(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
不完全グリコシル化標的化治療的融合タンパク質であって、
リソソーム酵素；および
マンノース−６−リン酸に非依存性の様式でヒトカチオン非依存性マンノース−６−リン酸レセプターに結合するリソソーム標的化ドメイン
を含み、ここで該リソソーム標的化ドメインは、成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩまたは成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩに少なくとも７０％同一なアミノ酸配列を有するヒトＩＧＦ−ＩＩムテインである、不完全グリコシル化標的化治療的融合タンパク質。
【請求項２】
前記リソソーム標的化ドメインが成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩである、請求項１に記載の不完全グリコシル化標的化治療的融合タンパク質。
【請求項３】
前記リソソーム標的化ドメインが成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩに少なくとも７０％同一なアミノ酸配列を有するヒトＩＧＦ−ＩＩムテインである、請求項１に記載の不完全グリコシル化標的化治療的融合タンパク質。
【請求項４】
前記ヒトＩＧＦ−ＩＩムテインが成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩのアミノ酸４８〜５５位を含む、請求項３に記載の不完全グリコシル化標的化治療的融合タンパク質。
【請求項５】
前記ヒトＩＧＦ−ＩＩムテインが、成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩのアミノ酸８位、アミノ酸４８位、アミノ酸４９位、アミノ酸５０位、アミノ酸５４位、およびアミノ酸５５位からなる群から選択される少なくとも３アミノ酸を含み、ここで該少なくとも３つのアミノ酸の相対位置は、成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩ中のそれらの位置に対応する、請求項３に記載の不完全グリコシル化標的化治療的融合タンパク質。
【請求項６】
前記ヒトＩＧＦ−ＩＩムテインが、ＩＧＦ−Ｉのアミノ酸配列またはＩＧＦ−Ｉムテインのアミノ酸配列を含み、ここで、
（ｉ）アミノ酸５５位および５６位が変更されているか、
（ｉｉ）アミノ酸１〜４位が除去されるかまたは変更されているか、あるいは
（ｉｉｉ）アミノ酸５５位および５６位が変更されて、かつアミノ酸１〜４位が除去されるかまたは変更されている、
請求項１に記載の不完全グリコシル化標的化治療的融合タンパク質。
【請求項７】
前記ヒトＩＧＦ−ＩＩムテインが、成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩの５４位および５５位に対応する位置で、ｐＨ７．４にて各々が荷電しないかまたは負荷電を帯びるアミノ酸を含む、請求項３に記載の不完全グリコシル化標的化治療的融合タンパク質。
【請求項８】
前記ヒトＩＧＦ−ＩＩムテインが、アミノ酸配列フェニルアラニン−アルギニン−セリンを含む、請求項３に記載の不完全グリコシル化標的化治療的融合タンパク質。
【請求項９】
前記ヒトＩＧＦ−ＩＩムテインが、成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩのアミノ酸８〜２８位および４１〜６１位を含む、請求項３に記載の不完全グリコシル化標的化治療的融合タンパク質。
【請求項１０】
前記ムテインが、成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩのアミノ酸１〜７位の欠失または置換を含む、請求項３に記載の不完全グリコシル化標的化治療的融合タンパク質。
【請求項１１】
前記ムテインが、ヒトＩＧＦ−ＩＩのＹ２７Ｌ変異を含む、請求項３に記載の不完全グリコシル化標的化治療的融合タンパク質。
【請求項１２】
前記ムテインが、天然に存在するヒトＩＧＦ−ＩＩのＩＧＦ−Ｉレセプターに対する親和性と比較して低下した親和性で前記ＩＧＦ−Ｉレセプターに結合する、請求項１に記載の不完全グリコシル化標的化治療的融合タンパク質。
【請求項１３】
前記酵素活性における細胞性欠損または亜細胞性欠損がヒトの疾患に関連する、請求項１に記載の不完全グリコシル化標的化治療的融合タンパク質。
【請求項１４】
前記ヒトの疾患がリソソーム蓄積症である、請求項１３に記載の不完全グリコシル化標的化治療的融合タンパク質。
【請求項１５】
前記リソソーム蓄積症がポーンプ病である、請求項１４に記載の不完全グリコシル化標的化治療的融合タンパク質。
【請求項１６】
前記リソソーム蓄積症がファブリー病である、請求項１４に記載の不完全グリコシル化標的化治療的融合タンパク質。
【請求項１７】
前記リソソーム蓄積症がゴーシェ病である、請求項１４に記載の不完全グリコシル化標的化治療的融合タンパク質。
【請求項１８】
前記リソソーム酵素が酸α１，４−グルコシダーゼである、請求項１に記載の不完全グリコシル化標的化治療的融合タンパク質。
【請求項１９】
前記リソソーム酵素がβ−グルクロニダーゼである、請求項１に記載の不完全グリコシル化標的化治療的融合タンパク質。
【請求項２０】
前記リソソーム酵素がα−ガラクトシダーゼＡである、請求項１に記載の不完全グリコシル化標的化治療的融合タンパク質。
【請求項２１】
前記標的化治療的融合タンパク質が脱グルコシル化されている、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の不完全グリコシル化標的化治療的融合タンパク質。
【請求項２２】
前記標的化された治療的融合タンパク質が過ヨウ素酸処理によって脱グルコシル化される、請求項１８に記載の不完全グリコシル化標的化治療的融合タンパク質。
【請求項２３】
患者を処置するための薬学的組成物であって、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の不完全グリコシル化標的化治療的融合タンパク質を含む、薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願に対する参照）
本出願は、米国特許第６０／３８４，４５２号（２００２年５月２９日出願）；同第６０／３８６，０１９号（２００２年６月５日出願）；同第６０／４０８，８１６号（２００２年９月６日出願）；同第１０／２７２，５３１号（２００２年１０月１６日出願）；および同第６０／４４５，７３４号（２００３年２月６日出願）の利益を主張し、それらのそれぞれの内容は、その全体が本明細書中に参考として援用される。本出願はまた、米国特許第６０／２８７，５３１号（２００１年４月３０日出願）；同第６０／３０４，６０９号（２００１年７月１０日出願）；同第６０／３２９，４６１号（２００１年１０月１５日出願）、同第６０／３５１，２７６号（２００２年１月２３日出願）；同第１０／１３６，８４１号（２００２年４月３０日出願）；および同第１０／２７２，４８３号（２００２年１０月１６日出願）に関し、それらそれぞれの内容は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
本発明は、哺乳動物細胞の標的化亜細胞区画にタンパク質を特異的に送達する手段を提供する。亜細胞区画にタンパク質を標的化する能力は、代謝疾患（例えば、リソソーム蓄積症（特に、リソソーム酵素を欠いているかまたは欠乏する４０を超える遺伝的疾患のクラス））の処置において非常に有用である。
【背景技術】
【０００３】
（背景）
細胞区画（例えば、ゴルジ、小胞体およびリソソーム）における酵素欠乏は、広範なヒト疾患を生じる。例えば、リシルヒドロキシラーゼ（これは、通常、小胞体の管腔内の酵素である）は、コラーゲンの適切なプロセッシングに必要とされ；この酵素を欠くことで、エーレルス−ダンロー症候群ＶＩ型（重篤な結合組織障害）が生じる。ＧｎＴ  ＩＩ（通常、ゴルジ中で見出される）は、タンパク質の正常なグリコシル化に必要とされ、ＧｎＴ  ＩＩを欠くことで、脳発達における欠陥を誘導する。４０を超えるリソソーム蓄積症（ＬＳＤ）が、リソソームにおける１つ以上のタンパク質を欠くことによって、直接的にかまたは間接的に引き起こされる。
【０００４】
哺乳動物のリソソーム酵素は、この酵素がＮ連結高マンノース型炭水化物でグリコシル化される、細胞質で合成され、そして小胞体（ＥＲ）に浸透する。ゴルジにおいて、高マンノース炭水化物は、リソソームタンパク質をリソソームに標的化するマンノース−６−リン酸（Ｍ６Ｐ）の添加によって、このリソソームタンパク質で修飾される。Ｍ６Ｐ修飾タンパク質は、２つのＭ６Ｐレセプターのいずれかとの相互作用を介して、リソソームに送達される。修飾の最も都合の良い形態は、二つのＭ６Ｐが高マンノース炭水化物に添加される場合である。
【０００５】
リソソーム蓄積症（ＬＳＤ）のための酵素置換治療は、活発に探求されている。ゴーシェ病における治療を除く治療は、一般的に、ＬＳＤタンパク質が取り込まれ、そして、Ｍ６Ｐ依存様式で種々の細胞型のリソソームに送達されることを必要とする。１つの可能なアプローチは、ＬＳＤタンパク質を精製すること、および、このタンパク質がＭ６Ｐを炭水化物部分に組み込むようにこれを修飾することを包含する。この修飾物質は、細胞表面上でのＭ６Ｐレセプターとの相互作用に起因して、非修飾ＬＳＤタンパク質よりもより効率的に細胞によって取り込まれ得る。しかし、亜細胞標的化における使用のためにタンパク質を調製、精製および修飾するために必要とされる時間および費用に起因して、治療剤を細胞区画に標的化するための、新規で、より単純で、より効率的で、かつ、より費用有効な方法についての必要性が、依然としてある。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の要旨）
本発明は、治療物が必要とされる細胞の亜細胞区画に局在化させる標的化タンパク質治療物を提供することよって、代謝疾患の処置を容易にする。本発明は、このタンパク質の翻訳後プロセッシングまたは合成後プロセッシングの必要性を減少させることによって、標的化タンパク質治療物の調製を簡単にする。例えば、本発明の標的化治療剤は、治療ドメインおよび融合タンパク質を正確な亜細胞区画に標的化するドメインを含む融合タンパク質として、合成され得る（本明細書中で使用される場合「融合タンパク質」は、同じポリペプチド中に通常存在しない、少なくとも２つのドメインを有する単一のポリペプチドをいう。従って、天然に存在するタンパク質は、本明細書中で使用される場合「融合タンパク質」ではない）。融合タンパク質としての合成は、例えば、別個の治療物および標的ドメインの化学的架橋に関連する複雑さなしに、治療ドメインを所望の亜細胞区画に、標的化することを可能にする。
【０００７】
本発明はまた、Ｍ６Ｐ非依存様式で、治療物をリソソームに標的化することも可能にする。従って、標的化治療物は、哺乳動物細胞中で合成されることを必要としないが、化学的に合成され得、またはグリコシル化パターンにかかわらず、細菌、酵母、原生生物もしくは他の生物中で合成され得、高収率でかつ比較的低コストでの標的化治療剤の生成を容易にする。この標的化治療物は、融合タンパク質として合成され得、さらに生成を簡単にするか、または、独立して合成された治療剤と標的部分を結合することによって、生成され得る。
【０００８】
本発明は、高マンノース炭水化物へのＭ６Ｐの添加を必要としないで、リソソームが治療物の標的となることを可能にする。このことは、これら２つのＭ６Ｐレセプターの１つがまた、高親和性で他のリガンドに結合するという知見に、部分的に基づいている。例えば、カチオン非依存性マンノース−６−リン酸レセプターはまた、このレセプターが高親和性でＩＧＦ−ＩＩに結合するので、インスリン様増殖因子２（ＩＧＦ−ＩＩ）レセプターとして公知である。この低分子量ポリペプチドは、３つのレセプター（インスリンレセプター、ＩＧＦ−ＩレセプターおよびＭ６Ｐ／ＩＧＦ−ＩＩレセプター）と相互作用する。前者の２つのレセプターとの相互作用を主に介して、その生物学的効果が発揮すると考えられている一方、カチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプターとの相互作用は、リソソーム（ここで、ＩＧＦ−ＩＩが分解される）に輸送されるＩＧＦ−ＩＩを優勢に生じると考えられる。
【０００９】
従って、本発明は、哺乳動物リソソームで治療的に活性である標的部分および治療剤を含む、標的化治療物の一つの局面に関する。本明細書中で使用される場合「治療的に活性な」とは、酵素活性が欠乏する細胞、またはその区画に酵素活性を提供する、少なくともポリペプチドまたは他の分子を含む。「治療的に活性な」とはまた、細胞中の生化学的欠乏を改善または補填することが意図される他のポリペプチドまたは他の分子を含むが、主として細胞傷害性または細胞増殖抑制性である分子（例えば、化学療法物）を含まない。
【００１０】
１つの実施形態において、標的性部分は、レセプターが標的細胞の原形質膜に存在する場合、Ｍ６Ｐ非依存性の様式で、ヒトカチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプターの細胞外ドメインに結合するための手段（例えば、分子）である。別の実施形態において、この標的性部分は、ヒトカチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプターの細胞外ドメインに結合する、非グルコシル化リソソーム標的性ドメインである。いずれかの実施形態において、標的性部分としては、例えば、ＩＧＦ−ＩＩ；レチノイン酸もしくはこの誘導体；ウロキナーゼ型プラスミノゲンアクチベーターレセプターのドメインに少なくとも７０％同一なアミノ酸配列を有するタンパク質；このレセプターを認識する抗体の可変ドメイン；またはこれらの改変体が挙げられ得る。いくつかの実施形態において、標的性部分は、ｐＨ７．４または約ｐＨ７．４で、マイクロモル未満の解離定数（例えば、１０−８Ｍ未満、１０−９Ｍ未満、１０−１０Ｍ未満、または１０−７Ｍと１０−１１Ｍとの間）、およびｐＨ５．５または約ｐＨ５．５で、少なくとも１０−６Ｍの解離定数、ならびにｐＨ７．４または約ｐＨ７．４で少なくとも１０倍の解離定数でレセプターに結合する。特定の実施形態において、結合するための手段は、ｐＨ７．４または約ｐＨ７．４でよりも、ｐＨ５．５または約ｐＨ５．５で、少なくとも１０倍弱く（ｌｅｓｓ  ａｖｉｄｌｙ）（すなわち、少なくとも１０倍高い解離定数で）細胞外ドメインに結合する；１つの実施形態において、ｐＨ５．５または約ｐＨ５．５での解離定数は、少なくとも１０−６Ｍである。さらなる実施形態において、標的化治療物と結合手段との結合は、ｐＨ７．４または約ｐＨ７．４からｐＨ５．５または約ｐＨ５．５へのｐＨ変化によって不安定化される。
【００１１】
別の実施形態において、標的性部分は、ヒトカチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプターの細胞外ドメインに結合するが、アミノ酸１５７２がイソロイシンからスレオニンに変化されるレセプターのムテインには結合しないか、または少なくとも１０倍弱い親和性（すなわち、少なくとも１０倍高い解離定数で）でこのムテインに結合する、リソソーム標的性ドメインである。別の実施形態において、この標的性部分は、本質的にヒトカチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプターのリピート１０〜１５からなるレセプタードメインに結合し得るリソソーム標的性ドメインである；このリソソーム標的性ドメインは、タンパク質が、このリソソーム標的ドメインに結合する他の部分を含まない場合でさえも、リピート１０〜１５を含むタンパク質に結合し得る。好ましくは、このリソソーム標的性ドメインは、ヒトカチオン非依存性マンノース−６−リン酸レセプターのリピート１０〜１３から本質的になるレセプタードメインに結合し得る。より好ましくは、このリソソーム標的性ドメインは、ヒトカチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプターのリピート１１〜１２、リピート１１またはアミノ酸１５０８〜１５６６から本質的になるレセプタードメインに結合し得る。これらの実施形態の各々において、このリソソーム標的性ドメインは、好ましくは、ｐＨ７．４または約ｐＨ７．４でマイクロモル未満の解離定数で、レセプターまたはレセプタードメインに結合する。１つの好ましい実施形態において、このリソソーム標的性ドメインは、約１０−７Ｍの解離定数で結合する。別の好ましい実施形態において、この解離定数は、１０−７Ｍ未満である。
【００１２】
別の実施形態において、標的性部分は、ヒトＩＧＦ−ＩＩの十分に重複する結合部分であり、その結果、この結合部分は、ヒトカチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプターに結合する。この結合部分は、ＩＧＦ−ＩＩの少なくとも一部に十分に相同であるアミノ酸配列を含むことによって、またはＩＧＦ−ＩＩの少なくとも一部に十分相当する分子構造を含むことによって十分に重複し得、その結果、この結合部分は、カチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプターに結合する。この結合部分は、ＩＧＦ−ＩＩの少なくとも一部（例えば、ヒトＩＧＦ−ＩＩのアミノ酸４８〜５５、またはヒトＩＧＦ−ＩＩのアミノ酸８、４８、４９、５０、５４および５５からなる群から選択される少なくとも３つのアミノ酸）に相当する三次元形状を有する有機分子であり得る。好ましい有機分子は、ヒトＩＧＦ−ＩＩのアミノ酸４８に相当する部分にて疎水性部分を有し、そして、ヒトＩＧＦ−ＩＩのアミノ酸４９に相当する部分にて、ｐＨ７．４または約ｐＨ７．４で、正の荷電を有する。１つの実施形態において、この結合部分は、５以下のアミノ酸によって分離される逆平行のαへリックスを有するポリペプチドを含む、ポリペプチドである。別の実施形態において、この結合部分は、アミノ酸５５〜５６が変更し、そして／またはアミノ酸１〜４が欠失または変化される、ＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−Ｉのムテインのアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。さらなる実施形態において、この結合部分は、ヒトＩＧＦ−ＩＩに少なくとも６０％同一なアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む；ヒトＩＧＦ−ＩＩの５４位および５５位に対応する位置でのアミノ酸は、好ましくは、ｐＨ７．４または約ｐＨ７．４で、荷電していないか、または負に荷電される。
【００１３】
１つの実施形態において、この標的性部分は、アミノ酸配列のフェニルアラニン−アルギニン−セリンを含むポリペプチドである。別の実施形態において、この標的性部分は、ヒトＩＧＦ−ＩＩのアミノ酸４８〜５５に対して少なくとも７５％相同なアミノ酸配列を含むポリペプチドである。別の実施形態において、この標的性部分は、単一のポリペプチドまたは別個のポリペプチド上に、ヒトＩＧＦ−ＩＩのアミノ酸８〜２８および４１〜６１を含む。別の実施形態において、この標的性部分は、ヒトＩＧＦ−ＩＩのアミノ酸４１〜６１、ならびにアミノ酸９、１９、２６および／または２７にてヒト配列とは異なる、ヒトＩＧＦ−ＩＩのアミノ酸８〜２８のムテインを含む。
【００１４】
いくつかの実施形態において、治療剤と標的性部分との結合は、ｐＨ５．５または約ｐＨ５．５で不安定である。好ましい実施形態において、この標的性部分と治療剤との結合は、５．５〜７．４の間のｐＫａを有するタンパク質アクセプター（例えば、イミダゾールまたはヒスチジンのようなこれの誘導体）によって媒介される。好ましくは、治療剤または標的性部分の一方は金属に連結され、そして他方は、ｐＨ依存性金属結合部分に連結される。
【００１５】
別の局面において、本発明は、治療的ドメインおよび亜細胞標的性ドメインを含む治療的融合タンパク質に関する。この亜細胞標的性ドメインは、細胞の外部表面上のレセプターの細胞外ドメインに結合する。このレセプターの内部移行の際に、亜細胞標的性ドメインは、治療的ドメインの亜細胞区画（例えば、リソソーム、エンドソーム、小胞体（ＥＲ）またはゴルジ複合体）への局在化を可能にして、ここで、この治療的ドメインは、治療的に活性である。１つの実施形態において、このレセプターは、構成的エンドサイトーシスを受ける。別の実施形態において、この治療的ドメインは、治療的酵素活性を有する。この酵素活性は、好ましくは、（細胞または細胞の特定の区画における）その欠損がヒト疾患（例えば、リソソーム蓄積症）に関連する活性である。
【００１６】
さらなる局面において、本発明は、治療的タンパク質をコードする核酸およびこれらの核酸を含む細胞（例えば、哺乳細胞、昆虫細胞、酵母細胞、原生生物、または細菌）に関する。本発明はまた、これらの細胞に、タンパク質の発現を可能にする条件を提供することによって（例えば、インビトロ培養との関連で、または、細胞を哺乳動物体内に維持することによって）、このタンパク質を生成する方法を提供する。このタンパク質は、（例えば、インビトロで生成される場合）その後回収され得るか、または（例えば、患者においてインビボで生成される場合）回収工程を介在することなく、使用され得る。従って、本発明はまた、（注入、インサイチュ合成、その他によって）治療的タンパク質を投与することによってか、このタンパク質をコードする核酸を投与することによって（これによって、インビボでのタンパク質合成が可能になる）か、または、このタンパク質をコードする核酸を含む細胞を投与することによって、患者を処置する方法を提供する。１つの実施形態において、この方法は、標的化治療物を合成する工程、ならびに、この標的化治療物を患者に投与する工程を包含し、この標的化治療物は、哺乳動物のリソソーム、およびマンノース−６−リン酸非依存性様式で、ヒトカチオン非依存性マンノース−６−リン酸レセプターを結合する標的性部分において治療的に活性である治療剤を含む。この方法はまた、（例えば、組み換えディスプレイ技術（例えば、ファージディスプレイ、細菌ディスプレイもしくは酵母２ハイブリッド）によってか、または、要求性結合特性についてライブラリーをスクリーニングすることによって）標的性部分を同定する工程を包含する。別の実施形態において、この方法は、ヒトＩＧＦ−ＩＩの少なくとも一部に相当する三次元形状を規定する分子モデルを（例えば、コンピューター上に）提供する工程；ＩＧＦ−ＩＩの少なくとも一部（例えば、アミノ酸４８〜５５）に相当する三次元形状を有する候補ＩＧＦ−ＩＩアナログを同定する工程、ならびに、哺乳動物のリソソームで活性であり、この候補ＩＧＦ−ＩＩアナログに直接的にかまたは間接的に結合される治療剤を生成する工程を包含する。この方法はまた、この候補ＩＧＦ−ＩＩアナログが、ヒトカチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプターに結合するか否かを決定する工程も包含し得る。
【００１７】
本発明はまた、リソソームに標的化され、かつ／または血液脳関門を横切り、そして哺乳動物における循環において、延長した半減期を保有する治療的タンパク質を産生する方法を提供する。本方法は、不完全グリコシル化（ｕｎｄｅｒｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）治療的タンパク質を産生する工程を包含する。本明細書中で使用される場合、「不完全グリコシル化」とは、タンパク質が哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）において産生される場合、通常存在する１つ以上の炭水化物構造が省略されるか、除去されるか、修飾されるか、またはマスクされて、それにより哺乳動物においてこのタンパク質の半減期を延長する、タンパク質をいう。従って、タンパク質は、循環からのクリアランスを促進する１つ以上の炭水化物構造の非存在によって実際に不完全グリコシル化され得るか、または１つ以上の炭水化物構造を修飾するかまたはマスクすることにより機能的に不完全グリコシル化され得る。例えば、構造は、（ｉ）マンノースレセプターもしくはアシアロ糖タンパク質レセプターによる構造の認識を妨害する１つ以上のさらなる部分（例えば、炭水化物基、リン酸基、アルキル基など）の添加によって、（ｉｉ）結合部分（例えば、レクチンまたはマンノースレセプターもしくはアシアロ糖タンパク質レセプターの細胞外部分）との糖タンパク質の共有結合もしくは非共有結合（これらのレセプターへの結合を、インビボで妨害する）によって、あるいは（ｉｉｉ）炭水化物構造の全体または一部分の存在をマスクすることにより血液からのそのクリアランスを低下する、糖タンパク質のポリペプチドまたは炭水化物部分への任意の他の修飾によって、マスクされ得る。
【００１８】
１つの実施形態において、治療的タンパク質は、ペプチド標的性部分（例えば、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、または標的レセプターに結合するために有効なその部分）を含み、この標的性部分は、従来の哺乳動物細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞）がするようにタンパク質をグリコシル化しない宿主（例えば、細菌または酵母）において産生される。例えば、宿主細胞によって産生されるタンパク質は、末端のマンノース残基、フコース残基および／もしくはＮ−アセチルグルコサミン残基（これらは、マンノースレセプターに識別される）を欠失してもよく、または完全に非グリコシル化されてもよい。別の実施形態において、哺乳動物細胞または他の宿主において産生され得る治療的タンパク質は、化学的または酵素的に処理され、１つ以上の炭水化物残基（例えば、１つ以上のマンノース残基、フコース残基および／もしくはＮ−アセチルグルコサミン残基）を除去するか、または１つ以上の炭水化物残基を修飾するかもしくはマスクする。このような修飾またはマスキングは、治療的タンパク質の肝性マンノースレセプターおよび／または肝性アシアロ糖タンパク質レセプターへの結合を低下し得る。別の実施形態において、１つ以上の潜在的グリコシル化部位は、標的化治療的タンパク質をコードする核酸の変異によって除去され、それにより、哺乳動物細胞またはタンパク質をグリコシル化する他の細胞において合成される場合に、タンパク質のグリコシル化を低下し得る。
【００１９】
（発明の詳細な説明）
本明細書中で使用され、他に特定しない場合、「グリコシル化非依存性リソソーム標的化」および「ＧＩＬＴ」とは、マンノース−６−リン酸非依存性であるリソソーム標的化をいう。
【００２０】
本明細書中で使用される場合、「ＧＩＬＴ構築物」とは、哺乳動物のリソソームにおいて有効な、マンノース−６−リン酸非依存性のリソソーム標的性部分および治療的部分を含む構築物をいう。
【００２１】
本明細書中で使用される場合、「ＧＵＳ」とは、β−グルクロニダーゼ（例示的な治療部分）をいう。
【００２２】
本明細書中で使用される場合、「ＧＵＳΔＣ１８」とは、Ｃ末端１８アミノ酸を欠失し、潜在的タンパク質分解部位を除去したＧＵＳをいう。
【００２３】
本明細書中で使用される場合、「ＧＵＳ−ＧＩＬＴ」とは、ＩＧＦ−ＩＩ標的性部分に連結されたＧＵＳを有するＧＩＬＴ構築物をいう。
【００２４】
ＩＧＦ−ＩＩ中のアミノ酸位置への全ての参照とは、成体ヒトＩＧＦ−ＩＩにおける位置をいう。従って、例えば、１位、２位および３位は、各々、アラニン、チロシンおよびアルギニンによって占められる。
【００２５】
本明細書中で使用される場合、ＧＩＬＴΔ１−７とは、Ｎ末端の７アミノ酸を欠失したＩＧＦ−ＩＩ標的性部分をいう。
【００２６】
本明細書中で使用される場合、ＧＵＳΔＣ１８−ＧＩＬＴΔ１−７とは、ＧＵＳΔＣ１８がＧＩＬＴΔ１−７のＮ末端に融合した融合タンパク質をいう。
【００２７】
本発明は、細胞の外に提供される場合に、この細胞に侵入して、標的化治療物が活性である亜細胞区画に局在する標的化治療物を提供することによって、代謝性疾患の処置を容易にする。この標的化治療物は、少なくとも治療剤および標的性部分（例えば、タンパク質の亜細胞標的性ドメイン）、または、リソソーム標的化のために、ヒトカチオン非依存性マンノース−６−リン酸レセプターに結合するための手段（例えば、タンパク質、ペプチド、ペプチドアナログまたは有機化学物質）を含む。
【００２８】
（治療剤と標的性部分との間の結合）
治療剤および標的性部分は、直接的または間接的に必ず結合される。１つの実施形態において、治療剤および標的性部分は、非共有結合される。この結合は、好ましくは、ｐＨ７．４または約ｐＨ７．４で安定である。例えば、標的性部分は、ビオチン化され得、そして、治療剤と結合したアビジンに結合する。あるいは、この標的性部分および治療剤は、各々、多量体タンパク質の異なるサブユニットに（例えば、融合タンパク質として）結合され得る。別の実施形態において、この標的性部分および治療剤は、（例えば、化学的架橋剤を使用して）互いに架橋される。
【００２９】
好ましい実施形態において、この治療剤は、融合タンパク質として、標的性部分に融合される。この標的性部分は、この融合タンパク質のアミノ末端、カルボキシ末端であり得るか、またはこの標的性部分の存在が、治療剤の治療活性を過度に干渉しない位置にて、治療剤の配列内に挿入され得る。
【００３０】
治療剤がヘテロマータンパク質である場合、サブユニットの１つ以上は、標的性部分に結合され得る。ヘキソサミニダーゼＡ（例えば、テイ−サックス病において作用されるリソソームタンパク質）は、αサブユニットおよびβサブユニットを含む。このαサブユニット、βサブユニット、またはこれらの両方は、本発明に従って、標的性部分に結合され得る。例えば、このαサブユニットが標的性部分に結合され、そして、βサブユニットと同時発現される場合、活性複合体は、適切に形成され、そして（例えば、リソソームに）標的化される。
【００３１】
治療物のリソソームへの標的化のために、治療剤は、ｐＨを、ｐＨ７．４またはｐＨ約７．４〜約５．５または約５．５に下げることにより崩壊される相互作用を介して、標的性部分に結合され得る。この標的性部分は、細胞の外部のレセプターに結合する；この選択されたレセプターは、エンドサイトーシスを受けそして、後期エンドソーム（これは、約５．５のｐＨを有する）を通るレセプターである。従って、後期エンドソームにおいて、治療剤は、標的性部分から解離して、そして、リソソームに向かい、ここで、治療剤が作用する。例えば、標的性部分は、金属イオン（例えば、ニッケル）に強固に結合するキレート剤（例えば、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡまたはトリニトリロトリ酢酸）を取り込むように、化学的に改変され得る。この標的性部分（例えば、ＧＵＳ）は、融合タンパク質として、６つのヒスチジンタグと共に（例えば、アミノ末端か、カルボキシ末端か、または、表面に接近可能な可撓性のあるループにおいて）発現され得る。ｐＨ７．４または約ｐＨ７．４で、この６つのヒスチジンタグは、実質的に脱プロトン化されて、金属イオン（例えば、ニッケル）に、高親和性で結合する。ｐＨ５．５または約ｐＨ５．５で、この６つのヒスチジンタグは、実質的にプロトン化されて、ニッケルの放出を導き、結果的に、標的性部分から治療剤を放出する。
【００３２】
（治療剤）
本発明の方法および組成物は、任意の治療剤を生成して、亜細胞区画に送達するために有用であるが、本発明は、代謝疾患を処置するための遺伝子産物を送達するために、特に有用である。
【００３３】
好ましいＬＳＤ遺伝子は、表１に示され、そして、ゴルジ欠損または小胞体欠損に関連する、好ましい遺伝子は表２に示される。好ましい実施形態において、野生型ＬＳＤ遺伝子産物は、同じＬＳＤ遺伝子の欠損に罹患する患者に送達される。代替の実施形態において、ＬＳＤ遺伝子の機能配列または種改変体が使用される。さらなる実施形態において、ＬＳＤ遺伝子欠損をレスキューし得る、異なる酵素をコードする遺伝子が、本発明の方法に従って使用される。
【００３４】
【表１−１】
0004828121.tif 000002
【００３５】
【表１−２】
0004828121.tif 000003
【００３６】
【表１−３】
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【００３７】
【表２】
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１つの特に好ましい治療剤は、ゴーシェ病のための効果的な酵素置換治療剤としてＧｅｎｚｙｍｅによって現在製造される、グルコセレブロシダーゼである。現在、その酵素は、曝露されたマンノース残基（これは、マクロファージ系列の細胞に、タンパク質を特異的に標的化する）によって調製される。１型ゴーシェ病患者の主な病理学は、グルコセレブロシドを蓄積するマクロファージに起因するが、他の細胞型に対してグルコセレブロシダーゼを送達することには治療効果が存在し得る。本発明を使用するリソソームへのグルコセレブロシダーゼの標的化は、複数の細胞型に対して薬剤を標的化し、そして他の調製物と比較して治療効果を有し得る。
【００３８】
別の好ましい治療剤は、ポーンプ病において欠乏するリソソームの酵素である、酸α−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）である（実施例１３Ｂの考察を参照のこと）。ポーンプ病は、酸マルタ―ゼ欠損（ＡＭＤ）、ＩＩ型グリコーゲン貯蔵疾患（ＧＳＤＩＩ）、ＩＩ型糖原病、またはＧＡＡ欠乏症としても公知であり、ＧＡＡの不十分な活性に起因する、リソソーム貯蔵疾患である。ＧＡＡは、マルトースおよび他の直鎖状オリゴ糖（グリコーゲンの外枝（ｏｕｔｅｒ  ｂｒａｎｃｈ）を含む）におけるα１〜α４連結を加水分解し、それにより、リソソームにおいて過剰なグリコーゲンを壊す酵素である（Ｈｉｒｓｃｈｈｏｒｎら（２００１）Ｔｈｅ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｓｃｒｉｖｅｒら編（２００１）ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐ．３３８９−３４２０）。酵素活性の減殺は、ＧＡＡをコードする遺伝子における種々のミスセンス変異またはナンセンス変異によって生じる。その結果、ポーンプ病の患者の全ての細胞のリソソームにおいて、グリコーゲンが蓄積する。特に、グリコーゲン蓄積は、心筋および骨格筋、肝臓、および他の組織のリソソームにおいて、最も顕著である。蓄積されたグリコーゲンは、最終的に筋肉機能を損なう。ポーンプ病の最も重篤な形態において、２歳になる前に、心臓呼吸不全によって死に至る。
【００３９】
目下、ポーンプ病を治癒させるかまたはその進行を遅延させることが可能な、認可された処置は存在しない。現在、臨床試験中の酵素置換治療は、筋肉組織および肝臓組織において、投与された組換えＧＡＡが細胞によって取り込まれ、これらの細胞内でリソソームに移動されることを必要とする。しかし、現在酵素置換治療に使用されている、操作ＣＨＯ細胞内およびトランスジェニックウサギの乳において産生される組換えＧＡＡは、非常に僅かなＭ６Ｐを含む（Ｖａｎ  Ｈｏｖｅら（１９９６）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，９３（１）：６５−７０；および米国特許第６，５３７，７８５号）。従って、組換えＧＡＡのリソソームへのＭ６Ｐ依存性送達は、効率的でなく、高用量かつ頻繁な注入を必要とする。対照的に、本発明は、実施例１３Ｂにより詳しく記載するように、リソソームに対するＧＡＡの患者のＭ６Ｐ非依存性標的化を可能にする。
【００４０】
（亜細胞標的化ドメイン）
本発明は、タンパク質、またはこのタンパク質の細胞レセプターに特異的に結合するタンパク質のアナログを使用して、リソソームに対する治療剤の標的化を可能にする。細胞表面の外部は、エンドソーム、リソソーム、ゴルジ、および小胞体区画と位相幾何学的に同等である。従って、適切なレセプターとの相互作用を介する分子のエンドサイトーシスは、膜を横切ることなくこれらの区画のいずれかへの分子の輸送を可能にする。遺伝欠損は、これらの区画のいずれかにおける特定の酵素活性の欠失を生じ、治療的タンパク質の送達は、適切なレセプターに対するリガンドとのこのタンパク質のタグ化によって達成され得る。
【００４１】
原形質膜からゴルジおよび／または小胞体に、レセプター結合タンパク質を指向させる複数の経路が特徴付けられている。従って、例えば、ＳＶ４０、コレラ毒素、または植物性リシン毒素（これらの各々は、これらの亜細胞輸送経路の１つ以上を選出する）由来の標的性部分を使用することによって、治療物は、細胞内の所望の位置に標的化され得る。各々の場合において、取りこみは、細胞の外側への物質の結合によって開始される。例えば、ＳＶ４０は、ＭＨＣクラスＩレセプターに結合し、コレラ毒素は、ＧＭ１ガングリオシド分子に結合し、そしてリシンは、細胞の表面上の、末端ガラクトースを有する糖脂質および糖タンパク質に結合する。この初期の工程に続いて、分子は種々の経路によってＥＲに達する。例えば、ＳＶ４０は、小胞エンドサイトーシスを起こし、そしてゴルジをバイパスする２段階のプロセスにおいてＥＲに達するのに対し、コレラ毒素は、小胞エンドサイトーシスを起こすが、ＥＲに達する前にゴルジを横切る。
【００４２】
コレラ毒素またはリシンに関連する標的性部分が使用される場合、コレラ毒素またはリシンの毒性が回避されることが重要である。コレラ毒素およびリシンの両方は、ヘテロマーのタンパク質であり、そしてその細胞表面結合ドメインおよび毒性を担う触媒活性は、別々のポリペプチド上に存在する。従って、レセプター結合ポリペプチドを含むが、毒性の原因であるポリペプチドは含まない、標的性部分が構築され得る。例えば、リシンの場合において、Ｂサブユニットは、タンパク質の内在化の原因であるガラクトース結合活性を有し、治療タンパク質と融合し得る。Ａサブユニットのさらなる存在が亜細胞局在を改善する場合、適切に折りたたまれるが触媒的に不活性であるＡ鎖の変異バージョン（ムテイン）は、Ｂサブユニット−治療剤融合タンパク質と共に提供され得る。
【００４３】
ゴルジに送達されたタンパク質は、ゴルジに逃げているＥＲ標的化タンパク質を回収するＫＤＥＬレセプターを介して小胞体（ＥＲ）に移送され得る。従って、治療的タンパク質をゴルジに配向する標的化ドメインの末端にＫＤＥＬモチーフを含ませることは、ＥＲへの引き続く局在化を可能にする。例えば、ｐＨ７．４または約ｐＨ７．４、およびｐＨ５．５または約ｐＨ５．５の両方で、カチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプターに結合する標的性部分（例えば、抗体、またはファージディスプレイ、酵母ツーハイブリッド、チップベース（ｃｈｉｐ−ｂａｓｅｄ）アッセイおよび溶液ベースアッセイのようなハイスループットスクリーニングによって同定されたペプチド）は、ゴルジに対する治療剤の標的化を可能にし；さらにＫＤＥＬモチーフの付加が、ＥＲに対する標的化を可能にする。
【００４４】
（リソソーム標的化部分）
本発明は、リソソームに対する治療剤の標的化を可能にする。標的化は、例えば、後にリソソームを通過する原形質膜レセプターの結合を介して起こり得る。あるいは、標的化は、後に後期（ｌａｔｅ）エンドソームを通過する原形質レセプターの結合を介して起こり得；ついで、治療剤は、後期エンドソームからリソソームへ移動し得る。好ましいリソソーム標的性機構は、カチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプターへの結合を含む。
【００４５】
（カチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプター）
カチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプターは、哺乳動物組織中で遍在的に発現される２７５ｋＤａの単鎖膜貫通糖タンパク質である。それは、Ｍ６Ｐに結合する２つの哺乳動物レセプターのうちの１つであり；２番目は、カチオン依存性Ｍ６Ｐレセプターと呼ばれる。このカチオン依存性Ｍ６Ｐレセプターは、Ｍ６Ｐ結合のために二価のカチオンを必要とするが；カチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプターは、必要としない。これらのレセプターは、リソソーム酵素上の高マンノース炭水化物におけるＭ６Ｐ部分の認識によって、リソソーム酵素の輸送に重要な役割を果たす。カチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプターの細胞外ドメインは、レセプター上の別個の位置に様々な群のリガンドに結合する１５個の相同ドメイン（「リピート」）を含む。
【００４６】
カチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプターは、Ｍ６Ｐのための２つの結合部位を含む：１つはリピート１〜３に位置し、そして他方は、リピート７〜９に位置する。このレセプターは、おそらくレセプターオリゴマー化に起因して、ｎＭ範囲の解離定数を有する二価のＭ６Ｐリガンドに結合したまま、μＭ範囲の解離定数を有する一価のＭ６Ｐリガンドに結合する。レセプターによるＩＧＦ−ＩＩの取りこみは、レセプターに対する、リソソーム酵素のような多価のＭ６Ｐリガンドの随伴性の結合によって増強される。
【００４７】
カチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプターはまた、少なくとも３つの別々のリガンドについての結合部位を含み、これは、標的性部分として使用され得る。カチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプターは、主に、リピート１１との相互作用を介して、ｐＨ７．４または約ｐＨ７．４で、約１４ｎＭの解離定数でＩＧＦ−ＩＩに結合する。リソソームへのＩＧＦ−ＩＩの標的化におけるその機能と一致して、解離定数は、ｐＨ５．５または約ｐＨ５．５で約１００倍に増加し、酸性後期エンドソームにおいてＩＧＦ−ＩＩの解離を促進する。このレセプターは、高分子量のＯ−グリコシル化ＩＧＦ−ＩＩ形態と結合し得る。
【００４８】
カチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプターのためにさらに有用なリガンドは、レチノイン酸である。レチノイン酸は、２．５ｎＭの解離定数でレセプターに結合する。カチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプターの、レチノイン酸との親和性光標識は、レセプターへのＩＧＦ−ＩＩの結合もＭ６Ｐの結合も妨害せず、レチノイン酸が、レセプター上の別々の部位に結合することを示す。レチノイン酸のレセプターへの結合は、細胞質小胞中のレセプターのより大きい蓄積を有するレセプターの細胞内分布を変更し、また、Ｍ６Ｐ修飾β−グルクロニダーゼの取りこみを増強する。レチノイン酸は、カチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプターに結合するその能力を妨害することなく、治療剤に結合するために使用され得る光活性化可能部分を有する。
【００４９】
このカチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプターはまた、９μＭの解離定数でウロキナーゼ型プラスミノーゲンレセプター（ｕＰＡＲ）に結合する。ｕＰＡＲは、ほとんどの細胞型の表面上のＧＰＩ−アンカーレセプターであり、ここで接着分子として、ならびにプラスミノーゲンおよびＴＧＦ−βのタンパク分解性活性化において機能する。ｕＰＡＲのＣＩ−Ｍ６Ｐレセプターへの結合は、ｕＰＡＲレセプターをリソソームに標的化し、それによって、その活性を改変する。従って、カチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプターに結合し得るｕＰＡＲの細胞外ドメインまたはその一部の治療剤への融合は、リソソームに対する薬剤の標的化を可能にする。
【００５０】
（ＩＧＦ−ＩＩ）
好ましい実施形態において、リソソーム標的性部分は、タンパク質、ペプチド、またはマンノース−６−ホスフェート−非依存性様式で、カチオン非依存性Ｍ６Ｐ／ＩＧＦ−ＩＩレセプターに結合する他の部分である。有利なことに、この実施形態は、ＬＳＤタンパク質の取りこみについての通常の生物学的機構を模倣するが、マンノース−６−ホスフェートに依存しない様式でこれを行なう。
【００５１】
例えば、成熟ＩＧＦ−ＩＩポリペプチドをコードするＤＮＡを、ＬＳＤ遺伝子カセットの３’末端に融合することによって、種々の細胞型によって取り込まれ得リソソームに輸送され得る融合タンパク質が、作製される。あるいは、前駆体ＩＧＦ−ＩＩポリペプチドをコードするＤＮＡが、ＬＳＤ遺伝子カセットの３’末端に融合され得る；前駆体は、哺乳動物細胞において切断されて成熟ＩＧＦ−ＩＩポリペプチドを生じるカルボキシ末端部分を含むが、ＩＧＦ−ＩＩシグナルペプチドは、好ましくは省略される（またはＬＳＤ遺伝子カセットの５’末端に移動される）。この方法は、一旦タンパク質が単離されると、さらなる改変がなされる必要がないので、単純さおよびコスト効率を含め、グリコシル化を含む方法よりも多くの利点を有する。
【００５２】
ＩＧＦ−ＩＩは、好ましくは、Ｍ６Ｐレセプターに特異的に標的化される。高い親和性でＭ６Ｐレセプターに結合するタンパク質を生じるが、感知可能な親和性で他の２つのレセプターにはもはや結合しないＩＧＦ−ＩＩポリペプチドにおける変異が、特に有用である。ＩＧＦ−ＩＩはまた、ＩＧＦ−ＩＩ／ＧＩＬＴ構築物の隔離を避けるために、血清ＩＧＦ−結合タンパク質への結合を最小化するように改変され得る（Ｂａｘｔｅｒ（２０００）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ．２７８（６）：９６７−７６）。多くの研究によって、ＩＧＦ−結合タンパク質に結合するために必要なＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ中の残基が特定された。これらの残基での変異を有する構築物は、Ｍ６Ｐ／ＩＧＦ−ＩＩレセプターへの高親和性結合の保持について、およびＩＧＦ−結合タンパク質に対する親和性の減少についてスクリーニングされ得る。例えば、ＩＧＦ−ＩＩのＰＨＥ２６の、ＳＥＲでの置換は、Ｍ６Ｐ／ＩＧＦ−ＩＩレセプターへの結合に影響を及ぼさずに、ＩＧＦＢＰ−１およびＩＧＦＢＰ−６についてのＩＧＦ−ＩＩの親和性を減少させることが報告されている（Ｂａｃｈら（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８（１３）：９２４６−５４）。ＰＨＥ１９からＳＥＲへ、およびＧＬＵ９からＬＹＳへのような他の置換もまた、有利であり得る。類似の変異は、ＩＧＦ−ＩＩと共に高度に保存されたＩＧＦ−Ｉ中の領域において、別々に、または組み合わせて、ＩＧＦ−ＢＰ結合における大きな減少を生じる（Ｍａｇｅｅら（１９９９）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３８（４８）：１５８６３−７０）。
【００５３】
代替的なアプローチは、Ｍ６Ｐ／ＩＧＦ−ＩＩレセプターに高親和性で結合し得るＩＧＦ−ＩＩの最小領域を同定することである。Ｍ６Ｐ／ＩＧＦ−ＩＩレセプターに結合するＩＧＦ−ＩＩに関与する残基は、ほとんどがＩＧＦ−ＩＩの１つの面でクラスター形成する（Ｔａｒａｓａｗａら（１９９４）ＥＭＢＯ  Ｊ．１３（２３）：５５９０−７）。ＩＧＦ−ＩＩの３次構造は、通常、３つの分子内ジスルフィド結合によって維持されるが、ＩＧＦ−ＩＩの表面に結合するＭ６Ｐ／ＩＧＦ−ＩＩレセプター上のアミノ酸配列を取りこむペプチドは、適切に折りたたみ、そして結合活性を有するように設計され得る。このような最小結合ペプチドは、高度に好ましい標的性部分である。アミノ酸４８〜５５周辺の領域に基づいて設計されたペプチドは、Ｍ６Ｐ／ＩＧＦ−ＩＩレセプターに対する結合について試験され得る。あるいは、ペプチドのランダムライブラリーは、酵母ツーハイブリッドアッセイを介するか、またはファージディスプレイ型アッセイを介するかのいずれかで、Ｍ６Ｐ／ＩＧＦ−ＩＩレセプターに結合する能力についてスクリーニングされ得る。
【００５４】
（血液脳関門）
リソソーム蓄積症のための治療における１つの挑戦は、これらの疾患の多くが、有意な神経学的関与を有していることである。血流に投与される治療酵素は、一般的に血液脳関門を横切らず、従って、この疾患と関連する神経学的症状を軽減し得ない。しかし、ＩＧＦ−ＩＩは、トランスサイトーシスを介して血液脳関門を横切る輸送を促進することが報告されている（Ｂｉｃｋｅｌら（２００１）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．４６（１−３）：２４７−７９）。従って、適切に設計されたＧＩＬＴ構築物は、血液脳関門を横切ることが可能であるべきであり、リソソーム蓄積症と関連する神経学的症状を処置する手段を初めて提供する。この構築物は、実施例１２に記載されるようにＧＵＳマイナスマウスを使用して試験され得る。血液から神経組織に達し得る標的化された治療剤の設計、構築物および試験に関するさらなる詳細は、米国特許第６０／３２９，６５０号（２００１年１０月１６日出願）および米国特許第１０／１３６，６３９号（２００２年４月３０日出願）に開示される。
【００５５】
（ＩＧＦ−ＩＩの構造）
ＩＧＦ−ＩＩのＮＭＲ構造は、２つのグループによって解明されている（Ｔｅｒａｓａｗａら（１９９４）ＥＭＢＯ  Ｊ．１３（２３）：５５９０−７；Ｔｏｒｒｅｓら（１９９５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４８（２）：３８５−４０１）（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ記録１ＩＧＬを参照のこと）。ＩＧＦ−ＩＩ構造の一般的な特徴は、ＩＧＦ−Ｉおよびインスリンと類似である。ＩＧＦ−ＩＩのＡドメインおよびＢドメインは、インスリンのＡ鎖およびＢ鎖に対応する。２次構造特徴は、残基２６〜２８中の短いβ鎖へと残基２２〜２５の逆行ターンによって接続される、Ｂ領域の残基１１〜２１からのαヘリックスを含む。残基２５〜２７は、小さい逆平行βシートを形成するようであり；残基５９〜６１および残基２６〜２８はまた、分子間βシート形成に関与し得る。ＩＧＦ−ＩＩのＡドメインにおいて、αヘリックスは、Ｂ−ドメインヘリックスと垂直な逆平行立体配置に配置される残基４２〜４９および５３〜５９におよぶ。３つのジスルフィド架橋のうちの２つおよび保存された疎水性残基によって形成される疎水性クラスターは、これらの２次構造特徴を安定化する。Ｎ末端およびＣ末端は、残基３１〜４０の間の領域として不充分に規定されたままである。
【００５６】
ＩＧＦ−ＩＩは、比較的高い親和性でＩＧＦ−ＩＩ／Ｍ６ＰおよびＩＧＦ−Ｉレセプターに結合し、そしてインスリンレセプターへはより低い親和性で結合する。ＩＧＦ−ＩＩはまた、多くの血清ＩＧＦＢＰと相互作用する。
【００５７】
（ＩＧＦ−ＩＩ／Ｍ６Ｐレセプターへの結合）
ＩＧＦ−ＩＩの残基４８〜５０（Ｐｈｅ  Ａｒｇ  Ｓｅｒ）の、インスリン由来の対応する残基（Ｔｈｒ  Ｓｅｒ  Ｉｌｅ）での置換、または残基５４〜５５（Ａｌａ  Ｌｅｕ）の、ＩＧＦ−Ｉ由来の対応する残基（Ａｒｇ  Ａｒｇ）での置換は、ＩＧＦ−ＩＩ／Ｍ６Ｐレセプターへの結合の減少を生じるが、ＩＧＦ−Ｉおよびインスリンレセプターへの結合は保持する（Ｓａｋａｎｏら（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６（３１）：２０６２６−３５）。
【００５８】
ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩは、残基４８〜５０の領域における同一の配列および構造を共有するが、ＩＧＦ−ＩＩレセプターについての親和性においては１０００倍もの差異を有する。このＮＭＲ構造は、ＩＧＦ−ＩＩの残基５３〜５８（ＩＧＦ−Ｉの残基５４〜５９）の領域におけるＩＧＦ−ＩとＩＧＦ−ＩＩとの間の構造的差異を表し：このαヘリックスは、ＩＧＦ−ＩにおいてよりもＩＧＦ−ＩＩにおいてよりよく規定され、そしてＩＧＦ−Ｉとは異なり、残基５３と５４の周りの骨格に曲がりが存在しない（Ｔｏｒｒｅｓら（１９９５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４８（２）：３８５−４０１）。この構造的差異は、ＩＧＦ−ＩＩにおけるＡｌａ５４およびＬｅｕ５５の、ＩＧＦ−ＩにおけるＡｒｇ５５とＡｒｇ５６での置換と相関する。ＩＧＦ−ＩＩレセプターへの結合が、この領域における荷電した残基の存在によって直接的に破壊されること、または荷電した残基によって引き起こされる構造中の変化が、ＩＧＦ−ＩＩレセプターに対する結合における変化を生じることのいずれかが可能である。いずれの場合においても、ＩＧＦ−Ｉ中の２つのＡｒｇ残基の非荷電残基での置換は、ＩＧＦ−ＩＩレセプターについてのより高い親和性を生じた（Ｃａｃｃｉａｒｉら（１９８７）Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｉａｎ  １４（３）：１４６−５３）。従って、これらの位置における正に荷電した残基の存在は、ＩＧＦ−ＩＩレセプターへの結合の喪失と関連する。
【００５９】
ＩＧＦ−ＩＩは、カチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプターのリピート１１に結合する。実際に、リピート１１のみがカチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプターの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインに融合されるミニレセプターは、（全長レセプターの約１０分の１の親和性で）ＩＧＦ−ＩＩに結合し得、かつＩＧＦ−ＩＩの内在化およびリソソームへのその送達を媒介し得る（Ｇｒｉｍｍｅら（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５（４３）：３３６９７−３３７０３）。Ｍ６Ｐレセプターのドメイン１１の構造は公知である（タンパク質データベース登録番号１ＧＰ０および１ＧＰ３；Ｂｒｏｗｎら（２００２）ＥＭＢＯ  Ｊ．２１（５）：１０５４−１０６２）。この推定ＩＧＦ−ＩＩ結合部位は、ＩＧＦ−ＩＩの疎水性アミノ酸と相互作用すると考えられる疎水性ポケットであり；ＩＧＦ−ＩＩの候補アミノ酸としては、ロイシン８、フェニルアラニン４８、アラニン５４、およびロイシン５５が挙げられる。リピート１１は、ＩＧＦ−ＩＩ結合には十分であるが、構築物は、カチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプターのより大きい部分（例えば、リピート１０〜１３、または１〜１５）を含み、一般的により大きい親和性で、および増加されたｐＨ依存性でＩＧＦ−ＩＩに結合する（例えば、Ｌｉｎｎｅｌｌら（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（２６）：２３９８６−２３９９１を参照のこと）。
【００６０】
（ＩＧＦ−Ｉレセプターへの結合）
ＩＧＦ−ＩＩの残基Ｔｙｒ２７のＬｅｕでの置換、Ｌｅｕ４３のＶａｌでの置換またはＳｅｒ２６のＰｈｅでの置換は、ＩＧＦ−Ｉレセプターに対するＩＧＦ−ＩＩの親和性を、それぞれ９４倍、５６倍、および４倍、低下させる（Ｔｏｒｒｅｓら（１９９５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４８（２）：３８５−４０１）。ヒトＩＧＦ−ＩＩの残基１〜７の欠失は、ヒトＩＧＦ−Ｉレセプターに対する親和性において３０倍の低下を生じ、そしてラットＩＧＦ−ＩＩレセプターに対する親和性において随伴性の１２倍の上昇を生じた（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏら（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０（３０）：１８０１３−８）。ＩＧＦ−ＩＩのＮＭＲ構造は、Ｔｈｒ７が、残基４８Ｐｈｅおよび５０Ｓｅｒの近く、ならびに９Ｃｙｓ−４７Ｃｙｓジスルフィド架橋の近くに位置することを示す。これらの残基とのＴｈｒ７の相互作用は、ＩＧＦ−Ｉレセプター結合に必要な可撓性のＮ−末端ヘキサペプチドを安定化し得ることが考えられる（Ｔｅｒａｓａｗａら（１９９４）ＥＭＢＯ  Ｊ．１３（２３）５５９０−７）。同時に、この相互作用は、ＩＧＦ−ＩＩレセプターへの結合を調節し得る。ＩＧＦ−ＩＩのＣ末端（残基６２〜６７）の短縮はまた、ＩＧＦ−Ｉレセプターに対するＩＧＦ−ＩＩの親和性を５倍低くするようである（Ｒｏｔｈら（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１８１（２）：９０７−１４）。
【００６１】
（ＩＧＦ−ＩＩの欠失変異）
ＩＧＦ−Ｉおよびカチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプターに対する結合表面は、ＩＧＦ−ＩＩの別々の面にある。構造データおよび変異データに基づいて、ヒトＩＧＦ−ＩＩよりも実質的に小さい機能性カチオン非依存性Ｍ６Ｐ結合ドメインが、構築され得る。例えば、アミノ末端アミノ酸１〜７および／またはカルボキシ末端残基６２〜６７は、欠失または置換され得る。さらに、アミノ酸２９〜４０は、ポリペプチドの残りの部分の折りたたみまたはカチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプターへの結合を変更することなく除去または置換されるようであり得る。従って、アミノ酸８〜２８および４１〜６１を含む標的性部分が、構築され得る。アミノ酸のこれらのストレッチは、おそらく直接的に結合され得るかまたはリンカーによって分離され得る。あるいは、アミノ酸８〜２８および４１〜６１は、別々のポリペプチド鎖上に提供され得る。ＩＧＦ−ＩＩと相同であり、そしてＩＧＦ−ＩＩの構造に近い３次構造を有するインスリンの匹敵するドメインは、別々のポリペプチド鎖に存在する場合でさえ、適切な３次構造への適切な再折りたたみを可能にする十分な構造情報を有する（Ｗａｎｇら（１９９１）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２７９−２８１）。従って、例えば、アミノ酸８〜２８、またはその保存的置換改変体は、治療剤に融合され得；生じる融合タンパク質は、アミノ酸４１〜６１またはその保存的置換改変体と混合され得、そして患者に投与され得る。
【００６２】
（ＩＧＦ結合タンパク質への結合）
ＩＧＦ−ＩＩおよび関連する構築物は、ＩＧＦＢＰに対する親和性を低下するように改変され得、それによって、タグ化タンパク質のバイオアベイラビリティーを増加する。
【００６３】
ＩＧＦ−ＩＩの残基フェニルアラニン２６のセリンでの置換は、ＩＧＦＢＰ１〜５への結合を、１／５〜１／７５に減少させる（Ｂａｃｈら（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８（１３）：９２４６−５４）。ＩＧＦ−ＩＩの残基４８〜５０のスレオニン−セリン−イソロイシンでの置換は、ＩＧＦＢＰの大分部への結合を１／１００未満に減少させる（Ｂａｃｈら（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８（１３）：９２４６−５４）；しかし、これらの残基はまた、カチオン非依存性マンノース−６−ホスフェートレセプターへの結合に重要である。ＩＧＦ−Ｉレセプターへの結合を破壊するＹ２７Ｌ置換は、ＩＧＦＢＰ３および酸不安定性サブユニットを有する３次複合体の形成を妨害する（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏら（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（４４）：２７９３６−４２）；この３次複合体は、循環におけるＩＧＦ−ＩＩの大部分を占める（Ｙｕら（１９９９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ  Ａｎａｌ．１３（４）：１６６−７２）。ＩＧＦ−ＩＩの始めの６残基の欠失はまた、ＩＧＦＢＰ結合を妨害する（Ｌｕｔｈｉら（１９９２）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０５（２）：４８３−９０）。
【００６４】
ＩＧＦ−ＩのＩＧＦＢＰとの相互作用の研究は、さらに、フェニルアラニン１６のセリンでの置換が、２次構造に影響を及ぼさないがＩＧＦＢＰ結合を１／４０〜１／３００倍の間、減少させることを明らかにした（Ｍａｇｅｅら（１９９９）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３８（４８）：１５８６３−７０）。グルタミン酸９の、リジンへの変化はまた、ＩＧＦＢＰ結合に有意な減少を生じた。さらに、リジン９／セリン１６の２重変異は、ＩＧＦＢＰに対する最も低い親和性を示した。これらの変異体は、ＩＧＦ−ＩＩにおいて以前に試験されていないが、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩのこの領域間の配列の保存は、類似の変異（グルタミン酸１２リジン／フェニルアラニン１９セリン）がＩＧＦ−ＩＩ中に作製される場合に類似の効果が観察されることを示唆する。
【００６５】
（ＩＧＦ−ＩＩホモログ）
ヒトＩＧＦ−ＩＩのアミノ酸配列またはカチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプターへの結合に作用するその一部分は、候補配列が本発明の方法において妥当な成功見込みを有するに十分なアミノ酸類似性を有するか否かを決定するための参照配列として使用され得る。好ましくは、改変体配列は、ヒトＩＧＦ−ＩＩに対して、少なくとも７０％類似または６０％同一であり、より好ましくは、少なくとも７５％類似または６５％同一であり、そして最も好ましくは、８０％類似または７０％同一である。
【００６６】
候補ペプチド領域がヒトＩＧＦ−ＩＩに対して必要な百分率の類似性または同一性を有するか否かを決定するために、この候補アミノ酸配列およびヒトＩＧＦ−ＩＩは、まず、ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ（１９９２）ＰＮＡＳ  ８９：１０９１５〜１０９１９の図２に記載されるＢＬＯＳＵＭ６２置換行列と組み合わせた、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５〜１９７に記載される動的プログラミングアルゴリズムを用いて整列される。本発明について、ギャップ挿入ペナルティーに対する適切な値は−１２であり、そしてギャップ伸長ペナルティーに対する適切な値は−４である。Ｓｍｉｔｈ−ＷａｔｅｒｍａｎのアルゴリズムおよびＢＬＯＳＵＭ６２行列を使用する整列を実施するコンピュータプログラム（例えば、ＧＣＧプログラム一式（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ））は、市販されており、そして当業者によって広範に使用されている。
【００６７】
一旦、候補配列と参照配列との間のアラインメントが作製されると、類似性スコアパーセントが計算され得る。各々の配列の個々のアミノ酸は、互いに対するそれらの類似性に従って順次比較される。２つの整列されたアミノ酸に対応するＢＬＯＳＵＭ６２行列における値が、ゼロまたは負の数である場合、このペアワイズ類似性スコアはゼロであるか；そうでなければ、このペアワイズ類似性スコアは１．０である。未処理の類似性スコアは、整列されたアミノ酸のペアワイズ類似性スコアの合計である。次いで、未処理のスコアは、これを候補配列または参照配列のより小さい方におけるアミノ酸の数で割ることによって正規化される。この正規化された未処理のスコアは、類似性パーセントである。あるいは、同一性パーセントを計算するために、各々の配列の整列されたアミノ酸は、再び順次比較される。アミノ酸が同一でない場合、ペアワイズ同一性スコアはゼロであるか；そうでなければ、ペアワイズ同一性スコアは１．０である。未処理の同一性スコアは、同一の整列アミノ酸の合計である。次いで、未処理のスコアは、これを候補配列または参照配列のより小さい方におけるアミノ酸の数で割ることによって正規化される。この正規化された未処理のスコアは、同一性パーセントである。挿入および欠失は、類似性パーセントおよび同一性パーセントを計算する目的で無視される。従って、ギャップペナルティーは、この計算において使用されないが、これらは、最初のアラインメントにおいて使用される。
【００６８】
（ＩＧＦ−ＩＩ構造アナログ）
ヒトＩＧＦ−ＩＩおよびカチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプターの既知の構造は、米国特許第６，２２６，６０３号および同第６，２７３，５９８号で考察されるようなコンピュータ支援設計原理を用いた、ＩＧＦ−ＩＩアナログおよび他のカチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプター結合タンパク質の設計を可能にする。例えば、ＩＧＦ−ＩＩの既知の原子座標は、従来のコンピュータモデリングプログラム（例えば、Ｂｉｏｓｙｍ，Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．から市販されるＩＮＳＩＧＨＴＩＩ、ＤＩＳＣＯＶＥＲ、もしくはＤＥＬＰＨＩ、またはＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．から市販されるＱＵＡＮＴＡもしくはＣＨＡＲＭＭ）を備えたコンピュータへ提供され得る。これらおよび他のソフトウェアプログラムは、分子構造の解析ならびに構造および分子間相互作用に対する分子的変化の効果を推定するシミュレーションを可能にする。例えば、このソフトウェアは、標的レセプターに対するアナログの親和性を改善する、さらなる分子間の水素結合またはイオン結合を形成する能力を有する改変されたアナログを同定するために使用され得る。
【００６９】
ソフトウェアはまた、ＩＧＦ−ＩＩのカチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプター結合面の表面の少なくとも一部に示される同一の特徴を模倣する構造的特徴および化学的特徴を有するペプチドおよび有機分子の設計を可能にする。レセプター結合表面への主な寄与は、レセプター結合表面をともに規定するアミノ酸の側鎖内に存在する化学的に相互作用性の部分の空間的配置であるので、本発明の好ましい実施形態は、ＩＧＦ−ＩＩのカチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプター結合面を構成するアミノ酸側鎖に対して配置された化学的部分の空間的関係を模倣する空間的関係において化学的に相互作用性の部分を保有するフレームワークを有する合成有機分子を設計および作製することに関する。好ましい化学的部分としては、ＩＧＦ−ＩＩのカチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプター結合面を構成するアミノ酸のアミノ酸側鎖によって規定される化学的部分が挙げられるが、これらに限定されない。従って、ＩＧＦ−ＩＩアナログのレセプター結合表面は、そこに配置されたアミノ酸残基を含む必要はないが、化学部分を含む必要があることが理解される。
【００７０】
例えば、関連する化学基の同定の際、従来のコンピュータプログラムを使用する当業者は、適切なキャリアフレームワーク上に配置されたレセプター相互作用性化学部分を有する低分子を設計し得る。有用なコンピュータプログラムは、例えば、Ｄｉｘｏｎ（１９９２）Ｔｉｂｔｅｃｈ  １０：３５７〜３６３；Ｔｓｃｈｉｎｋｅら（１９９３）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３６：３８６３〜３８７０；およびＥｉｓｅｎら（１９９４）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １９：１９９〜２２１（これらの開示は、本明細書中に参考として援用される）に記載されている。
【００７１】
「ＣＡＶＥＡＴ」という名の１つの特定のコンピュータプログラムは、化学部分の望ましい空間的配向を有する構造について、データベース（例えば、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｄａｔａｂａｓｅ）を検索する（Ｂａｒｔｌｅｔｔら（１９８９）「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ：Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｐｒｏｂｌｅｍｓ」（Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｓ．Ｍ．編）１８２〜１９６頁）。このＣＡＶＥＡＴプログラムは、テンダミスタット（ｔｅｎｄａｍｉｓｔａｔ）（α−アミラーゼの７４残基のインヒビター）の三次元構造における選択されたアミノ酸側鎖の配向に基づいて、テンダミスタットのアナログを設計するために使用されている（Ｂａｒｔｌｅｔｔら（１９８９）前出）。
【００７２】
あるいは、ＩＧＦ−ＩＩのカチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプター結合活性を模倣する一連のアナログの同定の際、当業者は、当業者が定量的構造活性関係（ＱＳＡＲ）を開発するのを支援し、そしてさらなるモルフォゲンアナログのデノボ設計をさらに支援する、種々のコンピュータプログラムを使用し得る。他の有用なコンピュータプログラムは、例えば、Ｃｏｎｎｏｌｌｙ−Ｍａｒｔｉｎ（１９９１）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２０３：５８７〜６１３；Ｄｉｘｏｎ（１９９２）前出；およびＷａｓｚｋｏｗｙｃｚら（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｎｍ．３７：３９９４〜４００２に記載されている。
【００７３】
（標的性部分の親和性）
好ましい標的性部分は、それらの標的レセプターに対してマイクロモル濃度未満の解離定数で結合する。一般的には、より低い解離定数（例えば、１０−７Ｍ未満、１０−８Ｍ未満、または１０−９Ｍ未満）が、ますます好ましい。解離定数の決定は、好ましくは、Ｌｉｎｎｅｌｌら（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（２６）：２３９８６〜２３９９１に記載されるように表面プラズモン共鳴によって決定される。標的レセプターの細胞外ドメインの可溶性形態（例えば、カチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプターのリピート１〜１５）が作製され、そしてアビジン−ビオチン相互作用を介してチップに固定化される。この標的性部分を、チップ上に通過させ、そしてチップ表面に関する質量の変化を測定することによって、速度定数および平衡定数が検出および計算される。
【００７４】
（核酸および発現系）
キメラ融合タンパク質は、インビトロの翻訳系およびインタクトな細胞を含む種々の発現系において発現され得る。Ｍ６Ｐの改変は、標的化のために必須ではないので、タンパク質をグリコシル化しない種々の発現系（酵母系、バキュロウイルス系および原核生物系（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）でさえも含む）は、標的化治療的タンパク質の発現に適切である。実際に、グリコシル化タンパク質は、肝臓の洞様毛細血管内皮におけるマンノースレセプターに対する結合を介して循環から迅速に除去されるので、非グリコシル化タンパク質は、一般的に、改善されたバイオアベイラビリティーを有する。
【００７５】
あるいは、哺乳類細胞発現系におけるキメラ標的化リソソーム酵素の生成は、カチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプターに対する複数の結合決定基を有するタンパク質を生成する。２つ以上のカチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプターリガンド（例えば、Ｍ６ＰおよびＩＧＦ−ＩＩ、またはＭ６Ｐおよびレチノイン酸）間の相乗作用が、利用され得る：多価リガンドは、レセプター架橋によってレセプターに対する結合を増強することが示されている。
【００７６】
一般的には、キメラ治療的タンパク質をコードする遺伝子カセットは、プロモーター、リボソーム結合部位、イントロン、またはコドン使用頻度を最適化するためのコード配列における変更を含む最適な発現のために必要な配列を組込むために、特定の発現系に対して作製され得る。このタンパク質は、好ましくは、産生細胞から分泌されるので、発現系と適合性のシグナルペプチドをコードするＤＮＡは、内因性シグナルペプチドに対して置換され得る。例えば、ＬｅｉｓｈｍａｎｉａにおいてＩＧＦ−ＩＩでタグ化されたβ−グルクロニダーゼおよびα−ガラクトシダーゼＡの発現について、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａシグナルペプチド（ＧＰ６３またはＳＡＰ）をコードするＤＮＡカセットは、最適な発現を達成するために内因性シグナルペプチドをコードするＤＮＡの代わりに挿入される。哺乳類発現系において、内因性シグナルペプチドが利用され得るが、ＩＧＦ−ＩＩタグがコード配列の５’末端で融合される場合、ＩＧＦ−ＩＩシグナルペプチドを使用することが所望され得る。
【００７７】
ＣＨＯ細胞は、治療的タンパク質の生成のために好ましい哺乳類宿主である。ＣＨＯ細胞からの高収率な発現を達成するための伝統的な方法は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）を欠損するＣＨＯ細胞株（例えば、ＣＨＯ株ＤＵＫＸ（Ｏ’Ｄｅｌｌら（１９９８）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．３０（７）：７６７〜７１））を使用することである。ＣＨＯ細胞のこの株は、増殖のためにヒポキサンチンおよびチミジンを必要とする。別個のプラスミドに対してかまたは単一のプラスミドでの、ＤＨＦＲ遺伝子カセットで過剰発現される遺伝子の同時トランスフェクションは、ＤＨＦＲ遺伝子についての選択を可能にし、そして一般的に、選択した組換えタンパク質もまた発現するクローンの単離を可能にする。例えば、プラスミドｐｃＤＮＡ３は、目的の遺伝子の発現を駆動するためのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期領域調節性領域プロモーターおよびＤＨＦＲの発現を促進するためのｐＳＶ２ＤＨＦＲを用いる。組換え遺伝子カセットを有する細胞の、漸増濃度の葉酸アナログメトトレキサートに対する引き続いての曝露は、ＤＨＦＲ遺伝子および同時トランスフェクトされた遺伝子の両方の遺伝子のコピー数の増幅をもたらす。
【００７８】
この系における真核生物発現についての好ましいプラスミドは、ＣＭＶのような強力なプロモーターの下流に配置された目的の遺伝子を含む。イントロンは、遺伝子カセットの３’側（ｆｌａｎｋ）に配置され得る。ＤＨＦＲカセットは、同一のプラスミド由来かまたは別個のプラスミド由来の第２のプロモーターによって駆動され得る。さらに、これは、プラスミド中にさらなる選択マーカー（例えば、Ｇ４１８に対する耐性を与えるネオマイシンホスホトランスフェラーゼ）を組込むために有用であり得る。
【００７９】
別のＣＨＯ発現系（Ｕｌｍａｓｏｖら（２０００）ＰＮＡＳ  ９７（２６）：１４２１２−１４２１７）は、上述のＤＨＦＲ／メトトレキサート系の代わりにＧ４１８を用いた目的の遺伝子の増幅に依存する。弱いプロモーターによって駆動される僅かにネオマイシンホスホトランスフェラーゼ欠損のｐＣＸＮベクター（例えば、Ｎｉｗａら（１９９１）Ｇｅｎｅ  １０８：１９３−２００を参照のこと）は、１工程で高コピー数（＞３００）の形質移入体についての選択を可能にする。
【００８０】
あるいは、組換えタンパク質は、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）複製系に基づく発現系を用いて、ヒトＨＥＫ２９３細胞株中で生成され得る。これは、ＥＢＶ複製起点ｏｒｉＰおよびＥＢＶ  ｏｒｉ結合タンパク質ＥＢＮＡ−１から構成される。ｏｒｉＰに対するＥＢＮＡ−１の結合は、染色体外プラスミドの複製および引き続く増幅を惹起する。この増幅は次に、プラスミド内に収容された遺伝子カセットの高レベルの発現をもたらす。ｏｒｉＰを含むプラスミドは、ＥＢＮＡ−１形質転換ＨＥＫ２９３細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから市販）中にトランスフェクトされ得るか、または代替的に、ＥＢＮＡ−１の発現を駆動し、そしてＥＢＶ  ｏｒｉＰを含むプラスミド（例えば、ｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから市販））が利用され得る。
【００８１】
Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、治療的タンパク質は、好ましくは、細胞周辺腔中に分泌される。これは、細菌性シグナルペプチド（例えば、ｏｍｐＡシグナル配列）をコードする核酸カセットで、ＬＳＤタンパク質の内因性シグナルペプチドをコードするＤＮＡを置換することによって達成され得る。発現は、任意の多くの強力な誘導性プロモーター（例えば、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、またはｔａｃプロモーター）のいずれかによって駆動され得る。１つの適切なベクターは、ｐＢＡＤ／ｇＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから市販）であり、これは、Ｇｅｎｅ  ＩＩＩシグナルペプチドおよびａｒａＢＡＤプロモーターを使用する。
【００８２】
（インビトロでのリフォールディング）
１つの有用なＩＧＦ−ＩＩ標的性部分は、３つの分子内ジスルフィド結合を有する。Ｅ．ｃｏｌｉにおいてＧＩＬＴ融合タンパク質（例えば、ＧＵＳ−ＧＩＬＴ）が、構築され得、これは、細胞膜周辺腔へタンパク質を指向する。別のタンパク質のＣ末端に融合される場合、ＩＧＦ−ＩＩは、Ｅ．ｃｏｌｉの周辺質において活性な形態で分泌され得る（Ｗａｄｅｎｓｔｅｎら（１９９１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３（３）：４１２〜２１）。ＩＧＦ−ＩＩ部分の最適なフォールディングを促進するために、適切な濃度の還元型および酸化型グルタチオンが、好ましくは、細胞性環境にジスルフィド結合形成を促進するために添加される。ジスルフィド結合を有する融合タンパク質が不完全に可溶性である場合、任意の不溶性物質は、好ましくは、変性したタンパク質を可溶化するためのカオトロピック剤（例えば、尿素）で処理され、そして適切なジスルフィド結合の形成を促進するために、適切な濃度の還元型および酸化型グルタチオン、または他の酸化剤および還元剤を有する緩衝液中でリフォールドされる（Ｓｍｉｔｈら（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４（１６）：９３１４〜２１）。例えば、ＩＧＦ−Ｉは、ＩＧＦ−ＩＩの変性および還元のための６Ｍグアニジン−ＨＣｌおよび０．１Ｍ  ｔｒｉｓ（２−カルボキシエチル）ホスフィン還元剤を用いてリフォールドされている（Ｙａｎｇら（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４（５３）：３７５９８〜６０４）。タンパク質のリフォールディングは、１ｍＭ酸化型グルタチオン、１０ｍＭ還元型グルタチオン、０．２Ｍ  ＫＣｌおよび１ｍＭ  ＥＤＴＡを含有する０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．７）中で達成された。
【００８３】
（不完全グリコシル化（Ｕｎｄｅｒｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ））
標的化治療的タンパク質は、好ましくは不完全グリコシル化される：通常、哺乳動物細胞においてタンパク質が産生される場合に存在する１つ以上の炭水化物構造は、好ましくは省略、除去、修飾、またはマスクされ、哺乳動物におけるタンパク質の半減期を延長する。不完全グリコシル化は、多くの方法によって達成され得、それらのうちの幾つかを図１に図示する。図１に示すように、タンパク質は、実際に不完全グリコシル化され得る（実際に１つ以上の炭水化物構造を欠失する）か、または１つ以上の炭水化物構造の修飾またはマスキングを介して、機能的に不完全グリコシル化される。タンパク質は、実施例１４において考察されるように合成された場合、実際に不完全グリコシル化され得、そして完全に非グリコシル化（ｕｎｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）され得る（Ｅ．ｃｏｌｉ内で合成する場合のように）か、部分的に非グリコシル化される（１つ以上のグリコシル化部位を部位特異的変異誘発によって壊した後で哺乳動物系において合成する場合のように）か、または非哺乳動物のグリコシル化パターンを有し得る。実際の不完全グリコシル化はまた、合成後のタンパク質の脱グリコシル化によって、達成され得る。実施例１４において考察するように、脱グリコシル化は、化学処理または酵素処理を介してなされ得、そして完全な脱グリコシル化をもたらすか、または、炭水化物構造の一部だけが除去される場合、部分的に脱グリコシル化される。
【００８４】
（インビボでの発現）
治療的タンパク質（好ましくは、分泌される治療的タンパク質）をコードする核酸は、疾患で苦しむ患者に直接的に有利に提供され得るか、またはエキソビボでの細胞に続いて、患者にこの生細胞を投与することによって提供され得る。当該分野で公知のインビボでの遺伝子治療法としては、精製されたＤＮＡを（例えば、プラスミド中におけるように）提供すること、ウイルス性ベクター中でＤＮＡを提供すること、またはリポソームもしくは他の小胞中でＤＮＡを提供することが挙げられる（例えば、遺伝子治療で使用するための脂質キャリアを開示する米国特許第５，８２７，７０３号、および遺伝子治療に有用なアデノウイルスベクターを提供する米国特許第６，２８１，０１０号を参照のこと）。
【００８５】
組換えタンパク質を発現するために改変された細胞を移植することによって疾患を処置するための方法もまた、周知である。例えば、ヒトへの導入のために始原ヒト細胞への核酸を導入するための方法を開示している米国特許第５，３９９，３４６号を参照のこと。エキソビボでの治療のためのヒト細胞の使用は、いくつかの実施形態において好ましいが、他の細胞（例えば、細菌性細胞）が、患者の脈管構造に移植されて、連続的に治療剤を放出し得る。例えば、米国特許第４，３０９，７７６号および同第５，７０４，９１０号を参照のこと。
【００８６】
本発明の方法は、精製工程を必要とすることなく、亜細胞区画に直接的にタンパク質を標的化するために特に有用である。１つの実施形態において、ＩＧＦ−ＩＩ融合タンパク質は、宿主に投与される共生または弱毒化した寄生生物中で発現される。発現されたＩＧＦ−ＩＩ融合タンパク質は、この生物によって分泌され、宿主細胞によって取り込まれ、そして宿主細胞のリソソームに標的化される。
【００８７】
本発明のいくつかの実施形態において、ＧＩＬＴタンパク質は、このタンパク質を感染したマクロファージのリソソームへ分泌する生きたＬｅｉｓｈｍａｎｉａを介してインサイチュで送達される。この小器官から、このタンパク質はその細胞を離れ、そしてそのマクロファージの系統でない隣接細胞によって取り込まれる。従って、ＧＩＬＴタグおよび治療剤は、このタンパク質が、マクロファージリソソーム中に存在する間、必然的にインタクトなままである。従って、ＧＩＬＴタンパク質がインサイチュで発現される場合、これらは、好ましくは、リソソームの環境との適合性を確実にするために改変される。ヒト−β−グルクロニダーゼ（ヒト「ＧＵＳ」）（例示的な治療的部分）は、通常、リソソームにおいてか、またはリソソームへの輸送の間のいずれかでＣ末端ペプチド切断を受ける（例えば、ＧＵＳにおける残基６３３と残基６３４との間）。従って、ＧＵＳ−ＧＩＬＴ構築物がマクロファージリソソームにおいてＬｅｉｓｈｍａｎｉａによって発現される実施形態において、ヒトＧＵＳが、好ましくは、このタンパク質に切断に対する耐性を与えるために改変されるか、または残基６３３に続く残基が、好ましくは、ＧＩＬＴ融合タンパク質から単に取り除かれる。同様に、ＩＧＦ−ＩＩ（例示的な標的性部分）が、好ましくは、タンパク質分解に対するその耐性を増加させるために改変されるか、または最小の結合ペプチド（例えば、ファージディスプレイまたは酵母ツーハイブリッドによって同定されるような）が、野生型ＩＧＦ−ＩＩ部分に対して置換される。
【００８８】
（投与）
本発明に従って生成された標的化治療物は、任意の経路によって哺乳類宿主に投与され得る。従って、必要に応じて、投与は、経口、または静脈内および腹腔内の投与経路を含む非経口であり得る。さらに、投与は、治療剤のボーラスの定期的な注射によってであり得るか、または外部であるレザバ（例えば、ｉ．ｖ．バッグ）からの静脈内もしくは腹腔内の投与によってより連続的になされ得る。特定の実施形態において、本発明の治療物は、製薬等級であり得る。すなわち、特定の実施形態は、ヒトへの投与のために要求される純度の規格および品質管理に従う。獣医学の適用もまた、本明細書中で使用されるような意図される意義の範囲内である。
【００８９】
本発明に従う治療物の獣医学的使用およびヒト医学的使用のための両方の処方物は、代表的には、そのための薬学的に受容可能なキャリアおよび必要に応じて他の成分と関連してこのような治療物を含む。キャリアは、処方物の他の成分と適合性であり、そしてそのレシピエントに有害でないという意味で「受容可能」であり得る。この点で、薬学的に受容可能なキャリアは、薬学的投与に適合性の任意ならびに全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含むことが意図される。薬学的に活性な物質のためのこのような媒体および薬剤の使用は、当該分野において公知である。任意の従来の媒体または薬剤が活性化合物と不適合性である範囲以外で、この組成物におけるその使用が企図される。補助的な活性化合物（本発明に従って同定され、そして／または当該分野で公知である）もまたこの組成物中に組込まれ得る。処方物は、簡便に、投薬単位形態で提供され得、そして薬学／微生物学の当該分野において周知の任意の方法によって調製され得る。一般的には、いくつかの処方物は、治療物を液体キャリアもしくは微細に分割された固体キャリアまたは両方と関連させ、必要に応じて、次いで所望の処方物へと生成物を形づくることによって調製される。
【００９０】
本発明の薬学的組成物は、その意図される投与経路と適合するように処方される。投与経路の例としては、経口または非経口（例えば、静脈内、皮内、吸入、経皮（局所）、経粘膜、および直腸の投与）が挙げられる。非経口、皮内、または皮下の適用のために使用される溶液または懸濁液は、以下の成分を含有し得る：滅菌した希釈剤（例えば、注射用水、生理食塩水溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒）；抗菌剤（例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン）；抗酸化剤（アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム）；キレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸）；緩衝液（例えば、アセテート、シトレートまたはホスフェート）および張度の調整のための薬剤（例えば、塩化ナトリウムまたはブドウ糖）。ｐＨは、酸または塩基（例えば、塩酸または水酸化ナトリウム）で調整され得る。
【００９１】
経口投与または非経口投与のための有用な溶液は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，（Ｇｅｎｎａｒｏ，Ａ．編），Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．，１９９０に記載される、製薬分野において周知の任意の方法によって調製され得る。非経口投与のための処方物はまた、頬投与のためのグリココレート、直腸投与のためのメトキシサリチレート、または膣投与のためのクエン酸（ｃｕｔｒｉｃ  ａｃｉｄ）を含み得る。非経口調製物は、ガラス製またはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジもしくは複数回投与バイアル中に封入され得る。直腸投与のための座剤はまた、薬物を非刺激性の賦形剤（例えば、カカオ脂、他のグリセリド、または室温で固体であり、そして体温で液体である他の組成物）と混合することによって調製され得る。処方物はまた、例えば、ポリアルキレングリコール（例えば、ポリエチレングリコール）、植物起源のオイル、水素添加されたナフタレンなどを含み得る。直接投与のための処方物は、グリセロールおよび高粘度の他の組成物を含み得る。これらの治療物について他の潜在的に有用な非経口キャリアとしては、エチレン−酢酸ビニルコポリマー粒子、浸透圧性ポンプ、移植可能な注入系、およびリポソームが挙げられる。吸入投与のための処方物は、賦形剤として、例えば、ラクトースを含み得るか、または例えば、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、グリココレートおよびデオキシコレートを含む水溶液、または点鼻剤の形態での投与のための油性溶液、または鼻腔内に塗布するためのゲルとしてであり得る。保持浣腸もまた、直腸送達のために使用され得る。
【００９２】
経口投与のために適切な本発明の処方物は、別個の単位の形態（例えば、カプセル、ゼラチンカプセル、薬袋（ｓａｃｈｅｔ）、錠剤、トローチ、または口内錠（各々が所定量の薬物を含む））；散剤または顆粒剤の形態；水性液体または非水性液体中の溶液もしくは懸濁液の形態；あるいは水中油乳剤または油中水乳剤の形態であり得る。この治療物はまた、ボーラス、舐剤またはペーストの形態で投与され得る。錠剤は、薬物を、必要に応じて１つ以上の副成分とともに、圧縮するかまたは成形することによって作製され得る。圧縮された錠剤は、自由に流れる形態（例えば、散剤または顆粒剤）における薬物を適切な機械で、必要に応じて、結合剤、潤沢剤、不活性な希釈剤、界面活性剤または分散剤と共に混合されて、圧縮することによって調製され得る。成形された錠剤は、不活性な液体希釈剤で湿らせた粉末状の薬物および適切なキャリアの混合物を適切な機械で成形することによって作製され得る。
【００９３】
経口組成物は、一般には、不活性な希釈剤または食用のキャリアを含む。経口治療投与の目的で、活性化合物は、賦形剤とともに組込まれ得る。うがい薬として使用するために流体キャリアを用いて調製される経口組成物は、流体キャリア中に化合物を含み、そして経口的に適用され、音を立てられ、そして吐かれるかまたは飲み込まれる。薬学的に適合性の結合剤、および／またはアジュバント物質は、この組成物の一部として含まれ得る。錠剤、丸剤、カプセル、トローチなどは、任意の以下の賦形剤、または同様な性質の化合物を含み得る：結合剤（例えば、微結晶性セルロース、トラガカントガムまたはゼラチン）；賦形剤（例えば、スターチまたはラクトース）；崩壊剤（例えば、アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、またはコーンスターチ）；潤沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウムまたはＳｔｅｒｏｔｅ）；潤滑剤（ｇｌｉｄａｎｔ）（例えば、コロイド状二酸化ケイ素）；甘味剤（例えば、スクロースまたはサッカリン）；または香味剤（例えば、ペパーミント、サリチル酸メチル、またはオレンジ香料）。
【００９４】
注射可能な使用に適切な薬学的組成物は、滅菌された注射可能な溶液または分散剤の即席調製物のための、滅菌された水溶液（水溶性の場合）または分散剤および滅菌された散剤を包含する。静脈投与について、適切なキャリアとしては、生理学的生理食塩水、静菌性水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬＴＭ（ＢＡＳＦ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，ＮＪ）またはリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。全ての場合において、この組成物は、滅菌され得、容易に注射可能である程度に、流動性であり得る。この組成物は、製造および保存の条件下で安定であり得、微生物（例えば、細菌および真菌）の汚染作用に対して保存され得る。このキャリアは、溶媒または分散系媒体であり得、これらとしては、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの適切な混合物が挙げられる。適切な流動性は、例えば、コーティング（例えば、レシチン）の使用によって、分散剤の場合には必要な粒子サイズの維持によって、そして界面活性剤の使用によって、維持され得る。微生物の作用の防止は、種々の抗菌剤および抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロザールなど）によって達成され得る。多くの場合において、等張剤（例えば、糖、ポリアルコール（例えば、マンニトール）、ソルビトール、および組成物中の塩化ナトリウム）を含むことが好ましい。注射可能な組成物の長時間の吸収は、組成物中に、吸収を遅らせる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）を含めることによって成し遂げられ得る。
【００９５】
滅菌された注射可能な溶液は、１つまたは上に列挙された成分の組合せを有する適切な溶媒中に必要量の活性化合物を組込むことによって調製され得、必要な場合、続いて、フィルター濾過を行う。一般的に、分散剤は、滅菌されたビヒクル中に活性化合物を組込むことによって調製され、このビヒクルは、基本的な分散媒体および上記に列挙される成分から必要な他の成分を含む。滅菌された注射可能な溶液の調製物について滅菌された散剤の場合、調製の方法は、活性成分の散剤および前に濾過滅菌されたこの成分の溶液からの任意のさらなる成分の散剤を生じる真空乾燥工程および凍結乾燥工程を包含する。
【００９６】
関節内投与に適した処方物は、微晶質形態であり得る、滅菌された水性治療調製物の形態、例えば、水性微晶質懸濁物の形態であり得る。リポソーム処方物または生体分解性ポリマー系はまた、関節内投与および眼内投与の両方に関する治療物を提供するために使用され得る。
【００９７】
局所投与（眼の処置を含む）に適切な処方物としては、液体調製物または半液体調製物（例えば、リニメント、ローション、ゲル、散布剤、水中油または油中水エマルジョン（例えば、クリーム、軟膏またはペースト）；あるいは溶液または懸濁液（例えば、ドロップ））が挙げられる。皮膚表面への局所投与のための処方物は、皮膚科学的に受容可能なキャリア（例えば、ローション、クリーム、軟膏または石鹸）を有する治療物を散布することによって調製され得る。いくつかの実施形態において、塗布を局在化し除去を防止するために、皮膚の上にフィルムまたは層を形成することが可能なキャリアが、有用である。組織の表面への接着が所望される場合、組成物は、フィブリノーゲン−トロンビン組成物または他の生体接着剤中に分散する治療物を含有し得る。次いで、治療物は、所望される組織表面に、塗布（ｐａｉｎｔ）されるか、スプレーされるかまたはそうでなければ塗布（ａｐｐｌｙ）され得る。内部組織表面への局所投与について、薬剤は、液体組織接着剤または組織表面への吸着を強化することが公知である他の物質中に分散され得る。例えば、ヒドロキシプロピルセルロースまたはフィブリノーゲン／トロンビン溶液が、有利に使用され得る。あるいは、組織コーティング溶液（例えば、ペクチン含有処方物）が使用され得る。
【００９８】
吸入処置（例えば、喘息に対する）について、スプレー缶、ネブライザ、またはアトマイザで調剤された散剤（自己推進処方物またはスプレー処方物）の吸入が、使用され得る。そのような処方物は、散剤吸入デバイスからの肺投与のための微細に粉砕された散剤の形態または自己推進散剤分配処方物の形態であり得る。自己推進溶液およびスプレー処方物の場合、効果は、所望のスプレー特性（すなわち、所望の粒子径を有するスプレーを生成し得る特性）を有するバルブの選択によってかまたは制御された粒子径の懸濁された散剤として活性成分を組込むことによってのいずれかで達成され得る。吸入による投与に関して、治療物はまた、適切な推進剤（例えば、気体（例えば、二酸化炭素）、またはネブライザ）を含む、加圧容器またはディスペンサから、エアロゾルスプレー形態で送達され得る。点鼻薬もまた使用され得る。
【００９９】
全身投与はまた、経粘膜的手段または経皮的手段であり得る。経粘膜的投与または経皮的投与に関して、浸透されるべき障壁に適切な浸透剤を、処方物に使用する。このような浸透剤は、当該分野で一般的に公知であり、そのような浸透剤としては、例えば、経粘膜的投与については、界面活性剤、胆汁塩、およびフィルシジン酸誘導体が挙げられる。経皮的投与は、スプレー式点鼻薬または坐剤の使用を介して達成され得る。経皮的投与に関して、治療物は、代表的には、当該分野で一般的に公知である軟膏（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、軟膏（ｓａｌｖｅ）、ゲル、またはクリーム中に処方される。
【０１００】
１つの実施形態では、治療物は、身体からの急速な排除を保護する、キャリア（例えば、インプラントおよびマイクロカプセル化送達系を含む、制御放出処方）と共に調製される。生分解性の、生体適合性ポリマー（例えば、エチレンビニルアセテート、ポリアンヒドライド、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸）が用いられ得る。このような処方物の調製方法は、当業者に理解される。材料もまた、Ａｌｚａ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から市販のものを入手し得る。リポソーム懸濁液はまた、薬学的に受容可能なキャリアとして用いられ得る。これらは、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号に記載されるように、当業者に公知の方法に従って調製され得る。ミクロソームおよび微粒子もまた、使用され得る。
【０１０１】
経口組成物または非経口組成物は、投与を容易にしかつ投薬を均一にするために、投薬単位形態で処方され得る。投薬単位形態とは、単一の投薬として、処置されるべき被験体に適した物理的に別個の単位をいい；各単位は、必要とされる薬学的キャリアと共に所望の治療効果を生じるように計算された所定の量の活性化合物を含む。本発明の投薬単位形態についての仕様は、個体の処置のための活性化合物のように、活性化合物の固有の特性および達成される特定の治療効果、ならびに配合の分野に固有の制限によって、そしてこれらに直接的に依存して、決定される。
【０１０２】
一般的に、本発明に従って同定された治療物は、例えば、治療的に有効な量（例えば、適切な濃度の薬物を、標的組織に対して所望の効果を誘導するのに十分な時間提供する量）で、ヒトまたは他の哺乳動物に対する非経口投与または経口投与のために処方され得る。さらに、本発明の治療物は、単独、または目的の特定の疾患もしくは症状に対する有益な効果を有することが公知の他の分子との組み合わせで投与され得る。単なる例示として、有用な補因子としては、症状緩和補因子（消毒剤、抗菌剤、抗ウイルス剤および抗真菌剤を含む）、ならびに鎮痛剤および麻酔剤が挙げられる。
【０１０３】
治療組成物中に送達されるべきである本発明に従って同定された治療物の有効濃度は、投与される薬物の最終の所望の投薬量および投与の経路を含む、多数の因子に依存して変化する。投与される好ましい投薬量はまた、処置される疾患または症状の型および程度、特定の患者の全体的な健康状態、送達される治療物の相対的な生物学的効力、治療物の処方、処方物中の賦形剤の存在および型、ならびに投与の経路のような変動に依存すると考えられる。いくつかの実施形態では、本発明の治療物は、最も最近に記載された非ヒト霊長類およびげっ歯類を用いた哺乳動物研究から推定された代表的な投薬単位を用いて個体に提供され得る。上記のように、投薬単位は、単一性（すなわち、患者に投与され得る単回用量、および治療物自体または固体もしくは液体の薬学的希釈剤もしくはキャリアとの混合物のいずれかを含む、生理学的および生物学的に安定な単位用量として残る、容易に扱われかつ充填され得る単回用量）をいう。
【０１０４】
特定の実施形態では、生物は、本発明に従って同定された治療物を産生するように操作される。これらの生物は、収集するために治療物を放出し得るか、または患者に直接導入され得る。別の一連の実施形態では、細胞を利用して、本発明に従って同定された治療物のキャリアとして作用し得る。
【０１０５】
本発明の治療物としてはまた、「プロドラッグ」誘導体が挙げられる。用語プロドラッグは、活性成分を放出または活性化する生物内で自発的かまたは酵素学的かのいずれかで生体内変化を必要とする親分子の、薬理学的に不活性な（または部分的に不活性な）誘導体をいう。プロドラッグは、代謝条件の下で切断可能な基を有する本発明の治療物の改変体または誘導体である。プロドラッグは、これらが生理学的条件下で加溶媒分化を受けるか、または酵素分解を受ける場合、インビボで薬学的に活性である本発明の治療物となる。本発明のプロドラッグは、生物内の活性な薬物成分を放出もしくは活性化するために必要とされる生体内変化の数に依存して、単一、二重、三重などと呼ばれ得、そして、このことは、前駆体型形態で存在する官能基の数を示す。プロドラッグ形態は、しばしば、哺乳動物生物において、可溶性、組織適合性、または遅延された放出の利点を提供する（Ｂｕｎｄｇａｒｄ，Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｄｒｕｇｓ，７−９頁，２１−２４頁，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ  １９８５およびＳｉｌｖｅｒｍａｎ，Ｔｈｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｃｔｉｏｎ，３５２−４０１頁，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．，１９９２を参照のこと）。さらに、本発明に従うプロドラッグ誘導体は、バイオアベイラビリティーを増大させる他の特徴と組合され得る。
【実施例】
【０１０６】
（参考例１．ＧＩＬＴ構築物）
ＩＧＦ−ＩＩカセットを、一連の重複するオリゴの連結により合成し、そしてＰｉｒ１−ＳＡＴ（標準的なＬｅｉｓｈｍａｎｉａ発現ベクター）中にクローニングした。４つのＩＧＦ−ＩＩカセットを作製した：１つは、野生型の成熟ポリペプチドをコードし、１つはΔ１−７欠失を有し、１つはＹ２７Ｌ変異を有し、そして１つは両方の変異を有する。これらの変異は、他のレセプターに対するＩＧＦ−ＩＩの結合を減少させるが、Ｍ６Ｐレセプターに対する結合に影響しないことが報告されている。
【０１０７】
ヒトＩＧＦ−ＩＩのコード配列を、図２に示す。タンパク質は、アミノ末端に２４個のアミノ酸の単一のペプチド、および８９個のアミノ酸のカルボキシ末端領域を有するプレ−プロ−タンパク質として合成され、これらの両方は、Ｏ’Ｄｅｌｌら（１９９８）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．３０（７）：７６７−７１に総説されるように、翻訳後に取り除かれる。成熟タンパク質は、６７個のアミノ酸である。成熟ＩＧＦ−ＩＩのＬｅｉｓｈｍａｎｉａコドン最適化バージョンは、図３に示される（Ｌａｎｇｆｏｒｄら（１９９２）Ｅｘｐ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ  ７４（３）：３６０−１）。このカセットを、重複するオリゴヌクレオチドをアニーリングすることにより構築した。このオリゴヌクレオチドの配列を、表３に示す。成熟ポリペプチドのアミノ酸１〜７の欠失（Δ１−７）、チロシンからロイシンへの残基２７の変異（Ｙ２７Ｌ）、または両方の変異（Δ１−７、Ｙ２７Ｌ）を含むさらなるカセットを、以下に記載されるような、所望のレセプターについてのみ特異性を有するＩＧＦ−ＩＩカセットを生じるように作製した。野生型ＩＧＦ−ＩＩカセットを作製するために、オリゴＧＩＬＴ１−９を、アニーリングおよび連結した。Ｙ２７Ｌカセットを作製するために、オリゴ１、１２、３、４、５、１６、７、８および９を、アニーリングおよび連結した。連結後、２つのカセットをカラム精製した。野生型カセットおよびＹ２７Ｌカセットを、オリゴＧＩＬＴ２０および１０ならびに適切なテンプレートを用いてＰＣＲにより増幅した。Δ１−７欠失を組み込むために、２つのテンプレートを、オリゴＧＩＬＴ１１および１０を用いて増幅した。得られた４つのＩＧＦ−ＩＩカセット（野生型、Ｙ２７Ｌ、Δ１−７およびＹ２７ＬΔ１−７）を、カラム精製し、ＸｂａＩで消化し、ゲル精製し、そしてＸｂａＩで切断したＰｉｒ１−ＳＡＴに連結した。
【０１０８】
次いで、遺伝子カセットを、リーディングフレームを保存するような方法でベクター中のＸｂａＩの上流のＸｍａＩ部位（示さず）とＡｓｃＩ部位との間にクローニングした。３’ＸｂａＩ部位の重複するＤＡＭメチラーゼ部位は、クローニングのためのＸｍａＩ部位の代わりに５’ＸｂａＩ部位の使用を可能にした。このＡｓｃＩ部位は、３つのアミノ酸残基のブリッジを加える。
【０１０９】
【表３】
0004828121.tif 000006
示した変異をＩＧＦ−ＩＩカセットに組み込む目的は、融合タンパク質を適切なレセプターに標的化することを保証するためである。ヒトＩＧＦ−ＩＩは、ＩＧＦ−Ｉ（例えば、図７を参照のこと）およびインスリンのＢ鎖およびＡ鎖に対して高い程度の配列類似性および構造類似性を有する（Ｔｅｒａｓａｗａら（１９９４）Ｅｍｂｏ  Ｊ．１３（２３）：５５９０−７）。従って、これらのホルモンが、重複するレセプター結合特異性を有することは驚くべきことではない。ＩＧＦ−ＩＩは、インスリンレセプター、ＩＧＦ−Ｉレセプターおよびカチオン依存マンノース６−ホスフェート／ＩＧＦ−ＩＩレセプター（ＣＩＭ６Ｐ／ＩＧＦ−ＩＩ）に結合する。ＣＩＭ６Ｐ／ＩＧＦ−ＩＩレセプターは、ＩＧＦ−ＩＩに対するレセプターとして、およびリソソームの加水分解酵素の分類に関与するマンノース６−ホスフェートレセプターとして作用する、二重活性レセプターである。長年にわたり、これらの２つの活性は、両方の活性が単一のタンパク質中に存在することが決定されるまで、別々のタンパク質に起因すると考えられてきた（Ｍｏｒｇａｎら（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ  ３２９（６１３７）：３０１−７）；（Ｔｏｎｇら（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３（６）：２５８５−８）。
【０１１０】
ＩＧＦ−ＩＩの殆どの著しい生物学的効果（例えば、その分裂促進効果）は、ＣＩＭ６Ｐ／ＩＧＦ−ＩＩレセプターよりむしろ、ＩＧＦ−Ｉレセプターを介して媒介される（Ｌｕｄｗｉｇら（１９９５）Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ５：２０２−２０６）において総説され、（Ｋｏｒｎｅｒら（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０（１）：２８７−９５）もまた参照のこと）。ＣＩＭ６Ｐ／ＩＧＦ−ＩＩレセプターに対するＩＧＦ−ＩＩの結合の最初の結果は、引き続いての分解のためのリソソームへの輸送であると考えられる。このことは、ＩＧＦ−ＩＩレベルを制御する重要な手段を表し、そしてなぜＣＩＭ６Ｐ／ＩＧＦ−ＩＩレセプターのヌル変異を有するマウスは、ＩＧＦ−ＩＩがまた欠失されない限り、出生前の死を示すのかを説明する（Ｌａｕら（１９９４）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．８（２４）：２９５３−６３）；（Ｗａｎｇら（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  ３７２（６５０５）；４６４−７）；（Ｌｕｄｗｉｇら（１９９６）Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１７７（２）：５１７−３５）。本発明の方法において、ＩＧＦ−ＩＩ融合タンパク質をＣＩＭ６Ｐ／ＩＧＦ−ＩＩレセプターに結合させることが望ましい。Ｙ２７ＬおよびΔ１−７変異は、ＣＩＭ６Ｐ／ＩＧＦ−ＩＩレセプターに対する親和性を変化させることなく、ＩＧＦ−Ｉレセプターおよびインスリンレセプターに対するＩＧＦ−ＩＩの結合を低下させる（Ｓａｋａｎｏら（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６（３１）：２０６２６−３５）；（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏら（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０（３０）：１８０１３−８）。従って、本発明に従って、これらのＩＧＦ−ＩＩの変異形態は、ＣＩＭ６Ｐ／ＩＧＦ−ＩＩレセプターに対して特異的に融合タンパク質を標的化する手段を提供する。
【０１１１】
１つの実験において、適切な配列を有する４つの異なるＩＧＦ−ＩＩカセット（野生型、Δ１−７、Ｙ２７ＬおよびΔ１−７／Ｙ２７Ｌ）を作製した。β−ＧＵＳカセットを、ＩＧＦ−ＩＩカセットに融合し、これらの構築物を寄生生物に置いた。α−ガラクトシダーゼカセットもまた、ＩＧＦ−ＩＩカセットに融合する。ＧＵＳ融合物を試験し、そして酵素学的に活性なタンパク質を産生することを示した。
【０１１２】
図４に示される、１つの好ましい構築物は、Ｌ．ｍｅｘｉｃａｎａ分泌酸ホスファターゼ（ＳＡＰ−１）のシグナルペプチドを含み、単一のＳａｌＩ部位が除去された改変型Ｐｉｒ１−ＳＡＴのＸｂａＩ部位へとクローニングされる。インフレームで融合されるものは、成熟β−ＧＵＳ配列であり、これは３つのアミノ酸ブリッジによりＩＧＦ−ＩＩタグに接続される。
【０１１３】
（参考例２．ＧＩＬＴタンパク質調製）
β−ＧＵＳを発現および分泌するＬ．ｍｅｘｉｃａｎａを、１００ｍｌのＳｔａｎｄａｒｄ  Ｐｒｏｍａｓｔｉｇｏｔｅ培地（４０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  アデニン、０．０００５％ヘミン、０．０００１％ビオチン、５％ウシ胎仔血清、５％胚流体、５０単位／ｍｌペニシリン、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび５０μｇ／ｍｌナルセオスリシン（ｎｏｕｒｓｅｏｔｈｒｉｃｉｎ）を含むＭ１９９）中、２６℃で増殖させた。約５×１０６無鞭毛型細胞／ｍｌの密度に到達した後、これら無鞭毛型細胞を、室温で１０分間の１０００×ｇにおける遠心分離によって集めた；これらの無鞭毛型細胞を用いて、室温で、１リットルの低タンパク質培地（０．１ｍＭアデニン、０．０００１％ビオチン、５０単位／ｍｌペニシリンおよび５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを補填したＭ１９９）に接種した。この１リットルの培養物は、滅菌攪拌バーを備えた２リットルのキャップ付フラスコ中に含められ、この培養物は、穏やかな攪拌とともに２６℃でインキュベートされ得た。この１リットルの培養物は、層流フード中にそれらを移動させること、キャップを取り除くこと、およびキャップを置き換える前に激しく旋回することにより１日に２度通気した。この培養物が、２−３×１０７無鞭毛型細胞／ｍｌの密度に到達したとき、上記のようにこの培養物を遠心分離した。ただし、無鞭毛型細胞ペレットは棄て、そして培地は滅菌フラスコにデカントした。１リットルあたり４３４ｇ（ＮＨ４）２ＳＯ４の添加は、培地から活性ＧＵＳタンパク質を沈殿させ；この塩折培地を４℃で一晩貯蔵した。沈殿したタンパク質を、１０，５００×ｇにおける３０分間の遠心分離か、またはＧｅｌｍａｎ  Ｓｕｐｏｒ−８００膜を通じる濾過のいずれかにより回収した；このタンパク質を、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８、１ｍＭ  ＣａＣｌ２中に再懸濁し、そして透析まで−８０℃で貯蔵した。数リットルの培地からの粗沈殿物を溶解し、プールし、透析チューブ（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ−７、ＭＷＣＯ  ２５，０００）中に置き、そして２つの１リットル容量の重炭酸塩を含むＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏの改変Ｅａｇｌｅ培地）に対して一晩透析した。
【０１１４】
（参考例３．ＧＩＬＴ取り込みアッセイ）
皮膚線維芽細胞株ＧＭ４６６８（ヒト、ＮＩＧＭＳ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍｕｔａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ）は、ＶＩＩ型ムコ多糖体沈着症の患者由来である；従って、細胞は、β−ＧＵＳ活性をほとんど有さないかまたは全く有さない。従って、ＧＭ４６６８細胞は、ヒト細胞中へのＧＵＳ−ＧＩＬＴ構築物の取り込みを試験するために特に有用である。ＧＭ４６６８細胞を、１２ウェル組織培養プレート中、１５％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清を補填したＤｕｌｂｅｃｃｏの改変Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）で、５％ＣＯ２中３７℃で培養した。線維芽細胞は、参考例２で記載のように調製された、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａで発現したヒトβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、ＧＵＳ−ＩＧＦ−ＩＩ融合タンパク質（ＧＵＳ−ＧＩＬＴ）、または変異体ＧＵＳ−ＩＧＦ−ＩＩ融合タンパク質（ＧＵＳΔ−ＧＩＬＴ）の約１５０単位の調製物存在下で一晩培養した。コントロールウェルは、添加された酵素を含まなかった（ＤＭＥＭ培地ブランク）。インキュベーションの後、培地をウェルから取り出し、そしてＧＵＳ活性を３連でアッセイした。ウェルを、１ｍｌの３７℃のリン酸緩衝化生理食塩水で５回洗浄し、次に０．２ｍｌの溶解緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、２ｍＭ  ４−（２−アミノエチル）−ベンゼンスルホニルフルオライドハイドロクロライド（ＡＥＢＳＦ、Ｓｉｇｍａ）、および１％  ＮＰ−４０）中、室温で１５分間インキュベートした。細胞溶解物を、微量遠心チューブに移し、次に１３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、細胞残渣を取り除いた。溶解物の３つの１０μＬのアリコートを、タンパク質濃度についてアッセイした（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｍｉｃｒｏ  ＢＣＡタンパク質アッセイ、Ｐｉｅｒｃｅ、ＩＬ）。
【０１１５】
溶解物の３つの３８μＬのアリコートを、（Ｗｏｌｆｅら（１９９６）Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ：Ｔｏｗａｒｄｓ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ２６３−２７４）から適合された標準的な蛍光定量的アッセイを用いて、ＧＵＳ活性についてアッセイした。アッセイは、廃棄可能な蛍光定量キュベット中で行なう。１５０μｌの反応混合物を各キュベットに添加する。１ｍｌの反応混合物は、８６０μｌのＨ２Ｏ、１００μｌの１Ｍ酢酸ナトリウム、４０μｌの２５×β−ＧＵＳ基質混合物である。２５×β−ＧＵＳ基質混合物は、デシケーター中−２０℃で貯蔵された４．５５ｍｌのエタノール中の２５０ｍｇ  ４−メチルウムベリフェリル−β−Ｄグルクロニドの懸濁物である。３８μｌのサンプルをこの反応混合物に添加し、そして反応物を３７℃でインキュベートする。反応を、２ｍｌの停止溶液（１０．６ｇ  Ｎａ２ＣＯ３、１２．０１ｇ  グリシン、Ｈ２Ｏで５００ｍｌに、ｐＨ１０．５）の添加により終結する。次いで、蛍光出力を蛍光定量計で測定する。
【０１１６】
取り込み実験の結果は、細胞会合ＧＵＳ−ＧＩＬＴの量が、非改変ＧＵＳのそれより１０倍大きいことを示す（図５）。二重変異体構築物は、非改変ＧＵＳより約５倍効果的である。これらの結果は、ＧＩＬＴ技術が取り込みのためにリソソーム酵素を標的化する効果的な手段であることを示す。取り込みはまた、標準的な免疫蛍光技術を用いて確認され得る。
【０１１７】
（参考例４．競合実験）
ＧＩＬＴ媒介取り込みが、カチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプター上のＩＧＦ−ＩＩ結合性部位を経由して生じることを確認するために、組換えＩＧＦ−ＩＩを用いて競合実験を実施した。実験設計は、ＧＭ４６６８線維芽細胞が、血清を含まないＤＭＥＭ＋２％ＢＳＡ中で約１８時間指定のタンパク質とインキュベートしたことを除いて上記に記載の設計と同じであった。各β−ＧＵＳ誘導体を１５０Ｕ／ウェルで添加した。競合のために、２．８５μｇのＩＧＦ−ＩＩを各ウェルに添加した。これは、ＧＩＬＴ−ＧＵＳに対し約１００倍モル過剰に相当し、Ｍ６Ｐ／ＩＧＦ−ＩＩレセプターへの結合について競合するに十分な濃度である。
【０１１８】
競合実験の結果を図６に示す。ＩＧＦ−ＩＩの非存在下、２４単位を超えるＧＩＬＴ−ＧＵＳ／ｍｇ溶解物が検出された。ＩＧＦ−ＩＩの添加に際し、細胞会合ＧＩＬＴ−ＧＵＳの量は５．４Ｕまで落ちた。このレベルは、線維芽細胞により取り込まれる非改変ＧＵＳのレベルと同様である。従って、ＧＩＬＴタンパク質取り込みの大部分（ｂｕｌｋ）は、ＩＧＦ−ＩＩによって競合され得、これは、この取り込みが実際に特異的レセプター−リガンド相互作用を介して生じていることを示す。
【０１１９】
（参考例５．血清非含有培地中の遺伝子産物発現）
発現産物はまた、血清非含有培地から単離され得る。一般に、発現株を血清含有培地中で増殖させ、血清非含有培地中に希釈し、そして発現産物を単離する前に、数世代の間（好ましくは２〜５世代）増殖させる。例えば、分泌された標的化治療的タンパク質の産生は、最初７５ｃｍ２フラスコ中の５０ｍｌの１×Ｍ１９９培地中２７℃で培養されるＬｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍｅｘｉｃａｎａ無鞭毛型細胞から単離され得る。細胞密度が１〜３×１０７／ｍｌに達する場合、この培養物を用いて１．２ＬのＭ１９９培地に接種する。この培養物の密度が約５×１０６／ｍｌに達する場合、細胞を遠心分離により回収し、１８０ｍｌの上清液中に再懸濁し、そして１６Ｌのスピナーフラスコ中の１２Ｌの「Ｚｉｍａ」培地に接種するために用いる。この培養物の初期細胞密度は、代表的には約５×１０５／ｍｌである。この培養物を、約１．０〜１．７×１０ｅ７細胞／ｍｌの細胞密度まで増殖させる。この細胞密度に到達するとき、細胞を遠心分離により培養培地から分離し、そして上清を４℃で０．２μフィルターを通じて濾過し、残存する無鞭毛型細胞を取り除く。濾過された培地を、タンデム（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ）流れ濾過デバイス（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ  Ｐｒｅｐ／Ｓｃａｌｅ−ＴＦＦカートリッジ）を用いて１２．０Ｌから５００ｍｌに濃縮した。
【０１２０】
この方法のために好適な増殖培地は、Ｍ１９９増殖培地および「Ｚｉｍａ」増殖培地である。しかし、その他の血清含有培地および血清非含有培地もまた有用である。Ｍ１９９増殖培地は以下のようである：（１Ｌバッチ）＝２００ｍｌ  ５×Ｍ１９９（フェノールレッドｐＨ指示薬を含む）＋６３６ｍｌ  Ｈ２Ｏ、５０．０ｍｌ  ウシ胎仔血清、５０．０ｍｌ  ＥＦ  ウシ胚流体、１．０ｍｌの５０ｍｇ／ｍｌノルセオトリシン（ｎｏｕｒｓｅｏｔｈｒｉｃｉｎ）、２．０ｍｌの５０％トリエタノールアミン中０．２５％ヘミン、１０ｍｌの５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．５中１０ｍＭ  アデニン、４０．０ｍｌの１Ｍ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．５、１ｍｌの９５％エタノール中０．１％ビオチン、１０．０ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン。用いる全ての血清を、熱により不活性化する。最終容量＝１Ｌであり、そして滅菌濾過する。「Ｚｉｍａ」改変Ｍ１９９培地は以下のようである：（２０．０Ｌバッチ）＝２１９．２ｇ  Ｍ１９９粉末（−）フェノールレッド＋７．０ｇ重炭酸ナトリウム、２００．０ｍｌの５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．５中１０ｍＭアデニン、８００．０ｍｌのＨｅｐｅｓ遊離酸ｐＨ７．５、２０．０ｍｌの９５％エタノール中０．１％ビオチン、２００．０ｍｌペニシリン／ストレプトマイシン、最終容量＝２０．０Ｌであり、そして滅菌濾過する。
【０１２１】
標的化治療的タンパク質は、好ましくは、ＣｏｎｃａｎａｖａｌｉｎＡ（ＣｏｎＡ）クロマトグラフィーにより精製される。例えば、培養物が１．０×１０７無鞭毛型細胞／ｍｌを超える密度に到達する場合、Ｌ．ｍｅｘｉｃａｎａを５００×ｇで１０分の遠心分離により取り除く。回収した培養培地を０．２μｍフィルターを通過させ、ＣｏｎＡ−アガロースカラム（４％架橋ビーズ状アガロース、Ｓｉｇｍａ）上に直接ロードする前に粒子を取り除く。このＣｏｎＡ−アガロースカラムを、１Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．４、各５ｍＭのＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２およびＭｎＣｌ２で前処理し、そして次に５容量のカラム緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．４、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、および１ｍＭ  ＭｎＣｌ２）で平衡化する。培養培地中の合計１７９，８００単位（ｎｍｏｌ／時間）のＧＵＳ活性（２Ｌ中）を、２２ｍｌのＣｏｎＡアガロースカラム上にロードする。フロースルーまたは洗浄中に活性は検出可能ではない。ＧＵＳ活性は、２００ｍＭメチルマンノピラノシドを含むカラム緩衝液で溶出される。活性ピークを含む溶出画分をプールし、そして濃縮する。取り込みおよび競合実験を参考例３および４に記載のように実施した。但し、生物は、血清非含有培地中で増殖させ、そしてＣｏｎＡで精製した；約３５０〜６００単位の酵素を線維芽細胞に適用した。結果を図８に示す。
【０１２２】
（参考例６．競合物として変性ＩＧＦ−ＩＩを用いる競合実験）
参考例４における実験を、競合物として正常ＩＧＦ−ＩＩまたは変性ＩＧＦ−ＩＩのいずれかを用いて繰り返す。参考例４におけるように、細胞会合ＧＵＳ−ＧＩＬＴの量は、競合に効果的である正常ＩＧＦ−ＩＩ濃度と同時インキュベートされる場合に減少するが、競合濃度では、変性ＩＧＦ−ＩＩはほとんど影響を有さないか、または影響を有さない。
【０１２３】
（参考例７．酵素アッセイ）
ＧＵＳ活性についてのアッセイを、参考例３および／または以下で記載のように行う。
【０１２４】
ガラスアッセイチューブを３連で番号付け、１００μＬの２×ＧＵＳ反応混合物を、各チューブに添加する。２×ＧＵＳ反応混合物を、１４．２ｍＬ  ２００ｍＭ酢酸ナトリウム（酢酸でｐＨを４．８に調整）への１００ｍｇ  ４−メチルメチルウムベリフェリル−β−Ｄグルクロニドの添加によって調製する。１００μＬまでのサンプルを、各チューブに移す；最終反応容量が２００μＬになるまで水を加える。反応チューブを、パラフィルムで覆い、３７℃の水浴で１〜２時間インキュベートする。反応を、１．８ｍＬの停止緩衝液（最終容量５００ｍＬの水中に１０．６ｇのＮａ２ＣＯ３および１２．０１ｇのグリシンを溶解し、ｐＨを１０．５に調整し、そして反復分配器（ｒｅｐｅａｔ−ｄｉｓｐｅｎｓｏｒ）内でフィルター滅菌することによって調製）の添加によって停止する。次いで、２ｍＬの停止溶液をブランクとして用いて蛍光定量器（ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｅｒ）をキャリブレーションし、残ったサンプルから蛍光を測定する。最終容量２ｍＬの停止緩衝液中の１、２、５、１０、および２０μＬの１６６μＭ  ４−メチルメチルウムベリフェロン標準を用いて標準曲線を作成する。
【０１２５】
２．５ｍｇ  ４−メチルメチルウムベリフェロンを１ｍＬエタノール中に溶解し、９９ｍＬの滅菌水、を加え、約２００ｎｍｏｌ／ｍＬの濃度にすることによって、４−メチルメチルウムベリフェロン標準溶液を調製する。正確な濃度を、分光光度法で決定する。３６０ｎｍの吸光係数は、１９．０００ｃｍ−１Ｍ−１である。例えば、１００μＬを、９００μＬの停止緩衝液に加え、そして３６０ｎｍでの吸光度を測定する。測定値が０．３３７である場合、標準溶液の濃度は、０．３３７×１０（希釈）／１９，０００＝１７７μＭであり、次いで、これを適切な量の滅菌水の添加によって１６６μＭに希釈し得る。
【０１２６】
（参考例８．結合取り込みおよび半減期の実験）
線維芽細胞上のＭ６Ｐ／ＩＧＦ−ＩＩレセプターに対するＧＵＳ−ＧＩＬＴタンパク質の結合を測定し、そして取り込み速度を、公開された方法（Ｙｏｒｋら、（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４（２）：１１６４−７１）と同様に評価する。上記のように１２ウェル培養ディッシュにおいて培養したＧＭ４６６８線維芽細胞を、１％  ＢＳＡを含む、氷冷した無血清培地中で洗浄する。リガンド（ＧＵＳ、ＧＵＳ−ＧＩＬＴまたはＧＵＳ−ΔＧＩＬＴのいずれか、あるいはコントロールタンパク質）を冷却した１％ＢＳＡ添加の無血清培地中の細胞に添加する。リガンド添加の際、プレートを氷上で３０分間インキュベートした。３０分後、リガンドを除去して、そして細胞を氷冷した培地で素早く５回洗浄する。０時点のウェルに１ｍｌの氷冷ストリップ緩衝液（０．２Ｍ酢酸、ｐＨ３．５、０．５Ｍ  ＮａＣｌ）を入れる。次いで、プレートを３７°の水浴に浮かべて、そして０．５ｍｌの予め加温した培地を添加して、取り込みを開始させる。全ての停止点で、１ｍｌのストリップ緩衝液を添加する。実験終了時に、ストリップ緩衝液のアリコートを、参考例３に記載されるようにβ−グルクロニダーゼ活性の蛍光定量的なアッセイのために保存する。次いで、細胞を上記のように溶解して、そして溶解物をβ−グルクロニダーゼ活性についてアッセイする。あるいは、免疫学的方法を使用して、標的化治療的タンパク質の存在について、溶解物を試験し得る。
【０１２７】
一旦、温度を３７°に移すと、ＧＵＳ−ＧＩＬＴが線維芽細胞によって数分以内に直ちに取り込まれる（Ｙｏｒｋら、（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４（２）：１１６４−７１）こと、およびその酵素活性が細胞内で長時間持続することが予想される。
【０１２８】
（実施例９．哺乳動物細胞におけるタンパク質産生）
（ＣＨＯ細胞）
Ｕｌｍａｓｏｖら（２０００）ＰＮＡＳ  ９７（２６）：１４２１２−１４２１７の系を用いて、ＧＵＳ−ＧＩＬＴΔ１−７およびＧＵＳΔＣ１８−ＧＩＬＴΔ１−７を、ＣＨＯ細胞内で発現させた。適切な遺伝子カセットを、ｐＣＸＮベクターのＥｃｏＲＩ部位内に挿入し、０．４ｃｍキュベット内において５０μＦおよび１，２００Ｖで、これをＣＨＯ細胞内にエレクトロポレーションした。コロニーの選択および増幅を、４００μｇ／ｍＬのＧ４１８によって、２〜３週間媒介した。ＣＨＯ細胞を、１５％  ＦＢＳ、１．２ｍＭグルタミン、５０μｇ／ｍＬプロリン、および１ｍＭピルビン酸を補填したＭＥＭ培地中で増殖させた。酵素産生のために、細胞を多底フラスコ（ｍｕｌｔｉｆｌｏｏｒ  ｆｌａｓｋ）内でＤＭＥＭ中にプレートした。一旦細胞がコンフルーエンスに達すると、回収培地（２％  ＦＢＳ、１．２ｍＭグルタミン、および１ｍＭピルビン酸を補填したＷｅｙｍｏｕｔｈ培地）を細胞に適用した。分泌された組換え酵素を含む培地を２４〜７２時間毎に回収した。１つのＧＵＳ−ＧＩＬＴΔ１−７細胞株の分泌の代表的なレベルは、４０００〜５０００単位／ｍＬ／２４時間である。
【０１２９】
多くのＧＵＳΔＣ１８−ＧＩＬＴΔ１−７  ＣＨＯ株を、分泌酵素産生量についてアッセイした。６個の最高産生株は、８６００〜１４９００単位／ｍＬ／２４時間を分泌した。最高産生株を、タンパク質収集のために選択した。
【０１３０】
（ＨＥＫ２９３細胞）
ＨＥＫ２９３細胞における発現のために、ＧＵＳ−ＧＩＬＴカセットを、ｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内にクローン化した。使用したカセットは、野生型ＧＵＳ−ＧＩＬＴ；ＧＵＳ−ＧＩＬＴΔ１−７；ＧＵＳＧＩＬＴＹ２７Ｌ；ＧＵＳΔＣ１８−ＧＩＬＴΔ１−７；ＧＩＬＴＹ２７Ｌ、およびＧＵＳ−ＧＩＬＴＦ１９Ｓ／Ｅ１２Ｋを含んだ。
【０１３１】
ＨＥＫ２９３細胞を、４ｍＭグルタミンおよび１０％  ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培地を含む１２ウェルプレート内で、５０〜８０％コンフルーエンシーまで培養した。ＦｕＧＥＮＥ  ６（Ｒｏｃｈｅ）を製造業者が記載するように使用して、細胞を、ｐＣＥＰ−ＧＵＳ−ＧＩＬＴ  ＤＮＡプラスミドでトランスフェクトした。１つのウェルにつき、０．５μｇのＤＮＡおよび２μＬのＦｕＧＥＮＥ  ６を加えた。トランスフェクション２〜３日後、トリプシンを使用して細胞をウェルから取り出し、次いで、１００μｇ／ｍＬハイグロマイシンを含有する上記のＤＭＥＭ培地を含むＴ２５ｃｍ２培養フラスコ内で培養し、トランスフェクトした細胞の安定な集団を選択した。ハイグロマイシンを含有する培地を、２〜３日ごとに交換した。１〜２週間以内に、培養物をＴ７５ｃｍ２培養フラスコに広げた。酵素産生のために、細胞を、細胞を多底フラスコ（ｍｕｌｔｉｆｌｏｏｒ  ｆｌａｓｋ）内でＭＥＭ中にプレートした。一旦細胞がコンフルーエンスに達すると、回収培地（２％  ＦＢＳ、１．２ｍＭグルタミン、および１ｍＭピルビン酸を補填したＷｅｙｍｏｕｔｈ培地）を細胞に与えた。この培地は、２９３細胞のためではなく、ＣＨＯ細胞のために最適化されている；従ってＨＥＫ２９３株の分泌レベルは、別の培地内でより有意に高いことが判明し得る。
【０１３２】
分泌酵素のレベルを、表４に示す。
【０１３３】
【表４】
0004828121.tif 000007
（実施例１０．ＧＵＳ−ＧＩＬＴ融合タンパク質の精製）
クロマトグラフィー（従来的クロマトグラフィーおよびアフィニティクロマトグラフィーを含む）を使用して、ＧＵＳ−ＧＩＬＴ融合タンパク質を精製し得る。
【０１３４】
（従来的クロマトグラフィー）
Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａにおいて産生されたＧＵＳ−ＧＩＬＴ融合タンパク質を精製する１つの手順を、参考例２に記載する。代替の手順を、以下の段落に記載する。
【０１３５】
ＧＵＳ−ＧＩＬＴ融合物を発現するＬｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍｅｘｉｃａｎａ細胞株からの培養上清を、回収し、遠心分離し、そして０．２μフィルター濾過し、細胞残渣を除去した。１００，０００分子量カットオフのタンデム（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ）ウルトラフィルターを用いて上清を濃縮し、−８０℃で保存した。濃縮した上清を、ビーズ化アガロースに固定したＣｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ  Ａ（ＣｏｎＡ）を含むカラム上に直接ロードした。このカラムを、ＣｏｎＡカラム緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、１ｍＭ  ＭｎＣｌ２）で洗浄し、その後ＧＵＳ−ＧＩＬＴ融合物を含むマンノシル化タンパク質を、０〜０．２Ｍ  メチル−α−Ｄ−ピラノシドの勾配を用いて、ＣｏｎＡカラム緩衝液中に溶出した。グルクロニダーゼ活性を有する画分（実施例７に記載のようにアッセイした）をプールし、濃縮し、そして次のカラムのために、緩衝液をＳＰカラム緩衝液（２５ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ６）、２０ｍＭ  ＮａＣＩ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に交換した。同緩衝液で平衡化したＳＰファストフローカラム（ｆａｓｔ  ｆｌｏｗ  ｃｏｌｕｍｎ）上に濃縮画分をロードし、そしてこのカラムを、さらなるＳＰカラム緩衝液で洗浄した。ＧＵＳ−ＧＩＬＴ融合物を、２工程でカラムから溶出した：１）２５ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６）および１０％グリセロール中の０〜０．１５Ｍグルクロン酸の勾配、次いで０．２Ｍグルクロン酸、２５ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ６）、１０％グリセロール。グルクロニダーゼ活性を含む画分をプールし、そして緩衝液を２０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．４）に交換した。これらのプールした画分を、同緩衝液で平衡化したＨＡ−ウルトロゲルカラム（ＨＡ−ｕｌｔｒｏｇｅｌ  ｃｏｌｕｍｎ）上にロードした。ＧＵＳ−ＧＩＬＴ融合タンパク質を、リン酸緩衝液の増加する勾配（１４５〜３４０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．４））で溶出した。グルクロニダーゼ活性を含有する画分をプールし、濃縮し、そして２５％グリセロール含有２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）中で、−８０℃で保存した。
【０１３６】
哺乳動物細胞中で産生されるＧＵＳ−ＧＩＬＴ融合タンパク質を精製するための従来のクロマトグラフィー方法を、以下の段落に記載する。
【０１３７】
ＧＵＳ−ＧＩＬＴ融合タンパク質を過剰発現する哺乳動物細胞を、Ｎｕｎｃ  Ｔｒｉｐｌｅフラスコ内でコンフルーエンシーまで増殖させ、次いで、２％ウシ胎仔血清を補填した無血清培地（Ｗａｙｍｏｕｔｈ  ＭＢ  ７５２／１）をフィードし、精製のための酵素を収集する。この培地を回収し、そしてフラスコを２４時間間隔で再フィードする。幾つかのフラスコからの培地をプールし、そして５０００×ｇで２０分間、４℃で遠心分離し、剥離した細胞などを除去する。上清を取り出し、そしてアリコートをβ−ＧＵＳアッセイのために採取する。ここで、この培地は、直接的に増殖させるために使用することも、または後の使用のために−２０℃で保存することも可能である。
【０１３８】
１Ｌの分泌培地を、３７℃で融解し（凍結している場合）、０．２μフィルターを通して濾過し、そして４Ｌビーカーに移す。培地の容量を、３Ｌのｄｄ水の添加によって４倍に希釈し、塩濃度を下げる：１Ｍ  Ｔｒｉｓ塩基（Ｔｒｉｓ  ｂａｓｅ）を用いて、希釈した培地のｐＨを９．０に調整する。１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ９．０）で平衡化済みのＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｃｅｌ  ５０ｍＬを、希釈した培地に加え、４℃で２時間、大型の撹拌子でゆっくりと撹拌する。（少量のアリコートを取り出し、微量遠心分離し、そして上清をアッセイして結合をモニターする。）結合が完了したら、フリットガラス漏斗上に樹脂を収集し、複数回、７５０ｍＬの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ９．０）で洗浄する。樹脂を２．５ｃｍカラムに移し、そしてさらに７５０ｍＬの同緩衝液で、流速１２０ｍＬ／時間で洗浄する。ＤＥＡＥカラムを、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ９．０）中０〜０．４Ｍ  ＮａＣｌの直線勾配で溶出する。ＧＵＳ−ＧＩＬＴ融合タンパク質を含む画分を、４−メチルメチルウムベリフェリル−β−Ｄグルクロニドアッセイによって検出し、プールし、そして２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）、１ｍＭ  βグリセリンリン酸、０．１５Ｍ塩化ナトリウムで平衡化したＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−２００の６００ｍＬカラム上にロードし、同緩衝液で溶出する。
【０１３９】
ＧＵＳ−ＧＩＬＴ融合タンパク質を含む画分をプールし、３×４Ｌの２５ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）、１ｍＭ  βグリセリンリン酸、０．０２５％アジ化ナトリウムで透析する。２５ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）、１ｍＭ  βグリセリンリン酸、０．０２５％アジ化ナトリウムで平衡化したＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅの１５ｍＬカラムに、流速３６ｍＬ／時間で、透析した酵素をロードする。次いで、これをカラムの１０倍量の同緩衝液で洗浄する。ＣＭカラムを、０〜０．３Ｍ塩化ナトリウムの直線勾配で、平衡緩衝液中に溶出する。ＧＵＳ−ＧＩＬＴ融合タンパク質を含む画分をプールし、そして１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  βグリセリンリン酸、０．１５Ｍ  ＮａＣｌで平衡化したＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−３００の２．４×７０ｃｍ（総容積＝３１７ｍＬ）カラム上に、流速４８ｍＬ／時間でロードする。融合タンパク質を含む画分をプールする；このプールを、ＧＵＳ活性およびタンパク質濃度についてアッセイし、特異的活性を決定する。アリコートを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上に泳動させ、その後クーマシー染色または銀染色を行って、純度を確認する。より高い濃度の酵素が必要な場合、ＸＭ−５０膜を用いるＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｕｎｉｔ（５０，０００分子量カットオフ）またはＣｅｎｔｒｉｃｏｎ  Ｃ−  ３０ユニット（３０，０００分子量カットオフ）を使用し、融合タンパク質を濃縮し得る。融合タンパク質を、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  βグリセリンリン酸ナトリウム、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ緩衝液中で、−８０℃で保存する。
【０１４０】
（アフィニティクロマトグラフィー）
アフィニティクロマトグラフィー条件は、本質的に、Ｉｓｌａｍら（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８（３０）：２２６２７−２２６３３に記載の条件である。ＧＵＳ−ＧＩＬＴ融合タンパク質（上記の従来的クロマトグラフィーと同様に収集し、遠心分離する）を過剰発現する哺乳動物細胞からの調整培地を、０．２２μフィルターを通して濾過する。塩化ナトリウム（結晶）を終濃度０．５Ｍまで添加し、そしてアジ化ナトリウムを（１／４００容量の１０％ストック溶液の添加により）終濃度０．０２５％まで添加する。抗ヒトβ−グルクロニダーゼ−Ａｆｆｉｇｅｌ  １０の５ｍＬカラム（Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭリン酸カリウム、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０２５％アジ化ナトリウム）で平衡化済）に、速度２５ｍＬ／時間で、４℃で培地を適用する。画分を収集し、流出物中任意のＧＵＳ活性についてモニタリングする。このカラムを、１０〜２０カラム容量のＡｎｔｉｂｏｄｙ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｗａｓｈ  Ｂａｆｆｅｒで、３６ｍＬ／時間で洗浄する。画分を回収し、ＧＵＳ活性をモニタリングする。このカラムを、１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ５．０）＋３．５Ｍ  ＭｇＣｌ２  ５０ｍＬで、３６ｍＬ／時間で溶出する。４ｍＬ画分を収集し、ＧＵＳ活性についてアッセイする。融合タンパク質を含む画分をプールし、等量のＰ６緩衝液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  βグリセリンリン酸、０．１５ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０２５％  アジ化ナトリウム）で希釈し、そしてＢｉｏＧｅｌ  Ｐ６カラム（Ｐ６緩衝液で平衡化済）上で脱塩してＭｇＣｌ２を除去し、そして保存のために緩衝液をＰ６緩衝液に変える。融合タンパク質をＰ６緩衝液で溶出し、ＧＵＳ活性を有する画分をプールし、そしてプールした画分をＧＵＳ活性およびタンパク質についてアッセイする。クーマシーブルーまたは銀で染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを用い、純度を確認する。融合タンパク質を、長期間の安定性のために、Ｐ６緩衝液中で、−８０℃で凍結保存する。
【０１４１】
（実施例１１．哺乳動物によって産生されたタンパク質の取り込み実験）
ＧＵＳまたはＧＵＳ−ＧＩＬＴ構築物を産生するＨＥＫ２９３細胞株またはＣＨＯ細胞株からの培養上清を回収し、０．２μｍフィルターを通して細胞を取り出した。ＧＭ４６８８線維芽細胞を、１２ウェル組織培養プレート内において１５％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清を補填したＤＭＥＭ中で、５％  ＣＯ２下３７℃で培養した。細胞を、３７℃で、取り込み培地（ＤＭＥＭ  ＋  ２％  ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ  Ａ−７０３０））で１回洗浄した。次いで、線維芽細胞を、１ｍＬの取り込み培地あたり１０００〜４０００単位の酵素と共に、培養した（３〜２１時間）。幾つかの実験において、取り込みの競合物を加えた。マンノース−６−リン酸（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ  ４４４１００）を２〜８ｍＭの濃度で幾つかの培地に加え、そして純粋組換えＩＧＦ−ＩＩ（Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＯＵ１００）を２．８６ｍＭで同一の培地に加えた（投入酵素の量に依存して、１０〜１００倍モル濃度過剰に相当する）。取り込みを、代表的に、３連のウェルで測定した。
【０１４２】
インキュベーション後、ウェルから培地を取り出し、ＧＵＳ活性について２連でアッセイした。ウェルを、１ｍＬの３７℃リン酸緩衝化生理食塩水で５回洗浄し、次いで、０．２ｍＬの溶解緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、および１％  ＮＰ−４０）中で、１５分間室温でインキュベートした。細胞溶解物を、微量遠心チューブに移し、１３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して、細胞残渣を除去した。溶解物の２つの１０μＬアリコートを、ＧＵＳ活性について標準的蛍光定量的アッセイを用いてアッセイした。溶解物の３つの１０μＬアリコートを、タンパク質濃度についてアッセイした（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｍｉｃｒｏ  ＢＣＡ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙ，Ｐｉｅｒｃｅ，  ＩＬ）。
【０１４３】
最初の実験で、ＣＨＯで産生されたＧＵＳ−ＧＩＬＴΔ１−７の取り込みを、ＣＨＯで産生されたＧＵＳΔＣ１８−ＧＩＬＴΔ１−７と比較した。表５に示すように、潜在的プロテアーゼ切断部位を消失するように操作したＧＵＳΔＣ１８−ＧＩＬＴΔ１−７タンパク質は、有意に高いレベルの取り込みレベルを有し、これは、ＩＧＦ−ＩＩおよびＭ６Ｐによって阻害され得る。対照的に、哺乳動物細胞において産生されたＩＧＦ−ＩＩタグを欠く組換えＧＵＳの取り込みは、過剰なＩＧＦ−ＩＩの存在によって影響されなかったが、過剰なＭ６Ｐによって完全に減殺された。この実験において、取り込みを、１８時間にわたって行った。
【０１４４】
【表５】
0004828121.tif 000008
その後の実験により、ＭＰＳＶＩＩ患者由来のヒト線維芽細胞によるＣＨＯおよびＨＥＫ２９３によって産生された酵素の取り込みを評価した。この実験において、取り込みは、２１時間であった。
【０１４５】
【表６】
0004828121.tif 000009
さらなる実験により、ＩＧＦ−ＩＩ、８ｍＭ  Ｍ６Ｐ、または両インヒビターの存在下での、選択した酵素の取り込みを評価した。取り込みを、２２．５時間の間測定した。
【０１４６】
【表７】
0004828121.tif 000010
上述の実験は、ＣＨＯ産生系およびＨＥＫ２９３産生系は、その機能的組換えタンパク質を分泌する能力において、本質的に同等であることを示す。この実験はまた、過剰なＩＧＦ−ＩＩの存在が、タグ化タンパク質の取り込みを７０〜９０＋％まで減殺するが、非タグ化タンパク質の取り込みにはあまり影響しない（４．５％）ことを示し、これは、哺乳動物によって産生されたタンパク質の、特異的なＩＧＦ−ＩＩ媒介性取り込みを示す。Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａによって産生されたタンパク質と違い、哺乳動物細胞によって産生された酵素は、Ｍ６Ｐを含むことが予測される。これらのタンパク質上の２つのリガンドの存在は、Ｍ６Ｐ／ＩＧＦ−ＩＩレセプターを介した取り込みを指向し得、過剰なＩＧＦ−ＩＩも過剰なＭ６Ｐも、取り込みを完全に減殺することはないことを意味する。さらに、２つのリガンドは離れた位置のレセプターに結合するので、１つのリガンドを介したレセプターへの結合は、他方の競合物の過剰な存在によってあまり影響されないはずである。
【０１４７】
（実施例１２．インビボ治療）
最初に、ＧＵＳマイナスマウスを使用して、酵素置換治療におけるＧＵＳ−ＧＩＬＴおよびその誘導体の有効性を評価し得る。ＧＵＳマイナスマウスを、Ｂｉｒｋｅｎｍｅｉｅｒら（１９８９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ  ８３（４）：１２５８−６によって記載されるように、Ｂ６．Ｃ−Ｈ−２ｂｍ１／ＢｙＢＩＲ−ｇｕｓｍｐｓ／＋マウスのヘテロ接合体交配によって産生する。好ましくは、このマウスはヒトβ−ＧＵＳに耐性である。このマウスは、ヒトβ−ＧＵＳの欠損コピーを有する導入遺伝子を保有して、ヒトタンパク質の免疫寛容性を誘導する（Ｓｌｙら（２００１）ＰＮＡＳ  ９８：２２０５−２２１０）。あるいは、ヒトβ−ＧＵＳ（例えば、ＧＵＳ−ＧＩＬＴタンパク質）を、新生仔マウスに投与して、免疫寛容性を誘導し得る。しかし、血管脳関門は、マウスにおいて約１５日までに形成されないため、１５日齢より後にマウスにおいて注射を開始する場合に、ＧＩＬＴ−ＧＵＳが脳血管門を横切るか否かを決定する方がより単純である；従って、トランスジェニックマウスが好ましい。
【０１４８】
最初の実験は、標的化治療的タンパク質の組織分布を測定することである。少なくとも３匹のマウスに、ＣＨＯで産生されたＧＩＬＴタグ化β−ＧＵＳタンパク質（本明細書中でＧＵＳΔＣ１８−ＧＩＬＴΔ１−７と呼ぶ）を与える。このＧＵＳΔＣ１８−ＧＩＬＴΔ１−７において、タンパク質の最後の１８アミノ酸を取り除いたβ−ＧＵＳタンパク質であるＧＵＳΔ１８が、成熟タンパク質の最初の７アミノ酸を欠くＩＧＦ−ＩＩタンパク質であるΔ１−７  ＧＩＬＴのＮ末端に融合される。他のマウスに、β−ＧＵＳ、緩衝液コントロール、または実施例１４に記載のように過ヨウ素酸塩および水素化ホウ素ナトリウムで処理したＧＵＳΔＣ１８−ＧＩＬＴΔ１−７タンパク質を与える。一般に、好ましい用量は、０．５〜７ｍｇ／ｋｇ体重の範囲である。１つの例として、酵素用量は１ｍｇ／ｋｇ体重で、静脈内投与され、そして酵素濃度は約１〜３ｍｇ／ｍＬである。さらに、少なくとも３匹のマウスに、５ｍｇ／ｋｇ体重用量の、過ヨウ素酸塩および水素化ホウ素ナトリウムで処理したＧＵＳΔＣ１８−ＧＩＬＴΔ１−７タンパク質を与える。２４時間後、このマウスを屠殺し、以下の器官および組織を単離する：肝臓、脾臓、腎臓、脳、肺、筋肉、心臓、骨、および血液。各組織の部分をホモジナイズし、そして１ｍｇのタンパク質あたりのβ−ＧＵＳ酵素活性を、Ｓｌｙら（２００１）ＰＮＡＳ  ９８：２２０５−２２１０に記載されるように測定する。組織の部分を、組織化学および／または組織病理学のために調製し、組織化学および／または組織病理学を公開された方法によって実行する（例えば、Ｖｏｇｌｅｒら（１９９０）Ａｍ  Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１３６：２０７−２１７を参照のこと）。
【０１４９】
さらなる実験としては、複数の注射プロトコールが挙げられ、そのプロトコールは、１ｍｇ／ｋｇ体重の用量で、毎週マウスに注射する。さらに、実施例１４に記載のように、過ヨウ素酸塩修飾酵素の半減期の測定を、未処理酵素と比較して測定する。
【０１５０】
２つの他のアッセイ形式を使用し得る。１つの形式では、３〜４匹の動物に、１００μｌの酵素希釈緩衝液（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５）中の２０，０００Ｕの酵素の単回注入を施す。マウスを７２〜９６時間後に屠殺して、この治療剤の有効性を検証する。２つ目の形式では、マウスに、３〜４週間にわたって２０，０００単位の毎週注入を施し、そして最終注入の１週間後に屠殺する。肝臓、脾臓および脳の組織化学的分析および組織病理学的分析を、公開された方法（Ｂｉｒｋｅｎｍｅｉｅｒら（１９９１）Ｂｌｏｏｄ  ７８（１１）：３０８１−９２；Ｓａｎｄｓら（１９９４）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ  ９３（６）：２３２４−３１；Ｄａｌｙら（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６（５）：２２９６−３００）によって実施する。治療剤の非存在下では、ＧＵＳ欠損マウス細胞（例えば、マクロファージおよびクップファー細胞）は、リソソーム中の廃棄物の蓄積に起因する巨大な細胞内蓄積区画を発達させる。ＧＵＳ−ＧＩＬＴ構築物で処置されたマウスの細胞において、これらの区画のサイズが明白に低下するか、またはこの区画がもはや光学顕微鏡では見えないまでに収縮することが、予想される。
【０１５１】
同様に、リソソーム蓄積症を患うヒトを、そのヒトのリソソームに対して適切な治療的部分を標的化する構築物を使用して処置する。いくつかの例において、処置は、ＧＩＬＴタンパク質の定期的な（例えば、毎週の）注入形態をとる。他の例においては、患者内で、ＧＩＬＴタンパク質のインビボ発現を持続し得る核酸の投与によるか、またはＧＩＬＴタンパク質を発現する細胞（例えば、ヒト細胞、または単一細胞の器官）の投与により、処置を達成する。例えば、米国特許第６，０２０，１４４号（２０００年２月１日発行）；米国特許仮出願第６０／２５０，４４６号；および米国特許仮出願事務所処理番号ＳＹＭ−００５ＰＲＡ，「Ｐｒｏｔｏｚｏａｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  Ｌｙｓｏｓｏｍａｌ  Ｓｔｏｒａｇｅ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｇｅｎｅｓ」（２００１年５月１１日出願）に記載されるＬｅｉｓｈｍａｎｉａベクターを使用して、ＧＩＬＴタンパク質をインサイチュで発現し得る。
【０１５２】
また、本発明の標的化治療的タンパク質を投与し得、そして以前にＧＵＳを用いた使用について記載された方法（酵素アッセイ、組織化学アッセイ、神経学アッセイ、生存アッセイ、繁殖アッセイなど）を使用して、その効果をモニタリングし得る。例えば、Ｖｏｇｌｅｒら（１９９３）Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  Ｒｅｓ．３４（６）：８３７−８４０；Ｓａｎｄｓら（１９９４）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９３：２３２４−２３３１；Ｓａｎｄｓら（１９９７）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９９：１５９６−１６０５；Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒら（１９９８）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０１：１３９４−１４００；およびＳｏｐｅｒら（１９９９）４５（２）：１８０−１８６を、参照のこと。
【０１５３】
（実施例１３．ファブリー病のためのＧＩＬＴ修飾酵素置換治療）
これらの実験の目的は、ファブリー病の酵素置換治療として、ＧＩＬＴ修飾α−ガラクトシターゼＡ（α−ＧＡＬ  Ａ）の有効性を評価することである。
【０１５４】
ファブリー病は、α−ＧＡＬ  Ａ（ＧＬ−３および他の神経スフィンゴ脂質から末端のガラクトースを除去することを担う酵素）の不十分な活性に起因する、リソソーム蓄積症である。この酵素活性の減少は、ｘ連鎖遺伝子における種々のミスセンス変異およびナンセンス変異に起因して起こる。ＧＬ−３の蓄積は、心臓、肝臓、腎臓、皮膚および脳の血管内皮細胞のリソソームにおいて最も優勢であるが、他の細胞および組織においても生じる。血管内皮細胞におけるＧＬ−３の蓄積は、最終的に、心疾患および腎不全を導く。
【０１５５】
酵素置換治療は、ファブリー病に対する効果的な処置であり、そしてその成功は、ＧＬ−３が蓄積する細胞のリソソームによって取り込まれる、この治療的酵素の能力に依存する。Ｇｅｎｚｙｍｅ産物であるＦａｂｒａｚｙｍｅは、この実証された有効性に起因してヨーロッパにおいてファブリー病の患者の処置のために認可されている、ＤＵＫＸ  Ｂ１１  ＣＨＯ細胞で生産された組換えα−ＧＡＬ  Ａである。
【０１５６】
Ｆａｂｒａｚｙｍｅの、細胞により取り込まれる能力、およびリソソームに送達される能力は、Ｎ連結した炭水化物上のマンノース  ６−ホスフェート（Ｍ６Ｐ）の存在に起因する。Ｆａｂｒａｚｙｍｅは、大部分の細胞型の細胞表面に存在する、マンノース−６−ホスフェート／ＩＧＦ−ＩＩレセプターとの結合、そしてその後のレセプター媒介性のエンドサイトーシスを介して、リソソームへと送達される。Ｆａｂｒａｚｙｍｅは、報告によると、ＡＳＮ残基１０８位、１６１位および１８４位に、３つのＮ連結性グリコシル化部位を有する。これら３つの位置で優勢な炭水化物は、それぞれ、フコシル化二方向アンテナの二重シアリル化複合体（ｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄ  ｂｉａｎｔｅｎｎａｒｙ  ｂｉｓｉａｌｙｌａｔｅｄ  ｃｏｍｐｌｅｘ）、モノリン酸化マンノース−７  オリゴマンノース、および二重リン酸化マンノース−７  オリゴマンノースである。
【０１５７】
本発明のグリコシル化非依存性のリソソーム標的化（ＧＩＬＴ）技術は、ＩＧＦ−ＩＩレセプターとの異なる相互作用を介して，リソソームに対して治療タンパク質を直接的に標的化する。標的性リガンドは、成熟したヒトＩＧＦ−ＩＩに由来し、これはまた、ＩＧＦ−ＩＩレセプターに対して高い親和性で結合する。現在の適用において、架橋を含む他の構成が実施可能であるが、ＩＧＦ−ＩＩタグは、治療的タンパク質とのｃ末端融合物として提供される。ＧＩＬＴ修飾酵素の細胞内への取り込みについての能力は、ＧＩＬＴ修飾β−グルクロニダーゼを使用して確立され、このＧＩＬＴ修飾β−グルクロニダーゼは、過剰なＩＧＦ−ＩＩと競合的であるプロセスにおいて、線維芽細胞によって効率的に取り込まれる。ＧＩＬＴ修飾の利点は、Ｍ６Ｐ／ＩＧＦ−ＩＩレセプターへの結合の増加、標的細胞のリソソーム内への取り込みの増強、薬理動態の変更または改善、および組織分布範囲の拡大、変更または改善である。組織分布範囲の改善は、ＩＧＦタンパク質が血液脳関門を実際に通過するので、ＧＩＬＴ修飾α−ＧＡＬ  Ａの血液脳関門を横切る送達を包含し得る。
【０１５８】
ＧＩＬＴ系の別の利点は、Ｍ６Ｐ修飾が起こらない非哺乳動物の発現系において、取り込み適合性のタンパク質を生成する能力である。特定の実施形態において、ＧＩＬＴ修飾タンパク質は、主に、ＣＨＯ細胞において生成される。特定の他の実施形態において、このＧＩＬＴタグは、α−ＧＡＬ  Ａのｃ末端に配置されるが、本発明はこのようには限定されない。
【０１５９】
（実施例１３Ｂ．ポーンプ病のためのＧＩＬＴ修飾酵素置換治療）
これらの実験の目的は、ポーンプ病のための酵素置換治療剤としてのＧＩＬＴ修飾酸α−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）の効力を評価することである。
【０１６０】
本発明のグリコシル化依存性リソソーム標的化（ＧＩＬＴ）技術は、ＧＡＡの患者リソソームへのＭ６Ｐ非依存性標的化を可能にする。１つの実施形態において、ＧＡＡまたはその触媒的活性フラグメントを、そのＮ末端で、ヒトＩＧＦ−ＩＩのシグナルペプチドを含む標的化部分に融合する。シグナルペプチドを含む標的化部分は、ＧＡＡの宿主細胞からの分泌を改善し、それにより、高収率の産生を達成し、そして治療的ＧＩＬＴ修飾ＧＡＡの回収を容易にする。１つの実施形態において、ハイブリッドＧＡＡ遺伝子カセットを作製し、このハイブリッドＧＡＡ遺伝子カセットにおいて、ヒトＩＧＦ−ＩＩシグナルペプチドおよび所望の修飾を含む成熟ＩＧＦ−ＩＩコード配列を、ＧＡＡカセットのＮ末端に、Ｈｉｓ２９（ＣＯＳ−１細胞においてシグナルペプチド切断が観察される部位）または別の適切な部位で融合する（Ｗｉｓｓｅｌａａｒら（１９９３）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２６８（３）：２２２３−３１）。あるいは、所望のＧＩＬＴタグを、公知の切断部位の下流の部位に配置し、潜在的なタンパク質分解性プロセシングによるＧＩＬＴタグの除去を防止し得る。例示的なＮ末端ＧＩＬＴタグ化ＧＡＡカセットを、図２０に図示する。
【０１６１】
別の実施形態において、ハイブリッドＧＡＡ遺伝子カセットを作製し、このハイブリッドＧＡＡ遺伝子カセットにおいて、ヒトＧＡＡ遺伝子に、一連の成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩペプチドタグの１つをコードする３’ＤＮＡセグメントをインフレームで付加する。融合は、９５２位のＣ末端Ｃｙｓの後またはＣｙｓ９５２の上流の部位のどちらかで生じ得る。また、Ｃ末端から上流にＧＩＬＴタグを配置することは、潜在的タンパク質分解部位および成熟ＧＡＡタンパク質に存在しない２つのグリコシル化部位を除去する。マンノースレセプターを介したクリアランスにおける多糖類粒子は、Ｃ末端から上流へのＧＩＬＴタグの配置によってＧＡＡにおけるグリコシル化を低下させるため、ＧＩＬＴ修飾ＧＡＡの半減期を上昇させるはずである。Ｃ末端から残基８１６までの１０アミノ酸残基毎に、Ｃ末端ＧＩＬＴタグを配置するために構築物を設計し、これらのタグは、予測される成熟７０ｋＤａ酵素のＣ末端の上流の限界を標識する。例示的なＣ末端ＧＩＬＴタグ化ＧＡＡカセットを、図２１に示す。
【０１６２】
なお別の実施形態において、ハイブリッドＧＡＡ遺伝子カセットを作製し、このハイブリッドＧＡＡ遺伝子カセットにおいて、所望のＧＩＬＴタグがＧＡＡカセットのＮ末端およびＣ末端の両方に融合される。
【０１６３】
上述のＧＩＬＴ修飾ＧＡＡ構築物のいずれが最も酵素学的に活性でありかつ取り込み能力が高い（ｕｐｔａｋｅ−ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）かを同定するため、この構築物を、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、または他の適切な細胞内にトランスフェクトし、活性な酵素についておよびポンペ線維芽細胞への取り込みについて、クローンのプールからの培養上清をアッセイする。
【０１６４】
酵素活性を試験するために、蛍光基質４−メチルウムベリフェリル−α−Ｄ−グルコピラノシド（Ｒｅｕｓｅｒら（１９７８）Ａｍ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ，３０（２）：１３２−４３）または比色（ｃｏｌｏｒｏｍｅｔｒｉｃ）基質ｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−グルコピラノシドを使用して、ＧＡＡ活性について培養上清をアッセイする。総酵素活性を、細胞数に対して基準化し、種々のクローン細胞株によって達成される発現の相対レベルを比較する。取り込み能力（ｕｐｔａｋｅ  ｃｏｍｐｅｔｅｎｃｙ）を試験するため、培養培地を回収し、濾過し、ポンペ線維芽細胞に供する。取り込みの特異性を評価するため、細胞を、５ｍＭのＭ６ＰもしくはＩＧＦ−ＩＩ、またはその両方の、存在下または非存在下で、３〜１６時間インキュベートする。ポンペ線維芽細胞を回収し、ＧＡＡ活性を有する細胞を測定する。
【０１６５】
最も有望な取り込み特性および／または酵素活性を有するＧＩＬＴ修飾ＧＡＡを、ＣＨＯ細胞または他の適切な発現系における大量生成のために選択する。
【０１６６】
ＧＡＡ欠損マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手可能）を使用して、ＧＩＬＴ修飾ＧＡＡの能力を評価し、組織からのグリコーゲンの蓄積を明らかにする（Ｂｉｊｖｏｅｔら（１９９９）Ｊ．  Ｐａｔｈｏｌ．，１８９（３）：４１６−２４；Ｒａｂｅｎら（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３（３０）：１９０８６−９２）。１つの例示的なプロトコールとしては３〜５匹のマウスの、１００ｍｇ／ｋｇまでの用量での４週毎の注射が挙げられる。注射したマウスの評価としては、選択した組織（種々の筋組織、心臓、および肝臓が挙げられる）におけるグリコーゲンおよびＧＡＡ活性の生化学的分析、ならびに組織におけるグリコーゲン蓄積を可視化する組織病理学的分析が挙げられる。
【０１６７】
（ＧＡＡ構築物）
Ｈｕｍａｎ  Ｉｍａｇｅ  ｃＤＮＡクローン番号４３７４２３８を、Ｏｐｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから入手した。このクローンは、ヒトＧＡＡをコードする、全長のｃＤＮＡを含む。これは精巣由来のＮＩＨ  ＭＧＣ  ９７ライブラリーから単離され、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにクローン化されている（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＧＡＡ）。ＧＡＡのクローン番号４３７４２３８における配列を、図２２および配列番号２３に示す。クローン番号４３７４２３８におけるＧＡＡの配列分析により、ＧｅｎＢａｎｋ配列ＮＭ０００１５２と比較して４つのサイレント（ｓｉｌｅｎｔ）なヌクレオチド変化を有する全長のｃＤＮＡの存在が確認された。これらの３つは、ＧＡＡ：
【０１６８】
【数１】
0004828121.tif 000011
における通常の１ヌクレオチド多型としてこれまでに記載されている。太字の残基は、クローン４３７４２３８中に存在する。これらの３つの多型についての予測されるヘテロ接合性は、集団全体においてそれぞれ約０．２３、０．４、および０．４２である。４つ目の多型は、
【０１６９】
【数２】
0004828121.tif 000012
である。
【０１７０】
例示的なＣ末端ＧＩＬＴタグ化ＧＡＡカセットを、図２１に図示する。種々の位置にＣ末端ＧＩＬＴタグを有するＧＡＡカセットの最初のセットを、クローン４３７４２３８をテンプレートとして使用するＰＣＲによって構築する。ＧＡＡオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、２８５９残基長である。ＰＣＲによって生じる変異を最小化するため、５’プライマーＧＡＡ１３（配列番号２５）および３’プライマーＧＡＡ１４（配列番号２６）を使用するＰＣＲによってＯＲＦの５’側半分をまず増幅する。これらのプライマーは、残基１６４９位で特異的ＳａｎＤＩ制限部位にアニールする。このＰＣＲ産物を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのＥｃｏＲＩ部位とＸｂａＩ部位との間にライゲーションし、プラスミドｐ５’ＧＡＡを作製する。次に、５’プライマーＧＡＡ  １５（配列番号２７）を用いてＧＡＡ  ＯＲＦの３’部分を増幅し、これは、表８に記載のように、ＳａｎＤＩ部位および３’プライマーのセットの１つ（３０ヌクレオチドによって一連の末端オフセットを特定するために設計される）を備える。各ＧＡＡ  １６〜ＧＡＡ  ２６のプライマーは、ＧＩＬＴタグのライゲーションのためにＡｓｃＩ部位を、そしてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔへのクローン化のためにＸｂａＩ部位を含む。プライマーを表８に示す：ＧＡＡ  １６〜ＧＡＡ  ２６プライマーの小文字部分は、設計されたＡｓｃＩ部位およびＸｂａＩ部位を含み、一方、大文字の部分は、ＧＡＡ遺伝子配列を含む。ネイティブの終止コドンを含み、ＡｓｃＩ部位を欠くプライマーＧＡＡ  ２７を使用し、全長かつ非タグ化のクローンを作製する。増幅した３’部分をｐ５’ＧＡＡにＳａｎＤＩおよびＸｂａＩ部位でライゲーションする。これは、一連のＧＡＡカセットを作製し、ＡｓｃＩ部位およびＸｂａＩ部位を用いて、これにＧＩＬＴタグを挿入する。次いで、ＨＥＫ２９３細胞内へのトランスフェクションのために、完全なＧＩＬＴタグ化ＧＡＡカセットを発現ベクターｐＣＥＰ４内にクローン化する。
【０１７１】
【表８】
0004828121.tif 000013
注記：ＧＡＡ  １６〜ＧＡＡ  ２７およびＧＡＡ１４のプライマーは、下側鎖プライマーである。ＧＡＡ  １６〜ＧＡＡ  ２６プライマーの小文字の部分は、設計したＡｓｃＩ部位およびＸｂａＩ部位を含む。ＧＡＡ  １３プライマーおよびＧＡＡ  １５プライマーは、上側鎖のプライマーである。ＧＡＡ  １３プライマーおよびＧＡＡ  １５プライマーの小文字の部分は、設計ＥｃｏＲＩ部位を含む。各プライマーの大文字部分が、ＧＡＡ遺伝子配列を含む。
【０１７２】
例示的なＮ末端ＧＩＬＴタグ化ＧＡＡカセットを、図２０に示す。５’Ｎ末端タグ化ＧＩＬＴカセットの構築物が、同様の様式で得られる。例えば、ＧＡＡのアミノ酸２９（ＣＯＳ細胞のシグナルペプチド切断部位）に融合するＧＩＬＴタグを有するＧＡＡカセットを構築するために、ＡｓｃＩ部位およびＥｃｏＲＩ部位ならびに残基Ｈｉｓ２９で開始するＧＡＡコード配列を含む５’プライマー、ならびにＧＡＡタンパク質の７７６位（開始位置に対応する）における特異的ＳｔｕＩ部位でアニールする３’プライマーを使用して、５’ＧＡＡカセットを増幅する。このフラグメントを、全長ＧＡＡを含むｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ内に、ＥｃｏＲＩ部位およびＳｔｕＩ部位でクローン化し（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＧＡＡ）、ネイティブアミノ末端を置換する。一旦このプラスミドが作製されると、所望のＧＩＬＴタグおよびシグナルペプチドを、ＥｃｏＲＩ部位とＡｓｃＩ部位との間にクローン化する。
【０１７３】
（実施例１４．不完全グリコシル化治療的タンパク質）
標的化治療物の効力は、標的化治療物の血清半減期の延長によって上昇し得る。肝性マンノースレセプターおよびアシアロ糖タンパク質レセプターは、特異的炭水化物構造を認識することにより、循環から糖タンパク質を消滅させる（Ｌｅｅら（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９５（５５６１）：１８９８−１９０１；Ｉｓｈｉｂａｓｈｉら（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９（４５）：２７８０３−６）。幾つかの実施形態において、本発明は、リソソームへの治療物の標的化、および／または炭水化物に非依存的だがポリペプチドまたはそのアナログに依存する様式での血管脳関門の通過を可能にする。マンノースレセプターおよびアシアロ糖タンパク質レセプターによる循環からのその除去を最小化することにより、これらのタンパク質の実際の不完全グリコシル化は、循環におけるその半減期を大幅に延長することが予測される。同様に、機能的脱グリコシル化（例えば、過ヨウ素酸塩／水素化ホウ素ナトリウム処理によって治療的タンパク質において炭水化物残基を修飾することによる）は、１つ以上のクリアランス経路による炭水化物の認識を妨害することにより、同様の効果をもたらす。それにもかかわらず、ほとんどの実施形態においてタンパク質の標的化は炭水化物−レセプター相互作用よりむしろタンパク質−レセプター相互作用に基づくため、グリコシル化の修飾または消失は、タンパク質のリソソームへの標的化および／または脳血管門の通過に悪影響を及ぼさない。
【０１７４】
ペプチド標的性シグナルを使用する任意のリソソーム酵素（例えば、ＩＧＦ−ＩＩ）を、化学的にもしくは酵素学的に脱グリコシル化し得るか、または、所望の特性（特異的リソソーム標的性に加え、長期間の血清半減期）を有する治療物を産生するために改変し得る。幾つかのリソソーム蓄積症の場合において、マンノースレセプターを介して治療物をマクロファージまたは関連する細胞型に送達するために重要であり得る場合、完全グリコシル化治療物を、不完全グリコシル化標的化治療物と併用して使用し、広範な種々の細胞型に対する標的化を達成し得る。
【０１７５】
（合成時のタンパク質不完全グリコシル化）
幾つかの場合、完全グリコシル化タンパク質を産生しない系において、標的化治療的タンパク質を、最初に産生することが好ましい。例えば、標的化治療的タンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて産生され得、それにより、完全な非グリコシル化タンパク質を産生し得る。あるいは、非グリコシル化タンパク質を、ツニカマイシン（Ｄｏｌ−ＰＰ−ＧｌｃＮＡｃ形成のインヒビター）で処理した哺乳動物細胞内で産生する。しかし、特定の標的化治療物が、グリコシル化の非存在下で正確に折りたたまれない場合、これは、好ましくは、まずグリコシル化タンパク質として産生され、そしてその後、脱グリコシル化されるかまたは機能的不完全グリコシル化を受ける。
【０１７６】
また、標的化治療的タンパク質をコードする遺伝子を操作し、通常はグリコシル化のためのアクセプターとして役目を果たすアミノ酸を、異なったアミノ酸に変えることによって、不完全グリコシル化標的化治療的タンパク質を調製し得る。例えば、Ｎ連結グリコシル化のためのアクセプターとして役目を果たすアスパラギン残基を、グルタミン残基またはグリコシル化アクセプターではない別の残基に置換し得る。この保存的置換は、おそらく酵素構造に最小の影響を有すると思われるが、一方、この部位でのグリコシル化を除去する。あるいは、グリコシル化アクセプターの近傍の他のアミノ酸を修飾し、通常グリコシル化されるアミノ酸を必ずしも変えることなく、グリコシル化酵素のための認識モチーフを破壊し得る。
【０１７７】
ＧＵＳの場合、４つの潜在的グリコシル化部位のいずれか１つの除去は、グリコシル化の量を減少させるが、十分な酵素活性が残る  （Ｓｈｉｐｌｅｙら（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８（１６）：１２１９３−８）。ＧＵＳからの２つのグリコシル化部位の幾つかのセットの除去は、まだ顕著な酵素活性を許容する。細胞をツニカマイシンで処理することによる４つ全てのグリコシル化部位の除去は、酵素活性を消失させるが、精製した酵素の脱グリコシル化は、酵素的に活性な物質をもたらす。従って、グリコシル化部位の除去に伴う活性の喪失は、酵素の誤った折りたたみに起因すると考えられる。
【０１７８】
しかし、他の酵素は、グリコシル化の非存在下でさえも正確に折りたたまれる。例えば、細菌性グルクロニダーゼは、天然に非グリコシル化されて、本発明の標的性部分を用いて、哺乳動物リソソームを標的化し得、そして／または血管脳関門を横切り得る。このような酵素を、例えば、グリコシル化タンパク質として合成した後に脱グリコシル化するより、非グリコシル化条件で合成し得る。
【０１７９】
（脱グリコシル化）
標的化治療物は、哺乳動物細胞培養系において産生される場合、これは、好ましくは増殖培地中に分泌される。これを回収し、その後、例えばクロマトグラフィー精製プロトコール（例えば、イオン交換、ゲル濾過、疎水性クロマトグラフィー、ＣｏｎＡクロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、または免疫アフィニティクロマトグラフィーが挙げられる）によって標的化治療物の精製を可能にする。
【０１８０】
糖タンパク質の化学的脱グリコシル化は、多くの方法（トリフルオロメタンスルホン酸（ＴＦＭＳ）処理、またはフッ化水素（ＨＦ）処理が挙げられる）によって達成され得る。
【０１８１】
ＴＦＭＳによる化学的脱グリコシル化（Ｓｏｊａｒら（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４（５）：２５５２−９；Ｓｏｊａｒら（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１３８：３４１−５０）：１ｍｇ  ＧＩＬＴ−ＧＵＳを、減圧下で一晩乾燥させる。乾燥したタンパク質を、０℃で０．５〜２時間、窒素下で時々撹拌しながら、１５０μｌのＴＦＭＳで処理する。反応混合物を、ドライアイス−エタノール浴中で−２０℃未満まで冷却し、予め冷却した（−２０℃）水中６０％ピリミジン溶液を徐々に添加することにより、この反応物を中性化する。次いで、中性化反応混合物を、ＮＨ４ＨＣＯ３を数回交換して、４℃でｐＨ７で透析する。ＴＦＭＳによる化学的脱グリコシル化は、処理したタンパク質に対してメチル化、スクシニミド形成、およびアスパラギン残基の異性化を含む修飾をもたらし得る（Ｄｏｕｇｌａｓｓら（２００１）Ｊ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍ．２０（７）：５７１−６）。
【０１８２】
ＨＦによる化学的脱グリコシル化（Ｓｏｊａｒら（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１３８：３４１−５０）：この反応を、例えば、Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．から入手し得る閉鎖反応系において実行する。１０ｍｇ  ＧＩＬＴ−ＧＵＳを減圧乾燥し、反応容器内に入れ、次いで、この反応容器をＨＦ装置に連結する。全ＨＦラインを排出後、反応容器を撹拌しながら、レザバから１０ｍＬの無水ＨＦを蒸留する。この反応を、０℃で１〜２時間続ける。その後、１５〜３０分にわたって水吸引機でＨＦを除去する。僅少残留ＨＦを、高減圧下で除去する。この反応混合物を、２ｍＬの０．２Ｍ  ＮａＯＨ中に溶解し、残留するＨＦ全てを中性化し、そして冷０．２Ｍ  ＨＣｌで、ｐＨを７．５に再調整する。
【０１８３】
酵素的脱グリコシル化（Ｔｈｏｔａｋｕｒａら（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１３８：３５０−９）：タンパク質Ｎ−グリコシダーゼ（ＰＮＧａｓｅ）Ａまたはタンパク質Ｎ−グリコシダーゼＦを用いて、Ｎ連結炭水化物を糖タンパク質から完全に除去し得る。１つの実施形態において、グリコシダーゼによる処理の前に糖タンパク質を変性させ、糖タンパク質上の酵素の作用を促進する；上記段落の「インビトロでのリフォールディング」で考察したように、糖タンパク質は、その後リフォールドされる。別の実施形態において、過剰なグリコシダーゼを使用し、ネイティブの糖タンパク質を処理して、効率的な脱グリコシル化を促進する。幾つかの細胞型（例えば、ＣＨＯ由来Ｌｅｃ１細胞株）は、実施例１４Ｄに記載のように、少ないグリコシル化または単純なグリコシル化を有する糖タンパク質を産生し、その後の酵素的脱グリコシル化を促進する。
【０１８４】
実際に不完全グリコシル化された標的化治療的タンパク質の場合、グリコシル化の減少が、標的化治療的タンパク質のプロテアーゼ感受性部位を明らかにし、タンパク質の半減期を減少させることが可能である。Ｎ連結グリコシル化は、タンパク質分解からリソソームの酵素のサブセットを保護することが知られている（Ｋｕｎｄｒａら（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４（４３）：３１０３９−４６）。このようなプロテアーゼ感受性部位は、好ましくは、タンパク質の外で（例えば、部位特異的変異誘発によって）操作される。以下で考察されるように、炭水化物全体の除去よりも、不完全な脱グリコシル化または炭水化物構造の修飾により、プロテアーゼ感受性部位または潜在的エピトープのいずれかを明らかにする危険性を、最小限にし得る。
【０１８５】
（炭水化物構造の修飾または部分的脱グリコシル化）
幾つかの実施形態において、治療的タンパク質は、部分的に脱グリコシル化される。例えば、治療的タンパク質を、エンドグリコシダーゼ（例えば、Ｎ連結高マンノース炭水化物（ｈｉｇｈ  ｍａｎｎｏｓｅ  ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ）を切断するが、複合型炭水化物は切断しない、エンドグリコシダーゼＨ）で処理し、アスパラギンに連結した１つのＧｌｃＮＡｃ残基を残し得る。このような方法で処理した治療的タンパク質は、高マンノース炭水化物を欠き、肝性マンノースレセプターとの相互作用を低下する。たとえこのレセプターが末端ＧｌｃＮＡｃを認識するとしても、タンパク質表面上の１つのＧｌｃＮＡｃとの生産的相互作用の確率は、インタクトな高マンノース構造と同じほど高くはない。治療的タンパク質が哺乳動物細胞において産生される場合、タンパク質上に存在する任意の複合炭水化物は、エンドグリコシダーゼＨ（ｅｎｄｏＨ）処理によって影響を受けないままであり、そして末端でシアリル化され、これにより、肝性炭水化物認識レセプターとの相互作用を減少させ得る。従って、このようなタンパク質は、延長した半減期を有するようである。同時に、残留する炭水化物による立体障害は、タンパク質表面上の潜在的エピトープを免疫系から保護し、（例えば、プロテアーゼ富化リソソーム環境において）タンパク質表面へのプロテアーゼのアクセスを減少させる。
【０１８６】
他の実施形態において、治療的タンパク質のグリコシル化は、例えば、酸化、還元、脱水、置換、エステル化、アルキル化、シアリル化、炭素−炭素結合切断などによって修飾され、血液からの治療的タンパク質のクリアランスを低下する。幾つかの好ましい実施形態において、治療的タンパク質は、シアリル化されない。例えば、過ヨウ素酸塩および水素化ホウ素ナトリウムでの処理は、糖タンパク質のほとんどの炭水化物構造を修飾するのに効果的である。過ヨウ素酸塩処理は、ビシナル（ｖｉｃｉｎａｌ）ジオールを酸化し、炭素−炭素結合を切断し、そしてヒドロキシル基をアルデヒド基で置換する；ホウ化水素は、アルデヒドをヒドロキシルに還元する。多くの糖残基は、ビシナルジオールを含み、それ故に、この処理によって切断される。図９Ａに示されるように、タンパク質は、アスパラギン残基において高マンノース炭水化物（アスパラギンに隣接するＮ−アセチルグルコサミン残基および構造中のあらゆる位置におけるマンノース残基を含む）を用いてグリコシル化され得る。図９Ｂにおいて示されるように、末端マンノース残基は、ヒドロキシル基を有する３個の連続する炭素を有する；含まれる両方の炭素−炭素結合は、過ヨウ素酸塩処理によって切断される。幾つかの非末端マンノース残基はまた、ビシナルジオール含み、これは、同様に切断される。それでもなお、この処理は環状炭水化物を直鎖状炭水化物に変換するが、完全に炭水化物を除去せず、潜在的にタンパク質感受性または抗原性のポリペプチド部位を露出する危険性を最小限にする。
【０１８７】
リソソームの酵素であるβ−グルクロニダーゼの半減期は、過ヨウ素酸塩および水素化ホウ素ナトリウムでの一連の処理の後、１０倍を超えて延長することが知られる（Ｈｏｕｂａら（１９９６）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．７（５）：６０６−１１；Ｓｔａｈｌら（１９７６）ＰＮＡＳ  ７３：４０４５−４０４９；Ａｃｈｏｒｄら（１９７７）Ｐｅｄｉａｔ．Ｒｅｓ．１１：８１６−８２２；Ａｃｈｏｒｄら（１９７８）Ｃｅｌｌ  １５（１）：２６９−７８）。同様に、リシンは、過ヨウ素酸塩とシアノ水素化ホウ素ナトリウムとの混合物で処理されている（Ｔｈｏｒｐｅら（１９８５）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４７：１９７）。ラットへの注射後、肝臓に吸収されたリシンの画分は、化学的処理により、注射した用量の４０％（未処理リシン）から２０％（修飾リシン）まで減少する。対照的に、血中のリシンの量は、２０％（未処理リシン）から４５％（修飾リシン）まで増加した。従って、処理したリシンは、循環においてより広範な組織分布およびより長い半減期に恵まれた。
【０１８８】
脱グリコシル化されるかまたは過ヨウ素酸塩および水素化ホウ素ナトリウムでの連続処理によって修飾される場合、本発明の標的性部分に結合するβ−グルコロニダーゼ構築物（または他の糖タンパク質）は、同様の（例えば、２倍を超えるか、４倍を超えるか、または１０倍を超える）半減期の延長に恵まれるが、カチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプターに対する高親和性をなお維持し、このレセプターを保有する全ての細胞型のリソソームに対する、この構築物の標的化を可能にする。この構築物はまた、血液脳関門を効率的に横切ることが予想される。対照的に、リソソーム標的化についてＭ６Ｐに依存するβ−グルクロニダーゼ調製物は、脱グリコシル化されるかまたは過ヨウ素酸塩および水素化ホウ素ナトリウムで処理される場合、より長い血清半減期に恵まれるが、リソソームを標的化し得ない。なぜなら、Ｍ６Ｐ標的化シグナルは、処理によって修飾されているからである。
【０１８９】
過ヨウ素酸塩および水素化ホウ素ナトリウムでの連続処理による炭水化物修飾を、以下のように実施し得る：精製ＧＩＬＴ−ＧＵＳを、５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）中４０ｍＭ  ＮａＩＯ４と共に２時間４℃でインキュベートする。反応を、過剰なエチレングリコールの添加によって停止し、反応混合物をＰＢＳ（ｐＨ７．５）で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５Ｍに通すことにより、未反応試薬を除去した。この処理の後、ＰＢＳ（ｐＨ７．５）中４０ｍＭ  ＮａＢＨ４と共に３７℃で３時間インキュベートし、次いで４℃で１時間インキュベートする。反応混合物をＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５Ｍカラムに通し、ＰＢＳ（ｐＨ  ７．５）で溶出して、反応を停止する。
【０１９０】
過ヨウ素酸塩および水素化ホウ素ナトリウムの処理の別のプロトコールは、Ｈｉｃｋｍａｎら（１９７４）ＢＢＲＣ  ５７：５５−６１に記載される。精製タンパク質を、０．０１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ  ６．０）、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ中で透析する。過ヨウ素酸ナトリウムを、最終濃度０．０１Ｍまで添加し、そして反応を、暗所中４℃で少なくとも６時間進める。これらの条件下でのβ−ヘキソサミニダーゼの過ヨウ素酸塩での処理は、線維芽細胞によるタンパク質の取り込みを十分に阻止する；取り込みは、線維芽細胞表面上のＭ６Ｐレセプターを有するβ−ヘキソサミニダーゼ上のＭ６Ｐ部分に通常依存する。従って、過ヨウ素酸塩酸化は、Ｍ６Ｐを十分に修飾し、Ｍ６Ｐレセプターと相互作用するその能力を減殺する。
【０１９１】
あるいは、炭水化物は、Ｔｈｏｒｐｅら（１９８５）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４７：１９７−２０６に開示されるような一工程反応における過ヨウ素酸塩およびシアノ水素化ホウ素ナトリウムでの処理によって修飾され得る。
【０１９２】
部分的脱グリコシル化タンパク質または修飾されたグリコシル化パターンを有するタンパク質における炭水化物の存在は、潜在的ポリペプチドエピトープを保護するはずであり、このエピトープは、グリコシル化の完全な非存在によってむき出しにされ得る。治療的タンパク質が免疫応答を引き起こす事象において、免疫抑制治療は、治療的タンパク質とともに使用され得る（Ｂｒｏｏｋｓ（１９９９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ６８：２６８−２７５）。例えば、アルグルセラーゼ（ａｌｇｌｕｃｅｒａｓｅ）で処置された約１５％のゴーシェ病患者が、免疫応答を発達させたことが報告されている（Ｂｅｕｔｌｅｒら，Ｔｈｅ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｓｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ（第８版）（２００１），Ｓｃｒｉｖｅｒら編，ｐｐ．３６３５−３６６８）。幸運にも、アルグルセラーゼに対する抗体を産生した患者の多く（８２／１４２）が、通常の処置レジメンによって寛容化された（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら（１９９９）Ｂｌｏｏｄ  ９３：２０８１−２０８８）。従って、免疫応答を発達し得る少数の患者を利するために、本発明の幾つかの実施形態において、治療的タンパク質を受ける患者はまた、免疫抑制治療をも受ける。
【０１９３】
（試験）
タンパク質が不完全グリコシル化されることを確認するために、これをＣｏｎＡに曝露することによって試験し得る。不完全グリコシル化タンパク質は、対応する完全にグリコシル化されたタンパク質を比較した場合、ＣｏｎＡセファロースへの結合の減少を実証することが予測される。
【０１９４】
また、実際に不完全グリコシル化したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析し得、対応する完全にグリコシル化されたタンパク質と比較する。例えば、化学的に脱グリコシル化したＧＵＳ−ＧＩＬＴを、未処理（グリコシル化）ＧＵＳ−ＧＩＬＴおよびＰＮＧａｓｅ  Ａによって調製した酵素学的脱グリコシル化ＧＵＳ−ＧＩＬＴと比較し得る。不完全グリコシル化タンパク質は、完全にグリコシル化されたタンパク質と比較した場合、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいてより大きな移動度を有することが予測される。
【０１９５】
不完全グリコシル化標的化治療的タンパク質は、標的性ドメインに依存する取り込みを示す。不完全グリコシル化タンパク質は、マンノースまたはＭ６Ｐに依存する取り込みの低下（および、好ましくは、実質的に取り込みがない）を示すはずである。これらの性質は、細胞取り込み実験において、実験的に確認され得る。
【０１９６】
例えば、哺乳動物細胞において合成され、その後過ヨウ素酸塩およびホウ化水素で処理されたＧＵＳ−ＧＩＬＴタンパク質を、Ｍ６Ｐ依存性取り込みおよびマンノース依存性取り込みを試験することによって機能的脱グリコシル化について試験し得る。Ｍ６Ｐ依存性取り込みが低下していることを実証するため、ＧＭ４６６８線維芽細胞を用いて、取り込みアッセイを行う。競合物の非存在において、処理酵素および未処理酵素は、それぞれ有意な取り込みを示す。過剰ＩＧＦ−ＩＩの存在は、実質的に処理酵素および未処理酵素の取り込みを低下するが、未処理酵素は、Ｍ６Ｐ依存性経路を介した残渣取り込みを保持する。過剰Ｍ６Ｐは、未処理酵素の取り込みを低下するが、機能的脱グリコシル化タンパク質の取り込みの低下において、実質的にあまり効率的でない。処理酵素および未処理酵素について、両方の競合物の同時存在は、実質的に取り込みをなくす。
【０１９７】
マンノース依存性取り込みを評価するための取り込みアッセイを、Ｊ７７４−Ｅ細胞、マンノースレセプターを保有するマウスマクロファージ様細胞株、必要である場合、僅かだがＭ６Ｐレセプターを用いて実行する（Ｄｉｍｅｎｔら（１９８７）Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｂｉｏｌ．４２：４８５−４９０）。細胞を、１０％ＦＢＳ、４ｍＭグルタミン、および抗生抗真菌溶液で（Ｓｉｇｍａ，Ａ−５９５５）補填したＤＭＥＭ、低グルコース中で培養する。これらの細胞を用いる取り込みアッセイを、線維芽細胞で行ったアッセイと同一の様式で実行する。過剰なＭ６Ｐおよび過剰なＩＧＦ−ＩＩ（これらは任意の残留Ｍ６Ｐ／ＩＧＦ−ＩＩレセプターに起因する取り込みを消滅させる）の存在下で、完全にグリコシル化された酵素は、マンノースレセプターとの相互作用に起因して有意な取り込みを示す。不完全グリコシル化酵素は、これらの条件下で、実質的に減少した取り込みを示すと予測される。完全にグリコシル化された酵素のマンノースレセプター依存性取り込みは、過剰（１００μｇ／ｍＬ）マンナンの添加によって競合され得る。
【０１９８】
脱グリコシル化されたＧＵＳ−ＧＩＬＴのの薬物速度論を、１時点あたり３匹のＭＰＳＶＩＩマウスの群に２０，０００酵素単位の静脈内注射を与えることによって決定し得る。各時点について、５０μＬの血液を、酵素活性についてアッセイする。
【０１９９】
（実施例１４Ａ．ＧＵＳΔＣ１８−ＧＩＬＴΔ１−７の脱グリコシル化）
ＧＵＳΔＣ１８−ＧＩＬＴΔ１−７を、エンドグリコシラーゼＦ１で処理し、グリコシル化を減少させた。具体的には、０．５ｍｇのＧＵＳΔＣ１８−ＧＩＬＴΔ１−７を、２５μＬのエンドグリコシダーゼＦ１（Ｐｒｏｚｙｍｅ，Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）と共に３７℃で７．５時間、２５０〜３００μＬの最終容量の５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．５）中でインキュベートした。インキュベートの後、ＧＵＳΔＣ１８−ＧＩＬＴΔ１−７を、５０ｋＤ分子量カットオフのＣｅｎｔｒｉｃｏｎスピン濃縮器（ｓｐｉｎ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ）中で繰り返し濃縮し、ＧＵＳΔＣ１８−ＧＩＬＴΔ１−７をエンドグリコシダーゼＦ１から分離した。
【０２００】
分離実験において、ＧＵＳΔＣ１８−ＧＩＬＴΔ１−７を、エンドグリコシダーゼＦ１およびエンドグリコシダーゼＦ２の両方で処理した。具体的には、１２８μＬのＧＵＳΔＣ１８−ＧＩＬＴΔ１−７（７７９万単位／ｍＬ）を、上記のように１２．８μＬの各エンドグリコシダーゼ（それぞれＰｒｏｚｙｍｅより）と共に、収容量３２５μＬの５０ｍＭリン酸（ｐＨ５．５）中で３７℃で６時間インキュベートし、その後、スピン濃縮器で精製した。
【０２０１】
エンドグリコシダーゼＦ１で処理した１〜３μｇのＧＵＳΔＣ１８−ＧＩＬＴΔ１−７を、７．５％ポリアクリルアミドゲルによる電気泳動によって解析した。このゲルを、クーマシーブリリアントブルー色素で染色した（図１０に示す）。ΔΔＮとは、未処理ＧＵＳΔＣ１８−ＧＩＬＴΔ１−７をいう。ＨＢＧ５とは、非タグ化ヒトβグルクロニダーゼをいい、これは、タグ化ＧＵＳΔＣ１８−ＧＩＬＴΔ１−７よりも低い分子量かつより大きな移動度を有する。処理ＧＵＳΔＣ１８−ＧＩＬＴΔ１−７を、ΔΔＮ＋Ｆ１で示し、これは、未処理タンパク質と比較して、平均で中程度の増大した移動度を有し、タンパク質の少なくとも部分的な脱グリコシル化に一致する。移動度のさらなる増大が、エンドグリコシダーゼＦ１およびエンドグリコシダーゼＦ２の両方で処理したＧＵＳΔＣ１８−ＧＩＬＴΔ１−７のサンプルにおいて観察され（データは示さない）、さらにエンドグリコシダーゼＦ１のみが部分的にこのタンパク質を脱グリコシル化することを示唆する。
【０２０２】
（実施例１４Ｂ．脱グリコシル化タンパク質のインビトロ取り込み）
培養したムコ多糖類ＶＩＩ皮膚線維芽細胞ＧＭ４６６８細胞を使用し、エンドグリコシダーゼＦ１で処理したか未処理のＧＵＳΔＣ１８−ＧＩＬＴΔ１−７の取り込みを評価した。具体的には、細胞を、５％  ＣＯ２中３７℃で、ＤＭＥＭ低グルコース＋４ｍＭグルタミン＋抗生物質／抗真菌剤＋１５％  ＦＢＳ（熱不活性せず）中で増殖させた。細胞の継代を、スクレーパ（ｓｃｒａｐｅｒ）で行った。細胞を、Ｔ７５フラスコ中で、約５０〜８０％のコンフルーエンシーまで培養した（７５ｃｍ２表面積）。取り込み実験の前日、細胞を１２ウェル組織培養プレートに分けた（４６ｃｍ２総表面積）。細胞を、１〜４時間再接着させ、次いで、培地を交換し、その後細胞を一晩増殖させた。
【０２０３】
取り込み実験を、３連で行った。取り込み培地は、ＤＭＥＭ低グルコース＋２％  ＢＳＡ（ＳｉｇｍａＡ−７０３０）＋４ｍＭグルタミン＋抗生物質／抗真菌剤である。取り込み培地＋酵素の最終容量は、１ｍＬ／ウェルである。細胞を、取り込み培地で洗浄し、そして取り込み培地＋β−グルクロニダーゼ（Ｍ６Ｐ）、未処理ＧＵＳΔＣ１８−ＧＩＬＴΔ１−７（ＧＩＬＴ）、またはエンドグリコシダーゼＦ１（ＧＩＬＴ＋Ｆ１）（約４０００単位）処理後のＧＵＳΔＣ１８−ＧＩＬＴΔ１−７中で、２ｍＭマンノース−６−リン酸（＋Ｍ６Ｐ）または２．８６ｍＭ組換えＩＧＦ−ＩＩ（＋Ｔａｇ）を添加または添加せずに、３時間インキュベートした。次いで、培地を除去し、各ウェルを４×１ｍＬ  ＰＢＳで洗浄し、そして細胞を、２００μＬの溶解緩衝液（１００ｍＬ溶解緩衝液：１ｍＬの１Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ  ７．５）、２ｍＬ  ＮａＣＩ、１ｍＬの０．５Ｍ  ＥＤＴＡ、９６ｍＬ水；１ｍＬの溶解緩衝液につき１０μＬのＮＰ−４０を使用直前に加える）と共に、室温で５〜１０分間インキュベートした。全ての溶解物を微小遠心チューブ内に移し、全速で５分間遠心分離した。１０μＬの溶解物を、ＧＵＳ活性について２連でアッセイした。１０μＬの溶解物を、Ｐｉｅｒｃｅ’ｓ  Ｍｉｃｒｏ  ＢＣＡキットを用いて、総タンパク質濃度について３連でアッセイした。また、２μＬの取り込み培地を、ＧＵＳ活性について２連でアッセイした。
【０２０４】
図１１において示されるように、ＧＵＳΔＣ１８−ＧＩＬＴΔ１−７（エンドグリコシダーゼＦ１処理または未処理）は、マンノース−６−リン酸の存在下においてさえ、線維芽細胞によって効率的に取り込まれ、他方で、非タグ化β−グルクロニダーゼの取り込みは、マンノース−６−リン酸競合物の存在によって本質的に除去される。対照的に、ＩＧＦ−ＩＩは、ＧＵＳΔＣ１８−ＧＩＬＴΔ１−７タンパク質の取り込みを首尾よく阻害し、エンドグリコシダーゼＦ１で処理したタンパク質の取り込みを本質的に減殺した。これは、処理したタンパク質の取り込みが、ＧＩＬＴΔ１−７タグによって実際に媒介されることを示す。
【０２０５】
（実施例１４Ｃ．インビボ取り込み実験）
処理タンパク質または未処理タンパク質の循環における半減期を決定するため、カニューレ挿入Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを使用して実験を行った。１００，０００〜１５０，０００単位のＧＵＳΔＣ１８−ＧＩＬＴΔ１−７を静脈内投与し、タンパク質を、処理しないか（ＧＵＳΔＣ１８−ＧＩＬＴΔ１−７）、エンドグリコシダーゼＦ１およびエンドグリコシダーゼＦ２で処理（＋Ｆ１＋Ｆ２）したか、またはエンドグリコシダーゼＦ１およびエンドグリコシダーゼＦ２で処理後、リン酸緩衝化生理食塩水中５ｍＭジチオスレイトールと共に３７℃で４５分間インキュベーションを行ってＧＩＬＴタグを破壊した。その後定期的な間隔で、血液をカニューレを通して採取し、６０℃で１時間処理して内在性ラットグルクロニダーゼを不活性化し、そしてグルクロニダーゼ活性についてアッセイした。この結果を図１２に示す。タンパク質の半減期を、ＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈ  ｖ．３．５２を使用して初期時点をｙ＝ｅ−ｋｔの形態の等式に当てはめることによって評価した。未処理タンパク質の半減期を、８分間測定する。エンドグリコシダーゼＦ１およびエンドグリコシダーゼＦ２での処理は、約１３分間半減期を延長させる。このことは、脱グリコシル化における細網内皮クリアランス系の回避の改善と呼応する。ＤＴＴによる処理は、ＩＧＦ−ＩＩレセプターを介したタグ化酵素の取り込みを妨害し、そしてエンドグリコシダーゼＦ１／エンドグリコシダーゼＦ２処理タンパク質の半減期をさらに約１６分間延長させる。
【０２０６】
未処理ＧＵＳΔＣ１８−ＧＩＬＴΔ１−７（ＧＩＬＴ）、エンドグリコシダーゼＦ１処理ＧＵＳΔＣ１８−ＧＩＬＴΔ１−７（ＧＩＬＴ＋Ｆ１）の組織へのインビボ送達を、評価し、非タグ化β−グルクロニダーゼ（Ｍ６Ｐ）の送達と比較した。全てのタンパク質を、ＣＨＯ細胞中で産生した。体重１ｋｇあたり１ｍｇのＭ６Ｐ、ＧＩＬＴまたはＧＩＬＴ＋Ｆ１を、このタンパク質の尾静脈への注入によって、ＭＰＳＶＩＩマウスに投与した。コントロール動物（コントロール）に、緩衝液のみを注入した。２４時間後、動物を屠殺し、そして組織サンプルを分析のために回収した。図１３〜図１５に図示したデータは、６〜７匹の動物の各酵素での注入からの結果である。
【０２０７】
図１３は、肝臓、脾臓、および骨髄において検出された種々の酵素のレベルを示す。これらの組織においてマクロファージは豊富であり、そして主に高マンノースレセプターを介して、循環からこの酵素を除去する。ＧＩＬＴ＋Ｆ１は、未処理酵素より少ない高マンノース炭水化物を有し、これらの組織におけるより少ない蓄積が予測される。肝臓および骨髄において、エンドグリコシダーゼＦ１処理酵素の蓄積は、未処理酵素の蓄積とほぼ同等の多さであった。しかし、脾臓において、ＧＩＬＴ＋Ｆ１の蓄積の注目すべき減少が存在した。図１４に示すように、処理ＧＵＳΔＣ１８−ＧＩＬＴΔ１−７タンパク質および未処理ＧＵＳΔＣ１８−ＧＩＬＴΔ１−７タンパク質の両方は、心臓、腎臓および肺組織に効率的に到達し、非タグ化β−グルクロニダーゼの同等の蓄積または過剰な蓄積を有する。従って、ＧＩＬＴΔ１−７タグは、マンノース−６−燐酸と同じ組織に対する標的化を、同等またはよりよい効率で可能にする。さらに、図１５において示されるように、処理ＧＵＳΔＣ１８−ＧＩＬＴΔ１−７タンパク質および未処理ＧＵＳΔＣ１８−ＧＩＬＴΔ１−７タンパク質の両方は、非タグ化β−グルクロニダーゼについて観察されるレベルを超えるレベルで脳組織に到達するが、脳組織における蓄積レベルは、他の組織における蓄積レベルより極めて低かった。
【０２０８】
また、注入した動物から選択された組織を組織学に供し、Ｗｏｌｆら（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ  ３６０：７４９−７５３に記載のように、β−グルクロニダーゼを検出した。β−グルクロニダーゼは、赤い染色として検出される；核は、青で染色する。非タグ化β−グルクロニダーゼ（ＨＧＵＳ）、未処理ＧＵＳΔＣ１８−ＧＩＬＴΔ１−７（Ｄｄ−１５ｇｉｌｔ）、およびエンドグリコシダーゼＦ１処理ＧＵＳΔＣ１８−ＧＩＬＴΔ１−７（ｄｄ１５Ｆ１）についての肝臓組織学の結果を、図１６に示す。ＨＧＵＳスライド上で、伸長クップファー細胞は、強く赤く染まるが、他方、より緻密な細胞である一次肝細胞は、赤の染色を比較的僅かしか含まず、そして図中に白っぽい領域によって取り囲まれる青い核として現れる。対照的に、未処理ＧＵＳΔＣ１８−ＧＩＬＴΔ１−７または処理ＧＵＳΔＣ１８−ＧＩＬＴΔ１−７を含む他の２つのスライドの肝細胞は、ある程度強く染まり、これは、白によって取り巻かれる青の核の数の急な減少により証明される。このことは、何故エンドグリコシダーゼＦ１で処理したＧＵＳΔＣ１８−ＧＩＬＴΔ１−７でさえが肝臓になお有意に局在するかを解明することを助ける。タグ化タンパク質は、肝臓における細胞型のより多様なサブセットに到達する。従って、高マンノースレセプターによるクリアランスに対する対象はより少なくあり得るが、それにもかかわらず、多量のタンパク質が肝臓に達する。何故なら、これは、より多様な細胞を標的化するためである。
【０２０９】
さらなる組織学的データを、図１７〜１９に示す。図１７は、腎臓の糸球体への局在を示す。組織化学的染色は滅多に定量的ではないが、ＧＵＳΔＣ１８−ＧＩＬＴΔ１−７を注入した動物からのスライド（Ｄｄ−１５（未処理）およびＦ１（エンドグリコシダーゼＦ１で処理）として示す）は、非タグ化タンパク質を注入した動物からのスライドよりも強い染色を、糸球体において再現可能に示す。図１８および図１９において示すように、タグ化タンパク質は、エンドグリコシダーゼＦ１で処理しようと（ｄｄ−１５Ｆ１）しまいと（ｄｄ−１５）、非タグ化タンパク質（ＨＧＵＳ）が到達する細胞と同じ細胞に到達可能であると考えられる。
【０２１０】
（実施例１４Ｄ．脱グリコシル化Ｌｅｃ−１産生タンパク質）
ＧＵＳΔＣ１８−ＧＩＬＴΔ１−７タンパク質は、エンドグリコシダーゼＦ１で処理したＬｅｃ１細胞において産生され、標的化および取り込みについて、インビトロおよびインビボで試験される。ＡＴＣＣから産生されるＬｅｃ１細胞（ＡＴＣＣ登録番号ＣＲＬ１７３５）は、β−１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ（ＧｌｃＮＡｃ−Ｔ１）活性を欠くＣＨＯ由来の細胞である（Ｓｔａｎｌｅｙら（１９７５）Ｃｅｌｌ  ６（２）：１２１−８；Ｓｔａｎｌｅｙら，（１９７５）ＰＮＡＳ  ７２（９）：３３２３−７）。ＧＩｃＮＡｃ−Ｔ１は、Ｎ−アセチルグルコサミンを多糖類Ｍａｎ５−ＧｌｃＮＡｃ２−Ａｓｎの中心に加える。この添加は、複合体Ｎ連結多糖類およびハイブリッドＮ連結多糖類の合成における最初の必須の工程である。従って、Ｌｅｃ１細胞由来の糖タンパク質は、複合体多糖類およびハイブリッド多糖類を欠く。Ｌｅｃ１細胞は、高マンノース多糖類を保有する糖タンパク質を産生するが、これらの構造は、エンドグリコシダーゼＦ１の除去の影響を受けやすい。従って、その後エンドグリコシダーゼＦ１処理を受けるＬｅｃ１細胞におけるＧＩＬＴ−タグ化タンパク質の産生は、必ず脱グリコシル化タンパク質を生じる。動物の血流内に注射する場合、このようなタンパク質は、肝臓に常在するマクロファージにおけるマンノースレセプターによるクリアランスを回避し、標的組織においてより高いレベルで蓄積する。
【０２１１】
発現プラスミドｐＣＸＮ中のβ−ＧＵＳΔＣ１８−ＧＩＬＴΔ１−７カセットを、０．４ｃｍキュベット内において５０μＦおよび１，２００Ｖで、Ｌｅｃ１細胞内にエレクトロポレーションした。細胞を、１５％  ＦＢＳ、１．２ｍＭ  グルタミン、５０μｇ／ｍＬプロリン、および１ｍＭピルビン酸で補填したα−ＭＥＭ中で増殖させた。コロニーの選択および増幅を、４００μｇ／ｍＬ  Ｇ４１８で２〜３週間媒介した。純系株のコンフルーエントな培養物を、培地（２％  ＦＢＳ、１．２ｍＭ  グルタミン、および１ｍＭピルビン酸で補填したＷｅｙｍｏｕｔｈ培地）中に入れた。分泌された組換え酵素を含む培地を、２４〜７２時間ごとに回収した。１つの株Ｌｅｃ１−１８を、組換え酵素の最高の収率を産生するような酵素産生について選択した。
【０２１２】
Ｌｅｃ１細胞からの組換え酵素を、実施例１０に記載のように、抗ヒトβ−グルクロニダーゼＡｆｆｉｇｅｌ  １０樹脂を使用して、アフィニティ精製した。Ｌｅｃ１によって産生されたＧＩＬＴ−タグ化酵素の取り込みを、ＣＨＯ産生されたタグ化酵素または非タグ化酵素の取り込みと比較する。表９において示すように、タグ化したＬｅｃ１産生酵素は、対応するタグ化されたＣＨＯ産生酵素より高いＭ６Ｐ非依存性取り込みを、そして非タグ化（ＣＨＯ産生）酵素よりずっと高いＭ６Ｐ非依存性取り込みを示す。Ｌｅｃ１産生酵素のエンドグリコシダーゼＦ１での処理は、Ｍ６Ｐ非依存性結合を除去するが、ＩＧＦ−ＩＩ依存性結合を除去しない。図２３に示すように、エンドグリコシダーゼＦ１処理Ｌｅｃ１産生酵素および未処理Ｌｅｃ１産生酵素のＳＤＳ−ＰＡＧＥは、ＰＮＧａｓｅ  Ｆ処理酵素の移動度に近づく明らかな移動度の移動を示し、これは、完全に脱グリコシル化される。これは、Ｌｅｃ１産生酵素のエンドグリコシラーゼＦ１による処理が、グリコシル化の有意な喪失を引き起こすことを示唆する。対照的に、ＣＨＯ産生酵素もＨＥＫ産生酵素も、エンドグリコシダーゼＦ１での処理後に、移動度の明らかな移動を示さない。
【０２１３】
【表９】
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エンドグリコシダーゼＦ１処理Ｌｅｃ１産生酵素およびエンドグリコシダーゼＦ１処理ＣＨＯ産生酵素、ならびに未処理ＨＥＫ２９３産生酵素を、１ｍｇ／ｋｇの容量で、それぞれ３匹の免疫寛容性ＭＰＳＶＩＩマウス内に注入した（Ｓｌｙら（２００１）ＰＮＡＳ  ９８：２２０５−２２１０）。２４時間後、このマウスを屠殺し、そして組織を酵素活性についてアッセイした。図２４において示されるように、Ｌｅｃ１産生酵素は、ＣＨＯ産生酵素が蓄積するよりも、肝臓においてより少なく、そして心臓、筋肉および腎臓の標的組織においてより多く蓄積した。ＨＥＫ２９３産生酵素は、Ｌｅｃ１産生酵素より、心臓、筋肉および腎臓において、僅かに高い酵素の蓄積を示した。
【０２１４】
標的化組織における測定した酵素の蓄積は、組織に対する標的化の効率、および組織から酵素のクリアランスの速度の両方に依存する。リソソームへの適切な標的化の際に、Ｌｅｃ−１産生酵素がＣＨＯ産生酵素よりもよりゆっくりと分解されるのであれば、これは、蓄積のより高い観察されたレベルを説明し得る。一方、Ｌｅｃ−１産生酵素のより迅速な分解は、増強された標的化の効力を覆い隠し得る。この可能性に取り組むため、ＭＰＳＶＩＩ線維芽細胞による取り込みアッセイにおいて、処理Ｌｅｃ−１産生酵素および処理ＣＨＯ産生酵素、ならびに未処理Ｌｅｃ−１産生酵素および未処理ＣＨＯ産生酵素の半減期を試験した。この線維芽細胞を、酵素と共に３時間インキュベートし、この細胞を洗浄し、新鮮な培地中に移し、この培地を毎日交換した。０日目、３日目、および７日目に、各酵素につき二連のウェルを溶解した。残留酵素の画分を、時間に対してプロットし、そしてこのデータを、指数方程式に当てはめた。図２５に示すように、エンドグリコシラーゼＦ１処理Ｌｅｃ−１産生酵素が、ヒト線維芽細胞において、ＨＢＧ５の半減期と同様の半減期を有すること、およびＣＨＯ産生酵素の半減期より僅かに短い半減期を有することを見出した。
【０２１５】
（参考文献による援用）
本明細書中で開示された特許文献、科学的刊行物およびタンパク質データバンクの記録、ならびに米国特許仮出願第６０／２５０，４４６号（２０００年１１月３０日出願）；米国特許仮出願第６０／２８７，５３１号（２００１年４月３０日出願）；米国特許仮出願第６０／２９０，２８１号（２００１年５月１１日出願）；米国特許仮出願第６０／３０４，６０９，（２００１年７月１０日出願）；米国特許仮出願第６０／３２９，４６１号（２００１年１０月１５日出願）；国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０１／４４９３５号（２００１年１１月３０日出願）；米国特許仮出願第６０／３５１，２７６号（２００２年１月２３日出願）；米国第１０／１３６，８４１号および同第１０／１３６，６３９号（２００２年４月３０日出願）、米国第６０／３８４，４５２号（２００２年５月２９日出願）；米国第６０／３８６，０１９号（２００２年６月５日出願）；ならびに米国第６０／４０８，８１６号（２００２年９月６日出願）は、本出願中でこれらの全体が参考として援用される。
【図面の簡単な説明】
【０２１６】
【図１】図１は、不完全グリコシル化のいくつかの型を示す。
【図２Ａ】図２Ａは、ヒトＩＧＦ−ＩＩオープンリーディングフレーム（配列番号１）およびそのコードタンパク質（配列番号２）のマップである。成熟ＩＧＦ−ＩＩは、シグナルペプチド切断領域およびＣＯＯＨ切断領域を欠失する。ＩＧＦ−ＩＩシグナルペプチドおよび成熟ポリペプチドは、ＧＡＡコード配列に融合され得る。ＩＧＦ−ＩＩ部分は、修飾され、ＩＧＦ−ＩＩのＩＧＦ−ＩＩレセプターへの選択的結合を増強する種々の変異を組み込まれ得る。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ヒトＩＧＦ−ＩＩオープンリーディングフレーム（配列番号１）およびそのコードタンパク質（配列番号２）のマップである。成熟ＩＧＦ−ＩＩは、シグナルペプチド切断領域およびＣＯＯＨ切断領域を欠失する。ＩＧＦ−ＩＩシグナルペプチドおよび成熟ポリペプチドは、ＧＡＡコード配列に融合され得る。ＩＧＦ−ＩＩ部分は、修飾され、ＩＧＦ−ＩＩのＩＧＦ−ＩＩレセプターへの選択的結合を増強する種々の変異を組み込まれ得る。
【図３】図３は、ｐＩＲ１−ＳＡＴのＸｂａＩ部位において示された、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａコドンに最適化されたＩＧＦ−ＩＩである；核酸は、配列番号３であり、そしてコードタンパク質は、配列番号４である。
【図４Ａ】図４Ａは、本発明の好ましい実施形態の描写であり、シグナルペプチド配列、成体ヒトβ−グルクロニダーゼ配列、三つのアミノ酸の橋、およびＩＧＦ−ＩＩ配列を組み込む。示した核酸は配列番号５であり、コードタンパク質は配列番号６である。
【図４Ｂ】図４Ｂは、本発明の好ましい実施形態の描写であり、シグナルペプチド配列、成体ヒトβ−グルクロニダーゼ配列、三つのアミノ酸の橋、およびＩＧＦ−ＩＩ配列を組み込む。示した核酸は配列番号５であり、コードタンパク質は配列番号６である。
【図４Ｃ】図４Ｃは、本発明の好ましい実施形態の描写であり、シグナルペプチド配列、成体ヒトβ−グルクロニダーゼ配列、三つのアミノ酸の橋、およびＩＧＦ−ＩＩ配列を組み込む。示した核酸は配列番号５であり、コードタンパク質は配列番号６である。
【図４Ｄ】図４Ｄは、本発明の好ましい実施形態の描写であり、シグナルペプチド配列、成体ヒトβ−グルクロニダーゼ配列、三つのアミノ酸の橋、およびＩＧＦ−ＩＩ配列を組み込む。示した核酸は配列番号５であり、コードタンパク質は配列番号６である。
【図４Ｅ】図４Ｅは、本発明の好ましい実施形態の描写であり、シグナルペプチド配列、成体ヒトβ−グルクロニダーゼ配列、三つのアミノ酸の橋、およびＩＧＦ−ＩＩ配列を組み込む。示した核酸は配列番号５であり、コードタンパク質は配列番号６である。
【図５】図５は、ＧＵＳ、ＧＵＳ−ＩＧＦ−ＩＩ融合タンパク質（ＧＩＬＴ−ＧＵＳ）、ＩＧＦ−ＩＩ部分中にΔ１−７およびＹ２７Ｌの変異を有するＧＩＬＴ−ＧＵＳ（ＧＩＬＴ２−ＧＵＳ）またはネガティブコントロール（ＤＭＥＭ）に曝露した、ヒトムコ多糖症ＶＩＩ皮膚線維芽細胞ＧＭ４６６８細胞におけるβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）活性を示す。
【図６】図６は、過剰なＩＧＦ−ＩＩ（＋ＧＩＬＴ＋ＩＧＦ−ＩＩ）またはネガティブコントロール（ＧＭ４６６８）の存在下で、ＧＵＳ（＋βＧＵＳ）、ＧＵＳ−ＧＩＬＴ（＋ＧＩＬＴ）、ＧＵＳ−ＧＩＬＴに曝露したＧＭ４６６８細胞におけるＧＵＳ活性を示す。
【図７】図７は、ヒトＩＧＦ−Ｉ（配列番号７）およびヒトＩＧＦ−ＩＩ（配列番号８）のアライメントであり、Ａドメイン、Ｂドメイン、ＣドメインおよびＤドメインを示す。
【図８】図８は、ＧＵＳ、ＧＵＳ−ＧＩＬＴ、ＧＵＳ−ＧＩＬＴ、７つのアミノ末端残基が欠失したＧＵＳ−ＧＩＬＴ（ＧＵＳ−ＧＩＬＴΔ１−７）、過剰なＩＧＦ−ＩＩの存在下でのＧＵＳ−ＧＩＬＴ、過剰なＩＧＦ−ＩＩの存在下でのＧＵＳ−ＧＩＬＴΔ１−７、またはネガティブコントロール（Ｍｏｃｋ）に曝露したＧＭ４６６８細胞中のＧＵＳを示す。
【図９Ａ】図９Ａは、アスパラギン残基を介して糖タンパク質に結合したリン酸化高マンノース炭水化物構造の１つの形態を図示し、また、マンノースおよびＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）の構造も図示する。
【図９Ｂ】図９Ｂは、高マンノース炭水化物構造の部分を、より高いレベルで詳細に図示し、そして、過ヨウ素酸塩処理による切断を受けやすい部分を示す。炭水化物構造内の糖残基の位置は、丸で標識した大文字Ａ〜Ｈである；リン酸基を、丸で囲った大文字Ｐで示す。
【図１０】図１０は、ＧＵＳΔＣ１８−ＧＩＬＴΔ１−７（ΔΔＮ）、ＧＵＳ（ＨＢＧ）、およびエンドグリコシダーゼＦ１（ΔΔＮ＋Ｆ１）で処理したＧＵＳΔＣ１８−ＧＩＬＴΔ１−７の、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を図示する。
【図１１】図１１は、非タグ化βグルルクロニダーゼ（Ｍ６Ｐ）、ＧＵＳΔＣ１８−ＧＩＬＴΔ１−７（ＧＩＬＴ）、あるいは競合物の非存在下（酵素のみ）またはマンノース−６−リン酸（＋Ｍ６Ｐ）もしくはＩＧＦ−ＩＩ（＋Ｔａｇ）の存在下でエンドグリコシダーゼＦ１処理したＧＵＳΔＣ１８−ＧＩＬＴΔ１−７（ＧＩＬＴ＋Ｆ１）の取り込みを図示する。
【図１２】図１２は、未処理、エンドグリコシダーゼＦ１およびエンドグリコシダーゼＦ２で処理（＋Ｆ１＋Ｆ２）、またはさらにジチオスレイトールで処理（＋Ｆ１＋Ｆ２＋ＤＴＴ）した、ＧＵＳΔＣ１８−ＧＩＬＴΔ１−７のインビボ半減期の測定実験の結果を示す。
【図１３】図１３は、注入した非タグ化βグルクロニダーゼ（Ｍ６Ｐ）、ＧＵＳΔＣ１８−ＧＩＬＴΔ１−７（ＧＩＬＴ）またはエンドグリコシダーゼＦ１処理したＧＵＳΔＣ１８−ＧＩＬＴΔ１−７（ＧＩＬＴ＋Ｆ１）の、肝臓、脾臓、または骨髄における蓄積の測定実験の結果を図示する。
【図１４】図１４は、注入した非タグ化βグルクロニダーゼ（Ｍ６Ｐ）、ＧＵＳΔＣ１８−ＧＩＬＴΔ１−７（ＧＩＬＴ）またはエンドグリコシダーゼＦ１処理したＧＵＳΔＣ１８−ＧＩＬＴΔ１−７（ＧＩＬＴ＋Ｆ１）の、心臓組織、腎臓組織、または肺組織における蓄積の測定実験の結果を図示する。
【図１５】図１５は、注入した非タグ化βグルクロニダーゼ（Ｍ６Ｐ）、ＧＵＳΔＣ１８−ＧＩＬＴΔ１−７（ＧＩＬＴ）またはエンドグリコシダーゼＦ１処理したＧＵＳΔＣ１８−ＧＩＬＴΔ１−７（ＧＩＬＴ＋Ｆ１）の、脳組織における蓄積の測定実験の結果を図示する。
【図１６】図１６は、非タグ化βグルクロニダーゼ（ＨＧＵＳ）、ＧＵＳΔＣ１８−ＧＩＬＴΔ１−７（Ｄｄ−１５ｇｉｌｔ）、またはエンドグリコシダーゼＦ１で処理したＧＵＳΔＣ１８−ＧＩＬＴΔ１−７（ｄｄ１５Ｆ１）を注入された動物の肝臓組織の組織学的分析を図示する。
【図１７】図１７は、非タグ化βグルクロニシダーゼ（ＨＧＵＳ）、ＧＵＳΔＣ１８−ＧＩＬＴΔ１−７（Ｄｄ−１５）、またはエンドグリコシダーゼＦ１で処理したＧＵＳΔＣ１８−ＧＩＬＴΔ１−７（Ｆ１）を注入された動物の腎臓組織の組織学的分析を図示する。
【図１８】図１８は、非タグ化βグルクロニダーゼ（ＨＧＵＳ）、ＧＵＳΔＣ１８−ＧＩＬＴΔ１−７（ｄｄ−１５）、またはエンドグリコシダーゼＦ１で処理したＧＵＳΔＣ１８−ＧＩＬＴΔ１−７（ｄｄ−１５Ｆ１）を注入された動物の骨組織の組織学的分析を図示する。
【図１９】図１９は、非タグ化βグルクロニダーゼ（ＨＧＵＳ）、ＧＵＳΔＣ１８−ＧＩＬＴΔ１−７（Ｄｄ−１５）、またはエンドグリコシダーゼＦ１で処理したＧＵＳΔＣ１８−ＧＩＬＴΔ１−７（Ｄｄ−１５Ｆ１：）を注入された動物の脾臓組織の組織学的分析を図示する。
【図２０】図２０は、酸α−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）のＮ−末端に融合する最適化シグナルペプチドを含む標的性部分（ＧＩＬＴ）を有する、例示的ＧＩＬＴ−タグ化ＧＡＡカセットを図示する。
【図２１】図２１は、ＧＡＡのＣ−末端に融合する標的性部分を有する、例示的ＧＩＬＴ−タグ化ＧＡＡカセットを図示する。
【図２２】図２２は、Ｈｕｍａｎ  Ｉｍａｇｅ  ｃＤＮＡクローン番号４３７４２３８のＧＡＡ  ｃＤＮＡ配列（配列番号２３）およびそのコードするＧＡＡタンパク質（配列番号２４）を示す。
【図２３】図２３は、エンドグリコシダーゼＦ１処理（＋）または未処理の、ＣＨＯ細胞（ＣＨＯ１５）、Ｌｅｃ１細胞（ＬＥＣ１８）、またはＨＥＫ２９３細胞（ＨＥＫ）中で産生された、ＧＵＳΔＣ１８−ＧＩＬＴΔ１−７のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を図示する。「Ｐ」で印を付けたレーンは、ＰＮＧａｓｅ  Ｆ（酵素を完全に脱グリコシル化すると予期される）で処理した酵素を示す
【図２４】図２４は、エンドグリコシダーゼＦ１処理ＣＨＯまたはエンドグリコシダーゼＦ１処理Ｌｅｃ１で産生された酵素および未処理ＨＥＫ２９３で産生された酵素を用いた、免疫寛容性ＭＰＳＶＩＩマウスにおける２４時間ＧＵＳΔＣ１８−ＧＩＬＴΔ１−７蓄積実験の結果を図示する。
【図２５】図２５は、非タグ化ヒトβ−グルクロニダーゼ（ＨＢＧ５）またはエンドグリコシダーゼＦ１処理（＋Ｆ１）もしくは未処理のＣＨＯ細胞またはＬｅｃ１細胞において産生されたＧＵＳΔＣ１８−ＧＩＬＴΔ１−７を用いた、ヒトＭＰＳＶＩＩ線維芽細胞における半減期実験の結果を図示する。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【配列表】
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