(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミラクリン遺伝子をトマトに導入し、２倍体の形質転換個体を選抜することにより、活性のあるミラクリンタンパク質を蓄積するトランスジェニックトマトを作製することを含む、食味修飾活性を有するトランスジェニックトマトの作製方法。
【請求項２】
ミラクリン遺伝子が、以下の(a)〜(c)のうち少なくとも１つのミラクリン遺伝子である、請求項１に記載の方法。
(a) 配列番号１に示す塩基配列からなる遺伝子；
(b) 配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子；
(c) 配列番号２に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ食味修飾活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
【請求項３】
ミラクリン遺伝子がそのシグナル様ペプチドコード配列を含んでいる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法によって作製される、ミラクリン遺伝子が導入され、活性のあるミラクリンタンパク質を蓄積する食味修飾活性を有する２倍体のトランスジェニックトマト。
【請求項５】
食味修飾活性が、酸味を甘味に変える活性である、請求項４に記載のトランスジェニックトマト。
【請求項６】
請求項４又は５に記載のトランスジェニックトマトからミラクリンを抽出することを含む、ミラクリンの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、ミラクリンを発現する遺伝子組換え植物の作成とその利用に関する。
【背景技術】  ミラクリンは、ミラクルフルーツ（Ｒｉｃｈａｄｅｌｌａ  ｄｕｌｃｉｆｉｃａ）果実中に含まれる食味修飾タンパク質である。ミラクリンは、１９６８年にミラクルフルーツの機能性成分であることが同定された（Ｋｕｒｉｈａｒａ  ａｎｄ  Ｂｅｉｄｌｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９６８）１６１（８４７）ｐ．１２４１−１２４３）。その後、ミラクリンタンパク質の全アミノ酸配列が決定され（Ｔｈｅｅｒａｓｉｌｐｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．（１９８９）２６４（１２），ｐ．６６５５−６６５９）、その遺伝子の塩基配列が決定された（Ｍａｓｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ（１９９５）１６１，ｐ．１７５−１７７）。ミラクリン遺伝子の完全長ｃＤＮＡ配列は、Ｍａｓｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ（１９９５）１６１，ｐ．１７５−１７７に報告されている。ミラクリンには食品中の酸味を甘味に変える働きがあり、例えば、ミラクルフルーツを食べたあとにレモン果実を食べると、オレンジ果実のような甘みを感じる。このような効果からこの果実はミラクルフルーツと呼ばれている。ミラクルフルーツは、熱帯地方の西アフリカ原産の植物であり、現地ではヤシ酒やトウモロコシパンなど酸味のある飲料や食品を食べる前に伝統的に食されている。
このようなミラクリンの機能を利用して、ミラクルフルーツを、体重制限のためのダイエットや糖尿病治療のための食事制限を無理なく行い、食事におけるカロリー摂取を低減するための補助食品として利用することが試みられている。食事をする前にミラクルフルーツを食べておけば、糖分を減らし、酸味を添加した食品でも十分に満腹感が得られ、無理なく食事量を減らすことができる。その結果、精神的なストレスを感じずにダイエットや食事療法を行うことが可能となる。ミラクルフルーツをこれらの用途に供するには、果実を安定して生産供給する必要がある。
しかしながら、現在までのところ十分な量のミラクルフルーツは安定して生産供給されておらず、これらの目的には十分に供されていない。ミラクルフルーツは、熱帯原産の植物であるために、熱帯地域以外で栽培するには周年を通した高温栽培条件が必要になる。そのため、暖房装置など重装備した温室等で栽培されている。また、この機能成分であるミラクリンは、果実中で分解され易く、熱帯地域で生産してそれ以外の地域に十分量を供給するのは技術的・コスト的に困難である。ミラクルフルーツの持つミラクリンの活性を効果的に活用するには、安定して低コストで周年的に供給する技術の開発が是非とも必要である。ミラクリン自体についても、ダイエットや糖尿病治療の食事療法の補助食品などへの利用が期待されているが、上記の通り十分量の供給は現状では難しい。
栗原らは、ミラクリン遺伝子を導入し発現させた酵母においてミラクリン特異的抗体と反応するタンパク質を産生させることができたこと、しかしそのタンパク質に甘味誘導活性はなかったことを報告している（Ｋｕｒｉｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｏｏｄｓ  ａｎｄ  Ｆｏｏｄ  Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ  Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｊａｐａｎ  Ｎｏ．１７４（１９９７）「甘味を誘導する物質（ミラクリン、クルクリン、ストロジン）及び耐熱性甘味タンパク質マビンリンの構造と活性」）。この栗原らのレビューには、ミラクリン遺伝子をタバコ細胞で発現させることにより、ミラクリン特異的抗体と反応するタンパク質を産生させることができたことも報告されている。しかし、タバコで発現されたそのミラクリン遺伝子産物が甘味誘導活性をもつかどうかについての報告はされておらず、ミラクリン遺伝子を植物に導入して発現させることにより甘味誘導活性を有するミラクリンを生産することに成功した例は、現在まで知られていない。
【発明の開示】
本発明は、上記のような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、ミラクリンを生産する有用遺伝子組換え植物の作成とその利用方法を提供することにある。
本発明者等は、これまで、世界中の殆どの地域で周年栽培が可能な有用植物、例えばレタスやトマト、また長期間果実収穫が可能な有用植物、例えばイチゴにおいて外来遺伝子を導入して発現させる研究に取り組んできた。
そこで本発明者等は、植物分子育種技術を用いて、周年生産や栽培が容易な有用植物にミラクリン遺伝子の導入を試みた結果、ミラクリンを発現する遺伝子組換え植物の作製に成功した。
作製した組換え植物をミラクリン特異抗体を用いて分析した結果、組換え植物はミラクリンをミラクルフルーツに匹敵する濃度で、機能できる型（二量体）で発現していた。
このようにして完成された本発明は、ミラクリンを発現する植物及びその作成方法、並びにその利用法に関するものである。
本発明の１つの態様は、植物にミラクリン遺伝子を導入しミラクリンを発現させる遺伝子組換え植物の作製方法である。ミラクルフルーツからミラクリンｃＤＮＡを単離しミラクリン遺伝子として使用する事ができる。また、ミラクリン遺伝子をベクターに挿入し、アグロバクテリウムに導入し、これを植物細胞への遺伝子導入に使用する事ができる。本発明では、このような方法で作製された遺伝子組換え植物が生産するミラクリンを、食品添加物あるいは医薬品、特に糖尿病治療薬として利用することができる。
本発明の別の態様は、ミラクリン遺伝子が導入された、食味修飾活性を有するトランスジェニック植物である。ミラクリン遺伝子としては、以下の（ａ）〜（ｆ）のうち少なくとも１つのミラクリン遺伝子が好ましい：
（ａ）配列番号１に示す塩基配列からなる遺伝子；
（ｂ）配列番号１に示す塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ食味修飾を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子；
（ｃ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子；
（ｄ）配列番号２に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ食味修飾活性を有するタンパク質をコードする遺伝子；
（ｅ）配列番号１に示す塩基配列と７０％以上の同一性を示す塩基配列からなり、かつ食味修飾活性を有するタンパク質をコードする遺伝子；及び
（ｆ）配列番号２に示すアミノ酸配列と８５％以上の同一性を示すアミノ酸配列からなり、かつ食味修飾活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
ここで食味修飾活性とは、典型的には、酸味を甘味に変える活性である。
また上記植物は、レタス、トマト、イチゴ又はシロイヌナズナであることが好ましい。さらに本発明においては、上記トランスジェニック植物は２倍体植物であることが特に好ましい。
本発明の別の態様は、上記トランスジェニック植物からミラクリンを抽出することを含む、ミラクリンの製造方法である。
本発明のさらなる態様は、上記のトランスジェニック植物において産生されたミラクリンを含む食品添加物である。あるいは本発明の態様は、上記のトランスジェニック植物において産生されたミラクリンを含む飲食品である。この飲食品は、糖尿病患者用のものであることがより好ましい。本発明の別の態様は、上記のトランスジェニック植物において産生されたミラクリンを含む糖尿病治療薬である。
ミラクリンを発現した有用植物は、産業上、様々な有用性がある。１つは、ダイエット食品の添加物としての利用である。糖分を加えることによって甘味を与えている食品に対して、糖分の代わりに酸とミラクリンを添加することで、カロリーをおさえた状態でも甘味を添加することができる。１つは、糖尿病患者の食事療法への利用である。糖尿病患者は、糖分の過剰摂取を抑える目的で食事制限が行われる。この食事制限は、食事療法の中で最もストレスのかかる場面である。しかし、ミラクリンを含む飲食品を食事の時に摂取することで無理なく満腹感が得られ、食事療法時のこのようなストレスを解消することができる。それにより、糖尿病治療がスムーズに行われる。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００４−２３０２０５号の明細書及び／又は図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】  図１は、ミラクリン遺伝子を植物細胞に導入するためのミラクリン発現ベクターの構造を示す図である。ｐＢＩＥＬ２ΩＭＩＲは高発現ベクターを示し、ｐＢＩ３５ＳＭＩＲは通常のべクターを示す。ＲＢはＴ−ＤＮＡの右端、ＮＰＴＩＩはネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、Ｔｎｏｓはノパリンシンターゼ遺伝子ターミネーター、３５ＳＰはＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター、ＭＩＲはミラクリン遺伝子を表す。
図２は、組換え体中のミラクリン遺伝子の組込みを調べるサザン解析の結果を示す写真である。非組換え体と４０系統の組換え体からゲノムＤＮＡを抽出し、サザン解析を行った。（Ａ）及び（Ｂ）は、調製したメンブレンをＢＡＳにより検出した画像、（Ｃ）及び（Ｄ）は、同じメンブレンについてオートラジオグラフィーにより検出したＸ線フィルム像である。ＷＴは非組換え体、左側の写真（Ａ）及び（Ｃ）のレーン１〜２０は、バイナリーベクターｐＢＩＥＬ２ΩＭＩＲを導入した組換え体、右側の写真（Ｂ）及び（Ｄ）のレーン１〜２０は、ｐＢＩ３５ＳＭＩＲを導入した組換え体を示す。
図３は、組換え体中のミラクリン遺伝子の転写を調べるノーザン解析の結果を示す写真である。非組換え体と１９系統の組換え体から全ＲＮＡを抽出し、ノーザン解析を行った。ＷＴは非組換え体、左側の写真の９レーンは、ｐＢＩＥＬ２ΩＭＩＲを導入した組換え体、右側の写真の１０レーンは、ｐＢＩ３５ＳＭＩＲを導入した組換え体を示す。
図４は、組換え体中のミラクリンの発現を調べるウエスタン解析の結果を示す図である。非組換え体と１８系統の組換え体から全タンパク質を抽出し、ウエスタン解析を行った。ＷＴは非組換え体、左側の写真の９レーンは、ｐＢＩＥＬ２ΩＭＩＲを導入した組換え体、右側の写真の９レーンは、ｐＢＩ３５ＳＭＩＲを導入した組換え体を示す。Ｍは、ミラクリンフルーツから単離精製されたミラクリンタンパク質を示す。
図５は、ミラクリン遺伝子を導入した組換え（トランスジェニック）トマトの葉におけるミラクリン遺伝子の発現を調べたサザンブロット解析の結果を示す写真である。「野生型」はミラクリン遺伝子を導入していないトマトを示す。他の１４レーンには、ｐＢＩ３５ＳＭＩＲを導入して作製された各組換え体の名称の略称を記載した。
図６は、ミラクリン遺伝子が導入された組換え（トランスジェニック）トマト個体の葉からのタンパク質抽出物を、非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより展開し、ミラクリンを検出したウェスタンブロット解析の結果を示す写真である。「マーカー」は、タンパク質分子量マーカー、「ミラクリン」は、ミラクリンフルーツから単離されたミラクリンタンパク質を示す。「野生型」はミラクリン遺伝子を導入していないトマトを示す。「１コピー」のレーン２−１、５−２、７Ｃ、１１Ａ、１４−３、２１−４、５６Ｂ、５８−１、６４−２は、１コピーのミラクリン遺伝子が導入された形質転換体の名称である。「２コピー」のレーン４Ａ、２０−１及び２２Ａは、２コピーのミラクリン遺伝子が導入された形質転換体の名称である。「多コピー」のレーン１５Ａは、２個を上回るコピー数のミラクリン遺伝子が導入された形質転換体の名称である。レーン３−１は、ミラクリン遺伝子によって形質転換されなかった個体（非形質転換体）である。レーン１１Ａ、２０−１、１４−３以外のレーンのサンプルは、全て２倍体トマトである。矢印は、二量体サイズのミラクリンタンパク質の存在を示している。
図７は、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより展開した、組換え（トランスジェニック）トマトの葉からのタンパク質抽出物について、ミラクリンを検出したウェスタンブロット解析の結果を示す写真である。Ｗｔは野生型トマト（ミラクリン遺伝子を導入していないトマト）を示す。Ｍは、ミラクリンフルーツから単離精製されたミラクリンタンパク質を示す。２Ａ、３Ａ、６Ａ、１４Ｃは、ｐＢＩ３５ＳＭＩＲを導入して作製された各組換え体の名称である。
図８は、ミラクリン遺伝子を増幅するためのプライマーを設計した位置を示す図である。ミラクリン遺伝子のｃＤＮＡ配列（アクセッション番号Ｄ３８５９８）上に、各プライマーがハイブリダイズする位置を矢印で示している。矢印の折れ曲がった尾部は、プライマーの５’末端に含まれるアダプター配列を示す。枠で囲った配列は、ミラクリンタンパク質のシグナル様ペプチド部分をコードする配列（シグナル様ペプチドコード配列）である。
図９は、ミラクリン遺伝子のＰＣＲ増幅産物の電気泳動写真である。図９（Ａ）は、プライマーセットＭ１（シグナル様ペプチドコード配列を増幅する）で増幅したＰＣＲ産物、図９（Ｂ）は、プライマーセットＭ２（シグナル様ペプチドコード配列を増幅しない）で増幅したＰＣＲ産物の結果である。
図１０は、ミラクリン遺伝子のＰＣＲ増幅断片を挿入したｐＢｉｇｓ２１１３ＳＦベクターのマップである。
図１１は、シグナル様ペプチドコード配列を含む増幅産物を導入したＭ１群の組換えシロイヌナズナのＴ２個体におけるミラクリン発現を示す、ウェスタンブロット解析の結果を示す写真である。ウェスタンブロット解析は、非還元条件下で展開した葉サンプルからのタンパク質抽出物について行った。ＰＭは、予備染色されたタンパク質マーカー、ＭＩＲは、ミラクリンフルーツから単離精製されたミラクリンを示す。Ｗｔは、ミラクリン遺伝子を導入していないシロイヌナズナを示す。Ｍ１−１−１〜Ｍ１−９−２は、Ｍ１群のＴ２個体の名称である。写真の右側の矢印は、二量体のミラクリンを示すバンド及び単量体のミラクリンを示すバンドを明示する。
図１２は、シグナル様ペプチドコード配列を含む増幅産物を導入したＭ１群、又はシグナル様ペプチドコード配列を含まない増幅産物を導入したＭ２群の組換えシロイヌナズナにおけるミラクリン発現を示す、ウェスタンブロット解析の結果を示す写真である。ウェスタンブロット解析は、非還元条件下で展開した葉サンプルからのタンパク質抽出物について行った。ＰＭは、予備染色されたタンパク質マーカー、ＭＩＲは、ミラクリンフルーツから単離精製されたミラクリンを示す。Ｗｔは、野生型シロイヌナズナ（ミラクリン遺伝子を導入していないシロイヌナズナ）を示す。Ｍ１−４−４及びＭ１−９−４は、シグナル様ペプチドコード配列を含む増幅産物を導入した個体、Ｍ２−１〜Ｍ２−６は、シグナル様ペプチドコード配列を含まない増幅産物を導入した個体の名称である。
【発明を実施するための最良の形態】１．ミラクリン遺伝子とその単離
現在、ミラクルフルーツ（Ｒｉｃｈａｄｅｌｌａ  ｄｕｌｃｉｆｉｃａ）果実に含まれるミラクリンが産業利用されている。しかし、ミラクルフルーツは熱帯原産の植物であり熱帯地域以外での栽培が非常に困難であるため、十分な量のミラクリンが供給されていない。本発明者等は、この問題を解決する有効な手段は、栽培技術が確立されており、広く世界中で栽培できる植物にミラクリン遺伝子を導入し、ミラクリンタンパク質を生産させることであると考えた。
本発明者等は、一般に公開されているＤＮＡデータベースに登録されているミラクリン遺伝子の塩基配列情報に基づいて、ミラクルフルーツからミラクリンｃＤＮＡを単離した。本発明に使用したミラクリン遺伝子のｃＤＮＡは、例えば、国際塩基配列データベースにおいてアクセッション番号Ｄ３９５９８により入手できるｃＤＮＡ配列、又は配列表に示された配列番号１の塩基配列の情報を元にプライマーを調製し、ミラクルフルーツの全ＲＮＡを鋳型にＲＴ−ＰＣＲを行なうことにより増幅し、調製することができる（実施例１を参照）。
しかしながら本発明で用いるミラクリン遺伝子は、そのような方法で得られるｃＤＮＡに限定されず、ミラクリンタンパク質をコードする単離された任意の核酸であってよい。本発明における「ミラクリン」とは、最初にミラクルフルーツの果実から単離された、いわゆる食味修飾活性を有するタンパク質である。ミラクリンの有する「食味修飾活性（味覚修飾活性とも呼ぶ）」とは、主として、酸味を甘味に変える活性、すなわち、ミラクリンの後に口に含んだ酸味のある素材について甘味を感じるように味覚を変化させる活性を言う。本発明のミラクリン遺伝子としては、ミラクルフルーツ（Ｒｉｃｈａｄｅｌｌａ  ｄｕｌｃｉｆｉｃａ）由来の、ミラクリンをコードする核酸が好ましく、例えば、配列番号１で示される塩基配列からなる遺伝子、そして配列番号２のアミノ酸配列（配列番号１の塩基配列によってコードされているアミノ酸配列）をコードする遺伝子がより好ましい。また本発明のミラクリン遺伝子は、ミラクルフルーツ以外の植物由来のミラクリン遺伝子ホモログも含むものとする（例えば、トマト［Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ］のＬｅＭｉｒ（ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ７００７６）、ダイズのダイズトリプシンインヒビターＡ及びＣ（Ｋｕｎｉｔｚ）など）。本発明に使用するミラクリン遺伝子は、ミラクリンの食味修飾活性（ミラクリン活性）を有するタンパク質をコードする限り、天然のミラクリン遺伝子の塩基配列（例えば、配列番号１）に１若しくは複数個の置換、欠失、付加及び／挿入などの変異が生じた配列からなる遺伝子であってもよい。本発明のミラクリン遺伝子はまた、食味修飾活性を有する天然のミラクリンのアミノ酸配列（例えば、配列番号２のアミノ酸配列）において１若しくは数個（２〜９個、好ましくは２〜５個）のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された配列からなり、かつ食味修飾活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。さらに本発明のミラクリン遺伝子は、配列番号１の塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ食味修飾活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子であってもよい。あるいは、本発明のミラクリン遺伝子は、配列番号１に示す塩基配列と少なくとも８５％以上、好ましくは９０％以上の同一性を示す塩基配列からなり、かつ食味修飾活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。本発明のミラクリン遺伝子はまた、配列番号２に示すアミノ酸配列と少なくとも６０％以上、好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８５％以上の同一性を示すアミノ酸配列からなり、かつ食味修飾活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。
本発明において「ストリンジェントな条件」とは、特異的な核酸ハイブリッドが形成される条件を言い、具体的には、例えば、ナトリウム塩濃度が１５〜７５０ｍＭ、好ましくは５０〜７５０ｍＭ、より好ましくは３００〜７５０ｍＭ、温度が２５〜７０℃、より好ましくは５５〜６５℃、ホルムアミド濃度が０〜５０％、より好ましくは３５〜４５％となる反応条件をいう。ストリンジェントな条件では、さらに、ハイブリダイゼーション後のフィルターの洗浄条件を、ナトリウム塩濃度が１５〜６００ｍＭ、好ましくは５０〜６００ｍＭ、より好ましくは３００〜６００ｍＭ、温度が５０〜７０℃、好ましくは５５〜７０℃、より好ましくは６０〜６５℃とすることが好適である。
上記のような様々なミラクリン遺伝子は、当業者であれば、例えば、部位特異的変異導入法（Ａｕｓｕｂｅｌら，１９９９，Ｃｕｒｒｅｎｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）など周知の技術を利用して既存のミラクリン遺伝子に変異を導入することによって得ることもできる。
本発明において「遺伝子」は、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。ＤＮＡには少なくともゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡが含まれ、ＲＮＡには、ｍＲＮＡなどが含まれる。本発明のミラクリン遺伝子は、ミラクリン遺伝子のＣＤＳ配列（開始コドンから終止コドンまで）以外に非翻訳領域（ＵＴＲ）などを含んでもよい。
以上のような本発明のミラクリン遺伝子を含むＤＮＡなどの核酸断片は、当業者であればミラクリン遺伝子の既知配列を利用して、ミラクリン遺伝子を有する生物から抽出した核酸から常法に従って得ることができる。
一実施形態としては、本発明のミラクリン遺伝子を含むＤＮＡ断片は、ミラクリンを発現しうる植物の組織から常法により抽出したｍＲＮＡを鋳型として、ミラクリン遺伝子の開始コドンから終止コドンまでの全長を増幅可能なように設計したプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲによる核酸増幅によって、ｃＤＮＡとして取得することができる。
こうして得られたミラクリン遺伝子を含むＤＮＡ断片は、ベクター中にクローニングしておくことが好都合である。例えば、ミラクリン遺伝子を公知の発現ベクター、例えばｐＵＣ１９などの大腸菌発現ベクターに挿入し、それを宿主、例えばＢＬ２１株などの大腸菌に導入して、宿主内で発現させることができる。ミラクリン遺伝子を含むＤＮＡ断片は、植物用過剰発現（高発現）プロモーターの下流に連結した状態で組換え発現ベクターに組み込んでもよい。ミラクリン遺伝子を含むＤＮＡ断片を、エンハンサーと植物用過剰発現（高発現）プロモーターの下流に導入した組換え発現ベクターも好適である。その場合、例えば、ミラクリン遺伝子を含むＤＮＡ断片の両末端を適当な制限酵素で切断し、その切断断片をベクター中の過剰発現プロモーター下流の適当な制限酵素部位にイン・フレームとなるように挿入して連結すればよい。植物に遺伝子導入するためにアグロバクテリウム法を用いる場合には、アグロバクテリウム由来のプラスミドベクター（例えばｐＢＩ１０１若しくはｐＢＩ１２１）又はそれを改変した発現ベクターなどのアグロバクテリウム法に適したベクターに、ミラクリン遺伝子を組み込むことが好ましい。例えば、植物発現用に開発された公知のベクター（汎用されているｐＢＩ１２１やｐＢＩ２２１など）のマーカー遺伝子部分を制限酵素を用いて切り出し、これに代えてミラクリン遺伝子を挿入することによって、アグロバクテリウム法のためのベクターを構築することができる。この方法により、ミラクリン遺伝子は、通常、過剰発現（高発現）プロモーターの制御下に置かれる。
なお、得られたミラクリン遺伝子を含むＤＮＡ断片については、塩基配列決定によりその配列を確認することが好ましい。塩基配列決定はマキサム−ギルバートの化学修飾法、ジデオキシヌクレオチド鎖終結法等の公知手法により行うことができるが、通常は自動塩基配列決定装置（例えばＡＢＩ社製ＤＮＡシークエンサーＰＲＩＳＭ３７７ＸＬ）を用いて行えばよい。
本発明において用いるｍＲＮＡの調製、ｃＤＮＡの作製（ＲＴ−ＰＣＲ）、ＰＣＲ、ベクター中へのライゲーション、細胞の形質転換、ＤＮＡの塩基配列決定、プライマーの合成、タンパク質の抽出などの分子生物学的・生化学的実験法は、通常の実験書の記載に従って行うことができる。そのような実験書としては、例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋらのＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，２００１，Ｅｄｓ．，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．＆  Ｒｕｓｓｅｌｌ，ＤＷ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓを挙げることができる。
２．ミラクリン遺伝子を導入した組換え植物の作製
本発明では、上記のようにして得たミラクリン遺伝子を植物に導入することにより、食味修飾活性を有するトランスジェニック植物を作製することができる。
例えば、後述の実施例２のようにして、ミラクリン遺伝子を組み込んだアグロバクテリウム法用の発現ベクターをアグロバクテリウムに導入し、それをアグロバクテリウム法による植物細胞への遺伝子導入に使用すればよい。本発明では、アグロバクテリウム法に、ｐＥＩ１２１由来のベクターを好適に用いることができる。ベクターを導入する植物細胞の形態は、組織、器官、カルスなどの任意の形態であってよい。
本発明においてミラクリン遺伝子を導入する植物は、限定するものではないが、単細胞藻類、裸子植物、双子葉植物若しくは単子葉植物であってよい。本発明では、ミラクリン遺伝子を導入する植物として、レタス、トマト、イチゴ、シロイヌナズナ等の作物植物がより好ましい。遺伝子導入効率の高低はあるものの、アグロバクテリウム法による遺伝子導入は、イネ、トマト、メロン、レタスなど広く植物において用いられていることが報告されている。なお本発明では、後述のように、ミラクリン遺伝子を２倍体植物に導入することが特に有用である。
植物細胞へのミラクリン遺伝子の導入法としては、アグロバクテリウム法に限らず、エレクトロポレーション法やパーティクルガン法などの直接法も用いることができる。これらの植物形質転換法の詳細は、『島本功、岡田清孝  監修「新版  モデル植物の実験プロトコール  遺伝学的手法からゲノム解析まで」（２００１）秀潤社』などの一般的な教科書の記載や、Ｈｉｅｉ  Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，″Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｉｃｅ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  Ｌ．）ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｎｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｏｕｎｄａｒｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｔ−ＤＮＡ．″Ｐｌａｎｔ  Ｊ．（１９９４）６，２７１−２８２等の文献を参照すればよい。
アグロバクテリウム法によりベクターを導入した植物細胞は、一般に、形質転換細胞を選抜する抗生物質とアグロバクテリウムを除菌するための抗生物質、及び植物体再生用の植物ホルモン（オーキシン、サイトカイニンなど）を含む組織培養用の培地で培養することにより、植物体の再生を行うことができる。エレクトロポレーション法及びパーティクルガン法でベクターを導入した植物細胞は、一般に、形質転換細胞を選抜する抗生物質と植物体再生用の植物ホルモン（オーキシン、サイトカイニンなど）を含む組織培養用の培地で培養することにより、植物体の再生を行うことができる。
例えば、レタスでは、次の方法を用いることができる。アグロバクテリウムＧＶ２２６０を用いてリーフディスク法により、レタスにミラクリン遺伝子を導入できる。ミラクリン遺伝子を保持したアグロバクテリウムを１００ｍｇ／Ｌカナマイシンを含んだＬＢ培地中で一晩振とう培養し、遠心洗浄の後、アセトシリンゴン２００μＭとメルカプトエタノール１０μＭを含むＭＳ液体培地にＯＤ６００が０．１になるように懸濁する。このアグロバクテリウム菌液に種まきして５日目の無菌のレタス葉切片を浸漬する。アグロバクテリウムを感染させたレタス葉切片は、１ｍｇ／Ｌベンジルアデニン（ＢＡ）、０．１ｍｇ／Ｌナフタレン酢酸（ＮＡＡ）を含むＭＳ培地で３日間共存培養する。その後、０．１ｍｇ／Ｌ  ＢＡ、０．１ｍｇ／Ｌ  ＮＡＡ、１００ｍｇ／Ｌカナマイシンを含む選抜ＭＳ培地に移し、２週間ごとに培地を交換しながら培養する。分化してきたシュートを０．０１ｍｇ／Ｌ  ＢＡ、０．０５ｍｇ／Ｌ  ＮＡＡ、５０ｍｇ／Ｌカナマイシンを含むＭＳ培地に移し、１〜３ｃｍぐらいに伸びたシュートを５０ｍｇ／Ｌカナマイシンを含む発根ＭＳ培地に移す。得られた再生個体について、導入遺伝子の確認を行い、形質転換体を確認する。
また、トマトでは、例えば、文献（Ｏｈｙａｍａら，１９９５，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，３６：３６９−３７６）に記載の方法を用いることができる。具体的には、トマトの種子をＭＳ培地上に無菌播種し、２５℃、１６時間照明（約４，０００ルクス）で発芽させる。発芽してきた実生の子葉を２分割し、導入したい遺伝子を持つアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）（ＬＢＡ４４０４株など）を接種する。ゼアチン１ｍｇ／Ｌを含むＭＳ培地上で２日間共存培養する。続いて、ゼアチン１ｍｇ／Ｌ、カルベニシリン２００ｍｇ／Ｌを含むＭＳ培地上で１週間除菌のための培養を行う。更に、ゼアチン１ｍｇ／Ｌ、カルベニシリン２００ｍｇ／Ｌ、カナマイシン１００ｍｇ／Ｌを含むＭＳ培地上で２週間毎に継代培養する。伸長してきたシュートをカルベニシリン２００ｍｇ／Ｌ、カナマイシン５０ｍｇ／Ｌを含むＭＳ培地に継代して発根させる。得られた再生個体について、導入遺伝子の確認を行い、形質転換体を確認する。
導入遺伝子の確認は、次の方法で行える。ゲノムＤＮＡに対するサザン解析により、導入遺伝子が核内に組み込まれたかどうかを、ノーザン解析により核内に組み込まれた遺伝子がｍＲＮＡに転写されているかどうかを、ウエスタン解析によりｍＲＮＡがミラクリンに翻訳されているかどうか確認できる（実施例４を参照）。ウエスタン解析に使用するミラクリン認識特異抗体は、大腸菌で発現させたミラクリンを抗原として公知の方法により作製できる（実施例５を参照）。
本発明のミラクリン遺伝子を導入した組換え植物にて産生されたミラクリンタンパク質は、二量体を形成する。このことは、非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより展開したタンパク質溶液についてのミラクリン特異抗体を用いたウエスタン解析によって確認される（例えば図１１を参照）。ミラクリンタンパク質の二量体は活性を有している（Ｋｕｒｉｈａｒａ，１９９２，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，３２（３）：２３１−２５２）が、ミラクリンタンパク質の単量体は活性を有しないことから、本発明の組換え植物に導入したミラクリン遺伝子は、活性のあるミラクリンを蓄積できることが示された。
ミラクリン遺伝子を導入した本発明の組換え植物は、ミラクリンを産生し、それにより、食味修飾活性を有する。すなわち、被験者（好ましくはヒト）が本発明の組換え植物を口に含み（そして好ましくはよく噛み）、その後、酸味のある素材を口に入れると、酸味の代わりに甘味を感じる。
従って、組換え植物が生産するミラクリンの活性（食味修飾活性）は、実施例６〜８に示すようなバイオアッセイ法により評価できる。直接法では、人がミラクリンを生産している組換え植物を直接口に含み、続いて酸味材料（クエン酸やレモン汁など）を口に含むことにより効果を評価できる。抽出法では、組換え植物からミラクリンを公知の方法で抽出し、その抽出液を口に含み、続いて酸味材料（クエン酸やレモン汁など）を口に含むことにより効果を評価できる。それらのアッセイでは、口に含んだ酸味材料に対して甘味が感じられた場合、その組換え植物において産生されたミラクリンは活性を有すると判断することができる。
レタスやトマトなどは、栽培技術や流通技術が非常に発達しており、世界中のどこの地域でも安定して周年生産が可能である。従ってこれらは、ミラクリンを生産する組換え植物の宿主としては極めて適している。逆に言うと、栽培の容易さの点では、ミラクリン遺伝子を導入する植物は、ミラクルフルーツ（Ｒｉｃｈａｄｅｌｌａ  ｄｕｌｃｉｆｉｃａ）のように特定の地域以外では栽培が難しい植物ではない方がよい。しかしながら、ミラクリン遺伝子を導入して発現させる有用植物は、これらに制限されず、食材となりうる全ての植物を含める。
ところで本発明者らは、後述の実施例にも示される通り、ミラクリン遺伝子を２倍体植物に導入して得られる２倍体の形質転換（トランスジェニック）植物が、特に高いミラクリン産生能を有することも見出した。本発明者らは、ミラクリン遺伝子が導入された２倍体植物が、活性のある二量体形態でミラクリンを蓄積すること、及びそのミラクリンが甘味誘導活性を有することを確認した。さらに本発明者らは、ミラクリン遺伝子が導入された２倍体植物細胞では、発現量の低下が起こりにくいことも見出した。このことから、２倍体の植物が、ミラクリン遺伝子を高発現させるために特に適していることが判明した。ミラクリン遺伝子が導入された２倍体のトランスジェニック植物は、活性のあるミラクリンを安定的に大量に産生できるため、ミラクリンの大規模生産用には特に有用である。
栽培の容易性の点からは、ミラクリン遺伝子を導入する２倍体植物として、２倍体の作物植物（栽培種）を用いることがなお好適である。上記２倍体植物としては、限定するものではないが、例えばトマト、キャベツ、ハクサイ、イネ、トウモロコシ、ダイズ等の２倍体が挙げられる。
動物では、２倍体よりも多い染色体数を有する倍数体は、両生類や魚類の一部の例を除いてほとんど知られていない。しかし植物では、同一種内で複数種の倍数体が存在することがしばしば知られている。植物の倍数体は、果実が大きくなるなどの栽培上有利な形質を生じうるため、作物として有利に用いられているものが多い。現在利用されている倍数体の作物植物には天然のものもあれば人為的に作製されたものもある。作物植物の倍数性の例としては、コムギの２倍体品種（染色体のセットを２組もつ）の他に、４倍体品種（染色体のセットを４組もつ）、６倍体品種（染色体のセットを６組もつ）がある。一方、サツマイモの栽培種は６倍体、栽培タバコは異質４倍体（異種のゲノム２セットずつが組み合わさって生じた倍数体；複２倍体とも呼ばれる）である。しかしながら、本発明において、ミラクリンの高効率な組換え生産を行う目的では、ミラクリン遺伝子を導入する植物は、上記の通り、倍数体（例えば、４倍体、６倍体や複２倍体）ではなく、２倍体であることが好ましい。本発明において「２倍体」とは、ゲノム（１セットの染色体）を２組有する植物を意味する。
本発明では、ミラクリン高発現性トランスジェニック植物を作製する上では、２倍体植物にミラクリン遺伝子を導入し、さらに２倍体植物を選抜することにより、確実に２倍体のトランスジェニック植物を得ることがより好ましい。これは、ミラクリン遺伝子を２倍体植物細胞に導入しても、継代培養などの細胞培養工程において染色体が４倍体などに自然倍加してしまうことがしばしばあるためである（実施例参照）。２倍体植物を選抜するためには、ミラクリン遺伝子が導入された細胞をマーカー選択などにより選択的に増殖させ、場合によっては植物体まで生長させて、その植物細胞（植物体の場合は、葉、根などの細胞が好ましい）について、当業者に公知の倍数性検定法によって倍数性を判定し、２倍体である細胞を選択することが好ましい。限定するものではないが、例えば、目的の植物体の葉由来の細胞について、フローサイトメーター（例えば、パルテック社のフローサイトメーター）を用いて倍数性の検定を行うことができる。この場合、倍数性が既知である植物体由来のサンプルをコントロールとしてそのピークと比較することにより、ミラクリン遺伝子を導入した植物体の倍数性を判定することができる。このような、２倍体植物にミラクリン遺伝子を導入し、遺伝子導入された植物体から２倍体植物を選抜することを含むミラクリン高発現性のトランスジェニック植物の製造方法も、本発明には含まれる。
本明細書において用語「トランスジェニック植物」、「組換え植物」及び「（植物の）形質転換体」は、ミラクリン遺伝子が外来遺伝子として導入されている植物を指すために互換的に使用される。本明細書において「トランスジェニック植物」、「組換え植物」及び「（植物の）形質転換体」は、植物体だけでなく、導入遺伝子を発現しているか又は発現しうる状態で保持している植物細胞、並びにその植物細胞を含む器官［例えば葉、花、茎、根、種子等］、組織［例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束、柵状組織、海綿状組織等］、及び培養細胞（例えばカルス）なども意味する。本発明の「トランスジェニック植物」、「組換え植物」及び「（植物の）形質転換体」には、遺伝子導入した植物細胞又はそれを含むカルスから再生させた植物体の、子孫個体及びその一部も包含される。
一旦、ミラクリンを生産する組換え植物が作出されれば、その繁殖材料（例えば、果実、種子など）は容易に得ることができる。さらに、得られた繁殖材料を基にミラクリンを生産する組換え植物を量産することが可能となる。また、ミラクリンを生産する組換え植物からは、当業者には周知のタンパク質抽出精製法を用いて、大量のミラクリンタンパク質を取得することができる。従って本発明は、組換え植物からミラクリンを含むタンパク質を抽出し、好ましくはさらにミラクリンを分離することにより、ミラクリンを大量生産する方法にも関する。
３．飲食品及び医薬品
本発明は、本発明の組換え植物が生産したミラクリンを含有する飲食品、食品添加物にも関する。本発明はまた、本発明の組換え植物が生産したミラクリンを有効成分として含む医薬品にも関する。
本発明の組換え植物が生産するミラクリンは、食味修飾活性として酸味を甘味に変える活性を有する。従って、本発明の組換え植物が生産するミラクリンを含有する飲食品、食品添加物、又は医薬品（治療薬、予防薬又は生活改善薬など）は、限定するものではないが、例えば、糖尿病の予防や糖尿病患者の治療効果の促進のため（例えば、食事療法におけるストレス緩和のため）に有用である。
本発明の導入されたミラクリン遺伝子が発現している組換え植物は、その植物体自体を食品として利用してもよいし、植物体の一部を食品又は食品添加物として使用してもよいし、植物体若しくは植物体の一部（葉など）から抽出したミラクリン若しくはミラクリンを含むタンパク質画分を飲食品、食品添加物又は医薬品として使用してもよい。本発明の組換え植物が生産するミラクリンを含有する飲食品、食品添加物及び医薬品に関する本発明の１つの態様は、ミラクリンを発現している本発明の組換え植物の植物体、その組換え植物の植物体の一部（葉や種子など）、又はその植物体若しくは植物体の一部から抽出したミラクリン含有タンパク質を含む、飲食品、食品添加物又は医薬品である。
本明細書において「飲食品」とは、限定するものではないが、飲料、食品及び機能性食品を包含する。本発明の飲食品には、本発明の組換え植物が生産するミラクリンに加えて、酸味材料（レモン汁、クエン酸など）を添加することが好ましい。ミラクリンは酸味を甘味に変える性質を持っていることから、本発明の飲食品は、酸味材料を添加する代わりに、糖分含量を減らしたものであることが好ましい。本発明の組換え植物が生産するミラクリンを添加する飲食品は、特に限定されない。例えば飲料として果物・野菜系飲料（オレンジ、りんご、ぶどうなどの果汁や、トマト、ニンジンなどの野菜汁を含む飲料）、アルコール性飲料（ビール、発泡酒、ワインなど）、炭酸飲料及び清涼飲料、発酵乳（ヨーグルトなど）、乳酸菌飲料、乳飲料（コーヒー牛乳、フルーツ牛乳など）、お茶系飲料（緑茶、紅茶及びウーロン茶など）等の飲料を例示することができる。各種飲料の製造法等については、既存の参考書、例えば「最新・ソフトドリンクス」（２００３）（株式会社光琳）等を参考にすることができる。
本発明の組換え植物が生産するミラクリンを添加する食品は、特に限定されず、生鮮食品であってもよいし、加工食品であってもよい。例えば、プリン、ゼリー、アイスクリーム類、ケーキ、キャンディ、パスタ、うどん、かまぼこ、ハム、しょう油、ドレッシング、マヨネーズ、豆腐、スープ、パン、魚の切り身、加工肉、野菜、きのこなどの様々な食品を例示することができる。
本発明の組換え植物が生産するミラクリンを含有する飲食品として、機能性食品はとりわけ好ましい。本発明の「機能性食品」は、生体に対して一定の機能性を有する食品を意味し、例えば、特定保健用食品（条件付きトクホ［特定保健用食品］を含む）及び栄養機能食品を含む保健機能食品、特別用途食品、栄養補助食品、健康補助食品、サプリメント（例えば、錠剤、被覆錠、糖衣錠、カプセル及び液剤などの各種剤形のもの）及び美容食品（例えばダイエット食品）などのいわゆる健康食品全般を包含する。本発明の機能性食品はまた、コーデックス（ＦＡＯ／ＷＨＯ合同食品規格委員会）の食品規格に基づく健康強調表示（Ｈｅａｌｔｈ  ｃｌａｉｍ）が適用される健康食品を包含する。
本発明の機能性食品として好ましいより具体的な例には、病者用食品、妊産婦・授乳婦用粉乳、高齢者用食品等の特別用途食品がある。
本発明の組換え植物が生産するミラクリンを含有する機能性食品の好ましい例として、保健機能食品が挙げられる。保健機能食品制度は、通常の食品のみならず錠剤、カプセル等の形状をした食品を対象としている。この制度の下、保健機能食品は、特定保健用食品（個別許可型）と栄養機能食品（規格基準型）の２種類の類型からなる。さらに、条件付きトクホ［特定保健用食品］等の新たな類型もある。
本発明の機能性食品は、酸味を甘味に変える活性を有する。従って本発明の機能性食品は、肥満に悩む人や糖尿病を患う人が食事療法を行う際に糖分を摂取しなくても甘味を味わえるようにするため、肥満や糖尿病の治療効果を生活面から促進する効果がある。本発明の機能性食品（好ましくは、特定保健用食品又は条件付きトクホ［特定保健用食品］）は、糖分摂取を無理なく抑制できることについて、記載又は表示したものであってよい。そのような記載又は表示は、保健機能食品制度において定められた規定に基づいて表示承認されたものでありうる。例えば本発明の機能性食品においては、「糖分摂取量の抑制に役立つ」「痩せたい人の食生活改善に役立つ」などの記載が考えられる。
本発明の機能性食品は、錠剤、顆粒剤、散剤、丸剤、カプセル剤などの固形製剤、液剤、懸濁剤、シロップ剤などの液体製剤、あるいはジェル剤などの製剤の形状であってもよいし、通常の飲食品の形状（例えば、飲料、粉状茶葉、菓子など）であってもよい。
本発明の組換え植物が生産するミラクリンの飲食品における含量は特に限定されず、場合に応じて様々であってよい。具体的な含量は、飲食品の種類や求める味や食感を考慮して、当業者が適宜定めることができる。しかし通常は、本発明の組換え植物が生産するミラクリンの量が、０．００１〜１００重量％、特に０．１〜１００重量％となるような含量が適当である。
本発明の飲食品の製造においては、飲食品に慣用的に使用されるような各種添加物を使用してもよい。添加物としては、限定するものではないが、発色剤、着色料、香料、保存料、乳化剤、酸化防止剤、ｐＨ調整剤、化学調味料、増粘剤、消泡剤、結着剤等が挙げられる。さらに、オタネニンジンエキス、エゾウコギエキス、ユーカリエキス、杜仲茶エキス等の機能性素材をさらに添加してもよい。
本発明の飲食品は、糖分の摂取を無理なく低減させたいヒト、家畜、愛玩動物、実験（試験）動物等を含む哺乳動物が摂取するためのものであることが好ましい。特に、痩せたい人、肥満の人、及び糖尿病患者などの、糖分の摂取を無理なく低減させることが望まれる人が、本発明の飲食品を摂取する対象として好ましい。太りやすい人及び糖尿病予備軍なども、本発明の飲食品を摂取する対象として好ましい。
本発明は、本発明の組換え植物が生産するミラクリンを含む食品添加物にも関する。本発明の食品添加物には、ミラクリンの他に、慣用的に使用されている各種添加物がさらに添加されていてもよい。本発明の食品添加物は、上記のような本発明の組換え植物が生産するミラクリンを含む飲食品を製造するために使用できる。
本発明は、本発明の組換え植物が生産するミラクリンを有効成分として含有する、医薬品にも関する。
本発明の医薬品には、製薬上許容される担体又は添加物を配合してもよい。このような担体及び添加物の例として、水、製薬上許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ペクチン、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、パラフィン、ステアリルアルコール、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ラクトース、医薬添加物として許容される界面活性剤などの他、リポゾームなどの人工細胞構造物などが挙げられる。使用される添加物は、製剤の剤形に応じて適宜又は組み合わせて選択される。本発明の医薬品は、さらに他の薬理成分を含有していてもよい。
本発明の医薬品は、基本的には経口製剤である。本発明の医薬品は、口腔内で作用させる必要があることから、錠剤、顆粒剤、散剤、丸剤、バッカル剤、トローチ剤などの固形製剤、ジェル剤、あるいは液剤、懸濁剤、シロップ剤などの液体製剤等の剤形であってよい。
上記経口固形製剤には、製薬上一般に使用される結合剤、賦形剤、滑沢剤、崩壊剤、湿潤剤などの添加剤を含有してもよい。また、経口液体製剤は、製薬上一般に使用される安定剤、緩衝剤、矯味剤、保存剤、芳香剤、着色剤などの添加剤を含有してもよい。
本発明の医薬品の投与量は、投与対象の年齢及び体重、投与経路、投与回数により異なり、当業者の裁量によって広範囲に変更することができる。
本発明の医薬品を投与する対象は、糖分の摂取を無理なく低減させたいヒト、家畜、愛玩動物、実験（試験）動物等を含む哺乳動物であることが好ましい。特に、痩せたい人、肥満の人、及び糖尿病患者などの、糖分の摂取を無理なく低減させることが望まれる人が、対象として好ましい。太りやすい人及び糖尿病予備軍なども対象として好ましい。
本発明の「医薬品」の好適な１つの具体例としては、糖尿病治療薬が挙げられる。この糖尿病治療薬には、例えば糖尿病予防改善剤が含まれる。この糖尿病予防改善剤には、食事療法におけるストレスを緩和する糖尿病患者のための生活改善剤を包含する。あるいは、本発明の「医薬品」の好適な別の具体例としては、肥満治療薬が挙げられる。この肥満治療薬には、例えば肥満予防改善剤が含まれる。この肥満予防改善剤には、食事療法におけるストレスを緩和する肥満患者のための生活改善剤を包含する。本明細書において「予防改善剤」とは、当該疾患の発症を予防する効果及び／又は疾患の症状等を改善する効果の両方を示す医薬品を意味する。
【実施例】  以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
実施例１：ミラクリン遺伝子のクローニングとシークエンス解析
本実験では、ミラクリン遺伝子をクローニングする材料としてミラクルフルーツとその葉を用い、以下の方法により遺伝子を獲得した。ミラクルフルーツとその葉からフェノール−ＳＤＳ法を用いて全ＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲハイキット（Ｔｏｙｏｂｏ）を用いてｃＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡを鋳型にして、ミラクリン遺伝子のｃＤＮＡ情報（Ｍａｔｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）に基づいて設計した２つの特異的プライマー（制限酵素ＸｂａＩサイトを付加したセンスプライマー５’−ＴＴＴＴＣＴＡＧＡＡＴＧＡＡＧＧＡＡＴＴＡＡＣＡＡＴＧＣＴ−３’（配列番号３）と制限酵素ＳａｃＩサイトを付加したアンチセンスプライマー５’−ＴＴＴＧＡＧＣＴＣＴＴＡＧＡＡＧＴＡＴＡＣＧＧＴＴＴＴＧＴ−３’（配列番号４））を用い、ミラクリンｃＤＮＡをＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲは、９５℃で５分間の熱変性のあと、９５℃で１分間、５７℃で１分間、７２℃で２分間を１サイクルとして４０サイクル行った。ＰＣＲ産物は、ＸｂａＩとＳａｃＩで切断し、ｐＵＣ１９にサブクローニングした（ｐＵＣＭＲＬ１９）。クローン化した断片は、ＤＮＡシークエンサーＡＢＩ３１０とＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ  Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｃｙｃｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅ  ＭＳ，Ｔｏｋｙｏ）を用いて、塩基配列の決定を行い、データベース上の登録配列（ＤＤＢＪアクセッション番号Ｄ３９５９８）と同一であることを確認した。クローン化断片の塩基配列上の、ミラクリン遺伝子の開始コドンから終止コドンまでの配列を配列番号１に示す。配列番号１の塩基配列にコードされるミラクリンタンパク質のアミノ酸配列を配列番号２に示す。
実施例２：植物発現ベクターの構築とアグロバクテリウムへの導入
ｐＵＣＭＲＬ１９プラスミドを保持する大腸菌（ＪＭ１０９）からプラスミドを常法に従って抽出した。このプラスミドからミラクリン遺伝子部分を制限酵素ＸｂａＩとＳａｃＩで切り出し、植物発現用のバイナリーベクターｐＥＩ１２１とｐＢＩ１２１のＣａＭＶ３５Ｓプロモーター領域を改変したベクター（高発現ベクター）のＧＵＳ遺伝子部分にクローニングした。このプラスミドをｐＢＩ３５ＳＭＩＲとｐＢＩＥＬ２ΩＭＩＲとした（図１）。このプラスミドを保持する大腸菌ＪＭ１０９は、抗生物質カナマイシン１００ｍｇ／Ｌを含むＬＢ培地で培養して維持した。続いて、この２つのプラスミドをそれぞれアグロバクテリウムＧＶ２２６０にエレクトロポレーション法により形質転換した。この形質転換したアグロバクテリウムＧＶ２２６０（ｐＢＩ３５ＳＭＩＲ又はｐＢＩＥＬ２ΩＭＩＲを導入）は、カナマイシン１００ｍｇ／Ｌを含むＬＢ培地で培養して維持した。
実施例３：レタス組換え体の作成
ｐＢＩ３５ＳＭＩＲ又はｐＢＩＥＬ２ΩＭＩＲを保持するアグロバクテリウムＧＶ２２６０を用いてリーフディスク法により、レタス（品種：カイザー、２倍体品種）にミラクリン遺伝子を導入した。形質転換したアグロバクテリウムを１００ｍｇ／Ｌカナマイシンを含んだＬＢ培地中で一晩振とう培養し、遠心洗浄の後、アセトシリンゴン２００μＭとメルカプトエタノール１０μＭを含むＭＳ液体培地にＯＤ６００が０．１になるように懸濁した。このアグロバクテリウム菌液には種蒔して５日目の無菌のレタス葉切片を浸漬させた。アグロバクテリウムを感染させたレタス葉切片は、１ｍｇ／Ｌベンジルアデニン（ＢＡ）、０．１ｍｇ／Ｌ  １−ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）を含むＭＳ培地で３日間共存培養した。その後、０．１ｍｇ／Ｌ  ＢＡ、０．１ｍｇ／Ｌ  ＮＡＡ、１００ｍｇ／Ｌカナマイシンを含む選抜ＭＳ培地に移し、２週間ごとに培地を交換しながら培養した。分化してきたシュートを０．０１ｍｇ／Ｌ  ＢＡ、０．０５ｍｇ／Ｌ  ＮＡＡ、５０ｍｇ／Ｌカナマイシンを含むＭＳ培地に移し、１〜３ｃｍぐらいに伸びたシュートを５０ｍｇ／Ｌカナマイシンを含む発根ＭＳ培地に移した。この培地で根を形成した個体から形質転換個体を選抜した。
実施例４：組換えレタスの解析
発根培地で根を形成した４０個体の形質転換体の葉からゲノムＤＮＡを抽出した。得られたゲノムＤＮＡ  １０μｇをＸｂａＩで切断し、ミラクリンコード領域のＰＣＲ増幅断片を３２Ｐ標識したプローブを用いてサザンブロット解析を行った。その結果、いずれの個体からもシグナルが見られ、ミラクリン遺伝子が導入されていることが確かめられた（図２）。続いて、ミラクリン遺伝子の導入が確認された個体から１９個体をランダムに選びノーザン解析を行った（図３）。その結果、調べた１９個体のうち１３個体でミラクリン遺伝子が発現していることが確認された。次に、ノーザン解析を行った結果ミラクリン遺伝子からのｍＲＮＡ発現の確認された個体について、実施例５で作成したミラクリン認識特異抗体を用いてウエスタン解析を行った（図４）。その結果、ノーザン解析で強い発現をしていた組換え体ではタンパク質レベルでもミラクリンが強く発現していることが確かめられた。
実施例５：ミラクリン認識特異抗体の作成
抗原用のタンパク質を調製するために制限酵素ＢａｍＨＩサイトを付加したセンスプライマー５’−ＴＡＧＧＡＴＣＣＧＡＴＴＣＧＧＣＡＣＣＣＡＡＴＣＣＧＧＴＴ−３’（配列番号５）と制限酵素ＳａｃＩサイトを付加したアンチセンスプライマー５’−ＴＴＴＧＡＧＣＴＣＴＴＡＧＡＡＧＴＡＴＡＣＧＧＴＴＴＴＧＴ−３’（配列番号４）を用いて、ｐＵＣ１９にサブクローニングした全長のミラクリンｃＤＮＡ（ｐＵＣＭＲＬ１９）を鋳型にしてＰＣＲを行った。そのＰＣＲ産物（アクセッション番号Ｄ３８５９８で得られるミラクリン遺伝子のｃＤＮＡ配列の９４−６６９番目の塩基を含む）を制限酵素ＢａｍＨＩとＳａｃＩで処理し、同じ制限酵素で処理したＮ末に６×Ｈｉｓタグをコードする配列を付加することができる大腸菌発現用ベクターｐＱＥ３０（Ｑｉａｇｅｎ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，Ｃａｌｉｆ）にクローニングした（ｐＱＥＭＲＬ３０）。ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）により発現を誘導した融合タンパク質はＨｉｓ−Ｔｒａｐカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，ＵＫ）で精製した。この精製した融合タンパク質を抗原としウサギに免疫して抗血清を得た（Ｓｃｒｕｍ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）。抗血清から抗原特異的抗体を精製するために制限酵素ＢａｍＨＩサイトを付加したセンスプライマー５’−ＴＡＧＧＡＴＣＣＧＡＴＴＣＧＧＣＡＣＣＣＡＡＴＣＣＧＧＴＴ−３’（配列番号５）と制限酵素ＸｈｏＩサイトを付加したアンチセンスプライマー５’−ＴＴＣＴＣＧＡＧＧＡＡＣＧＣＣＧＡＧＡＡＡＴＴＧＡＴＧＴＴ−３’（配列番号６）を設計し、ｐＵＣ１９にサブクローニングした（ｐＵＣＭＲＬ１９）全長のミラクリンｃＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲを行った。そのＰＣＲ産物（ミラクリン遺伝子の９４−３６０番目の塩基を含む）を制限酵素ＢａｍＨＩとＸｈｏＩで処理し、同じ制限酵素で処理したＮ末にＧＳＴ（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）をコードする配列を付加する大腸菌発現用ベクターｐＧＥＸ４Ｔ−１（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，ＵＫ）にクローニングした（ｐＧＥＸＭＲＬ）。ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）により発現を誘導した融合タンパク質はＧＳＴ−トラップカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，ＵＫ）で精製した。この精製した融合タンパク質をＣＮＢｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ  ｃｏｌｕｍｎ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，ＵＫ）にカップリングさせたアフィニティカラムを用いて抗血清から抗原特異的抗体を精製した。
実施例６：組換えレタスが生産するミラクリンのバイオアッセイ
実施例４でミラクリンの発現が確認された組換えレタスの葉１０ｇを水でよく洗浄し、口の中でよく噛んで５分間舌になじませてから吐き出し、脱イオン水で口の中を洗って、０．０２Ｍのクエン酸を味わい、その甘さと０．１〜１Ｍのショ糖標準液の甘さを比較することによりバイオアッセイを行った。また、ミラクリンの発現が確認された組換えレタスの葉１０ｇに０．５Ｍ  ＮａＣｌ  １０ｍＬを加えてタンパク質を抽出し、０．０１Ｍ  ＮａＨＣＯ３溶液に透析した溶液をテストに用いた。甘味誘導活性の評価は、５ｍＬのタンパク質溶液を口の中で５分間含み舌によくなじませた後吐き出し、脱イオン水で口をすすいで０．０２Ｍのクエン酸を味わい、その甘味の強さを０．１〜１Ｍのショ糖標準液の甘さと比較することにより行った。
さらに、実施例４においてミラクリンの発現が確認された組換えレタス及びミラクリン遺伝子を導入していない非組換えレタスのそれぞれの葉２ｇを、上記と同様に、水でよく洗浄し、口の中でよく噛んで、５分間舌になじませてから吐き出し、脱イオン水で口の中を洗って、０．０２Ｍのクエン酸を味わい、その甘さと０．１〜１Ｍのショ糖標準液の甘さを比較することによりバイオアッセイを行った。比較のために、ミラクルフルーツ１個の皮を剥きその果実を５分間舌になじませてから吐き出し、脱イオン水で口の中を洗ってから、０．０２Ｍのクエン酸を味わい、その甘さと０．１〜１Ｍのショ糖標準液の甘さを比較した。この結果を表１に示す。
【表１】
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表１中、被験者が同等の甘さであると感じたショ糖の濃度が大文字Ｏで示されている。このように、レタスで発現させたミラクリンは、ミラクルフルーツに含まれるミラクリンと同程度の強さの甘味誘導活性を示した。なお組換えレタスでは、世代が進むと、ミラクリンの発現量が低下する傾向にあった。
実施例７：組換えトマトの作製
実施例１及び２で作製したｐＢＩ３５ＳＭＩＲと、ｐＢＩＥＬ２ΩＭＩＲを保持するアグロバクテリウムＧＶ２２６０を用いて、リーフディスク法により、トマト（品種：Ｍｏｎｅｙｍａｋｅｒ、２倍体品種）にミラクリン遺伝子を導入した。形質転換したアグロバクテリウムを１００ｍｇ／Ｌ  カナマイシンを含んだＬＢ培地中で一晩振とう培養し、遠心洗浄の後、アセトシリンゴン２００μＭとメルカプトエタノール１０μＭを含むＭＳ液体焙地にＯＤ６００が０．１になるように懸濁した。このアグロバクテリウム菌液に種まきして７日目の無菌のトマト子葉切片を浸漬させた。アグロバクテリウムを感染させたトマト葉切片は、１．５ｍｇ／Ｌ  ゼアチン（Ｚｅａｔｉｎ）を含むＭＳ培地で３日間共存培養した。その後、１ｍｇ／Ｌ  ゼアチン、１００ｍｇ／Ｌカナマイシンを含む選抜ＭＳ培地に移し、２週間ごとに培地を交換しながら培養することにより伸びたシュートを５０ｍｇ／Ｌカナマイシンを含む発根ＭＳ培地に移した。この培地で根を形成した個体から形質転換個体を選抜した。
発根ＭＳ培地で根を形成した形質転換個体の葉からゲノムＤＮＡを抽出しサザン解析を行い、導入遺伝子を検定した（図５）。その結果、調べたいずれの個体からもシグナルが見られ、ミラクリン遺伝子が導入されていることが確かめられた。ミラクリン遺伝子が導入されたトランスジェニックトマトについては、フローサイトメーター（パルテック社）を用いて、倍数性の検定を行った。
続いて、ミラクリン遺伝子の導入が確認された個体の葉からタンパク質を抽出し、実施例５で作製したミラクリン特異抗体を用いて、常法によりウェスタン解析を行った。非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った後にウェスタンブロット解析を行った結果を図６に示す。図６中、レーン１１Ａ、２０−１、及び１４−３は、フローサイトメーターでの測定により４倍体であることが示された個体由来のサンプルであった。それ以外のレーンのサンプルは、いずれも２倍体個体由来のサンプルであった。そして、２倍体のトランスジェニックトマト由来のサンプル全てについて、活性型とされる二量体のサイズのミラクリンタンパク質が検出された。一方、４倍体のトランスジェニックトマトである系統１１Ａ及び２０−１にそれぞれ由来するサンプルについては、ミラクリンは全く検出されなかった。４倍体のトランスジェニックトマトである系統１４−３由来のサンプルについてはミラクリンの発現自体は確認されたが、その発現量は２倍体の場合と比較して半分以下であり、大幅に少なかった。一方、２倍体のトランスジェニックトマト由来のサンプルについて、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った後にウェスタンブロット解析を行った結果を図７に示す。図７では単量体のサイズのミラクリンが検出された。還元条件下では二量体が分離して単量体になると考えられることから、図７からは、二量体を形成したミラクリンがトランスジェニックトマトで産生されたことが示された。これらの結果に示されるように、組換え（トランスジェニック）トマトでの強いミラクリンの発現が確認された。
上記でミラクリンの発現が確認されたトランスジェニックトマト及びミラクリン遺伝子を導入していない非組換えトマトのそれぞれの果実２ｇを水でよく洗浄し、口の中でよく噛んで５分間舌になじませてから吐き出し、脱イオン水で口の中を洗って、０．０２Ｍのクエン酸を味わい、その甘さと０．１〜１Ｍのショ糖標準液の甘さを比較することによりバイオアッセイを行った。さらなる比較のために、ミラクルフルーツ１個の皮を剥きその果実を５分間舌になじませてから吐き出し、脱イオン水で口の中を洗ってから、０．０２Ｍのクエン酸を味わい、その甘さと０．１〜１Ｍのショ糖標準液の甘さを比較した。この結果の一例を表２に示す。
【表２】
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表２中、被験者が同等の甘さであると感じたショ糖の濃度が大文字Ｏで示されている。このように、トマト（ここでは２倍体）で発現させたミラクリンは、ミラクルフルーツに含まれるミラクリンと同程度の強さの甘味誘導活性を示した。
一方、４倍体に倍加したトランスジェニック（組換え）トマト系統１４−３の果実を用いた場合には、クエン酸について感じた甘味はごく弱いものであり、その甘味誘導活性はかなり低いと考えられた。
実施例８：組換えシロイヌナズナの作製
ミラクルフルーツから、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  ｍＲＮＡ  ＤＩＲＥＣＴ  Ｋｉｔ（ＤＹＮＡＬ社製；Ｐｒｏｄ  Ｎｏ．６１０．１１＆６１０．１２）を使用してｍＲＮＡを抽出し、それを鋳型として、Ｓｕｐｅｒ  Ｓｃｒｉｐｔ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ＲＴ−ＰＣＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製；Ｃａｔ．Ｎｏ．１１９０４−０１８）を使用して逆転写反応によりｃＤＮＡを作製した。
得られたｃＤＮＡを鋳型とし、ＰＣＲによりミラクリン遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。具体的には、ＰＣＲ用のプライマーセットとして、シグナル様配列を含めたミラクリンタンパク質をコードする領域を増幅するプライマーセットＭ１、及びシグナル様配列を含まないが、メチオニンをコードするＡＴＧを付加したミラクリンタンパク質部分をコードする領域を増幅するプライマーセットＭ２の２セットを設計した（図８）。これらのプライマーにはクローニング用アダプターを付加した（図８）。
・プライマーセットＭ１：下線部はシグナル様ペプチドコード配列の５’末端側配列、増幅サイズは７５３ｂｐ）
フォワードプライマーＭＮ１：５’−ＡＴＴＡＣＡＴＴＴＴＡＣＡＴＴＣＴＡＣＡＡＣＴＡＣＡＴＣＴＡＧＡＧＧＣＣＡＡＡＴＣＧＧＣＣａｔｇａａｇｇａａｔｔａａｃ  ａａｔｇｃｔｃｔｃｔ−３’（配列番号７）［大文字：アダプター配列］
リバースプライマーＭＣ１：５’−ＣＧＡＧＣＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧＡＧＧＣＣＣＴＴＡＴＧＧＣＣｔｔａｇａａｇｔａｔａｃｇｇｔｔｔｔｇｔｔｇａａｃ−３’（配列番号８）［大文字：アダプター配列］
・プライマーセットＭ２（シグナル様ペプチドコード配列を含まない；増幅サイズは６６９ｂｐ）
フォワードプライマーＭＮ２：５’−ＡＴＴＡＣＡＴＴＴＴＡＣＡＴＴＣＴＡＣＡＡＣＴＡＣＡＴＣＴＡＧＡＧＧＣＣＡＡＡＴＣＧＧＣＣＡＴＧｇａｔｔｃｇｇ  ｃａｃｃｃａａｔｃｃｇｇｔ−３’（配列番号９）［大文字：アダプター配列］
リバースプライマーＭＣ１：５’−ＣＧＡＧＣＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧＡＧＧＣＣＣＴＴＡＴＧＧＣＣｔｔａｇａａｇｔａｔａｃｇｇｔｔｔｔｇｔｔｇａａｃ−３’（配列番号８）［大文字：アダプター配列］
用いたＰＣＲ反応液組成は、総量３０μｌ当たり、プライマーセットＭ１又はＭ２の各プライマー１５ｐＭ、ｃＤＮＡ３μｌ、１０×ＰＣＲバッファー３μｌ、ｄＮＴＰｓ  ３μｌ、ポリメラーゼ酵素０．３μｌ、滅菌水２０．４μｌ（１０×ＰＣＲバッファー、ｄＮＴＰｓ、ポリメラーゼ酵素はＴＯＹＯＢＯ  ｒＴａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｏｄｅ；ＴＡＰ−２１１を使用）であった。ＰＣＲ反応は、９５℃で５分の熱変性の後、９４℃で０．５分の変性、６１℃で０．５分のアニーリング、７２℃で１分の伸長を１サイクルとして４０サイクル行った。
得られたＰＣＲ産物を電気泳動し、増幅産物の大きさを確認した。図９に示す通り、プライマーセットＭ１、Ｍ２とも、上記増幅サイズに適合するバンドを確認できた。次いで、これらのバンドのＰＣＲ増幅断片を切り出し、常法により精製を行った。精製後のこれらのＰＣＲ断片は、それぞれ、発現ベクターｐＢｉｇｓ２１１３ＳＦ（ｐＢＩＧ２１１３Ｎに２つのＳｆｉＩサイトを付加したもの。Ｔａｊｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｊ２９，４１７−４２６参照）中へ挿入した（図１０）。得られた組換え発現ベクターを、次にエレクトロポレーションにより、大腸菌コンピテントセル（ＤＨ１０Ｂ株）に遺伝子導入した。５０ｍｇ／Ｌカナマイシン存在下で陽性コロニーを単離し、それを鋳型にプライマーセットＭ１又はＭ２を用いたコロニーＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物を電気泳動した。プライマーセットＭ１及びＭ２のそれぞれについて、それらの増幅サイズと一致するサイズのインサートが挿入された発現ベクターを有するコロニーが確認された。
目的のサイズのインサートが挿入されていたコロニーを掻き取り、培地でサブカルチャーした後、常法により大腸菌プラスミドを抽出した。これらのプラスミドのインサートを配列決定したところ、プライマーセットＭ１、Ｍ２ともに、ミラクリン遺伝子の塩基配列から予測される増幅断片の配列と一致することが確認された。
これらの大腸菌プラスミドを、エレクトロポレーションにより、アグロバクテリウムＧＶ３１０１株中に形質転換した。この形質転換体は、５０ｍｇ／Ｌ  カナマイシンを含むＬＢ培地で選択的に培養した。
続いて、得られたアグロバクテリウム形質転換体を用いて、フローラルディッピング法により、アグロバクテリウムを介してシロイヌナズナへ遺伝子を導入した。具体的には、文献（Ｃｌｏｕｇｈら，１９９５，Ｐｌａｎｔ  Ｊ  １６，７３５−７４３）に記載の方法に従い、形質転換したアグロバクテリウムを５０ｍｇ／Ｌカナマイシンを含んだＬＢ培地中で一晩振とう培養した後、菌を遠心して回収し、５％ショ糖を含むＭＳ液体培地に懸濁後、その懸濁液に、播種して約１．５ヶ月経過したシロイヌナズナ野生型Ｃｏｌ−０（２倍体）の地上部全体を浸して感染させた。その後、ジッパー付の袋にシロイヌナズナを入れ、密封して１日、ジッパーを開封して１日置き、その後袋から出し、種子が収穫できるまで生育させた。
こうして処理したシロイヌナズナから種子（Ｔ１）を収穫し、これをＢＡＭ培地に播種し、２０ｍｇ／Ｌハイグロマイシン及び１００ｍｇ／Ｌセフォタキシムナトリウムによる薬剤選抜を行った。その結果、プライマーセットＭ１による増幅産物を用いた形質転換体（以下、Ｍ１群と称する）が９個体（Ｍ１−１、Ｍ１−２、Ｍ１−３、Ｍ１−４、Ｍ１−５、Ｍ１−６、Ｍ１−７、Ｍ１−８、Ｍ１−９）、プライマーセットＭ２による増幅産物を用いた形質転換体（Ｍ２群と称する）が６個体（Ｍ２−１、Ｍ２−２、Ｍ２−３、Ｍ２−４、Ｍ２−５、Ｍ２−６）得られた。これらの形質転換体（Ｔ１個体）は、その後、土へ移植し、生育させた。
葉が大きくなるまで生長させた後、各個体から２〜３枚の葉（１００ｍｇ程度）をサンプリングした。Ｍ１群由来の葉サンプル及びＭ２群由来の葉サンプルは、群毎にひとまとめにし、それを用いて、６人の被験者により味覚試験を行った。被験者はレモン汁を口に含んでその酸味を確認した。その後被験者は、口内を洗浄した後、葉サンプルを口の中で約１分間よく噛んで吐き出し、再度レモン汁を舐めた。その結果、６人の被験者は、全員一致して同じ味覚の変化を確認した。Ｍ１群のＴ１個体については、全員が、葉サンプルを噛んだ後に舐めたレモン汁に甘味を感じた。対照的に、Ｍ２群のＴ１個体については、全員が、葉サンプルを噛んだ後に舐めたレモン汁の味に変化を感じなかった。従って、Ｍ１群の植物体には多量のミラクリンタンパク質が活性状態で含まれていることが確認された。一方、Ｍ２群の植物体には、味覚の変化での確認ができなかったため、ミラクリンタンパク質は含量が少ないか、活性が弱いかのどちらかと考えられた。
次に、上記で得られたＭ１群の形質転換体について、個体毎に種子を収穫し、各個体（ライン）当たり５０粒ずつの種子を含むＢＡＭ培地に播種し、２０ｍｇ／Ｌハイグロマイシン及び１００ｍｇ／Ｌセフォタキシムナトリウムによる薬剤選抜を行った。選抜された形質転換体（Ｔ２個体）を、各ライン当たり４〜９個体ずつ土に移植し、生育させた。
葉が大きくなるまで生長させた後、これらのＴ２個体から、２〜３枚の葉（１００ｍｇ程度）をサンプリングした。サンプリングした葉は、ライン毎に１つにまとめて、味覚の変化を確認した。確認には酸味材料としてレモン汁を使用し、上記と同様にして行った。
この結果、ラインＭ１−４、Ｍ１−９、Ｍ１−２、Ｍ１−５由来のサンプルについて、被験者は、葉サンプルを噛んだ後に舐めたレモン汁に甘味を感じた。特にラインＭ−４由来のサンプルについては強い甘味が感じられた。従って、Ｍ１群の植物体における活性のあるミラクリンタンパク質の発現能は、Ｔ１個体から後代へ受け継がれたことが示された。
さらに、上記で作製したＭ１群のＴ２個体（下記の表３に示すサンプリングした個体）、及びＭ２群のＴ１個体（Ｍ２−１〜Ｍ２−６の６個体）の葉サンプルから常法によりタンパク質を抽出し、それを非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、それをメンブレンに転写した後、実施例５で作製したミラクリン認識特異抗体を用いて、ウェスタンブロット法によりサンプル中のミラクリンタンパク質を検出した。
【表３】
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この結果の代表例を、図１１及び図１２に示す。図１１に示すように、Ｍ１群では、調べた全ラインのＴ２個体について、精製したミラクリンタンパク質（二量体）と同じ移動度のバンドが観察された。
一方、図１２では、Ｍ１群のＭ１−４−４及びＭ１−９−４個体については、精製したミラクリンタンパク質（二量体）と同じ移動度のバンドが観察された。しかしＭ２群の個体については、精製したミラクリンタンパク質（二量体）と同じ移動度のバンドはごく薄いものしか観察されなかった。
以上の味覚試験及びウェスタンブロットの結果から、シグナル様ペプチド配列を含むミラクリンタンパク質をコードするＤＮＡを導入したトランスジェニックシロイヌナズナ（Ｍ１群）では、ミラクリンタンパク質が発現され、活性のある二量体状態で存在していることが示された。通常ミラクルフルーツ１個の重量は１．５ｇ程度であるのに対し、シロイヌナズナの葉わずか約１００ｍｇ程度でミラクリンタンパク質が発現され活性が確認できた。一方、シグナル様ペプチド配列を含まないミラクリンタンパク質部分をコードするＤＮＡを導入したトランスジェニックシロイヌナズナ（Ｍ２群）では、ごく僅かのミラクリンタンパク質しか生産されないことが示された。従ってミラクリン遺伝子の発現にはシグナル様ペプチド配列をコードする塩基配列が必要だと考えられた。
【産業上の利用可能性】  本発明において提供されたミラクリン遺伝子を導入した組換え植物を利用することにより、ミラクリンを安定的に大量に供給できるようになる。本発明では、食用となる汎用農作物でミラクリンを発現させるので、日常的な食材としてミラクリンを発現する植物を利用できるようになる。また、ミラクルフルーツと同レベルで発現させることができるため、発現させたミラクリンを抽出して食品添加物として利用することも可能である。ミラクリン遺伝子を導入した組換え植物やその植物材料を用いれば、ミラクリンのダイエットや医療目的での利用が容易になる。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願は、そのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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