(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料内の第一測定点と第二測定点にそれぞれ励起光を照射する二つの励起光照射手段と、
前記第一測定点と前記第二測定点から発せられる光をそれぞれ受光する二つの光検出器と、
前記二つの光検出器により検出された前記第一測定点と前記第二測定点からの二つの揺らぎ信号を利用して、前記第一測定点と前記第二測定点の間の相互相関関数の推定を行なう解析手段とを具備し、
前記解析手段は、前記二つの光検出器から出力される二つの揺らぎ信号に基づいて、次の（１）式を用いて前記第一測定点と前記第二測定点の間の相互相関関数の推定を行ない、前記第一測定点と前記第二測定点の間における分子の移動ベクトルを解析することを特徴とし、
【数１】
0004830087.tif 000006
ここで、ｔは時間を示し、τは遅延時間を示し、所定の時間幅の整数倍であり、ΣＤＰ１(ｔ)ＤＰ２(ｔ＋τ)は前記第一測定点と前記第二測定点のデータ間の積和計算を示し、ΣＤＰ１(ｔ)とΣＤＰ２(ｔ)は前記第一測定点と前記第二測定点のデータ総和を、ＮＰ１Ｐ２は前記第一測定点と前記第二測定点の積和計算の回数を、ＮＰ１とＮＰ２は前記第一測定点と前記第二測定点のデータ総和計算の回数を示している、光信号解析装置。
【請求項２】
前記光検出手段が検出する光は、蛍光・燐光・反射光・散乱光のいずれかであることを特徴とする請求項１に記載の光信号解析装置。
【請求項３】
前記解析手段は、前記二つの揺らぎ信号を再構成した信号に対して相互相関関数を推定することを特徴とする請求項１に記載の光信号解析装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光信号解析装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
例えば、「"New Concept in Correlator Design", Klaus Sch-tzel, Inst. Phys. Conf. Ser. No. 77, P175, 1985」と「"Noise on Multiple-Tau Photon Correlation Data", Klaus Sch-tzel, SPIE Vol. 1430, P109, Photon Correlation Spectroscopy: Multicomponent Systems, 1991」と「"Photon Correlation Measurements at Large Lag Times", Klaus Sch-tzel et al., Journal of Modern Optics, Vol. 35, No.4, P711, 1988」は、光信号解析方法を開示している。これらの光信号解析方法において、自己相関関数や相互相関関数などを推定する場合には、一回の測定で一個所だけの測定点から得た蛍光の強度の連続測定信号を用いるか、複数の測定点を時間で繰り返し切り替えながら測定した複数点時系列混合信号を用いる。解析アルゴリズムとしては、マルチプルτ方式の計算手法またはテーブル検索方式がある。測定点が一個所だけの場合、一般方式または単一測定点マルチプルτ方式というアルゴリズムを解析に用いる。つまり、単一測定点マルチプルτ方式の計算手法は、チャンネル計算やデータ再構成などのデータ処理過程を経て測定点における自己相関関数または相互相関関数を推定する。また、一回に複数の測定点を測定する場合、一般方式またはテーブル検索方式というアルゴリズムを解析に用いる。つまり、テーブル検索方式は、測定点ごとのデータの時分割、測定点の位置情報をテーブル化した位置情報によるデータ高速処理を経て同時に複数測定点におけるそれぞれの自己相関関数または相互相関関数を推定する。
【非特許文献１】"New Concept in Correlator Design", Klaus Sch-tzel, Inst. Phys. Conf. Ser. No. 77, P175, 1985
【非特許文献２】"Noise on Multiple-Tau Photon Correlation Data", Klaus Sch-tzel, SPIE Vol. 1430, P109, Photon Correlation Spectroscopy: Multicomponent Systems, 1991
【非特許文献３】"Photon Correlation Measurements at Large Lag Times", Klaus Sch-tzel et al., Journal of Modern Optics, Vol. 35, No.4, P711, 1988
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかし、一点の測定点における自己相関関数と相互相関関数の推定は、分子のミクロ領域による比較的小さい拡散速度を有する分子拡散を観察するものである。実際の応用において、例えば分子が細胞の核膜を通過する場合、分子拡散速度は遅く、拡散時間は長い。また、シグナルの伝達、ある方向への分子移動の影響などは、一点のみの観察による自己相関相互相関では観察不可能である。
【０００４】
つまり、従来技術では、観察領域は一点の測定点（コンフォカボリューム）に限定されている。また、二点間における分子の移動は観察できない。さらに、遅い分子拡散は観察不可能である。
【０００５】
本発明は、この様な実状を考慮して成されたものであり、その目的は、二点間における分子の移動を観察し得る光信号解析装置を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明による光信号解析装置は、試料内の第一測定点と第二測定点にそれぞれ励起光を照射する二つの励起光照射手段と、前記第一測定点と前記第二測定点から発せられる光をそれぞれ受光する二つの光検出器と、前記二つの光検出器により検出された前記第一測定点と前記第二測定点からの二つの揺らぎ信号を利用して、前記第一測定点と前記第二測定点の間の相互相関関数の推定を行なう解析手段とを備えており、前記解析手段は、前記二つの光検出器から出力される二つの揺らぎ信号に基づいて、次式を用いて前記第一測定点と前記第二測定点の間の相互相関関数の推定を行ない、前記第一測定点と前記第二測定点の間における分子の移動ベクトルを解析することを特徴とする。
【数１】
0004830087.tif 000002
ここで、ｔは時間を示し、τは遅延時間を示し、所定の時間幅の整数倍であり、ΣＤＰ１(ｔ)ＤＰ２(ｔ＋τ)は前記第一測定点と前記第二測定点のデータ間の積和計算を示し、ΣＤＰ１(ｔ)とΣＤＰ２(ｔ)は前記第一測定点と前記第二測定点のデータ総和を、ＮＰ１Ｐ２は前記第一測定点と前記第二測定点の積和計算の回数を、ＮＰ１とＮＰ２は前記第一測定点と前記第二測定点のデータ総和計算の回数を示している。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、二点間における分子の移動を観察し得る光信号解析装置が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
以下、図面を参照しながら本発明の実施形態について説明する。
【０００９】
図１は、本発明の実施形態による光信号解析装置を概略的に示している。光信号解析装置１０は、第一光照射部１２と、第二光照射部１４と、第一受光部２２と、第二受光部２４と、データ解析部３２とを備えている。
【００１０】
第一光照射部１２は光源１２ａとコリメートレンズ１２ｂと集光レンズ１２ｃ等を有し、試料Ｓ内の第一測定点に励起光を照射する。また第二光照射部１４は光源１４ａとコリメートレンズ１４ｂと集光レンズ１４ｃ等を有し、第一測定点とは異なる試料Ｓ内の第二測定点に励起光を照射する。
【００１１】
第一受光部２２は集光レンズ２２ａとピンホール２２ｂと結像レンズ２２ｃと光検出器２２ｄ等を有し、第一測定点から発せられた光を受光する。より詳しくは、ピンホール２２ｂは第一測定点と共役な位置に配置されており、結像レンズ２２ｃはピンホール２２ｂの像を光検出器２２ｄに投影する。従って光検出器２２ｄには第一測定点から発せられた光だけが選択的に入射する。光検出器２２ｄは、入射した光の強度を反映した連続測定信号すなわち第一測定点からの光の揺らぎに対応する揺らぎ信号を出力する。また第二受光部２４は集光レンズ２４ａとピンホール２４ｂと結像レンズ２４ｃと光検出器２４ｄ等を有し、第二測定点から発せられた光を受光する。より詳しくは、ピンホール２４ｂは第一測定点と共役な位置に配置されており、結像レンズ２４ｃはピンホール２４ｂの像を光検出器２４ｄに投影する。従って光検出器２４ｄには第二測定点から発せられた光だけが選択的に入射する。光検出器２４ｄは、入射した光の強度を反映した連続測定信号すなわち第二測定点からの光の揺らぎに対応する揺らぎ信号を出力する。
【００１２】
これまでの説明から分かるように、第一受光部２２と第二受光部２４は、試料内の二つの測定点から発せられる光を検出する光検出手段を構成している。また第一光照射部１２と第二光照射部１４は、励起光を二つの測定点に照射する励起光照射手段を構成している。
【００１３】
データ解析部３２は例えばパーソナルコンピューターで構成され、二つの光検出器２２ｄと２４ｄから出力される二つの揺らぎ信号に対して自己相関関数と相互相関関数を推定する。すなわちデータ解析部３２は、第一測定点と第二測定点のそれぞれにおける自己相関関数の推定を行なうとともに、第一測定点と第二測定点の間の相互相関関数の推定を行なう。  図２は第一測定点からの光の揺らぎに対応する揺らぎ信号を示し、図３は第二測定点からの光の揺らぎに対応する揺らぎ信号を示している。データ解析部３２は、これら二つの揺らぎ信号に基づいて、下記の（１）式の解析式を用いて第一測定点Ｐ１の自己相関関数の推定を行ない、下記の（２）式の解析式を用いて第二測定点Ｐ２の自己相関関数の推定を行ない、下記の（３）式の解析式を用いて第一測定点Ｐ１と第二測定点Ｐ２の間の相互相関関数の推定を行なう。
【数１】
0004830087.tif 000003
【００１４】
【数２】
0004830087.tif 000004
【００１５】
【数３】
0004830087.tif 000005
【００１６】
上記の（１）式〜（３）式中、ΣＤＰ１(ｔ)ＤＰ１(ｔ＋τ)とΣＤＰ２(ｔ)ＤＰ２(ｔ＋τ)とΣＤＰ１(ｔ)ＤＰ２(ｔ＋τ)はそれぞれデータ間の積和計算を示し、ΣＤＰ１(ｔ)とΣＤＰ２(ｔ)はそれぞれ測定点Ｐ１とＰ２のデータ総和を、ＮＰ１Ｐ１とＮＰ２Ｐ２とＮＰ１Ｐ２はそれぞれデータ間の積和計算の回数を、ＮＰ１とＮＰ２は測定点Ｐ１とＰ２のデータ総和計算の回数を示している。τは遅延時間を示し、所定の時間幅の整数倍をとる。
【００１７】
図４は、データ解析部３２による解析処理のフローチャートを示している。計算アルゴリズムを適用させる手順はステップＳ０〜Ｓ１４の通りである。
【００１８】
[ステップＳ０］
試料についての測定データとして、二つの測定点Ｐ１とＰ２における連続測定信号すなわち二つの測定点Ｐ１とＰ２の光の揺らぎ信号を取得する。取得した二つの測定点Ｐ１とＰ２の連続測定信号はそれぞれ図２と図３に示した通りである。
【００１９】
[ステップＳ１とＳ２］
データの総和を計算する。つまり、測定点Ｐ１とＰ２の連続測定データ（ステップS0における連続測定信号をデジタル化したもの）ＩＰ１とＩＰ２に対して、一定の遅延時間間隔のままの測定点Ｐ１とＰ２のそれぞれのデータ総和を計算する。または、遅延時間を一定の時間間隔で増やしながら、言い換えれば所定の時間幅の数倍を増やしながら、各遅延時間間隔における測定点Ｐ１とＰ２のそれぞれのデータを再構成し、その総和を計算する。つまり、ステップＳ１において、測定点Ｐ１の連続測定データＩＰ１に対して、読み込んだ測定点Ｐ１のすべてデータの和計算＝総和計算（あるいは再構成データの総和計算）を行なう。すなわち上記の（１）式〜（３）式中のΣＤＰ１(ｔ)を算出する。またステップＳ２において、同様に測定点Ｐ２の連続測定データＩＰ２に対して、読み込んだ測定点Ｐ２のすべてデータの和計算＝総和計算を行なう。すなわち上記の（１）式〜（３）式中のΣＤＰ２(ｔ)を算出する。
【００２０】
[ステップＳ３とＳ４］
読み込みデータ数をカウントする。つまり、測定点Ｐ１とＰ２の連続測定データＩＰ１とＩＰ２に対して、各遅延時間における測定点Ｐ１とＰ２のそれぞれのデータ総和回数を計算する。より詳しくは、ステップＳ３において、測定点Ｐ１の連続測定データＩＰ１に対して、ステップＳ１において行なう総和計算の回数を計算する。すなわち上記の（１）式〜（３）式中のＮＰ１を算出する。またステップＳ４において、同様に測定点Ｐ２の連続測定データＩＰ２に対して、ステップＳ２において行なう総和計算の回数を計算する。すなわち上記の（１）式〜（３）式中のＮＰ２を算出する。
【００２１】
[ステップＳ５とＳ６］
同じ測定点におけるデータ間の積和計算を行なう。ステップＳ５において、測定点Ｐ１の連続測定データＩＰ１に対して、すべての遅延時間について、図５に示されるように、同じ遅延時間を有するデータ間の掛け算をし、その和を算出する。すなわち上記の（１）式中のΣＤＰ１(ｔ)ＤＰ１(ｔ＋τ)を算出する。なお図５は、遅延時間τ＝２（所定の時間幅の２倍）の場合のデータ間の積算を模式的に示している。またステップＳ６において、測定点Ｐ２の連続測定データＩＰ２に対して、同様な計算処理を行なう。すなわち上記の（２）式中のΣＤＰ２(ｔ)ＤＰ２(ｔ＋τ)を算出する。
【００２２】
[ステップＳ７とＳ８］
同じ測定点におけるデータ積和計算の回数をカウントする。ステップＳ７において、上記のステップＳ５の計算と同時に積和計算の回数を計算する。すなわち上記の（１）式中のＮＰ１Ｐ１を算出する。またステップＳ８において、上記のステップＳ６の計算と同時に積和計算の回数を計算する。すなわち上記の（２）式中のＮＰ２Ｐ２を算出する。
【００２３】
[ステップＳ９］
異なる測定点間のデータの積和計算を行なう。つまり、測定点Ｐ１のデータと測定点Ｐ２のデータとの積和計算を行なう。より詳しくは、測定点Ｐ１とＰ２の連続測定データＩＰ１とＩＰ２に対して、すべての遅延時間について、図６に示されるように、同じ遅延時間を有する測定点Ｐ１のデータと測定点Ｐ２のデータとの掛け算をし、その和を算出する。すなわち上記の（３）式中のΣＤＰ１(ｔ)ＤＰ２(ｔ＋τ)を算出する。なお図６は、遅延時間τ＝１（所定の時間幅の１倍）の場合のデータ間の積算を模式的に示している。
【００２４】
[ステップＳ１０］
異なる測定点間のデータ積和計算の回数をカウントする。つまり、上記のステップＳ９の計算と同時に積和計算の回数を計算する。すなわち上記の（３）式中のＮＰ１Ｐ２を算出する。
【００２５】
[ステップＳ１１］
データの総合計算を行なう。つまり、上記の諸計算データに基づいて、二つの測定点Ｐ１とＰ２のそれぞれの自己相関関数の解析と二つの測定点Ｐ１とＰ２の点間相互相関関数の推定を行なう。より詳しくは、Ｐ１→Ｐ１とＰ２→Ｐ２とＰ１→Ｐ２の各相関方向についてそれぞれ異なる解析式を用いて相関関数を推定する。その際、Ｐ１→Ｐ１については（Ｓ５／Ｓ７）／（Ｓ１／Ｓ３）２の計算式を用い、Ｐ２→Ｐ２については（Ｓ６／Ｓ８）／（Ｓ２／Ｓ４）２の計算式を用い、Ｐ１→Ｐ２については（Ｓ９／Ｓ１０）／（Ｓ１／Ｓ３）（Ｓ２／Ｓ４）の計算式を用いる。
【００２６】
[ステップＳ１２］
各最終計算結果に基づいて、点間相互相関関数のカーブ表示などの処理を行なう。
【００２７】
これまでの説明から分かるように、本実施形態の光分析装置では、異なる二つの測定点Ｐ１とＰ２に対して相互相関関数の推定を行なっている。Ｐ１→Ｐ２への解析結果において、相関が高ければ、同一分子が測定点Ｐ１から測定点Ｐ２へ移動する確率が高いと推定でき、逆に相関が低ければ測定点Ｐ１を通った分子が測定点Ｐ２を通る確率が低く、その他方向への分子移動が多いと推定できる。つまり、本実施形態の光分析装置によれば、二つの測定点Ｐ１とＰ２の間における分子の移動を観察できる。また、複数セットの二つの測定点間の相関性を検討することで、分子移動のベクトルを推定することが可能である。
【００２８】
これまで、図面を参照しながら本発明の実施形態を述べたが、本発明は、これらの実施形態に限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲において様々な変形や変更が施されてもよい。
【００２９】
例えば、上述した実施形態による光信号解析装置は蛍光を検出しているが、検出対象光は蛍光に限定されるものではなく、ほかの光、例えば燐光や反射光や散乱光などであってもよい。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】本発明の実施形態による光信号解析装置を概略的に示している。
【図２】第一測定点からの光の揺らぎに対応する揺らぎ信号を示している。
【図３】第二測定点からの光の揺らぎに対応する揺らぎ信号を示している。
【図４】データ解析部による解析処理のフローチャートを示している。
【図５】ステップＳ５の処理におけるデータ間の積算を模式的に示している。
【図６】ステップＳ９の処理におけるデータ間の積算を模式的に示している。
【符号の説明】
【００３１】
１０…光信号解析装置、１２…第一光照射部、１２ａ…光源、１２ｂ…コリメートレンズ、１２ｃ…集光レンズ、１４…第二光照射部、１４ａ…光源、１４ｂ…コリメートレンズ、１４ｃ…集光レンズ、２２…第一受光部、２２ａ…集光レンズ、２２ｂ…ピンホール、２２ｃ…結像レンズ、２２ｄ…光検出器、２４…第二受光部、２４ａ…集光レンズ、２４ｂ…ピンホール、２４ｃ…結像レンズ、２４ｄ…光検出器、３２…データ解析部、ＩＰ１…連続測定データ、ＩＰ２…連続測定データ、Ｐ１…第一測定点、Ｐ２…第二測定点。
【図１】
0004830087.tif 000007
【図２】
0004830087.tif 000008
【図３】
0004830087.tif 000009
【図４】
0004830087.tif 000010
【図５】
0004830087.tif 000011
【図６】
0004830087.tif 000012