(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中のホモシステインを検出およびその量を定量する方法に用いられるキットであって：ハロケトンまたはα−ハロアルデヒド官能基を有する保護されたアルキル化試薬を含み、上記ハロケトンまたはα−ハロアルデヒド官能基のカルボニルが保護された官能基で誘導体化されており、上記保護された官能基は、脱保護された場合にホモシステインを化学的に修飾して修飾ホモシステインを形成することができる、第一の試薬、上記の保護されたアルキル化試薬を脱保護できる活性化試薬を含む第二の試薬、および上記修飾ホモシステインに特異的に結合できる第三の試薬のそれぞれが、少なくとも１回のアッセイを実施するのに十分な量詰め合わされている、キット。
【請求項２】
上記第一の試薬はホスフェート保護基を有する保護されたハロケトンを含む請求項１記載のキット。
【請求項３】
上記第一の試薬はさらにホモシステインジスルフィド還元剤を含む請求項１記載のキット。
【請求項４】
上記第一の試薬はさらに修飾ホモシステインでコートされた固体マトリックスを含む請求項１記載のキット。
【請求項５】
上記固体マトリックスはラテックスまたはガラスビーズを含む請求項４記載のキット。
【請求項６】
上述の保護されたハロケトンはＣＡＢＡエノールホスフェートまたはＢＡＢＡエノールホスフェートである請求項２記載のキット。
【請求項７】
上記第二の試薬は、さらにホスファターゼを含有する請求項１記載のキット。
【請求項８】
上記ホスファターゼはアルカリホスファターゼである請求項７記載のキット。
【請求項９】
サンプル中のホモシステインを検出およびその量を定量する方法に用いられるキットであって：ハロケトンまたはα−ハロアルデヒド官能基を有する保護されたアルキル化試薬を含み、上記ハロケトンまたはα−ハロアルデヒド官能基のカルボニルが保護された官能基で誘導体化されており、上記保護された官能基は、脱保護された場合にホモシステインを化学的に修飾して修飾ホモシステインを形成することができる、第一の試薬、ならびに、上記の保護されたアルキル化試薬を脱保護できる活性化試薬および修飾されたホモシステインに特異的に結合できる受容体でコートされた固体マトリックスを
含む第二の試薬のそれぞれが、少なくとも１回のアッセイを実施するのに十分な量詰め合わされている、キット。
【請求項１０】
上記受容体は抗体または免疫学的に活性なそのフラグメントである請求項９記載のキット。
【請求項１１】
上記マトリックスはさらにそれに結合したシグナリング物質を包含する請求項４または９記載のキット。
【請求項１２】
上記シグナリング物質は化学ルミネセンス物質、蛍光物質または色素原物質を含む請求項１１記載のキット。
【請求項１３】
ホモシステインの含有が疑われるサンプル中のホモシステインの量を定量する方法において、以下の工程：
（ａ） 水性メジウム中に
（１）上記サンプル
（２）ハロケトンまたはα−ハロアルデヒド官能基を有する保護されたアルキル化試薬を含み、上記ハロケトンまたはα−ハロアルデヒド官能基のカルボニルが保護された官能基で誘導体化されており、上記保護された官能基は、ホモシステインのスルフヒドリル基を化学的に修飾して修飾ホモシステインを形成するよう活性化させることができる、第一の試薬、および
（３）上記の修飾されたホモシステインに特異的に結合して免疫複合体を形成できるリガンドを含む第二の試薬、および
（４）上記の保護されたアルキル化試薬を活性化できる第三の試薬
を加える工程、
（ｂ） 上記サンプル中のホモシステインの量に相関する上記免疫複合体の量を測定する工程、
を含む方法。
【請求項１４】
上記第一の試薬はさらにジスルフィド還元剤を含む請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
上記の保護されたアルキル化試薬はハロビニルエーテルまたはエステルである請求項１３記載の方法。
【請求項１６】
上記ハロビニルエーテルまたはエステルはα−ハロケトンエノールホスフェートである請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
上記α−ハロケトンエノールホスフェートはＢＡＢＡエノールホスフェートおよびＣＡＢＡエノールホスフェートからなる群より選択される請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
上記第三の試薬はホスファターゼである請求項１３記載の方法。
【請求項１９】
上記ホスファターゼはアルカリホスファターゼである請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
上記第一の試薬はさらにｈｃｙ−ＡＢＡでコートされた固体マトリックスを含む請求項１３記載の方法。
【請求項２１】
上記第一の試薬はさらに修飾されたホモシステインに結合できる受容体でコートされた固体マトリックスを含む請求項１３記載の方法。
【請求項２２】
上記固体マトリックスはラテックスまたはガラスビーズを含む請求項２０または２１記載の方法。
【請求項２３】
上記固体マトリックスはマイクロタイタープレートを含む請求項２０または２１記載の方法。
【請求項２４】
上記受容体は抗体または抗体の免疫学的に活性なフラグメントである請求項２１記載の方法。
【請求項２５】
サンプル中のホモシステインの量を定量する方法において、上記ホモシステインの少なくとも一部はジスルフィド型であり、以下の工程:
（ａ） メジウム中、
（１）上記サンプル
（２）上記ホモシステインをジスルフィド型から放出させる放出剤、
（３）ハロケトンまたはα−ハロアルデヒド官能基を有し、上記ハロケトンまたはα−ハロアルデヒド官能基のカルボニルが保護された官能基で誘導体化されており、上記保護された官能基は、ホモシステインのスルフヒドリル基を化学的に修飾して修飾ホモシステインを形成するよう活性化させることができる、保護されたアルキル化試薬、および
（４）上記の修飾されたホモシステインに特異的に結合して免疫複合体を形成できる受容体、および
（５）上記の保護されたアルキル化試薬を脱保護できる活性化試薬
を含む混合物を調製する工程、
（ｂ） 上記メジウムを、上記サンプル中のホモシステインの量に相関する上記免疫複合体の量について調べる工程、
を含む方法。
【請求項２６】
ホモシステインが試薬によって修飾され、次いで修飾ホモシステインに特異的に結合できる試薬と合わされる、サンプル中のホモシステインの量を測定する方法において、上記サンプルとともに、以下の式：
【化８】
0004684511.tif 000013
（式中、Ｒ1およびＲ2はアルキル、アリールまたは置換されたアルキルもしくはアリールであり、ＸはＣｌ、ＢｒまたはＩであり、Ｙは酵素によって除去できる保護基である）を有するアルキル化試薬および上記アルキル化試薬の脱保護を触媒することができる酵素を提供することを含む改良された上記方法。
【請求項２７】
保護されたアルキル化試薬が、以下の式：
【化１０】
0004684511.tif 000014
（式中、Ｒ1およびＲ2はアルキル、アリールまたは置換されたアルキルもしくはアリールであり、ＸはＣｌ、ＢｒまたはＩであり、Ｙは酵素によって除去できる保護基である）を有する、請求項１に記載のキット。
【請求項２８】
保護されたアルキル化試薬が、以下の式：
【化１１】
0004684511.tif 000015
（式中、Ｒ1およびＲ2はアルキル、アリールまたは置換されたアルキルもしくはアリールであり、ＸはＣｌ、ＢｒまたはＩであり、Ｙは酵素によって除去できる保護基である）を有する、請求項１３に記載の方法。
【請求項２９】
保護されたアルキル化試薬が、以下の式：
【化１２】
0004684511.tif 000016
（式中、Ｒ1およびＲ2はアルキル、アリールまたは置換されたアルキルもしくはアリールであり、ＸはＣｌ、ＢｒまたはＩであり、Ｙは酵素によって除去できる保護基である）を有する、請求項２５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【技術分野】
本発明は保護されたα−ハロケトンの長期間の保存を可能にし、さらに必要な水溶性を付与し、簡単な生物適合性のある除去が可能な保護基を開示する。
【０００２】
【背景技術】
α−ハロケトンはたとえば、各種分子の他のスルフヒドリル含有分子へのカップリングを含む様々な関連で有用なアルキル化剤である。しかしながら、α−ハロケトンは、このような方法に使用されるキットの成分と一緒におよび／または長期間保存する必要があるアッセイや反応に用いるためには問題があり、実用的ではない性質を有する。たとえばα−ハロケトンは水、アルカリおよび有機塩基と自発的に反応し、したがって長期間水溶液中では、とくにタンパク質が存在する場合、生理学的ｐＨでは保存することができない。
【０００３】
α−ハロケトンは一般に、反応性が高すぎて、タンパク質と架橋を生じ、また他の加水分解に不安定なため、ほとんど使用されない。このような問題がなければ、それらの高い反応性は薬物誘導体のさらに低濃度での使用を可能にする筈である。一部のα−ハロケトンはまた、このような関連で使用されるためには溶解性が不十分である。したがって、多くの診断および合成に有用な可能性があるにもかかわらず、α−ハロケトンはこのような適用には不安定すぎると考えられることが多い。
【０００４】
同様に、タンパク質は他のタンパク質にカップリングさせることがしばしばである。この場合、一方のタンパク質にはアルキル化基、他方にはスルフヒドリル基を結合させる。しかしながらこの方法では、一方または両方のタンパク質のメンバーの高濃度での使用および／または一方のタンパク質への多重もしくは単一アルキル化剤の結合を行わなければ定量的なカップリングは達成されない。さらに、アルキル化剤を結合させたタンパク質はスルフヒドリル基をもたないかまたはそのスルフヒドリル基を重合の回避のために保護しなければならない。高度に反応性のアルキル化剤を含有するタンパク質の製造および保存の困難性がなければ、この場合もさらに高い反応性のα−ハロケトンを使用することによって問題を克服できる筈である。
【０００５】
本発明は上述の問題に新規な解決法を提供し、これによりこのクラスのアルキル化剤をとくに様々な診断および合成に有用なものとする。保護されたハロケトンからなる新規な化合物および組成物の開示に関連して、本発明はまた、様々な適用たとえばアッセイおよび接合反応に有用な保護されたハロケトンの製造および使用方法を開示する。
【０００６】
後者の例としては一部のＧ６ＰＤＨ薬物接合体が、まず酵素をα−ハロ酸とカップリングさせてα−ハロアミドを形成させ、ついでこの接合体をスルフヒドリル標識薬物とカップリングさせることによって製造される。この方法は薬物が薬物の活性エステルによるカップリングを妨害する遊離のアミノ基を有する場合に、とくに有用である。
【０００７】
【発明の開示】
したがって、本発明の一実施態様においては、保護されたα−ハロケトンの長期間の保存を可能にし、さらに必要な水溶性を付与し、簡単な生物適合性のある除去が可能な保護基が開示される。
すなわち一実施態様においては、本発明は保護されたアルキル化試薬からなり、その試薬の脱保護は酵素によって触媒される組成物を開示する。様々な好ましい実施態様においては、試薬にはホスフェート、エステル、炭水化物、核酸および脂質からなる群より選択される保護基が包含される。様々な好ましい実施態様ではまた、酵素はグリコシダーゼ、ヌクレアーゼ、リパーゼ、エステラーゼ、ヒドロキシラーゼおよびホスファターゼからなる群より選択される方法が開示される。
【０００８】
本発明の別の実施態様においては、試薬は２−ハロビニルエーテル、２−ハロビニルエステル、４−ハロブタンジエニルエーテル、または４−ハロブタンジエニルエステルである。様々な実施態様においては、２−ハロビニルエーテルまたはエステルは２−ハロビニルモノホスフェートである。他の実施態様においては、ビニル基は１または２個のアルキルまたはアリール基で置換され、アルキルまたはアリール基は置換または非置換である。
【０００９】
本発明の様々な好ましい実施態様においては、ハロケトンはα−ハロケトンである。好ましいα−ハロケトンにはα−ブロモアセチル安息香酸（ＢＡＢＡ）およびα−クロロアセチル安息香酸（ＣＡＢＡ）が包含される。本発明の組成物は、さらに親核性物質および／またはジスルフィド還元剤から構成される。有用なジスルフィド還元剤には、ホスフィンたとえばトリス（カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）が包含される。
【００１０】
本発明では、様々なキットたとえばカップリング反応を実施するために使用されるキットが開示される。このようなキットはパッケージされた配合物中、第一の試薬として少なくとも１回の反応を実施するのに十分な量の保護されたアルキル化剤からなる。
一つの変形では、第一に試薬には、ホスフェートエステル、カルボン酸エステル、硫酸エステル、グリコシドおよびケタールからなる群より選択される保護基が包含される。他の変形においては、第一の試薬にはホスフェートおよび炭水化物からなる群より選択される保護基が包含される。各種の実施態様においては、第一の試薬は保護されたハロケトンでもよく、２−ハロビニルエーテルまたはエステルからなる。２−ハロビニルエステルの例は２−ハロビニルモノホスフェートである。
【００１１】
本発明の保護されたハロケトンは好ましくはα−ハロケトンたとえばＢＡＢＡまたはＣＡＢＡからなる。また、第一の試薬は  ４−ハロブタジエニルエーテルまたはエステルである。様々な実施態様においては、ビニル基は１または２個のアルキルまたはアリール基で置換されている。
キットはさらに、保護されたアルキル化試薬を脱保護できる触媒からなる第二の試薬により構成される。様々な実施態様においては、第一および第二の試薬は分離された容器内に包含される。
【００１２】
開示されたキットの他の変形では、触媒は酵素からなる。開示された使用に適した酵素はグリコシダーゼ、ヌクレアーゼ、リパーゼ、ヒドロキシラーゼ、ホスファターゼ（たとえば、アルカリホスファターゼ）およびリボザイムからなる群より選択される。
本発明はまた、サンプル中のホモシステインを検出または定量的に測定する方法に使用されるキットにおいて、脱保護された場合に修飾されたホモシステインを形成する化学的にホモシステインを修飾できる保護されたアルキル化試薬からなる第一の試薬、保護されたアルキル化試薬を脱保護できる活性化試薬からなる第二の試薬、および修飾されたホモシステインに特異的に結合できる第三の試薬、それぞれ少なくとも１回のアッセイを実施するのに十分な量をパッケージした組み合わせからなるキットを開示する。
【００１３】
本発明の様々なキットにおいては、第一の試薬はホスフェート保護基を有する保護されたハロケトンからなる。開示される様々な実施態様においては、キットに包含される保護されたハロケトンはＣＡＢＡまたはＢＡＢＡである。第一の試薬はさらにホモシステインジスルフィド還元剤から構成されていてもよい。それはさらに修飾されたホモシステインでコートされた固体マトリックスから構成されていてもよい。修飾されたホモシステインは、保護されたハロケトンの脱保護によって形成された産物であっても、脱保護されたハロケトンとサンプル中のホモシステインとの反応により形成された産物であってもよい。また、修飾されたホモシステインはホモシステインの４−カルボキシフェナシルチオエーテル（ｈｃｙ−ＡＢＡ）であってもよい。
【００１４】
他の様々な実施態様においては、固体マトリックスは、ラテックスビーズ、ガラスビーズ、マイクロタイタープレート、ニトロセルロース、アガロース、リポソーム等からなる。ホモシステインジスルフィド還元剤を包含する実施態様においては、その物質はホスフィンからなってもよい。本発明のキットに有用なホスフィンの一例はＴＣＥＰである。
【００１５】
本発明のキットの他の実施態様においては、第二の試薬はさらにホスファターゼからなる。一変形においては、ホスファターゼはアルカリホスファターゼである。他の変形には、さらに、第二の試薬が修飾されたホモシステインに特異的に結合できる受容体でコートされた固体マトリックスからなるキットを包含する。受容体は抗体または免疫学的に活性なそのフラグメントからなる。第二の試薬がさらに固体マトリックスからなる場合は、そのマトリックスはラテックスビーズ、ガラスビーズ、マイクロタイタープレート、ニトロセルロース、アガロース、リポソーム等からなる。
本発明の様々なキットにおいては、マトリックスはさらにそれに固定されたシグナリング物質を包含する。各種の有用なシグナリング物質には化学ルミネセンス物質、蛍光物質、色素原物質等を包含し、数種の例を挙げることができる。
【００１６】
他の実施態様においては、本発明は以下の工程：
（ａ）第一の分子を保護されたアルキル化試薬で標識し、
（ｂ）標識された第一の分子を、それに結合した１または２種以上の親核性の基を含有する第二の分子と混合し、
（ｃ）第一および第二の分子の混合物に酵素を添加してカップリング反応を開始させる各工程からなる分子接合体の製造方法を開示する。
【００１７】
一変形においては、第一の試薬はアミノもしくはヒドロキシル基を包含する。第一の分子は小分子でも大分子（またはポリマー）であってもよい。
様々な実施態様においては、第二の分子はスルフヒドリル基を含有する。第一の分子のように、第二の分子は小分子（たとえば、脂質または修飾された脂質）でも大分子（またはポリマー）であってもよい。第二の分子が大分子またはポリマーからなる実施態様においては、大分子またはポリマーはタンパク質、グリコタンパク質、リポポリサッカライド、リポタンパク質、修飾されたサッカライドおよび修飾された核酸分子からなる群より選択される。
【００１８】
本発明の方法に用いられる保護されたアルキル化試薬に関しては、その試薬は好ましくはハロケトンエノールホスフェートたとえばＣＡＢＡ（クロロアセチル安息香酸）エノールホスフェート、またはＢＡＢＡ（ブロモアセチル安息香酸）エノールホスフェートである。開示される方法の他の変形では、酵素はホスファターゼ、たとえばアルカリホスファターゼである。
【００１９】
本発明はまた、ホモシステインの含有が疑われるサンプル中のホモシステインの量を定量する方法において、以下の工程：
（ａ）水性メジウム中に
（１）サンプル
（２）ホモシステインのスルフヒドリル基を化学的に修飾して修飾されたホモシステインを形成する活性化可能な保護されたアルキル化試薬をからなる第一の試薬、および
（３）修飾されたホモシステインに特異的に結合して免疫複合体を形成できるリガンドからなる第二の試薬、および
（４）保護されたアルキル化試薬を活性化できる第三の試薬を一緒に取り、
（ｂ）サンプル中のホモシステインの量に相関する免疫複合体の量を測定する工程からなる方法を開示する。
【００２０】
一実施態様においては、第一の試薬はさらにホモシステインジスルフィド還元剤から構成されていてもよい。他の変形においては、保護されたアルキル化試薬はハロビニルエーテルまたはエステルである。好ましい一実施態様においては、ハリビニルエーテルまたはエステルがα−ハロケトンエノールホスフェートである場合が提供される。本発明による有用なα−ハロケトンエノールホスフェートにはＢＡＢＡエノールホスフェートおよびＣＡＢＡエノールホスフェートが包含される。
【００２１】
開示された他の変形においては、第三の試薬はホスファターゼ−たとえばアルカリホスファターゼである。その上、第一の試薬はさらにｈｃｙ−ＡＢＡでコートされた固体マトリックスおよび／または修飾されたホモシステインに結合できる受容体でコートされた固体マトリックスからなる。固体マトリックスを包含する実施態様においては、マトリックスはラテックスビーズ、ガラスビーズ、マイクロタイタープレート、ニトロセルロース、リポソーム、アガロース等からなる。さらに他の実施態様では、受容体は抗体または抗体の免疫学的に活性なフラグメントからなる群より選択される場合が開示される。
【００２２】
他の実施態様においては、本発明は、サンプル中のホモシステインの量を定量する方法においてホモシステインの少なくとも一部はジスルフィド型であり、以下の工程：
（ａ）次の各物質：
（１）サンプル
（２）ホモシステインをジスルフィド型から放出させる放出剤、
（３）ホモシステインのスルフヒドリル基を化学的に修飾して修飾されたホモシステインを形成して活性化することが可能な保護されたアルキル化試薬、および
（４）修飾されたホモシステインに特異的に結合して免疫複合体を形成できる受容体、および
（５）保護されたアルキル化試薬を脱保護できる活性化試薬からなる混合物を調製し、
（ｂ）サンプル中のホモシステインの量に相関する免疫複合体の量についてメジウムを調べる工程からなる方法を開示する。
【００２３】
開示された様々な実施態様によれば、放出剤はホスフィン（たとえばＴＣＥＰ）であり、保護されたアルキル化試薬はハロゲン化エノールホスフェートであり、受容体は抗体またはその免疫学的に活性なフラグメントであり、活性化試薬はホスファターゼからなる。
また、ハロケトンのリン酸化からなりその相当するエノールホスフェートを形成させる安定な保護されたハロケトンの製造方法も開示される。一実施態様においては、保護されたハロケトンはα−ハロケトンであり、本発明に有用な保護されたハロケトンの例はＢＡＢＡおよびＣＡＢＡである。
【００２４】
本発明はさらにハロケトンエノールホスフェートの製造方法において、以下の工程：
（ａ）４−アセチル安息香酸エチルエステルとハロゲン化化合物を反応させて、ハロゲン化アセチル安息香酸エステルを製造し、
（ｂ）そのエステルをジイソプロピルエチルアミンの存在下にＴＨＦ中でホスホリルクロリドによりリン酸化してエノールホスフェートを製造し、
（ｃ）エノールホスホリルエステルを水酸化ナトリウム水溶液で処理してエノールホスフェートエステルナトリウム塩を製造し、ついで
（ｄ）エノールホスフェートエステルナトリウム塩を水酸化ナトリウムで処理してハロビニルエノールホスフェート安息香酸ナトリウム塩を生成させる工程からなる方法を開示する。
【化２】
0004684511.tif 000002
【００２５】
一変形においては、ハロゲン化化合物はスルフヒドリルクロリドである。他の変法においては、ハロゲンはＣｌ、ＢｒおよびＩからなる群より選択される。したがって、一実施態様においてはハロケトンエノールホスフェートはＢＡＢＡエノールホスフェートであり、他の実施態様においてはハロケトンエノールホスフェートはＣＡＢＡエノールホスフェートである。
本発明はまた、ホモシステインが試薬によって修飾されたサンプル中のホモシステインの量を定量する方法において、改良は試薬に対する前駆体および前駆体を試薬に変換できる酵素を提供することからなる方法を開示する。一変形においては、前駆体は保護されたアルキル化試薬であり、酵素は保護されたアルキル化試薬を脱保護できる。他の実施態様においては、試薬はα−ハロケトンであり、前駆体はα−ハロケトンのエノ−ルエステルである。一変形では、エノールエステルはエノールホスフェートであり、酵素はホスファターゼである。
【００２６】
本発明はまた、アルキル化試薬を水性メジウム中に放出させる方法において、水性溶液中にα−ハロケトンのエノ−ルエーテル、α−ハロケトンのエノ−ルエステル、γ−ハロ−α,β−不飽和ケトンまたはγ−ハロ−α,β−不飽和ケトンのエノールエステル、およびエノールエーテルまたはエステルを加水分解することができる酵素を混合することからなる方法が開示される。
一変形では、エノールエステルはエノールホスフェートであり、酵素はホスファターゼである。他の実施態様においては、水性溶液はさらに、混合工程についでアルキル化される化合物からなる。
【００２７】
さらに、水性溶液中でメルカプタンをアルキル化する方法において、メルカプタンをα−ハロケトンのエノ−ルエーテルまたはγ−ハロ−α,β−不飽和ケトンエノールエステル、およびエノールエステルを加水分解することができる酵素を混合することからなる方法が開示される。
【００２８】
本発明はまた、以下の式：
【化３】
0004684511.tif 000003
（式中、Ｒ1およびＲ2はアルキル、アリールまたは置換されたアルキルもしくはアリールであり、ＸはＣｌ、ＢｒまたはＩであり、Ｙは酵素によって除去できる保護基である）で表される保護されたハロケトンを開示する。
【００２９】
一実施態様においては、Ｒ1は−Ｃ6Ｈ4ＣＯＯＨであり、Ｒ2はＨであり、ＸはＢｒであり、Ｙは−ＰＯ3Ｈ2である。他の実施態様はＺがＨまたはＮＨ2である場合を開示する。また、Ｚはタンパク質、ポリペプチド、オリゴヌクレオチド、ポリサッカライドおよび脂質からなる群より選択される。開示される実施態様の一変形においては、酵素はアルカリホスファターゼである。
【００３０】
【発明の詳述】
α−ハロケトンは今回、それらの相当するエノールホスフェートに変換することによって保護できることが示された。エノールホスフェートは水溶液中で安定であるが、ホスファターゼたとえばアルカリホスファターゼの添加によって迅速に遊離のα−ハロケトンに変換することができる。α−ハロケトンエノールホスフェートは、他の場合には不飽和α−ハロケトンと反応する親核性試薬の存在下に保存できることが見いだされた。本発明の様々な実施態様のさらに詳細な説明を進める前に、一部の役に立つ定義を提供することは助けになるものと考えられる。以下は例示を意図するものであって、本発明を限定するものではない。
【００３１】
定義
本明細書で使用される「アナライト」の語は検出される化合物または組成物を意味する。アナライトは、特異的結合ペア（「ｓｂｐ」）のメンバーであり、１価（モノエピトーピック）または多価（ポリエピトーピック）のリガンドであり、通常、抗原性またはハプテン性であり、単一の化合物または少なくとも１つの共通のエピトープまたは決定部位を有する多重化合物である。
【００３２】
本発明はとくに、アナライトの同族体も含有するサンプル中のアナライトを、アナライトおよびその同族体を化学的に修飾し、ついで修飾されたアナライトを検出する様々な方法に有用である。したがって、アナライトは、興味あるアナライトがサンプル中に存在する場合にのみその存在が検出される反応産物を検出することにより検出される（すなわち、「修飾された」アナライトがアッセイ中に検出される。アナライトは、たとえば宿主からの体液、たとえば尿、血液、血漿、血清、唾液、精液、糞、痰、脳脊髄液、涙、粘液等のサンプル中好ましくは血清または血漿に直接見いだされるる。サンプルは以下に述べるように前処理される。
【００３３】
特異的結合ペアのメンバー（「ｓｂｐ」メンバー）：本明細書に用いられるこれらの語は、その表面または腔部に他の分子と互いに結合する領域を有し、したがって他の分子の特定の空間的または極性的実態と相補性と定義される２つの異なる分子の一方を意味する。ｓｂｐのメンバーはリガンドおよび受容体（またはアンチリガンド）たとえば免疫学的ペアたとえば抗原−抗体のメンバーを意味することが可能で、またそれらはオペレーター：リプレッサー、ヌクレアーゼ：ヌクレオチド、ビオチン：アビジン、ホルモン：ホルモン受容体、核酸二重鎖、ＩｇＧ：プロテインＡ、ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ等であってもよい。
【００３４】
本明細書で用いられる「リガンド」の語は、それに対する受容体が天然に存在するか、または調製できる任意の化合物を意味する。
本明細書で用いられる「受容体」の語は、分子の特定の空間的または極性的実態、すなわちエピトープまたは決定部位を認識することができる任意の化合物または組成物を意味する。相補性のｓｂｐメンバーはたとえばリガンドとその相補性受容体のように互いに結合する。ｓｂｐメンバーは、たとえば抗原および抗体のように免疫学的ペアでも、アビジンとビオチンのような非免疫学的ペアでも、またオリゴヌクレオチドの相補性の鎖であってもよい。ｓｂｐメンバーはまた小分子または小分子の残基およびそれらの受容体であってもよい。受容体の例には天然に存在する受容体（たとえば、サイロキシン結合グロブリン、抗体、酵素、Ｆａｂフラグメント、レクチン、核酸、リプレッサー、プロテクチン酵素、プロテインＡ、ＤＮＡ結合タンパク質等）が包含される。
【００３５】
「支持体」、「マトリックス」または「固相」の語は本明細書においては互いに同義に用いられ、多くの形状たとえばストリップ、ロッド、粒子、スラブ、スライド、様々の形状および外観を有するビーズ等、任意の非多孔性または多孔性表面を意図するものである。典型的な支持体表面にはガラスまたはプラスチックビーズ、ラテックスまたはセルロース粒子、ガラスまたはセルロースフィルターペーパー、ニトロセルロース膜、ポリスチレンプレート、磁性粒子、プラスチックチューブまたは容器等が包含される。マトリックスは、分子が非拡散性に結合可能で、リガンドのメジウムに溶解またはそれと不都合に反応しない慣用の材料で作成される。多くの場合支持体は、たとえばポリスチレン、ポリカルボネート、ポリアクリレート、ポリ塩化ビニル、ポリウレタン、テフロン等のプラスチックである。また、マトリックスは本質が金属でもよく、たとえばスチール、ニッケル、銅または金である。支持体はまた、たとえばガラス、石英等のようなセラミック材料から作成されてもよい。支持体またはマトリックスがビーズから構成される場合は、ビーズは一般に一定のほぼ均一なサイズを有し、好ましくは直径が約０.２〜２.５μｍであり、適用に応じて粗いかまたは平滑な表面を有する。
【００３６】
多くの好ましい実施態様においては、表面は好ましくは平滑である。ビーズは好ましくは円形または楕円形であり、通常ほぼ球状で、表面は非特異的な結合を最小にする性質を有する。本発明のアッセイに用いられる場合、支持体は分子−たとえばリガンド、受容体、またはより一般的には、特異的結合ペアのメンバーに結合している。適当な材料は本技術分野で周知であり、たとえばUllmanらの米国特許５,１８５,２４３（たとえば１０〜１１欄参照）に記載されている。したがって、上記特許の開示は引用により本明細書に導入される。同様に、支持体または表面へのｓｂｐメンバーの結合はよく知られた技術であって、一般的に文献から利用される。たとえば、Chibata, “Immobilized Enzyme,”Halsted Press, New York, 1978およびCuatrecasas, J.Biol. Chem. 245: 3059, 1970参照。
【００３７】
用いられた固体支持体のタイプに依存してその表面へのタンパク質、リガンドまたは受容体の結合を提供するために、タンパク質、リガンドまたは受容体の機能に干渉することなく、前処理が要求される。たとえば、アビジンまたはストレプトアビジンを０.５〜１.５μmの球状ガラスビーズに共有結合させて、ビオチン抗体の捕捉に使用することができる。
【００３８】
本明細書で使用される「イムノコンプレックス」または「免疫複合体」の語は抗原の抗体への免疫学的結合によって形成される複合体を意味する。
本明細書で使用されるシグナル産生システム（「ｓｐｓ」）の語は１または２以上の成分からなり、その少なくとも一方の成分は結合および／または非結合標識の量に関係する検知可能なシグナルを発生す標識である成分を意味する。好ましくは、標識は、酵素活性、ルミネセンス、蛍光、光の吸収、放射能またはある種の可視シグナルの観察によって検出される染料、フルオレッサー、放射性標識、酵素、化学ルミネサーまたはフォトセンシタイザーである。とくに有用なシステムは光活性化化学ルミネセンス標識を使用するシステムであり、これについては以下のＣ項でさらに詳細に説明する。しかしながら、本発明はここに記載された例示的なシステムに限定されるものではないことを理解すべきである。
【００３９】
適当な標識には、限定ではなく例示的に、酵素たとえばアルカリホスファターゼおよび西洋ワサビペルオキシダーゼ；レプリカーゼたとえばＱＢレプリカーゼの基質；プロモーター；染料；フルオレッサーたとえばフルオレセイン、ローダミン化合物、フィコエリスリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒドおよびフルオレスカミン；補酵素；酵素基質；放射性標識たとえば125Ｉ、131Ｉ、14Ｃ、3Ｈ、32Ｐおよび35Ｓ；粒子たとえばラテックスまたは炭素粒子；金属ゾル；クリスタライト；リポソーム；細胞等が包含され、それらはそのままでもまたさらに染料、触媒もしくは他の検出可能な基等で標識されてもよい。適当な酵素および補酵素は、Litmanら、米国特許4,275,149, 19〜28欄およびBoguslaskiら、米国特許4,318,980, 10〜14欄に、適当なフルオレッサーおよび化学ルミネサーは、Litmanら、米国特許4,275,149, 30〜31欄に開示されている。とくに有用な光活性化化学ルミネセンス標識ならびにそれらの製造および使用方法はUllmanらの米国特許5,340,716 に開示されている（上述の開示は引用によりすべて本明細書に導入される）。
【００４０】
本明細書で用いられる「粒子」の語は、直径少なくとも約２０nmで約２０μを越えず、通常少なくとも約４０nmで約１０μを越えず、好ましくは約０.１０〜２.０μ、通常は１ピコリットルの容積を有する。粒子は有機または無機の、膨潤性または非膨潤性、多孔性または非多孔性で、任意の密度を有するが、好ましくは水とほぼ等しい密度、一般的には約０.７〜約１.５ｇ／mlであり、好ましくは水中に懸濁が可能であり、透明、半透明または不透明な材料から構成される。粒子は荷電していてもしていなくてもよく、荷電している場合は陰性である。粒子は固体（たとえば、ポリマー、金属、ガラス、有機または無機物たとえばミネラル、塩および珪藻類）、油滴（たとえば炭化水素、フルオロカーボン、シリコン液体）または小胞（たとえば合成小胞たとえばリン脂質または天然の小胞たとえば細胞およびオルガネラ）である。粒子にはラテックスまたは合成もしくは天然の材料、有機または無機ポリマー；脂質二重層（たとえばリポソーム、リン脂質および非リン脂質小胞）；油滴、シリコン粒子；金属ゾル、細胞；および染料結晶が包含される。
【００４１】
有機粒子は通常、ポリマー、アッセイメジウムに容易に分散する付加または縮合ポリマーのいずれかである。有機粒子はまた、それらの表面でｓｂｐメンバーに直接または間接的に結合するように、およびそれらの表面で染料たとえばフルオレッサー、フォトセンシタイザー、または光化学的に活性化された化学ルミネサー化合物に結合するかまたはそれらの内部に導入される、好ましくは吸着可能または機能化可能な粒子である。
【００４２】
粒子は天然に存在する材料、合成的に修飾された天然に存在する材料、および合成材料から誘導することができる。天然のまたは合成のアッセンブリーが好ましい。とくに興味がある有機ポリマーには、ポリサッカライド、とくに架橋したポリサッカライド、たとえばアガロース（Sepharoseとして入手可能）、デキストラン（SepadexおよびSephacrylとして入手可能）、セルロース、デンプン等；付加ポリマーたとえばポリスチレン、ポリアクリルアミド、アクリル酸およびメタクリル酸のホモポリマーおよびコポリマー、とくに遊離ヒドロキシル基を有するエステルおよびアミドたとえばヒドロゲル等がある。無機ポリマーには、シリコン、Biogelとして入手できるガラス等がある。ゾルには金、セレンおよび他の金属が包含される。粒子はまた、水不溶性染料たとえば、フォトセンシタイザーとしても作用するポルフィリン、フタロシアニン等に分散してもよい。粒子にはまた、珪藻類、細胞、ウイルス粒子、マグネトソーム、細胞核等が包含される。粒子が市販品を入手できる場合には、粒子サイズは機械的手段、たとえば粉砕、超音波処理、撹乱等により大きな粒子を小さな粒子に破砕することによって変動させることができる。
【００４３】
粒子は通常、多機能性もしくは多機能化可能であるか、またはｓｂｐメンバー、フォトセンシタイザーまたは化学的に活性化可能な化学ルミネセンス化合物に特異的または非特異的な共有結合または非共有結合的相互作用によって結合できる。広範囲の官能基が利用または導入できる。官能基の例には、カルボン酸、アルデヒド、アミノ基、シアノ基、エチレン基、ヒドロキシル基、メルカプト基等が包含される。粒子へのｓｂｐメンバー、化学ルミネセンス化合物またはフォトセンシタイザーの共有結合が用いられる場合は、連結様式は周知であり文献中に豊富に例示されている。たとえば、Cuatrecasas, J.Biol. Chem. 245: 3059, 1970 参照。架橋基の長さは、架橋される化合物の性質、粒子の性質、架橋される化合物とｓｂｐメンバーおよびアナライト等の結合上の粒子との距離の効果に依存して広範囲に変動される。
【００４４】
粒子および他のマトリックス材料はまた標識手段によってタッグされてもよい。たとえば米国特許5,709,994（その開示は引用により、本明細書に導入される）には、フォトセンシタイザーおよび／または化学ルミネセンスおよび／またはエネルギーアクセプター化合物によりタッグされた粒子の製造方法が記載されている（たとえば、米国特許5,709,994の実施例１〜２参照）。
【００４５】
標識に、外部手段たとえば可視的検査、電磁線照射、電気化学的検出、光音響分光法等によって検出できるシグナルを産生させることができる方法は多い。標識および他のｓｐｓメンバーはまた、ｓｂｐメンバー、他の分子または支持体に結合させることができる。標識は直接シグナルを産生することが可能であり、したがってシグナルを産生するために付加的成分を要しない。多くの有機分子たとえばフルオレッサーは紫外線および可視光線を吸収することが可能で、この場合、光の吸収がこれらの分子へエネルギーを伝達し、それらを励起したエネルギー状態に上昇させる。この吸着されたエネルギーはついで第二の波長における光の放出によって消費される。直接シグナルを産生する他の標識には放射性同位元素および染料が包含される。
【００４６】
また、標識はシグナルを産生するために他の成分を必要とし、そのｓｐｓは、したがって測定可能なシグナルを産生するために要求されるすべての成分を包含することになる。これには基質、補酵素、エンハンサー、付加的な酵素、酵素産物と反応する物質、触媒、アクティベーター、コファクター、インヒビター、スカベンジャー、金属イオン、シグナル発生物質の結合に要求される物質等が包含される。適当なシグナル産生システムについての詳細な議論はUllmanらの米国特許5,185,243の11〜13欄に見いだされる。これは引用により本明細書に導入される。
【００４７】
標識は多くのｓｂｐメンバー：修飾されたアナライトに結合する抗体；修飾されたアナライトに結合する抗体の受容体；修飾されたアナライトに結合する抗体に接合する小分子に結合できる受容体；またはリガンド、とくに修飾されたアナライトの同族体に共有結合により結合することができる。標識のｓｂｐメンバーへの結合は標識の水素原子をｓｂｐメンバーへの結合と置換する化学反応によって達成されるか、または標識とｓｂｐメンバーの間の連結基を包含してもよい。他のｓｐｓメンバーはまたｓｂｐメンバーと共有結合により結合する。たとえば、２つのｓｐｓメンバー、フルオレッサーおよびクエンチャーはそれぞれ、修飾されたアナライトの同族体およびその同族体と複合体を形成するアナライトの抗体に結合することができる。複合体の形成はフルオレッサーとクエンチャーをきわめて接近した位置にもってきて、クエンチャーのフルオレッサーとの相互作用を可能にし、シグナルが消光される。
【００４８】
接合方法は本技術分野でよく知られている。たとえば、Rubensteinら、米国特許3,817,837参照。これは引用により本明細書に導入される。本発明はまた、抗体をシグナル産生システムの第一のメンバーおよびシグナル産生システムの第二のメンバーとしての検出可能な標識に結合させることを意図する。たとえば、検出可能な標識がアナライト同族体に結合した場合、抗体のその同族体への結合の程度を、シグナル産生システムのメンバーの相互作用によって産生するシグナルを検出することにより測定することができる。
【００４９】
補助材料：本発明の方法には、しばしば様々な保持材料が使用される。たとえば通常、緩衝液を通常アッセイメジウム中に存在させ、またアッセイメジウムおよびアッセイ成分の安定化のために安定剤を存在させる。これらの添加物に加えて、多くの場合、タンパク質たとえばアルブミン、有機溶媒たとえばホルムアミド、四級アンモニウム塩、ポリカチオンたとえばデキストラン硫酸、または界面活性剤とくに非イオン界面活性剤、結合エンハンサーたとえばポリアルキレングリコール等が包含される。
【００５０】
本明細書で使用されるアルキル化試薬には、α−ハロケトン、α−ハロアルデヒド、γ−ハロ−α,β−不飽和ケトンおよびγ−ハロ−α,β−不飽和α−ハロアルデヒドが包含される。これらの試薬はスルフフィドリル、アミノ、およびヒドロキシル基と反応することができる。ホモシステイン（ｈｃｙ）のために使用されるアルキル化試薬はｈｃｙのスルフフィドリル基と反応する。本発明のアルキル化試薬はまた、式：ＹＲ1Ｃ(ＣＲ3＝ＣＲ4)n-ＣＯＲ2（式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3またはＲ4は独立に水素（Ｈ）、アルキルまたはアリールであり、両者で環を形成し、ｎは０または１であり、Ｙ発明のＣl、ＢrまたはＩである）を有していてもよい。
【００５１】
本明細書で使用されるアルキルは、脂肪族炭化水素からＨ原子１個を除去して誘導される１価の分岐状または非分岐状のラジカルを意味し、低級アルキルおよび高級アルキルの両者を包含する。
本明細書で使用される低級アルキルは、１〜５個の炭素原子を含有するアルキルを意味し、たとえばメチル、エチル、プロピル、ブチル、イソプロピル、イソブチル、ペンチル、イソペンチル等である。
【００５２】
本明細書で使用される高級アルキルは６個以上の炭素原子、通常は６〜２０個の炭素原子を含有するアルキルを意味し、たとえばヘキシル、ヘプチル、オクチル等である。
本明細書で用いられるアリールは、芳香族炭化水素から１個の原子を除去して誘導される有機ラジカルであり、１個または２個以上の芳香環、通常は１〜４個の芳香環、たとえばフェニル（ベンゼンから）、ナフチル（ナフタレンから）を含有する。
【００５３】
本明細書で用いられるアラールキルは、アリール基が結合したアルキル基を有する有機ラジカル、たとえばベンジル、フェナチル、３−フェニルプロピル、１−ナフチルエチル等である。
本明細書で用いられる置換の語は、分子の水素原子が単一の原子であるたとえばハロゲン等のような他の原子、または機能性を形成する原子群の部分、たとえば原子は炭素、酸素、窒素、硫黄およびリンからなる群より独立に選択され、また１または２個以上の金属原子に結合していてもよい、１〜５０００個の原子（このような原子の原子価を満たすのに必要な必須水素原子以外の）を有する置換基によって置き換えられていることを意味する。
【００５４】
「小分子」、また本明細書において小有機分子（すなわちそれらが有機または有機金属基を含む場合）、アナライトまたはハプテンとして同定される分子は、分子量、約２,０００未満、さらに好ましくは約１,５００まで、さらに好ましくは約１,０００までを有するものである。様々の好ましい実施態様においては、小分子は少なくとも約１００、好ましくは２００以上、さらに好ましくは２５０またはそれ以上の分子量を有する。
【００５５】
本明細書に開示される有用な多くの小分子は、分子量１００〜２０００、好ましくは１５０〜１０００を有し、相当する小分子に特異的な受容体が存在するかまたは調製できる。小分子の例にはビオチン誘導体、リゼルギン酸、フルオレセインまたはフルオレセイン誘導体およびビタミンＢ12が包含され、それぞれの相当する受容体はアビジンまたはストレプトアビジン、抗リゼルギン酸、抗フルオレセインおよび内因子である。小分子に対する抗体は小分子を免疫原性担体に連結することによって製造できる。本明細書において使用される「小分子」の語には、米国特許5,340,176および5,709,994にたとえば記載および例示された薬物、代謝物、殺虫剤、汚染物等が包含される。この開示は引用により本明細書に導入される。
【００５６】
「ポリマー」または本明細書において「大分子」または「高分子量（ＨＭＷ）分子」と同定される分子には、様々な分子たとえばタンパク質、オリゴヌクレオチド、脂質、炭水化物、リポポリサッカライド、グリコタンパク質等が包含される。ポリマーたとえば受容体アナライトの分子量は一般に約１０,０００〜２×１０8の範囲，さらに通常には約１０,０００〜１０6の範囲である。免疫グロブリン、たとえばＩgＡ、ＩgＧ、ＩgＥおよびＩgＭでは分子量は一般に約１６０,０００から１０6の範囲を変動する。酵素の分子量は一般に約１０,０００〜１,０００,０００であるが、１０,０００未満または１,０００,０００の分子量を越える酵素も稀ではない。天然の受容体および結合分子の分子量はそれらの合成バージョンおよび模倣体と同様きわめて広範囲に変動し、一般にそれらの範囲は約２５,０００〜１０6およびそれ以上である。受容体／結合分子たとえばアビジン、ＤＮＡ、ＲＮＡ、サイロキシン、結合グロブリン、サイロキシン結合プレアルブミン、トランスコルチン、レクチン、プロテインＡ、補体成分等にはこのようなＨＭＷの少ない例である。
【００５７】
水溶液中で２つの分子をカップリングさせるために有用なアルキル化試薬は、試薬を興味ある分子の一つに接合させるのに適当な基をもたなければならない。他の分子は親核性の基、たとえばＯＨ、ＳＨもしくはアミンを有するか、またはこのような基を包含するように修飾されなければならない。２つの分子は、試薬に接合させる分子、親核性の基を有する分子および活性化物質を混合することによってカップリングさせる。
【００５８】
本明細書において使用される「活性化試薬」の語は、触媒、通常は生物触媒、好ましくは酵素、リボザイムまたは触媒性抗体を意味する。様々な実施態様においては、好ましい活性化試薬には酵素たとえばヒドロラーゼが包含され、ホスファターゼ、ホスホジエステラーゼ、グリコシダーゼおよび他のエステラーゼが含まれる。
【００５９】
以下の式
【化４】
0004684511.tif 000004
によって構成される保護されたアルキル化試薬を以下に例示する。このような保護されたアルキル化試薬の脱保護に有用な活性化試薬または酵素はまた、以下のチャートに掲げる。
【００６０】
【表１】
0004684511.tif 000005
【００６１】
【詳細な記述】
Ａ．保護試薬の調製
前述のように、多数の保護基が本発明に使用される保護された試薬の調製に有用である。たとえば、適当な保護基には、カルボン酸、炭水化物、核酸、脂質、ホスフェート等のエステルもしくはエーテルが包含される。このような保護基の除去に有用な酵素としては、したがって、エステラーゼ、グリコシダーゼ、ヌクレアーゼ、リボザイム、リパーゼ、ヒドロキシラーゼおよびホスファターゼが包含される。
【００６２】
有用な保護基には、エステル、好ましくは緩和な条件下に−たとえば酵素を用いて−容易に除去できるエステルを使用することができる。エステル保護基の例には、ホルメート、ベンゾイルホルメート、アセテート、置換アセテート、プロピオネート、イソブチレート、レブリネート、クロトネート、ベンゾエート、ナフトエート、および多くの他のエステルが包含される（たとえば、Greene, T.W.,Protective Groups in Organic Chemistry, John Wiley & Sons, New York,1981参照）。同様に広範囲の炭水化物が単純な糖からポリサッカライドまで、適当な酵素の使用を介して特異的に除去できる保護基として用いることができる。本技術分野の熟練者には、修飾された保護基−たとえばエステル、炭水化物等ならびに他の残基からなる分子もまた本発明の関係する範囲内で保護基として使用できることは自明の通りである。
【００６３】
すなわち、ホスフェート基はここに保護基の例として記載したが、それらは正確には本発明の関係内で有用な分子の例であることを理解すべきである。本発明の一変形においては、ＢＡＢＡおよびＣＡＢＡのエノールホスフェート誘導体が小分子および大分子の接合、ならびにアッセイの関連で様々なアナライトの検出を含む様々な適用にとくに有用であることが見いだされている。後者の例には、ホモシステイン（hcy）のアッセイがある。
【００６４】
たとえば、ＢＡＢＡは血清および血漿ホモシステインの識別および抗体認識のためのアルキル化試薬として使用されることが多い。ホモシステインは栄養評価、心脈管系の危険および新生児ホモシステイン尿症のマーカーである。ＢＡＢＡ−ホスフェート、「ｐｒｏ−ＢＡＢＡ」はＢＡＢＡに比較していくつかの利点がある。ＢＡＢＡは生理学的ｐＨ以上で保存した場合、安定性に限界があり、低いｐＨでは溶解度に限界がある。ＢＡＢＡ−ホスフェートは高いｐＨで有意に高い安定性を有し、広いｐＨ範囲で溶解度が高い。それは２成分系において試薬との適合性の可能性を有するという付加的な利点がある。ＣＡＢＡホスフェートも同様に挙動し、製造が容易である。ＣＡＢＡホスフェートおよびＢＡＢＡホスフェートはアルカリホスファターゼによって容易に脱保護される。
【００６５】
ＢＡＢＡの化学的構造およびそれと密接な関係があるホスフェート保護型の構造を以下に例示する。第一の構造におけるＢrをＣlで置換するとＣＡＢＡの構造が産生され、同様に第二の構造のＣlをＢrに置換するとＢＡＢＡホスフェートの構造が産生される。
【化５】
0004684511.tif 000006
【００６６】
ＣＡＢＡおよびＢＡＢＡはシステイン（ｃｙｓ）およびホモシステインのスルフヒドリル基をアルキル化する。アルキル化システインのアミノ基はＣＡＢＡまたはＢＡＢＡによって導入されるケトンと内部で反応して環状構造を与えるが、アルキル化されたホモシステインでは反応しない。ＢＡＢＡおよびＣＡＢＡの製造方法は本技術分野で入手できる。たとえば、米国特許5,478,729（たとえば、２１〜２２欄）参照。その関連する開示は引用により本明細書に導入される。
【００６７】
アルキル化されたホモシステインに対する抗体（ｈｃｙ−ＡＢＡ）は環状アルキル化システイン（ｃｙｓ−ＡＢＡ）からｈｃｙ−ＡＢＡを識別するので、これらの抗体を用いる hcy のイムノアッセイはシステインの存在下にも正確な結果を与える。これに反し、前もってアルキル化を行わないで、ｈｃｙに対する抗体を用いるｈｃｙのイムノアッセイではこれらの２つの同族アミノ酸は識別できない。
【００６８】
ＢＡＢＡおよびＣＡＢＡには維持が重要な各種機能性の設計を導入する。たとえば、以下の機能性が重要である。１）ハロアシル基はチオールと速い反応速度を有する；２）フェニル環は免疫システムに提供された場合、高度に免疫原性の残基を提供する；３）カルボキシレートはある程度の水溶性ならびに免疫原の調製のための担体タンパク質への慣用の結合点を提供する；および４）ハロアセチル基のカルボニルはシステインおよびホモシステイン付加物の間を識別する慣用の手段を提供する。
【００６９】
安定性および溶解度を上昇させる一方、上述の性質のすべてを維持するためには、保護された型のＢＡＢＡおよびＣＡＢＡ（たとえば、「ｐｒｏ−ＢＡＢＡおよび「ｐｒｏ−ＣＡＢＡ」）は本発明の態様である。ＢＡＢＡおよびＣＡＢＡのエノールホスフェート誘導体（ｐｒｏ−ＢＡＢＡおよびｐｒｏ−ＣＡＢＡ）の使用はこれらの利益を提供し、これらの誘導体はアッセイの実施の過程においてアルカリホスファターゼによって容易に脱保護されてＢＡＢＡおよびＣＡＢＡを与える。
【００７０】
ｐｒｏ−ＢＡＢＡまたはｐｒｏ−ＣＡＢＡの使用は、更なる利点、他の場合には不適合性の試薬を混合する能力を提供し、したがって、わずかな付加工程によりアッセイの実施を可能にする。たとえば、保護されていないＢＡＢＡでのアッセイはサンプルを放出剤と混合してｈｃｙジスルフィドの還元を要求する。ＢＡＢＡをついで、抗原試薬および抗体試薬と一緒に添加する。ｐｒｏ−ＢＡＢＡまたはｐｒｏ−ＣＡＢＡを使用する場合は、放出剤およびｐｒｏ−ＢＡＢＡまたはｐｒｏ−ＣＡＢＡは第一の試薬としての抗原と混合し、アルカリホスファターゼは第二の試薬としての抗体とともに混合することができる。これにより、アッセイ試薬の数を３から２に減じることができる。
【００７１】
エノールホスフェートは合成が難しいと報告されてきたが（たとえばKearney & Valentino, Pharm. Res. 9: 3789, 1992 参照）、本発明者はそれらをきわめて成功裡に合成することができた。たとえばＣＡＢＡ−ホスフェートは４０ｇのスケールにおいて良好な総収率で成功裡に調製される。以下の合成スキーム（スキームＡ参照）を参照しながら説明すれば（本文中のボールド体の数はスキーム中に示す構造に相当する）、市販品を入手できるの４−アセチル安息香酸エチルエステル（１，１９７mmol）を選択的にモノクロル化する（たとえばRogicら, J.Org. Chem. 46: 4486-9, 1981参照）と、７８％の収率において９９％の純度（核磁気共鳴（ＮＭＲ）分析を使用して定量：スキームＡ参照）の生成物が得られる。ＢＡＢＡのビニルブロミドのエノールホスフェート同族体を得るためにブロム化を使用する場合は、リン酸化工程の間に臭素の塩素による部分的もしくは完全な置換を行う。塩素誘導体は光活性化化学ルミネセンス標識を用いるアッセイにおいて臭素誘導体と同様に効率的な誘導体を提供する。塩素誘導体に基づく合成は明らかに、より再現性がある。
【００７２】
１．材料
すべての試薬は試薬特級で、使用前ナトリウムから新たに蒸留したＴＨＦおよび３Åのシーブ上で乾燥したジイソプロピルエチルアミンを除いて、さらに精製することなく使用する。シリカゲル２５０分析用プレートはAnaltech（Newark，DE）から入手する。1Ｈ−ＮＭＲはAldrich（Milwaukee, WI）から入手した重水素化溶媒を用いて、Bruker 250 ＭＨz スペクトロメーターで記録する。ＵＶスペクトルは Packard 8452型ダイオードアレイスペクトロフォトメーターで測定する。すべての反応はアルゴン雰囲気下に行う。元素分析、マススペクトル、およびＮＭＲスペクトル（1Ｈ，31Ｐ）は実験室内または業者−たとえばBerkeley Labsで実施する。
【００７３】
【化６】
0004684511.tif 000007
【００７４】
【化７】
0004684511.tif 000008
【００７５】
２．合成（スキームＡ：合成参照）
ａ．４−（クロロアセチル）安息香酸エチルエステル（２）の調製
４−アセチル安息香酸エチルエステル（Aldrich ９９％，３７.８７ｇ, １９７mmol）を３５０mLのＣＣl4に溶解し、これに１１.３mL（１９７mmol）の無水エタノールを加える。５０mLのＣＣl4中スルフリルクロリド（２０mL, ２３６mol）を２０分を要して滴下する。３０分後、発泡が止んだならば、反応をＮＭＲおよび薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）でチェックする（ＮＭＲによる置換比は２％ジクロロ：７４％モノクロロ：２４％（１）である。さらに２０分間５０℃に加熱しても、比は変化しなかった。ＴＬＣ：５×２０ ＳiＯ2：（１：３）４％ ＭeＯＨ／ＣＨ2Ｃl2−ヘキサン）。
【００７６】
さらに２０mLのＣＣl4中スルフリルクロリド（６.０mL, ７１mol）を滴下する。２０分に後発泡は停止する（ＮＭＲ比は７.５％ジクロロ：９２％モノクロロ：０.５％（１）である。さらに１５分後、反応液を５００mLのよく撹拌した飽和ＮaＨＣＯ3水溶液中に徐々に注ぎ、１００mLのＣＨ2Ｃl2で濯いだ（未成熟な結晶化を防止するため）。反応液を発泡が停止するまで撹拌する（ｐＨ＝８）。相を分離し、有機相を１回５００mLの水で洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥し、濃縮乾固する。
【００７７】
固体を２００mLの無水エタノールに８０℃で再溶解する（後処理生成物の結晶化前のＮＭＲ比は８.０％ジクロロ：９２％モノクロロ：０.０％（１，スキームＡ）である）。３時間常温で結晶化させたのち、生成物をろ過し、５０mLのフリーザーで冷却したエタノールで洗浄し、乾燥（０.１mmHg）すると、２５.５ｇ の第一の結晶が生成する。ろ液を約１００mLに濃縮し、フリーザー中で２時間冷却する。第二の結晶を２回、２５mL部のフリーザーで冷却したエタノールで洗浄し、乾燥する（１mmHg）と、７.４ｇの第二の結晶が得られる。
合わせた結晶（ＮＭＲにより９９％純度のモノクロロ生成物）をそのまま次の工程に使用する。第三の結晶（１.９ｇ, ＴＣＲにより純粋）も収集される。３つの結晶（３４.８ｇ, １５４mmol）を合わせた収率は７８％である。
【００７８】
ｂ．４−（クロロアセチル）安息香酸エノールホスフェートナトリウム塩（３，スキームＡ）（ＣＡＢＡ−ホスフェート）の調製
４−（クロロアセチル）安息香酸エチルエステル（２，スキームＡ)(３２.１５ｇ，１４１.８mmol）を４００mLのＴＨＦに溶解する。この無色澄明な溶液にジイソプロピルエチルアミン（８６mL, ４９６mmol）を加える。得られた澄明な淡い帯緑黄色の溶液にアルゴンを２分間通じ、氷浴中で内部温度が１０℃未満になるまで撹拌する。ＴＨＦ ５０mLに溶解したＰＯＣl3（３３mL, ３５５mmol）を温度が１０℃を越えないような速度で滴下して加える（１.５時間）。反応液を一夜放置して常温まで加温する。白色結晶（アミン塩酸塩）をろ過して除き、ろ液中にＴＨＦ １００mLで洗浄する（結晶を乾燥し秤量する。純粋なアミン−ＨＣl 塩の重量（１８.７１ｇ）を使用して、加水分解工程において加えるＮaＯＨ量の計算を調整する）。
【００７９】
澄明な橙色のろ液を７２０mLの氷浴で冷却し、アルゴンで洗浄した２.５０ＮのＮａＯＨ（１８００mmol）水溶液に反応温度が１５℃を越えないような速度で（１.５時間）滴下して加える（ＮａＯＨの量は、用いた５×３５５mmol ＰＯＣｌ3＋加水分解のための１４２mmolエステル−ろ過によって除去された１１３mmol アミン−ＨＣｌ塩に基づいている）。反応液を放置して一夜、常温まで加温する。ろ過によって除去した無機塩を、ろ液中にＴＨＦ １００mL部で２回洗浄する（これらの塩は標準とＵＶで比較してわずかに痕跡量の生成物を含有する）。２相のろ液を分離し、水相を１５０mL部のＴＨＦで抽出する。合わせたＴＨＦ相は捨てる（この有機相は濃縮固体のＮＭＲ分析により１ｇ未満の生成物を含むと計算される）。
【００８０】
水相のｐＨを２５mLの２.５Ｎ ＮａＯＨで１０.９〜１２.５に調整し、残ったエステルを加水分解するために、この溶液を一夜撹拌する（非加水分解エステルの量はＮＭＲにより２４％と評価される）。淡黄色の溶液（ｐＨ １１.８）を４０℃で濃縮乾固し、残った有機溶媒およびジイソプロピルエチルアミンの痕跡を除去する。残留物（１１０ｇ）を５０℃で水 １７０mLに再溶解し、常温に冷却し、９０mLの３Ｎ ＨＣｌを滴下して加えてｐＨを３.０に調整する。クリーム状の白色懸濁液を２時間冷蔵庫に入れ、ろ過する。ろ塊を２回１００mL部の氷水で洗浄し、一定の重量になるまで乾燥する（０.１mmHg）。このｐＨでは沈殿はまだかなり水溶性であるので、使用する水は最小限に保持しなければならない。標記生成物は乾燥し、粉末状の生成物として４０.７ｇである。実用的分子量は内部標準（以下の２パラグラフに記載）を用いて２５０ＭＨｚ 1ＨＮＭＲにより３５１mg／mmolと計算され、これは元素分析から得られた値（３６０mg／mmol）とよく一致する。
【００８１】
ジオキサン（１０.０μL／１０.００mL Ｄ2Ｏ，０.００８２２mmol／０.７０mL ＮＭＲ溶液，８ 1Ｈ ｓ ３.７, １.９５４インテグレーション単位）を内部標準に使用した。ＣＡＢＡ−ホスフェート（２５.４mg／０.７０mL ＮＭＲ溶液）ビニルプロトンＥ／Ｚアイソマーインテグレーション単位（1Ｈ ｄ ６.５, ２.１５２インテグレーション単位）をともに加える（アッセイ条件下に脱リン酸化する場合、両アイソマーともに同じ生成物を与える）。
計算：
8×2.15 ビニル 1Ｈ×0.00822＝0.0724 mmol ＣＡＢＡ−ホスフェート
1.954 ジオキサン 1Ｈ
25.4 mg／0.0724 mmol＝351 mg／mmol
【００８２】
完全にプロトン化されたＣＡＢＡ−ホスフェートの分子量は２７８mg／mmolである。実用的な分子量には、生成物中のナトリウム対イオン、水和水および残留塩化ナトリウムの重量を考慮する必要がある。この分子量を用いて４０.７ｇは １１６mmol ＣＡＢＡ−ホスフェートまたは約８２％の収率を表す。
【００８３】
生成物はまたＥ／Ｚアイソマーの比および有機ホスフェートとしての純度のために４００ＭＨｚ 1Ｈおよび31Ｐ ＮＭＲにより分析する（データは示していない）。マススペクトルは陰イオンモードで親イオン（２７７ Ｍ−１）および（２９９ Ｍ−２＋Ｎａ）を示す。元素分析（理論値％：Ｃ 30.00, Ｈ 3.08, Ｃｌ 14.39, Ｐ 8.61, Ｎａ 8.69；分析値％：Ｃ 30.04, Ｈ 2.93, Ｃｌ 14.36, Ｐ 8.62, Ｎａ 8.64）は、７.５重量％のＮａＣｌを含むＣＡＢＡ−ホスフェートのモノナトリウム塩の二水和物に一致する。このバッチの元素分析の基礎となった計算は、０.９eq Ｎａ＋対イオン，２eq水和水および７.５％ＮａＣｌと一致する。残留塩化ナトリウム％は沈殿した生成物の付加的な冷水洗浄によりさらに低下させることができるが、同時に生成物の収率は低下する。
【００８４】
ｃ．２−ハロビニルグリコシドの製造
ハロビニルグルコシドおよび他のハロビニルグリコシドは本発明においてはハロビニルホスフェートの有用な代替物である。酵素加水分解は２−クロロアセトアルデヒドを放出し、ここに様々な実施例で用いられるフェナシルクロリドのように、システインと同じ環化反応を受ける。たとえば、とくに好ましい化合物は２−クロロビニル−β−ガラクトシドである。β−ガラクトシドはβ−ガラクトシダーゼの商業利用性、その高い触媒活性およびその良好な安定性から望ましい。
【００８５】
アシル化された糖およびエトキシエチレンからのビニルグリコシドの製造およびその酵素的加水分解によるアセトアルデヒドの製造はHeisei JP 05039241またはKitazawaら, Chem. Lett. 6: 569-72, 1975に記載されている。これらの開示は引用により本明細書に導入される。類似の操作によって、２−ハロビニルグリコシドはエトキシエチレンの代わりに１−クロロ−２−エトキシエチレンを用いて製造することができる。
【００８６】
各種グリコシド−たとえば、ビニルグリコシドおよび１−エトキシエチルグリコシドのグリコシダーゼの基質としての有用性はDettingerら, Carbohydr. Res. 87(1): 63-70, 1980に記載されている。この開示は引用により本明細書に導入される。したがって、本発明はさらにハロビニルグリコシドおよび他のハロビニルグリコシドのハロビニルホスフェートの代替物としての使用を提供する。酵素的加水分解は２−ハロアセトアルデヒドを放出させ、これは以下の実施例に記載するようなアッセイにおけるフェナシルクロリドのようにシステインとの同じ環化反応を受けることが期待される。
【００８７】
Ｂ．アッセイ方法の例
１．一般的総説
本発明による方法を実施するためには、適当な反応条件が選択される。以下の記載は適当な条件を掲げるが、これらは特定の適用のために選択された特異的な試薬およびアッセイプロトコールに応じて本技術分野の熟練者により修飾されるものである。たとえば、本発明の方法は、不均一系、均一系、競合または直接アッセイのような多くのタイプのアッセイに適用することが可能であり、その条件および試薬はそれらに応じて選択されることになる。
【００８８】
サンプルは、好ましくは適当なメジウム中で直接調べることができるが、またサンプルをアッセイメジウム中に加える前に前処理することもできる。前処理は１または２以上のアッセイ試薬に対してアナライトが容易に利用されるようにし、また望ましくない物質を除去してアッセイにおける干渉を低下させることにより検出を容易にする。サンプルは、細胞を分離または溶解し；タンパク質を沈殿、加水分解または変性させ；脂質を加水分解し；アナライトを可溶化するために前処理される。このような前処理には、それらに限定されるものではないが、遠心分離；サンプルの有機溶媒（たとえば、アルコール好ましくは約８個未満の炭素原子を有するアルコール、たとえばメタノール）による処理；および界面活性剤による処理；還元剤を含む放出剤による処理が包含される。
【００８９】
アッセイされる化合物の濃度は一般に約１０-4〜１０-15Ｍ、さらに通常は１０-5〜１０-12Ｍを変動する。さらに特定すれば、ｈｃｙアナライトの場合、濃度は一般に約１０-4〜１０-8Ｍ、さらに通常は１０-5〜１０-7Ｍを変動する。アッセイが定性的、半定量的または定量的かの考慮、特定の検出技術およびアナライトの濃度が通常、他の試薬の濃度を決定する。さらに、各試薬の最終濃度は通常、興味ある範囲にわたるアッセイの感度を至適化するように経験的に決定される。
【００９０】
アッセイに使用され、また以下に述べるキットにパッケージされる各種試薬の相対量は、本発明の方法の間に起こる必要がある反応を実質的に至適化するようなまたさらに実施されるアッセイの感度を実質的に至適化する試薬濃度を提供するように広範囲に変動させることができる。アッセイメジウム中の抗体の濃度はアッセイのタイプに依存する（たとえば、不均一系もしくは均一系、競合または直接等）。通常、抗−修飾アナライト抗体はアッセイメジウム中に修飾アナライトの約半分から１０7倍までの濃度、より通常には修飾されたアナライトにほぼ等量から１０3倍までの濃度で存在させる。
【００９１】
本発明の方法の実施には好ましくは水性メジウムが使用される。他の極性共溶媒、通常１〜６個さらに通常には１〜４個の炭素原子を有する酸素化有機溶媒、たとえばアルコール、エーテル等もメジウム中に使用できる。通常、これらの共溶媒は約７０重量％未満、より頻繁には約３０重量％未満の量を存在させる。
【００９２】
本発明によるアッセイにおいては、メジウムのｐＨは通常約５〜１０の範囲であり、約７〜９の範囲がより好ましい。ｐＨはｓｂｐメンバー間の結合の有意なレベルを維持するように、一方ではシグナル産生効率を至適化するように選択される。場合により、この２つの間には矛盾がある。さらに、ｐＨは特定の構造コンフォーメーションたとえば環化を維持するように選択される。様々な緩衝液が所望のｐＨを達成し、定量時にそのｐＨを維持するために使用される。緩衝液の例としては、ホウ酸塩、リン酸塩、炭酸塩、トリス、バルビタール等が包含される。使用される特定の緩衝液は本発明に重要ではないが、個々のアッセイにおいて、ある緩衝液が他より好ましいことはある。
【００９３】
本発明の方法を実施するに際しては、通常、中等度の温度が用いられる。温度は行われる工程によって変動させることができる。しかしながら、典型的には、関連時間中、一定の温度が維持される。温度は一般的に約１０℃〜約５０℃であり、通常は約１５℃〜約４０℃である。
各種試薬の添加順序は広範囲に変化させることが可能であるが、使用される特定のアッセイフォーマットの性質によりある程度好ましい順序がある。試薬およびサンプルは同時にまたは完全にもしくは部分的に順序立てて混合することができる。ここに使用した「完全にもしくは部分的に順序立てて」の語は、サンプルおよび本発明に用いられる各種試薬は、一緒に（同時に）、１もしくは２以上の試薬を順次単独に、または他の試薬と一緒に混合することを意味する。たとえば、アナライトおよび還元剤は、ジスルフィド結合があればその還元を可能にするようにまず混合し、ついで残った試薬を同時にまたは段階的に添加する。
【００９４】
それぞれの試薬を添加したのちに、１または２以上のインキュベーション工程、一般に約30秒〜６時間、より通常には２分〜１時間を任意に行うことができる。工程にはより便利なある順序があり、用いられる特定の順序の選択は試薬およびアッセイフォーマットの選択に依存するが、それは本発明には重要ではない。  イムノアッセイの最終工程は、サンプル中のアナライトの存在または量に比例する修飾されたアナライトと抗体との間の結合の程度の測定である。結合の程度を測定するには多くの方法があり、本技術分野において周知である。これらの方法はアッセイの性質−すなわちアッセイが競合的、均一系、不均一系であるか等に依存して異なる傾向がある。
【００９５】
修飾されたアナライトと抗体の間の結合の程度を測定する一方法は、標識された修飾アナライト、すなわち検出可能な標識されたアナライト同族体を加え、標識されたアナライトの結合と競合する標識された修飾アナライトと抗体の結合によって産生するシグナルを検出することにより達成することができる。たとえば、均一系アッセイにおいては、検出可能な標識は酵素であり、最終工程は基質の添加による酵素標識の活性化とすることができる。産生されたシグナルは標識された修飾アナライトと抗体の間の結合の程度に比例する。したがって、シグナルの存在または量はサンプル中のアナライトの存在または量に比例する。
【００９６】
競合的均一系アッセイにおける他の測定では、結合の程度はフルオレッサーで標識された修飾アナライトとクエンチャーで標識された抗体の使用によって定量できる。この場合も、シグナルは結合の程度に比例し、これはサンプル中に存在するアナライトの量に逆比例する。別法として、フルオレッサーで修飾されたアナライトを別個の試薬として加えないで、フルオレッサーで修飾された修飾試薬とアナライトの反応によって形成させる均一系の非競合的アッセイを使用することもできる。この場合も、シグナルは、結合の程度に比例し、これはサンプル中に存在するアナライトの量に正比例する。
【００９７】
不均一系アッセイにおいては、標識されていない抗−（修飾アナライト）抗体が支持体に結合される。支持体を修飾されたアナライトおよび標識された修飾アナライトとインキュベーションしたのち、支持体を液相から分離し、ついで固相または液相からのシグナルの量を定量する。これは修飾されたアナライトと抗体の結合程度、すなわちサンプル中のアナライトの量を指示する。上述のイムノアッセイ技術およびここに開示される有用な他の技術のさらに詳細な説明はたとえばMaggio, Edwarg T,, “Enzyme-Immunoassay," CRC Press, Inc., Boca Ration,FL, 1980 を参照されたい。
【００９８】
２．ｈｃｙアッセイの例
例示的な目的で、以下のアッセイプロトコールを使用できる。これらの例示は本発明の範囲の限定として解釈すべきではなく、それらは本発明の方法をサンプル中のｈｃｙおよびｃｙｓの定量に使用できる定性的、半定量的および定量的アッセイプロトコールの単なる例示である。これらの方法で検出されるシグナルは既知のｈｃｙ濃度を有する標準または対照と比較する。
【００９９】
アルキル化剤を使用するｈｃｙのアッセイでは、修飾されたｈｃｙに特異的に結合するモノクローナル抗体−修飾されたｃｙｓではない−の使用が好ましい。ｈｃｙおよびｃｙｓの含有が疑われるサンプルを適当なメジウム中で保護されたアルキル化試薬と混合する。活性化試薬の添加により、保護されたアルキル化試薬は脱保護され、ついで以下の反応が起こる：アルキル化試薬＋ｈｃｙ→修飾されたｈｃｙおよびアルキル化試薬＋ｃｙｓ→修飾されたｃｙｓである。グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼに接合した修飾ｈｃｙの同族体およびＧ６ＰＤＨに接合した修飾ｈｃｙに対する結合は酵素の阻害を生じる。３０分インキュベートしたのちにグルコース−６−ホスフェートを加える。産生するシグナルはサンプル中のｈｃｙの量に正比例する。
【０１００】
前述のようにサンプルのアッセイには、好ましくは修飾されたｈｃｙ（修飾されたｃｙｓではない）に特異的なモノクローナル抗体が使用され、ガラスビーズに結合される。血清サンプルはまずジチオスレイトール（ＤＤＴ）で処理して、ジスルフィドとして結合しているｈｃｙを還元的に遊離させる。過剰のＤＤＴをヒ酸ナトリウムで処理して隔離する。前処理されたサンプルをついで保護されたアルキル化試薬（これは3Ｈで標識されている）と混合し、ついで抗体および活性化試薬と混合する。メジウムを１０分間インキュベートし、ビーズを分離して洗浄する。ビーズの放射能をついで測定する。産生されたシグナルはサンプル中におけるｈｃｙの量と正比例する。
【０１０１】
保護されたアルキル化試薬を使用するｈｃｙの例示的アッセイでは修飾されたｈｃｙ（修飾されたｃｙｓではない）に特異的に結合するモノクローナル抗体が支持体に結合される。西洋ワサビペルオキシダーゼに接合された修飾ｈｃｙの同族体も使用できる。ｈｃｙおよびｃｙｓの含有が疑われるサンプルをＴＣＥＰ、トリス（カルボキシエチル）ホスフィンおよび保護されたアルキル化試薬を適当なメジウム中に混合する。ＴＣＥＰは血清サンプル中のジスルフィド型のホモシステインを還元するために使用される。ジスルフィドの還元が起こるのに十分な時間が経過したのち、ついで抗−修飾ｈｃｙ−支持体接合体、活性化試薬および修飾されたｈｃｙ−ＨＲＰ接合体をメジウムに加える。懸濁液を３０分間インキュベートしたのち、液相および固相を分離し、固相を洗浄する。基質を加えた水性メジウムをついで固相に加えると、産生されたシグナルはサンプル中のｈｃｙ量に逆比例する。
【０１０２】
有用な保護されたアルキル化試薬は、４−（α−クロロアセチル) 安息香酸のエノールホスフェート、ＣＡＢＡ−ホスフェートである。この化合物は保護されていないアルキル化試薬と異なり、ＴＣＥＰの存在下でも安定であることが見いだされた。エノールホスフェート保護基のに使用により、これらの他の場合には不適合性な試薬は一緒に保存ことが可能になり、したがって、わずか２種の試薬を用いてアッセイを実施できる。第一の試薬はＴＣＥＰ、ＣＡＢＡのエノールホスフェート、およびアルキル化ホモシステインとＣＡＢＡによって形成された生成物（ｈｃｙ−ＣＡＢＡ）でコートされた染料粒子を含有した。この混合した試薬をサンプルと混合すると、ホモシステインジスルフィドの還元を生じる。第二の試薬はアルカリホスファターゼおよびｈｃｙ−ＡＢＡに対する抗体でコートされた化学ルミネサービーズを含有した（一般に化学ルミネサービーズは一重項酸素で活性化可能な化学ルミネセンス標識を導入したラテックス粒子である。センシタイザービーズはセンシタイザー染料が導入された粒子またはビーズである）。この第二の試薬を添加すると、エノールホスフェートがまず加水分解される。得られた遊離のＣＡＢＡをついでホモシステインと反応させると、形成されたｈｃｙ−ＡＢＡが化学ルミネサービーズに結合する。依然として遊離の抗体を有する化学ルミネサービーズはセンシタイザービーズに結合する。得られたビーズペアは照射により検出され、化学ルミネサー光の発生が確認される。
【０１０３】
ＣＡＢＡエノールホスフェートおよびＢＡＢＡエノールホスフェートはとくに有用であることを説明するが、それらは例として記載されたものであり、本発明を限定するものではないことを理解すべきである。他のα−エノールホスフェートも同様に調製され、様々なハロビニルグリコシドとして本明細書に開示されたように使用することができる。
【０１０４】
Ｃ．一重項酸素で活性化可能な化学ルミネセンス標識および方法
一重項酸素で活性化可能な化学ルミネセンス標識、ならびにそれの製造および使用方法はとくに本発明の方法および組成物に有用である。しかしながら、このような標識、方法および関連組成物（たとえば、標識粒子）は本発明を実施する唯一の手段ではないことを理解すべきである。
【０１０５】
すなわち、本発明の様々な態様においては、米国特許5,709,994，5,340,716および5,478,729−これらの開示は引用により本明細書に導入される−に記載された標識、粒子および他の組成物は、本明細書に開示されたようにとくに有用である。たとえば本発明は化学ルミネセンスおよび／またはセンシタイザー粒子で標識されたビーズ（または他の材料）、化合物、組成物または分子の使用を記載する。このような化学ルミネセンス粒子の製造は上述の米国特許、たとえば米国特許5,709,994の２５〜３３欄および４１〜４３欄または米国特許5,340,716の２１〜２２欄に記載されている。
【０１０６】
有用な光センシタイザーおよび化学ルミネセンス材料はまた、マトリックスが固体（たとえば、粒子）でも、さらに「流体」もしくは「流体／固体」の性質をもっていても（たとえば、油滴またはリポソーム）、マトリックスにそれらの材料を結合させる方法として上述の特許に詳細に開示されている。適当なシグナル産生システムの優れた論述はまた、Ullmanらの米国特許5,185,243に見いだすことができる。この開示は引用により本明細書に導入される。
【０１０７】
Ｄ．有用な抗体の製造方法
本発明の方法にはさらに、免疫学的に識別されるアナライト、すなわち「修飾された」アナライトと相同の免疫原に対するポリクローナルおよびモノクローナル抗体の製造が包含される。本発明の方法に有用な抗体を得るために使用される免疫原は、アッセイされる化合物を選ばれた修飾試薬と反応させて得られる修飾されたアナライトである。免疫原の調製には、典型的には、修飾試薬の可溶化基を、免疫原を有するタンパク質への試薬の結合のためにまず使用する。通常、これらの結合基はまず活性化され、ついで試薬を担体タンパク質へカップリングさせる。得られた試薬−タンパク質接合体はアナライトと反応させ、精製し、免疫原として用いられる。
【０１０８】
本発明は、第二の化合物が第一の化合物の同族体である場合を含めて、第二の化合物の存在下に第一の化合物を検出するのに有用な試薬、キットおよび方法を包含する。すなわち上述の抗体は修飾された試薬と第一の化合物（アナライト）または第二の化合物のいずれかの反応生成物と特異的に反応するそれらの能力、すなわち修飾されたアナライトまたは修飾された第二の化合物のいずれかに結合するそれらの能力についてスクリーニングされる。たとえば、hcy のアッセイにおいては、免疫原は免疫原性担体タンパク質に連結して誘導体化されたｈｃｙである。すなわち、得られた抗体は修飾されたｈｃｙアナライトを特異的に認識し、修飾されたｃｙｓを認識しない。
【０１０９】
修飾された試薬をタンパク質担体に結合させることができる様々な残基は、たとえばアルデヒド、ケトン、ジアゾニウム塩、アルキル化剤等を含めて使用することができる。便宜的には、カルボン酸またはスルホン酸が接合のために活性化エステルまた酸ハライドに変換される。担体タンパク質は任意のタンパク質であり、好ましくは免疫処置される宿主動物に異種のタンパク質、動物がたとえばマウス、ウサギ、ヒツジまたはヤギである場合は、たとえばキーホールリンペットヘモシアニンまたはウシ血清アルブミンである。
【０１１０】
本発明の方法に有用な抗体の調製は本技術分野で周知の方法を用いて達成される。たとえばモノクローナル抗体は本質的に、Kohler & Milstein, Nature 256:495-497, 1975 に記載された方法と類似の方法によって得られる。MilsteinとKohlerの方法は十分に確立されている。一般にこの方法は、宿主通常はマウスまたは他の適当な動物への免疫原の注射を包含する。ついで宿主動物の脾臓から細胞を採取する。別法として、宿主は非感作脾臓細胞からなり、これをインビトロで免疫原で感作する。得られた細胞をついで骨髄腫細胞と融合する。得られた結果はハイブリド細胞であり、「ハイブリドーマ」とも呼ばれ、インビトロで培養することができる。ハイブリドーマの集団をスクリーニングして個々のクローンが単離されるように操作すると、それぞれのクローンは抗原に対して単一の抗体を分泌する。
【０１１１】
免疫原を宿主に導入する場合には、宿主の免疫系はその免疫原を様々な部位で認識できる各種抗体を産生することによって応答する。これらの多くの抗体は異なる親和性および特異性を有する。用いられる特定のアッセイ方法に望ましい親和性および特異性形質を有する抗体を得るには、異なるハイブリドーマ細胞系を、所望の特性を有する抗体が同定されるまでスクリーニングする。
【０１１２】
Ｅ．接合体の調製
上述の方法の他の適用には接合体の調製が包含される。たとえば、スルフヒドリル基を有するタンパク質を、タンパク質１分子あたり１個のＣＡＢＡエノールホスフェートで標識する。ＣＡＢＡホスフェートはアルキル化剤ではないので、この接合体は安定である。この標識材料をついで過剰のスルフヒドリル含有タンパク質と混合する。アルカリホスファターゼを加えるとカップリング反応が始まり、この反応はＣＡＢＡの高い反応性のためにほぼ定量的である。
すなわち、１：１ タンパク質接合体の合理的な収率がＣＡＢＡ標識タンパク質の重合を妨害することなく容易に達成される。同様に、薬物接合体が上述と類似の方法により調製され、たとえばスルフヒドリル含有薬物がスルフヒドリルタンパク質の代わりに使用される。
【０１１３】
Ｆ．キット
便宜上、本発明に使用するための試薬は、アッセイ法、一つの分子を他の分子に接合させる方法（たとえばタンパク質接合体）、または本発明の任意の実際的適用に使用するためのキットとして提供することができる。ｈｃｙを検出するための方法に用いられる典型的なキットには、活性化するとｈｃｙおよびｃｙｓを化学的に修飾して修飾されたｈｃｙおよびｃｙｓを形成できる保護されたアルキル化試薬、修飾されたｈｃｙに特異的に結合できるが修飾されたｃｙｓには結合しない抗体、および活性化試薬をパッケージした組み合わせからなる。キットはさらに修飾されたｈｃｙの標識類縁体からなる。
【０１１４】
本明細書に別に記載されたように、修飾されたｈｃｙはアルキル化試薬とサンプル中のホモシステインの相互作用によって形成される生成物−たとえば、スルフヒドリル基の修飾が起こった生成物から構成される。一変形においては、修飾されたホモシステインは、ホモシステインのカルボキシフェナシルチオエーテル（ｈｃｙ−ＡＢＡ）である。
【０１１５】
キットはまた放出剤からなることもできる。ｈｃｙおよびｃｙｓ硫黄化合物を血清タンパク質から遊離させることができる適当な放出剤は本技術分野でよく知られていて、それらに限定されるものではないが、還元剤、たとえば水素化ホウ素ナトリウムおよびカリウム；ジチオスレイトール、ジチオエリスリトール、２−メルカプトエタノール、チオグルコール酸およびグルタチオンのようなチオール；ならびにホスフィンおよびトリアルキルホスフィン、たとえばトリブチルホスフィンおよびトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンが包含される。とくに適当な還元剤はジチオスレイトールおよびトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）であり、後者は Burnsら, J.Org. Chem. 56 (8): 2648-2650, 1991 に記載され、ジスルフィド型のｈｃｙを放出させるのに適している。
水性メジウム中で２つの分子をカップリングさせるためのキットは好ましくは、結合基と活性化試薬を分離された容器中に包含する。
【０１１６】
適当な環境下では、キット中の１または２以上の試薬は溶液中にまたは乾燥粉末として提供され、通常は賦形剤を含めて凍結乾燥され、それを溶解すると本発明の方法およびアッセイを実施するのに適当な濃度を有する試薬溶液が提供される。本発明の多機能性を増大させるため、試薬は、同じまたは別個の容器中に、その方法およびアッセイの実質的に至適化を与える試薬の比でパッケージされた組み合わせとして提供される。試薬の交差反応性および安定性に依存して、試薬はそれぞれ別個の容器にまたは各種の試薬を１または２個以上の容器に入れる。本発明に用いられる試薬は、便宜上、予め定められた量で提供されることが好ましい。キットには試薬の使用方法および／または特定のアッセイの実施方法についての説明書を、たとえばパッケージ挿入物の型で含有させる。
本明細書に記載された実施態様の様々な組み合わせは本発明の範囲内に包含されるものであることを理解すべきである。本発明の他の特徴および利点は以上の説明、以下の実施例、および特許請求の範囲から明らかになるものと確信する。
【０１１７】
略号
トリスＨＣｌ：トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−ＨＣｌ（１０×溶液），BioWhittaker, Walkersville, MD より
ＤＴＴ：ジチオスレイトール，Sigma Chemical Company, St. Louis, MOより  ＨＰＬＣ：高速液体クロマトグラフィー
ＤＰＰ：４,７−ジフェニルフェナンスロリン，Aldrich Chemical Company, Milwaukee WI より
ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン，Sigma Chemical Company, St. Louis, MOより  ＥＬＩＳＡ：固相酵素免疫測定法，“Enzyme-Immunoassay," Edward T. Maggio,CRC Press, Inc., Boca Raten, Florida, 1980 に記載されている
ｇ：グラム
mmol：ミリモル
ＤＭＦ：ジメチルホルムアミド
ＴＨＦ：テトラヒドロフラン
ＭＳ：マススペクトロスコピー
ＮＭＲ：核磁気共鳴スペクトロスコピー
ＴＭＳＣｌ：トリメチルシリルクロリド
ＥＤＡＣ：１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩
ＭＥＳ：２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸
ＳＰＤＰ：Ｎ−スクシンイミジル ３−（２−ピリジルチオ）−プロピオネート
Sulfo-ＳＭＣＣ：４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート
ＴＣＥＰ：トリス-カルボキシエチルホスフィン
【０１１８】
【実施例】
以下の実施例は本発明を例示するものであり、本発明を限定するものではない。
実施例１
アルキル化基の脱保護の証明
１．アルカリホスファターゼによるホスフェート保護基の脱保護
ｐＨ ８〜９のＮａＯＤ／Ｄ2Ｏ １mL中ＢＡＢＡ−ホスフェートおよびＣＢＡＢ−ホスフェート（ＢＡＢＡ−ホスフェートの製法により生じる）の混合物５mgをアルカリホスファターゼ（Sigma, ヒト胎盤）１mg（１５単位）によって室温で１５分間処理する。２０％Ｈ2Ｏ／ＡＣＮを使用する薄層クロマトグラフィー（２５０μ ＳｉＯ2, Analtech Uniplte）は、保護されたアルキル化試薬のホスフェート基がアルカリホスファターゼ処理により除去されるが、非処理の保護アルキル化試薬は無傷に維持されることを示す。これはさらにビニルプロトンピーク（通常はエノールホスフェートについては６.３ppmに見いだされる）の消失を示すＮＭＲ（Ｄ2Ｏ）分析により確認される。
【０１１９】
保護基の効率的な除去の更なる証明は脱保護されたアルキル化試薬とシステインの反応のＴＬＣ（上述）分析によって示される。アルカリホスファターゼとの反応の粗製生成物をシステインと約１０分間反応させると、第一の生成物、脱保護アルキル化試薬の消失と、さらに極性の生成物の出現を生じた。後者はアルキル化試薬とシステインの付加物と推測される。
【０１２０】
２．還元剤の存在下にける保護されたアルキル化試薬の安定性
ＣＢＡＢ−ホスフェート（保護されたアルキル化試薬と還元剤（トリス−カルボキシエチルホスフィンまたはＴＣＥＰ）の混合物の安定性はＢＡＢＡ、ＣＡＢＡホスフェートおよびＴＣＥＰを標準として使用し、上述のようにＴＬＣ分析で証明する。ＢＡＢＡとＴＣＥＰ（リン酸緩衝液ｐＨ ７.０中それぞれ５mM）の混合物の分析では、アルキル化試薬と還元剤の反応は、室温で３０分間混合物をインキュベートしたのちにほぼ完全である。遊離のアルキル化試薬と異なり、保護されたアルキル化試薬（ＣＡＢＡホスフェート）は２つの試薬（リン酸緩衝液ｐＨ７中それぞれ５mM）の混合物の室温における１６時間のインキュベーション後、ＴＣＥＰに対し抵抗性であることが見いだされた。
【０１２１】
実施例２
ＬＯＣＩを用いるホモシステインアッセイ（ルミネスンス酸素チャネリングイムノアッセイ）
様々なアッセイ方法および組成物が生物学的サンプル中−たとえば血清サンプル中の化合物および組成物の検出に有用である。本明細書に記載の組成物および方法を用いる有用なアッセイの一つは本明細書ではＬＯＣＩと呼ばれる（米国特許5,709,994, 5,340,716および5,478,729−これらの開示は引用により本明細書に導入される−にはルミネスンス酸素チャネリングイムノアッセイに関してさらに詳細に記載されている）。
【０１２２】
ｈｃｙは血漿中に様々な形態−たとえば、わずかな比率の遊離型小分子、一部はそれ自体およびシステインとのジスルフィド、一部はアルブミンとのジスルフィド（約７０％）として存在する。総ｈｃｙは臨床的に関連のある測定値であるが、絶食対象では約５〜１５μmol／Ｌの標準値が示されている。ホモシステイン血症といわれる血漿ｈｃｙの中程度の上昇でも、一般集団においては未成熟心脈管系疾患の危険因子と考えられている。
【０１２３】
抗体ベースのアッセイはポピュラーなフォーマットであり、サンプルの前処理の問題−とくにオフラインのサンプル前処理が解決されれば、高いスループットの自動化形態に容易に適合される。したがってホモシステイン（ｈｃｙ）および／または他の分子ならびに組成物の迅速な、完全に自動化された検出は、開示された方法および組成物内での使用を容易に証明する価値あるツールである。
【０１２４】
本質的に、このようなアッセイの工程は、(１)たとえばトリス−（２−カルボキシエチル) ホスフィン塩酸塩還元剤によるｈｃｙジスルフィドの遊離ｈｃｙへの変換；(２)ブロモアセチル安息香酸（ＢＡＢＡ）またはＢＡＢＡのエノールホスフェート誘導体によるｈｃｙの誘導体化によるｈｃｙ−ＡＢＡの形成；および(３)ｈｃｙ−ＢＡＢのＬＯＣＩによる検出および定量を包含する。このアッセイは、これらの誘導体化剤が保護されていない形態より広いｐＨ範囲にわたりより良好な溶解性とより長い貯蔵寿命を有するので、保護されたハロケトンたとえばＢＡＢＡまたはＣＡＢＡのエノールホスフェート誘導体の使用を介してさらに増強される。さらに、このような保護されたハロケトンは単純性の付加的な利点を有し、それは自動化関連においても２−試薬プロトコールの使用を可能にする。
【０１２５】
例示の目的で、自動化アッセイ方法をここに記載する。非自動化アッセイならびに異なる成分および工程を使用するアッセイはまた、本発明の組成物の使用を意図し、したがって本発明の範囲内に包含される。
Ａ．材料
以下に記載する様々な方法に使用される以下の試薬は、指定された商業的ソースから購入することができるが、広範囲な他のソースからも容易に入手できる。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；ICN Pharmaceuticals, Costa Mesa, CA）；ウシ小腸アルカリホスファターゼ（ＣＩＡＰ；Pierce Chemicals, Rockford, IL）；スルホスクシンイミジル６−(ビオチンアミド)ヘキサノエート（ＮＨＣ−ＬＣ−ビオチン；Pierce, Rockford, IL）；Ｌ−ホモシステイン、システインおよびメチオニン（Sigma, St.Louis, MO）；Ｌ−ホモシステインチオラクトン（ＨＣＴＬ；Fluka, Milwaukee, WI）；トリス−（２−カルボキシエチル) ホスフィン、塩酸塩（ＴＣＥＰ；Molecular Probes, Eugene,OR）；デキストランＴ−５００（PharmaciaCo., Piscataway, NJ）；ＨＢＲ−１（Heterophilic Blocking Reagent 2; Scantibodies Lab. Inc., Santee, CA）。他に特定されなければ、本発明で使用された他のすべての化学品は試薬特級である。
【０１２６】
以下の試薬は発明者らの実験室で調製された：ブロモアセチル安息香酸（ＢＡＢＡ）；ホモアセチル安息香酸Ｎ−ヒドロキシスクシンアミドエステル（ＢＡＢＡ−ＮＨＳ）；「ｐｒｏ−ＣＡＢＡ」またはＣＡＢＡホスフェート（ＣＡＢＡのエノールホスフェート誘導体）；ならびにホモシステイン−アセチル安息香酸（ｈｃｙ−ＡＢＡ）である。抗−ｈｃｙ−ＡＢＡモノクローナル抗体（たとえば、Ｓｙｖａのモノクローナルグループからのｈｃｙ−ＡＢＡ−ＡＢＡ接合体へのクローンＩ５Ｃ１２）が、以下に記載のように使用される。他の均等体、有用なモノクローナルおよびポリクローナル抗体は本技術分野の熟練者に周知の技術により容易に独立して発生させることができる（たとえば、上記Ｄ項参照）。
【０１２７】
血清カリブレーターは、正常個体の血清をプールした血清サンプルに既知量のホモシステインを注入して調製する。このプール中のホモシステインレベルは、標準技術に従いＨＰＬＣで定量した。たとえば、多くの臨床検査室−たとえば、Cleveland, OH−がこのようなプロトコールを実施するために準備される。
【０１２８】
固体マトリックス、好ましくはビーズ型のマトリックスを抗−ｈｃｙ−ＡＢＡモノクローナル抗体（ｍＡｂ）で標識し、本発明者らは「Ａｂ−アクセプタービーズ」と呼ぶマトリックスをほぼ以下のように調製する。ポリスチレンビーズをまず、アクセプター染料（たとえば、Ｃ−２８ チオキセン、ＤＤＰ／Ｅｕ（ＴＴＡ）３）で染色し、ついでデキストランでコートする。
【０１２９】
Ｃ−２８ チオキセンは次のように調製する。すなわち、乾燥ＴＨＦ（２００mL）中４−ブロモアニリン（３０ｇ, １７４mmol）の溶液に１−ブロモテトラデカン（８９.３mL, ３６６mmol）およびＮ,Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（６２.２mL, ３５７mmol）を加えた。この反応溶液をアルゴン下、９０℃に１６時間加熱したのち、室温に冷却した。この反応溶液に再び、１−ブロモテトラデカン（４５mL, １８４mmol）ならびにＮ,Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（３１mL, １７８mmol）を加え、反応混合物をさらに１５時間９０℃に加熱した。冷却したのち、反応溶液を真空中で濃縮し、残留物をＣＨ2Ｃｌ2（４００mL）で希釈した。ＣＨ2Ｃｌ2溶液を１Ｎ ＮａＯＨ（２×）、水および食塩水で洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥し、真空中で濃縮すると、暗褐色の油状物（約１１０ｇ）が得られた。Waters 500 Prep LC システムによりシリカゲル上プレパラティブカラムクロマトグラフィーに付し、ヘキサンで溶出すると主として生成物（４−ブロモ−Ｎ,Ｎ−ジ−(Ｃ14Ｈ29)−アニリン）を含有する黄色の油状物が、少量の１−ブロモテトラデカンとともに得られた。後者の化合物は真空蒸留（沸点１０５〜１１０℃，０.６mm）によって混合物から除去すると、生成物が褐色の油状物 ５０.２ｇ（５１％）として残留した。乾燥ＴＨＦ（３０mL）中アルゴン下にマグネシウム屑（９.６０ｇ, ３９５mmol）の混合物に、上述の置換アニリン生成物（４４.７ｇ, ７９mmol）のＴＨＦ（２５０mL）中溶液を滴下して加えた。ヨウ素の結晶数個を加えて、グリニヤール試薬の形成を開始させた。
【０１３０】
反応混合物が温かくなり還流を開始したならば、添加速度を穏やかな還流が維持されるように調整した。添加完了後、混合物をさらに１時間還流加熱した。冷却した上清溶液をカニューレによって添加フラスコに移し、ＴＨＦ（３００mL）中フェニルグリオキザール（１１.７ｇ, ８７mmol）の溶液にアルゴン下−３０℃で滴下して加えた（２.５時間以上）。反応混合物を徐々に１時間を要して０℃に加温し、さらに３０分間撹拌した。得られた混合物を、氷水（８００mL）および酢酸エチル（２５０mL）の混合物中に注いだ。有機相を分離し、水相は酢酸エチル（３×）で抽出した。有機相を合わせてＨ2Ｏ（２×）、食塩水で洗浄し、ＭｇＳＯ4上で乾燥した。溶媒を蒸発させると、４８.８ｇの粗製濃縮生成物が暗緑色の油状の液体として得られた。この液体をフラッシュカラムクロマトグラフィーに付すと（ヘキサン勾配で溶出、１.５：９８.５, ３:９７, ５:９５ 酢酸エチル：ヘキサン）、ベンゾイン生成物２４.７ｇ（５０％）が得られた。ＭＳ (Ｃ42Ｈ69ＮＯ2)：[Ｍ−Ｈ]＋６１８.６。
【０１３１】
1Ｈ ＮＭＲ（２５０ＭＨz, ＣＤＣｌ3）は期待されたベンゾイン生成物と一致した。乾燥トルエン（５００mL）中上記ベンゾイン生成物（２４.７ｇ, ４０mmol）の溶液に、２−メルカプトエタノール（２５ｇ, ３２０mmol）とＴＭＳＣｌ（１００mL, ７８８mmol）を順次加えた。反応溶液をアルゴン下に２３時間還流加熱したのち、室温に冷却した。これに付加的なＴＭＳＣｌ（５０mL, ３２０mmol）を加え、反応溶液をさらに３時間還流加熱した。得られた溶液を冷却させ、冷２.５Ｎ ＮａＯＨ水溶液で塩基性としてＣＨ2Ｃｌ2（３×）で抽出した。有機層を合わせて、飽和ＮａＨＣＯ3水溶液（３×）および食塩水で洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥し、真空中で濃縮すると褐色の油状の液体が得られた。Waters 500 Prep LC システムを用いてシリカゲル上プレパラティブカラムクロマトグラフィーに付して、ヘキサン勾配（１：９９, ２：９８ 酢酸エチル：ヘキサン）で溶出すると１５.５ｇ（６０％）のＣ−２８ チオキセンが橙黄色の油状物として得られた。ＭＳ (Ｃ44Ｈ71ＮＯＳ)：[Ｍ−Ｈ]＋６６１.６，1Ｈ ＮＭＲ（２５０ ＭＨｚ, ＣＤＣl3）は期待されたＣ−２８ チオキセン生成物２−（４−（Ｎ,Ｎ−ジ−(Ｃ14Ｈ29)−アニリノ)−３−フェニルチオキセンと一致した。
【０１３２】
ＤＤＰ／Ｅｕ（ＴＴＡ）３は次のように調製した。すなわちＥｕ(ＴＡＡ)３・３Ｈ2Ｏ（８.６９ｇ，１０mmol, Kodak Chemical Company, Rochester, NY）および１,１０−フェナンスロリン（１.８ｇ, １０mmol, Aldrich）を５０mLの乾燥トルエン中に混合し、油浴中９５℃に１時間加熱した。トルエンを減圧下に除去した。１０mLのトルエンから灰色の固体が結晶化して、１０ｇのＤＤＰ／Ｅｕ(ＴＡＡ）３ が生成した。吸収スペクトル：270 nm（20,000），340 nm（60,000)(トルエン）；Ｉ.Ｒ.（ＫＢr）：cm-1：3440 (s), 1600 (s), 1540 (s), 1400 (s), 1300 (s)。
【０１３３】
カルボキシルアクセプタービーズは次のように調製した。すなわち、出発材料のビーズは Seradyn Particle Technology, Indianaplis, IN から購入したカルボキシレート修飾ラテックスとした。洗浄した１７５nmのカルボキシレート修飾ラテックス（４００mg）の１０％懸濁液４mLを、撹拌棒を装着した２５mLの丸底（Ｒ.Ｂ.）フラスコ中、３mLのエトキシエタノールで希釈した。Ｒ.Ｂ.フラスコをついで１５０℃の油浴中に置き、１０分間撹拌した。ついで、ベンジルアルコール中３.３mMのＣ−２８ チオキセンおよび１５.５mMのＥｕ(ＴＡＡ)３ＤＤＰを加えた。ビーズを５分間以上撹拌した。
【０１３４】
この時点で、０.１Ｎ ＮａＯＨ １.０mLを５分間を要して徐々に添加した。添加時には油浴温度をずっと１５０℃に維持した。油浴温度を徐々に２時間を要して、室温まで低下させた。冷却後、混合物を２０mLのエタノールで希釈して遠心分離した（１２,５００rpm, ３０分間）。上清を捨て、ペレットを超音波処理によりエタノールに再懸濁した。遠心分離を反復し、ペレットを水に再懸濁し、遠心分離を反復した。ペレットを５mLのエタノール水溶液に再懸濁し、最終容量を４０mLにした。
【０１３５】
アミノデキストランの調製：
ヒドロキシプロピルアミノデキストラン：（１ＮＨ2／７ グルコース）はデキストランＴ−５００（Pharmacia, Uppsala, Sweden）５０mgを、機械撹拌機および滴下ろ斗を装着した３頚丸底フラスコ中、１５０mLのＨ2Ｏに溶解して調製した。上記溶液に１８.８ｇのＺｎ(ＢＦ)4を加え、温度を熱水浴で８７℃に調整した。エピクロロヒドリン（３５０mL）を約３０分を要して撹拌しながら滴下して加え、この間、温度は ８７〜８８℃に維持した。混合物を４時間撹拌し、この間、温度は８０〜９５℃に維持し、ついで混合物を室温に冷却した。激しく撹拌しながら３Ｌのメタノール中に徐々に注いでクロロデキストラン生成物を沈殿させ、ろ過して回収し、真空オーブン中で一夜乾燥させた。
【０１３６】
クロロデキストラン生成物を２００mLの水に溶解し、２Ｌの濃（３６％）アンモニア水に加えた。この溶液を室温で４日間撹拌し、ついでロータリーエバポレーターで約１９０mLに濃縮した。この濃縮液を２つの等しいバッチに分け、それぞれを急速に撹拌した２Ｌのメタノール中に徐々に注いで沈殿させた。最終生成物をろ過により回収し、真空下に乾燥させた。
【０１３７】
上に調製したヒドロキシプロピルアミノデキストラン（１ＮＨ2／７ グルコース）をｐＨ ７.２の５０mM ＭＯＰＳに１２.５mg／mLで溶解させた。この溶液を室温で８時間撹拌し、冷蔵庫に保存し、使用の直前に痕跡の固体物質を除去するために Sorvall RC-5B 遠心分離機により１５,０００rpmで４５分間遠心分離した。この溶液１０mLに１mLの水中２３.１ｇのSulfo−ＳＭＣＣを加えた。この混合物を室温で１時間インキュベートし、さらに精製することなく使用した。
【０１３８】
マレイミドアミノデキストランは次のように調製した。すなわち、０.５mLの蒸留水にSulfo−ＳＭＣＣ（１１.５５mg）を溶解した。徐々に、１０秒間で上記溶液を、上述のように製造したたアミノデキストラン溶液５mL（５０mM ＭＯＰＳ，ｐＨ ７.２中１２.５mg／mL）に撹拌しながら加えた。混合物を室温で１時間インキュベートした。
【０１３９】
上記撹拌溶液に［０１５１］で調製したセンシタイザービーズの蒸留水中２０mg／mLの５mL（１００mL）を加えた。ついで、２００mg／mL ＮＨＳ（５０mM ＭＥＳ中に新たに調製、ｐＨを６Ｎ ＮａＯＨにより６.０に調整）１mLを加えた。蒸留水１mLに２００mLのＥＤＴＡを溶解し、この溶液を撹拌しながらセンシタイザービーズに徐々に加えた。ｐＨを１Ｎ ＨＣｌ ４５０μLを加えて６.０に調整し、混合物を一夜暗所でインキュベートした。０.５mLのＤＭＳＯ中１００mgの無水コハク酸の溶液をセンシタイザービーズに加え、混合物を暗所で室温においてインキュベートした。この混合物に０.１３mLの１０％Tween-20を加え、Tween-20の最終濃度を０.１％にした。ビーズを上述のように１５,０００rpmで４５分間遠心分離した。上清を捨て、ビーズを１０mLの緩衝液（５０mM ＭＯＰＳ，５０mM ＥＤＴＡおよび０.２％Tween-20，ｐＨ ７.２）に再懸濁した。ビーズを上述のように３０分間遠心分離し、上清を捨て、ビーズを再懸濁した。この操作を計３回反復した。ついで、ビーズを上記緩衝液２.５mL中４０mg／mLに再懸濁し、アルゴンを飽和させ、Tween-20を加えて最終濃度を０.１％にした。ビーズは４℃で保存した。
【０１４０】
ＭＡＤでコートされたアクセプタービーズは次のように調製した。すなわち、上に調製したカルボキシルアクセプタービーズ（４.５mLの水中９９mg）を上述のＭＡＤ（マレイミドアミノデキストラン）５.５mLにボルテックス撹拌しながら徐々に添加し、ついで５０mM ＭＥＳ，ｐＨ ６中２００mg／mLのＮＨＳ １mL, 水中２００mg／mLのＥＤＴＡ １mLおよび４５０μLの１Ｍ ＨＣｌ，最終ｐＨ ６を加える。混合物を一夜暗所室温でインキュベートし、ついで０.５mLのＤＭＳＯ中２００mgの無水コハク酸と室温で３０分間反応させた。新たに開封した界面活性剤−Amps Tween-20（Pierce Chemical Company, Rockford, Illnois）を加え、ビーズをSorvall RC-5B 遠心分離機にて１５,０００rpmで３０分間遠心分離し、１０mL部の５０mM ＭＯＰＳ，５０mM ＥＤＴＡ，０.１％界面活性剤−Amps Tween-20（Pierce Chemical Company)，ｐＨ ７.２と３回遠心分離して洗浄し、この同じ緩衝液３mLに再懸濁した。
【０１４１】
抗体コートアクセプタービーズは次のように調製した。すなわちモノクロナール抗−ｈｃｙ−ＡＢＡ Ａｂは、６２２μL（４.２８mg）を１０.２μLのＳＡＴＡ（エタノール中１.２５mg／mL, ２ eq.）と混合し、室温で１時間インキュベートし、ついで２×２Ｌの１５０mM ＮａＣｌ, １０mM ＮａＨＣＯ3，１mM ＥＤＴＡ，ｐＨ ７.０ に対して透析することによってチオール化した。チオアセチル化された抗体をヒドロキシルアミン（１Ｍ Ｈ2ＮＯＨ，５０mM ＭＯＰＳ，５０mM ＥＤＴＡ，ｐＨ ７）６２.２μLを加え、アルゴンを通し、室温で１時間インキュベートすることにより脱アセチル化した。生成物をPharmacia PD-10 カラムに適用し、アルゴンを通した５０mM ＭＯＰＳ，５０mM ＥＤＴＡ，ｐＨ ７.２で溶出した。２.５mLを流したのち、３つの１mL分画を集めて合わせた。抗体の回収はＡ２８０により３.６６mgまたは８６％であった。界面活性剤−Amps Tween-20（１０％）を加え、最終濃度０.２％とした。
【０１４２】
上記チオール化抗体の１.４mLアリコート（１.７１mg抗体）を上述のように調製されたマレイミド化ビーズ３００μL（１０mg）および混合物中の最終濃度が ０.２％になるのに十分な１０％Tween-20を加えた。試験管をアルゴンで浄化し、室温暗所で一夜インキュベートした。上記に、水中１ＭのＨＳＣＨ2ＣＯＯＨ ３.４μLを加えた。３０分間室温に置いたのち、６.８μLのＩＣＨ2ＣＯＯＨ（水中１Ｍ）を添加した。３０分後、３.５mLの０.１７Ｍ グリシン、０.１Ｍ ＮａＣｌ, ０.１％（ｖ／ｖ）Tween-20, １０mg／mL ＢＳＡ，ｐＨ ９.２を加え、ビーズを遠心分離し（３０分間，１２,５００rpm）、５mLの同じ緩衝液中で３時間インキュベートし、緩衝液Ｃ ５mL部で３回遠心分離して洗浄し、緩衝液Ｃ ５mLに再懸濁し、冷蔵庫に保存した。ビーズのサイズは緩衝液Ｃ中で測定して、３０１±５６nmであった。
【０１４３】
本明細書において「センシタイザー」と命名されたビーズはｈｃｙ−ＡＢＡで標識された（ｈｃｙ−センシタイザービーズ）。センシタイザー染料（たとえば、シリコンテトラ−ｔ−ブチルフタロシアニン）で染色されたポリスチレンビーズの製造はほぼ次のように実施される。
【０１４４】
シリコンテトラ−ｔ−ブチルフタロシアニン：
新たに切り出したナトリウム金属（５.０ｇ, ２０８mmol）を磁気撹拌機、還流冷却機、乾燥管および気体バブラーを装着した２Ｌの３頚フラスコ中、３００mLの無水メタノールに加えた。ナトリウムが完全に溶消したのち、４−ｔ−ブチル−１,２−ジシクロベンゼン（３８.６４ｇ, ２１０mmol; TCI Chemicals, Portland, OR）をろ斗を用いて加えた。混合物は澄明になり、温度は約５０℃に上昇した。この時点で、無水アンモニアガスを気体バブラーを通して反応混合物に１時間導入した。ついで反応混合物を４時間還流下に加熱し、この間、アンモニアガスの導入は継続した。反応の経過時に、固体が沈殿を開始した。得られた懸濁液を蒸発乾固させて（実験室内真空）、残留物を水（４００mL）に懸濁し、ろ過した。固体を乾燥した（６０℃，実験室内真空，Ｐ2Ｏ5）。生成物（１,３−イミノイソインドリン，４２.２ｇ）の収率はほぼ定量的であった。この物質は次工程にさらに精製することなく使用した。冷却機および乾燥管を装着した１Ｌの３頚フラスコに上記生成物（１８ｇ，８９mmol）とキノリン（２００mL, Aldrich Chemical Company, St. Louis MO）を加えた。シリコンテトラクロリド（１１mL, ９５mmol, Aldrich Chemical Company）を撹拌した溶液に１０分間を要してシリンジで加えた。添加完了後、反応混合物を油浴中１８０〜１８５℃に１時間加熱した。反応混合物を室温まで冷却し、濃塩酸を注意深く加え、反応混合物を酸性（ｐＨ ５〜６）にした。暗褐色の反応混合物を冷却して、ろ過した。
【０１４５】
固体を１００mLの水で洗浄し、乾燥した（実験室内真空，６０℃，Ｐ2Ｏ5）。固体物質を１Ｌの丸底フラスコに取り、濃硫酸（５００mL）を撹拌しながら加えた。混合物を６０℃で４時間撹拌し、注意深く砕氷（２０００ｇ）で希釈した。得られた混合物をろ過し、固体を１００mLの水で洗浄し、乾燥した。暗青色の固体を１Ｌの丸底フラスコに移し、濃アンモニア水（５００mL）を加え、混合物を還流下に２時間加熱、撹拌し、室温に冷却し、ろ過した。固体を５０mLの水で洗浄し、真空中で乾燥（実験室内真空，６０℃，Ｐ2Ｏ5）すると、１２ｇの生成物、シリコンテトラ−ｔ−ブチルフタロシアニンが、暗青色の固体として得られた。３−ピコリン（１２ｇ, Aldrich Chemical Company）、トリ−ｎ−ブチルアミン（無水、４０mL）およびトリ−ｎ−ヘキシルクロロシラン（１１.５ｇ）を、磁気撹拌機および還流冷却機を装着した１Ｌの３頚フラスコ中で上記生成物１２ｇに加えた。混合物を還流下に１.５時間加熱し、ついで室温に冷却した。ピコリンを高真空（オイルポンプ、約１mmHg）下において蒸留乾固して除去した。残留物をＣＨ2Ｃｌ2に溶解し、シリカゲルカラム（ヘキサン）を用い精製すると１０ｇの純粋な生成物、ジ−(トリ−ｎ−ヘキシルシリル)−シリコンテトラ−ｔ−ブチルフタロシアニンが暗青色の固体として得られた。ＬＳＩＭＳ：[Ｍ−Ｈ]+ 1364.2, 吸収スペクトル：メタノール：674 nm（ε 180,000)，トルエン 678 nm, 1Ｈ ＮＭＲ（250 ＭＨz，ＣＤＣｌ3）：δ:-2.4 (m, 12H), -1.3 (m, 12H), 0.2-0.9 (m, 54H), 1.8 (s, 36H), 8.3 (d, 4H)および9.6 (m, 8H) は上述の期待された生成物と一致した。
【０１４６】
センシタイザー染料ビーズの製造：
磁気撹拌機、１つの頚にガラス栓に結合した温度計、および反対の頚にろ斗を装着した３頚フラスコ中に、１０％の固体カルボキシート修飾ビーズ（Seradyn）６００mLを取り調製した。フラスコを９４±１℃に保持した油浴に浸漬した。ビーズは頚のろ斗を通してフラスコに加え、ビーズ容器は８３０mLのエトキシエタノール、１７００mLのエチレングリコールおよび６０mLの０.１Ｎ ＮａＯＨで濯ぎ、濯いだ液はろ斗を通してフラスコに加えた。フラスコに２４〜４０の隔壁を設けた。ビーズは９４±１℃の温度で４０分間７６５rpmで撹拌した。
【０１４７】
シリコンテトラ−ｔ−ブチルフタロシアニン（１０.０ｇ）を６０±１℃でベンジルアルコール３００mLに溶解し、上記丸底フラスコに、１２０±１０℃に加熱したシリンジを用いて３mL／分の速度で隔壁を通して加えた。１５分後、９００mLの脱イオン水および７５mLの０.１Ｎ ＮａＯＨを、４０分を要して滴下して加えた。油浴の温度を徐々に４０±１０℃に低下させ、撹拌を停止した。ついで、ビーズを４３ミクロンのポリエステルフィルターを通してろ過し、エタノール：水，１００：０〜１０：９０を用いてMicrogen接線流ろ過装置（Microgen Inc., Laguna Hills, CA）に付した。
【０１４８】
ｈｃｙ−ＡＢＡセンシタイザービーズの調製：
ｈｃｙ−ＡＢＡの粒子上への固定化−たとえばセンシタイザービーズ上への固定化はほぼ次のように実施される（米国特許5,478,729も参照。この開示は引用により本明細書に導入される）。まず、カルボキシ−センシタイザービーズを以下のプロトコールに従ってアミノデキストラン−コートセンシタイザービーズに変換する。１３５mgのアミノデキストランを１.３５mLの０.２Ｍ ＭＥＳ，ｐＨ ６.０に撹拌しながら溶解した。ついで、３mg／mLで９.０mLのカルボキシ−センシタイザービーズを遠心分離し、１.３５mLの脱イオン水にそれぞれ再懸濁した。アミノデキストラン溶液に、撹拌しながらビーズを滴下して加え、続いて１７７.２μLの８０mg／mL脱イオン水を加え、混合物を室温（r.t.）暗所で一夜インキュベートした。次に、５Ｎ ＮａＣｌを加え、最終濃度０.５Ｎにし、混合物をr.t.で３０分間インキュベートした。最後に、ビーズ懸濁液を遠心分離し、０.１Ｎ ＮａＣｌおよび１０nM ＥＤＴＡを含む４×５mL ０.１Ｍリン酸塩緩衝液 ｐＨ ７.０で洗浄し、同じ緩衝液中に２４mgビーズ／mLで保存した。
【０１４９】
次に、ＢＡＢＡ−ＮＨＳと以下の反応を実施した。（１）１.０mLのアミノデキストランビーズ（２４mg／mL）を遠心分離し、１.０Ｎ ＮａＣｌを含む０.１Ｍ リン酸塩，ｐＨ ７.０に再懸濁した。（２）２８mgのＢＡＢＡ−ＮＨＳを１.０mLのＤＭＳＯに溶解し、２５０μLをそれぞれのアミノデキストラン−コートビーズ懸濁液に加え、ついで２５０μLの０.１Ｍリン酸緩衝液，ｐＨ ７.０を加えた。反応混合物を１.５時間室温でインキュベートした。（３）０.１Ｍリン酸緩衝液，ｐＨ ７.０を０.５mL加え、反応混合物をさらに１時間インキュベートした。（４）ビーズを遠心分離し、４×６mLの０.１Ｍリン酸塩（ｐＨ ７.０）で洗浄し、１.０mLの同じ緩衝液中に再懸濁した。
【０１５０】
上記ビーズをついでホモシステインチオラクトン塩酸塩（ＨＣＴＬ）と以下のように反応させた。すなわち、９２.５mgのＨＣＴＬを１.０Ｎ ＮａＯＨ １.２５mLに溶解し、１０分間３７℃でインキュベートした。５mLの０.５Ｍリン酸塩緩衝液，ｐＨ ７.０を加えた（ｐＨを７.０にする）。反応混合物を窒素ガスで浄化し、前のパラグラフにおける工程（４）からの脱気したビーズ懸濁液１.０mLに２つのアリコートで１.０mLのＨＣＴＬ溶液を加えた。反応混合物を３７℃で４時間インキュベートし、ビーズを５mLの０.１７Ｍグリシン、０.１Ｍ ＮａＣｌ，１０mMのＥＤＴＡ ｐＨ ９.２の緩衝液によってr.t.で１時間ブロックした。ビーズの懸濁液を０.１７Ｍグリシン、０.１Ｍ ＮａＣｌ，１０mg／mL ＢＳＡ，１０mM ＥＤＴＡ ｐＨ ９.２の１×５mL緩衝液、ついで４×５mL ＬＯＣＩ緩衝液で洗浄し、５mLのＬＯＣＩ緩衝液５.０mL中に４℃で保存した。
【０１５１】
「ＬＯＣＩ緩衝液」とも同定される、この場合用いられる一般的なアッセイ緩衝液は、０.１Ｍトリス塩基，０.３Ｍ ＮａＣｌ，２５mM ＥＤＴＡ，０.１％ＢＳＡ，０.１％デキストランT-500，０.０５％ Ｋathon，０.０１％ゲンタマイシン，０.１％Zwittergent 3-14およびＨＢＲ−１＠１／３２０を包含する。濃塩酸（この緩衝液の調製にはmilli-Q水を使用した）でｐＨ ８.２に調整した。
【０１５２】
関連緩衝液は次のように調製される。ＬＯＣＩプレストレス緩衝液：ＬＯＣＩ緩衝液は１０mM ビス−トリスを含有し、ｐＨ ９.０に調整する。ＬＯＣＩ−ｈｃｙ−アッセイ緩衝液（Assay Buffer）：５０mM ホウ酸塩緩衝液，０.３Ｍ ＮａＣｌ，０.１％デキストランT-500，０.０５％ Ｋathon，０.０１％ゲンタマイシン，０.１％Tween-20およびＨＢＲ−１，保存溶液の１／５０希釈。ｐＨを９.２に調整。
【０１５３】
反応混合物を３７℃で４時間インキュベートし、ビーズを５mLの０.１７Ｍグリシン、０.１Ｍ ＮａＣｌ，１０mg／mLのＢＳＡ，１０mMのＥＤＴＡ ｐＨ ９.２の緩衝液によりr.t.で１時間ブロックし、ビーズ懸濁液を１×５mLの０.１７Ｍグリシン、０.１Ｍ ＮａＣｌ，１０mg／mLのＢＳＡ，１０mMのＥＤＴＡ ｐＨ ９.２ついで４×５mLのＬＯＣＩで洗浄し、５.０mLのＬＯＣＩ緩衝液に４℃で保存した。
【０１５４】
関連緩衝液は次のように調製される。ＬＯＣＩプレストレス緩衝液：ＬＯＣＩ緩衝液は１０mM ビス−トリスを含有し、ｐＨ ９.０に調整する。ＬＯＣＩ−ｈｃｙ−アッセイ緩衝液（Assay Buffer）：５０mM ホウ酸塩緩衝液，０.３Ｍ ＮａＣｌ，０.１％デキストランT-500，０.０５％ Ｋathon，０.０１％ゲンタマイシン，０.１％Tween-20およびＨＢＲ−１，保存溶液の１／５０希釈。ｐＨを９.２に調整。
【０１５５】
以下のアッセイプロトコールは、好ましくは自動化装置（たとえば、自動化されたTecan-1装置）で実施されるが、また他の自動化装置での使用または非自動化での使用に適合されてもよい。関連技術の熟練者は以下のプロトコールを然るべく修飾することができる。
【０１５６】
Ｂ．３−試薬プロトコール
ｈｃｙ−ＡＢＡ−センシタイザービーズ（０.１mg／mL）および２mM ＴＣＥＰの混合物５０μLを反応キューベット中５μL ｈｃｙ血清カルビレーターに加え、ついで５０μLのアッセイ緩衝液を加える。混合物を４１７秒間インキュベートする。ついで、５０μLの５mM ＢＡＢＡ、ついで４５μLのアッセイ緩衝液を加える。１５７秒間インキュベートしたのち、５０μLのＡｂ−コートアクセプタービーズを加える（０.２５〜０.５mg／mLにおいて）。１５４秒のインキュベーション後、サンプルを読む。
【０１５７】
Ｃ．２−試薬プロトコール
ブロモアセチル安息香酸（ＢＡＢＡ）の他の試薬との不適合性、ならびにその限られた溶解性および安定性によって、ＣＡＢＡのエノールホスフェート誘導体（ＣＡＢＡ−ホスフェート）、ｐｒｏ−ＣＡＢＡ化合物についても検討する。誘導体化物質としてハロケトンのエノールホスフェート誘導体の使用の更なる利点は、自動化ＬＯＣＩアッセイに使用されるような自動化装置で２−試薬プロトコールを使用できる可能性である。
【０１５８】
５０μLのｈｃｙ−ＡＢＡ−センシタイザービーズ（０.１mg／mL）および２mM ＴＣＥＰの混合物５０μLを反応キューベット中５μL ｈｃｙ血清カルビレーターに加え、ついで１００μLのアッセイ緩衝液を加える。混合物を４１７秒間インキュベートする。ついで、５０μLのＡｂ−コートアクセプタービーズ（０.５mg／mL）およびアルカリホスファターゼ（１mg／mL）、ついで４５μLのアッセイ緩衝液を加える。１５７秒間インキュベートしたのち、３−試薬標準プロトコールの場合と同様にサンプルを読む。
【０１５９】
Ｄ．ＢＡＢＡによる３−試薬プロトコールの実施：
いわゆる３−試薬プロトコールアッセイフォーマットにおいて、ＴＣＥＰと混合したｈｃｙ−センシタイザービーズを第一の試薬として使用する。Ａｂ−コートアクセプタービーズはサンプル誘導体化工程後に加えられる第三の試薬として用いた。これは、可溶性ビーズおよび第三工程におけるアクセプタービーズ上のＡｂに対するビーズ結合ｈｃｙ−ＡＢＡの間の均一な競合を生じる。特異的なビーズ凝集により最大のシグナルは血清中にｈｃｙが存在しない場合に生じる。このビーズ凝集は血清サンプル中のｈｃｙによって阻害されるので、シグナルは血清中のｈｃｙの量と逆比例する。緩衝液中のホモシステインはカリブレーターとして使用される。
【０１６０】
ＬＯＣＩホモシステインアッセイは自動化LOCI Tecan装置により実施される。試薬および血清サンプルをこの装置上４℃に保持するが、アッセイ緩衝液および反応キュベットは３７℃に保持する。アッセイは３７℃で行われ、ここに記載されるように３−試薬プロトコールが用いられるが、別の誘導体化試薬としてＣＡＢＡ−ホスフェートとともに、以下の作業では２−試薬プロトコールも用いられる。
【０１６１】
ホモシステインの標準曲線は、ＨＰＬＣによって定量されたプール血清中にホモシステインをスパイクして調製された６つのカリブレーターを用いて構築される。６０％以上のシグナル修飾が２％血清サンプルを用いて得られる（データは示していない）。各種工程における反応混合物の容量は、この工程がアルキル化工程よりも遅いので、還元剤の最大濃度のために至適化する。使用したＴＣＥＰの最終量はアルキル化剤よりも少なかった。
【０１６２】
イントラ−アッセイＣＶはレプリケート（同じサンプルを用いて）でのカリブレーターの測定によって得られる。シグナル測定および濃度定量のＣＶは表１に示す。表１には、３−試薬アッセイプロトコールおよび上述のように２−試薬アッセイプロトコールが使用される。
【０１６３】
ＢＡＢＡの安定性は、表２に示すように３つの異なるｐＨにおいて試験する。表２においては、３−試薬アッセイプロトコールを前述のように使用し、５mMのＢＡＢＡは異なるｐＨの緩衝液にＲ−２（試薬２）として保存する。
ＢＡＢＡの活性は、３−試薬プロトコールを用いるＬＯＣＩによって得られる総アッセイシグナル修飾の量によりモニターする。ＢＡＢＡのわずかに限られた安定性はｐＨ ６.０の至適条件でも得られる。
【０１６４】
Ｅ．誘導体化物質としてのＣＡＢＡ−ホスフェートの実施：
ＣＡＢＡのエノールホスフェート誘導体を合成する。ＣＡＢＡ−ホスフェートは広いｐＨ範囲にわたって容易に溶解し、酵素によって誘発されるまでは不活性であり、酵素はアッセイの定められた工程で添加される。したがってそれは２−成分アッセイの可能性を有する。２−試薬プロトコールでは、試薬−１（Ｒ１）は、５０μg／mLでのｈｃｙ標識センシタイザービーズ、２mM ＴＣＥＰ，および５mM ＣＡＢＡ−ホスフェートのアッセイ緩衝液中の混合物であり、試薬−２（Ｒ−２）は、０.１mg／mLのＡｂ−コートアクセプタービーズのアッセイ緩衝液中０.１mg／mLのアルカリフォスファターゼとの混合物である。このプロトコールにおいては、５０μLのＲ１, ５〜１０μLのサンプルおよび５０μLのアッセイ緩衝液を混合し、３７℃で７分間インキュベートし（工程１）、ついで５０μLのＲ２および１００μLのアッセイ緩衝液を加える。反応混合物をさらに３分間インキュベートする。ＬＯＣＩの読みは上述のように行う。ＣＡＢＡ−ホスフェートを誘導体化物質として用いいるｈｃｙ血清カリブレーターの標準曲線および２−試薬プロトコールを決定する（データは示していない）。６０％以上のシグナル修飾が２％血清サンプルを用いて得られる
【０１６５】
誘導体化物質としてＣＡＢＡ−ホスフェートを使用する３−試薬アッセイプロトコールも評価する。ＢＡＢＡを用い３−試薬プロトコールでｈｃｙ血清カリブレーターにより類似の結果が得られる（データは示していない）。ＣＡＢＡの安定性についても検討する。ＣＡＢＡ−ホスフェートの誘導体化物質としての安定性は、３−試薬プロトコールを用いるＬＯＣＩによって得られる総アッセイシグナル修飾の量によりモニターする。それは表３に示すように、ＢＡＢＡよりはるかに長い貯蔵寿命を有する。表３には、３−試薬アッセイプロトコールを、Ｒ−２としてｐＨ ９.０において２つの温度で保存したＣＡＢＡ；Ｒ−１として混合ｈｃｙ−センシタイザービーズおよびＴＣＥＰ；Ｒ−３として混合Ａｂ−アクセプタービーズおよびアルカリフォスファターゼにより使用する。
【０１６６】
Ｆ．相関試験：
この相関試験では、ＢＡＢＡを用いる同じ３−試薬プロトコール、ならびに誘導体化物質としてＣＡＢＡ−ホスフェートを用いる同じ３−試薬プロトコールを使用する。結果は表４−ａに示す。誘導体化物質としてＢＡＢＡまたはＣＡＢＡ−ホスフェートいずれでも、表４−ａに示すようにＬＯＣＩによる３−試薬プロトコールを用いて類似の結果が得られる。２−試薬プロトコールを用いるＬＯＣＩ vs. ＨＰＬＣの相関は表４−ｂに示す。２−試薬プロトコールは３−試薬プロトコールよりもＨＰＬＣと若干よい相関を生じる。この結果は、自動化装置でも、３−試薬プロトコールより２−試薬プロトコールにける良好なアッセイの正確さを指示するものと思われる。したがって、ｈｃｙ定量のための迅速な−完全に自動化される抗体−ビーズアッセイの可能性が証明される。
【０１６７】
【表２】
0004684511.tif 000009
【０１６８】
【表３】
0004684511.tif 000010
【０１６９】
【表４】
0004684511.tif 000011
【０１７０】
【表５】
0004684511.tif 000012
【０１７１】
実施例３
血清／血漿中ホモシステインの定量のためのＥＩＡ
Ａ．材料
ホモシステイン（ｈｃｙ）の酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）は、標準操作に従い、典型的には次のように実施する。以下の成分、すなわち非コートチューブ；ストレプトアビジンコートマイクロタイタープレート；水中還元剤（たとえばＴＣＥＰ）；ＣＡＢＡ−ホスフェート；アルカリホスファターゼ溶液；ビオチンに結合した抗−ホモシステイン−ＡＢＡモノクローナル抗体；西洋ワサビペルオキシダーゼに接合したホモシステイン−ＡＢＡ（ＨＲＰ）の溶液；ＨＲＰ基質溶液；および洗浄緩衝液である。ホモシステインカリブレーターは、好ましくは標準プロトコールによって血清または血漿プールの既知濃度をスパイクして調製する。
【０１７２】
Ｂ．操作
最初に、サンプル調製チューブ中、５μLの血清、血漿サンプルまたはカリブレーター対照を水中１０μLの１０mM ＴＣＥＰと混合する。混合物を１０分間３７℃でインキュベートする。次に、５０μLの８mM ＣＡＢＡ−ホスフェート（０.１Ｍリン酸塩緩衝液，ｐＨ ７.５）、および５０μLのアルカリホスファターゼ溶液（１mg／mL, ホウ酸塩緩衝液，ｐＨ ９.２）を混合し、混合物を５分間３７℃でインキュベートする。
【０１７３】
３５０μLのホウ酸塩緩衝液(ｐＨ ９.０）をついで反応混合物に加え、この希釈された反応混合物をストレプトアビジンでコートされたマイクロタイターウエルに加える。次に、２５μLのビオチン標識抗−ホモシステイン−ＡＢＡモノクローナル抗体（２ピコモルの抗体含有）を各マイクロタイターウエルに加え、混合物を室温で振盪しながら２０分間インキュベートする。
【０１７４】
２５μLのＨＲＰ−ＡＢＡ−ホモシステイン接合体（０.１５μgの酵素接合体を含有する）を各反応混合物に加え、この混合物をさらに１０分間室温で振盪しながらインキュベートする。ついで、反応混合物を吸引して、マイクロタイターウエルを０.０５％Tween-20を含むリン酸塩緩衝液で洗浄する。
【０１７５】
ＨＲＰ基質溶液（たとえば、ELISA Tech. からのK-Blue）を洗浄したウエルに加え、室温で１０〜３０分インキュベーションしたのち、色の発生をマイクロタイタープレートリーダーを用いて読む。発色は抗体との相互作用によってマイクロタイターウエルに結合した酵素接合体の量に正比例する。結合した酵素接合体の量はサンプル中のホモシステインの定量はカリブレーターの定量によって生じた標準曲線から計算する（下記参照）。
【０１７６】
ＨＲＰ−ＡＢＡ−ホモシステイン接合体はＡＢＡ−ホモシステインの固体表面への固定化についての記載と同様にして調製する。ビオチン−標識モノクローナル抗体は関連技術の熟練者には周知の方法で調製される。
ビオチン化抗体：抗−ホモシステイン−ＡＢＡモノクローナル抗体（たとえば、15C12, Dade Behring, Deerfield, IL）または任意の他の適当な抗−ｈｃｙ−ＡＢＡ抗体はほぼ次のようにしてビオチン化される。すなわち、７.５mg（９.７５mL）のアリコートの全部を、２×２Ｌの０.１Ｍ ＮａＨＣＯ3（ｐＨ ８.０）に対し冷却条件下に透析し、Centriprep 30で４.６５mLに濃縮する。濃度はＵＶ（１.１mg／mL）で定量して、５.１３mgの回収を与える。ゲル電気泳動（たとえば、Paragonゲル電気泳動）を用いて単一のバンドの存在を確認する。
【０１７７】
次に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドビオチンアミドカプロン酸エステルを１３mMでＤＳＭＯに溶解し、ついで抗体溶液を加えて、５：１, １０：１および２５：１のモル比を得る。１.５mgのＡｂを各プレパレーションに使用する。室温で２時間、暗所に置いたのちに、反応混合物を冷却条件において２×２Ｌのリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ；１０mM ＮａＨＰＯ4, １５０mM ＮａＣｌ, ｐＨ ７.４）に対して透析する。濃度はＵＶで定量する。生成物は０.０５％のナトリウムアジドとともに冷蔵庫に保存する。
【０１７８】
血清カリブレーター：血清カリブレーション曲線は、個体（たとえば、３８例の正常個体）からの血清をプールして発生させた血清サンプルにスパイクした既知量のホモシステインによって発生させる。血清カリブレーターは枯渇させたプール血清または非処理プール血清のいずれかから調製する。ホモシステイン濃度はＨＰＬＣによる処置の前後に、たとえば参考実験室で確認する。
【０１７９】
特定の実施態様および実施例を含む以上の説明は、本発明を例示するものであり、本発明の限定を意図するものではない。本発明の真の精神および範囲から逸脱することなく、多くの改変および修飾が可能である。