(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ニトリルヒドラターゼを含有する微生物の菌体またはその菌体処理物を水性媒体中でニトリル化合物と反応して、アミド化合物を連続的に製造する方法において、槽形反応器を用いて該菌体又はその菌体処理物を水性媒体中でニトリル化合物と接触させた後、得られた反応液を、管型反応器、チューブラー反応器、スパイラル型の熱交換器、プレート型の熱交換器および塔型反応器からなる群から選択される少なくとも１種の反応器を用いてさらに反応させることを特徴とするアミド化合物の製造方法。
【請求項２】
槽形反応器を用いる反応ならびに管型反応器、チューブラー反応器、スパイラル型の熱交換器、プレート型の熱交換器および塔型反応器からなる群から選択される少なくとも１種の反応器を用いる反応における反応時間が、それぞれ０．５〜４０時間である請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
管型反応器、チューブラー反応器、スパイラル型の熱交換器、プレート型の熱交換器および塔型反応器からなる群から選択される少なくとも１種の反応器が、管型反応器および／またはチューブラー反応器である請求項１または２に記載の製造方法。
【請求項４】
槽形反応器を懸濁床として用いる請求項１〜３のいずれかに記載の製造方法。
【請求項５】
ニトリル化合物がアクリロニトリルであり、微生物の菌体またはその菌体処理物と接触させる際の、水およびアクリロニトリルの比率が、水１重量部に対しアクリロニトリル０．４〜１．５重量部である請求項１〜４のいずれかに記載の製造方法。
【請求項６】
微生物の菌体が、微生物よりクローニングしたニトリルヒドラターゼ遺伝子を任意の宿主で発現させた形質転換体である、請求項１〜５のいずれかに記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はアミド化合物の製造方法に関するものであり、より詳しくは、ニトリル化合物を高転化率で水和して高濃度アミド化合物水溶液を連続的に製造する方法であって、反応後の残留ニトリル化合物が少なく、かつ工業的にも適したアミド化合物水溶液の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
アミド化合物の主要な製造方法の一つとして、ニトリル化合物を原料とする水和法は多くの場合に用いられており、特にアクリルアミドは、古くからラネー銅等の金属銅触媒、あるいは近年ではニトリルヒドラターゼを含有する微生物菌体およびその菌体処理物等の水和触媒により、アクリロニトリルを原料として製造されることが知られている。
【０００３】
上記において、製品アクリルアミドは通常、水溶液または結晶の形態で供給されるが、それを使用する際には水性溶媒で希釈したり、あるいは溶解して用いることが一般的である。このため、特に近年では水溶液の形態での供給がほとんどである。
【０００４】
アクリルアミド水溶液の供給においては、製品形態は輸送および貯蔵等のコストの観点から、より高濃度のものが求められるが、また一方、輸送または貯蔵中等では結晶の析出を防止する必要がある。このため、常温付近での輸送および貯蔵等に適したアクリルアミド濃度は、通常は４０〜５０重量％程度である。
【０００５】
ところが、従来の工業的製造技術においては、反応工程でのアクリルアミド濃度は製造プロセスおよび使用触媒の種類にもよるが、通常４０重量％未満である。その理由は、反応工程でアクリロニトリルおよび／またはアクリルアミドの濃度を高めた場合は、触媒活性が失活する、反応が未完結となり原料アクリロニトリルが残存する、副生成物が増加する、等といった傾向がみられ、また反応熱の除熱能力による制限等といった問題もあるからであり、最終的な製品濃度のアクリルアミドのものを、上記反応終了時に直接得ることは、通常は困難であるからである。
【０００６】
従って、現状のアクリルアミドの工業的製造プロセスにおいては、原料アクリロニトリルを多段供給する方法（特公昭５７−１２３４号公報）や反応液の一部循環による原料希釈法（特公昭５８−３５０７７号公報）等により原料アクリロニトリルの濃度を制限したり、または原料アクリロニトリルの転化率を低く抑え、反応液中のアクリルアミド濃度を４０重量％未満とすること等により、触媒の失活や副生成物の増加を抑制している。このため通常は、得られたアクリルアミド水溶液の濃度向上、および／または残存アクリロニトリルの除去を目的とした濃縮が行われることが多い。
【０００７】
ところが一般に、アクリルアミド含有液の濃縮は減圧下に行われるが、アクリルアミドは非常に反応性に富む重合性モノマーであるため、濃縮中に重合を起こす危険性が大きい。このため、例えば濃縮時に酸素を導入して安定化させる方法、一酸化窒素を共存させる方法、および金属イオンを共存させる方法等が行われたりしているが、重合を完全に防止することは困難である。
【０００８】
また特開平１１−８９５７５号公報には、微生物の菌体または菌体処理物を利用したアクリルアミドの製法が開示され、該公報では原料アクリロニトリルを、反応の開始時または反応途中のアクリロニトリル濃度が水性媒体中でのアクリルニトリルの飽和濃度以上となるように添加することにより、より少ない菌体量で高濃度アクリルアミド濃度が得られる旨記載している。これにより濃縮をせずとも、濃度４０重量％以上のアクリルアミド水溶液を得ることは可能であるが、反応の触媒の使用量や反応温度と、開始時または反応途中のアクリロニトリル濃度の関係によっては、不都合を生じる場合がある。例えば、短時間のうちに反応を完結させるような場合では、初期の反応熱が大きく、反応器に対して比較的大きな熱交換器が必要となったり、あるいは逆に、アクリロニトリル転化率を９９％以上とするために長時間の反応時間を要する。
【０００９】
以上の理由から、アミド化合物の工業的な製法としては、ニトリル化合物の転化率がより高く、濃縮工程が不要で、かつ高濃度アミド化合物がより効率的に得られる方法が切望されていた。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は以上の問題点を解決するためになされたものであり、その目的とするところは、ニトリル化合物を高転化率で転化して高濃度アミド化合物を製造できる方法であって、残留ニトリル化合物が極めて少なく、連続操業の可能な、工業的にも適した製造方法を提供することにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記目的を達成するために鋭意検討した結果、ニトリルヒドラターゼを含有する微生物の菌体もしくは菌体処理物を水性媒体中でニトリル化合物と接触させて反応させ、次いで該反応液を、プラグフロー性の流域を有する条件下でさらに反応させることが、目的達成の上で極めて有効な手段であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち、本発明は、
（１）ニトリルヒドラターゼを含有する微生物の菌体またはその菌体処理物を水性媒体中でニトリル化合物と反応して、アミド化合物を連続定に製造する方法において、該菌体または菌体処理物を水性媒体中でニトリル化合物と接触させた後、得られた反応液を、プラグフロー性の流域を有する条件下でさらに反応させることを特徴とするアミド化合物の製造方法であり、
また、（２）ニトリル化合物がアクリロニトリルであり、微生物の菌体またはその菌体処理物と接触させる際の、水およびアクリロニトリルの比率が、水１重量部に対しアクリロニトリル０．４〜１．５重量部である上記（１）に記載の製造方法であり、
また、（３）微生物の菌体が、微生物よりクローニングしたニトリルヒドラターゼ遺伝子を任意の宿主で発現させた形質転換体である、上記（１）または（２）に記載の製造方法である。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明で重要な点は、ニトリルヒドラターゼを含有する微生物菌体またはその菌体処理物をニトリル化合物のニトリル基のアミド化触媒として用い、特に副生物の生成を抑制しつつ、高転化率でしかも高濃度のアミド化合物水溶液を効率よく製造できる点にある。
【００１４】
本発明にいうニトリルヒドラターゼとは、ニトリル化合物を加水分解して対応するアミド化合物を生成する能力をもつ酵素をいう。
ここで、ニトリルヒドラターゼを含有する微生物としては、ニトリル化合物を加水分解して対応するアミド化合物を生成する能力を有するニトリルヒドラターゼを産生し、かつ３０重量％のアクリルアミド水溶液中でニトリルヒドラターゼの活性を保持している微生物であれば、特に制限されるものではない。具体的には、ノカルディア(Nocardia)属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属、バチルス(Bacillus)属、好熱性のバチルス属、シュードモナス(Pseudomonas)属、ミクロコッカス(Micrococcus)属、ロドクロウス(rhodochrous)種に代表されるロドコッカス(Rhodococcus)属、アシネトバクター(Acinetobacter)属、キサントバクター(Xanthobacter)属、ストレプトマイセス(Streptomyces)属、リゾビウム(Rhizobium)属、クレブシエラ(Klebsiella)属、エンテロバクター(Enterobacter)属、エルウィニア(Erwinia)属、エアロモナス(Aeromonas)属、シトロバクター(Citrobacter)属、アクロモバクター(Achromobacter)属、アグロバクテリウム( Agrobacterium)属またはサーモフィラ(thermophila)種に代表されるシュードノカルディア(Pseudonocardia)属に属する微生物を好適な例として挙げることができる。
【００１５】
また、該微生物よりクローニングしたニトリルヒドラターゼ遺伝子を任意の宿主で発現させた形質転換体も本発明でいう微生物に含まれる。なお、ここでいう任意の宿主には、後述の実施例のように大腸菌(Escherichia coli)が代表例として挙げられるが、特に大腸菌に限定されるのものではなく、枯草菌(Bacillus subtilis)等のバチルス属菌、酵母や放線菌等の他の微生物菌株も含まれる。その様なものの例として、ＭＴ−１０８２２（本菌株は、１９９６年２月７日に茨城県つくば市東１丁目１番３号の通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−５７８５として、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に基づいて寄託されている。）が挙げられる。また、組換えＤＮＡ技術を用いて該酵素の構成アミノ酸の１個または２個以上を他のアミノ酸で置換、欠失、削除もしくは挿入することにより、アクリルアミド耐性やアクリロニトリル耐性、温度耐性をさらに向上させた変異型のニトリルヒドラターゼを発現させた形質転換体も、本発明でいう微生物に含まれる。
【００１６】
上記したような微生物を用い、アミド化合物を製造するに際しては通常、該微生物の菌体あるいは菌体処理物を用いる。菌体は、分子生物学、生物工学、遺伝子工学の分野において公知の一般的な方法を利用して調製すればよい。例えば、ＬＢ培地やＭ９培地等の通常液体培地に該微生物を植菌した後、適当な培養温度（一般的には、２０℃〜５０℃であるが、好熱菌の場合は５０℃以上でもよい）で生育させ、続いて、該微生物を遠心分離によって培養液より分離、回収して得る方法が挙げられる。
【００１７】
また、本発明における微生物の菌体処理物は、上記微生物菌体の抽出物や磨砕物、該抽出物や磨砕物のニトリルヒドラターゼ活性画分を分離精製して得られる後分離物、該微生物菌体や該菌体の抽出物、磨砕物、後分離物を適当な担体を用いて固定化した固定化物等を指し、これらはニトリルヒドラターゼの活性を有している限りは本発明の菌体処理物に相当するものである。これらは、単一の種類を用いてもよいし、２種類以上の異なる形態のものを同時あるいは交互に用いてもよい。
【００１８】
本発明において、ニトリルヒドラターゼを含有する微生物菌体、あるいはその微生物菌体の処理物を用いて、ニトリル化合物からアミド化合物を得る場合の反応形式は、２基以上の反応器が用いられ、その前段の反応器に、微生物の菌体もしくは菌体処理物、ニトリル化合物および水性媒体が供給される。この際の反応形式としては、特に限定するものではなく、例えば懸濁床として行ってもよいし、固定床であってもよいが、通常は、反応熱の除熱の容易さから、攪拌機を備えた槽形反応器での懸濁床がより好ましく用いられる。
【００１９】
本発明において、ニトリル化合物の種類については特に限定されるものではなく、具体的には炭素数が２〜２０程度のニトリル化合物であり、広い範囲のニトリル、たとえば脂肪族ニトリル、芳香族ニトリルなどが含まれる。脂肪族ニトリルとしては、炭素数２〜６の飽和または不飽和ニトリル、たとえば、アセトニトリル、プロピオニトリル、ブチロニトリル、イソブチロニトリル、バレルニトリル、イソバレロニトリル、カプロニトリルなどの脂肪族飽和モノニトリル類；マロノニトリル、サクシノニトリル、アジポニトリルなどの脂肪族飽和ジニトリル類；アクリロニトリル、メタアクリロニトリル、クロトンニトリルなどの脂肪族不飽和ニトリルなどが挙げられる。芳香族ニトリルとしては、ベンゾニトリル、ｏ−，ｍ−，およびｐ−クロロベンゾニトリル、ｏ−，ｍ−，およびｐ−フルオロベンゾニトリル、ｏ−，ｍ−，およびｐ−ニトロベンゾニトリル、ｏ−，ｍ−，およびｐ−トルニトリル、ベンジルシアナイド等が挙げられる。中でもアクリロニトリル、メタクリロニトリル、およびクロトンニトリル等が好適な例として挙げられる。
【００２０】
また、本発明における水性媒体とは、水、またはリン酸塩等の緩衝剤、硫酸塩や炭酸塩等の無機塩、アルカリ金属の水酸化物、もしくはアミド化合物等を適当な濃度で溶解させた水溶液をいう。
【００２１】
本発明において、前段の反応器に供給するニトリル化合物の濃度は、反応開始時において該ニトリル化合物の飽和濃度以上の濃度である。その濃度の上限は特に制限されるものではないが、あまりに大過剰のニトリル化合物の供給は、反応を完結させるために多くの触媒量および過大な容積をもつ反応器、および除熱のための過大な熱交換器等が必要となり、設備面での経済的負担が大きくなる。このため、ニトリル化合物の供給濃度としては、それが全て対応するアミド化合物に転化したときにその理論的な生成液濃度が、アクリルアミドの場合は４０〜８０重量％の範囲となるように、より具体的には水１重量部に対しアクリロニトリル０．４〜１．５重量部として供給することが好ましい。またメタクリルアミドの場合はその理論的生成液濃度が１０〜４０重量％の範囲となるように、より具体的には水１重量部に対しメタクリロニトリル０．０８〜０．５重量部として、ニトリル化合物および水を供給することが好ましい。
【００２２】
次いで本発明では、上記前段の反応器から取り出された反応液はプラグフロー性の流域を有する条件下で、さらに反応を行わせる。より具体的には前段の反応器で得られた反応液は、プラグフロー性の流域を有した後段の反応器に送液される。ここでプラグフロー性の流域を有した反応器とは、一般的には管型反応器またはチューブラー反応器とも言われることのある反応器であり、配管形状を有した管の中で反応液をピストン流れで移動させながら反応を進行させるようにしたもので、反応熱を除熱するために、二重管形式のものやシェル＆チューブ形式等のものを用いることができる。
【００２３】
しかしながら、本発明ではプラグフロー性の流域を有する反応器として上記形式のものに限られるわけではなく、他の形式の反応器であっても反応液のショートパスが起こり難い形態のものであれば、十分それを使用することができる。すなわち流速等、条件次第で反応液がプラグフロー性の流域を有することができれば、そして反応熱の除熱ができる構造のものであれば、プラグフロー性の流域を有した反応器として使用することができる。例えば、熱交換器におけるスパイラル型やプレート型であるもの、あるいは塔型反応器等、多様のものが使用できる。さらには、これらの内部に反応液の流動状態を均一にもっていくための邪魔板（バッフル）や、充填物を有している場合であっても、流速等の条件次第で反応液のプラグフロー性の流域を有すれば、プラグフロー性の流域を有した反応器として使用することが可能である。
【００２４】
なお、上記で示した前段の反応器、および後段であるプラグフロー性の流域を有した反応器はそれぞれが１基ずつに限られるものではなく、それぞれが単独でもまたは複数が直列にあるいは並列に並べられる形式であっても構わない。また上記前段および後段の反応における反応時間（滞留時間）は触媒使用量や温度等の条件にも左右され一定しないが、通常はそれぞれが０．５〜４０時間の範囲であり、好ましくはそれぞれが１〜２０時間の範囲である。また、全反応時間のうち、前段の反応器の反応時間は、全体の反応時間の２０〜９９％、好ましくは４０〜９０％であり、後半の反応器の反応時間は、全体の反応時間の１〜８０％、好ましくは１０〜６０％である。
【００２５】
触媒の使用量については、反応条件や触媒の種類、およびその形態により変化するが、通常は該微生物乾燥菌体重量換算で、反応液に対し、１０〜５００００重量ppm、好ましくは５０〜３００００重量ppmである。
【００２６】
また、アミド化反応は通常は常圧あるいは常圧近辺で行われるが、水性媒体中へのニトリル化合物の溶解度を高めるために加圧下で行うこともできる。また、反応温度に関しては、水性媒体の氷点以上であれば特に制限されるものではないが、通常は０〜５０℃の範囲で行うのが好ましく、より好ましくは１０〜４０℃の範囲である。また、生成物が反応液中に晶出したスラリー状態でも反応を行うことができる。
また、上記アミド化反応時における反応液のｐＨは、ニトリルヒドラターゼ活性が維持されている限りは特に制限されるものではないが、好ましくはｐＨ６〜１０の範囲であり、より好ましくはｐＨ７〜９の範囲である。
【００２７】
また、本実施例ではニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得を部位特異的な変異によって行っている。しかし、実施例において開示される変異点と置換される塩基の種類に基づいて、部位特異的な変異以外の方法で組替えプラスミドを構築し、それを宿主細胞に導入しても、本実施例と同様の結果を得ることが可能である。
【００２８】
例えば、実施例において開示される変異点に相当する領域のＤＮＡの塩基配列がアミノ酸置換後の配列となるような塩基配列を有するＤＮＡフラグメントをＤＮＡシンセサイザー等で合成し、得られたフラグメントと別途分離しておいたｐＰＴ−ＤＢ１の該フラグメントに相当する領域とを置換することにより、目的とする組替えプラスミドを取得することができる。
【００２９】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例によって何等限定されるものではない。以下において、反応液のＨＰＬＣ分析は、ＨＰＬＣカラムとしてＵＬＴＲＯＮ  ８０ＨＧ（５０×８φｍｍ）を用い、１０ｍＭリン酸水溶液を展開液として使用したものであり、アクリルアミドおよびアクリロニトリルは２２０ｎｍの吸光度により検出し、濃度を測定したものである。
【００３０】
実施例１
（１）ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得
αサブユニットの６番目のＬｅｕをＭｅｔに置換するために、特開平９−２７５９７８で得られたｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型として、宝酒造社製の「ＬＡ ＰＣＲ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ」を用いた部位特異的な変異導入を行った。以後、「ＬＡ ＰＣＲ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ」を単にキットと呼ぶ。以下の実施例では、基本的にキットの原理および操作方法を踏襲した。
【００３１】
３０ｍｌの試験管に１０ｍｌのＬＢ液体培地を調製し、１２１℃・２０分間のオートクレーブにより滅菌した。この培地に終濃度が１００μｇ／ｍｌとなるようにアンピシリンを添加した後、ＭＴ−１０８２２株を一白金耳植菌し、３７℃・３００ｒｐｍにて約２０時間培養した。該培養液１ｍｌを適当な遠心チューブに分取した後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ×５分）により該菌体を分離した。続いてアルカリＳＤＳ抽出法により該菌体よりｐＰＴ−ＤＢ１のプラスミドＤＮＡを調製した。
【００３２】
ｐＰＴ−ＤＢ１のプラスミドＤＮＡ１μｇを鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号１記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号２に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μｌの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号３に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号４に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μｌの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１およびＮｏ．２の反応終了液各５μｌを用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。Ｍｉｃｒｏｃｏｎ１００（宝酒造社製）を用いてそれぞれのＰＣＲ反応終了液より過剰なプライマーおよびｄＮＴＰを除去した後、ＴＥ（トリスヒドロキシメチルアミノメタン・ＥＤＴＡ緩衝液）を加えて各々５０μｌの溶液を調製した。該ＴＥ溶液を各０．５μｌずつ含む全量４７．５μｌのアニーリング溶液（組成はキットに記載の条件による）を調製し、熱変性処理（９８℃）を１０分間行った後、３７℃まで６０分間かけて一定の速度で冷却を行い、続いて３７℃で１５分間保持することによってアニーリング処理を行った。アニーリング処理液にＴＡＫＡＲＡＬＡ  Ｔａｑを０．５μｌ加えて７２℃で３分間加熱処理を行い、ヘテロ２本鎖を完成させた。これにＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号２に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号４に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ加えて全量を５０μｌとした後、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことによるＰＣＲ反応Ｎｏ．３を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．３の反応終了液５μｌを用いたアガロース電気泳動（シグマ社製タイプＶＩＩ低融点アガロース使用；アガロース濃度０．８重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、約２．０ｋｂｐの増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。続いて、アガロースゲルから約２．０ＫｂｐのＤＮＡ断片のみを切り出し、該アガロース片（約０．１ｇ）を細かく粉砕し１ｍｌのＴＥ溶液に懸濁後、５５℃で１時間保温してアガロースを完全に融解させた。この融解液に対して常法に従ってフェノール／クロロホルム抽出とエタノール沈澱を行って該ＤＮＡ断片を精製し、最終的に１０μｌのＴＥに溶解した。精製した約２．０ｋｂｐの増幅ＤＮＡ断片を制限酵素ＥｃｏＲI及びＨｉｎｄIIIにより切断した後、この制限酵素処理液に対してフェノール／クロロホルム抽出とエタノール沈澱を行って該ＤＮＡ断片を精製し、最終的に１０μｌのＴＥに溶解した。同様に、ｐＰＴ−ＤＢ１上の唯一の制限酵素サイトであるＥｃｏＲIおよびＨｉｎｄIIIによりｐＰＴ−ＤＢ１を切断し、アガロースゲル電気泳動（シグマ社製タイプＶＩＩ低融点アガロース使用；アガロース濃度０．７％）を行い、アガロースゲル��ら約２．７ＫｂｐのＤＮＡ断片のみを切り出した。切りだしたアガロース片（約０．１ｇ）を細かく粉砕し１ｍｌのＴＥ溶液に懸濁後、５５℃で１時間保温してアガロースを完全に融解させた。この融解液に対してフェノール／クロロホルム抽出とエタノール沈澱を行って該ＤＮＡ断片を精製し、最終的に１０μｌのＴＥに溶解した。この様にして得られた増幅ＤＮＡ産物とｐＰＴ−ＤＢ１断片をＤＮＡライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて連結させた後、大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、大腸菌バンクを調製した。
【００３３】
３０ｍｌの試験管に４０μｇ／ｍｌの硫酸第二鉄・七水和物及び１０μｇ／ｍｌの塩化コバルト・二水和物を含む１０ｍｌのＬＢ液体培地（以後、活性発現培地と呼ぶ）を調製し、１２１℃・２０分間のオートクレーブにより滅菌した。この培地に終濃度が１００μｇ／ｍｌとなるようにアンピシリンを添加した後、該大腸菌バンクより任意に選別した５クローンを各一白金耳ずつ植菌し、３７℃・３００ｒｐｍにて約２０時間培養した。該培養終了液１ｍｌをそれぞれ適当な遠心チューブに分取した後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ×５分）により菌体を分離した。該菌体を２００μｌのリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）に懸濁し、これに１重量％のアクリロニトリルを添加して１０℃で２分間反応させた。反応液にこれと等量の１Ｍリン酸水溶液を添加して反応を停止させ、生成したアクリルアミド濃度を実施例２と同様のＨＰＬＣ分析により測定した。その結果、５クローン中４クローンでアクリルアミドの生成が検出され、ニトリルヒドラターゼ活性を保持していることが確認された。
【００３４】
ニトリルヒドラターゼ活性の測定に供した上記培養液の残部１ｍｌより該４クローンの菌体をそれぞれ分離し、アルカリＳＤＳ抽出法により各クローンのプラスミドＤＮＡを調製した。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたプライマーエクステンション法により各クローンのニトリルヒドラターゼ構造遺伝子の塩基配列を決定した。その結果、表１（表１）に示したクローンＮｏ．１においてニトリルヒドラターゼのαサブユニットの６番目のＬｅｕがＭｅｔに置換されていた。
【００３５】
【表１】
0004672161.tif 000002
【００３６】
続いて、 αサブユニットの１２６番目のＰｈｅをＴｙｒに置換するために、クローンＮｏ．１のプラスミドＤＮＡを鋳型として、上述と同様の操作により部位特異的な変異導入を行った。
すなわち、３０ｍｌの試験管に１０ｍｌのＬＢ液体培地を調製し、１２１℃・２０分間のオートクレーブにより滅菌した。この培地に終濃度が１００μｇ／ｍｌとなるようにアンピシリンを添加した後、得られたクローンＮｏ．１株を一白金耳植菌し、３７℃・３００ｒｐｍにて約２０時間培養した。該培養液１ｍｌを適当な遠心チューブに分取した後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ×５分）により菌体を分離した。続いてアルカリＳＤＳ抽出法により該菌体よりクローンＮｏ．１株のプラスミドＤＮＡを調製した。
【００３７】
このクローンＮｏ．１株のプラスミドＤＮＡ１μｇを鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．４は、配列表の配列番号５記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号２に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μｌの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．５は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号３に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号４に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μｌの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．４と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．４およびＮｏ．５の反応終了液各５μｌを用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。以後、クローンＮｏ．１の場合と全く同じ操作により大腸菌バンクを調製した。
【００３８】
該大腸菌バンクより任意に選別した５クローンをクローンＮｏ．１の場合と同じ活性発現培地１０ｍｌに各一白金耳ずつ植菌し、３７℃・３００ｒｐｍにて約２０時間培養した。該培養終了液１ｍｌをそれぞれ適当な遠心チューブに分取した後、ニトリルヒドラターゼ活性を測定した。その結果、５クローン中４クローンでアクリルアミドの生成が検出され、ニトリルヒドラターゼ活性を保持していることが確認された。
【００３９】
ニトリルヒドラターゼ活性の測定に供した上記培養液の残部１ｍｌより該４クローンの菌体をそれぞれ分離し、アルカリＳＤＳ抽出法により各クローンのプラスミドＤＮＡを調製した。続いて、クローンＮｏ．１の場合と同様の操作により各クローンのニトリルヒドラターゼ構造遺伝子の塩基配列を決定した。その結果、表２（表２）に示したクローンＮｏ．２においてニトリルヒドラターゼのαサブユニットの６番目のＬｅｕがＭｅｔに、αサブユニットの１２６番目のＰｈｅがＴｙｒにそれぞれ置換されていた。
【００４０】
【表２】
0004672161.tif 000003
【００４１】
続いて、βサブユニットの２１２番目のＳｅｒをＴｙｒに置換するために、クローンＮｏ．２のプラスミドＤＮＡを鋳型として、上述と同様の操作により部位特異的な変異導入を行った。
すなわち、３０ｍｌの試験管に１０ｍｌのＬＢ液体培地を調製し、１２１℃・２０分間のオートクレーブにより滅菌した。この培地に終濃度が１００μｇ／ｍｌとなるようにアンピシリンを添加した後、得られたクローンＮｏ．２株を一白金耳植菌し、３７℃・３００ｒｐｍにて約２０時間培養した。該培養液１ｍｌを適当な遠心チューブに分取した後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ×５分）により菌体を分離した。続いてアルカリＳＤＳ抽出法により該菌体よりクローンＮｏ．１株のプラスミドＤＮＡを調製した。
【００４２】
このクローンＮｏ．２のプラスミドＤＮＡ１μｇを鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．６は、配列表の配列番号６記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号２に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μｌの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．７は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号３に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号４に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μｌの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．６と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．６およびＮｏ．７の反応終了液各５μｌを用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。以後、クローンＮｏ．１の場合と全く同じ操作により大腸菌バンクを調製した。
【００４３】
該大腸菌バンクより任意に選別した５クローンをクローンＮｏ．１の場合と同じ活性発現培地１０ｍｌに各一白金耳ずつ植菌し、３７℃・３００ｒｐｍにて約２０時間培養した。該培養終了液１ｍｌをそれぞれ適当な遠心チューブに分取した後、ニトリルヒドラターゼ活性を測定した。その結果、５クローン中４クローンでアクリルアミドの生成が検出され、ニトリルヒドラターゼ活性を保持していることが確認された。
【００４４】
ニトリルヒドラターゼ活性の測定に供した上記培養液の残部１ｍｌより該４クローンの菌体をそれぞれ分離し、アルカリＳＤＳ抽出法により各クローンのプラスミドＤＮＡを調製した。続いて、クローンＮｏ．１の場合と同様の操作により各クローンのニトリルヒドラターゼ構造遺伝子の塩基配列を決定した。その結果、表３（表３）に示したクローンＮｏ．３においてニトリルヒドラターゼのβサブユニットの２１２番目のＳｅｒがＴｙｒに置換されていた。
【００４５】
【表３】
0004672161.tif 000004
【００４６】
このクローンＮＯ．３の菌体を培養し、反応に必要な菌体を得た。以下典型的な培養例を示す。
５００ｍｌのバッフル付三角フラスコに下記の組成の培地１００ｍｌを調製し、１２１℃・２０分間のオートクレーブにより滅菌した。この培地に終濃度が５０μｇ／ｍｌとなるようにアンピシリンを添加した後、上記クローンＮＯ．３の菌体を一白金耳植菌し、３７℃・１３０ｒｐｍにて２０時間培養した。遠心分離（１５０００Ｇ×１５分間）により菌体のみを培養液より分離し、続いて、５０ｍｌの生理食塩水に該菌体を再懸濁した後に、再度遠心分離を行って湿菌体を得た。
【００４７】
0004672161.tif 000005
【００４８】
（２）アクリロニトリルの水和によるアクリルアミドの合成反応
上記の培養方法により得られた湿菌体２重量部を０．３ｍＭ-ＮａＯＨ水溶液９８重量部に懸濁し、この懸濁液とアクリロニトリルを各々５０ｇ／ｈ、３０ｇ／ｈで、第１反応器として予め４００ｇの水を仕込んだ１Ｌガラス製フラスコで攪拌を行いながら連続的にフィードし、液面レベルを一定に保つように８０ｇ／ｈづつ反応液を連続的に抜き出した。その液を第２反応器として内径５ｍｍのテフロン製チューブ２０ｍに連続的にフィードした。反応温度は、いずれも約１０〜２０℃の水浴中に上記第１反応器および第２反応器を浸漬し、内部の液温が１５℃になるように制御した。
反応開始から２００時間後にＨＰＬＣ分析により、第２反応器出口での反応液の分析を行った結果、反応液中にはアクリルアミドのみが存在（濃度＝５０重量％）しており、アクリロニトリルは検出限界（１００重量ｐｐｍ）以下であった。
【００４９】
比較例１
反応時間は上記実施例の場合と同様とし、反応器を第１反応器である撹拌槽のみとして行った。すなわち、反応器を２Ｌのガラス製フラスコに変更し、そして内部の液量を８００ｇに変更した以外は、実施例と同様に操作した。
反応開始から２００時間後にＨＰＬＣ分析により、反応器出口の反応液の分析を行った結果、反応液中のアクリルアミドは４８重量％、アクリロニトリルは１．９重量％が検出された。このように、本比較例では未反応のアクリロニトリルが残存しており、反応が未完結であることが確認された。
【００５０】
比較例２
第２反応器として、第１反応器と同様に予め４００ｇの水を仕込んだ１Ｌガラス製フラスコに、攪拌を行いながら、第１反応器出口の反応液を連続的にフィードし、液面レベルを一定に保つように連続的に反応液を抜き出す様操作を行う以外は、実施例１と同様に操作を行った。
反応開始から２００時間後にＨＰＬＣ分析により、第２反応器出口での反応液の分析を行った結果、反応液中にはアクリルアミドは４９．５％であり、アクリロニトリルが３０００重量ｐｐｍ検出された。本比較例でも未反応のアクリロニトリルが残存しており、反応が未完結であることが確認された。
【００５１】
【発明の効果】
本発明によれば、ニトリル化合物を高い転化率で水和して高濃度アミド化合物水溶液を連続的に製造することができ、残留ニトリル化合物も認められず、また比較的短時間のうちに容易に製造することが可能であり、本発明の方法は、工業的なアミド化合物の製法として好適に用いることができる。
【００５２】
【配列表】
0004672161.tif 000006
0004672161.tif 000007
0004672161.tif 000008
0004672161.tif 000009