(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
肝細胞を培養する方法であって：
第１の表面および第２の表面を有する気体透過性かつ液体不透過性の膜を提供し；
前記気体透過性かつ液体不透過性の膜の第１の表面上に、膜に直接あるいは該膜の表面に施された分子レベルの厚さのコーティング上に直接、肝細胞を播種し；
肝細胞と栄養素含有培地とを直接接触させ；
前記第１の表面上に播種された細胞に膜透過酸素供給をもたらすのに十分な圧力で、前記気体透過性かつ液体不透過性の膜の第２の表面に酸素化流体を提供し；さらに
肝細胞の生存性および機能を促進させる条件下で肝細胞を培養する：
各工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記酸素化流体中に含まれる酸素が、酸素の臨界分圧以上であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
2x109−2ｘ1010の肝細胞が播種された装置において肝細胞を培養することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記肝細胞が、ブタ、ウマ、ヒツジ、ウシ、ウサギ、ラット、イヌ、ネコ、またはマウスの肝細胞であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記肝細胞がヒト肝細胞であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記播種される肝細胞が保存肝細胞であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記保存肝細胞が、低温保存、低体温保存、または凍結乾燥によって保存された肝細胞であることを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記気体透過性かつ液体不透過性の膜の材料は、ポリスチレン、ポリオレフィン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリフッ化ビニリデン、ポリカーボネート、疎水性処理ナイロン、ポリウレタン、ポリエステル、スチレン−ブタジエン−スチレン／酢酸エチルビニル／スチレン−ブタジエン−スチレンの積層体、及びスチレン−ブタジエン−スチレン／ポリエチレンの積層体からなる群から選択されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項９】
前記気体透過性かつ液体不透過性の膜の前記第１の表面が、コロナ放電処理されていることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１０】
前記気体透過性かつ液体不透過性の膜の前記第１の表面が、分子レベルの厚さのコラーゲンコーティングで被覆されていることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１１】
前記酸素化流体中の酸素濃度は、１．３８×１０４−３．４５×１０４Ｐａ（２−５ｐｓｉ）で０％〜９０％酸素の間であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１２】
前記酸素化流体中の酸素濃度は、１．３８×１０４−３．４５×１０４Ｐａ（２−５ｐｓｉ）で１９％〜６０％酸素の間であることを特徴とする請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記酸素化流体中の酸素濃度は、１．３８×１０４−３．４５×１０４Ｐａ（２−５ｐｓｉ）で４０％〜６０％酸素の間であることを特徴とする請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
前記酸素化流体中の酸素濃度を制御して細胞の機能を促進または抑制することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１５】
前記栄養含有培地を灌流させることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１６】
前記栄養素含有培地が血漿を含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１７】
前記肝細胞が、前記膜の上方より膜全体にわたって播種されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１８】
前記肝細胞が、前記気体透過性かつ液体不透過性の膜上に直接播種されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１９】
流動細胞培養装置であって、
酸素化流体の流入口及び酸素化流体の流出口、液体流入口及び液体流出口、ならびに室を形成する第１及び第２の壁を有するハウジングと、
前記第１の壁と第２の壁との間に配されて前記室を酸素化流体の入口及び酸素化流体の出口を有する酸素化流体区画と、液体の入口及び液体の出口を有する液体区画とに分割する気体透過性かつ液体不透過性の膜と、
壁と前記気体透過性かつ液体不透過性の膜との間に配されて、前記液体区画を細胞区画と液体灌流区画とに分割する液体透過性の膜とを備え、
肝細胞が、前記気体透過性かつ液体不透過性の膜の表面上に直接あるいは該膜の表面に施された分子レベルの厚さのコーティング上に直接播種され、
前記酸素化流体流入口から流入する酸素化流体が前記酸素化流体入口より流入し、前記酸素化流体区画を通過して前記酸素化流体出口より該酸素化流体区画から流出し、前記酸素化流体流出口よりハウジングから流出するように前記酸素化流体流入口及び酸素化流体流出口は配され、
前記液体流入口から流入する液体が前記液体入口より流入し、前記液体灌流区画を通過して前記液体出口より前記液体灌流区画から流出し、前記液体流出口よりハウジングから流出するように前記液体流入口及び液体流出口は配されることを特徴とする流動細胞培養装置。
【請求項２０】
前記肝細胞が、前記気体透過性かつ液体不透過性の膜の表面上に直接播種され、該気体透過性かつ液体不透過性膜と前記液体透過性膜との間の空間は１個の細胞よりも大きいことを特徴とする請求項１９記載の装置。
【請求項２１】
前記気体透過性かつ液体不透過性膜と前記液体透過性膜との間の空間は、１個の細胞の大きさにほぼ等しいことを特徴とする請求項１９記載の装置。
【請求項２２】
前記肝細胞が、前記気体透過性かつ液体不透過性の膜の表面上に直接、及び前記液体透過性膜上に播種され、前記気体透過性かつ液体不透過性膜と前記液体透過性膜との間の空間は隣接細胞２個分の大きさにほぼ等しいことを特徴とする請求項１９記載の装置。
【請求項２３】
前記液体区画内に配される液体透過性の中空繊維を更に備えることを特徴とする請求項１９記載の装置。
【請求項２４】
装置の積み重ねが可能であるように前記ハウジングが構成されていることを特徴とする請求項１９記載の装置。
【請求項２５】
患者から前記ハウジングの流入口へと血漿を流すための第１の導管と、
前記細胞培養装置から前記患者へと血漿を流すための第２の導管と、
前記導管及び細胞培養装置を通じて血漿を搬送するためのポンプとを更に備えることを特徴とする請求項１９記載の流動細胞培養装置。
【請求項２６】
前記細胞培養装置を通じて流される血漿を得るために全血から血液細胞を除去する血漿分離要素を更に備えることを特徴とする請求項２５記載の装置。
【請求項２７】
前記第１の導管内の血漿が細胞培養装置に流入する以前に該血漿から気泡を除去するための気泡捕獲要素を更に備えることを特徴とする請求項２５記載の装置。
【請求項２８】
免疫隔離装置と、
患者から免疫隔離装置へと血漿を流すための第１の導管と、
前記免疫隔離装置から前記患者へと血漿を流すための第２の導管と、
前記細胞培養装置から前記免疫隔離装置へと液体培地を流すための第３の導管と、
前記免疫隔離装置から前記患者へと液体培地を流すための第４の導管と、
前記導管及び細胞培養装置を通じて血漿を搬送するためのポンプとを更に備えることを特徴とする請求項１９記載の流動細胞培養装置。
【請求項２９】
流動細胞培養装置であって、
液体流入口及び液体流出口、酸素化流体流入口及び酸素化流体流出口、ならびに室を形成する第１及び第２の壁を有するハウジングと、
前記壁の間に配されて前記室を酸素化流体の入口及び酸素化流体の出口を有する酸素化流体区画と液体の入口及び液体の出口を有する液体区画とに分割する気体透過性かつ液体不透過性の膜とを備え、
肝細胞が、前記気体透過性かつ液体不透過性の膜の表面上に直接、あるいは該膜の表面に施された分子レベルの厚さのコーティング上に直接播種され、
前記液体流入口から流入する生物学的液体が前記液体入口より流入し、前記液体区画を通過して前記液体出口より前記液体区画から流出し、前記液体流出口よりハウジングから流出するように前記液体流入口及び液体流出口は配され、
前記酸素化流体流入口から流入する酸素化流体が前記酸素化流体入口より流入し、前記酸素化流体区画を通過して前記酸素化流体出口より該酸素化流体区画から流出し、前記酸素化流体流出口よりハウジングから流出するように前記酸素化流体流入口及び酸素化流体流出口は配される流動細胞培養装置。
【請求項３０】
前記気体透過性かつ液体不透過性の膜は、多孔性または無孔性であることを特徴とする請求項２９記載の装置。
【請求項３１】
前記気体透過性かつ液体不透過性の膜は、ポリスチレン、ポリオレフィン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリフッ化ビニリデン、ポリウレタン、ポリ（スチレン−ブタジエン−スチレン）、ポリ（酢酸エチルビニル）、ナイロン、シリコーンゴム、ポリ（テトラフルオロエチレン）、またはこれらの複合体、混合物、もしくは共重合体からなることを特徴とする請求項２９記載の装置。
【請求項３２】
前記気体透過性かつ液体不透過性の膜が、表面処理されていることを特徴とする請求項２９記載の装置。
【請求項３３】
前記気体透過性かつ液体不透過性の膜が、コロナ放電によって処理されていることを特徴とする請求項２９記載の装置。
【請求項３４】
前記気体透過性かつ液体不透過性の膜が、細胞外基質のコーティングにて表面処理されていることを特徴とする請求項２９記載の装置。
【請求項３５】
患者から前記ハウジングの流入口へと血漿を流すための第１の導管と、
前記細胞培養装置から前記患者へと血漿を流すための第２の導管と、
前記導管及び細胞培養装置を通じて血漿を搬送するためのポンプとを更に備えることを特徴とする請求項２９記載の流動細胞培養装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、１９９９年６月２１日出願の米国仮特許出願第60/140,125号、１９９９年６月２１日出願の米国仮特許出願第60/140,239号、および２０００年２月１０日出願の米国仮特許出願第60/181,634号に基づく優先権を主張する。それら出願の内容の全てが参照によってこの中に組み込まれる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、臓器補助装置において細胞を培養するシステムおよび方法に関する。
【０００３】
発明の背景
肝疾患によって毎年43,000人を超えるアメリカ人が死亡し、それは米国における疾病関連の死因の上位１０番目となっている。肝疾患が肝不全に進行した場合、適合するドナー臓器が見つからなければ、死亡率は８０％である。他の臓器と同様に、ドナー肝臓が非常に不足している。12,000人を超える患者が移植候補者として現在記載されているが、毎年利用できるドナー肝臓の数はその半分未満である。肝臓補助装置（ＬＡＤ）での処置は、患者が移植に適した候補者となるように患者を安定させることによって、および／または適切なドナー肝臓が利用可能となるまで患者を支援することによって、および／または肝移植が必要とされる状態への悪化を防ぐことによって、肝不全に関連した死亡率を減らすであろう。また、それら患者の手術前の健康状態を改善することは、移植の成功率を高め、従って、再移植の頻度を減らし、ドナー臓器の需要を減らすであろう。
【０００４】
ウィルス感染または毒性によってしばしば生じる突然の肝不全の場合、ＬＡＤでの処置は、患者自身の肝臓が再生するまでそれら患者を支援することによって、移植の必要性を排除するであろう。肝移植は、現在最も高価な臓器移植手段である。ＬＡＤの開発の成功は、結果として、死亡率および医療費を減らすという重大な利益を米国にもたらすであろう。
【０００５】
一時的な肝臓支援のための体外装置は１９６０年代から研究されてきた。肝臓補助装置の開発において２つの方法が用いられてきた：（１）吸着剤での血液灌流、選択的透過性膜を介した血液透析、および血漿交換に基づく非生物学的装置（Malchesky, “Non-biological liver support: historic overview, “Artif. Organs, 18: 342-347, 1994）；ならびに（２）細胞または細胞成分を組み込んだ生物学的装置(Yarmush et al., “Assessment of artifical liver support technology, “Cell Trans., 1: 323-341, 1992)。
【０００６】
非生物学的装置は限られた有効性のみを示しており、通常肝臓によってなされている複雑な代謝機能の範囲およびレベルを合成物質で置き換えることはできないことを支持している。一方、肝細胞が中空糸の外面に播種され、血液または血漿がそれら中空糸の内腔を介して循環する生物学的ＬＡＤが、Wolfおよびその同僚によってほぼ２５年前に提案された(Wolf et al., “Bilirubin conjugation by an artificial liver composed of cultured cells and synthetic capillaries,” Tran, Amer. Soc. Artif. Int. Organs, 21: 16-23, 1975)。
【０００７】
現在の生物学的ＬＡＤ設計は、それとは逆の考え方を用いている。現代的設計は、しばしば、中空糸中に高密度の肝細胞懸濁液を維持し、中空糸の外側で血液または血漿を循環させることによって、重要な肝機能を提供することに基づく。その設計において、肝臓の再生によって患者が回復するまでまたは移植が可能となるまで、断続的な体外肝機能が提供される。しかしながら、中空糸設計は、以下のいくつかの要因によって制限される：ａ）不十分な量の輸送（特に酸素の）；ｂ）インビトロ環境での肝細胞機能に関する理解不足；ｃ）細胞の生存性および機能の支持に関して無作為的な組織構築；ならびに、ｄ）装置のための灌流回路における間隙容積の制約。
【０００８】
中空糸は、立証された肝細胞機能を支持する能力よりも、利用しやすさに基づいて、ＬＡＤのために選択されてきた。中空糸における高密度肝細胞培養は、とりわけ中空糸による高密度の培養支持を無効化してしまう輸送限界のために、有用性を示すことができなかった。そのような限界は、特に、基礎代謝機能のためならびに解毒における最初の段階のための両方において必要とされる酸素において深刻である。中空糸の網目を介したまたはその周囲での酸素を豊富に含んだ血漿または培地の循環は、それら水溶液が酸素の担体としては低機能でありかつ輸送のための距離が比較的大きいため、その問題を解決することはできない。コア中空糸設計の改良（例えば一体的酸素供給を提供する３つの独立した毛細管セットを織った網目の使用）は、製造を著しく複雑にし、かつ潜在的な輸送限界に対する対応が不完全である。また、それらは、より臓器特異的なラミン構造(laminar configuration)に肝細胞を適応させる能力を欠く。
【０００９】
発明の概要
本発明は、１つ以上の平板モジュールを含むモジュール式細胞培養装置に関する。本発明は、気体透過性かつ液体不透過性の膜によって液体培地の流れと酸素化流体とが分離されさらに細胞がその膜の液体培地側において培養増殖される場合に、装置を通過する液体の流速の制御に依存しないで膜を介して細胞に酸素を輸送するような装置を用いて細胞を培養することができることの発見に基づく。新規な流動細胞培養装置を用いて、細胞の産生のための、あるいは例えばタンパク質またはウィルスのような細胞由来産物の産生のための、あるいはアンモニアのような毒素を除去するためまたは細胞合成産物を添加するためまたはその両方のために生物学的液体を処置するシステムのための臓器（例えば肝臓）補助システムにおいて、高レベルの細胞機能を有する細胞（例えば肝細胞）を培養することができる。
【００１０】
概して、本発明は、平面的な気体透過性膜を介して細胞に直接酸素供給をもたらす細胞培養のための方法および装置に関する。器材に適切な細胞を播種して装置に組み込んだ場合、その装置を用いて、機能的支援を必要とする臓器（例えば肝臓）を持つ患者を処置することができる。
【００１１】
本発明は細胞を培養する方法に関し：第１表面と第２表面とを有する気体透過性かつ液体不透過性の膜を提供し；気体透過性かつ液体不透過性の膜の第１表面上に細胞を播種し；細胞と栄養素含有培地とを接触させ；第１表面上に播種された細胞に膜透過酸素供給をもたらすのに十分な圧力で、気体透過性かつ液体不透過性の膜の第２表面に酸素化流体を供給し；さらに、細胞の生存性および機能を促進する条件下で細胞を培養する：各工程を含む。
【００１２】
例えばブタ、ウマ、ヒツジ、ウシ、ウサギ、ラット、イヌ、ネコ、またはマウスの肝細胞のような肝細胞を装置に播種して差し支えない。さらには、ヒト肝細胞を装置に播種して差し支えない。2x109−2x1010の肝細胞を装置に播種することができる。気体透過性かつ液体不透過性の膜上に肝細胞を直接播種して、その後コラーゲンでコートして差し支えない。あるいは、コラーゲンでコートした気体透過性かつ液体不透過性の膜上に肝細胞を直接播種しても差し支えない。膜上から膜を貫通して細胞を播種させることができる。
【００１３】
１つの実施形態において、酸素化流体中に含まれる酸素は、酸素の臨界分圧以上である。
【００１４】
１つの実施形態において、細胞は保存される。低温保存、低体温保存、または凍結乾燥によって細胞を保存することができる。
【００１５】
気体透過性かつ液体不透過性の膜は、例えばポリスチレン、ポリオレフィン、ポリエチレン、ポリプロピレン、フッ化ポリビニリデン、ポリカ−ボネート、疎水性処理ナイロン、ポリウレタン、ポリエステル、層状スチレン-ブタジエン-スチレン／酢酸エチルビニル／スチレン-ブタジエン-スチレン、あるいは層状スチレン-ブタジエン-スチレン／ポリエチレンによって作られていて差し支えない。
【００１６】
気体透過性かつ液体不透過性の膜の第１表面を例えばコロナ処理する等、処理して差し支えない。別の実施形態において、気体透過性かつ液体不透過性の膜の第１表面をコラーゲンコートする。
【００１７】
１つの実施形態において、酸素化流体中の酸素濃度は、約0%から約90%酸素の範囲である。さらには、酸素化流体中の酸素濃度は約19%から約60%、または約40%から約60%酸素の範囲であって差し支えない。酸素化流体中の酸素濃度を制御して、細胞機能を促進または抑制させることができる。
【００１８】
１つの実施形態において、栄養素含有培地を灌流させる。さらには、本方法は血漿を濾過する工程をさらに含んでいて差し支えない。
【００１９】
本発明は更に、酸素化流体の流入口及び酸素化流体の流出口、液体流入口及び液体流出口、ならびに室を形成する第１及び第２の壁を有するハウジングと、前記第１の壁と第２の壁との間に配されて前記室を酸素化流体の入口及び酸素化流体の出口を有する酸素化流体区画と、液体の入口及び液体の出口を有する液体区画とに分割する気体透過性かつ液体不透過性の膜と、壁と前記気体透過性かつ液体不透過性の膜との間に配されて、前記液体区画を細胞区画と液体灌流区画とに分割する液体透過性の膜とを備え、前記酸素化流体流入口から流入する酸素化流体が前記酸素化流体入口より流入し、前記酸素化流体区画を通過して前記酸素化流体出口より該酸素化流体区画から流出し、前記酸素化流体流出口よりハウジングから流出するように前記酸素化流体流入口及び酸素化流体流出口は配されることと、前記液体流入口から流入する液体が前記液体入口より流入し、前記液体灌流区画を通過して前記液体出口より前記液体灌流区画から流出し、前記液体出口よりハウジングから流出するように前記液体流入口及び液体流出口は配されることとを特徴とする流動細胞培養装置に関する。
【００２０】
一実施形態においては、使用時に前記気体透過性かつ液体不透過性の膜に細胞を播種し、また該気体透過性かつ液体不透過性膜と前記液体透過性膜との間の空間は１個の細胞よりも大きい。更に、使用時に前記気体透過性かつ液体不透過性の膜または前記液体透過性膜のいずれか一方に細胞を播種し、前記気体透過性かつ液体不透過性膜と前記液体透過性膜との間の空間を１個の細胞の大きさにほぼ等しくすることも可能である。更に、使用時に前記気体透過性かつ液体不透過性の膜及び前記液体透過性膜の双方に細胞を播種し、前記気体透過性かつ液体不透過性膜と前記液体透過性膜との間の空間を隣接細胞２個分の大きさにほぼ等しくすることも可能である。
【００２１】
本装置は更に、液体区画内に配される液体透過性の中空繊維を更に備えることが可能である。更に装置の積み重ねが可能であるようにハウジングを構成することも可能である。
【００２２】
本発明は、肝臓補助システムであって、本発明の流動細胞培養装置と、患者からハウジングの流入口へと血漿を流すための第１の導管と、細胞培養装置から患者へと血漿を流すための第２の導管と、前記２本の導管及び細胞培養装置を通じて血漿を移送するためのポンプとを備えた肝臓補助システムを更に含むものである。当該システムは、全血から血液細胞を除去する血漿分離要素を備えることが可能であり、これにより細胞培養装置に通過させるための血漿を得ることが可能である。当該システムは更に気泡捕獲要素を備えることが可能であり、これにより血漿が細胞培養装置に流入する前に第１の導管内において血漿から気泡を除去することが可能である。
【００２３】
本発明は、肝臓補助システムであって、本発明の流動細胞培養装置と、免疫分離装置と、患者から免疫分離装置へと血漿を流すための第１の導管と、免疫分離装置から患者へと血漿を流すための第２の導管と、細胞培養装置から免疫分離装置へと液体培地を流すための第３の導管と、免疫分離装置から患者へと液体培地を流すための第４の導管と、これら導管及び細胞培養装置を通じて血漿を移送するためのポンプとを備えた肝臓補助システムを更に含むものである。
【００２４】
本発明は血漿を濾過するための一方法を更に含むものである。この方法は、本発明の流動細胞培養装置に肝細胞を播種する工程と、該装置の液体流入口に血漿を導入する工程と、該装置の酸素化流体流入口に酸素化流体を供給する工程と、前記酸素化流体区画を通過して前記酸素化流体流出口より該装置から流出するように酸素化流体を流す工程と、該装置を通過して前記液体流出口より流出するように血漿を流すことによって血漿を濾過する工程とを含む。
【００２５】
本発明は更に、肝機能の補助を必要とする患者を治療するための一方法を含むものである。この方法は本発明の肝臓補助システムを患者の血流に接続して当該患者を治療する工程を含むものである。
【００２６】
本発明は更に、液体流入口及び液体流出口、酸素化流体の流入口及び酸素化流体の流出口、ならびに室を形成する第１及び第２の壁を有するハウジングと、前記第１の壁と第２の壁との間に配されて前記室を酸素化流体の入口及び酸素化流体の出口を有する酸素化流体区画と、液体の入口及び液体の出口を有する液体区画とに分割する気体透過性かつ液体不透過性の膜とを備え、前記気体透過性かつ液体不透過性の膜には細胞が播種されることと、液体流入口に流入した生物学的液体が前記液体入口に流入して液体区画を通過して前記液体出口より液体区画から流出し、前記液体出口よりハウジングから流出するように前記液体流入口及び液体流出口は配されることと、前記酸素化流体流入口から流入する酸素化流体が前記酸素化流体入口より流入し、前記酸素化流体区画を通過して前記酸素化流体出口より該酸素化流体区画から流出し、前記酸素化流体流出口よりハウジングから流出するように前記酸素化流体流入口及び酸素化流体流出口は配されることとを特徴とする流動細胞培養装置を更に含むものである。
【００２７】
気体透過性かつ液体不透過性の膜は多孔性のものであっても非多孔性のものであってもよい。気体透過性かつ液体不透過性の膜は、ポリスチレン、ポリオレフィン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリフッ化ビニリデン、ポリウレタン、ポリ（スチレン−ブタジエン−スチレン）、ポリ（酢酸エチルビニル）、ナイロン、シリコーンゴム、ポリ（テトラフルオロエチレン）、またはこれらの複合体、混合物、共重合体などからなる。気体透過性かつ液体不透過性の膜には、例えばコロナ放電や細胞外基質によるコーティングなどの表面処理を施すことが可能である。
【００２８】
一実施形態においては、細胞上にゲルを形成する。あるいは気体透過性かつ液体不透過性の膜上にゲルを形成することも可能である。このゲルは細胞を懸濁したものであってもよい。
【００２９】
本発明は血漿を濾過するための一方法であって、本発明の流動細胞培養装置に肝細胞を播種する工程と、該装置の液体流入口に血漿を導入する工程と、該装置の酸素化流体流入口に酸素化流体を供給する工程と、前記酸素化流体区画を通過して前記酸素化流体流出口より該装置から流出するように酸素化流体を流す工程と、該装置を通過して前記液体流出口より流出するように血漿を流すことによって血漿を濾過する工程とを含む方法を更に含むものである。
【００３０】
特に断らないかぎり、本明細書中に用いられるすべての専門用語及び技術用語は本発明の属する技術分野における当業者によって一般的に理解される意味において使用されるものである。本発明の実施または試験において、本明細書に記載される方法及び材料に類似した、あるいはその均等物に相当する方法及び材料を使用することも可能であるが、好適な方法及び材料については下記に述べるものである。本明細書中に触れられるすべての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献はその全容にわたって参照して援用されるものである。係争発生の場合には、用語の定義を含め本明細書の記載に準拠するものとする。更に、ここに述べる材料、方法及び実施例はあくまで例示的なものであって限定的なものではない。
【００３１】
本発明の新規な流動細胞培養装置ならびに臓器補助システムは多くの利点を与えるものである。新規な当該装置により酸素や他の栄養、老廃物、及び有用生成物を所望の濃度にて大量輸送して各種細胞を培養することが可能であり、媒体の流れが大きい場合に通常生ずるせん断応力による悪影響が低減される。この結果、肝細胞のような比較的せん断力の影響を受けやすい細胞を、高次の機能にて比較的小さな培地流速にて長期間にわたって培養することが可能である。その結果、酸素化と灌流を独立して調節することが可能である。更にこうした装置により、肝臓のｉｎ  ｖｉｖｏでの構造を模した層状の培養細胞として、装置内における細胞の付着、機能及び細胞のより均一な分布が促進される。これらの特徴は臓器、例えば肝臓などの補助システムにおける本発明の新規な流動細胞培養装置の使用を可能とするものである。
【００３２】
臨床的な研究により、正常な細胞量の１０％程度で適正な肝機能がｉｎ  ｖｉｖｏにて維持されることが示された。これは、効率的なＬＡＤでは、ほぼｉｎ  ｖｉｖｏでの機能レベルを有する少なくとも１０１０個の肝細胞を支持しうることを示すものである。
【００３３】
本発明の他の特徴ならびに利点は以下の詳細な説明ならびに特許請求の範囲より明らかとなろう。
【００３４】
発明の詳細な説明
新規な細胞培養装置は、液体の全間隙容量を最小にし；正確な制御、拡張性、およびモジュール性をもたらし；さらに（栄養素および可溶性毒素および／または誘導物質の供給、ならびに老廃物および代謝副産物の除去のための）培地の流れを酸素供給から分離しながら、比較的に多数で高密度の細胞（例えば肝細胞）を装置において培養することを可能とする。その新規な装置は、本質的に拡張可能でかつモジュール方式である。その新規な装置は、気体透過性かつ液体不透過性の膜（その膜上において直接細胞を増殖させかつ培養する）の使用によって、酸素供給を生物学的液体の流れから分離することを可能とする。
【００３５】
図１は、新規な細胞培養装置を用いることができる体外肝臓支援システムの説明図を示す。そのシステムは、複数のカートリッジ２を有するバイオリアクター１を含む。バイオリアクターは、酸素化流体供給源４から酸素化流体を導入するための酸素化流体の流入口３、酸素化流体の流出口３’、免疫隔離ユニット７からバイオリアクタにポンプ６によって供給される生物学的液体を導入するための液体流入口５、生物学的液体をバイオリアクタから除去して免疫隔離ユニット７に戻すための液体流出口５’を含む。患者９からの血液は、ポンプ６’を介して血漿搬出ユニット８に流れ、そこから血漿部分がポンプ６”を介して免疫隔離ユニット７に流れる。処置された血漿は免疫隔離ユニット７から流れ出て、患者９に戻る前に、血漿搬出ユニット８からの血液と混合される。
【００３６】
新規な細胞培養装置は１以上の２区画に区画されたカートリッジ（またはユニット）を有する。図２は、不透過壁５０及び気体透過性かつ液体不透過性の膜３０を有する室１を含んでなる２区画カートリッジの一実施形態を示したものであり、膜３０は室を第１の区画１０及び第２の区画２０の２つの領域すなわち区画に分離する。第１の区画１０は不透過壁５０の一方、室の側壁、及び気体透過性かつ液体不透過性の膜３０によって区画される。第１の区画１０は、細胞培養の培地、平衡塩類溶液、血液もしくは血漿などの生物学的液体１１、及び細胞４０を含む「液体区画」である。細胞４０は膜３０上で実質的に培養され、生物学的液体１１に接触している。
【００３７】
壁部は通常、液体及び気体を透過しないような厚みを有するポリスチレンや共重合体などの細胞適合性プラスチック、アルミニウム、ステンレス鋼や他の合金などの金属またはその複合材料などから形成される。これらの材料は、連結部材やマニホルドなど、他の装置要素に使用することも可能である。
【００３８】
第２の区画２０は「酸素化流体区画」であり、不透過壁５０の他方、室の側壁、及び気体透過性かつ液体不透過性の膜３０によって区画される。通常は気体であるが液体である場合もある酸素化流体２１は、酸素または酸素化気体の運搬及び気体透過性かつ液体不透過性の膜３０を通じた酸素の輸送を可能とするものであって、区画２０を通って流れる。酸素は、気体透過性かつ液体不透過性の膜３０を介し、酸素化流体区画から液体区画内の細胞によって利用される。酸素化流体は気体または液体であり、空気、高酸素空気、酸素ガス、酸素と他のガスとの混合気体であって例えば二酸化炭素、窒素、アルゴン、ヘリウムや自然界に普通に見られる他のガスと酸素との混合気体、フルオロカーボン、ペルフルオロ液体及び天然もしくは合成ヘモグロビンまたはその均等物の水溶液などの液体が含まれる。
【００３９】
図２では、液体区画１０が気体透過性かつ液体不透過性の膜３０の上側となり、酸素化流体区画２０が膜の下側となるように分割された室１が示されているが、膜によって室が２つの区画に分割されるものであれば室は任意の方向に向けて配することが可能である。各区画の高さは一定であることが好ましい（両区画の高さが同じである必要はない）が、各区画の高さは区画の長さ及び／または幅に沿って変化するように不均一なものであってもよい。
【００４０】
第１の（液体）区画１０内の生物学的液体１１は、細胞４０に細胞培養に必要な基本栄養素を供給するとともに代謝産物を搬出する。生物学的液体はまた、細胞に毒素、アミノ化分子や代謝されるべき他の生物学的老廃物を供給するとともに、解毒産物、分泌された各種因子及びタンパク質を搬出する。細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養では、この生物学的液体は細胞培養用に設計された培地であることが好ましい。生物学的液体は好ましくは開口部を通じて区画内部に供給され、ここから除去されることが好ましい。より好ましくは開口部は、一つの開口部が生物学的液体の供給源から生物学的液体を供給するための流入口として、別の開口部が生物学的液体を排出すなわち排液するための流出口として機能するように少なくとも２個あることが好ましい（図２には示されていない）。これらの開口部はポートやマニホルドによって液体区画１０の内部と外部とを連通する。ポートは他のバイオリアクタユニットまたはカートリッジの他の液体区画と、並列、直列もしくはこの両方にて接続することにより生物学的液体を灌流させるためのフロー回路もしくはループを形成することが可能である。更なるポートを設けることにより充填時の空気排出のための通気口として、または他のポートが別のユニットのポートに取り付けられている場合に区画内の液体を排出する手段として機能させることが可能である。
【００４１】
第２の（気体）区画２０内の酸素化流体は、好ましくは開口部を通じて該区画の内部に供給され、またここから除去される。より好ましくは開口部は、一つの開口部が酸素化流体の供給源４から酸素化流体を供給するための流入口として、別の開口部が酸素化流体を排出または排気するための流出口として機能するように少なくとも２個あることが好ましい（図２には示されていない）。これらの開口部はポートやマニホルドによって酸素化流体区画２０の内部と外部とを連通する。ここでもやはり、ポートは他のバイオリアクタユニットまたはカートリッジの他の酸素化流体区画と、並列、直列もしくはこの両方にて接続することにより酸素化流体用のフロー回路もしくはループを形成することが可能である。該区画の壁に通気用の他のポートを設けることも可能である。
【００４２】
膜３０は気体透過性かつ液体不透過性である。細胞４０は液体区画内のいずれの表面に付着してもよいが、所定量の細胞が実質的に膜上で培養され、膜が細胞培養の基質として機能することが好ましい。細胞は膜を通じて酸素化流体と酸素などの気体を交換する。膜は好ましくは平面状の平らなシート様の形態を有し、液体区画１０と酸素化流体区画２０とを分離するように所定平面に沿って延びる。膜は気体透過性であることにより、酸素化流体から細胞へ、また細胞から酸素化流体へと、酸素及び場合により他の気体を輸送することが可能である。膜は動作時の加圧液体に対しては不透過性でなければならないが、約０．１ｍＬ／ｍ２／日〜約１０００Ｌ／ｍ２／日の範囲の気体に対しては透過性を有する必要がある。更に膜は、滅菌可能かつ穿孔、断裂、皺を生じにくく、装置の製造時に取り扱い可能なものでなければならない。
【００４３】
膜材料としては、以下の特性を有する１以上の層からなるものが本発明における使用に適当である。すなわち、膜３０を挟んで大きな圧力差が存在しない場合に酸素に対して比較的透過性を有し、水に対しては少なくとも部分的に不透過性であること、少なくとも一方の面において細胞に対する細胞毒性が比較的小さいこと（細胞の付着及び機能が材料によって制限されないため、また、材料の一方の面を表面処理した場合にこの表面処理された面によって細胞の付着及び機能が制限されないため）、及び、酸素化流体２１及び／または生物学的液体１１の存在下において分解性が比較的小さいことである。材料が両面に用いられる場合、液体区画１０側の面は比較的細胞毒性が小さく、生物学的液体の存在下にて比較的分解性が小さいことが求められ、酸素化流体区画２０側の面は酸素化流体の存在下にて比較的分解性が小さいことが求められる。これらの特性を有する膜材料は商業的に入手するか、標準的な方法により製造することが容易である。
【００４４】
本発明における使用に適当な膜材料としては具体的に、ＰＯＬＹＦＬＥＸ（登録商標）（Ｐｌａｓｔｉｃ  Ｓｕｐｐｌｉｅｒｓ製）のような厚さ０．００５１ｃｍ（０．００２インチ）の無孔性ポリスチレン、微孔性ポリオレフィン、ＴＹＶＥＫ（登録商標）、特にＴＹＶＥＫ（登録商標）１０７３（ＤｕＰｏｎｔ）などの微孔性高密度ポリエチレン（ＨＤＰＥ）、微孔性ポリプロピレン、微孔性フッ化ポリビニリデン、トラックエッチ加工したポリカーボネート（比較的小径の孔を有し、液相にて湿潤していないもの）、疎水処理を施したナイロン、ポリウレタン、微孔性ポリエステル（疎水性孔を有する）、微孔性無機ポリマー及び無孔性シリコーンゴムなどの他の無機ポリマー、共押出ししたポリスチレン及びポリエチレン、スチレン−ブタジエン−スチレン／酢酸エチルビニル／スチレン−ブタジエン−スチレン（ＳＢＳ／ＥＶＡ／ＳＢＳ）の３層共押出しフィルム、及びスチレン−ブタジエン−スチレン／ポリエチレン（ＳＢＳ／ＰＥ）の２層共押出しフィルムなどの、無孔性または微孔性材料の単層や複層複合材料が挙げられる。
【００４５】
気体透過性かつ液体不透過性の膜３０を通じた細胞４０の酸素化には、膜自身が自己支持型であるか（例、重力、膜の重量、生物学的流体が膜の上側となる場合生物学的液体の重量、及び膜を挟んで作用するすべての圧力差に耐えうるだけの充分な機械的剛性を有すること）、あるいはより剛性の高い支持材と膜を組み合わせるかまたは支持材上に膜を積層することが求められる。この支持材は、気体、特に酸素の輸送を大きく制限することがなく、かつ必要とされる機械的性質を有するよう、充分な透過性を有するか、多孔性であるか、あるいは空間的に分散したものである必要がある。例えば、膜を支持すべく比較的大きな間隔を隔てて配された複数の不透性の柱状材の使用によりこれらの条件を満たすことが可能である。
【００４６】
ある種の細胞の培養においては酸素化は細胞培養の培地によって行われる。しかしながら、肝細胞などの特定の種類の細胞では他の種類の細胞と比較して酸素要求量が特徴的に大きなものがある。また生育可能な肝細胞の機能は酸素分圧にも依存する。細胞培養や臓器補助装置におけるこの種の問題を更に複雑化させる点として比較的多数かつ高密度の細胞を装置に用いる一方で生物学的液体の量を制限しなければならない点がある。
【００４７】
細胞による酸素の消費速度は、膜を通じた酸素の輸送量かまたは流通する生物学的液体により細胞への酸素の輸送量を調節して平衡を保たなければならない。細胞による酸素消費の速度論は酸素取込み速度（ＯＵＲ）によって与えられる。酸素取込み速度は一般的にミハエリス−メンテンの速度論によって表され、１個の細胞によって単位時間当たりに消費される酸素のモル数に細胞数を乗じたものとして表される。膜を通じた酸素の輸送速度は、単位分圧差当たりの酸素の体積流量（単位分圧差当たり単位時間当たり単位面積当たりの酸素の体積として表される）、膜内外での分圧差、及び使用される膜の投影面積の積として与えられる。生物学的液体による酸素の輸送速度は、生物学的流体中の酸素の拡散率、細胞が培養されている部分の膜表面における膜に直交する方向に沿った酸素濃度勾配、及び使用される膜の投影面積の積に−１を乗じたものとして与えられる。
【００４８】
細胞培養装置内で維持される細胞の酸素化の最低レベルは、装置内への酸素輸送量と、装置内の細胞による酸素の消費速度とを等しくすることによって求められる。静的な動作時、すなわち、装置内に新たな生物学的液体を導入しない動作における装置では、酸素輸送の機構は膜輸送のみである。膜輸送の速度は膜を通じた酸素のフラックスと膜の表面積との積として与えられる。フラックスはそれ自体、膜の透過率Ｐｍと膜内外での酸素濃度差との積である。酸素の消費速度はＯＵＲとして与えられる。
【００４９】
静的な動作時の装置では、輸送量と消費量との平衡は次の支配式によって表される。
【００５０】
【数１】
0004605734.tif 000002
式中、ｐＯ２，ｃは、酸素化に必要な酸素の臨界分圧、Ｒは気体定数、Ｔは温度である。酸素分圧がこのｐＯ２，ｃよりも大きい場合には充分な酸素化度が得られ、酸素分圧がこのｐＯ２，ｃよりも小さい場合には酸素化度は不充分となる。生物学的液体１１の流れがない場合のこうした細胞培養装置をこの式を用いて設計及び動作させることが可能である。
【００５１】
図３は、この酸素化の支配式を、Ｐｌａｓｔｉｃ  Ｓｕｐｐｌｉｅｒｓ社（オハイオ州コロンバス）よりＰｏｌｙｆｌｅｘ（登録商標）として販売されている厚さ０．００５１ｃｍ（０．００２インチ）のポリスチレンを有する装置についてシミュレートしたデータをプロットしたものである。式中、Ｐｍは１０４ｍＬ／ｍ２・日・ａｔｍのオーダーであり、装置は生理学的温度（３１０Ｋ）にて１×１０−１６、５×１０−１６及び１×１０−１５モル／細胞・秒の細胞の酸素消費速度にて動作させている。これらの酸素消費量の値は、Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１：１−１４（Ｂａｌｉｓ等）（１９９９）に示されるブタの一次肝細胞についてのデータに基づくものである。
【００５２】
これらの曲線は、酸素に対する透過性が低い膜を使用した場合に左上に向かってシフトし、酸素に対する透過性が高い膜を使用した場合には右下に向かってシフトする。
【００５３】
これに対して、細胞が浸漬せられた静止性の生物学的液体の層、及び該生物学的液体層と接触する気体透過性の膜によって気体不透過性の支持材上の細胞に酸素が供給される場合、酸素の輸送量と消費量との平衡は次の支配式により表される。
【００５４】
【数２】
0004605734.tif 000003
式中、ｈは生物学的液体層の厚さ、Ｓは生物学的液体中の酸素の溶解度、Ｄは生物学的液体中の酸素の拡散率である。膜のＰｍが同じ値であるものとすると、酸素の輸送抵抗はこの形態の方が常に大きくなるため、この第２の形態では与えられた酸素濃度に対する酸素化度は常により小さくなる。
【００５５】
この支配式は更に培地の灌流にも依存するが、２つの支配式間の基本的な傾向は灌流の方向、体積流速や灌流の他の特性のいずれによっても変化しない。
【００５６】
例えば、酸素化の方向性自体が細胞に影響を及ぼさなければ、膜を介した細胞の直接的酸素化では、膜ついで培地を介して細胞が順次酸素化される場合と比較して、酸素に対する透過率が同じ複数の膜について、灌流速度とは無関係に、酸素化度をより自由に制御することが常に可能である。
【００５７】
以下に気体透過性かつ液体不透過性の膜を備えた２区画式細胞培養装置の他の異なる具体的実施例について述べる。これらの実施形態を図４ａ〜４ｉに示した。
【００５８】
図４ａは、２区画式細胞培養装置１の別の基本的構成を示したものである。細胞培養装置１は、生物学的液体１１が入った細胞区画１０、酸素化流体２１が入った酸素化流体区画２０、表面４１を有する気体透過性かつ液体不透過性の膜３０、細胞４０、及び剛性を有する不透過壁５０を備える。液体区画１０と酸素化流体区画２０とは気体透過性かつ液体不透過性の膜３０によって分離されており、膜の液体区画側の面には表面処理が施されている。細胞４０は液体区画内の生物学的液体１１に接触するようにして表面４１上で培養され、酸素化流体２１を酸素化流体区画２０に供給する酸素供給源から、気体透過性かつ液体不透過性の膜３０を通じて酸素の供給を受けることが可能である。
【００５９】
表面４１は、細胞接着を誘導し、所望の細胞機能を促進するうえで有利であり、接着性の低いある種の細胞の場合では不可欠である。この表面は１以上のコーティング材料を含有することが可能であり、膜の少なくとも一部分にコーティングされ、膜の液体区画１０側の面から膜の内部へと延在する場合もある。膜にコーティングすることが可能なコーティング材料としては、これらに限定されるものではないが、コラーゲン、フィブロネクチンや抽出した生物学的基質の調製物及びプロテオグリカンなどの他の細胞外基質成分などの生物学的コーティング、フィブリン、ＲＧＤ含有ペプチドもしくはその類似ペプチド、化学的もしくは生物学的に合成された生合成コーティング、及び／または細胞接着及び／または所望の細胞機能を誘導する他の物質などが挙げられる。好ましいコーティングとしてはコラーゲンであり、より好ましくはＩ型コラーゲンである。これらのコーティングは膜に受動的に吸着させるか、あるいは膜と化学的に反応させる（共有結合グラフティングなど）ことが可能である。細胞を接着、機能させるために膜を１以上のコーティングまたは複数のコーティング層にて処理する必要がある場合もある。これらのコーティングはその組成及び／または濃度において互いに同じであっても、異なっていてもよい。
【００６０】
膜に対する細胞の適合性を向上させるための更なる別の好適手段は膜にコラーゲンコーティングを施すことである。コーティングはバルクゲルとは区別され、バルクゲルが嵩高い３次元的厚さを有し、水和しているのに対して厚さが分子レベルであり膜表面がドライであるので、基本的には２次元である。複数の表面処理を順次膜に施すことが可能であり、例えば、コロナ放電処理の後にコラーゲン、好ましくはＩ型コラーゲンなどの細胞外基質のコーティングを施すことが可能である。
【００６１】
細胞の接着性を向上させるために膜３０を処理するための別の方法としては、酸素混合気（例えば空気）の存在下でのコロナ放電などの物理的な表面処理法がある。コロナ放電によって露曝面に酸素原子が取り込まれることにより露曝面は酸化され、親水性が高くなり、場合により帯電する。この処理は、材料が所定の表面自由エネルギー（湿潤度（ダイン／ｃｍ２）換算）及び組織培養皿の一般的な特徴と同様の他の化学的特徴を有するようになる程度に行われる。この処理は曝露される平面表面をこの程度にまで改変する（あるいは、所定の異なる自由エネルギーを有する表面に対して細胞の応答がより好ましくなるか否かに応じて、これよりも大きいか小さい程度にまで）うえで充分であるが、下層の材料自体の性質を大きく損なうことないような時間にわたって行われる。複数の表面処理を順次膜に施すことが可能であり、例えば、コロナ放電処理の後にコラーゲン、好ましくはＩ型コラーゲンなどの細胞外基質のコーティングを施すことが可能である。
【００６２】
通常、コロナ放電によって材料または膜の物理的トポグラフィに影響することなく表面の化学的性質のみが改質される。コロナ放電では、空気または他の酸素混合気の存在下で表面を高周波の放電に曝し、これにより酸素原子が材料表面に取り込まれて表面が酸化される。この処理によってプラスチック、紙、及び金属製フィルムの表面自由エネルギー及び親水性が増大する。材料にコロナ放電を適用するためのシステムとしてはＣｏｒｏｔｅｃ  Ｃｏｒｐ社（コネティカット州ファーミントン）などの企業より市販されているものがある。これらのシステムは高電圧変圧器と表面に対して最大でキロワットレベルのエネルギーを４０Ｈｚもの高い周波数にて印加するように構成された電極網とからなるものである。酸素を高電圧の放電に曝すことによってオゾンが発生し、このオゾンが表面と化学的に反応して酸素が表面に取り込まれる。この処理は化学及び生物学実験室の一般的な環境条件下で室温にて行うことが可能である。コロナ放電の動作条件は表面を改質する材料と表面自由エネルギーを増大させる程度に応じて異なりうる。
【００６３】
別の一実施形態では、気体透過性かつ液体不透過性の膜３０と細胞外基質成分を含んだバルクゲルとの間に細胞を挟み込む。図４ｂには、生物学的液体１１が入れられた液体区画１０、酸素化流体２１が入れられた酸素化流体区画２０、気体透過性かつ液体不透過性の膜３０、細胞４０、バルクゲル４２、及び剛性を有する不透過壁５０を有する細胞培養装置１が示されている。液体区画１０と酸素化流体区画２０とは気体透過性かつ液体不透過性の膜３０によって分離され、膜３０の液体区画側の面上で細胞４０が培養されている。膜とは反対側の細胞の面上にバルクゲル４２が配されている。細胞にはバルクゲル４２を介して生物学的液体１１から栄養素が供給され、酸素化流体２１を酸素化流体区画２０に供給する酸素供給源４から気体透過性かつ液体不透過性の膜３０を通じて酸素供給を受けることが可能である。
【００６４】
図４ｃに示される別の一実施形態では、国際特許出願公開公報第ＷＯ９６／３４０８７号及び米国特許第５，６０２，０２６号に述べられるような２個のバルクコラーゲンゲル４３のように、２個のバルクゲルの間に細胞が挟まれている。詳細には図４ｃには、生物学的液体１１が入れられた液体区画１０、酸素化流体２１が入れられた酸素化流体区画２０、気体透過性かつ液体不透過性の膜３０、細胞４０、２層ゲル４３、及び剛性を有する不透過壁５０を有する細胞培養装置１が示されている。液体区画１０と酸素化流体区画２０とは気体透過性かつ液体不透過性の膜３０によって分離され、その上に細胞４０が２層ゲル４３の間に配され、（膜３０の液体区画側の面上で）培養されている。細胞４０にはゲル４３を介して生物学的液体１１から栄養素が供給され、酸素化流体を酸素化流体区画２０に供給する酸素供給源４から気体透過性かつ液体不透過性の膜３０を通じて酸素供給を受けることが可能である。
【００６５】
膜に細胞を結合させる別の有用な方法は基質物質を用いることによるものである。図４ｄには、生物学的液体１１が入れられた液体区画１０、酸素化流体２１が入れられた酸素化流体区画２０、気体透過性かつ液体不透過性の膜３０、細胞支持格子もしくはスカフォールド４４内の細胞４０、及び剛性を有する不透過壁５０を備える細胞培養装置１の別の一実施形態が示されている。この格子はコラーゲンに基づいたものであるが、別の天然の細胞外基質物質及び／または合成ポリマー及びポリマーの配合物に基づいたものであってもよい。コラーゲン及び他の細胞外基質成分をコラーゲンからなる非収縮または収縮格子構造として細胞を基質中に懸濁することが可能である。材料がコラーゲンである場合、酸可溶化コラーゲン、ｐＨ中和溶液及び細胞懸濁液の混合物を型成形することによって細胞を含む格子材料を形成することが可能である。この型成型物はゲル化して細胞を含有するコラーゲン格子４４を形成する。細胞含有コラーゲン格子、特に収縮コラーゲン格子を製造するための方法は、先に米国特許第４，４８５，０９６号、同第５，１０６，９４９号、ならびに同第５，５３６，６５６号に開示されている。
【００６６】
あるいは、格子を多孔質の天然もしくは合成スカフォールドとし、細胞をスカフォールド内で培養し、スカフォールドと気体透過性膜上の細胞を接触させることも可能である。多孔質の支持材を初めに膜に設けてから細胞を多孔質スカフォールド内に播種するか、あるいは多孔質支持材に初めに細胞を播種してからこれを膜に設ける。多孔質支持材の例としては、コラーゲンスポンジ、高密度小繊維コラーゲン膜、及び加工組織膜などの細胞外基質成分を含むスカフォールドが挙げられる。合成多孔質支持材としてはポリウレタン発泡材が挙げられる。
【００６７】
図４ｅ及び４ｆには、生物学的液体１１が入れられた液体区画１０、酸素化流体２１が入れられた酸素化流体区画２０、気体透過性かつ液体不透過性の膜３０、細胞支持格子４４内の細胞４０、第２の細胞層４５、及び剛性を有する不透過壁５０を有する細胞培養装置１の更なる２つの実施形態が示されている。図４ｅは、第２の細胞層４５が格子４４の液体区画１０側の面上に配されている実施形態を示したものである。図４ｆは、第２の細胞層４５が格子４４と膜３０との間に配されている第２の実施形態を示したものである。第２の細胞層は格子内部の細胞と同種のものであっても異なる種類のものであってもよい。図４ｅ及び４ｆに示される実施形態における細胞の配置を組み合わせた実施形態も考えられる。
【００６８】
細胞の中には、その付着または機能的性質が生物学的液体の流れとの直接的接触によって悪影響を受けやすく、せん断応力に影響されやすいものがあるため、特定の用途においては、生物学的液体の流れと細胞との間に液体透過性の膜を配置して流体力学的相互作用を制限することも可能である。この構成では細胞が入れられた細胞区画としての更なる区画が液体区画と酸素化流体区画との間に置かれる。
【００６９】
図５ａには、不透過壁５０、第１の区画２０を第２の区画１５から分離する気体透過性かつ液体不透過性の膜３０、及び、第２の区画１５を第３の区画１６から分離する少なくとも１つの液体透過膜３１を有する３区画式細胞培養装置１の一実施形態が示されている。第１の区画２０は「酸素化流体」区画であり、不透過壁５０の一方、室の側壁、及び気体透過性かつ液体不透過性の膜３０によって区画されている。第２の区画１５は「細胞」区画であり、室の側壁、気体透過性かつ液体不透過性の膜３０、及び液体透過膜３１によって区画されている。第３の区画１６は「液体灌流」区画であり、不透過壁５０の他方、室の側壁、及び液体透過膜３１によって区画されている。
【００７０】
図５ａに示された室１は、液体灌流区画１６が前記１以上の液体透過膜３１の上方となり、酸素化流体区画２０が気体透過性かつ液体不透過性の膜３０の下方となるように分割されているが、細胞区画１５が液体灌流区画と酸素化流体区画との間に配され、気体透過性かつ液体不透過性の膜３０が酸素化流体区画と細胞区画との間に配され、１以上の液体透過膜３１が細胞区画と液体灌流区画との間に配されていれば、室は任意の方向にて配置することが可能である。
【００７１】
液体灌流区画１６には、細胞培養の培地、平衡溶液、血液や血漿などの生物学的液体１１ｂが入っている。細胞区画１５には、気体透過性かつ液体不透過性の膜３０上で実質的に培養される細胞４０、ならびに液体灌流区画１６内の生物学的液体１１ｂと同じかもしくは異なる生物学的液体１１ｂが入っている。生物学的液体１１ａと１１ｂとはその間に介在する１以上の液体透過膜３１を介して液体接触している。生物学的液体１１ａは細胞培養用の基本的栄養素、毒素、アミノ化分子、及び代謝が必要な他の生物学的老廃物を細胞４０に供給し、細胞の代謝産物、解毒化産物、分泌された各種因子、及びタンパク質を運び去る。これらの分子は液体透過性膜３１を通じて生物学的液体１１ａの内外に輸送される。
【００７２】
細胞区画１５内の細胞４０は液体透過膜３１とは実質的に接触していない。細胞区画内の細胞及び生物学的液体１１ａの容積によって充填される間隙は均一な厚さを有することが好ましいが、不均一であってもよい。この間隙は少なくとも気体透過性かつ液体不透過性の膜３０に付着した細胞層４０の高さとすることにより、細胞４０と液体透過膜３１の細胞側の面との間には少なくとも若干量の生物学的液体１１ａが介在することとなる。この間隙は１以上のスペーサによって維持される。
【００７３】
細胞区画１５内の生物学的液体１１ａの流速は極めて小さいかもしくは生物学的液体１１ａは静止しているため、その流れは液体灌流区画１６内の生物学的液体１１ｂの流れによって実質的に影響されない。生物学的液体１１ａは充填時に細胞区画１５に予め供給され、液体透過膜３１を通じて生物学的液体１１ｂと自由に交換可能であることが好ましい。１以上のポートを設けることにより充填時の空気置換用の通気口、及び／または動作時に細胞区画１５内の液体を排出するための手段として使用することが可能である。通気及び排液の目的でこれら他のポートを他のバイオリアクタの細胞区画からのポートと、並列、直列、あるいはこの両者にて多岐管接続することも可能である。
【００７４】
生物学的液体１１ｂは開口部を通じて液体灌流区画１６の内部に供給され、かつここから取り出されることが好ましい。より好ましくは、少なくとも２個の開口部を設け（図５ａには示されていない）、１個を生物学的液体の供給源から生物学的液体１１ｂを供給するための流入口とし、別の１個を生物学的液体１１ｂを排出すなわち排液するための流出口とする。これらの開口部はポートやマニホルドによって液体灌流区画１６の内部と外部とを連通するものである。ポートは他のバイオリアクタ・ユニットの他の液体灌流区画と、並列、直列もしくはこの両方にて接続することにより生物学的液体１１ｂのフロー回路もしくはループを形成することが可能である。更なるポートを設けることにより充填時の空気排出のための通気口として、または他のポートが別のユニットのポートに取り付けられている場合に液体灌流区画１６内の液体を排液する手段として機能させることが可能である。
【００７５】
通常は気体であるが液体である場合もある酸素化流体２１は、酸素または酸素化気体の運搬及び気体透過性かつ液体不透過性の膜３０を通じた酸素の輸送を可能とするものであって、酸素化流体区画２０を通じて流れる。酸素は、気体透過性かつ液体不透過性の膜３０を介して細胞区画１５内の細胞４０によって利用される。酸素化流体区画内の酸素化流体は開口部を通じて該区画内部に供給され、かつここから除去されることが好ましい。より好ましくは、少なくとも２個の開口部を設け（図５ａには示されていない）、１個を酸素化流体の供給源から酸素化流体を供給するための流入口とし、別の１個を酸素化流体を排出すなわち排気するための流出口とする。これらの開口部はポートやマニホルドによって酸素化流体区画２０の内部と外部とを連通するものである。ここでもやはり、ポートは他のバイオリアクタ・ユニットの他の酸素化流体区画と、並列、直列もしくはこの両方にて接続することにより酸素化流体のフロー回路もしくはループを形成することが可能である。通気用の他のポートを区画壁に設けることも可能である。
【００７６】
気体透過性かつ液体不透過性の膜及び液体透過膜を別個に有する３区画細胞培養装置の他の異なる具体的実施形態を以下に述べる。これらの実施形態は図５ｂ〜ｆに概略的に示されている。図５ｂは、気体透過性かつ液体不透過性の膜３０及び液体透過膜３１の両方に細胞４０が直接接触している一実施形態を示したものである。この実施形態では、細胞区画１５のサイズは最小容量にまで、具体的には、細胞区画内の細胞４０のサイズにまで縮小されており、液体透過膜３１は気体透過性かつ液体不透過性の膜３０上で生育する細胞に接触している。
【００７７】
図５ｃには別の一実施形態が示されているが、細胞の第１の層４０が気体透過性かつ液体不透過性の膜３０に付着せられ、細胞の第２の層４９が液体透過膜３１に付着せられることにより２細胞層すなわち多層培養層を形成している。この実施形態は少なくとも２層の細胞層を有するものである。更なる細胞層を細胞層４０と４９との間に介在させることも可能である。
【００７８】
図５ｄに示される別の一実施形態では、細胞４０は２個のバルクコラーゲンゲル４３の間に挟まれている。詳細には、図５ｄには、細胞培養の培地、平衡溶液や血漿などの生物学的液体１１ｂが入った液体灌流区画１６を有する細胞培養装置が示されている。細胞区画１５には、気体透過性かつ液体不透過性の膜３０上に配された第１のバルクコラーゲンゲル４３、該ゲル上に播種された１以上の細胞層４０、該細胞上に配された第２のバルクコラーゲンゲル４３、及び第２のゲルに接する液体透過膜３１が含まれる。生物学的液体１１ｂは１以上の液体透過膜３１を介して液体接触している。生物学的液体１１ｂはバルクコラーゲンゲル４３、液体透過膜３１を通じて生物学的液体１１ｂの内外に輸送される細胞培養に関係する成分を細胞４０に供給し、かつここから除去する。
【００７９】
図５ｅは、細胞４０を含有する細胞支持格子４３が気体透過性かつ液体不透過性の膜３０と液体透過膜３１との間に挟まれた別の一実施形態を示したものである。細胞支持格子はコラーゲン格子であってもよく、あるいは本明細書の別の箇所で述べるように細胞を包含する多孔質の基質と互換することも可能である。
【００８０】
図５ｂ〜５ｅに示される各実施形態では、スペーサを配して細胞区画１５の高さを維持することが可能である。図５ｂの実施形態では、細胞を先ず２枚の膜３０及び３１の一方に播種し、次いで２枚の膜の間に細胞が挟まれるように膜同士を一体化すれば、このスペーサを省略することが可能である。図５ｃの実施形態では、先ず隣接する膜上に細胞層４０をそれぞれ播種し、次いで細胞が播種された膜同士を一体化すれば、このスペーサを省略することが可能である。
【００８１】
別の一実施形態では、液体灌流区画１６として中空糸を使用することが可能である。この実施形態の一変形例が図５ｆに示されているが、平面をなす気体透過性かつ液体不透過性の膜３０に細胞４０が付着させられ、中空糸１７が細胞区画１５内に収容されている。中空糸１７は細胞の上方に位置する所定平面上に延び、生物学的液体１１ｄが入れられている。細胞区画１５内の生物学的液体１１ａは静止していても、流動していてもよい。生物学的液体１１ｄ（生物学的液体１１ａと同じでも異なっていてもよい）は好ましくは中空糸１７の内部を流れる。中空糸１７は、本明細書中に述べられる液体透過膜３１と同様、液体透過性の材料にて形成される。これにより生物学的液体１１ｄ中の栄養素を、細胞区画内の生物学的液体１１ａの流速（細胞４０に作用するせん断応力を低減するため、低速であることが好ましい）とは独立した流速にて装置全体にわたって輸送することが可能である。中空糸１７の方向は、酸素化流体区画２０内の流れの方向に対して、平行、逆平行、もしくは直交する方向とすることが可能である。
【００８２】
液体灌流区画１６内の生物学的液体１１ｄを細胞区画１５内の生物学的液体１１ａから効果的に分離するため、液体透過膜３１または中空糸１７の孔径は、高分子量の栄養素、毒素、因子、代謝産物や分泌タンパク質の輸送が可能である程度に大きいが、膜を通じた細胞の増殖は防止する程度に小さいものとなっている。液体透過膜の材料として適当なものには、これらに限定されるものではないが、セルロース膜、多孔質のポリ（スルホン）及びポリ（エーテルスルホン）膜、多孔質の非処理ナイロン及び他のポリアミド膜、多孔質ポリエステル、多孔質ガラス、穿孔ステンレス鋼、多孔質（トラックエッチ加工）ポリカーボネート（ＰＶＰ、エタノール、または他の湿潤剤にて湿潤した）、多孔質ポリ塩化ビニル、穿孔ポリジメチルシロキサン、及び多孔質セラミックなどが挙げられる。本発明に用いるためのこれらの特性を有する他の膜材料を、商業的に入手可能な材料から選択するか、あるいは標準的な方法により製造することが可能である。
【００８３】
酸素化流体の流れは静止しているか、任意の一方向に流れるか、あるいは多方向に流れる。酸素化流体の流れに対して、生物学的液体の流れは、同じ方向、逆方向、直交方向、またはこれらを任意に組合わせた方向などの任意の方向に流れることが可能である。物質移動を最大とするためには、流れの方向は反対、例えば、生物学的液体と酸素化流体とが反対方向となる方向が好ましい。並列、直列、あるいはその両方にて接続された複数のバイオリアクタ・ユニットまたはカートリッジでは、各カートリッジにおける流れの相対的方向は同じかあるいは異なっている。生物学的液体及び／または酸素化流体の流れは振動しているか、あるいは時間依存的なものとすることが可能である。更に、生物学的液体及び酸素化流体の体積流速は互いに独立している。
【００８４】
本発明のバイオリアクタ・ユニットは、細胞が含まれる少なくとも１つの区画と、酸素化流体が含まれる少なくとも１つの区画とを備えている。これらの区画は平板かつ平面状に配列されており、区画間に共通の平面を共有する。１個のユニットあるいはカートリッジは細胞を収容した１区画と酸素化流体を収容した１区画とから構成することが可能である。こうしたユニットは個別に収容されるかもしくは互いに積み重ねられ、ユニット間は剛性を有する不透膜にて分離される。細胞培養カートリッジまたはユニットのこうしたユニットとしての性質のため、このバイオリアクタは各区画の表面積及び容積を大きくし、更なるユニットを追加することによって大規模化が可能である。更なるユニットが追加される場合、区画同士をポートを介して連通することにより区画間で生物学的液体または培地または酸素化流体の流れが可能であることが好ましい。
【００８５】
図６ａは、平面状の２枚の気体透過性かつ液体不透過性の膜３０および３８を有するバイオリアクタからなる細胞培養装置の一実施形態を示したものである。膜の一方すなわち膜３０のみ、膜の液体区画１０側の生物学的液体１１に接する面上に細胞４０が播種されている。この実施形態では２個の酸素化流体区画２０及び２８が設けられている。酸素化流体区画２０及び２８では、酸素化流体２１及び２９は同じか異なっていても良く、それぞれ同じ方向かもしくは異なる方向に、同じかもしくは異なる流速にて流れている。この実施形態では、膜３０を通じた酸素の膜内外輸送による接着細胞４０の直接的酸素化と、膜３８を通じた酸素の膜内外輸送による流れている生物学的液体１１の直接的酸素化とが同時に行われる。
【００８６】
１個の液体区画と２個の酸素化流体区画とを有する３区画細胞培養装置の別の一実施形態が図６ｂに示されている。１枚の気体透過性かつ液体不透過性の膜３０は平面状をなし、その液体区画１０側の生物学的液体１１に接する面上には細胞４０が播種されている。第２の酸素化流体区画２３は、液体区画１０内の所定平面上に延びる、酸素化流体２９の入った中空糸によって形成される。酸素化流体２１（酸素化流体区画２０内の）と２９とは同じでも異なっていてもよく、同じかもしくは異なった方向に、同じかもしくは異なった流速にて流れている。この実施形態によれば、中空糸２３を通じた酸素の膜内外輸送による生物学的液体１１の流れの直接的酸素化に加え、膜３０を通じた酸素の膜内外輸送による接着細胞４０の直接的酸素化が行われる。
【００８７】
図６ｃには１個の液体区画と２個の酸素化流体区画とを有する３区画細胞培養装置の第３の実施形態が示されている。この実施形態は、気体透過性かつ液体不透過性でほぼ平面状をなす第２の膜３８上に支持される第２の細胞層４８に生物学的液体を接触させることによって生物学的液体１１の流れに接する細胞４０の数を増加させたバイオリアクタ・ユニットとして構成されたものである。酸素化流体区画２０、酸素化流体区画２８、及び液体区画１０内の流れの方向は互いに同じ方向、逆方向、直交方向、またはこれらを任意に組み合わせた方向であり、酸素化流体２１及び２９の一方もしくは両方が静止していてもよい。２つの細胞層４０及び４８の細胞密度は同じでも異なっていてもよく、同種かもしくは異種の細胞であってよい。この実施形態によれば、気体透過性かつ液体不透過性の膜の単位面積当たりの細胞数を変化させたり、システム内に灌流させる生物学的液体の体積を変えることなく、単一のバイオリアクタ・ユニットの処理容量を増大させることが可能である。
【００８８】
図６ａ及び６ｃに示される実施形態では、細胞４０は気体透過性かつ液体不透過性の膜３０の１枚にのみ接触している。液体区画内の細胞及び生物学的液体１１の容積によって充填される間隙は均一な幅を有することが好ましいが、不均一であってもよい。この間隙は少なくとも膜３０に付着した細胞層４０の高さとすることにより、細胞と液体透過膜の細胞側の面との間に少なくとも若干量の生物学的液体１１が介在することとなる。本発明においてはこの間隙の高さに絶対的な範囲はない。この間隙はスペーサによって維持することが可能である。
【００８９】
積層された複数のカートリッジからなるバイオリアクタの一実施形態が図７ａに示されているが、ここではバイオリアクタ１は積層された３個のカートリッジ２を有している（図１も参照）。カートリッジ２はそれぞれ上側壁５０ａ及び下側壁５０ｂを有するハウジングを備える。各カートリッジは生物学的液体１１が流れる液体区画１０と酸素化流体２１が流れる酸素化流体区画２０とを有する。各カートリッジすなわちユニット２の２個の区画は気体透過性かつ液体不透過性の膜３０によって分離されている。細胞４０は膜３０の液体区画側の面上で培養されている。酸素化流体及び生物学的液体の流れは同じ方向、逆方向、直交方向、またはこれらを任意に組合わせた方向などの任意の方向に流れることが可能である。区画の数は区画の種類別に最大で１００個以上にまで変化させることが可能である。更に、複数の酸素化流体区画２０間で個々の酸素化流体２１の流れの組成（例  酸素の比率）や体積流速は同じでも異なっていてもよい。同様に複数の液体区画１０間で個々の生物学的液体１１の組成（例  サイトカインの濃度）や体積流速は同じでも異なっていてもよい。
【００９０】
図７ｂには、バイオリアクタ１が、互いに積層された複数の気体透過性かつ液体不透過性の膜と、該膜の生物学的液体側かつ酸素化流体とは反対側の面上で培養される細胞とからなる別の一実施形態が示されている。この実施形態ではバイオリアクタ１は、バイオリアクタ１を通じて酸素化流体２１を流すための流入口及び流出口、ならびにバイオリアクタ１の全体を通じて生物学的液体１１を流すための流入口及び流出口を有する１個の大型の室を備える。この実施形態では、バイオリアクタ１は個別のカートリッジを有する代わりに互いに積層された複数の気体透過性かつ液体不透過性の膜３０（図７ｂでは６枚）を有することにより、生物学的液体１１の入った複数の細胞区画１０（図７ｂでは３個）と酸素化流体２１の入った複数の酸素化流体区画２０（図７ｂでは４個）とが交互に配された構造となっている。細胞４０は各膜３０の生物学的液体１１に接する面上で培養されている。区画の数は区画の種類別に最大で１００個以上にまで変化させることが可能である。図７ａに示された実施形態について示したように、各液体区画及び酸素化流体区画内の生物学的液体１１及び酸素化流体２１の組成及び流れは同じでも異なっていてもよい。
【００９１】
複数の酸素化流体区画のそれぞれに酸素化流体の流れを均等もしくは不均等に分配する第１のマニホルドに、バイオリアクタへの酸素化流体の流入口を接続することにより酸素や他の気体を酸素化流体区画に供給し、気体透過性かつ液体不透過性の膜を介したガス交換を行うことが可能である。酸素化流体は、（互いに平行に配された）複数の酸素化流体区画を通過した後、すべての酸素化流体区画に共通の第２のマニホルド内に回収され、酸素化流体用の流出口からバイオリアクタの外部に送り出される。同様に、生物学的液体用の流入口を、複数の液体区画のそれぞれに生物学的液体の流れを均等に分配するマニホルドに接続することにより、液体区画内の細胞が生物学的液体に露曝される。生物学的液体は、（やはり互いに平行に配された）複数の区画を通過した後、共通のマニホルド内に回収されてから流出口に送られ、生物学的液体用のフローループを循環する。
【００９２】
こうした多区画式細胞培養装置用のマニホルドは、着脱式のコネクタによってそれぞれの関連する区画に接続されることが好ましい。これらのコネクタによって個々の接続を容易に行い、また必要に応じこれを交換することが可能である。また、必要な場合、このマニホルドを各関連区画に恒久的に接続することも可能である。
【００９３】
図８ａにはこうしたマニホルド式バイオリアクタ１の具体的な一実施形態が示されており、バイオリアクタ１は互いに積層された複数のカートリッジ２（図８ａでは３個）を有している。カートリッジ２はそれぞれ、液体区画１０、気体透過性かつ液体不透過性の膜３０、細胞４０、及び剛性かつ不透過性のハウジング５０を有している。
【００９４】
バイオリアクタ１は更に共通の酸素化流体区画２２２、酸素化流体流入口３、酸素化流体流出口３’、液体流入口５、液体流出口５’、液体流入マニホルド５５５、及び液体流出マニホルド５５５’を有する。液体流入マニホルド５５５は生物学的液体を液体流入口５から各カートリッジ２の液体区画１０に流すものである。液体流出マニホルド５５５’は生物学的液体を各カートリッジ２の液体区画１０から液体流出口５’に流すものである。各液体区画毎に他のポートを設けることにより、充填時の空気排出のための通気口として、または各液体区画内の液体を個別に排出する手段として機能させることが可能である。酸素化流体流入口３は、カートリッジ２の外部のバイオリアクタ１の共通の酸素化流体区画２２２内に酸素化流体を流すものであり、酸素化流体は酸素化流体区画２２２において気体透過性かつ液体不透過性の膜３０に接触する。酸素化流体は酸素化流体流出口３’を通じてバイオリアクタの外部に流れる。酸素化流体を逃がすための他のポートをバイオリアクタ１の不透過壁５０５に設けることも可能である。区画の数は区画の種類別に最大で１００個以上にまで変化させることが可能である。
【００９５】
図８ｂには、互いに積層された複数のカートリッジ２（この図では３個）をバイオリアクタ１が有する別の構成が示されており、カートリッジ２はそれぞれが液体区画１０、酸素化流体区画２０、気体透過性かつ液体不透過性の膜３０、細胞４０、及び剛性を有する不透過性のハウジング５０を備えている。バイオリアクタ１は更に、酸素化流体流入口３、酸素化流体流出口３’、液体流入口５、液体流出口５’、液体流入マニホルド５５５、液体流出マニホルド５５５’、酸素化流体流入マニホルド３３３、及び酸素化流体流出マニホルド３３３’を備える。液体流入マニホルド５５５は生物学的液体１１を液体流入口５から各カートリッジ２の液体区画に流すものである。液体流出マニホルド５５５’は生物学的液体１１を各カートリッジ２の液体区画１０から液体流出口５’に流すものである。各液体区画毎に他のポートを設けることにより、充填時の空気排出のための通気口として、または各液体区画内の液体を個別に排出する手段として機能させることが可能である。酸素化流体流入マニホルド３３３は酸素化流体を酸素化流体流入口３から各カートリッジ２の酸素化流体区画２０に流すものである。酸素化流体流出マニホルド３３３’は酸素化流体を各カートリッジ２の酸素化流体区画２０から酸素化流体流出口３’に流すものである。酸素化流体を逃がすための他のポートを各酸素化流体区画２０に設けることも可能である。区画の数は区画の種類別に最大で１００個以上にまで変化させることが可能である。
【００９６】
更なる別の一実施形態においては、１以上の液体透過膜を介在させることによって細胞を生物学的液体の流れから分離することにより、液体区画を別々の液体灌流区画と細胞区画とする。これらの区画は間に介在する１以上の液体透過膜によって完全もしくは不完全に分割される。任意の数の区画を交互に配することが可能でありその場合、図７ｂに示されるように室のハウジングを境界としない。室のハウジングは不透性材料にて形成される。
【００９７】
バイオリアクタには機能性細胞を播種するが、より好ましくは播かれた細胞は共に機能して臓器中の細胞において可能な種類とレベルの機能を行う。細胞はバイオリアクタ内で増殖するか、その数が安定するか、あるいは増殖と数的安定のモードが切り換えられる。細胞はまた、元々の表現形を維持するか、あるいはバイオリアクタ中での培養時にその表現形が変化する。バイオリアクタはｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養システムとして使用され、その酸素化流体及び液体回路のために、臓器の補助を必要とする患者を治療するための臓器補助装置としての使用に適している。この装置には、細胞が由来する臓器におけるのと同様に機能するように培養された臓器細胞が播種される。
【００９８】
バイオリアクタ用の細胞の入手源の一つは哺乳動物の臓器である。この臓器が肝臓である場合、肝臓補助装置での使用のために培養される細胞は肝細胞である。肝細胞は、適当な化学的及び構造的環境下に置かれた場合に肝臓に通常求められる機能的条件を満たすことが可能な肝臓の主要な細胞である。装置は、内皮細胞、伊東細胞、クップファー細胞、特化したマクロファージ様細胞、繊維芽細胞など、肝臓に存在する他の細胞を含むことも可能である。ＬＡＤにおいてはこれらまたは他の種類の細胞の１種類以上と肝細胞とを共培養することが望ましい場合がある。複数のユニットからなるバイオリアクタでは、各ユニットに同種及び／または複数種の細胞の組合わせを同数播種するか、あるいは異なる数の細胞を播種するか、及び／またはこの組合わせが可能である。
【００９９】
ヒト肝細胞は入手困難であるので、本発明ではヒト以外の入手源の使用が可能である。他の哺乳動物由来の細胞としては、これらに限定されるものではないが、ウマ、イヌ、ブタ、ウシ、ヒツジ、及びネズミ由来のものの使用が可能である。細胞のドナーは、発達の程度及び年齢、性別、生物種、重量、及び大きさにおいて異なりうる。細胞は、胎児、新生児、または成人を含む加齢個人のドナー組織より得ることが可能である。本発明では、実質または間葉幹細胞などの胎児始源細胞を使用し、分化を誘導して所望の組織に発生させることが可能である。更に、異なる細胞株の細胞の混合物、正常細胞と遺伝子改変細胞との混合物、または２種類以上の生物種もしくは組織からの細胞の混合物の使用も可能である。
【０１００】
本発明に使用される肝細胞の供給源の一つとしてブタ肝臓がある。臨床的ＬＡＤ１台につき生育可能な肝細胞の数の現時点での最も正確な推定値は、およそ１０１０個であり、小型（９．１ｋｇ（２０ｌｂ））のブタ肝臓から得られる細胞数に近い。別の細胞の入手源としては、予め哺乳動物の臓器から得た細胞を培養するか、あるいは細胞系として樹立するように予め培養された細胞を培養することがある。本発明に使用される細胞は、正常細胞であっても、あるいは自然変異、化学変異、またはウイルスによる形質移入などにより遺伝子操作された細胞であってもよい。細胞の不死化、同種抗原性の低下、肝細胞の分化の目的で遺伝子組換えまたは遺伝子操作細胞を創出することも可能である。細胞に遺伝子操作を施す技術は当該技術分野においては公知であり、サムブルック等（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）のＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８９）（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，  コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州）に述べられている。
【０１０１】
細胞は、新鮮な処理組織、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにて予め培養した細胞、凍結保存組織から解凍した細胞、あるいはこれらの特定の組合わせより播種される。播種に先立ち、細胞は播種培地中に懸濁される。本発明の新規な方法及び装置では、細胞は気体透過性かつ液体不透過性の膜上に播種される。細胞の播種に先立ち、必要に応じて気体透過性かつ液体不透過性の膜に処理を施し、液体区画の液体内容物の必ずしもすべてではないが大部分を排液する。細胞の播種に先立って液体内容物の一部を例えば生物学的液体などで置換することも可能である。これらの液体の移送は、液体区画に設けた１以上のポートを通じて排液するか、液体区画に接している不透過壁を取り外し、これによって形成される開口部を通じて液体区画内に液体を直接導入もしくは吸引するか、あるいはこれらの組合わせによって行われる。
【０１０２】
細胞の播種には複数の実施形態が考えられる。一実施形態では、先ず液体区画に接している不透過壁を取り外し、懸濁液または天然または合成ポリマ基質中に懸濁した細胞を（手動または自動ピペットで）気体透過性かつ液体不透過性の膜上に滴下することにより細胞を導入する。別の一実施形態では、先ず液体区画のポートが少なくとも２個開いていることを確認してから、細胞懸濁液を液体区画内に流し込むことにより細胞を導入する。いずれの実施形態においても細胞は膜上に付着させられて機能を発現する。この後、播種培地を排液し（液体区画から／への液体の除去または導入に関し上記に述べた方法のいずれかによる）、生物学的液体を補充する。
【０１０３】
複数の培養ユニットまたはカートリッジを有するバイオリアクタでは、各ユニットまたはカートリッジに、組み立て状態の他のユニットと同時に上記実施形態のいずれかによって細胞を播種するか、あるいはマニホルドによって結束されていない個別のユニットとして別々に細胞を播いた後にマニホルドにて相互連結して完全なバイオリアクタシステムとする。後者の実施形態において細胞が播種された複数のユニットが組み立てられる時点は、播種後まもなくか、または培養が確立した後である。
【０１０４】
培養が確立され、バイオリアクタが肝臓補助装置として機能することが可能となった時点で、図１に示すようにバイオリアクタを使用して肝臓補助を要する患者を治療する。図１に示されるように、また本明細書中に述べるように、本発明の肝臓補助装置は、酸素化流体を供給するための流入口３及び流出口３’ならびに生物学的液体を供給するための流入口５及び流出口５’を有するバイオリアクタ１を備える。酸素化流体区画に酸素化流体を供給するための流入口３は酸素化流体供給源４より供給を受ける。酸素化流体流出口３’は大気中または回収容器中に通気していることが好ましい。酸素化流体供給源４には更に酸素化流体の混合度、圧力及び流速を監視するための制御部が接続されている（図に示されていない）。
【０１０５】
生物学的液体の流入口５及び流出口５’は閉鎖ループ内で接続される。生物学的液体のループ内には患者の血流をバイオリアクタから隔離するための免疫隔離ユニット７が設けられることが望ましいが、必ずしも必要ではない。バイオリアクタ１には血液の解毒をより効果的に行うために治療患者の血漿を血液から分離する血漿搬出ユニット８を接続することが可能である。生物学的液体の流れ上には異なるポンプ６，６’及び６”が配され、バイオリアクタ及び免疫隔離ユニット及びｐＨ、温度、流量の各センサ（図示せず）を通じて培地や生物学的液体を確実に流す機能を果たしている。
【０１０６】
実施例
以下の実施例において本発明をさらに説明しているが、それら実施例は請求項に記載されている本発明の範囲を限定しない。
【０１０７】
実施例１、２および１４は、新規な細胞培養装置について記載している。実施例３から８は、肝細胞の機能を測定するために用いられる測定法について記載している。実施例９から１４は本発明の特定実施形態について記載している。
【０１０８】
実施例１：細胞培養装置-静的構成
この構成に基づく実験室スケールの装置１を作ることによって、新規な細胞培養装置がインビトロで肝細胞の機能を支持する能力について評価した。図９ａおよび９ｂに示したように、その装置は、上側ハウジング６０および下側ハウジング７０、気体透過性かつ液体不透過性の膜３０、フレーム３５、下側ハウジングのためのウィンドウ７５、１組のＯ-リング８０、８５、９０および９５、カバー１００、蓋１１０、ならびに補助的なネジおよび連結具１２０、１５０、１８０、２１０、および２１５を含む。一般的に用いられる膜は、０．００５１ｃｍ（０．００２インチ）の厚さのポリスチレンフィルムであるPolyflecR(Plastics Suppliers, Inc., Columbus, OH)、またはUSPクラスVIポリオレフィンを含むミクロ細孔の不織膜であるTYVEKR1073(E.I. du Pont de Nemours and Co, Inc., Wilmington, DE)の何れかであるが、いくつかの実験において他の材料も用いられた。使用前に、軸対称の５．３９ｃｍ（２．１２２インチ）径のスルーホールを有する０．１５９ｃｍ（０．０６２５インチ）の厚さのアルミニウム環フレーム３５の１つの表面上に、その膜をエポキシ樹脂で接着させて、膜／フレーム組立部品を形成した。
【０１０９】
１組の４つの対称的に離間したステンレス鋼＃１０  ３２×１．２７ｃｍ（１／２インチ）丸頭ネジ１２０は、対向する１０．２ｃｍ（４インチ）径の上側ポリカーボネートハウジング６０（１．９１ｃｍ（０．７５０インチ）の厚さ）と下側ポリカーボネートハウジング７０（０．８ｃｍ（０．３１５インチ）の厚さ）を一緒にボルトで止めて、膜３０が上側ハウジングに面するように膜／組立部品を正しい方向に配置して、膜／フレーム組立部品４００を間に挟む。フレーム３５のスルーホール６３は、下側ハウジング７０のクリアランスホール６２を介して、上側ハウジングのネジ穴にネジ１２０を挿入することを可能とする。上側ハウジングにある軸対称の溝の中に設置された#039 Ｏ-リング８０を用いて、膜／フレーム組立部品の上面と上側ハウジングの下面との間に液体漏れしないシールを形成した。同様に、下側ハウジングにある軸対称の溝の中に設置された第２#039 Ｏ-リング８５を用いて、膜／フレーム組立部品の下面と下側ハウジングの上面との間にガス漏れしないシールを形成した。それら構成部品と共に用いられる膜の最小径はＯ-リングの外径に適合させるために７．４ｃｍ（２．９インチ）であったが、ネジの通路を邪魔するのを防ぐために膜の一部を切取ることによって、それより大きな径の膜を用いても差し支えない。
【０１１０】
５．９２ｃｍ（２．３３０インチ）径で０．３１８ｃｍ（０．１２５インチ）の厚さのポリカーボネートウィンドウ７５を下側ハウジング７０にある軸対称のスルーホールに固定することによって、軸対称の５．４ｃｍ（２．１２５インチ）径で０．１５７ｃｍ（０．０６２インチ）の深さのガス用のチャンバー３０を膜の下に形成した。２つのチャンネル１３０は、そのチャンバーと外との出入りのための出入口を提供するため、内蔵Ｏ-リングを有する＃１０  ３２×０．３１８ｃｍ（１／８インチ）チューブOD Legris連結具を取り付けられたネジ穴１４０に接続する。５．０８ｃｍ（２．０インチ）径で０．１５２ｃｍ（０．０６インチ）の厚さの非常に多孔性のブロック１６０をそのチャンバー中に置くことによって、膜の補助的な機械的支持を提供することができる。
【０１１１】
上側ハウジング６０にある軸対称の５．４ｃｍ（２．１２５インチ）径のスルーホール内に、膜３０に付着した細胞４０を浸している液体１１を保持する５．４ｃｍ（２．１２５インチ）径のチャンバー１０を形成するために２つの方法を用いた。１つの方法（図９ａに示した）において、上側ハウジングの上面に１０．７ｃｍ（４．２１６インチ）径のポリカーボネートカバー１００を配置することによって、膜に細胞を播種する時に用いられる１．９１ｃｍ（０．７５０インチ）の深さのチャンバー１７０を形成した。細胞を播種しさらに複数の装置を積み重ねた後その組立装置を無菌的に運搬することを可能とすることを目的とするそのカバーは、チャンバーから液体がこぼれることを防ぐとともにチャンバーに外部汚染が侵入するのを防止するために、その上面および下面の両方の面の周囲に沿って０．６３５ｃｍ（０．２５インチ）の高さの枠１０５を有する。
【０１１２】
第２の方法（図９ｂに示されている）において、上側ハウジング６０にあるスルーホールに１０．２ｃｍ（４．０００インチ）径のポリカーボネートの蓋１１０を固定することによって、細胞を播種するための懸濁液を含有する液体を除去した後に用いられる０．１５７ｃｍ（０．０６２インチ）の深さのチャンバー１０を形成した。#020 Ｏ-リング９０と上側ハウジングの上面にあるネジ穴に固定された４つの対称的に離間したステンレス鋼＃１０  ３２×３０．５ｃｍ（１２インチ）丸頭ネジ１８０とを用いて、蓋と上側ハウジングとの間に液体漏れしないシールを形成した。２つのチャンネル１９０は、そのチャンバーと外との出入りのための出入口を提供するため、#006 Ｏ-リング９５を有する＃１０  ３２×０．６３５ｃｍ（１／４インチ）３１６ステンレス鋼メスルア-ロック(luer lock)連結具２１０を取り付けられたネジ穴２００に接続する。静的培養の場合には、316ステンレス鋼オスルア-ロックプラグ２１５を用いてそれら出入口に栓をした。
【０１１３】
特に断りが無い限り、高圧蒸気滅菌法または他の実証された処理（例えば、γ線照射、あるいはエチレンオキシド、過酢酸、および／または過酸化水素等の酸化ガスに対する暴露）によって、全ての部品（膜／フレーム組立部品４００および下側ハウジング１１０のための連結具１５０以外の）を滅菌した後、生物学的安全キャビネットの中で全ての組立工程を実施した。そのキャビネット内では、滅菌ピンセットまたは手袋を用いて全ての材料を扱った。１−３日またはそれより短い比較的短期間の場合には、膜を滅菌しないで用い；他の場合、取り付け前にフレームにエポキシ樹脂で膜を接着させてからγ線照射するか（例えば、polyflexR）、あるいは取り付け前にフレーム無しで膜にγ線照射した（例えば、TYVEKR 1073）。
【０１１４】
組立における最初の工程は、上側ハウジング６０と下側ハウジング７０、#039 Ｏ-リング８０および８５、膜／フレーム組立部品４００、ネジ込み連結具１５０および２１０、ならびに#006 Ｏ-リング９５を噛み合せ、さらにそれら部品を一緒に保持する４つのネジ１２０を締める工程から成る。次に、連結具を締め、さらに上側ハウジングのための連結具用のプラグ２１５を取り付けた。その後、カバー１００を取り付け、さらに使用するまで無菌条件下で装置１を保存した。
【０１１５】
１％新生ウシ血清（ＮＢＣＳ）を含有する完全培地（4.5g/Lグルコース、0.5U/mLウシインシュリン、7ng/mLグルカゴン、7.5μg/mLヒドロコルチゾン、10mM HEPES、20ng/mL EGF、20mMグルタミン、10IUペニシリン、および10μgストレプトマイシンを補充したWilliams E 培地）中の初代肝細胞４０は、以下の方法を用いてドナーブタから得た。
【０１１６】
EM Parsons(Hadley, MA)から得た、体重8.3+3.0kgのヨークシャー／ハンプシャー交配種のブタの肝臓から肝細胞を単離した。ヘパリン(Elkins-Sinn, Cherry Hill, NJ)を0.5mg/kgで静脈注射し、さらに、テラゾール(Telazol, 7-10mg/kg, Fort Dodge Laboratories, Fort Dodge, LA)とロンパン(Rompun, 5mg/kg, Miles, Inc., Shawnee, Mission, KS)との混合物でドナーを麻酔した。イソフランガスを用いて麻酔状態を維持した。ＡＣＵＣガイドラインに従って、全ての手順を実施した。
【０１１７】
以前記載されているSelgen法(P Selgen, Preparation of isolated rate liver cells, In Method in Cell Biology(DM Prescott, et al.), Vol.13, Academic Press (New York, NY), 1976)の改良法を用いて細胞４０を単離した。詳細には、露出させた肝臓にカニューレを挿入し、切除の前に冷却乳酸化リンガー液を20mL/分でin situ で灌流させた。肝臓を急いで暖め、さらに３７℃で0.2％ EDTAを灌流させた。次に、消化が完了したように見えるまで（平均消化時間２２+４分）、３７℃で1mg/mLのコラゲナーゼ(Life Technologies, Grand Island, NY)を灌流させた。さらに、10％ NBCS(Cyclone, Logan UT)を補充した冷却ハンクス緩衝生理食塩水(Bio Whittaker, Walkerville, MD)の添加によってさらなる消化を止めた。消化されなかった組織および胆嚢を除去し、さらに、２００および１００マイクロメートル径のステンレス鋼の篩(Fisher Scientific, Pittsburgh, PA)を介して組織の残りを連続して通過させた。細胞懸濁液を２回洗浄し、さらに細胞ペレットを培地中に再懸濁させた。トリパンブルー排除によって生存性を特定した。
【０１１８】
次に、膜に細胞を播種した。ある実験では、細胞を播種する前に、水に溶解させた40μg/mLのI型コラーゲンの滅菌溶液4mLで膜３０を４５分間予めコートし、次にその溶液を吸引除去し、さらに、等容量の滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄した。細胞を播種する前に、細胞を含有する容器を旋回させ、さらに滅菌ピペットで複数回懸濁液をピペッティングすることによって、培地１１中において懸濁液を均一に懸濁させた。ほとんどの実験において、装置１当たり2x106細胞の開始密度で細胞を播種した。しかしながら、一部の実験では、さらに高い密度で実験した（実施例１３を参照）。装置１のカバー１００を取り除き、4mLの細胞懸濁液を膜上にピペットで載せ、膜の表面上に均一に液体を配分させるために装置を注意深く攪拌し、さらにカバーを元に戻した。細胞を播種した装置を培養器（37℃、85％の相対湿度に維持した）に移し、そこでは、１．３８×１０４−３．４５×１０４Ｐａ（２−５ｐｓｉ）、１．０ｍｌ／分以下で、10％ CO2および0−90％の範囲の濃度の酸素を供給するガスタンク４に下側ハウジング７０にある出入口１５０の１つを介してガスチャンバー２０が接続している。
【０１１９】
約18-24時間後、装置を培養器から取り出し、生物学的安全キャビネットに戻し、カバー１００を取り除き、さらに、滅菌パスツールピペットを用いて培地１１を吸引除去した。次に、付随の#020 Ｏ-リング９０を有するキャップ１１０を上側ハウジング６０にあるスルーホールに載せ、さらに４つのネジ１８０を用いて所定位置に固定した。ルアーロックプラグ２１５を取り外し、取り込み口を垂直に配向させて（全ての気泡がチャンバーから除かれる様に）1.5mL/分の速度で培地を移し、さらにルアーロックプラグを再度取り付けて取り込み口を閉めることによって、液体チャンバー１０に約2.7mLの新鮮な培地１１を導入した。その後、装置を培養器に戻し、上記の様に酸素化流体供給源４に再度接続させた。続いて、酸素化流体供給源を切断し、培養器から生物学的安全キャビネットに移し、ルアーロックプラグを取り外し、さらに小さな採取用ガラス瓶に液体部分を流出させることによって、装置の試料を採取した。本手順によって、直接膜透過酸素供給および独立した灌流を有する、膜３０での細胞４０の培養を可能とする装置１を提供する。
【０１２０】
実施例２：細胞培養装置−灌流を行うための構成
実施例１の装置を更に、閉鎖ループで培地を灌流した場合のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの肝細胞の機能を調べるために調整した。装置は蓋１１０を装着して実施例１に述べたように組み立てて扱った。図１０ａ及び１０ｂに示されるような簡単なフロー回路を生物学的に安全なキャビネット内で無菌的に装置に組み付けた。この回路の構成要素（図５ａに概略的に示される）は、細胞を播種した装置１（実施例１に述べたような蓋１１０を装着してある）、貯槽２２０、ポンプ２３０、連結管３００及び３０５、及びルアーロック連結具２１５及び３１５からなる。すべての要素は細胞を播いた装置（無菌的に扱った）を除き、組立てに先立ってオートクレーブ（もしくはこれに相当する処理）により滅菌した。細胞を播いた装置を接続する前に、オスのルアーロックプラグ２１５をルアーロック連結具２１０から取り外した。
【０１２１】
図１０ｂは貯槽を示したものである。貯槽は気泡捕獲要素としても機能し、ポリカーボネート製の頂部２４０及び底部２５０（各直径５．０８ｃｍ（２．００インチ）及び厚さ１．２７ｃｍ（０．５００インチ））、高さ７．６２ｃｍ（３インチ）×内径１．９１ｃｍ（０．７５インチ）×外径２．５４ｃｍ（１．００インチ）のポリカーボネート製チューブ２６０、１対の＃０１９のＯ−リング２７０、３組の金属製ネジ及びボルト２８０、及び、＃００６のＯ−リング９５を有する５個の＃１０−３２ｘ０．６３５ｃｍ（１／４インチ）３１６ステンレス鋼製メス・ルアーロック連結具２１０からなる。Ｏ−リング２７０は、底部及び頂部の上面及び下面にそれぞれ設けられた内径１．９１ｃｍ（０．７５インチ）×外径２．５４ｃｍ（１．００インチ）×深さ０．１５７ｃｍ（０．０６２インチ）の凹部（チューブの中心を合わせるため）の底に形成された内径１．９９ｃｍ（０．７８５インチ）×外径２．４５（０．９６５インチ）×深さ０．１３２ｃｍ（０．０５２インチ）の軸対称の溝内に置かれる。これらの溝にＯ−リング２７０を設置した後にチューブを配し、対称的に間隔をおいて配される３組のネジ及びボルト２６０を締結することによって、チューブと頂部及び底部との間はそれぞれ液密にシールされる。底部及び頂部の外周に設けられた螺刻孔２９５にルアーロック連結具２９０の組が配される。頂部の上面に設けられた螺刻孔２８５に第５のルアーロック連結具２１０が配される。
【０１２２】
オスルアーロックとしての内径（１／１６インチ）の、かかりを有する３１６ステンレス鋼製連結具３１５を両端に有する長さ約４５．７ｃｍ（１８インチ）のＴｙｇｏｎ  ＬＦＬ  Ｌ／Ｓサイズ＃１３の管（３００及び３０５）を使用して２組の接続箇所を設けることによって灌流用の閉鎖ループが形成される。管３００によって貯槽２２０の底部のルアーロック連結具２１０の一方を細胞が播かれた装置１のルアーロック連結具２１０の一方に連結する。この管は流動培地１１を細胞が播かれた装置に導入するための流路として機能する。第２の管３０５は貯槽の頂部のルアーロック連結具２１０の一方と細胞が播かれた装置のルアーロック連結具２１０の他方とを連結する。この管は細胞が播かれた装置から培地を除去するための流路として機能する。貯槽の底部の残りの連結具は３１６ステンレス鋼製ルアーロックプラグ２１５にて閉栓される。このプラグは、貯槽内の培地のサンプルを採取したり、貯槽を排液する場合に外される。
【０１２３】
次いで、通常１０〜２０ｍｌの範囲の所定量の灌流液１１を、貯槽の頂部２４０の上面のルアーロック連結部２１０から貯槽２２０に加えた。灌流液を加える間、貯槽の頂部外周の、接続されていない方のルアーロック連結具２１０はプラグを抜栓して通気に使用した。次いで残りのルアーロック連結具２１０をルアーロックプラグ２１５にて閉栓した後、組立てられた回路を生物学的に安全なキャビネットから培養器に移動した。培養器中で管３００をポンプ２３０のヘッド（通常、ＰＳＦハウジング及びＣｏｌｅ−Ｐａｒｍｅｒコントローラによって調整されるＣｏｌｅ−Ｐａｒｍｅｒステンレス鋼製ロータを備えたＣｏｌｅ−Ｐａｒｍｅｒ  Ｅａｓｙ−Ｌｏａｄポンプヘッドを備える蠕動ポンプ）に接続した。装置１を実施例１に述べたように酸素化流体供給源４に再接続した。次いでポンプを所望の体積流速（０〜１２ｍＬ／分、通常０．１〜１．５ｍＬ／分の範囲）にて駆動し、貯槽内の液体１１を管３００及びポンプヘッドを通じて細胞が播かれた装置１へ、更に管３０５から再び貯槽へと再循環させた。この間、装置を傾けて気泡の除去を促すことが可能である。
【０１２４】
灌流回路の更なる動作を２つの方法にて行った。第１の方法（灌流法Ｉ）では、培地１１を２４〜７２時間の動作毎の後に新鮮培地に完全に交換した。第２の方法（灌流法ＩＩ）では培地を交換しない代わりに、１日〜多数日にわたって細胞を支持するに足るだけの充分な量を最初に導入した。灌流法Ｉでは、ポンプ２３０を先ず停止させ、酸素化流体供給源４を切り離し、灌流回路を生物学的に安全なキャビネットに移す。貯槽２２０内に残留する培地は、貯槽の底部２５０の、管３００に接続されていない方のルアーロック連結具２１０のルアーロックプラグ２１５を抜栓してから貯槽を傾けることによって排液される。次いで貯槽の頂部２４０のルアーロック連結具２１０から管３０５を外すことによって回路を一時的に変更する。貯槽の頂部の頂面に設けられたルアーロック連結具からルアーロックプラグ２１５を抜栓した後、貯槽を初めに加えられた培地と同量だけ充填してから再びポンプを始動させる。この開放ループ構成で、体積流速に対する回路の排液後に残留する体積（初期に加えられた容量と排液された容量との差として求められる）の比に等しい所定の時間だけポンプを運転した。この後ポンプを停止させ、回路を最初の閉回路の形態に再構成した後、培養器に戻し、酸素化流体供給源に再接続し、ポンプを再始動させた。
【０１２５】
灌流法ＩＩでは、ポンプ２３０を停止させ、酸素化流体供給源４を切り離し、管３００をポンプから外し、ポンプを含まない灌流回路を装置を排液しないまま生物学的に安全なキャビネットに戻す。貯槽２２０のサンプリングのため、７５０μＬのサンプルをポート２１０から滅菌ピペットにて採取した（通気用ポートのルアーロックプラグ２１５を抜栓した後）。次いで灌流回路を培養器に戻し、管の適当な部分をポンプヘッドに再接続し、ポンプを始動し、酸素化流体供給源を装置に再接続した。
【０１２６】
上記の灌流回路は閉回路の形態を有するものであるが、実施例２に述べた実施形態において、流路が供給貯槽、ポンプ、装置を経て回収貯槽へとつながる開放ループ構成を有する形態も考えられる。この開放ループ回路の組立て及び動作は上記に述べた方法にならうものである。
【０１２７】
上記の方法及び動作によれば、肝機能が低下したヒトや動物の体外治療用のＬＡＤの使用を模したｉｎ  ｖｉｔｒｏの研究を行うための装置が得られた。
【０１２８】
実施例３：アルコキシレゾルフィンのレゾルフィンへの変換に基づいた肝細胞解毒活性
チトクロームＰ４５０（ＣＹＰ４５０）のアイソザイムは、第１相の混合機能モノオキシゲナーゼであり、相補的な第２相の抱合酵素とともに、生体異物や内因性の脂質親和体を、腎臓系によって容易にクリアランスされる可溶性化合物に生体内変換する反応を触媒する。モノオキシゲナーゼとしてのＣＹＰ４５０アイソザイムが機能するには分子状酸素の存在を必要とする。したがって、ＣＹＰ４５０アイソザイムの活性は酸素の利用可能度に依存するものと考えられている。
【０１２９】
非蛍光性アルコキシレゾルフィンエーテルの蛍光性レゾルフィンへのＯ−脱アルキル反応は、ＣＹＰ４５０アイソザイムの活性の研究における１つのツールを与えるものである。例えば、フェノキサゾンエーテルであるベンジルオキシレゾルフィン（ＢＲＯＤ）及びエトキシレゾルフィン（ＥＲＯＤ）の脱アルキル反応により、研究者は、個別のアイソザイムであるＣＹＰ  ＩＩＢ２及びＩＡ１の活性をそれぞれ研究することが可能である。静的培養におけるＣＹＰ４５０の活性を測定するため、実施例１の細胞が播かれた装置１中の１％ＮＢＣＳを含む標準完全培地１１を、血清を含まないが５μＭのＢＲＯＤまたはＥＲＯＤ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，ユージーン、オレゴン州）及び８０μＭのジクマロール（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，セントルイス、ミズーリ州）を含有する完全培地に置き換えた。ジクマロールは、この後の第２相の反応におけるＣＹＰ４５０アイソザイムによるアルコキシレゾルフィンの脱アルキル化によって生成する生成物であるレゾルフィンの細胞質における分解を抑制するために培養中に加えている。
【０１３０】
３時間の培養後にサンプルを収集し、それぞれ５４０ｎｍ及び５８５ｎｍの励起光及び放射光波長にてターナー４５０蛍光計で分析した。データは刺激指数としてまとめた（細胞が播かれた装置１に加える前の等分少量中の蛍光度に対する３時間の生体内変換後のサンプル中の蛍光度の比）。データは、同じドナーから得た播種後同日数の細胞を直径６０ｍｍの同サイズの組織培養皿に播種した場合の刺激指数に対する、試験を行う気体透過性細胞培養支持物質を有する装置についての刺激指数の比として表した。このアッセイは通常細胞の播種後第１日目に行われるが、最大で播種後７日以上まで行われる場合もある。
【０１３１】
このアッセイでは、アルコキシレゾルフィンのレゾルフィンへの変換が蛍光度の上昇に対応する結果、刺激指数及び解毒活性が、特定のアイソザイムの組のＰ４５０活性のレベル及び培養肝細胞の解毒応答の強さに対応する。
【０１３２】
実施例４：ジアゼパムのクリアランスに基づいた肝細胞Ｐ４５０アイソザイムの活性
薬剤であるジアゼパムの代謝は、実施例１の装置１によって支持される肝細胞におけるＰ４５０アイソザイムの活性を評価するための別の方法を与えるものである。ジアゼパムのクリアランス、及びそのノルジアゼパム及びテマゼパムへの生体内変換をＪａｕｒｅｇｕｉ等による方法に類似の方法によって評価した（HO Jauregui, SF Ng, KL Gann, DJ Waxman Xenobiotic induction of P-450 PB-4 (IIB1) and P-450c (IA1) and associated monooxygenase activities in primary cultures of rat hepatocytes, Xenobiotica 21: 1091-1106, 1991）。この方法では、キャップ１１０の装着後の播種後第１日目に実施例１の装置に加えた培地に７０μＭのジアゼパム（Ｓｉｇｍａ）を補った。２４時間の培養後に７５０μＬのサンプルを採取して抽出時まで凍結保存した。装置に加える前のジアゼパム補充培地のサンプルも同様に採取して凍結保存した。Ｏａｓｉｓカートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐ．，ミルフォード、マサチューセッツ州）及びＷａｔｅｒｓ抽出マニホルドを用いて固相抽出法を行った。カートリッジは先ずメタノール、次いで逆浸透脱イオン水（ＲＯＤＩ）にて順次処理した。サンプルをカラムに流し、ＲＯＤＩに５％メタノールを加えたもので洗い、メタノールにてカラムから溶離し、蒸発させてからｐＨ６．０にて２５０μＬの６５％メタノール／３５％０．０１Ｍ酢酸アンモニウムの移動相にて再構成した。Ｗａｔｅｒｓ  Ｍｉｃｒｏ−Ｂｏｎｄｐａｋ  Ｃ１８カラムを用い、２４．５℃にて、１．０ｍＬ／分の流速で逆相ＨＰＬＣを行った。溶出液の２４５ｎｍにおける吸光度を測定した。ジアゼパムは約１１分後に溶出し、代謝産物であるノルジアゼパム及びテマゼパムはそれぞれ１０分及び８分後に溶出した。データは、最初にクリアランスされたジアゼパムのパーセンテージと最初にノルジアゼパムまたはテマゼパムに変換されたジアゼパムのパーセンテージとして表した。
【０１３３】
このアッセイでは、最初にクリアランスされたジアゼパム、及びノルジアゼパム及びテマゼパムに変換されたジアゼパムは高いパーセンテージを示し、高いＰ４５０アイソザイム活性を示している。これらのパーセンテージが高いほどＰ４５０活性は高くなる。
【０１３４】
実施例５：リドカインの代謝に基づいた肝細胞の解毒活性
薬物であるリドカインの代謝は、実施例１の装置１にて支持される肝細胞の解毒活性を評価するための別の一方法を与えるものである。リドカインのクリアランスは、Ｎｙｂｅｒｇ等による方法に類似の方法を用いて評価することが可能である（SL Nyberg, HJ Mann, R Remmel, W-S Hu, FB Cerra, Pharmacokinetic analysis verifies P450 function during in vitro and in vivo application of a bioartificial liver, ASAIO J 39: M252-256, 1993）。この方法では、キャップ装着後の播種後第１日目に実施例１の装置に加えられた培地を７４０μＭのリドカイン（Ｐａｄｄｏｃｋ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．，ミネアポリス、ミネソタ州）にて補った。２４時間の培養後、６００μＬのサンプルを採取し、抽出までの間凍結保存した。装置に加える前の、リドカイン補充培地のサンプルも同様に採取して凍結保存した。Ｏａｓｉｓカートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐ．，）及びＷａｔｅｒｓ抽出マニホルドを用いて固相抽出法を行った。カートリッジを９９％ＭｅＯＨ／１％ＨＣＬ、及び０．５ＭのＢｏｒａｘにて処理した。サンプルをカラムに流し、０．５ＭのＢｏｒａｘにて洗い、ＭｅＯＨ／ＨＣｌにて溶出し、蒸発させてから２５０μＬの８５％（５０ｍＭ  ＮＨ４ＨＰＯ４＋１０ｍＭ  ヘキサンスルホン酸、ｐＨ３．０）／１５％アセトニトリルの移動相にて再構成した。Ｍｉｃｒｏｓｏｒｂ  Ｃ８カラム（Ｒａｉｎｉｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏ．，ウォバーン、マサチューセッツ州）を用い、室温にて、１ｍＬ／分の流速で逆相ＨＰＬＣを行った。溶出液の２１４ｎｍにおける吸光度を測定した。リドカインは約３７分後に溶出し、主要な代謝産物であるＭＥＧＸは２７分後に溶出した。データは最初にクリアランスされたリドカインのパーセンテージとして表した。
【０１３５】
このアッセイでは、最初にクリアランスされ、代謝産物に変換されたリドカインは高いパーセンテージを示し、高いＰ４５０アイソザイム活性を示している。これらのパーセンテージが高いほどＰ４５０活性は高くなる。
【０１３６】
実施例６：尿素の合成に基づく培地中の肝細胞尿素生成
実施例１及び２の装置１について尿素合成を次の２つの方法のいずれかによって調べた。
【０１３７】
方法１：
脱アミノ化及び尿素生成による、培地中のアンモニア、その塩、及びアミノ化成分のクリアランスは、ｉｎ  ｖｉｖｏの肝細胞の極めて重要な機能の一つであり、これらの細胞のＬＡＤの要素としての望ましい機能であると考えられる。脱アミノ化により尿素が生成するが、この尿素はｉｎ  ｖｉｖｏでは腎臓系によってクリアランスされる。尿素の合成を、Ｓｉｇｍａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社（セントルイス、ミズーリ州）よりＫｉｔ＃６４０−Ｂとして販売されている、窒素判定用の比色定量法を用い、実施例１及び２の装置１によって測定した。装置への細胞の播種後、サンプルを定期的に採取し、ウレアーゼ処理して尿素をＮＨ３とＣＯ２とに加水分解した。次いで得られたＮＨ３を触媒としてのニトロプルシドナトリウムの存在下で次亜塩素酸塩及びフェノールと反応させてインドフェノールを生成する。得られたインドフェノール溶液の吸光度を５７０ｎｍにて求め、基準曲線を用いて最初のサンプル中の尿素の濃度に換算した。データはこの濃度に装置内の培地１１の体積を乗じ、サンプリングからの経過日数にて割ることによって、装置１台当たり、１日当たりに生成する尿素の量として表した。
【０１３８】
方法２：
このアッセイでは、尿素の生成量を増大させるべく培養肝細胞を塩化アンモニウム及びオルニチンにて処理した。尿素の合成は脱アミノ化及び尿素生成の過程の一部である。したがって、特に外因性のアンモニア投与による尿素の合成量の増加は、培地を脱アミノ化する処理能力が昂進したことを示すものである。投与後、培養から得た培地について生成した尿素量を測定した。
【０１３９】
１０ｍＬのＲＯＤＩに１．０７ｇのＮＨ４Ｃｌを加えることにより、１Ｍの塩化アンモニウム（ＮＨ４Ｃｌ；Ｓｉｇｍａ  ＃Ａ−０１７１）の保存溶液を調製した。この溶液を使用時まで４℃にて保存した。０．２Ｍのオルニチン（Ｓｉｇｍａ  ＃Ｏ−６５０３）の保存溶液を１０ｍＬのＲＯＤＩに０．３４ｇを加えることにより調製した。この溶液を使用時まで４℃にて保存した。
【０１４０】
次いで培養皿を１Ｘリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）にて洗った。各皿にＷｉｌｌｉａｍの１％培地１ｍＬ当たり塩化アンモニウム及びオルニチンを各１０μＬづつ加えた（Ｗｉｌｌｉａｍの１％培地には以下を補った：４．５ｇ／Ｌ  グルコース、０．５Ｕ／ｍＬ  ウシインスリン、７ｎｇ／ｍＬ  グルカゴン、７．５μｇ／ｍＬ  ハイドロコルチゾン、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２０ｎｇ／ｍＬ  ＥＧＦ、２０ｍＭ  グルタミン、１０ＩＵ  ペニシリン及び１０μｇ  ストレプトマイシン、及び１％  ウシ新生児血清（ＮＢＣＳ））。すなわち、４ｍＬのＷｉｌｌｉａｍ培地に４０μＬを加えたものを用いて６０ｍｍの培養皿でブタ肝細胞を培養した。コントロールとして塩化アンモニウム及びオルニチンで処理しない通常の培地を入れた皿も用意した。各皿を２４時間培養器に戻した。培養後、２ｍＬの培地を各皿から取り出して適宜ラベリングした試験管（Ｆａｌｃｏｎ  ＃２０５４）に移し、試験管を−２０℃にて保存した。
【０１４１】
凍結サンプル中に存在する尿素の量を血中尿素窒素（ＢＵＮ）キット（Ｓｉｇｍａ，  ｋｉｔ＃５３５）を用いて求めた。４０μＬの解凍したサンプルを、３．０ｍＬのＢＵＮ酸試薬及び２．０ｍＬのＢＵＮ色試薬とともに１００ｍｍの使い捨てホウ珪酸塩ガラス管に加えた。各試験管を１００℃にて１０分間培養し、更に室温で３〜５分間培養した。冷却後、管をＶｏｒｔｅｘ震盪器を用いてよく混合した。得られた溶液を９６穴プレートに３重に採取して５４６ｎｍにて比色定量的にサンプリングした。基準曲線を用いて吸光度を尿素の濃度に換算し、データはこの濃度に装置内の培地１１の体積を乗じ、サンプリングからの経過日数にて割ることによって、装置１台当たり、１日当たりに生成する尿素の量として表した。
【０１４２】
このアッセイでは尿素の生成速度は大きく、臨床的に望ましい目的機能であるところの予測された高レベルのアンモニアの脱アミノ化及びクリアランスを示すものであった。尿素の合成速度が大きいほど予想される脱アミノ化のレベルは高くなる。
【０１４３】
実施例７：  アルブミンの分泌に基づいた肝細胞におけるタンパク質の合成及び分泌
アルブミンなどの血清タンパク質の合成及び分泌はｉｎ  ｖｉｖｏ及びＬＡＤにおける肝細胞の極めて重要な機能であると考えられる。アルブミンは肝細胞の分泌活性のマーカーとして用いられている。アルブミンの分泌量を実施例１及び２の装置１についてサンプルに標準的な競合ＥＬＩＳＡを用いて測定した。装置１に細胞４０を播種した後、定期的にサンプルを採取し、ＥＬＩＳＡによる分析を行うまで凍結保存した。ＥＬＩＳＡを行うにあたって、９６穴プレートの各ウェルを、２００μｇ／ｍＬのブタアルブミン（Ａｃｃｕｒａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，  ウエストベリー、ニューヨーク州）にて一晩コーティングした。Ｔｗｅｅｎ２０（Ｐｉｅｒｃｅ，ロックフォード、イリノイ州）による洗浄工程の後、多ウェルプレートの個々のウェルで５０μＬのサンプルまたは標準液（Ａｃｃｕｒａｔｅ）を、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ブタアルブミン抗体（Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｓ，モンゴメリー、テキサス州）とともに９０分間培養した。Ｏ−フェニレンジアミンジヒドロクロリド（Ｐｉｅｒｃｅ）を添加すると発色が見られたのでＨ２ＳＯ４を加えて反応を停めた。個々のウェルの４９０ｎｍにおける吸光度をＳｏｆｔＭａｘＰｒｏソフトウェアを用いてＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｍａｘ２５０プレート読み取り器にて測定し、基準曲線を用いて最初のサンプル中のアルブミン濃度に換算した。データはこの濃度に装置内の培地の体積を乗じ、サンプリングからの経過日数にて割ることによって、装置１台当たり、１日当たりに生成するアルブミンの量として表した。
【０１４４】
このアッセイでは、アルブミン分泌の速度は大きく、分化した肝細胞の臨床的に望ましい機能を示す指標となるものである。
【０１４５】
実施例８：  全肝細胞タンパク質の測定に基づいた接着性細胞量の決定
ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ，カタログＮｏ．２３２２５）を使用して、関連タンパク質の量に基づき実施例１及び２の装置１について肝細胞の細胞量及び接着性を調べた。アッセイの試薬は同梱の指示にしたがって調製した。０．２ＮのＮａＯＨに炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、ＢＣＡ検出試薬、及び酒石酸ナトリウムを加えた１Ｌのベース試薬として試薬Ａを調製した。試薬Ｂを２５ｍＬの４％硫酸銅溶液として調製した。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Ｐｉｅｒｃｅ，カタログＮｏ．２３２０９）を０．９％塩化ナトリウム及び０．０５％アジ化ナトリウム中２ｍｇ／ｍＬにて標準液として用いた。
【０１４６】
装置１は培養器から取出し、キャップ１１０を外し、培地１１を培養から吸引した。培地はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で置換し、培養を０℃で２４時間凍結した。この後、培養を解凍して気体透過性かつ液体不透過性の膜３０から適宜ラベリングした試験管中に掻き落とした。
【０１４７】
作用試薬の溶液を５０部の試薬Ａと１部の試薬Ｂとを組み合わせることにより調製した。０〜２ｍｇ／ｍＬのＢＳＡの保存溶液を同じ希釈液中で連続希釈して１組のタンパク質標準液を調製した。次に、１０μＬの各サンプルまたは標準溶液と２００μＬの作用試薬を９６穴プレートの個別のウェルに順次加えた。穏やかに振ることによってサンプルを３０秒間混合した後、カバーをして３７℃で３０分間培養した。次いで５６０ｎｍにて比色定量的に各ウェルを評価した。同定すべきサンプルのタンパク質濃度を基準曲線より求めた。
【０１４８】
実施例９：細胞培養装置中の肝細胞用の別の気体透過性膜間の比較
実施例１の装置を使用して、異なる気体透過性かつ液体不透過性の膜の、培養中の肝細胞の支持体としての性能を評価した。肝細胞はドナーからの単離後に固体支持体上に播種しなければその機能性を失ってしまう。更に肝細胞が培養中において実現する機能レベルは、培養支持体がコラーゲンや接着及び機能を促進する物質の層またはゲルにてコーティングされているか否か、といった培養支持体の性質に大きく依存しうる。
【０１４９】
評価を行った膜としては、Ｐｏｌｙｆｌｅｘ（登録商標名）（Ｐｌａｓｔｉｃｓ  Ｓｕｐｐｌｉｅｒｓ，Ｉｎｃ．，（コロンバス、オハイオ州）によって製造される厚さ０．０５０８ｍｍ（０．００２インチ）の無孔性ポリスチレンフィルム）、Ｂｒｅａｔｈ−Ｅａｓｙ（商標名）（Ｄｉｖｅｒｓｉｆｉｅｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社（ボストン、マサチューセッツ州）によって製造されるポリウレタンの無孔性フィルム）、スチレン−ブタジエン−スチレン／酢酸エチルビニル／スチレン−ブタジエン−スチレンの３層共押出しフィルム（ＢＡＳＦ社（ドイツ）よりＢａｘｔｅｒ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社（ニベレス、ベルギー）に供給される無孔性フィルム、ＳＢＳ／ＥＶＡ／ＳＢＳ）、スチレン−ブタジエン−スチレン／ポリエチレンの２層共押出しフィルム（Ｃｙｐｒｅｓｓ  Ｃｒｙｏｖａｃ／Ｓｅａｌｅｄ  Ａｉｒ  Ｃｏｒｐ．，（ロチェスター、ニューヨーク州）により製造、ＳＢＳ／ＰＥ）、無孔性ポリエステルシート（Ｐｅｒｆｅｃｓｅａｌ  Ｉｎｃ．，（フィラデルフィア、ペンシルベニア州）により製造）、ＴＹＶＥＫ（登録商標名）１０７３としてのＨＤＰＥ（Ｅ．Ｉ．ｄｕ  Ｐｏｎｔ  ｄｅ  Ｎｅｍｏｕｒｓ  ａｎｄ  Ｃｏ，Ｉｎｃ．（ウィルミントン、デラウェア州）により製造されるＵＳＰクラスＶＩのポリオレフィンからなる微孔性不織膜）、微孔性ポリエチレン（ＰＥ）シート（バブルポイント試験による平均孔径１．７μｍを有する、３Ｍ  Ｉｎｃ．，（ミネアポリス、ミネソタ州）より販売されるもの）、ＰｏｌｙＳｅｐ（登録商標名）（Ｍｉｃｒｏｎ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ社（ウェストボロー、マサチューセッツ州）により製造される微孔性ポリプロピレンシート）、微孔性ポリ（テトラフルオロエチレン）（ＰＴＦＥ）及びＨｙｄｒｕｌｏｎ（登録商標名）（疎水性加工された微孔性ナイロン６，６）（いずれもＰａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ポート・ワシントン、ニューヨーク州）により製造）、及び、トラックエッチ加工されたポリカーボネート（Ｍｉｃｒｏｎ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ社により製造）などが挙げられる。微孔性ＰＴＦＥ、Ｈｙｄｒｕｌｏｎ、及びトラックエッチ加工ポリカーボネートについては、２つの異なる孔径を有する膜を調べた。
【０１５０】
試験を行った膜はそれぞれ、接着肝細胞を膜内外輸送により直接的に酸素化するうえで、酸素及び二酸化炭素に対して充分な透過性を有するものと考えられる。更に、これらの膜はそれぞれ、細胞培養装置または臓器補助システムにおける酸素化及び灌流に関して予想される膜内外の圧力差のもとで、水に対して不透過性であるものと考えられる。
【０１５１】
これらの膜のそれぞれを、Ｉ型コラーゲンでコーティングせずに評価した後、装置１台当たり２×１０６個の肝細胞密度となるように細胞を播種した。１９％Ｏ２、１０％ＣＯ２、残りがＮ２であるような酸素化流体を供給した。ドナー５４（ポリウレタン、ＰＴＦＥ、及び疎水性加工ナイロン）、ドナー６１（ＨＤＰＥ）、ドナー７６（トラックエッチ加工ポリカーボネート）、ドナー８０（ＳＢＳ／ＥＶＡ／ＳＢＳ、ＰＳ／ＰＥ、及びＰＥ）、ドナー８４（ポリエステル）、及びドナー８９（ポリスチレン）から播種後１日目に得られた細胞について、アルコキシレゾルフィンのレゾルフィンへの変換を調べる方法（実施例３）による解毒活性のデータを表１に示した。
【０１５２】
【表１】
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ＢＲＯＤのレゾルフィンへの生体内変換による解毒活性は、Ｐｏｌｙｆｌｅｘ（登録商標）またはポリエステル膜を用いた装置で培養された細胞において最も高かった。微孔性のポリエチレン膜は、細胞が播かれた装置１におけるＢＲＯＤの変換による解毒活性を中間的レベルに支持した。ＥＲＯＤのレゾルフィンへの生体内変換による解毒活性は、Ｐｏｌｙｆｌｅｘ（登録商標）、ポリエステル膜、またはＨｙｄｒｕｌｏｎ（登録商標）を用いた装置で培養された細胞において最も高かった。孔径が大きくなるにしたがって、トラックエッチ加工ポリカーボネート上におけるアルコキシレゾルフィンのいずれにおいても解毒活性は低下したが、微孔性ＰＴＦＥ及び疎水性加工ナイロン６，６に対する影響は比較的小さかった。一般に解毒活性はＥＲＯＤよりもＢＲＯＤにおいて膜の種類により大きく依存した。更に、無孔性ポリスチレンまたはポリエステルを用いた細胞播種装置において、最も高い全体の解毒活性が見られた。
【０１５３】
これらの結果は、気体透過性かつ液体不透過性の膜３０の化学組成及び物理的構造を変化させることによって、装置１において培養される肝細胞４０の解毒能力がどのように影響されるかを示すものである。
【０１５４】
また実施例１の装置を使用してＰｏｌｙｆｌｅｘ（登録商標）を用いた装置１で培養された肝細胞の尿素生成能を、同等のサイズを有する６０ｍｍ径の組織培養皿で培養した肝細胞４０と比較した。組織培養皿は、Ｐｏｌｙｆｌｅｘ（登録商標）と比較して、酸素などの気体に対して高い不透過性を示す表面を細胞に与えるものである。すなわち、Ｐｏｌｙｆｌｅｘ（登録商標）が酸素に対して２．０×１０４ｍＬ／ｍ２・日・ａｔｍ程度の透過性を有するのに対して、組織培養皿の酸素に対する透過性は、現時点での技術の測定能を下回るものである。
【０１５５】
この実験を行うため、ドナー９３からの肝細胞２×１０６個を、Ｐｏｌｙｆｌｅｘ（登録商標）を用いた装置１または組織培養皿に播種した。装置には１９％Ｏ２、１０％ＣＯ２、及び残りがＮ２である気体を供給した。基底レベル（外因性アンモニア及びオルニチンを加えない場合の実施例６、方法２に基づいた白抜きの記号）、及び２０ｍＭの外因性アンモニア投与（外因性アンモニア及びオルニチンを加えた場合の実施例６、方法２に基づいた黒塗りの記号）の双方の尿素合成量のデータを、装置（四角）及び組織培養皿（丸）について図１１に示した。１１日間の培養期間にわたる装置での尿素の合成の基底レベルは、この期間にわたって組織培養皿で維持された肝細胞の基底レベルと差が見られない。更に、アンモニア投与に応じた尿素の合成量は、組織培養皿における場合と比較して同じかあるいは大きい。これらの結果は、Ｐｏｌｙｆｌｅｘ（登録商標）などの気体透過膜上で肝細胞を培養することによってより高い解毒レベルが実現されるばかりでなく、装置の気体透過膜に接着した肝細胞を培養することによって特に外因性アンモニアの投与に応じて尿素生成が促進されることを示すものである。
【０１５６】
実施例１０：細胞培養装置内の肝細胞に対する気体透過膜の表面処理の影響
実施例１の装置を使用して、気体透過性かつ液体不透過性の膜３０の表面の改質による影響を更に評価した。特異的改質（例えば特異的分子によるコーティングまたは特異的分子の共有結合による付着による）及び非特異的改質（例えば表面を化学的または物理的に酸化処理することによる）によって表面の細胞接着性ならびにこれらの表面が細胞機能を促進する能力が変化する。これらの処理は細胞支持膜の表面のみを改変し、膜の全体的性質は改変されない。
【０１５７】
本発明者等は、装置１内の気体透過性かつ液体不透過性の膜３０上で培養される肝細胞の機能を調節するために、細胞４０の播種に先立って行われた２種類の処理４１の効果について評価を行った。第１の処理では、膜の表面を１．１ｍｇ／ｍＬのＩ型コラーゲンの滅菌溶液にて４５分間コーティングした後、リン酸緩衝生理食塩水にて洗い流した。得られたコーティングはコラーゲン分子１個〜数個程度の厚さを有した。この種の処理により、処理を行わなければ接着性に乏しい多くの表面に対する多くの種類の細胞の接着性が向上する。第２の処理では、膜の細胞支持面に対してコロナ放電を行ってこの面を酸化する。ポリスチレン製の皿をコロナ放電にて処理することによって細胞支持面が酸化されるため、ｄｙｎｅレベル（臨界表面張力）は、４０〜５０ｄｙｎｅｓ／ｃｍとなり、多くの種類の細胞について細胞接着が促進される。この処理は、膜の厚さを増大させたり、膜上に巨視的な量の材料を付着させることなく、表面の最も表面側の厚さが約１ミクロンよりも小さい薄層のみを改質するものである。この処理を無孔性Ｐｏｌｙｆｌｅｘ（登録商標）（ポリスチレン）及び多孔性ＴＹＶＥＫ（登録商標）１０７３（不織ＨＤＰＥ）膜のそれぞれに行って、ｄｙｎｅレベル（臨界表面張力）を約４５ｄｙｎｅ／ｃｍとした。
【０１５８】
１９％Ｏ２、１０％ＣＯ２、残りがＮ２である流体を供給した装置に、ドナー６１（ＨＤＰＥ）、ドナー７６（トラックエッチ加工ポリカーボネート）、ドナー８０（ＳＢＳ／ＥＶＡ／ＳＢＳ、ＰＳ／ＰＥ、及びＰＥ）、及びドナー８９（ポリスチレン）からの細胞を装置１台当たり２×１０６個の肝細胞となるように播種し播種後１日目にアルコキシレゾルフィンのレゾルフィンへの変換（実施例３）に基づく方法によって求めた解毒活性のデータを表２に示した。表面処理４１に対する解毒活性の変化は膜の種類ならびに解毒作用の特異性（ＢＲＯＤまたはＥＲＯＤ）に依存していた。膜の内のあるものでは（例えばＨＤＰＥ及び孔径１ミクロンのトラックエッチ加工ポリカーボネート）、コラーゲンのコーティングによって解毒作用の特異性はいずれも向上した。また別のある膜では（例えばポリスチレン、共押出しポリエチレン／ポリスチレン、孔径０．１ミクロンのトラックエッチ加工ポリカーボネート）、コラーゲンのコーティングによって、一方の解毒作用の特異性のみが向上し、他方の特異性の変化は小さかった。膜の残りのものでは、コラーゲン処理による解毒作用の低下は小さかった。
【０１５９】
【表２】
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コラーゲンのコーティングを施さずにコロナ放電による表面処理を行った場合では、ポリススチレン及びＨＤＰＥのいずれの解毒活性も大幅に向上した。コロナ放電の後にコラーゲンコーティングを施す連続処理では、ポリスチレンの全解毒活性が更に向上した。この組合わせはＰｏｌｙｆｌｅｘ（登録商標）に適用される場合に、より高い解毒活性を有するシステムを提供するものである。
【０１６０】
コロナ放電処理かつコラーゲンコーティングを施されたＰｏｌｙｆｌｅｘ（登録商標）を用いた装置１において肝細胞を培養した場合にも解毒活性は培養の発展期間にわたって持続した。これらの評価を行うため、ＢＲＯＤ及びＥＲＯＤの生体内変換（実施例３）に基づいた解毒活性を、播種後１、３、及び７日後に測定した。ＢＲＯＤの値は（１日目の１．５１から３日目の１．４７、７日目の１．２０へと）若干低下したのに対し、ＥＲＯＤの値は１日目から３日目にかけて上昇した（１．６０から４．２５へ）後、７日目に低下した（０．８７）。解毒活性のこれらの値はすべて他の膜における値よりも高かった。
【０１６１】
これらの結果は、細胞培養装置１内の肝細胞の機能を所望どおり向上させるべく、膜の細胞４０に接する面のみを改質する（膜の気体透過性は改変しない）１以上の表面処理４１によって気体透過性かつ液体不透過性の膜３０を改質することの有用性を示すものである。
【０１６２】
実施例１１：灌流を行わない細胞培養装置での肝細胞に対する酸素化の影響
実施例１の装置を使用して各種の気体組成物について静的培養肝細胞の機能に与える影響を比較した。細胞、特に肝細胞が曝される酸素の分圧は細胞の機能に多大な影響を及ぼす可能性がある。装置１において、所望の酸素濃度を有する気体を気体透過膜の一方の面に供給し、他方の面上で細胞を培養することによって、接着細胞の膜を通じた直接的酸素化が可能である。このような酸素化の態様によれば、媒体を酸素で飽和させることによる酸素化と比較して細胞への酸素輸送に対する抵抗が低減される。更に、膜を通じた直接的酸素化によって細胞の酸素化と灌流とが効果的に乖離せられる。
【０１６３】
この例では、静的培養中の接着肝細胞の酸素化は、装置１に供給されて気体透過性かつ液体不透過性の膜３０に接触する気体中の酸素濃度を設定することによって制御した。２種類の異なる膜について調べた。すなわち、コロナ放電処理かつコラーゲンコーティングを施したポリスチレン（Ｐｌｙｆｌｅｘ（登録商標））と、コーティングを施さない不織ＨＤＰＥ（ＴＹＶＥＫ（登録商標）１０７３）である。試験を行った気体組成物は、１０％のＣＯ２と、０％、１９％、４０％、６０％、６５％または９０％のＯ２と、残りのＮ２とからなるものである。二酸化炭素は標準的な重炭酸塩緩衝溶液の使用に基づいた生理学的ｐＨを維持すべく加えられている。
【０１６４】
図１２ａ〜ｄは、厚さ０．０５０８ｍｍ（０．００２インチ）のコロナ処理かつコラーゲンコーティングを施したポリスチレンを有する装置１で静的に培養された肝細胞４０における、播種後１日目の細胞付着量（実施例６）、尿素生成量（実施例５）、アルコキシレゾルフィンの生体内変換に基づいた解毒活性（実施例３）、及びリドカインの代謝に基づいた解毒活性（実施例５）についてのデータを示したものである。データはドナー１００及び１０１より播種された２×１０６個の肝細胞について得られたものであり、１９％Ｏ２を供給した装置を基準として表した。接着細胞の全関連タンパク質の量で表される播種後１日目の付着量（図１２ａ）は、供給気体中のＯ２濃度が６０％に上昇するにしたがって倍増した。
【０１６５】
基底レベル（白抜き記号）及び２０ｍＭの外因性アンモニア（黒塗り記号）の投与における尿素の合成量のデータを、播種後２日目（四角）及び５日目（丸）における装置１について図１２ｂに示した。基底レベルは供給気体中のＯ２濃度とは比較的独立している。これに対して、アンモニア投与の場合の尿素合成速度は播種後２日目ではＯ２濃度とともに上昇したが、播種後５日目ではＯ２濃度の上昇にともなって低下した。
【０１６６】
ＢＲＯＤ（四角）及びＥＲＯＤ（丸）のレゾルフィンへの変換に基づく解毒活性のデータを、播種後１日目（黒塗り記号）及び４日後（白抜き記号）について図１２ｃに示した。播種後１日目では、４０％の中間的Ｏ２濃度において最も高い解毒活性が見られた。播種後４日目では、ＢＲＯＤに対する解毒活性はＯ２濃度とは無関係であったが、ＥＲＯＤに対する解毒活性は培養内のその日のＯ２濃度の上昇にともなって単調に低下した。
【０１６７】
リドカインの代謝産物の量については相補的な傾向が見られた（図１２ｄ）。播種後２日目（黒塗り四角）では、代謝産物の量はＯ２濃度の上昇とともに若干上昇したが、播種後５日目（黒塗り丸）ではリドカインの代謝産物の量はＯ２濃度の上昇とともに大きく減少した。
【０１６８】
これらの結果は、コロナ放電処理かつコラーゲンコーティングが施されたＰｏｌｙｆｌｅｘ（登録商標）を有する装置１に供給される酸素濃度を制御し、これにより肝細胞４０の静的培養の酸素化の程度を制御することによって、肝細胞の多岐にわたる機能の制御が可能であることを示すものである。更に、酸素濃度を選択し、これを培養中で日毎に変化させることによって異なる機能を促進または抑制することが可能である。
【０１６９】
気体透過性かつ液体不透過性の膜／細胞支持体３０としてＴＹＶＥＫ（登録商標）を有する装置１において静的に培養された肝細胞４０についても同様のデータが得られた。このシステムでは肝細胞を装置１台当たり２×１０６個の細胞密度となるように播種し、解毒活性に対する酸素化の影響を、ドナー７３からの細胞については播種後１日目のアルコキシレゾルフィンのレゾルフィンへの変換に基づいた方法（実施例３）、ドナー７８からの細胞については播種後２日目及び４日目のジアゼパムのクリアランスに基づいた方法（実施例４）、ドナー７６からの細胞については播種後３日目の尿素合成の基底レベルに基づいた尿素生成に基づいた方法（実施例５）、及びドナー７４からの細胞についてはアルブミンの合成及び分泌に基づいた方法（実施例６）によって評価した。これらのアッセイにおいて異なるブタドナーから収集したデータを図１３ならびに表３及び４にまとめた。
【０１７０】
図１３には、６５％Ｏ２での膜を通じた酸素化においてＢＲＯＤ（黒塗り四角）及びＥＲＯＤ（白抜き四角）に対する解毒活性が最も高かったことが示されている。これよりも高いかあるいは低いＯ２濃度に露曝した場合、解毒活性は低下した。すなわち、０％Ｏ２では細胞は窒息し、１９％及び４０％のＯ２への曝露では解毒活性が制限され、９０％Ｏ２への曝露では酸素過剰であり、細胞に悪影響が見られた。同様に表３では、酸素化度が１９％から４０％へと上昇した場合、クリアランスされてノルジアゼパム及びテマゼパムへと代謝されたジアゼパムのパーセンテージが高くなったことが示されている。
【０１７１】
【表３】
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さらに、ＴＹＶＥＫ（登録商標）１０７３を含みかつ１９％及び４０％のＯ２に接続された装置１は、それぞれ２０．５および４２．５μｇ／日の尿素を生成し、より酸素を豊富に含むガスへの暴露が、その膜材料における尿素合成レベルを上昇させることを示す。
【０１７２】
表４に示すように、装置１におけるＴＹＶＥＫ（登録商標）１０７３でのアルブミン分泌に関して、酸素化レベルに対する様々な傾向が観察された：アルブミン分泌の最大速度は１９％のＯ２への曝露において検出され、より低い速度はより高い濃度のＯ２への暴露において検出された。それら結果は共に、ガス中のＯ２濃度を操作することによって制御された膜を介した直接的酸素化が肝細胞機能に対してもたらす潜在的利益、ならびに肝細胞機能を操作するのにガス組成のどのような変化を用い得るかを示す。
【０１７３】
【表４】
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【０１７４】
実施例１２：細胞培養装置内の肝細胞に対する灌流の影響
実施例２の装置を使用し、コロナ放電処理かつコラーゲンコーティングを施したＰｏｌｙｆｌｅｘ（登録商標）を用いた実験室規模の装置において、異なる体積流速にて培養肝細胞を灌流した場合の影響を比較した。装置１にドナー９６からの肝細胞を２×１０６個播種し、灌流液として１０ｍＬの完全培地を流し、１９％Ｏ２、１０％ＣＯ２、及び残りのＮ２を含有する気体を供給した。図１４は、１．５ｍＬ／分（四角）及び０．１ｍＬ／分（丸）の流速にて灌流した装置における、尿素合成の基底レベル（白抜き記号）及び２０ｍＭの外因性アンモニアを投与した場合の尿素の合成速度（黒塗り記号）のデータを示したものである。データは静的コントロールに対するパーセンテージとして表した。両体積流速ならびに尿素の基底レベル及びアンモニア投与レベルの両方の培養において、ほぼ毎日、高い脱アミノ化度を反映したものと考えられる相対的な尿素合成量の増大が見られた。高い基底尿素生成レベル及びアンモニア投与を行った尿素生成レベルの双方においていずれの体積流速も好ましくなかった。ドナー１０８及び１０９から得られた肝細胞を４×１０６個播種した装置を、最大で１２ｍＬ／分の大きな体積流速にて動作させる以外は同様の条件で動作させた場合のデータによってもやはり流速が尿素生成に影響しないことが示された。これらの結果は、装置１が所定の範囲の体積流速において肝細胞の機能に悪影響を及ぼすことなく正常な動作が可能であることを示すものである。
【０１７５】
更に実施例２の装置を使用して、培養肝細胞を一定の体積流速かつ異なる体積の灌流液にて灌流した場合の、コロナ放電処理及びコラーゲンコーティングを施したＰｏｌｙｆｌｅｘ（登録商標）を用いた装置における細胞増殖及び尿素生成に対する影響を比較した。
【０１７６】
細胞増殖及び尿素生成について調べるため、装置１にドナー９６からの肝細胞を２×１０６個播種し、灌流液として１０ｍＬの完全培地を灌流回路に流し、１９％Ｏ２、１０％ＣＯ２、及び残りのＮ２を含有する気体を供給した。表５は、接着性肝細胞に関連する全タンパク量から求めた細胞量として表される、細胞の増殖率についてのデータを、カバー及び蓋を装着した装置について示したものである。細胞密度のデータは、組織培養皿内の培養について観察された細胞量に対するパーセンテージとして表した。静的かつカバーを装着した装置と、０．１ｍＬ／分の灌流速度で灌流し、かつキャップを装着した装置では、播種後３日目の組織培養皿に対して細胞量が増加している。すべての構成において、播種後９日目までに細胞量は大幅に増大した。これらの結果は、細胞の増殖にとって灌流は悪影響を及ぼすものではないことを示すものである。
【０１７７】
【表５】
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【０１７８】
図１５は、単一の装置において１．５ｍＬ／分で１０ｍＬ（四角）または２０ｍＬ（丸）を灌流液を灌流したときの尿素合成の基底レベルのデータを示したものである。ここでもやはりデータは静的コントロールに対するパーセンテージとして表している。３つのシステムすべての培養において、ほぼ毎日、高い脱アミノ化度を反映したものと考えられる相対的な尿素合成量の増大が見られた。１０ｍＬの灌流と比較して２０ｍＬを灌流した装置ではより大きな相対的増加が見られた。これらの結果は、灌流液の体積を調整することが、肝細胞の機能、特に尿素生成を制御するうえで有効な手段となることを示すものである。
【０１７９】
更に実施例２の装置を使用して、気体透過性かつ液体不透過性の膜／細胞培養支持体３０としてＴＹＶＥＫ（登録商標）１０７３を用いた装置１において培養肝細胞を異なる体積の灌流液により１．５ｍＬ／分の灌流速度で灌流した場合の影響を比較した。これらの実験では、装置に肝細胞を２×１０６個播種し、灌流液として１０または２０ｍＬの完全培地を流し、４０％Ｏ２、１０％ＣＯ２、及び残りのＮ２を含有する気体を供給した。播種後１〜１３日後にわたり、ドナー７５から得られた細胞における尿素の合成（実施例６、方法１）ならびにアルブミンの合成及び分泌（実施例７）について肝細胞を評価した。図１６ａ及び１６ｂにそのデータを示した。
【０１８０】
調べた時点のほぼすべてにおいて、尿素の合成量及びアルブミンの分泌量は、１０ｍＬの灌流液を用いた場合と比較して２０ｍＬの灌流液を用いた場合の方が大きかった。これらの結果は、灌流を行い、灌流液の体積を増すことによって尿素生成量及びアルブミン分泌量を増大させることが可能であることを示すものである。この例によれば、膜を通じて直接的酸素化を行う灌流によって機能を向上させることの有用性が示された。
【０１８１】
実施例１３：灌流を行った細胞培養装置内の肝細胞に対する細胞播種密度の影響
細胞培養装置の経済効率、実用性、及び有用性は、装置が支持することが可能な細胞の密度によって影響されうる。細胞の支持の高密度化によって、コストの低下ならびに装置及びユニットの小型化につながることがしばしばである。また、一般に細胞の高密度化によって細胞単位の機能が大きく損なわれないことが望ましい。
【０１８２】
こうした課題を解決すべく、更に実施例２の装置を使用して、異なる初期細胞密度にて播種された肝細胞を灌流した場合における、コロナ放電処理かつコラーゲンコーティングを施したＰｏｌｙｆｌｅｘ（登録商標）を用いた装置での尿素生成に対する影響を比較した。装置１に、４×１０６個、８×１０６個、または１２×１０６個のドナー１０９から得られた肝細胞４０を播種し、灌流液１１として１０ｍＬの完全培地を灌流回路に流し、１９％Ｏ２、１０％ＣＯ２、及び残りのＮ２を含有する気体を供給し、更に培養の１日目から２日目にかけて１．５ｍＬ／分の灌流速度にて灌流した。尿素生成量は実施例６の方法２に基づいて求めた。表６には、尿素の合成速度が初期の播種密度にほぼ線形比例して上昇することが示されている。すなわち、装置１台当たりの播種細胞数を４×１０６個から、８×１０６個、１２×１０６個と増加させるにしたがって、播種細胞１個当たりの尿素生成速度は９８から１０６に、更に８５へと変化した。これらの結果は、本発明によれば肝細胞の機能の細胞数による線形スケーリングが可能であることを示すものである。
【０１８３】
【表６】
0004605734.tif 000009
【０１８４】
更に実施例２の装置を用いて、高密度の灌流培養細胞の機能における酸素化の操作の実用性について検討した。コロナ放電処理かつコラーゲンコーティングを施したＰｏｌｙｆｌｅｘ（登録商標）を用いた装置１に４×１０６個、８×１０６個、または１２×１０６個のドナー１０５、１０９及び１１０から得られた肝細胞４０を播種し、灌流液１１として１０ｍＬの完全培地を灌流回路に流し、１０％ＣＯ２及び０〜９０％のＯ２（及び残りのＮ２）を含有する気体４を供給し、更に培養の１日目から２日目にかけて１．５ｍＬ／分の灌流速度にて灌流した。尿素生成量はやはり実施例６の方法２に基づいて求めた。図１７は、１９％Ｏ２のコントロールに対するパーセンテージとしてこれらの実験データをプロットしたものである。低密度の培養では（例えば黒塗りの四角にて表される４×１０６個の初期播種細胞）、２０ｍＭの外因性アンモニアの投与に応じた尿素の合成は１９％Ｏ２と比較して酸素化度が低い条件下において最も高かった。更に、このような低密度では、酸素化度が大きくなると尿素生成量は低下した。これに対し高細胞密度の培養では（例えば８×１０６個の細胞は黒塗りの菱形、１２×１０６個の細胞は黒塗りの三角にて表した）、尿素生成の速度は、６０％Ｏ２の中程度の酸素化度において最も高かった。
【０１８５】
これらの結果は、新規な細胞培養装置内で支持される肝細胞の性能及び機能を制御するための更なる手段として酸素化度の操作を用いることが可能であること、及び最適酸素化度レベルは支持される細胞の密度に依存することを示すものである。
【０１８６】
実施例１４：細胞培養装置のサイズによる性能のスケーリング
細胞培養装置の経済効率、実用性、及び有用性は、単位面積当たりの機能を損なうことなく装置全体を大型化できる能力によって更に影響されうる。例えば、１０倍の数の細胞が播種された装置１においては全体の機能が１０倍となるばかりでなく、細胞の播種密度が変化しないように気体透過性かつ液体不透過性の膜３０の投射面積も１０倍となることが一般に望ましい。この需要は、細胞当たりの機能を損なわずに、結合させずに播種した細胞の密度を高めることが不可能であることによって生じるものである。
【０１８７】
本発明によれば、単位面積当たりの機能を損なうことなく装置を大型化するための方法が少なくとも２つ提供される。すなわち、１個のユニットを大型化するか、もしくは複数のユニットを並列、直列、またはその両方によって連結することである。第１の方法では、絶対的なサイズの大きいユニットを有する装置を使用する。第２の方法ではモジュール式ユニットを使用する。
【０１８８】
単一のユニットによって装置の絶対的サイズを大型化することの可能性を、実施例２の装置の性能と、実施例２の灌流回路を使用した装置１の大型版との比較によって検討した。この大型装置は図１８に概略的に示されているが、実施例１の装置と比較して気体透過性かつ液体不透過性の膜３０の投射面積が５倍となるようなサイズに構成されている。このようなサイズ取りによって本装置を肝不全のラットの治療に適用することが可能であり、このため当該装置は「ラット・スケール」の装置として、図４に示されるような「実験室規模」すなわち「ラブ・スケール」の装置とは区別されるものである。
【０１８９】
このラット・スケール装置は、気体透過性かつ液体不透過性の膜３０、３個のシリコーン製ガスケット（Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ  Ｓｉｌｉｃｏｎｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．，バルストン・スパ、ニューヨーク州）８５，８０及び９０、及び補助ネジ及び連結具１２０，１８０，１８１及び２１０の他に、上側ハウジング６０及び下側ハウジング７０、フレーム３５、及び蓋１１０などの１式のアルミニウム部品からなる。膜／フレームアセンブリ４００は、実施例１に詳述されるように形成され、γ線照射によって滅菌される。更にラット・スケール装置１は次の点を除けば、ラブ・スケール装置に関して実施例１に詳述したのと同様に組立て、取り扱いされる（細胞４０の播種工程を含む）。すなわち、ラット・スケール装置には、４ｍＬの培地ではなく、３３ｍＬの培地に懸濁した細胞が播種される。懸濁液中の細胞数は播種密度（単位面積当たり）が２つの異なるスケールにおいて同じになるように調整される。
【０１９０】
この実験では、播種後１日目及び２日目にわたり、同じ流体力学的せん断応力の作用下に２０ｍＬの完全培地１１にて灌流したドナー１０１からの培養肝細胞についてラブ・スケール装置とラット・スケール装置とを比較した。いずれの装置にも１９％Ｏ２、１０％ＣＯ２、及び残りのＮ２を含有した気体４を供給した。尿素生成量は実施例６の方法２に基づいて求めた。表７は、各装置に播種される細胞の数を調整することによって同様の細胞密度が得られたことを示すものである。更に、ラット・スケール装置（約５倍の数の細胞を有する）における尿素の合成速度は、ラブ・スケール装置と比較して約５倍大きく、単位面積当たりの尿素の生成速度は両装置において同様の値である。
【０１９１】
【表７】
0004605734.tif 000010
これらの結果は、本発明によれば気体透過性かつ液体不透過性の膜３０のサイズによる肝細胞機能の線形スケーリングが可能であることを示すものである。
【０１９２】
実施例２の装置の性能をこの装置に似たモジュール式システムと比較することにより、複数のモジュール式ユニットによる装置のスケーリングの可能性を検討した。図１９は、こうしたモジュール式システムの構成を示したものであり、２個の装置１が１つの灌流回路内に並列に配置されている。両装置は１個の貯槽２２０からの体積流速が同じとなるようにポンプ２３０によって駆動されるので、両装置は同じ体積の灌流液１１を分け合うこととなる。両装置はまた同じ供給源４から同じ気体２１の供給を受ける。こうしたシステムでは、システム内の細胞密度または個別のユニットのサイズを変更することなく灌流液を処理するうえで用いられる細胞数を増やすことが可能である。
【０１９３】
この実験を行うため、装置１にドナー１１０から得た肝細胞４０を８×１０６個播種し、単一の装置あるいは２個が並列接続された装置として、灌流回路に灌流液１１としての２０ｍＬの完全培地を流し、１９％Ｏ２、１０％ＣＯ２、及び残りのＮ２を含有する気体４を供給した。灌流は、各装置が単体として使用されるかあるいは２個を並列接続したものとして使用されるかによらず、１日目から２日目にかけて２０ｍＭの外因性アンモニアを含む完全培地が１．５ｍＬ／分の流速にて各装置に供給されるように行われる。尿素生成量は実施例６の方法２に基づいて求めた。表８は、２個の装置を対で用いてシステム内の播種細胞数を２倍とすることによってシステムの尿素生成速度が２倍となることを示したものであり、これによりユニット当たりの尿素生成速度は一定となっている。これらの結果は、システムの全体的機能とシステム内のモジュール式ユニットの個数とは直線的な比例関係にあるために、並列動作する装置を追加してシステムを大型化することによってシステムの全体的性能が高められることを示している。
【０１９４】
【表８】
0004605734.tif 000011
【０１９５】
他の実施形態
以上本発明をその詳細な説明に準拠して説明したが、以上の記載は本発明を説明するためのものであって特許請求の範囲において定義されるところの発明の範囲を限定するものではない点に留意されたい。他の態様、利点、及び改変は特許請求の範囲に包含されるものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、体外肝臓支援システムの説明図
【図２】  図２は、２つの区画を分離する気体透過性かつ液体不透過性の膜を含む本発明の「２区画」細胞培養装置の説明図
【図３】  図３は、膜透過酸素供給において、細胞密度（Ｐcells）の程度に対して、ならびに酸素に対する異なる膜透過性および／または細胞の酸素消費速度に対して、肝細胞の酸素消費速度を平衡化させるのに十分な酸素供給を達成するために必要な装置搬送ガス中の酸素の分圧を示すグラフ
【図４ａ】  図４aは、２つの区画を分離する気体透過性かつ液体不透過性の膜を含む本発明の「２区画」細胞培養装置の実施形態の説明図
【図４ｂ】  図４ｂは、２つの区画を分離する気体透過性かつ液体不透過性の膜を含む本発明の「２区画」細胞培養装置の実施形態の説明図
【図４ｃ】  図４ｃは、２つの区画を分離する気体透過性かつ液体不透過性の膜を含む本発明の「２区画」細胞培養装置の実施形態の説明図
【図４ｄ】  図４ｄは、２つの区画を分離する気体透過性かつ液体不透過性の膜を含む本発明の「２区画」細胞培養装置の実施形態の説明図
【図４ｅ】  図４ｅは、２つの区画を分離する気体透過性かつ液体不透過性の膜を含む本発明の「２区画」細胞培養装置の実施形態の説明図
【図４ｆ】  図４ｆは、２つの区画を分離する気体透過性かつ液体不透過性の膜を含む本発明の「２区画」細胞培養装置の実施形態の説明図
【図５ａ】  図５ａは、別々の気体透過性かつ液体不透過性の膜と液体透過性膜とを含む本発明の「３区画」細胞培養装置の実施形態の説明図
【図５ｂ】  図５ｂは、別々の気体透過性かつ液体不透過性の膜と液体透過性膜とを含む本発明の「３区画」細胞培養装置の実施形態の説明図
【図５ｃ】  図５ｃは、別々の気体透過性かつ液体不透過性の膜と液体透過性膜とを含む本発明の「３区画」細胞培養装置の実施形態の説明図
【図５ｄ】  図５ｄは、別々の気体透過性かつ液体不透過性の膜と液体透過性膜とを含む本発明の「３区画」細胞培養装置の実施形態の説明図
【図５ｅ】  図５ｅは、別々の気体透過性かつ液体不透過性の膜と液体透過性膜とを含む本発明の「３区画」細胞培養装置の実施形態の説明図
【図５ｆ】  図５ｆは、別々の気体透過性かつ液体不透過性の膜と液体透過性膜とを含む本発明の「３区画」細胞培養装置の実施形態の説明図
【図６ａ】  図６ａは、少なくとも２つの気体透過性かつ液体不透過性の膜を含む多区画細胞培養装置の実施形態の説明図
【図６ｂ】  図６ｂは、少なくとも２つの気体透過性かつ液体不透過性の膜を含む多区画細胞培養装置の実施形態の説明図
【図６ｃ】  図６ｃは、少なくとも２つの気体透過性かつ液体不透過性の膜を含む多区画細胞培養装置の実施形態の説明図
【図７ａ】  図７ａは複数の積み重ねた区画を含む細胞培養装置の実施形態の説明図
【図７ｂ】  図７ｂは複数の積み重ねた区画を含む細胞培養装置の実施形態の説明図
【図８ａ】  図８ａは、複数の積み重ねた「２区画」細胞培養室を含む細胞培養装置のための分岐管接続の実施形態の説明図
【図８ｂ】  図８ｂは、複数の積み重ねた「２区画」細胞培養室を含む細胞培養装置のための分岐管接続の実施形態の説明図
【図９ａ】  図９ａは、細胞培養装置の側面図
【図９ｂ】  図９ｂは、細胞培養装置の側面図
【図１０ａ】  図１０ａは、細胞培養装置のための灌流回路の構成部品の説明図
【図１０ｂ】  図１０ｂは、細胞培養装置のための灌流回路の構成部品の説明図
【図１１】  図１１は、コラーゲンコートしてコロナ処理した０．００５１ｃｍ（０．００２インチ）の厚さのガス透過性ポリスチレン膜を含む装置または組織培養ディッシュにおいて静的に培養した肝細胞による尿素の合成を比較したグラフ
【図１２】  図１２は、０．００５１ｃｍ（０．００２インチ）の厚さのコロナ処理したコラーゲンコートポリスチレンガス透過性膜を含む装置において静的に培養した肝細胞における、細胞播種の１日後における細胞の付着（１２ａ）、基礎のおよび負荷状態での尿素合成、（１２ｃ）アルコキシレゾルフィンに対する解毒活性、ならびに（１２ｄ）リドカインの代謝に対する、酸素供給の効果を示すグラフ
【図１３】  図１３は、TYVEK（登録商標）1073を含む装置において静的に培養した肝細胞によるアルコキシレゾルフィンに対する解毒活性に対する、膜透過酸素供給の効果を示すグラフ
【図１４】  図１４は、０．００５１ｃｍ（０．００２インチ）の厚さのコロナ処理したコラーゲンコートポリスチレン膜を含む灌流装置において培養した肝細胞による尿素合成に対する、培養液の流量速度の変化の効果を示すグラフ
【図１５】  図１５は、０．００５１ｃｍ（０．００２インチ）の厚さのコロナ処理したコラーゲンコートポリスチレン膜を含む灌流装置において培養した肝細胞による尿素合成に対する、培養液の容量の変化の効果を示すグラフ
【図１６】  図１６は、TYVEK（登録商標）1073を含む灌流装置において培養した肝細胞における、（１６ａ）尿素の合成に対する、および（１６ｂ）アルブミンの分泌に対する、培養液の容量の変化の効果を示すグラフ
【図１７】  図１７は、０．００５１ｃｍ（０．００２インチ）の厚さのコロナ処理したコラーゲンコートポリスチレン膜を含む灌流装置において培養した肝細胞における尿素発生に対する、膜透過酸素供給および細胞播種密度の効果を示すグラフ
【図１８】  図１８は、ラット処置用のサイズの細胞培養装置の側面図
【図１９】  図１９は、単一の灌流回路中に並行配置させた一対の細胞培養装置の説明図
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
0004605734.tif 000016
【図４ｃ】
0004605734.tif 000017
【図４ｄ】
0004605734.tif 000018
0004605734.tif 000019
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【図５ａ】
0004605734.tif 000021
【図５ｂ】
0004605734.tif 000022
【図５ｃ】
0004605734.tif 000023
【図５ｄ】
0004605734.tif 000024
【図５ｅ】
0004605734.tif 000025
【図５ｆ】
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【図６ａ】
0004605734.tif 000027
【図６ｂ】
0004605734.tif 000028
【図６ｃ】
0004605734.tif 000029
【図７ａ】
0004605734.tif 000030
【図７ｂ】
0004605734.tif 000031
【図８ａ】
0004605734.tif 000032
【図８ｂ】
0004605734.tif 000033
【図９Ａ】
0004605734.tif 000034
【図９Ｂ】
0004605734.tif 000035
【図１０ａ】
0004605734.tif 000036
【図１０Ｂ】
0004605734.tif 000037
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
0004605734.tif 000040
【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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