(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌ１１タンパク質を欠いているリボソーム変異型大腸菌株を用いて可溶化状態の真核生物タンパク質を合成することを特徴とする大腸菌を用いたタンパク質の合成方法
【請求項２】
前記リボソーム変異型大腸菌株がＡＭ６８株であることを特徴とする請求項１記載の大腸菌を用いたタンパク質の合成方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、大腸菌を用いたタンパク質の合成方法及びそのタンパク質の合成方法により得られたタンパク質に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質は様々な生命現象を演出する主役分子であり、全てのタンパク質は遺伝情報に従い、リボソームと呼ばれる細胞内構造体により合成される。リボソームは、ほぼ等量のＲＮＡとタンパク質とからなり、細胞におけるタンパク質合成の場をなしている。リボソームには、タンパク質の合成速度を決定するリボソーム機能部位であるＧＴＰａｓｅセンターが存在することが知られている。
【０００３】
ところで、ヒトの場合、２万種類以上のタンパク質が存在するが、その大半は明確な機能がなお明らかにされていない。しかし、その各タンパク質の機能が解明できれば、生命現象を分子レベルで理解するうえで大きな助けとなるばかりでなく、医療や産業に役立つタンパク質の発掘と提供が可能となる。
【０００４】
従来の大腸菌によるタンパク質の合成方法には、通常、大腸菌に内在するＲＮＡポリメラーゼを利用して遺伝子を発現させ、タンパク質を合成させる方法（非特許文献１及び２）と、ファージ由来のＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を大腸菌に導入して、高効率に遺伝子を発現させ、目的のタンパク質を得る方法（非特許文献３及び４）が一般的であり、現在最も利用されているのは、後者の方法である。いずれの方法でもタンパク質の合成は細胞内の野生型リボソームが担っている。そして、このような通常の野生型大腸菌株を用いたタンパク質の合成方法では、ヒトを含む真核生物のタンパク質産物の場合、機能を保持しない、封入体とよばれる不溶化した凝集体として得られる場合が多いことが知られている（図１左）。その一因として、大腸菌細胞内でのタンパク質合成速度が速く、短時間に大量のタンパク質が合成されるため、タンパク質の折り畳みが異常になることが考えられている。その従来型の大腸菌によるタンパク質の合成方法の中には、低温（１５℃）下、低速でタンパク質を発現させ合成する方法（非特許文献５及び６）もあるが、その方法を用いても機能を保持した可溶化タンパク質を十分に発現させることができず、目的のタンパク質を得ることができない場合が多い。タンパク質の合成方法には、大腸菌ばかりでなく、動物培養細胞を用いる方法（非特許文献７及び８）、あるいは小麦胚芽細胞抽出液などの無細胞系用いる方法（非特許文献９）も確立されているが、タンパク質合成効率が低いことや、これらの発現コストが高額であるなどの問題がある。
【非特許文献１】Weinstock, G. M., ap Rhys, C., et.al Open reading frame expression vectors: a general method for antigen production in Escherichia coli using protein fusions to beta-galactosidase. Proc Natl Acad Sci U S A 80:4432-4436,1983
【非特許文献２】Guo, L. H., Stepien, P. P., et.al Synthesis of human insulin gene. VIII. Construction of expression vectors for fused proinsulin production in Escherichia coli. Gene 29:251-254,1984
【非特許文献３】Studier, F. W., and Moffatt, B. A. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. J Mol Biol 189:113-130,1986
【非特許文献４】Rosenberg, A. H., Lade, B. N., et.al Vectors for selective expression of cloned DNAs by T7 RNA polymerase. Gene 56:125-135,1987
【非特許文献５】Shirano, Y., and Shibata, D. Low temperature cultivation of Escherichia coli carrying a rice lipoxygenase L-2 cDNA produces a soluble and active enzyme at a high level. FEBS Lett. 271:128-130,1990
【非特許文献６】Vasina, J. A., and Baneyx, F. Expression of aggregation-prone recombinant proteins at low temperatures: a comparative study of the Escherichia coli cspA and tac promoter systems. Protein Expr Purif. 9:211-218,1997
【非特許文献７】Haynes, J., and Weissmann, C. Constitutive, long-term production of human interferons by hamster cells containing multiple copies of a cloned interferon gene. Nucleic Acids Res. 11:687-706,1983
【非特許文献８】Smith, G. E., Summers, M. D., Fraser, M. J. Production of human beta interferon in insect cells infected with a baculovirus expression vector. Mol Cell Biol. 3:2156-2165,1983
【非特許文献９】Sawasaki, T., Ogasawara, T., et.al A cell-free protein synthesis system for high-throughput proteomics. Proc Natl Acad Sci U S A 99:14652-14657,2002
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで、本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、従来の野生型大腸菌株を用いたタンパク質の合成方法では得られない場合が多かった、機能を保持した可溶化状態の真核生物タンパク質を安価かつ容易に合成することができる、大腸菌を用いたタンパク質の合成方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らはタンパク質の合成速度を決定するリボソーム機能部位であるＧＴＰａｓｅセンターを構成するタンパク質の一部、Ｌ１１タンパク質を欠く変異型大腸菌株ＡＭ６８株に注目した。変異型大腸菌株ＡＭ６８株は、リボソームＧＴＰａｓｅセンターを構成するタンパク質成分の一つであるＬ１１タンパク質が欠損した株として、１９７９年にＥ．Ｒ Ｄａｂｂｓ博士により作成、単離されている（Ｅ．Ｒ Ｄａｂｂｓ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１４０：７３４−７３７，１９７９）。ＡＭ６８株の生育速度は野生型大腸菌株の１／４〜１／５で、タンパク質合成速度も野生型大腸菌株と比較して減速型となっている。タンパク質合成用宿主細胞は現在数多く市販されているが、タンパク質合成を担うリボソームの機能部位の変異株を減速型タンパク質合成用宿主細胞として利用する例はこれまで見られない。
【０００７】
そこで本発明者らは、この変異型大腸菌株ＡＭ６８株の増殖速度が低速で、タンパク質合成速度がかなり低下している性質を、機能を保持した真核細胞タンパク質の合成に利用する、という発想に至った。
【０００８】
上記課題に鑑みて鋭意検討した結果、本発明者らはこの変異型大腸菌株ＡＭ６８株に動物または植物の遺伝子を導入し、タンパク質の発現を試み、野生型大腸菌株では不溶化産物しか得られないタンパク質について、リボソーム変異型大腸菌株であるＡＭ６８株を用いることで、機能を保持する可溶化状態で真核生物タンパク質を得られることを明らかにし、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明の請求項１記載の大腸菌を用いたタンパク質の合成方法は、Ｌ１１タンパク質を欠いているリボソーム変異型大腸菌株を用いて可溶化状態の真核生物タンパク質を合成することを特徴とする。
【００１０】
本発明の請求項２記載の大腸菌を用いたタンパク質の合成方法は、前記リボソーム変異型大腸菌株がＡＭ６８株であることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、タンパク質合成速度を決定するリボソーム機能部位を構成するリボソームタンパク質成分の一部、Ｌ１１タンパク質を欠くリボソーム変異型大腸菌株ＡＭ６８株を用いることにより、不溶化、不活性化しやすい真核生物タンパク質を安価かつ容易に発現、合成することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００１３】
本発明の大腸菌を用いたタンパク質の合成方法は、リボソーム変異型大腸菌株を用いてタンパク質を合成することを特徴とする。リボソーム変異型大腸菌株は、タンパク質の合成を行っている細胞内構造体であるリボソームの変異型大腸菌株である。とくに本発明で好適に用いられるリボソーム変異型大腸菌株は、リボソームＧＴＰａｓｅセンターが形成するタンパク質複合体構造構成成分の一部を欠損させた大腸菌株である。リボソームＧＴＰａｓｅセンターは、リボソームに存在し、タンパク質の合成速度を決定している。リボソームＧＴＰａｓｅセンターが形成するタンパク質複合体構造の構成成分の一部を欠損させることでタンパク質合成が全く停止するか、または合成速度を低下させることができることは、本発明者らによって実証されている（Ｕchiumi, T., Honma, S., Nomura, T., Dabbs, E. R., and Hachimori, A. Translation elongation by a hybrid ribosome in which proteins at the GTPase center of the Escherichia coli ribosome are replaced with rat counterparts. J.Biol.Chem.277:3857-3862.2002）。
【００１４】
そのリボソームＧＴＰａｓｅセンターが形成するタンパク質複合体構造の構成成分の一つとして、Ｌ１１タンパク質が知られている。本発明のタンパク質の合成方法により使用されるリボソーム変異型大腸菌株としては、このＬ１１タンパク質を欠いているものが好適に用いられる。
【００１５】
また、Ｌ１１タンパク質を欠いているリボソーム変異型大腸菌株としては、ＡＭ６８株が好適に用いられる。ＡＭ６８株は、リボソームＧＴＰａｓｅセンターを構成するタンパク質成分の一つであるＬ１１タンパク質が欠損した株として、１９７９年にＥ．Ｒ Ｄａｂｂｓ博士により作成、単離されている（Ｅ．Ｒ Ｄａｂｂｓ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１４０：７３４−７３７，１９７９）。ＡＭ６８株の生育速度は野生型大腸菌株の１／４〜１／５で、タンパク質合成速度も野生型大腸菌株と比較して減速型となっている。
【００１６】
本発明の大腸菌を用いたタンパク質の合成方法によれば、真核生物タンパク質を合成することができる。通常の野生型大腸菌株を用いたタンパク質の合成方法では、ヒトを含む真核生物のタンパク質産物の場合、機能を保持しない、封入体とよばれる不溶化した凝集体として得られる場合が多いことが知られている（図１左）。その一因として、大腸菌細胞内でのタンパク質合成速度が速く、短時間に大量のタンパク質が合成されるため、タンパク質の折り畳みが異常になることが考えられている。しかし、本発明の大腸菌を用いたタンパク質の合成方法によれば、機能を保持した可溶化状態で真核生物タンパク質を合成することができる。
【００１７】
このようにして得られたタンパク質は、可溶性で機能を保持している。通常の野生型大腸菌株を使用した際に得られるタンパク質は不溶性であるが、本発明に用いられる大腸菌株を用いると、可溶性で機能を保持したタンパク質が得られる（図１右）。このことは、野生型大腸菌株が高速で増殖し、細胞内のタンパク質合成速度も高いことに対し、本発明に用いられるリボソーム変異型大腸菌株ではＬ１１タンパク質が欠損し、タンパク質合成速度と細胞増殖速度が低下し、細胞増殖、タンパク質合成がともにゆっくりと行われるため、タンパク質産物が正常に折り畳まれて、可溶性で機能を保持したタンパク質が得られると考えられている。
【００１８】
以下に本発明の実施例によって、本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら制限されるものではない。
【実施例１】
【００１９】
イネα−アミラーゼＩ−１遺伝子のコード領域を、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ｓ−Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ：ＧＳＴ）のコード配列であるＧＳＴ−Ｔａｇを含むプラスミドｐＧＥＸ−６Ｐ−１（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）のＧＳＴ下流部位（ＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩサイト間）に組み込み、ＧＳＴとα−アミラーゼＩ−１間融合タンパク質の発現用プラスミドを構築した。構築されたプラスミドの概略を図２に示す。なお、Ａｍｐは抗生物質アンピシリン耐性遺伝子、Ｐｔａｃはタックプロモーター配列、ｌａｃ Ｉはラクトースオペロン発現インヒビターのコード配列であり、ｐＢＲ３２２ ｏｒｉはプラスミドの複製起点である。構築されたプラスミドを、リボソームが野生型の大腸菌株であるＱ１３株、およびリボソーム変異型大腸菌株であるＡＭ６８株に導入し、両種の菌を抗生物質アンピシリン耐性型に形質転換した。これら大腸菌をアンピシリン存在下、３７℃で培養し、５６０ｎｍの吸光度が０．５〜０．６にまで生育した段階で、遺伝子発現誘発剤（ＩＰＴＧ）を添加し、３０℃で一夜培養した。大腸菌体を遠心操作により回収し、少量の緩衝液に懸濁し、超音波により細胞を粉砕した。細胞抽出液を遠心分離にかけ、可溶性分画を回収した。得られた可溶性分画の一定量をＳＤＳゲル電気泳動で分離し、ゲルをタンパク質染色色素コマシーブリリアントブルーにより染色した（図３Ａ）。図３Ａにおいて、分子量標準タンパク質の移動度から推定した分子量を縦軸に示し、ＩＰＴＧ添加により発現誘導されたＧＳＴ−アミラーゼ融合タンパク質産物を矢印で示した。なお、図３Ａ、Ｂにおいて、レーン１〜３は野生型リボソーム大腸菌株Ｑ１３株を、レーン４〜６はリボソーム変異型大腸菌株ＡＭ６８株を示す。そして、レーン１と４はそのまま３０℃で一夜培養した場合であり、レーン２と５はアミラーゼ遺伝子を含むプラスミドで形質転換した後、抗生物質アンピシリン存在下で同様に培養した場合、レーン３と６は導入した遺伝子をさらにＩＰＴＧの添加により発現させ、アンピシリン存在下で同様に培養した場合を示す。
【００２０】
さらに、上記で得られた可溶性分画の一定量を水溶性デンプンと混合し、５分間３７℃で保温し、アミラーゼ活性によるデンプンの分解をヨード発色の低下により測定し、発現タンパク質のアミラーゼ活性をタンパク質量あたりのデンプンを分解する速度として分析した（図３Ｂ）。
【００２１】
その結果、ＧＳＴ−α−アミラーゼＩ−１融合タンパク質に対応する分子量のタンパク質の大量発現が、ＡＭ６８株で認められたが（図３Ａ、レーン６）、野生株Ｑ１３株では見られなかった（図３Ａ、レーン３）。野生株を使用した場合、発現した融合タンパク質は全て不溶性画分に見られた。回収した可溶性画分の一定タンパク質量を用いて、アミラーゼの活性を測定したところ、ＩＰＴＧで発現誘導したＡＭ６８株からの可溶性画分に高い活性が見られた（図３Ｂ、サンプル６）。発現タンパク質はＧＳＴのアフィニティーカラムを用いることで精製することが可能で、精製されたタンパク質のアミラーゼ活性も確認された。ほかの野生型大腸菌株、ＢＬ２１株を用いた場合でもＱ１３株と同様、発現タンパク質は全て不溶性であった。このようなＡＭ６８株に特異的な可溶化タンパク質の発現は、イネα−アミラーゼII−５およびカイコ翻訳伸長因子ＥＦ−１αでも同様に見られたが、通常の野生型リボソーム大腸菌株では可溶化状態では全く得られなかった。したがって、ＡＭ６８株が、通常の野生型リボソーム大腸菌株では得られない真核生物タンパク質の発現に利用できることが確認できた。
【００２２】
このように野生型リボソーム大腸菌株を使用した際に得られるタンパク質が不溶性であることに対し、ＡＭ６８株では可溶性であることは、野生型大腸菌が高速で増殖し、細胞内のタンパク質合成速度も高いことに対し、ＡＭ６８株ではリボソームＬ１１タンパク質が欠損し、タンパク質合成速度と細胞増殖速度が低下し、細胞増殖、タンパク質合成がともにゆっくりと行われるため、タンパク質産物が正常に折り畳まれて、可溶性で機能を保持するタンパク質が得られると考えられる。
【００２３】
タンパク質に関する研究は、基礎生命科学、医学、農学、工学の幅広い学術領域でなされている。そのため、本発明の大腸菌を用いたタンパク質の合成方法は多方面における基礎研究において利用することができる。また、タンパク質の研究は、産業界では医学、製薬、食料品の業種と密接な関係にある。とくに医学分野と製薬業界では病気と直結するタンパク質の同定、発病の仕組み、さらに発病を阻止する製薬の開発にタンパク質の合成技術が必要である。そこで、本発明のタンパク質の合成方法技術は有効に利用することができる。たとえば、特定の病気の原因遺伝子が同定された場合、その次のステップとしてその遺伝子がコードするタンパク質を大量に合成することが必要となる。このタンパク質の大量合成により、発現に関わるタンパク質の構造・機能解析、発病の分子機構の解析が可能となり、その結果、発病を抑制する薬剤の開発も可能となる。また、本タンパク質合成方法は直接、良質のタンパク質製剤の合成にも利用可能である。
【００２４】
なお、本実施例におけるαアミラーゼＩ−１とαアミラーゼII−５は、いずれもデンプンを分解する酵素であるが、これらの細胞内存在量、細胞内局在は両酵素で異なり、作用機構も異なっていると考えられているが、未だその詳細は明らかにされていない。また、本実施例において産出されたαアミラーゼＩ−１タンパク質またはαアミラーゼII−５タンパク質は、主に分子構造・機能に関する研究材料に用いられるが、そのほか、デンプンの加工等の工業的目的での利用も可能である。そして、本実施例におけるＥＦ−１αは、動物細胞内でタンパク質合成に関わる因子（翻訳因子）の一つであり、ｔＲＮＡという分子に結合した各アミノ酸をリボソームのもとに運ぶ役割を担っている。さらに、ＥＦ−１αは、遺伝情報に合致させたアミノ酸を選択的に運ぶ重要なはたらきを保有してるが、その詳細な分子機構はなお、解明されていない。また、本実施例において産出されたＥＦ−１αタンパク質は、タンパク質合成に関わる分子機能の研究材料に利用されるほか、ほかのタンパク質を試験管内で合成するための、タンパク質合成系を作製するうえでの必須の成分として利用することも可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】野生型リボソーム大腸菌株とリボソーム変異型大腸菌株ＡＭ６８株による細胞内タンパク質合成の概略図である。
【図２】本実施例で構築されたプラスミドの概略図である。
【図３】Ａ：本発明の実施例において、Ｑ１３株およびＡＭ６８株により得られたタンパク質のＳＤＳゲル電気泳動結果を示す写真である。Ｂ：本発明の実施例において、Ｑ１３株およびＡＭ６８株により得られたタンパク質のアミラーゼ活性を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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