターは、ＭＢＲの４ｋｂ下流に位置する。１５２ ｍｃｒはＭＢＲの３’２０ｋｂに位置し、５００ｂｐ領域をカバーする。１５３しかしＭＢＲに類似しているとはいえ、ｍｃｒは最初に考えたよりも広く、ｍｃｒの１０ｋｇ上流の領域、５’ｍｃｒサブクラスター、が報告されている。１５４，１６５ これらの典型的切断点に加えて、切断がＢＣＬ２の５’に起きる多数の変異転座が報告されている。１５６ しかしこれらは稀であり、したがってＰＣＲベースの検出法においては考慮しなくてよい。
【０１８４】
ｔ（１４；１８）の簡単なゴールドスタンダード検出法はなく、細胞発生学およびサザンブロット法の組み合わせが一般に使用されている。１５７，１５８ インタフェースＦＩＳＨ検出戦略はより多い転座を取り上げる可能性をもつ適用可能の方法である。１５９対照的に、ＰＣＲベース・ファイバーＦＩＳＨは変異転座を決定するためには非常に情報豊富であるが、日常的使用には不適切である。１６０ 分子診断の研究所ではＰＣベースの検出法は迅速に結果を提供し、一般に適用可能であり、残留疾患のモニターのために使用できる。しかし一般に使用されるプライマーはａｄ ｈｏｃベースで誘導され、切断点の分子解剖学の最近の情報を考慮するようには設計されなかった。その結果、ゴールドスタンダード・アプローチに比較して、ＰＣＲベースの技術は転座の６０％までしか検出せず、このことはＰＣＲの診断能力をひどく低下させる。この高いパーセンテージの偽陰性結果が集まると、他のサンプルおよびそれまでに増幅したＰＣＲ生成物による汚染に起因する偽陽性の問題が起きる。
【０１８５】
プライマーの設計
我々は２つのチューブ・マルチプレックス系を評価した。一つはＭＢＲ内の切断点を検出するために設計され、第二のチューブはこの領域外の切断点を確認するために使用された。ＭＢＲ戦略は３種のプライマー、ＭＢＲ１、ＭＢＲ２およびコンセンサスＪнプライマーを含んでいた。第二のマルチプレックス反応は５プライマー、すなわちＭＣＲ１、ＭＣＲ２、５’ｍｃｒ、３’ＭＣＲ１およびコンセンサスＪн（図１１Ａ）を含み、上記ｍｃｒ、５’ｍｃｒおよび３’ＭＢＲ領域内の切断点を検出するように設計された。
【０１８６】
初期試験段階の結果
これらのプライマーの評価は、３研究所で、ｔ（１４；１８）を担うことが知られている合計１２４症例の濾胞性リンパ腫から誘導されたＤＮＡで行われた。１０９症例（８８％）はＢＣＬ２−ＩＧＨ融合で確認され、８３／１２４（６７％）はＭＢＲマルチプレックス陽性で、２６／１２４（２１％）はｎｏｎ−ＭＢＲマルチプレックス法で陽性であった。１５／１２４（１２％）の症例では、増幅可能のＰＣＲ生成物はなかった。ｎｏｎ−ＭＢＲマルチプレックスで確認された症例をさらに試験すると、１１（９％）がｍｃｒ内に切断点をもち、５症例（４％）が５’ｍｃｒ内に、１０／１２４（８％）が３’ＭＢＲ内に切断点をもっていた。
【０１８７】
このプライマーセットをさらに研究して５’ｍｃｒおよび３’ＭＢＲサブクラスター領域内の切断点を検出するために、サザン・ハイブリダイゼーションによってＭＢＲおよびｍｃｒが生殖細胞系列であることが知られているｔ（１４；１８）陽性濾胞性リンパ腫の３２症例のシリーズを１研究所で分析した。これらのうち５症例は５’ｍｃｒ（２６０−４９０ｂｐ）内に切断点を有し、分離には５’ｍｃｒプライマーを使用し、マルチプレックス反応も用いて増幅した。残りの症例は陽性結果を示さなかった。３２症例のシリーズ中、９症例は３’ＭＣＲ領域内に切断点をもつことがすでに知られていた。そしてマルチプレックス法はこれら症例の５／９を検出することができた。
【０１８８】
この領域のアッセイ感度を改善するために、我々は３’ＭＢＲサブクラスター領域に広がる３つのプライマー、３’ＭＢＲ２、３’ＭＢＲ３および３’ＭＢＲ４をさらに設計し、これらを別のマルチプレックス反応で３’ＭＢＲ１およびコンセンサスＪＨと組合わせた；３’ＭＢＲマルチプレックス（図１１）。この新しいアプローチにより３２症例のうち８症例は陽性であるが、９番目には見いだされないことが確認された。その後これらのプライマーを個々に使用し、この実験では３２症例中１１症例が陽性であった。切断点は次のように分布した；２／１１症例はプライマー３’ＭＢＲ１および３’ＭＢＲ２の間に存在する切断点を有し、３／１１症例はプライマー３’ＭＢＲ２と３’ＭＢＲ３との間に、２／１１症例は３’ＭＢＲ３と３’ＭＢＲ４との間に切断点を有し、残る４症例ではプライマー３’ＭＢＲ４を用いて増幅し、このプライマーの３’の２００−１０００ｂｐに分布していた。このシリーズの症例では３’ＭＢＲマルチプレックスを使用して３つの偽陰性結果があった。そのうちの１症例は、切断がＡｌｕ反復配列に近い３’ＭＢＲの真ん中に起きる真の偽陰性結果であった。分離に用いた３’ＭＢＲ３プライマーを使用して転座が検出され、４５０ｂｐの生成物が生成し、上記マルチプレックスの感度の低下が示唆された。残る２つの偽陰性症例は３’ＭＢＲ４プライマーで１０００ｂｐより大きい生成物を生成した。それらはこのアプローチによって完全にはカバーされない離れた３’ＭＢＲに位置した。３’ＭＢＲアッセイの感度のさらなる改善がこの研究の全般的な試験段階の後に行われた。プライマー３’ＭＢＲ３を新しい下流プライマー５’−ＧＧＴＧＡＣＡＧＡＧＣＡＡＡＡＣＡＴＧＡＡＣＡ−３’（図１１Ａ参照）に代えると、３’ＭＢＲアッセイの感度も特異性も有意に改善した。
【０１８９】
これに基づいて、３’ＭＢＲマルチプレックスが我々の診断的戦略に組み込まれた。サザンプロット確定症例の分析は、図１１Ａに示す３チューブマルチプレックス系を使用して行われた。
【０１９０】
全般的な試験段階の結果
研究所間の差は診断的ＰＣＲ戦略における顕著な特徴である。これを評価するために、１１グループが大規模の対外的品質管理研究に参加した。ＤＮＡを９０例の組織学的に確定された悪性および反応性リンパ球増殖症シリーズから抽出し、ｔ（１４；１８）マルチプレックス・プロトコルを使用して分析した（図１１Ｂ、ＣおよびＤ）。全ての症例においてサザン・ハイブリダイゼーション法によってＩｇおよびＴＣＲ遺伝子座の状態が明らかにされた。このシリーズではｔ（１４；１８）の核型の確認はできなかった。そこで我々はｔ（１４；１８）を受け入れるネットワークのメンバー間で７０％以上の一致を必要とするアプローチを採用した。９０症例中１１は組織学的に濾胞性リンパ腫と特徴づけられた。１１症例全てがサザン・ハイブリダイゼーションによってクローンＩＧＨ再配列を有することが証明された。ＢＣＬ２遺伝子内の再配列の評価も、１０／１１症例においてＭＢＲに特異的なプローブ、ｍｃｒおよび３’ＭＢＲを用い、サザン・ハイブリダイゼーション法によって行われた。４／１０症例がＭＢＲ内の再配列を示し、それはＰＣＲの結果と一致した。ｍｃｒマルチプレックス陽性であることがわかっている一症例、ＧＢＳ−７、がｍｃｒプローブで決定的でないＳＢ結果を与えた。免疫表現型決定で、この症例は、最初の診断的材料の約５％および１５％を占める２つの明らかに異なるクローン集団を示した。この症例における上記２方法間の矛盾は、ＰＣＲと比較してＳＢの低い感度をあらわすものと考えられる。残る症例のいずれにも、ＳＢによる３’ＭＢＲ再配列の証拠はなかった。
【０１９１】
６症例のＳＢ陰性ＦＣＬのうち、１症例、ＥＳ−７、だけがＭＢＲマルチプレックスを使用してｔ（１４；１８）を示した。１１のＦＣＬ症例中５症例はＳＢまたはＰＣＲのいずれによってもｔ（１４；１８）の証拠を示さなかった。ｔ（１４；１８）はその他の２症例でＰＣＲによって検出された；ＤＬＢＣＬの症例であるＦＲ−６はＭＢＲ切断点を示し、１１研究所の全てによって確認された。この研究結果はＤＬＢＣＬ症例の２０−４０％においてｔ（１４；１８）を検出したこれまでの研究と一致する。１０１，１０２
３’ＭＢＲマルチプレックスを使用して、１０／１１研究所がサンプルＥＳ−１２で陽性結果を報告した。これはごくわずかのＢ細胞を含むホジキン病の症例であった。サザンブロット法によってＩＧＨ再配列が存在しなかったこの症例を説明することは難しい。サンプルソースの汚染または不正確な標識化が最も可能性のある説明である。
【０１９２】
少数の偽陽性および偽陰性結果に遭遇するとはいえ、全体としてこのネットワークには優秀な一致がみられた。全体として１２の偽陽性結果が確認され、それは分析総数の０．４％未満（１２／３０３６）である。これらは５研究所から報告され、６サンプルに関係していた。偽陽性の大部分（９／１２）は３症例に見いだされた。６％の失敗率である５偽陰性結果（５／８８）が３研究所によって報告され、２研究所ではＥＳ−７が検出されず、このネットワーク内の別の３グループは、この症例がＭＢＲマルチプレックスで弱い増幅シグナルを示したと注釈した。残りの３偽陰性症例はそれぞれ個々の研究所によって報告された。このアプローチを使用する診断の結果は非常に有望で、共通のアプローチおよび反応条件を決定すれば誤った結果は最小になることが示唆される。
【０１９３】
結論
結論として、我々はｔ（１４；１８）の検出を最大にするために、確実な３−チューブマルチプレックスＰＣＲを設計し、評価した。この戦略は細胞発生学的に明らかな転座を有するＦＣＬ症例の大部分において切断点領域を介して増幅させることができる。この方法の感度は従来の単一ラウンドまたはｎｅｓｔｅｄアプローチより低いとはいえ、診断法として完全に容認できる。標準化された試薬および方法の広範な採用がこの大規模多施設ネットワーク内の不正確な結果を最小にするのに役立つ。しかし、この研究の全般的な試験段階から、全症例においてｔ（１４；１８）を検出することは不可能であることは注目すべきである。これは、ＢＣＬ２遺伝子の調節変化をおこすその他の分子機構によって確実に影響を受ける。１６３，１６４
【実施例１０】
【０１９４】
パラフィン包埋組織生検材料から抽出されたＤＮＡの使用および標準遺伝子プライマーセットの開発
背景
新鮮／凍結組織は、ＰＣＲベースのクローン性分析に使用するＤＮＡを抽出するための理想的種類のサンプルと考えられる。しかし新鮮／凍結材料は診断的研究に常に使用できるとは限らず、ヨーロッパの多くの研究所ではパラフィン包埋組織サンプルが分析のための診断的生検材料の大きい部分を占めている。パラフィン包埋材料から抽出されるＤＮＡは低品質であることが多く、したがってこれらの種類のサンプルを広く診断研究に使用する前に、これらのサンプルを用いて実施するＰＣＲプロトコルを評価する必要がある。
【０１９５】
パラフィン包埋サンプルから抽出されるＤＮＡの完全性およびＰＣＲによるその増幅は多数の要因、例えば組織の厚さ、固体の種類、固定時間、分析前の保存期間、ＤＮＡ抽出法およびＰＣＲインヒビタの同時抽出などによって影響を受ける。１６５−１７２ １０％中性緩衝ホルマリン（１０％ＮＢＦ）は最も一般的に使用される固定剤である。ただし研究所では非緩衝ホルマリンおよびブアン液など多くのその他の固定剤も使用される。１０％ＮＢＦの使用により広範囲のサイズのＤＮＡフラグメントの増幅が可能であるが、ブアン液はＰＣＲ分析には最も適さない。１６７，１６８，１７１，１７３ パラフィン包埋サンプルから抽出されたＤＮＡフラグメントの完全性はその塊が保存された期間にも依存し、２年未満の塊からは最善の結果が得られるのが普通であるが、１５年より長く保存された塊は非常に分解したフラグメントを与える傾向がある。１７４
【０１９６】
プライマーの設計
分析するＤＮＡの品質を評価するために、最初に５セットの標準遺伝子ＰＣＲプライマーを設計し、正確に１００、２００、４００、６００および１０００ｂｐの生成物を増幅した。オープン・リーディング・フレームを有する大きいエクソンを有することに基づいて標的遺伝子を選択し、多型性領域を選択するリスクを減らした。そして標準プロトコルにおけるマルチプレックス使用のためのプライマーを設計した。次の標的遺伝子を選択した：ヒト・トロンボキサン・シンターゼ遺伝子（ＴＢＸＡＳ１、エクソン９；ジーンバンク受付番号Ｄ３４６２１）、ヒト組換え活性化遺伝子（ＲＡＧ１、エクソン２；ジーンバンク受付番号Ｍ２９４７４）、ヒト前骨髄球性白血病ジンク・フィンガー遺伝子（ＰＬＺＦ、エクソン１；ジーンバンク受付番号ＡＦ０６０５６８）、およびヒトＡＦ４遺伝子（エクソン３；ジーンバンク受付番号Ｚ８３６７９、およびエクソン１１；ジーンバンク受付番号Ｚ８３６８７）。
【０１９７】
初期試験段階の結果
プライマー対を個別の反応で試験し、その後高分子ＤＮＡを用いるマルチプル反応で試験した。生成物のサイズ範囲が大きいため（１００ないし１，０００ｂｐ）、マルチプル反応において等しい強度のバンドを得るためにプライマー濃度の比を変えることが必要であった。しかし、全てのバンドを再現性をもって増幅することは極めて難しいことがわかった。本発明によるＰＣＲプロトコルは６００ｂｐ未満の生成物を与えるから、１，０００ｂｐの生成物は多分不必要であると推定された。そこでアッセイの再現性を改善するために１，０００ｂｐの生成物は除外することに決めた。ＭｇＣｌ２濃度を２ｍＭに高め、プロトコルを１：１：１：２の割合で加えることによって、高分子ＤＮＡサンプルから等しい強度の４つのバンド（１００、２００、４００および６００ｂｐ）を再現性をもって増幅することができた。しかし、パラフィン塊から抽出したＤＮＡでは、３００ｂｐの臨時のサイズマーカーが非常に情報豊富であり、６００ｂｐマーカーは必要ないと考えられた。１，０００ｂｐマーカー（ＰＬＺＦ）のための遺伝子配列を使用して、プライマーを再設計し、３００ｂｐ生成物を作成した。これらはモノプレックス反応および１００、２００、３００、４００および６００ｂｐプライマーを一緒にしたマルチプレックス反応の両方で上首尾に試験された（図１２Ａ参照）。
【０１９８】
こうして２セットのプライマーが増幅のためのＤＮＡの品質を評価するために使用できる：２．５ｐｍｏｌで使用される１００、２００、３００および４００ｂｐの各プライマーはパラフィン包埋組織からのＤＮＡの評価に使用できる。６００ｂｐプライマーを５ｐｍｏｌ添加すると、このセットを使用して本発明によるプライマー類およびプロトコルと共に使用する任意のＤＮＡサンプルの質をチェックすることができる。両プライマーセットは標準化増幅条件下でＡＢＩ緩衝液ＩＩおよび２．０ｍＭ ＭｇＣｌ２と共にに使用できる。生成物は６％ＰＡＧＥまたは２％アガロースで分析できる（図１２Ｂを参照）。
【０１９９】
全般的な試験段階の結果
新鮮／凍結組織サンプルとして提供された３０のＢ細胞性悪性腫瘍、８のＴ細胞性悪性腫瘍および７の反応性リンパ球増殖に対応する４５パラフィン包埋生検材料を集めた。パラフィン塊の保存期間並びにサンプルの固定および包埋法はナショナルネットワーク間で様々であった。ＥＳサンプルはカット前切片として提供され、ＮＬ−１４、１５および１６がＤＮＡサンプルとして提供され、残る生検材料はパラフィン塊として提供された。５切片（各１０μｍ）をパラフィン塊から切り取り、パラフィン包埋組織からゲノムＤＮＡを分離するためのメーカーのプロトコルにしたがって、ＱＩＡａｍｐＤＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（キアゲン（ＱＩＡＧＥＮ））を使用してＤＮＡを抽出した。このＤＮＡ抽出法が選択されたのは、このキットを使用して血液、新鮮／凍結組織およびパラフィン包埋組織から高品質のＤＮＡを速やかに抽出でき、それによって確実な品質管理のもとで種々のサンプルを平行して処理することができるためである。パラフィン包埋組織からＤＮＡを抽出してＰＣＲ分析をするための多数のプロトコルが発表されている。１７１，１７２、１７５−１７７ これらの多くは、ＤＮＡの分解およびＰＣＲインヒビタの同時抽出を低減することを目的としているが、これらの方法の多くは長い抽出処理を必要とし、日常的診断的検査室で使用するには不適切である。１６６，１７８，１７９
【０２００】
ＤＮＡサンプルの濃度および完全性は、分光光度法によって、およびアガロースゲル電気泳動法でサンプルＤＮＡを既知標準と比較することによって推定された。その後ＤＮＡサンプル（１００ｎｇ）の完全性および増幅可能性を標準遺伝子ＰＣＲプライマー（１００−４００ｂｐ）を用いて分析し、全ての標的遺伝子座のクローン性をＰＣＲプロトコルを用いて評価した。
【０２０１】
２４／４５症例の標準遺伝子ＰＣＲ反応において、増幅した生成物は少なくとも３００ｂｐであったが、残りの２１サンプルでは増幅した生成物は２００ｂｐ以下であった。ＤＮＡの質と塊の保存期間または固定法との間に明らかな相関関係は証明できなかった。そこで、諸要因の組み合わせがこれらのサンプルのＤＮＡの質に関係していると考えられる。
【０２０２】
ＤＮＡサンプルのクローン性を１８のマルチプレックスＰＣＲ反応を用いて評価し、ＨＤおよびＧＳの両方によって分析した。９標的遺伝子座にクローン性および転座を示すパラフィンサンプルの数を、対応する新鮮／凍結サンプルデータと比較した。２００ｂｐまでの標準遺伝子ＰＣＲ生成物を含むサンプルにおいて、９標的遺伝子座のクローン性の全体的検出は９／５５（１６％）であった。再配列のない４６のうち、４５サンプルは、予想クローンＰＣＲ生成物の分子量が、標準遺伝子ＰＣＲにおいてそのサンプルによって増幅される最大サイズより大きかったという事実によって説明できる。残りのサンプル（ＰＴ−９）は標準遺伝子ＰＣＲで１００ｂｐに増幅したが、予想された８１ｂｐＴＣＲＧクローン生成物は検出されなかった。最低３００ｂｐの標準遺伝子ＰＣＲ生成物を有するサンプルでは、９標的遺伝子座のクローン性の全体的検出は４２／５５（７６％）であった。再配列のなかった１３のうち、５サンプルは、やはり予想クローンＰＣＲ生成物が標準遺伝子ＰＣＲにおいてそのサンプルによって増幅される最大サイズより大きかったという事実によって説明できた。再配列のなかった残る８サンプルは、ＤＮＡの質によって直接説明することはできなかった。１つの偽陽性クローン結果（ＧＢＮ−９；ＩＧＬ）が反応性リンパ節に検出された。この反応性リンパ節は偽クローン性であるかも知れない。
【０２０３】
ＰＣＲインヒビタがパラフィンサンプルから抽出されたＤＮＡ中に存在することは知られている。ＤＮＡサンプルを希釈して、これらインヒビターの濃度を、増幅がうまく開始し得るレベルにまで低下させることができる。ＤＮＡサンプルの希釈が増幅効率に与える影響を研究するために、４種類の濃度のＤＮＡを標準遺伝子ＰＣＲ反応において試験した：５、５０、１００および５００ｎｇ。ＤＮＡサンプルの希釈は標準遺伝子ＰＣＲにおけるＰＣＲ生成物のサイズに有意な影響を与えることが認められた。１００ｎｇから５０ｎｇに希釈した際、全体として、２４／４５症例（５３％）が増幅効率の増加を示した。最適ＤＮＡ濃度は５０ないし１００ｎｇ間であるようにみえ、他方、５００ｎｇＤＮＡの使用は大きい生成物（３００ｂｐ以上）の増幅を阻害するように見える。５ｎｇＤＮＡの使用は標準遺伝子ＰＣＲで容認できる結果を与えるとはいえ、ＰＣＲベースのクローン性アッセイでは、総リンパ性細胞ＤＮＡの量が少なくなるため、偽陽性になる可能性がある。１８０，１８１ より重要なことは、５ｎｇＤＮＡは５０ｎｇＤＮＡ希釈に比べて何ら有益性をもたないということである。
【０２０４】
５０ｎｇＤＮＡの使用がクローン性の検出も高めるかどうかを評価するために、このＤＮＡ濃度を用いて全てのサンプルをＩＧＨ Ｖ−Ｊ遺伝子座で再試験した。１００ｎｇＤＮＡを使用して３本のＩＧＨ Ｖ−Ｊチューブに検出されたクローン再配列の数は１２であり、それに対して対応する新鮮／凍結サンプルを用いた場合には２３であった。５０ｎｇＤＮＡを使用すると、この座におけるクローン性の全体的検出は２３中１７に増加し、追加的に９ ＦＲ１、６ ＦＲ２および４ ＦＲ３クローナル生成物が検出された。このように、ＤＮＡの希釈はクローン生成物の検出を高めることができる。これはＰＣＲインヒビタが薄まるためと考えられる。論理的には、もしＰＣＲインヒビタが存在し、もしＤＮＡサンプルが高度に分解されないとするならば、ＤＮＡの希釈は標準遺伝子ＰＣＲ結果およびクローン性の検出を両方共改善するだけですむかも知れない。そこで、ＤＮＡの少なくとも２種類の希釈を標準遺伝子ＰＣＲによって試験し、より良い結果を与える希釈をその後のクローン性分析に使用することを薦める。
【０２０５】
最初の分析後、９つのクローン再配列が検出されないままであった；これはＤＮＡの質によっては説明できない（ＰＴ−９およびＮＬ−１１のＴＣＲＧ；ＧＢＳ−４のＴＣＲＢ；ＮＬ−１５のＴＣＲＤ；ＧＢＮ−４、ＮＬ−４およびＮＬ−５のＩＧＫ；ＧＢＳ−６およびＧＢＳ−８のＩＧＨ Ｖ−Ｊн）。これらのサンプルを５０ｎｇＤＮＡを用いて再試験したが、１サンプル（ＧＢＳ８；ＩＧＨ）だけが改善された検出を示した。その他の未知の因子が少数の症例において特異的標的の増幅を阻止し得ることが示唆される。しかし、これらサンプルの７つの（ＮＬ−１１、ＧＢＳ−４、ＮＬ−１５、ＧＢＮ−４、ＮＬ−５、ＧＢＳ−６＆ＧＢＳ−８）クローナル生成物が少なくとも１つの別の座に検出されたことは注目しなければならない。これは、マルチプル標的遺伝子座のクローン性の試験がクローンリンパ球集団の検出の可能性を高めることを示すものである。
【０２０６】
結論
ここに提供するプロトコルは、パラフィン包埋材料から抽出されたＤＮＡで成功すると結論づけられる；ただしこのＤＮＡが標準遺伝子ＰＣＲにおいて３００ｂｐ以上の生成物を増幅できることが条件である。標準遺伝子ＰＣＲで２種類の濃度のＤＮＡを試験するのが好ましい。そしてより‘増幅可能の’濃度をその後の試験に使用すべきである。ただし２０ｎｇ未満のＤＮＡ濃度は標的リンパ性ＤＮＡの量が少ないため、偽クローン性の検出に貢献するかも知れない。１８０，１８１ 全体として上記データは、標準遺伝子ＰＣＲを使用するＤＮＡの品質評価が、ここに提供されるプロトコルを使用するクローン性分析における上記ＤＮＡの適性の良い指標を与えることを示している。標準遺伝子ＰＣＲはサンプル中に存在するリンパ細胞ＤＮＡの量の指標を与えず、したがって良質のＤＮＡでもクローン性分析において陰性結果を与えることがあり得ることを付け加えることは重要である。モノクローナル結果が再現性があることを確認するために（および潜在的偽クローン性を回避するために）全てのクローン性アッセイ、特にパラフィン抽出ＤＮＡを使用するアッセイは二回づつ行い、できればＨＤおよびＧＳによって分析することが好ましい。
【表１】
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【表２】
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【表３】
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【表４】
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【表５】
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【表６】
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【表７】
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【表８】
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【表９】
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【表１０】
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【表１１】
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【表１２】
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【図面の簡単な説明】
【０２０７】
【図１】図１はＴＣＲＢ遺伝子の連続的再配列段階、転写、および翻訳の略図である。
【図２】図２は再配列したＩｇおよびＴＣＲ遺伝子から得られるＰＣＲ生成物のヘテロ二本鎖分析および遺伝子走査の略図である。
【図３Ａ】図３ＡはＩＧＨ（Ｖн−Ｊн）再配列のＰＣＲ分析を示す図である。
【図３Ｂ】図３ＢはＩＧＨ（Ｖн−Ｊн）再配列のＰＣＲ分析を示す図である。
【図３Ｃ】図３ＣはＩＧＨ（Ｖн−Ｊн）再配列のＰＣＲ分析を示す図である。
【図３Ｄ】図３ＤはＩＧＨ（Ｖн−Ｊн）再配列のＰＣＲ分析を示す図である。
【図３Ｅ】図３ＥはＩＧＨ（Ｖн−Ｊн）再配列のＰＣＲ分析を示す図である。
【図４Ａ】図４ＡはＩＧＨ（Ｄн−Ｊн）再配列のＰＣＲ分析を示す図である。
【図４Ｂ】図４ＢはＩＧＨ（Ｄн−Ｊн）再配列のＰＣＲ分析を示す図である。
【図４Ｃ】図４ＣはＩＧＨ（Ｄн−Ｊн）再配列のＰＣＲ分析を示す図である。
【図５Ａ】図５ＡはＩＧＫ遺伝子再配列のＰＣＲ分析を示す図である。
【図５Ｂ】図５ＢはＩＧＫ遺伝子再配列のＰＣＲ分析を示す図である。
【図５Ｃ】図５ＣはＩＧＫ遺伝子再配列のＰＣＲ分析を示す図である。
【図５Ｄ】図５ＤはＩＧＫ遺伝子再配列のＰＣＲ分析を示す図である。
【図６Ａ】図６ＡはＩＧＬ遺伝子再配列のＰＣＲ分析を示す図である。
【図６Ｂ】図６ＢはＩＧＬ遺伝子再配列のＰＣＲ分析を示す図である。
【図６Ｃ】図６ＣはＩＧＬ遺伝子再配列のＰＣＲ分析を示す図である。
【図７Ａ】図７ＡはＴＣＲＢ遺伝子再配列のＰＣＲ分析を示す図である。
【図７Ｂ】図７ＢはＴＣＲＢ遺伝子再配列のＰＣＲ分析を示す図である。
【図７Ｃ】図７ＣはＴＣＲＢ遺伝子再配列のＰＣＲ分析を示す図である。
【図７Ｄ】図７ＤはＴＣＲＢ遺伝子再配列のＰＣＲ分析を示す図である。
【図７Ｅ】図７ＥはＴＣＲＢ遺伝子再配列のＰＣＲ分析を示す図である。
【図８Ａ】図８ＡはＴＣＲＧ遺伝子再配列のＰＣＲ分析を示す図である。
【図８Ｂ】図８ＢはＴＣＲＧ遺伝子再配列のＰＣＲ分析を示す図である。
【図８Ｃ】図８ＣはＴＣＲＧ遺伝子再配列のＰＣＲ分析を示す図である。
【図８Ｄ】図８ＤはＴＣＲＧ遺伝子再配列のＰＣＲ分析を示す図である。
【図９Ａ】図９ＡはＴＣＲＤ遺伝子再配列のＰＣＲ分析を示す図である。
【図９Ｂ】図９ＢはＴＣＲＤ遺伝子再配列のＰＣＲ分析を示す図である。
【図９Ｃ】図９ＣはＴＣＲＤ遺伝子再配列のＰＣＲ分析を示す図である。
【図１０Ａ】図１０ＡはＢＣＬ１−ＩＧＨ再配列の検出を示す図である。
【図１０Ｂ】図１０ＢはＢＣＬ１−ＩＧＨ再配列の検出を示す図である。
【図１１Ａ】図１１ＡはＢＣＬ２−ＩＧＨ再配列のＰＣＲ検出を示す図である。
【図１１Ｂ】図１１ＢはＢＣＬ２−ＩＧＨ再配列のＰＣＲ検出を示す図である。
【図１１Ｃ】図１１ＣはＢＣＬ２−ＩＧＨ再配列のＰＣＲ検出を示す図である。
【図１１Ｄ】図１１ＤはＢＣＬ２−ＩＧＨ再配列のＰＣＲ検出を示す図である。
【図１２Ａ】図１２ＡはＤＮＡサンプルの増幅可能性および完全性を評価するための標準遺伝子ＰＣＲを示す図である。
【図１２Ｂ】図１２ＢはＤＮＡサンプルの増幅可能性および完全性を評価するための標準遺伝子ＰＣＲを示す図である。
【図１３Ａ】図１３ＡはＴＣＲ遺伝子再配列の迅速かつ容易な同定を補助するための多色遺伝子走査の図である。
【図１３Ｂ】図１３ＢはＴＣＲ遺伝子再配列の迅速かつ容易な同定を補助するための多色遺伝子走査の図である。
【図１３Ｃ】図１３ＣはＴＣＲ遺伝子再配列の迅速かつ容易な同定を補助するための多色遺伝子走査の図である。
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【０２０８】
対比リスト
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【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
0004708029.tif 000039
【図３Ｅ】
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【図４Ａ】
0004708029.tif 000041
【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【配列表】
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