(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ａ）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ神経細胞移動を負に調節する機能を有するタンパク質
【請求項２】
配列表の配列番号１に示される塩基配列若しくはその相補的配列又はこれらの配列を含む配列からなるＤＮＡ。
【請求項３】
以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ａ）配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ神経細胞移動を負に調節する機能を有するタンパク質
【請求項４】
配列表の配列番号３に示される塩基配列若しくはその相補的配列を含む配列からなるＤＮＡ。
【請求項５】
配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
【請求項６】
配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ神経細胞移動を負に調節する機能を有するタンパク質。
【請求項７】
配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
【請求項８】
配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ神経細胞移動を負に調節する機能を有するタンパク質。
【請求項９】
神経細胞移動を負に調節する機能が、フィラミン（Ｆｉｌａｍｉｎ）１の分解に起因することを特徴とする請求項６又は８記載のタンパク質。
【請求項１０】
請求項５〜９のいずれか記載のタンパク質と、マーカータンパク質及び／又はペプチドタグとを結合させた融合タンパク質又は融合ペプチド。
【請求項１１】
請求項５〜９のいずれか記載のタンパク質に特異的に結合する抗体。
【請求項１２】
抗体がモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体であることを特徴とする請求項１１記載の抗体。
【請求項１３】
請求項５〜９のいずれか記載のタンパク質を発現することができる発現系を含んでなる宿主細胞。
【請求項１４】
請求項５〜９のいずれか記載のタンパク質をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物。
【請求項１５】
請求項５〜９のいずれか記載のタンパク質を過剰発現する非ヒト動物。
【請求項１６】
非ヒト動物が、マウス又はラットである請求項１４又は１５記載の非ヒト動物。
【請求項１７】
以下の（i）〜（vi）のいずれかのタンパク質と、被検物質とを用いることを特徴とする神経細胞移動を負に調節する機能を促進又は抑制する物質のスクリーニング方法。
（i）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ii）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ神経細胞移動を負に調節する機能を有するタンパク質
（iii）配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（iv）配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ神経細胞移動を負に調節する機能を有するタンパク質
（v）配列表の配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（vi）配列表の配列番号６に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ神経細胞移動を負に調節する機能を有するタンパク質
【請求項１８】
以下の（i）〜（vi）のいずれかのタンパク質を発現している細胞と、被検物質とを用いることを特徴とする神経細胞移動を負に調節する機能を促進又は抑制する物質、あるいは以下の（i）〜（vi）のいずれかのタンパク質の発現促進若しくは抑制物質のスクリーニング方法。
（i）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ii）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ神経細胞移動を負に調節する機能を有するタンパク質
（iii）配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（iv）配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ神経細胞移動を負に調節する機能を有するタンパク質
（v）配列表の配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（vi）配列表の配列番号６に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ神経細胞移動を負に調節する機能を有するタンパク質
【請求項１９】
以下の（i）〜（vi）のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損しているか、又は、以下の（i）〜（vi）のいずれかのタンパク質を過剰発現する非ヒト動物と、被検物質とを用いることを特徴とする神経細胞移動を負に調節する機能を促進又は抑制する物質のスクリーニング方法。
（i）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ii）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ神経細胞移動を負に調節する機能を有するタンパク質
（iii）配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（iv）配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ神経細胞移動を負に調節する機能を有するタンパク質
（v）配列表の配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（vi）配列表の配列番号６に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ神経細胞移動を負に調節する機能を有するタンパク質
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は、神経細胞等の細胞移動調節機能及び細胞死調節機能を有するタンパク質及びそれをコードするＤＮＡ、並びにかかるタンパク質等を用いた、細胞移動及び／又は細胞死の制御や、細胞移動調節及び／又は細胞死調節機能を促進又は抑制する物質等のスクリーニング方法などに関する。
【０００２】
背景技術
ヒトの脳には千億を超える神経細胞（ニューロン）が存在し、複雑な神経回路を形成している。神経細胞は、発生が進むと決められた位置に決められた数だけ形成される。かかる神経細胞は、他の体細胞には見られない非常に複雑な形状を有し、核をもつ原形質部分である細胞体からは、樹状突起と軸索突起という２種類の突起が伸びている。樹枝状に伸びる樹状突起はスパイン（ｓｐｉｎｅ）と呼ばれる無数の棘構造を有し、他の細胞からの情報を受け取る機能をもつシナプス後部を形成している。この神経細胞特異的形態は、神経特異的なアクチン結合タンパクにより決定されることが知られている。
【０００３】
一方、脳は無意識レベルの作用の制御を行うだけでなく、感情や記憶、学習、創造といったいわゆる高次機能をも制御している重要な器官であるが、どのようにして脳の領域が決定され、各領域に特異的な脳の分化が起きるのかは未だ解明されていない。脳組織の構築には神経細胞の移動が必須であり、例えば大脳皮質であれば脳室帯にある神経幹細胞（放射状グリア）が分裂し、分裂の際に受け継いだ放射状突起を頼りに放射方向へ移動すること（ｒａｄｉａｌ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）により層構造が形成される。このような神経細胞の移動にはＰＳ−ＮＣＡＭやｓｌｉｔなどの分子が関与していると指摘されているが、まだほとんど明らかにされていない。
【０００４】
上記のように有糸核分裂後の神経細胞の放射状移動（ｒａｄｉａｌ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）は、新皮質形成にとって重要である（Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．１４５，６１−８３，１９７２、Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．４，１４３−１５０，２００１、Ｎａｔｕｒｅ ４０９，７１４−７２０，２００１）。脳室帯で形成された神経細胞は、その目的地に正しく到達するまでに重要な判断を少なくとも２つ、すなわちいつ移動を開始するか、またいつ移動を停止するかという判断を下さなければならない。移動停止は、Ｒｅｅｌｉｎによって調節されていると考えられているが（Ｎａｔｕｒｅ ３７４，７１９−７２３，１９９５、Ｎａｔｕｒｅ ３８９，７３０−７３３，１９９７、Ｎａｔｕｒｅ ３８９，７３３−７３７，１９９７、Ｎｅｕｒｏｎ ２４，４７１−４７９，１９９９、Ｎｅｕｒｏｎ ２４，４８１−４８９，１９９９、Ｃｅｌｌ ９９，６３５−６４７，１９９９、Ｃｅｌｌ ９７，６８９−７０１，１９９９、Ｎｅｕｒｏｎ ２７，３３−４４，２０００）、移動開始を調節に関与する分子についてはほとんど解明されていない。唯一、アクチン結合タンパク質フィラミン１が、ヒトの神経細胞移動障害、すなわち脳室表面を覆う多くの神経細胞によるｐｅｒｉｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｎｏｄｕｌａｒ ｈｅｔｅｒｏｔｏｐｉａ（異所性脳室周囲結節状疾患）を引き起こすということが報告されているに過ぎなかった（Ｎｅｕｒｏｎ１６，７７−８７，１９９６、Ｎｅｕｒｏｎ ２１，１３１５−１３２５，１９９８）。
【０００５】
本発明の課題は、神経細胞等の細胞移動調節機能及び細胞死調節機能を有するタンパク質及びかかるタンパク質をコードするＤＮＡに関し、特にアクチン結合タンパク質と相互作用し、かかるアクチン結合タンパク質の分解を促進することにより、神経細胞等の細胞移動能及び細胞死を調節するタンパク質及びそれらをコードするＤＮＡ等を用いた、細胞移動及び／又は細胞死の制御や、細胞移動調節及び／又は細胞死調節機能を促進又は抑制する物質等のスクリーニング方法などを提供することにある。
【０００６】
大脳皮質構築時の神経細胞移動に関わる分子メカニズムの解明には層構造に異常を有する大脳皮質の解析が有力な手がかりを提供すると考えられており、例えば、リーラーマウスの研究から細胞移動を停止させる分子機構の解明は急速に進んでいる。同様に、移動できない神経細胞が神経上皮層に留まったままになるｐｅｒｉｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｎｏｄｕｌａｒ ｈｅｔｅｒｏｔｏｐｉａは神経細胞が移動を開始・維持するメカニズムを解く糸口と考えられ、アクチン結合タンパク質フィラミン１の異常が原因であることが判明している（なお、「フィラミン１」は「フィラミンＡ」と呼ばれることがあるが、本件発明においては、「フィラミン１」と表示する。）。
【０００７】
一方、本発明者らは、ラット発生期大脳皮質由来の細胞骨格関連新規タンパク質ＦＩＬＩＰ（Ｆｉｌａｍｉｎ−ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）について報告しており、かかるＦＩＬＩＰ（Ｓ−ＦＩＬＩＰ）分子は全長９６５アミノ酸残基からなると予測され、そのＮ末端側半分がロイシンジッパーモチーフを含むコイルド−コイル（ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌ）構造をとることを明らかにした。また、酵母ツーハイブリッド法や免疫沈降法によってＦＩＬＩＰ分子のＣ末端側半分がアクチン結合タンパク質であるフィラミン１と結合することを明らかにしている。フィラミン１は大脳皮質形成期における細胞移動に必須の分子であり、フィラミン１遺伝子の変異は大脳皮質神経細胞の移動障害を特徴とするｐｅｒｉｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｎｏｄｕｌａｒ ｈｅｔｅｒｏｔｏｐｉａの原因となることが知られている。このことから、形成中の大脳皮質においてＦＩＬＩＰ（Ｓ−ＦＩＬＩＰ）がフィラミン１と会合してそれらの機能を制御することにより細胞移動を調節する可能性が考えられた。この仮説を検証するため、培養細胞にＦＩＬＩＰを発現させ細胞移動の様子を時間を追って観察した。その結果、ＦＩＬＩＰ発現細胞の移動は対照に比べて制御されており、ＦＩＬＩＰ（Ｓ−ＦＩＬＩＰ）が細胞移動の負の調節因子であることが示唆された。
【０００８】
その後、本発明者らは鋭意研究した結果、ＦＩＬＩＰｓ（Ｌ−ＦＩＬＩＰ及びＳ−ＦＩＬＩＰ）を同定し、かかるＦＩＬＩＰｓが細胞移動能や細胞死をコントロールする機能を有することを見い出し、本発明を完成した。すなわちＦＩＬＩＰ分子（９６５アミノ酸残基；Ｓ−ＦＩＬＩＰ；ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｄ８７２５７）（配列表の配列番号３及び４）と、そのＮ末端側に２４７残基を加えた１２１２残基のＬ−ＦＩＬＩＰ（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＡＢ０５５７５９）（配列表の配列番号１及び２）である。
【０００９】
更に、本発明者らは、研究を進めた結果、ヒトＤＮＡライブラリーから、マウスＬ−ＦＩＬＩＰのヒューマン オーソログに相当するヒトＦＩＬＩＰ分子（１２１３アミノ酸残基；ｈ−ＦＩＬＩＰ；ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＡＢ０８６０１１）（配列表の配列番号５及び６）を同定した。
【００１０】
そして、新規タンパク質Ｌ−ＦＩＬＩＰ又はＳ−ＦＩＬＩＰを細胞内に導入すると、これらの分子は細胞内において一部繊維状アクチンと共存し、さらに同細胞においては、繊維状アクチンの分解、短小化が起こり、細胞膜からの葉状仮足（ｌａｍｅｌｌｉｐｏｄｉａ）形成率が低下し、細胞の移動度を有意に低下することを見い出した。さらに、新規分子であるＬ−ＦＩＬＩＰはＳ−ＦＩＬＩＰに比べて大脳皮質神経上皮におけるタンパク質発現量が多いだけでなく、培養細胞を用いた検討の結果フィラミン１分解促進作用もより顕著であることを見い出した。これらのことから、大脳皮質神経上皮においてフィラミン１の分解を促進することにより細胞移動を負に調節する役割はＳ−ＦＩＬＩＰよりも主としてＬ−ＦＩＬＩＰが担っていることが明らかとなった。
【００１１】
Ｓ−ＦＩＬＩＰ又はＬ−ＦＩＬＩＰと、フィラミン１とを同一細胞内に発現させ、フィラミン１の変化を観察したところ、上記と同様にＦＩＬＩＰの発現によりフィラミンの分解が促進される様子が観察された。かかる変化もＬ−ＦＩＬＩＰにおいて顕著であった。また、正常ラットの胎生期の脳においてフィラミン１の発現を検討したところ、フィラミン１の遺伝子発現は観察されるものの、ＦＩＬＩＰの遺伝子発現が観察され皮質板への細胞移動がいまだ起こっていない脳室帯に存在する細胞において、フィラミン１タンパク質の発現量が大きく低下している細胞が多く観察された。他方、新規分子Ｌ−ＦＩＬＩＰを導入した培養細胞において、かかる細胞数の減少が確認され、ＦＩＬＩＰｓが細胞死の調節にも関与していることを明らかにした。本発明は、以上のような知見に基づき完成するに至ったものである。
【００１２】
発明の開示
すなわち本発明は、（１）以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードするＤＮＡ:（ａ）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（ｂ）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ神経細胞移動を負に調節する機能を有するタンパク質や、（２）配列表の配列番号１に示される塩基配列若しくはその相補的配列又はこれらの配列を含む配列からなるＤＮＡや、（３）以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードするＤＮＡ：（ａ）配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（ｂ）配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ神経細胞移動を負に調節する機能を有するタンパク質や、（４）配列表の配列番号３に示される塩基配列若しくはその相補的配列を含む配列からなるＤＮＡや、（５）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質や、（６）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ神経細胞移動を負に調節する機能を有するタンパク質や、（７）配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質や、（８）配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ神経細胞移動を負に調節する機能を有するタンパク質や、（９）神経細胞移動を負に調節する機能が、フィラミン（Ｆｉｌａｍｉｎ）１の分解に起因することを特徴とする(６)又は(８)記載のタンパク質に関する。
【００１３】
また本発明は、（１０）上記（５）〜（９）のいずれか記載のタンパク質と、マーカータンパク質及び／又はペプチドタグとを結合させた融合タンパク質又は融合ペプチドや、（１１）上記（５）〜（９）のいずれか記載のタンパク質に特異的に結合する抗体や、（１２）抗体がモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体であることを特徴とする上記（１１）記載の抗体に関する。
【００１４】
さらに本発明は、（１３）上記（５）〜（９）のいずれか記載のタンパク質を発現することができる発現系を含んでなる宿主細胞に関する。
【００１５】
また本発明は、（１４）上記（５）〜（９）のいずれか記載のタンパク質をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物や、（１５）上記（５）〜（９）のいずれか記載のタンパク質を過剰発現する非ヒト動物や、（１６）非ヒト動物が、マウス又はラットである上記（１４）又は（１５）記載の非ヒト動物に関する。
【００１６】
さらに本発明は、（１７）以下の（i）〜（vi）のいずれかのタンパク質と、被検物質とを用いることを特徴とする神経細胞移動を負に調節する機能を促進又は抑制する物質のスクリーニング方法：（i）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（ii）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ神経細胞移動を負に調節する機能を有するタンパク質（iii）配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（iv）配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ神経細胞移動を負に調節する機能を有するタンパク質（v）配列表の配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（vi）配列表の配列番号６に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ神経細胞移動を負に調節する機能を有するタンパク質や、（１８）以下の（i）〜（vi）のいずれかのタンパク質を発現している細胞と、被検物質とを用いることを特徴とする神経細胞移動を負に調節する機能を促進又は抑制する物質、あるいは以下の（i）〜（vi）のいずれかのタンパク質の発現促進若しくは抑制物質のスクリーニング方法：（i）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（ii）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ神経細胞移動を負に調節する機能を有するタンパク質（iii）配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（iv）配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ神経細胞移動を負に調節する機能を有するタンパク質（v）配列表の配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（vi）配列表の配列番号６に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ神経細胞移動を負に調節する機能を有するタンパク質や、（１９）以下の（i）〜（vi）のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損しているか、又は、以下の（i）〜（vi）のいずれかのタンパク質を過剰発現する非ヒト動物と、被検物質とを用いることを特徴とする神経細胞移動を負に調節する機能を促進又は抑制する物質のスクリーニング方法：（i）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（ii）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ神経細胞移動を負に調節する機能を有するタンパク質（iii）配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（iv）配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ神経細胞移動を負に調節する機能を有するタンパク質（v）配列表の配列番号６に示されるアミノ��配列からなるタンパク質（vi）配列表の配列番号６に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ神経細胞移動を負に調節する機能を有するタンパク質に関する。
【００１７】
発明を実施するための最良の形態
本発明のタンパク質としては、配列番号２で示されるＬ−ＦＩＬＩＰや、配列番号４で示されるＳ−ＦＩＬＩＰや、配列番号２又は４で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ細胞移動調節及び細胞死調節機能を有するタンパク質等を挙げることができる。上記細胞移動調節及び細胞死調節機能とは、細胞移動能を制御したり、細胞死を制御する機能をいう。なお、本件タンパク質はそのＤＮＡ配列情報等に基づき公知の方法で調製することができ、その由来は特に制限されるものではない。また、本発明の対象となるペプチドとしては、本発明のタンパク質の一部からなり、細胞移動調節及び細胞死調節機能を有するものであればどのようなものでもよい。上記本発明の対象となるタンパク質及びペプチド、並びにこれらタンパク質及びペプチドに特異的に結合する抗体が特異的に結合する組換えタンパク質及びペプチドを総称して、以下「本件タンパク質・ペプチド」ということがある。なお、本件タンパク質・ペプチドはそのＤＮＡ配列情報等に基づき公知の方法で調製することができ、かかるタンパク質の由来はラットに限定されるものではない。
【００１８】
本発明の対象となるＤＮＡとしては、上記本件タンパク質をコードするものであればどのようなものでもよく、例えば、配列番号２に示されるＬ−ＦＩＬＩＰをコードするＤＮＡや、配列番号４で示されるＳ−ＦＩＬＩＰや、配列番号２又は４で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ細胞移動調節及び細胞死調節機能を有するタンパク質等をコードするＤＮＡや、配列番号１又は３に示される塩基配列又はその相補的配列並びにこれらの配列の一部又は全部を含む配列からなるＤＮＡを具体的に挙げることができる。これらはそのＤＮＡ配列情報等に基づき、例えばヒト、マウス、ラット、ウサギ等の遺伝子ライブラリーやｃＤＮＡライブラリーなどから公知の方法により調製することができる。
【００１９】
また、配列番号１又は３に示される塩基配列又はその相補的配列並びにこれらの配列の一部又は全部を含む配列からなるＤＮＡをプローブとして、各種ＤＮＡライブラリーに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションを行ない、該プローブにハイブリダイズするＤＮＡを単離することにより、新規の細胞移動調節及び細胞死調節機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡを得ることもできる。こうして得られるＤＮＡも本発明の範囲である。かかる本発明のＤＮＡを取得するためのハイブリダイゼーションの条件としては、例えば、４２℃でのハイブリダイゼーション、及び１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳを含む緩衝液による４２℃での洗浄処理を挙げることができ、６５℃でのハイブリダイゼーション、及び０．１×ＳＳＣ，０．１％のＳＤＳを含む緩衝液による６５℃での洗浄処理をより好ましく挙げることができる。なお、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を与える要素としては、上記温度条件以外に種々の要素があり、当業者であれば、種々の要素を適宜組み合わせて、上記例示したハイブリダイゼーションのストリンジェンシーと同等のストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００２０】
本発明の融合タンパク質や融合ペプチドとしては、本件タンパク質・ペプチドとマーカータンパク質及び／又はペプチドタグとが結合しているものであればどのようなものでもよく、マーカータンパク質としては、従来知られているマーカータンパク質であれば特に制限されるものではなく、例えば、アルカリフォスファターゼ、抗体のＦｃ領域、ＨＲＰ、ＧＦＰなどを具体的に挙げることができ、また本発明におけるペプチドタグとしては、ＨＡタグ、Ｍｙｃタグ、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、ＧＳＴタグなどの従来知られているペプチドタグを具体的に例示することができる。かかる融合タンパク質は、常法により作製することができ、Ｎｉ−ＮＴＡとＨｉｓタグの親和性を利用した細胞移動調節及び細胞死調節機能を有するタンパク質等の精製や、細胞移動調節及び細胞死調節機能を有するタンパク質の検出や、細胞移動調節及び細胞死調節機能を有するタンパク質等に対する抗体の定量、癌・腫瘍の転移抑制剤又は移植治療用細胞移動調節剤などとして、また当該分野の研究用試薬としても有用である。
【００２１】
本発明の前記タンパク質やペプチドに特異的に結合する抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体等の免疫特異的な抗体を具体的に挙げることができ、これらは上記本件タンパク質・ペプチド、融合タンパク質や融合ペプチド等の全部又は一部を抗原として用いて常法により作製することができるが、その中でもモノクローナル抗体がその特異性の点でより好ましい。かかるモノクローナル抗体等の抗体は、例えば、癌・腫瘍の転移抑制剤又は移植治療用細胞移動調節剤等ばかりでなく、癌・腫瘍の転移、神経細胞等の細胞移動などの機構を明らかにする上で有用である。
【００２２】
上記の本発明の抗体は、慣用のプロトコールを用いて、動物（好ましくはヒト以外）に本件タンパク質・ペプチド若しくはエピトープを含むその断片、又は該タンパク質を膜表面に発現した細胞を投与することにより産生され、例えばモノクローナル抗体の調製には、連続細胞系の培養物により産生される抗体をもたらす、ハイブリドーマ法（Ｎａｔｕｒｅ ２５６，４９５−４９７，１９７５）、トリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ４，７２，１９８３）及びＥＢＶ−ハイブリドーマ法（ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ ＡＮＤ ＣＡＮＣＥＲ ＴＨＥＲＡＰＹ，ｐｐ．７７−９６，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８５）など任意の方法を用いることができる。
【００２３】
本発明の上記本件タンパク質・ペプチドに対する一本鎖抗体をつくるために、一本鎖抗体の調製法（米国特許第４，９４６，７７８号）を適用することができる。また、ヒト化抗体を発現させるために、トランスジェニックマウス又は他の哺乳動物等を利用したり、上記抗体を用いて、本件タンパク質・ペプチドを発現するクローンを単離・同定したり、アフィニティークロマトグラフィーでそのポリペプチドを精製することもできる。本件タンパク質・ペプチドに対する抗体は、前記のように癌・腫瘍の転移抑制剤又は移植治療用細胞移動調節剤や、癌・腫瘍の転移、神経細胞等の細胞移動などの機構を明らかにする上で有用であるに使用できる可能性がある。そして、これら抗体が特異的に結合する組換えタンパク質又はペプチドも、前記のように本発明の本件タンパク質・ペプチドに包含される。
また前記モノクローナル抗体等の抗体に、例えば、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソシアネート）又はテトラメチルローダミンイソシアネート等の蛍光物質や、１２５Ｉ、３２Ｐ、１４Ｃ、３５Ｓ又は３Ｈ等のラジオアイソトープや、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ又はフィコエリトリン等の酵素で標識したものや、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等の蛍光発光タンパク質などを融合させた融合タンパク質を用いることによって、本件タンパク質・ペプチドの機能解析を行うことができる。また本件発明の抗体を用いる免疫学的測定方法としては、ＲＩＡ法、ＥＬＩＳＡ法、蛍光抗体法、プラーク法、スポット法、血球凝集反応法、オクタロニー法等の方法を挙げることができる。
【００２４】
本発明はまた、上記本件タンパク質・ペプチドを発現することができる発現系を含んでなる宿主細胞に関する。かかる本件タンパク質・ペプチドをコードする遺伝子の宿主細胞への導入は、Ｄａｖｉｓら（ＢＡＳＩＣ ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，１９８６）及びＳａｍｂｒｏｏｋら（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）などの多くの標準的な実験室マニュアルに記載される方法、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、トランスベクション（ｔｒａｎｓｖｅｃｔｉｏｎ）、マイクロインジェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープローディング（ｓｃｒａｐｅ ｌｏａｄｉｎｇ）、弾丸導入（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）、感染等により行うことができる。そして、宿主細胞としては、大腸菌、ストレプトミセス、枯草菌、ストレプトコッカス、スタフィロコッカス等の細菌原核細胞や、酵母、アスペルギルス等の真菌細胞や、ドロソフィラＳ２、スポドプテラＳｆ９等の昆虫細胞や、Ｌ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｃ１２７細胞、ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞（ジヒドロ葉酸レダクターゼやチミジンキナーゼなどを欠損した変異株を含む）、ＢＨＫ２１細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ｂｏｗｅｓ悪性黒色腫細胞等の動物細胞や、植物細胞等を挙げることができる。
【００２５】
また、発現系としては、上記本件タンパク質・ペプチドを宿主細胞内で発現させることができる発現系であればどのようなものでもよく、染色体、エピソーム、哺乳動物及びウイルスに由来する発現系、例えば、細菌プラスミド由来、酵母プラスミド由来、ＳＶ４０のようなパポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、レトロウイルス由来のベクター、バクテリオファージ由来、トランスポゾン由来及びこれらの組合せに由来するベクター、例えば、コスミドやファージミドのようなプラスミドとバクテリオファージの遺伝的要素に由来するものを挙げることができる。この発現系は発現を起こさせるだけでなく発現を調節する制御配列を含んでいてもよい。
【００２６】
上記発現系を含んでなる宿主細胞やかかる細胞の細胞膜、またかかる細胞を培養して得られる本件タンパク質・ペプチドは、後述するように本発明のスクリーニング方法に用いることができる。例えば、細胞膜を得る方法としては、Ｆ．Ｐｉｅｔｒｉ−Ｒｏｕｘｅｌ（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２４７，１１７４−１１７９，１９９７）らの方法などを用いることができる。また、かかる本件タンパク質・ペプチドを細胞培養物から回収し精製するには、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含めた公知の方法、好ましくは、高速液体クロマトグラフィーが用いられる。特に、アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、例えば、本件タンパク質・ペプチドに対する抗体を結合させたカラムや、上記本件タンパク質・ペプチドに通常のペプチドタグを付加した場合は、このペプチドタグに親和性のある物質を結合したカラムを用いることにより、本件タンパク質・ペプチドを得ることができる。上記本件タンパク質・ペプチドの精製方法は、ペプチド合成の際にも適用することができる。
【００２７】
本発明において、上記本件タンパク質・ペプチドをコードする遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物とは、染色体上の本件タンパク質・ペプチドをコードする遺伝子の一部若しくは全部が破壊・欠損・置換等の遺伝子変異により不活性化され、本件タンパク質・ペプチドを発現する機能を失なった非ヒト動物をいい、また、本件タンパク質・ペプチドを過剰発現する非ヒト動物としては、野生型非ヒト動物に比べてかかる本件タンパク質・ペプチドを大量に産生する非ヒト動物を具体的に提示することができる。そして、本発明における非ヒト動物としては、マウス、ラット等の齧歯目動物などの非ヒト動物を具体的に挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【００２８】
ところで、メンデルの法則に従い出生してくるホモ接合体非ヒト動物には、本件タンパク質・ペプチド欠損型又は過剰発現型とその同腹の野生型とが含まれ、これらホモ接合体非ヒト動物における欠損型又は過剰発現型とその同腹の野生型を同時に用いることによって個体レベルで正確な比較実験をすることができることから、野生型の非ヒト動物、すなわち本件タンパク質・ペプチドをコードする遺伝子機能が染色体上で欠損又は過剰発現する非ヒト動物と同種の動物、さらには同腹の動物を、例えば下記に記載する本発明のスクリーニングに際して併用することが好ましい。かかる本件タンパク質・ペプチドをコードする遺伝子機能が染色体上で欠損又は過剰発現する非ヒト動物の作製方法を、Ｌ−ＦＩＬＩＰノックアウトマウスやＬ−ＦＩＬＩＰトランスジェニックマウスを例にとって以下説明する。
【００２９】
例えば、Ｌ−ＦＩＬＩＰタンパク質をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損したマウス、すなわちＬ−ＦＩＬＩＰノックアウトマウスは、マウス遺伝子ライブラリーからＰＣＲ等の方法により得られた遺伝子断片を用いて、ラットＬ−ＦＩＬＩＰと相同性を有するマウスＬ−ＦＩＬＩＰをコードする遺伝子をスクリーニングし、スクリーニングされたマウスＬ−ＦＩＬＩＰをコードする遺伝子をウイルスベクター等を用いてサブクローンし、ＤＮＡシーケンシングにより特定する。このクローンのマウスＬ−ＦＩＬＩＰをコードする遺伝子の全部又は一部をｐＭＣ１ネオ遺伝子カセット等に置換し、３′末端側にジフテリアトキシンＡフラグメント（ＤＴ−Ａ）遺伝子や単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子等の遺伝子を導入することによって、ターゲッティングベクターを作製する。
【００３０】
この作製されたターゲティングベクターを線状化し、エレクトロポレーション（電気穿孔）法等によってＥＳ細胞に導入し、相同的組換えを行い、その相同的組換え体の中から、Ｇ４１８やガンシクロビア（ＧＡＮＣ）等の抗生物質により相同的組換えを起こしたＥＳ細胞を選択する。また、この選択されたＥＳ細胞が目的とする組換え体かどうかをサザンブロット法等により確認することが好ましい。その確認されたＥＳ細胞のクローンをマウスの胚盤胞中にマイクロインジェクションし、かかる胚盤胞を仮親のマウスに戻し、キメラマウスを作製する。このキメラマウスを野生型のマウスとインタークロスさせると、ヘテロ接合体マウスを得ることができ、また、このヘテロ接合体マウスをインタークロスさせることによって、本発明のＬ−ＦＩＬＩＰノックアウトマウスを作製することができる。また、Ｌ−ＦＩＬＩＰノックアウトマウスにおいてＬ−ＦＩＬＩＰの発現能が欠失しているかどうかを確認する方法としては、例えば、上記の方法により得られたマウスからＲＮＡを単離してノーザンブロット法等により調べたり、またこのマウスにおけるＬ−ＦＩＬＩＰの発現をウエスタンブロット法等により直接調べる方法がある。
【００３１】
Ｌ−ＦＩＬＩＰのトランスジェニックマウスは、ヒト、マウス、ラット、ウサギ等に由来するＬ−ＦＩＬＩＰをコードするｃＤＮＡに、チキンβ−アクチン、マウスニューロフィラメント、ＳＶ４０等のプロモーター、及びラビットβ−グロビン、ＳＶ４０等のポリＡ又はイントロンを融合させて導入遺伝子を構築し、該導入遺伝子をマウス受精卵の前核にマイクロインジェクションし、得られた卵細胞を培養した後、仮親のマウスの輸卵管に移植し、その後被移植動物を飼育し、産まれた仔マウスから前記ｃＤＮＡを有する仔マウスを選択することにより、トランスジェニックマウスを創製することができる。また、ｃＤＮＡを有する仔マウスの選択は、マウスの尻尾等より粗ＤＮＡを抽出し、導入したＬ−ＦＩＬＩＰをコードする遺伝子をプローブとするドットハイブリダイゼーション法や、特異的プライマーを用いたＰＣＲ法等により行うことができる。
【００３２】
また、上記本件タンパク質・ペプチドをコードする遺伝子若しくはＤＮＡ、本件タンパク質・ペプチド、本件タンパク質・ペプチドとマーカータンパク質及び／又はペプチドタグとを結合させた融合タンパク質、本件タンパク質・ペプチドに対する抗体、本件タンパク質・ペプチドを発現することができる発現系を含んでなる宿主細胞等は、以下に具体的に説明するように、癌・腫瘍の転移抑制剤又は移植治療用細胞移動調節剤等に有用であり、細胞移動及び／又は細胞死の制御や、細胞移動調節及び／又は細胞死調節機能を促進又は抑制する物質のスクリーニングや、本件タンパク質・ペプチドの発現促進又は抑制物質のスクリーニング方法などに用いることができるばかりでなく、癌・腫瘍の転移、神経細胞等の細胞移動などのメカニズムの解明にも使用することができる。
【００３３】
本発明の細胞移動調節及び／又は細胞死調節機能を促進又は抑制する物質のスクリーニング方法としては、前記本発明の本件タンパク質・ペプチド又は本件タンパク質・ペプチドを発現している細胞膜と、被検物質とを用いる方法や、前記本件タンパク質・ペプチドを発現している細胞と、被検物質とを用いる方法や、本件タンパク質・ペプチドのノックアウトマウスやトランスジェニックマウス等の非ヒト動物と、被検物質とを用いる方法等を挙げることができる。また、前記本件タンパク質・ペプチドを発現している細胞と、被検物質とを用いる方法や、本件タンパク質・ペプチドのノックアウトマウスやトランスジェニックマウス等の非ヒト動物と、被検物質とを用いる方法等は本件タンパク質・ペプチドの発現促進又は抑制物質のスクリーニング方法に用いることができる。
【００３４】
上記本件タンパク質・ペプチド又は本件タンパク質・ペプチドを発現している細胞膜と被検物質とを用いるスクリーニング方法としては、本件タンパク質・ペプチド又は細胞膜表面に発現している本件タンパク質・ペプチドと、被検物質とを接触せしめ、該本件タンパク質・ペプチドの細胞移動調節及び細胞死調節機能を測定・評価する方法を具体的に挙げることができる。また、本件タンパク質・ペプチドを発現している細胞と、被検物質とを用いるスクリーニング方法としては、本件タンパク質・ペプチドを発現している細胞と被検物質とを接触せしめ、該本件タンパク質・ペプチドの細胞移動調節及び細胞死調節機能や本件タンパク質・ペプチドの発現量の変化を測定・評価する方法を具体的に挙げることができる。
【００３５】
前記本件タンパク質・ペプチドをコードする遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物又は本件タンパク質・ペプチドを過剰発現する非ヒト動物と、被検物質とを用いたスクリーニング方法としては、これら非ヒト動物から得られる細胞又は組織と、被検物質とをインビトロで接触せしめ、該本件タンパク質・ペプチドの細胞移動調節及び細胞死調節機能や本件タンパク質・ペプチドの発現量の変化を測定・評価する方法や、前記本件タンパク質・ペプチドをコードする遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物又は本件タンパク質・ペプチドを過剰発現する非ヒト動物にあらかじめ被検物質を投与した後、該非ヒト動物から得られる細胞又は組織における該本件タンパク質・ペプチドの細胞移動調節及び細胞死調節機能や本件タンパク質・ペプチドの発現量の変化を測定・評価する方法や、前記本件タンパク質・ペプチドをコードする遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物又は本件タンパク質・ペプチドを過剰発現する非ヒト動物にあらかじめ被検物質を投与した後、該非ヒト動物における該本件タンパク質・ペプチドの細胞移動調節及び細胞死調節機能や本件タンパク質・ペプチドの発現量の変化を測定・評価する方法などを具体的に挙げることができる。
【００３６】
また上記スクリーニング方法により得られる本発明の細胞移動調節及び細胞死調節機能促進物質や発現促進物質は、細胞移動調節及び細胞死調節機能の促進や本件タンパク質・ペプチドの発現の促進を必要としている患者の治療等に用いることができる。また、上記スクリーニング方法により得られる本発明の細胞移動調節及び細胞死調節機能抑制物質や発現抑制物質は、細胞移動調節及び細胞死調節機能の抑制や本件タンパク質・ペプチドの発現の抑制を必要としている患者の治療等に用いることができる。本発明の本件タンパク質・ペプチド又はこれに対する抗体は、癌・腫瘍の転移抑制剤、移植治療用細胞移動調節剤等の有効成分として用いることができ、また、ミサイル療法に用いることもできる。これらの治療薬は、経口的あるいは非経口的に投与することができる。経口投与剤としては散剤、顆粒剤、カプセル剤、錠剤などの固形製剤あるいはシロップ剤、エリキシル剤などの液状製剤とすることができる。また、非経口投与剤として注射剤、経皮製剤あるいは座薬等とすることができる。これらの製剤は活性成分に薬理学的、製剤学的に認容される助剤を加えることにより常法に従って製造することができる。助剤としては、例えば、経口剤および粘膜投与剤にあっては、軽質無水ケイ酸、澱粉、乳糖、結晶セルロース、乳糖カルシウム等の賦形剤、カルボキシメチルセルロース等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシム等の滑沢剤などの製剤用成分が、また注射剤にあっては、生理食塩水、マンニトール、プロピレングリコール等の溶解剤ないし溶解補助剤、界面活性剤などの懸濁化剤などの製剤用成分が、さらに外用剤にあっては、水性ないし油性の溶解剤ないし溶解補助剤、粘着剤などの製剤用成分が使用される。また、投与量は、対象疾患の種類、患者の年齢、性別、体重、症状、投与形態に応じて適宜決定することができる。
【００３７】
以下に、実施例を揚げてこの発明を更に具体的に説明するが、この発明の範囲はこれらの例示に限定されるものではない。なお、下記の実施例に使用したウイスターラット（Ｋｅａｒｉ社製；ＳＬＣ社製）は、一定の温度・湿度条件下で、餌及び水分を十分に与えて飼育したものを用いた。上記動物において膣栓が確立した日を胎生０日（Ｅ０）とし、出生日をＰ０（生後０日）とした。また、Ｐ０〜Ｐ７のラットにおいては低体温法により、Ｐ１４ラット又は妊娠中ラットを含む成熟ラットにおいては４０ｍｇ／ｋｇのペントバルビタールナトリウムを腹腔内に投与し麻酔を施した。
【００３８】
実施例１（ＦＩＬＩＰ ｃＤＮＡの単離及びＦＩＬＩＰの局在化）
アクチン結合タンパク質であるフィラミン（Ｆｉｌａｍｉｎ）１（ＡＢＰ−２８０）は、有糸核分裂後新皮質神経細胞を得るための放射状移動（ｒａｄｉａｌ ｍｉｇｒａｔｏｒｙ）機構において重要な要素であることが知られているが（Ｎｅｕｒｏｎ ２１，１３１５−１３２５，１９９８）、フィラミン１が中間帯から皮質板における新皮質の形成に関与する移動性の神経細胞及び移動後の神経細胞において発現していること（Ｎｅｕｒｏｎ ２１，１３１５−１３２５，１９９８）から、脳室帯からの移動開始は他の系により制御されているのではないかと考えた。そこで、神経細胞の移動開始の調節に関与する分子を解明するため、文献（Ｍｏｌ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．６２，１８７−１９５，１９９８）記載の方法に従って、ｍＲＮＡディファレンシャルディスプレイ、インサイチューハイブリダイゼーション組織化学、及びラットｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングを行った。先ず、ｍＲＮＡディファレンシャルディスプレイにより、胎生１８〜２０日（Ｅ１８−２０）のウイスターラット（Ｗｉｓｔａｒ ｒａｔｓ）に比べ、胎生１１〜１２日（Ｅ１１−１２）のウイスターラットの新皮質において高発現を示した遺伝子を単離した。有糸核分裂後の神経細胞は、Ｅ１２のウイスターラットでは脳室帯から脳軟膜表面に向けて移動する段階であったが、Ｅ１８−２０頃までには上記神経細胞のほとんどは脳室を出て神経発生が完了していた。上記の結果得られた、Ｅ１２においては顕著に発現し、Ｅ１８−２０においてはあまり発現していなかった２００個の遺伝子フラグメントの配列を決定し、重複配列を除外した結果、８０個の独立クローンを得た。
【００３９】
次にプローブとしてラットＳ−ＦＩＬＩＰ全長の一部（１６５ヌクレオチド；１２８９〜１４５３番目までの塩基配列）を用いたインサイチューハイブリダイゼーション組織化学法により、さらなる選択を行った。その結果、８０個の独立クローンの中から皮質の脳室帯において発現を示した新規クローンを１個単離し、ｆｉｌｉｐ（Ｆｉｌａｍｉｎ−ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）と命名した。かかるＦＩＬＩＰ（Ｓ−ＦＩＬＩＰ）遺伝子の発現を調べるために、Ｅ１２及びＥ１８ラットを矢状断切片を用いてインサイチューハイブリダイゼーションを行った。結果を図１ａ示す。このことから、Ｅ１２の中枢神経系における大脳皮質（ｃｘ）及び上丘（ｓｃ）の脳室帯においてポジティブシグナルが確認できた（図１ａ左）。しかし、Ｅ１８における脳室帯ではシグナルがあまり確認できなかったが、心臓、大動脈、消化管、及び横隔膜においてシグナルが豊富にみられ、ｆｉｌｉｐ遺伝子が心筋、骨格筋、及び平滑筋において発現することがわかった（図１ａ右）。なお、図１ａ中のスケールバーは１ｍｍを表す。
【００４０】
Ｅ１１のウイスターラット前頭葉由来のｃＤＮＡライブラリーを構築し、上記インサイチューハイブリダイゼーションセレクションにおいて用いたプローブと、Ｍａｒａｔｈｏｎ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）を使用してＦＩＬＩＰをスクリーニングした。また、データベース（ＤＤＢＪ）による遺伝情報を一部利用し、ＦＩＬＩＰ ｃＤＮＡを単離した。その結果、上記プローブを認識する領域を含み、５′末端が異なる２つの完全長ＦＩＬＩＰ ｃＤＮＡが得られた。かかる２つのｃＤＮＡ情報からアミノ酸配列をそれぞれ決定し、その構造を図１ｂに示す。その結果、Ｓ−ＦＩＬＩＰ（ｓｈｏｒｔ ｆｏｒｍ ＦＩＬＩＰ；ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｄ８７２５７）はＬ−ＦＩＬＩＰ（ｌｏｍｇ ｆｏｒｍ ＦＩＬＩＰ；ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＡＢ０５５７５９）のＮ末端２４７残基が欠失していたが、それ以外の構造は一致することが確認できた。また、疎水性プロフィールにより上記２つのタンパク質はシグナル配列も膜貫通領域も有していないことから、細胞内タンパク質であることがわかった。しかし、Ｓ−ＦＬＩＰのＣ末端半分において４つのロイシンジッパーモチーフ及びコイルド−コイル領域が確認できたが（図１ｃ）、かかる領域のアミノ酸配列は現在までに報告されているタンパク質のいずれとも類似性を示さないことがわかった（図１ｂ、ｃ）。
【００４１】
次にＳ−ＦＩＬＩＰ（ｆｉｂｅｒ−ｌｉｋｅ；図１ｄ上）及びＬ−ＦＩＬＩＰ（ｐｕｎｃｔａｔｅ；図１ｄ下）の細胞局在を調べるため、ＦＩＬＩＰのＣ末端にグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）が結合されたＦＩＬＩＰｓ−ＧＦＰを含む哺乳類動物由来の発現ベクター［ｐＥＧＦＰ−Ｎ１（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）、ｐＣＡＧＧＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）又はｐＢｕｄＣＥ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）］を、５％ＣＯ２条件下の１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ：Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ ｍｅｄｉｕｍ）において３７℃で保持したＣＯＳ−７細胞に、トランスフェクションし、ＦＩＬＩＰｓ−ＧＦＰを発現させ、ｄｉｇｉｔａｌ ｃｏｏｌｅｄ ＣＣＤカメラ（Ｈａｍａｍａｔｓｕ Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ社製）を備えたＯＬＹＭＰＵＳ ＩＸ−７０顕微鏡により画像解析を行った（図１ｄのＧＦＰ）。
【００４２】
また、上記ＦＩＬＩＰｓはＦ−アクチンと共存するのかどうかを調べるために、上記ＣＯＳ−７細胞を４％のパラホルムアルデヒド／０．１Ｍのリン酸塩緩衝液（ＰＢ）（ｐＨ７．４）で１０分間固定し、０．１％のトリトンＸ−１００／リン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で３分間浸透処理した後、ローダミン−ファロイジン（１：４０；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社製）によりＦ−アクチンを染色し（図１ｄのｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ）、Ｓ−ＦＩＬＩＰ又はＬ−ＦＩＬＩＰと、Ｆ−アクチンとの共存を調べてみた（図１ｄのｍｅｒｇｅｄ）。その結果を図１ｄに示す。なお、図１ｄ中のスケールバーは１０μｍを表す。このことから、ＧＦＰが結合されたＳ−ＦＩＬＩＰは、一般的にアクチンフィラメントの末端部を除き、アクチンストレスフィラメントに沿って局在しており、Ｆ−アクチンとの共在が考えられた。一方、Ｌ−ＦＩＬＩＰは細胞質において斑点状に分布しており、Ｆ−アクチンの局在とは異なっていた。
【００４３】
また、上記ＧＦＰが結合したＳ−ＦＩＬＩＰ（図１ｅ）又はＬ−ＦＩＬＩＰ（図１ｆ）を発現する細胞をランダムにそれぞれ５０個抽出し、ＦＩＬＩＰｓ−ＧＦＰの各発現分布パターンにおける細胞数を計測した。なお、かかる計測は４回行い、得られた結果を平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍとして求めた。この結果から、各局在パターンはＦＩＬＩＰ分子の種類に大きく依存していることがわかった。次に、既知のアクチン結合ドメイン（Ｓ−ＦＩＬＩＰのＮ末端領域）を含まない領域においてもＦ−アクチンと共存するかどうかについて調べてみた。Ｓ−ＦＩＬＩＰ△Ｃ−ＧＦＰ（ＧＦＰが結合したＣ末端欠損Ｓ−ＦＩＬＩＰ）、ＦＩＬＩＰ△Ｎ（ＧＦＰが結合したＮ末端欠損ＦＩＬＩＰ）、又はＧＦＰのみを上記と同様にＣＯＳ７細胞において発現させた結果（図１ｇ）、既知のアクチン結合ドメインが存在しないにも関わらず、Ｓ−ＦＩＬＩＰはＦ−アクチンと共存することがわかった（図１ｇ中央）。このことから、Ｓ−ＦＩＬＩＰ及びＬ−ＦＩＬＩＰに共通するＣ末端半分（ＦＩＬＩＰ△Ｎ）は、Ｆ−アクチンとの共在に必要十分であることが明らかとなった。一方Ｌ−ＦＩＬＩＰはＦ−アクチンとほとんど共在していなかったが、大部分の細胞の細胞質において斑点状に分布していた。さらに、Ｌ−ＦＩＬＩＰを発現させるＣＯＳ−７細胞においてはアクチンストレスフィラメントはほとんど確認できなかった。なお、図１ｇ中のスケールバーは２０μｍを示す。
【００４４】
実施例２（ＦＩＬＩＰｓとアクチン結合タンパク質フィラミン１との相互作用）
Ｆ−アクチンと関連するＳ−ＦＩＬＩＰ独特の局在性をさらに考察し、両分子を結びつける因子を解明するために、Ｓ−ＦＩＬＩＰのＣ末端半分（ｂａｉｔ）及びマウスＥ１１の全胚ライブラリー（ｐｒｅｙ）を用い、酵母ツーハイブリッドスクリーニングを行った。なお、ツーハイブリッドスクリーニングは、Ｍａｔｃｈｍａｋｅｒ Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ ｓｙｓｔｅｍ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）を使用し、ＦＩＬＩＰｓの共通Ｃ末端領域（Ｓ−ＦＩＬＩＰの想定アミノ酸配列の５０８〜９６５残基）をコードするｃＤＮＡを含むｐＡＳ２−１プラスミドベクターにより形質転換した酵母株ＰＪ６９−２Ａに、あらかじめＭａｔｃｈｍａｋｅｒライブラリー（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）に組み込んだＥ１１マウス脳由来の全胚ライブラリーを形質転換し、Ｓ−ＦＩＬＩＰのＣ末端半分とマウスＥ１１の全胚ライブラリーとをかけ合わせた。その結果、８×１０６を超えるクローンをスクリーニングし、３つの選択マーカーにより１７個のクローンを選択した。これらのクローンから、アクチンフィラメントに相互作用するタンパク質であり、等方性にＦ−アクチンと相互作用し、直交に配列し、また、Ｆ−アクチンネットワークの粘性及び剛性を増加させるフィラミン１をコードするクローンを同定した。
【００４５】
次に、Ｌ−ＦＩＬＩＰ−ＧＦＰ、Ｓ−ＦＩＬＩＰ−ＧＦＰ、ＧＦＰでタグされたＳ−ＦＩＬＩＰのＮ末端半分にＧＦＰが結合した融合タンパク質（Ｓ−ＦＩＬＩＰ△Ｃ−ＧＦＰ）、ＦＩＬＩＰｓに共通のＣ末端半分にＧＦＰが結合した融合タンパク質（ＦＩＬＩＰ△Ｎ−ＧＦＰ）、又はＧＦＰのみを発現するＣＯＳ−７細胞から得た細胞溶解物「２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０００Ｕ／ｍｌのＤＮａｓｅＩ、１％のＮＰ−４０、１ｍＭのフェニルメタンスルホニルフルオリド、５μｇ／ｍｌのアプロチニン、１．５μＭのペプスタチンＡ、２μＭのロイペプチンを含む緩衝液で可溶化したタンパク質溶液］を、抗ＧＦＰ抗体（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）又は抗フィラミン１抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社製）により免疫沈降させ、プローブとして抗フィラミン１抗体又は抗ＧＦＰ抗体を用いて沈降したタンパク質を検出した。抗ＧＦＰ抗体を用いた免疫沈降の結果を図２ａに、抗フィラミン１抗体を用いた免疫沈降の結果を図２ｂに示す。これらの結果から、完全長のＦＩＬＩＰｓ又はＣ末端半分を有するＳ−ＦＩＬＩＰと、フィラミン１との複合体形成が確認できた。
【００４６】
さらに、免疫細胞化学を実施するために、Ｓ−ＦＩＬＩＰ（ｆｉｂｅｒ−ｌｉｋｅ；図２ｃ）又はＬ−ＦＩＬＩＰ（ｐｕｎｃｔａｔｅ；図２ｃ）と、フィラミン１との共在を調べるために、実施例１記載の方法と同様にＳ−ＦＩＬＩＰ−ＧＦＰ又はＬ−ＦＩＬＩＰ−ＧＦＰをＣＯＳ−７細胞にトランスフェクションし、かかる細胞を固定して浸透処理を行い、ｄｉｇｉｔａｌ ｃｏｏｌｅｄ ＣＣＤカメラ（Ｈａｍａｍａｔｓｕ Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ社製）を備えたＯＬＹＭＰＵＳ ＩＸ−７０顕微鏡により画像解析を行った。なお、内因性のフィラミン１の発現は、上記細胞を浸透処理した後１０％のヤギ血清／ＰＢＳで２０分間ブロックし、先ず抗フィラミン１抗体（１：２００；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社製）共存下でインキュベーションして、続いて抗マウスＩｇ−Ｃｙ３（１：４００；Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）共存下でインキュベートして染色した。これらの結果を図２ｃに示す。なお、図中の矢印は相互に共在するＦＩＬＩＰｓ−ＧＦＰ及びフィラミン１のシグナルを示し、図の上段及び中段中のスケールバーは１０μｍを、図の下段中のスケールバーは３μｍを表す。その結果、フィラミン１が全てＳ−ＦＩＬＩＰと共在するわけではないが、ほとんどのＳ−ＦＩＬＩＰシグナルがフィラミン１と共存しているのが確認できた（図２ｃ）。また、Ｌ−ＦＩＬＩＰ発現細胞では、斑点状シグナルのおよそ半分が、フィラミン１の斑点状シグナルと共在していているのが確認できた。よって本発明者らは、これらの新規分子をフィラミン１相互作用タンパク質（Ｆｉｌａｍｉｎ １−ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）、ＦＩＬＩＰｓと命名した。
【００４７】
実施例３（ＦＩＬＩＰｓによるフィラミン１の分解と、かかる分解による細胞移動能の低下）
フィラミン１は、種々の細胞の細胞移動に深く関与しているので（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５，３２５−３２７，１９９２）、ＦＩＬＩＰｓは恐らくフィラミン１を介して細胞移動を調節していると考えられる。そこでＦＩＬＩＰｓを、フィラミン１はもつがＦＩＬＩＰｓをもたないＣＯＳ−７細胞に導入して、ＦＩＬＩＰｓが細胞移動度に関与しているかどうかを調べた。プレーティング（１．８８ｃｍ２あたり約１×１０４細胞）の翌日、ＣＯＳ−７細胞にＳ−ＦＩＬＩＰ−ＧＦＰ（図３ａ左）、Ｌ−ＦＩＬＩＰ−ＧＦＰ（図３ａ中）、又はＧＦＰのみ（図３ａ右）を含む発現ベクターをトランスフェクションし、３６〜４８時間後、１０％ウシ胎児血清を含むダルベッコ改変イーグル培地を用い、ＩＸ−ＩＢＣ培養装置（ＯＬＹＭＰＵＳ社製）を備えたＩＸ−７０顕微鏡上に上記細胞を置いて低密度細胞条件下で培養し、１２０分の間隔をおいて２回画像を解析し細胞移動度を調べた（図３ａ）［なお、図３ａのＧＦＰの画像（緑色）は１２０分の間隔をおいて解析し、後から解析した画像が赤色に変化した後にその２枚の画像を１枚に統合した。］。また、図３ａにおける細胞移動を定量するために、１２０分の間隔において各細胞核（Ｓ−ＦＩＬＩＰ−ＧＦＰではｎ＝２０、Ｌ−ＦＩＬＩＰ−ＧＦＰではｎ＝１９、ＧＦＰのみではｎ＝１８）が移動した距離（平均値±ｓ．ｅ．ｍ．）を各グループ毎に測定した（図３ｂ）。なお、図３ａ中のスケールバーは５０μｍを表し、図３ｂの２回の画像解析において生じた核移動は、ｐｈａｓｅ−ｃｏｎｔｒａｓｔ ｉｍａｇｅｓも併用して定量した。これらの結果から、細胞が他の細胞を妨害することなく自由に移動できる低密度細胞条件下においても、ＦＩＬＩＰｓ−ＧＦＰを発現する細胞の移動度は、ＧＦＰのみを発現する細胞と比べ低下しているのが確認できた。
【００４８】
次に、葉状仮足形成に対するＦＩＬＩＰｓの影響を解明するため、創傷治癒分析（Ｗｏｕｎｄ ｈｅａｌｉｎｇ ａｓｓａｙ）を行った。オーバーコンフルエント状態のＣＯＳ−７細胞にＦＩＬＩＰｓ−ＧＦＰ又はＧＦＰのいずれかを含む発現ベクターをトランスフェクションして、３６〜４８時間後に細胞間に損傷を形成させ（図３ｂ）、さらに３時間培養した後、かかる細胞を固定し、ローダミン−ファロイジンで染色した。染色後、細胞間の損傷端部を観察し、葉状仮足が形成されたかどうかを確認した。その結果を図３ｃに示す。なお、図中の矢印はＳ−及びＬ−ＦＩＬＩＰ−ＧＦＰ発現細胞における損傷端部を、矢頭はＦＩＬＩＰｓを発現しない近隣細胞をそれぞれ示し、スケールバーは５０μｍを意味する。また、損傷を形成した上記ＣＯＳ−７細胞を５０個ランダムに抽出し、その中から損傷端部に葉状仮足を形成し、かかる領域に緑色のＧＦＰシグナル（ＦＩＬＩＰｓ−ＧＦＰ又はＧＦＰ単独）が見られる細胞の数を数えた。これらの結果、オーバーコンフルエント状態での静止細胞のほとんどは、隣接細胞の移動に応答して葉状仮足（ｓｈｅｅｔ−ｌｉｋｅ ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ）を形成するのが確認できた。また、図３ｃに示されているように、Ｓ−及びＬ−ＦＩＬＩＰ−ＧＦＰ発現細胞は、ＦＩＬＩＰｓを発現しない細胞と比べ、損傷端部において葉状仮足を形成するものはほとんど見られなかった。ＧＦＰを発現する細胞（対照）では、損傷端部において葉状仮足の形成率は６８％だったのに対し、Ｓ−及びＬ−ＦＩＬＩＰ−ＧＦＰを発現する細胞の葉状仮足形成率は、それぞれ２８％、及び４％であった。これらのことから、ＦＩＬＩＰｓは葉状仮足形成及び細胞移動を抑制することが示唆され、ＦＩＬＩＰｓはフィラミン１の機能に対して阻害効果を有すると考えられる。
【００４９】
さらに、２つのプロモーターを有する発現ベクターを用いて、組換えＦＩＬＩＰｓと組換えフィラミン１をＣＯＳ−７細胞内に同時に発現させ、フィラミン１に対するＦＩＬＩＰｓの阻害効果における分子機構を調べた。図３ｄに示すように、ＨＡでタグされたＦｉｌａｍｉｎ １ ｃＤＮＡ（ＨＡ−Ｆｉｌａｍｉｎ １）とＧＦＰ ｃＤＮＡの間にＩＲＥＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅ）配列を挿入し、ＣＭＶプロモーター（ｐ）によってフィラミン１とＧＦＰが転写され、また、ＦＩＬＩＰｓはＥＦ−１αプロモーター（ｐ’）により転写され発現できるように哺乳動物細胞用発現ベクター（ｐＢｕｄＣＥ４；インビトロジェン社製）に組込み、ＣＯＳ−７細胞にトランスフェクッションした。その後、実施例１と同様の条件に加えて５０μＭのカルペプチン存在下又は非存在下で培養し、ＨＡ−Ｆｉｌａｍｉｎ １とＧＦＰの発現量をＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により確認した。なお、ＨＡ−Ｆｉｌａｍｉｎ １及びＧＦＰは、かかる細胞の同一ｍＲＮＡから翻訳されているのを確認にし、Ｓ−ＦＩＬＩＰ（Ｓ）又はＬ−ＦＩＬＩＰ（Ｌ）の非存在下／存在下でＣＯＳ−７細胞において発現するＨＡ−Ｆｉｌａｍｉｎ １の相対量は、ＧＦＰ発現量に基づいて測定した（組換えフィラミン１とＧＦＰとの相対量は、ＦＩＬＩＰｓ非存在下で４．７、Ｓ−ＦＩＬＩＰ存在下で１．８であった）。これらの結果を図３ｄに示す。このことから、フィラミン１の発現量はＦＩＬＩＰｓ存在下、特にＬ−ＦＩＬＩＰの存在下で低下することがわかった。これはＨＡ−フィラミン１及びＧＦＰのｍＲＮＡ存在下では、ＨＡ−Ｆｉｌａｍｉｎ１タンパク質がほとんど存在しないことを示している。しかし、かかる効果はプロテアーゼ阻害剤であるカルペプチン存在下により消失することから、ＦＩＬＩＰｓがフィラミン１の分解を誘導することが示唆された。
【００５０】
また、実施例２記載の方法と同様にＬ−ＦＩＬＩＰ−ＧＦＰ発現ＣＯＳ−７細胞を作製し、フィラミン１に対する免疫反応性を調べてみた。その結果を図３ｅに示す。なお、図中の矢印はＬ−ＦＩＬＩＰ−ＧＦＰ発現ＣＯＳ−７細胞を示し、図中のスケールバーは２５μｍを表す。その結果、Ｌ−ＦＩＬＩＰ−ＧＦＰ発現ＣＯＳ−７細胞においては、ＦＩＬＩＰを発現しない隣接した細胞と比し、特に内因性フィラミン１の量が顕著に低下していた。このことから、Ｌ−ＦＩＬＩＰ−ＧＦＰ発現ＣＯＳ−７細胞は、フィラミン１に対し低い免疫反応性を示すことがわかった。また、Ｓ−ＦＩＬＩＰに比しＬ−ＦＩＬＩＰの方が、フィラミン１を分解するにあたってより高い活性を示すことが明らかになった。すなわち、Ｓ−ＦＩＬＩＰはフィラミン１をあまり分解しないゆえに、細胞におけるほとんどのＳ−ＦＩＬＩＰがフィラミン１及びＦ−アクチンと共在するとはいえ、Ｌ−ＦＩＬＩＰ発現ＣＯＳ−７細胞において観察されるＦ−アクチンの斑点状分布は、Ｓ−ＦＩＬＩＰ発現細胞のほんの一部分でも観察された。さらに、ＦＩＬＩＰｓと会合するフィラミン１タンパク質の分解の誘導は、図２ｃに示されるようにＦＩＬＩＰｓ（特にＬ−ＦＩＬＩＰ）と共在するフィラミン１に対する低い免疫反応性を引き起こす原因の一つであると考えられる。
【００５１】
実施例４（新皮質の形成におけるＦＩＬＩＰｓによる脳室帯からの細胞移動の調節）
ＣＯＳ−７細胞に導入されたＦＩＬＩＰｓが、フィラミン１分解を誘導するだけでなく細胞移動に対し阻害効果を示し、またフィラミン１遺伝子が変異すると、変異の影響を受けた分裂細胞が脳室帯に滞留し、ヒト皮質の奇形を引き起こす（Ｎｅｕｒｏｎ １６，７７−８７，１９９６、Ｎｅｕｒｏｎ ２１，１３１５−１３２５，１９９８）ことから、ＦＩＬＩＰｓは、新皮質形成における細胞移動を制御する上で中枢の役割を担っていると考えられる。そこで、インビボでの神経細胞移動におけるＦＩＬＩＰｓの役割を解明するために、プラスミドＤＮＡ（Ｓ−ＦＬＩＰＳ−ＧＦＰ ｃＤＮＡ、Ｌ−ＦＬＩＰＳ−ＧＦＰ ｃＤＮＡ、又はＧＦＰ ｃＤＮＡ）をＥ１８ラットの脳の側脳室に投与し、ｓｑｕａｒｅ−ｐｕｌｓｅ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒ（ＢＥＸ社製）により電気パルスを送ることにより、脳室帯細胞にかかるプラスミドＤＮＡを誘導した。上記Ｅ１８ラットの脳を冠状にミクロトームで２００μｍに切り、皮質の背面部分を切開・嫡出し、コラーゲンでコーティングした膜（Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ−ＣＯＬ，Ｃｏｓｔａｒ−Ｃｏｒｎｉｎｇ）上で、１０％のＦＢＳ及びＮ２サプリメントを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を用いて４日間培養した。培養後、上記得られた皮質切片を４％のパラホルムアルデヒド／０．１ＭのＰＢ（ｐＨ７．４）で固定し、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ５１０ ｌａｓｅｒ−ｓｃａｎｎｉｎｇ ｃｏｎｆｏｃａｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（Ｚｅｉｓｓ社製）により画像解析を行った（図４ａ）。なお、図４ａ中の各右図は左図における枠内の拡大図を、白い点は上記切片の端を、Ｐは柔膜表面を、Ｖは側脳室をそれぞれ示し、図４ａ中のスケールバーは２００μｍ（左図）と１００μｍ（右図）を意味する。また、ＧＦＰ又はＦＩＬＩＰｓ−ＧＦＰに対する各細胞の移動度は、培養４日目の皮質の各場所［皮質を側脳室（ＶＳ）から柔膜表面（ＰＳ）にかけて５等分した。］における細胞数を定量することにより求めた（図４ｂ）。なお、Ｓ−ＦＩＬＩＰ−ＧＦＰの値は３つの切片から、Ｌ−ＦＩＬＩＰ−ＧＦＰの値は５つの切片からそれぞれ求め、平均値±ｓ．ｅ．ｍ．として求めた。
【００５２】
上記のことから、対照としてのＧＦＰ発現細胞（ＧＦＰ）においては、脳室帯に存在する多くの標識化細胞が軟膜表面にむけて移動しているのが確認できた。これらの細胞は、紡錘形をしており、大脳皮質放射状方向に伸びる、リーディング（ｌｅａｄｉｎｇ）プロセス及びトレイリング（ｔｒａｉｌｉｎｇ）プロセスを有していた（Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．（Ｓｕｐｐｌ．）２４，Ｓ１８，２０００）。これに対して、Ｓ−又はＬ−ＦＩＬＩＰ−ＧＦＰ発現細胞の形状及び移動度はＧＦＰ発現細胞のものと大きく異なり、これらの発現細胞の形状は丸く、長く放射状に広がっておらず脳室帯近辺に留まっていてほとんど移動していなかった。脳室帯におけるＦＩＬＩＰｓの効果はＣＯＳ−７細胞の効果と整合していた。なお、ＧＦＰ又はＳ−ＦＩＬＩＰ−ＧＦＰと比し、Ｌ−ＦＩＬＩＰ−ＧＦＰを発現する細胞は少なかった。また、Ｌ−ＦＩＬＩＰ−ＧＦＰを発現する細胞の数が培養しても有意な変化を示さなかった。これらのことは、上記トランスフェクション又は翻訳の効率が低いことに起因していると思われる。
【００５３】
次に、ラット新皮質形成におけるＬ−及びＳ−ＦＩＬＩＰの個体発生の発現プロフィールを、抗ＦＩＬＩＰ抗体を用いてイムノブロット法により分析した。その結果を図４ｃに示す。なお、上記抗ＦＩＬＩＰ抗体（ポリクローナル抗ＦＩＬＩＰ抗体）は、Ｓ−ＦＩＬＩＰのアミノ酸配列８９２〜９０９残基に相当する合成ペプチドで免疫したウサギを用いて、文献（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．７５，１−８，２０００）記載の方法により調製した。この結果から、皮質形成の過程においては、Ｓ−ＦＩＬＩＰよりもＬ−ＦＩＬＩＰの方が顕著に確認できた。Ｓ−ＦＩＬＩＰとＬ−ＦＩＬＩＰの役割は一見似ているが、Ｌ−ＦＩＬＩＰの高レベルで発現し、フィラミン１分解に対して高い誘導能を示すことから、新皮質の形成においてＬ−ＦＩＬＩＰはフィラミン１の主要なパートナーであることが明らかである。また、ｆｉｌｉｐｓ ｍＲＮＡの発現はＥ１８において低く、既に転写されたＦＩＬＩＰタンパク質が十分に滞在していると考えられる。
【００５４】
ｆｉｌｉｐｓが脳室帯において発現されることから、ＦＩＬＩＰｓがフィラミン１遺伝子と相互作用し、脳室帯で分解を誘導すると考えられる。そこで、Ｅ１２ラットの皮質の溶解物［２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０００Ｕ／ｍｌのＤＮａｓｅ Ｉ、１％のＮＰ−４０、１ｍＭのフェニルメタンスルホニルフルオリド、５μｇ／ｍｌのアプロチニン、１．５μＭのペプスタチンＡ、２μＭのロイペプチンを含む緩衝液で可溶化したタンパク質溶液］を、抗フィラミン１抗体又は抗ｃ−Ｍｙｃ抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社製）により免疫沈降させ、プローブとして抗ＦＩＬＩＰ抗体を用いタンパク質を検出した。結果を図４ｄに示す。このことから、Ｌ−ＦＩＬＩＰは、Ｅ１２ラットの新皮質の溶解物から検出されたが、Ｓ−ＦＩＬＩＰはほとんど検出されなかった（図４ｄのライン１）。また、同一溶解物中において、Ｌ−ＦＩＬＩＰは抗フィラミン１抗体と共免疫沈降していたことから（図４ｄのライン３）、内因性ＦＩＬＩＰ（主にＬ−ＦＩＬＩＰ）が内因性フィラミン１と相互作用をしていることが明らかとなった。しかし、抗ｃ−Ｍｙｃ抗体（コントロール）は何らポジティブなシグナルを示さなかった（図４ｄのライン２）。
【００５５】
ヒト胎生期脳の中間帯及び皮質板における移動中及び移動後の神経細胞において、フィラミン１タンパク質が発現することは知られている（Ｎｅｕｒｏｎ ２１，１３１５−１３２５，１９９８）。そこで、インサイチューハイブリダイゼーション組織化学法により、ラット大脳皮質におけるフィラミン１の発現を調べてみた。結果を図４ｅに示す。なお、図中のＣＰは皮質板を、Ｓは頭蓋を、Ｖは側脳室を、ＶＺは脳室帯をそれぞれ示し、スケールバーは１００μｍを表す。この結果から、形成中の皮質全体にわたってフィラミン１遺伝子の発現が確認でき、特に脳室帯において高発現しているのが確認できた。また、上記ラット大脳皮質におけるフィラミン１の発現を免疫組織化学法により調べてみた。Ｅ１６ラットから調製した大脳皮質の凍結切片をＺａｍｂｏｎｉ溶液［０．１ＭのＰＢ（ｐＨ７．４）、２％のパラホルムアルデヒド、０．２１％のピクリン酸］で固定した後風乾し、０．２％のトリトンＸ−１００及び０．５％のウシ血清アルブミンを含むＰＢＳで３０分間浸透処理を行い、抗フィラミン抗体（１：４０；Ｓｉｇｍａ社製）共存下でインキュベーションし、続いてフルオレセインが結合した抗ヤギＩｇＧ抗体（１：１００；Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）共存下でインキュベーションし染色した。結果を図４ｆに示す。なお、図中のＣＰは皮質板を、Ｖは側脳室を、ＶＺは脳室帯をそれぞれ示し、スケールバーは１００μｍを表す。このことから、脳室帯細胞はフィラミン１遺伝子を高度に発現させる一方で、脳室帯におけるフィラミン様免疫反応性は、皮質板及び中間体で観察された反応に比べ低いことが明らかになった。フィラミン１は細胞移動に深く関与しているので（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５，３２５−７，１９９２、Ｎｅｕｒｏｎ ２１，１３１５−２５，１９９８）、脳室帯におけるＦＩＬＩＰｓを介したフィラミン１の分解は、移動開始の制御において重要なプロセスであると考えられる。かかるプロセスは、皮質形成において脳室帯から放射状に細胞移動するプロセスに対する阻害的制御の独特な分子機構である。
【００５６】
産業上の利用可能性
本発明の細胞移動調節及び細胞死調節機能を有するタンパク質やそれをコードするＤＮＡは、細胞骨格タンパクの調節分子であることから、細胞移動能のコントロール、細胞死のコントロールに応用することができ、また、癌・腫瘍の転移抑制剤又は移植治療用細胞移動調節剤等に応用することができる。上記細胞移動調節及び細胞死調節機能を有するタンパク質やそれをコードするＤＮＡ等を用いることにより、細胞移動及び／又は細胞死の制御や、細胞移動調節及び／又は細胞死調節機能を促進又は抑制する物質、本件タンパク質・ペプチドの発現促進若しくは抑制物質等をスクリーニングすることなどもできる。また、本件タンパク質・ペプチド等を用いることにより、癌・腫瘍の転移、神経細胞等の細胞移動などのメカニズムを明らかにすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】第１図は、本発明のＬ−ＦＩＬＩＰ ｃＤＮＡ又はＳ−ＦＩＬＩＰ ｃＤＮＡの局在化、及びＦＩＬＩＰｓの構造を示す写真である。
【図２】第２図は、本発明のＬ−ＦＩＬＩＰ又はＳ−ＦＩＬＩＰとアクチン結合タンパク質であるフィラミン１との相互作用に関する結果を示す写真である。
【図３】第３図は、本発明のＬ−ＦＩＬＩＰ又はＳ−ＦＩＬＩＰによるフィラミン１の分解と、かかる分解による細胞移動能の低下に関する結果を示す写真である。
【図４】第４図は、新皮質の形成におけるＬ−ＦＩＬＩＰ又はＳ−ＦＩＬＩＰによる脳室帯からの細胞移動の調節に関する結果を示す写真である。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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