(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原と、マンノースユニットとアルデヒド基とを含む酸化されたマンナンとの間の複合体と、薬学上許容される担体からなる免疫組成物。
【請求項２】
抗原が、花粉、C型肝炎ウイルス(HIV)コア、E1、E2及びNS2蛋白質、プラスモディウムファルシパルム（Plasmodiumfalciparum)周胞子体蛋白質、HIV-gp120/160エンベロープ蛋白質、連鎖球菌表面蛋白質抗原、インフルエンザ核蛋白質、血球凝集-ノイラミニダーゼ表面感染、TcpAピリンサブユニット、VP1蛋白質、LMCV核蛋白質、リーシュマニア（Leishmania）主要表面糖蛋白質（gp63）、百日咳菌表面蛋白質、恐水病ウイルスG蛋白質、連鎖球菌M蛋白質、シンシチアウイルス（Syncyticialvirus、RSV)FまたはG蛋白質、エプスタインバー(EpsteinBar)ウイルス（EBV)gp340、または核抗原3A、血球凝集素、ライム病ボレリア（Borreliaburgdorferi）外表面蛋白質（Osp)A、結核菌38kDaリポプロテインまたはAg85、髄膜炎菌クラス１外蛋白質、水痘帯状疱疹ウイルスIE62及びgpＩ、風疹ウイルスカプシド蛋白質、Ｂ型肝炎ウイルスpreS1ag、Ｉ型単純ヘルペスウイルス糖蛋白質ＧまたはgpＤまたはCP27、マリーバレー脳炎ウイルスE糖蛋白質、Ａ型肝炎ウイルスVP1、ポリオウイルスカプシド蛋白質VP1、VP2及びVP3、トラコーマクラミジア表面蛋白質、Ｂ型肝炎エンベロープAgpreS2、ヒトライノウイルス（HRV)カプシド、腫瘍遺伝子E6及びE7由来の乳頭腫ウイルスペプチド、リステリア表面蛋白質、水痘ウイルスエンベロープ蛋白質、ワクチニアウイルスエンベロープ蛋白質、ブルセラ表面蛋白質、前記抗原の１種またはそれ以上組合せ、長さに於て前記５個以上のアミノ酸または前記サブユニットの１個以上の組合せから成る前記抗原のアミノ酸サブユニットから選ばれた抗原であることを特徴とする請求項１記載の組成物。
【請求項３】
抗原が全細胞またはその細胞成分分画から成る請求項1に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は疾病状態の免疫療法、限定されることはないが、特に腫瘍の免疫療法に関する。
【０００２】
癌は近代社会に於て、死亡及び重度の侵襲の主要な原因である。癌は若年、老年、男性、女性に無差別で、全人種に癌は発病するが、小児の癌は比較的稀であり、恐らく例外は小児白血病である。西欧社会に於ては、結腸癌及び肺癌は主要な疾病である。女性に於ては、乳癌は最も多い癌である。
【背景技術】
【０００３】
多くの癌はヒト  ムチンの過剰産生を伴う。ムチン類は約100 Kdより大量の高度に糖の結合した蛋白質であり、多様な上皮細胞及び腫瘍に依って産生される(Gendler, S., Papadimitriou, J. T., Duhing, T., Rothbard, J. & Burchell, J., J. Biol. Chem., 263:12820-12823, 1988) 。癌細胞に見出されるムチン類は、通常の上皮細胞に見出されるムチン類とは幾つかの点で異なっており、或種のムチン類は炭水化物のコートを欠いて蛋白質の核が露出している(Harisch, F. G. & Uhlenbruck, G., J. Biol. Chem., 264:872-883, 1989)。既知のヒトのムチン類はMUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5、MUC6及びMUC7であり（Marjolijn, J. L., Ligtenberg, M. J. L., Vos, H. L., Annemiek, M. C., Gennissen, A. M. C. & Hilkens, J. Episialin, J. Biol. Chem., 265:5573-5578, 1990 、Crocker, G. & Price, M. R., Br. J. Cancer, 55:651-652, 1987 、Apostolopoulos, V., Xing, P.X., and McKenzie I.F.C., Cancer Forum, 17:11-116, 1993、Bobek, L.A., Tsai, H., Besbrock A. R., Levine, M.J., J. Biol, Chem., 268:20563-20569, 1993) 、MUC1が最も広く存在する。種々のムチン類はいずれも極めて類似した性状を有する膜透過性の糖蛋白質であり、種々の数の反復アミノ酸配列を有していて、セリン、スレオニン及びプロリンに富んでいる。
糖が結合していないか、または糖結合の不足した異常な糖結合のムチン類の過剰産生が、乳癌、子宮癌、膵癌、結腸癌、肺癌、前立腺癌及びその他の分泌組織の腫瘍の特徴である。ヒト  ムチン類MUC1乃至MUC7のそれぞれの蛋白質核のcDNA配列がクローンされて、特徴付られており、VNTR'sとして知られる特定アミノ酸の主要素の反復数が異なる高度に反復性の中心部が見出されている。例として挙げると、MUC1は特異なアミノ基及びカルボキシ基末端配列から成り、20種のアミノ酸主要部の40乃至80個の縦列主要素を有している。MUC1乃至MUC7のVNTRを以下に示す：
MUC1 VNTR - SAPDTRPAPGSTAPPAHGVT
MUC2 VNTR - PTTTPISTTTMVTPTPTPTGTQT
MUC3 VNTR - HSTPSFTSSITTTETTS
MUC4 VNTR - TSSASTGHATPLPVTD
MUC5 VNTR - PTTSTTSA  （494 塩基対を挿入 - 8個のアミノ酸の縦列反復）
MUC6 VNTR - 169 個のアミノ酸反復単位
MUC7 VNTR - TTAAPPTPPATTPAPPSSSAPPE
【０００４】
MUC6の反復サブユニットは169 個のアミノ酸から成るが、この際の反復アミノ酸配列単位は完全に解明されていない。MUC7配列は最近発表された(Bobek, L.A., Tsai, H., Besbrock A. R., Levine, M.J., J. Biol, Chem., 268:20563-20569, 1993)。
【０００５】
Finnらは乳癌(Barnd, D. L., Lan, M. S., Metzgar, R. S., Finn, O. J., Proc. Natl. Acad. Sci., 86:7159-7163, 1989、Jerome, K. R., Barnds, D. L.,Boyer, C. M., Taylor-Papadimitriou, J., McKenzie, I.F.C., Bast, R, C., and Finn, O. J., Adenocarcinoma reactive cytotoxic T-lymphocytes recognize an epitope present on the protein core of epithelial mucin molecules.Cellular immunity and immunotherapy of cancer, 321-328, 1990) 、膵癌、子宮癌及びその他の腫瘍患者のリンパ節中に、細胞毒性のリンパ球が存在してヒト
ムチンと反応することを示した。MUC1ペプチドに対する抗体は、MUC1+ 標的細胞上のこれらの細胞毒性T-リンパ球の活性を遮断することが可能である(Barnd,D. L., Lan, M. S., Metzgar, R. S., Finn, O. J., Proc. Natl. Acad. Sci.,86:7159-7163, 1989、Jerome, K. R., Barnds, D. L., Boyer, C. M., Taylor-Papadimitriou, J., McKenzie, I.F.C., Bast, R, C., and Finn, O. J., Adenocarcinoma reactive cytotoxic T-lymphocytes recognize an epitope present on the protein core of epithelial mucin molecules. Cellular immunity andimmunotherapy of cancer, 321-328, 1990) 、最近、ネズミ肺癌に対する細胞毒性リンパ球も報告された(Mandelboimo, O., Berke G., Fridkin, M., Feldman,M., Eisenstein, M., and Eisenbach, L., Nature, 369, 67-71, 1994)。
【０００６】
腫瘍摘除に伴う手術は患者にとっては侵襲であり、身体の形態を損ない、経費を要することが多い。腫瘍治療の為の確立された化学療法及び放射線治療は、外科手術の代りに又は外科手術と併用して行なわれて、しばしば患者を衰弱させ、重度の副作用を伴っている。従って、腫瘍の予防並びに治療の化合物および治療法の必要性は急を要する。
【０００７】
癌治療の新規化合物及び治療方法の必要性は急を要する。同様に、Ｉ型アレルギー、マラリア、HIV 、齲蝕、インフルエンザ、コレラ、口蹄疫、髄膜炎、リーシュマニア感染症、百日咳、恐水病、連鎖球菌感染症、呼吸器感染症、麻疹、ライム病、結核、細菌性髄膜炎、帯状疱疹、風疹、肝炎、ヘルペス、Ａ型肝炎、急性灰白髄炎、性病及びトラコーマ、Ｂ型肝炎、風邪、子宮頚癌、髄膜炎及び肺炎、水痘、天然痘、肺炎及び原因不明熱の様な疾病状態の治療に代わり得る化合物または治療方法の必要性は急を要する。
【０００８】
本発明の第１の態様に従うと、抗原及び炭水化物重合体との複合体から成る化合物を提供する。
【０００９】
本発明の別の態様に従うと、ヒト  ムチン  ポリペプチド、その１つまたはそれ以上のサブユニットの反復、または反復サブユニットの分画と炭水化物重合体との複合体から成る化合物を提供する。
【００１０】
本発明の好ましい実施態様に於ては、炭水化物重合体は、炭水化物に属するマンノースの重合体である。
【００１１】
本発明が関与する限り、抗原はヒト自己抗原またはウイルス、微生物もしくは植物由来のペプチド抗原、あるいは少なくともアミノ酸５つの長さのサブユニットのヒト自己抗原、またはウイルス、微生物もしくは植物由来のペプチド抗原であれば良い。本発明の抗原は１つ以上、上記した様に５つまたはそれ以上のアミノ酸サブユニットから成ることが可能である。これらの結合したサブユニットの起源は上記した範囲内に於て同一または異なって良い。
【００１２】
本発明に描かれた抗原の例は以下の通りである：花粉、Ｃ型肝炎ウイルス(HIV) コア、E1、E2及びNS2 蛋白質、プラスモディウム  ファルシパルム(Plasmodium falciparum）周胞子体蛋白質、HIV ー 群120/160 エンベロープ糖蛋白質、連鎖球菌表面蛋白質抗原、インフルエンザ核蛋白質、血球凝集- ノイラミニダーゼ表面感染、TcpAピリン(pilin) サブユニット、VP1 蛋白質、LMCV核蛋白質、リーシュマニア（Leishmania）主要表面糖蛋白質（gp63）、百日咳菌表面蛋白質、恐水病ウイルスG 蛋白質、連鎖球菌M 蛋白質、シンシチア  ウイルス(Syncyticial virus、RSV ＦまたはＧ蛋白質）、エプスタイン  バー(Epstein Bar) ウイルス(EBV) gp340 、または核抗原3A、血球凝集素、ライム病ボレリア(Borrelia burgdorferi)外表面蛋白質(Osp) Ａ、結核菌38kDa 脂質蛋白質またはAg85、髄膜炎菌クラス１外蛋白質、水痘帯状疱疹ウイルスIE62及びgpＩ、風疹ウイルス  カプシド蛋白質、Ｂ型肝炎ウイルスpre S1 ag 、Ｉ型単純ヘルペスウイルス糖蛋白質ＧまたはgpＤまたはCP27、マレー渓谷脳炎ウイルスE 糖蛋白質、Ａ型肝炎ウイルスVP1 、急性灰白髄炎カプシド蛋白質VP1 、VP2 及びVP3 、トラコーマ病原体表面蛋白質、Ｂ型肝炎ウイルス  エンベロープAg pre S2 、ヒト  ライノ  ウイルス (HRV)カプシド、腫瘍遺伝子E6及びE7由来の乳頭腫ウイルス  ペプチド、リステリア表面蛋白質、水痘ウイルス  エンベロープ蛋白質、ワクチニア  ウイルス  エンベロープ蛋白質、ブルセラ表面蛋白質、前記抗原の１種またはそれ以上組合せ、長さに於て５個以上のアミノ酸、または前記サブユニットの１個以上から成る前記抗原の１個以上の組合せ、５個以上の抗原のアミノ酸サブユニット、もしくは前記サブユニットの１個以上の組合せから選ばれた抗原である。
【００１３】
本発明の抗原は全細胞またはその細胞成分分画から成ることが可能である。この様な細胞またはその細胞成分分画はいずれの型の腫瘍又はその他の起源から誘導可能である。全細胞または細胞成分分画から誘導される癌の型の例として、乳癌、肺癌、膵及び結腸癌及び黒色腫がある。腫瘍から得られる特定抗原のその他の例としては、黒色腫特定抗原、例えばMAGEシリーズ抗原、結腸及びその他の癌からの癌胎児性抗原(CEA）、またはあらゆる腫瘍から抽出された抗原がある。
【００１４】
本発明は列挙した抗原のいずれか１つまたはそれ以上を含み、先に指摘した様に、いずれもセリン、スレオニン及びプロリンに富む反復アミノ酸配列を反復性中枢部分から成り、特にヒト  ムチンMUC1乃至MUC7の１つまたはそれ以上を含む。特に、本発明の化合物は通常の対立遺伝子の変化を伴う多様な反復数を含むヒト  ムチン  ポリペプチド、またはヒト  ムチンの反復配列の１つまたはそれ以上から成ることが可能で、好ましくは２乃至80個、更に好ましくは２乃至20個、また更により好ましくは２乃至10個のヒト  ムチンの反復サブユニットから成ることが可能である。ヒト  ムチン及びそのサブユニットは、好ましくは癌細胞に見出されてムチンに免疫反応を呈する様に、糖の結合していないか、または異常に糖が結合して、蛋白質核が露出したままである炭水化物コートを欠いている。ヒト  ムチンMUC1の使用が特に好まれるが、本発明があらゆる抗原及び特にヒト  ムチン類MUC1乃至MUC7の使用に及ぶと理解せねばならない。便宜上、MUC なる用語は以降全てのヒト  ムチンMUC1乃至MUC6及びその反復サブユニットに関して使用する。ヒト  ムチン類のみが以後扱われるので、本発明は前記した全てのその他の抗原に等しく関連すると承知すべきである。
【００１５】
MUC 分画も炭水化物重合体と複合する。これらの分画は通常すべてのムチン類MUC1乃至MUC6反復アミノ酸配列の５乃至20個のアミノ酸から成っている。例えば、ムチンMUC1の１分画は、アミノ酸配列APDTR 、APDTRPAPG 、DTRPAPGSTAPP及び類似物から成っている。記載の便宜上、これらの分画はMUC の定義に含まれる。同様に、その他の抗原分画は少なくともアミノ酸５個より成り炭水化物重合体と複合体を形成することが可能である。
【００１６】
MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5、MUC6またはMUC7の様な特定抗原は、組換え宿主細胞中の融合蛋白質の産生に於て、発現及び精製を促進する為に、融合蛋白質が形成可能である。融合蛋白質の非抗原部分は、通常抗原配列を構成するC-末端配列を有する融合ポリペプチドのN-末端領域を現わす。融合蛋白質はグルタチオン-S- トランスフェラーゼ、β- ガラクトシダーゼ、またはその他の蛋白質もしくはその一部から選ばれ、特に得られた融合蛋白質を精製する為に、結合性または蛋白質のその他の親和特性を用いて、親和精製を可能とするものから選ばれる。本蛋白質は担体蛋白質のC-末端またはN-末端と融合可能である。融合蛋白質の性状は、それを製造するベクトル  システムに依存する。細菌性発現ベクトルの例はpGEXであり、このベクトルの対象とする遺伝子のサブクローニングに於て、対象とする蛋白質と共にグルタチオン-S- トランスフェラーゼから成る融合蛋白質を形成する。対象とする蛋白質と共に融合蛋白質を形成するその他のベクトル  システムの例は、Sambrookらに依って報告されており(Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, 1989)、引用文献に依って本発明にすべて取り入れられている。これらは取入れ、または削除され、取り入れられた場合には"担体" の機能を有する。
【００１７】
蛋白質または融合蛋白質は、多種類の原核生物(E. coliまたはB. subtilis)もしくは真核生物（バキュロウイルス（bacuro virus) 、チャイニーズ  ハムスター卵巣(CHO) 由来細胞、cos 細胞または酵母）の多くに発現システムで発現可能である。これらのシステムの中で、例えば、バキュロ  ウイルスまたは酵母は、糖結合主要素を蛋白質または融合蛋白質、適当にはマンノースに富んだ糖結合に導入して、マンノースに富んだ炭水化物重合体との化学的結合の必要性を失わせる。これらの新規融合蛋白質は穏和な過ヨウソ酸酸化の有無双方で使用可能である。
【００１８】
本発明化合物の炭水化物部分はすべての炭水化物重合体、例えばグルコース、ガラクトース、マンノース、キシロース、アラビノース、フコース、グルコサミン、ガラクトサミン、ラムノース、6-O-メチル-D- ガラクトース、2-O-アセチル- β-D- キシロース、N-アセチル- グルコサミン、イズロネート(iduronate）、グルロネート(guluronate)、マンヌロネート(mannuronate）、ガラクツロン酸メチル(methyl galacturonate)、α-D- ガラクトピラノース 6- 硫酸エステル、フルクトースまたはαアベクォース(abequose)、それらの配座または立体配置異性体、または２つ以上の異なったモノマー単位から形成される炭水化物から選ばれる。重合体中の繰り返しモノマー単位は重要ではないが、通常炭水化物重合体は少なくとも20個のモノマー単位から成っており、好ましくは 100個以上のモノマー単位、更に好ましくは 1,000個以上のモノマー単位であり、また更により好ましくは10,000個以上のモノマー単位から成る。炭水化物重合体は種々の分子量の多糖類鎖の混合物で良い。最も好ましくは炭水化物重合体はマンノース重合体、またはマンノース単位を含む炭水化物重合体である。
【００１９】
抗原は多糖類及び単糖類の誘導体化及び反応の為の、炭水化物化学技術に周知の標準的方法に従って炭水化物重合体に結合可能である。炭水化物は過ヨウソ酸ナトリウムの様な通常の酸化剤を用いて酸化して多価アルデヒドを生成して、次いでMUC1の反復サブユニットの様な抗原と直接反応が可能であり、そこでは蛋白質鎖上のリジンのイプシロン基の様なアミノ官能基がアルデヒド基と反応して、場合に依りさらに還元されてシッフ塩基の形成が可能である。多糖類鎖は先ずブロモシアンで活性化され、活性化された多糖類がジアミンと反応し、次いで抗原と複合して複合体を形成し、場合に依り更に酸化される。炭水化物及びポリペプチドは２官能性試剤と反応して、炭水化物とポリペプチドとを架橋させ得る。通常使用される架橋剤には1,1-ビス（ジアゾアセチル)-2-フェニルエタン、グルタルアルデヒド、N-ヒドロキシスクシイミドエステル類、例えば4-アジドサルチル酸、3,3'- ジチオビス（スクシイミジル -プロパネート）の様なジスクシイミジルエステルを含む同種官能性イミドエステル類、及びビス-N- マレイミド-1,8-オクタエンの様な２官能性マレイン酸イミドが含まれる。3-[(p-アジドフェニル）ジチオ]-プロピオイミドメチルエステルの様な誘導体化剤は光学的に活性化可能な中間体を生成して、光の存在下に架橋が形成可能である。酸化された炭水化物は抗原のヒドラジン誘導体と反応して複合体を生成する。或いは、炭水化物はカルボニルジイミダゾールの様な試剤と反応して、酸化後に所望の複合体を生成する。
【００２０】
抗原の炭水化物へのカップリングは、炭水化物のいずれかの又はすべての官能基をして反応性基に変換し、その後炭水化物の反応性基とポリペプチドの反応性基と反応させる。炭水化物重合体には、水酸基が多数存し、時として、イズロン酸塩における様なカルボキシル基、ガラクチュロン酸メチルの様にエステル基及び類似基を有している。これらの基は通常の化学反応処理で活性化される。例えば、水酸基はヨウ化水素、臭化水素及び塩化水素の様なハロゲン化水素と反応して反応性ハロゲン化多糖類を形成する。水酸基は三ハロゲン化リン、ナトリウム  エトキシド、アルミニウム  イソプロキシド及びカリウム  ｔ−ブトキシドの様な活性化金属で活性化され、もしくは塩化トシルまたは酢酸のような基に依ってエステル化され反応性基を形成して、次いでポリペプチドの反応性基と反応して、１個またはそれ以上の結合を形成する。水酸基以外の炭水化物のその他の官能基は、当業者には周知の方法に依って活性化されて反応性基を生じる。
【００２１】
MUC またはその他の抗原からなるポリペプチドは、ペプチド合成、蛋白質精製、または宿主細胞中に於けるポリペプチドの発現の様な周知の方法に従って形成される。
ペプチド合成は、例えばMUC1の５つのサブユニットの反復の様な約100 個に及ぶアミノ酸を含有するポリペプチドに用いられる。通常、約20個以上のアミノ酸を含むポリペプチドには、好ましい生成方法は宿主細胞中、好ましくは原核宿主細胞、更に好ましくは細菌性宿主細胞中の組換え発現である。しかしながら、先に考察した様に、真核細胞系も用いられる。宿主細胞中の組換え蛋白質の発現方法は充分に確立されており、例えばSambrookらを参照のこと(Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, ColdSpring Harbor, 1989)。
【００２２】
常法によって炭水化物は天然起源のものから精製され又は合成される。炭水化物は多数の供給源から市販されている。
【００２３】
別の態様に於て、本発明はヒトの病的状態に対する及び特にヒト  ムチンまたはそのサブユニットを発現する腫瘍細胞に対する免疫原性ワクチンに関し、抗原と炭水化物重合体との複合体からなる化合物と薬学的に許容される担体から成る。本発明のこの態様で使用される抗原は先に記述した通りである。本ワクチンはヒト患者に、癌細胞の成長、及び特に乳癌、結腸癌、肺癌、膵癌、前立腺癌、及び類似の分泌組織の腫瘍の成長を含む種々の病的状態に対して防護の目的で投与される。患者は本ワクチンで分泌組織の腫瘍形成に対して免疫処置される。或は、腫瘍患者は腫瘍治療の一環としてワクチンで免疫処置される。例として、女性を乳癌から守る為に、思春期前期または後期にワクチンで免疫処置として、１回または複数回の注射を受け、好ましくは初期免疫処置を施行し、次いで数カ月乃至数年後に１回または複数回の追加抗原注射を行なう。１回の免疫処置スケジュールに於て、女性は本発明化合物に依って免疫処置し、次いで適当な間隔の後に追加免疫注射を受ける。その後の追加免疫注射は定期的に実施する。免疫処置の経路は通常のヒト  ワクチン投与と異なることはない。従って、ワクチンは皮下、筋肉内、経口、静注等の方法で投与される。
【００２４】
本方法に於て保護される可能性のあるその他の病的状態には、Ｉ型アレルギー、マラリア、HIV 、齲蝕、インフルエンザ、コレラ、口蹄疫、髄膜炎、リーシュマニア感染症、百日咳、恐水病、連鎖球菌感染症、呼吸器感染症、麻疹、ライム病、結核、細菌性髄膜炎、帯状疱疹、風疹、肝炎、ヘルペス、Ａ型肝炎、急性灰白髄炎、性病及びトラコーマ、Ｂ型肝炎、風邪、子宮頚癌、髄膜炎及び肺炎、水痘、天然痘、肺炎及び原因不明熱が含まれる。
【００２５】
本発明の化合物またはその組成物の、患者への投与量は臨界量的または限定的ではない。本発明化合物の有効量は抗原成分に対して免疫反応を刺激するであろう量である。本化合物または組成物の投与量は、患者の免疫状態に依って異なり、患者が免疫抑制されているか、免疫促進されているかに依存し、担当の医師または獣医が、本化合物をワクチンとして予防的に、または疾病状態の治療に、或は腫瘍形成の予防ワクチン、もしくはワクチンを既に存する腫瘍の治療に使用するかを判断する。例として、患者は本発明化合物の 1μg 乃至10,000μg 、より好ましくは50μg 乃至 5,000μg 、更により好ましくは 100μg 乃至 1,000μg、また更に好ましくは 100μg 乃至 500μg を投与する。添加剤は通常必要としない。しかしながら、添加剤は免疫処置には使用可能である。適当な添加剤にはいずれの添加剤でも、またはヒトの免疫処置のワクチン技術に周知の添加剤と同様に明礬が含まれる。
【００２６】
本発明化合物はサイトカイン(cytokine)またはその他の免疫制御剤と併用して患者に投与可能である。例として、本発明化合物と併用可能な免疫制御剤は、１種またはそれ以上のGM-CSF、G-CSF 、M-CSF 、TNF αまたはβ、インターフェロンαまたはγ、IL1 乃至IL3 のいずれか、またはすべてその他のサイトカインも含まれる。免疫制御剤は本発明の化合物と同時に、場合に依っては複数成分投与形の一部として投与可能である。或は、本発明の化合物及び免疫制御剤は異なった投与間隔で投与可能である。
【００２７】
本発明の更に別の態様では、抗原と炭水化物重合体との複合物から成る化合物を、場合に依り薬学的に許容される担体と共に、ヒトを含む動物に投与することから成る、抗原に対する細胞介在性免疫反応を誘発する方法を提供する。
【００２８】
本発明の化合物に依るヒト及び動物の免疫処置は、抗原成分を発現する細胞に対する細胞毒性である活性化T-リンパ球の細胞性の反応増強を誘発する。例として、ヒト及び動物はヒト  ムチン類を発現する腫瘍に対して免疫処置される。本発明の潜在的利点は、本発明の化合物が、ムチンまたはその他の抗原決定基を発現する腫瘍細胞を殺す細胞毒性T-細胞の細胞性免疫反応を誘発する可能性として、腫瘍が成長する前に癌に対して動物が保護されるであろう事実から生じる。本発明は腺癌の様な、より特に乳癌、子宮癌、膵癌、結腸癌、肺癌、前立腺癌等の分泌性組織の腫瘍に対する免疫処置に適用される。
【００２９】
本発明の化合物は、癌の根絶を目標とした総合的治療の一部に、癌患者の治療薬剤としても使用される。従って、本発明の化合物は癌患者に腫瘍を摘除する手術の前または後に投与可能である。好ましくは本化合物は腫瘍摘除後の化学療法の一部として投与する。これらの状況下で、本発明の化合物は、腫瘍治療に用いられる細胞毒性化合物の投与を目的とした標準的な化学療法に準じて投与する。
【００３０】
本発明の化合物は治療上の免疫処置、または先に指摘したその他の疾患状態の治療または予防に使用される。
【００３１】
更に別の観点から、本発明は腺癌、特に乳癌治療に於て、ヒト  ムチン  ポリペプチド、その１個またはそれ以上の反復サブユニット、または反復サブユニットの分画と炭水化物重合体との複合体から成る化合物の使用に関する。
【００３２】
本発明の化合物は動物及びヒトに投与して実質的に無毒である利点を有しており、その結果本化合物は患者の投与に充分安全である。
【００３３】
茲に記述した本発明はヒト  ムチンMUC1に限定されない。本発明は多糖類との結合でその他の抗原の使用すると同様に、明らかに癌細胞に依って発現するその他のムチン類の使用に迄拡張され、腫瘍細胞に対する細胞毒性T-細胞反応を誘発するに用いられ、本化合物は、癌治療、及び／または上記したその他の病的状態の治療または予防と同様に、腫瘍形成を予防するワクチンに使用される。
【００３４】
本発明は以下に非限定的実施例を参照して記述する。
【００３５】
以下の略号を実施例に使用する。
略号
ELISA:  enzyme linked immunosorbent assay   酵素結合免疫吸着剤検出法  
DTH:    delayed type hypersensitivity   遅延型過敏症
FP:     fusion protein  融合蛋白質
GST:    glutathione-S-transferase   グルタチオン-S- トランスフェラーゼ  
HMFG:   human milk fat globule  ヒト乳脂肪小球
Kd:     kilodalton  キロダルトン
KLH:    keyhole-impet haemocyanin   スカシガイのヘモシアニン
PAGE:   polyacrylamide gel electrophoresis  ポリアクリルアミド  ゲル電気泳動
PBS:    phosphate buffered saline   リン酸緩衝生理食塩液
SDS:    sodium dodecylsulfate   ドデシル硫酸ナトリウム
Tc:     cytotoxic T-lymphocyte  細胞毒性T-リンパ球
VNTR:   variable number of tandem repeats   数値変量縦列反復
CTL:    cytotoxic T-cells   細胞毒性T-細胞
M-FP:   mannan fusion protein   マンナン融合蛋白質
MHC:    major histocopmpatibility complex   主要組織適合遺伝子複合体  
MSA:    mucin serum antigen   ムチン血清抗原
CASA:   circulationg MUC1 serum antigen   循環血中MUC1血清抗原
【実施例１】
【００３６】
材料と方法
合成ペプチド、融合蛋白質、及びHMFG産生並びに免疫処置：
ペプチドC-p13-32（MUC1 VNTR)、p31-55及びp51-70（N-末端からVNTR）及びp344-364及びp408-423（C-末端からVNTR）をアップライド  バイオシステムズ社モデル430A（Applied Biosystems Model 430A)自動ペプチド合成器を用いて合成した（配列は表１に示す）。マウスCD4 N-末端領域ペプチド(T4N1)も陰性対照ペプチドとして合成して使用した（表１）。HMFGはヒト乳より単離した(Xing, P.X., Tjandra, J. J., Stacker, S. A., Teh, J. G., Thompson, C. H., McLaughlin, P. J., and McKenzie, I. F. C., Immunol. Cell Biol., 67:183-185, 1989)。
5 VNTR反復を含む融合蛋白質 (Apostolopoulos, V., Xing, P. X., Trapani,J. A. and McKenzie, I. F. C., Br. J. Cancer, 67:713-720, 1993)は、cDNAの細菌性発現ベクトルpGEX-3X 中にサブクローニングして作成した(Siddiqui, J., Abe, M., Hayes, D., Shani, E., Yunis, E. & Kufe, D., Proc. Natl. Acad.Sci., 85:2320-2323, 1988)(表１）。
【００３７】
雌性８週齢BALB/cマウスを、フロインドの完全アジュバンドで乳化したグルタールアルデヒドを用いてジフテリア毒素と縮合した融合蛋白質HMFG、C-p13-32またはジフテリア毒素と縮合したT4N1の50μg を腹腔内投与して免疫処置した。本操作をリン酸緩衝生理食塩液中で４及び６週間後に反復した。腫瘍注射前および腫瘍拒絶後に、マウスを飼育し、血清は対応する免疫原に対する抗体産生をELISA 法で測定した。
【００３８】
MUC1+ 3T3 腫瘍（これらの細胞の調製法は後記を参照）は、適量の腫瘍細胞を含有する0.2 mlを皮下注射した。抗-CD3、抗-CD4、抗-CD8および抗- γ- インターフェロン抗体を投与したマウスに、腫瘍投与の２日前、当日（第０日）、および２日後に腫瘍量0.2 mlを腹腔内投与した。抗体を投与すべきマウスに、約0.15 cm2の腫瘍を、0.2 mlのウサギ補体血清を静注した第０および５日に皮下注射し、また0.2 mlの抗体は、第５及び７日に腹腔内投与した。
【００３９】
[表１]
合成ペプチドの配列
────────────────────────────────
ペプチド                  アミノ酸配列
────────────────────────────────
MUC1 VNTR: Cp-13-32       C-PAHGVTSAPDTRPAPGSTAP
融合蛋白質                (PAHGVTSAPDTRPAPGSTAP) x 5-GST
N-末端領域からMUC1へ：
p31-55                    TGSGHASSTPGGEKETSATQRSSVP
p51-70                    RSSVPSSTEKNAVSMTSSVL
C-末端からMUC1へ：
p334-364                  NSSLEDPSTDVVQELQRDISE
p408-423                  TGFQYKTEAASRVNL
マウスCD4: T4N1           KTLVLGKEQESAELPCEY
────────────────────────────────
【００４０】
マウスへの抗体投与：
CD3 、CD4 およびCD8 に対する抗体が欠如しているか、または CD3+ 、CD 4+およびCD 8+ T-細胞がブロックされているかを確認する目的で、残留細胞の血清学的分析を、CD3 、CD4 及びCD8 に対する抗体を用いて実施した。脾臓およびリンパ節細胞を、正常および処置BALB/cマウスより摘除し、リンパ球を処置し、DME 中で洗浄し、37℃で５分間、0.83% 塩化アンモニウム中で赤血球を溶血する為に反応させた。血清学的テストは、抗-CD3、抗-CD4及び抗-CD8腹水の1:500 希釈液に、マウスの2 x 105 脾臓及びリンパ節細胞を添加して行なった。充分に洗浄した後に、細胞をマウス胸腺細胞を吸着したラット抗マウスIgG と、氷冷しながら30分間反応させた。抗-CD3、抗-CD4、抗-CD8または抗-CD4+ CD8 で処理したマウスを、これらの抗体に就いてそれぞれテストした。CD 3+ 細胞が欠如し、 CD4+ びCD8+ 細胞がブロックされていることが見出された。
【００４１】
可溶性GST-MUC1融合蛋白質の調製
MUC1 cDNA のVNTR領域から60塩基対主要部を５回よりやや多く反復コードした309 塩基対の挿入（FDF9.3）(Siddiqui, J., Abe, M., Hayes, D., Shani, E.,Yunis, E. & Kufe, D., Proc. Natl. Acad. Sci., 85: 2320-2323,1988) を、正確に読み取って位置付けした細菌性発現ベクトルpGEX-3X 中にサブクローンした(Smith, D. B. & Johnson, K. S., Gene, 67: 31-40, 1988)。グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST、26Kd) およびMUC1 VNTR (12kD)を含有する融合蛋白質(FP)を、0.1mM IPTGで誘発した(Smith, D. B. & Johnson, K. S., Gene, 67: 31-40, 1988)。細胞を遠心分離で集め、洗浄し、1%(v/v)Triton X-100 を含有する緩衝液中で超音波分解処理した。可溶性FPを含有する上清を硫黄結合グルタチオン- アガロース  ビーズ(Sigma社、St. Louis)と混合し、遠心分離して採取した。FP((C-PAHGVTSAPDTRPAPGSTAP)x 5-GST) を還元型グルタチオン５mMを含有する緩衝液で溶出し、リン酸緩衝生理食塩液に対して透析し、SDS-PAGEで分析した。      
【００４２】
PAGE（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）：
分析すべき試料はSDS 試料緩衝液と混合し、５分間煮沸し、12.5% SDS-PAGEゲルに負荷した。ゲルは0.2%  クーマシー  ブルー(Coomassie brilliant blue)で染色後、7%酢酸で脱色するか、または銀染色した (Apostolopoulos, V., Xing,P. X., Trapani, J. A. and McKenzie, I. F. C., Br. J. Cancer, 67(4):713-720,1993)。分子量マーカーとして、200,000 ミオシン、116,000 β- ガラクトシダーゼ、92,500  ホスホリラーゼ b、66,200  ウシ血清アルブミン(BSA）、43,000  鶏卵の卵白アルブミン、31,000  ウシ炭酸脱水酵素、21,500  大豆トリプシン阻害剤、および14,400  鶏卵の卵白リゾチームを使用した。
【００４３】
マンナンとMUC1融合蛋白質との復合
マンノースを含有する多糖類であるマンナン 14 mgを、0.1Mリン酸緩衝液１ml、pH 6.0乃至9.0 中で、リン酸緩衝液中0.1M  過ヨウ素酸ナトリウム 100μl を使用して４℃ 1時間で酸化してポリアルデヒドにした。エタンジオール10μl を添加して更に30分間、４℃で反応させた後、反応混合物をPD-10 カラムに通過させて、マンナン分画を採取した。酸化マンナンにMUC1 FP 230 μg を添加し、一夜室温で反応させ、以降の研究に使用した。
【００４４】
融合蛋白質はクロラミン-Tを用いて125Iで放射標識した。無標識の融合蛋白質を放射標識蛋白質と、比活性が１x 107 cpm/μg と成る様に混合して、上記の酸化マンナンと反応させた。マンナン-FP はシッフ塩基と残留アルデヒド基を還元することで安定化した。複合体はSDS-PAGE、ウェスターン  ブロット分析及びSepharyl S-208カラム(1.5cm x100cm)を用いてゲル浸透クロマトグラフィーで分析した。
【００４５】
免疫処置スケジュール
雌性８週齢BALB/cマウスを、リン酸緩衝生理食塩液(PBS）中のFP量に相当するマンナン-FP 5 μg 、FPおよびFPと非複合マンナン+FP との混合物で毎週１回３週間腹腔内に免疫処置した。予めFP単独で免疫処置したマウスは、抗体産生の対照として下記の様に用いた。腫瘍注射の前に、マウスを飼育し、血清はFP（抗マンナン抗体）に対する抗体産生に就いてELISA で下記の様に検査した。
【００４６】
腫瘍及び抗体
ras遺伝子とともにＭＵＣ１ｃＤＮＡ膜通過型をBALB/ｃマウス繊維芽細胞株3Ｔ3にトランスフェクトして、ＭＵＣ1+3Ｔ3細胞株を得た（イスラエル、Tel Aviv大学、Dr. D. Wreschnerより入手）。マウスにPBS 中の適量の腫瘍細胞 0.2mlを皮下注射して、以後の腫瘍の成長を測定した。測定のすべてはダイアルゲージ  カリパス（Schnelltaster 、H.C. Kroplin、Hessen、ドイツ）で行い、腫瘍の大きさは腫瘍面積(cm2、直径×直径）で現わした。ネズミのDBA/2 肥満細胞腫株P815、及びMUC1の膜固定型のcDNAを含むMUC1+ P815は、Dr. B. Acres（Trangene社、Strasboug、フランス）より入手した。
【００４７】
ネズミのCD3(KT3.2)、CD4(H129.19)及びCD8(53-6.72)に対するラットMabsを、腹水及び組織培養上清から調製した(Tomonari, K. Immunogenetics, 28:455-458, 1988、Pierres, A., Naquet, P., Van Agthoven, A., Bekkhoucha, F., Denizot, F., Mishal, Z., Schmitt-Verhulst, A-M. and Pierres, M., J. Immunol., 132:2775-2782, 1984、Ledbetter, J. A. and Herzenberg, L. A., Immunol.,Rev., 47:63-90, 1979) 。腹水は上記した様にSCIDマウス中で調製した(Harlow, D. and Lane, D., A Laboratory Manual, E. Harlow and D. Lane eds. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 271, 1988) 。抗-CD3、抗-CD4及び抗-CD8抗体で処理したマウスに、腫瘍注射２日前、当日、及び２日後に、各 0.2mlを３回腹腔内投与した。使用したMUC1抗体は、VNTR反復を５つ有するGST-MUC1細菌性FPに対して作成されたVA1 及びVA2 であった(Apostolopoulos, V., Xing, P. X., Trapani, J. A. and McKenzie, I. F. C., Br. J. Cancer, 67(4):713-720,1993) 。
【００４８】
ペプチド及びHMFGの調製
ペプチドC-p13-32（C-PAHGVTSAPDTRPAPGSTAP)(MUC1 VNTR)及びT4N1(KTLVLGKEQESAELPCEY) (マウスCD4 N-末端領域ペプチド）はアップライド  バイオシステムズ社  モデル430A（Applied Biosystems Model 430A)自動ペプチド合成器を用いて合成した。HMFGはヒト乳から単離して前記した様に調製した(Xing, P. X., Tjandra, J. J., Stacker, S. A., Teh, J. G., Thompson, C. H., McLaughlin, P. J., and McKenzie, I. F. C., Immunol. Cell Biol., 67:183-185, 1989)。
【００４９】
酵素結合免疫吸着剤検出法（ELISA)
(a) 抗融合蛋白質抗体の測定：
微量測定プレートのウェル中でコートした FP 20μg/ml、2%ウシ血清アルブミン（BSA)でブロックした非特異的結合、およびFP並びにマンナン-FP 免疫処置マウスの血清50μl を室温で２時間添加して、ELISA 検出を行なった(Xing, P. X., Tjandra, J. J., Stacker, S. A., Teh, J. G., Thompson, C. H., McLaughlin, P. J., and McKenzie, I. F. C., Immunol. Cell Biol., 67:183-185, 1989)。正常マウス血清(NMS) を陰性対照として用いた。洗浄後、西洋ワサビ  パーオキシダーゼ複合体に結合したヒツジ抗マウス免疫グロブリン（Amersham社、英国）を添加し、室温で反応させ、プレートは0.03% 2,2'- アジノ- ジ (3-エチルベンズチアゾリンスルホネート（Amersham社、英国）、0.1Mクエン酸緩衝液、pH 4.0中の0.02% H2O2(100容量、Ajax Chemical社）で発色させ、所望の濃度に達する迄室温で10乃至15分反応させた。吸光度はプレート読み取り器で 405nmで測定した。
(b) マンナンに縮合した融合蛋白質の活性の測定 :
上記した方法でELISA 検出は以下の変更を加えておこなった： FP 20μg/ml、マンナン-FP 及びマンナンはプレート上でコートし、使用した一次抗体はVA1 及びVA2(抗FP Mabs)とした。
【００５０】
DTH の誘導
マウスでDTH を誘導する為に、シクロフォスファミド（cyclophosphamide、Endoxan-Asta、Mead Johnson）200 mg/kg 体重の腹膜腔内投与を、マンナン-FP５μg の腹腔内投与２日前に行なった。６日後、後肢足蹠に凍結と融解を５回反復した105 個の3T3 またはMUC1+ 3T3 の20μl 、50μg のHMFG、FP、グルタールアルデヒドを用いてスカシガイのヘモシアニンに結合したC-p13-32、関連性のないペプチドT4N1、マンナン-FP 、GST 及びマンナン並びに等量のPBS を注射した。DTH 反応は48時間後に、足蹠の幅と厚さを測定して、その積を算出した。足蹠測定のすべてはダイアルゲージ  カリパス（Schnelltaster 、H.C. Kroplin、Hessen、ドイツ）で行った。
【００５１】
細胞毒性T-リンパ球検定
マンナン-FP で免疫処置したBALB/cマウスを屠殺して脾臓細胞を採取し、2%ウシ胎仔血清/PBSで洗浄した。標的細胞であるP815及びMUC1+ P815細胞は、標準的51Cr放出検定前に、フェニル N- アセチル -α-D- ガラクトサミニド(pagal）5mMを用いて、O-結合グリコシル化阻害の為に２日間反応の有無双方を行なった(Sigma、St. Louis 、米国）。106 個の標的腫瘍細胞は、 100μCi Na251CrO4（AmershamCorp., Arlington Heights）で、37℃、60分間放射性標識し、充分洗浄した。脾臓細胞および標的細胞は培養基中に再度懸濁させ、次いで96ウェル U- 型底プレート（Costar Corp.）中で種々の作用剤- 標的比で混合した。プレートは100 x g 、3 分間遠心して、細胞の接触を開始させ、10% CO2 中、37℃で４時間反応させた。反応後、上清を採取して放射活性をγ- 計数器（Beckman Instrument）で測定した。
【００５２】
自然放出51Crは標的細胞単独の培養で求め、一方51Crの最大放出は10% ドデシル硫酸ナトリウム（SDS ）処理で測定して、比放出率は
[(実験値- 自然放出値)/( 最大- 自然放出値)] x 100% で求めた。
【００５３】
T-増殖検定
M-FPで免疫処置したマウスを屠殺し、脾臓細胞を採取し、2%ウシ胎仔血清/PBSで洗浄し、赤血球を0.14% NH4Cl で溶血させ、100 μl 培養基中の 5x105脾臓細胞の重複培養（duplicate culture)は96- ウェル  プレートに接種した。脾臓細胞は以下の各種の 100μl で刺激した：10μg - T4N1、GST 、マンナン、HMFG、Cp13-32 、FP、MFP 、及び105 個のpagal 処理有無双方の、乳癌細胞3T3 、MUC1+ T3、P815、MUC1+ P815、及び105 個ヒト乳癌細胞株-T47D 、MCF7、及びZR15。すべての腫瘍細胞はmitomycin-C （Sigma 社、オーストラリア、Victoria）25μg/mlで、腫瘍細胞の成長を阻止する為に37℃で２時間処置した。培養は５％CO2中、37℃、36時間行なった。3[H]-TdR（Amersham社、英国）の6.7 Ci/mmol 取り込み測定は培養の最終４時間に行なった（１μCi/ ウェル）。
【実施例２】
【００５４】
MUC1+ 3T3 細胞の血清学的分析：
試験管内のMUC1+ 3T3 細胞は、通常の3T3 細胞と外観および成長の特徴が同一であるので異なっているとは見えなかった。血清学的分析では、MUC1+ 3T3 細胞は高濃度のMUC1を示し、H-2d+であった。MUC1 VNTR ペプチドに対する抗体は、ヒト乳癌細胞株T47DおよびMCF7と同様に、MUC1+ 3T3 およびMUC1+ P815と反応し、抗-HMFG 類別：BC2 抗体、抗- 融合蛋白質：VA1 及びVA2 抗体、並びに抗-MUC1 ペプチド抗体：BCP7、BCP8、BCP9及びBCP10 であった。しかしながら、ネズミ腫瘍はヒト腫瘍とは異なって糖と結合し、MUC1+ 3T3 及びMUC1+ P815細胞は、抗- 炭水化物（3E1.2 ）抗体（エピトープ：glycolylsialyl-Tn ）と反応性だが、その他の炭水化物に対する抗体（CC5-エピトープ：血液群Lca ）とは反応性ではなかった。このことは蛋白質抗原は変化しないが、糖結合が変化することを示す。マウスとヒトとが異なったグリコシル  トランスフェラーゼを有しており、従って糖結合に異なった形態を示すのは驚くことではない。しかしながら、pagal処理で糖が離脱した後は、先には細胞株との反応性が微弱または無く、非-APDTR反応性抗体であるMUC1 VNTR に対する抗体が、そのエピトープが露出したので反応性となった。(AP)DTR(PA) の反応性抗体に就いて差は認められなかった。炭水化物反応性抗体(3E1.2) との反応性には大きな差が存し、pagal 処理後には染色が微弱または失われ、3E1.2 のエピトープがムチンの蛋白質核に酸素を介して結合しているので、pagal が実際にO-結合糖を除去することを示した(Devine, P.L., Clark, B. A., Birrell, G. W., Layton, G. T., Ward, B. G, Alewood, P.F. and McKenzie, I. F. C., Cancer Res., 51:5826-5836, 1991) 。類別を別の機会に行なったが、同一結果が得られ、フェノタイプの安定性が示された（記載なし）。
【００５５】
MUC1+ 3T3 の生体内成長：
BALB/cマウスに5x106 個のMUC1+ 3T3 または3T3 細胞を皮下注射して、その後の成長を測定した。3T3細胞は進行的に成長して、BALB/cマウスに予測される様に拒絶されなかった。これに反して、MUC1+ 3T3 細胞は第10日迄は進行的に成長したが、その後縮小を始め、第18日迄には徐々に消失した。従って、ヒトMUC1+遺伝子生成物は3T3 細胞に免疫原性を与えて拒絶に至る様である。この点はその後の5 x 106 個のMUC1+ 3T3 または3T3 細胞の接種が免疫されたマウスではMUC1+ 3T3 細胞の成長に完全な抵抗性を示し、一方、3T3 細胞は成長して、免疫原性がMUC1+ を有する腫瘍にのみ見出され、この抗原に特異的であった。特異性及び記憶はMUC1+ への免疫反応と、MUC1+ が3T3 の成長性に影響する様な、その他の効果のないことを示す。生体内で経過した腫瘍を用いた反復実験の数週間後に、すべてのマウスがその腫瘍を拒絶するのではなく、30% に至るMUC1+ 腫瘍は成長を続けた。これらの腫瘍を摘除して、MUC1+ を血清学的に測定すると、腫瘍細胞の若干はMUC1- であり、MUC1+ 感染細胞の若干が生体内でそのMUC1+ 発現能力を失うが、本発明者らは遺伝子が未だ存するか否かは確認しなかった。この様な観察は別途にラット腫瘍(Hareuveni, M., Cautier, C., Kieny, M. P., Wreschner, D., Chambon, P. and Lathe, R., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:9498-9502, 1990)で報告され、恐らくMUC1の不安定発現に依るのであろう。その後の研究では、本発明者らは使用した腫瘍が100%MUC1+ であることを、抗-HMFG 抗体BC2を伴うMUC1+ 発現を血清学的にテストすることに依って確証した。
【００５６】
MUC1+ 3T3 細胞に対するT-細胞免疫反応
細胞性免疫はマウスの同種腫瘍移植の拒絶の、最も普遍的な形態であるので、最も妥当な拒絶の形態の様である。この点は抗CD3 抗体の能力が完全に免疫を失ったことで確認された。CD 4+ またはCD 8+ 細胞が拒絶に関与していたか否かを決定する為に、マウスに抗-CD4または抗-CD8抗体を、これらがその他のモデルでは免疫抑制を生じることが既知であるので複数回投与した(Pierres, A., Naquet, P., VanAgthoven, A., Bekkhoucha, F., Denizot, F., Mishal, Z., Schmitt-Verhulst, A-M. and Pierres, M., J. Immunol., 132:2775-2782, 1984、Miller, R. A. and Stutman, O., Nature, 296:76-78, 1982) 。ブロックに依る機能的CD4 細胞喪失は、腫瘍成長に一過性の影響を与え、腫瘍は無処置マウスと同様な経過で拒絶された。これに反して、抗-CD8投与は腫瘍成長の延長をもたらした。本発明者らは CD3+ 細胞が拒絶に深く関与し、CD 4+ 細胞は僅かな作用を有し、CD 8+ 細胞は移植拒絶に主要効果を有していると結論した。抗-CD8投与マウスに於ては、腫瘍は抗-CD3を投与したマウスより小さく、明かに抗-CD8抗体は抗-CD3抗体に依る完全なT-細胞排除程には効果がないことが注目された。CD4 細胞が僅かな作用を有するのは、抗-CD4及び抗-CD8の複合作用が、抗-CD8単独より優れていないので、可能性はありそうもない。しかしながら、本発明者らは単独では無効である。抗- γ- インターフェロン（γIFN ）治療を抗-CD8と併用すると、抗-CD3と同様の作用を現わし、従ってγIFN は腫瘍移植拒絶に役割を果たし、CD 8+ 細胞及びγIFN に依って介在されることに注目した。
【００５７】
従って、MUC1+ 3T3 細胞は3T3 細胞に担持されるMUC1に対してBALB/cマウスを免疫処置することが可能で、 CD3+ 8+ 細胞に依って発現される細胞性免疫を生 じるが、CD3+4+ に依っては生じなく、抗-MUC1 抗体が見出されなかったので体液性免疫は僅かであった。免疫反応の種々の変数を測定する為に、本発明者らは(a) 遅延型過敏性(DTH) 及び(b) 細胞毒性T-リンパ球を検討した。
【００５８】
(a) 遅延型過敏性（DTH)：
明らかに免疫反応は細胞性であり、CD 8+ 細胞に依る。これが通常CD4+ 細胞が介在すると考えられるDTH 反応、または通常CD 8+ である細胞毒性T-細胞反応を含むかを決定する為に、マウスをMUC1+ 3T3 細胞で免疫処置し、DTH を種々の抗原を後肢足蹠に注射することで行なった。
予備研究はシクロホスファミドが存在しないと、測定可能なDTH 反応は生じなかった。DTH 反応は、凍結、解凍を5 回反復した死滅MUC1+ 3T3 細胞を足蹠に注射して検出し、HMFG、融合蛋白質-GSTおよびCp13-32-KLH のいずれかを試験投与した際に、微弱な反応を検出した。これらの反応は3T3細胞が反応を生じなかったので、明らかに特異的であった。DTH反応がCD 4+ またはCD 8+ 細胞に依って介在されるか否かを決定する為に、マウスに抗-CD4及び抗-CD8抗体を注射して、DTH 反応を測定した。
MUC1+ 3T3 細胞、Cp13-32 、HMFG及び融合蛋白質を投与した際に、抗-CD4は完全にDTH 反応をブロックし、抗-CD8はDTH 反応を部分的にブロックしたが、程度は低かった。従って、ヒトMUC1(CD8) に対する効果的な免疫反応を生じる細胞は、DTH 反応を生じる細胞とは異なっているが、CD 8+ 細胞は確実にDTH に関与していた。
【００５９】
(b) 細胞毒性T-リンパ球：
細胞毒性の検定を実施し、MUC1+ 3T3 細胞の免疫処置後に、pagal 処理MUC1+P815標的の60% に及ぶ分解が生じた。無処理
MUC1+ P815標的及び非感染P815標的は分解されなかった。Pagal 処理及び無処理3T3及びMUC1+ 3T3 標的も分解せず、恐らくは3T3細胞がTc検定には好ましくない標的であったからであろう。Tc、抗-CD4及び抗-CD8抗体の表現型を決定する為に、ブロック研究に使用した、抗-CD8試剤（53-6.7）はCD8+細胞に依るT-細胞分解のブロックが可能であることは既知である。これらの研究で抗-CD8がTcをブロックできる状態であることが証明されたが、抗-CD4及び対照抗体の作用は僅かであった。Pagal 処理MUC1+ P815標的にはTcのみが見出され、非APDTR 反応性の抗-MUC1 抗体(VA1、BCP7、BCP9及びBCP10)がpagal 処理したMUC1+ 3T3 、MUC1+ P815、T47D及びMCF7細胞と反応性になったので、抗体反応性及びT-細胞反応性エピトープが隠されて、ともにpagal 処理後に曝露されることが明かである。
【００６０】
MUC1+ 3T3 細胞に抵抗性のマウスはCD 8+ T-細胞免疫性、CD 4+ 、DTH 、CD 8+ に依る検出可能なTc反応があり、抗体を有しない（下記参照）。Tc反応が少なくともT-細胞表現型の段階で、腫瘍拒絶のエフェクター細胞表現型に関連しているので、測定にはより適切な反応の様である。
【００６１】
免疫反応 - B細胞
細胞性免疫が効果的であり、抗体産生が僅かであることが先に示されたが、抗体の役割は不明確である。更に、マウスは通常抗体産生が少なく、補体の動きが乏しいので、a ）ポリクローナルまたはモノクローナルであろうと、充分な抗体の供給、b ）充分な補体の供給、c ）高密度の表面抗原等の特定の条件を満たさない限り、抗体介在性の移植破壊の研究に選択される選択種ではない。MUC1+ 抗原密度が高いので、追加の抗体及び補体が供給される。更に、マウスは細胞性免疫のすべての成分を除く様に、CD3 に依って免疫抑制された(Tomonari, K., Immunogenetics, 28:455-458, 1988)。材料と方法の項で記述した様に、皮膚の同種及び異種移植が可能な様に、大量の抗体及び補体にも拘らず、腫瘍は進行的に、事実抗体を投与されなかったマウスと同様な速度で増殖した。従って、抗体及び補体はMUC1+ 3T3 細胞の拒絶を起こし得ない。
【００６２】
HMFG、ペプチド及び融合蛋白質に依る免疫処置
前項は3T3 細胞に感染させたヒトMUC1に対するネズミ免疫反応のモデルを定義し、細胞性MUC1に依って産生されたと同様に、合成材料に依る同様もしくはより強力な免疫反応を生じる為に、種々の免疫原使用の基礎を形成した。本目的は免疫処置後に腫瘍成長を大きく低下させるにある。免疫原として、天然ムチン（HMFG）、VNTR二量体から成るMUC1ペプチド合成産物、及び5 x VNTR反復融合蛋白質を使用した。予め免疫処置なしには、腫瘍は18日後には拒絶され、この様なマウスは以後の接種に抵抗性と成る。従って、腫瘍が拒絶される迄には約18日間の"窓" が開いている。そこで、この期間の免疫処置は腫瘍の消失または大きさを縮小させられる。
【００６３】
HMFG、融合蛋白質及び合成ペプチド群の免疫原性を検討する目的で、15匹のBALB/cマウス群をこれらの物質の50μg で免疫処置し、1-5 x 106 個の 3T3またはMUC1+ 3T3 細胞を移植した。3T3 細胞は免疫処置の有無双方のマウスで同様の進行的成長を示し、従って、免疫処置過程に非特異的効果はなかった。マウスに１×106 細胞の低用量を移植すると、非免疫処置対照群に比して有意差が認められた。
従って、第６日に、ペプチドまたは融合蛋白質で免疫処置したマウスは、対照群に比して約25% の腫瘍を有しており、HMFGで免疫処置した群では、効果はより低く、腫瘍は対照群の約60% であった。しかしながら、MUC1+ 3T3 細胞 5x106個を移植した際には、対照群に比して腫瘍の大きさに若干差が生じたが、少量の移植では明瞭さが低下した。その後の腫瘍の移植では予想される様に、腫瘍を拒絶したペプチドで免疫処置したマウスは、今や腫瘍に抵抗性となった。従って、ペプチド、融合蛋白質またはHMFGで免疫処置して、少量のMUC1+3T3細胞を移植したマウスは、若干の抗腫瘍効果の上昇を示した。ペプチド、融合蛋白質及びHMFGを含有するVNTRは、若干保護作用を得たが、MUC1のN-またはC-末端ペプチドで免疫処置したマウスは有意な保護を示さず、これらのペプチドがMUC1に免疫を誘発しないことを示し、免疫処置自体が無効であることを示した。免疫反応の種々の変数を測定する為に、本発明者らは(a) MUC1抗体産生、(b) 遅延型過敏性及び(c)細胞毒性T-リンパ球を検討した。
【００６４】
(a) 抗体：
ペプチド、融合蛋白質またはHMFGで免疫処置したマウスは、腫瘍移植の前後の双方で高レベルの抗-MUC1 抗体値を有していた。従って、免疫処置は高レベルの抗体を生じるが、腫瘍に対する僅かな効果に依って示す様に見かけの細胞性免疫は僅かである。対照ペプチドT4N1で免疫処置して、腫瘍を拒絶したマウスは、MUC1に対する抗体を産生せず、ペプチド及びその他の免疫原で免疫処置したマウスは腫瘍拒絶後に抗体値が増加しなかったことは興味深い。
【００６５】
(b) DTH ：
HMFG 、Cp13-22及び融合蛋白質-GSTで免疫処置したマウスは種々のMUC1抗原に対してDTH 反応を示し、CD4 抗体で完全に、CD8 抗体で部分的に阻害された。従って、この3 試剤に依る免疫処置は、細胞性免疫を若干増加させるが、腫瘍成長を大きく阻害するには不十分であった。
【００６６】
細胞毒性T-リンパ球検定：
免疫処置したマウスの脾臓及びリンパ節細胞からTc検定を実施して、細胞毒性の細胞は検出されなかった。従って、種々の免疫処置方法は細胞性免疫より、抗体産生に対する免疫反応に偏向を生じる様である。
【００６７】
表２は細胞性及び合成抗原に依る免疫処置の差を要約する。
【００６８】
[表２]
細胞性及び合成抗原に依る免疫処置の差
──────────────────────────────
免疫原          腫瘍拒絶    抗体    DTH    Tc
──────────────────────────────
腫瘍              +++        +      +++    +
MUC1+ 3T3                                  +
+
ペプチド           +        +++     +++    -
融合蛋白質         +        +++     +++    -
HMFG（ムチン）     +        +++     +++    -
──────────────────────────────
+++ = 高値    + = 低値    - = なし
【実施例３】
【００６９】
M-FPの分析
MUC1 FP は材料と方法の項に記載した様に、過ヨウソ酸塩を用いてマンナンと結合させた。FPのアミノ基は酸化されたマンナンのアルデヒド残基と反応して不安定なシッフ塩基を形成する（図１２）。遊離マンナン及びFPは複合マンナンから分離しなかった。ゲル濾過クロマトグラフィーに依って得られた125I-FP 及び125I-M-FP の溶出状況はマンナン- 融合蛋白質が、201 Kd及び73 Kd と２つのピークとしてして溶出されることを示した。2 つのピークとして溶出されたFPは38 Kd 及び20 Kd を示し、低いピークはFPの開裂に依るGSTに依るのであろう。125I-FP及び125I-M-FPのオートラジオグラフィー分析は大部分のFPがマンナンと結合していることを示した。
【００７０】
ELISA で測定したマンナンに結合した後のFPの活性は、FPがその活性を完全に保持していることを示した。
【００７１】
MUC1+ 3T3 細胞の生体内成長
BALB/cマウスに皮下注射したMUC1+ 3T3 細胞の 5 x 106個は、第10日迄進行的に成長したが、その後縮小し始め、第18日迄に消失したが、3T3 細胞は実施例２に示されたBALB/cマウスから予測された様に拒絶されなかった（図１）。従って、ヒトMUC1+ 遺伝子生成物は3T3 細胞に免疫原性を与えて、拒絶をもたらし、その様なマウスは以後の接種に完全に抵抗性であった。細胞性免疫は、抗-CD3及び抗-CD8抗体が完全に免疫を失わせたので、拒絶の形態である。
【００７２】
マンナン融合蛋白質免疫処置
マンナン-FP の免疫原性を検討する為に、BALB/cマウス群をFP 5μg に相当するマンナン-FP  5μg で免疫処置し、MUC1+ 3T3 細胞105 乃至5 x 107 個を接種した。免疫処置したマウス（図2A）では非免疫処置マウス（図2B）に比して、明瞭な腫瘍成長がなかった。マンナン-FP 複合体が特異的抗腫瘍免疫を生じ、マンナンまたはFP単独では作用のないことを示す為に、マウスを等用量の複合体中では7 mg/ml に相当するマンナン、マンナンとFPとの混合物で免疫処置し、また免疫処置しなかったマウス群に、MUC1+3T3細胞106 個を接種した。マンナン-FP 複合体で免疫処置したマウスでは、腫瘍の成長が認められず、一方マンナン単独及びマンナンとFPとの混合物で免疫処置したマウスでは、非免疫処置マウスに比して成長に差はなかった（図3A、3B及び3C）。従って腫瘍成長の保護は、本複合物に特異的であり、マンナン及びFP単独には効果がなかった。マンナン-FP 免疫処置マウスに、3T3 細胞106 個を接種し、3T3 細胞は免疫処置の有無双方のマウスで同様な成長を示し（図４）、免疫処置生成物に非特異的作用のないことを示した。
【００７３】
M-FPに対する免疫反応
抗-CD3抗体はM-FPで免疫処置したマウスに於ける免疫を完全に失わせ（図５）、抗-CD4または抗-CD8抗体を投与したマウスは以下の効果を示した：CD4 免疫抑制処置は、腫瘍成長には効果が少なく（図５）、これに反して抗-CD8処置は腫瘍成長の延長をもたらした。従って、CD 3+ 及びCD 8+ 細胞は免疫及び腫瘍保護に完全に作用を示し、CD 4+ 細胞は最少の作用を有していた（図５）。従って、M-FPは3T3 細胞に担持されたMUC1に対して免疫作用を示し、CD 3+ 及びCD 8+ 胞に依って発現する細胞性免疫を生じるが、CD 3+ 及びCD 4+ に依っては発現しない。免疫反応の種々の変数を測定する為に、本発明者らは(a) 遅延型過敏性、(b)細胞毒性T-リンパ球、(c)T- 細胞増殖及び(d）抗体産生を検討した。
【００７４】
(a) 遅延型過敏性：
DTH 反応は通常CD4 + 細胞が介在すると考えられており、種々の抗原を後肢足蹠に注射することで現われる（図６）。DTH 反応は足蹠投与に依って凍結、解凍を5 回反復した死滅MUC1+ 3T3 細胞、HMFG、FP-GST、Cp13-32-KLH 、マンナン-FP 及びGST がFPの一部分であるのでGST に対する微弱な反応で検出される（図６）。これらの反応は死滅3T3 細胞、マンナン単独、関連のないT4N1ペプチドに明瞭に特異的であり、PBS は反応を生じなかった。DTH 反応がCD 4+ またはCD8 +細胞に依って介在されるか否かを決定する為に、マウスに抗-CD4及び抗-CD8抗体を注射し、DTH 反応を測定した。抗-CD4は完全にDTH 反応を阻害し、抗-CD8は阻害はしたが程度は低かった（図６）。従って、ヒトMUC1に効果的に免疫反応を生じさせる細胞は、DTH反応を生じさせるものとは異なっており、CD 8+ 細胞に就いては図５に示したが、確かにDTH に関与していた。
【００７５】
(b) 細胞毒性T-リンパ球：細胞毒性検定を実施し、M-FP免疫処置後には pagal処置したMUC1+ P815標的はMUC1特異的分解を30% 示した（図７）。無処置MUC1+P815標的は15% のMUC1特異的分解をしたが、非処置P815標的は分解されなかった（図７）。これらの細胞はCD 8+ の様である(Tomonari, K., Immunogenetics, 28:455-458, 1988)。
【００７６】
(c) T-細胞増殖：増殖検定を実施し、M-FP免疫処置後には、M-FP、FP、Cp13-32、HMFG、及びpagal 処置の有無双方のMUC1+ 3T3 、MUC1+ P815細胞に対する増殖性T-細胞が生じた。その他の刺激剤は無効であった。
【００７７】
(d) マンナンGST-MUC1融合蛋白質複合体に対する抗体：マウスを飼育して、その血清を抗-FP 抗体検査に就いてELISA を実施した。抗-FP 抗体はFP単独で免疫処置したマウスに比して認められなかった。BSA と結合したマンナンでコートしたプレートを、抗- マンナン抗体を検出する為に用いたが、検出されなかった。正常マウス血清を陰性対照とした。
【００７８】
従って、マンナンに結合したFPに依って免疫処置してMUC1+3T3細胞に完全に抵抗性となったマウスは、CD 8+ T-細胞免疫性、CD 4+ 及びCD 8+ DTH 、CD 8+ 細胞に依る検出可能なTc反応、免疫抗原に特異的な増殖性T-細胞を有し、及び抗-MUC1 抗体が見出されなかったので僅かしか体液性免疫を有さず、M-FPは腫瘍細胞拒絶と同様に抗腫瘍反応を誘発可能の様であった(Tomonari, K. Immunogenetics, 28:455-458, 1988) 。
【００７９】
治療に於けるM-FP
確立した腫瘍に対する治療剤としてのM-FPの有効性を測定する為に、MFP の注射は腫瘍が確立する迄遅らせた。MUC1+ P815細胞は（DBA/2 x BALB/c）F1マウスの皮下に移植すると、第16乃至20日迄進行的に成長し、その後縮小を開始し、通常第28日迄に消失した（図8A）。確立した腫瘍に対するM-FPの有効性を検討する為に、１群５匹の（DBA/2 x BALB/c）F1マウスにMUC1+ P815細胞5 x 106 個を注射し、13日後にFP 5μg に相当するM-FP 5μg を１回または隔日に注射した。PBS を投与した対照群マウスの腫瘍は、第28日迄に拒絶された。しかしながら、定期的に注射したマウスは直ちに腫瘍を拒絶し始め、腫瘍は第20日迄に急速に消失した。単回注射も、より速やかな拒絶を生じる傾向であった（図8A）。
【００８０】
別のモデルをDBA/2 マウス中のMUC1+ P815細胞を用いて検討し、第22乃至30日迄成長し、その後縮小を開始して、通常第42日迄に消失した。DBA/2 マウスにMUC1+ P815細胞を皮下注射し、第15日にMFP を注射した。対照群マウスにはPBS を注射し、腫瘍は第42日迄に拒絶されたが、MFP を第15日に１回投与で免疫処置したマウスは、第33日迄に拒絶し（図8B）、これに比して隔日に免疫処置したマウスは第27日迄に拒絶したが、単回投与後にその成長は急速に逆転した。従って、予め免疫したマウスが抗- 腫瘍効果を有するのみならず、これは確立した腫瘍に就いても得られた。
【実施例４】
【００８１】
乳癌患者に実施例１で作成したマンナン融合蛋白質50μg を注射した。免疫処置後に副作用は認められなかった。患者の癌治療は現在評価中であり、数カ所の骨の病変が既に消失したことが認められている。
【実施例５】
【００８２】
ムチンMU８乃至MUC6のVNTRを、マンナン及びその他の炭水化物と実施例１に記述した様な標準的方法で複合させた。表３は種々のムチン核蛋白質を表示する。
【００８３】
[表３]
ムチン核蛋白質、cDNA及び遺伝子の表示
────────────────────────────────────                            MUC1       MUC2       MUC3    MUC4     MUC5     MUC6
────────────────────────────────────
組  織          乳房、      GI       GI     呼吸器    気管支    胃
子宮、    呼吸器                      ±胃      胆嚢
sGI、 bGU、
呼吸器
多  形          あり      あり      あり      ?          ?        ?
染色体          1q21      11p5.5      7q      3      11p15    11015.4/5
蛋白質          120-       160       190-     ?         ?         ?
の分子量 kDa    240                  320
塩基対           60         60        51     48        24       507
VNTR+ Caa/ 反復)  20         23       17     16         8       169
──────────────────────────────────── 
aGI- 胃腸管； bGU- 胃泌尿器； caa- アミノ酸
*  MUC1 VNTR - SAPDTRPAPGSTAPPAHVT
MUC2 VNTR - PTTTPISTTTMVTPTPTPTGTQT
MUC3 VNTR - HSTPSFTSSITTTETTS
MUC4 VNTR - TSSASTGHATPLPVTD
MUC5 VNTR - PTTSTTSA （494 塩基対挿入 - 8アミノ酸の縦列反復）
MUC6 VNTR - 169アミノ酸の反復単位
MUC7 VNTR - TTAAPPTPPATTPAPPSSSAPPE
【実施例６】
【００８４】
MFP 免疫処置後のCTL のMHC 限定
マウス中有で産生されたCTL がMHC であるか、または実際にクラスIMHCに限定されたか否かを決定する為に、マウスをMFP 5 μg/週 x 3で免疫処置し、その脾臓細胞を採取して、種々の51Cr標識標的細胞に対してCTL として用いた。結果は以下の通りである：
a) 免疫処置したH-2d マウス(DBA/2、NZB 、BALB/cまたはB10.D2）はP815-Tm211（MUC1+ ) P815細胞に対してCTL を産生したが、P815-MUC1 細胞に対しては産生しなかった。
b) その他のH-2 ハプロ型マウスを免疫処置した場合、CTL はH-2d P815 MUC1+ 細胞テストでは見出されなかった、特にH-2h ；C57BL/6 ；129 及びBALB.B；H- 2k ；
CBA；H-2s；SJL 及びH-2w ：NZW 。これらの研究で興味ある所見は：
BALB/c (H-2d ) は＋）これらはH-2 のみが異なる類似遺伝子対である。   
BALB.B (H-2b ）は−）
B10.D2 (H-2d ）は＋）これらはH-2 のみが異なる類似遺伝子対である。   
C57BL/6(H-2h ）は−）
本図はH-2MIC複合体と反応性であることを示す。
c) 別個の研究では、H-2b ハプロ型マウスがH-2b (E3 MUC1+ 腫瘍細胞）に対して活性を有するが、その他のH-2 ハプロ型に対しては反応性ではなかった。従って、マウスのMFP に対するCTL 反応はH-2 (MHC）限定的である。
【実施例７】
【００８５】
マウス中のMFP に対するT-細胞増殖
マウスを種々のMFP 5 μg/週 x 3で免疫処置し、増殖検定に於て異なったペプチド用量でテストした。本検定で、組織培養中の脾臓細胞に異なったペプチドを異なった量で添加して、48時間後に3H- チミジンを24時間添加した。細胞を採取して取り込まれた放射活性を測定した。本研究で以下の点が示された：
i）MFPはペプチドの存在下に免疫処置されたマウスのT-細胞の増殖を刺激する。
ii）用量反応性があるのでペプチドの至適用量は以下の通りである：
C-p13-32、C-p1-24 ：5 mcM
p13-32、p1-24 ：10 mcM
Ap1-15  ＜1.0 mcM
p5-20   ＜1.0 mcM
配列番号は以下の通りである：
1       5         10        15        20 21 次の反復
P D T R P A P G S T A P P A H G V T S A  P ・・・・・・・・
iii)  使用されたペプチドに関して：
p5-20は＋
p14-24 ）は−
p16-24 ）は−
本エピトープは抗体エピトープAPDTR の様ではなく、p14-24は恐らくGSTAP である。
【実施例８】
【００８６】
合成MUC1の癌に対する第Ｉ相試験
本実施例の目的は、先ず合成またはその他のMUC1剤がヒトに於て免疫原性であるかを決定し、次いで自己ペプチドに対する免疫反応が、MUC1を含有する正常組織に及ぼす反応に依って、何等かの有害作用を有するか否かを決定するにある第Ｉ相試験である。抗腫瘍作用はその後に検討する。
【００８７】
対象者及び方法
【００８８】
患者
試験に参加の条件として、患者は組織学的に確認された乳癌を有さねばならず、また転移病巣を考慮される患者に限り、特に治験前４週間に細胞毒性の化学療法を受けていない患者に限定した。患者は書面に依る告知済み承諾書を提出せねばならず、授乳中及び妊娠中の患者は本試験には不適格とした。全患者は臨床的状態を記録し、基礎血液試料をMSA 及びCASA分析に採取した。実施された本試験は通常の第Ｉ相試験であり、病歴及び臨床検査、全血検査、毒性記録、クレアチニン及びアミラーゼ分析の採血を含む。注射された物質に対する免疫反応の為の特定テストは数種の方法で実施した：
【００８９】
血清学的及び細胞研究
a) MSA 及びCASAテストを実施した。これらのテストは血中MUC1を検出し、抗原に対する免疫反応に就いてあらゆる変更を行ない、MSA は特異的な炭水化物抗原を、CASAはAPDTR ペプチドを検出する。
b) 試料はELISA テストに依って抗-MUC1 抗体を、またジフテリア毒素、融合蛋白質、GST 、p13-32合成ペプチド、HMFG及びその他のペプチドに就いて別個にテストした（STPAはCD46の配列から誘導され、被特異的陰性対照として用いた）。 c) T-細胞反応は3 種の反応で測定した：
i)  遅延型過敏性反応（DTH ） -  本反応試験はジフテリアまたは破傷風、注射物質（DT- ペプチド）に対する反応、また別個にヒト血清アルブミンの様なその他の担体に結合したペプチドに対する患者の反応を測定する為に標準的抗原を用いて実施した。
ii) T-細胞増殖 -  本テストは患者から採血し、末梢リンパ球（PBL)を分離して、適当な抗原と共に組織培養で確立して（下記参照）、48〜72時間後に3H- チミジンを添加するか、あるいは24時間後に増殖を測定した。
iii)  T-細胞毒性 -  患者の増殖血球を分離してネズミMUC1+ 3T3 及びP815細胞並びにヒトMUC1（T47D、BT20）を発現するヒト腫瘍細胞から成る51Crで標識した標的細胞と４時間反応させた。
【００９０】
最後に腫瘍の反応を患者で監視した。
【００９１】
ペプチド及び複合体の合成
MUC1縦列反復の多様な変数（VNTR）の配列から誘導したペプチドC-p13-32
（CPAHGVTSAPDTRPAPGSTAP)を、ABI ペプチド合成器（Foster City 、California州、米国）を用いて合成した。ヒトCD46のセリン、スレオニン、及びプロリンに富んだ領域を現わすペプチドSTP-Aを、陰性対照として用いた。ペプチドC-p13-32は、グルタールアルデヒドを用いてジフテリア毒素(DT)（特別試料、CSL 、Melbourne 、オーストラリア）と複合体を形成させた。ペプチドC-p13-32 10mg を、0.25% グルタールアルデヒド 5 ml の存在下に、1250Lf DT と室温で６時間反応させ、リン酸緩衝生理食塩液に対して透析した。複合体DT-C-p13-32 を層流フード中で濾過（0.22 mm 、Millipore 社）した。DT-C-p13-32 の活性は抗-MUC1抗体BC2 でテストした。無菌度および発熱性物質テストはメルボルン大学、薬理学部及びAustin病院、微生物学部、オーストラリア）で実施した。
【００９２】
酵素結合免疫吸着剤検出法（ELISA)
C-p13-32に対するヒト抗体をテストする為に、FP、DT及びHMFGを含む種々の抗原をPVC プレート(Costar)上に、0.05M 炭酸緩衝液中、pH 9.6で、２時間37℃でコートし、非特異的結合部位を2% BSAで１時間37℃でブロックした。PBS で洗浄後、0.05% 間隔で20段階希釈した血清試料を、各ウェルに注ぎ、4 ℃で一夜培養した。プレートを十分洗浄後、セイヨウワサビ  パーオキシダーゼ(Silenus社、メルボルン、オーストラリア）で標識したヒツジ抗ヒト免疫グロブリンをプレートに添加し、2 時間室温で培養した。プレートを洗浄し、結合したヒト抗体は、0.02% H2O2含有0.1M  クエン酸緩衝液中、pH 4で0.03% 2,2-アジノジ（3-エチルベンゾ -チアゾリンサルフェート) を添加して検出した。吸光度はELISA 検出器（Bioteck 社、EL312e）を用いて405 nmで測定した。本検定に用いた抗原は、a)ヒト乳脂肪小球（HMFG）、b) MUC1 のVNTRを5 回反復とグルタチオン-S- トランスフェラーゼを含み、P-GEX ベクトルを用いて調製しした融合蛋白質、c) DT 、d) C-p13-32 、及び e) 陰性対照ペプチドSTP-A とした。
【００９３】
血清中のMUC1抗原を測定する為に、2種の市販キット(MSA測定及びCASA測定）（Medical Innovations Ltd.、Artarmon、NSW 、オーストラリア）を使用した。MSA 測定は抗MUC1抗体を用いる阻害測定であり、そのMUC1への結合は患者血清中のMUC1で阻害可能である。CASA測定はサンドイッチELISA であり、2 種の抗MUC1抗体を使用した。
【００９４】
結果
【００９５】
毒性：  一般的に、特に最初の注射では全身毒性は僅かである。後に、患者に局所的な反応が生じ、これは72時間迄持続した紅斑と硬結が存したので、ジフテリア毒素に対する局所的DTH 反応に依ると推定した。患者に依っては、この反応は局所のリンパ節の腫脹を伴った。注射後のこれらの反応を別として、その他に副作用は認められなかった。
【００９６】
MSA 及びCASAテスト：  これらのテストは殆どの患者に施行し、傾向は認められなかった。注射中の異なった時点で採血した試料からデータを得て、殆どの患者で注射中に MSA濃度の実質的な増加はなかった（図9A、9B及び9C）。同様なコメントがCASAテストでも得られた（図10A 、10B 及び10C ）。大部分の患者に於て、濃度の増加は殆どなかったが、2 名の患者では進行的な増加が認められ、これらの患者の疾患の進行に関連していた。注射中およびその後数週間に亘って、２つの別個のテストに依って検出されたMUC1血中濃度に実質的な変化はなかった。
【００９７】
抗-MUC1 抗体（図11):  先ず、本発明者らは合成ペプチドに就いてヒト血清試料を使用する上で若干困難を指摘した、大部分の症例で合成MUC1ペプチドには、HMFGまたはSTPA非特異的ペプチドには認められない、重要な背景が存した。従って、融合蛋白質およびC-p13-32は非特異的に"取扱困難" である。数名の患者を例外として、注射経過に抗体形成の殆ど増加は見られず、本発明者らはペプチドに依る免疫処置は患者12名中10名で抗体産生を見なかった。しかしながら、患者２名（No.5及びNo.10)では、融合蛋白質及び抗-C-p13-32 抗体と反応する抗体の有意な増加が認められ、これらはHMFG及びSTPAの効果に変動がなかったので特異的増加であった。患者No.5では、ジフテリア抗体値の増加も認められたが、患者 No.10にはなかった。従って、抗体反応は認められたが、一定ではなかった。
【００９８】
皮膚反応：  患者の皮膚反応は目下進行中である。低用量の0.15mg及び0.25mgでは実施せず、現在0.5mg 及び1mg で進行中である。現段階では、合成ペプチドに対しては反応はなかったが、ジフテリアに対しては存した。指摘する様に本試験は進行中である。
【００９９】
T-細胞増殖：  これらの検定の有効性は、ジフテリア毒素でテストした健常者10名中6 名に見出された増殖反応に依って示され、これらの反応は毒素に依る予め行なわれた免疫処置を示す。同様に認められたのは、健常人10名中では使用した異なった抗原、特にMUC1（融合蛋白質、合成ペプチド、C-p13-32、HMFG）を含む抗原及びMUC1を発現するネズミ細胞株（Mor5）に対する増殖反応は認められなかった。更に、癌患者で行なった９件の別個テスト中、５名がDTへの増殖性反応を示したが、これらのテストは患者6 名にのみ行なわれた。興味深いことに、数経路の注射後に、患者６名中４名が１つまたは複数のMUC1に対する増殖反応を示し、特に細胞表面上にMUC1を表現するネズミ細胞株に認められたが、患者2 名中１名ではC-p13-32 DT に認められ、本患者は融合蛋白質にも反応した。HMFG中のMUC1及び非特異的T4N1に反応した患者はなかった。従って若干の増殖反応が、若干の患者に認められるが、すべてには認められなかった。
【０１００】
腫瘍反応：  進行性疾患を有する患者7 名では、3 名の疾患は安定していた。
【０１０１】
なお、以下の文献も本発明の理解のために参考にされ得る。
(1)  Auchincloss, H., Moses, R., Conti, D., Sundt, T., Smith, C., Sachs, D. H. and Winn, II. J.,Transpl. Proc., 22(3):1059-1060, 1990.
(2)  Pierres, A., Naquet, P., Van Agthoven, A., Bekkhoucha, F., Denizot, F., Mishal, Z., Schmitt-Verhulst, A-M. and Pierres, M.,J. Immunol., 132:2775-2782, 1984.
(3)  Ledbetter, J. A. and Herzenberg, L. A., Immunol. Rev., 47:63-90, 1979.
【図面の簡単な説明】
【０１０２】
【図１】BALB/cマウス中の5 x 106 3T3 及びMUC1+ 3T3 細胞の成長。
【図２】(a) マンナン- 融合蛋白質及び(b) 非免疫BALB/cマウス中のMUC1+ 3T3 細胞の用量反応。用量範囲は106 〜5 x 107 細胞。
【図３】(a) マンナン、マンナン+ 融合蛋白質、M-FP及びPBS で免疫した対照群；  (b) 16.1FP- マンナン、酸化マンナン、純M-FP、M-FP及びPBS ；  (c) デキストラン-FP （D-FP）、M-FP及びPBS で免疫処置したマウス、並びに106 個のMUC1+ 3T3 試験投与。
【図４】M-FP蛋白質で免疫処置した及びリン酸緩衝液で免疫処置した対照群並びに1063T3 細胞の試験投与したマウス。
【図５】-2、0 及び+2日に、抗-CD3、抗-CD4、及び抗-CD8で処置したBALB/cマウス。106 MUC1+ 3T3 細胞の試験投与。
【図６】マンナン- 融合蛋白質で免疫処置したマウスに於いて、死滅3T3 及びMUC1+ 3T3 細胞、Cp13-32-KLH 、融合蛋白質、IIMFG 、マンナン- 融合蛋白質、GST 、T4N1及びPBS を後肢足蹠に試験投与して、48時間後に測定したDTH 反応。対照群（黒棒）、抗-CD4を投与したマウス（灰色棒）及び抗CD-8を投与したマウス（横断線）。
【図７】P815±phenyl N-acetyl-α-D-galactosaminide（pagal)で測定した細胞毒性T-リンパ球及びMUC1+ P815±pagal 処理標的細胞。
【図８】A:（DBA/2++ x BALB/c）F1マウスに5 x 106 個のMUC1+ P815細胞を試験投与。腫瘍接種13日後に腫瘍が確立したマウスを、FP５μg の量に相当するM-FP 5μgで、単回または隔日に免疫処置した。対照群マウスにはPBS を投与した。  B: DBA/2++  マウスに 5 x 106個のMUC1+ P815細胞を試験投与した。腫瘍接種15日後の腫瘍が確立したマウスを、FPの量に相当するM-FP 5μg で、単回または隔日に免疫処置した。対照群マウスにはPBS を投与した。
【図９】A 、B およびC - 図面は患者血清中の乳房の血清中抗原(MSA) 濃度を示す。縦軸は製造社の指示に依る濃度（単位/ml)を示し、横軸は異なった患者を示す。 A: 用量0.15 mg の患者１、２および３。 B: 用量0.25 mg の患者１乃至４。 C: 用量0.5 mgの患者１乃至３。
【図１０】A 、B およびC - 図は患者血清中の癌に伴う血清中抗原(CASA)濃度を示す。縦軸は製造社の指示に依る濃度 (免疫/ml)を示し、横軸は異なった患者を示す。 A: 用量0.15 mg の患者１、２及び３。 B: 用量0.25 mg の患者１乃至４。 C: 用量0.5 mgの患者１乃至３。
【図１１】A 、B 、C 、D およびE - 図は異なった抗原に対するELISA 検定に於ける光学的濃度をODとして測定した抗体価。 A: 抗-FP = 融合蛋白質； B: 抗-DT = ジフテリア抗毒素； C: 抗-IIMFG =  ヒト母乳脂肪小球蛋白質； D: 抗-Cp13 乃至32 =  抗-MUC1 ペプチド； F: 抗-SPTA （対照群、非反応性ペプチド）。  本群は前図と同様である。即ち、  第１群 = 0.15 mgペプチド注射、  第２群 = 0.25 mgペプチド注射、  第３群 = 0.05 mgペプチド注射、数値は患者番号を、この場合は症例No. １〜No. 10を現わす。バーコードは免疫前および免疫処置後３回の各患者の図面に示した。
【図１２】融合蛋白質のマンナンへのカップリングの過程を示す模式図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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