(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも一対の電極を配置した試料容器、光源、局所照明手段、高倍率光学観察手段、選別光学フィルター及び交流電圧印加手段を具備し、前記試料容器内で、親和性相互作用を解析しようとする少なくとも２種類の生体分子に対し、前記電極間に交流電圧を印加することによって、電気泳動による往復運動をさせることを特徴とする生体分子の親和性解析装置。
【請求項２】
前記局所照明手段が蛍光照明による蛍光励起手段であって、蛍光励起光源及び蛍光選別光学フィルターを有することを特徴とする請求項１に記載の生体分子の親和性解析装置。
【請求項３】
前記局所照明手段がエバネッセント照明による蛍光励起手段であることを特徴とする請求項２に記載の生体分子の親和性解析装置。
【請求項４】
前記試料容器が流路形状を成し、前記流路内に一対あるいは複数対の電極を配置し、前記電極間に交流電圧を印加することによって、前記生体分子を電気泳動による往復運動をさせることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の生体分子の親和性解析装置。
【請求項５】
少なくとも一対の電極を配置した試料容器、光源、局所照明手段、高倍率光学観察手段、選別光学フィルター及び交流電圧印加手段を具備する生体分子の親和性解析装置の試料容器に、相互作用を判別する少なくとも２種類の生体分子の混合物の溶液を保持させ、前記電極間に交流電圧を印加することによって、前記生体分子を前記溶液中で電気泳動による往復運動をさせ、親和性相互作用による反応前後の個別の生体分子の往復運動の最大速度または移動距離の変化を比較することによって、前記生体分子の会合状態を評価することを特徴とする生体分子間の親和性を解析する方法。
【請求項６】
前記生体分子の一方が、生体分子を表面に固定した粒子であることを特徴とする請求項５に記載の生体分子間の親和性を解析する方法。
【請求項７】
前記生体分子の一方が蛍光標識されていることを特徴とする請求項５又は６に記載の生体分子間の親和性を解析する方法。
【請求項８】
前記試料容器が流路形状を成し、前記試料溶液を保持する際に、フロー式あるいは合流フロー式流路を用いて、前記電極間の周波数変化によって、前記生体分子を電気泳動による往復運動をさせることを特徴とする請求項５〜７のいずれかに記載の生体分子間の親和性を解析する方法。
【請求項９】
前記生体分子の少なくとも一方が核酸分子であることを特徴とする請求項５〜８のいずれかに記載の生体分子間の親和性を解析する方法。
【請求項１０】
前記生体分子の少なくとも一方がタンパク質であり、前記試料溶液のｐＨを少なくとも一方のタンパク質の等電点でないｐＨ、あるいは２つの生体分子の等電点に挟まれたｐＨに調製することを特徴とする請求項５〜９のいずれかに記載の生体分子間の親和性を解析する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体分子の親和性を解析するための装置及び該装置を使用して生体分子間の親和性を解析する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、生体分子の親和性を解析する方法としては、例えば核酸分子と相互作用するタンパク質の場合、核酸分子にタンパク質が結合すると核酸分子のみの場合よりも分子量が大きくなるため、DNA-タンパク質複合体をゲルなどの担体で電気泳動し、移動度の差を検出するゲルシフトアッセイなどの方法が開発されている。（非特許文献１）
【非特許文献１】Nucleic Acids Research 23, 6505-6525 (1981)
【０００３】
また、核酸-タンパク質相互作用を検出する他の方法としては、次のような方法が提案されている。
フットプリンティング法：特定の遺伝子配列を認識し、結合するタンパク質の遺伝子結合部位を決定する方法。（非特許文献２)
サウスウェスタン法：SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動法にてタンパク質を分離した後、ニトロセルロースフィルターなどへ転写する。これにラジオアイソトープなどで標識したDNAをプローブとして用い、標的物質との結合を測定する方法。（非特許文献３)
２本鎖DNAアレイ：２本鎖DNAをガラス基板などにアレイ化し、基板上でタンパク質を反応させた後、DNAに結合したタンパク質を抗体などを用いて検出する方法。（非特許文献４〜６)
【非特許文献２】Nucleic Acids Research 5, 3157-3170 (1978)
【非特許文献３】Cell 52, 415-423 (1988)
【非特許文献４】Nature Biotechnology 17,536-537(1999)
【非特許文献５】Nature Biotechnology 17, 573-577 (1999)
【非特許文献６】Proc Natl Acad Sci USA 98, 7158-7168(2001)
【０００４】
この他、核酸-タンパク質相互作用を検出する方法として、表面プラズモン共鳴（SPR)法（非特許文献７)や、マイクロプレートでの検出法がある。マイクロプレートを用いてDNA結合タンパク質を検出するキットは市販されているが（たとえば、クロンテック社、Activemotif社（フナコシが販売))、これは、９６穴マイクロプレートにDNAが固定化されており、各ウェルに測定サンプルを滴下してDNAを相互作用させた後、抗体で検出を行うものである。
【非特許文献７】Nucleic Acids Research 19, 2788 (1999)
【０００５】
また、タンパク質間相互作用の親和性を解析する方法では、S. Fieldsらによって相互作用を調べたい２種類のタンパク質をそれぞれ酵母や培養細胞の中で発現させ、これらが相互作用した場合にのみ転写因子が機能して特定のレポーター遺伝子の発現活性化によって検出するツーハイブリットなどの方法が開発されている。（特許文献１、非特許文献８参照）
【特許文献１】米国特許第５，２８３，１７３号
【非特許文献８】Fields and Song, 1989, Nature, 340:245-246
【０００６】
核酸分子と相互作用するタンパク質をゲルシフトアッセイにより解析する方法における問題点としては、解析に使用するポリアクリルアミドゲルなどの大きさに対して移動度が充分に大きく変化する電気泳動条件を検討する必要がある。また、検討された電気泳動条件であってもゲルシフトで検出されるバンドは明瞭でない場合が多く、特に相互作用が弱い場合には、多くの核酸分子とタンパク質を用いても核酸分子のみのバンド自身が明瞭でないため、ゲルシフトの検出が困難になる。さらに、相互作用が強い場合であっても、精製したタンパク質を多くの濃度条件でＲＩあるいは蛍光標識した核酸分子との相互作用を検出するため、相当量のタンパク質及び核酸分子を調製し、準備する必要がある。
【０００７】
一方、タンパク質相互作用を酵母ツーハイブリットにより解析する方法は、時間がかかり、相互作用の検出感度が非常に高く網羅的な解析にも適しているが、擬陽性あるいは非特異的相互作用が多いため、正確な解析を行うためには、擬陽性あるいは非特異的相互作用を最小限にするための断片化タンパク質の設計、各種の分子生物学的手法及びデータ解析などを組み合わせて、擬陽性あるいは非特異的相互作用の検出を除去していくことが必要になる。
さらに、従来の相互作用解析では、目的とするタンパク質に対する抗体が必要であったが、新規のタンパク質を解析する手段にも適応可能な検出法が求められている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、本発明はこれら従来技術の問題点を解消して、少量の試料を使用し、簡単な操作により迅速かつ高精度で生体分子相互の親和性を解析することができ、新規なタンパク質を解析する手段としても適応可能な、生体分子の親和性を解析するための装置、及び該装置を使用して生体分子間の親和性を解析する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明では、上記課題を解決するために、次の１〜１２の構成を採用する。
１．少なくとも一対の電極を配置した試料容器、光源、局所照明手段、高倍率光学観察手段、選別光学フィルター及び交流電圧印加手段を具備し、前記試料容器内で、親和性相互作用を解析しようとする少なくとも２種類の生体分子に対し、前記電極間に交流電圧を印加することによって、電気泳動による往復運動をさせることを特徴とする生体分子の親和性解析装置。
２．前記局所照明手段が蛍光照明による蛍光励起手段であって、蛍光励起光源及び蛍光選別光学フィルターを有することを特徴とする１に記載の生体分子の親和性解析装置。
３．前記局所照明手段がエバネッセント照明による蛍光励起手段であることを特徴とする２に記載の生体分子の親和性解析装置。
４．前記試料容器が流路形状を成し、前記流路内に一対あるいは複数対の電極を配置し、前記電極間の電圧の周波数変化によって、前記生体分子を電気泳動させることを特徴とする１〜３のいずれかに記載の生体分子の親和性解析装置。
５．少なくとも一対の電極を配置した試料容器、光源、局所照明手段、高倍率光学観察手段、選別光学フィルター及び交流電圧印加手段を具備する生体分子の親和性解析装置の試料容器に、相互作用を判別する少なくとも２種類の生体分子の混合物の溶液を保持させ、前記電極間に交流電圧を印加することによって、前記生体分子を前記溶液中で電気泳動による往復運動をさせ、親和性相互作用による反応前後の個別の生体分子の往復運動の最大速度または移動距離の変化を比較することによって、前記生体分子の会合状態を評価することを特徴とする生体分子間の親和性を解析する方法。
６．前記生体分子の一方が、生体分子を表面に固定した粒子であることを特徴とする５に記載の生体分子間の親和性を解析する方法。
７．前記生体分子の一方が蛍光標識されていることを特徴とする５又は６に記載の生体分子間の親和性を解析する方法。
８．前記試料容器が流路形状を成し、前記試料溶液を保持する際に、フロー式あるいは合流フロー式流路を用いて、前記電極間の周波数変化によって、前記生体分子を電気泳動による往復運動をさせることを特徴とする５〜７のいずれかに記載の生体分子間の親和性を解析する方法。
（本発明において、合流フロー式流路とは、フロー式流路を２つ以上組合わせ、溶液を試料容器内で混合させる流路を意味する。）
９．前記生体分子の少なくとも一方が核酸分子であることを特徴とする５〜８いずれかに記載の生体分子間の親和性を解析する方法。
１０．前記生体分子の少なくとも一方がタンパク質であり、前記試料溶液のｐＨを少なくとも一方のタンパク質の等電点でないｐＨ、あるいは２つの生体分子の等電点に挟まれたｐＨに調製することを特徴とする５〜９のいずれかに記載の生体分子間の親和性を解析する方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、少量の試料を使用し、簡単な操作により迅速かつ高精度で生体分子相互の親和性を解析することができる。本発明は、新規なタンパク質を解析する手段としても適応可能なものであり、実用的価値の高い発明である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の生体分子どうしの親和性を解析する装置は、少なくとも一対の電極を配置した試料容器、光源、局所照明手段、高倍率光学観察手段、選別光学フィルター及び交流電圧印加手段を具備するものである。そして、装置の試料容器に相互作用を判別する少なくとも２種類の生体分子の混合物の溶液を保持させ、電極間に交流電圧を印加することによって、生体分子を溶液中で往復運動させ、反応前後の個別の生体分子の運動の指標の変化を比較し、分子の会合状態を評価することで分子間の親和性を調べるものである。
【００１２】
特に、局所照明手段としては、蛍光照明による蛍光励起手段を使用することが好ましく、蛍光励起光源及び蛍光選別光学フィルターによって、生体分子を表面に固定した蛍光粒子または蛍光標識した生体分子のみを検出し、その最大移動速度または移動距離（振幅）の変化を比較することによって、粒子または分子の会合状態を評価することで分子間の親和性を効率良く検出することができる。
【００１３】
また、試料容器を流路形状とし、流路内に一対あるいは複数対の電極を配置して、その電極間の電圧の周波数を変化させ、生体分子を表面に固定した粒子または生体分子を電気泳動させることによって、微量の試料により生体分子の親和性を検出することが可能となる。
さらに、試料容器を流路形状とし、微量な希薄試料溶液を保持する際に、フロー式あるいは合流フロー式流路を用いて、配置した電極間の電圧の周波数を変化させ、生体分子を表面に固定した粒子または生体分子を電気泳動させることによって、連続的な検出が可能となる。
【００１４】
以下、本発明の実施の形態について図面を参照しながら説明するが、以下の具体例は本発明を限定するものではない。
図１は、本発明の生体分子の親和性解析装置の１例を示す図で、（Ａ）は装置の概略を示す模式図、（Ｂ）は該装置の試料容器に交流電圧を印加した状態を示す模式図である。この装置１は、少なくとも一対の電極１０３を配置した試料容器１０２、光源１０５、局所照明手段１０７、高倍率光学観察手段１０７、選別光学フィルター１０９及び交流電圧印加手段１０４を具備するものである。
【００１５】
この装置１を使用して生体分子同士の親和性を解析するには、試料容器１０２内に相互作用を判別する少なくとも２種類の生体分子を表面に固定した粒子または生体分子１０１の混合物溶液を保持させ、交流電圧印加手段１０４により電極１０３，１０３間に交流電圧を印加することによって、判別する生体分子または判別する生体分子と生体分子を表面に固定した粒子１０１を溶液中で往復運動１１２させ〔図１（Ｂ）参照〕、反応前後の個別の粒子または分子の運動の指標の変化を比較することによって、粒子または分子の会合状態を評価することで分子間の親和性を調べるものである。
【００１６】
図２は、本発明の生体分子の親和性解析装置の他の例を示す図である。
この装置２は、相互作用を判別する対象となる生体分子を表面に固定した粒子または生体分子として蛍光粒子または蛍光標識した分子２０１を使用するものである。この装置２では、図１の装置１における局所照明手段及び高倍率光学観察手段１０７を、試料容器２０２の下方に配置した局所照明手段及び高倍率光学観察手段２０７による蛍光照明あるいはエバネッセント照明２１２による蛍光励起手段とし、蛍光励起光源２０５及び蛍光選別光学フィルター２０９によって、蛍光粒子または蛍光標識した分子２１３のみを検出し、その運動の指標の変化を比較することによって、粒子または分子の会合状態を評価することにより分子間の親和性を調べるものである。
【００１７】
この装置２では、１種類あるいは複数種類の蛍光粒子または蛍光標識した分子２０１に合わせ、蛍光励起光源２０５及び蛍光選別光学フィルター２０９を選択することによって、試料容器２０２内にある検出対象とする蛍光粒子または蛍光標識した分子２１３のみを選別して検出することが可能である。
また、局所照明手段及び高倍率光学観察２０７をエバネッセント照明とした場合には、試料容器２０２内の照明範囲２１２が、蛍光照明と比べ、局所照明手段及び高倍率光学観察２０７に非常に近接した範囲（励起光２０６の波長と入射角に依存するが、一般的に１００〜２００ｎｍ）に限定することが可能であるため、より低いバックグラウンドノイズで蛍光検出が可能となる。
【００１８】
図３は、本発明の生体分子の親和性解析装置に使用する試料容器の他の例を示す模式図である。
図３（ａ）は、図１の装置１における試料容器１０２を流路形状を成した試料容器３０２としたものである。この試料容器３０２には一対の電極３０４を配し、交流電源３０３により電極間の電圧の周波数を変化させ、一対の電極３０４の部分までフローさせた相互作用を判別する粒子または分子３０１を電気泳動させることによって往復運動を検出するものである。
【００１９】
また、図３（ｂ）は、試料容器３０２として合流フロー式流路を用いて、一対の電極３０４の前にある合流部３０６で、一方の粒子または分子３０１と混合させる他方の粒子または分子３０５とを合流させるものである。
図３（ｃ）は、流路形状を成した試料容器３０２内部に複数対の電極３０７を配置したものである。さらに、図３（ｄ）は図３（ａ）、図３（ｅ）は図３（ｂ）において、それぞれ一対の電極３０４に代えて複数対の電極３０７を配置したものである。
【００２０】
図３のように試料容器を流路形状にすることで、検出対象とする粒子または分子を微量で希薄な試料溶液とすることが可能となり、その溶液を保持する際に、フロー式あるいは合流フロー式流路を用いることで、連続的な検出が可能となる。
また、図３（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）のように複数対の電極３０７を配置し、それぞれの電極間に異なった周波数変化をさせることにより、一対の電極の場合と比較して、最大移動速度または移動距離（振幅）のより大きな変化を得ることが可能となる。
【００２１】
本発明の生体分子の親和性解析装置を構成する光源としては特に制限はないが、通常はアーク放電を発光体とする水銀ランプやキセノンランプ、特に超高圧水銀ランプが好適に用いられる。また、試料容器の構成材料は任意に選択することができるが、ポリメチルメタクリレート、ポリオレフィン等の透明性を有するプラスチックや、ガラス等が好適に用いられる。選別光学フィルターとしては、例えば市販の蛍光フィルターセットを使用して励起波長範囲と観察波長範囲を選択することができる。また、高倍率光学観察手段としては、各種顕微鏡の対物レンズを使用し、画像を検出するイメージセンサとしては、ＣＣＤカメラ等を用いることができる。
【００２２】
本発明により親和性を解析する対象となる生体分子としては、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ等の核酸分子等が挙げられる。
好適な解析対象としては、分子量が３０〜１５０ｋＤａ程度のタンパク質、例えばアクチン、ストレプトアビジン、ＩｇＧ、或いはサイズが２０塩基対程度の二本鎖ＤＮＡ、例えば転写因子認識配列等が挙げられる。
これらの生体分子は、生体分子そのものを測定対象とすることができるが、生体分子の少なくとも一方を平均粒径が０．１〜１０μｍ程度の微粒子の表面に固定した状態で測定対象とすることも可能である。生体分子を表面に固定する微粒子としては、例えばポリスチレン等のプラスチックビーズや、シリカビーズ等通常この分野で使用される微粒子はいずれも使用することができる。
測定対象とする生体分子、或いは生体分子を表面に固定した粒子は，通常は例えばヒドロキシプロピルメチルセルロース等を含むリン酸緩衝液等を溶媒とする希薄水系溶液として測定される。これらの生体分子、或いは生体分子を表面に固定した粒子としては、少なくとも一方を蛍光標識したものを使用することが好ましい。
【００２３】
核酸分子は負電荷を持ち、その電荷量は、核酸分子の塩基配列には依存せず、核酸分子の塩基長及び分子数に比例する。前記生体分子の少なくとも一方が核酸分子である場合、分子の会合状態によって粒子または分子の表面電荷に変化が生じるようなｐＨ２〜ｐＨ１０の範囲に試料溶液を調製することによって、最大移動速度または移動距離（振幅）の変化の検出が可能である。核酸分子が二本鎖ＤＮＡである場合、ＤＮＡが安定して二本鎖を形成する試料溶液のｐＨにおいて測定を行う必要がある。
【００２４】
タンパク質は固有の等電点において見かけの電荷が０となるため、測定対象とする生体分子の少なくとも一方がタンパク質である場合、前記微量な希薄試料溶液が少なくとも一方のタンパク質の等電点でないｐＨ、あるいは２つの等電点に挟まれたｐＨに調製することで、反応前後の個別の粒子または分子の最大移動速度または移動距離（振幅）の変化を大きくすることができる。生体分子の親和性のｐＨ依存性を調べる場合には、等電点を考慮しながら測定を行うことになる。
【００２５】
図４は、本発明の生体分子親和性解析装置を使用して得られる結果を説明する図である。図４（ａ）は、振幅電圧一定の場合の周波数ｆの２つの条件について、相互作用を判別する粒子または分子のもつ電荷に対する最大移動速度ｖｍａｘの関係を示している。振幅電圧一定の測定を行う場合、最大移動速度ｖｍａｘの絶対値は、周波数ｆに依存せず、電荷に依存した値となる。振幅電圧一定の測定を行うことにより、親和性がある場合、電荷の変化により、最大移動速度ｖｍａｘが変化することを示している。
図４（ｂ）は、振幅電圧一定の場合の周波数ｆの２つの条件について、相互作用を判別する粒子または分子のもつ電荷に対する移動距離（振幅）Ａの関係を示している。振幅電圧一定の測定を行う場合、周波数ｆが大きいほど、移動距離（振幅）Ａの絶対値が小さくなる。振幅電圧一定、かつ周波数ｆ一定の測定を行うことにより、親和性がある場合、電荷の変化により、移動距離（振幅）Ａが変化することを示している。
図４（ｃ）は、相互作用を判別する粒子または分子のもつ電荷の４つの条件について、振幅電圧一定の場合の周波数ｆに対する最大移動速度ｖｍａｘの関係を示している。振幅電圧一定の測定を行う場合、最大移動速度ｖｍａｘの絶対値は、周波数ｆに依存せず、電荷に依存した値となる。振幅電圧一定の測定を行うことにより、親和性がある場合、電荷の変化により、最大移動速度ｖｍａｘが変化することを示している。
図４（ｄ）は、相互作用を判別する粒子または分子のもつ電荷の４つの条件について、振幅電圧一定の場合の周波数ｆに対する移動距離（振幅）Ａの関係を示している。振幅電圧一定の測定を行う場合、周波数ｆが大きいほど、移動距離（振幅）Ａの絶対値が小さくなり、電荷の絶対値が大きいほど、移動距離（振幅）Ａの絶対値は大きい。振幅電圧一定、かつ周波数ｆ一定の測定を行うことにより、親和性がある場合、電荷の変化により、移動距離（振幅）Ａが変化することを示している。
本装置を使用して生体分子の親和性を調べる場合、最大移動速度または移動距離（振幅）の変化が最も大きい条件で測定することによって、より高精度な結果を得ることが可能である。
【００２６】
つぎに、本発明の生体分子の親和性解析装置、及び該解析装置により生体高分子の親和性を解析する方法について、実施例によりさらに説明するが、以下の具体例は本発明を限定するものではない。
（実施例１）
図２に示す生体分子の親和性解析装置２において、光源２０５として市販の倒立蛍光顕微鏡（ニコンインストルメンツカンパニー製、ＴＥ２０００−Ｕ）の超高圧水銀ランプを用いた。幅６０ｍｍ、奥行き４０ｍｍ、厚さ１ｍｍのポリメチルメタクリレート板の中央に幅方向に沿って、長さ４０ｍｍ、幅３７５μｍ、深さ４００μｍの溝状の流路をエキシマレーザー加工機（ビーム社製）により切削し、長さ方向の両端部に直径２．５ｍｍの貫通孔を設けた後に、幅５０ｍｍ、奥行き４０ｍｍ、厚さ０．１７ｍｍのカバーガラスで覆って、流路状の試料容器２０２を構成した。ポリメチルメタクリレート板とカバーガラスの間にはメルカプトエステルを成分とするＵＶ硬化接着剤を流し込み、紫外光を１０分間照射して接着剤を硬化させた。この流路の両端部には、径０．５ｍｍの白金線からなる一対の電極２０３を配置した。この試料容器２０２の下方には、蛍光選別フィルター２０９として緑色検出用の標準フィルターセット（ニコンインストルメンツカンパニー製、Ｇ−２Ａ）、及びイメージセンサ２１１として冷却ＣＣＤカメラを配置した。
この装置では、流路状の試料容器２０２に測定対象とする少なくとも２種類の生体分子２０１の希釈溶液を試料容器２０２の一方の貫通孔から注入し、流路内を生体分子２０１の希釈溶液で完全に充填した。交流印加手段２０４となる交流電源から電圧０〜３００Ｖ、周波数０．１〜１．０Ｈｚの交流電圧を例えば１５秒間程度印加し、交流電圧を印加している間、ＣＣＤカメラにより生体分子２０１の往復運動の連続画像を取得し、生体分子の最大移動距離（振幅）から生体分子相互作用の親和性を解析するものである。
【００２７】
（実施例２）
印加する交流電圧の電圧依存性や周波数依存性を測定するため、測定対象として、直径１．０μｍの球状粒子の表面にカルボキシル基が導入されたポリスチレン蛍光ビーズ〔インビトロジェン社製、ＦｌｕｏＳｐｈｅｒｅｓ  ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ  ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ，  １．０μｍ，  ｏｒａｎｇｅ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ（５４０／５６０）〕を使用した。このビーズを測定装置に導入するための水溶液としては、０．２５％ヒドロキシプロピルメチルセルロースを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を用いた。
【００２８】
印加する交流電圧の電圧依存性や周波数依存性の測定は、実施例１の解析装置２の試料容器２０２の流路内にこれらの測定試料を充填し、流路の中心付近を冷却ＣＣＤカメラで蛍光観察し、水溶液中のビーズの動きが測定する往復運動より十分小さくなってから交流電圧を印加し、連続画像を取得した。取得した画像から任意のビーズ１０個を選択し、それぞれの連続画像上の座標から、ビーズの往復運動の最大移動距離、即ち振幅を取得した。
測定条件として、この測定試料に対して、周波数を０．１，０．２，０．３Ｈｚで交流電圧を５０，１００，２００，３００Ｖ（１２．５，２５，５０，７５Ｖ／ｃｍ）印加し、データを解析した。その結果、各周波数の印加電圧あたりの振幅は、０．１Ｈｚでは２９０μｍ／１００Ｖ（相関係数０．８６）、０．２Ｈｚでは１００μｍ／１００Ｖ（相関係数０．９８）、０．３Ｈｚでは５４μｍ／１００Ｖ（相関係数０．９８）の比例関係があった。また、各印加電圧の周波数あたりの振幅は、反比例の関係があった。
測定を行った周波数の範囲では、周波数が高くなるほど振幅が小さくなり、０．２Ｈｚおよび０．３Ｈｚで印加電圧あたりの振幅の相関が高い結果となった。
【００２９】
（実施例３）
水溶液のｐＨによる振幅の変化を測定するため、測定対象として、実施例２と同じ直径１．０μｍの球状粒子の表面にカルボキシル基が導入されたポリスチレン蛍光ビーズを使用した。このビーズを測定装置に導入するための水溶液としては、０．２５％ヒドロキシプロピルメチルセルロースを含む広域緩衝液（０．１Ｍクエン酸水溶液に０．２Ｍリン酸二水素ナトリウム水溶液を加え、目的とするｐＨに調製した緩衝液）を用いた。
【００３０】
水溶液のｐＨによる振幅の変化の測定は、実施例１の解析装置２の試料容器２０２の流路内にこれらの測定試料を充填し、流路の中心付近を冷却ＣＣＤカメラで蛍光観察し、水溶液中のビーズの動きが測定する往復運動より十分小さくなってから交流電圧を印加し、連続画像を取得した。取得した画像から任意のビーズ１０個を選択し、それぞれの連続画像上の座標から、ビーズの往復運動の最大移動距離、即ち振幅を取得した。
測定条件として、この測定試料の水溶液のｐＨを４．０、５．０、６．０、７．０、８．０とし、周波数を０．２Ｈｚで交流電圧を２００Ｖ（５０Ｖ／ｃｍ）印加し、データを解析した。その結果、各ｐＨでの振幅は、ｐＨ４．０では６．４μｍ（標準偏差１．８μｍ）、ｐＨ５．０では２５．６μｍ（標準偏差１．８μｍ）、ｐＨ６．０では３８．７μｍ（標準偏差１０．６μｍ）、ｐＨ７．０では５５．４μｍ（標準偏差７．８μｍ）、ｐＨ８．０では１６４μｍ（標準偏差１３．２μｍ）となった。
測定を行ったｐＨの範囲では、ｐＨが高くなるほど振幅が大きくなり、測定試料の電荷によって振幅が変化することが判った。
【００３１】
（実施例４）
異種タンパク質の固定化による振幅の変化を測定するため、測定対象となる生体分子として、タンパク質のイムノグロブリンＧ（ＩｇＧ：分子量１５０ｋＤａ、等電点ｐＩ７付近）、及びアクチン（分子量４３ｋＤａ、等電点ｐＩ５付近）を使用した。これらの生体分子を測定装置に導入するための水溶液としては、０．２５％ヒドロキシプロピルメチルセルロースを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を用いた。
これらの生体分子を表面に固定する粒子として、実施例２と同じ直径１．０μｍの球状粒子の表面にカルボキシル基が導入されたポリスチレン蛍光ビーズ（以下、「非固定ビーズ」という）を使用し、このビーズにタンパク質のイムノグロブリンＧ（ＩｇＧ：分子量１５０ｋＤａ）をカルボジイミドで固定化した（以下、「ＩｇＧビーズ」という）。同様に、このビーズにタンパク質のアクチン（分子量４３ｋＤａ）をカルボジイミドで固定化した（以下、「アクチンビーズ」という）。
【００３２】
つぎに、上記１０ｍＭリン酸緩衝液に対して、非固定ビーズ、ＩｇＧビーズ、アクチンビーズをそれぞれ混和させて測定試料を調製した。
異種タンパク質の固定化による振幅の変化の測定は、実施例１の解析装置２の試料容器２０２の流路内にこれらの測定試料を充填し、流路の中心付近を冷却ＣＣＤカメラで蛍光観察し、水溶液中のビーズの動きが測定する往復運動より十分小さくなってから交流電圧を印加し、連続画像を取得した。取得した画像から任意のビーズ１０個を選択し、それぞれの連続画像上の座標から、ビーズの往復運動の最大移動距離、即ち振幅を取得した。
測定条件として、これらの測定試料に対して、周波数を０．３Ｈｚで交流電圧を２５０Ｖ（６３Ｖ／ｃｍ）印加し、データを解析した。その結果、各試料の振幅として、非固定ビーズでは４５．３μｍ（標準偏差７．９μｍ）、ＩｇＧビーズでは３２．０μｍ（標準偏差４．２μｍ）、アクチンビーズでは６３．８μｍ（標準偏差１２．８μｍ）であり、アクチンビーズ、非固定ビーズ、ＩｇＧビーズの順に振幅が大きかった。
ＩｇＧビーズでは、水溶液（ｐＨ７．０）のｐＨとＩｇＧ（等電点ｐＩ７付近）の等電点ｐＩが近いため、電荷が小さくなる。一方、アクチンビーズでは、水溶液と（ｐＨ７．０）のｐＨとアクチン（等電点ｐＩ５付近）の等電点ｐＩが遠いため、電荷が大きくなる。そのため、非固定ビーズと比較して、ＩｇＧビーズでは振幅が小さく、アクチンビーズでは振幅が大きくなったことが判る。
【００３３】
（実施例５）
測定対象となる生体分子として、タンパク質のイムノグロブリンＧ（ＩｇＧ：分子量１５０ｋＤａ）、ビオチン化ＩｇＧ（分子量１５０ｋＤａ）、及びストレプトアビジン（分子量６０ｋＤａ）を使用した。これらの生体分子を測定装置に導入するための水溶液としては、０．２５％ヒドロキシプロピルメチルセルロースを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を用いた。
これらの生体分子を表面に固定する粒子として、実施例２と同じ直径１．０μｍの球状粒子の表面にカルボキシル基が導入されたポリスチレン蛍光ビーズを使用し、このビーズにタンパク質のイムノグロブリンＧ（ＩｇＧ：分子量１５０ｋＤａ）をカルボジイミドで固定化した（以下、「非ビオチン化ビーズ」という）。つぎに、定法により非ビオチン化ビーズのＩｇＧをビオチン化試薬によってビオチン化したビーズ（以下、「ビオチン化ビーズ」）を調製した。
【００３４】
つぎに、上記１０ｍＭリン酸緩衝液に対して、非ビオチン化ビーズのみ、ビオチン化ビーズのみ、０．１ｍｇ／ｍＬストレプトアビジン（分子量約６０ｋＤａ）及び非ビオチン化ビーズ、０．１ｍｇ／ｍＬストレプトアビジン及びビオチン化ビーズ、をそれぞれ混和させて測定試料を調製した。
生体分子の親和性の測定は、実施例１の解析装置２の試料容器２０２の流路内にこれらの測定試料を充填し、流路の中心付近を冷却ＣＣＤカメラで蛍光観察し、水溶液中のビーズの動きが測定する往復運動より十分小さくなってから交流電圧を印加し、連続画像を取得した。取得した画像から任意のビーズ１０個を選択し、それぞれの連続画像上の座標から、ビーズの往復運動の最大移動距離、即ち振幅を取得した。
測定条件として、これらの測定試料に対して、周波数を０．２Ｈｚで交流電圧を３００Ｖ（７５Ｖ／ｃｍ）印加し、データを解析した。その結果、各試料の振幅として、非ビオチン化ビーズのみの試料では１５１μｍ（標準偏差１８μｍ）、ストレプトアビジン及び非ビオチン化ビーズを混和した試料では１４３μｍ（標準偏差１３μｍ）となり、６％程度の差であったのに対して、ビオチン化ビーズのみの試料では９４．１μｍ（標準偏差４．６μｍ）、ストレプトアビジン及びビオチン化ビーズを混和した試料では３９．３μｍ（標準偏差８．７μｍ）となり、ストレプトアビジン及びビオチン化ビーズを混和した試料では、ビオチン化ビーズのみの試料の振幅の４２％程度であった。
ストレプトアビジン及び非ビオチン化ビーズを混和した試料の振幅は、非ビオチン化ビーズのみの試料の振幅との差が小さいので、表面の電荷に大きな変化がなく、ストレプトアビジンと非ビオチン化ビーズの間の親和性が低いことが判る。一方、ストレプトアビジン及びビオチン化ビーズを混和した試料の振幅は、ビオチン化ビーズのみの試料の振幅との差が大きいので、表面の電荷に大きな変化があり、ストレプトアビジンとビオチン化ビーズの間の親和性が高いことが判る。
【００３５】
これらの結果によれば、交流電圧印加時に水溶液中での生体分子を表面に固定したビーズの往復運動の速度や振幅の変化から、測定対象とする生体分子同士の親和性の有無を簡便に測定できることが判明した。
測定対象となる生体分子として核酸分子を使用する場合には、核酸分子はタンパク質と異なり、負電荷を持ち、その電荷量は、核酸分子の塩基配列には依存せず、核酸分子の塩基長及び分子数に比例するため、実施例５の様にタンパク質の親和性が測定可能であれば、同様に測定可能である。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】本発明の生体分子親和性解析装置の１例を示す模式図である。
【図２】本発明の生体分子親和性解析装置の他の例を示す模式図である。
【図３】本発明の生体分子親和性解析装置の他の例を示す模式図である。
【図４】本発明の生体分子親和性解析装置を使用して得られる結果の説明図である。
【符号の説明】
【００３７】
１０１、３０１、３０５            相互作用を判別する粒子または分子
１０２、２０２、３０２            試料容器
１０３、２０３、３０４、３０７    一対の電極
１０４、２０４、３０３            交流電圧印加手段
１０５                            光源
１０６                            光
１０７、２０７                    局所照明手段及び高倍率光学観察
１０８                            像
１０９                            選別光学フィルター
１１０                            光学フィルターによって選別された像
１１１                            イメージセンサ
１１２                            粒子または分子の往復運動
２０１、２１３                    蛍光粒子または蛍光標識分子
２０５                            蛍光励起光源
２０６                            励起光
２０８                            蛍光励起像
２０９                            蛍光選別光学フィルター
２１０                            光学フィルターによって選別された蛍光励起像
２１１                            蛍光イメージセンサ
２１２                            蛍光照明あるいはエバネッセント照明
３０２                            流路形状を成した試料容器
３０６                            合流フロー式流路の合流部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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