(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
病原細菌感染又はその病原作用に対する動物の防御用弱毒生ワクチンであって、ｃｒａ遺伝子における突然変異の結果として機能的Ｃｒａタンパク質を発現することができない生きた弱毒細菌と、医薬的に許容可能なキャリヤーとを含み、且つ、前記病原細菌がエシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、アクチノバシラス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ヘモフィラス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、エアロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）、パステウレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）及びエルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）属のいずれかに属することを特徴とする弱毒生ワクチン。
【請求項２】
生きた弱毒細菌がヘテロ遺伝子をもつことを特徴とする請求項１に記載の弱毒生ワクチン。
【請求項３】
アジュバントを含むことを特徴とする請求項１又は２に記載の弱毒生ワクチン。
【請求項４】
凍結乾燥形態であることを特徴とする請求項１から３のいずれか一項に記載の弱毒生ワクチン。
【請求項５】
病原細菌感染又は感染の病原作用に対する動物の防御用ワクチンの製造のための、ｃｒａ遺伝子における突然変異の結果として機能的Ｃｒａタンパク質を発現することができない生きた弱毒細菌の使用であって、前記病原細菌がエシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、アクチノバシラス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ヘモフィラス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、エアロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）、パステウレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）及びエルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）属のいずれかに属することを特徴とする使用。
【請求項６】
生きた弱毒細菌がヘテロ遺伝子をもつことを特徴とする請求項５に記載の使用。
【請求項７】
生きた弱毒細菌を医薬的に許容可能なキャリヤーと混合することを含む請求項１に記載のワクチンの製造方法。
【請求項８】
病原細菌感染に対して動物を免疫するための医薬組成物であって、請求項１に記載のワクチンを含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項９】
請求項１に記載のワクチンを、ヒトを除く動物に投与することを含む病原細菌感染に対する動物の免疫方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は医薬に使用するための生きた弱毒細菌、微生物による疾病の予防に有用な前記細菌を使用したワクチン、ヘテロ遺伝子をもつ生きた弱毒細菌、及び前記ワクチンと細菌の製造方法に関する。
【０００２】
【従来技術及び発明が解決しようとする課題】
温血動物が微生物による疾病を克服する手段は複雑なプロセスである。微生物による疾病に対する免疫は、温血動物が発病を避けるか又は症状を軽減する手段の１つである。所与病原体に対する免疫が不完全である結果、病原体に暴露される集団に罹病又は死亡が生じる。生きた弱毒微生物を使用したワクチン（弱毒生ワクチン）は非常に有効な型の免疫応答を誘導することが一般に認められている。このようなワクチンは、一度動物宿主に接種すると、病原微生物の宿主侵入により早期の細胞性又は体液性免疫の促進誘発を誘導し、感染が臨床的に重大な程度に達する前に微生物の増殖を抑制できるという利点がある。殺した病原体を使用したワクチン（死菌ワクチン）ではこの種の応答が得られないことが一般に認められている。しかし、生きた病原体を含むワクチンは弱毒程度によっては、接種した宿主が接種後に防御の対象となる疾病に罹患する危険がある。従って、生きた微生物の免疫特性をもちながら、ワクチン接種後に望ましくない副作用を生じることのないワクチンを入手できることが望ましい。
【０００３】
細菌を弱毒化するための一般的なアプローチは１種以上のビルレンス因子の除去である。しかし、殆どの場合、ビルレンス因子も免疫誘導に加担している。このような場合、ビルレンス因子を除去すると、細菌の免疫能を損なうことは避けられない。これは当然望ましくない状況である。生ワクチンは野生型株の抗原補体を維持していることが好ましい。
【０００４】
更に、生ワクチンは許容できない疾病作用を避けるために十分に非病原性であると共に、宿主に十分なレベルの免疫を誘導することが必要である。最後に、弱毒生ワクチン株はビルレント野生型株に戻る可能性が実質的にないことが好ましい。
【０００５】
多くの細菌属で主要炭水化物代謝に関与することが知られているタンパク質をコードする遺伝子を欠失させると、このような細菌のｉｎ  ｖｉｖｏ生存可能性を損なわずにｉｎ  ｖｉｖｏ弱毒性を誘導できることが今般意外にも判明した。この遺伝子を欠失する細菌は意外にも弱毒性を示す。更に、この遺伝子によりコードされるタンパク質は免疫誘導に加担しないので、この遺伝子を欠失する細菌の抗原量は野生型と同一である。従って、このような細菌は意外にも医薬製造分野、より特定的には弱毒生ワクチンの製造に有利に使用できる。
【０００６】
本発明により欠失させることができ、欠失突然変異体のｉｎ  ｖｉｖｏ弱毒性を誘導する遺伝子は、以前はｆｒｕＲ遺伝子として知られていたが、現在ではｃｒａ遺伝子と呼ばれる遺伝子である。この遺伝子を欠失する突然変異体は、Ｃｒａ活性の不足に起因する欠乏を増殖培地に補償しないとｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖できないことが判明した。従って、増殖培地にはＣｒａ欠失突然変異体の増殖を可能にする栄養が存在していなければならない。
【０００７】
一般に、病原細菌は利用可能な栄養にその代謝を適応させるという意味で自立性である。ｃｒａ遺伝子は多くの主要代謝経路（下記参照）でこのような適応機能を果たす。しかし、ｃｒａ遺伝子を欠失させた突然変異体は炭素源としてのグルコース及び他の多くの糖類の存在下で完全に十分に増殖することができる。宿主動物ではこのような糖類を利用できるので、ｃｒａ遺伝子がｉｎ  ｖｉｖｏ条件下で機能的であるとは予想されなかった。従って、Ｃｒａ−突然変異体が宿主で弱毒性を示すとは予想されなかった。そのため、このような突然変異体は当技術分野で知られていたが、弱毒生ワクチンの候補として示唆されていなかった。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明の１態様は、ワクチンで使用するための、ｃｒａ遺伝子における突然変異の結果として機能的Ｃｒａタンパク質を発現することができない生きた弱毒細菌に関する。
【０００９】
【発明の実施の形態】
（以前はＦｒｕＲ（フルクトースリプレッサータンパク質）として知られており、現在ではＣｒａ（異化リプレッサー／アクチベータータンパク質）として知られる）遺伝子産物は炭水化物代謝の多くの主要経路における調節タンパク質である。
【００１０】
ｃｒａ遺伝子産物Ｃｒａは主要炭素代謝を調節する。より詳細には、Ｃｒａは生合成及び酸化酵素（例えばＴＣＡ回路、グリオキサル酸回路、糖新生経路及び電子輸送における主要酵素）をコードする遺伝子のプロモーターの上流に結合することによりこれらの遺伝子の転写を正に調節し、解糖酵素（例えばＥｍｂｄｅｎ−Ｍｅｙｅｒｈｏｆ及びＥｎｔｎｅｒ−Ｄｏｕｄｏｒｏｆｆ経路における主要酵素）をコードする遺伝子の転写を負に調節する。
【００１１】
炭水化物代謝におけるその重要な地位が故に、ｃｒａ遺伝子とその遺伝子産物Ｃｒａは細菌界に広く存在している。Ｃｒａタンパク質は高度に保存されたタンパク質である。例えば大腸菌、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ種（例えば血清型Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ及びＤｕｂｌｉｎ）、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ種（例えばＡ．ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ種（例えばＨ．ｐａｒａｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａｅ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ種（例えばＰ．ｐｉｓｃｉｄａ及びＰ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種（例えばＳ．ｅｑｕｉ及びＳ．ｓｕｉｓ）及びＹｅｒｓｉｎｉａ種（例えばＹ．ｐｅｓｔｉｓ）に認められる。
【００１２】
ＳａｌｍｏｎｅｌｌａとＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａにおける遺伝子自体とその完全ヌクレオチド配列は１９９１年にＪａｈｒｅｉｓ，Ｋ．ら（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２２６：３３２−３３６（１９９１））により明らかにされている。Ｊａｈｒｅｉｓは、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ、血清型Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ及び大腸菌におけるＣｒａタンパク質が４つの位置でしか相違せず、そのうちの２個も保存的交換であることを示した。これは、特に大腸菌とサルモネラにおいて進化中にさほど分岐していない細菌炭水化物代謝における非常に多くの普遍経路に加担するタンパク質に予想されたことに当然一致する。Ｃｒａタンパク質の結合メカニズムはＲａｍｓｅｉｅｒ，Ｔ．Ｍ．ら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３４：２８−４４（１９９３））により少なくとも部分的に明らかにされている。Ｃｒａタンパク質（異化リプレッサー／アクチベータータンパク質）の役割と機能は文献に広く記載されており、例えば最近ではＳａｉｅｒ，Ｍ．Ｈ．とＲａｍｓｅｉｅｒ，Ｔ．Ｍ．（Ｊｏｕｒｎ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８：３４１１−３４１７（１９９６））による短い論文に記載されている。
【００１３】
このような突然変異は機能的Ｃｒａタンパク質を発現させないものであれば、挿入、欠失、置換又はその組み合わせのいずれでもよい。機能的Ｃｒａタンパク質とは野生型タンパク質の調節特性をもつタンパク質を意味する。従って、その機能の少なくとも１つを欠損するＣｒａタンパク質は非機能的Ｃｒａタンパク質であるとみなされる。
【００１４】
本発明により使用される生きた弱毒細菌は数種の方法で得ることができる。このような細菌を得る方法の１例はｃｒａ遺伝子をもつ野生型細菌を塩基類似体等の突然変異誘発物質で処理したり、紫外線処理又は温度処理するなどの旧来の方法である。
【００１５】
機能的Ｃｒａタンパク質を産生しない株は容易に確認できる。これらの株は炭素源としてのグルコース及び他の糖類の存在下でのみ最少培地で増殖する（この点がｃｙａ及びｃｒｐ突然変異体から区別される）が、単独炭素源としての糖新生基質の存在下では増殖することができない（Ｃｈｉｎら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：８９７−８９９（１９８７））。従って、これらの株は非常に容易にｉｎ  ｖｉｔｒｏ選択することができる。
【００１６】
旧来の突然変異技術により生じる突然変異の種類は不明である。点突然変異ではないかと思われるが、点突然変異は、可能性は低いとしても野生型に戻ることがある。この小さな危険を避けるためには、トランスポゾン突然変異誘発が良好な代案であると思われる。トランスポゾン突然変異誘発も当技術分野で周知の突然変異誘発技術である。これは染色体中の局在部位で実施される突然変異である。トランスポゾン挿入は特定遺伝子を標的にすることができない。しかし、ｃｒａ突然変異体はＣｒａ活性欠失の栄養補償なしにはｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖しないので、ｃｒａ突然変異体を確認することは非常に容易である。従って、ランダムにトランスポゾン突然変異した細菌のプールから容易に選択することができる。予め決められた部位にランダムでなく計画的に突然変異を導入することが可能な手段は組換えＤＮＡ技術により得られる。このような突然変異は、突然変異遺伝子が機能的Ｃｒａをコードしない限り、挿入、欠失、１個のヌクレオチドを別のヌクレオチドで置換又はその組み合わせのいずれでもよい。このような突然変異は例えば多数の核酸の欠失により実施することができる。核酸１０個程度の非常に小さい欠失でもＣｒａを非機能的にすることができる。たった１個の核酸の欠失でも、このような突然変異の結果として他の核酸が適正な読み枠から外れる場合にはＣｒａを非機能的にすることができる。３で割り切れない数の核酸の欠失又は挿入によりこのようなフレームシフトが生じる。もっと長い配列（例えば核酸１００個）を欠失させるとより好ましい。完全ｃｒａ遺伝子を欠失させると更に好ましい。当然のことながら、機能的Ｃｒａをコードしない株を得るために非常に適しているのは、特にオープンリーディングフレームに停止コドンを導入する突然変異や、オープンリーディングフレームにフレームシフトを生じる突然変異である。
【００１７】
Ｃｒａ−突然変異体を構築するための全技術は周知標準技術である。これらの技術は、ｃｒａ遺伝子のクローニング、部位特異的突然変異誘発による遺伝子配列の改変、制限酵素消化後の再連結又はＰＣＲアプローチに続き、野生型ｃｒａ遺伝子を突然変異遺伝子で置換する（対立遺伝子交換又は対立遺伝子置換）。プラスミドにおけるｃｒａ遺伝子のクローニング、遺伝子の制限酵素消化後のエンドヌクレアーゼ処理、再連結及び宿主株における相同組換え等の標準組換えＤＮＡ技術は全て当技術分野で公知であり、例えばＭａｎｉａｔｉｓ／Ｓａｍｂｒｏｏｋ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ．ＩＳＢＮ  ０−８７９６９−３０９−６）に記載されている。部位特異的突然変異は例えばＣｌｏｎｔｅｃｈから市販されているＴｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ（登録商標）キットを使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏ部位特異的突然変異誘発により実施することができる。ＰＣＲ技術はＤｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ  ＆  Ｄｒｅｋｓｌｅｒ，ＰＣＲ  ｐｒｉｍｅｒｓ，ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ．ＩＳＢＮ  ０−８７９６９−４４７−３及びＩＳＢＮ  ０−８７９６９−４４７−５に詳細に記載されている。
【００１８】
ｃｒａ遺伝子はＣｒａタンパク質をコードする遺伝子だけでなく、プロモーター等の直接配列も含む。更に、Ｃｒａ  ｍＲＮＡの適正な翻訳に必須の部位（例えばリボソーム結合部位）も含む。
【００１９】
従って、コーディング領域の突然変異だけでなく、適正な転写及び翻訳に必須な配列の突然変異も本発明の範囲に含むものとする。
【００２０】
好ましい態様において、本発明はワクチンで使用するためのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ及びＹｅｒｓｉｎｉａ属の生きた弱毒細菌に関する。
【００２１】
本発明のより好ましい形態において、本発明の生きた弱毒細菌はＳ．ｅｎｔｅｒｉａ血清型Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ、Ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ、Ｄｕｂｌｉｎ、Ｔｙｐｈｉ、Ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ、Ａｂｏｒｔｕｓｏｖｉ、Ａｂｏｒｔｕｓｅｑｕｉ、Ｐｕｌｌｏｒｕｍ、Ｅ．ｃｏｌｉ又はＹ．ｐｅｓｔｉｓから構成される群から選択される。これらの細菌属はヒト及び種々の動物に病原性の多数の種を含む。
【００２２】
更に好ましい形態において、本発明の生きた弱毒細菌はＳ．ｅｎｔｅｒｉｃａ、Ｅ．ｃｏｌｉ又はＹ．ｐｅｓｔｉｓである。
【００２３】
更に好ましい形態において、本態様はｃｒａ遺伝子における突然変異を組換えＤＮＡ技術により実施した本発明の生きた弱毒細菌に関する。
【００２４】
ｃｒａ遺伝子のフラグメントもしくは完全遺伝子の欠失又はヘテロＤＮＡフラグメントの挿入又はその両者を含む明確且つ計画的になされた突然変異は、旧来通りに誘導した突然変異に比較して野生型状態に戻らないという利点がある。
【００２５】
従って、より好ましい形態において、本発明のこの態様はｃｒａ遺伝子が挿入及び／又は欠失を含む生きた弱毒細菌に関する。
【００２６】
今日ではペットと家畜の両者に多量のワクチンが投与されているので、単にワクチン接種費用の低減のためだけでも数種のワクチンの併用投与が望ましいことは明白である。従って、他の病原微生物又はウイルスから選択される抗原をコードするヘテロ遺伝子の組換えキャリヤーとして生きた弱毒細菌を使用することは非常に有利である。このような組換えキャリヤーを投与すると、２種以上の疾病に対する免疫が同時に誘導されるという利点がある。Ｃｒａタンパク質をコードする遺伝子をヘテロ遺伝子の挿入部位として使用することができるので、ワクチンで使用するための本発明の生きた弱毒細菌はヘテロ遺伝子の非常に適切なキャリヤーとなる。ｃｒａ遺伝子を挿入部位として使用すると、ｃｒａ遺伝子が不活化されると同時に、新たに導入したヘテロ遺伝子を（ホモ細菌遺伝子と同時に）発現させることができるという利点がある。このような組換えキャリヤーの構築は対立遺伝子交換等の標準的な分子生物学技術を使用して常法により実施することができる。従って、本発明の別の態様は機能的Ｃｒａタンパク質を産生せず、ヘテロ遺伝子を挿入した好ましくはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ及びＹｅｒｓｉｎｉａ属の生きた弱毒組換え細菌に関する。このようなヘテロ遺伝子は上述のように例えば他の病原微生物又はウイルスから選択される抗原をコードする遺伝子とすることができる。このような遺伝子は病原性ヘルペスウイルス（例えばヘルペスウイルスの構造タンパク質をコードする遺伝子）、レトロウイルス（例えばｇｐ１６０エンベロープタンパク質）、アデノウイルス等から誘導することができる。ヘテロ遺伝子は病原細菌からも得られる。例えば、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ毒素、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ毒素、外膜タンパク質等の細菌毒素をコードする遺伝子が非常に適切な細菌ヘテロ遺伝子である。あるいは、インターロイキン又はインターフェロン等の免疫系の開始に関与するタンパク質をコードする遺伝子や、免疫調節に関与する別の遺伝子を挿入してもよい。
【００２７】
ヘテロ遺伝子をｃｒａ遺伝子に挿入すると、ヘテロ遺伝子の挿入部位を見つけだす必要がないと同時にｃｒａ遺伝子を欠損させるので有利である。
【００２８】
従って、この態様の好ましい形態では、ヘテロ遺伝子をｃｒａ遺伝子に挿入する。ヘテロ遺伝子はｃｒａ遺伝子のどこかに挿入でき、部分的又は完全に欠失しているｃｒａ遺伝子の部位に挿入してもよい。
【００２９】
ワクチンで使用するための本発明の細菌は予想外のｉｎ  ｖｉｖｏにおける弱毒性であるが免疫原性を有するという特性により、弱毒生ワクチンの主成分として非常に適切である。従って、本発明の更に別の態様は野生型形態がｃｒａ遺伝子を含む細菌による感染に対して動物及びヒトを防御するための弱毒生ワクチンに関する。
【００３０】
このようなワクチンは免疫原として有効な量のワクチンで使用するための本発明の生きた弱毒細菌又は本発明の生きた組換えキャリヤー細菌と、医薬的に許容可能なキャリヤーを含む。
【００３１】
ワクチンはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ及びＹｅｒｓｉｎｉａの群から選択される本発明の生きた弱毒細菌を含むことが好ましい。
【００３２】
免疫原として有効とは、ワクチン接種時の生きた弱毒細菌の投与量が細菌のビルレント形態に対する有効な免疫応答を宿主に誘導するために十分であることを意味する。
【００３３】
免疫原として有効な量の上記生きた弱毒細菌に加え、本発明のワクチンは医薬的に許容可能なキャリヤーも含む。このようなキャリヤーは単に水でもよいし、例えば細菌を培養した培養液でもよい。別の利用可能なキャリヤーは例えば生理的塩濃度の溶液である。
【００３４】
有用な投与量は年齢、体重及びワクチン接種する動物、投与方法並びにワクチン接種の対象となる病原体の種類によって異なる。
【００３５】
ワクチンは免疫応答を誘導するために十分な任意用量の細菌を含むことができる。例えば、細菌１０３〜１０１０個が非常に適切な用量である。
【００３６】
場合により、アジュバント活性をもつ１種以上の化合物をワクチンに加えてもよい。アジュバントは免疫系の非特異的刺激剤である。アジュバントはワクチンに対する宿主の免疫応答を高める。当技術分野で公知のアジュバントの例はフロイント完全及び不完全アジュバント、ビタミンＥ、非イオン性ブロックポリマー、ムラミルジペプチド、ＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体、例えばヨーロッパ特許第ＥＰ１０９９４２号参照）、サポニン、鉱油、植物油及びカルボポールである。
【００３７】
粘膜投与に特に適したアジュバントは例えば大腸菌熱変性性毒素（ＬＴ）又はコレラ毒素（ＣＴ）である。
【００３８】
他の利用可能なアジュバントは例えば水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム又は酸化アルミニウム、オイルエマルション（例えばＢａｙｏｌ  Ｆ（登録商標）又はＭａｒｃｏｌ  ５２（登録商標））、サポニン又はビタミンＥ可溶分である。
【００３９】
従って、好ましい形態において、本発明のワクチンはアジュバントを含む。
【００４０】
本発明で有用な医薬的に許容可能なキャリヤー又は希釈剤の他の例としては安定剤が挙げられ、例えばＳＰＧＡ、炭水化物（例えばソルビトール、マンニトール、澱粉、スクロース、グルコース、デキストラン）、タンパク質（例えばアルブミン又はカゼイン）、タンパク含有物質（例えばウシ血清又は脱脂乳）及び緩衝液（例えばリン酸緩衝液）である。
【００４１】
特にこのような安定剤をワクチンに加えると、ワクチンは非常に凍結乾燥し易くなる。従って、より好ましい形態では、ワクチンは凍結乾燥形態である。
【００４２】
動物又はヒトに投与するには、本発明のワクチンは特に鼻腔内、皮内、皮下、経口、エアゾール又は筋肉内の経路で投与することができる。家禽に投与するには、羽板及び点眼投与が非常に適切である。
【００４３】
更に別の態様は、野生型細菌感染又は感染の病原作用に対する動物及びヒトの防御用ワクチンの製造のための、本発明のワクチン用細菌又は組換え細菌の使用に関する。
【００４４】
本発明の更に別の態様は、本発明のワクチンの製造方法に関する。このような方法は、本発明の生きた弱毒細菌又は本発明の生きた組換えキャリヤー細菌と医薬的に許容可能なキャリヤーを混合することを特徴とする。
【００４５】
【実施例】
実施例１
Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  ＳＲ−１１  Ｆａｄ−における突然変異遺伝子の同定、クローニング及び配列決定
突然変異体Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  ＳＲ−１１  Ｆａｄ−のトランスポゾン突然変異遺伝子を同定、クローニング及び配列決定した。
【００４６】
前記ＳＲ−１１  Ｆａｄ−を非病原性にする突然変異遺伝子のヌクレオチド配列を配列番号１に示す。
【００４７】
配列番号２は配列番号１のヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質分子のアミノ酸配列を示す。
【００４８】
Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  ＳＲ−１１  Ｆａｄ−はｃｒａ遺伝子における突然変異体であることが分かった。トランスポゾン挿入点はｃｒａ翻訳停止コドンの３’末端から約４５塩基対の範囲内に位置することが判明した。
【００４９】
１．９ｋｂのＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  ＳＲ−１１  ＤＮＡフラグメントと、１．１ｋｂのＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  ＳＲ−１１  ＤＮＡフラグメントに挟まれた１．５ｋｂのＴｎ  １０ｄ  Ｃａｍインサートを含む４．５ｋｂのＰｓｔＩフラグメントをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）のＰｓｔＩ部位に挿入した。得られたプラスミドｐＪＨＡ７をエレクトロポレーションにより大腸菌ＨＢ１０１に導入した。Ｔｎ  １０ｄ  Ｃａｍインサートの両側の領域をサンガージデオキシ熱サイクリング法により配列決定した。Ｔｎ  １０ｄ  Ｃａｍインサートのすぐ両側のヌクレオチド配列はＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  ｃｒａ（ｆｒｕＲ）遺伝子に１００％相同であることが判明し、挿入点はｃｒａ翻訳停止コドンの３’末端から４５ヌクレオチドであることが判明した。これは、Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  ＳＲ−１１  Ｆａｄ−がｃｒａ突然変異体であることを示唆している。
【００５０】
ＳＲ−１１と異なり、ＳＲ−１１  Ｆａｄ−はクエン酸、オレイン酸、ピルビン酸、酢酸、コハク酸及びフマル酸を含むＭ９最少寒天プレートで増殖することができなかった。
【００５１】
Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  ＳＲ−１１野生型ｃｒａ（ｆｒｕＲ）をＰＣＲにより増幅し、ｐＢＲ３２２のアンピシリン耐性遺伝子のＰｓｔＩ部位に挿入した。得られたプラスミドｐＪＨＡ８は炭素源として上記化合物の各々を利用してそれらの野生型親と同様に増殖するＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  ＳＲ−１１  Ｆａｄ−の能力を回復した。これらの実験は、Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  ＳＲ−１１−がｃｒａ（ｆｒｕＲ）突然変異体であることを裏付けている。
【００５２】
ＳＲ−１１  Ｆａｄ−はバクテリオファージＰ２２ＨＴ１０５ｉｎｔによりＬＴ−２のミニトランスポゾン突然変異体からクロラムフェニコール耐性をＳＲ−１１に形質導入することにより構築した。従って、可能性は低いが、ＳＲ−Ｆａｄ−の非病原性は欠損ｃｒａ遺伝子に起因するのでなく、形質導入後に一部のＳＲ−１１  ＤＮＡが損失、例えば病原性島が損失したためであるとも考えられた。そこで、以下に記載するように、ＳＲ−Ｆａｄ−に存在すると同一の突然変異をｃｒａ遺伝子に含む以外はＳＲ−１１と同一の株（以下、ＳＲ−１１  ＣｒａｍｏｄＡＸ−２と呼ぶ）を対立遺伝子交換により構築した。
【００５３】
アンピシリン耐性遺伝子とテトラサイクリン耐性遺伝子（ｔｅｔＡＲ）の両者を含む自殺ベクターであるｐＬＤ５５のＰｓｔＩ部位にＳＲ−１１  Ｆａｄ−突然変異ｃｒａ遺伝子（クロラムフェニコール耐性遺伝子を含むｃｒａ）を含む４．３ｋｂのＰｓｔＩ  ＳＲ−１１  Ｆａｄ−ＤＮＡフラグメントを挿入した。これをｐＭＪＮ１０と命名した。ｐＭＪＮ１０をエレクトロポレーションにより大腸菌Ｓ１７−１λｐｉｒに導入した。大腸菌Ｓ１７−１λｐｉｒ（ｐＭＪＮ１０）をＳＲ−１１と交配後、数種のアンピシリン、テトラサイクリン及びクロラムフェニコールＳＲ−１１接合体がオレイン酸、クエン酸、酢酸、ピルビン酸、コハク酸及びフマル酸を単独炭素源として利用できるか否かを試験した。相同配列を使用する単一交差によりｐＭＪＮ１０を染色体に組み込んだ場合、即ち突然変異及び野生型ｃｒａ対立遺伝子の両者が染色体に存在する場合には、全接合体は予想通りこれらの化合物を利用することができた。これらの「組込体」のうちの５個について遊離プラスミドとしてｐＭＪＮ１０が存在するか否かを試験した処、存在するものは皆無であり、プラスミドがＳＲ−１１染色体に挿入されたことが更に示唆された。５個の組込体の各々をクロラムフェニコール添加ルリア寒天プレートで画線培養した。この場合には、２回目の交差を行った細胞は、染色体に残っているｃｒａ対立遺伝子がクロラムフェニコール耐性遺伝子を含む突然変異対立遺伝子である場合にしか生存しない。次に、画線培養した組込体の試料をテトラサイクリン感受性選択寒天（ＴＳＳ寒天）で画線培養した。ＴＳＳ寒天はフマル酸を含んでおり、テトラサイクリン感受性細胞即ち自殺プラスミドを失った細胞は染色体中にプラスミドを維持しているテトラサイクリン耐性細胞に比較して非常に大きいコロニーとして増殖する。クロラムフェニコール耐性、アンピシリン及びテトラサイクリン感受性、並びにオレイン酸、酢酸、ピルビン酸、クエン酸、コハク酸及びフマル酸を単独炭素源として利用する能力について合計３４個の大きいコロニーを試験した。３４個の単離株のうち、６個はクロラムフェニコール耐性、アンピシリン及びテトラサイクリン感受性であり、上記化合物を単独炭素源として利用することができなかった。単離株のうちの１個（ＳＲ−１１  ＣｒａｍｏｄＡＸ−２（ＡＸは対立遺伝子交換を意味する）と呼ぶ）をｐＢＲ３２２又はｐＪＨＡ８（ｐＪＨＡ８は野生型ｃｒａ遺伝子を含む）で形質転換し、両者株がグルコース、グリセロール、オレイン酸、酢酸、ピルビン酸、クエン酸、コハク酸及びフマル酸を単独炭素源として利用する能力を試験した。ＳＲ−１１  ＣｒａｍｏｄＡＸ−２（ｐＢＲ３２２）と異なり、ＳＲ−１１  ＣｒａｍｏｄＡＸ−２（ｐＪＨＡ８）は上記化合物を単独炭素源として利用することができ、ＳＲ−１１  ＣｒａｍｏｄＡＸ−２がｃｒａ突然変異体であることが示唆された。どちらの株も予想通り、グルコースとグリセロールを単独炭素源として利用することができた。
【００５４】
機能的ｃｒａ（ｆｒｕＲ）遺伝子がＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  ＳＲ−１１をビルレントにするか否かを調べるために、以下の実験を実施した。
【００５５】
ＢＡＬＢ／ｃマウス４頭にＳＲ−１１（２．１×１０８ｃｆｕ／頭）、５頭にＳＲ−１１  ＣｒａｍｏｄＡＸ−２（２．８×１０８ｃｆｕ／頭）を経口感染させた。感染後８日までに全４頭のＳＲ−１１感染マウスは死亡したが、ＳＲ−１１  ＣｒａｍｏｄＡＸ−２を感染させた全５頭は健康であった（表１）。ＳＲ−１１  ＣｒａｍｏｄＡＸ−２は、ｃｒａにＳＲ−１１  Ｃｒａｍｏｄと同一の突然変異が存在する以外はＳＲ−１１と同一であるので、ＬＴ−２株からの形質導入によるＳＲ−１１  Ｃｒａｍｏｄの構築中にそのビルレンス低下の原因となるようなｃｒａに無関係の異常が発生したとは考えられない。
【００５６】
ｃｒａ遺伝子にクロラムフェニコール耐性カセットを挿入した結果、下流遺伝子に極性作用を生じたので、ＳＲ−１１  Ｆａｄ−の弱毒は欠損ｃｒａ遺伝子に起因しないとも考えられる。そこで、ＳＲ−１１  Ｃｒａｍｏｄ（ｐＪＨＡ８）がビルレンスを回復したか否かを調べるために、野生型ｃｒａ遺伝子のみを含むｐＪＨＡ８でＳＲ−１１  Ｃｒａｍｏｄを相補した。対照として、ｐＪＨＡ８の構築に使用したベクターであるｐＢＲ３２２でＳＲ−１１  Ｃｒａｍｏｄを相補した。ＢＡＬＢ／ｃマウス４頭にＳＲ−１１  Ｃｒａｍｏｄ（ｐＢＲ３２２）３．１×１０８ｃｆｕ／頭、４頭にＳＲ−１１  Ｆａｄ−（ｐＪＨＡ８）４．３×１０８ｃｆｕ／頭を経口感染させた。感染後９日までに、ＳＲ−１１  Ｃｒａｍｏｄ（ｐＪＨＡ８）を感染させた４頭のうち３頭が死亡したが、ＳＲ−１１  Ｃｒａｍｏｄ（ｐＢＲ３２２）を感染させた４頭は健康であった（表１）。死亡した全マウスの肝臓と脾臓は臓器当たり１０８ｃｆｕを上回るＳＲ−１１  Ｆａｄ−（ｐＪＨＡ８）を含んでいた。この結果、クロラムフェニコールカセットによるｃｒａ遺伝子の不活化が非病原性を誘導する下流作用を生じるという可能性はなくなり、ＳＲ−１１ビルレンスには機能的ｃｒａ遺伝子が必要であることが明らかである。
【００５７】
【表１】
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【００５８】
種々の細菌属におけるｃｒａ遺伝子の検出
４種のＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ株と、Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ、Ｓ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ、Ｓ．ｄｕｂｌｉｎ及びＳ．ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ株各１種について、サザンハイブリダイゼーションによりｃｒａ遺伝子を試験した。いずれの場合もＳＲ−１１と同一寸法の４．３ｋｂ  ＰｓｔＩ  ＤＮＡフラグメントにｃｒａ遺伝子が存在していた。６種の異なる病原性大腸菌株を試験した処、全株にｃｒａ遺伝子が検出されたが、６種の株で３種の異なる寸法のＰｓｔＩフラグメントに存在していた。更に、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａｅ株と、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ及びＹｅｒｓｉｎｉａ細菌属株も試験した処、全株にｃｒａ遺伝子が検出された。
【００５９】
上記細菌におけるｃｒａ遺伝子の存在は次のように検出した。これらの株のゲノムＤＮＡをＰｓｔＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ）２０単位で３７℃で一晩消化した。ゲル電気泳動（０．７％アガロース、１×ＴＡＥ）を使用して各種寸法のＰｓｔＩＤＮＡフラグメントを分離した。分離したＤＮＡをＳ＆Ｓ  Ｔｕｒｂｏｂｌｏｔｔｅｒシステム（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｅｌｌ）によりアルカリ条件下で３時間かけて正荷電ナイロンにトランスファーした。膜を３０分間９０℃で焼付け、ＤＮＡを膜に結合した。次に、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍのｃｒａ遺伝子の７００塩基対フラグメントをＤＩＧ標識し、膜をプローブするために使用した。５×ＳＳＣ、０．１％Ｎ−ラウロイルサルコシン、０．０２％ＳＤＳ、１．５％ブロッキング剤を含むハイブリダイゼーション緩衝液（ＣＳＰＤによるＤＩＧ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｔａｒｔｅｒ  Ｋｉｔ  ＩＩ，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）中６２℃で２〜４時間（回転びんハイブリダイゼーションオーブンで）膜をプレハイブリダイズした。標識プローブを変性させ、新鮮なハイブリダイゼーション緩衝液に加え、ブロットを６２℃で１６〜２０時間インキュベートした。ブロットを６２〜６５℃で５分間２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで２回洗浄した。次に、ブロットを６０℃で１５分間０．１％ＳＤＳ、０．５×ＳＳＣで２回洗浄した。推奨条件を次のように変更してブロットを展開した。ブロッキング溶液では２％ブロッキング剤を使用し（通常は１％使用）、ブロットを１時間ブロックし（通常ブロッキング時間は３０分間）、ＤＩＧ標識プローブの検出に低濃度抗体を使用した（通常は７０％濃度を使用）。これらの変更は低バックグラウンドシグナルについて製造業者により推奨されている。
【００６０】
実施例２
Ｃｒａ−Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ株ＳＲ１１  Ｃｒａｍｏｄによるニワトリのワクチン接種
ワクチン接種効果。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ株の増殖条件は実施例１に記載したと同様に行った。第１の実験ではブロイラー２０羽２群（３日齢）にＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔ．ＳＲ１１  Ｃｒａｍｏｄ６×１０７ＣＦＵをＰＢＳに加えて経口接種した。一方の群は１１日後に同一株８．３×１０７ＣＦＵをブースター投与した。１８日後に、両群をビルレント野生型株細菌１．９×１０９個で皮下、筋肉内及び経口攻撃した。結果を表２に示す。
【００６１】
【表２】
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【００６２】
併用ワクチン接種安全性及び効果実験。第２の実験では、ワクチンの効果とワクチンの安全性の両方を調べた。ワクチンの安全性は成長抑制に基づいて測定した。ブロイラー１５羽１群にＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔ．ＳＲ１１  Ｃｒａｍｏｄ２．７×１０８ＣＦＵを培地に加えて経口接種した。ブロイラー１５羽の別の群には同一株１．３×１０８ＣＦＵをＰＢＳ中に加えて経口接種した。１８日後に両群をビルレント野生型株細菌６．５×１０８個で皮下、筋肉内及び経口攻撃した。結果を表３に示す。
【００６３】
【表３】
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【００６４】
結果：２つの試験から明らかなように、高用量で攻撃したにも拘わらず、Ｃｒａ−Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ株では非常に高レベルの防御が得られる。更に、ワクチン接種の結果として有意成長抑制は認められない。従って、Ｃｒａ−Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ株は野生型細菌感染に対する家禽の防御用弱毒生ワクチンで使用するのに非常に適切であると結論することができる。
【００６５】
実施例３
序論
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ  Ｃｒａ−ノックアウト（ＫＯ）株３４６８２及び３５２７６の安全性をｃｒａ＋親株３４６８２及び３５２７６と比較検討するために、ブタ攻撃試験を実施した。これらのノックアウト突然変異株はＣｒａｍｏｄＡＸ−２の構築について上述したと同一のプラスミド及び方法を使用して作製した。
【００６６】
１．ブタ安全性試験
Ａ．動物及び飼育
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ病歴のない養豚場からＳａｌｍｏｎｅｌｌａワクチンを接種したことのない５〜６週齢ブタ２０頭を購入した。ブタを５頭ずつ４群に分けた。全試験を通してブタは４個の隔離室で飼育した。
【００６７】
Ｂ．攻撃
各群５頭に５〜６週齢で攻撃した。ブタを鼻腔内（０．５ｍｌ／鼻孔）及び経口（１．０ｍｌ培養物＋４．０ｍｌ細菌希釈剤）攻撃した。攻撃培養物は約９．０×１０８ＣＦＵ／ｍｌとした。攻撃後にブタの体重減少、下痢及び直腸体温上昇等のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ感染の典型的臨床徴候を毎日観察した。
【００６８】
Ｃ．屠殺
攻撃から７日後にブタを安楽死させた。ブタを解剖し、肺、肝臓、脾臓、腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）及び回腸を培養し、Ｓ．ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓを増殖させた。
【００６９】
Ｄ．体重増加
初期体重を最終体重から引き、攻撃から屠殺までの日数で割ることにより、１日平均増加（ＡＤＧ）を計算した。群ＡＤＧは個体ブタＡＤＧの平均である。
【００７０】
２．マウス安全性試験
ｃｒａ＋親株３４６８２及び３５２７６とｃｒａ−ノックアウト（ＫＯ）株３４６８２及び３５２７６の各Ｓ．ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ株のＬＤ５０を調べるためにマウス試験を実施した。
【００７１】
Ａ．動物
体重１６〜２０ｇのＣＦ−１  Ｓａｓｃｏマウス２００頭を１０頭ずつ２０群に分け、マウス安全性試験を行った。全試験を通してマウスは同一室内で別タブに入れて飼育した。
【００７２】
Ｂ．攻撃
各群１０頭からなる５サブ群に各株を投与した。５種の異なる希釈率の株（１０−３〜１０−７）を使用してこれらのサブ群を０．２５ｍｌで腹腔内（ＩＰ）攻撃した。４種の株の各々の凍結種子を１０−３〜１０−７に希釈した。これらの希釈液の各々をマウス１０頭に腹腔内（０．２５ｍｌ）注射した。
【００７３】
結果
Ｉ．ブタ安全性試験
Ａ．体重増加
ブタの体重増加を図１に示す。これらのデータはＫＯ株で攻撃したブタと親株で攻撃したブタの間の差を明白に示している。データは更に、動物の総合健康差も示している。親株で攻撃した両群のブタは攻撃時から屠殺まで体重が減少したが、ＫＯ株で攻撃したブタは約０．７５ｋｇ／日増加した。
【００７４】
ＩＩ．マウス安全性試験
Ａ．死亡
マウス試験の結果を下表４に示す。右欄は各株のＬＤ５０をＣＦＵで示す。ノックアウト株は明白に高弱毒レベルを示す。
【００７５】
【表４】
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【００７６】
結論
ブタ安全性試験から明らかなように、Ｃｒａノックアウト（ＫＯ）株は親株に比較して攻撃後に有意に高い体重増加を生じる。これはＣｒａ  ＫＯ突然変異株の弱毒性を裏付けている。ブタ安全性試験に加え、マウス安全性試験もＣｒａ  ＫＯ株が弱毒株であることを示しており、ＫＯ突然変異株のＬＤ５０は親株よりも著しく高い。
【００７７】
実施例４
序論
本実施例の目的は、ＫＯ−３４６８２  Ｃｒａ突然変異株の安全性を親株と比較評価し、ヘテロビルレントＳａｌｍｏｎｅｌｌａ株３５２７６攻撃に対するＳａｌｍｏｎｅｌｌａ株ＫＯ−３４６８２の効果を調べることであった。更に、ＫＯ−３４６８２  Ｃｒａ突然変異株の効果を非ワクチン接種対照と比較した。
【００７８】
動物及び飼育
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ病歴のない養豚場からＳａｌｍｏｎｅｌｌａワクチンを接種したことのない３週齢ブタ２０頭を購入した。ブタを５頭ずつ４群に分け、４個の別々の隔離室で飼育した。
【００７９】
ワクチン及びワクチン接種
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ株ＫＯ−３４６８２、３４６８２親約１×１０９ＣＦＵ／ｍｌを３週齢のブタに経口接種するか、又は接種せずにおいた。
【００８０】
攻撃
ワクチン接種から２１日後にビルレントＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ株３５２７６でブタを鼻腔内（０．５ｍｌ／鼻孔）及び経口（１．０ｍｌ培養物＋４．０ｍｌ細菌希釈剤）攻撃した。３５２７６攻撃株は攻撃前にナリジクス酸（Ｎａｌ）耐性にし、Ｎａｌを加えたプレートを使用すると、攻撃株をワクチン株から区別できるようにした。攻撃後、ブタの体重減少、下痢及び直腸体温上昇等のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ感染の典型的臨床徴候を毎日観察した。糞便を毎日培養することにより、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ排出期間を調べた。
【００８１】
攻撃から９日後にブタを安楽死させた。ブタを解剖し、ナリジクス酸８０μｇ／ｍｌを加えたＨｅｋｔｏｅｎ  ｅｎｔｅｒｉｃ（ＨＥ）寒天プレートで肺、肝臓、脾臓、腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）及び回腸を培養し、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓを増殖させた。
【００８２】
下痢得点
攻撃後に下痢を生じた日毎に各ブタに１点を与えることにより下痢得点を計算した。試験終了時に、試験中の得点の合計を攻撃から屠殺までの日数で割った。この数に１００を掛けて下痢日数の百分率とした。
【００８３】
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ排出
ブタの糞便を毎日採取し、ワクチン接種後と攻撃後のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ排出期間を調べた。マイナス結果の２日後に糞便採取を停止した。糞便はＨＥプレート上で滴定単離した。試料の各希釈後に観察される増殖に相関して得点を与えた。得点は次のように割り当てた。
【００８４】
１０−１          １点
１０−２          ２点
１０−３          ３点
１０−４          ４点
１０−５          ５点
【００８５】
体重増加
初期体重を最終体重から引き、攻撃から屠殺までの日数で割ることにより、１日平均増加（ＡＤＧ）を計算した。群ＡＤＧは個体ブタＡＤＧの平均である。
【００８６】
結果：
ワクチン接種後死亡
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ野生型親株３４６８２をワクチン接種したブタ２頭はワクチン接種後に死亡した。この群の残りの３頭は試験終了時まで生存した。
【００８７】
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ単離／剖検得点
図２は各種臓器のＳ．ｃ．単離結果を示す。全臓器でＫＯワクチンを接種したブタ群は親及び非ワクチン接種群と対照的にどの臓器からも単離されなかった。非ワクチン接種群は全５頭から回腸とＭＬＮでＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓが単離されたが、親株ではこれらのどちらの臓器でも単離されなかった。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓが単離された各臓器に１点を割り当てることにより、各群の単離得点を計算した。その結果、ＫＯワクチンを接種したブタは親株を接種したブタよりも得点が低く、非ワクチン接種群より有意に低かった。
【００８８】
下痢得点
１日平均下痢得点を図３に示す。同図は、他の３群に比較してＫＯ得点の有意差を示している。ＫＯ群は明白に最低得点を示した。
【００８９】
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ排出
ワクチン接種後及び攻撃後のブタのＳａｌｍｏｎｅｌｌａ排出を図４及び５に示す。ワクチン接種後のグラフによると親の排出レベルが最高である。攻撃後のグラフでは、非ワクチン接種群が最も長期間にわたってＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓを排出し、最高得点を示した。
【００９０】
体重増加
ブタの体重増加を図６に示す。これらのデータは各群間の差を明白に示している。動物間の総合健康差も示している。非ワクチン接種群は平均０．１５ｋｇ／日減少したが、ＫＯ群は平均０．６ｋｇ／日増加した。
【００９１】
考察
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓノックアウト株３４６８２は効果的で安全なワクチン株であることが判明した。剖検時のＳａｌｍｏｎｅｌｌａの単離はノックアウト株では完全に陰性であった。非ワクチン接種群は再単離が最高であった。攻撃後の１日平均体重増加については、ノックアウト株は体重増加が最高であり、非ワクチン接種群は体重増加が有意に低かった。
【００９２】
結論
ＫＯ−３４６８２Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ生ワクチン株は安全且つ有効である。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＵＳポンドで表した攻撃後ブタ１頭１日当たりの１日平均体重増加。この体重に０．４５３６を掛けると、ｋｇで表した体重が得られる。
【図２】Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓを各種組織から再単離することができたブタの百分率（ＭＬＮ＝腸間膜リンパ節）。
【図３】攻撃後下痢得点の平均百分率。
【図４】ワクチン接種後の１日平均Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ排出。
【図５】攻撃後の１日平均細菌排出
【図６】ＵＳポンドで表した攻撃後のブタ１頭１日当たりの１日平均体重増加。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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