(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検体の細胞老化を検査するために、膜構造を有する生体構造物である被検体由来の細胞に結合させた蛍光マーカーのゆらぎを測定する方法であって、
細胞を、該細胞が生理機能を維持し得る条件下で測定容器に固定する工程と、
前記細胞の膜構造に蛍光マーカー分子を結合させる工程と、
前記膜構造に結合させた前記蛍光マーカー分子の蛍光強度ゆらぎを測定する工程と、
前記工程により得られる測定結果を、正常な被検体由来の細胞を用いて予め決定された蛍光強度ゆらぎの基準値と比較する工程と
を含む方法。
【請求項２】
被検体の老化または糖尿病を検査するために、膜構造を有する生体構造物である被検体由来の赤血球膜に結合させた蛍光マーカーのゆらぎを測定する方法であって、
赤血球を、該赤血球が生理機能を維持し得る条件下で測定容器に固定する工程と、
前記赤血球の膜構造に蛍光マーカー分子を結合させる工程と、
前記膜構造に結合させた前記蛍光マーカー分子の蛍光強度ゆらぎを測定する工程と、
前記工程により得られる測定結果を、正常な被検体由来の赤血球を用いて予め決定された蛍光強度ゆらぎの基準値と比較する工程と
を含む方法。
【請求項３】
前記蛍光マーカー分子の蛍光強度ゆらぎの検出を、蛍光相関分光法または蛍光偏光法により行うことを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
細胞または赤血球の膜構造に蛍光マーカー分子を結合させる前記工程により得られた、蛍光マーカー分子結合生体構造物が、生体構造物近傍にて自由運動する蛍光マーカー分子の蛍光強度揺らぎ[ｘ]と、生体構造物の膜構造に結合して自由運動が抑制された蛍光マーカー分子の蛍光強度揺らぎ[ｙ]との比[ｘ/ｙ]が、０．２以下であることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体構造物（例えば細胞または細胞小器官）の膜構造におけるマーカー分子の揺らぎ強度を測定することにより、生体構造物の膜機能を解析する方法に関する。また本発明は、生体構造物の膜機能を解析することにより生体構造物の性状を評価する方法、並びに被検物質の存在下と非存在下で生体構造物の膜機能を解析することにより被検物質が生体に及ぼす影響を評価する方法に関する。特に本発明は、被検物質の生体構造物に与える毒性を評価する際に有用である。
【背景技術】
【０００２】
化合物が生体に及ぼす影響を評価する場合、近年、動物を使った投与実験から培養細胞を用いる方法へと移行しつつある。化合物が細胞に作用するときは、まずその細胞膜への関与が第一ステップとして起こり、そこでは膜構造を形成する物質、つまり（糖）脂質や蛋白との相互作用が生じる。次にこれによって変化した膜構造のために膜内外の環境が変化し、細胞シグナル系に影響を与えることが予想される。悪影響が及ぼされる場合、最終的には細胞自身の機能が損なわれて細胞死に至る。このように化合物が及ぼす影響が現れるまで（細胞死に至るまで）に要する時間は、細胞や化合物の種類によって様々である。しかし、第一ステップである、化合物と膜との関与についてはごく短期間の現象であり、これらを的確にモニターすることによって、最終的に化合物が細胞に及ぼす影響（細胞死）を早期に予測できると考えられる。
【０００３】
膜に対する化合物の毒性を測定する方法としては、従来、リポソームを用いた方法が一般的である。例えば、ｐＨ感受性の色素（アクリジンオレンジ）をリポソームに封入し、外部化合物がリポソーム膜を破壊した場合に流出する色素の蛍光を測定する方法などがある（特許文献１（特表2002−517726、20頁））。また、リポソームを用いた方法としては、リポソーム膜表面での抗原抗体複合体形成とそれに作用する補体の働きにより、リポソーム内から放出された色素の蛍光を測定する免疫測定法も報告されている（特許文献２（特開平7−191033、5頁））。
【０００４】
一方、蛍光相関分光法は、微小なレーザー焦点領域内における蛍光分子のゆらぎを測定することによって1分子レベルでの分子の拡散速度、分子数、さらにこれらの情報より分子間相互作用などが求められる。この方法により、リポソーム封入ローダミンが化合物（Melittin）によって膜外に流出する現象が測定されている（非特許文献１（Molecular interactions of peptides with phospholipid vesicle membranes as studied by fluorescence correlation spectroscopy., Pramanik A, Thyberg P, Rigler R., Chem Phys Lipids 2000 Jan; 104(1): 35-47））。また、蛍光相関分光法を用いた、細胞等の生体構造物上での受容体、リガンドの相互作用評価については、リグラーらの発明が先行技術として報告されている（特許文献３（特表平11-502608、115頁））。
【０００５】
上記リポソームを用いた従来の方法では実験系が単純になる利点はあるものの、実際の生体構造物（細胞等）がその複雑な構造により生理機能が維持されている点で、リポソ−ム系は生体構造物のモデルとしてはかなり特殊なものとされる。さらに均一なリポソ−ムを作成するにはある程度のノウハウと工数が必要とされる。そのため、実際の生体構造物をそのまま実験にもちいた評価系が求められ、しかもその生理機能を正常に維持した条件で測定が行われる系が求められる。
【０００６】
また、従来の生体構造物を用いる細胞毒性検査の場合、使用する細胞の数が十分量必要であり、しかも細胞に対する被検物質の影響を評価するのに時間がかかるなどの欠点がある。
【０００７】
【特許文献１】特表2002−517726公報、20頁
【０００８】
【特許文献２】特開平7−191033号公報、5頁
【０００９】
【非特許文献１】Molecular interactions of peptides with phospholipid vesicle membranes as studied by fluorescence correlation spectroscopy., Pramanik A, Thyberg P, Rigler R., Chem Phys Lipids 2000 Jan; 104(1): 35-47
【００１０】
【特許文献３】特表平11-502608号公報、115頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
上記事情に鑑み、本発明の目的は、生理機能を維持した微量の生体構造物（細胞等）を用い、短時間で、生体構造物の膜機能を解析する方法を提供することである。とりわけ、本発明の目的は、生理機能を維持した微量の生体構造物（細胞等）を用い、短時間で、被検物質が生体に及ぼす影響（例えば毒性）を評価する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
発明者らは上記課題を解決する方法、つまり生理機能を維持した生体構造物の膜上でのマーカー分子の揺らぎ強度を測定することにより、生体構造物の膜機能を短時間で解析する方法を開発した。
【００１３】
すなわち、本発明は以下に記載の手段を提供する。
（１）膜構造を有する生体構造物の膜機能を解析する方法であって、
膜構造を有する生体構造物を、該生体構造物が生理機能を維持し得る条件下で測定容器に固定する工程と、
前記生体構造物の膜構造にマーカー分子を結合させる工程と、
前記膜構造に結合させた前記マーカー分子の強度ゆらぎを測定する工程と
を含む方法。
（２）膜構造を有する生体構造物の膜機能を解析することにより前記生体構造物の性状を評価する方法であって、
膜構造を有する生体構造物を、該生体構造物が生理機能を維持し得る条件下で測定容器に固定する工程と、
前記生体構造物の膜構造にマーカー分子を結合させる工程と、
前記膜構造に結合させた前記マーカー分子の強度ゆらぎを測定する工程と、
前記工程により得られる測定結果を、予め決定された強度ゆらぎの基準値に基づいて前記生体構造物の性状と関連づける工程と
を含む方法。
（３）膜構造を有する生体構造物の膜機能を解析することにより被検物質が生体に及ぼす影響を評価する方法であって、
膜構造を有する生体構造物を、該生体構造物が生理機能を維持し得る条件下で測定容器に固定する工程と、
前記生体構造物の膜構造にマーカー分子を結合させる工程と、
前記マーカー分子を有する生体構造物と被検物質とを反応させる工程と、
前記膜構造に結合させた前記マーカー分子の強度ゆらぎを測定する工程と、
前記工程により得られる測定結果と、被検物質の非存在下における測定結果とを比較する工程と
を含む方法。
【００１４】
（４）（３）に記載の評価方法であって、前記被検物質と前記マーカー分子が、前記生体構造物に対して競合反応する関係にあることが疑われる場合に、前記強度ゆらぎの測定結果から、（i）前記マーカー分子の拡散速度および（ii）膜構造に結合した状態にあるマーカー分子と膜構造から遊離した状態にあるマーカー分子との比率を計算することを特徴とする方法。
（５）（１）〜（４）の何れか１に記載の方法であって、前記生体構造物が、動物または植物由来の細胞または細胞小器官であることを特徴とする方法。
（６）（１）〜（４）の何れか１に記載の方法であって、前記生体構造物が、血液細胞または神経細胞であることを特徴とする方法。
（７）（１）〜（６）の何れか１に記載の方法であって、前記マーカー分子が蛍光マーカー分子であり、当該蛍光マーカー分子の蛍光強度ゆらぎの検出を、蛍光相関分光法または蛍光偏光法により行うことを特徴とする方法。
（８）膜構造を有し、当該膜構造にマーカー分子を結合させた生体構造物を、当該生体構造物が生理機能を維持し得る条件下に保持した評価用物品であって、生体構造物近傍にて自由運動するマーカー分子の強度揺らぎ[ｘ]と、生体構造物の膜構造に結合して自由運動が抑制されたマーカー分子の強度揺らぎ[ｙ]との比[ｘ/ｙ]が、０．２以下であることを特徴とする評価用物品。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の方法は、生理機能を維持した生体構造物を用いるため、生体に近い条件下での解析、評価が可能である。また、本発明の方法は、膜構造に結合させたマーカー分子の強度ゆらぎを測定するため、微量の生体構造物の使用で測定が可能であるとともに、短時間（数十秒）での測定が可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、本発明を詳細に説明するが、以下の記載は本発明を説明するためのものであって、本発明を限定するためのものではない。
【００１７】
［１］膜構造を有する生体構造物の膜機能を解析する方法
膜構造を有する生体構造物の膜機能を解析する本発明の方法は、一つの態様に従えば、
（１）膜構造を有する生体構造物を、該生体構造物が生理機能を維持し得る条件下で測定容器に固定する工程と、
（２）前記生体構造物の膜構造に蛍光マーカー分子を結合させる工程と、
（３）前記膜構造に結合させた前記蛍光マーカー分子の蛍光強度ゆらぎを測定する工程と
を含む。
【００１８】
本発明において生体構造物は、膜構造を有する生体内に存在する任意の構造物を指し、より具体的には、細胞、細胞小器官、核、ミトコンドリアを指す。以下、生体構造物として細胞を用いた場合を例に説明する。なお、生体構造物は、生体内から抽出または切除して得られる天然の物質に限らず、生体内での機能を同等に有するように合成ないし培養された物質でもよい。また、天然由来の生体構造物であっても、解析の目的に沿うように化学的ないし物理的処理を施してもよい。
【００１９】
工程（１）では、細胞を、測定容器中の細胞培養液中で、測定容器底に接着させて室温で培養することにより、細胞を測定容器に固定する。血液細胞などの浮遊細胞については、レクチン等の接着因子を介して細胞をグラス底面に固定する（図１参照）。細胞培養液は、細胞が生育可能な生理的条件の整った溶液〔例えばPBS〕などとし、ｐＨは7.4付近に調整したものを用いることができる。特にFCS測定時、通常用いられる細胞培養用培地に含まれる赤いフェノール色素は測定を妨害する可能性があるため、これを用いず、その代わりに色素を除去した培地を好ましくは用いる。このような色素を含まない培地としては、Opti-MEM（商標）と呼ばれる市販の培地を使用してもよい。
【００２０】
工程（２）において、細胞の膜構造に蛍光マーカー分子を結合させる。本発明において蛍光マーカー分子とは、一般に疎水性部位をもつマーカー分子がこれに適するが、特に疎水性部分が長いマーカー分子が好ましく、例えばOctadecyl Rhodamine B Chrolide（以下R18という）を用いることができる。また、疎水性部位をもたない一般の色素であっても、疎水性部位をもつ結合性のプローブに対して色素標識したものでもよく、このような結合性プローブとしては例えばPhosphatidylcholinまたはDPH（diphenylhexatoriene）が挙げられる。このような蛍光マーカー分子を数ｎＭ、細胞含有溶液（細胞濃度３０〜５０重量％）に添加し１０〜６０分間培養することによりR18を生体膜に結合させる。R18の分子構造を図２に示す。工程（１）および（２）は、何れの工程を先に行ってもよい。
【００２１】
工程（３）において、膜構造に結合させた蛍光マーカー分子の蛍光強度ゆらぎを測定する。例えば、蛍光相関分光機のレーザー焦点を、蛍光マーカー分子（R18）が結合した生体膜近傍にちかづけて約10秒間FCSの測定を行う。十分な蛍光強度とそれにともなう自己相関関数が得られたならばこれにより「拡散速度」が計算される。さらに、膜近傍にて結合していないR18が自由拡散しているため、膜結合R18と膜に結合していないR18との「比率」がこの自己相関関数によって計算される。
【００２２】
［２］膜構造を有する生体構造物の性状を評価する方法
膜構造を有する生体構造物の性状を評価する本発明の方法は、一つの態様に従えば、
（１）膜構造を有する生体構造物を、該生体構造物が生理機能を維持し得る条件下で測定容器に固定する工程と、
（２）前記生体構造物の膜構造に蛍光マーカー分子を結合させる工程と、
（３）前記膜構造に結合させた前記蛍光マーカー分子の蛍光強度ゆらぎを測定する工程と、
（４）前記工程により得られる測定結果を、予め決定された蛍光強度ゆらぎの基準値に基づいて前記生体構造物の性状と関連づける工程と
を含む。
【００２３】
上記工程（１）〜（３）は、「膜構造を有する生体構造物の膜機能を解析する方法」の工程（１）〜（３）の説明を参照されたい。工程（４）では、工程（３）で得られた測定結果を、予め決定された蛍光強度ゆらぎの基準値に基づいて生体構造物の性状と関連づける。例えば、細胞構造物（被検対象物）の蛍光マーカー分子の蛍光強度ゆらぎの測定結果を、正常な細胞構造物（基準サンプル）の蛍光マーカー分子の蛍光強度ゆらぎの測定結果（基準値）に基づいて、生体構造物の性状（老化もしくは疾病の有無）と関連づける。あるいは、正常な細胞構造物に加えて種々の老化（もしくは疾病）の程度を有する細胞構造物を基準サンプルとして用いて、これらの蛍光マーカー分子の蛍光強度ゆらぎを測定し、複数の基準値を設定しておくことにより、細胞構造物（被検対象物）の蛍光マーカー分子の蛍光強度ゆらぎの測定結果を、老化もしくは疾病の程度と関連づけることができる（後述の実施例２参照）。
【００２４】
このように本発明の評価方法を用いて、生体膜における蛍光分子の動的解析を行うことにより、生体構造物の性状を評価することができる。また、本発明は、疾病により膜変性した状態にあると評価された生体構造物を用いて、これに治療薬を投与し、本発明の評価方法を用いてその蛍光強度ゆらぎを測定することにより、治療薬の効果をモニターすることも可能である。
【００２５】
［３］被検物質が生体に及ぼす影響を評価する方法
被検物質が生体に及ぼす影響を評価する本発明の方法は、一つの態様に従えば、
（１）膜構造を有する生体構造物を、該生体構造物が生理機能を維持し得る条件下で測定容器に固定する工程と、
（２）前記生体構造物の膜構造に蛍光マーカー分子を結合させる工程と、
（３）前記蛍光マーカー分子を有する生体構造物と被検物質とを反応させる工程と、
（４）前記膜構造に結合させた前記蛍光マーカー分子の蛍光強度ゆらぎを測定する工程と、
（５）前記工程により得られる測定結果と、被検物質の非存在下における測定結果とを比較する工程と
を含む。
【００２６】
この方法も、上記方法と同様に実施され得る。そのため、上記方法と異なる工程のみ以下で説明する。
工程（３）において、蛍光マーカー分子を有する生体構造物と被検物質とを反応させる。ここでの反応は、例えば、上記工程（１）と同じ条件下において、生体構造物である細胞（細胞濃度３０〜５０重量％）と１０〜８０ｎＭの被検物質とを１０〜６０分間培養することにより行うことができる。
【００２７】
工程（５）において、被検物質の存在下で測定される蛍光強度ゆらぎの測定結果と、被検物質の非存在下で測定される蛍光強度ゆらぎの測定結果とを比較する。この比較により、被検物質が、膜構造に影響を及ぼし、膜の粘性を増大もしくは減少させる場合を検出することができる。
【００２８】
例えば、被検物質と膜上の蛍光マーカー分子が、生体構造物に対して競合反応する関係にあることが疑われる場合は、蛍光強度ゆらぎの測定結果から、蛍光マーカー分子の「拡散速度」を計算することに加えて、蛍光強度ゆらぎの測定結果から、膜構造に結合した状態にある蛍光マーカー分子と膜構造から遊離した状態にある蛍光マーカー分子との「比率」を計算してもよい。すなわち、「拡散速度」および「比率」を、それぞれ被検物質の非存在下で得られる「拡散速度」および「比率」のデータと比較してもよい（後述の実施例３、表２参照）。実施例３に示されるとおり、被検物質が、蛍光マーカー分子と競合する物質である場合、被検物質の添加により、蛍光マーカー分子の「拡散速度」は遅くなり、膜構造に結合した蛍光マーカー分子の「比率」が減少し、膜構造から遊離した蛍光マーカー分子の「比率」が増大することが観察される。
【００２９】
また、本発明の評価方法を用いて、被検物質を細胞に与えてから経時的に蛍光強度ゆらぎを測定することにより、被検物質が生体構造物に与える影響の変化を時間を追って評価することができる。
【００３０】
［４］蛍光強度ゆらぎの測定方法について
本発明において蛍光マーカー分子が発する蛍光強度のゆらぎは、蛍光相関分光法（FCS）または蛍光偏光法を用いて測定することができる。
【００３１】
蛍光相関分光法は、励起レーザー光をN.A.(1.2)の高い対物レンズにより絞り、ステージ上サンプル内での極微小領域（サブフェムトリットル）にて蛍光マーカー分子の出入り、つまり蛍光強度の揺らぎを高感度検出器により検出する方法である。得られたデータから自己相関関数を得、これにより微小領域を通過した平均分子数、分子の平均拡散速度などが求められる（図３）。自己相関関数は次式で表される。
【００３２】
【数１】
0004746276.tif 000002
【００３３】
このように、蛍光相関分光法はその感度の高さから一分子レベルでの測定が可能であり、現在までin vitro あるいは in vivo における測定例が多数報告されている。さらに、FCSと顕微鏡を組み合わせることによってFCSの非侵襲性と顕微鏡による高い空間分解能が得られ、特に細胞(in vivo)測定では細胞内における蛋白やDNAなどの動きを捉えることが可能となっている。その装置の一例を図４に示す。図４において、Digital Correlator内に示されるグラフは、上から順に、測定される蛍光揺らぎおよび自己相関関数を示す。
【００３４】
一方、蛍光偏光法は、各分子に固有の回転ブラウン運動による蛍光強度ゆらぎの測定法の一種で、偏光解消の現象に基づいて、蛍光シグナルを発生する分子の回転運動の速度が速い（蛍光強度ゆらぎが大きい）ときには偏光が解消され、回転運動の速度が減少したときには偏光が解消されずに保存されるような条件で偏光状態の変化を検出する方法である。
【００３５】
［５］評価用物品
また本発明は、一つの態様に従えば、以下の特徴を有する評価用物品を提供する。本発明の評価用物品は、膜構造を有し、当該膜構造に蛍光マーカー分子を結合させた生体構造物を、当該生体構造物が生理機能を維持し得る条件下（溶液中）に保持した評価用物品であって、生体構造物近傍にて自由運動する蛍光マーカー分子の強度揺らぎ[ｘ]と、生体構造物の膜構造に結合して自由運動が抑制された蛍光マーカー分子の強度揺らぎ[ｙ]との比[ｘ/ｙ]が、０．２以下であることを特徴とする。ここで「強度ゆらぎ[ｘ]」および「強度ゆらぎ[ｙ]」は、それぞれ蛍光マーカー分子の総数を反映する値である。本発明の評価用物品は、膜構造を有する生体構造物の性状を評価するため、または被検物質が生体に及ぼす影響を評価するために使用され得る。
【００３６】
以上の本発明の各方法および物品において、膜構造を有する生体構造物とマーカー分子は、液体中の分子運動の特性において次のような関係になるように選ぶのが好ましい。すなわち、評価用物品［５］で述べたように、比[ｘ/ｙ]が０．２以下となるようにするのが好ましい。評価用物品を、該物品を懸濁している緩衝液等で洗浄することにより、「生体構造物近傍にて自由運動する未結合のマーカー分子」の数を、低減することができる。
【００３７】
一般に、生体構造物に結合したマーカー分子が、測定時間中に離脱する割合は、およそ５〜３０％（赤血球では約２０％、神経細胞では約５％）と考えられ、リポソームのような合成された生体構造物であれば、２０〜５０％の離脱もあり得る。本発明ではこのように蛍光分子が経時的に離脱する割合に着目し、この割合を考慮して[ｘ/ｙ]の比を０．２以下とし、測定ノイズとなり得る膜構造に未結合のマーカー分子の量を予め低減しておく。言い換えれば、生体構造物に初めから結合していないマーカー分子が存在していたとしても、[ｘ/ｙ]の比が０．２以下であれば、上述の想定される割合のマーカー分子が離脱しても測定は可能である。
【００３８】
生体構造物におけるマーカー分子の結合部分（例えば膜構造）のみを測定する場合には、未結合のマーカー分子は測定ノイズにならないが、この場合についても未結合のマーカー分子による励起光の余分な光吸収を低減するために[ｘ/ｙ]の比を０．２以下にしておくことが好ましい。
【００３９】
他方、未結合の状態のマーカー分子が検出可能な量で存在する場合、膜構造に結合したマーカー分子が離脱したり、未結合の状態のマーカー分子が膜構造に結合したりするマーカー分子の挙動を継続的にモニターすることもできる。このように未結合のマーカー分子を積極的に利用する場合、[ｘ/ｙ]の比は０．０５〜０．２であるのが好ましい。いずれにしても、[ｘ/ｙ]の比が０．２以下であることにより、生体構造物に結合したマーカー分子の強度ゆらぎの測定値と未結合のマーカー分子の強度ゆらぎの測定値を有効に区別することが可能となる。
【実施例】
【００４０】
FCS測定：全ての測定は市販機器であるConfoCor2（Carl Zeiss社）で行った。励起はヘリウム・ネオンレーザー（543nm）とし、蛍光はバンドパスフィルターBP560-615 nmを通して検出器（APD）によって検出した。
【００４１】
［実施例１］物理化学的変化によって変性を受けたヒト赤血球膜の測定
（１）バッファーの塩濃度を変化させて低張液とした場合の赤血球膜変化
通常、正常な赤血球は等張液バッファー（NaCl濃度：140mM）において中央が凹状にくぼんだ形状を示し、細い血管内でも通過できるようにその形状はフレキシブルに変形可能である。しかし、細胞外バッファーを低張液（NaCl濃度：70mM）に代えると浸透圧の働きで細胞外から水が細胞内に入り込むために細胞の形状は球状を呈するようになる。しかもこの場合、正常に比べてその変形能は大きく減少する。
【００４２】
このような環境変化によって細胞膜はその粘性が変わることが予想されるため、細胞膜に結合させた蛍光マーカー（R18）の膜上揺らぎ強度をFCSにて測定した。
方法：
ヒト赤血球はEDTA/Tris バッファーにて採血、遠心/洗浄後、10mM Tris/HCl バッファー（10mM Glucose, 0.1% BSA, 140mM、70mMあるいは50mM NaCl, pH=7.4）内にて適当量に希釈、レクチンでコーティングしたFCS測定用チェンバーに赤血球を静置した。その後、10 nMのR18を赤血球に添加して30分インキュベーションした後、FCS測定を行った。
【００４３】
結果：
低張液あるいは等張液における赤血球膜上のR18の拡散を比較すると、やや低張液（70mM）において遅い拡散速度を示したが、その差は顕著とはいえなかった。しかし、塩濃度50mM において赤血球内ヘモグロビンが流出したゴースト細胞では、拡散速度の顕著な遅延が認められた。このことから、細胞外塩濃度の変化によって赤血球の形状は大きく変化しているが、ミクロレベルでの膜粘性などの変化はあまり起こっていないと思われる。しかし、細胞内ヘモグロビンが流出するなどの大きな変化が生じた膜ではそのダメージが大きいことが示唆された（図５−１および図５−２）。
【００４４】
（２）コレステロール除去薬剤によって変化を受けた赤血球膜の測定
細胞膜の構成物質として最も重要な一つとしてコレステロールが挙げられる。このコレステロールを特異的に膜から除去する働きのある薬物、メチルβサイクロデキストリン（MβC）を用いて細胞(赤血球)のコレステロールを10〜20％程度除去した膜でのFCS測定を行った。
【００４５】
方法：
例1（１）同様に赤血球を調製した後、測定チェンバー内にてMβC１〜5mM処理し、37℃にて30分間インキュベーションしてからバッファーにて細胞を洗浄し、R18を添加してFCS測定を行った。
【００４６】
結果：
MβC処理によって赤血球の状態が変化するにつれ、拡散速度が遅くなる傾向が見られた。特にゴースト化した赤血球上での拡散は正常に比べて４倍ほどの遅さとなった。これはコレステロールが細胞膜脂質のスムーズな拡散をする上で重要なファクターとなっていることを示唆している。
【００４７】
【表１】
0004746276.tif 000003
【００４８】
［実施例２］細胞の老化または疾病による膜変化の測定
（１）赤血球及び培養細胞の老化に伴う膜機能変化の測定
赤血球の場合、生体から採血した後、試験管内でバッファーの塩濃度を高低交互に変化させることによって浸透圧ストレスを加えて擬似的な老化赤血球を調製する。
正常培養細胞（癌化していない）の場合、継代を繰り返すことによって最後には増殖が止まる。増殖が遅くなっていく過程を細胞老化とし、この段階での細胞膜変化を追う。このような実験的に操作した老化細胞に対して、正常の生体内において老化していく細胞の機能低下を評価するのに本発明の方法が有効である。
【００４９】
推測：細胞の老化によってその膜機能に変化がもたらされ、特に膜粘性が増して硬くなり、その結果細胞がダメージを受けやすくなって細胞死に至る。FCS測定ではこの初期段階として細胞膜におけるミクロ変化を見出すことが可能と考えられる。
【００５０】
（２）疾病、特に糖尿病患者赤血球膜の粘性変化の測定
糖尿病患者の赤血球は粘性が高く、血管内移動に悪影響を与えていることが知られていることから、患者赤血球膜が疾病によってどのように変性しているのかを測定する。これにより、疾病の型及び病歴による赤血球膜の粘性の違いを知ることが出来る可能性と、治療効果をモニターする方法を提供できる可能性がある。
【００５１】
方法：
正常ヒト赤血球及び糖尿病患者赤血球を採血し、実施例１に示した調製法にて各々の赤血球を測定チャンバーに入れ、R18マーカーを細胞膜に結合させてFCS測定を行った。
結果：
患者赤血球におけるR18の拡散速度は正常赤血球に比べて有意に（1.2倍）遅くなっていることが分かった。これは患者赤血球膜の柔軟性が低下していることを示唆する。このFCSによる評価法は、新しい糖尿病治療薬の効果を細胞レベルで検討する目的に適している。
【００５２】
［実施例３］赤血球及び神経培養細胞へのアミロイドβペプチドの毒性測定
アルツハイマー病の原因因子といわれるアミロイドβペプチドは細胞外から細胞膜を通して細胞内に影響を及ぼし、遂には神経細胞を死に至らしめる。アミロイドβペプチドの膜に対する毒性を測定することによって、疾病機序を知ることが出来るのと、各種治療薬のモニターとしてもこの方法が有効である。
【００５３】
方法：
実験に用いた細胞は（１）赤血球、（２）培養神経細胞とした。赤血球の調製は実施例１に従い、培養神経細胞はマウス脳神経細胞（Neuro2a）を培地（D-MEM）・10％FBSにて培養したものを用いた。R18を分子マーカーとして細胞膜に結合させた後、アミロイドβペプチド（アミノ酸数1-28 あるいは1-40）各種濃度を細胞に添加し、未添加をコントロールとしてR18の膜上拡散速度及び膜結合比率の変化をFCSにより測定した。
【００５４】
添加したアミロイドβペプチドはN末端にローダミン色素（Rh）がついており、以下にアミノ酸配列を示す。28アミノ酸ペプチドは細胞膜貫通部位である29-40アミノ酸部位が欠けていることから、細胞膜への結合は弱いと予想される。
Rh-DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV  (1-40)（Ab40；配列番号１）
Rh-DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNK              (1-28)（Ab28；配列番号２）
【００５５】
結果：
赤血球においてアミロイドβペプチド(1‐40)を添加した場合、R18の膜上拡散速度の遅延（約1.3倍）、およびそれに伴って膜結合R18の成分比率の減少（20％）がペプチドの濃度依存的に見られた。
一方、培養神経細胞上においては、アミノ酸数40のアミロイドβペプチド添加によって有意にR18拡散速度が遅延(1.6倍)したが、アミノ酸28のペプチドの影響は見られなかった。
【００５６】
さらに膜結合R18の比率も減少（5％）したがその度合いは赤血球での減少(20%)よりも少なかった。R18の膜結合比率が低下したのと相反して膜から遊離したR18分子がフリーとして存在する比率が増加した。これは、ペプチドの膜結合によって細胞膜環境が著しく異なった結果、遊離して膜近傍でフリー分子として観察されたものであると考えられる。
このことから、ペプチドなどの被検物質を膜に添加することによって、結合していたR18が遊離する現象を定量化することが出来る。しかもその度合いは被検物質の膜に対する毒性の度合いと相関するものと思われる。
【００５７】
【表２】
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【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】ステージ上の測定カバーグラスに接着した培養細胞と赤血球を模式的に示す図。
【図２】R18の分子構造式を示す図。
【図３】FCS測定原理を示す図。（a）はレーザー光による測定領域を示し、（b）は自己相関関数式を示し、（c）はそれから求められる分子情報を示す。
【図４】蛍光相関分光装置を示す図。
【図５−１】R18結合赤血球膜におけるFCS測定結果を示す図。（ａ）は等張液（50 mM NaCl）におけるｚ軸での蛍光強度プロファイル、（ｂ）は等張液における蛍光揺らぎと自己相関関数を示す。
【図５−２】R18結合赤血球膜におけるFCS測定結果を示す図。（ｃ）は低張液（50 mM NaCl）におけるｚ軸での蛍光強度プロファイル、（ｄ）は低張液における蛍光揺らぎと自己相関関数を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【配列表】
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