(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリジビニルベンゼンのポリアミン誘導化形態にある酸化窒素放出性のポリマーであって、該ポリマーが、一般式：
【化１】
0004796262.tif 000013
〔式中、
Ｒ1 〜Ｒ4 は、同じでも異なっていてもよく、Ｈ、フェニル、ベンジル、ビニルベンゼン、ジビニルベンゼン、置換若しくは未置換のアルキル、又は置換若しくは未置換のアリールであり；
Ｘ1 〜Ｘ4 は、同じでも異なっていてもよく、Ｈ、ハロゲン、置換若しくは未置換のアルキル、又は置換若しくは未置換のアリールであり；
但し、得られるポリマー主鎖が疎水性のままであり；
Ｒ5 及びＲ6 の少なくとも一方が：
【化２】
0004796262.tif 000014
（Ｒ8 は、単結合か又は置換若しくは未置換のＣ1-12アルキルであり；そして
Ｒ9 〜Ｒ13は、Ｈ又はＮ2 Ｏ2 - である。但し、Ｒ9 〜Ｒ13の少なくとも１つはＮ2 Ｏ2 - であるものとする。）であるか、又は、式：
【化３】
0004796262.tif 000015
のジアゼニウムジオレート化されたピペラジンであり、Ｒ5 及びＲ6 の残りが、Ｒ1 がとり得る基と同じ基である。〕
を有するポリマー。
【請求項２】
マイクロビーズを形成している、請求項１のポリマー。
【請求項３】
非晶質塊を形成している、請求項１のポリマー。
【請求項４】
前記マイクロビーズが１〜１００μｍ（１０００〜１００，０００ｎｍ）の直径を有する、請求項２のポリマー。
【請求項５】
前記マイクロビーズが気孔を有する、請求項２のポリマー。
【請求項６】
前記マイクロビーズが５〜５００，０００オングストローム（０．５〜５０，０００ｎｍ）の大きさの気孔を有する、請求項５のポリマー。
【請求項７】
前記非晶質塊が気孔を有する、請求項３のポリマー。
【請求項８】
前記非晶質塊が５〜５００，０００オングストローム（０．５〜５０，０００ｎｍ）の大きさの気孔を有する、請求項３のポリマー。
【請求項９】
Ｒ5 及びＲ6 の少なくとも一方が、ジアゼニウムジオレート化されたピペラジンである、請求項１〜８のいずれか１項のポリマー。
【請求項１０】
ブロム化ポリジビニルベンゼンマイクロビーズとメトキシメチル１−（ピペラジン−１−イル）−１−ジアゼニウム−１，２−ジオレートとの反応により得られるピペラジン誘導化ポリジビニルベンゼンマイクロビーズのポリ（メトキシメチルモノジアゼニウムジオレート）誘導体。
【請求項１１】
請求項１〜９のいずれか１項のポリマー又は請求項１０の誘導体を含んでなる治療剤。
【請求項１２】
請求項１〜９のいずれか１項のポリマー又は請求項１０の誘導体を含んでなる医療デバイスであって、前記医療デバイスが、ステント、血管移植片、ペースメーカーリード線、心臓弁、電極、センサー、トロカール、ガイドワイヤー、カテーテル、ペニスインプラント、コンドーム、タンポン、生理用ナプキン、眼のレンズ、吊るし材料、縫合糸、創傷包帯／バンテージ、採血バッグ及び保存チューブ、輸血及び血液透析に使用されるチュービングからなる群から選択される医療デバイス。
【請求項１３】
請求項１〜９のいずれか１項のポリマー又は請求項１０の誘導体を含んでなる医療デバイスコーティングであって、前記医療デバイスが、ステント、血管移植片、ペースメーカーリード線、心臓弁、電極、センサー、トロカール、ガイドワイヤー、カテーテル、ペニスインプラント、コンドーム、タンポン、生理用ナプキン、眼のレンズ、吊るし材料、縫合糸、創傷包帯／バンテージ、採血バッグ及び保存チューブ、輸血及び血液透析に使用されるチュービングからなる群から選択されるコーティング。
【請求項１４】
ヒト又は動物における虚血を治療するために、前記ヒト又は動物の特定位置に施与される、請求項１２のデバイス。
【請求項１５】
血管ステントである、請求項１４のデバイス。
【請求項１６】
１〜２０μｍ（１，０００〜２０，０００ｎｍ）の直径と５〜１００，０００オングストローム（０．５〜１０，０００ｎｍ）の気孔度の前記ポリマーのマイクロビーズの血管内投与を含んでなる治療に使用する、請求項１５のデバイス。
【請求項１７】
１〜２０μｍ（１，０００〜２０，０００ｎｍ）の直径と５〜１００，０００オングストローム（０．５〜１０，０００ｎｍ）の気孔度の前記ポリマーの非晶質塊の血管内投与を含んでなる治療に使用する、請求項１５のデバイス。
【請求項１８】
１〜２０μｍ（１，０００〜２０，０００ｎｍ）の直径と５〜１００，０００オングストローム（０．５〜１０，０００ｎｍ）の気孔度の前記ポリマーのマイクロビーズの心臓周辺嚢への導入を含んでなる治療に使用する、請求項１５のデバイス。
【請求項１９】
１〜２０μｍ（１，０００〜２０，０００ｎｍ）の直径と５〜１００，０００オングストローム（０．５〜１０，０００ｎｍ）の気孔度の前記ポリマーの非晶質塊の心臓周辺嚢への導入を含んでなる治療に使用する、請求項１５のデバイス。
【請求項２０】
ヒト又は動物における感染症を治療するために、前記ヒト又は動物に施与される、請求項１２のデバイスであって、ステント、トロカール、ガイドワイヤー、タンポン、生理用ナプキン、創傷包帯／バンテージ、血管移植片、縫合糸を含んでなるデバイス。
【請求項２１】
ヒトを除く動物のための、チュービングを介する輸血、透析及び他の血液成分の投与の間、血液凝集を阻止し及び無菌環境を維持する方法であって、該チュービングを、請求項１のポリマー又は請求項１０の誘導体とブレンドするか又は該ポリマー又は誘導体でコーティングすることを含んでなる方法。
【請求項２２】
ヒト又は動物血液のために血液凝集を阻止し及び無菌環境を維持する採取及び保存デバイスを含んでなる哺乳動物の血小板を保存する方法であって：
新鮮な血液を採取し；
前記血液から血小板を分離し；
前記単離された血小板を、請求項１のポリマー又は請求項１０の誘導体を含んでなる血液保存バッグ内に入れること
を含んでなる方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、一般的には、高度に架橋しかつ極度に疎水性のポリマーを製造する方法を提供する。本発明は、生理的条件下で酸化窒素の長期間放出を提供することができる高度に架橋しかつ極度に疎水性のポリマーに関する。特定的には、本発明は、高度に架橋しかつ極度に疎水性のポリマーを治療剤として使用することに関する。より特定的には、本発明は、酸化窒素放出性の高度に架橋しかつ極度に疎水性のポリマーから製造される医療デバイスに向けられている。
【０００２】
【従来の技術】
酸化窒素（ＮＯ）は、内皮細胞、神経細胞及びマクロファージを包含する殆ど全ての組織に見られる強力なシグナリング化合物でありかつ細胞増殖抑制剤である単純な２元素分子である。哺乳動物細胞は、Ｌ−アルギニンをＮ−ω−ヒドロキシ−Ｌ−アルギニンに酸化し、次いで、それがＬ−シトルリンと未荷電のＮＯフリーラジカルに転化されるといった、２段階酵素プロセスを使用して、ＮＯを合成する。３つの異なる酸化窒素シンターゼ酵素がＮＯ産生を調節している。神経酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳ１又はｎＮＯＳ）は、神経組織内で形成されて神経伝達に必須の役割を果たし；内皮酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳ３又はｅＮＯＳ）は、内皮細胞によって分泌されて血管拡張を誘発し；誘導性酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳ２又はｉＮＯＳ）は、主に、マクロファージ、肝細胞及び軟骨細胞内に見出され、免疫細胞障害に関連している。
【０００３】
神経性ＮＯＳ１又はｎＮＯＳは、少量のＮＯの迅速かつ短時間の放出を調節する。この僅かな量で、ＮＯは、環状グアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）濃度を高めるグアニル酸シクラーゼを活性化し、その環状グアノシン一リン酸が今度は細胞内Ｃａ2+レベルを高める。増加した細胞内Ｃａ2+濃度は、ＮＯの血管拡張効果の説明原因である平滑筋弛緩をもたらす。誘導性ＮＯＳは、より多量のＮＯの持続的放出の一因となっており、エンドトキシンやサイトカインを包含する細胞外因子によって活性化される。これら高いＮＯレベルは、細胞性の免疫性に大きな役割を演じている。
【０００４】
酸化窒素療法の可能性が、癌、冠状動脈心疾患、再狭窄、高血圧症、血管形成及び性的不能症を包含する多様な臨床的適応症において検討されてきた。更に、最近の研究で、ＮＯはかなりの in vivo及び ex vivoの抗微生物活性も有することが証明されているので (Fang, F.C., 1997. Perspectives series: host/pathogen interactions. Mechanisms of Nitric Oxide-antimicrobial activity. J Clin Invest June 15; 99 (12):2818-25; Fang, F.C., 1999. Nitric Oxide and Infection, Kiuwer Academic/Plenum Publishers: New York ；Green at al に発行された１９９５年４月２４日出願の米国特許第５，８１４，６６６号（ '６６６特許）も参照のこと。これらは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、感染症の治療に使用するのに適している。
【０００５】
酸化窒素のユニークな生理学的特性の組合せは、それを、道管病、特に虚血性心疾患を治療するための理想的な候補にしている。虚血性心疾患は、心臓への血流が制限されたときに、通常、１又はそれを越える冠状動脈内での遮断の結果として起こる。最も多い形態の虚血性心疾患は、冠状動脈バイパス移植（ＣＡＢＧ）手術を使用して又は経管冠状動脈形成術（ＰＴＣＡ）及び／又はステント置換を使用して詰まった血管流通性を修復することによって治療される。
【０００６】
しかしながら、ＣＡＢＧ及びＰＴＣＡは、再狭窄、つまり過去に切開した脈管が狭くなっていて再び詰まる多要因プロセスのために失敗することがある。再狭窄は、３〜６カ月以内に、血管形成術及び他の経カテーテル患者の３０〜５０％において起こることが分かっている (Currier, J.W. et al. 1995. Restenosis after percutaneous transiuminal coronary angioplasty: have we been aiming at the wrong target? J Am Coll Cardiol; 25:516-520) 。再狭窄は、バルーンを膨らませたことによって起こる血管傷害部位に血小板が接着したときに始まって血栓形成（血塊形成）及び／又は血管平滑筋細胞過剰増殖（過形成）を開始する。その結果、過去に切開した脈管が狭くなり始めて、傷害を受けた血管を細くするか又は詰まらせる。最近、研究者達は、ＮＯの抗血栓形成及び抗平滑筋増殖作用が、動物における再狭窄をかなり少なくすることを証明した (Bohl, K.S. et al. 2000. Nitric oxide-generating polymers reduce platelet adhesion and smooth muscle cell proliferation. Biomaterials; 21(22): 2273-8; Buergler, J.M. et al. Use of nitric-oxide-eluting polymer-coated stents for prevention of restenosis in pigs. Coron. Artery Dis.; 11(4): 351-7; Janero, D.R. et al. Nitric oxide and postangioplasty restenosis: pathological correlates and therapeutic potential. 29(12): 1199-221; Le Tourneau, T. et al. J. Am. Coil. Cardiol. Role of nitric oxide in restenosis after experimental balloon angioplasty in the hypercholesterolemic rabbit: effects on neointimal hyperplasia and vascular remodeling. 33 (3): 876-82) 。結果として、再狭窄の最も大きな危険性がある解剖学的部位へのＮＯの直接的な抗再狭窄作用に焦点を合わせた医療デバイスを開発することに大きな関心が向けられている。
虚血の臓器、特に心臓を治療するための別の方法は、新たな血管と毛細血管の成長を誘発することにより害された領域の血管を再生させることである。血管形成と呼ばれるこのプロセスは、虚血性心疾患の治療のためのＣＡＢＧ及びＰＴＣＡの代替法としてかなりの注目を集めた (Dulak, J. et al., 2000. Nitric oxide induces the synthesis of vascular endothelial growth factor by rat vascular smooth muscle cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol; March;20(3): 659-666)。血管形成を誘発又は上方調節することが分かった化合物には、酸化窒素；線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）；血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）；及び形質転換増殖因子α（ＴＧＦα）、形質転換増殖因子β（ＴＧＦβ）、βセルリン、アンフィレグリン及びワクシニア増殖因子のような、表皮増殖因子（ＥＧＦ）ファミリーのメンバーが含まれる。酸化窒素は、これら生体化学物質の調節に関与しているので、一定の条件下でＮＯは血管形成作用を発揮し得る。
【０００７】
血管形成を誘発し、再狭窄を予防し、望まれない血栓形成を軽減し、そして創傷治癒を促進するために、ＮＯ放出性化合物を in vivoで使用することには見込みがあると思われる。しかしながら、現今のＮＯ放出技術は、内皮細胞に付随する天然ＮＯ放出を十分に模倣することができていない。先に述べたように、天然のＮＯ産生は、構成性及び誘導性の酵素の組合せによって調節されている。血管恒常性の主要調節部である内皮細胞は、構成性酵素（ｅＮＯＳ）活性を通してＮＯ放出の継続的な低いレベルを提供されている。更には、必要なときには、誘導性酵素（ｉＮＯＳ）が細胞にＮＯの一時的一挙放出を提供することができる。原則として、ＮＯのそのような一時的な生理学的一挙放出は、水性の生理学的環境に曝されると即座にＮＯを放出するＮＯ供給性材料でコートされたポリマー又は金属表面を使用して、模倣されることができる。しかしながら、内皮細胞による低レベルのＮＯの持続的送逹は、ＮＯ放出性材料で刺激されるには、ずっと難しいことが実証されている。
【０００８】
別の困難な課題は、特定の標的臓器へＮＯを優先的に又は選択的に送逹することである。酸化窒素は、種々の生体分子と容易に反応するので、全身投与されたときに有毒であり得る。治療的ＮＯレベルを提供するためのこれまでの努力は、概して、トリ硝酸グリセリル及びニトロ青酸ナトリウムのようなＮＯプロドラッグに依存してきた。ＮＯガスと違って、これら化合物は一般に安定である。しかしながら、通常、それらの薬理活性は短命である。更には、トリ硝酸グリセリルをＮＯに転化するのに必要な酵素及び補助因子は、急速に無くなってしまう。このことから、この化合物の短時間にわたる繰り返し使用が、薬物耐性の発生をもたらす。ニトロ青酸ナトリウムの長期使用は、その結果として蓄積する、高い毒性のシアニドの過剰発生を起こし得るので、その長期使用には限界がある。結論として、有毒な副作用なしにＮＯの持続的で局所化された治療的投与のために使用されることができるＮＯ発生剤又はＮＯドナー化合物の開発に大きな注目が向けられている。
【０００９】
in vivo 用途に適する酸化窒素放出性化合物が多くの研究者によって開発されてきた。１９６０年代という早い時期に、酸化窒素ガスがアミンと反応して、次の一般式：
0004796262.tif 000002
を有するＮＯ放出性アニオンを形成することが示されていた。これら化合物の塩は、溶液中で自発的に分解してＮＯを放出する (R.S. Drago et al J. Am. Chem. Soc. 1960, 82, 96-98) 。
【００１０】
治療剤として有用である、生理学的水性緩衝液中で十分な安定性を有する酸化窒素放出性化合物が、とうとう、米国特許第 4,954,526, 5,039,705, 5,155,137, 5,212,204, 5,250,550, 5,366,997, 5,405,919, 5,525,357 及び 5,650,447号並びに J.A. Hrabie et al, J. Org. Chem. 1993, 58, 1472-1476 に記載のように、Keefer et alによって開発された。これら全ては、参照により本明細書に組み込まれる。簡単に説明すると、Hrabie et alは、一般式：
0004796262.tif 000003
を有するＮＯ放出性分子内塩（ツイッターイオン）を記載している。式２の安定なＮＯ放出性化合物（酸化窒素／親核体コンプレックス）は、その主鎖分子構造が架橋されていないか又は僅かに架橋されているだけの広範囲のアミン含有ポリマーにカップリングされている (Smith D.J. et al. 1996 Nitric oxide-releasing polymers containing the [N(O)NO]- group. J Med Chem 39:1148-1156, Pulfer, S.K. et al. 1997 Incorporation of nitric oxide-releasing crosslinked polyethyleneimine microspheres into vascular graft. J. Biomed Mater Res. 37:182-9, Mowery, K.A. et al. 2000. Preparation and characterization of hydrophobic polymeric films that are thromboresistant via nitric oxide release. Biomaterials 21:9-21, Bauer, J.A. et al. 1998. Evaluation of linear polyethyleneimine/nitric oxide adduct on wound repair:therapy verses toxicity. Wound Repair and Regeneration, Vol. 6 No. 6:569-576) 。このように記載された〔Ｎ（Ｏ）ＮＯ〕- （以後、ＮＯＮＯと略記する）含有化合物は、予測可能でありかつ容易に定量できる、一次反応を介してのＮＯ放出を示す。このようなＮＯドナー化合物は、当該技術分野において、ジアゼニウムジオレートとして広く知られている。
【００１１】
米国特許第５，４０５，９１９号（ '９１９特許）は、ジアゼニウムジオレートＮＯ放出基を生体許容性ポリマーへ結合又はカップリングする方法を記載した特許の例である。そのようなポリマーの例には、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリビニリデンのようなポリオレフィン、又はポリエチレンイミンのような誘導化されたポリオレフィン、ポリエステル、ポリエーテル、ポリウレタン等が含まれる。 '９１９特許において引用されたポリマーのＮＯ放出総量は、３〜１１ナノモル／ｍｇと測定された。生体許容性形態のそのようなポリマーから構成されるインプラント可能な医療デバイスは、特定の組織又は標的臓器への部位特異的ＮＯ送逹のための潜在的な手段に該当する。
【００１２】
ジアゼニウムジオレート・アミンの調製、形成、及びジアゼニウムジオレート・アミンの保護基誘導体化において有意な進歩が成されている。米国特許第５，１５５，１３７号は、心臓血管の疾患を治療するのに適するポリアミン／酸化窒素コンプレックスを調製するための一般的方法を開示している。 '６６６特許は、ジアゼニウムジオレート・アミンを配合するための新規な手段であって、そのような部分を多層リポソーム中に含浸させることによる手段を記載している。リポソームに包まれたジアゼニウムジオレートは、マクロファージにより食べられるまで水性環境から遮蔽される。マクロファージ内に入ると、リポソームに包まれたジアゼニウムジオレートは、その内容物をマクロファージの管腔内に放出して、“ フリー”のジアゼニウムジオレート部分としてＮＯの対応する発生を行なう。in vitro検討で、 '６６６特許に記載された方法は、マクロファージ内に食べられた病原性微生物を死滅させる特に効果のある手段であることが分かっている。ジアゼニウムジオレートのリポソーム被包は、非被包ジアゼニウムジオレートからみたＮＯ放出の半減期に対応する延長をもたらさないので、そのような化合物の細胞への送逹を増強する手段として至極機能すると思われる。
【００１３】
米国特許第５，３６６，９９７号は、ジアゼニウムジオレートアニオンの遠位の酸素原子が共有結合を介して保護基で誘導体化され得る技術を開示する。そのように修飾されたジアゼニウムジオレートは、生理学的温度及びｐＨの条件下で水性緩衝液に曝されたときに、概して全く安定である。しかしながら、一定の臓器は、その保護基を保護されたジアゼニウムジオレートから代謝で除去し得るので、親ジアゼニウムジオレート部分が混ざって生成することになる。
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】
安定なＮＯ放出性ジアゼニウムジオレートを利用できるようにすることは、ＮＯ送逹医薬品を開発するための可能性を大きく進歩させる。しかしながら、in vivo ＮＯ放出期間にわたってより良好に制御する必要性が依然として存在する。具体的には、生理学的緩衝液中で数カ月から数年の期間にわたってＮＯを持続して放出できるＮＯ供与性ポリマー材料を開発する必要性が存在している。更には、ＮＯ一挙放出の後に標的臓器又は細胞群に直接にＮＯの持続的低レベル放出が送逹されるといった、in situ ＮＯ産生をより良好に模倣できる材料を開発する必要性が存在している。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
本発明の目的は、長期間にわたって酸化窒素を持続的に放出できる高度に架橋しかつ極度に疎水性のポリマーを提供することである。
本発明の別の目的は、高度に架橋しかつ極度に疎水性の、生体適合性である酸化窒素放出性ポリマーを提供することである。
本発明の別の目的は、高度に架橋しかつ極度に疎水性の、生体適合性でありかつマイクロビーズの形態にある酸化窒素放出性ポリマーを提供することである。
本発明の別の目的は、高度に架橋しかつ極度に疎水性の、生体適合性でありかつ治療剤として有用な酸化窒素放出性ポリマーを提供することである。
本発明の別の目的は、高度に架橋しかつ極度に疎水性の生体適合性でありかつ持続的治療レベルで標的臓器又は細胞群への酸化窒素の送逹を提供する酸化窒素放出性ポリマーを使用して製造される医療デバイスを提供することである。
【００１６】
本発明は、驚くべき長期間にわたって、治療的レベルの酸化窒素（ＮＯ）を放出できるポリマーを製造する方法を開示する。本発明のポリマーは、一般的には、ポリアミン官能基が導入されたポリジビニルベンゼンのジアゼニウムジオレート形態から構成される。最も好ましくは、本発明のポリマーは、ジビニルベンゼンのジアゼニウムジオレート・ポリエチレンイミン誘導化形態である。先行技術と違って、本発明のジアゼニウムジオレート・ポリアミンは、高度に架橋しかつ極度に疎水性である主鎖分子構造に共有結合で連結している。本発明のポリマーは、マイクロビーズ、非晶質塊、又は特定形状への成型物であってもよい。
【００１７】
ＮＯ放出剤の先行技術で広く知られているように、本発明のポリマーは、虚血性心疾患、再狭窄、癌、高血圧症、感染症及び性的不能症を包含するがこれらに限定されない広範囲の状態を治療又は予防するのに用いられることができる。更には、本発明のポリマーは、血管形成として知られるプロセスにおいて新たな血管又は毛細血管の成長を促進するのに使用されることができる。本発明のＮＯ放出性ポリマーは、ステント、血管移植片、ペースメーカーリード線、心臓弁、電極、センサー、トロカール、ガイドワイヤー、カテーテル、ペニスインプラント、コンドーム、タンポン、生理用ナプキン、眼のレンズ、吊るし材料、縫合糸、創傷包帯／バンテージ、採血バッグ及び保存チューブ、輸血及び血液透析に使用されるチュービング等が含まれるがこれらに限定されないインプラント可能な医療デバイス及び材料のためのコーティング又は基体として使用されたときに、炎症を軽減しかつ治癒を促進するのにも使用されることができる。
【００１８】
このＮＯ放出性の高度に架橋しかつ極度に疎水性の本発明のポリマーは、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリ−Ｌ−ラクチド／グリコリド、ポリカプロラクトン、ポリグリコール等が含まれるがこれらに限定されない他の生体適合性ポリマーと共重合されてもブレンドされてもよい。更には、本発明のＮＯ放出性ポリマーのマイクロビーズは、標的臓器又は細胞群に直接投与されることができる。例えば、本発明の技術に従って製造されたＮＯ放出性ジアゼニウムジオレートマイクロビーズは、心臓の動脈内にカテーテルで直接に注入され、そしてそれらが冠状微小血管構造内に入り込むまで拡がって行くのを可能にすることができる。本発明のポリマー性マイクロビーズは、概して直径が５μｍ（５，０００ｎｍ）より小さく、それらの移動は、それらビーズの直径よりも細くなった血管に遭遇したときに止まることになる。それら血管が詰まってしまうと、それらマイクロビーズからのＮＯが、遮断された部位における血管形成を誘発するのに十分な量で継続的に放出される。そうしたプロセスによって、ＮＯ放出性マイクロビーズは、血管閉塞の部位周辺での新たな血管の成長を開始することになる。別の態様では、ＮＯの持続的局所レベルが、カテーテルを介してマイクロビーズを心臓周辺嚢内へ注入することによりもたらされる。
【００１９】
別の態様では、高度に架橋しかつ極度に疎水性の本発明のＮＯ放出性ポリマーが、血管ステント内又はその表面上に取り込まれることができる。本発明のジアゼニウムジオレートポリマーによって提供される持続的ＮＯ放出は、そのステント部位又はその近くの内皮細胞過形成を阻害することによって再狭窄を予防する。更には、本発明の技術に従って製造されたＮＯ放出性ステントは、そのデバイスの近傍における血栓形成及び血小板活性化をも阻害する。
【００２０】
要するに、本発明の高度に架橋しかつ極度に疎水性のＮＯ放出性ポリマーは、水性生理学的緩衝液中に浸けたときに、驚くほど高いＮＯ負荷能力と同じく驚くほど長期間のＮＯ放出性を有する化合物を提供する。本発明の高度に架橋しかつ極度に疎水性のＮＯ放出性ポリマーは、９カ月を越える期間ＮＯを放出する。米国特許第５，４０５，９１９号に記載された先行技術と比較することによって、本発明は、持続的ＮＯ放出の量及び期間に関して数オーダーの大きさの増加をもたらす。更には、本発明は、ＮＯ負荷並びに最終ポリマー幾何配置を制御する方法をも可能にする。この特性の組合せは、ポリマー科学及びポリマー化学の当業者が、高度に予測可能な量のＮＯを長期間かつ離散している解剖学的部位に局在的に送逹することができるＮＯ放出療法及び医療デバイスをデザインするのを可能にする。
【００２１】
生体調節剤としての酸化窒素の多様な役割は、生体及び医療科学において有意な関心を刺激している。ヒトを含む哺乳動物にＮＯを投与するための安全で効果的な方法を提供しようと、数多くのアプローチが開発されている。純粋なＮＯガスのような外因性ＮＯ供給源は、高度に有毒であり、短命でありかつ体液中で比較的不溶性である。結果として、外因性ＮＯの全身送達は、一般に、ニトログリセリン錠剤のような有機硝酸エステルプロドラッグ、静脈内懸濁液剤、スプレー及び経皮パッチを使用して行なわれる。人体は、ニトログリセリン及び他のＮＯプロドラッグを速やかにＮＯに転化する。しかしながら、繰り返し使用で、そのプロドラッグを活性化するのに必要な酵素が枯渇してしまう。結果として、有機硝酸エステル投与が再度血清ＮＯレベルを上昇させる前の１０〜１２時間の生理学的回復間隔内に、薬物耐性が起こる。
【００２２】
ＮＯプロドラッグ投与に付随する欠点を克服するための１つの潜在的方法は、内因性酵素系による活性化を必要としないＮＯ放出療法を提供することである。in vivo 使用に適するＮＯ放出性化合物を提供しようという早期の努力が、Keeferらへ１９９０年９月４日に発行された米国特許第４，９５４，５２６号に記載された。この '５２６特許は、一般式：
0004796262.tif 000004
（式中、Ｒは、低級アルキル、アリール、アラルキル又はシクロアルキルであって、いずれかのＲ基は、ハロ、ヒドロキシル、アルコキシ、アミノ、アミド、ホルミル、カルボキシル、又はニトロからなる群から選択される１〜３の官能基によって置換されていてもよく；Ｘは、薬学的に許容できるカチオン、金属中心、又は、低級アルキル、アシル、若しくはアミノからなる群から選択される有機基であり；ｙは、Ｘの価数と一致する１〜３である。）
を有するジアゼニウムジオレート・１級アミン塩を開示した。これら化合物の多くは、 '５２６特許が出願されたときに公知であったが、それらの生物学的特性は公知ではなかったので、この '５２６特許は、医療用ＮＯ化学の分野ではパイオニア特許と考えられる。
【００２３】
ＮＯ放出性化合物の別の重要なグループが、米国特許第5,380,758 、5,574,068 、5,583,101 、5,593,876 及び 5,770,645号に記載されている。これら特許は、一般式：
ＣＨ3(ＣＨ2)x ＳＮＯ  又は  ＨＳ（ＣＨ2)x ＳＮＯ
（式中、Ｘは、２〜２０に等しい。）
及び、一般式：
ＯＮＳ（ＣＨ2)x Ｙ
（式中、Ｘは、２〜２０に等しく、Ｙは、フルオロ、Ｃ1 〜Ｃ6 アルコキシ、シアノ、カルボキサミド、Ｃ3 〜Ｃ6 シクロアルキル、アラルコキシ、Ｃ2 〜Ｃ6 アルキルスルフィニル、アリールチオ、Ｃ1 〜Ｃ6 アルキルアミノ、Ｃ2 〜Ｃ15ジアルキルアミノ、ヒドロキシ、カルバモイル、Ｃ1 〜Ｃ6 Ｎ−アルキルカルバモイル、Ｃ2 〜Ｃ15Ｎ，Ｎ−ジアルキルカルバモイル、アミノ、ヒドロキシル、カルボキシル、水素、ニトロ及びアリールからなる群から選択され、アリールには、ベンジル、ナフチル、及びアントラセニル基が含まれる。）
を有するＳ−ニトロソチオールを開示している。しかしながら、ニトロソチオールからＮＯへの反応は、速度論的に複雑であるため制御するのが難しいので、ジアゼニウムジオレートに付随する明瞭な一次速度のような、医薬品に理想的に適するようなものではない。
【００２４】
本発明で使用されるアミンをジアゼニウムジオレート化する一般的方法は、もともと R.S. Drago et al によって開発された。しかしながら、これら化合物の幾つかは、−７８℃を越える温度で不安定であるので、長期間室温安定性を必要とする in vivo医薬品の製剤に適していない (Drago et al. 1960. The reaction of nitrogen(II) with various primary and secondary amines. J. Am. Chem. Soc. 1819-1822, その全体内容は参照により本明細書に組み込まれる）。
【００２５】
医薬製剤に配合されるだけの十分な安定性を有するＮＯ放出性化合物が、米国特許第４，９５４，５２６号（ '５２６特許）に開示されている。しかし、 '５２６特許の１級アミン誘導体は高度に反応性なので、これら化合物からのＮＯ放出速度を制御する能力は限られている。ＮＯの放出をより容易に制御できるようにし、従って、それらの医学的利用性を向上させようと、Keefer et alは、米国特許第５，０３９，７０５号（ '７０５特許）に開示しているように、２級アミンをジアゼニウムジオレート化する方法を開発した。この '７０５特許は、次の一般的構造：
【００２６】
【化３】
0004796262.tif 000005
【００２７】
（式中、Ｒ1 及びＲ2 は、直鎖状又は分岐状のＣ1 〜Ｃ12アルキル基及びベンジルから独立に選択されるが、但し、該アルキル基のα炭素では分岐が起こらない；又は、Ｒ1 及びＲ2 は、それら結合している窒素原子と一緒に、ピロリジノ、ピペリジノ、ピペラジノ又はモルホリノ基を形成し、そして、Ｍ+ は、薬学的に許容できるカチオンであり、Ｘは、該カチオンの価数である。）
を有するジアゼニウムジオレート・２級アミンを記載している。
ＮＯ放出の制御における更なる改善は、Keefer et alがＮＯとポリアミンの新規なコンプレックスを製造する方法を開発したときに達成された。これら化合物は、米国特許第５，１５５，１３７号及び５，２５０，５５０号に開示されており、次のような３つの一般式が提供されている。
【００２８】
【化４】
0004796262.tif 000006
【００２９】
（式中、ｂ及びｄは、独立に０又は１であり；ｘ、ｙ及びｚは、独立に２〜１２であり；Ｒ1 〜Ｒ8 は、独立に、水素、Ｃ3-8 シクロアルキル、Ｃ1-12直鎖状又は分岐状アルキル、ベンジル、ベンゾイル、フタロイル、アセチル、トリフルオロアセチル、ｐ−トリル、ｔ−ブトキシカルボニル又は２，２，２−トリクロロ−ｔ−ブトキシカルボニルであり；Ｒ9 は、水素又はＣ1 〜Ｃ12直鎖状又は分岐状アルキル；Ｂは：
【００３０】
【化５】
0004796262.tif 000007
であり；ｆは０〜１２であるが、但し、Ｂが置換ピペラジン部分：
【００３１】
【化６】
0004796262.tif 000008
であるときは、ｆは２〜１２であり；そしてｇは２〜６である。）このＮ2 Ｏ2 - は、構造：
【００３２】
【化７】
0004796262.tif 000009
【００３３】
を有する。
上述の各々の特許に開示されたジアゼニウムジオレートは、相対的利点と欠点を有する。主要な利点は、これらジアゼニウムジオレートが、生体適合性アミン含有ポリマー性化合物に配合され得ることである。例えば、 '９１９特許は、それにＮＯが結合することができる生物学的に許容できる、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリビニリデンのようなポリオレフィン；ポリエチレンイミン；ポリエステル；ポリエーテル；ポリウレタン等を包含するポリマーを記載している。 '９１９特許に記載されたポリマーの主要な欠点は、それらが典型的には架橋されていないか又は僅かに架橋されているだけなので、低〜中程度の疎水性を有するのみである。本明細書で使用される“結合”という用語は、共有結合、イオン結合、van der Waals 力、水素結合、静電気結合、及びジアゼニウムジオレートのようなＮＯ官能基をポリマー性化合物に付けるための他の全ての方法が含まれる。ポリマー表面に加えて、本発明者らは、その全体の内容が参照により本明細書に組み込まれる２０００年５月５日に出願された米国特許出願第０９／５６７，５７９号（ '５７９出願）に開示された、金属表面に共有結合したジアゼニウムジオレート基を提供する方法も共同開発した。
【００３４】
本発明の酸化窒素放出性ジアゼニウムジオレートは、ポリマー主鎖内で及び／又はそのポリマー主鎖に付いているペンダント基に沿って又はそのポリマーとの共沈殿を介して、アミン基をジアゼニウムジオレート化することによって、そのポリマーに提供されることができる。更には、ジアゼニウムジオレートポリマー間又はモノマー間に相互貫通網状構造や半相互貫通網状構造を形成することも意図されている。本発明のポリマーは、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリビニリデン、ポリエチレンイミン、ポリエステル、ポリエーテル、ポリウレタン等のような他のポリマーとブレンドされてもよい。より好ましくは、本発明のポリマーは、コポリマー混合物として押し出されて、ＮＯ放出性採血チューブ、保存バッグ、経皮パッチ、創傷包帯／バンテージ等のような ex vivo医療デバイスを形成することができる。
【００３５】
例えば、血小板は、現行では、それらを全血から分離した後に標準的な採血バッグ中に保存される。しかしながら、血小板の極度の熱感受性のために、それらは室温か又はそれ以下で保存されなければならない。このやり方で保存された血小板は活性化することによってそれらの治療有効性を減退させる。従って、保存中の血小板の保存寿命は極度に短い。しかしながら、本発明のブレンド又は共重合ポリマーから作られた保存バッグ中に維持された血小板は、血小板が浴する溶液と接触すると即座にＮＯを放出する。従って、そのようなバッグ中に保存された血小板の保存寿命が有意に増加すると同時に、微生物の増殖の可能性も大きく減退する。
【００３６】
本発明のＮＯ放出性の極度に疎水性のポリマーを使用する ex vivo医療デバイスの他の態様には、縫合糸及び創傷包帯が含まれる。これら創傷手当て用デバイスは、本発明のＮＯ放出性マイクロビーズを包含するように構成されることができる。創傷を封止又は覆うために使用される縫合糸又は創傷包帯は、傷害部位で直接ＮＯを放出する。そのＮＯ放出速度及び期間は、創傷の治癒を促進しかつ感染を阻止するように調節されることができる。
【００３７】
本発明のポリマー性化合物、前述のジアゼニウムジオレート特許及び '５７９出願に記載されたものは全て、部位特異的の in situＮＯ送逹に適している。部位特異的又は居所化されたＮＯ送逹は、ＮＯを全身投与することに付随する潜在的に毒性の多くの副作用を無くする。本発明のジアゼニウムジオレート及びポリマーは、ステント、カテーテル、ペニスインプラント、コンドーム、眼のレンズ、吊るし材料、縫合糸等を包含するがこれらに限定されない種々の医療デバイスに構成されることができる。これらデバイスは、道管病、性的不能症、感染症、高血圧症、癌、及び他の多くの急性及び慢性障害を治療又は予防するのに使用されることができる。しかしながら、広範囲の医療デバイスを使用してそのような広範囲の疾患への治療効力を最大にするために、長期間の正確かつ高度に制御可能な投与が要求されている。
【００３８】
正確な投与、特に長期間投与間隔にわたる投与は、これまでに開発されたＮＯ放出性化合物を使用する全ての潜在的用途について完璧ではなかった。先に述べたように、本発明のＮＯＮＯ／ポリアミン付加物（ジアゼニウムジオレート）は生理学的条件で高度に反応性である。これら化合物をそれほど有用なものにする明瞭な一次速度は、それらの１つの欠点にもなっている。水又は生理学的液体のような水素イオンドナーに曝されると、殆どのジアゼニウムジオレートは、急速にＮＯ放出を続けられなくなる。従って、遮蔽も保護もされていないＮＯ基は、概して急速に枯渇し、ＮＯの大波（一挙放出作用）の後は定常的にＮＯ放出の速度が低下してゆく。多くの場合、ＮＯは、数分〜２，３時間で枯渇する。
【００３９】
Keefer et alは、半予測可能速度で生物学的活性形態のＮＯを提供することができる多種多様な酸化窒素／親核体コンプレックスを報告した。米国特許第５，６７６，９６３号（ '９６３特許）に開示されたこれら化合物は、上記のジアゼニウムジオレート基を、ポリスチレン；ポリプロピレン；ポリエチレン；ポリテトラフルオロエチレン；ポリビニリデンジフルオライド；ポリ塩化ビニル；ポリエチレンイミン；ポリエーテル；ポリエステル；ナイロンのようなポリアミド；ポリウレタン；ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、抗体及び核酸のような生体ポリマー；スターバースト・デンドリマー (starburst dendrimers) 等が含まれるがこれらに限定されない多種多様なポリマー性材料内に取り込む。 '９６３特許の発明者らは、そこに記載されたポリマーに結合した酸化窒素／親核体付加物からのＮＯ放出の長命は、その組成物の物理的構造と静電効果が一因になっていると見做した。この発明者らは、ポリマーの表面上に存在するＮＯＮＯ基が、生理学的媒体と接触すると即座に放出される一方で、そのポリマー内に深く埋められたＮＯＮＯ基は、立体的に障害を受けているため解放されるにはより多くの時間を必要とすると述べている。更には、 '９６３特許の発明者らは、ポリマー内のＮＯＮＯ基の近傍におけるアミン基のプロトン化が、それらＮＯＮＯ官能基への水素イオン攻撃を阻害する静電的反発作用を発すると提案した。
【００４０】
'９６３特許のポリマーは、ＮＯ放出を医療グレードのポリマーから制御するのに有意な進歩を示した。しかしながら、長寿ＮＯ放出材料は、局所化されたＮＯ放出用のポリマー材料の恩恵を最大限にするよう要求されている。驚いたことに、ＮＯ放出の速度と期間の制御を可能にするポリマーを設計できることが発見された。これは、当業者に公知の技術を使用して、ポリマーの疎水性、架橋の範囲及び度合い、厚み及び最終ポリマーの気孔の大きさを制御することにより達成される。
【００４１】
本発明のＮＯ放出性材料は、高度に架橋しかつ極度に疎水性の主鎖であって、それに結合したポリジアゼニウムジオレート・ポリアミンを有する主鎖を含有するポリマーから構成される。そのような高度に架橋しかつ極度に疎水性のポリマーは、水による浸透に高度に抵抗性でありかつそれに不溶性である不特定数のモノマーから構成される巨大分子として定義される。この本発明の高度に架橋しかつ極度に疎水性のポリマー材料を形成するのに適するモノマーには、最も好ましくはジビニルベンゼン及びその置換誘導体が含まれるが、これらに限定されない。本発明の有用な材料を形成するのに適する他のポリマーには、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリ−Ｌ−ラクチド／グリコリド、ポリカプロラクトン、ポリグリコール、シリコーン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリビニリデン、ポリエチレンイミン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリエーテル、ポリラクトン、ポリ酢酸ビニル、ポリスチレン、ポリ（エチレンテレフタレート）、ポリ尿素、ポリアミド、天然ゴム、ポリウレタン、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルエチルセルロース、ナトリウム・カルボキシメチルセルロース、デキストラン、並びにそれらのコポリマー及び組合せが含まれるが、これらに限定されない。
【００４２】
本発明のＮＯ放出性ジアゼニウムジオレート基は、高度に架橋しかつ極度に疎水性のポリマーの主鎖に付いたポリアミンペンダント基から形成される。最も好ましくは、そのようなポリアミン基には、ポリエチレンイミン、ピペラジン及びそれらの誘導体が含まれるが、これらに限定されない。本発明の一態様では、ポリアミンペンダント基は、ペンタエチレンヘキサミンである。本発明の別の態様では、ポリアミン基はピペラジンの誘導体である。
本発明の一態様のポリアミン誘導化疎水性ポリマー主鎖は、以下：
【００４３】
【化８】
0004796262.tif 000010
【００４４】
〔式中、
Ｒ1 〜Ｒ4 は、同じでも異なっていてもよく、Ｈ、フェニル、ベンジル、ビニルベンゼン、ジビニルベンゼン、置換若しくは未置換のアルキル、又は置換若しくは未置換のアリールであり；
Ｘ1 〜Ｘ4 は、同じでも異なっていてもよく、Ｈ、ハロゲン、置換若しくは未置換のアルキル、又は置換若しくは未置換のアリールであり；
但し、得られるポリマー主鎖が疎水性のままであり；
Ｒ5 及びＲ6 の少なくとも一方が：
【００４５】
【化９】
0004796262.tif 000011
【００４６】
（Ｒ7 は、本発明の技術に従った疎水性ポリマー主鎖であり；
Ｒ8 は、単結合か又は置換若しくは未置換のＣ1-12アルキルであり；そして
Ｒ9 〜Ｒ13は、Ｈ、Ｈ2 + 又はＮ2 Ｏ2 - 、Ｎ2 Ｏ2 - + ＮＨ2 Ｒ、Ｎ2 Ｏ2 - + Ｎ2 Ｒ2 、Ｎ2 Ｏ2 - + ＮＲ3 、Ｎ2 Ｏ2 Ｘであることができ、ここで、Ｘは、メトキシメチル又は、参照によりその全内容が本明細書に組み込まれる  reene, T.K et al. Protecting groups in organic synthesis; J. Wiley & Sons: New York, 1999 において特定された他の適する保護基である。但し、Ｒ9 〜Ｒ13の少なくとも１つはＮ2 Ｏ2 - であるものとする。）である。〕
のように示されることができる。
一般に、ポリアミンで誘導化された本発明の高度に架橋しかつ極度に疎水性のポリマーは、当業者に公知でありかつ米国特許第５，１５５，１５７号、５，２５０，５５０号及び５，４０５，９１９号において公表された方法を使用して、ジアゼニウムジオレート化される。基本的反応は以下に示す通りである。
【００４７】
【化１０】
0004796262.tif 000012
【００４８】
（式中、
Ｘは少なくとも２であり、そして、Ｙは１以上の整数であるがＸより大きいことはなく；
Ｒ7 は、本発明の技術に従った疎水性ポリマー主鎖であり；
Ｒ8 は、単結合か又は置換若しくは未置換のＣ1-12アルキルであることができ；そして
Ｒ9 〜Ｒ13は、Ｈ又はＮ2 Ｏ2 - であることができる。但し、Ｒ9 〜Ｒ13の少なくとも１つはＮ2 Ｏ2 - であるものとする。）
【００４９】
驚いたことに、ＮＯ放出速度は、最終ポリアミン誘導化ポリマー主鎖の幾何的配置とモノマー架橋度を制御することにより、調節され得ることが発見された。適する幾何的配置には、直径が０．５〜１００μｍ（５００〜１００，０００ｎｍ）のマイクロビーズ、非晶質ポリマー化合物、及び特定形状に成型されたポリマー化合物が含まれるが、これらに限定されない。本発明の別の態様では、それらポリマーは、１〜１００ｎｍの大きさの気孔を有する。本発明の疎水性アミノ誘導化ポリマーに付随する幾何配置及び気孔の大きさは、当業者に公知であり、かつ参照によりその全内容が本明細書に組み込まれる Jordi, H. 1999. Jordi Gel Columns for Size Exclusion Chromatography. In: Column Handbook for Size Exclusion Chromatography. Academic Press:New York, pages 367-425 に記載されている操作を使用して達成される。基本的な化学的事項が、以下に単に読者の便宜のために記載される。ポリマー分野における当業者は、以下の記載なしでも、本発明の高度に架橋しかつ極度に疎水性のポリアミン誘導化ポリマーを製造できるであろう。
【００５０】
ジビニルベンゼンのような適する精製された疎水性モノマーが、水の連続相中に小さな液滴の分散物として懸濁され、そして、当業者に公知の方法を使用するフリーラジカル開始により重合される。これらプロセスでは、球状の非多孔性ビーズが形成される。多孔性ビーズは、１又はそれを越える種類の不活性溶媒がモノマー／水混合液に加えられることを除いては、本質的に同じやり方で製造される。使用される溶媒が最終的に気孔の大きさを制御する。比較的小さな気孔を有するポリマービーズについては、モノマーと形成ポリマーの両方が溶解性である溶媒が選択される。０．５〜１ｎｍの小さな気孔のポリジビニルベンゼンビーズを生成させるのに使用される溶媒の非限定的例には、トルエン、エチルベンゼン、ジエチルベンゼン等が含まれるがこれらに限定されない。より大きな気孔を有するポリジビニルベンゼンビーズについては、適する溶媒に、イソオクタン、１−又は２−ブタノール及びｔ−アミルアルコールが含まれるがこれらに限定されない。
【００５１】
本発明のポリマーが作られると、それらに反応性２級アミンが与えられてもよい。簡単に説明すると、それらポリマービーズは、当業者に公知である反応条件を使用して、臭素を使用した後クロルスルホン酸を使用してハロゲン化される。次に、それらハロゲン化されたポリマーは、ポリエチレンイミンのような適するポリアミンと反応される。次いで、本発明のポリアミン誘導化ポリマーは、上で説明したようにして、ポリジアゼニウムジオレート化されることができる。本発明の一態様では、ジアゼニウムジオレート基は、好ましくは、２級アミン上で生成する。ポリジアゼニウムジオレート化の度合いは、そのジアゼニウムジオレート塩を形成するのに使用される溶媒系によって制御される。アセトニトリルのような純粋な有機溶媒が、ジアゼニウムジオレート化操作の間ポリアミン誘導化ポリマーを懸濁させるのに使用されると、１つおきの２級アミンがジアゼニウムジオレート基に転化される。交互の２級アミンがアンモニウムカチオンを形成して安定なツイッターイオンをもたらす。しかしながら、ナトリウムメチレートのようなカチオンを含有する溶媒が使用されると、ジアゼニウムジオレート基が全ての利用可能な２級アミン上で生成して、安定なナトリウム・ポリジアゼニウムジオレート塩をそのポリマー上にもたらす。
【００５２】
本発明のポリジアゼニウムジオレートポリマーからのＮＯ放出は、架橋度、気孔の大きさ、及びそのポリマーの疎水性の組合せ効果によって調節される。本発明のポリマー化合物が、Keeferらに発行された米国特許第 4,954,526号、 5,039,705号、 5,155,137号、 5,212,204号、 5,250,550号、 5,366,997号、 5,405,919号、 5,525,357号、 5,650,447号及び 5,676,963号（以下、Keefer特許と総称する）に開示されたものと有意に異なることが当業者によって認識されるであろう。これら先行するKeefer特許における化合物と違って、本発明のポリマーは、高度に架橋している。架橋は、所与のポリマーの構造的硬度と化学安定性を向上させる。
【００５３】
本明細書で使用される“高度に架橋”という用語は、合成有機化学の分野における当業者によって理解される通りのその通常の意味と一致している。従って、本明細書で使用される“高度に架橋”という用語は、そのポリマーが本質的に単一の分子へとつながれ、個々のモノマーを一緒に連結する一次化学結合の広範な網状構造を有するポリマー基体として定義される。この定義は、“高度に架橋”の一般的理解と矛盾するものではない。例えば、限定を意図するものではないが、ジビニルベンゼン（ＤＶＢ）が本発明のポリマービーズを形成するのに使用されるとき、ＤＶＢの個々のモノマーは、隣のＤＶＢ分子上のビニル基との間の相互作用によって一緒に連結（重合）されるようになる。そのポリマー鎖が成長するにつれて、更なる重合反応がそのポリマー鎖内で起きて架橋マトリックスをもたらす。これら更なる相互作用がより広範になればなるほど、そのポリマーはより高度に架橋されるようになる。
【００５４】
そのジビニルベンゼン置換基の極度の疎水性が、そのようなポリマーが生理学的液体又は体液のような水性溶液に浸漬されたときの膨潤を阻止する。いかなる特定の理論にも拘束されることを望まないが、先行技術及び '９１９特許に開示されたタイプの架橋されていないか又は僅かに架橋されているだけのジアゼニウムジオレート疎水性ポリマーでは、そのポリマー内部への水又はプロトン化種の侵入がそのポリマーを急速に膨潤させると考えられる。大きな親水性の溝が創り出されると、そのポリマー内に引きこもっているジアゼニウムジオレート基のプロトン化が促進されて、そのポリマーからのＮＯの対応する解放が起こる。
【００５５】
この過程は、高度に架橋しかつ極度に疎水性の本発明のポリマーとは対照をなす。そのようなポリマーは、生理学的溶液又は体液中に浸けられても観察されるほどには膨潤しない。更には、そのようなポリマーの極度の疎水性が、そのポリマー内部に浸透する水分子の能力をかなり制限する結果として、先行技術に記載されたものより有意に長い期間ＮＯ放出が持続されることができる。気孔の存在又は不存在並びに気孔の大きさを制御する能力は、ポリマーからのＮＯ放出を所与の用途のために最適化する更なる手段を提供する。例えば、より大きな気孔は、より多くの水がポリマー内部のジアゼニウムジオレート基に到達するのを可能にすると同時に、ＮＯが出て行くための広い経路を提供する。従って、気孔が大きければ大きいほど、単位時間当たりに放出されるＮＯの量が大きくなり、決まったＮＯ負荷量についての全ＮＯ放出の期間が短くなる。ＮＯ放出性ポリマーデザインにおけるこの柔軟性の度合いは、以前に示されたことがなく、医療デバイスに関連するＮＯ用途の正確な局所化された投与と計量を可能にする。
【００５６】
本発明のＮＯ放出性ポリジアゼニウムジオレートポリマーは、約０．２〜２．０マイクロモル／ｍｇポリマーを発生する。これら値は、 '９１９特許のポリマーにより発生されるＮＯの量の１００〜１０００倍に相当する。更には、本発明のＮＯ放出性ポリマーは、９カ月又はそれを越えて継続してＮＯを放出する能力を有している。これは、これまで報告されたあらゆるＮＯ放出速度又は期間を遥かに越えるものである。例えば、Bauer らは、ポリエチレンイミン／酸化窒素付加物が０．２マイクロモル／ｍｇのＮＯを最大で６０時間放出したことを報告している (J.A. Bauer, et al. 1998. Evaluation of Linear Polyethyleneimine/nitric oxide adducts on wound repair: therapy versus toxicity. Wound Repair and Regeneration. Nov.-Dec: 569-576)。別の最近報告された研究で、Moweryらは、ＮＯの放出が本発明におけるような数カ月ではなく数日と測定されたポリジアゼニウムジオレート疎水性ポリマーを報告した (K.A. Mowery et al. 2000. Preparation and characterization of hydrophobic polymeric films that are thromboresistant via nitric oxide release. Biomaterials. 21:9-21) 。更に、Moweryらの疎水性ポリマーは、本発明のポリマーのように高度に架橋されておらず、極度の疎水性、気孔の大きさの制御及び化学的安定性も示さない。
【００５７】
Keefer特許は、多種多様なＮＯ放出速度と能力を有するポリジアゼニウムジオレートポリマーを報告している。例えば、米国特許第 5,650,447号、 5,676,963号、及び 5,718,892号は、３〜１１ナノモル／ｍｇの総ＮＯ発生能力と数分〜数時間と測定されるＮＯ放出半減期を有するＮＯ放出性ポリマーを報告している。これら特許に開示されたポリマーは、親水性でありかつ架橋されていないか又は僅かに架橋されているだけの傾向がある。
【００５８】
更には、いかなる特定の理論にも拘束されることを望まないが、本発明者らは、本発明のポリマーの高いＮＯ負荷能力と持続放出速度は、ポリマーの厚み、気孔の大きさ、疎水性、架橋の度合いと範囲、及びポリアミン置換基上に存在する２級アミン部位のタイプと数とを包含する複数要因現象であると考えている。本発明の一態様では、ビーズ形状ポリマーが形成されてからジアゼニウムジオレート化される。本発明の別の態様では、広範囲に架橋されたポリエチレンイミン誘導化ジビニルベンゼンが、種々の厚み、疎水性、及び気孔の大きさを有するように形成される。得られるポリマーの気孔度が、生理学的液体又は体液のような水性溶液中でのＮＯ放出に有意な役割を果たす。例えば、気孔を欠いている本発明の高度に架橋しかつ極度に疎水性のポリマーは、水性プロトン化性条件に曝されてもＮＯ“一挙放出”局面を示さない。むしろ、無気孔の本発明の高度に架橋しかつ極度に疎水性のポリマーは、多孔性ビーズがそれらの初期ＮＯ一挙放出局面後にＮＯを放出する速度に匹敵する定常速度でＮＯを放出する。
【００５９】
本発明者らは、更に、本発明の特徴的ＮＯ放出プロフィールを部分的に説明するための非限定的理論を提案した。非多孔性ポリマー中に存在する高度の架橋と極度の疎水性は、水のような極性溶媒がそのポリマー表面を容易に浸透する能力を大きく制限する。その結果、本発明の非多孔性ポリマーでは、そのポリマー表面の真下に横たわるジアゼニウムジオレート基が急速にプロトン化されることがないので、ＮＯは、急速な放出も“一挙放出”局面の放出もなく、そのようなポリマーからゆっくり発生する。対照的に、１００〜１００，０００オングストローム（１０〜１０，０００ｎｍ）の直径の気孔を含有するポリマーは、水分子がポリマー表面領域をプロトン化するのを可能にする。これらポリマーがプロトン化性の生理学的溶液又は体液と接触したときはいつでも、ポリマー表面の近く又は真下に存在するジアゼニウムジオレート基が急速にプロトン化されて、対応するＮＯ“一挙放出”又は急速なＮＯ放出が起こる。
【００６０】
以下の非限定性の実施例は、本発明の、ポリジアゼニウムジオレート化された高度に架橋しかつ極度に疎水性のポリマーを製造するための４つの方法を示す。ポリマー化学の分野の公知の技術を使用して、本発明の多くの他の態様が本明細書に記載された技術に従って行なわれ得ることが理解されるべきである。
【００６１】
【実施例】
実施例１
アセトニトリルを使用するペンタエチレンヘキサミン誘導化ポリジビニルベンゼンマイクロビーズ（大きさ：５μｍ，気孔度：１００オングストローム）のポリジアゼニウムジオレート化
５０ｍｌの Parr TM水素化容器中に、２５０ｍｇのペンタエチレンヘキサミン誘導化ポリジビニルベンゼンマイクロビーズ〔大きさ：５μｍ（５，０００ｎｍ），気孔度：１００オングストローム（１０ｎｍ）〕と１０ｍｌのアセトニトリルを加えた。その容器は、ＮＯ装置に取り付けられ、４気圧のＮ2 での加圧／圧抜きの繰り返しサイクル（×１０）によって脱気された。次に、その容器は、４気圧のＮＯの繰り返しサイクル（×１０）で加圧／圧抜きされた。次いで、その容器は、４気圧のＮＯで満たされてから室温で４８時間攪拌された。４８時間後に、その容器からＮＯが追い出され、そして４気圧のＮ2 の繰り返しサイクル（×１０）で加圧／圧抜きされた。次いで、ポリジアゼニウムジオレート化ペンタエチレンヘキサミン誘導化ポリジビニルベンゼンマイクロビーズ（大きさ：５μｍ，気孔度：１００オングストローム）のアセトニトリル懸濁液が、１２ｍｌの試験管に移され、Dynac TMテーブルトップ遠心分離機で５，０００ｒｐｍで７分間遠心分離された。上澄み液がデカンテーションされて、１０ｍｌのアセトニトリルが加えられ、そしてペレットが渦巻きミキサーを使用して再懸濁された。更に２サイクルの遠心分離−デカンテーション−再懸濁がアセトニトリルとジエチルエーテル中で行なわれた。この操作で、ポリジアゼニウムジオレート化ペンタエチレンヘキサミン誘導化ポリジビニルベンゼンマイクロビーズの置換アンモニウム形態の溶媒湿潤ペレットがその試験管の底に生じた。そのペレットは、窒素ガス気流下に１０分間置くことによって乾燥された。
乾燥マイクロビーズの２１．０５ｍｇのサンプルが、ｐＨ７のリン酸緩衝液中に３７℃で浸漬され、その後、１３８日間の分析期間中、化学発光検出可能なＮＯが発生した。放出された全ＮＯは、６．２１×１０-6モル又は０．１８μモル／ｍｇと測定された。１３８日間の初めからのＮＯ放出の測定データを慎重にプロットしてその曲線のその後を推定することにより、そのマイクロビーズからのＮＯ放出が更に１６０日間継続する（又は約９．８カ月の継続的放出）と見積もられた。
【００６２】
実施例２
６％ナトリウムメチレート溶液を使用するペンタエチレンヘキサミン誘導化ポリジビニルベンゼンマイクロビーズ（大きさ：５μｍ，気孔度：１００オングストローム）のジアゼニウムジオレート化
１５ｍｌのナシ型フラスコ中に、３００ｍｇのペンタエチレンヘキサミン誘導化ポリジビニルベンゼンマイクロビーズ〔大きさ：５μｍ（５，０００ｎｍ），気孔度：１００オングストローム（１０ｎｍ）〕と１０ｍｌの６％ナトリウムメチレート溶液を加えた。そのフラスコは、４７５１シリーズ Parr TM加圧容器に入れられ、１０気圧のＮ2 での加圧／圧抜きの繰り返しサイクル（×１０）によって脱気された。次に、その容器は、３０気圧のＮＯの繰り返しサイクル（×３）で加圧／圧抜きされた。次いで、その容器は、３０気圧のＮＯで満たされてから室温で４８時間攪拌された。４８時間後に、その容器からＮＯが追い出され、そして１０気圧のＮ2 の繰り返しサイクル（×１０）で加圧／圧抜きされた。次いで、ポリジアゼニウムジオレート化ペンタエチレンヘキサミン誘導化ポリジビニルベンゼンマイクロビーズ（大きさ：５μｍ，気孔度：１００オングストローム）を含有するフラスコがその容器から取り出された。次いで、懸濁したマイクロビーズが、１２ｍｌの試験管に移され、Dynac TMテーブルトップ遠心分離機で５，０００ｒｐｍで７分間遠心分離された。上澄み液がデカンテーションされて、１０ｍｌのメタノールが加えられ、そしてペレットが渦巻きミキサーを使用して再懸濁された。更に２サイクルの遠心分離−デカンテーション−再懸濁がメタノールとジエチルエーテル中で行なわれた。この操作で、ポリジアゼニウムジオレート化ペンタエチレンヘキサミン誘導化ポリジビニルベンゼンマイクロビーズの置換アンモニウム形態の溶媒湿潤ペレットがその試験管の底に生じた。そのペレットは、窒素ガス気流下に１０分間置くことによって乾燥された。
乾燥マイクロビーズの０．１５ｍｇのサンプルが、ｐＨ７のリン酸緩衝液中に３７℃で浸漬され、その後、５７日間の分析期間中、化学発光検出可能なＮＯが発生した。放出された全ＮＯは、２．７３×１０-7モル又は１．８５μモル／ｍｇと測定された。５７日間の初めからのＮＯ放出の測定データを慎重にプロットしてその曲線のその後を推定することにより、そのマイクロビーズからのＮＯ放出が更に２８０日間継続する（又は約１０．８カ月の継続的放出）と見積もられた。
【００６３】
実施例３
ポリジアゼニウムジオレート化ペンタエチレンヘキサミン誘導化ポリジビニルベンゼンマイクロビーズ（大きさ：５μｍ，気孔度：１００オングストローム）のナトリウム塩及びポリ塩化ビニルから構成されるポリマー性ブレンド
ＫＢｒプレス機中に、２００ｍｇのポリ塩化ビニルと２０ｍｇのポリジアゼニウムジオレート化ペンタエチレンヘキサミン誘導化ポリジビニルベンゼンのナトリウム塩（実施例２に記載したもの）を加え、水圧プレスを使用して１２，０００ｐｓｉに圧縮した。得られた薄いペレットは時計皿上に置かれてテトラヒドロフランで覆われた。その溶媒は、実験室のヒュームフードの端でゆっくり飛ばされた。残ったペレットは、短時間で減圧乾燥されて、ＮＯを放出するその能力について評価された。
ペレットの約２５％（０．５１ｍｇ）からなるサンプルが、ｐＨ７．４のリン酸緩衝液中に３７℃で浸漬され、その後、１４日間の分析期間中、化学発光検出可能なＮＯが発生した。放出された全ＮＯは、６．２３×１０-7モル又は０．１２μモル／ｍｇと測定された。初めの１４日間からのＮＯ放出の測定データを慎重にプロットしてその曲線のその後を推定することにより、そのマイクロビーズからのＮＯ放出が更に１０日間継続すると見積もられた。
【００６４】
実施例４
ピペラジン誘導化ポリジビニルベンゼンマイクロビーズ（大きさ：５μｍ，気孔度：１００オングストローム）のポリ（メトキシメチルモノジアゼニウムジオレート）誘導体
１５ｍｌのナシ型容器中に、５０ｍｇのブロム化されたポリジビニルベンゼンマイクロビーズ、２．０ｇのＯ2 −メトキシメチル  １−（ピペラジン−１−イル）−１−ジアゼニウム−１，２−ジオレート、及び５ｍｌのテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）を加えた。その混合液は、加熱されて窒素ガス気流下で攪拌下一晩還流された。翌朝、密度の高い沈殿物が形成されており、それは１２ｍｌの試験管中でＴＨＦ中に懸濁され、Dynac TMテーブルトップ遠心分離機で５，０００ｒｐｍで７分間遠心分離された。上澄み液がデカンテーションされて、１０ｍｌのメタノールが加えられ、そしてペレットが渦巻きミキサーを使用して再懸濁された。更に４サイクルの遠心分離−デカンテーション−再懸濁がメタノールとジエチルエーテル中で行なわれた。この操作で、ピペラジン誘導化ポリジビニルベンゼンマイクロビーズのポリ（メトキシメチルモノジアゼニウムジオレート）誘導体の溶媒湿潤ペレットがその試験管の底に生じた。そのペレットは、窒素ガス気流下に１０分間置くことによって乾燥され、７４ｍｇの生成物が生じた。
【００６５】
乾燥マイクロビーズの１．５ｍｇのサンプルが、ｐＨ７のリン酸緩衝液中に３７℃で浸漬され、その後、５日間の分析期間中、化学発光検出可能なＮＯが発生した。放出された全ＮＯは、３．１２×１０-8モル又は０．０２１μモル／ｍｇと測定された。５日間の初めからのＮＯ放出の測定データを慎重にプロットしてその曲線のその後を推定することにより、そのマイクロビーズからのＮＯ放出が更に７日間継続すると見積もられた。
酸化窒素分析は、酸化窒素分析装置を使用して行なわれ、Maragos, et al. 1991. J. Med. Chem., 34 3242-3247 （参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に従ってパターン化された。簡単に説明すると、隔壁が装備された反応器に、少量の試験ポリマーが仕込まれ、そして、その系からヘリウムガスを使用して酸素が追い出される。２ｍｌの０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）を隔壁から注入することにより反応が開始される。ＮＯ含有ガス状流出物が化学発光検出器（Thermal Energy Analyzer Model 502LC, Thermedics, Inc. Woburn, MA）内に掃き込まれる。データは電子的に分析されて既知標準と比較される。
【００６６】
本明細書の高度に架橋しかつ極度に疎水性のポリアミン誘導化ＮＯ放出性ポリマーは、短期及び長期ＮＯ放出の両方が望まれる種々の用途に使用されることができる。例えば、一定の心臓血管用途では、ステント又は血管移植の直後の高いＮＯ“一挙放出”の後に数週間から数カ月の持続的低レベルＮＯ送逹が必要とされ得る。また、継続的ＮＯレベルが好ましく一挙放出が望ましくない用途もあり得る。これらの場合には、ＮＯ放出性の本発明の高度に架橋しかつ極度に疎水性のポリマーは、これら結果を達成するために特別に配合されることができる。
【００６７】
本発明の高度に架橋しかつ極度に疎水性のＮＯ放出性ポリマーは、多方面に使用可能なので、治療的及び予防的レベルのＮＯをあらゆる解剖学的部位に送逹するのに使用されることができる。例えば、本発明の疎水性ポリマーは、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリビニリデン、ポリエチレンイミン、ポリエステル、ポリエーテル、ポリウレタン等が含まれるがこれらに限定されない他の生体適合性ポリマーと共重合されてもブレンドされてもよい。次いで、得られるポリマーは、心臓血管用途のためのステントから性的不能症の治療のためのペニスインプラントに及ぶ移植可能な医療デバイスを二次加工するために使用されることができる。更には、本発明の高度に架橋しかつ極度に疎水性のポリマーは、先に説明したように、マイクロビーズに形成されることができる。これらビーズは、カテーテルを介して冠状動脈内に注入されることができる。注射後、そのＮＯ放出性マイクロビーズは、冠状動脈循環の末端内に移動して、血管腔がそのビーズの直径より小さくなった地点に溜まるようになる。次いで、酸化窒素が、血管形成を誘発するのに十分なレベルでビーズから局所的に放出される。マイクロビーズの大きさは、それらが大きな動脈を遮断して進行中の狭窄から虚血症を悪化させないように制御される。
【００６８】
本発明の生体適合性の高度に架橋しかつ極度に疎水性のポリマーは、金属、ガラス、セラミックス、布、及びポリマーが含まれるがこれらに限定されない種々の材料から作られた多種多様な医療デバイスをコートするのに使用されることができる。更には、マイクロビーズ態様は、ＮＯ放出性表面を有する、ブタやウシの心臓弁のような人工器官を形作るために使用されることもできる。従って、本発明のＮＯ放出性化合物で、提供される医療インプラント及び人工器官の性能が大きく増進されるであろう。例えば、ペースメーカーのような医療デバイスに、本発明のポリマーから作られたＮＯ放出性表面を提供することができる。移植後に、そのようなポリマーコーティングからのＮＯ放出は、炎症を軽減するのに役立ち、創傷治癒を促進し、そして移植後感染を阻止するであろう。結果として、患者の全回復期間は、有意に変更されるであろう。他の期待される恩恵には、手術後副作用の減少、入院期間の短縮、及び健康管理関連費用の軽減が含まれる。