(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ローヤルゼリー、シロップ状のα，α−トレハロース及びプルランを混合してシロップ状の混合物を調製する工程と、得られた混合物を減圧乾燥する工程を含む方法により得られる、ローヤルゼリー、α，α−トレハロース及びプルランを含有する固状の細胞賦活剤。
【請求項２】
抗酸化剤の１種又は２種以上をさらに混合させた請求項１記載の細胞賦活剤。
【請求項３】
抗酸化剤がフラボノイド、ポリフェノール、ビタミンＥ及びビタミンＣである請求項２記載の細胞賦活剤。
【請求項４】
ローヤルゼリーを生ローヤルゼリーとしての重量換算で１重量％以上含み、該生ローヤルゼリーとしての重量に対して、無水物重量換算で、０．２倍量乃至５０倍量のα，α−トレハロースを含む請求項３記載の細胞賦活剤。
【請求項５】
強壮剤、健康食品又は健康補助食品としての請求項１乃至４のいずれかに記載の細胞賦活剤。
【発明の詳細な説明】
技術分野
この発明は、新規な細胞賦活剤、詳細には、ローヤルゼリーとトレハロースとを含む細胞賦活剤に関するものである。
背景技術
ローヤルゼリーは、ミツバチの巣における王台（女王バチの房）に蓄積された、働きバチの外分泌腺からの乳白色の分泌物であり、女王バチとなるべき幼虫に与えられる餌である。王台で孵化したミツバチの幼虫は、その時点では働きバチと区別できないが、ローヤルゼリーを十分に摂取して生育すると、働きバチに比べて体が大きく、寿命が長く、産卵数が多い女王バチに成長する。このことから、ローヤルゼリーには強壮・強精等の諸種の生理作用があるとされてきた。例えば、『嗜好  別冊ハネー・ブック』（昭和４０年、明治屋本社発行）、２２頁には、「人間に対するローヤル・ゼリーの生理実験結果を総括的にみてみると、『体力は増し、精力は盛んになり、皮膚は活力を増し、白髪が黒化する』など、はっきりした医用効果があるようである」と記載されている。また、ローヤルゼリーは天然の産物であることから、ヒトを含む哺乳類が摂取した際に重篤な副作用は示し難いと考えられる。これらのことから、強壮作用の発現を目的とするローヤルゼリーの利用は、現行の強壮剤にしばしば見られる危険性を克服しうるものとして大いに期待されている。
しかしながら、ローヤルゼリーは、採取されたそのままの状態では品質が劣化し易く、その作用が速やかに減衰するという問題がある。このような問題に対しては、ローヤルゼリーを採取後速やかに、例えば、０℃以下ないしはそれに近い低温で保存して利用したり、乾燥させて利用するなどの対策が講じられている。このような対処法は、保存期間中の品質の劣化の抑制にある程度の効果を示し得る。その一方で、ローヤルゼリーの低温保存は実際の取扱いが煩雑であるという問題がある。また、ローヤルゼリーの乾燥はその工程中に本来の品質の劣化が免れず、製品がローヤルゼリー本来の作用を十分に発揮し得ないという問題がある。このように、ローヤルゼリーは現在のところ、その期待に反して、簡便かつ有効に強壮剤として利用されているといえる状況にはない。
斯かる状況に鑑み、この発明の課題は、ローヤルゼリー本来の強壮作用を発揮する、日常的に簡便に利用することができる手段を提供することにある。
発明の開示
本発明者は、上記の課題を解決するため、低温保存された未加工のローヤルゼリー（以下、「未加工のローヤルゼリー」を「生ローヤルゼリー」という場合がある。）に種々の物質を配合してなる組成物を、低温保存された生ローヤルゼリーを対照として、諸種の条件下で一定期間保存した後の作用について比較検討した。その結果、上記のようにローヤルゼリーとトレハロースとを配合した組成物においては、常温条件下で比較的長期にわたって保存した後も、ローヤルゼリーによる細胞賦活作用が安定に維持され、ヒトを含む哺乳類の強壮に極めて有効であることを独自の知見として見出した。この発明は以上の知見に基づき完成されたものである。
すなわち、この発明は、ローヤルゼリーとトレハロースとを含んでなる細胞賦活剤とその製造方法ならびに用途を提供することにより上記の課題を解決するものである。
発明を実施するための最良の形態
この発明の細胞賦活剤はローヤルゼリーとトレハロースとを含んでなる。この発明でいうローヤルゼリーとは、働きバチにより分泌され、巣の王台に蓄積された、女王バチの幼虫に餌として与えられる乳白色の液体を意味し、分泌するハチの種類やその産地に特に限定はない。分泌するハチの種としては、セイヨウミツバチ（Ａｐｉｓ  ｍｅｌｌｉｆｅｒａ）、トウヨウミツバチ（Ａｐｉｓ  ｃｅｒａｎａ）、オオミツバチ（Ａｐｉｓ  ｄｏｒｓａｔａ）、コミツバチ（Ａｐｉｓ  ｆｌｏｒｅａ）などが挙げられる。産地としては、日本、南米、北米、豪州、中国、欧州などが挙げられる。一般に、ローヤルゼリーは、対象とする個体によってはアレルギー反応等の悪影響を惹き起こす場合がある。南米、とりわけ、ブラジル産のローヤルゼリーはこのような悪影響が比較的少ないので、この発明の実施に特に有用である。また、この発明で用いる材料としては、できるだけ新鮮な、又は、低温保存された生ローヤルゼリーを用いるのがより望ましい。
この発明でいうトレハロースとは、２分子のグルコースが還元性基どうしで結合してなる、α，α−トレハロースを意味する。トレハロースはローヤルゼリーの細胞賦活作用の安定化に奏効するので、この発明において有利に用いることができる。なお、この発明の細胞賦活剤においては、トレハロースは、ローヤルゼリーによる細胞賦活作用を安定に維持する有効量含まれてさえいればよく、その調製方法、純度及び性状は問わない。したがって、例えば、トレハロースの無水物や含水物、さらには、これらのいずれか又は両方を含有する糖組成物、これらのいずれかの結晶などは、いずれもこの発明に有利に利用できる。また、この発明の細胞賦活剤を、固状の形態、例えば、粉末、錠剤、ブロック等の形態で提供する場合には、トレハロースの無水物を用いるのが比較的望ましい。
トレハロースは種々の方法で調製することができる。例えば、経済性を問題にするのであれば、同じ特許出願人による特開平７−１４３８７６号公報、特開平７−２１３２８３号公報、特開平７−３２２８８３号公報、特開平７−２９８８８０号公報、特開平８−６６１８７号公報、特開平８−６６１８８号公報、特開平８−３３６３８８号公報及び特開平８−８４５８６号公報のいずれかに開示された非還元性糖質生成酵素及びトレハロース遊離酵素を澱粉部分加水分解物に作用させる方法が好適である。この方法によるときには、廉価な材料である澱粉から、トレハロースが高収量で得られる。ちなみに、斯かる方法により調製された市販品としては、例えば、含水結晶トレハロース粉末（商品名『トレハ』、固形分重量当りのトレハロース含量９８％以上、株式会社林原商事販売）及びトレハロース含有シロップ（商品名『トレハスター』、固形分重量当りのトレハロース含量２８％以上、株式会社林原商事販売）がある。なお、トレハロースは、マルトースに、例えば、同じ特許出願人による特開平７−１７０９７７号公報、特開平８−２６３号公報、特開平８−１４９９８０号公報のいずれかに記載されたマルトース・トレハロース変換酵素を作用させるか、あるいは、公知のマルトース・ホスホリラーゼ及びトレハロース・ホスホリラーゼを組合せて作用させることによっても得ることができる。また、トレハロースの無水物を製造するには、上記のようにして得られる含水結晶トレハロースを、例えば、７０℃乃至１６０℃の範囲の温度で常圧乾燥又は減圧乾燥、より望ましくは、８０℃乃至１００℃の範囲の温度で減圧乾燥するか、あるいは、水分１０％未満の高濃度トレハロース高含有溶液を助晶缶にとり、種晶共存下で５０乃至１６０℃、望ましくは８０乃至１４０℃の範囲で攪拌しつつ無水結晶トレハロースを含有するマスキットを製造し、これを比較的高温乾燥条件下で、例えば、ブロック粉砕、流動造粒、噴霧乾燥などの方法で晶出、粉末化する。
この発明の細胞賦活剤は、以上のようなローヤルゼリーとトレハロースとを含んでなる。この発明の細胞賦活剤におけるローヤルゼリーとトレハロースとの配合は、ローヤルゼリーの細胞賦活作用が発揮され、該作用の安定化が達成されるものであればいずれでもよい。ローヤルゼリーの細胞賦活作用は、下記の実験に詳述する方法にしたがって確認することができる。ローヤルゼリーの細胞賦活作用の安定化は、該細胞賦活作用の１又は２以上を指標として、当該細胞賦活剤とその原料に用いたローヤルゼリーとを所定の条件下で保存したときの該作用の残存率を比較することにより確認することができる。因みに、総重量あたりローヤルゼリーを、生ローヤルゼリーとしての重量換算で１重量％以上、望ましくは、２重量％以上含み、該生ローヤルゼリーとしての重量に対してトレハロースを無水物重量換算で０．２倍量以上、望ましくは、２倍量以上配合してなり、固状の形態にあるこの発明の細胞賦活剤は、細胞賦活作用の具体例である細胞延命作用や精巣機能の賦活作用の安定性にとりわけ優れ、その作用が顕著であることに加えて、呈味が良好であるという特長がある。なお、細胞賦活作用の安定性ならびに呈味の観点からは、この発明の細胞賦活剤におけるローヤルゼリーに対するトレハロースの配合割合の上限に特に制限はないけれども、後述のように、他の成分をさらに配合する場合には、生ローヤルゼリーとしての重量に対して、トレハロースの配合割合を、通常、５０倍量以下、望ましくは、２５倍量以下とするのがよい。
以上のようなこの発明の細胞賦活剤に抗酸化剤をさらに添加すると、細胞賦活作用の更なる安定化を達成することができる。したがって、当該細胞賦活剤の適用対象や適用地域などに応じて、例えば、温度制御することなく船舶などで当該細胞賦活剤を輸送したり、高温の地域で利用する場合などには、必要に応じて抗酸化剤を添加することも有利に実施できる。この発明で用いる抗酸化剤は特定の種類に限定されないけれども、当該細胞賦活剤をヒトを含む哺乳類のための食用として利用する場合には、食品分野で通常用いられるものから適宜選択するのが望ましい。食品分野で通常用いられる抗酸化剤としては、具体的には、フラボノイド、ポリフェノール、ビタミンＥ、ビタミンＣなどが挙げられる。フラボノイドとしては、より詳細には、ルチン、ヘスペリジン、ナリンジン、ケルセチンや、それらのそれぞれにグルコース又はその重合体などの糖類が結合してなる、糖転移ルチン、糖転移ヘスペリジン、糖転移ナリンジン、糖転移ケルセチンなどが挙げられる。ポリフェノールとしては、より詳細には、カテキン、没食子酸、プロアントシアニジンなどが挙げられる。さらに、植物抽出物である、エンジュ抽出物、ローズマリー抽出物、ユーカリ抽出物、ブドウ種子抽出物なども、この発明においては抗酸化剤として有利に利用できる。これらの抗酸化剤の当該細胞賦活剤における含量は特に制限がないけれども、当該細胞賦活剤を食用として用いる場合には、当該細胞賦活剤の呈味への影響を考慮して、食品分野で通常用いられる配合割合にしたがうか、またはそれ以下で用いるのが望ましい。
ところで、固状の形態にあるこの発明の細胞賦活剤は、安定性が優れていることに加えて、従来のローヤルゼリーに比べて、経口的に摂取する際に、その口腔内でより長期にわたって滞留する特徴がある。このことは、当該細胞賦活剤が口腔内の皮膚を介して直接的に、消化系での分解を受けずに体内に吸収され易いことを意味している。したがって、当該細胞賦活剤は、従来のローヤルゼリーに比べてより少量で所期の効果を発揮しうる。なお、マルチトールなどの糖アルコールやプルランなどの増粘多糖は、ローヤルゼリーの品質に影響を与えることなく、口腔内での滞留をさらに促すので、この発明の細胞賦活剤にさらに糖アルコール及び／又は増粘多糖を含有せしめることも有利に実施できる。
この発明の細胞賦活剤には、さらに必要に応じて、乳化剤、香料、香辛料、色素、ビタミン、アミノ酸、ミネラル等の上記で述べた以外の成分をさらに含有させることも有利に実施できる。これらの成分は、この発明の細胞賦活剤の個々の利用分野で通常用いられる成分から目的に応じて適宜選択される。以上のような成分を含むこの発明の細胞賦活剤の形態には特に制限はなく、粉末、錠剤、フィルム、シート、ペースト、乳液、溶液などの所望の形態で提供される。
以上のように構成されるこの発明の細胞賦活剤は、ローヤルゼリーが本来有している細胞賦活作用の１又は２以上を、より長期にわたって効果的に発揮する。ローヤルゼリー本来の細胞賦活作用としては、例えば、肝細胞などの細胞の延命、免疫担当細胞などの細胞の増殖又は分化の促進、免疫担当細胞による生体防御機能の亢進、細胞の新陳代謝の促進、性中枢細胞の老化防止、精巣機能の賦活化などが挙げられる。また、ローヤルゼリーは、以上のような細胞賦活作用故に、斯かる細胞賦活の結果として、加齢に伴う血清における総コレステロール及び／又は総脂質の上昇に対する抑制に奏効する場合もある。ローヤルゼリーによるこれらの細胞賦活作用は、実験的には、例えば、イン・ビトロで培養した細胞の延命、該培養細胞におけるＤＮＡ合成の亢進やアポトーシスの抑制、実験動物における精細管などの精巣機能に関わる細胞の賦活化、実験動物の延命などの現象として確認することができる。比較する細胞賦活作用の種類や、当該細胞賦活剤の配合成分ならびに組成、保存条件などにもよるけれども、例えば、２５℃で３０日間保存したとき、ローヤルゼリーの細胞賦活作用の残存率は通常４０％未満であるところ、この発明の細胞賦活剤の形態にすると、同様の細胞賦活作用の同じ条件下での残存率は、一般に、５０％程度以上、好適な場合には、６０％以上、更に好適な場合には、８０％以上である。
この発明の細胞賦活剤は、以上のような細胞賦活作用を安定して示すので、ヒトを含む哺乳類が摂取すると、その個々の細胞の機能を賦活化したり、該機能の低下の抑制に奏効する。したがって、この発明の細胞賦活剤は、ヒトを含む哺乳類が簡便に利用できる、健康の維持・増進を目的とする、例えば、強壮剤、健康食品、健康補助食品などとしてとりわけ有用である。対象とする哺乳類の種類、齢、性別や、目的とする効果などにもよるが、当該細胞賦活剤は、生ローヤルゼリーとしての重量換算で、体重１ｋｇあたり、通常、０．１ｍｇ乃至１０ｇ、望ましくは、１日あたり１ｍｇ乃至１ｇの用量で、１日１回又は数回に分けて、効果に応じて、連日又は１日以上の間隔をおいて摂取するか、あるいは摂取させればよい。
この発明の細胞賦活剤を製造するには、以上に示したような成分と個々の含量に基づいて、目的に応じて、すなわち、対象とする哺乳類やその摂取方法などに応じて選ばれる適宜の組成にしたがって混合し、希釈、濃縮、乾燥、濾過、遠心分離等の処理を適宜施し、ローヤルゼリー及びトレハロースを含む当該細胞賦活剤の成分を含有する画分を採取し、必要に応じて所望の形状に成形すればよい。各成分を配合する順序や、該処理を施す時期は、ローヤルゼリー本来の品質劣化を防ぐものであればいずれでもよく、例えば、できるだけ新鮮な、又は、採取後低温保存された生ローヤルゼリーにトレハロースを混合し、その後、必要に応じて該処理を適宜施せばよい。また、製造過程でのローヤルゼリーの品質の劣化を防ぐためには、上記の工程はいずれも常温以下、望ましくは、３０℃以下の条件下で行うのがよい。
固状の形態のこの発明の細胞賦活剤は、例えば、ローヤルゼリーとトレハロースを混合し、必要に応じて他の成分を更に混合した後、該混合物を、減圧乾燥、真空乾燥、加熱乾燥等の通常の乾燥工程に供することにより得ることができる。また、トレハロースの無水物を利用することにより、通常の乾燥工程を経ることなく固状の形態の当該細胞賦活剤を得ることもできる。すなわち、結晶又は非結晶のトレハロースの無水物を、ローヤルゼリーに、生ローヤルゼリーとしての重量に対して、通常、４倍量以上、望ましくは、８倍量以上混合し、必要に応じて他の成分を更に混合した後、該混合物を、常温以下、望ましくは、３０℃以下で、通常、４時間以上、望ましくは、８時間以上静置すればよい。トレハロースの無水物を用いて通常の乾燥工程を経ずに調製されたものは、細胞賦活作用の安定性がとりわけ優れているという特長がある。斯くして調製される固状の形態の当該細胞賦活剤は、必要に応じて、粉砕機、打錠機、圧延機などを用いて、粉末、錠剤、フィルム、シートなど所望の形態にしたり、さらに必要に応じて、例えば、斯かる粉末をカプセルに充填して利用することも有利に実施できる。
この発明の細胞賦活剤は、上記で述べたようにそれ自体で有用である一方、他の成分に配合してなる組成物の形態としても有利に利用できる。この発明は斯かる組成物を提供するものでもある。この発明による組成物は、通常、ヒトを含む哺乳類への経口的又は経皮的適用ないしは皮膚外用が許容される成分の１種又は２種以上を当該細胞賦活剤とともに含んでなり、例えば、食品分野、飲料分野、化粧品分野などで有利に利用することができる。この発明で用いる、ヒトを含む哺乳類への経口的又は経皮的適用ないしは皮膚外用が許容される成分としては、この発明の組成物の個々の利用分野で通常使用される、例えば、水、アルコール、澱粉質、蛋白質、アミノ酸、繊維質、糖質、脂質、脂肪酸、ビタミン、ミネラル、着香料、着色料、甘味料、調味料、香辛料、防腐剤、乳化剤、界面活性剤などが挙げられる。
この発明の組成物の形態には特に制限はないけれども、当該細胞賦活剤の細胞賦活作用をより有効に発揮させるという観点からは、常温を超えない、望ましくは、３０℃以下の温度条件下で利用可能なものが望ましい。望ましい食品の形態としては、例えば、アイスクリーム、アイスキャンデー、シャーベットなどの氷菓、氷蜜などのシロップ、バタークリーム、カスタードクリーム、フラワーペースト、ピーナッツペースト、フルーツペーストなどのスプレッド及びペースト、チョコレート、ゼリー、キャンディー、グミゼリー、キャラメル、チューインガム、プリン、シュークリーム、スポンジケーキなどの洋菓子、ジャム、マーマレード、シロップ漬、糖菓などの加工果実ないしは加工野菜、まんじゅう、ういろう、あん、羊羹、水羊羹、カステラ、飴玉などの和菓子、醤油、粉末醤油、味噌、粉末味噌、マヨネーズ、ドレッシング、食酢、三杯酢、テーブルシュガー、コーヒーシュガーなどの調味料などが挙げられる。望ましい飲料の形態としては、例えば、合成酒、醸造酒、果実酒、洋酒などの酒類、ジュース、ミネラル飲料、炭酸飲料、乳酸飲料、乳酸菌飲料、スポーツドリンク、ドリンク剤、茶、紅茶、ウーロン茶、コーヒー、ココアなどの清涼飲料などが挙げられる。望ましい化粧品の形態としては、例えば、ローション、乳液又はクリームの形態の、基礎化粧品、洗浄用化粧品、入浴用化粧品、頭髪化粧品、日焼け・日焼け止め化粧品、メイクアップ化粧品、発毛剤、育毛剤などが挙げられる。以上のような形態のこの発明による組成物を製造するには、目的とする製品を慣用の製造方法にしたがって製造する過程の適宜の時期にこの発明の細胞賦活剤を添加するか、あるいは、ローヤルゼリーとトレハロースをそれぞれ添加すればよい。添加の時期に特に制限はないけれども、目的とする製品が加熱工程を経て製造されるものの場合には、加熱工程の後、常温、望ましくは、３０℃以下に冷却した後に添加することにより、製造工程での細胞賦活作用の減衰を防ぐことができる。以上のようなこの発明の組成物は、この発明の細胞賦活剤を、製品重量あたり、通常、０．００１重量％乃至２０重量％、望ましくは、０．０１重量％乃至１０重量％含有する。
以上のようなこの発明による組成物は、ローヤルゼリーによる細胞賦活作用を示す上、該作用が安定化されているので、通常の製品と同様に日常的に利用することにより、利用した生体において細胞賦活作用が効果的に発揮され、その生体の抵抗力の増強や、体調不良の改善の早期化、健康な状態の維持などが達成される。したがって、この発明の組成物は、健康を維持・増進するための食品・飲料・化粧品などとして極めて有用である。また、頭皮を含む皮膚に適用する化粧品として利用する場合には、皮膚疾患の予防ならびに該疾患に対する治療効果の改善、シワの予防・改善、発育毛の改善などに奏効する。
以下、実験及び実施例に基づいてより詳細にこの発明を説明する。
実験１    細胞賦活作用の安定化に及ぼす糖質の影響
実験１−１    無水トレハロースの調製
市販の含水結晶トレハロース粉末（商品名『トレハ』、株式会社林原商事販売）をジャケット付き回転式真空乾燥機を用いて、温度９０℃、気圧−３００乃至−３５０ｍｍＨｇの条件で、約７時間減圧乾燥した。その後、温度を常温に、気圧を常圧に戻して、製品を回収し、無水トレハロースを得た。
実験１−２    細胞賦活剤の調製
本実験において、ローヤルゼリーとしては、未加工のブラジル産ローヤルゼリー（水分６７重量％、−２０℃で保存。以下、単に「生ローヤルゼリー」という。）を、使用の際に随時常温で解凍し、直後に必要量を小分けして用いた。
２５℃の条件下で、生ローヤルゼリー１重量部に実験１−１の方法で得た無水トレハロースの４重量部を加え十分に混合した。混合物を常温下で一夜減圧乾燥した後、粉砕機で粉末にし、この発明の細胞賦活剤（以下、「試験剤１」という。）を得た。
無水トレハロースに代えて可溶性澱粉を用いたこと以外は試験剤１と同様に操作して粉末を調製し、比較剤１とした。無水トレハロースに代えて無水マルトースを用いたこと以外は試験剤１と同様に操作して粉末を調製し、比較剤２とした。また、生ローヤルゼリーを常温下で一夜減圧乾燥した後、粉砕機を用いて調製した粉末を比較剤３とした。
実験１−３    細胞延命作用の安定化
ローヤルゼリーによる、イン・ビトロ培養系におけるラット肝細胞の延命作用と、該作用の保存安定性、ならびに、該保存安定性に及ぼす共存糖質の影響を以下の実験により調べた。
実験１−２の方法で調製した、試験剤１、比較剤１、比較剤２及び比較剤３を、調製直後にそれぞれガラス製褐色瓶に入れ２５℃の恒温槽内に静置した。また、解凍直後の生ローヤルゼリーを別途ガラス製褐色瓶に入れ、同様に恒温層に静置した（以下、「恒温保存生ローヤルゼリー」という）。以上の操作をした日を０日目として２０日目までの期間、毎日、試験剤１、比較剤１乃至３を調製し、その直後に同様に恒温層に静置するとともに、生ローヤルゼリーを解凍し、同様に恒温層内に静置した。
肝細胞のイン・ビトロ培養用の基本培地として、ウシ・トランスフェリン（２０μｇ／ｍｌ）、エタノールアミン（２０μＭ）、亜セレン酸ナトリウム（２．５×１０−８Ｍ）、インスリン（１×１０−６Ｍ）、デキサメタゾン（１×１０−５Ｍ）、ペニシリンＧ（１００μｇ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）、アプロチニン（２５ｎｇ／ｍｌ）及び重炭酸ナトリウム（２ｍｇ／ｍｌ）を補足したＬ−１５培地（以下、「無血清Ｌ−１５培地」という。）を調製した。
恒温層内で静置して、保存期間が３０日に達した上記の試料（試験剤１、比較剤１乃至３、恒温保存生ローヤルゼリー）のいずれかを、生ローヤルゼリーとしての重量換算で１０ｍｇ／ｍｌの濃度でローヤルゼリーを含むように、無血清Ｌ−１５培地に補足し、試験培地とした。また、無血清Ｌ−１５培地に、濃度１０ｍｇ／ｍｌの解凍直後の生ローヤルゼリーを補足したものを陽性対照とした。無血清Ｌ−１５培地を陰性対照とした。
ウイスター・ラット（体重約２００ｇ）より肝臓を摘出し、常法により破砕した。この破砕物を常法によりコラゲナーゼ処理して肝細胞を得た。この肝細胞を上記の試験培地又は対照培地に２．５×１０５個／ｍｌとなるように浮遊させた。それぞれの細胞浮遊液を２ｍｌずつプラスチックシャーレ（内径３５ｍｍ）に移し、５％ＣＯ２インキュベーター中で３７℃でインキュベートして肝細胞を培養した。培養開始から２４時間ごとに、上記の操作により、恒温層内で３０日間の保存を終えた試料又は解凍直後の生ローヤルゼリーを用いて、それぞれの試験培地ならびに対照培地と同様の組成の培地を調製して、各シャーレの培地をこの新鮮な培地と交換するとともに、シャーレあたりの全生細胞数を常法にしたがって求めた。同じ組成の培地による培養を３組ずつ行った。
いずれの培養系も、肝細胞は培養２４時間目で培養開始時の約２倍にまで増殖した一方、その後の生細胞数は培養系ごとに異なる動向を示した。各培養系の培養２４時間目における時点での生細胞数に対する、培養４８０時間目の生細胞数の百分率を求め、平均値を算出し、細胞生存率とした。陰性対照においては細胞生存率が約４５％であったのに対し、陽性対照では約９０％であった。この結果より、新鮮な生ローヤルゼリーには顕著な細胞延命作用があることが確認された。一方、生ローヤルゼリー又はその加工品（試験剤１及び比較剤１乃至３）を保存した後に用いた試験培地においてはそれぞれ異なる細胞生存率を示し、共存糖質の種類又は有無等により、細胞延命作用の保存後の残存率が異なることが示唆された。
そこで、各試験培地における細胞生存率から、下記に示す数式により、各試料の保存後の細胞延命作用の残存率を求めた。各試験培地ごとに求めた結果をまとめ、表１に示した。
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表１に示すとおり、生ローヤルゼリーを２５℃で３０日間保存すると解凍直後のときに示す細胞延命作用が顕著に減衰したのに対し、トレハロースを配合した場合（試験剤１）には、同条件で保存した後も、解凍直後の生ローヤルゼリーに匹敵する細胞延命作用を示した。一方、生ローヤルゼリーに可溶性澱粉又は無水マルトースを配合した場合（それぞれ、比較剤１、比較剤２）には、保存後に、ある程度の細胞延命作用の残存は認められたものの、トレハロースを配合した場合と比較すると残存率は低かった。また、生ローヤルゼリーを直接乾燥した場合（比較剤３）には、保存後に残存する細胞延命作用は顕著ではなかった。これは、乾燥生ローヤルゼリーの保存安定性の悪さというよりは寧ろ、生ローヤルゼリーの乾燥工程における該作用の減衰の結果と考えられる。以上の結果は、トレハロースが、ローヤルゼリーによる細胞賦活作用の一つである細胞延命作用の安定性を顕著に高めることを示している。
実験２    細胞賦活作用の安定化に及ぼすトレハロース量の影響
２５℃の条件下で、実験１で用いた生ローヤルゼリーと、実験１−１の方法で得た無水トレハロースとを、後記表２に示す割合で配合し、十分に混合した後、常温で一夜減圧乾燥し、乾燥物を粉砕して粉末を得た。
実験１−３の方法に準じて、上記の粉末を２５℃で３０日間保存した試料を、解凍直後の生ローヤルゼリーを補足したＬ−１５培地を陽性対照とし、無血清Ｌ−１５培地を陰性対照とする、ラット肝細胞の延命作用を確認する実験に供した。本実験における試験培地のローヤルゼリー含量は、生ローヤルゼリーとしての重量換算で、いずれも１０ｍｇ／ｍｌとなるように調整した。実験１に準じて各試料の保存後の細胞延命作用の残存レベルを求めた結果を表２にまとめた。
0004844786.tif 000004
表２に示されるとおり、細胞延命作用のトレハロースによる安定化は、生ローヤルゼリーとしての重量に対して、トレハロースを無水物重量換算で０．０５倍量以上配合したとき認められ、０．２倍量以上配合した場合に顕著となり、２倍量以上の配合でほぼ最大となった。以上の結果は、ローヤルゼリーの細胞延命作用の安定化という観点からは、ローヤルゼリーに対するトレハロース（無水物換算）の配合量は、生ローヤルゼリーとしての重量を基準として、望ましくは０．２倍量以上であって、２倍量以上あれば十分であることを示している。
一方、データは示していないけれども、本実験でより顕著な安定性を示した試料ほど、すなわち無水トレハロースの含量がより高い試料ほど、生ローヤルゼリーと比べてより良好な呈味を示すことをパネルテストにより確認した。また、この発明の細胞賦活剤におけるローヤルゼリーによる細胞賦活作用の発現という点からは、ローヤルゼリーの含量は高い方がよく、ヒトを対象とするローヤルゼリーの従来の用量を考慮すると、総重量あたり生ローヤルゼリーとしての重量換算で１重量％以上が望ましく、さらに、２重量％以上がより望ましいといえる。したがって、以上のことを総合すると、総重量あたりローヤルゼリーを生ローヤルゼリーとしての重量換算で１重量％以上、望ましくは、２重量％以上含み、該生ローヤルゼリーとしての重量に対してトレハロースを無水物重量換算で０．２倍量以上、望ましくは、２倍量以上配合してなるこの発明の細胞賦活剤は、細胞賦活作用の一つである細胞延命作用の安定性にとりわけ優れ、その作用が顕著であることに加えて、それ自体の呈味が良好であるという特性を示すものである。また、ローヤルゼリーとトレハロース以外の成分を配合する場合を考慮すると、ローヤルゼリーに対するトレハロースの配合割合は、生ローヤルゼリーとしての重量を基礎として、トレハロースを無水物換算で、通常、５０倍量以下、望ましくは２５倍量以下がよい。
実験３    ローヤルゼリーによる精巣機能の賦活化に及ぼすトレハロースの影響
実験１−２の方法により調製した、この発明の細胞賦活剤である試験剤１を、その調製後直ちに、実験動物用の通常の粉末飼料と混合し、生ローヤルゼリーとしての重量換算で、総重量あたり５０ｐｐｍ又は５００ｐｐｍの含量でローヤルゼリーを含む粉末飼料（以下、「試験飼料」という。）を調製した。また、５００ｐｐｍでローヤルゼリーを含む試験飼料における試験剤１を、同重量の、実験１−１で調製された無水トレハロースに置き換えた飼料（以下、「対照飼料」という。）を調製した。３０匹の２６週齢の雄性ハムスターを対照飼料で１週間飼育した後、１群あたり１０匹の３群に群分けした。第１群のハムスターには対照飼料を、第２群及び第３群のハムスターには、それぞれ、５０ｐｐｍ及び５００ｐｐｍの含量でローヤルゼリーを含む試験飼料を、粉末飼料用の市販の給餌器を介して自由摂取させつつ１２週間飼育した。
この飼育期間中の毎日、各個体の飼料の摂取量と体重を計測した。また、この飼育期間の終了後、各個体の精巣機能を、以下のとおり精巣標本を解析することにより調べた。すなわち、先ず、全ての個体より１個の精巣（右側）を摘出し、常法にしたがって、１５％中性緩衝ホルマリン液に固定して精巣組織標本を作製した。この標本を、ヘマトキシリン−イオシン染色した後、顕微鏡観察下、精細管を組織学的に解析した。各標本において、任意の５箇所を１００倍の倍率で目視し、１視野内の精細管の数を計測するとともに、計測された精細管を、退行性変化を示すもの（精細胞の変性・消失、精細管の空洞など）と、組織構造が堅持された、造精の活発なものとに分類した。各標本ごとに、全精細管中に占める、造精の活発な精細管の率（％）の平均値を求め、さらに、求められた値を各群ごとに平均した。
上記の飼育期間中、１日あたりの飼料の摂取量はいずれの個体も体重の約５重量％であり群間に差はなかった。また、体重の推移も群間に差は認められなかった。精巣標本の組織学的解析の結果を、表３にまとめて示す。
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表３に示すとおり、造精の活発な精細管の占める率は、ローヤルゼリーの摂取量に依存的に上昇した。また、顕微鏡観察下での目視において、対照飼料を摂取した群と比較して、試験剤１を配合した試験飼料を摂取した群、特に、ローヤルゼリーを５００ｐｐｍで含有する試験飼料を摂取した群においては、明らかに多くの精子形成が確認された。
次に、上記の実験で用いた試験剤１（調製直後）に代えて、実験１−２の方法により調製し、実験１−３にしたがって暗下、２５℃で、３０日間保存した試験剤１及び比較剤２、ならびに、実験１−３にしたがって同様に暗下、２５℃で、３０日間保存した恒温保存生ローヤルゼリーを用いて上記と同様の実験を行った。その結果、保存後の試験剤１を用いた場合には上記とほぼ同等の結果が得られた。これに対して、保存後の比較剤２ならびに恒温保存生ローヤルゼリーを用いた場合には、いずれも、造精の活発な精細管の占める率がローヤルゼリーの摂取量に依存して上昇する傾向は顕著ではなかった。しかも、個体によっては、ローヤルゼリーを摂取したにも関わらず、対照群と同等の率に留まるものも数多く見られた。
以上に示した結果は、トレハロースの添加によって、ローヤルゼリーによる精巣機能の賦活化作用が顕著に安定化されることを示している。
実験４    ローヤルゼリーによるマウスの延命作用に及ぼすトレハロースの影響
実験１−２の方法により調製した、この発明の細胞賦活剤である試験剤１を、その調製後直ちに、実験動物用の通常の粉末飼料と混合し、生ローヤルゼリーの重量換算で、総重量あたり５０ｐｐｍ又は５００ｐｐｍの含量でローヤルゼリーを含む粉末飼料（以下、「試験飼料」という。）を調製した。また、５００ｐｐｍでローヤルゼリーを含む試験飼料における試験剤１を、同重量の、実験１−１で調製された無水トレハロースに置き換えた飼料（以下、「対照飼料」という。）を調製した。３０匹の７週齢の雄性Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウスを１群あたり１０匹の３群に群分けした。第１群のマウスには対照飼料を、第２群及び第３群のマウスには、それぞれ、５０ｐｐｍ及び５００ｐｐｍの含量でローヤルゼリーを含む試験飼料を、粉末飼料用の市販の給餌器を介して自由摂取させつつ飼育した。それぞれの個体の、生存中の１日あたりの飼料の摂取量は、いずれも、一般的な飼料を用いた場合とほぼ同じであり、群間に差はなかった。
対照飼料を摂取させた第１群のマウスは、３２週齢の時点で死亡個体が見られはじめ、４２週齢の時点での死亡個体数は３匹に達した。一方、この発明の細胞賦活剤である試験剤１を配合した飼料を摂取させた第２群及び第３群のマウスは４２週齢の時点でも全て生存していた。
次に、上記の実験で用いた試験剤１（調製直後）に代えて、実験１−２の方法により調製し、実験１−３にしたがって暗下、２５℃で、３０日間保存した試験剤１及び比較剤２、ならびに、実験１−３にしたがって同様に暗下、２５℃で、３０日間保存した恒温保存生ローヤルゼリーを用いて上記と同様の実験を行った。その結果、保存後の試験剤１を摂取させた群では、上記と同じく４２週齢の時点で全てのマウスは生存していた。これに対して、保存後の比較剤２ならびに恒温保存生ローヤルゼリー摂取させた群は、いずれも、対照飼料を摂取させた群と同様の生存曲線をたどり、４２週齢の時点での死亡個体数は２乃至３匹であった。以上の結果は、トレハロースの添加によって、ローヤルゼリーによるマウスの延命作用が顕著に安定化されることを示している。
実施例１    健康食品
２５℃の条件下で、実験１−１の方法で得た無水トレハロースの９重量部と、実験１−２で用いた解凍直後の生ローヤルゼリーの１重量部とを均一に混合し、この混合物を２５℃で一夜静置した後、粉砕機を用いて粉末にした。この粉末を０．４２ｍｍφメッシュの篩を通したものを回収し、この発明の細胞賦活剤を得た。実験１に準じて操作し、当該細胞賦活剤が常温保存後も安定して細胞延命作用を示すことを確認した。
当該細胞賦活剤を打錠機を用いて１錠あたり約２００ｍｇの錠剤に成形した。本品は、常温保存の後も安定して細胞賦活作用を示す、簡便に利用できかつ著効を示す細胞賦活剤である。本品は、まろやかな甘味と適度な酸味を示すので、日常的に利用する健康食品として有用である。
実施例２    健康食品
以下の成分を以下の配合で均一に混合した後、実施例１に準じて操作して、粉末の形態のこの発明の細胞賦活剤を調製した。調製後、実験１に準じて操作し、当該細胞賦活剤が常温保存後も安定して細胞延命作用を示すことを確認した。
実験１−１の方法で得た無水トレハロース                ８．５重量部
実験１−２の解凍直後の生ローヤルゼリー                ０．５重量部
糖転移ヘスペリジン（商品名『αＧヘスペリジンＰＳ』、株式会社林原商事販売）
０．５重量部
プルラン（商品名『プルランＰＦ−２０』、株式会社林原商事販売）
０．５重量部
この細胞賦活剤を、打錠機を用いて１錠あたり約３００ｍｇの錠剤に成形した。本品は、常温保存の後も安定して細胞賦活作用を示す、簡便に利用できかつ著効を示す細胞賦活剤である。本品は、まろやかな甘味と適度な酸味により良好な呈味を示すので、日常的に利用する健康食品として有用である。
実施例３    健康食品
以下の成分を以下の配合で均一に混合した後、実施例１に準じて操作して、粉末の形態のこの発明の細胞賦活剤を調製した。調製後、実験１に準じて操作し、当該細胞賦活剤が常温保存後も安定して細胞延命作用を示すことを確認した。
実験１−１の方法で得た無水トレハロース                ７．５重量部
実験１−２の解凍直後の生ローヤルゼリー                １．０重量部
マルチトール                                          １．３重量部
Ｌ−トリプトファン                                    ０．２重量部
本品は、常温保存の後も安定して細胞賦活作用を示す、簡便に利用できかつ著効を示す細胞賦活剤である。本品は、まろやかな甘味と適度な酸味により良好な呈味を示すので、日常的に利用する健康食品として有用である。
実施例４    アイスクリーム
生クリーム（油脂含量約４６重量％）１８重量部、脱脂粉乳７重量部、全乳５１重量部、砂糖１０重量部、ラクトスクロース含有粉末（登録商標『乳化オリゴ』）４重量部、プルラン２重量部、及びアラビアガム２重量部の混合物を溶解し、７０℃で３０分間保持して殺菌した後、ホモゲナイザーで乳化分散させ、次いで、３乃至４℃にまで急冷し、これに、実施例２の方法で得た細胞賦活剤４重量部を加えてさらに混合し、一夜熟成した後、フリーザーで凍結させてアイスクリームを得た。
本品は、適度な甘味と上品な風味を示すとともに、細胞賦活作用を示す、健康の維持・増進に奏効するアイスクリームである。
実施例５    甘酒
白米１０重量部を、常法に従って水を加えて炊き上げ、次いで、得られた飯米を冷却して５５℃とし、常法により調製したた麹３０重量部と食塩０．１重量部を混合して５０乃至５５℃で８時間保ち、これをミキサーにかけ、さらに約２５℃にまで冷却した時点で、実施例１の方法で得た細胞賦活剤２重量部を加えて混合した後、小包に充填し、甘酒を得た。
本品は、色調もよく、風味豊かな高品質の甘酒である上、穏やかに細胞賦活作用を示すので、健康の維持・増進のための飲料として有用である。
実施例６    健康飲料
無水結晶マルトース５００重量部、実施例３の細胞賦活剤１００重量部、粉末卵黄１９０重量部、脱脂粉乳２００重量部、塩化ナトリウム４．４重量部、塩化カリウム１．８５重量部、硫酸マグネシウム４重量部、チアミン０．０１重量部、アスコルビン酸ナトリウム０．１重量部、ビタミンＥアセテート０．６重量部及びニコチン酸アミド０．０４重量部からなる配合物を調製した。この配合物２５重量部を精製水１５０重量部に均一に分散・溶解させ、１５０ｇずつ褐色ガラス瓶に封入した。
本品は、細胞賦活作用を安定して示す上、栄養源が補足されているので、健康維持、成長促進、病気の予防、治療の促進、スポーツ後の疲労回復促進などを目的とする健康飲料として有利に利用できる。なお、本品は、ヒトのみならず、家畜などの動物のための経口摂取又は経管投与用組成物としても有利に利用できる。
実施例７    皮膚外用クリーム
以下の成分を、以下の配合にしたがって、常法により加熱しつつ混合した。
モノステアリン酸ポリオキシエチレングリセリン          ２．０重量部
自己乳化型モノステアリン酸グリセリン                  ５．０重量部
ベヘニン酸エイコサニル                                １．０重量部
流動パラフィン                                        １．９重量部
トリオクタン酸トリメチロールプロパン                  １０．０重量部
上記の混合物に、細胞賦活剤を除く以下の成分を以下の配合にしたがって添加・混合し、３０℃以下にまで冷却した後に、さらに細胞賦活剤を以下の配合で加え、ホモゲナイザーにより乳化して、皮膚外用クリームを製造した。
１，３−ブチレングリコール                            ５．０重量部
乳酸ナトリウム液                                      １０．０重量部
パラオキシ安息香酸メチル                              ０．１重量部
モモ葉エキス                                          １．５重量部
精製水                                                ６２．２重量部
実施例１の方法で得た細胞賦活剤                        １．０重量部
本クリームは、優れた保湿性を示す上、皮膚の細胞に活力を与えるので、皮膚のみずみずしさを保つ基礎化粧品として有用である。
産業上の利用の可能性
以上説明したように、この発明は、ローヤルゼリーとトレハロースを含んでなる細胞賦活剤が、ヒトを含む哺乳類に対して、生ローヤルゼリー本来の顕著な細胞賦活作用を示す上に該作用の保存安定性に優れているという全く独自の知見に基づくものである。当該細胞賦活剤は、重篤な副作用の懸念がない上、トレハロースの共存によりまろやかな甘味を呈するので、ヒトを含む哺乳類が簡便かつ快適に、健康の維持・増進のために利用することができる。また、以上のような特長を有するこの発明の細胞賦活剤は、他の成分と配合することにより、食品、飲料、化粧品など各種組成物として利用することも有利に実施できる。
この発明は、斯くも顕著な作用効果を奏する発明であり、斯界に貢献すること誠に多大な意義のある発明である。