(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体試料を添加可能な試料添加部位を備えかつ該液体試料中の分析対象物質に基づいて発色物質を形成する試薬を含ませた試薬層と、該試薬層に接触して設けられると共に該発色物質を拡散展開させて測定又は検出する発色展開層とを備えていることを特徴とする試験紙。
【請求項２】
液体試料を添加可能な試料添加層と、この試料添加層に接触して設けられると共に該試料添加層に添加された液体試料中の分析対象物質に基づいて発色物質を形成する試薬を含ませた試薬層と、該試薬層に接触して設けられると共に該発色物質を拡散展開させて測定又は検出する発色展開層とを備えていることを特徴とする試験紙。
【請求項３】
発色展開層に接触して設けられる検体吸収層を備えていることを特徴とする、請求項１または請求項２のいずれかに記載の試験紙。
【請求項４】
試薬層と発色展開層の間に、血漿分離膜が接触して設けられていることを特徴とする、請求項１〜請求項３のいずれかに記載の試験紙。
【請求項５】
発色展開層が、ニトロセルロース、ナイロン、及びポリビニリデンジフライドからなる群から選択される材質で作られていることを特徴とする、請求項１〜請求項４のいずれかに記載の試験紙。
【請求項６】
試薬層、試料添加層、もしくは試薬層と試料添加層の両者に、赤血球を凝集する作用のある、レクチン、抗赤血球抗体、及び陽イオン性ポリマーからなる群から選択される１以上の凝集剤を含有することを特徴とする、請求項１〜請求項５のいずれかに記載の試験紙。
【請求項７】
耐水性支持体上に貼付されていることを特徴とする請求項１〜請求項６のいずれかに記載の試験紙。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は臨床化学の分野等で、液体試料中の特定の成分を、発色により定量的または定性的に分析、測定する試験紙に関するものである。
背景技術
従来、化学反応による発色を利用する試験紙においては、米国特許第３，０５０，３７３号、同３，０６１，５２３号等に記載されているように、ろ紙等に試薬を含ませた一層だけの試験紙で、同一の層に試料を添加して発色させ、目視または簡単な反射率計などで測定していた。
多層構造を有する試験紙としては、特開平４−３０４８９９号、特公平６−１０４０７７号等に、試薬層と展開層をもつ試験紙が開示されているが、これらの展開層は、試薬層の上流に位置する試料添加部位であり、試薬層において発色及び判定を行っていた。また、特開平９−１８４８３７号には、独立した検出層を備える試験片が開示されているが、この独立した検出層は、低濃度域での検出を向上させるために、発色した色素を試薬層に対して垂直方向に移して吸着させ判定するものであった。このため、低濃度域での測定感度は良好である一方、高濃度域で色素の発色が頭打ちになってしまい、試料中に予想以上の分析対象物質が含有されていた場合には、再測定を余儀なくされてしまう等、定量的測定という観点からは、十分でない。
また、これらの従来技術においては、発色した色素の偏りにより、定量的測定という観点からの問題のみならず、測定再現性が悪いという問題があった。
一方、赤血球等の固形成分を除く処理を行っていない血液試料（以下全血試料と略す）中の特定成分を検出するには、試験紙によって分析対象物質を検出する操作を行う前に、全血試料から赤血球等の固形成分を除くという前処理工程が必要である。このような前処理工程もしくは前処理工程を含む分析法として、特開昭５７−５３６６１号には、ガラス繊維層を使用した血液分析法が、特開昭６３−１７７０５９号には、可溶性凝集素を保持したフィルターによる血漿分離装置が、それぞれ開示されている。
従来、発色反応を用いた試験紙では、定量的測定が可能な濃度範囲が狭い、測定再現性が悪いなどの問題があった。また、特に全血試料を用いる場合には、上記の問題に加え、試薬層の前に血球分離層が存在することから、全血試料が少量の場合は測定が困難であるという問題があった。
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、測定再現性を改善し、低濃度から高濃度までの広範囲に渡って分析対象物質を定量的に検出できると共に、少量の全血試料中の分析対象物質を測定可能な試験紙を提供することにある。
発明の開示
本発明者らは、発色反応を用いた試験紙では、試料の添加、発色試薬の保持、発色反応、発色の測定のために、担体には異なった特性が求められることに着目し、発色展開層を試薬層から別の層に分離し、それぞれに最適の担体を用い、試薬層で発色した発色物質を発色展開層に拡散展開させて判定することにより、定量的測定が可能な濃度範囲の拡大、測定再現性の改善を可能にした。更に、場合によっては、試料添加層を試薬層から分離する構成、発色展開層の次に検体吸収層を設ける構成を採用した。また、全血試料を用いる場合は、上記構成に加え、試薬層及び／又は試料添加層に赤血球凝集剤を含有させる等により赤血球濾過機能を持たせること、及び／又は、試薬層と発色展開層との間に血漿分離膜を設置することにより、血漿の分離をより完全に行い、血漿分離と測定を同時に行うとともに、定量的測定が可能な濃度範囲の拡大、測定再現性の改善を可能とした。
このように分析対象物質を発色試薬により発色させて測定する試験紙において、本発明の構成を採用することにより、低濃度から高濃度までの広い濃度範囲での定量的測定と、良好な再現性を実現した。また、特に血液試料を用いる場合には、血球の分離と測定を同時に行い、広い濃度範囲での定量的測定と良好な再現性を実現すると共に、少量の全血試料での測定を可能とした。
発明を実施するための最良の形態
本発明の試験紙は、基本的には、第１図〜第６図に示すように、発色展開層２が試薬層３、５から分離された試験紙である。発色展開層２は、試薬層３、５で発色した発色物質を拡散展開させて判定する部位である。ここで、少量の全血試料に対応するためには、試料添加層４と試薬層３を分離しない試験紙（つまり、試料添加部位を有する試薬層５とする）とすることが好ましいが、通常、試料中の不純物を除くなどの前処理が必要な場合や試料の容量が多い場合は、図１および図２に示すように、試料添加層４と試薬層３を分離した試験紙とすることが好ましい。また、図５および図６に示すように、発色展開層２の次に検体吸収層８を設けることで検体の流れをより良くすることも出来る。更に、赤血球の分離をより良くするためには、図５および図６に示すように、試料添加部位を有する試薬層５と発色展開層２の間に血漿分離膜７を組みこむことが効果的である。もちろん、本発明によれば、試薬層３と発色展開層２の間に血漿分離膜７を組みこんでも良い。
これらの各層は、一定の重なりを持たせるか接触させる等により、試料の移動を可能にし連続性のある構造となっている。また、これらの各層は、耐水性を備えた支持体１上に貼付されていることが好ましい。
上記各層の材質については、試料添加層４および試薬層３、５には、グラスファイバー、セルロース、ポリプロピレン、ろ紙等が使用でき、好ましくは、厚さ０．２ｍｍ〜２．０ｍｍ、密度０．１ｇ／ｃｍ３〜０．５ｇ／ｃｍ３のグラスファイバーである。また、発色展開層２には、ニトロセルロース、ナイロン、ポリビニリデンジフライド等が使用でき、好ましくは、ニトロセルロースである。ここで、ニトロセルロースの特性としては、厚さ１００μｍ〜２００μｍ、流速１０ｓｅｃ／ｃｍ〜８０ｓｅｃ／ｃｍであることが好ましい。血漿分離膜７としては、市販されているポリエステル製、ポリエーテルスルホン製血漿分離膜などが使用可能である。検体吸収層８には、グラスファイバー、セルロース、ろ紙等が使用できる。耐水性を備えた支持体１には、プラスチック（ポリエチレンテレフタレート、ポリエチレン、塩化ビニル、アクリル、ＡＢＳ樹脂、スチロール樹脂、ポリカーボネートなど）又は、ガラス、金属などが使用でき、好ましくはプラスチックである。試験紙の裏側からの反射光の測定や透過光での測定のためには、耐水性の支持体１は透明であることが好ましい。
本発明の試験紙は、発色に必要な試薬が、試薬層３、５に乾燥状態で保持されている。試料添加層４を備えた試験紙（図１または図２に示すもの）では、資料添加層４に添加された液体試料は、試料添加層４、試薬層３、発色展開層２の順に流れる。また、試料添加部位を有する試薬層５（図３〜図６に示すもの）に添加された液体試料は、試薬層５、発色展開層２の順に流れる。即ち、試薬層３、５に移動した又は添加された試料中の分析対象物質が、試薬層３、５に含まれる試薬と反応して発色物質を形成し、該発色物質が発色展開層２に拡散展開し、発色展開層２において測定もしくは判定を行う。
発色展開層２の効果としては、▲１▼試薬層３、５で発色した色素を発色展開層２で分散させて測定することにより、高濃度の試料での発色の頭打ちを回避し、定量範囲を高濃度域まで広げられる、▲２▼発色展開層２は試薬の保持能が不要なため、発色測定に最適な平滑で均質な素材を選択でき、また色素が分散する際に発色のむらや偏りが均一化され、再現性の良い定量測定が可能である、▲３▼材質やサイズを選ぶことで、色素の分散を制御して発色の濃さを調整でき、必要に応じて定量範囲を低濃度側にも高濃度側にも変えられる、▲４▼特に全血試料を用いる場合に、全血のまま試薬層での反応を行わせ、血漿分離は発色反応終了後に行うことが可能なので、必要な全血検体量は試薬層のベッドボリューム分だけであり、ベッドボリュームの小さい発色展開層を満たすだけの血漿が得られれば良いので、添加する全血検体量を少なく出来る等が挙げられる。尚、これらは、本発明に伴う必須の効果だけでなく、付加的効果をも含んでいる。
また、発色展開層２の次には、検体吸収層８を設けることもできる。検体吸収層８の効果としては、▲１▼発色展開層２が検体で飽和した後も検体の流れが継続し、発色の均一化に効果的であること、▲２▼検体量と検体吸収層８の容量のバランスを調整することで、任意の時間で検体の流れを止めることが出来ること、▲３▼過剰な検体が添加された場合に試験紙から検体が溢れるのを防止すること、などがあげられる。
発色方法としては、試料中の分析対象物質が直接色素前駆物質を酸化または還元して色素を形成する方法の他に、試料中の分析対象物質が酵素存在下で酸化型補酵素を還元し、この還元型補酵素が、電子伝達剤を介して色素前駆物質を還元して色素を形成する方法等が例示される。
測定もしくは判定方法としては、発色展開層２の色調または／および濃度の変化を目視判定する方法、色調または／および濃度の変化を、反射光を用いて反射率測定装置で測定し、または、透過光を用いて吸光度測定装置で測定し、試料中の分析対象物質の濃度を測定する方法が例示される。
例えば、分析対象物質が、血中３−ヒドロキシ酪酸であるときには、３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素法を使用することができる。その場合においては、試薬層３、５中の試薬として、３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素、ニコチン酸アミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）、ジアホラーゼ、及びニトロテトラゾリウムブルーを用いる。試料中の３−ヒドロキシ酪酸は、試薬層３、５中でアセト酢酸になり、ＮＡＤ＋は還元されＮＡＤＨとなる。このＮＡＤＨを利用して、ジアホラーゼによりニトロテトラゾリウムブルーを発色させる。発色展開層２に展開されてくる紫色の発色は３−ヒドロキシ酪酸量を反映する。
また、分析対象物質が、血中グルコースであるときには、グルコースオキシダーゼ／パーオキシダーゼ法を使用することができる。その場合においては、試薬層３、５中の試薬として、グルコースオキシダーゼ、パーオキシダーゼ、アミノアンチピリンおよびフェノールを用いる。試料中のグルコースは、試薬層３、５中でグルコノラクトンになり、過酸化水素を発生する。この過酸化水素、アミノアンチピリン、およびフェノールによりキノン色素が生成する。発色展開層２に展開されてくる赤色の発色は、グルコース量を反映する。
血中グルコース濃度のグルコース脱水素酵素法による測定においては、試薬層３、５中の試薬として、グルコース脱水素酵素、ＮＡＤ＋、ジアホラーゼ、及びニトロテトラゾリウムブルーを用いる。試料中のグルコースは、試薬層３、５中でグルコノラクトンになり、ＮＡＤ＋は還元されＮＡＤＨとなる。このＮＡＤＨを利用して、ジアホラーゼによりニトロテトラゾリウムブルーを発色させる。発色展開層２に展開されてくる紫色の発色はグルコース量を反映する。
また、特に全血試料を使用する場合は、発色展開層２への赤血球の移行を防ぐ必要がある。そのためには、試薬層３、５及び／又は試料添加層４に赤血球を保持し血漿を濾過する機能をもたせること、及び／又は、試薬層３、５と発色展開層２の間に血漿分離膜７を設けることで、赤血球の分離を行うことになる。
前者の場合、濾過機能のある担体に、赤血球を凝集する作用のある、レクチン、抗赤血球抗体、又は陽イオン性ポリマー等の凝集剤を含有させて使用するのが好ましい。ここで、濾過機能のある担体は、表面で粒子を捕捉する孔径が均一なスクリーンフィルターよりも、繊維状の構造の表面および内部で粒子を捕捉して目詰まりを起こしにくいデプスフィルターであるグラスファイバーなどが好ましい。グラスファイバーの場合、ランダムな構造を持つため明確なポアサイズは規定できないが、厚さ０．２ｍｍ〜２．０ｍｍ、密度０．１ｇ／ｃｍ３〜０．５ｇ／ｃｍ３のグラスファイバーで、直径１μｍ以上の粒子を保持できるものが好ましい。また、何らかの凝集剤を使用するのは、赤血球の直径約７μｍに対し、グラスファイバーの粒子保持能は直径１μｍ以上であるが、直径１μｍ以上の粒子保持率は１００％ではなく、また赤血球は変形可能なためである。
尚、凝集剤を含有させる方法としては、凝集剤の水溶液をフィルターに含浸させた後、乾燥させる方法等がある。
後者の血漿分離膜については説明済みであるが、単独でも、前者の濾過機能との併用も可能であり、特に凝集剤を含有させた前者の濾過手段と併用した場合には、凝集剤の効果により血漿分離膜の目詰まりが避けられ、単独で使用した場合よりも血漿分離量が増大し好ましい。
実施例
実施例１
５ｍｍｘ６５ｍｍの白色ポリエチレンテレフタレート支持体上に、５ｍｍｘ８ｍｍのグラスファイバー試料添加層、５ｍｍｘ５ｍｍのグラスファイバー試薬層、及び５ｍｍｘ１０ｍｍのニトロセルロース発色展開層を２ｍｍずつの重なり幅を持たせて順次貼付して試験紙を作製した。尚、試薬層には、あらかじめ、４０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ８．０中に、１０ｍｇ／ｍｌのニコチン酸アミドアデニンジヌクレオチド、５０ｕｎｉｔｓ／ｍｌの３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素、２００ｕｎｉｔｓ／ｍｌのジアホラーゼ、１０ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン、及び４．５ｍｇ／ｍｌのニトロテトラゾリウムブルーを含有させたものを、１００μｌ／ｃｍ２（２５μｌ／ｔｅｓｔ）添加し減圧下で乾燥させた。
グラスファイバー（試料添加層）：  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社（ＵＳＡ）製  Ｃａｔ．Ｎｏ．ＡＰ２０２９３２５
グラスファイバー（試薬層）：      Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社（ＵＳＡ）製  Ｃａｔ．Ｎｏ．ＳＡ３Ｊ７６３Ｈ８
ニトロセルロース（発色展開層）：Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社（ＵＳＡ）製  Ｃａｔ．Ｎｏ．ＳＴＨＦ０４０００
比較例１
５ｍｍｘ６５ｍｍの白色ポリエチレンテレフタレート支持体上に、５ｍｍｘ８．３ｍｍの濾紙の単一層を貼付して試験紙を作製した。尚、該単一層には、実施例１と同様に、４０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ８．０中に、１０ｍｇ／ｍｌのニコチン酸アミドアデニンジヌクレオチド、５０ｕｎｉｔｓ／ｍｌの３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素、２００ｕｎｉｔｓ／ｍｌのジアホラーゼ、１０ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン、及び４．５ｍｇ／ｍｌのニトロテトラゾリウムブルーを含有させたものを、６０μｌ／ｃｍ２（２５μｌ／ｔｅｓｔ）添加して減圧下で乾燥させた。
濾紙：Ｗｈａｔｍａｎ社（ＧＢ）製  Ｃａｔ．Ｎｏ．３００１９０２
試験例１
上記実施例１の本発明の試験紙および比較例１の試験紙に、１０００μＭの濃度の３−ヒドロキシ酪酸水溶液を２５μｌ添加し、２分後、反射率測定装置で５３０ｎｍでの反射率を測定した。その結果を表１に示すが、表１から明らかなように、本発明の試験紙は、比較の試験紙に比べて発色のばらつきが少ないことがわかった。
0004681198.tif 000002
試験例２
本発明の試験紙（実施例１）および比較の試験紙（比較例１）に、０，１０００，２０００，４０００，６０００μＭの濃度の３−ヒドロキシ酪酸水溶液を２５μｌ添加し、２分後、反射率測定装置で５３０ｎｍでの反射率を測定した。３−ヒドロキシ酪酸水溶液の濃度を横軸にとり、反射率の逆数を縦軸にとり、検量線を作成した。その結果を図７及び表２に示す。
0004681198.tif 000003
図７から明らかなように、本発明の試験紙は検量線の直線性のある濃度範囲が広く、０μＭから６０００μＭの範囲で検量線の相関係数Ｒ２＝０．９９３６となり、比較の試験紙の相関係数Ｒ２＝０．５７８６に比べて良好であった。
定量的測定が可能な測定範囲も、比較の試験紙の０〜２０００μＭに対し、本発明の試験紙は、０〜６０００μＭ以上に拡大できることがわかった。
実施例２
５ｍｍｘ６５ｍｍの白色ポリエチレンテレフタレート支持体上に、５ｍｍｘ１０ｍｍの試料添加部位を有するグラスファイバー試薬層、及び５ｍｍｘ１０ｍｍのニトロセルロース発色展開層を、２ｍｍずつの重なり幅を持たせて順次貼付して試験紙を作製した。尚、試薬層には、あらかじめ、４０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ８．０中に、１０ｍｇ／ｍｌのニコチン酸アミドアデニンジヌクレオチド、５０ｕｎｉｔｓ／ｍｌのグルコース脱水素酵素、２００ｕｎｉｔｓ／ｍｌのジアホラーゼ、１０ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン、及び４．５ｍｇ／ｍｌのニトロテトラゾリウムブルーを含有させたものを、１００μｌ／ｃｍ２（５０μｌ／ｔｅｓｔ）添加し減圧下で乾燥させた。
グラスファイバー（試薬層）：    Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社（ＵＳＡ）製  Ｃａｔ．Ｎｏ．ＳＡ３Ｊ７６３Ｈ８
ニトロセルロース（発色展開層）：Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社（ＵＳＡ）製  Ｃａｔ．Ｎｏ．ＳＴＨＦ０４０００
比較例２
５ｍｍｘ６５ｍｍの白色ポリエチレンテレフタレート支持体上に、５ｍｍｘ１６．７ｍｍの濾紙の単一層を貼付して試験紙を作製した。尚、該単一層には、実施例２と同様に、４０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ８．０中に、１０ｍｇ／ｍｌのニコチン酸アミドアデニンジヌクレオチド、５０ｕｎｉｔｓ／ｍｌのグルコース脱水素酵素、２００ｕｎｉｔｓ／ｍｌのジアホラーゼ、１０ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン、及び４．５ｍｇ／ｍｌのニトロテトラゾリウムブルーを含有させたものを、６０μｌ／ｃｍ２（５０μｌ／ｔｅｓｔ）添加し減圧下で乾燥させた。
濾紙：Ｗｈａｔｍａｎ社（ＧＢ）製  Ｃａｔ．Ｎｏ．３００１９０２
試験例３
上記実施例２の本発明の試験紙および比較例２の試験紙に、３１ｍｇ／ｄｌの濃度のグルコース水溶液を３０μｌ添加し、２分後、反射率測定装置で５３０ｎｍでの反射率を測定した。その結果を表２に示すが、表２から明らかなように、本発明の試験紙は比較の試験紙に比べて、発色のばらつきが少ないことがわかった。
0004681198.tif 000004
試験例４
本発明の試験紙（実施例２）および比較の試験紙（比較例２）に、０，７．８，１５．６，３１．２５，６２．５，１２５ｍｇ／ｄｌの濃度のグルコース水溶液を３０μｌ添加し、２分後、反射率測定装置で５３０ｎｍでの反射率を測定した。グルコース水溶液の濃度を横軸にとり、反射率の逆数を縦軸にとり、検量線を作成した。その結果を図８及び表４に示す。
0004681198.tif 000005
図８から明らかなように、本発明の試験紙は検量線の直線性のある濃度範囲が広く、０ｍｇ／ｄｌから１２５ｍｇ／ｄｌの範囲で検量線の相関係数Ｒ２＝０．９９２３となり、比較の試験紙の相関係数Ｒ２＝０．８４５２に比べて良好であった。
定量的測定が可能な測定範囲も、比較の試験紙の０〜３１．２５ｍｇ／ｄｌに対し、本発明の試験紙は、０〜１２５ｍｇ／ｄｌ以上にまで拡大できることがわかった。
実施例３
５ｍｍｘ６５ｍｍの白色ポリエチレンテレフタレート支持体上に、５ｍｍｘ１０ｍｍの試料添加部位を有するグラスファイバー試薬層、及び５ｍｍｘ１０ｍｍのニトロセルロース発色展開層を、２ｍｍずつの重なり幅を持たせて順次貼付して試験紙を作製した。尚、試薬層には、あらかじめ、４０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ８．０中に１０ｍｇ／ｍｌのニコチン酸アミドアデニンジヌクレオチド、５０ｕｎｉｔｓ／ｍｌの３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素、２００ｕｎｉｔｓ／ｍｌのジアホラーゼ、４．５ｍｇ／ｍｌのニトロテトラゾリウムブルー、１０ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン、１０ｍｇ／ｍｌ蔗糖、及び４％抗ヒト赤血球ウサギ抗体（０．１８ｍｇ／ｍｌ抗ヒト赤血球ウサギ抗体ＩｇＧ画分）を含有させたものを、１００μｌ／ｃｍ２（５０μｌ／ｔｅｓｔ）添加し減圧下で乾燥させた。
グラスファイバー（試薬層）：    Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社（ＵＳＡ）製  Ｃａｔ．Ｎｏ．ＳＡ３Ｊ７６３Ｈ８
ニトロセルロース（発色展開層）：Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社（ＵＳＡ）製  Ｃａｔ．Ｎｏ．ＳＴＨＦ０４０００
試験例５
本発明の試験紙（実施例３）に３−ヒドロキシ酪酸を添加して１２，１１４．５４５，１１７９，１４９１，４７６５，６９３０μＭの濃度にした全血を３０μｌ添加し、２分後、反射率測定装置で５３０ｎｍでの反射率を測定した。
全血中の赤血球は試料添加部位を有するグラスファイバー試薬層中に止まり、発色展開層で判定が可能であった。全血中の３−ヒドロキシ酪酸濃度を横軸にとり、反射率の逆数を縦軸にとり、検量線を作成した。その結果を図９及び表５に示す。
図９から明らかなように、本発明の試験紙は、全血試料でも０〜７０００μＭまで検量線の直線性が良く相関係数Ｒ２＝０．９９２９と良好で、広い濃度範囲で定量的測定ができることがわかった。
0004681198.tif 000006
実施例４
５ｍｍｘ６５ｍｍの透明ポリエチレンテレフタレート支持体上に、５ｍｍｘ８ｍｍの試料添加部位を有するグラスファイバー試薬層、５ｍｍｘ１２ｍｍの血漿分離膜、５ｍｍｘ９ｍｍのニトロセルロース発色展開層及び５ｍｍｘ１０ｍｍのろ紙検体吸収層を、それぞれ６ｍｍ，２ｍｍ，２ｍｍずつの重なり幅を持たせて順次貼付した。５ｘ２５ｍｍの白色ユポ紙トップラミネートで試料添加部位５ｍｍｘ４ｍｍを残して試験紙をカバーして試験紙を作製した。
尚、試薬層には、あらかじめ、４０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ８．０中に、２０ｍｇ／ｍｌのニコチン酸アミドアデニンジヌクレオチド、５０ｕｎｉｔｓ／ｍｌの３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素、２００ｕｎｉｔｓ／ｍｌのジアホラーゼ、１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌのアスコルビン酸酸化酵素、０．０５％のトライトンＸ−１００、１０ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン、及び２．２５ｍｇ／ｍｌのニトロテトラゾリウムブルーを含有させたものを、７５μｌ／ｃｍ２（３０μｌ／ｔｅｓｔ）添加し減圧下で乾燥させた。
グラスファイバー（試薬層）：Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社（ＵＳＡ）製  ＧＦＦ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｐａｄ  Ｃａｔ．Ｎｏ．ＳＡ３Ｊ７６３Ｈ８
ニトロセルロース（発色展開層）：Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社（ＵＳＡ）製  Ｈｉ−Ｆｌｏｗ  Ｐｌｕｓ  Ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｃａｔ．Ｎｏ．ＳＨＦ１８０
ろ紙（検体吸収層）  ：Ｗｈａｔｍａｎ社（ＧＢ）製  ３ＭＭ  ｃｈｒ  Ｃａｔ．Ｎｏ．３０３０  ９０９
試験例６
本発明の試験紙（実施例４）に、３−ヒドロキシ酪酸を添加して５，５８，１０８，４２２，１０６２，２０８４，３３４８，５６１０μＭの濃度にした全血を３０μｌ添加し、２分後、試験紙の裏から判定するタイプの反射率測定装置で６３５ｎｍの反射率を測定した。各濃度で５回測定を繰り返した。反射率（Ｒ）をＫｕｂｅｌｋａ−Ｍｕｎｋの式Ｋ／Ｓ＝（１−Ｒ）２／２ＲによりＫ／Ｓ値に換算した。
全血中の赤血球は試料添加部位を有するグラスファイバー試薬層及び血漿分離膜中に止まり、発色展開層で赤血球の色に影響されずに発色の判定が可能であった。全血中の３−ヒドロキシ酪酸濃度を縦軸にとり、Ｋ／Ｓ値を横軸にとり、検量線を作成した。その結果を図１０及び表６に示す。
0004681198.tif 000007
図１０から明らかなように、本発明の試験紙は、全血試料でも０〜５６００μＭまで近似曲線の相関係数Ｒ２＝１と良好であった。発色のばらつきも少なく、５０〜５６００μＭの広い濃度範囲で、５回測定での測定値のＣＶ％は１０％以内であった。
【図面の簡単な説明】
第１図は、試料添加層、試薬層、発色展開層を、一定の重なりを持たせて支持体上に貼付した三層式試験紙の分解斜視図である。
第２図は、試料添加層、試薬層、発色展開層を、一定の重なりを持たせて支持体上に貼付した三層式試験紙の平面図（Ａ）及び側面図（Ｂ）である。
第３図は、試料添加部位を有する試薬層、発色展開層を、一定の重なりを持たせて支持体上に貼付した二層式試験紙の分解斜視図である。
第４図は、試料添加部位を有する試薬層、発色展開層を、一定の重なりを持たせて支持体上に貼付した二層式試験紙の平面図（Ａ）及び側面図（Ｂ）である。
第５図は、試料添加部位を有する試薬層、血漿分離膜、発色展開層および検体吸収層を、一定の重なりを持たせて支持体上に貼付した四層式試験紙の分解斜視図である。
第６図は、試料添加部位を有する試薬層、血漿分離膜、発色展開層および検体吸収層を、一定の重なりを持たせて支持体上に貼付した四層式試験紙の平面図（Ａ）及び側面図（Ｂ）である。
第７図は、３−ヒドロキシ酪酸水溶液の濃度を横軸にとり、反射率の逆数を縦軸に取った検量線である。反射率の逆数は発色の濃度に比例する。発色の濃度（反射率の逆数）と３−ヒドロキシ酪酸水溶液の濃度に直線性のある範囲が定量性のある測定範囲である。
第８図は、グルコース水溶液の濃度を横軸にとり、反射率の逆数を縦軸に取った検量線である。反射率の逆数は発色の濃度に比例する。発色の濃度（反射率の逆数）とグルコース水溶液の濃度に直線性のある範囲が定量性のある測定範囲である。
第９図は、３−ヒドロキシ酪酸添加全血の濃度を横軸にとり、反射率の逆数を縦軸に取った検量線である。反射率の逆数は発色の濃度に比例する。発色の濃度（反射率の逆数）と３−ヒドロキシ酪酸の濃度に直線性のある範囲が定量性のある測定範囲である。
第１０図は、３−ヒドロキシ酪酸添加全血の濃度を縦軸にとり、Ｋ／Ｓ値を横軸に取った検量線である。Ｋ／Ｓ値は反射率（Ｒ）からＫｕｂｅｌｋａ−Ｍｕｎｋの式Ｋ／Ｓ＝（１−Ｒ）２／２Ｒにより得られる。Ｋ／Ｓ値から近似式Ｙ＝−５１４．０６Ｘ５＋２７２２．７Ｘ４−４１８９．２Ｘ３＋２３２２．７Ｘ２＋１３７５．８Ｘ−２７．３５７により３−ヒドロキシ酪酸の濃度が求められる。  なお、図中の符号は、それぞれ、１：支持体、２：発色展開層、３：試薬層、４：試料添加層、５：試料添加部位を有する試薬層、６：両面テープ、７：血漿分離膜、８：検体吸収層、９：トップラミネート、Ｘ：液体試料の添加、Ｙ：反射率測定である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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