(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡ：
（ａ）配列表の配列番号１に示す塩基配列を含むＤＮＡ、
（ｂ）配列表の配列番号１に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、下記式(１)：
【化１】
0004757804.tif 000014
で表される３−オキソ−３−フェニルプロパンニトリルを不斉的に還元して、下記式(２)：
【化２】
0004757804.tif 000015
で表される（Ｒ）−３−ヒドロキシ−３−フェニルプロパンニトリルを生成する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項２】
配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項３】
請求項１記載のＤＮＡにコードされ、かつ、前記式(１)で表される３−オキソ−３−フェニルプロパンニトリルを不斉的に還元して、前記式(２)で表される（Ｒ）−３−ヒドロキシ−３−フェニルプロパンニトリルを生成する活性を有するポリペプチド。
【請求項４】
配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項５】
請求項１又は２記載のＤＮＡを含むベクター。
【請求項６】
組換えプラスミドが、配列番号１に示す塩基配列からなるＤＮＡを含み、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０４１８の受託番号で寄託されているＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＴＣＭ）に含まれる、プラスミドｐＮＴＣＭである請求項５記載のベクター。
【請求項７】
グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡをさらに含む、請求項５に記載のベクター。
【請求項８】
前記グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドがバシラス・メガテリウム（Bacillus megaterium）由来のグルコース脱水素酵素である、請求項７記載のベクター。
【請求項９】
請求項５〜８のいずれかに記載のベクターにより宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体。
【請求項１０】
前記宿主細胞が大腸菌である請求項９記載の形質転換体。
【請求項１１】
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＴＣＭ）ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０４１８である、請求項１０記載の形質転換体。
【請求項１２】
請求項１又は２に記載のＤＮＡおよびグルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの両方が導入された形質転換体。
【請求項１３】
請求項３又は４に記載のポリペプチド、又は、請求項９〜１１のいずれかに記載の形質転換体または当該形質転換体の培養物を、カルボニル基を有する化合物と反応させることを特徴とする光学活性アルコールの製造方法。
【請求項１４】
前記カルボニル基を有する化合物が、前記式(１)で表される３−オキソ−３−フェニルプロパンニトリルであり、前記光学活性アルコールが、前記式(２)で表される（Ｒ）−３−ヒドロキシ−３−フェニルプロパンニトリルである、請求項１３記載の製造方法。
【請求項１５】
前記カルボニル基を有する化合物が、下記式(３)：
【化３】
0004757804.tif 000016
で表される４−クロロ−３−オキソ酪酸エチルであり、前記光学活性アルコールが、下記式(４)：
【化４】
0004757804.tif 000017
で表される（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エチルである、請求項１３記載の製造方法。
【請求項１６】
前記カルボニル基を有する化合物が、下記式(５)：
【化５】
0004757804.tif 000018
で表される２−クロロ−１−（３′−クロロフェニル）エタノンであり、前記光学活性アルコールが、下記式(６)：
【化６】
0004757804.tif 000019
で表される（Ｒ）−２−クロロ−１−（３′−クロロフェニル）エタノールである、請求項１３記載の製造方法。
【請求項１７】
前記カルボニル基を有する化合物が、下記式(７)：
【化７】
0004757804.tif 000020
で表される（Ｓ）−６−ベンゾイルオキシ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルであり、前記光学活性アルコールが、下記式(８)：
【化８】
0004757804.tif 000021
で表される（３Ｒ，５Ｓ）−６−ベンゾイルオキシ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルである、請求項１３記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、下記式（１）：【０００２】
【化９】
0004757804.tif 000002
【０００３】
で表される３−オキソ−３−フェニルプロパンニトリルを不斉的に還元して、下記式(２)：【０００４】
【化１０】
0004757804.tif 000003
【０００５】
で表される（Ｒ）−３−ヒドロキシ−３−フェニルプロパンニトリルを生成する活性を有する微生物より単離された、該活性を有するポリペプチド（カルボニル還元酵素）、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含むベクター、および該ベクターで形質転換された形質転換体に関する。【０００６】
本発明はまた、該ポリペプチド、または、該形質転換体を用いた、光学活性アルコール類、とりわけ前記式(２)で表される（Ｒ）−３−ヒドロキシ−３−フェニルプロパンニトリルの製造法に関する。【０００７】
（Ｒ）−３−ヒドロキシ−３−フェニルプロパンニトリルは、β−アドレナリン受容体遮断薬等の医薬品の中間体として有用な化合物である。
【関連出願の相互参照】
【０００８】
日本国特許２００４−３１２３６５号（２００４年１０月２７日出願）の明細書、請求の範囲、図面および要約を含む全開示内容は、これら全開示内容を参照することによって本出願に合体される。
【背景技術】
【０００９】
光学活性３−ヒドロキシ−３−フェニルプロパンニトリルの製造法としては、１）光学活性な前駆物質から誘導する方法（特許文献１、特許文献２）、２）リパーゼ等の加水分解酵素を用いて、３−ヒドロキシ−３−フェニルプロパンニトリルのラセミ体を光学分割する方法（特許文献３、非特許文献２）、３）不斉配位子の存在下、金属触媒を用いてベンズアルデヒドとアセトニトリルを縮合する方法（非特許文献３）、４）不斉配位子または不斉触媒の存在下、３−オキソ−３−フェニルプロパンニトリルのカルボニル基を還元する方法（特許文献４、非特許文献４）、５）微生物を用いて３−オキソ−３−フェニルプロパンニトリルのカルボニル基を還元する方法（非特許文献５、非特許文献６）等が知られている。
【非特許文献１】Bulletin of the Korean Chemical Society, 23, 1693 (2002)
【非特許文献２】Advanced Synthesis & Catalysis, 344, 947 (2002)
【非特許文献３】Organic Letters, 5, 3147 (2003)
【非特許文献４】Tetrahedron:Asymmetry, 3, 677 (1992)
【非特許文献５】Tetrahedron:Asymmetry, 11, 3693 (2000)
【非特許文献６】Organic Letters, 1, 1879 (1999)
【特許文献１】米国特許出願公開第２００４／１１０９８５号公報
【特許文献２】特開平５−９２９４６号公報
【特許文献３】特表２００４−５２００３９号公報
【特許文献４】特開２００３−２０１２６９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上記文献に開示されている方法のうち、上記１）は高価な前駆物質を必要とする、２）は理論収率が５０％であるため原料の半分が無駄となる、３）および４）は高価な不斉配位子あるいは不斉触媒を必要とする、５）は反応容積あたりの生産性が低い、などの欠点をそれぞれ有し、いずれも経済的な製造方法とは言い難い。【００１１】
上記に鑑み、本発明は、（Ｒ）−３−ヒドロキシ−３−フェニルプロパンニトリルの製造において有用なポリペプチド、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含むベクター、および該ベクターで形質転換された形質転換体を提供することを課題とする。【００１２】
また、本発明は、該ポリペプチド、または、該形質転換体を用いた、（Ｒ）−３−ヒドロキシ−３−フェニルプロパンニトリルを始めとする種々の光学活性アルコールの効率的な製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、３−オキソ−３−フェニルプロパンニトリルを不斉的に還元し、（Ｒ）−３−ヒドロキシ−３−フェニルプロパンニトリルを生成する活性を有する微生物より該活性を有するポリペプチドを単離した。さらに、該ポリペプチドをコードするＤＮＡを単離し、これを利用して、該ポリペプチドを高生産する形質転換体を創製することに成功した。そして、該ポリペプチドまたは該形質転換体を利用することにより、（Ｒ）−３−ヒドロキシ−３−フェニルプロパンニトリルを始めとする種々の有用な光学活性アルコールを効率良く製造することが可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。【００１４】
即ち、本発明の一つの特徴は、３−オキソ−３−フェニルプロパンニトリルを不斉的に還元して、（Ｒ）−３−ヒドロキシ−３−フェニルプロパンニトリルを生成する活性を有するポリペプチドである。また、本発明の別の特徴は、該ポリペプチドをコードするＤＮＡである。また、本発明の別の特徴は、該ＤＮＡを含むベクターである。また、本発明の別の特徴は、該ベクターを含む形質転換体である。さらに、本発明の別の特徴は、該ポリペプチドまたは該形質転換体を用いた、（Ｒ）−３−ヒドロキシ−３−フェニルプロパンニトリルを始めとする光学活性アルコール類の製造方法である。
【発明の効果】
【００１５】
本発明により、（Ｒ）−３−ヒドロキシ−３−フェニルプロパンニトリルを始めとする、有用な光学活性アルコール類の実用的な製造方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】組換えベクターｐＮＴＣＭＧ１の作製法および構造を示す
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、本発明を詳細に説明する。
本明細書において記述されている、ＤＮＡの単離、ベクターの調製、形質転換等の遺伝子操作は、特に明記しない限り、Molecular Cloning 2nd Edition（Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989）等の成書に記載されている方法により実施できる。また、本明細書の記述に用いられる％は、特に断りのない限り、％（ｗ／ｖ）を意味する。【００１８】
１．ポリペプチド及びその起源
本発明のポリペプチドは、３−オキソ−３−フェニルプロパンニトリルを不斉的に還元し、（Ｒ）−３−ヒドロキシ−３−フェニルプロパンニトリルを生成する活性を有するポリペプチドである。このようなポリペプチドは、当該活性を有する微生物から単離することができる。本発明のポリペプチドの起源となる微生物は、特に限定されないが、例えばキャンディダ（Candida）属に属する酵母が挙げられ、特に好ましいものとしてはキャンディダ・マグノリエ（Candida magnoliae）ＮＢＲＣ０６６１株を挙げることができる。当該微生物は、独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部  生物遺伝資源部門（ＮＢＲＣ：〒292-0818  千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8）より入手することができる。【００１９】
本発明のポリペプチドの起源となる微生物を培養するための培地としては、その微生物が増殖する限り、通常の、炭素源、窒素源、無機塩類、有機栄養素などを含む液体栄養培地を用いることができる。【００２０】
２．ポリペプチドの単離
本発明のポリペプチドの起源となる微生物からの該ポリペプチドの単離は、通常公知の蛋白質精製法を適当に組み合わせて用いることにより実施できる。例えば、以下のように実施できる。まず、当該微生物を適当な培地で培養し、培養液から遠心分離、あるいは、濾過により菌体を集める。得られた菌体を、超音波破砕機、あるいは、グラスビーズ等を用いた物理的手法で破砕した後、遠心分離にて菌体残さを除き、無細胞抽出液を得る。そして、塩析（硫酸アンモニウム沈殿、リン酸ナトリウム沈殿など）、溶媒沈殿（アセトンまたはエタノールなどによる蛋白質分画沈殿法）、透析、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、限外濾過等の手法を単独で、または組み合わせて用いることにより、該無細胞抽出液から本発明のポリペプチドを単離する。【００２１】
３．還元反応
３−オキソ−３−フェニルプロパンニトリルを還元する活性は、例えば、０．３３％（ｖ／ｖ）のジメチルスルホキシドを含む１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に、０．５ｍＭの基質３−オキソ−３−フェニルプロパンニトリル、０．２５ｍＭの補酵素ＮＡＤＰＨ、および粗酵素を添加し、３０℃で１分間反応させた際の、波長３４０ｎｍにおける吸光度の減少速度から算出できる。【００２２】
また、上記反応において生成した、３−ヒドロキシ−３−フェニルプロパンニトリルの光学純度の測定は、キャピラリーガスクロマトグラフィー（カラム：ＣＨＩＲＡＬＤＥＸ  Ｇ−ＴＡ（φ０．２５ｍｍ×２０ｍ；東京化成工業株式会社製）、カラム温度：１３０℃、キャリアガス：ヘリウム（１５０ｋＰａ）、検出：ＦＩＤ）を用いて実施できる。【００２３】
４．ＤＮＡ
本発明のＤＮＡは、上述の本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡであり、後述する方法に従って導入された宿主細胞内で該ポリペプチドを発現し得るものであればいかなるものでもよく、任意の非翻訳領域を含んでいてもよい。該ポリペプチドが取得できれば、該ポリペプチドの起源となる微生物より、当業者であれば公知の方法で、このようなＤＮＡを取得できる。例えば、以下に示した方法で取得できる。【００２４】
まず、単離された本発明のポリペプチドを適当なエンドペプチダーゼを用いて消化し、生じたペプチド断片を逆相ＨＰＬＣにより分取する。そして、例えば、ＡＢＩ４９２型プロテインシークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）により、これらのペプチド断片のアミノ酸配列の一部または全部を決定する。【００２５】
このようにして得られたアミノ酸配列情報をもとにして、該ポリペプチドをコードするＤＮＡの一部を増幅するためのＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）プライマーを合成する。次に、通常のＤＮＡ単離法、例えば、Ｖｉｓｓｅｒ等の方法（Appl. Microbiol. Biotechnol., 53, 415 (2000)）により、該ポリペプチドの起源となる微生物の染色体ＤＮＡを調製する。この染色体ＤＮＡを鋳型として、先述のＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲを行い、該ポリペプチドをコードするＤＮＡの一部を増幅し、その塩基配列を決定する。塩基配列の決定は、例えば、 ＡＢＩ３７３Ａ型  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）等を用いて行うことができる。【００２６】
該ポリペプチドをコードするＤＮＡの一部の塩基配列が明らかになれば、例えば、ｉ−ＰＣＲ法（Nucl. Acids Res., 16, 8186 (1988)）によりその全体の配列を決定することができる。【００２７】
このようにして得られる本発明のＤＮＡの例としては、配列表の配列番号１に示す塩基配列を含むＤＮＡを挙げることができる。また、配列表の配列番号１に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、かつ、３−オキソ−３−フェニルプロパンニトリルを不斉的に還元し、（Ｒ）−３−ヒドロキシ−３−フェニルプロパンニトリルを生成する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡも本発明のＤＮＡに包含される。【００２８】
配列表の配列番号１に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとは、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法、あるいはサザンハイブリダイゼーション法等を実施した際、配列表の配列番号１に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡが、特異的にハイブリッドを形成するＤＮＡを言う。【００２９】
ここで、ストリンジェントな条件とは、例えば、７５ｍＭクエン酸三ナトリウム、７５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．５％ドデシル硫酸ナトリウム、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ポリビニルピロリドン、および、０．１％Ｆｉｃｏｌｌ  ４００（アマシャムバイオサイエンス株式会社製）の組成からなる水溶液中、６５℃でハイブリダイズさせた後に、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、および０．１％ドデシル硫酸ナトリウムの組成からなる水溶液を用いて、６０℃で洗浄が行われる条件を言う。好ましくは、上記条件でハイブリダイズさせた後に、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、および０．１％ドデシル硫酸ナトリウムの組成からなる水溶液を用いて、６５℃で洗浄が行われる条件であり、より好ましくは、１．５ｍＭクエン酸三ナトリウム、１５ｍＭ塩化ナトリウム、および０．１％ドデシル硫酸ナトリウムの組成からなる水溶液を用いて、６５℃で洗浄が行われる条件である。【００３０】
５．ポリペプチド
本発明のポリペプチドの例としては、配列表の配列番号１に示す塩基配列によってコードされる、配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドを挙げることができる。【００３１】
また、配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドと一定値以上の相同性を有し、かつ、３−オキソ−３−フェニルプロパンニトリルを不斉的に還元し、（Ｒ）−３−ヒドロキシ−３−フェニルプロパンニトリルを生成する活性を有するポリペプチドは、当該ポリペプチドと機能的に同等であり、本発明に含まれる。【００３２】
ここで配列の相同性は、例えば、相同性検索プログラムＦＡＳＴＡ（W.R. Pearson & D.J. Lipman P.N.A.S. (1988) 85:2444-2448）を用いて２つのアミノ酸配列を比較解析した場合に、配列全体に対するＩｄｅｎｔｉｔｙの値で表される。配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等なポリペプチドとしては、当該ポリペプチドとの相同性が７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上であるポリペプチドを挙げることができる。【００３３】
このようなポリペプチドは、例えば、先述の、配列表の配列番号１に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを、適当なベクターに連結した後、適当な宿主細胞に導入して発現させることにより得られる。また、例えば、Current Protocols in Molecular Biology（John Wiley and Sons, Inc., 1989）等に記載の公知の方法に従い、配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドに、アミノ酸の置換、挿入、欠失または付加を生じさせることによっても取得できる。３−オキソ−３−フェニルプロパンニトリルを不斉的に還元し、（Ｒ）−３−ヒドロキシ−３−フェニルプロパンニトリルを生成する活性が顕著に失われない限り、上記ポリペプチドにおいて、置換、挿入、欠失または付加するアミノ酸の個数は限定されないが、例えば２０アミノ酸以下、好ましくは、５個以下、さらに好ましくは２または１個である。【００３４】
６．ベクター及び形質転換体
本発明のＤＮＡを宿主微生物内に導入し、導入された宿主微生物内で発現させるために用いられるベクターは、適当な宿主微生物内で当該ＤＮＡがコードする遺伝子を発現できるものであれば、特に限定されない。このようなベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、コスミドベクターなどが挙げられ、さらに、他の宿主株との間での遺伝子交換が可能なシャトルベクターも使用できる。【００３５】
このようなベクターは、通常、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｔｕｆＢプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ｐＬプロモーター等の制御因子を含み、本発明のＤＮＡと作動可能に連結された発現単位を含む発現ベクターとして好適に使用できる。例えば、ｐＵＣＮＴ（国際公開第ＷＯ９４／０３６１３号公報）が好適に使用できる。【００３６】
本明細書で用いる用語「制御因子」は、機能的プロモーター及び、任意の関連する転写要素（例えばエンハンサー、ＣＣＡＡＴボックス、ＴＡＴＡボックス、ＳＰＩ部位など）を有する塩基配列をいう。【００３７】
本明細書で用いる用語「作動可能に連結」は、遺伝子の発現を調節するプロモーター、エンハンサー等の種々の調節エレメントと遺伝子が、宿主細胞中で作動し得る状態で連結されることをいう。制御因子のタイプ及び種類が、宿主に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。【００３８】
本発明の発現ベクターの例としては、ｐＵＣＮＴに配列番号１に示すＤＮＡを導入した、後述するｐＮＴＣＭを挙げることができる。【００３９】
本発明のＤＮＡを含むベクターを導入する宿主細胞としては、細菌、酵母、糸状菌、植物細胞、動物細胞などが挙げられるが、導入及び発現効率から細菌が好ましく、大腸菌が特に好ましい。本発明のＤＮＡを含むベクターは、公知の方法により宿主細胞に導入できる。宿主細胞として大腸菌を用いる場合、例えば、市販のＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）を用いることにより、当該ベクターを宿主細胞に導入できる。【００４０】
本発明の形質転換体の例としては、後述するＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＴＣＭ）  ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０４１８が挙げられる。この形質転換体は、前記の受託番号にて、２００５年９月２６日付けで独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒305-8566  茨城県つくば市東１−１−１  中央第６）に寄託されている。（原寄託日２００３年１０月２３日の国内寄託株を、ブダペスト条約に基づく国際寄託に移管）。【００４１】
７．補酵素再生能を有するポリペプチド
本発明のポリペプチド、カルボニル基を有する化合物、および、ＮＡＤＰＨ等の補酵素を接触せしめ、反応させることにより、当該カルボニル基を有する化合物を不斉的に還元し、光学活性アルコール類を製造することができる。この時、当該反応の進行に伴い、ＮＡＤＰＨ等の補酵素は酸化型に変換される。しかし、この酸化型の補酵素を還元型に変換する能力（以後、補酵素再生能と呼ぶ）を有するポリペプチド、および、当該ポリペプチドの基質となる化合物を、本発明のポリペプチドと共存させて当該反応を行うことにより、高価な補酵素の使用量を大幅に削減できる。補酵素再生能を有するポリペプチドとしては、例えば、ヒドロゲナーゼ、ギ酸脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、アルデヒド脱水素酵素、グルコース−６−リン酸脱水素酵素およびグルコース脱水素酵素などを使用できる。好適には、グルコース脱水素酵素が使用される。【００４２】
８．形質転換体の使用
本発明のポリペプチドのかわりに、該ポリペプチドをコードするＤＮＡを含む形質転換体を使用しても、同様に光学活性アルコール類を製造することができる。また、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ、および、補酵素再生能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの両者を含む形質転換体を使用しても、同様に光学活性アルコール類を製造することができる。とりわけ、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ、および、補酵素再生能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの両者を含む形質転換体を使用した場合には、補酵素を再生するための酵素を別途調製・添加する必要がなく、光学活性アルコール類の製造をより効率良く行うことができる。【００４３】
なお、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを含む形質転換体、若しくは、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡおよび補酵素再生能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの両者を含む形質転換体は、培養菌体は言うまでもなく、その形質転換体の処理物としても光学活性アルコール類の製造に使用することができる。ここで言う「形質転換体の処理物」とは、例えば、界面活性剤や有機溶媒で処理した細胞、乾燥細胞、破砕処理した細胞、細胞の粗抽出液、またはそれらの混合物等のほか、公知の手段（例えば、架橋法、物理的吸着法、包括法など）でそれらを固定化した固定化菌体を意味する。【００４４】
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ、および、補酵素再生能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの両者を含む形質転換体は、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ、および、補酵素再生能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの両者を、同一のベクターに組み込み、これを宿主細胞に導入することにより得られるほか、これら２種のＤＮＡを不和合性グループの異なる２種のベクターにそれぞれ組み込み、それら２種のベクターを同一の宿主細胞に導入することによっても得られる。【００４５】
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ及び補酵素再生能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの両者が組込まれたベクターの例としては、前記発現ベクターｐＮＴＣＭにバシラス・メガテリウム由来のグルコース脱水素酵素遺伝子を導入した、後述するｐＮＴＣＭＧ１が挙げられる。また、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ、および、補酵素再生能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの両者を含む形質転換体の例としては、当該ベクターでＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１を形質転換して得られる、後述するＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＴＣＭＧ１）が挙げられる。【００４６】
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを含む形質転換体の培養、および、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡと補酵素再生能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの両者を含む形質転換体の培養は、それらが増殖する限り、通常の、炭素源、窒素源、無機塩類、有機栄養素などを含む液体栄養培地を用いて実施できる。【００４７】
形質転換体中の補酵素再生能を有するポリペプチドの活性は、常法により測定することができる。例えば、グルコース脱水素酵素の活性は、１Ｍのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に、１００ｍＭのグルコース、２ｍＭの補酵素ＮＡＤＰまたはＮＡＤ、および酵素を添加し、２５℃で１分間反応させた際の、波長３４０ｎｍにおける吸光度の増加速度から算出できる。【００４８】
９．光学活性アルコール類の製造
本発明のポリペプチド、又は、該ポリペプチドをコードするＤＮＡを含む形質転換体のいずれかを用いた光学活性アルコール類の製造は、適当な溶媒中に、基質となるカルボニル基を有する化合物、ＮＡＤＰＨ等の補酵素、及び、本発明のポリペプチド又は該ポリペプチドをコードするＤＮＡを含む形質転換体を添加し、ｐＨ調整下、攪拌することにより実施できる。【００４９】
一方、本発明のポリペプチドと補酵素再生能を有するポリペプチドを組み合わせて反応を行う場合は、上記反応組成に、補酵素再生能を有するポリペプチド（例えば、グルコース脱水素酵素）と、その基質となる化合物（例えば、グルコース）をさらに添加する。なお、後者の場合においても、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡと補酵素再生能を有するポリペプチド（例えば、グルコース脱水素酵素）をコードするＤＮＡの両者を含む形質転換体、または、その処理物を用いる場合は、補酵素再生能を有するポリペプチド（例えば、グルコース脱水素酵素）を別途添加する必要はない。【００５０】
反応には水系溶媒を用いてもよいし、水系と有機系の溶媒を混合して用いてもよい。有機系溶媒としては、例えば、トルエン、酢酸エチル、酢酸ｎ−ブチル、ヘキサン、イソプロパノール、ジイソプロピルエーテル、メタノール、アセトン、ジメチルスルホキシド等が挙げられる。反応は１０℃〜７０℃の温度で行われ、反応液のｐＨは４〜１０に維持する。反応は、バッチ方式あるいは連続方式で実施できる。バッチ方式の場合、反応基質は０．１％から７０％（ｗ／ｖ）の仕込み濃度で添加される。【００５１】
１０．基質及び生成物
基質となるカルボニル基を有する化合物としては、例えば、下記式（１）：【００５２】
【化１１】
0004757804.tif 000004
【００５３】
で表される３−オキソ−３−フェニルプロパンニトリル、下記式（３）：【００５４】
【化１２】
0004757804.tif 000005
【００５５】
で表される４−クロロ−３−オキソ酪酸エチル、下記式（５）：【００５６】
【化１３】
0004757804.tif 000006
【００５７】
で表される２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノン、および、下記式（７）：【００５８】
【化１４】
0004757804.tif 000007
【００５９】
で表される（Ｓ）−６−ベンゾイルオキシ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチル等が挙げられるが、上述の反応条件において還元され、光学活性アルコールに変換されるものであれば、特に限定されない。【００６０】
上述の反応条件において、前記式（１）で表される３−オキソ−３−フェニルプロパンニトリルを基質とした場合、下記式（２）：【００６１】
【化１５】
0004757804.tif 000008
【００６２】
で表される（Ｒ）−３−ヒドロキシ−３−フェニルプロパンニトリルが得られる。前記式（３）で表される４−クロロ−３−オキソ酪酸エチルを基質とした場合、下記式（４）：【００６３】
【化１６】
0004757804.tif 000009
【００６４】
で表される（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エチルが得られる。前記式（５）で表される２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノンを基質とした場合、下記式（６）：【００６５】
【化１７】
0004757804.tif 000010
【００６６】
で表される（Ｒ）−２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノールが得られる。また、前記式（７）で表される（Ｓ）−６−ベンゾイルオキシ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルを基質とした場合、下記式（８）：【００６７】
【化１８】
0004757804.tif 000011
【００６８】
で表される（３Ｒ，５Ｓ）−６−ベンゾイルオキシ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルが得られる。【００６９】
１１．精製および分析
反応で生じた光学活性アルコール類は、常法により精製できる。例えば、反応で生じた光学活性アルコール類を含む反応液を、酢酸エチル、トルエン等の有機溶媒で抽出し、有機溶媒を減圧下で留去した後、蒸留、再結晶、または、クロマトグラフィー等の処理を行うことにより、精製できる。【００７０】
３−オキソ−３−フェニルプロパンニトリル、および、（Ｒ）−３−ヒドロキシ−３−フェニルプロパンニトリルの定量、さらに、（Ｒ）−３−ヒドロキシ−３−フェニルプロパンニトリルの光学純度の測定は、キャピラリーガスクロマトグラフィー（カラム：ＣＨＩＲＡＬＤＥＸ  Ｇ−ＴＡ（ＩＤ０．２５ｍｍ×２０ｍ；東京化成工業株式会社製）、カラム温度：１３０℃、キャリアガス：ヘリウム（１５０ｋＰａ）、検出：ＦＩＤ）を用いて行うことができる。【００７１】
４−クロロ−３−オキソ酪酸エチル、および、（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エチルの定量は、ガスクロマトグラフィー（カラム：ＰＥＧ−２０Ｍ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｒｂ  ＷＡＷ  ＤＭＣＳ  １０％  ８０／１００  ｍｅｓｈ（ＩＤ３ｍｍ×１ｍ；ジーエルサイエンス株式会社製）、カラム温度：１５０℃、キャリアガス：窒素、検出：ＦＩＤ）を用いて行うことができる。また、（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エチルの光学純度の測定は、高速液体クロマトグラフィー（カラム：Ｃｈｉｒａｌｃｅｌ  ＯＢ（ＩＤ４．６ｍｍ×２５０ｍｍ；ダイセル化学工業社製） 、溶離液：ｎ−ヘキサン／イソプロパノール＝９／１、流速：０．８ｍｌ／ｍｉｎ、検出：２１５ｎｍ、カラム温度：室温）を用いて行うことができる。【００７２】
２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノン、および、（Ｒ）−２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノールの定量は、高速液体クロマトクロマトグラフィー（カラム：株式会社ワイエムシィ製ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＯＤＳ  Ａ−３０３（ＩＤ４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）、溶離液：水／アセトニトリル＝１／１、流速：１ｍｌ／ｍｉｎ、検出：２１０ｎｍ、カラム温度：室温 ）を用いて行うことができる。また、（Ｒ）−２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノールの光学純度の測定は、高速液体クロマトクロマトグラフィー（カラム：ダイセル化学工業株式会社製Ｃｈｉｒａｌｃｅｌ  ＯＪ（ＩＤ４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）、溶離液：ｎ−ヘキサン／イソプロパノール＝３９／１、流速：１ｍｌ／ｍｉｎ、検出：２５４ｎｍ、カラム温度：室温 ）を用いて行うことができる。【００７３】
（Ｓ）−６−ベンゾイルオキシ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチル、および、（３Ｒ，５Ｓ）−６−ベンゾイルオキシ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルの定量、さらに、（３Ｒ，５Ｓ）−６−ベンゾイルオキシ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルのジアステレオマー過剰率の測定は、高速液体クロマトグラフィー（カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＯＤＳ−Ａ３０３（ＩＤ４．６ｍｍ×２５０ｍｍ；ＹＭＣ社製）、溶離液：水／アセトニトリル＝１／１、流速：１ｍｌ／ｍｉｎ、検出：２１０ｎｍ、カラム温度：室温）を用いて行うことができる。【００７４】
以上のように、本発明に従えば、本発明のポリペフチドの効率的生産が可能であり、それを利用することにより、（Ｒ）−３−ヒドロキシ−３−フェニルプロパンニトリルを始めとする、有用な光学活性アルコール類の優れた製造法が提供される。
【実施例】
【００７５】
以下、実施例で本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。なお、以下の実施例において用いた組み換えＤＮＡ技術に関する詳細な操作方法などは、次の成書に記載されている：
Molecular Cloning 2nd Edition（Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989）、
Current Protocols in Molecular Biology（Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience）。【００７６】
（実施例１）ポリペプチドの精製
以下の方法に従って、キャンディダ・マグノリエ（Candida magnoliae）ＮＢＲＣ０６６１株より、３−オキソ−３−フェニルプロパンニトリルを不斉的に還元して（Ｒ）−３−ヒドロキシ−３−フェニルプロパンニトリルを生成する活性を有するポリペプチドを分離し、単一に精製した。特に断りのない限り、精製操作は４℃で行った。【００７７】
３−オキソ−３−フェニルプロパンニトリルに対する還元活性は、０．３３％（ｖ／ｖ）のジメチルスルホキシドを含む１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に、基質３−オキソ−３−フェニルプロパンニトリルを終濃度０．５ｍＭ、補酵素ＮＡＤＰＨを終濃度０．２５ｍＭとなるよう溶解し、さらに粗酵素液を添加して３０℃で１分間反応を行った際の、当該反応液の波長３４０ｎｍにおける吸光度の減少速度から算出した。本反応条件において、１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＰＨをＮＡＤＰに酸化する活性を、１ｕｎｉｔと定義した。【００７８】
（微生物の培養）
３０Ｌジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ社製）に、グルコース４％、イーストエキス０．３％、リン酸ニ水素カリウム０．７％、リン酸水素ニアンモニウム１．３％、塩化ナトリウム０．１％、硫酸マグネシウム・七水和物０．０８％、硫酸亜鉛・七水和物０．００６％、硫酸第一鉄・七水和物０．００９％、硫酸銅・五水和物０．０００５％、硫酸マンガン・四〜六水和物０．００１％、アデカノールＬＧ−１０９（日本油脂株式会社製）０．０１％からなる液体培地１８Ｌを調製し、１２０℃で２０分間蒸気殺菌をおこなった。
この培地に、予め同培地にて前培養しておいたキャンディダ・マグノリエ（Candida magnoliae）ＮＢＲＣ０６６１株の培養液を１８０ｍｌ接種し、攪拌回転数２５０ｒｐｍ、通気量５．０ＮＬ／ｍｉｎ、３０℃で、３０％（ｗ／ｗ）水酸化ナトリウム水溶液の滴下により下限ｐＨを５．５に調整しながら培養した。培養開始から１８時間後、２２時間後、２６時間後にそれぞれ５５％（ｗ／ｗ）グルコース水溶液６５５ｇを添加し、３０時間培養を行った。【００７９】
（無細胞抽出液の調整）
上記の培養液から遠心分離により菌体を集め、０．８％塩化ナトリウム水溶液を用いて菌体を洗浄した。この菌体を、５ｍＭのβ−メルカプトエタノールおよび０．１ｍＭのフッ化フェニルメタンスルホニルを含む１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁し、ダイノミル（ Ｗｉｌｌｙ  Ａ．  Ｂａｃｈｏｆｅｎ社製）で破砕した後、破砕物から遠心分離にて菌体残渣を除き、無細胞抽出液１９００ｍｌを得た。【００８０】
（核酸の除去）
上記で得た無細胞抽出液に、５％硫酸プロタミン水溶液を１００ｍｌ添加し、１夜攪拌後、遠心分離により沈殿を除去した。【００８１】
（硫酸アンモニウム分画）
上記で得た核酸除去後の粗酵素液のｐＨを、アンモニア水を用いて７．０に調整した後、同ｐＨを維持しながら、５０％飽和となるように硫酸アンモニウムを添加・溶解し、生じた沈殿を遠心分離により除いた。先と同様にｐＨ７．０を維持しながら、この遠心上清に６０％飽和となるよう、さらに硫酸アンモニウムを添加・溶解し、生じた沈殿を遠心分離により集めた。この沈殿を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解した後、同一緩衝液で１夜透析し、活性画分を得た。【００８２】
（ＤＥＡＥ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬカラムクロマトグラフィー）
硫酸アンモニウム分画により得られた活性画分を、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で予め平衡化したＤＥＡＥ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ６５０Ｍ（東ソー株式会社製）カラム（４００ｍｌ）に供し、活性画分を吸着させた。同一緩衝液でカラムを洗浄した後、ＮａＣｌのリニアグラジエント（０Ｍから０．５Ｍまで）により活性画分を溶出させた。活性画分を集め、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）にて１夜透析を行った。【００８３】
（Ｂｌｕｅ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムクロマトグラフィー）
ＤＥＡＥ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬカラムクロマトグラフィーにより得られた活性画分を、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で予め平衡化したＢｌｕｅ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−６Ｂ（アマシャムバイオサイエンス株式会社製）カラム（５０ｍｌ）に供し、活性画分を吸着させた。同一緩衝液でカラムを洗浄した後、ＮａＣｌのリニアグラジエント（０Ｍから１Ｍまで）により活性画分を溶出させた。活性画分を集め、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）にて１夜透析を行った。【００８４】
（２’，５’−ＡＤＰ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムクロマトグラフィー）
Ｂｌｕｅ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムクロマトグラフィーにより得られた活性画分を、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で予め平衡化した２’，５’−ＡＤＰ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（アマシャムバイオサイエンス株式会社製）カラム（２０ｍｌ）に供し、活性画分を吸着させた。同一緩衝液でカラムを洗浄した後、ＮａＣｌのリニアグラジエント（０Ｍから１Ｍまで）により活性画分を溶出させた。活性画分を集め、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）にて１夜透析を行った。【００８５】
（ＨｉＴｒａｐ  Ｐｈｅｎｙｌ  ＨＰカラムクロマトグラフィー）
２’，５’−ＡＤＰ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムクロマトグラフィーにより得られた活性画分に、終濃度が３５％となるよう硫酸アンモニウムを溶解し、３５％の硫酸アンモニウムを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）にて予め平衡化したＨｉＴｒａｐ  Ｐｈｅｎｙｌ  ＨＰカラム（アマシャムバイオサイエンス株式会社製）に供し、活性画分を吸着させた。同一緩衝液でカラムを洗浄した後、硫酸アンモニウムのリニアグラジエント（３５％から０％まで）により活性画分を溶出させた。活性画分を集め、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）にて１夜透析を行い、ポリペプチドの精製標品を得た。【００８６】
（実施例２）  遺伝子のクローニング
（ＰＣＲプライマーの作成）
実施例１で得られた精製ポリペプチドを８Ｍ尿素存在下で変性した後、アクロモバクター由来のリシルエンドペプチダーゼ（和光純薬工業株式会社製）で消化し、得られたペプチド断片のアミノ酸配列をＡＢＩ４９２型プロテインシーケンサー（パーキンエルマー社製）により決定した。このアミノ酸配列から予想されるＤＮＡ配列に基づき、該ポリペプチドをコードする遺伝子の一部をＰＣＲにより増幅するためのプライマー１：５’−cargarcaytaygtntggcc−３’（配列表の配列番号３）、および、プライマー２：５’−atygcrtcnggrtadatcca−３’（配列表の配列番号４）を合成した。【００８７】
（ＰＣＲによる遺伝子の増幅）
実施例１と同様に培養したキャンディダ・マグノリエ（Candida magnoliae）ＮＢＲＣ０６６１株の菌体からＶｉｓｓｅｒ等の方法（Appl. Microbiol. Biotechnol., 53, 415 (2000)）に従って染色体ＤＮＡを抽出した。次に、上記で調製したＤＮＡプライマー１および２を用い、得られた染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行ったところ、目的遺伝子の一部と考えられる約０．５ｋｂｐのＤＮＡ断片が増幅された。ＰＣＲは、ＤＮＡポリメラ−ゼとしてＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（タカラバイオ社製）を用いて行い、反応条件はその取り扱い説明書に従った。このＤＮＡ断片を、プラスミドｐＴ７Ｂｌｕｅ  Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）にクローニングし、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）およびＡＢＩ  ３７３Ａ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）を用いてその塩基配列を解析した。その結果判明した塩基配列を、配列表の配列番号５に示した。【００８８】
（ｉ−ＰＣＲ法による目的遺伝子の全長配列の決定）
上記で調製したキャンディダ・マグノリエ（Candida magnoliae）ＮＢＲＣ０６６１株の染色体ＤＮＡを、制限酵素ＰｓｔＩで完全消化し、得られたＤＮＡ断片の混合物をＴ４リガーゼにより分子内環化させた。これを鋳型として用い、ｉ−ＰＣＲ法（Nucl. Acids Res., 16, 8186 (1988)）により、上述の配列番号５に示す塩基配列を含む遺伝子の全塩基配列を決定した。その結果を配列表の配列番号１に示した。ｉ−ＰＣＲは、ＤＮＡポリメラ−ゼとしてＴａＫａＲａ  ＬＡ  Ｔａｑ（タカラバイオ社製）を用いて行い、反応条件はその取り扱い説明書に従った。また、配列番号１に示した塩基配列がコードするアミノ酸配列を配列番号２に示した。【００８９】
（実施例３）  発現ベクターの構築
プライマー３：５’−gtgcatatgtcttctcttcacgctcttg−３’（配列表の配列番号６）と、プライマー４：５’−ggcgaattcttattaaacggtagagccattgtcg−３’（配列表の配列番号７）を用い、実施例２で得たキャンディダ・マグノリエ（Candida magnoliae）ＮＢＲＣ０６６１株の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。その結果、配列表の配列番号1
に示す塩基配列からなる遺伝子の開始コドン部分にＮｄｅＩ認識部位が付加され、かつ終始コドンの直後にＥｃｏＲＩ認識部位が付加された二本鎖ＤＮＡを得た。ＰＣＲは、ＤＮＡポリメラ−ゼとしてＴａＫａＲａ  ＬＡ  Ｔａｑ（タカラバイオ社製）を用いて行い、反応条件はその取り扱い説明書に従った。このＤＮＡをＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、プラスミドｐＵＣＮＴ（国際公開第ＷＯ９４／０３６１３号公報）のｌａｃプロモーターの下流のＮｄｅＩ認識部位とＥｃｏＲＩ認識部位の間に挿入し、組換えベクターｐＮＴＣＭを構築した。【００９０】
（実施例４）  グルコース脱水素酵素遺伝子をさらに含む発現ベクターの構築
プライマー５：５’−gccgaattctaaggaggttaacaatgtataaa−３’（配列表の配列番号８）と、プライマー６：３’−gcggtcgacttatccgcgtcctgcttgg−５’（配列表の配列番号９）を用い、プラスミドｐＧＤＫ１（Eur. J. Biochem., 186, 389 (1989)）を鋳型としてＰＣＲを行い、バシラス・メガテリウム（Bacillus megaterium）ＩＡＭ１０３０株由来のグルコース脱水素酵素（以後、ＧＤＨと呼ぶ）遺伝子の開始コドンから５塩基上流に大腸菌のリボゾーム結合配列が、さらにその直前にＥｃｏＲＩ切断点が付加され、かつ、終止コドンの直後にＳａｌＩ切断点が付加された、二本鎖ＤＮＡを取得した。得られたＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩで消化し、プラスミドｐＵＣＮＴ（国際公開第ＷＯ９４／０３６１３号公報）のｌａｃプロモーターの下流のＥｃｏＲＩ認識部位とＳａｌＩ認識部位の間に挿入し、組換えベクターｐＮＴＧ１を構築した。【００９１】
次に、配列表の配列番号１に示す塩基配列からなる遺伝子の開始コドン部分にＮｄｅＩ認識部位が付加され、かつ終始コドンの直後にＥｃｏＲＩ認識部位が付加された二本鎖ＤＮＡを、実施例３と同様に調製し、これを上記の組換えベクターｐＮＴＧ１のＮｄｅＩ認識部位とＥｃｏＲＩ認識部位の間に挿入して、組み換えプラスミドｐＮＴＣＭＧ１を構築した。ｐＮＴＣＭＧ１の作製法および構造を図１に示す。【００９２】
（実施例５）  形質転換体の作製
実施例３で構築した組換えベクターｐＮＴＣＭを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）を形質転換し、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＴＣＭ）を得た。この形質転換体は、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０４１８の受託番号にて、２００５年９月２６日付けで独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒305-8566  茨城県つくば市東１−１−１  中央第６）に寄託されている。（原寄託日２００３年１０月２３日の国内寄託株を、ブダペスト条約に基づく国際寄託に移管）。【００９３】
また、同様に、実施例４で構築した組換えベクターｐＮＴＣＭＧ１を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）を形質転換し、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＴＣＭＧ１）を得た。【００９４】
（実施例６）  形質転換体における遺伝子の発現
実施例５で得た２種の形質転換体、および、ベクタープラスミドｐＵＣＮＴを含む形質転換体であるＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＵＣＮＴ）のそれぞれを、２００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２×ＹＴ培地（トリプトン１．６％、イーストエキス１．０％、ＮａＣｌ０．５％、ｐＨ７．０）５０ｍｌに接種し、３７℃で２４時間振盪培養した。遠心分離により菌体を集め、５０ｍｌの１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に懸濁した。これを、ＵＨ−５０型超音波ホモゲナイザー（ＳＭＴ社製）を用いて破砕した後、遠心分離により菌体残渣を除去し、無細胞抽出液を得た。この無細胞抽出液の３−オキソ−３−フェニルプロパンニトリル還元活性、および、ＧＤＨ活性を測定し、比活性として表したものを、表１に示した。実施例５で得られた２種の形質転換体のいずれにおいても、３−オキソ−３−フェニルプロパンニトリル還元活性の発現が認められた。また、ＧＤＨ遺伝子を含むＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＴＣＭＧ１）では、ＧＤＨ活性の発現も認められた。３−オキソ−３−フェニルプロパンニトリル還元活性は、実施例１に記載の方法で測定した。ＧＤＨ活性は、１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に、グルコース０．１Ｍ、補酵素ＮＡＤＰ２ｍＭ、および粗酵素液を添加して２５℃で１分間反応を行い、波長３４０ｎｍにおける吸光度の増加速度より算出した。この反応条件において、１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＰをＮＡＤＰＨに還元する酵素活性を１ｕｎｉｔと定義した。また、無細胞抽出液中の蛋白質濃度は、プロテインアッセイキット（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いて測定した。【００９５】
【表１】
0004757804.tif 000012
【００９６】
（実施例７）  形質転換体を用いた（Ｒ）−３−ヒドロキシ−３−フェニルプロパンニトリルの製造
実施例６と同様に調製したＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＴＣＭ）の無細胞抽出液５０ｍｌに、グルコース脱水素酵素（天野エンザイム社製）２０００Ｕ、グルコース３ｇ、ＮＡＤＰ６ｍｇ、３−オキソ−３−フェニルプロパンニトリル２ｇを添加し、５Ｍの水酸化ナトリウムの滴下によりｐＨ６．５に調整しつつ、３０℃で２２時間攪拌した。反応終了後、酢酸エチルで抽出し、脱溶剤した後、抽出物を分析した。その結果、収率８６．３％で光学純度９７．３％ｅ．ｅ．の（Ｒ）−３−ヒドロキシ−３−フェニルプロパンニトリルが得られた。【００９７】
３−オキソ−３−フェニルプロパンニトリル、および、（Ｒ）−３−ヒドロキシ−３−フェニルプロパンニトリルの定量、さらに、（Ｒ）−３−ヒドロキシ−３−フェニルプロパンニトリルの光学純度の測定は、キャピラリーガスクロマトグラフィー（カラム：ＣＨＩＲＡＬＤＥＸ  Ｇ−ＴＡ（φ０．２５ｍｍ×２０ｍ；東京化成工業株式会社製）、カラム温度：１３０℃、キャリアガス：ヘリウム（１５０ｋＰａ）、検出：ＦＩＤ）を用いて行った。【００９８】
（実施例８）  形質転換体を用いた（Ｒ）−３−ヒドロキシ−３−フェニルプロパンニトリルの製造
実施例６と同様に調製したＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＴＣＭＧ１）の無細胞抽出液５０ｍｌに、グルコース３ｇ、ＮＡＤＰ６ｍｇ、３−オキソ−３−フェニルプロパンニトリル２ｇを添加し、５Ｍの水酸化ナトリウムの滴下によりｐＨ６．５に調整しつつ、３０℃で２２時間攪拌した。反応終了後、酢酸エチルで抽出し、脱溶剤した後、抽出物を分析した。その結果、収率９２．１％で光学純度９７．４％ｅ．ｅ．の（Ｒ）−３−ヒドロキシ−３−フェニルプロパンニトリルが得られた。【００９９】
３−オキソ−３−フェニルプロパンニトリル、および、（Ｒ）−３−ヒドロキシ−３−フェニルプロパンニトリルの定量、さらに、（Ｒ）−３−ヒドロキシ−３−フェニルプロパンニトリルの光学純度の測定は、実施例７と同様に行った。【０１００】
（実施例９）  形質転換体を用いた（Ｒ）−２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノールの製造
実施例６と同様に培養したＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＴＣＭＧ１）の培養液５０ｍｌに、グルコース５ｇ、ＮＡＤＰ６ｍｇ、２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノン４ｇ、および、トルエン４ｇを添加し、５Ｍの水酸化ナトリウムの滴下によりｐＨ６．５に調整しつつ、３０℃で２４時間攪拌した。反応終了後、反応液をトルエンで抽出し脱溶剤した後、抽出物を分析した。その結果、収率９０．５％で光学純度８２．０％ｅ．ｅ．の（Ｒ）−２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノールが得られた。【０１０１】
２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノン、および、（Ｒ）−２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノールの定量は、高速液体クロマトクロマトグラフィー（カラム：株式会社ワイエムシィ製ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＯＤＳ  Ａ−３０３（ＩＤ４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）、溶離液：水／アセトニトリル＝１／１、流速：１ｍｌ／ｍｉｎ、検出：２１０ｎｍ、カラム温度：室温）を用いて行った。また、（Ｒ）−２−クロロ−１−（３’−クロロフェニル）エタノールの光学純度の測定は、高速液体クロマトクロマトグラフィー（カラム：ダイセル化学工業株式会社製Ｃｈｉｒａｌｃｅｌ  ＯＪ（ＩＤ４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）、溶離液：ｎ−ヘキサン／イソプロパノール＝３９／１、流速：１ｍｌ／ｍｉｎ、検出：２５４ｎｍ、カラム温度：室温）を用いて行った。【０１０２】
（実施例１０）  形質転換体を用いた（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エチルの製造
実施例６と同様に培養したＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＴＣＭＧ１）の培養液５０ｍｌに、グルコース６ｇ、ＮＡＤＰ４ｍｇを添加した。この反応液を３０℃で攪拌し、５Ｍの水酸化ナトリウムの滴下によりｐＨ６．５に調整しつつ、１時間に０．５ｇの割合で、合計５ｇの４−クロロ−３−オキソ酪酸エチルを添加した後、さらに５時間攪拌を続けた。反応終了後、反応液を酢酸エチルで抽出し脱溶剤した後、抽出物を分析した。その結果、収率９３．１％で、光学純度８０．５％ｅ．ｅ．の（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エチルが得られた。【０１０３】
４−クロロ−３−オキソ酪酸エチル、および、（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エチルの定量は、ガスクロマトグラフィー（カラム：ＰＥＧ−２０Ｍ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｒｂ  ＷＡＷ  ＤＭＣＳ  １０％  ８０／１００  ｍｅｓｈ（３ｍｍＩＤ×１ｍ；ジーエルサイエンス株式会社製）、カラム温度：１５０℃、キャリアガス：窒素、検出：ＦＩＤ）を用いて行った。また、（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシ酪酸エチルの光学純度の測定は、高速液体クロマトグラフィー（カラム：Ｃｈｉｒａｌｃｅｌ  ＯＢ（４．６ｍｍＩＤ×２５０ｍｍ；ダイセル化学工業社製）、溶離液：ｎ−ヘキサン／イソプロパノール＝９／１、流速：０．８ｍｌ／ｍｉｎ、検出：２１５ｎｍ、カラム温度：室温）を用いて行った。【０１０４】
（実施例１１）  形質転換体を用いた６−ベンゾイルオキシ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルの製造
実施例６と同様に培養したＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＴＣＭＧ１）の培養液４０ｍｌに、グルコース３ｇ、ＮＡＤＰ６ｍｇ、（Ｓ）−６−ベンゾイルオキシ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチル４ｇ、および、トルエン１．６ｇを添加し、５Ｍの水酸化ナトリウムの滴下によりｐＨ６．５に調整しつつ、３０℃で２４時間攪拌した。反応終了後、反応液をトルエンで抽出し脱溶剤した後、抽出物を分析した。その結果、収率９２．３％でジアステレオマー過剰率９９．７％ｄ．ｅ．の（３Ｒ，５Ｓ）−６−ベンゾイルオキシ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルが得られた。【０１０５】
（Ｓ）−６−ベンゾイルオキシ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチル、および、（３Ｒ，５Ｓ）−６−ベンゾイルオキシ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルの定量、さらに、（３Ｒ，５Ｓ）−６−ベンゾイルオキシ−３，５−ジヒドロキシヘキサン酸ｔｅｒｔ−ブチルのジアステレオマー過剰率の測定は、高速液体クロマトグラフィー（カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＯＤＳ−Ａ３０３（４．６ｍｍＩＤ×２５０ｍｍ；ＹＭＣ社製）、溶離液：水／アセトニトリル＝１／１、流速：１ｍｌ／ｍｉｎ、検出：２１０ｎｍ、カラム温度：室温）を用いて行った。【０１０６】
（実施例１２）  ポリペプチドの基質特異性
０．３３％（ｖ／ｖ）のジメチルスルフォキシドを含む１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に、基質となるカルボニル化合物を終濃度１ｍＭ、補酵素ＮＡＤＰＨを終濃度０．２５ｍＭとなるようそれぞれ溶解した。これに、実施例１で調製した精製ポリペプチドを適当量添加し、３０℃で１分間反応を行った。当該反応液の波長３４０ｎｍにおける吸光度の減少速度から、各カルボニル化合物に対する還元活性を算出し、これを３−オキソ−３−フェニルプロパンニトリルに対する活性を１００％とした場合の相対値で表し、表２に示した。表２から明らかなように本発明のポリペプチドは、広範なカルボニル化合物に対して還元活性を示した。【０１０７】
【表２】
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【図１】
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【配列表】
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