(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞培養容器中に培養液等の液体と共に入れられた細胞または其のオルガネラの隔壁を透過して内部の領域にイオン性の微小物質を移送するための微小物質移送方法であって、
前記細胞培養容器と独立して位置および姿勢を操作されるピペット内に予め前記微小物質を充填しておき、前記細胞培養容器中に形成された対象物保持部で前記細胞を保持して前記隔壁の選択箇所にピペットの先端を位置決めし、前記ピペットに内装された電極を作用極として微小物質を移送する際に必要とされる極性と反転させた状態で前記隔壁に外部から高圧の直流電圧パルスを印加することで前記隔壁の選択箇所に一時的に局所的な細孔を開けてから、前記作用極に前記微小物質と同じ極性で直流電圧を印加し、其の電圧印加時間を制御することで前記ピペットから前記内部の領域に微小物質を移送することを特徴とした微小物質移送方法。
【請求項２】
細胞培養容器中に培養液等の液体と共に入れられた細胞または其のオルガネラの隔壁を透過して内部の領域に非イオン性の微小物質を移送するための微小物質移送方法であって、
前記細胞培養容器と独立して位置および姿勢を操作されるピペット内に予め前記微小物質を充填しておき、前記細胞培養容器中に形成された対象物保持部で前記細胞を保持して前記隔壁の選択箇所にピペットの先端を位置決めし、前記ピペットに内装された電極を作用極として前記隔壁に外部から高圧の直流電圧パルスを印加することで前記隔壁の選択箇所に一時的に局所的な細孔を開けてから、前記作用極に周波数帯を変化させて不均一な交流電圧を印加し、其の電圧印加時間を制御することで前記微小物質の電気双極子を誘起させ、周辺の電界との相互作用によって引力と斥力を発生させて前記ピペットから前記内部の領域に微小物質を移送することを特徴とした微小物質移送方法。
【請求項３】
前記作用極と対を成す極性の電極を前記作用極と対向させて前記ピペットに内装して電圧を印加することを特徴とした請求項１または請求項２記載の微小物質移送方法。
【請求項４】
前記作用極と対を成す極性の電極を前記細胞培養容器中に配置して電圧を印加することを特徴とした請求項１または請求項２記載の微小物質移送方法。
【請求項５】
前記ピペットの先端を前記隔壁よりも外側に位置させて前記内部の領域に微小物質を移送することを特徴とした請求項１，請求項２，請求項３または請求項４記載の微小物質移送方法。
【請求項６】
前記ピペットの先端を前記隔壁に接触させて前記内部の領域に微小物質を移送することを特徴とした請求項１，請求項２，請求項３または請求項４記載の微小物質移送方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞培養容器中に培養液等の液体と共に入れられた細胞または其のオルガネラの隔壁を透過して内部の領域に微小物質を移送するための微小物質移送方法の改良に関する。
【背景技術】
【０００２】
この種の微小物質移送方法に利用される技術としては、直流の電気パルスを利用して細胞膜や核膜等の隔壁に微小物質の通り道となる穿孔を施すエレクトロポレーション法が公知である。また、電流の電位勾配やエレクトロオズモシスを利用してイオン性や非イオン性の微小物質を培養液中で移送するエレクトロフォレーシス法も知られている。
しかし、従来のエレクトロポレーション法は、培養液等の液体と共に細胞培養容器中に入れられた細胞の全体を対象として表面積の大きな電極で電圧を印加することで隔壁に穿孔を施すようにしたものであるため、隔壁の任意の選択箇所に穿孔を施すことが困難であり、また、穿孔箇所も複数となってしまうため、細胞に必要以上のダメージを与えてしまう欠点がある。
特に、細胞内の選択箇所、例えば、特定のオルガネラに微小物質を移送する場合には、このオルガネラを最終的な操作対象として隔壁上の穿孔位置を適正化することが重要であるが、前述した通り、従来のエレクトロポレーション法では隔壁上の穿孔位置を特定することが困難である。更に、穿孔箇所が複数となってしまうため、このような手法で穿孔を施してからエレクトロフォレーシス法等を併用して微小物質を細胞内に移送するとしても、微小物質の移送先が全く不確かなものとなってしまい、目標とする箇所に微小物質を移送できなくなる可能性が多分にある。
つまり、所望する細胞内の箇所に微小物質が移送されるかどうかは常に確率的な問題であり、特に、所望する箇所に微小物質を取り込んだ多数の細胞を用意して対照実験を行うような場合には、同一位置に微小物質を入れられた細胞を得るといった段取り作業自体に多大な手間隙を要するといった不都合が生じる。
【０００３】
隔壁の選択箇所に的確に穿孔を施すための技術としては、ピエゾ素子で瞬間的に駆動されるピペットを利用して細胞膜等に穿孔を施すようにした微小器具の挿入方法が特許文献１として提案されている。
この挿入方法によれば、隔壁の選択箇所に穿孔を施すことは可能であるが、穿孔の過程で隔壁や細胞に衝撃的な力が作用することになるので、必ずしも、低侵襲の細胞操作が実現されるという保証はなく、また、微小物質の移送に際してはプレッシャーインジェクター等を利用する必要があるので、微小物質のみならずピペット内の媒体等が微小物質と共に細胞内に移送されてしまう問題がある。
【０００４】
更に他の方法として、外周部を絶縁したパイプ状の活性電極から成るポレーション工具を細胞培養容器の底面から突出するようにして設け、その上に細胞を載置した状態で当該活性電極を用いてエレクトロポレーション法による穿孔を行い、その後、パイプ状の活性電極の内部の空間をマニュピレータ等の通り道として利用することで細胞内への微小物質の移送や細胞内からのオルガネラの取り出しを行うようにした細胞内操作方法等が特許文献２として提案されている。
この技術によれば、パイプ状の活性電極を利用して局限的な範囲でエレクトロポレーション法による穿孔を実施することが可能となり、隔壁に１つの孔を穿設するといった目的は達成され得るが、その穿孔位置は必ず細胞培養容器の底面と接する位置となるので、隔壁の所望箇所に穿孔を施すためには、細胞を細胞培養容器に載置する段階で的確な位置決めを行う必要があり、仮に、細胞の位置決め操作を行うためのマニュピレータ等があったとしても、細胞の下面側の状況を顕微鏡等で確認することが困難であるため、隔壁の所望箇所に穿孔を施すことは難しい。また、細胞の隔壁にはパイプと接続する孔が定常的に形成されることになるので、細胞の自己修復の妨げとなる弊害がある。
しかも、パイプ状の活性電極は細胞を保持した細胞培養容器の底部に一体的に固着されているため、細胞膜や核膜等の隔壁に穿孔を施すことはできるが、細胞膜や核膜等の内側にあるオルガネラの隔壁に穿孔を施すことは極めて困難であり、オルガネラの内部に微小物質を移送するための穿孔方法としては事実上利用できない。
【０００５】
【特許文献１】特開２００３−１５７４号（段落０００７）
【特許文献２】特開平１１−３４６７６４号（段落００４２〜００４４）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで、本発明の課題は、前記従来技術の不都合を改善し、細胞膜や核膜等の内側にあるオルガネラの隔壁を含め、隔壁の任意の選択箇所に穿孔を施して目標とする箇所に微小物質を的確に移送することができる低侵襲の微小物質移送方法と此れを実施するために好適なピペットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の微小物質移送方法は、細胞培養容器中に培養液等の液体と共に入れられた細胞または其のオルガネラの隔壁を透過して内部の領域にイオン性の微小物質を移送するための微小物質移送方法において前記課題を達成するため、特に、
前記細胞培養容器と独立して位置および姿勢を操作されるピペット内に予め前記微小物質を充填しておき、前記細胞培養容器中に形成された対象物保持部で前記細胞を保持して前記隔壁の選択箇所にピペットの先端を位置決めし、前記ピペットに内装された電極を作用極として微小物質を移送する際に必要とされる極性と反転させた状態で前記隔壁に外部から高圧の直流電圧パルスを印加することで前記隔壁の選択箇所に一時的に局所的な細孔を開けてから、前記作用極に前記微小物質と同じ極性で直流電圧を印加し、其の電圧印加時間を制御することで前記ピペットから前記内部の領域に微小物質を移送することを特徴とした構成を有する。
【０００８】
具体的には、細胞培養容器と独立して位置および姿勢を操作されるピペット内に予め微小物質を充填しておき、まず、細胞培養容器中に形成された対象物保持部で細胞を保持した状態で隔壁の選択箇所にピペットの先端を位置決めする。
ピペットは細胞培養容器と独立して位置および姿勢を操作することができるので、細胞培養容器に細胞をどのように載置して対象物保持部で細胞を保持したかに関わりなく、確実にピペットの先端を隔壁の選択箇所に位置決めすることができる。
次いで、ピペット内の電極を作用極として隔壁に外部から直流電圧を印加することで隔壁に細孔を開ける。その作用原理は従来のエレクトロポレーション法と同様であるが、本発明においては、ガラス等の絶縁物から形成されたピペットに内装された電極を作用極として利用することで局限された範囲で電気的な穿孔を行うようにしているので、穿孔箇所が複数となることはなく、ピペット先端の位置決め位置つまり隔壁の選択箇所に対してのみ的確に穿孔を施すことができる。
細胞膜や核膜等の内側にあるオルガネラの内部に微小物質を移送する場合には、細胞膜や核膜等の隔壁に穿孔を施した後、ピペットの先端を進め、細胞膜や核膜等の隔壁の場合と同様にしてオルガネラの隔壁に対しても穿孔を施す。
そして、ピペット内の作用極に微小物質と同じ極性で直流電圧を印加し、其の電圧印加時間を制御することでピペットから細胞の内部の領域、つまり、細胞内の選択箇所やオルガネラの内部に微小物質を移送する。直流電圧の印加を利用して微小物質を移送する原理は従来のエレクトロフォレーシス法と同様であるが、本発明においては、隔壁の穿孔過程で隔壁の選択箇所にのみ的確に穿孔が施され、しかも、ピペットの先端が穿孔位置に極めて近接しているので、オルガネラの隔壁の内部を始め、細胞膜や核膜等の内部の選択箇所に微小物質を的確に移送することができる。
以上に述べたように、隔壁の穿孔過程で細胞に衝撃的な力が作用しないこと、穿孔箇所が１箇所に局限されること、微小物質を移送した後でピペットの先端を細胞の隔壁の外側の領域に退避させることで細胞の自己修復作用による孔の閉鎖が可能になること等により、極めて低侵襲の細胞操作が実現される。
また、細胞培養容器と独立して位置および姿勢を操作されるピペットの先端を基準として隔壁に対する穿孔作業や微小物質の移送作業が行われることになるため、ピペットの先端を顕微鏡等で確認しながら、目的とする箇所に的確にピペットの先端を位置決めして隔壁に対する穿孔作業や微小物質の移送作業を行うことができる。
特に、細胞内のオルガネラの内部に微小物質を移送するような場合には、細胞膜や核膜等の隔壁とオルガネラの隔壁に対して次々と電気的な穿孔作業を行って微小物質の通り道を形成することができるので、複数層の隔壁を通過して内部領域に微小物質を移送するといった操作にも容易に対処することができる。
しかも、エレクトロフォレーシス法を応用した電気的な移送方法であるため、ピペット内の媒体等を伴わずに微小物質のみを細胞内に移送することも可能である。
このように、作用極として機能する電極を内装したピペットの先端を作業領域としてエレクトロポレーション法の作用原理を応用した穿孔作業とエレクトロフォレーシス法の作用原理を応用した微小物質の移送作業を連続的に行うといった技術思想は従来にないものである。
【０００９】
また、本発明の微小物質移送方法は、細胞培養容器中に培養液等の液体と共に入れられた細胞または其のオルガネラの隔壁を透過して内部の領域に非イオン性の微小物質を移送するための微小物質移送方法において前記課題を達成するため、特に、
前記細胞培養容器と独立して位置および姿勢を操作されるピペット内に予め前記微小物質を充填しておき、前記細胞培養容器中に形成された対象物保持部で前記細胞を保持して前記隔壁の選択箇所にピペットの先端を位置決めし、前記ピペットに内装された電極を作用極として前記隔壁に外部から高圧の直流電圧パルスを印加することで前記隔壁の選択箇所に一時的に局所的な細孔を開けてから、前記作用極に周波数帯を変化させて不均一な交流電圧を印加し、其の電圧印加時間を制御することで前記微小物質の電気双極子を誘起させ、周辺の電界との相互作用によって引力と斥力を発生させて前記ピペットから前記内部の領域に微小物質を移送することを特徴とした構成を有する。
【００１０】
穿孔過程における処理操作は前記と同様である。この発明は、特に、非イオン性の微小物質の移送に対処するためのもので、周波数帯を変化させて不均一な交流電圧を作用極に印加し、其の電圧印加時間を制御することで微小物質の電気双極子を誘起させ、周辺の電界との相互作用によって引力と斥力を発生させてピペットから細胞の内部の領域、つまり、細胞内の選択箇所やオルガネラの内部に微小物質を移送するようにしたものである。交流電圧の印加を利用して微小物質を移送する原理に関しては従来のエレクトロフォレーシス法におけるエレクトロオズモシスと同様である。
従って、前記と同様、極めて低侵襲の細胞操作が可能であり、細胞の内部領域の選択箇所に的確に微小物質を移送することができ、複数層の隔壁を通過して内部領域の選択箇所に微小物質を移送するといった操作やピペット内の媒体等を伴わずに微小物質のみを細胞内に移送するといった操作にも容易に対処することができる。
【００１１】
何れの場合も、作用極と対を成す極性の電極を作用極と対向させてピペットに内装して電圧を印加すること、あるいは、作用極と対を成す極性の電極を細胞培養容器中に配置して電圧を印加することにより、前述の穿孔作業と微小物質の移送作業を一連の工程として実施することができる。
【００１６】
直流電圧の印加や不均一な交流電圧の印加によって微小物質の移送を行う場合、ピペットの先端は隔壁よりも外側に位置させても、隔壁に接触させても、更には、隔壁よりも内側に位置させても構わない。
【００１７】
微小物質それ自体に電気的な移送力が方向性をもって作用するため、隔壁の孔とピペットの先端との間にギャップが存在しても、孔の内側の目的とする箇所に的確に微小物質を移送できるからである。
【発明の効果】
【００２５】
本発明の微小物質移送方法によれば、隔壁の穿孔過程で細胞に衝撃的な力が作用することがなく、穿孔箇所が１箇所に局限され、しかも、細胞の自己修復作用による孔の閉鎖も許容されるので、極めて低侵襲の細胞操作が実現される。
また、細胞培養容器と独立して位置および姿勢を操作されるピペットの先端を基準として隔壁に対する穿孔作業や微小物質の移送作業が行われるので、ピペットの先端を顕微鏡等で確認しながら、目的とする箇所に的確にピペットの先端を位置決めして隔壁に対する穿孔作業や微小物質の移送作業を行うことができる。
特に、細胞内のオルガネラの内部に微小物質を移送するような場合には、細胞膜や核膜等の隔壁とオルガネラの隔壁に対して次々と局限的な穿孔作業を行って微小物質の通り道を形成することができるので、複数層の隔壁を通過して内部領域に微小物質を移送するといった操作にも容易に対処することができる。
これにより、オルガネラの内部を含め、細胞膜や核膜等の隔壁の内部領域の任意の選択箇所に低侵襲の細胞操作で微小物質を自由に移送することが可能となり、これまで困難とされていた単一細胞に対する局所的な実験および厳密な定量解析が可能となり、更には、異なる個体に対して均一の条件で細胞操作を行うことができるため、入手が困難である細胞を用いた対照実験等も安心して行えるようになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
次に、本発明を実施するための最良の形態について図面を参照して詳細に説明する。図１は本発明を適用した一実施形態の微小物質移送方法を実施する際に利用される単一細胞操作支援システムの一例を簡略化して示した図である。
【００２８】
この単一細胞操作支援システム１は、概略において、細胞操作部２とコントローラ３およびマン・マシン・インターフェイスとして機能するジョイスティックコントロールユニット４，フットペダル群５，モニタ６によって構成される。
【００２９】
細胞操作部２は、細胞培養容器を載置するためのテーブル７と細胞培養容器内の細胞を操作するためのマニピュレータ８，９を実装したステージ１０、および、細胞培養容器内の細胞を観察するための顕微鏡１１を備える。
【００３０】
ステージ１０上に設けられたテーブル７はステッピングモータ等からなる各軸の駆動手段により直交二軸の水平面内で駆動され、また、テーブル７の右側に配備されたマニピュレータ８は、ステッピングモータ等からなる各軸の駆動手段とピエゾ素子等からなる駆動手段によって直交三軸の空間内で独立的に駆動されるようになっている。ピエゾ素子等からなる駆動手段は、マニピュレータ８を軸方向に沿って駆動することでマニピュレータ８に装着された微小物質移送用ピペット１３を瞬間的に移動させるためのものである。なお、ここでいう軸方向とは図１中でステージ１０を基準として４５°の傾斜角を有する右肩上がりの直線の方向である。テーブル７の左側に配備されたマニピュレータ９も、ステッピングモータ等からなる各軸の駆動手段によって直交三軸の空間内で独立的に駆動されるようになっている。
【００３１】
テーブル７の左側に配備されたマニピュレータ９は、細胞培養容器内に配置された単一細胞を吸引等の手段で保持するためのキャピラリー１２をエンドエフェクタとして備え、また、テーブル７の右側に配備されたマニピュレータ８は、単一細胞に対して遺伝子や薬品等の注入を行うための微小物質移送用ピペット１３をエンドエフェクタとして有する。
【００３２】
コントローラ３はテーブル７やマニピュレータ８，９を駆動する各軸のステッピングモータおよびピエゾ素子等からなる駆動手段を制御するためのものであり、モニタ６には、コントローラ３からの指令に基づいて、テーブル７上に設置された細胞培養容器内の単一細胞の教示位置や操作対象となる単一細胞の位置、あるいは、顕微鏡１１に内蔵されたハーフミラーを介して顕微鏡１１内のＣＣＤカメラで撮像された映像等が表示されるようになっている。
【００３３】
ジョイスティックコントロールユニット４およびフットペダル群５は、コントローラ３に対する各種の指令やデータ等を入力するためのマン・マシン・インターフェイスであり、ジョイスティックコントロールユニット４には、ジョイスティックの他にも各種の操作ボタンやスイッチおよび手動パルス発生器等が設けられている。
【００３４】
この実施形態では、エレクトロポレーション法やエレクトロフォレーシス法さらにはソノポレーション法等を応用した様々な穿孔方法と微小物質の移送方法を組み合わせて利用することで微小物質移送用ピペット１３から細胞内への微小物質の移送が行われるようになっており、これらの方法を単一細胞操作支援システム１で実施するために必要とされる各種の駆動制御プログラムがコントローラ３のハードディスク内に予めインストールされており、ジョイスティックコントロールユニット４およびフットペダル群５の操作により、これらの駆動制御プログラムを選択的にハードディスクからコントローラ３内のＲＡＭ上に展開し、この駆動制御プログラムに従ってコントローラ３のＣＰＵが各軸の軸制御回路や周辺装置を制御することで、細胞操作部２のテーブル７およびマニピュレータ８，９と他の周辺装置が駆動されるようになっている。
【００３５】
微小物質移送用ピペット１３の構成例を図２に示す。この微小物質移送用ピペット１３は、概略において、電気的な絶縁性を有するガラス管の先端を狭搾して形成したピペット本体１４と、ピペット本体１４の基部を圧入する円筒部１５およびキャップ部１８を先端に備えたピペットホルダー１６と、ピペットホルダー１６の後端部に接続するチューブコネクタ１７とから成り、ピペットホルダー１６の軸方向長さを、ピペット本体１４とチューブコネクタ１７との接続に必要とされる最低限度の長さとすることによって微小物質移送用ピペット１３全体としての重量の軽減化が図られている。なお、従来のピペットホルダーは手作業に際しての取り回し等を考慮して１５０mm程度の金属製バレル、もしくは、ピペット本体に相当する部分と一体に形成されたガラス製のキャピラリー等によって構成されていたので、この部分を短縮してマニュピレータ８のための専用構造とすることで大幅な重量軽減が可能である。ピペットホルダー１６は剛性の維持と軽量化の観点から、エンジニアリングプラスチック等の合成樹脂で形成することが望ましい。
【００３６】
チューブコネクタ１７はシリコンゴム等からなるチューブ１９をピペットホルダー１６に接続するためのもので、捩じ込み式，ルアーロック式，指し込み式，ユニオンコネクタ式等のものを適宜選択して利用することができる。前述した最低限度の長さの意味合いは、チューブコネクタ１７をピペットホルダー１６に取り付ける際に必要とされるピペットホルダー１６側のネジ部，ロック部，指し込み部，コネクタ嵌合部の長さ、あるいは、チューブ１９を直にピペットホルダー１６に取り付ける場合のピペットホルダー１６側のニップル部の長さを含んだ長さである。
【００３７】
ピペット本体１４には、例えば、図３（ａ），（ｂ）に示されるようにしてピペット本体１４の基部外周面から径方向外側に突出するフランジ状の突起１４ａ，１４ｂ、または、図３（ｃ）に示されるようにしてピペット本体１４の基部外周面から径方向外側に突出する舌片状の突起１４ｃがストッパとして設けられ、図２に示されるようにしてピペットホルダー１６の円筒部１５にピペット本体１４を圧入して差し込んだ際に、ストッパとして機能する突起１４ａ，１４ｂ，１４ｃがキャップ部１８の先端部と当接することにより、ピペットホルダー１６に対するピペット本体１４の突入量が一義的に規制されるようになっている。
【００３８】
一般に、突起１４ａ，１４ｂ，１４ｃ等を備えないピペット本体を手動操作で円筒部１５に差し込んだ際の突入量のバラツキは５mm〜１０mmの範囲であり、プログラムプラーを使用して製造されるピペット本体１４の全長のバラツキは０．５mm以下であるから、突起１４ａ，１４ｂ，１４ｃ等から成るストッパをピペット本体１４に設けることによって、従来、キャップ部１８の先端からピペット本体１４の先端に至るまでの間で生じていた５．５mm〜１０．５mm程度の寸法のバラツキを０．５mm以下に抑制することが可能となる。
【００３９】
ピペット本体１４の目詰まりや欠損等の障害が発生してピペット本体１４の取り替え作業を行った際にキャップ部１８の先端からピペット本体１４の先端に至る距離に５mm〜１０mmといった大幅な変動が生じてしまうと、例えば、ジョイスティックコントロールユニット４の手動パルス発生器等を操作してピペット本体１４の先端位置をテーブル７上の予め決められた基準位置に合わせた状態で、単一細胞の教示位置を記憶する座標系の原点位置に対してオフセットの補正を行うか、あるいは、現在位置記憶レジスタの値をリセットする等の処理操作が必要となり、全体としての作業に大幅な遅れが生じることが見込まれるが、この問題は、キャップ部１８の先端からピペット本体１４の先端に至るまでの間で生じる寸法のバラツキを０．５mm以下に抑制するといったことで、解消が可能である。
【００４０】
あるいは、図３（ａ），（ｂ），（ｃ）に示すような突起１４ａ，１４ｂ，１４ｃを省略し、図４に示されるようにしてピペットホルダー１６側の円筒部１５の奥に段付きの縮径部１５ａを形成し、この縮径部１５ａの端面にピペット本体１４の基部側の端面を当接させることによって、ピペットホルダー１６に対するピペット本体１４の突入量を一義的に規制するようにしてもよい。この場合は、段付きの縮径部１５ａがストッパとして機能することになる。
【００４１】
段付きの縮径部１５ａによってストッパを構成した場合には、ピペット本体１４には何らの加工を行う必要もなく従来通りのものを利用でき、また、ピペットホルダー１６自体に損傷が発生する可能性が低いことから、設備投資やランニングコストの軽減化の面で有益である。
【００４２】
この実施形態のピペットホルダー１６は、図５に示されるように、別部材から成るピペットホルダー本体１６ａと円筒部１５によって構成されている。キャップ部１８は図５に示されように円錐部１８ａと此れに連絡する環状部１８ｂとを一体に成形した部材であり、円錐部１８ａの内部には、弾性変形可能な合成樹脂等からなる円筒部１５が固設され、この円筒部１５にピペット本体１４の基部が差し込まれるようになっている。
【００４３】
この実施形態では、図５に示されるように、円筒部１５の先端側のみを円錐部１８ａの内側に固着し、円筒部１５の他部を弾性変形可能な状態としている。このため、キャップ部１８の環状部１８ｂをピペットホルダー本体１６ａに螺合して捩じ込むと、円筒部１５の弾性変形可能部分がピペットホルダー本体１６ａの先端面で軸方向に押圧されて圧縮方向に弾性変形し、円筒部１５の内径が縮径化する。この縮径化で生じる締め付け力を利用することで円筒部１５にピペット本体１４の基部を強固に固定することができる。ピペット本体１４は一般にガラス製であるが、前述の締め付け力はピペット本体１４の基部において周方向の応力として作用するので、ピペット本体１４の基部に損傷が生じる心配はない。
【００４４】
また、円筒部１５の内径とピペット本体１４の基部外径の嵌め合いのみを利用した圧入で円筒部１５にピペット本体１４を固定することも可能である。
【００４５】
このように、キャップ部１８と一体化して円筒部１５をピペットホルダー本体１６ａから取り外す構成を適用した場合、ピペット本体１４を装着したキャップ部１８を予め何本か準備しておいて、ピペット本体１４の取り替えに備えることができる。
【００４６】
あるいは、円筒部１５をピペットホルダー本体１６ａと一体に形成してキャップ部１８のみを着脱する構成としてもよい。この場合、キャップ部１８の環状部１８ｂをピペットホルダー本体１６ａに螺合して捩じ込むことで、円錐部１８ａのテーパ状の内周面を円筒部１５の先端に当接させて円筒部１５を縮径させることで、前記と同様、円筒部１５にピペット本体１４の基部を強固に固定することができる。なお、円筒部１５を形成する素材の剛性が相当に高いような場合であっても、ピンバイス等のチャック構造を転用し、円筒部１５の先端部に軸方向のスリットを何本か形成すれば、スリットで区切られる部分の先端部を容易に弾性変形させて、円筒部１５とピペット本体１４との間の水密状態を保持したまま利用者を強固に固定することができる（水密状態は嵌め合いを利用した圧入のみで保証され得る）。
【００４７】
ピペットホルダー１６内に電極２０を内装した微小物質移送用ピペット１３’の一例を図６に、また、ピペットホルダー１６内に超音波発振器２１を内装した微小物質移送用ピペット１３”の一例を図７に示す。何れの場合も、電極２０および超音波発振器２１はピペットホルダー１６内（ピペットホルダー本体１６ａと円筒部１５を別部材で構成した場合においてはピペットホルダー本体１６ａの側）に固着して取り付けられており、ピペット本体１４の取り外しに際しては、図８，図９に示されるように、電極２０や超音波発振器２１をピペットホルダー１６（ピペットホルダー本体１６ａ）の側に残した状態でピペット本体１４のみを交換できるようになっている。なお、図６あるいは図８において、作用極として機能する電極２０ａと此れと対を成す電極２０ｂを並列的に配置する場合もある。
【００４８】
マニピュレータ８の先端に設けられたステー２２に対する微小物質移送用ピペット１３，１３’，１３”の取り付け例を図１０〜図１２に示す。前述したとおり、この実施形態においては、ピペットホルダー１６の短縮化および素材の軽量化によって微小物質移送用ピペット１３，１３’，１３”の重量の軽減化が図られているので、例えば、図１０に示されるようにして、ピペット本体１４の基部をステー２２の先端部に直付け状態で取り付けることが可能となる。この際、ピペットホルダー１６の部分はピペット本体１４の基部のみによって支えられることになるが、ピペットホルダー１６は十分に軽量化されているので、ピペットホルダー１６を支えるピペット本体１４の基部に破損等が生じる心配はない。
【００４９】
結果的に、ピペット本体１４それ自体は実質的にステー２２と一体の構成となり、ピペット本体１４とステー２２との間の介在物がなくなるので、マニピュレータ８を駆動してステー２２を移動させた場合のピペット本体１４の動作遅れが解消され、ピペット本体１４の動作の高速化と振動の軽減化および位置決め精度の点で有利となる。
【００５０】
あるいは、図１１に示されるようにして微小物質移送用ピペット１３，１３’，１３”におけるピペットホルダー１６とキャップ部１８の部分をステー２２に固定するようにすることも可能である。この場合、ピペット本体１４とステー２２との間にはピペットホルダー１６やキャップ部１８が介在することになるが、微小物質移送用ピペット１３，１３’，１３”が軽量化されているため、従来型のピペットを装着した場合に比べてピペット本体１４の動作遅れや共振振動が改善される。
【００５１】
また、ピペットホルダー１６が従来品に比べて大幅に短縮化されているので、微小物質移送用ピペット１３，１３’，１３”の姿勢を変えてもピペットホルダー１６の端部が他の部材、例えば、顕微鏡１１等に干渉する可能性が軽減され、図１２に示されるようにして、ステー２２上で微小物質移送用ピペット１３，１３’，１３”の姿勢調整を許容する構成を適用することもできるようになる。図１２ではステー２２の最先端部を別部材によって構成し、ピンもしくはネジ等の枢着手段２３を介してステー２２の最先端部を揺動させることで微小物質移送用ピペット１３，１３’，１３”の姿勢を変化させる例について示しているが、この部分に姿勢制御装置を設けることも可能である。
【００５２】
次に、図１中のコントローラ３に接続される各種の周辺装置について簡単に説明する。
【００５３】
直流電圧印加装置２４は、電極を内装した微小物質移送用ピペット１３’をマニピュレータ８に装着した際に、微小物質移送用ピペット１３’に内装された作用極としての電極２０ａと其の対となる電極２０ｂ、もしくは、作用極としての電極２０と細胞培養容器中に設置されて電極２０と対を成す電極（以下、電極２０ｃと称する）に電圧を印加するためのもので、エレクトロポレーション法を応用して細胞膜や核膜等の隔壁あるいはオルガネラの隔壁等に穿孔を施す際に必要とされる高圧の直流電圧のパルス出力と、エレクトロフォレーシス法を応用してイオン性の微小物質を微小物質移送用ピペット１３’から細胞内に移送する際に必要とされる直流電圧の出力とが可能である。エレクトロフォレーシス法を応用してイオン性の微小物質を移送する際には微小物質の極性に応じて電極２０ａと電極２０ｂ（または電極２０と電極２０ｃ）の極性を反転する必要が生じる場合があるので、直流電圧印加装置２４の出力端子と電極２０ａ，２０ｂ（または電極２０と電極２０ｃ）との間は、極性反転スイッチ２５を介して接続される。直流電圧印加装置２４はコントローラ３によって制御され、各種の細胞膜や核膜等の隔壁あるいはオルガネラの隔壁等に穿孔を施す際に適した電圧値や、各種のイオン性の微小物質を移送する際に必要とされる電圧値は、予め、パラメータとしてコントローラ３のハードディスクまたは不揮発性メモリに記憶されている。コントローラ３のＣＰＵはジョイスティックコントロールユニット４から入力されるオペレータの指令を受け、細胞の種類や隔壁の種別あるいはイオン性の微小物質の種別等に応じて穿孔作業や移送作業に適したパラメータを選択して直流電圧印加装置２４に設定し、直流電圧印加装置２４をオン／オフ制御する。極性反転スイッチ２５もジョイスティックコントロールユニット４から入力されるオペレータの指令に応じて切り替えられるようになっている。
【００５４】
交流電圧印加装置２６は、電極を内装した微小物質移送用ピペット１３’をマニピュレータ８に装着してエレクトロフォレーシス法におけるエレクトロオズモシスの応用で非イオン性の微小物質を微小物質移送用ピペット１３’から細胞内に移送する際に必要とされる交流電圧を印加するためのもので、交流電圧印加装置２６の出力端子は、極性反転スイッチ２５を経ずに電極２０ａと電極２０ｂ（または電極２０と電極２０ｃ）に接続される。交流電圧印加装置２６はコントローラ３によって制御され、各種の非イオン性の微小物質を移送する際に必要とされる周波数帯の変化パターンや電圧印加時間は、予め、パラメータとしてコントローラ３のハードディスクまたは不揮発性メモリに記憶されている。コントローラ３のＣＰＵはジョイスティックコントロールユニット４から入力されるオペレータの指令を受け、非イオン性の微小物質の種別等に応じて微小物質の移送作業に適したパラメータを選択して交流電圧印加装置２６に設定し、電圧印加時間を制御する。
【００５５】
超音波発振器制御装置２７は、超音波発振器２１を内装した微小物質移送用ピペット１３”をマニピュレータ８に装着してソノポレーション法の応用で細胞膜や核膜等の隔壁あるいはオルガネラの隔壁等に穿孔を施して微小物質を移送する際に必要とされる超音波発振器２１の振動数や振幅を制御するためのものである。超音波発振器制御装置２７はコントローラ３によって制御され、各種の細胞膜や核膜等の隔壁あるいはオルガネラの隔壁等に穿孔を施して微小物質を移送するのに適したキャビテーションを生成するための発振周波数や振幅等のデータは、予め、パラメータとしてコントローラ３のハードディスクまたは不揮発性メモリに記憶されている。コントローラ３のＣＰＵはジョイスティックコントロールユニット４から入力されるオペレータの指令を受け、細胞の種類や隔壁の種別等に応じて穿孔作業および微小物質の移送作業に適したパラメータを選択して超音波発振器制御装置２７に設定し、超音波発振器制御装置２７からの出力をオン／オフ制御する。
【００５６】
パルスレーザー制御装置２８は、微小物質移送用ピペット１３をマニピュレータ８に装着した状態でアブレーションを利用して細胞膜や核膜等の隔壁あるいはオルガネラの隔壁等に穿孔を施して微小物質を移送する際に必要とされるパレスレーザーの出力を制御するためのものである。この実施形態では、ステージ１０とテーブル７の中央部にレーザーの通過を許容する開口部が設けられ、ステージ１０の下面側に図１３に示されるようにしてパルスレーザー光源２９，スリット３０，λ／２板３１，ポラライザー３２，コリメーターレンズ３３，ダイクロイックミラー３４および集光レンズ３５が配備され、パルスレーザー光源２９から射出されたレーザーがこれらの光学系を介して、マニピュレータ８に装着された微小物質移送用ピペット１３の先端近傍の領域に集光されるようになっている。既に述べたとおり、テーブル７は直交二軸の水平面内で任意の方向への移動が可能であり、また、マニピュレータ８はテーブル７と独立して直交三軸の空間内の任意方向に移動することが可能であるから、レーザーの集光位置と，テーブル７上の細胞培養容器に載置された細胞の位置と，微小物質移送用ピペット１３の先端位置との位置合わせは、各軸の駆動制御によって容易に実現できる。パルスレーザー制御装置２８はパルスレーザー光源２９の電源を兼ねるオン／オフ制御手段であり、前述の直流電圧印加装置２４，交流電圧印加装置２６，超音波発振器制御装置２７と同様にしてコントローラ３で制御される。
【００５７】
プレッシャーインジェクター制御装置３６は微小物質移送用ピペット１３のチューブコネクタ１７にチューブ１９を介して接続されたプレッシャーインジェクターを駆動制御するためのものである。プレッシャーインジェクターは微小物質移送用ピペット１３内の媒体等に外圧を印加して細胞内に媒体と共に微小物質を注入するためのもので、その構成に関しては既に公知であるので、ここでは説明を省略する。
【００５８】
次に、これらの装置を用いて行われる微小物質移送方法について具体的に説明する。
【００５９】
微小物質の移送先は、隔壁としての細胞膜を有する動物細胞の内部の領域、あるいは、隔壁としての細胞壁および細胞膜を有する植物細胞の内部の領域、更には、これらの細胞中に存在する核，ミトコンドリア，葉緑体，小胞体，ゴルジ体等のオルガネラの内部の領域である。核，ミトコンドリア，葉緑体，小胞体等のオルガネラは隔壁となる核膜や脂質２重膜を備えているので、その内部に微小物質を移送するためには、細胞自体の隔壁に加えオルガネラの隔壁を透過してその内部に微小物質を移送する必要がある。また、移送の対象となる微小物質は、前述のオルガネラ，低分子試薬，阻害剤，有機高分子ＤＮＡ，ＲＮＡ，蛋白質，ポリペプチド，脂質，糖類および此れらの誘導体，微粒子，修飾微粒子，金属，無機物等である。
【実施例１】
【００６０】
まず、エレクトロポレーション法とエレクトロフォレーシス法を局限的に適用して細胞または其のオルガネラの隔壁を透過して内部の領域にイオン性の微小物質を移送する微小物質移送方法（以下、ピペットエレクトロフォレーシス法と称する）について説明する。
【００６１】
この場合、作用極として機能する電極２０ａと此れと対を成す電極２０ｂを並列的に配置して内装した微小物質移送用ピペット１３’、または、作用極として機能する電極２０のみを内装した微小物質移送用ピペット１３’（以上、図６参照）をマニピュレータ８に装着して使用することになる。
【００６２】
電極２０ａと電極２０ｂを並列的に配置して内装した微小物質移送用ピペット１３’を使用する場合には、図１４に示すように、作用極としての電極２０ａを極性反転スイッチ２５の一方の出力端子に接続すると共に、其の対となる電極２０ｂを極性反転スイッチ２５の他方の出力端子に接続する（以下、マルチチャネル式と称する）。
【００６３】
また、電極２０のみを内装した微小物質移送用ピペット１３’を使用する場合においては、図１５に示すように、微小物質移送用ピペット１３’の電極２０を極性反転スイッチ２５の一方の出力端子に接続すると共に、細胞培養容器３７中に設置されて電極２０と対を成す電極２０ｃを極性反転スイッチ２５の他方の出力端子に接続する（以下、シングルチャネル式と称する）。図１５では単一の電極を内装した別のピペット３８をマニピュレータ９に装着し、このピペット３８の電極を電極２０ｃとして利用する場合について示しているが、電極２０ｃの設置方法は此れに限定されない。但し、電極２０ｃは、細胞培養容器３７中で培養されている細胞３９の位置を基準として、微小物質移送用ピペット１３’の電極２０と対局する位置に設置する必要がある。
【００６４】
なお、図１４および図１５では、図面の簡略化のため、微小物質移送用ピペット１３’に接続するチューブ１９や微小物質移送用ピペット１３’をマニピュレータ８に取り付けるためのステー２２および細胞培養容器３７を載置するテーブル７に関しては記載を省略し、電極２０，２０ａ，２０ｂ，２０ｃと極性反転スイッチ２５との電気的な接続状態のみを記載している。
【００６５】
ここでは、一例として、図１５に示されるシングルチャネル式の段取りを適用して細胞３９のオルガネラの一種である核３９ｂに微小物質を移送する場合、つまり、全体として２層の隔壁を透過して微小物質を移送する場合について説明する。
【００６６】
細胞３９は細胞培養容器３７中に形成された細胞付着蛋白質のコーティングや親水性コーティング等の対象物保持部によって実質的に細胞培養容器３７に固定され、微小物質移送用ピペット１３’の中には予め移送対象となる微小物質が媒体と共に充填されているものとする。
【００６７】
ここで、移送対象となるＤＮＡや低分子等の微小物質が負に帯電している場合には、作用極として機能する電極２０が微小物質と反発するマイナス極となるように電極２０および電極２０ｃの極性を決める。また、移送対象となる微小物質が蛋白質である場合には、当該微小物質の表面に存在する解離基の種類と数により、見かけ上、当該微小物質が正と負に帯電する性質があるので、予め、極性反転スイッチ２５を切換え操作してテスト泳動を行い、微小物質の帯電性を確認してから作用極として機能する電極２０の極性を決めるようにする。
【００６８】
そして、細胞培養容器３７中の対象物保持部に細胞３９を保持した状態で、顕微鏡１１の視野を確認しながらジョイスティックコントロールユニット４を操作してテーブル７の各軸を駆動制御し、細胞３９を顕微鏡１１の視野内に納め、更に、顕微鏡１１の視野を確認しながらジョイスティックコントロールユニット４を操作してマニュピレータ８の各軸を駆動制御し、細胞３９の最初の隔壁を構成する細胞膜の所望する位置に微小物質移送用ピペット１３’の先端を位置決めする。
【００６９】
この例では、細胞３９内の核３９ｂに微小物質を移送することを目的としているので、微小物質移送用ピペット１３’の軸線方向の延長線が核３９ｂと突き当たるような状態となるようにして細胞３９の細胞膜上に微小物質移送用ピペット１３’の先端を位置決めすることが望ましい。
【００７０】
次いで、ジョイスティックコントロールユニット４からの指令で直流電圧印加装置２４および極性反転スイッチ２５を作動させ、微小物質の移送に必要とされる極性と逆の極性で微小物質移送用ピペット１３’の電極２０とピペット３８の電極２０ｃに高圧の直流電圧パルスを印加し、この直流電圧によって隔壁である細胞膜に外部から細孔を開ける。高圧の直流電圧パルスの印加で穿孔を行う作用原理に関しては従来のエレクトロポレーション法と同様であるが、本実施例においては、ガラス等の絶縁物から形成された微小物質移送用ピペット１３’に内装された電極２０を利用することによって局限された範囲で電気的な穿孔を行うようにしているので、穿孔箇所が複数となることはなく、微小物質移送用ピペット１３’の位置決め位置、つまり、細胞膜上の選択箇所に対してのみ的確に穿孔を施すことができる。また、この段階では、微小物質を移送する際に必要とされる極性と反転させた状態で作用極となる電極２０に直流電圧を印加しているので、微小物質移送用ピペット１３’内にあるイオン性の微小物質が電極２０に反発して不用意に細胞３９の細胞質３９ａ内に流出するといった問題も生じない。
【００７１】
次いで、顕微鏡１１の視野を確認しながらジョイスティックコントロールユニット４を操作してマニュピレータ８の各軸を更に駆動制御し、微小物質移送用ピペット１３’に僅かに送りを掛けて、微小物質移送用ピペット１３’の先端を第二の隔壁である核膜上の選択位置に位置決めし、前記と同様の作業工程を繰り返し実行することで、核膜上の選択箇所に穿孔を施す。
【００７２】
そして、更に、直流電圧印加装置２４および極性反転スイッチ２５を作動させ、微小物質の移送に必要とされる極性に合わせて微小物質移送用ピペット１３’内の電極２０とピペット３８の電極２０ｃに直流電圧を印加し、其の電圧印加時間を制御することで微小物質移送用ピペット１３’から核３９ｂの内部の領域に微小物質を移送する。
【００７３】
直流電圧の印加を利用して微小物質を移送する原理は従来のエレクトロフォレーシス法と同様であるが、本実施例においては、最初の隔壁である細胞膜および第二の隔壁である核膜の穿孔過程で隔壁の選択箇所にのみ的確に穿孔が施され、しかも、この穿孔の過程で微小物質が不用意に細胞質３９ａ内に拡散することがなく、更に、微小物質移送用ピペット１３’の先端が核膜の穿孔位置に極めて近接しているので、細胞３９の細胞質３９ａ内に不用意に微小物質を分散させることなく核３９ｂの内部にのみ的確に微小物質を移送することができる。
【００７４】
このピペットエレクトロフォレーシス法を適用する場合は、微小物質それ自体に電気的な移送力が方向性をもって作用することになるので、微小物質の移送時における微小物質移送用ピペット１３’の先端位置は核３９ｂの隔壁である核膜よりも多少外側に位置させても構わない。当然、微小物質移送用ピペット１３’の先端を核膜に接触させること、および、核膜よりも内側に突入させることに不都合はない。
【００７５】
このように、本実施例のピペットエレクトロフォレーシス法では、隔壁である細胞膜や核膜に穿孔を施す際に、微小物質移送用ピペット１３’をピエゾ素子等の駆動手段で瞬間的に駆動して突き入れる必要がなく、衝撃的な力が細胞３９に作用することがないので、極めて低侵襲の細胞操作が可能であり、また、微小物質それ自体に移送力を作用させるようにしているので、微小物質移送用ピペット１３’内の媒体を伴うことなく微小物質のみを必要箇所に移送することができる。
【００７６】
また、微小物質移送用ピペット内に外圧を印加して細胞内に微小物質を注入する従来型のプレッシャーインジェクターの場合では、ピペットの先端から微小物質を送出するために媒体の流れが必要となるため、流体の抵抗等の関係でピペットの先端開口部を例えば０．５μm以下のように極端に縮径することは難しく、また、先端開口部を極端に縮径化した場合にはプレッシャーインジェクターを大出力化してピペットの内部圧力を相当に上昇させないと微小物質の送出ができない不都合があり、ピペット本体がピペットホルダーから抜け飛ぶような場合もあったが、この実施例のピペットエレクトロフォレーシス法においては、微小物質それ自体に移送力が作用するので、微小物質の通過が可能な範囲で微小物質双方向移送用ピペット１３’の先端開口部を例えば低分子遺伝子・低分子タンパク質の標準的な大きさである１０nm程度にまで縮径化することが可能であり、また、微小物質の移送に際して微小物質移送用ピペット１３’の内圧を上昇させる必要がないので、ピペット本体１４がピペットホルダー１６から抜け飛ぶ弊害も生じない。
【００７７】
ここでは、一例として、オルガネラの一種である核３９ｂの内部に微小物質を移送する場合について述べたが、ミトコンドリア，葉緑体，小胞体等の脂質２重膜を備えた他のオルガネラの場合も処理工程は前記と同様である。
【００７８】
また、細胞質３９ａに微小物質を移送する場合には、細胞膜にのみ穿孔を施せばよいので穿孔の工程は１回となるが、他の処理操作に関しては前記と同様である。
【００７９】
図１４に示されるマルチチャネル式の段取りを適用し、微小物質移送用ピペット１３’内の電極２０と細胞培養容器３７内の電極２０ｃに代えて微小物質移送用ピペット１３’内の電極２０ａ，２０ｂを用いて微小物質を移送する場合も、実質的に前記と同様の処理操作を適用することが可能である。
【００８０】
また、電極２０のみを内装した微小物質移送用ピペット１３’と細胞培養容器３７中の電極２０ｃを利用して行うシングルチャネル式のピペットエレクトロフォレーシス法においては、図１５に示されるように単一の電極を内装した別のピペット３８を電極２０ｃとして利用する他、図１６に示すように、細胞培養容器３７を構成するマイクロウェル３７ａの底面をＩＴＯ（Indium Tin Oxide）等の透明電極で構成し、この透明電極を各マイクロウェル３７ａに共通の電極２０ｃとして利用したり、あるいは、図１７に示すように各マイクロウェル３７ａの側面に電極２０ｃを設け、これらの電極２０ｃを極性反転スイッチ２５の一方の出力端子に並列的に接続するようにしてもよい。
【００８１】
更には、図１８に示すように、マイクロウェルを備えない通常のディッシュ状の細胞培養容器３７の底面全体を透明電極２０ｃで構成し、複数の細胞３９を載置するようにすることも可能である。
【００８２】
また、細胞培養容器中の対象物保持部としては、前述した細胞付着蛋白質のコーティングや親水性コーティングの他、細胞培養容器３７の底面を構成する電極２０ｃに図１９に示されるようにして孔４０を設け、この電極２０ｃと下面板４１との間に吸引路を形成し、吸引装置４２からの真空引きによって孔４０に細胞３９を固定するといったことも可能である。
【実施例２】
【００８３】
次に、エレクトロポレーション法とエレクトロオズモシスを局限的に適用して細胞または其のオルガネラの隔壁を透過して内部の領域に非イオン性の微小物質を移送する微小物質移送方法（以下、ピペットダイエレクトロフォレーシス法と称する）について説明する。
【００８４】
この場合も、全体的な段取りに関しては図１４あるいは図１５のものを其のまま適用することができるが、ここでは、一例として、図１５に示されるシングルチャネル式の段取りを適用した場合について説明する。
【００８５】
細胞膜や核膜に対しての穿孔に関わる処理は前記と同様である。但し、ここでは非イオン性の微小物質を移送することを前提としており、電極２０や電極２０ｃへの直流電圧の印加によって微小物質が移動することはないので、細胞膜や核膜に対しての穿孔に関わる直流電圧の印加に際して電極２０や電極２０ｃの極性を格別考慮する必要はない。
【００８６】
このように、前記と同様にして細胞膜や核膜に対しての穿孔を終え、微小物質移送用ピペット１３’の先端部が核膜の穿孔部に位置決めされた状態とする。
【００８７】
そして、このピペットダイエレクトロフォレーシス法においては、更に、ジョイスティックコントロールユニット４からの指令で交流電圧印加装置２６を作動させ、微小物質移送用ピペット１３’内の電極２０とピペット３８の電極２０ｃに、予め設定されたパラメータに従って周波数帯の変化パターンや電圧印加時間を調整しながら不均一な交流電圧を印加して非イオン性の微小物質の電気双極子を誘起させ、周辺の電界との相互作用によって引力と斥力を発生させて微小物質移送用ピペット１３’から核３９ｂの内部の領域に微小物質を移送する。
【００８８】
前記と同様、隔壁である細胞膜および核膜の穿孔過程で隔壁の選択箇所にのみ的確に穿孔が施され、更に、微小物質移送用ピペット１３’の先端が核膜の穿孔位置に極めて近接しているので、核３９ｂの内部にのみ的確に微小物質を移送することができる。
【００８９】
しかも、このピペットダイエレクトロフォレーシス法を適用する場合においては、周波数帯の変化パターンや電圧印加時間を調整することにより、無電荷の粒子や表面電荷が同じ粒子のうち移送対象となる微小物質を区別して移送することが可能である。
【００９０】
ピペットダイエレクトロフォレーシス法を適用する場合においても、微小物質それ自体に電気的な移送力が方向性をもって作用するので、微小物質の移送時における微小物質移送用ピペット１３’の先端位置は、核３９ｂの隔壁である核膜よりも多少外側に位置しても構わない。当然、微小物質移送用ピペット１３’の先端を核膜に接触させること、および、核膜よりも内側に突入させることに不都合はない。
【００９１】
このピペットダイエレクトロフォレーシス法においても微小物質それ自体に移送力が作用するので、前記と同様、微小物質の通過が可能な範囲で微小物質移送用ピペット１３’の先端開口部を縮径化することが可能である。
【００９２】
図１４に示されるマルチチャネル式の段取りを適用して微小物質を移送する場合も実質的に此れと同様の処理操作を適用することが可能である。
【実施例３】
【００９３】
次に、ソノポレーション法を局限的に適用して細胞または其のオルガネラの隔壁を透過して内部の領域に非イオン性あるいはイオン性の微小物質を移送する微小物質移送方法（以下、ピペットソノポレーション法と称する）について説明する。
【００９４】
この場合、ピペットホルダー１６内に超音波発振器２１と其のホーン２１ａを内装した微小物質移送用ピペット１３”（図７参照）をマニピュレータ８に装着し、図２０に示すように、超音波発振器２１の電源入力端子を超音波発振器制御装置２７の出力端子に接続して用いることになる。
【００９５】
なお、図２０では、図面の簡略化のため、微小物質移送用ピペット１３”に接続するチューブ１９や微小物質移送用ピペット１３”を取り付けるためのステー２２および細胞培養容器３７を載置するテーブル７に関しては記載を省略し、超音波発振器２１と超音波発振器制御装置２７との電気的な接続状態のみを記載している。
【００９６】
前記と同様、細胞３９は細胞培養容器３７に形成された細胞付着蛋白質のコーティングや親水性コーティング等の対象物保持部によって実質的に細胞培養容器３７に固定され、微小物質移送用ピペット１３”の中には予め移送対象となる微小物質が超音波造影材と共に充填されているものとする。
【００９７】
微小物質移送用ピペット１３”の位置決め操作に関しては前記と同様であり、顕微鏡１１の視野を確認しながらジョイスティックコントロールユニット４を操作してテーブル７の各軸を駆動制御して細胞３９を顕微鏡１１の視野内に納め、更に、顕微鏡１１の視野を確認しながらジョイスティックコントロールユニット４を操作してマニュピレータ８の各軸を駆動制御することで細胞３９の隔壁を構成する細胞膜の所望する位置に微小物質移送用ピペット１３”の先端を位置決めする。
【００９８】
次いで、ジョイスティックコントロールユニット４からの指令で超音波発振器制御装置２７を作動させ、微小物質移送用ピペット１３”内の超音波発振器２１のシグナル印加時間を制御してホーン２１ａを振動させてバブルを生成することで隔壁である細胞膜の選択箇所にキャビテーションを発生させる。そして、バブルが破砕する際の衝撃波で隔壁を破壊することにより微小物質移送用ピペット１３”の先端に位置する隔壁の箇所を弱体化させ、この箇所に局限的に穿孔を施して微小物質移送用ピペット１３”から例えば細胞質３９ａの内部の領域に微小物質を移送する。
【００９９】
キャビテーションを利用した隔壁の破壊に関わる作用原理は従来のソノポレーション法と同様であるが、本実施例においては、微小物質移送用ピペット１３”に内装された超音波発振器２１でホーン２１ａを振動させることによって局限された範囲でキャビテーションを発生させて穿孔を行うようにしているので、穿孔箇所が複数となることはなく、微小物質移送用ピペット１３”の位置決め位置つまり細胞膜の選択箇所に対してのみ的確に穿孔を施して、目的とする箇所に微小物質を移送することができる。
【０１００】
なお、核３９ｂを始めとするオルガネラの内部に微小物質を移送する必要がある場合には、この状態から更に微小物質移送用ピペット１３”の先端を進め、細胞膜の場合と同様にしてオルガネラの隔壁に対しても穿孔を施すようにすればよい。
【０１０１】
隔壁である細胞膜の穿孔過程で隔壁の選択箇所にのみ的確に穿孔が施され、更に、微小物質の移送時点では微小物質移送用ピペット１３”の先端が穿孔位置に極めて近接しているので、細胞３９の内部の目標とする位置に的確に微小物質を移送することができる。
【０１０２】
微小物質の移送が電気的な力に依存するわけではないので移送対象となる微小物質はイオン性であっても非イオン性であっても構わないが、前述したピペットエレクトロフォレーシス法やピペットダイエレクトロフォレーシス法とは違って、微小物質それ自体に方向性をもった移送力が作用するわけではないので、微小物質の移送時における微小物質移送用ピペット１３”の先端は、細胞膜等の隔壁に接触させるか、あるいは、隔壁よりも内側に突入させ、目標とする位置に的確に微小物質を移送することが望ましい。
【実施例４】
【０１０３】
次に、アブレーションを局限的に適用して細胞または其のオルガネラの隔壁を透過して内部の領域に非イオン性あるいはイオン性の微小物質を移送する微小物質移送方法（以下、ピペットパルスレーザー法と称する）について説明する。
【０１０４】
この場合は微小物質移送用ピペット１３（図２参照）をマニピュレータ８に装着し、パルスレーザー制御装置２８で図１３に示されるようなパルスレーザー光源２９を駆動制御する。
【０１０５】
但し、図１３では、図面の簡略化のため、微小物質移送用ピペット１３に接続するチューブ１９や微小物質移送用ピペット１３を取り付けるためのステー２２および細胞培養容器３７を載置するテーブル７に関しては記載を省略し、パルスレーザー光源２９と周辺の光学系のみを記載している。
【０１０６】
前記と同様、細胞３９は細胞培養容器３７に形成された細胞付着蛋白質のコーティングや親水性コーティング等の対象物保持部によって実質的に細胞培養容器３７に固定され、微小物質移送用ピペット１３の中には予め移送対象となる微小物質が媒体と共に充填されているものとする。
【０１０７】
まず、顕微鏡１１の視野を確認しながらジョイスティックコントロールユニット４を操作してテーブル７の各軸を駆動制御して細胞３９を顕微鏡１１の視野内に納め、更に、顕微鏡１１の視野を確認しながらジョイスティックコントロールユニット４を操作してマニュピレータ８の各軸を駆動制御することで細胞３９の隔壁を構成する細胞膜の所望する位置に微小物質移送用ピペット１３の先端を位置決めする。
【０１０８】
そして、更に、テーブル７の移動にマニュピレータ８を同期させて細胞３９と微小物質移送用ピペット１３の先端との相対位置を保持したままテーブル７の各軸を駆動制御してテーブル７を移動させ、レーザーの集光位置を微小物質移送用ピペット１３の先端近傍に合わせる。
【０１０９】
次いで、ジョイスティックコントロールユニット４からの指令でパルスレーザー制御装置２８を作動させ、微小物質移送用ピペット１３の先端近傍の領域にパルスレーザーを集光してアブレーションを生成することにより、隔壁となる細胞膜を衝撃波により局所的に破壊して微小物質移送用ピペット１３から細胞３９の内部領域に微小物質を移送する。
【０１１０】
オルガネラの内部に微小物質を移送する必要がある場合には、この状態から更に微小物質移送用ピペット１３の先端を進め、細胞膜の場合と同様にしてオルガネラの隔壁に対しても穿孔を施すようにすればよい。
【０１１１】
前述したピペットソノポレーション法の場合と同様、隔壁である細胞膜の穿孔過程で隔壁の選択箇所にのみ的確に穿孔が施され、更に、微小物質移送用ピペット１３の先端が細胞膜の穿孔位置に極めて近接しているので、細胞３９の内部の目標とする位置に的確にイオン性あるいは非イオン性の微小物質を移送することができる。微小物質の移送は電気的な力に依存するわけではないので、移送対象となる微小物質はイオン性であっても非イオン性であっても構わないが、微小物質それ自体に方向性をもった移送力が作用するわけではないので、微小物質の移送時における微小物質移送用ピペット１３の先端は、細胞膜等の隔壁に接触させるか、あるいは、隔壁よりも内側に突入させ、目標とする位置に的確に微小物質を移送することが望ましい。
【０１１２】
また、パルスレーザー光源２９としては、ナノ秒未満の時間幅を有するパルスレーザーが望ましく、特に、細胞３９に吸収されない波長で効率的に衝撃波を発生させられることから、フェムト秒チタンサファイアレーザー，フェムト秒イットリビウムレーザー，フェムト秒ファイバーレーザー等が好適である。
【図面の簡単な説明】
【０１１３】
【図１】本発明を適用した一実施形態の微小物質移送方法を実施する際に利用される単一細胞操作支援ロボットの一例を簡略化して示した図である。
【図２】微小物質移送用ピペットの構成例について示した図である。
【図３】ピペット本体側に設けられたストッパを例示した図で、図３（ａ），図３（ｂ）はフランジ状のもの、図３（ｂ）は舌片状のものについて示している。
【図４】ピペットホルダー側の円筒部に設けられたストッパ（段付きの縮径部）を例示した図である。
【図５】ピペットホルダーの構成例を示した図である。
【図６】ピペットホルダー内に電極を内装したピペットの一例を示した図である。
【図７】ピペットホルダー内に超音波発振器を内装したピペットの一例を示した図である。
【図８】電極を内装したピペットホルダーからピペット本体を取り外した状態を例示した図である。
【図９】超音波発振器を内装したピペットホルダーからピペット本体を取り外した状態を例示した図である。
【図１０】マニピュレータの先端に設けられたステーに対する微小物質移送用ピペットの取り付け例を示した図である。
【図１１】微小物質移送用ピペットの別の取り付け例を示した図である。
【図１２】微小物質移送用ピペットの更に別の取り付け例を示した図である。
【図１３】パルスレーザー光源の周辺の構造について簡略化して示したブロック図である。
【図１４】エレクトロポレーション法とエレクトロフォレーシス法を局限的に適用して細胞の内部の領域にイオン性の微小物質を移送する微小物質移送方法、および、エレクトロポレーション法とエレクトロフォレーシス法におけるエレクトロオズモシスを局限的に適用して細胞の内部の領域に非イオン性の微小物質を移送する微小物質移送方法を実施する際の段取り例について示した概念図である（実施例１，実施例２）。
【図１５】エレクトロポレーション法とエレクトロフォレーシス法を局限的に適用して細胞の内部の領域にイオン性の微小物質を移送する微小物質移送方法、および、エレクトロポレーション法とエレクトロフォレーシス法におけるエレクトロオズモシスを局限的に適用して細胞の内部の領域に非イオン性の微小物質を移送する微小物質移送方法を実施する際の他の段取り例について示した概念図である（実施例１，実施例２）。
【図１６】底面に共通電極を設けたウェルを備えた細胞培養容器を利用した場合の段取り例について示した概念図である。
【図１７】側面に電極を設けたウェルを備えた細胞培養容器を利用した場合の段取り例について示した概念図である。
【図１８】通常のディッシュを細胞培養容器として利用した場合の段取り例について示した概念図である。
【図１９】真空引きで細胞を固定するようにした細胞培養容器を利用した場合の段取り例について示した概念図である。
【図２０】ソノポレーション法を局限的に適用して細胞の内部の領域に非イオン性あるいはイオン性の微小物質を移送する微小物質移送方法を実施する際の段取り例について示した概念図である（実施例３）。
【符号の説明】
【０１１４】
１  単一細胞操作支援システム
２  細胞操作部
３  コントローラ
４  ジョイスティックコントロールユニット
５  フットペダル群
６  モニタ
７  テーブル
８  マニピュレータ
９  マニピュレータ
１０  ステージ
１１  顕微鏡
１２  キャピラリー
１３  微小物質移送用ピペット
１３’  電極を内装した微小物質移送用ピペット
１３”  超音波発振器を内装した微小物質移送用ピペット
１４  ピペット本体
１４ａ，１４ｂ，１４ｃ  突起（ストッパ）
１５  円筒部
１５ａ  段付きの縮径部（ストッパ）
１６  ピペットホルダー
１６ａ  ピペットホルダー本体
１７  チューブコネクタ
１８  キャップ部
１８ａ  円錐部
１８ｂ  環状部
１９  チューブ
２０  電極
２０ａ  電極（作用極）
２０ｂ  電極（作用極と対を成す電極）
２１  超音波発振器
２１ａ  ホーン
２２  ステー
２３  枢着手段
２４  直流電圧印加装置
２５  極性反転スイッチ
２６  交流電圧印加装置
２７  超音波発振器制御装置
２８  パルスレーザー制御装置
２９  パルスレーザー光源
３０  スリット
３１  λ／２板
３２  ポラライザー
３３  コリメーターレンズ
３４  ダイクロイックミラー
３５  集光レンズ
３６  プレッシャーインジェクター制御装置
３７  細胞培養容器
３８  ピペット
３９  細胞
３９ａ  細胞質
３９ｂ  核
４０  孔
４１  下面板
４２  吸引装置
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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