(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者における、５−ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ又はＣｉｓｐｌａｔｉｎの投与による副作用の発症リスクを予測する方法であって、以下の工程（ａ）及び（ｂ）を含むことを特徴とする方法。
（ａ）前記被験者より採取された生体試料のゲノムＤＮＡを抽出し、該ゲノムＤＮＡについて、Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１β（ＩＬ−１β）遺伝子プロモーター領域であって、米国生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）においてＧｅｎｅ  Ｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＣ０７９７５３．７（更新日；２００５年４月１５日）として登録されているヒト２番染色体の５２７００位（complement）の塩基における遺伝子型、
Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６（ＩＬ−６）遺伝子プロモーター領域であって、ＮＣＢＩにおいてＧｅｎｅ  Ｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＣ０７３０７２．１１（更新日；２００４年１月３１日）として登録されているヒト７番染色体の１０６６３位の塩基における遺伝子型、及び、
Ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−α（ＴＮＦ−α）遺伝子プロモーター領域であって、ＮＣＢＩにおいてＧｅｎｅ  Ｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＬ６６２８０１．７（更新日；２００５年１月６日）として登録されているヒト６番染色体の４７２０２位の塩基における遺伝子型から選択される少なくとも１以上の遺伝子型を同定する遺伝子型同定工程；
（ｂ）上記工程（ａ）により同定された遺伝子型から、前記被験者における、５−ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ又はＣｉｓｐｌａｔｉｎの投与による副作用の発症リスクを予測する工程であって、前記副作用が、白血球減少症、好中球減少症、血小板減少症、又は口内炎である副作用発症リスク予測工程； 
【請求項２】
副作用発症リスク予測工程が、以下の工程（Ｉ）〜（IV）から選択される少なくとも１以上の工程であることを特徴とする請求項１記載の方法。
（Ｉ）ＩＬ−１β遺伝子プロモーター領域であって、ＮＣＢＩにおいてＧｅｎｅ  Ｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＣ０７９７５３．７（更新日；２００５年４月１５日）として登録されているヒト２番染色体の５２７００位（complement）の塩基における遺伝子型がＣＴ又はＴＴであるときに、ＣＣであるときと比較して、血小板減少症の発症リスクが高いと予測する工程；
（II）ＩＬ−６遺伝子プロモーター領域であって、ＮＣＢＩにおいてＧｅｎｅ  Ｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＣ０７３０７２．１１（更新日；２００４年１月３１日）として登録されているヒト７番染色体の１０６６３位の塩基における遺伝子型がＣＧ又はＧＧであるときに、ＣＣであるときと比較して、白血球減少症、好中球減少症、又は血小板減少症の発症リスクが高いと予測する工程；
（III）ＴＮＦ−α遺伝子プロモーター領域であって、ＮＣＢＩにおいてＧｅｎｅ  Ｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＬ６６２８０１．７（更新日；２００５年１月６日）として登録されているヒト６番染色体の４７２０２位の塩基における遺伝子型がＴＴであるときに、ＣＣ又はＣＴであるときと比較して、口内炎の発症リスクが高いと予測する工程；
（IV）ＩＬ−１β遺伝子プロモーター領域であって、ＮＣＢＩにおいてＧｅｎｅ  Ｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＣ０７９７５３．７（更新日；２００５年４月１５日）として登録されているヒト２番染色体の５２７００位（complement）の塩基における遺伝子型がＣＴ又はＴＴであり、且つ、ＩＬ−６遺伝子プロモーター領域であって、ＮＣＢＩにおいてＧｅｎｅ  Ｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＣ０７３０７２．１１（更新日；２００４年１月３１日）として登録されているヒト７番染色体の１０６６３位の塩基における遺伝子型がＣＧ又はＧＧであるときに、ＩＬ−１β遺伝子プロモーター領域であって、ＮＣＢＩにおいてＧｅｎｅ  Ｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＣ０７９７５３．７（更新日；２００５年４月１５日）として登録されているヒト２番染色体の５２７００位（complement）の塩基における遺伝子型がＣＴ又はＴＴであり、且つ、ＩＬ−６遺伝子プロモーター領域であって、ＮＣＢＩにおいてＧｅｎｅ  Ｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＣ０７３０７２．１１（更新日；２００４年１月３１日）として登録されているヒト７番染色体の１０６６３位の塩基における遺伝子型がＣＣであるとき、又は、ＩＬ−１β遺伝子プロモーター領域であって、ＮＣＢＩにおいてＧｅｎｅ  Ｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＣ０７９７５３．７（更新日；２００５年４月１５日）として登録されているヒト２番染色体の５２７００位（complement）の塩基における遺伝子型がＣＣであり、且つ、ＩＬ−６遺伝子プロモーター領域であって、ＮＣＢＩにおいてＧｅｎｅ  Ｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＣ０７３０７２．１１（更新日；２００４年１月３１日）として登録されているヒト７番染色体の１０６６３位の塩基における遺伝子型がＣＧ又はＧＧであるときと比較して、血小板減少症の発症リスクがさらに高いと予測する工程；
【請求項３】
遺伝子型同定工程が、ＩＬ−１β遺伝子プロモーター領域であって、ＮＣＢＩにおいてＧｅｎｅ  Ｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＣ０７９７５３．７（更新日；２００５年４月１５日）として登録されているヒト２番染色体の５２７００位（complement）の塩基における遺伝子型を同定するためのプライマーセット、
ＩＬ−６遺伝子プロモーター領域であって、ＮＣＢＩにおいてＧｅｎｅ  Ｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＣ０７３０７２．１１（更新日；２００４年１月３１日）として登録されているヒト７番染色体の１０６６３位の塩基における遺伝子型を同定するためのプライマーセット、及び、
ＴＮＦ−α遺伝子プロモーター領域であって、ＮＣＢＩにおいてＧｅｎｅ  Ｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＬ６６２８０１．７（更新日；２００５年１月６日）として登録されているヒト６番染色体の４７２０２位の塩基における遺伝子型を同定するためのプライマーセット
から選択される、少なくとも１以上のプライマーセットを用いたＡＲＭＳ法により遺伝子型を同定する工程であることを特徴とする請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
ＩＬ−１β遺伝子プロモーター領域であって、ＮＣＢＩにおいてＧｅｎｅ  Ｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＣ０７９７５３．７（更新日；２００５年４月１５日）として登録されているヒト２番染色体の５２７００位（complement）の塩基における遺伝子型を同定するためのプライマーセットが、以下の配列（ｉ）〜（iv）で示されるプライマーからなるプライマーセットであることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
（ｉ）5'-atctggcattgatctggttcatcc-3'；
（ii）5'-cttaactttaggaatcttcccactt-3'；
（iii）5'-cctgcaattgacagagagctacc-3'；
（iv）5'-cttgggtgctgttctctgccgca-3'；
【請求項５】
ＩＬ−６遺伝子プロモーター領域であって、ＮＣＢＩにおいてＧｅｎｅ  Ｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＣ０７３０７２．１１（更新日；２００４年１月３１日）として登録されているヒト７番染色体の１０６６３位の塩基における遺伝子型を同定するためのプライマーセットが、以下の配列（ｖ）〜（viii）で示されるプライマーからなるプライマーセットであることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
（v）5'-acctggagacgccttgaagtaact-3'；
（vi）5'-aaaccaaagatgttctgaactgagt-3'；
（vii）5'-gccaggcagtctacaacaggcc-3'；
（viii）5'-gtgttctggctctccctgtgtgc-3'；
【請求項６】
ＴＮＦ−α遺伝子プロモーター領域であって、ＮＣＢＩにおいてＧｅｎｅ  Ｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＬ６６２８０１．７（更新日；２００５年１月６日）として登録されているヒト６番染色体の４７２０２位の塩基における遺伝子型を同定するためのプライマーセットが、以下の配列（ix）〜（xii）で示されるプライマーからなるプライマーセットであることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
（ix）5'-gctgtggggagaacaaaaggataa-3'；
（x）5'-ggtccccatactcgacttccata-3'；
（xi）5'-gaagcaaaggagaagctgagaacat-3'；
（xii）5'-tccagaccctgacttttcctgcg-3'；
【請求項７】
生体試料が、抹消血又は非がん組織であることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載の方法に用いるための検査試薬であって、
ＩＬ−１β遺伝子プロモーター領域であって、ＮＣＢＩにおいてＧｅｎｅ  Ｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＣ０７９７５３．７（更新日；２００５年４月１５日）として登録されているヒト２番染色体の５２７００位（complement）の塩基における遺伝子型を同定するためのプライマーセット、
ＩＬ−６遺伝子プロモーター領域であって、ＮＣＢＩにおいてＧｅｎｅ  Ｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＣ０７３０７２．１１（更新日；２００４年１月３１日）として登録されているヒト７番染色体の１０６６３位の塩基における遺伝子型を同定するためのプライマーセット、及び、
ＴＮＦ−α遺伝子プロモーター領域であって、ＮＣＢＩにおいてＧｅｎｅ  Ｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＬ６６２８０１．７（更新日；２００５年１月６日）として登録されているヒト６番染色体の４７２０２位の塩基における遺伝子型を同定するためのプライマーセットから選択される少なくとも１以上のプライマーセット
を備えることを特徴とする検査試薬。
【請求項９】
ＩＬ−１β遺伝子プロモーター領域であって、ＮＣＢＩにおいてＧｅｎｅ  Ｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＣ０７９７５３．７（更新日；２００５年４月１５日）として登録されているヒト２番染色体の５２７００位（complement）の塩基における遺伝子型を同定するためのプライマーセットが、以下の配列（ｉ）〜（iv）で示されるプライマーからなるプライマーセットであることを特徴とする請求項８記載の検査試薬。
（ｉ）5'-atctggcattgatctggttcatcc-3'；
（ii）5'-cttaactttaggaatcttcccactt-3'；
（iii）5'-cctgcaattgacagagagctacc-3'；
（iv）5'-cttgggtgctgttctctgccgca-3'；
【請求項１０】
ＩＬ−６遺伝子プロモーター領域であって、ＮＣＢＩにおいてＧｅｎｅ  Ｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＣ０７３０７２．１１（更新日；２００４年１月３１日）として登録されているヒト７番染色体の１０６６３位の塩基における遺伝子型を同定するためのプライマーセットが、以下の配列（ｖ）〜（viii）で示されるプライマーからなるプライマーセットであることを特徴とする請求項８又は９のいずれかに記載の検査試薬。
（v）5'-acctggagacgccttgaagtaact-3'；
（vi）5'-aaaccaaagatgttctgaactgagt-3'；
（vii）5'-gccaggcagtctacaacaggcc-3'；
（viii）5'-gtgttctggctctccctgtgtgc-3'；
【請求項１１】
ＴＮＦ−α遺伝子プロモーター領域であって、ＮＣＢＩにおいてＧｅｎｅ  Ｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＬ６６２８０１．７（更新日；２００５年１月６日）として登録されているヒト６番染色体の４７２０２位の塩基における遺伝子型を同定するための
プライマーセットが、以下の配列（ix）〜（xii）で示されるプライマーからなるプライ
マーセットであることを特徴とする請求項８〜１０のいずれかに記載の検査試薬。
（ix）5'-gctgtggggagaacaaaaggataa-3'；
（x）5'-ggtccccatactcgacttccata-3'；
（xi）5'-gaagcaaaggagaagctgagaacat-3'；
（xii）5'-tccagaccctgacttttcctgcg-3'；
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、がん治療における抗がん剤の副作用を予測する方法に関し、特に指標としてサイトカイン遺伝子の多型に着目した、がん治療における抗がん剤の副作用を予測する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
がん治療において、抗がん剤の効果と副作用の多様性は大きな問題である。同じ抗がん剤を用いた治療においても、ケースによっては重い副作用を示す場合があり、抗がん剤の効果そのものと同様にその副作用予測を的確に行い、適切な抗がん剤を選択することが、効果的ながん治療には不可欠であると考えられる。
【０００３】
これまでに、抗がん剤の副作用には薬物代謝に関わる遺伝子の多型が影響を持つことが報告されてきている（非特許文献１−３）。すなわち、これらの遺伝子のｃｏｄｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎに多型が存在することにより、タンパク質のアミノ酸配列に変異が生じ、この変異がタンパク質の活性に影響を与えることが、抗がん剤の副作用となって現れるのだと考えられている。
【０００４】
またこの様な観点から、特に薬物代謝酵素の多型と抗がん剤の副作用に着目して、ＣＹＰ遺伝子の多型等を利用した抗がん剤副作用や感受性の判定方法が開示されている（特許文献１，２）。しかしながら、これまでに知られている抗がん剤はその種類、作用機序ともに極めて多様であり、薬物代謝遺伝子の多型もその遺伝子産物が代謝する薬剤にのみ適用可能であるのが現状である。このため、薬剤と遺伝子の１対１の対応関係にとどまらない、広範な薬剤に対する副作用を容易に予測可能な方法の開発が望まれていた。
【非特許文献１】Ｖａｎ  Ｋｕｉｌｅｎｂｕｒｇ  ＡＢ．ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  １０１：２５３−８．
【非特許文献２】Ｒｏｕｉｔｓ  Ｅ．ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１０：５１５１−９．
【非特許文献３】Ｌｅｃｏｍｔｅ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１０：５８８０−８
【非特許文献４】Ｗａｎｇ  Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．２２：１７７４−５．
【非特許文献５】Ｈａｍａｊｉｍａ  Ｎ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．９１：８６５−８．
【非特許文献６】Ｙｅ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．２９：８８．
【非特許文献７】Ｏｋａｙａｍａ  Ｎ．ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｌａｂ．Ｍｅｄ．４２：１３−６．
【特許文献１】特開２００４−０００００４  薬剤代謝へ影響を及ぼすＣＹＰ３Ａ４遺伝子多型、およびその利用
【特許文献２】特開２００３−１９９５８５  細胞の抗癌剤感受性の判定法
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、上記の現状に鑑み、これまでの様な個々の薬剤代謝に係る遺伝子ではなく、細胞への刺激に対する応答に関与するサイトカインに着目して、ある細胞のサイトカイン遺伝子に存在する多型からその細胞に対する抗がん剤の副作用を予測する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは上記観点から、サイトカイン遺伝子に存在する多型と抗がん剤投与による副作用との関係について研究を進め、サイトカイン遺伝子のプロモーター領域に存在する多型が抗がん剤の副作用と相関があるという事実を見出し、本発明を完成した。
【０００７】
すなわち、本発明の第１の態様は、被験細胞のサイトカイン遺伝子（本出願において「遺伝子」とは、ゲノムＤＮＡ内でｍＲＮＡとして転写される配列に加え、その５’上流及び３’下流に位置し前記ｍＲＮＡの転写調節に関与している配列を含んだ領域全体、と定義する。以下同じ）の多型を検出することを特徴とし、被験細胞に対する抗がん剤の副作用を予測する方法を提供する。
【０００８】
本発明の第２の態様は、被験細胞のサイトカイン遺伝子に存在する多型を検出することを特徴とし、被験細胞に対する抗がん剤の副作用を予測する方法であって、前記サイトカイン遺伝子が、炎症性サイトカインである、副作用予測方法を提供する。
【０００９】
本発明の第３の態様は、被験細胞のサイトカイン遺伝子に存在する多型を検出することを特徴とし、被験細胞に対する抗がん剤の副作用を予測する方法であって、前記サイトカイン遺伝子が、炎症性サイトカインであって、Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１β（ＩＬ−１β）、Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６（ＩＬ−６）、Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１０（ＩＬ−１０）、Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１８（ＩＬ−１８）、Ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−α（ＴＮＦ−α）、Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ（ＭＭＩＦ）、Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ（ＩＬ−１ｒａ）、またはこれらと同じファミリーに属する炎症性サイトカインのうち少なくとも１つである、副作用予測方法を提供する。
【００１０】
本発明の第４の態様は、被験細胞のサイトカイン遺伝子に存在する多型を検出することを特徴とし、被験細胞に対する抗がん剤の副作用を予測する方法であって、前記サイトカイン遺伝子が、炎症性サイトカインであって、Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１β（ＩＬ−１β）、Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６（ＩＬ−６）、Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１０（ＩＬ−１０）、Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１８（ＩＬ−１８）、Ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−α（ＴＮＦ−α）、Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ（ＭＭＩＦ）、Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ（ＩＬ−１ｒａ）のうち少なくとも１つである、副作用予測方法を提供する。
【００１１】
本発明の第５の態様は、被験細胞のサイトカイン遺伝子に存在する多型を検出することを特徴とし、被験細胞に対する抗がん剤の副作用を予測する方法であって、前記サイトカイン遺伝子が、炎症性サイトカインであって、Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１β（ＩＬ−１β）、Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６（ＩＬ−６）、Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１０（ＩＬ−１０）、Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１８（ＩＬ−１８）、Ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−α（ＴＮＦ−α）、Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ（ＭＭＩＦ）、Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ（ＩＬ−１ｒａ）のうち少なくとも１つであって、前記多型が、前記サイトカイン遺伝子のプロモーター領域に存在する、副作用予測方法を提供する。
【００１２】
本発明の第６の態様は、被験細胞のサイトカイン遺伝子に存在する多型を検出することを特徴とし、被験細胞に対する抗がん剤の副作用を予測する方法であって、前記サイトカイン遺伝子が、炎症性サイトカインであって、Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１β（ＩＬ−１β）、Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６（ＩＬ−６）、Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１０（ＩＬ−１０）、Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１８（ＩＬ−１８）、Ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−α（ＴＮＦ−α）、Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ（ＭＭＩＦ）、Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ（ＩＬ−１ｒａ）のうち少なくとも１つであって、前記多型が、ＩＬ−１βにおいては−５１１位（Ｃ／Ｔ）に、ＩＬ−６においては−６３４位（Ｃ／Ｇ）に、ＩＬ−１０においては−８１９位に、ＩＬ−１８においては−１３７位に、ＴＮＦ−αにおいては−１０３１位（Ｔ／Ｃ）に、ＭＭＩＦにおいては−１７３位に、ＩＬ−１ｒａにおいてはイントロン２に存在する、副作用予測方法を提供する。
【００１３】
本発明の第７の態様は、被験細胞のサイトカイン遺伝子に存在する多型を検出することを特徴とし、被験細胞に対する抗がん剤の副作用を予測する方法であって、前記多型が、前記サイトカイン遺伝子のプロモーター領域に存在する、副作用予測方法を提供する。
【００１４】
本発明の第８の態様は、被験細胞のサイトカイン遺伝子に存在する多型を検出することを特徴とし、被験細胞に対する抗がん剤の副作用を予測する方法であって、前記多型が、前記サイトカイン遺伝子のプロモーター領域に存在し、前記サイトカイン遺伝子の転写量の増減と相関のある多型である、副作用予測方法を提供する。
【００１５】
本発明の第９の態様は、被験細胞のサイトカイン遺伝子に存在する多型を検出することを特徴とし、被験細胞に対する抗がん剤の副作用を予測する方法であって、前記多型が、前記サイトカイン遺伝子のプロモーター領域に存在し、前記サイトカイン遺伝子の転写量の増減と相関のある多型である、請求項２から請求項６のうちいずれか１項に記載の、副作用予測方法を提供する。
【００１６】
被験細胞のサイトカイン遺伝子に存在する多型を検出することを特徴とし、被験細胞に対する抗がん剤の副作用を予測する方法であって、前記副作用が、体内における炎症に起因する副作用である、副作用予測方法を提供する。
【００１７】
本発明の第１１の態様は、被験細胞のサイトカイン遺伝子に存在する多型を検出することを特徴とし、被験細胞に対する抗がん剤の副作用を予測する方法であって、前記副作用が、体内における炎症に起因する副作用であって、白血球減少、好中球減少、血小板減少、肝機能障害、腎機能障害、口内炎、嘔吐、下痢、食欲不振、発熱のうち少なくとも１つの症状である、副作用予測方法を提供する。
【００１８】
本発明の第１２の態様は、被験細胞のサイトカイン遺伝子に存在する多型を検出することを特徴とし、被験細胞に対する抗がん剤の副作用を予測する方法であって、前記副作用が、体内における炎症に起因する副作用であって、白血球減少、好中球減少、血小板減少、肝機能障害、腎機能障害、口内炎、嘔吐、下痢、食事不振、発熱のうち少なくとも１つの症状である、請求項２から請求項９のうちいずれか１項に記載の、副作用予測方法を提供する。
【００１９】
本発明の第１３の態様は、被験細胞のサイトカイン遺伝子に存在する多型を検出することを特徴とし、被験細胞に対する抗がん剤の副作用を予測する方法であって、前記抗がん剤が、５−ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ、Ｃｉｓｐｌａｔｉｎのうち少なくとも１つである、副作用予測方法を提供する。
【００２０】
本発明の第１４の態様は、被験細胞のサイトカイン遺伝子に存在する多型を検出することを特徴とし、被験細胞に対する抗がん剤の副作用を予測する方法であって、前記抗がん剤が、５−ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ、Ｃｉｓｐｌａｔｉｎのうち少なくとも１つである、請求項２から請求項１２のうちいずれか１項に記載の、副作用予測方法を提供する。
【００２１】
本発明の第１５の態様は、被験細胞のサイトカイン遺伝子に存在する多型を検出することを特徴とし、被験細胞に対する抗がん剤の副作用を予測する方法であって、前記被験細胞が、日本人由来の細胞である、請求項２から請求項１４のうちいずれか１項に記載の、副作用予測方法を提供する。
【００２２】
本発明の第１６の態様は、被験細胞のサイトカイン遺伝子の多型を検出することを特徴とし、被験細胞に対する抗がん剤の副作用を予測することを特徴とする、被験細胞の検査方法を提供する。
【００２３】
本発明の第１７の態様は、被験細胞のサイトカイン遺伝子の多型を検出することを特徴とし、被験細胞に対する抗がん剤の副作用予測をすることを特徴とする、被験細胞の検査方法であって、前記副作用予測が、請求項２から請求項１６のうちいずれか１項に記載の、被験細胞の検査方法を提供する。
【００２４】
本発明の第１８の態様は、被験細胞のサイトカイン遺伝子の多型を検出することを特徴とし、被験細胞に対する抗がん剤の副作用を予測することを特徴とする、被験細胞の検査方法において使用される検査試薬であって、前記副作用予測が、請求項２から請求項１６のうちいずれか１項に記載の方法を用いた副作用予測であって、被験細胞から抽出されたＤＮＡを鋳型とし、標的となるサイトカイン遺伝子の断片を特異的に増幅する過程に係る、核酸合成酵素と、デオキシヌクレオチド３リン酸（ｄＮＴＰ）と、標的となるサイトカイン遺伝子のプライマーと、増幅反応を最適化する塩類を含み、前記抗がん剤の副作用に相関のある多型またはそれに係る塩基を識別可能とする過程に係る、前記多型またはそれに係る塩基の標識に用いられる試薬と、前記標識の有無を判別可能とするための試薬とを含む、検査試薬を提供する。
【発明の効果】
【００２５】
本発明の提供する予測方法及び検査方法を利用することにより、抗がん剤に対する副作用を予め推測することが可能となり、副作用のリスクを抑えたがん治療に結びつけることが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
以下に本発明を実施するための最良の形態を述べる。本発明の第１の態様は、被験細胞のサイトカイン遺伝子（本出願において「遺伝子」とは、ゲノムＤＮＡ内でｍＲＮＡとして転写される配列に加え、その５’上流及び３’下流に位置し前記ｍＲＮＡの転写調節に関与している配列を含んだ領域全体、と定義する。以下同じ）の多型を検出することを特徴とする、被験細胞に対する抗がん剤の副作用を予測する方法を提供する。抗がん剤の副作用予測については、これまでに幾つかの発明が開示されているが、本発明では、これまでの様に薬剤の副作用を「薬剤代謝タンパク質の活性」の問題として捉えるのでは無く、「刺激に対する応答物質としてのサイトカイン」に着目し、その遺伝子多型から副作用を予測するという全く新しい予測方法を提供する。
【００２７】
本発明の第２から第５の態様においては、被験細胞のサイトカイン遺伝子に存在する多型を検出することを特徴とする、被験細胞に対する抗がん剤の副作用を予測する方法であって、前記サイトカイン遺伝子が、炎症性サイトカインであることを特徴とする、被験細胞に対する抗がん剤の副作用を予測する方法を提供する。本発明者らは、抗がん剤の副作用のうち特に炎症性のサイトカインが関与していると考えられるものに着目し、炎症性サイトカイン遺伝子に存在する多型と抗がん剤の副作用との間の相関関係を明らかにして、本発明を完成した。本発明における炎症性サイトカインは、詳しくはＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１８、ＴＮＦ−α、ＭＭＩＦ、ＩＬ−１ｒａ、またはこれらと同じファミリーに属する炎症性サイトカインのうち少なくとも１つであり、より詳しくはＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１８、ＴＮＦ−α、ＭＭＩＦ、ＩＬ−１ｒａのうち少なくとも１つである。前記多型は、前記サイトカイン遺伝子における多型は当該遺伝子のプロモーター領域に存在し、具体的にはＩＬ−１βにおいては−５１１位（Ｃ／Ｔ）に、ＩＬ−６においては−６３４位（Ｃ／Ｇ）に、ＩＬ−１０においては−８１９位に、ＩＬ−１８においては−１３７位に、ＴＮＦ−αにおいては−１０３１位（Ｔ／Ｃ）に、ＭＭＩＦにおいては−１７３位に、Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔにおいてはイントロン２に存在する多型である。尚、個々の数字はそれぞれ、開始コドンの最初の塩基を１としたときのゲノム上の位置を示すものである。
【００２８】
本発明の第７から第９の態様においては、被験細胞のサイトカイン遺伝子に存在する多型を検出することを特徴とする、被験細胞に対する抗がん剤の副作用を予測する方法であって、前記多型が、前記サイトカイン遺伝子のプロモーター領域に存在することを特徴とする、被験細胞に対する抗がん剤の副作用を予測する方法が提供される。本発明においては、抗がん剤に対する副作用を代謝酵素の活性の大小ではなく、刺激に対する応答の大小と捉え、その指標として遺伝子の発現調節に関与するプロモーター領域に着目して、そこに存在する遺伝子多型と副作用との相関関係を明らかにし本発明を完成した。前記多型は、前記サイトカイン遺伝子のプロモーター領域に存在し、詳しくは転写量の増減と相関のある多型である。本発明の第２から第６の態様において、標的となる多型が第７から第９の態様に記載のプロモーター領域に存在する抗がん剤の副作用予測方法もまた、本発明の実施の形態として含まれるものである。
【００２９】
本発明の第１０から第１２の態様においては、被験細胞のサイトカイン遺伝子に存在する多型を検出することを特徴とする、被験細胞に対する抗がん剤の副作用を予測する方法であって、前記副作用が、体内における炎症に起因する副作用であることを特徴とする、被験細胞に対する抗がん剤の副作用を予測する方法が提供される。本発明における副作用は、詳しくは体内における炎症に起因する副作用であって、白血球減少、好中球減少、血小板減少、肝機能障害、腎機能障害、口内炎、嘔吐、下痢、食欲不振、発熱のうち少なくとも１つの症状である。これらの副作用は、これまでの研究によって炎症性サイトカインとの関連が知られるものであり、本発明の予測方法によって予測可能な副作用である。また、本発明の第２から第９のいずれかの態様において、予測対象となる副作用が第１０から第１２の態様に記載の副作用である抗がん剤の副作用予測方法もまた、本発明の実施の形態として含まれるものである。
【００３０】
本発明の第１３、第１４の態様においては、被験細胞のサイトカイン遺伝子に存在する多型を検出することを特徴とする、被験細胞に対する抗がん剤の副作用を予測する方法であって、前記抗がん剤が、５−ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ（５−ＦＵ）、Ｃｉｓｐｌａｔｉｎの（ＣＤＤＰ）うち少なくとも１つであることを特徴とする、被験細胞に対する抗がん剤の副作用を予測する方法が提供される。本発明は、薬剤の刺激が炎症性サイトカインを誘導する点に着目したものであり、薬剤の種類に限定されるものではないが、その中でも抗がん剤は細胞に対して強い作用を及ぼす薬剤であり、副作用も大きいことから、本発明は抗がん剤を主な対象とし、具体的には５−ＦＵ、ＣＤＤＰのいずれかである副作用予測方法を提供する。本発明の第２から第１２のいずれかの態様において、対象薬剤が第１３の態様に記載の副作用予測方法もまた、本発明の実施の形態として含まれるものである。
【００３１】
本発明の第１５の態様においては、被験細胞のサイトカイン遺伝子に存在する多型を検出することを特徴とする、被験細胞に対する抗がん剤の副作用を予測する方法であって、前記被験細胞が、日本人由来の細胞であることを特徴とする、請求項２から請求項１４のうちいずれか１項に記載の、被験細胞に対する抗がん剤の副作用を予測する方法が提供される。遺伝子多型は、人種間・集団間でその頻度に差がある例が知られており、実施例で述べるとおり、本発明の対象としては日本人由来の細胞が好ましい。
【００３２】
本発明の第１６、１７の態様においては、被験細胞のサイトカイン遺伝子の多型を検出することを特徴とし、被験細胞に対する抗がん剤の副作用を予測することを特徴とする、被験細胞の検査方法を提供する。がん治療においては、個々のがんに対して適切な薬剤を選択することが極めて重要である。この選択の判断材料として、患者さんから細胞（粘膜や血液など）を採取し、炎症性サイトカイン遺伝子を増幅し、遺伝子の多型を可視化して副作用を予測する工程を含む被験細胞の検査方法が、本発明の応用例として提示される。本態様における副作用予測方法は、本発明の第２から第１５の態様にそれぞれ記載の副作用予測方法である。
【００３３】
本発明の第１８の態様においては、上記第１７の態様に記載の検査方法に供される検査試薬が提供される。前記検査試薬は、被験細胞から抽出されたＤＮＡを鋳型とし、標的となるサイトカイン遺伝子の断片を特異的に増幅する過程に係る、核酸合成酵素（例えば、Ｔａｑポリメラーゼ）と、デオキシヌクレオチド３リン酸（ｄＮＴＰ）と、標的となるサイトカイン遺伝子のプライマー（例えば、ＩＬ−１ｒａのイントロン２用プライマーとして、５’−ＣＣＴＣＡＧＣＡＡＣＡＣＴＣＣＴＡＴＴＧＡＣ−３’及び５’−ＧＧＴＣＴＣＡＴＣＴＴＣＣＴＧＧＴＣＴＧＣ−３’）と、増幅反応を最適化する塩類を含み、前記抗がん剤の副作用に相関のある多型またはそれに係る塩基を識別可能とする過程に係る、前記多型またはそれに係る塩基の標識に用いられる試薬と、前記標識の有無を判別可能とするための試薬とを含むことを特徴とする、検査試薬である。
【実施例１】
【００３４】
（対象）  本発明に係る調査は、１９９７年から２００４年までの間に山口大学医学部付属病院の第２外科で抗がん剤による化学療法を受けた患者さん１００名を対象に行った。患者さんの年齢は２７歳から８３歳までの間（平均６３歳）で、他の特徴等を表１に示した。化学療法の副作用の評価はＮＣＩ−ＣＴＣに従い、化学療法の期間中または後に現れた最も高い値の症状をその患者さんの副作用とした。
【表１】
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【００３５】
（化学療法）  本発明における化学療法とは、以下のものである。対象となる患者さんに対し、５−ＦＵ＋ＣＤＤＰ療法として、３３０ｍｇ／ｍ２／ｄａｙの５−ＦＵを連続静脈注射で１日目から７日目まで投与し、また６ｍｇ／ｍ２／ｄａｙのＣＤＤＰを点滴によって１日２時間、１日目から５日目まで投与した。ＣＤＤＰ投与前には、５−ＨＴ３−ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔを経口的に投与した。このスケジュールで４週間投与を行ったが、その間にｇｒａｄｅ３から４の副作用が見られた場合には、直ちに化学療法を中止した。
【実施例２】
【００３６】
（遺伝子解析）  ＤＮＡ解析のために、７８人の患者さんから７ｍｌの抹消血を採取した。ＤＮＡはＮａＩ法で抽出し、４℃で保存した（非特許文献４）。残り２２人の患者さんについては、切除した非がん組織の冷凍標本からＨｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  ＰＣＲ  Ｔｅｍｐｌａｔｅ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてＤＮＡを抽出した（抹消血が採取できなかったため）。
【００３７】
（Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）  ＩＬ−１ＲＡ遺伝子のイントロン２にある８６ｂｐのＶＮＴＲ（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｎｕｍｂｅｒ  ｏｆ  ｔａｎｄｅｍ  ｒｅｐｅａｔ）領域を、配列１に示すプライマーを用いて増幅した。増幅の条件は次の通りである：ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ  ９５℃，２ｍｉｎ：２６ｃｙｃｌｅｓ  ｏｆ（ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ  ９４℃，３０ｓｅｃ；ａｎｎｅａｌｉｎｇ  ６１℃，２０ｓｅｃ；ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ７２℃，３０ｓｅｃ）。増幅された４２３ｂｐ（８６ｂｐの４回くり返し）、２５１ｂｐ（２回）、５０９ｂｐ（５回）、３３７ｂｐ（３回）のそれぞれの産物を、２％アガロースゲル（０．１％臭化エチジウム入り）電気泳動で解析した。
【００３８】
ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１８、ＭＭＩＦ遺伝子のプロモーター領域の遺伝子多型は、ＡＲＭＳ法で検出した（非特許文献５−７）。ＦＯ，ＲＯ，ＦＩ，ＲＩの４つのプライマーを各多型の検出に用い、Ａｌｌｅｌｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙは、内側プライマーの３’末端塩基と鋳型ＤＮＡとの間のミスマッチ及び内側プライマーの３’末端から−２塩基の位置の故意の２次ミスマッチを調べた。遺伝子増幅は１０μｌ系（８０ｎｇ／μｌ  ＤＮＡ  ｔｅｍｐｌａｔｅ，１０ｐｍｏｌ／μｌ  ｐｒｉｍｅｒｓ，２００μＭ  ｄＮＴＰ，２ｍＭ  ＭｇＣｌ２，２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０，１００ｍＭ  ＫＣｌ，１Ｕ  Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｅｘ  Ｔａｑ，Ｔａｋａｒａ，Ｊａｐａｎ）で行い、遺伝子増幅の主な条件は以下の通りである：ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ  ９５℃，２ｍｉｎ；３０ｃｙｃｌｅｓ  ｏｆ（ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ  ９５℃，３０ｓｅｃ；ａｎｎｅａｌｉｎｇ  ６０℃，２０ｓｅｃ；ｅｘｔｅｎｔｉｏｎ  ７２℃，３０ｓｅｃ）。表２に詳しい条件を示した。
【表２】
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【００３９】
（統計的解析）  値は平均値±標準誤差で表す。遺伝子型または対立遺伝子の分布の違いはχ２テストで解析した。潜在的に化学療法に関連した副作用の前兆となる変数は、多変量解析の回帰モデルに入力し、またＯＲと９５％ＣＩを算出した。多型のＯＲに関して、Ｃｒ−ＯＲは副作用の解析として単変量解析で算出され、Ａｄ−ＯＲは多変量解析で算出した。Ｐ＜０．０５を統計的に有意であると判定した。全ての解析は、Ｓｔａｔ  Ｖｉｅｗ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｖｅｒ．５．０；ＳＡＳ  Ｉｎｓｔ．，Ｉｎｃ．，Ｃａｒｙ，ＮＣ）で行った。
【実施例３】
【００４０】
（抗がん剤の副作用）  表３に、化学療法を受けた患者さんの示した副作用を表す。グレード３−４の副作用の出現率は、それぞれ白血球減少で２３．０％、好中球減少で３１．０％、食欲不振が３３．０％であった。他のタイプの重い副作用は、少数しか見られなかった。
【表３】
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【００４１】
（遺伝的多型と副作用との関係）
解析したサイトカイン遺伝子のプロモーター配列に存在する塩基多型のうち、化学療法に伴う副作用（白血球減少、好中球減少、血小板減少、口内炎含む）と有意な関係があったものは、表４に示す通り、ＩＬ−６の−６３４Ｃ／Ｇ、ＩＬ−１βの−５１１Ｃ／Ｔ、ＴＮＦ−αの−１０３１Ｔ／Ｃであった。ＩＬ−６の−６３４ＧＣとＧＧの遺伝子型を併せ持つ頻度は、グレード１−４の白血球減少（Ｐ＜０．０１；Ｃｒ−ＯＲ＝４．０；９５％ＣＩ＝１．５−１０）、好中球減少（Ｐ＜０．０１；Ｃｒ−ＯＲ＝３．６；９５％ＣＩ＝１．５−８．９）、血小板減少（Ｐ＜０．０１；Ｃｒ−ＯＲ＝６．１；９５％ＣＩ＝２．５−１４）を示した群で、示さなかった群に比べて有意に高かった（表５、表６）。同様の遺伝子型頻度と副作用との関係が、ＩＬ−１βの−５１１ＴＣ、ＴＴとグレード１−４の血小板減少（Ｐ＝０．０１３；Ｃｒ−ＯＲ＝２．９；９５％ＣＩ＝１．２−７．０）及びＴＮＦ−αの−１０３１ＴＴとグレード１−４の口内炎（Ｐ＝０．０２；Ｃｒ−ＯＲ＝３．１；９５％ＣＩ＝１．２−８．３）でも観察された。
【表４】
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【表５】
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【表６】
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【００４２】
化学療法の副作用が、３以上では重大であると考えられている事から、副作用のグレードを０−２と３−４のグループに分割し、それらの副作用とサイトカイン遺伝子のプロモーターに存在する塩基多型の間の関係を解析した。その結果、ＩＬ−６の−６３４ＧＣ、ＧＧの両方の遺伝子型を持つ頻度が、グレード３−４の好中球減少を示した群において、グレード０−２の好中球減少を示した群に比べて有意に高かった。
【００４３】
抗がん剤の副作用に影響する因子を検出するために、臨床病理学的変数である、年齢（６３歳の内外）、性別、疾患の種別（食道がんかそれ以外）、化学療法の目的（補助的なものか否か）、放射線治療の有無、サイトカイン遺伝子のプロモーターに存在する塩基多型を、それぞれ多変量回帰モデルに入力した。表５に示すとおり、サイトカイン遺伝子のプロモーター領域に存在する塩基多型は、抗がん剤の副作用と有意に相関があった。
【００４４】
抗がん剤による副作用のうち、血小板減少（グレード１−４）はＩＬ−１βの−５１１位とＩＬ−６の−６３４位の塩基多型と関連があった。これら２つの多型と血小板減少との関連を解析した結果、ＩＬ−１βの−５１１ＣＴまたはＴＴとＩＬ−６の−６３４ＣＧまたはＧＧの両方を持つ患者さんでは、血小板減少の出現率が８７％であった。反対に、ＩＬ−１βの−５１１ＣＣとＩＬ−６の−６３４ＣＣの両方を持つ患者さんでは、血小板減少の出現率は２０％であった（図１）。
【産業上の利用可能性】
【００４５】
本発明は、抗がん剤による副作用を、サイトカイン遺伝子に存在するプロモーター領域の塩基多型に基づいて予測するものであり、抗がん剤を用いる医療の現場において、その副作用を予測し、個々の患者さんにとって適切な薬剤を選択するための有効な手段を提供するものである。またこの目的のために、本発明の提供する検査試薬を利用して、対象となる遺伝子領域を増幅し多型を検出するシステムが有効である。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】ＩＬ−１βの−５１１Ｃ／Ｔ多型及びＩＬ−６の−６３４Ｇ／Ｃ多型と、抗がん剤による副作用の１つである血小板減少との間の関係を示す。ＩＬ−１βの−５１１ＴとＩＬ−６の−６３４Ｇの両方を持つ群では８７％が血小板減少を示し、この２つを持たない群（２０％）に比べて遙かに高い値を示した。
【図１】
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【配列表】
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