(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（２）：
ＮＣＣＨ2Ｃ*Ｈ（ＣＨ3）ＣＯＯＲ2 （２）
（式中、Ｒ2は炭素原子数１〜６のアルキル基を示す。＊が付された炭素原子は不斉炭素原子である。）
で表されるラセミ体β−シアノイソ酪酸エステルを、エステル不斉加水分解酵素であるリパーゼＯＦ（商標）の存在下で不斉加水分解することを特徴とする、一般式（３）：
ＮＣＣＨ2Ｃ*Ｈ（ＣＨ3）ＣＯＯＲ2 （３）
（式中、Ｒ2は前記のとおりである。＊が付された炭素原子は不斉炭素原子である。）
で表される光学活性β−シアノイソ酪酸エステル及び／又はその対掌体である式（４）：
ＮＣＣＨ2Ｃ*Ｈ（ＣＨ3）ＣＯＯＨ （４）
（式中、＊が付された炭素原子は不斉炭素原子である。）
で表される光学活性β−シアノイソ酪酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光学活性医薬品、光学活性農薬などの製造中間体として有用な、新規光学活性β−シアノイソ酪酸類及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ラセミ体β−シアノイソ酪酸エステルの製造方法としては、特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４、特許文献５、特許文献６等に記載される方法が公知である。しかしながら、これらの光学活性体及びその製造方法については知られていない。
【特許文献１】米国特許第３，６４４，４６７号明細書
【特許文献２】米国特許第３，６４４，４６８号明細書
【特許文献３】米国特許第２，８１０，７４２号明細書
【特許文献４】英国特許第８０８，８３５号公報
【特許文献５】特開平８−２９１１５８公報
【特許文献６】特開平９−６７３３０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明の課題は、光学活性医薬品や光学活性農薬などの有効な製造中間体である光学活性β−シアノイソ酪酸類と、その製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、ラセミ体β−シアノイソ酪酸エステルを、光学選択的に加水分解する能力のある酵素及び該酵素生産能を有する微生物を見い出し、本発明を完成した。
即ち、本発明は、一般式（１）：
ＮＣＣＨ2Ｃ*Ｈ（ＣＨ3）ＣＯＯＲ1 （１）
（式中、Ｒ1は水素又は炭素原子数１〜６のアルキル基を示す。＊が付された炭素原子は不斉炭素原子である。）
で表される光学活性β−シアノイソ酪酸類である。
【０００５】
また、本発明は、一般式（２）：
ＮＣＣＨ2Ｃ*Ｈ（ＣＨ3）ＣＯＯＲ2 （２）
（式中、Ｒ2は炭素原子数１〜６のアルキル基を示す。＊が付された炭素原子は不斉炭素原子である。）
で表されるラセミ体β−シアノイソ酪酸エステルを、エステル不斉加水分解酵素、又は該酵素生産能を有する微生物の培養物、菌体もしくは菌体処理物の存在下で不斉加水分解することを特徴とする、一般式（３）：
ＮＣＣＨ2Ｃ*Ｈ（ＣＨ3）ＣＯＯＲ2 （３）
（式中、Ｒ2は前記のとおりである。＊が付された炭素原子は不斉炭素原子である。）
で表される光学活性β−シアノイソ酪酸エステル及び／又はその対掌体である式（４）：
ＮＣＣＨ2Ｃ*Ｈ（ＣＨ3）ＣＯＯＨ （４）
（式中、＊が付された炭素原子は不斉炭素原子である。）
で表される光学活性β−シアノイソ酪酸の製造方法である。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、光学活性医薬品や光学活性農薬等の有効な製造中間体である新規光学活性β−カルボキシアミノイソ酪酸類が得られる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
以下、本発明を詳細に説明する。
一般式（１）〜（３）において、Ｒ1又はＲ2で表される炭素原子数１〜６のアルキル基は、それぞれ直鎖状及び分岐状のいずれの構造でもよい。具体的には、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、sec-ブチル、tert−ブチル、イソブチル、n-ペンチル等が例示される。
【０００８】
本発明の上記一般式（１）の光学活性化合物は以下の方法で製造することができる。
原料としては、上記一般式（２）で表されるラセミ体β−シアノイソ酪酸エステルを用いる。このラセミ体β−シアノイソ酪酸エステルは、従来公知の一般的な方法で製造することができる。例えば、ラセミ体β−シアノイソ酪酸メチルは、メチルメタクリレートと青酸をアルカリ性触媒存在下で反応させることにより製造することができる（英国特許第８０８，８３５号公報、米国特許第２，８１０，７４２号明細書，米国特許第３，６４４，４６７号明細書，特開平８−２９１１５８公報、特開平９−６７３３０号公報）。
【０００９】
本発明において使用する酵素は、一般式（２）で表されるラセミ体β−シアノイソ酪酸エステルのエステル結合を不斉加水分解する活性を有するものであれば酵素の種類、その製造源を問わない。そのような酵素には、リパーゼ、エステラーゼ及びプロテアーゼ類が含まれる。酵素としては、例えば、エステル不斉加水分解酵素生産能を有する微生物由来の酵素を用いることができる。エステル不斉加水分解能を有する微生物の代表的なものとしては、シュードモナス(Pseudomonas) 属、及びエシェリキア(Escherichia)属に属する微生物が挙げられる。具体的には、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)FERM BP-3846、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)FERM BP-3835等が挙げられる。尚、エシェリキア・コリ FERM BP-3835 は、シュードモナス・プチダ FERM BP-3846 由来のエステラーゼをコードする遺伝子によって形質転換された株である。
【００１０】
上記微生物の培養は、液体培地でも固体培地でも行うことができる。培地としては、微生物が通常資化しうる炭素源、窒素源、ビタミン、ミネラルなどの成分を適宜配合したものが用いられる。微生物の加水分解能を向上させるため、培地にエステルを少量添加することも可能である。培養は、微生物が生育可能である温度、pHで行われるが、使用する菌株の最適培養条件で行えばよい。微生物の生育を促進させるため、通気攪拌を行ってもよい。
【００１１】
また、本発明においては、精製酵素はもちろんのこと、上記のエステル不斉加水分解酵素生産能を有する微生物を培地中で培養して得られる培養物をそのままか、又は該培養物から遠心分離等の集菌操作によって得られる菌体若しくはその菌体処理物を用いることもできる。菌体処理物としては、アセトン、トルエン等で処理した菌体、凍結乾燥菌体、菌体破砕物、無細胞抽出物、無細胞抽出物からゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー等の分離操作により得られる粗酵素等が挙げられる。微生物菌体又は酵素は、架橋したアクリルアミドゲルなどに包括固定化したり、イオン交換樹脂、ケーソー土等の固体担体に物理的、化学的に固定化して用いることができる。これにより反応を行った後に回収再利用することが容易になる。
【００１２】
エステル不斉加水分解酵素としては市販品を用いることができる。具体的には、リパーゼＯＦ（商品名、名糖産業社製、キャンディダ由来）、デュラザイム（商品名、ＮＯＶＯ社製、バシラス属由来）、サビナーゼ（商品名、ＮＯＶＯ社製、バシラス属由来）、Flavourzyme MG（商品名、ＮＯＶＯ社製、アスペルギルス属由来）、リパーゼA-6 （商品名、天野製薬製、アスペルギルス属由来）、リパーゼＭ（商品名、天野製薬製、ムコール属由来）、ニューラーゼＦ（商品名、天野製薬製、リゾプス属由来）、Lipase type VII （商品名、ＳＩＧＭＡ社製、キャンディダ属由来）、Acylase I （商品名、ＳＩＧＭＡ社製、アスペルギルス属由来）、Tripsin type II （商品名、ＳＩＧＭＡ社製、ブタ膵臓由来）、Protease type XVI （商品名、ＳＩＧＭＡ製、バシルス属由来）、Palatase（商品名、ＮＯＶＯ社製）等を用いることができる。
【００１３】
一般式（２）で表されるラセミ体β−シアノイソ酪酸エステルの光学選択的な加水分解は、以下のようにして行うことができる。すなわち、反応媒体に基質であるラセミ体β−シアノイソ酪酸エステルを添加して溶解乃至懸濁し、触媒である酵素又は微生物の培養物等を加える。ただし、この触媒は、基質を反応媒体に添加する前に加えてもよい。そして、反応温度及び必要により反応液のpHを制御しながらラセミ体β−シアノイソ酪酸エステルの加水分解反応を行う。この加水分解反応は半量程度が反応するまで行うが、場合によっては、基質の半量未満で反応を終了したり、基質の半量を越えて過剰に反応させることもある。
【００１４】
反応媒体としては、例えばイオン交換水、緩衝液等が用いられる。
反応液中の基質濃度は０．１〜７０重量％の範囲であれば特に制限はないが、基質となるラセミ体β−シアノイソ酪酸エステルの溶解度、反応性などを考慮すると５〜４０重量％の範囲であるのが好ましい。
反応温度は、好ましくは５〜７０℃であり、より好ましくは２０〜６０℃である。
【００１５】
反応液のpHは用いる酵素又は微生物の不斉加水分解能の至適pHに依存するが、一般的にはpH６〜８の範囲内で実施すると化学的加水分解反応による光学純度の低下を抑えることができるので好ましい。反応が進行するに従って、生成したカルボン酸により反応液のpHが低下してくるので、適当な中和剤で最適pHに維持しながら反応を行うことが望ましい。なお、以上のような基質濃度、媒体、温度、ｐＨ及びその反応条件は、反応収率、光学収量を考慮して目的とする光学活性化合物が有利に得られる条件を適宜選択することが望ましい。
【００１６】
このような不斉加水分解反応により、上記式（４）で表される光学活性β−シアノイソ酪酸が生成する。また、未反応の残存基質は、生成した光学活性βシアノイソ酪酸の対掌体を主成分とする上記一般式（３）で表される光学活性β−シアノイソ酪酸エステルとなる。
【００１７】
反応終了後、反応液から、ヘキサン、酢酸エチルなどの溶剤で抽出することにより、本発明の化合物である未反応の光学活性β−シアノイソ酪酸エステルを分離することができる。その際、予め、触媒として使用した微生物菌体、酵素等を遠心分離、濾過などの操作により除去し、その後に溶剤抽出を行うことで抽出操作をより容易に行うことができる。一方、抽出残液を硫酸、塩酸などの酸でpH１〜２とした後に、ヘキサン、酢酸エチルなどの溶剤で抽出することによりその対掌体である光学活性β−シアノイソ酪酸を得ることができる。抽出された生成物と溶媒は、蒸留等の公知の方法により容易に分離できる。
【００１８】
さらに、得られた光学活性β−シアノイソ酪酸エステルは、通常の方法で加水分解することにより光学活性を維持したままβ−シアノイソ酪酸にすることができる。また、光学活性β−シアノイソ酪酸は、通常の方法でエステル化することにより光学活性を維持したままβ−シアノイソ酪酸エステルにすることができる。従って、任意の立体配置のβ−シアノイソ酪酸を取得することができる。
【実施例】
【００１９】
以下、本発明を実施例によって具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例の範囲に限定されるものではない。
〔実施例１〕
光学活性−β−シアノイソ酪酸類の合成
エシェリキア・コリ(Escherichia coli) FERM BP-3835 を、アンピシリン５０μg/mlを含むＬＢ培地（１％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、０．５％NaCl）５０mlに植菌し、３７℃で２４時間振盪培養した。培養終了後、培養液を遠心分離して菌体を採取した。得られた菌体の全量をイオン交換水で洗浄した。洗浄後、５０mMリン酸緩衝液（pH７．０)５０mlに懸濁した。この菌体懸濁液にラセミ体β−シアノイソ酪酸メチルエステルを５ｇ添加し、３０℃で２０時間反応させた。この間、反応液のpHを、１ＮのNaOH水溶液を用いて７．０に調整した。反応終了後、遠心分離により菌体を除き、未反応のβ−シアノイソ酪酸メチルを酢酸エチルで抽出した。有機相に無水硫酸ナトリウムを加えて脱水し、溶媒を蒸発留去した。このようにして、１.2ｇの光学活性β−シアノイソ酪酸メチルエステルを得た。
【００２０】
得られた光学活性β−シアノイソ酪酸メチルエステルについて、高速液体クロマトグラフィー（カラム：Chiralcel OD（ダイセル社製）、移動層：ヘキサン／イソプロパノール／ＴＦＡ＝９０／１０／０．１、流速：０．５ml/min）で光学純度を測定したところ、（Ｓ）体９７．５％e.e.であった。
【００２１】
上記の酢酸エチル抽出における抽出残液である水相に２Ｎ塩酸を添加してpHを２．０に調整し、反応生成物である光学活性β−シアノイソ酪酸を酢酸エチルで抽出した。有機相に無水硫酸ナトリウムを加えて脱水し、溶媒を蒸発留去した。このようにして、２．５ｇの光学活性β−シアノイソ酪酸を得た。
得られた光学活性β−シアノイソ酪酸について上記と同様にして光学純度を測定したところ、（Ｒ）体３１％e.e.であった。
【００２２】
以下、（Ｓ）−β−シアノイソ酪酸メチルエステルの物性値を示す。
（1Ｈ−ＮＭＲスペクトル（図１））
溶媒：CDCl3、内部標準：TMS
δH １．２３〜１．２６（３Ｈ，ｄ，−ＣＨ3 ）
δH ２．７０〜２．７３（２Ｈ，ｍ，−ＣＨ2 −）
δH ２．８４〜２．９２（１Ｈ，ｍ，−ＣＨ−）
δH ３．６７ （３Ｈ，ｓ，−ＣＨ3 ）
【００２３】
（13Ｃ−ＮＭＲスペクトル（図２））
溶媒：CDCl3、内部標準：TMS
δC １６．２４ （−ＣＨ3 ）
δC ２０．４８ （−ＣＨ2 −）
δC ３５．５７ （−ＣＨ−）
δC １１８．７９ （−ＣＮ）
δC １７３．７０ （−ＣＯＯＣＨ3 ）
【００２４】
（光学純度）
（Ｓ）体 ９７．５％e.e.
（比旋光度）
[α]D25＝−９．９７(neat)
【００２５】
以下、（Ｒ）−β−シアノイソ酪酸の物性値を示す。
（1Ｈ−ＮＭＲスペクトル（図３））
溶媒：CDCl3、内部標準：TMS
δH １．２１〜１．２４（３Ｈ，ｄ，−ＣＨ3 ）
δH ２．６３〜２．６６（２Ｈ，ｍ，−ＣＨ2 −）
δH ２．７１〜２．７９（１Ｈ，ｍ，−ＣＨ−）
δH １０．４７ （１Ｈ，ｓ，−ＯＨ）
【００２６】
（13Ｃ−ＮＭＲスペクトル（図４））
溶媒：CDCl3、内部標準：TMS
δC １６．２９ （−ＣＨ3 ）
δC ２０．４０ （−ＣＨ2 −）
δC ３５．５０ （−ＣＨ−）
δC １１９．０３ （−ＣＮ）
δC １７４．８３ （−ＣＯＯＨ）
【００２７】
（光学純度）
（Ｒ）体 ３１％e.e.
【００２８】
〔実施例２〕
光学活性（Ｒ）−β−シアノイソ酪酸誘導体の合成
５０mMリン酸緩衝液（pH７．０）５０mlに１ｇのリパーゼＯＦ（商品名、名糖産業社製、キャンディダ属由来）を溶解した。この溶液にラセミ体β−シアノイソ酪酸メチルエステルを２．５ｇ添加し、３０℃で２０時間反応させた。この間、反応液のpHを、１ＮのNaOH水溶液を用いて７．０に調整した。反応終了後、未反応のβ−シアノイソ酪酸メチルを酢酸エチルで抽出した。有機相に無水硫酸ナトリウムを加えて脱水し、溶媒を蒸発留去した。このようにして、０．４ｇの光学活性β−シアノイソ酪酸メチルエステルを得た。
【００２９】
さらに、得られた光学活性β−シアノイソ酪酸メチルエステルは、通常の方法で加水分解することにより光学活性を維持したままβ−シアノイソ酪酸にすることができる。また、光学活性β−シアノイソ酪酸は、通常の方法でエステル化することにより光学活性を維持したままβ−シアノイソ酪酸エステルにすることができる。従って、任意の立体配置を取得することができる。
【００３０】
得られた光学活性β−シアノイソ酪酸メチルエステルについて、高速液体クロマトグラフィー（カラム：Chiralpak AS（ダイセル社製）、移動層：ヘキサン／イソプロパノール／ＴＦＡ＝９０／１０／０．１、流速：０．５ml/min）で光学純度を測定したところ、（Ｒ）体９２．３％e.e.であった。
【００３１】
〔実施例３〜１３〕
ラセミ体β−シアノイソ酪酸メチルエステルを２％溶解した５０mMリン酸緩衝液（pH７．０）１mlに、表１に示す酵素０．０２〜０．０５ｇを加えた後、３０℃で２０時間反応させた。反応液に酢酸エチル１mlを加えて十分に攪拌した後、有機相を高速液体クロマトグラフィー（カラム：Chiralpak AS（ダイセル社製）、移動層：ヘキサン／イソプロパノール／ＴＦＡ＝９０／１０／０．１、流速：０．５ml/min）にかけて生成した光学活性β−シアノイソ酪酸メチルエステルの光学純度を測定した。その結果を表１に示す。
【００３２】
【表１】
0004746019.tif 000002
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】実施例１で得られた（Ｓ）−β−シアノイソ酪酸メチルエステルの1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図２】実施例１で得られた（Ｓ）−β−シアノイソ酪酸メチルエステルの13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図３】実施例１で得られた（Ｒ）−β−シアノイソ酪酸の1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図４】実施例１で得られた（Ｒ）−β−シアノイソ酪酸の13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
0004746019.tif 000005
【図４】
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