(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
インドール−３−ピルビン酸とピルビン酸とをアルドール縮合させて４Ｒ体の４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸を生成する反応、および、フェニルピルビン酸とピルビン酸とをアルドール縮合させて４Ｒ体の４−フェニルメチル−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸を生成する反応のうち、少なくとも一方の反応を触媒するアルドラーゼ活性を有するタンパク質であって、
下記（Ａ）または（Ｂ）のアミノ酸配列からなることを特徴とするタンパク質。
（Ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、下記（ａ）および（ｂ）から選ばれる少なくとも１個のアミノ酸残基の置換を有するアミノ酸配列
（ａ）３７番目のアルギニン残基から他のアミノ酸残基への置換
（ｂ）９９番目のロイシン残基から他のアミノ酸残基への置換
（Ｂ）（Ａ）のアミノ酸配列において、３７、６７、７１、９７、９８、９９、１００、１１９、１２０、１３９、１４１、１８９、１９２、１９３および２０９番目に位置するアミノ酸残基以外の箇所に、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加および／または逆位を有するアミノ酸配列
【請求項２】
前記（ａ）の置換は、下記（ａ'）の置換であることを特徴とする、請求項１記載のタンパク質。
（ａ'）３７番目のアルギニン残基からチロシン残基、トリプトファン残基、ヒスチジン残基、フェニルアラニン残基またはプロリン残基への置換
【請求項３】
前記（ｂ）の置換は、下記（ｂ'）の置換であることを特徴とする、請求項１記載のタンパク質。
（ｂ'）９９番目のロイシン残基からアスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、リジン残基、トリプトファン残基、チロシン残基またはグリシン残基への置換
【請求項４】
インドール−３−ピルビン酸とピルビン酸とをアルドール縮合させて４Ｒ体の４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸を優先的に生成する反応、および、フェニルピルビン酸とピルビン酸とをアルドール縮合させて４Ｒ体の４−フェニルメチル−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸を優先的に生成する反応のうち、少なくとも一方の反応を触媒するアルドラーゼ活性を有することを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項５に記載のポリヌクレオチドを含む組換えＤＮＡ。
【請求項７】
請求項６に記載の組換えＤＮＡを保有する微生物。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のタンパク質、又は、それを含有する微生物を、インドール−３−ピルビン酸およびピルビン酸ないしオキサロ酢酸に作用させて４Ｒ体の４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸を生成させ、生成された４Ｒ体の４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸を採取することを特徴とする４Ｒ体の４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸の製造方法。
【請求項９】
請求項４に記載のタンパク質、又は、それを含有する微生物を、インドール−３−ピルビン酸およびピルビン酸ないしオキサロ酢酸に作用させて４Ｒ体の４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸を優先的に生成させ、生成された４Ｒ−４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸を採取することを特徴とする４Ｒ−４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸の製造方法。
【請求項１０】
請求項４に記載のタンパク質、又は、それを含有する微生物を、インドール−３−ピルビン酸およびピルビン酸ないしオキサロ酢酸に作用させて４Ｒ体の４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸を優先的に生成させる第１の工程、および、
前記第１の工程によって得られた４Ｒ体の４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸を、アミノ化することにより４Ｒ−モナティンを生成させ、生成した４Ｒ−モナティンを採取する第２の工程
を含むことを特徴とする４Ｒ−モナティンの製造方法。
【請求項１１】
前記第２の工程において、（２Ｒ，４Ｒ）−モナティンを優先的に生成させることを特徴とする請求項１０に記載の４Ｒ−モナティンの製造方法。
【請求項１２】
前記第２の工程において、４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸に酵素を作用せしめてアミノ化することを特徴とする請求項１０または１１に記載の４Ｒ−モナティンの製造方法。
【請求項１３】
請求項４に記載のタンパク質、又は、それを含有する微生物を、インドール−３−ピルビン酸およびピルビン酸ないしオキサロ酢酸に作用させて４Ｒ体の４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸を優先的に生成させることにより４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸を含有する反応液を取得する第１の工程、
前記第１の工程によって得られた前記反応液に含まれる４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸を、中性又はアルカリ性条件下において下記一般式（１）
【化１】
0004604524.tif 000014
（上記一般式（１）において、Ｒは水素原子、アルキル基、アリール基又はアラルキル基を表す。）
で表されるアミン化合物又はその塩と反応せしめ、４−ヒドロキシ−４−（３−インドリルメチル）−２−ヒドロキシイミノグルタル酸を生成させ、生成した４−ヒドロキシ−４−（３−インドリルメチル）−２−ヒドロキシイミノグルタル酸又はその塩の４Ｒ体を晶析する第２の工程、および、
得られた４Ｒ体の４−ヒドロキシ−４−（３−インドリルメチル）−２−ヒドロキシイミノグルタル酸又はその塩を還元し、生成した４Ｒ−モナティン又はその塩を採取する第３の工程を含むことを特徴とする４Ｒ−モナティンの製造方法。
【請求項１４】
前記一般式（１）で表されるアミン化合物が、ヒドロキシルアミン、メトキシアミン、ベンジルオキシアミンからなる群より選ばれる少なくとも一種のアミン化合物である、請求項１３に記載の４Ｒ−モナティンの製造方法。
【請求項１５】
前記第３の工程において、水素及び水素添加触媒の存在下で、還元を実施することを特徴とする請求項１３または１４に記載の４Ｒ−モナティンの製造方法。
【請求項１６】
前記第３の工程において、晶析により（２Ｒ，４Ｒ）−モナティンを採取することを特徴とする請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の４Ｒ−モナティンの製造方法。
【請求項１７】
前記第２の工程において、晶析溶媒として水、アルコール溶媒又は含水アルコール溶媒を用いることを特徴とする請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の４Ｒ−モナティンの製造方法。
【請求項１８】
インドール−３−ピルビン酸とピルビン酸とをアルドール縮合させて４Ｒ体の４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸を生成する反応、および、フェニルピルビン酸とピルビン酸とをアルドール縮合させて４Ｒ体の４−フェニルメチル−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸を生成する反応のうち、少なくとも一方の反応を触媒するアルドラーゼ活性を有するタンパク質のスクリーニング方法であって、
下記（ａ）〜（ｅ）の工程を含む、スクリーニング方法：
（ａ）任意のアルドラーゼの立体構造を、配列番号２記載のアミノ酸配列からなるアルドラーゼの立体構造と比較する工程；
（ｂ）任意のアルドラーゼのなかから、配列番号２記載のアミノ酸配列からなるアルドラーゼと立体構造の類似性を有するアルドラーゼを、スレッディング法により３次構造をアライメントすることにより選択する工程；
（ｃ）選択されたアルドラーゼのアミノ酸配列のうち、配列番号２記載のアミノ酸配列からなるアルドラーゼをテンプレートタンパク質として、前記テンプレートタンパク質の３７番目のアルギニン残基および９９番目のロイシン残基に対応するアミノ酸残基を特定する工程；
（ｄ）選択されたアルドラーゼにおいて、前記テンプレートタンパク質の３７番目のアルギニン残基および９９番目のロイシン残基に対応するアミノ酸残基を、他のアミノ酸残基に置換する工程；および
（ｅ）（ｄ）で得られたアミノ酸残基の置換を有するアルドラーゼの活性を測定する工程であって、該活性が、インドール−３−ピルビン酸とピルビン酸とをアルドール縮合させて４Ｒ体の４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸を生成する反応、および、フェニルピルビン酸とピルビン酸とをアルドール縮合させて４Ｒ体の４−フェニルメチル−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸を生成する反応のうち、少なくとも一方の反応を触媒するアルドラーゼ活性である、工程。
【請求項１９】
インドール−３−ピルビン酸とピルビン酸とをアルドール縮合させて４Ｒ体の４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸を生成する反応、および、フェニルピルビン酸とピルビン酸とをアルドール縮合させて４Ｒ体の４−フェニルメチル−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸を生成する反応のうち、少なくとも一方の反応を触媒するアルドラーゼ活性を有するタンパク質のスクリーニング方法であって、
下記（ａ１）および（ｂ１）の工程を含む、スクリーニング方法：
（ａ１）Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｔａｅｔｒｏｌｅｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  Ｃｏｒｏｎａｆａｃｉｅｎｓ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｋｅｙｓｅｒｉまたはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｏｃｈｒａｃｅａｅに由来する、アルドラーゼ活性を有するタンパク質のアミノ酸配列のうち、配列番号２記載のアミノ酸配列からなるアルドラーゼをテンプレートタンパク質として、スレッディング法により３次構造をアラインメントした場合に、前記テンプレートタンパク質の３７番目のアルギニン残基および９９番目のロイシン残基に対応するアミノ酸残基の少なくとも一つのアミノ酸残基を、前記テンプレートタンパク質のアミノ酸残基とは異なるアミノ酸残基に置換する工程；および
（ｂ１）で得られたアミノ酸残基の置換を有するアルドラーゼの活性を測定する工程であって、該活性が、インドール−３−ピルビン酸とピルビン酸とをアルドール縮合させて４Ｒ体の４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸を生成する反応、および、フェニルピルビン酸とピルビン酸とをアルドール縮合させて４Ｒ体の４−フェニルメチル−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸を生成する反応のうち、少なくとも一方の反応を触媒するアルドラーゼ活性である、工程。
【請求項２０】
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｔａｅｔｒｏｌｅｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  Ｃｏｒｏｎａｆａｃｉｅｎｓ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｋｅｙｓｅｒｉまたはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｏｃｈｒａｃｅａｅに由来する、アルドラーゼ活性を有するタンパク質が、配列番号２、配列番号２３、配列番号２４または配列番号２５記載のアミノ酸配列からなるアルドラーゼであり、かつ
配列番号２記載のアミノ酸配列からなるアルドラーゼをテンプレートタンパク質として、スレッディング法により３次構造をアラインメントした場合に、前記テンプレートタンパク質の３７番目のアルギニン残基および９９番目のロイシン残基に対応するアミノ酸残基が、３７番目のアルギニン残基および９９番目のロイシン残基または９９番目のメチオニン残基である、請求項１９に記載のスクリーニング方法。
【請求項２１】
さらに以下の工程（ａ２）を含む、請求項１９記載のスクリーニング方法：
（ａ２）Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｔａｅｔｒｏｌｅｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  Ｃｏｒｏｎａｆａｃｉｅｎｓ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｋｅｙｓｅｒｉまたはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｏｃｈｒａｃｅａｅに由来する、アルドラーゼ活性を有するタンパク質のアミノ酸配列のうち、前記テンプレートタンパク質を用いてスレッディング法により３次構造をアラインメントした場合に、前記テンプレートタンパク質の６７、７１、９７、９８、１００、１１９、１３９、１４１、１８９、１９２、１９３および２０９番目に位置するアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基において、少なくとも１つのアミノ酸残基を、前記テンプレートタンパク質のアミノ酸残基とは異なるアミノ酸残基に置換する工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、モナティンの前駆体である４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸を４Ｒ体または４Ｓ体選択的に生成する変異型アルドラーゼ、およびこれを用いた光学活性ＩＨＯＧの製造方法、ならびに光学活性モナティンの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
下記構造式で示される４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−グルタミン酸（３−（１−アミノ−１，３−ジカルボキシ−３−ヒドロキシ−ブタン−４−イル）−インドール）（以下、「モナティン」と称する。）は、植物シュレロチトン  イリシホリアス（Schlerochitom ilicifolius）の根に含有され、甘味強度が著しく高いことから、特に低カロリー甘味料として期待される化合物である（特開昭６４−２５７５７号公報参照）。
【０００３】
【化１】
0004604524.tif 000002
【０００４】
上記モナティンは２つの不斉（２位、４位）が存在し、天然に存在する立体異性体は、（２Ｓ，４Ｓ）体と報告されていた。その他に３種の立体異性体の存在が確認され、何れもショ糖の数十倍から数千倍の甘味強度を有することが確かめられている（表１）。
【０００５】
【表１】
0004604524.tif 000003
【０００６】
表１に示すように、（２Ｓ，４Ｓ）−モナティンのみならず、その他の立体異性体の何れもがそれぞれ高倍率の甘味度を有しているが、特に、（２Ｒ，４Ｒ）−モナティンは甘味度がショ糖の２７００倍と著しく高く、甘味剤或いは甘味剤成分（甘味料）として最も期待される異性体である。従って、（２Ｒ，４Ｒ）−モナティンを効率的に生成する方法の開発が望まれる。
【０００７】
本発明者らは、試薬として購入可能であるインドールピルビン酸とピルビン酸とを用いて、下記の反応（a）および（b）からなる新たなモナティンの合成方法を開発した（特許文献１）。
（a）  インドールピルビン酸とピルビン酸（ないしオキサロ酢酸）のアルドール縮合により前駆体ケト酸（４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸：ＩＨＯＧ）を合成する反応工程
（b）  ＩＨＯＧの２位をアミノ化する反応工程
【０００８】
【化２】
0004604524.tif 000004
【０００９】
特許文献１は、上記モナティンの合成ルートにおける（a）のアルドール縮合反応について、インドールピルビン酸とピルビン酸（ないしオキサロ酢酸）から前駆体ケト酸（ＩＨＯＧ）を生成することができる酵素として、Pseudomonas taetrolensおよびPseudomonas coronafaciens由来のアルドラーゼを開示している。これらのアルドラーゼは、ＩＨＯＧ以外にも、４−フェニルメチル−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸（ＰＨＯＧ）等のケト酸を生成する反応を触媒することが分かっている。
【００１０】
ＩＨＯＧには４Ｒ体と４Ｓ体の２つの異性体が存在するが、最も甘味度の高い異性体である（２Ｒ，４Ｒ）−モナティンを効率的に生成するためには、上記モナティンの合成ルートにおける（a）のアルドール縮合反応において、４Ｒ−ＩＨＯＧを優先的に生成させ、４Ｒ体リッチなＩＨＯＧを得ることが望ましい。また、キラル分子は、異性体ごとに異なる生理活性を示すことが多々あるが、ＩＨＯＧについても異性体ごとに異なる性質を有している可能性があり、４Ｒ体と４Ｓ体を作り分けることにより、モナティンの前駆体以外の他の用途に利用することも考えられる。したがって、４Ｒ−ＩＨＯＧ、４Ｓ−ＩＨＯＧのうち一方の異性体を優先的に生成する方法の開発は、工業上極めて有用である。
【００１１】
【特許文献１】国際公開第０３／０５６０２６号パンフレット
【特許文献２】国際公開第０４／０１８６７２号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
しかしながら、従来の化学合成系では、生成するＩＨＯＧは、４Ｒ体と４Ｓ体の混合物（ラセミ体）であった。また、本発明者らはＩＨＯＧの合成に好適なアルドラーゼとして、Pseudomonas taetrolens由来のアルドラーゼを取得しているが、当該野生型アルドラーゼによって生成されるＩＨＯＧは４Ｒ体リッチではなく、反応の条件にもよるが、むしろやや４Ｓ体リッチなＩＨＯＧを生成することが明らかとなっていた。（特許文献１、特許文献２）。また、４Ｒ−ＩＨＯＧを優先的に生成するアルドラーゼについては、今までのところ、報告されてない。したがって、現状では、光学活性ＩＨＯＧ、特に、４Ｒ体リッチなＩＨＯＧを効率的に生成する方法が確立されていない。
【００１３】
本発明は、上記に鑑みてなされたものであって、４Ｒ体または４Ｓ体選択的にＩＨＯＧやＰＨＯＧを生成する変異型アルドラーゼ、およびこれを用いた光学活性ＩＨＯＧの製造方法、ならびに光学活性モナティンの製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者等は前記課題を解決すべく鋭意検討した結果、Ｘ線結晶構造解析によって得られたPseudomonas taetrolens ＡＴＣＣ４６８３由来のアルドラーゼ（ＰｔＡＬＤ）の構造情報に基づき、ＰｔＡＬＤの活性中心近傍において、生成物（ＩＨＯＧ、ＰＨＯＧ）の４位のキラリティーに関与する部位を見出し、この特定部位のアミノ酸残基を置換することにより、光学選択性を改変したアルドラーゼが得られることを見出し、本発明に想到した。すなわち、本発明の変異型アルドラーゼは、４Ｒ体または４Ｓ体のいずれか一方の異性体を優先的に生成するように改変を施されていることを特徴とする。なお、本願明細書において、「光学選択性」とは、４Ｒ体または４Ｓ体のいずれか一方の異性体を優先的に生成させることにより光学活性な生成物を生成する性質を意味し、「４Ｒ体選択性」とは４Ｒ体を優先的に生成させる性質を意味し、「４Ｓ体選択性」とは４Ｓ体を優先的に生成させる性質を意味する。
【００１５】
さらに、本発明者らは、Ｘ線結晶構造解析によって得られたＰｔＡＬＤの構造情報から、ＰｔＡＬＤと同じ酵素ファミリーに属する他のアルドラーゼにおいても、相同のアミノ酸変異を施せば、ＩＨＯＧを光学選択的に生成できる変異型アルドラーゼに改変しうることを見出した。
【００１６】
即ち、本発明は以下の通りである。
【００１７】
〔１〕  インドール−３−ピルビン酸とピルビン酸とをアルドール縮合させて４位の不斉炭素について光学活性を有する４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸を生成する反応、および、フェニルピルビン酸とピルビン酸とをアルドール縮合させて４位の不斉炭素について光学活性を有する４−フェニルメチル−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸を生成する反応のうち、少なくとも一方の反応を触媒するアルドラーゼ活性を有するタンパク質であって、
前記タンパク質のアミノ酸配列のうち、配列番号２記載のアミノ酸配列を有するシュードモナス  タエトロレンス由来アルドラーゼをテンプレートタンパク質として、スレッディング法により３次構造をアラインメントした場合に、前記テンプレートタンパク質の３７番目のアルギニン残基および９９番目のロイシン残基に対応するアミノ酸残基の少なくとも一つのアミノ酸残基が、前記テンプレートタンパク質のアミノ酸残基とは異なるアミノ酸残基に置換されており、かつ、
前記タンパク質のアミノ酸配列のホモロジースコアが前記テンプレートタンパク質との比較時にSeqFold Total Score(bit)値として１００以上であることを特徴とするタンパク質。
【００１８】
〔２〕  〔１〕記載のタンパク質の立体構造と、前記テンプレートタンパク質の立体構造とを重ね合わせたときに、
前記テンプレートタンパク質の基質結合部位を構成する３７、６７、７１、９７、９８、９９、１００、１１９、１２０、１３９、１４１、１８９、１９２、１９３、および２０９番目に位置するアミノ酸残基と、
当該タンパク質において、前記テンプレートタンパク質の前記基質結合部位を構成するアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基と、
の間の主鎖Ｃα原子の位置のずれが、根二乗平均誤差値として４Å以下となることを特徴とするタンパク質。
【００１９】
〔３〕  〔１〕記載のタンパク質であって、
当該タンパク質のアミノ酸配列のうち、前記テンプレートタンパク質を用いてスレッディング法により３次構造をアラインメントした場合に、前記テンプレートタンパク質の６７、７１、９７、９８、１００、１１９、１３９、１４１、１８９、１９２、１９３および２０９番目に位置するアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基において、少なくとも１つのアミノ酸残基が、前記テンプレートタンパク質のアミノ酸残基とは異なるアミノ酸残基に置換されていることを特徴とするタンパク質。
【００２０】
〔４〕  下記（Ａ）または（Ｂ）のアミノ酸配列を有することを特徴とする〔１〕に記載のタンパク質。
（Ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、下記（ａ）および（ｂ）から選ばれる少なくとも１個のアミノ酸残基の置換を有するアミノ酸配列
（ａ）３７番目のアルギニン残基から他のアミノ酸残基への置換
（ｂ）９９番目のロイシン残基から他のアミノ酸残基への置換
（Ｂ）（Ａ）のアミノ酸配列において、３７、６７、７１、９７、９８、９９、１００、１１９、１２０、１３９、１４１、１８９、１９２、１９３および２０９番目に位置するアミノ酸残基以外の箇所に、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加および／または逆位を有するアミノ酸配列
【００２１】
〔５〕  前記（ａ）の置換は、下記（ａ'）の置換であることを特徴とする、〔４〕記載のタンパク質。
（ａ'）３７番目のアルギニン残基からチロシン残基、トリプトファン残基、ヒスチジン残基、フェニルアラニン残基またはプロリン残基への置換
【００２２】
〔６〕  前記（ｂ）の置換は、下記（ｂ'）の置換であることを特徴とする、〔４〕記載のタンパク質。
（ｂ'）９９番目のロイシン残基からアスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、リジン残基、トリプトファン残基、チロシン残基またはグリシン残基への置換
【００２３】
〔７〕  インドール−３−ピルビン酸とピルビン酸とをアルドール縮合させて４Ｒ体の４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸を優先的に生成する反応、および、フェニルピルビン酸とピルビン酸とをアルドール縮合させて４Ｒ体の４−フェニルメチル−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸を優先的に生成する反応のうち、少なくとも一方の反応を触媒するアルドラーゼ活性を有することを特徴とする〔１〕〜〔６〕のいずれか一項に記載のタンパク質。
【００２４】
〔８〕  インドール−３−ピルビン酸とピルビン酸とをアルドール縮合させて４Ｓ体の４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸を優先的に生成する反応、および、フェニルピルビン酸とピルビン酸とをアルドール縮合させて４Ｓ体の４−フェニルメチル−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸を優先的に生成する反応のうち、少なくとも一方の反応を触媒するアルドラーゼ活性を有することを特徴とする〔１〕〜〔６〕のいずれか一項に記載のタンパク質。
【００２５】
〔９〕  〔１〕〜〔８〕のいずれか一項に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【００２６】
〔１０〕  〔９〕に記載のポリヌクレオチドを含む組換えＤＮＡ。
【００２７】
〔１１〕  〔１０〕に記載の組換えＤＮＡを保有する微生物。
【００２８】
〔１２〕  〔１〕〜〔８〕のいずれか一項に記載のタンパク質、又は、それを含有する微生物を、インドール−３−ピルビン酸およびピルビン酸ないしオキサロ酢酸に作用させて光学活性４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸を生成させ、生成された光学活性４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸を採取することを特徴とする光学活性４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸の製造方法。
【００２９】
〔１３〕  〔７〕に記載のタンパク質、又は、それを含有する微生物を、インドール−３−ピルビン酸およびピルビン酸ないしオキサロ酢酸に作用させて４Ｒ体の４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸を優先的に生成させ、生成された４Ｒ−４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸を採取することを特徴とする４Ｒ−４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸の製造方法。
【００３０】
〔１４〕  〔８〕に記載のタンパク質、又は、それを含有する微生物を、インドール−３−ピルビン酸およびピルビン酸ないしオキサロ酢酸に作用させて４Ｓ体の４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸を優先的に生成させ、生成された４Ｓ−４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸を採取することを特徴とする４Ｓ−４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸の製造方法。
【００３１】
〔１５〕  〔７〕に記載のタンパク質、又は、それを含有する微生物を、インドール−３−ピルビン酸およびピルビン酸ないしオキサロ酢酸に作用させて４Ｒ体の４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸を優先的に生成させる第１の工程、および、
前記第１の工程によって得られた４Ｒ体の４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸を、アミノ化することにより４Ｒ−モナティンを生成させ、生成した４Ｒ−モナティンを採取する第２の工程
を含むことを特徴とする４Ｒ−モナティンの製造方法。
【００３２】
〔１６〕  前記第２の工程において、（２Ｒ，４Ｒ）−モナティンを優先的に生成させることを特徴とする〔１５〕に記載の４Ｒ−モナティンの製造方法。
【００３３】
〔１７〕前記第２の工程において、４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸に酵素を作用せしめてアミノ化することを特徴とする〔１５〕または〔１６〕に記載の４Ｒ−モナティンの製造方法。
【００３４】
〔１８〕  〔７〕に記載のタンパク質、又は、それを含有する微生物を、インドール−３−ピルビン酸およびピルビン酸ないしオキサロ酢酸に作用させて４Ｒ体の４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸を優先的に生成させることにより４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸を含有する反応液を取得する第１の工程、
前記第１の工程によって得られた前記反応液に含まれる４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸を、中性又はアルカリ性条件下において下記一般式（１）
【化３】
0004604524.tif 000005
（上記一般式（１）において、Ｒは水素原子、アルキル基、アリール基又はアラルキル基を表す。）
で表されるアミン化合物又はその塩と反応せしめ、４−ヒドロキシ−４−（３−インドリルメチル）−２−ヒドロキシイミノグルタル酸を生成させ、生成した４−ヒドロキシ−４−（３−インドリルメチル）−２−ヒドロキシイミノグルタル酸又はその塩の４Ｒ体を晶析する第２の工程、および、
得られた４Ｒ体の４−ヒドロキシ−４−（３−インドリルメチル）−２−ヒドロキシイミノグルタル酸又はその塩を還元し、生成した４Ｒ−モナティン又はその塩を採取する第３の工程を含むことを特徴とする４Ｒ−モナティンの製造方法。
【００３５】
〔１９〕  前記一般式（１）で表されるアミン化合物が、ヒドロキシルアミン、メトキシアミン、ベンジルオキシアミンからなる群より選ばれる少なくとも一種のアミン化合物である、〔１８〕に記載の４Ｒ−モナティンの製造方法。
【００３６】
〔２０〕  前記第３の工程において、水素及び水素添加触媒の存在下で、還元を実施することを特徴とする〔１８〕または〔１９〕に記載の４Ｒ−モナティンの製造方法。
【００３７】
〔２１〕  前記第３の工程において、晶析により（２Ｒ，４Ｒ）−モナティンを採取することを特徴とする〔１８〕〜〔２０〕のいずれか一項に記載の４Ｒ−モナティンの製造方法。
【００３８】
〔２２〕  前記第２の工程において、晶析溶媒として水、アルコール溶媒又は含水アルコール溶媒を用いることを特徴とする〔１８〕〜〔２１〕のいずれか一項に記載の４Ｒ−モナティンの製造方法。
【００３９】
〔２３〕  〔８〕に記載のタンパク質、又は、それを含有する微生物を、インドール−３−ピルビン酸およびピルビン酸ないしオキサロ酢酸に作用させて４Ｓ体の４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸を優先的に生成させる第１の工程、および、
前記第１の工程によって得られた４Ｓ体の４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸を、アミノ化することにより４Ｓ−モナティンを生成させ、生成した４Ｓ−モナティンを採取する第２の工程
を含むことを特徴とする４Ｓ−モナティンの製造方法。
【００４０】
〔２４〕  アルドラーゼ活性を有するタンパク質のアミノ酸残基の一部を置換することによって、アルドラーゼ活性が改変された変異型アルドラーゼを作成する変異型アルドラーゼの作成方法であって、
前記アルドラーゼ活性を有するタンパク質のアミノ酸配列のうち、配列番号２記載のアミノ酸配列を有するシュードモナス  タエトロレンス由来アルドラーゼをテンプレートタンパク質として、スレッディング法により３次構造をアラインメントした場合に、前記テンプレートタンパク質中の３７、６７、７１、９７、９８、９９、１００、１１９、１３９、１４１、１８９、１９２、１９３、２０９番目に位置するアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基のうち、少なくとも１箇所のアミノ酸残基において、アミノ酸の置換、欠失、挿入、付加および／または逆位を導入することを特徴とする変異型アルドラーゼの作成方法。
【発明の効果】
【００４１】
本発明の変異型アルドラーゼを用いることにより、インドールピルビン酸とピルビン酸（ないしオキサロ酢酸）から光学活性ＩＨＯＧを生成でき、また、生成した光学活性ＩＨＯＧをアミノ化することにより光学活性モナティンを生成できる。
【００４２】
本発明の変異型アルドラーゼは、アルドール縮合反応の段階における効率的な不斉導入をはじめて可能とするものであり、本発明のアルドラーゼを用いることにより、４Ｒ−ＩＨＯＧ、４Ｓ−ＩＨＯＧの一方を目的に応じて優先的に生成させることができる。
【００４３】
また、モナティンの合成ルートにおける（b）のアミノ化反応工程においては、アミノトランスフェラーゼなどの酵素を作用させて反応を行う場合は、４Ｓ−ＩＨＯＧは４Ｒ−ＩＨＯＧに対して拮抗阻害的に作用していると考えられるため、（a）のアルドール縮合反応で４Ｒ−ＩＨＯＧを優先的に生成し、副生する４Ｓ−ＩＨＯＧを削減できれば、目的とする（２Ｒ，４Ｒ）−モナティンの収率を向上させることができる。
【００４４】
また、従来は、ラセミ体のＩＨＯＧ（４Ｒ、４Ｓ−ＩＨＯＧ）から４Ｒ体を単離しようとする場合、４Ｒ、４Ｓ−ＩＨＯＧをオキシム化した後、キラルアミンを作用させて４Ｒ−ＩＨＯＧ−oximeを晶析する必要があった。これに対し、本発明によれば、アルドール縮合反応の段階で４Ｒ体リッチなＩＨＯＧを生成させることができるため、晶析の際、キラルアミンを用いて光学分割する必要がなく、オキシム化後、そのまま４Ｒ−ＩＨＯＧ−oximeを晶析させることができる。したがって、４Ｒ−ＩＨＯＧの精製処理プロセスを軽減することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４５】
ＰｔＡＬＤは、前述したようにPseudomonas taetrolens ＡＴＣＣ４６８３株から取得されたアルドラーゼである。野生型ＰｔＡＬＤ遺伝子の塩基配列を配列表の配列番号１に示し、野生型ＰｔＡＬＤのアミノ酸配列を配列表の配列番号２に示す。配列表の配列番号２は、配列表の配列番号１記載の塩基配列のうち、塩基番号４５６〜１１１８の塩基配列がコードするＰｔＡＬＤのアミノ酸配列である。本願明細書においては、ＰｔＡＬＤのアミノ酸残基の位置を規定する際には、配列表配列番号２に記載アミノ酸配列を基準とすることとする。
【００４６】
本発明者らの研究により、ＰｔＡＬＤは、インドールピルビン酸とピルビン酸（ないしオキサロ酢酸）からアルドール縮合により４−（インドール−３−イルメチル）−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸（ＩＨＯＧ）を生成する反応、および、フェニルピルビン酸とピルビン酸から４−フェニルメチル−４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸（ＰＨＯＧ）を生成する反応を触媒することが分かっている。
【００４７】
野生型のＰｔＡＬＤを用いてＩＨＯＧを生成させた場合、反応の条件にもよるが、得られるＩＨＯＧはややＳ体リッチとなる傾向がある。Ｓ−ＩＨＯＧとＲ−ＩＨＯＧの生成比は、基質濃度、その他の反応条件によって異なるため、一概には規定することができないが、例えば、５０ ｍＭ のインドール−３−ピルビン酸と２５０ｍＭのピルビン酸を基質とした反応条件では、ＰｔＡＬＤはＳ−ＩＨＯＧとＲ−ＩＨＯＧを約６５：３５の比で生成することが確認されている（実施例３参照）。
【００４８】
また、野生型のＰｔＡＬＤを用いてＰＨＯＧを生成させた場合、得られるＰＨＯＧは、Ｒ体とＳ体の比がほぼ５０：５０となることが確認されている（実施例３参照）。
【００４９】
本発明者らは、野生型のＰｔＡＬＤの立体構造を解析することにより、ＰｔＡＬＤの活性部位を構成するアミノ酸残基を明らかにし、さらに、生成物（ＩＨＯＧ、ＰＨＯＧ）の４位のキラリティーに関与しているアミノ酸残基を特定した。そしてこのようなアミノ酸残基に部位特異的な変異を導入することにより、変異型アルドラーゼを得ることに成功した。
【００５０】
さらに、解析したＰｔＡＬＤの構造情報から、ＰｔＡＬＤと同じ酵素ファミリーに属する他のアルドラーゼにおいても、相同のアミノ酸変異を施せば、ＩＨＯＧを光学選択的に生成できる変異型アルドラーゼに改変しうることを見出した。
【００５１】
以下、本発明の実施形態について下記の順に説明する。
〔Ｉ〕野生型ＰｔＡＬＤの立体構造
〔II〕変異型アルドラーゼ
（Ａ）変異型アルドラーゼのアミノ酸配列
（Ｂ）変異型アルドラーゼの製造方法
〔III〕光学活性ＩＨＯＧの製造方法
〔IV〕光学活性モナティンの製造方法
【００５２】
〔Ｉ〕野生型ＰｔＡＬＤの立体構造
Ｘ線結晶構造解析によるタンパク質立体構造の決定は、以下の(１)〜(３)の手順で行う。
【００５３】
（１）タンパク質を結晶化する。結晶化は、立体構造決定のためには欠かせないが、それ以外にも、タンパク質の高純度の精製法、高密度でプロテアーゼ抵抗性の強い安定な保存法として産業上有用である。
【００５４】
（２）作製した結晶にＸ線を照射して回折データを収集する。なお、タンパク質結晶はＸ線照射によりダメージを受け回折能が劣化するケースが多々あるが、その場合、結晶を急激に−173℃程度に冷却し、その状態で回折データを収集する低温測定技術が最近普及している。なお、最終的に、構造決定に利用する高分解能データを収集するために、輝度の高いシンクロトロン放射光が利用される。
【００５５】
（３）結晶構造解析を行うには、回折データに加えて、位相情報が必要になる。ＰｔＡＬＤは、類縁のタンパク質の結晶構造が未知であるため、重原子同型置換法により位相問題が解決されなくてはならない。重原子同型置換法は、水銀や白金等原子番号が大きな金属原子を結晶に導入し、金属原子の大きなＸ線散乱能のＸ線回折データへの寄与を利用して位相情報を得る方法である。決定された位相は、結晶中の溶媒領域の電子密度を平滑化することにより改善することが可能である。溶媒領域の水分子は揺らぎが大きいために電子密度がほとんど観測されないので、この領域の電子密度を０に近似することにより、真の電子密度に近づくことができ、ひいては位相が改善される。このようにして改善された位相を用いて計算した電子密度図にタンパク質のモデルをフィットさせる。このプロセスは、コンピューターグラフィックス上で、Accelrys社（アメリカ）のQUANTA等のプログラムを用いて行うことができる。この後、Accelrys社のCNX等のプログラムを用いて、構造精密化を行い、構造解析は完了する。重原子同型置換法によりタンパク質自身の結晶(ネイティヴ結晶)の構造が決定されれば、そのタンパク質に基質等を結合させた複合体の結晶構造は、ネイティヴ結晶構造を利用した分子置換法や差フーリエ法により、比較的容易に決定できる。
【００５６】
本発明者らは、大腸菌に大量発現させたＰｔＡＬＤを用いて結晶化を行い、構造解析に適した結晶を得た（実施例９）。そしてその結晶を用いて重原子同型置換法による構造解析を行い、ＰｔＡＬＤの立体構造を得ることに成功した（実施例１０）。更に、本発明の目的生成物の１つであるＰＨＯＧ及び、もう１つの目的生成物であるＩＨＯＧの類縁化合物である４−ヒドロキシ−４−（３−インドリルメチル）−２−ヒドロキシイミノグルタル酸（ＩＨＯＧ−oxime）とＰｔＡＬＤの複合体についても結晶化を行い（実施例９）、さらにＸ線構造解析も実施して、その立体構造を決定した（実施例１１、１２）。
【００５７】
図１は、本発明で解明されたネイティヴ結晶におけるＰｔＡＬＤの立体構造を、リボンモデルで表した図である。図１においては、α−へリックスとβ−シートを、それぞれ、らせんを巻いたリボンと伸長したリボンで示した。
【００５８】
ＰｔＡＬＤ単分子は、図１に示すように、勾玉状の外形をしており、Ｎ末端側が勾玉の頭部を、Ｃ末端側が勾玉の尾部を形成している。実際には、この単分子が６個のサブユニットとして会合した６量体を形成して、アルドラーゼとしての機能をはたす。ＰＨＯＧ複合体結晶構造、ＩＨＯＧ−oxime複合体結晶構造における、６量体のリボンモデルを図２、図３に示す。両図においては、それぞれＰＨＯＧ、ＩＨＯＧ−oximeをスペースフィリングモデルで示した。ＰｔＡＬＤ ６量体は、直径約８０Å、高さ約７５Åの円柱状の形をしている。３回回転軸によって関係付けられたサブユニットからなる３量体２つが、２回回転軸によって関係付けられることにより、６量体が形成されている。この２つの３量体サブユニットのうち、一方のサブユニットをサブユニット甲とし、もう一方のサブユニットをサブユニット乙とすると、サブユニット甲を構成する３個のＰｔＡＬＤ単分子における頭部が、当該サブユニット甲と対峙するサブユニット乙においての対応するＰｔＡＬＤ単分子の尾部と相互作用しており、その相互作用部位にＰＨＯＧ、ＩＨＯＧ−oximeが結合している。また図４は、ＰｔＡＬＤのネイティヴ結晶構造における６量体に関して、円柱の軸方向から見て、その表面の凹凸を示した図である。電荷を持つ領域は濃い色で、電荷を持たない領域は薄い色で、表示されている。
【００５９】
ＰｔＡＬＤにおける、ＰＨＯＧ、ＩＨＯＧ−oxime結合部位周辺の拡大図を、ボール・アンド・スティック・モデルで、図５〜図７に示す。図５はネイティヴ結晶構造、図６はＰＨＯＧ複合体結晶構造、図７はＩＨＯＧ−oxime複合体結晶構造における、基質結合部位周辺の拡大図である。なお、図５〜図７においては、ＰｔＡＬＤは基質結合部位を構成する１５個のアミノ酸残基のみを表示している。また、図６でＰｔＡＬＤに結合しているのは４Ｒ体のＰＨＯＧであり、図７でＰｔＡＬＤに結合しているのは４Ｒ体のＩＨＯＧ−oximeである。ネイティヴ結晶においては、結晶化時に沈殿剤として用いたリン酸イオンが、両複合体結晶構造においては、それぞれ、４Ｒ-ＰＨＯＧ、４Ｒ-ＩＨＯＧ−oximeが結合している。両分子の周囲４Å以内には、Ａｒｇ３７、Ａｓｎ６７、Ｔｙｒ７１、Ｇｌｙ９７、Ｇｌｕ９８、Ｌｅｕ９９、Ｉｌｅ１００、Ａｒｇ１１９、Ａｓｐ１２０、Ｐｒｏ１３９、Ｌｙｓ１４１、Ｈｉｓ１８９、Ｈｉｓ１９２、Ｇｌｕ１９３、Ｔｒｐ２０９の１５個の残基が存在している。そのうち、Ａｓｎ６７、Ｔｙｒ７１、Ｇｌｙ９７、Ｇｌｕ９８、Ｌｅｕ９９、Ｉｌｅ１００、Ａｒｇ１１９、Ａｓｐ１２０、Ｐｒｏ１３９、Ｌｙｓ１４１の１０残基が、サブユニット甲由来であり、残りの５残基(Ａｒｇ３７、Ｈｉｓ１８９、Ｈｉｓ１９２、Ｇｌｕ１９３、Ｔｒｐ２０９)が、サブユニット乙由来である。従って、基質構成部位を構成する上記１５個のアミノ酸と立体構造を重ね合わせた場合に対応するアミノ酸間の主鎖Ｃα原子の位置のずれが、根二乗平均誤差値として約４Å以内にあるタンパク質は、ＰｔＡＬＤと同様に、４Ｒ-ＰＨＯＧ及び４Ｒ-ＩＨＯＧ−oximeとの結合活性を有するアルドラーゼであることが合理的に推測できる。これらの内Ａｓｐ１２０は、他の残基に改変すると、酵素活性が完全に失われることがある(実施例３)。したがって、Ａｓｐ１２０にはアミノ酸残基の置換を導入しないことが好ましい。
【００６０】
上述したアミノ酸残基は、水素結合、静電相互作用(塩橋)、疎水性相互作用、π−π相互作用(芳香環の環電流が発生する磁場同士の相互作用)、ＣＨ／π相互作用(芳香環の環電流とメチル基の電子が発生する磁場の相互作用)等を介して、ＰＨＯＧやＩＨＯＧ−oximeを捕捉している。従って、本複合体構造を良く観察し、これらのアミノ酸残基に対して適切な改変を設計すれば、４Ｒ体または４Ｓ体選択的にＰＨＯＧやＩＨＯＧを生成する変異体酵素や、ＰＨＯＧやＩＨＯＧの生成能の改善された変異体酵素を創出することが可能である。
【００６１】
例えば、複合体結晶構造中では、４Ｒ−ＰＨＯＧ、４Ｒ−ＩＨＯＧ−oximeの４位カルボキシル基の２つの酸素原子は、一方がＡｒｇ３７のＮη１原子と水素結合或は塩橋を形成しており、もう一方がＡｓｎ６７ Ｎδ、Ｔｙｒ７１ Ｏη、Ｌｙｓ１４１ Ｎζと水素結合（Ｌｙｓ１４１のＮζの場合は塩橋の可能性もあり）を形成している。基質であるフェニルピルビン酸やインドールピルビン酸がＲ体の生成物を生成する配置（プロＲ配置）で結合したときも、そのカルボキシル基は、ＰｔＡＬＤと上記のような相互作用を形成し得ると期待される。それに対して、４Ｓ−ＰＨＯＧや４Ｓ−ＩＨＯＧが結合する場合には、４位のカルボキシル基と水酸基の位置関係が逆になる。その場合には、Ａｒｇ３７のＮη１原子と４位カルボキシル基の間の相互作用は残存するが、Ａｓｎ６７ Ｎδ、Ｔｙｒ７１ Ｏη、Ｌｙｓ１４１ Ｎζとカルボキシル基の間の相互作用は消失すると考えられる。また水酸基の酸素原子は、Ａｓｎ６７ Ｎδ、Ｔｙｒ７１ Ｏη、Ｌｙｓ１４１ Ｎζの方を向くが、カルボキシル基の酸素原子ほど、これらの残基には近づけないので、水素結合等の極性の強い相互作用は形成し得ない。基質であるフェニルピルビン酸やインドールピルビン酸がＳ体の生成物を生成する配置（プロＳ配置）で本酵素と結合したときも、カルボキシル基が相互作用し得る酵素側の残基は、Ａｒｇ３７のみであると考えられる。従って、この３７番目のＡｒｇ残基に対して、プロＳ配置で結合した基質のカルボキシル基と水素結合相互作用が出来ないような改変を実施すれば、同配置での基質の結合が起こりにくくなる。プロＲ配置での基質の結合は、３７番残基との相互作用が消失しても、Ａｓｎ６７、Ｔｙｒ７１、Ｌｙｓ１４１とカルボキシル基の強固な相互作用は保存し得るので、４Ｒ体の生成には影響は軽微と考えられる。結果的に４Ｒ−ＩＨＯＧおよび４Ｒ−ＰＨＯＧの一方を優先的に生産する改変酵素を得ることができる。
【００６２】
また、４Ｒ−ＰＨＯＧ、４Ｒ−ＩＨＯＧ−oximeの４位炭素原子の近傍には、丁度Ａｒｇ３７の反対側付近に、Ｌｅｕ９９が存在している。このアミノ酸残基を、電荷を持ったアミノ酸に変換させることにより、フェニルピルビン酸やインドールピルビン酸のカルボキシル基との間に、静電的な反発或は吸引を生じさせしめ、両基質がプロＲ配置で結合するようにさせることも可能である。或は、このアミノ酸残基の側鎖の大きさを変えることにより、基質結合部位の表面形状を変化させ、両基質がプロＲ配置で結合するようにさせることも可能であると考えられる。
【００６３】
こうした変異は、Ａｒｇ３７およびＬｅｕ９９の２残基に限られるものではなく、ＰＨＯＧ、ＩＨＯＧ−oximeを取り囲むアミノ酸残基の全てを変異導入の対象とすることができる。但し、活性に重要な働きをするＡｓｐ１２０を改変すると活性が失われることが予想されるので、これを除外して変異体を作成することが好ましい。
【００６４】
〔II〕変異型アルドラーゼ
本発明の変異型アルドラーゼは、ＩＨＯＧを光学選択的に生成できるように、野生型アルドラーゼの特定のアミノ酸残基に変異を導入したものである。
上述のように、ＰｔＡＬＤの立体構造情報を解析した結果、ＰｔＡＬＤの基質結合部位は、Ａｒｇ３７、Ａｓｎ６７、Ｔｙｒ７１、Ｇｌｙ９７、Ｇｌｕ９８、Ｌｅｕ９９、Ｉｌｅ１００、Ａｒｇ１１９、Ａｓｐ１２０、Ｐｒｏ１３９、Ｌｙｓ１４１、Ｈｉｓ１８９、Ｈｉｓ１９２、Ｇｌｕ１９３、Ｔｒｐ２０９の１５個のアミノ酸残基によって囲まれた空間で構成されていることが分かった。すなわち、これらの１５個のアミノ酸残基によって囲まれた空間が基質（インドールピルビン酸およびピルビン酸）が結合するために好適な環境を構成している。
【００６５】
従って、野生型アルドラーゼのアミノ酸配列において、ＰｔＡＬＤの基質結合部位を構成する１５個のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基のうち、活性に重要な働きをすると考えられるＡｓｐ１２０を除くいずれかのアミノ酸残基に置換、欠失、挿入、付加および／または逆位を導入することにより、野生型アルドラーゼの活性を改変させることができる。ここでいうアルドラーゼ活性の改変とは、４Ｒ体または４Ｓ体選択的にＰＨＯＧやＩＨＯＧを生成する改変や、ＰＨＯＧやＩＨＯＧの生成能の改変のほか、基質特異性の改変等をも含む広義の改変を意味する。
【００６６】
ＰｔＡＬＤの基質結合部位を構成する１５個のアミノ酸残基のうち、生成物（ＩＨＯＧ、ＰＨＯＧ）の４位のキラリティーに関与するアミノ酸残基は、Ａｒｇ３７およびＬｅｕ９９の２つである。４Ｒ体または４Ｓ体選択的にＩＨＯＧを生成する変異型アルドラーゼは、光学活性モナティンの製造に有用であるので、以下、このような変異型アルドラーゼを中心に説明する。
【００６７】
（Ａ）変異型アルドラーゼのアミノ酸配列
光学活性を有する変異型アルドラーゼを得るためには、野生型アルドラーゼのアミノ酸配列において、生成物の４位のキラリティーに関与する部位を特定し、該当部分のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換すればよい。変異を導入する対象となる野生型アルドラーゼとしては、ＰｔＡＬＤのほか、ＰｔＡＬＤと類似する立体構造を有する他のアルドラーゼを用いることができる。以下、変異型アルドラーゼのアミノ酸配列について、野生型アルドラーゼとして、（i）ＰｔＡＬＤを用いる場合と、（ii）ＰｔＡＬＤ以外の他のアルドラーゼを用いる場合に分けて説明する。
【００６８】
（i）ＰｔＡＬＤから変異型アルドラーゼのアミノ酸配列を決定する場合
ＰｔＡＬＤは、配列表配列番号２に記載されたアミノ酸配列を有するタンパク質である。ＰｔＡＬＤの光学選択性を改変させる場合は、配列表配列番号２に記載された２２１個のアミノ酸残基のうち、Ａｒｇ３７およびＬｅｕ９９の少なくとも一方のアミノ酸残基に変異を導入すればよい。すなわち、配列番号２に示すアミノ酸配列において、３７番目のアルギニン残基および９９番目のロイシン残基のうち、少なくとも１箇所のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換することにより、光学選択性を有する変異型アルドラーゼが得られる。
【００６９】
フェニルピルビン酸やインドールピルビン酸がプロＳ配置で結合する際の基質カルボキシル基に対して、特異的に水素結合相互作用しやすいような改変をＡｒｇ３７残基に実施すれば、４Ｓ-ＰＨＯＧや４Ｓ-ＩＨＯＧを選択的に生成させることが可能であり、また、両基質がプロＳ配置で結合する際の基質カルボキシル基に対して、水素結合相互作用が出来ないような改変を実施すれば、相対的にプロＲ配置での基質の結合が起こりやすくなり、４Ｒ-ＰＨＯＧや４Ｒ-ＩＨＯＧを選択的に生成させることが可能となる。例えば、プロＳ配置での基質の結合を起こしにくくするアミノ酸残基としては、チロシン残基、トリプトファン残基、ヒスチジン残基、フェニルアラニン残基、プロリン残基等を例示することができる。
【００７０】
また、Ｌｅｕ９９については、電荷を持ったアミノ酸に変換することにより、フェニルピルビン酸やインドールピルビン酸のカルボキシル基と静電的な吸引或いは反発を生じせしめたり、或は、このアミノ酸残基の側鎖の大きさを変えて、基質結合部位の表面形状を変化させることにより、両基質がプロＲ配置またはプロＳ配置の何れかで結合し易くするようにさせることも可能である。例えば、基質をプロＲ配置で結合しやすくするアミノ酸残基としては、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、リジン残基、トリプトファン残基、チロシン残基、グリシン残基等を例示することができる。
【００７１】
したがって、４Ｒ体選択的な変異型アルドラーゼを得るには、配列番号２に示すアミノ酸配列において、３７番目のアルギニン残基からチロシン残基、トリプトファン残基、ヒスチジン残基、フェニルアラニン残基またはプロリン残基への置換を導入することが好ましい。また、９９番目のロイシン残基からアスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、リジン残基、トリプトファン残基、チロシン残基またはグリシン残基への置換を導入することが好ましい。また、３７番目のアルギニン残基と９９番目のロイシン残基の両方のアミノ酸残基にこれらの置換を導入することも好ましい。
【００７２】
また、上述のＡｒｇ３７、Ｌｅｕ９９への変異導入と併せて、基質結合部位を構成する残りのアミノ酸残基のうちＡｓｐ１２０を除くアミノ酸残基、すなわち、Ａｓｎ６７、Ｔｙｒ７１、Ｇｌｙ９７、Ｇｌｕ９８、Ｉｌｅ１００、Ａｒｇ１１９、Ｐｒｏ１３９、Ｌｙｓ１４１、Ｈｉｓ１８９、Ｈｉｓ１９２、Ｇｌｕ１９３、Ｔｒｐ２０９の少なくともひとつのアミノ酸残基に、置換、欠失、挿入、付加および／または逆位を導入してもよい。これら１２個のアミノ酸残基は基質結合部位を構成しているため、これらの部位に変異を導入することにより、ＰＨＯＧやＩＨＯＧの生成能や、基質特異性を改変することが期待できる。ただし、上記１２個のアミノ酸残基に変異を導入する場合は、アルドラーゼ活性、および、Ａｒｇ３７、Ｌｅｕ９９へのアミノ酸残基の置換によって得られた光学選択性を大きく損なわない範囲で行う。
【００７３】
また、上述のＡｒｇ３７、Ｌｅｕ９９へのアミノ酸残基の置換に加え、基質結合部位を構成するアミノ酸残基以外の箇所、すなわち、Ａｒｇ３７、Ａｓｎ６７、Ｔｙｒ７１、Ｇｌｙ９７、Ｇｌｕ９８、Ｌｅｕ９９、Ｉｌｅ１００、Ａｒｇ１１９、Ａｓｐ１２０、Ｐｒｏ１３９、Ｌｙｓ１４１、Ｈｉｓ１８９、Ｈｉｓ１９２、Ｇｌｕ１９３、Ｔｒｐ２０９以外のアミノ酸残基に、１若しくは数個の置換、欠失、挿入、付加および／または逆位を有するアミノ酸配列を有する場合であっても、アルドラーゼ活性、および、Ａｒｇ３７、Ｌｅｕ９９へのアミノ酸残基の置換によって得られた光学選択性を大きく損なわない場合は、本発明の変異型アルドラーゼに該当する。
【００７４】
ここで、「１若しくは数個」とは、タンパク質の全体的な立体構造や、アルドラーゼ活性、および、Ａｒｇ３７、Ｌｅｕ９９へのアミノ酸残基の置換によって得られた光学選択性を大きく損なわない範囲のものであり、具体的には、１〜５０個、好ましくは１〜３０個、さらに好ましくは１〜１０個である。この場合、３３℃、ｐＨ９の条件下で配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の１％以上、好ましくは５％以上、より好ましくは２０％以上、さらに好ましくは５０％以上、特に好ましくは７０％以上、とりわけ好ましくは１００％以上のアルドラーゼ活性を保持していることが望ましい。
【００７５】
（ii）ＰｔＡＬＤ以外の他のアルドラーゼから変異型アルドラーゼのアミノ酸配列を決定する場合
以下、図８を参照しながら、ＰｔＡＬＤ以外の他のアルドラーゼに対して、Ｘ線結晶構造解析によって得られたＰｔＡＬＤの構造情報をもとに、ＰｔＡＬＤと同様のアミノ酸変異を施す方法について説明する。他のアルドラーゼとしては、アルドラーゼ活性が確認されているアミノ酸配列が既知のタンパク質を用いることが好ましい。特に、インドール−３−ピルビン酸とピルビン酸とをアルドール縮合させてＩＨＯＧを生成する反応、および、フェニルピルビン酸とピルビン酸とをアルドール縮合させてＰＨＯＧを生成する反応のうち、少なくとも一方の反応を触媒するアルドラーゼ活性が確認されているタンパク質を用いることが好ましい。
【００７６】
まず他のアルドラーゼとＰｔＡＬＤの立体構造を比較し、ＰｔＡＬＤの立体構造との類似性を判断する（ステップＳ１）。
【００７７】
ここで、他のアルドラーゼが、ＰｔＡＬＤと類似の立体構造を有するか否かについては、スレディング(Threading)法を用いて判定することが好ましい。スレッディング法とは、あるアミノ酸配列がどのような立体構造をとるかを、データベース中の既知の立体構造との類似性で評価し、予測する方法である(Science、第253巻、第164〜170頁(1991))。具体的には、他のアルドラーゼのアミノ酸配列をデータベース中のＰｔＡＬＤの立体構造に乗せて、二次構造のとり易さ等に関して、両者の適合度を定量化する目的関数を算出し、その結果を比較検討することにより、評価を行う。スレディング(Threading)法に用いるＰｔＡＬＤの立体構造データとしては、図９−１〜図９−２６に記載のデータを用いることができる。
【００７８】
スレッディング法は、INSIGHT II、LIBRA等のプログラムにより実行が可能である。INSIGHT IIは、米国Accelrys社より購入できる。スレッディング法を実施するには、同プログラム中のSeqFoldモジュールを利用する。LIBRAは、インターネットを使って、そのホームページのアドレス(http://www.ddbj.nig.ac.jp/E-mail/libra/LIBRA_I.html)にアクセスして、使用することが出来る。
【００７９】
あるタンパク質がＰｔＡＬＤの立体構造と類似性を有するか否かの判定する基準としては、例えばINSIGHT II-SeqFoldを用いる場合には、スレッディング法による評価関数をすべて総合して算出した総合評価値(SeqFold Total Score (bits))を用いることが好ましい。SeqFold Total Score (bits)を算出することにより、タンパク質の立体構造が全体的に類似しているかどうかを判定することができる。プログラムSeqFoldを用いてスレッディング法を実施すると、SeqFold(LIB) P-Value、SeqFold(LIB) P-Value、SeqFold(LEN) P-Value、SeqFold(LOW) P-Value、SeqFold(High) P-Value、SeqFold Total Score (raw)、SeqFold Alignment Score (raw)等の各種の評価値が算出されるが、SeqFold Total Score (bits)は、これらの評価値をすべて総合して算出した総合評価値であり、SeqFold Total Score (bits)の値が大きいほど、対比している２つのタンパク質の立体構造の類似性が高いことを意味する。例えば、INSIGHT IIを用いてスレッディング法を実施した場合、ＰｔＡＬＤと類似した立体構造を有するタンパク質であると判断する際の閾値としては、SeqFold Total Score (bits)の値にして、１００程度が妥当と考えられる。すなわち、SeqFold Total Score (bits)が１００以上であれば、ＰｔＡＬＤの立体構造と他のアルドラーゼの立体構造が類似性を有していると判定できる。より好ましい閾値としては、SeqFold Total Scoreの値にして１０５以上、更に好ましくは１２０以上であり、特に好ましくは１５０以上である。
【００８０】
また、ＰｔＡＬＤと他のアルドラーゼは、基質結合部位について、さらに高い類似性を有していることが好ましい。したがって、SeqFold Total Score (bits)を用いてタンパク質の立体構造の全体的な類似性を判断するのと併せて、他のアルドラーゼの立体構造が決定されている場合には、タンパク質の基質結合部位の立体構造の類似性について判断してもよい。
【００８１】
ＰｔＡＬＤと他のアルドラーゼが基質結合部位について高い類似性を有するか否かは、他のアルドラーゼの立体構造とＰｔＡＬＤの立体構造とを重ね合わせたときに、基質結合部位を構成する１５個のアミノ酸残基における主鎖Ｃα原子の位置のずれが、根二乗平均誤差値として所定の閾値以下となるか否かで判定することができる。基質結合部位について高い類似性を有すると判断する際の閾値としては、主鎖Ｃα原子の位置のずれが、根二乗平均誤差値として４Å程度が妥当である。すなわち、主鎖Ｃα原子の位置のずれが４Å以下であれば、ＰｔＡＬＤと他のアルドラーゼが基質結合部位について高い類似性を有していると判定できる。具体的には、他のアルドラーゼの立体構造とＰｔＡＬＤの立体構造とを重ね合わせる。そして、両者の立体構造を重ね合わせたときに、ＰｔＡＬＤの基質結合部位を構成する１５個のアミノ酸残基（Ａｒｇ３７、Ａｓｎ６７、Ｔｙｒ７１、Ｇｌｙ９７、Ｇｌｕ９８、Ｌｅｕ９９、Ｉｌｅ１００、Ａｒｇ１１９、Ａｓｐ１２０、Ｐｒｏ１３９、Ｌｙｓ１４１、Ｈｉｓ１８９、Ｈｉｓ１９２、Ｇｌｕ１９３、Ｔｒｐ２０９）と、これら１５個のアミノ酸残基に対応する他のアルドラーゼ中のアミノ酸残基との間の主鎖Ｃα原子の位置のずれが、所定の閾値以下となるかを判断する。従って、SeqFold Total Score (bits)が所定の閾値以上であるか、又は、基質結合部位を構成する１５個のアミノ酸残基における主鎖Ｃα原子の位置のずれが所定の閾値以下である場合に、ＰｔＡＬＤと類似した立体構造を有するタンパク質であると判断することができる。
【００８２】
他のアルドラーゼがＰｔＡＬＤと類似の立体構造を有すると判定された場合（ステップＳ２  Ｙｅｓ）、他のアルドラーゼのアミノ酸配列において、ＰｔＡＬＤのＡｒｇ３７およびＬｅｕ９９に対応するアミノ酸残基を特定する（ステップＳ３）。ＰｔＡＬＤのＡｒｇ３７およびＬｅｕ９９に対応するアミノ酸残基は、そのタンパク質のアミノ酸配列について、スレッディング法によりＰｔＡＬＤと３次構造のアラインメントを実施することによって特定することができる。
【００８３】
そして、前記タンパク質に対し、ＰｔＡＬＤのＡｒｇ３７に対応するアミノ酸残基、および、ＰｔＡＬＤのＬｅｕ９９に対応するアミノ酸残基のうち、少なくとも一方のアミノ酸残基を置換することにより変異型アルドラーゼのアミノ酸配列を決定する（ステップＳ４）。ここでいうアミノ酸残基の置換は、ＰｔＡＬＤに施すアミノ酸残基と同様の置換を適用することができる。
【００８４】
例えば、４Ｒ体選択性を有する変異型アルドラーゼのアミノ酸配列を得るためには、ＰｔＡＬＤとの類似性に関して高いスコアの得られた他のアルドラーゼのアミノ酸配列において、ＰｔＡＬＤのＡｒｇ３７に対応するアミノ酸残基を、チロシン残基、トリプトファン残基、ヒスチジン残基、フェニルアラニン残基、および、プロリン残基等のアミノ酸残基へ置換することが好ましい。また、ＰｔＡＬＤとの類似性に関して高いスコアの得られた他のアルドラーゼのアミノ酸配列において、ＰｔＡＬＤのＬｅｕ９９に対応するアミノ酸残基を、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、リジン残基、トリプトファン残基、チロシン残基およびグリシン残基等のアミノ酸残基へ置換することが好ましい。また、ＰｔＡＬＤのＡｒｇ３７に対応するアミノ酸残基と、ＰｔＡＬＤのＬｅｕ９９に対応するアミノ酸残基の両方のアミノ酸残基に上述の置換を施してもよい。
【００８５】
本発明者らは、Pseudomonas coronafaciens、Arthrobacter keyseri、Pseudomonas ochraceae由来の３種のアルドラーゼに対して、INSIGHT IIを用いてスレッディング法を実施した結果、これらのアルドラーゼがＰｔＡＬＤと類似した立体構造をとっていることを見い出した(実施例１３)。
【００８６】
Pseudomonas coronafaciens由来のアルドラーゼ（ＰｃＡＬＤ）とＰｔＡＬＤとのアミノ酸配列のSeqFold Total Score (bits)値は１６５．９４である。
【００８７】
ＰｃＡＬＤのアミノ酸配列を配列表配列番号２３に、ＰｃＡＬＤとＰｔＡＬＤとのアラインメント結果を図１５に示す。図１５において、上段がＰｃＡＬＤのアミノ酸配列、下段がＰｔＡＬＤのアミノ酸配列であり、両者のアミノ酸残基が一致する部分については＊を付している。また、図１５においては、ＰｔＡＬＤの活性部位を構成する１５個のアミノ酸残基（Ａｒｇ３７、Ａｓｎ６７、Ｔｙｒ７１、Ｇｌｙ９７、Ｇｌｕ９８、Ｌｅｕ９９、Ｉｌｅ１００、Ａｒｇ１１９、Ａｓｐ１２０、Ｐｒｏ１３９、Ｌｙｓ１４１、Ｈｉｓ１８９、Ｈｉｓ１９２、Ｇｌｕ１９３、Ｔｒｐ２０９）について網掛けして表示している。改変するとアルドラーゼ活性が失われるおそれのあるＰｔＡＬＤのＡｓｐ１２０については、ＰｃＡＬＤにおいてもＰｔＡＬＤと同じアミノ酸残基が対応していることが分かる。
【００８８】
ＰｃＡＬＤにおいて、ＰｔＡＬＤのＡｒｇ３７に対応するアミノ酸残基はＡｒｇ、ＰｔＡＬＤのＬｅｕ９９に対応するアミノ酸残基はＭｅｔである。したがって、ＰｃＡＬＤのアミノ酸配列において、これら２個所のアミノ酸残基のうち、少なくとも一方のアミノ酸残基に置換を導入すればよい。なお、ＰｔＡＬＤのＬｅｕ９９に対応するＭｅｔについては、アミノ酸残基の種類がＰｔＡＬＤとは異なるが、この場合は、ＭｅｔおよびＬｅｕ以外のアミノ酸残基に置換することにより、野生型ＰｃＡＬＤの光学選択性を改変することができる。
【００８９】
Arthrobacter keyseri由来のアルドラーゼ（ＰｃｍＥ）とＰｔＡＬＤとのアミノ酸配列のSeqFold Total Score (bits)値は１０５．５１である。
【００９０】
ＰｃｍＥのアミノ酸配列を配列表配列番号２４に、ＰｔＡＬＤとのアラインメント結果を図１６に示す。図１６において、上段がＰｃｍＥのアミノ酸配列、下段がＰｔＡＬＤのアミノ酸配列であり、両者のアミノ酸残基が一致する部分については＊を付している。また、図１６においても、ＰｔＡＬＤの活性部位を構成する１５個のアミノ酸残基について網掛けして表示している。改変するとアルドラーゼ活性が失われるおそれのあるＰｔＡＬＤのＡｓｐ１２０については、ＰｃｍＥにおいてもＰｔＡＬＤと同じアミノ酸残基が対応していることが分かる。
【００９１】
ＰｃｍＥにおいて、ＰｔＡＬＤのＡｒｇ３７に対応するアミノ酸残基はＡｒｇ、ＰｔＡＬＤのＬｅｕ９９に対応するアミノ酸残基はＬｅｕである。したがって、ＰｃｍＥのアミノ酸配列において、これら２個所のアミノ酸残基のうち、少なくとも一方のアミノ酸残基に置換を導入すれば光学選択性を付与することができる。
【００９２】
Pseudomonas ochraceae由来のアルドラーゼ（ＰｒｏＡ）とＰｔＡＬＤとのアミノ酸配列のSeqFold Total Score (bits)値は１１９．８５である。
【００９３】
ＰｒｏＡのアミノ酸配列を配列表配列番号２５に、ＰｔＡＬＤとのアラインメント結果を図１７に示す。図１７において、上段がＰｒｏＡのアミノ酸配列、下段がＰｔＡＬＤのアミノ酸配列であり、両者のアミノ酸残基が一致する部分については＊を付している。また、図１７においても、ＰｔＡＬＤの活性部位を構成する１５個のアミノ酸残基について網掛けして表示している。改変するとアルドラーゼ活性が失われるおそれのあるＰｔＡＬＤのＡｓｐ１２０については、ＰｒｏＡにおいてもＰｔＡＬＤと同じアミノ酸残基が対応していることが分かる。
【００９４】
ＰｒｏＡにおいて、ＰｔＡＬＤのＡｒｇ３７に対応するアミノ酸残基はＡｒｇ、ＰｔＡＬＤのＬｅｕ９９に対応するアミノ酸残基はＬｅｕである。したがって、ＰｒｏＡのアミノ酸配列において、これら２個所のアミノ酸残基のうち、少なくとも一方のアミノ酸残基に置換を導入すれば光学選択性を付与することができる。
【００９５】
ただし、ＰｔＡＬＤと立体構造が類似するアルドラーゼは、ＰｃＡＬＤ、ＰｃｍＥ、ＰｒｏＡに限定されるものではなく、これ以外の菌株由来のアルドラーゼであっても、ＰｔＡＬＤと立体構造が類似しているアルドラーゼについては、同様のアミノ酸残基の置換を導入できることは言うまでもない。
【００９６】
また、ＰｔＡＬＤと立体構造が類似するアルドラーゼについて、上述したＰｔＡＬＤのＡｒｇ３７およびＬｅｕ９９に対応するアミノ酸残基への変異導入と併せて、ＰｔＡＬＤの基質結合部位を構成する残りアミノ酸残基のうちＡｓｐ１２０を除くアミノ酸残基、すなわち、Ａｓｎ６７、Ｔｙｒ７１、Ｇｌｙ９７、Ｇｌｕ９８、Ｉｌｅ１００、Ａｒｇ１１９、Ｐｒｏ１３９、Ｌｙｓ１４１、Ｈｉｓ１８９、Ｈｉｓ１９２、Ｇｌｕ１９３、Ｔｒｐ２０９に対応する少なくとも１つのアミノ酸残基に、置換、欠失、挿入、付加および／または逆位を導入してもよい。これら１２個のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基は、基質結合部位を構成しているため、アミノ酸残基をＰｔＡＬＤとは異なるアミノ酸残基に置換することにより、ＰＨＯＧやＩＨＯＧの生成能や、基質特異性を改変することが期待できる。また、これら１２個のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基が、もともとＰｔＡＬＤとは異なるアミノ酸残基である場合は、ＰｔＡＬＤと同じアミノ酸残基に置換してもよい。ＰｔＡＬＤの基質結合部位を構成するアミノ酸残基のうち、ＰｔＡＬＤとは異なるアミノ酸残基を、ＰｔＡＬＤと同じアミノ酸残基に置換することによって、ＰＨＯＧやＩＨＯＧの生成能を向上させることができる場合がある。ただし、上記１２個のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基に変異を導入する場合は、アルドラーゼ活性、および、Ａｒｇ３７、Ｌｅｕ９９に対応するアミノ酸残基への置換によって得られた光学選択性を大きく損なわない範囲で行う。
【００９７】
また、ＰｔＡＬＤと立体構造が類似するアルドラーゼのアミノ酸配列のうち、ＰｔＡＬＤの基質結合部位を構成するアミノ酸残基に対応していない他のアミノ酸残基において、１若しくは数個の置換、欠失、挿入、付加および／または逆位を有するアミノ酸配列を有する場合であっても、アルドラーゼ活性、および、Ａｒｇ３７、Ｌｅｕ９９に対応するアミノ酸残基への置換によって得られた光学選択性を大きく損なわない場合は、本発明の変異型アルドラーゼに該当する。
【００９８】
ここで、「１若しくは数個」とは、タンパク質の全体的な立体構造や、アルドラーゼ活性、および、Ａｒｇ３７、Ｌｅｕ９９に対応するアミノ酸残基への置換によって得られた光学選択性を大きく損なわない範囲のものであり、具体的には、１〜５０個、好ましくは１〜３０個、さらに好ましくは１〜１０個である。この場合、３３℃、ｐＨ９の条件下で配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の１％以上、好ましくは５％以上、より好ましくは２０％以上、さらに好ましくは５０％以上、特に好ましくは７０％以上、とりわけ好ましくは１００％以上のアルドラーゼ活性を保持していることが望ましい。
【００９９】
（Ｂ）変異型アルドラーゼの製造方法
本発明の変異型アルドラーゼは、野生型アルドラーゼのアミノ酸配列をコードする遺伝子に変異を導入することによって、変異型アルドラーゼをコードする変異型遺伝子を作製し、当該変異型遺伝子を適当な宿主を用いて発現させることによって製造することができる。
【０１００】
また、変異型アルドラーゼを産生する変異株から取得した変異型アルドラーゼ遺伝子を適当な宿主を用いて発現させることによっても、製造することができる。
【０１０１】
(i)野生型アルドラーゼ遺伝子の取得
ＰｔＡＬＤを用いて変異型アルドラーゼを作成する場合、野生型アルドラーゼ遺伝子は、Pseudomonas taetrolens ＡＴＣＣ４６８３の細胞からクローニングすることができる。
【０１０２】
また、ＰｔＡＬＤと立体構造が類似している他のアルドラーゼから変異型アルドラーゼを作成する場合、野生型アルドラーゼ遺伝子は、当該酵素を産生する微生物等の細胞からクローニングすることができる。ＰｔＡＬＤと立体構造が類似している他のアルドラーゼを産生する細菌の具体例としては、Pseudomonas coronafaciens、Arthrobacter keyseri、Pseudomonas ochraceaeを例示することができるが、これらに限定されるものではない。このうち、Pseudomonas coronafaciensがより好ましい。この菌株については下記の通り寄託されている。
【０１０３】
Pseudomonas coronafaciens ＡＪ２７９１株
(a)受託番号  ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２４６（平成１４年６月１０日に寄託されたＦＥＲＭ  Ｐ−１８８８１より平成１４年１１月２２日に国際寄託へ移管）
(b)受託日    ２００２年６月１０日
(c)寄託先    独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）
【０１０４】
また、Arthrobacter keyseri及びPseudomonas ochraceaeについては下記の文献に記載の通り、アルドラーゼ活性菌であることが知られている。
【０１０５】
Arthrobacter keyseri 12B株
(a)文献  Eaton,R.W., Plasmid-encoded phthalate catabolic pathway in Arthrobacter keyseri 12B, J. Bacteriol. 183 (12), 3689-3703 (2001)
(b)Genebank Accession Number: AF331043
【０１０６】
Pseudomonas ochraceae NGJ1株
(a)文献  Maruyama,K., Miwa,M., Tsujii,N., Nagai,T., Tomita,N., Harada,T.,Sobajima,H. and Sugisaki,H., Cloning, sequencing, and expression of the gene encoding
4-hydroxy-4-methyl-2-oxoglutarate aldolase from Pseudomonas ochraceae NGJ1, Biosci. Biotechnol. Biochem. 65 (12), 2701-2709 (2001)
(b)Genebank Accession Number: AB050935
【０１０７】
次に、アルドラーゼ産生菌から野生型アルドラーゼをコードするＤＮＡを取得する方法について説明する。
【０１０８】
野生型アルドラーゼ遺伝子の塩基配列に基づいて、３０塩基対程度のＤＮＡ分子を合成する。該ＤＮＡ分子を合成する方法はテトラヘドロン  レターズ（Tetrahedron Letters）、１９８１年、２２、１８５９頁に開示されている。また、Applied Biosystems社製のシンセサイザーを用いて該ＤＮＡ分子を合成できる。
【０１０９】
該３０塩基対程度のＤＮＡ分子は、アルドラーゼをコードするＤＮＡ全長を、アルドラーゼ産生菌染色体遺伝子ライブラリーから単離する際に、プローブとして利用できる。あるいは、アルドラーゼをコードするＤＮＡをＰＣＲ法で増幅する際に、プライマーとして利用できる。ただし、ＰＣＲ法を用いて増幅されるＤＮＡはアルドラーゼをコードするＤＮＡ全長を含んでいないので、ＰＣＲ法を用いて増幅されるＤＮＡをプローブとして用いて、アルドラーゼをコードするＤＮＡ全長をアルドラーゼ産生菌染色体遺伝子ライブラリーから単離する。
【０１１０】
ＰＣＲ法の操作については、White, T.J. et al., トレンズ  ジェネティックス  ５（Trends Genet. 5）, １９８９年、１８５頁等に記載されている。染色体ＤＮＡを調製する方法、さらにＤＮＡ分子をプローブとして用いて、遺伝子ライブラリーから目的とするＤＮＡ分子を単離する方法については、モレキュラー  クローニング  第２版（Molecular Cloning, 2nd edition）, Cold Spring Harbor press 、１９８９年等に記載されている。
【０１１１】
(ii)変異型アルドラーゼ遺伝子の調製
上記のアルドラーゼ産生菌から得られる野生型アルドラーゼ遺伝子に対し、所定の部位に人為的に変異を起こさせ、変異型アルドラーゼ遺伝子を調製する。野生型ＰｔＡＬＤ遺伝子を用いて、光学選択性を有する変異型アルドラーゼ遺伝子を作製する場合、Ａｒｇ３７およびＬｅｕ９９の少なくとも一方のアミノ酸残基を置換するように野生型ＰｔＡＬＤ遺伝子に対して人為的に変異を起こさせる。また、ＰｔＡＬＤ以外の野生型アルドラーゼ遺伝子を用いて光学選択性を有する変異型アルドラーゼ遺伝子を作製する場合は、ＰｔＡＬＤのＡｒｇ３７に対応するアミノ酸残基、および、ＰｔＡＬＤのＬｅｕ９９に対応するアミノ酸残基の少なくとも一方のアミノ酸残基が置換されるように、人為的に変異を起こさせる。
【０１１２】
ＤＮＡの目的部位に目的の変異を起こす部位特異的変異法としては、ＰＣＲを用いる方法（Higuchi, R., イン  ＰＣＲ  テクノロジー（in PCR technology）、６１、Erlich, H. A. Eds., Stockton press 、１９８９年、Carter, P., メソッド  イン  エンザイモロジー（Meth. in Enzymol.）、 １９８７年、１５４、 ３８２頁）、ファージを用いる方法（Kramer,W. and Frits, H. J., メソッド  イン  エンザイモロジー（Meth. in Enzymol.）、１９８７年、１５４、 ３５０頁、Kunkel, T. A. et al., メソッド  イン  エンザイモロジー（Meth. in Enzymol.）、 １９８７年、１５４、 ３６７頁）などがある。
【０１１３】
４Ｒ体選択的にＩＨＯＧを生成できるように改変された変異型アルドラーゼＤＮＡの具体例としては、下記のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡを例示できる。
【０１１４】
（1） 配列番号２に示すアミノ酸配列において、３７番目に位置するアミノ酸残基をアルギニン残基からチロシン残基へ置換したアミノ酸配列
（2） 配列番号２に示すアミノ酸配列において、３７番目に位置するアミノ酸残基をアルギニン残基からトリプトファン残基へ置換したアミノ酸配列
（3） 配列番号２に示すアミノ酸配列において、３７番目に位置するアミノ酸残基をアルギニン残基からヒスチジン残基へ置換したアミノ酸配列
（4） 配列番号２に示すアミノ酸配列において、３７番目に位置するアミノ酸残基をアルギニン残基からフェニルアラニン残基へ置換したアミノ酸配列
（5） 配列番号２に示すアミノ酸配列において、３７番目に位置するアミノ酸残基をアルギニン残基からプロリン残基へ置換したアミノ酸配列
（6） 配列番号２に示すアミノ酸配列において、９９番目に位置するアミノ酸残基をロイシン残基からアスパラギン酸残基へ置換したアミノ酸配列
（7） 配列番号２に示すアミノ酸配列において、９９番目に位置するアミノ酸残基をロイシン残基からグルタミン酸残基へ置換したアミノ酸配列
（8） 配列番号２に示すアミノ酸配列において、９９番目に位置するアミノ酸残基をロイシン残基からリジン残基へ置換したアミノ酸配列
（9） 配列番号２に示すアミノ酸配列において、９９番目に位置するアミノ酸残基をロイシン残基からトリプトファン残基へ置換したアミノ酸配列
（10） 配列番号２に示すアミノ酸配列において、９９番目に位置するアミノ酸残基をロイシン残基からチロシン残基へ置換したアミノ酸配列
（11）配列番号２に示すアミノ酸配列において、９９番目に位置するアミノ酸残基をロイシン残基からグリシン残基へ置換したアミノ酸配列
（12）配列番号２に示すアミノ酸配列において、３７番目に位置するアミノ酸残基をアルギニン残基からフェニルアラニン残基へ置換し、かつ、９９番目に位置するアミノ酸残基をロイシン残基からリジン残基へ置換したアミノ酸配列
（13）配列番号２に示すアミノ酸配列において、３７番目に位置するアミノ酸残基をアルギニン残基からチロシン残基へ置換し、かつ、９９番目に位置するアミノ酸残基をロイシン残基からリジン残基へ置換したアミノ酸配列
（14）配列番号２に示すアミノ酸配列において、３７番目に位置するアミノ酸残基をアルギニン残基からトリプトファン残基へ置換し、かつ、９９番目に位置するアミノ酸残基をロイシン残基からリジン残基へ置換したアミノ酸配列
【０１１５】
上記（1）〜（14）のアミノ酸配列に基づいて、これをコードするＤＮＡを演繹するには、ＤＮＡの塩基配列ユニバーサルコドンを採用すればよい。
【０１１６】
また、これらの変異型アルドラーゼの基質結合部位以外の部位、すなわち、（1）〜（14）において置換した部位並びに３７、６７、７１、９７、９８、９９、１００、１１９、１２０、１３９、１４１、１８９、１９２、１９３および２０９番目に位置するアミノ酸残基以外の部位に１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加および／または逆位を有するアミノ酸配列を有し、かつ、４Ｒ体選択性を有するアルドラーゼをコードするＤＮＡも例示できる。ここで、「１若しくは数個」の定義は、（Ａ）変異型アルドラーゼの設計の項で説明した場合と同じである。
【０１１７】
また、当然ながら、（1）〜（14）のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、４Ｒ体選択性を有する変異型アルドラーゼをコードするＤＮＡも例示できる。ここで「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば８０％超、好ましくは８５％超、より好ましくは９０％超、特に好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件（ここでいう相同性（homology）は、比較する配列間において一致する塩基の数が最大となるような並べ方にして演算された値であることが望ましい）、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である３７℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、好ましくは６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、さらに好ましくは６５℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳに相当するに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件があげられる。ただし、（1）〜（14）のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、４Ｒ体選択性を有する変異型アルドラーゼをコードするＤＮＡの場合、３３℃、ｐＨ９の条件下で配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の１％以上、好ましくは５％以上、より好ましくは２０％以上、さらに好ましくは５０％以上、特に好ましくは１００％以上のアルドラーゼ活性を保持していることが望ましい。
【０１１８】
従って、これらの変異型アルドラーゼをコードするように、上記の部位特異的変異法により、野生型アルドラーゼ遺伝子の特定の部位において塩基の置換を行えばよい。
【０１１９】
(iii)変異型アルドラーゼ産生菌の作製・培養
上記のようにして得られる変異型アルドラーゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片は、適当なベクターに再度組換えて宿主細胞に導入させることにより、変異型アルドラーゼを発現した組換え菌を得ることができる。
【０１２０】
尚、組換えＤＮＡ技術を利用して酵素、生理活性物質等の有用タンパク質を製造する例は数多く知られており、組換えＤＮＡ技術を用いることで、天然に微量に存在する有用タンパク質を大量生産できる。組み込まれる遺伝子としては、(ii)変異型アルドラーゼ遺伝子の調製の項で説明した遺伝子が挙げられる。
【０１２１】
形質転換される宿主細胞としては、細菌細胞、放線菌細胞、酵母細胞、カビ細胞、植物細胞、動物細胞等を用いることができる。宿主-ベクター系が開発されている細菌細胞としてはエシェリヒア属細菌、シュードモナス属細菌、コリネバクテリウム属細菌、バチルス属細菌などが挙げられるが、好ましくはエシェリヒア・コリが用いられる。エシェリヒア・コリを用いてタンパクを大量生産する技術について数多くの知見があるためである。以下、形質転換された大腸菌を用いてアルドラーゼを製造する方法を説明する。
【０１２２】
変異型アルドラーゼをコードするＤＮＡを発現させるプロモーターとしては、通常大腸菌における異種タンパク生産に用いられるプロモーターを使用することができ、例えば、Ｔ７プロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ＰＬプロモーター等の強力なプロモーターが挙げられる。
【０１２３】
変異型アルドラーゼを融合タンパク封入体として生産させるためには、アルドラーゼ遺伝子の上流あるいは下流に、他のタンパク、好ましくは親水性であるペプチドをコードする遺伝子を連結して、融合タンパク遺伝子とする。このような他のタンパクをコードする遺伝子としては、融合タンパクの蓄積量を増加させ、変性・再生工程後に融合タンパクの溶解性を高めるものであればよく、例えば、Ｔ７ｇｅｎｅ １０、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、デヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、インターフェロンγ遺伝子、インターロイキン−２遺伝子、プロキモシン遺伝子等が候補として挙げられる。
【０１２４】
これらの遺伝子と変異型アルドラーゼをコードする遺伝子とを連結する際には、コドンの読み取りフレームが一致するようにする。適当な制限酵素部位で連結するか、あるいは適当な配列の合成ＤＮＡを利用すればよい。
【０１２５】
また、生産量を増大させるためには、融合タンパク遺伝子の下流に転写終結配列であるターミネーターを連結することが好ましい。このターミネーターとしては、Ｔ７ターミネーター、ｆｄファージターミネーター、Ｔ４ターミネーター、テトラサイクリン耐性遺伝子のターミネーター、大腸菌ｔｒｐＡ遺伝子のターミネーター等が挙げられる。
【０１２６】
変異型アルドラーゼまたは変異型アルドラーゼと他のタンパクとの融合タンパクをコードする遺伝子を大腸菌に導入するためのベクターとしては、いわゆるマルチコピー型のものが好ましく、Ｃｏｌ Ｅ１由来の複製開始点を有するプラスミド、例えばｐＵＣ系のプラスミドやｐＢＲ３２２系のプラスミド、あるいはその誘導体が挙げられる。ここで、「誘導体」とは、塩基の置換、欠失、挿入、付加または逆位などによってプラスミドに改変を施したものを意味する。なお、ここでいう改変とは、変異剤やＵＶ照射などによる変異処理、あるいは自然変異などによる改変をも含む。
【０１２７】
また、形質転換体を選別するために、該ベクターがアンピシリン耐性遺伝子等のマーカーを有することが好ましい。このようなプラスミドとして、強力なプロモーターを持つ発現ベクターが市販されている（ｐＵＣ系（宝酒造（株）製）、ｐＰＲＯＫ系（クローンテック製）、ｐＫＫ２３３-２（クローンテック製）ほか）。
【０１２８】
プロモーター、変異型アルドラーゼまたは変異型アルドラーゼと他のタンパクとの融合タンパクをコードする遺伝子、ターミネーターの順に連結したＤＮＡ断片と、ベクターＤＮＡとを連結して組換えＤＮＡを得る。
【０１２９】
該組換えＤＮＡを用いて大腸菌を形質転換し、この大腸菌を培養すると、変異型アルドラーゼまたは変異型アルドラーゼと他のタンパクとの融合タンパクが発現生産される。形質転換される宿主は、異種遺伝子の発現に通常用いられる株を使用することができるが、特にエシェリヒア・コリ ＪＭ１０９(ＤＥ３)株、ＪＭ１０９株が好ましい。形質転換を行う方法、および形質転換体を選別する方法はMolecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor press (1989)等に記載されている。
【０１３０】
なお、本発明の変異型アルドラーゼは、上述のように野生型アルドラーゼをコードする遺伝子を直接変異させることによって得られる変異型遺伝子を発現させることによって得られるが、アルドラーゼを産生する微生物（例えばPseudonomas属）を、紫外線照射またはＮ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）等の通常人工突然変異に用いられている変異剤により処理し、ＩＨＯＧおよびＰＨＯＧを光学選択的に生成できるようになった変異株を培養することによっても得ることができる。
【０１３１】
次に、本発明における微生物の培養方法について説明する。ここでの用語「微生物」とは、本発明の変異型アルドラーゼを発現した遺伝子組換え細胞、および、変異型アルドラーゼを産生するようになった変異株の両方を意味する。また、ここで説明する培養条件は、微生物に変異型アルドラーゼを産生させこれを取得するための培養と、微生物を培養して変異型アルドラーゼを産生させながら同時にＩＨＯＧを生成する反応を行う場合の培養の両方に適用できる。
【０１３２】
本発明における微生物の培養方法としては、通常この分野において用いられる培地、即ち炭素源、窒素源、無機塩類、微量金属塩類、ビタミン類等を含む培地を用いて行うことができる。
【０１３３】
遺伝子組換え細胞を培養する場合は、ベクターの選択マーカーに対応してアンピシリン、カナマイシン、ネオマイシン、クロラムフェニコール等の薬剤を適宜添加することもできる。また、ベクターに塔載されているプロモーターに合わせて、誘導剤を適量添加することによって該組換え遺伝子の発現量を上げることもできる。一例を挙げると、ｌａｃプロモーターの下流に目的とする遺伝子を連結してベクターを構築した場合は、イソプロピル１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を終濃度０．１ｍＭ〜５ｍＭの範囲で適宜添加することも可能であり、また、この代りとしてガラクトースを終濃度０.１〜５ｇ／ｄｌ望ましくは０.５ｇ／ｄｌ〜２ｇ／ｄｌ適宜添加することもできる。
【０１３４】
培養温度は、通常、利用する微生物が生育する範囲内、即ち１０〜４５℃で行われるが、好ましくは２０℃〜４０℃、更に好ましくは２５〜３７℃の範囲である。また、培地のｐＨ値については、好ましくは２〜１２、より好ましくは３〜１０、更に好ましくは４〜８の範囲で調節される。通気条件については、利用する微生物の生育に適した条件に設定されるが、好気条件が好ましい。培養時間については、通常１２〜１２０時間、好ましくは２４〜９６時間程度である。
【０１３５】
このように変異型アルドラーゼを発現した遺伝子組換え細胞、または、変異型アルドラーゼを産生するようになった変異株を培養することによって、菌体内や培養液中に、本発明の変異型アルドラーゼを蓄積することができる。
【０１３６】
〔III〕光学活性ＩＨＯＧの製造方法
本発明の光学活性ＩＨＯＧの製造方法は、光学選択性が改変された本発明の変異型アルドラーゼを用いて、インドールピルビン酸とピルビン酸（ないしオキサロ酢酸）のアルドール縮合によりＩＨＯＧを製造する方法である。本発明の変異型アルドラーゼを用いることにより、光学活性ＩＨＯＧを生成でき、また、生成した光学活性ＩＨＯＧをアミノ化することにより光学活性モナティンを生成できる。
【０１３７】
本発明の変異型アルドラーゼは、アルドール縮合反応の段階における効率的な不斉導入を可能とするものである。従来の方法では、得られるＩＨＯＧは、４Ｒ体と４Ｓ体の混合物（ラセミ体）であったが、本発明のアルドラーゼを用いることにより、４Ｒ体および４Ｓ体の一方を、目的に応じて優先的に生成させることができるため、４Ｒ体リッチなＩＨＯＧあるいは４Ｓ体リッチなＩＨＯＧが得られる。
【０１３８】
（２Ｒ，４Ｒ）−モナティンを効率的に生産するためには、４Ｒ−ＩＨＯＧを優先的に生成させる変異型アルドラーゼを用いて、４Ｒ体リッチなＩＨＯＧを得ることが好ましい。このような変異型アルドラーゼの具体例としては、上述の（1）〜（14）のアミノ酸配列を有するアルドラーゼを例示することができる。
【０１３９】
本発明の変異型アルドラーゼは、インドールピルビン酸とピルビン酸（ないしオキサロ酢酸）のからＩＨＯＧを生成するアルドール縮合反応を触媒可能である限り本発明の変異型アルドラーゼを反応系に添加してもよいし、本発明の変異型アルドラーゼを含有する微生物を反応系に添加してもよい。
【０１４０】
すなわち、変異型アルドラーゼを含むものであればよく、具体的には培養物、培地（培養物から菌体を除去したもの）、菌体（培養菌体、洗浄菌体のいずれも含む）、菌体を破砕あるいは溶菌させた菌体処理物、前記培地および／または細胞を精製処理することにより得られるアルドラーゼ活性を有する組成物（粗酵素液、精製酵素）などを含む。例えば、変異型アルドラーゼを産生する細菌を用いて、ＩＨＯＧを製造する場合、細菌を培養しながら、培養液中に直接基質を添加してもよい。また、培養液より分離された菌体、洗浄菌体、菌体を破砕あるいは溶菌させた菌体処理物を反応液中に添加してもよいし、当該菌体処理物からアルドラーゼを回収し、粗酵素液または精製酵素として反応液中に添加してもよい。すなわち、変異型アルドラーゼを含有する画分であれば、どのような形態であっても本発明のＩＨＯＧの製造方法に使用することが可能である。
【０１４１】
本発明の変異型アルドラーゼを用いてアルドール縮合反応を進行させるには、インドールピルビン酸、ピルビン酸（ないしオキサロ酢酸）、および、本発明の変異型アルドラーゼを含む反応液を２０〜５０℃の適当な温度に調整し、ｐＨ６〜１２に保ちつつ、３０分〜５日静置、振とう、または攪拌すればよい。
【０１４２】
ＩＨＯＧの生成量を高めるには反応液中の基質濃度を上げればよいが、基質濃度などの反応条件によって生成するＩＨＯＧの光学純度が変わることもある。従って、ＩＨＯＧの生成量よりも、得られるＩＨＯＧの光学純度を重視するのであれば、必要に応じて、基質濃度をコントロールしてもよい。
【０１４３】
反応液にＭｇ2+、Ｍｎ2+、Ｎｉ2+、Ｃｏ2+などの２価のカチオンを添加することによって反応速度を向上させることもできる。コスト等の面から、好ましくはＭｇ2+を用いることがある。
【０１４４】
これら２価カチオンを反応液に添加する際は、反応を阻害しない限りにおいてはいずれの塩を用いてもよいが、好ましくはＭｇＣｌ2、ＭｇＳＯ4、ＭｎＳＯ4等を用いることがある。これら２価カチオンの添加濃度は当該業者であれば簡単な予備検討によって決定することができるが、０．０１ｍＭ〜１０ｍＭ、好ましくは０．１ｍＭ〜５ｍＭ、さらに好ましくは０．１ｍＭ〜１ｍＭの範囲で添加することができる。
【０１４５】
〔IV〕光学活性モナティンの製造方法
本発明の光学活性モナティンの製造方法は、本発明の変異型アルドラーゼを用いて光学活性ＩＨＯＧを製造した後、当該光学活性ＩＨＯＧをモナティンに変換する方法である。４Ｒ−ＩＨＯＧは、（２Ｒ，４Ｒ）−モナティンおよび（２Ｓ，４Ｒ）−モナティンを生成し、４Ｓ−ＩＨＯＧは、（２Ｒ，４Ｓ）−モナティンおよび（２Ｓ，４Ｓ）−モナティンを生成する。
【０１４６】
モナティンの４種の異性体のうち、最も甘味度の高い異性体である（２Ｒ，４Ｒ）−モナティンを効率的に生産するためには、４Ｒ体リッチなＩＨＯＧを用いることが好ましい。この場合、ＩＨＯＧの全体量に対する４Ｒ−ＩＨＯＧの割合が、５５％超となることが好ましく、より好ましくは、６０％超、さらに好ましくは７０％超、特に好ましくは８０％超である。
【０１４７】
ＩＨＯＧをモナティンに変換する方法は特に限定されず、化学反応法、酵素法等の公知の方法を用いることができる。
【０１４８】
（ｉ）化学反応法
化学反応法によってＩＨＯＧからモナティンを製造する方法としては、ＩＨＯＧをオキシム化し、このＩＨＯＧ−oximeまたはその塩を化学的に還元してモナティンを生成する方法を挙げることができる。
【０１４９】
好ましくは、４Ｒ体リッチなＩＨＯＧをオキシム化し、この４Ｒ体リッチなＩＨＯＧ−oximeを含有する溶液から晶析によって４Ｒ−ＩＨＯＧ−oximeまたはその塩を単離し、この４Ｒ−ＩＨＯＧ−oximeまたはその塩を化学的に還元して４Ｒ−モナティンを生成する。
【０１５０】
ＩＨＯＧのオキシム化は、中性又はアルカリ性条件下において、ＩＨＯＧと、下記一般式（１）
【化４】
0004604524.tif 000006
（上記一般式（１）において、Ｒは水素原子、アルキル基、アリール基又はアラルキル基を表す。）
に表されるアミン化合物又はその塩とを反応せしめることによって行う。ここに、Ｒがアルキル基、アリール基又はアラルキル基である場合、Ｒは炭素原子を１〜３有するアルキル基、又は、側鎖に置換基を有していてもよいアリール基またはアラルキル基が好ましく、結晶化の観点からより好ましくは、Ｒはメチル基、エチル基、ベンジル基から選択される。
【０１５１】
このオキシム化反応は、ＩＨＯＧを含むアルドラーゼ反応液に、直接上記一般式（１）のアミンを添加することによって行うことができる。この４Ｒ体リッチなＩＨＯＧ−oximeを含有する溶液から、４Ｒ−ＩＨＯＧ−oximeまたはその塩を晶析することによって、４Ｒ体を単離することができる。晶析溶媒としては、水、アルコール溶媒又は含水アルコール溶媒を用いることが好ましい。
【０１５２】
晶析によって得られた４Ｒ−ＩＨＯＧ−oximeまたはその塩を還元することによって４Ｒ−モナティンを得ることができる。４Ｒ−ＩＨＯＧ−oximeまたはその塩の還元は、水素及び水素添加触媒の存在下で実施する。水素添加触媒としては、シリカ、アルミナ、チタニア、マグネシア、ジルコニア、活性炭などの担体に、白金、ロジウム、パラジウム、ニッケル、コバルトなどの金属触媒を担持させた金属担持触媒を用いることが好ましい。
【０１５３】
従来は、光学活性ＩＨＯＧを効率的に生成させることができなかったため、ラセミ体のＩＨＯＧ（４Ｒ、４Ｓ−ＩＨＯＧ）から４Ｒ−ＩＨＯＧを単離するには、４Ｒ、４Ｓ−ＩＨＯＧをオキシム化した後、キラルアミンを作用させて４Ｒ−ＩＨＯＧ−oximeを晶析させる必要があった。これに対し、本発明によれば、アルドール縮合反応の段階で４Ｒ体リッチなＩＨＯＧを生成させることができるため、晶析の際、キラルアミンを用いて光学分割する必要がなく、４Ｒ体リッチなＩＨＯＧをオキシム化した後、そのまま４Ｒ−ＩＨＯＧ−oximeを晶析させることができる。したがって、４Ｒ−ＩＨＯＧの精製処理プロセスに要するコストを軽減することが可能となる。
【０１５４】
化学的還元法によって得られる４Ｒ−モナティンは、（２Ｒ、４Ｒ）−モナティンおよび（２Ｓ、４Ｒ）−モナティンのラセミ混合物となる。（２Ｒ、４Ｒ）−モナティンを単離する場合は、晶析によって（２Ｒ、４Ｒ）−モナティンを析出させればよい。具体的には国際公開パンフレット第０３／０５９８６５号に記載の方法を用いることが出来る。
【０１５５】
（ii）酵素法
酵素法によってＩＨＯＧからモナティンを製造する場合、ＩＨＯＧの２位をアミノ化する反応を触媒する酵素の存在下でＩＨＯＧをアミノ化すればよい。当該反応を触媒する酵素としては、例えばＩＨＯＧに対してアミノ基転移反応を触媒するアミノトランスフェラーゼ、また、ＩＨＯＧの還元的アミノ化反応を触媒するデヒドロゲナーゼ等を例示することができるが、アミノトランスフェラーゼを用いることがより好ましい。
【０１５６】
アミノトランスフェラーゼを用いる場合、アミノトランスフェラーゼおよびアミノ基供与体の存在下で、ＩＨＯＧを反応させることによって、モナティンを生成することができる。具体的には、国際公開パンフレット第０３／０５６０２６号に記載の方法を用いることが出来る。
【０１５７】
この際、アミノトランスフェラーゼとしてはＬ−アミノトランスフェラーゼおよびＤ−アミノトランスフェラーゼのいずれも使用することが可能である。Ｌ−アミノトランスフェラーゼを用いた場合は、ＩＨＯＧの２位にＬ−アミノ酸のアミノ基を転移することによって２Ｓ−モナティンを選択的に生成することができる。また、Ｄ−アミノトランスフェラーゼを用いた場合は、ＩＨＯＧの２位にＤ−アミノ酸のアミノ基を転移することによって２Ｒ−モナティンを選択的に生成することができる。したがって、甘味度の高い（２Ｒ，４Ｒ）−モナティンを選択的に生成するには、Ｄ−アミノトランスフェラーゼを用いて、４Ｒ体リッチなＩＨＯＧを反応させることが好ましい。
【０１５８】
本発明者らの研究によれば、ＩＨＯＧからモナティンを生成するアミノ化反応工程においては、アミノトランスフェラーゼなどの酵素を作用させてアミノ化反応を行う場合は、４Ｓ−ＩＨＯＧは４Ｒ−ＩＨＯＧに対して拮抗阻害的に作用していると考えられる。本発明の変異型アルドラーゼを用いてアルドール縮合反応を実施することにより、副生する４Ｓ−ＩＨＯＧを削減することができるため、４Ｓ−ＩＨＯＧの拮抗阻害作用を抑制することができ、目的とする（２Ｒ，４Ｒ）−モナティンの収率を向上させることができる。
【実施例】
【０１５９】
以下、実施例に基づき、本発明についてさらに詳細に説明する。なお、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【０１６０】
なお、本実施例におけるＩＨＯＧおよびＰＨＯＧの定量はジーエルサイエンス社製「Inertsil ODS-2 」(5μm, 4.6×250mm)を利用したＨＰＬＣ分析を用いて行った。分析条件は、以下に示す通りである。
移動相：40％(v/v) アセトニトリル/5 mM リン酸二水素テトラブチルアンモニウム溶液
流速：1 ml/min
カラム温度：40℃
検出：UV210nm
【０１６１】
また、生成したＩＨＯＧあるいはＰＨＯＧの４位の不斉の解析は、ジーエルサイエンス社製「Inertsil ODS-３」(5μm, 4.6×160mm)と住化分析センター製「SUMICHIRAL OA-7100」(5μm, 4.6×250mm)を順に直結したＨＰＬＣ分析にて解析した。分析条件は、以下に示すとおりである。
【０１６２】
移動相Ａ：５%（ｖ／ｖ） アセトニトリル２０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．８）
移動相Ｂ：５０%（ｖ／ｖ） アセトニトリル２０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．８）
０〜９０分まで移動相Ａで溶出し、９０分〜１２０分まで移動相Ｂで溶出・洗浄
流速：０．４ ｍｌ／ｍｉｎ
カラム温度：１７℃
検出：ＵＶ２１０ｎｍ
【０１６３】
〔実施例１〕  Ｅ．ｃｏｌｉでのＩＨＯＧアルドラーゼ（ＰｔＡＬＤ）の大量発現
（１）ｔｒｐプロモーター及びｒｒｎＢターミネーター搭載プラスミドｐＴｒｐ４の構築
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０染色体ＤＮＡ上のｔｒｐオペロンのプロモーター領域を表２に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲ（配列番号３および４の組み合わせ）により目的遺伝子領域を増幅し、得られたＤＮＡ断片をｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙベクター（プロメガ製）にライゲーションした。このライゲーション溶液でＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を形質転換し、アンピシリン耐性株の中からｔｒｐプロモーターの方向がｌａｃプロモーターと反対向きに挿入された目的のプラスミドを有する株を選択した。次にこのプラスミドをＥｃｏＯ１０９ｉ／ＥｃｏＲＩにて処理して得られるｔｒｐプロモーターを含むＤＮＡ断片と、ｐＵＣ１９（Ｔａｋａｒａ製）のＥｃｏＯ１０９ｉ／ＥｃｏＲＩ処理物とライゲーションした。このライゲーション溶液でＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を形質転換し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択し、プラスミドをｐＴｒｐ１と命名した。次にｐＫＫ２２３−３（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）をＨｉｎｄＩＩＩ／ＨｉｎｃＩＩにて処理し、得られたｒｒｎＢターミネーターを含むＤＮＡ断片とｐＴｒｐ１のＨｉｎｄＩＩＩ／ＰｖｕＩＩ処理物とライゲーションした。このライゲーション溶液でＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を形質転換し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択し、プラスミドをｐＴｒｐ２と命名した。次にｐＴｒｐ２を鋳型として表２に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲ（配列番号３および５の組み合わせ）によりtrpプロモーター領域を増幅した。このＤＮＡ断片をＥｃｏＯ１０９ｉ／ＮｄｅＩにより処理し、ｐＴｒｐ２のＥｃｏＯ１０９ｉ／ＮｄｅＩ処理物とライゲーションした。このライゲーション溶液でＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を形質転換し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択し、このプラスミドをｐＴｒｐ４と命名した。
【０１６４】
【表２】
0004604524.tif 000007
【０１６５】
（１）アルドラーゼ遺伝子発現プラスミドｐｔｒｐＰｔＡＬＤの構築とＥ．ｃｏｌｉでの発現
表３に示すプライマー（配列番号６および７）を用いてＰ． ｔａｅｔｒｏｌｅｎｓ ＡＴＣＣ４６８３染色体ＤＮＡより増幅した断片をＮｄｅＩ／ＨＩＮＤＩＩＩ消化し、ｐＴｒｐ４のＮｄｅＩ ／ＨｉｎｄＩＩＩサイトに挿入したプラスミドｐｔｒｐＰｔＡＬＤを構築した。このプラスミドは配列番号１に記載の塩基配列のうち４５６番目のＡＴＧを翻訳開始コドンとして配列番号２記載のアミノ酸配列からなるアルドラーゼ遺伝子を発現する。構築した発現プラスミドをＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９に導入し、形質転換体を１００ μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ培地５０ ｍｌに１白金耳接種し、３７℃で１６時間振盪させた。培養終了後、集菌、洗浄を行い、１ｍｌの２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ (ｐＨ７．６)に懸濁し、マルチビーズショッカー（安井器械社製）を用いて菌体を破砕した。破砕液を１５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した上清を粗酵素液とした。
【０１６６】
【表３】
0004604524.tif 000008
【０１６７】
該粗酵素液を用いてアルドラーゼ活性を測定した。アルドラーゼ活性測定は、ＰＨＯＧを基質としたアルドール分解活性を以下の条件で測定した。
【０１６８】
反応条件：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ (ｐＨ８．０)、２ｍＭ ＰＨＯＧ、０．２ｍＭ ＮＡＤＨ、０．２ｍＭＫＰｉ、１ｍＭ ＭｇＣｌ2、１６Ｕ／ｍｌ lactate dehydrogenase、 ３μｌ酵素／６００μｌ反応液、３０℃、３４０ｎｍの吸光度を測定
【０１６９】
測定した結果、ｐＴｒｐ４を導入したＥ．ｃｏｌｉ（コントロール）においてはＰＨＯＧアルドラーゼ活性は検出されなかったのに対して、ｐｔｒｐＰｔＡＬＤ導入株においては３６．０ Ｕ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎのＰＨＯＧアルドラーゼ活性が検出された。
【０１７０】
〔実施例２〕変異型ＰｔＡＬＤの作製
（１）変異導入プラスミドpKFＰｔＡＬＤの構築
ＰｔＡＬＤへの部位特異的変異の導入は、Ｍｕｔａｎ−Ｓｕｐｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｋｍ （ＴａＫａＲａ製）を用いて、キット添付のプロトコール通りに行った。まず、変異導入用プラスミドｐＫＦＰｔＡＬＤを構築した。表４に示すプライマー（配列番号６および８）を用いてｐｔｒｐＰｔＡＬＤを鋳型としてｔｒｐプロモーターからＰｔＡＬＤの構造遺伝子全長を含む断片をＰＣＲにて増幅した。増幅した断片をＸｂａＩ／ ＨｉｎｄＩＩＩ消化し、ｐＫＦ１８−２のＸｂａＩ／ ＨｉｎｄＩＩＩサイトに挿入したプラスミドｐＫＦＰｔＡＬＤを構築した。
【０１７１】
【表４】
0004604524.tif 000009
【０１７２】
（２）ＰｔＡＬＤへの部位特異的変異の導入
ＰｔＡＬＤのＸ線結晶構造情報より、ＰｔＡＬＤのピルビン酸結合部位と推定される部位と、基質（インドールピルビン酸、フェニルピルビン酸など）結合部位の間を向いており、酵素反応生成物の４位の不斉に影響を与えると考えられた、Ｒ３７およびＬ９９について部位特異的変異を導入した。まず、目的とする塩基置換を導入するように設計した合成オリゴＤＮＡプライマーをそれぞれ合成した。作製した変異型酵素と変異導入に使用した合成オリゴＤＮＡプライマーの配列を表５に示す。変異型酵素の名称についてであるが、「野生型酵素でのアミノ酸残基→残基番号→置換したアミノ酸残基」の順に表記する。例えばＲ３７Ｙ変異型酵素は野生型酵素の３７番目のＡｒｇ（Ｒ）残基をＴｙｒ（Ｙ）残基に置換した変異型酵素であることを意味する。なお、触媒反応に必須な残基を特定するために、活性中心近傍に位置するＡｓｐ１２０についても変異型酵素を作製した。
【０１７３】
【表５】
0004604524.tif 000010
【０１７４】
該キットの方法に従い、ｐＫＦＰｔＡＬＤを鋳型として変異型プラスミドを作製した。まず、合成オリゴＤＮＡプライマーの５’末端をを以下の条件で、３７℃で３０分間リン酸化反応後、７０℃、５分間インキュベートして反応を停止した。
【０１７５】
１０×Ｔ４ polynucleotide kinase buffer              ２μｌ
合成オリゴＤＮＡプライマー(１００ ｐｍｏｌ／Ｌ)      １μｌ
１０ｍＭ ＡＴＰ                                      ２μｌ
Ｔ４ polynucleotide kinase                            １μｌ
ＤＷ                                                １４μｌ
【０１７６】
リン酸化した合成オリゴＤＮＡプライマーと添付のセレクションプライマーを用いて、以下の条件で変異型ＰｔＡＬＤ発現プラスミドを増幅した。なお、例えばｐＫＦＲ３７Ｙの作製にあたっては、ｐＫＦＰｔＡＬＤを鋳型として、５’末端をリン酸化したプライマーＲ３７Ｙを用いてＰＣＲを行い、得られた反応液でＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換した。形質転換体よりプラスミドを回収して塩基配列を決定し、目的とする塩基置換が導入されていることを確認した。
【０１７７】
９４℃      １分
５５℃      １分
７２℃      ３分          ×３０サイクル
【０１７８】
なお、２重変異体の作製は、先に作製した単変異体の発現プラスミドを鋳型として、導入したいもう一方の変異導入用プライマーを用いて行った。例えばＲ３７Ｙ／Ｌ９９Ｋ変異型酵素発現プラスミドの作製は、ｐＫＦＲ３７Ｙを鋳型として５’末端をリン酸化したプライマーＬ９９Ｋを用いてＰＣＲを行った。なお、２重変異体の作製には、変異導入プラスミドの作製効率を高めるために、ＰＣＲ後のＤＮＡをメチル化ＤＮＡを認識して切断する制限酵素ＤｐｎＩ処理することにより、鋳型プラスミドを切断した後に、得られた反応液でＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換した。形質転換体よりプラスミドを回収して塩基配列を決定し、目的とする塩基置換が導入されていることを確認した。
【０１７９】
（３）変異型ＰｔＡＬＤ発現Ｅ．ｃｏｌｉの作製
各種変異型ＰｔＡＬＤ遺伝子塔載プラスミドあるいはｐＫＦＰｔＡＬＤを持つＥ．ｃｏｌｉ形質転換体を０．１ ｍｇ／ｍｌ アンピシリン、０．１ ｍＭイソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を含む３ｍｌのＬＢ培地（バクトトリプトン １ｇ／ｄｌ、酵母エキス ０．５ｇ／ｄｌ、及びＮａＣｌ １ｇ／ｄｌ）に接種し、３７℃、１６時間振とう培養した。得られた培養液より集菌、洗浄し、ＰｔＡＬＤ発現Ｅ．ｃｏｌｉを調製した。各種変異型ＰｔＡＬＤの発現の確認は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて行った。培養液２５０μｌより遠心分離により集菌して得られる菌体を５００μｌのＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーに懸濁して１０分間煮沸させ、溶菌・変性させた。遠心分離（１０，０００×ｇ、１０ｍｉｎ）により得られる上清５〜１０μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供したところ、野生型およびすべての変異型ＰｔＡＬＤ発現プラスミド導入株にて約２５ｋＤａ付近の位置に特異的に出現するバンドを認め、野生型および変異型ＰｔＡＬＤの発現を確認した。
【０１８０】
〔実施例３〕  変異型ｐＫＦＰｔＡＬＤ導入Ｅ．ｃｏｌｉを用いたＩＨＯＧおよびＰＨＯＧ合成反応
実施例２にて調製した各種変異型ＰｔＡＬＤ発現Ｅ．ｃｏｌｉを用いてＩＨＯＧおよびＰＨＯＧの生産を実施した。４００μｌ培養液より遠心分離にて調整した菌体を以下の組成の反応液２００μｌにそれぞれ懸濁した。
【０１８１】
ＩＨＯＧ合成反応溶液：１００ ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ （ｐＨ ８．５）， ５０ ｍＭ インドールピルビン酸, ２００ ｍＭ ピルビン酸ナトリウム, １ ｍＭ ＭｇＣｌ2, ５ ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．５）
ＰＨＯＧ合成反応溶液：１００ ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ （ｐＨ ８．５）， ５０ ｍＭ フェニルピルビン酸ナトリウム， ２００ ｍＭ ピルビン酸ナトリウム, １ ｍＭ ＭｇＣｌ2, ５ ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．５）
【０１８２】
反応液を３７℃で６時間インキュベートした後に、生成したＩＨＯＧあるいはＰＨＯＧを定量し、さらに反応生成物の４位の不斉についても解析した。結果を表６に示す。作製した変異型ＰｔＡＬＤ発現株において、ｐＫＦＰｔＡＬＤ導入株（親酵素発現株）と比較して４Ｒ-ＩＨＯＧあるいは４Ｒ-ＰＨＯＧの選択性の向上が認められた。
【０１８３】
なお、ｐＫＦＤ１２０Ａ導入株については、菌体抽出液を酵素源としてＰＨＯＧを基質としたアルドール分解活性を先に示した条件で測定したが、活性は検出されず、Ａｓｐ１２０に変異を導入することによりアルドラーゼ活性が消失することが明らかとなった。
【０１８４】
【表６】
0004604524.tif 000011
【０１８５】
〔実施例４〕  変異型ｐｔｒｐＰｔＡＬＤの構築とＩＨＯＧおよびＰＨＯＧ合成反応
（１）変異型ｐｔｒｐＰｔＡＬＤの構築と変異型ＰｔＡＬＤ発現Ｅ．ｃｏｌｉの作製
ｐＫＦＰｔＡＬＤを鋳型として作製した変異型ＰｔＡＬＤ遺伝子をｐＴｒｐ４に連結してｐＴｒｐ４系での高発現プラスミドを作製し、これを導入した変異型ＰｔＡＬＤ高発現Ｅ．ｃｏｌｉを用いて初発インドールピルビン酸あるいはフェニルピルビン酸濃度を３００ ｍＭに上げた条件にてＩＨＯＧ合成反応を実施し、４位の不斉を解析した。
【０１８６】
表３に示すプライマー（配列番号６および７）を用いて、実施例２で作製した各種変異型ｐＫＦＰｔＡＬＤのプラスミドＤＮＡより増幅した断片をＮｄｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ消化し、ｐＴｒｐ４のＮｄｅＩ ／ＨｉｎｄＩＩＩサイトに挿入したプラスミドｐｔｒｐＰｔＡＬＤを構築した。例えばｐＫＦＲ３７Ｙを鋳型として増幅したＤＮＡをｐＴｒｐ４に連結したＲ３７Ｙ高発現プラスミドをｐｔｒｐＲ３７Ｙとした。
【０１８７】
構築した発現プラスミドをＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９に導入し、形質転換体を１００ μg/ｍｌアンピシリンを含むＬＢ培地３ ｍｌに１白金耳接種し、３７℃で１６時間振盪させた。各種変異型ＰｔＡＬＤの発現の確認は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて行った。培養液２５０μｌより遠心分離により集菌して得られる菌体を５００μｌのＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーに懸濁して１０分間煮沸させ、溶菌・変性させた。遠心分離（１０，０００×ｇ， １０ｍｉｎ）により得られる上清５〜１０μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供したところ、野生型およびすべての変異型ＰｔＡＬＤ発現プラスミド導入株にて約２５ｋＤａ付近の位置に特異的に出現するバンドを認め、野生型および変異型ＰｔＡＬＤの発現を確認した。
【０１８８】
（２）変異型ｐｔｒｐＰｔＡＬＤ導入Ｅ．ｃｏｌｉを用いたＩＨＯＧおよびＰＨＯＧ合成反応
（１）にて調製した各種変異型ｐｔｒｐＰｔＡＬＤ導入Ｅ．ｃｏｌｉの培養液１ｍｌより遠心分離にて調製した菌体を、以下の組成の反応液５００ μｌにそれぞれ懸濁した。
【０１８９】
ＩＨＯＧ合成反応溶液：１００ ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ （ｐＨ ８．５）， ３００ ｍＭ インドールピルビン酸, ７５０ ｍＭ ピルビン酸ナトリウム, １ ｍＭ ＭｇＣｌ2， ５ ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．５）, （６Ｎ ＫＯＨにてｐＨを調整）
【０１９０】
ＰＨＯＧ合成反応溶液：１００ ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ （ｐＨ ８．５）， ３００ ｍＭ フェニルピルビン酸， ７５０ ｍＭ ピルビン酸ナトリウム， １ ｍＭ ＭｇＣｌ2， ５ ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８.５）， （６Ｎ ＫＯＨにてｐＨを調整）
【０１９１】
ＩＨＯＧ合成反応液は３７℃で２４時間、ＰＨＯＧ反応液は３７℃で６時間、それぞれインキュベートした後に生成したＩＨＯＧあるいはＰＨＯＧを定量し、さらに反応生成物の４位の不斉についても解析した。結果を表７に示す。作製した変異型ＰｔＡＬＤ発現株において、ｐｔｒｐＰｔＡＬＤ導入株（親酵素発現株）と比較して４Ｒ-ＩＨＯＧあるいは４Ｒ-ＰＨＯＧの選択性の向上が認められた。
【０１９２】
【表７】
0004604524.tif 000012
【０１９３】
〔実施例５〕  Ｒ３７Ｙ／Ｌ９９Ｋ変異型アルドラーゼによるＩＨＯＧ合成
ＬＢ−ａｍｐ平板培地で３７℃、１６時間培養したＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９ ／ ｐｔｒｐＲ３７Ｙ／Ｌ９９Ｋ菌体を一白金耳かきとり、５０ ｍｌのＬＢ−ａｍｐ培地を含む５００ｍｌ容フラスコ２０本に接種し、３７℃で１６時間振とう培養した。得られた培養液から遠心分離により集菌し、バッファーＡ（２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ-ＫＯＨ（ｐＨ７．６））に懸濁して洗浄した後、再度遠心分離にて集菌した。遠心分離にて調製した菌体(湿菌体重量で約５ｇ)を、以下の組成の反応液５００ｍｌに懸濁した。
【０１９４】
ＩＨＯＧ合成反応溶液：５０ ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ （ｐＨ ８．５）， ２００ ｍＭ インドールピルビン酸， ５００ ｍＭ ピルビン酸ナトリウム， １ ｍＭ ＭｇＣｌ2， ５ ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．５）， （６Ｎ ＫＯＨにてｐＨ ８．５に調整）
【０１９５】
菌体を懸濁した反応液にアルゴンガスを通気し、以後、アルゴンガス雰囲気下で反応を実施した。反応は３７℃で攪拌しながら、２１時間行った。反応終了後、遠心分離により除菌してアルドール反応液４９５ ｍｌを得た。
【０１９６】
〔実施例６〕  アルドール反応液のオキシム化および４Ｒ-ＩＨＯＧ−oximeの単離
実施例５で取得したアルドール反応液に、８Ｎ水酸化ナトリウム水溶液にてｐＨ値を９に保ちながら、ヒドロキシルアミン塩酸塩２７．１ｇ（３９１ｍｍｏｌ）を加え、５℃にて２０時間攪拌した。得られた反応液中のＩＨＯＧ−oxime量をＨＰＬＣ分析にて定量した。その結果、反応液中に２６ｍｍｏｌの４−ヒドロキシ−４−（３−インドリルメチル）−２−ヒドロキシイミノグルタル酸（ＩＨＯＧ−oxime）が生成した。４位の不斉について分析を行ったところ、４Ｒ−ＩＨＯＧ−oximeが２１．３ｍｍｏｌ、４Ｓ−ＩＨＯＧ−oximeが４．７ｍｍｏｌ生成しており、ｅ．ｅ．＝６４．２%で４Ｒ体が優先的に生成していることを確認した。
【０１９７】
濃塩酸を用いて得られた反応液のｐＨ値を２にし、有機物を酢酸エチルで抽出した。有機層を濃縮して残渣を得た。残渣に２８％アンモニア水２０ｍｌ及び水１５ｍｌを添加し、２−プロパノール１７０ｍｌを加えて結晶化を行い、４−ヒドロキシ−４−（３−インドリルメチル）−２−ヒドロキシイミノグルタル酸の２アンモニウム塩１１．１８ｇ(湿重量)を結晶として得た。得られた結晶を６０ｍｌの水に溶解させた後に、２−プロパノール２００ｍｌを加えて再結晶を行った。再結晶の操作を２回実施し、４．５４ｇ (１３．４ｍｍｏｌ)のＩＨＯＧ−oxime・２アンモニウム塩を得た。得られた結晶の４位の不斉について分析を行ったところ、４Ｒ体としてのｅ．ｅ．値が９９．７％であり、高純度の４Ｒ−ＩＨＯＧ−oxime・アンモニウム塩を２−プロパノールからの晶析により単離・取得することができた。
【０１９８】
〔実施例７〕  ４Ｒ-ＩＨＯＧ−oximeの化学的還元による４Ｒ−モナティンの生成
実施例６で得た（４Ｒ）−４−ヒドロキシ−４−（３−インドリルメチル）−２−ヒドロキシイミノグルタル酸のアンモニウム塩４．３９ ｇ（１２．９ｍｍｏｌ）を２８％アンモニア水４５ ｍｌに溶解し、５％ロジウム炭素（５０％含水品）２．３１ ｇを加えて２５℃にて１ＭＰａの水素圧で反応を行った。２４時間後に触媒を濾過し（０．２ミクロンフィルター）、その濾過液に炭酸カリウムを溶解した。その溶解液を濃縮し、得られた濃縮物１０．９ ｇに水６．７ ｍｌ及びエタノール１５ ｍｌを加え２５℃で撹拌し、更にエタノール２０ ｍｌを３時間かけて滴下した後。２５℃で２０時間攪拌した。
【０１９９】
得られた湿結晶３．２６ ｇを水４ ｍｌに溶解し、エタノール８ ｍｌを添加した後、更にエタノール１７ｍｌを３時間かけて滴下した。このエタノール溶液を１５℃まで４時間かけて冷却した後、１５℃で１０時間攪拌した。得られた湿結晶２．３６ ｇを減圧乾燥し、目的とする（２Ｒ，４Ｒ）−モナティンのＫ塩１．９ ｇを得た。
【０２００】
〔実施例８〕  Pseudomonas taetrolens ＡＴＣＣ４６８３株由来アルドラーゼの組換え酵素の精製
P. taetrolens ＡＴＣＣ４６８３由来アルドラーゼ（以下、ＰｔＡＬＤ）を高発現させたＥ．ｃｏｌｉの可溶性画分から組換えＰｔＡＬＤの精製を以下の通り行った。アルドラーゼ活性測定は、ＰＨＯＧを基質としたアルドール分解活性を以下の条件で測定した。
【０２０１】
反応条件：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２ｍＭ ＰＨＯＧ、０．２ｍＭ ＮＡＤ、０．２ｍＭ Ｋｐｉ、１ｍＭ ＭｇＣｌ2、１６ Ｕ／ｍｌ lactate dehydrogenase、３μｌ酵素／６００μｌ反応液、３０℃、３４０ｎｍの吸光度を測定
【０２０２】
(1) 可溶性画分の調製：
ＬＢ−ａｍｐ平板培地で３７℃、１６時間培養したＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９ ／ ｐｔｒｐＡＬＤに菌体を一白金耳かきとり、３ｍｌのＬＢ−ａｍｐ培地を含む試験管に接種し、３７℃で１６時間振とう培養した。該培養液０．５ｍｌをＬＢ−ａｍｐ培地５０ｍｌを含む５００ｍｌ容フラスコ１０本に接種し、３７℃で１６時間振とう培養した。得られた培養液から遠心分離により集菌し、バッファーＡ（２０ｍＭ Hepes-ＫＯＨ（ｐＨ７．６））に懸濁して洗浄した後、再度遠心分離にて集菌した。得られた洗浄菌体を２５ｍｌのバッファーＡに懸濁し、４℃で３０分間超音波破砕した。破砕液を遠心分離（ｘ８０００ｒｐｍ、１０分間×２回）により菌体残渣を除き、得られた上清を粗抽出画分とした。
【０２０３】
（2）陰イオン交換クロマトグラフィー：Q-Sepharose FF
上記の粗抽出画分２３ｍｌをバッファーＡで平衡化した陰イオン交換クロマトグラフィーカラムQ-Sepharose FF ２６/１０（ファルマシア社製、ＣＶ＝２０ｍｌ）に供して担体に吸着させた。担体に吸着しなかったタンパク質（非吸着タンパク質）をバッファーＡを用いて洗い流した後、ＫＣｌ濃度を０Ｍから０．７Ｍまで直線的に変化させて（total １４０ｍｌ）吸着したタンパク質の溶出を行った。各溶出画分についてＰＨＯＧアルドラーゼ活性を検出したところ約０．５Ｍ相当の画分にＰＨＯＧアルドラーゼ活性のピークを検出した。
【０２０４】
(3)  疎水性クロマトグラフィー ：Phenyl Sepharose HP HR 16/10
アルドラーゼ活性が検出された溶液をバッファーＢ（２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ７．６）、１Ｍ硫酸アンモニウム、ｐＨ７．６）に対して４℃で一晩透析し、１００００ｒｐｍで１０分間遠心分離した上清を０．４５μｍのフィルターで濾過した。得られた濾液を、バッファーＢで平衡化した疎水性クロマトグラフィーカラムPhenyl Sepharose HP HR 16/10（ファルマシア社製）に供した。この操作によりアルドラーゼは担体に吸着した。
【０２０５】
担体に吸着しなかった非吸着タンパク質をバッファーＢを用いて洗い流した後、硫酸アンモニウム濃度を１Ｍから０Ｍまで直線的変化させてアルドラーゼを溶出させた。得られた各溶出画分についてアルドラーゼ活性を測定し、硫酸アンモニウム濃度がおよそ０．２Ｍの溶出位置にアルドラーゼ活性が認められた。
【０２０６】
以上のカラムクロマト操作により精製した画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供したところ、約２５ｋＤａに相当する位置にＣＢＢ染色で単一なバンドとして検出された。取得した組換えＰｔＡＬＤ溶液はバッファーＡに対して４℃で一晩透析した。上記の操作により、３５０Ｕ／ｍｌのＰｔＡＬＤ溶液を１７ｍｌ取得した。
【０２０７】
〔実施例９〕  ＰｔＡＬＤの結晶化
実施例８で得られたＰｔＡＬＤの精製酵素溶液を、限外ろ過セントリプレップ１０（分画分子量１０ｋＤａ）を用いて４℃で濃縮した。得られた濃縮酵素溶液（２０．３ ｍｇ／ｍｌ）を用いて、ハンプトンリサーチ社のcrystal screenキットを使用して、結晶化条件を探索した。各種沈殿剤溶液２ＬとＰｔＡＬＤ溶液２Ｌとを混合し、ｓｉｔｔｉｎｇ ｄｒｏｐ蒸気拡散法により結晶化を試みた。その結果、１Ｍ ammomium phosphate, ０．１Ｍ sodium citrate (ｐＨ ５．６)を沈殿剤として４℃の条件で、２〜３日で０．１ ｍｍ×０．１ ｍｍ×１ ｍｍの柱状晶を取得した。
【０２０８】
また、ＰｔＡＬＤとＰＨＯＧあるいはＩＨＯＧ−oximeとの複合体での結晶を採取した。なお、ＰＨＯＧおよびＩＨＯＧ−oximeは、後述の参考例１および参考例２に記載の方法によって取得した。濃縮酵素溶液（２０ ｍｇ／ｍｌ）２Ｌ、上記の沈殿剤溶液２Ｌ、および１０ｍＭのＰＨＯＧ溶液またはＩＨＯＧ−oxime／２ＮＨ3溶液１Ｌを混合し、ｓｉｔｔｉｎｇ ｄｒｏｐ蒸気拡散法により結晶化し、４℃で２〜３日インキュベートし、共結晶を得た。
【０２０９】
〔実施例１０〕  ＰｔＡＬＤネイティヴ結晶のＸ線結晶構造解析
ＰｔＡＬＤの結晶は、常温測定では、Ｘ線損傷により結晶が劣化し、徐々に分解能が下がるため、低温条件下でのＸ線回折強度測定を行った。結晶を、２５％のグリセロール及び１．５Ｍ リン酸アンモニウムを含む０．１５Ｍクエン酸-ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．６）に移した後、−１７３℃の窒素ガスを吹き付け、急速冷却した。文部科学省高エネルギー加速器研究機構放射光実験施設のビームライン６Ｂに設置された(株)リガク製のＸ線回折装置Ｒ−ＡＸＩＳ Ｖ＋＋を用いて、ＰｔＡＬＤネイティヴ結晶のＸ線回折データを収集した。Ｘ線の波長は１．０Åに設定し、結晶からイメージングプレート検出器までの距離は１８０ｍｍとした。１フレームのイメージングプレートに対しては振動角０．８°で１２０秒間露光し、１５０フレーム分のデータを集めた。結晶学的パラメータは、空間群がＰ６3２２、格子定数がａ＝９４．３８Å、ｃ＝１１１．４９Åとなった。非対称単位には１個のアルドラーゼ分子が含まれており、結晶の水分含有率は６０％である。結晶は１．５Å程度まで回折した。(株)リガク製のプログラムCrystalClearを用いて、データを処理した。データの質の指標であるＲmergeの値は，４０．０〜１．５Å分解能で０．０９７、最外郭シェルの１．５５〜１.５０Å分解能で０．２６０となった。データの完全率は、４０．０〜１.５Å分解能で９９．２％、最外郭シェルの１．５５〜１．５０Å分解能で９９．９％となった。
【０２１０】
続いて、重金属塩類の溶液中にＰｔＡＬＤの結晶を浸すことにより、重原子誘導体結晶のスクリーニングを行った。重原子に浸漬させた結晶のＸ線回折データも、文部科学省高エネルギー加速器研究機構放射光実験施設のビームライン６Ｂに設置された(株)リガク製のＸ線回折装置Ｒ−ＡＸＩＳ Ｖ＋＋を用いて測定した。１．０ ｍＭ エチル水銀チオサリシル酸(Ethylmercurithiosalicylic acid、ＥＭＴＳ)、１．８ Ｍ リン酸アンモニウムを含む０．１８ Ｍクエン酸−ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．６）中に約１日浸漬させた結晶、２．５ｍＭ ＨｇＣｌ2、１．８ Ｍ リン酸アンモニウムを含む０．１８ Ｍクエン酸−ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．６）中に約１日浸漬させた結晶の２つが、ネイティブ結晶のデータとの差パターソン図より、良好な重原子同形置換結晶となったことが判明した。ＥＭＴＳの重原子同形置換結晶について、差パターソン図よりメジャーな重原子サイトを求めた後、この座標から計算される位相を用いて差フーリエ図を計算し、他の複数のマイナーな重原子サイトを決定した。これらの重原子サイトの座標や占有率を、タンパク質構造解析プログラムパッケージＣＣＰ４（Acta Crystallogr. Sect. D、第５０巻、第７６０〜７６３頁（１９９４））に含まれる位相決定用プログラムＭＬＰＨＡＲＥにより精密化し、初期位相を算出した。同じくＣＣＰ４に含まれる位相改良プログラムＤＭを用いて、溶媒平滑化とヒストグラムマッチングを行い、位相を改良した。改良位相に基づき、２．７Å分解能の電子密度図を計算し、Accelrys社製のコンピュータグラフィクスプログラムＱＵＡＮＴＡ上で、電子密度図を描いた。電子密度図は非常に良好で、Ｃ末端残基のＡｓｎ２２１を除く全てのアミノ酸残基を電子密度にフィットすることができた。
【０２１１】
構築した分子モデルを初期構造として、Accelrys社製のプログラムＣＮＸを用いて構造精密化を行った。１．５Å分解能までのＸ線データを用いて精密化された最終モデル（図１、図４、図５）は、ＰｔＡＬＤのＳｅｒ２からＡｌａ２２０までの全てのアミノ酸残基、１個のリン酸イオン、３４１個の水分子を含む。リン酸イオンは、基質であるピルビン酸の結合部位付近に結合している（図５）。４０．０〜１．５Å分解能の反射を用いた結晶学的信頼度因子は、Ｒcrystが１９．９％、Ｒfreeが２２．７％となった。タンパク質分子中の原子間結合距離、結合角の理想値からのずれは、根自乗平均誤差の値で、それぞれ０．００７９Å、１．６３１３°となった。プログラムＰＲＯＣＨＥＣＫ（J. Appl. Crystallogr.、第２６巻，第２８３〜２９１頁（１９９３））を用いてラマチャンドランプロットを作製したところ、グリシン以外の１８０残基の９１．７％が最も好ましい領域に、８．３％が次に好ましい領域に位置し、全ての残基が十分許容され得るペプチド結合の二面角を有することが示された。尚、ＰｔＡＬＤネイティヴ結晶の原子座標を、図９−１〜図９−２６に示した。
【０２１２】
〔実施例１１〕  ＰｔＡＬＤとＰＨＯＧとの複合体結晶のＸ線結晶構造解析
ＰｔＡＬＤとＰＨＯＧの共結晶化によって得られた結晶を、１０ ｍＭ ＰＨＯＧ、２５％ グリセロール及び１．５Ｍ リン酸アンモニウムを含む０．１５ Ｍ クエン酸−ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．６）に移した後、−１７３℃の窒素ガスを吹き付け、急速冷却した。文部科学省高エネルギー加速器研究機構放射光実験施設のビームライン６Ｂに設置された（株）リガク製のＸ線回折装置Ｒ−ＡＸＩＳ Ｖ＋＋を用いて、結晶のＸ線回折データを収集した。Ｘ線の波長は１．０Åに設定し、結晶からイメージングプレート検出器までの距離は１８０ｍｍとした。１フレームのイメージングプレートに対しては振動角０．８°で１２０秒間露光し、６０フレーム分のデータを集めた。結晶学的パラメータは、空間群がＰ６3２２、格子定数がａ＝９４．３７Å、ｃ＝１１１．６７Åとなり、ネイティヴ結晶とほぼ同型な結晶が得られた。結晶は１．８Å程度まで回折した。（株）リガク製のプログラムCrystalClearを用いて、データを処理した。データの質の指標であるＲmergeの値は、４０．０〜１．８Å分解能で０．０９７、最外郭シェルの１．８６〜１．８０Å分解能で０．２０１となった。データの完全率は、４０．０〜１.８Å分解能で９９．２％、最外郭シェルの１．８６〜１．８０Å分解能で９９．５％となった。
【０２１３】
ネイティヴ結晶の構造を元に電子密度図を計算し、Accelrys社製のコンピュータグラフィクスプログラムＱＵＡＮＴＡ上で観察したところ、隣接する２つのサブユニットの界面に、ＰＨＯＧらしい電子密度が、はっきりと存在していることが確認された。その部分にＰＨＯＧの分子モデルを構築した。タンパク質部分に関しては、ネイティブ結晶の構造から殆ど変化は無かった。引き続き、Accelrys社製のプログラムＣＮＸを用いて構造精密化を行った。１．８Å分解能までのＸ線データを用いて精密化された最終モデル（図２、図６）は、ＰｔＡＬＤのＳｅｒ２からＡｌａ２２０までの全てのアミノ酸残基、ＰＨＯＧ １分子、２９５個の水分子を含む。４０．０〜１．８Å分解能の反射を用いた結晶学的信頼度因子は、Ｒcrystが１９．８％、Ｒfreeが２４．２％となった。タンパク質分子中の原子間結合距離、結合角の理想値からのずれは、根自乗平均誤差の値で、それぞれ０．００７６Å、１．４８８３°となった。プログラムＰＲＯＣＨＥＣＫを用いてラマチャンドランプロットを作製したところ、グリシン以外の１８０残基の９３．９％が最も好ましい領域に、６．１％が次に好ましい領域に位置し、全ての残基が十分許容され得るペプチド結合の二面角を有することが示された。
【０２１４】
〔実施例１２〕  ＰｔＡＬＤとＩＨＯＧ−oximeとの複合体結晶のＸ線結晶構造解析
ＰｔＡＬＤとＩＨＯＧ−oximeの共結晶化によって得られた結晶を、１０ ｍＭ ＩＨＯＧ−oxime・２ＮＨ3，２５％ グリセロール及び１．５ Ｍ リン酸アンモニウムを含む０．１５ Ｍ クエン酸−ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．６）に移した後、−１７３℃の窒素ガスを吹き付け、急速冷却した。文部科学省高エネルギー加速器研究機構放射光実験施設のビームライン６Ｂに設置された（株）リガク製のＸ線回折装置Ｒ−ＡＸＩＳ Ｖ＋＋を用いて、結晶のＸ線回折データを収集した。Ｘ線の波長は１．０Åに設定し、結晶からイメージングプレート検出器までの距離は１８０ｍｍとした。１フレームのイメージングプレートに対しては振動角０．８°で１２０秒間露光し、１００フレーム分のデータを集めた。結晶学的パラメータは、空間群がＰ６3２２、格子定数がａ＝９４．７５Å、ｃ＝１１１．８４Åとなり、ネイティヴ結晶とほぼ同型な結晶が得られた。結晶は２．２Å程度まで回折した。（株）リガク製のプログラムCrystalClearを用いて、データを処理した。データの質の指標であるＲmergeの値は、４０．０〜２．１５Å分解能で０．０９７、最外郭シェルの２．２５〜２．１５Å分解能で０．２０３となった。データの完全率は、４０．０〜２．１５Å分解能で９８．７％、最外郭シェルの２．２５〜２．１５Å分解能で９８．７％となった。
【０２１５】
ネイティヴ結晶の構造を元に電子密度図を計算し、Accelrys社製のコンピュータグラフィクスプログラムＱＵＡＮＴＡ上で観察したところ、隣接する２つのサブユニットの界面に、ＩＨＯＧ−oximeらしい電子密度が、はっきりと存在していることが確認された。その部分にＩＨＯＧ−oximeの分子モデルを構築した。タンパク質部分に関しては、ネイティブ結晶の構造から殆ど変化は無かった。引き続き、Accelrys社製のプログラムＣＮＸを用いて構造精密化を行った。２．２Å分解能までのＸ線データを用いて精密化された最終モデル（図３、図７）は、ＰｔＡＬＤのＳｅｒ２からＡｌａ２２０までの全てのアミノ酸残基、ＩＨＯＧ−oxime１分子、２８７個の水分子を含む。４０．０〜２．２Å分解能の反射を用いた結晶学的信頼度因子は、Ｒcrystが２１．７％、Ｒfreeが２５．６％となった。タンパク質分子中の原子間結合距離、結合角の理想値からのずれは、根自乗平均誤差の値で、それぞれ０．０１４０Å、１．７５３２°となった。プログラムＰＲＯＣＨＥＣＫを用いてラマチャンドランプロットを作製したところ、グリシン以外の１８０残基の９２．８％が最も好ましい領域に、７．２％が次に好ましい領域に位置し、全ての残基が十分許容され得るペプチド結合の二面角を有することが示された。
【０２１６】
〔実施例１３〕  スレッディング法による、ＰｔＡＬＤと立体構造が類似したタンパク質の探索
以下の４種の配列に関して、Ａｃｃｅｌｒｙｓ社製のソフトウェアＩｎｓｉｇｈｔ ＩＩのヴァージョン２０００．１に含まれる、スレッディング法のプログラムSeqFoldを用いて、各タンパク質のＰｔＡＬＤに対する立体構造類似性を解析した。
【０２１７】
Pseudomonas taetrolens由来アルドラーゼ（ＰｔＡＬＤ）：  立体構造を解析した酵素
Pseudomonas coronafaciens由来アルドラーゼ（ＰｃＡＬＤ）：  ＰｔＡＬＤに対する相同性４０．６％
Arthrobacter keyseri由来アルドラーゼ（ＰｃｍＥ）：  ＰｔＡＬＤに対する相同性２８．０％
Pseudomonas ochraceae由来アルドラーゼ（ＰｒｏＡ）：  ＰｔＡＬＤに対する相同性２９．３％
【０２１８】
SeqFoldの理論、操作法等に関しては、インターネットを使って、そのホームページのアドレス(http://www.accelrys.com/doc/life/insight2000.1/SeqFold)にアクセスして、情報を得ることが出来る。SeqFoldは、個々のタンパク質の二次構造情報(αへリックス、βシート等の二次構造をどの残基がとっているかという情報)をデータベース化し、それを対象配列の二次構造予測の結果と照合して、立体構造の類似性を判定する。本解析では、まずSeqFoldのデータベースの再構築を行った。即ち、プロテインデータバンク(ＰＤＢ)に登録されている立体構造の内、配列相同性が９５%以下の６０２７構造に関する二次構造情報をデータベース化したものに、ＰｔＡＬＤの二次構造情報を追加し、それをデータベースとして用いた。ＰｔＡＬＤの二次構造情報は、Accelys社提供のコマンドスクリプトcreate_1d_prof.plを用い、ＰｔＡＬＤの立体構造座標データ(図９−１〜図９−２６)を入力データとして、プログラムInsightIIにより計算させた。ＰｔＡＬＤの二次構造情報を図１０に示す。図１０では、立体構造が決定された２〜２２０番目のアミノ酸配列を表示した。データベース中のＰｔＡＬＤのコード名は9ald_Aとした。またデータベース自体の電子ファイル名は、pdb95+9ald.1d_prfである。実際のスレッディング法の処理は、Insight IIのグラフィックス・ユーザー・インターフェイスから、プルダウンメニューHomology:SeqFold/Fold_Searchでパラメータ設定画面を呼び出し、そこにおいて各種のパラメータを設定した。その詳細を以下に記すが、これらは開発元が推奨する設定をそのまま利用したものである。
【０２１９】
Scoring_Defaults:        seqseq
Score_Parameters:        on
Substitution_Matrix:    Gonnet
Seq_Weight:            1.00
Sec_Weight:            0.6
Align_Parameters:        on
Align_Type:            Global_Local
Max_Top_Scores:        50
Max_Top_Alignments:    25
Change_Fold_Lib:              on
Fold_Library:          pdb95+9ald.1d_prf
Change_Fold_Path:      off
Quick_Z_Score:         off
Random_Alignments:     500
Gap_Parameters:          on
Struct_Gap_Open:      10.8
Struct_Gap_Extend:    0.6
Struct_Gap_Terminal:  0.6
Seq_Gap_Open:         10.8
Seq_Gap_Extend:          0.6
Seq_Gap_Terminal:     0.00
【０２２０】
スレッディング法による解析結果の一部を図１１〜図１４に示す。各グラフ（１０）において、横軸のｉｄは一次配列の相同性であり、縦軸のraw maxは、SeqFoldのスレッディング法評価関数の１つであるSeqFold Total Score (raw)を略記したものである。各グラフ（１０）はSeqFold Total Score (raw)の値で上位２５個の構造についてプロットしたものであり、左端のリスト（１１）は、その上位２５構造のＰＤＢコード名である。なお、ＰｔＡＬＤの立体構造は「9ald_A_...」というコード名で示される。また、右端のリスト（１２）は左端のリスト（１１）に記載の上位２５構造のそれぞれについて、スレッディング法によって算出された評価値を示しており、このうち左端の列（Ｌｉｓｔの列）の値がSeqFold Total Score (raw)の値を示している。
【０２２１】
ＰｔＡＬＤの配列に対するスレッディング法の実施結果（図１１）においては、自身の構造に対するSeqFold Total Score (raw)が１０１６．８６という傑出して高い値を示しており、計算処理が正しく実施されていることを示すと共に、ＰｔＡＬＤが構造既知のタンパク質とは全く異なる、新規な立体構造を有していることを示唆している。
【０２２２】
一方、ＰｃＡＬＤ、ＰｃｍＥ、ＰｒｏＡについては（図１２、図１３、図１４）、配列相同性が２５％程度ある他の立体構造既知タンパク質とのSeqFold Total Score (raw)の値が１００程度であるのに対して、ＰｔＡＬＤとのSeqFold Total Score (raw)値はそれぞれ５０４．４４、３２０．７４、３６４．３４と極めて高値であり、これらのアルドラーゼが、ＰｔＡＬＤとよく似た立体構造をとっていることが示唆された。その他の評価関数を用いた評価結果と併せた総合評価値(SeqFold Total Score (bit))を以下の表８に示す。この総合評価においても、上記と同様な結論が導き出せる。ＰｔＡＬＤと類似した立体構造を有するタンパク質であると判断する際の閾値としては、SeqFold Total Score (bit)の値にして、１００程度が妥当と考えられる。
【０２２３】
【表８】
0004604524.tif 000013
【０２２４】
スレッディング法を実施すると、探索配列と、データベース中にある立体構造既知タンパク質の配列とを、アラインメントさせることができる。図１５は、ＰｔＡＬＤとPseudomonas coronafaciens由来アルドラーゼのアミノ酸配列のアラインメントを表した図である。保存されているアミノ酸残基を*で示した。また、図１６は、ＰｔＡＬＤとArthrobacter keyseri由来アルドラーゼのアミノ酸配列のアラインメントを表した図である。保存されているアミノ酸残基を*で示した。更に、図１７は、ＰｔＡＬＤとArthrobacter keyseri由来アルドラーゼのアミノ酸配列のアラインメントを表した図である。保存されているアミノ酸残基を*で示した。
【０２２５】
〔参考例１〕４−フェニルメチル−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸（ＰＨＯＧ）の合成
水酸化カリウム（純度８５％）１３．８ｇを溶解した水２５ｍｌに対し、フェニルピルビン酸５．０ｇ（３０．５ｍｍｏｌ）、オキサル酢酸１２．１ｇ（９１．４ｍｍｏｌ）を加えて室温にて７２時間反応させた。濃塩酸を用いて反応液のｐＨ値を２．２に調節し、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥を行った後に、濃縮して残渣を得た。残渣を酢酸エチルとトルエンから再結晶を行い、４−フェニルメチル−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸２．８ｇ（１１．３ｍｍｏｌ）を結晶として得た。
（ＮＭＲ測定）
1H NMR (D2O) δ：2.48（d, J=14.4 Hz, 0.18H）, 2.60 (d, J= 14.4 Hz, 0.18H) , 2.85 − 3.30 (m, 3.64H) , 7.17 − 7.36 (m, 5H)
（分子量測定）
ESI-MS 計算値 C12H12O6 = 252.23, 分析値 251.22 (MH-)
【０２２６】
〔参考例２〕４−ヒドロキシ−４−（３−インドリルメチル）−２−ヒドロキシイミノグルタル酸２アンモニウム塩(ＩＨＯＧ−oxime・２ＮＨ3)の合成
1.6 wt%水酸化ナトリウム水溶液９１７ｇに、インドール−３−ピルビン酸７３．８ｇ（３５２ｍｍｏｌ）を加えて溶解した。反応溶液を３５℃とし、３０％水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨ値を１１．１に保ちながら、５０％ピルビン酸水溶液３１０．２ｇ（１７６１ｍｍｏｌ）を２時間かけて滴下した。更に４．５時間反応させて、４−ヒドロキシ−４−（３−インドリルメチル）−２−ケトグルタル酸を含有する反応溶液を得た。これに、３０％水酸化ナトリウム水溶液にてｐＨ値を７に保ちながら、４０％ヒドロキシルアミン塩酸塩水溶液３６７．２ｇ（２１１４ｍｍｏｌ）を加え、５℃にて１７．５時間攪拌した。濃塩酸を用いて反応液のｐＨ値を２にし、有機物を酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、濃縮して残渣を得た。残渣に２８％アンモニア水６０ｍｌと２−プロパノール１３５０ｍｌから再結晶を行い、４−ヒドロキシ−４−（３−インドリルメチル）−２−ヒドロキシイミノグルタル酸の２アンモニウム塩４３．４ｇ（１４２ｍｍｏｌ：収率４０％  対インドール−３−ピルビン酸）を結晶として得た。
【産業上の利用可能性】
【０２２７】
以上のように、本発明の変異型アルドラーゼを用いることによって、ＩＨＯＧおよびＰＨＯＧを光学選択的に生成することが可能となる。本発明の変異型アルドラーゼは、モナティンの合成ルートにおけるアルドール縮合反応の段階において、効率的な不斉導入を可能とするものであり、光学活性ＩＨＯＧ、および、光学活性モナティンの製造に好適に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０２２８】
【図１】ネイティヴ結晶におけるＰｔＡＬＤサブユニットの立体構造を、リボンモデルで表した図である。
【図２】ＰｔＡＬＤとＰＨＯＧとの複合体の結晶における、６量体の立体構造であり、ＰｔＡＬＤ分子をリボンモデルで、ＰＨＯＧ分子をスペースフィリングモデルで表した図である。
【図３】ＰｔＡＬＤとＩＨＯＧ−oximeとの複合体の結晶における、６量体の立体構造であり、ＰｔＡＬＤ分子をリボンモデルで、ＩＨＯＧ−oxime分子をスペースフィリングモデルで表した図である。
【図４】ネイティヴ結晶におけるＰｔＡＬＤ ６量体の立体構造であり、構造の表面の凹凸を、図２と同じ方向で示した図である。
【図５】ネイティヴ結晶におけるＰｔＡＬＤの活性部位付近の立体構造を、ボールアンドスティックモデルで表した図である。結合しているリン酸イオンに関しては、スティックを太めにして表示してある。水素結合或は塩橋の相互作用を点線で示している。
【図６】ＰｔＡＬＤとＰＨＯＧとの複合体結晶におけるＰｔＡＬＤの活性部位付近の立体構造を、ボールアンドスティックモデルで表した図である。結合しているＰＨＯＧ分子に関しては、スティックを太めにして表示してある。水素結合或は塩橋の相互作用を点線で示している。
【図７】ＰｔＡＬＤとＩＨＯＧ−oximeとの複合体結晶におけるＰｔＡＬＤの活性部位付近の立体構造を、ボールアンドスティックモデルで表した図である。結合しているＩＨＯＧ−oxime分子に関しては、スティックを太めにして表示してある。水素結合或は塩橋の相互作用を点線で示している。
【図８】ＰｔＡＬＤ以外の他のアルドラーゼを用いて変異型アルドラーゼのアミノ酸配列を決定するためのフローチャートを示した図である。
【図９−１】ＰｔＡＬＤネイティヴ結晶の原子座標（１）を示す図である。
【図９−２】ＰｔＡＬＤネイティヴ結晶の原子座標（２）を示す図である。
【図９−３】ＰｔＡＬＤネイティヴ結晶の原子座標（３）を示す図である。
【図９−４】ＰｔＡＬＤネイティヴ結晶の原子座標（４）を示す図である。
【図９−５】ＰｔＡＬＤネイティヴ結晶の原子座標（５）を示す図である。
【図９−６】ＰｔＡＬＤネイティヴ結晶の原子座標（６）を示す図である。
【図９−７】ＰｔＡＬＤネイティヴ結晶の原子座標（７）を示す図である。
【図９−８】ＰｔＡＬＤネイティヴ結晶の原子座標（８）を示す図である。
【図９−９】ＰｔＡＬＤネイティヴ結晶の原子座標（９）を示す図である。
【図９−１０】ＰｔＡＬＤネイティヴ結晶の原子座標（１０）を示す図である。
【図９−１１】ＰｔＡＬＤネイティヴ結晶の原子座標（１１）を示す図である。
【図９−１２】ＰｔＡＬＤネイティヴ結晶の原子座標（１２）を示す図である。
【図９−１３】ＰｔＡＬＤネイティヴ結晶の原子座標（１３）を示す図である。
【図９−１４】ＰｔＡＬＤネイティヴ結晶の原子座標（１４）を示す図である。
【図９−１５】ＰｔＡＬＤネイティヴ結晶の原子座標（１５）を示す図である。
【図９−１６】ＰｔＡＬＤネイティヴ結晶の原子座標（１６）を示す図である。
【図９−１７】ＰｔＡＬＤネイティヴ結晶の原子座標（１７）を示す図である。
【図９−１８】ＰｔＡＬＤネイティヴ結晶の原子座標（１８）を示す図である。
【図９−１９】ＰｔＡＬＤネイティヴ結晶の原子座標（１９）を示す図である。
【図９−２０】ＰｔＡＬＤネイティヴ結晶の原子座標（２０）を示す図である。
【図９−２１】ＰｔＡＬＤネイティヴ結晶の原子座標（２１）を示す図である。
【図９−２２】ＰｔＡＬＤネイティヴ結晶の原子座標（２２）を示す図である。
【図９−２３】ＰｔＡＬＤネイティヴ結晶の原子座標（２３）を示す図である。
【図９−２４】ＰｔＡＬＤネイティヴ結晶の原子座標（２４）を示す図である。
【図９−２５】ＰｔＡＬＤネイティヴ結晶の原子座標（２５）を示す図である。
【図９−２６】ＰｔＡＬＤネイティヴ結晶の原子座標（２６）を示す図である。
【図１０】ＰｔＡＬＤのアミノ酸配列に対して、二次構造をアサインした図である。αへリックスを太い二重線で、βストランドを太い一重線で示してある。なお、立体構造が決定された２〜２２０番目のアミノ酸配列を表示した。
【図１１】ＰｔＡＬＤのアミノ酸配列に対する、プログラムSeqFoldによるスレッディング法の実施結果を示した図である。
【図１２】Pseudomonas coronafaciens由来アルドラーゼのアミノ酸配列に対する、プログラムSeqFoldによるスレッディング法の実施結果を示した図である。
【図１３】Arthrobacter keyseri由来アルドラーゼのアミノ酸配列に対する、プログラムSeqFoldによるスレッディング法の実施結果を示した図である。
【図１４】Pseudomonas ochraceae由来アルドラーゼのアミノ酸配列に対する、プログラムSeqFoldによるスレッディング法の実施結果を示した図である。
【図１５】ＰｔＡＬＤとPseudomonas coronafaciens由来アルドラーゼのアミノ酸配列のアラインメントを表した図である。なお、アラインメントがなされなかった、Ｎ末、Ｃ末の一部配列は表示していない。
【図１６】ＰｔＡＬＤとArthrobacter keyseri由来アルドラーゼのアミノ酸配列のアラインメントを表した図である。なお、アラインメントがなされなかった、Ｎ末、Ｃ末の一部配列は表示していない。
【図１７】ＰｔＡＬＤとPseudomonas ochraceae由来アルドラーゼのアミノ酸配列のアラインメントを表した図である。なお、アラインメントがなされなかった、Ｎ末、Ｃ末の一部配列は表示していない。
【配列表フリーテキスト】
【０２２９】
配列番号１：Pseudomonas taetrolens由来アルドラーゼＤＮＡ
配列番号２：Pseudomonas taetrolens由来アルドラーゼ
配列番号３：プライマー
配列番号４：プライマー
配列番号５：プライマー
配列番号６：プライマー
配列番号７：プライマー
配列番号８：プライマー
配列番号９：Ｒ３７Ｙ作製用プライマー
配列番号１０：Ｒ３７Ｗ作製用プライマー
配列番号１１：Ｒ３７Ｈ作製用プライマー
配列番号１２：Ｒ３７Ｐ作製用プライマー
配列番号１３：Ｒ３７Ｆ作製用プライマー
配列番号１４：Ｌ９９Ｄ作製用プライマー
配列番号１５：Ｌ９９Ｗ作製用プライマー
配列番号１６：Ｌ９９Ｙ作製用プライマー
配列番号１７：Ｌ９９Ｇ作製用プライマー
配列番号１８：Ｌ９９Ｋ作製用プライマー
配列番号１９：Ｄ１２０Ａ作製用プライマー
配列番号２０：Ｌ９９Ｅ作製用プライマー
配列番号２１：Ｌ９９Ｈ作製用プライマー
配列番号２２：Ｌ９９Ｖ作製用プライマー
配列番号２３：Pseudomonas coronafaciens由来アルドラーゼ
配列番号２４：Arthrobacter keyseri由来アルドラーゼ
配列番号２５：Pseudomonas ochraceae由来アルドラーゼ                                                                             
【図１】
0004604524.tif 000015
【図２】
0004604524.tif 000016
【図３】
0004604524.tif 000017
【図４】
0004604524.tif 000018
【図５】
0004604524.tif 000019
【図６】
0004604524.tif 000020
【図７】
0004604524.tif 000021
【図８】
0004604524.tif 000022
【図９−１】
0004604524.tif 000023
【図９−２】
0004604524.tif 000024
【図９−３】
0004604524.tif 000025
【図９−４】
0004604524.tif 000026
【図９−５】
0004604524.tif 000027
【図９−６】
0004604524.tif 000028
【図９−７】
0004604524.tif 000029
【図９−８】
0004604524.tif 000030
【図９−９】
0004604524.tif 000031
【図９−１０】
0004604524.tif 000032
【図９−１１】
0004604524.tif 000033
【図９−１２】
0004604524.tif 000034
【図９−１３】
0004604524.tif 000035
【図９−１４】
0004604524.tif 000036
【図９−１５】
0004604524.tif 000037
【図９−１６】
0004604524.tif 000038
【図９−１７】
0004604524.tif 000039
【図９−１８】
0004604524.tif 000040
【図９−１９】
0004604524.tif 000041
【図９−２０】
0004604524.tif 000042
【図９−２１】
0004604524.tif 000043
【図９−２２】
0004604524.tif 000044
【図９−２３】
0004604524.tif 000045
【図９−２４】
0004604524.tif 000046
【図９−２５】
0004604524.tif 000047
【図９−２６】
0004604524.tif 000048
【図１０】
0004604524.tif 000049
【図１１】
0004604524.tif 000050
【図１２】
0004604524.tif 000051
【図１３】
0004604524.tif 000052
【図１４】
0004604524.tif 000053
【図１５】
0004604524.tif 000054
【図１６】
0004604524.tif 000055
【図１７】
0004604524.tif 000056
【配列表】
0004604524000001.app