(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトA型抗原に結合能を有する腸管結合性Lactobacillus gasseri乳酸菌であって、下記(i)〜(vii)の全ての性質を有することを特徴とするLactobacillus gasseri乳酸菌。
(i) 式［GalNAcα1-3（Fucα1-2）Gal-］で表されるヒトA型抗原との結合能を示すRU値（A抗原認識性）が2000RU以上
(ii) 式［Galα1-3（Fucα1-2）Gal-］で表されるヒトB型抗原との結合能を示すRU値（B抗原認識性）が100RU以下
(iii) 式［Fucα1-2Gal-］で表されるヒトH型抗原との結合能を示すRU値（H抗原認識性）が100RU以下
(iv) A抗原認識性/B抗原認識性の比が70以上
(v) A抗原認識性/H抗原認識性の比が100以上
(vi) ヒトA型腸管ムチン(A-HCM)との結合能を示すRU値が100RU以上
(vii) ヒトO型腸管ムチン(O-HCM)との結合能を示すRU値が100RU以下
【請求項２】
ヒトB型抗原に結合能を有する腸管結合性Lactobacillus gasseri乳酸菌であって、下記(i)〜(vi)の全ての性質を有することを特徴とするLactobacillus gasseri乳酸菌。
(i) 式［Galα1-3（Fucα1-2）Gal-］で表されるヒトB型抗原との結合能を示すRU値（B抗原認識性）が2000RU以上
(ii) 式［GalNAcα1-3（Fucα1-2）Gal-］で表されるヒトA型抗原との結合能を示すRU値（A抗原認識性）が100RU以下
(iii) 式［Fucα1-2Gal-］で表されるヒトH型抗原との結合能を示すRU値（H抗原認識性）が100RU以下
(iv) B抗原認識性/A抗原認識性の比が50以上
(v) B抗原認識性/H抗原認識性の比が50以上
(vi) ヒトB型腸管ムチン(B-HCM)との結合能を示すRU値が、ヒトA型腸管ムチン(A-HCM) との結合能を示すRU値およびヒトH型腸管ムチン(H-HCM) との結合能を示すRU値より高い
【請求項３】
ヒトH型抗原に結合能を有する腸管結合性Lactobacillus gasseri乳酸菌であって、下記(i)〜(vii)の全ての性質を有することを特徴とするLactobacillus gasseri乳酸菌。
(i) 式［Fucα1-2Gal-］で表されるヒトH型抗原との結合能を示すRU値（H抗原認識性）が700RU以上
(ii) 式［GalNAcα1-3（Fucα1-2）Gal-］で表されるヒトA型抗原との結合能を示すRU値（A抗原認識性）が100RU以下
(iii) 式［Galα1-3（Fucα1-2）Gal-］で表されるヒトB型抗原との結合能を示すRU値（B抗原認識性）が100RU以下
(iv) H抗原認識性/A抗原認識性の比が800以上
(v) H抗原認識性/B抗原認識性の比が20以上
(vi) ヒトO型腸管ムチン(O-HCM)との結合能を示すRU値が100RU以上
(vii) ヒトA型腸管ムチン(A-HCM)との結合能を示すRU値が1000RU以下
【請求項４】
受託番号：NITE BP-25、受託番号：NITE BP-26、受託番号：NITE BP-27、受託番号：NITE BP-28、受託番号：NITE BP-145、受託番号：NITE BP-146のいずれかで特定される、請求項１〜３のいずれかに記載のLactobacillus gasseri乳酸菌。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載のLactobacillus gasseri乳酸菌を含む、ヒトABO式血液型適合性発酵乳および乳製品製造用スターター。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれかに記載のLactobacillus gasseri乳酸菌を含有する、飲食品。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれかに記載のLactobacillus gasseri乳酸菌を含有する、発酵乳および乳酸菌飲料。
【請求項８】
下記条件(i)から(vii)の全てを満たすことを指標とする、表面プラズモン共鳴スペクトルによる血液型A型適合乳酸菌のスクリーニング方法。
(i) 式［GalNAcα1-3（Fucα1-2）Gal-］で表されるヒトA型抗原との結合能を示すRU値（A抗原認識性）が2000RU以上
(ii) 式［Galα1-3（Fucα1-2）Gal-］で表されるヒトB型抗原との結合能を示すRU値（B抗原認識性）が100RU以下
(iii) 式［Fucα1-2Gal-］で表されるヒトH型抗原との結合能を示すRU値（H抗原認識性）が100RU以下
(iv) A抗原認識性/B抗原認識性の比が70以上
(v) A抗原認識性/H抗原認識性の比が100以上
(vi) ヒトA型腸管ムチン(A-HCM)との結合能を示すRU値が100RU以上
(vii) ヒトO型腸管ムチン(O-HCM)との結合能を示すRU値が100RU以下
【請求項９】
下記条件(i)から(vi)の全てを満たすことを指標とする、表面プラズモン共鳴スペクトルによる血液型B型適合乳酸菌のスクリーニング方法。
(i) 式［Galα1-3（Fucα1-2）Gal-］で表されるヒトB型抗原との結合能を示すRU値（B抗原認識性）が2000RU以上
(ii) 式［GalNAcα1-3（Fucα1-2）Gal-］で表されるヒトA型抗原との結合能を示すRU値（A抗原認識性）が100RU以下
(iii) 式［Fucα1-2Gal-］で表されるヒトH型抗原との結合能を示すRU値（H抗原認識性）が100RU以下
(iv) B抗原認識性/A抗原認識性の比が50以上
(v) B抗原認識性/H抗原認識性の比が50以上
(vi) ヒトB型腸管ムチン(B-HCM)との結合能を示すRU値が、ヒトA型腸管ムチン(A-HCM) との結合能を示すRU値およびヒトH型腸管ムチン(H-HCM) との結合能を示すRU値より高い
【請求項１０】
下記条件(i)から(vii)の全てを満たすことを指標とする、表面プラズモン共鳴スペクトルによる血液型O型適合乳酸菌のスクリーニング方法。
(i) 式［Fucα1-2Gal-］で表されるヒトH型抗原との結合能を示すRU値（H抗原認識性）が700RU以上
(ii) 式［GalNAcα1-3（Fucα1-2）Gal-］で表されるヒトA型抗原との結合能を示すRU値（A抗原認識性）が100RU以下
(iii) 式［Galα1-3（Fucα1-2）Gal-］で表されるヒトB型抗原との結合能を示すRU値（B抗原認識性）が100RU以下
(iv) H抗原認識性/A抗原認識性の比が800以上
(v) H抗原認識性/B抗原認識性の比が20以上
(vi) ヒトO型腸管ムチン(O-HCM)との結合能を示すRU値が100RU以上
(vii) ヒトA型腸管ムチン(A-HCM)との結合能を示すRU値が1000RU以下
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、乳酸菌および乳酸菌のスクリーニングに関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト腸管には約200種・100兆個以上の腸内細菌（腸管定住性微生物）が生息している。プロバイオティクスと呼ばれる微生物は、ヒト腸管内で有用菌と有害菌のバランスを改善し、宿主の健康に貢献する。最近では、このプロバイオティクス微生物を食品に応用する動きが潮流となっている。例えば、プロバイオティクス機能を有する乳酸菌を用いて生産された機能性ヨーグルトが、幾つか商品化されている。そのため、よりすぐれたプロバイオティクスを選抜するマススクリーニング技術が求められている。
【０００３】  腸管定住性乳酸菌はヒト腸管に接着し増殖する。そのため、プロバイオティクス機能が発揮されるためには、乳酸菌の腸管結合性が非常に重要である。ヒト腸管内での乳酸菌の結合機構は、いまだ解明されたとはいえない。腸管系乳酸菌に関するこれまでの研究から、L. caseiが糖脂質糖鎖との結合性を有すること、L. reuteriやL. crispatusがコラーゲンとの結合性を有することが確認されており、さらに上記腸管系乳酸菌と結合するレクチン様タンパク質が同定されている。しかし、多くの健常者の腸管上皮では、細胞骨格タンパク質（コラーゲン）の露出箇所は極めて少なく、腸管上皮のレクチン様タンパク質による乳酸菌定着は考えにくい。そこで、腸管定住性乳酸菌の腸管結合性には腸管ムチンに結合する糖鎖が重要な役割を果たしていると考えられる。多くの腸管定住性乳酸菌の表層タンパク質（surface layer protein , SLP）には、糖質を認識するタンパク質であるレクチン様タンパク質が存在する。腸管の表面には腸管ムチンが存在する。  また、腸管ムチンは、O-グリコシド結合を介してポリペプチド（コアタンパク質、アポムチン）に結合した無数のムチン型糖鎖を持つ、粘液性の高分子量糖タンパクである。すなわち腸管定住性乳酸菌は、菌表層のレクチン様タンパク質を通じて腸管ムチンの糖鎖に結合することにより腸管結合性を獲得し、安定的な増殖を図っていると考えられる。【０００４】  一方、近年になって、ヒト大腸ムチン（human colonic mucin : HCM）を構成する糖鎖の化学構造は、ABO式血液型により異なるという興味深い事実が報告された（非特許文献1-4）。【０００５】  ヒトABO式血液型は、赤血球表面に発現している抗原物質の種類によって区別される。このABO式血液型物質の抗原部位は、特定化学構造の糖鎖（ABO式血液型抗原）である。A型抗原とB型抗原はともに３個の糖からなる分子で、２個の糖からなるH型抗原と呼ばれる基本構造に特定の結合様式でα-N-アセチルガラクトサミンが結合したのがA型抗原であり、α-ガラクトースが結合したのがB型抗原である。A型の血液のヒトはA型抗原、B型の血液のヒトはB型抗原、AB型の血液のヒトはA型抗原およびB型抗原の両方を赤血球表面に発現している。それに対し、O型の血液のヒトは基本構造のH型抗原を発現する。【０００６】  上述の、消化管ムチンの糖鎖構造が血液型により異なるという科学的事実は、消化管に結合増殖するプロバイオティクス乳酸菌の種類が血液型により異なることを示唆している。それぞれの血液型に適合した乳酸菌が見つかれば、個人レベルに対応した機能性ヨーグルトの開発が実現可能になる。これまでに本発明者らは、この点に着目し、ヒト腸管結合性乳酸菌をABO式血液型抗原との吸着力によりスクリーニングする方法を開発した（特許文献1）。この方法は、乳酸菌とABO式血液型抗原との吸着力を、表面プラズモン共鳴スペクトル（SPR）を利用して検出し、血液型によって適合する乳酸菌を選択する画期的方法である。具体的には、リガンドとしてABO式血液型抗原または腸管由来のムチンを用い、センサーチップ上に固定化したリガンドに乳酸菌を接触させたときの乳酸菌とリガンドとの結合を、該結合に伴ってセンサーチップ上に生じる質量変化を表面プラズモン共鳴（Surface Plasmon Resonance＝SPR）シグナルとして検出する���法である。上記質量変化は、Resonance Unit（=RU レゾナンスユニット）で表され、１RU＝１pg/mm2であり、１RUは１mm2に物質１pgが結合したことを表す。本発明者らは、上記方法を実施し、Lactobacillus crispatus JCM8778株、Lactobacillus acidophilus OLL2769株がA型抗原認識性であることを確認している（特許文献1、非特許文献5）。しかし、ヨーグルトをはじめとする、プロバイオティクス乳酸菌を用いた食品の需要増が期待されることから、さらに結合性にすぐれた血液型結合性乳酸菌の獲得が待たれていた。【０００７】
【特許文献１】特開2004-101249
【非特許文献１】天野純子、生化学，社団法人日本生化学会，1999年，第71巻，p.274-277
【非特許文献２】Holgersson, J., Stromberg, N., and Breimer, M. E., Glycolipids of human large intenstine: glycolopid expression related to anatomical localization, epithelial / non-epithelial tissue and the ABO, Le and Se phenotypes of the donors. Biochimie, 70, 1565-1574(1988).
【非特許文献３】Holgersson, J., Jovall, P. A., and Breimer, M. E., Glycosphingolipids of human large intenstine: detailed structural characterization with special reference to blood group compounds and bacterial receptor structures. J. Biochem, (Tokyo), 110, 120-131(1991).
【非特許文献４】Vanak, J., Ehrmann, J., Drimalova, D., Nemec, M., monoclonal antibodies in the detection of blood group antigens A and B in the mucosa of the large intestine. Cas Lek Cesk, 18, 364-367(1988).
【非特許文献５】Uchida, H. et al，Biosci. Biotechnol. Biochem., 68(5), 1004-1010 (2004).
【非特許文献６】Holmes, S. D.et al, Studies on the interaction of Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis with fibronectin using surface plasmon resonance (BIACORE). J. Microbiological Methods, 28, 77-84 (1997).
【非特許文献７】Fratamico, P. M.et al, Detection of Escherichia coli O157:H7 using a surface plasmon resonance biosensor. Biotechnol. Techniques., 7, 571-576 (1998).
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】  本発明はこのような状況に鑑みてなされたものであり、本発明が解決しようとする課題は、ヒトABO式血液型に適合した新規な腸管結合性乳酸菌を見出すことである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】  上記課題を解決すべく、本発明者らは、上述の表面プラズモン共鳴スペクトルによる乳酸菌スクリーニング方法を実施した。上記方法は既に乳酸菌スクリーニング方法として確立されているが、大規模スクリーニングにより適合させるため、本発明者らにより上記乳酸菌スクリーニング方法における「選択基準値」を設定する試みが行われた。これまでに、細菌について表面プラズモン共鳴スペクトルで検討した例として、黄色ブドウ球菌とフィブロネクチンの結合を表面プラズモン共鳴スペクトルにより測定した例（非特許文献6）、Eschelichia coli O157を、抗Eschelichia coli O157抗体を介してチップ上に固定化したプロテインAまたはプロテインGにより検出する例（非特許文献7）が知られており、これらの論文では、生菌体の結合を示すRU値は約100から1000RUとなっている。しかし、乳酸菌について表面プラズモン共鳴スペクトルで検討した例は、本発明者らによる報告以外に知られていない（特許文献1、非特許文献5）。また、検体が同じであっても測定諸条件によりRU値は変化しうる。そこで本発明者らは、鋭意努力の結果、一定条件の下において100RUを菌結合の判断基準とすることにより、ABO式血液型に適合する乳酸菌のスクリーニング方法を確立した。【００１０】
さらに本発明者らは、ヒト腸管より単離したヒト腸起源の乳酸菌238菌株について上記スクリーニング方法を実施し、さらにヨーグルト産生用途の適合性を判断するための試験を実施し、ついに血液型A型、B型、およびO型に適合する菌株を具体的に見出した。すなわち、本発明は血液型適合性ヨーグルトに適した乳酸菌および該乳酸菌のスクリーニング方法に関し、具体的には下記を提供するものである。
（１）下記（ａ）から（ｃ）のいずれかの式で表されるヒトABO式血液型抗原に結合能を有する腸管結合性Lactobacillus gasseri乳酸菌
（ａ）［GalNAcα1-3（Fucα1-2）Gal-］
（ｂ）［Galα1-3（Fucα1-2）Gal-］
（ｃ）［Fucα1-2Gal-］、
（２）受託番号：NITE BP-25、受託番号：NITE BP-26、受託番号：NITE BP-27、受託番号：NITE BP-28、受託番号：NITE BP-145、受託番号：NITE BP-146のいずれかで特定される、上記（１）に記載のLactobacillus gasseri乳酸菌、
（３）上記（１）または上記（２）に記載のLactobacillus gasseri乳酸菌を含む、ヒトABO式血液型適合性発酵乳および乳製品製造用スターター、
（４）上記（１）または上記（２）に記載のLactobacillus gasseri乳酸菌を含有する、飲食品、
（５）上記（１）または上記（２）に記載のLactobacillus gasseri乳酸菌を含有する、発酵乳および乳酸菌飲料、
（６）下記条件（i）から（iii）を満たすことを指標とする、表面プラズモン共鳴スペクトルによる乳酸菌のスクリーニング方法。
（i）A型のヒトABO式血液型抗原との結合能を示すRU値が100RU以上であること
（ii）B型および／またはH型のヒトABO式血液型抗原との結合能を示すRU値が100RU以下であること
（iii）ヒトA型腸管ムチンとの結合能を示すRU値が100RU以上であること、
（７）下記条件（i）から（iii）を満たすことを指標とする、表面プラズモン共鳴スペクトルによる乳酸菌のスクリーニング方法。
（i）B型のヒトABO式血液型抗原との結合能を示すRU値が100RU以上であること
（ii）A型および／またはH型のヒトABO式血液型抗原との結合能を示すRU値が100RU以下であること
（iii）ヒトB型腸管ムチンとの結合能を示すRU値が100RU以上であること
（８）下記条件（i）から（iii）を満たすことを指標とする、表面プラズモン共鳴スペクトルによる乳酸菌のスクリーニング方法。
（i）H型のヒトABO式血液型抗原との結合能を示すRU値が100RU以上であること
（ii）A型および／またはB型のヒトABO式血液型抗原との結合能を示すRU値が100RU以下であること
（iii）ヒトO型腸管ムチンとの結合能を示すRU値が100RU以上であること。
（９）下記条件（i）から（iii）を満たすことを指標とする、表面プラズモン共鳴スペクトルによる乳酸菌のスクリーニング方法。
（i）B型のヒトABO式血液型抗原との結合能を示すRU値が100RU以上であること
（ii）A型およびH型のヒトABO式血液型抗原との結合能を示すRU値が100RU以下であること
（iii）ヒトB型腸管ムチンとの結合能を示すRU値が、ヒトA型腸管ムチンとの結合能を示すRU値およびヒトO型腸管ムチンとの結合能を示すRU値よりも大きいこと
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ヒトABO式血液型の糖鎖抗原部位を有するビオチニル化ポリマー（BP）プローブの化学構造を示す図である。
【図２】A型抗原BP-プローブの糖鎖部分（上）、B型抗原BP−プローブの糖鎖部分（中）、およびO型抗原BP-プローブの糖鎖部分（下）を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】  本発明は、（ａ）［GalNAcα1-3（Fucα1-2）Gal-］、（ｂ）［Galα1-3（Fucα1-2）Gal-］、（ｃ）［Fucα1-2Gal-］のいずれかの式で表されるヒトABO式血液型抗原に結合能を有する腸管結合性Lactobacillus gasseri乳酸菌を提供する。【００１３】
一般的に、乳酸菌とは、グルコースから乳酸をモル比換算で50％以上つくる細菌群の総称である。Lactobacillus属、Lactococcus属、Streptococcus属、Leuconostoc属は、乳酸菌の代表的な属である。またBifidobacterium属は本明細書における乳酸菌に含まれる。Lactobacillus属は、さらに種に分類される。Lactobacillus 属の菌種の代表例として、Lactobacillus delbruekii subsp. bulgaricus (L. bulgaricus)、Lactobacillus delbruekii subsp.  delbruekii(L. delbruekii)、Lactobacillus acidophilusグループ乳酸菌（L. acidophilusグループ）、 Lactobacillus casei (L. casei)、Lactobacillus  plantarum（L. plantarum）、Lactobacillus brevis (L. brevis)、Lactobacillus buchneri （L. buchneri）、Lactobacillus fermentum （L. fermentum）、Lactobacillus helveticus （L. helveticus）などを挙げることができる。L. acidophilusグループ乳酸菌は、DNA-DNAホモロジーおよび細胞壁組成分析の結果により、Lactobacillus acidophilus（A-1）、Lactobacillus crispatus（A-2）、Lactobacillus amylovorus（A-3）、Lactobacillus gallinarum（A-4）、Lactobacillus gasseri（B-1）、およびLactobacillus johnsonii（B-2）の６菌種に分類される。
【００１４】  本発明のLactobacillus gasseri（以下、場合により「L. gasseri」と略す）乳酸菌は、ヒトABO式血液型抗原に結合能を有することを特徴とする腸管結合性Lactobacillus gasseriである。本発明においてABO式ヒト血液型抗原とは、血液型を決定する糖鎖であり、具体的には、A型糖鎖（A型抗原）：［GalNAcα1-3（Fucα1-2）Gal-］、B型糖鎖（B型抗原）：［Galα1-3（Fucα1-2）Gal-］、O型糖鎖（本明細書において、血液型O型を決定する糖鎖を意味し、H型抗原、O型抗原ともいう。）：［Fucα1-2Gal-］である。上述の通り、腸管表層に存在する腸管ムチンはABO式血液型により異なる糖鎖を有する。本発明者らは、A型のヒト腸管から調製されたムチンに結合する乳酸菌のうち、ヒト血液型A型を決定する抗原であるA型糖鎖に結合するL. gasseri乳酸菌があることを確認した。また、上記ムチンにA型糖鎖が発現していることも確認した。したがって本発明のL. gasseri乳酸菌において、上記A型糖鎖に結合し、他の型の糖鎖に吸着しない乳酸菌は、腸管ムチン上のA型糖鎖に結合することにより、ABO式血液型A型のヒトについて腸管結合性を獲得している。該L. gasseri乳酸菌は、血液型A型のヒトの腸管に安定的に結合・増殖し、プロバイオティクス機能を発揮すると考えられる。すなわち、該L. gasseri乳酸菌は、特に血液型A型のヒトの健康に貢献することができ、血液型A型のヒトに適合しているということができる。同様に、上記B型糖鎖に結合し、他の型の糖鎖に吸着しない本発明L. gasseri乳酸菌は、ABO式血液型B型のヒトに適合する。上記O型糖鎖に結合し、他の型の糖鎖に吸着しない本発明L. gasseri乳酸菌は、ABO式血液型O型のヒトに適合する。【００１５】  本発明のL. gasseri乳酸菌（以下、時に「血液型別結合性L. gasseri乳酸菌」と称す）は、ヒト糞便から分離することができる。血液型A型のヒトに適合するL. gasseri乳酸菌（以下、「A型適合乳酸菌」と略す）であれば、ABO式血液型A型のヒトの糞便から、血液型B型のヒトに適合するL. gasseri乳酸菌（以下、「B型適合乳酸菌」と略す）であれば、ABO式血液型B型のヒトの糞便から、血液型O型のヒトに適合するL. gasseri乳酸菌（以下、「O型適合乳酸菌」と略す）であれば、ABO式血液型O型のヒトの糞便から、より効率よく分離できる可能性が高い。分離に際しては、当業者に周知のL. gasseri乳酸菌の性質を目安とすることができる。例えば、桿菌、ホモ発酵、好気性発育あり、ガス生成無し、等を目安とすることができる。【００１６】  本発明の血液型別結合性L. gasseri乳酸菌を培養するには、一般的に乳酸桿菌の培養に適した培地であればよく、グルコース、ラクトース、ガラクトース、フルクトース、トレハロース、スクロース、マンノース、セロビオース等の炭素源、肉エキス、ペプトン、イーストエキストラクト、カゼイン、ホエータンパク質等の窒素源、硫酸マグネシウム、硫酸鉄、硫酸マンガン等の無機栄養素を含む培地を用いることができる。好適な例の一つとして、Lactobacilli MRS broth (Difco, Ref. No.288130)を挙げることができる。培養条件は、腸内乳酸菌が生育しうる条件であれば、特に制限はない。好ましい条件としては、例えば、pH5.0−pH8.0、温度20℃−45℃であり、より好ましい条件としては、嫌気性、pH5.0−pH7.0、温度30℃−40℃である。【００１７】
上記のようにして分離・培養したL. gasseriが血液型別の腸管結合性および血液型抗原との結合性を有するかについては、ヒト腸管ムチンまたは血液型抗原との結合性の有無を判断することにより知ることができる。例えば、被験菌の表層より菌体表層タンパク質（SLP）を調製し、ビオチン等で標識したSLPと腸管ムチンあるいは血液型抗原との結合性を検出してもよい。または、標識腸管ムチンあるいは標識血液型抗原を用いて、被験菌のSLPの電気泳動後にハイブリダイゼーションの手法により検出してもよい。また後述する実施例のように、表面プラズモン解析装置（例えば、BIACORE1000）を用いれば、生菌のまま検出することが可能である。
【００１８】
血液型別のヒト腸管ムチンを調製するには、特定の血液型のヒト腸管から表層部分を採取し、塩酸グアニジン等の可溶化剤を用いてゲルろ過を行い、タンパク質吸収と中性糖含量がともに高いことを目安にして精製することができる。例えば、Purushothaman, S. S. et al, Adherence of Shigella dysenteriae 1 to Human Colonic Mucin. Curr. Microbiol., 42(6), 381-387 (2001) 記載の方法を参考に実施することができる。抗血液型抗原抗体を用いて、調製したヒト腸管ムチンに血液型抗原が発現していることを確認すると、より好ましい。具体例として、実施例に記載の方法を挙げることができる。一方、血液型抗原は、後述する式または図２に記載した糖鎖配列をもとに合成してもよく、市販の糖鎖プローブ（例：生化学工業製）あるいはネオグリコプロテイン・Blood Group A Trisaccaride-BSA（例：Calbiochem社）やネオグリコプロテイン・Blood Group B Trisaccaride-BSA（例：Calbiochem社）などを用いてもよい。
【００１９】  本発明の血液型別結合性L. gasseri乳酸菌の代表例として、受託番号：NITE BP-25、受託番号：NITE BP-26、受託番号：NITE BP-27、受託番号：NITE BP-28で特定されるLactobacillus gasseriを挙げることができる。これらのうち、受託番号：NITE BP-26と受託番号：NITE BP-27で特定される乳酸菌はA型適合乳酸菌であり、受託番号：NITE BP-25と受託番号：NITE BP-28で特定される乳酸菌はO型適合乳酸菌である。これらの菌株は、本発明者らによって、上述した各血液型への適合性が確認された乳酸菌である。さらなる本発明の血液型別結合性L. gasseri乳酸菌の代表例として、受託番号：NITE BP-145、受託番号：NITE BP-146で特定されるLactobacillus gasseriを挙げることができる。これら受託番号：NITE BP-145、受託番号：NITE BP-146で特定される乳酸菌はB型適合乳酸菌である。これら菌株は、本発明者らによって、血液型B型への適合性が確認された。【００２０】  本発明者らは、これら菌株を、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に基づき、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに寄託した。以下に、寄託を特定する内容を記載する。受託番号NITE BP-25,26,27,28については以下のとおりである。（イ）寄託機関：独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター    （所在地：日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  郵便番号292-0818）（ロ）原寄託日：平成16年（2004年）10月8日      ブダペスト条約に基づく寄託への移管請求受領日（移管日）：平成17年（2005年）5月6日（ハ）受託番号：      Lactobacillus gasseri OLL2915株  （受託番号NITE BP-25）      Lactobacillus gasseri OLL2804株  （受託番号NITE BP-26）      Lactobacillus gasseri OLL2818株  （受託番号NITE BP-27）      Lactobacillus gasseri OLL2827株  （受託番号NITE BP-28）受託番号NITE BP-145,146については以下のとおりである。（イ）寄託機関：独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター    （所在地：日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  郵便番号292-0818）（ロ）原寄託日：平成17年（2005年）10月4日      ブダペスト条約に基づく寄託への移管請求受領日（移管日）：平成17年（2005年）11月25日（ハ）受託番号：      Lactobacillus gasseri OLL2877株  （受託番号NITE BP-145）      Lactobacillus gasseri OLL2901株  （受託番号NITE BP-146）【００２１】  本発明の血液型別結合性L. gasseri乳酸菌は、血液型別に適合する飲食品の製造に用いることができる。本発明の血液型別結合性L. gasseri乳酸菌を用いて作る飲食品は、カテゴリーや種類に制限はなく、機能性食品、特定保健用食品、健康食品、介護用食品でもよく、また、菓子、乳酸菌飲料、チーズやヨーグルト等の乳製品、調味料等であってもよい。飲食品の形状についても制限はなく、固形、液状、流動食状、ゼリー状、タブレット状、顆粒状、カプセル状など、通常流通しうるあらゆる飲食品形状をとることができる。上記飲食品の製造は、当業者の常法によって行うことができる。上記飲食品の製造においては、乳酸菌生育を妨げない限り、糖質、タンパク質、脂質、食物繊維、ビタミン類、生体必須微量金属（硫酸マンガン、硫酸亜鉛、塩化マグネシウム、炭酸カリウム、等）、香料やその他の配合物を添加することもできる。【００２２】  本発明の血液型別結合性L. gasseri乳酸菌は、一般飲食品に混合して用いることができるほ��、特に、ヨーグルトやチーズ等の乳製品・発酵乳の製造用スターターとすることができる。スターターとする場合は、本発明の血液型別結合性L. gasseri乳酸菌の生息・増殖に支障がない限り、また乳製品製造に支障がない限り、他の微生物が混合されていてもよい。例えば、ヨーグルト用乳酸菌として主要な菌種であるLactobacillus delbruekii subsp. bulgaricus, Streptococcus thermophilus， Lactobacillus acidophilus等と混合してもよく、その他、一般にヨーグルト用やチーズ用として用いられる菌種と混合してスターターとすることができる。上記スターターによるヨーグルト製造は、常法にしたがって行うことができる。例えば、加温・混合・均質化・殺菌処理後冷却した乳または乳製品に、上記スターターを混合し、発酵・冷却すれば、プレーンヨーグルトを製造することができる。【００２３】  本発明血液型別結合性L. gasseri乳酸菌を用いて製造された飲食品は、飲食品中に同菌を含有する。該飲食品をABO式血液型の適合したヒトが摂取すると、該飲食品中の本発明血液型別結合性L. gasseri乳酸菌が腸管に結合・増殖し、腸内バランスの調整・維持やプロバイオティクス機能の早期発揮が見込まれる。したがって、該飲食品は一般の飲食品としてのみならず、健康増進目的の機能性食品・保健栄養食品・介護用食品・健康食品等として有用である。【００２４】  また本発明は、表面プラズモン共鳴スペクトルによる乳酸菌のスクリーニング方法を提供する。本発明のスクリーニング方法は、血液型別に適合する乳酸菌を選別するための方法である。本発明のスクリーニング方法は、表面プラズモン共鳴スペクトルにより乳酸菌と血液型別ヒト腸管ムチン及びABO式血液型抗原との結合性を測定することによりスクリーニングを行うものであって、（i）特定の血液型のABO式血液型抗原と一定量以上の結合能を有すること、（ii）上記（i）における特定の血液型以外の血液型のABO式血液型抗原と一定量以上の吸着能を有しないこと、（iii）上記（i）における特定の血液型のヒト腸管ムチンと一定量以上の結合能を有すること、を指標として選別する。ABO式血液型抗原との結合能を測定することで、主に血液型を決定する抗原以外の部分（例えば、糖鎖の非末端部分の部分構造、シアル酸や硫酸基の発現部位、ムチンタンパク質部位）に結合する乳酸菌を排除することができ、血液型特異性の高い乳酸菌のスクリーニングを可能とする。本発明においてヒトA型腸管ムチンとは、ABO式血液型のA型のヒト由来の腸管ムチンを指す。同様に、ヒトB型腸管ムチンとは、血液型B型ヒト由来腸管ムチンであり、ヒトO型腸管ムチンとは、血液型O型ヒト由来腸管ムチンである。【００２５】
本発明のスクリーニング方法では、ABO式血液型抗原及びヒト腸管ムチンをプローブとして表面プラズモン共鳴スペクトル解析を行う。表面プラズモン共鳴スペクトルを利用した生体分子間相互解析装置としては、例えばBIACORE1000（ビアコア株式会社）を用いることができる。ABO式血液型抗原及びヒト腸管ムチンの調製方法については、上述のとおりである。プローブを固定化する場合は、公知の固定化方法によって行うことができる。固定化方法は、物理的吸着による方法または共有結合による吸着でもよい。一例を挙げれば、チップをストレプトアビジンでコートし、プローブをビオチン化すれば、ビオチン-アビジン結合により、容易に固定化することができる。あらかじめストレプトアビジン化した市販のチップ（BIACORE社）を使用してもよい。
【００２６】  本発明の方法は表面プラズモン共鳴スペクトルによるものであるため、上記「結合能」は、レゾナンスユニット（RU）で示される。1RUは、1mm2に1pgの物質が結合することを表す。本発明の方法において、上記「一定量以上の結合能」は、「100RU」を基準として判断する。すなわち、「100RU」以上の測定値によって、乳酸菌がプローブに一定量以上結合すると判断する。例えば、血液型A型ヒト由来腸管ムチンをプローブとしたときの測定結果が100RU以上あれば、その乳酸菌は該腸管ムチンに結合する乳酸菌である。RU値は、測定条件により変化しうる。本方法における温度条件は、例えば、20-40℃、好ましくは、20-30℃、より好ましくは23−28℃である。また、本方法における好ましいサンプル濃度は0.1−0.5mg/mL、本方法における好ましい流速は3-10μl/minである。上記範囲であれば、上記諸条件を変化させてもRU値に変動はないため、結合の有無を「100RU」で判断できる。さらに、サンプル濃度等の諸条件を上記範囲外に変化させた場合でも、実質的に上記条件における100RUと同等であれば、本方法における「100RU」に含まれる。またABO式血液型抗原プローブとの結合能に関しては、より選抜基準を厳しくする目的であれば、「100RU」以外の数値によって選別してもよい。本発明の方法においては、RU値が高い菌ほどプローブ（リガンド）との強い結合能を有する菌であることを意味する。そこで、より強い結合力を有する菌を求める目的であれば、100よりも高いRU値でABO式血液型抗原プローブと結合する菌をスクリーニングしてもよい。例えば、150,200,300,400,500,600,700,800,900,または1000RUでもよく、後述の実施例のように2000RUを基準としてスクリーニングしてもよい。逆に、目的としない血液型に対する認識については、「100RU以下」より厳しい数値を基準としてスクリーニングしてもよい。例えば、90,80,70,60,50RUを基準としてもよい。【００２７】  なお、血液型別結合性乳酸菌は、本発明のスクリーニング法において、血液型別ヒト腸管ムチンをプローブとしたときの測定値（RU）がABO式血液型プローブを用いたときの測定値（RU）より低くなると予想される。これは、ヒト腸管ムチンをチップに固定化した場合のヒト腸管ムチンに結合している血液型抗原（糖鎖）は、チップ単位面積あたりで比較すると、血液型抗原（糖鎖）のみをチップに固定化した場合に少なくなるからと考えられる。特定のABO式血液型プローブを用いたときの測定値が他のABO式血液型プローブを用いたときの測定値に比較して充分に高い乳酸菌については、該特定の血液型別ヒト腸管ムチンをプローブとしたときの測定値が100RU以下であっても、該特定の血液型別ヒト腸管ムチンをプローブとしたときの測定値がその他の血液型別ヒト腸管ムチンプローブを用いたときの測定値よりも充分高いかどうか検討し、本発明の目的における有用性があると判断できる場合は、本発明の血液型別結合性乳酸菌とすることができる。例えば、A型適合乳酸菌では、（i）A型のヒトABO式血液型抗原との結合能を示すRU値が100RU以上であること、（ii）B型およびH型のヒトABO式血液型抗原との結合能を示すRU値が100RU以下であること、（iii）ヒトA型腸管ムチンとの結合能を示すRU値が、ヒトB型腸管ムチンとの結合能を示すRU値およびヒトO型腸管ムチンとの結合能を示すRU値よりも大きいこと、を指標としてスクリーニングすることが可能である。B型適合乳酸菌では、（i）B型のヒトABO式血液型抗原との結合能を示すRU値が100RU以上であること、（ii）A型およびH型のヒトABO式血液型抗原との結合能を示すRU値が100RU以下であること、（iii）ヒトB型腸管ムチンとの結合能を示すRU値が、ヒトA型腸管ムチンとの結合能を示すRU値およびヒトO型腸管ムチンとの結合能を示すRU値よりも大きいこと、を指標としてスクリーニングすることが可能である。O型適合乳酸菌では、（i）H型のヒトABO式血液型抗原との結合能を示すRU値が100RU以上であること、（ii）A型およびB型のヒトABO式血液型抗原との結合能を示すRU値が100RU以下であること、（iii）ヒトO型腸管ムチンとの結合能を示すRU値が、ヒトA型腸管ムチンとの結合能を示すRU値およびヒトB型腸管ムチンとの結合能を示すRU値よりも大きいこと、を指標としてスクリーニングすることが可能である。【００２８】  表面プラズモン共鳴スペクトル測定の際、被験菌が非特異的吸着により菌凝集を起こし、RU値が異常に高くなる場合がある。そのため、ヒト由来腸管ムチンやABO式血液型抗原との吸着が測定結果に正しく反映されなくなる。そこで、RU値が異常に高い場合は、非特異的吸着（菌凝集）を起こしていると疑われるとして、該乳酸菌をスクリーニングから除外することができる。【００２９】
本発明のスクリーニング方法の対象は、乳酸菌であれば特に限定はない。あえて対象例を挙げるとすれば、Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus amylovorus, Lactobacillus gallinarum, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus casei, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus zeae, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus delbruekii subsp. bulgaricus, Lactobacillus delbruekii subsp. lactis, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus murinus, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium pseudolongum, Enterococcus faecium, Enterococcus fecalis, Streptococcus thermophilusについて好適に用いることができる。より好適な対象例としては、Lactobacillus属であり、最も好適な対象例としては、L.gasseriを含むLactobacillus acidophilusグループ乳酸菌である。
【００３０】  本発明の方法によりスクリーニングされた乳酸菌は、特定のABO式血液型のヒトの腸管に結合しやすい乳酸菌である。該特定血液型のヒトが、本発明の方法によりスクリーニングされた乳酸菌を摂取することにより、短期間での腸内バランスの向上などの効果により、健康増進を図ることができる。そのため、本発明の方法によりスクリーニングされた乳酸菌は、特定血液型ヒト用の飲食品、機能性食品、特定保健用食品、乳製品、乳酸菌飲料などに適用できる。  なお、本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【００３１】  以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。【００３２】［実施例１］  ガス産生試験  ヨーグルト生産に使用する乳酸菌は、ガスを産生しないことが望ましい。これは、我が国の法令では密封容器で市販することが義務付けられているためであり、またガス産生に伴う容器膨張による製品不良や破裂を防ぐためでもある。そこで238株について、ガス産生試験を実施した。【００３３】  乳酸菌を、MRS Broth (DIFCO) で2回賦活培養 (37℃,18h)した。アルミキャップ付き試験管にあらかじめダーラム管及びMRS Broth (5ml) を共に入れて滅菌 (121℃, 15分) した。ダーラム管は開口部を下に向けてあり、滅菌時にダーラム管中から気泡が除かれる。上記の滅菌したアルミキャップ付き試験管に、約109cfu/mLの乳酸菌液10μLを接種し、嫌気的に37℃で24時間培養した。培養終了後、ダーラム管内に蓄積したガスの有無を目視観察した。明らかな気泡が観察された場合に、ガス産生有り（+）と判定した（表１）。【００３４】［実施例２］  血液型抗原認識性の解析  血液型適合性ヨーグルト用の乳酸菌を取得するため、血液型抗原を認識して結合する乳酸菌を、表面プラズモン共鳴スペクトル測定により選抜することにした。供試菌として、乳酸菌Lactobacillus acidophilusグループに属する238株（L. gasseri, L. plantarum, L. crispatus, L. amylovorus, L. casei, L. salivarius, L. brevis, L. fermentum等）を準備した。表面プラズモン共鳴スペクトル解析装置は、BIACORE1000を用いた。【００３５】  ２-（１）アナライトの調製  各菌株は起菌後MRS培地にて3回継代し、12時間培養後1.5ml容チューブに500μl分注した。本溶液を遠心分離（6,000rpm, 4℃, 10min)して得た菌体をPBS (pH7.2)中で2回洗浄後、凍結乾燥した。本菌体をHBS-EP buffer（0.01M HEPES pH7.4, 0.15M NaCl, 3mM EDTA, 0.005% Surfactant P20）を用いて0.1mg/ml濃度に調製し、アナライト溶液とした。【００３６】  ２-（２）血液抗原プローブおよびチップへの固定化  菌選抜に用いるプローブとして、ヒトABO式血液型物質の抗原構造を使用した。具体的には、下記の３糖糖鎖ビオチニル化ポリマープローブ（生化学工業製）（以下、「BP-プローブ」とも記載する）を使用した。A抗原プローブ：［GalNAcα1-3（Fucα1-2）Gal-］B抗原プローブ：［Galα1-3（Fucα1-2）Gal-］H抗原プローブ：［Fucα1-2Gal-］上記BP-プローブの化学構造について図１に、糖鎖構造について図２に示す。【００３７】
上記血液抗原BP-プローブを、HBS-EP buffer(pH7.4)で 0.1mg/10ml に調製した。本溶液をセンサーチップSAに添加して、ビオチン・アビジン反応により、市販のプローブをセンサーチップ表面に固定した。センサーチップSA（ビアコア株式会社）とは、ストレプトアビジンが固定化されているBIACORE専用チップである。A抗原プローブの固定化量は750RUを示す量、B抗原プローブの固定化量は850RUを示す量とした。O抗原プローブの固定化は、次のように行った。１ｍｇのA抗原糖鎖プローブ（生化学工業（株））をα-結合で存在するGalNAcを加水分解する酵素α-N-Acetylgalactosaminidase (E.C.3.2.1.97 Streptococcus pneumoniae由来、 SIGMA, JAPAN)0.5Uを用いて、酢酸緩衝液pH4.5中、５５℃で２０時間反応させ、末端GalNAcを除去した。（A抗原抗体での除去率の測定では、８０％以上のGalNAcは除去されていることを確認した）このビオチニル化H型抗原糖鎖プローブをA型抗原糖鎖プローブと同様に、アビジンを結合したセンサーチップ上に固定化した。この際の結合量は、約1000RUであった。
【００３８】  ２-（３）ヒト腸管ムチンの調製およびチップへの固定化  菌選抜に用いるもう1つのリガンドとして、ヒト大腸ムチンを調製した。ヒトA型腸管（大腸）、ヒトB型腸管（大腸）、およびヒトO型腸管（大腸）は東北大学大学院医学系研究科より、標本採取試料として分譲された。粘液ムチン層は、大腸正常部位から表層掻き取り法で採取した。ムチン層は、Folchの溶媒およびジエチルエーテルにより脱脂後乾燥させ、4M塩酸グアニジン溶液により37℃で2時間抽出した。ゲルろ過を行い、精製したヒトA型、ヒトB型、またはヒトO型腸管ムチン（human colon mucin :HCM、以下において、時にA型腸管ムチンをA-HCM、B型腸管ムチンをB-HCM、O型腸管ムチンをO-HCMと略す）として、試験に供した。ゲルろ過精製は、Purushothaman, S. S. et al, Adherence of Shigella dysenteriae 1 to Human Colonic Mucin. Curr. Microbiol., 42(6), 381-387 (2001).に記載されたヒト大腸ムチンの精製方法に基づき実施した。移動層は4M 塩酸グアニジン溶液、カラムはToyopearl HW-65F (90cm×2.6cm, Tosoh. Tokyo. Japan)を用いた。検出に関しては、中性糖をフェノール硫酸法(490nm)で、タンパク質を280nmで測定をした。タンパク質吸収があり、かつ中性糖含量の最も高いピークを選択し、さらに分子量約200万以上を目安に分取し、ヒト大腸ムチン（HCM）とした。得られたHCMについて、各血液型のヒト血液型基質抗原性を抗体により確認した。なお、上記試料採取に関しては、東北大学大学院医学系研究科の倫理委員会を経て実施し、また患者の同意を得ている。【００３９】
HCMのBIACORE1000用チップへの固定化は、アミンカップリング法により行った。まず、予めカルボキシメチルデキストラン基を導入したセンサーチップCM5に対して、75.0mg/mlのN-ethyl-N’-(3-dimethyl aminopropyl-carbodiimide hydrochloride (EDC) を50μlおよび11.5mg/mlのN-hydroxysuccinimide (NHS)を50μlを混合した混合試薬を流し、デキストラン末端に導入されているカルボキシル基を活性化させた。そこへ120μl 固定化用酢酸 buffer（pH4.0）にHCM-A 30μlを加えた混合溶液を流し、アミン・カップリング反応により共有結合させた。ついで、1M ethanolamine hydorochloride-NaOH pH8.5を用いて、リガンドが結合していない場所の残存活性基のブロッキングを行った。Running Buffer にはHBS-EP bufferを用いた。HCMの固定化量は、本発明のスクリーニング方法を再現よく実施できることを考慮して、1000〜2000RUとした。
【００４０】
２-（４）BIACORE1000による測定
上記の血液型抗原プローブ固定化チップまたはHCM固定化チップを用い、上記アナライトの血液型抗原に対する相互作用をBIACORE1000により解析した。BIACORE1000の測定条件を下記に示す。
ランニング緩衝液：HBS-EP buffer(pH7.4)
サンプル添加量：20μl
流速：3μl/min
温度：25℃
再生溶液：1Mグアニジン塩酸塩溶液 5μl
【００４１】  BIACOREによる解析において、アナライトと血液型抗原との相互作用は、レゾナンスユニット（RU）によって表される。１レゾナンスユニット（RU）とは、１mm2に物質１pgが結合したことを表す。結果を表１に示す。【００４２】
【表１】
0004738348.tif 000002
【００４３】
２-（５）菌の選抜（その１）
これまでの結果から、乳酸菌を選抜した。まず、上記BIACORE1000測定結果および実施例１のガス産生試験結果から、選抜を行った。
【００４４】
血液型A型用ヨーグルト乳酸菌として、（i）A抗原認識性及び（ii）ガス産生の観点から選抜した。選抜基準は、
（i）A抗原認識性：BIACORE1000による測定において、A抗原プローブによる結果が2000RU以上（上位約35％）
（ii）ガス産生：ガス産生試験でガス産生が認められないこと（-）
とした。これにより、Lactobacillus238菌株を43菌株までに絞った。
【００４５】
同様に、血液型O型用ヨーグルト乳酸菌として、（i）H抗原認識性及び（ii）ガス産生で選抜した。選抜基準は、
（i）H抗原認識性：BIACORE1000による測定において、H抗原プローブによる結果が700RU以上（上位約13％）
（ii）ガス産生：ガス産生試験でガス産生が認められないこと（-）
とした。これにより、Lactobacillus238菌株を14菌株までに絞った。
【００４６】
同様に、血液型B型用ヨーグルト乳酸菌として、（i）B抗原認識性及び（ii）ガス産生で選抜した。選抜基準は、
（i）B抗原認識性: BIACORE1000による測定において、B抗原プローブによる結果が2000RU以上 （上位約14%）
（ii）ガス産生: ガス産生試験でガス産生が認められないこと（-）
とした。これにより、Lactobacillus238菌株を25菌株までに絞った。
【００４７】
２-（６）菌の選抜（その２）
上記のとおり、血液型A型用ヨーグルト乳酸菌候補として、A抗原を認識し、かつガス産生が認められない菌株43株を選抜した。さらにこれらの中から、（i）他血液型抗原（B抗原およびH抗原）の認識性がないこと（ii）A抗原を特異的に認識すること、の観点から選抜した。選抜基準は、
（i）他血液型抗原（B抗原およびH抗原）の認識性
B抗原認識性：BIACORE1000による測定において、B抗原プローブによる結果が100RU以下、
H抗原認識性：BIACORE1000による測定において、H抗原プローブによる100RU以下
（ii）A抗原の特異的認識性
A抗原認識性/B抗原認識性の比が70以上で、A抗原認識性/H抗原認識性の比が100以上
とした。これらにより、43菌株から13菌株を選抜した。
【００４８】
同様に、血液型O型用ヨーグルト乳酸菌候補についても、選抜した。選抜基準は、
（i）他血液型抗原（A抗原およびB抗原）の認識性
A抗原認識性：BIACORE1000による測定において、A抗原プローブによる結果が100RU以下、
B抗原認識性：BIACORE1000による測定において、B抗原プローブによる結果が100RU以下、
（ii）H抗原の特異的認識性
H抗原認識性/A抗原認識性の比が800以上で、H抗原認識性/B抗原認識性の比が20以上
とした。これらにより、14菌株から5菌株を選抜した。
【００４９】
同様に、血液型B型用ヨーグルト候補株についても選抜した。選抜基準は、
（i）他血液型抗原 (A抗原およびH抗原) の認識性
A抗原認識性: BIACORE1000による測定において、A抗原プローブによる結果が100RU以下、
H抗原認識性: BIACORE1000による測定において、H抗原プローブによる結果が100RU以下、
（ii）B抗原の特異的認識性
B抗原認識性/A抗原認識性の比が50以上で、B抗原認識性/H抗原認識性の比が50以上とした。これらにより、25菌株から6菌株を選抜した。
【００５０】  ２-（７）菌の選抜（その３）  上記で選抜した菌株について、さらに、血液型別ヒト大腸ムチン（HCM）認識性により選抜した。【００５１】
血液型A型用ヨーグルト乳酸菌候補については、（i）A-HCMを認識するものを選抜し、（ii）O-HCMを認識するものを除いた。すなわち、ヒトHCMによるBIACORE1000測定結果において（i）A-HCM認識性が100RU以上、（ii）O-HCM認識性が100RU以下であることを選抜基準とした。また、MEP165511株、MEP165530株はA-HCM認識性が10000RU以上であり、菌の凝集が疑われたため除外した。上記選抜により、13菌株から2菌株（L.gasseri OLL 2804, L.gasseri OLL 2818）を選抜した。
【００５２】
同様に、血液型O型用ヨーグルト乳酸菌候補については、（i）O-HCMを認識するものを選抜し、（ii）A-HCMの認識性が比較的に高いものを除いた。すなわち、ヒトHCMによるBIACORE1000測定結果において（i）O-HCM認識性が100RU以上、（ii）A-HCM認識性が1000RU以下であることを選抜基準とした。上記選抜により、5菌株から2菌株（L.gasseri OLL 2827, L.gasseri OLL 2915）を選抜した。
【００５３】  同様に、血液型B型用ヨーグルト候補株については、B-HCMの認識性がA-HCMおよびH-HCMの認識性よりも高いことを選抜基準とした。上記選抜により、6菌株から2菌株（L. gasseri OLL2877, L. gasseri OLL2901）を選抜した。【００５４】［実施例３］  胃酸耐性試験および胆汁酸耐性試験  ヨーグルトとして体内に取り込まれた乳酸菌が、その機能を十分に発揮するには、生きたまま腸管に留まることが望ましい。そのため、胃酸耐性試験および胆汁酸耐性試験を実施した。【００５５】  ３−（１）胃酸耐性試験  ろ過滅菌したpH２の人工胃液［NaCl(0.2％）、Pepsin(1：5000、東京化成工業)(0.35％)：1N塩酸でpH2に調整］9mlにLactobacilli MRS broth (DIFCO)で2回賦活培養（37℃、18時間）し、生理食塩水で2回洗浄した乳酸菌の菌体懸濁液を1ml添加し、好気的に37℃で2時間接触後、1mlを取り67mMのリン酸緩衝液(pH6.5) 9mlに添加し、反応を停止させた。人工胃液に接触前および接触後の生菌数をLactobacilli MRS Agar (DIFCO)を用いて計測し、生存率(%)を算出した。【００５６】  選択基準は菌の種類により異なるが、今回選抜された菌種は全てLactobacillus gasseriであるため、0.50以上とした。血液型A型用ヨーグルト乳酸菌（L.gasseri OLL 2804, L.gasseri OLL 2818）、血液型O型用ヨーグルト（L.gasseri OLL 2827, L.gasseri OLL 2915）、血液型B型用ヨーグルト乳酸菌（L.gasseri OLL2877, L.gasseri OLL2901）のいずれも、上記基準を満たした（表1）。【００５７】  ３−（２）胆汁酸耐性試験  Lactobacilli MRS broth (DIFCO)で2回賦活培養（37℃、18時間）した乳酸菌を0.9％のBacto-Oxgall (DIFCO)を含むLactobacilli MRS broth (DIFCO) 5mlに10μl接種し、嫌気的に37℃で培養した。培養18時間後に培地の濁度（OD650）を測定した。【００５８】  選択基準は菌の種類により異なるが、血液型A型用ヨーグルト乳酸菌、および血液型O型用ヨーグルト乳酸菌については0.08以上とした。血液型A型用ヨーグルト乳酸菌（L.gasseri OLL 2804, L.gasseri OLL 2818）、血液型O型用ヨーグルト乳酸菌（L.gasseri OLL 2827, L.gasseri OLL 2915）のいずれも、上記基準を満たした（表1）。血液型B型用ヨーグルト乳酸菌のうち、 L.gasseri OLL2901の胆汁酸耐性は0.031であったが、腸管滞留には、特に支障の無い範囲と考えられる。上記6菌株の科学的性質を表2に示す。【００５９】
【表２】
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【００６０】［実施例４］血液型別結合性乳酸菌によるヨーグルトの製造  上述で選抜した乳酸菌（血液型A型用ヨーグルト乳酸菌：L.gasseri OLL 2804, L.gasseri OLL 2818、血液型O型用ヨーグルト乳酸菌：L.gasseri OLL 2827, L.gasseri OLL 2915）を用いてヨーグルトを製造した。【００６１】  ４−（１）  L. gasseri OLL 2804を用いたヨーグルトの製造例  L. gasseri OLL 2804 株を用いてプレーンヨーグルトの調製を行った。まず、10％脱脂粉乳培地に、L. gasseri OLL2804 株、L. bulgaricus JCM 1002T、S. thermophilus ATCC19258 を各１％ずつ接種し、37℃で15時間培養してバルクスターターを調製した。【００６２】  95℃で5分間加熱処理したヨーグルトミックス（SNF:9.5％、FAT:3.0％）に、L. bulgaricusJCM 1002T及びS. thermophilus ATCC 19258 のスターターを各1％、L. gasseri OLL 2804 株のスターターを5％接種して、43℃で4時間発酵させた。【００６３】  発酵・冷却直後のL. gasseri OLL 2804、L. bulgaricus JCM 1002T、S. thermophilus ATCC 19258 それぞれの生菌数は12.5×10 7 CFU/mL、14.0×10 7 CFU/mL、11.8×10 8 CFU/mLであり、風味、物性はいずれも良好であった。また、上記ヨーグルトを10℃で保存したところ、保存25日目のL. gasseri OLL 2804、L. bulgaricus JCM1002T、S. thermophilus ATCC 19258 それぞれの生菌数は、9.60×10 7 CFU/mL、7.50×10 7 CFU/mL、11.0×10 7 CFU/mLであり、L. gasseri OLL 2804 株の生残率は保存１日目の77％と、その生菌数の低下は僅かであった。保存品の風味、物性も良好であった。【００６４】  ４−（２）  L. gasseri OLL 2818を用いたヨーグルトの製造例  L. gasseri OLL 2818 株を用いてプレーンヨーグルトの調製を行った。まず、10％脱脂粉乳培地に、L. gasseri OLL2818 株、L. bulgaricus JCM 1002T、S. thermophilus ATCC19258 を各1％ずつ接種し、37℃で15時間培養してバルクスターターを調製した。【００６５】  95℃で5分間加熱処理したヨーグルトミックス（SNF:9.5％、FAT:3.0 ％）に、L. bulgaricusJCM 1002T 及びS. thermophilus ATCC 19258 のスターターを各1％、L. gasseri OLL 2818 株のスターターを5％接種して、43℃で4時間発酵させた。【００６６】  発酵・冷却直後のL. gasseri OLL 2818、L. bulgaricus JCM 1002T、S. thermophilus ATCC 19258 それぞれの生菌数は14.0×10 7 CFU/mL、20.0×10 7 CFU/mL、11.4×10 8 CFU/mLであり、風味、物性はいずれも良好であった。また、このヨーグルトを10℃で保存したところ、保存25日目のL. gasseri OLL 2818、L. bulgaricus JCM1002T、S. thermophilus ATCC 19258 それぞれの生菌数は、11.4×10 7 CFU/mL、7.00×10 7 CFU/mL、10.0×10 7 CFU/mLであり、L. gasseri OLL 2818 株の生残率は保存１日目の８２％と、その生菌数の低下は僅かであった。保存品の風味、物性も良好であった。
【産業上の利用可能性】
【００６７】  本発明により、ヒトABO式血液型に適合する乳酸菌およびそのスクリーニング方法が提供された。本発明の乳酸菌または本発明のスクリーニング方法により得られる乳酸菌株は、ABO式血液型別に腸管結合性の高い乳酸菌であり、該乳酸菌を飲食品製造に応用することにより血液型別機能性ヨーグルトをはじめとする、新しいプロバイオティクス飲食品の提供が可能になる。
【図１】
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【図２】
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