(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式I：
【化１】
0004652820.tif 000018
の新規のニトリルグリコシド。
【請求項２】
請求項１に記載の式Iの化合物を含む、医薬組成物（ただし、組成物が植物抽出物の形態の組成物である場合を除く）。
【請求項３】
リファンピシン、アンピシリン、テトラサイクリン、ナリジクス酸またはクロトリマゾールを更に含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記式Iの化合物が、0.1μg/mlから100μg/mlの濃度で存在する、請求項２または３に記載の組成物。
【請求項５】
Moringa oleiferaから式I：
【化２】
0004652820.tif 000019
の化合物を単離する方法であって、Moringa oleiferaの種子を乾燥および粉砕する工程、乾燥および粉砕した種子をエタノールで処理してエタノール抽出物を得る工程、エタノール抽出物をろ過、濃縮および凍結乾燥に供する工程、エタノール抽出物を水に溶解する工程、溶液をフィルターろ過して水に不溶性の成分および可溶性の成分を得る工程、可溶性の成分をヘキサンで抽出し、その後、それぞれクロロホルム、酢酸エチルおよびH2O飽和n-ブタノールで抽出する工程、酢酸エチル抽出物をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル）および薄層クロマトグラフィーに供する工程を含む方法。
【請求項６】
前記種子を、30℃から45℃の範囲の温度で日陰で風乾させる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記乾燥および粉砕した種子を、30℃から45℃の範囲の温度で48時間エタノールで処理する、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記エタノール抽出物を、40℃の温度で減圧下で濃縮する、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
水分を除去するためにそれぞれのクロロホルム、酢酸エチルおよびn-ブタノール画分にNaSO4（無水）を加える、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
全てのクロロホルム、酢酸エチルおよびn-ブタノール画分を、40℃で減圧下で濃縮する、請求項５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ニアジリジン（NIAZIRIDIN）と名付けられた式I：
【０００２】
【化１】
0004652820.tif 000002
【０００３】
の新規のニトリルグリコシド、ならびに、そのアナログおよび誘導体に関する。本発明は、また、Moringa oleiferaの鞘から、生体活性を指標とする分画によって、ニアジリジンと名付けられた式Iの新規のニトリルグリコシドならびにその誘導体およびアナログを単離する方法に関する。本発明は、特に、ニアジリジンと名付けられた式Iの新規のニトリルグリコシドならびにその誘導体およびアナログの、グラム陽性および陰性の細菌に対して一般的に用いられる抗生物質（例えばリファンピシン、テトラサイクリンおよびアンピシリン）の生体活性を増大するバイオエンハンサーとしての活性に関する。この生物分子は、また、胃腸の膜を介した薬剤、ビタミンおよび栄養素の吸収を、その生体活性を増すことによって増大させる。それゆえ、ニアジリジンは、薬剤および栄養素との併用療法に使用することができ、その結果、薬剤に関する毒性を減らし、費用を減らし、化学療法の期間を減らすことが出来る。
【背景技術】
【０００４】
細菌および真菌類によって引き起こされる感染症は、世界で何百万人もの人が罹患しており、米国単独においては、病気が与える負荷が年間200億ドルを超える。新たな抗生物質および抗真菌剤を発見して開発するための具体的で系統的なプログラムが、かなりの程度まで、市販で使用されている薬剤へのこれらの微生物の耐性の研究によって行われている。しかしながら、抗生物質の見境のない使用が原因で、バンコマイシンおよびメチシリンのような比較的に新しい抗生物質に対する耐性が、既に、EnteroccocciおよびStaphylococciにおいてそれぞれ報告されている。Pharmaceutical Research and Manufacturers of America (PhRMA)によれば、1998年には、臨床開発の全ての段階において、細菌感染および真菌感染に対する開発中の27の抗生物質および12の抗真菌剤が存在していた。現在、約100かそこらの抗生物質が治療で使用されている。抗生物質業界の重要な課題は、耐性のためだけでなく、副作用のためにも、絶え間ない技術革新が必要であることである。ペニシリンにアレルギー症状を呈する患者への代替手段として使用される良く知られたマクロライド系抗生物質であるエリスロマイシンの使用は、著しい胃腸の問題をもたらし、肝薬物代謝酵素との相互作用も示す。しかしながら、アジスロマイシン、ジリスロマイシンと名付けられたエリスロマイシンの誘導体は、これらの問題を生じない。そのため、しばしば、有用な抗生物質のアナログであって、同じ結果が得られるがより少ない副作用を有する複数のアナログを開発することが可能である。一方、これらの誘導体は、化学療法の費用を増大するであろう。抗結核治療のような、化学療法をより長い期間（6から8ヶ月）維持しなければならない場合、臨床の場面では、更により複雑になる。第一線で用いられている抗結核剤であるリファンピシンおよびイソニアジドは、哺乳類系において著しい毒性を示す。胃の炎症、肝炎が、リファンピシンの主な副作用であり、末梢神経炎、拒食症、吐き気、黄疸はイソニアジドの高用量投与に関連している22。このような場合、薬剤に関連する毒性を減ずるために、生体活性を有するエンハンサー（バイオエンハンサー）を使用することができる。
【０００５】
バイオエンハンサーは、それ自身は薬剤活性を有さないが、併用療法において、薬剤の生物学的活性または生体利用度または吸収の促進および増加をもたらす分子である。天然物、特に植物に由来する天然物は、感染症の薬剤開発において重要な役割を担っている。単離した植物の生体分子またはその半合成誘導体によって、医薬品の生産に有用な手がかりが得られている。WHOによれば、世界の人口の80％近くが、一次医療（プライマリー・ヘルス・ケア）として漢方薬に頼っている。1つの生体分子の作用が他の無関係の化合物によって増幅される相乗作用は、漢方薬の特徴である。例えば、ベルベリン（Berberis fremontiiから単離された抗菌剤アルカロイド）は、単体では非常に弱い抗菌活性を有している。しかしながら、他の化合物である5-メトキシヒドノカプリン（5-MHC）と組み合わせることにより、Staphylococcus auruesに対するベルベリンの抗菌活性は、200倍増す23。他の興味深い報告としては、Piper nigrumから単離されたピペリンと、必須医薬品、例えば、抗生物質、降圧剤および抗癲癇剤ならびに栄養素24、フェニトイン25、ペントバルビタール26、テオフィリン27との組み合わせがあり、この組み合わせによって、吸収増加、血中濃度の増加および生体内での長時間における薬剤利用性による「用量の抑制」をもたらす（米国特許第5,536,506、米国特許第5,616,593および米国特許第5,972,382）。ピペリンは、また、結核およびハンセン病の治療のための多剤処方において加えられる。リファンピシン、ピラジナミドおよびイソニアジドを含む製剤が、ヒトのボランティアにおいて試験されている（印国特許第1232/DEL/89）。大部分の薬剤において、ピペリンの存在下での薬剤の相対的レベルおよびピーク濃度がより高いものであった。我々は、最近、抗生物質および抗がん剤を含む組成物におけるウシの尿留出物のバイオエンハンサー活性を証明した（米国特許第6,410,059）。それゆえ、生体利用性を増すことは、用量レベルを低下させ、治療期間を短くするのに役立つ。
【特許文献１】米国特許第5,536,506
【特許文献２】米国特許第5,616,593
【特許文献３】米国特許第5,972,382
【特許文献４】印国特許第1232/DEL/89
【特許文献５】米国特許第6,410,059
【非特許文献１】Kumar et al 1976; J. Bacteriology 125: 545
【非特許文献２】Philipp et al 1996; Proc. Natl. Acad. Sci USA 93, 3132-3137
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の主目的は、抗生物質、他の薬剤および栄養素と組み合わせて使用する場合に、生物学的活性を増大する活性を有する植物抽出物を同定することである。
【０００７】
本発明の他の目的は、バイオエンハンサー特性を有する活性な植物抽出物から生体分子の種類を同定、特徴づけおよび確証することである。
【０００８】
本発明の更なる他の目的は、バイオエンハンサーとともに用いた場合における、胃腸の膜を介した栄養素および薬剤の生体利用性（吸収または摂取）の増大を試験することである。
【０００９】
本発明の更なる他の目的は、in vitroアッセイを使用した、バイオエンハンサー分子の作用機構を同定することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
新規のニトリルグリコシド、ニアジリジン（1）を、Moringa oleiferaの鞘から、生体活性を指標とする分画によって単離した。この化合物は、グラム陽性および陰性の細菌に対して一般的に用いられる抗生物質（例えばリファンピシン、テトラサイクリンおよびアンピシリン）の生体活性を増大することができる。更には、この化合物は、C. albicansに対する抗真菌剤の活性を増大し、胃腸の膜を介した薬剤および栄養素の吸収を増す。それゆえ、ニアジリジンは、抗生物質との併用療法に使用することができ、その結果、薬剤に関する毒性を減らし、費用を減らし、化学療法の期間を減らすことが出来る。
【００１１】
したがって、本発明は、以下の式I：
【００１２】
【化２】
0004652820.tif 000003
【００１３】
の新規のニトリルグリコシド、ならびに、医薬的に許容されるその誘導体およびアナログを供給する。
【００１４】
本発明の1つの実施態様においては、誘導体は、式II：
【００１５】
【化３】
0004652820.tif 000004
【００１６】
（式中、Rが
【００１７】
【化４】
0004652820.tif 000005
【００１８】
である場合、R1は、CH3、CH2CH3、COCH3、COCH2CH3、ベンゾエート、3-ニトロベンゾエート、4-ニトロベンゾエート、3,4,5-トリメトキシベンゾエート、o-アニソエート、m-アニソエート、p-アニソエート、ラウレート、3,3-ジメチルアクリレート、クロトネート、ミリステート、パルミテート、ペントース、ヘキソースおよびHからなる群から選択され、ただし、R1がペントースおよびヘキソースから選択される場合は、R2もそれぞれペントースおよびヘキソースであり、R1がHである場合は、R2はペントースまたはヘキソースのいずれかであり、他の場合はR2は式III:
【００１９】
【化５】
0004652820.tif 000006
【００２０】
の化合物である）の化合物を含む。
【００２１】
本発明の他の実施態様においては、式IIにおいて、Rが-N=C=Sである場合、R1は、CH3、CH2CH3、COCH3、COCH2CH3、ベンゾエート、3-ニトロベンゾエート、4-ニトロベンゾエート、3,4,5-トリメトキシベンゾエート、o-アニソエート、m-アニソエート、p-アニソエート、ラウレート、3,3-ジメチルアクリレート、クロトネート、ミリステート、パルミテート、ペントース、ヘキソースおよびHからなる群から選択され、ただし、R1がペントースである場合は、R2はペントースまたはヘキソースのいずれかであり、R1がヘキソースである場合は、R2はヘキソースであり、R1がHである場合は、R2はペントースまたはヘキソースのいずれかであり、他の場合はR2は式IIIである。
【００２２】
本発明は、また、生物学的に活性な分子、ならびに、薬剤分子の生物学的活性および生体利用吸収性（胃腸の膜を介した吸収性）を有効に増大する量で、式I：
【００２３】
【化６】
0004652820.tif 000007
【００２４】
の化合物を含む医薬組成物に関する。
【００２５】
本発明の1つの実施態様においては、生物学的活性分子は、薬剤および栄養補助剤から選択される。
【００２６】
本発明の更なる実施態様においては、薬剤は、グラム陰性およびグラム陽性の細菌の感染の治療に使用される、抗生物質、抗菌剤および抗-TB剤からなる群から選択される。
【００２７】
本発明の他の実施態様においては、抗生物質は、アミノグリコシド、リファンピシン、ペニシリン、フルオロキノロン、およびこれらの臨床的に使用される誘導体からなる群から選択される。
【００２８】
本発明の更なる実施態様においては、薬剤は、リファンピシン、エタンブトール、ピラジナミドおよびストレプトマイシンからなる群から選択される抗結核剤を含む。
【００２９】
本発明の更なる他の実施態様においては、薬剤は、真菌類の感染の治療に用いられる抗真菌剤を含む。
【００３０】
本発明の更なる実施態様においては、抗真菌剤は、クロトリマゾール、ミカノゾール、ケタコノゾール、フルカノアゾールおよびイトラカノゾールを含むアゾールからなる群から選択される。
【００３１】
本発明の更なる他の実施態様は、抗真菌剤は、真菌類の菌糸型および酵母型に対して有効な抗真菌剤を含む。
【００３２】
本発明の更なる他の実施態様においては、式Iの化合物は、0.1μg/mlから100μg/mlの濃度で存在する。
【００３３】
本発明の更なる他の実施態様においては、式Iの化合物は、Moringa oleiferaの鞘に由来する植物粗抽出液の形態または単離した濃縮フラクションの形態で使用される。
【００３４】
本発明の更なる他の実施態様においては、生物学的に活性な分子の生体活性は、式Iの化合物と組み合わせて使用した場合に1.5倍から80倍の範囲で増幅する。
【００３５】
本発明の他の実施態様においては、栄養補助剤は、ビタミン、アミノ酸、イオンおよび窒素含有塩基からなる群から選択される。
【００３６】
本発明は、また、Moringa oleiferaの種子を乾燥および粉砕する工程、乾燥および粉砕した種子をエタノールで処理してエタノール抽出物を得る工程、エタノール抽出物をろ過、濃縮および凍結乾燥して式I：
【００３７】
【化７】
0004652820.tif 000008
【００３８】
のエタノール粗抽出物を得る工程を含む、Moringa oleiferaから式Iの化合物を単離する工程を供給する。
【００３９】
本発明の1つの実施態様においては、種子は、30℃から45℃の範囲の温度で日陰で風乾させる。
【００４０】
本発明の他の実施態様においては、乾燥および粉砕した種子は、30℃から45℃の範囲の温度で約48時間エタノールで処理する。
【００４１】
本発明の他の実施態様においては、エタノール抽出物は、約40℃の温度で減圧下で濃縮する。
【００４２】
本発明の更なる他の実施態様においては、エタノール粗抽出物は、溶媒分画に供して式Iの化合物を単離する。
【００４３】
本発明の他の実施態様においては、溶媒分配は、式Iの化合物のエタノール粗抽出物を水に溶解する工程、溶液をフィルターろ過して水に不溶性の成分および可溶性の成分を得る工程、前記得られた不溶性の成分をメタノールに溶解する工程、可溶性の成分をヘキサンで抽出し、その後、それぞれクロロホルム、酢酸エチルおよびH2O飽和n-ブタノールで抽出する工程、全ての溶媒成分を減圧下で濃縮する工程によって行われる。
【００４４】
本発明の他の実施態様においては、NaSO4（無水）は、水分を除去するためにそれぞれの溶媒画分に加える。
【００４５】
本発明の更なる他の実施態様においては、全ての溶媒画分は、40℃で減圧下で濃縮する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４６】
一般に使用されるが毒性を有する抗生物質、栄養補助剤等の生物学的活性のエンハンサーとして機能することができる生体分子を、植物から探索する試みにおいて、我々は、Moringa(Moringa oleifera)の種子を有する鞘のエタノール抽出物が、Mycobacterium tuberculosis（結核の病原菌）を含むグラム陽性およびグラム陰性の細菌に対するリファンピシン、アンピシリンおよびテトラサイクリンの活性を増大することが出来ることを見出した。鞘の活性なエタノール抽出物を、生体活性を指標とする分画に供することによって、不純物を含まない化合物が得られた。この化合物は、化学的特徴により、式Iのニアジリジンであることがわかった。化合物Iは、Escherichia coli（Kumar et al 1976; J. Bacteriology 125: 545）、Bacillus subtilis（ATCC6015と同等物）、Mycobacterium smegmatis（ATCC10231と同等物）およびM. tuberculosis H37Rvに対する、リファンピシン、アンピシリンおよびテトラサイクリンなどの抗生物質の活性を増すことが出来た。この化合物は、また、C. albicans（カンジダ症の病原菌）に対するクロトリマゾールなどの抗真菌剤アゾール薬の活性を増すことが出来た。この化合物は、また、組み合わせることにより、腸の膜を介してビタミンB12のような栄養素の吸収を促進することが出来、それゆえ、生体利用性促進剤としての機能も有する。
【００４７】
M. oleifera Lam.は、小型および中型の木（高さ約10mt.）であり、Moringaceae科に属し、「ドラムスティック（Drumstick）」としても知られている。ヒマラヤ山麓の土地が原産地であり、インドおよびビルマにわたって栽培されている。この木はインドの西北部が原産地であり、川および小川の砂床の中または近くの最近堆積して出来た土地に多く見られる。そして、生垣および家庭の庭において、たびたび栽培されている。この木は、全ての種類の土壌抽出物・固い粘土で生育し、南インドの熱帯半島性の気候の環境下で最も成長する。この木は、野菜として高く評価されている柔らかい鞘により主に評価されている。薄く切られ、料理の調製に用いられている；ピクルスにもされている。花と柔らかい葉は、香味野菜として食されている。種子は揚げた後に消費され、ピーナッツのような味覚を有すると報告されている。
【００４８】
この木の全ての部分は、医薬品と考えられており、腹水、リウマチ、有毒な咬症の治療において、ならびに、強心薬および循環刺激薬として伝統的に使用されている。アーユルベーダの専門家は、断続的な熱、癲癇および慢性リウマチの治療において、刺激剤としてM. oleiferaの根を処方している1。根は、また、駆風薬、駆虫薬および利尿薬としても有用である。木の皮は、妊娠中絶薬、強心薬および抗真菌剤として使用されている。葉は、炎症、寄生虫病および壊血病に有用である。種子は、下剤、解熱剤および抗炎症剤として有用である20。
【００４９】
花は、利尿薬および胆汁促進剤として使用されている21。葉は、ビタミンAおよびビタミンCが豊富であり、壊血病およびカタル性疾患に有用であると考えられている；これらは、また、催吐薬として使用されている。葉のペーストは、傷を外部から塗布するのに使用されている。花は、強壮薬、利尿薬および胆汁促進剤として使用されている。
【００５０】
種子は、解熱作用あり、においがつんと鼻をつき、苦いと考えられている。種子の油は、リウマチおよび痛風に塗布される。多くの生体分子が、moringaの木の異なる部分から単離されている。詳細を表１に示す。
【００５１】
【表１】
0004652820.tif 000009
【００５２】
以下の生体活性が、M. oleifera植物から単離された抽出物または化合物について報告されている。
a)抗がん活性：M. oleiferaの葉のペーストを、スイスマウスにおいて、カルシノゲン解毒グルタチオン-s-トランスフェラーゼへの影響についてスクリーニングした13。
b)避妊活性：M. oleiferaの根および木の皮の水溶性抽出物は、200mg/kgの用量で、それぞれ、ラットにおける性行後の避妊効果を示し、妊娠後期での胎児吸収も誘導された14。
c)抗炎症活性：乾燥させた種子のエタノール粗抽出物を、マウスの後足でのカラギーナン誘導炎症を使用して、抗炎症活性を試験した14, 15。
d)抗潰瘍活性：M. oleiferaの葉のメタノール抽出物は、ラットにおいて、アスピリン、セロトニンまたはインドメタシンによって誘導される胃の損傷形成を阻害した16。
e)心臓血管活性：葉のエタノール抽出物から単離した化合物ニアジニンAおよびB、ニアジミシン、ニアジミニンAおよびBは、1-10mg/kgの用量でI.V.で、低血圧効果および除脈性効果が生じた17。
f)抗菌活性：葉、根、木の皮および種子の抗菌活性を、細菌、酵母、皮膚糸状菌および家畜の寄生蠕虫に対して調べた。新鮮な葉のジュースおよび種子の水溶性抽出物は、Pseudomonas aeruginosa、Staphylococcus aureusの生育を阻害した18。M. oleiferaの種子の抽出物は、1-10の希釈率で、Trichophyton rubrumおよびT. mentagrophytesのような真菌類の生育を阻害した19。
【００５３】
しかしながら、Moringaの鞘に由来する分子による抗生物質、抗真菌剤および栄養素のバイオエンハンサー活性は、いまだ報告されていない。
【００５４】
本発明は、生体活性および生体利用性促進剤として、有効量のニアジリジン、ならびに、抗生物質、薬剤、治療および栄養補助剤および生物系を標的とする類似の分子から選択される医薬的に許容される付加剤を含む医薬組成物を供給する。
【００５５】
ニアジリジンは、C. albicans等の酵母によって引き起こされる真菌類感染の処置のための抗真菌類治療に用いることができる。ニアジリジンは、また、リファンピシン、イソニアジドおよび他の抗結核剤と組み合わせて、結核治療に使用することができる。
【００５６】
生体利用性促進剤であるニアジリンは、化合物、薬剤および栄養素の膜を介した伝達を促進し、標的部位へより有効に伝達する。
【００５７】
抗生物質としては、リファンピシン、テトラサイクリン、アンピシリン、キノロン、フルオロキノロン、イソニアジドおよび類似の化合物が挙げられる；栄養素としては、ビタミン、アミノ酸、窒素含有塩基が挙げられる；抗真菌剤としては、クロトリマゾール、ケタコノゾール、ミカノゾール、およびイトラカノゾール等のアゾールが挙げられる。
【００５８】
式Iの化合物は、生体利用性促進剤として機能し、抗生物質および他の分子について、効率を増すことによって標的上でより良く機能することを促進する。
【００５９】
生物系としては、細菌、真菌類または他の任意の生物細胞とすることができる。好ましくは、ニアジリジンは、0.1μg/mlから10μg/mlの範囲で使用する。1つの態様においては、使用されるMoringa oleiferaの鞘から単離された凍結乾燥した活性フラクションは、0.1μg/mlから100μg/mlの範囲である。生体活性フラクションは、抗細菌剤、抗真菌剤および抗結核剤の活性を、2から80倍増大させる。
【００６０】
このスクリーニングのために我々が行った方法は、実施例として以下に示す特別に設計したバイオアッセイを含む。本発明で用いた細菌および真菌類の種は、言及するATCC種の対応する特性を有するInstitute of Microbial Technology (IMTECH), Chandigarh, IndiaにおけるMicrobial Type Culture Collection (MTCC)から購入した。
【実施例】
【００６１】
（１．鞘原料の回収および抽出）
20.0kgのMoringa oleiferaの鞘をLucknow地域から集めた。鞘を分離し、室温（35℃から40℃）で、日陰で風乾した。風乾後、それらを砕き、ミキサー粉砕機で、微細なパウダーをふるい分けした。8kgの粉末の鞘原料を、パーコレーター内で、室温（35℃から40℃）48時間、エタノールに漬けた。エタノール抽出物を、WhatmanフィルターペーパーNo.1を用いてろ過し、減圧下40℃で濃縮した。その後、エタノール抽出物を凍結乾燥することにより、208gの粗抽出物を得た。100mg/mlのストックをDMSOで調製し、バイオエンハンサー活性を試験した。表２で示す結果は、Moringa oleiferaの鞘から調製されたエタノール粗抽出物が、E.coli CA8000 (Kumar et al 1976; J. Bacteriology 125: 545)に対するリファンピシンの活性を、2.5から3.0倍増大することができたことを示している。
【００６２】
【表２】
0004652820.tif 000010
【００６３】
（２．生体活性を指標とする分画）
活性を有する粗抽出物の溶媒分画を行い、活性成分を単離した。250gのエタノール抽出物を500mlの蒸留水に溶かした。その後、Whatman No.1フィルターペーパーを用いてろ過した。不溶性の成分をメタノールに溶かし、可溶性の成分（H2O）をヘキサンで抽出し、その後、それぞれ、クロロホルム、酢酸エチルおよびn-ブタノール（H2O飽和）で抽出した。NaSO4（無水）を、水分を除去するために、それぞれのフラクションに加えた。
【００６４】
全ての溶媒フラクションを、減圧下40℃で濃縮し、試験した。結果は、鞘粗抽出物から得られた酢酸エチルフラクションが増大活性特性を有していたことを示している。
【００６５】
【表３】
0004652820.tif 000011
【００６６】
シリカゲルを用いて、生体活性を有する酢酸エチルフラクション(7.0g)をカラムクロマトグラフィーに供した。カラムの溶出に異なる溶媒系を用い、100％ヘキサンから開始して、その後、クロロホルム、酢酸エチルで更なる分画を行った。150mlのフラクションを回収し、このような10本のフラクションを更なる活性評価のためにプールした。抗生物質のバイオエンハンサー活性を、「30%クロロホルム＋70%酢酸エチル」フラクションから、「95%酢酸エチル＋5%メタノール」フラクションにおいて求めた。その後、活性を有するカラムフラクションの薄層クロマトグラフィー（TLC）を、文書化され、天然物の単離を行っている業界における当業者によって行うことができる方法によって行った。ヨウ素処理して得られた全てのスポットを分離し、活性評価のために、適切な溶媒（メタノール、酢酸エチルおよびクロロホルム）に再溶解させた。活性を有するスポットを同じ方法によって更に五回精製し、20mgの活性を有する単一なTLCスポットを得た。
【００６７】
（３．活性を有する不純物を含まない化合物の特徴づけ）
TLCによって得られた活性なスポットを、この業界における当業者によって行うことができるカラムクロマトグラフィーを繰り返すことによって更に精製し、その後、1H＆13C NMR、LC-MSで分析し、活性を有する不純物を含まない化合物の構造を求めた。スペクトル分析のデータに基づき、Moringa oleiferaの鞘から単離した新規の化合物を、天然からの新規のニトリルグリコシド、ニアジリジン（式I）とした。
【００６８】
（４．組み合わせることによる抗生物質および抗真菌剤の生体活性増大）
抗生物質単独での殺菌効率およびバイオエンハンサー（抽出物/不純物を含まない化合物）と組み合わせた場合の殺菌効率を求めることによって、抗生物質の生体活性増大を求めた。細菌/酵母培養液を、シングルコロニーを培養することによって、それぞれ、6mlのnutrient brothおよびSabouraud’s dextrose brothを用いて48時間37℃で増殖させた。培養液を3つに分け、2.0mlの新鮮なbrothをそれぞれのチューブに加えて、4mlとした。1.0および0.1μg/mlの試験化合物を2つの培養チューブに加え、試験化合物を溶かすために用いた溶媒であるメタノールをコントロールとして3番目のチューブに加えた。培養液を、インキュベーターシェイカー内で、200rpm、37℃で4時間増殖させ、遠心分離して細胞をペレットにした。細胞は、一度、滅菌水またはPBSで前記のように洗浄した。その後、それぞれのチューブのペレットを4mlの新鮮なbrothで溶解して、細胞のタイターを、連続希釈してNAプレートに塗布することによって求めた。48時間37℃での培養後に得られたコロニー数によって、それぞれのチューブにおける細胞の最初のタイターを求めた。異なる濃度の抗生物質とともに5mlのNBを含む一連のチューブを、3セット調製した。試験化合物（1.0および0.1μg/ml）で予め処理した0.1mlの培養液およびコントロールチューブの0.1mlの培養液を、3つのセット分けた一連のチューブに植菌した。チューブを、37℃で48時間培養し、増殖させた。0.1mlの培養液を全てのチューブから取り出し、前記したようにタイターを求めて、最終的なタイターとして、結果は、細胞の最初のタイターおよび最終的なタイターから、抗生物質の殺菌作用の増大倍数として計算した。表４から、不純物を含まないニアジリジン化合物は、E. coli（グラム陰性の細菌）に対する、リファンピシン、テトラサイクリン、ナリジクス酸などの一般的に用いられる抗生物質の活性を増大させた。化合物を、更に、代表的なグラム陽性の細菌種であるMycobacterium smegmatisおよびB. subtilisに対するバイオエンハンサー特性を試験した。表５で示す結果は、化合物が、両方のグラム陽性の細菌に対する、リファンピシン、アンピシリン、ナリジクス酸の活性を、1.2から19倍増大したことを示している。
【００６９】
【表４】
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【００７０】
【表５】
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【００７１】
更に、Moringaの鞘に由来する不純物を含まない化合物が抗真菌剤の活性を増大することができるかどうか求めるために、類似のbrothアッセイを、Candida albicansに対して一般に用いられているアゾール系の抗真菌剤であるクロトリマゾールを用いて行った。結果（表６）は、化合物ニアジリジンは、組み合わせて存在する場合、C albicansに対するクロトリマゾールの抗真菌活性を5から6倍増大することができたことを示している。しかしながら、この抗真菌活性の増大は、化合物が比較的に高い濃度（10μg/ml）の時のみ観察された。
【００７２】
【表６】
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【００７３】
（５．BACTEC 460 TBシステムによる、M. tuberculosisに対する抗結核剤の生体活性増大）
バイオエンハンサー化合物は、M. smegmatis等のグラム陽性の細菌に対する抗生物質の活性を増大することができたので、我々の次なる対象は、一般的な結核菌であるM. tuberculosis H37Rv (ATCC 27294)に対して化合物を試験することであった(Philipp et al 1996; Proc. Natl. Acad. Sci USA 93, 3132-3137)。このことを達成するために、我々は、M/S Becton Dickinson Ltd., USAによって製造されているBACTEC 460 TBシステムを使用して放射測定アッセイを利用した。製造業者(BACTEC 460 TBシステム: Product & Procedure Manual, MA 0029, 1996; Becton Dickinson Co., USA)によって作成された推奨薬剤感度プロトコールどおりに、バイオエンハンサーと組み合わせた薬剤の抗マイコバクテリア特性を求めた。以下に、簡単に記載する。
(a)植菌前に、製造業者によって提供される12Bバイアルを予め試験して、推奨するCO2雰囲気下を構築する。最初の試験では、20以上の増殖指数(GI)を示すバイアルは用いなかった。
(b)GI値が500を示す100μlのマイコバクテリア懸濁液を、抗生物質を含む12Bへと植菌した。
(c)コントロールバイアルとしては、0.1mlの懸濁液を9.9mlの特別な希釈液へと移すことによって、1:100倍希釈した植菌材料を用いた。
(d)製造業者から推奨されているように、生物学的に安全な予防措置をとった。
(e)製造業者に推奨されているように、バイアルを、毎日ほとんど同じ時間に、12日間BACTEC 460 TBシステムで試験した。マイコバクテリアの増殖は、増殖指数(GI)として表し、コントロールバイアル（抗生物質単独）の増殖指数と比較した。
【００７４】
図１および図２から、化合物ニアジリジンが、M. tuberculsisの毒性種に対するリファンピシンおよびイソニアジドの抗マイコバクテリア活性を増大することができたことは明らかである。
【００７５】
（６．胃腸上皮を用いた生体利用性の試験）
2つの部分（逆L型）からなる特別にデザインしたUガラス管を用いた。このUガラス管は、L型の一方の開いている端を、他のL試験管の端に固定するように、徐々に細くして調製した（米国特許第6,410,059）。ヤギの消化管（最初の部分）の膜を広げ、2つの端の間の仕切りとして機能するように固定し、2つのL試験管を結合してU試験管を調製した。その後、両サイドの高さが同じになるように滅菌した蒸留水を満たした。抗生物質/化合物をドナー試験管（細くした方）に加え、分光光度計を介して、それぞれの分子のUVおよび可視光の最大吸収を用いて、特定の波長でのOD（イソニアジド：264nm）を測定することによって、分子の移動を観察した。
【００７６】
（７．細菌におけるλファージ吸着の増大）
一晩増殖させた細菌培養液（Escherichia coli, CA 8000）をスクリュートップチューブに5mlずつ分注した。細菌培養液が入ったチューブの1つを、最終濃度が1μg/mlになるようにニアジリジンで処理した。コントロールおよび処理チューブの両方を、37℃で4時間インキュベートした。その後、培養液をλファージ(MOI=10)で、37℃で10分間感染させた後で、4℃で10分間、10000RPMで遠心分離した。
【００７７】
その後、処理培養液および非処理培養液の両方の上清およびペレットについて、異なる希釈率で感受性菌を含むトップアガー上にプレーティングすることによって、ファージのタイターを比較した。処理培養液の上清のファージタイターは2.6倍減少しており、この結果は、ペレットとして沈殿した細菌細胞への吸着が増大したことを示す。
【００７８】
【表７】
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【００７９】
（８．細菌の形質転換の増大）
一晩増殖させた細菌E. coli DH5α(Sambrook et al28)細胞を、増殖培地で10倍に希釈し、ニアジリン（1から10μg/ml）で、37℃で4時間、シェーカー内（200RPM）で処理した。
【００８０】
その後、これら指数増殖期の細胞を塩化カルシウムで処理、コンピテントセルを誘導し、pUC18プラスミドDNAで形質転換し、100μg/mlのアンピシリンを含むLuriaアガープレートにプレーティングした。詳細な方法は、Sambrook et al28を参考にすることができる。
【００８１】
処理培養液および非処理培養液の両方のプレートについて、生じたコロニーの数をカウントした。DH5α種の場合は、2.3倍の形質転換の増加が観察され、CA8000の場合は5.5倍の増加であり、これらの結果は、化合物がE. coliへのプラスミドDNAの取り込みを増大したことを示している。
【００８２】
【表８】
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[参考文献]
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【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】図１は、本発明の化合物による、Mycobacterium tuberculosis（H37Rv）に対するリファンピシン活性の相乗効果を示すグラフである。
【図２】図２は、本発明の化合物による、Mycobacterium tuberculosis（H37Rv）に対するイソニアジド活性の相乗効果を示すグラフである。
【図３】図３は、本発明の化合物の存在における、胃腸管を介したリファンピシンおよびビタミンB12のin vitro生体利用性を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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