(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
−Bifidobacteria属、Lactobacillus bulgaricus、Lactobacillus acidophilus、Lactobacillus casei、Lactobacillus plantarum、Streptococcus faeciumおよびStreptococcus thermophilusから選択される細菌、
−プレバイオティック、
−Bacillus pasteurii、Sporosarcina ureaeおよびLactobacillus acidophilusから選択される細菌、
−イナゴマメゴム、サイリウム繊維、グアールガムから選択される吸水剤
を含む、マイクロカプセル化および腸溶コーティングされた、毒素と代謝老廃物の蓄積および好ましくない菌の異常増殖を抑制するための医薬組成物。
【請求項２】
無機リン酸塩吸着剤および尿素以外の特定の尿毒素溶質吸着剤をさらに含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
無機リン酸塩吸着剤が、水酸化アルミニウムゲル、水酸化カルシウムゲル、水酸化マグネシウムゲルから選択され、特定の尿毒素溶質吸着剤が活性炭である、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
プレバイオティックが、フルクタンオリゴ糖およびアラバンオリゴ糖から選択される、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項５】
Lactobacillus acidophilusを含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項６】
腎機能不全、尿素代謝の先天異常を予防、軽減または治療するための、請求項１〜５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
尿毒症の症状を軽減するための、請求項１〜５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、毒素や他の代謝老廃物を除去し、望ましくない細菌の異常増殖を減少、遅延させることで、腎疾患、肝疾患、胃腸疾患を治療するための医薬組成物とその組成物の使用方法に関するものである。１つの実施例では、この医薬組成物がプロバイオティック、プレバイオティック、好アンモニア性菌、吸着剤を含み、そのすべてがマイクロカプセル化および／または腸溶コーティングされている。代わりに、プロバイオティック、プレバイオティック、好アンモニア性菌を一緒にマイクロカプセルとしたゼラチンカプセルに入れて投与し、必要であれば吸着剤をマイクロカプセル化および／または腸溶コーティングされた製剤で別に投与してもよい。これらの医薬組成物は、腎疾患、肝疾患、消化管における細菌の異常増殖の治療に有用である。
【背景技術】
【０００２】
腎疾患は米国の主要疾患の第４位を占め、２０００万人以上の米国人を苦しめている。毎年９０，０００人以上の患者が腎疾患のため死亡している。最近では、慢性腎疾患の患者数が年間約１１％上昇した。毎年透析を受けている米国人約８０，０００人が様々な合併症により死亡し、毎年２７，０００人以上が腎移植の待機者名簿に載せられているが、移植を受けられる患者はこのうち約１１，０００人のみである。さらに、約２５０，０００人の米国人が末期腎不全（ＥＳＲＤ）に罹患し、これは慢性腎疾患の最終段階である。
【０００３】
正常な健常人では、代謝老廃物の窒素が主に腎臓から尿中に尿素として排泄される。しかし、腎疾患や尿素サイクル酵素に欠陥がある先天異常などの多数の疾患患者では、老廃物の窒素が体内に蓄積し、毒性症状を表す。高アンモニア血症（Ｈｙｐｅｒａｍｍｏｎｉｕｍ）は精神遅滞、重篤な症例では昏睡状態に至る可能性がある。
【０００４】
現在、その治療法は血液透析あるいは腹膜透析、腎移植のみである。しかし、これらの治療法の経済費用は非常に高い。例えば、１９９６年、米国のみでＥＳＲＤの年間治療費が１４０億ドルを超えた。医療予算の低い発展途上国や低発達国では、費用が高いためにＥＳＲＤ患者がそのような治療を受けることができない。従って、尿毒症治療には代わりの治療法が必要である。
【０００５】
腎機能の代用に腸を利用することを基本として、多くの治療が試みられた。正常の消化プロセスでは、消化管が血流に栄養素と水を運び、老廃物と未消化の物質を腸から除去する。腸壁は栄養素、電解質、水、胆汁酸などの特定の消化剤を制御している。腸壁は小分子を腸管から血流に通過させ、大分子が血液循環に入らないようにする半透膜としても機能している。
【０００６】
尿素、クレアチニン、尿酸などの窒素老廃物は、いくつかの他の低分子量、中分子量化合物とともに小腸に流れ、小腸上皮で平衡化する。腸管透析の研究からは、１日に尿素７１グラム、クレアチニン２．９グラム、尿酸２．５グラム、リン酸塩２．０グラムが腸液に流れることが示された（Ｓｐａｒｋｓ，Ｒ．Ｅ．Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．Ｓｕｐｐｌ．１９７５  Ｓｕｐｐｌ  ３，７：３７３−３７６）。それに応じて、消化管から尿毒性老廃物を排泄するために、外腸瘻、腸管透析、下痢の誘導、経口吸着剤の投与、カプセル化したウレアーゼ酵素など、様々な侵襲性、非侵襲性の試みがなされた（Ｔｗｉｓｓ，Ｅ．Ｅ．ａｎｄ  Ｋｏｌｆｆ，Ｗ．Ｊ．ＪＡＭＡ  １９５１  １４６：１０１９−１０２２；Ｃｌａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｒａｎｓ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ａｒｔｉｆ．Ｉｎｔｒｎ．Ｏｒｇａｎｓ  １９６２  ８：２４６−２５１；Ｐａｔｅｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｒａｎｓ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ａｒｔｉｆ．Ｉｎｔｒｎ．Ｏｒｇａｎｓ  １９６５  １１：２９２−２９５；Ｓｈｉｍｉｚｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｂｓｔｒａｃｔｓ  １９５５  １０３：１２９００４；Ｋｊｅｌｌｓｔｒａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｒａｎｓ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ａｒｔｉｆ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｏｒｇａｎｓ  １９８１２７：２４−２９；Ｋｏｌｆｆ，Ｗ．Ｊ．Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．１９７６  １０：Ｓ２１１−Ｓ２１４）。
【０００７】
活性炭は、尿毒症の治療で検討された初の経口吸着剤であった。活性炭は非常に多孔質の物質で、木、石油、石炭、ピート、ココナッツの殻などの有機物を炭化した後、蒸気、二酸化炭素、塩化亜鉛などの化学物質により活性化することで、表面積を大きくしている。活性炭の溶質吸収は、バルク相の溶質濃度、溶質の化学的性質、温度、ｐＨなど、多数の要因に依存する。ただし、一般に活性炭は極性の溶質よりも非極性の溶質を結合しやすい。ｉｎ  ｖｉｖｏ研究では、４５０ｍｇのクレアチニンを除去するため、１９０グラムの活性炭が必要であった（Ｇｏｌｄｅｎｈｅｒｓｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．１９７６  １０：８２５１−８２５３）。このように効率が低下したのは、コレステロールや関連する胆汁酸など、他の親油性化合物が吸着したためと考えられる（Ｋｏｌｆｆ，Ｗ．Ｊ．Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．１９７６  １０：８２１１−８２１４；Ｇｏｌｄｅｎｈｅｒｓｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．１９７６  １０：８２５１−８２５３）。活性炭をマイクロカプセルに封入すると、必要な活性炭量が５０グラムに減少することが示された（Ｇｏｌｄｅｎｈｅｒｓｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．１９７６  １０：８２５１−８２５３）。
【０００８】
ＡＳＴ−１２０は、ポーラスカーボン０．２〜０．４ｍｍを自社独自に特別に調整、コーティングした物質であり、より効果の高い活性炭を基本とした吸着剤であることが証明された。腎摘出術を施したラットおよび尿毒症患者２７名において、尿毒症患者に３．２〜７．２グラムを投与すると、クレアチニンの血清濃度上昇を遅延させ、腎機能不全の発症を遅らせることが示された（Ｏｗａｄｕ，Ａ．ａｎｄ  Ｓｈｉｉｇａｉ，Ｔ．Ａｍ．Ｊ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．１９９６  １６（２）：１２４−７；Ｏｋａｄａ，Ｋ．ａｎｄ  Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｓ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．Ｄｉａｌ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．１９９５  １０（５）：６７１−６）。ＡＳＴ−１２０を経口吸着剤としても、腎不全の進行を遅くする（Ｍｉｙａｚａｋｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ｎｅｐｈｒｏｌ  Ｄｉａｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ２０００  Ｎｏｖ；１５（１１）．１７７３−８１）。
【０００９】
いくつかの研究では、オキシスターチ（ｏｘｙｓｔａｒｃｈ）とも呼ばれるジアルデヒドデンプンを摂取すると、非タンパク性窒素の排泄が亢進することが示された（Ｇｉｏｒｄａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｕｌｌ．Ｓｏｃ．Ｉｔａｌ．Ｂｉｏｌ．Ｓｐｅｒ．１９６８  ４４：２２３２−２２３４；Ｇｉｏｒｄａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．１９７６  １０：Ｓ２６６−８２６８：Ｆｒｉｅｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｃｌｉｎ．Ｄｉａ．Ｔｒａｎｓ．Ｆｏｒｕｍ  １９７７  ７：１８３−１８４）。尿毒性溶質の吸収が簡単な可逆性の物理プロセスである活性炭とは異なり、ジアルデヒドデンプンは２つのアルデヒド基の共有結合が関与する化学吸着により、尿素およびアンモニアと結合する。ただし、活性炭と同様、非常に多量のオキシスターチ約３０〜５０グラムを摂取しても、尿素１．５グラムしか除去することができない。ジアルデヒドデンプンと活性炭をともに摂取させた別の研究では、尿毒性老廃物の除去にいくらか改善が示された（Ｆｒｉｅｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｃｌｉｎ．Ｄｉａ．Ｔｒａｎｓ．Ｆｏｒｕｍ  １９７７  ７：１８３−１８４）。さらに、ゼラチンとアルブミンでコーティングしたジアルデヒドデンプンでは、コーティングしていないジアルデヒドデンプンと比べ、６倍の吸収性が得られた（Ｓｈｉｍｉｚｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｂｓｔｒａｃｔｓ  １９８２  ９７：２２２９０３）。つい最近では、キトサンでコーティングしたオキシセルロースあるいはセルロールジアルデヒドを投与後、慢性腎不全の進行が遅くなることが示された（Ｎａｇａｎｏ  ａｌ．Ｍｅｄｌｉｎｅ  Ａｂｓｔｒａｃｔ  ＵＩ  ９６０５８３３６  １９９５）。
【００１０】
天然の炭水化物を基盤とした重合体経口吸着剤であるイナゴマメゴムは、尿毒症患者に綿実油中、２５グラム／日で投与すると、多量の尿素、クレアチニン、リン酸塩を除去することも証明された。さらに、イナゴマメゴムは水中でそれ自体の重量の約１０倍吸収する（Ｙａｔｚｉｄｉｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ  １９７９１１：１０５−１０６）。アラビアゴム繊維を食事から補給すると、低タンパク食を摂取している慢性腎不全患者において、糞便中の窒素排泄量が増加し、血清窒素濃度を低下させることも示された（Ｂｌｉｓｓ  ｅｔ  ａｌ．Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．１９９６  ６３：３９２−９８）。
【００１１】
アンモニアを結合する非吸収性経口吸着剤として、カプセル化したウレアーゼ酵素も検討された。初期の研究では、リン酸ジルコニウムとカプセル化したウレアーゼ酵素がアンモニアを結合する非吸収性経口吸着剤として使用された（Ｋｊｅｌｌｓｔｒａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｒａｎｓ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ａｒｔｉｆ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｏｒｇａｎｓ  １９８１  ２７：２４−２９）。カプセル化したウレアーゼを用いて尿素をアンモニアに加水分解し、そのアンモニアをクエン酸で中和する、液体膜カプセル装置（ｌｉｑｕｉｄ−ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｃａｐｓｕｌｅ  ｄｅｖｉｃｅ）についても検討された（Ａｓｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．１９７６  １０：８２５４−８２５８）。土壌中の細菌も、代謝サイクルで利用できるアミノ酸として尿素を再利用するために用いられた（Ｓｅｔａｌａ，Ｋ．Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔｌ  Ｓｕｐｐｌ．１９７８  ８：８１９４−２０２）。
【００１２】
さらに、遺伝子組換えＥ．ｈｅｒｂｉｃｏｌａ細胞をカプセルに封入し、これが腸から排泄される前にアンモニアを細胞が利用できるアミノ酸に変換することが証明された。マイクロカプセルに封入した遺伝子組換えＥｓｃｈｅｒｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ５細胞も、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ系および尿毒症ラットの動物モデルにおいて、尿素とアンモニア除去に効果的であることが示された（Ｐｒａｋａｓｈ，Ｓ．ａｎｄ  Ｃｈａｎｇ，Ｔ．Ｍ．Ｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １９９５  ４６：６２１−２６；Ｐｒａｋａｓｈ，Ｓ．ａｎｄ  Ｃｈａｎｇ，Ｔ．Ｍ．Ｓ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．１９９６２：８８３−８８７）。しかし、遺伝子組換え菌を投与することは、規制上、安全上の懸念を生じ、患者の服薬不履行につながるおそれのある、倫理的問題を生じる。
【００１３】
さらに、腎不全を効果的に治療するためには、少なくとも１０〜２５．０グラムの尿素、１．０〜２．５グラムのクレアチニン、０．７〜１．５グラムの尿酸を除去する必要があると推定されている。従って、患者の尿毒症症状を軽減するためには、高濃度で複数の尿毒症毒素を除去する、より効果的な治療法が必要である。
【００１４】
小腸の細菌異常増殖（ｓｍａｌｌ  ｂｏｗｅｌ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｏｖｅｒｇｒｏｗｔｈ：ＳＢＯ）は、糸球体濾過量が２０ｍｌ／分未満に低下する、腎不全進行時の別の臨床徴候である。窒素老廃物が腸に流入する結果、顕著な細菌の異常増殖がみられ、有益な細菌と病原性でアミン、ニトロソアミン、フェノール、インドール誘導化合物などの発癌性、変異原性化合物などの二次性毒物を産生することができる菌が同時に変化する。
【００１５】
ヒトの消化管には、多数の様々な細菌が含まれる複雑な微生物生態系がある。ヒトの消化管に生息する細菌集団は、消化管の機能に大きく影響し、そのためヒトの健康、幸福にも大きく影響する。この中で、日和見性であるか、有害と考えられ、下痢、感染症、胃腸炎、内毒素症などの有害な病状を引き起こす細菌もあれば、「プロバイオティック」と考えられ、ヒトの微生物に有益な機能を示す細菌種もある（Ｈｏｌｚａｐｆｅｌ  ＷＨ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｆｏｏｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １９９８  Ｍａｙ  ２６；４１（２）：８５−１０１）。
【００１６】
プロバイオティック菌の中で、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ属は最も重要である。Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ属は生存し成長可能な場合、免疫系を刺激し、病原菌や腐敗菌を競合的に排除し、血中のアンモニアとコレステロール量を低下させ、ミネラル吸収を促進する。さらに、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ属は前発癌物質を発癌物質に変換する酵素の活性を抑制することで、大腸癌の予防作用を示すことが指摘されてきた（ｖｏｎ  Ｗｒｉｇｈｔ，ｅｔ  ａｌ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  Ｈｅｐａｔｏｌ  １９９９  Ｎｏｖ；１１（１１）：１１９５−１１９８）。
【００１７】
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍなどの乳酸菌、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓもプロバイオティック菌である。これらの細菌は病原菌に対して拮抗作用を示し、免疫系を刺激、乳糖の消化を改善、脂肪をより消化しやすくする脂肪分解能（ｌｙｐｏｌｙｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）を示し、コレステロールの血漿値を低下させ、腸粘膜を保護して栄養物質を均一に混成し、一部の腫瘍で活性化する多糖類を産生し、前発癌物質から発癌物質への変換を触媒する一部の酵素産生菌の活性度を低下させる。
【００１８】
プロバイオティック菌は相乗的な作用を示し、腸の病原菌／有害菌の成長を抑え、遅延させると考えられている（Ｍａｒｔｅａｕ，ＰＲ  ｅｔ  ａｌ．Ａｍ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｎｕｔｒ  Ｆｅｂ；７３（２  Ｓｕｐｐｌ）：４３０Ｓ−４３６Ｓ；Ｃｕｍｍｉｎｇｓ  ＪＨ，ｅｔ  ａｌ．Ａｍ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｎｕｔｒ  ２００１  Ｆｅｂ；７３（２  Ｓｕｐｐｌ）：４１５Ｓ−４２０Ｓ）。
【００１９】
抗生物質治療やその他の治療を受けている患者、炎症性腸疾患、腎疾患、肝疾患に罹患している患者では、腸の細菌フローラが減少するか、不均衡となるか、除去されている可能性がある。さらに、正常な老化においてもＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ属数が減少し、同時に病原菌と腐敗菌の濃度が上昇することが示された（Ｏｒｒｈａｇｅ  Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．  Ｄｒｕｇｓ  Ｅｘｐ  Ｃｌｉｎ  Ｒｅｓ  ２０００；２６（３）：９５−１１１）。
【００２０】
また、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属などの微生物の有益な作用は、一部、大腸に存在し、プレバイオティックとして知られる、消化できない糖を発酵する作用によるものであることが知られている。プレバイオティックは消化できない食品成分であり、１種類あるいは限られた数の結腸細菌の成長や活性を選択的に刺激することで、宿主に有益に作用する。プレバイオティックは典型的には比較的短鎖の炭水化物と考えられている。プレバイオティックは、デンプン以外の多糖類、糖アルコール、耐性デンプン（ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｓｔａｒｃｈ）など、盲腸に到達する他の炭水化物と同様、発酵される物質である。しかし、そのミクロフローラに対する選択的な作用は特殊である。効果を発揮するためにはプレバイオティックは盲腸に到達する必要がある（Ｂｅｚｋｏｒｏｖａｉｎｙ，Ａ．Ａｍ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｎｕｔｒ  ２００１  Ｆｅｂ；７３（２  Ｓｕｐｐｌ）．３９９Ｓ−４０５Ｓ）。
【００２１】
最も優れたプレバイオティック作用を示すと考えられる、消化されないオリゴ糖は、イヌリン型のフルクタンであり、ｉｎ  ｖｉｖｏで胃酸と膵酵素による消化に耐性を示す。純培養では、ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ属のほとんどがこれらの消化されないオリゴ糖を利用できるように適応している。しかし、他の多くの細菌もこれらのオリゴ糖を代謝することができる。イヌリンおよびオリゴフルクトースあるいはラクツロースを対照食に添加した場合、結腸のｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ属数が有意に増加することが認められ、このような変化は腸のミクロフローラを変化させることで結腸と全身の健康を促進するように思われる。イヌリンおよびオリゴフルクトースは、結腸のミクロフローラで急速かつ完全に発酵され、発酵産物は酢酸と他の短鎖脂肪酸である。イヌリン、乳糖、他の吸収されない炭水化物の効果は、これらが二糖あるいはオリゴ糖であり、ヒトの消化管にはこれらを加水分解する酵素ジサッカリダーゼがないという事実に由来する。従って、これらの発酵性炭水化物は消化されず、無変化で結腸に入る。結腸では、生息するフローラが酵素ジサッカリダーゼを持ち、これらのオリゴ糖あるいは二糖を加水分解し、エネルギーとして、また成長のために利用することができる。この過程の中で、フローラは腸の内容物を酸性化する多量の短鎖脂肪酸を産生し、浸透圧の機序により腸の内壁に水を取り入れて緩下作用を示し、異常増殖を予防、アンモニアや他の老廃物の窒素生成物除去を促進する。ラクツロースと同様、糞便の生物量を増加させることもでき、これによりアンモニアが取り込まれ、細菌がタンパク質を合成し、アンモニウムイオンに変換する。細菌の増殖と発酵を刺激する際、プレバイオティックは用便習慣にも影響し、軽度の緩下作用を示す（Ｊｅｎｋｉｎｓ，ＤＪ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｎｕｔｒ  １９９９  Ｊｕｌ；１２９（７  Ｓｕｐｐｌ）：１４３ＩＳ−１４３３Ｓ）。
【００２２】
米国特許５，７３３，５６８号では、マイクロカプセルに封入した乳酸桿菌属を抗生物質に関連した下痢や他の急性、慢性下痢の治療、皮膚や腟の酵母菌感染に利用する方法について示している。マイクロカプセル化により桿菌の不活化が妨げられ、腸に輸送するとともに、上述の下痢で見られる乳糖不耐症を回避すると言われている。
【００２３】
米国特許５，０３２，３９９号では、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ属を腸の粘膜に付着させることで、有益な細菌数を減少させる抗生物質投与の胃腸系副作用を軽減させる利用法について示している。
【００２４】
米国特許５，５３１，９８８号では、有益な細菌に加え、栄養補助食品成分に免疫グロブリンを使用する方法について示している。
【００２５】
米国特許５，８４０，３１８号でも、動物の免疫系を調節することができる有益な細菌組成について示している。
【００２６】
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓなどのプロバイオティックを使用すると、細菌の異常増殖および尿毒症毒素や発癌性化合物の蓄積を抑制することが指摘されている。尿毒症患者の食事中に吸収されない炭水化物を含めると、糞便中の窒素が増加することも示されている。また、ラクツロースと食物繊維を使用すると、血漿中の尿素が１１〜２７％減少し、糞便中の窒素排泄量が３９〜６２％に増加することが示された（Ｗｒｏｎｇ，Ｏ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２−３，１９９７）。
【００２７】
しかし、これら先行技術のアプローチの主な欠点は、尿毒性溶質や毒素を個別に扱う傾向があることである。しかし、実際、腎疾患、肝疾患、胃腸疾患、障害の適切な臨床処置では、複数の症状を軽減させることが必要である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２８】
本発明の目的は、腎機能不全、肝機能不全、尿代謝の先天異常、胃腸疾患に対する総合的な、腸を基本とした低費用の代替治療を提供することである。先行技術と異なり、本発明では１つ以上の症状が同時に軽減される。さらに、正常な健康状態を回復する上で、腸の細菌フローラの有益な作用を利用している。  
【課題を解決するための手段】
【００２９】
従って、本発明では、有益な細菌と有害な細菌の正常なバランスを回復させ、正常なタンパク質代謝の過剰な尿素老廃物を除去することで弱っている腎臓の負担を軽減し、アンモニアを除去して精神遅滞と関連疾患を回避するためのプロバイオティックを含む医薬組成物を示す。本発明の医薬組成物には、有益な細菌群を刺激し、尿素やアンモニアなどの窒素源が効率的に利用されるように、プロバイオティックの活性度を確保するプレバイオティックも含まれる。さらに、本医薬組成物には高アルカリ性ｐＨに安定で、高ウレアーゼ活性を持つ好アンモニア性尿素分解性菌が含まれてもよい。いくつかの実施例では、プロバイオティックが有益な細菌と有害な細菌の正常なバランスを回復させ、正常なタンパク質代謝の過剰な尿素老廃物を除去することで弱っている腎臓の負担を軽減し、アンモニアを除去して精神遅滞と関連疾患を回避するように機能するとともに、好アンモニア性尿素分解性菌として作用することができる。
【００３０】
１つの実施例では、本発明の医薬組成物は、さらに下痢と腎機能不全において水分を除去する吸水剤、他の窒素代謝老廃物、尿酸、クレアチニン、グアニジンなどの細菌の異常増殖による生成物、フェノールおよびインドールを除去する吸着剤の混合物、リン酸塩バランスを維持する無機リン酸塩吸着剤をさらに含んでもよい。好適な実施例では、活性炭と無機リン酸塩吸着剤を合わせて相乗作用を示す組成とし、プロバイオティックおよびプレバイオティックと関連した２成分の相対比を低下させる。さらに、プロバイオティックおよびプレバイオティックはほとんどの尿素を除去し、細菌の異常増殖を抑え、他の正常な窒素老廃物や細菌の最終生成物の量を最小限とするため、先行技術の組成と比べ、活性炭および無機吸着剤は少なくて済む。
【００３１】
代わりに、プロバイオティック、プレバイオティック、好アンモニア性菌を含む医薬組成物は、疾患の進行による尿毒症の急性、慢性症状がみられる患者に予防的に利用することができ、吸水剤や、吸着剤混合物と無機リン酸塩吸着剤の混合物は、下痢などの胃腸疾患の管理に必要な場合にのみ、別に投与してもよい。
【００３２】
本発明の医薬組成物は、それを必要とする患者の回腸あるいは結腸に輸送するため、腸溶コーティングあるいはマイクロカプセル化することが好ましい。
【発明の効果】
【００３３】
本医薬組成物は、腎疾患患者の透析を予防するか、透析が必要となる時期を遅らせ、透析の回数および／または期間を短縮させるために特に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３４】
腎不全時には糸球体濾過量が低下し、腎臓が血液の恒常性を維持することができない。水、ナトリウム、カリウム、カルシウム、その他の塩の恒常性バランスを保つことができず、窒素老廃物が排泄されない。水が貯留されると浮腫が生じ、水素イオン濃度が上昇するにつれ、アシドーシスが生じる。窒素老廃物が蓄積し、血液と組織が尿毒症と呼ばれる状態になる。尿毒症毒素は、（Ｉ）健康な腎臓では正常に排泄され、（ｉｉ）腎不全が発症すると進行的に蓄積して濃度が上昇し、（ｉｉｉ）様々な生理的、生化学的機能を阻害する溶質と定義することができる。全体として、尿毒症毒素は尿毒症症候群を構成する、複雑な臨床症状に寄与している。尿毒症毒素の例としては、アンモニア、尿素、クレアチニン、フェノール、インドール、中分子量分子などがあるが、これだけに限らない。より具体的には、尿毒症において、血清クレアチニン、血中尿素窒素（ＢＵＮ）、尿酸や、Ｎ−メチルグアニジン（ＮＭＧ）、グアニジノコハク酸（ＧＳＡ）などのグアニジノ化合物が有意に変化し、酸塩基平衡、電解質、水貯留の異常が伴う。さらに、尿毒症毒素として同定されている既知、未知の低分子量、中分子量物質がいくつかあり、これらも蓄積する。治療を行わないと、アシドーシスおよび尿毒症は昏睡状態を引き起こし、最終的に死亡に至る可能性がある。
【００３５】
さらに、代謝老廃物のクリアランスが悪い結果、何らかの代償性、適応性のプロセスがみられ、これがさらに病状を悪化させる。例えば、腎臓の機能が２０％未満に低下し、血清のクレアチニンレベルが８ｍｇ／ｄｌに上昇すると、腸の正常な細菌フローラが異常増殖する。続いて、この細菌の異常増殖により正常な物質の代謝が亢進し、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、フェノール、インドール代謝物など、様々な毒性アミンが生じる。小腸の細菌増殖が亢進すると、アンモニアの放出が増し、これが腸肝循環に入り、尿素に変換される。
【００３６】
腎透析の導入は、腎不全の臨床治療と尿毒症の解明を急速に進歩させることに貢献した。血清クレアチニンレベルが４００μｍｏｌ／Ｌ未満の軽度腎不全の場合、この患者では透析や腎移植などの腎臓置換療法は必要ない。しかし、一般に血清クレアチニンレベルが９００μｍｏｌ／Ｌに上昇すると、生存のためには定期的な透析あるいは腎移植が必要となる。
【００３７】
ＥＳＲＤ患者に対して透析を生涯行うこともできる。通常、透析を受けている尿毒症患者では、リン酸レベルの上昇を軽減するため、酢酸カルシウム、炭酸カルシウム、水酸化アルミニウムなどのリン酸結合剤が処方される。しかし、一般的に透析は非常に高価、不便であり、時間がかかり、時に１種類以上の副作用を生じることがある。腎臓移植が成功すれば、患者はより少ない長期的費用でより正常な生活を送ることができる。しかし、移植手術、快復期、拒絶反応抑制剤が継続して必要であることに伴い、費用も高くなる。さらに、多くの場合、適切な臓器提供者が不足している。そのため、代わりの治療戦略が必要である。
【００３８】
本発明は、尿毒症の軽減に利用する、プロバイオティック、プレバイオティック、高ウレアーゼ活性を持つ好アンモニア性菌、クレアチニン、尿酸、フェノール、インドール、中分子量分子、無機リン酸塩などの尿毒症毒素に特異的な吸着親和性を持つ吸着剤の混合物、また吸水剤を含む医薬組成物に関するものである。好適な実施例では、この組成物は、プロバイオティック菌、イヌリン、フルクタンオリゴ糖、ラクツロース、その他の野菜繊維などのプレバイオティック、高アルカリ性ｐＨに安定で、高ウレアーゼ活性を持つ好アンモニア性尿素分解性菌、クレアチニンと尿素に特異的な吸着親和性を持つイナゴマメゴムなどの吸着剤、クレアチニン、グアニジン、フェノール、インジカン、中分子量の不特定化合物に特異的な吸着親和性を持つ活性炭、サイリウム繊維、グアールガム、イナゴマメゴムなどの吸水剤を含む。
【００３９】
プロバイオティックの細菌源が、好ましくは細菌あるいは患者が利用できるアミノ酸まで、尿素とアンモニアを代謝することができることが望ましい。この能力を示す模範的な細菌種は、Ｂｉｆｉｄｉｕｍ菌種および乳酸桿菌属である。
【００４０】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｓｔｅｕｒｉｉおよびＳｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ  ｕｒｅａｅは土壌菌に近く、いずれも尿素に高い結合力を示す。これらの細菌には病原性がなく、安全である。さらに、これらの細菌は高アンモニウムイオン濃度、高アルカリ性ｐＨでよく繁殖し、腸、特に尿毒症の状態で存在する。Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｓｔｅｕｒｉｉおよびＳｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ  ｕｒｅａｅではアンモニウムイオンの蓄積が起こらず、細胞膜のアンモニアの受動拡散に依存している。Ｂ．ｐａｓｔｅｕｒｉｉおよびＳ．ｕｒｅａｅはいずれもアンモニウムイオンに対する親和性が低く、Ｋｍ値はそれぞれ５５．２ｍＭ、３６．７ｍＭである。中性ｐＨおよび２ｍＭという低アンモニウム濃度でのみ繁殖できる病原菌Ｐ．ｖｕｌｇａｒｉｓとは対照的に、Ｂ．ｐａｓｔｅｕｒｉｉおよびＳ．ｕｒｅａｅは高いアンモニウム濃度（４０ｍＭ）と高アルカリ性ｐＨが必要である（Ｋａｌｔｗａｓｓｅｒ，Ｍｏｒｓｄｏｒｆ  Ｇ．Ｈ．Ａｒｃｈ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １９８９；  １５２（２）：１２５−３１）。さらに、Ｓｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ  ｕｒｅａｅのウレアーゼには、ｐＨ７．５で毎分９３００Ａｍｏｌ以上の尿素分解を行う、特異的活性があることが知られている。
【００４１】
従って、本発明の好アンモニア性菌として有用な好適細菌源の例として、Ｓｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ  ｕｒｅａｅ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｓｔｅｕｒｉｉ、調整した乳酸桿菌属、バシラス属、新規乳酸桿菌属ＫＢ−Ｉ、その他適切なバシラス属などがあるが、これだけに限らない。
【００４２】
いくつかの実施例では、プロバイオティックが有益な細菌と有害な細菌の正常なバランスを回復させ、正常なタンパク質代謝の過剰な尿素老廃物を除去することで弱っている腎臓の負担を軽減し、アンモニアを除去して精神遅滞と関連疾患を回避するように機能するとともに、好アンモニア性尿素分解性菌として作用することができる。従って、この実施例では別に好アンモニア性尿素分解性菌は必要ない代わりに、プロバイオティックと好アンモニア性尿素分解性菌が同一の細菌種となる。
【００４３】
これらの混合物を含む組成物は、腸溶コーティングおよび／またはマイクロカプセル化される。本組成物の腸溶コーティングは、尿毒性溶質などの分子の再吸収が最大限であることが分かっている回腸および結腸に吸着剤と細菌源を輸送するように特別にデザインされている。これは、ｐＨ７．５以上で分解、溶解する腸溶性物質により達成することが望ましい。そのような特徴を持った腸溶コーティングの例としては、ゼイン、ポリグリコ乳酸（ｐｏｌｙｇｌｙｃｏｌａｃｔｉｃ  ａｃｉｄ）、ポリ乳酸、乳酸・グリコール酸共重合体（ｐｏｌｙｌａｃｔｉｄｅ−ｃｏ−ｇｌｙｃｏｌｉｄｅ）、同様のコーティング剤が含まれるが、これだけに限らない。また腸溶コーティングは、標的部位に届く前に吸着剤に様々な消化物質を結合させることなく、比較的そのままの状態で作用部位に吸着剤を輸送することができる。
【００４４】
代わりに、本発明の組成物をマイクロカプセルに封入し、Ｃｈａｎｇ，Ｔ．Ｍ．Ｓ．が報告しているとおり、本組成物を微細な透析ユニットのように作用させることができる（Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｃｅｌｌｓ，  Ｃｈａｐｔｅｒ  ５，ｉｎ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ，ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｌｉｍ，Ｆ．ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  Ｆｌｏｒｉｄａ，ｐｐ  ８６−１００）。この実施例では、組成物を非吸収性のポリマー化合物でコーティングし、小分子および中分子のみを溶媒と細菌の混合物があるコアに入れる。マイクロカプセル用の非吸収性ポリマーコーティングの例としては、アルギン酸塩／アルギン酸、キトサン、酢酸フタル酸セルロース、ヒドロキシエチルセルロース、同様のコーティング剤が含まれるが、これだけに限らない。マイクロカプセル化は、吸着剤の効率を大幅に低下させる高分子や他の消化物質の結合を阻害し、尿毒性溶質を吸着剤混合物に特異的に吸収させる。吸着剤混合物が複数の尿毒性溶質を吸収し、細菌が尿素やアンモニア＋尿素を代謝したマイクロカプセルは、腸を通過し、腸からそのまま排泄される。従って、この実施例では、細菌源がマイクロカプセル内に留まるため、この細菌による微生物感染の可能性から患者を保護する。
【００４５】
本発明の好適な実施例では、その医薬組成物はマイクロカプセル化も腸溶コーティングも両方されている。
【００４６】
本発明の医薬組成物には、さらに水酸化アルミニウムゲル、炭酸カルシウム、酢酸カルシウムなどのリン酸結合剤、水酸化マグネシウムゲル、サイリウム繊維、イナゴマメゴム、グアールガム、加工デンプンのような天然ゴムなどの水結合剤が含まれていてもよい。
【００４７】
本発明の医薬組成物は、毒素と代謝老廃物の蓄積を軽減し、被験者における望ましくない細菌の異常増殖を阻害あるいは軽減するため、それを必要とする被験者に経口投与する。１つの実施例では、本医薬組成物を尿毒症被験者に投与し、尿毒症の症状を軽減する。尿毒症の「症状軽減」とは、その組成が十分な量の尿毒症毒素を除去し、尿毒症に罹患している患者において透析に必要性をなくする、必要な透析頻度を減少させる、透析期間を短くする、またはむしろ透析を開始する必要をなくすることを意味する。本発明の組成は、腎機能不全や尿素代謝の先天異常を治療するだけではなく、肝機能不全や胃腸疾患を治療するためにも、それを必要とする被験者に投与することができる。
【００４８】
好適な実施例では、２〜４オンスの乳濁液あるいはペーストをミルクセーキやヨーグルトなど食べやすい食品に混合して本組成を経口投与する。マイクロカプセルとした細菌のプロバイオティックおよびプレバイオティックは、乳濁液あるいはペーストに吸着剤を混合するか、別に飲み込むことができるゼラチンカプセルとして投与することができる。
【００４９】
拡散により腸の内腔へに溶質が流れた後、物理的な結合あるいは化学的な捕捉が生じることに基づき、経口吸着剤の溶質輸送の数学的モデルが開発された（Ｇｏｔｃｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｄｉａｌｙｓｉｓ  １９７６−１９７７  １（２）：１０５−１４４）。このモデルでは、腸からの溶質除去の理論モデルを示している。
【００５０】
例えば、尿素の腸クリアランスは、腎機能が正常であれば１０〜１２ｍｌ／分であり、腎機能が重度に低下している患者では３〜４ｍｌ／分に低下する。このクリアランス速度の低下は、血中尿素濃度とは無関係で、腎機能障害に直接関連している。正常なクレアチニンクリアランスは２〜５ｍｌ／分である。
【００５１】
さらに、定常状態では質量増加速度が質量低下速度と等しいため、吸着剤が刺激する溶質の一次腸クリアランスは以下の質量平衡式で与えられる：
【００５２】
Ｇｓ＝（Ｋｒ＋Ｋｇ）Ｃｓ
【００５３】
ここで、Ｇｓ＝質量増加速度、Ｋｒ＝質量低下速度、Ｋｇ＝腸クリアランス速度、Ｃｓ＝溶質の濃度である。
【００５４】
一定量の吸着剤では、吸着剤結合のプロセスは飽和する。従って、飽和濃度以下では溶質の腸クリアランス速度が一次であるため、上記の方程式を以下のように示すことができる：
【００５５】
Ｃｓ＝Ｇｓ／（Ｋｒ＋Ｋｇ）
【００５６】
飽和濃度以上では、腸クリアランス速度がゼロであるため、この方程式を以下のように書き直すことができる。
【００５７】
Ｃｓ＝（Ｇｓ−最大溶質量）／Ｋｒ
【００５８】
これらの方程式は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究において腸からの溶質除去効率を予測する上で有用である。
【００５９】
実際、オキシスターチ経口吸着剤を用いた尿毒症患者において、腸からの尿素除去に関するＦｒｉｅｄｍａｎのデータにこのモデルが応用された（Ｆｒｉｅｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｒａｎｓ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ａｒｔｉｆ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｏｒｇａｎｓ  １９７４  ２０：１６１−１６７）。これらのデータを用いた場合、モデルでは天然のオキシスターチ経口吸着剤の最大吸着力が１．５ｇ／日であることが示されたが、これは透析の代用として、また透析回数を減少させるには不十分である。このモデルでは、同一の患者データについて、タンパク質異化速度０．９５グラム／ｋｇ／２４時間、尿の生成速度５ｍｇ／分では、オキシスターチの最大吸着力が尿素窒素７．２グラム／日、腸クリアランスが５．６ｍｌ／分であると予測された。吸着力がこれよりも低く、尿素５．４グラム／日などであると、タンパク質異化速度が０．６グラム／ｋｇ／２４時間で保たれることを考えれば、よく見ても透析を１ヶ月遅らせるだけである。従って、このモデルは、患者の尿毒症症状を軽減する本発明組成の様々な組成製剤について、最適な結果を決定する上で有用である。
【００６０】
本発明をさらに説明するため、以下に例を示すが、これだけに限定されるものではない。
【００６１】
例
例１：吸着剤の原料
オキシスターチ（ジアルデヒドデンプン）はＭＰＤ  Ｌａｂｓ（Ｆｅａｓｔｅｒｖｉｌｌｅ，ＰＡ）から購入した。供給業者の分析証明によれば、これは医療用物質（純度９８％）であり、含水率１３％、最大９０％の酸化型物質が含まれている。
【００６２】
イナゴマメゴム（純度９９％以上）はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。
【００６３】
活性炭Ｓｕｐｒａ  Ａ、医療用（純度９９．９％）はＮｏｒｉｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ（Ａｔｌａｎｔａ，ＧＡ）から購入した。各吸着剤は、ゼインで腸溶コーティング、ｅｔｈｏｃｅｌでマイクロカプセル化し、さらにｅｔｈｏｃｅｌでマイクロカプセル化、シェル物質としてゼインで腸溶コーティングを施した。カプセル化はディスク加工により実施した。ｅｔｈｏｃｅｌのみ、ゼインのみ、ｅｔｈｏｃｅｌとゼインの併用の３種類、シェル物質の溶液を調整した。シェル物質を調整した後、（理論最大積載量の６０％となるまで）各吸着剤をシェル溶液に加え、混合して分散させた。この分散液を約２０，０００ＲＰＭで回転させたディスク上で超音波処理し、約５０グラム／分で膨張させ、微粒子を生成した。加熱した円錐体中に微粒子を形成させ、内部温度を約５０℃としてエタノールと水を留去した。カプセルはサイクロンで回収した。
【００６４】
【表１−１】
0004693085.tif 000002
【００６５】
【表１−２】
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【００６６】
ジアルデヒドデンプン、イナゴマメゴム、活性炭、水酸化アルミニウムなどの原料と１２種類のマイクロカプセル剤の走査型電子顕微鏡写真（ＳＥＭ）を準備した。１１回目に棒状のカプセルが形成されたが、これは原料が直接ディスクの中心に入らないか、固体内容量が多すぎたためであった。１１回目の実験は、１３回目にゼインを１５％から１２％に減少させて繰り返し、成功した。
【００６７】
各回ではＳＥＭに加えてデジタル顕微鏡写真も撮影した。
【００６８】
例２：Ｅｓｃｈｅｒｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ５およびその他の細菌源
ＣｈａｎｇおよびＰｒａｋａｓｈ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １９９５  ４６：６２１−２６）が報告した手順に沿って、遺伝子組換えを行ったＥｓｃｈｅｒｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ５細胞を播種、培養、増殖、収集、マイクロカプセル化した。本発明のプロバイオティックおよび好アンモニア性菌も同様の方法で処理した。
【００６９】
例３：製剤化
様々なプロバイオティック、プレバイオティック、吸着剤を様々な食品添加物と混合し、異なる本発明の製剤を作成した。一般的な成分を以下の表２に示す。
【００７０】
【表２】
0004693085.tif 000004
【００７１】
例４：Ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの効率評価
酸性ｐＨおよび胃の条件で製剤の安定性を検討するため、ＮａＣｌ、ＨＣｌ、ペプシンを蒸留水に溶かし、ｐＨを１．２に調整した疑似胃液を米国薬局方に沿って調整する。調整した吸着剤が完全となるように、疑似胃液の被検物質溶液に約５グラムを３７℃で１〜２時間撹拌し、調整した吸着剤、２成分、３成分の製剤をすべて検討する。
【００７２】
一塩基リン酸水素カリウム、水酸化ナトリウム、パンクレアチン混合物、蒸留水で構成される疑似合成腸液も米国薬局方の被検溶液調整法に沿って調整し、ｐＨ７．５に調整する。この腸液に尿毒症溶質を加え、１００ミリリットルの合成腸液当たり、尿素１５０ミリグラム、クレアチニン３０ミリグラム、尿酸３０ミリグラムの溶液とする。
【００７３】
濃度を変化させるため、尿毒症溶質を加えていない腸原液でこの原液を希釈し、濃度７５〜５０％で変化させた尿毒症腸液を作成する。まず、オキシスターチ、イナゴマメゴム、活性炭を５グラムずつ入れた１５グラムの吸着剤製剤を用い、１００％、７５％、５０％の濃度の尿毒症腸液評価する。これらのデータから、容積、尿毒症腸液の濃度、処理前後の時間など、これだけに限らないが、様々な実験パラメータを最適化することができる。次に最適なパラメータをさらにすべての吸着剤評価、製剤化、実験測定に利用する。すべての実験観察は３回ずつ行う。
【００７４】
ただし、最初に５、１０、１５グラムの吸着剤あるいは製剤について吸着剤／製剤の検査を実施する場合は、メスシリンダー中、様々な濃度で尿毒症溶質を加えた腸液５００ｍｌを用いて実施し、８時間穏やかに振盪する。１時間間隔で上清からサンプルを採取し、必要に応じて遠心分離、市販のキット（Ｓｉｇｍａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）で尿素、クレアチニン、尿酸を分析する。最大吸着力と平衡時間を決定したら、この時間（推定２時間以上）を用いる。
【００７５】
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｐａｓｔｅｕｒｉｉ（Ｂ．ｐ．）、Ｅｓｃｈｅｒｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ５（Ｅ．ｃ．）について、尿毒症溶質を加えた人工腸液（ＦＡＩＦ：パンクレアチン、ＫＨ２ＰＯ４、ＮａＯＨの水溶液中に尿素１００／１５０ｍｇ／ｄＬ、クレアチニン１５／３０ｍｇ／ｄＬ、尿酸１５／３０ｍｇ／ｄＬ）から、ウレアーゼの酵素活性により尿素を除去する活性を評価する。Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ＰａｓｔｅｕｒｉｉおよびＥｓｃｈｅｒｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ５は、そのままの状態およびアルギン酸−ポリ−Ｌ−リジン−アルギン酸のマイクロカプセルとして評価する。クレアチニンと尿酸を除去するため、活性炭をＦＡＩＦ系に添加する。イナゴマメゴムについては、尿酸とクレアチニンの最大吸着力を評価する。
【００７６】
滅菌条件下において、様々な組み合わせで天然細菌、活性炭、イナゴマメゴムを５０ｍＬのＦＡＩＦにそれぞれ添加し、３７℃、１００ｒｐｍにて培養する。別の試験において、Ｂ．ｐ．あるいはＥ．ｃ．を含む直径約１ミリメーターのアルギン酸−ポリ−Ｌ−リジン−アルギン酸マイクロカプセルを、細胞のタンパク質含有量をＦＡＩＦ５０ｍＬに規格化できる量で加える。１、２、３、４、６、２４時間で一定分量を採取し、尿素窒素の減少、アンモニアの生成、尿酸とクレアチニンの安定性を評価する。すべてのアッセイは３回実施し、平均として結果を出す。
【００７７】
細菌の濃度を最適化した後、５０ｍｇ／ｄＬのアンモニア溶液にＷａｔｅｒ  Ｌｏｃｋｅ（登録商標）（ＷＬ）Ａ−２２０を様々な濃度で加え、アンモニアの摂取を評価する。アンモニア濃度の分析は、ろ過した懸濁液の上清で行う。次にイナゴマメゴム（ＬＢＧ）を様々な濃度の系に添加し、細菌のみを添加せずにＦＡＩＦを大幅に濃縮する。この系について、３７℃、１００ｒｐｍで２時間培養した後、残りのクレアチニンおよび尿酸を分析する。適切な濃度のＬＢＧを決定したら、活性炭を様々な量で添加し、細菌のみを添加せずにＦＡＩＦを大幅に濃縮する。この系を３７℃、１００ｒｐｍで培養し、２時間後に残りのクレアチニンおよび尿酸を測定する。
【００７８】
尿素、アンモニア、クレアチニン、尿酸の定量分析法は市販の診断キットが入手できる（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、各Ｃａｔ番号５３５および１７１、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，  Ｉｎｃ．、Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎａｍｃｏ  Ｇｒｏｕｐ、Ｓｏｕｔｈ  Ｐｌａｉｎｆｉｅｌｄ、ＮＪ、各Ｃａｔ番号１３１  ５００およびＣＡＳＯ−５０）。
【００７９】
例６：ＴＮＯ消化管モデル（ＴＮＯ  Ｇａｓｔｒｏ−Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  Ｍｏｄｅｌ：ＴＩＭ）
ＴＮＯ消化管モデル（ＴＩＭ）は、消化管内腔の動的な状態を非常によく模造している（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｗｅｒｆ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．４９，３７８−３８３，  ２００１）。模造されている動的パラメータは、飲食物の摂取、唾液、膵液を含む小腸など、胃内のｐＨ曲線と酵素および酵素前駆体の濃度、腸の様々な部位での胆汁濃度、胃から小腸にかけての消化粥の動力学的通過、水溶性消化物と水の吸収などである。大腸モデルでは、ｐＨ値、水の吸収、短鎖脂肪酸や気体などの微生物代謝物の吸収を模造した自然の結腸環境にて、ヒト由来の複雑な高密度ミクロフローラが未消化の植物成分を発酵する。従って、小腸、大腸ともに本発明の様々な成分製剤の最終結果を評価するためにこのモデルを利用する。
【００８０】
例７：Ｉｎ  ｖｉｖｏ試験
体重約１５０±１５グラム、１０回の透析開始に近づいている末期腎不全のヒトで見られる程度と同様の慢性腎不全（ＣＲＦ）ラットを用い、ＣＲＦにおいて蓄積する尿毒症毒素の除去と尿毒症症状の軽減に対し、マイクロカプセル化した吸着剤とＥｓｃｈｅｒｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ５細胞を経口投与する効果を検討する。全体として、対照群、慢性腎不全群（ｎ＝１５）、急性腎不全群２群の４群を設定する。特に、体重２５０−３００グラム、約８週齢の雄ラットをＣｈａｒｌｅｓ  ＲｉｖｅｒまたはＨａｒｌａｎから購入し、ラットが自らの糞便に触れられないようにしたケージに収容する。すべての動物について、ベースラインの標準的な臨床化学測定値、尿毒症毒素と考えられる化合物の２０の測定値を決定する。次に、外科手術によって急性あるいは慢性尿毒症とする。
【００８１】
Ｗａｙｎｆｏｒｔｈ，Ｈ．Ｂ．およびＦｌｅｃｋｎｅｌｌ，Ｐ．Ａ．のＮｅｐｈｒｅｃｔｏｍｙ．Ｉｎ：Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｎｄ  ｓｕｒｇｉｃａｌ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒａｔ．２ｎｄ  ｅｄ．，１９９２，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（Ｈａｒｃｏｕｒｔ，Ｂｒａｃｅ，Ｊｏｖａｎｏｖｉｃｈ），Ｌｏｎｄｏｎ，ｐｐ．２９，２７４−２７５で報告された手順に沿って、両側性腎切除術により急性腎不全を誘導する。手術後、ラットをランダムに年齢あるいは大きさをマッチさせた群にペアとし、ペアフィーディングを行う。食餌はカーブした投与針で胃内投与した。１群には、カリウムをコントロールするケイキサレートとともに、吸着剤を経口給餌することで投与する（治療群）。もう一方の群にはケイキサレートのみを投与し、カリウムのみをコントロールする（対照群）。両群とも少なくとも７〜１０日間密接にモニターする。効果的な吸着剤は、非治療群と比べて寿命が延長する。
【００８２】
慢性腎不全（ＣＲＦ）は、Ｎｉｗａ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｉｎｅｒ．Ｅｌｅｃｔｒ．Ｍｅｔａｂ．１９９７  ２３：１７９−１８４）およびＥｉｎｂａｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｃａｒｔｅｒ（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９６６  １２３：２３９−２５０）により報告された５／６腎切除モデルと同様の２段階外科手術にて誘導するが、血液透析が必要な時期に近づいているヒトと同程度のより顕著な腎不全とするため、いくつか変更を行った。この変更手順では、柔らかいプラスチックの箱を残った腎臓の周囲に縫合し、反対側の腎切除後の過剰肥大を防ぐ。この手順は、臓器出血のコントロールにも役立つ。
【００８３】
具体的には、２段階のアプローチを利用する。計画された手術日に１時間食餌を中止する。次に吸入薬のイソフルラン（ＦＯＲＡＮＥ）で麻酔する。麻酔したラットを腹側で手術者の左から右に置く。両横腹の毛をＯｓｔｅｒシェーバーで最小限刈り取り、ベータダインで準備する。ラットの左横腹を一部滅菌する。背腹側を腹腔に向けて切開し、左側の胸郭と肋骨との境界線近くまで横腹を下ろす。左腎を結合組織から離し、好ましくは脂肪被膜をつかんでゆっくりと引き出す。結合組織と脂肪で腎臓の前極にゆるく接合した副腎は、その付着物を裂いてそっと離す。腎臓を適当な位置に置き、腎動脈が臓器に入る点の近くで両極を結紮する。新しい４．０モノフィラメントシルクを緩く結び、上極の周りに掛けて結び目をちぎらないように注意しながらきつく結ぶ。二重小間結びを利用する。過剰の出血がないか臓器を調べる。必要であれば、ジアテルミーにより出血を止め、皮質にｏｘｙｃｅｌを用いる。低極でも同様の手順を繰り返す。残った腎臓を事前に作成したプラスチック、好ましくはサランラップの箱に入れ、固定する。この腎臓を腹部に戻し、２層にして切開部を閉じる。この部分にベータダインを塗布し、動物を回復させる。鎮痛剤ブプレノルフィン（０．２５ｍｇ／ｋｇ）を投与して疼痛を軽減する。３〜４週間後、右腎を切除する。この手術では、腹部から進入し、残った腎臓を検査する。麻酔法は同様であるが、白線に沿って正中線を切除し、出血を最小限とする。腸をゆっくりと移動し、残った左腎を観察し、機能しているかを確認する。必要に応じて箱を調節する。その左腎はすべて正常であると仮定し、右腎を露出、（副腎から離し）被膜から外して露出させ、腎臓の血管周囲を結紮することで右腎を切除する。できるだけ腎臓から離れたところで正中線に向かって尿管周囲を別に結紮するが、ぶつかる血管側枝を傷つけるか閉塞させないようにする。二重小間結びにより結紮糸をしっかりと結び、腎臓の隣の血管を横切し、これを取り除く。切開部位を閉じ、鎮痛剤を投与して暖かい場所で動物を回復させる。
【００８４】
この変更手順を行ったラットでは、一貫して血清クレアチニンレベル２．６±０．２（２．３〜３．５）、血中尿素レベル９８±５であり、死亡率も低かった（術後４週間で２０％未満）。
【００８５】
２回目の手術から約５日後、反対側の血管を抜き、体重、血清クレアチニン、血中尿素ができるだけ近いラット同士でマッチさせる。ラットはランダムに４群に割り当てる。Ａ群とＢ群はペアフィーディングとする。Ａ群はＣＲＦラットとして被検吸着剤は与えず、Ｂ群には吸着剤を与える。３つ目のＣ群には吸着剤を与え、食餌と水を自由に取らせる。Ｂ群とＣ群の比較から食欲と栄養状態に対する尿毒症の影響が示される。４つ目の偽手術を行ったＤ群は対照とした。Ｄｕｎｎ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９７６  ４８：４１−４４で報告されているとおり、ラットを４〜７ヶ月間観察し、この間２週間おきに血液と尿を採取、ガスクロマトグラフィーによりジメチルアミン、トリメチルアミンを定量する。また、１週間おきに体重を測定し、血圧と尿浸透圧を１ヶ月おきに測定する。食餌と水の摂取量を観察することで毎日食欲を評価する。１ヶ月おきに定期的に尿を採取し、２週間おきにスポット尿を採取する。さらに栄養状態の測定として、皮下脂肪厚（ｓｋｉｎｆｏｌｄ  ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ）も評価する。７ヶ月の時点でラットを殺処分し、臨床化学検査およびその他の特定の検査を行うため、最後の採血を行う。血液、尿、脳組織のジメチルアミンも定量する。これらの試験では、吸着剤を滅菌生理食塩水の懸濁液とし、１２ゲージの胃洗浄チューブでラットに経口投与する。