(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
各々の対が、アセトアミドメチル（Ａｃｍ）、４−メチルベンジル（ＭＢｚｌ）及びｔ−ブチル（ｔＢｕ）から選択される異なるチオール保護基で保護された少なくとも２対のチオール基を有する前駆体から少なくとも２つのジスルフィド結合を有する化合物を調製する方法であって、
（ｉ）第１の対の保護チオール基についてｔＢｕ保護チオール基の脱保護とジスルフィド結合の生成をもたらすのに十分な第１の温度において、酸化剤の存在下で、前記前駆体を酸と反応させる工程、及び
（ｉｉ）工程（ｉ）からの反応混合物の温度を、第２の対の保護チオール基についてＡｃｍ及び／又はＭＢｚｌ保護チオール基の脱保護とジスルフィド結合の生成をもたらすのに十分な第２の温度に上昇させる工程
を含む方法。
【請求項２】
前記酸がトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記酸化剤がジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）である、請求項１又は請求項２記載の方法。
【請求項４】
脱保護を１〜２０％のＤＭＳＯを含むＴＦＡ／ＤＭＳＯ混合物を用いて行う、請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
前記保護チオールがペプチド中に存在する、請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
前記ペプチドが少なくとも２つのｔＢｕ保護チオール及び少なくとも２つのＡｃｍもしくはＭＢｚｌ保護チオールを含む、請求項５記載の方法。
【請求項７】
ｔＢｕ保護チオールが工程（ｉ）において室温で脱保護される、請求項１乃至請求項６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
Ａｃｍ又はＭＢｚｌ保護チオールが工程（ｉｉ）において３０℃以上の温度で脱保護される、請求項１乃至請求項７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
Ａｃｍ又はＭＢｚｌ保護チオールが工程（ｉｉ）において５０℃以上の温度で脱保護される、請求項８記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、保護されたチオール化合物、特にアセトアミドメチル、４−メチルベンジルおよびｔ−ブチル基（本明細書では以後、それぞれＡｃｍ、ＭＢｚｌおよびｔＢｕと称する）により保護されたチオールであって、ジスルフィドを生成する脱保護されたチオールの同時酸化を伴う脱保護のための新規な方法に関する。そのような方法は、ペプチド合成において特に有用である。
【０００２】
有機合成の間、望ましからぬ副反応における関与を防ぐためにある種の反応性官能基を保護することはまったく日常的なことである。例えば、反応性カルボニル官能基はしばしばケタールとして保護され、反応性ヒドロキシル及びカルボキシル基はしばしばエステルとして保護される。
【０００３】
システイン中に存在する中性であるがしかし強い求核性のチオール基は、一般的に、ペプチド合成の間保護を必要とする。ベンジル、ＭＢｚｌ、４−メトキシベンジル、トリチル、メトキシトリチル、ｔＢｕ、ｔ−ブチルチオール、アセチル、３−ニトロ−２−ピリジンスルフェニルおよびＡｃｍを含む広範なチオール保護基が公知である。それら全ての基は、ペプチド合成において有効に用いられてきたし、「ザ・ペプチド」第２巻、グロスおよびマインホッファー編集、アカデミックプレス、２３３〜２４０ページ（１９８０年）においてバラニーとメリフィールドにより概説されている。
【０００４】
Ａｃｍはチオール保護基であり、それは、通常、例えば、水銀（ＩＩ）、ヨウ素、銀（Ｉ）またはタリウム（ＩＩＩ）による処理により酸化開裂（ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｃｌｅａｖａｇｅ）により取り除かれる。それは一般的に酸安定性とみなされる。というのは、Ａｃｍの酸分解開裂は、無水または水性酸中で理論的に可能であるけれども、そのような反応は、硫黄原子のプロトン付加における困難さのために実際上不便なほど遅延性であるからである。
【０００５】
このコンテキストにおいて、Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．４１（６）、１０３０〜１０３４ページ（１９９３）においてフジイらは、Ｃｙｓ（Ａｃｍ）およびトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）／１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を用いるオキシトシンの合成および酸化を記述する。その著者らは、Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−オキシトシンが、上記ＴＦＡ／ＤＭＳＯ混合物中の１２時間処理後にほぼ無傷に持ちこたえたと述べ、Ａｃｍ保護がそのような酸条件の下で安定であることを示している。Ｓ−Ａｃｍ基はまた、フッ化水素酸（ＨＦ）およびヒドラジンのような強力な求核試薬に対して安定であるとして、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．９４、５４５６〜５４６１ページ（１９７２）においてビーバーらによっても報告されていた。
【０００６】
バン・リートショーテンらは、ペプチド（１９７７）、５２２〜５２４ページにおいてＨＦ−アニソールによる４つのＡｃｍ基を含むペプチドの処理は、２０％の除去されたＡｃｍ基をもたらしたと報告した。より最近では、フィッシャーらは、Ｊ．Ｐｅｐ．Ｒｅｓ．４９（４）、３４１〜３４６ページ（１９９７）において、Ａｃｍの酸分解開裂によるチロシン残基に対する修飾を記載し、シンらは、テトラヘドロン・レターズ第３７巻第２４号４１１７〜４１２０ページ（１９９６）においてＣ末端Ｃｙｓ（Ａｃｍ）ペプチドからのＡｃｍの部分的酸分解開裂について報告する。それらの酸誘起脱保護反応は、ペプチド開裂の間の望ましからぬ副反応とみなされる。
【０００７】
ＭＢｚｌチオール保護基は、伝統的に、−５℃から０℃の温度でＨＦのような強酸を用いて開裂される。テトラヘドロン・レターズ第３２巻第９号１２２３〜１２２６ページ（１９９１）においてオオタカらは、ＭＢｚｌ基はＴＦＡに対して安定であり、ＭＢｚｌ保護化システインは室温でＴＦＡ／１０％ＤＭＳＯによる処理の際にシスチンに変換されないことを報告する。
【０００８】
ｔＢｕチオール保護基は、典型的に、例えば水銀（ＩＩ）による処理により、またはトリフルオロメタンスルホン酸による酸分解により酸化開裂により取り除かれる。その基は、ＴＦＡおよびヨウ素酸化に対して安定であると考えられる。
【０００９】
Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．第１１４巻第１１号４１３７〜４１４３ページ（１９９２）においてアカジらは、ＭＢｚｌ、ｔＢｕおよびＡｃｍを含む様々のシステイン保護基の酸分解除去を報告するけれども、反応は、適切なシリルクロリドの存在に依存する。
【００１０】
本発明は、特に反応温度が上昇するとき、Ａｃｍ、ＭＢｚｌおよびｔＢｕチオール保護基が酸化条件の下で酸に対して不安定であるという予想しなかった発見に基づいている。したがって、ｔＢｕチオール保護基は、室温でこの方法で急速に開裂し、高温でさらにより急速に開裂しうる。ＡｃｍおよびＭＢｚｌチオール保護基は、数時間以下の反応時間で実質的に定量的な脱保護を達成することが可能であるほど、３０℃を超える温度で、特に５０℃以上の温度でそのような条件の下で不安定さが増大するようになる。そのような酸誘起脱保護は、そのことがＡｃｍ、ＭＢｚｌおよびｔＢｕ基を除去するために現在用いられるより毒性の試薬の使用の必要を回避するという点において特に有益である。酸化剤の存在下で脱保護を行うことにより、遊離したチオール基は、直接分子間または分子内ジスルフィド基に変換される。本明細書で以下検討されるように、このことは、ジスルフィド結合を含む環状ペプチドの合成において特に有用な応用を有する。
【００１１】
したがって、１つの側面によれば、本発明は、Ａｃｍ−、ＭＢｚｌ−および／またはｔＢｕ−保護化チオールの脱保護のための方法であって、脱保護およびジスルフィド結合の生成をもたらすのに十分な温度で酸化剤の存在下で前記保護化チオールと酸を反応させることを含む方法を提供する。
【００１２】
水性および無水酸の両方が本方法において用いられ得る。したがって、例えば、塩酸のような鉱酸のような水性無機酸および例えば、酢酸、またはより好ましくはＴＦＡのような強カルボン酸のようなカルボン酸、およびメタンスルホン酸のようなスルホン酸のような水性または無水有機酸が有用であろう。
【００１３】
ＤＭＳＯは、本方法において有用な酸化剤の好ましい例である。テトラメチレンスルホキシドのような他のスルホキシドもまた有用であろう。しかしながら、カリウムスーパーオキシドまたはニッケルペルオキシドのような金属スーパーオキシドおよびペルオキシド、ナトリウムトリチオカーボネートのようなチオカーボネートおよび炭酸トリフェニルビスマスのような有機金属炭酸塩もまた有用であろう。
【００１４】
好ましい態様において、脱保護されるチオールは、１以上のＡｃｍ−、ＭＢｚｌ−および／またはｔＢｕ−保護化システイン残基を含むペプチドである。
【００１５】
ペプチドは、インビボでの疾患特異的マーカーのターゲッティングにとってきわめて適している分子のクラスを表し、顕著な関心が、標的とされる画像化薬剤（ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｉｍａｇｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）の潜在成分としての合成ペプチドの調製に向けられている。
【００１６】
システインを含むペプチドの合成は、ペプチド化学者に特別の挑戦の機会を提供する。というのは、そのペプチドは、還元されている状態かまたは酸化されている状態かのいずれかで存在し得るからである。２以上のシステイン残基を含む酸化されたペプチドは、ダイマー、トリマーもしくはマルチマー（ｍｕｌｔｉｍｅｒ）のような分子内ジスルフィドまたは分子間ジスルフィドを形成し得る。したがって、例えば、６個のシステイン残基を含むペプチドは、潜在的に１５のジスルフィド異性体を形成することが可能であり、それゆえ、もし正確なジスルフィド対形成がそのようなペプチドにおいて達成されるべきであるならば、注意深い計画と適切な保護ストラテジーの選択が要求される。強い親和性の受容体との結合が可能な生物学的に活性のコンフォメーションを与えるためには、正確な対形成がペプチド主鎖（ｂａｃｋｂｏｎｅ）の正確な折りたたみおよび側鎖官能基の付随する配向にとってしばしば重要であることが理解されるであろう。
【００１７】
２以上のジスルフィド結合の選択的生成のための典型的な現在のストラテジーは、トリチルとＡｃｍまたはｔ−ブチルチオとＡｃｍのような保護基の組み合わせを用い、第１ジスルフィド結合はトリチルまたはｔ−ブチルチオ基の除去の後に生成し、第２の結合は、例えば、ヨウ素またはトリフルオロ酢酸タリウムを用いてのＡｃｍ基の酸化開裂により生成する。多橋（ｍｕｌｔｉｂｒｉｄｇｅｄ）ペプチドの合成の他の例には、Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ．５７、２６１７〜２６２１ページ（１９７４）において記載されているシーバーらによるインスリンの溶液合成（ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）およびアサートンら、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．１、２０６５ページ（１９８５）およびアカジら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１５、１１３８４ページ（１９９３）の手順が含まれる。
【００１８】
本発明による脱保護は、２以上のジスルフィド結合が「ワンポット（ｏｎｅ  ｐｏｔ）」反応で生成しうるようにし、それにより部分的に酸化されたか部分的に保護されたペプチドの中間精製の必要を回避し、そうして溶媒の使用および時間の節約ならびに生成収率の改善を達成して、そのようなストラテジーの顕著な単純化を可能とする。したがって、２つの酸不安定チオール保護基（例えばトリチル基）ならびに２以上のＡｃｍおよび／またはＭＢｚｌ基を含むペプチドを調製することにより、第１のジスルフィド結合は比較的低温（例えば周囲温度）でペプチドの酸処理により生成しうるものであり、１以上の更なるジスルフィド結合は、Ａｃｍおよび／またはＭＢｚｌ基が開裂するように３０℃を超える温度に反応混合物の温度を高めることにより簡単に生成しうる。必要とされる酸化剤は、所望により、低温処理の前後に加えられ得る。
【００１９】
酸不安定保護基の位置は、最初に形成されるジスルフィド結合が、残りのＡｃｍ−保護化および／またはＭＢｚｌ−保護化チオール基が残りのジスルフィド結合の正確な生成を容易にする方式で近接するように、分子を折りたたまれたコンフォメーションにもたらすようにすることが有利である。
【００２０】
上記のように、ｔＢｕチオール保護基は、酸性および酸化処理により室温で容易に開裂するので、ｔＢｕとＡｃｍおよび／またはＭＢｚｌ保護の組み合わせが用いられ得、その場合、ｔＢｕ基は室温で開裂し、Ａｃｍおよび／またはＭＢｚｌ基は続いて３０℃を超える温度に加熱することにより除去される。それゆえ、多数のジスルフィドの特異的生成が、クロマトグラフィーによる中間体の単離の必要無しに「ワンポット」ストラテジーを用いて高収率でもたらされ得る。
【００２１】
脱保護およびジスルフィド結合生成を促進する、例えば１から２０％、例えば２〜１０％のＤＭＳＯ含有量のＴＦＡ／ＤＭＳＯ混合物の使用は、本発明のそのような態様において特に好ましい。というのは、Ｓ−保護化出発物質とジスルフィド結合した中間体と最終生成物の全ては、典型的には、そのような混合物に溶解性であるからである。ＴＦＡとＤＭＳＯの両方は、更なる使用のために容易にリサイクルされ得る。
【００２２】
トリチルおよびメトキシトリチルのようなチオール保護基は一般的に酸不安定性であり、一方、ｔＢｕチオール保護基は酸化条件の下でのみ酸不安定性であるという事実は、位置選択的「ワンポット」酸化プロセスによる３つのジスルフィド結合を含むペプチドの合成において利用され得る。したがって、トリチル、メトキシトリチルまたは他の酸不安定性基で、ｔＢｕ基で、ならびにＡｃｍおよび／またはＭＢｚｌ基でそれぞれ保護されたシステイン残基の適切に位置した対を含む、樹脂で支持された合成ペプチドは、最初は、樹脂からの開裂およびトリチル、メトキシトリチルまたは他の酸不安定性保護基の開裂をもたらすために酸で処理され得る。チオール基のこのようにして発生した対は、最初の所望のジスルフィド結合を生成するように塩基性ｐＨの水溶液中で、または水性ＤＭＳＯ中で酸化され得るものであり、その後、溶媒は、真空中でまたは凍結乾燥により蒸発させることができる。次いで、上記の生成物の連続低温（例えば室温）および高温（すなわち＞３０℃）酸性および酸化処理は、チオール基のｔＢｕ−保護化およびＡｃｍ−および／またはＭＢｚｌ−保護化対の連続反応により所望の第２および第３のジスルフィド結合の生成をもたらす。
【００２３】
本発明の手順は、システインを含むペプチドを１ｍｇ／ｍｌを超える濃度で酸化することを可能とし、それにより、典型的には、０．１ｍｇ／ｍｌ台のペプチド濃度を用い、それで最終精製の前に例えばイオン交換クロマトグラフィーにより生成物が濃縮されることを必要とする、Ａｃｍのヨウ素開裂および空気酸化のような現存のプロトコールと比較して溶媒体積要求を実質的に減少させる。他方、本発明の手順によれば、生成物濃縮は、真空中での溶媒蒸発により簡単に行うことができる。
【００２４】
以下の発明を限定しない例は、発明を例示する役割を果たす。
【００２５】
例１：α−コノトキシンＳＩ［Ｃｙｓ２とＣｙｓ７およびＣｙｓ３とＣｙｓ１３を結合するジスルフィド結合を有するＩｌｅ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−ＮＨ2 ］の「ワンポット」合成
【化１】
0004738683.tif 000002
本ペプチドシーケンスは、１ｍｍｏｌアミノ酸カートリッジを用いて０．１２ｍｍｏｌ規模のリンク（Ｒｉｎｋ）アミド樹脂（ノババイオケム）で出発するＡＢＩ４３３Ａ自動ペプチドシンセサイザーで組み立てられた（ａｓｓｅｍｂｌｅｄ）。システイン残基２および７をトリチル基で保護し、一方、残基３および１３をアセトアミドメチル基で保護した。全てのアミノ酸を、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）を用いて予備活性化させた（ｐｒｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ）。
【００２６】
樹脂からのペプチドのおよびペプチドからの（Ａｃｍを除く）側鎖保護基の同時除去は、５％トリイソプロピルシランおよび５％の水を含むトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）による２時間の処理により行い、１３０ｇの粗生成物を得た。粗生成物のＨＰＬＣ分析（バイダック２１８ＴＰ５４カラム）を、１ｍｌ／分の流量で２０分にわたって５から３０％Ｂの勾配（Ａ＝０．１％ＴＦＡ／水およびＢ＝０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル）を用いて実施した。生成物は、＞９０％純粋であることが見出された。更なる生成物特性測定をＭＡＬＤＩ質量スペクトロメトリーを用いて実施した。Ａｃｍ保護化生成物についてのＭ＋Ｈは、１４９６と予測され、１５０２であることが見出された。
【００２７】
２ｍｇの粗生成物にＴＦＡ（１０ｍｌ）およびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（０．１ｍｌ）を加えた。混合物を氷上で攪拌し、酸化の経路（ｃｏｕｒｃｅ）をＨＰＬＣで追跡した。出発生成物、滞留時間１６．２分（２０分にわたって０から３０％ＢでＡ＝０．１％ＴＦＡ／水およびＢ＝０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル）を１６．４分の滞留時間の新たな生成物とゆっくりと置換し、２時間後、出発生成物は完全に消失した。ついで、０．０５ｍｌのアニソールをペプチド溶液に加え、混合物をさらに２時間６０℃に暖め、その後ＴＦＡを真空中で除去し、ペプチドをジエチルエーテルの添加により沈殿させた。完全に酸化された粗生成物（１．４ｍｇ）は、それぞれ１６．９および１７．８分のＨＰＬＣ滞留時間で１：５の比で２つの主生成物を含んでいた。ほぼ８０％の生成物を含む１７．８分生成物は、α−コノトキシンの信頼しうるサンプル（バッケム，Ｈ−１１１２）と共溶出することが見出された。
【００２８】
５ｍｌ／分の流量で３０分にわたっての０から３０％Ｂの勾配（Ａ＝０．１％ＴＦＡ／水およびＢ＝０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル）を用いてのバイダック２１８ＴＰ１５２０１０半分取カラム上での精製と続く凍結乾燥は、＞９０％純粋であることが見出されたコノトキシン（０．７ｍｇ、３５％収率）を与えた。更なる特性測定をＭＡＬＤＩ質量スペクトロメトリーを用いて実施した。生成物についてのＭ＋Ｈは１３５４と予測され、１３５６であると見出された。
【００２９】
例２：α−コノトキシンＳＩの「ワンポット」合成
本ペプチドシーケンスを、システイン残基２および７をｔ−ブチル基で保護し、一方、残基３および１３を４−メチルベンジル基で保護することを除いて例１において記載されているように組み立てた。全てのアミノ酸を、ＨＢＴＵを用いて予備活性化した。
【００３０】
樹脂からのペプチドのおよびペプチドからの（ｔ−ブチルおよび４−メチルベンジルを除く）側鎖保護基の同時除去を、５％トリイソプロピルシランおよび５％水を含むＴＦＡによる２時間の処理により行い、１２５ｍｇの粗生成物を得た。粗生成物のＨＰＬＣ分析（バイダック２１８ＴＰ５４カラム）を１ｍｌ／分の流量で２０分にわたり２０から６０％Ｂの勾配（Ａ＝０．１％ＴＦＡ／水およびＢ＝０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル）を用いて実施した。生成物は、１５．７分の滞留時間および＞９０％の純度を有することが見出された。更なる生成物の特性測定をＭＡＬＤＩ質量スペクトロメトリーを用いて実施した。部分的に保護された生成物についてのＭ＋Ｈは１６８０と予測され、１６８５であることが見出された。
【００３１】
清浄なフラスコの中の５０ｍｇの部分的に保護された粗生成物にＴＦＡ（９８ｍｌ）、ＤＭＳＯ（２．０ｍｌ）およびアニソール（０．１ｍＬ）を加えた。混合物を室温で４０分間攪拌し、反応混合物の試料をＭＡＬＤＩ質量スペクトロメーターに掛けた。確認された新たな生成物が現れ、これは、単一のジスルフィドであり、４−メチルベンジル保護基が残っていることを確認した。この部分的に保護された生成物についてのＭ＋Ｈは１５６５と予測され、１５６８であることが見出された。
【００３２】
次いでフラスコを油浴中に配置し、３時間７０℃に加熱し、続いてＴＦＡを真空中で除去し、ペプチドをジエチルエーテルの添加により沈殿させた。沈殿をエーテルとともに粉砕し、空気乾燥してほとんど定量的収率で完全に酸化された粗生成物（４５ｍｇ）を得、＞９０％のＨＰＬＣ純度であった。
【００３３】
完全に酸化された粗生成物の２０ｍｇのアリコットを、９ｍｌ／分の流量で４０分にわたって０から３０％Ｂの勾配（Ａ＝０．１％ＴＦＡ／水およびＢ＝０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル）を用いてバイダック２１８ＴＰ１０２２  Ｃ１８分取カラム上の分取ＨＰＬＣにより精製した。純粋な生成物を含む画分を集め、凍結乾燥した（１０ｍｇ、５０％収率）。生成物は、分析用ＨＰＬＣにより＞９９％純粋であることが見出された。更なる特性測定をＭＡＬＤＩマススペクトロメトリーを用いて実施した。生成物についてのＭ＋Ｈは１３５４と予測され、１３５６であることが見出された。
【００３４】
生成物は、α−コノトキシンの信頼し得るサンプル（バッケム、Ｈ−１１１２）と共溶出することを示した。
【００３５】
例３：オキシトシンの合成
ａ）Ｃｙｓ（Ａｃｍ）保護化オキシトシンの合成：ＮＨ2 −Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＮＨ2 
【化２】
0004738683.tif 000003
本ペプチドを、１ｍｍｏｌアミノ酸カートリッジを用いて０．２５ｍｍｏｌ規模でリンクアミドＡＭ樹脂で出発してＡＢＩ４３３Ａ自動ペプチドシンセサイザーで合成した。アミノ酸を、カップリングの前にＨＢＴＵを用いて予備活性化した。樹脂からのペプチドのおよびペプチドからの（Ａｃｍを除く）側鎖保護基の同時除去を、５％トリイソプロピルシランおよび５％水を含むＴＦＡによる１時間の処理により行った。
【００３６】
得られた粗生成物（３００ｍｇ）を、９ｍｌ／分の流量で４０分にわたって５から３０％Ｂの勾配（Ａ＝０．１％ＴＦＡ／水およびＢ＝０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル）を用いて分取ＨＰＬＣ（バイダックＣ１８  ２１８ＴＰ１０２２カラム）により精製した。凍結乾燥の後、１６６ｍｇの純粋な生成物を得た。この精製された生成物のＨＰＬＣ分析（バイダックＣ１８  ２１８ＴＰ５４カラム）を、２１４ｎｍのＵＶによる生成物検出により５から５０％Ｂの勾配（Ａ＝０．１％ＴＦＡ／水およびＢ＝０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル）を用いて実施した。生成物の滞留時間は１４．３０分であった。更なる生成物の特性測定をＭＡＬＤＩマススペクトロメトリーを用いて実施した。生成物についてのＭ＋Ｈは、１１５１．０と予測され、１５５１．５であることが見出された。
【００３７】
ｂ）オキシトシン［Ｃｙｓ１とＣｙｓ６を結合するジスルフィド結合を有するＮＨ2 −Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＮＨ2 ］を生成するための脱保護と酸化
【化３】
0004738683.tif 000004
５ｍｇのＣｙｓ（Ａｃｍ）−保護化オキシトシンをＴＦＡ（２ｍｌ）中に溶解させ、次いで、６０℃に予備加熱されたアニソール（４０μｌ）、ＤＭＳＯ（１ｍｌ）およびＴＦＡ（１８ｍｌ）の混合物に加えた。この温度で５時間後、オキシトシンへの定量的変換が生じたことを、２１４ｎｍのＵＶによる生成物検出による５から５０％Ｂの勾配（Ａ＝０．１％ＴＦＡ／水およびＢ＝０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル）を用いての分析用ＨＰＬＣ（バイダック  Ｃ１８  ２１８ＴＰ５４カラム）により確認した。生成物の滞留時間は１２．９８分であった。更なる生成物の特性測定をＭＡＬＤＩマススペクトロメトリーを用いて実施した。生成物についてのＭ＋Ｈは１００７と予測され、１０１１であることが見出された。生成物は、ノババイオケムから購入されたオキシトシンの信頼し得る試料とともに共溶出することが見出された。
【００３８】
例４：室温および６０℃でのシステイン保護化オキシトシン類似体の脱保護および酸化速度の比較研究
例３（ａ）の手順を、オキシトシンのＣｙｓ（ｔＢｕ）−保護化およびＣｙｓ（ＭＢｚｌ）−保護化類似体を調製するために反復した。それらの類似体およびＣｙｓ（Ａｃｍ）−保護化オキシトシンの脱保護および酸化を、室温および６０℃で例３（ｂ）において記載されたように実施した。以下の表は、分析用ＨＰＬＣにより定量されたオキシトシンへの変換の程度を要約する。６０℃で定量的変換が生じたことをＭＡＬＤＩ質量スペクトロメトリーにより確認した。
【００３９】
【表１】
0004738683.tif 000005
例５：熱安定性エンテロトキシンＳＴペプチド［Ｃｙｓ１とＣｙｓ６、Ｃｙｓ２とＣｙｓ１０およびＣｙｓ５とＣｙｓ１３を結合させるジスルフィド結合を有するＮＨ2 −Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−ＯＨ］の「ワンポット」合成
【化４】
0004738683.tif 000006
本ペプチドシーケンスを例１において記載されているのと同様の方式で組み立てた。システイン残基１および６をトリチル基で保護し、残基２および１０をｔ−ブチル基で保護し、残基５および１３を４−メチルベンジル基で保護した。ペプチドを例１において記載された固相支持体から開裂させ、１９０ｍｇの粗収率を得た（システイン残基１および６はチオール形態にあり、残りのシステインはいまだ保護されたままである）。５０ｍｇの部分的に保護された粗ペプチドを４００ｍｌの水／アセトニトリル（６０：４０）中に溶解し、ｐＨを希釈水酸化アンモニウムの添加により８に調節した。ＤＭＳＯ（１０ｍｌ）を加え、続く酸化の経路を分析用ＨＰＬＣおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦにより追跡した。Ｃｙｓ１とＣｙｓ６を結合させるジスルフィド結合を有する新たな生成物が１時間以内に生成することが見出され、その後、溶媒を真空中で除去した。
【００４０】
同じフラスコの中の得られたＤＭＳＯ含有残渣に、ＴＦＡ（７５ｍｌ）およびアニソール（０．１ｍｌ）を加え、混合物を１時間攪拌した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析は、ｔ−ブチル基が除去され、Ｃｙｓ２とＣｙｓ１０を結合させる第２のジスルフィド結合が形成されたことを示した。次いで、フラスコを凝縮器に取り付け、温度を１時間７０℃に上昇させた。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析は、４−メチルベンジル基の完全な開裂が起こったことを明らかにした。ＴＦＡを除去し、生成物をジエチルエーテルの添加により沈殿させた。ジエチルエーテルによる粉砕と空気乾燥に続いて粗生成物を回収した。ＨＰＬＣによる精製は、３０％収率で純粋な生成物を産生させた。
【００４１】
生成物は、ＳＴペプチドの信頼し得る試料と共溶出することを示し、インビトロのスクリーニングアッセイで活性（Ｋｉ＝３ｎＭ）であることを確認した。