(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）以下の式：
【化１】
0004831914.tif 000028
を有する色素であって、ｎは０、１、２又は３であり；Ｒ１はＨ、アルキル又はアルコキシ基であり；Ｒ２はＣＨ２（ＣＨ２）ｍＯＨであり、ここで、ｍは０、１、２又は３であり；ＸはＯ、Ｓ又はＣ（ＣＨ３）２であり；ＲはＣＨ３、ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、アルキル、アルキルスルホネート又はヒドロキシアルキルであり、そしてＢ−は対陰イオンである色素；及び
（ｂ）界面活性剤、保存料、及びスルホン酸又はその塩から成る群から選ばれる１以上の成分；
を含む、核酸を染色するための色素組成物。
【請求項２】
式中、ｎは１であり、Ｒ１はＨであり、ＲはＣＨ２ＣＨ２ＯＨであり、Ｒ２はＣＨ２ＣＨ２ＯＨであり、そしてＸはＳである、請求項１に記載の色素組成物。
【請求項３】
式中、ｎは１であり、Ｒ１はＨであり、ＲはＣＨ（ＣＨ３）２であり、Ｒ２はＣＨ２ＣＨ２ＯＨであり、そしてＸはＳである、請求項１に記載の色素組成物。
【請求項４】
式中、ｎは１であり、Ｒ１はＨであり、ＲはＣＨ３であり、Ｒ２はＣＨ２ＣＨ２ＯＨであり、そしてＸはＳである、請求項１に記載の色素組成物。
【請求項５】
式中、ｎは１であり、Ｒ１はＣＨ３であり、ＲはＣＨ３であり、Ｒ２はＣＨ２ＣＨ２ＯＨであり、そしてＸはＳである、請求項１に記載の色素組成物。
【請求項６】
式中、ｎは１であり、Ｒ１はＣＨ３であり、ＲはＣＨ（ＣＨ３）２であり、Ｒ２はＣＨ２ＣＨ２ＯＨであり、そしてＸはＳである、請求項１に記載の色素組成物。
【請求項７】
式中、ｎは１であり、Ｒ１はＣＨ３であり、ＲはＣＨ２ＣＨ２ＯＨであり、Ｒ２はＣＨ２ＣＨ２ＯＨであり、そしてＸはＳである、請求項１に記載の色素組成物。
【請求項８】
前記成分が界面活性剤である、請求項１に記載の色素組成物。
【請求項９】
前記成分がスルホン酸又はその塩である、請求項１に記載の色素組成物。
【請求項１０】
核酸を含む血液細胞のサンプルを、以下の式：
【化２】
0004831914.tif 000029
｛式中、ｎは０、１、２又は３であり；Ｒ１はＨ、アルキル又はアルコキシ基であり；Ｒ２はＣＨ２（ＣＨ２）ｍＯＨであり、ここで、ｍは０、１、２又は３であり；ＸはＯ、Ｓ又はＣ（ＣＨ３）２であり；ＲはＣＨ３、ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、アルキル、アルキルスルホネート又はヒドロキシアルキルであり、そしてＢ−は対陰イオンである。｝を有する色素と接触させるステップを含む核酸の染色方法。
【請求項１１】
前記血液細胞が有核赤血球細胞又は網状赤血球を含む、請
求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
以下の式：
【化３】
0004831914.tif 000030
｛式中、ｎは０、１、２又は３であり；Ｒ１はＨ、アルキル又はアルコキシ基であり；Ｒ２はＣＨ２（ＣＨ２）ｍＯＡｃであり、ここで、ｍは０、１、２又は３であり；ＸはＯ、Ｓ又はＣ（ＣＨ３）２であり；ＲはＣＨ３、ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨ２ＣＨ２ＯＡｃ、アルキル、アルキルスルホネート又はヒドロキシアルキルであり、そしてＢ−は対陰イオンである。｝を有する色素。
【請求項１３】
以下の式：
【化４】
0004831914.tif 000031
｛式中、ｎは０、１又は２であり；Ｒ１はＨ、アルキル又はアルコキシ基であり；Ｒ２はＣＨ２（ＣＨ２）ｍＯＨ又はＣＨ３であり、ここでｍは1であり；ＸはＯ、Ｓ又はＣ（ＣＨ３）２であり；Ｂ−は対陰イオンであり；Ｒ３はＯＣＨ３またはＨであり；Ｒ４はＨまたはＣＯＯＣＨ３であり；Ｒ５はＨまたはＯＣＨ３であり、そしてＲ６はＨまたはＢ（ＯＨ）２である。｝により表される色素。
【請求項１４】
式中、ｎ＝１；Ｒ１＝Ｈ；Ｒ＝ＣＨ３、Ｒ２＝ＣＨ２ＣＨ２ＯＡｃ；Ｘ＝Ｓ、及びＢ−はＢｒ−である、請求項１２に記載の色素。
【請求項１５】
式中、ｎ＝１、Ｒ１＝Ｈ、Ｒ２＝Ｒ＝ＣＨ２ＣＨ２ＯＡｃ、Ｘ＝Ｓ、及びＢ−はＢｒ−である、請求項１２に記載の色素。
【請求項１６】
式中、ｎ＝１；Ｘ＝Ｓ；Ｒ２＝ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ；Ｒ１＝Ｒ４＝Ｒ６＝Ｈ；Ｒ３＝Ｒ５＝ＯＣＨ３；及びＢ−はＢｒ−である、請求項１３に記載の色素。
【請求項１７】
式中、ｎ＝１；Ｘ＝Ｓ；Ｒ２＝ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ；Ｒ１＝Ｒ３＝Ｒ５＝Ｒ６＝Ｈ；Ｒ４＝ＣＯＯＣＨ３；及びＢ−はＢｒ−である、請求項１３に記載の色素。
【請求項１８】
式中、ｎ＝１；Ｘ＝Ｓ；Ｒ２＝ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ；Ｒ１＝Ｒ３＝Ｒ４＝Ｒ５＝Ｒ６＝Ｈ；及びＢ−はＢｒ−である、請求項１３に記載の色素。
【請求項１９】
式中、ｎ＝１；Ｘ＝Ｓ；Ｒ２＝ＣＨ３；Ｒ１＝Ｒ３＝Ｒ４＝Ｒ５＝Ｈ；Ｒ６＝Ｂ（ＯＨ）２；及びＢ−はＩ−である、請求項１３に記載の色素。
【請求項２０】
請求項１２又は１３に記載の色素に加えて、さらに界面活性剤を含む、網状赤血球染色用色素組成物。
【請求項２１】
請求項１２又は１３に記載の色素に加えて、さらにスルホン酸又はその塩を含む、色素組成物。
【請求項２２】
請求項１２又は１３に記載の色素に加えて、さらに、保存料を含む、色素組成物。
【請求項２３】
（ａ）有核赤血球細胞又は網状赤血球を含む血液細胞サンプルを、請求項１２又は１３に記載の化合物と接触させて、上記有核赤血球細胞又は網状赤血球を前記化合物により染色し；及び（ｂ）網状赤血球の存在を検出するために、フローサイトメトリーにより上記染色された血液細胞サンプルを分析する：
のステップを含む、血液細胞サンプルの分析方法。
【請求項２４】
フローサイトメトリーによる前記分析が１の蛍光パラメーター、並びに光分散、軸光損失、ＤＣ電気インピーダンス、及び無線周波数（ＲＦ）伝導性及びそれらの組み合わせから成る群から選ばれる少なくとも１のパラメーターの計測を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
（ａ）以下の式：
【化５】
0004831914.tif 000032
を有する色素であって、ここで、ｎは１であり；Ｒ１はＨまたはＣＨ３であり；ＲはＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ（ＣＨ３）２またはＣＨ３；Ｒ２はＣＨ２ＣＨ２ＯＨであり；ＸはＳであり；そしてＢ−は対陰イオンである色素、及び
（ｂ）界面活性剤、保存剤およびスルフォン酸またはその塩からなる群から選択された一つ以上の成分を含む、色素組成物。
【請求項２６】
式中、ｎは１であり；Ｒ１はＨであり；ＲはＣＨ２ＣＨ２ＯＨ；Ｒ２はＣＨ２ＣＨ２ＯＨであり；ＸはＳである、請求項２５の色素組成物。
【請求項２７】
式中、ｎは１であり；Ｒ１はＨであり；ＲはＣＨ（ＣＨ３）２；Ｒ２はＣＨ２ＣＨ２ＯＨであり；ＸはＳである、請求項２５の色素組成物。
【請求項２８】
式中、ｎは１であり；Ｒ１はＨであり；ＲはＣＨ３であり；Ｒ２はＣＨ２ＣＨ２ＯＨであり；ＸはＳである、請求項２５の色素組成物。
【請求項２９】
式中、ｎは１であり；Ｒ１はＣＨ３であり；ＲはＣＨ３であり；Ｒ２はＣＨ２ＣＨ２ＯＨであり；ＸはＳである、請求項２５の色素組成物。
【請求項３０】
式中、ｎは１であり；Ｒ１はＣＨ３であり；ＲはＣＨ（ＣＨ３）２であり；Ｒ２はＣＨ２ＣＨ２ＯＨであり；ＸはＳである、請求項２５の色素組成物。
【請求項３１】
式中、ｎは１であり；Ｒ１はＣＨ３であり；ＲはＣＨ２ＣＨ２ＯＨであり；Ｒ２はＣＨ２ＣＨ２ＯＨであり；ＸはＳである、請求項２５の色素組成物。
【請求項３２】
前記成分が界面活性剤である、請求項２５の色素組成物。
【請求項３３】
前記成分がスルフォン酸またはその塩である、請求項２５の色素組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は一般的に、蛍光核酸結合色素を使用することによる流動細胞光度測定法による、赤血球細胞における核酸の検出用新規色素、色素組成物、及び方法の分野に関する。より詳しくは、本発明は網状赤血球及び有核の赤血球の計測用試薬及び方法を提供する。
【０００２】
発明の背景
赤血球の分析及びその未成熟の予備集団の計測は診断血液学の価値のある成分である。例えば、ヒト末梢血中の網状赤血球、すなわち、未成熟の赤血球の計測は出血、貧血の診断、骨髄移植のモニターにおいて及び化学療法及び血液細胞産生に関する他の障害を経験する患者のモニターに有用である［米国特許第５，３６０，７３９；Ｈ．Ｓｈａｐｉｒｏ，  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，  ３ｒｄ  ｅｄｉｔ，  １９９５；  Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；  Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ，（１９９０）Ｐａｔｈｏｂｉｏｌ．，５８：９９−１０６；Ｈｏｙ，（１９９０）Ｂａｉｌｌｉｅｒｅ’ｓ  Ｃｌｉｎ．  Ｈａｅｍａｔ．，  ３：９７７−９８８；Ｈ．Ｊ．Ｔａｎｋｅ，  Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅｓ  ａｎｄ  Ｍａｔｕｒｅ  Ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅｓ  ｉｎ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ｉｎ  Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ（１９９２）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｔｄ．，  ｐｐ．  ７５−９３］。網状赤血球はリボ核酸（ＲＮＡ）を含むため、ＲＮＡに結合する励起可能な色素で染色されると、これらの細胞は好適な波長の光源により照射されたとき蛍光を発する。ＲＮＡ結合色素はＲＮＡを欠く成熟赤血球（ＲＢＣｓ）から網状赤血球を区別するために使用されてきた。
【０００３】
比較的大きな網状赤血球集団の蛍光強度の分布は速くそして信頼できる様式で流動細胞光度測定法により決定されることができ、そして網状赤血球の異なる成熟段階は、ＲＮＡの含有量における相違により反映されるように、区別されうる。
赤色−励起可能な色素の使用は、上記色素は比較的費用のかからないダイオード又はＨｅＮｅレーザーで励起することにより検出されるので、所望される。しかしながら、ダイオードレーザー及び赤色−励起可能な色素を網状赤血球の高速流動細胞光度測定分析に使用するための、初期の分野におけるはじめの努力は成功ではなかった。Ｙａｍａｍｏｔｏ，米国特許第５，５６３，０７０号は、大量のＴＯ−ＰＲＯ−３、赤色−励起可能な色素の添加、それに続く３０分間のインキュベーションは生きた網状赤血球内のＲＮＡを染色することを示した。しかしながら、上記方法は、サンプル調製時間が長く、そしてそれぞれのサンプルを染色するのに必要とされる大量の色素のために試験当たりの費用が高いので、高いサンプル処理量を必要とする臨床研究室における網状赤血球の日常の分析には実用的でない。
【０００４】
チアゾールブルー（ＴＢ）と呼ばれる赤色−励起可能な色素は米国特許第４，９５７，８７０号において示された。しかしながら、この特許（米国特許第４，９５７，８７０号）において示されるように、この色素も約３０分間の、長いインキュベーション時間を必要とする。
Ａｋａｉ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，８２１，１２７号も、赤色領域における蛍光を介して費用のかからない検出器を用いて網状赤血球を検出することができる蛍光色素の調製を示した。しかしながら、上記サンプルは約４０℃の高温でのインキュベーションを必要とする。
【０００５】
より最近では、米国特許第５，９９４，１３８号は、約３５℃の高温での洗剤及びイオノフォアと共の赤色−励起可能な色素の使用を介して網状赤血球を染色することを示した。しかしながら、網状赤血球の染色は環境温度が使用されたとき成功ではなかった。
Ｆａｎ  ｅｔ．  ａｌ（米国第５，４１１，８９１号、米国第５，３６０，７３９号）は色素及び網状赤血球ＲＮＡの間の特異的結合定数及び上記色素の透過率はそれぞれの色素で異なり、そしてどんな状況下で特定の色素が赤血球膜を速く通過し、網状赤血球を染色するのか予測することは不可能であることをはっきりと示す。このことはＡｋａｉ  ｅｔ．  ａｌ（米国第５，８２１，１２７号）によりさらに支持された。
したがって、本分野において、赤色領域で励起可能であり、そして費用のかからない容易に入手可能な赤色−照明装置を使用しうる、色素の使用を介した、室温での細胞内ＲＮＡの速い染色を可能にする色素、組成物及び方法の必要性が存在する。さらに、本分野において、赤色−励起可能な色素にのみでなく、青色波長におけるように他の波長で励起可能な色素にも使用できる、色素組成物及び方法の必要性が存在する。そうすることにより、網状赤血球の容易で正確な検出が励起波長の特定の制限なしに達成されうる。
【０００６】
網状赤血球に加えて、臨床診断において重要な未成熟の赤血球の他の型は有核の赤血球（ＮＲＢＣｓ）である。網状赤血球とは対照的に、ＮＲＢＣｓはＤＮＡを含む。ＮＲＢＣｓは通常脊髄内に起こるが、末梢血中にはない。しかしながら、貧血及び白血病の如きある疾患においては、ＮＲＢＣｓは末梢血にも起こる。したがって、ＮＲＢＣｓを計測することは臨床的に重要である。ＮＲＢＣｓはＤＮＡを含むので、蛍光検出及びＮＲＢＣｓの計測はこれらの細胞をＤＮＡを認識する色素で染色することにより可能でありうる。したがって、本分野において、ＮＲＢＣｓ及び網状赤血球の両方が異なる方法を使用する同じ色素の使用を介して計測されうるように、細胞内ＤＮＡ及びＲＮＡの両方を染色することができる、色素及び組成物の必要性が存在する。
【０００７】
発明の要約
１の局面においては、本発明は群Ｉ、群ＩＩ、及び群ＩＩＩとして示される３群の新規色素を提供し：
群Ｉは以下の一般式：
【化４】
0004831914.tif 000002
を有し、式中、ｎは０、１、２又は３であり；Ｒ１はＨ、アルキル又はアルコキシ基であり；Ｒ２はＣＨ２（ＣＨ２）ｍＯＨであり、ここで、ｍは０、１、２又は３であり；ＸはＯ、Ｓ又はＣ（ＣＨ３）２であり；ＲはＣＨ３、ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、アルキル、アルキルスルフォネート又はヒドロキシアルキルであり；そしてＢ−は対陰イオンである；
群ＩＩは以下の一般式：
【化５】
0004831914.tif 000003
を有し、式中、ｎは０、１、２又は３であり；Ｒ１はＨ、アルキル又はアルコキシ基であり；Ｒ２はＣＨ２（ＣＨ２）ｍＯＡｃであり、ここで、ｍは０、１、２又は３であり；ＸはＯ、Ｓ又はＣ（ＣＨ３）２であり；ＲはＣＨ３、ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨ２ＣＨ２ＯＡｃ、アルキル、アルキルスルフォネート又はヒドロキシアルキルであり；そしてＢ−は対陰イオンである；
【０００８】
そして、
群−ＩＩＩは以下の一般式：
【化６】
0004831914.tif 000004
を有し、式中、ｎは０、１又は２であり；Ｒ１はＨ、アルキル又はアルコキシ基であり；Ｒ２はＣＨ２（ＣＨ２）ｍＯＨ又はＣＨ３であり；ＸはＯ、Ｓ又はＣ（ＣＨ３）２であり；Ｂ−は対陰イオンであり、そしてＲ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６は特定化合物色素−３〜色素−６についての式により示されるさまざまな置換基である。
【０００９】
他の局面においては、本発明は本発明に係る色素を含む試薬及び溶媒を提供する。
さらに他の局面においては、本発明は細胞膜を通る色素分子の速い通過を促進させる組成物及び方法を提供する。上記速い染色はサンプルが少なくとも１の界面活性剤及び場合によりスルフォン酸又はその塩の存在下で本発明に係る色素組成物と接触されることを必要とする。
【００１０】
本発明の他の局面及び利点は本発明の詳細な説明から容易に明らかになるであろう。
【００１１】
発明の詳細な説明
本発明は、網状赤血球を染色するために細胞膜を通る色素の速い移動を促進するための組成物及び方法に加えて、核酸を染色する色素を提供する。都合の良いことに、本発明に係る色素は核酸に結合しているとき、結合していないときよりも、顕著に強い蛍光を示すことにより特徴付けられる。
好ましい態様においては、本発明に係る色素、組成物及び方法を使用する分析に好適な網状赤血球細胞集団を含むサンプルは全血又は染色前のある追加のプロセスにより強化された又は減少された血液サンプルから好ましく選ばれる。上記強化又は減少のプロセスは、他のものの中では、遠心分離、フィコールで補助された重力分離又は磁気分離を含みうる。
都合の良いことに、本発明に係る色素、方法及び組成物は細胞の固定を必要とせず、そしてそれゆえ代謝的に活性な細胞の分析における使用に特によく合う。しかしながら、上記細胞集団の選択は本発明上の制限ではない。
【００１２】
上記に議論されるように、赤色又は青色領域において蛍光を発する能力を有する、いくつかの色素のみが網状赤血球の計測に好適である。これらの色素は、しかしながら、高温の使用を必要とし、長いインキュベーション時間を要し、大量の非特異的なバックグラウンド蛍光を作出し、及び／又はＲＮＡの存在下で蛍光の高まりをほとんど示さない。本発明は、核酸に結合し、そして環境温度で蛍光を介して網状赤血球の検出を可能にさせる、赤色及び青色−励起可能な新規色素を提供する。好適には、本発明に係る色素は実質的なバックグラウンド蛍光の非存在下で網状赤血球の速い検出を優先的に可能にさせる方法に適合される。本発明に係る方法の利点は上記染色が達成される速さ及び室温で全血を用いて達成されうるという事実である。
【００１３】
本発明は以下に示される３群の新規色素を提供する：
群１は以下の一般式：
【化７】
0004831914.tif 000005
を有し、式中、ｎは０、１、２又は３であり；Ｒ１はＨ、アルキル又はアルコキシ基であり；Ｒ２はＣＨ２（ＣＨ２）ｍＯＨ、であり、ここで、ｍは０、１、２又は３であり；ＸはＯ、Ｓ又はＣ（ＣＨ３）２であり；ＲはＣＨ３、ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、アルキル、アルキルスルフォネート又はヒドロキシアルキルであり；そしてＢ−は対陰イオンである。
群ＩＩは以下の一般式：
【化８】
0004831914.tif 000006
を有し、式中、ｎは０、１、２又は３であり；Ｒ１はＨ、アルキル又はアルコキシ基であり；Ｒ２はＣＨ２（ＣＨ２）ｍＯＡｃであり、ここで、ｍは０、１、２又は３であり；ＸはＯ、Ｓ又はＣ（ＣＨ３）２であり；ＲはＣＨ３、ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨ２ＣＨ２ＯＡｃ、アルキル、アルキルスルフォネート又はヒドロキシアルキルであり；そしてＢ−は対陰イオンである。
群ＩＩＩは以下の一般式：
【化９】
0004831914.tif 000007
を有し、式中、ｎは０、１又は２であり；Ｒ１はＨ、アルキル又はアルコキシ基であり；Ｒ２はＣＨ２（ＣＨ２）ｍＯＨ又はＣＨ３であり；ＸはＯ、Ｓ又はＣ（ＣＨ３）２であり；Ｂ−は対陰イオンであり、そしてＲ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６は特定化合物色素−３〜色素−６についての式により示されるさまざまな置換基である。
【００１４】
本発明に従って、対イオンは、非限定的に、単一の元素又は負に荷電した基を含む。本発明の１の態様においては、上記対陰イオンはＢｒ−、Ｃｌ−又はＩ−から選ばれるハライドである。本発明の他の態様においては、上記対陰イオンはトシレート基（ＯＴｓ−）であり、ここでＯＴｓ−は［ＣＨ３（Ｃ６Ｈ４）ＳＯ３］−である。本発明のさらなる他の態様においては、上記対陰イオンはＢＦ４−である。しかしながら、本発明はそのように限定されない。非限定的に、ＰＦ６−を含むこれらの既知のイオン及びイオン基から好適な対陰イオンを選択することは当業者の技術範囲内にある。
【００１５】
本発明は、赤色−励起可能又は青色−励起可能でありうる、上記に示される一般式を有する色素化合物を提供する。本明細書中に使用されるとき、赤色励起可能な色素は赤色スペクトル範囲における波長の光で照射されたとき蛍光を発する色素である。本明細書中で使用されるとき、この赤色スペクトル範囲は約６００ｎｍ〜約７２５ｎｍ、そして好ましくは６３０ｎｍ〜６７０ｎｍである。青色励起可能な色素は青色スペクトル範囲における波長の光を当てられたとき蛍光を発する色素である。本明細書中で使用されるとき、青色励起可能な色素は典型的に４２０ｎｍ〜５６０ｎｍ、そして好ましくは約４５０ｎｍ〜約５２０ｎｍの範囲で、吸収最大を有しうる。
【００１６】
上記に示されるように、本発明に係る色素は核酸に結合したとき、蛍光の強い高まりを示す。一般的に、群Ｉの一般式の色素は約２００超の蛍光の高まり率（遊離の色素の蛍光強度に対するＲＮＡ−結合した色素の蛍光強度の率）を有する。いくつかの態様においては、本発明に係る色素は約３００超の蛍光高まり率を有する。本発明に係るさらに他の色素は約３５０超の蛍光高まり率を有するであろうが、本発明に係る他の色素は約４００超の蛍光高まり率を有するであろう、そして本発明に係るさらに他の色素は約４５０超の蛍光高まり率を有するであろう。特定の例には、例えば、図（１Ｂ）及び表（１）を参照のこと。しかしながら、本発明は本明細書中に提供される率により限定されない。
【００１７】
１の所望される態様においては、本発明は、以下の式：
【化１０】
0004831914.tif 000008
を有する、本明細書中でＲｅｔｉｃＲｅｄ１と呼ばれる色素を提供する。ＲｅｔｉｃＲｅｄ１はさらに実施例（１Ａ）、化合物（６）において示される。ＲｅｔｉｃＲｅｄ１における上記一般式について、ｎは１であり、Ｒ１はＨであり、Ｒ２＝ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、Ｒ＝ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、ＸはＳであり、そしてＢ−はＢｒ−である。
【００１８】
他の所望される態様においては、本発明は以下の式：
【化１１】
0004831914.tif 000009
を有する、ＲｅｔｉｃＲｅｄ２と呼ばれる色素を提供する。ＲｅｔｉｃＲｅｄ２における上記一般式について、ｎは１であり、Ｒ１はＨであり、ＲはＣＨ（ＣＨ３）２であり、ＸはＳであり、Ｒ２はＣＨ２ＣＨ２ＯＨであり、そしてＢ−はＢｒ−である。
【００１９】
さらに他の所望される態様においては、本発明は以下の式：
【化１２】
0004831914.tif 000010
を有する、ＲｅｔｉｃＲｅｄ３と呼ばれる色素を提供する。ＲｅｔｉｃＲｅｄ３における上記一般式について、ｎは１であり、Ｒ１はＨであり、ＲはＣＨ３であり、Ｒ２はＣＨ２ＣＨ２ＯＨであり、ＸはＳであり、そしてＢ−はＢｒ−である。
さらに他の所望される態様においては、本発明は以下の式：
【化１３】
0004831914.tif 000011
を有する、ＲｅｔｉｃＲｅｄ４と呼ばれる色素を提供する。ＲｅｔｉｃＲｅｄ４における上記一般式について、ｎは１であり、Ｒ１はＣＨ３であり、ＲはＣＨ３であり、Ｒ２はＣＨ２ＣＨ２ＯＨであり、ＸはＳであり、そしてＢ−はＢｒ−である。
さらなる態様においては、本発明は以下の式：
【化１４】
0004831914.tif 000012
を有する、ＲｅｔｉｃＲｅｄ５と呼ばれる色素を提供する。ＲｅｔｉｃＲｅｄ５における上記一般式について、ｎは１であり、Ｒ１はＣＨ３であり、ＲはＣＨ（ＣＨ３）２であり、Ｒ２はＣＨ２ＣＨ２ＯＨであり、ＸはＳであり、そしてＢ−はＢｒ−である。
【００２０】
他の所望される態様においては、本発明は以下の式：
【化１５】
0004831914.tif 000013
を有する、ＲｅｔｉｃＲｅｄ６と呼ばれる色素を提供する。ＲｅｔｉｃＲｅｄ６における上記一般式について、ｎは１であり、Ｒ１はＣＨ３であり、ＲはＣＨ２ＣＨ２ＯＨであり、Ｒ２はＣＨ２ＣＨ２ＯＨであり、ＸはＳであり、そしてＢ−はＢｒ−である。
【００２１】
さらに他の所望される態様においては、本発明はＲｅｔｉｃＢｌｕｅ１と呼ばれる青色−励起可能な色素を提供し、ここで一般式について、ｎは０である。好ましい青色励起可能な色素の１の特に所望される例は、上記一般式により示されるＲｅｔｉｃＢｌｕｅ１であり、ここで、ｎ＝０、Ｒ１＝Ｈ、ｍ＝１、Ｒ２＝ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、Ｒ＝ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、Ｘ＝Ｓ、Ｂ−＝Ｂｒ−である。
【００２２】
１の所望されうる態様においては、本発明は以下の式：
【化１６】
0004831914.tif 000014
を有する、本明細書中で色素−１と呼ばれる色素を提供する。上記群ＩＩの一般式について、上記色素−１はｎ＝１；Ｒ１＝Ｈ；Ｒ＝ＣＨ３；Ｒ２＝ＣＨ２ＣＨ２ＯＡｃ；Ｘ＝Ｓ；及びＢ−はＢｒ−である、を有する。
【００２３】
他の所望される態様においては、本発明は以下の式：
【化１７】
0004831914.tif 000015
を有する、色素−２と呼ばれる色素を提供する。色素−２は実施例（１Ｂ）中でさらに示される。上記群ＩＩの一般式について、上記色素−２はｎ＝１、Ｒ１＝Ｈ、Ｒ２＝Ｒ＝ＣＨ２ＣＨ２ＯＡｃ、Ｘ＝Ｓ、及びＢ−はＢｒ−である、を有する。
【００２４】
他の所望される態様においては、本発明は以下の式：
【化１８】
0004831914.tif 000016
を有する、本明細書中で色素−３と呼ばれる色素を提供する。色素−３は実施例（１Ｃ）中でさらに示される。上記群ＩＩＩの一般式について、上記色素−３はｎ＝１、ＸはＳであり、Ｒ１＝Ｈ、Ｒ２＝ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、Ｒ３＝Ｒ４＝ＯＣＨ３、Ｒ５＝Ｒ６＝Ｈ、及びＢ−はＢｒ−である、を有する。
【００２５】
他の所望される態様においては、本発明は以下の式：
【化１９】
0004831914.tif 000017
を有する、色素−４と呼ばれる色素を提供する。色素−４は実施例（１Ｃ）中でさらに示される。上記群ＩＩＩの一般式について、上記色素−４はｎ＝１；Ｘ＝Ｓ；Ｒ１＝Ｈ；Ｒ２＝ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ；Ｒ３＝Ｒ５＝Ｒ６＝Ｈ；Ｒ４＝ＣＯＣＨ３；及びＢ−はＢｒ−である、を有する。
【００２６】
他の所望される態様においては、本発明は以下の式：
【化２０】
0004831914.tif 000018
を有する、色素−５と呼ばれる色素を提供する。色素−５は実施例（１Ｃ）中でさらに示される。上記群ＩＩＩの一般式について、上記色素−５はｎ＝１；Ｘ＝Ｓ；Ｒ１＝Ｈ；Ｒ２＝ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ；Ｒ３＝Ｒ４＝Ｒ５＝Ｒ６＝Ｈ；及びＢ−はＢｒ−である、を有する。
さらに他の所望される態様においては、本発明は以下の式：
【化２１】
0004831914.tif 000019
を有する、色素−６と呼ばれる色素を提供する。
色素−６は実施例（１Ｃ）中でさらに示される。上記群ＩＩＩの一般式について、上記色素−６はｎ＝１；Ｘ＝Ｓ；Ｒ１＝Ｈ；Ｒ２＝ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ；Ｒ３＝Ｒ４＝Ｒ５＝Ｈ；Ｒ６＝Ｂ（ＯＨ）２；及びＢ−はＩ−である、を有する。
【００２７】
本発明に係る色素は当業者に容易に明らかであろうさまざまな目的に有用である。上記使用は、例えば、それらが結合される分子又は化合物の存在を検出するためのマーカー又はタグとしての色素の使用を含む。上記マーカーはｉｎ  ｖｉｖｏで治療用化合物の効率をモニターするために又は診断の使用等のために使用されうる。しかしながら、本発明に係る色素は特に核酸の染色によく合う。例えば、これらの色素は特に網状赤血球内のＲＮＡの染色に好適である。他の例示的な使用においては、これらの色素は有核の赤血球においてＤＮＡを染色するのに好適である。典型的に、核酸の染色において使用されるとき、上記色素は試薬溶液に調合される。
【００２８】
Ｉ．  染色試薬
本発明は、さまざまな分析フォーマットを含む、さまざまな使用における染色試薬として有用である、本明細書中に示されるさまざまな組成物を提供する。上記使用の例は、本明細書に示される組成物の総覧について、当業者に容易に明らかであろう。
【００２９】
Ａ．  色素組成物
核酸の染色のための本発明に係る新規色素を利用するために、上記色素は溶液を形成するために好適な溶媒中に溶解される。本明細書中に示されるとき、溶媒は固体、液体又は気体を溶解しうるいかなる液体をも示すと意味される。本発明の好ましい態様は、ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）、メタノール、エタノール、及びその混合物の如き、水に基づく又は混和性の液体を利用する。好適な溶媒の選択は、しかしながら、本発明の限定ではない。貯蔵のためには、典型的に比較的高い濃度の色素が貯蔵溶液を得るために好適な溶媒中に溶解される。好ましい態様においては、上記色素の貯蔵溶液を得るために、上記色素は０．５ｍＭ〜１０ｍＭ、そして最も好ましくは１〜５ｍＭの範囲の色素濃度でＤＭＳＯ中に溶解される。
【００３０】
本発明に係る方法における上記色素組成物のさらなる使用のためには、上記貯蔵溶液は、例えば、水、塩水、リン酸緩衝塩水（ＰＢＳ）又は等張塩水を含む、他の試薬又は緩衝液中に希釈されうる。上記色素組成物中の最終的な色素濃度は上記使用に因り変動しうる。１の態様においては、全血のサンプルに添加される最終的な色素組成物における上記色素の濃度は約０．１〜５０μＭ、好ましくは約０．５〜２５μＭ、そしてより好ましくは２〜１０μＭの範囲内である。しかしながら、好適な濃度又は希釈溶媒の選択は本発明における限定ではない。
【００３１】
本発明に係る色素組成物はさまざまな目的に利用されうる。本発明の好ましい態様は核酸の染色、検出、及び分析のための色素組成物の使用である。本発明の他の好ましい態様は全血における網状赤血球の染色、検出、及び分析のための上記色素組成物の使用である。本発明のさらに他の好ましい態様は全血における有核の赤血球の染色、検出、及び分析のための上記色素の使用である。当業者は本発明に係る上記色素及び試薬の使用は限定されないことを容易に理解するであろう。１の特定の所望される態様においては、例えば、上記色素は無傷の細胞に接触する場合、１以上の上記色素が混合物中に調合されることが所望されうる。
【００３２】
Ｂ．  速い染色のための組成物
他の局面においては、本発明に係る色素組成物は細胞膜を通る上記色素の速い移動を促進し、それにより色素が約１分間以内でも網状赤血球を染色するようにさせるために利用されうる。したがって、本発明に係る方法は約０〜約６０秒、好ましくは約０秒〜約４５秒、より好ましくは約０秒〜約３０秒、最も好ましくは約０秒〜約２０秒で染色させうる。
【００３３】
一般的に、上記速い染色は、サンプルが少なくとも１の界面活性剤、及び場合により、スルフォン酸又はその塩の存在下で、本発明に係る色素組成物と接触されることを必要とする。
【００３４】
速い染色に使用されるとき、追加の成分が本発明に係る組成物に添加されうる。例えば、緩衝液は上記色素組成物のｐＨを維持することが必要である状況において使用されうる。好ましくは、上記色素試薬のｐＨは約６〜約９の範囲内に維持される。より好ましくは、約７〜約７．５の範囲のｐＨが得られる。上記緩衝液は、本発明に係る組成物において使用されるために、当業者に知られるさまざまな緩衝液から選ばれることができ、非限定的に、リン酸緩衝塩水（ＰＢＳ）又はＩＳＯＴＯＮ（商標）ＩＩ希釈液、米国特許第３，９６２，１２５号、［Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，  Ｉｎｃ．，  Ｍｉａｍｉ，  Ｆｌｏｒｉｄａ］等の如き、等張塩水を含む。さらに、上記緩衝液は本発明に係る組成物の１以上の成分の濃度を調節するのにも使用されうる。保存料も本発明に係る組成物に添加されることができ、そして、非限定的に、５−クロロ−２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン、及び２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オンから選ばれうる［上記保存料は、例えば、ＰｒｏＣｌｉｎ  ３００又はＰｒｏＣｌｉｎ  １５０として商業的に購入されうる］。
【００３５】
少なくとも１の界面活性剤が速い染色組成物中で使用される。１の例示的な態様においては、上記界面活性剤は細胞の球状化剤として機能する洗剤及び第二の界面活性剤を含む。他の例示的な態様においては、上記界面活性剤は、単一の界面活性剤が洗剤及び球状化剤の両方として機能するように設計されうる。さらに他の例示的な態様においては、上記界面活性剤は、単一の界面活性剤が必要とされる界面活性剤機能を提供するが、球状化剤機能は必要とされないように設計されうる。
【００３６】
本発明に係る組成物において使用されるべき界面活性剤は、陰イオン界面活性剤アンモニウムペルフルオルアルキルカルボキシレート［Ｆｌｕｏｒａｄ（商標）  ＦＣ−１４３（３Ｍ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，  Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ）として商業的に入手可能］、ラウロイルミリストイルラクチレートナトリウム［Ｐａｔｉｏｎｉｃ（商標）  １３８Ｃ（Ｒ．Ｉ．Ｔ．Ａ．  Ｃｏｒｐ，  Ｗｏｏｄｓｔｏｃｋ，  Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）として商業的に入手可能］から又は非イオン性界面活性剤ドデシル−β−Ｄ−マルトシド、Ｎ，Ｎ−ビス［３−Ｄ−グルコン−アミドプロピル］コールアミド、ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンブロック共重合体、Ｎ−テトラデシル−β−Ｄ−マルトシド、ダコニル−Ｎ−メチル−グルカミド、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−デシル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ステアリン酸のポリエチレングリコールエステル、エトキシル化ココモノグリセリド、オクチフェノキシポリ（エチレンオキシ）エタノール、エトキシル化オクチルフェノール、及び直鎖アルコールから又は陽イオン性界面活性剤、ココヒドロキシエチルイミダゾリン、塩化ラウリルトリメチルアンモニウム、臭化デシルトリメチルアンモニウム、臭化オクチルトリメチルアンモニウムから又は双極性イオン性界面活性剤ラウルアミドプロピルベタイン、Ｎ−テトラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルフォネート、Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルフォネート、ココアミドプロピルベタイン、ココアミドスルフォベタイン、Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルフォネート、Ｎ−テトラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルフォネートから選ばれうる。
【００３７】
上記に議論されるように、上記選択される界面活性剤は、上記濃度及び容量オスモル濃度が好適に調節されるとき、赤血球細胞の球状化剤として機能しうる。球状化剤は当業者により容易に選択されうる。好ましい球状化試薬は、好適に溶液中でリン酸緩衝塩水の如き緩衝液を伴う、非イオン性界面活性剤ドデシル−β−Ｄ−マルトシドに基づく。血液サンプル中の網状赤血球及び赤血球を有効に等体積的に球状化するために、上記組成物中の球状化試薬の濃度は約２００〜約４００ｍＯＳｍ、そして好ましくは約２５０ｍＯｓｍ〜約３５０ｍＯｓｍの範囲内のｍＯｓｍで、最も好ましくは約３μｇ／ｍｌ〜約５０μｇ／ｍｌである。しかしながら、当業者はこの濃度及び容量オスモル濃度を、上記選択された界面活性剤を考慮に入れて、細胞を等体積的に球状化するように必要とされ又は所望されるように容易に調節しうる。上記に議論されるように、場合により上記球状化試薬の選択は上記洗剤の必要性を消去しうる。
【００３８】
１の態様においては、洗剤は本発明に係る色素組成物中に含まれる。使用されるべき洗剤は非イオン性洗剤から選ばれる。所望のように、これらの洗剤は約０〜約１％の濃度で使用される。本発明の１の好ましい態様においては、上記洗剤は約０．００１％〜約０．５％の濃度で使用され、そしてより好ましい態様においては、約０．００５％〜０．１％の範囲内である。１の今般の好ましい洗剤はオクチルフェノキシポリ（エチレンオキシ）エタノール［Ｉｇｅｐａｌ（商標）ＣＡ−６３０（Ｓｉｇｍａ  Ｎ−６５０７）又はＮｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０（Ｓｉｇｍａ）として商業的に入手可能］である。他の好適な洗剤の例はエチオキシル化オクチルフェノール［Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ  Ｔ９２８４）として商業的に入手可能］、及び直鎖アルコールアルコキシレート［Ｐｌｕｒａｆａｃ（商標）  Ａ−３８（ＢＡＳＦ  Ｃｏｒｐ）又はＰｌｕｒａｆａｃ（商標）  Ａ−３９（ＢＡＳＦ  Ｃｏｒｐ）として商業的に入手可能］を含む。典型的に、これらの洗剤はサンプル、例えば、１〜２μｌの全血等と混合される（又はその逆）、又は別々に本発明に係る組成物中に調合される。
【００３９】
１の所望されうる態様においては、スルフォン酸又はその塩は本発明に係る組成物中に含まれる。上記スルフォン酸又はその塩は上記色素組成物を細胞膜を通って移動させるさらなる促進剤としてはたらき、そして約０．０１〜約２５０μＭ、より好ましくは約０．０１〜約５０μＭの範囲の濃度で使用される。本発明の１の態様はｐ−トルエンスルフォン酸を利用する。本発明の他の態様においては、ｐ−トルエンスルフォン酸塩はｐ−トルエンスルフォン酸に置換されうる。上記塩の例はｐ−トルエンスルフォン酸ナトリウム、カリウム、銀、亜鉛、及びバリウム塩を含む。上記塩のいくつかの例は、例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから、商業的に入手可能である。他の好適なスルフォン酸は本発明における使用のために容易に選択されうる。
【００４０】
本発明に係る色素組成物は、場合により他の色素の存在下で、単一の色素を含みうる。本発明の１の態様においては、本発明に係る組成物は本発明に係る１以上の色素化合物又はその組み合わせを含みうる。
本発明のさらに他の態様においては、本発明に係る組成物は本発明に係る１以上の新規色素と共に当業者に知られる他の色素を含みうる。上記色素は公開された及び／又は商業的に入手可能である色素のうちから容易に選ばれる。例えば、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，  Ｉｎｃ．（Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）のカタログを参照のこと。当業者に容易に明らかであろう、本発明に係る色素及び組成物のためのさまざまな使用がある。
【００４１】
本発明のさらに他の態様においては、本発明に係る組成物は、本発明に係る１以上の新規色素と共に、細胞内の特定の核酸又はタンパク質のブロッキング剤として本分野において知られる他の色素及び試薬を含みうる。上記ブロッキング剤は公開された及び／又は商業的に入手可能である色素及び試薬のうちから容易に選ばれる。例えば、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，  Ｉｎｃ．（Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）のカタログ又はＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ，  Ｏｒｅｇｏｎ）のカタログを参照のこと。当業者に容易に明らかであろう、本発明に係る色素及び組成物のためのさまざまな使用がある。
【００４２】
ＩＩ．  本発明に係る色素を用いた核酸染色法
本発明に係る色素組成物は、ＤＮＡ及びＲＮＡを含む、さまざまな核酸の染色において有用である。
遊離の核酸、例えば、細胞又は非細胞源の無傷の細胞膜により囲まれていない核酸を含むサンプルにおいては、本発明に係る色素組成物は上記核酸を染色しうる。本発明の１の態様においては、方法は核酸を含むサンプルを本発明に係る色素組成物と接触させるために提供される。好ましくは、上記方法は核酸を含むサンプルを、場合により当業者に知られる他の色素及び試薬の存在下で、本発明に係る色素組成物と接触させることを含む。本発明の好ましい態様においては、上記方法は核酸を含むサンプルを、約２〜約１０μＭの赤色励起可能なＲｅｔｉｃＲｅｄ１色素及び等張水性緩衝液を含む、本発明に係る色素組成物と接触させることを含む。本発明の他の好ましい態様においては、上記方法は核酸を含むサンプルを、約１〜約１０μＭの赤色励起可能な色素−１、色素−２、色素−３又はそれらの組み合わせ及び等張水性緩衝液を含む、本発明に係る色素組成物と接触させることを含む。
本発明に係る色素組成物はＲＮＡを含む網状赤血球の検出及び計測における使用に特によく合う。本発明に係る方法は、それゆえ、核酸を含む網状赤血球を１以上の本発明に係る色素組成物と接触させることを含む。
【００４３】
本発明に係る色素組成物、好ましくは群ＩＩ及び群ＩＩＩは、ＤＮＡを含む有核の赤血球の検出及び計測における使用によく合う。
【００４４】
１の態様においては、上記方法は上記血液細胞を、少なくとも１の界面活性剤の存在下で、場合により保存剤及びスルフォン酸試薬と共に、本発明に係る色素組成物と接触させることを含む。上記に示すように、界面活性剤は洗剤及び／又は球状化剤を含みうる。本発明に係る方法に従って、上記細胞はこれらの成分を含む組成物と接触されうる。あるいは、１以上のこれらの成分は、例えば、上記成分を上記サンプルに直接添加することにより、別々にデリバリーされうる。上記混合物はその後好適な時間インキュベートされる。以前に議論したように、上記インキュベーション時間は１分以内であろう。しかしながら、便利の目的のために所望される場合、上記インキュベーション時間は延長又は短縮されうる。例えば、上記色素、界面活性剤又は洗剤の濃度を調節することにより、上記インキュベーション時間は１分間以上に増加されうる。所望のように、この混合及びインキュベーションは約２０℃〜４０℃の温度で行われうる。しかしながら、本発明の好ましい態様においては、２２℃〜２８℃の範囲の温度が利用されうる。
【００４５】
今般の好ましい態様においては、本発明に係る方法は、網状赤血球を染色するために、約０秒間〜約１分間の範囲の期間の上記色素のインキュベーション時間を必要とし、そして上記染色は室温で達成されうる。他の好ましい態様においては、インキュベーション時間は上記血液サンプルは上記色素組成物と混合され、そしてその後即座に上記器具により分析されるため、消去される。例えば、実施例（５）、図（７）及び図（８）並びに実施例（７）、図（１０Ａ）〜（２Ｂ）、（１１Ａ）〜（１１Ｃ）、（１２Ａ）〜（１２Ｃ）を参照のこと。この時間枠内における網状赤血球の赤色−励起可能な色素を用いた前人工染色技術は高温でのインキュベーション及び／又は毒性イオノフォア化合物の追加の使用を必要とする。
【００４６】
本発明に係る方法に従って、上記色素組成物で染色された網状赤血球は自動流動細胞光度測定器で好ましく計測される。しかしながら、これらの細胞は手動の手順又は自動化された光学顕微鏡によっても計測されうる。
【００４７】
したがって、本発明に係る方法は、自動化された流動細胞光度測定法に所望される時間枠内で細胞膜を介する本発明に係る核酸特異的色素の移動を促進する。自動流動細胞光度測定器は本分野において周知であり、そして本発明は特定のどの流動細胞光度測定器の使用にも限定されない。本発明の好ましい態様はＸＬ（商標）流動細胞光度測定器［Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｉｎｃ．，  Ｍｉａｍｉ，  Ｆｌｏｒｉｄａ］を用いた網状赤血球の検出及び計測を含む。異なる分析技術は、非限定的に、光分散、蛍光、光学吸収、軸光損失、ＤＣ電気インピーダンス、及び無線周波数（ＲＦ）伝導性を含む、流動細胞光度測定法による網状赤血球の計測において使用されうる。本発明の好ましい態様においては、上記流動細胞光度測定器を用いて、光分散ゲートが赤血球を単離するために使用され、そして蛍光ゲートがその後成熟赤血球から網状赤血球を線引きし、そして上記網状赤血球を計測するのに使用される。本発明の他の態様においては、流動細胞光度測定器を用いて、ＤＣ及び光分散ゲートが赤血球を単離するために使用され、そして蛍光ゲートがその後成熟赤血球から網状赤血球を線引きし、そして上記網状赤血球を計測するのに使用される。本発明のさらに他の態様においては、流動細胞光度測定器を用いて、ＤＣ及び蛍光計測のみが成熟赤血球から網状赤血球を線引きし、そして上記網状赤血球を計測するのに使用される。
【００４８】
本発明の好ましい態様の他の注目に値する利点は上記組成物が、ＲｅｔｉｃＲｅｄ１、ＲｅｔｉｃＲｅｄ３、色素−１、色素−２又は色素−３の如き、本発明に係る赤色−励起可能な色素を含むとき、それはＣＰＯ、ＡＯ［Ｓｅｌｉｇｍａｎ，  Ａｍ．  Ｊ．  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，  １４：５７９１９８３）］、ＴＯ［Ｌｅｅ  ｅｔ．  ａｌ．，  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，  ７：５０８（１９８６）］、Ａｕｒａｍｉｎｅ−Ｏ及びＰｙｒｏｎｉｎ−Ｙの如き他の現在入手可能な網状赤血球色素に使用されるアルゴンレーザーよりも費用のかからない励起源の使用を許す。例えば、本発明に係る上記赤色−励起可能な色素組成物が使用されるとき、本発明は都合のよいことに上記励起源として赤色レーザーの使用を許す。特に、赤色ダイオードレーザー、強力発光ダイオード（ＬＥＤ）又は赤色ヘリウム−ネオンレーザーは本発明に係る赤色−励起可能な色素を用いた網状赤血球計測を行うのに使用されうる。
【００４９】
上記流動細胞光度測定器のために励起源として利用されうる、さまざまなレーザーが当業者に知られる。上記レーザーは、網状赤血球の検出に選択される本発明に係る色素の励起波長に因り、非限定的に、アルゴン、ヘリウム−ネオン、ダイオード、及びダイオード駆動固体−状態レーザーから選ばれうる。好適な光源、及び好適な励起波長の選択は本発明上の限定ではない。
【００５０】
好適な励起波長は当業者により容易に決定されうる。赤色スペクトル範囲内の好適な励起波長の例は６００ｎｍ〜７２５ｎｍ、そして好ましくは６３０ｎｍ〜６７０ｎｍの範囲内のものを含む。他の好適な励起源及び波長は、本発明に係る方法及び組成物における使用のために選択される上記色素を考慮に入れて、当業者により容易に選択されうる。ＲｅｔｉｃＲｅｄ１、ＲｅｔｉｃＲｅｄ２、ＲｅｔｉｃＲｅｄ３、ＲｅｔｉｃＲｅｄ４、ＲｅｔｉｃＲｅｄ５、ＲｅｔｉｃＲｅｄ６、色素−１、色素−２又は色素−３等の如き、本発明に係る赤色−励起可能な色素化合物が本質的に核酸の非存在下（結合していない状態）では水性溶液中で非蛍光又は非常に弱い蛍光であるという事実から追加の利点が起こる。その結果、バックグラウンド蛍光に関連する問題は最小で、そして網状赤血球はこの色素を用いて高感度で検出されうる。
したがって、本発明は、次に続く流動分析のために、網状赤血球が本発明に係る色素で速く染色されることを許す。本発明に係る方法は上記細胞の固定を必要とする前人工Ｐｙｒｏｎｉｎ−Ｙ［上記に引用される、Ｔａｎｋｅ  ｅｔ  ａｌ．］染色手順及び細胞−固定は必要としないが、染色を達成するために上記血液との長いインキュベーションを必要とするＣＰＯ（ｒｅｔｉｃＯＮＥ（商標））又はチアゾールオレンジ（Ｒｅｔｉｃ−Ｃｏｕｎｔ（商標））の如き膜透過性色素に関連する前人工蛍光染色手順のどちらとも異なる。
【００５１】
ＩＩＩ．  実施例
以下の実施例は本発明を例示するために提供され、そしてその範囲を限定しない。当業者は特定の試薬及び状態が以下の実施例中に概略されているが、本発明の精神及び範囲により含まれるように意味される改変がなされうることを理解するであろう。
【００５２】
実施例（１Ａ）−群Ｉの化合物の合成用材料及び方法
【化２２】
0004831914.tif 000020
【００５３】
Ｂ．  特定色素の調製
臭化１−（２−ヒドロキシ）エチルエピジニウムの調製。レピジン（１１．５ｇ）及びブロモエタノール（１００ｇ）の溶液を攪拌し、そして１１０℃の油浴中で４８時間熱した。上記反応混合物を室温まで冷却し、酢酸エチル（１００ｍｌ）を添加し、そして５分間攪拌して、固体を生じ、それを回収し、酢酸エチル（２×２０ｍｌ）で洗浄し、そして乾燥させた。上記固体をその後メタノール（８０ｍｌ）中に溶解し、そして酢酸エチル（６００ｍｌ）で沈殿した。上記固体をろ過を介して回収し、酢酸エチル（２×１００ｍｌ）で洗浄し、そして高い吸引下で５０℃のオーブン内で一晩乾燥させ、１１．４７ｇ（５３％収率）の生成物（２ｃ）を得た。
【００５４】
臭化３−（２−ヒドロキシ）エチル−２−メチルベンゾチアゾリウム（４ａ）の調製。２−メチルベンゾチアゾール（５．８７ｇ）及び２−ブロモエタノール（４９．２ｇ）の溶液攪拌し、そして１１０℃の油浴中で１８時間熱した。上記反応混合物を室温まで冷却した後、酢酸エチル（１００ｍｌ）を添加し、そしてデカントし、生ずる固体をその後メタノール（５０ｍｌ）中に溶解し、そして酢酸エチル（３００ｍｌ）で沈殿させた。上記固体をメタノール及び酢酸エチルの混合物から再び再結晶し、酢酸エチル（２×２５ｍｌ）で洗浄し、そして高い吸引下で５０℃のオーブン内で一晩乾燥させ、４．２１ｇ（３９％）の４ａを得た。
【００５５】
臭化３−（２−ヒドロキシ）エチル−２，６−ジメチルベンゾチアゾリウム（４ｂ）の調製。２，６−ジメチルベンゾチアゾール（１３．０ｇ）及び２−ブロモエタノール（１００ｇ）の溶液を攪拌し、そして１２０℃まで９６時間油浴中で熱した。上記混合物を室温まで冷却した後、酢酸エチル（１５０ｍｌ）を添加し、そして１時間攪拌して、生ずる固体をろ過し、そして回収した。上記固体をその後メタノール（１５０ｍｌ）中へ溶解し、そして木炭（２ｇ）を添加した。上記木炭をＣｅｌｉｔｅ（商標）のパッドを通すことにより除去した。上記溶液をその後小体積まで濃縮し、そしてアセトン（２００ｍｌ）で粉砕した。上記固体を回収し、アセトン（２×３０ｍｌ）、酢酸エチル（２×３０ｍｌ）で洗浄し、そして高い吸引下で５０℃のオーブン内で一晩乾燥させ、１３．９５ｇ（６１％）の４ｂを得た。
【００５６】
臭化３−（２−ヒドロキシ）エチル−６−メトキシ−２−メチルベンゾチアゾリウム（４ｃ）の調製。６−メトキシ−２−メチルベンゾチアゾール（１．８２ｇ）及び２−ブロモエタノール（８．８ｇ）の溶液を攪拌し、そして１２０℃の油浴中で７４時間熱した。上記反応混合物を室温まで冷却後、酢酸エチル（２５ｍｌ）を添加し、そして１時間攪拌し、上記固体をろ過して、そして回収した。上記固体をその後メタノール（５０ｍｌ）中に溶解し、そして木炭（０．５ｇ）を添加した。上記木炭をＣｅｌｉｔｅ（商標）のパッドを通すことにより除去した。上記溶液をその後小体積まで濃縮し、そして酢酸エチル（１００ｍｌ）で粉砕した。上記固体を回収し、酢酸エチル（２×３０ｍｌ）で洗浄し、そして高い吸引下で５０℃のオーブン内で一晩乾燥させ、０．９ｇ（３０％）の４ｃを得た。
【００５７】
臭化３−（２−ヒドロキシ）エチル−２−（２−Ｎ−フェニル）エテニルベンゾチアゾリウム（５ａ）の調製。メタノール／エタノール（３：１、８０ｍｌ）の混合した溶媒中の臭化３−（２−ヒドロキシ）エチル−２−メチルベンゾチアゾリウム（４ａ、１．１９ｇ）の溶液に過剰のエチルＮ−フェニルフォルムイミデート（３．０ｇ）を添加し、そして上記溶液を室温で３６時間攪拌した。上記溶媒を減圧下で除去し、乾燥した固体を得た。上記固体をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、塩化メチレン／メタノール）精製にかけた。上記生成物を含む画分を混合し、そして減圧下で乾燥するまで濃縮した。上記固体をメタノール（１０ｍｌ）中に溶解し、そしてエチルエーテル（２００ｍｌ）で沈殿した。５０℃で高い吸引下で一晩乾燥させた後、１．０４ｇ（６３％）の５ａを黄色固体として得た。
【００５８】
臭化３−（２−ヒドロキシ）エチル−６−メチル−２−（２−Ｎ−フェニル）エテニルベンゾチアゾリウム（５ｂ）の調製。メタノール（８０ｍｌ）中の臭化３−（２−ヒドロキシ）エチル−２，６−ジメチルベンゾ−チアゾリウムの溶液に過剰のエチルＮ−フェニルフォルムイミデート（３．６ｇ）を添加し、そして上記溶液を室温で３６時間攪拌した。酢酸エチル（１６０ｍｌ）をその後添加し、そして一晩攪拌した。上記固体を回収し、酢酸エチル（２×３０ｍｌ）で洗浄し、そして乾燥させた。上記固体を５０℃のオーブン内で高い吸引下で一晩さらに乾燥させ、２．３２ｇ（６２％）の５ｂを黄色固体として得た。
【００５９】
臭化３−（２−ヒドロキシ）エチル−６−メトキシ−２−（２−Ｎ−フェニル）エテニルベンゾチアゾリウム（５ｃ）の調製。メタノール（３０ｍｌ）中の臭化３−（２−ヒドロキシ）エチル−６−メトキシ−２−メチルベンゾチアゾリウムの溶液に過剰のエチルＮ−フェニルフォルムイミデート（１．５ｇ）を添加し、そして上記溶液を室温で１６時間攪拌した。上記溶媒を減圧下で除去し、乾燥した固体を作出した。上記固体をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル）にかけ、そしてメタノール／塩化メチレン勾配（０〜１５％メタノール）で溶出した。上記生成物を含む画分を混合し、そして減圧下で乾燥するまで濃縮した。上記固体をメタノール（５ｍｌ）中に溶解し、そしてエチルエーテル（１５０ｍｌ）で沈殿させた。５０℃のオーブン内で高い吸引下で一晩乾燥させた後、０．３５ｇ（３３％）の５ｃを黄色固体として得た。
【００６０】
色素化合物６（ＲｅｔｉｃＲｅｄ１）の調製。塩化メチレン（２０ｍｌ）中の臭化３−（２−ヒドロキシ）エチル−２−（２−Ｎ−フェニル）エテニルベンゾチアゾリウム（５ａ、８５．８ｍｇ）及び臭化１−（２−ヒドロキシ）エチルレピジニウム（２、５８．４ｍｇ）の溶液にトリエチルアミン（９１μＬ）及び酢酸無水物（６２μＬ）を添加した。室温で２時間攪拌後、上記溶媒を減圧下で除去し、青色固体を得た。上記固体をメタノール（１５ｍｌ）中に部分的に再溶解し、そして酢酸エチル（３００ｍｌ）を添加した。生ずる固体をろ過を介して回収し、酢酸エチル（２×３０ｍｌ）で洗浄し、そして乾燥させた。上記固体を５０℃のオーブン内で高い吸引下で一晩さらに乾燥させた後、６７．８ｍｇ（６６％）の８を青色固体として得た。最大吸収スペクトル：６３０ｎｍ（メタノール中）、６４０ｎｍ（ＤＭＳＯ中）。
【００６１】
色素化合物７（ＲｅｔｉｃＲｅｄ６）の調製。塩化メチレン（１０ｍｌ）中の臭化３−（２−ヒドロキシ）エチル−６−メチル−２−（２−Ｎ−フェニル）エテニルベンゾチアゾリウム（５ｂ、８５．６ｍｇ）、臭化１−（２−ヒドロキシ）エチルレピジニウム（２、５８．７ｍｇ）、及びメタノール（１．０ｍｌ）の溶液に、トリエチルアミン（９１μＬ）及び酢酸無水物（６１μＬ）を添加した。室温で２時間攪拌した後、上記溶媒を減圧下で除去し、青色固体を得た。上記固体を部分的にメタノール（１０ｍｌ）中に再溶解し、そして酢酸エチル（２００ｍｌ）を添加した。生ずる固体をろ過を介して回収し、酢酸エチル（２×３０ｍｌ）で洗浄し、そして乾燥させた。上記固体を５０℃のオーブン内で高い吸引下で一晩さらに乾燥させ、６３．７ｍｇ（６０％）の１１を青色固体として得た。最大吸収スペクトル：６３６ｎｍ（メタノール中）、６４５ｎｍ（ＤＭＳＯ中）。
実施例１Ｂ：群−ＩＩ化合物の合成用材料及び方法
【化２３】
0004831914.tif 000021
【００６２】
（ｉ）ヨー化１−メチルレピジニウム（２ａ）の調製。レピジン（１０．５６ｇ）及びヨー化メチル（１０５ｇ）の溶液を攪拌し、そして５０℃の油浴中で１９時間還流まで熱した。上記反応混合物を室温まで冷却し、アセトン（２００ｍＬ）を添加し、そして２時間攪拌した。生ずる固体を回収し、酢酸エチル（２×２０ｍＬ）で洗浄し、そしてその後酢酸エチル（２００ｍＬ）で粉砕した。上記固体をろ過を介して回収し、酢酸エチル（２×２５ｍＬ）で洗浄し、そして５０℃のオーブン内で高い吸引下で一晩乾燥させた。２０．７４ｇ（９８．６％収率）の生成物を得た。
【００６３】
（ｉｉ）臭化１−（２−ヒドロキシエチル）レピジニウム（２ｂ）の調製。レピジン（１１．５ｇ）及びブロモエタノール（１００ｇ）の溶液を１１０℃の油浴中で４８時間攪拌した。上記反応混合物を室温まで冷却し、酢酸エチル（１００ｍＬ）を添加し、そして５分間攪拌した。生ずる固体を回収し、酢酸エチル（２×２０ｍＬ）で洗浄し、そして乾燥させた。上記固体をその後メタノール（８０ｍＬ）中に溶解し、そして酢酸エチル（６００ｍＬ）で沈殿させた。上記固体をろ過を介して回収し、酢酸エチル（２×１００ｍＬ）で洗浄し、そして５０℃のオーブン内で高い吸引下で一晩乾燥させた。１１．４７ｇ（５３％収率）の生成物を得た。
【００６４】
（ｉｉｉ）臭化３−（２−ヒドロキシエチル）−２−メチルベンゾチアゾリウム（４）の調製。５．８７ｇの２−メチルベンゾチアゾール（３）及びブロモエタノール（４９．２ｇ）の溶液を１１０℃の油浴中で１８時間攪拌した。酢酸エチル（１００ｍＬ）を上記反応混合物に添加し、そしてデカントした。上記残留固体をその後メタノール（５０ｍＬ）中に溶解し、そして酢酸エチル（３００ｍＬ）で沈殿させた。上記固体をメタノール−酢酸エチル（１５ｍＬ／１５０ｍＬ）から再び再結晶させ、酢酸エチル（２×２５ｍＬ）で洗浄し、そして５０℃のオーブン内で高い吸引下で一晩乾燥させた。上記収率は４．２１ｇ（３９％）であった。ＴＬＣ（シリカゲル、４：１  塩化メチレン：メタノール）Ｒｆ＝０．３４。
【００６５】
（ｉｖ）臭化３−（２−ヒドロキシエチル）−２−（２−Ｎ−フェニル）エテニルベンゾチアゾリウム（５）の調製。メタノール／エタノール（３：１、８０ｍＬ）の混合された溶媒中の臭化３−（２−ヒドロキシエチル）−２−メチルベンゾチアゾリウム（４、１．１９ｇ）の溶液に過剰のエチルＮ−フェニルフォルミジエート（３．０ｇ）を添加し、そして室温で３６時間攪拌した。上記溶媒を減圧下で蒸発させ、乾燥させた。上記固体をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、塩化メチレン／メタノール）精製にかけた。上記生成物を含む画分を混合し、そして減圧下で乾燥するまで濃縮した。上記固体をメタノール（１０ｍＬ）中に溶解し、そしてエチルエーテル（２００ｍＬ）で沈殿させた。５０℃のオーブン内で高い吸引下で一晩乾燥させた後、１．０４ｇ（６３％）の黄色固体を得た。ＴＬＣ（シリカゲル、９：１  塩化メチレン／メタノール）Ｒｆ＝０．２７。
【００６６】
（ｖ）Ｒ＝ＣＨ３、Ｒ１＝Ｈを有する、上記図において６として示される配置と一致する色素化合物の調製。ピリジン（１０ｍＬ）中の臭化３−（２−ヒドロキシエチル）−２−（２−Ｎ−フェニル）エテニルベンゾチアゾリウム（５、２０３．８ｇ）及びヨー化１−メチルレピジニウム（２ａ、１５４．０ｍｇ）の溶液を９０℃の油浴中で２時間無水条件下で熱した。ＤＭＦ（０．５ｍＬ）中のテトラフルオロホウ酸ナトリウム（５９．３ｍｇ）の溶液を添加し、そして上記加熱をさらに２０分間９０℃で続けた。室温まで冷却後、上記反応溶液を酢酸エチル（１００ｍＬ）中に注ぎ、そして生ずる固体をろ過を介して回収した。上記固体をメタノール（１００ｍＬ）中に再溶解し、そして酢酸エチル（３００ｍＬ）を添加し、そして一晩攪拌した。生ずる固体をろ過を介して回収し、酢酸エチル（２×２０ｍＬ）で洗浄し、そして乾燥させた。上記固体を５０℃のオーブン内で高い吸引下で一晩さらに乾燥させ、１６５．４ｍｇ（６８％）の青色固体を得た。ＴＬＣ（シリカゲル、４：１  塩化メチレン：メタノール）Ｒｆ＝０．６５。最大吸収：６２９ｎｍ（メタノール中）。
【００６７】
（ｖｉ）Ｒ＝ＣＨ２ＣＨ２（ＯＨ）、Ｒ１＝Ｈを有する、７として示される配置と一致する色素化合物の調整。塩化メチレン（２０ｍＬ）中の臭化３−（２−ヒドロキシエチル）−２−（２−Ｎ−フェニル）エテニルベンゾチアゾリウム（５、８５．８ｍｇ）及び臭化１−（２−ヒドロキシエチル）レピジニウム（２ｂ、５８．４ｍｇ）の溶液にトリエチルアミン（９１μＬ）及び酢酸無水物（６２μＬ）を添加した。室温で２時間攪拌後、上記溶媒を減圧下で蒸発させ、青色固体を得た。部分的に上記固体をメタノール（１５ｍＬ）中に再溶解し、そして酢酸エチル（３００ｍＬ）を添加した。生ずる固体をろ過を介して回収し、酢酸エチル（２×３０ｍＬ）で洗浄し、そして乾燥させた。上記固体を５０℃のオーブン内で高い吸引下で一晩さらに乾燥させ、６７．８ｍｇ（６６％）の青色固体を得た。ＴＬＣ（シリカゲル、４：１  塩化メチレン：メタノール）Ｒｆ＝０．１８。最大吸収：６３１ｎｍ（メタノール中）。
【００６８】
（ｖｉｉ）８として示される分子配置と一致するアセチル化色素化合物の調製。酢酸無水物（４ｍＬ）及びピリジン（１ｍＬ）中の上記（ｖ）中に示される色素化合物（５０ｍｇ）の懸濁物を油浴中で無水条件下で１０時間攪拌しながら５０℃で熱した。室温まで冷却後、上記反応溶液を酢酸エチル（１００ｍＬ）中に注ぎ、そして３分間攪拌した。生ずる細かい結晶をろ過を介して回収し、酢酸エチル（２×２０ｍＬ）で洗浄し、そして５０℃のオーブン内で高い吸引下で一晩乾燥させた。５６．５ｍｇ（定量的な収率）の青色結晶固体生成物を得た。ＴＬＣ（シリカゲル、４：１  塩化メチレン：メタノール）Ｒｆ＝０．７９  最大吸収：６２５ｎｍ（メタノール中）。この化合物は本明細書中後に色素−１として示される。
【００６９】
（ｖｉｉｉ）９として示される上記分子配置と一致するアセチル化色素化合物の調製。酢酸無水物（８ｍＬ）及びピリジン（２ｍＬ）中の上記（ｖｉ）中に示される色素化合物（３７７．５ｍｇ）の懸濁物を油浴中で無水条件下で１０時間攪拌しながら５０℃で熱した。室温まで冷却後、上記反応溶液を酢酸エチル（１００ｍＬ）中に注ぎ、そして３分間攪拌した。生ずる固体をろ過を介して回収し、酢酸エチル（２×２０ｍＬ）、エチルエーテル（２×２０ｍＬ）で洗浄し、そして５０℃のオーブン内で高い吸引下で一晩乾燥させた。４１１．９ｍｇ（９２．６％収率）の青色固体生成物を得た。ＴＬＣ（シリカゲル、４：１  塩化メチレン：メタノール）Ｒｆ＝０．９６。最大吸収：６３１ｎｍ（メタノール中）。この化合物は本明細書中後に色素−２として示される。
【００７０】
実施例（１Ｃ）−群ＩＩＩ化合物の合成用材料及び方法
【化２４】
0004831914.tif 000022
【化２５】
0004831914.tif 000023
【００７１】
２−ブロモメチルフェニルホウ酸（５）の調製。テトラ塩化炭素（１０００ｍＬ）中の２−メチルフェニルホウ酸（１０．６５ｇ）、Ｎ−ブロモスクシンイミド（ＮＢＳ、１６．８６ｇ）及び２，２’−アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ、１．７０８ｇ）の懸濁物を８２℃の油浴中で還流まで２時間無水条件下で熱した。上記反応混合物を室温まで冷却し、そして上記固体をろ過した。水（２×２００ｍＬ）でろ過物を抽出した。上記有機層を分離し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、そしてｉｎ  ｖａｃｕｏで乾燥するまで濃縮した。上記固体をメタノール（１００ｍＬ）中に再溶解し、そして酢酸エチル（１０００ｍＬ）をそれに添加した。生ずる沈殿物を回収し、酢酸エチル（２×５０ｍＬ）で洗浄し、そして風乾した。上記ろ過物を小体積まで濃縮し、そして固体の第二収穫物も回収した。上記混合された固体を５０℃のオーブン内で高い吸引下で一晩乾燥させた。６．４８ｇ（３９％）の生成物を得た。
【００７２】
臭化１−ベンジルレピジニウム（６）の調整。アセトニトリル（１００ｍＬ）中のレピジン（３７．８２ｇ）及び臭化ベンジル（６．４７１ｇ）の溶液を攪拌し、そして９３℃の油浴中で２０時間還流まで熱した。上記反応混合物を室温まで冷却し、酢酸エチル（５０ｍＬ）を添加し、そして３０分間攪拌した。生ずる固体を回収し、酢酸エチル（４×２０ｍＬ）で洗浄し、そして風乾した。上記ろ過物を小体積まで濃縮し、そして固体の第二の収穫物も回収した。上記混合された固体を５０℃のオーブン内で高い吸引下で一晩乾燥させた。１１．５２ｇ（９６．９％）の生成物を得た。
【００７３】
臭化１−（３’−５’−ジメトキシベンジル）レピジニウム（７）の調製。アセトニトリル（１００ｍＬ）中のレピジン（３．３６ｇ）及び臭化３，５−ジメトキシベンジル（５．４１ｇ）の溶液を攪拌し、そして９０℃の油浴中で３０時間還流まで熱した。上記反応混合物を室温まで冷却し、酢酸エチル（５０ｍＬ）を添加し、そして３０分間攪拌した。生ずる固体を回収し、酢酸エチル（４×２０ｍＬ）で洗浄し、そして風乾した。上記固体をメタノール（２００ｍＬ）中に再溶解し、そして木炭（５ｇ）で処理し、そして還流まで１５分間熱して濃い色の不純物を除去した。Ｃｅｌｉｔｅ（商標）のパッドを通してろ過した後、上記ろ過物を小体積（〜２０ｍＬ）まで濃縮し、そして酢酸エチル（３００ｍＬ）を添加した。生ずる沈殿物を回収し、酢酸エチル（２×５０ｍＬ）、エチルエーテル（２×２０ｍＬ）で洗浄し、そして風乾した。５０℃のオーブン内で高い吸引下で一晩さらに乾燥させ、６．６５ｇ（７６％）の生成物を得た。
【００７４】
臭化１−（４’−カルボキシメチルベンジル）レピジニウム（８）の調製。アセトニトリル（１００ｍＬ）中のレピジン（３．３２ｇ）及びメチル４−（ブロモメチル）ベンゾエート（５．３１ｇ）の溶液を攪拌し、そして９０℃の油浴中で還流まで１６時間熱した。室温まで冷却後、上記溶媒を減圧下で乾燥するまで蒸発させた。生ずる固体を酢酸エチル（３×１００ｍＬ）で洗浄した。上記固体をメタノール（１００ｍＬ）中に再溶解し、そして木炭（５ｇ）で処理し、そして還流まで１５分間熱して濃い色の不純物を除去した。Ｃｅｌｉｔｅ（商標）のパッドを通してろ過した後、上記ろ過物を乾燥するまで濃縮した。上記固体をその後アセトン（１００ｍＬ）で粉砕した。生ずる固体を回収し、酢酸エチル（２×５０ｍＬ）で洗浄し、そして風乾した。上記ろ過物を小体積まで濃縮し、そして固体の第二の収穫物も回収した。上記混合された固体を５０℃のオーブン内で高い吸引下で一晩乾燥させた。７．２６ｇ（８４％）の生成物を得た。
【００７５】
臭化１−（２’−ボロン酸）ベンジルレピジニウム（９）の調製。アセトニトリル（１２ｍＬ）中のレピジン（３０６ｍｇ）及び２−ブロモメチルフェニルボロン酸（４１７ｍｇ）の溶液を攪拌し、そして９０℃の油浴中で還流まで１７時間熱した。室温まで冷却後、上記溶媒を減圧下で乾燥するまで蒸発させた。上記固体を酢酸エチル（３×２０ｍＬ）で洗浄し、そして上記溶媒をデカントした。上記固体をメタノール（３ｍＬ）中に再溶解し、そして再び乾燥するまで濃縮した。上記固体を酢酸エチル（３×２０ｍＬ）で洗浄した。上記固体をその後５０℃のオーブン内で高い吸引下で一晩乾燥させた。６５０ｍｇ（９３．５％）の生成物を得た。
【００７６】
ヨー化２，３−ジメチルベンゾチアゾリウム（１１ａ）の調製。２−メチルベンゾチアゾール（５．００ｇ）及びヨードメタン（５０ｇ）の溶液を４５℃の油浴中で４４時間攪拌した。室温まで冷却後、上記固体をろ過を通して回収し、そして上記固体を酢酸エチル（２×１００ｍＬ）で洗浄し、そして５０℃のオーブン内で高い吸引下で一晩乾燥させた。８．０２ｇ（８２．３％収率）の生成物を得た。
【００７７】
臭化３−（２−ヒドロキシ）エチル−２−メチルベンゾチアゾリウム（１１ｂ）の調製。２−メチルベンゾチアゾール（５．８７ｇ）及びブロモエタノール（４９．２ｇ）の溶液を１１０℃の油浴中で１８時間攪拌した。酢酸エチル（１００ｍＬ）を上記反応混合物に添加し、そしてデカントした。上記残留の固体をその後メタノール（５０ｍＬ）中に溶解し、そして酢酸エチル（３００ｍＬ）で沈殿させた。上記固体を再びメタノール−酢酸エチル（１５ｍＬ／１５０ｍＬ）から再結晶化し、酢酸エチル（２×２５ｍＬ）で洗浄し、そして５０℃のオーブン内で高い吸引下で一晩乾燥させた。上記収率は４．２１ｇ（３９％）であった。ＴＬＣ（シリカゲル、４：１  塩化メチレン−メタノール）Ｒｆ＝０．３４。
【００７８】
ヨー化３−メチル−２−（２−Ｎ−フェニル）エテニルベンゾチアゾリウム（１２ａ）の調製。エタノール（３０ｍＬ）中の臭化２，３−ジメチルベンゾチアゾリウム（１１ａ、１．０１ｇ）の溶液に過剰のエチルＮ−フェニルフォルミジエート（１．５ｇ）を添加し、そして室温で４日間攪拌した。溶媒を減圧下で乾燥するまで蒸発させた。上記固体をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、塩化メチレン／メタノール）精製にかけた。上記生成物を含む画分を混合し、そして減圧下で乾燥するまで濃縮した。上位固体をメタノール（１０ｍＬ）に溶解し、そしてエチルエーテル（２００ｍＬ）で沈殿した。５０℃のオーブン内で高い吸引下で一晩乾燥後、０．８８ｇ（６０％）の黄色固体を得た。ＴＬＣ（シリカゲル、４：１  塩化メチレン−メタノール）Ｒｆ＝０．６０。
【００７９】
臭化３−（２−ヒドロキシ）エチル−２−（２−Ｎ−フェニル）エテニルベンゾチアゾリウム（１２ｂ）の調製。メタノール／エタノール（３：１、８０ｍＬ）の混合した溶媒中の臭化３−（２−ヒドロキシ）エチル−２−メチルベンゾチアゾリウム（１１ｂ、１．１９ｇ）の溶液に過剰のエチルＮ−フェニルフォルミジエート（３．０ｇ）を添加し、そして室温で３６時間攪拌した。溶媒を減圧下で乾燥するまで蒸発した。上記固体をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、塩化メチレン／メタノール）精製にかけた。上記生成物を含む画分を混合し、そして減圧下で乾燥するまで濃縮した。上記固体をメタノール（１０ｍＬ）中に溶解し、そしてエチルエーテル（２００ｍＬ）で沈殿させた。５０℃のオーブン内で高い吸引下で一晩乾燥させた後、１．０４ｇ（６３％）の黄色固体を得た。ＴＬＣ（シリカゲル、４：１  塩化メチレン−メタノール）Ｒｆ＝０．５８。
【００８０】
実施例（１Ｃ）中の合成スキームＩＩ下の１３として示される色素化合物の調製。塩化メチレン（５ｍＬ）中の臭化３−（２−ヒドロキシ）エチル−２−（２−Ｎ−フェニル）エテニルベンゾチアゾリウム（１２ｂ、４１．９ｍｇ）及び臭化１−ベンジルレピジニウム（６、３３．４ｍｇ）の溶液にトリエチルアミン（４４．３μＬ）及び酢酸無水物（３０．１μＬ）を添加した。室温で１時間攪拌後、上記溶媒を減圧下で蒸発させ、青色固体を得た。上記固体をメタノール（１０ｍＬ）中に再溶解し、そして酢酸エチル（２００ｍＬ）を添加した。生ずる固体をろ過を介して回収し、酢酸エチル（３×１０ｍＬ）で洗浄し、そして乾燥させた。上記固体を５０℃のオーブン内で高い吸引下で一晩さらに乾燥させ、４９．１ｍｇ（８９％）の青色固体を得た。ＴＬＣ（シリカゲル、９：１  塩化メチレン−メタノール）Ｒｆ＝０．４３。吸収スペクトル：６３６ｎｍ（メタノール）。
【００８１】
実施例（１Ｃ）中の合成スキームＩＩ下の１４として示される色素化合物の調製。塩化メチレン（１５ｍＬ）及びメタノール（１ｍＬ）中の臭化３−（２−ヒドロキシ）エチル−２−（２−Ｎ−フェニル）エテニルベンゾチアゾリウム（１２ｂ、１２０．５ｍｇ）及び臭化１−（３’−５’−ジメトキシベンジル）レピジニウム（７、１１９．５ｍｇ）の溶液にトリエチルアミン（１３３μＬ）及び酢酸無水物（９０μＬ）を添加した。室温で３０分間攪拌後、上記溶媒を減圧下で蒸発させ、青色固体を得た。上記固体をメタノール（１０ｍＬ）中に再溶解し、そしてアセトン（１００ｍＬ）及び酢酸エチル（１００ｍＬ）を添加した。生ずる固体をろ過を介して回収し、酢酸エチル（３×２０ｍＬ）で洗浄し、そして乾燥させた。上記固体を５０℃のオーブン内で高い吸引下で一晩さらに乾燥させ、１４７．３ｍｇ（８０％）の青色固体を得た。ＴＬＣ（シリカゲル、４：１  塩化メチレン−メタノール）Ｒｆ＝０．９１。吸収スペクトル：６３７ｎｍ（メタノール）。
【００８２】
実施例（１Ｃ）中の合成スキームＩＩ下の１５として示される色素化合物の調製。塩化メチレン（１５ｍＬ）及びメタノール（１ｍＬ）中の臭化３−（２−ヒドロキシ）エチル−２−（２−Ｎ−フェニル）エテニルベンゾチアゾリウム（１２ｂ、１７１．１ｍｇ）及び臭化１−（４’−カルボキシメチル−ベンジル）レピジニウム（８、１６８．８ｍｇ）の溶液にトリエチルアミン（１８９μＬ）及び酢酸無水物（１２８μＬ）を添加した。室温で１時間攪拌後、上記溶媒を減圧下で蒸発させ、青色固体を得た。上記固体をメタノール（１０ｍＬ）中に再溶解し、そしてアセトン（５０ｍＬ）及び酢酸エチル（５０ｍＬ）を添加した。生ずる固体をろ過を介して回収し、酢酸エチル（３×３０ｍＬ）で洗浄し、そして乾燥させた。上記固体を５０℃のオーブン内で高い吸引下で一晩さらに乾燥させ、２０８．９ｍｇ（８０％）の青色固体を得た。ＴＬＣ（シリカゲル、４：１  塩化メチレン−メタノール）Ｒｆ＝０．８０。吸収スペクトル：６３９ｎｍ（メタノール）。
【００８３】
実施例（１Ｃ）中の合成スキームＩＩ下の１６として示される色素化合物の調製。塩化メチレン（５ｍＬ）及びメタノール（１ｍＬ）中のヨー化３−メチル−２−（２−Ｎ−フェニル）エテニルベンゾチアゾリウム（１２ａ、１４４．６ｍｇ）及び臭化１−（２’−ボロン酸）ベンジルレピジニウム（９、１３１．３ｍｇ）の溶液にトリエチルアミン（１５３μＬ）及び酢酸無水物（１０４μＬ）を添加した。室温で１５分間攪拌後、上記溶媒を減圧下で蒸発させ、青色固体を得た。上記固体をメタノール（５ｍＬ）中に再溶解し、そして酢酸エチル（２００ｍＬ）を添加した。生ずる固体をろ過を介して回収し、酢酸エチル（３×３０ｍＬ）で洗浄し、そして乾燥させた。上記固体を５０℃のオーブン内で高い吸引下で一晩さらに乾燥させ、１０７ｍｇ（５０％）の青色固体を得た。ＴＬＣ（シリカゲル、４：１  塩化メチレン−メタノール）Ｒｆ＝０．５８。吸収スペクトル：６３４ｎｍ（メタノール）。
【００８４】
Ｄ．  色素貯蔵溶液
ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）中の５ｍＭの濃度の色素の貯蔵溶液を絶対量のそれぞれの色素化合物を好適な体積のＤＭＳＯ中に溶解することにより調製した。
【００８５】
Ｅ．  色素スペクトロスコピー
スペクトロスコープ計測のために、ＰＢＳ中のそれぞれの色素の個々のサンプル溶液をその貯蔵溶液の一部をリン酸緩衝塩水（ＰＢＳ）に希釈することにより調製した。特別には、１の実験において、上記色素溶液を、２μｌの５ｍＭ貯蔵色素溶液を５ｍＬのＰＢＳと混合して最終２μＭの色素濃度を与えることにより調製した。上記溶液の蛍光スペクトルを６３３ｎｍの励起波長を用いてスペクトロフルオロメーターで計測した。
【００８６】
ＲＮＡに結合した本発明に係る上記色素溶液を、２μＬの５ｍＭ色素貯蔵溶液及び１ｍｇ／ｍｌのＲＮＡ濃度でＰＢＳ中に溶解した５ｍｌのＲＮＡ溶液を混合することにより調製した。それぞれの色素／ＲＮＡ溶液の蛍光スペクトルを６３３ｎｍの励起波長を用いてスペクトロフルオロメーターで計測した。
【００８７】
ＤＮＡに結合した本発明に係る色素溶液を、２μｌの５ｍＭ色素貯蔵溶液及び０．５ｍｇ／ｍｌのＤＮＡ濃度でＰＢＳ中に溶解した５ｍｌのＤＮＡ溶液を混合することにより調製した。それぞれの色素／ＤＮＡ溶液の蛍光スペクトルを６３３ｎｍの励起波長を用いてスペクトロフルオロメーターで計測した。
【００８８】
Ｆ．  赤色励起可能な色素の流動細胞光度測定法
ＸＬ（商標）流動細胞高度測定器［Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｉｎｃ．，  Ｍｉａｍｉ，Ｆｌｏｒｉｄａ］は、本明細書中に示される本発明に係る赤色−励起可能な色素を用いる実験を行うのに使用された。上記流動細胞高度測定器はＨｅＮｅレーザー（６３２．８ｎｍ）及び２の赤色−感受性フォトマルチプライヤー管（ＰＭＴ）を導入することにより、標準のＸＬ（商標）流動細胞高度測定器から改変された。上記レーザーからの約１１．５ｍＷの６３２．８ｎｍのレーザー光は上記流動細胞高度測定器のビーム形の光学で入射された。直交の方向における前方光散乱（ＦＳ）、側方散乱（ＳＳ）及び１の蛍光（ＦＬ）パラメーターが上記赤血球を分析するために計測された。上記赤血球はＳＳ対ＦＳドットプロット上にゲートされた。固定されたゲートはその後ＦＬ対ＦＳドットプロット上のｒｅｔｉｃｓを計測するのに使用された。
【００８９】
Ｇ．  引用分析
網状赤血球用の別々の分析は（１）４８８ｎｍアルゴンレーザーを照明源として有する、標準のＸＬ（商標）流動細胞高度測定器［Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｉｎｃ．，  Ｍｉａｍｉ，Ｆｌｏｒｉｄａ］を用いる、青色−励起可能な異染性蛍光色素化合物に基づく、標準のＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ網状赤血球試薬ｒｅｔｉｃＯＮＥ（商標）又は（２）ＦＡＣＳＣＡＮ（商標）流動細胞光度測定器において４８８ｎｍで励起されたチアゾールオレンジを用いる、慣用のＲｅｔｉｃ−Ｃｏｕｎｔ（商標）網状赤血球計測法（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｃａｔ．  ＃３４９２０４）のいずれかを用いて行われた。上記ｒｅｔｉｃＯＮＥ（商標）法において、ＦＳ、ＳＳ、及び２のＦＬパラメーターは、上記ｒｅｔｉｃＯＮＥ（商標）試薬中に含まれる上記青色−励起可能な蛍光色素で染色された上記赤血球を分析するために計測された。計測された２のＦＬパラメーターのうち、１はＤＮＡに結合した色素のための蛍光に一致する、５２５ｎｍで計測され、そしてもう一方はＲＮＡに結合した色素に一致する、６７５ｎｍで計測される。商業的なＸＬ（商標）流動細胞光度測定器で入手可能な自動化された開閉アルゴリズムはＤＮＡ対ＲＮＡ蛍光ドットプロットからの網状赤血球のパーセントを計測した。この方法は米国特許第５６３９，６６６号中に示される。
【００９０】
上記Ｒｅｔｉｃ−Ｃｏｕｎｔ（商標）法には、ＦＳ、ＳＳ、及び１のＦＬパラメーターがＲｅｔｉｃ−Ｃｏｕｎｔ（商標）試薬中に含まれる上記青色−励起可能な蛍光色素チアゾールオレンジで染色された赤血球を分析するために計測された。
【００９１】
実施例（２）−結合及び非結合状態における本発明に係る色素の蛍光比較
蛍光色素を網状赤血球計測の好適な候補として同定するために、さまざまな異なる化合物の上記蛍光特性が決定された。網状赤血球の計測には、それらがＲＮＡに結合していないときは弱い蛍光であるが、それらがＲＮＡに結合しているときは蛍光強度における顕著な高まりを示す色素を有することが最も所望される。しかしながら、どの色素化合物がＲＮＡの非存在下及び存在下の両方においてその蛍光活性にこの理想的な組み合わせ効果を有するであろうか予想することは可能ではない。意義深いことに、本発明は本発明に係る色素はＲＮＡの敏感な検出に必要とされる好ましい蛍光特性を有することを見出した。
蛍光計測には、ＤＭＳＯ中のそれぞれの化合物の貯蔵溶液を作成した（実施例（１Ｄ）中に示される）。この貯蔵溶液の一部を２μＭの色素濃度得るためにＰＢＳ中に希釈した。１ｍｌのこの希釈溶液をガラスキュベット中に入れ、そして上記色素をその最大励起波長で励起して蛍光スペクトルを得た。次に、８ｍｇ／ｍｌの濃度でＰＢＳ中に溶解された１ｍｌの遊離のウシ肝臓ＲＮＡ（Ｓｉｇｍａ）の溶液、及び上記色素貯蔵溶液の計測された体積がＲＮＡ溶液中に２μＭの色素濃度を得るために混合された。上記ＲＮＡ溶液中に希釈されたこの色素溶液をガラスキュベット中に入れ、そして前の計測におけるものと同じ励起を用いて蛍光スペクトルを計測した。例として、図（１Ａ）は、溶液中にＲＮＡあり（上側の曲線を参照のこと）及びなし（下側の曲線を参照のこと）のＰＢＳ溶液中の上記色素化合物ＲｅｔｉｃＲｅｄ１の蛍光スペクトルの比較を示す。
【００９２】
図（１Ｂ）においては、溶液中ＲＮＡ存在下でのさまざまな化合物の蛍光強度の比較が示される。この図（１Ｂ）においては、上記色素の蛍光強度は、本明細書中で引用標準として使用される商業的な色素Ｓｙｔｏ６２（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｉｎｃ．）の蛍光強度に比較して示される。本研究に含まれ、そして図（１Ｂ）において示されるがまだ上記に示されていない追加の化合物の構造は表（２）において示される。
【００９３】
表（１）は、それらがＲＮＡに結合していない（ＲＮＡに非結合である）とき及びそれらがＲＮＡ存在下にある（ＲＮＡに結合している）ときの、本発明に係る色素、ＲｅｔｉｃＲｅｄ１〜ＲｅｔｉｃＲｅｄ６（濃度２μＭ）の蛍光強度を比較する。これらの強度は上記に示されるように計測されたそれぞれの蛍光スペクトルのピーク発光波長で得られた。図（１Ｃ）はグラフ形のＲＮＡ−結合及び非結合色素の蛍光強度を比較する。
【表１】
0004831914.tif 000024
【表２】
0004831914.tif 000025
【００９４】
実施例（３）−等張塩水溶液ＩＳＯＦＬＯＷ（商標）におけるＲｅｉｔｃＲｅｄ１での網状赤血球の染色
地元の病院から得られた血液サンプルは、ＲｅｔｉｃＲｅｄ１（実施例（１Ａ）及び（Ｄ）において示されるように調製された）のみの染色速度を決定するために使用された。上記血液サンプルははじめに２の独立した引用自動化法：ｒｅｔｉｃＯＮＥ（商標）法［実施例（１Ｇ）中に示された］及びＧｅｎ＊Ｓ（商標）ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）における使用のために入手可能である商業的な方法である、Ｎｅｗ  Ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｂｌｕｅ法により分析された。上記ｒｅｔｉｃＯＮＥ（商標）引用法は７％のｒｅｔｉｃパーセントを与え、そして上記Ｇｅｎ＊Ｓ（商標）法は６．７％のｒｅｔｉｃパーセントを与えた。
【００９５】
ＲｅｔｉｃＲｅｄ１を用いた計測には、１μｌの全血を、５μＭのＲｅｔｉｃＲｅｄ１（実施例（１Ｃ）中に示される５ｍＭの貯蔵溶液から希釈された）溶液を含む、１ｍｌの等張塩水溶液に添加し、そして１０及び４０分間インキュベートした。上記サンプルをその後、実施例（１Ｅ）で示されるように赤色ＨｅＮｅレーザー（６３２．８ｎｍ）を導入するように改変されたＸＬ（商標）流動細胞光度測定器内で分析した。全血をＲｅｔｉｃＲｅｄ１で処理し、そして赤血球の集団に由来する６６０ｎｍ帯における流動、赤色蛍光内で分析し、そして上記細胞におけるＲｅｔｉｃＲｅｄ１に結合された核酸の存在を示した。この蛍光はＲｅｔｉｃＲｅｄ１で染色された網状赤血球のためである。上記流動細胞光度測定法のデータは以下のインキュベーション時間に従って要約されうる：（ａ）１０分間：総計４２６６０、赤血球３２８４１、網状赤血球８０１、計測されたｒｅｔｉｃパーセント２．４％（ｂ）４０分間：総計４６１９９、赤血球３９７１３、網状赤血球２３１０、計測されたｒｅｔｉｃパーセント５．８％。図（２Ａ）及び（２Ｂ）を参照のこと。
【００９６】
これらの結果はＲｅｔｉｃＲｅｄ１色素のみは細胞内ＲＮＡを有効に染色するのに比較的長い時間を必要とすることを明らかに示す。
【００９７】
実施例（４）−全血サンプルを用いたＲｅｔｉｃＲｅｄ１での網状赤血球の速い染色
上記の実施例（３）は、等張塩水溶液中の上記色素ＲｅｔｉｃＲｅｄ１が網状赤血球を染色するのに比較的長い時間を要することを示したが、私たちはこの色素を本発明に係る追加の試薬組成物の存在下で網状赤血球を染色するのに用いることは染色のためのインキュベーション時間を顕著に減少させうることを発見した。４の別々の血液サンプルを用いる実施は上記色素ＲｅｔｉｃＲｅｄ１による網状赤血球の速い染色を示すのに示される。
【００９８】
Ａ．  実施（Ｉ）
１μｌの（上記実施例（３）中で示される分析を行うのに使用された血液と同じ提供者からの）全血を、赤血球を球状化する球状化試薬、０．０１％の濃度の洗剤Ｉｇｅｐａｌ（Ｓｉｇｍａ  ＣＡ−６３０）、５μＭの濃度の上記色素ＲｅｔｉｃＲｅｄ１、及び５μＭの最終濃度のｐ−トルエンスルフォン酸一水和物の溶液を含む１ｍｌの溶液に添加し、そして約１分間インキュベートした。上記サンプルをその後、赤色ＨｅＮｅレーザー（６３２．８ｎｍ）を導入するように改変されたＸＬ（商標）流動細胞光度測定器内で分析した。上記球状化試薬は、約ｐＨ７．４及び約２９０ｍＯｓｍでのＰＢＳ中に約２０μｇ／ｍｌのドデシル−β−Ｄ−マルトシド及び０．０５％Ｐｒｏｃｌｉｎ３００を含む溶液である。
【００９９】
そのようにしてＲｅｔｉｃＲｅｄ１で染色された上記サンプルをその後ＨｅＮｅレーザーからの６３２．８ｎｍ励起を用いて流動細胞光度測定器内で分析した。６６０ｎｍ帯における明るい赤色蛍光は網状赤血球に由来する。この実験の結果は図（３）中に示される。このドットプロットにおける上記細胞の分布は、前方分散対蛍光を示し、以前にＴａｎｋｅ  ｅｔ．  ａｌ．［上記に引用される］により彼らの蛍光に基づいた網状赤血球計測についての業績に関連して示された成熟赤血球及び網状赤血球の分布と一致する。この方法により計測された網状赤血球パーセントは７．３％であった。
【０１００】
Ｂ．  実施（２）
他の異常な提供者からの１μｌの全血を、赤血球を球状化する（実施例（４Ａ）、上記の実施（１）中に示される）球状化試薬、０．０１％の濃度の洗剤Ｉｇｅｐａｌ（Ｓｉｇｍａ  ＣＡ−６３０）、５μＭの濃度の上記色素ＲｅｔｉｃＲｅｄ１、及び５μＭの最終濃度のｐ−トルエンスルフォン酸一水和物の溶液を含む１ｍｌの溶液に添加し、そして約１分間インキュベートした。上記サンプルをその後、赤色ＨｅＮｅレーザー（６３２．８ｎｍ）を導入するように改変されたＸＬ（商標）流動細胞光度測定器内で分析した。
【０１０１】
そのようにして上記色素ＲｅｔｉｃＲｅｄ１で染色された上記サンプルを、その後ＨｅＮｅレーザーからの６３２．８ｎｍ励起を用いて流動細胞光度測定器内で分析した。この実験の結果は図（４）中に示される。この前方分散対蛍光のドットプロットにおける上記細胞の分布は、上記赤血球を高い蛍光強度で顕著に示す。この実験により計測された網状赤血球パーセントは７．５％であった。このサンプルにおける網状赤血球パーセントの独立の引用値は８％であった。
【０１０２】
Ｃ．  実施（３）
正常な提供者からの１μｌの全血を、赤血球を球状化する（実施例（４Ａ）、上記の実施（１）中に示される）球状化試薬、０．０１％の濃度の洗剤Ｉｇｅｐａｌ（Ｓｉｇｍａ  ＣＡ−６３０）、５μＭの濃度の上記色素ＲｅｔｉｃＲｅｄ１、及び５μＭの最終濃度のｐ−トルエンスルフォン酸一水和物の溶液を含む１ｍｌの溶液に添加し、そして約１分間インキュベートした。上記サンプルをその後、赤色ＨｅＮｅレーザー（６３２．８ｎｍ）を導入するように改変されたＸＬ（商標）流動細胞光度測定器内で分析した。そのようにして上記色素ＲｅｔｉｃＲｅｄ１で染色された上記血液サンプルをＨｅＮｅレーザーからの６３２．８ｎｍ励起を用いて流動で分析した。この実験の結果は図（５）中に示される。この実験により計測された網状赤血球パーセントは０．８２％であった。商業的に入手可能な臨床血液学分析器におけるニューメチレンブルーを用いた上記同じ提供者からの血液の独立の引用計測は０．９５％のｒｅｔｉｃパーセントを与えた。
【０１０３】
Ｄ．  実施（４）
提供者からの１μｌの異常な全血を、赤血球を球状化する（実施例（４Ａ）、上記の実施（１）中に示される）球状化試薬、０．０１％の濃度の洗剤Ｉｇｅｐａｌ（Ｓｉｇｍａ  ＣＡ−６３０）、５μＭの濃度の上記色素ＲｅｔｉｃＲｅｄ１、及び５μＭの最終濃度のｐ−トルエンスルフォン酸ナトリウムの溶液を含む１ｍｌの溶液に添加し、そして約１分間インキュベートした。上記サンプルをその後、赤色ＨｅＮｅレーザー（６３２．８ｎｍ）を導入するように改変されたＸＬ（商標）流動細胞光度測定器内で分析した。
そのようにしてＲｅｔｉｃＲｅｄ１で染色された上記サンプルを、その後ＨｅＮｅレーザーからの６３２．８ｎｍ励起を用いて流動細胞光度測定器内で分析した。この実験の結果は図（６）中に示される。この実験により計測された網状赤血球のパーセントは１３．７％であった。この同じサンプルの独立の引用法は１３％のｒｅｔｉｃパーセントを与えた。
【０１０４】
実施例（５）−全血サンプルを用いたＲｅｔｉｃＲｅｄ３での網状赤血球の速い染色
Ａ．  実施（１）
高い網状赤血球数を有する異常な提供者からの２μｌの全血を、赤血球を球状化する（実施例（４Ａ）、上記の実施（１）中に示される）球状化試薬、０．０１％の濃度の洗剤Ｉｇｅｐａｌ（商標）（Ｓｉｇｍａ  ＣＡ−６３０）、５μＭの濃度の上記色素ＲｅｔｉｃＲｅｄ１、及び５０μＭの最終濃度のｐ−トルエンスルフォン酸ナトリウムの溶液を含む１ｍｌの溶液に添加し、そして約１秒間緩やかに混合し／インキュベートした。上記混合物をその後、分析のために赤色ＨｅＮｅレーザーを含む上記ＸＬ（商標）流動細胞光度測定器内に吸引した。
【０１０５】
この実験の結果は図（７）中に示され、ここで、上記網状赤血球はそれらに関連した高い蛍光強度により成熟した赤血球と区別される。この実験により計測された網状赤血球パーセントは１３．８％であった。（４８８ｎｍで励起されるチアゾールアレンジを用いる）上記慣用のＲｅｔｉｃ−Ｃｏｕｎｔ（商標）網状赤血球計測法を用いた、このサンプルについてＦＡＣＳＣＡＮ流動細胞光度測定器内で計測された網状赤血球パーセントの独立の引用値は１３．３％であった。
【０１０６】
Ｂ．  実施（２）
低い網状赤血球数を有する異常な提供者からの２μｌの全血を、赤血球を球状化する（実施例（４Ａ）、上記の実施（１）中に示される）球状化試薬、０．０１％の濃度の洗剤Ｉｇｅｐａｌ（Ｓｉｇｍａ  ＣＡ−６３０）、５μＭの濃度の上記色素ＲｅｔｉｃＲｅｄ１、及び５０μＭの最終濃度のｐ−トルエンスルフォン酸ナトリウムの溶液を含む１ｍｌの溶液に添加し、そして約１秒間緩やかに混合し／インキュベートした。上記混合物をその後、分析のために上記赤色ＨｅＮｅレーザーを含む上記ＸＬ（商標）流動細胞光度測定器内に吸引した。
この実験の結果は図（８）中に示される。この実験により計測された網状赤血球パーセントは１％であった。上記慣用のＲｅｔｉｃ−Ｃｏｕｎｔ（商標）網状赤血球計測法（４８８ｎｍで励起されるチアゾールアレンジ）を用いた、このサンプルについてＦＡＣＳＣＡＮ流動細胞光度測定器内で計測された網状赤血球パーセントの独立の引用値は１．３％であった。
【０１０７】
実施例（６）−結合の及び非結合の状態における本発明に係る色素の蛍光強度の比較
結合の及び非結合の状態における上記色素の比較の蛍光強度を比較するため、蛍光計測は、好適な条件下で６３３ｎｍでそれぞれの色素溶液を励起し、それぞれのサンプルの蛍光スペクトルを記録し、そしてこれらの蛍光スペクトルのピークでの強度を計測することによりスペクトロフルオロメーター内で行われた。
ＤＮＡ又はＲＮＡの非存在下（すなわち、非結合の状態）で上記色素溶液の蛍光強度を計測するために、はじめにＤＭＳＯ中のそれぞれの化合物の貯蔵溶液を調製した（実施例（１Ｄ）中に示されるように）。上記色素−１の貯蔵溶液の一部をＰＢＳ中に希釈し、２μｌの色素濃度を得た。次に、１ｍｌのこの希釈溶液をガラスキュベット中に入れ、そしてこの溶液の蛍光スペクトルを６３３ｎｍの励起波長を用いてスペクトロフルオロメーターにより計測した。
次に、１ｍｇ／ｍｌの濃度でＰＢＳ中に溶解した遊離のＴｏｒｕｌａ酵母ＲＮＡ（Ｓｉｇｍａ）の１ｍｌの溶液、及び上記色素−１の上記色素貯蔵溶液の計測された体積を混合し、上記ＲＮＡ溶液中に２μＭの色素濃度を得た。ＲＮＡの存在下でのこの色素溶液の蛍光スペクトルを６３３ｎｍで上記サンプルを照射することにより計測した。図（９Ａ）は上記溶液中に存在するＲＮＡあり（上側の曲線を参照のこと）及びなし（下側の曲線を参照のこと）のＰＢＳ溶液中の上記色素色素−１の蛍光スペクトルの比較を示す。
【０１０８】
ＤＮＡにおける蛍光計測のために、０．５ｍｇ／ｍｌの濃度でＰＢＳ中に溶解された遊離のウシ胸腺ＤＮＡ（Ｓｉｇｍａ）の１ｍｌの溶液、及び上記色素貯蔵溶液の計測された体積を混合し、上記ＲＮＡ溶液中に２μＭの色素濃度を得た。次に、上記色素溶液の蛍光スペクトルを、６３３ｎｍで上記サンプルを照射することにより計測した。図（９Ｂ）は、上記溶液中に存在するＤＮＡあり（上側の曲線を参照のこと）及びなし（下側の曲線を参照のこと）のＰＢＳ溶液中での上記色素色素−１の蛍光スペクトルの比較を示す。
同じ様式で、上記に示される実験を、上記色素色素−２〜色素−６について繰り返した（図（９Ｃ）〜及び（９Ｌ）を参照のこと）。
【０１０９】
表（３）は、それらがＲＮＡに結合していない（ＲＮＡに非結合の）とき、それらがＲＮＡの存在下にある（ＲＮＡに結合している）とき、そしてそれらがＤＮＡの存在下にある（ＤＮＡに結合している）ときの、本発明に係る色素、色素−１及び色素−２（濃度２μＭ）の比較の蛍光強度を比較する。これらの強度は上記に示されるそれぞれの蛍光スペクトルのピークで得られた。
【表３】
0004831914.tif 000026
【０１１０】
表（４）は、それらがＲＮＡに結合していない（ＲＮＡに非結合の）とき及びそれらがＲＮＡの存在下にある（ＲＮＡに結合している）ときの、本発明に係る上記群−ＩＩＩ色素（色素−３〜色素−６）の蛍光強度を比較する。上記強度は発光スペクトルのピークで計測された。
表（５）は、それらがＤＮＡに結合していない（ＤＮＡに非結合の）とき及びそれらがＤＮＡの存在下にある（ＤＮＡに結合している）ときの、本発明に係る上記群−ＩＩＩ色素（色素−３〜色素−６）の蛍光強度を比較する。上記強度は発光スペクトルのピークで計測された。
【表４】
0004831914.tif 000027
【０１１１】
実施例（７）−全血サンプルを用いた色素−１での網状赤血球の速い染色
私たちは上記色素色素−１が本発明に係る試薬組成物の存在下で網状赤血球の細胞膜を速く通り抜けることができ、したがって染色のためのインキュベーション時間を顕著に減少させることを発見した。３の別々の血液サンプルを用いた実験は上記色素色素−１による網状赤血球の速い染色を示すために示される。私たちはこれらの３の実験をそれぞれ実施（１）、実施（２）及び実施（３）という。
【０１１２】
Ａ．  実施（１）
正常な提供者からの１μｌの全血を、上記赤血球を球状化する球状化試薬、０．０１％の濃度の洗剤Ｉｇｅｐａｌ（Ｓｉｇｍａ  ＣＡ−６３０）、５μＭの濃度の上記色素色素−１を含む１ｍｌの溶液に添加し、そして、その後即座に、分析のために赤色ＨｅＮｅレーザー（６３２．８ｎｍ）を導入するように改変されたＸＬ（商標）流動細胞光度測定器内に吸引した。上記球状化試薬は約ｐＨ７．４及び約２９０ｍＯｓｍでＰＢＳ中に約２０μｇ／ｍｌのドデシル−β−Ｄ−マルトシド及び０．０５％Ｐｒｏｃｌｉｎ３００を含む溶液である。
図（１０Ａ）はこのサンプルについての成熟赤血球に比較した網状赤血球からの蛍光を示す。この方法により計測された網状赤血球パーセントは１．９％であり、予想された正常な範囲内であった。
【０１１３】
Ｂ．  実施（２）
異常な提供者からの１μｌの全血を、上記赤血球を球状化する（実施例（７）、上記の実施（１）中に示される）球状化試薬、０．０１％の濃度の洗剤Ｉｇｅｐａｌ（Ｓｉｇｍａ  ＣＡ−６３０）、及び５μＭの濃度の上記色素色素−１を含む１ｍｌの溶液に添加した。その後即座に、上記混合物を、分析のために赤色ＨｅＮｅレーザー（６３２．８ｎｍ）を導入するように改変されたＸＬ（商標）流動細胞光度測定器内に吸引した。
【０１１４】
図（１０Ｂ）はこのサンプルについての成熟赤血球に比較した網状赤血球からの蛍光を示す。この前方分散対蛍光のドットプロットにおける上記細胞の分布は比較的高い蛍光強度で上記網状赤血球を顕著に示す。この方法により計測された網状赤血球パーセントは１０．６％であった。このサンプルにおける網状赤血球パーセントの独立の引用値は１２％であった。
【０１１５】
Ｃ．  実施（３）
他の異常な提供者からの１μｌの全血を、上記赤血球を球状化する（実施例（７）、上記実施（１）中に示される）球状化試薬、０．０１％の濃度の洗剤Ｉｇｅｐａｌ（Ｓｉｇｍａ  ＣＡ−６３０）、及び５μＭの濃度の上記色素色素−１を含む１ｍｌの溶液に添加した。その後即座に、上記混合物を、分析のために赤色ＨｅＮｅレーザー（６３２．８ｎｍ）を導入するように改変されたＸＬ（商標）流動細胞光度測定器内に吸引した。
【０１１６】
図（１０Ｃ）はこのサンプルについての成熟赤血球に比較した網状赤血球からの蛍光を示す。この前方分散対蛍光のドットプロットにおける上記細胞の分布は高い蛍光強度で上記網状赤血球を顕著に示す。この方法により計測された網状赤血球パーセントは２６．３％であった。このサンプルにおける網状赤血球パーセントの独立の引用値は２７％であった。
【０１１７】
実施例（８）−全血サンプルを用いた色素−２での網状赤血球の速い染色
私たちは、色素−２も本発明に係る試薬組成物の存在下で網状赤血球の細胞膜を速く通り抜けることができ、それゆえ、上記染色のためのインキュベーション時間を顕著に減少させることを発見した。３の異なる血液サンプルを用いた実験は上記色素色素−２による網状赤血球の速い染色を示すために示される。私たちはこれらの３の実験をそれぞれ、実施（４）、実施（５）及び実施（６）という。
【０１１８】
Ａ．  実施（４）
正常な提供者からの１μｌの全血を、上記赤血球を球状化する球状化試薬、０．０１％の濃度の洗剤Ｉｇｅｐａｌ（Ｓｉｇｍａ  ＣＡ−６３０）、５μＭの濃度の上記色素色素−２を含む１ｍｌの溶液に添加し、そして、その後即座に、分析のために赤色ＨｅＮｅレーザー（６３２．８ｎｍ）を導入するように改変されたＸＬ（商標）流動細胞光度測定器内に吸引した。上記球状化試薬は約ｐＨ７．４及び約２９０ｍＯｓｍでＰＢＳ中に約２０μｇ／ｍｌのドデシル−β−Ｄ−マルトシド及び０．０５％Ｐｒｏｃｌｉｎ３００を含む溶液である。
図（１１Ａ）はこのサンプルについての成熟赤血球に比較した網状赤血球からの蛍光を示す。この方法により計測された網状赤血球パーセントは１．８％であった。
【０１１９】
Ｂ．  実施（５）
異常な提供者からの１μｌの全血を、上記赤血球を球状化する（実施例（７）、上記実施（１）中に示される）球状化試薬、０．０１％の濃度の洗剤Ｉｇｅｐａｌ（Ｓｉｇｍａ  ＣＡ−６３０）、及び５μＭの濃度の上記色素色素−２を含む１ｍｌの溶液に添加した。その後即座に、上記混合物を、分析のために赤色ＨｅＮｅレーザー（６３２．８ｎｍ）を導入するように改変されたＸＬ（商標）流動細胞光度測定器内に吸引した。
図（１１Ｂ）はこのサンプルについての成熟赤血球に比較した網状赤血球からの蛍光を示す。この前方分散対蛍光のドットプロットにおける上記細胞の分布は高い蛍光強度で上記網状赤血球を明らかに示す。この実験により計測された網状赤血球パーセントは１２．５％であった。このサンプルにおける網状赤血球の独立の引用値は１２％であった。
【０１２０】
Ｃ．  実施（６）
高いｒｅｔｉｃの異常な提供者からの１μｌの全血を、上記赤血球を球状化する（実施例（７）、上記実施（１）中に示される）球状化試薬、０．０１％の濃度の洗剤Ｉｇｅｐａｌ（Ｓｉｇｍａ  ＣＡ−６３０）、及び５μＭの濃度の上記色素色素−２を含む１ｍｌの溶液に添加した。その後即座に、上記混合物を、分析のために赤色ＨｅＮｅレーザー（６３２．８ｎｍ）を導入するように改変されたＸＬ（商標）流動細胞光度測定器内に吸引した。
【０１２１】
図（１１Ｃ）はこのサンプルについての成熟赤血球に比較した網状赤血球からの蛍光を示す。この前方分散対蛍光のドットプロットにおける上記細胞の分布は高い蛍光強度で上記網状赤血球を顕著に示す。この実験により計測された網状赤血球パーセントは２４％であった。このサンプルにおける網状赤血球パーセントの独立の引用値は２７％であった。
【０１２２】
実施例（９）−全血サンプルを用いた色素−３での網状赤血球の速い染色
Ａ．  実施（７）
正常な提供者からの１μｌの全血を、上記赤血球を球状化する球状化試薬、０．０１％の濃度の洗剤Ｉｇｅｐａｌ（Ｓｉｇｍａ  ＣＡ−６３０）、５μＭの濃度の上記色素色素−３を含む１ｍｌの溶液に添加し、そして、その後即座に、分析のために赤色ＨｅＮｅレーザー（６３２．８ｎｍ）を導入するように改変されたＸＬ（商標）流動細胞光度測定器内に吸引した。上記球状化試薬は約ｐＨ７．４及び約２９０ｍＯｓｍでＰＢＳ中に約２０μｇ／ｍｌのドデシル−β−Ｄ−マルトシド及び０．０５％Ｐｒｏｃｌｉｎ（商標）３００を含む溶液である。この方法により計測された網状赤血球パーセントは２．３％であった（図（４Ａ）を参照のこと）。
【０１２３】
Ｂ．  実施（８）
異常な提供者からの１μｌの全血を、上記赤血球を球状化する（実施例（７）、上記実施（１）中に示される）球状化試薬、０．０１％の濃度の洗剤Ｉｇｅｐａｌ（Ｓｉｇｍａ  ＣＡ−６３０）、及び５μＭの濃度の上記色素色素−３を含む１ｍｌの溶液に添加した。その後即座に、上記混合物を、分析のために赤色ＨｅＮｅレーザー（６３２．８ｎｍ）を導入するように改変されたＸＬ（商標）流動細胞光度測定器内に吸引した。この実験により計測された網状赤血球パーセントは１４．６％であった（図（４Ａ）を参照のこと）。このサンプルにおける網状赤血球パーセントの独立の引用値は１２％であった。
【０１２４】
Ｃ．  実施（９）
他の異常な提供者からの１μｌの全血を、上記赤血球を球状化する（実施例（７）、上記実施（１）中に示される）球状化試薬、０．０１％の濃度の洗剤Ｉｇｅｐａｌ（Ｓｉｇｍａ  ＣＡ−６３０）、及び５μＭの濃度の上記色素色素−３を含む１ｍｌの溶液に添加した。その後即座に、上記混合物を、分析のために赤色ＨｅＮｅレーザー（６３２．８ｎｍ）を導入するように改変されたＸＬ（商標）流動細胞光度測定器内に吸引した。この実験により計測された網状赤血球パーセントは約２４％であった（図（１２Ａ）を参照のこと）。このサンプルにおける網状赤血球パーセントの独立の引用値は２７％であった。
【０１２５】
本明細書中に引用される全ての刊行物は本明細書中に援用する。本発明は特に好ましい態様について示したが、本発明の本質から離れることなしに改変がなされうることが理解されるであろう。上記改変は添付の請求項の範囲内には入ると意図される。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】  図（１Ａ）は、本明細書中後にＲｅｔｉｃＲｅｄ１と呼ばれる、実施例（１）において示される色素化合物第６の、ＰＢＳ溶液中での溶液中に存在するＲＮＡあり又はなしの蛍光スペクトルの比較である。
【図１Ｂ】  図（１Ｂ）は、商業的な核酸色素Ｓｙｔｏ６２（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，  Ｉｎｃ）の蛍光強度に対する、本発明に係る色素及び本実験中に調べられたいくつかの他の色素の蛍光強度の、全て溶液中に同じ量のＲＮＡ存在下での比較である。
【図１Ｃ】  図（１Ｃ）は８ｍｇ／ｍｌのＲＮＡ存在下での本発明に係る色素、ＲｅｔｉｃＲｅｄ１〜ＲｅｔｉｃＲｅｄ６の、溶液中にＲＮＡが存在しないときのそれらのそれぞれの蛍光強度に比較した、蛍光強度を示す。
【図２Ａ】  図（２Ａ）及び（２Ｂ）は、速い染色組成物の存在なしに等張塩水溶液中で上記色素ＲｅｔｉｃＲｅｄ１で処理され、そして２の異なる期間インキュベートされた、異常な血液サンプルについての網状赤血球からの蛍光を示す。図（２Ａ）はＲｅｔｉｃＲｅｄ１のみで処理し、そして約１０分間インキュベートした細胞からの蛍光を示し：総カウント４２６６０、赤血球３２８４１、網状赤血球８０１、計測された網状パーセント２．４％である。
【図２Ｂ】  図（２Ｂ）はＲｅｔｉｃＲｅｄ１のみで処理し、そして約４０分間インキュベートした細胞からの蛍光を示し：総カウント４６１９９、赤血球３９７１３、網状赤血球２３１０、計測された網状パーセント５．８％である。このサンプルにおける網状赤血球についての引用値は約７％であった。
【図３】  図（３）は、図（２Ａ）及び（２Ｂ）中で示される実験において使用されたのと同じ提供者からの、上記色素ＲｅｔｉｃＲｅｄ１を含む本発明に係る組成物で処理され、そして約１分間インキュベートされた後の、血液サンプルにおける網状赤血球からの蛍光を示す。この方法により計測された網状赤血球のパーセントは７．３％であった。
【図４】  図４は、上記色素ＲｅｔｉｃＲｅｄ１を含む本発明に係る組成物で処理され、そして約１分間インキュベートされた後の、異常な血液サンプルにおける網状赤血球からの蛍光を示す。この方法により計測された網状赤血球のパーセントは７．５％であった。独立の計測法を用いてこの提供者について得られた網状赤血球パーセントについての引用値は８％であった。この実施例における試薬組成物はＩｇｅｐａｌ、ドデシル−β−Ｄ−マルトシド及びｐ−トルエンスルフォン酸一水化物を含んだ。
【図５】  図（５）は、上記色素ＲｅｔｉｃＲｅｄ１を含む本発明に係る組成物で処理され、そして約１分間インキュベートされた後の、正常な提供者からの血液サンプルにおける網状赤血球からの蛍光を示す。この方法により計測された網状赤血球パーセントは０．８２％であった。この実施例における試薬組成物はＩｇｅｐａｌ、ドデシル−β−Ｄ−マルトシド及びｐ−トルエンスルフォン酸一水化物を含む。独立の計測法を用いてこの提供者について得られた網状赤血球の引用値は０．９５％であった。
【図６】  図（６）は、上記色素ＲｅｔｉｃＲｅｄ１を含む本発明に係る組成物で処理され、そして約１分間インキュベートされた後の、異常な血液サンプルにおける網状赤血球からの蛍光を示す。この方法により計測された網状赤血球パーセントは１３．７％であった。独立の計測法を用いてこの提供者について得られた網状赤血球パーセントの引用値は１３％であった。この態様における試薬組成物はＩｇｅｐａｌ、ドデシル−β−Ｄ−マルトシド及びｐ−トルエンスルフォン酸ナトリウムを含んだ。
【図７】  図（７）は、上記色素ＲｅｔｉｃＲｅｄ３を含む本発明に係る組成物で処理され、そしてさらにインキュベートされることなしに約１秒間混合された後の、異常な血液サンプルにおける網状赤血球からの蛍光を示す。この方法により計測された網状赤血球パーセントは１３．８％であった。慣用のＲｅｔｉｃ−Ｃｏｕｎｔ（商標）法によるこのサンプルについて得られた網状赤血球パーセントの独立の引用値は約１３．３％であった。この態様における試薬組成物はＩｇｅｐａｌ（商標）、ドデシル−β−Ｄ−マルトシド及びｐ−トルエンスルフォン酸ナトリウムを含んだ。
【図８】  図（８）は、上記色素ＲｅｔｉｃＲｅｄ３を含む本発明に係る組成物で処理され、そしてさらにインキュベートされることなしに約１秒間混合された後の、異常な血液サンプルにおける網状赤血球からの蛍光を示す。この方法により計測された網状赤血球パーセントは１％であった。慣用のＲｅｔｉｃ−Ｃｏｕｎｔ（商標）法によるこのサンプルについて得られた網状赤血球パーセントの独立の引用値は約１．３％であった。この態様における試薬組成物はＩｇｅｐａｌ、ドデシル−β−Ｄ−マルトシド及びｐ−トルエンスルフォン酸ナトリウムを含んだ。
【図９Ａ】  図（９Ａ）は、溶液中にＲＮＡの存在あり又はなしのＰＢＳ溶液中における、実施例（１Ｂ）において示される上記色素色素−１の蛍光スペクトルの比較である。
【図９Ｂ】  図（９Ｂ）は、溶液中にＤＮＡの存在あり又はなしのＰＢＳ溶液中における、実施例（１Ｂ）において示される上記色素色素−１の蛍光スペクトルの比較である。
【図９Ｃ】  図（９Ｃ）は、溶液中にＲＮＡの存在あり又はなしのＰＢＳ溶液中における、実施例（１Ｂ）において示される上記色素色素−２の蛍光スペクトルの比較である。
【図９Ｄ】  図（９Ｄ）は、溶液中にＤＮＡの存在あり又はなしのＰＢＳ溶液中における、実施例（１Ｂ）において示される上記色素色素−２の蛍光スペクトルの比較である。
【図９Ｅ】  図（９Ｅ）は、溶液中にＲＮＡの存在あり又はなしのＰＢＳ溶液中における、実施例（１Ｃ）において示される色素−３の蛍光スペクトルの比較である。
【図９Ｆ】  図（９Ｆ）は、溶液中にＤＮＡの存在あり又はなしのＰＢＳ溶液中における、実施例（１Ｃ）において示される色素−３の蛍光スペクトルの比較である。
【図９Ｇ】  図（９Ｇ）は、溶液中にＲＮＡの存在あり又はなしのＰＢＳ溶液中における、実施例（１Ｃ）において示される色素−４の蛍光スペクトルの比較である。
【図９Ｈ】  図（９Ｈ）は、溶液中にＤＮＡの存在あり又はなしのＰＢＳ溶液中における、実施例（１Ｃ）において示される色素−４の蛍光スペクトルの比較である。
【図９Ｉ】  図（９Ｉ）は、溶液中にＲＮＡの存在あり又はなしのＰＢＳ溶液中における、実施例（１Ｃ）において示される色素−５の蛍光スペクトルの比較である。
【図９Ｊ】  図（９Ｊ）は、溶液中にＤＮＡの存在あり又はなしのＰＢＳ溶液中における、実施例（１Ｃ）において示される色素−５の蛍光スペクトルの比較である。
【図９Ｋ】  図（９Ｋ）は、溶液中にＲＮＡの存在あり又はなしのＰＢＳ溶液中における、実施例（１Ｃ）において示される色素−６の蛍光スペクトルの比較である。
【図９Ｌ】  図（９Ｌ）は、溶液中にＤＮＡの存在あり又はなしのＰＢＳ溶液中における、実施例（１Ｃ）において示される色素−６の蛍光スペクトルの比較である。
【図１０Ａ】  図（１０Ａ）は、速い染色組成物の存在下で等張塩水溶液中において上記色素色素−１で処理され、そしてその後即座に分析された、３の異なる血液サンプル（１は正常、２は異常な高いｒｅｔｉｃｓ）についての網状赤血球からの蛍光を示す。これらの実施例において、速い染色を促進させるために使用される上記試薬組成物はＩｇｅｐａｌ（商標）、及びドデシル−β−Ｄ−マルトシドを含んだ。
【図１０Ｂ】  図（１０Ｂ）は、速い染色組成物の存在下で等張塩水溶液中において上記色素色素−１で処理され、そしてその後即座に分析された、３の異なる血液サンプル（１は正常、２は異常な高いｒｅｔｉｃｓ）についての網状赤血球からの蛍光を示す。これらの実施例において、速い染色を促進させるために使用される上記試薬組成物はＩｇｅｐａｌ（商標）、及びドデシル−β−Ｄ−マルトシドを含んだ。
【図１０Ｃ】  図（１０Ｃ）は、速い染色組成物の存在下で等張塩水溶液中において上記色素色素−１で処理され、そしてその後即座に分析された、３の異なる血液サンプル（１は正常、２は異常な高いｒｅｔｉｃｓ）についての網状赤血球からの蛍光を示す。これらの実施例において、速い染色を促進させるために使用される上記試薬組成物はＩｇｅｐａｌ（商標）、及びドデシル−β−Ｄ−マルトシドを含んだ。
【図１１Ａ】  図（１１Ａ）は、速い染色組成物の存在下で等張塩水溶液中において上記色素色素−２で処理され、そしてその後即座に分析された、３の異なる血液サンプル（１は正常、２は異常な高いｒｅｔｉｃｓ）についての網状赤血球からの蛍光を示す。これらの実施例において、速い染色を促進させるために使用される上記試薬組成物はＩｇｅｐａｌ（商標）、及びドデシル−β−Ｄ−マルトシドを含んだ。
【図１１Ｂ】  図（１１Ｂ）は、速い染色組成物の存在下で等張塩水溶液中において上記色素色素−２で処理され、そしてその後即座に分析された、３の異なる血液サンプル（１は正常、２は異常な高いｒｅｔｉｃｓ）についての網状赤血球からの蛍光を示す。これらの実施例において、速い染色を促進させるために使用される上記試薬組成物はＩｇｅｐａｌ（商標）、及びドデシル−β−Ｄ−マルトシドを含んだ。
【図１１Ｃ】  図（１１Ｃ）は、速い染色組成物の存在下で等張塩水溶液中において上記色素色素−２で処理され、そしてその後即座に分析された、３の異なる血液サンプル（１は正常、２は異常な高いｒｅｔｉｃｓ）についての網状赤血球からの蛍光を示す。これらの実施例において、速い染色を促進させるために使用される上記試薬組成物はＩｇｅｐａｌ（商標）、及びドデシル−β−Ｄ−マルトシドを含んだ。
【図１２Ａ】  図（１２Ａ）は、異なる数の網状赤血球を含む赤血球の蛍光ヒストグラムを示す。これらの３の異なる血液サンプル（１は正常、２は異常な高いｒｅｔｉｃｓ）について、それぞれのサンプルは速い染色組成物の存在下で等張塩水溶液中において色素−３で処理され、そしてその後即座にＢＥＣＫＭＡＮ  ＣＯＵＬＴＥＲ（商標）  ＸＬ（商標）流動細胞光度測定器で分析された。これらの実施例において、速い染色を促進させるために使用される上記試薬組成物は洗剤Ｉｇｅｐａｌ、及び界面活性剤ドデシル−β−Ｄ−マルトシドを含んだ。
【図１２Ｂ】  図（１２Ｂ）は、異なる数の網状赤血球を含む赤血球の蛍光ヒストグラムを示す。これらの３の異なる血液サンプル（１は正常、２は異常な高いｒｅｔｉｃｓ）について、それぞれのサンプルは速い染色組成物の存在下で等張塩水溶液中において色素−３で処理され、そしてその後即座にＢＥＣＫＭＡＮ  ＣＯＵＬＴＥＲ（商標）  ＸＬ（商標）流動細胞光度測定器で分析された。これらの実施例において、速い染色を促進させるために使用される上記試薬組成物は洗剤Ｉｇｅｐａｌ、及び界面活性剤ドデシル−β−Ｄ−マルトシドを含んだ。
【図１２Ｃ】  図（１２Ｃ）は、異なる数の網状赤血球を含む赤血球の蛍光ヒストグラムを示す。これらの３の異なる血液サンプル（１は正常、２は異常な高いｒｅｔｉｃｓ）について、それぞれのサンプルは速い染色組成物の存在下で等張塩水溶液中において色素−３で処理され、そしてその後即座にＢＥＣＫＭＡＮ  ＣＯＵＬＴＥＲ（商標）  ＸＬ（商標）流動細胞光度測定器で分析された。これらの実施例において、速い染色を促進させるために使用される上記試薬組成物は洗剤Ｉｇｅｐａｌ、及び界面活性剤ドデシル−β−Ｄ−マルトシドを含んだ。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
0004831914.tif 000048
【図９Ｆ】
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【図９Ｇ】
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【図９Ｈ】
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【図９Ｉ】
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【図９Ｊ】
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【図９Ｋ】
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【図９Ｌ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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