(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
妊婦唾液からの生体サンプルにおける尿酸塩と子癇前症の検出とを関連付ける方法であって、以下のステップを含む方法：
（１）被験者から生体サンプルを採取するステップ、
（２）アッセイにかける前に前記生体サンプルを処理するステップ、
（３）存在する尿酸塩の濃度について前記サンプルをアッセイするステップ、および
（４）（３）で得た結果と正常な対照値とを比較するステップ。
【請求項２】
尿酸塩を時間エンドポイント法によりアッセイする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
尿酸塩を乾燥検査法によりアッセイする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
尿酸塩をディップスティック法によりアッセイする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
妊婦唾液中の尿酸塩レベルの子癇前症の指標としての使用であって、子癇前症の検出が以下のステップを含む使用：
（１）被験者から生体サンプルを採取するステップ、
（２）アッセイにかける前に前記生体サンプルを処理するステップ、
（３）存在する尿酸塩の濃度について前記サンプルをアッセイするステップ、および
（４）（３）で得た結果と正常な対照値とを比較するステップ。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
本発明は子癇前症の検出に関する。特に、本発明は、生体サンプル（唾液）中の尿酸塩、尿酸のナトリウム塩、２，６，８−トリオキシプリンの上昇した値を検出することによる子癇前症の診断に関する。
【０００２】
本発明は、血液中の尿酸塩濃度と比較して唾液中の尿酸塩濃度に固有の高い感度を用いる方法であり、独自の予測可能な挙動を有する代謝化合物として尿酸塩に依存している。
【０００３】
子癇前症は妊婦の約２〜４％で発症し、母親及び胎児の死亡率及び罹患率の一般的原因である。重篤な場合、早期分娩しなければならず、そのため子供がハンディキャップを負うリスクがある。
【０００４】
子癇前症（妊娠中毒症、子癇前症性中毒症）は“妊娠蛋白尿性高血圧症”（ＧＰＨ）としても公知であるが、原因が不明の妊娠の多臓器疾患である。母性症候群は各種異常、すなわち高い血圧、浮腫、蛋白尿、及び異常な凝固、肝機能及び腎機能により特徴づけられる。これにより、多臓器不全、頭蓋内出血及び痙攣が生ずる恐れがある。子癇前症の原因は胎盤中にあると考えられ、循環内皮細胞“毒性”因子を支持する証拠がある。
【０００５】
酸化ストレスが子癇前症の発症にとって重要であると考えられており、弱い胎盤灌流を伴っている。酸化ストレスのマーカーである高い血中尿酸塩は子癇前症の重篤度及び胎児の結果に関連している（Manyら，１９９６）。血液尿酸塩も子癇前症の予測因子である（Chappellら，２００２）。
【０００６】
一般的に、子癇前症の症状は約２８週から満期の間で検出可能であり、通常２４週までは明らかでない。従来技術の欧州特許出願公開第０９２７３５５号明細書に開示されている慣用の検査は、血液中の尿素または尿中のタンパク質を測定することによる腎不全及び高い妊婦血圧に向けられている。
【０００７】
しかしながら、従来方法は、血液検査に時間がかかる；経験をつんだオペレーターが必要である；肉体的及び心理的不快をもたらすことがある；危険な針を刺して感染性肝炎やエイズのような病気にかかる恐れがあるといった幾つかの重大な点で役立たない。血液サンプルは分解を阻むために専門家の保存技術も必要である。
【０００８】
従って、酸化ストレスを検出するための生化学的検査を用いて子癇前症のリスクがあるか子癇前症を患っている妊婦を同定するための高感度であり、安価であり、非侵襲性であり、日常時または緊急時に実施するのに簡単且つ迅速であり、血液よりも安全、簡単、迅速且つ安価に得られる方法が要望されている。
【０００９】
尿酸塩は強力な酸化防止物質であり、酸化ストレスのマーカーであるので、尿酸塩の検査は理想的である。更に、生化学的変化は、組織が不可逆的にダメージを受ける前に多分起こるであろう。しかしながら、血液尿酸塩濃度は、正常妊娠でも上昇するので子癇前症の判断因子としては十分でない。
【００１０】
しかしながら、血液尿酸塩は、内因性尿酸塩の産生、食事、腎排泄及び胃腸排泄の産物である。腸では、尿酸塩は細菌分解（経腸尿酸分解）され（Sorensen，１９６０）、日内変動を受ける（Owen-Smithら，１９８１、図１）。夜間に尿酸の尿排泄は低下するが、腸放出は増加する。血液尿酸塩濃度も少し日内変動を示すことが判明している（Kanabrockiら，２０００、図２）。日内変動は主に睡眠が原因であると考えられている（Owen-Smith，１９８３、図３）。これらの変化の正味の結果は、血液尿酸塩が比較的安定であり、細胞尿酸塩の過剰産生を伴って血液濃度の上昇が遅れることにある。
尿酸塩は小さい分子であり、唾液を含めた細胞外流体中に広く散在している。唾液尿酸塩は（腎臓におけるように）再吸収されないが、嚥下され、腸内細菌により分解される。よって、血液尿酸塩濃度が有意に変化しなくても唾液中の尿酸塩産生の迅速変化または急激変化が検出される。
【００１１】
唾液中の尿酸塩濃度が細胞尿酸塩の代謝に関して血液中で見られるよりも高い感度を有する指標であることが立証された。このことは、（尿酸塩の形成を防止する）アロプリノールでの治療前及びその後の痛風患者及び（排泄の日内変動を評価するために）運動をしたり昼間及び夜間にサンプルを採取する正常な被験者において確立された（Owen-Smithら，１９９８）。
【００１２】
更に、分娩の前またはその後に子癇前症患者から血液及び唾液尿酸塩サンプルを採取した（図４）。両方のサンプルとも正常な非妊娠女性及び２８週の妊婦と比較して大きく上昇していた。子癇前症における唾液レベルは血液レベルとうまく相関していることが分かった。２８週妊娠から分娩までの唾液濃度の増加は１８０μｍｏｌ／ｌであった。
【００１３】
本発明によれば、生体サンプル中の尿酸塩を測定することを含む子癇前症の診断方法を提供する。妊婦の尿酸塩レベルを測定することにより得た値を、子癇前症を発症していない同程度の妊娠期間を有する妊婦から得た生体サンプル中の尿酸塩レベルを測定して得た正常値と比較してもよい。
【００１４】
サンプルは全血または血漿からなり、ここに抗凝固薬を含んでいなくてもよい。しかしながら、本発明の好ましい態様では、サンプルは妊婦の唾液から採取する。妊婦の唾液尿酸塩が妊娠時に子癇前症を診断するために使用されたことは今までなかった。唾液尿酸塩レベルが日内変動するので、妊娠期間中尿酸塩レベルの変化をモニターするためにはサンプルを好ましくは一日の同じ時間に採取すべきである。
【００１５】
唾液サンプルは適当な方法により採取することができる。例えば、唾液サンプルを管に直接採取してもよい。或いは、サンプルを綿棒を入れるために底部に孔を有するインサートを有する管に採取してもよい。綿棒を舌の下で湿らした後、唾液を吸収するために約４５秒間噛む。次いで、採取したサンプルを、運んで、検査室で処理できるまで１０℃、好ましくは４℃で冷蔵する。次いで、直ぐにアッセイできるように管を例えば３０００回転で５分間遠心してもよい。
【００１６】
生体サンプル中の尿酸塩レベルは、ディップスティック検査(dip stick test)、時間エンドポイント法(timed end point method)または乾燥検査法を用いるような適当な検査または生物学的アッセイを用いて測定され得る。
【００１７】
ディップスティック検査では、生物学的検査に用いられる、尿酸塩が検出されたときに色が変化する試薬をコートした領域を有する一般的な医薬ディップスティックが用いられる。使用される試薬は、唾液中の尿酸塩を検出するのに特異的な試薬であり、得られた値は標準カラーチャートと比較され得る。
【００１８】
時間エンドポイント法により尿酸濃度を測定するために尿酸試薬が使用され得る。尿酸はウリカーゼにより酸化されると、アラントインと過酸化水素が生ずる。この過酸化水素は、ペルオキシダーゼにより触媒される反応において４−アミノアンチピリン（４−ＡＡＰ）及び３，５−ジクロロ−２−ヒドロキシベンゼンスルホネート（ＤＣＨＢＳ）と反応して、着色生成物を生成する。
【００１９】
サンプルをアッセイするために、市販のマルチテスターのＳＹＮＣＨＲＯＮ  ＣＸシステムＭＵＬＴＩキャリブレーター（ここでは、サンプルがそれ自体の試薬である）を使用することができる。次いで、９２０ｎｍでの吸光度の変化がモニターされ得る。この変化はサンプル中の尿酸濃度に正比例しており、ＳＹＮＣＨＲＯＮ  ＣＸシステムを用いて尿酸濃度を計算し、表示する。このアッセイ方法は±５％以内の精度を与え、３０〜１０００μｍｏｌ／ｌの範囲の値で読みとることができる。
【００２０】
唾液サンプル中の尿酸塩レベルをアッセイするために乾燥検査法を使用してもよい。この方法では、乾燥多層化学フィルムアッセイが使用され得る。乾燥試薬がサンプルと反応すると、着色生成物が形成され、これは数分以内に現れる。唾液サンプルは塗沫することにより均一に分布され、試薬層に拡散する。この試薬層では、尿酸塩はウリカーゼにより加水分解されて過酸化水素を生成する。ペルオキシダーゼの存在下での過酸化水素の酸化により青色に変化するロイコ染料が使用され得、スポットの色濃度は反射率光度計測法により測定することができる。しかしながら、他の適当な染料を代わりに使用してもよい。
【００２１】
本発明の第２態様によれば、唾液中の尿酸塩レベルの子癇前症の指標としての使用が提供される。
【００２２】
本発明の第３態様によれば、生体サンプル中の尿酸塩レベルの測定用試薬を含む上記方法を実施するための診断用キットが提供される。このキットが本発明の方法に使用するための説明書を含むことが適当である。
【００２３】
前記キットの試薬は、１つ以上の酵素及び１つ以上の、尿酸塩レベルを測定するために分光光度法により（または、別の適当な方法により）測定され得る色素原を形成するように反応する化合物を含み得る。前記キットの酵素は、尿酸をアラントインと過酸化水素に変換するウリカーゼであり得る。その後、更なる反応でペルオキシダーゼが使用され、その結果反応化合物がカップリングされて色素原が形成され得る。反応化合物は３，５−ジクロロ−２−ヒドロキシベンゼンスルホン酸または２−ヒドロキシ−３，５−ジクロロベンゼンスルホネート及び４−アミノアンチピレンまたは４−アミノフェナゾンから選択され得る。或いは、尿酸または尿酸塩アッセイにおいて通常使用されている他の適当な試薬が本発明に従って使用され得る。
【００２４】
本発明の第４態様では、生体サンプル（好ましくは、唾液）中の尿酸塩レベルの測定用試薬を含む前記生体サンプル中の尿酸塩を測定するための検査器具が提供される。検査器具の試薬は本発明の第３態様に関連して上にリストされている。
【００２５】
本発明の好ましい実施態様によれば、
（１）被験者から生体サンプルを採取し、場合によりこのサンプルを１０℃以下で保存するステップ、
（２）アッセイにかける前に生体サンプルを処理するステップ、
（３）サンプルを存在する尿酸塩濃度についてアッセイするステップ、
（４）（３）で得た結果を正常な対照値と比較して、子癇前症を診断するステップ
を含む子癇前症の診断方法が提供される。
【００２６】
ステップ（１）に関連して、サンプルは上記したように唾液であり得、記載したように得ることができる。唾液は上記したようにステップ（２）に従って処理され得る。サンプルが血液の場合、サンプル採取、処理及び保存はサンプルの血漿成分をアッセイするために適当に改変してもよい。
【００２７】
ステップ（３）に従うサンプル中の尿酸塩濃度のアッセイは、一般的な慣用方法（例えば、乾燥検査法、ディップスティック検査または時間エンドポイント法）により上に言及した通りであり得る。
【００２８】
ステップ（４）に従う検査結果の比較は、子癇前症を発症していない同程度の妊娠期間を有する妊婦由来の生体サンプル中の尿酸塩レベルを測定して得た正常値となされる。アッセイでサンプル中の尿酸塩レベルが正常な対照値と比較して高ければ、患者が子癇前症であることを示す。
【００２９】
本発明は、妊娠における他の原因による酸化ストレスの診断条件でもあり、子癇前症の活動または重篤度を評価し得る。
【００３０】
本発明は、胎児の健康状態の非物理的・非化学的非侵襲検査としても有用であり得る。胎児のみが尿酸塩を羊水中に排泄することができ、高度に濃縮されるようになり、中毒となる。
【００３１】
唾液を採取するのが容易であり、尿酸塩のアッセイが容易であることはコスト、安全性及び患者や検査官にとって便利であるという基準を満たす。
【００３２】
本発明は、妊娠及び子癇前症の監視に対する有用な補助手段である。
【００３３】
本発明中の尿酸塩に対する言及は、他の方法で特記しない限り尿酸を含む。身体の生体流体中の尿酸塩は通常尿酸のナトリウム塩の形態で存在している。
【００３４】
第１態様の好ましい要件は、必要に応じて変更を加えて第２及びその後の態様にも適用される。
【００３５】
実施例により、図面を参照して本発明を説明する。
【００３６】
サンプル採取
歯磨きまたは食事を取る前に、女性は滅菌Ｓａｌｉｖｅｔｔｅ（登録商標）管（図５）（２）から綿棒（１）を取り出す。Ｓａｌｉｖｅｔｔｅ（登録商標）は、綿棒を入れるための底部に孔を有するインサートを有するプラスチック製使い捨て遠心管である。これは本発明にとって重要でないが、本発明者らは乾燥検査スティックまたは適当な試薬をコーティングしたディップスティックのような他の唾液サンプリング及び検査方法が開発されると予測している。女性は綿棒を舌の下に入れて綿棒を湿らせた後、約４５秒間舌の上でやさしく噛む。こうすると、口内で唾液分泌が活性化され、綿棒は混合唾液を吸収する。次いで、サンプルの安全な保存を確保すべく適切にラベリングしたＳａｌｉｖｅｔｔｅ（登録商標）のインサートに綿棒を戻す。次いで、運んで、検査室で処理するまで通常の家庭用冷蔵庫において約４℃で冷却する。
【００３７】
サンプルアッセイ
検査室で受領し、その後患者の情報を管のラベルから集めた後、綿棒インサートを含むＳａｌｉｖｅｔｔｅ（登録商標）管を３０００回転で５分間遠心する。混合唾液（３）の透明なサンプルはすぐにアッセイにかけることができる。或いは、綿棒インサートを圧縮することによりアッセイ用サンプルを作成してもよい。アッセイは、±５％の精度を与え、３０〜１０００μｍｏｌ／ｌの値の範囲内で読みとることができる任意の方法により実施され得る。しかしながら、完全とするために、市販されているマルチテスターのＳＹＮＣＨＲＯＮ  ＣＸシステムマルチキャリブレーターを用いる方法を以下に説明する。
【００３８】
サンプルはそれ自体の試薬であり、ＳＹＮＣＨＲＯＮ  ＣＸシステムマルチキャリブレーターと一体である。血清、血漿または尿中の尿酸（尿酸塩）濃度の定量測定が意図されているが、唾液がこのシステムに完全に適合している。
【００３９】
尿酸濃度を時間エンドポイント法により測定するために尿酸試薬が使用される。尿酸がウリカーゼにより酸化されると、アラントインと過酸化水素が生成される。この過酸化水素をペルオキシダーゼを触媒とする反応において４−アミノアンチピリン（４−ＡＡＰ）及び３，５−ジクロロ−２−ヒドロキシベンゼンスルホネート（ＤＣＨＢＳ）と反応させると、着色生成物が生ずる。
【００４０】
Ｓｙｎｃｈｒｏｎ  ＣＸシステムは自動的にサンプル及び試薬の適切容量をキュベットに配分する。使用する比率はサンプル１部に対して試薬２５部である。このシステムは９２０ｎｍでの吸光度の変化をモニターする。吸光度の変化はサンプル中の尿酸濃度に正比例しており、Ｓｙｎｃｈｒｏｎ  ＣＸシステムを用いて尿酸濃度を計算し、表示する。
【化１】
0004690317.tif 000002
【００４１】
例
血液尿酸塩と比較した唾液尿酸塩の感受性を評価する際（図２）、２４時間にわたり２時間毎の尿酸塩濃度の結果をＫａｎａｂｒｏｃｋｉらの血清尿酸塩データと比較した。唾液尿酸塩は血清尿酸塩の日内変動と相関しており、夜には上昇した。血清の２４時間範囲は３８０〜４０５μｍｏｌ／ｌ、すなわちたった２５μｍｏｌ／ｌの変動しかなかったのに対して、唾液の結果は１２５〜３５０μｍｏｌ／ｌ、すなわち２２５μｍｏｌ／ｌの範囲に増幅された。
【００４２】
４人の非妊娠女性（図６）が、日内変動を立証するために唾液尿酸塩サンプルを提供した。早い時間に上昇があった。このことは検査結果及び妊娠による正常な変動の変化を解釈する際に考慮しなければならない。午前８時から午後６時までの検査結果の平均（７６μｍｏｌ／ｌ）は、子癇前症（３２５μｍｏｌ／ｌ）（図４）よりも有意に低い値を示している。
【００４３】
１４８人の患者からランダムに１個集めた１４９個のサンプルを比較することにより尿酸塩レベルについてのルーチンな出産前臨床調査を実施した。患者の平均年齢は２７歳であり、平均妊娠期間は３１週であった。平均唾液尿酸塩レベルは１７９μｍｏｌ／ＳＤ  ８４μｍｏｌ／ｌであった。唾液尿酸塩レベルは妊娠期間が長くなると上昇することが分かった。２３人の患者は比較のために利用し得る血清尿酸塩レベルを有していた（唾液尿酸塩  Ｍ±ＳＤ：１８０±５０、血清尿酸塩：２４９±５５）。よって、唾液尿酸塩レベルは妊娠中血液レベルの約７０％であり、２５０μｍｏｌ／ｌの唾液尿酸塩レベルは女性の血液中の正常値の上限レベルの３６０μｍｏｌ／ｌに等しい。唾液尿酸塩は妊娠以外の複数の病態生理学的要因により影響されるので、この日内臨床調査の結果は驚くことであった。これは、超音波スキャン後２０週の小さな残存サンプルで実証されている。２８週で双子を身ごもっている１人の患者は、血液検査、超音波前に異常な検査結果を呈していることが判明し、早期分娩を実施した。
【００４４】
高血圧の観察または子癇前症の治療のために入院している患者の入院患者研究を“正常な”コントロールと比較した。午前８時、正午、午後４時、午後８時、真夜中の１２時及び午前４時に３７組の唾液尿酸塩サンプルを採取した。子癇前症の場合、唾液尿酸塩の上昇が日中に起こり、このことから、母性尿酸塩産生の増加、腎排泄及び高い胎児羊水尿酸塩濃度が示唆される。１つの子癇前症の重症例では、唾液尿酸塩レベルは血液レベルよりも高かった。
【００４５】
参考文献
Many A., Hubel CA., Roberts JM., Hyperuricaemia and xanthine oxidase in preeclampsia, revisited, American Journal of Obstetrics and Gynaecology 174(1), 288-291 (1996)、
Chappell LC., Seed PT., Briley AL., Kelly FJ., Hunt BJ., JH.,Charnock-Jones S., Mallet AI., Poston L. A longitudinal study of biochemical variables in women at risk of preeclampsia, American Journal of Obstetrics and Gynaecology, 186, 127-136 (2002)、
Sorensen LB., The elimination of uric acid in man studied by means of C14-labelled uric acid, Scandinavian Journal of Clinical Laboratory Investigation, 補遺: 54 (1960)、
Owen-Smith BD及びWhyman A., Diurnal and nocturnal variations of enteral uricolysis during fasting and refeeding, (Abstract), Annals of Rheumatic Diseases, 40, 523-524 (1981)、
Kanabrocki EL., Third J., Ryan MD., Nemchausky BA., Shirazi P., Scheving LE., Hines E Jr.,McCormick JB, Circadian relationships of serum uric acid and nitric oxide, Journal of the American Medical Association, 283: 2240-2241 (2000)、
Owen-Smith BD, Significance of variations of uric acid elimination Annals of Rheumatic Diseases, 42, 補遺: 87 (1983)、
Owen-Smith BD., Quiney, J & Read J., Salivary urate in gout, exercise and diurnal variation, Lancet, 351:1932 (1998)。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】経腸尿酸分解の日変動は夜に増加した。（Ａ）高尿酸血症で５日間断食している間及び（Ｂ）正常尿酸血状態で５日間低プリン食を補給している間、分解／秒／静注した水２ｍｌ中の尿酸−２−１４Ｃ  ２００ｍｇ，３６μＣｉ由来の１４ＣＯ２のｍｍｏｌのグラフである。
【図２】Ｋａｎａｂｒｏｃｋｉらの血清データを用いた血液尿酸塩と比較した唾液尿酸塩濃度の高い感受性及び日内変動を示す。唾液尿酸塩は血清尿酸塩と相関している。血清尿酸塩（棒及び左のＹ軸）は３８０〜４０５μｍｏｌ／ｌの範囲であり、唾液（線及び右のＹ軸）は１２５〜３５０μｍｏｌ／ｌ、すなわち２２５μｍｏｌ／ｌの範囲に増幅された。
【図３】血液尿酸塩は（低プリン食を補給していた）４２時間の断眠中低下し、睡眠中は上昇し、尿中尿酸排泄は低下したことを示す。
【図４】非妊娠女性及び２８週の正常妊娠女性の血液及び唾液データ、並びに子癇前症患者の３日間の血液及び唾液尿酸塩データ。前記患者は唾液尿酸塩の上昇を示した２日目に分娩した。
【図５】プラスチックキャップ付きＳａｌｉｖｅｔｔｅ（登録商標）管及び綿棒インサートを示す。インサート容器が底部に孔を有することに注目されたい。遠心後管の先端に０．５〜１ｍｌの唾液が集まる。
【図６】４人の非妊娠女性における唾液妊娠塩の平均正常日内変動を示す。変動は７０〜１９０μｍｏｌ／ｌの範囲である。
【図１】
0004690317.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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