(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
電子顕微鏡と共に使用される装置において、
高電圧電子ビームを受け取り、減速された高電圧電子ビームを作る減速器と、
減速された前記高電圧電子ビームを受け取り、光を作るシンチレータと、
前記シンチレータからの光を受け取る位置に配置され、減速された電子ビームの減速された高電圧状態に維持される荷電結合素子と、を備える装置。
【請求項２】
前記減速器は逆方向に使用される加速管を有する、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記シンチレータと、前記荷電結合素子との間に配置された光ファイバ束を更に有する、請求項１に記載の装置。
【請求項４】
前記荷電結合素子上に直接的に蒸着されたシンチレータ層を更に有する、請求項１に記載の装置。
【請求項５】
タンクを更に備え、前記タンクが減速器と前記荷電結合素子を有している、請求項１に記載の装置。
【請求項６】
タンク内に配置され、前記荷電結合素子に接続された密閉エレクトロニクスボックスを備える、請求項１に記載の装置。
【請求項７】
前記減速器及びエレクトロニクスボックスの外部でタンク内の領域に加圧されたガスを含む、請求項６に記載の装置。
【請求項８】
前記ガスはＳＦ6である、請求項７に記載の装置。
【請求項９】
前記減速器は、複数の減速器電極と、前記減速器電極間の絶縁体とを含む、請求項１に記載の装置。
【請求項１０】
前記減速器の周りにコロナシールドを有する、請求項９に記載の装置。
【請求項１１】
隣接する電極間に電位付け抵抗を有する、請求項９に記載の装置。
【請求項１２】
前記タンク内に配置されると共に、前記密閉エレクトロニクスボックスに接続されて荷電結合素子制御信号と荷電結合素子出力信号を送信する光ファイバケーブルを有する、請求項６に記載の装置。
【請求項１３】
前記タンク内に配置され、前記荷電結合素子を冷却するために前記密閉エレクトロニクスボックスと外部冷却器とに接続された冷却ラインを有する、請求項６に記載に装置。
【請求項１４】
電子顕微鏡と組み合わされた、請求項１に記載の装置。
【請求項１５】
前記電子顕微鏡は、電子ソースと、前記電子ソースに接続されて３００kV〜４００kVの電子ビームを作る３００kV〜４００kVの電源とを有する、請求項１４に記載の装置。
【請求項１６】
前記減速器に接続され、電子ビームを約１００kVに減速する減速器電源を有する、請求項１５に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、一般的に荷電結合素子（ＣＣＤ）カメラに関し、特に透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）において使用されるＣＣＤカメラに関する。
【０００２】
【従来の技術】
電子顕微鏡において低速スキャンＣＣＤが広く使用されるようになっており、ある状況ではそれらは直接的なディジタル読み取りの明確な長所と共に、写真フィルムに対するデータ品質の改善をもたらす。しかし、より一般的な１００kV顕微鏡と比較すると、ＣＣＤの性能は、３００〜４００kVで動作する中間電圧電子顕微鏡（ＩＶＥＭ）において大きく低下する。ＩＶＥＭはより広く使用されるようになっているので、ＣＣＤカメラの低い性能は制限的である。
【０００３】
現在まで、高エネルギー電子を伴なうＣＣＤの性能は写真フィルムのそれより大きく劣っており、多くの生物学的応用における映像記録のためにＣＣＤを使用することは現実的ではなかった。タンパク質の高解像度電子結晶学や細胞の超微細構造の断層撮影研究のために必要とされるような高品質映像データはＣＣＤカメラでは直接収集することができない。
【０００４】
電子顕微鏡の電圧を上げることは多数の利益がある。加速電圧が増加すると、弾性的及び非弾性的錯乱断面が減少し、より厚い標本を使用可能となる。これは、大型分子又は集合の凍結水和前処理や３次元表示のための断層撮影により研究される埋込部分については特に重要である。また、映像解析及び処理の多くについて不可欠である単一錯乱近似は電圧の増加により改善され、そのデータは標本をより良く表示する。時間干渉性の包括線関数が改善され、定期的に高解像度を得ることが容易になる。フィールドの深さが大きくなれば、焦点に近い傾斜標本の領域は大きくなる。回折制限スポットサイズはより小さくなり、点走査イメージングをより小さい照明スポットで行うことができる。点走査イメージングによる集束傾斜補正は、確実にイメージ全体を本質的に同一の集束とするであろう。銃の輝度がより高く、干渉性及び／又は露光時間に改善をもたらす。これらの各因子は増加的な改善をもたらし、全体的としての相違は相当大きい。実際、顕微鏡製造者に依然として中間及び高電圧顕微鏡の改善を行わしめているのはこの因子の組み合わせであり、“ルーチン”顕微鏡と考えられる電圧は増加し続ける。
【０００５】
生物学的応用においては、高電圧顕微鏡は当初は厚い標本の高い浸透のためのみに使用されていた。３００〜４００kVで動作する安定的なＩＶＥＭが高解像度タンパク質構造の作業にも使用される。カメラの解像度は現在のＩＶＥＭの使用においては制限因子として残っている。多くの潜在的応用、例えば結晶学や単一分子構造の研究などにおいて、ディジタル化及び高解像度ＣＣＤ計装化は構造の研究のために非常に有益であろう。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
電子顕微鏡検査は、データ収集と処理技術の改善により高度化される。データ収集効率を大きく改善することができる進歩は、ＣＣＤカメラの全能力の電子顕微鏡検査への発展である。低速スキャンＣＣＤが使用され、いくつかの例ではデータ収集については完全に写真フィルムの代わりとなっている。特に１００kVの顕微鏡では、ＣＣＤは少なくともフィルムと同程度であることが示唆されている。しかし、事実上はＣＣＤ性能の全ての定量的分析は、ＣＣＤで収集されたデータの質が特定のシステム特性によって低下することを示している。このことはどの電圧でも当てはまるが、電圧の増加により問題は増大する。特に影響があるのが点広がり関数であり、それはシンチレータ内の電子の散乱（横方向ストラグリング）により拡大される。この問題は高電圧で特に悪化し、それは中間電圧電子顕微鏡の１つの欠点とされる。けれども、高電圧の長所の数を考えると、ＩＶＥＭは構造研究のための非常に好ましい機器であろう。
【０００７】
文献の再調査は、ＩＶＥＭにおいてＣＣＤを使用する可能性について、どちらかといえば不利な状況を与える。Daberkow et al.の"Development and performance of a fast fibre-plate coupled CCD camera at medium energy and image processing system for electron holography", Ultramicroscopy 64, 35-48 (1996) は、１００〜３００kVで起きる検出量子効率（ＤＱＥ）の急激な低下を示す計算及び測定を提示している。ＤＱＥの損失は厚いシンチレータによってある程度防止することができるが、それはかなり広い点広がり関数（ＰＳＦ）を犠牲にする場合のみである；例えば、３００kVで０．５を超えるＤＱＥを提供するあらゆる条件においてＰＳＦは６０μｍより広い。その状況は２００kVの場合より悪くはないが、それでも１００kVよりはかなり悪い。Faruqi et al.の"A high sensitivity imageing detector for electron microscopy" Nucl. Instum. & Methods in Phys. Res. A 367, 408-412 (1995)も、感度を改善するために厚いシンチレータを使用したが、１２０kVでも５０μｍ（ＦＷＨＭ）をゆうに超えるＰＳＦを得た。Weickenmeier et al.の"Quantitative characterization of point spread function and detection quantum efficiency for a YAG scintillator slow scan CCD camera" Optik 99, 147-154(1995) は、ＣＣＤシステムの変調用変成機能（ＭＴＦ）を測定し、それは１２０kVでも０．２未満であった。DeRuijterの"Imaging properties and applications of slow-scan charge-coupled device cameras suitable for electron microscopy" Micron 26, 247-275 (1995)は１００と３００kVの動作を比較し、高電圧ではＭＴＦ内で２の因数の損失を示し、またいくつかのＭＴＦ測定を例外的に有利とした別のノイズソースについての良好な議論を提供している。主たる問題は、入射電子ごとの光子の広パルス高さ分布からなどのシンチレータ内のノイズがＭＴＦによって弱まらず、よって高い空間周波数においてパワースペクトルに有限の増幅度を加えることである。入力のフーリエ変換又は自己相関のみに基づくＭＴＦ測定は、ノイズソースによって高い値へバイアスされる。Van Zwet とZandbergenの"Measurement of the modulation transfer function of a slow-scan CCD camera on a TEM using a thin amorphous film as test signal" Ultramicroscopy 64, 49-55(1996)は、異なる手法により行われたＭＴＦ測定の相違を示す。Sherman et al.の"Performance of a slow-scan CCD camera for macromolecular imageing in a 400kV electron cryomicroscope" Micron 27, 129-139 (1996)は、最も好ましいものであるが、それでもフィルムと比較すると高解像度で信号及び信号対雑音比の両方の大きな損失を示す。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明は、高電圧ＴＥＭにおいて使用するためのＣＣＤカメラの適応化であり、その高電圧ＴＥＭでは、電子はＣＣＤカメラに衝突する前に１００kV程度まで減速される。ＣＣＤは、高電圧隔離装備内の減速器の下に高電圧でフロートされる。この構成は、電子がそのエネルギーを堆積するシンチレータの容積を大きく減少させることにより、信号レベルと解像度の両方において大きな改善を可能とする。非常に薄い高効率なシンチレータ材料、例えば真空蒸着したCsIを使用することにより、更なる改善が得られる。
【０００９】
本発明のＣＣＤカメラは、ビームの標本との相互作用においてＩＶＥＭの全ての形態を利用するが、高電圧電子によるＣＣＤの制限を克服するものである。この発展は、多くの生理学的応用においてＣＣＤカメラを非常に便利なものとする。もちろん、その利益は、それが最も劇的な改善が見られるところではあるものの、低線量の作業に限定されない。
【００１０】
【発明の実施の形態】
この透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）の荷電結合素子（ＣＣＤ）カメラは、顕微鏡の倍率を伴うことなく記録イメージの解像度を改善する。顕微鏡の倍率を増加させることは、解像度を上げるためには満足できない方法である。なぜなら、それは、倍率を上げることにより、より少数の分子又は標本のより小さい領域が所定のサイズのＣＣＤチップ上に記録されることになり、標本の一部分を他の一部分と関係付ける能力を制限するからである。このカメラは、一連のレンズ電極を使用してＴＥＭ電子をそれらがＣＣＤカメラのシンチレータに入る前に約１００ｋＶまで減速する。これは、ＣＣＤチップへ到達するノイズ成分を大幅に減少させる。ＴＥＭのＣＣＤカメラは、透過型電子顕微鏡に近接配置された電子減速器と、減速器の低エネルギー側のＣＣＤカメラとを含む。減速器は、電気的絶縁体により分離された複数のレンズ電極と、電極へ電圧を提供する手段と、を含む。カメラは、シンチレータ材料、ＣＣＤチップ、シンチレータにより発生した光子をＣＣＤチップへ透過するために配置された光ファイバ材料、及び、電気信号をイメージに変換可能なＣＣＤチップに接続されたエレクトロニクスを含む。
【００１１】
近接する画素をビンニング（binning）して広いＰＳＦを保証することは、標本領域を増加させるので有用ではない。縮小を伴うレンズカップリング、光ファイバの減少、及びシンチレータを薄くすることを含む広いＰＳＦを克服するための方法としての画素ビンニングの代わりは、いずれもＣＣＤへ結合する十分な光を提供して適当な信号を保証することができない。高電圧で作られた広パルス高さスペクトルにより導入されるノイズは、ＤＱＥを大きく低下させ、４００kVでフィルムより劣る性能につながる。これらは、高電圧におけるＣＣＤカメラ性能の本質的制限である。本発明のＣＣＤカメラで使用される１つの解決策は、ＣＣＤを顕微鏡のＨＶの下に５０〜２００kV程度で浮かせることである。これは現在より多くの信号を利用可能とし、シンチレータ内の点広がり関数はＣＣＤの画素サイズより小さくなる。
【００１２】
モンテカルロ電子散乱計算は、シンチレータへ入射するビームエネルギーを減少させることの長所（又は、一般的な高電圧動作の欠点）を示している。図１Ａ〜１Ｃは、５０、１００及び３００kVの電子について、シリコン光ファイバ８上のＹＡＧシンチレータ６内の電子軌跡の計算を示す。これは平均的な電子軌道を正確に与えるわけではないが、５０μｍの層でさえ、３００kVの電子エネルギーをほとんど停止することができないことが容易にわかる。停止パワーテーブルに基づく推定は、ＹＡＧ内で約２０kVが吸収されるというものである。３００kVの電子は、ＹＡＧ内でいくつかのＣＣＤ画素（２４μｍの画素間隔）に対応する範囲にわたって錯乱するが、光ファイバ内を移動し、ＹＡＧ中でバックアップされる電子により、点広がり関数の幅に対するより大きな貢献が発生する。１０％程度の入射電子が、しばしば入射位置から１０画素の距離でＹＡＧへ散乱して戻る。一方、低エネルギー電子についての停止パワーは、全ての電子がシンチレータの薄い層内で停止し、横方向の広がりは１画素未満であるというものである。この劇的な改善は、シンチレータ及びＣＣＤの性能と良好に適合した高電圧にＣＣＤをフロートさせることに基づいている。
【００１３】
図２は、電子顕微鏡において使用される減速器１４内にＣＣＤ１２をフロートさせるための減速器−ＣＣＤカメラ装置１０を示す。減速電圧は、高電圧タンク２０内の貫通接続１８を通じてＨＶケーブル１６上で提供され、その高電圧タンク２０は顕微鏡の観察チャンバの下で顕微鏡ベース２２に取り付けられる。エレクトロニクスパッケージ２６（増幅器、Ａ／Ｄ変換器、光学的隔離要素、など）を含むボックス２４がタンク２０の内部に配置され、タンク２０はボックス２４と減速器１４の外部領域２８に加圧（例えば８０psi）ＳＦ6ガスを含む。ボックス２４の内部は典型的に大気圧である。ＣＣＤ１２は、ボックス２４内への貫通接続として機能するプレート３０上に配置され、そのプレート３０は顕微鏡動作中に高電圧になる。エレクトロニクスパッケージ２６は再充電可能なバッテリー３２を使用し、そのバッテリー３２は、減速用高電圧がオフの時に取り外し可能なプラグ３４を通じて外部電源に接続することができる。ＣＣＤ制御及び出力信号は光ファイバ３６を通じて送られる。外部冷蔵庫（冷却器）４０から冷却剤ライン３８を通じて循環されるフレオン等の非導電性冷却剤は、ＣＣＤ温度を通常の−２０Ｃまで下げるために使用され、ペルチェ冷却器を実行するために要求される重大なパワー排出を防止する。光ファイバ３６と冷却ライン３８は、ＣＣＤコントローラ４４及び冷却器４０への接続のためにタンク２０の貫通接続４２を通る。薄いシンチレータ４６は光ファイバ４８を通じてＣＣＤ１２へ接続される。
【００１４】
減速器１４は、絶縁体（セラミックリング）５２により分離された複数の電極段５０により形成される。減速器１４の内部５４は顕微鏡動作中は真空（例えば、１０-6  torr未満）
であり、顕微鏡ベース２２の開口５８と一致する顕微鏡貫通開口５６と通じている。整列した開口５６、５８はスライドバルブ６０により閉じることができ、そのバルブ６０は開いた状態で図示されているが、矢印６２で示すように移動することができる。
【００１５】
減速電極５０の機能は、ＣＣＤカメラに到達する前に高電圧電子を減速させることである。これは、スパークを防止するために重要である。ガードリング（コロナシールド）６４は減速器１４の外側で電極５０と接続し、高圧領域２８内でのスパークを防止する。電位付け抵抗Ｒも減速器１４の外側上の電極５０間に接続される。抵抗Ｒは、電極間に均一な電圧降下を提供するために一定値とすることができ、又は他の電圧分布を提供するために異なる値とすることができる。例えば、ウィスコンシン州、ミドルトンのナショナル・エレクトロスタティック社の大型高勾配加速管などの商業的に入手可能な機器を減速器１４に使用することができる。しかし、従来型の加速管は逆方向で使用されるので、それは電子ビームを加速ではなくむしろ減速させる。よって、３００kVのビームが２００kVだけ減速されるならば、シンチレータ／ＣＣＤに１００kVのビームが入射する。
【００１６】
図１Ａ〜１Ｃに示すモンテカルロ計算は、シンチレータ上の電子の最適エネルギーが１００kVよりいくらか低いことを示している。１００kVでも全ての電子エネルギーが非常に小さな容積に吸収され、おそらく厚いシンチレータのＭＴＦの重大な制限を克服する。しかし、シンチレータ上に入射する電子エネルギーを５０kVへ減少させることがより良い。電源及び減速器の両方の設計について、ＣＣＤ電圧を２００kV以上に上げることの増分コストは、２００kVをプロトタイプのカメラ変形の合理的な上限とする。高電圧の全ての長所を本質的に維持しつつ、顕微鏡のＨＶを３００kVから２７５kVへ下げることにより、より低い入射電圧をテストすることができる。
【００１７】
これらのＣＣＤのテストのいくつかは、より低電圧で動作する１００kV顕微鏡で実行することができるが、そうするとタンパク質構造の作業に理想的な条件下でＣＣＤ性能をテストする能力を失うことになる。
【００１８】
高電圧放電は、ＣＣＤ１２及びそれに関係するエレクトロニクス２６に重大な脅威を与える。ＳＦ6タンク２０内の放電は、保守的な設計により容易に回避することができる。ＣＣＤ１２の上のマルチステップ減速器１４は、減速器１４内部の真空中での放電のリスクを最小化する。減速器の電子光学的性質は、最小のイメージ歪みと高電圧隔離における大きな安全率を提供する。
【００１９】
薄いシンチレータ４６は、光ファイバ４８を通じてＣＣＤ１２へ光学的に接続されている。低電圧は、光ファイバ４８なしでシンチレータ４６をＣＣＤ１２上に直接配置することを可能とする。シンチレータ上の金属化層は、エレクトロニクス２６のためのファラディーシールドの一部としてある程度の保護を提供する。低線量作業については、ＹＡＧと比較して約５倍高い光出力を有するので、Ｐ４３蛍光体が好ましい。これは、５０μｍの厚さの層内でさえ約２０kVしか吸収されない４００kVの顕微鏡においては特に重要な問題である。一方、低電圧では、より薄いＹＡＧ層内でほぼ全ての電子エネルギーが吸収でき、非常に小さい横方向範囲内でほぼ同じ光出力を与える。ＹＡＧは点広がり関数において長く低増幅度のコンポーネントであるという欠点があるものの、それはその応答の空間均一性とパルス高さスペクトルにおいて大きな長所を有する。
【００２０】
ＹＡＧよりさらに良好な代替物は、CsIの真空蒸着層であり、それはＹＡＧよりいくらか大きい停止パワーとかなり高い光出力効率を有する。ＹＡＧのシンチレータは約２０μＭ程度まで機械的に薄くされるが、その厚さは正確には予測不能であり、２ｋＣＣＤにわたって変化する傾向がある。CsI層は２０μｍ未満に作ることができ、それは５０〜１００kVの電子を吸収するには依然として十分に厚いが、研磨されたＹＡＧにより得られたより良好なＭＴＦを確保するのに十分に薄い。CsIコーティングは、Bicron社（オハイオ州、ニューバリー）により光ファイバ上に蒸着される。光ファイバと冷却剤コネクタはＳＦ6タンク内で減速電極を通って上昇し、フィールド勾配の影響とアーキングの危険を最小にする。
【００２１】
減速器は大きなレンズ効果を有する。第１の近似について、減速フィールドは倍率において２未満の係数を導入する。減速器により導入されるイメージの歪みは、既に結晶イメージの処理の一部となっているタイプのイメージ処理により除去することができる。歪みパターンが特徴付けされると、それは全てのイメージについて一定とし、イメージ処理のルーチンステップ内に含められる。
【００２２】
静電レンズの倍率は電圧降下の平方根に比例する。これを使用して、高電圧供給に耐えうる安定度とリップルの発想を与えることができる。倍率の最初の推定は２の因数程度である。それから、２ｋフィールド、即ち1/1000の端部において１画素に対応する量だけ倍率を変化させることを防止するために、ＨＶは1/1000の安定度とリップルのみを要し、それらは両方とも利用可能な電力供給の仕様の範囲内であろう。
【００２３】
電子顕微鏡システム７０の全体が図３に示される。顕微鏡の柱又は構造７２が顕微鏡ベース６４上に配置され、顕微鏡ベース６４には図２の減速器−ＣＣＤカメラ装置１０を含むタンク２０が顕微鏡構造７２と整列して配置される。装置１０はＨＶケーブル１６を通じてＨＶ電源７６に接続される。Gamma High Voltage社のモデルRR200.75による小型２００kV電源を使用することができる。第２のＨＶ電源７８は、構造７２の頂部において電子ビームソース８２にＨＶケーブル８０を通じて接続される。電源７６、７８は１つの電源に結合することができる。ソース８２からの電子ビームはビーム集束レンズを通過し、標本マウント８８上に配置された標本８６上に入射する。標本８４と相互作用した後、電子ビームは磁気レンズ９０を通り減速器−ＣＣＤ装置１０へ進む。構造７２のウィンドウ９２が可視的検査を可能とする。
【００２４】
このように、本発明は、良好な相互作用のために高電圧電子（例えば３００kV〜４００kV）を目標に入射させることと、良好なイメージクオリティのためにそれよりかなり低い電圧の電子（例えば１００kV）をシンチレータ／ＣＣＤに入射させることという競合する目的を実現可能とする。本発明は、利用可能な技術により実施することができる。電子顕微鏡とシンチレータ／ＣＣＤ要素は従来からあり、減速器は商業的に入手可能である。
【００２５】
本発明の視野から外れることなく、詳細に説明した実施形態の変更及び変形が実行可能であり、本発明の視野は添付の請求の範囲によってのみ制限される。
【図面の簡単な説明】
【図１】  加速電圧５０ｋＶ、１００ｋＶ及び３００ｋＶで光ファイバ上に配置した厚さ５０μｍのＹＡＧシンチレータ内における電子軌道のモンテカルロ計算である。
【図２】  電子減速器及びＣＣＤ配置の断面図である。
【図３】  本発明のＣＣＤカメラを有する電子顕微鏡の簡略図である。
【図１】
0004757383.tif 000002
【図２】
0004757383.tif 000003
【図３】
0004757383.tif 000004