(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）表面コーティング材料であって、溶媒ベース系中のポリ塩化ビニル樹脂、溶媒ベース系中の塩素化ゴム、溶媒ベース系または水性系中のアクリル樹脂およびメタクリル樹脂、水性分散体または溶媒ベース系としての塩化ビニル−酢酸ビニルコポリマー系、ブタジエンコポリマー、ブタジエン−スチレンゴム、ブタジエン−アクリロニトリルゴム、ブタジエン−スチレン−アクリロニトリルゴム、乾性油、アマニ油、アルキド樹脂、アスファルト、エポキシ樹脂、ウレタン樹脂、ポリエステル樹脂、フェノール樹脂、それらの誘導体および混合物から選択される、表面コーティング材料；
（ｉｉ）第１の酵素および第１の基質であって、ここで、該第１の基質が第２の基質のオリゴマーまたはポリマーであり、そしてここで、該第１の基質がスターチ、セルロース、デキストロース、ペプチド、イヌリンおよびそれらの混合物からなる群から選択され、該第２の基質がオキシダーゼのための基質であり、そしてここで、該第１の酵素が該第１の基質から該第２の基質を生成し得る、第１の酵素および第１の基質；ならびに
（ｉｉｉ）第２の酵素であって、ここで、該第２の酵素がグルコースオキシダーゼ、Ｌアミノ酸オキシダーゼ、Ｄアミノ酸オキシダーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、ピラノースオキシダーゼ、リンゴ酸オキシダーゼ、アスパラギン酸オキシダーゼ、Ｄグルタミン酸オキシダーゼおよびそれらの混合物から選択されるオキシダーゼであり、そしてここで、該第２の酵素が、該第２の基質に作用するとき防汚化合物を生成する、第２の酵素
を含む、防汚組成物。
【請求項２】
前記第１の基質が水不溶性である、請求項１に記載の防汚組成物。
【請求項３】
前記オキシダーゼが、海洋生物からである、請求項１または２に記載の防汚組成物。
【請求項４】
前記オキシダーゼが、海洋藻類からである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記オキシダーゼが、Ｃｈｏｎｄｒｕｓ  ｃｒｉｓｐｕｓからである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記オキシダーゼが、ヘキソースオキシダーゼである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
前記ヘキソースオキシダーゼが、
ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列、あるいは
ｂ）１または数個のアミノ酸の置換、欠失または付加によって配列番号１に記載のアミノ酸配列から誘導された配列を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
前記ヘキソースオキシダーゼが、このタンパク質をコードする遺伝子の組換え宿主生物におけるクローニングおよび発現によって得られる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
前記第２の基質が糖である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記糖がグルコースである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記第１の酵素がアミログルコシダーゼである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記第１の基質がスターチである、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
前記組成物が、コーティング、ラッカー、ステインまたはエナメルとして処方される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の組成物からなる、コーティング組成物。
【請求項１５】
屋外用木工製品、セントラルヒーティングシステムの外表面、および海洋船舶の船体から選択される表面の処理のために処方される、請求項１４に記載のコーティング組成物。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の組成物からなる、海洋防汚剤。
【請求項１７】
前記防汚剤が自己研磨性である、請求項１６に記載の海洋防汚剤。
【請求項１８】
表面コーティングから防汚化合物を放出するための方法であって、該方法が、表面コーティング中に
（ｉ）第１の酵素および第１の基質であって、ここで、該第１の基質が第２の基質のオリゴマーまたはポリマーであって、そしてここで、該第１の基質が、スターチ、セルロース、デキストロース、ペプチド、イヌリンおよびそれらの混合物からなる群から選択され、該第２の基質がオキシダーゼのための基質であり、そしてここで、該第１の酵素が該第１の基質から該第２の基質を生成する、第１の酵素および第１の基質；ならびに
（ｉｉ）第２の酵素であって、ここで、該第２の酵素がグルコースオキシダーゼ、Ｌアミノ酸オキシダーゼ、Ｄアミノ酸オキシダーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、ピラノースオキシダーゼ、リンゴ酸オキシダーゼ、アスパラギン酸オキシダーゼ、Ｄグルタミン酸オキシダーゼ、およびそれらの混合物から選択されるオキシダーゼであり、そしてここで、該第２の酵素が該第２の基質に対する作用によって防汚化合物を生成する、第２の酵素を配合する工程を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、防汚性組成物（ａｎｔｉ−ｆｏｕｌｉｎｇ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）に関する。特に、本発明は、防汚効果を有する化合物を産生し得る酵素を含む防汚性組成物に関する。
【０００２】
ＵＳ−Ａ−５０７１４７９で論じられているように、殺生物剤は多くの異なる状況下で必要とされる（例えば、家屋塗料中の抗真菌剤、淡水の殺藻剤、海水の植物相および動物相に曝露される海洋構造物のための防汚剤）。公知のように、白カビおよび真菌は、家屋塗料などの上で生長し得、そして塗料の媒体を栄養として利用し、あるいは、いくつかの場合には、その下にある基材（例えば、木）を栄養素として利用する。明らかな理由から、これは、塗料表面に損傷を与え得、および／または塗料表面の外観を損ない得る。殺生物剤を塗料に配合してもよく、真菌の菌糸体および子実体が塗膜に接触または浸透して、そのため、その塗膜中の殺生物剤と密接に接触することにより、真菌は破壊される。淡水を用いる冷却塔において、ヘドロ、カビ、および藻が、それらの生長に対抗する有効な化合物が存在しない場合に発生し得る。
【０００３】
ＵＳ−Ａ−５０７１４７９に論じられているように、船舶の船体の浸水している部分における海洋生物の生長は、特に問題がある。このような生長は、船体の水への通過に対する摩擦抵抗を増大させ、その結果、燃料消費の増加、および／または船の速度の低下を引き起こす。海洋生物の生長の蓄積は、非常に急速なので、乾ドックにおける必要に応じての清掃および再塗装による措置は、通常、高価になると考えられる。長年にわたってますます高い効力で実施されている別の方法は、防汚剤を配合したトップコート塗料を船体に塗布することによって、付着物の範囲を制限することである。防汚剤は殺生物剤であり、この殺生物剤は、船体表面の海洋生物に対して致死的な濃度で、長期間にわたって塗料の表面から遊離する。防汚性塗料は、塗料表面で利用可能な殺生物剤の濃度が致死濃度を下回ったときにのみ、作用しなくなり、最新の塗料では、有用な寿命は２年目までと予期されている。
【０００４】
特に海洋の防汚において、非常に広範囲に使用されている殺生物剤は、トリブチルスズ（ＴＢＴ）である。しかし、このような有機スズ殺生物剤を水中（海洋）用途のためのコーティング組成物中の防汚活性成分として現在の市販のレベルで使用することによって引き起こされる環境への影響に関する懸念が高まっている。特にトリブチルスズ型の化合物は、船底用の塗料中に２０重量％もの高い濃度で広範囲に使用されているので、浸出による周囲の水の汚染が、イガイおよび甲殻類生物の分解を引き起こすようなレベルに達していることが示されている。これらの影響は英仏の海岸線に沿って検出されており、そして同様の影響が米国および極東の海域においても確認されている。最近の規則制限下では、限定された例外を除いて、２５メートルまでの遊覧船はもはや、高レベルのトリブチルスズ化合物を含む防汚塗料の使用が許可されていない。
【０００５】
研究によれば、スズの浸出速度が１日当たり約４μｇ／ｃｍ2以下に維持され得る限り、水生生物は長期間にわたって影響をうけないようであることが示されている。しかし、海藻、ならびに高等進化海洋生物の制御に有効であるためには、船底の塗装面から、約９から１６μｇ／ｃｍ2／日のスズの一定の最小浸出速度が必要とされることもまた見いだされている。通常、この高い浸出速度は、トリブチルスズ化合物の濃度が塗料重量の約１５％から２０％で達成される。
【０００６】
ＴＢＴの有効性の観点から、防汚性有機スズ活性成分の満足すべき代替物が存在しない以上、より大きい船（すなわち、長さ２５メートルを超える船）は、付着物の最小化のためにこのような化合物を用いることがまだ許可されていることに、規制当局は不本意ながら同意している。従って、ＴＢＴに基づく化合物の代替の殺生物剤を提供することが望まれる。
【０００７】
ＵＳ−Ａ−４２９７１３７は、防汚性組成物の効果を、防汚性成分の放出を節制することによって延長し得ることを開示する。この文献は、不連続な固体マトリックスに均一に配合された、海洋生物に対して毒性の少なくとも１つの物質を含む防汚性塗料を開示し、この固体マトリックスは海水に対して難溶性であり、塗料中に分散されている。マトリックスは少なくとも部分的に、阻害されるべき海洋生物、および／または塗料に接触する細菌の膜によって放出される酵素の作用下で海水に可溶性となる、少なくとも１つの物質から形成される。それゆえ、海洋生物が塗装面に会合したとき、毒性物質が放出され、そして生物が阻害される。先行技術の開示と同様に、ＵＳ−Ａ−４２９７１３７によって認識されている毒性物質は、周知の銅およびスズに基づく化合物、例えばＴＢＴのみを包含している。
【０００８】
Ａｂａｒｚｕａら、Ｍａｒ．Ｅｃｏｌ．Ｐｒｏｇ．Ｓｅｒ．、第１２３巻：３０１−３１２、１９９５「Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｏｆｏｕｌｉｎｇ．Ｉ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｏｆｏｕｌｉｎｇ」は、藻類および海洋無脊椎動物からの、抗細菌、抗藻類、抗原生動物および抗マクロ付着（ｍａｃｒｏｆｏｕｌｉｎｇ）特性を有する生物源因子の抽出を提唱する。抽出された因子の構造を決定し、次に合成し、そして合成された因子を生物付着の防止に使用し得ることが提唱されている。抽出または合成の教示は提供されていない。
【０００９】
ＥＰ−Ａ−０８６６１０３は、抗微生物活性を有する化合物の制御放出方法およびこの系を利用したコーティング組成物を開示する。この方法は、酵素および基質をマトリックス中に配合することを含む。酵素が基質と作用して、化合物を提供する。認識されている実施態様において、更なる酵素によって化合物が作用し得る。基質および酵素が、抗微生物活性を有する化合物を生成する。
【００１０】
ＵＳ−Ａ−５７４７０７８は、食品に関する。この文献は、重篤な健康問題を引き起こし得る微生物の食品および飼料への混入が、過酸化水素の徐放を与えるラクトペルオキシダーゼ系を含む組成物によって阻害され得ることを教示する。過酸化水素は、オキシドレダクターゼと酸化可能基質との反応によって調製される。過酸化水素は、次に、ラクトペルオキシダーゼによる触媒作用下でチオシアナートと反応して、次亜チオシアナートを生成する。次亜チオシアナートは次に、抗微生物剤として作用し得る。この文献は、固定化酵素系の背景的教示を提供する。この文献は、防汚特性をもたらす防汚剤または任意の微生物に関しては、触れていない。
【００１１】
本発明は、先行技術の問題点を解消する。
【００１２】
本発明の局面は、添付の特許請求の範囲において定義される。これら、ならびに他の好適な局面を以下に論じる。
【００１３】
海洋生物由来の酵素を利用した防汚性化合物の生成のための一体化された系の提供が、安定な系を提供することを見出した。この安定な系は、以下の通りである。
・海洋環境のような厳しい環境下において長期間の有効性を有する。
・所定の抗微生物効果を提供するために、先行技術の系よりも少ない基質しか必要としない。
【００１４】
藻類ヘキソースオキシダーゼ（ＨＯＸ）のような、海洋生物由来の酵素は、グルコースに対して低いＫｍ値、すなわち２．７ｍＭを有する。この低いＫｍは、酵素がグルコースに対して非常に高い親和性を有することを意味する。対照的に、非海洋性グルコースオキシダーゼ（ＧＯＸ）のような非海洋性酵素は、グルコースに対して少なくとも１０倍高いＫｍ値を有し得る。換言すると、先行の酵素系は、本発明の酵素系よりも、グルコースに対してはるかに低い親和性を有する。防汚用途において、これは顕著な違いを与える。なぜなら、高いグルコース親和性を有する酵素は、存在するグルコースを全て転化し得るからである。他方、より低いグルコース親和性を有する酵素は、グルコースが周囲の環境中に浸出することを許容すると予想される。グルコースの浸出は、所望の防汚活性に逆行する。なぜなら、グルコースは付着生物に対する基質だからである。従って、グルコースの浸出は、付着物の増大を引き起こす。
・所定の抗微生物効果を提供するために、先行技術の系よりも少ない酵素しか必要としない。
【００１５】
海洋生物由来の酵素、例えば、藻類ＨＯＸはまた、酸素に対しても低いＫｍ値を有し、これはまたＧＯＸのような先行技術の系の、酸素に対するＫｍ値よりも低い。この基質に対する高い親和性は、また、藻類ＨＯＸに利点を与える。なぜなら、防汚用途において、最悪の付着は、港のような、水の交換が少なく、そして藻および他の付着生物の生長が多い、「閉鎖」された環境中で起こるからである。ちょうどこのような場所では付着が最悪であり、水中の酸素含量もまた外海に比べて、最も低い。従って、酸素に対する親和性が高い、海洋生物由来の酵素は有利である。
・適当な操作温度で向上した活性を提供する。
【００１６】
防汚塗料のような表面コーティング組成物中で、抗微生物（防汚性）化合物は、典型的には、１５℃と３０℃との間で活性でなければならない。防汚性組成物については、これは付着が問題を引き起こす海水温度である。先行技術の系とは対照的に、海洋生物由来の酵素、例えば、藻類ＨＯＸは、ちょうど付着に対して至適な温度で活性の至適温度を有し、従ってこれらの酵素は防汚剤として完璧に適している。至適温度を実施例９に示す。
・安全で、容易に入手可能な基質を利用する。
・向上した耐塩性を有し、この耐塩性がさらに、海洋環境中での向上した活性をもたらす。
・汚染生物による分解に抵抗性である。
【００１７】
海洋生物由来の酵素、例えば藻類ＨＯＸは、顕著なプロテアーゼ耐性酵素である。これらは、プロナーゼ（広いスペクトルのプロテアーゼ調製物）による処理に対して、活性の損失なく耐える。このプロテアーゼ耐性は、防汚用途において特に重要であると考えられる。なぜなら、それにより、酵素が、コーティングされた表面にそれ自体が付着しようとする防汚性生物由来のプロテアーゼによる分解に対して耐性となるからである。
【００１８】
本明細書において、用語「防汚（ａｎｔｉ−ｆｏｕｌ（ｓ））」、「防汚性（ａｎｔｉ−ｆｏｕｌｉｎｇ）」、および「防汚剤（ａｎｔｉ−ｆｏｕｌａｎｔ（ｓ））」によって言及される「付着物（ｆｏｕｌａｎｔ（ｓ））」は、本発明の組成物で処理される表面上で存在および／または生長し得る生物を包含する。この生物は、細菌、真菌、および原生動物、ならびに藻類のような微生物、ならびに藻類、植物および動物のような生物を含む。この生物は、海洋生物であり得る。
【００１９】
本発明の組成物は、前駆体酵素および前駆体基質を含み、ここで前駆体酵素および前駆体基質は、前駆体酵素の前駆体基質に対する作用によって、本発明の酵素に対する基質を生成する。前駆体酵素および前駆体基質のこの組合せを、以下、本明細書中で、「基質ジェネレータ（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｇｅｎｅｒａｔｏｒ）」と呼ぶ。
【００２０】
本発明の系の酵素は、海洋微生物から得られたものでもよく、あるいは海洋微生物から入手可能であり得るものでもよい。
【００２１】
好ましくは、本系の酵素は、海藻類から得られるか、あるいは入手可能であり得る。好ましくは、本発明の系の酵素は、Ｃｈｏｎｄｒｕｓ  ｃｒｉｐｕｓから得られるか、あるいは入手可能であり得る。
【００２２】
好ましくは、防汚性化合物は過酸化水素である。
【００２３】
好ましくは、酵素はオキシダーゼである。好ましくは、酵素は、グルコースオキシダーゼ、Ｌアミノ酸オキシダーゼ、Ｄアミノ酸オキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、ピラノースオキシダーゼ、リンゴ酸オキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、アリールアルコールオキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、ラソステロール（ｌａｔｈｏｓｔｅｒｏｌ）オキシダーゼ、アスパラギン酸オキシダーゼ、アミンオキシダーゼ、Ｄグルタミン酸オキシダーゼ、エタノールアミンオキシダーゼ、ＮＡＤＨオキシダーゼ、尿酸オキシダーゼ（ウリカーゼ）、およびそれらの混合物から選択される。好ましくは、酵素はヘキソースオキシダーゼである。
【００２４】
（ヘキソースオキシダーゼ（ＨＯＸ）酵素）
ヘキソースオキシダーゼ（Ｄ−ヘキソース：Ｏ2−オキシドレダクターゼ、ＥＣ１．１．３．５）（ＨＯＸとも呼ぶ）は、酸素の存在下で、Ｄ−グルコースおよびいくつかの他の還元糖（マルトース、ラクトースおよびセロビオースを含む）を、その対応するラクトンへと酸化し得、引き続き、加水分解して、各々のアルドビオン酸（ａｌｄｏｂｉｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）にする。従って、ＨＯＸは、Ｄ−グルコースのみを転化し得る別のオキシドレダクターゼ、グルコースオキシダーゼとは、この酵素ＨＯＸが、広範囲の糖基質を利用し得るという点で異なる。ＨＯＸによって触媒される酸化は以下のように示され得る：
Ｄ−グルコース＋Ｏ2−−−＞γ−Ｄ−グルコノラクトン＋Ｈ2Ｏ2、または
Ｄ−ガラクトース＋Ｏ2−−−＞γ−Ｄ−ガラクトノラクトン（ｇａｌａｃｔｏｎｏｌａｃｔｏｎｅ）＋Ｈ2Ｏ2。
ＨＯＸはいくつかの海藻種から天然に産生される。このような種はとりわけ、Ｇｉｇａｒｔｉｎａｃｅａｅ科の中に見いだされる。本明細書において使用される場合、用語「ＨＯＸ」は、Ｄ−グルコース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−マンノース、マルトース、ラクトースおよびセロビオースからなる群から選択される基質を酸化し得る酵素を表す。
【００２５】
好ましくは、ヘキソースオキシダーゼは、海藻Ｃｈｏｎｄｒｕｓ  ｃｒｉｐｕｓから入手可能であるか、または得られる。
【００２６】
１つの局面において、ヘキソースオキシダーゼ酵素は、ＥＰ−Ａ−０８３２２４５の開示によって包含される酵素である。
【００２７】
（ヘキソースオキシダーゼ（ＨＯＸ）の産生）
ＨＯＸ酵素をコードする遺伝子は、海藻Ｃｈｏｎｄｒｕｓ  ｃｒｉｐｕｓからクローニングされた（ＳｔｏｕｇａａｒｄおよびＨａｎｓｅｎ、１９９６、ＨａｎｓｅｎおよびＳｔｏｕｇａａｒｄ、１９９７）。メチロトローフ（ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃ）酵母Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ（Ｒｈｅｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｄｕｓｓｅｌｄｏｒｆ／Ｇｅｒｍａｎｙで、異種タンパク質の発現系として開発）もまた、ＨＯＸ酵素の産生のために用いられている（ネイティブなタンパク質は海藻から精製された（ＰｏｕｌｓｅｎおよびＨφｓｔｒｕｐ、１９９８））。ＷＯ  ９６／４０９３５およびＷＯ  ９８／１３４７８もまた、ＨＯＸ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の組換え宿主生物中でのクローニングおよび発現を開示する。
【００２８】
好ましい実施態様において、ヘキソースオキシダーゼ酵素は、配列番号１に示されるアミノ酸配列、あるいはその変異体、ホモログ、誘導体またはフラグメントを含む。好ましい実施態様において、ヘキソースオキシダーゼ酵素は、配列番号１に示すアミノ酸配列を含む。
【００２９】
好ましい実施態様において、ヘキソースオキシダーゼ酵素は、配列番号１に示されるヌクレオチド配列、あるいはその変異体、ホモログ、誘導体またはフラグメントによってコードされる。好ましい実施態様において、ヘキソースオキシダーゼ酵素は、配列番号１に示されるヌクレオチド配列によってコードされる。
【００３０】
好ましい実施態様において、ヘキソースオキシダーゼ酵素は、配列番号１に示されるヌクレオチド配列、あるいはその変異体、ホモログ、誘導体またはフラグメントにハイブリダイズし得るヌクレオチド配列、あるいはそのハイブリダイズし得る配列に対して相補的な配列によってコードされる。好ましい実施態様において、ヘキソースオキシダーゼ酵素は、配列番号１に示されるヌクレオチド配列にハイブリダイズし得るヌクレオチド配列、あるいはそのハイブリダイズし得る配列に対して相補的な配列によってコードされる。
【００３１】
酵素、好ましくは、ヘキソースオキシダーゼ酵素は、英国特許出願番号第９９２７８０１．２号に記載の方法で調製され得る。
【００３２】
（変異体／ホモログ／誘導体（アミノ酸配列））
本発明の好ましいアミノ酸配列は、配列番号１に示され、あるいは本発明のＨＯＸ酵素から得られ得る配列であるが、また、任意の供給源、例えば、関連のウイルス／細菌タンパク質、細胞ホモログおよび合成ペプチドから得られる相同な配列、ならびにそれらの変異体または誘導体も包含する。
【００３３】
それゆえ、本発明は、本明細書において提示されるアミノ酸配列の変異体、ホモログまたは誘導体、ならびにこれらのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の変異体、ホモログまたは誘導体を包含する。
【００３４】
本発明の文脈において、相同配列は、少なくとも、例えば、本明細書の配列表の配列のうち配列番号１に示されるアミノ酸配列に関して、アミノ酸レベルで少なくとも７５、８５または９０％同一、好ましくは、少なくとも９５％または９８％同一のアミノ酸配列を包含するように選択される。特に、相同性は、典型的には、酵素活性に関して、必須ではない隣接の配列よりもむしろ、必須であることが知られている配列の領域に関して考慮されるべきである。これらの領域は、限定はされないが、ＨＯＸ中の推定ＦＡＤ結合ドメイン、例えば、ＳＧＧＨ79Ｃ、ＬＧＧＨ146ＩおよびＬＧＧＨ320Ａを含む。相同性はまた、類似性に関して考慮され得るが（すなわち、類似の化学的特性／機能を有するアミノ酸残基）、本発明の文脈において、相同性は、配列の同一性に関して表現されることが好ましい。
【００３５】
相同性の比較は、目視によって、あるいは、もっと普通には、容易に入手可能な配列比較プログラムの補助の下に行われ得る。これらの市販のコンピュータプログラムは、２以上の配列の間の％相同性を計算し得る。
【００３６】
％相同性は、連続した配列に関して計算され得る。すなわち、１つの配列を他の配列と整列し、そして１つの配列中の各アミノ酸を他の配列中の対応のアミノ酸と、一度に１つの残基ずつ、直接比較する。これは、「アンギャップ（ｕｎｇａｐｐｅｄ）」整列と呼ばれる。典型的には、このようなアンギャップ整列は、比較的短い残基数に対してのみ行われる。
【００３７】
これは、非常に単純かつ一貫した方法であるが、例えば、それ以外は同一の配列の対において、１つの挿入または欠失がそれ以降のアミノ酸残基を整列から外れさせ、それにより、全体的な整列を行ったときに、％相同性における非常な低下を潜在的にもたらすような場合を、考慮できない。従って、大部分の配列比較方法は、全体としての相同性スコアに過度の不利を与えることなく、可能性のある挿入および欠失を考慮に入れて、至適な整列を生成するように設計されている。これは、配列の整列中に「ギャップ」を挿入して、局所相同性を最大化するように試行することによって、達成される。
【００３８】
しかし、これらのより複雑な方法は「ギャップペナルティ」を整列において生じる各ギャップに割り当て、同じ数の同一のアミノ酸に対して、できる限り少ないギャップの配列整列（比較される２つの配列間のより高い関連性を反映する）が、多くのギャップを有するものよりも高いスコアを達成するようにする。「アフィンギャップコスト」は、典型的には、ギャップの存在に対して比較的高いコストを課し、そしてギャップ中の、その後に続く各配列に対して、より少ないペナルティを課すために用いられる。これは、最も普通に用いられているギャップスコアリングシステムである。高いギャップペナルティは、もちろん、より少ないギャップで至適化された整列を生じる。大部分の整列プログラムは、ギャップペナルティを調節することを可能とする。しかし、このようなソフトウエアを配列の比較のために用いる場合には、デフォルトの値を用いることが好ましい。例えば、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージ（下記参照）を用いる場合、アミノ酸配列に対するデフォルトのギャップペナルティは、１ギャップに対して−１２であり、各伸長に対して−４である。
【００３９】
従って、最大％相同性の計算は、最初に、ギャップペナルティを考慮に入れて、至適な整列を作成することを必要とする。このような整列を行うための適切なコンピュータプログラムはＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージ（ウィスコンシン大学、米国；Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、１９８４、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２：３８７）である。配列比較を行い得る、その他のソフトウエアの例には、限定はされないが、ＢＬＡＳＴパッケージ（Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９９、同書−第１８章を参照のこと）、ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌら、１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ、４０３−４１０）およびＧＥＮＥＷＯＲＫＳパッケージの比較ツールが含まれる。ＢＬＡＳＴおよびＦＡＳＴＡの両方は、オフラインおよびオンラインの検索で入手可能である（Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９９，同書、７−５８から７−６０頁参照）。しかし、ＧＣＧ  Ｂｅｓｔｆｉｔプログラムを用いることが好ましい。
【００４０】
最終的な％相同性は同一性に関して測定され得るが、整列プロセスそれ自体は、典型的には、絶対的な（ａｌｌ−ｏｒ−ｎｏｔｈｉｎｇ）対比較には基づかない。そのかわり、化学的類似性または進化の距離に基づく各々対のような比較に対してスコアを割り当てる、尺度を有する類似性スコアマトリックスが一般に用いられる。通常用いられるこのようなマトリックスの例は、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスである。これはＢＬＡＳＴパッケージのプログラムのデフォルトマトリックスである。ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎプログラムは、通常、公開のデフォルト値、あるいは、供給される場合にはカスタムのシンボル比較表のいずれかを用いる（更に詳細はユーザーマニュアル参照）。ＧＣＧパッケージのための公開のデフォルト値、あるいは他のソフトウエアの場合には、ＢＬＯＳＵＭ６２のようなデフォルトマトリックスを用いることが好ましい。
【００４１】
一旦ソフトウエアが至適な整列を作成したなら、％相同性、好ましくは％配列同一性を計算することが可能である。ソフトウエアは、典型的には、これを、配列比較の一部として行い、数値の結果を生成する。
【００４２】
本発明のアミノ酸配列に関連した用語「変異体」または「誘導体」は、酵素活性を有する、好ましくは、配列番号１に示されるアミノ酸配列と少なくとも同じ酵素活性を有する、得られるアミノ酸配列を提供する、配列からの、またはその配列への、１つ（またはそれより多くの）アミノ酸の、任意の置換、バリエーション、改変、置き換え、欠失または付加を包含する。
【００４３】
配列番号１は、本発明での使用のために改変され得る。典型的には、改変は、その配列の酵素活性を維持するようになされる。アミノ酸置換は、改変された配列が必要とされる酵素活性を保持するという条件で、例えば、１、２または３個から１０または２０個の置換でなされ得る。アミノ酸置換は、天然に存在しないアナログの使用を包含し得る。
【００４４】
本発明の配列番号１は、また、サイレントな変化を生じ、機能的に等価な酵素をもたらす、アミノ酸残基の欠失、挿入または置換を有し得る。意図的なアミノ酸置換は、ＨＯＸ酵素の酵素活性が維持される限り、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、および／または両親媒性の性質の類似性に基づいてなされ得る。例えば、負に荷電したアミノ酸はアスパラギン酸およびグルタミン酸を包含する；正に荷電したアミノ酸は、リジンおよびアルギニンを包含する；そして同様の親水性値を有する非荷電の極性ヘッド基を有するアミノ酸は、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、フェニルアラニン、およびチロシンを包含する。
【００４５】
保存的置換は、例えば、下記の表に従って、なされ得る。２列目の同じ枠内のアミノ酸、そして好ましくは３列目の同じ行の中のアミノ酸が、互いに置換され得る。
【００４６】
【表１】
0004679776.tif 000002
（変異体／ホモログ／誘導体（ヌクレオチド配列））
多数の異なるヌクレオチド配列が、遺伝暗号の縮重の結果として、同じＨＯＸ酵素をコードし得ることが、当業者には理解される。加えて、本発明のＨＯＸ酵素が発現される任意の特定の宿主生物のコドン使用法を反映するために、当業者は、慣用的な手法を用いて、本発明のヌクレオチド配列によってコードされるＨＯＸ酵素に影響を及ぼさないヌクレオチド置換をなし得ることが理解される。
【００４７】
本発明の配列番号１で示されるヌクレオチド配列に関連した、用語「変異体」、「ホモログ」または「誘導体」は、酵素活性を有する、好ましくは、配列表の配列番号１に示されるヌクレオチド配列と少なくとも同じ活性を有する、ＨＯＸ酵素に対する、得られるヌクレオチド配列コードを提供する、配列からの、またはその配列への、１つ（またはそれより多くの）核酸の、任意の置換、バリエーション、改変、置き換え、欠失または付加を包含する。
【００４８】
上記のように、配列の相同性に関して、本明細書の配列表に示される配列に対して、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％の相同性がある。より好ましくは、少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％の相同性がある。ヌクレオチドの相同性の比較は、上記のように行われ得る。好ましい配列比較プログラムは、上記のＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｅｓｔｆｉｔプログラムである。デフォルトスコアリングマトリックスは、同一の各ヌクレオチドに対して１０、そして各ミスマッチに対して−９のマッチ値を有する。デフォルトのギャップ生成ペナルティは、−５０であり、そしてデフォルトギャップ伸長ペナルティは各ヌクレオチドに対して−３である。
【００４９】
本発明はまた、本明細書で提示された配列、あるいはその任意の変異体、フラグメント、または誘導体、あるいは上記の任意のものの相補体に、選択的にハイブリダイズし得るヌクレオチド配列も包含する。ヌクレオチド配列は、好ましくは少なくとも１５ヌクレオチド長であり、より好ましくは、少なくとも２０、３０、４０または５０ヌクレオチド長である。
【００５０】
（基質）
好ましくは、基質は、ペプチド、Ｌアミノ酸、ならびに、ヘキソース、好ましくはグルコース、ガラクトース、ラクトース、２−デオキシグルコース、ピラノース、キシラン、セルロース、イヌリン、スターチ、デキストラン、ペクチン、およびそれらの混合物を包含する、炭水化物／糖から選択される。
【００５１】
非常に好ましい実施態様において、酵素／基質の組合せは、グルコース／ヘキソースオキシダーゼ、グルコース／グルコースオキシダーゼ、Ｌアミノ酸／Ｌアミノ酸オキシダーゼ、ガラクトース／ガラクトースオキシダーゼ、ラクトース／β−ガラクトシダーゼ／ヘキソースオキシダーゼ、ラクトース／β−ガラクトシダーゼ／グルコースオキシダーゼ、２−デオキシグルコース／グルコースオキシダーゼ、ピラノース／ピラノースオキシダーゼ、およびそれらの混合物から選択される。
【００５２】
１つの局面において、防汚化合物は、組成物中に存在する基質に対する酵素の作用によって生成される。それゆえ、防汚化合物は、「１ステップ」プロセスで生成される。いくつかの場合には、基質は、インサイチュで調製され得る。これらの場合には、組成物はさらに、前駆体酵素および前駆体基質を含み、ここで前駆体酵素および前駆体基質は、前駆体酵素が基質を生成するように選択される。この後者の局面において、防汚化合物は、「２ステップ」プロセスで生成される。
【００５３】
１ステッププロセスにおいて、好ましくは、酵素は、ヘキソースオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、Ｌアミノ酸オキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、ピラノースオキシダーゼ、およびそれらの混合物から選択される。
【００５４】
１ステッププロセスにおいて、好ましくは、基質は、ヘキソースから選択され、好ましくは、グルコース、Ｌアミノ酸、ガラクトース、２−デオキシグルコース、ピラノース、およびそれらの混合物から選択される。
【００５５】
１ステッププロセスにおいて、好ましくは、酵素／基質の組合せは、グルコース／ヘキソースオキシダーゼ、グルコース／グルコースオキシダーゼ、Ｌアミノ酸／Ｌアミノ酸オキシダーゼ、ガラクトース／ガラクトースオキシダーゼ、２−デオキシグルコース／グルコースオキシダーゼ、ピラノース／ピラノースオキシダーゼ、およびそれらの混合物から選択される。
【００５６】
２ステッププロセスにおいて、好ましくは、酵素はヘキソースオキシダーゼである。
【００５７】
２ステッププロセスにおいて、好ましくは、基質はグルコースである。
【００５８】
２ステッププロセスにおいて、好ましくは、前駆体酵素はアミログルコシダーゼである。
【００５９】
２ステッププロセスにおいて、好ましくは、前駆体基質は、スターチである。
【００６０】
それゆえ、２ステッププロセスにおいて、好ましくは、前駆体基質／前駆体酵素／酵素の組合せは、スターチ／アミログルコシダーゼ／ヘキソースオキシダーゼである。
【００６１】
好ましくは、２ステッププロセスの前駆体基質は、酸化酵素、スターチ、ラクトース、セルロース、デキストロース、ペプチド、インスリン、あるいはそれらの組合せに対する基質の、オリゴマーおよびポリマーから選択される。
【００６２】
前駆体基質を備えることが特に好ましい。なぜなら、これらは、前駆体酵素の前駆体基質に対する作用によって、基質の持続および／または長期の放出を提供するからである。
【００６３】
天然のスターチが前駆体基質として特に好ましい。天然スターチは、密に充填された結晶を提供し、これは、表面コーティングに容易に適用され得る。さらに、天然スターチは水不溶性である。
【００６４】
セルロースもまた、前駆体基質として特に好ましい。セルロースは、塗料における一般的な成分であり、セルロースの前駆体基質の使用は、塗料組成物に添加しなければならない追加成分の数を低減する。
【００６５】
好ましくは、２ステッププロセスの前駆体酵素は、オリゴマーまたはポリマー基質をモノマー単位に分解し得るエキソ作用性（ｅｘｏ−ａｃｔｉｎｇ）酵素、例えば、β−ガラクトシダーゼ、ペプチダーゼ；アミログルコシダーゼ、およびそれらの混合物から選択される。
【００６６】
必要に応じて、組成物はさらに、構成要素の少なくとも１つを固定化する、必要に応じて酵素を固定化するための、バインダーを含む。
【００６７】
本発明の組成物は、コーティング、ラッカー、ステイン、エナメルなどとして処方され得、以下、概して、「コーティング」と呼ばれる。
【００６８】
それゆえ、１つの局面において、本発明は、上記で定義した組成からなるコーティングを提供する。
【００６９】
好ましくは、コーティングは、屋外用木製品、セントラルヒーティングシステムの外表面、および海洋船舶の船体から選択される表面の処理のために処方される。
【００７０】
コーティングは、組成物を溶解または懸濁する、液体ビヒクル（溶媒）を含み得る。
【００７１】
液体ビヒクルは、組成物の任意の必須成分の活性を妨害しない任意の液体から選択され得る。特に、液体ビヒクルは、必須の酵素および／または防汚化合物の活性を妨害すべきではない。適切な液体ビヒクルは、ＵＳ−Ａ−５０７１４９７に開示され、そして水、ならびに、脂肪族炭化水素、芳香族炭化水素（例えば、キシレン、トルエン）１００から３２０℃の間の沸点、好ましくは１５０から２３０℃の間の沸点を有する脂肪族および芳香族炭化水素の混合物；高芳香族石油留出物（例えば、ソルベントナフサ、蒸留タール油およびそれらの混合物）；ブタノール、オクタノール、およびグリコールなどのアルコール；植物油および鉱物油；アセトンなどのケトン；ミネラルスピリットおよび灯油などの石油留分、塩素化炭化水素、グリコールエステル、グリコールエステルエーテル、それらの誘導体および混合物を包含する有機溶媒、を包含する。
【００７２】
液体ビヒクルは、少なくとも１つの極性溶媒（例えば、水）を、油性または油状の低揮発性有機溶媒（例えば、ホワイトスピリット中に見いだされる芳香族）および脂肪族溶媒の混合物（一般に、ミネラルスピリットとも呼ばれる）との混合剤（ａｄｍｉｘｔｕｒｅ）中に含み得る。
【００７３】
ビヒクルは、典型的には、希釈剤、乳化剤、湿潤剤、分散剤または他の界面活性剤のうちの少なくとも１つを含み得る。適切な乳化剤の例は、ＵＳ−Ａ−５０７１４７９に開示され、ノニルフェノール−エチレンオキシドエーテル、脂肪酸のポリオキシエチレンソルビトールエステルまたはポリオキシエチレンソルビタンエステル、これらの誘導体および混合物を包含する。
【００７４】
任意の適切な表面コーティング材料が、本発明の組成物および／またはコーティング中に配合され得る。商品として認識されているコーティング材料の例は、溶媒ベース系中のポリ塩化ビニル樹脂、溶媒ベース系中の塩素化ゴム、溶媒ベースまたは水性系中のアクリル樹脂およびメタクリル樹脂、水性分散体または溶媒ベース系としての塩化−ビニルアセテートコポリマー系、ブタジエン−スチレンゴム、ブタジエン−アクリロニトリルゴム、およびブタジエン−スチレン−アクリロニトリルゴムのようなブタジエンコポリマー、アマニ油のような乾性油、アルキド樹脂、アスファルト、エポキシ樹脂、ウレタン樹脂、ポリエステル樹脂、フェノール樹脂、それらの誘導体および混合物である。
【００７５】
本発明の組成物および／またはコーティングは、海水に難溶性の、無機顔料（例えば、二酸化チタン、酸化第二鉄、シリカ、タルク、または陶土）、有機顔料（例えば、カーボンブラックまたは染料）、それらの誘導体および混合物を含み得る。
【００７６】
本発明の組成物および／またはコーティングは、調節された防汚化合物の徐放を提供するために、ロジンなどの物質を含み得る。ロジンは、海水への溶解度が非常にわずかである。
【００７７】
本発明の組成物および／またはコーティングは、可塑剤（ｐｌａｓｔｉｃｉｓｅｒｓ）、レオロジー特性調節因子、他の従来の成分およびそれらの混合物を含み得る。
【００７８】
本発明の組成物および／またはコーティング、特にコーティングは、さらに、水性環境に曝露される物質を保護するために用いられる組成物中で従来使用されているアジュバントを含む。これらのアジュバントは、追加の殺真菌剤、補助溶媒、処理用（ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）添加剤（例えば、消泡剤、固定剤、可塑剤、ＵＶ安定剤または安定性増強剤、水溶性または非水溶性染料、着色顔料、乾燥剤、腐食防止剤、増粘剤または抗沈降剤（例えば、カルボキシメチルセルロース、ポリアクリル酸またはポリメタクリル酸、抗皮膜剤、それらの誘導体および混合物から選択され得る。
【００７９】
本発明の組成物および／またはコーティング中で用いられる追加の殺真菌剤は、好ましくは、液体ビヒクルに可溶である。
【００８０】
本発明の１つの局面において、先の定義のような組成からなる海洋防汚剤が提供される。
【００８１】
好ましくは、防汚剤は自己研磨性（ｓｅｌｆ−ｐｏｌｉｓｈａｂｌｅ）である。
【００８２】
本発明の１つの局面において、基質または基質ジェネレータはおよび／または酵素は、被包される。好ましくは、基質／基質ジェネレータおよび／または酵素は、半透膜で被包される。
【００８３】
基質／基質ジェネレータおよび酵素は、個別に、互いに独立して被包されてもよく、あるいは、一緒に被包されてもよい。前者の実施形態において、基質／基質ジェネレータまたは酵素は、付着物（ｆｏｕｌａｎｔ）で活性化され得る。例えば、被包材料は、付着物と接触すると、基質／基質ジェネレータまたは酵素を放出して、基質／基質ジェネレータまたは酵素のうちの他のものと接触するように、選択され得る。この方法において、組成物は、付着物と接触した場合にのみ、防汚化合物を提供するか、あるいは防汚化合物の提供を増大させるように、備え得る。
【００８４】
本発明の組成物は、既製（ｒｅａｄｙ−ｆｏｒ−ｕｓｅ）製品または濃縮物として提供され得る。既製製品は、水溶液、水性分散体、油溶液、油性分散体、乳濁液、またはエアロゾル調製物の形態であり得る。濃縮物は、例えば、コーティングのための添加剤として使用でき、あるいは、追加の溶媒または懸濁剤で、使用の前に希釈され得る。
【００８５】
本発明によるエアロゾル調製物は、適切な溶媒を含む、または適切な溶媒中に溶解または懸濁した本発明の組成物を、噴霧剤として使用するのに適した揮発性液体（例えば、商品名「Ｆｒｅｏｎ」で市販のメタンおよびエタンの塩素化およびフッ素化誘導体の混合物）、または圧縮空気中に、通常の方法で配合することによって得られ得る。
【００８６】
ＵＳ−Ａ−５０７１４７９で論じられているように、本発明の組成物および／またはコーティングは、防腐剤および／またはコーティングにおいて有用であることが知られている追加成分を含み得る。このような成分は、固定剤（例えば、カルボキシメチルセルロース）、ポリビニルアルコール、パラフィン、共溶媒（例えば、酢酸エチレングリコールおよび酢酸メトキシプロピル、可塑剤（ｐｌａｓｔｉｃｉｓｅｒｓ）（例えば、安息香酸エステル）、およびフタル酸エステル（ｐｈｔｈｌａｔｅｓ）（例えば、フタル酸ジブチル、フタル酸ジオクチル、およびフタル酸ジドデシル）、それらの誘導体および混合物を包含する。任意に、染料、着色顔料、腐食防止剤、化学安定剤、またはオクタン酸コバルトおよびナフテン酸コバルトのような乾燥剤（ドライヤー）もまた、特定の用途に応じて、含まれ得る。
【００８７】
本発明の組成物および／またはコーティングは、ブラッシング、スプレー塗り、ロールコーティング、浸漬、およびそれらの組合せを含む、当該分野で公知の任意の技術で塗布され得る。
【００８８】
本発明の組成物は、単に、種々の成分を、これらに悪影響を与えない温度で混合することによって調製され得る。調製条件は重要ではない。コーティングおよび同様の組成物を製造するために従来利用されている装置および方法が有利に使用され得る。
【００８９】
本発明を、例示のためにのみ、以下の実施例で記載する。
【００９０】
（実施例）
本発明の防汚組成物の防汚効果を以下の実施例に従って試験する。これらの実施例は、付着の防止に対する本発明の組成物の有効性を示す。実施例はまた、本発明の組成物の防汚特性の最適化（ｏｐｔｉｍｉｓａｔｉｏｎ）を提供する。
【００９１】
本実施例の各々に用いられるヘキソースオキシダーゼ（ＨＯＸ）は、ＤａｎｉｓｃｏＣｕｌｔｏｒから入手可能である。ＨＯＸは、海藻Ｃｈｏｎｄｒｕｓ  ｃｒｉｐｕｓからクローニングされたＨＯＸ酵素をコードする遺伝子を発現する、酵母Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ由来の発酵産物である。
【００９２】
（実施例１−防汚組成物の調製（「１ステップ」））
可溶性または固定化されたヘキソースオキシダーゼまたはグルコースオキシダーゼのような他の過酸化水素産生酵素を、防汚組成物中で酵素を生成する防汚化合物として試験する。ヘキソースオキシダーゼは、例えば、アニオン交換体、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦTM（Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能）に、ｐＨ７．３のトリエタノールアミン緩衝液２０ｍＭを用いて結合することによって、固定化され得る。あるいは、ヘキソースオキシダーゼまたは他の過酸化水素産生酵素は、エポキシ活性化ＳｅｐｈａｒｏｓｅTM（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｓｗｅｄｅｎ）、カルボジイミド活性化アガロース（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ＵＳＡ）のような適切なキャリアに共有結合される。当該分野で公知の、固定化のための他の従来の手順もまた利用され得る。
【００９３】
用いられる濃度の範囲は、防汚組成物１ｍｌ当たり、０．０００１〜１０００Ｕのヘキソースオキシダーゼ活性／過酸化水素産生酵素である。酵素活性の１ユニットは、２５℃で１分間当たり１μモルのＨ2Ｏ2を産生する酵素の量として定義される。
【００９４】
本発明において使用する適性を確認するために、酵素の活性を以下のようにアッセイし得る。ヘキソースオキシダーゼ（ＨＯＸ）活性を以下の手順に従って測定する。
【００９５】
ＨＯＸアッセイは、グルコースの酸化の際に生成される過酸化水素の測定に基づく。過酸化水素は、ペルオキシダーゼの存在下でｏ−ジアニシジンを酸化して、染料を形成する。
【００９６】
【化１】
0004679776.tif 000003
（試薬）
１．１００ｍＭ  リン酸緩衝液、ｐＨ６．３
２．１００ｍＭ  Ｄ−グルコース（ＳＩＧＭＡ、Ｇ−８７２０）（１００ｍＭ  リン酸緩衝液、ｐＨ６．３中）
３．ｏ−ジアニシジン（ＳＩＧＭＡ、Ｄ−３２５２）、３．０ｍｇ／ｍｌ（蒸留水中）
４．ペルオキシダーゼ（ＳＩＧＭＡ、Ｐ−８１２５）、０．１０ｍｇ／ｍｌ（１００ｍＭ  リン酸緩衝液、ｐＨ６．３中）
（アッセイ）
１２０μｌ  試薬１
１５０μｌ  試薬２
１０μｌ  試薬３
１０μｌ  試薬４  および
１０μｌ  酵素溶液
アッセイは、マイクロタイタープレート上で行う。反応を、酵素溶液の添加によって開始する。混合物を２５℃で１５分間、振盪しながら、インキュベートする。ブランクランは、全ての成分を含み、酵素溶液の代わりに水を用いる。染料の形成を、マイクロタイタープレートリーダーで４０５ｎｍで測定する。反応の直線性は、マイクロタイターリーダー上で速度論的プログラムを用いてチェックし得る。
【００９７】
過酸化水素検量線は、新鮮なＨ2Ｏ2（ＭＥＲＣＫ）の濃度を変えて用いることによって、構築され得る。
【００９８】
（実施例２−防汚組成物の調製（「２ステップ」））
防汚組成物１ｍｌあたり０．０１〜１００μｇの濃度のグルコースおよびガラクトースを、実施例１に記載した系におけるヘキソースオキシダーゼに対する基質を生成するための基質として試験する。連続的基質生成系を提供するために、スターチ、好ましくは、コムギ、トウモロコシまたはバレイショ由来のインタクトなスターチ顆粒を、防汚組成物１ｍｌ当たり０．０１ｎｇ〜１００μｇの濃度で、アミログルコシダーゼ（ＧＲＩＮＤＡＭＹＬTM、ＡＧ１５００  Ｂａｋｅｒｙ  Ｅｎｚｙｍｅ、ＤａｎｉｓｃｏＣｕｌｔｏｒ製、または他の市販のアミログルコシダーゼ製品）と共に用いる。成分は、防汚組成物１ｍｌ当たり０．０００００１から１０ＡＧＵを与える濃度で存在する。
【００９９】
１ＡＧＵは、４０℃でｐＨ５．０（濃酢酸で調節）の５０ｍＭ酢酸ナトリウム中、マルトース（０．５％ｗ／ｖ）から、１分間当たり１μモルのグルコースを放出する、アミログルコシダーゼ活性として定義される。アッセイは、２００μｌのアッセイ混合物を１００μｌの０．１Ｍ塩化水素塩化物に移すことによって停止され、放出されたグルコースの量は、グルコースデヒドロゲナーゼ試薬（Ｍｅｒｃｋ  ｎｏ．１２１９３）または他のグルコース検出系を用いて測定される。
【０１００】
（実施例３−ＨＯＸを含む塗料による過酸化水素の生成）
ヘキソースオキシダーゼ（ＨＯＸ）が過酸化水素を生成する能力を試験するために、以下の実験を行った。
【０１０１】
１１．０ｇの塗料（各々、水性壁用塗料Ｓａｄｏｌｉｎ  Ｇｌａｎｓ  ７および油性Ｈｉｓｔｏｒ  ９０１０）に、スターチ（１０Ｕ／ｇ）にスプレーした０．２、０．５および１ｇのＨＯＸ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ由来のＤａｎｉｓｃｏＣｕｌｔｏｒｎｏの発酵産物）を各々、添加した。水性塗料には、処理あたり５ｇの水も加えた。
【０１０２】
ディスポーザブルのプラスチック移動ピペット（Ｓａｒｓｔｅｄｔ）を塗料中に浸漬（頭部）した。移動ピペットを持ち上げて、３時間、風乾した。
【０１０３】
次にヘキソースオキシダーゼ（ＨＯＸ）活性を、塗料で被覆されたピペット頭部を２ｍＬのＨＯＸアッセイ試薬（下記参照）を入れたガラスチューブ中に浸すことによって測定した。ＨＯＸ活性は塗料中のＨＯＸ由来のもののみである。
【０１０４】
チューブを室温でインキュベートした。
【０１０５】
ブランクとして、ＨＯＸを添加しない塗料を用いた。
【０１０６】
実験の結果を表１に示す。ＨＯＸは、塗料中に均一に分配された。なぜなら、塗料の表面全体が、ＨＯＸアッセイ試薬と接触したときに、即時に赤に変わったからである。発色は、即時に観察され、これは塗料がＨＯＸ活性を阻害する効果を有していないことを示唆する。この実験は、ＨＯＸが、乾燥後に塗料マトリックス中に固定化された場合でさえも、外部から付加された基質（ここではグルコース）から過酸化水素を生成することができることを証明する。
【０１０７】
0004679776.tif 000004
用いられる濃度の範囲は、防汚組成物１ｍｌ当たり、０．０００１〜１０００Ｕの、ヘキソースオキシダーゼ活性、あるいは別の過酸化水素産生酵素である。
【０１０８】
（実施例４−コーティングのモデル系）
防汚組成物を入れた透析チューブを、コーティングが被覆された材料の表面上の付着を防止するモデル系として用いる。
【０１０９】
透析チューブ内の防汚組成物を用いて、付着を防ぐのに有効な濃度の過酸化水素を透析チューブの表面上に生成する。使用した透析チューブは、約１００００Ｄａのカットオフ値を有する。透析チューブは、透析チュービングまたは透析カセットのいずれかである（例えば、Ｓｌｉｄｅ−Ａ−ＬｙｚｅｒTM、Ｐｉｅｒｃｅ；ＩＬ、ＵＳＡから入手可能）。
【０１１０】
透析チュービングを、上記のようにして収集した１〜５リットルの湖水または海水を入れたガラスビーカー中に浸漬する。ガラスビーカーを磁性スターラーでゆっくりと攪拌し、そして日光が当たるように窓際で、室温でインキュベートする。透析チュービング上への付着を、目視で、４週間まで、透析チュービング上の微生物増殖層の外観に基づいてモニターし、そして上記のように１〜５の尺度で評価する。ネガティブコントロールとして、生水をいれた透析チューブを用いる。
【０１１１】
任意に、ニトロセルロース膜の断片の上に固定化したカタラーゼを次に０．１％Ｔｗｅｅｎ２０でブロックしたものを、透析チュービングの周囲の水中の過酸化水素の蓄積を回避するために、湖水または海水中に添加する。用いられるカタラーゼの濃度は、０．０００００１〜１００ＣＵの範囲であり、ここで１ＣＵは、Ｓｉｇｍａカタログ：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ｆｏｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｔｃ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ  １９９５、２２１頁にカタラーゼについて記載しているように、ｐＨ７．０の５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液中、３０℃で１分間当たり、１μモルの過酸化水素を分解するカタラーゼ活性として定義される。
【０１１２】
本発明の組成物は、付着を防ぐのに有効である。
【０１１３】
（実施例５−塗料中のＨＯＸの安定性）
実施例１に記載の移動ピペットの塗装された頭部を室温で２ヶ月保持し、そして次に、実施例２で記載した試薬混合物中で「アッセイ」した。
【０１１４】
0004679776.tif 000005
表２の結果から、ＨＯＸは室温で乾燥塗料マトリックス中で、２ヶ月間安定であったことが明らかである。
【０１１５】
（実施例６−コーティングの試験）
（防汚組成物のための試験システムのセットアップ）
０．５〜５ｍｌの湖水または海水試料を、デンマーク、Ａａｒｈｕｓ近郊のＢｒａｂｒａｎｄｓφｅｎ湖、およびＡａｒｈｕｓ沖のバルチック海から試験管に採集した。水試料の採集日に、試験する防汚組成物を試験管に加え、そしてこれをＰａｒａｆｉｌｍTMで密閉した。
【０１１６】
試験管を室温で、日光が当たるように窓際でインキュベートする。付着を、目視で、４週間まで、試験管の壁の上の微生物増殖層の外観に基づいてモニターする。比較のために、０．１％のアジ化ナトリウムを入れた試験管および防汚組成物なしの試験管を、各々、ポジティブコントロールおよびネガティブコントロールとして用いる。
【０１１７】
これらの試験管を、各々、非常に有効から防汚活性なしまで１〜５の尺度で、各々、１および５で評価する。
【０１１８】
市販の海洋防汚コーティング材を防汚殺生物剤を添加せずに用いる。本発明による防汚組成物をこのコーティング材中に混合し、そして金属、ガラスおよびプラスチックプレートの表面に、コーティング材の製造者の指示に従って塗布する。
【０１１９】
コーティングされたプレートを湖水または海水の水中に浸漬する。プレート上の付着を、目視で、２年間、プレート上の微生物増殖層の外観に基づいてモニターし、そして上記のように１〜５の尺度で評価する。ネガティブコントロールとして、防汚組成物なしのコーティングを用いる。
【０１２０】
本発明の組成物は付着の防止に有効である。
【０１２１】
（実施例７−水槽の水の中での防汚組成物の安定性）
１０．０ｇの塗料（油性Ｈｉｓｔｏｒ  ９０１０）に５００ｍｇのスターチ（Ｍｅｒｃｋ１２５３）、スターチ上にスプレー乾燥した（ｓｐｒａｙｄｒａｙｅｄ）（１０Ｕ／ｇ）５０ｍｇのＨＯＸ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ由来のＤａｎｉｓｃｏＣｕｌｔｏｒの発酵産物）を加えた。
【０１２２】
ディスポーザブルのプラスチック移動ピペット（Ｓａｒｓｔｅｄｔ）を塗料中に浸漬（頭部）した。移動ピペットを持ち上げて、２４時間、風乾した。これを次に水槽由来の２５０ｍＬの水中に、Ｋａｕｔｅｘボトル中で、２ヶ月間保持した。ボトルを日光が十分に当たる窓に置いた。２ヶ月後、ピペット頭部を洗浄し、風乾し、そして次に完全ＨＯＸ試薬混合物中で「アッセイ」した。ＨＯＸは、まだ、完全な活性を示した。
【０１２３】
（実施例８−基質生成コンセプトの証明）
連続的な基質生成系を提供するために、デンプン、好ましくは、コムギ、トウモロコシまたはバレイショ由来のインタクトなスターチ顆粒を防汚組成物１ｍｌ当たり０．０１ｎｇ〜１００ｍｇの濃度で、ならびに、防汚組成物１ｍｌ当たり０．０００００１〜１００ＡＧＵを与える濃度で、アミログルコシダーゼ（ＡＭＧ）（ＧＲＩＮＤＡＭＹＬTM、ＡＧ１００００  Ｂａｋｅｒｙ  Ｅｎｚｙｍｅ、ＤａｎｉｓｃｏＣｕｌｔｏｒ製、または他の市販のアミログルコシダーゼ製品）をＨＯＸと共に用いた。
【０１２４】
１０．０ｇの塗料（油性Ｈｉｓｔｏｒ  ９０１０）に５００ｍｇのスターチ（Ｍｅｒｃｋ）、スターチ上にスプレー乾燥した（１０Ｕ／ｇ）５０ｍｇのＨＯＸ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ由来のＤａｎｉｓｃｏＣｕｌｔｏｒの発酵産物）およびＡＭＧ（１０００００ＡＧＵ／ｇ）を、表に示すように、加えた。
【０１２５】
ディスポーザブルのプラスチック移動ピペット（Ｓａｒｓｔｅｄｔ）を塗料中に浸漬（頭部）した。移動ピペットを持ち上げて、３時間、風乾した。
【０１２６】
次に、ヘキソースオキシダーゼ（ＨＯＸ）活性を、塗料で被覆されたピペット頭部を、グルコースなしの２ｍＬのＨＯＸアッセイ試薬を入れたガラスチューブ中に浸すことによって測定した。アッセイ試薬については実施例１参照。ＨＯＸ活性は塗料中のＨＯＸ由来のもののみであり、そしてＨＯＸに対する基質は、塗料中のＡＭＧによって、塗料中のスターチが加水分解でグルコースになることによって生成されるもののみである。
【０１２７】
チューブを室温で４８時間インキュベートした。
【０１２８】
ブランクとして、ＨＯＸおよびＡＭＧを添加しない塗料を用いた。
【０１２９】
0004679776.tif 000006
表３に示される結果は、ＨＯＸとＡＭＧとの組合せが、意図したように働くことを示す。ＡＭＧは、塗料中で、共に固定化されたスターチからグルコースを生成し、そしてＨＯＸは生成されたグルコースから過酸化水素を生成する。
【０１３０】
（実施例９−温度活性）
ヘキソースオキシダーゼ（精製されたＨＯＸ）を、温度の関数としての活性に関して評価し、そして市販のグルコースオキシダーゼ（Ａｍａｎｏ  ０８１４４３／０００１８）と比較した。
【０１３１】
手順：
試料：酵素試料を水中に溶解し、そしてＰＤ１０カラム中で、ｐＨ６．３の２０ｍＭリン酸緩衝液を用いて脱塩し、０．４Ｕ／ｍｌに希釈する。
【０１３２】
Ｅｌｉｓａウェルに以下のものを加えた：
１５０μｌの１００ｍＭグルコース（１００ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ６．３中）１２０μｌの１００ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ６．３
１０μｌのｏ−ジアニシジン（３ｍｇ／ｍｌ、水中）
１０μｌのペルオキシダーゼ（０．１０ｍｇ／ｍｌ、１００ｍＭリン酸緩衝液中、ｐＨ６．３）
１０μｌの試料
３０℃で１０分間、アッセイを行い、４０５ｎｍで測定する。
【０１３３】
（結果）
温度の関数としての活性の測定からの結果を、表４および図１に示す。
【０１３４】
【表２】
0004679776.tif 000007
（表４）
活性対温度の結果は、明らかに、活性プロフィールの違いを示す。
【０１３５】
ヘキソースオキシダーゼは、２５〜３５℃の間にその至適温度を有しそうであり、これは、最大付着温度についての至適温度にほぼ一致する。対照的に、ＧＯＸは至適温度が５０℃であり、これはいままで海洋で達成された温度よりも遙かに高い。
【０１３６】
上記明細書中で言及された全ての刊行物は、本明細書中に参照として援用される。本発明の記載された方法および系の種々の改変およびバリエーションは、本発明の範囲および精神を逸脱することなく、当業者に明らかである。発明を特定の好ましい実施形態に関連して記載してきたが、特許請求される発明はこのような特定の実施形態に過度に制限されるものではないことが理解されるべきである。実際、発明を実施するための記載された様式の種々の改変は、化学または関連分野の当業者には明らかであり、上記の請求の範囲内であると意図される。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、温度の関数としての活性を示す。
【配列表】
0004679776.tif 000008
0004679776.tif 000009
【図１】
0004679776.tif 000010