(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
非ヒト温血脊椎動物の肝臓基底膜を含み、前記肝臓基底膜が供給源肝臓組織の内因性細胞を実質的に含まない移植片組成物。
【請求項２】
非ヒト温血脊椎動物の肝臓基底膜から調製される組成物であって、温血脊椎動物に移植されたときに内因性組織の増殖を誘発するための非免疫原性組織移植片として有益であり、かつ供給源肝臓組織の内因性細胞を実質的に持たない肝臓基底膜から本質的に成る細胞外基質を含んで成る移植片組成物。
【請求項３】
損傷または病変組織の修復に利用するための非免疫原性組織移植片組成物を調製するための肝臓基底膜の利用。
【請求項４】
前記肝臓基底膜が流動状である請求項３記載の利用。
【請求項５】
前記肝臓基底膜が乾燥していて粉体状である請求項３記載の利用。
【請求項６】
温血脊椎動物における内因性組織の増殖が必要な部位で内因性組織の形成を誘発するための移植片組成物を製造するための、非ヒト温血脊椎動物の肝臓基底膜の利用であって、前記肝臓基底膜が供給源肝臓組織の内因性細胞を実質的に持たないことを特徴とする、利用。
【請求項７】
前記肝臓基底膜が流動化されている請求項６記載の利用。
【請求項８】
前記肝臓基底膜が乾燥していて粉末状である請求項６の利用。
【請求項９】
非ヒト温血脊椎動物の肝臓組織から移植片組成物を調製する方法であって、細胞外基質を実質的に崩壊させることなく細胞外基質から前記肝臓組織の細胞を解離させるのに十分な時間細胞解離溶液で前記肝臓組織を処理する段階と、前記細胞を前記細胞外基質から分離する段階と、前記細胞外基質を移植片組成物において使用する段階、とを含む方法。
【請求項１０】
前記細胞解離溶液がカオトロピック剤を含む請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞解離溶液がプロテアーゼを含む請求項９記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞解離溶液がEDTAおよびトリプシンを含む請求項９記載の方法。
【請求項１３】
前記肝臓組織が前記細胞解離溶液で処理される前にシート状またはストリップ状にスライスされる請求項９記載の方法。
【請求項１４】
前記肝臓組織が500μまでの厚さを有するシート状またはストリップ状にスライスされる請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
非ヒト温血脊椎動物の単離された肝臓基底膜を含む細胞外基質組成物であって、細胞集団の増殖を支持するための組成物であり、供給源肝臓組織の内因性細胞を実質的に持たない前記肝臓基底膜を含み、前記細胞集団の増殖をインビトロで支持するための添加栄養素を含む組成物。
【請求項１６】
非ヒト温血脊椎動物の肝臓基底膜由来組成物であって、前期組成物は、細胞集団の増殖を支持するための組成物であり、供給源肝臓組織の内因性細胞を実質的に持たない肝臓基底膜を含む細胞外基質で被覆された培養用器具を含む組成物。
【発明の詳細な説明】
本発明は国立衛生研究所より授与された助成金#HD-31425を受け米国政府の支援の下に行われた。米国政府は本発明に一定の権利を保有する。
発明の分野
本発明は組織移植片組成物、その調製方法および利用に関する。より詳細には、本発明は肝臓基底膜からなる非免疫原性組織移植片組成物、およびインビボ(in vivo)でそれを利用して内因性組織の増殖を促進すること、および、インビトロ(in Vitro)でそれを利用して培養真核細胞の増殖と分化を支援することを指向する。
発明の背景および要約
多くの研究努力が組織移植片としての利用に不可欠な特性を有する天然および合成材料の発見に向けられてきた。温血脊椎動物の肝臓組織から肝臓組織の細胞要素を除去して作成した基底膜(支質)が、米国特許第4,902,508号、第5,281,422号および第5,275,826号に報告された腸管粘膜下組織と同様の一定の機械的およびビオトロピック特性を示すことが予期することなく発見された。この基底膜は従来報告された腸管粘膜下組織の用途の全てではないにしても、その殆どを代替することができ、その用途には創傷治癒の向上、内因性組織の増殖促進、細胞増殖の刺激および細胞分化の誘発が含まれる。
肝臓基底膜は粘膜下細胞外基質と異質の細胞外基質である。肝臓基底膜は重塁する粘膜を支持せず、かつ粘膜下細胞外基質に備わっている積層組織構造を欠失する。肝臓は体内での種々の調節プロセスに中心的な役割を果たし、これらの役割にはグルコース代謝、インスリン制御、粘膜-骨格系および中枢神経系の同化に関するプロセス、日毎の恒常性に必須なタンパク質の循環を適切なレベルに維持することが含まれる。
本発明の一実施態様において、肝臓基底膜は損傷または病変組織の修復に用いられる非免疫原性組織移植片組成物の調製に利用される。本発明の組織移植片組成物は温血脊椎動物の器官組織、たとえば肝臓組織、の基底膜からなり、その温血脊椎動物の細胞の全て(たとえば、肝細胞および胆管細胞)を実質的に包含しない、好ましくはそれを欠失している。本発明の組織移植片組成物は脊椎動物ホストに埋込または流動化させて注入され、損傷または欠陥組織と接触してかかる組織の修復または代替を誘発することができる。本発明の組成物は流動状または固体状の創傷包帯要素(軟膏または包帯)として、創傷の治癒を促進させる局所的な適用にも用いられる。別の選択肢として、肝臓組織誘導細胞外基質はインビトロで真核細胞を増殖させる細胞増殖基質として用いられる。
発明の詳細な説明
本発明の組織移植片組成物は肝臓基底膜からなり、温血脊椎動物肝臓組織の自生の共生細胞要素から基底膜を分離して作成する。以下に説明する作成技術は、本質的にいかなる細胞要素も実質的に含まない肝臓基底膜からなる、細胞外基質組成物を提供する。本明細書では、これらの組成物を一般的に肝臓基底膜(LBM)と呼ぶ。本発明による利用のための基底膜に関するその他の器官組織供給源には、脾臓、リンパ節、唾液腺、前立腺、膵臓およびその他の分泌腺が含まれる。
本発明の移植片組成物に使用する基底膜は、代表的にたとえば、ブタ、ウシ、ヒツジまたはその他の温血脊椎動物を含む食肉生産用に飼育された動物から採取した肝臓組織から作成される。したがって、本発明になる組織移植片組成物の調製に使用する肝臓組織の供給源は安価な市場である。一実施態様によると、肝臓基底膜からなる組成物は温血脊椎動物の肝臓組織から調製される。この組成物は温血脊椎動物に移植されたとき、内因性組織の増殖を誘発することができる非免疫原組織移植片として有用である。一実施態様では、組成物は、本質的に、組成物の調製に使用された元の脊椎動物の肝臓組織と共生する内因性細胞を欠失する肝臓基底膜からなる細胞外基質を含む。
本発明による基底膜の温血脊椎動物の肝臓組織からの作成は肝臓組織から細胞要素を除去することによって行われる。理想的には、プロセスは基底膜組織に損傷を与えずに、または少なくとも損傷または崩壊を最小にして、基底膜から細胞を分離することによって行われる。肝臓の細胞外基質から細胞要素を取り除くことで、非免疫原性の移植片組成物の調製が可能になり、移植片組成物がホストに移植されたときにホストの免疫反応は誘発されない。一般的に、温血脊椎動物の肝臓組織から組織移植片組成物を調製する方法は、肝臓組織の細胞要素を細胞外要素から細胞外要素を著しく崩壊させないで解離するのに十分な時間、肝臓組織を細胞解離液で処理するステップと、その細胞外要素から細胞要素を分離するステップとからなる。代表的な解離溶液はカオトロピック剤または酵素またはその両方を含む。
本発明の一実施態様によるLBM作成の第一のステップは肝臓組織の体節を切片(たとえば、ストリップまたはシート)に薄切りにし、肝臓組織の表面積-体積比を増加させることである。一実施態様では、肝臓組織をそれぞれの厚さが約50-500ミクロン、より好ましくは約250-300ミクロンの一連のシートにスライスする。採取した生鮮な肝臓組織は標準の肉スライサーを用いてスライスされる。または組織を凍結して低温ミクロトンでスライスすることができる。次いで、肝臓組織の薄片は肝臓細胞要素を共生する細胞外基底膜基質から解離させる溶液で処理される。
一実施態様によると、肝臓組織は酵素、たとえばトリプシンまたはペプシン等のプロテアーゼを含む溶液で処理される。肝臓基底膜のコラーゲン質構造のため、また細胞解離時における基底膜構造の劣化を最小にすることが望ましいため、コラーゲン特異的酵素の活性は細胞解離段階で使用される酵素溶液で最小でなければならない。さらに、肝臓組織は標準的にカルシウムキレート剤またはトリトン100(Triton100)等の穏和な洗剤等のカオトロピック剤でも処理される。したがって、本発明による一実施態様では、肝臓組織は組織の薄片またはストリップを酵素およびカオトロピック剤を含む細胞解離溶液中で懸濁させて処理される。しかしながら、細胞解離の段階は組織の酵素処理を行わずに、カルシウムキレート剤またはカオトロピック剤を用いて行うこともできる。
好ましい実施態様では、細胞解離の段階は肝臓組織薄片を約0.05-2重量%、より標準的には約0.1-1重量%のプロテアーゼを含む攪拌溶液中に懸濁させて行われ、懸濁溶液は、随意に、膜基質を著しく劣化させずに基底膜から細胞の解離および分離を最適にする有効量のカオトロピック剤またはカルシウムキレート剤を含む。
細胞が基質から解離するのに十分な時間、肝臓組織を細胞解離溶液に接触させた後、得られた肝臓基底膜を1回以上生理食塩水ですすぎ、以下に説明するように、使用時まで随意に凍結水和状態または部分的な水和状態で保存する。細胞解離段階は、実質的に全ての細胞を基底膜から除去するために、数回の細胞解離溶液での処理を必要とすることもある。一実施態様では、肝臓組織は細胞要素を除去するためにプロテアーゼ溶液で処理され、得られた細胞外基質材(基底膜)は残留する酵素活性を除去または抑止するためにさらに処理される。たとえば、得られた基底膜を加熱または1種類以上のプロテアーゼ阻害剤で処理される。
本発明による肝臓基底膜は流動化腸管粘膜下組織の作成と同様の方法で流動化する(注入可能な状態または粉体状に変換する)ことができる。流動化腸管粘膜下組織は米国特許第5,275,826号に記述されていて、その開示は参照によって明示的に本明細書の記載の一部とする。肝臓基底膜(供給源肝臓組織から細胞を欠いた)は引き裂き、切断、研削、剪断等によって細断される。肝臓基底膜の懸濁液を高速(高剪断)ミキサーで処理して脱水し、必要であれば遠心分離して過剰水をデカントすることによっても良好な結果が得られるが、肝臓基底膜を凍結または凍結乾燥状態で研削することが好ましい。さらに、細断された流動化組織をプロテアーゼ(たとえばコラーゲナーゼおよびグリカナーゼ等のほかの適切な酵素または基質構造要素を崩壊させるほかの酵素)で、流動化組織が可溶化し、実質的に均一な溶液を生成するのに十分な時間、酵素的に消化させて可溶化させることができる。
本発明では肝臓基底膜の粉体形態の利用も考慮する。一実施態様では、肝臓基底膜の粉体形態は肝臓基底膜粘膜化組織を液体窒素の下で粉砕して0.1-1mmの寸法の粒子を生成させることによって作成される。次いで、微粒組成物を一晩減圧下で凍結乾燥し、滅菌して実質的に無水の粒状組成物の固体を生成させる。別法として、粉体形態の肝臓基底膜は、粉砕した肝臓基底膜の溶液または懸濁液を乾燥させることによって、流動化肝臓基底膜から作成することもできる。脱水形態のものは再度水和して、細胞増殖の支持能力を明らかに失うことなく、以下に説明するように細胞培養基質として用いられる。
本発明の単離肝臓基底膜の要素を確認するために、膜を抽出して分離留分をウェスタンブロット法で分析した。LBMは、例4に説明するように、グァニジン塩酸または尿素で抽出され、種々の特異的増殖因子に定方向抗体を用いるウェスタンブロット法によって、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)、肝細胞増殖因子(HGF)および表皮増殖因子(EGF)の存在が確認された。
この肝臓基底膜組成物は、グルタルアルデヒド、ホルムアルデヒドによるなめし、酸性pHによるなめし、酸化エチレン処理、酸化プロピレン処理、ガスプラズマ滅菌、ガンマ線照射および過酢酸殺菌等の通常の滅菌方法を用いて殺菌することもできる。滅菌方法は材料の機械的強度およびビオトロピック特性を著しく弱めない方法が好んで用いられる。たとえば、強力なガンマ線照射は移植材料の強度を損じると思われる。好ましい滅菌方法には、移植片を過酢酸に曝すこと、低線量でのガンマ線照射、ガスプラズマ殺菌が含まれ、過酢酸滅菌は最も好ましい方法である。特にLBMの消毒および滅菌には、過酢酸または1メガラドのガンマ線照射のいずれかが組織の材料特性または生物特性に悪影響を与えることなく用いられてきた。過酢酸による処理はエタノール水溶液(エタノール2-10容積%)中、pH約2-5、過酸濃度約0.03-0.5容積%で行われる。標準的には、移植片組成物を殺菌した後で多孔性のプラスチックラップでくるみ、電子ビームまたはガンマ線照射滅菌方法を用いて再度滅菌する。
一実施態様によると、肝臓基底膜は本発明の組織移植片組成物として利用または調製のために用いられる。かかる組織移植片組成物は、たとえば結合組織の修復等、損傷組織の代替または修復に関連した広範囲の外科的用途に用いられる。本発明の目的とする結合組織には、骨、軟骨、筋肉、腱、靱帯、皮膚層を含む繊維組織が含まれる。
本発明によると、この組織移植片組成物は温血脊椎動物の所望部位における内因性組織の生成の誘発に好適に利用される。本質的に肝臓基底膜からなる細胞外基質を含む組成物は、損傷または病変組織が存在するためにホストに必要な部位で内因性組織の増殖を誘発するのに効果的な量が、脊椎動物ホストに施される。本発明の肝臓組織由来組織移植片組成物は外科的体内埋込による固体状または注入による流動状のいずれかの形態でホストに施される。
肝臓基底膜の体節は本発明によって、米国特許第5,281,422号および第5,352,463号における腸管粘膜下組織の利用に関する記述と同じ操作を用いて、結合組織の代替または修復を目的とする組織移植片構成物として利用することができる。これら上述の米国特許は両方とも参照によって本明細書の一部とする。
本発明によって成形および利用される組織移植片組成物は、体内に埋め込まれると、生物学的再造形を受ける。組成物は急速に血管生成基質として作用し、新しい内因性結合組織の増殖を支持する。組織移植材料として利用される場合、肝臓基底膜は埋め込まれた環境において移植材料が接着するホスト組織、さもなくば共生するホスト組織の栄養であると期待される。
肝臓基底膜移植片組成物は種々の形状および構成に成形することができ、たとえば軟骨または腱の代替体または破損または痛んだ靱帯または腱のパッチとして役立つ。好ましくは、体節は層または多層配置に生成または成形され、少なくとも対抗端および/または対抗平行部が移植材料の多層を有するように成形されていて、骨、腱、軟骨、靱帯、筋肉等の生理的構造体への接着を補強する。靱帯代替用途では、両端を通常の外科技術を用いてそれぞれ第1および第2二の骨に接着させて、骨は膝関節の場合のように接合する。
肝臓基底膜移植片組成物の終端部は、たとえば、結合点で移植片がちぎれる可能性を減らすような方法で、骨構造体に結合するように生成、細工または成形することができる。好ましくは、材料は折り畳むことができ、噛み合うための多層、たとえばスパイク付き座金またはステープルを具備する。
別の選択肢として、肝臓基底膜移植片組成物は背中合わせに折り畳まれて両端が結合して、たとえば、第1の骨に結合するための第1結合部を与え、かつ中間部で曲げられて第1の骨に関して関節をなす第2の骨に結合するための第2結合部を具備させることもできる。たとえば、一方の端を、たとえば大腿骨のトンネルを介して引っ張れるように適合させて結合し、他端を脛骨のトンネルを介して引っ張れるように適合させて結合して自生の十字靱帯の代替を提供することもでき、体節をトンネルの間で伸張下に置いて靱帯機能、すなわち正常な靱帯によって得られる伸張と位置決定機能を付与することもできる。
本発明の肝臓基底膜はウサギ、イヌに埋め込まれ、アキレス腱代替移植構造体として用いた。ウサギ2羽とイヌ2匹それぞれに、米国特許第4,902,508号に記述された腸管粘膜下組織に使用された操作と同じ手順で、アキレス腱代替LBM移植構造体を埋め込んだ。この実験はLBM移植構造体がアキレス腱の再生を支持することを実証した。
肝臓基底膜の作成において、組織は切片/薄片に切断またはスライスされる。細胞解離段階の後に、肝臓基底膜の個々の小片を相互に重ね合わせ、縫合、架橋剤、接着剤またはペースト等の当業者にとって公知な標準的技術を用いて結合させる。別の選択肢として、一実施態様では粘膜下組織の重なった層に脱水条件下で重なり部に圧力を加えて互いに融合させる。用語「脱水条件」は、粘膜下組織から水分除去を誘発または促進するいかなる機械的条件または環境条件を含むものと規定する。圧縮粘膜下組織の脱水を促進するために、圧縮される組織の2表面の少なくとも1面は水透過性である。組織の脱水はブロッティング剤の添加、組織の加熱または圧縮外表面に空気を吹き付けることによって、随意的に増強される。こうして、多層肝臓基底膜構造体により強度が増強した組織移植片組成物を調製することが可能になる。
さらに、肝臓基底膜の一片の一部とすくなくとも別の基底膜の一片の部分を重ね合わせ、かつ重なり部を相互に結合させることで、面積の大きな肝臓基底膜を作成することができる。一実施態様では、面積の大きい組織のシートを作製する際に、重なった組織体節を二つの面の間で圧縮して、脱水条件下で重なった部分に圧力を加える。二つの面は種々の材料から、所望する形状および目的の移植構造体の仕様に合わせて、いかなる形状にも成形することができる。代表的な二つの表面は平面状に形成されるが、スクリーン、対抗する円筒形状またはローラー状、相補的な非平坦面等の形状も含まれる。これらの表面はそれぞれ随意に加熱または目打ちすることができる。好ましい実施態様では、二つの面の少なくとも一つは水透過性である。本明細書で使用される用語「水透過性面」は水分吸収性、ミクロポアまたはマクロポア面を含む。マクロポア材料には、プラスチック、金属、セラミックまたは木製の多孔板が含まれる。
肝臓基底膜は一実施態様により、細胞を解離した肝臓基底膜のストリップの重なった部分を第1の面上に置き、第2の面を露出した膜表面の頂部に置くことによって圧縮される。次いで、力を二つの面が互いに偏向するように加えて膜組成物を二つの面の間で圧縮する。偏向する力は当業者にとって公知な方法、たとえば、装置を一対のピンチローラ(ローラの2面間の間隔は元の2表面間の間隔より短い)を通過させる、頂部プレートに荷重をかける、油圧プレスを利用する、二つの面に大気圧をかける、等いずれかの方法によって発生させることができる。
好ましい一実施態様では、多層肝臓基底膜移植材料は接着剤または化学的前処理を使用しないで、粘膜下組織の少なくとも重なった部分を、材料の脱水と組織の圧縮とを併発させる脱水条件下で、圧縮することによって作成される。圧縮材料の脱水を促進するために、組織を圧縮する二つの面のうち、少なくとも一つの面は水透過性である。脱水はブロッティング剤の添加、材料の加熱、二つの圧縮面の外側に空気を吹き付けることによって随意的に増強される。圧縮された多層肝臓基底膜材料は一体性のコンプライアンスな大表面移植構造体として二つの面から取り出される。構造体はさらに細工されて(切断、折り畳み、縫合等)、肝臓基底膜材料が必要な種々の医療用途に適合させることができる。
圧縮操作中に、肝臓基底膜に真空を随意的に適用することができる。真空をかけることは組織の脱水を強化し、組織の圧縮に役立つ。別の選択肢として、真空をかけることによって、肝臓基底膜の多層重なり部を圧縮するための唯一の圧縮力が得られる。たとえば一実施態様では、重なり合った肝臓基底膜を、好ましくは一つの面が水透過性である二つの面の間に載せる。装置をブロッティング剤で被覆して水を吸い取り、通気ブランケットが空気を流通させる。次いで、装置を真空室に入れ、真空をかける。適用する真空は通常、35.6-177.8cmHg(0.49-2.46Kg/cm2)の範囲で、適用されるより好ましい真空はほぼ129.5cmHg(1.76Kg/cm2)である。随意的に真空室の頂部を熱ブランケットで覆い、圧縮中に肝臓基底膜を加熱する。この実施態様の使用に適切な真空室は当業者に公知なもので、真空口を装着した全ての装置が含まれる。得られる大気圧の低下で二つの面に共に作用して組織が圧縮され、同時に圧縮された組織が脱水される。
本発明の別の実施態様では、肝臓基底膜はインビトロで培養された真核細胞の組織分化の増殖および誘発を支持するための方法および組成で利用される。一般的に、この方法は真核細胞がインビトロで肝臓基底膜組成物と真核細胞の増殖に伝導性である条件下で接触する段階を含む。本明細書で細胞培養に関連して使われる用語「接触」は肝臓基底膜と培養細胞、たとえば流体連通における、直接接触および間接接触の両方を含むと解釈する。本明細書で使われる用語「真核細胞の増殖に伝導性である条件」は現在入手可能な培養操作の下で、真核細胞の増殖に最適と考えられる滅菌方法、温度および栄養素供給等の環境条件を意味する。真核細胞の培養に使用される最適培養条件は幾分特定な細胞の種類に左右されるが、細胞の増殖条件は一般的に公知な技術である。しかしながら、幾つかの分化した細胞は未だに培養することが難しい(たとえば、ランゲルハンス島、肝細胞、軟骨細胞、骨芽細胞等)。
出願人は本発明になる肝臓基底膜を含む組成物がインビボでの真核細胞の増殖または増殖を支持することを発見した。一実施態様によると、細胞集団の増殖を支持する肝臓組織誘導組成物は温血脊椎動物の肝臓組織から調製される。組成物は供給源の内因性細胞を欠失する肝臓基底膜とインビトロでの細胞増殖を支持する添加された栄養素とから成る。さらに、肝臓基底膜の流動化形態が供給源の内因性細胞を欠失する肝臓基底膜で培養物を被覆するために用いられる。この様に、肝臓基底膜はシート状構造を含む種々の形状の細胞増殖基質として、ゲル基質、技術的に認められた細胞/組織培地の添加剤、細胞増殖の支持および増強に生理的に関連する基質を提供するための培養用器具の被覆として利用することができる。
肝臓基底膜はそのハチの巣状構造(この構造は細胞解離後も残る)のために、細胞接着のために大きな表面積を提供し、かつ細胞の分化も誘発する。走査型電子顕微鏡は単離された肝臓基底膜が極めて多孔性であることを示す。ラット胎児細胞を自生の三次元形状を保持する肝臓基底膜上で培養すると、ラット胎児細胞は肝臓細胞基質上で密集シートを生成し、LBM基質内に侵入することが走査型電子顕微鏡で明らかにされた。膜材料は、好ましくは、細胞培養に供する前に滅菌されるが、細胞培養形に抗体が含まれていれば、滅菌していない材料も使用することができる。
好ましい一実施態様では、細胞は真核細胞の増殖に伝導性である条件下で直接肝臓基底膜のシート上に幡種される。肝臓基底膜の極めて多孔性な特質が膜基質全般にわたり細胞栄養素の拡散を可能にする。この様にして、細胞を肝臓基底膜上または膜内部で培養することができる。
本発明のほかの実施態様では、細胞増殖基質は肝臓基底膜の流動化形態から作製される。流動化した組織をゲル化して固体または半固体基質を形成させる。本発明によって用いられる流動化した組織の粘度は組織組成物の濃度および水和の程度を調節することで細工することができる。粘度は25度で約2から約300,000cpsの範囲に調節される。高粘度調合体、たとえばゲルは、消化液から溶液のpHを約6.0-7.4に調節して調製することができる。真核細胞または原核細胞はこうして基質面上に直接幡種され、真核細胞の増殖に伝導性な条件下で培養される。
本発明の細胞増殖基質はミネラル、アミノ酸、糖、ペプチド、タンパク質を含む栄養素またはラミニンおよびフィブロネクチン等の細胞増殖を促進する糖タンパク質および表皮増殖因子、血小板由来増殖因子、トランスフォーミング増殖因子ベータまたは線維芽細胞増殖因子等の増殖因子と複合させることができる。一実施態様では、流動化または粉体状の肝臓基底膜が真核細胞標準培地を補足するために用いられ、インビトロで培養された細胞の増殖を誘発、維持する標準培地の能力を増強する。
本発明によって、温血脊椎動物の肝臓基底膜と複合した真核細胞集団のインビトロでの増殖を支持する細胞培養組成物が提供される。組成物は実質的に元の共生内因性細胞を含まない肝臓基底膜からなる。組成物はさらに、栄養素および培養細胞の最適増殖に必要な増殖因子を含む。肝臓基底膜細胞培養基質は市販の液体細胞培地と共に(両者とも血清ベースおよび血清を含まない)用いられる。増殖細胞は肝臓基底膜と直接的に接触するか肝臓基底膜と単なる流体連通であるかいずれかである。
本発明の肝臓基底膜組成物に用いる増殖因子組成物はランゲルハンス島、肝細胞および軟骨細胞等の分化細胞と同様に、未分化肝細胞の増殖を刺激するために用いられるはずである。さらに、上述の細胞増殖因子は分化細胞の増殖を支持し、一方でかかる細胞の分化状態を維持していると信じられる。種々の初代細胞株がインビトロでのLBM由来細胞培養基質上で増殖してきた。これらの細胞株には、十字靱帯由来の初代細胞株が含まれる。十字靱帯由来の初代細胞株はプラスチック上での増殖に比較してほぼ2倍の増殖率を示す。
肝臓基底膜はホスト細胞の増殖を誘発することができると思われ、インビボで種々の微環境(たとえば、腱、靱帯、骨、関節軟骨、動脈および静脈)に移植されて適切な組織構造体を再造成および再生する。本発明の一実施態様では、温血脊椎動物の肝臓基底膜からなる移植片組成物の組織代替能力は移植前に組織を種々の細胞種で播種することでさらに増強または拡大する。たとえば、細胞培養基質由来の肝臓基底膜を血管移植または皮膚代替として、それぞれの使用される内皮細胞またはケラチノサイトで幡種することもできる。その他に、肝臓基底膜は最初に細胞集団の拡大に、その後にホスト内への移植のために間葉細胞(肝細胞)で幡種することもできる。肝臓基底膜は、流動形態または自生の固体のどちらかの形態で、遺伝子修飾細胞を含む種々の細胞集団をホストの特定部位に導入するための送達伝達体としても作用する。随意的に、肝臓基底膜を真核細胞で幡種した後、移植片組成物のホストへの移植前に、移植片組成物を真核細胞の増殖に伝導性である条件下に置き、幡種細胞の集団をさらに拡大することもできる。
その他の実施態様では、肝臓基底膜および増殖細胞集団からなる組成物はホストに移植する生物適合性基質内にカプセル化される。カプセル化基質は栄養素をカプセル内の細胞に拡散させ、一方ではカプセル内細胞の生成物をカプセル化細胞からホスト細胞に拡散させる。生きた細胞をカプセル化する適切な生物適合性ポリマーは当業者には公知である。たとえば、ポリリシン/アルギン酸カプセル化プロセスはリン(F. Lim)およびサン(A. Sun)によって既に記述されている(Science Vol. 210 pp. 908-910)。この肝臓基底膜組成物そのものが人工器官として移植するための本発明による増殖細胞集団のカプセル化に好適に利用される。
例1. 肝臓基底膜の調製
実験に用いられる2mM EDTAカオトロピック溶液
140mM        NaCl
5mM          KCl
0.8mM        MgSO4
0.4mM        KH2HPO4
2mM          EDTA
25mM         NaHCO3
操作: 肝臓薄片の調製
零下70℃で凍結した肝臓を低温ミクロトンで約50μMの厚さにスライスする。次いで、肝臓組織の薄片を以下に示すように、カオトロピック溶液(サンプル1および2)、酵素単独(サンプル3および4)、カオトロピック溶液単独(サンプル5)で酵素(トリプシン)処理する。
試料#        処理
1)           2mM EDTA溶液中0.05%トリプシン
2)           2mM EDTA溶液中0.1%トリプシン
3)           2mM PBS溶液中0.05%トリプシン
4)           2mM PBS溶液中0.1%トリプシン
5)           2mM EDTA溶液
肝臓薄片をそれぞれ25mLの異なる酵素処理バッファー溶液を含む50mlチューブに入れる。肝臓薄片を水浴中37℃で、静かに振りながら1時間インキュベートする。肝臓薄片を室温で1時間、攪拌/振とうしてPBSで2回洗浄する。この酵素処理を3回繰り返す。
洗浄バッファー液を集め2000rpmで10分間、回転沈降させる。ペレットを懸濁させ、等量のトリパンブルーを加えて残存細胞を確認する。顕微鏡下で材料中の細胞の存在をチェックする。
例2. 単離した肝臓基底膜の機械的特性
移植材料の気孔率は圧力120mmHgで通過した水ml/cm2min-1で標準的に測定される。異なる2個のLBM資料片につき確立された平均「気孔率指標」は1162であった。LBMの縫合保持強度はほぼ68グラムであった。材料は縫合強度が全ての方向でほぼ同じな異方性を呈した。
例3. 種々の細胞株の肝臓基底膜上における増殖および分化
本研究において、3種の異なる細胞株の肝臓基底膜(LMB)上における増殖および分化を調査した。これらの試験細胞株は、Swiss3T3線維芽細胞株、ROS.17/2.8骨肉腫細胞株およびPC12ニューロン細胞株を包含した。全ての細胞はコラーゲン被覆プレート上に幡種された。Swiss3T3およびROS細胞の幡種密度は20x104細胞/ml、一方PC12は5x104細胞/mlであった。これら細胞株のLBMおよび腸管粘膜下組織(SIS)上における増殖および分化を比較するために、同一密度の同じ細胞をSIS上に幡種した。さらに、PC12につき、細胞に神経増殖因子(NGF)50ng/ml加えて正の制御を行った。SISおよびLBM上に幡種したそれぞれの細胞株から、組織学用の1個の試料を5日後に調製した。
予備観察では、3種の細胞株全てに増殖が、両基質上のROSおよびPC12細胞株に分化が認められた。光学顕微鏡での観察では、PC12細胞はSIS上の細胞増殖に比べ、LBM上の分化の程度は大きかった。さらに、ROSおよび3T3細胞はSIS上と同様に増殖/分化すると思われた。LBMの透明性のため、細胞の増殖および分化を定量することは困難であったが、組織学的考察がより詳細な評価を可能にすると思われる。
例4. LBM抽出物の調製
本研究に用いられた抽出バッファーはそれぞれが50mMのトリスHCl中で、pH7.4で調製された4Mのグアニジンおよび2Mの尿素を含有した。粉体形態のLBMをフェニルメチル弗化スルホニル、N-エチルマレイミドおよびベンズアミジン(プロテアーゼ阻止剤)それぞれを1mM含む関係抽出バッファーに懸濁させ、4℃で24時間激しく攪拌した。次いで、抽出混合物を12,000xgで30分、遠心分離し、上澄みを集めた。不溶物質を抽出バッファーで軽く洗浄し、遠心分離して洗浄液を最初の上澄み液と一緒にした。上澄み液をスペクトラポール(Spectrapor)管(MWCO3500、スペクトラム・メディカル・インダストリー(Spectrum Medical Industries)，ロスアンジェルス、カリフォルニア州)中、30容積の脱イオン水で徹底的に透析した。透析物を12,000xgで遠心分離して不溶物を全て除去し、上澄み液をだだちに使用するか、長期保存用に凍結乾燥した。
bFGF、HGFおよびEGFに特異的な抗体でのウェスタン・ブロッティング法で抗体のそれぞれにつき対応する反応性バンドを検出し、LBMにこれらの増殖因子が存在することを確認した。