(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
in vitroで細胞内の標的ＤＮＡ配列の１または複数個の塩基を変換する方法であって、以下の工程：
標的ＤＮＡのセンス鎖と相同な配列を含み、かつ、変換すべき塩基を含む、一本鎖環状ＤＮＡを調製する工程；
前記一本鎖環状ＤＮＡから、標的ＤＮＡのセンス鎖と相同な配列を含み、かつ、変換すべき塩基を含む、３００〜３，０００塩基の一本鎖ＤＮＡ断片を切断により調製する工程；および
前記一本鎖ＤＮＡ断片を細胞内に導入する工程
を含むことを特徴とするＤＮＡ配列の塩基変換方法。
【請求項２】
一本鎖環状ＤＮＡが、ファージミドＤＮＡである請求項１の方法。
【請求項３】
細胞内の標的ＤＮＡ配列が、その１または複数個の塩基によって疾患の原因となっているＤＮＡ配列である請求項１または２の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  この出願の発明は、ＤＮＡ配列の塩基変換方法に関するものである。さらに詳しくは、この出願の発明は、細胞内の標的ＤＮＡ配列の１または複数個の塩基または塩基配列を他の塩基または塩基配列に変換する方法に関するものである。
【背景技術】  近年のヒトゲノム計画の進展や大量遺伝子サンプルのスクリーニング方法の開発によって、個人の遺伝子情報がより詳細かつ簡便に調べることが可能になった（文献１、２）。このような技術の進歩と共に、個々の患者の遺伝子情報に合わせて、変異の入った配列を直接正常な配列に戻す遺伝子修復法は、遺伝子治療におけるテーラーメード医療として、非常に期待できる技術である。この遺伝子修復法の一つであるＳｍａｌｌ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＳＦＨＲ）法は、正常遺伝子配列を含む、熱変性させたＰＣＲ産物（二本鎖ＤＮＡ断片）を細胞へ導入することによって、変異遺伝子を正常型へ変換することを目的としている（文献３〜５）。これまでこの方法によって、嚢胞性線維症や筋ジストロフィーなどの原因遺伝子を修復できることが報告されてきた（文献６、７）。このように修復された遺伝子は、正常遺伝子と同様に本来のプロモーターの制御下で、細胞内で適切に発現されることが期待できる。また、これまでの遺伝子治療では難しいとされてきた癌遺伝子に代表されるような機能獲得性変異も、原理的に治療・修復することが可能である。
また、一本鎖ＤＮＡ断片を用いる遺伝子修復方法としては、化学合成により得られた末端修飾オリゴヌクレオチドを用いた方法が知られている。これは、両末端をホスホロチオエート（文献８〜１０）や２’−Ｏ−Ｍｅ−ＲＮＡ（文献１１〜１３）、さらにはＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）（文献１４）で修飾した２５〜１００塩基の一本鎖ＤＮＡを用いて、哺乳動物細胞と酵母においてそれぞれ１０−２、１０−５の修復効率を示すことが報告されている。またこの末端修飾オリゴヌクレオチドを用いた方法では、標的ＤＮＡ配列のアンチセンス鎖と相同の一本鎖ＤＮＡ断片を用いたときに、より高い遺伝子修復効率を示すことが知られている（文献８、１１）。
前記のとおり、ＳＦＨＲ法は新しい遺伝子治療の形態として極めて有望である。しかしながら、現在のところＳＦＨＲ法における変異遺伝子の修復効率は、用いているアッセイ系や標的遺伝子により大きくばらついているものの、多くは１％未満にとどまり、この値を飛躍的に向上させることが、ＳＦＨＲ法を臨床応用可能な技術とするためには不可欠である。
そこで、この出願の発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであって、相補鎖から分離することなく、遺伝子修復用の一本鎖ＤＮＡ断片を調製でき、また、この一本鎖ＤＮＡ断片を利用して、細胞内ＤＮＡ配列の塩基をより効率良く変換することのできる方法を提供することを課題としている。
文献
文献１：Ｊｏｏｓ  Ｌ，Ｅｒｙｕｓｅｌ  Ｅ  ａｎｄ  Ｂｒｕｔｓｃｈｅ  ＭＨ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ａｎｄ  ｇｅｎｅ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ−ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｉｎ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ．Ｓｗｉｓｓ  Ｍｅｄ  Ｗｋｌｙ．２００３；１３３：３１−３８．
文献２：Ｆｅｒｒａｒｉ  Ｍ，Ｓｔｅｎｉｒｒｉ  Ｓ，Ｂｏｎｉｎｉ  Ｐ，Ｃｒｅｍｏｎｅｓｉ  Ｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ｍｉｃｒｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  ｍｉｃｒｏｃｈｉｐｓ．Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｌａｂ  Ｍｅｄ．２００３；４１：４６２−４６７．
文献３：Ｋｕｎｚｅｌｍａｎｎ  Ｋ．Ｌｅｇｅｎｄｒｅ  Ｊ−Ｙ，Ｋｎｏｅｌｌ  ＤＬ，Ｅｓｃｏｂａｒ  ＬＣ，Ｘｕ  Ｚ  ａｎｄ  Ｇｒｕｅｎｅｒｔ  ＤＣ．Ｇｅｎｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ＣＦＴＲ  ＤＮＡ  ｉｎ  ＣＦ  ｅｐｉｔｈｅｒｉａｌ  ｃｅｌｌｓ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１９９６；３：８５９−８６７．
文献４：Ｇｏｎｃｚ  ＫＫ，Ｋｕｎｚｅｌｍａｎｎ  Ｋ，Ｘｕ  Ｚ  ａｎｄ  Ｇｒｕｅｎｅｒｔ  ＤＣ．Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｎｏｒｍａｌ  ａｎｄ  ｍｕｔａｎｔ  ＣＦＴＲ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ａｉｒｗａｙ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｕｓｉｎｇ  ＤＮＡ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ．Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ．１９９８；７：１９１３−１９１９．
文献５：Ｃｏｌｏｓｉｍｏ  Ａ，Ｇｏｎｃｚ  ＫＫ，Ｎｏｖｅｌｌｉ  Ｇ，Ｄａｌｌａｐｉｃｃｏｌａ  Ｂ  ａｎｄ  ＧｒｕｅｎｅｒｔＤＣ．Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ  ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ  ｍａｒｋｅｒ  ｇｅｎｅ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｓｍａｌｌ  ＤＮＡ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ．Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．２００１；３：１７８−１８５．
文献６：Ｇｏｎｃｚ  ＫＫ，Ｃｏｌｏｓｉｍｏ  Ａ，Ｄａｌｌａｐｉｃｃｏｌａ  Ｂ，Ｇａｇｎｅ  Ｌ，Ｈｏｎｇ  Ｋ，Ｎｏｖｅｌｌｉ  Ｇ，Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ  Ｄ，Ｓａｗａ  Ｔ，Ｓｃｈｒｅｉｅｒ  Ｈ，Ｗｅｉｎｅｒ−Ｋｒｏｎｉｓｈ  Ｊ，Ｘｕ  Ｚ  ａｎｄ  ＧｒｕｅｎｅｒｔＤＣ．Ｅｘｐｒｅｓｉｏｎ  ｏｆ  ｄｅｌｔａ−Ｆ５０８  ＣＦＴＲ  ｉｎ  ｎｏｒｍａｌ  ｍｏｕｓｅ  ｌｕｎｇ  ａｆｔｅｒ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＦＴＲ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｂｙ  ＳＦＨＲ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２００１；８：９６１−９６５．
文献７：Ｋａｐｓａ  Ｒ，Ｑｕｉｇｌｅｙ  Ａ，Ｌｙｎｃｈ  ＧＳ，Ｓｔｅｅｐｅｒ  Ｋ，Ｋｏｒｎｂｅｒｇ  ＡＪ  Ｇｒｅｇｏｒｅｖｉｃ  Ｐ，Ａｕｓｔｉｎ  Ｌ  ａｎｄ  Ｂｙｒｎｅ  Ｅ，Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｄｘ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ  ｇｅｎｅ  ｎｏｎｓｅｎｓｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｓｈｏｒｔ−ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ．Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２００１：１２：６２９−６４２．
文献８：Ｌｉｕ  Ｌ，Ｒｉｃｅ  ＭＣ，Ｄｒｕｒｙ  Ｍ，Ｃｈｅｎｇ  Ｓ，Ｇａｍｐｅｒ  Ｈ  ａｎｄ  Ｋｍｉｅｃ  ＥＢ．Ｓｔｒａｎｄ  ｂｉａｓ  ｉｎ  ｔａｇｅｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｒｅｐａｉｒ  ｉｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｄ  ｂｙ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２００２；２２：３８５２−３８６３．
文献９：Ｌｉｎ  Ｌ，Ｃｈｅｎｇ  Ｓ．ｖａｎ  Ｂｒａｂａｎｔ  ＡＪ  ａｎｄ  Ｋｍｉｅｃ  ＥＢ．Ｒａｄ５１ｐ  ａｎｄ  Ｒａｄ５４ｐ，ｂｕｔ  ｎｏｔ  Ｒａｄ５２ｐ，ｅｌｅｖａｔｅ  ｇｅｎｅ  ｒｅｐａｉｒ  ｉｎ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｂｙ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｓｉｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｎｕｃｌｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００２；３０：２７４２−２７５０．
文献１０：Ｂｒａｃｈｍａｎ  ＥＥ  ａｎｄ  Ｋｍｉｅｃ  ＥＢ．ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｒｅｐａｉｒ  ｏｆ  ｃｙｃｌ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｂｙ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．２００３；１６３；５２７−５３８．
文献１１：Ｉｇｏｕｃｈｅｖａ  Ｏ，Ａｌｅｘｅｅｖ  Ｖ  ａｎｄ  Ｙｏｏｎ  Ｋ．Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｓｍａｌｌ  ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２００１；８：３９１−３９９．
文献１２：Ａｌｅｘｅｅｖ  Ｖ，Ｉｇｏｕｃｈｅｖａ  Ｏ  ａｎｄ  Ｙｏｏｎ  Ｋ．Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ  ａｎｄ  ｃ−ｋｉｔ  ｇｅｎｅｓ  ｂｙ  ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２００２；９：１６６７−１６７５．
文献１３：Ｐｉｅｒｃｅ  ＥＡ，Ｌｉｕ  Ｑ，Ｉｇｏｕｃｈｅｖａ  Ｏ，Ｏｍａｒｒｕｄｉｎ  Ｒ，Ｍａ  Ｈ，Ｄｉａｍｏｎｄ  ＳＬ  ａｎｄ  Ｙｏｏｎ  Ｋ．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｓｉｎｇｌｅ  ｂａｓｅ  ＤＮＡ  ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２００３；１０：２４−３３．
文献１４：Ｐａｒｅｋｈ−Ｏｌｍｅｄｏ  Ｈ，Ｄｒｕｒｙ  Ｍ  ａｎｄ  Ｋｍｉｅｃ  ＥＢ．Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｉｎ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｂｙ  ｓｈｏｒｔ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ．Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．２００２；９：１０７３−１０８４．
【発明の開示】
この出願は、前記の課題を解決するための第１の発明は、細胞内の標的ＤＮＡ配列の１または複数個の塩基を変換する方法であって、標的ＤＮＡ配列と相同であり、かつ、変換すべき塩基を含む、一本鎖環状ＤＮＡから調製される３００〜３，０００塩基の一本鎖ＤＮＡ断片を細胞内に導入することを特徴とするＤＮＡ配列の塩基変換方法である。
この第１発明においては、一本鎖ＤＮＡ断片が、標的ＤＮＡ配列のセンス鎖と相同であることを好ましい態様としている。
また、この第１発明における一つの実施態様は、一本鎖環状ＤＮＡが、ファージミドＤＮＡであることであり、また、その１または複数個の塩基変異によって疾患の原因となっている標的ＤＮＡ配列を塩基変換することである。
さらに第１発明における別の実施態様は、生物体内細胞の標的ＤＮＡ配列の１または複数個の塩基を変換することである。
この出願の第２の発明は、前記発明第１発明の方法によって、標的ＤＮＡ配列の１または複数個の塩基が変換された細胞である。
この出願の第３の発明は、前記第２発明の細胞を体内に保有する生物個体である。
この出願の第４の発明は、標的ＤＮＡ配列の１または複数個の塩基変異が原因となっている疾患を治療するための薬剤であって、標的ＤＮＡ配列に相補的であり、かつ、変換すべき塩基を含む、一本鎖環状ＤＮＡから調製される３００〜３，０００塩基の一本鎖ＤＮＡ断片が細胞内に導入可能な形態を有する治療薬剤である。
この第４発明における一つの実施態様は、一本鎖環状ＤＮＡが、ファージミドＤＮＡであることであることである。
この出願の第５の発明は、標的ＤＮＡ配列の１または複数個の塩基変異が原因となっている疾患を治療する方法であって、標的ＤＮＡ配列に相補的であり、かつ、変換すべき塩基を含む、一本鎖環状ＤＮＡから調製される３００〜３，０００塩基の一本鎖ＤＮＡ断片を細胞内に導入することを特徴とする治療方法である。また、第５発明における一つの実施態様は、一本鎖環状ＤＮＡが、ファージミドＤＮＡであることであることである。
なお、この発明において「ＤＮＡ配列」とはプリンまたはピリミジンが糖にβ−Ｎ−グリコシド結合したヌクレオシドのリン酸エステル（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ）が結合した分子を意味する。
また、「変換」とは、標的ＤＮＡ配列の１または複数個の塩基（Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ）がそれぞれ他の塩基に置き換わること（塩基置換）、標的ＤＮＡ配列の１または複数個の塩基が欠失すること（塩基欠失）、標的ＤＮＡ配列に１または複数個の塩基が付加されること（塩基付加）を意味する。さらに、これらの塩基変換は、標的ＤＮＡ配列の個々に独立した１または複数個の塩基が対象であってもよく、あるいは標的配列中の複数個の塩基からなる配列の置換、欠失および付加（それぞれ配列置換、配列欠失、配列付加：以下これらを「配列変換」と記載することがある）であってもよい。
この発明におけるその他の用語や概念は、発明の実施形態の説明や実施例において詳しく規定する。またこの発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。例えば、薬剤の調製はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｅｄ．Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９９０、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ，１９９５等に記載されている。さらに、この発明における用語は基本的にはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによるものであり、あるいは当該分野において慣用的に使用される用語の意味に基づくものである。
上記のとおりのこの出願の前記発明によれば、目的とする遺伝子修復用の一本鎖ＤＮＡ断片は、相補鎖を持たない一本鎖環状ＤＮＡから調製されるため、目的の一本鎖ＤＮＡ断片を相補鎖から分離操作する必要がなく、しかも従来のＳＦＨＲ法に比較して、高い効率で標的ＤＮＡ配列の塩基または塩基配列を正確に変換することが可能となる。特に標的ＤＮＡ配列のセンス鎖に相同の一本鎖ＤＮＡ断片を使用することによって、効率よく標的遺伝子の目的塩基を正確に変換することが可能となる。
【図面の簡単な説明】  図１Ａは、正常型および変異型のＨｙｇＥＧＦＰ遺伝子をそれぞれ組み込んだ標的プラスミドｐＴＥＮＨＥＳおよびｐＴＥＮＨＥＸの構成図である。図１Ｂは、一本鎖のアンチセンスＤＮＡ断片およびセンスＤＮＡ断片を作成するためのファージミドベクターｐＢＳＨＥＳ／ＡｎｔｉＳｅｎｓｅおよびｐＢＳＨＥＳ／Ｓｅｎｓｅの構成図である。
図２は、標的プラスミドｐＴＥＮＨＥＸと一本鎖センスＤＮＡ断片を哺乳動物細胞（ＣＨＯ−Ｋ１細胞）に導入した場合の蛍光シグナルを観察した顕微鏡写真像である。変異型ＨｙｇＥＧＦＰ遺伝子が一本鎖ＤＮＡ断片によって修復され、ＥＦＧＰ遺伝子が発現して蛍光シグナルが生じる。
図３は、標的プラスミドｐＴＥＮＨＥＸと一本鎖ＤＮＡ断片（ｆＡｎｔｉＳ、ｆＳｅｎｓｅ）、二本鎖ＤＮＡ断片（ｄｓＨＥＳ）およびＰＣＲ産物（ｐｃｒＨＥＳ）を導入した哺乳動物細胞（ＣＨＯ−Ｋ１細胞）から回収したプラスミドＤＮＡを大腸菌に導入し、ハイグロマイシンＢ添加寒天培地で培養した状態をイメージアナライザで解析した像である。特に一本鎖センスＤＮＡ断片（ｆＳｅｎｓｅ）を導入した場合に、変異型ＨｙｇＥＧＦＰ遺伝子が修復され、細胞はハイグロマイシンＢ耐性および蛍光シグナル陽性形質を獲得する。
図４は、ｄｓＨＥＳ、ｆＡｎｔｉＳ、ｆＳｅｎｓｅおよびｐｃｒＨＥＳのそれぞれの細胞導入量における遺伝子修復効率を示したグラフ図である。
図５は、ＥＧＦＰ陽性細胞から抽出した標的プラスミドより増幅したＰＣＲ産物の制限酵素ＰｍａＣＩ断片の電気泳動の結果を示した。
図６は、ＥＧＦＰ陽性細胞から抽出した標的プラスミドの配列分析の結果を示した図である。
【発明を実施するための最良の形態】  この出願の発明は上記のとおりの特徴をもつものであるが、以下にその実施の形態について詳しく説明する。
第１発明の方法は、標的ＤＮＡ配列と相同であり、かつ、変換すべき塩基を含む、一本鎖環状ＤＮＡから調製される３００〜３，０００塩基の一本鎖ＤＮＡ断片を細胞内に導入することによって、標的ＤＮＡ配列の１または複数個の塩基を変換することを特徴としている。すなわちこの方法は、標的ＤＮＡ配列またはその一部領域を一本鎖ＤＮＡ断片により「相同置換（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）」することによって、標的ＤＮＡ配列内の変換しようとする塩基または塩基配列（以下「標的塩基」と記載する）を、別の塩基または塩基配列（以下「変換塩基」と記載する）に変換することを原理としている。そして、従来のＳＦＨＲ法が二本鎖ＤＮＡ断片（例えばＰＣＲ産物）を熱変性してそれぞれ一本鎖ＤＮＡ断片とし、センス鎖とアンチセンス鎖の両方を標的ＤＮＡ配列に作用させるのに対し、この発明の方法は、一本鎖ＤＮＡ断片のみ（センス鎖またはアンチセンス鎖、好ましくはセンス鎖）を標的ＤＮＡ配列に作用させることを特徴としている。
「一本鎖ＤＮＡ断片」は、変換塩基を含むことを除き、標的ＤＮＡ配列と相同である。この場合の「相同」とは、二本鎖の標的ＤＮＡ配列のセンス鎖およびアンチセンス鎖のいずれか一方と９５％以上、好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、そして理想的には１００％同一の配列であることを意味するが、標的ＤＮＡ配列のセンス鎖と相同であることが、変換効率の点から好ましい。
またこの一本鎖ＤＮＡ断片は、その端部が非修飾である。すなわち、前記の修飾オリゴヌクレオチドのように、両末端がホスホロチオエート、２’−Ｏ−Ｍｅ−ＲＮＡ、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）で修飾されていないＤＮＡ断片である。
「一本鎖ＤＮＡ断片のサイズ」は、標的ＤＮＡ配列の長さや標的塩基の数等に応じて、３００〜３，０００塩基の範囲から選択される。例えば、３００〜５００塩基長、５００〜８００塩基長、８００〜１２００塩基長、１２００〜１７００塩基長、１７００〜２３００塩基長、２３００〜３０００塩基長といったＤＮＡ断片である。
「標的ＤＮＡ配列」は、細胞内に存在するＤＮＡ配列であれば特に限定されるものではなく、ゲノム遺伝子のＤＮＡ配列、ミトコンドリアのＤＮＡ配列、プラスミドのＤＮＡ配列など、細胞内において何らかの機能を担うＤＮＡ配列を対象とすることができる。
一本鎖ＤＮＡ断片における「変換塩基」の数は、標的ＤＮＡ配列における標的塩基の数に依存する。例えば個々の塩基変換（塩基置換、塩基欠失、塩基付加）の場合には、標的ＤＮＡ配列や一本鎖ＤＮＡ断片のサイズに応じて、１または複数個（２〜３０個程度）とすることができるが、効率良く置換するためには、１〜１０程度が好ましい。また、配列変換の場合には、２〜３０程度、好ましくは２〜１０程度の塩基からなる配列を変換塩基とする。また一本鎖ＤＮＡ断片における変換塩基の位置には特段の制限はないが、ＤＮＡ断片の末端部ではないことが好ましい。
一本鎖ＤＮＡ断片は、例えば以下のように作成することができる。例えば、標的ＤＮＡ配列が、塩基変異を有する配列（例えば疾患原因となっているゲノム遺伝子ＤＮＡ配列）である場合、１本鎖ＤＮＡ断片は、例えば正常なゲノム遺伝子ＤＮＡ配列やそのｃＤＮＡを適当な一本鎖ＤＮＡベクター（例えば、ファージミドＤＮＡ等）で増幅し、酵素等により断片化して、目的の部分と不要の部分とに分離・精製して作成することが好ましい。このような調製によって、相補鎖と分離する必要もなく、また、短鎖および長鎖にかかわらず一本鎖ＤＮＡ断片を得ることができる。
なお、ＤＮＡ断片を調製する方法としては、試験管内で鋳型ＤＮＡを増幅する方法［例えば、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、ＮＡＳＢＮ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法等］が知られているが、これらの方法の場合には、鋳型ＤＮＡと高度に一致する一本鎖ＤＮＡ断片を増幅することが困難である。例えばＰＣＲ法の場合には、数百塩基に一回の確率で変異が導入されることが知られている（Ｔａｋａｇｉ  Ｍ，Ｎｉｓｈｉｏｋａ  Ｍ，Ｋａｋｉｈａｒａ  Ｈ，Ｋｉｔａｂａｙａｓｈｉ  Ｍ，Ｉｎｏｕｅ  Ｈ．Ｋａｗａｋａｍｉ  Ｈ，Ｏｋａ  Ｍ  ａｎｄ  Ｉｍａｎａｋａ  Ｔ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ｓｔｒａｉｎ  ＫＯＤ１  ａｎｄ  ｉｔｓ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ＰＣＲ，Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９７；６３：４５０４−４５１０）。このような一本鎖ＤＮＡ断片における「予想外の変異」は、例えば疾患遺伝子の修復に使用した場合、正常な塩基に新たな変異を導入する危険性があり、好ましくない。また、大腸菌プラスミドの場合には、ＰＣＲ法よりも約１０８倍の正確さでそのインサート（二本鎖ＤＮＡ断片）を増幅することができる（Ｄｒａｋｅ  ＪＷ．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｒａｔｅｓ  ｏｆ  ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  ｍｕｔａｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ．１９６９；２２１：１１３２参照）が、増幅した二本鎖ＤＮＡ断片を変性させて一本鎖ＤＮＡ断片とした場合、センス鎖とアンチセンス鎖を分離することが困難である。従って、特にセンス一本鎖ＤＮＡ断片を標的ＤＮＡ配列に作用させる場合には、プラスミドＤＮＡによる一本鎖ＤＮＡ断片の作成は好ましくない（このような不都合は、ＰＣＲ産物（二本鎖ＤＮＡ断片）から一本鎖ＤＮＡ断片を作成する場合も同様である）。
一方、細胞内の正常ゲノム遺伝子配列に変異を導入することによって、非天然型の細胞や動物個体（これらの細胞や動物個体は、例えば特定の化合物等に対する感受性が正常型とは異なることによって化合物スクリーニング系として有用であり、あるいは疾患モデル細胞または疾患モデル動物等として有用である）を作出するためにも、この発明の方法を使用することができる。このような正常な標的ＤＮＡ配列の１または複数個の塩基を変換するための（すなわち、人為的な変異導入のための）１本鎖ＤＮＡ断片は、市販の変異導入キット等を用いた方法や、変異導入型のＰＣＲ法等の公知の方法により作成した、一本鎖環状ＤＮＡ（たとえば、ファージミドＤＮＡ等）から調製することができる。
上記のような、一本鎖環状ＤＮＡから調製される一本鎖ＤＮＡ断片を細胞内に導入するには、リン酸カルシウム法、リポソームや赤血球ゴーストを使用する方法、エレクトロポレーション法、ガラスピペットを用いた微量注入法等の公知の手法を用いることができる。
また、一本鎖ＤＮＡ断片は、生物体内に存在する細胞内に導入することができる。その場合には、適当な溶媒と混合した状態で一本鎖ＤＮＡ断片を生物体内に投与する方法を採用することができる。あるいは生体認識分子を提示した中空ナノ粒子やリポソーム等に一本鎖ＤＮＡ断片を包埋して生物体内に導入するようにしてもよい。また、エレクトロポレーション法を採用することもできる。
そして、この生物体内に存在する細胞内に一本鎖ＤＮＡ断片を導入する方法は、対象となる標的ＤＮＡ配列が、その１または複数個の塩基変換変異によって疾患の原因となっているような「疾患原因遺伝子」の場合には、その原因遺伝子の塩基変換変異を修正することが可能となる（第５発明）。また、そのような一本鎖ＤＮＡ断片を、前記のとおりに「細胞内に導入可能な形態」とすることによって、遺伝子の塩基変換変異を原因とする疾患の治療薬剤となる（第４発明）。
なお、遺伝子疾患の原因として知られている変異には、一塩基の変換だけではなく、ハンチントン舞踏病に見られるようなＣＡＧリピートによる長鎖挿入変異（ＭｃＭｕｒｒａｙ  ＣＴ．Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ：ｎｅｗ  ｈｏｐｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｎｅｒｏｓｃｉ．２００１；２４：Ｓ３２−Ｓ３８）や、筋ジストロフィーのジストロフィン遺伝子における長鎖欠失変異（Ｆｏｒｒｅｓｔ  ＳＭ，Ｃｒｏｓｓ  ＧＳ，Ｓｐｅｅｒ  Ａ，Ｇａｒｄｎｅｒ−Ｍｅｄｗｉｎ  Ｄ，Ｂｕｒｎｓ  Ｊ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｅｓ  ＫＥ．Ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｘｏｎｓ  ｉｎ  Ｄｕｃｈｅｎｎｅ  ａｕｄ  Ｂｅｃｋｅｒ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ．１９８７；３２９：６３８−６４０．１９．Ｄｅｎ  Ｄｕｎｎｅｎ  ＪＴ，Ｂａｋｋｅｒ  Ｅ，Ｂｒｅｔｅｌｅｒ  ＥＧ，Ｐｅａｒｓｏｎ  ＰＬ  ａｎｄ  ｖａｎ−Ｏｍｍｅｎ  ＧＪ．Ｄｉｒｅｃｔ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｒｅ  ｔｈａｎ  ５０％  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｄｕｃｈｅｎｎｅ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｂｙ  ｆｉｅｌｄ  ｉｎｖａｓｉｏｎ  ｇｅｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ．１９８７；３２９：６４０−６４２）のように、修復用一本鎖ＤＮＡに正確かつ長い塩基配列を必要とするような原因遺伝子も存在する。このような変異遺伝子に対しても、この発明の治療方法および治療薬剤は有効である。
この出願の第２の発明は、前記第１発明の方法によって、標的ＤＮＡ配列の１または複数個の塩基若しくは塩基配列が他の塩基または塩基配列に変換された「細胞」である。細胞の種類には特段の制限はなく、大腸菌、枯草菌等の原核細胞、酵母、昆虫細胞、動植物細胞等の真核細胞等を対象とすることができる。このように作成された細胞は、例えば、その機能遺伝子配列に１または複数個の塩基変換が導入された細胞であり、特定の機能が欠損または亢進した細胞として、例えば薬剤や生理活性物質、細胞毒性物質等のｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニングの材料として使用することができる。また、バイオリアクターや発酵工学等において使用する細胞について、その用途において「不都合」な特定の細胞機能を欠損させるためにも使用することができる。
この出願の第３の発明は、前記第２発明の細胞を体内に保有する生物個体であり、特に動植物細胞等の多細胞生物である。また、この生物個体は、前記第２発明の細胞（ｉｎ  ｖｉｔｒｏで塩基変換された細胞）を体内に移植された生物個体であってもよく、あるいは一本鎖ＤＮＡ断片を体内に導入された結果、体内細胞の標的ＤＮＡ配列の１または複数個の塩基が他の塩基または塩基配列に変換された生物個体であってもよい。このような生物個体は、例えば、その標的ＤＮＡ配列の塩基置換が疾患の原因となる場合には、「疾患モデル動物」として有用である。また、様々な遺伝子を塩基変換し、薬剤成分や毒性物質をｉｎ  ｖｉｖｏスクリーニングする等の用途にも使用することができる。
以下、実施例を示してこの出願の発明についてさらに詳細、かつ、具体的に説明するが、この出願の発明は以下の例によって限定されるものではない。
【実施例】  この実施例では、哺乳動物細胞および大腸菌のプロモーター下流に、ハイグロマイシン耐性遺伝子（Ｈｙｇ）と緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）遺伝子の融合遺伝子（ＨｙｇＥＧＦＰ）を導入したプラスミドを構築し、一本鎖ＤＮＡ断片による塩基置換を検討した。すなわち、標的プラスミドであるｐＴＥＮＨＥＸは、ＨｙｇＥＧＦＰ遺伝子のコドン３４に終止変異（Ｓｔｏｐ：ＴＧＡ）が導入されているため、哺乳動物細胞および大腸菌内で正常なＨｙｇＥＧＦＰ遺伝子を発現することができない。そこで、コドン３４が正常型のＳｅｒ（ＴＣＡ）である一本鎖ＤＮＡ断片（ＨｙｇＥＧＦＰ遺伝子）を細胞に導入することによって、この変異ＨｙｇＥＧＦＰ遺伝子のコドン３４を正常型のＳｅｒ（ＴＣＡ）に修復するか否かを、ハイグロマイシン耐性およびＥＧＦＰの蛍光発色という２種類の表現型によって確認した。
これまでの研究において、相同な配列を持つ二組のＤＮＡが相互作用する際、一方の二本鎖が一本鎖になることによって、他方の二本鎖へ進入することが知られている（Ｋｏｗａｌｃｚｙｋｏｗｓｋｉ  ＳＣ．Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｔｒｅｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ．２０００；２５：１５６−１６５；Ｂａｕｍａｎｎ  Ｐ，Ｂｅｎｓｅｎ  ＦＥ  ａｎｄ  Ｗｅｓｔ  ＳＣ．Ｈｕｍａｎ  Ｒａｄ５１  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ＡＴＰ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｐａｉｒｉｎｇ  ａｎｄ  ｓｔｒａｎｄ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．Ｃｅｌｌ．１９９６；８７：７５７−７６６．）。そこで、ＳＦＨＲ法の機構にこれと類似した仕組みが存在するならば、二本鎖ＤＮＡを使うよりも、あらかじめ一本鎖ＤＮＡを調製して遺伝子修復を行えば、より高い遺伝子修復効率が得られることが想定される。そこで、ファージミドＤＮＡを用いて環状一本鎖ＤＮＡを調製し、これを制限酵素で切り出して一本鎖ＤＮＡ断片としたもの（ｆＳｅｎｓｅ、ｆＡｎｔｉＳ）を使用した。
なお、比較に用いる二本鎖ＤＮＡ断片は、ＰＣＲ法よりも１０８倍の正確さを持つ大腸菌内（Ｄｒａｋｅ  ＪＷ．Ｎａｔｕｒｅ．１９６９；２２１：１１３２９）で複製されたプラスミドより、制限酵素を用いて二本鎖ＤＮＡ断片を調製し、これを熱変性させたもの（ｄｓＨＥＳ）を使用した。
（１）方法
（１−１）プラスミドおよびファージミド
ｐＨｙｇＥＧＦＰ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．，ＣＡ）のＫｐｎＩ−ＳａｌＩ断片を、ｐＡＬＴＥＲ−１（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．，ＷＩ）の同じ制限酵素部位へ導入したｐＡＬＨＥに対し、Ａｌｔｅｒｅｄ  Ｓｉｔｅｓ  ＩＩ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．，ＷＩ）を用いて部位特異的変異導入反応を行った。一回目の反応ではオリゴヌクレオチドＸｈｏ（５’−ｃｇｇｃａｃｃｔｃｇａｇｃａｃｇｃｇｇａｔ−３’：ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１）を用いてＸｈｏＩ部位を導入した（ｐＡＬＨＥＸ）。このときコドン１９５はＶａｌからＧｌｕへ変化するが、遺伝子修復反応の定量には影響しなかった。二回目の反応では、正常ＨｙｇＥＧＦＰ遺伝子のコドン３４に遺伝子マーカーとなるＰｍａＣＩ部位を、オリゴヌクレオチドＳｉｌｅｎｔ（５’−ｇｃｇａａｇａａｔｃａｃｇｔｇｃｔｔｔｃａ−３’：ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２）を用いて導入した（ｐＡＬＨＥＸＰ）。さらにｐＡＬＨＥＸＰに対し、コドン３４にｏｐａｌ変異を導入するために、オリゴヌクレオチドＯｐａｌ（５’−ｇｇｃｇａａｇａａｔｇａｃｇｔｇｃｔｔｔｃ−３’：ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３）を用いた（ｐＡＬＨＥＸＢ）。最後の反応はｏｐａｌ変異と同時に、先ほど導入されたＰｍａＣＩ部位が除去され、代わりに変異型ＨｙｇＥＧＦＰ遺伝子のマーカーとしてＢｍｇＢＩ部位が導入される。それぞれのＨｙｇＥＧＦＰ遺伝子の配列はシークエンス反応によって確認した。ｐＡＬＨＥＸＰおよびｐＡＬＨＥＸＢよりＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ断片を精製し、ＮＸＢリンカー（Ｕｐｐｅｒ：５’−ｃａｔｇｇｃｇａｔｃｃｔｃｇａ−３’：ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４、Ｌｏｗｅｒ：５’−ｇａｔｃｔｃｇａｇｇａｔｃｇｃ−３’：ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５）を用いて、ｐＴｒｉＥｘ−３Ｎｅｏ（Ｎｏｖａｇｅｎ，ＷＩ）のＣＭＶプロモーターおよびＴ７プロモーターの下流に存在するＮｃｏＩ−ＸｈｏＩ部位へ導入した（ｐＴＥＮＨＥｓ、ｐＴＥＮＨＥＸ、図１Ａ）。ここで得られたプラスミドは、大腸菌および哺乳動物の両細胞内で、それぞれ正常型または変異型ＨｙｇＥＧＦＰ遺伝子を発現することができることが確認された。これらのプラスミドを大腸菌ＤＨ−５α株に導入し、Ｅｎｄｏｆｒｅｅ  Ｍｅｇａ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ，ＣＡ）を用いて調製した。
ファージミドは、ｐＴＥＮＨＥＳのＸｈｏＩ断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ＋のＸｈｏＩ部位に導入することによって得られた（図１Ｂ）。これによって得られるｐＢＳＨＥＳ／ＡｎｔｉＳｅｎｓｅおよびｐＢＳＨＥＳ／Ｓｅｎｓｅは、それぞれＸｈｏＩ断片の向きがｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＣＡ）のｆｌ  ｏｒｉに対し逆の向きに挿入され、このファージミドから得られる一本鎖環状ＤＮＡは、それぞれｈＨｙｇＥＧＦＰ遺伝子のアンチセンス配列またはセンス配列を含んでいる。それぞれの挿入方向は制限酵素ＮａｅＩおよびＰｍａＣＩによって確認した。これらのファージミドをＪＭ１０５株に導入し、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２×ＹＴ培地で一晩培養した後、５ｍｌを５００ｍｌの２×ＹＴ培地（５０μｇ／ｍｌ  Ａｍｐ）に移し、激しく攪拌しながら３７℃で培養した。１時間後に２５μｇ／ｍｌとなるようカナマイシンを加え、再び培養を続け、２３時間後、遠心分離（２．１５×ｌ０３ｇ、１５分）によってファージを大腸菌と分離した。上清に含まれるファージに、７５ｍｌの２０％ＰＥＧ６０００／２．５Ｍ  ＮａＣｌ溶液を加え、一晩４℃に静置した。遠心分離（１８．８×１０３ｇ、２０分）により、ファージを沈殿させた後、２０ｍｌの０．３Ｍ  ＡｃＯＮａ／１ｍＭ  ＥＤＴＡに懸濁し、フェノール、フェノール／クロロフォルム（１／１）、クロロフォルムによって、環状一本鎖ＤＮＡを回収した。ＤＮＡ溶浚に２５ｍｌ  ＥｔＯＨを加え、室温に１５分間静置した後、遠心分離によって沈殿させ、５００μｌのＨ２Ｏに溶解した。
（１−２）断片の調製
ｐＴＥＮＨＥＳ１μｇ当たり２．５Ｕの制限酵素ＸｈｏＩで消化し、６０６ｂｐの断片を３．５％低融点アガロースゲルによって分離した後、フェノール・クロロフォルム抽出によって回収した。また一本鎖状のｐＢＳＨＥＳ／ＡｎｔｉＳｅｎｓｅおよびｐＢＳＨＥＳ／Ｓｅｎｓｅ  １ｐｍｏｌ（１．１μｇ）に対し５ＵのＸｈｏＩを用い、二本鎖と同様の操作によって、６０６ｎｔの断片を回収した。環状一本鎖ＤＮＡの制限酵素処理では、ＸｈｏＩ部位周辺を二本鎖とするため、ｐＢＳＨＥＳ／ＡｎｔｉＳｅｎｓｅの５′および３′側のＸｈｏＩ部位に相同なオリゴヌクレオチドＡＳ５’（５’−ｃｃｃｃｃｃｔｃｇａｇａｔｃｃｃｃ−３’：ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６）およびＡＳ３’（５’−ｃｇｇｃａｃｃｔｃｇａｇｇｔｃｇａｃ−３’：ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７）、またｐＢＳＨＥＳ／Ｓｅｎｓｅの５’および３’側に対しＳ５’（５’−ｃｃｃｃｃｃｔｃｇａｇｇｔｇｃｃｇ−３’：ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８）およびＳ３’（５’−ｇｇｇｇｃｔｃｔｃｇａｇｇｔｃｇａｃ−３’：ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．９）を、環状一本鎖に対し５モル当量、制限反応溶液に加えた。
回収された断片は、それぞれゲルろ過（ＮＡＰ５  ｃｏｌｕｍｎｓ，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｌｔｄ．，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、Ｅｎｇｌａｎｄ）により精製を行い、精製度をＡ２６０／Ａ２８０が１．８以上であることにより確認した。濃度は１．０  ＯＤ２６０を、二本鎖ＤＮＡでは５０μｇ、一本鎖では４０μｇとして算出した。
（１−３）遺伝子導入
遺伝子導入反応の前日に、４ｍｌの１０％ＦＢＳを含むＤ’ＭＥＭ／Ｆ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中に懸濁した３×１０５のＣＨＯ−Ｋ１細胞を６−ｃｍディッシュに播き、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下において培養した。あらかじめ熱変性処理（９８℃、５分間→０℃、５分間）させた２．５、５、１０ｎｍｏｌ（それぞれ０．４７、０．９４、１．９μｇ）の一本鎖ＤＮＡまたは１０ｎｍｏｌ（３．８μｇ）の二本鎖ＤＮＡに、７２μｇのＰＬＵＳ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を含む１４９μｌのＤ’ＭＥＭ／Ｆ１２、および２５ｆｍｏｌ（１２５ｎｇ）のｐＴＥＮＨＥＸを加えた。さらに、Ｎ／Ｐ比の違いが遺伝子修復効率に大きな影響を及ぼすことが報告されている（Ｓａｎｇｉｕｏｌｏ  Ｆ，Ｂｒｕｓｃｉａ  Ｅ，Ｓｅｒａｆｉｎｏ  Ａ，Ｎａｒｄｏｎｅ  ＡＭ，Ｂｏｎｉｆａｚｉ  Ｅ，Ｌａｉｓ  Ｍ，Ｇｒｕｅｎｅｒｔ  ＤＣ  ａｎｄ  Ｎｏｖｅｌｌｉ  Ｇ．Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｙｓｔｉｃ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ｅｐｉｔｈｅｒｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｂｙ  ｓｍａｌｌ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＳＦＨＲ）ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ．ＢＭＣ  Ｍｅｄ  Ｇｅｎｅｔ．２００２；３：８）ため、すべてのサンプルにおいてＤＮＡ量が一定（計４μｇ）となるよう、Ａｍｐ耐性遺伝子を含まないｐＡＬＴＥＲ−Ｅｘ２（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．，ＷＩ）を適量加えた。これを２０分間室温に放置した後、３２μｇのＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を含む１４１μｌのＤ’ＭＥＭ／Ｆ１２を加え、さらに２０分間室温に放置し、細胞に処理する直前に２５０μｌのＤ’ＭＥＭ／Ｆ１２を加えた。細胞は４ｍｌのＤ’ＭＥＭ／Ｆ１２で洗った後、２ｍｌのＤ’ＭＥＭ／Ｆ１２に置換し、そこへ先に調製したＤＮＡ溶液を全量加え、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下においてインキュベートした。６時間後、反応溶液を４ｍｌの１０％ＦＢＳを含むＤ’ＭＥＭ／Ｆ１２に置換し、導入反応を終了した。さらに４２時間培養した細胞をトリプシン処理し、１ｍｌ  ＰＢＳで洗った後、遠心分離により細胞を集めた。これを１００μｌのＴＥＧ（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０ｍＭ  Ｇｌｃ、ｐＨ８．０）に懸濁し、２００μｌの０．２Ｎ  ＮａＯＨ／１％  ＳＤＳを加え穏やかに攪拌した後、室温に５分間放置した。さらに１５０μｌの８Ｍ  ＡｃＯＮＨ４を加え、４℃で１５分間冷やした。遠心分離後、ｉｓｏＰｒＯＨ沈殿によって、上清からプラスミドＤＮＡを回収した。プラスミドＤＮＡは２０μｌのＨ２Ｏに溶解し、−２０℃に保存した。
（１−４）遺伝子修復効率の定量
前日から１．４１ｍｌのＬＢ培地で培養したＤＨ−５αを、１サンプル当たり１２５μｌとり１２．５ｍｌの新鮮なＬＢ培地へ移し、さらに４時間培養した。大腸菌は７．５、１、０．２ｍｌの冷Ｈ２Ｏで洗浄し、最後に約１００μｌとなるよう冷Ｈ２Ｏを加え、再度懸濁させた。これを４μｌのｐＤＮＡと共に０．１−ｃｍギャップのキュベットへ移し、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＩＩ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ｉｎｃ．ＣＡ）を用いて、４℃、１．８ｋＶ、２５μＦ、２００Ωの条件でエレクトロポレーションを行った。プラスミドを導入したＤＨ−５αは、１ｍｌ  ＳＯＣ培地で１時間培養した後、５０μｇ／ｍｌ  Ａｍｐ添加ＬＢ培地に希釈し、一晩培養した。このときＤＨ−５αの一部をとり、ＬＢ寒天培地に播き、コロニー数によってエレクトロポレーション効率を測定したが、大きな違いは観察されなかった。翌日得られたＤＨ−５αを遠心分離によって回収し、１００μｌのＴＥＧに再懸濁した。これに２００μｌの０．２Ｎ  ＮａＯＨ／１％  ＳＤＳを加え穏やかに攪拌した後、さらに１５０μｌ  Ｓｏｌ  ＩＩＩ（３Ｍ酢酸カリウム、１１．５％酢酸）を加え、氷上に５分間放置した。遠心分離した上清をフェノール／クロロフォルム（１／１）で処理し、エタノール沈殿によりプラスミドＤＮＡを回収した。これを２０μｌのＨ２Ｏに溶解し、このうち１−２μｌを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株へエレクトロポレーションにより導入した。このとき、ＤＨ−５αと同様の操作によって、ＢＬ２１（ＤＥ３）への形質転換を行った。
形質転換後、１ｍｌのＳＯＣ培地を加え、３７℃で１時間培養した後、その５０μｌをとり５０μｇ／ｍｌ  Ａｍｐおよび１０μＭ  ＩＰＴＧを含む１ｍｌのＬＢ培地で３７℃、３時間培養した。培養後、培地の一部を１−１０倍希釈したものを７５μｇ／ｍｌハイグロマイシンＢ添加ＬＢ寒天培地（Ｈｙｇ７５：５０μｇ／ｍｌ  Ａｍｐ、１０μＭ  ＩＰＴＧ）へ、１００−１０００倍希釈したものを、ハイグロマイシンＢを含まないＬＢ寒天培地（Ｈｙｇ０：５０μｇ／ｍｌ  Ａｍｐ、１０μＭ  ＩＰＴＧ）へ、それぞれ等量ずつ播き、３７℃でインキュベートした。１２−２４時間後、Ｈｙｇ０に生えたコロニーを数え、また、２６−４８時間後にＨｙｇ７５に生えたコロニーは、ＦＬＡ２０００Ｇ（ＦＵＪＩ  ＰＨＯＴＯ  ＦＩＬＭ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ｋａｎａｇａｗａ，Ｊａｐａｎ）を用いて解析し、ＥＧＦＰの蛍光（Ｅｘ．４７３ｎｍ、Ｅｍ．５２０ｎｍ）を発するコロニーを数えた。Ｈｙｇ０で得られたコロニー数を分母に、Ｈｙｇ７５で得られたＥＧＦＰの蛍光陽性コロニー数を分子とすることで遺伝子修復効率を算出した。
（１−５）遺伝子型の確認
Ｈｙｇ７５プレート上に得られたＥＧＦＰ陽性コロニーをいくつか選び、その一部を２０μｌのＨ２Ｏに懸濁した後、９８℃で５分間、熱処理を行った。細菌の不溶性成分を遠心分離によりペレットとし、上清２μｌを鋳型として、ｒＴａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＯＹＯＢＯ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）を用いてＰＣＲを行った。このときプライマーとして、Ｔ７ｐｒｏ（５’−ｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇｇ−３’：ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１０）およびＨＥＴ７（５’−ａｔｃｇｃｃｔｃｇｃｔｃｃａｇｔｃａａｔ−３’：ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１１）を用いた。ここで得られたＰＣＲ産物は、さらに正常型ＨｙｇＥＧＦＰ遺伝子マーカーであるＰｍａＣＩ処理およびＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いたシークエンシング反応に用いた。
（２）結果
（２−１）遺伝子修復反応の評価系
ｐＴＥＮＨＥＳおよびｐＴＥＮＨＥＸ（図１Ａ）は、それぞれ正常型、変異型ＨｙｇＥＧＦＰ遺伝子が組み込まれており、それぞれのコドン３４はＳｅｒ（ＴＣＡ：ＰｍａＣＩ）、Ｓｔｏｐ（ＴＧＡ：ＢｍｇＢＩ）である。また、一本鎖を作成するためのファージミドベクターｐＢＳＨＥＳ／ＡｎｔｉＳｅｎｓｅおよびｐＢＳＨＥＸ／Ｓｅｎｓｅ（図１Ｂ）は、ｐＴＥＮＨＥＳをＸｈｏＩ処理して得られた正常ＨｙｇＥＧＦＰ遺伝子の一部が組み込まれており、環状一本鎖となったとき、それぞれアンチセンス配列およびセンス配列をコードする。
ｐＴＥＮＨＥＳおよび一本鎖環状ｐＢＳＨＥＳ／ＡｎｔｉＳｅｎｓｅ、ｐＢＳＨＥＳ／ＳｅｎｓｅをＸｈｏＩ処理して得られたＤＮＡ断片を、今後それぞれｄｓＨＥＳ、ｆＡｎｔｉＳ、ｆＳｅｎｓｅと記載する。標的プラスミドｐＴＥＮＨＥＸは、ｄｓＨＥＳ、ｆＡｎｔｉＳ、ｆＳｅｎｓｅと共にＣＨＯ−Ｋ１細胞へ導入した。このプラスミドには、哺乳動物細胞での発現のためのＣＭＶプロモーターおよび大腸菌内での発現のためのＴ７プロモーターによって、変異型ＨｙｇＥＧＦＰ遺伝子が支配されているため、修復反応が成功したとき両細胞からＥＧＦＰの蛍光が観察される（図２）。さらに、ハイグロマイシンＢに耐性となるため、修復された遺伝子を容易に単離することができる（図３）。
（２−２）遺伝子修復反応
ＣＨＯ−Ｋ１細胞に、ＸｈｏＩ処理して得られたＤＮＡ断片と共に、標的であるｐＴＥＮＨＥＸを導入した。このとき、ｄｓＨＥＳは二本鎖であるため、これまでのＳＦＨＲ法と同様、細胞へ導入する直前に熱変性した。またｆＡｎｔｉＳおよびｆＳｅｎｓｅは一本鎖ＤＮＡではあるが、分子内高次構造を解き、またｄｓＨＥＳと比較を行うために、ｄｓＨＥＳと同様に熱変性処理を行い細胞内へ導入した。導入開始から４８時間後に細胞を蛍光顕微鏡で観察したところ、ＣＨＯ−Ｋ１細胞内で修復されたＨｙｇＥＧＦＰ遺伝子が発現しているのが観察された（図２）。これらの細胞よりプラスミドを回収し、ＢＬ２１（ＤＥ３）へ形質転換することにより得られるハイグロマイシンＢ耐性かつＥＧＦＰ陽性のコロニー（図３）を確認し、遺伝子修復効率を算出した。ｐＴＥＮＨＥＸに対し４００倍のモル比に相当する１０ｎｍｏｌのＤＮＡ断片を処理したとき、二本鎖ＤＮＡ断片であるｄｓＨＥＳでは、０．４３％といった従来のＳＦＨＲ法と同等の修復効率であった（図４）。これに対し、一本鎖ＤＮＡ断片であるｆＡｎｔｉＳは、ｄｓＨＥＳを越える遺伝子修復効率は示さなかったものの（０．１５％）、ｆＳｅｎｓｅを処理した場合、２．０％という、ｄｓＨＥＳに対して約５倍高い遺伝子修復効率を示した（図４）。
この解析によって得られたＥＧＦＰ陽性コロニーをいくつか選び、その遺伝子配列を制限酵素ＰｍａＣＩ（図５）およびシークエンシング反応（図６）によって確認した。その結果、コドン３４におけるＳｔｏｐからＳｅｒ（ＴＧＡ→ＴＣＡ）への配列変換が確認された。また、その他の配列変換は観察されなかったことより、この方法における配列特異性が確認された。
比較例
実施例で使用したｐＴＥＮＨＥＸ（コドン３４に終止変異（Ｓｔｏｐ：ＴＧＡ）を導入したＨｙｇＥＧＦＰ遺伝子を保有するプラスミドＤＮＡ）に対して、ＰＣＲ産物を用いた従来のＳＦＨＲ法を行い、変異ＨｙｇＥＧＦＰ遺伝子の修復効率を実施例と同様に検討した。
ＰＣＲ産物（ｐｃｒＨＥＳ）は、以下のプライマー１とＴａｑポリメラーゼ（Ｔｏｙｏｂｏ社製）を用いて増幅し、３’−末端をＢｌｕｎｔｉｎｇ  Ｈｉｇｈ  Ｋｉｔ（Ｔｏｙｏｂｏ社製）により平滑末端化し、実施例のｄｓＨＥＳと同様にして３．５％低融点アガロース電気泳動により生成した。
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結果は、図３および図４に示したとおりである。ＰＣＲ産物（ｐｃｒＨＥＳ）は、一本鎖センスＤＮＡ断片（ｆＳｅｎｓｅ）と比較して細胞のハイグロマイシンＢ耐性形質の獲得効果が低く（図３）、変換効率は０．１６％であった。この値はｄｓＨＥＳの変換効率（０．４３％）の半分以下であり、また、一本鎖センスＤＮＡ断片（ｆＳｅｎｓｅ）の変換効率（２．０％）の１０分の１以下であった。
【産業上の利用可能性】  以上詳しく説明したとおり、この出願の発明によって、細胞内ＤＮＡ配列の特定塩基または塩基配列を高効率で他の塩基、または、塩基配列に変換する方法が提供される。これによって、疾患遺伝子等の変異箇所を効率よく修復することが可能となる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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