(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一又は複数のリポタンパク質成分を含むタンパク質成分を含有する試料を分析するためのアルカリ性ｐＨでの自由溶液キャピラリー電気泳動方法において、分析用バッファーを含むキャピラリー管中に試料を導入する少なくとも一の工程を含み、上記分析用バッファーがリポタンパク質と疎水的相互作用をして電気泳動移動度を他のタンパク質成分の移動度に対して変更可能な少なくとも一のアニオン性界面活性剤系添加剤を更に含有し、バッファー中の添加剤の濃度が０．００１ｍＭから０．２ｍＭの範囲にある方法。
【請求項２】
一又は複数のリポタンパク質成分を含むタンパク質成分を含有する試料を分析するためのアルカリ性ｐＨでの自由溶液キャピラリー電気泳動方法において、分析用バッファーを含むキャピラリー管中に試料を導入する少なくとも一の工程を含み、上記分析用バッファーがリポタンパク質と疎水的相互作用をして電気泳動移動度を他のタンパク質成分の移動度に対して変更可能な少なくとも一のアニオン性界面活性剤系添加剤を更に含有し、バッファー中の添加剤の濃度が０．０１ｍＭより多く０．１ｍＭ未満である方法。
【請求項３】
電気泳動によって成分を分離し、上記成分を検出することを更に含むことを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
試料が生物学的試料であることを特徴とする、請求項１ないし３の何れか一項に記載の方法。
【請求項５】
試料が血清、溶血血液、血漿、尿又は脳脊髄液の試料である、請求項１ないし４の何れか一項に記載の方法。
【請求項６】
試料が血清成分であることを特徴とする、請求項１ないし５の何れか一項に記載の方法。
【請求項７】
成分が、アルブミン、α１-、α２-、β-又は（β１-及びβ２-）、γ-グロブリン画分であり、リポタンパク質成分がα-リポタンパク質、β-リポタンパク質及び／又はプレ-β-リポタンパク質であることを特徴とする、請求項１ないし６の何れか一項に記載の方法。
【請求項８】
上記添加剤が９を越えるｐＨでアニオン性部分と疎水性部分を含むことを特徴とする、請求項１ないし７の何れか一項に記載の方法。
【請求項９】
上記添加剤が、少なくとも１０の炭素原子を含む線形部分を有する、分岐していてもしていなくともよい少なくとも一のＣ１０からＣ２４のアルキル鎖からなる疎水性部分と、スルホネート、カルボキシレート、サルフェート及びホスフェートから選択される一又は複数の基によって構成されるアニオン性部分を含むことを特徴とする、請求項１ないし８の何れか一項に記載の方法。
【請求項１０】
上記添加剤が、Ｃ１０−Ｃ２４アルキルモノ-、ジ-、又はトリ-サルフェート、Ｃ１０−Ｃ２４アルキルモノ-、ジ-、又はトリ-スルホネート、Ｃ１０−Ｃ２４アルキルモノ-、ジ-、又はトリ-カルボキシレート、Ｃ１０−Ｃ２４アルキルモノ-、ジ-、又はトリ-ホスフェート、及びＣ１０−Ｃ２４アルキルカルボキシ-スルホネート、-サルフェート及び-ホスフェート、特にＣ１０からＣ２４のアルキルサルフェート等のアニオン性界面活性剤から選択されることを特徴とする、請求項１ないし９の何れか一項に記載の方法。
【請求項１１】
添加剤が、Ｃ１０からＣ２０のアルキルサルフェートであることを特徴とする、請求項１ないし１０の何れか一項に記載の方法。
【請求項１２】
添加剤がドデシル硫酸ナトリウムであることを特徴とする、請求項１ないし１１の何れか一項に記載の方法。
【請求項１３】
バッファー中の添加剤の濃度が０．０１ｍＭから０．０９ｍＭの範囲にあることを特徴とする、請求項１ないし１２の何れか一項に記載の方法。
【請求項１４】
バッファー中の添加剤の濃度が０．０７ｍＭのオーダーであることを特徴とする、請求項１ないし１３の何れか一項に記載の方法。
【請求項１５】
バッファーがオクタンスルホネート系添加剤を１ｍＭから１０ｍＭの範囲の濃度で上記バッファー中に更に含有することを特徴とする、請求項１ないし１４の何れか一項に記載の方法。
【請求項１６】
バッファーがオクタンスルホネート系添加剤を２．５から５ｍＭの範囲の濃度で上記バッファー中に更に含有することを特徴とする、請求項１ないし１４の何れか一項に記載の方法。
【請求項１７】
上記分析用バッファーのｐＨが９から１１の範囲にあることを特徴とする、請求項１ないし１６の何れか一項に記載の方法。
【請求項１８】
キャピラリーが溶融シリカから形成されていることを特徴とする、請求項１ないし１７の何れか一項に記載の方法。
【請求項１９】
分析用バッファーが少なくとも一のｐＨ調節剤を更に含有することを特徴とする、請求項１ないし１８の何れか一項に記載の方法。
【請求項２０】
ｐＨ調節剤が、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化ルビジウム、水酸化セシウム、水酸化フランシウム、アルキル部分に１から８の炭素原子を含む水酸化モノ-、ジ-、トリ-又はテトラ-アルキルアンモニウムから選択されることを特徴とする、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
リポタンパク質とバッファー中のα１-、α２-、β１-グロブリン画分を含む試料のタンパク質成分とリポタンパク質を電気泳動法によって分離する方法であって、上記成分を含む試料がリポタンパク質と疎水的相互作用をなし得る少なくとも一の添加剤を更に含有する分析用バッファーを含むキャピラリーを通過させられ、バッファー中の添加剤の濃度が０．００１ｍＭから０．２ｍＭの範囲にある方法。
【請求項２２】
リポタンパク質とバッファー中のα１-、α２-、β１-グロブリン画分を含む試料のタンパク質成分とリポタンパク質を電気泳動法によって分離する方法であって、上記成分を含む試料がリポタンパク質と疎水的相互作用をなし得る少なくとも一の添加剤を更に含有する分析用バッファーを含むキャピラリーを通過させられ、バッファー中の添加剤の濃度が０．０１ｍＭより多く０．１ｍＭ未満である方法。
【請求項２３】
液体試料のタンパク質成分をアルカリ性ｐＨでの自由溶液キャピラリー電気泳動法によって電気泳動分離する方法であって、上記成分を含む試料が、リポタンパク質と疎水的相互作用をなし得、少なくとも一の添加剤を更に含有する分析用バッファーを含むキャピラリーを通過させられ、添加剤が、９を越えるｐＨで負に荷電したアニオン性部分と少なくとも一のＣ１０からＣ２０のアルキル鎖を含む疎水性部分を含む化合物であり、バッファー中の添加剤の濃度が０．００１ｍＭから０．２ｍＭの範囲にある方法。
【請求項２４】
液体試料のタンパク質成分をアルカリ性ｐＨでの自由溶液キャピラリー電気泳動法によって電気泳動分離する方法であって、上記成分を含む試料が、リポタンパク質と疎水的相互作用をなし得、少なくとも一の添加剤を更に含有する分析用バッファーを含むキャピラリーを通過させられ、添加剤が、９を越えるｐＨで負に荷電したアニオン性部分と少なくとも一のＣ１０からＣ２０のアルキル鎖を含む疎水性部分を含む化合物であり、バッファー中の添加剤の濃度が０．０１ｍＭより多く０．１ｍＭ未満である方法。
【請求項２５】
分析用バッファーが硫酸ナトリウム又は硫酸リチウムを更に含有することを特徴とする、請求項１ないし２４の何れか一項に記載の方法。
【請求項２６】
少なくとも一のバッファーと、適した担体中にリポタンパク質と疎水的相互作用をなし得る少なくとも一の添加剤をまた含有し、バッファー中の添加剤の濃度が０．００１ｍＭから０．２ｍＭの範囲にあることを特徴とする、キャピラリー電気泳動用の電解質組成物。
【請求項２７】
少なくとも一のバッファーと、適した担体中にリポタンパク質と疎水的相互作用をなし得る少なくとも一の添加剤をまた含有し、バッファー中の添加剤の濃度が０．０１ｍＭより多く０．１ｍＭ未満であることを特徴とする、キャピラリー電気泳動用の電解質組成物。
【請求項２８】
少なくとも一の分析用バッファーと、１０の炭素原子を含む少なくとも一の線形鎖を有する、分岐していてもしていなくともよい少なくとも一のＣ１０からＣ２４のアルキル鎖からなる疎水性部分と、スルホネート、カルボキシレート、サルフェート及びホスフェートから選択される一又は複数の基によって構成されるアニオン性部分を含む少なくとも一の添加剤を含有し、バッファー中の添加剤の濃度が０．００１ｍＭから０．２ｍＭの範囲にあることを特徴とする、キャピラリー電気泳動用の組成物。
【請求項２９】
少なくとも一の分析用バッファーと、１０の炭素原子を含む少なくとも一の線形鎖を有する、分岐していてもしていなくともよい少なくとも一のＣ１０からＣ２４のアルキル鎖からなる疎水性部分と、スルホネート、カルボキシレート、サルフェート及びホスフェートから選択される一又は複数の基によって構成されるアニオン性部分を含む少なくとも一の添加剤を含有し、バッファー中の添加剤の濃度が０．０１ｍＭより多く０．１ｍＭ未満であることを特徴とする、キャピラリー電気泳動用の組成物。
【請求項３０】
上記添加剤が、Ｃ１０−Ｃ２４アルキルモノ-、ジ-、又はトリ-サルフェート、Ｃ１０−Ｃ２４アルキルモノ-、ジ-、又はトリ-スルホネート、Ｃ１０−Ｃ２４アルキルモノ-、ジ-、又はトリ-カルボキシレート、Ｃ１０−Ｃ２４アルキルモノ-、ジ-、又はトリ-ホスフェート、及びＣ１０−Ｃ２４アルキルカルボキシモノ-、ジ-、又はトリ-スルホネート、サルフェート及びホスフェート、特にＣ１０からＣ２４のアルキルサルフェート等のアニオン性界面活性剤から選択されることを特徴とする、請求項２６ないし２９の何れか一項に記載のキャピラリー電気泳動用の組成物。
【請求項３１】
上記添加剤が、Ｃ１０からＣ２４のアルキルサルフェートアニオン性界面活性剤及びその混合物から選択されることを特徴とする、請求項２６ないし３０の何れか一項に記載の組成物。
【請求項３２】
上記添加剤が、Ｃ１０からＣ１６のアルキルサルフェートであることを特徴とする、請求項２６ないし３１の何れか一項に記載の組成物。
【請求項３３】
添加剤がドデシル硫酸ナトリウムであることを特徴とする、請求項２６ないし３２の何れか一項に記載の組成物。
【請求項３４】
少なくとも一の分析用バッファー、及びリポタンパク質をそれが通常移動する領域を越えて、特にα１、α２及びβ１画分の領域を越えて移動させ得る、及び／又はＣ１０からＣ２０のアルキル鎖等の疎水性部分と、９を越えるｐＨで負電荷を供給するアニオン性部分を含むアニオン性界面活性剤系添加剤；及び／又はキャピラリー洗浄用の溶液、及び／又は一又は複数の適切な希釈剤及び／又は希釈セグメントを含み、バッファー中の添加剤の濃度が、場合によってはバッファーと添加剤を混合した後に、０．００１ｍＭから０．２ｍＭの範囲にある、生物学的試料中のタンパク質成分を分析するためのキット。
【請求項３５】
少なくとも一の分析用バッファー、及びリポタンパク質をそれが通常移動する領域を越えて、特にα１、α２及びβ１画分の領域を越えて移動させ得る、及び／又はＣ１０からＣ２０のアルキル鎖等の疎水性部分と、９を越えるｐＨで負電荷を供給するアニオン性部分を含むアニオン性界面活性剤系添加剤；及び／又はキャピラリー洗浄用の溶液、及び／又は一又は複数の適切な希釈剤及び／又は希釈セグメントを含み、バッファー中の添加剤の濃度が、場合によってはバッファーと添加剤を混合した後に、０．０１ｍＭより多く０．１ｍＭ未満である、生物学的試料中のタンパク質成分を分析するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
本発明は、試料中にリポタンパク質が存在する場合において、キャピラリー電気泳動法によりタンパク質及びペプチドを分離する方法並びに上記分離に使用される添加剤を含有するバッファー組成物に関する。
【０００２】
分析目的、特に診断目的での血清などの生物学的液体中のタンパク質の量の分析は知られ、通常は、ゲル電気泳動とキャピラリー電気泳動の双方を使用する電気泳動法によってタンパク質は分離される。キャピラリー電気泳動法の利点の一つは、分析に必要とされる生物学的液体が非常に少量でよいという点にある。更に、この方法を使用した分離は、分離中に試料を過度に加熱しないで高電圧を使用できるならば、非常に迅速にできる。
【０００３】
血清タンパク質を分離する場合、キャピラリー電気泳動は一般的にアルカリ性バッファーを用いて実施される。通常、得られるタンパク質特性（プロファイル）はタンパク質成分に対応する５ないし６の画分、つまり、アルブミン画分、α１-及びα２-画分、β-画分又はβ１-及びβ２-画分、及びγ-グロブリン画分を含んでいる。これらの画分の各々が一又は複数の血清タンパク質を含んでいる。
【０００４】
このような分離は、キャピラリー電気泳動及び分析用バッファー、米国再発行特許第３６０１１号、特に欧州特許出願公開第０５１８４７５号、同第１２２９３２５号又は同第１２５８７２４号に記載されたもののような技術を使用して実施することができる。
【０００５】
しかしながら、血清タンパク質の分離はしばしば満足できないものであった。
【０００６】
実際、「タンパク質成分」なる用語はここではタンパク質成分、つまり、α１-；α２-；β-又はβ１-及びβ２-；及びγ-グロブリン画分だけでなく、リポタンパク質成分、主として「高密度リポタンパク質」、「低密度リポタンパク質」及び「超低密度リポタンパク質」に対してＨＤＬ、ＬＤＬ及びＶＬＤＬとも呼ばれているα-リポタンパク質、β-リポタンパク質及びプレ-β-リポタンパク質をも意味する。α１-及びα２-グロブリン及びβ１-グロブリンに対応する特性ゾーンに出現する主としてβ-リポタンパク質及びプレ-β-リポタンパク質のようなリポタンパク質のために、特性はしばしば不正確である。
【０００７】
しかして、本出願人は、分析用バッファーに添加剤としてアニオン性界面活性剤を使用すると分離を改善することができ、特に電気泳動特性のα１-及びα２-及びβ１-グロブリン領域において純粋な特性を得ることができることを実証した。上記添加剤は、一又は複数のリポタンパク質成分、特にリポタンパク質の疎水性残基と疎水的相互作用をなし得るアニオン性界面活性剤から選択される。添加剤はリポタンパク質成分又は成分群に一又は複数の負の電荷を供給しうる。添加剤は電気泳動移動度を、他のタンパク質成分のものに対して変更し、特に低減しうる。
【０００８】
本発明に使用される上記添加剤の濃度が低い場合、つまり他の用途の場合に添加剤に用いられる濃度に対して添加剤の濃度が低い場合、キャピラリー電気泳動で得られる特性は、特にα１-及びα２-画分に関して、実施例から明らかなように、肩は別にして、非常に弱いピークを提示することがある。これは、特に高脂血血清の特性の活用に対しては非常に興味深いことであり、正常脂血試料の分析に対してもある程度の興味を等しくもたらす。
【０００９】
よって、本発明は、リポタンパク質成分又は成分群を含むタンパク質成分を含有する試料を分析するためのアルカリ性ｐＨでの自由溶液キャピラリー電気泳動方法に関し、試料は分析用バッファーを含むキャピラリー管中に導入され、上記分析用バッファーは一（又は複数）のリポタンパク質成分（群）と疎水的相互作用可能な少なくとも一のアニオン性界面活性剤系添加剤を更に含有する。上記添加剤は上記リポタンパク質成分又は成分群に一又は複数の負電荷を供給可能であり、よって電気泳動移動度を他の非脂血タンパク質成分の移動度に対して変更する。
【００１０】
一般に、上記工程には、移動によるタンパク質成分の分離と、成分の検出が続く。
【００１１】
本発明はまた分析用バッファー中に少なくともアルブミン及びα１-、α２-、及びβ１-グロブリン画分並びにリポタンパク質を含む試料のタンパク質成分を、電気泳動によって分離する方法にも関し、分析用バッファーは、リポタンパク質と疎水的相互作用をなし得る少なくとも一のアニオン性界面活性剤系添加剤を更に含有する。
【００１２】
本発明はまた液体試料のタンパク質成分をアルカリ性ｐＨでの自由溶液キャピラリー電気泳動法によって電気泳動分離する方法であって、上記成分を含む試料が、リポタンパク質と特異的に相互作用をなし得る添加剤を更に含有する分析用バッファーを含むキャピラリーを通過させられ；添加剤が、Ｃ１０からＣ２０のアルキル鎖のような疎水性部分と、９を越えるｐＨで強い負電荷を供給するアニオン部分を含むアニオン性界面活性剤でありうる方法にも関する。
【００１３】
アニオン性界面活性剤系の添加剤は、アルブミン又は他の非脂質タンパク質成分との相互作用が弱いままで、特にリポタンパク質に集中するように（ここでは「リポタンパク質特異的」と呼ぶ）、バッファー中で低濃度で使用される。そのようなリポタンパク質特異的相互作用に対しては、アニオン性タイプの界面活性剤添加剤を低濃度で使用することが好ましい。各アニオン性界面活性剤に対しては、上記濃度は、一部はリポタンパク質に対するその親和性に、一部はアルブミン又は他の非脂質タンパク質成分に対するその親和性に依存する。よって、最適な濃度は各界面活性剤によって異なる。濃度はバッファー中、１ｍＭ未満のオーダー、例えば０．００１ｍＭから０．２ｍＭのオーダー、好ましくは０．０１ｍＭより多く０．１ｍＭ未満、例えば０．０１ｍＭから０．０９ｍＭの範囲であってよい。
【００１４】
本出願人は、特にＳＤＳに対して、約０．０５ｍＭの濃度がリポタンパク質成分の十分なシフトに関与せず、０．２ｍＭを超える濃度で、特性が変わる（０．２５ｍＭでβ２画分の減少とα１画分の変形、及び０．５ｍＭの濃度で、完全に変わった特性さえ得られる）。
【００１５】
従って、リポタンパク質と特異的な疎水的相互作用をなし得る本発明のキャピラリー電気泳動分析用バッファー用の添加剤として使用される化合物は、ＭＥＣＣ（ミセル動電キャピラリークロマトグラフィー）に使用されるもののようなアニオン性界面活性剤でありうるが、臨界ミセル濃度よりも実質的に低い濃度でである。本発明において、上記化合物は上に示した自由溶液ＣＥにおいて使用され、リポタンパク質には、上記リポタンパク質の疎水性残基と上記化合物の疎水性部分の疎水的相互作用によって負の電荷が供給され、上記リポタンパク質の移動度を他のタンパク質の移動度に対して遅くする結果になる。一つの結果は、α１-、α２-、及びβ１画分の分離の改善であり、リポタンパク質はそれらが通常移動する領域、つまりα１-、α２-、及びβ１領域を越えて移動する。それらはまた欧州特許出願公開第１２２９３２５号に記載された濃度よりも低い濃度で使用される。
【００１６】
更に、本発明は、許容可能な担体（支持体）中に、少なくとも一のバッファーと、リポタンパク質をそれらが通常移動する領域を越えて、特に画分α１-、α２-、及びβ１画分を越えて移動させることが可能な上述のアニオン性界面活性剤系添加剤を含有するキャピラリー電気泳動用の電解質組成物に関する。
【００１７】
実施例に示されるように、本発明の添加剤の使用により、リポタンパク質をその通常の領域を越えて移動させることによりα１-、α２-、及びβ１画分の大いに改善された分離が可能になる。よって、通常のバッファーを用いて実施される分析と比較すると、血清タンパク質の定量分析の速度と精度を改善することができる。添加剤はβ-リポタンパク質及びプレ-β-リポタンパク質に富む生物学的試料の分析に特に有利である。
【００１８】
最後に、本発明は、少なくとも一の分析用バッファーと、リポタンパク質をそれが通常移動する領域を越えて、特にα１、α２及びβ１画分の領域を越えて移動させ得る、及び／又はＣ１０からＣ２０のアルキル鎖等の疎水性部分と、９を越えるｐＨで強い負電荷を供給するアニオン性部分を含むアニオン性界面活性剤系添加剤；及び／又はキャピラリー洗浄用の一又は複数の溶液、及び／又は希釈セグメント及び／又は分析する試料のための一又は複数の希釈剤を含む、生物学的試料中のタンパク質成分を分析するためのキットに関する。このキットでは、バッファーと添加剤と希釈剤は即時混合のために別個に保存してもよいし、又はそれらは混合物として保存されてもよい。上記キットは分析を実施するための指示書を含んでいてもよい。
【００１９】
本発明の更なる特徴及び利点は次の詳細な説明と実施例並びに添付図から明らかになるであろう。
【００２０】
キャピラリー電気泳動（ＣＥ）を実施するための条件は当該分野で知られている。それらは通常キャピラリーを洗浄溶液で洗浄し、分析用バッファーで洗浄し、場合によっては試料を一又は複数回希釈し、試料を注入し、移動させ検出することからなりうる。上記工程は自動機器を使用して実施することができる。
【００２１】
キャピラリー電気泳動を実施するための条件は、例えばCapillarys（セビア）自動機器を用いて実施するのに適した条件である。
【００２２】
アルカリ性ｐＨで強い負の電荷を供給するアニオン極とリポタンパク質の疎水性部分と相互作用をなすことが可能な疎水性部分を含む化合物は、本発明に係るバッファーの添加剤として使用することができる。
【００２３】
疎水性アルキル鎖は、少なくとも１０の炭素原子、特に１０から２０の炭素原子の少なくとも一の線形部分を有する、分岐していてもしていなくともよい少なくとも一のＣ１０からＣ２４のアルキル鎖からなりうる。当業者には直ぐに分かるように、上記疎水性部分はその疎水性を本質的に変えない残基又は官能基を含んでいてもよい。
【００２４】
アニオン極は次のリストからの一又は複数の基又は化学官能基によって構成されうる：スルホネート、カルボキシレート、サルフェート及びホスフェート。
【００２５】
特に、次のものを挙げることができる：Ｃ１０−Ｃ２４アルキルモノ-、ジ-、又はトリ-サルフェート、Ｃ１０−Ｃ２４アルキルモノ-、ジ-、又はトリ-スルホネート、Ｃ１０−Ｃ２４アルキルモノ-、ジ-、又はトリ-カルボキシレート、Ｃ１０−Ｃ２４アルキルモノ-、ジ-、又はトリ-ホスフェート、及びＣ１０−Ｃ２４アルキルカルボキシ-スルホネート、-サルフェート及び-ホスフェート、特にＣ１０からＣ２４のアルキルサルフェート等のアニオン性界面活性剤。
【００２６】
上記のジ-又はトリ-カルボキシレート、ジ-又はトリ-スルホネート、ジ-又はトリ-サルフェート及びジ-又はトリ-ホスフェート及びカルボキシ-スルホネート、-サルフェート及び-ホスフェートはよって１０から２４の炭素原子を含むアルキル鎖上での一又は複数のカルボキシレート、スルフェート、スルホネート、又はホスフェート官能基の組合せである。
【００２７】
上に引用したものの中で好適なアニオン性界面活性剤はＣ１０−Ｃ２４モノアルキルサルフェート、特にＣ１０からＣ２０のアルキルサルフェート、中でもＣ１０からＣ１６のアルキルサルフェートである。
【００２８】
上記化合物はそれ自体は公知であり商業的に入手できる。それらは酸の形態又は塩の形態、特にアルカリ金属塩の形態であり得る。
【００２９】
ドデシルサルフェートが特に好ましく、より正確にはドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）である。
【００３０】
上記の名称において、アルキル基は好ましくは線形である。
【００３１】
上述のアニオン性界面活性剤系添加剤はまた混合物として使用することもできる。
【００３２】
更に、アニオン性界面活性剤系添加剤は、有利には欧州特許出願公開第１２２９３２５号に記載されたようにα１-グロブリンとアルブミンの間の距離を改善することによってアルブミンと相互作用することが知られている他の添加剤の存在下で使用することができる。
【００３３】
アルブミンと相互作用する欧州特許出願公開第１２２９３２５号に挙げられている好適な添加剤はＣ６からＣ１０のアルキルスルホネートであり、これらＣ６からＣ１０のアルキルスルホネートのうち、オクタンスルホネートが特に好ましいが、それは、それがα１-グロブリンとアルブミンの間の分離のため特性の明確さを実質的に改善するからである。
【００３４】
「本発明に係る試料」という用語は、例えば適切な希釈溶液又は分析用バッファーで前もって希釈されているか、又は純粋な、分析される生物学的試料を意味する。
【００３５】
健常な又は病気に罹っている患者の任意の液体生物学的試料を分析することができる。よって、ヒトの液体生物学的試料は正常な又は異常な血清、並びに、溶血血液、血漿、尿又は脳脊髄液でありうる。ヒトの生物学的試料に加えて、動物由来の試料もまた分析することができる。試料はまた合成タンパク質であってもよく、その場合、本発明の方法は例えば生産コントロールを標的とすることができる。
【００３６】
本発明の添加剤は血清の分析とヒト試料中の血清タンパク質の分離に特に使用される。
【００３７】
血清試料では、分離される血清タンパク質はアルブミン及びα１-；α２-；β（又はβ１-及びβ２-）；及びγ-グロブリン画分、及びα-リポタンパク質、β-リポタンパク質及びプレ-β-リポタンパク質、特にβ-リポタンパク質及びプレ-β-リポタンパク質である。上記命名は上記クラスの全てのサブタイプのタンパク質成分を含む。
【００３８】
分析用バッファーは所望の分離と電気泳動一般、特にキャピラリー電気泳動に適した任意の既知の分析用バッファーでありうる。挙げることができる例は、ボレート、ホスフェート及びカーボネートバッファー、アミノ酸系バッファー及び生物学的バッファーである。特に、CapillarysＢ１Ｂ２＋バッファー（セビア）を用いることができる。
【００３９】
挙げることができる生物学的バッファーは、ビス-ＴＲＩＳ（２-ビス[２-ヒドロキシエチル]アミノ-２-ヒドロキシメチル-１,３-プロパンジオール）、ＡＤＡ（Ｎ-[２-アセトアミド]-２-イミノ二酢酸）、ＡＣＥＳ（２-[２-アセトアミノ]-２-アミノエタンスルホン酸）、ＰＩＰＥＳ（１,４-ピペラジンジエタンスルホン酸）、ＭＯＰＳＯ（３-[Ｎ-モルホリノ]-２-ヒドロキシプロパンスルホン酸）、ビス-ＴＲＩＳ ＰＲＯＰＡＮＥ（１,３-ビス[トリス(ヒドロキシメチル)メチルアミノプロパン]）、ＢＥＳ（Ｎ,Ｎ-ビス[２-ヒドロキシエチル]-２-アミノエタンスルホン酸）、ＭＯＰＳ（３-[Ｎ-モルホリノ]プロパンスルホン酸）、ＴＥＳ（２-[２-ヒドロキシ-１,１-ビス(ヒドロキシメチル)エチルアミノ]エタンスルホン酸）、ＨＥＰＥＳ（Ｎ-[２-ヒドロキシエチル]ピペラジン-Ｎ'-(２-エタンスルホン)酸）、ＤＩＰＳＯ（３-Ｎ,Ｎ-ビス[２-ヒドロキシエチル]アミノ-２-ヒドロキシプロパンスルホン)酸）、ＭＯＢＳ（４-Ｎ-モルホリノブタンスルホン酸）、ＴＡＰＳＯ（３[Ｎ-トリス-ヒドロキシメチル-メチルアミノ]-２-ヒドロキシプロパンスルホン酸）、ＴＲＩＳ（２-アミノ-２-[ヒドロキシメチル]-１,３-プロパンジオール）、ＨＥＰＰＳＯ（Ｎ-[２-ヒドロキシエチル]ピペラジン-Ｎ'-[２-ヒドロキシプロパンスルホン]酸）、ＰＯＰＳＯ（ピペラジン-Ｎ,Ｎ'-ビス[２-ヒドロキシプロパンスルホン]酸）、ＴＥＡ（トリエタノールアミン）、ＥＰＰＳ（Ｎ-[２-ヒドロキシエチル]-ピペラジン-Ｎ'-[３-プロパンスルホン]酸）、ＴＲＩＣＩＮＥ（Ｎ-トリス[ヒドロキシメチル]メチルグリシン）、ＧＬＹ-ＧＬＹ（ジグリシン）、ＢＩＣＩＮＥ（Ｎ,Ｎ-ビス[２-ヒドロキシエチル]-グリシン）、ＨＥＰＢＳ（Ｎ-[２-ヒドロキシエチル]ピペラジン-Ｎ'-[４-ブタンスルホン]酸）、ＴＡＰＳ（Ｎ-トリス[ヒドロキシメチル]メチル-３-アミノプロパンスルホン]酸）、ＡＭＰＤ（２-アミノ-２-メチル-１,３-プロパンジオール）、ＴＡＢＳ（Ｎ-トリス[ヒドロキシメチル]メチル-４-アミノブタンスルホン酸）、ＡＭＰＳＯ（３-[(１,１-ジメチル-２-ヒドロキシエチル)アミノ]-２-ヒドロキシプロパンスルホン酸）、ＣＨＥＳ（２-(Ｎ-シクロヘキシルアミノ)エタンスルホン酸）、ＣＡＰＳＯ（３-[シクロヘキシルアミノ]-２-ヒドロキシ-１-プロパンスルホン酸）、ＡＭＰ（２-アミノ-２-メチル-１-プロパノール）、ＣＡＰＳ（３-シクロヘキシルアミノ-１-プロパンスルホン酸）又はＣＡＢＳ（４-[シクロヘキシルアミノ]-１-ブタンスルホン酸）、好ましくはＡＭＰＤ、ＴＡＢＳ、ＡＭＰＳＯ、ＣＨＥＳ、ＣＡＰＳＯ、ＡＭＰ、ＣＡＰＳ又はＣＡＢＳとして知られているバッファーである。
【００４０】
アルカリ性ｐＨでのキャピラリー電気泳動法において、分析用バッファーのｐＨは８から１２の範囲、好ましくは９から１１の範囲、より好ましくは約１０の値である。
【００４１】
本発明の分析用バッファーはまたｐＨを調節する少なくとも一の化合物を含んでいてもよい。使用することができるｐＨ調節剤の例は、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化ルビジウム、水酸化セシウム、水酸化フランシウム、アルキル部分に１から８の炭素原子を含む水酸化モノ-、ジ-、トリ-又はテトラ-アルキルアンモニウムから選択される化合物である。
【００４２】
本発明によれば、分析用バッファーは通常の条件下で通常の濃度、つまり１０から５００ｍＭ、好ましくは２０から４００ｍＭのオーダーの濃度で使用される。
【００４３】
本発明の添加剤は上述の濃度で使用され、これはそのアルブミンとの相互作用の点において欧州特許出願公開第１２２９３２５号に記載された濃度と比較すると低い。一般に、濃度は、０．００１から０．２ｍＭ、好ましくは０．０１ｍＭから０．０９ｍＭのオーダーにあり、ＳＤＳの場合は、アルブミン又は他の非脂質タンパク質成分との相互作用を余りに大きくするもの、つまり特性を余りに大きく乱すものよりも少ない。
【００４４】
アルブミンと相互作用することが知られているより特定の添加剤は、分析用バッファー中のその臨界ミセル濃度を越えないでではあるが、０．１ｍＭから５００ｍＭの濃度で使用される。この臨界ミセル濃度値は界面活性剤である添加剤の場合に有効である。
【００４５】
オクタンスルホネートが使用される場合、バッファー中のその濃度は１から１０ｍＭ、好ましくは２．５から５ｍＭのオーダーである。
【００４６】
ＳＤＳの存在下でのその使用は、特にアルブミン領域においてピーク移動に対するＳＤＳの作用を無効にしうる。
【００４７】
更に、バッファーはイオン強度を増加させることができる一又は複数の添加剤を含みうる。
【００４８】
挙げることができる電解質のイオン強度を増加させることができるバッファーの上記添加剤の例は、アルカリ金属の塩化物、硫酸塩、スルホン酸塩、炭酸塩、カルボン酸塩、フッ化物及びリン酸塩並びにその混合物から選択される化合物である。これらの中で、アルカリ金属の塩化物、硫酸塩又はスルホン酸塩とその混合物が好ましい。
【００４９】
より好ましくは、硫酸塩が使用される。好ましくは、ナトリウム、リチウム又はカリウム塩が選択される。上に挙げた添加剤の中で、硫酸ナトリウム及び／又はリチウムが好ましい。
【００５０】
本発明のバッファー組成物は、分析用バッファー組成物に対して通常の方法、すなわち希釈される固体形態又は液体形態の成分を許容可能な担体に加えることによって調製される。担体は、通常は、蒸留されていても又は脱塩されていてもよい水である。
【００５１】
キャピラリーに使用される材料はキャピラリー電気泳動において通常のものである。よって、溶融シリカキャピラリーを使用することができる。その内径は５から２０００μｍとすることができる。好ましくは、２００μｍ未満、より好ましくは１００μｍ未満の内径を持つキャピラリーを使用することができる。好ましくは、未処理の内面を持つキャピラリーが使用される。当業者であれば、キャピラリーの性質とそのサイズを分析要件に適合させることができるであろう。
【実施例】
【００５２】
方法と装置
Ａ）キャピラリー電気泳動
内径２５ミクロンの溶融シリコンキャピラリーを装備したＣＥ装置を使用して臨床試料のキャピラリー電気泳動を実施した。検出は２００ｎｍで実施した。試料をCapillarys装置（セビア）の試料トレイに配し、流体駆動注入によって自動的に注入した。試料の分離を約４００Ｖ／ｃｍの電場を印加することによって５分以内で実施した。０．２５Ｍの水酸化ナトリウムと次に分析用バッファーを使用して各分析前にキャピラリーを洗浄した。
【００５３】
分析用バッファー：
使用した化学薬品は分析用等級のものとした。
５．１ｇの水酸化ナトリウム（モル質量：４０．０ｇ／ｍｏｌ）と共に、１リットルの脱塩水中に９．３ｇのホウ酸（モル質量：６１．８３ｇ／ｍｏｌ）を溶解させることによって、１５０ｍＭのボレートバッファーを調製した。最終濃度は１５０ｍＭでｐＨは１０．０であった。
【００５４】
Ｂ）臨床試料：
ＣＥに対しては、分析用バッファー中でヒト血清を１／５まで希釈した。
【００５５】
実施例１（比較例）
ボレート分析用バッファーを上述のようにして調製した。
高脂血症のヒト血清（トリグリセリド：５．７３ｇ／ｌ）に対して上述の方法を使用して電気泳動を実施した。
【００５６】
図１から分かるように、得られた電気泳動図は、左から右に、それぞれアルブミン、α１、α２、β１、β２及びγ-グロブリン画分に帰す６つの連続ピークを有している。
【００５７】
【表１】
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【００５８】
実施例２
実施例１の分析用バッファーに０．０７ｍＭの濃度でＳＤＳを添加した。
実施例１に記載されたようにして電気泳動を実施した。
【００５９】
図２から分かるように、得られた電気泳動図は、左から右に、それぞれアルブミン、α１、α２、β１、β２及びγ-グロブリン画分に帰す６つの連続ピークを有している。実施例１と比較すると、二つの画分間の分離が改善されていることが分かる。α-１ピーク（プレβ-リポタンパク質に相当）上の肩として矢印が付されたピークは特性から除去された。
【００６０】
【表２】
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【００６１】
実施例３
正常脂血ヒト血清（トリグリセリド：１．１０ｇ／ｌ）の電気泳動を、０．００；０．０５；０．０７及び０．２５ｍＭの濃度でバッファーにＳＤＳを添加して前の実施例と同じようにして実施した。
【００６２】
得られたこれらの電気泳動図は、左から右に、それぞれアルブミン画分及びα１-、α２-、β１-、β２-及びγ-グロブリン画分に帰す６つの連続ピークを示す。以下の表は得られた結果を表す。
【００６３】
【表３】
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【００６４】
実施例４
高脂血ヒト血清（トリグリセリド：５．６３ｇ／ｌ）を用いて実施例３と同じ方法を使用する。得られたこれらの電気泳動図は、左から右に、それぞれアルブミン画分及びα１-、α２-、β１-、β２-及びγ-グロブリン画分に帰す６つの連続ピークを示す。以下の表は得られた結果を表す。
【００６５】
【表４】
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【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】欧州特許出願公開第１２２９３２５号に従うバッファーを使用してキャピラリー電気泳動によって分析されたヒト血清の電気泳動図を示す。
【図２】同じバッファーであるが本発明のアニオン性界面活性剤を含有するキャピラリー電気泳動によって分析された同血清の電気泳動図を示す。
【図３】図３Ａ、３Ｂ、３Ｃ及び３Ｄは、０；０．０５；０．０７及び０．２５ｍＭのＳＤＳがそれぞれ添加された同じバッファーを使用したＥＣによる同じ正常脂血血清の電気泳動図を表す。
【図４】図４Ａ、４Ｂ、４Ｃ及び４Ｄは、０；０．０５；０．０７及び０．２５ｍＭのＳＤＳがそれぞれ添加された同じバッファーを使用したＥＣによる同じ高脂血血清の電気泳動図を表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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