(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号３からなる重鎖ＤＮＡ配列および配列番号４からなる軽鎖ＤＮＡ配列によってコードされる、イヌＩｇＥに特異的に結合するキメラマウス／イヌモノクローナル抗体。
【請求項２】
抗体が、イヌＩｇＥのエキソン３に対してアフィニティーを有する、請求項１記載の抗体。
【請求項３】
抗体が、遊離イヌＩｇＥおよびＢ細胞に結合したＩｇＥに結合する、請求項１記載の抗体。
【請求項４】
抗体が、ＩｇＥの別の受容体への結合を阻害し、別の受容体がＢ細胞、肥満細胞または好塩基球上にある、請求項１記載の抗体。
【請求項５】
イヌのアレルギーの治療方法であって、請求項１記載の抗体をイヌに投与することを含む、方法。
【請求項６】
抗体の投与が、治療を受けたイヌにおいて血清ＩｇＥレベルの低下をもたらす、請求項５記載の方法。
【請求項７】
抗体の投与が、Ｂ細胞に対するＩｇＥの結合、次いで、Ｂ細胞のクローン集団の排除をもたらす、請求項５記載の方法。
【請求項８】
抗体の投与が、請求項１記載の抗体と血漿中の可溶性ＩｇＥとの結合をもたらす、請求項５記載の方法。
【請求項９】
抗体の投与が、イヌにおいてＩｇＥ産生の阻害をもたらす、請求項５記載の方法。
【請求項１０】
血清ＩｇＥレベルの低下が、ＩｇＥとＩｇＥに対する受容体との相互作用の阻害または遮断によってもたらされる、請求項６記載の方法。
【請求項１１】
ＩｇＥに対する受容体が、肥満細胞または好塩基球上にある、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
治療上有効な量の請求項１記載の抗体を含む医薬製剤。
【請求項１３】
セイラインまたは他の非経口用溶液、緩衝化剤、安定化剤、増量剤、酸化防止剤および共溶媒からなる群より選択される１種または複数の成分をさらに含む、請求項１２記載の医薬製剤。
【請求項１４】
静脈内投与、皮下投与および筋肉内投与による投与に適している形態における、請求項１２記載の医薬製剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本願は２０００年２月１日付け出願の米国出願番号６０／１７９６２９の一部継続出願である。
（技術分野）
本発明はイヌにおけるＩｇＥレベルを減少させ、アレルギー症状を緩和するための組成物および方法を提供する。該組成物はキメライヌ抗−ＩｇＥｍＡｂを含み、該方法はイヌにおけるアレルギーを治療するのに有用である。
【０００２】
（背景技術）
すべてのイヌの３０％までもがアレルギーまたはアレルギー関連の皮膚障害に罹患していると予測される。具体的には、アレルギー性皮膚炎はイヌ全体の３ないし１５％に影響を与えていると予測される。イヌにおけるアレルギーの蔓延に鑑みて、イヌのアレルギーを適切に診断し、治療する方法および組成物を開発する必要がある。
アレルギー反応の原因となる可能性が最も高い物質は種によって変わる。通常のイヌのアレルゲンは、ノミ、花粉、カビおよび埃を包含する。ノミに対するアレルギーが最も一般的なイヌのアレルギーであると考えられる。典型的には、ノミの唾液がアレルゲンであり、ノミが一回噛むだけで実質的にカユミが生じ得る。イヌにおけるアレルギーのさらなる形態はアトピーと称される。アトピーはイヌが花粉、カビまたはハウスダスト中に見られる微視的なダニなどの吸入物に対してアレルギー性であるところの症状である。イヌのアレルギーを治療する最近の方法は、望ましくない副作用を引き起こすステロイドを使用すること、または各型のアレルギーに対して異なる処理を必要とするアレルゲン介在の脱感作操作を使用することに焦点が当てられることが多い。
【０００３】
動物において、抗体分子はＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭなどの種々のイソタイプに分類される。抗体分子は長および短鎖成分からなる。所定のイソタイプの分子の長鎖は、アミノ酸配列が相同の長い領域と、逆に他のイソタイプに属する抗体とは異なる領域とを有する。長鎖の割り当てられた領域は、特定の細胞表面受容体に、または補体などの他の巨大分子に結合して、したがって、個々の免疫エフェクター機能を活性化する共通の能力を各イソタイプのメンバーに提供する。かくして、抗体分子のイソタイプへの分離はまた、それらが共通して活性化する一連のエフェクター機能に従って抗体を分離することにも役立つ。ヒトおよびイヌにおいて、イムノグロブリンＥ（ＩｇＥ）がアレルギーに関与しており、即時過敏性反応における抗原を認識する。
【０００４】
さらには、ＩｇＥは、哺乳動物にて、Ｉ型即時過敏症を含む、アレルギー応答の重要な媒介物質であると考えられている抗体型である。ＩｇＥは肥満細胞などの伝達物質細胞上の受容体に結合する。この結合はＩｇＥ分子のＦｃ領域が肥満細胞上のＦｃ受容体に結合すると起こる。ついで、かかる細胞と結合したＩｇＥ抗体がアレルゲンに結合すると、このアレルゲンにより複数のＩｇＥ抗体が肥満細胞表面に架橋する。この架橋がＩ型即時過敏性反応を媒介し、アレルギーと関連する症状を引き起こすヒスタミンおよび他の分子の放出を引き起こす。
ヒトにおいて、血清中のＩｇＥ全体のレベルはアレルギー疾患の診断手段である。ＩｇＥの血清レベルがイヌにおいてもアレルギーの診断手段であり得る可能性を探るため、デボアおよびヒル（DeBoerおよびHill）はさらなる研究を行った（HillおよびDeBoer、Am.J.Vet.Res. ５５（７）：９４４−４８（１９９４））。彼らは以下の構成（Ｄ９を基質に結合させ、抗体をＤ９で捕獲させ、ついでマーカーを有するＤ９を用いて捕獲した抗体に印を付ける）のエライザアッセイにてモノクローナル抗体（「ｍＡｂ」）Ｄ９を用いた。
【０００５】
ヒルおよびデボアのエライザを用い、イヌのアレルギーを診断するための努力においてイヌ血清中のＩｇＥの総量を確立した。しかし、ＩｇＥの定量はイヌにおけるアレルギーを診断するのに有用でないことが見出された（例えば、ヒルおよびデボアの要約および考察のセクションを参照のこと）。この知見はヒト免疫学における状況とは正反対であった。この結果は異なる２種類の動物の間のデータを相関させる試みが難しいことを指摘している。
この困難性はイヌがヒトよりも一連の異なる抗原に対してアレルギー的であり得るという事実によってさらに具現化される。例えば、ノミに対するアレルギーはイヌでは大きな問題であるが、ヒトではそうではない。さらには、イヌおよびヒトが同じアレルゲン抽出物に対してアレルギー作用性であることが明らかな場合に、グリール研究所（Greer Laboratories）（Lenoir,NC）のエシュおよびグリール（EschおよびGreer）博士による研究で、イヌの疾患を発症するアレルゲン抽出物中の特異的アレルゲンがヒトにおいて疾患を発症するアレルゲンと必ずしも同じである必要がないことを示した。例えば、チリダニ抽出物の免疫優勢成分がイヌとヒトとでは異なることが知られている。
【０００６】
アレルギー機構および応答の種交差実験の困難性に加えて、イヌのアレルギーは主に皮膚で発症するのに対して、ヒトは主に呼吸器系にてアレルギー症状を示す。加えて、好酸球はヒトにおいてアレルギーと相関するが、イヌでは相関しない。
生理学的症状を治療するために医薬組成物の投与を考慮するにおいて、組換えまたはキメラ分子を動物にインビボにて投与した場合、それらはその動物から速やかに一掃される。組換え体を動物に投与する場合、組換え分子の半減期を長くするために組換えＩｇＧ分子が用いられた。例えば、カポン・ディ（Capon,D.）、チャモウ・エス（Chamow,S.）ら、「Designing CD4 Immunoadhesins」Nature ３３７：５２５（１９８９）；バイルン・アール（Byrn,R.）、モルデンチ・シー（Mordenti,C.）ら、「Biological Properties of a CD４ Immunoadhesin」Nature ３４４：６６７（１９９０）；ハーク−フレンドスコ・エム（Haak−Frendscho M.）、リドウェイ・ジェイ（Ridgway,J.）ら、「Human IgE Receptor Alpha-Chain IgG Chimera Blocks Passive Cutaneous Anaphylaxis Reaction in vitro」Journal of Immunology １５１：３５１−５３（１９９３）；米国特許第５１１６９６４号（１９９２年５月２６日発行；カポン・ディ・ジェイ（Capon,D.J.）ら、発明の名称「ハイブリッド・イムノグロブリン」）を参照のこと。
【０００７】
一般に、ＩｇＧはヒトにおいて血清半減期の長いイソタイプのイムノグロブリンであると了承されている。イヌにおいて、半減期の長いイソタイプは知られていない。少なくとも２本の、あるいは４本すべての長鎖イヌＩｇＧイムノグロブリン配列のエキソン１および３の一部に対応すると考えられている配列が米国特許第５５９３８６１号（マエダ（Maeda）ら）に報告されているが、これら長鎖配列のいずれがイヌの半減期の長いＩｇＧ構造の部分であるかわかっていない。
ＩｇＥレベルはアレルギー疾患を経験しているヒト患者では高く、ＩｇＥはアレルギー症状を媒介すると考えられる。イヌにおいて、血清ＩｇＥのレベルはアレルギー疾患と相関していないが、それにも拘わらず、アレルギー症状を軽減するための機構としてＩｇＥレベルを減少させることが望ましい。
さらには、通常の組成物および方法の欠点を回避し、さらにイヌのアレルギーに対して効果的な治療活性を付与する、イヌのアレルギーの治療用組成物および方法に対する要求もある。
【０００８】
（発明の開示）
本発明の一の目的は、イヌのアレルギーの治療用の組成物および方法であって、ステロイド処理で経験するよりも副作用が実質的に少ない、組成物および方法を提供することである。
本発明のもう一つ別の目的は、アレルゲンの型とは関係なく効果的であるイヌのアレルギー症状を軽減するための治療用組成物および方法であって、その処理が特異的アレルゲンよりもアレルギー応答の存在を基礎とする、組成物および方法を提供することである。
本発明のもう一つ別の目的はＩｇＥ合成を標的とすることによりイヌのアレルギー症状を軽減するための治療用組成物および方法を提供することである。
これらおよび他の目的は、以下の開示および添付したクレームから当業者に明らかであろう。
【０００９】
本発明はイヌのアレルギーを治療するための組成物および方法に関する。さらに詳細には、本発明はイヌに投与するための方法および組成物であって、遊離した血清ＩｇＥが組成物と結合することで、このＩｇＥが肥満細胞および好塩基球上にある高アフィニティー性のＩｇＥ受容体への結合を阻害するように、実質的にイヌのイムノグロブリンＥ分子に結合する組成物を提供する。その提供される組成物および方法は遊離した血清ＩｇＥのレベルを排除または減少させることができる。遊離した血清ＩｇＥレベルが低いほど、好塩基球および肥満細胞上にある高アフィニティー性ＩｇＥ受容体の合成および発現をダウンレギュレートさせることができる。その結果として遊離したおよび／または全体としての血清ＩｇＥが減少または排除され、皮膚の肥満細胞上のアレルゲンに対するＩｇＥ応答が減少または排除される。「遊離した血清ＩｇＥ」とは、高アフィニティー性ＩｇＥ受容体に結合することができるＩｇＥであって、血清中の結合していないＩｇＥを意味する。
【００１０】
本発明者らは、検出可能な遊離したおよび／または全体としての血清ＩｇＥの排除を７日間、あるいはさらに短期間維持することで、ＩｇＥの合成を抑制しつづける、負のフィードバック−ループが得られることを明らかにした。ＩｇＥ合成の抑制を維持することでアレルゲンに対する皮膚応答の排除が得られるであろう。
好ましい具体例において、本発明のキメラ抗−ＩｇＥ分子の特異性および構造をＩｇＥ＋Ｂ細胞に直接標的化させることができる。この結合は成熟Ｂ細胞の負の刺激を介するか、またはアポトーシスもしくは補体介在溶菌によりＢ細胞を破壊するかのいずれかによりＩｇＥ合成の減少または排除を得ることができる。
【００１１】
したがって、本発明は、キメラを含み、イヌＩｇＥに特異的に結合するＩｇＥ受容体分子を含む。その受容体分子は抗体分子、好ましくはモノクローナル抗体（「ｍＡｂ」）であってもよく、そのｍＡｂはイヌＩｇＥのエキソン３に対してアフィニティーを有することが好ましい。キメラはイヌおよびマウスのイムノグロブリンを含むことができる。キメラはさらにマウスの長および短鎖可変領域に融合したイヌの長および短不変ドメインを含むこともできる。本発明の受容体および抗体分子もまた、ＩｇＧ長鎖配列を含んでいてもよい。
本発明の受容体および抗体分子はＩｇＥが別のＩｇＥ受容体に結合することを妨げることができる。その別のＩｇＥ受容体は１またはそれ以上の肥満細胞または好塩基球上にあってもよい。本発明の受容体および抗体分子は蛋白、ペプチドまたは他の有機分子からなっていてもよい。
【００１２】
本発明はまた、イヌのアレルギーの治療方法であって、本発明のキメラを含み、イヌＩｇＥに特異的に結合する受容体またはモノクローナル抗体をイヌに投与することを特徴とする方法を提供する。本発明の方法は、治療されるイヌの血清ＩｇＥレベルの低下をもたらすことができ、あるいはＩｇＥをＢ細胞に結合させて、つづいてＢ細胞のクローン集団を排除することができる。該方法はまた、血漿中の血清ＩｇＥの結合をもたらし、あるいは治療されるイヌにおけるＩｇＥの産生の阻害をもたらすこともできる。本発明の方法の血清ＩｇＥレベルの低下は、ＩｇＥと、肥満細胞または好塩基球上にあってもよいＩｇＥについての受容体との間の相互作用の遮断を破壊することにより惹起することもできる。
本発明はさらには、本発明の受容体を治療上有効な量含有する医薬処方を提供する。
【００１３】
（発明を実施するための最良の形態）
定義
アフィニティー：リガンドとその受容体の間の、あるいは２つの結合基の間の誘引力または結合力。アフィニティーはまた結合した結合対を平衡状態に保持する。
アミノ酸：リニアーアレイにて結合してポリペプチド、ペプチドまたは蛋白を形成することのできるアミノ基を含有する有機分子。２０種の通常のアミノ酸は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、トリプシンおよびバリンである。保守的変種を含む本発明の具体例において、当業者であれば、通常のアミノ酸のいずれも、ならびに列挙されていない他の物も本発明において用いることができることを理解するであろう。
【００１４】
イヌＩｇＥ受容体：イヌＩｇＥに対してアフィニティーを示すか、さもなければインビボまたはインビトロにて結果としてイヌの血清からＩｇＥを除去する、本明細書にて限定される組換えまたはキメラ受容体。
ｃＤＮＡクローン：クローニングベクター中に保有される、ＲＮＡを提示する二重ＤＮＡ配列。
キメラｍＡｂ：少なくとも２種の異なるイヌ免疫グロブリン源からのアミノ酸を合して得られるハイブリッドアミノ酸配列を有するイムノグロブリン分子。一般に、アミノ酸配列は天然では一緒になって見られないのが普通である。「ｍＡｂ」はモノクローナル抗体をいう。
クローニングベクター：宿主細胞にて複製することができ、付加したＤＮＡ配列の増幅または発現を目的として外因的に付加されたＤＮＡ配列の保持能を有するプラスミド、ファージＤＮＡまたは他のＤＮＡ配列。
【００１５】
保守的変種：ヌクレオチド配列の保守的変種は、アミノ酸配列の変化をもたらさないヌクレオチド置換、ならびに同類アミノ酸置換またはそのヌクレオチドから翻訳されたポリペプチドの特性に実質的に影響を及ぼさないアミノ酸置換をもたらすヌクレオチド置換を包含する。例えば、置換がペプチドとイヌのＩｇＥ受容体またはイヌの他のＩｇＥリガンドとの特異的結合を妨げないならば、ポリペプチド特性は実質的には影響を受けていない。
アミノ酸配列の保守的変種は、出発ペプチドに関連するポリペプチド変種の特性に実質的に影響を及ぼさないアミノ酸の置換または欠失を包含する。例えば、置換または欠失がペプチド変種の出発ペプチドの特異的結合パートナーへの特異的結合を妨げないならば、ポリペプチド特性は実質的には影響を受けていない。糖鎖形成および他の変種ならびに当業者に明らかであろう誘導体はこの定義に含まれ、本発明の範囲内にあると考えられる。さらに、出発ペプチドに対してポリペプチドの特性に実質的に影響を及ぼさないアミノ酸挿入、置換、欠失および切断もこの定義に含まれる。
【００１６】
発現調節配列：構造遺伝子に作動的に連結した場合に、その遺伝子の発現を調節および制御するヌクレオチドのＤＮＡ配列を意味する。
エキソン：ポリペプチドの一部をコードするＤＮＡの１つの連続領域。いずれかのエキソンに言及すること、例えば「エキソン６のＤＮＡ配列」は完全なエキソンまたはその一部をいう。
遊離したＩｇＥまたは血清ＩｇＥ：ＩｇＥまたは他のＩｇＥ分子に対してアフィニティーを有する未変性または投与受容体と複合または結合していない、患者において循環しているＩｇＥ。
ゲノム：１の物質の全ＤＮＡ。ゲノムは、とりわけ、その物質のポリペプチドをコードする構造遺伝子ならびにオペレーター、プロモーターおよびシャイン−ダルガーノ配列などのリボソーム結合および相互作用配列を含む。
【００１７】
特異結合：バックグラウンド結合よりも大きな結合アフィニティーでの１つの物質の別の物質への結合。特異結合を示す２つの物質は特異結合パートナーまたは特異結合対と称される。抗体およびその抗原は特異結合対の一例である。
構造遺伝子：そのテンプレートまたはメッセンジャーＲＮＡ（「ｍＲＮＡ」）を介して特定のポリペプチドに特有のアミノ酸の配列をコードするＤＮＡ配列。
治療量：「治療量」は、治療された動物にて、血清ＩｇＥレベルを減少またはＩｇＥ産生もしくは活性を抑制し、障害または生理学的症状の徴候を軽減または防止する効果を有する、ｍＡｂの量である。
全ＩｇＥ：「全ＩｇＥ」とは別の分子と結合しているか、または結合していない、全血清ＩｇＥを意味する。
【００１８】
本明細書において開示されるように、新規なキメライヌ抗−ＩｇＥｍＡｂを産生し、ブタクサに感作したイヌに投与した。ｃ１５Ａ．２と称されるこのキメラ分子はマウスの長および短可変領域に融合したイヌの不変長および短ドメインからなる。いずれのケースにおいても、かかる投与により、循環している遊離したＩｇＥのレベルの検出可能なレベル以下までの持続的な減少が得られた。加えて、キメラ１５Ａ．２と複合体を形成し、今なお循環し、ｃ１５Ａ．２の投与直後では検出可能なＩｇＥを含む、全ＩｇＥは時間の経過と共に減少した。投与から２８日後、遊離したｃ１５．２が血清中で検出可能であったが、遊離および全血清ＩｇＥは共に検出できなかった。ヒトアレルギー用の治療薬としてのヒト化抗−ＩｇＥモノクローナル抗体の使用が米国特許第５５９３８６１号（マエダら）に開示された。組換え抗−ＩｇＥｍＡｂの投与によるＩｇＥの除去は今までイヌでは知られていなかったと考える。当業者であれば、本願発明および本明細書中のｍＡｂに関する開示が抗体分子の一部を含んでいてもよい受容体にも同様に適用できると認識するであろう。したがって、本明細書の開示は抗体だけでなく受容体の組成物にも関係するものである。
【００１９】
本発明のイヌ抗−ＩｇＥｍＡｂ組成物はイヌおよびマウスイムノグロブリンの組換え体またはきキメラ構造物であってもよい。該分子は、イヌＩｇＧ不変長および短ドメインと、イヌＩｇＥのエキソン３に対してアフィニティーを有するネズミイムノグロブリン長および短可変領域ドメインとから製造されるキメラを包含しうる。
本明細書において使用されるイヌ抗−ＩｇＥｍＡｂ、キメラｍＡｂ、組換えｍＡｂおよび受容体なる語は、そのいずれのおよびすべての保守的変種を包含し、本発明の範囲内にあると考えられる。
キメライヌ抗−ＩｇＥｍＡｂまたは受容体の投与がイヌアレルギーの治療方法にて有用であることが本発明の特徴である。本発明の組成物の投与がイヌにおける血清ＩｇＥレベルを低下させることも本発明の特徴である。
本発明のキメライヌ抗−ＩｇＥｍＡｂおよび受容体はＩｇＥとその受容体の間の相互作用を中断または遮断することができる。一般に、ＩｇＥとその受容体の間の干渉は、アレルギー症状を惹起する、または惹起する可能性のあるアレルゲンの型とは無関係である。
【００２０】
本発明の具体例において、本発明のキメライヌ抗−ＩｇＥｍＡｂおよび受容体は、ＩｇＥ分子上の結合部位を遮断することにより、さもなければＩｇＥのその受容体への結合を干渉することにより、ＩｇＥが肥満細胞または好塩基球上にあるその受容体への結合を遮断することによって作用することができる。本発明のキメライヌ抗−ＩｇＥｍＡｂおよび受容体はまた、血漿中の可溶性ＩｇＥを結合させ、ついで正常な体内機構により循環系からその複合体を除去することにより作用することもできる。本発明の他の具体例において、キメライヌ抗−ＩｇＥｍＡｂまたは受容体は、ＩｇＥをＢ−細胞と結合させ、ＩｇＥ＋Ｂ−細胞のクローン集団を排除することにより作用してもよい。本発明のキメライヌ抗−ＩｇＥｍＡｂまたは受容体はまた、ＩｇＥ産生を阻害することにより作用してもよい。特定の理論により拘束するつもりはないが、ｍＡｂまたは受容体はＢ細胞に結合し、細胞のアポトーシスを誘発するか、またはＩｇＥ合成をダウンレギュレートまたは排除する阻害シグナルに至ることができる架橋事象を誘発すると考えられる。加えて、血清ＩｇＥ、すなわち遊離したＩｇＥの結合は、通常、エキソン３領域の血清ＩｇＥと結合することのできるもう一つ別の制御分子をＢ細胞上のＩｇＥに結合させ、その後、かかる結合に付随かつ由来する負のシグナルを介してＩｇＥ合成を行うことができる。
【００２１】
もう一つ別の具体例において、本発明のキメライヌ抗−ＩｇＥｍＡｂまたは受容体はＩｇＧ長鎖配列を含むか、または上記配列と一緒に処方し、該分子のインビボでの半減期を長くし、またはその活性を増強することもできる。
アレルギー症状に罹患しているイヌの治療方法またはイヌにおけるアレルギー症状の予防方法は、一般に、治療量のキメライヌ抗−ＩｇＥｍＡｂまたは受容体を治療される動物に投与することを含む。キメライヌ抗−ＩｇＥｍＡｂまたは受容体の正確な投与量および投与変数は当業者に公知の方法と矛盾しない方法にて確立されるであろう。これは以下の１またはそれ以上の因子を考慮することを含むが、このような列挙は代表的なものを意図するものであり、当業者に公知の、または知られるようになる他の変数を排除することを意図とするものではない：アレルギー症状の存在および重度、イヌの種類、個々の患者の状態、デリバリー部位、投与方法および期間、当業者に公知の、または将来公知となる可能性のある他の因子。
【００２２】
同様に、投与されるキメライヌ抗−ＩｇＥｍＡｂまたは受容体の用量は、使用されるＩｇＥ長鎖イソタイプの特性および他の因子の事項に依存しているかもしれない。例えば、これらの事項は結合活性およびインビボでの血漿中半減期、処方中のキメライヌ抗−ＩｇＥｍＡｂまたは受容体の濃度、投与経路、投与部位および速度、ならびに治療される患者の臨床耐性を包含する。この列挙は限定を意図するものではなく、当業者は他の因子も関連しており、有利であると考えることができると考えられる。
このキメライヌ抗−ＩｇＥｍＡｂまたは受容体の治療量を、アレルギー症状を緩和または抑制し、および／または血清ＩｇＥレベルを減少させ、および／またはＩｇＥ産生または活性を抑制するのに十分な投与量および期間、投与することができる。
【００２３】
一般に、本発明の処方は、イヌ抗−ＩｇＥｍＡｂまたは受容体の安定および効能のある形態の調製に干渉しない量の他の成分を含有していてもよい。キメライヌ抗−ＩｇＥｍＡｂまたは受容体と共に投与されるいずれの付加成分も効果的で安全な医薬処方に適する量にて配合することができる。当業者に知られている医薬賦形剤も本発明の組成物の一部を形成することができる。例えば、かかる賦形剤として、セイラインおよび他の非経口用溶液、バッファーおよび安定化剤、ならびに種々の適当な増量剤、緩衝化剤、酸化防止剤、共溶媒および配合するのが有利であると当業者にわかっている他の成分が挙げられる。好ましい具体例において、イヌ抗−ＩｇＥｍＡｂまたは受容体は滅菌ＰＢＳ中の蛋白の溶液として処方することができる。
【００２４】
本発明のキメライヌ抗−ＩｇＥｍＡｂまたは受容体は、ＩｇＥとその受容体の間の結合を破壊し、遮断するか、そうではなく干渉するように投与することができ、あるいは投与されるｍＡｂまたは受容体とＩｇＥの間の結合を強化するように投与することができる。これらの方法は当業者に明らかであろう。好ましい具体例において、キメライヌ抗−ＩｇＥｍＡｂまたは受容体は皮下的、筋肉内または静脈内投与することができる。別法として、ｍＡｂまたは受容体は、懸濁液、錠剤、カプセルあるいは経口、経直腸または経膣投与用の坐剤に処方して投与することができる。
以下の実施例を用いて１５Ａ．２ｍＡｂのクローニング、発現および精製を説明するが、これに限定されるものではない。
【００２５】
実施例Ｉ：マウス１５Ａ．２可変領域のクローニング
マウスモノクローナル１５Ａ．２可変領域を１５Ａ．２ハイブリドーマ細胞からＲＴ−ＰＣＲによりクローン化した。マウスハイブリドーマ細胞株からＩｇＶｈおよびＩｇＶｌのｍＲＮＡの逆転写および増幅用の一式の縮重ＰＣＲプライマーからなる市販のキット（ノバゲン（Ｎｏｖａｇｅｎ）、マディソン、ＷＩ、Ｉｇ−プライム・キット）を、短および長可変ドメインをコードする１５Ａ．２ｍＲＮＡをクローン化するためのプライマー源として使用した。ＩｇＶｈドメイン用５’および３’プライマーはそれぞれＭｕＩｇＶｈ５’−ＢおよびＭｕＩｇＭｖｈ３’−１であった。ＭｕＩｇＶｈ５’−Ｂは１つのチューブ中の２つのプライマーの混合物（ノバゲンにより提供）であって、配列ＧＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＲＡＡＴＧＳＡＳＣＴＧＧＧＴＹＷＴＹＣＴＣＴＴ（配列番号１）および配列ＡＣＴＡＧＴＣＧＡＣＡＴＧＧＡＣＴＣＣＡＧＧＣＴＣＡＡＴＴＴＡＧＴＴＴＴＣＣＴ（配列番号２）を有する。ＭｕＩｇＭｖｈ３’−１は配列ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＡＣＧＡＧＧＧＧＧＡＡＧＡＣＡＴＴＴＧＧＧＡＡを有する。ＩｇＶｌドメイン用の５’および３’プライマーはそれぞれＭｕＩｇλＶｌ５’−ＡおよびＭｕＩｇλＶｌ３’−１であった。１５Ａ．２のＩｇＶｈおよびＩｇＶｌ可変ドメインをコードするｍＲＮＡを逆転写し、増幅させ、クローン化した。ＭｕＩｇλＶｌ５’−Ａは 配列ＧＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＣＣＴＧＧＡＹＴＹＣＷＣＴＹＷＴＭＹＴＣＴを有する。ＭｕＩｇλＶｌ３’−１は 配列ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＡＧＣＴＣＹＴＣＷＧＷＧＧＡＩＧＧＹＧＧＲＡＡを有する。
【００２６】
ＰＣＲ反応は以下のように行った：
酵素：        Ｔａｑポリメラーゼ
１）  ９４℃    ２０秒            ３５サイクル
６０℃    ５８秒
７２℃    ２０秒
２）  ４℃      保持
１５Ａ．２のＩｇＶｈおよびＩｇＶｌ可変ドメインの適当なクローンを、制限酵素分析およびＤＮＡ配列分析を用いて同定した。周知のマウスＩｇＶｈおよびＩｇＶｌ遺伝子とこれらのＤＮＡ配列の比較により、それらをマウスモノクローナル抗体可変ドメインに相当するとして確認した。
【００２７】
実施例ＩＩ：イヌＩｇＧ定常領域のクローニング
イヌのイムノグロブリン短および長定常領域を、イヌのリンパ球細胞からＲＴ−ＰＣＲによりクローン化した。イヌＩｇＧの定常ドメインの配列に準じたＰＣＲプライマーを、イムノグロブリンの定常ドメインをコードしているｍＲＮＡの逆転写およびＰＣＲ増幅に用いた（Ｍａｅｄａらにより、米国特許第５５９３８６１号に開示）。ＰＣＲ反応条件は前記した通りであった。ＰＣＲ産生物をクローン化し、ＤＮＡ配列分析を行った。イムノグロブリンドメインの適当なクローンを、制限酵素分析およびＤＮＡ配列分析を用いて同定した。周知のイムノグロブリン遺伝子とこれらのＤＮＡ配列の比較により、それらをイヌイムノグロブリンの定常ドメインに相当するとして確認した。
【００２８】
実施例ＩＩＩ：マウス／イヌキメラ１５Ａ．２の全長のクローニング
キメラモノクローナル抗体の調製のための慣用法を、マウス／イヌキメラ１５Ａ．２モノクローナル抗体遺伝子の全長を構築するために用いた。マウス１５Ａ．２可変領域をコードしている配列および適当なイヌ定常領域をコードしている配列をＰＣＲであわせてクローニングした。ＤＮＡ配列分析によるキメラ遺伝子の検証後、適当なマウス／イヌキメラ１５Ａ．２短鎖遺伝子およびマウス／イヌ１５Ａ．２長鎖遺伝子を、キメラタンパク質の発現およびタンパク質産生のために選択した。
【００２９】
機能的クローンの同定
１５Ａ．２キメラ長および短鎖の機能的クローンをＣＯＳ細胞一過的発現系を用いて同定した。全長長鎖および全長短鎖をｐｃＤＮＡ３．１ベクター（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カールスバッド、ＣＡ）上のＣＭＶプロモーターの正しい方向にて下流にクローニングした。タンパク質上のイムノグロブリンのリーダーシグナルは、細胞から培地上清中にタンパク質を分泌させる。両方のＤＮＡをＣＯＳ細胞に同時にトランスフェクションさせることにより、細胞中の機能的キメラ抗体の一過的遺伝子発現、タンパク質産生および集合が認められた。ＩｇＥ結合エライザおよび抗イヌＩｇＧエライザを、細胞培地上清中の機能的抗体活性を検出するために用いた。最もよい結合活性を与えるクローンを、バキュロウィルス発現系においてキメラモノクローナル抗体産生用ベクターを構築するために用いた。長鎖および短鎖両方の配列を以下に示す：
【００３０】
0004605973.tif 000002
0004605973.tif 000003
【００３１】
0004605973.tif 000004
【００３２】
実施例ＩＶ：昆虫細胞におけるキメラ１５Ａ．２の発現
キメラ１５Ａ．２マウス/イヌモノクローナル抗体をより大規模に産生するために、バキュロウィルス発現系を用いた。バキュロウィルス発現は一般的な操作であって、該方法は当業者において周知である。１５Ａ．２長鎖ＤＮＡを、ファーミンゲン社（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）（サンディエゴ、ＣＡ）のバキュロウィルスに組換えるためのｐＡｃ  ＬＩＣバキュロウィルストランスファーベクター中にクローン化した。キメラ１５Ａ．２短鎖ＤＮＡを、ファーミンゲン社のバキュロウィルスに組換えるためのｐＡｃＨｉｓ  ＮＴ−Ａ（商標登録）バキュロウィルス輸送ベクター中にクローン化した。両方のウィルス構築物の組換え体および増幅物を昆虫ｓｆ−９細胞中で増幅した。キメラ１５Ａ．２を昆虫Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ細胞を用いて発現させた。感染条件は以下の通りであった：
感染用Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ細胞密度：            １．５ｘ１０６／ｍｌ
長鎖ウィルス感染用ＭＯＩ：                    １０
短鎖ウィルス感染用ＭＯＩ：                      ３
タンパク質発現の時間：                        ７２時間
１５Ａ．２を細胞培地中で発現および分泌させた。
【００３３】
キメラ１５Ａ．２タンパク質の精製
一般的な精製スキームは以下の通りである：
１．細胞浄化：
１５Ａ．２タンパク質を含む細胞培地上清を、感染後７２時間で回収した。該上清をミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）（ベッドフォード、ＭＡ）の細胞浄化用のミリガード（ＭＩＬＬＩＧＵＡＲＤ）（商標登録）カートリッジ濾過システムを通して濾過した。また、０．２μｍの孔の大きさを有し、低タンパク質吸着の高い処理能力のフィルターであって、高圧力に耐えることができる別の濾過システムも適当であろう。次いで、不純物を除去した上清をカラムクロマトグラフィーで濃縮した。
【００３４】
２．タンパク質Ａのカラムクロマトグラフィー：
濃縮した試料を、ＰＢＳ緩衝液で平衡にしたタンパク質Ａカラムに装填した。１５Ａ．２タンパク質を４％グリセロール、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）および４％グリセロール、２５ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ２．５）を混合することにより得られたｐＨ勾配液により溶出させた。該タンパク質は約ｐＨ４で溶出した。
【００３５】
３．イオン交換カラムクロマトグラフィー：
タンパク質Ａで精製した１５Ａ．２を、４％グリセロール、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）で平衡にしたＱセファロース（商標登録）（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ウプサラ、スウェーデン）カラムに装填し、混入したタンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ウィルスなどを除去した。また、精製したタンパク質からＤＮＡ、ＲＮＡ、エンドトキシンおよび別の負に帯電した物質を除去する類似のイオン交換樹脂を利用してもよい。流出物を回収した。
４．滅菌：
Ｑを流出した１５Ａ．２を濃縮し、０．２μｍのフィルターを通して濾過することにより滅菌した。最終的な緩衝液の成分は以下の通りである：
０．７ｘＰＢＳ
６．５ｍＭクエン酸ナトリウム
４％グリセロール
ｐＨ：約７．０
該タンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥタンパク質ゲルにより示されるように、少なくとも９５％の純度を有し、将来使用するために−８０℃で保管した。
【００３６】
実施例Ｖ：組換えイヌ抗−ＩｇＥｍＡｂ（ｃ１５Ａ．２）：インビトロおよびインビボのＩｇＥ活性の効果
実施例ＩＶで得た精製したｃ１５Ａ．２を、インビトロでのイヌＩｇＥ受容体へのイヌＩｇＥの結合能力について試験を行った（図１）。２００２、２００３および２１０３で示される３匹のイヌの血清中のＩｇＥを中和するために必要なｃ１５Ａ．２の量を血清中和アッセイにより調べ、それを図８に示す。４０日の実験期間での時間経過および事象を図２ａおよび２ｂにまとめる。イヌをラブレース・レスピレイトリー・リサーチ・インスティテュート（Ｌｏｖａｌａｃｅ  Ｒｅｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）（アウバカーキ、ＮＭ）産のブタクサに感作させ、その効能をアレルゲンの投与後に皮下皮膚反応を生じるイヌの能力により評価して試験する実験に用いた。
ｃ１５Ａ．２をイヌ２００２、２００３および２１０３に５日おきに８回連続して投与した。最初の処置でのｃ１５Ａ．２の投与量は、投与を開始する３日前に測定した遊離した血清ＩｇＥ濃度の１０倍の濃度に相当していた。１および２回の投与は遊離した血清ＩｇＥ濃度の１０倍を与えた。後のすべての投与は遊離した血清ＩｇＥ濃度の５倍とした。３０分間にわたって静脈内注入することにより、１０倍または５倍の血清ＩｇＥ濃度をデリバリーするために必要な濃度に、試験物質を滅菌ＰＢＳで希釈した。
【００３７】
図２ａは、ｃ１５Ａ．２ｍＡｂの投与量に基づく、各々のイヌにおける時間に対する遊離および全血清ＩｇＥのレベルを示す。次いで、付加的なｃ１５Ａ．２を５日おきに合計して４０日間連続して投与した。血清ＩｇＥレベルを当業者により周知である標準的なエライザ法によりアッセイする。ＩｇＥレベルが約１ｎｇ／ｍｌ以下では、一般的にエライザ法で検出されないと考えられている。
図２ａはまた、実験用イヌにおける遊離したＩｇＥが６０分以内で検出されないレベルにまで低下し、４０日の処理期間の間に戻らなかったことを示す。生理食塩水を与えただけの対照イヌ１１０１および１１０２における遊離した血清ＩｇＥのレベルはこの期間の間著しく変化しなかった（図２ｂ）。これらの実験において使用したアッセイは、マウスｃ１５Ａ．２抗体でのエライザ固相捕捉、イヌＩｇＥのエキソン４を認識する別のＨＲＰＯ接合ｍＡｂである１４Ｋ．２での検出からなる。該アッセイはｃ１５Ａ．２に結合しないすべての血清ＩｇＥを検出する。
【００３８】
ｃ１５Ａ．２と結合した全ＩｇＥは、おそらく、再循環するためそのＩｇＥは実験用イヌにおける遊離したＩｇＥよりゆっくり低下し、結局は循環から一掃される。ここで使用したアッセイはｍＡｂ１４Ｋ．２でのエライザ捕捉およびｃ１５Ａ．２に結合することを阻害しない別の抗イヌＩｇＥｍＡｂでの検出からなる。イヌ２００３および２１０３において、遊離および全血清ＩｇＥは、組換え抗体の最終投与後、６０日間以上アッセイで検出されないままである。イヌ２００２において、キメラ抗体の投与を中断した後３０日で、遊離した血清ＩｇＥは約２００ｎｇ／ｍｌで検出することができ、観測の残りの３０日間このレベルを保ったままであった。
【００３９】
これらのデータは、本発明の組換え抗体の、（１）血清中に循環しているＩｇＥを一掃すること；および（２）ＩｇＥを補充する過程に影響を及ぼす方法を示すこと、における効果を示す。これらの結果から、血清ＩｇＥが短い半減期、おそらく、約２日のオーダーの半減期を有することがわかり、組換え体またはキメラ分子も同様にインビボで相対的に短い半減期を示していてもよいという意外なものである。処置していない動物において、循環している血清ＩｇＥは４ないし５日おきに完全に補充されると考えられており、さらに、本発明のイヌ抗−ＩｇＥｍＡｂ１５Ａ．２の投与後、血清ＩｇＥレベルは、キメラ抗体の投与後１８日で検出したレベル未満に抑えられたままであった。
【００４０】
実施例ＶＩ：ｃ１５Ａ．２の浄化値
イヌ２００２、２００３および２１０３の血清における本発明の遊離したキメラ１５Ａ．２の存在を、ポリクロナールヤギ抗イヌＩｇＧ接合体により検出する組換えイヌＩｇＥ固相を用いてエライザにより調べた。図３は、血清中のｃ１５Ａ．２レベルが、投与の周期の各々の５日間の最初と最後に常に、上昇および下降することを示す。遊離したｃ１５Ａ．２は、注入後２４日の実験用イヌ血清においてまだ検出可能（Ｘμｇ／ｍｌ）である。
ｃ１５Ａ．２およびイヌＩｇＥの免疫複合体を、１４Ｋ．２固相のエライザにより測定し、ポリクロナール抗−イヌＩｇＧｆｃ接合体により検出した。図４に要約したこれらのデータは、複合したＩｇＥは、処置の早い時期では高い濃度で検出されるが、複合体レベルはやがて経時的に下降することを示す。２８日までは、ｃ１５Ａ．２を与えたイヌにおいて免疫複合体は検出されない。この結果は、該複合体が血清イムノグロブリンの循環しているプールから一掃され、この時間枠において新しいＩｇＥの合成が減少し、排除されていることを示唆する。対照イヌでは変化は観察されなかった。イヌ２００３および２１０３において、キメラモノクローナル抗体ｃ１５Ａ．２に対する免疫反応は観察されなかった。第一の注入後２８日で、イヌ２００２において試験物質に対する免疫反応が観察された。図５に示すデータは、より多くのキメラ１５Ａ．２を投与すると、この反応が増大し、イヌ２００２におけるｃ１５Ａ．２のより短い血清中半減期で一定の役割を果たしうる（図３）ことを示す。
【００４１】
実施例ＶＩＩ：イヌ抗−ＩｇＥｍＡｂ１５Ａ．２（ｃ１５Ａ．２）の投与による好塩基球上の高アフィニティーＩｇＥ受容体の発現のレベルへの効果
ｃ１５Ａ．２投与開始後の５日、１４日、および２９日に、１０ｍｌの全血を摂取した。末梢血の白血球の半精製個体群を密度勾配遠心分離により調製し、２次元フローサイトメトリー解析用試薬で染色した。これらの実験において用いた試薬はＦＩＴＣ接合、抗イヌ高アフィニティーＩｇＥ受容体ｍＡｂ９Ｌ．４およびＰＥ接合１４Ｋ．２であった。これらの抗体用に２重染色し、図６のドットブロット図の４つの象限（右上が第１象限）中にある細胞種は好塩基球である。
図６のデータはイヌ２００２のものであって、代表例である。象限中の２重染色した細胞の数はｃ１５Ａ．２の投与と経時的に減少する。該データは、好塩基球における高アフィニティーＩｇＥ受容体の発現レベルが実験用イヌ２００２へのｃ１５Ａ．２の投与から２９日後には９０％以上減少することを示唆する。経時的に血清ＩｇＥの排除が好塩基球上のＩｇＥ用受容体の発現の減少をもたらし、皮膚肥満細胞においても同様の反応を反映するかもしれない。高アフィニティーＩｇＥ受容体の肥満細胞での発現の減少はアレルゲンに対する皮膚試験の反応性の減少または排除をもたらすであろう。
【００４２】
実施例ＶＩＩＩ：イヌ抗−ＩｇＥｍＡｂ１５Ａ．２を投与したブタクサ皮膚試験反応性に対する効果
ブタクサに感作したイヌにエバンスブルー色素のＰＢＳ中０．５％溶液を０．２ｍｌ／ｋｇで注入し、次いで、１０分後にアレルゲンで攻撃した。１０００ＰＭＵ／ｍｌで開始するＰＢＳ中のブタクサアレルゲンの５回連続して１０倍に希釈したものを調製し、胴体の毛をそった部分に１００μｌ皮下注入した。生理食塩水（ＰＢＳ）は負の対照として供し、ヒスタミン（ＰＢＳ中０．２７５μｇ／ｍｌのヒスタミン希釈体１００μｌ）は正の対照として供した。反応性を１０分後に測定し、皮膚における腫れおよび青色素の拡散をヒスタミンの対照と比較した。２の評価は該反応がヒスタミン反応に対する大きさおよび色に相当するアレルゲン希釈体に与えた。１の評価はヒスタミン対照の半分であった反応に与え、０の評価は反応が負の対照である生理食塩水に相当した場合に与えた。２００２、２００３および２１０３の３つの実験用イヌおよび１１０１および１１０２の２つの対照イヌを、c１５Ａ．２を投与する一週間前、次いで、最終投与から３日および７日後に前記した通りに皮膚試験行った。図７は、対照イヌにおいてブタクサアレルゲンに対する皮膚反応が研究を通して一様であったことを示す。対照イヌ１１０２において、ブタクサ皮膚反応は実際のところ経時的に増加した。実験用イヌ２００３および２１０３において、ｃ１５Ａ．２の投与後４０日間でブタクサ感作は少なくとも７日間完全になくなった。イヌ２００２だけが、注入後３日目に最も高いブタクサ濃度でのブタクサ感作を示し、反応は色素の拡散から１の評価を得た。対照イヌを観察および記録した評価１においてみられた特徴的な腫れを有するわけではなかった。イヌ２００２に注入後７日で、１の反応評価を１０００ＰＭＵ／ｍｌ、１００ＰＭＵ／ｍｌおよび１０ＰＭＵ／ｍｌのスポットに与えた。腫れることなく色の拡散のみあった。イヌ２００２において、この皮膚試験期間で検出できない遊離または全ＩｇＥがあるという事実が得られたならば、観察された皮膚反応は肥満細胞上の高アフィニティーＩｇＥ受容体とＩｇＥとの架橋によるものではないと思われる。これらを試験手順に伴う別の皮膚反応の結果としてもよい。
【００４３】
実施例ＩＸ：長期血清安定性、免疫原性の喪失およびＩｇＥ＋Ｂ−細胞を標的とするために設計したキメライヌ抗−ＩｇＥｍＡｂ
イヌの配列から選ばれた分子のかなりの部分をＩｇとして含む形態の本発明のイヌ抗−ＩｇＥｍＡｂを提供し、それゆえ、より大きな血清安定性、免疫原性の喪失およびより効果的にＩｇＥ＋Ｂ−細胞を標的とすることが期待できることを、当業者は理解するであろう。
それゆえ、もう一つ別の例において、長期血清安定性およびそれに対する免疫反応を誘発不能にするように操作されたキメライヌ抗−ＩｇＥｍＡｂをイヌに投与する。このｍＡｂは血清中のＩｇＥ、および肥満細胞または好塩基球上のＩｇＥではなく、ＩｇＥ産生Ｂ−細胞の表面上のＩｇＥに結合する。それゆえ、ＩｇＥ合成は減少または排除される。結果として減じたＩｇＥレベルは肥満細胞ＩｇＥ受容体発現の減少および伴うアレルギー反応の減少の原因となる。
【００４４】
実施例Ｘ：組換えイヌＩｇＥ受容体を意味するｃＲｃＩｇの、昆虫細胞中のクローニングおよび発現
イヌＩｇＥ受容体のα−サブユニットの少なくとも一部に相当すると考えられている配列が、ＧＥＮＢＡＮＫデータベースの受入番号Ｄ１６４１３に示されている。
ｃＲｃＩｇ受容体は、イヌＩｇＥのエキソン２および３に架橋しているＩｇＥに結合する受容体のαドメインからなる。受容体のＩｇＧ長鎖部分はｃ１５Ａ．２のエキソン２および３と同様である。
キメラＩｇＥ受容体ｃＲｃＩｇをコードしているＤＮＡを標準的な操作を用いてバキュロウィルス遺伝子に導入した。Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ昆虫細胞菌株を、ｃＲｃＩｇを産生するバキュロウィルスに感染させた。ｃＲｃＩｇタンパク質をタンパク質Ａのクロマトグラフィーにより細胞培地から精製し、続いて、イオン交換クロマトグラフィーにより混入しているタンパク質を除去した。組換えＩｇＥ受容体であるｃＲｃＩｇのＤＮＡ配列を、対応する翻訳とともに、図１０に示す。
【００４５】
実験に用いたＩｇＥ受容体はｃＲｃＩｇと称される組換えキメラ受容体であり、イヌＩｇＧ  ＣＨ２およびＣＨ３ドメインに融合した可溶性高アフィニティーＩｇＥ受容体のαユニットからなる。膜貫通ドメインを欠く可溶性αサブユニットをＧｅｎｅＢａｎｋで利用できる情報を用いてＰＣＲによりクローン化した。ＩｇＧ  ＣＨ２およびＣＨ３ドメインはＣｈｅｍｏ−Ｓｅｒｏパテントにより請求されたＤＥ９４の配列の一部であった。可溶性受容体およびＤＥ９４ＣＨ２／ＣＨ３をＰＣＲにより結合させ、全長ｃＲｃＩｇを形成した。
全長ｃＲｃＩｇをファーミンゲン社のバキュロウィルスｐＡｃＨｉｓＴＮＡベクター中にクローン化した。該ウィルスをｓｆ−９細胞を用いて増幅させた。ｃＲｃＩｇタンパク質を秘密形態で産生し、４８時間、ＭＯＩ（感染の多重度）５で、Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ細胞中で発現させた。該タンパク質をＣＨ２／ＣＨ３ドメインのタンパク質Ａカラムへの結合に基づいて精製した。詳細な精製スキームは実施例ＩＶに示す１５Ａ．２のものと同様である。
精製したｃＲｃＩｇを２．９ｍｇ／ｍｌに濃縮し、０．２μｍのフィルターユニットを通して濾過することにより滅菌した。最終的な緩衝液成分は以下の通りである：
０．７ｘＰＢＳ
６．５ｍＭクエン酸ナトリウム
１５％グリセロール
ｐＨ：約７．０
該タンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥタンパク質ゲルにより示されるように、少なくとも９５％の純度を有し、将来使用するために−８０℃で保管した。
【００４６】
実施例ＸＩ：インビボおよびインビトロでのＩｇＥ活性に対する組換えイヌＩｇＥ受容体の効果
血清ＩｇＥレベルを、前記した通りに、エライザにより測定した。実施例Ｘで得られた精製したｃＲｃＩｇをインビトロで、イヌＩｇＥ受容体とイヌＩｇＥの結合を妨げるその能力の試験をした。血清ＩｇＥを中和させるのに必要なｃＲｃＩｇ量を、インビトロで、イヌ血清に対する精製したｃＲｃＩｇの滴定により測定した。次いで、精製したｃＲｃＩｇを静脈内注射によりボーラスで投与した。
それゆえ、組換えイヌＩｇＥ受容体ｃＲｃＩｇを、イヌ１００１および１００２に静脈内ボーラス投与した。ｃＲｃＩｇ量は、インビトロで結合する組換え受容体の５０％中和に必要な量の１０倍（イヌ１００２において、１４１ｍｇｓ；２ｍｇ／ｍｌで７．０８ｍｌ）または２０倍（イヌ１００１において、２２０ｍｇｓ；２ｍｇ／ｍｌで１１．０４ｍｌ）に相当した。次いで、付加的なｃＲｃＩｇを各々のイヌに第１３日目ないし１７日目に５日連続して２ｍｇ／ｍｌで５ｍｌの投与量でボーラス投与した。図９は時間に対する各々のイヌにおける遊離した血清ＩｇＥのレベルを示す。いずれのイヌにおいても、０日目のｃＲｃＩｇの最初の投与後に、ＩｇＥは急速に循環して戻った。血清ＩｇＥレベルは、一般的に、当業者に周知の標準的なエライザ法によりアッセイされる。ＩｇＥレベルは、一般的に、約１ｎｇ／ｍｌ以下だとエライザ法では検出できないと考えられている。
【００４７】
イヌ１００１において、血清ＩｇＥは組換えＩｇＥ受容体の最終投与から２ヶ月を超えてもアッセイにより検出できなかった。イヌ１００２において、血清ＩｇＥレベルは組換え受容体の最終投与の一定の期間経過後には、検出可能なレベルに戻った。しかしながら、イヌ１００２において、血清ＩｇＥレベルは増加したが、０日目の組換え受容体の投与前に示していた高いレベルまでは戻らなかった。図１０は、各々のイヌにおける実験期間中の全および遊離した血清ＩｇＥレベルを示す。これらのデータは、循環しているＩｇＥを血清から速やかに除去することができなかったことを示す。遊離した血清ＩｇＥは利用できないが、おそらく、ｃＲｃＩｇと複合した全ＩｇＥはまだ循環していた。
これらのデータは、（１）血清の循環しているＩｇＥを明らかにすること；および（２）ＩｇＥを補充する過程に影響を及ぼす方法を示すことにおいて、本発明の組換え抗体の効果を示す。
【００４８】
実施例ＸＩＩ：イヌＩｇＥに結合し、ＩｇＥ受容体に結合することを妨げ、および／またはＢ−細胞上のＩｇＥに結合し、ＩｇＥの合成に影響を及ぼすペプチド
ペプチドはコンビナトリアルペプチドライブラリー由来であって、ＩｇＥと結合した場合、ＩｇＥ受容体に結合するのを妨げるアミノ酸配列を含むと当業者により認識されているであろう。次いで、それらはＩｇＥ、好ましくはＩｇＥのエキソン３に結合可能で、このＩｇＥがＩｇＥ受容体に結合するのを妨げることができるアミノ酸配列のペプチドである。また、それらはＢ−細胞上のＩｇＥに結合していてもよい。
それゆえ、別の例において、イヌＩｇＥに結合するペプチドをイヌに投与する。該ペプチドは血清中のＩｇＥおよび、肥満細胞または好塩基球上のＩｇＥではなく、ＩｇＥ産生Ｂ−細胞の表面上のＩｇＥに結合する。ＩｇＥ合成を減少させるか、または排除する。結果として減じたＩｇＥレベルは肥満細胞におけるＩｇＥ受容体の発現の減少およびそれに伴うアレルギー反応の減少を引き起こす。
【００４９】
実施例ＸＩＶ：イヌＩｇＥに結合し、ＩｇＥ受容体へ結合するのを妨げ、および／またはＢ−細胞上のＩｇＥに結合し、ＩｇＥ合成に影響を及ぼす小分子
小有機分子はコンビナトリアルライブラリーに由来し、アッセイでスクリーニングし、よってＩｇＥがＩｇＥ受容体に結合することを阻害する能力で小有機分子を単離すると、当業者は認識している。それゆえ、それらはＩｇＥ、好ましくはエキソン３内の領域に結合していてもよく、ＩｇＥ受容体に結合することを阻害する。
別の例において、小分子をイヌに投与する。小分子は血清中のＩｇＥおよび肥満細胞または好塩基球上のＩｇＥではなく、ＩｇＥ生成Ｂ−細胞の表面上のＩｇＥに結合する。したがって、ＩｇＥ合成を減少させるか、または排除する。結果として減じたＩｇＥレベルは肥満細胞中のＩｇＥ受容体発現の減少およびそれに伴うアレルギー反応の減少を引き起こす。
【００５０】
おわりに
本明細書および請求の範囲で用いる単数形「ａ」「ａｎｄ」および「ｔｈｅ」は特に明記のない限り複数形を包含する。例えば、「処方」なる用語は、異なる処方の混合物を包含し、「治療法」なる用語は同等の工程および当業者により周知の方法を包含する。
特に記載がない限り、本明細書で用いたすべての技術および特定の用語は当業者により一般的に理解すると同じ意味を有する。本明細書で記載したものと類似または同等の方法および物質のいずれも、本発明の実施または試験に使用でき、本明細書に記載した好ましい方法および物質である。本明細書に記載した全ての刊行物は出典明示により本明細書の一部とする。
【図面の簡単な説明】
【図１】  ＩｇＥが組換えイヌＩｇＥ受容体と結合することを阻害するキメラ１５Ａ．２の能力を示す。
【図２】  １のコースのキメラ抗体を投与した後の、イヌにおけるｃ１５Ａ．２活性に関する経時的データを示す。
【図３】  ｃ１５Ａ．２と称される組換えキメラ抗−ＩｇＥｍＡｂを投与した後の、２匹の対照および３匹の実験用のイヌにおける（遊離の、および合計のＩｇＥ）の循環しているＩｇＥレベルに関する経時的データを示す。このｍＡｂ１５Ａ．２およびその特異性は１９９９年３月３０日出願の係属している特許出願番号０９／２８１７６０に開示されている。
【図４】  ８つのコースのキメラ抗体を投与した後の、３匹のイヌにおけるｃ１５Ａ．２と複合したＩｇＥの循環に関する経時的データを示す。
【図５】  キメラ抗体を投与した後の、実験用イヌの血清中に観察される抗−キメラ１５Ａ．２活性に関する経時的データを示す。
【図６】  キメラ抗−１５Ａ．２ｍＡｂを投与する最初のコースから４日後の、第２のコースから３日後の、および第５のコースから５日後の、ＰＥ−標識した抗−エキソン４イヌＩｇＥｍＡｂ１４Ｋ．２およびＦＩＴＣ−標識した抗−イヌＩｇＥ受容体ｍＡｂ９Ｌ．４で二重染色した、イヌからのフローサイトメトリーデータを示す。
【図７】  ｃ１５Ａ．２ｍＡｂの投与前、８つのコースを投与した３日および８日後の、イヌにおけるラグウェード（Ragweed）皮膚試験反応性に関する経時的データを示す。
【図８】  ｃＲｃＩｇと称される組換え受容体−ＩｇＧアンタゴニストを投与した後の、イヌ１００１および１００２における循環している遊離したＩｇＥレベルの経時的データを示す。
【図９】  実験の時間経過にわたる実験用イヌ１００１および１００２の遊離したＩｇＥおよび全体としてのＩｇＥを示す。
【図１０】  組換えＩｇＥ受容体ｃＲｃＩｇのＤＮＡ配列（配列番号５）と対応する翻訳（配列番号６）を示す。図の最後に４個のアミノ酸を付加した、その対応するヌクレオチドを欠くのが配列番号７である。
【配列表】
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【図１】
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【図２Ａ−１】
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【図２Ａ−２】
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【図２Ａ−３】
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【図２Ｂ−１】
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【図２Ｂ−２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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