(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体試料をキャピラリ電気泳動により分析する方法であって、負に過剰に帯電した修飾抗体を用いることによって、電気泳動による分離時に、負に過剰に帯電した修飾抗体と生物試料中に存在する可能性のある単クローン性蛋白質との間で形成された抗原−抗体型の複合体を生体試料のグロブリンの泳動帯から外れた位置の帯域へ泳動させることを含み、前記修飾抗体は所定の目的単クローン性蛋白質に対して抗原特異性を有しており、及び前記修飾抗体は(i)ＥＤＣＩ（１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド・ヒドロクロリド）の存在下でメリト酸と、または(ii)少なくとも１つのカルボン酸基を含む無水物と反応させることによって得られる、方法。
【請求項２】
生体試料をキャピラリ電気泳動により分析する請求項１に記載の方法であって、
ａ）特定の抗原特異性を有し、生体試料中に存在する可能性のある単クローン性蛋白質と抗原−抗体型の複合体を形成することができる負に過剰に帯電した修飾抗体の存在下に、キャピラリ電気泳動によって生体試料の第１のアリコート部分の成分を分離し、分離した生体試料の成分を検出する工程と、
ｂ）工程ａ）で得られた電気泳動プロフィルと、所定の抗原特異性を有する前記負に過剰に帯電した修飾抗体の非存在下にキャピラリ電気泳動により分離した同じ試料からの別のアリコート部分の成分の電気泳動プロフィルとを比較する工程
を含む方法。
【請求項３】
請求項１または請求項２に記載の方法であって、負に過剰に帯電した修飾抗体を用いて、異なる抗原特異性を有する一連の抗体を形成して、生体試料の同一アリコート部分と接触させてキャピラリ電気泳動により試料の成分を分離する、方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法であって、前記一連の抗体において各タイプの抗体は免疫グロブリン・アイソタイプに対し所定の抗原特異性を有するものである、方法。
【請求項５】
少なくとも２つのアリコート部分に分けた生体試料をキャピラリ電気泳動により分析する、請求項２ないし請求項４のいずれか一項に記載の方法であって、電気泳動により生体試料の成分を分離する前に、
１）特定の抗原特異性を有する負に過剰に帯電した修飾抗体と、生体試料中に存在する該抗体により特異的に認識される目的単クローン性蛋白質との間の免疫反応を可能にするインキュベーション条件の下に、該抗体を含むメジウムと該生体試料の１つのアリコート部分とを接触させ、該生体試料の別のアリコート部分と、修飾抗体を含まない該メジウムとを接触させる工程と、
２）工程１）でインキュベートした生体試料の両アリコート部分を電気泳動キャピラリに注入する工程
を含む方法。
【請求項６】
生体試料をキャピラリ電気泳動により分析する請求項１または請求項２に記載の方法であって、電気泳動により生体試料の成分を分離する前に、
１）特定の抗原特異性を有する負に過剰に帯電した修飾抗体を含むメジウムを該電気泳動キャピラリに注入し、該修飾抗体を含まない該メジウムを別の電気泳動キャピラリに注入する工程と、
２）該抗体と生体試料中に存在する目的単クローン性蛋白質または目的単クローン性蛋白質類との免疫反応を可能にする条件下で、工程１）によって処理された電気泳動キャピラリに生体試料を注入する工程
を含む方法。
【請求項７】
請求項１ないし６の何れか１項に記載の方法であって、一連の負に過剰に帯電した修飾抗体が所定の異なる特異性を有するｎ種のタイプの抗体を含む場合、生体試料を少なくともｎ＋１個のアリコート部分に分ける方法。
【請求項８】
請求項１ないし７の何れか１項に記載の方法であって、負に過剰に帯電した修飾抗体が抗ＩｇＧ、抗ＩｇＡ、抗ＩｇＭ、抗カッパ、抗ラムダ抗体、抗遊離型カッパ抗体および抗遊離型ラムダ抗体から選ばれることを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項１ないし７の何れか１項に記載の方法であって、負に過剰に帯電した修飾抗体が抗ＩｇＧ、抗ＩｇＡ、抗ＩｇＭ、抗カッパ及び抗ラムダ抗体の混合物、又は抗ＩｇＧ、抗ＩｇＡ及び抗ＩｇＭ抗体の混合物であること特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項１ないし７の何れか１項に記載の方法によって生体試料の種々のアリコート部分をキャピラリ電気泳動を用いて分析し、各アリコート部分を、負に過剰に帯電するように修飾された抗ＩｇＧ、抗ＩｇＡ、抗ＩｇＭ、抗カッパ、抗ラムダ、抗遊離型カッパおよび抗遊離型ラムダ免疫グロブリンからそれぞれ選ばれる抗体に接触させることを含む、生体試料中のＭｃ蛋白質と呼ばれる単クローン性蛋白質を検査し、タイピングする方法。
【請求項１１】
請求項１ないし１０の何れか１項に記載の方法であって、負に過剰に帯電した修飾抗体が、目的単クローン性蛋白質が生体試料中に存在する場合に、認識する目的単クローン性蛋白質に対して過剰であることを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項１ないし１１の何れか１項に記載の方法であって、負に過剰に帯電した修飾抗体が無水１，２，４−ベンゼントリカルボン酸との反応生成物である方法。
【請求項１３】
請求項１ないし１２の何れか１項に記載の方法であって、負に過剰に帯電した修飾抗体が抗体と少なくとも１つのカルボン酸基を含む無水物との反応生成物であり、該反応が、無水物をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に即座に溶かし、溶かした無水物を抗体溶液と接触させて無水物と抗体とを反応させることを含み、該反応が、負電荷を抗体に付加することができる条件下に３７℃で行われる方法。
【請求項１４】
請求項１ないし１３の何れか１項に記載の方法であって、キャピラリ電気泳動はｐＨが９ないし１１の範囲にあるアルカリ性緩衝液中で行い、該緩衝液は緩衝剤と該分析用緩衝液のイオン強度を増大させることが可能な少なくとも１種の添加剤を含む方法。
【請求項１５】
請求項１ないし１４の何れか１項に記載の方法であって、生体試料が血漿、尿もしくは頭脊柱液の試料から選ばれる方法。
【請求項１６】
請求項１ないし１４の何れか１項に記載の方法であって、生体試料が血清試料である方法。
【請求項１７】
生体試料中の単クローン性蛋白質（Ｍｃ蛋白質）を検査し、タイピングする方法であって、生体試料中のＭｃ蛋白質の存在は、該Ｍｃ蛋白質に相当するピークのイムノサブトラクションによって検出され、生体試料からの蛋白質の電気泳動プロフィルにおいて、負に過剰に帯電した修飾抗体−Ｍｃ蛋白質複合体の移動は生体試料のグロブリンの電気泳動プロフィルの帯域を超えて生じるものであって、前記負に過剰に帯電した抗体は(i)ＥＤＣＩ（１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド・ヒドロクロリド）の存在下においてメリト酸と、または(ii)少なくとも１つのカルボン酸基を含む無水物と反応させることによって得られるものである、方法。
【請求項１８】
負に過剰に帯電した修飾抗体であって、該抗体に酸性官能基が付加されることにより、同一のキャピラリ電気泳動分離条件下で分離されるタイプＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥおよびＩｇＤ免疫グロブリンの泳動プロフィルの帯域を超えて電気泳動する能力が、負に過剰に帯電した修飾抗体と生物試料中に存在する可能性のある単クローン性蛋白質との間で形成された抗原−抗体型の複合体に付与され、前記酸性官能基は、前記抗体を(i)ＥＤＣＩ（１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド・ヒドロクロリド）の存在下においてメリト酸と、または(ii)少なくとも１つのカルボン酸基を含む無水物、と反応させることで該抗体に付加されることを特徴とする、修飾抗体。
【請求項１９】
抗ＩｇＧ、抗ＩｇＡ、抗ＩｇＭ、抗カッパ、抗ラムダ、抗遊離型カッパおよび抗遊離型ラムダ免疫グロブリンから選ばれる、請求項１８に記載の負に過剰に帯電した修飾抗体。
【請求項２０】
前記負に過剰に帯電した修飾抗ＩｇＧ、抗ＩｇＡ、抗ＩｇＭ、抗カッパおよび抗ラムダ抗体を含む５価抗血清として、または前記負に過剰に帯電した修飾抗ＩｇＧ、抗ＩｇＡおよび抗ＩｇＭ抗体を含む３価抗血清として混合されている、請求項１８に記載の負に過剰に帯電した修飾抗体。
【請求項２１】
請求項１８ないし２０の何れか１項に記載の負に過剰に帯電した修飾抗体であって、ポリクロナール抗体であることを特徴とする修飾抗体。
【請求項２２】
請求項１８ないし２１の何れか１項に記載の負に過剰に帯電した修飾抗体を含む、生体試料中の単クローン性蛋白質を検出しタイピングするためのキット。
【請求項２３】
負に過剰に帯電した修飾抗体と生物試料中に存在する可能性のある単クローン性蛋白質との間で形成された抗原−抗体型の複合体のキャピラリ電気泳動および免疫転位により生体試料中に存在する単クローン性蛋白質を検出するための、請求項１８ないし２１の何れか１項に記載の負に過剰に帯電した修飾抗体の使用。
【請求項２４】
負に過剰に帯電した修飾抗体と生物試料中に存在する可能性のある単クローン性蛋白質との間で形成された抗原−抗体型の複合体のキャピラリ電気泳動および免疫転位により生体試料中に存在する単クローン性蛋白質をタイピングするための、請求項１８ないし２１の何れか１項による負に過剰に帯電した修飾抗体の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
本発明は、キャピラリ電気泳動および免疫転位（immunodisplacement）による生体試料分析の分野に関する。
【０００２】
特に、本発明は、試料成分の電気泳動による分離が免疫学的手法による試料の処理を伴うキャピラリ電気泳動により生体試料を分析する方法に関する。本発明の文脈の中で、「イムノサブトラクション」という用語は、特定の蛋白質ピークが免疫転位によりその電気泳動プロフィルにおける別の位置へ転位することによって、その電気泳動プロフィルにおける特定蛋白質のピークが消失することを意味する。
【０００３】
特に、本発明は、診断プロトコルに利用することができる方法に関し、殊に、単クローン性ガンマグロブリン異常症もしくはパラプロテイン血症としても知られている単クローン性疾患を説明するものとなる蛋白質の生体試料における検査およびタイピングに関する。
【０００４】
Ｂリンパ球が正常に発達すると、成熟Ｂリンパ球の表面に、初期に共通のアイソタイプを有し、その後アイソタイプＭおよびＧを有する免疫グロブリンが形成される。単クローン性疾患の発端となる形質細胞障害は、表面免疫グロブリンの特異抗原への接触後に抗体を分泌する細胞へと細胞が成熟する過程が制御不能になることにより生じる。この状況では、宿主が接触した抗原に親和性を有する免疫グロブリンは、この抗原の消失後も分泌され続ける。一般に、所与の種の免疫グロブリンは、種々のクラスの抗体に分類され、それぞれのクラスはアイソタイプにより特定され、種内で特定されるこれら種々のアイソタイプは、その種の全ての正常な個体間で共通である。概して、免疫グロブリンは重鎖（２本の重鎖）および軽鎖（２本の軽鎖）で構成される。この４本鎖構造では５つの重鎖アイソタイプ（Ｍ、Ｇ、Ａ、Ｄ、Ｅ）および２つの軽鎖アイソタイプ（カッパおよびラムダ）が特定されている。アイソタイプの他に、免疫グロブリンは、アロタイプと呼ばれる所与の種の個体差に相当する決定基、および免疫グロブリン分子の抗原結合部位に相当するイディオタイプによって特徴付けられている。従って、イディオタイプは、所与のクローンの抗体産生細胞により産生される分子に特有のものである。
【０００５】
従って特に、形質細胞障害は、特定免疫グロブリンもしくは特定免疫グロブリン鎖の産生の変調を特徴とするものであり、この変調を検出して性質を明らかにすることは臨床的に極めて重要である。
【０００６】
生体試料を電気泳動法を用いて分析することにより、セリック（seric）蛋白質類の同定、およびこれらの蛋白質、とくに免疫グロブリンの量の測定が可能になる。電場では、蛋白質はそのサイズおよび電荷に応じて泳動し、それぞれが１種以上の蛋白質に相当する一連のピーク（画分とも呼ばれる）を含む電気泳動プロフィルを形成する。特に、ガンマ画分は、免疫グロブリン、主にタイプＧによって形成される。単クローン性蛋白質（Ｍｃ蛋白質とも呼ばれる）の分泌を生じる形質細胞障害を有する患者では、既知のアイソタイプの１種に相当する免疫グロブリンの量が正常量を大きく上回る結果、血清試料から分離した蛋白質の１つ以上のピークが変化することによる電気泳動プロフィルの変化を生じる可能性がある。
【０００７】
従って、形質細胞障害を検査する場合ばかりでなく、パラプロテイン血症を有する患者をモニターする場合にも、単クローン性蛋白質を検出すること、特に、特定の免疫グロブリン・アイソタイプの産生増大を検出することは極めて重要である。例としては、症例にもよるが、特に腫瘍の増殖中では、セリックＭｃ蛋白質の量は疾患の進行に直接関連づけることができるとの知見がある。従って、Ｍｃ蛋白質は、他の症状と相互に関連付けられる場合、診断時に考慮に入れることが可能な腫瘍マーカとなることができる。
【０００８】
Ｍｃ蛋白質の異常産生と関係しているのは形質細胞障害ばかりではなく、列挙することができるＭｃ蛋白質の産生と関連づけられる病理学的疾患として、例えば、ＢもしくはＴリンパ球由来の慢性リンパ性白血病またはリンパ腫などのリンパ性腫瘍、慢性骨髄性白血病などの一部の非リンパ性増殖、および乳癌または大腸癌が挙げられる。
【０００９】
また、単クローン性Ｍｃ蛋白質は、肝硬変、サルコイドーシス、寄生虫症、ゴーシェ病などの一部の非悪性腫瘍性疾患においても産生されることがある。また、単クローン性蛋白質の産生は、リウマチ性多発関節炎、無筋力症、寒冷凝集素症などの自己免疫疾患においても検出される。
【００１０】
従って、アガロースゲルおよびキャピラリ電気泳動法は、生体試料の単クローン性蛋白質の有無についての検出を可能にし、検出された単クローン性蛋白質の経時的変化を追跡することにより、診断を確定し、もしくは患者をモニターすることを目的として選択される方法となっている。
【００１１】
該当する疾患に応じて、Ｍｃ蛋白質は、完全な抗体分子または抗体断片により構成され、性質が異なる。従って、重鎖もしくは軽鎖のみが産生されることがある。このことは、例えば、骨髄腫患者の尿中に分泌されるベンス・ジョーンズ蛋白質の場合に当てはまり、これは軽鎖単独の形をとる。
【００１２】
免疫グロブリンのアイソタイプを特定することにより、Ｍｃ蛋白質に関し、その重鎖の種類に応じて、および／またはその軽鎖の種類に応じてタイピングすることができる。従って、免疫グロブリンをタイピングする技術を用いることにより、生体試料中の各単クローン性蛋白質と関連する重鎖および／または軽鎖のタイプを明らかにすることができる。
【００１３】
従って、該Ｍｃ蛋白質の有無を検出することの他に、この蛋白質をタイピングすることにより、これと関連する疾患の性質を明らかにすることができることは重要であると思われる。この目的を達するために、既に、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動、キャピラリ電気泳動などの種々の方法が提案されている。アガロースゲル電気泳動を用いる方法では、生体試料からの蛋白質は、蛋白質、特にグロブリンが、単クローン性蛋白質を含むと考えられるピークもしくはバンドとして示される電気泳動プロフィルの形で電気泳動により分離されるが、単クローン性蛋白質の種類は、その後、例えば、アガロースゲルでの免疫固定法により確認する必要がある。即ち、この方法は、アガロースゲル電気泳動およびその後の免疫沈降を用いる２工程を組み合わせたものである。同一生体試料からのいくつかのアリコートをアガロースゲル上に並行して沈着させた後、電場をかけて蛋白質、特に免疫グロブリンを分離する。次いで、各トラックについて、検査している免疫グロブリンのタイプ（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ラムダおよびカッパ、ならびに場合によっては遊離カッパ、遊離ラムダ、ＩｇＤおよびＩｇＥ）に特異的なタイプの抗体とインキュベートして、試料中の免疫グロブリンと抗体との間で免疫複合体を形成させる。ゲルを洗って非沈降蛋白質を除去した後、染色工程により免疫複合体の位置を明らかにする。即ち、単クローン性蛋白質が存在しなければ、（「多クローン性バックグラウンド」を構成する多数のモノクロナール抗体に相当する）拡散性に染色されたバックグラウンドのみが現れるが、単クローン性蛋白質が存在する場合には、ゲルの特定領域に染色バンドが示される。対照トラック（抗血清なし）を用いると、ゲル上に目で見ることができる各単クローン性バンドをタイピングすることができる。
【００１４】
キャピラリ電気泳動法において用いられるタイピング手法の１つは、米国特許第５２２８９６０号に記載されているようなイムノサブトラクションである。この手法は、生体試料から特定の成分（例えば、免疫グロブリン）を除去することができる特異的な抗体と、該試料のアリコートをインキュベートすることからなるものである。この成分は、抗体が固定されている固相に吸着されたままとなるので、キャピラリ電気泳動法により分析する試料中には存在しなくなる。次に、使用した抗体の特異性によって特定の免疫グロブリンを除去した種々の処理アリコートをキャピラリに注入した後、キュピラリの両端に電場をかけることにより、アリコートに含まれる蛋白質を分離する。得られたプロフィルは、未処理アリコートのプロフィルと比較する。
【００１５】
試料からキャピラリ電気泳動法により分離した単クローン性蛋白質の同定については、例えば欧州特許第０６９０９８８Ｂ１号に、他の手法が提案されている。その欧州特許では、Ｍｃ蛋白質の類別を容易にすることを目的としたキャピラリ電気泳動による分離とイムノサブトラクション工程との併用について開示されている。この特許では、試料の第１の部分を電気泳動により種々の成分に分離してこれらの成分を検出した後、試料の第２の部分を、試料中に含まれる所定の被分析物を特異的に結合することができる少なくとも１つの相手と混合する工程であって、結合させる特異的な相手が、該被分析物と異なる電気泳動易動度を有すると理解される工程を含む方法を用いて、「キュピラリ使用下（ｏｎ−ｃａｐｉｌｌａｒｙ）」にイムノサブトラクションを行う。次いで、キャピラリ電気泳動によりこの試料の２の部分を種々の成分に分離した後、これらの成分を検出する。その後、目的の被分析物を結合する特異的な相手を存在させないで分離した成分を用いて、分離成分間で比較する工程を実施する。
【００１６】
欧州特許第０６９０９８８Ｂ１号では、被分析物に結合させるための相手は、修飾分子、特に、化学修飾を行って、キャピラリ電気泳動における易動時間により電気泳動プロフィルのガンマ領域からはずれるようにした抗Ｍｃ蛋白質抗体であると記載されている。抗体に対して提案されている化学修飾の１つは、これを無水コハク酸と反応させて、アルカリ性ｐＨで負電荷を有するカルボキシル基を付加することからなるものである。従って、記載されている分析条件（ｐＨ１０）では、抗体の全体としての負電荷は増大する。
【００１７】
欧州特許出願公開第０６９０９８８号で抗体修飾について開示されている条件、および記載されている実験結果は、単に精製Ｇ免疫グロブリンの分析・分離に関するもので、血清の分析に関するものではなく、「生の」生体試料、例えば、血清中の単クローン蛋白質を検査する場合では、提案の方法の妥当性に疑問を投げかけるものである。
【００１８】
従って、本発明は、生体試料の成分を分離するためのキャピラリ電気泳動と、分析生体試料中に存在するＭｃ蛋白質のタイピングを可能にするためのイムノサブトラクションとを関連付けた、生体試料に対して効果的に適用できる代替的な方法を提案するものである。
【００１９】
本発明の１つの利点は、この方法では、生体試料中に存在し、キャピラリ電気泳動により分離されたＭｃ蛋白質に相当する電気泳動ピークを、試料の蛋白質の泳動プロフィルに相当する帯域から外れた領域、特に、免疫グロブリン泳動帯から外れた領域へ転位させることができることである。この転位により、試料の他の蛋白質の分離を妨げることなく、泳動工程の最後に、分離Ｍｃ蛋白質を表すピークは所定の位置から除去される。特許文献１に開示された方法とは対照的に、抗体により認識された単クローン性蛋白質は、キャピラリ電気泳動を行うために注入された試料内に存在する。これは、元の位置から転位するので、単純に上記プロフィルから除去される。その結果、この方法では、分析結果の読み取りを確実に行うことができ、試料中の分離蛋白質に相当する近接ピーク間で混同を生じる可能性をなくすことができる。
【００２０】
また、本発明は、抗体の特定の化学官能基を修飾物質と反応させ、その結果、それぞれの修飾された化学官能基により抗体に１つ以上の負電荷を付加することによって、アルカリ性ｐＨで負に荷電する（カルボキシル基などの）化学官能基を抗体に付加するように化学修飾を行った抗体に関する。こうして得られた抗体は、その後、生体試料中のＭｃ蛋白質に相当するピークの特異的イムノサブトラクション／免疫転位に用いる。
【００２１】
アルカリ性ｐＨの場合に既に負に帯電している出発抗体に比し、その後本発明の下で調製した抗体は、カルボン酸基などの付加により官能基を獲得しているため、アルカリ性ｐＨの場合に負電荷が増加する。以後、こうした抗体のことを「負に過剰に帯電した修飾抗体（negatively surcharged modified antibody）」もしくは「修飾抗体」と呼ぶことにする。
【００２２】
また、本発明は、キャピラリ電気泳動により生体試料から蛋白質を分離し、イムノサブトラクションにより検出して、試験生体試料に含まれている可能性のある単クローン性蛋白質類からこれらを特定し、適切な場合、定量するためのキットに関する。
【００２３】
また、本発明は、イムノサブトラクションに使用できる条件下で、アルカリ性ｐＨで負となる電荷を付加する化学的修飾を加えた抗体（負に過剰に帯電した修飾抗体）を調製する方法に関する。
【００２４】
従って、本発明は、負に過剰に帯電した修飾抗体を用い、これを、電気泳動による分離時に生体試料の蛋白質類の泳動帯から外れて位置する帯域を泳動させることを含み、該抗体が所定の単クローン性蛋白質に対し抗原特異性を有するものとする、生体試料をキャピラリ電気泳動により分析する方法に関する。
【００２５】
電解液を充填したキャピラリ内で生体試料の蛋白質を分離する場合、蛋白質を電場の効果により泳動させるが、このとき、蛋白質は陰極から陽極の方へ引っ張られて泳動する。蛋白質自体の（蛋白質の帯電に連関した）電気泳動流と（キャピラリ内面の帯電に連関した）電気浸透流との間に差があることにより、蛋白質を検出し、分離することができる。
【００２６】
従って、本出願の図に示したように、キャピラリ内に注入される試料の蛋白質によって、（陽極に最も近い）ガンマ帯、ベータ−２帯、ベータ−１帯、アルファ−２帯、アルファ−１帯および（陰極に最も近い）アルブミン帯に相当する複数の帯域に切り分けられ得る電気泳動プロフィルが決まる。Ｍｃ蛋白質などの生体試料に含まれる免疫グロブリンは、アルファ−１帯からガンマ帯までの間を泳動する。
【００２７】
本発明者は、生体試料に含まれる単クローン性蛋白質の電気泳動による分離およびイムノサブトラクション反応による確実なタイピングを可能にすることを目的として、イムノサブトラクションを行って試料の蛋白質類の泳動プロフィル（特に、グロブリン類の泳動プロフィル）から単クローン性蛋白質に相当するピークを除去し、これをガンマ帯とアルファ−１帯間の領域から外れた領域に転位させることができる条件を策定した。
【００２８】
より正確には、検査する試料中の単クローン性蛋白質は、分析されるメジウムから除去するのではなく、試料中のグロブリン類（これらのグロブリン類は電気泳動プロフィルのガンマ、ベータ−２、ベータ−１、アルファ−２およびアルファ−１電気泳動画分に相当する）の泳動プロフィルから外れた領域にこの単クローン性蛋白質と負に過剰に帯電した修飾抗体との複合体が転位するような条件下で該単クローン性蛋白質とこれを特異的に認識する該負に過剰に帯電した修飾抗体とを結合させることによる効果に基づいて転位させる。
【００２９】
さらにより正確には、この（Ｍｃ蛋白質−アルカリ性ｐＨで負に帯電する抗体）複合体は、電気泳動後、分離された蛋白質プロフィルの最も陰極側の帯域に位置する。
【００３０】
従って、この修飾抗体−Ｍｃ蛋白質複合体は、分離された免疫グロブリン類により示されるプロフィルから外れた領域に見ることができ、特に、ガンマ帯から間隔を置いてアルブミンの方向に配列されて、場合によってはアルブミンおよびアルファ−１の近辺に見ることができるが、上記複合体の易動度がこの単クローン性蛋白質と修飾抗体との中間にあるので、複合体が陰極側の（即ち、アルファ−１／アルファ−２へと泳動する）単クローン性蛋白質の検出を妨害することはない。
【００３１】
修飾抗体は、原理的に、上記反応に対して過剰に供給されるので、未反応抗体の画分がアルブミンに相当するピークよりも陰極側に現れる（即ち、アルブミンよりもより陰極側へ泳動する）。
【００３２】
生体試料をキャピラリ電気泳動により分析し、イムノサブトラクションを行う本発明による第１の方法は、以下の工程を含む：
ａ）特定の抗原特異性を有し、生体試料中に存在する可能性のある単クローン性蛋白質と抗原−抗体型複合体を形成することができる負に過剰に帯電した修飾抗体の存在下に、生体試料の第１のアリコート部分の成分をキャピラリ電気泳動により分離した後、分離した生体試料の成分を検出し、
ｂ）特定の抗原特異性を有する該負に過剰に帯電した修飾抗体の非存在下にキャピラリ電気泳動により分離した同じ試料からの別のアリコート部分の成分の電気泳動プロフィルと、工程ａ）で得られた電気泳動プロフィルを比較する。
【００３３】
生体試料は、通常、電気泳動プロフィルのガンマ領域(もしくはその近辺)に位置する「多クローン性バックグラウンド」を構成する免疫グロブリン類の多クローン性画分を含むことが観察されよう。該多クローン性免疫グロブリン類は、Ｍｃ蛋白質の分離に適したキャピラリ電気泳動を実施するための条件下、(これらが極めて類似した易動度を有する多数の免疫グロブリンを含むため）Ｍｃ免疫グロブリン類よりも幅の広いピークの形で現れるが、成分免疫グロブリン（Ｇ、Ａ、Ｍ、カッパもしくはラムダ）のタイプに応じた負に過剰に帯電した修飾抗体と試料を接触させると、この多クローン性バックグラウンドを低減させることができる。この単クローン性ピークと多クローン性バックグラウンドとの識別は、この場合、着目するＭｃピークに対し、幅の広い多クローン性ピークに対して検出できるように、標識することにより、行う。
【００３４】
本発明の好ましい実施においては、所与の生体試料のアリコート部分を、一連の負に過剰に帯電した修飾抗体を形成する種々の抗体と並列に接触させるが、この一連の各タイプの抗体は免疫グロブリン・アイソタイプに対し所定の抗原特異性を有するものとする。
【００３５】
従って、異なる特異性を有する該修飾抗体を用いて同一生体試料を並行して分析することが可能であるが、該抗体の抗原特異性は、該抗体により認識されると考えられる検査対象の単クローン性蛋白質に応じて、および電気泳動装置に並列させるキャピラリの数に応じて選択する。
【００３６】
本発明の別の特定の実施にあっては、上述の方法の１つとして、生体試料を少なくとも２つのアリコート部分に分けると共に、この方法は、電気泳動により生体試料の成分を分離する前に、以下の工程を含む:
１）負に過剰に帯電した修飾抗体と、生体試料中に存在する、該抗体により特異的に認識される目的蛋白質との免疫反応を可能にするインキュベーション条件の下で、特定の抗原特異性を有する該抗体を含有するメジウムを生体試料の１つのアリコート部分と接触させ、および別のアリコート部分を修飾抗体は含有しない該メジウムと接触させ、
２）工程１でインキュベートした生体試料の両アリコート部分を電気泳動キャピラリに注入する。
【００３７】
本発明のさらに特定の実施において、キャピラリ電気泳動による分析方法は、電気泳動により生体試料の成分を分離する前に、以下の工程を含む：
１）特定の抗原特異性を有する負に過剰に帯電した修飾抗体を含有するメジウムを電気泳動キャピラリに注入し、および該修飾抗体は含有しない該メジウムを別の電気泳動キャピラリに注入し、
２）該抗体と、生体試料中に存在する目的蛋白質もしくは目的蛋白質類との免疫反応を可能にする条件の下で、工程１）によって処理した電気泳動キャピラリに生体試料を注入する。
【００３８】
生体試料を分析する際、負に過剰に帯電した修飾抗体が異なる所定の特異性を有するｎタイプの抗体を含む場合は、生体試料は少なくともｎ＋１個のアリコート部分に分ける。
【００３９】
負に過剰に帯電した修飾抗体を調製するのに用いる抗体は、抗ＩｇＧ、抗ＩｇＡ、抗ＩｇＭ、抗ＩｇＥ、抗ＩｇＤ、抗カッパ、抗ラムダ、遊離型抗カッパおよび遊離型抗ラムダ抗体から選ばれる免疫グロブリンである。
【００４０】
好ましくは、この抗体は、抗ＩｇＧ、抗ＩｇＡ、抗ＩｇＭ、抗カッパおよび抗ラムダ抗体から選ばれる。本発明の特定の実施においては、以上の５種の抗体を含む一連の抗体を用いる。本発明の別の実施では、これらの抗体の全てもしくは一部の混合物、例えば、５種の抗体の混合物（５価抗血清）、または例えば抗ＩｇＧ、抗ＩｇＡ、抗ＩｇＭ重鎖抗体を含有する３種の抗体の混合物（３価抗血清）を用いる。
【００４１】
また、本発明の方法の実施は、上記抗体のごく一部の使用に限定することもできる。
【００４２】
本発明との関連で用いることができる負に過剰に帯電した修飾抗体を得るには、アルカリ性ｐＨで負電荷を付加することができる化合物、例えば、負に帯電した無水物と、選択した抗原特異性を有する抗体を反応させる。１例として、抗体のアミン基を無水物と反応させて、抗体の各修飾アミン基につきカルボン酸基を付加（従って、アルカリ性ｐＨで負電荷を付加）することができる。
【００４３】
該負に過剰に帯電した修飾抗体を作製するために用いる無水物は、無水ベンゼントリカルボン酸とするのが有利である。この無水物は、各修飾アミン基につき２個のカルボン酸基を付加（従って、アルカリ性ｐＨで２個の負電荷を付加）するが、第１の官能基は無水物とアミン基との反応によるものであり、第２の官能基はその構造によるものである。この場合、本発明のこの無水物は、アルカリ性ｐＨで負に帯電する少なくとも１個のカルボン酸基を有するので、負に帯電した無水物と呼ぶことができる。
【００４４】
抗体を負に帯電した無水物と反応させて十分に修飾された抗体、即ち、アルカリ性ｐＨで十分に負に帯電する抗体を得ることができるためには、この無水物、特に無水ベンゼントリカルボン酸をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に即座に溶かした後、溶かした無水物を抗体溶液と接触させ、該反応を、カルボン酸基を抗体に結合させることができる条件下、３７℃で行うことで、抗体に負電荷を付加する。
【００４５】
無水物のＤＭＦ溶液と抗体との接触を、カルボン酸基を付加（従って、アルカリ性ｐＨで負となる電荷を付加）した抗体が得られ、抗体溶液中の水分による無水物の変化を防止できるぎりぎりの時間で行うと、無水物の抗体への結合をより効果的に実施することができる。
【００４６】
以下に、修飾抗体を調製する１つの方法をさらに詳細に説明する。
【００４７】
カルボン酸基を付加（従って、アルカリ性ｐＨで負となる電荷を付加）するためのバリエーションとして、（アルカリ性ｐＨで負となる電荷を付与する）カルボン酸をカップリング剤、例えば、ＥＤＣＩ（１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド・ヒドロクロリド）と結合させて用いることができる。１例として、ＥＤＣＩの存在下に、抗体のアミン基と反応するメリト酸を用いることができる。
【００４８】
本発明のキャピラリ電気泳動による分析法に用いる修飾抗体は、通常、これが認識する生体試料中の目的蛋白質に対して過剰とする。
【００４９】
このように過剰にすると、蛋白質プロフィルの目的Ｍｃ蛋白質を完全に消失させることができるばかりでなく、このプロフィルにおける修飾抗体−Ｍｃ蛋白質複合体の位置を最適化することができるが、所定の抗原特異性を有する修飾抗体と、この抗体により認識される試料の目的蛋白質との比率が低すぎると、Ｍｃ蛋白質を完全に除去できず、複合体はこの比率がより高い場合よりも陽極側に泳動するはずである。
【００５０】
本発明の特定の実施において、イムノサブトラクションに用いる各特異性の負に帯電した抗体の濃度は約１０ｇ／ｌである。
【００５１】
また、本発明は、少なくとも２個のカルボン酸基を有する無水物、好ましくは無水１，２，４−ベンゼントリカルボン酸と、抗体との反応生成物である負に過剰に帯電した修飾抗体に関する。
【００５２】
従って、キャピラリ電気泳動およびイムノサブトラクションによる分析法に用いる抗体は、抗体と負に帯電した無水物との反応生成物であることが有利であり、該反応はこの無水物をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に即座に溶かし、溶かした無水物を抗体溶液と接触させることによりこの無水物と抗体を反応させることを含むが、該反応は、抗体に対し、アルカリ性ｐＨを示す化学官能基、特にカルボン酸基を結合、付加させることができる条件下、３７℃で行う。
【００５３】
生体試料を分析するこの方法は、血清、血漿、尿、頭脊柱（cephalorhachidian）液試料などの種々のタイプの生体試料に対して用いることができる。
【００５４】
用いる生体試料の性質および／またはその由来（即ち、患者の病歴）にもよるが、電気泳動による分離の結果の解釈では、負に過剰に帯電した修飾抗体と試料の蛋白質との間に起こり得る干渉を考慮に入れる。このような干渉については当業者が観察、分析することができ、フィブリノーゲンを含む試料、即ち、抗凝固性化合物を投与された特定の患者からの血漿もしくは血清試料において認められている。本発明者は、フィブリノーゲンが、本発明の負に過剰に帯電した修飾抗体との非特異的な反応（即ち、抗原−抗体型ではない反応）として反応し得ることを観察している。もしそうであれば、泳動プロフィルにおいてβ帯とγ帯間のピークの存在により示されるフィブリノーゲンが存在する場合は、本発明の負に過剰に帯電した修飾抗体で試料を処理した後に、このピークはその標準的な泳動帯から除去され、こうした除去は、用いた負に過剰に帯電した修飾抗体の特異性とは関係なく起こる。言い換えれば、試料内のフィブリノーゲンの存在を表すピークは、対照電気泳動プロフィル（ＥＬＰ）においてのみ現れ、負に過剰に帯電した修飾抗体と免疫反応を行う蛋白質のプロフィルでは（このプロフィルから外れた帯域への免疫転位により）消失する。
【００５５】
液体状態でキャピラリ電気泳動を行うための条件は、試料をキャピラリ・チューブに注入し、電気浸透電流の作用の下、電気泳動により試料の成分を分離する工程に対して当業者が通常用いている条件である。こうした工程は、国際特許出願第ＷＯ−Ａ−０２／０５７７３６号および第ＷＯ−Ａ−０２／０５７７３７号に開示されているような電気泳動用緩衝液の使用を含むが、この電気泳動用緩衝液はＭｃ蛋白質をピークの形で分離することができるように選ばれるものと理解される。キャピラリ電気泳動を行う条件とは、例えば、ＣＡＰＩＬＬＡＲＹＳ  Ｂ１Ｂ２＋、キャピラリーズ・プロテイン（Ｃａｐｉｌｌａｒｙｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ）（ｅ）６およびＣＡＰＩＬＬＡＲＹＳプロテイン（Ｐｒｏｔｅｉｎ）（ｅ）５の商標名でＳＥＢＩＡ社から市販されている緩衝液を含む、キャピラリーズ（Ｃａｐｉｌｌａｒｙｓ）（ＳＥＢＩＡ社）自動装置を用いることができる条件である。
【００５６】
一例として、電気泳動に用いる分析用緩衝液は、ｐＨが９ないし１１、好ましくは約１０のアルカリ性緩衝液であって、特に、緩衝剤、およびこの分析用緩衝液のイオン強度を高めることのできる少なくとも１種の添加剤を含む緩衝液とするのが有利である。
【００５７】
前述のキャピラリ電気泳動分析法では、イムノサブトラクション工程を実施するために利用する抗体の易動度に対し化学修飾の作用を加えることによって、電気泳動分離工程において単クローン性蛋白質と試料の蛋白質諸成分との同時泳動により生じる結果を改善することができる。また、本発明の方法では、負に過剰に帯電した修飾抗体によって認識される単クローン性蛋白質と、生体試料を構成するその他の蛋白質との間に干渉が起こるのを防止することができる。生体試料中の単クローン性蛋白質の検出を確実なものにするのに重要なこの利点は、Ｍｃ蛋白質−修飾抗体複合体がグロブリンより遅く泳動するため、負に過剰に帯電した修飾抗体により認識されるＭｃ蛋白質のタイピングが、電気泳動におけるこの単クローン性蛋白質の位置とは関係なく、可能となるという事実に起因するものである。
【００５８】
さらに、単クローン性蛋白質に相当すると思われるピークが生体試料からのグロブリンの泳動プロフィルに相当する帯域に検出されなくなるという意味で、Ｍｃ蛋白質−負に帯電した抗体複合体に相当するピークのイムノサブトラクションは完全である。
【００５９】
このため、泳動プロフィルのガンマ、ベータおよびアルファ帯が、負に過剰に帯電した修飾抗体およびこれと生体試料中のＭｃ蛋白質との複合体の泳動帯に干渉しないので、本発明の方法は、あらゆるタイプの単クローン性ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥおよび遊離鎖免疫グロブリンについて、これらの易動度に関係なく検出、タイピングするのに有利に応用することができる。
【００６０】
従って、本発明の方法は、生体試料中の単クローン性蛋白質をキャピラリ電気泳動により分析するのに応用できる。
【００６１】
生体試料の単クローン性蛋白質を検出し、タイピングするには、生体試料を種々のアリコート部分に分け、アリコート部分の数をＭｃ蛋白質の検査に用いる免疫グロブリンのタイプの数と少なくとも等しくして、複数のキャピラリ分析を並行して実施するのが有利である。
【００６２】
生体試料中のＭｃ蛋白質をタイピングするのに、通常、少なくとも６回分のキャピラリ分析を同時に行う。
【００６３】
負に過剰に帯電した修飾抗体は、抗ＩｇＧ、抗ＩｇＡ、抗ＩｇＭ、抗カッパおよび抗ラムダおよび／または抗遊離型カッパおよび／または抗遊離型ラムダ免疫グロブリンから選ばれる抗原特異性を有する免疫グロブリンとするのが有利である。
【００６４】
また、抗ＩｇＤおよび／または抗ＩｇＥ免疫グロブリンを追加することもできる。
【００６５】
生体試料中に存在している可能性のあるＭｃ蛋白質を本発明の方法によりタイピングすることができるという事実の他に、存在している該Ｍｃ蛋白質を定量することもできる。このためには、プロフィルから除去したＭｃ蛋白質に相当するピークの表面積を測定する。
【００６６】
また、本発明の方法を用いて、電気泳動プロフィルで見ることのできる（免疫グロブリン以外の）他の蛋白質を同定することもでき、例としては、抗ヒト・ハプトグロビン抗体、抗ヒト・アルファ１アンチトリプシン抗体、抗ヒト・Ｃ３補体抗体、抗ヒト・Ｃ４補体抗体、抗ヒト・トランスフェリン特異性抗体、抗ヒト・ＲＢＰ抗体、抗ヒト・β２−マイクログロブリン抗体、抗ヒト・α１−マイクログロブリン抗体もしくは他の特異性を有する抗体を含む修飾抗体を用いることができる。これらの抗体を使用すれば、電気泳動プロフィルの画分を構成する蛋白質類を同定し、通常とは異なる易動度を有するこれらの蛋白質の特定の表現型を見出すことも可能であろう。
【００６７】
免疫グロブリン以外の蛋白質を検出する場合、本出願において説明した本発明の実施条件を同じように適用することができる。
【００６８】
また、本発明は、
少なくとも１つのカルボン酸基を含む無水物をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に即座に溶解する工程、および
この無水物と抗体を反応させてアルカリ性ｐＨで負に過剰に帯電する修飾抗体を得ることができる条件下に、抗体と、上記の溶解した無水物とを接触させる工程
を含む、負に過剰に帯電した修飾抗体を調製する方法に関する。
【００６９】
アルカリ性ｐＨで負の電荷を抗体に付加するために選ばれる無水物は、少なくとも１つのカルボン酸基を有する無水物である。
【００７０】
アルカリ性ｐＨで負の電荷を付加するために選ばれる無水物は、好ましくは、無水ベンゼントリカルボン酸である。
【００７１】
負に過剰に帯電した修飾抗体の調製については、実験の項で詳細に説明する。
【００７２】
効果的に負の電荷を付加するには、上記の工程が、無水物をジメチルホルムアミドの純品に溶かした後、該無水物溶液を抗体と混合すると同時に、即ち、引き続いて該無水物を抗体と結合させることを含むのが有利であることは、強調しておく必要がある。
【００７３】
抗体溶液中の水分により無水物が分解されると、帯電抗体の調製品の効力が変化し、アルカリ性ｐＨでの負電荷の付加が減じることになるが、上記の条件を順守すればこうした無水物の分解を防止することができる。
【００７４】
好ましくは、無水物と抗体、特に、無水ベンゼントリカルボン酸と抗体との反応は、３７℃の温度もしくは抗体に結合する無水物分子の数を増加させるような適切な温度で、例えば、約１時間行う。
【００７５】
結合させる抗血清は、無水物と接触させる前に、ＰＢＳ緩衝液もしくはリン酸緩衝液に対して透析するのが有利である。さらに、抗体を無水物のＤＭＦ溶液と接触させる時、水酸化ナトリウムを添加することが好ましく、これにより、既に存在する無水ベンゼントリカルボン酸のカルボン酸基および無水物と抗体との反応中に形成されるカルボン酸基をより十分に緩衝することができる（このため、反応メジウムのｐＨを中性に維持し無水物と抗体のアミン基との反応を継続させることができる）。
【００７６】
本発明の特に好ましい実施においては、無水物のＤＭＦ溶液と接触中の、前もってｐＨ７．４でＰＢＳ緩衝液もしくはリン酸緩衝液に対して透析した抗体に対し、５Ｎ水酸化ナトリウムを接触させ、好ましくは添加する水酸化ナトリウムの当量数を、（１）反応中に形成され、および（２）無水物により付加されるカルボン酸基の数と等しくする。得られた修飾抗体は、次いで、抗体を保存するメジウムで透析した後、該溶液を適当な使用濃度（約１０ｇ／ｌ）に調整して、抗体／抗原比が最適となる条件にこれを合わせる。
【００７７】
また、本発明は、結合したカルボン酸基を含むことによって、キャピラリ電気泳動により同一分離条件下で分離された生体試料の免疫グロブリンの泳動プロフィルから外れて電気泳動する能力を付与されていることを特徴とする負に過剰に帯電した修飾抗体に関する。該負に過剰に帯電した修飾抗体は、前述の方法の１つを実施することによって得ることが好ましい。
【００７８】
負に帯電した抗体は、モノクロナール抗体とすることができる。あるいは、これをポリクロナール抗体とすることもできる。
【００７９】
抗体と試料の抗原性蛋白質との接触は２つの方法、即ち、キャピラリに注入する前に、試料担体、例えば、キャピラリーズ（Capillarys）のヘッドにおいて生体試料、好ましくは希釈した生体試料と修飾抗体溶液を混合する方法か、あるいは、キャピラリに修飾抗体溶液を注入した後、連続して希釈試料を注入する方法によって行うことができる。接触工程を行うこの第２の方法では、抗原／抗体反応をキャピラリ内部で行わせることができ（キャピラリ内反応）、これは、上記ヘッドその他の試料担体においてこれら２種の溶液を混合する従来の方法と同じくらい効果的であり、試料の蛋白質に対する修飾抗体の易動度の差およびこれら２種の溶液の注入順序によって可能になるが、その理由は、修飾抗体の易動度が試料の蛋白質よりも（これらが大きな負電荷を有するため）はるかに低く、また、最初に注入されるので、修飾抗体の後に試料を注入することにより、試料が抗体帯を通過し、従って、抗体によって認識される抗原を蛋白質プロフィルから除去することが可能となることにある。
【００８０】
また、本発明は、生体試料中の単クローン性蛋白質を検出するためのキットであって、本発明の抗体、および他の成分、例えば、この抗体の添加用であるが(対照プロフィルを得るために)この抗体を含まないメジウム、および／または電気泳動用緩衝液および／またはキャピラリおよび／または特定の減量（ｒｅｄｕｃｅｄ  ｖｏｌｕｍｅ）希釈ヘッド洗浄用溶液および／または分析対象試料の希釈液を含み、このことによって、例えば、別々の分析で得られた種々の曲線をうまく重ね合わせることができるキットに関する。必要に応じて、このキットは、電気泳動および免疫転位による分析を実施してＭｃ蛋白質を明らかにし、タイピングするための取扱説明書を含む。
【００８１】
好ましくは、該キットは、抗ＩｇＧ、抗ＩｇＡ、抗ＩｇＭ、抗カッパおよび抗ラムダ特異性を有する一連の抗体を含む。
【００８２】
別のタイプのキットは、抗ＩｇＧ、抗ＩｇＡ、抗ＩｇＭ、抗カッパおよび抗ラムダ特異性を有する抗体の混合物を含む。５価抗血清と呼ぶことができるこの混合物によって、電気泳動プロフィルに現れるピークおよびこのプロフィルの画分における変形の単クローン性を確認することができる。Ｍｃ免疫グロブリンはガンマ帯ばかりでなく、ベータおよびアルファ帯にも現れることがあり、得られるキャピラリ電気泳動プロフィルのこれらの帯域に通常現れる蛋白質類によりマスクされることがあるので、該キットは特に興味深いものである。本発明のこのような実施に際しては、試料は、２つのトラック、即ち、（抗体メジウムのみを含み、抗体を含まない）対照トラック、および（５価抗血清を使用して）電気泳動蛋白質における単クローン性ピークの存在を明らかにすることができるトラックを用いて試験する。
【００８３】
別のタイプのキットは、抗重鎖特異性を有する抗体（３価抗血清と呼ぶことができるγ、αおよびμ、抗ＩｇＧ、抗ＩｇＡ、抗ＩｇＭ）および／または抗軽鎖、カッパおよびラムダ（遊離型および結合型）特異性を有する抗体、および／または抗遊離型カッパおよびラムダ軽鎖特異性を有する抗体の混合物を含むことができる。このキットにより、ヒト尿もしくは血清中のベンス・ジョーンズ蛋白質または遊離型Ｍｃ（カッパもしくはラムダ）軽鎖をキャピラリ電気泳動で検出、同定することができよう。これを実施するのに際して以上の抗血清を用いる場合、試料は、６つのトラック、即ち、（抗体メジウムのみを含み、抗体を含まない）１つの対照トラック、Ｍｃ帯もしくは帯群、即ち、３価抗血清を用いて重鎖の存在、および軽鎖型（カッパもしくはラムダ；遊離もしくは結合型）の存在を特徴付けるための５つのトラックを用いて試験する。
【００８４】
修飾抗体の混合物は、未処理抗体の混合物を修飾するか、抗体のタイプ別に既に修飾されている抗体を混合することによって得ることができる。本発明との関連においては、前もって修飾して負に過剰に帯電させた抗体の混合物を作製することが好ましい。
【００８５】
本発明との関連において、電気泳動による分離の結果は、実施例に示したように、電気泳動プロフィルとして、負に過剰に帯電した抗体との特異的な免疫反応により特定される蛋白質に相当するピークがそのプロフィルから消失した形で示すことができる。
【００８６】
あるいは、こうした結果は、負に過剰に帯電した抗体との特異的な免疫反応により特定される蛋白質に相当するピークのみを示す電気泳動プロフィルとして提示することができる。本発明の方法の実施との関連では、このピークは、分離された蛋白質類のプロフィルから消失する。しかしながら、その結果は、単にこのピークを示すようにして処理する。
【００８７】
このためには、適当なデータ処理法を利用して、負に過剰に帯電した修飾抗体で処理した検査対象試料のアリコート部分の各電気泳動プロフィルを、同一試料の未処理アリコート部分のプロフィルから除去することができる。処理したアリコート部分のプロフィルを全て除去すると、免疫固定により得られるタイプの画像が得られる。
【００８８】
本発明の他の特徴と利点は、本発明を例証する次の実施例と図面から明らかであろう。
【００８９】
キャピラリ電気泳動
内径２５ミクロンの石英ガラス製キャピラリを８本装着したＣＥ装置（ＣＡＰＩＬＬＡＲＹＳ、セビア社（Ｓｅｂｉａ））を用い、臨床試料のキャピラリ電気泳動を実施した。検出は２００ｎｍで行った。試料は、この装置の試料フィーダに入れ、落差法により自動注入した。試料は、約４００Ｖ／ｃｍの電場をかけることにより、５分未満で分離した。キャピラリは、それぞれの分析の前に、０．２５Ｍの水酸化ナトリウムで洗浄した後、分析用緩衝液で洗浄した。
【００９０】
トリカルボン酸無水物による抗体修飾のプロトコル
ａ）濃度１０ｇ／ｌの結合対象抗血清（抗ヒトＩｇＧ、Ａ、Ｍ、抗カッパもしくはラムダ、ＤＡＫＯ社、デンマーク）１０ｍｌをｐＨ７．４、１００ｍＭのリン酸緩衝溶液に対して透析した。
ｂ）ＤＭＦを用いて無水１，２，４−ベンゼントリカルボン酸の１００ｍＭ溶液を調製した。
ｃ）上記の透析した抗体溶液を５Ｎ水酸化ナトリウムと混合した後、これを上記無水物のＤＭＦ溶液と混合した（５Ｎ水酸化ナトリウム２１３μｌ＋抗体溶液１０ｍｌ＋無水物のＤＭＦ溶液５．３３ｍｌ）。
ｄ）次いで、この反応メジウムをロッカに入れ、３７℃で１時間、ゆるやかに撹拌した。
ｅ）次に、この混液を１００ｍＭ、ｐＨ７．４のリン酸緩衝溶液に対して透析し、この間、透析液を数回交換した。
ｆ）透析が完了するとすぐに、カラムをＰＥＧ６０００の粉末中に１時間入れておいた。
ｇ）濃縮が完了するとすぐに、後者を１００ｍＭ、ｐＨ７．４のリン酸塩＋１ｇ／ｌの窒化ナトリウムに対して透析した。
ｈ）１００ｍＭ、ｐＨ７．４のリン酸塩＋１ｇ／ｌの窒化ナトリウムの溶液を用いて、カラムの容量を１０ｍｌに調整した。
ｉ）得られた溶液は、０．４５μｍの孔を有する膜でろ過した後、４℃で貯蔵した。他の貯蔵メジウムでも、そのイオン強度が抗体を確実に保存できるのに十分（即ち、生理食塩水のそれに近い）であれば、用いることができよう。
【００９１】
メリト酸による抗体修飾のプロトコル
ａ）濃度１０ｇ／ｌの分析対象抗血清（抗ヒトＩｇＧ、Ａ、Ｍ、抗カッパもしくはラムダ、ＤＡＫＯ社、デンマーク）１０ｍｌをｐＨ７．４、４０ｍＭのリン酸緩衝溶液に対して透析した。
ｂ）これに、５０μｌ／ｍｌの５Ｎ水酸化ナトリウムを加えた。
ｃ）（１８ｍｇ／ｍｌのメリト酸、次いで５０ｍｇ／ｍｌのＥＤＣＩを）加えた。
ｄ）次いで、この反応メジウムをロッカに入れ、３７℃で１時間、ゆるやかに撹拌した。
ｅ）次に、この混液を１００ｍＭ、ｐＨ７．４のリン酸緩衝溶液に対して透析し、この間、透析液を数回交換した。
ｆ）透析が完了するとすぐに、カラムをＰＥＧ６０００の粉末中に１時間入れておいた。
ｇ）濃縮が完了するとすぐに、後者を１００ｍＭ、ｐＨ７．４のリン酸塩＋１ｇ／ｌの窒化ナトリウムに対して透析した。
ｈ）１００ｍＭ、ｐＨ７．４のリン酸塩＋１ｇ／ｌの窒化ナトリウムの溶液を用いて、カラムの容量を１０ｍｌに調整した。
ｉ）得られた溶液は、０．４５μｍの孔を有する膜でろ過した後、４℃で保存した。
【００９２】
血清イムノタイピングのプロトコル
キャピラリーズ（セビア社）は、８回分のキャピラリ分析を同時に行う装置である。イムノタイピング・ヘッドは、６個の１００μｌウェルおよび１個の４００μｌダブルウェルからなるタイピング専用のＣＡＰＩＬＬＡＲＹＳヘッドである。これは、ウェル１に１００ｍＭリン酸塩、ウェル２に修飾抗ＩｇＧ抗体、ウェル３に修飾抗ＩｇＡ抗体、ウェル４に修飾抗ＩｇＭ抗体、ウェル５に修飾抗カッパ抗体、ウェル６に修飾抗ラムダ抗体をそれぞれ６０μｌ含み、ダブルウェル７／８は、３８０μｌのイムノタイピング用希釈液（セビア社が用いているベンジルアルコールの０．０２Ｍ分析緩衝溶液）を含む。
【００９３】
ａ）「イムノタイピング」ヘッドが設置されているＣＡＰＩＬＬＡＲＹＳキャリアの位置１に、タイピング対象血清のチューブを入れる。
ｂ）このキャリアを装置に導入すると、次いで、この自動装置はダブルウェル７／８においてこの血清を２０倍希釈し、ダブルウェルを均質化して、ウェル１ないし６のそれぞれに４０μｌずつ分配し、これらのウェルをそれぞれ均質化する。
ｃ）次に、以下の条件でキャピラリ分析を行う：
分析用緩衝液は、セビア・キャピラリーズ（Ｓｅｂｉａ  Ｃａｐｉｌｌａｒｙｓ）Ｂ１Ｂ２＋もしくはセビア・キャピラリーズ・プロテイン（Ｓｅｂｉａ  Ｃａｐｉｌｌａｒｙｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）緩衝液とすることができる；
Ｂ１Ｂ２＋緩衝液：温度３２℃、泳動電圧７ｋＶ、捕捉時間枠（ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ  ｗｉｎｄｏｗ）１００ないし２３５ｓ、注入２５０ｍｂａｒｓ＊５ｓ；
セビア・キャピラリーズ・プロテイン（ｅ）緩衝液：温度３７℃、泳動電圧６．５ｋＶ、捕捉時間枠１１０ないし２７５ｓ、注入２５０ｍｂａｒｓ＊５ｓ；
ｄ）ウェル１で得られたキャピラリ分析結果を続く５個のウェルでの結果と比較して分析血清をタイピングする。
【００９４】
個別の血清の使用条件
血清のガンマの割合が低い場合、ｂ）の希釈液による希釈は１０倍とする。このガンマの割合は、Ｂ１Ｂ２＋緩衝液を用いたキャピラリーズ装置によるその分析値がこの緩衝液を用いて該割合について規定された正常値を下回る値、即ち、約１０％未満（もしくは＜７．５ｇ／ｌ）を示す場合、低いと見なされている。
【００９５】
血清のガンマの割合が２０ｇ／ｌを超える場合には、ｂ）の希釈液による希釈は４０倍とする。
【００９６】
血清をイムノタイピングする場合のプロトコルの変更：キュピラリ内イムノサブトラクション
この場合は、２つのヘッドを用いる：
ウェル１に１００ｍＭリン酸塩、ウェル２に修飾抗ＩｇＧ抗体、ウェル３に修飾抗ＩｇＡ抗体、ウェル４に修飾抗ＩｇＭ抗体、ウェル５に修飾抗カッパ抗体、ウェル６に修飾抗ラムダ抗体をそれぞれ１００μｌ含む６穴のウェルからなる１つのヘッド；
ダブルウェル７／８に３８０μｌのイムノタイピング用希釈液（ベンジルアルコールの０．０２Ｍセビア・キャピラリーズＢ１Ｂ２＋緩衝液）を含む７穴のウェルからなる血清希釈用の１つのヘッド；
ａ）上記抗血清ヘッドを含む第１のキャリアを装置に導入すると、次いで、この自動装置が該抗体をキャピラリに注入する（２５０ｍｂａｒｓ＊５ｓ）。
ｂ）位置１に上記血清希釈ヘッドおよび血清チューブを含む第２のキャリアを装置に導入すると、次いで、この自動装置がダブルウェル７／８において２０倍希釈を行い、ダブルウェルを均質化して、ウェル１ないし６に（ウェル当たり２０倍希釈血清４０μｌ＋分析用緩衝液６０μｌを）分配し、次に、この希釈血清をキャピラリに注入する（２５０ｍｂａｒｓ＊５ｓ）。
ｃ）分析用緩衝液は、セビア・キャピラリーズ（Ｓｅｂｉａ  Ｃａｐｉｌｌａｒｙｓ）Ｂ１Ｂ２＋緩衝液もしくはセビア・キャピラリーズ・プロテイン（Ｓｅｂｉａ  Ｃａｐｉｌｌａｒｙｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（ｅ））緩衝液とすることができる；
Ｂ１Ｂ２＋緩衝液：温度３２℃、泳動電圧７ｋＶ、捕捉時間枠（ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ  ｗｉｎｄｏｗ）１００ないし２３５ｓ；
セビア・キャピラリーズ・プロテイン（ｅ）緩衝液：温度３７℃、泳動電圧６．５ｋＶ、捕捉時間枠１１０ないし２７５ｓ。
ｄ）ウェル１で得られたキャピラリ分析結果を続く５個のウェルでの結果と比較してこの血清をタイピングする。
【００９７】
実験結果
【実施例１】
【００９８】
セビア・キャピラリーズＢ１Ｂ２＋緩衝液（捕捉時間枠１０５ないし３５０ｓ）を用いたキャピラリーズにおいて、１，２，４−無水ベンゼントリカルボン酸による修飾前後の抗ヒトＩｇＧ、ＤＡＫＯを分析した結果、抗体の修飾によりその泳動は著しく遅延し、泳動時間が１２２ｓから２６７ｓへ延長した（図１ａおよび図１ｂ）。
【実施例２】
【００９９】
セビア・キャピラリーズＢ１Ｂ２＋緩衝液（捕捉時間枠１００ないし２３５ｓ）を用いたキャピラリーズによって、ベータ−２の位置へ泳動する単クローン性タイプＡラムダ蛋白質を含有する血清のイムノタイピングを行った：この血清の６つのアリコートを、１，２，４−無水ベンゼントリカルボン酸により修飾した５種の抗体（抗ＩｇＧ、抗ＩｇＡ、抗ＩｇＭ、抗カッパ、抗ラムダ）、および該抗体のメジウム（抗体を含まない；ＥＬＰトラック）とそれぞれ混合した。ＥＬＰトラックとの比較（図２の黒色部分）から明らかなように、抗ＩｇＡ抗体および抗ラムダ抗体で処理したアリコートのベータ−２の位置の単クローン性ピークは消失した。その他のトラックでは、多クローン性バックグラウンドの減少のみが認められた。また、グロブリンの泳動に対するこれらの免疫複合体および修飾抗体の干渉が見られないことにも注目されたい。ガンマの前方を泳動するピークは、プロフィルの重ね合わせを容易にするための注入マーカーである。
【実施例３】
【０１００】
セビア・キャピラリーズＢ１Ｂ２＋緩衝液（捕捉時間枠１００ないし２３５ｓ）を用いたキャピラリーズによって、ベータ−１の位置へ泳動する単クローン性タイプＧラムダ蛋白質を含有する血清のイムノタイピングを行った：この血清の６つのアリコートを、１，２，４−無水ベンゼントリカルボン酸により修飾した５種の抗体（抗ＩｇＧ、抗ＩｇＡ、抗ＩｇＭ、抗カッパ、抗ラムダ）、および該抗体のメジウム（抗体を含まない；ＥＬＰトラック）とそれぞれ混合した。ＥＬＰトラックとの比較（図３の黒色部分）から明らかなように、抗ＩｇＧ抗体および抗ラムダ抗体で処理したアリコートのベータ−１の位置の単クローン性ピークは消失した。その他のトラックでは、多クローン性バックグラウンドの減少のみが認められた。また、グロブリンの泳動に対するこれらの免疫複合体および修飾抗体の干渉が見られないことにも注目されたい。ガンマの前方を泳動するピークは、プロフィルの重ね合わせを容易にするための注入マーカーである。
【実施例４】
【０１０１】
セビア・キャピラリーズＢ１Ｂ２＋緩衝液（捕捉時間枠１００ないし２３５ｓ）を用いたキャピラリーズによって、ベータ−１の位置とアルファ−２の位置の間を泳動する単クローン性タイプＡカッパ蛋白質を含有する血清のイムノタイピングを行った：この血清の６つのアリコートを、１，２，４−無水ベンゼントリカルボン酸により修飾した５種の抗体（抗ＩｇＧ、抗ＩｇＡ、抗ＩｇＭ、抗カッパ、抗ラムダ）、および該抗体のメジウム（抗体を含まない；ＥＬＰトラック）とそれぞれ混合した。ＥＬＰトラックとの比較（図４の黒色部分）から明らかなように、抗ＩｇＡ抗体および抗カッパ抗体で処理したアリコートのベータ−１／アルファ−２の位置の単クローン性ピークは消失した。その他のトラックでは、多クローン性バックグラウンドの減少のみが認められた。また、グロブリンの泳動に対するこれらの免疫複合体および修飾抗体の干渉が見られないことにも注目されたい。ガンマの前方を泳動するピークは、プロフィルの重ね合わせを容易にするための注入マーカーである。
【実施例５】
【０１０２】
セビア・キャピラリーズＢ１Ｂ２＋緩衝液（捕捉時間枠１００ないし２３５ｓ）を用いたキャピラリーズによって、ガンマの位置へ泳動する単クローン性タイプＧラムダ蛋白質を含有する血清のイムノタイピングを行った：この血清の６つのアリコートを、１，２，４−無水ベンゼントリカルボン酸により修飾した５種の抗体（抗ＩｇＧ、抗ＩｇＡ、抗ＩｇＭ、抗カッパ、抗ラムダ）、および該抗体のメジウム（抗体を含まない；ＥＬＰトラック）とそれぞれ混合した。ＥＬＰトラックとの比較（図５の黒色部分）から明らかなように、抗ＩｇＧ抗体および抗ラムダ抗体で処理したアリコートのガンマの位置の単クローン性ピークは消失した。その他のトラックでは、多クローン性バックグラウンドの減少のみが認められた。また、グロブリンの泳動に対するこれらの免疫複合体および修飾抗体の干渉が見られないことにも注目されたい。ガンマの前方を泳動するピークは、プロフィルの重ね合わせを容易にするための注入マーカーである。
【実施例６】
【０１０３】
セビア・キャピラリーズＢ１Ｂ２＋緩衝液（捕捉時間枠１００ないし２３５ｓ）を用いたキャピラリーズによって、ベータ−１の位置とベータ−２の位置との間を泳動する単クローン性タイプＡラムダ蛋白質を含有する血清のイムノタイピングを行った：この血清の６つのアリコートを、１，２，４−無水ベンゼントリカルボン酸により修飾した５種の抗体（抗ＩｇＧ、抗ＩｇＡ、抗ＩｇＭ、抗カッパ、抗ラムダ）、および該抗体のメジウム（抗体を含まない；ＥＬＰトラック）とそれぞれ混合した。ＥＬＰトラックとの比較（図６の黒色部分）から明らかなように、抗ＩｇＡ抗体および抗ラムダ抗体で処理したアリコートのベータ−１／ベータ−２の位置の単クローン性ピークは消失した。その他のトラックでは、多クローン性バックグラウンドの減少のみが認められた。また、グロブリンの泳動に対するこれらの免疫複合体および修飾抗体の干渉が見られないことにも注目されたい。ガンマの前方を泳動するピークは、プロフィルの重ね合わせを容易にするための注入マーカーである。
【実施例７】
【０１０４】
セビア・キャピラリーズＢ１Ｂ２＋緩衝液（捕捉時間枠１００ないし２３５ｓ）を用いたキャピラリーズによって、ガンマの位置へ泳動する単クローン性タイプＭカッパ蛋白質を含有する血清のイムノタイピングを行った：この血清の６つのアリコートを、１，２，４−無水ベンゼントリカルボン酸により修飾した５種の抗体（抗ＩｇＧ、抗ＩｇＡ、抗ＩｇＭ、抗カッパ、抗ラムダ）、および該抗体のメジウム（抗体を含まない；ＥＬＰトラック）とそれぞれ混合した。ＥＬＰトラックとの比較（図７の黒色部分）から明らかなように、抗ＩｇＭ抗体および抗カッパ抗体で処理したアリコートのガンマの位置の単クローン性ピークは消失した。その他のトラックでは、多クローン性バックグラウンドの減少のみが認められた。また、グロブリンの泳動に対するこれらの免疫複合体および修飾抗体の干渉が見られないことにも注目されたい。ガンマの前方を泳動するピークは、プロフィルの重ね合わせを容易にするための注入マーカーである。
【実施例８】
【０１０５】
セビア・キャピラリーズＢ１Ｂ２＋緩衝液（捕捉時間枠１００ないし２３５ｓ）を用いたキャピラリーズによって、ガンマの位置へ泳動する単クローン性遊離型ラムダタイプ蛋白質を含有する血清のイムノタイピングを行った：この血清の８つのアリコートを、１，２，４−無水ベンゼントリカルボン酸により修飾した７種の抗体（抗ＩｇＧ、抗ＩｇＡ、抗ＩｇＭ、抗カッパ、抗ラムダ、抗遊離型カッパ、抗遊離型ラムダ）、および該抗体のメジウム（抗体を含まない；ＥＬＰトラック）とそれぞれ混合した。ＥＬＰトラックとの比較（図８の黒色部分）から明らかなように、抗ラムダ抗体および抗遊離型ラムダ抗体で処理したアリコートのガンマの位置の単クローン性ピークは消失した。その他のトラックでは、多クローン性バックグラウンドの減少のみが認められた。また、グロブリンの泳動に対するこれらの免疫複合体および修飾抗体の干渉が見られないことにも注目されたい。ガンマの前方を泳動するピークは、プロフィルの重ね合わせを容易にするための注入マーカーである。
【実施例９】
【０１０６】
セビア・キャピラリーズＢ１Ｂ２＋緩衝液（捕捉時間枠１００ないし２３５ｓ）を用いたキャピラリーズによって、ガンマの位置へ泳動する単クローン性タイプＧカッパ蛋白質を含有する血清に関し、１，２，４−無水ベンゼントリカルボン酸またはメリト酸／ＥＤＣＩにより修飾した抗ヒトＩｇＧ抗体を使用して得られるイムノタイピングの結果を比較した：この血清の３つのアリコートを、１，２，４−無水ベンゼントリカルボン酸およびメリト酸／ＥＤＣＩにより修飾した２種の抗ヒトＩｇＧ抗体、および該抗体のメジウム（抗体を含まない；ＥＬＰトラック）とそれぞれ混合した。ＥＬＰトラックとの比較（図９の黒色部分）から明らかなように、上記２種の修飾抗体で処理したアリコートのベータ−１の位置の単クローン性ピークは消失した。また、この２つの場合において、グロブリンの泳動に対するこれらの免疫複合体および修飾抗体の干渉が見られないことにも注目されたい。ガンマの前方を泳動するピークは、プロフィルの重ね合わせを容易にするための注入マーカーである。
【実施例１０】
【０１０７】
セビア・キャピラリーズＢ１Ｂ２＋緩衝液（捕捉時間枠１００ないし２３５ｓ）を用いたキャピラリーズによって、ガンマの位置へ泳動する単クローン性タイプＧカッパ蛋白質を含有する血清のキャピラリ内（ｉｎ−ｃａｐｉｌｌａｒｙ）イムノタイピングを行った：抗体のメジウム（抗体を含まない）および１，２，４−無水ベンゼントリカルボン酸により修飾した５種の抗体（抗ＩｇＧ、抗ＩｇＡ、抗ＩｇＭ、抗カッパ、抗ラムダ）を第１のヘッドに入れ、血清の６つのアリコートは、注入マーカーを含むセビア・キャピラリーズＢ１Ｂ２＋緩衝液で希釈した（ヘッド２）。これらの抗体、次いで希釈血清アリコートを注入し、これらの６泳動を行った。ＥＬＰトラックとの比較（図１０の黒色部分）から明らかなように、抗ＩｇＧ抗体および抗カッパ抗体で処理したアリコートのガンマの位置の単クローン性ピークは消失した。その他のトラックでは、多クローン性バックグラウンドの減少のみが認められた。また、グロブリンの泳動に対するこれらの免疫複合体および修飾抗体の干渉が見られないことにも注目されたい。ガンマの前方を泳動するピークは、プロフィルの重ね合わせを容易にするための注入マーカーである。
【実施例１１】
【０１０８】
５価抗血清（１，２，４−無水ベンゼントリカルボン酸により修飾した抗ＩｇＧ、抗ＩｇＡ、抗ＩｇＭ、抗カッパおよび抗ラムダ抗体の混合体）を使用して、セビア・キャピラリーズＢ１Ｂ２＋緩衝液（捕捉時間枠１００ないし２３５ｓ）を用いたキャピラリーズ装置により分析を行い、血清においてベータ−１の肩を形成するピークのＭｃとしての性質を立証した：この血清の２つのアリコートを、５価抗血清およびこれらの抗体のメジウム（抗体を含まない；ＥＬＰトラック）とそれぞれ混合した。ＥＬＰトラックとの比較（図１１の黒色部分）から明らかなように、５価抗血清で処理したトラックではベータ−１の肩を形成するピークは消失し、このピークのＭｃとしての性質（タイプＭカッパＭｃ蛋白質）が明らかとなった。また、多クローン性バックグラウンドが消失し、この血清のベータ−２画分がなく、グロブリンの泳動に対するこれらの免疫複合体および修飾抗体の干渉が見られないことにも注目されたい。ガンマの前方を泳動するピークは、プロフィルの重ね合わせを容易にするための注入マーカーである。
【実施例１２】
【０１０９】
セビア・キャピラリーズＢ１Ｂ２＋緩衝液（捕捉時間枠１００ないし２３５ｓ）を用いたキャピラリーズによって、ガンマの位置へ泳動する遊離型ラムダタイプＭｃ蛋白質を含有する血清のイムノタイピングを行った：この血清の６つのアリコートを、１，２，４−無水ベンゼントリカルボン酸により修飾した５種の抗体（３価抗血清（抗ＩｇＧ、抗ＩｇＡ、抗ＩｇＭ抗体の混合物）、抗カッパ、抗ラムダ、抗遊離型カッパ、抗遊離型ラムダ）、およびこれらの抗体のメジウム（抗体を含まない；ＥＬＰトラック）とそれぞれ混合した。ＥＬＰトラックとの比較（図１２の黒色部分）から明らかなように、３価抗血清で処理したトラックでは多クローン性バックグラウンドは消失したが、Ｍｃピークは消失しなかった。同時に、抗ラムダおよび抗遊離型ラムダのトラックではＭｃピークの消失が認められた。抗カッパおよび抗遊離型カッパのトラックでは、多クローン性バックグラウンドの減少のみが認められた。また、この血清ではベータ−２画分がないこと、ならびにグロブリンの泳動に対するこれらの免疫複合体および修飾抗体の干渉が見られないことにも注目されたい。ガンマの前方を泳動するピークは、プロフィルの重ね合わせを容易にするための注入マーカーである。
【実施例１３】
【０１１０】
キャピラリーズ蛋白質（ｅ）＋緩衝液（捕捉時間枠１１０ないし２７５ｓ）を用いたキャピラリーズ装置によって、ガンマの位置へ泳動するタイプＭカッパＭｃ蛋白質を含有する血清のイムノタイピングを行った：この血清の６つのアリコートを、１，２，４−無水ベンゼントリカルボン酸により修飾した５種の抗体（抗ＩｇＧ、抗ＩｇＡ、抗ＩｇＭ、抗カッパ、抗ラムダ）、および該抗体のメジウム（抗体を含まない；ＥＬＰトラック）とそれぞれ混合した。ＥＬＰトラックとの比較（図１３の黒色部分）から明らかなように、抗ＩｇＭおよび抗カッパで処理したアリコートのガンマの位置のＭｃピークは消失した。その他のトラックでは、多クローン性バックグラウンドの減少のみが認められた。また、グロブリンの泳動に対するこれらの免疫複合体および修飾抗体の干渉が見られないことにも注目されたい。ガンマの前方を泳動するピークは、プロフィルの重ね合わせを容易にするための注入マーカーである。
【図面の簡単な説明】
【０１１１】
【図１】種々の生体試料中の単クローン性蛋白質の検出および該単クローン性蛋白質のタイピングの例を示し、これにより、こうした疾患の予後診断および治療を改善する。
【図２】種々の生体試料中の単クローン性蛋白質の検出および該単クローン性蛋白質のタイピングの例を示し、これにより、こうした疾患の予後診断および治療を改善する。プロフィルの灰色面は、本発明の抗体の存在下に分離したセリック蛋白質を表し、また、この抗体の非存在下で分離したセリック蛋白質のプロフィルも細い線で示した。また、本発明の抗体で処理しなかった分離蛋白質のプロフィルも、ＥＬＰの名称で独立させて示した。
【図２Ａ】図２と同様の図である。
【図２Ｂ】図２と同様の図である。
【図２Ｃ】図２と同様の図である。
【図２Ｄ】図２と同様の図である。
【図２Ｅ】図２と同様の図である。
【図３】種々の生体試料中の単クローン性蛋白質の検出および該単クローン性蛋白質のタイピングの例を示し、これにより、こうした疾患の予後診断および治療を改善する。プロフィルの灰色面は、本発明の抗体の存在下に分離したセリック蛋白質を表し、また、この抗体の非存在下で分離したセリック蛋白質のプロフィルも細い線で示した。また、本発明の抗体で処理しなかった分離蛋白質のプロフィルも、ＥＬＰの名称で独立させて示した。
【図３Ａ】図３と同様の図である。
【図３Ｂ】図３と同様の図である。
【図３Ｃ】図３と同様の図である。
【図３Ｄ】図３と同様の図である。
【図３Ｅ】図３と同様の図である。
【図４】種々の生体試料中の単クローン性蛋白質の検出および該単クローン性蛋白質のタイピングの例を示し、これにより、こうした疾患の予後診断および治療を改善する。プロフィルの灰色面は、本発明の抗体の存在下に分離したセリック蛋白質を表し、また、この抗体の非存在下で分離したセリック蛋白質のプロフィルも細い線で示した。また、本発明の抗体で処理しなかった分離蛋白質のプロフィルも、ＥＬＰの名称で独立させて示した。
【図４Ａ】図４と同様の図である。
【図４Ｂ】図４と同様の図である。
【図４Ｃ】図４と同様の図である。
【図４Ｄ】図４と同様の図である。
【図４Ｅ】図４と同様の図である。
【図５】種々の生体試料中の単クローン性蛋白質の検出および該単クローン性蛋白質のタイピングの例を示し、これにより、こうした疾患の予後診断および治療を改善する。プロフィルの灰色面は、本発明の抗体の存在下に分離したセリック蛋白質を表し、また、この抗体の非存在下で分離したセリック蛋白質のプロフィルも細い線で示した。また、本発明の抗体で処理しなかった分離蛋白質のプロフィルも、ＥＬＰの名称で独立させて示した。
【図５Ａ】図５と同様の図である。
【図５Ｂ】図５と同様の図である。
【図５Ｃ】図５と同様の図である。
【図５Ｄ】図５と同様の図である。
【図５Ｅ】図５と同様の図である。
【図６】種々の生体試料中の単クローン性蛋白質の検出および該単クローン性蛋白質のタイピングの例を示し、これにより、こうした疾患の予後診断および治療を改善する。プロフィルの灰色面は、本発明の抗体の存在下に分離したセリック蛋白質を表し、また、この抗体の非存在下で分離したセリック蛋白質のプロフィルも細い線で示した。また、本発明の抗体で処理しなかった分離蛋白質のプロフィルも、ＥＬＰの名称で独立させて示した。
【図６Ａ】図６と同様の図である。
【図６Ｂ】図６と同様の図である。
【図６Ｃ】図６と同様の図である。
【図６Ｄ】図６と同様の図である。
【図６Ｅ】図６と同様の図である。
【図７】種々の生体試料中の単クローン性蛋白質の検出および該単クローン性蛋白質のタイピングの例を示し、これにより、こうした疾患の予後診断および治療を改善する。プロフィルの灰色面は、本発明の抗体の存在下に分離したセリック蛋白質を表し、また、この抗体の非存在下で分離したセリック蛋白質のプロフィルも細い線で示した。また、本発明の抗体で処理しなかった分離蛋白質のプロフィルも、ＥＬＰの名称で独立させて示した。
【図７Ａ】図７と同様の図である。
【図７Ｂ】図７と同様の図である。
【図７Ｃ】図７と同様の図である。
【図７Ｄ】図７と同様の図である。
【図７Ｅ】図７と同様の図である。
【図８】種々の生体試料中の単クローン性蛋白質の検出および該単クローン性蛋白質のタイピングの例を示し、これにより、こうした疾患の予後診断および治療を改善する。プロフィルの灰色面は、本発明の抗体の存在下に分離したセリック蛋白質を表し、また、この抗体の非存在下で分離したセリック蛋白質のプロフィルも細い線で示した。また、本発明の抗体で処理しなかった分離蛋白質のプロフィルも、ＥＬＰの名称で独立させて示した。
【図８Ａ】図８と同様の図である。
【図８Ｂ】図８と同様の図である。
【図８Ｃ】図８と同様の図である。
【図８Ｄ】図８と同様の図である。
【図８Ｅ】図８と同様の図である。
【図８Ｆ】図８と同様の図である。
【図８Ｇ】図８と同様の図である。
【図９】種々の生体試料中の単クローン性蛋白質の検出および該単クローン性蛋白質のタイピングの例を示し、これにより、こうした疾患の予後診断および治療を改善する。プロフィルの灰色面は、本発明の抗体の存在下に分離したセリック蛋白質を表し、また、この抗体の非存在下で分離したセリック蛋白質のプロフィルも細い線で示した。また、本発明の抗体で処理しなかった分離蛋白質のプロフィルも、ＥＬＰの名称で独立させて示した。
【図９Ａ】図９と同様の図である。
【図９Ｂ】図９と同様の図である。
【図１０】種々の生体試料中の単クローン性蛋白質の検出および該単クローン性蛋白質のタイピングの例を示し、これにより、こうした疾患の予後診断および治療を改善する。プロフィルの灰色面は、本発明の抗体の存在下に分離したセリック蛋白質を表し、また、この抗体の非存在下で分離したセリック蛋白質のプロフィルも細い線で示した。また、本発明の抗体で処理しなかった分離蛋白質のプロフィルも、ＥＬＰの名称で独立させて示した。
【図１０Ａ】図１０と同様の図である。
【図１０Ｂ】図１０と同様の図である。
【図１０Ｃ】図１０と同様の図である。
【図１０Ｄ】図１０と同様の図である。
【図１０Ｅ】図１０と同様の図である。
【図１１】種々の生体試料中の単クローン性蛋白質の検出および該単クローン性蛋白質のタイピングの例を示し、これにより、こうした疾患の予後診断および治療を改善する。プロフィルの灰色面は、本発明の抗体の存在下に分離したセリック蛋白質を表し、また、この抗体の非存在下で分離したセリック蛋白質のプロフィルも細い線で示した。また、本発明の抗体で処理しなかった分離蛋白質のプロフィルも、ＥＬＰの名称で独立させて示した。
【図１２】種々の生体試料中の単クローン性蛋白質の検出および該単クローン性蛋白質のタイピングの例を示し、これにより、こうした疾患の予後診断および治療を改善する。プロフィルの灰色面は、本発明の抗体の存在下に分離したセリック蛋白質を表し、また、この抗体の非存在下で分離したセリック蛋白質のプロフィルも細い線で示した。また、本発明の抗体で処理しなかった分離蛋白質のプロフィルも、ＥＬＰの名称で独立させて示した。
【図１２Ａ】図１２と同様の図である。
【図１２Ｂ】図１２と同様の図である。
【図１２Ｃ】図１２と同様の図である。
【図１２Ｄ】図１２と同様の図である。
【図１２Ｅ】図１２と同様の図である。
【図１３】種々の生体試料中の単クローン性蛋白質の検出および該単クローン性蛋白質のタイピングの例を示し、これにより、こうした疾患の予後診断および治療を改善する。プロフィルの灰色面は、本発明の抗体の存在下に分離したセリック蛋白質を表し、また、この抗体の非存在下で分離したセリック蛋白質のプロフィルも細い線で示した。また、本発明の抗体で処理しなかった分離蛋白質のプロフィルも、ＥＬＰの名称で独立させて示した。
【図１３Ａ】図１３と同様の図である。
【図１３Ｂ】図１３と同様の図である。
【図１３Ｃ】図１３と同様の図である。
【図１３Ｄ】図１３と同様の図である。
【図１３Ｅ】図１３と同様の図である。
【図１】
0004693392.tif 000002
【図２】
0004693392.tif 000003
【図２Ａ】
0004693392.tif 000004
【図２Ｂ】
0004693392.tif 000005
【図２Ｃ】
0004693392.tif 000006
【図２Ｄ】
0004693392.tif 000007
【図２Ｅ】
0004693392.tif 000008
【図３】
0004693392.tif 000009
【図３Ａ】
0004693392.tif 000010
【図３Ｂ】
0004693392.tif 000011
【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図４】
0004693392.tif 000015
【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
0004693392.tif 000017
【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図５】
0004693392.tif 000021
【図５Ａ】
0004693392.tif 000022
【図５Ｂ】
0004693392.tif 000023
【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図６】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図７】
0004693392.tif 000033
【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図８】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
0004693392.tif 000041
【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図８Ｇ】
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【図９】
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【図９Ａ】
0004693392.tif 000048
【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１３】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１３Ｅ】
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