(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＤＥ４Ｄ活性を調節するためのＰＤＥ４Ｄに相補的な酸抵抗性ポリマーであって、
２’−Ｏ−メチル修飾を含む骨格構造を有する核酸を含み、
前記ポリマーは、逆塩基により３’および５’末端をブロックされており、かつ、前記核酸は、配列番号３２からなる配列からなるポリマー。
【請求項２】
前記ポリマーが、ＰＤＥ４ＤのＤＮＡ配列にハイブリダイゼーションする請求項１に記載のポリマー。
【請求項３】
前記ポリマーが、ＰＤＥ４ＤのｍＲＮＡにハイブリダイゼーションする請求項１に記載のポリマー。
【請求項４】
ポリマーが７未満のｐＨを有するようにプロトン付加される請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリマー。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリマーと、製薬学的に許容されうる担体とを含む製薬学的組成物。
【請求項６】
ポリマーが７未満のｐＨを有するようにプロトン付加される請求項５に記載の製薬学的組成物。
【請求項７】
薬剤としての使用のための請求項１〜４のいずれか１項に記載の１以上の酸抵抗性ポリマー。
【請求項８】
非経口投与、経口投与、静脈内投与または局所投与に適した請求項１に記載のポリマー。
【請求項９】
経口投与に適した請求項１に記載のポリマー。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
[技術分野]
酵素ホスホジエステラーゼ(PDE)は、アデニル酸シクラーゼおよびグアニル酸シクラーゼと共に細胞のサイクリックAMPおよびサイクリックGMPの適正なバランスを維持することを担う酵素である。多数の別個のホスホジエステラーゼ（PDE1〜PDE9）が存在し、そのほとんどは、細胞分布、cAMPまたはcGMPの加水分解に対する特異性、種々の化合物による選択的な阻害並びにカルシウム、カルモジュリン、cAMPおよびcGMPによる調節に対する特異性が異なることがある2つ以上のアイソザイム変種またはスプライス変種として存在する(J. A. Beavo in Cyclic Nucleotide Phosphodiesterases: Structure, Regulation and Drug Action. Multiple Phosphodiesterase Isozymes: Background, Nomenclature, and Implications. Eds. Beavo, J. and Houslay, M. D., John Wiley and Son, New York, 1990, pp. 3-15 and T. J. Torphy et al., "Novel Phosphodiesterases Inhibitors for the Therapy of Asthma", Drug News & Prospective, 6(4) May 1993, pp. 203-214)。cAMPに特異的であるPDE4ファミリーは少なくとも4つのアイソザイム変種(a〜d)および多数のスプライス変種を含む（Houslay, M. D., et al. in Advances in Pharmacology 44, Eds. J. August et al., p.225, 1998）。総合的には、細胞特異的パターンにおいて発現される、数多くのプロモーターによって調節される20を超えるPDE4アイソフォームが存在することができる。
【０００２】
PDE4は、脳および主要な炎症細胞に存在し、アトピー性皮膚炎または湿疹、喘息および枯草熱を含む数多くの疾患において異常に高い濃度で見出されている（AST1 Connections, Vol. 8#1(1996)p. 3 and J. of Allergy and Clinical Immunology 70: 452-457, 1982）。選択的PDE4阻害剤が求められた疾患状態には、喘息、アトピー性皮膚炎、抑うつ、再灌流傷害、敗血症性ショック、内毒素性ショック、成人呼吸窮迫症候群、自己免疫性糖尿病、尿崩症、多発梗塞性痴呆、AIDS、癌、クローン病、多発性硬化症、脳虚血、乾癬、同種移植片拒絶、再狭窄、潰瘍性大腸炎、悪液質、大脳マラリア、アレルギー性鼻・結膜炎、骨関節炎、リウマチ性関節炎、慢性気管支炎、好酸性肉芽種および自己免疫性脳脊髄炎が挙げられる(Houslay et al., 1998)。アトピー性疾患に罹患している患者では、患者の末梢血単核白血球、T細胞、肥満細胞、好中球および好塩基球において、高いPDE4活性を検出することができる。この増加したPDE活性は、cAMP濃度を低下し、これらの細胞におけるcAMPコントロールをくずし、罹患している個体の血液および組織における免疫応答が増加する。
【０００３】
PDE阻害剤は多数の機能的経路に影響し、多数の免疫経路および炎症性経路に作用し、数多くの免疫媒介物質の合成または放出に影響する(J. M. Hanifin and S. C. Chan, "Atopic Dermatitis-Therapeutic Implication for New Phoaphodiesterase Inhibitors, Monocyte Dysregulation of T Cells" in AACI News, 7/2, 1995; J. M. Hanifin et al., "Type 4 Phosphodiesterase Inhibitors Have Clinical and In Vitro Anti-inflammatory Effects in Atopic Dermatitis," J. of Invest. Der., 1996, 107: 51-56 and Cohen, V. L. in INC's 7th Annual Conference on Asthma and Allergy(Oct. 27-28, 1997)-Phosphodiesterase 4 Inhibitors: Second Generation and Beyond)。PDE4阻害剤が臨床的に使用されることにより、喘息と、アトピー性皮膚炎および枯草熱を含む他のアレルギーとの疾患モデルにおいて、強烈な活性を有する広域スペクトルの抗炎症剤であることが示された。臨床で使用されているPDE4阻害剤にはテオフィリン、ロリプラム(rolipram)、デンブフィリン(denbufylline)、CDP 840(トリアリールエタン)およびCP80633（ピリミドン）が挙げられる。PDE4阻害剤は好酸球応答に影響し、好塩基球ヒスタミン放出を低下し、IgE、PGE2およびIL10合成を低下し、抗CD3刺激性IL4産生を低下することが示されている。
【０００４】
これまでに開発されたPDE4阻害剤の全ては、中枢神経系作用および消化管作用を示す小型分子化合物であった。第1世代のPDE4阻害剤はPDE4活性を低下し、この酵素の過剰発現によって生じる数多くの炎症性問題を改善する際に有効であったが、それらの有効性は機序に関連する副作用によって制限されており、吐き気および嘔吐のためにそれらのどれも全身的に使用することができない(ASTI Connections, Vol. 8#1(1996)p.3 and Hanifin reference and Cohen, V. L. in INC's 7th Annual Conference on Asthma and Allergy(Oct. 27-28, 1997)-Phophodiesterase 4 Inhibitors: Second Generation and Beyond)。
【０００５】
オリゴヌクレオチド治療、すなわち特定の遺伝子の発現を調節するためのオリゴマーの使用は、多くの伝統的な治療の望ましくない非特定的毒性作用を生じることなく、遺伝子の発現を選択的に改変する機会を提供している。アンチセンスオリゴヌクレオチドの使用は多数の疾患を治療する強力な新規方法として登場した。これまでの多数の研究は抗ウィルス剤または抗癌剤としてのアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用に焦点を絞っている(Wickstrom, E., Ed., Prospects for Antisence Nucleic Acid Therapy of Cancer and AIDS, New York: Wilcy-Liss, 1991; Crooke, S. T., and Lebleu, B., Eds., Antisence Research and Applications. Boca Raton: CRC Press, 1993, pp. 154-182; Baserga, R., and Denhardt, D. T., 1992, Antisense Strategies, New York: The New York Academy of Sciences, Vol. 660; Murray, J. A. H., Ed., Antisense RNA and DNA, New York: Wiley-Liss, 1993, Agrawal et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 7079-7083(1988), Zamecnik et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 4143-4146(1986))。
【０００６】
有効であるが、現在のPDE4阻害剤の副作用を持たない、PDE4を調節する治療薬を開発する必要性がある。従って、PDE4を特異的に調節し、生物学的に有効であり、無毒性の治療薬が必要である。
【０００７】
[発明の概要]
本発明は、インビボまたはインビトロにおいてPDE4活性を調節する際に使用するための、末端をブロックした(end-blocked)酸抵抗性核酸ポリマー、例えば末端をブロックした(end-blocked)2'-O-アルキルおよび2'-O-アルキル-n(O-アルキル)オリゴヌクレオチドを提供する。これらのPDE4ポリマーは低いpHにおいて、実質的な安定性と、ヌクレアーゼ分解に対する実質的な抵抗性と、インビボおよびインビトロにおける結合特異性を示す。これらのポリマーのヌクレオチドはリボヌクレオチドおよび/またはデオキシリボヌクレオチドであってもよく、PDE4の発現に関与するDNA配列（例えば、コード配列、プロモーター配列、エンハンサー配列等）またはPDE4mRNAをターゲットとすることができる。これらの低毒性で、高い特異性を有し、酸安定性である末端をブロックした(end-blocked)ポリマーは、PDE4媒介性疾患の治療薬による治療のための改善された核酸構造である。3'、5'または3'および5'酸安定性で、ヌクレアーゼ抵抗性末端は、ヌクレアーゼ抵抗性を増加することによって改善された生物学的に有効性（bioavailability)を提供する。
【０００８】
本発明はまた、本発明のポリマーを含む製薬学的組成物を提供する。これらの製薬学的組成物は任意の製薬学的に許容されうる担体を含んでもよい。製薬学的組成物は、補助剤、安定化剤、フィラー等などの添加剤を含んでもよい。
【０００９】
本発明はまた、PDE4をターゲットとする治療的に有効な量のポリマーでこのような治療を必要としている患者を治療する方法を提供する。好ましい具体例において、本発明は、異なるPDE4アイソザイムをコードするmRNAsをターゲットとする一連のアンチセンスオリゴヌクレオチドポリマーを提供する。PDE4Dをターゲットとするオリゴヌクレオチドの治療の有効性は、本明細書において、予備的なヒトでの臨床試験のデータを使用して証明される。
【００１０】
本発明はまた、1つ以上のオリゴヌクレオチドポリマーを患者に投与するステップを含む、1つ以上のPDE4酵素の活性を低下する方法を含む。好ましくは、オリゴヌクレオチドはPDE4をコードするmRNAをターゲットとする。
【００１１】
酸安定性末端が酸性環境（例えば、pHが1〜2の胃）において、修飾された核酸に安定性の改善を与え、それによってインビボにおいてポリマーの生物学的有効性（バイオアベイラビリティー：bioavailability）を増加するのは本発明のポリマーの利点である。
【００１２】
それらがインビボおよびインビトロにおいてPDE4ターゲット配列に特異的に結合するのは本発明のポリマーの別の利点である。
【００１３】
末端をブロック化した核酸が、修飾された核酸で治療した被験者に無毒性であることは本発明の別の利点である。本発明の修飾された核酸、例えば2'-O-アルキルおよび2'-O-アルキル-n(O-アルキル)末端-ブロック化オリゴヌクレオチドは、通常のポリアニオンオリゴヌクレオチドの治療的投与によって通常生じる、血清および他の蛋白質への結合の増加、血清アミノ基転移酵素の刺激、血小板数の減少等などの副作用を示さない。
【００１４】
酸安定性末端が、リポソーム小胞のマクロファージおよび好中球中での酸性環境において、PDE4オリゴヌクレオチドに安定性の改善を提供するのはさらに別の利点である。
【００１５】
本発明のPDE4オリゴヌクレオチドが帯電したリポソームに容易に封入されるのはさらに別の利点である。
【００１６】
PDE4ポリマーが低い毒性である、すなわち本発明のPDE4オリゴヌクレオチドで非経口的に治療したマウスが400 mg/ml以下のLD50を示すことはさらに別の利点である。
【００１７】
本発明のこれらの目的および他の目的、利点および特徴は、以下にさらに詳細に記載する本発明の核酸およびその用途の詳細を読むと当業者に明らかになる。
【００１８】
[好ましい例の詳細な説明]
本発明を記載する前に、本発明は記載されている特定の方法、プロトコール、細胞系統、動物種または属、構築物および試薬に限定されず、従って当然のことであるが変更することが可能であることを理解されるべきである。また、本明細書において使用する用語は特定の具体例を説明する目的だけのためであり、添付の請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定する意図のものではないことも理解されるべきである。
【００１９】
本明細書および添付の請求の範囲において、単数形「a」、「and」および「the」は、内容がそうでないことを明らかに記載していない限り、複数のものを含むことが注目されるべきである。従って、例えば「構築物」の言及は複数のこのような構築物を含み、「オリゴヌクレオチド」の言及は1つ以上のオリゴヌクレオチドおよび当業者に周知のその等価物等への言及を含む。
【００２０】
そうでないことを規定しない限り、本明細書において使用する全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に通常理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載するものと同様または等価な任意の方法、装置および材料を本発明を実施または試験する際に使用することができるが、好ましい方法、装置および材料を本明細書において記載する。
【００２１】
本明細書において記載される全ての刊行物は、本明細書において記載される発明に関連して使用してもよい、刊行物に記載されている、例えば、細胞系統、構築物および方法を記載および開示する目的のために参照することで本明細書の一部をなすものとする。上記および本文中に論ぜられている刊行物は、本願の提出日以前にそれらの開示内容が単に提供されているだけのものである。発明者が従来の発明によってなされたこのような開示より先行するという権利を得ないことを自認すると解釈されるべきものは本明細書にはない。
【００２２】
本明細書において論ぜられる刊行物は、本願の提出日以前にその開示のためだけに提供されている。本発明が従来の発明によってこのような刊行物より先行するという権利を得ないことを自認すると解釈されるべきものは本明細書にはない。さらに、提供される刊行物の刊行日は、個々に確認する必要がある場合もある実際の刊行日と異なる場合もある。
【００２３】
[定義]
本明細書において交換可能として使用される「核酸」および「核酸分子」という用語は、ヌクレオチド、すなわちリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドまたは両方を含む分子をいう。この用語はリボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドのモノマーおよびポリマーを含み、リボヌクレオチドおよび/またはデオキシリボヌクレオチドは、ポリマーの場合は5'から3'への結合を介して互いに結合される。しかし、結合は、例えば5'から2'への結合を含む核酸を含む核酸合成分野に周知の結合のいずれを含んでもよい。核酸分子に使用されるヌクレオチドは天然に存在しても、または天然に存在する塩基対と塩基対関係を形成することができる合成によって製造される類似物であってもよい。塩基対関係を形成することができる非天然型塩基の例には、アザおよびデアザピリミジン類似物、アザおよびデアザプリン類似物並びにプリンおよびピリミジン環の炭素および窒素原子の1つ以上が酸素、硫黄、セレン、リン等のようなヘテロ原子によって置換された他のヘテロ環状塩基類似物が挙げられるが、それらに限定されない。
【００２４】
本明細書において使用される「オリゴヌクレオチド」という用語は、約1〜約100個のヌクレオチド、さらに好ましくは1〜80個のヌクレオチド、よりさらに好ましくは約4〜約35ヌクレオチドを含む核酸分子をいう。本明細書において使用される「オリゴヌクレオチドポリマー」という用語は、約1〜約100個のヌクレオチド、さらに好ましくは約1〜80個のヌクレオチド、よりさらに好ましくは約4〜約35ヌクレオチドを有する本明細書のポリマーをいう。
【００２５】
本明細書において使用される「PDE4オリゴヌクレオチド」という用語は、PDE4発現または活性に影響を与える配列をターゲットにするオリゴヌクレオチドをいう。これらには、PDE4DNAコード配列、PDE4DNAプロモーター配列、PDE4DNAエンハンサー配列、PDE4をコードするmRNA等が挙げられるが、それらに限定されない。
【００２６】
本明細書において使用される「修飾されたオリゴヌクレオチド」および「修飾された核酸分子」という用語は、核酸塩基、糖部分、ヌクレオシド間リン酸結合およびジアミン、コレステリルまたは他の親油性基などの付加置換基を有する分子の全てまたはいずれかの天然分子構造の分子レベルでの1つ以上の化学的修飾、またはこれらの部位の修飾の組み合わせを有するオリゴヌクレオチドを含む核酸をいう。ヌクレオシド間リン酸結合は、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、ホスホールアミデート、シロキサン、カルボネート、カルボキシメチルエステル、アセトアミデート、カルバメート、チオエーテル、架橋ホスホーアルアミデート、架橋メチレンホスホネート、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホロジチオネート、架橋ホスホロチオエートおよび/またはスルホンインターヌクレオチド結合または3'-3'、5'-2'もしくは5'-5'結合、並びに（混合骨格修飾オリゴヌクレオチドを生じる）このような同様の結合の組み合わせであってもよい。修飾はオリゴヌクレオチド分子の内部（1つまたは反復）または末端部であってもよく、コレステリル、アミノ基と末端リボースとの間の種々の数の炭素を有するジアミン化合物、対向鎖または関連酵素または他の蛋白質に切断または架橋するデオキシリボースおよびリン酸修飾などの、ヌクレオシド間リン酸結合の分子への付加を含んでもよい。リボース-ジアルデヒドなどの求電子基は、蛋白質などのリジル残基のεアミノ基に共有結合すると思われる。オリゴマーに結合するn-エチルマレイミドなどの求核基は、mRNAの5'側末端または別の求電子部位に共有結合すると思われる。修飾されたオリゴヌクレオチドという用語は、そのいずれもが5'〜3'結合を介して共に結合する、2'-置換リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドモノマーなどの糖部分の修飾を含むオリゴヌクレオチドも含む。修飾されたオリゴヌクレオチドはまた、配列のターゲット特異性が維持されるRNAまたはモルホリノ修飾の骨格を含んでもよい。
【００２７】
本明細書において使用される「核酸骨格（nucleic acid backbone) 」という用語は、分子中でヌクレオチドを結合する化学的部分の構造をいう。これは、化学的に結合しているヌクレオチドのいずれかおよび全ての手段から形成される構造を含んでもよい。本明細書において使用される修飾された骨格は、ヌクレオチド間の化学結合の修飾、並びに安定性および親和性を増強するために使用することができる、糖構造の修飾などの他の修飾を含む。例えば、塩基が天然のbアノマーに対して逆転しているデオキシリボースのaアノマーを使用することができる。好ましい具体例において、糖基の2'-OHを、親和性を含むことなく、分解に抵抗する2'-O-アルキルまたは2'-O-アルキルn(O-アルキル)に変更することができる。
【００２８】
本明細書において交換可能として使用される「酸性化（acidification)」および「プロトン付加されたまたは酸性化」という用語は、核酸のプロトン受容部位にプロトン（または正の水素イオン）を添加する過程をいう。プロトン受容部位には核酸の塩基構造のアミン基およびホスホジエステル結合のリン酸が挙げられる。pHが低下すると、プロトン付加されるこれらのアクセプター部位の数は増加して、核酸はより高くプロトン付加または酸性化される。
【００２９】
「プロトン付加された核酸または酸性化された核酸」という用語は、約16 A260/mlの濃度で水に溶解したとき、生理的なpHより低いpH、すなわち約pH7より低いpHを有する核酸をいう。修飾された核酸、ヌクレアーゼ抵抗性核酸およびアンチセンス核酸はこの定義に含まれると意味される。一般に、核酸の反応性部位にプロトンを付加することによって核酸をプロトン付加または酸性化するが、核酸のpHを低下する他の修飾を使用することもでき、この用語によってふくまれることが意図される。
【００３０】
本明細書において使用される「末端をブロック化した（end-blocked)」という用語は、例えばヌクレアーゼ作用による選択したヌクレオチドの分解を防止する分子レベルでの化学的修飾を有する核酸をいう。化学的修飾が核酸の必須部分、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチドのコード領域を保護するように、この化学的修飾は位置付けされる。末端ブロックは3'末端ブロックまたは5'末端ブロックであってもよい。例えば、3'末端ブロックは分子の最も3'-側の位置であっても、または3'末端の内側であってもよいが、ただし、それは核酸の必須配列の3'側である。
【００３１】
「実質的にヌクレアーゼ抵抗性である」という用語は、天然に存在する核酸または未修飾の核酸と比較したとき、ヌクレアーゼ分解に抵抗性である核酸をいう。本発明の修飾された核酸は、未修飾のものと比較して少なくとも1.25倍ヌクレアーゼ分解に対する抵抗性が大きく、さらに好ましくは少なくとも2倍抵抗性が大きく、よりさらに好ましくは少なくとも5倍抵抗性が大きく、最も好ましくは未修飾のものと比較して少なくとも10倍抵抗性が大きい。このような実質的にヌクレアーゼ抵抗性である核酸には、2'-ハロゲン、2'-O-メチル、2'-O-アルキル、2'-O-アルキル-n(O-アルキル)、3'-ハロゲン、3'-O-アルキル、3'-O-アルキル-n(O-アルキル)、ホスホジエステル結合、ホスホトリエステル結合、ホスホールアミデート結合、シロキサン結合、カルボネート結合、カルボキシメチルエステル結合、アセトアミデート結合、カルバメート結合、チオエーテル結合、架橋ホスホーアルアミデート結合、架橋メチレンホスホネート結合、ホスホロチオエート結合、メチルホスホネート結合、ホスホロジチオネート結合、モルホリノ、架橋ホスホロチオエート結合、スルホンインターヌクレオチド結合、3'-3'結合、5'-2'結合、5'-5'結合、2'-デオキシ-エリスロペントフラノシル、2'-フルオロ、2'-O-アルキルヌクレオチド、2'-O-アルキル-n(O-アルキル)ホスホジエステル、モルホリノ結合、p-エトキシオリゴヌクレオチド、PNA結合、p-イソプロピルオリゴヌクレオチドまたはホスホールアミデート、スルフィド結合、スルホキシド結合、スルファメート結合、スルファミド結合、ホルムアセタール/ケタール結合、チオホルムアセタール結合、キラルリン結合、アミノアルキルホスホロチオアミデートおよび4残基結合またはこれらの骨格のキメラ変種を有する核酸が挙げられるが、それらに限定されない。
【００３２】
本明細書において使用される「実質的に酸抵抗性である(substantially acid resistant)」という用語は、未修飾の核酸と比較したとき、酸分解に対して抵抗性である核酸をいう。典型的には、核酸の相対的な酸抵抗性は、抵抗性核酸の分解の割合を未修飾のもの（すなわち、「通常の」骨格、塩基およびホスホジエステル結合を有する対応する核酸）の分解の割合と比較することによって測定される。抵抗性である核酸は、好ましくは、未修飾のものと比較して、酸分解に対して少なくとも1.5倍抵抗性が大きく、少なくとも2倍抵抗性が大きく、よりさらに好ましくは少なくとも5倍抵抗性が大きく、最も好ましくは少なくとも10倍抵抗性が大きい。
【００３３】
本明細書において使用される「ポリマー」という用語は、1)修飾された核酸骨格および2)分子の末端部分または末端付近の少なくとも1つの末端ブロックを有する核酸またはオリゴヌクレオチド分子をいう。
【００３４】
本明細書において使用される「LD50」という用語は、処理した全ての実験動物において50パーセント致死にいたる作用物質の用量である。これは、通常、経口、非経口等などの侵襲的投与をいうが、作用物質の局所適用などの侵襲性の低い投与方法を使用して毒性点まで適用することもできる。
【００３５】
本明細書において使用される「アルキル」という用語は、メチル、エチル、プロピル、tert-ブチル、n-ヘキシル等などの1-6炭素原子を含有する分岐または未分岐の飽和炭化水素をいう。
【００３６】
本明細書において使用される「感受性」という用語は、関心のある核酸、すなわちPDE4に相補的なオリゴヌクレオチドのような結合パートナーによる核酸の認識の相対的な強度をいう。関心のある配列に対する結合パートナーの認識は、背景配列の認識より有意に大きくなければならず、好ましくは結合パートナーの認識の強度は背景蛋白質の認識より少なくとも10倍、さらに好ましくは少なくとも100倍大きく、よりさらに好ましくは少なくとも500倍大きくなければならない。
【００３７】
本明細書において使用される「選択性」という用語は、特定の核酸配列に対する結合パートナーの優先的な結合をいう。好ましくは、選択的な結合パートナーは少なくとも10倍、さらに好ましくは100倍、よりさらに好ましくは1000倍任意の他の背景配列と比較して指定されたポリヌクレオチド配列に結合しやすい。
【００３８】
「治療」、「治療用の」等の用語は、一般に、望ましい薬理学的および/または生理学的影響を得ることを意味するために本明細書において使用される。この影響は、疾患またはその症状を完全または部分的に予防するということに関しては予防的であってもよく、および/または疾患および/または疾患に寄与する有害な影響の部分的または完全な治癒に関しては治療的であってもよい。本明細書において使用される「治療」は、哺乳類、特にヒトの疾患の任意の治療を含み、
(a)疾患の素因を有する可能性があるが、疾患に罹患しているとまだ診断されていない被験者において疾患が生じることを予防すること、
(b)疾患を阻止、すなわち疾患の発症を停止すること、
(c)疾患を軽減、すなわち疾患の寛解を生ずること
を含む。本発明は、一般に、内因性遺伝子の発現をインビボにおいて調節する核酸配列を投与することによって、患者を治療することに関する。
【００３９】
「治療的に有効な」量は、無毒性であるが、望ましい治療的影響を提供するのに十分な量の化合物を意味し、本願の場合には、その用量の修飾された核酸が治療される状態または疾患の症状の軽減、改善または予防に有効である。
【００４０】
[発明の一般的な態様]
アンチセンスの概念は十分に発展されており、数多くの異なるアンチセンス治療薬が臨床試験に導入され、臨床試験を終了している。アンチセンス治療化合物は、特定の蛋白質をコードするmRNAに相補的で、好ましくはヌクレアーゼ抵抗性であるオリゴヌクレオチドである。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、一般に、ターゲットとされる遺伝子の転写または翻訳を妨害し、それによってターゲットとされる遺伝子の発現を低下する。アンチセンスの場合に可能である特異性の大きさのために、副作用はあったとしてもかなり少ない。
【００４１】
好ましい具体例において、本発明は、実質的にヌクレアーゼ抵抗性である中性またはプロトン付加されたオリゴヌクレオチドポリマーまたは酸性化オリゴヌクレオチドポリマーを使用する。この具体例は、ホスホールチオエート結合、2'-デオキシ-エリスロペントフラノシル、2'-フルオロ、2'-O-アルキルまたは2'-アルキル-n(O-アルキル)ホスホジエステル、p-エトキシオリゴヌクレオチド、p-イソプロピルオリゴヌクレオチド、ホスホールアミデート、キメラ結合および任意の他の骨格修飾によって完全または部分的に誘導化されるオリゴヌクレオチドポリマーを含む。この具体例はまた、オリゴヌクレオチドポリマーを内因性ヌクレアーゼ活性に対して実質的に抵抗性を有するようにする他の修飾も含む。オリゴヌクレオチドポリマーをヌクレアーゼ抵抗性にする別の方法には、オリゴヌクレオチドポリマーを含むプリンまたはピリミジン塩基を共有結合により修飾することが挙げられるが、それらに限定されない。例えば、修飾された塩基を含むオリゴヌクレオチドポリマーを実質的にヌクレアーゼ抵抗性を有するように、塩基をメチル化、ヒドロキシルメチル化することができ、またはそれ以外に置換してもよい。
【００４２】
本発明のオリゴヌクレオチドポリマーのエキソヌクレアーゼ抵抗性を増強するために、核酸配列の3'側および/または5'側末端は、好ましくは、エキソヌクレアーゼブロック官能基に結合される。例えば、オリゴヌクレオチドのどちらかの末端に1つ以上のホスホチオエートヌクレオチドを配置してもよい。また、オリゴヌクレオチドポリマーのどちらかの末端に1つ以上の逆塩基を配置してもよく、または1つ以上のアルキル部分、例えばブタノール置換ヌクレオチドまたは化学基をオリゴヌクレオチドポリマーの1つ以上の末端に配置してもよい。5'側ブロック基および3'側ブロック基は1つ以上のホスホールチオエートヌクレオチド（典型的には6未満）、逆塩基結合またはアルキル、アルケニルまたはアルキニル基または置換ヌクレオチドまたは2'-O-アルキル-n(O-アルキル)を含んでもよい。ブロック基の掲載の一部には、逆塩基、ジデオキシヌクレオチド、メチルホスフェート、アルキル基、アルコール基、アリール基、コルジセビン、シトシンアラバノシド、2'-メトキシエトキシヌクレオチド、ホスホールアミデート、ペプチド結合、ジニトロフェニル基、ホスホロチオエート結合を有する2'または3'-O-メチル塩基、3'-O-メチル塩基、フルオレセイン、コレステロール、ビオチン、アクリジン、ローダミン、ソラーレン、グリセリル、メチルホスホネート、ヘキサ-エチルオキシ-グリコール、ブタノール、ヘキサノールおよび3'-O-アルキルが挙げられる。酵素-抵抗性ブタノールは、好ましくは、C4スペーサーとも呼ばれる構造OH-CH2CH2CH2CH2(4-ヒドロキシブチル)を有する。
【００４３】
典型的には、核酸の相対的ヌクレアーゼ抵抗性は、抵抗性核酸の消化の割合を未修飾のもの（すなわち、「通常の」骨格、塩基およびホスホジエステル結合を有する対応する核酸）の消化の割合と比較することによって、測定することができる。分解の割合は、全長の核酸の損失を評価するための分析HPLCを使用することによって、または任意の他の好適な方法によって（例えば、染色、オートラジオグラフィー、蛍光等を使用して逐次ゲル上の産物を可視化することによって、または光学密度のシフトを測定することによって）測定することができる。分解は、一般に、時間の関数として測定される。
【００４４】
未修飾核酸と修飾核酸の比較は、無傷の未修飾核酸の割合に対する無傷の修飾核酸の割合を判定することによって実施することができる。例えば、ヌクレアーゼに15分間暴露後に、未修飾核酸の25%(すなわち、75%分解)が無傷であり、修飾核酸の50%（すなわち、50%分解）が無傷である場合には、修飾核酸は、未修飾核酸より2倍（50%を25%で割る）ヌクレアーゼ分解に対して抵抗性であるといわれる。一般に、実質的にヌクレアーゼ抵抗性である核酸は、15分間のヌクレアーゼ暴露後に、対応する配列を有する未修飾核酸と比較して、ヌクレアーゼ分解に対して少なくとも約1.25倍抵抗性が大きく、典型的には少なくとも約1.5倍抵抗性が大きく、好ましくは約2倍抵抗性が大きく、さらに好ましくは少なくとも約5倍抵抗性が大きく、よりさらに好ましくは少なくとも約10倍抵抗性が大きい。
【００４５】
酸分解の割合は、全長の核酸の損失を評価するための分析HPLCを使用することによって、または任意の他の好適な方法によって（例えば、染色、オートラジオグラフィー、蛍光等を使用して逐次ゲル上の産物を可視化することによって、または光学密度のシフトを測定することによって）測定することができる。分解は、一般に、時間の関数として測定される。
【００４６】
未修飾核酸と修飾核酸の比較は、完全な（inatact)未修飾核酸の割合に対する完全な修飾核酸の割合を判定することによって実施することができる。例えば、低いpH環境に30分間暴露後に、未修飾核酸の25%(すなわち、75%分解)が完全であり、修飾核酸の50%（すなわち、50%分解）が完全である場合には、修飾核酸は、未修飾核酸より2倍（50%を25%で割る）ヌクレアーゼ分解に対して抵抗性であるといわれる。一般に、実質的に「酸抵抗性である」核酸は、37℃における約1.5〜約4.5のpHへの30分間の暴露後に、対応する配列を有する未修飾核酸と比較して、酸分解に対して少なくとも約1.25倍抵抗性が大きく、典型的には少なくとも約1.5倍抵抗性が大きく、好ましくは約1.75倍抵抗性が大きく、さらに好ましくは少なくとも約5倍抵抗性が大きく、よりさらに好ましくは少なくとも約10倍抵抗性が大きい。
【００４７】
核酸の酸性化はプロトン（または水素原子）を核酸の反応性部位に付加する過程である。pHが低下すると、プロトン付加される反応性部位の数は増加し、核酸はさらに高度にプロトン付加または酸性化される。核酸のpHが低下すると、その細菌阻止作用が増加する。従って、本発明の核酸は、水に溶解されたとき、pH7未満〜pH 1、好ましい具体例ではpH 6〜約1またはpH 5〜約1のpHを与えるようにプロトン付加または酸性化される。他の好ましい具体例において、溶解された核酸はpH 4.5〜約1のpHを有し、好ましい具体例では、4.0〜約1のpHを有し、より好ましい具体例では、pH 3.0〜約1のpHを有し、別の好ましい具体例では、2.0〜約1のpHを有する。
【００４８】
本発明の第1の態様は、適当なPDE4mRNA(s)の1つ以上にハイブリダイゼーションすることをターゲットとする1つ以上のオリゴヌクレオチドポリマーの治療的に有効な量を投与するステップを含むこのような治療を必要としている患者を治療する方法である。第2の態様では、本発明は、適当なPDE4mRNA(s)の1つ以上にハイブリダイゼーションすることをターゲットとする1つ以上のオリゴヌクレオチドポリマーの、PDE4酵素の1つ以上の発現を低下するのに効果的な量を投与するステップを含む、このような治療を必要としている患者を治療する方法である。好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチドは製薬学的に許容されうる担体に含有される。ターゲットとされるPDE4遺伝子配列は、PDE4遺伝子、それらのアイソザイム変種およびそれらのスプライス変種からなる群から選択される。
【００４９】
本発明の方法および組成物は、個々のPDEアイソフォームを検討する際の分析ツールとしておよび治療薬による治療の際に有用である。本発明の方法および組成物は、喘息、枯草熱、アトピー性皮膚炎、抑うつ、再灌流傷害、敗血症性ショック、毒性ショック、内毒素性ショック、成人呼吸窮迫症候群、自己免疫性糖尿病、尿崩症、多発梗塞性痴呆、AIDS、癌、クローン病、多発性硬化症、脳虚血、乾癬、同種移植片拒絶、再狭窄、潰瘍性大腸炎、悪液質、大脳マラリア、アレルギー性鼻-結膜炎、骨関節炎、リウマチ性関節炎、慢性気管支炎、好酸性肉芽種および自己免疫性脳脊髄炎を含む種々の疾患または障害を治療するのに有用である。本発明の特定の具体例は上記の疾患の治療に関する。
【００５０】
必要に応じて、本明細書に記載するオリゴヌクレオチドポリマーは、種々の生理学的担体分子を用いて製剤化することができる。本明細書に記載するオリゴヌクレオチドポリマーはまた、ターゲット細胞に流入する能力を増強する分子で複合体化することもできる。このような分子の例には、炭水化物、ポリアミン、アミノ酸、ペプチド、脂質および細胞増殖に必須の分子が挙げられるが、それらに限定されない。例えば、オリゴヌクレオチドポリマーは脂質と組み合わせることができ、得られるオリゴヌクレオチドポリマー/脂質エマルジョンまたはリポソーム懸濁液はオリゴヌクレオチドポリマーのインビボにおける半減期を特に効果的に増加することができる。陽イオン、陰イオンおよび/または中性脂質組成物またはリポソームは、一般に、参照することで本明細書の一部をなすものとする国際公開公報第90/14074号、国際公開公報第91/16024号、国際公開公報第91/17424号、特許番号第4,897,355号に記載されている。
【００５１】
または、PDEターゲットに向かうオリゴヌクレオチドポリマーはまたホスホジエステラーゼ阻害剤および抗菌剤として二重の役割において機能するようにプロトン付加または酸性化することもできる。従って、本明細書に記載する発明の別の具体例は、細胞の取り込みを増加し、リポソームへの封入を改善するようにさらにプロトン付加または酸性化されるPDE調節作用を有する治療用オリゴヌクレオチドポリマーの用途であり、結果としてそれはまた抗生物質として作用することができる。
【００５２】
また、オリゴヌクレオチドポリマーは、例えば、オリゴヌクレオチドポリマーのインビボ安定性をさらに増強し、またはそれ以外には薬理学的特性（例えば、インビボにおける半減期の延長、毒性の低下等）を増強する種々の十分に確立されている化合物または構造と複合体化することができる。
【００５３】
アンチセンスオリゴヌクレオチドポリマーの選択
アンチセンスオリゴヌクレオチドポリマーは、遺伝子またはmRNA転写物の特定の機能的ドメインをターゲットとすることができる。可能なターゲットには、調節領域、5'側非翻訳領域、翻訳開始部位、翻訳停止部位、3'側非翻訳領域、エクソン/イントロン境界およびスプライス部位並びにコード領域内部の配列が挙げられるが、それらに限定されない。
【００５４】
ターゲット遺伝子内のターゲットドメインを選択する際の第1のステップとして、ターゲット遺伝子、プレ-mRNAまたはmRNAをターゲット配列内のホモポリマーラン（列中の4以上の塩基）の存在について検討する。
【００５５】
ターゲット遺伝子を選択し、ホモポリマーランにマーキングし、ターゲットドメインを同定したら、そのドメイン内のプレ-mRNA、mRNAまたはDNA配列の領域を分析する。可能なアンチセンスターゲット部位の上流および下流の約5〜100塩基延在する配列セグメントの分析を実施する。安定と思われる二次構造の位置を20℃より高い予測された融点を有するステム-ループ構造と規定する。MacのOLIGO 4.0またはOligo Techなどの市販のソフトウェアーを使用してこの分析を実施することができる。ループ-ステム二次構造形成のためのステムハイブリダイゼーションに関与する配列を二次構造の一部と考え、アンチセンスオリゴヌクレオチドポリマーを分析および選択する目的のための構造単位として取り扱う。このターゲット選択技法の一具体例において、アンチセンスオリゴヌクレオチドポリマーは（市販の分析プログラムにより）100℃より低い予測された二次構造融点を有する遺伝子、プレ-mRNAまたはmRNAの配列をターゲットとすることができる。好ましい具体例において、二次構造融点は60℃より低くてもよい。さらに別の好ましい具体例において、二次構造融点は40℃より低くてもよい。最も好ましい具体例において、二次構造融点は20℃より低くてもよい。
【００５６】
安定なループ構造を有するまたは安定なダイマーを形成するオリゴヌクレオチドポリマー配列は避けるべきである。このターゲット選択技法の一具体例において、（市販の分析プログラムにより）100℃より低い予測二次構造融点を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドポリマーを選択する。好ましい具体例において、二次構造融点は80℃より低くてもよい。さらに好ましい具体例において、二次構造融点は60℃より低くてもよい。さらに別の好ましい具体例において、二次構造融点は40℃より低くてもよい。最も好ましい具体例において、二次構造融点は20℃より低くてもよい。アンチセンスオリゴヌクレオチドポリマーによる安定な二次または三次構造の形成は、ターゲットDNAまたはターゲットRNAに結合する能力によりおそらく完了されうる。同様に、アンチセンスオリゴヌクレオチドポリマーによるホモダイマーの形成は、ターゲットDNAまたはターゲットRNAに結合する能力により完了しうる。1塩基のホモダイマーランは、理想的には、オリゴヌクレオチドポリマー配列内では3塩基以下である。一般に、ターゲット内では、最も低い二次構造融点（ループTm）を有する、または二次構造を持たない配列が最も良好に作用する。
【００５７】
本発明の組成物としておよび本発明の方法において有用なアンチセンスオリゴヌクレオチドポリマーの配列は以下を含む。
ターゲット遺伝子      （配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）46）
ターゲットドメイン      アンチセンスオリゴヌクレオチド配列
（ヌクレオチド
位置#S)
【化１】
0004787409.tif 000002
【００５８】
ターゲット遺伝子      （配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）47）
ターゲットドメイン      アンチセンスオリゴヌクレオチド配列
（ヌクレオチド
位置#S)
【化２】
0004787409.tif 000003
【００５９】
ターゲット遺伝子      （配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）48）
ターゲットドメイン      アンチセンスオリゴヌクレオチド配列
（ヌクレオチド
位置#S)
【化３】
0004787409.tif 000004
【００６０】
ターゲット遺伝子      （配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）49）
ターゲットドメイン      アンチセンスオリゴヌクレオチド配列
（ヌクレオチド
位置#S)
【化４】
0004787409.tif 000005
【００６１】
ターゲット遺伝子      （配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）50）
ターゲットドメイン      アンチセンスオリゴヌクレオチド配列
（ヌクレオチド
位置#S)
【化５】
0004787409.tif 000006
【００６２】
ターゲット遺伝子      （配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）51）
ターゲットドメイン      アンチセンスオリゴヌクレオチド配列
（ヌクレオチド
位置#S)
【化６】
0004787409.tif 000007
【００６３】
オリゴヌクレオチドポリマーのインビボ試験
疾患の治療薬による治療に使用する場合には、アンチセンスPDEオリゴヌクレオチドポリマーまたはその混合物の適当な用量はいくつかの十分に確立されている方法のいずれかによって決定することができる。例えば、生体作用薬の体重1kgあたりの最大耐性用量またはMTDを決定するために動物の研究を通常使用する。一般に、試験する動物種の少なくとも1つは哺乳類である。当業者は、通常、ヒトを含む他の種に対する有効性のため、および毒性を回避するために用量を外挿する。また、治療用量は、疾患の重症度および宿主のサイズまたは種に応じて異なってもよい。
【００６４】
オリゴヌクレオチドポリマーは、好ましくは、経口、鼻腔内、直腸、局所、腹腔内、筋肉内、皮下、頭蓋内、真皮下、経皮、気管内方法等を介して製薬学的に許容されうる担体中で投与される。
【００６５】
例えば、局所疾患は、好ましくは、局所適用用に設計された製剤によって治療または予防される。または、ターゲットとされる疾患状態が胃または腸内にある場合には、オリゴヌクレオチドポリマーの製剤は経口投与によって提供することができる。また、喘息のような肺部位の疾患は、非経口および吸入治療による肺への好適に製剤化された形態のオリゴヌクレオチドポリマーを直接適用により治療することができる。
【００６６】
好適に製剤化されたオリゴヌクレオチドポリマーを非経口的に投与する場合には、オリゴヌクレオチドポリマーは腎臓、肝臓、脾臓、リンパ腺、副腎、大動脈、膵臓、骨髄、心臓および唾液腺に比較的高い濃度に蓄積することがある。オリゴヌクレオチドポリマーはまた、骨格筋、膀胱、胃、食道、十二指腸、脂肪および気管にはわずかにしか蓄積しない傾向もある。典型的には、大脳皮質、脳幹、小脳、脊髄、軟骨、皮膚、甲状腺および前立腺にはさらに低い濃度しか見出されない（一般に、Crooke, 1993, Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, FL）。
【００６７】
当業者は、医療従事者または患者の点から、望ましくない症状の実質的に任意の改善または予防が望ましいと考える。従って、本明細書において使用される「治療」、「治療的用途」または「医療用用途」という用語は、疾患状態または症状を治療するまたはそれ以外には疾患または他の望ましくない症状の進行をいかなるようにも予防、妨害、遅延または回復する主張されているオリゴヌクレオチドポリマーの任意の用途および全ての用途をいう。
【００６８】
好ましくは、本発明のオリゴヌクレオチドポリマーを使用して治療することができる動物宿主には、無脊椎動物、脊椎動物、鳥類、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、イヌ、ネコおよび特にヒトなどの哺乳類が挙げられるが、それらに限定されない。オリゴヌクレオチドポリマーは、治療される特定の動物に適当であるように設計される。
【００６９】
本明細書に記載する発明の別の具体例は、さらにプロトン付加または酸性化される治療用オリゴヌクレオチドポリマーの用途であり、その結果、それは抗生物質としても作用することができる。精製された核酸または粗核酸は、リン酸、硝酸、塩酸、酢酸等を含む酸でプロトン付加または酸性化することができる。例えば、酸を核酸溶液と合わせてもよく、または核酸を酸性溶液に溶解してもよい。過剰の酸はクロマトグラフィーによって、またはある場合には、核酸を乾燥することによって除去することができる。
【００７０】
当業者に周知のプロトン付加された核酸を製造するための他の方法は本発明の範囲内であると等しく考えられる。本発明の核酸をプロトン付加したら、それらを過剰な酸などの任意の望ましくない成分から分離することができる。当業者は、望ましくない成分からオリゴヌクレオチドポリマーを分離する多数の方法を知っていると思われる。例えば、プロトン付加後に、オリゴヌクレオチドポリマー溶液にクロマトグラフィーを実施することができる。好ましい具体例において、オリゴヌクレオチドポリマー溶液は、プロトン付加後に、ポリ（スチレン-ジビニルベンゼン）系樹脂カラム（例えば、Hamilton's PRPまたはPolymer Lab's PLRP）で分析される。
【００７１】
プロトン付加または酸性化した核酸は、直接使用しても、または好ましい具体例では、沈殿、逆相クロマトグラフィー、ダイアフィルトレーションまたはゲルろ過により任意の過剰の酸および塩を除去するためにさらに処理してもよい。プロトン付加されたオリゴまたは酸性化オリゴは、沈殿、凍結乾燥、溶媒留去等によって濃縮してもよい。水または生理食塩液に懸濁させたとき、本発明の酸性化した核酸調製物は、典型的には、1)酸性化過程においてどのくらいの酸が使用されるかによって決定することができるプロトン付加のレベルまたは酸性化のレベルおよび2)核酸の濃度に応じて、0.5〜4.5のpHを示す。または、核酸は、水素イオンを負荷した陽イオン交換カラムを通過させることによってプロトン付加することができる。
【００７２】
配列の独立的な方法によって、プロトン付加したオリゴヌクレオチドポリマーは抗菌作用を示すことが発見されている。本発明のプロトン付加したオリゴヌクレオチドポリマーは、水に溶解するとき、7未満から約1のpH、または好ましい具体例では、pH6〜約1もしくはpH5〜約1を生ずるようにプロトン付加または酸性化される。他の好ましい具体例において、溶解した核酸はpH 4.5〜約1のpH、または好ましい具体例では、4.0〜約1のpH、またはより好ましい具体例では、3.0〜約1のpH、または別の好ましい具体例では、2.0〜約1のpHを有する。
【００７３】
製薬学的組成物および送達
オリゴヌクレオチドポリマーは、インビボにおいて使用するために種々の生理学的担体分子を用いて製剤化することができる。例えば、オリゴヌクレオチドポリマーは脂質、カチオン型脂質またはアニオン型脂質（プロトン付加または酸性化されたオリゴヌクレオチドポリマーにとって好ましくてもよい）と組み合わせることができ、得られるオリゴヌクレオチドポリマー/脂質エマルジョンまたはリポソーム懸濁液はオリゴヌクレオチドポリマーのインビボにおける半減期を特に効果的に延長する。
【００７４】
疾患を治療薬によって治療する際に使用する場合には、PDE調節オリゴヌクレオチドポリマーまたはその混合物の適当な用量はいくつかの十分に確立されている方法のいずれかによって決定することができる。例えば、生体作用薬の体重1kgあたりの最大耐性用量またはMTDを決定するために動物研究を通常使用する。一般に、試験する動物種の少なくとも1つは哺乳類である。当業者は、通常、ヒトを含む他の種に対する有効性のため、および毒性を回避するために用量を外挿する。また、治療用量は、疾患の重症度および宿主のサイズまたは種に応じて異なってもよい。
【００７５】
プロトン付加または酸性化したオリゴヌクレオチドポリマーの使用は、カチオン型リポソームを上回る数多くの利点を有すると考えられるアニオン型脂質への封入化を容易にする（R. J. Lee and L. Huang, "Lipidic Vector Systems for Gene Transfer", in Critical Reviews in Therapeutics Drug Carrier Systems 14(2): 173-206(1997)）。具体的には、アニオン型リポソームはカチオン型リポソームより毒性が低いと思われ、非特異的取り込みが低く、特定の細胞に対して適当なリガンドでターゲット化することができる。
【００７６】
プロトン付加されたまたは酸性化オリゴヌクレオチドポリマーを使用するための好適なアニオン型脂質の例には、カルジオリピン、ジミリストイル、ジパルミトイルまたはジオレオイル、ホスファチジルコリンまたはホスファチジルグリセロール、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリンまたはホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、リソホスファチジン酸、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトールおよびコレステロールのアニオン型が挙げられるが、それらに限定されない。カチオン型、アニオン型および/または中性脂質組成物の使用は、一般に、参照することで本明細書の一部をなすものとする国際公開公報第90/14074号、国際公開公報第91/16024号、国際公開公報第91/17424号および米国特許第4,897,355号に記載されている。
【００７７】
オリゴヌクレオチドポリマーを脂質結合構造に集成することによって、好適なターゲッティング剤（例えば、特異的抗体または受容体）をオリゴヌクレオチドポリマー/脂質複合体に導入することによって、オリゴヌクレオチドポリマーを特定の細胞種にターゲット化することができる。
【００７８】
本発明のオリゴヌクレオチドポリマーを製薬学的担体と混合して含有する製薬学的組成物は従来の製剤作製技法により調製することができる。担体は、例えば、静脈内、経口、局所、エアゾール（局所または吸入療法用）、坐剤、非経口または脊髄注射のような投与に望ましい調製物の形態に応じて多種多様の形態をとることができる。
【００７９】
経口投与形態における組成物を調製する際には、例えば、経口液体製剤（例えば、懸濁液、エリキシルおよび溶液など）の場合には、水、グリセロール、オイル、香味剤、保存剤、着色剤等、または経口固形製剤（例えば、粉末、カプセルおよび錠剤など）の場合には、デンプン、糖、希釈剤、顆粒化剤、潤滑剤、結合剤、崩壊剤等などの通常の製薬学的媒体のいずれかを使用することができる。投与の容易さのために、錠剤およびカプセルは最も有利な経口投与単位形態となり、その場合には、固形の製薬学的担体が明らかに使用される。望ましい場合には、錠剤は標準的な糖衣または腸溶性であってもよい。
【００８０】
注射による非経口適用のためには、製剤は、適当な生理食塩液中に水溶性または溶解性で、製薬学的に許容されうる形態のオリゴヌクレオチドポリマーの水溶液を含んでもよい。注射用懸濁液も、適当な脂質担体、懸濁化剤、等張性を調節するための薬剤、保存剤等を使用して調製することができる。非経口的に投与可能な組成物を調製する実際の方法および被験者に投与するのに必要な調節は示されており、また当業者に明らかであり、より詳細には、例えば参照することで本明細書の一部をなすものとするRemington's Pharmaceutical science, 15th Ed., Mack Publishing Company, Easton, PA(1980)に記載されている。本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドポリマーは、オリゴヌクレオチドについて確立されている最大耐性用量(MTD)より低い濃度で非経口的に投与されるべきである。
【００８１】
局所投与のためには、担体は、クリーム、包帯、ゲル、ローション、軟膏または液体であってもよい、製剤に応じて多種多様の形態をとってもよい。
【００８２】
エアゾールは、オリゴヌクレオチドを、エチルアルコールなどの噴射剤または噴射剤と溶媒相にオリゴヌクレオチドを溶解または懸濁させることによって調製される。局所またはエアゾール形態の製薬学的組成物は、一般に、使用する特定の形態に応じて、約0.01重量%（ヌクレオチドの）〜約40重量％、好ましくは約0.02重量％〜約10重量％、さらに好ましくは約0.05重量％〜約5重量％を含有する。
【００８３】
坐剤は、オリゴヌクレオチドポリマーに、カカオオイル、カカオ脂、グリセリン、ゼラチンまたはポリオキシエチレングリコールなどの脂質基剤を混合することによって調製される。
【００８４】
本明細書に記載するオリゴヌクレオチドポリマーは、従来の治療薬を投与するために使用される実質的に任意の手段によって生体に投与することができる。動物に生体作用性化合物を送達する分野において種々の送達系が知られている。これらの系には、静脈内または筋肉内または気管内注射、鼻腔スプレー、吸入用エアゾールおよび経口または坐剤投与が挙げられるが、それらに限定されない。使用する特定の送達系は疾患の位置に依存し、疾患の位置を決定し、適当な送達系を選択することは当業者の技術の範囲内である。
【００８５】
例
当業者に本発明をどのように製造し、使用するかについての完全な開示および説明を提供するために以下の例を記載し、発明と考えられるものの範囲に限定する意図はない。使用する数（例えば、量、温度、濃度等）に関して正確さを確実にするための努力が払われているが、弱冠の実験誤差および偏差は許されるべきである。特に明記しないかぎり、部は重量部であり、分子量は平均分子量であり、温度は℃単位であり、圧力は周囲または周囲温度付近である。
【００８６】
例1: B細胞媒介性皮膚炎
抗炎症性オリゴヌクレオチドポリマー、OE-2a(配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：32)は5'側および3'側が逆Tsでブロックされた2'O-メチルRNAホスホジエステルであり、ヒトPDE4遺伝子をターゲットとする。OE-2aは35mg/ml(7.7μMolar)の濃度で約pH3の水に溶解し、重症の再発性アトピー性皮膚炎の病歴を有する37歳の男性を治療するために使用された。皮膚炎はOE-2aで特異的に消失した。また、アトピー性皮膚炎のその後の発症は完全になくなった。
【００８７】
37歳の男性は、両側の前腕の内側を完全に覆う重症のアトピー性皮膚炎で来院した。アトピー性皮膚炎は、強烈な掻痒感を伴う丘疹によって特徴づけられる慢性疾患である。炎症性応答は、Bリンパ球によるIgEの過剰な産生に関連する。より高い濃度のPDE4がアトピー性皮膚炎患者で報告されている。PDE4をターゲットとするアンチセンスオリゴヌクレオチドポリマー、OE-2aは左側の前腕の2"×3"部分に適用された。第2のオリゴ、OE-1は同じ腕の別の部分に適用された。OE-1はOE-2aと同様の塩基分布を有するが、細菌遺伝子と相同である。オリゴヌクレオチドポリマーは12時間間隔で2回適用された。
【００８８】
OE-2aは、適用した領域の皮膚炎の消失が成功した。OE-1は影響がなかった。患者は、第2回めの治療の前に、掻痒感は約6時間後OE-2aに対応する領域でなくなったと言った。
【００８９】
第2の腕の治療は、主にOE-2aを用いてこの時点で開始した。再度、12時間間隔で2回の追跡調査を実施した。患者は、6時間以内に掻痒感は全く消失したと言った。皮膚炎は、第2の治療の12時間以内に完全に消失した。
【００９０】
1年の2月から12月までこの患者のアトピー性皮膚炎の再発は見られなかったが、夏の暑さの間には患者は典型的には発作が再発する。
【００９１】
例2:T細胞媒介性皮膚炎
35 mg/ml(7.7μMolar)のOE-2aの約pH3の水溶液を、ツタウルシの一種（poison ivy）によって誘発されたT細胞媒介性接触皮膚炎の症例を治療するために使用した。皮膚炎は2回の治療で完全に消失し、罹患した患者の他の領域のその後の発疹を予防した。
【００９２】
女性は、足の裏の数箇所の領域のツタウルシの一種（poison ivy）による炎症で来院した。患者は、T細胞媒介性の種類の過敏症に関連する掻痒感を愁訴した。接触皮膚炎は、発赤、硬結および小胞形成によって特徴づけられた。抗炎症性ｐリゴOE-2aを足の裏に適用した。12時間以内に、患者は強力な掻痒感が消失したことに気づいた。OE-2aの2回めの適用により、発赤、硬結および小胞形成は消失した。OE-2aの適用が足の裏の目に見えるツタウルシの一種（poison ivy）による炎症を消失させただけでなく、患者の別の箇所でのツタウルシの一種（poison ivy）によって誘発される皮膚炎のいかなる別の発疹をも予防したことに注目することは興味深い。
【００９３】
例3:急性膨疹-潮紅反応
43.6 mg/ml(7.7μMolar)でpH7のOE-2aは、スズメバチに多数さされた数分以内に適用したとき、即時型および遅延型過敏症の療法を予防することができた。
【００９４】
昆虫にかまれたことに応答した重症の膨疹および潮紅皮膚反応の病歴を有する女性患者は、腕に多数箇所スズメバチにさされて来院した。患者は重症の疼痛を有し、ヒステリー状態であった。OE-2aを速やかに投与した。5分以内に、患者は沈静化し、疼痛は消失した。注目すべきことに、さされてから5分以内のOE-2aの投与はいかなる即時型膨疹および潮紅反応並びにいかなる遅延型反応も予防した。
【００９５】
例4:化学的に誘発された皮膚炎
OE-2aは、標準的な皮膚治療に応答しなかった化学的に誘発された接触皮膚炎の症例の治療に使用して成功した。
【００９６】
59歳の女性は、タートルネックセーターのドライクリーニング剤に反応して誘発された頸部の接触皮膚炎の症例で来院した。1ヶ月の治療経過中、女性患者はコルチゾン、抗生物質および種種の他の局所的薬剤により皮膚科医によって治療された。種々の治療は一時的な散発的な寛解しか生じず、掻痒および発赤を消失させることはなかった。この時点で、患者はOE-2aで局所的に治療された。2回の治療後に掻痒および発赤は完全に消失し、5ヶ月間再発しなかった。
【００９７】
例5:PDE4の鼻腔内投与
重症のアレルギー性鼻炎に罹患している数人の健康な男性被験者をOE-2aで治療した。男性は年齢が45歳から73歳の範囲であった。体重は175ポンドから230ポンドの範囲であった。滅菌した経鼻的スプレー容器に、通常の生理食塩液に溶解したOE-2aを含有する溶液を充填した。約300 A260/mlの濃度のオリゴヌクレオチドポリマーの生理食塩溶液を、各鼻腔に鼻腔内経路に1日2回投与した。この投与療法を3日間持続した。
【００９８】
検討の結果、3日の治療経過後、全ての被験者は全てのアレルギー性鼻炎の症状が完全に消失したことが見出された。具体的には、鼻づまりがなく、鼻汁がなく、くしゃみがなく、鼻呼吸の困難さがなく、鼻排泄物は完全に消失したようであった。被験者は、鼻炎を誘発するアレルゲンに暴露され続けたが、治療スケジュールが終了した以降も鼻炎症状のいかなるものの再発も生じなかった。結論として、生理食塩液に溶解し、経鼻スプレーを介して投与したPDE-4の鼻腔内投与は、わずか3日の治療後に健康な男性被験者のアレルギー性鼻炎を治癒し、さらなる症状の再発はないと思われた。
【００９９】
本発明は、本発明の具体的な例を参照することにより記載されているが、本発明の真の精神および範囲から逸脱することなく種々の変更を実施することができ、等価物と置換することができることが当業者によって理解されるべきである。また、特定の状況、材料、物質の組成、方法、工程段階を適合するために、本発明の目的、精神および範囲に多数の改良を加えることができる。全てのこのような改良は、本明細書に添付の請求の範囲内であることが意図されている。
【配列表】
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【図１】
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