(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効成分として不活性化されたセンダイウイルスエンベロープのみを含有する、抗癌剤。
【請求項２】
注射により癌患部に局所投与することを特徴とする、請求項１記載の抗癌剤。
【請求項３】
１回あたり投与される抗癌剤中の不活性化されたセンダイウイルスエンベロープの投与量が、１０００〜５０００ＨＡＵである、請求項２記載の抗癌剤。
【請求項４】
癌が固形癌であることを特徴とする、請求項１記載の抗癌剤。
【請求項５】
固形癌が、皮膚癌、皮膚悪性腫瘍、頭頚部癌、肺癌、食道癌、悪性リンパ腫、子宮頚癌、神経膠腫、甲状腺癌、前立腺癌および経腸癌からなる群より選択される癌であることを特徴とする、請求項４記載の抗癌剤。
【請求項６】
固形癌が、皮膚癌、皮膚悪性腫瘍、前立腺癌および経腸癌からなる群より選択される癌であることを特徴とする、請求項５記載の抗癌剤。
【発明の詳細な説明】
発明の属する技術分野：
本発明は、遺伝子導入ベクターを用いて細胞内あるいは生体内へ、化学療法剤を移入する際に用いる医薬製剤に関する。
【背景技術】  現在のがん治療における治癒率は約５０％程度といわれ、その治癒は一般的には外科療法や放射線療法など局所療法によりもたらされる場合が多い。特に固形癌の治療においては、全身療法である化学療法が単独で治癒に貢献する割合は極めて少なく、各種療法と併用されるのが通常である。
一方外科療法では、全ての臓器癌の手術が可能となり、治療法として既に完成域に達していると考えられ、これ以上の治癒率向上は望めない。また放射線療法も感受性のある臓器癌の治療成績がほぼ一定率に達しており、同様にこれ以上の治癒率向上は望めない。
従ってこれらの治療法により、今後の癌治癒率の大幅な向上は期待しがたいため、癌の治癒率を現状の５０％からさらに改善し癌制圧に達するには、より優れた化学療法の開発が欠かせない。
化学療法に使用される抗癌剤は、癌細胞のような増殖能の高い細胞の殺細胞効果を目的としており、正常細胞、特に細胞増殖能の高い骨髄細胞等に与えるダメージが大きく、その結果患者に与える苦痛も大である。これは抗癌剤の送達法が注射剤による全身への投与であり、がん細胞以外の正常細胞にも抗癌剤が到達し、正常細胞が殺傷されホメオスタシスが機能しなくなるためである。
しかし現状では、抗癌剤を単独投与した際の効果は概ね３０％程度であるとされており、ゲノムの遺伝子情報解析研究が進められ適切な抗癌剤の選定が今後可能なることも期待されているが、現時点での抗癌剤療法は効果と比較して副作用が高いといわれている。
これは抗癌剤全身投与により正常細胞がダメージを受けたためである。よって、癌組織特異的な抗癌剤の導入、加えて癌細胞への取り込み方法が確立できれば、理想的な抗癌剤の送達システムとなる。さらに、抗癌剤のベシクル（ｖｅｓｉｃｌｅ）への封入が可能になれば、標的臓器・細胞選択的に、しかも正常細胞への影響（副作用）が少ない治療法を確立できる。また、これにより副作用が強く開発を断念した抗癌剤の再評価に結びつくものと考えられる。
【発明の開示】
本発明者らは上記問題を解決すべく鋭意検討した結巣、化学療法剤を封入したウイルスエンベロープベクターを有効成分として含有する医薬製剤を完成させることができた。
従って本発明は具体的には例えば、外来遺伝子の封入能を有する不活性化ＨＶＪ−Ｅベクター等の中に、抗癌剤等を封入した医薬製剤を提供するものである。
本発明は、遺伝子導入ベクターを用いて細胞内あるいは生体内へ、化学療法剤、好ましくは制癌剤、抗癌剤または抗腫瘍剤（以下まとめて、抗癌剤という）を移入する際に用いる医薬製剤に関する。より詳しくは、本発明は毒性の高い抗癌剤を遺伝子導入ベクターを用いて生体移入し、副作用を軽減して安全に、標的臓器あるいは細胞に到達させる医薬製剤に関する。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、本発明を詳細に説明する。
本発明において使用される化学療法剤とは、細胞に直接作用する低分子化合物であれば限定されないが、例えば東京化学同人刊・生化学事典第３版には、「現在、選択毒性の高い化学物質を用いる治療法すなわち化学療法の対象は微生物による感染症のみならず悪性腫瘍にまで広げられている。」と記載されており、抗菌剤、抗癌剤等が含まれることは論を待たない。
なお本発明においては、化学療法剤としてより好ましくは制癌剤、抗癌剤または抗腫瘍剤（以下、抗癌剤と総称）を挙げることができ、抗癌剤としてさらに具体的には例えば、ブレオマイシン類、アドリアマイシン・ダウノマイシンのアントラキノン系制癌剤、マイトマイシン類、アクチノマイシン類、タキソール等のタキサン誘導体、イリノテカン等のカンプトテシン類、シスプラチン類、スタウロスポリン類、ビンクリスチン、ストレプトゾトシン、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）およびその誘導体、ビラルビシン、ドラスタチン（Ｄｏｌａｓｔａｔｉｎ）およびそれらの薬理学的に許容される塩を挙げることができる。
これら化学療法剤の中でも、さらに好ましくはブレオマイシン類を挙げることができ、具体的にはブレオマイシン（Ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ）またはその薬理学的に許容される塩、あるいはペプロマイシン（Ｐｅｐｌｏｍｙｃｉｎ）またはその薬理学的に許容される塩を挙げることができ、さらに詳しくは塩酸ブレオマイシン、硫酸ブレオマイシン、硫酸ペプロマイシンを挙げることができる。
本発明にかかる医薬製剤を抗癌剤として使用する場合、適応となる癌の種類は限定されず、具体的には固形癌、血液細胞癌等を挙げることができる。これらの中でも固形癌が好適対象である。
固形癌としてより具体的には、例えば肺癌、乳癌、消化器癌、頭頚部癌、婦人科領域の癌、泌尿器科領域の癌、骨・軟部肉腫、悪性リンパ腫、原発不明癌等を挙げることができ、さらに具体的には、例えば消化器癌として胃癌、大腸癌、食道癌等を、頭頚部癌として上顎癌、舌癌、口唇癌、咽頭癌、喉頭癌、口腔癌等を、婦人科領域の癌として子宮癌、卵巣癌、子宮頸癌等を、泌尿器科領域の癌として前立腺癌等を挙げることができる。
これらの固形癌の中でも、より好適な対象としては、皮膚癌、皮膚悪性腫瘍、頭頸部癌（上顎癌、舌癌、口唇癌、咽頭癌、口腔癌など）、肺癌（特に原発性および転移性扁平上皮癌）、食道癌、悪性リンパ腫（細網肉腫、リンパ肉腫、ホジキン病など）、子宮頸癌、神経膠腫、甲状腺癌、前立腺癌を挙げることができる。
次に本発明におけるウイルスエンベロープベクターとは、ウイルスからＲＮＡまたはＤＮＡを取り除いた膜であり、通常は遺伝子、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、プラスミド等を封入して細胞移入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）に利用されるものである。
ウイルスの種類も限定されないが具体的には、例えばレトロウイルス科、トガウイルス科、コロナウイルス科、フラビウイルス科、パラミクソウイルス科、オルトミクソウイルス科、ブニヤウイルス科、ラブドウイルス科、ポックスウイルス科、ヘルペスウイルス科、バキュロウイルス科、およびヘパドナウイルス科からなる群から選択される科に属するウイルスを挙げることができる。
本発明にかかるウイルスとしてさらに具体的には、例えばセンダイウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、インフルエンザウイルス等を挙げることができる。
これらの中でも、好ましくはマウス肺炎ウイルスの一つであるセンダイウイルス（Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｎｇ  Ｖｉｒｕｓ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ、以下ＨＶＪ）を挙げることができる。
なおセンダイウイルスとして具体的には、例えばＶＲ−１０５，ＶＲ−９０７等をＰ．Ｏ．Ｂｏｘ１５４９，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ２０１０８，ＵＳＡ在のＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），ｔｅｌｅｐｈｏｎｅ  １−７０３−３６５−２７００から購入することができる。
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ／ＳｅａｒｃｈＣａｔａｌｏｇｓ／ｌｏｎｇｖｉｅｗ．ｃｆｍ？ｖｉｅｗ＝ａｖ，１５２３７６，ＶＲ−１０５＆ｔｅｘｔ＝Ｓｅｎｄａｉ＆ｍａｘ＝２０
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ／ＳｅａｒｃｈＣａｔａｌｏｇｓ／ｌｏｎｇｖｉｅｗ．ｃｆｍ？ｖｉｅｗ＝ａｖ，１３７５４７８，ＶＲ−９０７＆ｔｅｘｔ＝Ｓｅｎｄａｉ＆ｍａｘ＝２０
ウイルスエンベロープベクターについてより詳しくは、例えば特開２００１−２８６２８２号公報（ＷＯ０１／５７２０４号公報）、特開２００２−０６５２７８号公報、ＷＯ−Ａ  ０３／０１４３３８（ＰＣＴ／ＪＰ０２／０７８７９）等に記載されており、具体的には例えば特開２００１−２８６２８２号公報の実施例８などに従って調製することができる。
なお化学療法剤をウイルスエンベロープベクターに封入する工程においては界面活性剤を使用することが好ましく、界面活性剤として具体的には、例えばトリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ１００、デオキシコール酸またはその塩、コール酸またはその塩等を挙げることができる。デオキシコール酸の塩として好ましくはデオキシコール酸ナトリウム、コール酸の塩として好ましくはコール酸ナトリウムを挙げることができる。
本発明にかかる医薬製剤の剤型は限定されないが、具体的には例えば注射剤、軟膏等を挙げることができ、好ましくは注射剤である。
続いて不活性化センダイウイルス・エンベロープベクター（以下、ＨＶＪ−Ｅベクター）の場合を例にとって、より詳細に説明する。
ＨＶＪ−Ｅベクターに抗癌剤を封入する場合には、抗癌剤を緩衝液に溶解する。ここで使用する緩衝液は限定されず、具体的には例えば、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  トリス、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））、ＰＢＳ（リン酸緩衝液）等を適宜選択し使用できるが、ｐＨが６−９の緩衝液が好ましい。
本発明の特長として、副作用あるいは毒性の強い抗癌剤をＨＶＪ−Ｅベクターに封入し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験では培養液中に抗癌剤がもれることなく直接細胞に抗癌剤を送達することができる。
またｉｎ  ｖｉｖｏ動物実験においては、抗癌剤の全身投与ではなく、局所投与を行うことが可能であり、固形癌の癌細胞のみに効率よく抗癌剤を送達することができる。
さらに人の治療においては、抗癌剤封入ＨＶＪ−Ｅベクターの単独投与による化学療法だけではなく、進行癌患者で抗癌剤の投与不能な患者に対し局所投与を行うことにより癌の退縮を図り、さらに放射線治療、外科的処理との併用により、一層優れた抗癌効果が得られる。
抗癌剤を封入したＨＶＪ−Ｅベクターは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験ではホスト細胞にトランスフェクションする。その場合の手続きは、例えば抗癌剤を封入したＨＶＪ−Ｅベクターの溶液を培養細胞の培地に添加するなどの方法を採用することができる。
トランスフェクションは３７℃で反応させる場合、３０分以上、４８時間程度とする。効果判定は生細胞数のカウントあるいはＷＳＴ  ａｓｓａｙ（生細胞のカウント手法：ｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｋｉｔ−８、同仁化学）により行うのが好ましい。
ｉｎ  ｖｉｖｏ動物実験における対象は、例えばマウスの場合、癌細胞が同系移植では免疫不全マウスではない通常マウスを、異種移植の場合はヌードマウスあるいはＳＣＩＤマウスを使用するのが好ましい。
ペトリディッシュで培養した培養癌細胞をマウスの皮内に移植し、移植細胞が増殖後、抗癌剤を封入したＨＶＪ−Ｅベクターを増殖固形癌部内に投与し、癌部の長径および短径を測定し、その抗癌効果測定をするなどの方法を採用することができる。
本発明により副作用が大きな抗癌剤を、簡便しかも安全に癌部に送達できる方法が提供される。
よって、わが国で急速に増加しつつある肺癌、乳癌、胃癌・大腸癌・食道癌などの消化器癌、頭頚部癌（上顎癌，舌癌，口唇癌，咽頭癌，喉頭癌，口腔癌など）、婦人科領域の癌（子宮癌、卵巣癌、子宮頸癌など）、泌尿器科領域の癌（前立腺癌）、骨・軟部肉腫、悪性リンパ腫、原発不明癌等すべての固形癌への新たな化学療法が、ＨＶＪ−Ｅベクターを用いることにより可能になる。
【図面の簡単な説明】  図１は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験における、各群の生細胞数を比較したグラフである（平均±標準偏差で示す）。
図２は、ｉｎ  ｖｉｖｏ実験における、各群の平均腫瘍容量を比較したグラフである（平均±標準偏差で示す）。
図３は、ｉｎ  ｖｉｖｏ実験における、投与１６日後の各群の平均腫瘍容量の変化率、およびメデューム（ＰＢＳ）群に対する変化率を示したグラフである（平均±標準偏差で示す）。
図４は、実施例３の腫瘍体積結果を示すグラフである。
【実施例】  以下に、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
実施例１ｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験
特開２００１−２８６２８２号公報の実施例８に従い、６，０００ＨＡＵ／６００μｌ（６ウエルプレート６枚分）の不活性化したＨＶＪ−Ｅベクターを−８０℃から３４．５℃に移した。試料の入ったマイクロチューブを１５，０００ｒｐｍ、１５分間、４℃で遠心し、ＨＶＪ−Ｅベクターを沈殿物として回収し上清を除去した。得られた沈殿物を６０μｌのブレオマイシン／ＰＢＳ（５ｍｇ／ｍｌ）（塩酸ブレオマイシン：日本化薬）溶液に懸濁した。さらに３％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を２μｌ加え、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００の最終濃度０．１％の試料を調製し、氷中に１５分間放置した。その後、ＰＢＳ溶液を５００μｌ加えた。マイクロチューブを１５，０００ｒｐｍ、１５分間、４℃で遠心し、沈殿物を取らないよう上清を除去し、ＰＢＳ溶液を５００μｌ加えた。再度、マイクロチューブを１５，０００ｒｐｍ、１５分間、４℃で遠心し、沈殿物を取らないように上清を除去した。
得られた沈殿物を１８０μｌのＰＢＳに懸濁し、試料溶液を３０μｌづつ６本のマイクロチューブに分注した。各チューブに５ｍｇ／ｍｌに調製したプロタミン硫酸溶液を５μｌ、さらに５００μｌのＤＭＥＭ溶液（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ変法Ｅａｇｌｅ培地）を加えた。
投与群として以下のものを調製し、それぞれ比較することによりその効果を評価した。
ＨＶＪ−ブレオマイシン群；：１，０００ＨＡＵ，ブレオマイシン２００ｎｇ／ＤＭＥＭ  ５００μｌ／ｌ  ｗｅｌｌ
ＨＶＪ−ＰＢＳ；群：１，０００ＨＡＵ／ＤＭＥＭ  ５００μｌ／ｌ  ｗｅｌｌ
１／５０ブレオマイシン群：ブレオマイシン５０μｇ／ＤＭＥＭ  ５００μｌ／ｌ  ｗｅｌｌ
１／５００ブレオマイシン群：ブレオマイシン５μｇ／ＤＭＥＭ  ５００μｌ／ｌ  ｗｅｌｌ
１／５，０００ブレオマイシン群：ブレオマイシン５００ｎｇ／ＤＭＥＭ  ５００μｌ／ｌ  ｗｅｌｌ
メデューム群：ＤＭＥＭ
６ウエルプレートに調製したマウス経腸癌細胞ＣＴ２６に上記試料溶液を加えた。３０分間３７℃の保温器中に放置後、培地（ＤＭＥＭ，１０％ＦＣＳ含有）５００μｌの交換を行った。３７℃のＣＯ２保温器中で２日間保温した。２日後に生細胞数を数え、抗癌効果の評価を行った。
その結果を下表および図１に示す。
0004746877.tif 000002
メデューム群、ＨＶＪ−ＰＢＳ各群における平均生細胞数は、２２０，１００個、２０１，１００個であった。培地へのブレオマイシン添加各群（５００ｎｇ，５μｇ，５０μｇ）の生細胞数は、１９６，８００個、１６４，６００個、８１，８００個に対して、ブレオマイシンＨＶＪ−Ｅ封入群の生細胞数は、１６，８００個となった。メデュームを１００％とし百分率で比較すると、ＨＶＪ−ＰＢＳ群９１．４％、ブレオマイシン５００ｎｇ，５μｇ，５０μｇ添加群８９．４％、７４．８％、３３．９％であるのに対し、ブレオマイシンＨＶＪ−Ｅ封入群における生細胞率はわずか７．６％であった。
この結果、ブレオマイシンをＨＶＪ−Ｅに封入することにより劇的な細胞殺傷効果を得ることに成功した。ブレオマイシンの培養液添加時の細胞殺傷効果があまり大きくないことを考えると、ＨＶＪ−Ｅベクターにより直接細胞に導入した場合の効果の大きさが分かる。
本結果は、全身投与により重篤な副作用を引き起こすような抗癌剤をＨＶＪ−Ｅベクターに封入することによって、患者患部細胞に直接薬剤を運搬できる可能性を示した。
実施例２ｉｎ  ｖｉｖｏ実験
６，０００ＨＡＵ／６００μｌのＨＶＪ−Ｅベクターを−８０℃から３４．５℃に移し急速に可溶化した。試料の入ったマイクロチューブを１５，０００ｒｐｍ、１５分間、４℃で遠心し、ＨＶＪ−Ｅベクターを沈殿物として回収し、上清を除去した。得られた沈殿物を６０μｌのブレオマイシン／ＰＢＳ（４０ｍｇ／ｍｌ）溶液に懸濁した。さらに３％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を２μｌ加えＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００の最終濃度が０．１％となるように調製し、氷中に１５分間放置した。その後、ＰＢＳ溶液を５００μｌ加えた。マイクロチューブを１５，０００ｒｐｍ、１５分間、４℃で遠心し、沈殿物を取らないよう上清を除去し、ＰＢＳ溶液を５００μｌ加えた。再度、マイクロチューブを１５，０００ｒｐｍ、１５分間、４℃で遠心し、沈殿物を取らないように上清を除去した。沈殿物を１２０μｌのＰＢＳに懸濁した。
投与群として以下のものを調製し、それぞれ比較することによりその効果を評価した。
ＨＶＪ−ブレオマイシン投与群：５，０００ＨＡＵ，ブレオマイシン６．５μｇ／１００μｌ／匹
ＨＶＪ−ＰＢＳ投与群：５，０００ＨＡＵ／１００μｌ／匹
６５μｇ／ｍｌブレオマイシン投与群：ブレオマイシン／ＰＢＳ（６５μｇ／ｍｌ），１００μｌ／匹
ＰＢＳ投与群：１００μｌのＰＢＳ
動物実験には、ＢＡＬＢ／ｃマウス（週齢：８週齢、雄）を用いた。経腸癌ＣＴ２６の移植部位はマウス背部皮内とし、移植癌細胞容量測定のために背部を剃毛した。移植用ＣＴ−２６細胞は、１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ溶液にて調製し、５×１０６個（１００μｌ  ＰＢＳ／匹）の細胞を背部に移植した。麻酔は、２０倍希釈ネンブタール注射液５００μｌの腹腔内投与にて行った。移植癌細胞容量は、長径×短径×短径／２の計算法にて見積もった。移植１週間後に腫瘍径が７−８ｍｍとなったところで、上記調製試料１００μｌを、それぞれマウス癌部に投与した。癌細胞移植後７、１０、１３、１６、１９日後（つまり３日毎）に腫瘍系を測り、抗癌効果を評価した。動物数は各群８とした。
その結果を下表および図２に示す。（上段；平均、下段；標準偏差）
0004746877.tif 000003
また投与１６日後における各群の平均腫瘍容量、およびメデューム（ＰＢＳ）群に対する変化率を図３に示す。
調製試料接種時に差が認められなかった腫瘍径に、試料投与３日目以降（図２では１０ｄａｙに相当）差が認められた（図２）。９日後（図２では１６ｄａｙに相当、試料投与９日後）の腫瘍容量は、前述の計算式より算出した結果、ＰＢＳ投与群：１，２７７ｍｍ３、６５μｇ／ｍｌ  ＢＬＭ投与群：１，２３５ｍｍ３、ＨＶＪ−ＰＢＳ投与群：１，０８３ｍｍ３、ＨＶＪ−ＢＬＭ投与群：６７６ｍｍ３となった（図２）。百分率比で表すと、ＰＢＳ投与群：６５μｇ／ｍｌ  ＢＬＭ投与群：ＨＶＪ−ＰＢＳ投与群：ＨＶＪ−ＢＬＭ投与群＝０％：３．４％：１５．２％：４７．１％（図３）となった。ブレオマイシンを直接腫瘍患部に投与した群では、ＰＢＳ投与群に比べて３．４％の腫瘍縮小効果に留まり、ほとんど腫瘍容量の縮小効果が認められなかった。これは、通常行われている全身投与とは異なり腫瘍内部への直接投与によるものか、低濃度投与によるものか、あるいはその他の要因であるかは今回の結果からでは判断できない。ＨＶＪ−ＰＢＳ投与群では腫瘍容量縮小効果が１５．２％となり、ＨＶＪ−Ｅベクターのみでもある程度の効果が認められた。これはＨＶＪ−Ｅにより惹起された免疫作用による抗癌効果がある程度現れたものと予想される。それに比べてブレオマシン封入投与群では腫瘍容積が４７．１％となり、高い抗癌効果が認められた。
実施例より、以下のことが示された。
・ｉｎ  ｖｉｖｏにおいては、固形腫瘍細胞にブレオマシンを直接投与してもほとんど抗癌効果は認められなかった。
・ＨＶＪ−Ｅベクター単独でも、弱い抗癌効果が認められた。
・ＨＶＪ−Ｅにブレオマイシンを封入し固形腫瘍中に直接投与した場合には、優れた抗癌効果が認められた。
実施例３ｉｎ  ｖｉｖｏ実験（２）
（１）試験デザイン
マウス大腸癌由来ＣＴ−２６細胞を、８週齢のＢＡＬＢ／ｃＡｎＮＣｒｊ系雄マウスの背部皮内に移植し、腫瘍径（長径）が約５ｍｍとなった動物（各群１０匹）に、０．２あるいは０．４ｍｇ／ｂｏｄｙのプラトシン注（シスプラチン，ＣＤＤＰ）を腹腔内に単回投与し、投与の１日後にＨＶＪ−Ｅ、あるいはブレオマイシン１３．２ｍｇを含有するＨＶＪ−Ｅ／ＢＬＭを腫瘍内に単回投与した。腫瘍内投与の２１日後に屠殺してＨＶＪ−Ｅ／ＢＬＭの抗腫瘍作用を調べた。
なお、本試験での群構成を以下に示す。
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（２）実験方法
２−１）癌細胞の培養
マウス大腸癌由来ＣＴ−２６細胞を、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地を用い、３７℃、５％ＣＯ２存在下で培養した。
７５平方センチメートルのフラスコを用いて細胞培養を行った。約８０％コンフルエントに達した後、継代培養を行った。ＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ含有）液を除去後，１０ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で細胞を洗浄し、１ｍＬの０．２５％トリプシンおよび１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ−２Ｎａ含有ＰＢＳを添加し、３７℃で細胞を剥離した。９ｍｌのＤＭＥＭ培地を添加後、細胞を集め、遠心分離（１０００ｒｐｍ，５分間）にて細胞を回収した。上清除去後、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地にて細胞を希釈し、培養した。
２−２）癌細胞懸濁液の調製
約８０％コンフルエントに達した細胞の培養液を除去後、ＰＢＳを用いて、培養フラスコを洗浄した。０．２５％トリプシンおよび１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ−２Ｎａ含有ＰＢＳを少量添加し、３７℃で細胞を剥離し始めるまで放置した。ＤＭＥＭ培地を用いて細胞を集め、遠心分離（１０００ｒｐｍ，５分間）した。上清を除去後，ＰＢＳに懸濁した。再度遠心分離（１０００ｒｐｍ，５分間）し、上清を除去後、ＰＢＳを用いて５×１０７個／ｍＬに調製した。
２−３）マウスの馴化
１６日間の検疫馴化期間中、固型飼料および飲水を自由に与えた。
２−４）癌細胞の接種
検疫馴化が終了した動物にバリカンを用いて剃毛を実施した。マウスの背部に、ディスポーザブル注射筒および注射針（２６Ｇ）を用いて、１００μＬ／ｓｉｔｅ（５×１０６個／ｂｏｄｙ）を５９匹の動物に皮内投与した。投与した翌日に５７匹の動物（未投与動物）に同様に投与した。
２−５）動物の群分け
腫瘍の径（長径、短径）を、移植後４，５，６および７日目に測定（群分け後は測定しなかった）した。腫瘍径（長径）が４．５〜５．５ｍｍ（実測値４．６４〜５．４８ｍｍ）になった動物を、平均腫瘍径（長径）がほぼ均一になるよう、層別無作為化によって群分けした。
２−６）投与
ディスポーザブル注射筒および注射針を用いて、各群、対照物質を１回腹腔内投与（１０００μＬ）し、その１日後に被験物質を腫瘍内投与（１００μＬ）した。
２−７）腫瘍径の測定
投与日を投与後０日とした。投与後３，６，９，１２，１５，１８および２１日に、全例について腫瘍径を計測し、腫瘍体積（長径×短径×短径÷２）を算出した。
２−８）腫瘍重量の測定
各群全例、投与後２１日（絶食１６〜２４時間後）に、ペントバルビタールナトリウム（東京化成工業株式会社）水溶液（６．４８ｍｇ／ｍＬ，５ｍＬ／ｋｇ）の腹腔内投与による麻酔下で放血安楽死させた後、腫瘍を摘出し、重量を測定した。
（３）結果
３−１）腫瘍体積
対照群、ＨＶＪ−Ｅ群、１３ｍｇ／ｔｕｍｏｒ  ＨＶＪ−Ｅ／ＢＬＭ群、０．２ｍｇ／ｂｏｄｙ  ＣＤＤＰ群、０．４ｍｇ／ｂｏｄｙ  ＣＤＤＰ群および０．２ｍｇ／ｂｏｄｙ  ＣＤＤＰ−１３ｍｇ／ｔｕｍｏｒ  ＨＶＪ−Ｅ／ＢＬＭ群では、投与後２１日まで腫瘍体積は経時的に増加し、投与後２１日の腫瘍体積平均値はそれぞれ３２１６．１４，２７１６．００，２２８３．８４，１７２０．１４，１３６７．６２および１０２２．３４ｍｍ３であった（０．４ｍｇ／ｂｏｄｙ  ＣＤＤＰ群は３例，その他は各１０例）。０．４ｍｇ／ｂｏｄｙ  ＣＤＤＰ−ＨＶＪ−Ｅ群の生存１例では、投与後６日に腫瘍体積は１２２．２７ｍｍ３まで増加し、投与後９日に１１８．８２ｍｍ３、投与１２から２１日は１３．１２〜２３．２６ｍｍ３に減少した。  （図４参照）
３−２）腫瘍重量
投与後２１日の腫瘍重量は、対照群（２５７０．３５ｍｇ）≧ＨＶＪ−Ｅ群（２４２８．６４ｍｇ）＞１３ｍｇ／ｔｕｍｏｒ  ＨＶＪ−Ｅ／ＢＬＭ群（１６８０．６５ｍｇ）≧０．２ｍｇ／ｂｏｄｙ  ＣＤＤＰ群（１６１９．７９ｍｇ）＞０．４ｍｇ／ｂｏｄｙ  ＣＤＤＰ群（１１６４．１３ｍｇ）＞０．２ｍｇ／ｂｏｄｙ  ＣＤＤＰ−１３ｍｇ／ｔｕｍｏｒ  ＨＶＪ−Ｅ／ＢＬＭ群（９８７．３３ｍｇ）＞０．４ｍｇ／ｂｏｄｙ  ＣＤＤＰ−ＨＶＪ−Ｅ群（９０．４ｍｇ）の順であった。なお、０．２ｍｇ／ｂｏｄｙ  ＣＤＤＰ−１３ｍｇ／ｔｕｍｏｒ  ＨＶＪ−Ｅ／ＢＬＭ群では、投与時に存在した腫瘍が１０例中２例で消失した。
以上の結果から、１３ｍｇ／ｔｕｍｏｒのＨＶＪ−Ｅ／ＢＬＭは、マウスに移植したＣＴ−２６細胞に対して抗腫瘍作用を示し、その作用は、さらにＣＤＤＰ腹腔内投与との併用により増強されることが示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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