(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
底生生物が生息可能であって細菌の培地となる透明ゲルまたは当該透明ゲルと共存させた緩衝液に細菌の生理活性によって呈色、発色、変色または発光する指示薬を加えることを特徴とする細菌と底生生物とが共存した状況下における細菌活性の観察方法。
【請求項２】
前記指示薬として、
細菌細胞膜上の酸化還元酵素活性により呈色、発色若しくは発光する化合物、
細菌細胞内のエステラーゼ活性により呈色する化合物、
細菌細胞外加水分解酵素活性により呈色若しくは発光する化合物、
細菌細胞内の核酸合成活性により呈色する化合物、
酸素感受性を有する蛍光物質、
のうちの１以上を含有する薬剤を用いることを特徴とする請求項１記載の細菌と底生生物とが共存した状況下における細菌活性の観察方法。
【請求項３】
前記透明ゲルにおいて前記指示薬によって呈色、発色、変色、あるいは発光した部位を撮像した画像データをコンピュータにおいて二値化処理して表示装置に映像として表示することを特徴とする請求項１または２記載の細菌と底生生物とが共存した状況下における細菌活性の観察方法。
【請求項４】
前記画像データと前記指示薬の分光学的データとによって検量線を作成し、前記検量線に基づいて細菌活性を定量することを特徴とする請求項３記載の細菌活性の観察方法。
【請求項５】
前記緩衝液中へ空気中の酸素を供給するための微細気泡発生手段を用いることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の細菌と底生生物とが共存した状況下における細菌活性の観察方法。
【請求項６】
前記微細気泡発生手段として、筒体形状または回転体形状の流体旋回室へ前記緩衝液と空気とを導入し前記流体旋回室内の軸心周りに発生させた旋回流を前記流体旋回室の一部に開設した吐出口から吐出させることにより微細気泡混じりの緩衝液を前記緩衝液中へ供給する機能を有する微細気泡発生器を用いることを特徴とする請求項５記載の細菌と底生生物とが共存した状況下における細菌活性の観察方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、海底の堆積物中などに底生生物と同所的に生息する各種細菌類の生理活性を観察する技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
海底の堆積物中に生息する細菌の増殖状態および活性状態は底生生物（ベントス）の存在によって影響を受ける。特に、底生生物による堆積物の撹拌、改変作用が強い場合は、その影響も大きくなる。このような堆積物中の細菌の増殖、代謝活性を観察したり、定量的に把握したりする場合、従来、堆積物の一部を試料として採取し、これを分析するという手法をとる必要がある。従って、これらの過程においては、操作が煩雑となり、その時間・空間分解能を高めることは困難である。
【０００３】
一方、本願発明に関連する従来技術として、酸化還元指示薬を用いて微生物の検出を行う方法が提案されている（例えば、特許文献１参照。）。
【０００４】
【特許文献１】特開平９−２０１１９８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
特許文献１記載の「細菌、酵母、真菌類又は球菌の増殖及び非色検出の改良方法」を用いることにより、細菌や微生物を検出することはできるが、この方法はあくまでも細菌や微生物を純粋培養あるいはそれに近い状態で培養する場合にのみ有効な検出方法である。従って、天然の堆積物環境中に見られるように、細菌と他の高等生物（底生生物）とが共存した状態下における細菌や微生物の存在を検出したり、その活性を観察したりする手段として利用することはできない。
【０００６】
そこで、本発明が解決しようとする課題は、底生生物と共生する従属栄養細菌などの各種細菌類の活性状態を、当該細菌に悪影響を及ぼすことなく、高精度で簡便に把握することのできる、細菌活性の観察技術を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の細菌と底生生物とが共存した状況下における細菌活性の観察方法（以下、「細菌活性の観察方法」と記載する。）は、底生生物が生息可能であって細菌の培地となる透明ゲルまたは当該透明ゲルと共存させた緩衝液に細菌の生理活性によって呈色、発色、変色または発光する指示薬を加えることを特徴とする。このような構成とすれば、底生生物が生息できる環境であると同時に細菌が増殖できる透明ゲルまたは当該透明ゲルと共存させた緩衝液に加えられた指示薬が、当該細菌の生理活性により呈色、発色、変色または発光するため、その呈色、発色、変色または発光の状況を確認することにより、細菌の生理活性状態を高精度で簡便に把握することができる。また、透明ゲルまたは当該透明ゲルと共存させた緩衝液に指示薬を加えるだけで観察することが可能であり、透明ゲルや細菌に手を加える必要がないため、当該細菌に悪影響を及ぼすこともない。
【０００８】
ここで、前記指示薬として、細菌細胞膜上の酸化還元酵素活性により呈色、発色若しくは発光する化合物、細菌細胞内のエステラーゼ活性により呈色する化合物、細菌細胞外加水分解酵素活性により呈色若しくは発光する化合物、細菌細胞内の核酸合成活性により呈色する化合物、酸素感受性を有する蛍光物質、のうちの１以上を含有する薬剤を用いることができる。
【０００９】
このような薬剤を指示薬として用いれば、細菌細胞膜上の酸化還元酵素活性、細菌細胞内のエステラーゼ活性、細菌細胞外加水分解酵素活性、細菌細胞内の核酸合成活性、あるいは細菌細胞による酸素消費活性の程度に応じて、鋭敏な呈色、変色あるいは発光が生じるため、比較的短時間で、細菌の生理活性の検出を行うことができる。
【００１０】
なお、細菌細胞膜上の酸化還元酵素活性により呈色、発色若しくは発光する化合物は、テトラゾリウム化合物、メナジオン、ルミノールのいずれかを含み、細菌細胞内のエステラーゼ活性により呈色する化合物は6-carboxyfluorescein diacetateまたはリゾルフィン化合物を含み、細菌細胞外加水分解酵素活性により呈色若しくは発光する化合物はメチルウンベリフェリル化合物またはリゾルフィン化合物を含み、細菌細胞内の核酸合成活性により呈色する化合物はブロモデオキシウリジンを含み、酸素感受性を有する蛍光物質はトリス1、7-ジフェニル-1、10フェナトロリン塩化ルテニウム（II）を含む。
【００１１】
また、このような薬剤としては、例えば、同仁化学研究所の「INT；2-(4-iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-phenyl-2H-tetrazolium chloride」、同仁化学研究所の「Cell Counting Kit-F」あるいはナカライテスク株式会社の4-Methylumbelliferyl-β-D-galactosideなどが好適である。
【００１２】
一方、前記透明ゲルにおいて前記指示薬によって発色、変色、あるいは発光した部位を撮像した画像データをコンピュータにおいて二値化処理して表示装置に映像として表示することもできる。このような構成とすれば、透明ゲル中に生じている呈色、発色、変色または発光した部位の状況を画像データとして取得し、解析することができる。
【００１３】
この場合、前記画像データと前記指示薬の分光学的データとによって検量線を作成し、前記検量線に基づいて細菌活性を定量することもできる。このような構成とすれば、細菌の活性をさらに正確に分析、定量することが可能となる。
【００１４】
さらに、前記緩衝液中へ空気中の酸素を供給するための微細気泡発生手段を用いることもできる。このような構成とすれば、緩衝液中へ空気中の酸素が供給されるため、透明ゲル中の底生生物および好気性細菌の生理活性を損ねることなく観察を行うことが可能となる。
【００１５】
この場合、前記微細気泡発生手段として、筒体形状または回転体形状の流体旋回室へ前記緩衝液と空気とを導入し前記流体旋回室内の軸心周りに発生させた旋回流を前記流体旋回室の一部に開設した吐出口から吐出させることにより微細気泡混じりの緩衝液を前記緩衝液中へ供給する機能を有する微細気泡発生器を用いることができる。
【００１６】
このような微細気泡発生器を用いれば、微細気泡発生器の流体旋回室から緩衝液とともに、透明ゲルと共存する緩衝液中へ供給される微細気泡は、緩衝液の下方に位置する透明ゲルに向かって沈降していく性質があるため、透明ゲル中に存在する底生生物および細菌類に対して、さらに効率良く空気中の酸素を供給することが可能となる。従って、酸素濃度の低下による底生生物および好気性細菌の生理活性の低下を最小限に保った状態で、継続した観察を行うことができる。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の細菌活性の観察方法により、底生生物と同所的に存在、あるいは共生する従属栄養性好気性細菌などの各種細菌類の活性状態を、当該細菌に悪影響を及ぼすことなく、高精度で簡便に把握することができるようになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下、図面を参照して、本発明の実施の形態について説明する。図１は本発明の実施の形態である細菌活性の観察方法における培地および緩衝液の変化を模式的に示す図であり、図２は図１（ｂ）に示す培地と緩衝液との境界部分を示す一部拡大断面図である。
【００１９】
本実施形態においては、図１（ａ）に示すように、底生生物が生息可能であって細菌の培地となる透明ゲル１０として寒天を用い、この透明ゲル１０と共存する緩衝液１１として海水を用いている。まず、透明ゲル１０の調整手順について説明する。海水１００ｍｌに対して、０．７ｇの寒天（Ｂａｃｔｏ  ａｇａｒ，Ｄｉｆｃｏ社）を加え、高圧滅菌処理（１２１℃雰囲気下で１５分保持）した後、所定長さの透明パイプ１５の底部をシリコンゴム栓１２で閉塞することによって形成した培養容器１６に流し込み、固化させた。このとき、寒天を溶かした海水は、１つの培養容器１６当たり４０ｍｌ程度流し込んでいる。そして、寒天が固化して形成された透明ゲル１０の上に、緩衝液１１として、細菌（図示せず）を含む海水を５０ｍｌ程度重層した後、１５尾のイトゴカイ１７を入れた。
【００２０】
この後、指示薬として、テトラゾリウム化合物の一種である薬剤を培養容器１６内へ添加する。この薬剤は、同仁化学研究所の２−（ｐ−ｉｏｄｏｐｈｅｎｙｌ）−３−（ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）−５−ｐｈｅｎｙｌ  ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＩＮＴ）であるが、これに限定するものではない。この場合、指示薬であるＩＮＴの添加の仕方として、次の２通りの方法を採用した。
（１）イトゴカイ１７が透明ゲル１０中に巣穴を掘り進み、定着したことを確認した後、透明ゲル１０上に共存する緩衝液（海水）１１中に、ＩＮＴの最終濃度が０．１重量％濃度になるようにＩＮＴ水溶液を加えた。
（２）寒天を溶かした海水の高圧滅菌処理が終わった後、透明ゲル１０の温度が４５℃程度になった時点で、ＩＮＴを加え、ＩＮＴの最終濃度が０．１重量％になるようにした。
【００２１】
次に、指示薬ＩＮＴを加えて所定時間経過した後の状況について説明する。前記（１）に示したように、ＩＮＴを緩衝液（海水）１１に加えた場合、まず、緩衝液（海水）１１中の細菌の細胞膜上の脱水素酵素活性によって、ＩＮＴが還元され赤色のＩＮＴフォルマザンとなり、緩衝液（海水）１１自体が赤く染まってきた。その赤色が目視によって判別できるようになるまでに要する時間は３０分以内であった。このときの赤色部分は図１（ｂ）上の細かい点々で示すような状態となる。
【００２２】
この場合、図２上の細かな点々で示すように、イトゴカイ１７の巣穴１９もその場にいる細菌の活性によりＩＮＴフォルマザンが形成され、赤色を呈した。赤色を目視観察によって判別できるようになるまでに２〜３時間程度を要した。これは、巣穴１９にいるイトゴカイ１７の移動、灌水活動によって、巣穴１９内の緩衝液（海水）１１が、透明ゲル１０上のＩＮＴを含んだ緩衝液（海水）１１と交換されるまでに、若干の時間を要するためである。これ以降は、時間経過に伴い、各場所の赤色部位がより鮮明になっていった。
【００２３】
一方、前記（２）に示したように、ＩＮＴを加えた場合は、緩衝液（海水）１１は前述（１）の場合ほどは赤くならず、イトゴカイ１７の巣穴１９がＩＮＴフォルマザン由来の赤色に染まった．また、巣穴１９の赤色の染色度合いは一様ではないことから、巣穴１９に存在する細菌の活性は空間的に不均一であると判断された。
【００２４】
このように、図１（ａ）で示したように、底生生物であるイトゴカイ１７の生息可能な基質であると同時に細菌の培地として、透明ゲル１０を用いることにより、イトゴカイ１７の底質撹拌作用を擬似的に再現した環境を培養容器１６内に作り出すことができる。また、図１（ｂ）で示したように、培養容器１６内で生起する従属栄養菌の活性を指示薬ＩＮＴの赤色発色によって観察することが可能である。即ち、本実施形態の細菌活性の観察方法により、イトゴカイ１７が存在する環境下における細菌の活性を非破壊的に可視化し、簡便に評価することができる。また、後述するように、これらの赤色部位を画像データとして記録して、解析することにより、定量化も可能である。
【００２５】
本実施形態において透明ゲル１０は、試験に供する従属栄養細菌が利用する無機塩類や有機物類を含んでいるが、細菌の代謝活性指示薬ＩＮＴを予め透明ゲル１０に加えておく場合もある。また、透明ゲル１０の上部には当該透明ゲル１０の乾燥を防ぎ、適切な浸透圧を保つための緩衝液１１として海水を満たしている。
【００２６】
前述したように、培養容器１６内の透明ゲル１０中において、細菌の活性指示薬ＩＮＴによって赤色に発色した部位を画像として記録、定量解析することも可能である。この場合、既存のスキャナ、デジタルカメラ、顕微鏡、その他のイメージングデバイスを用いて赤色に発色した部位の画像を撮像し、この画像に対し、コンピュータ上で二値化処理を行い、解析する。
【００２７】
また、指示薬ＩＮＴの発色部位の画像データと、指示薬ＩＮＴ自身の分光学的データとによって検量線を作成する。指示薬ＩＮＴ自身の分光学的データは、透明ゲル１０中より既知量の指示薬ＩＮＴの発色部位を抽出し、分光学的に定量する。その結果と画像データの結果とから検量線を作成し、未知試料における指示薬ＩＮＴの発色（変色）部位の定量を画像データから行えば、細菌の活性を定量的に測定することができる。
【００２８】
本実施形態で使用した無色の指示薬ＩＮＴは細菌の呼吸酵素で還元されることにより、ＩＮＴ−フォルマザンという、水に不溶性の赤色沈殿を生じるため、これによって細菌の生理活性を容易に可視化することができる。従って、ＩＮＴを緩衝液（海水）１１中に添加した場合、図２に示すように、イトゴカイ１７の糞粒２０からなる棲管２１および巣穴１９内壁上が他の部分より濃い赤色に発色しており、これによって、呼吸活性の高い細菌が巣穴１９や棲管２１上に集積することが判明した。
【００２９】
そのほか、本実施形態において、透明ゲル（寒天）１０の表面に針やナイフなどで微小な穴や切り込みを入れて、僅かな凹凸をつけておくと、イトゴカイ１７の巣穴１９内部への移動が促進されることが分かった。また、透明ゲル１０表面（緩衝液（海水）１１と接する界面）付近の海水を撹乱したり、透明ゲル１０の入った透明な培養容器１６そのものに物理的な動揺（回転、振動など）を与えたりすると、イトゴカイ１７は巣穴１９内部への移動が促進された。イトゴカイ１７は、透明ゲル１０の内部に潜ることによって表面における擾乱を避けることができるためと思われる。
【００３０】
また、透明ゲル１０を用いた細菌培地として、円筒形の透明パイプ１５のほかに、２枚の透明ガラス平板若しくはアクリル平板の間に、前述した要領で作成した海水と寒天との混合物を流し込んで固化させることによって形成した平板状細菌培地を用いて実験を行った。これらの平板状細菌培地は、至近距離で撮影する際にも広範囲に焦点が合わせやすいので、そのまま実体顕微鏡のステージ上にのせて、より高倍率での観察、撮影も可能である。その際には、ステージ上の平板状細菌培地に対して斜め上から光をあてる斜光照明を採用すると、より鮮明な状態で発色部位の観察および画像取得を行うことができた。
【００３１】
一方、底生生物（イトゴカイ１７）が作った巣穴１９を含む透明ゲル１０部分を培養容器１６から取り出せば（例えば、滅菌したメスなどを用いて切り出せば）、特定の場所をより詳細に顕微鏡観察することも可能である。切り出した透明ゲル１０部分はホルマリンなどの固定溶液中に浸潤することで、生物活性を停止させ、長期に保存し、必要な時に観察、分析することもできる。さらに、透明ゲル１０中の寒天成分を融解後、遠心することにより、底生生物（イトゴカイ１７）の巣穴１９を構成する壁面の粘性物質や細菌細胞などを、沈殿固形残渣として回収することも可能である。また、これらは顕微鏡観察や成分分析に供することができる。
【００３２】
さらに、透明ゲル（寒天）１０に特定の化合物を含有させて、その化合物が底生生物および細菌に与える影響を評価することも可能である。例えば、透明ゲル１０に硫化ナトリウムＮａ2Ｓ・９Ｈ2Ｏを加えて、イトゴカイの巣穴形成活性ならびに周囲の細菌の呼吸活性を評価したところ、１０ｍＭ未満の濃度でイトゴカイの活性と巣穴周囲の細菌の活性が促進されることが判明した。
【００３３】
次に、図３〜図７を参照し、本発明のその他の実施の形態である、緩衝液中へ空気中の酸素を供給するための微細気泡発生器を使用した場合の細菌活性の観察方法について説明する。図３は微細気泡発生器を使用した場合の細菌活性の観察方法を示す概略構成図、図４は図３に示す微細気泡発生器の斜視図、図５は図４におけるＡ−Ａ線断面図、図６は図５におけるＢ−Ｂ線断面図、図７は図５に示す微細気泡発生器内における微細気泡発生状態を模式的に示す図である。
【００３４】
図３に示すように、収容槽２２内には緩衝液１１が収容され、透明ゲル１０を収容した複数の培養容器２３が、その内部を緩衝液１１で満たすとともに培養容器２３全体が完全に緩衝液１１中に没する状態で収容槽２２内に配置されている。また、収容槽２２内の緩衝液１１中には、微細気泡発生器１３が浸漬されるとともに、電動式のポンプＰで緩衝液１１を吸い上げるための吸引管２４が配管され、吸引管２４の先端にはフィルタ２４ｆが取り付けられている。ポンプＰと微細気泡発生器１３との間には給液管１８が配管され、微細気泡発生器１３に空気を供給するための給気管１４が微細気泡発生器１３から収容槽２２の外部へ配管され、その先端にはフィルタ１４ｆが取り付けられている。
【００３５】
このような状態において、ポンプＰを作動させると、収容槽２２内の緩衝液１１がフィルタ２４ｆを通して吸引管２４に吸い込まれ、給液管１８を経由して、緩衝液１１中に浸漬された微細気泡発生器１３へ供給される。このとき、微細気泡発生器１３内に生じる負圧により、大気中の空気がフィルタ１４ｆを通して給気管１４内へ吸い込まれ、給気管１４を経由して緩衝液１１中の微細気泡発生器１３内へ供給される。これにより、図３，図４に示すように、微細気泡発生器１３の吐出口２８から微細気泡ＮＢ混じりの緩衝液１１が、収容槽２２内の緩衝液１１中へ吐出される。なお、微細気泡発生器１３によって微細気泡ＮＢが発生する機構および微細気泡発生器１３内に負圧が生じる機構などについては後述する。
【００３６】
図５，図６に示すように、微細気泡発生器１３は、仮想中心線２５ｃを包囲するように設けられた円筒状の周壁２５ｄと、周壁２５ｄの仮想中心線２５ｃ方向の両端に設けられた隔壁２５ａ，２５ｂとで形成された流体旋回室２５と、仮想中心線２５ｃに対してねじれの位置をなす方向に沿って流体旋回室２５内へ緩衝液を導入するため流体旋回室２５に連通して設けられた給液管１８と、流体旋回室２５内へ空気を導入するため流体旋回室２５の一方の隔壁２５ａに連結された給気管１４と、流体旋回室２５の他方の隔壁２５ｂに開設された吐出口２８と、を備えている。給液管１８は液体導入口２７を経て流体旋回室２５内に連通し、給気管１４は気体導入口２６を経て流体旋回室２５内に連通している。
【００３７】
図３に示すように、収容槽２２内の緩衝液１１中に微細気泡発生器１３および吸引管２４のフィルタ２４ｆを浸漬した状態で、ポンプＰを作動させると、収容槽２２内からフィルタ２４ｆおよび吸引管２４を経由して吸い込まれた緩衝液１１が、給液管１８を経由して液体導入口２７から流体旋回室２５内へ流入し、図５，図７に示すように、流体旋回室２５内に旋回流Ｒが発生する。そして、この旋回流Ｒのほぼ仮想中心線２５ｃに沿って略円筒状の負圧空洞部Ｖが出現する。この負圧空洞部Ｖの一方の端部は、流体旋回室２５の隔壁２５ａに開設された気体導入口２６付近に位置するとともに、負圧空洞部Ｖの他方の端部は流体旋回室２５の隔壁２５ｂに開設された吐出口２８付近に位置し、吐出口２８付近に位置する負圧空洞部Ｖの端部は括れた状態となる。
【００３８】
このように流体旋回室２５内に出現する負圧空洞部Ｖの負圧により、気体導入口２６付近にも負圧が生じるため、この負圧に起因する吸引力により、給気管１４を経由して大気中から吸引された空気が気体導入口２６から流体旋回室２５内の負圧空洞部Ｖ内へ連続的に流入し、流体旋回室２５内に導入された緩衝液１１とともに旋回流Ｒを形成する。
【００３９】
負圧空洞部Ｖ内へ流入した空気は、流体旋回室２５内に発生している旋回流Ｒに連行され吐出口２８から吐出される。このとき、負圧空洞部Ｖの吐出口２８側の端部において旋回流Ｒによってねじ切られて微細気泡ＮＢとなり、旋回流Ｒを形成する緩衝液１１とともに、微細気泡ＮＢ混じりの緩衝液１１となって吐出口２８から、収容槽２２内の緩衝液１１中へ吐出される。
【００４０】
このように、吐出口２８から緩衝液１１中へ微細気泡ＮＢ混じりの流体（緩衝液１１）を放出することにより、収容槽２２内の緩衝液１１中へ酸素を供給、溶解させることができる。このため、溶存酸素濃度の高い微細気泡ＮＢ混じりの緩衝液１１が、収容槽２２内をムラなく循環することとなり、緩衝液１１中に浸漬された複数の培養容器２３内の透明ゲル１０に対し、均等に酸素を供給することができる。従って、図３に示すように、複数の培養容器２３を用いて実験を行う場合、各々の培養容器２３に関する実験条件の均一化を図ることができ、実験精度の向上に有効である。また、収容槽２２内の緩衝液１１中に複数の培養容器２３を浸漬するとともに、微細気泡発生器１３を緩衝液１１中に投入し、ポンプＰを作動させるだけで使用できるため、使い方は極めて簡単である。
【００４１】
また、微細気泡発生器１３は、略円筒形状をした流体旋回室２５に液体導入口２７、気体導入口２６および吐出口２８を開設した簡素な構造であるため、取り扱いは容易であり、緩衝液１１や空気に伴って流入した異物が詰まりやすい細かな流路もないので、定期的なメンテナンスも不要である。
【００４２】
さらに、図６に示すように、流体旋回室２５の隔壁２５ａに開設された気体導入口２６を、流体旋回室２５の仮想中心線２５ｃに沿って内側へ突出させて配置するとともに、流体旋回室２５の周壁２５ｄと気体導入口２６との間に、滑らかに連続した凹曲面２９を設けている。このため、図７に示すように、流体旋回室２５内に形成される負圧空洞部Ｖの隔壁２５ａ側の端部から空気が導入され、隔壁２５ｂ側の端部の延長方向に向かって微細気泡ＮＢ混じりの緩衝液１１を吐出する。従って、負圧空洞部Ｖは流体旋回室２５の仮想中心線２５ｃ付近に安定的に存在し続け、その両端部も吐出口２８付近および気体導入口２６付近に安定的に位置する。
【００４３】
このように、気体導入口２６を流体旋回室２５の内側へ突出させて配置するとともに凹曲面２９を設けているため、負圧空洞部Ｖの気体導入口２６側の端部が不規則に移動することがない。このため、流体旋回室２５の隔壁２５ａ，２５ｂにキャビテーション・エロージョンなどが生じることもなくなり、優れた耐久性が得られる。また、図５，図６に示すように、流体旋回室２５の隔壁２５ｂ寄りの領域には、他の領域より内径の大きい予備旋回部２５ｐを設けている。このため、液体導入口２７から導入された緩衝液１１を予備旋回部２５ｐにおいて一旦整流した後、流体旋回室２５全体へ導入することができる。これによって、液体導入口２７から導入される緩衝液１１の圧力変動が緩衝され、この圧力変動に起因する負圧空洞部Ｖの移動を防止することができるため、キャビテーション・エロージョンも発生しない。
【００４４】
また、図６に示すように、微細気泡発生器１３においては、液体導入口２７の開口面積を吐出口２８の開口面積より大としているため、流体旋回室２５内へ送給される緩衝液１１の入り口よりも微細気泡ＮＢ混じりの緩衝液１１の出口の方が小さくなっている。従って、ポンプＰによって送給される緩衝液１１の圧力によって流体旋回室２５内の液圧が高まり、吐出口２８から放出される微細気泡ＮＢ混じりの緩衝液１１の流勢が増大するため、収容槽２２内の緩衝液１１の循環が良好となり、実験条件の均一化に有効である。
【００４５】
次に、図８〜図１１を参照して、前述した微細気泡発生器１３と同様の機能を有するその他の微細気泡発生手段について説明する。図８はその他の実施形態である微細気泡発生装置を示す側面図、図９は図８に示す微細気泡発生装置の一部省略平面図、図１０は図８に示す微細気泡発生装置を構成する微細気泡発生器の一部切欠側面図、図１１は図１０におけるＣ−Ｃ線断面図である。
【００４６】
図８，図９に示すように、微細気泡発生装置１は、防液性の液体ポンプ２と、液体ポンプ２を作動させる駆動機である防液性の電動機３と、微細気泡発生器４と、を一体的に連結した構造である。電動機３は、外部に配置された発電機（図示せず）から電源コード５を介して給電され、スイッチ（図示せず）によってＯＮ−ＯＦＦすることができる。液体ポンプ２は電動機３の回転軸（図示せず）と同軸上に連結され、吸引口２ａから吸い込んだ海水などの緩衝液１１を、吐液部８を経由して微細気泡発生器４の液導入経路３５へ供給する。
【００４７】
微細気泡発生器４は、概略形状が円筒形であり、外部に配置された気体ポンプ（図示せず）から送給される大気中の空気を導入するための給気管９の先端部が接続され、給気管９の基端部は気体ポンプに接続されている。給気管９の途中には、緩衝液１１が上方へ逆流するのを防ぐための逆止弁３３が設けられている。
【００４８】
図１０，図１１に示すように、微細気泡発生器４は、流体（緩衝液および空気）が軸心Ｓ周りを旋回可能な流体旋回室３４を内蔵する円筒ケーシング４ａと、流体旋回室内３４内へ緩衝液１１を導入して流体旋回流Ｒを発生させるために流体旋回室３４内へ緩衝液１１を噴出する液導入経路３５と、流体旋回室３４内へ空気を導入するため流体旋回室３４と連通して形成された空気導入経路３６と、流体旋回室３４の軸心Ｓ方向の端部に形成された吐出経路３７とを備えている。吐出経路３７は、円筒ケーシング４ａの軸心Ｓと直交する平面状の隔壁３７ａの中心部分（軸心Ｓとの交差部分）に形成されている。
【００４９】
液導入経路３５は円筒ケーシング４ａより外径の小さな円筒形であり、その基端部には液体ポンプ２の吐液部８との連結部３５ｃが設けられ、その先端部は、流体旋回室３４の吐出経路３７と反対側の端部において流体旋回室３４内へ突出して配置され、その先端部分は閉塞板３５ａで閉塞されている。図１０，図１１に示すように、流体旋回室３４内に位置する液導入経路３５の外周には、流体旋回室３４の軸心Ｓとねじりの位置をなす方向に沿って緩衝液１１を噴出するための複数の噴出口３５ｂが設けられている。
【００５０】
図１１に示すように、空気導入経路３６は、液導入経路３５の側面部を貫通してその内部へ進入し、軸心Ｓ方向へ直角に曲がった後、その先端開口部３６ａが閉塞板３５ａの表面側（流体旋回室３４側）に開口している。液導入経路３５の側面に突出した空気導入経路３６に給気管９の基端部が着脱可能に連結されている。従って、給気管９から送られる空気は空気導入経路３６を経由して、閉塞板３５ａ表面に開口した先端開口部３６ａから流体旋回室３４内に直接供給される。
【００５１】
図１１に示すように、流体旋回室３４を内蔵する円筒ケーシング４ａの吐出経路３７の外側において、この吐出経路３７と対向する位置には、軸心Ｓと交差する平面３８ａを有する円板状の誘導部材３８が配置されている。誘導部材３８は、円弧状をした３つの連結部材３８ｂ，３８ｃを介して円筒ケーシング４ａの先端部分に接合されており、これらの連結部材３８ｂ，３８ｃの間に形成された３つの吹出口３９から、後述する、微細気泡ＮＢ混じりの緩衝液１１を吹き出すことができる。なお、これら３つの吹出口３９は、平面視状態で、電動機３の配置方向を除く３方向へ９０度間隔で配置されている。
【００５２】
図３で示したように、微細気泡発生装置１を収容槽２２（図３参照）内の緩衝液１１中に投入し、緩衝液１１中で起立状態に保持し、電動機３を作動させると、ポンプ２の吸引口２ａから吸い込まれた緩衝液１１が吐液部８から液導入経路３５へ流れ込み、噴出口３５ｂを経由して流体旋回室３４内へ噴出される。このとき、緩衝液１１の噴出方向は流体旋回室３４の軸心Ｓとねじれの位置をなす方向となっているため、流体旋回室３４内には軸心Ｓ周りに旋回する液流が発生するとともに、この液流の一部は吐出経路３７から緩衝液１１中へ排出される。
【００５３】
このとき、図１１に示すように、流体旋回室３４内の軸心Ｓ付近には負圧空洞部Ｖが発生し、この負圧空洞部Ｖの存在によって流体旋回室３４内が負圧となるため、流体旋回室３４と連通する空気導入経路３６および給気管９を経由して大気中の空気が円滑に導入され、空気導入経路３６の先端開口部３６ａから流体旋回室３４内へ流入する。これによって、流体旋回室３４内には、軸心Ｓ付近に位置する負圧空洞部Ｖと、その周りを回転する空気混じりの緩衝液とからなる旋回流（例えば、旋回二層流とも呼ばれる。）が形成される。
【００５４】
このような旋回流が流体旋回室３４内に形成されている状態において、空気導入経路３６の先端開口部３６ａを経由して流体旋回室３４内へ導入された空気は前述した旋回流の剪断作用によって微細化され、流体旋回流Ｒとなって流体旋回室３４内を高速旋回する。そして、流体旋回流Ｒはやがて流体旋回室３４の隔壁３７ａ方向へ移動し、この隔壁３７ａに当接することによって吐出経路３７に向かって収束し、流体旋回室３４の内径より細い吐出経路３７を通過することによって、さらに高速で旋回する微細気泡ＮＢ混じりの緩衝液となった後、吐出される。このように、吐出経路３７から緩衝液１１中へ微細気泡ＮＢ混じりの流体（緩衝液１１）を放出するため、図３で示した微細気泡発生器１３と同様、収容槽２２内の緩衝液中へ酸素を供給、溶解させることができる。
【００５５】
次に、図１２〜図１５を参照して、前述した微細気泡発生器１３と同様の機能を有するその他の微細気泡発生手段について説明する。図１２はその他の実施形態である微細気泡発生器を示す正面図、図１３は図１２に示す微細気泡発生器の斜視図、図１４は図１３におけるＤ−Ｄ線断面図、図１５は図１２に示す微細気泡発生器の稼働状態を示す模式図である。
【００５６】
図１２〜図１５に示す微細気泡発生器４０は、略直方体形状のケーシング４１内に流体（緩衝液および空気）が旋回可能な円筒状の流体旋回室４２が設けられ、流体旋回室４２の軸心Ｓ方向の中央部分の内周面４２ａには、その法線方向に、空気を導入するための空気導入経路４４が開設され、この空気導入経路４４を挟む両端寄り部分には、流体旋回室
４２の内周面４２ａの接線方向に、緩衝液を導入可能な２つの液導入経路４３が開設されている。
【００５７】
これらの液導入経路４３および空気導入経路４４は、それぞれケーシング４１を貫通して形成され、ケーシング４１外面のそれぞれの開口部分に液導入管４３ａ、空気導入管４４ａが接続されている。２本の液導入管４３ａは、その上流側で一本化された状態で送液管４３ｂに連結され、空気導入管４４ａはそのまま送液管４３ｂ方向に延長されている。
【００５８】
また、流体旋回室４２の軸心Ｓ方向の両端部には、軸心Ｓと直交する平面状の隔壁４１ａが設けられ、これらの隔壁４１ａの中心部分（軸心Ｓとの交差部分）には、それぞれ円形の吐出経路４５が開設され、２つの吐出経路４５にそれぞれ誘導管４６が連結されている。誘導管４６は、後述するように、吐出経路４５から吐出される微細気泡ＮＢ混じりの緩衝液の吐出方向に沿って直線状に突出するように連通され、この誘導管４６によって、その吐出方向を規制している。
【００５９】
図３と同様、収容槽２２内の緩衝液１１中へ微細気泡発生器４０を浸漬し、外部に配置した液体ポンプ（図示せず）から送液管４３ｂおよび液導入管４３ａを経由して緩衝液１１を圧送し、液導入経路４３から流体旋回室４２内へ海水を圧送するとともに、空気導入管４４ａを経由して空気導入経路４４から流体旋回室４２内へ空気を流入させると、流体旋回室４２内に軸心Ｓ周りの流体旋回流Ｒが発生するとともに、軸心Ｓ付近には負圧空洞部Ｖが形成される。
【００６０】
空気導入経路４４から流体旋回室４２内に流入する空気は、流体旋回流Ｒの剪断作用によって細かく砕かれ、負圧空洞部Ｖの周りを回転しながら微細気泡ＮＢとなっていき、やがて、吐出経路４５から微細気泡ＮＢ混じりの海水となって吐出される。吐出経路４５から吐出された微細気泡ＮＢ混じりの海水は、誘導管４６によって誘導されながら収容槽２２内の緩衝液１１中へ吐出される。これによって、緩衝液１１中の溶存酸素量が高まり、微細気泡発生器１３を用いた場合と同様の作用効果を得ることができる。
【産業上の利用可能性】
【００６１】
本発明は、沿岸堆積物中に底生生物とともに生息する従属栄養細菌などの活性状態を観察する手段として広く利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】本発明の実施の形態である細菌活性の観察方法における培地および緩衝液の変化を模式的に示す図である。
【図２】図１（ｂ）に示す培地と緩衝液との境界部分を示す一部拡大断面図である。
【図３】微細気泡発生器を使用した細菌活性の観察方法を示す概略構成図である。
【図４】図３に示す微細気泡発生器の斜視図である。
【図５】図４におけるＡ−Ａ線断面図である。
【図６】図５におけるＢ−Ｂ線断面図である。
【図７】図５に示す微細気泡発生器内における微細気泡発生状態を模式的に示す図である。
【図８】その他の実施形態である微細気泡発生装置を示す側面図である。
【図９】図８に示す微細気泡発生装置の一部省略平面図である。
【図１０】図８に示す微細気泡発生装置を構成する微細気泡発生器の一部切欠側面図である。
【図１１】図１０におけるＣ−Ｃ線断面図である。
【図１２】その他の実施形態である微細気泡発生器を示す正面図である。
【図１３】図１２に示す微細気泡発生器の斜視図である。
【図１４】図１３におけるＤ−Ｄ線断面図である。
【図１５】図１２に示す微細気泡発生器の稼働状態を示す模式図である。
【符号の説明】
【００６３】
１  微細気泡発生装置
２  液体ポンプ
２ａ  吸込口
３  電動機
４ａ  円筒ケーシング
５  電源コード
８  吐液部
９  給気管
１０  透明ゲル
１１  緩衝液
１２  シリコンゴム栓
４，１３，４０  微細気泡発生器
１４  給気管
１４ｆ，２４ｆ  フィルタ
１５  透明パイプ
１６，２３  培養容器
１７  イトゴカイ
１８  給液管
１９  巣穴
２０  糞粒
２１  棲管
２２  収容槽
２４  吸引管
２５，３４，４２  流体旋回室
２５ａ，２５ｂ，３７ａ，４１ａ  隔壁
２５ｃ  仮想中心線
２５ｄ  周壁
２５ｐ  予備旋回室
２６  気体導入口
２７  液体導入口
２８  吐出口
２９  凹曲面
３３  逆止弁
３５，４３  液導入経路
３５ａ  閉塞板
３５ｂ  噴出口
３５ｃ  連結部
３６，４４  空気導入経路
３６ａ  先端開口部
３７，４５  吐出経路
３８  誘導部材
３８ａ  平面
３８ｂ，３８ｃ  連結部材
３９  吹出口
４１  ケーシング
４２ａ  内周面
４３ａ  液導入管
４４ａ  空気導入管
４３ｂ  送液管
４６  誘導管
ＮＢ  微細気泡
Ｐ  ポンプ
Ｒ  旋回流
Ｓ  軸心
Ｖ  負圧空洞部
【図１】
0004605559.tif 000002
【図２】
0004605559.tif 000003
【図３】
0004605559.tif 000004
【図４】
0004605559.tif 000005
【図５】
0004605559.tif 000006
【図６】
0004605559.tif 000007
【図７】
0004605559.tif 000008
【図８】
0004605559.tif 000009
【図９】
0004605559.tif 000010
【図１０】
0004605559.tif 000011
【図１１】
0004605559.tif 000012
【図１２】
0004605559.tif 000013
【図１３】
0004605559.tif 000014
【図１４】
0004605559.tif 000015
【図１５】
0004605559.tif 000016