(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効成分としてのＧ−ＣＳＦ及び医薬用担体を含有し、レシピエントに投与することを特徴とし、骨髄細胞移植を除く造血幹細胞移植後に生じるＧＶＨＤを抑制する医薬組成物。
【請求項２】
上記造血幹細胞移植が末梢血幹細胞移植である請求項１記載の医薬組成物。
【請求項３】
末梢血幹細胞移植が他家移植である請求項２記載の医薬組成物。
【請求項４】
骨髄細胞移植を除く造血幹細胞移植後に生じるＧＶＨＤを抑制する医薬組成物を調製するためのＧ−ＣＳＦの使用であって、
当該医薬組成物はレシピエントに投与される、前記使用。
【請求項５】
上記造血幹細胞移植が末梢血幹細胞移植である請求項４記載のＧ−ＣＳＦの使用。
【請求項６】
末梢血幹細胞移植が他家移植である請求項５記載のＧ−ＣＳＦの使用。
【発明の詳細な説明】
［技術分野］
本発明はヒト顆粒球コロニー刺激因子（以下Ｇ−ＣＳＦと略す）を有効成分とする移植片対宿主病（ｇｒａｆｔ−ｖｅｒｓｕｓ−ｈｏｓｔ  ｄｉｓｅａｓｅ）（以下ＧＶＨＤと略す）の治療剤に関する。更に詳細には、本発明は、末梢血幹細胞移植後に生じるＧＶＨＤの治療に有効なＧ−ＣＳＦを有効成分とする医薬組成物に関する。
［背景技術］
近年、造血器腫瘍や固形癌、白血病、再生不良性貧血の治療の目的で広く造血幹細胞移殖が行われている。造血幹細胞移植は幹細胞ソースの違いやドナーの選択によって、血縁者、非血縁者間の同種骨髄移植、末梢血幹細胞移植、臍帯血幹細胞移植、また本人によって行われる自家骨髄移植、末梢血幹細胞移植、および臍帯血幹細胞移植等がある。これらの造血幹細胞移植のうち、同種骨髄移植は普及した治療法であるが、骨髄採取に伴うドナーへの負担が大きいなどの問題がある。
最近は、ドナーへの負担が大きい同種骨髄移植に代えて、同種末梢血幹細胞移植の臨床応用が進んでいる。同種末梢血幹細胞移植は、造血幹細胞採取の際にドナーの負担が少ないこと、レシピエントの好中球や血小板の回復が早いこと等の利点がある。しかしながら、末梢血幹細胞移植も、骨髄移植と同様にＧＶＨＤを起すため、その制御が問題となっている。
ＧＶＨＤは移入又は移植された免疫担当細胞が、宿主の組織に対して起す免疫反応により生じる疾患の総称である。移入または移植される末梢血中に含まれる成熟Ｔ細胞等の免疫担当細胞がレシピエントの組織に対して免疫応答を起こすことが主な原因であると考えられている。ＧＶＨＤは急性及び慢性の疾患があり、その症状としては皮膚症状、下痢、黄疸等があり、時には致死的となる重篤な作用を発現する。
これまでＧＶＨＤを抑制するにはメトトレキセートやシクロスポリンＡ等の免疫抑制剤を用いる方法と、移植細胞群（移植片）から成熟Ｔ細胞を除去する方法とが使用されている。メトトレキセートやシクロスポリンＡを用いる場合にはそれらが生体に及ぼす副作用が大きな問題となっている。シクロスポリンＡの副作用は強い腎毒性であり、メトトレキセートの副作用は骨髄抑制である。
また、移植細胞群から成熟Ｔ細胞を取り除く方法によりＧＶＨＤが抑制可能であったが、白血病の再発が認められるなど抗腫瘍効果が減弱するという欠点があった（Ｂｌｏｏｄ，７８：２１２０−２１２３，１９９１参照）。従って、Ｔ細胞除去療法は抗腫瘍効果への対応が必要である。
ドナーに顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）を投与して誘導した造血幹細胞をレシピエントに移植し、その後のレシピエントのＧＶＨＤに及ぼす影響について様々な研究が行われている。ヒトにＧ−ＣＳＦを投与すると単球又はＣＤ４−ＣＤ８−αβ＋細胞が増加し、これらの細胞はＴ細胞の増殖能を抑制しうることが報告されている（臨床免疫、３０（６）：８３３−８３８，１９９８参照）。他家骨髄移植（Ａｌｌｏ−ＢＭＴ）後Ｇ−ＣＳＦを投与すると、急性ＧＶＨＤの発症がＧ−ＣＳＦ非投与群に比べて抑制される傾向が報告されている（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，６２：２３５，１９９５参照）。しかしながら、移植に用いる末梢血幹細胞群は骨髄細胞群と比較すると、幹細胞比率が著しく低く、また幹細胞の性状等も異なるため、末梢血幹細胞移植後に生じるＧＶＨＤを抑制する作用機序は骨髄移植によるそれと異なると考えられている。
末梢血中には、骨髄に比較して造血幹細胞数が極めて少ないため、ドナーにＧ−ＣＳＦを投与して末梢血幹細胞を誘導することが行われているが、Ｇ−ＣＳＦ投与群のドナーからの細胞群は感染防御や抗腫瘍作用には好都合であるが、ＧＶＨＤの誘導と増悪に関してはさらに慎重な解析が望まれていることが報告されている。特にドナーに対するＧ−ＣＳＦのインビボでの投与と、それによって誘導された末梢血幹細胞の移植後に生じるレシピエントの慢性ＧＶＨＤとの関連については未だ十分に解析されていない（Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  ＆  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ３７（５）：４２５−４３２，１９９８参照）。
このような状況において、副作用が少なく、しかも同種末梢血幹細胞移植後に生じ得るＧＶＨＤを有効に抑制する方法、又はそのための薬剤の開発が望まれていた。
［発明の開示］
本発明者等は同種末梢血移植を行った後に、レシピエントに対してＧ−ＣＳＦを投与することによって、意外にも格別の副作用も生じさせることなくＧＶＨＤを抑制できることを見出し、本発明を完成した。
本発明者等は、ドナーマウスにＧ−ＣＳＦを投与して誘導した幹細胞を含む脾臓細胞（以後ＳＰＣという）を、予めＸ線照射して免疫担当細胞の機能を失活させたレシピエントマウスに移植してＧＶＨＤを発症させた。ＳＰＣ移植後Ｇ−ＣＳＦをレシピエントマウスに投与すると、対照群（Ｇ−ＣＳＦ非投与群）に比べ延命したが、この現象はＧＶＨＤ発症抑制によると考えられた（実験例１参照）。
ＧＶＨＤの発症をレシピエントマウスの脱毛程度で判定すると、Ｇ−ＣＳＦ投与群のレシピエントマウスは対照群に比べては改善傾向にあった。対照群のレシピエントマウスはＳＰＣ移植後ＧＶＨＤを発症するが、末梢血単核球中に正常マウスに比べてＮＫ１．１＋，ＣＤ８＋細胞の著しい増加が認められた。ＮＫ１．１＋，ＣＤ８＋細胞のように、ヒトＮＫマーカーとＣＤ８Ｔ細胞マーカー両方が陽性であるＣＤ５６＋ＣＤ８＋細胞が細胞傷害作用を有していることから（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０００），１６４（３），１１４８−１１５２）、このＮＫ１．１＋，ＣＤ８＋細胞も細胞傷害作用を有している可能性が高く、この細胞がＧＶＨＤの発症に強く関与していると考えられる。Ｇ−ＣＳＦ投与レシピエントマウスはＧ−ＣＳＦの投与量に依存してＧＶＨＤが抑制され、末梢血中ＮＫ１．１＋，ＣＤ８＋細胞が減少していた（実験例２参照）。このような結果からＳＰＣ移植後のレシピエントマウスにＧ−ＣＳＦを投与することによりＧＶＨＤを抑制することが発見された。末梢血幹細胞移植の実験では、脾臓幹細胞が末梢血幹細胞の代わりに用いられており（Ｂｌｏｏｄ，Ｖｏｌ  ９３，Ｎｏ  １２（Ｊｕｎｅ  １５），１９９９：ｐ４０７１−４０７８）、又、末梢血幹細胞移植と脾臓幹細胞移植とを比較した場合、Ｇ−ＣＳＦ投与後の末梢血中と脾臓細胞中との幹細胞の誘導増加現象、幹細胞の細胞表面抗原、および細胞移入後のレシピエントにおけるＧＶＨＤの発症状況が類似していた為、末梢血幹細胞移植においても脾臓幹細胞移植と同様のＧＶＨＤ抑制効果があると推測される。
［発明を実施するための好ましい形態］
本発明の有効成分であるＧ−ＣＳＦは高度に精製されたヒトＧ−ＣＳＦであれば全て使用できる。具体的には、哺乳動物、特にヒトＧ−ＣＳＦと実質的に同じ生物学的活性を有するものであり、天然由来のもの、および遺伝子組換え法によって得られたもの、又、得られたＧ−ＣＳＦを化学修飾したものを含む。遺伝子組換え法によって得られるＧ−ＣＳＦには天然のＧ−ＣＳＦとアミノ酸配列が同じであるもの、あるいは該アミノ酸配列例中の１または２以上のアミノ酸を欠如、置換、付加したもので前記生物学的活性を有するものを含む。
本発明におけるＧ−ＣＳＦは、いかなる方法で製造されたものでもよく、ヒト腫瘍細胞の細胞株を培養し、これから種々の方法で抽出し分離精製したもの、あるいは遺伝子工学的手法により大腸菌、イースト菌、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、Ｃ１２７細胞などに産生せしめ、種々の方法で抽出し分離精製したものが用いられる。最も好ましくはＣＨＯ細胞によって遺伝子組換え法を用いて生産されたものである。（例えば、特公平１−４４２００号公報、特公平２−５３９５号公報、特開昭６２−１２９２９８号公報、特開昭６２−１３２８９９号公報、特開昭６２−２３６４８８号公報、特開昭６４−８５０９８号公報に記載されたものを含む。）
更に本発明のＧＶＨＤ抑制剤については、その投与方法や剤型に応じて必要により、懸濁化剤、溶解補助剤、安定化剤、等張化剤、保存剤、吸着防止剤等を添加することができる。ここで、懸濁化剤の例としては例えばメチルセルロース、ポリソルベート８０、ヒドロキシエチルセルロース、アラビアゴム、トラガント末、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート等を挙げることができ、溶液補助剤としては例えばポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリソルベート８０、ニコチン酸アミド、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、マグロゴール、ヒマシ油脂肪酸エチルエステル等を挙げることができ、安定化剤としては例えばヒト血清アルブミン、デキストラン４０、メチルセルロース、ゼラチン、亜硫酸ナトリウム、メタ亜硫酸ナトリウム等を挙げることができ、等張化剤としては例えばＤ−マンニトール、ソルビトール等を挙げることができ、また、保存剤としては例えばパラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、ソルビン酸、フェノール、クレゾール、クロロクレゾール等を挙げることができ、更に、吸着防止剤としては例えばヒト血清アルブミン、レシチン、デキストラン、エチレンオキサイド・プロピレンオキサイド共重合体、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリエチレングリコール等をあげることができる。
本発明のヒトＧ−ＣＳＦを有効成分とする医薬組成物は、注射剤（皮下、皮内、筋肉内、静脈内および腹腔内）として、または経皮、経粘膜、経鼻等の投与に適した剤形、又は経口投与に適した剤形（錠剤、カプセル剤、顆粒剤、液剤、懸濁剤等）であっても良い。
本発明のヒトＧ−ＣＳＦを有効成分とする医薬組成物は、急性ＧＶＨＤ及び慢性ＧＶＨＤの抑制に有効である。又、本発明の医薬組成物は、末梢血幹細胞移植後のＧＶＨＤだけでなく、骨髄細胞移植を除く他の造血幹細胞移植後のＧＶＨＤの抑制にも有効であると考えられる。
Ｇ−ＣＳＦを有効成分とする製剤に含まれるＧ−ＣＳＦの投与量、投与回数は対象の疾患患者の病状を配慮して決めることができるが、通常成人一人当たり０．１μｇ／ｋｇ〜１００μｇ／ｋｇ、好ましくは１μｇ／ｋｇ〜１０μｇ／ｋｇのヒトＧ−ＣＳＦを含有する製剤を１日に１回、朝夕２回あるいは朝昼夕３回投与することができる。しかし本発明はヒトＧ−ＣＳＦの含有量、投与経路、投与回数等によって限定されるものではない。造血幹細胞移植時の好中球数の増加促進が目的でＧ−ＣＳＦを投与する場合には、好中球数がある程度増加した時（例えば好中球数５０００／ｍｍ３以上）には投与を中止する必要があるが、ＧＶＨＤを抑制する目的でＧ−ＣＳＦを投与する場合には、好中球数がある程度増加していてもＧＶＨＤを抑制する為に投与を続けることが可能である。又、Ｇ−ＣＳＦの投与開始時期も特に限定されない。
本発明を、以下の実験例及び実施例により、更に詳細に説明する。
（実験例１）
延命効果の実験
６〜１０週齢の雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｎドナーマウス（日本チャールズリバー）にＧ−ＣＳＦ（中外製薬），１００μｇ／ｋｇを４日間、朝（８：００〜１０：００）夕（１６：００〜１８：００）２回、さらに５日目の朝、皮下投与して脾臓中に幹細胞を誘導した。致死量の放射線照射（Ｘ線；８５０Ｒ）を施した６〜１０週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃレシピエントマウス（日本チャールズリバー）に、ドナーマウスの脾細胞（２．５Ｘ１０７ｃｅｌｌｓ／ｈｅａｄ）を尾静脈から移入した。さらに、レシピエントマウスにＧ−ＣＳＦ，１０，３０あるいは１００μｇ／ｋｇを移入翌日より７日間皮下投与した後、２日間の休薬と５日間の投与スケジュールを検討期間中繰り返した。対照群にはＧ−ＣＳＦの希釈用液（Ｖｅｈｉｃｌｅ：０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０（ニッコウケミカル），５％マンニトール（ナカライテスク）溶液）を投与した。レシピエントマウスのＧＶＨＤの発症は生存率と体重の変化で比較検討した。生存率についての結果を図１に示した。その結果から明らかなように、対照群（Ｖｅｈｉｃｌｅ群）のレシピエントマウスの平均生存日数は１７．０±２．７１日であったが、Ｇ−ＣＳＦを皮下投与すると、１０μｇ／ｋｇ群が２４．３±１．０５日（ｐ＜０．０５）、３０μｇ／ｋｇ群が３７．４±３．９１日（ｐ＜０．００５）、さらに１００μｇ／ｋｇ群が３３．０±１．１５日（ｐ＜０．００１）と、対照群に比べて有意な延命効果が認められた。この延命効果はＧ−ＣＳＦ３０μｇ／ｋｇ投与群が最も強かった。死亡したマウスはＧＶＨＤ発症の指標である体重減少が認められた。従って、これらマウスの死因はＧＶＨＤによると考えられた。また、本検討で明らかとなったＧ−ＣＳＦの皮下投与による延命効果はＧＶＨＤの発生抑制に起因したと考えられる。
（実験例２）
細胞増殖抑制の実験
ＧＶＨＤに関与する細胞群を特定することを目的に、実験例１で用いた、細胞移入１９日目のレシピエントマウスの末梢血中細胞群をフローサイトメトリー（ＦＡＣＳｃａｎ：ベクトンディキンソン）で検討した。末梢血は約２０μＬをそれぞれの群のマウスの背側中足静脈から採取し、ＰＥ結合抗ＣＤ８抗体，ＦＩＴＣ結合抗ＮＫ１．１抗体（ファーミンジェン）で４℃，３０分間染色した後、０．７５％塩化アンモニウムＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファーで溶血を行った後に、ＦＡＣＳ用培地（２０％ＦＣＳ、０．１％  ＮａＮ３，１０ｍＭ  ＰＢＳ）で２回洗浄し、ＦＡＣＳｃａｎを用いて細胞比率を解析した。結果を図２に示す。
その結果によれば、ＮＫ１．１＋，ＣＤ８＋細胞の比率は対照群で１４．６％検出されたが、Ｇ−ＣＳＦを投与すると１０μｇ／ｋｇ群で１０．６％、３０μｇ／ｋｇ群で１０．０％、１００μｇ／ｋｇ群で９．０％と投与量に依存して減少し、１００μｇ／ｋｇ群は対照群の約半分の値を示した。このＮＫ１．１＋，ＣＤ８＋細胞群は正常マウス（ＢＡＬＢ／ｃ，Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ）あるいはレシピエントマウスに同系のＣ５７ＢＬ／６Ｎを用いた場合は出現が認められない。また、ＮＫ１．１＋，ＣＤ８＋細胞の構成比率はマウスの生存率と強い逆相関性が認められた。これらの結果から、ＮＫ１．１＋，ＣＤ８＋細胞はＧＶＨＤの発生に中心的な役割を担う細胞群であると考えられる。従って、Ｇ−ＣＳＦのインビボ投与は細胞傷害作用を示すＮＫ１．１＋，ＣＤ８＋細胞の出現を抑え、ＧＶＨＤ発症を抑制したと考えられる。
（実施例１）製剤例
ヒトＧ−ＣＳＦ（１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．０）５０μｇ／ｍＬに非イオン界面活性剤であるポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ２０：ポリオキシエチレンソルビンモノラウレート）を０．１ｍｇ／ｍＬとなるように加え、ＮａＣｌにて浸透圧を１にあわせた後、０．２２μｍのポアサイズを有するメンブランフィルターで濾過滅菌する。得られた溶液を滅菌処理を施したバイアル瓶中に充填し、同様に滅菌処理したゴム栓で打栓し、続いてアルミニウムキャップにて巻き締めて注射用溶液製剤を得た。この注射用製剤は１０℃以下の冷暗所に保存する。
（実施例２）製剤例
ヒトＧ−ＣＳＦ（１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．０）１００μｇ／ｍｌに非イオン界面活性剤であるポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０：ポリオキシエチレンソルビンモノオレエート）を０．１ｍｇ／ｍＬとなるように加え、ＮａＣｌにて浸透圧を１にあわせた後、０．２２μｍのポアサイズを有するメンブランフィルターで濾過滅菌する。得られた溶液を滅菌処理を施したバイアル瓶中に充填し、同様に滅菌処理したゴム栓で打栓し、続いてアルミニウムキャップにて巻き締めて注射用溶液製剤を得た。この注射用製剤は１０℃以下の冷暗所に保存する。（実施例３）製剤例
ヒトＧ−ＣＳＦ（１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．０）５０μｇ／ｍｌに非イオン界面活性剤であるポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ２０：ポリオキシエチレンソルビンモノラウレート）０．１ｍｇ／ｍＬ、ＨＳＡ１０ｍｇ／ｍＬ及びマンニトール５０ｍｇ／ｍｌとなるように加えて溶解した後、０．２２μｍのポアサイズを有するメンブランフィルターで濾過滅菌する。得られた溶液を滅菌処理を施したバイアル瓶に充填し、同様に滅菌処理したゴム栓を半打栓し、凍結乾燥を行い注射用凍結乾燥剤を得た。この注射用凍結乾燥剤は室温以下の温度条件に保存し、注射用蒸留水にて用時溶解して使用する。
［産業上の利用分野］
本発明のヒトＧ−ＣＳＦを有効成分とする医薬組成物は、急性ＧＶＨＤ及び慢性ＧＶＨＤの抑制に有効であるばかりでなく、臍帯血幹細胞移植後のＧＶＨＤも抑制可能であると考えられる。
【図面の簡単な説明】
図１はＧ−ＣＳＦを投与したドナーマウスの脾細胞を尾静脈から移入したレシピエントマウスへの、Ｇ−ＣＳＦ投与が生存率に及ぼす影響を示すグラフである。
図２はレシピエントマウスへの脾細胞移植後における、末梢血単核球中のＮＫ１．１陽性ＣＤ８陽性細胞の比率に及ぼす、Ｇ−ＣＳＦ投与の影響を示すグラフである。グラフの縦軸は、末梢血単核球中のＮＫ１．１陽性ＣＤ８陽性細胞の比率（％）を示す。横軸は移植後の経過日数を示す。
【図１】
0004684513.tif 000002
【図２】
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