(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
バラの内在性のジヒドロフラボノール還元酵素の発現を人為的に抑制し、かつパンジー由来のフラボノイド３’，５’−水酸化酵素をコードする遺伝子及びバラ以外の由来のジヒドロフラボノール還元酵素をコードする遺伝子を発現させることを特徴とするバラの製造方法。
【請求項２】
バラの内在性のフラボノイド３’−水酸化酵素の発現を人為的に抑制し、かつパンジー由来のフラボノイド３’，５’−水酸化酵素をコードする遺伝子を発現させる、請求項１に記載のバラの製造方法。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の製造方法により得られるバラもしくはその子孫またはそれらの組織。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、新たな花色を有するバラの製造方法に関するものである。詳しくは、バラ内在性の代謝経路を人為的に抑制し、かつパンジーのフラボノイド３’，５’−水酸化酵素をコードする遺伝子と、ジヒドロミリセチンを還元するジヒドロフラボノール還元酵素をコードする遺伝子を発現させることによるバラの製造方法に関するものである。
【背景技術】  花弁の役割は花粉を運ぶ昆虫・鳥類などのポリネーターを魅了することにあるため、花の色や形、模様、香りはポリネーターと共進化してきた（本田利夫ら  現代化学５月号２５−３２（１９９８））。おそらくはその結果、ひとつの種の花があらゆる色をもつ場合は少なく、例えば、バラやカーネーションには紫から青の品種がなく、ショウブやリンドウには鮮やかな赤い品種はない。花の色は鑑賞の際にも花卉の最も重要な形質であることから、古くから様々な色の花が交配によって育種されてきた。特にバラは花の女王と呼ばれ、また、市場価値も高いことから、世界中で交配が行われてきた。
例えば、黄色の品種のなかったバラに西アジア原産のＲｏｓａ  ｆｏｅｔｉｄａを交配することにより現在の黄色のバラが育種された。しかしながら花の色はその植物のもつ遺伝的能力によって決定されているため、利用できる遺伝子源が限定される交配による育種では実現できる花色には限界がある（Ｔａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．３９  １１１９−１１２６，１９９８、Ｍｏｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０，１９８−２０１  １９９９）。なかでも青いバラの育成は不可能の代名詞とも、アーサー王の聖杯に匹敵するとされてきた（大場英章「バラの誕生」１９９７中公新書、鈴木正彦  「植物バイオの魔法  青いバラも夢ではなくなった」１９９０講談社ブルーバックス、最相葉月  「青いバラ」２００１小学館）。
現在、一般に「青バラ」と呼ばれる品種は存在するが、これは「藤色系」のバラのことを指す。交配による「青バラ」の品種改良は１９４５年作出された薄紫を帯びた灰色の「グレーパール」が最初であると言われている。その後、１９５７年に薄紫ピンクの「スターリングシルバー」が作出され、これらの品種を交配親として「ブルームーン」（１９６４年作出）や「マダムビオレ」（１９８１年作出）など、多くの藤色系バラが作られている。また、これらの藤色系バラなどを利用し、さらに育種を重ねることで、「青龍」（１９９２年作出）や「ブルーヘブン」（２００２年作出）などの、淡いグレー系のバラが作出され、新タイプの「青バラ」として注目を集めている。
しかしながらこれらの花の色は実際には青くはなく灰色がかったぼんやりしたピンクに留まっており、長年の育種努力にも関わらず、未だ「青」と呼べるバラは存在しない。園芸業界においては一般にイギリス王立園芸協会カラーチャート（ＲＨＳＣＣ：Ｔｈｅ  Ｒｏｙａｌ  Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｃｏｌｏｕｒ  Ｃｈａｒｔ）でバイオレットからブルーのグループが「青」と呼ばれることが多い。本発明はイギリス王立園芸協会カラーチャートでバイオレットグループ、バイオレット−ブルーグループまたはブルーグループに示される花色を有するバラの創出を目指すものである。
花の色は主にアントシアニン、カロテノイド、ベタレインの３種の化合物群に由来するが、青色を司るのは極大吸収波長の幅が最も広い（オレンジ色から青色）アントシアニンである。アントシアニンはフラボノイドの一種で図１に示した代謝経路で生合成される。アントシアニンは、通常上皮細胞の液胞中に局在する。アントシアニンの色調（すなわち花の色）は、アントシアニンの構造に大きく依存し、Ｂ環の水酸基の数が多いほど青くなる。Ｂ環の水酸化は、フラボノイド３’−水酸化酵素（Ｆ３’Ｈ）およびフラボノイド３’，５’−水酸化酵素（Ｆ３’５’Ｈ）によって触媒される。Ｆ３’Ｈ活性とＦ３’５’Ｈ活性がない場合にはペラルゴニジン（橙色から赤色）が合成され、Ｆ３’Ｈ活性がある場合はシアニジン（赤から紅色）が合成され、Ｆ３’５’Ｈ活性がある場合はデルフィニジン（紫色）が合成される。
これらのアントシアニジンは糖やアシル基により修飾され、様々なアントシアニンとなる。一般的に修飾する芳香族アシル基が多いほどアントシアニンは青くなる。アントシアニンは液胞のｐＨ、共存するフラボノールやフラボン、金属イオンなどによっても大きく色を変える（斎藤規夫  蛋白質核酸酵素  ４７  ２０２−２０９  ２００２，Ｂｒｏｕｌｌａｒｄ  ａｎｄ  Ｄａｎｇｌｅｓ，Ｉｎ  ｔｈｅ  ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ：Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｓｉｎｃｅ  １９８６（Ｅｄ  ｂｙ  Ｈａｒｂｏｒｎｅ）Ｃａｐｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｈａｌｌ，Ｌｏｎｄｏｎ  ｐｐ５６５−５８８，Ｔａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．３９  １１１９−１１２６，１９９８、Ｍｏｌ  ｅｔ  ａｌ，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３，２１２−２１７  １９９８，Ｍｏｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０，１９８−２０１  １９９９）。
バラの花弁のアントシアニンは、ペラルゴニジンとシアニジンおよびペオニジンの誘導体であり、デルフィニジンの誘導体は存在しない（Ｂｉｏｌｌｅｙ  ａｎｄ  Ｍａｙ，Ｊ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｂｏｔａｎｙ，４４，１７２５−１７３４  １９９３，Ｍｉｋａｎａｇｉ  Ｙ，Ｓａｉｔｏ  Ｎ，Ｙｏｋｏｉ  Ｍ  ａｎｄ  Ｔａｔｓｕｚａｗａ  Ｆ（２０００）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃｓ  Ｅｃｏｌ．２８：８８７−９０２）。これが青いバラがない最大の理由とされている。現在のバラは、交配可能なバラの近縁種（Ｒ．ｍｕｌｔｉｆｌｏｒａ，Ｒ．ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ，Ｒ．ｇｉｇａｎｔｅａｎ，Ｒ．ｍｏｓｃｈａｔａ，Ｒ．ｇａｌｌｉｃａ，Ｒ．ｗｈｉｃｈｕｒａｉａｎａ，Ｒ．ｆｏｅｔｉｄａなど）の交配によって作出された。
多くの交配の努力にもかかわらず、青いバラが実現していないのはバラの近縁種にはデルフィニジンを生産する能力がないからだと考えられている。花弁でデルフィニジンを生産するためには上述のようにＦ３’５’Ｈが花弁で発現する必要があるが、バラ及びバラの近縁種の花弁ではＦ３’５’Ｈが発現していないと考えられている。したがって交配によりデルフィニジンを花弁で蓄積させ青いバラを取得することは不可能であろう。また、バラ花弁に微量の青い色素ロザシアニンが含まれることは知られており、その化学構造も決定されているが（特開２００２−２０１３７２）、ロザシアニンを増加させることにより青いバラを作出した報告はなく、ロザシアニンの生合成経路、それに関わる酵素や遺伝子の知見もない。
また、生物が生産する青や紫の色素の例として藍が生産するインディゴ（たとえば、Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２００３  Ｆｅｂ；６０（６）：７２０−５）や微生物が生産するビオラセイン（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０００  Ｏｃｔ；２（４）：５１３−９、Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．，Ｖｏｌ．３，Ｎｏ．１３，２００１，１９８１−１９８４）があり、これらはトリプトファンに由来することや生合成経路についても知見はある。
この他にクチナシの実由来のイリドイド化合物による青色色素（Ｓ．Ｆｕｊｉｋａｗａ，Ｙ．Ｆｕｋｕｉ，Ｋ．Ｋｏｇａ，Ｔ．Ｉｗａｓｈｉｔａ，Ｈ．Ｋｏｍｕｒａ，Ｋ．Ｎｏｍｏｔｏ，（１９８７）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｇｅｎｉｐｏｃｙａｎｉｎ  Ｇ１，ａ  ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｇｅｎｉｐｉｎ  ａｎｄ  ｇｌｙｃｉｎｅ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．２８（４０），４６９９−７００、Ｓ．Ｆｕｊｉｋａｗａ，Ｙ．Ｆｕｋｕｉ，Ｋ．Ｋｏｇａ，Ｊ．Ｋｕｍａｄａ，（１９８７）Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  ｓｋｙｂｌｕｅ  ｐｉｇｍｅｎｔ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｇａｒｄｅｎｉａ  ｆｒｕｉｔｓ．Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．６５（４），４１９−２４）や、コケ由来のアズレン（和光純薬工業株式会社）なども知られているが、これらを植物花弁で発現させ、花色を青くした報告はない。
バラに他の植物で発現しているＦ３’５’Ｈの遺伝子を導入し花弁で発現させることができれば青いバラを作出できるのではないかと期待されていた（最相葉月  「青いバラ」２００１小学館）。Ｆ３’５’Ｈ遺伝子はペチュニア、リンドウ、トルコギキョウなど多くの植物から得られている（Ｈｏｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ３６６，２７６−２７９，１９９３，Ｔａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．３７，７１１−７１６  １９９６，ＷＯ９３／１８１５５）。また、バラの形質転換系についても報告はある（たとえばＦｉｒｏｏｚａｂａｂｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２：８８３−８８８（１９９４），ＵＳ  ５４８０７８９、ＵＳ  ５７９２９２７、ＥＰ  ５３６  ３２７  Ａ１、ＵＳ  ２００１０００７１５７  Ａ１）。
さらに、実際にバラにペチュニアのＦ３’５’Ｈ遺伝子を導入した報告もある（ＷＯ９３／１８１５５、ＷＯ９４／２８１４０）。
しかしながら、青いバラを得るまでには到っておらず、青いバラを得るためにはバラに適した花色色素の代謝を改変する工夫が必要であると考えられる。
一方、Ｆ３’５’Ｈ遺伝子を、デルフィニジンを生産せずペラルゴニジンを生産している赤いカーネーションに導入したところ、ペラルゴニジンとともに、デルフィニジンの蓄積が確認されたが、花色はやや紫がかった赤に変わるに留まった（ＷＯ９４／２８１４０）。この結果は、Ｆ３’５’Ｈの発現だけでは「青い」カーネーションを得ることはできず、カーネーションの内在性のペラルゴニジン合成への代謝の流れを抑制する必要があることを示唆している。
カーネーションの内在性の代謝経路（ジヒドロフラボノール還元酵素（ＤＦＲ）によるジヒドロケンフェロール（ＤＨＫ）の還元）との競合を回避するために、白いカーネーションの中からＤＦＲが欠損している品種を選択した。このカーネーションに、Ｆ３’５’ＨとペチュニアＤＦＲ（ＤＨＫを還元できず、ジヒドロミリセチン（ＤＨＭ）を効率よく還元することが知られていた）の遺伝子を導入した。その結果、デルフィニジンの含量がほぼ１００％で、花色も従来のカーネーションにはない青紫色となった組換えカーネーションを取得することができた例がある（蛋白質核酸酵素，Ｖｏｌ．４７，Ｎｏ．３，ｐ２２８，２００２）。このようにカーネーションに青い花を実現するためには、Ｆ３’５’Ｈ遺伝子の発現によるデルフィニジンの蓄積だけではなく、工夫が必要であった。
ＤＦＲはすでに多くの植物からクローニングされている（ペチュニア、タバコ、バラ、トレニア、キンギョソウ、ガーベラ、シンビジウム、オオムギ、トウモロコシなど）（Ｍｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ３３０，６７７−６７８，１９８７，Ｈｅｌａｒｉｕｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２  １８３−１９３  １９９３，Ｔａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．３６，１０２３−１０３１，Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｊ．１９，８１−８５，１９９９）。ＤＦＲ遺伝子については植物種によって基質特異性が異なり、ペチュニア、タバコ、シンビジウムのＤＦＲ遺伝子はＤＨＫを還元できないこと、ペチュニアのＤＦＲ遺伝子はジヒドロフラボノールの中ではＤＨＭをもっとも効率よく還元することが知られている（Ｆｏｒｋｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｚ．Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ．４２ｃ，１１４６−１１４８，１９８７，Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｊ．１９，８１−８５，１９９９）。しかしながらこれらのＤＦＲ遺伝子をバラで発現させた例は報告されていない。
内在性の代謝経路や酵素と外来の遺伝子由来の酵素たとえばＦ３’５’Ｈとの競合を回避する方法としては上述のように、ある遺伝子が欠損した品種に遺伝子を導入する方法がある。また、人為的に目的の遺伝子の発現を抑制する方法として、目的の遺伝子を相同組換えなどにより欠失させる方法も知られてはいるが、相同組換えの頻度が低く、適応できる植物種も限定されているため、実用化にはいたっていない（たとえば、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２００２、２０：１０３０−４）。
転写レベルでの抑制方法として、標的遺伝子のｍＲＮＡのアンチセンスＲＮＡを転写させるアンチセンス法（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｋｒｏｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ３３３，８６６−８６９，１９８８）、標的の遺伝子のｍＲＮＡと同じＲＮＡを転写させるセンス（コサプレッション）法（Ｎａｐｏｌｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２，２７９−２８９，１９９０）、標的の遺伝子のｍＲＮＡに対応する二本鎖ＲＮＡを転写する方法（ＲＮＡｉ法、Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５，１３９５９−１３９６４  １９９８）が利用されている。
これらの３つの方法については多くの成功例が知られている。バラにおいてはアントシアニンの合成に必要なカルコンシンターゼ（ＣＨＳ）遺伝子のコサプレッションにより、花色を赤からピンクに改変した報告がある（Ｇｕｔｔｅｒｓｏｎ  ＨｏｒｔＳｃｉｅｎｃｅ  ３０：９６４−９６６  １９９５）が、この場合ＣＨＳの抑制が不完全であり、完全にアントシアニンの合成を抑制し白い花の系統を得るには至らなかった。
【特許文献１】特開２００２−２０１３７２号公報
【特許文献２】ＷＯ９３／１８１５５
【特許文献３】ＵＳＰ  ５４８０７８９
【特許文献４】ＵＳＰ  ５７９２９２７
【特許文献５】ＥＰ  ５３６  ３２７  Ａ１
【特許文献６】ＵＳ  ２００１０００７１５７  Ａ１
【特許文献７】ＷＯ９４／２８１４０
【非特許文献１】本田利夫ら  現代化学５月号２５−３２（１９９８）
【非特許文献２】Ｔａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．３９  １１１９−１１２６，１９９８
【非特許文献３】Ｍｏｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０，１９８−２０１  １９９９
【非特許文献４】大場英章「バラの誕生」１９９７中公新書
【非特許文献５】鈴木正彦  「植物バイオの魔法  青いバラも夢ではなくなった」１９９０講談社ブルーバックス
【非特許文献６】最相葉月  「青いバラ」２００１小学館
【非特許文献７】斎藤規夫  蛋白質核酸酵素  ４７  ２０２−２０９  ２００２
【非特許文献８】Ｂｒｏｕｌｌａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎ  ｔｈｅ  ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ：Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｓｉｎｃｅ  １９８６（Ｅｄ  ｂｙＨａｒｂｏｒｎｅ）Ｃａｐｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｈａｌｌ，Ｌｏｎｄｏｎ  ｐｐ５６５−５８８
【非特許文献９】Ｔａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．３９  １１１９−１１２６，１９９８
【非特許文献１０】Ｍｏｌ  ｅｔ  ａｌ，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３，２１２−２１７  １９９８
【非特許文献１１】Ｍｏｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０，１９８−２０１  １９９９
【非特許文献１２】Ｂｉｏｌｌｅｙ  ａｎｄ  Ｍａｙ，Ｊ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｂｏｔａｎｙ，４４，１７２５−１７３４  １９９３
【非特許文献１３】Ｍｉｋａｎａｇｉ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃｓ  Ｅｃｏｌ．２８：８８７−９０２
【非特許文献１４】Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２００３  Ｆｅｂ；６０（６）：７２０−５
【非特許文献１５】Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０００  Ｏｃｔ；２（４）：５１３−９
【非特許文献１６】Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．，Ｖｏｌ．３，Ｎｏ．１３，２００１，１９８１−１９８４
【非特許文献１７】Ｓ．Ｆｕｊｉｋａｗａ，ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．２８（４０），４６９９−７００
【非特許文献１８】Ｓ．Ｆｕｊｉｋａｗａ，ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．６５（４），４１９−２４
【非特許文献１９】Ｈｏｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ３６６，２７６−２７９，１９９３
【非特許文献２０】Ｔａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．３７，７１１−７１６  １９９６
【非特許文献２１】Ｆｉｒｏｏｚａｂａｂｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２：８８３−８８８（１９９４）
【非特許文献２２】蛋白質核酸酵素，Ｖｏｌ．４７，Ｎｏ．３，ｐ２２８，２００２
【非特許文献２３】Ｍｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ３３０，６７７−６７８，１９８７
【非特許文献２４】Ｈｅｌａｒｉｕｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２  １８３−１９３  １９９３
【非特許文献２５】Ｔａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．３６，１０２３−１０３１
【非特許文献２６】Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｊ．１９，８１−８５，１９９９
【非特許文献２７】Ｆｏｒｋｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｚ．Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ．４２ｃ，１１４６−１１４８，１９８７
【非特許文献２８】Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２００２、２０：１０３０−４
【非特許文献２９】ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｋｒｏｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ３３３，８６６−８６９，１９８８
【非特許文献３０】Ｎａｐｏｌｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２，２７９−２８９，１９９０
【非特許文献３１】Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５，１３９５９−１３９６４  １９９８
【非特許文献３２】Ｇｕｔｔｅｒｓｏｎ  ＨｏｒｔＳｃｉｅｎｃｅ  ３０：９６４−９６６  １９９５
【非特許文献３３】鈴木省三，「ばら、花図譜」，小学館，ｐ．２５６−２６０，１９９０
【発明の開示】
上記のようにバラにＦ３’５’Ｈ遺伝子を導入し、花弁で発現させることによりバラの花の色を改変することができた。カーネーションでは、ＤＦＲ欠損の品種でＦ３’５’Ｈ遺伝子とペチュニアＤＦＲ遺伝子を発現させることにより、青紫色のカーネーションを作ることができた。しかしながら、いまだに「青いバラ」は創出されていない。そこで、未発明は、青い花を咲かせるバラを提供しようとするものである。
従って本発明は、（１）バラの内在性の代謝経路を人為的に抑制し、かつパンジー由来のフラボノイド３’，５’−水酸化酵素をコードする遺伝子を発現させることを特徴とするバラの製造方法を提供する。
本発明はまた、（２）バラの内在性の代謝経路を人為的に抑制し、かつパンジー由来のフラボノイド３’，５’−水酸化酵素をコードする遺伝子及びジヒドロフラボノール還元酵素をコードする遺伝子を発現させることを特徴とするバラの製造方法を提供する。
本発明は更に、（３）バラの内在性のジヒドロフラボノール還元酵素の発現を人為的に抑制し、かつパンジー由来のフラボノイド３’，５’−水酸化酵素をコードする遺伝子及びバラ以外の由来のジヒドロフラボノール還元酵素をコードする遺伝子を発現させることを特徴とするバラの製造方法を提供する。
本発明は更に、（４）バラの内在性のフラボノイド３’−水酸化酵素の発現を人為的に抑制し、かつパンジー由来のフラボノイド３’，５’−水酸化酵素をコードする遺伝子を発現させることを特徴とするバラの製造方法を提供する。
前記のパンジーのフラボノイド３’，５’−水酸化酵素をコードする遺伝子は、例えば、配列番号：１または配列番号：３記載の遺伝子である。また、前記のジヒドロフラボノール還元酵素をコードする遺伝子は、好ましくは、アイリス、ニーレンベルギア、ペチュニア、シンビジュウム、リンドウ、トルコギキョウ由来である。
本発明は更に、（５）上記（１）〜（４）のいずれかに記載の製造方法により得られるバラもしくはそれと同じ性質を有するその子孫またはそれらの組織を提供する。
本発明はまた、（６）上記（１）〜（４）のいずれかの製造方法により得られたバラの花弁の色が、紫、青紫又は青であるバラもしくはそれと同じ性質を有する子孫またはそれらの組織を提供する。
本発明はまた、バラの花弁の色が、イギリス王立園芸協会カラーチャート（ＲＨＳＣＣ）のバイオレットグループ、バイオレット−ブルーグループまたはブルーグループに属するものであり、上記（６）に記載のバラもしくはそれと同じ性質を有する子孫またはそれらの組織を提供する。
本発明は更に、バラの花弁の色が、イギリス王立園芸協会カラーチャート（ＲＨＳＣＣ）のバイオレットグループの８５ａまたは８５ｂに属するものである、上記（７）に記載のバラもしくはそれと同じ性質を有する子孫またはそれらの組織を提供する。
【図面の簡単な説明】  図１は、フラボノイドの生合成経路を示す。
ＣＨＳ：カルコン合成酵素、ＣＨＩ：カルコンイソメラーゼ、
ＦＮＳ：フラボン合成酵素、Ｆ３Ｈ：フラバノン３−水酸化酵素、
Ｆ３’Ｈ：フラボノイド３’−水酸化酵素、
Ｆ３’５’Ｈ：フラボノイド３’５’−水酸化酵素、ＦＬＳ：フラボノール合成酵素、
ＤＦＲ：ジヒドロフラボノール４−還元酵素、
ＡＮＳ：アントシアニジン合成酵素、ＡＳ：オーロン合成酵素、
Ｃ２’ＧＴ：カルコン２’配糖化酵素
図２は、プラスミドｐＢＥＲＤ１の構造を示す。
図３は、プラスミドｐＢＰＤＢＰ２の構造を示す。
図４は、プラスミドｐＢＰＤＢＰ８の構造を示す。
図５は、プラスミドｐＳＰＢ４６１の構造を示す。
図６は、プラスミドｐＳＰＢ４７２の構造を示す。
図７は、プラスミドｐＳＰＢ１３０の構造を示す。
図８は、プラスミドｐＳＰＢ９１９の構造を示す。
図９は、プラスミドｐＳＰＢ９２０の構造を示す。
図１０は、プラスミドｐＳＰＢ１１０６の構造を示す。
【発明を実施するための最良の形態】  バラでデルフィニジンが生産されても花色が青くならない理由にはいくつか考えられる。アシル基や糖の修飾によってアントシアニンの安定性、溶解度、色が変化する。すなわち、芳香族アシル基の付加により青くなることが知られている。また、フラボノールやフラボンといったコピグメントとアントシアニンが複合体を形成すると、色が青くなり、極大吸収波長は長波長にシフトし吸光度も増す。アントシアニンの色はｐＨによっても変化する。ｐＨが低いと赤く、中性付近で青くなるため、花の色はアントシアニンが局在する液胞のｐＨに依存する。また、Ａｌ３＋、Ｍｇ２＋などの金属イオンとの共存による金属錯体の形成が花色に重要な影響を与える場合もある。試行錯誤と鋭意検討の結果、ここでは花弁でのデルフィニジンの割合を高める工夫を考案した。
まず、青紫色のカーネーションの作出と同様な手法で青いバラの作出を試みた。すなわち白いバラ１１２品種を解析しＤＦＲ欠損株の同定を試みたが、カーネーションの場合とは異なり完全なＤＦＲ欠損系統を取得することはできなかった。これはカーネーションが２倍体であるのに対し、通常栽培されるバラは４倍体であるため、単一の遺伝子の欠損株を求めることが困難であるためであろう。
次に、花色が白い品種ＴｉｎｅｋｅにパンジーのＦ３’５’Ｈ遺伝子とペチュニアのＤＦＲ遺伝子を導入したところ、デルフィニジンの蓄積は認められたが、量がわずかであり、青いバラには至らなかった。
本発明においては、バラの内在性のフラボノイド合成経路に属する酵素であるＤＦＲの遺伝子を遺伝子工学の手法を用いて人為的に抑制し、かつパンジーのＦ３’５’Ｈ遺伝子を発現させ、さらにジヒドロミリセチンを還元するＤＦＲ遺伝子を発現させることによりデルフィニジンの含有率を花弁に含まれる総アントシアニジン中のほぼ８０−１００％にすることにより、青いバラを実現することができた。
ジヒドロミリセチンを還元するＤＦＲ遺伝子はここではアイリス（アヤメ科）、ニーレンベルギア（ナス科）、ペチュニア（ナス科）を用いたが、他にジヒドロミリセチンを還元するＤＦＲ遺伝子の起源としてはタバコ（ナス科）、シクラメン（サクラソウ科）、デルフィニウム（キンポウゲ科）、シンビジウム（ラン科）、リンドウ（リンドウ科）、トルコギキョウ（リンドウ科）などペラルゴニジンを蓄積しない植物を挙げることができる（Ｆｏｒｋｍａｎｎ  １９９１  Ｐｌａｎｔ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  １０６  １−２６  Ｊｏｈｎｓｏｎら、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．１９９９  １９  ８１−８５）。本発明において使用するＤＦＲ遺伝子は、ジヒドロミリセチンを好んで還元する遺伝子が好ましい。
また、本発明においては、バラの内在性のフラボノイド合成経路に属する酵素であるフラボノイド３’−水酸化酵素（Ｆ３’Ｈ）の遺伝子を遺伝子工学の手法を用いて人為的に抑制し、かつパンジーのＦ３’５’Ｈ遺伝子を発現させることにより、デルフィニジンの含有率を花弁に含まれる総アントシアニジン中のほぼ８０−１００％にすることにより、青いバラを実現することができた。
本発明により得られたバラは、これまでにない花色を有するものであり、本発明により、イギリス王立園芸協会カラーチャートで、レッド−パープルグループ、パープルグループ、パープル−バイオレットグループのみならず、バイオレットグループ、バイオレット−ブルーグループ、ブルーグループに属する花色を有するバラを提供することができる。
【実施例】  以下実施例に従って、発明の詳細を述べる。分子生物学的手法はとくに断らない限り、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，２００１，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）に依った。
［実施例１］花色測定方法
花弁色彩評価は、分光測色計ＣＭ２０２２（ミノルタ株式会社、日本）を用いて１０度視野、Ｄ６５光源で測定し、色彩管理ソフトＳｐｅｃｔｒａＭａｇｉｃ（ミノルタ株式会社、日本）により解析を行った。なお、イギリス王立園芸協会カラーチャート（ＲＨＳＣＣ）番号は、目視判定および上記の機器測定により得られた色彩値（ＣＩＥ  Ｌ＊ａ＊ｂ＊表色系）をもとに、色彩分類システムＶｅｒｓｉｏｎ２．１．１（株式会社日本総合研究所（日本）、特開２００２−０１６９３５号公報）を用いて近似色の照合をおこなった。このシステムを用いることにより客観的に近似のＲＨＳＣＣ番号を選択できる。
この方法で従来いわゆる“青いバラ”と呼ばれている品種の花弁の色彩を測定し、ＲＨＳＣＣにおける近似色を求めたところ、ブルームーンやマダムビオレは１８６ｄ（ＧＲＥＹＥＤ−ＰＵＲＰＬＥ  ＧＲＯＵＰ）、ラバンデは１８６ｃ（ＧＲＥＹＥＤ−ＰＵＲＰＬＥ  ＧＲＯＵＰ）、青龍は１８９ｄ（ＧＲＥＹＥＤ−ＧＲＥＥＮ  ＧＲＯＵＰ）、ブルーヘブンは１９８ｄ（ＧＲＥＹＥＤ−ＧＲＥＥＮ  ＧＲＯＵＰ）であった。したがってこれらの品種は青いバラと呼ばれているがＲＨＳＣＣ番号の分類ではグレーグループであり、本発明が目的としている青さを有していなかった。
［実施例２］フラボノイドの分析
１）花弁色素の抽出
凍結乾燥した花弁０．５ｇを４ｍｌの０．１％ＴＦＡを含む５０％アセトニトリル（ＣＨ３ＣＮ）中で２０分間、超音波下で抽出し０．４５μｍのフィルターで濾過した。この抽出液のアントシアニンの高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析は以下の条件で行った。カラムはＲＳｐａｋ  ＤＥ−４１３Ｌ（４．６ｍｍφｘ２５ｃｍ、昭工株式会社）を用い、流速０．６ｍｌ／ｍｉｎで、移動相は０．５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含む１０％から５０％のＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏの直線濃度勾配１５分間の後、０．５％ＴＦＡを含む５０％ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏで１０分間のイソクラティック溶出を行った。検出はフォトダイオードアレイ検出器ＳＰＤ−Ｍ１０Ａ（島津製作所）を用い、６００−２５０ｎｍの波長領域を検出し、５２０ｎｍの吸光度の面積により各アントシアニンの存在比を求めた。
２）アントシアニジンの分析
上記濾液０．２ｍｌをガラス試験管中で減圧乾固し、０．２ｍｌの６Ｎ塩酸（ＨＣｌ）に溶解し、１００℃で２０分間、加水分解を行った。分解後のアントシアニジンは０．２ｍｌの１−ペンタノールで抽出し、有機層をＨＰＬＣで以下の条件により分析した。カラムはＯＤＳ−Ａ３１２（６ｍｍφｘ１５ｃｍ、ワイエムシー株式会社）を用い移動相にはＣＨ３ＣＯＯＨ：ＣＨ３ＯＨ：Ｈ２Ｏ＝１５：２０：６５の溶液を用い流速１ｍｌ／ｍｉｎで溶出した。
検出はフォトダイオードアレイ検出器ＳＰＤ−Ｍ１０Ａ（島津製作所）で６００−４００ｎｍのスペクトルを測定し、吸収極大（λｍａｘ）およびリテンションタイム（Ｒ．Ｔ．）で同定し５２０ｎｍの吸光度の面積で定量した。このＨＰＬＣ条件下でデルフィニジンおよびシアニジンのリテンションタイムおよびλｍａｘは４．０分、５．２分および５３４ｎｍ、５２５ｎｍであった。同定、定量にはフナコシ株式会社より購入したデルフィニジン塩酸塩およびシアニジン塩酸塩を標品として用いた。
３）フラボノールの分析
花弁の抽出濾液０．２ｍｌを１．５ｍｌのエッペンドルフチューブ中で減圧乾固し０．２ｍｌの０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ＫＰＢ）ｐＨ４．５に溶解し、６ユニットのβ−グルコシダーゼ（新日本化学株式会社）と１ｕｎｉｔのナリンゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，ＭＯ，ＵＳＡ）を加え、３０℃で１６時間保持した。反応後、０．２ｍｌの９０％ＣＨ３ＣＮを酵素反応液に添加し、反応を終了した。この液を０．４５μｍのフィルターでろ過し、下記の条件でＨＰＬＣを行った。
カラムはＤｅｖｅｌｏｓｉｌ  Ｃ３０−ＵＧ−５（４．６ｍｍφｘ１５ｃｍ、野村化学株式会社）を用い、流速０．６ｍｌ／ｍｉｎで、移動相は０．１％ＴＦＡを含む１８％から６３％のＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏの直線濃度勾配１０分間の後、０．１％ＴＦＡを含む６３％のＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏのイソクラティック溶出１０分間を行った。検出はフォトダイオードアレイ検出器ＳＰＤ−Ｍ１０Ａを使用し、４００−２５０ｎｍの波長領域を検出した。この条件下でケンフェロールとケルセチンのＲ．Ｔ．とλｍａｘはそれぞれ１１．６分間、３６５ｎｍおよび１０．３分間、３７０ｎｍであった。定量はＡ３３０ｎｍの面積で行い、標品としてフナコシ株式会社のケンフェロールとケルセチンを用いた。
［実施例３］ｐＨの測定方法
−８０℃で１時間以上凍結したバラ花弁約２ｇを、ホモジナイザーを用いて搾り、搾汁液を得た。これをｐＨメーター（Ｆ−２２、堀場製作所）に微小電極６０６９−１０Ｃ（堀場製作所）を接続しｐＨを測定した。
［実施例４］バラの形質転換
バラの形質転換に関してはすでに多くの方法が報告されており（たとえばＦｉｒｏｏｚａｂａｂｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２：８８３−８８８（１９９４）、ＵＳ  ５４８０７８９、ＵＳ  ５７９２９２７、ＥＰ  ５３６  ３２７  Ａ１、ＵＳ  ２００１０００７１５７  Ａ１）、これらの方法に従って形質転換を実施できる。具体的にはアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）Ａｇ１０株（Ｌａｚｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：９６３−９６７，１９９１）の菌液中に、無菌苗の葉から誘導したバラのカルスを５分間浸し、滅菌濾紙で余分な菌液を拭き取った後、継代用培地に移植し、２日間暗所で共存培養した。
その後、カルベニシリンを４００ｍｇ／Ｌ加えたＭＳ液体培地で洗浄し、継代用培地にカナマイシン５０ｍｇ／Ｌとカルベニシリン２００ｍｇ／Ｌを加えた選抜・除菌用培地へ移植した。選抜培地上で生育阻害を受けず、正常に増殖する部分の移植と培養を繰り返し、カナマイシン耐性カルスを選抜した。カナマイシン耐性を示した形質転換カルスを、カナマイシン５０ｍｇ／Ｌ、カルベニシリン２００ｍｇ／Ｌを添加した再分化用の培地で培養し、カナマイシン耐性シュートを得た。得られたシュートは１／２ＭＳ培地で発根させた後、馴化を行った。馴化個体は鉢上げ後、閉鎖系温室で栽培して開花させた。
［実施例５］バラのフラボノイド遺伝子の取得
バラ品種カーディナル花弁由来のｃＤＮＡライブラリーをペチュニアのＤＦＲ遺伝子（ＷＯ９６／３６７１６に記載）をプローブにしてスクリーニングしバラのＤＦＲ  ｃＤＮＡを取得し、ｐＣＧＰ６４５とした。詳細はすでに報告されている（Ｔａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．３６，１０２３−１０３１  １９９５）。
同様に、同じライブラリーをペチュニアのカルコンシンターゼ−Ａ（ＣＨＳ−Ａ）遺伝子（Ｋｏｅｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ（１９８９）８１，２４５−２５７）とキンギョソウのアントシアニジンシンターゼ（ＡＮＳ）遺伝子（Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｊ，（１９９１）１，３７−４９）で、公知の方法（Ｔａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．３６，１０２３−１０３１  １９９５）でスクリーニングすることによりバラのカルコンシンターゼ（ＣＨＳ）とアントシアニジンシンターゼ（ＡＮＳ）のホモログを取得し、それぞれｐＣＧＰ６３４とｐＣＧＰ１３７５とした。バラのＣＨＳの塩基配列を配列表・配列番号：５に、バラのＡＮＳの塩基配列を配列番号：６にそれぞれ示す。
［実施例６］白バラスクリーニング
遺伝子組換えの手法で青い品種を作出するためには、内在性のアントシアニン合成経路と導入する遺伝子（具体的にはＦ３’５’Ｈ遺伝子）との競合を回避するためにＤＦＲ遺伝子のみが欠損している品種を選抜し、その品種にペチュニア由来ＤＦＲ遺伝子とＦ３’５’Ｈ遺伝子を導入すればよい（ＷＯ９６／３６７１６）。
白いバラの品種は多数あり、この中でＤＦＲ遺伝子のみが欠損し、他のアントシアニン生合成酵素遺伝子は正常に発現している品種を探索した。花の色が白くなる原因は、アントシアニン生合成に関わる構造遺伝子の変異あるいは欠失に寄る場合とアントシアニン生合成に関わる構造遺伝子の転写を制御する転写調節因子の欠失に寄る場合があると考えられる。ここではＷＯ９６／３６７１６に従い、ＤＦＲ遺伝子のｍＲＮＡが欠損しているバラを探索した。
主に白色のバラ１１２系統についてまず実施例１に記載した方法により花弁のフラボノイドの組成を分析し、フラボノールが高蓄積している系統を選択した。その後、花弁の搾汁のｐＨを測定し、相対的にｐＨが高い品種８０系統を一次候補とした。
次に、これら品種の花弁からＲＮＡを抽出した。ＲＮＡの抽出は公知の方法に従った（Ｔａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．３６，１０２３−１０３１  １９９５）。得られたＲＮＡを用いてバラＤＦＲ遺伝子（Ｔａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．３６，１０２３−１０３１  １９９５）とバラアントシアニジンシンターゼ（ＡＮＳ）遺伝子に対応するｍＲＮＡの有無を調べた。ＲＴ−ＰＣＲ法により、内在性のＤＦＲ  ｍＲＮＡの発現量が低く、かつＡＮＳ  ｍＲＮＡ量が正常なレベルの品種８品種（ＷＫＳ−１１、１３、２２、３６、４３、ホワイトキラニー、つるＮｏ．２、ティネケ）を選抜した。
なお、ＲＴ−ＰＣＲはそれぞれの品種の花弁から得たＲＮＡを用いてＳｕｐｅｒ  Ｓｃｒｉｐｔ  Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ＲＴ−ＰＣＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた。ＤＦＲｍＲＮＡの検出にはＤＦＲ−２Ｆ（５’−ＣＡＡＧＣＡＡＴＧＧＣＡＴＣＧＧＡＡＴＣ−３’）（配列番号：１３）とＤＦＲ−２Ｂ（５’−ＴＴＴＣＣＡＧＴＧＡＧＴＧＧＣＧＡＡＡＧＴＣ−３’）（配列番号：１４）のプライマーを、ＡＮＳｍＲＮＡの検出にはＡＮＳ−２Ｆ（５’−ＴＧＧＡＣＴＣＧＡＡＧＡＡＣＴＣＧＴＣＣ−３’）（配列番号：１５）とＡＮＳ−２Ｂ（５’−ＣＣＴＣＡＣＣＴＴＣＴＣＣＣＴＴＧＴＴ−３’）（配列番号：１６）のプライマーを用いた。
これらの８品種について、ノザン解析を行い（表１）、ＤＦＲｍＲＮＡレベルが低い傾向を示し、ＡＮＳｍＲＮＡレベルが正常であり、かつ培養特性が優れ、形質転換可能な２品種（ティネケ、ＷＫＳ３６）について実際にデルフィニジン生産用コンストラクトを導入することを決定した。
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［実施例７］ティネケへのバラ由来ＤＦＲ遺伝子の導入
ｐＥ２１１３（Ｍｉｔｓｕｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｖｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．３７，４５−５９  １９９６）はエンハンサー配列を繰り返したカリフラワーモザイクウィルス３５Ｓ（Ｅｌ２３５Ｓ）プロモーターとノパリンシンターゼターミネーターを有する。このプラスミドをＳａｃＩで消化し、Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ（タカラ）を用いて平滑末端にした。このＤＮＡ断片を８ｂｐのＳａｌＩリンカー（タカラ）とライゲーションし、得られたプラスミドをｐＵＥ５とした。
ｐＵＥ５をＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで消化して得られる約３ｋｂのＤＮＡ断片をＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで消化したｐＢｉｎ１９（Ｂｅｖａｎ  Ｍ，Ｂｉｎａｒｙ  Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  Ｖｅｃｔｏｒ  ｆｏｒ  ｐｌａｎｔ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１２．８７１１−２１，１９８４）に導入し、得られたプラスミドをｐＢＥ５とした。ｐＣＧＰ６４５をＢａｍＨＩとＸｈｏＩで消化して完全長のバラＤＦＲｃＤＮＡを含むＤＮＡ断片を得た。これをＢａｍＨＩとＸｈｏＩで消化したｐＢＥ５に連結し、ｐＢＥＲＤ１（図２）とした。このプラスミドをＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ  Ａｇ１０株に導入した。
白色系バラ品種「ティネケ」へｐＢＥＲＤ１（図２）を導入し、１８個体の形質転換体を得た。得られた形質転換体のうち６個体で花色が変化した。白からピンクへの明確な花色がみられた２個体について色素分析を行ったところ、いずれもシアニジン、ペラルゴニジンの蓄積が確認された（表２）。この結果により、品種ティネケはＤＦＲ遺伝子が欠損した品種であるということが推察された。
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［実施例８］ティネケへのパンジー由来Ｆ３’５’Ｈ遺伝子（＃１８）とペチュニア由来ＤＦＲ遺伝子の導入
パンジー（品種ブラックパンジー）の若い蕾の花弁からＴｕｒｐｅｎとＧｒｉｆｆｉｔｈの方法（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：１１−１５，１９８６）に従ってＲＮＡを抽出し、ｏｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡを精製した。本ｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡとλＺＡＰＩＩ／ＧｉｇａｐａｃｋＩＩクローニングキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて、パンジー若い蕾の花弁に由来するｃＤＮＡライブラリーを作製した。ＮＺＹプレート上で生育させた約１００，０００ｐｆｕのファージプラークをＣｏｌｏｎｙ／ＰｌａｑｕｅＳｃｒｅｅｎ（Ｄｕｐｏｎｔ）に転写した後、製造元推奨の方法に従って処理をした。これらを３２Ｐでラベルした、ペチュニアＨｆ１ｃＤＮＡ（ｐＣＧＰ６０２、Ｈｏｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６６，ｐ２７６−２７９，１９９３）をプローブとしてスクリーニングした。
メンブレンをハイブリダイゼーションバッファー（１０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣｌ，１０％（ｗ／ｖ）デキストランサルフェート、１％ＳＤＳ）中で４２℃、１時間プレハイブリダイゼーションした後、３２Ｐラベルしたプロープを１ｘ１０６ｃｐｍ／ｍｌとなるように加えて、４２℃、１６時間ハイブリダイゼーションを行った。その後、メンブレンを２ｘＳＳＣ，１％ＳＤＳ中、４２℃、１時間洗浄し、さらに新たな洗浄液に換えて１時間洗浄した。洗浄後のメンブレンをコダックＸＡＲフィルムに増感スクリーンとともに感光させ、ハイブリダイゼーションシグナルを検出した。
得られたｃＤＮＡの解析の結果、ペチュニアＨｆ１と高い同一性を示す２種類のｃＤＮＡが得られたことが明らかとなった。この２種類のｃＤＮＡをパンジーのＦ３’，５’Ｈ  ｃＤＮＡ，ＢＰ＃１８（ｐＣＧＰ１９５９）ならびにＢＰ＃４０（ｐＣＧＰ１９６１）とした。＃１８の塩基配列を配列番号：１、そのアミノ酸配列を配列番号：２に示し、＃４０の塩基配列を配列番号：３、そのアミノ酸配列を配列番号：４に示す。ＢＰ＃１８とＢＰ＃４０はＤＮＡレベルで８２％の同一性を有する。またＢＰ＃１８とＢＰ＃４０はともにＤＮＡレベルで、ペチュニアＨｆ１と６０％、ペチュニアＨｆ２（Ｈｏｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６６，ｐ２７６−２７９，１９９３）と６２％の同一性を示す。
一方、ｐＵＥ５をＥｃｏＲＩで消化し、Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ（タカラ）を用いて平滑末端にしたＤＮＡ断片と８ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩリンカー（タカラ）とライゲーションし、得られたプラスミドをｐＵＥ５Ｈとした。パンジー由来のＦ３’５’Ｈ＃１８  ｃＤＮＡを含むプラスミド  ｐＣＧＰ１９５９（をＢａｍＨＩで完全消化し、さらにＸｈｏＩで部分消化し得られる約１．８ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。一方、これとＢａｍＨＩとＸｈｏＩで消化したｐＵＥ５Ｈとライゲーションし得られたプラスミドをｐＵＥＢＰ１８とした。
一方、ペチュニアＤＦＲ  ｃＤＮＡを含むＤＮＡ断片を、ｐＣＧＰ１４０３（ＷＯ９６／３６７１６）をＢａｍＨＩとＸｈｏＩで消化することにより回収し、このＤＮＡ断片とＢａｍＨＩとＸｈｏＩで消化したｐＢＥ５と連結し、ｐＢＥＰＤ２とした。次にｐＵＥＢＰ１８をＨｉｎｄＩＩＩで部分消化し、Ｅｌ２３５Ｓプロモーター、パンジー由来Ｆ３’５’Ｈ＃１８ｃＤＮＡ、ｎｏｓターミネーターを含む約２．８ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。この断片とｐＢＥＰＤ２をＨｉｎｄＩＩＩで部分消化したＤＮＡ断片とを連結し、バイナリーベクタープラスミドｐＢＰＤＢＰ２（図３）を得た。このプラスミドをアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）Ａｇ１０株に導入した。
白色系バラ品種「ティネケ」へｐＢＰＤＢＰ２（図３）を導入し、４０個体の形質転換体を得た。得られた形質転換体のうち２３個体で花色が変化し、色素分析を行った１９個体のうち１６個体でデルフィニジンの蓄積を確認した（表３）。デルフィニジン含有率は最高１００％（平均８７％）となったが、色素量が最高でも花弁１ｇあたり０．０３５ｍｇと極めて少なく、花色はＲＨＳカラーチャート１５８ｄ（ＹＥＬＬＯＷ−ＷＨＩＴＥ  ＧＲＯＵＰ）から、５６ａ（ＲＥＤ  ＧＲＯＵＰ）や６５ｂ（ＲＥＤ−ＰＵＲＰＬＥ  ＧＲＯＵＰ）への変化に止まりＲＨＳＣＣのバイオレットグループ、バイオレット−ブルーグループ、ブルーグループには至らず、目的の青いバラを得ることは出来なかった。
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［実施例９］ティネケへのパンジー由来Ｆ３’５’Ｈ遺伝子（＃４０）とペチュニア由来ＤＦＲ遺伝子の導入
プラスミドｐＥ２１１３（Ｍｉｔｓｕｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｖｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．３７，４５−５９  １９９６）をＨｉｎｄＩＩＩとＸｂａＩで消化して得られる約８００ｂｐのＤＮＡ断片を回収し、ＨｉｎｄＩＩＩとＸｂａＩで消化したｐＢｉｎ１９（Ｂｅｖａｎ  Ｍ，Ｂｉｎａｒｙ  Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  Ｖｅｃｔｏｒ  ｆｏｒ  ｐｌａｎｔ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１２．８７１１−２１，１９８４）に連結した。得られたプラスミドをｐＣＧＰ１３９１とした。一方、ｐＣＧＰ６６９（ＷＯ９４／２８１４０に記載）はペチュニアのカルコンシンターゼＡ（ＣＨＳ−Ａ）遺伝子のプロモーターを含んでいる。このプラスミドをＥｃｏＲＩで消化した後平滑末端化し、さらにＨｉｎｄＩＩＩで消化した。
この約７００ｂｐのＤＮＡ断片をＨｉｎｄＩＩＩとＳｎａＢＩで消化したｐＣＧＰ１３９１と連結し、得られたプラスミドをｐＣＧＰ１７０７とした。また、パンジー由来のＦ３’５’Ｈ＃４０  ｃＤＮＡを含むプラスミドｐＣＧＰ１９６１をＢａｍＨＩで完全消化し、さらにＸｈｏＩで部分消化し得られる約１．８ｋｂのＤＮＡ断片を回収し、これとＢａｍＨＩとＸｈｏＩで消化したｐＵＥ５Ｈとライゲーションし得られたプラスミドをｐＵＥＢＰ４０とした。ｐＵＥＢＰ４０をＥｃｏＲＶとＸｂａＩで消化した約５．５ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。
この断片と、ｐＣＧＰ１７０７をＨｉｎｄＩＩＩで消化後平滑末端化し、さらにＸｂａＩで消化して得られる約７００ｂｐの断片を連結し、ｐＵＦＢＰ４０を得た。次にｐＵＦＢＰ４０をＨｉｎｄＩＩＩで部分消化し、カリフラワー３５Ｓプロモーターエンハンサー、ＣＨＳ−Ａプロモーター、パンジー由来Ｆ３’５’Ｈ＃４０  ｃＤＮＡ、ｎｏｓターミネーターを含む約３．４ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。この断片とｐＢＥＰＤ２をＨｉｎｄＩＩＩで部分消化したＤＮＡ断片とを連結し、バイナリーベクタープラスミドｐＢＰＤＢＰ８（図４）を得た。このプラスミドをＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ  Ａｇ１０株に導入した。
白色系バラ品種「ティネケ」へｐＢＰＤＢＰ８（図４）を導入し、５３個体の形質転換体を得た。得られた形質転換体のうち１７個体で花色が変化し、色素分析を行った９個体のうち８個体でデルフィニジンの蓄積を確認した（表４）。デルフィニジン含有率は最高９３％（平均７９％）となったが、色素量が最高でも花弁１ｇあたり０．０１４ｍｇと極めて少なく、花色はＲＨＳカラーチャート１５８ｄ（ＹＥＬＬＯＷ−ＷＨＩＴＥ  ＧＲＯＵＰ）から、５６ａ（ＲＥＤ  ＧＲＯＵＰ）や６５ｂ（Ｒｅｄ−Ｐｕｒｐｌｅ  Ｇｒｏｕｐ）への変化に止まりＲＨＳＣＣのバイオレットグループ、バイオレット−ブルーグループ、ブルーグループには至らず、目的の青いバラを得ることは出来なかった。また、以上は品種ティネケがＤＦＲ遺伝子のみが欠損した品種ではないことを示唆している。
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［実施例１０］ＷＫＳ３６へのパンジー由来Ｆ３’５’Ｈ遺伝子（＃１８）とペチュニア由来ＤＦＲ遺伝子の導入
白色系バラ「ＷＫＳ３６」へｐＢＰＤＢＰ２（図３）を導入し、１３８個体の形質転換体を得た。得られた形質転換体のうち１０個体で花色が変化し、全ての個体でデルフィニジンの蓄積を確認した（表５）。デルフィニジン含有率は最高９１％（平均６０％）となったが、色素量が花弁１ｇあたり０．０３３ｍｇと極めて少なく、花色はごく薄いピンクへの変化に止まりＲＨＳＣＣのバイオレットグループ、バイオレット−ブルーグループ、ブルーグループには至らず、目的の青いバラを得ることは出来なかった。また、以上は品種ＷＫＳ３６はＤＦＲ遺伝子のみが欠損した品種ではないことを示唆している。
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［実施例１１］ＷＫＳ３６へのパンジー由来Ｆ３’５’Ｈ遺伝子（＃１８）とペチュニア由来ＤＦＲ遺伝子の導入
ｐＵＣＡＰ（ｖａｎ  Ｅｎｇｅｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４，２８８−２９０，１９９５）のＡｓｃＩ部位をＰａｃＩリンカーで置換したプラスミドをｐＵＣＰＰとした。一方、バラのカルコンシンターゼプロモーターとパンジー由来のＦ３’５’Ｈ＃１８ｃＤＮＡとｎｏｓターミネーターを連結した発現カセットを以下のように得た。
バラ品種Ｋａｒｄｉｎａｌの若い葉から染色体ＤＮＡを抽出した（Ｔａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，３６：１０２３−１０３１，１９９５）。約１００μｇのＤＮＡをＳａｕ３ＡＩで部分消化し、ショ糖密度勾配により約２０ｋｂのＤＮＡ画分を回収した。
これとＢａｍＨＩで消化したラムダファージＥＭＢＬ３（たとえばストラタジーン社）と連結し、製造者が推奨する方法で染色体ＤＮＡライブラリーを作製した。このライブラリーをバラのカルコンシンターゼｃＤＮＡ（ＤＮＡデータベースＧｅｎＢａｎｋのアクセション番号ＡＢ０３８２４６）をプローブとして公知の方法（Ｔａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，３６：１０２３−１０３１，１９９５）でスクリーニングした。得られたカルコンシンターゼの染色体クローンのうちラムダＣＨＳ２０にはカルコンシンターゼの開始コドンの上流約６．４ｋｂのＤＮＡ配列が含まれていた。ラムダＣＨＳ２０をＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＶで消化して得られる約２．９ｋｂのＤＮＡ断片にはカルコンシンターゼのプロモーター領域が含まれている。
この断片をｐＵＣ１９（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ３３：１０３−１１９，１９８５）をＨｉｎｄＩＩＩとＳｍａＩで消化した断片と連結した。これをｐＣＧＰ１１１６とした。これに含まれるカルコンシンターゼプロモーター部分の配列は配列番号：２１に示した。ｐＣＧＰ１１１６をＨｉｎｄＩＩＩとＫｐｎＩで消化して得られる約２．９ｋｂのＤＮＡ断片と、ｐＪＢ１（Ｂｏｄｅａｕ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｒｏｎｚｅ−２  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｍａｉｚｅ  ａｎｔｈｏｃｙａｎｉｎ  ｇｅｎｅｓ．Ｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ（学位論文），Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＵＳＡ，１９９４）をＨｉｎｄＩＩＩとＫｐｎＩで消化して得られるＤＮＡ断片を連結しｐＣＧＰ１９７を得た。
他方、ｐＵＥ５をＳａｃＩとＫｐｎＩで消化して得られる約３００ｂｐのノパリンシンターゼターミネーターを含むＤＮＡ断片を平滑末端化し、ＥｃｏＲＶとＢａｍＨＩで消化しさらに平滑末端化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ−と結合した。得られるプラスミドのうちターミネーターの５’側がｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ−のＳａｌＩに近いものをｐＣＧＰ１９８６とした。ｐＣＧＰ１９８６をＸｈｏＩで消化し、平滑末端化し、さらにＳａｌＩで消化したＤＮＡ断片と、ｐＣＧＰ１９７をＨｉｎｄＩＩＩで消化した後平滑末端化しさらにＳａｌＩで消化して得られるＤＮＡ断片を連結し、ｐＣＧＰ２２０１を得た。
さらに、ｐＣＧＰ２２０１をＳａｌＩで消化し、平滑末端化したＤＮＡ断片とｐＣＧＰ１９５９をＢａｍＨＩとＫｐｎＩで消化しさらに平滑末端化した約１．７ｋｂのＤＮＡ断片（パンジーのフラボノイド３’，５’−水酸化酵素遺伝子を含む）を連結した。得られるプラスミドのうちバラカルコンシンターゼプロモーターがパンジーのフラボノイド３’，５’−水酸化酵素遺伝子を順方向に転写できる向きに挿入されたものをｐＣＧＰ２２０３とした。プラスミドｐＣＧＰ２２０３をＨｉｎｄＩＩＩとＳａｃＩで消化することにより回収した。このＤＮＡ断片をｐＵＣＰＰのＨｉｎｄＩＩＩとＳａｃＩ部位にクローニングし、これをｐＳＰＢ４５９とした。次にプラスミドｐＥ２１１３をＳｎａＢＩで消化し、ＢａｍＨＩリンカー（タカラ）を挿入して得られたプラスミドをｐＵＥ６とした。
ｐＵＥ６をＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩで消化して得られる約７００ｂｐのＤＮＡ断片と、ｐＣＧＰ１４０５（ＷＯ９６／３６７１６）をＢａｍＨＩとＢｇｌＩＩで消化して得られる約２．２ｋｂのＤＮＡ断片と、ＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩで消化したバイナリーベクターｐＢｉｎｐｌｕｓ（ｖａｎ  Ｅｎｇｅｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４，２８８−２９０，１９９５）を連結し、ｐＳＰＢ４６０を得た。ｐＳＰＢ４５９をＰａｃＩで消化して得られる約５ｋｂのＤＮＡ断片を、ｐＳＰＢ４６０のＰａｃＩサイトに導入することによって、バイナリーベクター上でペチュニアＤＦＲとパンジーＦ３’５’Ｈ＃１８遺伝子が順方向に連結されたｐＳＰＢ４６１（図５）を得た。本プラスミドは植物においてはペチュニア由来のＤＦＲ遺伝子を構成的に発現し、パンジー由来のＦ３’５’Ｈ＃１８遺伝子を花弁特異的に転写するように工夫されている。このプラスミドをアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）Ａｇ１０株に導入した。
白色系バラ「ＷＫＳ３６」へｐＳＰＢ４６１（図５）を導入し、２２９個体の形質転換体を得た。得られた形質転換体のうち１６個体で花色が変化し、色素分析を行った１２個体全てでデルフィニジンの蓄積を確認した（表６）。デルフィニジン含有率は最高７９％（平均５８％）となったが、色素量が花弁１ｇあたり０．０３１ｍｇと極めて少なく、花色はごく薄いピンクへの変化に止まりＲＨＳＣＣのバイオレットグループ、バイオレット−ブルーグループ、ブルーグループには至らず、目的の青いバラを得ることは出来なかった。また品種ＷＫＳ３６はＤＦＲ遺伝子のみが欠損した品種ではないことを示唆された。
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［実施例１２］ＷＫＳ３６へのパンジー由来Ｆ３’５’Ｈ遺伝子（＃１８）、ペチュニア由来ＤＦＲ遺伝子およびシソ由来アントシアニン３−グルコシドアシル基転移酵素遺伝子の導入
シソ由来のヒドロキシシナモイルＣｏＡ：アントシアニン３−グルコシドアシル基転移酵素（３ＡＴ）遺伝子に開始コドンを付加した遺伝子をｐＳＡＴ２０８Ｆ（Ｙｏｎｅｋｕｒａ−Ｓａｋａｋｉｂａｒａ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．４１，４９５−５０２，２０００）とした。ｐＳＰＢ５８０（ＰＣＴ／ＡＵ０３／０００７９）をＢａｍＨＩとＸｈｏＩで消化して得られる約３．９ｋｂのＤＮＡ断片とｐＳＡＴ２０８ＦをＢａｍＨＩとＸｈｏＩで消化して得られる約１．８ｋｂのＤＮＡ断片を連結した。
得られたプラスミドをＡｓｃＩで消化することにより、Ｅ１２３５Ｓプロモーターとシソ３ＡＴ遺伝子とペチュニアフォスフォリピドトランアスファー蛋白質由来のターミネーターを含むＤＮＡ断片を回収した。このＤＮＡ断片を前述のｐＳＰＢ４６１のＡｓｃＩ部位に挿入し、シソ由来３ＡＴ、ペチュニア由来ＤＦＲ，パンジー由来Ｆ３’５’Ｈ＃１８の遺伝子の転写方向が順方向になっているプラスミドｐＳＰＢ４７２（図６）を得た。本プラスミドは植物においてはシソ由来３ＡＴ遺伝子とペチュニア由来ＤＦＲ遺伝子を構成的に発現し、パンジー由来Ｆ３’５’Ｈ＃１８遺伝子を花弁特異的に転写するように工夫されている。このプラスミドをアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）Ａｇ１０株に導入した。
白色系バラ「ＷＫＳ３６」へｐＳＰＢ４７２（図６）を導入し、７５個体の形質転換体を得た。得られた形質転換体のうち４個体で花色が変化し、色素分析を行った３個体全てでデルフィニジンの蓄積を確認した（表７）。デルフィニジン含有率は最高６７％（平均４９％）となったが、色素量が花弁１ｇあたり０．０１１ｍｇと極めて少なく、花色はごく薄いピンクへの変化に止まりＲＨＳＣＣのバイオレットグループ、バイオレット−ブルーグループ、ブルーグループには至らず、目的の青いバラを得ることは出来なかった。以上も品種ＷＫＳ３６はＤＦＲ遺伝子のみが欠損した品種ではないことを示唆している。
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このように多数の白いバラをスクリーニングしたにもかかわらずＤＦＲ遺伝子のみが欠損した品種を得ることができなかった。すなわち、青色のカーネーションを作出した方法（ＷＯ９４／２８１４０）では青いバラを得ることはできなかった。
［実施例１３］コサプレッションによるバラ由来ＤＦＲ遺伝子の抑制
藤色系バラ品種「ラバンデ」へｐＢＥＲＤ１を導入し、２６個体の形質転換体を得た。しかし、花色の変化した個体は全く得られず、コサプレッション法ではバラの内在性のＤＦＲ遺伝子を抑制することが困難であることが示唆された。
［実施例１４］有色バラのスクリーニング
次に有色のバラの中から、青いバラを作製するための品種を選抜することにした。有色のバラの中で相対的に青みを帯びている品種を中心に目視により１３６系統を選抜し、８９系統について色素分析を行った。調査した有色バラの分析値を表８〜表１０に示す。
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［実施例１５］ラバンデへのパンジー由来Ｆ３’５’Ｈ遺伝子（＃４０）とトレニア由来アントシアニン５−アシル基転移酵素遺伝子の導入
アントシアニンを芳香族アシル基により修飾することによりアントシアニンを安定化させ、かつその色を青くすることができる（たとえば、ＷＯ９６／２５５００）。アシル化したデルフィニジン型アントシアニンの生産を目指して以下の実験を行った。
トレニア品種サマーウェーブ花弁からＲＮＡを得、さらにこれからｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡを調製した。このｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡからλＺＡＰＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）をベクターとするｃＤＮＡライブラリーをｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  ｃＤＮＡライブラリー作製キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いて製造者が推奨する方法で作製した。トレニアの主要アントシアニンはその５位のグルコースが芳香族アシル基により修飾されている（Ｓｕｚｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  ２０００  ６，２３９−２４６）ので、トレニア花弁においてはアントシアニンアシル基転移酵素が発現している。
アントシアニンアシル基転移酵素はＡｓｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓというアミノ酸配列が保存されており、これに対応する合成ＤＮＡをプライマーとして用いることによりアントシアニンアシル基転移酵素遺伝子を取得することができる（ＷＯ９６／２５５００）。具体的には、トレニアｃＤＮＡライブラリー作製の際に合成した１本鎖ｃＤＮＡ１０ｎｇを鋳型とし、１００ｎｇのＡＴＣプライマー（５’−ＧＡ（ＴＣ）ＴＴ（ＴＣ）ＧＧＩＴＧＧＧＧＩＡＡ−３’、Ｉはイノシン）（配列番号：１７）、１００ｎｇのオリゴｄＴプライマー（５’−ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＴＣＧＡＧ−３’）（配列番号：１８）をプライマーとし、Ｔａｑポリメラーゼ（タカラ、日本）を用いて製造者の推奨する条件でＰＣＲを行った。
ＰＣＲは、９５℃にて１分間、５５℃にて１分間、及び７２℃にて１分間を１サイクルとする反応を２５サイクル行った。得られた約４００ｂｐのＤＮＡ断片をＧｅｎｅ  Ｃｌｅａｎ  ＩＩ（ＢＩＯ，１０１．Ｉｎｃ．）により製造者の推奨する方法で回収し、ｐＣＲ−ＴＯＰＯにサブクローニングした。その塩基配列を決定したところリンドウのアシル基転移酵素遺伝子（Ｆｕｊｉｗａｒａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｐｌａｎｔ  Ｊ．１６  ４２１−４３１）に相同な配列が見られた。なお塩基配列はダイプライマー法（アプライドバイオシステムズ社）を用い、シークエンサー３１０あるいは３７７（いずれもアプライドバイオシステムズ社）を用いて決定した。
このＤＮＡ断片をＤＩＧ標識検出キット（日本ロッシュ）を用いてＤＩＧにより標識し、製造者が推奨する方法でトレニアのｃＤＮＡライブラリーをプラークハイブリダイゼーション法によりスクリーニングした。得られたポジティブシグナルをもたらしたクローンを無作為に１２選択し、そこからプラスミドを回収し、塩基配列を決定した。これらはアントシアニンアシル基転移酵素によい相同性を示した。これらのクローンのうちｐＴＡＴ７としたクローンに含まれるｃＤＮＡの全塩基配列を決定した。この塩基配列を配列番号：７に示し、そしてそてに対応するアミノ酸配列を配列番号：８に示す。
ｐＢＥ２１１３−ＧＵＳ（Ｍｉｔｓｕｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｖｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．３７，４５−５９  １９９６）をＳａｃＩで消化した後、平滑末端化し、８ｂｐのＸｈｏＩリンカー（タカラ）を挿入した。このプラスミドのＢａｍＨＩとＸｈｏＩ部位にｐＴＡＴ７をＢａｍＨＩとＸｈｏＩで消化して得られる約１．７ｋｂのＤＮＡを挿入し、ｐＳＰＢ１２０を得た。ｐＳＰＢ１２０をＳｎａＢＩとＢａｍＨＩで消化した後平滑末端化しライゲーションすることによりｐＳＰＢ１２０’を得た。一方、パンジー由来のＦ３’５’Ｈ＃４０  ｃＤＮＡを含むプラスミドｐＣＧＰ１９６１をＢａｍＨＩで完全消化し、さらにＸｈｏＩで部分消化し得られる約１．８ｋｂのＤＮＡ断片を回収し、これとＢａｍＨＩとＸｈｏＩで消化したｐＵＥ５Ｈとライゲーションし得られたプラスミドをｐＵＥＢＰ４０とした。
ｐＵＥＢＰ４０をＳｎａＢＩとＢａｍＨＩで消化した後平滑末端化しライゲーションすることによりｐＵＥＢＰ４０’を得た。ｐＵＥＢＰ４０’をＨｉｎｄＩＩＩで部分消化し得られる約２．７ｋｂのＤＮＡ断片を回収し、ｐＳＰＢ１２０’をＨｉｎｄＩＩＩで部分消化したＤＮＡ断片と連結した。得られたプラスミドのうち、バイナリ−ベクター上でライトボーダー側から、ネオマイシンフォスフォトランスフェラーゼ遺伝子、パンジー由来Ｆ３’５’Ｈ＃４０遺伝子、トレニア由来５ＡＴ遺伝子の順にそれぞれが同方向に連結されたバイナリ−ベクターをｐＳＰＢ１３０（図７）とした。本プラスミドは植物においてはパンジー由来Ｆ３’５’Ｈ＃４０遺伝子とトレニア由来５ＡＴ遺伝子構成的に発現し、遺伝子を花弁特異的に転写するように工夫されている。このプラスミドをアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）Ａｇ１０株に導入した。
藤色系バラ品種「ラバンデ」へｐＳＰＢ１３０（図７）を導入し、４１個体の形質転換体を得た。色素分析を行った３２個体のうち２０個体でデルフィニジンの蓄積を確認した（表１１及び表１２）。デルフィニジン含有率は最高７１％（平均３６％）であった。花色はＲＨＳカラーチャート１８６ｃ（ＧＲＡＹＥＤ−ＰＵＲＰＬＥ  ＧＲＯＵＰ）から７９ｄ（ＰＵＲＰＬＥ  ＧＲＯＵＰ）へ変化した。またこの際のアシル化アントシアニンの割合は総アントシアニンの３０％程度に留まった。アシル化されたアントシアニンのスペクトルを測定したところ、その吸収極大波長はデルフィニジン３，５−ジグルコシドよりも４ｎｍ長波長シフトしていたが、総アントシアニン中の割合が低いため、花色に明瞭な効果を与えるには至らなかった。
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［実施例１６］ＷＫＳ１００へのパンジー由来Ｆ３’５’Ｈ遺伝子（＃４０）とトレニア由来アントシアニン５−アシル基転移酵素遺伝子の導入
藤色系バラ「ＷＫＳ１００」へｐＳＰＢ１３０（図７）を導入し、１４６個体の形質転換体を得た。色素分析を行った６３個体のうち５６個体でデルフィニジンの蓄積を確認した（表１３〜表１５）。デルフィニジン含有率は最高９５％（平均４４％）であった。花色はＲＨＳカラーチャート５６ｄ（ＲＥＤ  ＧＲＯＵＰ）から１８６ｄ（ＧＲＡＹＥＤ−ＰＵＲＰＬＥ  ＧＲＯＵＰ）へ変化した。しかしながらＲＨＳＣＣのバイオレットグループ、バイオレット−ブルーグループ、ブルーグループには至らず、目的の青いバラを得ることは出来なかった。
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［実施例１７］ＷＫＳ１１６へのパンジー由来Ｆ３’５’Ｈ遺伝子（＃４０）とトレニア由来アントシアニン５−アシル基転移酵素遺伝子の導入
薄藤色系バラ「ＷＫＳ１１６」へｐＳＰＢ１３０（図７）を導入し、２８２個体の形質転換体を得た。色素分析を行った３６個体のうち３３個体でデルフィニジンの蓄積を確認した（表１６及び表１７）。デルフィニジン含有率は最高８０％（平均７３％）であった。ＲＨＳカラーチャート１９６ｄ（ＧＲＡＹＥＤ−ＧＲＥＥＮ  ＧＲＯＵＰ）から１８６ｄ（ＧＲＥＹＥＤ−ＰＵＲＰＬＥ  ＧＲＯＵＰ）へ変化した。しかしながらＲＨＳＣＣのバイオレットグループ、バイオレット−ブルーグループ、ブルーグループには至らず、目的の青いバラを得ることは出来なかった。
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［実施例１８］ＷＫＳ１２４パンジー由来Ｆ３’５’Ｈ遺伝子（＃４０）とトレニア由来アントシアニン５−アシル基転移酵素遺伝子の導入
薄橙色系バラ「ＷＫＳ１２４」へｐＳＰＢ１３０（図７）を導入し、５０個体の形質転換体を得た。色素分析を行った１５個体のうち１３個体でデルフィニジンの蓄積を確認した（表１８）。デルフィニジン含有率は最高９５％（平均８２％）であった。花色はＲＨＳカラーチャート５２ｄ（ＲＥＤ  ＧＲＯＵＰ）から７１ｃ（ＲＥＤ−ＰＵＲＰＬＥ  ＧＲＯＵＰ）へ変化した。しかしながらＲＨＳＣＣのバイオレットグループ、バイオレット−ブルーグループ、ブルーグループには至らず、目的の青いバラを得ることは出来なかった。
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［実施例１９］ＷＫＳ１３２へのパンジー由来Ｆ３’５’Ｈ遺伝子（＃４０）とトレニア由来アントシアニン５−アシル基転移酵素遺伝子の導入
鮮紅色系バラ「ＷＫＳ１３２」へｐＳＰＢ１３０（図７）を導入し、２４個体の形質転換体を得た。色素分析を行った７個体のうち６個体でデルフィニジンの蓄積を確認した（表１９）。デルフィニジン含有率は最高４３％（平均１２％）であった。花色はＲＨＳカラーチャート５７ａ（ＲＥＤ−ＰＵＲＰＬＥ  ＧＲＯＵＰ）から６６ａ（ＲＥＤ−ＰＵＲＰＬＥ  ＧＲＯＵＰ）へ変化した。しかしながらＲＨＳＣＣのバイオレットグループ、バイオレット−ブルーグループ、ブルーグループには至らず、目的の青いバラを得ることは出来なかった。
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［実施例２０］ＷＫＳ１３３へのパンジー由来Ｆ３’５’Ｈ遺伝子（＃４０）とトレニア由来アントシアニン５−アシル基転移酵素遺伝子の導入
濃赤紫系バラ「ＷＫＳ１３３」へｐＳＰＢ１３０（図７）を導入し、１６個体の形質転換体を得た。色素分析を行った８個体全てでデルフィニジンの蓄積を確認した（表２０）。デルフィニジン含有率は最高３４％（平均１１％）であった。花色はＲＨＳカラーチャート５３ａ（ＲＥＤ  ＧＲＯＵＰ）から６１ａ（ＲＥＤ−ＰＵＲＰＬＥ  ＧＲＯＵＰ）へ変化した。しかしながらＲＨＳＣＣのバイオレットグループ、バイオレット−ブルーグループ、ブルーグループには至らず、目的の青いバラを得ることは出来なかった。
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［実施例２１］ＷＫＳ１３７へのパンジー由来Ｆ３’５’Ｈ遺伝子（＃４０）とトレニア由来アントシアニン５−アシル基転移酵素遺伝子の導入
濃赤紫系バラ「ＷＫＳ１３７」へｐＳＰＢ１３０（図７）を導入し、２０個体の形質転換体を得た。色素分析を行った１７個体全てでデルフィニジンの蓄積を確認した（表２１）。デルフィニジン含有率は最高１．３％（平均０．４％）であった。花色はＲＨＳカラーチャート６１ｂ（ＲＥＤ−ＰＵＲＰＬＥ  ＧＲＯＵＰ）から変化はみられなかった。
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［実施例２２］ＷＫＳ１４０へのパンジー由来Ｆ３’５’Ｈ遺伝子（＃４０）とトレニア由来アントシアニン５−アシル基転移酵素遺伝子の導入
藤色系バラ「ＷＫＳ１４０」へｐＳＰＢ１３０（図７）を導入し、１９７個体の形質転換体を得た。色素分析を行った４５個体のうち３７個体でデルフィニジンの蓄積を確認した（表２２及び表２３）。デルフィニジン含有率は最高９４％（平均４７％）であった。花色はＲＨＳカラーチャート１８６ｄ（ＧＲＥＹＥＤ−ＰＵＲＰＬＥ  ＧＲＯＵＰ）から７９ｄ（ＰＵＲＰＬＥ  ＧＲＯＵＰ）へ変化した。しかしながらＲＨＳＣＣのバイオレットグループ、バイオレット−ブルーグループ、ブルーグループには至らず、目的の青いバラを得ることは出来なかった。
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［実施例２３］ＷＫＳ７７へのパンジー由来Ｆ３’５’Ｈ遺伝子（＃４０）とトレニア由来アントシアニン５−アシル基転移酵素遺伝子の導入
濃赤紫系バラ「ＷＫＳ７７」へｐＳＰＢ１３０（図７）を導入し、３５個体の形質転換体を得た。色素分析を行った１７個体全てでデルフィニジンの蓄積を確認した（表２４）。デルフィニジン含有率は最高５７％（平均３３％）であった。花色はＲＨＳカラーチャート５７ａ（ＲＥＤ−ＰＵＲＰＬＥ  ＧＲＯＵＰ）から７１ａ（ＲＥＤ−ＰＵＲＰＬＥ  ＧＲＯＵＰ）へ変化した。しかしながらＲＨＳＣＣのバイオレットグループ、バイオレット−ブルーグループ、ブルーグループには至らず、目的の青いバラを得ることは出来なかった。
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［実施例２４］ＷＫＳ８２へのパンジー由来Ｆ３’５’Ｈ遺伝子（＃４０）とトレニア由来アントシアニン５−アシル基転移酵素遺伝子の導入
藤色系バラ「ＷＫＳ８２」へｐＳＰＢ１３０（図７）を導入し、８９個体の形質転換体を得た。色素分析を行った４４個体全てでデルフィニジンの蓄積を確認した（表２５及び表２６）。デルフィニジン含有率は最高９１％（平均４９％）であった。花色はＲＨＳカラーチャート１８６ｄ（ＧＲＥＹＥＤ−ＰＵＲＰＬＥ  ＧＲＯＵＰ）から８０ｃ（ＰＵＲＰＬＥ−ＶＩＯＬＥＴ  ＧＲＯＵＰ）へ変化した。しかしながらＲＨＳＣＣのバイオレットグループ、バイオレット−ブルーグループ、ブルーグループには至らず、目的の青いバラを得ることは出来なかった。
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［実施例２５］ＷＫＳ９１へのパンジー由来Ｆ３’５’Ｈ遺伝子（＃４０）とトレニア由来アントシアニン５−アシル基転移酵素遺伝子の導入
薄橙色系バラ「ＷＫＳ９１」へｐＳＰＢ１３０（図７）を導入し、１０個体の形質転換体を得た。色素分析を行った２個体のうち１個体のみでデルフィニジンの蓄積を確認した（表２７）。デルフィニジン含有率は最高２％であった。花色はＲＨＳカラーチャート４３ｃ（ＲＥＤ  ＧＲＯＵＰ）から変化がみられなかった。
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［実施例２６］ラバンデでのパンジー由来Ｆ３’５’Ｈ遺伝子（＃４０）とアーイリス由ＤＦＲ遺伝子の発現とバラ内在性ＤＦＲ遺伝子の抑制
切花の青いアイリス花弁からＲＮＡを得、さらにこれからｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡを調製した。このｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡからλＺＡＰＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）をベクターとするｃＤＮＡライブラリーをｃＤＮＡライブラリー作製キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いて製造者が推奨する方法で作製した。アイリスのＤＦＲ遺伝子断片は、リンドウのＤＦＲ遺伝子断片を取得した報告と同様に行った（Ｔａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．３７，７１１−７１６，１９９６）。
得られた約４００ｂｐのＤＮＡ断片をジーンクリーンにより製造者の推奨する方法で回収し、ｐＣＲ−ＴＯＰＯにサブクローニングした。その塩基配列を決定したところバラＤＦＲ遺伝子に相同な配列が見られた。このＤＮＡ断片を用いてアイリスｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、全長のアミノ酸配列を含むアイリスＤＦＲｃＤＮＡを得た。そのうちｐＳＰＢ９０６としたクローンに含まれるｃＤＮＡの全塩基配列を決定した。この塩基配列を配列番号：９に示し、そして対応するアミノ酸配列を配列番号：１０に示す。
次にｐＳＰＢ５８０をＢａｍＨＩとＸｈｏＩで消化して得られる約３．９ｋｂのＤＮＡ断片とｐＳＰＢ９０６をＢａｍＨＩとＸｈｏＩで消化して得られる約１．５ｋｂのＤＮＡ断片を連結し得られたプラスミドをｐＳＰＢ９０９とした。
植物中でバラＤＦＲｃＤＮＡの二本鎖ＲＮＡを転写するは次のように作製した。ｐＣＧＰ１３６４（Ｔａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．（１９９５）３６  １０２３−１０３１）をＰｓｔＩで部分消化して得られる約３．５ｋｂのＤＮＡ断片（Ｍａｃ１プロモーター、バラＤＦＲｃＤＮＡ，ｍａｓターミネーターを含む）をｐＵＣ１９（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ３３：１０３−１１９，１９８５）のＰｓｔＩ部位に挿入することによって得られるプラスミドのうちｐＵＣ１９のＨｉｎｄＩＩＩ部位がＭａｃＩプロモーターに近接しているものをｐＣＧＰ１３９４とした。
次に、ｐＣＧＰ１３９４をＨｉｎｄＩＩＩとＳａｃＩＩで消化して得られる約１．４ｋｂのＤＮＡ断片と、ｐＣＧＰ１３９４をＰｓｔＩで消化した後平滑末端化しさらにＳａｃＩＩで消化して得られる約１．９ｋｂのＤＮＡ断片と、ｐＢｉｎＰＬＵＳをＳａｃＩで消化した後平滑末端化しさらにＨｉｎｄＩＩＩで消化して得られるバイナリ−ベクター断片を連結しｐＳＰＢ１８５を得た。ｐＳＰＢ１８５をＸｂａＩで消化し、平滑末端化し、ＳａｌＩリンカーとライゲーションすることにより、ｐＳＰＢ５２１を得た。ｐＵＥ６をＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩで消化して得られる約７００ｂｐのＤＮＡ断片と、ｐＳＰＢ５２１をＨｉｎｄＩＩＩとＳａｃＩで消化して得られるバイナリ−ベクターＤＮＡ断片とｐＥ２１１３をＢａｍＨＩとＳａｃＩで消化して得られるＧＵＳ遺伝子ＤＮＡ断片を連結することによりｐＳＰＢ５２８を得た。
ｐＳＰＢ５２８はエンハンサーを有するカリフラワーモザイクウィルス３５Ｓプロモーターとマノピンシンターゼターミネーターの間に構造遺伝子を挿入し植物で発現させることができるバイナリ−ベクターである。また、ｐＣＧＰ６４５に含まれるバラＤＦＲｃＤＮＡの５’非翻訳領域配列を短くするためにｐＣＧＰ６４５をＳｍａＩとＰｖｕＩで消化した後平滑末端化し、ライゲーションして得られたｐＣＧＰ６４５ｓを得た。
バラＤＦＲｃＤＮＡの５’側配列を、ｐＣＧＰ６４５ｓを鋳型にリバースプライマーと合成プライマーＲＤＦ３１０（５’−ＣＣＣＴＣＧＡＧＣＣＣＴＴＧＡＴＧＧＣＣＴＣＧＴＣＧ−３’）（配列番号：１９）をプライマーに用いてＰＣＲにより増幅することにより取得し、ｐＣＲＴＯＰＯにクローニングした。ＤＮＡの塩基配列を決定しＰＣＲによるエラーがないことを確認した。これをｐＳＰＢ５６９とした。また長さの異なるバラＤＦＲｃＤＮＡの５’側配列を、ｐＣＧＰ６４５ｓを鋳型にリバースプライマーと合成プライマーＲＤＦ８３０（５’−ＧＧＧＴＣＧＡＣＧＣＧＧＣＣＣＴＣＴＧＣＴＴＴＣＧＧ−３’）（配列番号：２０）をプライマーに用いてＰＣＲにより増幅することにより取得し、ｐＣＲＴＯＰＯにクローニングした。ＤＮＡの塩基配列を決定しＰＣＲによるエラーがないことを確認した。
これをｐＳＰＢ５７０とした。ｐＳＰＢ５２８をＢａｍＨＩとＳａｃＩで消化して得られるバーナリーベクターのＤＮＡ断片と、ｐＳＰＢ５６９をＳａｃＩとＸｈｏＩで消化して得られる０．３ｋｂのＤＮＡ断片とｐＳＰＢ５７０をＢａｍＨＩとＳａｌＩで消化して得られるＤＮＡ断片を連結しｐＳＰＢ５７２を得た。本ベクターは植物中でバラＤＦＲｃＤＮＡの二本鎖ＲＮＡを転写するようにデザインされている。
ｐＵＥ６をＳａｃＩで消化し、平滑末端化し、ＳａｌＩリンカーを挿入しｐＵＥ８を得た。ｐＵＥ８をＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで消化して得られるＤＮＡ断片をｐＢｉｎＰＬＵＳのＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩ部位に導入し、ｐＳＰＢ１８９とした。ｐＳＰＢ１８９をＢａｍＨＩとＳａｌＩで消化して得られる約３．７ｋｂのＤＮＡ断片とｐＣＧＰ１９６１をＢａｍＨＩで完全消化しさらにＸｈｏＩで部分消化して得られる約１．８ｋｂのＤＮＡ断片を連結しｐＳＰＢ５６７を得た。ｐＳＰＢ５７２をＰａｃＩ消化し、脱リン酸化処理を行った後、ｐＳＰＢ５６７をＰａｃＩで消化して得られる約２．８ｋｂのＤＮＡ断片を連結し、ｎｐｔＩＩ遺伝子とパンジー由来のＦ３’５’Ｈ＃４０が同じ向きに転写されるプラスミドを選択し、ｐＳＰＢ９０５とした。
ｐＳＰＢ９０５をＡｓｃＩで消化し、脱リン酸化処理を行った後、ｐＳＰＢ９０９をＡｓｃＩで消化して得られる約２．５ｋｂのＤＮＡ断片を連結し、ｎｐｔＩＩ遺伝子と同じ方向にアイリスＤＦＲ遺伝子が転写されるプラスミドを得、ｐＳＰＢ９１９（図８）とした。本プラスミドはバラにおいてはアイリス由来のＤＦＲ遺伝子とパンジー由来のＦ３’５’Ｈ＃４０遺伝子を転写し、バラのＤＦＲ遺伝子の発現を二本鎖ＲＮＡの転写により抑制することが期待される。このプラスミドをＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ  ＡｇｌＯ株に導入した。
藤色系バラ品種「ラバンデ」へｐＳＰＢ９１９（図８）を導入し、８７個体の形質転換体を得た。色素分析を行った３８個体のうち３１個体でデルフィニジンの蓄積を確認した（表２８及び表２９）。デルフィニジン含有率は最高１００％（平均７６％）であった。花色はＲＨＳカラーチャート１８６ｃ（ＧＲＥＹＥＤ−ＰＵＲＰＬＥ  ＧＲＯＵＰ）から８５ａ，ｂ（ＶＩＯＬＥＴ  ＧＲＯＵＰ）へと大きく変化した。
バラ花弁からＲＮＡを前述のように抽出し、アガロースゲル電気泳動によりＲＮＡを分離した後ハイボンドＮ（アマシャム社）に転写した（たとえばＴａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．１９９５）。ｍＲＮＡの検出はＤＩＧ  Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｓｔａｒｔｅｒ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて製造者の推奨する方法により行った。バラＤＦＲｍＲＮＡの検出にはｐＣＧＰ６４５（Ｔａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．３６，１０２３−１０３１  １９９５）を鋳型として用いてＴ７プライマーで転写したものをプローブとして用いた。
パンジーＦ３’５’Ｈ＃４０  ｍＲＮＡの検出にはｐＣＧＰ１９６１を鋳型として用いてＴ７プライマーで転写したものをプローブとして用いた。アイリスＤＦＲｍＲＮＡの検出にはｐＳＰＢ９０６を鋳型として用いてＴ７プライマーで転写したものをプローブとして用いた。色の変化したバラにおいては、パンジー由来Ｆ３’５’Ｈ＃４０とアイリスＤＦＲ遺伝子のｍＲＮＡは検出された。一方、バラＤＦＲｍＲＮＡは宿主に比べ有意に減少しており、低分子量の位置にバンドが検出されることからバラＤＦＲ  ｍＲＮＡの分解が起こっていることがわかった。
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［実施例２７］ラバンデでのパンジー由来Ｆ３’５’Ｈ遺伝子（＃４０）とニーレンベルギア由来ＤＦＲ遺伝子の発現とバラ内在性ＤＦＲ遺伝子の抑制
ニーレンベルギア（Ｎｉｅｒｅｍｂｅｒｇｉａ  ｈｙｂｒｉｄａ）品種フェアリーベルパティオライトブルー（サントリーフラワーズ株式会社）の花弁からＲＮＡを得、さらにこれからｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡを調製した。このｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡからλＺＡＰＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）をベクターとするｃＤＮＡライブラリーをｃＤＮＡライブラリー合成キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いて製造者が推奨する方法で作製した。このｃＤＮＡライブラリーをＤＩＧ標識したペチュニアＤＦＲｃＤＮＡ（ｐＣＧＰ１４０５に由来）を用いてスクリーニングした。
スクリーニングの条件はＤＩＧ標識システムで製造者が推奨するプラークハイブリダイゼーション方法に従った。ただし、プレハイブリダイゼーションならびにハイブリダイゼーションバッファー中のホルムアミド濃度３０％とし、３７℃で一晩ハイブリダイゼーションを行った。またメンブレンの洗浄は、１％ＳＤＳを含む５ｘＳＳＣ中５５℃で行った。得られた多数のポシティブなシグナルのうち２０プラークからプラスミドを回収し、リバースプライマー（タカラ）を用いて塩基配列の決定を行った。これらはペチュニアはじめ他の植物のＤＦＲ遺伝子に相同性を示した。これらのうちｐＳＰＢ７０９としたクローンのｃＤＮＡの全配列を決定した。得られた塩基配列を配列番号：１１に示し、そしてそれに対応するアミノ酸配列を配列番号：１２に示す。
ｐＳＰＢ５８０をＢａｍＨＩとＸｈｏＩで消化して得られる約３．９ｋｂのＤＮＡ断片とｐＳＰＢ７０９をＢａｍＨＩとＸｈｏＩで消化して得られる約１．５ｋｂのＤＮＡ断片を連結し得られたプラスミドをｐＳＰＢ９１０とした。ｐＳＰＢ９０５をＡｓｃＩで消化し、脱リン酸化処理を行った後、ｐＳＰＢ９１０をＡｓｃＩで消化して得られる約２．５ｋｂのＤＮＡ断片を連結し、ｎｐｔＩＩ遺伝子と同じ方向にニーレンベルギアＤＦＲ遺伝子が転写されるプラスミドを得、ｐＳＰＢ９２０（図９）とした。本プラスミドはバラにおいてはニーレンベルギア由来のＤＦＲ遺伝子とパンジー由来のＦ３’５’Ｈ＃４０遺伝子を転写し、バラのＤＦＲ遺伝子の発現を二本鎖ＲＮＡの転写により抑制することが期待される。このプラスミドをアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ＡｇｌＯ株に導入した。
藤色系バラ品種「ラバンデ」へｐＳＰＢ９２０（図９）を導入し、５６個体の形質転換体を得た。色素分析を行った２４個体のうち２３個体でデルフィニジンの蓄積を確認した（表３０）。デルフィニジン含有率は最高１００％（平均４３％）であった。花色はＲＨＳカラーチャート１８６ｃ（ＧＲＥＹＥＤ−ＰＵＲＰＬＥ  ＧＲＯＵＰ）から８５ｂ（ＶＩＯＬＥＴ  ＧＲＯＵＰ）へと変化した。
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［実施例２８］後代への形質の遺伝
藤色系バラ品種「ラバンデ」へｐＳＰＢ９１９（図８）を導入し得られた形質転換体（ＬＡ／９１９−２−１３）を花粉親に用い、母親として非組換え体のＷＫＳ７７あるいはＷＫＳ１３３を用いて交配（鈴木省三，「ばら、花図譜」、小学館，ｐ．２５６−２６０、１９９０）を行った。受粉後１００日目に果実を収穫した。播種は、まず果実を剥いて痩果を採取し、さらに痩果を剥いて胚を取り出した後、シャーレ内の湿らせたろ紙上に置床した。播種時に使用する水は滅菌水にＰＰＭＴＭ（Ｐｌａｎｔ  Ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｖｅ  Ｍｉｘｔｕｒｅ，ＰＬＡＮＴ  ＣＥＬＬ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，ＩＮＣ．）を１ｍｌ／ｌ、カナマイシンを５０ｍｇ／ｌ添加したものを用い、正常に発芽したもののみを鉢上げし、育苗を行った。
得られた形質転換体後代のうち、色素分析を行った４０個体全てでデルフィニジンの蓄積を確認した（表３１及び表３２）。デルフィニジン含有率は最高９９％（平均４６％）であった。
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［実施例２９］ＷＫＳ１４０でのパンジーＦ３’５’Ｈ＃４０遺伝子とアイリスＤＦＲ遺伝子の発現とバラ内在性ＤＦＲ遺伝子の抑制
藤色系バラ品種「ＷＫＳ１４０」へｐＳＰＢ９１９を導入し、８９個体の形質転換体を得た。色素分析を行った７９個体のうち７４個体でデルフィニジンの蓄積を確認した。デルフィニジン含有率は最高１００％（平均６８％）であった。花色はＲＨＳカラーチャート１８６ｄ（ＧＲＥＹＥＤ−ＰＵＲＰＬＥ  ＧＲＯＵＰ）から主に８４ｃ（ＶＩＯＬＥＴ  ＧＲＯＵＰ）へと変化した。
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［実施例３０］ＷＫＳ７７でのパンジーＦ３’５’Ｈ＃４０遺伝子とアイリスＤＦＲ遺伝子の発現とバラ内在性ＤＦＲ遺伝子の抑制
濃赤紫系バラ品種「ＷＫＳ７７」へｐＳＰＢ９１９を導入し、５０個体の形質転換体を得た。色素分析を行った２３個体のうち２１個体でデルフィニジンの蓄積を確認した。デルフィニジン含有率は最高８１％（平均１９％）であった。花色はＲＨＳカラーチャート５７ａ（ＲＥＤ−ＰＵＲＰＬＥ  ＧＲＯＵＰ）から７７ｂ（ＰＵＲＰＬＥ  ＧＲＯＵＰ）へ変化した。
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［実施例３１］ＷＫＳ７７でのパンジーＦ３’５’Ｈ＃４０遺伝子とニーレンベルギアＤＦＲ遺伝子の発現とバラ内在性ＤＦＲ遺伝子の抑制
濃赤紫系バラ「ＷＫＳ７７」へｐＳＰＢ９２０を導入し、３０個体の形質転換体を得た。色素分析を行った２７個体中、２６個体でデルフィニジンの蓄積を確認した。デルフィニジン含有率は最高９８％（平均６０％）であった。花色はＲＨＳカラーチャート５７ａ（ＲＥＤ−ＰＵＲＰＬＥ  ＧＲＯＵＰ）から７７ｂ（ＰＵＲＰＬＥ  ＧＲＯＵＰ）へ変化した。
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［実施例３２］ＷＫＳ７７でのパンジーＦ３’５’Ｈ＃４０遺伝子とペチュニアＤＦＲ遺伝子の発現とバラ内在性ＤＦＲ遺伝子の抑制
濃赤紫系バラ「ＷＫＳ７７」へｐＳＰＢ９２１を導入し、１５個体の形質転換体を得た。色素分析を行った１３個体のうち１２個体でデルフィニジンの蓄積を確認した。デルフィニジン含有率は最高９８％（平均６０％）であった。花色はＲＨＳカラーチャート５７ａ（ＲＥＤ−ＰＵＲＰＬＥ  ＧＲＯＵＰ）から７２ｂ（ＲＥＤ−ＰＵＲＰＬＥ  ＧＲＯＵＰ）へ変化した。
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［実施例３３］後代への形質の遺伝
藤色系バラ品種「ラバンデ」へｐＳＰＢ９１９を導入し得られた形質転換体（ＬＡ／９１９−４−１０）を花粉親に用い、母親として非組換え体バラの品種ブラックバカラを用いて実施例２８と同様に交配を行った。受粉後１００日目に果実を収穫した。播種は、まず果実を剥いて痩果を採取し、さらに痩果を剥いて胚を取り出した後、シャーレ内の湿らせたろ紙上に置床した。播種時に使用する水は滅菌水にＰＰＭＴＭ（Ｐｌａｎｔ  Ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｖｅ  Ｍｉｘｔｕｒｅ，ＰＬＡＮＴ  ＣＥＬＬ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，ＩＮＣ．）を１ｍｌ／ｌ、カナマイシンを５０ｍｇ／ｌ添加したものを用い、正常に発芽したもののみを鉢上げし、育苗を行った。
得られた形質転換体後代のうち、色素分析を行った１８個体全てでデルフィニジンの蓄積を確認した。デルフィニジン含有率は最高９９．８％（平均９８．７％）であった。
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［実施例３４］ＷＫＳ７７でのパンジーＦ３’５’Ｈ＃４０遺伝子の発現とバラ内在性Ｆ３’Ｈ遺伝子の抑制
濃赤紫系バラ品種「ＷＫＳ７７」へｐＳＰＢ１１０６（図１０）を導入し、４０個体の形質転換体を得た。色素分析を行った２６個体全てでデルフィニジンの蓄積を確認した。デルフィニジン含有率は最高８０．０％（平均３０．５％）であった。花色はＲＨＳカラーチャート５７ａ（ＲＥＤ−ＰＵＲＰＬＥ  ＧＲＯＵＰ）から８３ｄ（ＶＩＯＬＥＴ  ＧＲＯＵＰ）へと大きく変化した。
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［実施例３５］ＬａｖａｎｄｅでのパンジーＦ３’５’Ｈ＃４０遺伝子の発現とバラ内在性Ｆ３’Ｈ遺伝子の抑制
藤色系バラ品種「Ｌａｖａｎｄｅ」へｐＳＰＢ１１０６を導入し、４０個体の形質転換体を得た。色素分析を行った２５個体のうち２３個体でデルフィニジンの蓄積を確認した。デルフィニジン含有率は最高９８．３％（平均４６．９％）であった。
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以上は導入した外来遺伝子が後代へ伝達され、かつその遺伝子が後代において発現し、本来バラ花弁では見られないディフィニジンを生成するという形質が後代のバラに伝わることを示している。したがって、本遺伝子を用いて色の変化したバラを交配育種することによって、青や紫を含む新しい色のバラを作出できることを示している。
【産業上の利用可能性】  バラの内在性の代謝経路の働き、例えばジヒドロフラボノール還元酵素の発現、を人為的に抑制し、かつパンジー由来のフラボノイド３’，５’−水酸化酵素をコードする遺伝子及びバラ以外の由来のジヒドロフラボノール還元酵素をコードする遺伝子を発現させることにより、青〜紫のバラを作出することが出来る。また、これらの遺伝子は次の世代にも伝達され、青いバラの形質は交配により利用されうることもわかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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