(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
オリゴヌクレオチドを基体に結合させる方法であって、
ａ.３'末端および５'末端を有するオリゴヌクレオチドを準備し、
ｂ.前記オリゴヌクレオチドを分岐型連結部分と接触させて前記３'または５'末端を介して分岐型連結構造を形成させ、ここに前記分岐型連結構造は複数のヒドラジド部分を含み、前記連結構造は基体内の結合部分とカップリングすることができ；
ｃ.前記連結構造を、基体内に含まれる結合部分と接触させて、カップリングした基体結合構造を形成させることを含み；ここに、オリゴヌクレオチドが前記分岐型連結部分と前記基体との間の複数の連結を介して前記基体に結合する該方法。
【請求項２】
前記分岐型連結構造が、カップリングした基体結合構造を形成する前に、保護されたヒドラジドまたはヒドラジド前駆体の活性化を必要とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記基体がポリマーである請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記基体が活性化されたポリマーである請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記基体が電子的にアドレス指定可能なマイクロチップと接触している請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
前記基体が活性化されたスライドガラスである請求項３または４に記載の方法。
【請求項７】
前記基体がスライドガラスである請求項３または４に記載の方法。
【請求項８】
基体の結合部分がルイス酸または求電子種を含む請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ルイス酸または求電子種がエポキシド、アジリジン、ビニル、アルデヒド、ケトン、アセタール、ジスルフィド、カルボン酸、アミド、ブロモアセトアミドまたはヨードアセトアミド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル、スルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル、アズラクトン、イソシアナート、チオイソシアナート、フェニルボロン酸、ホスホルアミダイトおよびカルボナートよりなる群から選択される請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記分岐型連結部分がホスホルアミダイトである請求項１記載の方法。
【請求項１１】
前記ホスホルアミダイトが、
３−［（２−シアノエトキシ）（ジイソプロピルアミノ）ホスファニルオキシ］グルタル酸ジエチル、
５−｛［（２−シアノエトキシ）（ジイソプロピルアミノ）ホスファニルオキシ］メチル｝イソフタル酸ジエチル、
３，３’−（２−｛［（２−シアノエトキシ）（ジイソプロピルアミノ）ホスファニルオキシ］メチル｝−２−｛［２−（メトキシカルボニル）エトキシ］メチル｝プロパン−１，３−ジイルビスオキシ）ジプロピオン酸ジメチル、
６−［（２−シアノエトキシ）（ジイソプロピルアミノ）ホスファニルオキシ］ヘキサン酸エチル、および
６−［（２−シアノエトキシ）（ジイソプロピルアミノ）ホスファニルオキシ］−Ｎ’−トリチルヘキサノヒドラジドよりなる群から選択される請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記分岐型連結部分が、基体に結合するための複数の活性化されたヒドラジド部分を含む分岐型連結構造を形成する請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
ヒドラジドを生体分子に結合させるための方法であって：
ａ.保護されたヒドラジドまたはヒドラジド前駆体を含む分岐型ホスホルアミダイトに生体分子をカップリングさせ、ついで
ｂ.前記保護されたヒドラジドまたはヒドラジド前駆体を少なくとも１の試薬と接触させて、保護された形態または前駆体形態をヒドラジド部分に変換することを含む該方法。
【請求項１４】
前記ホスホルアミダイトが、
３−［（２−シアノエトキシ）（ジイソプロピルアミノ）ホスファニルオキシ］グルタル酸ジエチル、
５−｛［（２−シアノエトキシ）（ジイソプロピルアミノ）ホスファニルオキシ］メチル｝イソフタル酸ジエチル、
３，３’−（２−｛［（２−シアノエトキシ）（ジイソプロピルアミノ）ホスファニルオキシ］メチル｝−２−｛［２−（メトキシカルボニル）エトキシ］メチル｝プロパン−１，３−ジイルビスオキシ）ジプロピオン酸ジメチル、
６−［（２−シアノエトキシ）（ジイソプロピルアミノ）ホスファニルオキシ］ヘキサン酸エチル、および
６−［（２−シアノエトキシ）（ジイソプロピルアミノ）ホスファニルオキシ］−Ｎ’−トリチルヘキサノヒドラジドよりなる群から選択される請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
３−［（２−シアノエトキシ）（ジイソプロピルアミノ）ホスファニルオキシ］グルタル酸ジエチル、
５−｛［（２−シアノエトキシ）（ジイソプロピルアミノ）ホスファニルオキシ］メチル｝イソフタル酸ジエチル、
３，３’−（２−｛［（２−シアノエトキシ）（ジイソプロピルアミノ）ホスファニルオキシ］メチル｝−２−｛［２−（メトキシカルボニル）エトキシ］メチル｝プロパン−１，３−ジイルビスオキシ）ジプロピオン酸ジメチル、
６−［（２−シアノエトキシ）（ジイソプロピルアミノ）ホスファニルオキシ］ヘキサン酸エチル、および
６−［（２−シアノエトキシ）（ジイソプロピルアミノ）ホスファニルオキシ］−Ｎ’−トリチルヘキサノヒドラジドよりなる群から選択されるホスホルアミダイトの組成物。
【請求項１６】
前記生体分子を、最初に活性化し、その後、アルデヒド、ケトン、エステル、活性化エステル、アセタール、ハロアセトアミドおよびハロゲン化アルキルよりなる群から選択される結合部分を含む基体に結合する請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
保護されたヒドラジドまたはヒドラジド前駆体を有する前記生体分子を、最初にヒドラジドに変換し、その後、２−ホルミルフェニルボロン酸、３−ホルミルフェニルボロン酸および４−ホルミルフェニルボロン酸よりなる群から選択される試薬で処理する請求項１６に記載の生体分子の活性化方法。
【請求項１８】
活性化された生体分子を還元する請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ヒドラジドを含むオリゴヌクレオチドを作製する方法であって：
ａ.オリゴヌクレオチドを、ヒドラジド部分の少なくとも１の前駆体形態を含む分岐型連結部分にカップリングし、ついで
ｂ.前記前駆体形態を少なくとも１の試薬と接触させて前駆体形態をヒドラジド部分に変換することを含む該方法。
【請求項２０】
ヒドラジド部分の前記前駆体形態がアルデヒド、ケトン、エステル、カルボン酸、活性化エステル、アセタール、ハロアセトアミド、ハロゲン化アルキルおよびトリチルヒドラジドよりなる群から選択される請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
電子的にアドレス指定可能なマイクロチップ上において、活性エステルを含有する基体表面に生体分子を結合するための、複数のヒドラジド部分を含む分岐型連結構造を含有する生体分子の使用。
【請求項２２】
前記活性エステルがアズラクトン、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルおよびスルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルよりなる群から選択される請求項２１に記載の使用。
【請求項２３】
電子的にアドレス指定可能なマイクロチップ上において、アルデヒドを含有する基体表面に生体分子を結合するための、複数のヒドラジド部分を含む分岐型連結構造を含有する生体分子の使用。
【請求項２４】
電子的にアドレス指定可能なマイクロチップ上において、ケトンを含有する基体表面に生体分子を結合するための、複数のヒドラジド部分を含む分岐型連結構造を含有する生体分子の使用。
【請求項２５】
それに結合した生体分子を有するマイクロアレイであって、前記生体分子の各々が複数の結合部分によって前記マイクロアレイに結合し、前記結合部分がヒドラジドを含む分岐型連結構造によって前記生体分子にカップリングしている該マイクロアレイ。
【請求項２６】
前記アレイが前記アレイ１μｍ２あたり１０３を超える結合した生体分子の密度を有する請求項２５に記載のマイクロアレイ。
【請求項２７】
分岐型連結構造を含む化合物であって、前記分岐型連結構造が、
５−｛［（２−シアノエトキシ）（ジイソプロピルアミノ）ホスファニルオキシ］メチル｝イソフタル酸ジエチル、
３−［（２−シアノエトキシ）（ジイソプロピルアミノ）ホスファニルオキシ］グルタル酸ジエチル、および
３，３’−（２−｛［（２−シアノエトキシ）（ジイソプロピルアミノ）ホスファニルオキシ］メチル｝−２−｛［２−（メトキシカルボニル）エトキシ］メチル｝プロパン−１，３−ジイルビスオキシ）ジプロピオン酸ジメチル
よりなる群から選択される分岐型連結部分を用いた生体分子の処理から生じ、分岐型連結部分のエステル基がヒドラジド基に変換する該化合物。
【請求項２８】
生体分子が単一の核酸、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、DNA、RNA、タンパク質、ペプチド、酵素、抗体、CNA（シクロヘキシル核酸）、p-MeNA（メチルホスファートまたはメトキシホスファート核酸）、ペプチド核酸（PNA）およびピラノシルRNA（p-RNA）よりなる群から選択される請求項２７記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、生体分子を基体表面に結合させるための結合化学反応に関する。より詳細には、本発明は、生体分子を基体表面に結合させるために複数の化学的な結合部分を有する生体分子を提供するための、分岐型構造体を含む結合化学反応に関する。
【０００２】
発明の背景
下記の説明は、本発明に関連する情報の要約を提供する。本明細書中に提供した情報のいずれかがここに特許請求する発明に対して先行技術となることも、また具体的または明示的に参照する刊行物のいずれかが本発明に対して先行技術となることも断じて認められるものではない。
【０００３】
オリゴヌクレオチドを基体に固定化することは、ＤＮＡチップ技術、表面プラズモン共鳴実験または他のバイオセンサー適用などの多くの適用に関して重要かつ必要な工程である。従来、オリゴヌクレオチドは、１の反応基（例えば、アミン、チオールまたはアルデヒド）を用いた３’−末端または５’−末端の修飾（共有結合）あるいは安定な複合体を形成する基（例えば、ビオチン、フェニルボロン酸など）を用いた３’−末端または５’−末端の修飾（非共有結合）によって基体に固定化されている。ついで、修飾されたオリゴヌクレオチドは、固定化が望まれる場所にアドレス指定され、アルデヒド、マレイミド、ヒドラジドなどの適当な官能基と反応するか、またはストレプトアビジンなどの結合分子と複合体形成する。基体上の特定の場所にアドレス指定することは、スポッティング（ピンまたは液滴による付着）によって、または電子的なアドレス指定によって、または様々な他の方法によって行うことができる。場合により、固定化の反応は遅く、基体上におけるオリゴヌクレオチドの長時間（一晩）のインキュベーションを必要とする。これらの固定化反応はまた可逆的であることがあり、時間とともに生体分子の放出を生じる。
【０００４】
また、生体分子上におけるデンドリマー構造が記載されている（例えば、WO99/10362、WO96/19240およびWO99/43287）。しかし、デンドリマー構造の使用は、検出などのためのシグナル部位を提供することに指向されており、一方、生体分子そのものは、従来の方法を使用して基体に単に結合されているだけである。
【０００５】
これに対して、本発明では、複数の反応部位（すなわち、求核種、求電子種およびルイス酸またはルイス塩基）を含有するオリゴヌクレオチドを使用する生体分子の改善された固定化方法を記載する。このアプローチの利点は、固定化速度がより大きいこと、結合の安定性がより高いこと、および基体表面により多量の固定化オリゴヌクレオチドを得る可能性があることである。これらの改善は、固定化のために使用するアプローチから独立している。複数の結合部位を有するオリゴヌクレオチドは、共有結合および非共有結合の両方の結合法を用いて得ることができる。
【０００６】
さらに、本発明は、１または複数のヒドラジドを含有するオリゴヌクレオチドの調製を記載する。ヒドラジドは、いずれのタイプのコンジュゲーション反応にも使用することができる求核性の反応基である。ヒドラジドは、例えば、ヒドラゾン（これは還元によってさらに安定化させることができる）を形成する求電子性のアルデヒド、および安定した共有結合を形成する活性エステルと反応し得る（図１８を参照されたい）。この化学反応は、蛍光物質、タンパク質またはペプチド、レポーター基および他のオリゴマーをオリゴヌクレオチドに結合させるために使用し得る。ヒドラジドの反応はまた、生体分子を基体に固定化するためにも使用することができる。かかるヒドラジド修飾オリゴヌクレオチドは以前に全く記載されていない。
【０００７】
本説明の範囲に含まれる本発明の利点は無数である。例えば、本発明では、短い反応時間を使用し、結合物あたり複数の結合部位が許容され、比較的広いｐＨ範囲に対する安定性が提供され、そして無水条件または水性条件の両方での結合能が提供され、それによりいずれの適用可能な使用に関してもいずれの固相表面にも分子を結合させる改善された方法を提供する。本発明は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ｐ−ＲＮＡ（ピラノシル−ＲＮＡ）およびペプチド（これらに限定されない）を含む生体分子のごとき小分子ライブラリーの固相合成および／または合成に対して有用である。本発明はまた、ハイブリダイゼーションに基づくアッセイ、診断、遺伝子配列同定およびその他（これらに限定されない）などの、固定化試薬を必要とする分析技術に対しても有用である。
【０００８】
発明の概要
本発明の第１の実施形態において、基体表面に結合するための機能的部位または反応部位をそれに連結するための複数の分岐型基またはデンドリマー基を有する生体分子を提供する。
【０００９】
複数の反応部位または複合体形成因子を１のオリゴヌクレオチド内に有するオリゴヌクレオチドを使用することにより、著しい利点がこの固定化プロセスにもたらされる。第１に、固定化プロセスの速度が増大する。この効果に対する１の理由は、１のオリゴヌクレオチドが複数の反応基を有する場合に、拡散による結合パートナー間の最初の接触の機会がより高くなることである。また、そのようなオリゴヌクレオチドは、一次結合の後（またはそれと同時）に形成される二次的な複数の共有的または非共有的な結合を介して固定化することができる。この場合、このような二次結合の形成は、分子間の一次結合が形成されることに対して速度論的に優先する分子内プロセスである。このことは、固定化速度がより高い別の理由である。
【００１０】
第２に、複数の結合がオリゴヌクレオチドと基体との間で形成されるため、結合の全体的な安定性が増大する。これは、生体分子を基体と接触させるために使用するアプローチとは無関係である。
【００１１】
複数の非共有的な複合体が形成されることは、オリゴヌクレオチドと基体との複合体のより高い全体的な安定性をもたらし、これにより、安定な固定化のために低親和性の複合体形成剤を使用することが可能になる。オリゴヌクレオチドについて頻繁に適用される固定化化学反応のいくつか（例えば、アミンとアルデヒドとの間におけるシッフ塩基の形成）は可逆的であり、例えば、ＮａＣＮＢＨ３を用いた還元によるその後の安定化工程が必要である。このような可逆的な反応の場合には、複数の結合を介した固定化が有益である。なぜなら、そのような固定化により、要するに、安定化反応に先立って形成された中間体のより高い安定性につながるからである。場合により、安定性の増大は、安定化反応が不必要になるほど十分に大きい。
【００１２】
第３に、複数の結合部位を有するオリゴヌクレオチドの使用により、より多くのオリゴヌクレオチドを負荷する基体を製造することが可能になる。通常、基体上の反応部位はオリゴヌクレオチドに対して大過剰であり、複数の結合基による改善された結合により、基体上の利用可能な部位のより良好な使用につながり得る。
【００１３】
別の実施形態において、生体分子にもたらされる種々の反応性の結合基により、生体分子を共有的様式または非共有的様式のいずれかで基体表面に結合させることができる。非共有的な結合に関して、様々な結合基には、ビオチン、ストレプトアビジン、フェニルボロン酸（ＰＢＡ）およびサリチルヒドロキサム酸（ＳＨＡ）などの化学基が含まれ得る。共有結合に関して、様々な結合基には、反応性のヒドラジド構造体を使用することが含まれ得る。そのような構造は分岐型または非分岐型のいずれでもよく、それにより、利用できる可能な結合部分のレベルにおいて大きな多用性が可能になる。したがって、生体分子に樹枝状の分岐する構造で提供される生体分子のみならず、反応性の結合部分自身もまた、生体分子を基質表面に結合させるときに使用される反応性のヒドラジドエレメントを各枝分かれが有するように分枝させることもできる。
【００１４】
別の実施形態において、生体分子における様々な結合部分により、電子的にアドレス指定可能なマイクロチップを含む基体表面に結合させた生体分子が、マイクロチップ電極の電子的バイアスから生じる高電圧および高電流によって引き起こされるマイクロチップ上の結合部位からの偶発的な除去から保護される手段が提供される。したがって、好ましい実施形態において、本発明の多結合スキームにより、少なくとも４ｍＡ／ｃｍ２の電流密度に耐えることができる、基体に対する生体分子の結合が提供される。
【００１５】
さらに別の実施形態において、本発明は、付加が単一反応工程で生じ得るように、生体分子に結合した樹枝状構造に反応性結合部分を付加する方法を提供する。
【００１６】
さらに別の実施形態において、本発明は、１または複数のヒドラジドを含有するオリゴヌクレオチドの新たな化学的修飾、およびそれにより、その修飾されたオリゴヌクレオチドを生成するための組み立てブロック（例えば、ホスホルアミダイト）を含む組成物を提供する。これらのヒドラジドは反応基を含み、蛍光物質または他の小分子に、あるいはペプチド、タンパク質または抗体に、あるいは基体表面にオリゴヌクレオチドを結合させるために使用することができる。
【００１７】
さらに別の実施形態において、結合スキームは、生体分子の表面合成に対して、そして化合物の表面固定化を必要とする分析的適用に対して適用することができる。
【００１８】
好ましい実施形態の詳細な説明
ここでは、本発明の具体的な実施形態を参照することにより、種々の基体表面結合部分を有する生体分子が提供される。
【００１９】
「生体分子」とは、試験サンプル中の分子物と接触させるために使用する生物学的に関連する分子を意味する。一般に、これらには、少なくとも一部は、生体分子を基体表面に結合させるための化学基に結合させた核酸（一本鎖核酸、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＣＮＡ（シクロヘキシル核酸）、ｐ−ＭｅＮＡ（メチルホスファート核酸またはメトキシホスファート核酸）を含む）、タンパク質、ペプチド、酵素および抗体などの分子が含まれる。生体分子にはまた、生体分子を基体表面に結合させるための化学基に結合させたペプチド核酸（ＰＮＡ）またはｐ−ＲＮＡ（ピラノシルＲＮＡ）などの、天然に存在する分子から構造的に由来する非天然型分子または合成分子も含まれる。そのような結合部分を有することにより、生体分子はまた「誘導体化生体分子」と呼ばれることがある。したがって、そのような生体分子にはまた、酸化されたリボース、アミン末端、またはHermanson(Hermanson,G.T.、Bioconjugate Techiniques、著作権:1996年、Academic Press、San Diego、CA)（これは参考として本明細書中に組み込まれる）によって概略されているような、よく知られているバイオコンジュゲート対のいずれかの物を含有するオリゴヌクレオチド、および／または（同時係属出願09/374,338(1999年8月13日出願、これは参考として本明細書中に組み込まれる）に記載されるようなｐＲＮＡに関連して）ｐＲＮＡなどの別の核酸構造が含まれる。一般に、生体分子に対する化学基の結合は共有結合を含む。誘導体化生体分子を基体表面に結合させることに関して、そのような結合は共有結合または非共有結合のいずれかを使用することができる。
【００２０】
「ポリマー」とは、当業者によって認識されているように、モノマーと一般に呼ばれる小分子の非常に多くの数が連続的に連結していることから組み立てられる高分子を一般に意味する（より詳しい説明については、Odian, G. Principles of Polymerization (第3版、著作権: 1991年、John Wiley and Sons Inc.、New York、NY)を参照されたい）。好ましい実施形態において、均一ポリマーは単一タイプのモノマーから構成され得るが、不均一ポリマーは２以上のタイプのモノマーから構成される。別の好ましい実施形態において、ポリマーの形成は、開始剤（例えば、ＡＩＢＮ、過酸化ベンゾイル）の熱分解によって、または開始剤の光分解的切断（例えば、Daracur 4265のＵＶ開始）によって、またはレドックス反応（例えば、硫酸セリウム（ＩＶ））によって、またはイオン化放射線（例えば、α線、β線、γ線またはＸ線）によって、またはプラズマ開始（例えば、アルゴン、窒素、酸素）によって、または電流を使用して重合が所定の部位でのみ生じる、過塩素酸テトラブチルアンモニウムを使用する電気分解的開始 (Samal, S. K.; Nayak, B.、J. Polym. Sci. Polym. Chem. Ed. 1988、21、1035)によって開始することができる。
【００２１】
「結合部分」とは、基体表面に対する生体分子の結合を生じさせる際に利用されるいずれの化学基をも一般に意味する。結合部分は、生体分子表面に含有させることができるか、または基体表面に含有させることができる。表１（結合部分）に、使用した結合部分のリストを掲載する。
【００２２】
【表１】
0004731781.tif 000002
【００２３】
【表２】
0004731781.tif 000003
【００２４】
【表３】
0004731781.tif 000004
【００２５】
記号：Ｘ＝生体分子または基体／固体支持体；Ｒ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３＝別途示されない限り、有機炭素基。
【００２６】
「ルイス塩基」とは、電子対を電子不足中心に供与することができるいずれの化学基をも一般に意味する。「親電子物」とは、一般に、好ましい実施形態において、ルイス塩基は、当業者によって認識されているように、反応中心が電子対を炭素に供与し、これにより反応中心と炭素との間に共有結合を生じさせる「求核種」として、より具体的に呼ばれる（拡大された定義については、Smith, M.B.、Organic Synthesis (著作権:1994年、McGraw Hill Inc.、New York、NY)またはいずれかの有機化学教本を参照されたい）。
【００２７】
「ルイス酸」とは、電子対を受け取ることができるいずれの電子不足の化学基を一般に意味する。「求電子種」とは、当業者によって認識されているように、ルイス酸が炭素である特別な場合が一般に意味される（拡大された定義については、Smith, M. B.、Organic Synthesis (著作権:1994年、 McGraw Hill Inc.、  New York、 NY）またはいずれかの有機化学教本を参照されたい）。好ましい実施形態において、一例として、サリチルヒドロキサム酸は、フェニルボロン酸のホウ素（ルイス酸）に電子対を供与するルイス塩基として作用することができ、これにより非共有結合を生じさせることができる。さらに別の好ましい実施形態において、一例として、ヒドラジドは、ＮＨＳエステル（求電子種）の反応性の炭素中心に電子対を供与する求核種として作用することができ、これにより前記炭素中心に対する共有結合を形成することができる。
【００２８】
「分岐型連結部分」とは、特定の反応基を介して生体分子にカップリングすることができ、かつまた別の反応中心を介して２以上の分子に対するさらなる結合も可能であるいずれの化学種も一般に意味する。好ましい実施形態において、分岐型連結部分は、表２のエントリー１−４にその例が示されるホスホルアミダイトである。これらの例において、リンは反応性成分として作用し、一方、エントリー１、２および３のエステルならびに４の保護されたアルコールは別の反応中心である。
【００２９】
「分岐型連結構造」とは、生体分子を分岐型連結部分で処理することから生じる生体分子を一般に意味する。この場合には、分岐型連結部分の別の反応中心が、分岐型連結構造内に含まれる。好ましい実施形態において、一例として、分岐型連結構造は表２のエントリー５によって表される。表２において、示す生体分子は、生体分子を分岐型連結部分（具体的には、表２のエントリー４に示す化合物）で処理した結果である。別の好ましい実施形態において、分岐型連結構造は均一なシリーズで組み合わせることができる。この場合、生体分子は分岐型連結部分で修飾され、ついで、得られた分岐型連結構造の別の反応中心を介して同じ分岐型連結部分によってさらに修飾され、これにより新しい分岐型連結構造が作製される。分岐型連結部分の一連の連結による、より大きい分岐型連結構造のこの構築は、表２のエントリー６−８に示すようにさらに続けることができる。さらに別の実施形態において、分岐連結部分は不均一なシリーズで組み合わせることができる。この場合、生体分子は分岐連結部分で修飾され、ついで、最初の分岐型連結部分の別の反応中心を介して異なる分岐型連結部分によってさらに修飾され、これにより新しい分岐型連結構造が作製される。分岐型連結部分の一連の連結による、より大きい分岐型連結構造のこの構築は、表２のエントリー９−１２に示すようにさらに続けることができる。
【００３０】
【表４】
0004731781.tif 000005
【００３１】
【表５】
0004731781.tif 000006
【００３２】
【表６】
0004731781.tif 000007
【００３３】
【表７】
0004731781.tif 000008
【００３４】
「基体」とは、生体分子の複数の反応性結合部分がそれとカップリングし得る部分をその表面に含むいずれの材料をも一般に意味する。このような基体は、中でも、スライドガラス、官能基化されたスライドガラス、化学的に活性化されたマイクロチップ表面、反応性分子の単層または多層で覆われた表面、あるいは生体分子の複数の反応性結合部分がそれと反応し得る部分を有するポリマーで覆われた表面であり得る。好ましい実施形態において、基体の表面は、電子的にアドレス指定可能なマイクロチップの透過層である。好ましい実施形態において、基体の官能基、化学的に活性な部分または反応性成分は、表１に列記された官能基（これらに限定されない）から選択される。
【００３５】
「前駆体」とは、１またはそれを超える化学試薬の処理によって別の反応性部分に変換することができるいずれの反応性部分をも一般に意味する。好ましい実施形態において、一例として、１ｄ（表２のエントリー３）の３のエステル部分は、ヒドラジドに対する前駆体である。それらは、ヒドラジンの処理によってヒドラジド基に変換される。
【００３６】
「保護された」とは、１またはそれを超える試薬を用いて反応性部分の反応性をブロックし、その一方で、最初の反応性部分に由来する妨害または面倒なことを伴うことなく、化学反応を同じ化合物の別の反応部位において行うことができることを一般に意味する。別の反応部位における変換が完了したとき、反応性基の保護基は除去することができ、これにより反応中心を脱ブロックすることができる。好ましい実施形態において、保護された部分は特定タイプの前駆体である。さらに別の好ましい実施形態において、一例として、図９Ａの１ａのヒドラジド基はトリチル基で保護する。１ａが生体分子に付加されたとき、トリチル基は化学的に除去され、ヒドラジド官能基が脱保護される。
【００３７】
「活性化可能な」とは、１またはそれを超える化学試薬で処理した場合に反応性部分への変換を受けることができるいずれの官能基をも一般に意味する。「活性化された」とは、反応性部分へのそのような変換を受けている官能基を意味する。好ましい実施形態において、活性化可能な部分は、保護された部分または前駆体であり得る。さらに別の好ましい実施形態において、官能基は一般には、基体または生体分子に対して良性、非反応性であるか、またはそれに結合することができないと考えられる。１またはそれを超える化学試薬で処理した場合、官能基は、基体または生体分子に結合することができる部分に変換される。好ましい実施形態において、一例として、表２のエントリー１−３に掲載する化合物のエステル基は、ヒドラジンでの処理によってヒドラジドに変換される。さらに別の好ましい実施形態において、一例として、アセタール基を含有する基体は一般には非反応性であると考えられる。酸の供給源で処理した場合、アセタールは、ヒドラジドで修飾された生体分子に結合することができるアルデヒドに変換される。
【００３８】
「マイクロアレイ」とは、決った生体分子を含有する複数の場所の構造配置を一般に意味する。この場合、そのような個々の場所は１ｍｍ以下の長さ寸法に制限される。マイクロアレイには、米国特許第5,632,957号（これは参考として本明細書中に組み込まれる）におけるような「ＡＰＥＸチップ」と呼ばれるアレイなどの電子的にアドレス指定可能なマイクロアレイが含まれる。
【００３９】
図２は、生体分子が複数の結合部分を介して基体表面に結合している本発明のスキームに対する基本的な概略図を示す。そのような複数の結合部分は、下記の方法を使用して生体分子に提供し得る。これらのアプローチはそれぞれ、オリゴヌクレオチドを含む生体分子の標準的な固相合成と適合し得る。
【００４０】
１.複数の結合部位を有するオリゴヌクレオチドの調製
１.１  分岐するホスホルアミダイトを有するオリゴヌクレオチドの合成：
分岐型ホスホルアミダイトを有する分岐型生体分子（例えば、オリゴヌクレオチド）構造は市販されている（Chemgenes, Ashland, MA; Glenn Research, Sterling, VA）。そのような分岐するアミダイトを固相オリゴヌクレオチド合成（図５ＡおよびＢ）において１回以上連続してカップリングした後には、２以上の末端ヒドロキシル基を有するオリゴヌクレオチドが生成する。枝分かれをオリゴヌクレオチドに導入するいずれの他の組み立てブロックも、本発明では、類似する様式で適用することができる。これらのヒドロキシル基は、生体分子を基体に結合させるための反応基（すなわち、結合部分）を生じさせるために第二のタイプのホスホルアミダイトと反応させることができる。このようなホスホルアミダイトは、ビオチンアミダイト（例えば、Glenn Research, カタログ゛番号10595002）、アミノ修飾剤（例えば、Glenn Research, カタログ番号10190602）、チオール修飾剤（例えば、Glenn Research, カタログ番号10192602）、フェニルボロン酸アミダイト（Prolinx, Bothell, WA）およびその他などのいくつかの入手可能なアミダイトから選択し得る。さらに、保護された形態または前駆体形態でヒドラジドを含有するホスホルアミダイト（図９Ａ）を使用することができる。結果は、２またはそれを超える（好ましくは２−８）の反応性基を有するオリゴヌクレオチドである。
【００４１】
１.２  結合のために２以上の反応性基を有するシントンの直接的な導入：
あるいは、複数の結合部位を有する生体分子は、特別なホスホルアミダイトのカップリングによっても得ることができる。このようなアミダイトは、基体における固定化のための２以上の反応性基に由来する保護された形態または前駆体で含まれ得る。分岐型アミダイトにおける反応性基は、再度ではあるが、アミノ基、チオール、アルデヒドまたはヒドラジドなどの公知の官能基の１であり得る。そのようなアミダイトの例を図６Ａ−Ｃに示す。
【００４２】
１.３  組合せアプローチ：
複数の反応性基を有する生体分子を合成するための第３のアプローチは、分岐するアミダイトと、複数の反応性部位を有するアミダイトとをカップリングすることの組合せである（図８Ａ−Ｃ）。
【００４３】
特に好ましい実施形態において、共有結合を介して基体表面に結合させるためにつながれたヒドラジドを有する生体分子が提供される。この実施形態において、ＮＨＳおよびスルホ−ＮＨＳおよび他の部分を、基体またはいずれの他のタイプの生体分子を活性化し、および生体分子にまたはさらには固体表面にカップリングする手段として使用することができる。本発明の適用において、そのような結合は、生体分子の結合を行うことができる新規な手段を提供し、そして電子的マイクロチップの電子的なアドレス指定に伴う極端な反応条件によって生じるつながれた生体分子への損傷に対する耐性を提供する。したがって、本発明のヒドラジド化学および多結合スキームは、電子的システムの環境における残存性に対する要求を満たす。そのような要求には、生体分子の水溶性、固定化する基体における生体分子およびそのカップリング対の水に対する安定性、ならびに約ｐＨ４のｐＨに対する機能性が含まれる。
【００４４】
本発明においてヒドラジド結合部分を付加し、利用する方法を下記の実施例に提供する。これらの実施例は、オリゴヌクレオチドを含む生体分子の部位特異的な共有結合を示している。この場合、結合は、電子的にアドレス指定可能なマイクロアレイの上方のＮ−ヒドロキシスクシンイミジル（ＮＨＳ）修飾ポリアクリルアミド透過層へのヒドラジド修飾オリゴの電子的濃縮によって達成される。オリゴマーのヒドラジド部分はＮＨＳエステルに置換わって、ビスヒドラジド結合を形成する。したがって、これらの実施例により、以下のことが示される：１.）実施例１に示すような新規なヒドラジドホスホルアミダイト（例えば、化合物１）の合成（図９）および標準的な合成手法を使用してこのようなアミダイトを合成オリゴマーに首尾よく取り込ませること；２）Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルまたはＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミジルで修飾された透過層の調製；ならびに３）活性化されたモノマーが上部層にだけ取り込まれた電子的にアドレス指定可能なマイクロアレイの上方の２層型透過層。
【００４５】
別段指摘しない限り、すべての反応は磁気攪拌した。試薬はAldrich Chemical Company (Milwaukee, WI)から分析等級で入手し、溶媒はRiedelから入手した。カラムクロマトグラフィーは、シリカゲル６０（Merck、２３０−４００メッシュ）を使用して行う。融点は未補正である。ＩＲスペクトルは、Graseby Specac 10500ＡＴＲユニットを備えたPerkin Elmer Paragon 1000FT-IRで測定する。１Ｈ−ＮＭＲスペクトルは、Bruker DRX400分光計を用いて、４００ＭＨｚで、１３Ｃスペクトルは１００ＭＨｚで測定し、そして３１Ｐは１６２ＭＨｚで測定する。１Ｈのケミカルシフトは、ＴＭＳを内部標準として使用するδの単位で報告し、そしてカップリング定数はＨｚ単位で報告する。ＥＳＩ質量スペクトルは負イオン化モードでFinnigan LCQ装置に記録する。
【００４６】
実施例１
実験１.１  Ｎ−トリフェニルメチル−６−ヒドロキシカプロン酸ヒドラジドの合成（化合物５、図９Ａ）：
６.２ｇ（２０ｍｍｏｌ）のトリチルヒドラジン塩酸塩（３ａ）を含む２００ｍｌのＴＨＦの溶液に、２.２２ｇ（２２ｍｍｏｌ、１.１当量）のトリエチルアミンを加えた。溶液を室温（ｒｔ）で１５分間攪拌し、ろ過し、濃縮して、化合物３を得た。次いで、これを２.２９ｇ（２０ｍｍｏｌ、１当量）のε−カプロラクトン（化合物４）で処理した。混合物を６５℃に５時間加熱し、そしてｒｔに１８時間冷却した。沈殿を集め、酢酸エチルから再結晶化させて、３.５５ｇ（４５％）の白色粉末（化合物５）を得た：
１Ｈ−ＮＭＲ  ７.４９−７.４７（ｍ、５Ｈ）、７.３５−７.１０（ｍ、１０Ｈ）、６.５５（ｄ、Ｊ＝７.５２、１Ｈ）、５.５５（ｄ、Ｊ＝７.２５、１Ｈ）、３.５４（ｔ、Ｊ＝６.４５、２Ｈ）、１.８７（ｔ、Ｊ＝７.２５、２Ｈ）、１.６２（ｂｓ、１Ｈ）、１.５７−１.３４（ｍ、４Ｈ）、１.２７−１.１１（ｍ、２Ｈ）。
【００４７】
実験１.２  ６−［（２−シアノエトキシ）（ジイソプロピルアミノ）ホスファニルオキシ］−Ｎ’−トリチルヘキサノヒドラジドの合成（化合物１ａ、図９Ａ）
ｒｔにて３.０ｇ（７.７ｍｍｏｌ）のＮ−トリフェニルメチル−６−ヒドロキシカプロン酸ヒドラジド（化合物５）を含む５０ｍｌの乾燥ジクロロメタンの溶液に、４.０ｇ（３１ｍｍｏｌ、４当量）のＮ−エチルジイソプロピルアミンおよび２.０１ｇ（８.５ｍｍｏｌ、１.１当量）のクロロ（ジイソプロピルアミノ）−β−シアノエトキシホスフィン（化合物６）を１５分にわたって徐々に加えた。添加が終了すると、反応物を１時間攪拌し、濃縮し、クロマトグラフィー処理（０.２％トリエチルアミンを含む酢酸エチル／ｎ−ヘプタン（２／３））して、３.１９ｇ（７０％）の１ａを淡黄色フォームとして得た。
１Ｈ−ＮＭＲ：７.４９−７.４６（ｍ、５Ｈ）、７.３４−７.２０（ｍ、１０Ｈ）、６.５７（ｄ、Ｊ＝７.２、１Ｈ）、５.５７（ｄ、Ｊ＝７.５、１Ｈ）、３.８５−３.７４（ｍ、２Ｈ）、３.６２−３.４８（ｍ、４Ｈ）、２.６２−２.５９（ｍ、２Ｈ）、１.８８−１.８４（ｍ、２Ｈ）、１.５３−１.３３（ｍ、４Ｈ）、１.２７−１.１３（ｍ、１４Ｈ）；
３１Ｐ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ＝１４７.９７。
【００４８】
実験１.３  ６−［（２−シアノエトキシ）（ジイソプロピルアミノ）ホスファニルオキシ］ヘキサン酸エチルの合成（化合物１ｂ、図９Ｂ、スキーム２）
ｒｔにて１.６５ｇ（１０ｍｍｏｌ）の６−ヒドロキシヘキサン酸エチル（化合物７）を含む３０ｍｌのジクロロメタンの溶液に、５.１７ｇ（４０ｍｍｏｌ、４当量）のＮ−エチルジイソプロピルアミンおよび２.６ｇ（１１ｍｍｏｌ、１.１当量）の化合物６を１５分かけて徐々に加えた。添加が終了すると、反応物をさらに１５分間攪拌し、濃縮し、クロマトグラフィー処理（０.２％トリエチルアミンを含む酢酸エチル／ｎ−ヘプタン（１／４））して、２.４７ｇ（６９％）の化合物１ｂを透明なオイルとして得た：
１Ｈ−ＮＭＲ  ４.１２（ｑ、Ｊ＝７.２５、２Ｈ）、３.９０−３.７７（ｍ、２Ｈ）、３.７５−３.５５（ｍ、４Ｈ）、２.６４（ｔ、Ｊ＝６.４４、２Ｈ）、２.３０（ｔ、Ｊ＝７.２５、２Ｈ）、１.６９−１.５９（ｍ、４Ｈ）、１.４４−１.３４（ｍ、２Ｈ）、１.２５（ｔ、Ｊ＝７.２５、３Ｈ）、１.２０−１.１２（ｍ、１２Ｈ）；
３１Ｐ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ＝１４８.０１。
【００４９】
実験１.４  エステルホスホルアミダイト：５−｛［（２−シアノエトキシ）（ジイソプロピルアミノ）ホスファニルオキシ］メチル｝イソフタル酸ジエチルの調製（化合物１ｃ、図６Ｂ）
ＲＴにて１.２９ｇ（５ｍｍｏｌ）の５−（ヒドロキシメチル）イソフタル酸ジエチル［２５２.２７］（９８％、Aldrich；CAS181425-91-2）を含む２０ｍｌの乾燥ジクロロメタンの溶液に、攪拌下で、２.５９ｇ（４０ｍｍｏｌ、４当量）のＮ−エチルジイソプロピルアミン［１２９.２５］および１.３ｇ（１１ｍｍｏｌ、１.１当量）の２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−クロロ−ホスホルアミダイト［２３６.６８］（Aldrich；CAS89992-70-1）を１５分かけて加えた。混合物を濃縮して、３０ｍＬの酢酸エチル／ｎ−ヘプタン（２：３）を用いて塩を沈殿させた。塩酸塩の沈殿をろ過し、ろ液を濃縮して、クロマトグラフィーカラムに直接加えた。数滴のトリエチルアミンを含有する酢酸エチル／ｎ−ヘプタン（１：４）を用いて溶出されたことにより、１.６ｇ（７０％）の１ｃを無色のオイルとして得た。
Ｃ２２Ｈ３３Ｎ２Ｏ６Ｐ；
１Ｈ−ＮＭＲ  ８.５９（ｍ、１Ｈ、芳香族）、８.２１（ｍ、２Ｈ、芳香族）、４.８７−４.７５（ｍ、２Ｈ、ＣＨ２、シアノエチル）、４.４１（ｑ、Ｊ＝６.９８Ｈｚ、４Ｈ、ＣＨ２、エチル）、３.９５−３.８０（ｍ、２Ｈ、２ｘＣＨ  Ｉ−Ｐｒ）、３.７４−３.６１（ｍ、２Ｈ、ＣＨ２、シアノエチル）、２.６６（ｔ、Ｊ（Ｐ，Ｈ）＝６.４５Ｈｚ、２Ｈ、Ｏ−ＣＨ２−芳香族）、１.４１（ｔ、Ｊ＝６Ｈ、２ｘＣＨ３、エチル）、１.２３−１.２０（ｍ、１２Ｈ、ＣＨ３、Ｉ−Ｐｒ）；
３１Ｐ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ＝１４９.９４；
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ＝１６５.８（Ｃ＝Ｏ）、１４０.２（Ｃ−ＣＨ２−Ｏ−Ｐ）、１３２.１（２ｘＣ、芳香族）、１３１.１（２ｘＣ−Ｈ、芳香族）、１２９.７（ＣＨ、芳香族）、１１７.６（ＣＮ）、６４.７（Ｐ−Ｏ−ＣＨ２−芳香族）、６１.４（２ｘＣＨ２、エチル）、５８.６（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＮ）、４３.４（２ｘＣ−Ｈ、Ｉ−Ｐｒ）、２４.７（４ｘＣＨ３、Ｉ−Ｐｒ）、２０.５（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＮ）、１４.４（ＣＨ３、エチル）；  ＨＲＭＳ  ４５３.２１５６（［Ｍ＋Ｈ］＋  Ｃ２２Ｈ３４Ｎ２Ｏ６Ｐ（計算値）：４５３.２１５４５）。
【００５０】
実験１.５  ３.３’−（２−｛［（２−シアノエトキシ）（ジイソプロピルアミノ）ホスファニルオキシ］メチル｝−２−｛［２−（メトキシカルボニル）エトキシ］メチル｝プロパン−１，３−ジイルビスオキシ）ジプロピオン酸ジメチルの合成（化合物１ｄ、図８Ｂ）
ＲＴにて３００ｍｇ（０.７６０ｍｍｏｌ）のトリス−２，２，２−｛［（メトキシカルボニル）エトキシ］メチル｝エタノール（ＣＡＳ１６９７４４−２８−９；(Coutts, S.; Jones, D.S.; Livingston, D.A.; Yu, L.: 1995、化学的規定される非ポリマー原子価プラットホーム分子およびその結合体、欧州特許公開EP0642798A2）を含む２ｍｌの乾燥ジクロロメタンの溶液に、１Ｈ−テトラゾールの乾燥アセトニトリルの０.４Ｍ溶液（固相ＤＮＡ合成に由来する標準的な活性化剤溶液）の２滴および２７４ｍｇ（０.９１ｍｍｏｌ、１.１当量）の２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト（Aldrich；CAS102691-36-1）を加え、そして出発物質が完全に消費されたことがＴＬＣにより示されるまでＲＴで攪拌する（３時間）。溶媒を真空下で除き、残渣をシリカゲルクロマトグラフィーによって精製する。数滴のトリエチルアミンを含有する酢酸エチル／ｎ−ヘプタン（２：３）を用いて溶出されたことにより、２４０ｍｇ（５３％）の１ｄを無色のオイルとして得た。
Ｃ２６Ｈ４７Ｎ２Ｏ１１Ｐ；
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：３.８８−３.７１（ｍ、２Ｈ、Ｃ−Ｈ）、３.６８（ｓ、９Ｈ、ＣＨ３エステル）、３.６５（ｔ、Ｊ＝６.４５、６Ｈ、３ｘＣＨ２−Ｏ）、３.６２−３.４７（ｍ、４Ｈ、２ｘＣＨ２）、３.３６（ｓ、６Ｈ、３ｘＣ−ＣＨ２−Ｏ）、２.６３（ｔ、Ｊ＝７.２５Ｈｚ、２Ｈ、Ｃ−ＣＨ２−Ｏ−Ｐ）、２.５４（ｔ、Ｊ＝６.４５Ｈｚ、６Ｈ、−ＣＨ２−ＣＯＯＲ）、１.１９−１.１６（ｍ、１２Ｈ、ＣＨ３ｉＰｒ）；
３１Ｐ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ＝１４８.６；
ＨＲＭＳ：５９５.２９９９（［Ｍ＋Ｈ］＋  Ｃ２６Ｈ４８Ｎ２Ｏ１１Ｐ（計算値）：５９５.２９９５７）。
【００５１】
実験１.６  トリチルで保護されたヒドラジドアミダイトを有するオリゴヌクレオチドの合成（例えば、化合物１；図１７Ａも参照されたい）：
オリゴヌクレオチドは、自動オリゴヌクレオチド合成機において固相ホスホルアミダイト法を使用して合成した。保護されたヒドラジドを有するホスホルアミダイトを、アセトニトリル中の０.１Ｍ溶液として加え、そして標準的な活性化試薬およびカップリング時間を使用して配列内の所望の場所にカップリングした。
【００５２】
ＣＰＧ結合オリゴ（１ｍｍｏｌ）を１.５ｍｌの試験管に入れ、２.０ｍｌの濃ＮＨ４ＯＨで処理した。５５℃で２時間後、アンモニア溶液を取り出し、減圧下で蒸発乾固した。残渣を１ｍｌの水に溶解して、０.４５μｍのシリンジフィルターでろ過した。トリチルで保護されたヒドラジドオリゴを、緩衝液Ａとして０.１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム（ｐＨ＝７.０）（ＴＥＡＡ）および緩衝液Ｂとして緩衝液Ａに中の７５％アセトニトリルを使用して、Merck LiChrospher RP18（１０μＭ）カラム（分析用：４ｘ２５０ｍｍ、流速＝１.０ｍｌ／分；分取用：１０ｘ２５０、流速＝３.０ｍＬ／分）を使用する逆相ＨＰＬＣによって精製した。１００分間の０％Ｂ−１００％Ｂのグラジエントを分析用分離および分取用分離のために使用した。トリチル−オン生成物を含有する画分をまとめて、蒸発乾固した。
【００５３】
トリチル保護基を除去するために、オリゴをＲＴにおいて８０％酢酸で３０分間処理した。酸を真空下で除き、残渣を水に溶解し、その後、酢酸エチルで２回抽出した。水層を再び乾固して、再度溶解した。分析用ＨＰＬＣにより、通常、単一の生成物（場合により、二重ピークとして）が示され、これは、精製することなくさらなる反応に用いることができる。あるいは、ＨＰＬＣによる精製を、上記に記載した溶媒系を使用して行うこともできる。
【００５４】
実験１.７  前駆体形態を含有するホスホルアミダイト（例えば、化合物１ｂなどのエステル、図９Ｂ、スキーム２；図１７Ｂも参照されたい）を使用するオリゴヌクレオチドのヒドラジド官能基合成のイン・サイチュ生成：
オリゴヌクレオチドは、自動オリゴヌクレオチド合成機において固相ホスホルアミダイト法を使用して合成した。ヒドラジドの前駆体形態を有するホスホルアミダイトは、アセトニトリル中の０.１Ｍ溶液として加え、そして標準的な活性化試薬およびカップリング時間を使用して配列内の所望の位置にカップリングさせた。ヒドラジド前駆体だけでなく、酸に不安定な保護基で標識したヒドロキシル基を含有するホスホルアミダイトの使用により、オリゴヌクレオチドのいずれの位置にもヒドラジドの導入が可能になる。これは、ヒドラジドの前駆体形態がオリゴヌクレオチド合成の条件に対して安定であり、その一方で、ヒドラジンとのインキュベーションが行われるまでは、反応性のヒドラジドが形成されないからである。
【００５５】
ＣＰＧ結合オリゴ（１ｍｍｏｌ）を、５０ｍｇのジエチルアミンを含む３.５ｍＬのジクロロメタン溶液で処理した。（遮光して）一晩インキュベーションした後、上清を除き、支持体に結合したオリゴをジクロロメタンで数回洗浄し、真空下で乾燥した。
【００５６】
ベンゾイル保護基およびイソブチリル保護基の切断、オリゴの５’末端におけるエステルのヒドラジドへの変換、ならびにオリゴの支持体からの切断（図１７Ｂ）のために、結合したオリゴを有するＣＰＧを１ｍｌの２４％ヒドラジン水和物で処理した。４℃における一定の攪拌のもとで１８時間後に反応が完了した。ヒドラジン溶液からのオリゴの単離は逆相抽出（例えば、Ｓｅｐ−ＰａｋまたはＨＰＬＣ）によって達成することができる。
【００５７】
Ｃ１８Ｓｅｐ−Ｐａｋカートリッジ（０.５ｇ、Waters、No.20515）を、１０ｍｌのアセトニトリルで洗浄し、その後、１０ｍｌの０.１Ｍ重炭酸トリエチルアンモニウム緩衝液（ｐＨ７.０）（ＴＥＡＢ）で濯ぐことによって活性化した。ヒドラジン溶液を５倍容量のＴＥＡＢで希釈して、カートリッジに加えた。オリゴをＳｅｐ−Ｐａｋカラムに結合させた後、残留するヒドラジンを１０ｍｌのＴＥＡＢで洗い流した。その後、オリゴを、ＴＥＡＢ／アセトニトリル（１：２）を用いてカラムから溶出した。オリゴを含有する画分をまとめ、蒸発乾固させた。生成物のＲＰ−ＨＰＬＣによる特徴付けおよび精製については、プロトコール１に記載したのと同じ条件を適用することができる。
【００５８】
他の例が下記に示されるが、オリゴマーは、本発明の複数の結合部分に連結させるために処理される。オリゴは、本開示におけるそのそれぞれの説明の順に番号が付けられている。
【００５９】
実施例２：
実験２.１  非分岐型オリゴヌクレオチドの合成
２.１.１  オリゴ９：ヒドラジド−１５マー（１−ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ−３’）
合成および脱保護をアミダイト化合物１ａに関して記載したごとく行った。トリチル−オン生成物は、記載された条件のもとでは４２.２分に溶出された。オリゴ９は２５.６分に溶出された（二重ピーク）。
ＬＲＭＳ（ＥＳＩ）：分子量の計算値：４７０９.１５、実測値：４７０９.５。
【００６０】
２.１.２  オリゴ１０：ヒドラジド−１９マー（１−ｄＧＡ ＴＧＡ ＧＣＡ ＧＴＴ ＣＴＡ ＣＧＴ ＧＧ−３’）
合成および脱保護は、アミダイト化合物１ａに関して記載したように行った。トリチル−オン生成物は、記載された条件のもとでは４１.５分に溶出された。オリゴ１０は２５.１分に溶出された（単一ピーク）。
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：分子量の計算値：６０９２、実測値：６０９２。
【００６１】
２.１.３  ヒドラジドのイン・サイチュ生成（オリゴ１１：ヒドラジド−１９マー（８−ｄＧＡ ＴＧＡ ＧＣＡ ＧＴＴ ＣＴＡ ＣＧＴ ＧＧ−Ｃｙ３’））
オリゴヌクレオチドの合成は以前に記載したように行った。Ｃｙ３色素が負荷されたＣＰＧ支持体を使用して、発蛍光団をオリゴの３’末端に標識した。ＣＰＧ結合オリゴを上記の実施例１（Ｅ）に概略したように処理し、生成物をＲＰ−ＨＰＬＣによって精製した。ヒドラジドオリゴは、実施例１（Ｄ）に記載したＨＰＬＣ条件のもとでは３１.８分に溶出された。
ＬＲＭＳ（ＥＳＩ）：分子量の計算値：６５９９.７、実測値：６５９８±２。
【００６２】
実験２.２  分岐しているオリゴヌクレオチドの合成
複数のヒドラジドをオリゴヌクレオチドに導入するために、分岐しているホスホルアミダイト（ヒドラジドに変換される２以上のエステル基を有するホスホルアミダイト）を、両方のアプローチの組合せと同様に使用した。この柔軟な方法により、１個から数個（約４０）までの規定された数のヒドラジドを有するオリゴヌクレオチドの合成が可能になる。本実施例におけるこれらの実験は、ｐ−ＲＮＡを使用して記載されているが、ＤＮＡなどの他のオリゴヌクレオチドにも適用することができる。
【００６３】
実験２.２.１  ｐ−ＲＮＡオリゴヌクレオチドの合成
ｐ−ＲＮＡオリゴヌクレオチドの合成は、下記の例外および改変を用いて、Miculka, C.; Windhab, N.; Brandstetter, T.; Burdinski, G.、ＰＣＴ国際特許出願公開WO99/15540 (1999)に記載したごとく行った：ペンタピラノシルヌクレオシドのホスホルアミダイトをＫＯＨ上で真空下にて乾燥し、そして乾燥アセトニトリルに溶解して０.１Ｍ溶液を得た。この溶液を、新たに活性化したモレキュラーシーブ（３Å）で３時間乾燥し、その後、PE Biosystems Expedite 8905 ＤＮＡ合成機上の固相オリゴヌクレオチド合成のために適用した。他のホスホルアミダイトは乾燥アセトニトリルに０.１Ｍで溶解し、そしてさらに処理することなく使用した。モノメトキシトリチルで保護されたＣｙ３（CAS:182873-80-9、AP-Biotech、Freiburg、ドイツ）が負荷された支持体特注品のＣＰＧの２’末端にＣｙ３色素を有するｐ−ＲＮＡオリゴヌクレオチドについては、乾燥アセトニトリル中の無水ピリジニウム塩酸塩の０.１Ｍ溶液を活性化剤として使用した。ペントピラノシルヌクレオシドに対する脱トリチル化時間は１０分に増大され、カップリング時間は２５分に増大した。すべての他の試薬および溶液ならびに手法は装置製造業者の推奨に従った。
【００６４】
実験２.２.２  ｐ−ＲＮＡオリゴヌクレオチドの脱保護：
β−シアノエチル保護基を切断するために、オリゴヌクレオチドをジクロロメタン中のジエチルアミンの１.５％（ｗ／ｖ）溶液を用いて（遮光して）ＲＴで一晩処理した。上清を除き、支持体に結合したオリゴヌクレオチドをジクロロメタンで数回洗浄して真空乾燥した。
【００６５】
ベンゾイル保護基およびイソブチリル保護基の切断、オリゴの５’末端におけるエステルのヒドラジドへの変換、ならびにオリゴの支持体からの切断のために、結合したオリゴを有するＣＰＧを１ｍｌの２４％ヒドラジン水和物で処理した。４℃における一定の攪拌のもとで１８時間後に反応が完了した。ヒドラジン溶液からのオリゴの単離は逆相抽出（例えば、Ｓｅｐ−ＰａｋまたはＨＰＬＣ）によって達成することができる。
【００６６】
Ｃ１８Ｓｅｐ−Ｐａｋカートリッジ（０.５ｇ、Waters、No.20515）を、１０ｍｌのアセトニトリル、その後、１０ｍｌの０.１Ｍ重炭酸トリエチルアンモニウム緩衝液（ｐＨ７.０）（ＴＥＡＢ）で濯ぐことによって活性化した。ヒドラジン溶液を５倍容量のＴＥＡＢで希釈して、カートリッジに加えた。オリゴをＳｅｐ−Ｐａｋカラムに結合させた後に、残留するヒドラジンを１０ｍｌのＴＥＡＢで洗い流した。その後、オリゴを、ＴＥＡＢ／アセトニトリル（１：２）を用いてカラムから溶出した。オリゴを含有する画分をまとめて、蒸発乾固させた。生成物の特徴付けおよび精製は、緩衝液Ａとして０.１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム（ｐＨ＝７.０）（ＴＥＡＡ）および緩衝液Ｂとして緩衝液Ａ中の７５％アセトニトリルを使用して、Merck LiChrospher RP18（１０μＭ）カラム（分析用：４ｘ２５０ｍｍ、流速＝１.０ｍｌ／分；分取用：１０ｘ２５０、流速＝３.０ｍＬ／分）を使用する逆相ＨＰＬＣによって行った。１００分間の０％Ｂ−１００％Ｂのグラジエント（ＨＰＬＣ法Ａ）または３０分間の０％Ｂ−１００％Ｂのグラジエント（ＨＰＬＣ法Ｂ）を分析用分離および分取用分離のために使用した。
【００６７】
Ａ.オリゴ１２：１のヒドラジドを有するＣｙ３標識ｐ−ＲＮＡオリゴ：ｐ−ＲＮＡオリゴ４’−（Ｈｙｄ１）ＴＡＧ ＧＣＡ ＴＴ（Ｃｙ３）−２’
合成および脱保護は、アミダイト化合物１ｂに関して記載したごとく行った。
【００６８】
Ｂ.オリゴ１３：３のヒドラジドを有するＣｙ３標識ｐ−ＲＮＡオリゴ：ｐ−ＲＮＡオリゴ４’−（Ｈｙｄ３）ＴＡＧ ＧＣＡ ＴＴ（Ｃｙ３）−２’
合成および脱保護は、アミダイト化合物１ｄに関して記載したごとく行った。生成物は、記載された条件のもとでは３７.９分に溶出された（ＨＰＬＣ法Ａ）。
ＬＲＭＳ（ＥＳＩ）：分子量の計算値：３５１６.６、実測値：３５１５。
【００６９】
Ｃ.オリゴ１４：４のヒドラジドを有するＣｙ３標識ｐ−ＲＮＡオリゴ：ｐ−ＲＮＡオリゴ４’−（Ｈｙｄ２）２（ＳＢＡ）ＴＡＧ ＧＣＡ ＴＴ（Ｃｙ３）−２’
合成および脱保護は、対称的な分岐するホスホルアミダイト（ＳＢＡ；Clontech、No.5252-2）を用いて、アミダイト化合物１ｃに関して記載したごとく行った。生成物は、記載された条件のもとでは３７.３分に溶出された（ＨＰＬＣ法Ａ）。
ＬＲＭＳ（ＭＡＬＤＩ）：分子量の計算値：３７８４.７、実測値：３７８４。
【００７０】
Ｄ.オリゴ１５：８のヒドラジドを有するＣｙ３標識ｐ−ＲＮＡオリゴ：ｐ−ＲＮＡオリゴ４’−（Ｈｙｄ２）４（ＳＢＡ）２（ＳＢＡ）ＴＡＧ ＧＣＡ ＴＴ（Ｃｙ３）−２’
合成および脱保護は、対称的な分岐するホスホルアミダイト（ＳＢＡ；Clontech、No.5252-2）を用いて、アミダイト化合物１ｃに関して記載したごとく行った。生成物は、記載された条件のもとでは３６.９分に溶出された（ＨＰＬＣ法Ａ）。
ＬＲＭＳ（ＭＡＬＤＩ）：分子量の計算値：４６６１.１、実測値：４４６４。
【００７１】
Ｅ.オリゴ１６：スペーサーおよび８のヒドラジドを有するＣｙ３標識ｐ−ＲＮＡオリゴ：ｐ−ＲＮＡオリゴ４’−（Ｈｙｄ２）４（ＳＢＡ）２（ＳＢＡ）（Ｓ１８）ＴＡＧ ＧＣＡ ＴＴ（Ｃｙ３）−２’
合成および脱保護は、対称的な分岐するホスホルアミダイト（ＳＢＡ；Clontech、No.5252-2）およびスペーサー１８（Ｓ１８、Glen research、No.10-1918-02）を用いて、アミダイト化合物１ｃに関して記載したごとく行った。生成物は、記載された条件のもとでは３８.７分に溶出された（ＨＰＬＣ法Ａ）。
【００７２】
Ｆ.オリゴ１７：１６のヒドラジドを有するＣｙ３標識ｐ−ＲＮＡオリゴ：ｐ−ＲＮＡオリゴ４’−（Ｈｙｄ２）８（ＳＢＡ）４（ＳＢＡ）２（ＳＢＡ）ＴＡＧ ＧＣＡ ＴＴ（Ｃｙ３）−２’
合成および脱保護は、対称的な分岐するホスホルアミダイト（ＳＢＡ；Clontech、No.5252-2）を用いて、アミダイト化合物１ｃに関して記載したごとく行った。生成物は、記載された条件のもとでは３８.７分に溶出された（ＨＰＬＣ法Ａ）。
【００７３】
Ｇ.オリゴ１８：４のヒドラジドを有するｐ−ＲＮＡオリゴ（Ｃｙ３色素なし）：ｐ−ＲＮＡオリゴ４’−（Ｈｙｄ２）２（ＳＢＡ）ＴＡＧ ＧＣＡ ＴＴ−２’
合成および脱保護は、アミダイト化合物１ｃに関して記載したごとく行った。生成物は、記載された条件のもとでは１２.７５分に溶出された（ＨＰＬＣ法Ｂ）。
ＬＲＭＳ（ＥＳＩ）：分子量の計算値：３２７５.１、実測値：３２７５.４。
【００７４】
実験２.３  ヒドラジドオリゴヌクレオチドをボロン酸オリゴヌクレオチドに変換するための一般的手法
５０ｎｍｏｌのヒドラジドオリゴヌクレオチドを２００μＬの１０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ４.０）に溶解し、１のヒドラジド当り１５当量の４−ホルミルフェニルボロン酸（Aldrich、No.C43,196-6；CAS:87199-17-5）を加えた。４のヒドラジドを含有するオリゴヌクレオチドについては、例えば、ＤＭＳＯ中の４−ホルミルフェニルボロン酸の０.１Ｍ溶液の３０μＬ（３μｍｏｌ）を使用した。混合物をＲＴで１時間インキュベーションし、４−ホルミルフェニルボロン酸当り２０当量のＮａＣＮＢＨ３を加えて、インキュベーションをＲＴでさらに１時間続けた。例えば、４のヒドラジドを有するオリゴヌクレオチドの場合には、１０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ４.０）中のＮａＣＮＢＨ３の１Ｍ溶液（６.３ｍｇを１ｍＬに溶解した）の１５０μＬ（１５０μｍｏｌ）が必要であった。
【００７５】
過剰な４−ホルミルフェニルボロン酸およびシアノホウ水素化ナトリウムの除去は、ＨＰＬＣ、ゲルろ過（Pharmacia PD10 column）または固相抽出（Merck LiChrolute column）によって除去した。ボロン酸で修飾されたオリゴヌクレオチドの場合、エンドキャップ処理したＨＰＬＣカラムを使用することが重要である。典型的な条件としては、緩衝液Ａとして０.１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム（ｐＨ＝７.０）（ＴＥＡＡ）および緩衝液Ｂとして緩衝液Ａ中の７５％アセトニトリルを使用する、５μｍのPhenomenex Lunaフェニルヘキシルカラム（分析用：４.６ｘ２５０ｍｍ、流速＝１.０ｍｌ／分；分取用：１０ｘ２５０、流速＝３.０ｍｌ／分）とした。１００分間の０％Ｂ−１００％Ｂのグラジエント（ＨＰＬＣ法Ａ）または３０分間の０％Ｂ−１００％Ｂのグラジエント（ＨＰＬＣ法Ｂ）が分析用分離および分取用分離のために使用した。生成物を含有する画分をまとめ、蒸発乾固させた。
【００７６】
Ａ.オリゴ１９：１のボロン酸を有するｐ−ＲＮＡオリゴ：ｐ−ＲＮＡオリゴ４’−（ＰＢＡ）ＴＡＧ ＧＣＡ ＴＴ（Ｃｙ３）−２’
合成および脱保護は、出発物質としてオリゴヌクレオチド１２を使用して一般的なプロトコールに記載したごとく行った。
【００７７】
Ｂ.オリゴ２０：３のボロン酸を有するｐ−ＲＮＡオリゴ：ｐ−ＲＮＡオリゴ４’−（ＰＢＡ）３ＴＡＧ ＧＣＡ ＴＴ（Ｃｙ３）−２’
合成および脱保護は、出発物質としてオリゴヌクレオチド１３を使用して一般的なプロトコールに記載したごとく行った。
【００７８】
Ｃ.オリゴ２１：４のボロン酸を有するｐ−ＲＮＡオリゴ：ｐ−ＲＮＡオリゴ４’−（ＰＢＡ）４（ＳＢＡ）ＴＡＧ ＧＣＡ ＴＴ（Ｃｙ３）−２’
合成および脱保護は、出発物質としてオリゴヌクレオチド１４を使用して一般的なプロトコールに記載したごとく行った。
【００７９】
Ｄ.オリゴ２２：８のボロン酸を有するｐ−ＲＮＡオリゴ：ｐ−ＲＮＡオリゴ４’−（ＰＢＡ）８（ＳＢＡ）２（ＳＢＡ）ＴＡＧ ＧＣＡ ＴＴ（Ｃｙ３）−２’
合成および脱保護は、出発物質としてオリゴヌクレオチド１５を使用して一般的なプロトコールに記載したごとく行った。生成物は、記載された条件のもとでは４６.３分に溶出された（ＨＰＬＣ法Ａ）。
【００８０】
Ｅ.オリゴ２３：スペーサー１８および８のボロン酸を有するｐ−ＲＮＡオリゴ：ｐ−ＲＮＡオリゴ４’−（ＰＢＡ）８（ＳＢＡ）２（ＳＢＡ）ＴＡＧ ＧＣＡ ＴＴ（Ｃｙ３）−２’
合成および脱保護は、出発物質としてオリゴヌクレオチド１６を使用して一般的なプロトコールに記載したごとく行った。
【００８１】
Ｆ.オリゴ２４：１６のボロン酸を有するｐ−ＲＮＡオリゴ：ｐ−ＲＮＡオリゴ４’−（ＰＢＡ）１６（ＳＢＡ）４（ＳＢＡ）２（ＳＢＡ）ＴＡＧ ＧＣＡ ＴＴ（Ｃｙ３）−２’
合成および脱保護は、出発物質としてオリゴヌクレオチド１７を使用して一般的なプロトコールに記載したごとく行った。生成物は、記載された条件のもとでは４９.０分に溶出された（ＨＰＬＣ法Ａ）。
【００８２】
Ｇ.オリゴ２５：１のボロン酸を有するｐ−ＲＮＡオリゴ：ｐ−ＲＮＡオリゴ４’−（ＰＢＡ）ＴＡＧ ＧＣＡ ＴＴ（Ｃｙ３）−２’
合成および脱保護は、出発物質としてオリゴヌクレオチド１８を使用して一般的なプロトコールに記載したごとく行った。
【００８３】
実施例３：ＨＰＬＣ分析：
ヒドラジドオリゴの合成が完了したら、最初の１組の実験により、ヒドラジドで標識されたオリゴとＮＨＳエステルまたはスルホ−ＮＨＳエステルとの溶液反応速度論を調べた。５μＬの１３２μＭヒドラジドＡＴＡ５を含む３０μＬの５０ｍＭヒスチジン溶液に、１０ｍＭのＮＨＳアクリラートの５μＬを加えた。溶液をＲＴで短時間攪拌し、その後、ＨＰＬＣシステムに注入した。溶液中の化合物のＨＰＬＣ軌跡は、所与の反応時間について反応混合物中に存在するヒドラジドＡＴＡ５およびＮ’アクリロ−ＡＴＡ５ジヒドラジドの量を示した。出発物質のＡＴＡ５ヒドラジドおよび修飾されたＡＴＡ５ヒドラジドの保持時間は異なり、分離可能であった。
【００８４】
図１０Ａ−Ｃに、反応混合物の３の異なる軌跡をが示す。最初の軌跡（Ａ）は未修飾のＡＴＡ５ヒドラジド（Ａ）から得られたが、３番目の軌跡（Ｃ）は、ＮＨＳアクリラートとの５分の反応時間の後における完全に修飾されたＡＴＡ５ヒドラジド（Ｂ）を表している。中央の軌跡（Ｂ）は、反応物中に１分で捕捉された不完全な修飾体を表している。ＡＴＡ５ヒドラジドがほぼ消費されたことを考えれば、１２００Ｍ−１ｓ−１の擬一次反応速度が決定される。
【００８５】
この速度と利用した他の結合システムとの比較を図１１に示す。水性環境におけるヒドラジドとＮＨＳエステルに対する反応速度は、非常に優れた効率的な反応を表している。さらに、ヒドラジド修飾のｐＨ依存性を明らかにするために、反応のｐＨを変化させた。実験は、ｐＨ＝６、５.５、５.０、４.５および４にＨＣｌで調節した５０ｍＭヒスチジンの緩衝化系を用いて行った。この変換は、ｐＨ＝４.５まで下げ続けた。しかし、ｐＨ＝４では、ヒドラジドオリゴは影響を受けず、変換が起こらなかった。したがって、ｐＨの下限は約４.５である。
【００８６】
実施例４：チップの調製：
マイクロアレイを含有するチップをアルゴン下で５分間プラズマ洗浄した。その後、２５部位を有する１ｃｍｘ１ｃｍのチップを、気相蒸着を使用してシラン化した。マイクロアレイの中心に、０.３％のDaracur4265をＵＶ開始剤として含む１：１のＤＭＳＯ／Ｈ２Ｏ中の９：１（モル比）のアクリルアミド／ビスアクリルアミドの２０％（重量比）溶液の０.１０μＬを加えた。チップは、一辺が３.ｍｍの正方形の４ｕＭのくぼみを含むマイクロアレイ部位がＵＶウインドに押し付けられたマイクロ反応成形システムに入れた。溶液は、ＵＶ光を２０秒間照射され、そして成形システムから取り出し、水で濯ぎ、空気乾燥した。ウエルには、正方形のヒドロゲル層がマイクロアレイを覆って形成された。鋳型の限界を超える過度な重合物は除いた。
【００８７】
存在する透過層に、２０％（重量比）のモノマー濃度のＮＨＳまたはスルホ−ＮＨＳ／Ａｍ／Ｂｉｓ（１０／８３／７のモル比）を含有する溶液の０.８０μＬを加えて、存在するポリマーを１分間飽和させた。チップをマイクロ反応成形システムに置き、直径が４.６ｍｍでウエルの深さが５μＭである円形鋳型を用いて上記のように重合した。この第２の鋳型は、存在する正方形の層を完全に含み、それよりも外側に広がる。第２の層の結合は、ポリマー鎖およびバインドシランのインターカレーションによって達成される。チップは水で洗浄し、圧縮空気で乾燥し、続いて下記の実験で試験した。
【００８８】
実験４.１：活性化エステルの濃度；標識された捕捉物のアドレス：
０％、１％、２％および４％のスルホ−ＮＨＳを含有する上記の二倍透過層で修飾されたチップに、特異的な標識された捕捉物として５００ヒドラジド−Ｔ１２−ＢＴＲを電子的に負荷し、その一方で、５０ｍＭｎＭのビオチン−Ｔ１２−ＢＴＲを非特異的な標識された捕捉物として使用した。すべての溶液は５０ｍＭヒスチジンで緩衝化した。捕捉物は、５００ｎＡ／パッドの電流で１２０秒間、一度に４パッドでアドレス指定した。それぞれのチップを、１％ＳＤＳ、０.２ｘＳＴＥで洗浄し、そして１％ＳＤＳで２０分間すすいだ。このチップを１秒間画像化して、平均ＭＦＩ値を記録した。
【００８９】
図１２において理解され得るように、標識されたヒドラジドオリゴの共有結合は、透過層中の活性化エステルの量に依存し、その濃度が増大するにしたがって大きくなった。ビオチン標識されたオリゴの非特異的な結合はまた、極めて低く、この実験の場合には平均して４０ＭＦＩ／ｓであった。
【００９０】
実験４.２：電子的条件：
１０％のＮＨＳまたはスルホ−ＮＨＳを含有する上記の二倍透過層で修飾されたチップに、特異的な標識された捕捉物として５００ｎＭおよび５ｎＭのヒドラジド−Ｔ１２−ＢＴＲを電子的に負荷した。５００ｍＭｎＭのビオチン−Ｔ１２−ＢＴＲを非特異的な標識した捕捉物として使用した。すべての溶液は５０ｍＭヒスチジンで緩衝化した。捕捉物は、４００ｎＡ／パッド、５００ｎＡ／パッド、６００ｎＡ／パッド、７００ｎＡ／パッドおよび８００ｎＡ／パッドの電流で１２０秒間、一度に３パッドをアドレス指定した。非特異的な捕捉物は８００ｎＡ／パッドで負荷した。それぞれのチップは、１％ＳＤＳ、０.２ｘＳＴＥで洗浄し、そして１％ＳＤＳ中に２０分間浸漬した。これらのチップを１秒間画像化して、平均ＭＦＩ値を記録した。
【００９１】
図１３によって示され得るように、ＮＨＳで修飾された透過層に対する特異的な捕捉物の結合は６００ｎＡで劇的に増大しているが、スルホ−ＮＨＳで修飾されたヒドロゲルは最大の結合のためにわずかに大きい電流を必要とした（図１４）。
【００９２】
実験４.３：多結合の効果
１０％のＮＨＳを含有する上記の二倍透過層で修飾されたチップに、１、２、４または８のヒドラジド基を含有するＣｙ３標識されたＡＴＡ５オリゴを負荷した。これらの４のオリゴマーを、５０ｍＭヒスチジンで緩衝化された状態で、７００ｎＡ／パッドまたは８００ｎＡ／パッドのいずれかの電流で１２０秒間、５００ｎＭで電子的に負荷した。完了後、これらのチップを洗浄して、結合レベルを測定した。
【００９３】
記録されたＭＦＩ／ｓ値を図１５に示す。等しい電流を与えたオリゴマー当りの結合に利用し得るヒドラジド基の数を比較すると、オリゴマーに対するヒドラジドが増加するにしたがって結合レベルが増加することが示された。
【００９４】
実験４.４：リバースドットブロットによる電子的ハイブリダイゼーション
１５％のＮＨＳを含有する上記の二倍透過層で修飾されたチップに、特異的な捕捉物として、Ｃｙ３標識を有するオクタ−ヒドラジドＡＴＡ５オリゴマーを負荷した。特異的な捕捉物は、５０ｍＭヒスチジンで緩衝化された状態で、６００ｎＡ／パッドまたは７００ｎＡ／パッドのいずれかの電流で１２０秒間、５００ｎＭで電子的に負荷した。電子的ハイブリダイゼーションを、特異的な標的として５ｎＭのＲＣＡ５−Ｔ１２−Ｃｙ５を用いて行い、一方、５ｎＭのＲＣＡ４−Ｃｙ５の溶液を非特異的な標的として使用した。標的は４００ｎＡ／パッドで６０秒間負荷された。これらのチップを、標準的なプロトコールにしたがって洗浄し、そして画像化した。
【００９５】
図１６に示されるデータは、特異的な標的のハイブリダイゼーションが非特異的な標的に対して優先することを明確に示している。上記に報告されたデータと一致して、捕捉物の電子的負荷について、電流を６００ｎＡから７００ｎＡに増大することにより、ハイブリダイゼーションの増大が生じていることにもまた留意しなければならない。
【００９６】
実施例５：非共有結合部分を有する生体分子の合成
図４ならびに図５Ａおよび図５Ｂは、複数の結合部分を含むオリゴヌクレオチドの合成を示している。図４には、２のＰＢＡを含有する単一の分岐型ホスホルアミダイトを付加するオリゴ合成が示されている。図５Ａおよび図５Ｂはそれぞれ、４のＰＢＡを有する２の枝分かれ、および８のＰＢＡを有する３の枝分かれを示している。示されるような合成はＡＢＩ３９４ ＤＮＡ合成機で行った。分岐型ホスホルアミダイトの逐次カップリング収率は、通常のヌクレオチドホスホルアミダイトと類似し、約９６％−９８％であった。ＰＢＡホスホルアミダイトは最終工程で加えた。オリゴヌクレオチドの固体支持体からの切断および保護基の除去は、当業者に十分に知られているような通常のオリゴヌクレオチドの取扱いと同じであった。
【００９７】
ＰＢＡを含有する分岐型オリゴヌクレオチドをＨＰＬＣによって精製および分析した。ＰＢＡ含有オリゴヌクレオチドのＨＰＬＣは、通常のオリゴヌクレオチドのピークよりも広いピークを示した。
【００９８】
実験５.１：非共有的な結合部分を介する生体分子の電子的負荷
２０ｎＭの非分岐型および分岐型のＰＢＡ含有ＡＴＡ５捕捉物プローブをヒドロゲル基体に電子的に負荷した。捕捉物プローブは、５０ｍＭヒスチジンにおいて、一度に１０パッド、１２０秒間負荷した。２０ｎＭのＲＣＡ５−ＢＴＲは５分間受動的に負荷した。基体を洗浄し、画像化した。分析は、分岐型および非分岐型の両方の捕捉物プローブが透過層に所望するように固定化されていることを示していた。
【００９９】
実験５.２：非共有的な結合部分を介して電子的に負荷された生体分子の安定性
オリゴ２０、オリゴ２１およびオリゴ２２（３、４および８個のＰＢＡ結合部位を含むｐ−ＲＮＡ）をＳＨＡで修飾されたヒドロゲルチップに電子的にアドレス指定した。完了したら、最初の像を、前に記載した標準的な洗浄手法の後に記録した。その後、チップアレイを、１０μＬの５０ｍＭヒスチジンによる洗浄を繰り返しながら通常の洗浄に供した。像は５回の洗浄の後に記録した。図２１に示す結果は２の特徴を含む。第１に、オリゴあたりの結合部位の数がより多い、より高次のデンドリマーについて記録されたシグナルは明らかに大きくなっている。また、シグナルは、２５回の洗浄サイクルの期間にわたって極めて安定している。このことは、デンドリマー状の結合システムを使用することの改善された安定性を例示している。オリゴ２２はその初期シグナルの約１４％を失い、その一方で、オリゴ２０およびオリゴ２１はそれぞれ２５％および３５％低下していた。
【０１００】
実施例６：複数のヒドラゾン形成を介する共有的な結合
以前、単一のアミンまたはヒドラジドで修飾されたオリゴが、アルデヒドで修飾されたヒドロゲルに電子的に負荷されている。アルデヒドとアミンまたはヒドラジドとの相互作用により、それぞれ、イミン（窒素に対する二重結合を有する炭素）またはヒドラゾンの生成がもたらされる。これらの基は、水性条件のもとでは可逆的であり、安定した不可逆的な共有的な結合を成形させるためには、ＮａＢＨ３ＣＮによるさらなる還元を必要とする。実際、単一のヒドラジドを含有するオリゴマーの電子的濃縮により、ヒドラゾンの形成を介したオリゴマーの表面への結合がもたらされた。還元工程の省略は、容易に加水分解される不安定な結合をもたらし、結合したオリゴは容易に拡散して散らばった。著しい数のヒドラゾンがオリゴあたりに形成されるならば、デンドリマー状のヒドラジドを使用することにより、さらなる還元を必要としない、少し不安定な結合による共有的な結合手段が提供される。可逆的なヒドラゾン形成は一部の連結部位において生じ得るが、他の部位は無傷のままである（図２２）。ヒドラジドは拡散することができず、アルデヒドが多い環境では捕捉され、ヒドラジドが容易に再び形成され得る。この平衡は、オリゴ当りの結合部位の数が増大するほど有利であり、そしてすべての結合が一度に加水分解されないならば、安定な結合システムを提供すると考えられる。アルデヒドが多い透過層は、グリオキシルアガロースの場合のように直接調製することができるか、またはアセタールで修飾された透過層から得ることができる。後者の場合、アセタール基は、酸の存在下で容易に加水分解されてアルデヒドをもたらす。アセタールは保護基として作用し、これにより、活性化が所望されるまで、アルデヒドの機能性が維持される。加水分解は、酸性溶液に１時間に曝すことによって完了し得るか、または希釈された塩溶液において緩衝化された状態で穏和な電流に供することができる。後者の方法では、カソードで生成する酸を利用することによる部位特異的な加水分解が得られる。
【０１０１】
実験６.１：グリオキシルアガロースに結合したデンドリマー状ヒドラジドオリゴマー
標準的な２５部位チップにグリオキシルアガロース（FMC、Princeton、NJ）をスピンコーティングした。１、２、４および８のヒドラジドを含有するヒドラジドＣｙ３標識オリゴ（５００ｎＭ）を、５０ｍＭヒスチジンで緩衝化した状態で、それぞれ、２分間、５００ｎＡ／パッドで電子的に負荷した。これらのチップを、確立された手順にしたがって洗浄し、画像化した。記録されたMＦＩ／ｓ値を図２３に示す。１または２のヒドラジドを有するオリゴは極めて不安定であり、そして予想されるように、バックグラウンドのノイズを越える検出可能な蛍光をほとんどもたらさなかった。より多くの数のヒドラジドを有するオリゴは安定した共有的な結合を形成することができる。
【０１０２】
実験６.２：アセタールで修飾されたヒドロゲルに結合したデンドリマー状のヒドラジドオリゴマー：脱保護および共有的な結合
標準的な２５アレイ部位チップを、１５：２：３の比率で、アクリルアミド、ビスアクリルアミドおよびビニルアセタールから構成される単層ヒドロゲルで修飾した。選択された部位を５０ｍＭのＮａＣｌ溶液中で３００ｎＡ／パッドの電流に対して２分間処理して、アセタール機能性を加水分解し、アルデヒドを露出させた。オリゴあたり８のヒドラジドを含有するデンドリマー状のヒドラジドオリゴマーを、活性化されたパッドおよび活性化されていないパッドに、５０ｍＭヒスチジンに緩衝化された状態で、２分間、５００ｎＡ／パッドで電子的に負荷した。非特異的なオリゴもまた、アセタール修飾部位およびアルデヒド修飾部位の両方に電子的に負荷した。標準的な洗浄サイクルの後、これらのチップを画像化した。記録されたＭＦＩ／ｓデータを図２４に示す。
【０１０３】
図２４に示され得るように、電子的に活性化され、その後、デンドリマー状の標識オリゴマーが電子的に負荷されたパッドは、最大の蛍光シグナルを示している。興味深いことに、前処理せず、アセタールとして残留しているそのようなパッドはまた、ヒドラジドで修飾されたオリゴマーのいくらかの結合を示している。おそらくは、オリゴマーを濃縮するために加えられた電流により、ヒスチジンの緩衝能を局所的に越えるのに十分な酸が生じ、したがって、有意な量のアセタール基を加水分解することができたと考えられる。
【０１０４】
実施例７：基体表面以外の分子に対するヒドラジドオリゴヌクレオチドのカップリング
実験７.１  ヒドラジド−１５マー９とベンジルオキシアセトアルデヒドとの反応；図１９
１０μｍｏｌのヒドラジドオリゴヌクレオチド９を６０μＬの１０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ４.０）に溶解した。１滴のベンジルオキシアセトアルデヒド（CAS:6065-87-3；Ｃ９Ｈ１０Ｏ２［１５０.１７６０］、Aldrich No.38,218-3）を加えて、混合物をＲＴで１時間放置する。溶媒および過剰なアルデヒドを真空下で除去し、生成物をＨＰＬＣによって分析した（カラム：Merck LiChrospher RP18、１０μＭ、４ｘ２５０ｍｍ；緩衝液Ａ＝０.１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム（ｐＨ＝７.０）、緩衝液Ｂ＝緩衝液Ａ中の７５％アセトニトリル；流速＝１.０ｍＬ／分；グラジエント：１００分でＢを０％から１００％に）。生成物の保持時間は３０.７分であり、オリゴ９は２５.５分に溶出された。
【０１０５】
実験７.２  オリゴ１０とペプチドとの結合反応、図２０
４.４ｎｍｏｌのオリゴ１０を６０μＬの１０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ４.０）に溶解した。４４ｎｍｏｌ（１０当量）のアンチパイン塩酸塩（CAS:37682-72-7；Ｃ２７Ｈ４４Ｎ１０Ｏ６・２ＨＣｌ；［６７７.６３０４］；Calbio No.F178220）を含む１５μＬの緩衝液を加え、ＲＴで３時間攪拌した。中間生成物をＮａＢＨ３ＣＮ（１００当量）によってＲＴで１時間還元した。生成物はＨＰＬＣによって単離した（カラム：Merck LiChrospher RP18、１０μＭ、４ｘ２５０ｍｍ；緩衝液Ａ＝０.１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム（ｐＨ＝７.０）、緩衝液Ｂ＝緩衝液Ａ中の７５％アセトニトリル；流速＝１.０ｍＬ／分；グラジエント：６０分で１０％Ｂから８５％Ｂに）。生成物（オリゴヌクレオチドペプチド結合体）の保持時間は１６.５分であり、オリゴ１０は１３.９分に溶出された。
ＭＳ（ＥＳＩ）：計算値：６６８０.６；実測値：６６７９.６。
【０１０６】
実施例８：スライドガラス表面におけるヒドラジド修飾生体分子の受動的適用
ヒドラジドで修飾されたオリゴヌクレオチドを市販のスライドガラスに結合させるために、１個から６個のヒドラジドを含有する一連のｐ−ＲＮＡオリゴヌクレオチドを使用した。オリゴヌクレオチド１２、１３および１４とともに、１ｄから調製され、３個および６個のヒドラジドを有するオリゴマーを使用した。また、アミン末端オリゴマー（５’アミノ修飾剤Ｃ６（Glenn Research）を用いて調製）および修飾を有しないオリゴヌクレオチドが、非特異的なコントロールとして使用される。すべてのオリゴマーは、２’末端がＣｙ３で標識され、同じヌクレオチド配列を保持した。
【０１０７】
実験８.１：Surmodics 3D LinkＴＭアミン結合性スライドガラスへの結合
オリゴヌクレオチドを、１０μＭ−１００ｎＭの範囲の濃度で、ｐＨ＝８.５の３ＤＬｉｎｋＴＭプリント緩衝液（Surmodics, Inc.、Eden Prairie、Minnesota）に溶解した。それぞれの溶液から、０.５μＬをスライドガラスの表面に直接付け、そして密閉チャンバーにおいて、ＮａＣｌ飽和溶液の上方で一晩、暗所にて室温でインキュベーションした。その後、スライドガラスを、３ＤＬｉｎｋＴＭブロッキング緩衝液を用いて５０℃で１５分間処理して、未反応の表面部位をブロッキングした。スライドガラスを水で２回洗浄し、次いで０.２％ＳＤＳを用いて５０℃で３０分間洗浄し、そして最後に水で２回洗浄し、その後、空気乾燥した。蛍光の検出は、２０秒の積算時間を用いてPharmaciaスキャナーで行った。像ならびに強度のプロフィルを図２５に示す。
【０１０８】
非特異的なオリゴヌクレオチドは１０μＭで１０ｘ１０３−２５ｘ１０３の相対ユニットのシグナルをもたらした。シグナルは、強度が、単一のアミノ基を含有するオリゴヌクレオチドについて測定された強度に匹敵する。これに対して、ヒドラジドで修飾されたオリゴヌクレオチドは、３５−４５ｘ１０３蛍光ユニットのはるかに大きい負荷をもたらした。さらに、ヒドラジドで修飾されたオリゴヌクレオチドは、検出下限が５μＭであるアミン修飾オリゴマーと比較した場合、より大きな蛍光シグナルをより低い濃度で有し、検出限界が１.２５μＭと低くなった。
【０１０９】
実験８.２：スーパーアルデヒドスライドガラスへの結合
オリゴヌクレオチドを、１０μＭ−１００ｎＭの範囲の濃度でｐＨ＝８.５の３ＤＬｉｎｋＴＭプリント緩衝液（Surmodics,Inc.、Eden Prairie、Minnesota）に、またはｐＨ＝４.０の１０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液に溶解する。それぞれの溶液から、０.５μＭをスーパーアルデヒドスライドガラス（Telechem International、Inc.、Sunnyvale、CA）の表面に直接付けて、ｒｔで一晩インキュベーションする。その後、スライドガラスを０.２％ＳＤＳで２回洗浄し、そして水で４回洗浄する（それぞれ２分間）。その後、表面を、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ＝７）における０.３％ＮａＢＨ３ＣＮ溶液を用い、そして発泡を抑えるために１３３ｍＬのエタノールとともに処理した。この後、０.２％ＳＤＳおよび水による１分間の洗浄を３回行った。蛍光の検出を、２０秒の積算時間を用いてPharmaciaスキャナーで行った。像ならびに強度のプロフィルが図２６に示される。
【０１１０】
図２６において理解され得るように、ｐＨ＝８.５および４.０の両方において、ヒドラジドオリゴヌクレオチドは、アミン末端オリゴマーと比較して、はるかに大きいシグナル強度をもたらし、そしてｐＨの変化による影響を受けなかった。さらに、同じ濃度の場合、ヒドラジドで修飾されたオリゴマーは、アミンで修飾されたオリゴマーよりもはるかに大きいシグナル強度をもたらす。アミンオリゴヌクレオチドは２.５μＭ未満ではもはや検出することができず、一方、ヒドラジドオリゴマーは１.２５μＭもの低い濃度で検出される。
【０１１１】
前記は、本発明の様々な実施形態を例示することを目的とし、本発明を限定することを決して意図するものではない。本発明は特定の修飾に関して記載されているが、その細部は限定として解釈してはならない。様々な均等物、変化および改変を、本発明の精神および範囲から逸脱することなく用いることができることが明かであり、そしてそのような均等的な実施形態は本発明に包含され得ることが理解されるからである。すべての刊行物および特許出願は、それぞれの個々の刊行物または特許出願が参考としてに組み込まれるように具体的かつ個々に示されているかのようにそれと同じ程度で参考として本明細書中に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  平坦な基体にオリゴヌクレオチドを固定化する従来の方法を示す概略図である。一般には、単一の反応基を、オリゴマーを基体表面に結合させるために使用する。
【図２】  本発明の固定化方法の概略図である。この方法では、生体分子は、基体に対する生体分子の共有的な結合または非共有的な結合に関与し得る複数の結合部分または結合部分を有する。
【図３】  基体表面に結合させるための複数の反応性成分に結合した核酸鎖の一例をより詳細に示す図である。この例では、様々な分岐型ホスホルアミダイトの化学構造が、生体分子に結合したデンドリマー状構造体を作製するために複数の様式で付加されている。
【図４】  フェニルボロン酸（ＰＢＡ）の結合部分を含有するデンドリマー状構造体を有する構造体を製造するための一連の化学工程を示す。
【図５Ａ−Ｂ】  生体分子を基体表面に非共有結合的に結合させるための４（Ａ）または８（Ｂ）のいずれかの結合部分を有するオリゴヌクレオチド生体分子を含む化学的構造体を製造するための一連の化学工程を示す。
【図６Ａ−Ｃ】  複数の反応基を有する生体分子を製造するためにホスホルアミダイトを使用する合成工程を例示する。これらの部分は、オリゴヌクレオチドをヒドラジンで脱保護しているときにヒドラジドに変換されるエステル基を含有する。
【図７】  基体への共有結合を介して生体分子を固定化する際に使用されるヒドラジド基の直接的な結合を有する生体分子を含む化学構造体ＡおよびＢを示す。
【図８Ａ−Ｄ】  複数の結合部分を有する構造体を製造するための化学合成を示す。（Ａ）では、分岐型ホスホルアミダイトがオリゴヌクレオチドに付加され、これはさらに二官能性ホスホルアミダイトで修飾され、その後、ジエチルアミン／ＣＨ２Ｃｌ２およびヒドラジンで脱保護され、基体と結合するための４のヒドラジド基を有する結合部分が作製される。（Ｂ）では、（Ａ）に類似する反応スキームが提供され、６のヒドラジド結合部分が得られる。（Ｃ）では、２の異なる分岐型ホスホルアミダイトを連続的に使用することにより、１の生体分子あたり１６のヒドラジド結合部分が得られる。（Ｄ）では、分岐型ホスホルアミダイトが、デンドリマー構造体を形成させる２の工程において使用され、その後、ホスホルアミダイトおよびヒドラジンの処理により、１の生体分子あたり４のヒドラジド結合部分が得られる。
【図９Ａ−Ｃ】  オリゴヌクレオチド生体分子に取り込まれる新規なホスホルアミダイトを作製するための工程がＡおよびＢによって示される３のスキームを示す。図９Ｃはヒドラジドで標識されたオリゴヌクレオチドを活性化エステルモノマーと反応させ、そして生体分子を固定化するための基体を形成するために使用することができるスキームを示す。
【図１０】  ヒドラジドで標識されたオリゴを、図９のスキーム３に示されるモノマーなどの活性化エステルモノマーにカップリングするための反応混合物の３の異なるＨＰＬＣ軌跡のグラフである。
【図１１】  多標識生体分子の結合に対する反応速度を示すグラフである。ヒドラジド／Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル（ＮＨＳ）エステルの結合が、他の共有的な結合システムの速度よりも測定可能などに大きい速度で、そして２の非共有結合的なシステムの速度に近い速度で生じた。
【図１２】  標識されたヒドラジドオリゴの共有的な結合が基体表面の活性化エステルの量に依存することを示すグラフである。
【図１３】  ＮＨＳエステルまたはＮ−ヒドロキシ−スルホスクシンイミジル（スルホ−ＮＨＳ）エステルのいずれかで修飾された基体表面に対する共有的な結合の完全性を示すグラフである。これらのグラフは、加えた電流の範囲にわたる、電極に結合させた標識オリゴマーに由来する特異的な蛍光強度および非特異的な蛍光強度を示している。
【図１４】  ＮＨＳエステルまたはＮ−ヒドロキシ−スルホスクシンイミジル（スルホ−ＮＨＳ）エステルのいずれかで修飾された基体表面に対する共有的な結合の完全性を示すグラフである。これらのグラフは、加えた電流の範囲にわたる、電極に結合させた標識オリゴマーに由来する特異的な蛍光強度および非特異的な蛍光強度を示している。
【図１５】  ヒドラジド基を多数結合させることにより、基体における生体分子のより高レベルの検出がもたらされることを示すグラフである。
【図１６】  ハイブリダイゼーションが、ヒドラジドで修飾されたオリゴヌクレオチド（ＡＴＡ５）を含有するそれらの部位においてのみ完全であった電子的リバースドットブロットの結果を示すグラフである。捕捉物プローブを、適切な電子的条件のもとで活性化エステル含有基体に特異的に結合させた。ヒドラジドを有しない非特異的な捕捉物は活性化エステルと反応せず、したがってハイブリダイゼーションに利用することができない。
【図１７】  ２の異なるプロトコールＡおよびＢにしたがったヒドラジド修飾オリゴヌクレオチドの合成を示す。Ａでは、保護されたヒドラジドホスホルアミダイトを使用して、オリゴマーを修飾し、その後、オリゴマーを脱保護する。Ｂでは、エステルのホスホルアミダイトを使用して、オリゴマーを修飾し、その後、オリゴマーをヒドラジンと反応させる。
【図１８】  ヒドラジド修飾オリゴマーと反応し得る様々な官能基を例示する概略図である。
【図１９】  アルデヒドと縮合するヒドラジドオリゴマーの例である。
【図２０】  アルデヒドと縮合するヒドラジドオリゴマーの例である。
【図２１】  １のオリゴあたり３、４および８のフェニルボロン酸で標識したオリゴマーに対する記録された平均蛍光強度（ＭＦＩ）値を示す。結合したオリゴマーを、この結合システムの安定性をモニターするために様々な洗浄条件に付した。
【図２２】  アルデヒドが多い透過層におけるデンドリマー状ヒドラジドの動的平衡および安定性を例示する概略図を示す。４のヒドラジド基とともに示されるオリゴマーをアルデヒドが多い透過層に電子的に負荷し、これにより複数のヒドラゾン結合がもたらされる。この特定の例において、結合は個々に加水分を受けやすい。複数の結合部位を使用することにより得られる安定性は、一部のヒドラゾンが無傷で維持される一方で、一部のヒドラゾンが加水分解されることを考慮している。隣接するヒドラゾン結合部位によって結び付けられているヒドラジドは、拡散することができず、したがって、結合を回復させることができるアルデヒドが多い透過層において保持される。
【図２３】  ヒドラゾン結合を介してカップリングされたグリオキシルアガロース透過層に対する、１、２、４および８のヒドラジドのデンドリマー状オリゴマーの結合を示すグラフである。
【図２４】  アセタールで修飾されたヒドロゲルに対するデンドリマー状オリゴマーの結合を示すグラフである。アセタール基は、共有的な結合能力に必要なアルデヒドを生成させるためには酸による加水分解を必要とする。
【図２５】  様々な濃度におけるSurmodics 3D LinkＴＭアミン結合性スライドガラスに対するヒドラジドオリゴマーの使用および改善された結合を例示する。図２５Ｂはガラス製スライドガラスに結合させたオリゴマーの実際の蛍光像であり、その結合レベルを図２５Ａにグラフで示す。
【図２６】  図２５で使用したSurmodicsスライドガラスに対する非特異的な結合の結合レベルを示す。図２６Ｂは、スライドガラスに結合させたオリゴマーの実際の蛍光像であり、その結合レベルを図２６Ａにグラフで示す。
【図２７】  図２７Ａは、ヒドラジドオリゴマーが固体支持体に対する固定化を成功させることができる適用可能なｐＨ範囲を示す。図２７Ｂは、標準的なアミン修飾オリゴマーを上回るヒドラジドオリゴマーの改善された感度はより低い濃度で検出可能であることを示している。
【図２８】  分岐型または非分岐型のヒドラジド修飾オリゴマーがいかにして別の結合システムに対して容易に改変され得るかの一例を例示する。この特定の例では、６のヒドラジドを有する分岐型オリゴマーを、分岐型ＰＢＡ結合プローブを得るためにｐ−ホルミルフェニルボロン酸で修飾している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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