(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ４６レセプターに結合せず又は赤血球吸着又は赤血球凝集を生じさせないが、その抗原性を保持しており、かつ、抗麻疹抗体により認識されるように改変された麻疹ウイルスタンパクである第１構成部分；及び
第１構成部分に融合し、かつ、遺伝学的可変性ウイルス又は他の治療ターゲットに結合可能な第２構成部分を含み、
第１構成部分が、麻疹ウイルス赤血球凝集素タンパク（ＭｅａＨ）の外部ドメインであり、
ＭｅａＨタンパクが、Ｎ末端から第５８番目〜第１００番目のアミノ酸の除去；第２４３番目、第４５１番目及び第４８１番目のアミノ酸の変異誘発；及び第２４４番目〜第２５０番目及び第４５０番目〜第５０５番目のアミノ酸領域の欠失をもたらすことにより改変されたものである組換え型の二機能性融合タンパク。
【請求項２】
欠失が第４７３番目〜第４７７番目のアミノ酸領域にもたらされる請求項１に記載の組換え型融合タンパク。
【請求項３】
第２構成部分が、第１構成部分のＮ末端に融合している請求項１又は２に記載の組換え型融合タンパク。
【請求項４】
第２構成部分が、ヒトにおける望ましくない免疫反応を避けるためのヒト起源のタンパクである請求項1〜３のいずれか１項に記載の組換え型融合タンパク。
【請求項５】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に結合可能な請求項１〜４のいずれか１項に記載の組換え型融合タンパク。
【請求項６】
第２構成部分が、ＨＣＶエンベロープタンパクＥ１を結合するアポリポタンパクＢ（アポＢ）のフラグメントである請求項５に記載の組換え型融合タンパク。
【請求項７】
第２構成部分が、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に結合可能である請求項１〜４のいずれか１項に記載の組換え型融合タンパク。
【請求項８】
第２構成部分が、ヒトクレアチンキナーゼＢである請求項７に記載の組換え型融合タンパク。
【請求項９】
ＨＩＶ１エンベロープタンパクｇｐ１２０に特異的に結合可能なヒトクレアチンキナーゼＢの一部である請求項７に記載の組換え型融合タンパク。
【請求項１０】
アミノ酸の位置の相違が５％以下であり、かつ、ＨＩＶ１エンベロープタンパクｇｐ１２０に特異的に結合可能であるヒトクレアチンキナーゼの変異体である請求項７に記載の組換え型融合タンパク。
【請求項１１】
第２構成部分が、以下の部分的ヌクレオチド配列：
【化１】
0004768944.tif 000009
によりコードされるタンパクである請求項７に記載の組換え型融合タンパク。
【請求項１２】
第２構成部分が、アミノ酸の位置の相違が５％以下である請求項１１に記載のタンパクの変異体である組換え型融合タンパク。
【請求項１３】
第２構成部分が、癌細胞の表面構造、タンパク又はエピトープに特異的に結合可能である請求項１〜４のいずれか１項に記載の組換え型融合タンパク。
【請求項１４】
第２構成部分が、ヒト単一鎖抗体（ｓｃＦｖ）である請求項１〜４のいずれか１項に記載の組換え型融合タンパク。
【請求項１５】
第２構成部分が、ヒトモノクローナル抗体である請求項１〜４のいずれか１項に記載の組換え型融合タンパク。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか１項に記載の融合タンパクをコードするポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野：
本発明は、特には、排他的なものではないが、そのワクチンを開発するのが困難な遺伝的可変性ウイルス及び他の治療的ターゲットによる感染症を治療するための新規な組換え型の二機能性融合タンパクに関する。
発明の背景：
ワクチン接種の原理は、天然痘に対する経験的治療の方式で１８世紀から知られている。最初の化学的ワクチンは、パスツールにより開発された（狂犬病）。これは、天然痘ワクチンのように、第１世代ワクチンであり、産生のために生存動物を利用する。第２世代ワクチンは、卵において産生され（インフルエンザ、黄熱病）、また、第３世代ワクチンは、細胞培養で産生される（ポリオ、麻疹、風疹、おたふく風邪、ダニ媒介脳炎）。第４世代ワクチンは、組換えＤＮＡ技術により種々の発現システムにおいて産生され、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）により代表される
ワクチンは、全体的に微生物（バクテリア、ウイルス、寄生虫等）からなっていてもよく、又は、その一部（サブユニットワクチン）からなっていてもよい。前者の場合、微生物は、不活性化（滅菌）又は弱毒化される。また、上述したように、組換え型抗原又は合成免疫原性ペプチドが近年用いられており、また、ＤＮＡワクチンが、所望の抗原を産生する宿主細胞を利用して開発されてきている。
ワクチン接種の第１の目的は、特定疾患の予防である。
【０００２】
それにもかかわらず、生命を脅かす数種の疾患に対するワクチンの比較的迅速な開発でさえ、既に感染した者にとっては遅過ぎる。最も一般的なヒトウイルス３種−Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）及びヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に感染した者の全世界における人数は、最新のもので、ＨＢＶについては３億人〜４億人であり、ＨＣＶについては６千万人より多く、及びＨＩＶについては３千万人より多く、これらを組み合せると、人口の１０％までに及ぶ。従って、治療の必要性が明らかであり、その選択の１つは治療的ワクチンの開発である。
ワクチンの開発の費用は高く、５千万〜２億ＵＳドルかかる。費用の大部分は、特定の感染因子の種々の抗原性変異体が、そのワクチンにより無力化されることを確実なものとするための労力による。これは、中程度で遺伝学的に分岐した微生物については困難であるが、ＨＩＶ、ＨＣＶ又はインフルエンザの表面糖タンパクと同程度の可変性の抗原を有するウイルスについては殆ど不可能である。一方、ポリオ、麻疹、おたふく風邪及び風疹（ＭＭＲ）等については、効果及び安全性の実験記録がある、高度に成功したワクチンが存在する。一方のＨＣＶ、ＨＩＶ及びインフルエンザと、他方のポリオ、麻疹、おたふく風邪及び風疹の間の主な相違は、成功的ワクチンが存在する後者群の因子が、前者群より遺伝的にかなり安定であることである。
インフルエンザワクチン接種は、各シーズンごとに、疫学的研究に基づき出現すると予測される特定の変異体に対して照準を合わせる。経験的ＨＩＶワクチンは、１又は数種の株から生じるエンベロープタンパクの種々の構成をベースとする。しかしながら、このアプローチが、全範囲又は少なくとも世界の単離物の大部分に効果的であるとは、依然として見込みがない。依然としてＨＣＶについて試験においてワクチンは開発されていない。
【０００３】
対照的に、先に記載したように、麻疹等のウイルスは、遺伝学的により安定である。ワクチン株により、幅広い交差反応性抗体が誘発される。麻疹赤血球凝集素(hemagglutinnin)（ＭｅａＨ）は、これらの抗体の主なターゲットである。それは、第２表面タンパク−融合タンパク（Ｆ）であるように、糖タンパクである。それらの両者には、細胞膜の融合が必要とされるが、その配列は、ＣＤ４６であると考えられる、細胞レセプターに結合するＭｅａＨで開始する。ＭｅａＨは、細胞質ドメインを形成することが意図される第１番目〜第３４番目のアミノ酸を有する膜固着タンパクであるが、第３５番目〜第５８番目は、膜貫通ドメイン（図１参照）を含む。第５９番目〜第１８１番目の残部は、柄を形成すると考えられ、その一部（第１３５番目〜第１８１番目）は、おそらく、分子のヒンジを形成する（Satoら, J. Virol. 69, 513-516 (1995)）。ビリオン表面におけるＭｅａＨのスパイクは、四量体（ジスルフィド架橋結合ホモダイマーのダイマー）からなる。第１３９番目及び第１５４番目のシステインは、単量体ＭｅａＨ糖タンパク間の分子間ジスルフィド結合に関係することが示唆された。麻疹ウイルス粒子のエンドプロテアーゼ消化により得られる可溶性形態のもの全てが、抗原性／反応性の予防を示すモノクローナル抗体と反応した（Satoら, J. Virol. 69, 513-516 (1995)）。赤血球吸着及び赤血球凝集作用に必要とされるＭｅａＨドメインは、第４５１番目〜第５０５番目の残部の間に位置付けされている（Hummel及びBellini, J. Virol. 69, 1913-1916 (1995)）。赤血球吸着の他に、突然変異誘発Val451Glu及びTyr481Asnが、また、ＣＤ４６下方制御及びＨｅＬａ細胞融合を抑止した（Lecouturierら, J. Virol. 70, 4200-4204 (1996)）。ＣＤ４６相互作用に必要とされる新規部位は、第４７３番目〜第４７７番目の間に位置付けされた（Pattersonら, Virology 256, 142-151 (1999)）。ＣＤ４６下方制御アミノ酸Arg（第２４３番目）に続いて位置する更なる中和エピトープＮＥ（第２４４番目〜第２５０番目）が、ＣＤ４６結合中に含まれ得る（Fournierら, J. Gen. virol. 78, 1295-1302 (1997)）。
本発明の目的は、遺伝学的可変性ウイルス及び他の治療的ターゲットに感染した者のための治療を提供することである。
【０００４】
発明の概要
本発明により、ＣＤ４６レセプターに結合せず又は赤血球吸着又は赤血球凝集を生じさせないが、その抗原性を保持しており、かつ、抗麻疹抗体により認識されるように改変された麻疹ウイルスタンパクである第１構成部分；及び
第１構成部分に融合し、かつ、遺伝学的可変性ウイルス又は他の治療ターゲットに結合可能な第２構成部分
を含む組換え型の二機能性融合タンパクを提供する。
本発明は、そのターゲットを認識し、特異的に結合する構成部分（“第２構成部分”）の使用をベースとする。そのような結合物は、適切なものであり、特には、エンベロープ糖タンパク等の、可変性ウイルスの表面構造における保存ペプチド配列に結合可能なものである。成功的ワクチン配合物に必要とされる中和抗体は、一般には、可変性表面タンパクに対するものである。本発明により、ウイルスを中和しないが、ウイルス株間に保存される表面タンパクに結合し得るものを用いることにより可変性の問題を解消する。
ウイルスクリアランスは、第１構成部分をそれらに融合させることにより達成する。この第１構成部分は、多量ワクチン接種プログラムの結果として一般個体群中に存在する抗麻疹抗体により認識される。好ましくは、第１構成部分は、麻疹ウイルス赤血球凝集素(hemagglutin)タンパク（ＭｅａＨ）の外部ドメインである。ＭｅａＨ第１構成部分は、それ自身がウイルス疾患を生じさせないが、その抗原性を保持しており、かつ、流行性抗麻疹抗体により認識され、結合される。これにより、本発明の融合タンパクが、ＨＣＶ及びＨＩＶ等の可変性ウイルスによる長期ウイルス感染の治療のために、治療的に有用なものとなる。
【０００５】
従って、本発明の好ましい態様により、二機能性融合タンパクが提供され、その一部は、ＣＤ４６レセプターに結合せず又は赤血球吸着又は赤血球凝集を生じさせないが、その抗原性を保持しており、先の感染及びワクチン接種により得られる患者の抗ＭｅａＨ抗体及び記憶細胞により認識され得るように改変された麻疹ウイルス赤血球凝集素（ＭｅａＨ）の外部ドメインである。融合タンパク物質の第２の部分は、例えばそれらのエンベロープ糖タンパクにより形成される、ＨＩＶ及びＨＣＶの表面構造に結合可能な分子又はその一部からなる。
これらの二機能性タンパクは、患者における現存抗麻疹免疫性をブーストし、同時に、それを、新たなターゲット、例えば、ＨＩＶ又はＨＣＶウイルスに対して再ターゲッティングすることが可能であり、新たな組成物がターゲットにする病因(agent)に感染した患者を治療するための治療的ワクチンとして使用可能である。
本発明の更なる態様は、組換え型融合タンパクをコードするポリヌクレオチド（特にはＤＮＡ）に関連する。これらは、治療的抗ウイルス剤目的で“ＤＮＡワクチン”として使用してもよい。
本発明は、また、その融合タンパク又はポリヌクレオチドを、薬理学的に許容可能なキャリヤと共に含む医薬組成物に関する。キャリヤは、一般には、アピロゲニックインジェクション又はインフュージョンビヒクル、例えば食塩水であり；胃腸管における放出のために公知の手段で配合された経口用組成物であってもよい。
本発明の態様を、例により記載する。
【０００６】
発明の記載
本発明は、治療される個体(individual)が先の感染又はワクチン接種のいずれかの結果としてそれに対する抗体を既に発現している抗原、及び複合体の実際のターゲットへの結合を仲介する複合体のターゲッティング部からなる二機能性融合タンパクによる、現存の体液性及び／又は細胞性免疫のブーストを利用する、新規な治療的アプローチに関する。この態様のために、抗原は、提案のアプローチを最適なものとするために数種の方法で改変された、麻疹ウイルスの赤血球凝集素（ＭｅａＨ）である。麻疹Ｆタンパクが、また、本発明における使用のために改変されてもよい。通常の複製サイクルにおいて行われるＭｅａＨの大抵の機能を、本発明の目的のために排除した。ブースター／キャリヤ抗原としてＭｅａＨに要求されるものは次のとおりである：
１）保存免疫原性／反応性（現存抗体に対する）及び記憶細胞による保存認識、
２）溶解性／膜固着の欠如、
３）新たな融合分子の２つの非関連部間のリンカー／ヒンジの提供、
４）ＣＤ４６結合の欠如、
５）赤血球の結合／凝集の欠如。
【０００７】
これらの変更をもたらす目的で、Ｎ−末端から第５８番目〜第１００番目のアミノ酸を欠く麻疹ワクチン株のＭｅａＨ遺伝子の構築を、ＰＣＲにより増幅させ、クローン化した（図１）。これらのクローンを、更に、第４５１番目及び第４８１番目のアミノ酸、及び第２４３番目についてのコドンの指定部位突然変異誘発(site directed mutagenesis)により改変した。また、小規模な欠如を、第２４４番目〜第２５０番目及び第４５０番目〜第５０５番目（特には第４７３番目〜第４７７番目）の領域においてもたらした。選択基準は次のものとした：ＣＤ４６の欠如、赤血球吸着及び赤血球凝集作用の欠如。同時に、成功的構築物は、それらの抗原性／ワクチン接種した個体からの抗体により認識される能力を保持する。
第２構成部分として、可変性ウイルスターゲット、即ち、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）及び非と免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に対して複合体を再ターゲッティングさせる数種の候補的分子が挙げられる。他の治療的ターゲットとしては、他の病原体；及び癌細胞に特異的な表面構造体、タンパク及びエピトープが挙げられる。クロイツフェルト−ヤコブ病（ＣＪＤ）又は新たな変異型ＣＪＤ（ｎｖＣＪＤ）に関連するプリオンタンパクがまたターゲットとされ得る。複合体分子のこの部分への望ましくない免疫反応を避けるために、ヒト起源の再ターゲッティングタンパクのみが、ヒトの治療に考慮される。候補分子は、ラージファージディスプレーライブラリーから選ばれ得る単鎖抗体（ｓｃＦｖ）である。モノクローナル抗体を、また、使用してもよい。ＨＣＶについて、少なくとも、血流におけるウイルスの亜集団が、低密度リポタンパク（ＬＤＬ）フラクションに対して、ＬＤＬのアポリポタンパクＢ（アポＢ）及びＨＣＶ  Ｅｌ糖タンパクの間の結合を介して関連していることが知られている。アポＢは、従って、化学的フラグメント化に付されており、ＨＣＶビリオン及び／又はＨＣＶ  Ｅｌ糖タンパクへ結合する関連フラグメントを決定した。これらのものは、遺伝レベルで、ＭｅａＨに対して融合させ、上述したように改変した。
【０００８】
同様に、ＨＩＶ結合についての候補分子又はそれらの部分について研究した。この目的のために、大抵はウイルスと接触しない源から調製される発現ライブラリーを研究して、ＨＩＶビリオンのアクセシブル(accessible)構造を結合可能な先に知られていないタンパクを発見した。数種の結合タンパクを、ヒトの脳からのライブラリー及び配列したそれらの幾らかにおいて確認した。比較的高い結合性を有する２つのクローンは次のものであった：
１）ヒトクレアチンキナーゼＢについてのコード配列を有するクローン、
２）未知のヒトタンパクについてのクローンであって、その部分的配列が次のもの。
【０００９】
【化２】
0004768944.tif 000002
【００１０】
アミノ酸の位置の相違が５％以下であり、かつ、ＨＩＶエンベロープタンパクに対して依然として結合性のこれらのクローンの変異体が、また、適切なものである。
アポリポタンパクＢについて上述したような方法を利用して、ＨＩＶビリオン及び／又はｅｎｖタンパクへの結合を仲介するこれらのタンパクのフラグメントを、ＭｅａＨと融合させ、先に記載したように改変した。
本発明の基本的思想は、自然感染又は好ましくはワクチン接種（それは標準方法論及び利用可能な記録の付加利点を有する）の結果としての遺伝学的に安定な抗原に対する、集団(population)の大多数に存在する免疫学的記憶を利用すること、及びそれを遺伝学的可変性又は他の理由からそのワクチンを製造するのが困難である感染性又は他の病因に対して再向(redirect)させることである。麻疹赤血球凝集素（ＭｅａＨ）は数種の理由で選ぶ：
１）麻疹に対するワクチン接種が、長時間にわたり成功的なものであり、麻疹が、世界的撲滅の将来的候補の１つである。従って、ワクチン接種適用範囲が大抵の発展途上国において高い。
２）麻疹ウイルス（ＭＶ）に対する保護作用の殆どが、赤血球凝集素に向けられていることが示されている。
３）赤血球凝集素について利用可能な構造的及び機能的データが十分である。
【００１１】
このタイプの再ターゲッティングは、結合／再ターゲッティング分子又はモチーフの利用可能性に依存して極めて幅広く利用可能であり、また、感染性病因とは別に、癌細胞を含み得る。しかしながら、本発明においては、重点は、可変性ヒトウイルス、即ち、ＨＩＶ及びＨＣＶにある。特に、いくらかのアフリカ及びアジア地域におけるＨＩＶ罹患率が重大な意味を持ち、迅速な新規治療アプローチが必要とされる。
ＡＩＤＳ患者が免疫系の機能障害を被ることはよく知られている。従って、前者のワクチン接種抗原、例えば麻疹に対する抗体のレベルがどの程度であるか、及びその患者において免疫学的記憶がいかに影響するかという問題が生じ得る。驚くべきことに、ＨＩＶ関連免疫不全の進行にもかかわらず、弱毒(waning)麻疹免疫は、ＨＩＶ感染成人において大きく進行しなかった[Zolopaら, Clinical Infectious Diseases 18, 636-638 (1994)]。麻疹抗体のレベルは、ＨＩＶ感染進行者及び非進行者の双方において安定なままであり[Brostromら, Clinical and Experimental Immunology 106, 35-39 (1996)]、ＨＩＶ陽性患者２１０人の９５％が、ＣＤ４カウントにかかわらずに麻疹抗体を有していた[Wallaceら, Vaccine 12, 1222-1224 (1994)]。
ＨＣＶ感染個体は、この方法で影響するそれらの免疫系を有することは知られておらず、記載の治療アプローチの無制限が予測される。
【００１２】
実施例
以下の実施例は、説明のみ目的として記載するのであって、本発明の範囲を制限するものと理解すべきでない。添付の図１は、概略的に、関連遺伝子工学を示す。図２は、ＨＩＶエンベロープ糖タンパクに対する数種のｃＤＮＡクローン（第１構成部分として有用）により表されるタンパクの結合を示す。以下においては、μｌはマイクロリットルを意味し、’は分を意味し、”は秒を意味する（ヌクレオチド配列における以外）。
【００１３】
実施例１
麻疹ウイルスのワクチン株の赤血球凝集素についての遺伝子の増幅及びクローニング
ＲＮＡを、製造業者の指示に従ってＲＮａｓｏｌ  Ｂ（ＡＭＳバイオテクノロジー）を用いて麻疹ウイルスのエドモンストン株から抽出した。ＲＮＡを、８０％エタノールで２回洗浄し、風乾し、ＤＥＰＣ処理水１００μｌ中に溶解させた。
ｃＤＮＡ合成：３０μｌのＲＮＡを、１３μｌ（２５ｐＭｏｌ／μｌ）のプライマーXhoMH/full/A[5'-ggCCTCgAgTCTgCgATTggTTCCATCTTCCCg-3';33-mer]と混合し、７０℃で１０分間加熱し、氷上冷却した。
以下の成分の反応混合物を添加した：３４．５μｌの水／ＤＥＰＣ；４μｌのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰの２５ｍＭ混合物；５μｌの１０×超逆転写酵素（スーパーＲＴ）（ＨＴバイオテクノロジー）バッファー；２．５μｌの（１００Ｕ）Ｒｎａｓｉｎ（プロメガ社）４μｌスーパーＲＴ。反応混合物（最終容量１００μｌ）を４２℃で４０分間インキュベートした。
得られたｃＤＮＡを使用して、ＭｅａＨの２種の変異体：完全長（ＭｅａＨｆｌ）及びＮ−末端から第５９番目のアミノ酸を欠く短変異体（ＭｅａＨｓｖ）を増幅させた。ＭｅａＨｆｌは比較目的で示し、ＭｅａＨｓｖは二機能性分子の再ターゲッティング部についての融合及び更なる変異誘発のために示した。
【００１４】
0004768944.tif 000003
*BamMH/full/S：5'-CgCggATCCATgTCACCACAACgAgACCggATA-3'
**BamMH/short/S：5'-CgCggATCCCTTCATCgggCAgCCATCTACACC-3'
【００１５】
反応混合物に５０μｌの鉱油をオーバーレイした。AmpliTaqを、第１変性工程（９５℃）の間に付加した。ＰＣＲを、トリオブロック(Trioblock)及び以下のプログラムを利用して行った：
0004768944.tif 000004
２．５μｌのＰＣＲ反応アリコートを、アガロースゲル電気泳動法により分析した。ＰＣＲ反応生成物を、製造業社の指示に従って、ＱＰＣＲ精製スピンカラムキット（キアゲン）を用いて清浄化し、５０μｌの溶出液中に溶出させた。
【００１６】
サブクローニングのためのベクターＴＯＰＯ２．１へのクローニング：
１μｌのＴＡクローニングキット（インビトロゲン）中ＴＯＰＯ２．１ＤＮＡを、１．５μｌの各ＰＣＲ溶出液及び２．５μｌの水と混合した。室温で５分間のインキュベーションの間、２μｌのβ−メルカプトール−エタノールを、ＴＯＰ１０細胞（インビトロゲン）の各アリコートへ添加した。１μｌのプラスミド−挿入混合物を、ＴＯＰ１０細胞に添加し、氷上で３０分間インキュベートし、４２℃で３０秒間熱ショックし、氷上で２分間冷却した。２５０μｌのＳＯＣ培地（インビトロゲンキット）を各トランスフォーメーションに添加し、チューブをシェーカー中に３７℃で３０’水平に位置させた。１０及び１００μｌをアンピシリン（１００μｇ／μｌ）を有する寒天板上に置いたが、それには、３０分前に、４０μｌの４０ｍｇ／ｍｌＸ−Ｇａｌを添加しておいた。
各構築物の白色コロニー５つを、プラスミドミニプレプ(Plasmid mini Prep)（キアゲン）を用いて抽出したプラスミドＤＮＡ及びアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＴＹＥ培地中において一晩成長させた。正確なサイズの挿入断片(insert)の存在を、ＢａｍＨＩ及びＸｈｏｌでのプラスミドＤＮＡの同時消化後にチェックした。制限エンドヌクレアーゼ及び反応成分（バッファー２；ＢＳＡ）は、ニューイングランドバイオラブ（ＮＥＢ）からのものとした。反応物を３７℃で１時間インキュベートし、２５μｌの各反応物を、製造業社の指示に従って、キアクイックゲル精製キット（キアゲン）により清浄した挿入断片及びアガロースゲルに付した。
【００１７】
変異誘発及び発現のためのプラスミドｃＤＮＡ４／ＨｉｓＭａｘＡ、Ｂ及びＣへのクローニング
ｐｃＤＮＡ４／ＨｉｓＭａｘの３つの変異体（Ａ、Ｂ及びＣ；インビトロゲン）を使用して、挿入断片のインフレームクローニング(in-frame cloning)を確実なものとした。プラスミドは、哺乳類細胞系における組換え型タンパクの過剰生産のために示す。
プラスミドのＡ、Ｂ及びＣ変異体のＤＮＡを、ＢａｍＨＩ及びＸｈｏｌで消化し、挿入断片に関し上記したようにゲル精製した。精製プラスミド及び挿入断片を標準連結反応において一緒に連結させ、ＴＯＰ１０細胞を上述したように形質転換した。
白色コロニーを、上述したように成長させ、インフレーム挿入断片をシークエンシングによりチェックした。
【００１８】
実施例２
ＭｅａＨｆｌ及びＭｅａＨｓｖのインビトロでの変異誘発
変異誘発のメインターゲットは次のとおりとした：
１．第２４３番目のアミノ酸についてのコドンの指定部位突然変異誘発、
２．第４５１番目のアミノ酸についてのコドンの指定部位突然変異誘発、
３．第４８１番目のアミノ酸についてのコドンの指定部位突然変異誘発、
４．第２４４番目〜第２５０番目のアミノ酸の領域間の短欠失、
５．第４５０番目〜第５０５番目（即ち第４７３番目〜第４７７番目）のアミノ酸領域間の短欠失。
変異誘発は、クイックチェンジ指定部位突然変異誘発キット（ストラタジーン）を用いて行った。その利点は、対象クローン化配列を有するプラスミドが、更なるサブクローニングの必要なしに、直接的に変異されることである。２つの相補プライマーが各変異に必要とされ、そこでは、変異されるヌクレオチド又は挿入／欠失が、プライマーの中間に位置付けされるべきである。その手順は、原（非変異）ＤＮＡストランドのＤｐｎＩでの消化を含む。手順は、その指示マニュアルに記載されたように行った。
【００１９】
変異誘発のために使用したプライマーの例は次のとおりである：
１  アルギニン２４３：
センス(28-mer): 5'-CTgAgCAgCAAAgCgTCAgAgTTgTCAC-3'
アンチセンス(28-mer): 5'-gTgACAACTCTgACgCTTTgCTgCTCAg-3'
アルギニン２４３は、このケースにおいてはアラニンに変更した。
２  バリン４５１：
センス(32-mer): 5'-CCAACCACAACAATgACTATTggCTgACTATC-3'
アンチセンス(32-mer): 5'-gATAgTCAgCCAATAgTCATTgTTgTggTTgg-3'
バリン４５１は、このケースにおいてはアスパラギン酸に変更した。
３  チロシン４８１：
センス(30-mer): 5'-CAAggTTAgTCCCCAgCTCTTCAATgTCCC-3'
アンチセンス(30-mer): 5'-gggACATTgAAgAgCTggggACTAACCTTg-3'
チロシン４８１は、このケースにおいてはグルタミンに変更した。
４  領域244-250:Leu247-Ser248のコドンの6ヌクレオチド(2アミノ酸)欠失
センス(38-mer): 5'-gAgCAgCAAAAggTCAgAgCAACTgAgCATgTACCgAg-3'
アンチセンス(38-mer): 5'-CTCggTACATgCTCAgTTgCTCTgACCTTTTgCTgCTC-3'
５  領域451-505: Arg475のコドンの3ヌクレオチド(1アミノ酸)欠失
センス(32-mer): 5'-CATTggAgTggATACCgTTCAAggTTAgTCCC-3'
アンチセンス(32-mer): 5'-gggACTAACCTTgAACggTATCCACTCCAATg-3'
【００２０】
５ケースの全てにおいて、反応の例は次のとおりであった（キットからの系の成分）：
５μｌの１０×反応バッファー
５〜５０ｎｇのｄｓＤＮＡテンプレート（pcDNA4／HisMax／MeaHfl又はpcDNA4／HisMax／MeaHsvで開始）
１２５ｎｇのプライマー１
１２５ｎｇのプライマー２（相補的）
１μｌのｄＮＴＰ混合物
ｄｄＨ2Ｏ５０μlまで
１μｌ（２．５Ｕ）のＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ
サイクリングパラメーター：
1サイクル  95℃で30”
12サイクル(点変異のため)
16サイクル(単一アミノ酸変化のため)  95℃／30”、55℃／1’、68℃／14’
18サイクル(複数のアミノ酸の欠失又は挿入のため)(プラスミドkbあたり2’)
【００２１】
サイククリング後、反応物を氷上で２’冷蔵した。１μｌのＤｐｎＩ（１０Ｕ）を添加し、反応混合物を混合し、ミクロ遠心分離において手短に遠心沈澱し、かつ、３７℃で１時間インキュベートした（非変異ＤＮＡの除去）。
得られた各変異プラスミドＤＮＡ１μｌを、Ｆａｌｃｏｎ２０５９ポリプロピレンチューブを使用する場合に４２℃での熱ショックを４５”とした以外は、実施例１に記載したように、標準手段を用いてEpicurian Coli XL1-Blueスーパーコンピテント細胞へ形質転換した。ＮＺＹ＋ブロス（０．５ｍｌ）を使用して、形質転換反応物を、３７℃で、１時間、２２５〜２５０ｒｐｍで振とうしながらインキュベートし、予め２０μｌの１０％（ｗ／ｖ）Ｘ−ガル及び２０μｌの１００ｍＭ ＩＰＴＧを添加しておいたＬＢ−アンピシリン板へ広げた。コロニーが、３７℃で１６時間後に現われた。
pcDNA4/HisMax/MeaHfl及びpcDNA4/hisMax/MeaHsvを、平行して、比較目的で、段階的手法で変異誘発した：変異誘発反応１（Ａｒｇ２４３変化）の生成物を、シークエンシングによる変異サイトの確認後に変異誘発工程２（バリン４５１変化）のためのテンプレートとして使用した。従って、指定部位突然変異誘発の最終生成物は、５タイプの変異体すべてを含む：Ａｒｇ２４３；Ｖａｌ４５１；Ｔｙｒ４８１；２４４〜２５０及び４７３〜４７７領域における短欠失。
【００２２】
これらの変異誘発プラスミドにより発現する麻疹赤血球凝集素の変異体を、細胞レセプター結合及び赤血球吸着の欠如について研究した。重要なことには、それらは、先のワクチン接種又は自然感染個体からの抗体により認識される能力を保持しているべきである。これらの基準を満たすものを、最終融合タンパクの再ターゲッティング構成部分とのインフレーム融合のために使用する。融合は、制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩについての認識サイトを含む特定のプライマーを用いる再ターゲッティング構成部分の増幅により仲介される。再ターゲッティング構成部分の配向は、再ターゲッティング構成部分のＣ末端を変異誘発ＭｅａＨｓｖのＮ末端へ融合し、従って、ＭｅａＨのオリジナルのＮ末端から５８番目のアミノ酸を置換するようにチェックしなければならない。そのような構築物においては、ＭｅａＨ分子（記載を参照）の天然ヒンジを使用して、融合タンパクの２つの部分を位置付けすることができる。完全融合タンパクは、結合作用及び抗体反応性が関わる限りは変異誘発ＭｅａＨ変異体として同一セットの研究に付される。
【００２３】
実施例３
再ターゲット目的のためにＨＩＶ １エンベロープ（ｅｎｖ）タンパクへ結合するタンパクの同定
ａ）ビオチン化組換え型ｅｎｖを有するヒト発現ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング
ｂ）ウエスタンブロットにおける結合の確認
ｃ）シークエンシングによる選択ｃＤＮＡクローンの同定
【００２４】
ａ）ビオチン化組換え型ｅｎｖを有するヒト発現ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング
ビオチン化：組換え型ＨＩＶ １ｇｐ１２０をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に０．５μｇ／μｌで溶解し、製造業者の指示に従ってビオチン化キット（ベーリンガー, Cat. No 1418 165）を用いてビオチン化した。簡潔には、カラムを固定し、５ｍｌのブロッキング溶液を添加し、次いで、６×５ｍｌＰＢＳで洗浄した。
ｅｎｖ：５００μｌＰＢＳ中への溶解
４７５μｌラベリング
１７．５μｌのＰＢＳ及び７．５μｌの２０ｍｇ／ｍｌビオチン−７−ＮＨＳ（ＤＭＳＯ中）の撹拌下での添加
チューブ中への配置
２時間／ｒｔ／回転輪でのインキュベート
調製カラムからのストッパー及びキャップの除去
５００μｌのＰＢＳを添加して、１ｍｌ容量に調整し、貫流(flow through)
別の１．５ｍｌのＰＢＳを添加、貫流
３．５ｍｌのＰＢＳを添加、及び１０滴（約０．５ｍｌ）を収集
最初の４チューブにおける予測されるタンパク-ゲル上におけるラン７．５μｌ
タンパクアッセイ後、選択フラクションをプール
ヒト発現ｃＤＮＡライブラリのスクリーニング
【００２５】
ｃＤＮＡライブラリーは、ヒトの脳からのｃＤＮＡを発現ベクターへクローニングすることにより製造した。そのライブラリーは、寒天板上において高密度で成長させ、ナイロンフィルターに移し、溶解させ、標準技術で固定化した。
フィルタースクリーニング：
１）200mlの無水エタノール中における20分間のインキュベーション
２）1リットルのPBS-T-T(PBS-Tween20)中における5分間の洗浄1回
３）1リットルのPBS中における水洗2回及び1リットルのPBS中における第3の洗浄5分間
４）3%マーベルPBS中における45分間の洗浄
５）ビオチン化env/3%マーベルPBS中における1時間のインキュベーション
６）1リットルのPBS-T-T中における5分間の洗浄１回
７）それぞれ1リットルのPBS中における水洗2回及び1リットルのPBS中における第3の洗浄5分間
８）20ml×PBS 3%マーベル
９）3%マーベル-PBS中におけるストレプトアビジン-ワサビペルオキシダーゼ(HRP)の5000希釈度におけるｌ中での４０分間のインキュベーション、150mlの3%マーベル-PBS中における30μlのストレプトアビジン-HRP
10）1リットルのPBS-T-T中における5分間の洗浄2回
11）1リットルのPBS中における5分間の洗浄2回
12）ECL試薬(アマシャム)を用いる発達
【００２６】
ｂ）ウエスタンブロットにおける結合の確認（図２）
同定した１１の陽性コロニーを、液体中での一晩培養でマスタープレートから成長させた。
４×溶解バッファーを用いるクローン1~11の誘導培養20mlから製造した抽出物  3時間のインキュベーション後の4000rpmで15'の細胞スピン
600μlの水中におけるペレットの再懸濁
52μlの1M DTT及び220μl 4×溶解バッファー(0.2×PBS, 8%SDS)の添加
37℃予備ボルテックスでのインキュベーション
曇った外観のため容量を24mlに上昇
4000rpm/15'での遠心分離、ペレットの処分
4000rpm/40'/25℃でのCentriprep10における2×12mlスピン
リテンテート(retentate)の結合、0.5×PBSでの12mlへの希釈及び同一条件下での再スピン
ろ液の処分及びリテンテートの10'の再スピン、最終容量0.5ml付近まで、4.5μlのゲル上におけるラン、ビオチン化envでのウエスタンブロットにおける結合確認
【００２７】
クローン1、2、3、6及び8:  ４ｍｌの一晩の培養、シークエンシング反応あたり200-500ngにより製造されたプラスミドミニプレップ
反応混合物前進（６について）
0004768944.tif 000005
反応混合物逆進（６について）
0004768944.tif 000006
４０μｌのオイルでのオーバーレイ。９６のウエルプレートにおける増幅：
２５サイクル：
0004768944.tif 000007
【００２８】
チューブをスピンした。２μｌの３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．６〜５．２）及び５０μｌの９５％ＥｔＯＨを含む１．５ｍｌチューブを製造した。２０μｌをチューブへ移した。ボルテックスし、氷上で少なくとも１５分間置いた。ミクロ遠心分離において１５〜３０分間スピンした。上清を処分した。２５０μｌの７０％エタノールで水洗した。ペレットを風乾した。４μｌの５０ｍＭ ＥＤＴＡ（７．４〜８．０）及び２００μｌの脱イオン化ホルムアミド中において再懸濁した。変性及び充填した。
結果：
クローン１：このＨＩＶ−１ｅｎｖ−結合タンパクについて測定されたヌクレオチド配列は、ヒトクレアチンキナーゼＢ（ジーンバンク受入番号X15334）に相当するものであった。
クローン２：このＨＩＶ−１ｅｎｖ−結合タンパクについて測定されたヌクレオチド配列は、未知のヒトタンパクに相当するものであった。配列は、本件明細書中に示す。最近、殆ど同一の配列を含むジーンバンクへの提出があった（共に2000年中）：受入番号AK 026796; 及びAK 000685。双方とも、原特許出願後に提出された。
クローン３：このＨＩＶ−１ｅｎｖ−結合タンパクについて測定されたヌクレオチド配列は、ヒトリボソームタンパクＬ８（RPL8；ジーンバンク受入番号NM000973）に相当するものであった。
クローン６：このＨＩＶ−１ｅｎｖ−結合タンパクについて測定されたヌクレオチド配列は、未知のヒトタンパクに相当するものであった。部分的配列は次のとおりであった：
【００２９】
【化３】
0004768944.tif 000008
【００３０】
実質的に同一の配列を含む日本ＮＥＤＯヒトシークエンシングプロジェクトからのジーンバンクへの最近の提出があった（2000年9月29日）（受入番号AK 023367）。
クローン８：このＨＩＶ−１ｅｎｖ−結合タンパクについて測定されたヌクレオチド配列は、ヒト脳クレアチンキナーゼのＢサブユニットについて、クローン１のものと部分的に同一であった。
【００３１】
実施例４
ヒト血漿から精製されたアポリポタンパクＢの化学的断片化（ヨーロッパバイオプロダクツＬｔｄ）
化学的断片化を、タンパク工学でよく知られた方法を用いて行った。４つの化学的処理を、アポリポタンパクＢ（アポＢ）分子におけるカット数についてのコンピューター予測に基づいて選択した。
ギ酸：予測：６カット。３７℃で２４及び４８時間の７Ｍ塩酸グアニジン中における７０％ギ酸でのアポＢ１００μｇの処理。
ヒドロキシルアミン：予測：１７カット。１００μｇのアポＢを、４５℃で４時間、２Ｍヒドロキシルアミン、２Ｍ塩酸グアニジン、０．２Ｍ Ｋ2ＣＯ3（ｐＨ９．０）中にクレーブ(cleave)した。反応は、濃ギ酸を添加してｐＨ２〜３とし、セファデックスＧ−２５において脱塩することにより終了した。２５００（ｍ．ｗ．）より大きなペプチドがボイド容量で現われた。
【００３２】
ＮＴＣＢ（２−ニトロ−５−チオシアノベンゾエート）：
予測：２５カット。１００μｇのアポＢを、６Ｍ塩酸グアニジン、０．２ＭトリスアセテートバッファーｐＨ８．０中に溶解し、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）を１０ｍＭまで添加して、ジスルフィドを還元した。３７℃で１〜２時間のインキュベーション。ＮＣＴＢを全チオールより５倍過剰に添加した。３７℃で１５分間のインキュベーション。ｐＨ４又はそれ未満まで酸性化し、冷却して４℃とした。
Ｃ型肝炎ウイルスの組換え型エンベローププロテインＥ１（ヨーロッパバイオプロダクツＬｔｄ）を、実施例３においてＨＩＶｅｎｖタンパクに関し記載したようにビオチン化し、ストレプトアビジン被覆常磁性粒子（プロメガ）に結合し、ＰＢＳで洗浄した。化学的に処理したアポＢ製造物をＰＢＳ中において希釈し、フラグメントを、固定Ｅ１を有する粒子上に捕獲させた。捕獲フラグメントをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。
【００３３】
実施例５
変異ＭｅａＨの結合及び抗原特性
ＭｅａＨの選択変異構築物を、インビトロ翻訳ベクター（ストラタジーン）でｐＳＰＵＴＫへサブクローン化し、製造業者の指示に従ってインビトロで発現させた。製造物は、記載のようにＣＤ４６外部ドメイン又はＣＤ４６発現細胞へのそれらの結合について研究した[Devauxら, Journal of General Virology 77, 1477-1481 (1996)]。ｐＳＰＵＴＫ／ＭｅａＨ製造物を有する赤血球のプレインキュベーション及びエドモンストンＭＶを用いる赤血球凝集は、Norrby及びGollmarにより記載されたようなものである[Infect. Immunity 11, 231-239 (1975)]。無名の血漿／血清サンプルにおける抗ＭｅａＨ抗体の存在は、商業的アッセイを利用して測定した。通常及び変異ＭｅａＨの外部ドメイン並びに適切な構成部分２を有する融合タンパクに対するこれらのサンプルの反応性は、研究インビトロ翻訳タンパク（ｐＳＰＵＴＫ）でのマキシソーブ(Maxisorb)９６ウエルプレートのウエルのコーティング後に測定した。プレートは、ＰＢＳ−マーベルでブロックし、１：１０希釈血漿／血清サンプルでインキュベートし、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０で繰り返し洗浄し、タンパクＬ−ＨＲＰ（ワサビペルオキシダーゼ）結合体(conjugate)でインキュベートし、再び洗浄した。ＨＲＰ基質（ＴＳＢ）でのインキュベーション後、反応性が明らかとなった。その発達は、硫酸の添加により停止し、その結果は、ＥＬＩＳＡリーダーを用いて得られた。
【図面の簡単な説明】
【図１】  標準形態及び工学的形態の麻疹ウイルス赤血球凝集素（ワクチン株）を示す図である。
【図２】  発現ｃＤＮＡライブラリーの選択されたクローンからのタンパクを結合するＨＩＶ１エンベロープ（ｇｐ１２０）のウエスタンブロットを示す図である。
【図１】
0004768944.tif 000010
【図２】
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