(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０８２７，ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０８２８，ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０８２９，及びＦＥＲＭ  Ｐ−２１５０７である各菌株より選ばれる菌株。
【請求項２】
請求項１の菌株であって，ポリエステル分解性を有し，該ポリエステルが芳香族脂肪族ポリエステル又は脂肪族ポリエステルであってよいものである，菌株。
【請求項３】
該芳香族脂肪族ポリエステルが，芳香族ジカルボン酸としてテレフタル酸を、ジオールとしてグリコールモノマーまたはオリゴマーを、及び脂肪族ジカルボン酸としてＨＯＣ(Ｏ)(ＣＨ２)ｎＣ(Ｏ)ＯＨ（ここに，ｎは０〜１０の整数を表す。）を含んでなるモノマーの重合したポリエステルである，請求項２の菌株。
【請求項４】
該芳香族脂肪族ポリエステルがバイオマックス（Biomax，登録商標）又はエコフレックス（Ecoflex，登録商標）である，請求項２又は３の菌株。
【請求項５】
該バイオマックス（Biomax，登録商標）が，バイオマックス（Biomax，登録商標）４０２４，４０２６又は４０２７であり、該エコフレックス（Ecoflex，登録商標）がＦ又はＳグレードである，請求項４の菌株。
【請求項６】
請求項１ないし５の何れかの菌株を，分解処理すべきポリエステルの表面及び／又は該ポリエステルを埋設する堆肥に適用し，該ポリエステルを該堆肥中に埋設することにより，該菌株による該ポリエステルの促進された生分解反応を行なわせることを特徴とする，ポリエステルの分解処理方法。
【請求項７】
該芳香族脂肪族ポリエステルが，芳香族ジカルボン酸としてテレフタル酸を、ジオールとしてグリコールモノマーまたはオリゴマーを、及び脂肪族ジカルボン酸としてＨＯＣ(Ｏ)(ＣＨ２)ｎＣ(Ｏ)ＯＨ（ここに，ｎは０〜１０の整数を表す。）を含んでなるモノマーの重合したポリエステルである，請求項６の方法。
【請求項８】
該芳香族脂肪族ポリエステルがバイオマックス（Biomax，登録商標）又はエコフレックス（Ecoflex，登録商標）である，請求項６又は７の方法。
【請求項９】
該バイオマックス（Biomax，登録商標）が，バイオマックス（Biomax，登録商標）４０２４，４０２６又は４０２７であり、該エコフレックス（Ecoflex，登録商標）がエコフレックス（Ecoflex，登録商標）Ｆ及びＳグレードである，請求項８の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は，ポリエステルを分解する新規の菌株に関し，より詳しくは，堆肥より分離された，ポリエステルを分解することのできる好熱性の菌株及びその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般に芳香族ポリエステルは生分解性がなく，一方脂肪族ポリエステルは生分解性を有することが知られている。芳香族ポリエステル，すなわち芳香族化合物，特にテレフタル酸をモノマーとして用いたポリエステル（例えば，ポリエチレンテレフタレート，ポリブチレンテレフタレートその他）は，繊維，不織布，ボトル，結紮テープ，紙コート，フィルムその他広範囲にわたり，膨大な量の様々な製品に使用されている。それらの製品は，使用済みとなった後，かなりの割合が焼却や埋め立てにより処分されている。芳香族ポリエステルの焼却は高温を発して焼却炉を傷め易く，焼却炉内で不完全燃焼を起こし易く，排気ガスの処理にもコストを要する上，焼却により温暖化ガスの一つである二酸化炭素を大気中に大量に放出してしまうという問題もある。一方，埋め立てによる処分は，処分場確保が益々困難になっており，また処分後にも自然に分解することがないため，そのままの形で残り続け，別の形で環境を汚染するという問題がある。従って，一つの重要な解決方向は，それらポリエステルを生分解により処理できるようにすることである。
【０００３】
このような事情を背景に，これまで多くの生分解性ポリマーが開発されてきた。実用的な生分解性ポリマーは，基本的にはポリエステル（ポリラクトン）である。それらは大きく，（１）微生物産生ポリエステル，（２）合成ポリエステル，及び（３）半合成ポリエステル（例えば，発酵生産物の乳酸を化学合成させたポリエステル）に分けることができる。このうち，（２）の合成ポリエステルに関しては，脂肪族ポリエステルからポリエチレンテレフタレートの類まで，種々の開発が行われてきた。しかしながら，脂肪族ポリエステルは生分解性に優れるものの，物性が劣っており，そのため用途が限定される。また常温で生分解性が高いものは，使用時に徐々に崩壊するため，実用性が低い。他方，芳香族ポリエステルであるポリエチレンテレフタレートについては，土壌からスクリーニングされた生育温度３０℃の分解菌（トリコスポロンＦＥＲＭ  ＢＰ−６４４５およびアルスロバクターＦＥＲＭ  ＢＰ−６４４４）が報告されている（特許文献１参照）。
【０００４】
尤も，ポリエチレンテレフタレートに関しては，現在までのところボトルとしての使用が主であるためリサイクルが行い易く，使用後に回収し，化学的に分解して原料を再生し，これを用いて再度芳香族ポリエステルを製造する等の形でリサイクルするシステムが確立されているため，これを徹底させることにより大半は処理できると見込まれる。また，芳香族脂肪族ポリエステル（本明細書において，原料モノマーのジカルボン酸として，芳香族ジカルボン酸及び脂肪族ジカルボン酸の双方を含むポリエステルをいう。）であるエコフレックス〔Ecoflex（登録商標）：ＢＡＳＦ製〕は，テレフタル酸，１，４−ブタンジオール及びアジピン酸のランダムコポリマーよりなるものであるが，堆肥より分離した好熱性放線菌Thermobifida fuscaなどにより分解されることが報告されている(非特許文献２参照)。
【０００５】
一方，強度，耐熱性その他の物性で優れ且つ生分解性を謳った芳香族脂肪族ポリエステルとして，バイオマックス（Biomax，登録商標，デュポン製）が市販されている。バイオマックスは，テレフタル酸，エチレングリコールオリゴマー及び脂肪族ジカルボン酸をモノマーとするポリマーであり，ポリエチレンテレフタレートに近い構造及び物性を有する。このポリマーは，常温で長期間変質することなく，しかも熱に強いため，繊維に加工してアイロン掛けも可能であることから，いずれ非常に広範な用途に大量使用されるようになると予測される。
【０００６】
バイオマックスは，その５０μｍの微細粒子が堆肥抽出液を接種したバイオリアクター中で５８℃にて分解されることが示されており，またその際のバイオリアクター中の菌の解析が行われているが，分解菌の特定には成功していない（非特許文献２参照）。またバイオマックスは，その優れた多用途性のため種々の製品に用いられるようになると考えられることから，ポリエチレンテレフタレートのような単純な形のリサイクルシステムには乗りにくく，回収したバイオマックスから直接に原料を再生して利用するという形のリサイクルシステムが処理の主流になる可能性は低い。このため，バイオマックスを用いた製品は，生分解性という特徴を利用して，多くは使用後に埋設処分されることが主流になると予想される。従って一旦は埋設されることから，処分場確保が容易でないことを考慮すれば，埋設処分されたバイオマックスが，埋設環境中で急速に生分解されることが非常に重要である。埋設処分されたバイオマックスの生分解速度が遅いと，処分場に次々と持ち込まれる廃棄物量の生分解が追いつかず，処分場内の未分解のバイオマックス量が急速に蓄積して，処分場の使用寿命を短縮する等の問題を生ずるからである。
【０００７】
一方，バイオマックスは，堆肥中で生分解性ではあるものの，もともと長期安定性が高く，且つ熱にも強いポリマーでもあるためか堆肥中の生分解の速度は遅い。しかしながら，もし堆肥中でのバイオマックスの生分解を速やかに進めることが可能になれば，同ポリマーをそれにより効率よく生分解することで，これを一原料とする堆肥の製造ができるようになる。このことは，同ポリマーを利用したリサイクル，すなわち，同ポリマーを原料に用いて堆肥を作成し，その堆肥により植物を育て，育てた植物からポリエステル原料となるモノマーを発酵等の方法により生産し，得られたモノマーを用いて再度同ポリマーを合成するというリサイクルが可能となることを意味する。ポリエステルの原料となるグリコールを植物原料から生産する方法は，既に知られている。従って，同ポリマーの堆肥中への埋設後の生分解を大きく促進させる何らかの手段があれば，その現実的なリサイクルへの途が切り拓かれることとなる。
【０００８】
通常，ポリマーの分解菌を得る方法としてハロー形成菌の検索が行われる。すなわち，ポリマーを溶剤に溶かして，無機塩などを含む寒天培地と混釈して乳濁寒天培地を作成する。これに微生物試料を塗布して出現するコロニーのうち，透明環（ハロー）を形成するものを分解菌とする方法である。しかしながら，バイオマックスは，アセトン，クロロホルム，テトラヒドロフラン等に溶解せず，乳濁寒天培地が作成できない。従って，如何にして分解菌を見つけるかという方法が全く確立されていなかった。
【特許文献１】特開２０００−１４３８６８号公報
【非特許文献１】Kleeberg et al. 1998, Appl. Environ. Microbiol., 64, 1731-1735.
【非特許文献２】Nagarajan et al.2006, J. Polym. Environ. 14, 281-287.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上記背景において，本発明は，ポリエステル，特に芳香族脂肪族ポリエステル，取り分けバイオマックスまたはエコフレックスに代表される，テレフタル酸とグリコールモノマーまたはオリゴマー及び脂肪族ジカルボン酸（Ｃ２〜Ｃ１２）をモノマーとして重合した芳香族脂肪族ポリエステル及び脂肪族ポリエステルを高い効率で分解する能力を有する微生物，及びこれを用いたポリエステルの分解処理方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは，上記能力を有する微生物を求めて検討し，堆肥中にそのような分解菌として放線菌株及び細菌株を見出し，それらを初めて単離し同定することに成功した。またそれらの菌の懸濁液を同ポリマーに適用すると堆肥に埋設したとき，菌の懸濁液を塗布せずに堆肥に埋設した対照ポリマーに較べて，極めて効率的に生分解されることから，これを同ポリマーの生分解促進を目的として使用できることも見出した。本発明は，これらの発見に基づいて完成されたものである。
【００１１】
すなわち，本発明は以下を提供する。
１．受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０８２７，ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０８２８，ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０８２９，及びＦＥＲＭ  Ｐ−２１５０７である各菌株より選ばれる菌株。
２．上記１の菌株であって，ポリエステル分解性を有し，該ポリエステルが芳香族脂肪族ポリエステル又は脂肪族ポリエステルであってよいものである，菌株。
３．該芳香族脂肪族ポリエステルが，芳香族ジカルボン酸としてテレフタル酸を，ジオールとしてグリコールモノマーまたはオリゴマーを，及び脂肪族ジカルボン酸としてＨＯＣ(Ｏ)(ＣＨ2)nＣ(Ｏ)ＯＨ（ここに，ｎは０〜１０の整数を表す。）を含んでなるモノマーの重合したポリエステルである，上記２の菌株。
４．該芳香族脂肪族ポリエステルがバイオマックス又はエコフレックスである，上記２又は３の菌株。
５．該バイオマックスが，バイオマックス４０２４，４０２６又は４０２７であり，該エコフレックスがＦ又はＳグレードである，上記４の菌株。
６．上記１ないし５の何れかの菌株を，分解処理すべきポリエステルの表面及び／又は該ポリエステルを埋設する堆肥に適用し，該ポリエステルを該堆肥中に埋設することにより，該菌株による該ポリエステルの促進された生分解反応を行なわせることを特徴とする，ポリエステルの分解処理方法。
７．該芳香族脂肪族ポリエステルが，芳香族ジカルボン酸としてテレフタル酸を，ジオールとしてグリコールモノマーまたはオリゴマーを，及び脂肪族ジカルボン酸としてＨＯＣ(Ｏ)(ＣＨ2)nＣ(Ｏ)ＯＨ（ここに，ｎは０〜１０の整数を表す。）を含んでなるモノマーの重合したポリエステルである，上記６の方法。
８．該芳香族脂肪族ポリエステルがバイオマックス及びエコフレックスである，上記６又は７の方法。
９．該バイオマックスが，バイオマックス４０２４，４０２６又は４０２７であり，該エコフレックスがエコフレックＦ及びＳグレードである，上記８の方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明は，広くポリエステル全般の分解，特に好ましくはバイオマックス，エコフレックス等のような芳香族脂肪族ポリエステル及び脂肪族ポリエステルの生分解の促進により，これらの素材の減量化という形で廃棄物の処理に寄与する。更には，本発明の菌株は温度の高い堆肥中で特に効率的に増殖してポリエステルを生分解するため，本発明の菌株を加えて堆肥中でそれらのポリエステルを生分解させることにより，ポリエステルを一原料とする堆肥を製造することができる。従って，本発明は，ポリエステルをリサイクルさせること，すなわち，ポリエステル廃材を一原料として用いて堆肥を作成し，これを利用して植物を育成し，育った植物からポリエステル原料となるモノマーを発酵等により製造し，これを用いて。ポリエステルを再生産するという形でのリサイクルを実現可能にする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明において，「ポリエステル」とは，芳香族，芳香族脂肪族及び脂肪族ポリエステルを含み，好ましくは芳香族脂肪族及び脂肪族ポリエステルを対象とする。これらのうち，芳香族脂肪族ポリエステルとして好ましい一例は，芳香族ジカルボン酸として，特にテレフタル酸を用い，ジオールとしてＣ２〜Ｃ４のグリコールモノマー及び／又はオリゴマーを用い，更に，脂肪族ジカルボン酸としてＨＯＣ(Ｏ)(ＣＨ2)nＣ(Ｏ)ＯＨ（ここに，ｎは０〜１０の整数を表す。）含む原料を重合させることにより製造したポリエステルである。特に好ましい例としては市販のバイオマックス（Biomax（登録商標），デュポン製），例えばバイオマックス４０２４，４０２６，４０２７等，及びエコフレックス〔Ecoflex（登録商標）：ＢＡＳＦ製〕，例えばエコフレックスＦ及びＳグレードである。
【００１４】
本発明において，上記芳香族脂肪族ポリエステル，特にバイオマックスの分解菌の探索及び同定は次のようにして行うことができる。すなわち，分解の有無を調べようとする芳香族脂肪族ポリエステルのフィルムを堆肥中に適当な期間（例えば約２週間）埋設する。フィルムに分解が認められたとき，分解部位に菌が付着しているか否かを確認する。菌が付着していることが確認できたときは，付着菌を，変性ゲル濃度勾配電気泳動を用いる等の適宜の手段で解析する。フィルムを引き続き堆肥中に埋設して分解を進行させ，十分に分解菌が付着したフィルム取り出して緩衝液中にてミキサーで撹拌することにより付着菌を分離させ，５０℃にて一夜保温する。この液（懸濁液）を，約０．１重量％の割合で上記ポリエステルの粉末を含有する培地（例えば，ＬＢ培地）に塗布し，出現するコロニーをそれぞれ採取して単離する。各単離菌について，次の方法で該ポリエステルの分解に関する菌の特性を確認する。すなわち：
(1) 該ポリエステルのフィルムに菌体懸濁液を塗り付け，内部温度６０ C前後の堆肥に埋設し，約２週間後に回収して何も塗布していないフィルムと比較して分解促進を肉眼観察と分子量測定で判定する。
(2) 該ポリエステル粉末をオートクレーブ（１２１ Ｃ，６時間）処理して部分水解し，部分水解物を得る（元のポリマー粒子は水中で直ぐに沈殿し懸濁液を作らないが，この条件での部分水解に付したポリマー粒子は，水中で懸濁状態を形成するものと沈殿するものとに分離する。このうち，懸濁状態を保った上清を沈殿から分離して，部分水解物とする。部分水解物には元の分子量に近いポリマーからオリゴマーまでが含まれる。）。この部分水解物を無機塩培地に添加し，これに菌体を加えて，濁度の減少を観察する。
(3) 上記(2)の培地に生成するテレフタル酸の増加を２６０ｎｍの吸光度で測定する。
これらの方法に基づき，分解菌を分離する。分離された菌は，１６Ｓ ｒＤＮＡ解析に基づき同定を行うことができる。これら３種の分解確認方法の全てで分解が確認されたものを，目的のポリエステル分解菌とする。〔但し，この項目(3)は細菌に関しては除外する。細菌の生育は濁度を増加させるため，ポリマー濁度の減少と相殺されるためである。〕
【００１５】
本発明のポリエステル分解菌は，ポリエステル廃材を堆肥に埋設するに際して，ポリエステル廃材の表面に塗布，噴霧などすることにより適用してもよく，又は堆肥に噴霧，注入する等して適用してもよく，或いはポリエステル廃材と堆肥との双方に適用してもよい。こうして堆肥中に埋設されたポリエステル廃材は，堆肥中の高温で好適に増殖する本発明の分解菌により，堆肥中の高温条件下に速やかに生分解されて堆肥の一部となることができる。
【実施例】
【００１６】
以下，実施例を参照して本発明をより具体的に説明するが，本発明が当該実施例に限定されることは意図しない。
【００１７】
〔実施例１〕
１．分解菌の探索及び同定
芳香族脂肪族ポリエステルとしてバイオマックス〔Biomax（登録商標）〕４０２４，４０２６及び４０２７製の市販のフィルム（０．０４０ｍｍ厚）を入手した。バイオマックスはエコフレックス〔Ecoflex（登録商標），ＢＡＳＦ製〕よりも耐熱性がはるかに高く，より難生分解性である。当該フィルムを７×７ｃｍのサイズに切断し，メッシュ袋に入れ，これをプラスチック製の鎖に括りつけて，内部温度約６０℃の堆肥に埋設し，約２〜３週間放置した後，フィルムを取り出した。外観を観察し，何れのフィルムも，フィルムの一部，特に周辺部が分解していることが確認された。各フィルムから付着している菌を採取し，以下に述べるようにして１６Ｓ ｒＤＮＡに基づく変性剤ゲル濃度勾配電気泳動（ＤＧＧＥ；Denaturing Gradient Gel Electrophoresis）により解析した。ＤＧＧＥ用プライマーとしては、配列番号１及び２に示すものを用いた。
【００１８】
堆肥から取り出した各フィルムからＤＮＡを，PowerSoil DNA Isolation kit (MO BIO)を使い，キットに添付のプロトコルに従って抽出した。抽出したＤＮＡはエタノール沈殿で精製し，３０μＬのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０）に溶解した。このうち５ｎｇ分を使ってＰＣＲを行った。ＰＣＲに使用したプライマーは，16S-338-f-GC（配列番号３）及び16S-517-r（配列番号４）（Muyzer, G. et al., Profiling of complex microbial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction-amplified genes coding for 16S rRNA. Appl Environ Microbiol. 59. pp.695-700(1993).）である。ＤＮＡポリメラーゼにはExTaq（TaKaRa）を用い，緩衝液としては粗精製ＤＮＡ用のAmpdirect（登録商標）（Shimadzu）を使用した。ＰＣＲ産物はエタノール沈殿後，２０μＬのＴＥ緩衝液に溶解した。変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法には１０μＬを使用した。
【００１９】
ＰＣＲ条件は以下のとおりであった。
〔反応液組成〕
ＤＮＡ溶液・・・・・・５μＬ
５× Ampdirect・・・１０μＬ
ｄＮＴＰ・・・・・・・４μＬ
16S-338-f-GC  ・・・・２．５μＬ
16S-517-r ・・・・・・２．５μＬ
ExTaq ・・・・・・・・０．２５μＬ
超純水・・・・・・・２５．７５μｌ
全量・・・・・・・・５０μＬ
〔反応温度及び時間〕
(1) ９４℃２分，次いで
(2) ９４℃３０秒，５５℃１分及び７２℃１分の３５サイクル，及び
(3) ７２℃２分
【００２０】
ＤＧＧＥゲルは，８％ポリアクリルアミドで，変性剤濃度は３５−６５％であった（変性剤濃度１００％は，７Ｍ  尿素及び４０％（ｖ／ｖ）ホルムアミドを含む）。泳動は，１ｘＴＡＥ緩衝液（４０ｍＭ Ｔｒｉｓ-acetate，１ｍＭ ＥＤＴＡ，pH８．０）を用い，６０℃，７５Ｖで，７５０分行った。泳動後，ゲルは，超純水（Milli-Q水，MILLIPORE CORP.）で希釈したSYBR Green I (INVITROGEN)で３０分間染色した。バンドはカッターで切り出し，０．２ｍＬ  ＰＣＲチューブに入れた３００μＬ程度の超純水で洗浄後，３０μＬ程度のＴＥ緩衝液中−２０℃で保存した。
【００２１】
各バンドの塩基配列を決定するため，ＤＮＡ断片のＰＣＲ再増幅を行った。ＴＥ緩衝液中で保存しておいたＤＧＧＥバンドをイエローチップの先で砕き，１μＬをＰＣＲテンプレートとした。
【００２２】
ＰＣＲ条件は以下のとおりであった。
〔反応液組成〕
ＤＮＡ溶液・・・・・・・・１μＬ
１０× ExTaq緩衝液・・・・１．５μＬ
ｄＮＴＰ（２５ｍＭ）・・・１．２μＬ
16S-338-f-GC  ・・・・・・０．７５μＬ
16S-517-r ・・・・・・・・０．７５μＬ
ExTaq ・・・・・・・・・・０．２５μＬ
超純水・・・・・・・・・・９．５５μＬ
全量・・・・・・・・・・１５μＬ
〔反応温度及び時間〕
(1) ９４℃２分，次いで
(2) ９４℃３０秒，５５℃３０分及び７２℃１分の２５サイクル，及び
(3) ７２℃２分
【００２３】
ＰＣＲ産物は再びＤＧＧＥを行い，増幅産物が単一のバンドになっているか否かを確認した。単一でない場合，再び目的のバンドを切り出し，再増幅，ＤＧＧＥ解析を行った。単一のバンドとなったサンプルは，シークエンス解析を行った。シークエンス解析を行うＰＣＲ産物は，２％アガロースゲルで泳動後，ゲルから切り出し，MagExtractor（磁性ビーズ利用核酸抽出・精製キット，TOYOBO）を用いて精製した。１２μＬのＴＥ緩衝液でＰＣＲ断片を溶出した。16S-338-fプライマー（配列番号５）を用いてBigDye Terminator v1.1 (APPLIED BIOSYSTEMS)でシークエンス反応を行った後，ABI3100（APPLIED BIOSYSTEMS）で解析を行った。
【００２４】
表１及び図１に結果を示す。
【００２５】
【表１】
0004625900.tif 000002
【００２６】
これらの結果から，バチルス属細菌および放線菌が同ポリマーの分解に関わっていることが推定された。十分量の菌が付着するよう上記の堆肥中により長期間（４週間）埋設しておいた上記ポリマー（バイオマックス４０２４，４０２６，４０２７）の各シートにつき数断片を取り出し，５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）５０ｍＬに加え，スターラーで撹拌して付着菌を分離させ，菌液を５０℃にて一夜保温した。この菌液（懸濁液）を，上記ポリマーの粉末（Biomax（登録商標）４０２６粉末，平均粒径２５０μｍ）の部分水解物（調製方法は前記に同じ。）を０．１％の濃度で含有するＬＢ寒天培地（ｐＨ７．５）に塗布し，５０℃で培養して，出現したコロニーを観察した。出現したコロニーを同寒天培地上で繰り返し培養して純培養を得た。
【００２７】
上記で分離した菌について，上記ポリマーの分解能力に関し次の（１）〜（３）の方法を用いて確認した。すなわち：
（１）上記ポリマーのフィルム（各７×７ｃｍ）のそれぞれに，上記で分離した各菌体懸濁液（培養液換算で４〜５ｍＬ／片面）を塗り付けた。これらの菌体塗布フィルムと，無処置のフィルム（対照フィルム）とを，メッシュ袋に入れ，これをプラスチック製の鎖に括りつけたものを，内部温度約６０℃の堆肥に埋設し，約２〜３週間放置した後，フィルムを取り出した。菌の懸濁液を塗布したフィルムと，何も塗布しなかった対照フィルムの外観を肉眼観察して比較すると共に，分子量測定により判定した。方法及び判定基準は次のとおりである。
〔分子量測定方法〕
分子量測定は，ゲル濾過クロマトグラフィー（GPC：gel permeation chromatography）により，以下の条件で行い，対照フィルムと比べて分子量低下の認められたものを分解促進と判定した。
GPC装置：Shodex GPC104
カラム：Shodex GPC HFIP606M ×２（２本連結）
溶出液：５ｍＭトリフルオロ酢酸ナトリウム含有ヘキサフルオロイソプロパノール
速度：０．３ｍＬ／分
カラム温度：４０℃
検出：ＲＩ
分子量標準：ポリメタクリル酸メチル（Polymer Laboratories, USA)
（２）上記ポリマー粉末の部分水解物（調製方法は前記に同じ。）を下記の無機塩培地にポリマー濃度約０．１％（Ａ610   約１．０）になるように添加して分散させた。これに予めＬＢ培地で生育させておいた菌を数％接種して，５０〜６０℃にて２週間培養し，懸濁状態のポリマー粉末の分解による濁度の減少を観察した。
〔無機塩培地〕
ＫＨ2ＰＯ4   ・・・・・・・・・・  ４．５ｇ
Ｎａ2ＨＰＯ4   ・・・・・・・・・  ４．７ｇ
ＮＨ4Ｃｌ  ・・・・・・・・・・・  １．０ｇ
ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ   ・・・・・・  ０．５ｇ
クエン酸第二鉄アンモニウム  ・・  ５０．０ｍｇ
ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ ・・・・・・・  ５．０ｍｇ
酵母エキス          ・・・・・・・  ０．５ｇ
カゼイン加水分解物  ・・・・・・・  ０．１ｇ
ｐＨ  ７．５
（３）上記(2)の培地に生成するテレフタル酸の増加を２６０ｎｍの吸光度で測定した。
【００２８】
上記３種の確認方法において（但し細菌については生育に伴って濁度が増加するため，(2)は適用できないことから，項目から除外）において芳香族ポリエステルの実質的な分解能力が確認された菌を，芳香族ポリエステル分解菌として分離し，ＡＨＫ１０９（放線菌），ＡＨＫ１１９（放線菌），及びＢＨＫ２５（細菌）とした。
【００２９】
分離されたこれら分解菌についての確認試験結果を表２に示す。また，確認試験(1)におけるポリマーフィルム分解状態についての典型例を図面代用写真である図２（対照），図３（菌株ＡＨＫ１０９），図４（菌株ＡＨＫ１１９），図５（菌株ＢＨＫ２５）に，また確認試験(2)の濁度低下例の外観の図面代用写真を図６に示す（左側；菌培養液，右側；対照）。
【００３０】
【表２】
0004625900.tif 000003
【００３１】
注１）菌体を付着させなかった対照と比較して目視および分子量測定の結果，分解に実質的促進が認められたものを＋とし，分解の程度に応じて，＋＋（中等度の促進），＋＋＋（甚だしく促進してフィルムが断片化）とした。フィルムが断片化したものは，フィルムの分子量も低下していた。
注２）この方法は，菌が分解物に生育する場合は菌体による濁度増加とポリマー粒子の減少が相殺されるため，利用できない。放線菌は菌糸をつくるため，濁度への影響は小さいが，細菌は粒子と細胞の区別がつかない。Ｎ．Ｄ．:菌体増殖と相殺されて測定不可能。
注３）対照と比べて，２６０ｎｍの吸収が顕著に認められたものを「＋」とした。
注４）上記１）〜３）の結果と分解で生じるテレフタル酸への生育から総合的に判定。
【００３２】
上記の図に見られるように，本発明の菌の懸濁液を塗布せずに堆肥中に２週間埋設したバイオマックスフィルムでは周辺部が分解したに止まったのに対し，本発明の菌株の何れを塗布して堆肥中に同期間埋設したバイオマックスフィルムも，細かな断片群へと分解されており，このことは，本発明の菌株が試験した芳香族ポリエステルを分解する高い能力を有することを示している。またＡＨＫ１０９及びＢＨＫ２５は，テレフタル酸も資化した。
【００３３】
これらの菌株の各々につき，１６Ｓ ｒＤＮＡの塩基配列を決定し。これを日本ＤＮＡデータバンク（DNA Data Bank of Japan：ＤＤＢＪ）に，次の登録番号で登録した。各１６Ｓ ｒＤＮＡの塩基配列を併せて示す。なお既存の菌株のデータバンクに完全同一のものは見出せず，本発明の菌株が新規の菌株であることが確認された。
寄託菌の１６Ｓ  ｒＤＮＡ登録（ＤＤＢＪ）
（１）ＡＨＫ１０９：  ＡＢ３００４３２（配列番号６）
（２）ＡＨＫ１１９：  ＡＢ２９８７８３（配列番号７）
（３）ＢＨＫ２５：    ＡＢ３００７７４（配列番号８）
【００３４】
上記の芳香族ポリエステル分解菌ＡＨＫ１０９，ＡＨＫ１１９及びＢＨＫ２５は，特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約に基づき，２００７年５月１７日付けで，独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに，それぞれ次の受託番号を以って国際寄託されている。
（１）菌株ＡＨＫ１０９：  ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０８２８
（２）菌株ＡＨＫ１１９：  ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０８２９
（３）菌株ＢＨＫ２５：    ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０８２７
【００３５】
上記及び以下の試験結果に基づいて，これら各菌株の分類学上の位置を次のとおりに判定した。
（１）菌株ＡＨＫ１０９：  Streptomyces sp.
（２）菌株ＡＨＫ１１９：  Thermobifida alba
（３）菌株ＢＨＫ２５：  Ureibacillus thermosphaericus
（なお上記国際寄託の申請に際して，菌株ＡＨＫ１１９の分類学上の位置をThermomonospora sp.としたが，その後の１６Ｓ ｒＤＮＡ及び生理試験の結果に基づき上記のThermobifida albaに修正し，２００７年６月２６日付で上記国際寄託について当該変更を届け出てある。）
【００３６】
本発明の芳香族ポリエステル分解菌株ＡＨＫ１１９及びＡＨＫ１０９の菌学的性質を以下に示す。
【００３７】
【表３−１】
0004625900.tif 000004
【００３８】
【表３−２】
0004625900.tif 000005
【００３９】
上記において，各ＩＳＰ培地の組成は次のとおりである。
（１）ＩＳＰ培地Ｎｏ．２（イースト・麦芽寒天培地）
イーストエキス  ・・・・・・  ４ｇ
麦芽エキス  ・・・・・・・  １０ｇ
グルコース  ・・・・・・・・  ４ｇ
脱イオン水  ・・・・・  １０００ｍＬ
寒天  ・・・・・・・・  １５〜２０ｇ
ｐＨ７．３
（２）ＩＳＰ培地Ｎｏ．３（オートミール寒天培地）
オートミール  ・・・・・・・・  ２０ｇ
微量塩液*  ・・・・・・・・・・・  １ｍＬ
脱イオン水  ・・・・・・・  １０００ｍＬ
寒天  ・・・・・・・・・・・・  １８ｇ
ｐＨ７．２
オートミールを脱イオン水１０００mL中で２０分間煮た後，チーズ濾布で濾過し，減量分を脱イオン水で補う。これに微量塩液を加えてpHを調整した後，寒天を加える。
＊）微量塩液
ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  ・・・・・  ０．１ｇ  
ＭｎＣｌ2・４Ｈ2Ｏ  ・・・・・  ０．１ｇ
ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  ・・・・・  ０．１ｇ
脱イオン水  ・・・・・・・・  １００ｍＬ
（３）ＩＳＰ培地Ｎｏ．４（スターチ・無機塩寒天培地）
液Ｉ：可溶性デンプン１０ｇを少量の冷脱イオン水でペースト状とし，さらに薄めて５００ｍＬとする。
液II：
Ｋ2ＨＰＯ4   ・・・・・・・・・  １ｇ  
ＭｇＳＯ4・7Ｈ2Ｏ  ・・・・・・  １ｇ
ＮａＣｌ  ・・・・・・・・・・・  １ｇ
（ＮＨ4）2ＳＯ4  ・・・・・・・  ２ｇ  
ＣａＣＯ3   ・・・・・・・・・・  ２ｇ
脱イオン水  ・・・・・・・・  ５００ｍＬ
微量塩液（上記（２）に同じ）・・・  １ｍＬ
上記液Ｉ及び液IIを混合し，寒天１５〜２０ｇを加える。
（４）ＩＳＰ培地Ｎｏ．５（グリセリン・アスパラギン寒天培地）
グリセリン  ・・・・・・・・・・  １０ｇ
Ｌ−アスパラギン  ・・・・・・・・  １ｇ
Ｋ2ＨＰＯ4  ・・・・・・・・・・・  １ｇ
脱イオン水  ・・・・・・・・  １０００ｍＬ
微量塩液（上記（２）に同じ）・・・  １ｍＬ
寒天  ・・・・・・・・・・・・・・  １５〜２０ｇ
ｐＨ７．０〜７．４
（５）ＩＳＰ培地Ｎｏ．６（ペプトン・イースト・鉄寒天培地）
（I）ペプトン・鉄寒天*  ・・・・・・  ３６．５８ｇ
（II）イーストエキス   ・・・・・・・・  １ｇ  
（III）脱イオン水  ・・・・・・・  １０００ｍＬ
ｐＨ７．０〜７．２
上記（I）〜(III)を混和しｐH７．０〜７．２とする。
＊）ペプトン・鉄寒天
ペプトン  ・・・・・・・・・・・  １５ｇ
プロテオース・ペプトン  ・・・・・  ５ｇ
クエン酸鉄アンモニウム  ・・・・・  ０．５ｇ
Ｋ2ＨＰＯ4  ・・・・・・・・・・・  １ｇ
Ｎａ2Ｓ2Ｏ3   ・・・・・・・・・・  ０．０８ｇ
寒天  ・・・・・・・・・・・・・  １５ｇ
（６）ＩＳＰ培地Ｎｏ．７（チロシン寒天培地）
グリセリン  ・・・・・・・・・・  １５ｇ
Ｌ−チロシン  ・・・・・・・・・・  ０．５ｇ
Ｌ−アスパラギン  ・・・・・・・・  １ｇ
Ｋ2ＨＰＯ4   ・・・・・・・・・・  ０．５ｇ
ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ   ・・・・・・  ０．５ｇ
ＮａＣｌ  ・・・・・・・・・・・・  ０．５ｇ
ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  ・・・・・・  １０ｍｇ
脱イオン水  ・・・・・・・・  １０００ｍＬ
微量塩液（上記（２）に同じ）・・・  １ｍＬ
寒天  ・・・・・・・・・・  １５〜２０ｇ
ｐＨ７．２〜７．４
（７）ＩＳＰ培地Ｎｏ．９（プリドハム・ゴトリーブ寒天培地）
（ＮＨ4）2ＳＯ4  ・・・・・・・・・・  ２．６４ｇ
ＫＨ2ＰＯ4  ・・・・・・・・・・・・・  ２．３８ｇ
Ｋ2ＨＰＯ4  ・・・・・・・・・・・・・  ５．６５ｇ
ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  ・・・・・・・・・  １ｇ
脱イオン水  ・・・・・・・・・・・  １０００ｍＬ
プリドハム・ゴトリーブ微量塩液*  ・・・  １ｍＬ
＊）プリドハム・ゴトリーブ微量塩液
ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ  ・・・・・０．６４ｇ
ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ・・・・・０．１１ｇ
ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ  ・・・・・０．７９ｇ
ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ・・・・・０．１５ｇ
脱イオン水  ・・・・・・・・・・１００ｍＬ
【００４０】
また，本発明の芳香族ポリエステル分解菌株ＢＨＫ２５の菌学的性質を以下に示す。培養条件は次のとおりであった。
〔培養条件〕
培地  ＬＢ寒天（Becton Dickinson, MD, USA）
培養温度  ５０℃
培養時間  ２４時間
【００４１】
【表４】
0004625900.tif 000006
【００４２】
注４）グリセロール，エリスリトール，Ｄ≡アラビノース，Ｌ≡アラビノース，リボース，Ｄ≡キシロース，Ｌ≡キシロース，アドニトール，β≡メチル−Ｄ≡キシロシド，ガラクトース，グルコース，フラクトース，マンノース，ソルボース，ラムノース，ズルシトール，イノシトール，マンニトール，ソルビトール，α≡メチル−Ｄ≡マンノシド，    α≡メチル−Ｄ≡グルコシド，Ｎ−アセチルグルコサミン，アミグダリン，アルブチン，エスクリン，サリシン，セロビオース，マルトース，乳糖，メリビオース，白糖，トレハロース，イヌリン，メレチトース，ラフィノース，澱粉，グリコーゲン，キシリトール，ゲンチオビオース，Ｄ≡ツラノース，Ｄ≡リキソース，Ｄ≡タガトース，Ｄ≡フコース，Ｌ≡フコース，Ｄ≡アラビトール，Ｌ≡アラビトール，グルコネート，２≡ケトグルコン酸，５≡ケトグルコン酸。
【００４３】
〔実施例２〕
１．分解菌の探索及び同定
実施例１と同様の手順で，バイオマックス〔Biomax（登録商標）〕フィルムを堆肥に長期間埋設しておいた後に取り出し，付着菌を分離して，菌液（懸濁液）を，バイオマックスの粉末の部分水解物を含有するＬＢ寒天培地に塗布し，培養して，出現したコロニーを観察し，１個のコロニーを同寒天培地上で繰り返し培養して純培養を得た。こうして得られた分離菌（ＡＨＫ１９０）について，実施例１と同様の方法で，バイオマックスに対する分解能力を確認した。結果を表５に示す。
【００４４】
【表５】
0004625900.tif 000007
【００４５】
表５に見られるとおり，この菌株ＡＨＫ１９０は，バイオマックスフィルムに対して，実施例１の３菌株と同等の優れた分解能力を示した。
【００４６】
得られた菌株について決定した１６Ｓ ｒＤＮＡの塩基配列を，日本ＤＮＡデータバンク（DNA Data Bank of Japan：ＤＤＢＪ）に，次の登録番号で登録した。その塩基配列を併せて示す。既存の菌株のデータバンクに完全同一のものは見出せず，本発明の菌株が新規の菌株であることが確認された。
ＡＨＫ１９０：  ＡＢ３７６２２８（配列番号９）
１６Ｓ ｒＤＮＡ配列と生理試験に基づいて、当該菌株の分類学上の位置をSaccharomonospora viridis．と判定した。
得られた菌は，２００８年２月１３日付けで，独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに，受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１５０７を以って国内寄託されている。
【００４７】
この芳香族ポリエステル分解菌ＡＨＫ１９０の菌学的性質を次の表に示す。
【００４８】
【表６−１】
0004625900.tif 000008
【００４９】
【表６−２】
0004625900.tif 000009
【産業上の利用可能性】
【００５０】
本発明の菌株は，テレフタル酸とグリコールモノマーまたはオリゴマー及び脂肪族ジカルボン酸をモノマーとして用いた芳香族脂肪族ポリエステルに作用して分解を促進し，且つ堆肥中で高い分解能力を有するため，同ポリマー廃材を用いた堆肥の生産，得られた堆肥による植物の育成，育成された植物からのポリエステル原料の製造，使用，廃棄処分後の堆肥生産への利用という形でのリサイクルを実現するために用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】フィルム付着菌の１６Ｓ ｒＤＮＡに基づく変性ゲル濃度勾配電気泳動結果を示す
【図２】対照フィルムの分解状態を示す図面代用写真
【図３】ＡＨＫ１０９菌体塗布フィルムの分解状態を示す図面代用写真
【図４】ＡＨＫ１１９菌体塗布フィルムの分解状態を示す図面代用写真
【図５】ＢＨＫ２５菌体塗布フィルムの分解状態を示す図面代用写真
【図６】懸濁ポリマー粉末の分解による濁度の減少例を示す図面代用写真
【図７】菌株ＡＨＫ１０９のコロニー表面形状を示す図面代用写真
【図８】菌株ＡＨＫ１１９のコロニー表面形状を示す図面代用写真
【図９】菌株ＡＨＫ１０９の気菌糸の形状及び胞子形成を示す図面代用写真
【図１０】菌株ＡＨＫ１１９の気菌糸の形状及び胞子形成を示す図面代用写真
【図１１】菌株ＡＨＫ１９０のコロニー表面形状を示す図面代用写真
【図１２】菌株ＡＨＫ１９０の気菌糸の形状及び胞子形成を示す図面代用写真
【図１】
0004625900.tif 000010
【図２】
0004625900.tif 000011
【図３】
0004625900.tif 000012
【図４】
0004625900.tif 000013
【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
0004625900.tif 000018
【図１０】
0004625900.tif 000019
【図１１】
0004625900.tif 000020
【図１２】
0004625900.tif 000021
【配列表】
0004625900000001.app