(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
添加した可溶性の化学種を不溶性の析出物へ変換することを触媒する、触媒活性部分を含むタグが、標的生体分子に直接的または間接的に付けられている、複数の生体分子を含んだサンプルにおける標的生体分子の検出方法であって、以下の手順からなる検出方法：
ａ）固体担体の表面上に、少なくとも一つの部位が導電性であり、その部位に、プローブ生体分子が付着している複数の別個の柔軟なナノ電極が連結している、複数の空間的に異なる部位を定め、
ｂ）サンプルを、前記プローブ生体分子を含む固体担体と接触させることによって、プローブ生体分子と標的生体分子との間で認識複合体を形成させ、
ｃ）可溶性の化学種を添加し、
ｄ）その可溶性の化学種を、ナノ電極上に、または該電極のところに堆積物を形成する不溶性の析出物に変換することによって、ナノ電極の柔軟性を減退させ、
ｅ）少なくとも一つの部位において、複数のナノ電極の導電性を測定する。
【請求項２】
手順ｅ）で得られた導電性についての数値を、手順ｅ）の前に得られた数値と比較することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
導電性の変化の測定を、電流測定、微分パルスボルタンメトリー及びクロノアンペロメトリー、インピーダンス分光分析からなるグループから選択された方法で行うことを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
触媒活性部分が生体触媒であることを特徴とする、請求項１から３のいずれか一つに記載の方法。
【請求項５】
生体触媒が酵素であることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
酵素が、オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、還元酵素、脱水素酵素、およびホスファターゼからなるグループから選択されたものであることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
タグが更にビオチン／アビジンまたはビオチン／ストレプトアビジン複合体を有していることを特徴とする、請求項１から６のいずれか一つに記載の方法。
【請求項８】
一つの単一のプローブ生体分子を、各ナノ電極に付着させることを特徴とする、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
二つ以上の同じか互いに異なるプローブ生体分子を、各ナノ電極に付着させることを特徴とする、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１０】
プローブ生体分子が、オリゴヌクレオチド、ポリペプチド、タンパク質、抗原、抗体、酵素、受容体及び炭水化物からなるグループの中から選択されるものであることを特徴とする、請求項１から９のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１１】
プローブ生体分子及び／またはナノ電極の一部もしくは全部が、更に電子供与基を含んでいることを特徴とする、請求項１から１０のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１２】
電子供与基が遷移金属複合体を含むことを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
固体担体が、導電性であるか、または導電性の層に堆積した絶縁体であることを特徴とする、請求項１から１２のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１４】
標的生体分子が、プローブ分子に部分的に相補的なセグメントを含むオリゴヌクレオチドであることを特徴とする、請求項１から１３のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１５】
タグが更に第一の検出対象化学種を含むことを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
第一の検出対象化学種がオリゴヌクレオチドであることを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
オリゴヌクレオチドが、標的生体分子に部分的に相補的なセグメントを含むことを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
可溶性の検出対象化学種が、５−ブロモ−４−クロロ−３−フォスフェート−１Ｈ−インドール（ＢＣＩＰ）、ニトロブルーテトラゾリウムクロライド（ＮＢＴ）、ジメチルベンジジン、ジアミノベンジジン、４−クロロ−ナフトール、３−アミノ−３−エチル−カルバゾール及びテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）からなるグループの中から選択されたものであることであることを特徴とする、請求項１から１７のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１９】
固体担体およびプローブ分子からなるバイオチップであって、該固体担体には、複数の柔軟な棒状のナノ電極が特定の電導性の部位に付着しており、該ナノ電極は、各部位で同一でも異なっていてもよく、前記プローブ分子は、同一でも異なっていてもよく、前記ナノ電極の全てまたは複数に結合しており、該プローブ分子のセグメントは、標的生体分子のセグメントと特異的に相互作用することが可能である、バイオチップ。
【請求項２０】
プローブ分子が、オリゴヌクレオチド、ペプチド、タンパク質、抗原、抗体、酵素、受容体、炭水化物、ホルモン受容体、脂質からなるグループの中から選択されることを特徴とする、請求項１９に記載のバイオチップ。
【請求項２１】
前記プローブ分子がオリゴヌクレオチドであることを特徴とする、請求項２０に記載のバイオチップ。
【請求項２２】
標的生体分子が、様々な病原微生物の核酸配列であることを特徴とする、請求項２１に記載のバイオチップ。
【請求項２３】
前記核酸配列が、様々な遺伝病に関連する核酸配列であることを特徴とする、請求項２２に記載のバイオチップ。
【請求項２４】
前記核酸配列が、様々な組織の核酸配列であることを特徴とする、請求項２３に記載のバイオチップ。
【請求項２５】
前記核酸配列が、様々な個体の核酸配列であることを特徴とする、請求項２４に記載のバイオチップ。
【請求項２６】
複数の生体分子を含むサンプルにおける標的生体分子を検出するための、さらに以下のものを含むキット：
ａ）柔軟な棒状のナノ電極で部分的に官能化し、そこにプローブ分子を付着させた担体と、
ｂ）不溶性の析出物に変換可能な可溶性の化学種。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
本発明は、複数の生体分子を含んだサンプルにおける標的生体分子の検出方法と、このような生体分子の検出システムに関するものである。
【０００２】
伝染性の病気、遺伝子スクリーニングやガンのスクリーニングのための、例えば病原体の遺伝物質や核酸配列の生体分子の検出は、近年の生化学及び医学の研究において重要性を増してきている。
【０００３】
例えば、核酸に基づくプローブを用いる方法は、ＮａｋａｍｕｒａとＢｕｌｕｎｄ（Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，６，７３−８３，１９９２）が説く、従来の微生物学的または免疫学的な生物の検出方法に優る幾つかの利点を提供する。
【０００４】
従来の技術において既知の方法の多くは、核酸プローブのハイブリダイゼーションの後、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写に基づく増幅、サイクリングプローブ反応等のような様々な増幅方法の後に生成されるシグナルを検出することに依るものである。
【０００５】
プローブ分析やハイブリダイゼーション分析の多くは、標的となる核酸分子をサンプルから捕捉することができるよう、オリゴヌクレオチドプローブを表面に付着させることに基づいている。プローブを表面へ付着させることは、共有結合の形成、または、様々な受動的吸着メカニズムによって成し遂げられる。固定されたプローブは、標的分子、例えば溶液中の核酸配列と、特異的に相互作用することができる。相互作用と、それに続くハイブリダイゼーションは、様々な方法を介して標的の検出を可能にする。
【０００６】
米国特許第６３５５４２９号明細書は、サンプル中の第一の核酸の存在を検出するための光学装置を開示しており、該サンプルは、第一の核酸に相補的で、ハイブリダイゼーション条件下で第一の核酸とハイブリダイズすることが可能な、第二の核酸を含み、該第二の核酸は固体担体に固定されており、該固体担体は、前記サンプルと標的核酸とのハイブリダイゼーションにより光反射特性が変化するような光反射表面で形成されており、該特性が、サンプル中の前記標的核酸の存在を検出するための方法として用いられる。前記表面の光学的特性の変化における最後の分析手順は、酵素に依存する反応によって表面に巨大分子が堆積する、酵素基質の析出によって成し遂げられる。析出の結果は、光学的測定方法によって検出することができる、金色から紫色へと目に見える色の変化として生じる。
【０００７】
米国特許第６０９６８２５号明細書には、第一の生物学的分子に連結可能な、導電性及び電気活性を有するように官能化された共役ポリピロールポリマーフィルムの活用が開示されている。これらのポリピロールフィルムは導電性であり、平面電極を形成する。このように付着した第一の生物学的分子は、特異的に前記第一の生物学的分子と相互作用を行うことが可能で、それにより「ポリマー電極」の全体的な導電性を変える、第二の生物学的分子の検出および／または抽出のための分析に用いることができる。その方法の主な欠点は、基準となるポリマーに対する電気化学的反応の変化が、このようなバイオチップの全体的な感度が相当に減退するような規模で起こらなくてはならないという点である。これらのバイオチップの感度は、１０11分子／ｍｌを超える程度に制限される。
【０００８】
国際公開第０２／２０８３８号パンフレットは、核酸の混合物を含んだサンプル中の核酸配列を検出するための方法並びにシステムを開示している。複数の金属電極を有する表面において、標的核酸のセグメントに相補的なオリゴヌクレオチドを含むプローブが金属電極に付着しており、次に、オリゴヌクレオチドが結合している表面にサンプルが接触することによって、プローブが標的核酸に結合することが可能になり、その後、結合した標的核酸と四種のヌクレオチド、及び複製触媒のインキュベーションを行い、少なくとも一種のヌクレオチドが標識と結合している、複数の鎖を有する核酸の集合体を形成し、そして複数の鎖を有する核酸の集合体にある標識を検出し、それにより標的核酸を間接的に検出することができる。検出は、酸化還元対の働きをし、また導電性が減退した金属電極上において析出する、基質に対する酵素の作用を介して行われる。
【０００９】
この方法の主な欠点は、結合した標的核酸と四種のヌクレオチド、及び複製触媒のインキュベーションが、検出手順を不必要に複雑なものにしてしまうという点にある。更にその方法が核酸にしか用いることができないことから、幾つもの不都合が生じる。核酸とは異なるバイオポリマー、例えばタンパク質、ペプチド、抗体などは、この方法では使用することができない。更に、国際公開第０２／２０８３８号パンフレットの金属電極は、平坦な「二次元」電極である。
【特許文献１】米国特許第６３５５４２９号明細書
【特許文献２】米国特許第６０９６８２５号明細書
【特許文献３】国際公開第０２／２０８３８号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
それゆえ、本発明の目的は、サンプル中の生体分子の最適な検出を行うために、高感度の、そして信頼性および柔軟性のある方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
添加した可溶性の化学種を不溶性の析出物へ変換する反応を触媒する触媒活性部分を含んだタグを標的生体分子に付ける、複数の生体分子を含んだサンプル中の標的生体分子の検出方法によって、課題は解決されるが、前記方法は以下の手順から成るものである：
ａ）固体担体の表面上に、少なくとも一つの部位が導電性であり、前記部位に、プローブ生体分子が付着している複数の別個の柔軟なナノ電極が連結している、複数の空間的に異なる部位を定め、
ｂ）サンプルを、前記プローブ生体分子を含む固体担体と接触させることによって、プローブ生体分子と標的生体分子との間で認識複合体を形成させ、
ｃ）本質的に可溶性の化学種を添加し、
ｄ）その可溶性の化学種を、原則的にナノ電極上に、または該電極のところに堆積物を形成する不溶性の析出物に変換することによって、ナノ電極の柔軟性を減退させ、
ｅ）少なくとも一つの部位において、複数のナノ電極の導電性を測定する。
【００１２】
「柔軟なナノ電極」という用語は、本発明に関連して用いる範囲では、ナノ電極自体が柔軟であること、つまりは、剛直でなく、部位に固定した後も一定の可動性を持つということである。ナノ電極は、例えば別個のフィラメントであるときが最も良いものとすることができる。ナノ電極の長さは、３から５００ｎｍのナノメーターの範囲である。好ましくは、ナノ電極は分子集合体からなるものである。
【００１３】
析出物は、電気的に絶縁されているものでもよいし、または、導電性であってもよい。好ましくは、原則的に電気的に絶縁されている析出物である。析出物の基本的な機能の一つは、ナノ電極の電導性に影響を与えるナノ電極の柔軟性／可動性を阻害することである。
【００１４】
ナノ電極を形成する分子集合体は、好ましくは、置換された、または置換されていない、ポリピロール、ポリチオフェン、ポリテトラヒドロフラン、ポリアニリン等、及びそれらのコポリマーのような導電性のポリマー鎖から成るものである。更には、電子供与部分（ＥＤＭ）を一つまたは複数、そこに付着させる。ＥＤＭは、好ましくは、様々なσ供与配位子及びπ供与配位子を有する遷移金属複合体、例えば、Ｆｅ、Ｒｕ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｐｔ、Ｐｄ、Ｃｎなどの遷移金属複合体であり、このような配位子の例としては、これらに限定されるものではないが、フェナントロリン、フタロシアニン、ポルフィリン、ポルフィリノーゲン、カリックスアレーン、ビピリジンから、更には、シクロペンタジエン、ベンゼンピリジン及び類似のπ供与配位子のような、窒素、硫黄及び酸素の供与配位子が例として挙げられる。好ましくはサンドイッチ構造の複合体、更に好ましくは、フェロセン、ルテノセン、ニッケロセンなどのメタロセンである。ＥＤＭの電気的応答は、ポリマーの応答よりも精確であり、堆積物によって強い影響を受けて変調される。
【００１５】
各ポリマー鎖は、それ自身で「ナノ電極」を構成している。ポリマー鎖の導電性は、それらの柔軟性／可動性と相関関係をもつ。ポリマー鎖の長さは、２０から３００ｎｍの範囲で変化するものであり、好ましくは３０から２００ｎｍであり、最も好ましくは９０から１８０ｎｍである。驚くべきことに、本発明による方法によって、ナノ電極の柔軟性及び可動性と導電性との間の相関関係を明らかにすることができる。この相関関係、すなわち導電性の変化は、以下に説明する様々な電気測定方法で利用しやすい。このように、不溶性の析出物が堆積することによってナノ電極の導電性に変化が生じ、それにより、プローブ生体分子と標的生体分子との間に認識複合体が形成されたことが示される。
【００１６】
本発明による方法により、１０8分子／ｍｌ未満の分子の感度で標的生体分子を検出することが可能になる。手順ａ）とｂ）（つまり、ポリマー鎖の合成、その上の特定の部位への生体分子の付着）を同時に行う実施例もある。しかしながら言うまでもなく、ポリマー鎖の合成と生体分子の付着を、違う時期に行うこと、つまり、生体分子を合成し、続いてナノ電極に固定することは可能である。
【００１７】
不溶性の、原則的に電気と絶縁している析出物がナノ電極上に堆積する前と後に電導性を測定するのには、二つの異なる方法がある。
【００１８】
第一の方法は、「速度測定」とも呼ばれるものであり、原則的に不溶性の可溶性の化学種を添加する前、つまり触媒反応が起こる前に、そして不溶性の析出物が堆積した後に、導電性を測定するものである。測定は継続的な時間間隔で行われるが、その間隔は、同一または異なった間隔時間であり、時間の経過と共に進む反応を追いつつ、原則的に不溶性の化学種の添加を始めた時から析出が完了するまでである。それゆえ、析出前と後の導電性の差が測定される。
【００１９】
第二の方法は、通常は平坦で円形のまたは長方形の金属層からなる、例えば金製の「陰性の」参照電極を用いる方法である。金属層は通常、部位（または「スポット」）のアレイの一部であり、通常は、それら全てが、ナノ電極が付着している一つまた複数の金属層から成っている。この「裸の」参照電極の導電性を、ナノ電極上に析出物が堆積した後に、ナノ電極を有するスポットの導電性と比較する。言うまでもなく、参照電極を一つ以上存在させることができる。
【００２０】
本発明のもう一つの具体的な実施態様においては、析出物は着色されている。それゆえ、着色された析出物は、さらに比色分析やＵＶ／ＶＩＳ吸光分光分析などの光学的手段によって検出することができ、このことにより、電気的測定のみに頼るよりも、例えばハイブリダイゼーションや相互作用の事象についての、更なる情報を得ることができる。
【００２１】
不溶性で、好ましくは電気的に絶縁されている析出物は、柔軟性のあるナノ電極の自由な可動性を阻害することにより、ナノ電極と静電気的に相互に作用する。ナノ電極の立体構造は、この場合「凍結」していると考えられる。この相互作用の結果、ナノ電極鎖の柔軟性が減じる。ナノ電極の柔軟性の減退は、ナノ電極の導電性がそれに対応して低下するということと相関関係があり、この電導性の低下は、当業者には基本的に既知の技法により測定が可能である。
【００２２】
好ましくは、ナノ電極の導電性の変化の検出は、電流測定、微分パルスボルタンメトリー、インピーダンス分光分析及びクロノアンペロメトリーのグループから選択された方法で行われる。とくに好ましいのは、安価で操作の簡単な機器を用いることが可能なサイクリックボルタンメトリーである。一般的に、適切な測定方法の選択は、希望する用途と感度によって左右される。
【００２３】
例えばサイクリックボルタンメトリーとクロノアンペロメトリーは、小型で安価なシステムを複合させた設備および容易な取扱いが必要な場合に好まれる。サイクリックボルタンメトリーは、ナノ電極が電子供与化学種を含んだポリマー鎖である場合に好まれる。電子供与化学種は、ポリマー鎖の不可分な部分であってもよく、または、そこに付着させたものであってもよい。インピーダンス分光分析は、極めて感度の高い方法が必要とされる場合に選択されることになる。
【００２４】
インピーダンス分光分析により、調査対象のシステムの導電性についての情報が得られる。サイクリックボルタンメトリーもしくはボルタンメトリーは一般的に、関連する電気化学的反応の検査をする。
【００２５】
例えば原則的にポリマー鎖からなるナノ電極の導電性に影響を与えることによって、検査対象のシステムがその導電性を変化させた場合は、インピーダンス分光分析が好まれる。
【００２６】
特に好ましくは、触媒活性部分は生体触媒である。好ましくは、生体触媒は、それらの化学的性質、構造及び触媒する反応について広範な多様性を有する酵素である。このようにして、それらを、具体的な必要性に合わせて調整し、選択することが可能である。更に、酵素は、消費されることなく、広範かつ多様な生物化学的反応及び化学反応を触媒する。
【００２７】
相応しい酵素の非限定的例としては、例えば、プロテアーゼ、オキシダーゼ、還元酵素及び脱水素酵素がある。好ましいのはペルオキシダーゼである。特に好ましいのは、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、アセチルコリンエステラーゼ及びホースラディッシュペルオキシダーゼである。
【００２８】
更に望ましい実施態様では、タグは更にビオチン／ストレプトアビジンまたはビオチン／アビジン複合体を有している。これは、ビオチン／アビジンまたはビオチン／ストレプトアビジン結合対がかなり詳細に調査されたという事実によるものである（例えばＬｉｖｎａｈ，Ｏ．；Ｂａｙｅｒ，Ｅ．Ａ．；Ｗｉｌｃｈｅｋ，Ｍ．；Ｓｕｓｓｍａｎ，Ｊ．Ｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９９３，９０，５０７６−５０８０参照）。結合相互作用の強度は、主にエンタルピーによるのものである。ビオチンは、オリゴヌクレオチドやペプチドなどの生体分子の中に容易に導入される。酵素もまた、アビジンまたはストレプトアビジンのペプチド骨格に容易に結合することができる。そこで、結合力の強いビオチン／アビジン対またはビオチン／ストレプトアビジン対が、酵素を標的生体分子に直接導入するよりも便利な方法で形成される。標的生体分子に直接導入する方法は、多くの場合、面倒であり、収率も悪く、広範で多様な酵素から選択することもできない。本発明による方がより良く達成できる。
【００２９】
本発明の更に好ましい実施態様においては、一つの単一のプローブ生体分子を、各ナノ電極に付着させる。これにより、ナノ電極の更なる柔軟性を得ることができる。検出対象化学種の析出により、ナノ電極の性質、更に具体的には使用するポリマーの性質に依存するナノ電極の柔軟性が、相当に減退する。このことは、ポリマー鎖全体が固定してしまうことにもなりかねない。それゆえ、柔軟性が相当に低下するということは、それに応じて、それらの導電性が急激に低下することである。このような低下は検出が容易であり、更に感度を高め、より精確な測定が可能になる。
【００３０】
もう一つの好ましい実施態様では、少なくとも二つのプローブ生体分子を各ナノ電極に付着させる。プローブ生体分子は、互いに同じでも異なっていてもよい。言うまでもなく、複数の、つまり二つより多い、同じまたは異なるプローブ生体分子も、一つのナノ電極に付着させる。更にもう一つの実施態様においては、複数のプローブ生体分子を付着させる。より多くのプローブ生体分子を各ナノ電極に付着させる程、より多くの析出物が形成される。複数のプローブ生体分子を備えたナノ電極の柔軟性が低下することにより減少の程度が低下すれば、その埋め合わせに、検出可能な析出物が増大し、それにより感度が高められる。
【００３１】
「生体分子」という用語は、本文中において、オリゴヌクレオチド、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、炭水化物、抗体等のような、ポリマーの形をした何らかの生物学的分子のことを意味する。「ヌクレオシド」という用語は、本文中において、デオキシリボヌクレオシドとリボヌクレオシドの両方を含む。「オリゴヌクレオチド」という用語は、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドの単位を有するオリゴヌクレオチドを示す。したがって、この用語は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡ、ＰＮＡ及びそれらのキメラを含む。本発明との関連で、特に好ましい生体分子は、オリゴヌクレオチド、ポリペプチド及び炭水化物である。
【００３２】
プローブ生体分子は、好ましくは更に電子供与部分（ＥＤＭ）を含んでいる。ＥＤＭが存在することにより、導電性のポリマーの電気活性が強化される。本発明の特に好ましい実施例において、ＥＤＭは、置換した、または置換していない、フェロセン、ルテノセン、ニッケロセン、コバルトセンなどの、遷移金属のサンドイッチ複合体を含んでいる。これらの複合体は、合成しやすく、プローブ生体分子への固定を容易にする官能化も容易である。
【００３３】
更にもう一つの好ましい実施例では、ナノ電極、つまり、通常はポリマーまたはコポリマー鎖は、電子供与部分（ＥＤＭ）を含んでいる。ＥＤＭは、ＥＤＭが例えば二官能性のもの、つまり二つの官能基からなるものなら、ポリマー鎖（バックボーン）の一部、つまり鎖の中に「鎖の構成要素」として組み込まれたものであり、あるいはＥＤＭが一官能性のもの、つまり一つの官能基からなるものであれば、そこに付着したものである。
【００３４】
更に好ましくは、固体担体は導電性のものである。もう一つの実施例においては、担体は電気的に絶縁された層からなり、または、例えば導電性の層で少なくとも部分的に被覆されたプラスチック材料のような電気的に絶縁した材料によって、原則的に構成される。担体は、もう一つの実施例においては、それぞれの場合において好ましくは電気的制御装置との電気的接続を行うことが可能であれば、電気的に絶縁された層からなる半導体材料を含むものである。好ましくは、その電気的接続は、空間的に異なる位置、または担体の表面にスポットの所謂「アレイ」をなしている「平坦な」二次元の金属電極（「スポット」）を介して行われる。
【００３５】
本発明の特に好ましい実施例において、標的生体分子はオリゴヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）であり、同様にオリゴヌクレオチドであるプローブ分子に部分的にまたは完全に相補的なセグメントを含む。プローブオリゴヌクレオチドは、天然ヌクレオチドに類似した、自動的合成装置で作ることが可能なアルファヌクレオチドを含んでいてもよい。標的とするオリゴヌクレオチドは、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドまたはＲＮＡ（リボソームＲＮＡまたはメッセンジャーＲＮＡ）であってもよい。もちろん、二本鎖またはハイブリダイゼーションオリゴヌクレオチドの場合には、周知のサンドイッチハイブリダイゼーション法を用いて本発明による検出方法を行う前に、変性させておくべきである。
【００３６】
特定の好ましい実施例においては、タグは更に、特にオリゴヌクレオチド配列である第一の検出対象化学種を含んでいる。更に好ましくは、オリゴヌクレオチドは標的生体分子に部分的に相補的なセグメントを含んでいる。それゆえ、従来の、または便利な技法でタグを付けることのできない標的分子を、間接的にタグ付けすることができる。
【００３７】
特に好ましいのは、可溶性の検出対象化学種が、５−ブロモ−４−クロロ−３−フォスフェート−１Ｈ−インドール（ＢＣＩＰ）、ニトロブルーテトラゾリウムクロライド（ＮＢＴ）、ジメチルベンジジン、ジアミノベンジジン、４−クロロ−ナフトール、３−アミノ−３−エチル−カルバゾール及びテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）からなるグループの中から選択されたものであることである。最も好ましいのは、ＮＢＴが発色の増幅剤として作用する、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ混合物であることである。よって、ＢＣＩＰ／ＮＢＴを使用することによって、析出物を電気化学的に及び／または光学的に測定することが可能になる。
【００３８】
本発明の根本的な課題は更にバイオチップにより解決されるが、該バイオチップは、複数の空間的に異なる部位に複数の柔軟な棒状のナノ電極を有する固体担体、および前記ナノ電極の全てまたは複数に結合した同一でも異なっていてもよいプローブ分子から成り、前記プローブ分子のセグメントは、標的生体分子のセグメントと特異的に相互作用することが可能である。
【００３９】
本発明のバイオチップは、複数の単一の「ナノ電極」を提供するものであり、各「ナノ電極」または所定の数の「ナノ電極」は、一つ、二つまたは複数のプローブ生体分子を有している。好ましくは、プローブ生体分子は、オリゴヌクレオチド、ペプチド、タンパク質、炭水化物、ホルモン受容体、脂質の中から選択される。特に好ましいのはのは、オリゴヌクレオチドである。
【００４０】
本発明のバイオチップは、好ましくは、様々な病原微生物の核酸配列、様々な遺伝病に関する核酸配列、または様々な組織の核酸配列の検出に用いられる。
【００４１】
本発明は更に、複数の生体分子からなるサンプル中の標的生体分子を検出するためのキットに関するものであり、以下を含むものである：
ａ）複数の個々のナノ電極によって様々な部位において部分的に官能化し、そこにプローブ分子を付着させた担体と、
ｂ）検出対象化学種。
【００４２】
「検出対象化学種」という用語は、本発明との関連では、上述したような、不溶性の析出物に変換可能な、添加した、原則的に可溶性の化学種と同義である。
【００４３】
定義と略称
本発明を更に明らかにするため、本文中で用いる用語と定義を以下に説明する。
【００４４】
本文において用いられている「検出する」または「検出」という用語は、サンプル中の標的分子の、電気的または光学的な測定方法による質的及び量的な測定及び識別ということである。
【００４５】
「生体分子」という用語は、自然界に存在する何らかの分子または自然界に存在する原型に従って人工的に合成された何らかの分子を指すものであり、該生体分子は、例えば、抗体、タンパク質、ペプチド、核酸配列、即ちポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを含み、該ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、少なくとも二つのデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを含み、必要に応じて、例えば、修飾された塩基、ホルモン受容体、脂質、抗原を含むヌクレオチドのような、少なくとも一つの修飾されたヌクレオチドを含む。
【００４６】
本文中において用いられる「ペプチド」という用語は、とりわけ、抽出し、分離し、または実質的に単離または合成した、少なくとも二つのアミノ酸のあらゆるペプチド、とりわけ、タンパク質、タンパク質断片またはオリゴペプチドのことであり、とりわけ、遺伝子組換え生物における化学合成または発現によって得られたものである。
【００４７】
「担体」という用語は、サンプルとは化学的または物理的な相互作用をしない、あらゆる固体の三次元の物体を示すものである。担体は、導電性であっても、または導電性でなくともよい。
【００４８】
本文中において用いられる「相互に作用する」という用語は、（共有結合またはイオン結合の）化学結合の形成、ファンデルワールス相互作用、水素結合相互作用、吸着現象などを含む、分子成分間のあらゆる相互作用を示すものである。
【００４９】
「複合体」という用語は、上記で詳しく述べたような相互作用をする、少なくとも二つの異なる分子成分で形成された一つの統一体を指す。本発明の複合体は、上記で詳しく述べたような相互作用によって繋がっている。
【００５０】
以下に本発明の詳細を、図を参照しつつ、技術的な説明も加えて説明していく。言うまでもなく、以下の例は説明を目的とするものに過ぎず、本発明の範囲を限定する趣旨のものではない。
【００５１】
図１は、本発明の方法の実施例の一つを示している。
【００５２】
図２は、触媒活性化学種によって誘導される反応における検出対象化学種の化学反応のフローチャートを示すものである。
【００５３】
図３は、ポリマー鎖からなるナノ電極にプローブ生体分子を組み込むための本発明の二つの実施例を示すものである。
【００５４】
図４は、窒素で官能化したＰＰｙ／ＰＰｙ−ＯＤＮナノ電極のポリマー鎖の酸化状態がそれぞれの導電性に与える影響を示すものである。
【００５５】
図５は、窒素で官能化したＰＰｙ／ＰＰｙ−ＯＤＮナノ電極のポリマー鎖の長さがそれらの導電性に与える影響を示すものである。
【００５６】
図６は、官能化の位置（Ｎ−官能化と３位での官能化）がポリマー鎖（長さ１８０ｎｍ）からなるナノ電極の導電性に与える影響を示すものである。
【００５７】
図７は、ハイブリダイゼーションと析出の前の、３位で官能化されたコポリマーＰＰｙ−ＯＨ／ＰＰｙ−ＣＰ及びＰＰｙ−ＯＨ／ＰＰｙ−Ｍ５からなるナノ電極のインピーダンス測定の反応の安定性を示すものである。
【００５８】
図８は、（ＣＰ−ｂｉｏでの）ハイブリダイゼーションと析出の後の、３位で官能化されたポリマー鎖からなるポリマーナノ電極であるＰＰｙ−ＯＨ／ＰＰｙ−ＣＰ（曲線１）及びＰＰｙ−ＯＨ／ＰＰｙ−Ｍ５（曲線２）の、鎖の長さが１２０ｎｍであるときの、反応曲線の比較を示すものである。
【００５９】
図９は、３位で官能化されたナノ電極であるＰＰｙ−ＯＨ／ＰＰｙ−ＣＰ及びＰＰｙ−ＯＨ／ＰＰｙ−Ｍ５（鎖の長さ１２０ｎｍ；〔標的〕＝１ｎＭ）のインピーダンスモジュールの比率を示すものである。
【００６０】
図１０は、インピーダンス分光分析の検出感度を、標的分子の濃度の関数で示すものである。
【００６１】
図１１は、ＣＰ−ｂｉｏでのハイブリダイゼーションとＢＣＩＰ／ＮＢＴの析出後の、３位で官能化されたナノ電極であるＰＰｙ−ＯＨ／ＰＰｙ−ＣＰ（曲線１）とＰＰｙ−ＯＨ／ＰＰｙ−Ｍ５（曲線２）のボルタンメトリー測定の反応を示すものである（ナノ電極の長さ：５０ｎｍ）。
【００６２】
図１２ａは、ＢＣＩＰ／ＮＢＴがＰＰｙ−ＯＨ／ＰＰｙ−ＣＰに析出する間の、３位で官能化されたナノ電極ＰＰｙ−ＯＨ／ＰＰｙ−Ｍ５を有する陰性のサンプルのインピーダンス分光分析の反応を示す（速度測定）。
【００６３】
図１２ｂは、３位で官能化したコポリマーＰＰｙ−ＯＨ／ＰＰｙ−ＣＰからなるナノ電極の上にＢＣＩＰ／ＮＢＴが析出する間の、インピーダンス分光分析の反応を示すものである（速度測定）。
【００６４】
図１は、（例えば銅、銀、金メッキしたケイ素、銅メッキしたケイ素のような）金属または合金でできた基板１０１を示すものである。基板１０１は複数のナノ電極１０２を有しており、該ナノ電極は、共有結合を介して基板１０１に付着している。ナノ電極は、好ましくは、規則的または不規則に配置され、長さが同一かまたは異なる、別個のポリマー鎖である。好ましい実施態様においては、それらの配置は規則的であり、ナノ電極の長さが基本的に同じである「ブラシ」を形成している。好ましくは、ナノ電極のためのポリマーは、好ましくは２位、３位または１位を介して表面に連結されたポリマーである、ポリピロールである。本発明のもう一つの実施例においては、例えばポリチオフェン、ポリアニリン、ポリテトラヒドロフランやそれらの置換誘導体などの、ポリピロール（及びその置換誘導体）のような、別の導電性のポリマーを用いてもよい。ホモポリマーの単量体構築ブロックは、それぞれの３位または１位を介して結合する。言うまでもなく、上記に述べた様々な単量体構築ブロックのコポリマーも、本発明の範囲に含まれるものである。置換基に関しては、当業者が必要とする導電性に応じて選ぶということは、当然のことである。
【００６５】
更に、ナノ電極には、ポリマー鎖に組み込むか、または付着させるという形で、一つまたはそれ以上の電子供与部分（ＥＤＭ）、好ましくは、上記に具体的に説明した、フェロセン、ニッケロセンなどのようなメタロセンのような遷移金属複合体が含まれる。
【００６６】
本発明の更にもう一つの実施例においては、ポリマー鎖からなるナノ電極は、三つの異なる構成要素、即ち、ａ）３−ヒドロキシピロール、ｂ）３−ヒドロキシピロールに結合させたフェロセン、そしてｃ）３−ヒドロキシピロールに結合させたオリゴヌクレオチド、を共重合することによって得られるものであり、それにより、各ポリマー鎖の中に三つの異なるセグメントが生成される。全てのポリマー鎖が複数あることを考慮すると、セグメントが各ナノ電極において同じ位置、または少なくともほぼ同じ位置にあれば、複数のナノ電極の三つの異なるセグメントがスポット上に三つの「層」をなすものと考えてよい。
【００６７】
リンカー１０４と相補的セグメント１０３を有する、例えばオリゴヌクレオチドのような生体分子１０５は、リンカー１０４を介してポリマー鎖１０２に固定されている。付着は、当業者には基本的に知られている方法により、プローブ生体分子とポリマー鎖との間の化学結合の形成を介して成し遂げられている。
【００６８】
標的生体分子の検出を実施するために、複数のポリマー鎖１０２に固定されたプローブ生体分子１０５を有する基板１０１を、標的分子１０６と接触させる。標的生体分子は、溶液、分散液、乳濁液などの中に含まれている。標的分子１０６をバイオチップと接触させる前に、標的生体分子１０６は、検出対象生体分子１０７と反応するが、ここで、標的生体分子１０６及び検出対象生体分子１０７は、互いに化学的または物理的相互作用を行うことができる相補的な区域を有している。好ましくは、標的生体分子１０６及び検出対象生体分子１０７は、相補配列を有するオリゴヌクレオチドである。検出対象生体分子１０７は更に、好ましくはビオチンであるタグ１０９を有している。ビオチンを検出対象生体分子１０７に結合させるためには、好ましくは、化学的共有結合を用いる。言うまでもなく、もう一つ別の具体例では、検出対象生体分子は用いる必要がない。この場合には、タグは直接、標的となる生体分子に付けられる。
【００６９】
プローブ生体分子１０５と標的分子１０６は、検出対象生体分子１０７とともに、図１ｃに示されたような認識複合体を形成する。認識複合体１ｃを、次にタグ結合部位１１１を含むシグナル生成剤１１０と反応させるが、該生成剤は、例えばアビジンかストレプトアビジンでよい。タグ１１０は更に、生体触媒１１２を含んでおり、該触媒は、例えばアルカリホスファターゼであるが、本発明の目的に適したものであれば、前の章で述べた他のどのような酵素触媒も代わりに用いることができる。
【００７０】
ビオチン１０９とストレプトアビジン１１１は、ビオチン−ストレプトアビジン複合体を形成し、その結果、触媒活性化学種１１２が認識複合体に付着する。
【００７１】
ＢＣＩＰ／ＮＢＴのその後の反応により、ＢＣＩＰの酸化と、ＮＢＴの還元がなされる。酸化ＢＣＩＰ／ＮＢＴは、バイオチップのポリマー鎖１０２の上に析出物１１３として析出する。ポリマー鎖は、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ１１３が析出した後では、立体構造が固定しており（「凍結」）、動きを封じられている。固定されていることにより、それらの導電性が変化し、それは、上記に述べた導電度測定によって検出することが可能である。
【００７２】
もう一つ他の実施例においては、様々な組み合わせの酵素及びシグナル生成剤が使用されている。これらの組み合わせは、例えば、４−クロロ−ナフタレン、アルカリホスファターゼ及びインドイルホスフェートの誘導体、グルコースオキシダーゼ及びテトラゾリウム塩に加えて、ホースラディッシュペルオキシダーゼを含むが、これらに限定されるわけではない。
【００７３】
ポリマー鎖１０２の電導性の変化は、インピーダンス分光分析、サイクリックボルタンメトリー等により測定される。
【００７４】
図２は、アルカリホスファターゼの影響下での、検出対象化学種ＢＣＩＰ／ＮＢＴの酸化還元反応を示している。酸化及び酸のプロトンの付加の後、５３０ｎｍで強い吸光を示す、着色した四量体の生成物ＮＢＴが得られる。ＮＢＴは、ポリマー鎖１０２上に析出し、それはまた、比色分析またはＵＶ／ＶＩＳ測定を介して検出される。
【００７５】
図３は、オリゴヌクレオチドプローブ生体分子を、ピロール単位からなるポリマー鎖で構成されるナノ電極上に付着させる手法に関する二つの実施例を示している。
【００７６】
図３ａは、基板Ｓを示している。例えば金メッキされたケイ素を含む基板である基板Sに付着しているのは、３位で連結したポリピロール鎖である。更に、フェロセン部分は、それに相応しいリンカーを介してポリマーに付着する。フェロセンの一つのｃｐ部分はアシル置換基を有しており、該置換基は、オリゴヌクレオチドプローブ分子をそこに付着させられるように改変されることが可能である。しかしながら、アシルの他にも、それに相応しい置換基があれば、本発明の範囲内で用いることができる。文字ｎ及びｌは１から４までの整数である。図３ａに示したように、一つの単一のプローブ生体分子は、各単量体構築ブロック、即ち、ポリマー鎖の各ピロール単位に付着させられる。
【００７７】
図３ｂは、オリゴヌクレオチドプローブ生体分子を、３位で連結したポリピロール鎖に付着させるための、もう一つの実施例を示している。図３ｂに示されているように、各ポリマー鎖には、一つのオリゴヌクレオチドプローブ生体分子のみが付着している。
【００７８】
図４は、窒素の部位で官能化されたナノ電極を経由する電荷移動の抵抗（Ｒt）の推移を、ナノ電極に印加した電位の関数として示している。この抵抗は、印加した電位が正値の方向に増大していくと低下する。これは、ポリマーの酸化が進むほど、導電性が増すということを示している。電位が＋０．５Ｖであれば、抵抗Ｒtは、０Ｖの電位を印加した場合と比べると、八倍低下する。したがって一つの態様においては、導電性の、または半導体のポリマーナノ電極が、固体担体上でオリゴヌクレオチドを固定するための基盤を形成し、また、他の態様においては、真性導電性が変調可能な場合にはトランスデューサを形成する。
【００７９】
図５は、（ポリマーがその窒素部位で官能化している）ポリマーナノ電極ＰＰｙ／ＰＰｙ−ＯＤＮの長さが電導性に与える影響を、（インピーダンスの虚数部をそれらの実数部の関数として）ナイキスト線図で示している。曲線１は、長さ８０ｎｍのナノ電極における測定であり、曲線２は、長さ１６０ｎｍのナノ電極で行われた測定を示している。図５に示されているように、ナノ電極の長さが１６０ｎｍであるときには、８０ｎｍのときに対して、導電性は十倍高くなる。それゆえ、ナノ電極が長い程（約２００ｎｍまで）、それらの導電性が増す。長さが増えると、イオン伝導率も増す。しかしながら、ある長さ（約２００ｎｍ）から、導電性は低下し、これが、導電性を増大させる上での限界因子となる。それゆえ、ポリマーナノ電極の長さを変えることで、導電性の形態を決定することが可能となる。
【００８０】
図６は、窒素で官能化されたコポリマーナノ電極と、３位で官能化されたコポリマーナノ電極との違いを、ナイキスト線図で示したものである。曲線１は、Ｎ位で官能化したコポリマーを示し、曲線２は３位で官能化したコポリマーを示す。導電性は、オリゴヌクレオチの３位で官能化すると、窒素での官能化に比べ、六倍高い。それゆえ、より導電性の優れたトランスデューサを用いることが好ましい場合には、オリゴヌクレオチドを３位でピロール単量体上に固定することが特に好ましい。
【００８１】
図７は、ハイブリダイゼーション及び析出の前の、３位で官能化されたコポリマーナノ電極ＰＰｙ−ＯＨ／ＰＰｙ−ＣＰ及びＰＰｙ−ＯＨ／ＰＰｙ−Ｍ５のインピーダンス応答の安定性を示している（インピーダンスモジュールを周波数の関数として示すボード線図）。
【００８２】
図８は、〔標的〕＝１ｎＭの標的濃度で、標的が析出した、および析出していない、３位で官能化したコポリマーＰＰｙ−ＯＨ／ＰＰｙ−ＣＰ及びＰＰｙ−ＯＨ／ＰＰｙ−Ｍ５からなる、長さが１２０ｎｍのナノ電極の、ボード線図を示したものである。曲線は、そのインピーダンスモジュールＺに関する、Ｈｚで表した周波数の関数である。曲線１は、析出のあるインピーダンス応答であり、曲線２は、析出のないインピーダンス応答を示している。図８にみられるように、低周波数（１から１００Ｈｚ）において、析出の有無で応答の違いは明らかである。モジュールＺは、析出がある場合、約二倍高い。図８は、基板との関連において、この方法の感受性が高いことを明示している。それゆえ、陽性のスポット（この例ではＣＰ）と陰性のスポット（Ｍ５）との間で、インピーダンス技法によって、明確に区別することが可能である。
【００８３】
図９は、３位で官能化した、長さが１２０ｎｍのポリマーナノ電極ＰＰｙ−ＯＨ／ＰＰｙ−ＣＰ及びＰＰｙ−ＯＨ／ＰＰｙ−Ｍ５のインピーダンスモジュールの比率を示したものである。標的分子の濃度は０．１ｎＭであった。これらのモジュール間の比率は、長さが１２０ｎｍのナノ電極について、１Ｈｚの周波数では、二の範囲内である。また、図９の例からも明らかなように、周波数が検出感度に影響する。
【００８４】
図１０は、標的分子の濃度の関数としてインピーダンス測定の感度を示している。濃度（ｌｏｇμＭ）は、３位で官能化されたナノ電極ＰＰｙ−ＯＨ／ＰＰｙ−ＣＰ及びＰＰｙ−ＯＨ／ＰＰｙ−Ｍ５のインピーダンスモジュールの比率の関数である。０．１μＭの標的濃度で濃度を測定すると、インピーダンスモジュールの比率は８であり、標的分子の濃度が１ｎＭでは、インピーダンスモジュールの比率は２である。
【００８５】
結論：１ｎＭの標的オリゴヌクレオチドの濃度では、周波数１Ｈｚでのインピーダンスモジュールの比率は２である。それゆえ、この技法により、ＣＰ及びＭ５のモジュールの比率の係数１で得られる検出限界に近づく前に、標的オリゴヌクレオチドの濃度を１０3の範囲で減少させることができる。
【００８６】
図１１は二つの電圧電流図を示しており、それらは、ハイブリダイゼーション及び析出の後の、３位で官能化されたコポリマーＰＰｙ−ＯＨ／ＰＰｙ−ＣＰからなるナノ電極に関するものであり、また他方では、３位で官能化されたコポリマーＰＰｙ−ＯＨ／ＰＰｙ−Ｍ５からなる陰性対照のナノ電極に関するものである。標的ＣＰ−ｂｉｏの濃度は１ｎＭであった。ナノ電極ＰＰｙ−ＯＨ／ＰＰｙ−ＣＰ（３）の応答の酸化ピークの強度の測定値は、析出物のないナノ電極ＰＰｙ−ＯＨ／ＰＰｙ−Ｍ５のそれよりも弱い。ＣＰナノ電極とＭ５ナノ電極の酸化ピークの強度の比率は、電位が−５０ｍＶのとき、約１．６である。同じことが、約−１８０ｍＶのときの還元ピークについてもいえる。それゆえ、この電気化学的技法により、陽性のナノ電極（ＣＰ）と陰性のナノ電極（Ｍ５）との間を区別することも可能である。
【００８７】
図１２は、基板のバッファにおけるインピーダンスの測定結果を示している。これは、反応時間中の析出反応の評価を追うことを可能にしている。ハイブリダイゼーションの起きていないコポリマーＰＰｙ−ＯＨ／ＰＰｙ−Ｍ５（３）からなるナノ電極においては、インピーダンスモジュールを周波数の関数として示すボード線図は、反応時間に関して、僅かにしか増加しない。それゆえ、ポリマーナノ電極の導電性は変化を受けない。
【００８８】
図１２ｂは、３位で官能化されたコポリマーＰＰｙ−ＯＨ／ＰＰｙ−ＣＰのポリマーナノ電極でＢＣＩＰ／ＮＢＴが析出している間の、導電性の変化をボード線図で示している。図１２ｂの曲線グラフは、ｋＨｚ表示のインピーダンスモジュールに対するＨｚ表示の周波数の関数である。標的分子の濃度は１ｎＭ（ＣＰ−ｂｉｏ）であり、ナノ電極の長さは１８０ｎｍであった。
【００８９】
ハイブリダイゼーションが起きた、３位で官能化されたコポリマーナノ電極ＰＰｙ−ＯＨ／ＰＰｙ−ＣＰでは、周波数の関数としてのインピーダンスモジュールのものとして得られた曲線は、約４０分の間で増加する。１から１００Ｈｚまでの範囲のすべて周波数について、この反応時間の間、モジュールの値は二倍になる。この増加は、オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションの結果としてナノ電極において形成された析出物の運動性に関係している。
【００９０】
略称及び定義
ＥＣＳ：飽和カロメル電極（参照電極）
ＣＰ：以下の配列を有する陽性対照のオリゴヌクレオチド：
５’ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧＣＣＴＴＧＡＣＧＡＴＡＣＡＧＣＴＡ３’
ＣＰ−ビオチン（ＣＰ−ｂｉｏ）：以下の配列を有するＣＰの相補的ビオチン化オリゴヌクレオチド：
５’ビオチン−ＴＡＧＣＴＧＴＡＴＣＧＴＣＡＡＧＧＣＡ３’
Ｍ５：以下の配列を有する陰性対照のオリゴヌクレオチド：
５’ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧＧＡＧＣＴＧＣＴＧＧＣＧ３’
Ｍ５−ビオチン（Ｍ５−ｂｉｏ）：以下の配列を有するＭ５の相補的ビオチン化オリゴヌクレオチド：
５’ビオチン−ＣＧＣＣＡＧＣＡＧＣＴＣＣＡＡＡ３’
ＯＤＮ：オリゴヌクレオチド
ＴＨ１Ｘ：ＴＨ１Ｘは、以下から成るバッファー溶液である：１３．３ｇ／ｌ未満のＮａ2ＨＰＯ4、２９．２２ｇ／のＮａＣｌ、２０ｇ／ｌのＰＥＧ４０００、６．５％Ｔｗｅｅｎ２０、１ｇ／ｌのゼラチン、超音波処理されたニシンの精子１０ｍｇ／ｍｌの１４％ＤＮＡ。
ＴＲ：ＴＲは、以下から成る洗浄バッファーである：８ｇ／ｌのＮａＣｌ、０．２ｇ／ｌのＫＣｌ、０．７６ｇ／ｌのＮａ2ＨＰＯ4、０．１９ｇ／ｌのＫＨ2ＰＯ4、０．５％ｔｗｅｅｎ２０、１ｍＭのＥＤＴＡ。
ＰＡＬ：アルカリホスファターゼ
ＢＭパープルＡＰ基質：アルカリホスファターゼのための発色基質（Ｒｏｃｈｅアプライ基質）
ＣＶ：サイクリックボルタンメトリー
【００９１】
次の実施例２で用いられる電気化学電池は、白金対極（直径：４ｍｍ）を有する容積１ｍｌのＭｉｃａｍ電池である。全ての設定では３つの電極を有する。実施例３については、電気化学電池は使われていない。電気的に合成した溶液の５０μｌの液滴を、一体化した参照電極と対極を有するバイオチップにアプライする。
【実施例１】
【００９２】
窒素で官能化されたポリピロールを電解重合し、ナノ電極を得る：全てのコポリマーは、２０ｍＭのピロール単量体と５μＭのピロールオリゴヌクレオチド単量体（ＣＰまたはＭ５）とを含む０．１ＭのＬｉＣｌＯ4溶液から、（ＥＣＳ）に対して＋１Ｖの電位を印加して、電気合成する。ポリピロールホモポリマーもまた、２０ｍＭピロール溶液から、ＥＣＳに対して＋１Ｖの電位を印加して、電気合成した。Ｍｉｃａｍ電池を電気化学電池として用いた。主にプラスチック材料から成る各バイオチップ上の、金製の層による金属製の円から成る、円形に配置された９つのスポット（ＯＬＩＳＡ（登録商標））に、ポリマーナノ電極を提供する。スポットは、通常の手段によって外部制御装置に接続される。
【００９３】
ポリピロール／ポリピロール−ＣＰのコポリマー鎖を有する４つのスポット（Ｑｓ＝５５μＣ；Ｑｓ＝７０μＣ；Ｑｓ＝４０μＣ；Ｑｓ＝１００μＣ）、ポリピロール／ポリピロール−Ｍ５のコポリマーの四つのスポット（Ｑｓ＝５５μＣ；Ｑｓ＝７０μＣ；Ｑｓ＝４０μＣ；Ｑｓ＝１００μＣ）及びプローブ生体分子を有さないポリピロールホモポリマーのスポット（Ｑｓ＝６０μＣ）を合成した。各スポットにポリマーナノ電極を定着させた後に、サイクリックボルタンメトリー（ＣＶ）により、０．１Ｍ  ＬｉＣｌＯ4溶液中で、ＥＣＳに対して−０．２Ｖと＋０．６Ｖの間で電位を変化させることにより、それぞれのポリマーの電気化学的応答を測定した。各スポットを、その後、ハイブリダイゼーションバッファーを用いて分析した。
【００９４】
ハイブリダイゼーション
Ｍ５プローブのハイブリダイゼーションは、濃度０．５μＭで標的ＯＤＮ  Ｍ５ビオチンを含む溶液中で、バイオチップを３０分間インキュベートすることで行った。各スポットは、その後、ＥＣＳに対して−０．２Ｖと＋０．６Ｖの間で電位を変化させることで、ハイブリダイゼーションバッファーを用いてＶＣによって分析した。
【００９５】
各スポットの測定後、バイオチップを洗浄バッファーで四回洗浄した。
【００９６】
各スポットに、１００倍に希釈したストレプトアビジンアルカリホスファターゼ溶液（ＰＡＬ）の液滴を添加した。バイオチップを室温で５分間立てて放置した。バイオチップをその後、洗浄バッファーで四回洗浄した。
【００９７】
析出
各スポットの上に、ＢＭパープルＡＰ基質の溶液の液滴をアプライした。バイオチップを一時間、室温の暗所で放置した（インキュベーション）。その後、バイオチップを洗浄バッファーで四回洗浄した。洗浄バッファーの組成は、８ｇ／ｌのＮａＣｌ、０．２ｇ／ｌのＫＣｌ、０．７６ｇ／ｌのＮａ2ＨＰＯ4、０．１９ｇ／ｌのＫＨ2ＰＯ4、０．５％Ｔｗｅｅｎ２０、１μＭのＥＤＴＡである。
【００９８】
青い堆積物または析出物が、全てのＭ５スポット上に現れた。
【００９９】
各フィルムは、ＥＣＳに対して−０．２Ｖと＋０．９Ｖの間で電位を変化させることにより、ＣＶで、新たなハイブリダイゼーションバッファー溶液を用いて分析した。
【実施例２】
【０１００】
それぞれ９つのスポットを有する四つのバイオチップを用意した。各チップの４つのスポットは、Ｎ位で官能化したＰＰＹ／ＰＰＹ−ＣＰからなるコポリマーナノ電極を有しており、４つのスポットは、Ｎ位で官能化したＰＰＹ／ＰＰＹ−Ｍ５からなるコポリマーナノ電極を有している。一つのスポットは純金のみから成っており、またそれは対極である。
【０１０１】
電導性ポリマーナノ電極の合成は、ＥＣＳに対して＋０．６Ｖの電位を印加することで行った。コポリマーを電気合成するための溶液は、２０ｍＭの単量体ピロールとオリゴヌクレオチド（ＣＰまたはＭ５）で官能化した単量体ピロール５μＭを含む水の中に０．１ＭのＬｉＣｌＯ4を加えたものである。電気化学電池は、三つの電極を有するＭｉｃａｍ電池であった。
【０１０２】
バイオチップ１は、長さ４０ｎｍのポリマーナノ電極で合成した（Ｑｓ＝２０ｍＣ×ｃｍ-2／スポット）。バイオチップ２は、長さ６０ｎｍのポリマーナノ電極で合成した（Ｑｓ＝３０ｍＣ×ｃｍ-2／スポット）。バイオチップ３は、長さ８０ｎｍのポリマーナノ電極で合成した（Ｑｓ＝４０ｍＣ×ｃｍ-2／スポット）。バイオチップ４は、長さ２０ｎｍのポリマーナノ電極で合成した（Ｑｓ＝１０ｍＣ×ｃｍ-2／スポット）。
【０１０３】
ハイブリダイゼーション
９９μｌのＴＨ１Ｘバッファー中の１μｌのＯＤＮ−ビオチン（ＯＤＮ＝それぞれ１０μＭのＣＰまたはＭ５）を３７℃で一時間インキュベートした。ＯＤＮ−ビオチンの最終的な濃度は０．１μＭであった。バイオチップ１及び３をＣＰ−ビオチンでインキュベートしたのに対し、バイオチップ２及び４はＭ５−ビオチンでインキュベートした。
【０１０４】
タグ付け
３０μｌのハイブリダイゼーションバッファー中に希釈したストレプトアビジン−ＰＡＬ複合体（０．４μｌのＣｉ＝１ｍｇ／ｍｌ）の３０μｌの液滴を、各バイオチップ上にアプライし、その後に室温で５分インキュベートし、洗浄バッファー（ＴＲ）で洗浄する。
【０１０５】
析出
各バイオチップにＢＭパープルＡＰ基質の溶液の３０μｌの液滴をアプライし、その後室温で４５分インキュベートし、その後ＴＲで４回洗浄した。
【０１０６】
青い析出物が、ハイブリダイゼーション反応が生じた、ハイブリダイゼーションした各スポットに現れる。
【０１０７】
ポリマーナノ電極のそれらの平均的長さに関する分析
バイオチップ１から４のポリマーナノ電極の分析は、析出後のサイクリックボルタンメトリーで行った。各スポットの電気化学的応答の測定は、０．１ＭのＬｉＣｌＯ4溶液の中で走査速度１０ｍＶ／ｓで、ＥＣＳに対して−０．１Ｖと＋０．５Ｖの間の範囲で電位を変化させることで行った。
【０１０８】
表１は、窒素で官能化されたポリマーＰＰｙ／ＰＰｙ−ＯＤＮからなるコポリマーナノ電極に析出物が与える影響を、様々な長さについて示している。表１は、ハイブリダイゼーションと析出の後の、窒素で官能化されたポリマーＰＰｙ／ＰＰｙ−ＯＤＮコポリマーナノ電極で得られた、電圧電流応答の酸化ピークの強度の値を示すものである。参照測定は、ハイブリダイゼーションが起きておらずそのため析出物も形成されていない、ＰＰｙ／ＰＰｙ−Ｍ５コポリマーナノ電極で示されている。ハイブリダイゼーションと絶縁析出物の形成が起きたポリマー電極では、２０から３０％のより小さな強度の値が得られる。数値は、ポリマーナノ電極の長さが測定の感度において重要な役割を果たしていることを示している。ナノ電極は、平均で２０ｎｍの長さで作成される。ハイブリダイゼーションが起きていないスポットのＩｐ酸化は（Ｅ＝＋０．３５Ｖ／ＥＣＳで）３５ｎＡであるのに対し、ハイブリダイゼーションして析出物を有するスポットのＩｐ酸化は（Ｅ＝＋０．３５Ｖ／ＥＣＳで）２７ｎＡであった。
【０１０９】
【表１】
0004625547.tif 000002
【０１１０】
表１はまた、平均の長さが４０ｎｍのコポリマーナノ電極に析出物が与える影響を示している。ハイブリダイゼーションが起きていないスポットのＩｐ酸化が（Ｅ＝＋０．３５Ｖ／ＥＣＳで）４５ｎＡであったのに対し、ハイブリダイゼーションがして析出物を有するスポットのＩｐ酸化は（Ｅ＝＋０．３５Ｖ／ＥＣＳで）３３ｎＡであった。
【０１１１】
表１はまた、平均の長さが６０ｎｍのコポリマーナノ電極に析出物が与える影響を示している。ハイブリダイゼーションが起きていないスポットのＩｐ酸化が（Ｅ＝＋０．３５Ｖ／ＥＣＳで）６５ｎＡであったのに対し、ハイブリダイゼーションして析出物を有するスポットのＩｐ酸化は（Ｅ＝＋０．３５Ｖ／ＥＣＳで）４９ｎＡであった。
【０１１２】
更に、平均の長さが８０ｎｍのコポリマーナノ電極に析出物が与える影響が表１に示されている。ハイブリダイゼーションが起きていないスポットのＩｐ酸化が（Ｅ＝＋０．３５Ｖ／ＥＣＳで）７３ｎＡであったのに対し、ハイブリダイゼーションして析出物を有するスポットのＩｐ酸化は（Ｅ＝＋０．３５Ｖ／ＥＣＳで）５０ｎＡであった。
【０１１３】
ブラインドの（Ｎ位で官能化された）コポリマーナノ電極ＰＰｙ／ＰＰｙ−Ｍ５に対して、窒素で官能化されたコポリマーナノ電極ＰＰｙ／ＰＰｙ−ＣＰについて観察された、最も重要な強度は、長さが８０ｎＭのポリマーナノ電極で得られた。この場合、強度は約３０％弱くなる。それゆえ、窒素で官能化されたコポリマーナノ電極の場合、最適の鎖長は約５０−１６０ｎｍであり、最も好ましいのは８０−１２０ｎＭである。長いポリマーナノ電極の表面上の絶縁析出物の形成は、ポリマーナノ電極の測定に影響を及ぼす。ポリマーナノ電極が長くなるほど、長いポリマーナノ電極の間への析出物の挿入と、イオン伝導率の大幅な低下とが容易となる。
【０１１４】
ポリマーナノ電極の酸化状態、その長さ及び構造（オリゴヌクレオチドによる官能化の位置）がそれらの電導性に及ぼす影響を示すことは重要である。ポリマーナノ電極の導電性の調整は、先行技術において既知のオリゴヌクレオチドの他の固定方法よりも優れたものである、本発明の付着態様の主な利点の一つである。図４、５は、窒素で官能化されたポリマーナノ電極ＰＰｙ／ＰＰｙ−ＣＰのインピーダンス分光分析と測定を行った結果を示している。
【０１１５】
更に、単量体ピロールにおけるオリゴヌクレオチドの置換位置は、その結果生じるポリマーナノ電極の導電性を変調させることを可能にする（図６）。置換基の間で様々な相互作用が起こりうることから、ポリマー鎖の捩れが生じる可能性がある。３位で官能化したポリマーの構造は、その捩れの度合いが弱いため、電導性にとって更に好ましいものである。鎖への電子の移動が改善され、そして３位で官能化したコポリマーナノ電極の導電性が、Ｎで官能化したコポリマーと比べると大きく改善される。
【０１１６】
グランドノイズを小さくするために、測定はファラデーケージの中で行った。安定度を正すためにフィルタを用いた。それぞれの周波数ごとに、三つの測定値を平均化した（Ｎａ＝３）。電極に印加する電位は、当業者であれば通常の測定法によって選択することができる。選択された周波数範囲は、およそ１００ｋＨｚ−０．１Ｈｚである。正弦波の形で変化する符号付きの入力の振幅をおよそ４０ｍＶで選択した。
【０１１７】
ポリマーナノ電極の導電性は、ポリマー鎖の酸化状態を増大させることで改善可能である（図４）。ポリピロールタイプのポリマーナノ電極の電子構造は、印加した酸化電位と相関関係がある。ポリマーの共役鎖における電荷の可動性は、酸化電位の増加によって増加する。しかしながら、インピーダンス測定は、ポリマー鎖がその平衡電位付近でない場合には、より不安定なものになる。
【０１１８】
ポリマーナノ電極の長さは、インピーダンスの測定値に影響を及ぼす。（図５）
【０１１９】
ポリマーナノ電極の長さは、インピーダンスの測定値に影響するものであり、それは具体的には、鎖が長くなるほど、インピーダンスの測定値が減少するということである。これはつまり、ポリマー鎖が長いほうが、短いポリマー鎖よりも導電性が高いということである。
【実施例３】
【０１２０】
材料
５０μｌの液滴を、参照電極と対極を有するチップにアプライして、ポリマーナノ電極を電気合成した。
【０１２１】
ポテンショスタットとして、４−チャンネルＶＭＰ−２（Ｂｉｏ−ｌｏｇｉｃ  Ｇｒｅｎｏｂｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）を用い、クロノアンペロメトリーとインピーダンス測定のためのソフトウエアには、ＥＧＧ及びＢｉｏ−ｌｏｇｉｃを用いた。ポリマーナノ電極の電気合成は、実施例２で説明した基板上で、＋７５Ｖ／ＥＣＳの電位を印加して行った。コポリマーナノ電極の電気合成のための溶液は、３位で官能化したピロール−ＯＨ単量体を０．１Ｍと、３位で官能化したピロール−ＯＤＮ単量体を２５μＭ含む（ＣＰ及びＭ５）、０．１MのＬｉＣｌＯ4水溶液である。コポリマーナノ電極ＰＰＹ−ＯＨ／ＰＰＹ−ＣＰを有する四つのスポットとコポリマーナノ電極ＰＰＹ−ＯＨ／ＰＰＹ−Ｍ５を有する四つのスポットを合成した。各スポットにおけるポリマーナノ電極の長さは異なるものである。
【０１２２】
ハイブリダイゼーションは以下のように行われた。
【０１２３】
室温で１時間インキュベートし、これに続き、以下のハイブリダイゼーション溶液を添加する。
［ＯＤＮ−ｂｉｏ］１＝１μＭ
または
［ＯＤＮ−ｂｉｏ］２＝０．１μＭ
または
［ＯＤＮ−ｂｉｏ］３＝１ｎＭ
【０１２４】
標識手順
【０１２５】
０．４μｌのＰＡＬ及び３０μｌのＴＨＩＸである、ストレプトアビジンアルカリホスファターゼ（ＰＡＬ）溶液（ＰＡＬの濃度は１ｍｇ／ｍｌである）の３０μｌの液滴を室温で５分間インキュベートし、バイオチップ（８つのスポット）上に４００ｎｇ／液滴をもたらす。
【０１２６】
析出手順
ＢＭパープルＡＰ基質の溶液をバイオチップ上に置き、その後、光に当てずに室温で４０分インキュベートした。
【０１２７】
培養手順の後に、スポットとバイオチップとを洗浄バッファー（ＴＲ）で濯いだ。
【０１２８】
インピーダンス測定
インピーダンス測定は、バイオチップの各ポリマーナノ電極のスポットにおいて行った（析出後の０．１ＭのＬｉＣｌＯ4中の四つの陽性のスポット（ＣＰ）と四つのブラインドのスポット（Ｍ５））。
【０１２９】
インピーダンス測定は、実施例２で示したものと同じ条件下で行った。
【０１３０】
図７は、ハイブリダイゼーションと析出が起きた所謂陽性のコポリマーナノ電極と呼ばれるインピーダンス応答と、ハイブリダイゼーションが起こらない陰性の検定用のコポリマーナノ電極の応答とを比較した際の変化を示している。ハイブリダイゼーション前は、電気化学的応答は、どちらのコポリマーナノ電極も同じである。それゆえ、付着したオリゴヌクレオチド配列（ＣＰまたはＭ５）でさえも、ポリマーナノ電極の導電性に影響しない。
【０１３１】
ハイブリダイゼーションと析出の後のインピーダンス測定（図８）は、ポリマーナノ電極の上に絶縁析出物が形成されるとポリマーナノ電極／溶液の界面でイオンの移行と電子の移行が阻害されるということを裏付けるものである。ポリマーナノ電極の導電性は強い影響を受け、しかもそれは、少量のハイブリダイズした標的オリゴヌクレオチドと相関関係を有する非常に少量の析出物に影響されるのである。この電気化学的技法は、オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを検出するために絶縁基質を析出させる、選ばれたシステムに完全に適合するものである。ナノ電極の長さが約１２０ｎＭであれば、析出物は個々の複数のポリマーナノ電極の間にかなり挿入され、導電性を減じることが認められた。
【０１３２】
コポリマーナノ電極の導電性の変化は、１から１００Ｈｚの間の低い周波数が用いられる場合に更に大きくなる（図９）。
【０１３３】
検出感度は１ｐＭ程度であり、それは約１０8分子／ｍＬである（図１０）。
【０１３４】
インピーダンス測定は、バッファ基板でも行うことができる（図１２）。それゆえ、析出反応の推移を実時間で追うことが可能である。析出の速度測定を介してのハイブリダイゼーションの検出は、検証用のコポリマーナノ電極と陽性のコポリマーナノ電極のインピーダンスモジュールの測定の比較法として、より迅速で、より信頼性が高い。
【０１３５】
また、サイクリックボルタンメトリーによる検討も、３位で官能化されたコポリマーナノ電極で、１ｎＭの濃度の標的ＣＰ−ｂｉｏについて行った（図１１）。ＣＰコポリマーナノ電極の応答における酸化ピークの測定値の強度は、コポリマーナノ電極Ｍ５について測定したものよりも４０％低い。この強度の低下は、ポリマーナノ電極の導電性の低下と直接の相関関係がある。これは、ポリマーナノ電極の表面上に絶縁析出物が形成されることの直接の結果である。それゆえ、この技法により、ハイブリダイゼーションの現象を検出して定量化することも可能である。言うまでもなく、この技法により、特異的なリガンドが理由しうる限りは、タンパク質やハプテンによる分析を定量化することも可能である。しかしながら、インピーダンス分光分析と比べると、感度は僅かに落ちる。それゆえ、使いやすいということと、測定機器を小型化できるということから、インピーダンス分光分析の方が好ましい。
【図面の簡単な説明】
【０１３６】
【図１】本発明の方法の実施例の一つを示した図。
【図２】触媒活性化学種によって誘導される反応における検出対象化学種の化学反応のフローチャート。
【図３】ポリマー鎖からなるナノ電極にプローブ生体分子を組み込むための本発明の二つの実施例を示した図。
【図４】窒素で官能化したＰＰｙ／ＰＰｙ−ＯＤＮナノ電極のポリマー鎖の酸化状態がそれぞれの導電性に与える影響を示したグラフ。
【図５】窒素で官能化したＰＰｙ／ＰＰｙ−ＯＤＮナノ電極のポリマー鎖の長さがそれらの導電性に与える影響を示したグラフ。
【図６】官能化の位置がポリマー鎖（長さ１８０ｎｍ）からなるナノ電極の導電性に与える影響を示したグラフ。
【図７】コポリマーＰＰｙ−ＯＨ／ＰＰｙ−ＣＰ及びＰＰｙ−ＯＨ／ＰＰｙ−Ｍ５からなるナノ電極のインピーダンス測定の反応の安定性を示したグラフ。
【図８】ＰＰｙ−ＯＨ／ＰＰｙ−ＣＰ（曲線１）及びＰＰｙ−ＯＨ／ＰＰｙ−Ｍ５（曲線２）の反応曲線の比較を示したグラフ。
【図９】ＰＰｙ−ＯＨ／ＰＰｙ−ＣＰ及びＰＰｙ−ＯＨ／ＰＰｙ−Ｍ５のインピーダンスモジュールの比率を示したグラフ。
【図１０】インピーダンス分光分析の検出感度を、標的分子の濃度の関数で示したグラフ。
【図１１】ＰＰｙ−ＯＨ／ＰＰｙ−ＣＰ（曲線１）とＰＰｙ−ＯＨ／ＰＰｙ−Ｍ５（曲線２）のボルタンメトリー測定の反応を示したグラフ。
【図１２】ＢＣＩＰ／ＮＢＴがＰＰｙ−ＯＨ／ＰＰｙ−ＣＰに析出する間のインピーダンス分光分析の反応を示したグラフ。
【符号の説明】
【０１３７】
１０６  標的分子
１０９  タグ
１０２  ナノ電極
１０５  プローブ生体分子
【図１ａ−ｂ】
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【図１ｃ】
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【図１ｄ】
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【図１ｅ】
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【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２ａ】
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【図１２ｂ】
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