(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
オクロバクトラム・インターメディウム（Ochrobactrum intermedium）、及び２種のパントエア・アグロメランス（Pantoea agglomerance）を含む共生微生物群によって、醤油粕を分解することを特徴とする共生微生物を用いた醤油粕の分解方法。
【請求項２】
オクロバクトラム・インターメディウム（Ochrobactrum intermedium）の１６ＳｒＤＮＡの塩基配列が、配列表の配列番号２に記載の配列である請求項１記載の共生微生物を用いた醤油粕の分解方法。
【請求項３】
一方のパントエア・アグロメランス（Pantoea agglomerance）の１６ＳｒＤＮＡの塩基配列が、配列表の配列番号３に記載の配列である請求項１又は２に記載の共生微生物を用いた醤油粕の分解方法。
【請求項４】
他方のパントエア・アグロメランス（Pantoea agglomerance）の１６ＳｒＤＮＡの塩基配列が、配列表の配列番号４に記載の配列である請求項１乃至３のいずれかに記載の共生微生物を用いた醤油粕の分解方法。
【請求項５】
共生微生物群を醤油粕とともに硫酸アンモニウムを添加したツァベック培地によって培養する請求項１乃至４のいずれかに記載の共生微生物を用いた醤油粕の分解方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、醤油製造後の醤油粕を、共生微生物を用いて分解する、醤油粕の分解方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
醤油粕は、醤油醸造の圧搾工程において、醤油諸味から諸味液汁（生醤油）を分離した残渣であり、その一部は塩分補給のために家畜の飼料として利用されている。またキノコ栽培の床素材として利用することも検討されている。さらに、最近では食品リサイクル法が施行され、その施工に伴い食品加工廃棄物の有効利用に関する技術について多くの検討がなされている。
【０００３】
しかし、醤油粕に含まれている塩分は５〜８％程度であり、そのままの状態では上記のような飼料等に利用するにしても、塩分の含有量を低減させる必要がある。このようなことから、上記のような有効利用はごく一部に限られており、醤油粕の大部分は廃棄、焼却されているのが現状である。このように焼却がなされると、醤油粕に含有されている塩分によって焼却炉が腐食するおそれがあり、また塩分が含まれているので、燃焼によってダイオキシン等の有害な塩素化合物が発生するおそれもある。
【０００４】
そこで、このような問題を解決するため、燃焼によらない醤油粕の分解技術を開発することも検討されており、そのような技術として、たとえば下記特許文献１乃至特許文献３のような特許出願がなされている。
【０００５】
【特許文献１】特開２００５−６６４９号公報
【特許文献２】特開２００５−７３９０号公報
【特許文献３】特開平１０−９９０７２号公報
【０００６】
特許文献１や特許文献２は、醤油粕を嫌気性細菌によって処理してメタンガスを発生させることを開示するものであり、発生したメタンガスはエネルギーとして有効利用されている。また特許文献３は、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）によって醤油粕を好気的に分解する技術を開示するものである。
【０００７】
嫌気処理に比べると、好気処理の方が微生物による醤油粕の分解反応が速く進行し、醤油粕の分解率も良好となる。この特許文献３に開示された技術では、醤油粕を５０％程度まで分解することができる。一方、キノコによって醤油粕を分解することも行なわれているが、この場合でも醤油粕の分解は５０％程度である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、上記のような従来技術の現状に鑑み、醤油粕の分解率を一層高めることができる醤油粕の分解方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、このような課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、オクロバクトラム・インターメディウム（Ochrobactrum intermedium）、及び２種のパントエア・アグロメランス（Pantoea agglomerance）を含む共生微生物群を用いることにより、醤油粕の分解率が著しく向上することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、請求項１記載の発明は、オクロバクトラム・インターメディウム（Ochrobactrum intermedium）、及び２種のパントエア・アグロメランス（Pantoea agglomerance）を含む共生微生物群によって、醤油粕を分解することを特徴とする。
【００１２】
さらに請求項２記載の発明は、請求項１記載の共生微生物を用いた醤油粕の分解方法において、オクロバクトラム・インターメディウム（Ochrobactrum intermedium）の１６ＳｒＤＮＡの塩基配列が、配列表の配列番号２に記載の配列であることを特徴とする。さらに請求項３記載の発明は、請求項１又は２に記載の共生微生物を用いた醤油粕の分解方法において、一方のパントエア・アグロメランス（Pantoea agglomerance）の１６ＳｒＤＮＡの塩基配列が、配列表の配列番号３に記載の配列であることを特徴とする。
【００１３】
さらに請求項４記載の発明は、請求項１乃至３のいずれかに記載の共生微生物を用いた醤油粕の分解方法において、他方のパントエア・アグロメランス（Pantoea agglomerance）の１６ＳｒＤＮＡの塩基配列が、配列表の配列番号４に記載の配列であることを特徴とする。さらに請求項５記載の発明は、請求項１乃至４のいずれかに記載の共生微生物を用いた醤油粕の分解方法において、共生微生物群を醤油粕とともに硫酸アンモニウムを添加したツァベック培地によって培養することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によって、醤油粕の分解率が従来に比べて著しく向上することとなった。ちなみに、従来では醤油粕の分解がせいぜい５０％程度であったところ、本発明においては、
２５％程度まで分解することができた。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明の共生微生物を用いた醤油粕の分解方法は、上述のようにオクロバクトラム・インターメディウム（Ochrobactrum intermedium）、及び２種のパントエア・アグロメランス（Pantoea agglomerance）を含む共生微生物群によって、醤油粕を分解する方法である。
【００１６】
オクロバクトラム・インターメディウム（Ochrobactrum intermedium）は、オクロバクトラム属に属する微生物であり、好ましくは、１６ＳｒＤＮＡの塩基配列が、配列表の配列番号２に記載された塩基配列を有するオクロバクトラム・インターメディウム（  Ochrobactrum intermedium）が用いられる。
【００１７】
またパントエア・アグロメランス（Pantoea agglomerance）は、パントエア属に属する微生物であり、好ましくは、１６ＳｒＤＮＡの塩基配列が、配列表の配列番号３に記載された塩基配列を有するもの、及び１６ＳｒＤＮＡの塩基配列が、配列表の配列番号４に記載された塩基配列を有するものの、２種のパントエア・アグロメランス（Pantoea agglomerance）が用いられる。
【００１８】
さらに、共生微生物群には、１６ＳｒＤＮＡの塩基配列が、配列表の配列番号１に記載のアンカルチャード・バクテリウム（uncultured bacterium）を含ませることも可能である。これは、属及び種が特定されていないが、１６ＳｒＤＮＡの塩基配列のみが特定されている公知の微生物である。
【００１９】
上記１６ＳｒＤＮＡの塩基配列が、配列表の配列番号２に記載された塩基配列を有するオクロバクトラム・インターメディウム（Ochrobactrum intermedium）、配列表の配列番号３に記載された塩基配列を有するパントエア・アグロメランス（Pantoea  agglomerance）、配列表の配列番号４に記載された塩基配列を有するパントエア・アグロメランス（Pantoea agglomerance）、及び配列表の配列番号１に記載記載された塩基配列を有するアンカルチャード・バクテリウム（uncultured bacterium）を含む共生微生物群は、発酵した腐葉土から分離して得られるものである。このような腐葉土は、採取された後、１年以上放置することで発酵させて使用されるものである。
【００２０】
このようにして得られた共生微生物群を、醤油粕を唯一の炭素源とした培地で振とう培養することによって、醤油粕が分解される。培地としては、たとえばツァベック培地に、（ＮＨ4）2ＳＯ4を添加したようなものが用いられる。尚、ツァベック培地の組成は次のとおりである。
【００２１】
成分                      重量（ｇ／ｌ）
ＮａＮＯ3               ２ｇ
Ｋ2ＨＳＯ4              １ｇ
ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ              ０．５ｇ
ＫＣｌ                      ０．５ｇ
ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ              ０．０１ｇ
炭素源                    ３０ｇ
このツァベック培地中の炭素源とは、本実施形態では醤油粕のことである。
【００２２】
培養時の温度は２５℃〜４０℃程度であることが好ましく、２８℃〜３２℃であることがより好ましい。また培養時のｐＨは、３．５〜５．５であることが好ましく、４．０〜５．０であることがより好ましい。
【実施例】
【００２３】
以下、本発明の実施例について説明する。
【００２４】
〔試験例１〕醤油粕の分解能の測定
次の実施例１、実施例２、比較例１、比較例２について醤油粕の分解能の測定試験を行った。
【００２５】
（実施例１）
発酵した腐葉土から共生微生物群を分離し、その共生微生物群と醤油粕とを培地に添加して共生培養を行なった。腐葉土としては、有限会社京栃製の「腐葉土１００％」を含む腐葉土を用いた。また発酵した腐葉土からの共生微生物群の分離は、腐葉土１ｇを１０ｍｌの滅菌水に懸濁し、その上清を植菌することによって行なった。
【００２６】
また分離した共生微生物群による共生培養の培地としては、ツァベック培地に、（ＮＨ4）2ＳＯ4を添加してｐＨ４．５に調製したものを用いた。また共生培養は、３０℃で２週間回転数１２０ｒｐｍ、振とう行った。
【００２７】
（実施例２）
上記実施例１の共生微生物群、醤油粕とは別に、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）を上記実施例１の培地に添加し、実施例１と同様の条件で培養して醤油粕を分解した。
【００２８】
（比較例１）
醤油粕の他にアスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）のみを上記実施例１の培地に添加し、実施例１と同様の条件で培養して醤油粕を分解した。
【００２９】
（比較例２）
ブランクとして、微生物を添加せずに醤油粕のみを上記実施例１の培地に添加し、実施例１と同様の条件で培養して醤油粕を分解した。
【００３０】
上記のような実施例１、２、比較例１、２について、培養１週間後及び２週間後のタンパク質量、還元糖量、残存粕量を測定した。醤油粕は湿潤重量で１０ｇ、乾燥固形分重量で８．２０ｇのものを用い、その乾燥固形分重量と、残存粕量とから醤油粕残渣の分解率を求めた。試験結果を次表１に示す。
【００３１】
【表１】
0004693169.tif 000002
【００３２】
表１からも明らかなように、ブランクである比較例２では、２週間後の残存粕量が６．２５ｇで、醤油粕残渣は７６％程度であるのに対し、共生微生物群を添加した実施例１及び２では、２週間後の残存粕量がそれぞれ２．０５及び１．９９で、醤油粕残渣は２５％及び２３％まで分解されており、共生微生物群を添加した場合とブランクとの比較では醤油粕残渣の分解率に顕著な差異があった。
【００３３】
一方、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）のみを添加した比較例１では、残存粕量は３．５１ｇで、醤油粕残渣は４３％にまで減少していた。しかし共生微生物群を添加した実施例１及び２では、このアスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）のみを添加した比較例１よりも醤油粕残渣の分解率が優れていた。
【００３４】
また実施例２は実施例１に比べてわずかに醤油粕残渣の分解率が優れていたが、その差は２％程度であり、従って、上記のような共生微生物群にさらにアスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）を添加しても、分解率が著しく向上するわけではないこともわかった。
【００３５】
さらに、実施例１の培養１週間後の残存粕量は５．０３ｇで、醤油粕残渣は６１％程度であり、上記培養２週間後の醤油粕残渣の分解率とはかなりの差異があった。このことから、上記共生微生物群による醤油粕残渣の分解能は２週間程度でより好適に発揮されることがわかった。一方、実施例１についてはさらに３週間後まで培養を行なったが、
醤油粕残渣は２３％程度であり、培養２週間後と３週間後とではさほど効果の差異が認められなかった。
【００３６】
尚、培養１週間後及び２週間後のタンパク質量は、実施例１、２ともに、ブランクの比較例２に比べて多く、また比較例１よりも多かった。これは、実施例１、２の共生微生物群から、醤油粕を分解するための酵素が産生されたためと推定され、またその産生量が比較例１よりも多かったものと推定される。そして、実施例１、２ともに、培養１週間後よりも２週間後のタンパク質量が多かったが、醤油粕を分解するための酵素産生量が増加したものと推定される。また他の要因として不溶性タンパク質が可溶化されていることも考えられる。
【００３７】
さらに、培養１週間後及び２週間後の還元糖量は、実施例１、２ともに、ブランクの比較例２に比べて少なかった。これは、セルロースの分解の程度の差異によるものと認められる。ただし表１における試験結果の重要性はあくまで残存粕量であり、この表１の結果から、実施例１、２の醤油粕残渣の分解率が比較例やブランクよりも優れていることは明らかである。
【００３８】
〔試験例２〕醤油粕分解に対する初発ｐＨの影響
上記試験例１のような試験を行なうに際して、培養直後における初発ｐＨが醤油粕の分解能にどのような影響を与えるかについて試験を行なった。上記実施例１のように共生微生物群を添加した場合と、比較例２のブランクとについて、初発ｐＨを、５、６、７、８、９と変えて、試験例１のような培養を行い、醤油粕の残渣量を求めた。その試験結果を図１に示す。
【００３９】
図１からも明らかなように、実施例１及び比較例２ともに、初発ｐＨを変えても、２週間後の醤油粕の残渣量のほとんど変化はなく、従って醤油粕の分解に対して、培養直後の初発ｐＨはほとんど影響しないことがわかった。ちなみに、培養２週間後においては、初発ｐＨのいかんにかかわらず、いずれの場合もｐＨ９．２〜９．５程度となっていた。
【００４０】
〔試験例３〕共生微生物群の解析
さらに共生微生物群の解析を、ＰＣＲ−ＤＧＧＥ法によって行った。
これをより詳細に説明すると、先ず上記のような共生微生物群から１６ＳｒＤＮＡを抽出し、抽出された１６ＳｒＤＮＡの約４００ｂｐをＰＣＲ法によって増幅した。
【００４１】
ＤＮＡポリメラーゼにはAmpliTaq Gold（Applied Biosystems，CA，USA）を用い、プライマーには次に示すものを用いた。
【００４２】
ＧＣ−ＮＳ3f（Forward）
５’−ＧＣクランプ−ＧＣＡＡＧＴＣＴＧＧＴＧＣＣＡＧＣＡＧＣＣ−３’
ここで、ＧＣクランプとは、次の配列のものである。
ＣＧＣＣＣＧＣＣＧＣＧＣＣＣＣＧＣＧＣＣＣＧＴＣＣＣＧＣＣＧＣＣＣＣＣＧＣＣＣＧ
【００４３】
907r（Reverse）
５’−ＣＣＧＴＣＡＡＴＴＣＣＴＴＴＲＡＧＴＴＴ−３’
【００４４】
上記プライマーＧＣ−ＮＳ3f及びプライマー907rは、次の文献１に記載されている。
〔文献１〕「ISHI(K.),TAKII(S.),FUKUNAGA(S.) and AOKI(K.):Characterization by   denaturing gradiant gel electrophoresis of bacterial communities in deep       groundwater at the Kamaishi Mine, Japan.j.Gen.Appl.Microbiol.2000,46,85-93.」
【００４５】
また上記プライマーＧＣ−ＮＳ3fの配列は、配列表の配列番号５に記載され、プライマー907rの配列は、配列表の配列番号６に記載されている。
【００４６】
さらに、サーマルサイクラーには  GeneAmp PCR System 9600（Applied Biosystems，CA，USA）を用いた。ＰＣＲは、次の（１）〜（８）の手順で行なった。
【００４７】
（１）９４℃              ７分
（２）９４℃            ６０秒
（３）５５℃〜６５℃    ６０秒
（４）７２℃          １２０秒
（５）９４℃            ６０秒
（６）５５℃            ６０秒
（７）７２℃          １２０秒
（８）７２℃            １０分
【００４８】
尚、（２）〜（４）の変性、アニーリング、ポリメラーゼ伸長の各工程は、２０サイクル行った。このサイクル中、（３）のアニーリングでは２サイクル毎にアニーリング温度が１℃下がるように設定した。さらに（５）〜（７）の変性、アニーリング、ポリメラーゼ伸長の各工程は、１５サイクル行った。
【００４９】
次に、このようにして増幅させた共生微生物群の１６ＳｒＤＮＡについて、ＤＧＧＥ
（変性剤濃度勾配ゲル電気泳動）を行なった。ゲルには２％アガロースゲルを用い、変性剤としては、ホルムアミドと尿素との混合液を用い、変性剤の濃度勾配は３０〜６０％で行なった。そして電気泳動後の変性剤濃度勾配ゲルを、臭化エチジウウムのような蛍光色素で染色し、紫外線で励起された蛍光をＣＣＤカメラのような撮像素子で撮影してバンドパターンを得た。蛍光を励起する紫外線としては、３１０ｎｍの波長のものを用いた。
【００５０】
この電気泳動バンドパターンの写真を図２に示す。図２からも明らかなように、後述する４種の微生物由来のものと認められる別々の４つのバンドが現出されていた。
【００５１】
さらに、このようにして得られたバンドをテンプレートとし、上記プライマーＧＣ−ＮＳ3f（Forward）及びプライマー907r（Reverse）を用いて１６ＳｒＤＮＡの約４００ｂｐ（E.coli No.518-907）を増幅した。ＤＮＡポリメラーゼとサーマルサイクラーも上記と同じものを用い、同じ条件でＰＣＲを行なった。
【００５２】
ＰＣＲ産物の増幅確認には、２％アガロースゲル電気泳動を用いた。電気泳動後、紫外線照射下でアガロースゲル中の増幅断片とマーカー100bp DNA Ladder（タカラバイオ社製）を比較し、目的の長さと考えられる増幅断片を確認した。
【００５３】
得られたＰＣＲ産物を再度ＤＧＧＥによる電気泳動をし、バンドの純度を確認後、バンド部分のゲルを切り出した。このバンドをテンプレートとし、次のプライマー518f  （Forward）及び上記プライマー907r（Reverse）を用いてＰＣＲを行なった。
【００５４】
518f（Forward）
５’−ＣＡＧＣＡＧＣＣＧＣＧＧＴＡＡＴＡＣ−３’
このプライマー518fは、次の文献２に記載されている。
〔文献２〕「長島浩二、八十川大輔、中川良二、池田隆幸：塩基配列に基づく細菌同定法の食品ミクロフローラ解析への応用、日本食品科学工学会誌．1998,45(1),58-65.」
また、このプライマー518fは、配列表の配列番号７に記載されている。
【００５５】
さらにＰＣＲは次の条件で行なった。
（１）９４℃            １０分
（２）９４℃            ３０秒
（３）４８℃              １分
（４）７２℃            ９０秒
（５）７２℃            １０分
【００５６】
尚、（２）〜（４）の変性、アニーリング、ポリメラーゼ伸長の各工程は、２５サイクル行った。
【００５７】
得られた産物をQIA quick PCR Purification Kit（QIAGEN,Hilden,Germany）を用いて精製し、塩基配列解析の試料とした。精製したＰＣＲ産物をテンプレートとし、シーケンシング反応に供した。シーケンシング反応は、ABI PRISM BigDye Terminator Kit    （Applied Biosystems，CA，USA）とシーケンスプライマー（上記518f（Forward）及び
907r（Reverse））を用い、GeneAmp PCR System 9600（Applied Biosystems，CA，USA）上で行なった。
【００５８】
反応生成物はDye Ex 2.0 Spin Kit（QIAGEN, Hilden, Germany）を用いて精製し、ABI PRISM 3100 DNA Sequencer（Applied Biosystems，CA，USA）で配列解読を行なった。得られたバンドの配列と類似の塩基配列を国際塩基配列データベース（GenBank/EMBL/DDBJ）から検索するためＢＬＡＳＴによる相同性検索を行なった。
【００５９】
公知の微生物との相同率から、次表２に記載した４種の微生物が、共生微生物群に含まれているものであると同定した。すなわち、共生微生物群にはオクロバクトラム・インターメディウム（Ochrobactrum intermedium）、２種のパントエア・アグロメランス（Pantoea agglomerance）が含まれていることがわかった。また他の１種として属及び種が特定されていないが、１６ＳｒＤＮＡの塩基配列のみが特定されているアンカルチャード・バクテリウム（uncultured bacterium）が含まれていることもわかった。
【００６０】
【表２】
0004693169.tif 000003
【００６１】
また、共生微生物群における各菌株の形態学的特徴は、次のとおりである。
【００６２】
オクロバクトラム・インターメディウム（Ochrobactrum intermedium）は、偏性好気性菌で、薄いクリーム色を呈し、湿り気をもち広がる。パントエア・アグロメランス（Pantoea  agglomerance）は、２種ともに偏性好気性菌で、薄い黄色を呈し、点状でコロニーは小さい。アンカルチャード・バクテリウム（uncultured bacterium）は、偏性好気性菌で、白色を呈し、放射状にコロニーが形成されている。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】培地のｐＨと醤油粕の残渣量の相関関係を示すグラフ。
【図２】共生微生物群の１６ＳｒＤＮＡの電気泳動バンドパターンの写真。
【図１】
0004693169.tif 000004
【図２】
0004693169.tif 000005
【配列表】
0004693169000001.app