(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
インフルエンザウイルスのＲＮＡポリメラーゼ構成蛋白（ＰＡ、ＰＢ１及びＰＢ２）遺伝子に対応して作成し、サブユニットＰＡのＮ末端にタグを付したｃＤＮＡを、それぞれバキュロウイルスゲノムに組み込むことにより、前記ＲＮＡポリメラーゼ構成蛋白遺伝子に対応する数の組換え体ウイルスを作成し、これら全ての組換え体ウイルスを同一の昆虫細胞に感染させて、該ＲＮＡポリメラーゼ構成蛋白遺伝子を同時に発現させ、前記タグの付されたＲＮＡポリメラーゼをタグ部分で結合する吸収体を利用して精製することから成るインフルエンザウイルスＲＮＡポリメラーゼの製法。
【請求項２】
前記タグがＨｉｓタグである請求項１に記載の製法。
【請求項３】
更に、得られたＲＮＡポリメラーゼ構成蛋白複合体をインフルエンザウイルスＲＮＡ又はその必須部分に接触させることから成る請求項１又は２に記載の製法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、ＲＮＡウイルスのウイルスＲＮＡポリメラーゼを製造する方法に関し、より詳細には、ウイルスゲノムＲＮＡから単離されたウイルスＲＮＡポリメラーゼを製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来の方法インフルエンザウイルスＲＮＡポリメラーゼは抗ウイルス剤の究極のターゲットとしての関心と、基礎科学分野では、これまで知られていたＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼとは異なり、生物進化の起源としてのＲＮＡゲノムの増殖に関係するＲＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼとしての興味から、ウイルス粒子からＲＮＡポリメラーゼを精製する様々の試みがなされて来た。しかし、ウイルスゲノムＲＮＡに強く結合するＲＮＡポリメラーゼを効率的に分離し、精製する方法はなかった。
我々は先に、ウイルス粒子から、高濃度塩化セシウム溶液中での遠心分離により、ゲノムＲＮＡに結合したＲＮＡポリメラーゼを複合体として遠心分離法により分離回収した。更に、ＲＮＡポリメラーゼーＲＮＡ複合体を、セシウムトリフルオロアセテート塩溶液中で遠心分離法により解離し、ＲＮＡポリメラーゼをＲＮＡから分離するのには成功した。しかし、精製過程での失活が激しく、大量精製には利用できなかった。
【０００３】
次の段階では、３種類のＰ蛋白質を精製し、それらを試験管中で混合し、ＲＮＡポリメラーゼを再構成する試みがなされた。米国Ｓｕｍｍｅｒｓらは、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）で蛋白質を分離精製して利用し、微量ながらＲＮＡ合成活性の回復を見た。我々は、バキュロウイルス感染細胞から３種類のＰ蛋白を別々に精製し、試験管内再構成を試みたが、同様に微量の活性回復を認めたに過ぎない。従って、この方法にも期待できないまま、今日に至っている（Honda, A., Mukaigawa, J., Yokoiyama, A., Kato, A., Ueda, S., Nagata, K., Krystal, M., Nayak, D. and Ishihama, A.: Purification and molecular structure of RNA polymerase from influenza virus A/PR8. J. Biochem. 107, 624-628 ( 1990)、 Kobayashi, M., Tuchiya, K., Nagata, K. and Ishihama, A.: Reconstitution of influenza virus RNA polymerase from three subunits expressed using recombinant baculovirus system. Virus Res. 22, 235-245 (1992)）。
また、特開平９−１２１８６７や特開平１１−１９９４８９にはインフルエンザウイルス等の蛋白質発現を抑制するオリゴリボヌクレオチド等からなる抗ウイルス剤が開示されているが、これらも上述の課題を解決していないため、有効な抗ウイルス剤となっていない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
従来は、ウイルスから直接分離する方法があったが、ウイルス粒子に含まれているＲＮＡポリメラーゼは微量で、混在物を除去して精製することは困難であった。その上、微量のＲＮＡポリメラーゼは早急に失活する性質があるので、活性をもつＲＮＡポリメラーゼを単離精製する、実用的方法はなかった。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
ウイルスは宿主生物に寄生して増殖し、増殖に必要な物質は、大方宿主のものを利用する。ウイルスが自らの遺伝子の指令で生産するのは、ウイルスゲノムとウイルス粒子を構成する蛋白成分に過ぎない。全ての生物のゲノムはＤＮＡであるが、ウイルスではＲＮＡをゲノムにもつものが多い。従って、ウイルスがゲノムを複製するためには、宿主の複製装置が利用できず、自らＲＮＡ複製装置（ＲＮＡポリメラーゼ）を合成して対応する。抗ウイルス剤の重要なひとつの要件は、宿主の生存増殖には悪い影響を与えないことである。その点で、ＲＮＡウイルスが自ら準傭する唯一の酵素であるＲＮＡポリメラーゼが、抗ウイルス剤開発の究極のターゲットと考えられて来た。しかし、開発に要するウイルスＲＮＡポリメラーゼが調製できなかったために、このアイディアは実現していない。その難関を突破した本発明によって、抗ウイルス剤開発の新局面が可能となった。
【０００６】
この発明は、インフルエンザウイルスのＲＮＡポリメラーゼ構成蛋白（ＰＡ、ＰＢ１及びＰＢ２）遺伝子に対応して作成し、サブユニットＰＡのＮ末端にタグを付したｃＤＮＡを、それぞれバキュロウイルスゲノムに組み込むことにより、前記ＲＮＡポリメラーゼ構成蛋白遺伝子に対応する数の組換え体ウイルスを作成し、これら全ての組換え体ウイルスを同一の昆虫細胞に感染させて、該ＲＮＡポリメラーゼ構成蛋白遺伝子を同時に発現させ、前記タグの付されたＲＮＡポリメラーゼをタグ部分で結合する吸収体を利用して精製することから成るインフルエンザウイルスＲＮＡポリメラーゼの製法である。
【０００７】
【発明の実施の形態】
ＲＮＡウイルスには二つの集団がある。ひとつは、宿主生物に感染し、その中でゲノムＲＮＡを翻訳してＲＮＡポリメラーゼを合成できる集団で、ゲノムが蛋白合成の鋳型（ｍＲＮＡ）として利用できる性質から、「プラス鎖ＲＮＡウイルス」と呼ばれている。もう一群のウイルスは、ゲノムが蛋白合成の鋳型として働かず、一度相補鎖に転写したものをｍＲＮＡとして利用する集団である。この集団は、「マイナス鎖ＲＮＡウイルス」と呼ばれている。ゲノムＲＮＡの相補鎖ＲＮＡへの転写酵素を生物はもたないので、この集団のウイルスでは、ウイルス粒子の中に予めＲＮＡポリメラーゼを備えている。この集団には、パラミクスウイルス科、オルソミクソウイルス科、ラブドウイルス科、ブンヤウイルス科及びアレナウイルス科に属するウイルスが含まれる。本発明は、この集団のウイルス全てに適用できる。
【０００８】
本発明のインフルエンザウイルスの場合のＲＮＡポリメラーゼの製法は以下の手順で行う。
（１）インフルエンザウイルスＲＮＡポリメラーゼＰＢ１，ＰＢ２，ＰＡ各サブユニット発現バキュロウイルスの作製
ＰＢ１，ＰＢ２両サブユニットのｃＤＮＡはバキュロウイルスゲノムＤＮＡに相同組換えにより組み込むために以下の操作を行う。即ち、まずそれらｃＤＮＡを中間のベクターに組み込み大腸菌での発現を確認する。これらの中間ベクターＤＮＡをそれぞれバキュロウイルスＤＮＡと同時に、バキュロウイルスが感染する宿主である昆虫細胞株にエレクトロポーレーション法又はリポフェクチン法を用いて導入する。細胞内で相同組換えを起こし、ＰＢ１，ＰＢ２各遺伝子を持つ変異バキュロウイルスを単離する。一方、もうひとつのＰＡサブユニットのｃＤＮＡは、発現細胞からのＲＮＡポリメラーゼの精製を簡便にするため、そのＮ末端にヒスチジン（Ｈｉｓ）残基を多く含む配列を融合して発現させるために、Ｈｉｓタグ標識（ＨＡＴ）を含むｐＨＡＴベクターのＨＡＴ標識の下流にＰＡ−ｃＤＮＡを繋ぐ。この中間ベクターもＰＢ１、ＰＢ２と同様に相同組換えによりバキュロウイルスＤＮＡに挿入する。
【０００９】
（２）組換えバキュロウイルスを用いての、インフルエンザウイルス３種Ｐ蛋白サブユニットの昆虫細胞での同時発現によるＲＮＡポリメラーゼの再構成
各Ｐ蛋白サブユニットをもつ３種類の組換えバキュロウイルスを昆虫細胞に同時に感染させ、各サブユニットの発現を抗体を用いたウェスタンブロット（免疫検出）法で確認する。細胞をホモジナイザーで破砕し、核分画を調製した。核を界面活性剤を加えて壊し、超遠心機で毎分５万回転の速度で２時間遠心後、上澄み液をＴＡＬＯＮ金属アフィニティレジン（吸収体）と混合し、Ｈｉｓタグをもつ蛋白質を吸着させる。蛋白を吸着したレジンを１００ｍＭイミダゾール液で処理して、Ｈｉｓタグとの結合を弱め、蛋白を溶出させた。溶出液をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分画し、各Ｐ蛋白サブユニットの存在をウェスタンブロッテイング法により分析する。本発明においては、ＨｉｓタグはＰＡにしか結合していないのに、ＰＢ１，ＰＢ２蛋白もこの分画に回収されたので、３種類Ｐ蛋白が会合体を形成していると判定された。
【００１０】
（３）昆虫細胞で形成されたインフルエンザウイルスＲＮＡポリメラーゼの精製と活性測定
組換え体バキュロウイルス感染昆虫細胞を破砕し、細胞素抽出液から、上記の方法で、再構成ＲＮＡポリメラーゼを純化する。ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分画した後、ゲル中の蛋白をクマシーブルー（Coomassie blue）染色により検出し、Ｐ蛋白の精製度の確認を行う。本発明においては、純化Ｐ蛋白複合体につき、インフルエンザウイルスＲＮＡポリメラーゼがもつ以下の既知４種類の活性の全てを検出した。
（１）ＲＮＡ鋳型依存ＲＮＡ合成活性；
（２）プライマー依存ＲＮＡ含成活性；
（３）宿主細胞由来ｍＲＮＡキャップ(cap-1)構造認識結合活性；
（４）キャップ(ｃａｐ１)構造をもつＲＮＡの特異部位での切断活性
この手順と同様の手順で、上述の本発明の集団に属するウイルスのＲＮＡポリメラーゼを製造することができる。
【００１１】
【実施例】
本実施例は以下の材料を用いて行った。
(i)  組換バキュロウイルス作製のためのＢａｃ−ｔｏ−Ｂａｃベクター（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社製）。
(ii)  ウイルス蛋白発現の為の昆虫細胞株（Ｓｆ９，Ｔｎ５など）。
(iii)  昆虫細胞で発現した蛋白の精製の為のＴＡＬＯＮ metal affinity resins（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）。
(iv)  ＲＮＡポリメラーゼ活性測定試薬
ＲＮＡ合成基質（ＡＴＰ，ＧＴＰ，ＣＴＰ，ＵＴＰ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）。プライマーとして利用するＡｐＧ，ｇｌｏｂｉｎ  ｍＲＮＡ。
(v)  鋳型ＲＮＡ作製試薬
鋳型ＲＮＡ作製のためのベクターｐＶ５３。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（ＴＡＫＡＲＡ製）。
(vi)  キャップＲＮＡ切断活性測定試薬
ｍＲＮＡのｃａｐ位標識試薬。[α−３２Ｐ]ＧＴＰ。キャッピング酵素。
【００１２】
試験手順
組換えバキュロウイルスを感染させるためには昆虫細胞株Spodoptera frugiperda（Ｓｆ９）及びTrichoplusia ni（Ｔｎ５）を用い、組換えウイルスを作製するためにＡｃＮＰＶ(Autographa california nuclear polyhedrosis virus)を用いた。
ＰＢ１及びＰＢ２を発現させるための組換えバキュロウイルスは、既発表の文献（Kobayashi M., Tsuchiya K., Nagata K. and Ishihama A.(1992) Virus Res. 22 235-245）の記載に従って構成した。ＰＡを発現させるための組換えウイルスを構成するために、ＰＣＲによりＰＡ用のｃＤＮＡを増幅し、ｐＡｃＨＬＴ−Ｂ(Phamigen)のＮｃｏＩ位置及びＢｇ１ＩＩ位置の間に挿入した。その結果生成したプラスミドＤＮＡ（ｐＡｃＨＬＴＰＡ）を線状にして、リポソーム法によりバキュロウイルスＤＮＡとともにＳｆ９昆虫細胞に導入し形質転換した。２７℃で７２時間培養した後、上澄みを回収し、そこに含まれる組換えウイルスをＳｆ９細胞に感染させ増殖させた。７２時間後、培養上澄み液を回収し、プラークアッセイ法により組換えウイルス（ＲＢＶＨ−ＰＡ）の力価を測定した。このウイルスの力価は１０８ＰＦＵ／ｍｌであった。
【００１３】
３種類の組換えバキュロウイルスをそれぞれ感染多重度２で、Ｔｎ５又はＳｆ９に共感染させた。４日間培養後、その１０８細胞を回収し、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．６）、１０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２ｍＭ ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００及び１ｍＭ フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ、Ｓｉｇｍａ）を含む破砕緩衝液５ｍｌ中に懸濁し、Ｄｏｕｎｃｅ型ホモジェナイザーを用いて破砕した。核を２０００ｒｐｍで５分間の遠心分離により回収し、次に１０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、５００ｍＭ ＮａＣｌ及び２０％グリセリンを含む核抽出緩衝液３ｍｌ中で均質化した。このホモジネートを攪拌しながら氷上に３０分置き、４００００ｒｐｍで２時間遠心分離した。この上澄み（核抽出物）を金属親和性樹脂（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）と混合し、一定速度で回転しながら４℃で１時間反応させた。この樹脂を、ＵＶモニターにより溶液中に蛋白が検出されなくなるまで、５０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、３００ｍＭ ＮａＣｌ及び５ｍＭ イミダゾールを含む洗浄緩衝液により洗浄し、次に１００ｍＭ イミダゾールを含む溶出緩衝液を用いて溶出した。溶出した蛋白をＳＤＳ−８％ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析し、このゲルをクマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）で染色した。
【００１４】
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離したＰ蛋白を、１０％メタノールを含有する１０ｍＭ ＣＡＰＳ緩衝液（ｐＨ１１）中のＰＶＤＦ膜上にエレクトロブロットした。ブロットされたフィルターを抗ＰＡ抗体、抗ＰＢ１抗体及び抗ＰＢ２抗体と３７℃で１時間反応後、ペルオキシダーゼ付加抗ラビットＩｇＧで処理した後、これを３，３’−ジアミノベンジジンテトラヒドロクロリド（ＤＡＢ）（ＤＯＪＩＮ）で染色することによりＰ蛋白を検出した。抗Ｐ蛋白抗体は大腸菌細胞中で過剰に発現させた後精製したＰ蛋白を用いてウサギを免疫し調製した。
【００１５】
５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ（ｐＨ７．６）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ酢酸マグネシウム、２ｍＭ ＤＴＴ、それぞれ０．２５ｍＭのＡＴＰ、ＧＴＰ及びＣＴＰ、４μＭ ＵＴＰ、１０μＣｉ[α-３２Ｐ]ＵＴＰ、０．２５ｍＭ ＡｐＧ又は２５０ｎｇグロビンｍＲＮＡ、１単位のＲＮａｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、並びに１ピコモルのｖ５３又はｃ５３モデルＲＮＡ鋳型を含む標準反応混合物５０μｌ中において、３０℃で６０分保温し、ＲＮＡ合成を行った。転写物を７Ｍ尿素の存在下１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析し、このゲルをイメージングプレートに曝し、次にこれをＢＡＳ２０００イメージアナライザー（フジ製）で分析した。モデル鋳型（ｖ５３及びｃ５３）はＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いてｐＶ５３又はｐＣ５３プラスミドＤＮＡを転写することにより合成した。
【００１６】
放射性基質の存在下でＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いてｐＶ５３又はｐＣ５３ＤＮＡを転写することにより放射性ｖ-及びｃＲＮＡを合成した。５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ 酢酸マグネシウム、２ｍＭ ＤＴＴ、及び１０μｇ ｔＲＮＡを含むＲＮＡ結合反応液５０μｌ中において、３Ｐ複合体（３種のＰ蛋白から成る複合体）１０μｌ及び放射性ｖ５３、ｃ５３又はランダムＲＮＡ（ＴＭＶ ３’-末端配列）１００００ｃｐｍを３０℃で３０分反応させた。３０分間ＵＶ照射後、抗ＰＢ１抗体を添加し、３７℃で１時間反応を継続した。氷上で蛋白Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて２時間反応させた後、形成された抗原・抗体複合体を回収した。この蛋白Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ複合体をＰＢＳで一度洗浄して、次にＳＤＳ−８％ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた。このゲルを上記と同様に分析した。
【００１７】
既発表の文献（Honda A., Mizuno K. and Ishihama A.(1998) Virus Res. 55 199-206）の記載に従って、キャップされたＲＮＡをＰ蛋白に架橋した。簡単に記載すると、[α-３２Ｐ]ＧＴＰの存在下でワクシニアウイルスグアニリルトランスフェラーゼ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を用いて、脱キャップされたＲＮＡの再キャップ反応を１サイクル行なった。５’位のみに３２Ｐを有するキャップ構造（約１０００ｃｐｍ）をもつグロビンｍＲＮＡ及び３Ｐ複合体又はウイルス核蛋白（ＲＮＰ）を、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ（ｐＨ７．６）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ 酢酸マグネシウム、２ｍＭ ＤＴＴ、及び１単位のＲＮａｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を含む、最終容積が５０μｌの溶液中において、３０℃で３０分反応させた後、３０分ＵＶに曝した。このＲＮＡ架橋蛋白をＲＮａｓｅ Ａ及びＲＮａｓｅ Ｔ１で消化し、次に抗ＰＢ２と共に３７℃で１時間反応させた。氷上で蛋白Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて２時間反応させた後、形成された抗原・抗体複合体を沈殿させた。この沈殿物をＰＢＳで一度洗浄して、ＳＤＳ−８％ゲル上でゲル電気泳動して分画した。このゲルを上記と同様に分析した。
【００１８】
精製した３Ｐ複合体を５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＤＴＴ、０．３％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．２５ｍｇ／ｍｌＢＳＡ及びキャップされたグロビンｍＲＮＡまたはポリ(Ａ)（５’位のみに３２Ｐを含む、約２０００ｃｐｍのキャップをもつＲＮＡ）を含む反応混合物５０μｌ中において、３０℃で３０分反応させた。反応生成物をフェノール−クロロホルムで抽出し、エタノールで沈殿させ、７Ｍ尿素の存在下で１２％ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析した。このゲルを上記と同様に分析した。
この反応混合物にＯｌｉｇｏｔｅｘ(ｄＴ)３０（Ｔａｋａｒａ）を添加し、７５℃で１０分間処理した。この熱処理された混合物を氷上に５分間置き、次に最終濃度が５００ｍＭとなるように５Ｍ ＮａＣｌを加えた。３７℃で１０分間培養後、このサンプルを２０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。沈殿物を、１ｍＭＥＤＴＡ、０．５Ｍ ＮａＣｌ及び０．０５％ＳＤＳを含む１０ｍＭトリスＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄し、滅菌蒸留水０．１ｍｌ中に再懸濁した。ＲＮＡをフェノール−クロロホルムで抽出し、エタノールで沈殿させ、次に７Ｍ尿素の存在下でポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析した。
【００１９】
試験結果
それぞれＰＢ１、ＰＡ及びＰＢ２蛋白の遺伝子を含むｖＲＮＡセグメント１、２、及び３のｃＤＮＡを用いて、インフルエンザウイルスＲＮＡポリメラーゼの３つの異なるＰ蛋白サブユニットを発現させるために組換えバキュロウイルスを構築した。３Ｐ複合体の精製を容易にするために、長さが４０アミノ酸のヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ配列をそのＮ末端に付加した融合体ＰＡ蛋白を発現させるために、ＰＡ ｃＤＮＡをｐＡｃＨＬＴベクターに挿入した。ＰＡのＮ末端配列がサブユニット−サブユニット接点に見られなかったことから推察すると、このＨｉｓタグの付加はＲＮＡポリメラーゼの集合及び活性を阻害するものではなかったといえる。ＰＢ１及びＰＢ２を生成するための組換えバキュロウイルスの構成については既発表の文献（Kogayashi M., Tsuchiya K., Nagata K. and Ishihama A.(1992) Virus Res. 22 235-245）に記載した。
【００２０】
Ｐ蛋白の発現を確認するために、様々な条件下で組換えバキュロウイルスをＳｆ９細胞に感染させ、全細胞の溶解物を各Ｐ蛋白に対するポリクローナル抗体で免疫染色することにより分析した。組換えバキュロウイルスＲＢＶＨ−ＰＡを単独で感染させた場合には、ＳＤＳ-８％ポリアクリルアミドゲル電気泳動において細胞質及び核部分の両方に抗ＰＡに対して交差反応するバンドが観察された（図１Ａのレーン２及び３）。Ｈ−ＰＡ（Ｈｉｓタグの付されたＰＡ）の泳動速度はＨｉｓタグの付されていない元のＰＡより僅かに遅かった（図１Ａのレーン１）。非感染細胞抽出物においては、いかなる免疫染色されたバンドも観察することは出来なかった（図１Ａのレーン４及び５）。組換えウイルスＲＢＶＨ−Ｐの単独感染細胞では、ＰＢ１及びＰＢ２の発現は観察されなかった。一方、３つ全ての組換えウイルス、ＲＢＶＰＢ１、ＲＢＶＰＢ２及びＲＢＶＨ−ＰＡをＳｆ９細胞に共に感染させた場合には、それぞれ抗ＰＢ１及び抗ＰＢ２で免疫染色を行うと、Ｈ−ＰＡだけでなくＰＢ１及びＰＢ２の発現も観察された（図１Ｂ及びＣ）。ＰＢ１及びＰＢ２は、細胞質及び核部分の両方で回収された。
【００２１】
３種類のウイルスＰ蛋白が昆虫細胞中で複合体を形成するか否かを調べるために、３種類の組換えバキュロウイルスをＴｎ５細胞に同時に感染させた（各ウイルスについて感染多重度２）。細胞溶解物のＳＤＳ-８％ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った後、対応する抗体で免疫染色することにより３種類の全てのＰ蛋白が検出され、それぞれの大部分は核部分で回収された（図１）。Ｐ蛋白複合体を精製するために、核抽出物を４００００ｒｐｍで１時間遠心分離し、上澄みを直接金属親和性樹脂と混合し、吸着させた。樹脂より１００ｍＭイミダゾールを用いて溶出された物質をＳＤＳ-８％ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分画し、このゲルをクマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）で染色したところ、３つの染色されたバンドが観察された（図２Ａ、レーン３）。これらは泳動の順に抗ＰＢ１、抗ＰＡ及び抗ＰＢ２抗体と交差反応を起こした。ＰＢ１及びＰＢ２の両方ともウイルスＲＮＰコアと結合した、対応するＰ蛋白と同じ移動度でＳＤＳポリアクリルアミドゲル上を泳動した（図２Ａ、レーン１）。一方、Ｈ−ＰＡは、ＲＢＶＨ−ＰＡウイルス感染細胞から回収された組換えＨ−ＰＡと同じく速く泳動したが（図２Ａ、レーン２）、ＲＮＰに結合するタグをもたないＰＡよりも遅く移動した（図２Ａ、レーン１）。従って、少なくともＰＢ１及びＰＢ２分子のいくつかはＨｉｓタグの付加されたＰＡ蛋白と結合しているものと結論される。
【００２２】
インフルエンザウイルスＰ蛋白を高水準に発現させるシステムを構築するために、次に２つの細胞株（Ｔｎ５及びＳｆ９）に感染し２７℃で同条件下で培養してＰ蛋白の発現レベルを比較した。金属親和性樹脂による精製後、３つ全てのＰ蛋白はＳＤＳ-ゲルのＣＢＢ染色によっても検知可能であった（図２Ｂ）。この染色強度から、同量の３つのＰ蛋白が３Ｐ複合体中に存在していることがわかる。Ｔｎ５細胞における発現レベルがＳｆ９の場合よりも高いため、３Ｐ複合体の大規模精製のためにはＴｎ５を使用した。このＣＢＢ染色強度に基づくと、３Ｐ複合体の収率は１×１０８ウイルス感染Ｔｎ５細胞から約５μｇであると推定された。
【００２３】
ウイルスＲＮＰコアから可溶化されたインフルエンザウイルスＲＮＡポリメラーゼは、ＲＮＡ鋳型がウイルスゲノムＲＮＡセグメントの末端配列を有していれば、ＲＮＡ合成活性を示す。精製された３Ｐ複合体のＲＮＡ合成活性を、２つのモデル鋳型（ｖ−センス（マイナス鎖）ｖ５３及びｃ−センス（プラス鎖）ｃ５３）、２種類の代替プライマー（グロビンｍＲＮＡ及びジヌクレオチドＡｐＧ）を用いて試験した。ｖ５３を鋳型として用いる場合には、ＲＮＡ生成物は、ＡｐＧ−及びｍＲＮＡいずれのプライマーを用いても検出された（図３Ａ、レーン１及び３）。ｍＲＮＡプライマーを用いた反応の転写物の一つ（レーン３）はＡｐＧプライム化転写物（レーン１）よりも約１２ヌクレオチド（ｎｔｓ）長かった。非感染細胞の核抽出物はいずれの鋳型からもＲＮＡを合成することは出来なかった（図３Ａ、レーン５〜８）。これは、観察されたＲＮＡ合成が、組換えウイルスで感染した昆虫細胞中に形成された３Ｐ複合体の活性によるものであって、細胞由来の酵素によるものではないことを示している。ＲＮＡ鋳型がランダムな配列を有している場合には３Ｐ複合体はいかなるＲＮＡをも合成することはできないので、この３Ｐ複合体は、天然のウイルスＲＮＡポリメラーゼと同様に、ｖＲＮＡを特異的に認識することを示している。
【００２４】
ｃ５３を鋳型として用いた場合に、ＲＮＡ生成物をＡｐＧプライマーの存在下で検出した（図３Ａ、レーン２）。しかし、このｃＲＮＡを鋳型としＡｐＧをプライマーとして合成された転写物のサイズは５３ｎｔ鋳型より短く、これはｃ５３ＲＮＡ内のまだ同定されていないＡｐＧ結合部位からの内部開始によるものであると考えられる。グロビンｍＲＮＡをプライマーとして用いた転写の活性は低く、転写物の明確なバンドは、少なくとも試験した条件下では、検出されなかった（図３Ａ、レーン４）。これはｖセンスＲＮＡのみが、キャップされたＲＮＡをプライマーとして転写する活性を誘導することができることを示している。
インフルエンザウイルスＲＮＡポリメラーゼは、転写酵素及び複製酵素間の機能交換をしている。しかし、キャップされたＲＮＡをプライマーとするＲＮＡ合成の開始は、転写酵素の特徴ある性質である。一方、複製酵素形態のＲＮＡポリメラーゼは、ウイルス粒子中のｖＲＮＡが５’-三燐酸塩を保持していることから明らかなように、プライマーを用いずに新規なＲＮＡ合成を開始すると考えられる。組換えバキュロウイルスで感染した昆虫細胞から精製された３Ｐ複合体は、プライマーの存在なしではＲＮＡ合成を触媒することはできない。従って、この３Ｐ複合体は、ウイルス性ＲＮＡポリメラーゼの転写酵素形態を表すものであるといえる。
【００２５】
インフルエンザウイルスＲＮＡポリメラーゼはｖＲＮＡ及びｃＲＮＡの５’及び３’−末端の保持された塩基配列を、転写プロモーター及び複製開始点として認識し、その配列に結合することによって、酵素がもつ固有の活性を発現する。そこで、我々は３Ｐ複合体のｖＲＮＡ及びｃＲＮＡへの結合を調べた。放射性物質でラベルされたモデル鋳型、ｖ５３及びｃ５３、並びに同等サイズのランダムなＲＮＡを、基質なしの転写反応混合液中で、３Ｐ複合体と共に３０℃で３０分反応させ、次に架橋を促進するために紫外線に３０分曝した。直ちにＲＮａｓｅで消化させた後、生成物を抗ＰＢ１抗体及びＡ蛋白の組み合わせにより免疫沈降し、この免疫沈降物をＳＤＳ−８％ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析した。その結果、ｖＲＮＡ（図４、レーン２及び３）及びｃＲＮＡ（図４、レーン５及び６）モデル鋳型の双方とも３Ｐ複合体に架橋されたが、ランダムＲＮＡは架橋されなかった（図４、レーン８及び９）。この結果は、昆虫細胞中で形成した３Ｐ複合体が、天然ウイルスＲＮＡポリメラーゼの場合のように、ｖＲＮＡ及びｃＲＮＡの両方を特異的に認識することができることを示している。
【００２６】
インフルエンザウイルスの増殖の一つの特徴は、宿主細胞のキャップされたＲＮＡがウイルスの転写を開始するためのプライマーとして用いられていることである。更に注目すべきことに、このインフルエンザウイルスＲＮＡポリメラーゼ自体が５’−キャップ構造近傍の特異的位置においてキャップされたＲＮＡを特定部位で切断することができる。グロビンｍＲＮＡが３Ｐ複合体自身による転写用のプライマーとして機能することができるということの発見は、この複合体がキャップされたＲＮＡの結合及び切断の活性を有していることを示すものである。この予測を確かめるために、我々は次に３Ｐ複合体のキャップされたＲＮＡへの結合活性を調べた。この目的のために、ワクシニアウイルスグアニリルトランスフェラーゼを用いて[α−３２Ｐ]ＧＴＰで再キャップされたラビットグロビンｍＲＮＡを用意した。次にこの３Ｐ複合体又はウイルスＲＮＰをこの再キャップされたＲＮＡ（キャップ−１構造のみに３２Ｐを有する）と共に反応させ、直ちに紫外線に曝して架橋させた。引き続いてＲＮａｓｅ Ａ及びＲＮａｓｅ Ｔ１で消化した後、この３Ｐ複合体を抗ＰＢ２血清及びＡ蛋白と共に免疫沈降し、ＳＤＳ−８％ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析した。非感染細胞からの核抽出物はＰ蛋白部位に何の放射性バンドをも示さなかった（図５Ａ、レーン１）。しかし、３Ｐ複合体（図５Ａ、レーン２及び３）及びウイルスＲＮＰ（図５Ａ、レーン４）の両方で、ＰＢ２バンドに３２Ｐ放射能が検出された。これは３Ｐ複合体がキャップされたＲＮＡ結合活性を有していることを示している。組換えバキュロウイルスで感染された昆虫細胞からの抽出物の生成物において、ＰＢ２よりも速く泳動する少なくとも一つの追加バンドにおいても放射能が検出された。しかし、このバンドは非感染細胞からの核抽出物によっても生じており、これがキャップされたＲＮＡ結合活性を有する速く泳動する（昆虫細胞）蛋白に相当するものであることを示している。
【００２７】
次に精製した３Ｐ複合体を用いてキャップされたＲＮＡ切断活性を調べた。この試験では、グロビンｍＲＮＡ及びキャップされたポリ(Ａ)の両方（両者ともキャップ−１構造のみに３２Ｐを有する）を基質として用いた。キャップされたポリ(Ａ)はＲＮＰによるエンドヌクレアーゼ切断のためのよい基質である。期待したように、ＲＮＰと共に反応すると、キャップされたポリ(Ａ)は切断されて長さが１０〜１３ｎｔの断片を生成した（図５Ｂ、レーン１）。精製３Ｐ複合体を用いると、このキャップされたＲＮＡは、ｖ５３鋳型の存在下でのみ、切断されたが（図５Ｂ、レーン４）、鋳型ＲＮＡが存在しない場合（図５Ｂ、レーン３）又は非感染細胞からの相当する抽出物を用いる場合（図５Ｂ、レーン２）には切断されない。鋳型ＲＮＡと結合させることによる、ＲＮＡポリメラーゼ付随のキャップＲＮＡエンドヌクレアーゼが活性化されることは、すでに観察されていたが（Hagen,M., Chung,T.D., Butcher,J.A. and Krystal,M.(1994)J.Virol.68,1509-1515、Li,M.L.,Ramirez,B.C., and Krug,R.M. (1998) EMBO J. 17, 5844-5852）、しかし驚くべきことに、キャップＲＮＡエンドヌクレアーゼの活性促進はｖ５３鋳型でのみ観察された。ｃ５３には、ＲＮＡポリメラーゼ活性調節機能は認められなかった（図５Ｂ、レーン５）。この観察結果は、３Ｐ複合体がｖセンス及びｃセンスＲＮＡを区別することを初めて示した。
【００２８】
もし昆虫細胞中に形成された３Ｐ複合体が転写酵素としての触媒活性を有しているならば、ｖＲＮＡ転写に加えてポリ(Ａ)付加活性ももっている可能性がある。この可能性を調べるために、グロビンｍＲＮＡをプライマーとして、ｖＲＮＡ転写生成物の詳細な解析を行った。ＲＮＡ生成物を１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析すると、長さが６５ｎｔの転写物の上に拡散した放射性バンドが観察された。このゆっくり泳動するＲＮＡが新規に合成されたＲＮＡに付加されたポリ（Ａ）配列を有しているか否かを試験するために、転写物をオリゴ(ｄＴ)３０樹脂と混合し、この樹脂に結合したＲＮＡを高濃度の塩の存在下で熱処理することにより溶出し、７Ｍ尿素の存在下で６％ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析した。図３Ｂに示すように、長さが約１００ｎｔのサイズのマーカーより遅く泳動する放射性ＲＮＡが検出された。オリゴ(ｄＴ)３０に結合したＲＮＡの平均サイズは、ＡｐＧプライム化転写物（図３Ｂ、レーン２及び３）についてよりもｍＲＮＡプライム化転写物（図３Ｂ、レーン５及び６）についての方が大きかった。この結果はＡｐＧ又はｍＲＮＡプライマーいずれかの存在下でｖＲＮＡモデル鋳型上に形成されるＲＮＡ生成物の少なくとも一部はポリ(Ａ)配列を含んでいることを示している。一方、ｃＲＮＡで誘導される転写物の大部分はオリゴ(ｄＴ)３０樹脂に結合しない。ｖＲＮＡ転写物をＲＮａｓｅ Ａ及びＲＮａｓｅ Ｔ１で処理した後、ヌクレアーゼ耐性ＲＮＡ部分がゲル電気泳動で検出された。これはポリ(Ａ)鎖と推定される。このようなｖＲＮＡで誘導された転写物へのポリ(Ａ)付加は、転写酵素に付随する別の特徴的機能である。
【００２９】
【発明の効果】
インフルエンザの予防治療に関しては、ウイルス全体またはウイルス構成蛋白を抗原とした免疫療法の開発と、ウイルス蛋白成分の生理活性を妨害する薬剤の探索開発が、主たる方向であった。その中で、残された唯一のターゲットがＲＮＡポリメラーゼであった。今回、ＲＮＡポリメラーゼの大量製造法が確立したことで、ＲＮＡポリメラーゼを対象とした阻害物質のマススクリーニングや、ＲＮＡポリメラーゼの酵素反応基質類似物の創薬が可能となる。その上、大量製造ＲＮＡポリメラーゼを利用して、その蛋白構造が解明できる見通しがあるので、将来は構造知見を利用した創薬も可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】組換えバキュロウイルス感染昆虫細胞中でのインフルエンザウイルスＰ蛋白の発現を示す図である。
[図１Ａ]  組換えバキュロウイルスＲＢＶＨ−ＰＡ（Ｈｉｓタグの付されたＰＡ蛋白（Ｈ−ＰＡ）遺伝子をもつバキュロウイルス）をＳｆ９細胞に感染多重度２で感染させた。４日間培養した後、この細胞を採取破砕し、細胞抽出液を調製した。2,000ｒｐｍで５分間遠心分離を行った後、上澄み（ＳＵＰ、細胞質）と沈殿物（ＰＰＴ、核）をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、このゲルを抗ＰＡ抗体を用いてイムノ・ブロット法（ウエスタンンブロット）で検出した。
[図１Ｂ及びＣ]  ３種類の組換えウイルス（ＲＢＶＰＢ１、ＲＢＶＰＢ２及びＲＢＶＨ−ＰＡ）を各ウイルスについて感染多重度２でＳｆ９に同時に感染させた。４日間培養した後、この細胞を採取し、上記と同様の処理を行った。この細胞質と核の両方の画分を抗ＰＢ１[Ｂ]又は抗ＰＢ２[Ｃ]抗体を用いてそれぞれイムノ・ブロットした。
【図２】組換えバキュロウイルス感染昆虫細胞からの３Ｐ複合体の精製を示す図である。
[図２Ａ]  組換えバキュロウイルスＲＢＶＨ−ＰＡ（レーン２）若しくは３つの全ての組換えバキュロウイルス（ＲＢＶＰＢ１、ＲＢＶＰＢ２及びＲＢＶＨ−ＰＡ）をＴｎ５細胞に各ウイルスについて感染多重度２で感染させ、４日間培養した。この全細胞抽出液の上澄み（ＳＵＰ）を金属親和性樹脂と混合し、イミダゾール溶出液をＳＤＳ−８％ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離、ゲルをＣＢＢで染色した。レーン１、インフルエンザウイルスＡ／ＰＲ８から単離されたＲＮＰ；レーン２、ＲＢＶＨ−ＰＡ感染細胞のイミダゾール溶出画分；レーン３、３つの組換えバキュロウイルスで同時に感染された細胞から単離された３Ｐ複合体。
[図２Ｂ]  ３種類の全ての組換えバキュロウイルスを同時にＳｆ９（レーン１）又はＳｎ５（レーン２）に感染させた。４日間培養した後、３Ｐ複合体を単離し、上記と同様の方法で分析した。
【図３】３Ｐ複合体によるモデル鋳型依存ＲＮＡ合成活性を示す図である。
[図３Ａ]  組換えバキュロウイルス感染細胞から精製された３Ｐ複合体又は非感染細胞からの同等画分により、ｖ５３（レーン１，３，５及び６）又はｃ５３鋳型（レーン２，４，７及び８）及びＡｐＧレーン１，２，５及び７）又はグロビンｍＲＮＡ（レーン３，４，６及び８）プライマーを用いて、試験管内ＲＮＡ合成を行った。生成物は尿素−８％ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離した。
[図３Ｂ]  ｖ５３鋳型（レーン１〜６）又はｖ５３（レーン７〜１２）及びプライマーＡｐＧ（レーン１〜３及び７〜９）又はグロビンｍＲＮＡ（レーン４〜６及び１０〜１２）の存在下に３Ｐ複合体で合成したＲＮＡを、オリゴ(ｄＴ)３０と混合した。樹脂に結合したＲＮＡを回収し、尿素−６％ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析した。長さ１００ｎｔのマーカーＲＮＡの泳動位置を図の左に示した。
【図４】３Ｐ複合体の鋳型ＲＮＡ結合活性を示す図である。
精製３Ｐ複合体を３２Ｐ−標識ｖ５３（レーン１〜３）、ｃ５３（レーン４〜６）又は配列がランダムなＲＮＡ（レーン７〜９）と混合し、紫外線に曝して架橋した。ＲＮＡが架橋された蛋白質を尿素−８％ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析し、ゲルをＸ線フィルムに曝した。
【図５】３Ｐ複合体のキャップされたＲＮＡに対する結合及び解離活性を示す図である。
[図５Ａ]  精製３Ｐ複合体（１２ピコモル／ｍｌ又は３μｇ／ｍｌ；レーン２、５μｌ；レーン３、１０μｌ）及びＲＮＰ（レーン４）のキャップＲＮＡに対する結合活性を測定した。キャップ位置にのみ３２Ｐ放射能をもつＲＮＡを、３Ｐ複合体又はＲＮＰと混合し、紫外線を照射した。リボヌクレアーゼＴ１及びリボヌクレアーゼＡで消化された後、ＲＮＡが架橋された蛋白質を尿素−８％ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析した。このゲルをＸ線フィルムに曝した。
[図５Ｂ]  ＲＮＰ（レーン１）、３Ｐ複合体（レーン２〜４）及び非感染細胞からの対応画分（レーン５）のキャップＲＮＡエンドヌクレアーゼ活性を測定した。各画分を、ｖ５３（レーン３及び４）若しくはｃ５３（レーン５）鋳型それぞれ１ピコモルの存在下又は非存在下（レーン１及び２）で、キャップ１のみにおいて３２Ｐをもつポリ(Ａ)と混合し、３０℃で３０分反応後、ＲＮＡを分析した。ゲルを一晩イメージプレートに曝し、このプレートをＢＡＳ２０００イメージアナライザー（フジ製）で分析した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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