(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含んでなるプロモーター、およびプロモーター活性を有するその断片：
（ａ）配列番号１のヌクレオチド配列、
（ｂ）配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有し、かつプロモーター活性を有するヌクレオチド配列、
（ｃ）置換、欠失、付加、および挿入から選択される１以上の改変を有し、かつプロモーター活性を有する配列番号１のヌクレオチド配列の改変体、および
（ｄ）ストリンジェントな条件下で配列番号１のヌクレオチド配列とハイブリダイズし、かつプロモーター活性を有するヌクレオチド配列。
【請求項２】
無胞子不完全菌に分類される糸状菌において機能する、請求項１に記載のプロモーター。
【請求項３】
プロモーター活性を有する断片が、少なくとも６００塩基対の長さである、請求項１に記載のプロモーター。
【請求項４】
下記からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含んでなるターミネーター、およびターミネーター活性を有するその断片：
（ｅ）配列番号２のヌクレオチド配列、
（ｆ）配列番号２のヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有し、かつターミネーター活性を有するヌクレオチド配列、
（ｇ）置換、欠失、付加、および挿入から選択される１以上の改変を有し、かつターミネーター活性を有する配列番号２のヌクレオチド配列の改変体、および
（ｈ）ストリンジェントな条件下で配列番号２のヌクレオチド配列とハイブリダイズし、かつターミネーター活性を有するヌクレオチド配列。
【請求項５】
無胞子不完全菌に分類される糸状菌において機能する、請求項４に記載のターミネーター。
【請求項６】
ターミネーター活性を有する断片が、少なくとも４００塩基対の長さである、請求項４に記載のターミネーター。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のプロモーターまたはその断片を含んでなる、発現ベクター。
【請求項８】
請求項４〜６のいずれか一項に記載のターミネーターまたはその断片を含んでなる、発現ベクター。
【請求項９】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のプロモーターまたはその断片と請求項４〜６のいずれか一項に記載のターミネーターまたはその断片とを含んでなる、発現ベクター。
【請求項１０】
目的タンパク質をコードするヌクレオチド配列を更に含んでなり、かつヌクレオチド配列がプロモーターおよび／またはターミネーターと作動可能に連結された、請求項７〜９のいずれか一項に記載の発現ベクター。
【請求項１１】
請求項７〜１０のいずれか一項に記載の発現ベクターにより形質転換された宿主。
【請求項１２】
宿主がMycelia steriliaである、請求項１１に記載の宿主。
【請求項１３】
請求項１１または１２に記載の宿主を培養し、次いで培養物から目的タンパク質を採取することを含んでなる、目的タンパク質の製造法。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
発明の分野
本発明は糸状菌において機能するプロモーターおよびターミネーター、それらを含んでなる発現ベクター、およびそれにより形質転換された宿主に関する。
関連技術の説明
糸状菌であるＰＦ１０２２菌株（Ｍｙｃｅｌｉａ ｓｔｅｒｉｌｉａ）は駆虫活性を有する２４員環状デプシペプチドであるＰＦ１０２２物質を生産する（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２６７１）。本菌株は有性および無性の生殖器を形成しないため、無胞子不完全菌に分類される（特開平３−３５７９６号）。
一方、薬剤耐性とともにアスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）由来のタカアミラーゼ遺伝子を連結したプラスミドをＰＦ１０２２菌株に導入することにより、ＰＦ１０２２菌株の形質転換体が得られている（ＷＯ９７／００９４４号）。
しかし、ＷＯ９７／００９４４号公報に示されているアスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）由来のタカアミラーゼ遺伝子の制御ＤＮＡ配列は、異種菌株由来の制御ＤＮＡ配列である。しかもＭｙｃｅｌｉａ ｓｔｅｒｉｌｉａは遺伝学的特性は未だ十分に明らかにされておらず、発現ベクター系が満たすべき条件も不明である。従って、異種菌株由来の制御配列を用いた形質転換体については、ＰＦ１０２２菌株に内在する遺伝子の発現と同調した発現制御がなされるかどうか不明である。また、ＰＦ１０２２菌株は無胞子不完全菌に属するため、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属以外の、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属、およびノイロスポーラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属等において使用されている従来の制御ＤＮＡ配列が合目的に発現するかどうかも同様に不明である。
このことから、Ｍｙｃｅｌｉａ ｓｔｅｒｉｌｉａで安定して機能する制御配列および発現ベクター系、さらにそれを利用したＭｙｃｅｌｉａ ｓｔｅｒｉｌｉａにおける有用物質の生産技術の確立が望まれているといえる。
発明の概要
本発明は、無胞子不完全菌に属する糸状菌、特にＭｙｃｅｌｉａ ｓｔｅｒｉｌｉａ、において、内在する遺伝子の発現と同調して機能する制御配列を提供することをその目的とする。
本発明はまた、無胞子不完全菌に属する糸状菌、特にＭｙｃｅｌｉａ ｓｔｅｒｉｌｉａ、において目的タンパク質を高発現する発現ベクターの提供をその目的とする。
本発明は更にまた、目的タンパク質を高生産する、形質転換された無胞子不完全菌に属する糸状菌、特にＭｙｃｅｌｉａ ｓｔｅｒｉｌｉａ、の提供をその目的とする。
本発明はまた、無胞子不完全菌に属する糸状菌、特にＭｙｃｅｌｉａ ｓｔｅｒｉｌｉａ、において目的タンパク質を製造する方法の提供をその目的とする。  本発明者らは、ＰＦ１０２２菌株において、高率に発現している遺伝子（Ａｂｐ１遺伝子）とその制御ＤＮＡ配列を単離、同定することに成功した。
本発明者らはまた、得られた制御ＤＮＡ配列を用いて遺伝子発現用の発現ベクターを作製し、これをＰＦ１０２２物質生産菌に導入し、形質転換体を得、このプロモーターの下流に連結した目的遺伝子をその機能が損なわれることなく効率的に発現させることに成功した。
本発明によるプロモーターは、下記からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含んでなるもの、およびプロモーター活性を有するその断片である：
（ａ）配列番号１のヌクレオチド配列、
（ｂ）配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも７０％の同一性を有し、かつプロモーター活性を有するヌクレオチド配列、
（ｃ）置換、欠失、付加、および挿入から選択される１以上の改変を有し、かつプロモーター活性を有する配列番号１のヌクレオチド配列の改変体、および
（ｄ）ストリンジェントな条件下で配列番号１のヌクレオチド配列とハイブリダイズし、かつプロモーター活性を有するヌクレオチド配列。
本発明によるターミネーターは、下記からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含んでなるもの、およびターミネーター活性を有するその断片である：
（ｅ）配列番号２のヌクレオチド配列、
（ｆ）配列番号２のヌクレオチド配列と少なくとも７０％の同一性を有し、かつターミネーター活性を有するヌクレオチド配列、
（ｇ）置換、欠失、付加、および挿入から選択される１以上の改変を有し、かつターミネーター活性を有する配列番号２のヌクレオチド配列の改変体、および
（ｈ）ストリンジェントな条件下で配列番号２のヌクレオチド配列とハイブリダイズし、かつターミネーター活性を有するヌクレオチド配列。
本発明による発現ベクターは前記プロモーターまたはその断片と前記ターミネータまたはその断片とをいずれかまたは両方含んでなるものである。
本発明による形質転換された宿主は前記発現ベクターにより形質転換されたものである。
本発明による目的物質の製造法は、前記の形質転換された宿主を培養し、次いで培養物から目的タンパク質を採取することを含んでなるものである。
発明の具体的な説明
微生物の寄託
ＰＦ１０２２菌株は、１９８９年１月２４日付で通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号）に寄託された。受託番号は、ＦＥＲＭ  ＢＰ−２６７１である。
制御配列
本発明によればＰＦ１０２２生産菌で機能する制御配列、すなわち、プロモーターおよびターミネーターが提供される。
配列（ｂ）において、配列番号１のヌクレオチド配列との同一性は、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％であることができる。
配列（ｆ）において、配列番号２のヌクレオチド配列との同一性は、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％であることができる。
配列（ｃ）および配列（ｇ）において、改変の数は、例えば１〜数十個であることができる。
配列（ｃ）および配列（ｇ）において改変が複数個存在する場合、導入された改変の種類は同一でも異なっていてもよい。
配列（ｄ）および配列（ｈ）において、「ストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイゼーション後のメンブレンの洗浄操作を、高温下低塩濃度溶液中で行うことを意味し、例えば、０．５×ＳＳＣ濃度（１×ＳＳＣ：１５ｍＭクエン酸３ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム）、６０℃、１５分間の洗浄条件、好ましくは０．５×ＳＳＣ濃度、０．１％ＳＤＳ溶液中で６０℃、１５分間の洗浄条件、を意味する。
プロモーター活性を有する断片は、少なくとも６００塩基対、好ましくは少なくとも８００塩基対、より好ましくは少なくとも１０００塩基対、最も好ましくは少なくとも１２００塩基対の長さであることができる。
ターミネーター活性を有する断片は、少なくとも４００塩基対、好ましくは少なくとも６００塩基対、より好ましくは少なくとも８００塩基対、最も好ましくは１０００塩基対の長さであることができる。
配列（ｂ）、（ｃ）、および（ｄ）、並びにプロモーター活性を有する断片に関して、「プロモーター活性を有する」か否かは、例えば、実施例３に記載のように発現ベクターを作成し、実施例４に記載のように異種遺伝子を宿主にて発現させ、異種タンパク質の生産を検出することにより評価することができる。
配列（ｆ）、（ｇ）、および（ｈ）、並びにターミネーター活性を有する断片に関して、「ターミネーター活性を有する」か否かは、例えば、実施例３に記載のように発現ベクターを作成し、実施例４に記載のように異種遺伝子を宿主にて発現させ、異種タンパク質の生産を検出することにより評価することができる。
本発明によるプロモーターおよびターミネーターは無胞子不完全菌に分類される糸状菌、特にＭｙｃｅｌｉａに属する微生物、より具体的にはＭｙｃｅｌｉａ ｓｔｅｒｉｌｉａに属する微生物、で機能することができる。
本発明によるプロモーターおよびターミネーターはＰＦ１０２２生産菌において機能することができる。ＰＦ１０２２生産菌としてはＰＦ１０２２物質を生産する無胞子不完全菌に分類される糸状菌が挙げられる。
本発明によるプロモーターおよびターミネーターは例えば以下のようにして得ることができる。
ＰＦ１０２２株のｍＲＮＡをＰＦ１０２２物質生産時の細胞より単離し、それを鋳型に用いてｃＤＮＡを合成する。それを無作為に選抜し、塩基配列解析を行い、高い頻度で発現している遺伝子、即ちＡｂｐ１遺伝子に由来するｃＤＮＡを単離する。
ＰＦ１０２２株からゲノムＤＮＡを抽出し、適当な制限酵素にて切断後、ファージベクターまたはプラスミドベクターを用いて、ＰＦ１０２２物質生産菌のゲノムＤＮＡからなるライブラリーを作製する。
このように調製したＰＦ１０２２株由来のゲノムＤＮＡライブラリーより、Ａｂｐ１遺伝子をコードする翻訳領域をプローブとして用いて、Ａｂｐ１遺伝子全長のクローニングを行う。単離されたゲノムＤＮＡおよび前記ｃＤＮＡの塩基配列を比較検討し、本遺伝子のプロモーターおよびターミネーター部位を決定し、プロモーターおよびターミネーターとすることができる。
発現ベクター
本発明によればＰＦ１０２２物質生産菌で機能する制御配列を含んでなる発現ベクターが提供される。
本発明による発現ベクターの構築の手順および方法は、遺伝子工学の分野で慣用されているものを用いることができる。
本発明において使用できる発現ベクターとしては、宿主染色体ＤＮＡに組込まれるものや、自己複製可能な自律的複製配列を有するベクターを宿主細胞内でプラスミド状態で存在させるものが挙げられ、例えば、ｐＵＣ系（ｐＵＣ１８又はｐＵＣ１１８等）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ系（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＫＳ＋等）、およびｐＢＲ３２２等のプラスミドが挙げられる。宿主細胞内に存在する遺伝子のコピー数は、１コピーでも複数であっても良い。
本発明による発現ベクターは、その第一の態様において、本発明によるプロモーターおよび／またはターミネーターと、場合によっては遺伝子マーカーおよび／または他の制御配列とを含んでなるものである。従って、本発明によるプロモーターおよびターミネーターのいずれかあるいは両方を含んでなる発現ベクターは本発明の範囲に包含される。
本発明によるプロモーターを少なくとも含んでなる発現ベクターにあっては、ターミネーターは本発明によるターミネーター以外のものであってもよい。
本発明によるターミネーターを少なくとも含んでなる発現ベクターにあっては、プロモーターは本発明によるプロモーター以外のものであってもよい。
遺伝子マーカーの導入は、例えば、本発明による制御配列にＰＣＲ法により適当な制限酵素切断部位を導入し、これをプラスミドベクターに挿入した後、薬剤耐性遺伝子および／または栄養要求性相補遺伝子等の選択マーカー遺伝子を連結する事により行うことができる。
遺伝子マーカーは形質転換体の選択手法に応じて適宜選択できるが、例えば、薬剤耐性をコードする遺伝子や栄養要求性を相補する遺伝子を使用することができる。薬剤耐性遺伝子としては、デストマイシン、ベノミル、オリゴマイシン、ハイグロマイシン、Ｇ４１８、ブレオマイシン、ビアラフォス、ブラストサイジンＳ、フレオマイシン、フォスフィノスリシン、アンピシリン、カナマイシン等の薬剤に対する遣伝子が挙げられる。栄養要求性を相補する遺伝子としては、ａｍｄＳ、ｐｙｒＧ、ａｒｇＢ、ｔｒｐＣ、ｎｉａＤ、ＴＲＰ１、ＬＥＵ２、ＵＲＡ３等の遺伝子が挙げられる。
本発明による発現ベクターは、その第二の態様において、更にその制御配列に作動可能に連結された目的タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでいてもよい。
制御配列への連結は、例えば、常法に従い、目的タンパク質をコードする遺伝子（目的遺伝子）の翻訳領域をプロモーターの下流に順方向に挿入することによって行うことができる。この場合、目的遺伝子を他のタンパク質の翻訳領域をコードする外来遺伝子と連結させて融合タンパク質として発現させることもできる。本明細書において「目的遺伝子」とは、発現の対象となる任意の遺伝子を意味し、異種遺伝子または同種遺伝子のどちらでも良い。目的遺伝子は、例えば、ＰＦ１０２２物質生産関連遺伝子群から選ばれる遺伝子であることができる。
形質転換体および目的タンパク質の生産
本発明によれば前記発現ベクターにより形質転換された宿主が提供される。
本発明において使用できる宿主としては、遺伝子組換えの宿主として使用可能な微生物であれば特に限定されるものではないが、糸状菌、好ましくは無胞子不完全菌に分類される糸状菌、より好ましくはＭｙｃｅｌｉａに属する微生物、最も好ましくはＭｙｃｅｌｉａ ｓｔｅｒｉｌｉａに属する微生物が挙げられる。本発明において使用できる宿主としてはまた、ＰＦ１０２２物質生産菌、好ましくはＰＦ１０２２物質を生産する糸状菌、より好ましくはＰＦ１０２２物質を生産するＰＦ１０２２菌株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２６７１）が挙げられる。
宿主への遺伝子発現用の組換えベクターの導入は、常法に従って行うことができる。導入法としては、例えぱ、エレクトロポレーション法、ポリエチレングリコール法、アグロバクテリウム法、リチウム法または塩化カルシウム法等が挙げられ、宿主細胞にとって効率の良い手法が選択される。ＰＦ１０２２物質生産菌を宿主として用いる場合、好ましくはポリエチレングリコール法である。
本発明によれば前記形質転換体を培養する工程を含む目的タンパク質の製造法が提供される。
形質転換体の培養は常法に従って、培地、培養条件等を適宜選択することにより行うことができる。培地としては、慣用の成分、例えば炭素源としては、グルコース、シュークロース、セルロース、水飴、デキストリン、澱粉、グリセロール、糖蜜、動・植物油等が使用できる。また、窒素源としては、大豆粉、小麦胚芽、ファーマメディア、コーン・スティープ・リカー、綿実粕、ブイヨン、ペプトン、ポリペプトン、マルトエキス、イーストエキス、硫酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、尿素等が使用できる。その他必要に応じ、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、コバルト、塩素、リン酸、硫酸およびその他のイオンを生成することのできる無機塩類、例えば塩化カリウム、炭酸カルシウム、リン酸水素２カリウム、硫酸マグネシウム、リン酸１カリウム、硫酸亜鉛、硫酸マンガン、硫酸銅を添加することも有効である。また、必要に応じてチアミン（チアミン塩酸塩等）等の各種ビタミン、グルタミン酸（グルタミン酸ナトリウム等）、アスパラギン（ＤＬ−アスパラギン等）等のアミノ酸、ヌクレオチド等の微量栄養素、抗生物質等の選抜薬剤を添加することもできる。さらに、菌の発育を助け、環状デプシペプチドの生産を促進するような有機物および無機物を適当に添加することができる。
培養方法は、液体培地では、好気的条件での培養法、振とう培養法、通気撹拌培養法または深部培養法により行うことができる。培地のｐＨは、例えばｐＨ６〜ｐＨ８程度である。培養温度は通常の条件、例えば温度１４℃〜４０℃、好ましくは２６℃〜３７℃、培養日数は、２日〜２５日間程度の条件で行うことができる。
また、本発明による目的タンパク質の製造法においては、形質転換された細胞の培養物から目的とする遺伝子発現産物であるタンパク質を取得することができる。培養物から目的タンパク質を抽出（磨砕処理、加圧破砕等）し、回収（ろ過、遠心分離等）し、および精製（塩析法、溶媒沈殿法等）する事ができる。またこれらの過程において、必要に応じてフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、ベンズアミジンまたはロイペプチン等のプロテアーゼ阻害剤を添加することもできる。
実    施    例
以下に実施例により本発明を詳述するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１：ｃＤＮＡのランダムシーケンスによる高発現遺伝子の検索
ＰＦ１０２２物質生産菌内で高率に発現している遺伝子を検索するため、ＰＦ１０２２物質生産菌由来のｃＤＮＡを無作為にクローニングし、そのＤＮＡ配列の比較を行い、大量に発現している遺伝子を分離同定した。
（１）ＰＦ１０２２物質生産菌由来ｃＤＮＡの調製
ＰＦ１０２２菌株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２６７１）を生産培地（グルコース  ２．０％、澱粉  ５．０％、小麦胚芽  ０．８％、大豆粕  １．３％、肉エキス  ０．３８％、塩化ナトリウム  ０．１３％、および炭酸カルシウム  ０．１５％；殺菌前ｐＨが７．０；ＷＯ９７／００９４４号  実施例４参照）で２６℃、４日間培養し、遠心分離（３０００ｒｐｍ、１０分）により菌体を回収した。これを精製水で洗浄し、−８０℃で凍結後、液体窒素存在下、ブレンダー（日本精機社製ＡＭ−３）で粉砕した。これを変性液（４Ｍグアニジンチオシアン酸、２５ｍＭクエン酸３ナトリウム、０．５％Ｎ−ラウリルサルコシン酸ナトリウム、０．１Ｍメルカプトエタノール）に懸濁後、室温で５分間撹拌の後、２Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）で中和し、ＴＥ飽和フェノールを加え更に撹拌した。ここにクロロホルム−イソアミルアルコール（２４：１）を加え、撹拌の後、遠心分離によりフェノールで変性した菌体成分を分離した。上層（水層）を回収し、イソプロパノールで核酸を沈殿化した。この沈殿は核酸濃度１ｍｇ／ｍｌとなるようにＴＥ（１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に溶解し、２．５Ｍ塩化リチウムで沈殿化（５℃、２時間）した。これを遠心分離により回収し、７０％エタノールで洗浄後、ＴＥに再溶解し、これを全ＲＮＡ画分とした。
全ＲＮＡ画分はｍＲＮＡピュアリフィケーションキット（アマシャムファルマシアバイオテク社製）を用いて、ｍＲＮＡを精製した。更に、このｍＲＮＡを鋳型にタイムセーバーｃＤＮＡ合成キット（アマシャムファルマシアバイオテク社製）を用いて、ｃＤＮＡを合成した。
（２）ｃＤＮＡのランダムシーケンス
実施例１（１）のように調製したｃＤＮＡを、ＥｃｏＲＩ切断後、アルカリフォスファターゼ処理したｐＵＣ１８にＤＮＡライゲーションキットＶｅｒ．２（宝酒造社製）を用いて連結した。これを大腸菌ＪＭ１０９株に導入し、形質転換した各種コロニーをアンピシリンを含むＬＢ培地（１％ポリペプトン、０．５％イーストエキス、１％塩化ナトリウム）で培養した。これらの形質転換体からのプラスミドの精製はフレキシプレップキット（アマシャムファルマシアバイオテク社製）を用いた。
上記のように調製した４０種のプラスミドをＡＬＦ  ＤＮＡシーケンサーＩＩ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）に供し、挿入断片のＤＮＡ配列を解読した。シーケンスゲルはロングレンジャー（ＦＭＣ社製）、シーケンス反応はオートリードシーケンシングキット（アマシャムファルマシアバイオテク社製）を用いた。
その結果、１０種のクローンが同一のＤＮＡ塩基配列を示した。そこでクローン化された遺伝子をＡｂｐ１と命名し、本遺伝子のプロモーターおよびターミネーターをゲノムＤＮＡよりクローニングすることとした。
（３）ＰＦ１０２２物質生産菌のゲノムＤＮＡの単離
ＰＦ１０２２菌株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２６７１）のゲノムＤＮＡの単離は（Ｈ．Ｈｏｒｉｕｃｈｉ  ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７０，２７２−２７８，（１９８８））に記載の方法に従った。具体的には、まずＰＦ１０２２物質生産菌（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２６７１）を種培地（可溶性澱粉  ２．０％、グルコース  １．０％、ポリペプトン  ０．５％、小麦胚芽  ０．６％、酵母エキス  ０．３％、大豆粕  ０．２％および炭酸カルシウム  ０．２％；殺菌前がｐＨ７．０；ＷＯ９７／００９４４号  実施例１参照）で２日間培養し、遠心分離（３５００ｒｐｍ、１０分）によって菌体を回収した。次いで、得られた菌体を凍結乾燥後、ＴＥに懸濁し、３％ＳＤＳ溶液中、６０℃、３０分間処理後、ＴＥ飽和フェノール抽出により、菌体残渣を除去した。抽出液はエタノール沈澱化後、リボヌクレアーゼＡ（シグマ社製）およびプロテイナーゼＫ（和光純薬社製）処理し、さらに１２％ポリエチレングリコール６０００により核酸を沈殿化させた。これをＴＥ飽和フェノール抽出、エタノール沈殿化を行い、同沈殿をＴＥに溶解し、これをゲノムＤＮＡとした。
（４）ＰＦ１０２２物質生産菌のゲノムライブラリーの作製
実施例１（３）のように調製したＰＦ１０２２物質生産菌由来ゲノムＤＮＡをＳａｕ３ＡＩにより部分消化した。これをファージベクター、λＥＭＢＬ３クローニングキット（ストラタジーン社製）のＢａｍＨＩアームにＴ４リガーゼ（宝酒造社製ライゲーションキットＶｅｒ．２）を用いて連結させた。これをエタノール沈澱後、ＴＥに溶解した。連結混合物の全量をギガパックＩＩＩプラスパッケージングキット（ストラタジーン社製）を用いて、大腸菌ＬＥ３９２株に感染させ、ファージプラークを形成させた。この方法により得られた１．３×１０４個（２．６×１０４ＰＦＵ／ｍｌ）のファージライブラリーを用いてＡｂｐ１遺伝子のクローニングを行った。
（５）ＰＦ１０２２物質生産菌由来のゲノムＤＮＡからのＡｂｐ１遺伝子クローニング
プローブはＡｂｐ１遺伝子の翻訳領域をＰＣＲ法により増幅し、用いた。実施例１（３）のように調製したゲノムＤＮＡを鋳型に、８−７３Ｕおよび８−７３Ｒなる合成プライマーを用いて、レッツゴーＰＣＲキット（サワディーテクノロジー社製）に従いＰＣＲを行った。ＰＣＲの反応条件は、９４℃３０秒間、５０℃３０秒間、７２℃９０秒間のステップを２５回繰り返すことにより増幅を行った。以下に８−７３Ｕおよび８−７３ＲのＤＮＡ配列を示す。
0004672222.tif 000002
このようにして得られたＰＣＲ産物はＥＣＬダイレクトシステム（アマシャムファルマシアバイオテク社製）を用いて、標識化した。実施例１（４）のように作成したファージプラークは、ハイボンドＮ＋ナイロントランスファーメンブラン（アマシャムファルマシアバイオテク社製）に転写し、アルカリ変成後、５倍濃度ＳＳＣ（ＳＳＣ：１５ｍＭ  クエン酸３ナトリウム、１５０ｍＭ  塩化ナトリウム）で洗浄し、乾燥させＤＮＡを固定した。キットに記載の方法に従って、１時間のプレハイブリダイゼーション（４２℃）の後、先の標識化したプローブを添加し、１６時間（４２℃）ハイブリダイゼーションを行った。プローブの洗浄は前述キットに記載の方法に従った。プローブの洗浄を行ったナイロン膜は、検出溶液に１分間浸したあと、メディカルＸ線フィルム（富士写真フィルム社製）に感光させ、１個の陽性クローンを得た。本クローンはサザン解析の結果、少なくとも６ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ断片がゲノムＤＮＡの制限酵素断片長と一致していた。このＨｉｎｄＩＩＩ断片の制限酵素地図を図１に示す。ＨｉｎｄＩＩＩ断片はｐＵＣ１１９にサブクローニングし（ｐＲＱＨｉｎ／１１９）、以降の実験に供した。
実施例２：Ａｂｐ１遺伝子のプロモーターおよびターミネーターのＤＮＡ配列決定
ＤＮＡ配列解析用テンペレートとしてｐＲＱＨｉｎ／１１９をＳａｌＩおよびＳｍａＩで消化し、同様の制限酵素で消化しておいたｐＵＣ１８に連結し、これをＤＮＡ配列解析用テンペレートとした。ＤＮＡ配列解析は実施例１（２）と同様に行った。次に、実施例１（２）で得られたｃＤＮＡの塩基配列と比較し、Ａｂｐ１遺伝子のプロモーターおよびターミネーター領域を決定し、そのＤＮＡ配列をそれそれ配列表の配列番号１および配列番号２に示す。
実施例３：Ａｂｐ１遺伝子の発現制御領域を用いた発現ベクターの構築
ｐＲＱＨｉｎ／１１９を鋳型にＡｂｐ１遺伝子のプロモーター領域およびターミネーター領域をＰＣＲ法を用いて増幅した。プロモーターの増幅はＡＢＰ−ＮｅｃｏおよびＡＢＰ−Ｎｂａｍ、一方、ターミネーターの増幅はＡＢＰ−ＣｂａｍおよびＡＢＰ−Ｃｘｂａなるプライマーを用い、ＰＣＲスーパーミックスハイフィデリティ（ライフテックオリエンタル社製）によりＰＣＲ法を行った。反応条件は、９４℃３０秒間、５０℃３０秒間、７２℃９０秒間のステップを２５回繰り返すことにより増幅を行った。以下にＡＢＰ−Ｎｅｃｏ、ＡＢＰ−Ｎｂａｍ、ＡＢＰ−ＣｂａｍおよびＡＢＰ−ＣｘｂａのＤＮＡ配列を示す。
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各ＰＣＲ産物はマイクロスピンＳ−４００カラム（アマシャムファルマシアバイオテク社製）で精製し、エタノール沈殿化の後、プロモーターはＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ、ターミネーターはＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで消化し、同様の酵素で消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ＋に順次連結した。これをＸｂａＩで消化し、ｐＭＫＤ０１（ＷＯ９８／０３６６７号）由来デストマイシン耐性カセットを挿入しｐＡＢＰｄを構築した（図２）。
実施例４：β−グルクロニダーゼ遺伝子を用いた発現ベクターの能力確認
レポーター遺伝子として用いたβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子の翻訳領域はｐＬＣ−ＧＵＳ（Ｋ．Ｙａｎａｉ，ｅｔ．ａｌ．，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６０，４７２−４７５，（１９９６））をＢａｍＨＩで切断することにより得た。これをあらかじめＢａｍＨＩ消化、アルカリフォスファターゼ処理しておいたｐＡＢＰｄに連結し、Ａｂｐ１プロモーターの下流にＧＵＳ遺伝子が挿入されたプラスミド、ｐＡＢＰｄ−Ｇを構築した。
ｐＡＢＰｄ−ＧによるＰＦ１０２２物質生産菌（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２６７１）の形質転換はＷＯ９７／００９４４号の実施例１に記載されている方法に従って行った。その結果、１μｇのＤＮＡあたり約３個の形質転換体が得られた。
このようにして得られた形質転換体は実施例１（１）の生産培地を用いて液体培養し、遠心分離により菌体を回収した。得られた菌体はミニビードビーター（バイオスペックプロダクツ社製）を用いて細胞を破砕した。これを遠心分離し、菌体残渣を除去し、上澄のＧＵＳ活性を測定した。活性測定は（Ｋ．Ｙａｎａｉ，ｅｔ．ａｌ．，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６０，４７２−４７５，（１９９６））に記載の方法に従った。
その結果、表１から明らかのように、ｐＡＢＰｄ−Ｇ形質転換体のみに顕著なＧＵＳ活性が認められた。すなわち、該発現ベクターであるｐＡＢＰｄは、ＰＦ１０２２物質生産菌で有効に機能することが確認された。
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【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１はＡｂｐ１遺伝子を含む６ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ断片の制限酵素地図を示す。
図２はｐＡＢＰｄの構成および制限酵素地図を示す。
【図１】
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【図２】
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