(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
特定の配列を有する遺伝子を検出する遺伝子検出方法であって、
検出すべき遺伝子を一本鎖に変性して遺伝子サンプルを作製する遺伝子サンプル作製工程と、
前記検出すべき遺伝子サンプルの塩基配列に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖の核酸プローブを電極に固定化させる固定化工程と、
前記遺伝子サンプルを前記核酸プローブが固定化された電極に添加し、該核酸プローブと遺伝子サンプルとがハイブリダイズした二本鎖核酸を形成する二本鎖核酸形成工程と、
前記二本鎖核酸が形成された電極に、下記一般式（１）のそれぞれの部位に、−Ｌｂ−Ｉｂ、−Ｌｃ−Ｆｂで表される化合物のいずれか一方もしくは両方の組合せからなる置換基を有する挿入剤を添加する挿入剤添加工程と、
Ｆａ−Ｌａ−Ｉａ  （１）
［但し、Ｆａ，Ｆｂは電気化学活性を有する電気化学活性部位、Ｉａ，Ｉｂは二本鎖核酸に特異的に挿入し、且つ光照射により二本鎖核酸と共有結合を形成する二本鎖核酸結合部位、Ｌａ，Ｌｂ，Ｌｃは前記二本鎖核酸結合部位と前記電気化学活性部位とを連結する連結部位である］
光照射を行うことにより、前記二本鎖核酸と前記挿入剤とを共有結合させる光照射工程と、
前記二本鎖核酸と共有結合した挿入剤を電気化学的な測定により検出する検出工程とを含む、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。
【請求項２】
請求項１に記載の遺伝子検出方法において、
前記ＦａとＦｂ、前記ＩａとＩｂは、それぞれ同一の化合物である、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。
【請求項３】
請求項１に記載の遺伝子検出方法において、
前記検出工程は、前記電極に対して電圧を印加し、前記二本鎖核酸と共有結合した挿入剤による電気化学発光量を測定する、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。
【請求項４】
請求項１に記載の遺伝子検出方法において、
前記Ｉａ、Ｉｂが、感光性を有する化合物である、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。
【請求項５】
請求項４に記載の遺伝子検出方法において、
前記感光性を有する化合物が、フロクマリン誘導体である、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。
【請求項６】
請求項５に記載の遺伝子検出方法において、
前記フロクマリン誘導体が、ソラレン誘導体である、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。
【請求項７】
請求項１に記載の遺伝子検出方法において、
前記Ｆａ、Ｆｂが、酸化還元性を有する化合物である、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。
【請求項８】
請求項７に記載の遺伝子検出方法において、
前記酸化還元性を有する化合物が、電気化学発光を示す化合物である、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。
【請求項９】
請求項８に記載の遺伝子検出方法において、
前記電気化学発光を示す化合物が、配位子に複素環系化合物を有する金属錯体、ルブレン、アントラセン、コロネン、ピレン、フルオランテン、クリセン、フェナントレン、ペリレン、ビナフチル、オクタテトラエンのいずれかである、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の遺伝子検出方法において、
前記配位子に複素環系化合物を有する金属錯体が、配位子にピリジン部位を有する金属錯体である、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の遺伝子検出方法において、
前記配位子にピリジン部位を有する金属錯体が、金属ビピリジン錯体、金属フェナントロリン錯体のいずれかである、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。
【請求項１２】
請求項９に記載の遺伝子検出方法において、
前記配位子に複素環系化合物を有する金属錯体の中心金属が、ルテニウム、オスミウムのいずれかである、
ことを特徴とする遺伝子検出方法。
【請求項１３】
下記一般式（１）で表される挿入剤において、
Ｆａ−Ｌａ−Ｉａ  （１）
［但し、Ｆａは電気化学活性を有する電気化学活性部位、Ｉａは二本鎖核酸に特異的に挿入し、且つ光照射により二本鎖核酸と共有結合を形成する二本鎖核酸結合部位、Ｌａは前記二本鎖核酸結合部位と前記電気化学活性部位とを連結する連結部位である］、
該一般式（１）中のそれぞれの部位に、−Ｌｂ−Ｉｂ、−Ｌｃ−Ｆｂ［但し、Ｉｂは二本鎖核酸に特異的に挿入し、且つ光照射により二本鎖核酸と共有結合を形成する二本鎖核酸結合部位、Ｆｂは電気化学活性を有する電気化学活性部位、Ｌｂ，Ｌｃは連結部位である］で表される化合物のいずれか一方もしくは両方の組合せからなる置換基を有する、
ことを特徴とする挿入剤。
【請求項１４】
請求項１３に記載の挿入剤において、
前記ＦａとＦｂ、前記ＩａとＩｂは、それぞれ同一の化合物である、
ことを特徴とする挿入剤。
【請求項１５】
請求項１３に記載の挿入剤において、
前記Ｉａ、Ｉｂが、感光性を有する化合物である、
ことを特徴とする挿入剤。
【請求項１６】
請求項１５に記載の挿入剤において、
前記感光性を有する化合物が、フロクマリン誘導体である、
ことを特徴とする挿入剤。
【請求項１７】
請求項１６に記載の挿入剤において、
前記フロクマリン誘導体が、ソラレン誘導体である、
ことを特徴とする挿入剤。
【請求項１８】
請求項１３に記載の挿入剤において、
前記Ｆａ、Ｆｂが、酸化還元性を有する化合物である、
ことを特徴とする挿入剤。
【請求項１９】
請求項１８に記載の挿入剤において、
前記酸化還元性を有する化合物が、電気化学発光を示す化合物である、
ことを特徴とする挿入剤。
【請求項２０】
請求項１９に記載の挿入剤において、
前記電気化学発光を示す化合物が、配位子に複素環系化合物を有する金属錯体、ルブレン、アントラセン、コロネン、ピレン、フルオランテン、クリセン、フェナントレン、ペリレン、ビナフチル、オクタテトラエンのいずれかである、
ことを特徴とする挿入剤。
【請求項２１】
請求項２０に記載の挿入剤において、
前記配位子に複素環系化合物を有する金属錯体が、配位子にピリジン部位を有する金属錯体である、
ことを特徴とする挿入剤。
【請求項２２】
請求項２１に記載の挿入剤において、
前記配位子にピリジン部位を有する金属錯体が、金属ビピリジン錯体、金属フェナントロリン錯体のいずれかである、
ことを特徴とする挿入剤。
【請求項２３】
請求項２０に記載の挿入剤において、
前記配位子に複素環系化合物を有する金属錯体の中心金属が、ルテニウム、オスミウムのいずれかである、
ことを特徴とする挿入剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中に存在する特定の遺伝子配列を高感度に検出するための遺伝子検出方法に関し、特に、挿入剤により電気化学的に遺伝子を検出する技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来の、電気化学的に特定の遺伝子配列を検出するＤＮＡチップは、検出すべき目的遺伝子に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖の核酸プローブを電極表面に固定化し、該核酸プローブと一本鎖に変性された目的遺伝子サンプルとをハイブリダイズさせた後、該核酸プローブと目的遺伝子サンプルとの二本鎖核酸に特異的に結合し且つ電気化学的に活性な挿入剤を、該核酸プローブと遺伝子サンプルとの反応系に添加し、前記電極を介した電気化学的な測定により、前記二本鎖核酸に結合した挿入剤を検出し、これにより、目的遺伝子サンプルとハイブリダイズした前記核酸プローブを検出することで、目的とする遺伝子の存在を確認する（例えば、特許文献１及び特許文献２参照）。
【０００３】
ここで、前記挿入剤とは、前記二本鎖の核酸を認識して、該二本鎖核酸と特異的に結合する物質を指す。前記挿入剤は、何れも分子中にフェニル基等の平板状挿入基を有し、該挿入基が二本鎖核酸の塩基対と塩基対との間に介入することによって、二本鎖核酸と結合する。この挿入剤と二本鎖核酸との結合は、静電気的相互作用あるいは疎水的相互作用での結合であって、前記挿入剤の二本鎖核酸の塩基対間への挿入、及びその塩基対間からの離脱が一定の速度で繰り返される平衡反応による結合である。
【０００４】
前述した挿入剤の中には、電気的に可逆な酸化還元反応を起こす物質がある。よって、挿入剤として、このような電気化学的に可逆である、酸化還元反応を起こすものを用いることにより、電気化学的変化を測定することで、前記二本鎖核酸に結合した挿入剤の存在を検出することができる。なお、この電気化学的変化の出力信号としては、酸化還元時に発生する電流や発光が挙げられる。
【０００５】
つまり、従来の遺伝子検出方法においては、前記挿入剤が二本鎖核酸にのみ特異的に結合すること、さらに、前記二本鎖核酸に結合した挿入剤の量を正確に検出することが重要であった。
【０００６】
しかし、従来の遺伝子検出に用いられる挿入剤は、配位結合や共有結合といった化学結合、あるいは静電気的相互作用、疎水的相互作用等といった原因により、一本鎖の核酸プローブや、該核酸プローブが固定される電極表面にも非特異的に吸着してしまう。そして、この非特異的に吸着した挿入剤は、前記二本鎖核酸に結合した挿入剤の量の検出時に、バックグランドノイズとなり、検出感度を低下させる原因となる。
【０００７】
これを解消するため、前記検出方法においては、前記挿入剤の添加後に、前記一本鎖の核酸プローブ及び電極表面に非特異的な吸着をしている挿入剤を除去するための洗浄処理が必要となっている。
【特許文献１】特許第２５７３４４３号公報
【特許文献２】特許第３２３３８５１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、前述したように、前記挿入剤と二本鎖核酸とは、静電気的相互作用あるいは疎水的相互作用によって結合されているものであってその結合力が弱いため、前記一本鎖の核酸プローブや、該核酸プローブが固定される電極表面に、非特異的に吸着した挿入剤を除去する洗浄工程の際、前記二本鎖核酸に結合している挿入剤も解離してしまい、逆に検出感度を低下させてしまう、という課題がある。
【０００９】
一方、前記洗浄工程の際において、前記二本鎖核酸に結合した挿入剤が解離しないように考慮した場合、バックグランドノイズとなる、前記一本鎖の核酸プローブや電極表面に非特異的に吸着している挿入剤を十分に除去できないため、検出感度が低下する、という課題がある。
【００１０】
さらに、前記挿入剤と二本鎖核酸間の結合反応が平衡反応であることから、該挿入剤が二本鎖核酸の塩基対間へ挿入される割合が低く、検出感度が低い、という課題もある。
【００１１】
本発明は、前記課題を解決するためにされたものであって、検体試料中の検出すべき遺伝子を高感度に検出可能な遺伝子検出方法、及び挿入剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
前記課題を解決するため、本発明の遺伝子検出方法は、特定の配列を有する遺伝子を検出する遺伝子検出方法であって、検出すべき遺伝子を一本鎖に変性して遺伝子サンプルを作製する遺伝子サンプル作製工程と、前記検出すべき遺伝子サンプルの塩基配列に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖の核酸プローブを電極に固定化させる固定化工程と、前記遺伝子サンプルを前記核酸プローブが固定化された電極に添加し、該核酸プローブと遺伝子サンプルとがハイブリダイズした二本鎖核酸を形成する二本鎖核酸形成工程と、前記二本鎖核酸が形成された電極に、下記一般式（１）のそれぞれの部位に、−Ｌｂ−Ｉｂ、−Ｌｃ−Ｆｂで表される化合物のいずれか一方もしくは両方の組合せからなる置換基を有する挿入剤を添加する挿入剤添加工程と、
【００１３】
Ｆａ−Ｌａ−Ｉａ  （１）
【００１４】
［但し、Ｆａ，Ｆｂは電気化学活性を有する電気化学活性部位、Ｉａ，Ｉｂは二本鎖核酸に特異的に挿入し、且つ光照射により二本鎖核酸と共有結合を形成する二本鎖核酸結合部位、Ｌａ，Ｌｂ，Ｌｃは前記二本鎖核酸結合部位と前記電気化学活性部位とを連結する連結部位である］、
光照射を行うことにより、前記二本鎖核酸と前記挿入剤とを共有結合させる光照射工程と、前記二本鎖核酸と共有結合した挿入剤を電気化学的な測定により検出する検出工程とを含むものである。
【００１５】
これにより、前記遺伝子サンプルと核酸プローブとをハイブリダイズさせた二本鎖核酸と、前記挿入剤とを、不可逆的、且つ強固に結合させることができ、この結果、一本鎖の核酸プローブ及び電極表面に非特異的な吸着をしている挿入剤を除去するために洗浄する際、二本鎖核酸に結合した挿入剤が解離することがなくなり、検出すべき遺伝子サンプルを高感度に検出することができる。また、挿入剤分子内に存在する二本鎖核酸結合部位および電気化学活性部位の数が増加し、この結果、二本鎖核酸の塩基対間への挿入割合が高くなって、二本鎖核酸に結合した挿入剤からの電気化学的な出力信号も大きくなるため、前記遺伝子サンプルを高感度に検出することができる。
【００１６】
さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記ＦａとＦｂ、前記ＩａとＩｂが、それぞれ同一の化合物であるものである。
【００１７】
これにより、検出すべき遺伝子の定量的な検出を行うことができる。
【００１８】
さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記検出工程は、前記電極に対して電圧を印加し、前記二本鎖核酸と共有結合した挿入剤による電気化学発光量を測定するものである。
【００１９】
これにより、前記電極に電圧を印加した際、より良好な電気化学発光量を得ることができ、前記遺伝子サンプルをより高感度に検出することができる。
【００２０】
さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記Ｉａ、Ｉｂが、感光性を有する化合物であるものである。
【００２１】
これにより、二本鎖核酸に挿入された挿入剤が、二本鎖核酸と強固に且つ不可逆的に結合するため、強い洗浄処理を行なっても挿入剤が二本鎖核酸よりぬけおちないようにでき、この結果、遺伝子サンプルを高感度に検出できる。
【００２２】
さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記感光性を有する化合物が、フロクマリン誘導体であるものである。
【００２３】
さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記フロクマリン誘導体が、ソラレン誘導体であるものである。
【００２４】
さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記Ｆａ、Ｆｂが、酸化還元性を有する化合物であるものである。
【００２５】
これにより、酸化還元反応時に生じる酸化還元電流を測定することで、検出対象である遺伝子の存在を検出することが可能となる。
【００２６】
さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記酸化還元性を有する化合物が、電気化学発光を示す化合物であるものである。
【００２７】
これにより、前記電極に電圧を印加すると、該電極に固定化された二酸化核酸に結合した挿入剤が酸化還元反応すると共に発光し、該電気化学発光量を測定することで、検出対象である遺伝子を検出することができる。
【００２８】
さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記電気化学発光を示す化合物が、配位子に複素環系化合物を有する金属錯体、ルブレン、アントラセン、コロネン、ピレン、フルオランテン、クリセン、フェナントレン、ペリレン、ビナフチル、オクタテトラエンのいずれかである。
【００２９】
さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記配位子に複素環系化合物を有する金属錯体が、配位子にピリジン部位を有する金属錯体であるものである。
【００３０】
さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記配位子にピリジン部位を有する金属錯体が、金属ビピリジン錯体、金属フェナントロリン錯体のいずれかであるものである。
【００３１】
さらに、本発明の遺伝子検出方法は、前記配位子に複素環系化合物を有する金属錯体の中心金属が、ルテニウム、オスミウムのいずれかであるものである。
【００３２】
また、本発明の挿入剤は、下記一般式（１）で表される挿入剤において、
【００３３】
Ｆａ−Ｌａ−Ｉａ  （１）
【００３４】
［但し、Ｆａは電気化学活性を有する電気化学活性部位、Ｉａは二本鎖核酸に特異的に挿入し、且つ光照射により二本鎖核酸と共有結合を形成する二本鎖核酸結合部位、Ｌａは前記二本鎖核酸結合部位と前記電気化学活性部位とを連結する連結部位である］、
該一般式（１）中のそれぞれの部位に、−Ｌｂ−Ｉｂ、−Ｌｃ−Ｆｂ［但し、Ｉｂは二本鎖核酸に特異的に挿入し、且つ光照射により二本鎖核酸と共有結合を形成する二本鎖核酸結合部位、Ｆｂは電気化学活性を有する電気化学活性部位、Ｌｂ，Ｌｃは連結部位である］で表される化合物のいずれか一方もしくは両方の組合せからなる置換基を有するものである。
【００３５】
これにより、二本鎖核酸への挿入剤の挿入割合を向上させて、検出すべき遺伝子サンプルを高感度に検出することができる挿入剤を提供できる。
【００３６】
さらに、本発明の挿入剤は、前記ＦａとＦｂ、前記ＩａとＩｂが、それぞれ同一の化合物であるものである。
【００３７】
これにより、検出すべき遺伝子の定量的な検出を行うことができる。
【００３８】
さらに、本発明の挿入剤は、前記Ｉａ、Ｉｂが、感光性を有する化合物であるものである。
【００３９】
これにより、二本鎖核酸に挿入された挿入剤が、二本鎖核酸と強固に且つ不可逆的に結合するため、強い洗浄処理を行なっても挿入剤が二本鎖核酸よりぬけおちないようにでき、この結果、遺伝子サンプルを高感度に検出できる。
【００４０】
さらに、本発明の挿入剤は、前記感光性を有する化合物が、フロクマリン誘導体であるものである。
【００４１】
さらに、本発明の挿入剤は、前記フロクマリン誘導体が、ソラレン誘導体であるものである。
【００４２】
さらに、本発明の挿入剤は、前記Ｆａ、Ｆｂが、酸化還元性を有する化合物であるものである。
【００４３】
これにより、酸化還元反応時に生じる酸化還元電流を測定することで、検出対象である遺伝子の存在を検出することが可能となる。
【００４４】
さらに、本発明の挿入剤は、前記酸化還元性を有する化合物が、電気化学発光を示す化合物であるものである。
【００４５】
これにより、前記電気化学発光を測定することで、検出対象である遺伝子の存在を検出することができる。
【００４６】
さらに、本発明の挿入剤は、前記電気化学発光を示す化合物が、配位子に複素環系化合物を有する金属錯体、ルブレン、アントラセン、コロネン、ピレン、フルオランテン、クリセン、フェナントレン、ペリレン、ビナフチル、オクタテトラエンのいずれかであるものである。
【００４７】
さらに、本発明の挿入剤は、前記配位子に複素環系化合物を有する金属錯体が、配位子にピリジン部位を有する金属錯体であるものである。
【００４８】
さらに、本発明の挿入剤は、前記配位子にピリジン部位を有する金属錯体が、金属ビピリジン錯体、金属フェナントロリン錯体のいずれかであるものである。
【００４９】
さらに、本発明の挿入剤は、前記配位子に複素環系化合物を有する金属錯体の中心金属が、ルテニウム、オスミウムのいずれかであるものである。
【発明の効果】
【００５０】
本発明の遺伝子検出方法によれば、特定の配列を有する遺伝子を検出する際に、電気化学的に活性であり、且つ光照射により二本鎖核酸と共有結合する挿入剤を用いるようにしたので、光照射により、前記二本鎖核酸と前記挿入剤とを共有結合させて、該二本鎖核酸と挿入剤とを、不可逆的、且つ強固に結合させることができ、この結果、一本鎖の核酸プローブ及び電極表面に非特異的な吸着をしている挿入剤を除去するために洗浄する際、二本鎖核酸に結合した挿入剤が解離することがなくなり、前記遺伝子サンプルを高感度に検出することができる。
【００５１】
さらに、本発明の遺伝子検出方法によれば、挿入剤が複数個の電気化学活性部位、あるいは複数個の二本鎖核酸結合部位を有するようにしたので、挿入剤の二本鎖核酸の塩基対間への挿入割合が高くなり、また二本鎖核酸に結合した挿入剤からの電気化学的な出力信号も大きくなるため、検出対象の遺伝子サンプルをより高感度に検出することができる。
【００５２】
また、本発明の挿入剤によれば、光照射により二本鎖核酸と共有結合する二本鎖結合部位を有するようにしたので、挿入剤と二本鎖核酸とを強固且つ不可逆的に結合させることができ、洗浄処理によっても二本鎖核酸から解離しない挿入剤を提供できる。
【００５３】
また、本発明の挿入剤によれば、複数個の電気化学活性部位、あるいは複数個の二本鎖核酸結合部位を有するので、挿入剤の二本鎖核酸の塩基対間への挿入割合を高くすることができ、また二本鎖核酸に結合した挿入剤からの電気化学的な出力信号を大きくできる挿入剤を提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５４】
以下に、本発明の遺伝子検出方法について詳細に説明する。なお、以下の実施の形態における遺伝子サンプルとは、例えば、血液、白血球、血清、尿、糞便、精液、唾液、培養細胞、各種臓器細胞のような組織細胞、その他遺伝子を含有する任意の試料から、該試料中の細胞を破壊して二本鎖核酸を遊離させ、熱処理あるいはアルカリ処理によって、一本鎖の核酸に解離させたものである。また、本実施の形態における遺伝子サンプルは、制限酵素で切断して電気泳動による分離等で精製した核酸断片でもよい。
【００５５】
（実施の形態１）
以下、本実施の形態１における遺伝子検出方法、及び本実施の形態で用いる挿入剤について説明する。
【００５６】
まず、検査対象となる遺伝子サンプルを作成する。この遺伝子サンプルは、前述したように、任意の試料中の細胞を破壊して二本鎖核酸を遊離させ、熱処理あるいはアルカリ処理によって、一本鎖に変性させる。
【００５７】
このとき、前記試料中の細胞の破壊は、常法により行うことができ、例えば、振とう、超音波等の物理的作用を外部から加えて行うことができる。また、核酸抽出溶液（例えば、ＳＤＳ、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ、Ｔｗｅｅｎ−２０等の界面活性剤、又はサポニン、ＥＤＴＡ、プロテア−ゼ等を含む溶液等）を用いて、細胞から核酸を遊離させることもできる。
【００５８】
次に、検出すべき遺伝子配列に対して相補的な塩基配列を有する一本鎖の核酸プローブを生成する。
【００５９】
この核酸プローブは、生物試料から抽出した核酸を制限酵素で切断し、電気泳動による分離等で精製した核酸あるいは化学合成で得られた一本鎖の核酸を用いることができる。生物試料から抽出した核酸の場合には、熱処理あるいはアルカリ処理によって、一本鎖の核酸に解離させておくことが好ましい。
【００６０】
そしてこの後、前述のようにして得られた核酸プローブを電極に固定する。
【００６１】
本発明で用いる電極は、電極として使用可能であればどのようなものであってもよく、例えば、金、白金、白金黒、パラジウム、ロジウムのような貴金属電極や、グラファイト、グラシーカーボン、パイロリティックグラファイト、カーボンペースト、カーボンファイバーのような炭素電極や、酸化チタン、酸化スズ、酸化マンガン、酸化鉛のような酸化物電極や、Ｓｉ、Ｇｅ、ＺｎＯ、ＣｄＳ、ＴｉＯ、ＧａＡｓのような半導体電極等が挙げられる。これらの電極は、導電性高分子によって被覆しても良く、このように被覆することによって、より安定なプローブ固定化電極を調製することができる。
【００６２】
なお、前記核酸プローブを前記電極に固定化する方法としては、公知の方法が用いられる。一例をあげると、例えば前記電極が金である場合、固定する核酸プローブの５’−もしくは３’−末端（好ましくは、５’−末端）にチオール基を導入し、金とイオウとの共有結合を介して、前記核酸プローブが該金電極に固定される。この核酸プローブにチオール基を導入する方法は、文献（Ｍ．Ｍａｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１８０５〜１８０８（１９９４）及びＢ．Ａ．Ｃｏｎｎｏｌｌｙ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃ
ｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１３，４４８４（１９８５））に記載されているものが挙げられる。
【００６３】
即ち、前記方法によって得られたチオール基を有する核酸プローブを、金電極に滴下し、低温下で数時間放置することにより、該核酸プローブが電極に固定され、核酸プローブが作製される。
【００６４】
また別の例をあげると、例えば前記電極がグラシーカーボンである場合、まずグラシーカーボンを過マンガン酸カリウムで酸化することによって、電極表面にカルボン酸基を導入し、これにより、核酸プローブが、アミド結合によりグラシーカーボン電極表面に固定される。このグラシーカーボン電極に核酸プローブを固定する、実際の固定化方法については、文献（Ｋ．Ｍ．Ｍｉｌｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，６５，２３１７〜２３２３（１９９３））に詳細が記載されている。
【００６５】
次に、前述の核酸プローブが固定化された電極に、前記遺伝子サンプルを含む溶液を接触させる。これにより、前記核酸プローブの塩基配列と相補的な塩基配列を有する遺伝子サンプルとがハイブリダイズし、二本鎖核酸が形成される。この核酸プローブと遺伝子サンプルとをハイブリダイズさせる方法は周知であるため、ここでは説明を省略する。
【００６６】
このようにして前記電極に二本鎖核酸を形成した後、該二本鎖核酸が形成された電極に挿入剤を添加し、挿入剤を前記二本鎖核酸に挿入反応させる。なお、この挿入剤の添加は、二本鎖核酸を形成する前、つまりハイブリダイゼーション反応前に、前記検体試料中に添加するものであってもよい。
【００６７】
そしてこの後、挿入剤が添加された二本鎖核酸に対して光照射を行い、該二本鎖核酸と挿入剤とを共有結合を形成させる。
【００６８】
以下、前記二本鎖核酸に挿入する挿入剤について説明する。
【００６９】
本発明の挿入剤には、前記二本鎖核酸に特異的に挿入し、且つ光照射により二本鎖核酸と共有結合する特徴をもつ物質を用いる。これにより、前記挿入剤は、二本鎖核酸と、強固且つ不可逆的に結合されるため、この後の洗浄工程により、二本鎖核酸と結合された挿入剤が、該二本鎖核酸から解離することがなく、洗浄工程では、前記二本鎖核酸と結合していない未反応の挿入剤を除去できる。
【００７０】
さらに、本発明の挿入剤には、電気化学的に活性である特徴を持つ物質を用いる。これにより、前記二本鎖核酸に特異的に結合した挿入剤由来の電気化学的な信号を検出することで、前記二本鎖核酸、すなわち遺伝子サンプルの存在を高感度に検出できる。
【００７１】
前述した２つの特性を満たす挿入剤は、前記二本鎖核酸に特異的に挿入し、且つ光照射により二本鎖核酸と共有結合する二本鎖核酸結合部位Ｉａと、電気化学活性を有する電気化学活性部位Ｆａと、前記二本鎖核酸結合部位Ｉａと前記電気化学活性部位Ｆａとを連結する連結部位Ｌａとを有する化合物である。
【００７２】
例えば、このような挿入剤は、下記一般式（１）で表すことができる。
一般式
【００７３】
Ｆａ−Ｌａ−Ｉａ  （１）
【００７４】
（式中、Ｆａは電気化学的に活性な電気化学活性部位、Ｉａは光照射により二本鎖核酸と架橋する部位を有する二本鎖核酸結合部位、Ｌａは前記ＩａとＦａとを連結する連結部位を表わす。）
【００７５】
ここで、前記一般式（１）に示す、前記二本鎖核酸結合部位Ｉａとして用いることができる物質としては、二本鎖核酸に特異的に挿入し、且つ光照射により二本鎖核酸と共有結合する、感光性をもつ化合物が挙げられる。
【００７６】
そして、このような感光性をもつ化合物としては、例えば、フロクマリン誘導体が挙げられ、特に、ソラレン誘導体が好ましい。このソラレン誘導体は、二本鎖核酸に挿入すると、二本鎖核酸と非共有的相互作用を起こし、さらにこれに長波長紫外線（３００〜４００ｎｍ）を照射すると、二本鎖核酸に挿入したソラレン誘導体部分が、安定な共有結合を形成するため、結果、挿入剤と二本鎖核酸とを強固に且つ不可逆的に結合させることができる。
【００７７】
従って、後の洗浄工程で、前記一本鎖の核酸プローブや、前記電極表面に非特異吸着した挿入剤を洗浄する際に、二本鎖核酸に結合している挿入剤が抜け落ちることがなくなり、該洗浄工程において強い洗浄を行なって、前記一本鎖の核酸プローブ及び電極表面に非特異吸着した挿入剤のみを確実に除去することができる。
【００７８】
このようなソラレン誘導体の具体的な例としては、ソラレン、メトキシソラレン、トリメチルソラレン等が挙げられる。
【００７９】
前記一般式（１）に示す、前記電気化学活性部位Ｆａとして用いることができる物質としては、電気化学的に検出可能な物質であれば、特に制限されるものはない。例えば、可逆な酸化還元反応時に生じる酸化還元電流を測定することで物質の検出が可能な、酸化還元性を有する化合物を挙げることができる。これにより、前記酸化還元反応時に生じる酸化還元電流を測定することで、前記二本鎖核酸、すなわち前記検出すべき遺伝子の存在を検出することが可能となる。
【００８０】
そして、このような酸化還元性を有する化合物としては、例えば、フェロセン、カテコールアミン、配位子に複素環系化合物を有する金属錯体、ルブレン、アントラセン、コロネン、ピレン、フルオランテン、クリセン、フェナントレン、ペリレン、ビナフチル、オクタテトラエンもしくはビオローゲン等がある。
【００８１】
さらに、前述した、配位子に複素環系化合物を有する金属錯体、ルブレン、アントラセン、コロネン、ピレン、フルオランテン、クリセン、フェナントレン、ペリレン、ビナフチル、オクタテトラエンには、酸化還元反応時に電気化学発光を生じるものもあり、このような電気化学発光を生じる物質を挿入剤として用いれば、その発光を測定することで、前記遺伝子サンプルの存在を検出することもできる。
【００８２】
さらに、前記配位子に複素環系化合物を有する金属錯体としては、酸素や窒素等を含む複素環系化合物、例えば、ピリジン部位、ピラン部位等を配位子に有する金属錯体があり、特にピリジン部位を配位子に有する金属錯体が好ましい。なお、前記ピリジン部位を配位子に有する金属錯体としては、例えば、金属ビピリジン錯体、金属フェナントロリン錯体等が例に挙げられる。
【００８３】
さらに、前記配位子に複素環系化合物を有する金属錯体の中心金属としては、例えば、ルテニウム、オスミウム、亜鉛、コバルト、白金、クロム、モリブデン、タングステン、テクネチウム、レニウム、ロジウム、イリジウム、パラジウム、銅、インジウム、ランタン、プラセオジム、ネオジム、サマリウム等を挙げることができる。そして特に、中心金属がルテニウム、オスミウムである錯体は、良好な電気化学発光特性を有する。なお、良好な電気化学発光特性を有する物質としては、例えば、ルテニウムビピリジン錯体、ルテニウムフェナントロリン錯体、オスミウムビピリジン錯体、オスミウムフェナントロリン錯体等を挙げることができる。
【００８４】
前記一般式（１）において、前記連結部位Ｌａとして用いることができる物質としては、前記電気化学活性部位Ｆａと前記二本鎖核酸結合部位Ｉａとを連結するものであれば、その連結部位のリンカー配列は特に制限されるものではない。例えば、アルキル基、−Ｏ−基、−ＣＯ−基、−ＮＨ−基、又はこれらの組み合わせから成る基などを挙げることができる。
【００８５】
さらに、本発明の挿入剤は、前記一般式（１）において、前記電気化学活性部位Ｆａ、連結部位Ｌａ、二本鎖核酸結合部位Ｉａのそれぞれが、−Ｌｂ−Ｉｂ、あるいは−Ｌｃ−Ｆｂで表される化合物のいずれか一方、もしくは両方の組合せからなる置換基を有するものである。但し、前記Ｉｂは二本鎖核酸に特異的に挿入し、且つ光照射により二本鎖核酸と共有結合を形成する二本鎖核酸結合部位であり、前記Ｆｂは電気化学活性を有する電気化学活性部位であり、前記Ｌｂ，Ｌｃは前記二本鎖核酸結合部位と前記電気化学活性部位とを連結する連結部位である。
【００８６】
なお、前述した、−Ｌｂ−Ｉｂ、−Ｌｃ−Ｆｂで示される置換基の、前記一般式（１）への導入位置は特に限定されず、前記Ｆａ，Ｌａ，Ｉａのどの部位に導入してもよく、また、前記置換基の前記一般式（１）への導入数も特に限定されるものではない。
【００８７】
また、前記置換基の構造は、−Ｌｂ−Ｉｂ、もしくは−Ｌｃ−Ｆｂそれぞれ単独でもよいが、−Ｌｂ−Ｉｂと−Ｌｃ−Ｆｂとを組み合わせた構造でもよい。例えば、−Ｌｂ−Ｉｂのみ、もしくは−Ｌｃ−Ｆｂのみが直列に複数結合している直列構造、あるいは、−Ｌｂ−Ｉｂと、−Ｌｃ−Ｆｂとが複合して直列に複数結合している直列構造、あるいは、−Ｌｂ−Ｉｂ、−Ｌｃ−ＦｂのＬｂ、Ｌｃそれぞれに、さらに−Ｌｂ−Ｉｂ、もしくは−Ｌｃ−Ｆｂが複数結合されている分岐構造、あるいは前記直列構造と前記分岐構造との複合構造等が挙げられる。
【００８８】
前記二本鎖核酸結合部位Ｉｂとして用いられる物質は、二本鎖核酸に特異的に挿入し、且つ光照射により二本鎖核酸と共有結合する物質であり、前記一般式（１）中のＩａと同様、感光性の化合物、例えば、フロクマリン誘導体が挙げられ、特に、ソラレン誘導体が好ましい。なお、前記ソラレン誘導体の具体的な例としては、ソラレン、メトキシソラレン、トリメチルソラレン等が挙げられる。
【００８９】
このような二本鎖核酸結合部位Ｉｂを含む置換基を、前記一般式（１）に導入することにより、挿入剤の分子内には複数の二本鎖核酸結合部位が存在することとなり、結果、二本鎖核酸への挿入割合が向上し、高感度な検出が可能となる。
【００９０】
前記二本鎖核酸結合部位Ｉａ，Ｉｂはともに、二本鎖核酸に特異的に挿入し、且つ光照射により二本鎖核酸と共有結合できる物質であればよく、例えば、前記一般式（１）中のＩａがメトキシソラレン、前記置換基中のＩｂがトリメチルソラレンであるといったように、ＩａとＩｂとが異なる物質であってもよい。
【００９１】
しかし、前記ＩａとＩｂとが異なる物質の場合、ＩａとＩｂとで二本鎖核酸への挿入能力が異なるため、定量的な検出を考えると、例えば、前記Ｉａ，Ｉｂがともにトリメチルソラレンであるといったように、ＩａとＩｂとが同一の物質であることが好ましい。
【００９２】
また、前記電気化学活性部位Ｆｂとして用いられる物質は、電気化学的に検出可能な物質であれば、限定されるものではなく、前記一般式（１）中のＦａと同様、酸化還元性を有する化合物、例えば、配位子に複素環系化合物を有する金属錯体等が挙げられる。
【００９３】
さらに、前記配位子に複素環系化合物を有する金属錯体としては、酸素や窒素等を含む複素環系化合物、例えば、ピリジン部位、ピラン部位等を配位子に有する金属錯体等が挙げられ、特にピリジン部位を配位子に有する金属錯体が好ましい。なお、前記ピリジン部位を配位子に有する金属錯体としては、例えば、金属ビピリジン錯体、金属フェナントロリン錯体等がある。
【００９４】
また、前記配位子に複素環系化合物を有する金属錯体の中心金属としては、例えば、ルテニウム、オスミウム、亜鉛、コバルト、白金、クロム、モリブデン、タングステン、テクネチウム、レニウム、ロジウム、イリジウム、パラジウム、銅、インジウム、ランタン、プラセオジム、ネオジム、サマリウム等を挙げることができる。そして特に、中心金属がルテニウム、オスミウムである錯体は良好な電気化学発光特性を有する。なお、前記良好な電気化学発光特性を有する物質としては、例えば、ルテニウムビピリジン錯体、ルテニウムフェナントロリン錯体、オスミウムビピリジン錯体、オスミウムフェナントロリン錯体等を挙げることができる。
【００９５】
このような電気化学活性部位Ｆｂを含む置換基を、前記一般式（１）に導入することにより、挿入剤の分子内には複数の電気化学活性部位が存在することとなり、結果、二本鎖核酸に結合した挿入剤からの電気化学的な出力信号が大きくなり、高感度な検出が可能となる。
【００９６】
前記電気化学活性部位ＦａとＦｂはともに、電気化学的に検出可能な物質であればよく、例えば、前記一般式（１）中のＦａがルテニウムビピリジン錯体、前記置換基中のＦｂがオスミウムフェナントロリン錯体であるといったように、ＦａとＦｂとが異なる物質であってもよい。
【００９７】
しかし、前記ＦａとＦｂとが異なる物質の場合、ＦａとＦｂとで電気化学的な検出信号の強度が異なるため、定量的な検出を考えると、例えば、前記Ｆａ，Ｆｂがともにルテニウムビピリジン錯体であるといったように、ＦａとＦｂとが同一の物質であることが好ましい。
【００９８】
さらに、前記連結部位Ｌｂ，Ｌｃとして用いられる物質は、前記一般式（１）中のＦａ，Ｌａ，Ｉａのそれぞれと、ＩｂもしくはＦｂとを連結する物質であり、前記一般式（１）中のＬａと同様、そのリンカー配列は特に限定されない。例えば、アルキル基、−Ｏ−基、−ＣＯ−基、−ＮＨ−基、−リン酸基、又はこれらの組み合わせから成る基などを挙げることができる。
【００９９】
前述した置換基を導入した挿入剤の具体例を、（化１）から（化１０）に示す。
【０１００】
【化１】
0004701176.tif 000002
【０１０１】
【化２】
0004701176.tif 000003
【０１０２】
【化３】
0004701176.tif 000004
【０１０３】
【化４】
0004701176.tif 000005
【０１０４】
【化５】
0004701176.tif 000006
【０１０５】
【化６】
0004701176.tif 000007
【０１０６】
【化７】
0004701176.tif 000008
【０１０７】
【化８】
0004701176.tif 000009
【０１０８】
【化９】
0004701176.tif 000010
【０１０９】
【化１０】
0004701176.tif 000011
【０１１０】
なお、挿入剤には、既知の手法を利用して前述した置換基を導入することが可能である。例えば、アミド結合を利用した手法では、前記一般式（１）中の置換基を導入する部位の末端にアミノ基を修飾した挿入剤と、該挿入剤と結合する部分の末端にカルボキシル基を修飾した置換基とを反応させることにより、アミド結合を形成させ、置換基を挿入剤に導入することができる。その他、エステル結合、エーテル結合、チオエーテル結合、カルボニル結合、イミノ結合等を利用した手法によっても、置換基を導入することができる。
【０１１１】
以上に説明したような挿入剤を、前記遺伝子サンプルと、前記電極に固定化された核酸プローブとをハイブリダイズさせる前か後に添加する。
【０１１２】
そして、前記核酸プローブと遺伝子サンプルとがハイブリダイズした二本鎖核酸と、前記挿入剤とを光照射により共有結合させた後、電極の洗浄処理を行う。これにより、電極表面に固定された二本鎖核酸を形成していない一本鎖の核酸プローブや、電極表面に非特異的に吸着した挿入剤を除去し、この結果、前記ハイブリダイズした二本鎖核酸に、特異的に共有結合した挿入剤のみが残り、この挿入剤由来の電気化学的な信号を測定することにより、二本鎖核酸、すなわち遺伝子サンプルの存在を高感度に検出することができる。
【０１１３】
前記挿入剤由来の電気化学的な信号は、添加する挿入剤の種類により異なるが、酸化還元電流を生じる挿入剤を用いた場合には、ポテンショスタット、ファンクションジェネレータ等からなる計測系で測定できる。一方、電気化学発光を生じる挿入剤を用いた場合には、フォトマルチプライヤー等を用いて計測が可能である。
【実施例１】
【０１１４】
以下、本発明の実施例を示すが、本発明はこれに限定されるものではない。
【０１１５】
（１）金電極表面への核酸プローブの固定化
ガラス基板上にスパッタ装置（アルバック製ＳＨ−３５０）によりチタン１０ｎｍを下地に金２００ｎｍを形成し、フォトリソグラフィ工程により電極パターンを形成することで、金電極を準備した。電極表面をピラニア溶液（過酸化水素：濃硫酸＝１：３）で１分間洗浄し、純水ですすいだ後、窒素ブローで乾燥させた。
【０１１６】
核酸プローブには、ヒト由来Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ−４５０の遺伝子配列の５’−末端より６２９−６６８番目に位置するＣＣＣＣＣＴＧＧＡＴ  ＣＣＡＧＡＴＡＴＧＣ  ＡＡＴＡＡＴＴＴＴＣ  ＣＣＡＣＴＡＴＣＡＴの配列を有する５’−末端のリン酸基を介してチオール基を修飾した４０塩基のオリゴデオキシヌクレオチド（タカラバイオ製）を使用した。そして、該核酸プローブを１０ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ７．４のリン酸ナトリウム緩衝液）に溶解させ、１００μＭに調整した。
【０１１７】
この調整した核酸プローブの溶液を前記金電極上に滴下し、飽和湿潤下、室温で４時間放置することで、チオール基と金とを結合させて、核酸プローブを金電極に固定した。
【０１１８】
（２）ハイブリダイゼーション
遺伝子サンプルには、前記核酸プローブと相補的な５’−末端からＡＴＧＡＴＡＧＴＧＧ  ＧＡＡＡＡＴＴＡＴＴ  ＧＣＡＴＡＴＣＴＧＧ  ＡＴＣＣＡＧＧＧＧＧの配列を有するオリゴデオキシヌクレオチド（タカラバイオ製）を使用した。そして、該遺伝子サンプルを、１０ｍＭのＰＢＳ、及び２ＸＳＳＣを混合したハイブリダイゼーション溶液に溶解させ、２０μＭに調整した。
【０１１９】
この調整した、遺伝子サンプルが溶解したハイブリダイゼーション溶液を、前記核酸プローブを固定した金電極上に滴下し、４０℃の恒温槽内で４時間反応させ、二本鎖核酸を形成させた。これにより、二本鎖核酸が形成された金電極ｘを得た。
【０１２０】
さらに、本実施例においては、比較対象として、二本鎖核酸が形成されていない金電極ｙを作成する。この二本鎖核酸が形成されない金電極ｙは、前記核酸プローブと非相補的な配列を有する遺伝子サンプル（以下、「比較遺伝子サンプル」と称す。）を使用して、前記二本鎖核酸が形成された金電極ｘを得る時と同様の処理をする。なお、ここでは、前記比較遺伝子サンプルとして、４０ｍｅｒのＰｏｌｙ−Ａ（タカラバイオ製）、ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ  ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ  ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ  ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡの配列を有する遺伝子サンプルを使用した。
【０１２１】
（３）挿入剤の添加
挿入剤には、下記の（化１１）に示すソラレン修飾ルテニウム錯体を使用した。
【０１２２】
【化１１】
0004701176.tif 000012
【０１２３】
ソラレン修飾ルテニウム錯体の合成は、以下の手順により得ることができる。
【０１２４】
窒素充填した容器に、４，５’，８−トリメチルソラレン（和光純薬製）１．０ｇ（４．４ｍｍｏｌ）、高純度（９９．６％）酢酸１１４ｍＬを加え、ソラレンを溶解させた。この溶液を４０℃に加温しながらクロロメチルメチルエーテル７．６ｍＬ（０．１０ｍｏｌ）を滴下した。２４時間後、再度クロロメチルメチルエーテルを７．６ｍＬ滴下した。滴下からさらに２７時間後と４０時間後に、クロロメチルメチルエーテルを７．６ｍＬずつ加えて、４日間反応させた。反応後、氷上で８時間冷却させて生成物を析出させた。これを採取し、冷却したジエチルエーテルで洗浄し、生成物Ａ（３，４’−ジクロロメチル−４，５，８−トリメチルソラレン）を得た（収率２５％）。
【０１２５】
窒素雰囲気にした容器に、乾燥ジメチルホルムアミド１０ｍＬに溶解させた生成物Ａ０．３０ｇ（０．９２ｍｍｏｌ）、フタルイミドカリウム０．４３ｇ（２．３ｍｍｏｌ）を加え、６時間還流した。反応溶液は、クロロホルムから抽出した後、０．２Ｍ水酸化ナトリウム５０ｍＬで洗浄した。洗浄後、中和してから溶媒を留去し、ジエチルエーテル，クロロホルムで再結晶を行い、生成物Ｂを得た（収率６２．４％）。
【０１２６】
生成物Ｂ０．５０ｇ（０．９１ｍｍｏｌ）をエタノール３０ｍＬに溶解させた後、ヒドラジン一水和物０．３７ｍＬ（７．４２ｍｍｏｌ）を加え、３時間還流を行った。その後、蒸留水２０ｍＬ、塩酸２．５ｍＬを加え、さらに２時間加熱還流した。エタノールを留去し、１時間氷冷して析出した副反応物をろ過で取り除き、ろ液に炭酸水素ナトリウムを加え中和した。クロロホルムで抽出し、溶媒を留去して生成物Ｃを得た（収率６２．１％）
【０１２７】
クロロホルム５ｍＬに溶解した生成物Ｃ０．１５ｇ（０．５２ｍｍｏｌ）と、クロロホルム５ｍＬに溶解したトリエチルアミン０．１８ｍＬ（１．３ｍｍｏｌ）を容器内に加えた。その後、グルタル酸無水物１．１９ｇ（１０．４ｍｍｏｌ）を加えて９時間室温で撹拌した。反応後、溶媒を留去し、粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー処理により精製し、生成物Ｄを得た（収率４２％）。
【０１２８】
ＴＨＦ６０．０ｍＬに溶解させた４，４’−ジメチル−２，２’ビピリジン２．５０ｇ（１．３５×１０-2ｍｏｌ）溶液を窒素雰囲気の容器に注入した後、リチウムジイソプロピルアミド２Ｍ溶液１６．９ｍＬ（２．７０×１０-2ｍｏｌ）を滴下し、冷却しながら３０分撹拌した。一方、同様に窒素気流中で乾燥させた容器に１，２−ジブロモエタン７．６１ｇ（４．０５×１０-2ｍｏｌ）とＴＨＦ１０ｍＬを加え、冷却しながら撹拌させた。この容器に、先程の反応液をゆっくり滴下させて２．５時間反応させた。反応溶液は２Ｎの塩酸で中和し、ＴＨＦを留去した後、クロロホルムで抽出した。溶媒を留去して得た粗生成物をシリカゲルカラムで精製し、生成物Ｅを得た（収率４７％）。
【０１２９】
窒素雰囲気の容器に、生成物Ｅ１．０ｇ（３．２８ｍｍｏｌ），フタルイミドカリウム０．６７ｇ（３．６１ｍｍｏｌｌ），ジメチルホルムアミド（脱水）３０．０ｍＬを加え、オイルバスで１８時間還流した。反応後、クロロホルムで抽出し、０．２Ｎ水酸化ナトリウム５０ｍＬで蒸留水洗浄した。溶媒を留去して酢酸エチルとヘキサンから再結晶を行い、生成物Ｆを得た（収率６１・５％）。
【０１３０】
塩化ルテニウム（ＩＩＩ）（２．９８ｇ、０．０１ｍｏｌ）および２，２’−ビピリジン（３．４４ｇ、０．０２２ｍｏｌ）をジメチルホルムアミド（８０．０ｍＬ）中で６時間還流した後、溶媒を留去した。その後、アセトンを加え、一晩冷却することで得られた黒色沈殿物を採取し、エタノール水溶液１７０ｍＬ（エタノール：水＝１：１）を加え１時間加熱還流を行った。ろ過後塩化リチウムを２０ｇ加え、エタノールを留去し、さらに一晩冷却した。析出した黒色物質は吸引ろ過で採取し、生成物Ｇを得た（収率６８．２％）。
【０１３１】
窒素置換した容器に、生成物Ｆ０．５０ｇ（１．３５ｍｍｏｌ），生成物Ｇ０．７８ｇ（１．６１ｍｍｏｌ），エタノール５０ｍＬを加えた。９時間窒素雰囲気で還流した後、溶媒を留去し、蒸留水で溶解させ、１．０Ｍの過塩素酸水溶液で沈殿させた。この沈殿物を採取し、メタノールで再結晶を行い、生成物Ｈを得た（収率８１．６％）。
【０１３２】
生成物Ｈ１．０ｇ（１．０２ｍｍｏｌ），メタノール７０．０ｍＬを１時間還流した。室温まで冷却した後、ヒドラジン一水和物０．２１ｍＬ（４．２１ｍｍｏｌ）を加え、再び１３時間還流した。反応後、蒸留水を１５ｍＬ加え、メタノールを留去した。次に、濃塩酸を５．０ｍＬ加え、２時間還流して得られた反応液を一晩冷蔵し、不純物を自然ろ過で除去した。
【０１３３】
これを炭酸水素ナトリウムで中和した後、水を留去し、無機物をアセトニトリルで除去した。溶媒を留去して得た粗生成物をシリカゲルカラムで精製し、生成物Ｉを得た（収率７１．４％）。
【０１３４】
生成物Ｄ０．１ｇ（０．１９ｍｍｏｌ）をアセトニトリル１０ｍＬで溶解し、１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド０．２７ｇ（１．３１ｍｍｏｌ）を加えた後、冷却しながら３時間撹拌し、析出した不純物をろ過で除去した。次に、生成物Ｉ０．３６ｇ（０．４２ｍｍｏｌ）をアセトニトリル１０ｍＬに溶解させ、トリエチルアミン８８μＬ（０．６３ｍｍｏｌ）を加え、４℃で撹拌させていた溶液を滴下し、２４時間室温で撹拌した。反応後、溶媒を留去して得た粗生成物をシリカゲルカラムで精製し、前述した（化１１）に示すソラレン修飾ルテニウム錯体を得た（収率３５．８％）。表１は、前述のようにして得たソラレン修飾ルテニウム錯体のプロトンＮＭＲの結果（1Ｈ−ＮＭＲ結果）である。
【０１３５】
（表１）
1Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯｄ−６）
σ：
１．３９      （４Ｈ，ｍ）
１．５〜１．８（８Ｈ，ｍ）
１．９〜２．２（８Ｈ，ｍ）
２．３〜２．６（１５Ｈ，ｍ）
２．７５      （４Ｈ，ｔ）
３．０４      （４Ｈ，ｔ）
４．２９      （４Ｈ，ｓ）
７．３５      （４Ｈ，ｄ）
７．４〜７．６（１３Ｈ，ｍ）
７．７〜７．８（８Ｈ，ｍ）
８．１５      （８Ｈ，ｔ）
８．７４      （４Ｈ，ｄ）
８．８２      （８Ｈ，ｄ）
【０１３６】
このようにして得られたソラレン修飾ルテニウム錯体を１０ｍＭのＰＢＳで２μＭに調整した。
【０１３７】
この調整した溶液を、二本鎖核酸が形成された金電極ｘ、及び二本鎖核酸が形成されていない金電極ｙにそれぞれ添加し、３０分間４℃の冷蔵庫内で暗反応を行った。
【０１３８】
（４）二本鎖核酸と挿入剤との共有結合
３０分後、金電極ｘ，ｙそれぞれに、ＵＶクロスリンカー（フナコシ製ＵＶＰＣＬ１０００Ｌ型）を用いて波長３６５ｎｍ、５ｍＷ／ｃｍ2の紫外線を１０分間照射し、前記ソラレンと二本鎖核酸とを共有結合させた。共有結合後、金電極ｘを１０ｍＭのＰＢＳで１０分間揺動洗浄し、未反応のＲｕ錯体を取り除いた。
【０１３９】
（５）電気化学測定
以上の工程の後、二本鎖核酸が形成された電極ｘ、及び二本鎖核酸が形成されていない電極ｙのそれぞれに、０．１ＭのＰＢＳおよび０．１Ｍのトリエチルアミンを混合した電解液を滴下した。その後、それぞれの電極ｘ，ｙに電圧を印加し、この時に生じた挿入剤由来の電気化学発光の測定を行った。なお、電圧の印加は、０Ｖから１．３Ｖまで走査し、１秒間電気化学測定を行った。電気化学発光量の測定は、光電子増倍管（浜松ホトニクス製Ｈ７３６０−０１）を用いて行い、電圧走査中における最大発光量を測定した。
【０１４０】
図１は、本実施例における、二本鎖核酸が形成された電極ｘ、及び二本鎖核酸が形成されていない電極ｙにおいて検出された最大電気化学発光量を示したものである。図１から明らかなように、二本鎖核酸が形成された電極ｘでの発光量は、二本鎖核酸が形成されていない電極ｙでの発光量と比較して著しく高い値となっており、本実施例の挿入剤を用いれば、高感度に二本鎖核酸の検出が可能であることが分かる。
【産業上の利用可能性】
【０１４１】
本発明にかかる遺伝子検出方法は、特定の配列を有する遺伝子を高感度に検出することができ、遺伝子診断、感染症診断、ゲノム創薬等の用途に適用できる。
【図面の簡単な説明】
【０１４２】
【図１】図１は、本発明の実施例１により得られる、二本鎖核酸が形成された電極ｘ、及び二本鎖核酸が形成されていない電極ｙそれぞれにおいて検出された最大電気化学発光量を示す図である。
【図１】
0004701176.tif 000013
【配列表】
0004701176000001.app