(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
測定試料を吸着させた固定相に、捕捉物質が結合した標識物質を有する検出試薬を含む移動相を展開させることにより、測定試料中のヘモグロビンＡに対するヘモグロビンＡ１ｃの比率を測定するヘモグロビンＡ１ｃの測定方法であって、
前記標識物質として磁性体含有粒子を用い、前記磁性体含有粒子の磁性量を測定することにより、ヘモグロビンＡに対するヘモグロビンＡ１ｃの比率を算出する
ことを特徴とするヘモグロビンＡ１ｃの測定方法。
【請求項２】
検出試薬としてヘモグロビンＡ１ｃと特異的に結合する抗ヘモグロビンＡ１ｃ抗体が結合又は吸着した磁性体含有粒子を用いることを特徴とする請求項１記載のヘモグロビンＡ１ｃの測定方法。
【請求項３】
磁性体含有粒子は、有機高分子物質と、前記有機高分子物質中に分散した磁性体とからなり、前記磁性体を５０〜８０重量％含有し、かつ、平均粒子径が０．０３〜０．５μｍ、前記有機高分子物質中における前記磁性体の分散径が１〜３０ｎｍであることを特徴とする請求項１又は２記載のヘモグロビンＡ１ｃの測定方法。
【請求項４】
磁性体は、酸化鉄であることを特徴とする請求項３記載のヘモグロビンＡ１ｃの測定方法。
【請求項５】
有機高分子物質は、スチレン系モノマーに由来するセグメントを６０重量％以上含有することを特徴とする請求項３又は４記載のヘモグロビンＡ１ｃの測定方法。
【請求項６】
検出試薬の展開方法がフロースルー方式を用いることを特徴とする請求項１、２、３、４又は５記載のヘモグロビンＡ１ｃの測定方法。
【請求項７】
固定相は、フッ化ビニリデン樹脂製メンブレン、ナイロン製メンブレン又はニトロセルロースメンブレンからなることを特徴とする請求項１、２、３、４、５又は６記載のヘモグロビンＡ１ｃの測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、簡易かつ迅速に、ヘモグロビンＡに対するヘモグロビンＡ１ｃの比率を高い精度で測定することが可能なヘモグロビンＡ１ｃの測定方法及びヘモグロビンＡ１ｃ測定用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
血中のヘモグロビンに糖が結合したグリコヘモグロビンは、その濃度が過去１〜２ケ月間の平均的な血中糖濃度を反映するために、糖尿病の診断や、糖尿病の経過観察等に適した指標として広く利用されている。
【０００３】
このようなグリコヘモグロビンは、全体のヘモグロビン量を対照とした際のグリコヘモグロビン量の比率で示される。ヘモグロビンの種類としては、ヘモグロビンＡ、Ｓ、Ｃ、Ｅがあるが、通常、臨床試験では、これらのなかでもヘモグロビンＡ（以下、ＨｂＡともいう）中の特定の糖化ヘモグロビンであるヘモグロビンＡ１ｃ（以下、ＨｂＡ１ｃともいう）の割合を指標として用いることが一般化されている。なお、ＨｂＡ量に対するＨｂＡ１ｃ量の比率は、通常約４〜６％がその目安とされている。
【０００４】
従来、ＨｂＡ１ｃを含む糖化ヘモグロビンの測定法としては、電気泳動法、ボロン酸アフィニティクロマトグラフィー法、イオン交換クロマトグラフィー法、免疫アッセイ法等が知られているが、現在では所要時間や分離性等の点からイオン交換クロマトグラフィー法が主流となっている。しかしながら、イオン交換クロマトグラフィー法は大型で高価な装置が必要であるため、最近では特異性の高い抗体を用いた免疫アッセイ法を用いた測定方法が行われている。
【０００５】
免疫アッセイ法としては、例えば、特許文献１〜３に開示されているように、別途調製したポリハプテンとヘモグロビンの糖化部位の競合反応を利用した免疫凝集を利用する方法や、ラテックス粒子に吸着した糖化ヘモグロビン分子に抗糖化ヘモグロビン抗体を反応させて生じるラテックス凝集反応を利用する方法等が行われている。このような免疫アッセイ法は、用いる抗体の特異性が高いため、イオン交換クロマトグラフィー法において問題とされる不安定型グリコヘモグロビン、カルバミル化ヘモグロビン、アセトアルデヒド化ヘモグロビン、アセチル化ヘモグロビン等の影響を受けず、迅速で、検体処理能力が高いという長所を有している。
【０００６】
しかしながら、これらの方法は何れも凝集反応を利用しているため、非特異的な凝集反応が生じる可能性があり、異常値が出現したり、抗原抗体反応による濁度増加が検出されにくくなったりすることがあり、特異性や測定精度の点で問題があった。
また、従来の免疫アッセイ法においては、糖結合部位を露出させ、抗ヘモグロビンＡ１ｃ抗体との抗原抗体反応をしやすくするためや、不安定型ヘモグロビンＡ１ｃを除去するために、測定試料を変性処理する必要があり、手間がかかるという問題があった。
【特許文献１】特開平６−６６７９５号公報
【特許文献２】特開平７−５１７８号公報
【特許文献３】特表２００２−３０３６２９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、上記現状に鑑み、簡易かつ迅速に、ヘモグロビンＡに対するヘモグロビンＡ１ｃの比率を高い精度で測定することが可能なヘモグロビンＡ１ｃの測定方法及びヘモグロビンＡ１ｃ測定用キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、測定試料を吸着させた固定相に、捕捉物質が結合した標識物質を有する検出試薬を含む移動相を展開させることにより、測定試料中のヘモグロビンＡに対するヘモグロビンＡ１ｃの比率を測定するヘモグロビンＡ１ｃの測定方法であって、上記標識物質として磁性体含有粒子を用い、上記磁性体含有粒子の磁性量を測定することにより、ヘモグロビンＡに対するヘモグロビンＡ１ｃの比率を算出するヘモグロビンＡ１ｃの測定方法である。
以下に本発明を詳述する。
【０００９】
本発明者らは、鋭意検討の結果、測定試料を吸着又は結合させた固定相に、捕捉物質が結合した標識物質を有する検出試薬を含む移動相を展開させることにより、非特異的な凝集反応が生じることがほとんどなく、また、測定試料が固定相に吸着し変性を起こすため、従来のようにヘモグロビンＡ１ｃを変性させてヘモグロビンＡと化学構造が異なる部位、すなわち、糖結合部位を露出させる変性処理を行う必要がないため、簡易かつ迅速に、ヘモグロビンＡに対するヘモグロビンＡ１ｃの比率を高い精度で測定することが可能となるということを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１０】
本発明のヘモグロビンＡ１ｃの測定方法では、検出試薬の標識物質として、磁性体含有粒子を用いることにより、測定試料中のヘモグロビンＡに対するヘモグロビンＡ１ｃの比率を測定する。
【００１１】
上記磁性体含有粒子は、有機高分子物質と、上記有機高分子物質中に分散した磁性体とからものであることが好ましい。
この場合、上記有機高分子物質は、磁性体含有粒子のマトリックスとしての役割を有する。
上記有機高分子物質としては特に限定されないが、スチレン系モノマーに由来するセグメントを有する共重合体であることが好ましい。スチレン系モノマーに由来するセグメントを有することにより、得られる磁性体含有粒子の水系媒体中における分散性が向上する。
【００１２】
上記スチレン系モノマーとしては特に限定されず、例えば、スチレン、α−メチルスチレン、ｐ−メチルスチレン、ｐ−クロロスチレン、クロロメチルスチレン等、又は、二官能性のジビニルベンゼン等が挙げられる。これらのスチレン系モノマーは単独で用いられてもよいし、２種以上が併用されてもよい。
【００１３】
上記スチレン系モノマーに由来するセグメントの含有量の好ましい下限は６０重量％である。６０重量％未満であると、得られる磁性体含有粒子の水系媒体中での分散性が劣ることがある。
【００１４】
上記有機高分子物質は、スチレン系モノマーに由来するセグメントのほかに、反応性官能基を含有するビニルモノマーに由来するセグメントを有していてもよい。反応性官能基を含有するビニルモノマーに由来するセグメントを有することにより、該反応性官能基を介して抗原や抗体を容易に結合することができる。
【００１５】
上記反応性官能基を含有するビニルモノマーの反応性官能基としては、抗原や抗体等を共有結合により結合可能なものであれば特に限定されず、例えば、カルボキシル基、水酸基、エポキシ基、アミノ基、トリエチルアンモニウム基、ジメチルアミノ基、スルホン酸基等が挙げられる。このような反応性官能基を含有するビニルモノマーとしては、例えば、（メタ）アクリル酸、（メタ）アクリル酸−２−ヒドロキシエチル、グリシジル（メタ）アクリレート、トリエチルアンモニウム（メタ）アクリレート、ジメチルアミノ（メタ）アクリレート等が挙げられる。これらの反応性官能基を含有するビニルモノマーは単独で用いられてもよいし、２種以上が併用されてもよい。
【００１６】
上記共重合体は、その他のビニルモノマーに由来するセグメントを有していてもよい。
その他のビニルモノマーとしては特に限定されず、例えば、塩化ビニル；酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル等のビニルエステル類；アクリロニトリル等の不飽和ニトリル類；（メタ）アクリル酸メチル、（メタ）アクリル酸エチル、（メタ）アクリル酸ブチル、（メタ）アクリル酸２−エチルヘキシル、（メタ）アクリル酸ステアリル、エチレングリコール（メタ）アクリレート、トリフルオロエチル（メタ）アクリレート、ペンタフルオロプロピル（メタ）アクリレート、シクロヘキシル（メタ）アクリレート、グリシジルメタクリレート、テトラヒドロフルフリル（メタ）アクリレート等の（メタ）アクリル酸エステル誘導体等が挙げられる。これら単量体は単独で用いられてもよいし、２種以上が併用されてもよい。
【００１７】
上記共重合体は、架橋性モノマーに由来するセグメントを有していてもよいし、これらのセグメントにより架橋が施されていてもよい。
上記架橋性モノマーとしては特に限定されず、例えば、エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、１，６−ヘキサンジオールジ（メタ）アクリレート、ネオペンチルグリコールジ（メタ）アクリレート、トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、テトラメチロールメタントリトリ（メタ）アクリレート、テトラメチロールプロパンテトラ（メタ）アクリレート、ジアリルフタレート及びその異性体、トリアリルイソシアヌレート及びその誘導体等が挙げられる。これら架橋性単量体は単独で用いられてもよいし、２種以上が併用されてもよい。
【００１８】
上記磁性体としては特に限定されないが、残留磁気がない超常磁性を有するものが好適である。残留磁気があると自己凝集しやすくなり、クロマト展開性が劣ることがある。
上記超常磁性を有する磁性体としては特に限定されず、例えば、四三酸化鉄（Ｆｅ３Ｏ４）、γ−重三二酸化鉄（γ−Ｆｅ２Ｏ３）等の各種フェライト類；鉄、マンガン、コバルト等の金属又はこれらの合金等が挙げられる。なかでもフェライト類が好適であり、なかでも四三酸化鉄（Ｆｅ３Ｏ４）が好適である。
このような磁性体としては、Ｆｅ２＋とＦｅ３＋とを１：２の割合で含む混合液を塩基性の溶液に滴下することでＦｅ３Ｏ４が得られる共沈反応法により調製したもの等を用いることができる。また、フェリコロイドＨＣ−５０（タイホー工業社製）、ＨＸ―２０（シグマハイケミカル社製）等の市販品も用いることができる。
【００１９】
上記有機高分子物質中における磁性体の分散径の好ましい下限は１ｎｍ、好ましい上限は３０ｎｍである。１ｎｍ未満であると、磁性体の製造自体が困難であることに加え、磁性体の磁性応答特性が減少し、標識として用いたときの感度が低下することがある。３０ｎｍを超えると、残留磁気を生じやすくなり、自己凝集しやすくなることに加え、磁性体が磁性体含有粒子の表面に露出しやすくなることがある。より好ましい下限は５ｎｍ、より好ましい上限は２０ｎｍである。
【００２０】
上記磁性体含有粒子中における磁性体の含有量の好ましい下限は５０重量％、好ましい上限は８０重量％である。５０重量％未満であると、磁性量が低く、極微量の測定対象成分を分析する際に検出が困難となることがあり、８０重量％を超えると、自己凝集しやすくなったり、磁性体含有粒子全体の重量が大きくなり過ぎたりしてクロマト展開性が劣ることがある。より好ましい下限は６０重量％、より好ましい上限は７０重量％である。
【００２１】
上記磁性体含有粒子は、平均粒子径の好ましい下限が５０ｎｍ、好ましい上限が５００ｎｍである。５０ｎｍ未満であると、媒体中に懸濁させたときの分散安定性が悪くなって自己凝集しやすくなることがあり、５００ｎｍを超えると、クロマト担体の孔を通過しにくくなり、クロマト展開性が劣ることがある。より好ましい下限は１００ｎｍ、より好ましい上限は４００ｎｍである。
【００２２】
上記磁性体含有粒子は、粒子径のＣＶ値が５０％未満であることが好ましい。５０％以上であると、粒子径の大きい粒子がクロマト担体の孔を通過しにくくなり、クロマト担体中に残存することがある。
【００２３】
上記磁性体含有粒子は、上記有機高分子物質を構成する炭素元素と上記磁性体を構成する金属元素との構成比率の絶対偏差の好ましい上限が０．３である。
なお、本明細書において絶対偏差とは、上記有機高分子物質を構成する炭素元素と、磁性体を構成する金属元素の同期発光を測定し、粒子毎の炭素元素と金属元素との混在比率のバラツキから算出したその測定データの分散状態を示す偏差値であって、磁性体含有粒子の磁性体含有量のバラツキを示すパラメータである。上記絶対偏差の数値が小さいほど磁性体含有量のバラツキが小さく、すなわち、磁性体含有粒子の均一性が高く、大きいほど磁性体含有量のバラツキが大きい、すなわち、磁性体含有粒子の均一性が低いことを示す。
上記絶対偏差が０．３を超えると、免疫測定法に利用した場合に、測定再現性や定量性が低くなり測定精度が悪化することがあり、得られる測定データの信頼性が低くなる。より好ましい上限は０．２７、更に好ましい上限は０．２５、特に好ましい上限は０．２０である。
【００２４】
上記磁性体含有粒子を製造する方法としては特に限定されず、例えば、懸濁重合法、マイクロサスペンジョン重合法、ミニエマルジョン重合法、分散重合法等を応用した方法が挙げられる。なかでも、粒子径の小さな粒子を容易に製造することができることから、ミニエマルジョン重合法を応用した方法が好適である。
【００２５】
本発明のヘモグロビンＡ１ｃの測定方法では、固定相を有する試験片等に測定試料を展開させて上記測定試料を上記固定相に吸着又は結合させ、更に、上記磁性体含有粒子を標識物質とし、標識物質を有する検出試薬を含む移動相を上記試験片等に展開させることにより、測定試料中のＨｂＡに対するＨｂＡ１ｃの比率を測定することができる。
固定相を有する試験片等に測定試料を展開させることにより、測定試料が吸着変性を起こすため、従来のようにＨｂＡ１ｃを変性させてＨｂＡと化学構造が異なる部位、すなわち、糖結合部位を露出させる変性処理等を行う必要がない。これにより、簡易かつ迅速に、ＨｂＡに対するＨｂＡ１ｃの比率を高い精度で測定することが可能となる。
なお、複数の測定試料の測定を行う際や、１つの測定試料に対して複数回測定を行う際には、上記固定相における上記測定試料を吸着又は結合させる面積を一定にすることが好ましい。
【００２６】
上記試験片としては、例えば、多孔質の担体に捕捉物質が固定化された固定相に、試料導入材料や吸収材料等が組み合わされもの等を用いることができる。上記試験片の形態としては、例えば、ラテラルフロータイプ、フロースルータイプ等が挙げられる。
【００２７】
上記多孔質の担体としては、移動相を適度な速度で展開することができるものであれば特に限定されず、例えば、メンブレンフィルターや、ニトロセルロース、ガラス濾紙、モノリス構造体等の多孔質体が挙げられる。本発明では移動相を展開した後に、磁性量を測定するため、非磁性材料からなる担体を用いることが好ましい。
上記メンブレンフィルターの具体的な例示としては、例えば、ニトロセルロースメンブレン、フッ化ビニリデン樹脂製メンブレン、ナイロン製メンブレン、ポリプロピレンフィルター等が挙げられる。なかでも、測定試料が吸着し、変性しやすいことから、フッ化ビニリデン樹脂製メンブレン、ナイロン製メンブレン等が好適に用いられる。
【００２８】
上記試料導入材料は、移動相の展開速度や展開量等を制御することを目的として用いられるものであり、移動相を適度な速度で展開することができるものであれば特に限定されず、例えば、メンブレンフィルターや、ニトロセルロース、ガラス濾紙等の多孔質体が挙げられる。
上記吸水材料は、過剰の試料を迅速に吸収することを目的として用いられるものであり、毛細管現象により、多孔質の担体を展開した測定試料液を吸収するものであれば特に限定されず、例えば、セルロースやコットン等の吸水性材料が挙げられる。
【００２９】
本発明のヘモグロビンＡ１ｃの測定方法では、上記移動相の展開を補助するために展開液を用いてもよい。上記展開液としては、通常の免疫アッセイ法に使用されるような、少量の蛋白質、塩、界面活性剤等を含む緩衝液が望ましく、具体的には例えば、０．１％ウシ血清アルブミンと、０．０１％トリトンＸ−１００と、０．９％塩化ナトリウムとを含む０．１Ｍリン酸緩衝液等を用いることができる。
【００３０】
本発明のヘモグロビンＡ１ｃの測定方法において、上記検出試薬としては、ＨｂＡ１ｃと特異的に結合する抗ＨｂＡ１ｃ抗体が結合又は吸着した上記磁性体含有粒子を用いることが好ましい。
【００３１】
上記抗ＨｂＡ１ｃ抗体としては、ＨｂＡ１ｃと特異的に結合する抗体であれば特に限定されず、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体のいずれであってもよいし、またそれらをフラグメント化したものであってもよい。これらのなかでは、モノクローナル抗体を用いることが好ましい。
【００３２】
上記検出試薬を含む移動相を展開させる方法としては特に限定されないが、フロースルー方式、ラテラルフロー方式等が挙げられ、なかでも、簡易かつ迅速に展開ができることから、フロースルー方式が好適に用いられる。
【００３３】
ＨｂＡ及びＨｂＡ１ｃを含有する測定試料に対して、上記検出試薬としてＨｂＡ１ｃと特異的に結合する抗ＨｂＡ１ｃ抗体が結合又は吸着した磁性体含有粒子を用いる場合のＨｂＡ１ｃの測定方法を示す概略図を図１に示す。
なお、（Ｉ）は、ＨｂＡに対するＨｂＡ１ｃの比率が比較的低い場合であり、（ＩＩ）は、ＨｂＡに対するＨｂＡ１ｃの比率が比較的高い場合である。
【００３４】
図１（Ｉ）に示すように、ＨｂＡ及びＨｂＡ１ｃを含有する測定試料を固定相に展開すると、ＨｂＡ及びＨｂＡ１ｃは固定相に吸着変性し、吸着されなかった測定試料等は排出される。この際、固定相に吸着したＨｂＡ及びＨｂＡ１ｃの比率は、測定試薬中のＨｂＡ及びＨｂＡ１ｃの割合を反映したものとなる。
その後、捕捉物質が結合した標識物質を有する検出試薬を含む移動相を展開させると、固定相に吸着したＨｂＡ１ｃを捕捉物質が捕捉する。
そして、固定相の磁性量を測定することにより、所定濃度での磁性量を求める。
次いで、図１（ＩＩ）に示すように、ＨｂＡに対するＨｂＡ１ｃの比率が比較的高い場合についても、同様の操作を行い、固定相の磁性量を測定する。そして、これらの測定結果に基づき、検量線を作成する。このようにして作成した検量線を用いることで、磁性量の測定値から測定試料中のＨｂＡに対するＨｂＡ１ｃの比率を求めることが可能となる。
【００３５】
本発明において、上記磁性体含有粒子の磁性量の計測方法としては特に限定されず、例えば、ホールセンサーやＧＭＲセンサ等の磁気センサを用いる方法や磁気緩和測定を利用する方法等が挙げられる。このようにして測定した磁性量の計測結果をもとに、予め作成した検量線からＨｂＡに対するＨｂＡ１ｃの比率を求めることができる。
【００３６】
本発明のヘモグロビンＡ１ｃの測定方法を実施するために用いるヘモグロビンＡ１ｃ測定用キットもまた、本発明の１つである。
このようなヘモグロビンＡ１ｃ測定用キットを用いることで、簡易かつ迅速に、ヘモグロビンＡに対するヘモグロビンＡ１ｃの比率を高い精度で測定することが可能となる。
【発明の効果】
【００３７】
本発明によれば、簡易かつ迅速に、ヘモグロビンＡに対するヘモグロビンＡ１ｃの比率を高い精度で測定することが可能なヘモグロビンＡ１ｃの測定方法及びヘモグロビンＡ１ｃ測定用キットを提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３８】
以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。
【００３９】
（実施例１）
（１）試験片の作製
フッ化ビニリデン樹脂製メンブレン（ＰＯＲＥＸ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社製）を幅５ｃｍ×長さ５ｃｍに裁断し、メンブレン下部に吸収体を接触させた。メンブレン、吸収体を密着させるため、フロースルー用のデバイスで固定した。
【００４０】
（２）抗ＨｂＡ１ｃモノクローナル抗体結合磁性体含有粒子の作製
磁性体含有粒子（ポリスチレン系、磁性体量６０％、平均粒子径０．３μｍ、積水化学工業社製）１０ｍｇに、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）１０ｍＬを加え、１５０００ＲＰＭにて２０分間遠心分離を行った。得られた沈渣に、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に抗ＨｂＡ１ｃモノクローナル抗体を０．２ｍｇ／ｍＬの濃度になるように溶解した溶液を２ｍＬ加え、充分に混和して、室温にて１時間撹拌した。
【００４１】
その後、未反応の抗ＨｂＡ１ｃモノクローナル抗体を除去するため、１５０００ＲＰＭにて２０分間遠心分離を行い、沈渣を２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）３ｍＬに懸濁させ、再度遠心分離を行った。その沈渣を２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に牛血清アルブミンを１％（ｗ／ｖ）の濃度になるように溶解した溶液３ｍＬに懸濁させ、室温で１時間撹拌し、ブロッキング処理を行った。その後、１５０００ＲＰＭにて２０分間遠心分離を行い、沈渣を２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に牛血清アルブミンを１％（ｗ／ｖ）の濃度になるように溶解し、更にアジ化ナトリウムを０．０１％（ｗ／ｖ）の濃度になるように溶解した溶液２ｍＬに懸濁させて抗ＨｂＡ１ｃモノクローナル抗体結合磁性体含有粒子の懸濁液を調製し、使用までこれを冷蔵保存した。
【００４２】
（３）試験液の調製
検体として、グリコＨｂコントロールレベルＩ（ＨｂＡ１ｃ＝５．４±０．３％）、又は、レベルＩＩ（ＨｂＡ１ｃ＝１０．６±０．５％）（国際試薬社製）を用い、牛血清アルブミン１％（ｗ／ｖ）、トリトン−１００  ０．０１％（ｗ／ｖ）、及び、ヘモグロビン濃度が５μｇ／ｍＬになるように５０ｍＭＰＢＳを用いて調整することにより、レベルＩ試験液及びレベルＩＩ試験液を調製した。また、レベルＩ試験液及びレベルＩＩ試験液の等量混合液（ＨｂＡ１ｃ＝８．０±０．４％）を調製した。
【００４３】
（４）メンブレン洗浄液の調製
牛血清アルブミン１％（ｗ／ｖ）、トリトン−１００  ０．０１％（ｗ／ｖ）を含む５０ｍＭＰＢＳを用いて調製した。
【００４４】
（実施例２）
（１）試験片の作製
ニトロセルロースメンブレン（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ社製）を幅５ｃｍ×長さ５ｃｍに裁断し、メンブレン下部に吸収体を接触させた。メンブレン、吸収体を密着させるため、フロースルー用のデバイスで固定した。
【００４５】
（２）抗ＨｂＡ１ｃモノクローナル抗体結合磁性体含有粒子の作製
磁性体含有粒子（ポリスチレン系、磁性体量６０％、平均粒子径０．３μｍ、積水化学社製）１０ｍｇに、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）１０ｍＬを加え、１５０００ＲＰＭにて２０分間遠心分離を行った。得られた沈渣に、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に抗ＨｂＡ１ｃモノクローナル抗体を０．２ｍｇ／ｍＬの濃度になるように溶解した溶液を２ｍＬ加え、充分に混和して、室温にて１時間撹拌した。
【００４６】
その後、未反応の抗ＨｂＡ１ｃモノクローナル抗体を除去するため、１５０００ＲＰＭにて２０分間遠心分離を行い、沈渣を２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）３ｍＬに懸濁させ、再度遠心分離を行った。その沈渣を２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に牛血清アルブミンを１％（ｗ／ｖ）の濃度になるように溶解した溶液３ｍＬに懸濁させ、室温で１時間撹拌し、ブロッキング処理を行った。その後、１５０００ＲＰＭにて２０分間遠心分離を行い、沈渣を２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に牛血清アルブミンを１％（ｗ／ｖ）の濃度になるように溶解し、更にアジ化ナトリウムを０．０１％（ｗ／ｖ）の濃度になるように溶解した溶液２ｍＬに懸濁させて抗ＨｂＡ１ｃモノクローナル抗体結合磁性体含有粒子の懸濁液を調製し、使用までこれを冷蔵保存した。
【００４７】
（３）試験液の調製
検体として、グリコＨｂコントロールレベルＩ（ＨｂＡ１ｃ＝５．４±０．３％）、又は、レベルＩＩ（ＨｂＡ１ｃ＝１０．６±０．５％）（国際試薬社製）を用い、牛血清アルブミン１％（ｗ／ｖ）、トリトン−１００  ０．０１％（ｗ／ｖ）、及び、ヘモグロビン濃度が５μｇ／ｍＬになるように５０ｍＭＰＢＳを用いて調整することにより、レベルＩ試験液及びレベルＩＩ試験液を作製した。また、レベルＩ試験液及びレベルＩＩ試験液の等量混合液（ＨｂＡ１ｃ＝８．０±０．４％）を調製した。
【００４８】
（４）メンブレン洗浄液の調製
牛血清アルブミン１％（ｗ／ｖ）、トリトン−１００  ０．０１％（ｗ／ｖ）を含む５０ｍＭＰＢＳを用いて調製した。
【００４９】
＜評価＞
各試験液１００μＬを試験デバイスに添加し、１０分後、洗浄液５００μＬで洗浄した。抗ＨｂＡ１ｃモノクローナル抗体結合磁性体含有粒子懸濁液（固形分０．５％に調整）３００μＬをデバイスに添加した後、洗浄液５００μＬで洗浄した。メンブレン部を吸収体と分離し、メンブレン部の磁性量を、市販のＧＭＲセンサ（差動磁界センサ、ＮＶＥ社製）を用いて測定した。結果を表１に示した。
【００５０】
【表１】
0004796893.tif 000002
【００５１】
表１に示したように、実施例１、２では、ＨｂＡ１ｃの比率の変化に伴い、磁性量についても大きく変化していることが確認された。これにより、測定結果に基づき検量線を作成し、作成した検量線を用いることで、磁性量の測定値から測定試料中のＨｂＡに対するＨｂＡ１ｃの比率を求めることが可能となる。
従って、実施例１、２のヘモグロビンＡ１ｃの測定方法は、簡便で、精度の高い有用な測定法であることがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００５２】
本発明によれば、簡易かつ迅速に、ヘモグロビンＡに対するヘモグロビンＡ１ｃの比率を高い精度で測定することが可能なヘモグロビンＡ１ｃの測定方法及びヘモグロビンＡ１ｃ測定用キットを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】本発明のヘモグロビンＡ１ｃの測定方法の一例を示す模式図である。
【符号の説明】
【００５４】
１  固定相
２  ヘモグロビンＡ
３  ヘモグロビンＡ１ｃ
４  検出試薬
【図１】
0004796893.tif 000003