(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの挿入を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の構造タンパク質であって、該突然変異構造タンパク質は粒子形成することができ、
ＶＰ３領域における１つ以上の挿入が、ＡＡＶ２の、ＹＹＬＳＲ  ＴＮＴＰＳ、ＥＥＫＦＦ  ＰＱＳＧＶ、ＮＰＶＡＴ  ＥＱＹＧＳ、ＬＱＲＧＮ  ＲＱＡＡＴ及びＮＶＤＦＴ  ＶＤＴＮＧから選択された配列における少なくとも１つのアミノ酸の直前及び／又は直後に局在することを特徴とする、前記構造タンパク質。
【請求項２】
該挿入がウイルスの感染性を上昇させ、ＶＰ３領域における１つ以上の挿入が、ＡＡＶ２の、ＬＱＲＧＮ  ＲＱＡＡＴ配列における少なくとも１つのアミノ酸の直前及び／又は直後に局在することを特徴とする、請求項１記載の構造タンパク質。
【請求項３】
突然変異（単数又は複数）がウイルス表面に局在することを特徴とする、請求項１または２記載の構造タンパク質。
【請求項４】
突然変異した構造タンパク質がタンパク質−細胞膜受容体相互作用の変化を惹起することを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の構造タンパク質。
【請求項５】
細胞膜受容体が約１５０ｋＤの糖タンパク質及び／又は硫酸ヘパラン−プロテオグリカンであることを特徴とする、請求項４記載の構造タンパク質。
【請求項６】
突然変異したＶＰ１、突然変異したＶＰ２及び／又は突然変異したＶＰ３から選択されることを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の構造タンパク質。
【請求項７】
ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５及び／又はＡＡＶ６に由来することを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載の構造タンパク質。
【請求項８】
挿入が細胞膜受容体−リガンド、Ｒｅｐ−タンパク質若しくはペプチド、免疫抑制タンパク質若しくはペプチド、及び／又は外来遺伝子の二本鎖合成シグナルを有するタンパク質若しくはペプチドであることを特徴とする、請求項７記載の構造タンパク質。
【請求項９】
リガンドがインテグリン、サイトカイン、又はサイトカイン、インテグリン若しくは成長因子の受容体結合ドメイン、細胞表面受容体に結合する一本鎖抗体、細胞表面構造、抗体結合構造若しくはエピトープに対する抗体から、並びにそれらの電荷、特徴的なアミノ酸組成の性質及び／又はそれらの特異的なグリコシル化及び／又はリン酸化を介して細胞表面分子に結合するリガンドから選択されることを特徴とする、請求項８記載の構造タンパク質。
【請求項１０】
ＡＡＶ粒子の形態である請求項１〜９のいずれかに記載の構造タンパク質。
【請求項１１】
ＡＡＶキャプシドの形態である請求項１〜９のいずれかに記載の構造タンパク質。
【請求項１２】
請求項１〜９のいずれかに記載の構造タンパク質をコードする核酸。
【請求項１３】
請求項１２記載の核酸を含む細胞。
【請求項１４】
請求項１〜９のいずれかに記載の構造タンパク質の製造方法であって、請求項１３記載の細胞を培養することを特徴とする前記方法。
【請求項１５】
発現した構造タンパク質を単離することを特徴とする請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
請求項１〜１１のいずれかに記載の構造タンパク質、請求項１２記載の核酸及び／又は請求項１３記載の細胞を含む薬物。
【請求項１７】
請求項１〜１１のいずれかに記載の構造タンパク質、請求項１２記載の核酸及び／又は請求項１３記載の細胞を含む診断薬。
【請求項１８】
ＡＡＶのトロピズムを変化させるため、細胞を形質転換させるため、診断のため、有効性検査のため、遺伝子治療のため及び／又はゲノム・ターゲッティングのための、請求項１〜１１のいずれかに記載の構造タンパク質を含む薬物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、感染性を高める少なくとも１つの突然変異を含む、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の構造タンパク質に関する。
【０００２】
ＡＡＶウイルスはパルボウイルスのファミリーに属する。これは、約５ｋｂの線状一本鎖ＤＮＡを含有する、直径１８〜３０ｎｍを有する二十面体の非被覆キャプシドによって識別される。ＡＡＶの効果的な増殖のためには、ヘルパーウイルスによる、例えばアデノウイルス、ヘルペスウイルス又はワクシニアウイルスによる宿主細胞の同時感染が必要である。ヘルパーウイルスが不存在の場合には、ＡＡＶは潜伏状態になり、この場合には、ウイルスゲノムは宿主細胞ゲノム中に安定に組み込まれる状態になる。宿主ゲノム中に組み込まれるＡＡＶの性質は、哺乳動物細胞の形質導入ベクターとしてそれを特に興味深いものにする。このベクター機能のために、一般に、両側の約１４５ｂｐ長さの逆方向末端反復配列（ＩＴＲ：“Ｉｎｖｅｒｔｅｄ  Ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ｒｅｐｅａｔｓ”）で充分である。これは複製、パッケージング及び宿主ゲノムへの組み込みのために必要な“シス”シグナルを有する。組換えベクター粒子へのパッケージングのために、非構造タンパク質（Ｒｅｐ−タンパク質）と構造タンパク質（Ｃａｐ−タンパク質）との遺伝子を有するベクタープラスミドをパッケージングに適した細胞、例えば、ＨｅＬａ細胞又は２９３細胞においてトランスフェクトし、さらに例えばアデノウイルスで感染させる。２、３日後に、組換えＡＡＶ粒子を有する溶菌物（Ｌｙｓａｔ）が得られる。
【０００３】
ＡＡＶ−キャプシドは３種類の異なるタンパク質、ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３から成り、これらの相対的割合はＶＰ１  ５％、ＶＰ２  ５％及びＶＰ３  ９０％である。ＡＡＶキャプシド遺伝子はＡＡＶゲノムの右末端に局在し、種々な出発コドンの使用下で同じオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）のオーバーラップ配列によってコードされる。ＶＰ１遺伝子は完全なＶＰ２遺伝子配列を含有し、ＶＰ２遺伝子配列は再び完全なＶＰ３遺伝子配列を特異的なＮ末端領域と共に含有する。オーバーラップ・リーディング・フレームが全ての３種類のＡＡＶキャプシドタンパク質をコードするという事実は、非常に異なる割合であったとしても、全てのキャプシド−タンパク質の絶対的な発現のために必要である。
【０００４】
キャプシドタンパク質の分子質量は、ＶＰ１に関して８７ｋＤ、ＶＰ２に関して７３ｋＤ及びＶＰ３に関して６２ｋＤである。キャプシド遺伝子の配列は，例えば、Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ，Ａ．等，（１９８３），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，４５，５５５〜５６４；Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｎ．（１９９２），Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５８，９７〜１２９，Ｒｕｆｆｉｎｇ，Ｎ．等（１９９２）、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６６，６９２２〜６９３０又はＲｕｔｌｅｄｇｅ，Ｅ．Ａ．等（１９９８），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７２，３０９〜３１９に記載されている。ＡＡＶゲノムの物理的及び遺伝的マップは例えばＫｏｔｉｎ，Ｒ．Ｍ．（１９９４）、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、５、７９３〜８０１に記載されている。
【０００５】
さらに、種々なＡＡＶ血清型が知られており、そのうちのヒトＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）は身体の遺伝子治療のために有利な性質を有するウイルスベクターである。重要な利点は、ヒトに対する病原性の無いこと、細胞ゲノム中へのウイルスＤＮＡの安定な組み込み、非分割細胞を感染させる能力、ビリオンの安定性（これは高い力価（１０11粒子／ｍｌ）を得るための精製を可能にする）、僅少な免疫原性並びに組換えＡＡＶ−ベクターにおけるウイルス遺伝子と遺伝子産物との広範囲な欠損（これは安全性の観点で遺伝子治療に用いるために有利である）である。そうこうする間に、ＡＡＶベクターへの遺伝子のクローニングが例えばＷＯ９５／２３８６７、Ｃｈｉｏｒｉｎｉ，Ｊ．Ａ．等（１９９５），Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，６，１５３１〜１５４１又はＫｏｔｉｎ，Ｒ．Ｍ．（１９９４），上記文献に記載されているように、専門家に一般に知られた方法によって行われる。
【０００６】
一般に、例えばＡＡＶ２は広範囲な作用スペクトルを有する。ヒト上皮腫瘍細胞系のような上皮組織、但し頚部癌又は卵巣癌又はメラノーマのような原発性腫瘍物質も、及びヒトケラチノサイトとは非常に効果的に感染される（７０〜８０％）、これに反して、リンパ造血細胞のような造血細胞は１０分の１〜１００分の１の小さい効率で（０．５〜５％）感染される（Ｍａｓｓ等（１９９８），Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，９，１０４９〜１０５９）。この理由は、細胞にＡＡＶを受容するためには、ＡＡＶと、細胞表面上のＡＡＶ受容体との間の相互作用が必要であることでありうる。そこで、例えば、推定上の主要なＡＡＶ２受容体は１５０ｋＤの細胞膜−糖タンパク質である（Ｍｉｚｕｋａｍｉ，Ｈ．等（１９９６），Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２１７，１２４〜１３０）又は硫酸ヘパラン−プロテオグリカン（Ｓｕｍｍｅｒｆｏｒｄ，Ｃ．とＳａｍｕｌｓｋｉ，Ｒ．Ｊ．（１９９８），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７２，１４３８〜１４４５）である。可能な第２受容体としては、αＶβ５インテグリン（Ｓｕｍｍｅｒｆｏｒｄ等（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ５，７８〜８２）とヒト線維芽細胞成長因子受容体１（Ｑｉｎｇ等，（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ５，７１〜７７）とが決定された。結合研究は現在、ＡＡＶ２によって効果的に感染されない細胞上ではこれらの受容体の表面密度が減少することを示した。
【０００７】
レトロウイルスとアデノウイルスのキャプシドタンパク質の遺伝子修飾によって、受容体の結合部位がキャプシドにもたらされることができ、これは特定の細胞においてのみ発現されるので、ベクターの受容体仲介ターゲッティングを可能にした（例えば、Ｃｏｓｓｅｔ，Ｆ．Ｌ．とＲｕｓｓｅｌｌ，Ｓ．Ｊ．（１９９６），Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，３，９４６〜９５６，Ｄｏｕｇｌａｓ，Ｊ．Ｔ．等，（１９９６），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１４，１５７４〜１５７８，Ｋｒａｓｎｙｋｈ，Ｖ．Ｎ．等，（１９９６），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０，６８３９〜６８４６，Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ，Ｓ．Ｃ．等（１９９７），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７１，４７８２〜４７９０，又はＷｉｃｋｈａｍ，Ｔ．Ｊ．等（１９９６），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１４，１５７０〜１５７３参照）。ＷＯ９６／００５８７では、免疫応答が誘導されるように、臨床的に関連する抗原の異種エピトープを含有すべきであり、キャプシド形成を妨害すべきではないＡＡＶキャプシド融合タンパク質が指摘されている。しかし、この刊行物は一般的な指示のみを含み、実行可能なための詳細な指示、特に適当な挿入部位に関する詳細な指示を含まない。Ｓｔｅｉｎｂａｃｈ等（１９９７）（Ｂｉｏｌ．Ａｂｓｔ．１０４，Ｒｅｆ．４６５７０）は、予めバキュロ系で発現したＡＡＶ粒子のｉｎ  ｖｉｔｒｏ構築を扱っている。ｃａｐ−遺伝子においても突然変異がなされるが、これはトロピズムの変化を生じるのではなく、そのつど１つのみのＶＰ−タンパク質が発現されるプラスミド構造を生じることになる。感染性の変化は言及されていない。Ｒｕｆｆｉｎｇ等（１９９４）（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７５，３３８５〜３３９２）は、ＡＡＶ２の天然のトロピズムを調べることを意図している。このために、ＡＡＶ２−ＶＰ−タンパク質のＣ末端に突然変異が挿入されたが、この際に（模擬出発データに基いて誤った）受容から出発したので、ＲＧＤ−Ｍｏｔｉｖを変化させている。この突然変異は単に感染性の低下を生ずるに過ぎない。
【０００８】
間接的なターゲッティングがＢａｒｔｌｅｔｔ等（１９９９；Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７，１８１〜１８６）から知られている。この場合には、ＡＡＶ２キャプシドにも標的細胞にも向けられる二重特異性抗体が用いられた。しかし、ウイルスキャプシドは共有結合もされていず、修飾もされていない、又はキャプシドタンパク質が突然変異している。ＡＡＶ２の直接ターゲッティングの今までの唯一の実験は、Ｙａｎｇ等（１９９８、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１，１９２９〜１９３７）によって行われた。この場合には、ＣＤ３４分子に対する一本鎖抗体フラグメントがＶＰ２のＮ末端と融合して、ＶＰ１のＮ末端に直接挿入される。しかし、この方法は２つの明白な欠点を有する。一方では、感染力価(infektionstiter)が非常に低く、他方では、未突然変異キャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３による上首尾なパーケッジングのために融合タンパク質を同時発現しなければならない。しかし、このことからキメラキャプシドタンパク質と野生型キャプシドタンパク質との混合物が生じて、その組成とそれによる有効性とは予測可能ではなかった。その他の点では、パッケージング効率とＨｅＬａ細胞上の野生型受容体を介しての感染性も野生型に比べてかなり低下した。
【０００９】
それ故、本発明の課題は、既知のＡＡＶベクターによるよりも特異的かつ効果的な遺伝子導入を可能にするように、ＡＡＶを修飾することである。
ＡＡＶの構造−若しくはキャプシドタンパク質が感染性を上昇させるように修飾されうることが、意外にも今回発見された。
【００１０】
それ故、本発明の目的は、ウイルスの感染性を上昇させる、少なくとも１つの突然変異を含むＡＡＶの構造タンパク質である。感染性を上昇させることによって、例えば、造血組織のような、感染されにくい組織への特異的かつ効果的な遺伝子導入を達成することができる。本発明の意味での変化、特に上昇とは、特定の細胞種類に関しても、一般的ではなくて細胞特異的な変化又は上昇と理解すべきである。それによって、感染性の上昇とは、特定細胞の感染性が低下し、単に１つの他の細胞種類又は幾つかの他の細胞種類の感染性が上昇するような場合も包含する。
【００１１】
好ましくは、突然変異（単数又は複数種類）はウイルス表面に局在する。構造タンパク質の表面局在領域の決定に関して、本発明によると意外にも、ＣＰＶ−とＡＡＶ２−配列及び構造が比較可能であることが発見された。それ故、特に、パルボイルスＢ１９又はＣＰＶ（イヌ−パルボイルス）のようなパルボウイルスの既知結晶構造を参照して、ＡＡＶ／ＡＡＶ受容体−相互作用のために重要であり、修飾されることができるタンパク質ドメインを相同性比較によって同定することができる。それ故、本発明によると、ＣＰＶとＡＡＶ２又はパルボウイルスＢ１９とＡＡＶ２のコンピューター補助比較が、配列が変化し、即ち、僅かな相同性を有し、ウイルスのトロピズム(tropism)又は異なる感染性に応答することができる、ＶＰ３におけるループ（ｌｏｏｐｓ）の同定を意外にも再現可能に生じている。そこで、ＣＰＶ  ＶＰ２−キャプシド−タンパク質の既知結晶構造（例えば、Ｌｕｏ  Ｍ（１９８８），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２００，２０９〜２１１；ＷｕとＲｏｓｓｍａｎｎ（１９９３），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２３３，２３１〜２４４）を、ウイルスキャプシド表面にさらされ、局部的なアミノ酸配列に基いて充分にフレキシブルである領域を見出し、ペプチド配列の挿入を克服するために、ＡＡＶ２  ＶＰ３への高度な類似性に基いてタンパク質の二次構造にパターンとして用いた。この際に、キャプシドを脱安定化させる、ＡＡＶ２−キャプシドタンパク質の二次構造要素が選択されないように、細心に注意した。
【００１２】
構造タンパク質の表面局在領域を決定するための他の可能性は、種々なＡＡＶ血清型のキャプシドコーディング核酸配列の比較である。これに加えて、例えば、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４又はＡＡＶ６のような、種々なＡＡＶ血清型の既知ＤＮＡ配列を例えばＡＡＶ２の可能なキャプシド形態学の構造分析に利用することができ、この場合に、最初から可能な三次構造を算出して、配列領域を一般に知られたアミノ酸特性に基いて内外のキャプシド領域に割り当てることができる。そこで、例えば、本発明によると、ＡＡＶ２キャプシドのＶＰ３領域の７つの可能な挿入部位を確認することができ、これらの部位は例えばリガンドの挿入とウイルス表面上のその発現を可能にした（以下参照）。
【００１３】
他の好ましい実施態様では、例えば、パルボウイルスＣＰＶとＢ１９の場合には、Ｎ末端が細胞表面に局在することが判明しているので、突然変異（単数又は複数）は構造タンパク質のＮ末端に局在する。この場合には、突然変異をＶＰ１のＮ末端に直接行うのではなく、Ｎ末端から２，３のアミノ酸下流で行うことが好ましい。
【００１４】
他の好ましい実施態様では、突然変異がタンパク質−細胞膜受容体相互作用の変化を惹起し、上記で詳述したように、細胞膜受容体は好ましくは約１５０ｋＤの糖タンパク質及び／又は硫酸ヘパラン−プロテオグリカンである。これらの２つの受容体は、恐らく、少なくとも１つの二次受容体を補充された一次受容体であると考えられる（上記参照）。
【００１５】
一般に、突然変異はＶＰ１、ＶＰ２及び／又はＶＰ３構造タンパク質に存在することができ、ＶＰ１構造タンパク質及び／又はＶＰ３構造タンパク質が好ましい。さらに、突然変異した構造タンパク質は好ましくはさらに粒子形成、即ち、二十面体キャプシド形成することができる。その上、構造タンパク質はあらゆるＡＡＶ血清型、特に、ヒト血清型、好ましくはＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５及び／又はＡＡＶ６、特にＡＡＶ２、ＡＡＶ３及び／又はＡＡＶ６に由来することができる。これらはまた、前記血清型、特にＡＡＶ２に由来する血清型も包含する。
【００１６】
他の好ましい実施態様では、突然変異（単数又は複数）は点突然変異（単数又は複数）、幾つかのアミノ酸の突然変異（単数又は複数）、１つ以上の欠失及び／又は１つ以上の挿入、並びに構造タンパク質におけるこれらの突然変異の組み合わせであり、挿入は好ましくは、細胞膜受容体−リガンド、Ｒｅｐ−タンパク質若しくはペプチド（例えば、Ｒｅｐドメインとして）、免疫抑制タンパク質若しくはペプチド、及び／又は導入遺伝子若しくは外来遺伝子の二本鎖合成シグナルを有するタンパク質若しくはペプチドの挿入である。
【００１７】
挿入の例は、特に、インテグリン、サイトカイン、又はサイトカイン若しくは成長因子の受容体結合ドメイン、例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＣＤ４０Ｌ、ＴＮＦ、ＮＧＦ、ＰＤＧＦ若しくはＥＧＦ、細胞表面受容体に結合する一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、例えば表面受容体  ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、Ｂ７、ＣＤ２８若しくはＣＤ３４に結合する一本鎖抗体、又はエピトープ又は受容体結合部位（これらは次に特定の抗体、例えば抗ＣＤ４０Ｌモノクローナル抗体によって、又は化学物質若しくはホルモン、例えばカテコールアミンによって認識される）である。他の例も、特定細胞の細胞表面に部分的に提示される、例えば細胞認識粒子又は例えば薬物のような異物(xenobiotics)の一部のような、特定のエピトープに対する抗体である。
【００１８】
好ましい実施態様では、例えば、プロテインＡ、プロテインＧ又は抗ＦＣ抗体又はそれらの一部のような抗体結合構造が挿入される。これらには、次に、特定の細胞表面構造に対する（例えば、リンパ球(lymphatic cell)の場合にはＣＤ４０に対する、又は造血細胞の場合にはＣＤ３４に対する）特異的抗体が結合される。このことは、実際に任意の抗体が結合することができるので、本発明による構造タンパク質を含有する物質の殆ど普遍的な使用を可能にし、この場合に、使用は非常に特異的にも可能である。
【００１９】
この間接的なターゲッティングでは、個別に及びその使用に依存して種々な抗体と共に負荷されることができる普遍的なＡＡＶターゲッティング・ベクターを製造することができる、これらの抗体の各々はターゲット細胞上の、種々な特異的な表面受容体又は表面分子に向けられ、これらを介してウイルスがターゲット細胞に結合し、細胞を感染させることになる。このことは特定のターゲッティング問題のために異なるＡＡＶ変異体の個別クローニングを不必要にする。さらに、ターゲット細胞上のターゲッティング受容体を迅速かつ効果的にスクリーニングすることができるように、広範囲な抗体を用いることによって、本発明による適当なベクター又はキャプシド変異体を、ウイルス結合に適した若しくは細胞内にそれらを取り込むために適したターゲット細胞上の適当な表面受容体を判定するために用いることも可能である。
【００２０】
特に、例えばＺ３４Ｃタンパク質として、切頭欠失形態のプロテインＡのＺドメインを１回以上（好ましくは１回）挿入することが特に好ましい（Ｓｔａｒｏｖａｓｎｉｋ等（１９９７），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １６：９４，１００８０〜１００８５）、この場合には、状況に応じて、キャプシドタンパク質の欠失部位における幾つかのタンパク質を予め欠失させることが特に好ましい。プロテインＡのＺドメインと、シンドビスウイルスのキャプシド中へのそれらの２回の連続挿入とは、Ｏｈｎｏ等（１９９７）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５，７６３〜７６７によって述べられている。プロテインＡは５個の独立的ドメインを介して抗体のＦＣ部分に結合する。最も強力な結合ドメインはＢ又はＺドメインであり、これらの３３アミノ酸は結合のために必須である。この結合構造は２個のシステイン架橋によって安定化されることができる（Ｓｔａｒｏｖａｓｎｉｋ等、上記文献）。
【００２１】
特に好ましいリガンドの例はＰ１ペプチド（ＱＡＧＴＦＡＬＲＧＤＮＰＱＧ）であり、これはラミニン・ファミリーのα鎖のコア配列から１４アミノ酸長さのペプチドである。この配列は、特に、例えばアデノウイルスのウイルス粒子のエンドサイトーシスを仲介するインテグリン受容体を認識するために充分である。Ｐ１ペプチドは、そのコンホメーション（線状又は環状）に拘わらず、インテグリン受容体に結合する。本発明によると、Ｐ１ペプチドのコーディングＤＮＡ配列を例えばヘルパー・プラスミド上に局在するＡＡＶ構造タンパク質をコードする遺伝子に挿入する。変異体ヘルパー・プラスミドによるパッケージングはキャプシド中にＰ１を有する組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ−Ｐ１）を生じる。
【００２２】
挿入部位に挿入すべき他の可能なリガンドは、単に、それらの電荷、特徴的なアミノ酸組成の性質及び／又はそれらの特異的なグリコシル化及び／又はリン酸化を介して細胞表面分子に結合するリガンドである。これに関連して、特徴的なアミノ酸組成の性質とは、これらが例えば主として疎水性、親水性、立体的に嵩のある、荷電したアミノ酸残基又はアミノ、カルボン酸、ＳＨ若しくはＯＨ基を含有するものを有することを意味する。したがって、細胞を非特異的な機構によってＡＡＶトランスフェクションを受けやすくさせることが可能である。これに関連して、例えば、多くの細胞表面分子が特異的にグリコシル化され、リン酸化される、又は負に荷電する、したがって、多重の正電荷を有するアミノ酸リガンドと共にＡＡＶ変異体のターゲットを提示することができる。
【００２３】
他の好ましい実施態様では、突然変異（単数又は複数）がＶＰ１コーディング核酸のＸｈｏＩ切断部位における挿入によって生じ、他の好ましい実施態様では、突然変異（単数又は複数）がＶＰ１コーディング核酸のＢｓｒＢＩ切断部位における挿入によって生ずる。本発明による構造タンパク質の他の好ましい実施態様は、ＶＰ１コーディング核酸のＢｓｒＢＩ／ＨｉｎｄＩＩ切断部位間における欠失と、好ましくはこの欠失部位における１つ以上の挿入とによって生ずる。
【００２４】
本発明の他の好ましい実施態様では、突然変異(単数又は複数)が、６２アミノ酸を含むＶＰ１コーディング核酸のＸｈｏＩ／ＸｈｏＩ切断部位間の１つ以上の欠失によって、生ずる（Ｈｅｒｍｏｎａｔ，Ｐ．Ｌ．等（１９８４），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，５１，３２９〜３３９）。他の好ましい対応実施態様では、ＶＰ１コーディング核酸のＢｓｒＢＩ／ＨｉｎｄＩＩ切断部位間に欠失(単数又は複数)が局限され、この欠失は上記欠失範囲内に局在し、２９アミノ酸を含む。この欠失は、ｒｅｐ遺伝子との重複を有さず、それ故、パッケージング機構に本質的に影響を及ぼさないという利点を有する。
【００２５】
他の好ましい実施態様では、ＹＫＱＩＳ  ＳＱＳＧＡ、ＹＬＴＬＮ  ＮＧＳＱＡ、ＹＹＬＳＲ  ＴＮＴＰＳ、ＥＥＫＦＦ  ＰＱＳＧＶ、ＮＰＶＡＴ、ＥＱＹＧＳ、ＬＱＲＧＮ  ＲＱＡＡＴ、ＮＶＤＦＴ  ＶＤＴＮＧから選択された配列における少なくとも１つのアミノ酸の前及び／又は後のＶＰ３構造タンパク質（Ｒｕｔｌｅｄｇｅ、Ｅ．Ａ．等（１９９８）上述）に１つ以上の挿入が存在する、この理由は、これらの部位がループの暴露された部位に局在し、この場合にＶＰ３構造を変化させる危険性が低いからである。
【００２６】
点突然変異(単数又は複数)、幾つかのアミノ酸の突然変異(単数又は複数)、欠失(単数又は複数)又は挿入(単数又は複数)は一般に公知の方法によって、構造タンパク質をコードする遺伝子における欠失又は挿入によって行われる。欠失は、例えばＰＣＲ支援変異誘発によって個々の構造タンパク質遺伝子中に導入されることができる。挿入は一般に公知方法によって、例えば適当な構造タンパク質遺伝子の制限エンドヌクレアーゼによる加水分解と、続いてのリガーゼ反応とによって導入されることができる。
【００２７】
本発明による突然変異構造タンパク質の感染性の変化、例えばＡＡＶ表面のＰ１ペプチドの機能的発現を検出することは、選択された受容体、例えばラミニンα受容体を発現するが、野生型ＡＡＶ，例えば野生型ＡＡＶ２に感染されにくい適当な細胞を用いて、付着試験において比較的容易に可能である（Ｖａｌｓｅｓｉａ−Ｗｉｔｔｍａｎ，Ｓ．等，（１９９４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８，４６０９〜４６１９）。この試験系の利点は、検査によって迅速に、光学密度の測定によって定量的に、例えばウイルス表面上のＰ１ペプチドの発現を測定することができることである。
【００２８】
それ故、ウイルス表面に挿入されたリガンドの発現と、トロピズムの修飾とを迅速スクリーニングするために、ラミニン／インテグリン  リガンド／受容体系に基いて、適当なターゲッティング・モデルが開発されている。このために、突然変異ＡＡＶ２ゲノムによるウイルス・パッケージング後にキャプシド中にＰ１リガンドを有するｒＡＡＶ（ｒＡＡＶ−Ｐ１）が得られるように、既に上記で詳述した、そのコンホメーション(線状又は環状）に拘わらず、インテグリン受容体に結合するＰ１ペプチドをコードする核酸がｃａｐ遺伝子に導入されている。この試験系は２つの異なる細胞系を用いて行われるものであり、これらの細胞系は、一方では、野生型ＡＡＶ２によって感染されて、ＡＡＶ２受容体（硫酸ヘパラン−プロテオグリカン受容体、ＨＰＲ、恐らく二次受容体も（上記参照））を発現することができるが、ラミニンＰ１のインテグリン受容体（ＬＰ１−Ｒ）を発現することができず、他方では、それらの表面にＬＰ１−Ｒを発現するが、ＨＰＲを発現しない。適当な細胞系は、抗−ＨＰＲ抗体とラミニンＰ１上での付着分析とを用いて、フローサイトメトリー試験において同定することができる。
【００２９】
これらの試験は、例えば、上記変異体がラミニンα受容体陽性指示細胞、例えば細胞系Ｍ０７−ＬＰ１−Ｒを野生型ＡＡＶよりも少なくとも１０倍大きい効率で感染させることを示した。可溶性Ｐ１−ペプチドを用いる競合アッセイでは、ｒＡＡＶ−Ｐ１による感染は実際に挿入リガンドによって仲介されることも判明した。同様に、ｒＡＡＶ−Ｐ１変異体を用いる別の試験では、Ｂ１６Ｆ１０細胞、通常は野性型ＡＡＶによって感染されない細胞系のトランスフェクションは野生型ＡＡＶによって可能であるよりも４桁以上大きかった。
【００３０】
本発明の他の態様も、ＡＡＶ粒子の形態、特にＡＡＶキャプシドの形態の本発明による構造タンパク質である、この理由は粒子とキャプシドとが選択された化合物、例えばｒＡＡＶ形質導入ベクターのキャリヤーとして特に適しているからである。
【００３１】
本発明の他の態様は、本発明の構造タンパク質をコードする核酸、好ましくはＲＮＡ又はＤＮＡ，特に二本鎖ＤＮＡである。
本発明はまた、本発明による核酸を含む細胞、好ましくは哺乳動物細胞、例えばＣＯＳ細胞、Ｈｅｌａ細胞又は２９３細胞にも関する。このタイプの細胞は例えば組換えＡＡＶ粒子の調製に適している。
【００３２】
それ故、本発明の他の態様は、また、本発明による構造タンパク質の調製方法、特にＡＡＶ粒子の形態の本発明による構造タンパク質の調製方法であって、本発明による構造タンパク質をコードする核酸を含む適当な細胞を培養し、適当な場合には、発現した構造タンパク質を単離する前記方法である。例えば、本発明による構造タンパク質は、例えば、Ｃｈｉｏｒｉｎｉ，Ｊ．Ａ．等（１９９５）上記文献に記載されたように、塩化セシウム勾配で単離することができる。
【００３３】
本発明の他の態様は、ＡＡＶのトロピズムを変えるため、細胞をトランスフォーミングする、特に、例えば造血細胞のような、ＡＡＶ感染への感受性が今までは低かった細胞をトランスフォーミングするため、既に上記で詳述したような、適当なｒＡＡＶベクターの形態で遺伝子治療のため、又はゲノム・ターゲッティングのための、本発明による融合タンパク質の使用に関する。
【００３４】
突然変異が例えばインテグリン受容体を有するＢ１６Ｆ１０のような、特定細胞の感染性上昇をもたらした本発明による融合タンパク質の、これらの細胞を用いた活性刺激のための使用も包含される。例は、好ましくはネズミ起源の、腫瘍モデルと腫瘍細胞系である。この使用において、現実的であり、ヒトに対して比較可能であり、今まではこのようにアクセス可能ではなかった、例えばある種のマウス細胞系のような、研究モデルを用いることができる。これに関連して、マウス細胞の感染感受性が一般にヒト細胞の感染感受性よりも非常に低いことを述べなければならない。したがって、Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ細胞によってマウスに誘導された腫瘍は未突然変異キャプシドを有するＡＡＶ２に感受性ではない。しかし、的確にこの場合には、本発明によるタンパク質はマウスにおけるこの腫瘍モデル及び対応する他の腫瘍モデルでのＡＡＶ２活性研究を可能にする。付加的な促進要因は、多くの組織及び細胞種類でのマウス細胞が、本発明によって突然変異を起こした構造タンパク質の好ましいリガンドであるＰ１ペプチドの特異的インテグリン受容体を有することである。したがって、例えば、この特異的なインテグリン受容体を有する、例えばＢ１６Ｆ１０及び他のネズミ腫瘍細胞に対する感染性上昇を介して、したがって誘導された腫瘍がかなり効果的に形質導入されうるので、今までに開示されたよりも現実的でかつヒトと比較可能である試験モデルを構築することが、本発明による変異体によって可能になる。
【００３５】
本発明による融合タンパク質の他の使用は、診断においてである。したがって、シグナルが発せられるように、例えば、血液サンプル中の細胞上に特に提示されたエピトープを認識して、結合する抗体、又は抗体を含む抗体結合物質をリガンドとして用いることが、本発明によって可能である。用途例は、例えば薬物又は細胞認識粒子のような異物の一部を提示し、それによって、例えば腫瘍診断において組織細胞の起源を調べることを可能にする。
【００３６】
本発明の他の態様は、本発明による融合タンパク質、本発明による核酸又は本発明による細胞を含み、適当である場合には、適当な賦形剤と添加剤、例えば生理的食塩水溶液、安定剤、プロテイナーゼ阻害剤等をも含む、医薬製品又は診断助剤にも関する。
【００３７】
本発明の重要な利点は、ＡＡＶ構造タンパク質の本発明による変異誘発を介して、感染性を本質的に、ウイルスのキャプシド中への組換えＡＡＶベクターのパッケージング効率を低下させずに変えることができることであり、特に、例えば造血細胞のような、低感受性の細胞の感染性を数倍に上昇させることができる。それ故、本発明は、例えば身体遺伝子治療のために、特定細胞の改良されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏトランスホーメーションに特に適している。
【００３８】
以下の実施例および図面は本発明をより詳細に説明するものであるが、本発明がこれらに限定されるものではない。
実施例
ＰＣＲ支援変異誘発、および制限酵素ＸｈｏＩ、ＢｓｒＢＩまたはＨｉｎｄＩＩＩを用いる切断により、下記の変異を形成した：
１．ＶＰ１における変異
ａ）ＶＰ−１のＸｈｏＩ−ＸｈｏＩ切断部位間の欠失（△Ｘｈｏ；６２アミノ酸（ＡＳ））（Ｈｅｒｍｏｎａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５１，３２９−３３９）；
ｂ）ＶＰ−１のＢｓｒＢＩとＨｉｎｄＩＩ切断部位間の欠失；これは上記の欠失ａ）の範囲内にあり、２９ＡＳを含む（△ＢＨ）；
ｃ）ＢｓｒＢＩとＨｉｎｄＩＩ間の欠失、およびリガンド（Ｐ１−ペプチド）の挿入（△ＢＨ＋Ｌ）；ならびに
ｄ）ＢｓｒＢＩ切断部位へのリガンド（Ｐ１−ペプチド）の挿入のみ（Ｂ＋Ｌ）。
【００３９】
２．ＶＰ３における変異
ａ）４４７中へ；ＹＹＬＳＲ  ＴＮＴＰＳ（ＣＰＶ：３００）
ｂ）５３４中へ；ＥＥＫＦＦ  ＰＱＳＧＶ（ＣＰＶ：３９０）
ｃ）５７３中へ；ＮＰＶＡＴ  ＥＱＹＧＳ（ＣＰＶ：４２６）
ｄ）５８７中へ；ＬＱＲＧＮ  ＲＱＡＡＴ（ＣＰＶ：４４０）
ｅ）７１３中へ；ＮＶＤＦＴ  ＶＤＴＮＧ（ＣＰＶ：５６５）
ここでＣＰＶは、同等のＣＰＶキャプシド中の位置を意味する
（アミノ酸（ＡＳ）の数による命名は、ＡＡＶ２のＶＰ−１中におけるＮ−末端の最初のＡＳで数え、それのＮ−末端にある５個のアミノ酸およびＣ−末端にある５個のアミノ酸を枠に入れた；その後に挿入を行ったアミノ酸に下線を施した）
下線を施したＡＳの隣にある５個の隣接ＡＳも同様にＡＡＶ２−キャプシドのループ内にあるので、これらにも挿入を行うことができる。
【００４０】
３．キャプシド変異体の解明
ＡＡＶ２−ゲノムにおける変異を行い、ＬａｃＺ−レポーター遺伝子を含む変異ウイルスをパッケージングした後、物理的ベクター力価をドットブロット法により測定し、キャプシド力価をＡ２０−抗体−ＥＬＩＳＡ法により測定し、ＨｅＬａ細胞への初回感染試験を行った。これにより、パッケージングが起こらないかまたは目的細胞の感染が妨害される程度にまで、変異がＶＰ−タンパク質の構造または種々のＶＰ−タンパク質間の相互作用を妨害したかどうかを判定できた（表１）。
【００４１】
【表１】
0004652570.tif 000002
物理的ウイルス力価（ドットブロット）およびキャプシド力価（Ａ２０−キャプシド−ＥＬＩＳＡ）を示す。濃度を粒子数／ｍｌで記載する。
【００４２】
結果：
ＬａｃＺ−トランスジーン（導入遺伝子）を含む組換えベクターである４種類すべてのＶＰ１変異体について、変異はパッケージング効率に影響を与えず、すべての変異ウイルスが非変異キャプシドをもつベクターと同様に良好な力価でパッケージングしうることを証明できた（粒子約１０12個／ｍｌ）。ＶＰ３領域に変異をもつＡＡＶ−ベクターも、ＬａｃＺ−レポーター遺伝子によってパッケージングに成功した（物理的粒子１０10〜１０12個／ｍｌ）。
【００４３】
４．ｒＡＡＶ−Ｐ１とラミニン受容体陽性指示細胞の結合
先に詳細に記載した付着試験で、上記の変異体は少なくともある場合にはラミニン−アルファ−受容体陽性指示細胞、たとえば細胞系Ｍ０７−ＬＰ１−Ｒに、野生型ＡＡＶより少なくとも１０倍高い効率で感染することが示された。さらに、可溶性Ｐ１−ペプチドを用いる競合アッセイにおいて、ｒＡＡＶ−Ｐ１による感染は実際に挿入リガンドにより仲介されることが認められた。
【００４４】
５．ＶＰ３におけるＰ１−変異
まず、ｐＡＶ２（ＡＴＣＣ  ３７２６１，参考文献５３）の４．８ｋｂ  ＢｇｌＩＩフラグメントをｐＵＣ１９（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ社）のＢａｍＨＩ切断部位にサブクローニングすることにより作成したプラスミドｐＵＣ−ＡＶ２から出発した。当業者に既知のＰＣＲ支援変異誘発により、プラスミドの特定部位に変異を形成した。その際、Ｐ１については、ラミニンフラグメントのＲＧＤ−結合モチーフ（Ａｕｍａｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，２６２，８２−８６）を含むアミノ酸配列ＱＡＧＴＦＡＬＲＧＤＮＰＱＧの１４アミノ酸ペプチドをコードする配列を、ヌクレオチド３５４３、３８０４、３９２１および３９６３の後に挿入した。これらはＡＡＶ２−キャプシドタンパク質のアミノ酸４４７、５３４、５７３および５８７の後への挿入に相当する（アミノ酸（ＡＳ）の数による命名は、ＡＡＶ２のＶＰ−１中におけるＮ−末端の最初のＡＳで数える）。これに続くＰＣＲにおいて、それぞれ２つの変異特異性プライマー、および鋳型としてのプラスミドｐＣａｐを用いた。これはｃａｐ−遺伝子のみを含み、ｐＵＣ−ＡＶ２から２．２ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＢｓｐＭＩ−フラグメントを切り取ってｐＵＣ１９のＥｃｏＲＩ切断部位へ挿入することにより構築される。次いで、このＰＣＲ生成物を細菌中で増幅し、配列決定し、Ｐ１を含む１．４ｋｂ  ＥｃｏＲＩ−ＸｃｍＩ−フラグメントを、対応する野生型−ｃａｐ−配列が切り取られたｐＵＣ−ＡＶ２中にサブクローニングした。したがって、アミノ酸挿入部位によりｐＩ−４４７、ｐＩ−５３４、ｐＩ−５７３およびｐＩ−５８７と命名したこれらのプラスミド（変異体）は、完全なＡＡＶ２−ゲノムを含んでいた。
【００４５】
６．ＡＡＶ２粒子の調製
ＨｅＬａ細胞（ヒト子宮頸部上皮細胞系）を前記プラスミドでトランスフェクションし、次いで約２０時間インキュベートした後、アデノウイルスタイプ５を感染させた。感染の７２時間後、細胞を破壊し、ＣｓＣｌグラディエントによりＡＡＶ２粒子を精製した。
【００４６】
７．実施例５によるキャプシド変異体の解明
この実験では、キャプシド変異体がウイルスゲノムをパッケージングして完全なキャプシドを形成できるかどうかを確認する。実施例５による変異体のＡＡＶ２粒子をまず、ウイルスゲノムを保有する粒子の数およびキャプシド変異体にパッケージングされたＤＮＡの量について調べた。このために、実施例６により精製したウイルス（変異体および野生型）をＤＮＡｓｅで処理し、ブロットし、Ｒｅｐプローブとハイブリダイズさせた。表２に示した力価は、ＬａｃＺレポーター遺伝子（トランスジーン）をもつＡＡＶ２変異体の力価を示す表１と異なり、変異キャプシドおよび野生型遺伝子（対応するリガンド挿入配列を保有する）をもつＡＡＶ２粒子の力価である。
【００４７】
これにより得られる力価は、野生型と比較して量的な差はあっても質的な差を示さなかった。量的な差もわずかであり、パッケージングに必須のドメインを変異によって機能的に排除できるほどではない（表２参照）。
【００４８】
これらの結果からキャプシドのコンホメーションに関する情報を得ることはできなかった。さらに他の実験で、Ａ２０モノクローナル抗体（Ａ２０ＭＡｂ）をＥＬＩＳＡに用いた。Ａ２０ＭＡｂは完全に構成されたＡＡＶ２キャプシドとのみ特異的に反応し、遊離キャプシドタンパク質とは反応しない（Ｗｉｓｔｕｂａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１，１３４１−１３５２）。これについても結果を表２に示す。この場合も、これからみられる力価は野生型と比較して量的または質的な決定的相異を示さなかった。これは、この場合Ｐ１の挿入により変化を引き起こさずに、構造的に関連のないループの挿入が行われたことを示す。そのＤＮＡ含有粒子形成能を考慮して、変異を２グループに分けることができた（表２）。１つのグループ（変異体Ｉ−４４７およびＩ−５８７）はＤＮＡ含有粒子形成能が野生ＡＶＶ２型に匹敵した。第２グループでは、この形成能が２桁小さかった（変異体Ｉ−５３４およびＩ−５７３）。これらの結果は電子顕微鏡分析により確認できた。
【００４９】
【表２】
0004652570.tif 000003
物理的ウイルス力価（ドットブロット）およびキャプシド力価（Ａ２０−キャプシド−ＥＬＩＳＡ）を示す。濃度を粒子数／ｍｌで記載する。
【００５０】
８．キャプシド表面でのＰ１の発現
次いで、Ｐ１がキャプシド表面で発現するかどうかを調べた。このために、抗−Ｐ１−ポリクローナル抗体を用いて２種類の異なるＥＬＩＳＡを行った。”直接”と呼ぶＥＬＩＳＡの場合、ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳ中のウイルス粒子で一夜、直接覆っておき、ブロックし、そして抗−Ｐ１−ポリクローナル抗体と共にインキュベートした。対照はＰＢＳ（陰性）およびラミニンフラグメント（陽性）であった。間接試験では、プレートをまずＡ２０ＭＡｂで覆い、次いでウイルス粒子、続いて抗−Ｐ１−ポリクローナル抗体を添加した。直接試験では、Ｉ−４４７およびＩ−５８７はきわめて顕著な反応を示したのに対し、Ｉ−５３４およびＩ−５７３は弱い反応を示したにすぎない。これに対し間接試験では、Ｉ−４４７、Ｉ−５８７およびＩ−５７３がきわめて顕著な反応を示したのに対し、Ｉ−５３４は全く反応を示さなかった（図１参照）。
【００５１】
９．インテグリン発現細胞へのＡＡＶ２−キャプシド変異体の結合
インテグリン受容体への変異体の結合を細胞付着試験法により調べ、その際この試験法をウイルス調製物に適合させた（Ａｕｍａｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，前掲；Ｖａｌｓｅｓｉａ−Ｗｉｔｔｍａｎｎ（１９９４），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８，４６０９−４６１９）。１００μｌのＰＢＳ中１×１０9個のウイルス粒子で直接に９６ウェルマイクロタイタープレートを覆い、１％ＢＳＡを含有するＰＢＳでブロックした。対照を、濃度４０μｇ／ｍｌのラミニンフラグメント（陽性対照）またはＢＳＡ（１０ｍｇ／ｍｌ；陰性対照）で覆った。１００μｌ当たり１×１０5個の細胞を、上記で覆ったウェルに添加した。付着させるために、それを３７℃で３０分間、加湿インキュベーター中でインキュベートした。付着時間後、付着していない細胞を除去するためにウェルをＰＢＳで２回洗浄した。付着した細胞を１００％エタノールで１０分間固定し、クリスタルバイオレットで染色し、ＥＬＩＳＡ読取器により５７０ｎｍで定量した。この場合はＢ１６Ｆ１０細胞およびＲＮ２２細胞系を選んだ。これらはＰ１特異性インテグリンをその表面に発現し、ＡＡＶ２感染に対し耐性だからである（Ｍａａｓｓ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｈｕｍ．Ｇｅｎ．Ｔｈｅｒ．，９，１０４９−１０５９；Ａｕｍａｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，前掲）。変異体のうちの２つ、Ｉ−４４７およびＩ−５８７はＢ１６Ｆ１０細胞にもＲＮ２２細胞にも同様に高い効率で結合した。これと明らかに対照的に、野生型ＡＡＶ２ならびに変異体Ｉ−５３４およびＩ−５７３のこれらの細胞への結合はみられなかった（図２）。
【００５２】
阻害試験では、細胞をプレートに乗せる前に種々の濃度（１〜２５０μｍｏｌ）の可溶性合成ペプチドＲＧＤＳまたはＲＧＥＳと混合した。この実験は、Ｂ１６Ｆ１０細胞への変異体Ｉ−４４７およびＩ−５８７の結合の特異性を調べるために行われた。したがって、これらの細胞付着試験は、結合部位に対して競合するペプチド（ＲＧＤＳ）（活性Ｐ１部位に対応）の存在下、および不活性ＲＧＥＳペプチドの存在下で行われた。Ｂ１６Ｆ１０細胞への変異体Ｉ−４４７およびＩ−５８７の結合は両方とも、３０μｍｏｌのＲＧＤＳペプチドを用いると５０％の効率で行われ、これに対しＲＧＥＳペプチド自体はより高い濃度でも不活性であった。ＲＧＤＳペプチドは、２５０μｍｏｌの濃度でＢ１６Ｆ１０細胞への結合を完全に阻害した（図３および４）。ＲＮ２２細胞についても同様な結果が得られた。
【００５３】
１０．実施例５による変異体を用いた感染試験
キャプシド変異体Ｉ−４４７およびＩ−５８７の親和性（トロピズム：ｔｒｏｐｉｓｍ）を調べるために、細胞系ＣＯ１１５およびＢ１６Ｆ１０に変異ウイルスを感染させた。ＣＯ１１５細胞はビリオンの野生型受容体親和性を調べるために用いられた。これらの細胞は野生型ＡＡＶ２により形質導入することができ、かつＰ１ペプチドを結合しないからである。Ｂ１６Ｆ１０細胞は、実施例９において既に得られた結果により用いられた。感染の３日後、抗−Ｒｅｐ抗体の補助により免疫蛍光測定法で、ウイルスＲｅｐタンパク質が発現するかどうかについて細胞を調べた（Ｗｉｓｔｕｂａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７１，１３４１−１３５２；Ｗｉｓｔｕｂａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６９，５３１１−５３１９）。細胞を顕微鏡スライド上で７０％集密にまで増殖させ、種々の濃度の本発明ウイルス調製物と共に無血清培地中でアデノウイルス５と一緒にインキュベートした。３日後、免疫蛍光アッセイ法でＲｅｐタンパク質合成のｉｎ  ｓｉｔｕ検出により、ウイルス調製物の力価を測定した（Ｒｅｐ力価）。その際、ＡＡＶ２感染細胞についての免疫蛍光染色をＷｉｓｔｕｂａらの方法（Ｗｉｓｔｕｂａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７１，１３４１−１３５２；Ｗｉｓｔｕｂａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６９，５３１１−５３１９）により行った。顕微鏡スライドをＰＢＳで１回洗浄し、メタノール（５分間、４℃）中で固定し、次いでアセトン（５分間、４℃）で処理した。次いで、ＡＡＶ２のＲｅｐタンパク質と反応するモノクローナル抗体７６−３と共に、細胞を室温で１時間インキュベートした。次いで洗浄し、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ中に１：５０希釈したローダミン共役−抗−マウス−二次抗体と共に、１時間インキュベートした。蛍光陽性細胞が得られたウイルス原液の下限希釈率から、力価を計算した。
【００５４】
Ｒｅｐ陽性ＣＯ１１５細胞は、野生型ＡＡＶ２ならびに両変異体Ｉ−４４７およびＩ−５８７の感染後に検出できた。ＣＯ１１５細胞の場合、Ｉ−４４７およびＩ−５８７の感染性は野生型より２〜３桁小さかった（表３）。Ｂ１６Ｆ１０細胞のトランスフェクションは、Ｉ−４４７によるものが野生型ウイルスによるものと同じく無効であった（表３）。これと明らかに対照的に、Ｉ−５８７による感染後にはＲｅｐ陽性Ｂ１６Ｆ１０細胞を検出でき、その際Ｉ−５８７ウイルスの力価は１×１０6Ｒｅｐ−ＥＦＵ／ｍｌと測定された（表３）。
【００５５】
変異体Ｉ−５８７によるＢ１６Ｆ１０細胞のトランスフェクションが変異キャプシド表面のＰ１配列とＢ１６Ｆ１０細胞表面のインテグリン受容体との相互作用によって特異的に仲介されるのかどうかを調べるために、細胞をウイルス感染前に、２００μｍｏｌ濃度の競合性ＲＧＤＳペプチドまたは不活性ＲＧＥＳペプチドと共にインキュベートした。ＲＧＤＳペプチドの添加はＢ１６Ｆ１０細胞に対するＩ−５８７の感染性を中和した（表３）が、対照ペプチドＲＧＥＳは影響を与えなかった。
【００５６】
【表３】
0004652570.tif 000004
野生型感受性ＣＯ１１５細胞および野生型耐性Ｂ１６Ｆ１０細胞に対する力価を示した。力価を、Ｉ−４４７およびＩ−５８７については野生型と同様にＲｅｐ−ＥＦＵ／ｍｌで、ｒＡＡＶ／ＬａｃＺおよびｒＡＡＶ（Ｉ−５８７）／ＬａｃＺについてはＬａｃＺ−ＥＦＵ／ｍｌで表した。ここでＥＦＵは発現形成単位を意味し、ｎｂは”測定しなかった”を意味する。
【００５７】
補足試験で、変異体Ｉ−５８７によるＢ１６Ｆ１０細胞の感染がさらに一次受容体ヘパラン硫酸−プロテオグリカンにより仲介されるのを排除するために、受容体類似体ヘパリンを用いた競合試験を行った。Ｂ１６Ｆ１０細胞の場合、ヘパリン添加後に感染力価（すなわちＩ−５８７の感染性）の変化を確認できなかった。これと対照的に、ＣＯ１１５細胞の感染は５０μｇ／ｍｌ（感染培地）のヘパリン添加で完全に遮断できた。このことから、この感染がヘパラン硫酸−プロテオグリカンと無関係にＰ１リガンドおよびインテグリン受容体を介して行われると推論される。
【００５８】
１１．ガラクトシダーゼを用いる、実施例５による変異体の感染アッセイ
さらに、実施例１０に基づく試験において、ＬａｃＺレポーター遺伝子を含むｒＡＡＶベクターであって、野生型（ｒＡＡＶビリオン）またはＩ−５８７（ｒＡＡＶ（Ｉ−５８７）ビリオン）を含有するものを調製した。これらのウイルス調製物をｒＡＡＶ／ＬａｃＺおよびｒＡＡＶ（Ｉ−５８７）／ＬａｃＺと命名し、Ｂ１６Ｆ１０細胞またはＣＯ１１５細胞（対照）の感染に用いた。
【００５９】
感染細胞を、感染の３日後、Ｘ−Ｇａｌ染色によりβ−ガラクトシダーゼ発現について調べた。その際、細胞化学的染色のためにＸ−Ｇａｌ−ｉｎ  ｓｉｔｕ試験（ＬａｃＺ力価）を用いた。次いで、β−ガラクトシダーゼ発現について調べるために、細胞をＰＢＳ中で１回洗浄し、次いで１．５％グルタルアルデヒドで固定した。次いで、細胞をＸ−Ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）で処理した。これについては既にＣｈｉｏｒｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｈｕｍ．Ｇｅｎ．Ｔｈｅｒ．，６，１５３１−１５４１に記載されている。β−ガラクトシダーゼ産生細胞が得られたウイルス原液の下限希釈率から、力価を計算した。
【００６０】
対照の場合、ＣＯ１１５細胞は両ビリオンに感染性であり、ただしｒＡＡＶ（Ｉ−５８７）／ＬａｃＺは有効性が２桁低かった。タイプＢ１６Ｆ１０の場合、予想どおりｒＡＡＶ／ＬａｃＺ感染後にβ−ガラクトシダーゼ陽性細胞はみられなかった。これに対しｒＡＡＶ（Ｉ−５８７）／ＬａｃＺ感染後には予想外に明らかに多数のβ−ガラクトシダーゼ陽性細胞が存在した。ｒＡＡＶ（Ｉ−５８７）／ＬａｃＺの力価は、５×１０4ＬａｃＺ−ＥＦＵ／ｍｌと測定された。Ｂ１６Ｆ１０細胞に対するｒＡＡＶベクターの感染性は、本発明の変異により４桁以上改善された（表３）。
【００６１】
補足試験で、変異体Ｉ−５８７によるＢ１６Ｆ１０細胞の感染がさらに一次受容体ヘパラン硫酸−プロテオグリカンにより仲介されるのを排除するために、受容体類似体ヘパリンを用いた競合試験を行った。Ｂ１６Ｆ１０細胞の場合、ヘパリン添加後に感染力価（すなわちＩ−５８７の感染性）の変化を確認できなかった。これと対照的に、ＣＯ１１５細胞の感染は５０μｇ／ｍｌ（感染培地）のヘパリン添加で完全に遮断される。このことから、この感染がヘパラン硫酸−プロテオグリカンと無関係にＰ１リガンドおよびインテグリン受容体を介して行われると推論される。
【００６２】
１２．ＶＰ３におけるＺ３４Ｃ−プロテインＡ変異
実施例５と同様に、ＶＰ３においてそこに述べた部位にＶＰ３の種々の変異を起こさせた。その際、プロテインＡのＺ３４Ｃドメイン（Ｓｔａｒｏｖａｓｎｉｋ，１９９７，前掲）をコードする配列をヌクレオチド３５４３、３８０４、３９２１および３９６３の後に挿入した。その際、長すぎる挿入による問題を避けるために、挿入部位にあるアミノ酸を１個または数個欠失させた。変異体の調製を、既に実施例５で実施したように行った。次いで、実施例６の場合と同じ方法で、対応するＡＡＶ２粒子を調製した。
【図面の簡単な説明】
【図１】  直接ＥＬＩＳＡ（黒色の棒）または間接ＥＬＩＳＡ（灰色の棒）における、キャプシド変異体および野生型の表面のＰ１の検出を示す。
【図２】  種々の細胞タイプへのキャプシド変異体または野生型の結合を示す。
【図３】  Ｂ１６Ｆ１０細胞へのキャプシド変異体Ｉ−４４７の結合の阻害を示す。
【図４】  Ｂ１６Ｆ１０細胞へのキャプシド変異体Ｉ−５８７の結合の阻害を示す。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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