(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒアルロン酸の肌細胞表面への結合を向上することにより表皮の含水を向上させるための化粧用活性剤であって、
ＭｎＣｌ２、グルコン酸カルシウム、及び塩化カルシウムと組み合わせたグルコン酸ナトリウムからなる群より選択される成分を含む
ことを特徴とする化粧用活性剤。
【請求項２】
グルコン酸に対するカルシウムのモル比は２〜６であることを特徴とする請求項１に記載の化粧用活性剤。
【請求項３】
ヒアルロン酸の肌細胞表面への結合を向上することにより表皮の含水を向上させるための化粧組成物であって、
塩化カルシウムと組み合わせたグルコン酸ナトリウムを、組成物中の割合が最終化粧組成物の総量に対して、０．００５重量％〜５重量％含むことを特徴とする化粧組成物。
【請求項４】
組成物中の塩化カルシウムと組み合わせたグルコン酸ナトリウムの割合は、最終化粧組成物の総量に対して０．０５重量％〜０．５重量％であることを特徴とする請求項３に記載の化粧用組成物。
【請求項５】
塩化カルシウムと組み合わせたグルコン酸ナトリウムを、ビタミン、トコフェロール、キサンチン、レチノイド、シーゲスベキア・オリエンタリス（Ｓｉｅｇｅｓｂｅｃｋｉａ  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）抽出物、コミホラ・ムクル（Ｃｏｍｍｉｐｈｏｒａ  ｍｕｋｕｌ）抽出物、並びに、エリオボトリア・ジァポニカ（Ｅｒｉｏｂｏｔｒｙａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）抽出物、化粧学上許容性のあるシリコン誘導体、アミノ酸及びその塩、セラミド、グリコセラミド、スフィンゴシン誘導体、リン脂質、フォルスコリン及びその誘導体、コレウス（Ｃｏｌｅｕｓ）抽出物、テフロシア（Ｔｅｐｈｒｏｓｉａ）抽出物、エラスターゼ阻害剤、大豆ペプチド、コラゲナーゼ阻害剤、フラボノイド、ギンコ・ビローバ（Ｇｉｎｋｇｏ  ｂｉｌｏｂａ）葉、モスラ・チネンシス（Ｍｏｓｌａ  ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）葉、サルビア・オフィシナリス（Ｓａｌｖｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）葉、シナモナン・カシア（Ｃｉｎｎａｍｏｍｕｍ  ｃａｓｓｉａ）葉の水−エタノール抽出物、カメリア・シネンシス（Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）のカセシック（ｃａｔｈｅｃｈｉｃ）抽出物、並びに、セオブロマ・カカオ（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ  ｃａｃａｏ）豆皮の水抽出物、フェロデンドロン・アムレンス（Ｐｈｅｌｌｏｄｅｎｄｒｏｎ  ａｍｕｒｅｎｓｅ）抽出物、抗炎症剤、鎮静剤（ｃａｌｍａｎｔ）、保湿剤、抗ストレッチ・マーク剤、微小循環を保護又は向上する薬剤、フリー・ラジカル殺菌剤、植物抽出物、抗脂漏剤、並びに、血液微小循環を促進する為の薬剤、アルファルファサポニン、大豆サポゲノール、コラーゲンＶＩＩ合成促進の為の薬剤、エラグ酸、Ｄ−キシロース並びに微量元素錯体からなる群より選択される少なくとも１つの物質と組み合わせて使用することを特徴とする請求項３または４に記載の組成物。
【請求項６】
更に、日光の有害な効果から肌を保護する為の物質、ＤＮＡより生じる損傷を制限する物質、並びに、年齢によるホクロを除去するのに資する物質から選択される少なくとも１つの物質と組み合わせることを特徴とする請求項３〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
ヒアルロン酸の前記細胞表面への結合における欠損を修正することを特徴とする請求項１または２に記載の化粧用活性剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、肌細胞ＣＤ４４膜受容体の機能性及び／又は発現を増加するための物質を少なくとも１つ含有する化粧組成物又は皮膚科学組成物に関する。
ヒアルロン酸はケラチノサイト間の細胞間隙に位置し、ヒト表皮に豊富に存在する。
ヒアルロン酸は繊維芽細胞間の細胞間隙に位置し、ヒト真皮にも豊富に存在する。
ＣＤ４４として知られている糖タンパク質は、表皮中ケラチノサイト表面に存在し、その機能はケラチノサイト表面へのヒアルロン酸の結合を可能にすることである。
【０００２】
ＣＤ４４として知られている糖タンパク質は、真皮中繊維芽細胞表面に存在し、その機能はその細胞表面へのヒアルロン酸、コラーゲン、特にコラーゲンＩ及びＩＶ、並びに、フィブロネクチンの結合を可能にすることである。
ヒアルロン酸は、その体積の１０００倍の水を保持することができるので、表皮及び真皮の天然の水摂取剤である。従って、細胞に接触した水を維持し、細胞の含水を可能にする為に、この水摂取剤の結合可能な受容体を細胞が有することは重要と予見することは、このことより明らかである。
ヒアルロン酸の堆積は様々な成長組織及び器官中の強い細胞の再生及び移動活性と一致していることが更に知られている。表皮において、それは細胞の再生及び移動が最大になる基底及び上基底レベルにある活性（ｌｉｖｉｎｇ）深在層に位置する。しかしながら、マトリックス成分への細胞接着が必須である局部において、例えば、真皮基底細胞間の界面及び真皮−表皮接合部で、ＣＤ４４は存在しない。
【０００３】
表皮及び真皮の生理学に関する別の重要な要素は、炎症状態において、炎症細胞、リンパ球及び好中球により侵害された部位でが、ＣＤ４４及びヒアルロン酸の消滅を示すことである。この消滅は、炎症細胞の強い接着、並びに、組織中でのその侵害及び出現にとって必然的なものである（ＣＤ４４  Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｈｅｐａｒａｎ  Ｓｕｌｆａｔｅ  ａｎ  Ｅｎｄｏ−β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ−Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ：  Ａ  Ｍａｊｏｒ  Ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ  ｉｎ  Ａｄａｌｔ  Ｈｕｍａｎ  Ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ．  Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，１９９７，１０９，ｐｐ．２１３−２１８）。
【０００４】
さらに、ヒアルロン酸は隣接細胞により保持された２つのＣＤ４４受容体間の実際の架橋を設立することが知られている。このことは、ヒアルロン酸を分解するヒアルロニダーゼで生存条件下で維持された肌を処置する場合、細胞間隙は開いて、棘状突起状態（ａｃａｎｔｈｏｓｉｓ）、すなわち表皮過形成が生じる。このようなＣＤ４４消滅を伴う棘状突起状態は、白血球により侵害された表皮部位中でも観察される。
これらのデータは、ＣＤ４４が表皮の成長、維持及び機能性で重要な役割を有することを一緒になって証明している。
本発明者らは、さらに年齢に伴うＣＤ４４受容体及びヒアルロン酸間の結合の減少を観察した。この現象は、年齢に伴う表皮の乾燥の増加及び表皮細胞再生の減少の原因である。特に、表皮は年齢と共に萎縮して再生がずいぶん減少する。
この認識の全てより、ＣＤ４４トランスメンブラン受容体の機能性を増加する、すなわち細胞表面へのヒアルロン酸結合を向上するいずれかの手段は、表皮及び真皮の細胞の含水を向上する好適な手段を構成する。
その上、２つの隣接細胞のＣＤ４４受容体へのヒアルロン酸結合によって表皮細胞間の相互連結網状組織を強化するいずれかの手段は、表皮細胞に対するリンパ球及び好中球等の炎症細胞の移動を制限する特に効果的な手段を構成する。このような作用は炎症現象の予防又は処置の効果を有する。このように、本発明は敏感肌及び反応性肌を治癒に特に好適である。
【０００５】
最終的に、ＣＤ４４トランスメンブラン受容体の発現及び／又は機能性を増加するための、すなわち細胞表面へのヒアルロン酸結合を向上するためのいずれかの手段は、特にシワ、肌の乾燥、肌色の劣化、タルミ等の肌の生化学的性質の劣化、並びに、肌のハリ、丈夫さ及び弾力の欠損等の肌加齢のサインの開始に対抗する、又は、少なくとも遅延させる及び／若しくは延長するための好適な手段を構成する。
【０００６】
本発明は、体系的な研究の後、一定の物質が表皮細胞のＣＤ４４受容体の機能性及び発現に効果的に作用することを実証することより結論を得た。この発見により、本発明の発明者らは、特に表皮の細胞含水の維持若しくは保持、又は、肌加齢のサインの開始の遅延及び／若しくは延期、並びに、炎症現象の処置又は予防、特に敏感肌及び反応性肌を治癒することを目的とする化粧組成物又は皮膚科学組成物において、その活性を実証して物質を得た。
すなわち、本発明は、局所使用のための化粧活性剤又は医薬活性剤を介した、肌細胞のＣＤ４４膜受容体の発現及び／又は機能性での作用を可能にし、肌上の局所使用のための化粧処置方法又は治療処置方法におけるこれらの活性剤の使用を認識することを可能にした発見から基本的に結論を得た。
【０００７】
「発現の増加」という表現は、細胞により製造されるＣＤ４４受容体量の増加が生じることを意味する。
本発明の趣旨に関し、「ＣＤ４４受容体の機能性の増加」と言う表現は、目的とする細胞表面におけるヒアルロン酸並びに／又はコラーゲン、特にコラーゲンＩ及び／若しくはコラーゲンＩＶ並びに／又はフィブノレクチンの結合の向上があることを意味する。
すなわち、本発明はこの発見を用いた化粧分野及び医薬分野の両方における使用に関するものである。言うまでもなく、当業者は、それが化粧適用又は医薬適用かに従って、目的とする分野において許容できる活性剤を選択することができよう。
すなわち、基本的な側面の１つに従えば、本発明は、肌細胞のＣＤ４４膜受容体の発現の増加及び／又は機能性の向上を目的とする少なくとも１つの活性剤の化粧組成物における使用に関するものである。
【０００８】
更に詳しくは、第一の側面に従えは、本発明は、肌細胞のＣＤ４４膜受容体の発現を増加する、並びに／又は、ヒアルロン酸、及び／若しくは、コラーゲン、特にコラーゲンＩ及び／若しくはコラーゲンＩＶ、及び／若しくは、フィブロネクチンの上記肌細胞表面への結合を向上する少なくとも１つの活性剤の化粧組成物における使用に関するものである。
第一の実施形態に従えば、この活性剤の使用により、活性剤がヒアルロン酸、並びに／又は、コラーゲン、特にコラーゲンＩ及び／又はコラーゲンＩＶ、並びに／又は、フィブロネクチンの上記肌細胞表面へ結合する点で肌細胞のＣＤ４４膜受容体の機能性を向上することが可能となる。
ＣＤ４４膜受容体でのこの作用は、ケラチノサイト及び繊維芽細胞の両方のＣＤ４４受容体で経られることが発見された。
【０００９】
すなわち、第一の実施形態に従えば、上記活性剤は、ケラチノサイト及び／若しくは繊維芽細胞のＣＤ４４受容体の発現を増加し、並びに／又は、これらの細胞の表面へのヒアルロン酸の結合を向上する。
別の実施形態に従えば、上記活性剤は、繊維芽細胞のＣＤ４４受容体の発現を増加し、並びに／又は、上記繊維芽細胞表面へのコラーゲン、特にコラーゲンＩ及び／若しくはコラーゲンＩＶ及び／又はフィブロネクチンの結合を向上する。
【００１０】
上述のように、本発明は、多数の活性剤の体系的な試験より結論が得られた。この試験により、特に肌細胞のＣＤ４４膜受容体の発現及び／又は機能性で最も効果的な活性剤は、
−言うまでもなく、本発明の範疇において、化粧学上許容性のあるもの、その塩及びそのエステルから選択されようα−ヒドロキシ酸。好適に選択されるα−ヒドロキシ酸は、炭素数２〜１２のα−ヒドロキシ酸である、
−化粧学上許容性のあるα−ケト酸、好適には炭素数３〜１２のα−ケト酸、その塩及びそのエステル：
であることが見いだされるのを示すことを可能とした。
【００１１】
特に効果的な別の製品は、塩化マグネシウムである。
α−ヒドロキシ酸又はその塩若しくはエステルを使用する場合、この酸は乳酸、グリコール酸、ゲンチジン酸、サリチル酸、グルコン酸及びヘプトン酸（ｈｅｐｔｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）からなる群より選択されることが好ましい。
α−ケト酸を使用する場合、ピルビン酸を選択することが好ましい。
α−ヒドロキシ酸エステル又はα−ケト酸エステルは炭素数２〜２４、好ましくは炭素数１４〜２２のアルコールとのそのエステルから選択することが好適である。
【００１２】
α−ヒドロキシ酸塩及びα−ケト酸塩は、ナトリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、亜鉛塩及びマンガン塩から選択されることが好適である。
結局、例から現れるものとして、カルシウム塩、例えば塩化カルシウムと合わせたグルコン酸のような、グルコン酸カルシウムが特に好適であることが分かる。グルコン酸がカルシウムの存在下で使用される場合、グルコン酸に対するカルシウムのモル比は、好適には２〜６、好ましくは約４であることも例より挙げられる。
【００１３】
本発明の化粧組成物中の活性剤の割合は広い範囲で変化してよい。しかしながら、最終化粧組成物の総量に対して、好適には０．００５重量％〜５重量％、好ましくは０．０５重量％〜０．５重量％の活性剤が使用される。
【００１４】
好適には、上記活性剤は、ビタミン、特にＡ群のビタミン（レチノール）、Ｃ群のビタミン、Ｄ３群のビタミン、エステル、特にパルミチン酸及びプロピオン酸エステル、トコフェロール等のその誘導体、キサンチン、特にカフェイン又はチオフェリン、レチノイド、特にビタミンＡ酸、センテラ・アジアチカ（Ｃｅｎｔｅｌｌａ  ａｓｉａｔｉｃａ）抽出物、アジアチカ酸（ａｓｉａｔｉｃ  ａｃｉｄ）及びマデカス酸（ｍａｄｅｃａｓｓｉｃ  ａｃｉｄ）、並びに、アジアチコシド若しくはマデカソイド等のそれらのグリコシル誘導体、シーゲスベキア・オリエンタリス（Ｓｉｅｇｅｓｂｅｃｋｉａ  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）抽出物、コミホラ・ムクル（Ｃｏｍｍｉｐｈｏｒａ  ｍｕｋｕｌ）抽出物、並びに、エリオボトリア・ジァポニカ（Ｅｒｉｏｂｏｔｒｙａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）抽出物、ポリシロキサン、シラノール及びシリコーン等の化粧学上許容性のあるシリコン誘導体、アミノ酸及びその塩、特にマグネシウム塩又はカルシウム塩、特にアスパラギン酸、アルギニン、シトルリン及びトレオニン、セラミド、グリコセラミド、スフィンゴシン誘導体、特にＩＩ型セラミド、ＩＩＩ型セラミド、リン脂質、フォルスコリン及びその誘導体、コレウス（Ｃｏｌｅｕｓ）抽出物、テフロシア（Ｔｅｐｈｒｏｓｉａ）抽出物、エラスターゼ阻害剤、特にエラグ酸、大豆ペプチド、コラゲナーゼ阻害剤、特にペプチド、コプチデス（Ｃｏｐｔｉｄｉｓ）根抽出物、シュクテリア・バイカレンシス・ジョージの根（Ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉａ  ｂａｉｃａｌｅｎｓｉｓ  Ｇｅｏｒｇｉ  ｒｏｏｔ）抽出物、ヴォーゴニン（ｗｏｇｏｎｉｎｅ）、バイカリン及びバイカレリン等のフラボノイド、ギンコ・ビローバ（Ｇｉｎｋｇｏ  ｂｉｌｏｂａ）葉、モスラ・チネンシス（Ｍｏｓｌａ  ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）葉、サルビア・オフィシナリス（Ｓａｌｖｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）葉、シナモナン・カシア（Ｃｉｎｎａｍｏｍｕｍ  ｃａｓｓｉａ）葉の水−エタノール抽出物、カメリア・シネンシス（Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）のカセシック（ｃａｔｈｅｃｈｉｃ）抽出物、並びに、セオブロマ・カカオ（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ  ｃａｃａｏ）豆皮の水抽出物、フェロデンドロン・アムレンス（Ｐｈｅｌｌｏｄｅｎｄｒｏｎ  ａｍｕｒｅｎｓｅ）抽出物、抗炎症剤、特にフォスフォリパーゼＡ２阻害剤、鎮静剤（ｃａｌｍａｎｔ）、特にカンゾウ抽出物、グリシルヒチン酸、グリシルヒチン酸アンモニウム、保湿剤、特にポリオール、プロピレングリコール、ブチレングリコール、グリセロール、ヒアルロン酸、抗ストレッチ・マーク剤、特に一般のトチノキ抽出物及びエスシン抽出物、微小循環を保護又は向上する薬剤、特にギンコ・ビローバ由来のバイオフラボノイド、イソドン、アミ・ビスナーガ（Ａｍｉ  ｖｉｓｎａｇａ）抽出物、ビスナジン、ラスコゲニン（ｒｕｓｃｏｇｅｎｉｎ）、フリー・ラジカル殺菌剤、ＰＣＯ（ポリシアニドール・オリゴマー）等の特にポリフェノール及びその誘導体、植物抽出物、特にカークマ・ロンガ（Ｃｕｒｃｕｍａ  ｌｏｎｇａ）抽出物、５−α−リダクターゼ・インヒビター、特にピュゲウム・アフリカナム抽出物等の抗脂漏剤、並びに、セファランチン及びメチルニコチネート等の血���微小循環を促進する為の薬剤、アルファルファサポニン、大豆サポゲノール、特にＡ型、Ｂ型のもの、ベーソレティア（Ｂｅｒｔｈｏｌｌｅｔｉａ）抽出物等のコラーゲンＶＩＩ合成促進の為の薬剤、エラグ酸、Ｄ−キシロース並びに微量元素錯体からなる群より選択される少なくとも１つの物質と組み合わせた組成物中で使用される。
【００１５】
好適には、上記活性剤は、特にＵＶＡスクリーン剤及びＵＶＢスクリーン剤、特に酸化チタン及び酸化亜鉛、オキシベンゾン、桂皮酸塩、特にオクチルメトキシ桂皮酸塩（商標名Ｐａｒｓｏｌ  ＭＣＸで販売されている）、ブチルメトキシジベンゾイルメタン（商標名Ｐａｒｓｏｌ１７８９で販売されている）及び植物由来のスクリーン剤等を単独又は組み合わせたサンスクリーン剤等の日光の有害な効果から肌を保護する為の物質、ＤＮＡに生じる損傷を制限する物質、特にアスコルビン酸及びその誘導体及び／又はフォトニル（Ｐｈｏｔｏｎｙｌ）等、チミンダイマー形成を制限する物質、並びに、メラニン合成インヒビター若しくはチロシナーゼインヒビター等の年齢によるホクロを除去するのに資する物質から選択される少なくとも１つの物質を組み合わせた組成物中で使用される。
別のその基本的な性質に従えば、本発明は、化粧ケア方法に関する。この方法は、肌細胞のＣＤ４４膜受容体の発現及び／又は機能性における欠損を修正することを更に特別に目的とするものである。
【００１６】
更に詳しくは、本発明の化粧ケア方法は、肌細胞のＣＤ４４膜受容体の発現を増加する、並びに／又は、ヒアルロン酸及び／又はコラーゲン、特にコラーゲンＩ及び／若しくはコラーゲンＩＶ及び／又はフィブロネクチンの上記肌細胞表面への結合を向上するための少なくとも１つの薬剤を活性成分として含有する化粧組成物を処置すべき肌部分へ塗布することからなる。
本発明の方法に従えば、活性成分は、好適にはα−ヒドロキシ酸、α−ケト酸及び上記それらの塩及びそれらの誘導体から選択される。
塩化マグネシウムは本発明の化粧ケア方法で使用される化粧組成物の活性成分としても選択されてよい。
【００１７】
この化粧方法において、上記定義した活性剤の１つを含有する化粧組成物は処置すべき肌部分へ適用される。
この化粧ケア方法により、ヒアルロン酸並びに／又はコラーゲン、特にコラーゲンＩ及び／若しくはコラーゲンＩＶ並びに／又はフィブロネクチンの肌細胞表面への結合の欠損を特に修正することが可能となる。
この化粧ケア方法により、特に表皮の含水の向上又は敏感肌若しくは反応性肌の処置が可能となる。
【００１８】
本発明は、肌細胞のＣＤ４４膜受容体の発現及び／又は機能性における加齢の不の効果を修正する為の上記化粧ケア方法にも関する。ケラチノサイトのヒアルロン酸を結合する能力が加齢の過程でかなり減少する、すなわちＣＤ４４の機能性の損失をもたらすと言うことが本発明の発明者らにより実証されているので、この点は特に重要である。
別のその側面に従えば、本発明は、本発明の発明者らによりなされた発見の治療上の分野においての使用にも関する。
すなわち、本発明は、肌細胞のＣＤ４４膜受容体の発現を増加する、並びに／又は、ヒアルロン酸及び／又はコラーゲン、特にコラーゲンＩ及び／若しくはコラーゲンＩＶ及び／又はフィブロネクチンのこの肌細胞表面への結合を向上するための少なくとも１つの活性剤を活性成分として含有する局所使用のための医薬組成物を肌へ塗布することによる治療処置方法にも関する。
【００１９】
さらに本発明は、医薬組成物が医薬上許容性のあるα−ヒドロキシ酸、その塩及び炭素数２〜２４、好ましくは炭素数１４〜２２のアルコールとのそのエステル、医薬上許容性のあるα−ケト酸、その塩及び炭素数２〜２４、好ましくは炭素数１４〜２２のアルコールとのそのエステル並びに塩化マグネシウムから選択される活性剤を活性剤として含有する場合にさらに特別に関するものである。
これらの様々な治療上の適用において、言うまでもなく活性剤は医薬上許容性のあるものから選択されよう。しかしながら、α−ヒドロキシ酸又はα−ケト酸及びそれらの好ましい塩及びエステルに関して上記開示における全ての説明が当てはまる。
組成物中の活性製品の濃度も、上記化粧組成物中の化粧活性製品の濃度と同一の好ましい範囲内で選択される。
【００２０】
このように、別の側面に従えば、本発明は、肌細胞のＣＤ４４受容体の発現、並びに／又は、ヒアルロン酸及び／又はコラーゲン、特にコラーゲンＩ及び／若しくはコラーゲンＩＶ及び／又はフィブロネクチンの上記細胞表面へ結合するその能力の欠損を処置するための局所使用のための医薬組成物調製のために、医薬上許容性のあるα−ヒドロキシ酸、その塩及び炭素数２〜２４、好ましくは炭素数１４〜２２のアルコールとのそのエステル、医薬上許容性のあるα−ケト酸、その塩及び炭素数２〜２４、好ましくは炭素数１４〜２２のアルコールとのそのエステル並びに塩化マグネシウムから選択される少なくとも１つの活性剤の使用に関する。
炎症現象の予防及び／又は処置の分野は、特に好適な分野の１つである。
以下の実施例は、純粋に本発明を描写する目的で与えられるものである。
【００２１】
実施例１
ケラチノサイト表面へのヒアルロン酸結合を蛍光により実証するための試験プロトコール
Ｉ−ケラチノサイト表面へ結合したヒアルロン酸量の測定
以下のステップを行った：
１−細胞接種：
１５０００のヒトケラチノサイトを、培養ウェル（９６−ウェルプレート）中のＫ−ＳＦＭ液（Ｇｉｂｃｏ）に接種した。
２−密集培地の製造：
５％ＣＯ２を有する湿度飽和雰囲気下、３７℃、７２時間培地をインキュベートし、培養液は４８時間後に更新した。
【００２２】
３−ヒアルロン酸の結合：
０．２％アジドナトリウムを含有するＫ−ＳＦＭ中で調製し、“Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｅ−ｌａｂｅｌｌｅｄ  ｈｙａｌｕｒｏｎａｔｅ；ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９７５，Ｖｏｌ．４４，ｐｐ．２５１−２５７”に記載された技術に従い実験室で合成した蛍光色素、フルオレサミン（ＨＡ−ＦＡ）に共有結合したヒアルロン酸と一緒に、４時間、４℃で細胞をインキュベートした。
４−試験製品の活性評価：
ケラチノサイトにより結合したＨＡ−ＦＡ量で作用を評価することが望まれる製品をインキュベーション開始時にインキュベーション液へ添加した。評価すべき製品の不存在下にあり、それを溶解する為に使用した補形薬の存在下にあるコントロールを実施した。
【００２３】
５−ＨＡ−ＦＡの非特異性結合：
非特異性標識を測定する為に、蛍光色素で標識してヒアルロン酸を２００倍以上添加したが、ステップ３と同様の実験条件を正確に用いた。
６−蛍光定量：
ＨＡ−ＦＡ結合液を除去した後ＰＢＳで２回洗浄を行い、その後ケラチノサイトに結合した蛍光を励起波長λｅｘ＝４８５ｎｍ及び発光波長λｅｍ＝５３８ｎｍで測定した。
７−結果の表示：
非特異蛍光を差し引いて、蛍光単位（「特異的蛍光」）で結果を表現した（５−参照）。
８−正規化：
一定の場合、特に例えば異なる年齢のドナー又は異なる処置を受けたドナーより由来する２つの異なる系統の細胞を比較する必要がある場合、培養ウェル中に存在する細胞数を考慮して正規化する必要がある。これをする為に、測定した蛍光値を細胞ＤＮＡ含量に減少させて、ＤＡＰＩ法に従い実施した（ＩＩＩ−参照）。
【００２４】
ＩＩ−ケラチノサイト表面でのヒアルロン酸受容体（ＣＤ４４）の発現の測定
ステップ１及び２は、Ｉのステップ１及び２と同一とした。
３−カルシウム及びマグネシウムを含有する２％パラホルムアルデヒドＰＢＳ液へ細胞を、５分間、室温で結合した。
４−非特異性抗原−抗体結合部位の飽和：
ＰＢＳで２度洗浄した後、５ｖ／ｖ％ウシ血清及び０．０５ｗ／ｖ％アジドナトリウムを配合したカルシウム及びマグネシウムのＰＢＳ飽和液で、１時間、室温で細胞をインキュベートした。
５−標識：
１時間、室温で、光が無い状態で、飽和液（４−参照）で５０倍に希釈したＲ−フィコエリトリン結合ヒト抗ＣＤ４４ＩｇＧ１モノクローナル抗体を添加した。６−Ｒ−フィコエリトリン結合ＩｇＧ１とのイソタイプ・コントロールを、標識に関し同一実験条件下で調製した。得られた値を標識値より控除した。
７−蛍光定量：
飽和液で２度洗浄した後、ウェル中に存在する蛍光を、５０μｌのＰＢＳ中、λ励起＝５４４ｎｍ、λ発光＝５９０ｎｍで読み取った。
８−試験プロトコールの評価：
ＣＤ４４受容体の発現上の活性を評価することが望まれている製品を、細胞接種２４時間後培養液へ添加した。これを行う為に、接種液を除去して、試験物質を含有する同一の液に置換した。インキュベーションを４８時間続けた。評価する製品の不存在下であり、それを溶解するのに使用した補形薬の存在下にあるコントロールを実施した。その他の全ての要素は同一にした。
９−ＣＤ４４受容体機能性の測定：
評価すべき物質（８−参照）で培地を４８時間処置した後、プロトコールＩ−のステップ３においてＣａＣｌ２を濃度２０ｍＭで添加して、細胞のヒアルロン酸を結合する能力をプロトコールＩ−に従い測定した。
１０−正規化：
このように得られた値を、ウェル中に存在する細胞物質の量を考慮して正規化した。これを行う為に、細胞ＤＮＡ含量をＤＡＰＩ法で測定した（下記プロトコール参照）。
【００２５】
ＩＩＩ−４′，６′−ジアミノフェニルインドールジヒドロクロライド（ＤＡＰＩ）での細胞ＤＮＡの定量
細胞ＤＮＡの定量は、ＣＤ４４発現を定量した後、培地上で直接行うことができた。
１−浸透化ステップ：
−２０℃にした３０μｌメタノールを１分間各ウェルへ添加した。
２−ＤＡＰＩでの標識：
ＰＢＳで２度洗浄した後、２０μｇ／ｍｌのＤＡＰＩ溶液を、室温、暗中で１５分かけて添加した。
３−蛍光定量：
ＰＢＳで２度洗浄した後、５０μｌのＰＢＳ中、λ励起＝３５５ｎｍ、λ発光＝４６０ｎｍでウェルに存在する蛍光を読み取った。
【００２６】
実施例２
そのヒアルロン酸結合におけるＣＤ４４受容体の機能性における加齢の効果の実証
この試験は実施例１で与えたプロトコール（Ｉ−）の試験を行って実施した。
異なる年齢のドナーより得られた普通ヒトケラチノサイトの培地で試験を行った。
結果を以下の表Ｉで示した。
【００２７】
【表１】
0004708571.tif 000002
【００２８】
加齢の過程で、ＣＤ４４機能性の損失がもたらすヒアルロン酸を結合するケラチノサイトの能力に、かなり大きな減少が観察された。
実施例３
ケラチノサイトへのヒアルロン酸の結合におけるグルコン酸及びカルシウムの組み合わせの効果
実施例１のプロトコールＩ−に従って、以下の試験が行われた。
ａ）最初の実験で、等モル濃度であるＣａＣｌ２及びグルコン酸カルシウムの存在下、培地中、蛍光色素で標識したヒアルロン酸のヒトケラチノサイトへの結合を比較した。
結果を以下の表ＩＩに示した。
【００２９】
【表２】
0004708571.tif 000003
【００３０】
等モル濃度の塩化カルシウムよりグルコン酸カルシウム存在下で、測定した蛍光量が顕著なことが観察された。このことは、塩化カルシウムの存在下より、この製品の存在下で、ずっと多量のヒアルロン酸がケラチノサイト培地に結合することを示唆した。
ｂ）第二の実験において、１０ｍＭグルコン酸ナトリウムが存在下又は不存在でのＣａＣｌ２濃度の増加作用を比較した。
結果を以下の表ＩＩＩに示した。
【００３１】
【表３】
0004708571.tif 000004
【００３２】
この結果により、ヒアルロン酸結合においてカルシウムの正の効果が確証された。カルシウムの正の効果は濃度１０ｍＭで顕在的であった。
グルコン酸ナトリウムの形態をしたグルコン酸の存在下で、１０ｍＭのＣａＣｌ２で結合したヒアルロン酸量はより大きかった。その上、５ｍＭのＣａＣｌ２濃度では、この結合上の効果はなく、グルコン酸ナトリウムの添加により顕著なヒアルロン酸結合を観察することが可能となった。
ｃ）第三の実験において、カルシウム濃度を１０ｍＭに設定して、ナトリウム塩の形態で供給したグルコン酸濃度を変えた。
結果を以下の表ＩＶに示した。
【００３３】
【表４】
0004708571.tif 000005
【００３４】
グルコン酸ナトリウムの形状で供給したグルコン酸は、カルシウムの効果で投与依存的増強を誘導し、カルシウム単独の存在下よりもずっと多量のヒアルロン酸結合が可能となった。この実験は、選択的なＣａ／グルコン酸モル比（１０ｍＭ／２．５ｍＭ）が４近くに現れたことを示した。
この最終的な実験は、カルシウム量に対するグルコン酸量を調節して、最大作用を生じるのに有用である。
比較的最適な条件下で、グルコン酸ナトリウムにより力価１２でカルシウムの効果を少なくとも増強することが可能となった。
グルコン酸ナトリウムが、表皮中のケラチノサイト表面へのヒアルロン酸を結合する表皮中に豊富に存在するカルシウムの効果を増強することができるので、これら最後の２つの要素は重要である。
このように、本発明はグルコン酸カルシウムに限らず、塩、又は、カルシウム、マグネシウム、マンガン、亜鉛若しくはナトリウム又はその他の１価若しくは２価カチオンとの錯体の形態であるグルコン酸にもさらに一般に関連することが分かった。
【００３５】
実施例４
培養液中のヒトケラチノサイト表面でのＣＤ４４の発現及び培養液中のヒトケラチノサイトによるヒアルロン酸の結合における乳酸ナトリウムの効果
ａ）乳酸ナトリウムの存在又は不存在下でのヒトケラチノサイト表面でのＣＤ４４の発現
この試験は、実施例１で示されたプロトコールの試験を使用して行った。
試験を普通ヒトケラチノサイトの培養液において実施した。
結果を以下の表Ｖに示した。
【００３６】
【表５】
0004708571.tif 000006
【００３７】
この実験において、乳酸ナトリウム濃度０．２２ｍＭで細胞を４８時間処置した場合、ケラチノサイトのＣＤ４４標識に該当する蛍光値が増加されることが観察された。
ｂ）乳酸ナトリウムの存在又は不存在下でのヒトケラチノサイト表面でのヒアルロン酸の結合
この試験は、実施例１で示されたプロトコールの試験を使用して行った。
この試験は普通ヒトケラチノサイトの培養液で行った。
結果を以下の表ＶＩに示した。
【００３８】
【表６】
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【００３９】
この実験において、乳酸ナトリウム濃度０．２２ｍＭ２５（上記表ＶＩ参照）でケラチノサイトのＣＤ４４発現の増加がヒアルロン酸を結合するケラチノサイトの能力の増加によって達成されたことが実証された。
ヒアルロン酸結合の活性化が受容体の発現の増加より大きなことが着目され、乳酸ナトリウムも受容体機能上好ましい作用を有しうることが示唆された。
コメント：細胞数、最終的に受容体数における試験物質のありうる効果を考慮するため、ＣＤ４４標識又はヒアルロン酸結合に該当する蛍光値は、培養液中に存在するＤＮＡ値により表される細胞物質の量に対して標準化がなされている。
【００４０】
実施例５
培養液中でヒトケラチノサイトによりヒアルロン酸結合する塩化マグネシウムの効果
この実験では、等モル濃度のＣａＣｌ２の存在下又はＭｎＣｌ２の存在下の培地中での蛍光ヒアルロン酸のヒトケラチノサイトへの結合を、実施例１で与えたプロトコールを適用して比較した。
【００４１】
【表７】
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【００４２】
ＭｎＣｌ２の存在下で測定した蛍光量は、等モル濃度の塩化カルシウムより顕著に大きなことが観察された。このことは、塩化カルシウムの存在下より、この製品の存在下の方が、ずっと多量のヒアルロン酸がケラチノサイト培養液に結合することを示唆している。
【００４３】
肌細胞へのヒアルロン酸結合を促進するための薬剤の性質を使用する化粧処方の実施例
実施例６：保湿及び滋養の抗加齢エマルション
【００４４】
【表８】
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【００４５】
この滋養エマルションは、肌、特に表皮の含水、肌の精緻さ及び肌理を向上し、シワを消す。それは毎日顔に塗布されるものである。
実施例７：ファーミング及び再構築の保湿ジェル
【００４６】
【表９】
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【００４７】
この保湿ジェルは肌への緊張効果を発揮して、その柔軟さ及び丈夫さを向上する。それは、毎日顔、首及びネックラインに塗布する。
実施例８：保湿及び修復のリポソームジェル
【００４８】
【表１０】
0004708571.tif 000011
【００４９】
このリポソームジェルは、毎日、好ましくは晩に顔に塗布して使用する。それは、肌の柔軟さ及びその保湿化を向上し、その再生を促進する。
実施例９：保湿及び強壮のローション
【００５０】
【表１１】
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【００５１】
この保湿ローションは、より美しく、より輝く肌を得るために、毎日、好ましくは朝、顔に塗布して使用される。
実施例１０：保湿及び鎮静の液体
【００５２】
【表１２】
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【００５３】
この液体は、顔及び体に毎日局所塗布して使用される。
実施例１１：保湿マスカラ
【００５４】
【表１３】
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【００５５】
実施例１２：日焼け後の緩和のための貼付薬
【００５６】
【表１４】
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【００５７】
実施例１３：あかぎれ、小さな表面の傷及び炎症の赤味用の殺菌及び緩和のクリーム
【００５８】
【表１５】
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