(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
１５０℃〜３２０℃の間の温度条件で、紙としての再生が困難なセルロース繊維または紙類を無触媒水熱法により回分的にあるいは連続的に分解する工程；および該分解されたセルロース繊維または紙類とβ1,4-グルコシド結合を切断し得る酵素または微生物とを反応させる工程を含む、グルコースの製造方法。
【請求項２】
前記微生物が、エンドβ1,4-グルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、およびβ-グルコシダーゼからなる群から選択される少なくとも１種を細胞表層に発現するように組換えられた１または２以上の微生物である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記微生物が、以下の（Ａ）から（Ｃ）：
（Ａ）β-グルコシダーゼ；
（Ｂ）エンドβ1,4-グルカナーゼ；および
（Ｃ）エンドβ1,4-グルカナーゼとβ-グルコシダーゼとの組合せ
からなる群から選択される酵素を細胞表層に発現するように組換えられた微生物である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記微生物が酵母である、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
１５０℃〜３２０℃の間の温度条件で、紙としての再生が困難なセルロース繊維または紙類を無触媒水熱法により回分的にあるいは連続的に分解する工程；および該分解されたセルロース繊維または紙類とβ1,4-グルコシド結合を切断し得る酵素または微生物Ａとを反応させてグルコースを製造する工程；および該得られたグルコースと、アルコール発酵能を有する微生物Ｂとを反応させる工程を含む、アルコールの製造方法。
【請求項６】
前記微生物Ａが、エンドβ1,4-グルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、およびβ-グルコシダーゼからなる群から選択される少なくとも１種を細胞表層に発現するように組換えられた１または２以上の微生物である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記微生物Ａが、以下の（Ａ）から（Ｃ）：
（Ａ）β-グルコシダーゼ；
（Ｂ）エンドβ1,4-グルカナーゼ；および
（Ｃ）エンドβ1,4-グルカナーゼとβ-グルコシダーゼとの組合せ
からなる群から選択される酵素を細胞表層に発現するように組換えられた微生物である、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
前記微生物Ａと微生物Ｂとが同一の微生物である、請求項５から７のいずれかの項に記載の方法。
【請求項９】
前記微生物が酵母である、請求項８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、紙類製造工程あるいは紙類再生工程から生じる廃棄物から有用な物質を生産する方法に関する。さらに詳しくは、紙としての再生が困難なセルロース繊維または紙類からグルコースおよびアルコールを製造する方法に関する。
背景技術
近年、環境問題が大きくクローズアップされている。特に、最近のコンピューター化に伴って、紙類の使用が大幅に増加し、木材の伐採による森林破壊、それによる環境の激変などが問題となり、紙のリサイクルが検討されている。我が国においても、１９９６年度の資料によれば、約３０００万トンの紙類が消費され、約半分の１５００万トンが古紙として回収されている。
回収された古紙は、さらに再生紙として利用されるが、何度も繰り返し再生するうち、繊維が脆くなり、再生紙として製紙原料とならないものがある。また、シュレッダーにかけられた紙は、繊維が短く、ほとんどの場合、製紙原料となりにくい。このような再生されない紙類は、前記資料によると、約１５００万トンにもおよび、これらが廃棄または焼却され，環境破壊の原因の１つとなっているのが現状である。従って、紙の再生だけではなく、この廃棄される古紙または紙をどう利用するかは、資源の再利用と環境問題の解決において、重要な問題である。
ところで、古紙の再生に関する研究は広く行われているものの、その古紙再生の際に生じる廃棄物の利用に関する研究はほとんど行われていないのが現状であり、再生紙とならない古紙粕の有効な利用法が望まれている。
発明の開示
本発明者らは、従来廃棄されていた、再生することが困難なセルロース繊維または紙類からグルコースを生産し、このグルコースからアルコールを製造することができることを見出して、本発明を完成させたものである。
すなわち、本発明は、紙としての再生が困難なセルロース繊維または紙類と、β１，４−グルコシド結合を切断し得る酵素または微生物とを反応させる工程を含む、グルコースの製造方法に関する。
好ましい実施態様においては、前記紙としての再生が困難なセルロース繊維または紙類が、無触媒水熱法により回分式であるいは連続的に分解されたセルロース繊維または紙類である。
好ましい実施態様においては、前記紙としての再生が困難なセルロース繊維が、１２０〜３００℃の無触媒水熱法で分解されたセルロース繊維である。
また、別の好ましい実施態様においては、前記微生物が、エンドβ１，４−グルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、およびβ−グルコシダーゼからなる群から選択される少なくとも１種を細胞表層に発現するように組換えられた１または２以上の微生物である。
さらに好ましい実施態様においては、前記微生物が、以下の：
（Ａ）β−グルコシダーゼ；
（Ｂ）エンドβ１，４−グルカナーゼ；および
（Ｃ）エンドβ１，４−グルカナーゼとβ−グルコシダーゼとの組合せ
からなる群から選択される酵素を細胞表層に発現するように組換えられた微生物である。
さらに好ましい実施態様においては、前記微生物が酵母である。
本発明は、また、紙としての再生が困難なセルロース繊維または紙類と、β１，４−グルコシド結合を切断し得る酵素または微生物Ａとを反応させてグルコースを製造する工程、および該得られたグルコースと、アルコール発酵能を有する微生物Ｂとを反応させる工程を含む、アルコールの製造方法に関する。
好ましい実施態様においては、前記紙としての再生が困難なセルロース繊維または紙類が、無触媒水熱法により回分式であるいは連続的に分解されたセルロース繊維または紙類である。
好ましい実施態様においては、前記紙としての再生が困難なセルロース繊維が、１２０〜３００℃の無触媒水熱法で分解されたセルロース繊維である。
また、別の好ましい実施態様においては、前記微生物Ａが、エンドβ１，４−グルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、およびβ−グルコシダーゼからなる群から選択される少なくとも１種を細胞表層に発現するように組換えられた１または２以上の微生物である。
さらに好ましい実施態様においては、前記微生物Ａが、以下の：
（Ａ）β−グルコシダーゼ；
（Ｂ）エンドβ１，４−グルカナーゼ；および
（Ｃ）エンドβ１，４−グルカナーゼとβ−グルコシダーゼとの組合せ
からなる群から選択される酵素を細胞表層に発現するように組換えられた微生物である。
さらに好ましい実施態様においては、前記微生物Ａと微生物Ｂとが同一の微生物である。
より好ましい実施態様においては、前記微生物Ａと微生物Ｂが、同一の酵母である。
発明を実施するための最良の形態
本明細書において、「紙としての再生が困難なセルロース繊維」とは、紙の製造工程あるいは紙の再生工程において生じるセルロース繊維を含む廃棄物をいい、製紙粕、古紙粕などを含む。
一般に、紙は、使用中に熱、湿度、光などの影響を受けるとともに、再生過程において、叩解、加熱、乾燥、機械的圧力などの処理工程を経るため、繰り返し再生されるとセルロース繊維自体が傷む、短くなる、硬くなるなど変質、劣化する。このため、再生紙としての抄造時に抄造されないセルロース繊維が大量に発生し、古紙粕が発生する。このような紙としての再生が困難なセルロース繊維が本発明に用いられる。
「紙としての再生が困難な紙類」には、例えば、シュレッダーにかけられたような、セルロース繊維が短くされた紙も含まれる。また、「紙類」は、紙のみならずダンボールなどの板紙なども含む概念である。
本発明においては、前記紙としての再生が困難なセルロース繊維または紙類（以下、単に「原料のセルロース繊維」という）が、無触媒水熱法により回分式であるいは連続的に分解されたセルロース繊維または紙類であることも好ましい。原料のセルロース繊維を無触媒水熱処理することにより、例えば、適当な長さのセルロース単位あるいはオリゴ糖を形成するように処理され、あるいは繊維間（例えば、セルロース間）の架橋が外れ、セルロース分解酵素が作用し易くなるようにセルロースが変化したものと考えられる。この処理を受けた原料のセルロース繊維は、そのまま、グルコース生産の、あるいはアルコール発酵の基質となり得る。
従来、セルロースの分解等を目的として、無触媒水熱法が種々検討されている。例えば、福岡大学工学部集報第６１号（平成１０年９月号）には、５７８〜６７８Ｋ（すなわち３０５〜４０５℃）の熱水でバッチ処理することにより、セルロースが加水分解されることが記載されている。この処理で得られるセルロース分解物にはグルコースが含まれているが、これを用いてアルコール発酵させても、なんらかの理由で、アルコール発酵がほとんど進行しないことを本発明者らは見い出した。さらに、前記文献の無触媒水熱法では反応時間が極めて短いため、安定的に適切な処理をしたセルロース分解物が得られないという問題がある。
そこで、より低温での、回分（バッチ）式の無触媒水熱法を検討した結果、処理する濃度にも依存するが、約１０重量％濃度の、原料のセルロース繊維を１２０〜３００℃、好ましくは１５０〜２８０℃、より好ましくは１８０〜２５０℃で処理することにより、アルコール発酵に適した分解物を得ることができることを見出した。処理時間は、一般に、１時間〜１５秒の範囲が好ましい。
さらに、原料のセルロース繊維の、無触媒水熱法による加水分解は、連続法でも行うことができる。連続法の場合は、熱履歴時間の関係で、若干温度を高くした無触媒水熱法としてもよい。約１０重量％濃度の原料のセルロース繊維を１２０〜３７３℃、好ましくは１５０〜３２０℃で、好ましくは１時間〜１秒で行う。この連続無触媒水熱法により、原料のセルロース繊維をアルコール発酵に適した分解物とすることができる。
さらに、原料のセルロース繊維を、例えば、硫酸、塩酸、硝酸、リン酸等を添加して酸性、好ましくは、弱酸性条件下、無触媒水熱法を用いて分解することにより、原料のセルロース繊維をアルコール発酵に適した分解物とすることもできる。
本発明に用いられる「β１，４−グルコシド結合を切断し得る酵素」は、このβ１，４−グルコシド結合を切断することができる酵素であれば、特に制限はないが、好ましくは、エンドβ１，４−グルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、β−グルコシダーゼ、カルボキシメチルセルラーゼなどが用いられる。
これらの酵素のうち、β−グルコシダーゼ一種のみでも、セルロース繊維を分解してグルコースを生産することができる。また、これらの酵素を組合せて、原料のセルロース繊維（上記、無触媒水熱処理で得られたセルロース繊維または紙類を含む。以下、同じ）を分解し、グルコースを生産できることが、本発明で初めて見出された。
２種以上の酵素を組合せて用いることはより好ましく、例えば、（１）エンドβ１，４−グルカナーゼとβ−グルコシダーゼとを組合せるか、（２）セロビオヒドロラーゼとβ−グルコシダーゼとを組合せるか、（３）エンドβ１，４−グルカナーゼとセロビオヒドロラーゼとβ−グルコシダーゼとを組合せることができる。グルコースを生成するためには、β−グルコシダーゼを含めることが最も好ましい。これらの組合せにより、効率よくセルロース繊維が分解され、グルコースが生産される。
β１，４−グルコシド結合を切断することができる酵素を生産する微生物もまた、好ましく用いられる。このような微生物には、いわゆるセルラーゼ生産菌が含まれる。なお、「セルラーゼ」というときは、一般にはエンドβ１，４−グルカナーゼをいうが、本明細書では、エンドβ１，４−グルカナーゼとともに生産されるβ１，４−グルコシド結合を切断し、セルロースからグルコースを生産する一群の酵素（例えば、セロビオヒドロラーゼ、β−グルコシダーゼ）を称して、セルラーゼという場合がある。
セルラーゼ生産菌としては、代表的には、トリコデルマ属、クロステリディウム属、セルロモナス属、シュードモナス属などに属する微生物が挙げられる。
また、エンドβ１，４−グルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、β−グルコシダーゼを単独で生産する微生物もまた、使用できることはいうまでもない。
本発明では、β−グルコシダーゼを細胞表層に発現する微生物、エンドβ１，４−グルカナーゼを細胞表層に発現するように組換えられた微生物、またはセロビオヒドロラーゼを細胞表層に発現するように組換えられた微生物を、単独で、あるいは組合せて、用いてもよい。組合せとしては、例えば、エンドβ１，４−グルカナーゼとβ−グルコシダーゼの組合せ、セロビオヒドロラーゼとβ−グルコシダーゼの組合せ、エンドβ１，４−グルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼおよびβ−グルコシダーゼの組合せが挙げられる。
さらに、以下の（１）〜（３）：
（１）エンドβ１，４−グルカナーゼとβ−グルコシダーゼとの組合せ；
（２）セロビオヒドロラーゼとβ−グルコシダーゼとの組合せ；
（３）エンドβ１，４−グルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼおよびβ−グルコシダーゼの組合せ；
のような、複数の酵素を細胞表層に発現するように組換えられた微生物も好ましく使用される。
さらに好ましい微生物は、以下の（Ａ）〜（Ｃ）：
（Ａ）β−グルコシダーゼ；
（Ｂ）エンドβ１，４−グルカナーゼ；および
（Ｃ）エンドβ１，４−グルカナーゼとβ−グルコシダーゼとの組合せ
からなる群から選択される酵素を細胞表層に発現するように組換えられた微生物である。
このような微生物は、いわゆる遺伝子組換え技術を用いる細胞表層工学技術を適用して作成される。
細胞表層工学を利用した例として、村井ら、Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．６３，１３６２−１３６６（１９９７）の文献がある。この文献には、酵母のαアグルチニンのＣ末端領域３２０アミノ酸をコードする遺伝子にグルコアミラーゼ遺伝子を連結し、細胞表層にグルコアミラーゼを固定して、デンプンの分解を行っている。
本発明のβ１，４−グルコシド結合を切断する酵素を有する微生物、あるいはこのいような酵素を発現するための宿主微生物としては、糸状菌、細菌、酵母などが挙げられるが、これらに限定されない。取扱等を考慮すると酵母が好ましい。
β１，４−グルコシド結合を切断する酵素、このような酵素を生産する微生物、またはこのような酵素を細胞表層に発現する微生物は、好ましくは、担体に固定される。そのことにより、再使用が可能となる。
酵素を固定する担体および方法は、当業者が通常用いる担体および方法が用いられ、例えば、担体結合法、包括法、架橋法などが挙げられる。
微生物を固定する担体としては、多孔質体が好ましく用いられる。例えば、ポリビニルアルコール、ポリウレタンフォム、ポリスチレンフォーム、ポリアクリルアミド、ポリビニルフォルマール樹脂多孔質体、シリコンフォームなどの発泡体あるいは樹脂が好ましい。多孔質体の開口部の大きさは、用いる微生物およびその大きさを考慮して決定すればよい。酵母の場合、５０〜１０００μｍが好ましい。
また、担体の形状は問わない。担体の強度、培養効率などを考慮すると、球状あるいは立方体が好ましい。大きさは、用いる微生物により決定すればよいが、一般には、球状の場合、直径が２〜５０ｍｍ、立方体状の場合、２〜５０ｍｍ角が好ましい。
上記の酵素類、微生物、固定化酵素類、固定化微生物と、原料のセルロース繊維と反応させるとグルコースが生成される。酵素の基質となる原料（原料のセルロース繊維）の濃度は特に制限されない。反応は、用いる酵素に応じて、適切な温度（例えば、一般的には、１０〜７０℃）で適切な時間行われる。耐熱性あるいは超耐熱性の酵素を用いる場合、９０℃またはそれ以上でも反応は進行し得る。
この反応は、固定化酵素あるいは微生物を用いる場合、カラムを用いた連続反応とすることができる。エンドβ１，４−グルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、およびβ−グルコシダーゼの各処理を、この順で多段式カラム処理を行ってもよい。得られたグルコースは、常法により単離される。
また、このグルコースからアルコールを製造することも、本発明の一つである。得られたグルコースを基質として、アルコール発酵し得る微生物を反応させればよい。
アルコール発酵し得る微生物としては、特に制限はないが、酵母が好ましく用いられる。アルコール発酵し得る酵母としては特に制限はなく、清酒酵母、ビール酵母、ワイン酵母、パン酵母など、従来から発酵工業に用いられている酵母が挙げられる。
アルコール発酵に際して、いったん、原料のセルロース繊維からグルコースを生成し、これにアルコール発酵能を有する酵母を添加するという２段階の反応が一般的に考えられる。
別の方法は、原料のセルロース繊維から直接アルコール発酵を行う方法である。これには、（ｉ）原料のセルロース繊維を無触媒水熱法で分解して得られる分解液を用いる方法、（ｉｉ）原料のセルロース繊維の分解とアルコール発酵を同時に行う方法、および（ｉｉｉ）原料のセルロース繊維を無触媒水熱法で分解して得られる分解液中のセルロース繊維の分解とアルコール発酵を同時に行う方法などが挙げられる。
（ｉ）の方法は、原料のセルロース繊維を無触媒水熱法で分解して得られる分解液は、そのまま、アルコール発酵の原料とすることができるため、分解液に直接、アルコール発酵能を有する酵母を添加することにより、行われる。
（ｉｉ）の方法は、原料のセルロース繊維を分解する酵素あるいは（組換え）微生物と、アルコール発酵能を有する微生物を共存させることにより、行われる。あるいは、アルコール発酵能を有する酵母を宿主とし、これに、例えば、β−グルコシダーゼおよび／またはエンドβ１，４−グルカナーゼを細胞表層に発現するように組換えられた酵母を用いることにより、行われる。この組換え酵母を用いると、セルロース繊維を分解してグルコースを生成する工程、および生じたグルコースをアルコール発酵する工程が同時に行われ、効果的である。
（ｉｉｉ）の方法は、（ｉ）と（ｉｉ）の組み合わせであり、原料のセルロース繊維をさらに有効利用してアルコールを製造する方法である。
このようなアルコール発酵能を有する微生物（組換え酵母も含む）は、上記グルコース生産の所で記載したように、固定されていてもよい。
実施例
以下、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこの実施例に限定されない。
実施例１：再生困難なセルロース繊維からのグルコース生産
再生紙製造工程の廃液を集め、再生されないセルロース繊維を回収した。この回収したセルロース繊維を以下、古紙粕という。別途、結晶性のアビセル（ａｖｉｃｅｌ）とＦｉｌｔｅｒ  ｐａｐｅｒ  ｐｏｗｄｅｒ  Ｃを準備した。これらを１０ｇ／Ｌ濃度となるように０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液に分散させ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ由来のセルラーゼ（（株）フナコシ製）を用いて、３０℃で反応させ、生成するグルコースをグルコースＣＩＩテストワコー（和光純薬（株）製）を用いて定量した。結果を図１に示す。
図１において、▲は古紙粕を、■はアビセルを、●はＦｉｌｔｅｒ  ｐａｐｅｒ  ｐｏｗｄｅｒ  Ｃをそれぞれ表す。この図１は、古紙粕は、他のセルロース材料と比較して、非常に効率よく分解されることを初めて発見したものであり、古紙粕がグルコース製造の原料として極めて有望であることを示している。
実施例２：β−グルコシダーゼ１および／またはエンドβ１，４−グルカナーゼＩを細胞表層に発現する酵母を用いる、古紙粕からのアルコール生産
２−１  β−グルコシダーゼ１を細胞表層に発現する酵母の作製
β−グルコシダーゼ１を細胞表層に発現するプラスミド作成の模式図を図２および図３に示す。図２は、目的のプラスミドであるｐＢＧ２１１の材料となるプラスミドｐＩＣＡＳ１作成の模式図である。
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＧＡＰＤＨプロモーターにＲｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ由来のグルコアミラーゼが接続された配列を有するプラスミドｐＹＧＡ２２６９（Ａｓｈｉｋａｒｉら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３０：５１５−５２０（１９８６））をテンプレートとして、２つのオリゴヌクレオチド５’−ｃｃｇａｇｃｔｃａｃｃａｇｔｔｃｔｃａｃｃｇｇａａｃａ−３’（配列番号１）および５’−ｇｃｃｃｇｃｇｇｃａｇａａａｃｇａｇｃａａａｇａａａａ−３’（配列番号２）を用いて、ＰＣＲで増幅し、ＳａｃＩおよびＳａｃＩＩで切断して、ＧＡＰＤＨプロモーターとＲｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ由来のグルコアミラーゼ分泌シグナル配列を有するＳａｃＩ−ＳａｃＩＩＤＮＡフラグメントを作製した（フラグメントＩ）。
これとは別に、２つのオリゴヌクレオチド５’−ｇｇａｇａｔｃｔｃｃａｔｇｇｃ−３’（配列番号３）および５’−ｔｃｇａｇｃｃａｔｇｇａｇａｔｃｔｃｃｇｃ−３’（配列番号４）とをアニールさせて、ＳａｃＩＩ−ＸｈｏＩ  ＤＮＡフラグメントを作製した（フラグメントＩＩ）。
さらに、プラスミドｐＧＡ１１（Ｍｕｒａｉら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６３：１３６２−１３６６（１９９７））からＸｈｏＩ−ＫｐｎＩ断片を切り出し、α−アグルチニンのＣ末端３２０アミノ酸と４４６ｂｐフランキング領域を含むＤＮＡフラグメント（フラグメントＩＩＩ）を得た。
他方で、プラスミドｐＲＳ４０４（Ｓｉｋｏｒｓｋｉら、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １２２：１９−１７（１９８９））をＳａｃＩ−ＫｐｎＩで切断し、上記のフラグメンＩ〜ＩＩＩを混合してプラスミドｐＩＣＡＳ１を作製した。このプラスミドは、ＧＡＰＤＨプロモーター、分泌配列、α−アグルチニンのＣ末端３２０アミノ酸、および４４６ｂｐフランキング領域をこの順で含む配列を有している。
このプラスミドｐＩＣＡＳ１を用いて、目的のプラスミドｐＢＧ２１１を作成する手順を図３に示す。プラスミドｐＩＣＡＳ１をＢｇｌＩＩ−ＸｈｏＩで切断し、この部位にプラスミドｐＡＢＧ７（Ｋａｗａｇｕｃｈｉら、Ｇｅｎｅ  １７３：２８７−２８８（１９９６））のＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｃｕｌｅａｔｕｓ由来のβ−グルコシダーゼ１遺伝子を挿入した。すなわち、プラスミドｐＡＢＧ７をテンプレートとして、５’−ｇｔｃｇａｇａｔｃｔｃｔｇａｔｇａａｃｔｇｇｃｇｔｔｃｔｃｔ−３’（配列番号５）および５’−ｔｔｃａｃｔｃｇａｇｃｃｔｔｇｃａｃｃｔｔｃｇｇｇａｇｃｇｃｃｇ−’（配列番号６）をプライマーとしてＰＣＲによりＤＮＡを増幅させ、ＢｇｌＩＩ−ＸｈｏＩで切断し、このフラグメントをプラスミドｐＩＣＡＳ１のＢｇｌＩＩ−Ｘｈｏ切断部位の導入し、プラスミドｐＭＨＣＳを得た。このプラスミドｐＭＨＣＳは、ＧＡＰＤＨプロモーター、分泌シグナル配列、β−グルコシダーゼ構造遺伝子、α−アグルチニンのＣ末端領域３２０アミノ酸および４４６ｂｐフランキング領域を含む遺伝子配列を有している。ｐＭＨＣＳをＢｓｓＨＩＩで切断して、ＧＡＰＤＨプロモーター、分泌シグナル配列、β−グルコシダーゼ構造遺伝子、α−アグルチニンのＣ末端領域３２０アミノ酸と４４６ｂｐフランキング領域を含むＢｓｓＨＩＩ−ＢｓｓＨＩＩ  ＤＮＡフラグメント（フラグメントＩＶ）を単離した。
他方で、２μｍＤＮＡを含むプラスミドｐＭＴ３４（＋３）（Ｔａｊｉｍａら、Ｙｅａｓｔ  １：６７−７７（１９８５））からＥｃｏＲＩフラグメントを切り出し、プラスミドｐＲＳ４０３（Ｓｉｋｏｒｓｋｉら、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １２２：１９−１７（１９８９））のＡａｔＩＩ部位に挿入し、多コピープラスミドｐＭＨ１を作製した。このプラスミドｐＭＨ１をＢｓｓＨＩＩで切断し、そこにフラグメントＩＶを挿入して、β−グルコシダーゼを細胞表層に発現するプラスミドｐＢＧ２１１を得た。
プラスミドｐＢＧ２１１をＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＭＴ８−１（ＭＡＴａ  ｕｒａ３  ｔｒｐ１  ａｄｅ  ｌｅｕ２  ｈｉｓ３）にＹｅａｓｔ  Ｍａｋｅｒ（ＣＬＯＮＴＥＣ社製）を用いて酢酸リチウム法により導入した。形質転換株はＳＤ培地（６．７ｇ／Ｌ  ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ  ｗ／ｏ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ、２０ｇ／Ｌグルコース、０．０３ｇ／Ｌロイシン、０．０２ｇ／Ｌトリプトファン、０．０２ｇ／Ｌアデニン、０．０２ｇ／Ｌウラシル）で選択した。得られた形質転換体をＭＴ８−１／ｐＢＧ２１１と命名した。
２−２  エンドβ１，４−グルカナーゼＩ（エンドグルカナーゼＩ）を細胞表層に発現する酵母の作製
エンドグルカナーゼＩを細胞表層に発現するプラスミドｐＥＧ１９の作成の模式図を図４に示す。
２μｍＤＮＡを有するプラスミドｐＷＩ３（Ｋａｎａｉら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４４：７５９−７６５（１９９６））のＥｃｏＲＩＤＮＡフラグメントをプラスミドｐＲＳ４０５（Ｓｉｋｏｒｓｋｉら、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １２２：１９−１７（１９８９））のＡａｔＩＩ部位に導入し、プラスミドｐＲＳ４０５＋２を作製した。
他方で、上記プラスミドｐＩＣＡＳ１のＧＡＰＤＨプロモーター、分泌シグナル配列、α−アグルチニンのＣ末端３２０アミノ酸と４４６ｂｐフランキング領域を含むＤＮＡフラグメントをＰＣＲで増幅し、ＥｃｏＲＶで切断して、プラスミドｐＲＳ４０５＋２のＰｖｕＩＩ−ＰｖｕＩＩ部位に導入し、プラスミドｐＭＬＣＳ５を作製した。増幅に用いたプライマーは、５’−ｇｇａａａｃａｇｃｔａｔｇａｃｃａｔｇａｔａｔｃｇｃｃａａｇｃｇｃｇｃａａｔｔａ−３’（配列番号７）および５’−ｔｔｇｔａａａａｃｇａｔａｔｃｃａｇｔｇａｇｃｇｃｇｃｇｔａａｔａｃｇａｃｔｃａ−３’（配列番号８）であった。
このプラスミドｐＭＬＣＳ５のＢｇｌＩＩ部位に、Ｔｒｉｃｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ由来のエンドβ１，４−グルカナーゼ遺伝子を挿入した。すなわち、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉのｍＲＮＡから作成した１ｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡをテンプレートとして、５’−ｇｃｔｃｇａｇａｔｃｔｃｃｃａｇｃａａｃｃｇｇｇｔａｃｃａｇｃａｃｃｃｃｃｇａｇ−３’（配列番号９）、および５’−ｇｇａｇａｔｃｔｇｇａａｇｇｃａｔｔｇｃｇａｇｔａｇｔａｇｔｃｇｔｔｇｃｔａｔａｃｔ−３’（配列番号１０）をプライマーとして用いて、ＰＣＲで増幅し、ＢｇｌＩＩで切断して、エンドグルカナーゼＩをコードするｃＤＮＡのＢｇｌＩＩＤＮＡフラグメントを得、これをプラスミドｐＭＬＣＳ５のＢｇｌＩＩ部位に導入し、プラスミドｐＥＧ１９を得た。
得られたプラスミドｐＥＧ１９を、２−１と同様の方法で、酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＭＴ−８に導入し、ＳＤ培地（６．７ｇ／Ｌ  ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ  ｗ／ｏ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ、２０ｇ／Ｌグルコース、０．０２ｇ／Ｌトリプトファン、０．０２ｇ／Ｌヒスチジン、０．０２ｇ／Ｌアデニン、０．０２ｇ／Ｌウラシル）で選択した。得られた形質転換体をＭＴ８−１／ｐＥＧ１９とした。
２−３  β−グルコシダーゼ１とエンドグルカナーゼＩとを細胞表層に発現する酵母の作製
形質転換体ＭＴ８−１／ｐＢＧ２１１を宿主として、プラスミドｐＥＧ１９を２−１と同様に形質転換し、ＳＤ培地（６．７ｇ／Ｌ  ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ  ｗ／ｏ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ、２０ｇ／Ｌグルコース、０．０２ｇ／Ｌトリプトファン、０．０２ｇ／Ｌアデニン、０．０２ｇ／Ｌウラシル）で形質転換株を得た。得られた形質転換株をＭＴ８−１／ｐＢＧ２１１＋ｐＥＧ１９とした。
２−４  古紙粕からのアルコール生産
β−グルコシダーゼ１を細胞表層に発現する形質転換体（ＭＴ８−１／ｐＢＧ２１１）、エンドグルカナーゼＩ細胞表層に発現する形質転換体（ＭＴ８−１／ｐＥＧ１９）およびβ−グルコシダーゼ１とエンドグルカナーゼＩとを細胞表層に発現する形質転換体（ＭＴ８−１／ｐＢＧ２１１＋ｐＥＧ１９）をそれぞれの選択に用いたＳＤ培地（液体培地）に懸濁し、３０℃、４８時間培養し、前培養液を得た。この前培養液を、４０ｇ／Ｌの古紙粕を含むＹＰＤ培地（１０ｇ／Ｌ  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ、２０ｇ／Ｌポリペプトン、グルコース５ｇ／Ｌ）１Ｌを有する２Ｌジャーファーメンター（ＢＭＪ−０２ＰＩＡｂｌｅ）に植菌し、０．０１〜０．０３ｐｐｍの微好気条件下培養を行った。いずれの形質転換体も、グルコース添加量が少ないにも係わらず、生育した。これは、細胞表層で発現した酵素により、グルコースが生産され、生産されたグルコースを利用して生育したためと思われる。β−グルコシダーゼ１とエンドグルカナーゼＩとを細胞表層に発現する形質転換体（ＭＴ８−１／ｐＢＧ２１１＋ｐＥＧ１９）の生育が一番よかった。
乾燥菌体量が約１５ｇ／Ｌに達したところで培養を終了し、遠心分離により菌体を回収し、７０ｇ／Ｌの古紙粕を含有する５ｇ／Ｌ  ＹＰＤ培地で、３０℃、ｐＨ６．０、０．０１〜０．０３ｐｐｍの微好気条件下、発酵を行った。１００時間培養後、培養液中のエタノールを測定した結果、形質転換体（ＭＴ８−１／ｐＢＧ２１１）、形質転換体（ＭＴ８−１／ｐＥＧ１９）および形質転換体（ＭＴ８−１／ｐＢＧ２１１＋ｐＥＧ１９）は、それぞれ、３ｇ／Ｌ、４ｇ／Ｌおよび６ｇ／Ｌのエタノールを生産した。
２−５  無触媒熱水法で分解した古紙粕からのアルコール生産
内容積３５ｍｌ、内径１６ｍｍ、高さ２００ｍｍの耐圧容器にヒーターを取り付け、７０ｇ／Ｌ濃度の古紙懸濁液を表１に記載の条件で処理し、得られた分解液をそのまま炭素源として用いて、アルコール発酵を行った。用いた形質転換体は、β−グルコシダーゼ１を細胞表層に発現する形質転換体（ＭＴ８−１／ｐＢＧ２１１）およびβ−グルコシダーゼ１とエンドグルカナーゼＩとを細胞表層に発現する形質転換体（ＭＴ８−１／ｐＢＧ２１１＋ｐＥＧ１９）である。
７０ｇ／Ｌの処理した古紙の濃度を有する５ｇ／Ｌ  ＹＰＤ培地で、３０℃、ｐＨ６．０、０．０１〜０．０３ｐｐｍの微好気条件下、発酵を行った。１００時間培養後、培養液中のエタノールを測定した結果を表１に示す。
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表１の結果は、何も処理しない古紙を培地に添加した場合よりも、４００℃、１５秒間処理した古紙を培地に添加した場合アルコール発酵の程度は小さかったし、４００℃、３０分間処理したものを添加した場合には、もっと低かった。これよりも緩い条件で処理した古紙を添加した場合、処理しない場合よりもはるかにアルコール発酵の程度は大きかった。過酷な条件で古紙を処理することにより、セルロースが分解されて必要な糖が生成されないか、反応を阻害する物質が生成するなどの原因により、アルコール発酵が進行しなかったものと考えられる。他方、より緩やかな条件で古紙を処理することにより、古紙が適度に分解され、酵素が古紙（セルロース）に対して働き易くなったためと考えられる。
実施例３：エンドβ１，４−グルカナーゼＩＩを細胞表層に発現する酵母の構築とβ−グルカンの分解
３−１  エンドβ１，４−グルカナーゼＩＩ（以下、エンドグルカナーゼＩＩという）を細胞表層に発現する酵母の作成
エンドグルカナーゼＩＩを細胞表層に発現するプラスミドｐＥＧ２３ｕ３１の作成手順を図５に示す。
２−１で作成したプラスミドｐＩＣＡＳ１をテンプレートとして、配列番号７および８で示される配列をプローブとして、ＰＣＲによる増幅を行った。得られた断片をＥｃｏＲＶで切断し、ＥｃｏＲＶ−ＥｃｏＲＶフラグメントを得た。このフラグメントには、ＧＡＰＤＨプロモーター、分泌シグナル配列、α−アグルチニンのＣ末端３２０アミノ酸と４４６ｂｐフランキング領域が含まれている。
他方、本発明者の田中、植田らが作成したプラスミドｐＵＲＩ２４をＰｖｕＩＩおよびＢａｍＨＩで切断し、平滑末端とした。この平滑末端化部位に、ＥｃｏＲＶ−ＥｃｏＲＶフラグメントを挿入し、プラスミドｐＭＵＣＳを作成した。
次に、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉのｍＲＮＡから作成した１ｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡをテンプレートとして、ＰＣＲを行った。用いたプライマーは５’−ｃｇｇｃｇａｇａｔｃｔｃａｃａｇｃａｇａｃｔｇｔｃｔｇｇｇｇ−３’（配列番号１１）および５’−ｇａｃａｇｃｔｃｇａｇｇｇｃｔｔｔｃｔｔｇｃｇａｇａｃａｃｇ−３’（配列番号１２）であった。このＰＣＲ産物をＢｇｌＩＩおよびＸｈｏＩで切断し、エンドβ１，４−グルカナーゼＩＩ（グルカナーゼＩＩ）をコードする配列を有するＢｇｌＩＩ−ＸｈｏＩフラグメントを得た。このＢｇｌＩＩ−ＸｈｏＩフラグメントをプラスミドｐＭＵＣＳのＢｇｌＩＩ−ＸｈｏＩ部位に挿入し、目的のプラスミドｐＥＧ２３ｕ３１を得た。
得られたプラスミドｐＥＧ２３ｕ３１を、２−１と同様の方法で、酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＭＴ−８に導入し、ＳＤ培地（６．７ｇ／Ｌ  ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ  ｗ／ｏ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ、２０ｇ／Ｌグルコース、０．０２ｇ／Ｌトリプトファン、０．０２ｇ／Ｌヒスチジン、０．０２ｇ／Ｌアデニン、０．０３ｇ／Ｌロイシン）で選択した。得られた形質転換体をＭＴ８−１／ｐＥＧ２３ｕ３１とした。
３−３  β−グルカンの分解
５０ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ５．０）に１０ｇ／Ｌの濃度のβ−グルカンを懸濁して、これにエンドグルカナーゼＩＩを細胞表層に発現する酵母ＭＴ８−１／ｐＥＧ２３ｕ３１を添加して、６０時間反応させた。Ｓｏｍｏｇｙｉ−Ｎｅｌｓｏｎ法により、遊離してくる還元糖量をグルコース当量として測定した。コントロールとして、エンドグルカナーゼＩＩ遺伝子の組込みに使用したｐＭＵＣＳを有するＭＴ８−１（ＭＴ８−１／ｐＭＵＣＳ）を用いた。結果を図６に示す。
図６の結果は、細胞表層にエンドグルカナーゼＩＩを有する酵母は、βグルカンを効率よく分解することを示している。
実施例４：βグルコシダーゼ１および／またはエンドグルカナーゼＩＩを細胞表層に発現する酵母の作成
４−１  β−グルコシダーゼ１を細胞表層に発現する酵母の作成
ここでは、染色体組込み型のプラスミドで形質転換された酵母を作成した。３−１と同様、プラスミドｐＩＣＡＳ１をテンプレートとして、ＥｃｏＲＶ−ＥｃｏＲＶフラグメントを調製した。このフラグメントを染色体組込型プラスミドｐＲＳ４０３（Ｓｉｋｏｒｓｋｉ，Ｒ．Ｓ．およびＰ．Ｈｉｅｔｅｒ、（１９８９）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１２２：１９−２７）のＰｖｕＩＩ部位に挿入し、プラスミドｐＩＨＣＳを作成した。
他方で、２−１で作成したｐＢＧ２１１をテンプレートとして、ＰＣＲを行い、βグルコシダーゼ１をコードする配列を有するＰＣＲ産物を得た。用いたプライマーは、５’−ｇａｔｃｔｃｃａｔｇｇｃｔｇａｔｇａａｃｔｇｇｃｇｔｔｃｔｃｔｃｃｔｃｃｔｔｔｃ−３’（配列番号１３）および５’−ｔｇｇｃｇｃｔｃｇａｇｃｃｔｔｇｃａｃｃｔｔｃｇｇｇａｇｃｇｃｃｇｃｇｔｇａａｇ−３’（配列番号１４）であった。得られたＰＣＲ産物をＮｃｏＩおよびＸｈｏＩで切断し、プラスミドｐＩＨＣＳのＮｃｏＩ−ＸｈｏＩ部位に導入し、目的のプラスミドである、β−グルコシダーゼ１表層発現染色体組込型プラスミドｐＩＢＧ１３を作成した。
得られたプラスミドｐＩＢＧ１３を、ＮｈｅＩで切断して一本鎖ＤＮＡにした後、２−１と同様の方法で、酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＭＴ−８に導入し、ＳＤ培地（６．７ｇ／Ｌ  ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ  ｗ／ｏ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ、２０ｇ／Ｌグルコース、０．０３ｇ／Ｌロイシン、０．０２ｇ／Ｌトリプトファン、０．０２ｇ／Ｌアデニン、０．０２ｇ／Ｌウラシル）で選択して、得られた形質転換体をＭＴ８−１／ｐＩＢＧ１３とした。
４−２  β−グルコシダーゼ１およびエンドグルカナーゼＩＩを共発現する酵母の作成
３−１で得られた、エンドグルカナーゼＩＩを細胞表層に発現する酵母ＭＴ８−１／ｐＥＧ２３ｕ３１を、４−１で得られたβ−グルコシダーゼ１を細胞表層に発現するプラスミドｐＩＢＧ１３（染色体組込型）で形質転換し、形質転換体ＭＴ８−１／ｐＥＧ２３ｕ３１ｐＩＢＧ１３を作成した。
この形質転換体がβ−グルコシダーゼ１およびエンドグルカナーゼＩＩを発現していることを、プレートアッセイにより確認した。
β−グルコシダーゼ１のアッセイはＳＤ選択プレート上で３０℃、４８時間インキュベートした後、１０ｍＭの合成基質（４−ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｙ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ）を含む７．５ｇ／Ｌソフトアガーを重層し、３０℃、１２時間さらにインキュベートした。このプレートを波長３００ｎｍの紫外線を照射し、基質が分解されて生成する蛍光物質の蛍光を観察したところ、蛍光が見られ、発現が確認された。
また、エンドグルカナーゼＩＩの発現は、１ｇ／Ｌ  β−グルカンを含むＳＤ選択プレート上で３０℃、４８時間インキュベートし、１ｇ／Ｌコンゴレッドで染色することにより行い、ハローが確認された。
以上から、ＭＴ８−１／ｐＥＧ２３ｕ３１ｐＩＢＧ１３は、β−グルコシダーゼ１およびエンドグルカナーゼＩＩを発現していることが確認された。
４．３  β−グルコシダーゼ１を細胞表層に発現する酵母によるセロビオースの利用
β−グルコシダーゼ１を細胞表層に発現するＭＴ８−１／ｐＩＢＧ１３、およびＭＴ８−１／ｐＥＧ２３ｕ３１ｐＩＢＧ１３を用いて、セロビオースを単一炭素源として培養し、酵母の生育を観察した。対照として、ＭＴ８−１株を用いた。６．７ｇ／Ｌ  ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ  ｗ／ｏ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ、１０ｇ／Ｌセロビオース、０．０３ｇ／Ｌロイシン、０．０２ｇ／Ｌトリプトファン、０．０２ｇ／Ｌアデニン、０．０２ｇ／Ｌウラシル）の培地を用い、３０℃で培養した結果を図７に示す。
この結果は、β−グルコシダーゼ１を細胞表層に発現する酵母は、元来酵母が資化することができない二糖であるセロビオースを分解し、生育できたことを示している。
４−４  β−グルコシダーゼ１およびエンドグルカナーゼＩＩを発現する酵母による可溶性長鎖セルロースからのエタノール生産
形質転換体ＭＴ８−１／ｐＥＧ２３ｕ３１ｐＩＢＧ１３をＳＤ培地（６．７ｇ／Ｌ  ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ  ｗ／ｏ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ、２０ｇ／Ｌグルコース、０．０３ｇ／Ｌロイシン、０．０２ｇ／Ｌトリプトファン、０．０２ｇ／Ｌアデニン、０．０２ｇ／Ｌウラシル）の培地で前培養し、ＳＤ培地（６．７ｇ／Ｌ  ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ  ｗ／ｏ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ、１０ｇ／Ｌ  β−グルカン、０．０３ｇ／Ｌロイシン、０．０２ｇ／Ｌトリプトファン、０．０２ｇ／Ｌアデニン、０．０２ｇ／Ｌウラシル）で培養し、生成するエタノールの量をガスクロマトグラフィーで測定した。全糖は、カルバゾール・硫酸法で測定した。結果を図８に示す。
この結果は、β−グルカンが完全に糖化され、アルコール発酵が行われたことを示している。
産業上の利用可能性
本発明の方法により、紙として再生されないセルロース繊維が有効に資源として再利用される。特に、β１，４−グルコシド結合を切断し得る酵素をアンカリングした微生物が、好ましく用いられる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、古紙粕のセルラーゼによる分解を示す図である。
図２は、プラスミドｐＩＣＡＳ１の作成の模式図である。
図３は、プラスミドｐＢＧ２１１の作成の模式図である。
図４は、プラスミドｐＥＧ１９の作成の模式図である。
図５は、プラスミドｐＥＧ２３ｕ２１の作成の模式図である。
図６は、プラスミドｐＥＧ２３ｕ２１で形質転換され、エンドβ１，４−グルカナーゼを細胞表層に発現する酵母を用いてβ−グルカンを分解することを示す図である。
図７は、β−グルコシダーゼ１を細胞表層に発現する酵母によるセロビオースの利用を示す図である。
図８は、βグルコシダーゼ１とエンドβ１，４−グルカナーゼＩＩとを細胞表層に発現する酵母を用いて、β−グルカンを基質としてアルコールを製造することを示す模式図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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