(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数のオリゴヌクレオチドを含み、これらのオリゴヌクレオチドがその上に固定されている分析支持体において、前記オリゴヌクレオチドの各々はフラビン、デアザフラビン、及びそれらの誘導体の中から選ばれる蛍光化合物により標識されて、この化合物により標識されたオリゴヌクレオチドの蛍光が、この標識されたオリゴヌクレオチドと、相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの後に減衰されるようになっていることを特徴とする分析支持体。
【請求項２】
蛍光の減衰が、蛍光強度の変化、蛍光の時定数の変化、又は蛍光の波長のシフトからなる請求項１記載の支持体。
【請求項３】
蛍光化合物が、ハイブリダイゼーションにより減衰される蛍光強度を呈する、請求項２記載の分析支持体。
【請求項４】
減衰が、ハイブリダイゼーション前の蛍光強度の３０乃至９９％に相当する請求項３記載の支持体。
【請求項５】
オリゴヌクレオチドが、式−（ＣＨ２）ｎ−Ｒ１（ｎは２乃至８の整数であり、Ｒ１は以下の式：
【化１】
0004729226.tif 000020
【化２】
0004729226.tif 000021
のうちの一方に相当する基を表す）の基により標識されている、請求項１から４のいずれか一項記載の支持体。
【請求項６】
ｎが６である請求項５記載の支持体。
【請求項７】
複数のオリゴヌクレオチドを含み、これらのオリゴヌクレオチドがその上に固定されている分析支持体の制御方法において、固定されたオリゴヌクレオチドが、フラビン、デアザフラビン、及びそれらの誘導体の中から選ばれる蛍光化合物により標識されたオリゴヌクレオチドであり、支持体上に固定されたオリゴヌクレオチドの量が、蛍光化合物の蛍光の測定により、位置決定され測定されることを特徴とする方法。
【請求項８】
生物学的ターゲットを複数のオリゴヌクレオチドを含む分析支持体に接触させることと、この支持体のオリゴヌクレオチドとターゲットとの間の１回または複数のハイブリダイゼーションを決定することによる、生物学的ターゲットの分析方法において、請求項１乃至６のいずれか１項記載の分析支持体が用いられ、ハイブリダイゼーションを生じる支持体のオリゴヌクレオチドが、ターゲットと支持体とを接触させる前後で、支持体の各オリゴヌクレオチドに対応する蛍光の測定により決定されることを特徴とする方法。
【請求項９】
前記ターゲットは、その発光波長が、オリゴヌクレオチドの蛍光化合物、又は第１の蛍光化合物の発光波長と異なる、第２の蛍光化合物でも標識され、蛍光の変化を生じたオリゴヌクレオチドが、この第２の化合物の蛍光の測定により制御される請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記支持体のオリゴヌクレオチドの蛍光化合物、又は第１の蛍光化合物が、フラビン、デアザフラビン、及びそれらの誘導体から選ばれ、第２の蛍光化合物がフラビンに対して赤色へシフトしている安定な蛍光体から選ばれる、請求項８または９記載の方法。
【請求項１１】
前記第１の化合物の蛍光強度が、分光法により測定される、請求項８乃至１０のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
前記第２の蛍光化合物は、その励起波長が５４３．５ナノメートルで、その発光波長が５８０ナノメートルであるＣＹ３である請求項９記載の方法。
【請求項１３】
この第２の化合物の存在が、ＨｅＮｅレーザーを用いたスキャナーで決定される、請求項１２記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、DNAまたはRNA生物学的ターゲットの決定のための分析支持体または「バイオチップ」を目的とする。
【０００２】
この分析支持体は、数多くの分野において、特にゲノム配列決定の生物学、変異の研究、新しい医薬の開発において、その適用が見出される。
【０００３】
【従来の技術】
このタイプの分析支持体は、分析される生物学的ターゲットとハイブリダイゼーションを生じることができる複数のオリゴヌクレオチドプローブを含む。ハイブリダイゼーションは、支持体上の相補的ＤＮＡ鎖とターゲット鎖のペアリングに相当する。したがって、ターゲットの性質を決定するために、支持体上のどの部位が、したがってどのヌクレオチドがハイブリダイゼーションを生じるかを位置決定し得ることが必要である。
【０００４】
文献Medecine/Science 第13巻、第11号、1997、1317-1324頁[1]は、このタイプの分析支持体を記載している。
【０００５】
通常、支持体上での生物学的ターゲットのハイブリダイゼーションは、所望の領域の抽出（溶解及び潜在的増幅）の後に、生物学的ターゲットと結合される蛍光マーカーを用いて、決定される。
【０００６】
標識されたターゲットを、オリゴプローブを含む分析支持体と接触させた後、ハイブリダイゼーションが起こった部位を、蛍光マーカーのセットの励起を行ない、その部位を読み取り、マーカーによる蛍光の再発光を検出することにより決定する。蛍光が検出される部位は、ターゲット分子を固定した部位である。種々のバイオチップに適合した読み取りシステムが、記載されており、例えばUS-A-5578832［２］及びUS-A-5646411[3]に記載されている。
【０００７】
この技術は、分析支持体と接触させる前に、生物学的ターゲットの標識が必要であるという欠点を有する。これは、標識の定量化及び/又は効率と、実施するため許される時間に関し、実用的な問題を有する。さらに、与えられた工程での標識がその状況を固定し、ハイブリダイゼーション反応の後の動的測定を行なうことを妨げる。
【０００８】
分析支持体または「バイオチップ」の製造が、得られた支持体の質の最終的な制御のすべての問題を有する種々の方法により行なわれることが特記される。
【０００９】
実際は、支持体、支持体または接触の部位、または、この支持体に形成された空隙に付着したプローブの量は、オリゴヌクレオチドの存在の有効な制御の問題を有する。現在のところ、正確に、例えば、ケイ素、ガラスまたはプラスチック、例えばナイロンからなる分析支持体上に、付着したまたは原位置形成されたオリゴプローブを定量し、位置決定する方法は存在していない。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、最高の条件で、製造の予備的な制御を確実にでき、そしてハイブリダイゼーションがおこった支持体の部位の決定を容易にし、より感受性にする析支持体、またはバイオチップを目的とする。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明によれば、分析支持体は、この支持体の上に固定された複数のオリゴヌクレオチドを含み、前記オリゴヌクレオチドの各々は蛍光化合物により標識されて、この化合物により標識されたオリゴヌクレオチドの蛍光が、この標識されたオリゴヌクレオチドと、相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの後に減衰されるようになっていることを特徴とする。
【００１２】
蛍光の減衰は、蛍光強度の変化、蛍光の時定数の変化、又は蛍光の波長のスペクトルシフトからなるものでよい。
【００１３】
そのような分析支持体では、分析されるターゲットの標識化をもはや必要としない。その理由は、ハイブリダイゼーション部位の位置決定が、対象となるオリゴヌクレオチド部位上でのハイブリダイゼーションの時に得られる蛍光の変化をチェックすることにより検出できるためである。
【００１４】
本発明によれば、ハイブリダイゼーションにより減衰される蛍光強度を呈する蛍光化合物がより好ましく用いられる。より好ましくは、この減衰は、ハイブリダイゼーションの前の蛍光強度の３０乃至９９％に相当する。
【００１５】
これらの特徴を示す蛍光化合物は、例えば、フラビン、デアザフラビン、及びそれらの誘導体の中から選ばれる。そのような化合物は、例えば、タイプ−−−（ＣＨ2）n−−−などのスペーシングアームを介してオリゴヌクレオチド上に固定し、フラビン（デアザフラビン）−オリゴヌクレオチドコンジュゲートを得ることができる。このタイプのコンジュゲートの合成は、J.Org.Chem.,C.Frierら、62,1997,3520-3528頁[4]により記載されている。
この合成は、式：
【００１６】
【化３】
0004729226.tif 000002
【００１７】
（ｎは２乃至８の整数、例えば６である）
の誘導体からのホスホルアミダイト又はＨ−リン酸カップリング法によりオリゴヌクレオチド上に、フラビンの誘導体を固定することからなる。
【００１８】
合成ストラテジーは、フラビン基を導入することを可能にし、自動化オリゴヌクレオチド合成法を含む。この合成は、オリゴヌクレオチドデアザフラビンコンジュゲートの製造のためにも用いることができる。
【００１９】
こうして、オリゴヌクレオチドは式−−−（ＣＨ2）n−−−Ｒ1の基（式中ｎは２乃至８の整数であり、Ｒ1は以下の式
【００２０】
【化４】
0004729226.tif 000003
【００２１】
【化５】
0004729226.tif 000004
【００２２】
のいずれかに相当する基を表す）により標識化される。
【００２３】
本発明の蛍光化合物としてフラビン、デアザフラビン、又はそれらの誘導体は特に興味深いものである。
【００２４】
実際、フラビンは、非常に特徴的な強い黄色−緑色蛍光を有する分子である。蛍光励起スペクトルは、可視光の吸収スペクトルと同一であって、３７４と４４６ナノメートルに２つの最大波長を有し、それらの蛍光発光スペクトルは、５２０ナノメートル付近に最大を有する広いバンドからなる。デアザフラビンは、３２０と３９６ナノメートル付近を吸収し、フラビンより強い蛍光強度を示す（４５２ナノメートルで発光）。
【００２５】
本発明によれば、フラビンのオリゴヌクレオチドへの結合は、水性媒体中でのこれらの蛍光特性、励起と発光の最大を有意には変化させず、フリーのフラビンとオリゴヌクレオチド−フラビンコンジュゲートで強度も同じであることが発見された。
【００２６】
他の関連で、コンジュゲートの１００μモル／Ｌの濃度まで、蛍光の強度と濃度との間に優れた直線性がある。
【００２７】
しかしながら、蛍光の強度に対して塩の効果、すなわち、ＮａＣｌの増加する濃度が、フラビンの蛍光の励起「クエンチング」の増加効果を有するという事実を示すことが必要である。これはコンジュゲートでも同じである。このことは特記されるべきである。その理由は、ハイブリダイゼーションが、二重鎖の形成（オリゴヌクレオチドがその相補的オリゴヌクレオチドと結合）を促進するために、０．１乃至１ＭのＮａＣｌ濃度を必要とするためである。
【００２８】
本発明によれば、オリゴヌクレオチドフラビンコンジュゲートが、１当量のその相補的ターゲットオリゴヌクレオチドとインキュベートされるとき、９０乃至１００％のフラビンの特異的蛍光が消失することが発見された。
【００２９】
本発明により奏するこの効果は、バイオチップ上のハイブリダイゼーションの部位の読み取りを容易にする。
【００３０】
したがって、本発明は、生物学的ターゲットを複数のオリゴヌクレオチドを含む分析支持体に接触させることと、この支持体のオリゴヌクレオチドとターゲットとの間の１回または複数のハイブリダイゼーションを決定することによる、生物学的ターゲットの分析方法において、支持体の各オリゴヌクレオチドが、相補的オリゴヌクレオチドと標識化されたオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションで蛍光変化を呈する蛍光化合物により標識され、ハイブリダイゼーションを生じる支持体のオリゴヌクレオチドが、ターゲットと支持体との接触の前後で、支持体の各オリゴヌクレオチドに対応する蛍光の測定により決定されることを特徴とする方法も目的とする。
【００３１】
したがって、この方法において、上記特徴を示す本発明の分析支持体が用いられる。
【００３２】
この方法の変形によれば、ターゲットは、その発光波長が、オリゴヌクレオチドの蛍光化合物、又は第１の蛍光化合物の波長と異なる、第２の蛍光化合物でも標識され、蛍光の変化を生じたオリゴヌクレオチドが、この第２の化合物の蛍光の測定により制御される。
【００３３】
この場合、支持体のオリゴヌクレオチドの蛍光化合物、又は第１の蛍光化合物が、フラビン、デアザフラビン、及びそれらの誘導体から選ばれ、第２の蛍光化合物が、ＤＮＡチップで用いられる安定な蛍光体、好ましくは可視で発光するもの（ローダミン、ＣＹ3、ＣＹ5、など）、例えばフラビンに対して赤色へシフトしている安定な蛍光体から選ばれる。
【００３４】
そのオリゴヌクレオチドが蛍光化合物で標識されている本発明の分析支持体で、支持体の質の制御も可能である。
【００３５】
したがって、本発明は、支持体上に固体された複数のオリゴヌクレオチドを含む分析支持体の制御方法であって、固定されたオリゴヌクレオチドは、蛍光化合物により標識されたオリゴヌクレオチドであり、支持体上に固定されたオリゴヌクレオチドの量は位置決定され、蛍光化合物の蛍光の測定により決定されることを特徴とする方法も目的とする。
【００３６】
本発明の他の特徴や利点は、図面を参照した以下の説明によって、より明確となるであろう。これらは単に例示的なものであり、これで本発明が網羅されるものではない。
【００３７】
【発明の実施の形態】
以下の実施例において、以下のオリゴヌクレオチドを用いる。
【００３８】
ターゲットＴ11（配列番号１）
［配列１］
0004729226.tif 000005
【００３９】
ターゲットＴ16（配列番号２）
［配列２］
0004729226.tif 000006
【００４０】
配列番号１の相補的オリゴヌクレオチド（配列番号３）
［配列３］
0004729226.tif 000007
【００４１】
配列番号２の相補的オリゴヌクレオチド（配列番号４）
［配列４］
0004729226.tif 000008
【００４２】
ＨＩＶオリゴヌクレオチド（配列番号５）
［配列５］
0004729226.tif 000009
【００４３】
ＨＩＶターゲットの二重鎖（配列番号６と７）
［配列６］
0004729226.tif 000010
【００４４】
［配列７］
0004729226.tif 000011
【００４５】
【実施例】
実施例１
この実施例において、フラビン−オリゴヌクレオチドＴ11とフラビン−オリゴヌクレオチドＴ16コンジュゲートが、式（Ｉ）（ｎ＝６）のフラビンＦ１の誘導体を用いて文献［４］に記載された手法にしたがって、調製される。こうして、式：
【００４６】
【化６】
0004729226.tif 000012
【００４７】
のコンジュゲート（配列番号８）が得られる。
同様に、式：
【００４８】
【化７】
0004729226.tif 000013
【００４９】
のフラビンＴ16コンジュゲート（配列番号９）が調製される。
最後に、式：
【００５０】
【化８】
0004729226.tif 000014
【００５１】
の（配列番号１０）のＨＩＶ−フラビンコンジュゲートが、式（Ｉ）（ｎ＝６）のフラビンＦ１の誘導体を用いて調製される。
同様に、式：
【００５２】
【化９】
0004729226.tif 000015
【００５３】
のＴ11−デアザフラビンＤＦ１コンジュゲート（配列番号１１）が調製される。
【００５４】
実施例２
この実施例では、Ｔ11−フラビンコンジュゲート（配列番号８）の蛍光発光に対する、他のオリゴヌクレオチドの存在の影響を調べる。
【００５５】
この目的のために、０．１ｍＭ−１Ｍ  ＮａＣｌを含むｐＨ７．０の１０ｍＭトリス−ＨＣｌバッファー中に、１当量のオリゴヌクレオチド（配列番号１）存在下、０．１乃至１０μモル／ＬのＴ11−フラビンコンジュゲートを入れる。
【００５６】
４６０ナノメートルにおいて励起が生じ、５４０ナノメートルの付近で蛍光発光が測定される。
【００５７】
これらの条件において、蛍光発光は、Ｔ11−フラビンコンジュゲート単独で測定した発光の５％を超えるものではない。
【００５８】
この操作を、オリゴヌクレオチド（配列番号３）、すなわち配列番号１の相補的オリゴヌクレオチド存在下で再開する。これらの条件において、蛍光発光は、Ｔ11−フラビンコンジュゲートの蛍光発光の９８％に相当する。したがってこのオリゴヌクレオチドの存在は、Ｔ11−フラビンコンジュゲートの蛍光発光に影響を及ぼさない。
【００５９】
１当量のオリゴヌクレオチド配列番号１と１当量のオリゴヌクレオチド配列番号３をを添加することによってこの操作を再開するとき、二重鎖が形成できない条件下で、蛍光発光は、コンジュゲート単独の蛍光発光の６％に相当する。
【００６０】
こうして、Ｔ11−オリゴヌクレオチドの相補的ターゲット（配列番号１）の存在がフラビンの特異的蛍光の９０乃至１００％の消失をもたらすことが明白である。
【００６１】
実施例３
Ｔ16−フラビンコンジュゲート（配列番号９）について、二重鎖が形成できない条件下で、Ｔ16ターゲット（配列番号２）存在下、または配列番号２に相補するオリゴヌクレオチド（配列番号４）存在下、または配列番号２と配列番号４の２つのオリゴヌクレオチドの混合物存在下において、同じ実験を行なう。
以下の結果が得られる。
【００６２】
【表１】
0004729226.tif 000016
【００６３】
こうして、実施例２の場合と同様に、ターゲットとＴ16オリゴヌクレオチドとの間のハイブリダイゼーションにより、ターゲット（配列番号２）とＴ16オリゴヌクレオチドの存在が、フラビンの蛍光の消失をもたらす。
【００６４】
実施例４
この実施例において、フラビンとコンジュゲートを形成しているＨＩＶヌクレオチド（配列番号１０）の特性を、配列番号６と配列番号７により形成されたＨＩＶ二重鎖の存在下で、テストする。
【００６５】
これらの条件において、蛍光発光は、最初の発光の９０％に相当する。ＨＩＶターゲットはすでにハイブリダイゼーションを起していたので、Ｆ１−ＨＩＶコンジュゲートと二重鎖との間のハイブリダーゼーションはなかった。
【００６６】
実施例２乃至４はこうして、蛍光の消失が、オリゴヌクレオチド−フラビンコンジュゲートと相補的オリゴヌクレオチドと間の二重鎖の形成に特異的であることを示す。その理由は以下の通りである。
【００６７】
１）温度の上昇は、二重鎖の不安定にし、平衡の移動をもたらす：二重鎖→一本鎖は、バックアップする蛍光の強度を生じる。したがって、蛍光分光法は、与えられた温度における結合定数を評価するために、優れた方法である。温度の新たな降下は、再び蛍光の強度を減少させる。
【００６８】
２）コンジュゲートに相補しないオリゴヌクレオチドの添加は、蛍光の減少をもたらさない。
【００６９】
３）三重鎖形成をもたらす条件下でのコンジュゲートに相補する二重鎖の、オリゴヌクレオチド−フラビンコンジュゲートへの溶液への添加は、実施例４で示されるように、蛍光の消失をもたらさない。
【００７０】
４）ターゲットが相補的ＲＮＡであるとき、蛍光の減少も観察されるが、その程度は低い。
【００７１】
オリゴヌクレオチド配列番号１のＡ11配列に隣接したダブレットｇｇについては、このｇｇに変えて配列ｇｃ、ｃｇ及びｃｃを含む配列番号１と同じオリゴヌクレオチドでも同じ結果が得られたので、ペアリングに関与せず必要でないことが特記される。
【００７２】
実施例５
この実施例は、コンジュゲートのデアザフラビンの蛍光に対し、１当量のＴ11−デアザフラビンコンジュゲート（配列番号１１）について、１．５当量までの濃度範囲において、ターゲットオリゴヌクレオチド配列番号１の存在の影響を調べる。実施例２，３，４と同じ条件が用いられた。
【００７３】
図１は、得られた結果、すなわち、ポリＡターゲット（配列番号１）の当量数の関数として、４５２ナノメートルにおける蛍光強度の進展を示す。
【００７４】
実施例６
この実施例では、コンジュゲートとしてＴ11−フラビンコンジュゲート（配列番号８）を用いる以外は、実施例５と同じ実験を行なう。
【００７５】
図２は、得られた結果、すなわち、ポリＡターゲット（配列番号１）の当量数の関数として、５２０ナノメートルにおける蛍光強度の進展を示す。
【００７６】
図１と２の比較は、そのような理由で、より感受性であるデアザフラビンで、蛍光の偏差がより有意であることを示す。
【００７７】
実施例７
この実施例では、相補的配列番号１とＴ11−フラビン（配列番号８）の複合体の安定性を調べる。ゲル減速度の実験と融合温度Ｔmの測定を行なう。こうして、オリゴヌクレオチド末端でのフラビン又はデアザフラビンの存在が、このオリゴヌクレオチドが相補的オリゴヌクレオチドとともに形成する複合体に、安定性において有意な増加を与えることを示すことが可能であった。
【００７８】
例えば、０．１ＭのＮａＣｌ濃度で、Ｔ11配列は、オリゴヌクレオチド配列番号１と、Ｔｍ２３℃（１ＭＮａＣｌにおいて３７℃）の複合体をもたらすが、Ｔ11−フラビンコンジュゲート（配列番号８）は、配列番号１とＴｍ２８℃（０．１Ｍ  ＮａＣｌにおいて４２℃）の複合体を形成する。
【００７９】
ゲル減速度実験は、二重鎖の形成が、フラビンなしのＴ11オリゴヌクレオチドと比べて、ずっと少ない量のＴ11−フラビンコンジュゲート（配列番号８）しか必要としないことを示す。
【００８０】
フラビンなしのＴ16に対して、Ｔ16−フラビンコンジュゲート（配列番号９）とターゲット（配列番号２）で同様の結果が見られた。
【００８１】
オリゴヌクレオチド−フラビンのコンジュゲート（配列番号８と９）の研究は、これらの分子の全体の興味深い特性を明らかにする。
−フラビンの存在は、まだあまり解明されていない機構（フラビンとヌクレオチド延期との間の水素結合、スタッキング、・・・）により、相補的オリゴヌクレオチドとのこのコンジュゲートの結合を安定化する。
−この結合は蛍光において非常に有意な減少をもたらす（ある場合は消失）。
−蛍光のこの消失は、非常に特異的である：コンジュゲートが、二重鎖の形成の条件下、相補的オリゴヌクレオチド存在下にあるときだけ起こる。
【００８２】
実施例８
この実施例では、２０ベースのオリゴヌクレオチドとフラビンから形成されるコンジュゲート（配列番号１２）：
【００８３】
【化１０】
0004729226.tif 000017
【００８４】
を相補的オリゴヌクレオチド（配列番号１３）：
【００８５】
［配列８］
0004729226.tif 000018
【００８６】
とを、増加した濃度で、実施例２乃至４と同じ濃度で、接触させ、５２０ナノメートルの付近での蛍光スペクトルをスペクトルフルオロメーターで測定した。
【００８７】
励起の波長は４４６ナノメートルで、フラビンに相当する最大の発光は５２０ナノメートルである。
【００８８】
測定は、すぐに、そして５分後に、その都度相補的ターゲット（配列番号１３）のより高い濃度で、実施する。
【００８９】
図３は、相補的オリゴヌクレオチドを用いずに、０．２、０．４、０．６、０．８、１、１．２及び１．４当量の相補的オリゴヌクレオチド配列番号１３を用いて得られた蛍光スペクトルを示す。
【００９０】
ターゲット（相補的オリゴヌクレオチド）の非存在下での３１８の最初の強度から出発して、約２０の比の蛍光の減光が、相補的ターゲットが少し過剰なときに観察される。
【００９１】
減光は、エネルギー移動、衝突による減光（「衝突クエンチング」）、又はプローブ−ターゲットハイブリダイゼーションに相当する複合体形成（「静的クエンチング」）のいずれかであることができる種々の工程に対応することができる。
【００９２】
衝突による減光又は「衝突クエンチング」は、蛍光化合物（フラビン）と濃度［Ｑ］の減光するオリゴヌクレオチドとの間に衝突があるときにおこる。以下の式に相当するStern-Volmerの法則により、記載されている。
Ｉ0／Ｉ＝１＋ｈqτ0［Ｑ］
（式中Ｈqは減光定数を表し、τ0は蛍光寿命である）
【００９３】
Stern-Volmer定数は以下の通り規定される：
ＫD＝ｈqτ0
この場合、一方で寿命はτでＩ0／Ｉ＝τ0／τであり、他方で、温度は、温度が増加するとき、ＫD増加の現象を増大する効果を有する。
【００９４】
図４は、［Ｑ］の関数としてのＩ0／Ｉとτ0／τの進展を示す。温度が増加するとき、右からの傾きが増加する。
【００９５】
複合体形成による減光の場合、すなわち我々の興味を引く場合、プローブ／ターゲットハイブリダイゼーション、すなわち「静的クエンチング」の場合、Stern-Volmerの法則は：
Ｉ0／Ｉ＝１＋Ｋs［Ｑ］
（式中、Ｋsは結合定数である）
となる。
【００９６】
図５は、［Ｑ］の関数として、Ｉ0/Ｉの進展を示す。この場合、温度が増加するとき、τ0／τ＝１で、傾きは減少する。これは通常のことである。その理由は、温度上昇は複合体の部分的変性を起こし、消えていた蛍光が発散されるためである。
【００９７】
多くの場合、図６に示すように、静的と動的のクエンチングの協同作用が見出され、それはｙ軸に対して、正の曲率で表される。Stern-Volmerの関係は、以下の通り修正されるべきである：
Ｉ0/Ｉ＝１＋（Ｋd＋Ｋs）［Ｑ］＋ＫdＫs［Ｑ］2
【００９８】
図３に示された蛍光スペクトルに戻るなら、そして、スペクトルからの［Ｑ］の関数として法則Ｉ0／Ｉをたどるなら、実際に、正の曲率で直線でないものが見出され、図７で示されるように、それは静的及び動的クエンチングの同時存在が表される。
【００９９】
図８は、図３の結果と等価な濃度［Ｑ］の関数として、Ｋappの偏差を示す。
【０１００】
第２の蛍光は、クエンチングを受けずに、蛍光化合物に対する蛍光波長に強くシフトしており、ターゲットに結合している。こうして、この蛍光は、協同して励起されることができ、ハイブリダイゼーション複合体の有効な存在を解明する。
【０１０１】
特に、ＣＹ3などのフルオロクロムを用いることができ、５４３．５ナノメートルの励起波長と５８０ナノメートルの発光波長を有する。低パワー（１ｍＷ）緑色ＨｅＮｅレーザーを用いて、バイオチップ読み取り装置で行なったように、スキャナーで可視化することができる。
【０１０２】
この二重の標識は、すなわち、フラビンなどの第１の蛍光化合物を用いてバイオチップ上に固定化されオリゴヌクレオチドの二重の標識、及びＣＹ3などの第２の蛍光化合物により決定されるターゲットの二重の標識は、単純な従来の標識に対して、優れた利点を有する。
【０１０３】
実際に、バイオチップ上のプローブの固定化で、フラビンの存在は、全ての部位がプローブの蛍光を有するようにチップの全画像を作製することにより、ハイブリダイゼーション前のプローブの質の制御を可能にする。そして、チップの欠点をマップすることが可能である（蛍光強度の不均一な画像）；いくつかの隣接する部位上に同じタイプのプローブを置くことにより、重剰性を利用することもできる。
【０１０４】
ハイブリダイゼーション相において、４００−４５０ナノメートルの近隣で励起するが、５２０ナノメートルの読み取りに関する部位で蛍光の減少が観察される。ついで、ハイブリダイズされた複合体だけが蛍光の減少と協同したＣＹ3ターゲットを有しているであろうから、ＣＹ3の読み取りが、非特異性の分析を可能にする。
【０１０５】
その吸収バンドから非常に遠いものであるから（５５０ナノメートルでの最大吸収）、これは、波長の非常に異なる範囲の有意性が、あらゆる目的での４００−４５０ナノメートルでの励起が、ＣＹ3蛍光を生成しないという事実に存在する。
【０１０６】
評価できる興味深いパラメーターは、寿命であり、観察されたように、複合体の形成の時間で変化しないが、動的クエンチングの場合で強く変化する。競合における２つの現象は、したがって、衝突クエンチングと、単独で興味深いハイブリッドの形成が容易に分離できる。
【０１０７】
追跡するのに適当な他のパラメーターは、温度の機能としての蛍光の進展である。実際に、従来の「チップ」において、蛍光は、与えられた温度で読み取られる。温度を上昇することは、非特異的ハイブリダイゼーションを「破壊する」効果（変性）を有するが、複合体の蛍光を減少するという問題のある効果（温度が増加するとき蛍光の量子収率が減少するため）も有する。静的クエンチングの場合、反対に、原因となる蛍光の「解放」が存在するために、温度進展が、あまりハイブリダイズしていない複合体の蛍光を回復することががみられた。
【０１０８】
こうして、２つのマーカー（フラビン＋従来の蛍光体）での読み取りの識別できる結合、温度制御、そして寿命の測定も、ハイブリッドの形成を完全に追跡すること、そして種々の定数（Stern-Volmer定数、結合定数、そして作用の球の半径の計算も）を計算することも可能にする。
【０１０９】
【参考文献】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ターゲットポリＡ（配列番号１）の当量数の関数として、コンジュゲートＴ11−デアザフラビンの蛍光強度の進展を示す曲線である。
【図２】図２は、ポリＡターゲット（配列番号１）の当量数の関数として、コンジュゲートＴ11−フラビンの蛍光強度の進展を示す曲線である。
【図３】図３は、相補的配列の当量の添加を増加させるために相補的オリゴヌクレオチド（配列番号１３）と、コンジュゲート配列番号１２−フラビンのハイブリダイゼーションにより得られる蛍光スペクトルを示す。
【図４】図４は、動的減光の場合に蛍光化合物の濃度［Ｑ］の関数として、蛍光強度Ｉ0/Ｉの比の進展を示す。
【図５】図５は、静的減光の場合に蛍光化合物の濃度［Ｑ］の関数として、蛍光強度Ｉ0/Ｉの比の進展を示す。
【図６】図６は、動的減光と動的減光の組み合わせの作用の場合に蛍光化合物の濃度［Ｑ］の関数として、蛍光強度Ｉ0/Ｉの比の進展を示す。
【図７】図７は、図３に示されたスペクトルの場合にフラビンの濃度［Ｑ］の関数として、進展Ｉ0/Ｉを示す曲線である。
【図８】図８は、図３に示されたスペクトルの場合にフラビンの濃度［Ｑ］の関数として、みかけの定数Ｋappの進展を示す曲線である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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