(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
マーカー物質としてビオチンを含有する外用製剤を皮膚に適用し、当該外用製剤を適用した皮膚面を複数回テープストリッピングして複数枚のテープストリップ試料を取得し、得られたテープストリップ試料を任意の数のグループに分け、各グループのテープストリップ試料中に含まれているビオチン量を測定することを特徴とする外用製剤の角層貯留性評価方法。
【請求項２】
角層の表層部分に対応するテープストリップ試料のグループと、角層の下層部分に対応するテープストリップ試料のグループに分ける請求項第１項記載の外用製剤の角層貯留性評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、外用製剤の角層貯留性評価方法に関し、更に詳細には、外用製剤の組成の相違による薬剤の角層での貯留性の変化を、安全に評価することのできる外用製剤の角層貯留性評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、皮膚角層における外用製剤の貯留性の評価は、作成した外用製剤に、マーカー物質として蛍光物質あるいは放射性物質等を配合し、これを皮膚に塗布ないし適用した後、一定時間経過後の角層におけるマーカー物質の濃度を蛍光あるいは放射線量を指標にして測定するというものであった。
【０００３】
これらの方法により、外用製剤の貯留性は評価可能ではあるものの、ヒト皮膚での貯留性評価を行うには安全性に問題があった。すなわち、蛍光物質や放射性物質には発癌性の問題があり、これらのものを使用した試験を繰り返し行うことは、人道上の問題ともなりかねないものであった。
【０００４】
しかしながら、人の皮膚での貯留性試験に代えて、動物の皮膚を用いて試験した場合では、種差の問題もあり、正確なものとは言い難かった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従って、人の皮膚で試験することができ、しかも安全性の高い角層貯留性試験方法の開発が求められており、このような試験方法の提供が本発明の課題である。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、水溶性ビタミンであるビオチンは、安全性が高く、しかもこれと特異反応する化合物があり、マーカー物質として利用可能であることに気づいた。更に、ビオチンを皮膚に適用後、複数回のテープストリッピングを行うことにより、表面側から内部に向かって順次、対応する角層を採取することができ、角層での薬剤の貯留性を反映した結果が得られることを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
すなわち本発明は、マーカー物質としてビオチンを含有する外用製剤を皮膚に適用し、当該外用製剤を適用した皮膚面を複数回テープストリッピングして複数枚のテープストリップ試料を取得し、得られたテープストリップ試料を任意の数のグループに分け、各グループのテープストリップ試料中に含まれているビオチン量を測定することを特徴とする外用製剤の角層貯留性評価方法である。
【発明の効果】
【０００８】
本発明方法は、従来使用されていた蛍光物質や放射性物質と比べ、安全性が高いビオチンを使用するため、人の皮膚を使用し、繰り返して外用製剤の角層貯留性を試験することが可能である。また、テープストリッピングを複数回繰り返して行うため、例えば角層の表面側と内部側での薬物貯留性の相違を調べることも可能となる。
【０００９】
このように、本発明により、安全性と高感度検出・簡便性を全て兼ね備えた貯留性評価が可能となるため、新しい化粧料や外用剤の設計に有利に使用することができるものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明を実施するには、まず、マーカー物質としてビオチンを含有する外用製剤を調製し、これを皮膚に適用する。外用製剤としては、ビオチンを皮膚から吸収できるように含むものであれば、特に制約はなく、液剤であっても、クリーム剤、軟膏剤等であっても良い。また、皮膚に適用するにあたっては、貯留性の比較が正しくできるように、適用面積を正確に把握することが好ましく、更に、塗布する手指の影響を防ぐために、ラテックスやビニール製の手袋をして塗布することが好ましい。
【００１１】
次いで、外用製剤を適用した皮膚面を、複数回テープストリッピングして複数枚のテープストリップ試料を取得する。すなわち、粘着性のあるテープを用い、１回毎にテープを代えながらテープストリッピングを行う。このテープストリッピングに使用するテープとしては、ビオチンないしはこれに類似する化学物質が含まれていないものであれば、特に制約なく使用することができ、例えば、一般に市販されているアクリル系粘着剤を使用する粘着テープを使用することができる。
【００１２】
このテープストリップにより、最上部の角層から順次内側の角層が採取される。すなわち、最初のテープストリップで、最上部の角層が剥離、採取され、２回目のテープストリップでは、最上部の角層の直下の角層が剥離、採取されるというように、順次内部の角層が剥離、採取されることになる。そして、角層は、十数層とされるので、これらをすべて採取できる程度の回数のテープストリップを行うことが好ましく、一般には、１５〜２０回程度行われる。このテープストリップは、一般には外用製剤を皮膚に適用後、３０分以上経過してから行うことが好ましい。
【００１３】
上記のようにして得られたテープストリップ試料は、各角層を代表することになるので、各部分での貯留性を調べるためには、任意の数のグループに分けることが好ましい。このグループ分けの仕方は、特に制約があるものではないが、例えば、角層の表層部分に対応するテープストリップ試料のグループと、角層の下層部分に対応するテープストリップ試料のグループに分けることが、それぞれの部分での貯留性を対比するために好ましい。例えば、テープストリッピングを２０回行う場合、始めから５回目までのテープストリップ試料を角層の表層に対応するものとし、それ以降のものを角質下部に対応するものとすることができる。
【００１４】
更に、いくつかのグループとされたテープストリップ試料は、その中に含まれているビオチン量が測定される。この測定に先立ち、ビオチンを角層成分や、粘着剤成分から分離するため、適当な溶媒、例えばエタノール等で抽出することが好ましい。このビオチン量の測定に当たっては、ビオチンと特異的に反応する化合物が使用される。このような化合物の例としては、卵白中に多量に存在するタンパク質であるアビジンや、４'−ヒドロキシアゾベンゼン−２−カルボン酸（ＨＡＢＡ）を挙げることができる。また、その測定方法も、ＥＬＩＳＡ法や、アビジンと反応性を有する蛍光物質であるＨＡＢＡ等を利用したＨＡＢＡ法、乳酸菌を用いた微生物学的定量法などを利用することができる。
【００１５】
以上のようにして測定される角層中のビオチンの量から、外用製剤毎の角質貯留性が判断される。すなわち、実際に使用する薬剤に代えてビオチンを配合した外用製剤では、角層中でのビオチン残存量は、実際の製剤での薬剤の角層での残存程度を意味するものと判断できる。そして、同一量のビオチンを配合した、異なる組成の製剤を皮膚に適用した場合、角質中でのビオチンの残存量の差は、各外用製剤の組成の影響を受けたものと解釈することができる。
【００１６】
従って、実際の薬剤を配合した外用製剤に代えて、マーカー物質としてのビオチンを配合した外用製剤を製造し、本発明方法で角層中のビオチン量を測定することにより、外用製剤の組成の相違による、角層での薬物の貯留性の程度が評価可能となるのである。
【実施例】
【００１７】
次に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例に何ら制約されるものではない。
【００１８】
製  剤  例
ビオチン入り製剤の調製：
下記の各組成により、遊離のビオチンを０.０１％含有するビオチン製剤を調製した。
【００１９】
水溶液製剤：                          （％）
ビオチン                          ０.０１
エタノール                      １０
１，３−ブチレングリコール        ２
グリセリン                        ４
精製水                          残  部
【００２０】
リポソームローション製剤：            （％）
卵黄リン脂質                      ０.０４
コレステロール                    ０.０１
ビオチン                          ０.０１
エタノール                      １０
１，３−ブチレングリコール        ２
グリセリン                        ４
精製水                          残  部
【００２１】
白濁化粧水製剤：                      （％）
油  剤                            ０.０８
セスキオレイン酸ソルビタン        ０.０３
モノオレイン酸ポリオキシ
エチレンソルビタン              ０.０１
ビオチン                          ０.０１
エタノール                        ８
グリセリン                        ２
精製水                          残  部
【００２２】
実  施  例  １
（１）角質試料の採取：
製剤例で得た各ビオチン製剤について、本発明方法による吸収性試験を行った。まず、各ビオチン製剤１００μｌを、皮膚の１.２ｃｍ×５ｃｍの面積に３回塗布した。塗布は、前の塗布製剤が肌に吸収ないしは乾燥したことを確認した後、さらに塗布した。またこの塗布は、ラテックスのグローブを用いて行った。
【００２３】
上記の塗布が終了してから１２時間後に、テープストリッピングによって製剤を塗布した場所の角層を剥離、採取した。テープストリッピングには、粘着剤としてアクリル系のものを使用している、幅１.２ｃｍのスコッチ＊粘着テープ（３Ｍ社製、品番：ＣＨ−１２）を用いた。また、ストリッピングは、１０数層と言われている角層を全て採取するため、１回毎に新しい粘着テープを用い、２０回行った。
*  商標名
【００２４】
（２）ビオチンの抽出：
ストリッピングしたテープから、以下の方法により、過剰量のエタノールを用いてビオチンを抽出した。まず、５０ｍｌのプラスチックチューブに予め１０ｍｌ程度のエタノールを２本準備し、そのうちの１本には、最初に剥離した５枚のテープ試料（角層の表層部分に対応）を、他の１本には、残りの１５枚のテープ試料（角層の下層部分に対応）を入れた。その後、ボルテックスミキサーによって３０００ｒｐｍの速度で１分間×３回に渡り攪拌した。
【００２５】
撹拌終了後、各プラスチックチューブ中のエタノールをロータリーエバポレーターを用いて除き、更に残渣にリン酸バッファー３００μｌを加えてビオチンを再溶解させ、測定試料とした。
【００２６】
（３）ビオチンの検出
各測定試料中のビオチン量は、これと特異的かつ強固に結合するアビジンを用いて測定した。具体的には、以下の定量法により測定した。
【００２７】
まず、９６ウエルプラスチックプレートの各ウエルに、アビジン溶液（１μｇ／ｍｌ）を入れ、４℃で一晩（１２時間程度）静置することにより、プラスチックプレートのウエル（固相）をアビジンでコートした。次いで、ＰＢＳＴ緩衝液（組成：ＮａＣｌ  ８ｇ、ＫＣｌ  ０．２ｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４  １.１５ｇ、ＫＨ２ＰＯ４  ０.２ｇ、Ｔｗｅｅｎ２０  ０.５ｍｌ／１０００ｍｌ精製水  ｐＨ＝７.２−７.４）によって三回洗浄後、ウエルに上記（２）で得た測定試料を加え、室温で３０分静置した。各ウエルをＰＢＳＴで三回洗浄後、リン酸バッファーに溶かしたアルカリホスファターゼ（ＡＰ）とビオチンとを結合させたビオチン化ＡＰ（０.５μｇ／ｍｌ）を加え、室温で３０分静置した。
【００２８】
ウエルを洗浄後、ＡＰの基質となるｐ−ニトロフェニルホスフェート（ｐ−ＮＰＰ）を加え、４０５ｎｍの発色をプレートリーダーで検出した。この発色は、ＡＰがプレ−ト上に保持されている場合に、これにより分解されるｐ−ＮＰＰの分解生成物であるニトロフェノールの発色である。上記の吸光度を、濃度既知のビオチン水溶液を用いて作成した濃度―吸光度の検量線にあてはめ、各試料中のビオチン濃度を算出した。
【００２９】
（４）結果
この結果を図１に示す。この結果から本発明方法により、製剤の相違による角質貯留性の差異、すなわち、リポソームローション製剤は、白濁化粧水製剤にくらべ、薬剤の貯留性が高く、特に表面に近い角層において貯留性が高いことが示されることが明らかになった。
【００３０】
実  施  例  ２
実施例１の（１）ないし（２）で得た測定試料について、以下の４'−ヒドロキシアゾベンゼン−２−カルボン酸（ＨＡＢＡ）を用いる方法（ＨＡＢＡ法）により、ビオチン量を測定した。まず、０.９％のＮａＣｌを含む５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ＝６.０）中に、０.５ｍｇ／ｍｌとなるようアビジンを加えた溶液（試液１）を調製した。別に、１０ｍＭ  ＮａＯＨ水溶液中に、ＨＡＢＡを１０ｍＭとなるように加えた溶液（試液２）と０.９％のＮａＣｌを含む５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ＝６.０）に、ビオチンを０.５ｍＭとなるように加えた溶液（試液３）も調製した。
【００３１】
上記のようにして調製した試液のうち、試液１を３ｍｌとり、これに７５μｌの試液２を加えてブランク液とし、この５００ｎｍの吸光度を測定した。次いで、このブランク液に対して、試料３を２μｌずつ加えて、検量線のサンプルとし、これらのサンプルの吸光度（５００ｎｍ）を測定した。上記ブランクの吸光度およびサンプルの吸光度変化と、ビオチン量から検量線を作成した。
【００３２】
３ｍｌの試液１に、７５μｌの試液２を加えた後、この混合液中に、測定試料を３０μｌ加え、５００ｎｍの吸光度を測定し、その吸光度から上で作成した検量線を利用して測定試料中のビオチン量を算出した。なお、吸光度の変化が小さい場合は、サンプルを１０μｌ程度ずつ追加して測定すれば良い。
【００３３】
上記のようにして、各製剤での角質貯留性の差異を調べた結果、実施例１と同様な結果を得た。すなわち、リポソームローション製剤は、白濁化粧水製剤や水溶液製剤にくらべ、薬剤の貯留性が高く、特に表面に近い角層において貯留性が高いことが示されることが明らかになった
【産業上の利用可能性】
【００３４】
本発明によれば、種々の組成の外用製剤に配合される薬物の角層での貯留性を、簡便かつ安全に評価することができる。しかも、人の皮膚を用いた評価を行うため、温度、湿度、時刻など、人のおかれた環境に応じた製剤の貯留性を評価することが可能である。
【００３５】
従って本発明は、化粧品や医薬の分野において、新しい化粧料や外用剤の組成設計に有利に使用することができるものである。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】リポソームローション製剤、白濁化粧水製剤および水溶液製剤での角層貯留性を比較した図面である。
【図１】
0004690174.tif 000002