(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験物質の存在下に、ＥＬＭＯ１の発現量を評価し、該発現量の減少をもたらす被験物質を選別することを特徴とする、糖尿病性腎症の治療又は予防薬のスクリーニング方法。
【請求項２】
被験物質の存在下に、ＥＬＭＯ１をコードする核酸を導入した哺乳動物細胞におけるＥＬＭＯ１の発現量を測定するステップを含み、ここで、被験物質の存在した場合にＥＬＭＯ１の発現量が減少することを、該被験物質が糖尿病性腎症の治療又は予防薬であることの指標とする、請求項１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖尿病性腎症の治療又は予防薬のスクリーニング方法、糖尿病の治療又は予防薬のスクリーニング方法、細胞外基質の産生抑制剤のスクリーニング方法、マトリックスメタロプロテイナーゼの発現促進剤のスクリーニング方法、サイトカイン産生抑制剤のスクリーニング方法、糖取り込み促進剤のスクリーニング方法、糖尿病性腎症の診断方法、糖尿病性腎症の診断キット及び糖尿病性腎症の発症に寄与する核酸の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病性腎症は、ある程度の糖尿病罹病期間の後、尿アルブミン排泄量の増加（微量アルブミン尿）で発症し、顕性蛋白尿を経て慢性腎不全へと至る連続性の経過をたどる。当該糖尿病性腎症は、透析療法導入後の生命予後が極めて不良で患者のＱＯＬも損なう重大な合併症であり、腎症の早期診断及び治療法の確立が急務であると考えられている。【０００３】
現在、糖尿病性腎症の主な治療法は、血糖コントロール、血圧コントロール、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害薬の投与、アンジオテンシンＩＩ受容体拮抗薬の投与、タンパク質制限食である。【０００４】
しかしながら、前記ＡＣＥ阻害薬、アンギオテンシンＩＩ受容体拮抗薬等は、糖尿病性腎症の進展を遅延させているに過ぎず、根本的治療には不十分であるという欠点がある。また、これらの薬剤は、その作用機序から、しばしば高カリウム血症を生じることが知られており、糖尿病性腎症の治療には十分な注意が必要であるという欠点がある。さらに、糖尿病性腎症の病因は、多要因的であると考えられており、正確な機構等について、不明な点が多いのが現状である。【０００５】
一方、ＥＬＭＯ１（Ｅｎｇｕｌｆｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｔｉｌｉｔｙ  １）は、貪食作用と細胞形態の変化とを促進することが知られている（非特許文献１を参照のこと）。また、前記ＥＬＭＯ１は、Ｄｏｃｋとの相互作用を介してＲａｃによるＧＴＰローディングを促進させることが示されている（非特許文献２を参照のこと）。しかしながら、前記非特許文献１及び非特許文献２によれば、前記ＥＬＭＯ１が、細胞骨格変化におけるＲａｃの作用を促進させる可能性を示すにとどまっている。
【非特許文献１】ティナ（Ｔｉｎａ  Ｌ．Ｇｕｍｉｅｎｎｙ）ら，Ｃｅｌｌ，１０７，２７−４１，２００１年１０月５日発行
【非特許文献２】エンリコ（Ｅｎｒｉｃｏ  Ｂｒｕｇｎｅｒａ）ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，４，５７４−５８２，２００２年７月１５日オンライン公開，ウェブページアドレス：http://cellbio.nature.com
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の１つの側面は、糖尿病患者において、糖尿病性腎症を併発する可能性を低減させること、糖尿病性腎症を治療すること、ＥＬＭＯ１に基づき、細胞外基質の産生を抑制すること、マトリックスプロテイナーゼの発現を促進すること、サイトカインの産生を抑制すること等のいずれかの性質を発揮しうる物質をスクリーニングすること、前記物質を簡便にスクリーニングすること、前記物質を効率よくスクリーニングすること等を可能にする糖尿病性腎症の治療又は予防薬のスクリーニング方法を提供することに関する。本発明の別の側面は、糖尿病を治療すること、ＥＬＭＯ１及び／又はＥＬＭＯ２に基づき、細胞内への糖の取り込みを促進すること等のいずれかの性質を発揮しうる物質を、簡便に、効率よくスクリーニングすること等を可能にする糖尿病の治療又は予防薬のスクリーニング方法を提供することに関する。本発明の別の側面は、細胞外基質の産生抑制剤、マトリックスメタロプロテイナーゼの発現促進剤、サイトカイン産生抑制剤又は糖取り込み促進剤のスクリーニング方法を提供することに関する。さらに、本発明の別の側面は、糖尿病性腎症を容易に高処理量で高い信頼性で診断することができる糖尿病性腎症の診断方法を提供することに関する。また、本発明の別の側面は、被験試料から、糖尿病性腎症の発症に寄与する核酸を、容易に、迅速に検出すること等を可能にする糖尿病性腎症の発症に寄与する核酸の検出方法を提供することに関する。さらに、本発明の別の側面は、糖尿病性腎症を容易に迅速に診断すること、被験試料から、糖尿病性腎症の発症に寄与する核酸を、容易に迅速に検出すること等を可能にする前記核酸の糖尿病性腎症の診断キットを提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の要旨は、
〔１〕  被験物質の存在下に、ＥＬＭＯ１の発現量を評価し、該発現量の減少をもたらす被験物質を選別することを特徴とする、糖尿病性腎症の治療又は予防薬のスクリーニング方法、
に関する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の糖尿病性腎症の治療又は予防薬のスクリーニング方法によれば、糖尿病患者において、糖尿病性腎症を併発する可能性を低減させ、糖尿病性腎症を治療し得、かつＥＬＭＯ１に基づき、細胞外基質の産生を抑制、マトリックスプロテイナーゼの発現を促進及び／又はサイトカインの産生を抑制しうる物質を、簡便に、効率よくスクリーニングすることができるという優れた効果を奏する。本発明の糖尿病の治療又は予防薬のスクリーニング方法によれば、糖尿病患者において、糖尿病を治療し得、かつＥＬＭＯ１及び／又はＥＬＭＯ２に基づき、細胞内への糖の取り込みを促進しうる物質を、簡便に、効率よくスクリーニングすることができるという優れた効果を奏する。本発明の細胞外基質産生抑制剤、本発明のマトリックスメタロプロテイナーゼの発現促進剤、本発明のサイトカイン産生抑制剤又は糖取り込み促進剤のスクリーニング方法によれば、糖尿病等に対する治療効果を発揮しうる物質を、簡便に、効率よくスクリーニングすることができるという優れた効果を奏する。さらに、本発明の糖尿病性腎症の診断方法によれば、糖尿病性腎症を容易に、迅速に診断することができるという優れた効果を奏する。また、本発明の糖尿病性腎症の発症に寄与する核酸の検出方法によれば、被験試料から、糖尿病性腎症の発症に寄与する核酸を、容易に迅速に検出することができるという優れた効果を奏する。また、本発明の診断キットによれば、本発明は、糖尿病性腎症を容易かつ迅速に診断することができ、被験試料から、糖尿病性腎症の発症に寄与する核酸を、容易かつ迅速に検出することができるという優れた効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、ＥＬＭＯ１遺伝子周辺における連鎖不均衡マッピングを示す。
【００１０】
【図２】図２は、ＥＬＭＯ１遺伝子における多型、ランドマークＳＮＰを示す。
【００１１】
【図３】図３は、図２の続きを示し、ＥＬＭＯ１遺伝子における多型、ランドマークＳＮＰを示す。
【００１２】
【図４】図４は、図３の続きを示し、ＥＬＭＯ１遺伝子における多型、ランドマークＳＮＰを示す。
【００１３】
【図５】図５は、正常マウス腎臓を用いたＥＬＭＯ１遺伝子のインサイチュハイブリダイゼーションの結果を示す。図中、パネルａ）ｂ）は、腎糸球体上皮細胞、パネルｃ）ｄ）は、間質細胞を示す。また、パネルａ）及びｃ）は、アンチセンスプローブを用いた結果、ｂ）及びｄ）は、センスプローブを用いた結果を示す。矢頭は、陽性シグナルの細胞を示す。なお、スケールバーは、約５０μｍを示す。
【００１４】
【図６】図６は、ＣＯＳ細胞におけるＥＬＭＯ１遺伝子の発現に対する影響を調べた結果を示す図である。データは、正常グルコース下で１日培養された細胞に比べた増加倍数として示される。値は、平均±標準偏差で、＊はｐ＜０．０００１である。
【００１５】
【図７】図７は、ＣＯＳ細胞に対するＥＬＯＭＯ１発現の影響を示す。各遺伝子の発現を、リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲで解析した。パネルａ）は、ＴＧＦ−β１、ｂ）Ｉ型コラーゲン（α１）、ｃ）フィブロネクチン、ｄ）マトリックスメタロプロテイナーゼ−２（ＭＭＰ−２）、ｅ）マトリックスメタロプロテイナーゼ−３（ＭＭＰ−３）を示す。白バーは、ｐＣＤＮＡ−ＬａｃＺによりトランスフェクトされた細胞、黒バーは、ＥＬＭＯ１でトランスフェクトされた細胞を示す。
【００１６】
【図８】図８は、ＥＬＭＯ１の発現変動を調べた結果を示す図である。左パネルは、骨格筋、右パネルは、脂肪組織を示す。
【００１７】
【図９】図９は、ＥＬＭＯ２の発現変動を調べた結果を示す図である。図中、左パネルは、骨格筋、右パネルは、脂肪組織を示す。
【００１８】
【図１０】図１０は、Ｌ６細胞に導入されたＥＬＭＯ１遺伝子又はＥＬＭＯ２遺伝子の発現を示す図である。図中、左パネルは、ＥＬＭＯ１の発現、右パネルは、ＥＬＭＯ２の発現を示す。
【００１９】
【図１１】図１１は、ＥＬＭＯ１又はＥＬＭＯ２発現細胞における糖取り込みを調べた結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明は、糖尿病性腎症を発症した糖尿病患者において、ＳＮＰ解析をした結果、ＥＬＭＯ１遺伝子の第１６イントロン、第１７イントロン及び第１８イントロンにおいて、驚くべく、高い頻度で変異が見られ、前記ＥＬＭＯ１が高グルコース濃度条件下で増加し、前記ＥＬＭＯ１の増加により、細胞外基質が蓄積され、マトリックスメタロプロテイナーゼが減少するという本発明者らの知見に基づく。すなわち、本発明は、貪食作用及び細胞運動に関与することが知られていたＥＬＭＯ１が、予想外にも、糖尿病性腎症と関連するという本発明者らの知見に基づく。また、本発明は、ＥＬＭＯ１及びＥＬＭＯ２がさらに糖尿病の憎悪因子であり、細胞内への糖の取込みを減少させるという本発明者らの知見に基づく。【００２１】
本発明のスクリーニング方法においては、ＥＬＭＯ１及び／又はＥＬＭＯ２の作用を、被験物質の存在下に評価する。【００２２】
前記「ＥＬＭＯ１及び／又はＥＬＭＯ２の作用」としては、「ＥＬＭＯ１及び／又はＥＬＭＯ２の発現量」、例えば、該発現量の変動等、「ＥＬＭＯ１及び／又はＥＬＭＯ２を発現させることにより引き起こされる事象」等が挙げられる。【００２３】
前記事象としては、より具体的には、細胞外基質量の上昇、マトリックスメタロプロテイナーゼの減少、サイトカインの上昇等が挙げられる。本発明のスクリーニング方法においては、かかる事象を評価することにより、より簡便に、ＥＬＭＯ１及び／又はＥＬＭＯ２に対する被験物質の作用を評価することができるという優れた効果を発揮する。【００２４】
したがって、本発明によれば、
−  被験物質の存在下に、ＥＬＭＯ１の発現若しくはＥＬＭＯ１を発現させることにより引き起こされる事象〔すなわち、発現（例えば、発現量）の抑制（例えば、減少）若しくは該事象の阻害等〕を評価し、該発現量の抑制（例えば、減少）若しくは該事象の阻害をもたらす被験物質を選別することを特徴とする、糖尿病性腎症の治療又は予防薬のスクリーニング方法（実施態様１）；
−  被験物質の存在下に、ＥＬＭＯ１及び／又はＥＬＭＯ２の発現〔すなわち、発現（例えば、発現量）の抑制（例えば、減少）若しくは事象の阻害等〕を評価し、該発現量の抑制（例えば、減少）若しくは該事象の阻害をもたらす被験物質を選別することを特徴とする、糖尿病の治療又は予防薬のスクリーニング方法（実施態様２）；
−  被験物質の存在下に、ＥＬＭＯ１及び／又はＥＬＭＯ２の発現〔すなわち、発現（例えば、発現量）の抑制（例えば、減少）等〕を評価し、該発現（例えば、発現量）の抑制（例えば、減少）をもたらす被験物質を選別することを特徴とする、細胞外基質産生抑制剤のスクリーニング方法（実施態様３）；
−  被験物質の存在下に、ＥＬＭＯ１及び／又はＥＬＭＯ２の発現〔すなわち、発現（例えば、発現量）の促進（例えば、増加）等〕を評価し、該発現（例えば、発現量）の促進をもたらす被験物質を選別することを特徴とする、マトリックスメタロプロテイナーゼの発現促進剤のスクリーニング方法（実施態様４）；
−  被験物質の存在下に、ＥＬＭＯ１及び／又はＥＬＭＯ２の発現〔すなわち、発現（例えば、発現量）の抑制（例えば、減少）等〕を評価し、該発現（例えば、発現量）の抑制（例えば、減少）をもたらす被験物質を選別することを特徴とする、サイトカイン産生抑制剤のスクリーニング方法（実施態様５）；
−  被験物質の存在下に、ＥＬＭＯ１及び／又はＥＬＭＯ２の発現〔すなわち、発現（例えば、発現量）の抑制（例えば、減少）等〕を評価し、該発現（例えば、発現量）の抑制（例えば、減少）をもたらす被験物質を選別することを特徴とする、糖取込み促進剤のスクリーニング方法（実施態様６）；
が提供される。なお、これらのスクリーニング方法は、薬理評価においても利用されうる。【００２５】
前記ＥＬＭＯ１及びＥＬＭＯ２は、貪食作用及び細胞運動に関与していることが知られている因子であり、それぞれ、配列番号：１に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド及び配列番号：２に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。【００２６】
前記ＥＬＭＯ１をコードする核酸としては、配列番号：１に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸等が挙げられる。また、前記ＥＬＭＯ２をコードする核酸としては、配列番号：２に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸等が挙げられる。【００２７】
なお、本発明においては、コードされるポリペプチドが、配列番号：１に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド（以下、野生型ＥＬＭＯ１ともいう）と同等の生物学的活性を呈するものであれば、前記ＥＬＭＯ１をコードする核酸は、前記配列番号：１に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸のバリアントであってもよい。また、同様に、コードされるポリペプチドが、配列番号：２に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド（以下、野生型ＥＬＭＯ２ともいう）と同等の生物学的活性を呈するものであれば、前記ＥＬＭＯ２をコードする核酸は、前記配列番号：２に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸のバリアントであってもよい。【００２８】
前記野生型ＥＬＭＯ１及び野生型ＥＬＭＯ２それぞれと同等の生物学的活性は、例えば、ＧＴＰ結合型Ｒａｃを測定することにより、Ｒａｃの活性化を指標として評価されうる。また、さらに、前記野生型ＥＬＭＯ１及び野生型ＥＬＭＯ２それぞれと同等の生物学的活性は、当該ＥＬＭＯ１及びＥＬＭＯ２それぞれの存在に基づく細胞外基質量の上昇、マトリックスメタロプロテイナーゼの減少及びサイトカインの上昇をもたらす性質を指標としても評価されうる。ただし、この場合、野生型ＥＬＭＯ１及び／又は野生型ＥＬＭＯ２とは無関係な経路により、細胞外基質量の上昇、マトリックスメタロプロテイナーゼの減少及びサイトカインの上昇をもたらす因子であり、かつ糖尿病腎症に無関係な因子は除かれる。【００２９】
前記野生型ＥＬＭＯ１をコードする核酸のバリアントとしては、例えば、
１）配列番号：１に示されるアミノ酸配列において、少なくとも１残基、具体的には、1個若しくは複数個、好ましくは、１個若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、付加又は挿入を有するアミノ酸配列をコードする核酸、
２）野生型ＥＬＭＯ１をコードする核酸のアンチセンス鎖とストリンジェントな条件下にハイブリダイズしうる核酸、
３）配列番号：１に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列に対し、Ｌｉｐｍａｎ−ｐｅａｒｓｏｎ法〔Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２７、ｐ１４３５（１９８５）〕により、最適な状態にアラインメントされ、算出された値であり、少なくとも５０％、好ましくは、８０％以上、より好ましくは、９０％以上である塩基配列からなる核酸、
等が挙げられる。【００３０】
前記核酸は、天然由来のバリアントであってもよく、人為的な変異を有する変異体であってもよい。人為的な変異を有する変異体は、例えば、モレキュラークローニング・ア・ラボラトリーマニュアル第３版等の記載に準じ、部位特異的変異導入法等により作製されうる。【００３１】
本明細書において、前記ストリンジェントな条件としては、例えば、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ  クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）と０．５％  ＳＤＳと５×デンハルトと１００μｇ／ｍｌ  変性サケ精子ＤＮＡと５０％  ホルムアミドとを含む溶液中、５０℃、よりストリンジェントには、６０℃で１２時間インキュベーションし、低イオン強度、例えば、０．５×ＳＳＣ、よりストリンジェントには、０．１×ＳＳＣ等の条件及び／又はより高温、５０℃以上、よりストリンジェントには、５５℃、さらにストリンジェントには、６０℃、より一層ストリンジェントには、６５℃等の条件下での洗浄を行なう条件が挙げられる。【００３２】
本発明のスクリーニング方法に用いられる「被験物質」としては、例えば、生物の細胞抽出物、該生物の無細胞抽出物、該生物の細胞培養上清等の試料中に含まれた物質、生物学的に産生された物質、化学的に合成された化合物等が挙げられる。【００３３】
より具体的には、前記被験試料としては、例えば、化合物、ペプチド、ペプチドミメティックス、各種タンパク質、核酸、核酸アナログ、抗体、抗体断片等が挙げられる。なお、前記化合物には、コンビナトリアルケミストリーにより得られたコンビナトリアルライブラリーの化合物も含まれる。また、前記抗体及び抗体断片には、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、単鎖抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、Ｆａｂフラグメント等が含まれる。前記核酸及び核酸アナログには、アンチセンス核酸、リボザイム、ＰＮＡ等が含まれる。【００３４】
ここで、前記生物としては、例えば、植物、動物、微生物等が挙げられる。【００３５】
１．実施態様１について
前記実施態様１のスクリーニング方法によれば、ＥＬＭＯ１の発現の抑制（例えば、発現量の減少）若しくはＥＬＭＯ１を発現させることにより引き起こされる事象の阻害を評価するため、糖尿病性腎症の進行を遅延させるための治療に一般的に用いられているＡＣＥ阻害薬、アンジオテンシンＩＩ受容体拮抗薬等とは異なる作用機序を示す物質を簡便に、効率よくスクリーニングすることができるという優れた効果を発揮する。【００３６】
なお、本発明のスクリーニング方法においては、対照として、被験物質非存在下におけるＥＬＭＯ１の発現量、前記事象等を、被験物質存在下の場合と同様に評価し、被験物質存在下の場合のＥＬＭＯ１の発現量、前記事象と比較すればよい。【００３７】
かかるスクリーニング方法は、評価対象に応じて、
（１）  被験物質の存在下に、ＥＬＭＯ１をコードする核酸をコードする核酸を導入した哺乳動物細胞におけるＥＬＭＯ１の発現量を測定し、ＥＬＭＯ１の発現量を減少させる被検物質を、糖尿病性腎症の治療又は予防薬の候補物質としてスクリーニングする方法（方法１という）；
（２）  被験物質の存在下に、ＥＬＭＯ１をコードする核酸を導入した哺乳動物細胞における細胞外基質の量を測定し、ＥＬＭＯ１の発現により引き起こされる該細胞外基質量の上昇を抑制する被験物質を、糖尿病性腎症の治療又は予防薬の候補物質としてスクリーニングする方法（方法２という）；
（３）  被験物質の存在下に、ＥＬＭＯ１をコードする核酸を導入した哺乳動物細胞におけるマトリックスメタロプロテイナーゼの量を測定し、ＥＬＭＯ１の発現により引き起こされる該マトリックスメタロプロテイナーゼの減少を抑制する被験物質を、糖尿病性腎症の治療又は予防薬の被験物質としてスクリーニングする方法（方法３という）；
（４）  被験物質の存在下に、ＥＬＭＯ１をコードする核酸を導入した哺乳動物細胞におけるサイトカインの量を測定し、ＥＬＭＯ１の発現により引き起こされる該サイトカイン量の上昇を抑制する被験物質を、糖尿病性腎症の治療又は予防薬の被験物質としてスクリーニングする方法（方法４という）；
により行なわれうる。【００３８】
前記方法１としては、より具体的には、例えば、被験物質の存在下に、ＥＬＭＯ１をコードする核酸をコードする核酸を導入した哺乳動物細胞におけるＥＬＭＯ１の発現量を測定するステップを行ない、被験物質の存在した場合にＥＬＭＯ１の発現量が減少することを、該被験物質が糖尿病性腎症の治療又は予防薬であることの指標として、目的の被験物質をスクリーニングする方法等が挙げられる。【００３９】
前記ＥＬＭＯ１をコードする核酸を哺乳動物細胞に導入する際、該核酸を適切なベクターに連結し、得られた組換えベクターを慣用の遺伝子導入法により、哺乳動物細胞に導入してもよい。また、哺乳動物細胞への核酸の導入に際して、前記核酸を、いわゆるｎａｋｅｄ-ＤＮＡとして用いてもよく、リポソーム、金粒子、ウイルス抽出物等の慣用の担体に担持させ、得られた産物（以下、核酸導入用担体ともいう）を用いてもよい。【００４０】
前記ベクターとしては、安定発現細胞株を樹立する観点から、好ましくは、抗生物質耐性遺伝子を含有しているベクターが望ましく、例えば、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＣＤＭ８、ｐＲＥＰ、ｐＵＣ１９、ｐＴｒｘＦｕｓ（商品名、インビトロジェン社製）、ｐＥＴ−３、ｐＥＴ−１１、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（＋）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（−）、ｐＣＭＶ−Ｓｃｒｉｐｔ（商品名、ストラタジーン社製）、ｐＣｌ−ｎｅｏ（プロメガ社製）、ｐＵＣ１１８、ｐＳＴＶ２８（タカラバイオ社製）等が挙げられる。【００４１】
前記哺乳動物細胞としては、例えば、ヒト由来株細胞のＨＥＫ２９３（ヒト胎児腎細胞、ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１５７３）、ＨｅＬａ（子宮頚部癌細胞、ＡＴＣＣ：ＣＣＬ−２）ＨＢＴ５６３７（白血病細胞、特開昭６３−２９９）、ＢＡＬＬ−１（白血病細胞）及びＨＣＴ−１５（大腸癌細胞）、ヒト腎糸球体上皮細胞、マウス由来株細胞のＳｐ２／０−Ａｇ１４（マウス骨髄種細胞、ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１５８１）及びＮＳＯ（マウス骨髄種細胞）、マウス腎糸球体上皮細胞、サル由来株細胞のＣＯＳ−１（アフリカミドリザル腎細胞（ＳＶ４０形質転換細胞）、ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１６５０）及びＣＯＳ−７（アフリカミドリザル腎細胞（ＳＶ４０形質転換細胞）、ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１６５１）、ハムスター由来株細胞のＣＨＯ−Ｋ１（チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＡＴＣＣ：ＣＣＬ−６１）及びＢＨＫ−２１（Ｃ−１３）（シシリアンハムスター仔腎細胞、ＡＴＣＣ：ＣＣＬ−１０）、ラット由来株細胞のＰＣ１２（副腎褐色細胞腫、ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１７２１）及びＹＢ２／０（ラット骨髄種細胞、ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１６６２）、ラット腎糸球体上皮細胞等が挙げられる。なかでも、治療薬等をスクリーニングする観点から、好ましくは、ヒト由来細胞が望ましい。【００４２】
前記核酸が導入された哺乳動物細胞について、例えば、細胞中におけるＥＬＭＯ１若しくはその遺伝子の発現が、核酸導入前の哺乳動物細胞における発現に比べ、増加していることを指標として、本発明のスクリーニング方法に用いられうる細胞であることが評価されうる。【００４３】
被験物質存在下における前記細胞中のＥＬＭＯ１の量は、例えば、
（Ｉ）  被験物質を含有した培地又は被験物質を含まない培地で、細胞を培養し、得られた細胞から全ＲＮＡを抽出し、得られた全ＲＮＡを鋳型とし、適切なプライマー（対）を用いてＲＴ−ＰＣＲを行なう方法；
（ＩＩ）  被験物質を含有した培地又は被験物質を含まない培地で、細胞を培養し、得られた細胞から全ＲＮＡを抽出し、適切なプローブを用いて、ノーザンブロット解析を行なう方法；
（ＩＩＩ）  被験物質を含有した培地又は被験物質を含まない培地で、細胞を培養し、得られた細胞から無細胞抽出液を調製し、得られた無細胞抽出液と、適切な抗体とを用いて、イムノアッセイを行なう方法；
（ＩＶ）  被験物質を含有した培地又は被験物質を含まない培地で、細胞を培養し、得られた培養上清と、適切な抗体とを用いて、イムノアッセイを行なう方法；
等により、測定されうる。【００４４】
なかでも、スクリーニングを迅速かつ多量に行なう観点から、迅速かつ多量に処理可能な方法が望ましく、好ましくは、ＲＴ−ＰＣＲを行なう方法、及び得られた培養上清と適切な抗体とを用いて、イムノアッセイを行なう方法が望ましい。【００４５】
前記培地としては、哺乳動物細胞の培養に適した培地であればよく、例えば、ＭＥＭ培地〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，１３０，４３２（１９５９）〕、Ｄ−ＭＥＭ培地〔Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８，３９６（１９５９）〕、ＲＰＭＩ１６４０培地〔Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，１９９，５１９（１９６７）〕等にウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を適量添加したもの等が挙げられる。【００４６】
本発明において用いられるプライマーは、例えば、Ｔｍ値等、公知配列、核酸の二次構造の形成等を考慮し、プライマーのデザインを支援する慣用のソフトウェア等により作製されうる。プライマーの鎖長は、特に限定はないが、例えば、１５〜４０ヌクレオチド長であり、好ましくは、１７〜３０ヌクレオチド長であることが望ましい。【００４７】
本発明において用いられるプローブは、前記プライマーと同様に、例えば、Ｔｍ値等、公知配列、核酸の二次構造の形成等を考慮し、慣用のソフトウェア等により作製されうる。前記プローブの鎖長は、特に限定はないが、非特異的なハイブリダイゼーションを防止する観点から、連続した１５ヌクレオチド長以上であり、好ましくは、１８ヌクレオチド長以上であることが望ましい。前記プローブとしては、検出対象のポリペプチドをコードする核酸の塩基配列のうち、データベースの公知配列に存在しない塩基配列からなる核酸又はそのアンチセンス鎖、該塩基配列中の連続した１５ヌクレオチド長以上の塩基配列を有する核酸又はそのアンチセンス鎖等が挙げられる。【００４８】
本発明に用いられる抗体は、例えば、カレント・プロトコルズ・イン・イムノロジー〔Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、ジョン・Ｅ・コリガン（Ｊｏｈｎ  Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ）編、ジョン・ワイリー＆サンズ社（Ｊｏｈｎ  Ｗｅｉｌｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ）発行、１９９２年〕に記載の方法により、検出対象のポリペプチドを用いて、ウサギやマウス等を免疫することにより、容易に作製され得る。本発明に用いられる抗体は、検出対象のポリペプチドに特異的に結合する能力を有するものであれば、ポリクローナル抗体であってもよく、モノクローナル抗体であってもよく、モノクローナル抗体を精製後、ペプチダーゼ等により処理することにより得られた抗体の断片であってもよい。さらに、本発明に用いられる抗体は、前記抗体の誘導体、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、Ｆａｂフラグメント、単鎖抗体等や公知技術により修飾された抗体等であってもよい。なお、本発明に用いられる抗体の特異性は、例えば、検出対象のポリペプチド及び他のポリペプチドを用い、オクタロニー法により、検出対象のポリペプチドとは反応して、沈降線を示し、他のポリペプチドとは反応せず、沈降線を示さないことを指標として評価されうる。【００４９】
前記方法２としては、より具体的には、例えば、被験物質存在下に、ＥＬＭＯ１をコードする核酸をコードする核酸を導入した哺乳動物細胞における細胞外基質の量を測定するステップを含み、ここで、被験物質の存在した場合に細胞外基質の産生が抑制されることを、該被験物質が糖尿病性腎症の治療又は予防薬であることの指標として、目的の被験物質をスクリーニングする方法等が挙げられる。【００５０】
前記方法２において、細胞外基質の量は、例えば、前記方法１と同様に、前記（Ｉ）〜（ＩＶ）に記載の手法等により、測定され得、スクリーニングを迅速かつ多量に行なう観点から、好ましくは、ＲＴ−ＰＣＲを行なう方法、及び得られた培養上清と適切な抗体とを用いて、イムノアッセイを行なう方法が望ましい。【００５１】
なお、細胞外基質の測定に用いられうるプライマー対としては、例えば、フィブロネクチンについて、配列番号：５に示される塩基配列を有するプライマーと配列番号：６に示される塩基配列を有するプライマーとからなるプライマー対、Ｉ型コラーゲン（アルファ１）について、配列番号：７に示される塩基配列を有するプライマーと配列番号：８に示される塩基配列を有するプライマーとからなるプライマー対等が挙げられる。【００５２】
前記方法３としては、より具体的には、例えば、被験物質存在下に、ＥＬＭＯ１をコードする核酸をコードする核酸を導入した哺乳動物細胞におけるマトリックスメタロプロテイナーゼの量を測定するステップを行ない、該被験物質の存在した場合にマトリックスメタロプロテイナーゼ産生が促進されること（例えば、ＥＬＭＯ１の発現により引き起こされる該マトリックスメタロプロテイナーゼの減少が抑制されること）を、該被験物質が糖尿病性腎症の治療又は予防薬であることの指標として、該被検物質をスクリーニングする方法等が挙げられる。【００５３】
マトリックスメタロプロテイナーゼの量は、例えば、
前記方法１と同様に培養された各細胞の全ＲＮＡを鋳型とし、マトリックスメタロプロテイナーゼに応じたプライマー（対）を用いてＲＴ−ＰＣＲを行なう方法；
前記方法１と同様に培養された各細胞の全ＲＮＡとマトリックスメタロプロテイナーゼに応じたプローブとを用いて、ノーザンブロット解析を行なう方法；
前記方法１と同様に培養された無細胞抽出液とマトリックスメタロプロテイナーゼに対する抗体とを用いて、イムノアッセイを行なう方法；
前記無細胞抽出液について、マトリックスメタロプロテイナーゼの活性を測定する方法；
前記無細胞抽出液について、天然基質であるコラーゲンの分解活性を測定する方法；
前記無細胞抽出液について、蛍光ラベルされた合成ペプチド基質の分解活性を測定する方法；
等により、測定されうる。【００５４】
なかでも、簡便にハイスループットで測定可能である観点から、好ましくは、蛍光ラベルされた合成ペプチドを利用する方法が望ましい。【００５５】
ＲＴ−ＰＣＲを行なう場合、用いられうるプライマー対としては、特に限定されないが、例えば、マトリックスメタロプロテイナーゼ−２（ＭＭＰ−２）について、配列番号：１１に示される塩基配列を有するプライマーと、配列番号：１２に示される塩基配列を有するプライマーとからなるプライマー対、マトリックスメタロプロテイナーゼ−３（ＭＭＰ−３）について、配列番号：１３に示される塩基配列を有するプライマーと、配列番号：１４に示される塩基配列を有するプライマーとからなるプライマー対等が挙げられる。【００５６】
マトリックスメタロプロテイナーゼの活性は、例えば、天然基質であるコラーゲンの分解活性を測定する方法や蛍光ラベルされた合成ペプチド基質の分解活性を測ること等により測定されうる。【００５７】
前記方法４としては、より具体的には、例えば、被験物質存在下に、ＥＬＭＯ１をコードする核酸をコードする核酸を導入した哺乳動物細胞におけるサイトカインの量を測定するステップを行ない、被験物質の存在した場合にサイトカイン産生が抑制されることを、該被験物質が糖尿病性腎症の治療又は予防薬であることの指標として、目的の被検物質をスクリーニングする方法等が挙げられる。【００５８】
サイトカインの量は、例えば、
前記方法１と同様に培養された各細胞の全ＲＮＡを鋳型とし、サイトカインに応じたプライマー（対）を用いてＲＴ−ＰＣＲを行なう方法、
前記方法１と同様に培養された各細胞の全ＲＮＡとサイトカインに応じたプローブとを用いて、ノーザンブロット解析を行なう方法、
前記方法１と同様に培養された無細胞抽出液とサイトカインに対する抗体とを用いて、イムノアッセイを行なう方法
等により、測定されうる。【００５９】
ＲＴ−ＰＣＲを行なう場合、用いられうるプライマー対としては、特に限定されないが、例えば、ＴＧＦ−β１について、配列番号：９に示される塩基配列を有するプライマーと、配列番号：１０に示される塩基配列を有するプライマーとからなるプライマー対等が挙げられる。【００６０】
また、方法４においては、サイトカイン又はそれにより引き起こされる生理学的事象を指標としてサイトカインの量を測定してもよい。【００６１】
前記方法４においては、被験物質の存在下に、ＥＬＭＯ１の発現により引き起こされる該サイトカインの上昇が抑制されることが、該被験物質が糖尿病性腎症の治療又は予防薬の被験物質であることの指標となる。【００６２】
２．実施態様２について
前記実施態様２のスクリーニング方法は、より具体的には、例えば、被験物質の存在下に、ＥＬＭＯ１をコードする核酸及び／又はＥＬＭＯ２をコードする核酸を導入した哺乳動物細胞におけるＥＬＭＯ１及び／又はＥＬＭＯ２の発現量を測定するステップを行ない、該被験物質の存在した場合に該発現量が減少することを、該被験物質が糖尿病の治療又は予防薬であることの指標として、目的の被験物質をスクリーニングすることができる。【００６３】
前記実施態様２のスクリーニング方法において、ＥＬＭＯ１及び／又はＥＬＭＯ２の発現量は、前記実施態様１における（Ｉ）〜（ＩＶ）と同様の手法と同様に測定されうる。【００６４】
前記実施態様２のスクリーニング方法によれば、ＥＬＭＯ１及び／又はＥＬＭＯ２の発現の抑制若しくは前記事象の阻害を評価するため、現在、糖尿病の治療において一般的に標的とされている「インスリン分泌促進」、「α−グルコシダーゼ阻害」等の作用機序とは異なる作用機序を示す物質をスクリーニングすることができるという優れた効果を発揮する。【００６５】
３．実施態様３について
前記実施態様３のスクリーニング方法においては、より具体的には、例えば、被験物質の存在下に、ＥＬＭＯ１をコードする核酸及び／又はＥＬＭＯ２をコードする核酸を導入した哺乳動物細胞におけるＥＬＭＯ１及び／又はＥＬＭＯ２の発現量を測定するステップを行ない、該被験物質の存在した場合に該発現量が減少することを、該被験物質が細胞外基質産生抑制剤であることの指標として、目的の被験物質をスクリーニングすることができる。【００６６】
なお、ＥＬＭＯ２をコードする核酸を導入した哺乳動物細胞は、前記ＥＬＭＯ１をコードする核酸を導入した哺乳動物細胞と同様に作製されうる。【００６７】
前記「細胞外基質」とは、糸球体を構成するメサンギウム領域に蓄積すること等の性質を有し、糖尿病性腎症に関与する生体構造物をいう〔例えば、アヨ（Ayo, S. H.）ら、 American Journal of Pathology １３６巻、１３３９−１３４８、１９９０年；ワーブ（Wahab, N. A）ら、Biochemical Journal.、３１６巻、９８５−９９２、１９９６年；アヨ（Ayo, S. H.）ら、American Journal of Physiology、２６０巻、１８５−１９１、１９９１年等を参照〕。前記「細胞外基質」としては、例えば、フィブロネクチン、Ｉ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、ラミニン等が挙げられる。【００６８】
前記実施態様３のスクリーニング方法において、ＥＬＭＯ１及び／又はＥＬＭＯ２の発現量は、前記実施態様１における（Ｉ）〜（ＩＶ）におけるＥＬＭＯ１の発現量の測定等の場合と同様の手法と同様に測定されうる。【００６９】
コラーゲン、フィブロネクチン等の細胞外基質は、糸球体のメサンギウム領域に蓄積することにより糸球体の硬化を引き起こすことから、これらの産生を抑制する物質（細胞外基質産生抑制剤）は、糸球体硬化や間質の線維化、及びそれに伴う慢性腎疾患、特に糖尿病性腎症の治療薬又は予防薬としての作用が期待される。【００７０】
４．実施態様４について
前記実施態様４のスクリーニング方法においては、より具体的には、例えば、被験物質の存在下に、ＥＬＭＯ１をコードする核酸及び／又はＥＬＭＯ２をコードする核酸を導入した哺乳動物細胞におけるＥＬＭＯ１及び／又はＥＬＭＯ２の発現量を測定するステップを行ない、該被験物質の存在した場合にＥＬＭＯ１及び／又はＥＬＭＯ２の発現量が減少することを、該被験物質が、マトリックスメタロプロテイナーゼの発現促進剤であることの指標として、被験物質をスクリーニングすることができる。【００７１】
前記実施態様４のスクリーニング方法において、ＥＬＭＯ１及び／又はＥＬＭＯ２の発現量は、前記実施態様１における（Ｉ）〜（ＩＶ）におけるＥＬＭＯ１の発現量の測定等の場合と同様の手法と同様に測定されうる。【００７２】
前記「マトリックスメタロプロテイナーゼ」とは、コラーゲン、ラミニン等の細胞外基質を分解する酵素であるマトリックスプロテイナーゼにおいて糖尿病性腎症に関与するものをいう〔例えば、前田ら、Kidney International. ６０巻、１４２８−１４３４、２００１年；マクレナン（McLennan SV）ら、Diabetologia、４３巻、６４２−６４８、２０００年；シング（Singh R）ら、Experimental Nephrology、９巻、９巻、２４９−２５７、２００１年等を参照〕。前記「マトリックスメタロプロテイナーゼ」としては、例えば、マトリックスプロテイナーゼ−１、マトリックスプロテイナーゼ−２、マトリックスプロテイナーゼ−３、マトリックスプロテイナーゼ−９等が挙げられる。【００７３】
前記マトリックスメタロプロテイナーゼは、各種コラーゲンやフィブロネクチン等の細胞外基質を分解するため、マトリックスメタロプロテイナーゼの発現を促進させるような物質（ＭＭＰ発現促進剤）は、これらの基質のメサンギウム領域への蓄積を防ぐことにより糸球体硬化や間質の線維化及びそれに伴う慢性腎疾患、特に糖尿病性腎症の治療薬又は予防薬としての作用が期待される。【００７４】
５．実施態様５について
前記実施態様５のスクリーニング方法においては、より具体的には、例えば、被験物質の存在下に、ＥＬＭＯ１をコードする核酸及び／又はＥＬＭＯ２をコードする核酸を導入した哺乳動物細胞におけるＥＬＭＯ１及び／又はＥＬＭＯ２の発現量を測定するステップを含み、ここで、被験物質の存在した場合にＥＬＭＯ１及び／又はＥＬＭＯ２の発現量が減少することを、該被験物質が、サイトカイン産生抑制剤であることの指標として、被験物質をスクリーニングすることができる。【００７５】
本明細書において、前記「サイトカイン」とは、糖尿病性腎症の発症に関与し、細胞から放出されるタンパク質性因子をいう〔例えば、ワング（Wang S）ら、American Journal of Physiology、２７８巻、５５４−５６０、２０００年；ワング（Wang S）ら、Kidney International、５７巻、１００２−１０１４、２０００年；ヒルシュベルク（Hirschberg R）ら、The Journal Clinical Investigation、９８巻、１１６−１２４、１９９６年等を参照のこと）。前記「サイトカイン」としては、例えば、ＴＧＦ−β１、ＴＮＦ−α、ＰＤＧＦ、ＣＴＧＦ、ＩＧＦ−１、ＶＥＧＦ−Ａ、ＨＧＦ、ＩＬ−６等が挙げられる。【００７６】
なお、ＴＧＦ−β１、ＩＬ−６等のサイトカインは各種細胞外基質の発現を誘導し、さらに分解を抑制させることにより細胞外基質をメサンギウム領域に蓄積させることが知られている。そのため、これらのサイトカインの産生を抑制させる物質（サイトカイン産生抑制剤）はこれらの基質のメサンギウム領域への蓄積を防ぐことにより糸球体硬化や間質の線維化、及びそれに伴う慢性腎疾患、特に糖尿病性腎症の治療薬又は予防薬としての作用が期待される。【００７７】
前記実施態様５のスクリーニング方法において、ＥＬＭＯ１及び／又はＥＬＭＯ２の発現量は、前記実施態様１における（Ｉ）〜（ＩＶ）におけるＥＬＭＯ１の発現量の測定等の場合と同様の手法と同様に測定されうる。【００７８】
６．実施態様６について
前記実施態様６のスクリーニング方法においては、より具体的には、例えば、被験物質の存在下に、ＥＬＭＯ１をコードする核酸及び／又はＥＬＭＯ２をコードする核酸を導入した哺乳動物細胞におけるＥＬＭＯ１及び／又はＥＬＭＯ２の発現量を測定するステップを行ない、被験物質の存在した場合にＥＬＭＯ１及び／又はＥＬＭＯ２の発現量が減少することを、該被験物質が、糖取込み促進剤であることの指標として、被験物質をスクリーニングすることができる。【００７９】
前記「糖」とは、グルコース（ブドウ糖）をいう。【００８０】
前記実施態様６のスクリーニング方法において、ＥＬＭＯ１及び／又はＥＬＭＯ２の発現量は、前記実施態様１における（Ｉ）〜（ＩＶ）におけるＥＬＭＯ１の発現量の測定等の場合と同様の手法と同様に測定されうる。【００８１】
なお、血糖値の上昇は、糖尿病及び血管障害を引き起こし、糖尿病性腎症、神経症、網膜症等の合併症を発症するため、糖の主たる消費組織である脂肪細胞や骨格筋細胞などにおいて糖の取込みを促進するような物質（糖取込み促進剤）は高血糖状態になるのを防ぐため糖尿病の治療薬又は予防薬としての作用が期待される。【００８２】
さらに、糖尿病性腎症を発症した糖尿病患者において、ＥＬＭＯ１遺伝子の第１６イントロン、第１７イントロン及び第１８イントロンにおいて、糖尿病性腎症との強い関連性を示す変異が高い頻度で見られるという本発明者らの知見に基づき、糖尿病性腎症の診断方法が提供される。かかる診断方法も本発明に含まれる。【００８３】
本発明の診断方法は、ＥＬＭＯ１遺伝子の第１６イントロン、ＥＬＭＯ1遺伝子の第１７イントロン及びＥＬＭＯ１遺伝子の第１８イントロンからなる群より選ばれた少なくとも１種のイントロンにおける多型を検出することを１つの大きな特徴とする。【００８４】
ＥＬＭＯ１遺伝子並びにその第１６イントロン、第１７イントロン及び第１８イントロンは、いずれもヒト第７染色体に位置しており、ＤＮＡ配列について、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＣ−０００００７に従った場合、第１６イントロンは、塩基番号：４３５５４〜塩基番号：５５３８３４までの領域、第１７イントロンは、塩基番号：５５３９９９〜塩基番号：５６１１７９までの領域、第１８イントロンは塩基番号：５６１２９３〜塩基番号：５７０７３４までの領域をいう。【００８５】
本発明の診断方法では、例えば、第１６イントロンにおける６５０１５位のシトシン（Ｃ）からチミン（Ｔ）への置換、６５２８７位のシトシン（Ｃ）からグアニン（Ｇ）への置換、６７３６３位のアデニン（Ａ）からグアニン（Ｇ）への置換、７９４１０位のシトシン（Ｃ）からグアニン（Ｇ）への置換、８０７１６位のシトシン（Ｃ）からチミン（Ｔ）への置換、１０１３２６位のグアニン（Ｇ）からシトシン（Ｃ）への置換、１０５６１２位のシトシン（Ｃ）からチミン（Ｔ）への置換、１１４４５８位のシトシン（Ｃ）からチミン（Ｔ）への置換、第１７イントロンにおける５４９５位のグアニン（Ｇ）からアデニン（Ａ）への置換、６９５８位のチミン（Ｔ）からシトシン（Ｃ）への置換、第１８イントロンにおける９１７０位のグアニン（Ｇ）からアデニン（Ａ）への置換を検出する。【００８６】
また、本発明の診断方法は、ＥＬＭＯ１遺伝子の第１６イントロン、ＥＬＭＯ1遺伝子の第１７イントロン及びＥＬＭＯ１遺伝子の第１８イントロンからなる群より選ばれた少なくとも１種のイントロンにおける多型、すなわち、変異を指標とするため、被験個体における糖尿病性腎症を高い信頼度で診断することができ、被験個体における糖尿病性腎症を容易に、迅速に診断することができるという優れた効果を発揮する。【００８７】
前記多型、すなわち、変異とは、少なくとも１塩基（すなわち、ヌクレオチド）の多型を意味し、例えば、少なくとも１ヌクレオチドの置換、欠失、付加又は挿入を有することを意味する。【００８８】
なお、本明細書において、「少なくとも１塩基」とは、１個〜数百個の塩基（すなわち、ヌクレオチド）、好ましくは、１個若しくは複数個のヌクレオチド、好ましくは、１個若しくは数個のヌクレオチドを意味する。【００８９】
前記多型は、核酸多型解析手段等を行なうことにより検出されうる。前記多型は、具体的には、例えば、（Ｉ）ＥＬＭＯ１遺伝子の第１６イントロン、ＥＬＭＯ1遺伝子の第１７イントロン及びＥＬＭＯ１遺伝子の第１８イントロンからなる群から選ばれた少なくとも１種のイントロンにおいて糖尿病性腎症に罹患する可能性に関連する多型を検出するために用いられるプローブ、及び／又は
（ＩＩ）ＥＬＭＯ１遺伝子の第１６イントロン、ＥＬＭＯ1遺伝子の第１７イントロン及びＥＬＭＯ１遺伝子の第１８イントロンからなる群より選ばれた少なくとも１種のイントロンにおいて糖尿病性腎症に罹患する可能性に関連する多型を検出するために用いられるプライマー対、
を用いて、ＰＣＲ、ＡＳＯ（Ａｌｌｅｌｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ法）、ＡＬＢＵＭ（Ａｌｄｅｈｙｄｅ−Ｌｉｎｋｅｒ−Ｂａｓｅｄ  Ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｍｉｓｍａｔｃｈ  Ｓｃａｎｎｉｎｇ法）、マイクロアレイによる解析、ｃｌｅｖａｇｅを用いた解析、インベーダー法、ＴａｑＭａｎＰＣＲ、ＲＦＬＰ等を行なうことにより塩基配列の決定することにより検出されうる。【００９０】
なお、前記（Ｉ）のプローブは、ＥＬＭＯ１遺伝子の第１６イントロン領域、ＥＬＭＯ1遺伝子の第１７イントロン領域若しくはＥＬＭＯ１遺伝子の第１８イントロン領域の配列又はこれらのアンチセンス配列と実質的に相補的なプローブであればよく、特に限定されない。ここで、実質的に相補的とはこれらの配列にストリンジェントな条件でハイブリッドできる程度に相補的であればよいことを意味する。さらに、これらのプローブは、５’側又は３’側、又はその両方に、イントロン領域の配列と相補的ではない配列を含んでも、イントロン領域の配列とハイブリダイズできるものであれば、本発明に用いられるプローブに含まれるものとする。本発明においては、例えば、検出しやすいように、任意の配列を付加したプローブを用いることができる。また、本発明においては、検出しやすいように５’末端を適切な標識物質で標識したものを用いることもできる。前記標識物質としては、ビオチン、蛍光物質、又は32Ｐ等が例示されうる。少なくとも数ヌクレオチド長、好ましくは、数ヌクレオチド長〜数千ヌクレオチド長、より好ましくは、数ヌクレオチド長〜数十ヌクレオチド長であることが望ましい。なお、ストリンジェントな条件は、前記と同様である。【００９１】
前記プローブとしては、具体的には、例えば、ＥＬＭＯ１遺伝子の塩基配列において、
ａ）  第１６イントロンの６５０１５位のヌクレオチドを含む連続した１０〜１００ヌクレオチドの塩基配列又はそのアンチセンス鎖を有するプローブ、
ｂ）  第１６イントロンの６５２８７位のヌクレオチドを含む連続した１０〜１００ヌクレオチドの塩基配列又はそのアンチセンス鎖を有するプローブ、
ｃ）  第１６イントロンの６７３６３位のヌクレオチドを含む連続した１０〜１００ヌクレオチドの塩基配列又はそのアンチセンス鎖を有するプローブ、
ｄ）  第１６イントロンの７９４１０位のヌクレオチドを含む連続した１０〜１００ヌクレオチドの塩基配列又はそのアンチセンス鎖を有するプローブ、
ｅ）  第１６イントロンの８０７１６位のヌクレオチドを含む連続した１０〜１００ヌクレオチドの塩基配列又はそのアンチセンス鎖を有するプローブ、
ｆ）  第１６イントロンの１０１３２６位のヌクレオチドを含む連続した１０〜１００ヌクレオチドの塩基配列又はそのアンチセンス鎖を有するプローブ、
ｇ）  第１６イントロンの１０５６１２位のヌクレオチドを含む連続した１０〜１００ヌクレオチドの塩基配列又はそのアンチセンス鎖を有するプローブ、
ｈ）  第１６イントロンの１１４４５８位のヌクレオチドを含む連続した１０〜１００ヌクレオチドの塩基配列又はそのアンチセンス鎖を有するプローブ、
ｉ）  第１７イントロンの５４９５位のヌクレオチドを含む連続した１０〜１００ヌクレオチドの塩基配列又はそのアンチセンス鎖を有するプローブ、
ｊ）  第１７イントロンの６９５８位のヌクレオチドを含む連続した１０〜１００ヌクレオチドの塩基配列又はそのアンチセンス鎖を有するプローブ、及び
ｋ）  第１８イントロンの９１７０位のヌクレオチドを含む連続した１０〜１００ヌクレオチドの塩基配列又はそのアンチセンス鎖を有するプローブ、
等が挙げられる。【００９２】
前記（ＩＩ）のプライマー対は、例えば、Ｔｍ値等、公知配列、核酸の二次構造の形成等を考慮し、プライマーのデザインを支援する慣用のソフトウェア等により作製されうる。ＥＬＭＯ１遺伝子の第１６イントロン、第１７イントロン及び第１８イントロン領域の糖尿病性腎症に罹患する可能性に関連する多型の上流及び下流の配列の一部と実質的に相補的なプライマー対であればよく、特に限定されない。ここで、実質的に相補的とは、ＥＬＭＯ１遺伝子の第１６イントロン、第１７イントロン、第１８イントロン領域の配列若しくはこれらのアンチセンス配列とアニーリングできる程度に相補的であればよいことを意味する。例えば、これらのプライマーは、５’側又は３’側、又はその両方に、ＥＬＭＯ１遺伝子の第１６イントロン、第１７イントロン又は第１８イントロン領域の配列と相補的ではない配列を含んでも、前記イントロン領域のいずれかの配列を有する核酸とハイブリダイズできるものであれば、本発明に用いられるプライマーに含まれるものとする。また、非特異的な増幅を防ぐためや、適当な制限酵素認識部位を導入するために、ＥＬＭＯ１遺伝子の第１６イントロン、第１７イントロン、第１８イントロン領域と相補的でないミスマッチ配列を有するプライマーを使用することができる。プライマーの鎖長は、特に限定はないが、例えば、１５〜４０ヌクレオチド長であり、好ましくは、１７〜３０ヌクレオチド長であることが望ましい。【００９３】
前記プライマー対としては、具体的には、例えば、ＥＬＭＯ１遺伝子の塩基配列において、
Ａ）  第１６イントロンの６５０１５位から５’又は３’末端方向に０〜２０ヌクレオチド長離れた位置に存在するヌクレオチドを一端とする連続した１５〜４０ヌクレオチドの塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、それに対応する方向に、該６５０１５位に対応するアンチセンス鎖上のヌクレオチドから０〜２０ヌクレオチド長離れた位置に存在するヌクレオチドを一端とする連続した１５〜４０ヌクレオチドの塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとからなるプライマー対、
Ｂ）  第１６イントロンの６５２８７位から５’又は３’末端方向に０〜２０ヌクレオチド長離れた位置に存在するヌクレオチドを一端とする連続した１５〜４０ヌクレオチドの塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、それに対応する方向に、該６５２８７位に対応するアンチセンス鎖上のヌクレオチドから０〜２０ヌクレオチド長離れた位置に存在するヌクレオチドを一端とする連続した１５〜４０ヌクレオチドの塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとからなるプライマー対、
Ｃ）  第１６イントロンの６７３６３位から５’又は３’末端方向に０〜２０ヌクレオチド長離れた位置に存在するヌクレオチドを一端とする連続した１５〜４０ヌクレオチドの塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、それに対応する方向に、該６７３６３位に対応するアンチセンス鎖上のヌクレオチドから０〜２０ヌクレオチド長離れた位置に存在するヌクレオチドを一端とする連続した１５〜４０ヌクレオチドの塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとからなるプライマー対、
Ｄ）  第１６イントロンの７９４１０位から５’又は３’末端方向に０〜２０ヌクレオチド長離れた位置に存在するヌクレオチドを一端とする連続した１５〜４０ヌクレオチドの塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、それに対応する方向に、該７９４１０位に対応するアンチセンス鎖上のヌクレオチドから０〜２０ヌクレオチド長離れた位置に存在するヌクレオチドを一端とする連続した１５〜４０ヌクレオチドの塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとからなるプライマー対、
Ｅ）  第１６イントロンの８０７１６位から５’又は３’末端方向に０〜２０ヌクレオチド長離れた位置に存在するヌクレオチドを一端とする連続した１５〜４０ヌクレオチドの塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、それに対応する方向に、該８０７１６位に対応するアンチセンス鎖上のヌクレオチドから０〜２０ヌクレオチド長離れた位置に存在するヌクレオチドを一端とする連続した１５〜４０ヌクレオチドの塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとからなるプライマー対、
Ｆ）  第１６イントロンの１０１３２６位から５’又は３’末端方向に０〜２０ヌクレオチド長離れた位置に存在するヌクレオチドを一端とする連続した１５〜４０ヌクレオチドの塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、それに対応する方向に、該１０１３２６位に対応するアンチセンス鎖上のヌクレオチドから０〜２０ヌクレオチド長離れた位置に存在するヌクレオチドを一端とする連続した１５〜４０ヌクレオチドの塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとからなるプライマー対、
Ｇ）  第１６イントロンの１０５６１２位から５’又は３’末端方向に０〜２０ヌクレオチド長離れた位置に存在するヌクレオチドを一端とする連続した１５〜４０ヌクレオチドの塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、それに対応する方向に、該１０５６１２位に対応するアンチセンス鎖上のヌクレオチドから０〜２０ヌクレオチド長離れた位置に存在するヌクレオチドを一端とする連続した１５〜４０ヌクレオチドの塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとからなるプライマー対、
Ｈ）  第１６イントロンの１１４４５８位から５’又は３’末端方向に０〜２０ヌクレオチド長離れた位置に存在するヌクレオチドを一端とする連続した１５〜４０ヌクレオチドの塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、それに対応する方向に、該１１４４５８位に対応するアンチセンス鎖上のヌクレオチドから０〜２０ヌクレオチド長離れた位置に存在するヌクレオチドを一端とする連続した１５〜４０ヌクレオチドの塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとからなるプライマー対、
Ｉ）  第１７イントロンにおける５４９５位から５’又は３’末端方向に０〜２０ヌクレオチド長離れた位置に存在するヌクレオチドを一端とする連続した１５〜４０ヌクレオチドの塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、それに対応する方向に、該５４９５位に対応するアンチセンス鎖上のヌクレオチドから０〜２０ヌクレオチド長離れた位置に存在するヌクレオチドを一端とする連続した１５〜４０ヌクレオチドの塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとからなるプライマー対、
Ｊ）  第１７イントロンにおける６９５８位から５’又は３’末端方向に０〜２０ヌクレオチド長離れた位置に存在するヌクレオチドを一端とする連続した１５〜４０ヌクレオチドの塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、それに対応する方向に、該６９５８位に対応するアンチセンス鎖上のヌクレオチドから０〜２０ヌクレオチド長離れた位置に存在するヌクレオチドを一端とする連続した１５〜４０ヌクレオチドの塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとからなるプライマー対、及び
Ｋ）  第１８イントロンにおける９１７０位から５’又は３’末端方向に０〜２０ヌクレオチド長離れた位置に存在するヌクレオチドを一端とする連続した１５〜４０ヌクレオチドの塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、それに対応する方向に、該９１７０位に対応するアンチセンス鎖上のヌクレオチドから０〜２０ヌクレオチド長離れた位置に存在するヌクレオチドを一端とする連続した１５〜４０ヌクレオチドの塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとからなるプライマー対、
等が挙げられる。【００９４】
前記多型の検出に用いうるプローブ及びプライマーとしては、例えば、
ＥＬＭＯ１イントロン１６  ＋６５０１５のＣがＴに置換したプローブ（１２１ヌクレオチド）（配列番号：１７）：
5'-AAGGAGTCTGGTGTCTTTTGCACATGATGATGTCAACTTGGGTCCCTCACATTGCCTTAGTGTCCTTCACCCAACCCACCAGTGCAGGACATAGTGGTCCTCCCCACCCCGCCCATTGTCT-3'；
ＥＬＭＯ１イントロン１６  ＋６５０１５の部分を含むポリヌクレオチドを検出するためのプライマー（配列番号：１８）：
5'-GCACATGATGAT GTCAACTTGG-3'；
ＥＬＭＯ１イントロン１６  ＋６５０１５の部分を含むポリヌクレオチドを検出するためのプライマー（配列番号：１９）：
5'-ATCTAGTTCATCCACTGAGCTC-3'；
ＥＬＭＯ１イントロン１６  ＋６５０１５の塩基がCであるものを検出するプローブ（配列番号：２０）：
5'-TTGCCTTAGCGTCCTT-3'；
ＥＬＭＯ１イントロン１６  ＋６５０１５の塩基がTであるものを検出するプローブ（配列番号：２１）：
5'-ATTGCCTTAGTGTCCTT-3'；
ＥＬＭＯ１イントロン１６  ＋６５０１５の塩基がTであるかCであるかを検出するためのＴａｑｍａｎ  ＰＣＲプライマー（配列番号：２２）：
5'-CTGGTGTCTTTTGCACATGATGATG-3'；
ＥＬＭＯ１イントロン１６  ＋６５０１５の塩基がTであるかCであるかを検出するためのＴａｑｍａｎ  ＰＣＲプライマー（配列番号：２３）：
5'-GCACTGGTGGGTTGGGT-3'；
ＥＬＭＯ１イントロン１６  ＋６５２８７のCがGに置換したポリヌクレオチド（１２１ヌクレオチド）（配列番号：２４）：
5'-TTCTGCATGCTAGGAACCGACATAGGAGTTGGGGATAATAAGTCAAAGAACGCACAATAAGTCACTTGACTGTGTCTATGATAGACAAGTGTTTGCCTAGCTTATGTCACTTGAACTCGAC-3'；
ＥＬＭＯ１イントロン１６  ＋６５２８７の部分を含むポリヌクレオチドを検出するためのプライマー（配列番号：２５）：
5'-GCACATGATGATGTCAACTTGG-3'；
ＥＬＭＯ１イントロン１６  ＋６５２８７の部分を含むポリヌクレオチドを検出するためのプライマー（配列番号：２６）：
5'-ATCTAGTTCATCCACTGAGCTC-3'；
ＥＬＭＯ１イントロン１６  ＋６５２８７の塩基がCであるものを検出するプローブ（配列番号：２７）：
5'-CAGTCAAGTGAGTTATT-3'；
ＥＬＭＯ１イントロン１６  ＋６５２８７の塩基がGであるものを検出するプローブ（配列番号：２８）：
5'-CAGTCAAGTGACTTATT-3'；
ＥＬＭＯ１イントロン１６  ＋６５２８７の塩基がTであるかCであるかを検出するためのＴａｑｍａｎ  ＰＣＲプライマー（配列番号：２９）：
5'-GCTAGGAACCGACATAGGAGTTG-3'；
ＥＬＭＯ１イントロン１６  ＋６５２８７の塩基がTであるかCであるかを検出するためのＴａｑｍａｎ  ＰＣＲプライマー（配列番号：３０）：
5'-ACATAAGCTAGGCAAACACTTGTCT-3'；
ＥＬＭＯ１イントロン１６  ＋６７３６３のAがGに置換したポリヌクレオチド（１２１ヌクレオチド）（配列番号：３１）：
5'-GTGGAGATCAGTCATTTCAATAACCTACCTCCGATGCCTTTCATTCCAGGATTCCAAAGGGGTTTCTTAAAAATGTCACTTCCTTGGGTTCTACAGTCCAAAGTGGGAATCTGTCTGATCT-3'；
ＥＬＭＯ１イントロン１６  ＋６７３６３の部分を含むポリヌクレオチドを検出するためのプライマー（配列番号：３２）：
5'-TGTCTTCATAGCATA GCATGAG-3'；
ＥＬＭＯ１イントロン１６  ＋６７３６３の部分を含むポリヌクレオチドを検出するためのプライマー：
5'-AGAATGTCATTACCTCAATCAGC-3'（配列番号：３３）；
ＥＬＭＯ１イントロン１６  ＋６７３６３の塩基がAであるものを検出するプローブ（配列番号：３４）：
5'-ACATTTTTAAGAAACTCCTTTG-3'；
ＥＬＭＯ１イントロン１６  ＋６７３６３の塩基がGであるものを検出するプローブ（配列番号：３５）：
5'-ACATTTTTAAGAAACCCCTTTG-3'；
ＥＬＭＯ１イントロン１６  ＋６７３６３の塩基がAであるかGであるかを検出するためのＴａｑｍａｎ  ＰＣＲプライマー（配列番号：３６）：
5'-CGATGCCTTTCATTCCAGGATTC-3'；
ＥＬＭＯ１イントロン１６  ＋６７３６３の塩基がAであるかGであるかを検出するためのＴａｑｍａｎ  ＰＣＲプライマー（配列番号：３７）：
5'-GGACTGTAGAACCCAAGGAAGTG-3'；
ＥＬＭＯ１イントロン１６  ＋７９４１０のCがGに置換したポリヌクレオチド（１２１ヌクレオチド）（配列番号：３８）：
5'-GCTTAGCGGAAACTCAGTAAATAATTGCTGTACAGCAGAGCTGTTGTCATTCAGATGGGAGGGGCAACTTGAAGTCCTGCCCCTTGATACTCCGAGGTGAGCCCTGCCTCTTTTGAACATT-3'；
ＥＬＭＯ１イントロン１６  ＋７９４１０の部分を含むポリヌクレオチドを検出するためのプライマー（配列番号：３９）：
5'-TAGAGTGTGGATGCTGCGAAGC-3'；
ＥＬＭＯ１イントロン１６  ＋７９４１０の部分を含むポリヌクレオチドを検出するためのプライマー（配列番号：４０）：
5'-CTAAGGTGAGAAGTGAGCTGTG-3'；
ＥＬＭＯ１イントロン１６  ＋７９４１０の塩基がCであるものを検出するプローブ（配列番号：４１）：
5'-AAGTTGCCCGTCCCAT-3'；
ＥＬＭＯ１イントロン１６  ＋７９４１０の塩基がCであるものを検出するプローブ（配列番号：４２）：
5'-CAAGTTGCCCCTCCCAT-3'；
ＥＬＭＯ１イントロン１６  ＋７９４１０の塩基がCであるかGであるかを検出するためのＴａｑｍａｎ  ＰＣＲプライマー（配列番号：４３）：
5'-AAGGCTTAGCGGAAACTCAGTAAAT-3'；
ＥＬＭＯ１イントロン１６  ＋７９４１０の塩基がCであるかGであるかを検出するためのＴａｑｍａｎ  ＰＣＲプライマー（配列番号：４４）：
5'-GGCTCACCTCGGAGTATCAAG-3'；
ＥＬＭＯ１イントロン１６  ＋８０７１６のCがTに置換したポリヌクレオチド（１２１ヌクレオチド）（配列番号：４５）：
5'-GCTTTTTCTTCAGTTACAGAAGCATAAGACTCCATAGAACCTTCCAGCTTTGTTTCACTTTGTTCACTTAGTTTGTTTCACTTACTTTGCACTGTATTCTCACTGTTGCCCTTGCCCCCAC-3'；
ＥＬＭＯ１イントロン１６  ＋８０７１６の部分を含むポリヌクレオチドを検出するためのプライマー（配列番号：４６）：
5'-ACGTGCTCTGAGCTGCTTTG-3'；
ＥＬＭＯ１イントロン１６  ＋８０７１６の部分を含むポリヌクレオチドを検出するためのプライマー（配列番号：４７）：
5'-ACAGAACACTTAGTATAGCTGTG-3'；
ＥＬＭＯ１イントロン１６  ＋８０７１６の塩基がCであるものを検出するプローブ（配列番号：４８）：
5'-AAACTAAGTGAACGAAGTGA-3'；
ＥＬＭＯ１イントロン１６  ＋８０７１６の塩基がTであるものを検出するプローブ（配列番号：４９）：
5'-AAACTAAGTGAACAAAGTGA-3'；
ＥＬＭＯ１イントロン１６  ＋８０７１６の塩基がCであるかTであるかを検出するためのＴａｑｍａｎ  ＰＣＲプライマー（配列番号：５０）：
5'-CTCCATAGAACCTTCCAGCTTTGTT-3'；
ＥＬＭＯ１イントロン１６  ＋８０７１６の塩基がCであるかTであるかを検出するためのＴａｑｍａｎ  ＰＣＲプライマー（配列番号：５１）：
5'-CAACAGTGAGAATACAGTGCAAAGT-3'；
ＥＬＭＯ１イントロン１６  ＋１０１３２６のGがCに置換したポリヌクレオチド（１２１ヌクレオチド）（配列番号：５２）：
5'-TAGCTGACGTACATTCTCTGCATGGTGTTTACCCAACAGTCATCACTCATGTTTGCTCATCAGGTGTTGGGGTGATGAGCCGAGCTGCTGTATTCTCAGCTGGGCCTGGAGCCTGCTTAGT-3'；
ＥＬＭＯ１イントロン１６  ＋１０１３２６の部分を含むポリヌクレオチドを検出するためのプライマー（配列番号：５３）：
5'-TCTACTACAGGTAAGTAGATACC-3'；
ＥＬＭＯ１イントロン１６  ＋１０１３２６の部分を含むポリヌクレオチドを検出するためのプライマー（配列番号：５４）：
5'-AGCATTGTCTACTGCAGAATCTG-3'；
ＥＬＭＯ１イントロン１６  ＋１０１３２６の塩基がGであるものを検出するプローブ（配列番号：５５）：
5'-CAACACCTCATGAGCA-3'；
ＥＬＭＯ１イントロン１６  ＋１０１３２６の塩基がCであるものを検出するプローブ（配列番号：５６）：
5'-CAACACCTGATGAGCA-3'；
ＥＬＭＯ１イントロン１６  ＋１０１３２６の塩基がGであるかCであるかを検出するためのＴａｑｍａｎ  ＰＣＲプライマー（配列番号：５７）：
5'-TTTACCCAACAGTCATCACTCATGT-3'；
ＥＬＭＯ１イントロン１６  ＋１０１３２６の塩基がGであるかCであるかを検出するためのＴａｑｍａｎ  ＰＣＲプライマー（配列番号：５８）：
5'-AGCAGCTCGGCTCATCAC-3'；
ＥＬＭＯ１イントロン１６  ＋１０５６１２のCがTに置換したポリヌクレオチド（１２１ヌクレオチド）（配列番号：５９）：
5'-ATAATTGTTGTTTATTCTGTGTCCTCCAAAGGACTCATCAGTAAGGAAAGGGACTGCATTTGGGTGAGAGAATGGGAGACCCAGCAGATTTCTGGAAACCATTGCAATAACTGGCTTCACA-3'；
ＥＬＭＯ１イントロン１６  ＋１０５６１２の部分を含むポリヌクレオチドを検出するためのプライマー（配列番号：６０）：
5'-ATTGACTTCAGCAGCCAAGATG-3'；
ＥＬＭＯ１イントロン１６  ＋１０５６１２の部分を含むポリヌクレオチドを検出するためのプライマー（配列番号：６１）：
5'-CTGGCAAGTCTTCATGAAGGC-3'；
ＥＬＭＯ１イントロン１６  ＋１０５６１２の塩基がCであるものを検出するプローブ（配列番号：６２）：
5'-TCACCCGAATGCAG-3'；
ＥＬＭＯ１イントロン１６  ＋１０５６１２の塩基がTであるものを検出するプローブ（配列番号：６３）：
5'-TCACCCAAATGCAG-3'；
ＥＬＭＯ１イントロン１６  ＋１０５６１２の塩基がCであるかTであるかを検出するためのＴａｑｍａｎ  ＰＣＲプライマー（配列番号：６４）：
5'-CTCCAAAGGACTCATCAGTAAGGAA-3'；
ＥＬＭＯ１イントロン１６  ＋１０５６１２の塩基がCであるかTであるかを検出するためのＴａｑｍａｎ  ＰＣＲプライマー（配列番号：６５）：
5'-GCCAGTTATTGCAATGGTTTCCA-3'；
ＥＬＭＯ１イントロン１６  ＋１１４４５８のCがTに置換したポリヌクレオチド（１２１ヌクレオチド）（配列番号：６６）：
5'-GCTCCCCTGTGACATCGCGTCTTCCCTTGGGTGAGGCAAGTATGTGTCTTTCCACTGTCCTAGGCTGAGAGCTCATCCGGCACAGGGCCTCCAGTGTCGCGTCATTCCTTGCACTGAGTAG-3'；
ＥＬＭＯ１イントロン１６  ＋１１４４５８の部分を含むポリヌクレオチドを検出するためのプライマー（配列番号：６７）：
5'-TCAGCCTGTCTGCATGTGGC-3'；
ＥＬＭＯ１イントロン１６  ＋１１４４５８の部分を含むポリヌクレオチドを検出するためのプライマー（配列番号：６８）：
5'-TCTATGGTCACTCTGCATGTC-3'；
ＥＬＭＯ１イントロン１６  ＋１１４４５８の塩基がCであるものを検出するプローブ（配列番号：６９）：
5'-TCTCAGCCTGGGACAG-3'；
ＥＬＭＯ１イントロン１６  ＋１１４４５８の塩基がTであるものを検出するプローブ（配列番号：７０）：
5'-CTCTCAGCCTAGGACAG-3'；
ＥＬＭＯ１イントロン１６  ＋１１４４５８の塩基がCであるかTであるかを検出するためのＴａｑｍａｎ  ＰＣＲプライマー（配列番号：７１）：
5'-GTGAGGCAAGTATGTGTCTTTCCA-3'；
ＥＬＭＯ１イントロン１６  ＋１１４４５８の塩基がCであるかTであるかを検出するためのＴａｑｍａｎ  ＰＣＲプライマー（配列番号：７２）：
5'-GCCCTGTGCCGGATGAG-3'；
ＥＬＭＯ１イントロン１７  ＋５４９５のGがAに置換したポリヌクレオチド（１２１ヌクレオチド）（配列番号：７３）：
5'-ACTTTCTTTTCCACTCAGTGCAGGGTTCTTCAAAGCTGCAATTTACTGAGTCCATTTTAGATAGAGCTAAGTGCTGATAATAAATAGTTTAGTGATCTGAAAGCCTGAAATGAGACCCTAA-3'；
ＥＬＭＯ１イントロン１７  ＋５４９５の部分を含むポリヌクレオチドを検出するためのプライマー（配列番号：７４）：
5'-ATAACTCAACCCTGGCCTAGTG-3'；
ＥＬＭＯ１イントロン１７  ＋５４９５の部分を含むポリヌクレオチドを検出するためのプライマー（配列番号：７５）：
5'-TAAGCACTGAGCAGGAATGTAAG-3'；
ＥＬＭＯ１イントロン１７  ＋５４９５の塩基がGであるものを検出するプローブ（配列番号：７６）：
5'-ACTTAGCTCTACCTAAAAT-3'；
ＥＬＭＯ１イントロン１７  ＋５４９５の塩基がAであるものを検出するプローブ（配列番号：７７）：
5'-CACTTAGCTCTATCTAAAAT-3'；
ＥＬＭＯ１イントロン１７  ＋５４９５の塩基がGであるかAであるかを検出するためのＴａｑｍａｎ  ＰＣＲプライマー（配列番号：７８）：
5'- GGGTTCTTCAAAGCTGCAATTTACT-3'；
ＥＬＭＯ１イントロン１７  ＋５４９５の塩基がGであるかAであるかを検出するためのＴａｑｍａｎ  ＰＣＲプライマー（配列番号：７９）：
5'-GTCTCATTTCAGGCTTTCAGATCAC-3'；
ＥＬＭＯ１イントロン１７  ＋６９５８のTがCに置換したポリヌクレオチド（１２１ヌクレオチド）（配列番号：８０）：
5'-ATAAAAGAAGAAAATTTTCAGGACACTTTGCTCTGGAAAAACATCACTGAAGTAGCTGGTCCTTTTGTGGAATTCTGTAAATGTCACAGAATCTATTGTGGTGTTGTACTTATGCCCCTGG-3'；
ＥＬＭＯ１イントロン１７  ＋６９５８の部分を含むポリヌクレオチドを検出するためのプライマー（配列番号：８１）：
5'-TGATTGTCTTAGCAGTGCTGAATG-3'；
ＥＬＭＯ１イントロン１７  ＋６９５８の部分を含むポリヌクレオチドを検出するためのプライマー（配列番号：８２）：
5'-AACAGTGAGTGCCAGCTCTC-3'；
ＥＬＭＯ１イントロン１７  ＋６９５８の塩基がTであるものを検出するプローブ
5'-CCACAAAAGAACCAGC-3'（配列番号：８３）；
ＥＬＭＯ１イントロン１７  ＋６９５８の塩基がCであるものを検出するプローブ（配列番号：８４）：
5'-TCCACAAAAGGACCAGC-3'；
ＥＬＭＯ１イントロン１７  ＋６９５８の塩基がTであるかCであるかを検出するためのＴａｑｍａｎ  ＰＣＲプライマー（配列番号：８５）：
5'-CATAACTTTGTATCCGTGGCTTTGT-3'；
ＥＬＭＯ１イントロン１７  ＋６９５８の塩基がTであるかCであるかを検出するためのＴａｑｍａｎ  ＰＣＲプライマー（配列番号：８６）：
5'-GGGCATAAGTACAACACCACAATAGA-3'；
ＥＬＭＯ１イントロン１８  ＋９１７０のGがAに置換したポリヌクレオチド（１２１ヌクレオチド）（配列番号：８７）：
5'-TAAATGAATAAGGAGCAGTTCCCATGGTGGTTATCATTAGTGATAACATAACCTCTGGAAACCACCACCTCATAAAATCTATTGCTATTGAGCTTGAAGAGTTCAATGACTTTACTAATGG-3'；
ＥＬＭＯ１イントロン１８  ＋９１７０の部分を含むポリヌクレオチドを検出するためのプライマー（配列番号：８８）：
5'-TGGTCATACCTATCCAGAGAAG-3'；
ＥＬＭＯ１イントロン１８  ＋９１７０の部分を含むポリヌクレオチドを検出するためのプライマー（配列番号：８９）：
5'-CCTGGAGGAAACAAGCAGTTC-3'；
ＥＬＭＯ１イントロン１８  ＋９１７０の塩基がGであるものを検出するプローブ（配列番号：９０）：
5'-ATGACGTGGCAGACCTTCCAGAGGTTATGTTATCA-3'；
ＥＬＭＯ１イントロン１８  ＋９１７０の塩基がAであるものを検出するプローブ（配列番号：９１）：
5'-CGCGCCGAGGTTTCCAGAGGTTATGTTATCA-3'；
ＥＬＭＯ１イントロン１８  ＋９１７０の塩基がGであるかAであるかを検出するためのインベーダープローブ（配列番号：９２）：
5'-TAGATTTTATGAGGTGGTGGN-3'
等が挙げられる。【００９５】
前記被験個体としては、哺乳動物、具体的には、ヒト、非ヒト哺乳動物、例えば、マウス、ラット、ウサギ、サル、イヌ等が挙げられる。【００９６】
本発明の診断方法に用いられる試料としては、前記被験個体から得られた生物学的試料、例えば、だ液、皮膚、末梢血、摘出された臓器、各種組織、毛髪、体液等が挙げられる。【００９７】
本発明の診断方法においては、前記多型が検出された場合、被験個体が、糖尿病性腎症を発症していること、あるいは将来の発症が予想されることの指標となる。【００９８】
また、本発明により、被験核酸試料中における糖尿病性腎症の発症に寄与する核酸の検出方法が提供される。【００９９】
本発明の検出方法によれば、前記多型を検出しているため、被験核酸試料から、糖尿病性腎症の発症に寄与する核酸を、容易に迅速に検出することができるという優れた効果を発揮する。【０１００】
本発明の検出方法に用いられる被験核酸試料は、慣用の方法で、個体の細胞又は組織より調製されうる。【０１０１】
本発明の検出方法は、例えば、輸血用血液、採血された血液の検査、腎移植に用いられる提供された腎臓の検査に適用されうる。【０１０２】
本発明の検出方法は、前記（Ｉ）及び／又は（ＩＩ）を含有した糖尿病性腎症の診断キットにより、より容易かつ迅速に行なうことができる。かかる糖尿病性腎症の診断キットも本発明に含まれる。【０１０３】
本発明の糖尿病性腎症の診断キットは、前記（Ｉ）のプローブ及び／又は前記（ＩＩ）のプライマー対からなる群より選ばれた少なくとも１種を含有するものである。【０１０４】
本発明のキットは、ＥＬＭＯ１遺伝子における糖尿病性腎症に関連する多型における変異を有するポリヌクレオチドを、そのような変異を有さないポリヌクレオチドと区別して特異的にハイブリダイゼーションできるプローブ、そのような変異を有するポリヌクレオチドを増幅できるプライマー又はそのような変異領域を増幅できるプライマーを含む。キットに含まれる試薬としては、塩基の置換を検出できる方法により適宜変更可能である。例えば、相補鎖を合成するタイプの変異の検出方法であれば、ｄｄＮＴＰ、ｄＮＴＰ、ＤＮＡ合成酵素、緩衝液などを含み、ＲＦＬＰのように制限酵素の切断に基づき検出する場合には適当な制限酵素を含む。【０１０５】
本発明のキットは、前記核酸、プライマー対等を含有するため、糖尿病患者における糖尿病性腎症を容易かつ迅速に診断することができ、糖尿病患者から得られた被験試料から、糖尿病性腎症の発症に寄与する核酸を、容易かつ迅速に検出することができるという優れた効果を発揮する。したがって、本発明のキットは、本発明の診断方法及び本発明の検出方法に有用である。なお、本発明のキットは、発症の疑いのある個体の診断、診断を要する個体の診断（いわゆる発症前診断）等にも用いられうる。【０１０６】
本発明を、下記実施例等により説明するが、本発明は、かかる実施例に限定されるものではない。また、以下の実施例において、遺伝子操作、細胞培養等には、特に断りのない限り、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）等に記載された方法を用いた。
【実施例１】
【０１０７】
糖尿病性腎症関連のＳＮＰのスクリーニング
インフォームドコンセントの下、滋賀医科大学、東京女子医科大学、順天堂大学、川崎医科大学、岩手医科大学、又は千葉徳洲会病院に定期的に来診する２型糖尿病患者を対象として実験を行なった。【０１０８】
なお、糖尿病患者について、下記診断基準：
1）糖尿病性腎症症例：糖尿病網膜症と、明らかな糖尿病性腎症（２００μｇ／分を超える尿中アルブミン排泄率若しくは３００ｍｇ／ｇＣｒを超える尿中アルブミン／クレアチニン比）とを伴う患者、又は慢性透析療法を受けている患者、及び
2）対照群：腎機能障害の兆候を示していないが糖尿病網膜症を伴う患者〔２０μｇ／分未満の尿中アルブミン排泄率若しくは３０ｍｇ／ｇＣｒ未満の尿中アルブミン／クレアチニン比〕
により２つのグループに分類した。【０１０９】
前記２型糖尿病患者の末梢血液を採血し、得られた末梢血液７ｍｌを３０００回転で１０分間遠心分離して、血漿を除去した。ついで、得られた産物に、赤血球溶解液を添加して、室温で２０分間インキュベートした。その後、インキュベーション後の混合物を、３０００回転で５  分間遠心分離して、上清を除去した。得られた沈殿に、プロテイナーゼＫを添加し、３７℃４時間以上インキュベートした。得られた産物を、フェノール−クロロホルムで処理し、得られた上層（水層）に、イソプロパノールを添加して、ＤＮＡの沈殿を生じさせた。ついで、遠心分離（１２０００回転、１０分）を行ない、ＤＮＡを回収し、１ｍｌ  ７０％  エタノールを添加し、得られたＤＮＡのペレットをＴＥ緩衝液〔組成：１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）〕に溶解し、ＤＮＡ試料を得た。【０１１０】
前記ＤＮＡ試料を用いて、インベーダー法により遺伝子型の判定を行った。解析するＳＮＰは、ＪＳＮＰデータベース（ＩＭＳ−ＪＳＴ  ＳＮＰｓ  データベース:http://snp.ims.u-tokyo.ac.jp）から無作為に選択した。各ＳＮＰ遺伝子座の遺伝子型を、Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲと組み合わせたインベーダー法〔例えば、オオニシ（Ｏｈｎｉｓｈｉ  Ｙ．）ら，Ｊ．Ｈｕｍａｎ．Ｇｅｎｅｔ．，４６，４７１−４７７，２００１等を参照のこと〕により解析した。【０１１１】
より詳細に遺伝子多型の検索をダイレクトシーケンス法にて行った。ＥＬＭＯ１を含むゲノム配列に関連するジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）の情報〔アクセッション番号：ＡＣ０７８８４３、ＡＣ０８３８６１、ＡＣ００７４４４、ＡＣ００９１９６、ＡＣ０７８８４４、ＡＣ００７３４９〕を基にデザインしたＰＣＲプライマーを用いて、標的部位を増幅した。また、ＰＣＲプライマーのデザインに際して、ベッデル（Ｂｅｄｅｌｌ）ら、〔Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、１６、１０４０−１０４１、２０００〕に記載されたように、商品名：ＲＥＰＥＡＴ  ＭAＳＫＥＲプログラム〔ワシントン大学より供給、ウェブページアドレス：http://repeatmasker.genome.washington.eduにて利用可能〕により、検索対象から反復エレメントを排除した。【０１１２】
Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲにおける反応条件は、反応溶液〔組成：１６．６ｍＭ  （ＮＨ4）2ＳＯ4、６７ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．８）、６．７ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、６．７μＭ  ＥＤＴＡ、１．５ｍＭ  ｄＮＴＰ、１０ｘＴａｑミックス（２．５Ｕ／μｌ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、３１．２５Ｕ／μｌ  Ｔａｑ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ）、０又は１０％  ＤＭＳＯ、各０．２５μＭ  プライマー〕、９５℃、５分の反応後、９５℃で１５秒と６０℃で４５秒と７２℃で３分とを１サイクルとする４０サイクルの反応を行なった。【０１１３】
増幅された産物をｄＨ2Ｏで、１：１１に希釈し、３８４プレートの各ウェルに分注した。ついで、プレートを風乾させ、プレート上の各ウェルに、３μｌ  インベーダー反応液（組成：１０×緩衝液、１０×ＦＲＥＴプローブ、１０×ｃｌｅｖａｓｅ、アレルプローブ）を添加した。その後、６３℃で２０分間インキュベートし、ついで、プレートの各ウェルについて、蛍光（５２０ｎｍ、５４６ｎｍ）を測定した。【０１１４】
糖尿病性腎症症例の９４患者及び対照群の９４個体のそれぞれに対し、８１３１５個のＳＮＰ座について遺伝子タイピングを行なった。ついで、２×３又は２×２分割表を用いた統計学的データを評価することにより、糖尿病性腎症症例の患者と対照群個体との間の遺伝子型又は対立遺伝子頻度に有意な差異を示したＳＮＰを選択した。【０１１５】
なお、相関解析、ハプロタイプ頻度及びＨａｒｄｙ−Ｗｅｉｎｂｅｒｇ平衡の統計解析並びに連鎖不均衡係数（Ｄ’）の算出は、デブリン（Ｄｅｖｌｉｎ  Ｂ．）ら〔Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２９，３１１−３２２，１９９５〕及びニールセン（Ｎｉｅｌｓｅｎ  ＤＭ．）ら〔Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，６３，１５３１−１５４０，１９９８〕のように行なった。【０１１６】
スクリーニングにおいて、腎症症例の患者と対照群の個体との間で０．０１未満のｐ値を示したＳＮＰ座を、さらに多数の患者について、解析した。【０１１７】
【表１】
0004659620.tif 000002
【０１１８】
その結果、表１に示されるように、第７染色体のｐ１４のＥＬＭＯ１遺伝子の第１８イントロンにおける１つのＳＮＰ座の遺伝子型の分布が、糖尿病性腎症との強い関連性を示した〔ＣＣ対ＣＴ＋ＴＴ，χ2＝１６．３、ｐ＝０．００００５、オッズ率３．３３、９５％ＣＩ  １．８１〜６．１５〕【０１１９】
また、図１に示されるように、ＥＬＭＯ１におけるランドマークＳＮＰ周辺の領域の連鎖不均衡マッピングにより、ランドマーク部位の約１００ｋｂ上流及び１００ｋｂ下流において、この領域における連鎖不均衡が広がっていることが示された。【０１２０】
したがって、糖尿病性腎症の罹病性に重要な領域は、この２００ｋｂの高連鎖不均衡ブロック内に存在すると考えられる。また、この連鎖不均衡ブロック内に、ＥＬＭＯ１の他に遺伝子がないため、ＥＬＭＯ１自体が、糖尿病性腎症の罹病性に関する候補であると考えられる。【０１２１】
ついで、複数の健常人由来のＥＬＭＯ１遺伝子配列を決定することにより、ＥＬＭＯ１における多型を調べた。結果を図２に示す。【０１２２】
その結果、図２に示されるように、別の５１６多型、具体的には、４４８ＳＮＰｓ、４９挿入／欠失多型、１８タンデムリピート多型及び１つのその他の多型が同定された。多型の多くは、ＥＬＭＯ１遺伝子の第１６イントロン、第１７イントロン及び第１８イントロンに存在していた。これらの中に、糖尿病性腎症の罹患性に関する多型が存在することが推定される。【０１２３】
全体で４７１人の患者と２４９人の対照において、これらの遺伝子型を、例えば、配列番号：１７〜８９のプライマーやプローブを用いて上述のようなインベーダー法又はダイレクトシーケンス法を用いて特定することにより、これらの変異のいくつかは糖尿病性腎症と有意な相関があることがわかった。【０１２４】
具体的には、ＥＬＭＯ１遺伝子の第１６イントロンにおける６５０１５位、６５２８７位、６７３６３位、７９４１０位、８０７１６位、１０１３２６位、１０５６１２位、１１４４５８位の塩基における多型、第１７イントロンにおける５４９５位、６９５８位の塩基における多型がｐ値の結果より非常に密接に糖尿病性腎症と関連している可能性が高いことがわかった。
【実施例２】
【０１２５】
ＥＬＭＯ１発現組織の同定
糖尿病性腎症の病因におけるＥＬＭＯ１遺伝子の考えうる役割を調べるため、インサイチュハイブリダイゼーションにより、正常マウス腎臓における本遺伝子の発現パターンを調べた。【０１２６】
センスプローブ及びアンチセンスプローブの両方を得るために、３７４ｂｐの断片〔ＥＬＭＯ１をコードする核酸〕を、ｌａｃプロモーターに対して、正方向（ｌａｃプロモーターの転写方向と該ｃＤＮＡの転写方向とが同じ）及び逆方向（ｌａｃプロモーターの転写方向と該ｃＤＮＡの転写方向とが異なる）の２つの方向で、商品名：ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ〔ストラタジーン社製〕にサブクローン化し、組換えプラスミドを得た。得られたプラスミドを直鎖状にした後、得られた産物と、商品名：ＤＩＧ  ＲＮＡ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｍｉｘ（ロシュ社製）とを用いて、インビボ転写法により、ジゴキシゲニン標識ＲＮＡプローブを合成した。【０１２７】
ハイブリダイゼーションの後、組織切片とアルカリホスファターゼ結合抗ジゴキシゲニン抗体とをインキュベーションし、得られた混合物に、ＮＢＴ／ＢＣＩＰを含む発色溶液を添加した。指示された時間に発色反応を終了させ、核染色を行なった。結果を図５に示す。【０１２８】
図５のパネルａ）及びパネルｃ）に示されるように、興味深いことに、ＥＬＭＯ１遺伝子の発現は、腎糸球体上皮細胞及び間質細胞に見られた。【０１２９】
また、糸球体メサンギウム細胞、近位尿細管上皮細胞、ＣＯＳ細胞及び網膜色素上皮細胞等の種々の培養細胞において、ＲＴ−ＰＣＲによりＥＬＭＯ１遺伝子の発現を調べた。【０１３０】
前記ＲＴ−ＰＣＲにおいて、プライマー対として、5'-ccggattgtgcttgagaaca-3'（配列番号：６）と5'-ctcactaggcaactcgccca-3'（配列番号：４）とを用いた。また、サーマルプロファイルは、５０℃２分間と９５℃１０分間のインキュベーションの後、９５℃３０秒と６３℃３０秒と７２℃３０秒とを１サイクルとする４０サイクルの反応を行なう条件とした。また、前記ＲＴ−ＰＣＲにおける反応溶液の組成は、１×ＴａＫａＲａ  Ｅｘ  ＴａｑTM緩衝液（タカラバイオ社製）、２００ｎＭ  ｄＮＴＰ混合物、１／２００００  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ、各８００ｎＭのプライマー、０．０５Ｕ  Ｅｘ  ＴａｑTM  ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製）、２．７５ｎｇ  商品名：ＴａｑＳｔａｒｔ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ（クローンテック社製）及び５ｎｇ  鋳型である。【０１３１】
以上の結果から、細胞外基質蓄積に関与すると推測される糸球体上皮、及び繊維化が進行する間質細胞で発現が確認されたことにより、ＥＬＭＯ１が糖尿病性腎症の発症、進展に寄与している可能性が示唆された。
【実施例３】
【０１３２】
（１）高グルコース条件化でのＥＬＭＯ１発現変動
正常グルコース濃度（５．５ｍＭ）又は高グルコース濃度（２５ｍＭ）で培養されたＣＯＳ細胞において、ＥＬＭＯ１遺伝子の発現に対するグルコースの影響を調べた。【０１３３】
ＣＯＳ細胞を、５．５ｍＭ  グルコースを含むＤＭＥＭ培地又は２５ｍＭ  グルコースを含むＤＭＥＭ培地で、５％  ＣＯ2、３７℃で２４〜７２時間培養した。得られた細胞から、ＴＲＩＺＯＬを用い、全ＲＮＡを調製した。【０１３４】
定量リアルタイムＰＣＲは、下記プライマー：
ＥＬＭＯ１について、
センスプライマー：5'-ccggattgtgcttgagaaca-3'（配列番号：３）、
アンチセンスプライマー：5'-ctcactaggcaactcgccca-3'（配列番号：４）、
フィブロネクチンについて、
センスプライマー：5'-gctcagaatccaagcggaga-3'（配列番号：５）、
アンチセンスプライマー：5'-ctttcccaagcaattttgatgg-3'（配列番号：６）、
Ｉ型コラーゲン（アルファ1）について、
センスプライマー：5'-caccaatcacctgcgtacaga-3'（配列番号：７）、
アンチセンスプライマー：5'-caccaatcacctgcgtacaga-3'（配列番号：８）、
ＴＧＦ−β１について、
センスプライマー：5'-aggtcacccgcgtgctaat-3'（配列番号：９）、
アンチセンスプライマー：5'-ggttcaggtaccgcttctcg-3'（配列番号：１０）、
マトリックスメタロプロテイナーゼ−２（ＭＭＰ−２）について、
センスプライマー：5'-gatgccgcctttaactggag-3'（配列番号：１１）、
アンチセンスプライマー：5'-catctgcgatgagcttggg-3'（配列番号：１２）、
マトリックスメタロプロテイナーゼ−３（ＭＭＰ−３）について、
センスプライマー：5'-tttctcgttgctgctcatgaa-3'（配列番号：１３）、
アンチセンスプライマー：5'-gagacaggcggaaccgagt-3'（配列番号：１４）、
ＧＡＰＤＨについて
センスプライマー：5'-gctcagaatccaagcggaga-3'（配列番号：１５）、
アンチセンスプライマー：5'-ctttcccaagcaattttgatgg-3'（配列番号：１６）
を用いて行なった。【０１３５】
２５μｌの反応溶液〔組成：ＴａＫａＲａ  Ｅｘ  ＴａｑTM緩衝液（タカラバイオ社製）、２００ｎＭ  ｄＮＴＰ混合物、１／２００００  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ、各８００ｎＭのプライマー、０．０５Ｕ  Ｅｘ  ＴａｑTM  ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製）、２．７５ｎｇ  商品名：ＴａｑＳｔａｒｔ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ（クローンテック社製）及び５ｎｇ  鋳型〕中で反応を行なった。【０１３６】
サーマルプロファイルは、５０℃２分間、９５℃１０分間のインキュベーションの後、９５℃３０秒と６３℃３０秒と７２℃３０秒とを１サイクルとする４０サイクルの反応である。ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）  ７０００シークエンスディテクションシステム〔ＰＥアプライドバイオシステムズ社製〕を用いて、増幅及び測定を行なった。なお、ＧＡＰＤＨを用いた場合の結果により測定結果を正規化した。結果を図６に示す。【０１３７】
図６に示されるように、ＥＬＭＯ１遺伝子の発現は、正常グルコース条件又はマンニトール（＋１９．５ｍＭ）で浸透圧調節された条件で培養された細胞に比べ、高グルコース濃度条件で培養された細胞において、顕著に増加した。【０１３８】
したがって、高グルコース条件下でのＥＬＭＯ１遺伝子の発現の増加は、糖尿病性腎症の発症と進行とに寄与するものと考えられる。【０１３９】
（２）ＥＬＭＯ１強制発現時の糖尿病性腎症関連遺伝子群の発現変動
ついで、ＥＬＭＯ１遺伝子を発現させた細胞を用い、細胞外マトリックス遺伝子、ＴＧＦ−β１遺伝子及びマトリックスメタロプロテアーゼ遺伝子の発現に対する過剰のＥＬＭＯ１遺伝子影響を調べた。【０１４０】
ｐＣＤＮＡ３．１に、ＥＬＭＯ１をコードする核酸を連結させ、ｐＣＤＮＡ３．１−ＥＬＭＯ１を得た。また、対照として、ｐＣＤＮＡ３．１に、ｌａｃＺ遺伝子を連結させ、ｐＣＤＮＡ３．１−ＬａｃＺを得た。得られたプラスミドを用いて、ＣＯＳ細胞をトランスフェクションした。【０１４１】
得られたトランスフェクト細胞から、前記と同様に全ＲＮＡを調製した。ついで、得られた全ＲＮＡを用いて、前記と同様に、定量的ＲＴ−ＰＣＲを行なった。結果を図７に示す。【０１４２】
図７のパネルａ）〜ｃ）に示されるように、ｐＣＤＮＡ３．１−ＥＬＭＯ１で安定にトランスフェクトされた細胞において、ＴＧＦ−β１遺伝子、Ｉ型コラーゲン遺伝子及びフィブロネクチン遺伝子それぞれの発現は、ｐＣＤＮＡ３．１−ＬａｃＺを用いてトランスフェクトされた細胞におけるこれらの遺伝子の発現に比べ、顕著に増加した（それぞれ、１．５５倍、９．９３倍及び１３．８倍）。図７のパネルｄ）及びｅ）に示されるように、一方、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−３）遺伝子の発現は、減少した（それぞれ、０．４４倍及び０．５２倍）。【０１４３】
以上により、ＥＬＭＯ１の発現上昇に伴い、糖尿病性腎症の憎悪因子であるＴＧＦ−β１、及び細胞外基質の発現上昇、さらにはマトリックスメタロプロテイナーゼの発現低下が確認された。したがって、細胞外基質の蓄積を特徴とする糖尿病性腎症の発症と進展にＥＬＭＯ１が寄与しているものと推定される。
【実施例４】
【０１４４】
ＳＮＰ同定に基づく糖尿病性腎症の診断
被験個体の末梢血より、慣用の核酸抽出法で核酸含有試料を調製する。ＥＬＭＯ１の第１８イントロンの領域の核酸を基に作製されたＳＮＰ検出用マイクロアレイに、前記核酸含有試料を供して、ハイブリダイズさせ、生じるＤＮＡハイブリッドの一方のＤＮＡ鎖について、４種の蛍光標識ジデオキシヌクレオチドとＤＮＡポリメラーゼとを用いて、プライマー伸長させる。ＳＮＰが、存在する部分の塩基に取り込まれた蛍光を指標として検出されることに基づき、核酸含有試料が、糖尿病性腎症の発症に寄与する核酸を含むことが示され、被験個体が、糖尿病性腎症を発症しているか、あるいは、将来発症する可能性があると判断される。
【実施例５】
【０１４５】
ＥＬＭＯ１阻害剤のスクリーニング方法
ｐＣＤＮＡ３．１−ＥＬＭＯ１を、エレクトロポレーション法により、哺乳動物腎臓由来細胞（ＣＯＳ７細胞、ＨＥＫ２９３細胞等）に導入する。得られた形質転換細胞を、化合物ライブラリーの化合物を含有したＤＭＥＭ培地において、５％  ＣＯ2、３７℃で４〜２４時間培養する。また、対照として、前記化合物ライブラリーの化合物を含まないＤＭＥＭ培地において、同様に培養する。培養後の細胞から、全ＲＮＡを抽出する。ついで、全ＲＮＡを鋳型とし、前記実施例２と同様に、フィブロネクチン、Ｉ型コラーゲン（アルファ1）、ＴＧＦ−β１、マトリックスメタロプロテイナーゼ−２（ＭＭＰ−２）、マトリックスメタロプロテイナーゼ−３（ＭＭＰ−３）及びＧＡＰＤＨのそれぞれに対するプライマーを用いて、定量的ＲＴ−ＰＣＲを行なう。ＧＡＰＤＨの結果により、数値を正規化し、化合物存在下及び非存在下におけるフィブロネクチン、Ｉ型コラーゲン（アルファ１）、ＴＧＦ−β１、マトリックスメタロプロテイナーゼ−２（ＭＭＰ−２）及びマトリックスメタロプロテイナーゼ−３（ＭＭＰ−３）それぞれの発現量を評価する。【０１４６】
形質転換細胞におけるフィブロネクチン、Ｉ型コラーゲン（アルファ１）、ＴＧＦ−β１、マトリックスメタロプロテイナーゼ−２（ＭＭＰ−２）及びマトリックスメタロプロテイナーゼ−３（ＭＭＰ−３）の発現量を、哺乳動物腎臓由来細胞の場合の発現量と比較して、化合物の存在により、形質転換細胞におけるフィブロネクチン、Ｉ型コラーゲン（アルファ１）及びＴＧＦ−β１の発現量の上昇が抑制され、マトリックスメタロプロテイナーゼ−２（ＭＭＰ−２）及びマトリックスメタロプロテイナーゼ−３（ＭＭＰ−３）の発現量の減少が抑制されることを指標として、糖尿病性腎症の治療又は予防薬の被験物質をスクリーニングする。
【実施例６】
【０１４７】
（１）糖尿病モデルラットにおけるＥＬＭＯ  ｍＲＮＡの発現
インスリン抵抗性モデル動物について、１）  インスリン抵抗性改善剤であるピオグリタゾンの投与〔ピオグリタゾン投与群〕、２）  食餌制限〔食餌制限群〕、又は３）  食餌制限と運動負荷との組み合わせ〔食餌制限＋運動負荷群〕による処理を行なった。【０１４８】
インスリン抵抗性モデル動物として、Ｚｕｃｋｅｒ  ｆａｔｔｙ  ｒａｔ（塩野義製薬株式会社油日ラボラトリーズＡＣ部門育成供給、１０齢）を用いた。対照として、Ｚｕｃｋｅｒ  ｌｅａｎ  ｒａｔ（塩野義製薬株式会社油日ラボラトリーズAC部門育成供給、１０齢）を用いた。飼育温度２４.１℃、湿度５５.５％、照明期間１２時間（８時から２０時）の飼育条件の下、自由に摂餌飼育した。【０１４９】
前記１）のピオグリタゾン投与群については、ピオグリタゾン（武田薬品社製、商品名：アクトス）１０ｍｇ／ｋｇラット体重を、１日あたり、１回投与した。上記と同じの飼育条件の下、３週間、飼育した。【０１５０】
前記２）の食餌制限群については、Ｚｕｃｋｅｒ  ｆａｔｔｙ  ｒａｔに、一日摂餌量の７０％相当量のみを摂餌させた。期間は５週間とした。上記と同じ条件の下、飼育した。【０１５１】
前記３）の食餌制限＋運動負荷群については、食事制限に加え、トレッドミルを用いて運動負荷を行なった。運動負荷条件は、１５ｍｌ／分で１５分間のウォーミングアップ、２０ｍｌ／分で６０分間の運動、１５ｍｌ／分で１５分間のクールダウンとした。期間は、５週間とした。【０１５２】
インスリン抵抗性の改善は、グルコースクランプ試験を行ない、グルコース注入量の増加をインスリン抵抗性が改善したことの指標として評価した。【０１５３】
前記１）〜３）の各処理群について、ＲＴ−ＰＣＲにより、Ｚｕｃｋｅｒ ｆａｔｔｙ  ｒａｔの骨格筋及び脂肪組織それぞれにおけるＥＬＭＯ１及びＥＬＭＯ２の遺伝子発現プロファイルを調べた。【０１５４】
なお、ＲＴ−ＰＣＲには、ＥＬＭＯ１について、
センスプライマー：5'-TCAACAAGGTAATGCAGGTGGT-3'（配列番号：９３）、
アンチセンスプライマー：5'-TGGCGGATTTTCAGGATCTC-3'（配列番号：９４）、
ＥＬＭＯ２について、
センスプライマー：5'- GCCGGCAAGAAAGGTTCTG-3'（配列番号：９５）、
アンチセンスプライマー：5'- TCACCATAATGCAAAACCTTGTG-3'（配列番号：９６）、
ＧＡＰＤＨについて
センスプライマー：5'- TGCACCACCAACTGCTTAGC-3'（配列番号：９７）、
アンチセンスプライマー：5'- GGATGCAGGGATGATGTTCTG-3'（配列番号：９８）
を用いた。【０１５５】
対照として、未処理検体由来のｍＲＮＡを用いた。具体的には、３０％食餌制限と週５日間運動を実施したラットの骨格筋、及び脂肪組織より、インビトロジェン社製のＴＲＩｚｏｌ試薬（商品名）を用いて、添付マニュアルに従い、全ＲＮＡを抽出し、５０μｇの全ＲＮＡを得た。得られた全ＲＮＡを、キアジェン（ＱＩＡＧＥＮ）社製の商品名：ＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔにて添付マニュアルに従いＤＮａｓｅ  Ｉ処理した後、回収した。得られた全ＲＮＡ  ２μｇと、ＲＴ−ＰＣＲ用ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）  Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓiｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（商品名、インビトロジェン社製）とを用いて添付マニュアルに従い、ｃＤＮＡを合成した。次に、遺伝子統合解析ソフトEnsembl（http://www.ensembl.org/）より抽出したラットＥＬＭＯ１、ＥＬＭＯ２の配列をもとにプローブ検索ソフトＰｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（商品名、ＡＢＩ社製）によりリアルタイム定量ＰＣＲ用プライマーを選択した。プライマーは、キアジェン（ＱＩＡＧＥＮ）社に合成を依頼した。このプライマーを用いて、合成したｃＤＮＡを鋳型としてＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉによるリアルタイム定量ＰＣＲを行ない、ｍＲＮＡ量を定量した。【０１５６】
反応試薬としては、キアジェン社の商品名：ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  ｋｉｔを使用し、９５℃で１５分間インキュベーションした後、９４℃で３０秒と６０℃で３０秒と７２℃で１分とを１サイクルとする４０サイクルの反応を行なって定量した。ＰＣＲ及び蛍光測定は、ＡＢＩ社のＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７０００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（商品名）を用いて行なった。図８及び図９に結果を示す。図８及び図９のグラフは、未処置  ラットにおける発現量を１とした相対量で示す。なお、リアルタイム定量ＰＣＲでは、増幅産物の電気泳動と融解曲線を作製することにより目的の一種類のみ増幅されていることを確認した。【０１５７】
その結果、図８に示されるように、ＥＬＭＯ１については、糖尿病ラット骨格筋、及び脂肪組織で食餌制限や運動によりインスリン抵抗性が改善されると発現が減少することが確認された。一方、図９に示されるように、ＥＬＭＯ２については、糖尿病ラット骨格筋では顕著な変動は見られなかったが、脂肪組織において、食餌制限や運動によりインスリン抵抗性が改善されると発現が減少することが確認された。【０１５８】
また、図８及び図９に示されるように、２）の食餌制限群及び３）の食餌制限＋運動負荷群において、インスリン抵抗性の改善により、改善前（対照群）に比べ、ＥＬＭＯ１、及びＥＬＭＯ２の遺伝子発現が約１／２に減少することがわかった。また、インスリン抵抗性改善薬物であるピオグリタゾンによっては、骨格筋での前記２種のＥＬＭＯ遺伝子の発現に変化は認められなかった。【０１５９】
以上の結果より、ＥＬＭＯ１及びＥＬＭＯ２の発現を指標として、糖尿病が診断できることが示唆される。
【実施例７】
【０１６０】
ヒトＥＬＭＯ１、及びＥＬＭＯ２の発現細胞株の樹立
ヒトＥＬＭＯ１及びＥＬＭＯ２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿０１４８００、ＮＭ＿１３３１７１）の塩基配列に基づき、Ｈｕｍａｎ  Ｓｋｅｌｅｔａｌ  Ｍｕｓｃｌｅ  Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡ（商品名、クローンテック社製）より、ヒトＥＬＭＯ１及びＥＬＭＯ２  ｃＤＮＡ全長をＰＣＲにより増幅し、ＰＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯベクター（商品名、インビトロジェン社）へクローニングした。【０１６１】
得られたクローンにおける塩基配列を確認した後、ｃＤＮＡ全長を切りだし、ｐ３ｘＦＬＡＧ−ＣＭＶ−１４ベクター（商品名、シグマ社製）のマルチクローニングサイトへクローニングして、発現ベクターを得た。得られた発現ベクターを、商品名：ＦＵＧＥＮ〔ロシュ（Ｒｏｃｈｅ）社製〕を用いてＬ６細胞に導入し、ＥＬＭＯ１又はＥＬＭＯ２を安定的に発現する細胞を得た。【０１６２】
発現ベクターを導入した細胞におけるヒトＥＬＭＯの発現は、抗ＦＬＡＧ抗体を用いたウェスタンブロット法により検出した。全細胞抽出液をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した後、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ（商品名、ミリポア社製）に転写した。得られたメンブランを、５重量％  スキムミルクを含むＰＢＳ中で室温、１時間ブロッキング処理した。その後、前記ＰＢＳ中のメンブランに、Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  Ａｎｔｉ−ＦＬＡＧ抗体（シグマ社製）を加え、さらに１時間室温でインキュベーションした。インキュベーション後、メンブランを０．１％  Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄し、ＥＣＬ＋ｐｌｕｓ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ〔商品名、アマシャムバイオサイエンシーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）社製〕を用いて発色させ、Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ  ＥＣＬ〔商品名、アマシャムバイオサイエンシーズ社製〕に露光した。結果を図１０に示す。【０１６３】
図１０にしめされるように、ヒトＥＬＭＯ１を発現する細胞株及びＥＬＭＯ２を発現する細胞株が得られた。
【実施例８】
【０１６４】
ヒトＥＬＭＯ発現細胞株におけるグルコース取り込み活性の測定
前記実施例７で得られたヒトＥＬＭＯ発現細胞株を用いて、グルコース取りこみ活性の測定を行なった。ＣｙｔｏＳｔａｒ−Ｔ  ｐｌａｔｅ（商品名、アマシャムバイオサイエンシーズ社製）に、細胞を２×１０4細胞／ウェルとなるように播種し、ＣＯ2インキュベーターで３７℃、一晩培養した。【０１６５】
得られた細胞を、３００μｌのＰＢＳ（−）で３回洗浄し、各ウェルに、８０μｌのＨＥＰＥＳ−Ｋｒｅｂｓバッファー〔組成：１１９ｍＭ  ＮａＣｌ、４．７５ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  ＮａＨＣＯ3、２．５４ｍＭ  ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ、１．２ｍＭ  ＭｇＳＯ4、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ・７Ｈ2Ｏ(ｐＨ７．４)〕を添加した。ついで、３μＭ  インスリン  １０μｌと２−デオキシ−Ｄ−〔Ｕ−14Ｃ〕グルコース溶液〔アマシャムバイオサイエンシーズ社製〕  １０μｌとを前記細胞に添加し、軽く混和して、該細胞をＣＯ2インキュベーターで３７℃、２０分間インキュベーションした。なお、細胞の培養については、１０％  ウシ胎仔血清と  １ｘＡｎｔｉ〔１００ｘＡｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（商品名）、インビトロジェン社製〕を加えたα−ＭＥＭを培地として使用し、７０−８０％コンフルエントに達した時点でトリプシンを使用して細胞を回収し、得られた産物を１／１０−１／２０希釈して、継代する条件で行なった。【０１６６】
インキュベーション後、１００μＭ  Ｃｙｔｏｃｈａｌａｓｉｎ  Ｂ〔シグマ社製〕  １０μｌを前記細胞に添加し、商品名：１４５０  ＭＩＣＲＯ  ＢＥＴＡ  ＴＲＩＬＵＸ（商品名、パーキンエルマー社製）で放射活性を測定した。アッセイに使用した試料は、商品名：ＣｙＱＵＡＮＴ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ〔モレキュラープローブ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）社製〕を用いて測定したＤＮＡ量で補正した。【０１６７】
その結果、図１１に示されるように、ＥＬＭＯ細胞では、対照細胞（Ｍｏｃｋベクター導入細胞）と比較してインスリン濃度非依存的にグルコース取りこみ能が低下していることが観察された。すなわち、ＥＬＭＯの強制発現により、グルコース取り込み能が低下することがわかった。したがって、ＥＬＭＯの発現の増加が、糖尿病の病態に関連することが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【０１６８】
本発明のスクリーニング方法は、糖尿病、特に、糖尿病性腎症の治療又は予防の手段の開発に有用である。また、本発明の診断方法は、糖尿病性腎症に対する治療計画又は予防処置を立てるに際して有用である。さらに、本発明の検出方法によれば、移植用腎臓、血液等の検査等に有用である。また、本発明の糖尿病性腎症の診断キットは、糖尿病性腎症の診断等に用いられうる。
【配列表フリーテキスト】
【０１６９】
配列番号：３は、ＥＬＭＯ１遺伝子のセンスプライマーの配列である。【０１７０】
配列番号：４は、ＥＬＭＯ１遺伝子のアンチセンスプライマーの配列である。【０１７１】
配列番号：５は、フィブロネクチン遺伝子のセンスプライマーの配列である。【０１７２】
配列番号：６は、フィブロネクチン遺伝子のアンチセンスプライマーの配列である。【０１７３】
配列番号：７は、Ｉ型コラーゲン（α１）遺伝子のセンスプライマーの配列である。【０１７４】
配列番号：８は、Ｉ型コラーゲン（α１）遺伝子のアンチセンスプライマーの配列である。【０１７５】
配列番号：９は、ＴＧＦ−β１遺伝子のセンスプライマーの配列である。【０１７６】
配列番号：１０は、ＴＧＦ−β１遺伝子のアンチセンスプライマーの配列である。【０１７７】
配列番号：１１は、ＭＭＰ−２遺伝子のセンスプライマーの配列である。【０１７８】
配列番号：１２は、ＭＭＰ−２遺伝子のアンチセンスプライマーの配列である。【０１７９】
配列番号：１３は、ＭＭＰ−３遺伝子のセンスプライマーの配列である。【０１８０】
配列番号：１４は、ＭＭＰ−３遺伝子のアンチセンスプライマーの配列である。【０１８１】
配列番号：１５は、ＧＡＰＤＨ遺伝子のセンスプライマーの配列である。【０１８２】
配列番号：１６は、ＧＡＰＤＨ遺伝子のアンチセンスプライマーの配列である。【０１８３】
配列番号：１７は、ＥＬＭＯ１イントロン１６  ＋６５０１５のＣがＴに置換したポリヌクレオチド（１２１ヌクレオチド）を示す。【０１８４】
配列番号：１８は、ＥＬＭＯ１イントロン１６  ＋６５０１５の部分を含むポリヌクレオチドを検出するためのプライマーを示す。【０１８５】
配列番号：１９は、ＥＬＭＯ１イントロン１６  ＋６５０１５の部分を含むポリヌクレオチドを検出するためのプライマーを示す。【０１８６】
配列番号：２０は、ＥＬＭＯ１イントロン１６  ＋６５０１５の塩基がCであるものを検出するプローブを示す。【０１８７】
配列番号：２１は、ＥＬＭＯ１イントロン１６  ＋６５０１５の塩基がTであるものを検出するプローブを示す。【０１８８】
配列番号：２２は、ＥＬＭＯ１イントロン１６  ＋６５０１５の塩基がTであるかCであるかを検出するためのＴａｑｍａｎ  ＰＣＲプライマーを示す。【０１８９】
配列番号：２３は、ＥＬＭＯ１イントロン１６  ＋６５０１５の塩基がTであるかCであるかを検出するためのＴａｑｍａｎ  ＰＣＲプライマーを示す。【０１９０】
配列番号：２４は、ＥＬＭＯ１イントロン１６  ＋６５２８７のCがGに置換したポリヌクレオチド（１２１ヌクレオチド）を示す。【０１９１】
配列番号：２５は、ＥＬＭＯ１イントロン１６  ＋６５２８７の部分を含むポリヌクレオチドを検出するためのプライマーを示す。【０１９２】
配列番号：２６は、ＥＬＭＯ１イントロン１６  ＋６５２８７の部分を含むポリヌクレオチドを検出するためのプライマーを示す。【０１９３】
配列番号：２７は、ＥＬＭＯ１イントロン１６  ＋６５２８７の塩基がCであるものを検出するプローブを示す。【０１９４】
配列番号：２８は、ＥＬＭＯ１イントロン１６  ＋６５２８７の塩基がGであるものを検出するプローブを示す。【０１９５】
配列番号：２９は、ＥＬＭＯ１イントロン１６  ＋６５２８７の塩基がTであるかCであるかを検出するためのＴａｑｍａｎ  ＰＣＲプライマーを示す。【０１９６】
配列番号：３０は、ＥＬＭＯ１イントロン１６  ＋６５２８７の塩基がTであるかCであるかを検出するためのＴａｑｍａｎ  ＰＣＲプライマーを示す。【０１９７】
配列番号：３１は、ＥＬＭＯ１イントロン１６  ＋６７３６３のAがGに置換したポリヌクレオチド（１２１ヌクレオチド）を示す。【０１９８】
配列番号：３２は、ＥＬＭＯ１イントロン１６  ＋６７３６３の部分を含むポリヌクレオチドを検出するためのプライマーを示す。【０１９９】
配列番号：３３は、ＥＬＭＯ１イントロン１６  ＋６７３６３の部分を含むポリヌクレオチドを検出するためのプライマーを示す。【０２００】
配列番号：３４は、ＥＬＭＯ１イントロン１６  ＋６７３６３の塩基がAであるものを検出するプローブを示す。【０２０１】
配列番号：３５は、ＥＬＭＯ１イントロン１６  ＋６７３６３の塩基がGであるものを検出するプローブを示す。【０２０２】
配列番号：３６は、ＥＬＭＯ１イントロン１６  ＋６７３６３の塩基がAであるかGであるかを検出するためのＴａｑｍａｎ  ＰＣＲプライマーを示す。【０２０３】
配列番号：３７は、ＥＬＭＯ１イントロン１６  ＋６７３６３の塩基がAであるかGであるかを検出するためのＴａｑｍａｎ  ＰＣＲプライマーを示す。【０２０４】
配列番号：３８は、ＥＬＭＯ１イントロン１６  ＋７９４１０のCがGに置換したポリヌクレオチド（１２１ヌクレオチド）を示す。【０２０５】
配列番号：３９は、ＥＬＭＯ１イントロン１６  ＋７９４１０の部分を含むポリヌクレオチドを検出するためのプライマーを示す。【０２０６】
配列番号：４０は、ＥＬＭＯ１イントロン１６  ＋７９４１０の部分を含むポリヌクレオチドを検出するためのプライマーを示す。【０２０７】
配列番号：４１は、ＥＬＭＯ１イントロン１６  ＋７９４１０の塩基がCであるものを検出するプローブを示す。【０２０８】
配列番号：４２は、ＥＬＭＯ１イントロン１６  ＋７９４１０の塩基がCであるものを検出するプローブを示す。【０２０９】
配列番号：４３は、ＥＬＭＯ１イントロン１６  ＋７９４１０の塩基がCであるかGであるかを検出するためのＴａｑｍａｎ  ＰＣＲプライマーを示す。【０２１０】
配列番号：４４は、ＥＬＭＯ１イントロン１６  ＋７９４１０の塩基がCであるかGであるかを検出するためのＴａｑｍａｎ  ＰＣＲプライマーを示す。【０２１１】
配列番号：４５は、ＥＬＭＯ１イントロン１６  ＋８０７１６のCがTに置換したポリヌクレオチド（１２１ヌクレオチド）を示す。【０２１２】
配列番号：４６は、ＥＬＭＯ１イントロン１６  ＋８０７１６の部分を含むポリヌクレオチドを検出するためのプライマーを示す。【０２１３】
配列番号：４７は、ＥＬＭＯ１イントロン１６  ＋８０７１６の部分を含むポリヌクレオチドを検出するためのプライマーを示す。【０２１４】
配列番号：４８は、ＥＬＭＯ１イントロン１６  ＋８０７１６の塩基がCであるものを検出するプローブを示す。【０２１５】
配列番号：４９は、ＥＬＭＯ１イントロン１６  ＋８０７１６の塩基がTであるものを検出するプローブを示す。【０２１６】
配列番号：５０は、ＥＬＭＯ１イントロン１６  ＋８０７１６の塩基がCであるかTであるかを検出するためのＴａｑｍａｎ  ＰＣＲプライマーを示す。【０２１７】
配列番号：５１は、ＥＬＭＯ１イントロン１６  ＋８０７１６の塩基がCであるかTであるかを検出するためのＴａｑｍａｎ  ＰＣＲプライマーを示す。【０２１８】
配列番号：５２は、ＥＬＭＯ１イントロン１６  ＋１０１３２６のGがCに置換したポリヌクレオチド（１２１ヌクレオチド）を示す。【０２１９】
配列番号：５３は、ＥＬＭＯ１イントロン１６  ＋１０１３２６の部分を含むポリヌクレオチドを検出するためのプライマーを示す。【０２２０】
配列番号：５４は、ＥＬＭＯ１イントロン１６  ＋１０１３２６の部分を含むポリヌクレオチドを検出するためのプライマーを示す。【０２２１】
配列番号：５５は、ＥＬＭＯ１イントロン１６  ＋１０１３２６の塩基がGであるものを検出するプローブを示す。【０２２２】
配列番号：５６は、ＥＬＭＯ１イントロン１６  ＋１０１３２６の塩基がCであるものを検出するプローブを示す。【０２２３】
配列番号：５７は、ＥＬＭＯ１イントロン１６  ＋１０１３２６の塩基がGであるかCであるかを検出するためのＴａｑｍａｎ  ＰＣＲプライマーを示す。【０２２４】
配列番号：５８は、ＥＬＭＯ１イントロン１６  ＋１０１３２６の塩基がGであるかCであるかを検出するためのＴａｑｍａｎ  ＰＣＲプライマーを示す。【０２２５】
配列番号：５９は、ＥＬＭＯ１イントロン１６  ＋１０５６１２のCがTに置換したポリヌクレオチド（１２１ヌクレオチド）を示す。【０２２６】
配列番号：６０は、ＥＬＭＯ１イントロン１６  ＋１０５６１２の部分を含むポリヌクレオチドを検出するためのプライマーを示す。【０２２７】
配列番号：６１は、ＥＬＭＯ１イントロン１６  ＋１０５６１２の部分を含むポリヌクレオチドを検出するためのプライマーを示す。【０２２８】
配列番号：６２は、ＥＬＭＯ１イントロン１６  ＋１０５６１２の塩基がCであるものを検出するプローブを示す。【０２２９】
配列番号：６３は、ＥＬＭＯ１イントロン１６  ＋１０５６１２の塩基がTであるものを検出するプローブを示す。【０２３０】
配列番号：６４は、ＥＬＭＯ１イントロン１６  ＋１０５６１２の塩基がCであるかTであるかを検出するためのＴａｑｍａｎ  ＰＣＲプライマーを示す。【０２３１】
配列番号：６５は、ＥＬＭＯ１イントロン１６  ＋１０５６１２の塩基がCであるかTであるかを検出するためのＴａｑｍａｎ  ＰＣＲプライマーを示す。【０２３２】
配列番号：６６は、ＥＬＭＯ１イントロン１６  ＋１１４４５８のCがTに置換したポリヌクレオチド（１２１ヌクレオチド）を示す。【０２３３】
配列番号：６７は、ＥＬＭＯ１イントロン１６  ＋１１４４５８の部分を含むポリヌクレオチドを検出するためのプライマーを示す。【０２３４】
配列番号：６８は、ＥＬＭＯ１イントロン１６  ＋１１４４５８の部分を含むポリヌクレオチドを検出するためのプライマーを示す。【０２３５】
配列番号：６９は、ＥＬＭＯ１イントロン１６  ＋１１４４５８の塩基がCであるものを検出するプローブを示す。【０２３６】
配列番号：７０は、ＥＬＭＯ１イントロン１６  ＋１１４４５８の塩基がTであるものを検出するプローブを示す。【０２３７】
配列番号：７１は、ＥＬＭＯ１イントロン１６  ＋１１４４５８の塩基がCであるかTであるかを検出するためのＴａｑｍａｎ  ＰＣＲプライマーを示す。【０２３８】
配列番号：７２は、ＥＬＭＯ１イントロン１６  ＋１１４４５８の塩基がCであるかTであるかを検出するためのＴａｑｍａｎ  ＰＣＲプライマーを示す。【０２３９】
配列番号：７３は、ＥＬＭＯ１イントロン１７  ＋５４９５のGがAに置換したポリヌクレオチド（１２１ヌクレオチド）を示す。【０２４０】
配列番号：７４は、ＥＬＭＯ１イントロン１７  ＋５４９５の部分を含むポリヌクレオチドを検出するためのプライマーを示す。【０２４１】
配列番号：７５は、ＥＬＭＯ１イントロン１７  ＋５４９５の部分を含むポリヌクレオチドを検出するためのプライマーを示す。【０２４２】
配列番号：７６は、ＥＬＭＯ１イントロン１７  ＋５４９５の塩基がGであるものを検出するプローブを示す。【０２４３】
配列番号：７７は、ＥＬＭＯ１イントロン１７  ＋５４９５の塩基がAであるものを検出するプローブを示す。【０２４４】
配列番号：７８は、ＥＬＭＯ１イントロン１７  ＋５４９５の塩基がGであるかAであるかを検出するためのＴａｑｍａｎ  ＰＣＲプライマーを示す。【０２４５】
配列番号：７９は、ＥＬＭＯ１イントロン１７  ＋５４９５の塩基がGであるかAであるかを検出するためのＴａｑｍａｎ  ＰＣＲプライマーを示す。【０２４６】
配列番号：８０は、ＥＬＭＯ１イントロン１７  ＋６９５８のTがCに置換したポリヌクレオチド（１２１ヌクレオチド）を示す。【０２４７】
配列番号：８１は、ＥＬＭＯ１イントロン１７  ＋６９５８の部分を含むポリヌクレオチドを検出するためのプライマーを示す。【０２４８】
配列番号：８２は、ＥＬＭＯ１イントロン１７  ＋６９５８の部分を含むポリヌクレオチドを検出するためのプライマーを示す。【０２４９】
配列番号：８３は、ＥＬＭＯ１イントロン１７  ＋６９５８の塩基がTであるものを検出するプローブを示す。【０２５０】
配列番号：８４は、ＥＬＭＯ１イントロン１７  ＋６９５８の塩基がCであるものを検出するプローブを示す。【０２５１】
配列番号：８５は、ＥＬＭＯ１イントロン１７  ＋６９５８の塩基がTであるかCであるかを検出するためのＴａｑｍａｎ  ＰＣＲプライマーを示す。【０２５２】
配列番号：８６は、ＥＬＭＯ１イントロン１７  ＋６９５８の塩基がTであるかCであるかを検出するためのＴａｑｍａｎ  ＰＣＲプライマーを示す。【０２５３】
配列番号：８７は、ＥＬＭＯ１イントロン１８  ＋９１７０のGがAに置換したポリヌクレオチド（１２１ヌクレオチド）を示す。【０２５４】
配列番号：８８は、ＥＬＭＯ１イントロン１８  ＋９１７０の部分を含むポリヌクレオチドを検出するためのプライマーを示す。【０２５５】
配列番号：８９は、ＥＬＭＯ１イントロン１８  ＋９１７０の部分を含むポリヌクレオチドを検出するためのプライマーを示す。【０２５６】
配列番号：９０は、ＥＬＭＯ１イントロン１８  ＋９１７０の塩基がGであるものを検出するプローブを示す。【０２５７】
配列番号：９１は、ＥＬＭＯ１イントロン１８  ＋９１７０の塩基がAであるものを検出するプローブを示す。【０２５８】
配列番号：９２は、ＥＬＭＯ１イントロン１８  ＋９１７０の塩基がGであるかAであるかを検出するためのインベーダープローブを示す。【０２５９】
配列番号：９３は、ＥＬＭＯ１用センスプライマーを示す。【０２６０】
配列番号：９４は、ＥＬＭＯ１用アンチセンスプライマーを示す。【０２６１】
配列番号：９５は、ＥＬＭＯ２用センスプライマーを示す。【０２６２】
配列番号：９６は、ＥＬＭＯ２用アンチセンスプライマーを示す。【０２６３】
配列番号：９７は、ＧＡＰＤＨ用センスプライマーを示す。【０２６４】
配列番号：９８は、ＧＡＰＤＨ用アンチセンスプライマーを示す。
【図１】
0004659620.tif 000003
【図２】
0004659620.tif 000004
【図３】
0004659620.tif 000005
【図４】
0004659620.tif 000006
【図５】
0004659620.tif 000007
【図６】
0004659620.tif 000008
【図７】
0004659620.tif 000009
【図８】
0004659620.tif 000010
【図９】
0004659620.tif 000011
【図１０】
0004659620.tif 000012
【図１１】
0004659620.tif 000013
【配列表】
0004659620000001.app