(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
エリスロウィルスＢ１９の配列と比較して全ゲノムにわたって１０％以上の遺伝子的変異を示すので分子的にエリスロウィルスＢ１９ゲノムとは認めることができないこと、配列SEQ ID NO:1に対し６％に等しいか、それより低い遺伝子的変異を示すこと、およびそのゲノムがストリンジェントな条件の下で配列SEQ ID NO:45〜80、108および110の１つと特異的にハイブリッドすることを特徴とする、エリスロウィルスタイプV9として知られる変異体エリスロウィルス。
【請求項２】
ａ)全てのコード配列を含み請求項１で定義されるエリスロウィルスタイプV9のゲノムの95％を示す配列SEQ ID NO:1のポリヌクレオチド、ならびに
ｂ)−エリスロウィルスＢ１９配列に関して全ゲノムにわたって１０％以上の遺伝子的差異を示し、配列SEQ ID NO:1に関して６％に等しいか、それより低い遺伝子的差異を示す配列、および
−ストリンジェントな条件のもとで次の配列：SEQ ID NO:45〜80、SEQ ID NO:108、およびSEQ ID NO:110の１つとハイブリッドできる配列
からなる群より選択される配列を示す請求項１で定義されるエリスロウィルスタイプV9のゲノム
からなる群から選択されることを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項３】
図7.1〜7.3の制限プロフィールを有することを特徴とする請求項２のポリヌクレオチド。
【請求項４】
配列SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:91またはSEQ ID NO:93からなる群から選択される、エリスロウィルスタイプＶ９のタンパク質をコードするポリヌクレオチドであることを特徴とする配列SEQ ID NO:1のフラグメント。
【請求項５】
配列SEQ ID NO:45〜80、108およびNO:110、それらの相補的配列、少なくとも１７個のヌクレオチドからなるこれらの配列由来の配列および前記配列を含む配列からなる群から選択され、エリスロウィルスＶ９または関連エリスロウィルスの特異的同定においてプローブまたはプライマーとして用いることができることを特徴とする配列SEQ ID NO:1のフラグメント。
【請求項６】
配列SEQ ID NO:2〜44、105〜107、109および111〜121、ならびにそれらの相補的配列からなる群から選択され、エリスロウィルスの識別検出のためにプライマーまたはプローブとして用いることができることを特徴とする配列SEQ ID NO:1のフラグメント。
【請求項７】
−対Ａ：プライマーSEQ ID NO:111とSEQ ID NO:112；
−対Ｂ：プライマーSEQ ID NO:105とSEQ ID NO:106；
−対Ｃ：配列SEQ ID NO:2〜44、105、106、107、109、111または112の中から１つと配列SEQ ID NO:45〜80、108または110の中から１つ；
−対Ｄ：プライマーSEQ ID NO:107とプライマーSEQ ID NO:109；
−対Ｅ：配列SEQ ID NO:2〜44、105、106、107、109、111または112から選択される２つのプライマー；および
−対Ｆ：配列SEQ ID NO:45〜80、108または110から選択される２つのプライマー
からなる群から選択されることを特徴とするプライマー対。
【請求項８】
配列SEQ ID NO:45〜80、108、110及び121からなる群より選択されることを特徴とするプローブ。
【請求項９】
請求項２または３に記載のポリヌクレオチド、または請求項４〜６のいずれか１項に記載のフラグメントを含むことを特徴とするプラスミド。
【請求項１０】
配列SEQ ID NO:1を含むことを特徴とする請求項９のプラスミド。
【請求項１１】
配列SEQ ID NO:45〜80、108および110、それらの相補的配列、少なくとも１７個のヌクレオチドからなるこれらの配列由来の配列から選択され、任意に適切なマーカーで標識付けされていることを特徴とする、タイプＶ９エリスロウィルス類の識別検出のための診断試薬。
【請求項１２】
(１)分析対象生物学的試料を配列SEQ ID NO:45〜80、108または110の少なくとも１つのプローブと接触させる工程と、
(２)エリスロウィルスヌクレオチド配列プローブ相互作用によって生じた産物を適切な手段で検出する工程
とを含むことを特徴とする、原材料として生物学的試料を用いてハイブリダイゼーションおよび／または遺伝子増幅によってエリスロウィルス類を迅速に識別検出するための方法。
【請求項１３】
工程(１)に先立って、
・ウィルスゲノムに属する、生物学的試料に存在するかもしれない検出対象核酸を抽出する工程と、
・少なくとも１つの遺伝子増幅サイクル
とを含むことを特徴とする請求項１２の方法。
【請求項１４】
請求項７のプライマー対を利用して増幅サイクルが行われることを特徴とする請求項１３の方法。
【請求項１５】
・ウィルスゲノムに属する、生物学的試料に存在するかもしれない検出対象核酸を抽出する工程と、
・請求項７のプライマー対Ｂを利用する少なくとも１つの遺伝子増幅サイクルと、
・一方で配列SEQ ID NO:121とのハイブリダイゼーションによる、もう一方で制限酵素MunIの作用による、増幅した産物の検出
とを含むことを特徴とするエリスロウィルス類を迅速に識別検出するための方法。
【請求項１６】
・ウィルスゲノムに属する、生物学的試料に存在するかもしれない検出対象核酸を抽出する工程と、
・請求項７のプライマー対Ａを利用する少なくとも１つの遺伝子増幅サイクルと、
・制限酵素ApaIの作用による、増幅した産物の検出
とを含むことを特徴とするエリスロウィルス類を迅速に識別検出するための方法。
【請求項１７】
・ウィルスゲノムに属する、生物学的試料に存在するかもしれない検出対象核酸を抽出する工程と、
・請求項７のプライマー対Ｃを利用する少なくとも１つの遺伝子増幅サイクルと、
・増幅した産物の検出
とを含むことを特徴とするエリスロウィルス類を迅速に識別検出するための方法。
【請求項１８】
・ウィルスゲノムに属する、生物学的試料に存在するかもしれない検出対象核酸を抽出する工程と、
・請求項７のプライマー対Ｄを利用する少なくとも１つの遺伝子増幅サイクルと、
・配列SEQ ID NO:58〜60及び110からなる群より選択される配列を有するプローブとのハイブリダイゼーションによる、増幅した産物の検出
とを含むことを特徴とするエリスロウィルス類を迅速に識別検出するための方法。
【請求項１９】
・ウィルスゲノムに属する、生物学的試料に存在するかもしれない検出対象核酸を抽出する工程と、
・請求項７のプライマー対Ｅを利用する少なくとも１つの遺伝子増幅サイクルと、
・配列SEQ ID NO:45〜80、108及び110からなる群より選択される配列を有するプローブとのハイブリダイゼーションによる、増幅した産物の検出
とを含むことを特徴とするエリスロウィルス類を迅速に識別検出するための方法。
【請求項２０】
・ウィルスゲノムに属する、生物学的試料に存在するかもしれない検出対象核酸を抽出する工程と、
・請求項７のプライマー対Ｆを利用する少なくとも１つの遺伝子増幅サイクルと、
・増幅した産物の検出
とを含むことを特徴とするエリスロウィルス類を迅速に識別検出するための方法。
【請求項２１】
個人のエリスロウィルスによる潜在的感染の生体外診断に用いることができるエリスロウィルス核酸配列のハイブリダイゼーション法または遺伝子増幅法を実行するための請求項２または３のポリヌクレオチドあるいは請求項４〜６のいずれか１つのフラグメントの使用。
【請求項２２】
請求項５のフラグメントからなる群から選択され任意に標識付けされたプローブを任意に標識付けされた分類対象ウィルスの核酸と接触させ、得られた核酸−プローブハイブリッドを検出することを含むことを特徴とするエリスロウィルスＶ９または関連エリスロウィルスのスクリーニングおよび分類方法。
【請求項２３】
請求項１１の少なくとも１つの試薬および／または請求項７のプライマー対および／または請求項８のプローブを含むことを特徴とするエリスロウィルス診断キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、ヒトのエリスロウィルス（erythrovirus）由来の核酸配列、そのフラグメントならびにそれらの診断試薬および免疫原性試薬としての応用に関する。
【０００２】
エリスロウィルスＢ１９と最近名づけられたパルボウィルスＢ１９による感染は世界中で一般に広く分布していることが、血清疫学研究により分かっている。
ヨーロッパにおいて、エリスロウィルスＢ１９の血清有病率は、５才未満の被験者の約１０％、２０才を越える被験者については約５０％であり、高齢者では９０％を越える。
この高い血清有病率は、エリスロウィルスＢ１９の感染性が高いことを示唆している。近距離で接触した被験者への伝染率は１０〜６０％で、感染経路は主に空気によるものである（呼吸器系分泌物）。
エリスロウィルスＢ１９は、ヒトに特異的なウィルスである。急性感染は、普通、子供に良性の斑点状皮膚丘疹を引き起こす（表皮性巨大紅斑または第５疾患（5th disease））。関節痛が湿疹に伴うこともあり、まれに慢性化する。
慢性溶血性貧血（鎌状赤血球貧血、サラセミア、ピルベートキナーゼ欠損症等）にすでに罹っている患者では、通常、一過性の急性赤芽球症が起こり、一過性の急性無再生貧血を引き起こす。
【０００３】
エリスロウィルスＢ１９の急性一次感染は妊婦には特に危険で、胎児への感染の危険性は３０％と推定される。貧血、肝機能不全、心機能不全及び胎盤不全による胎児死の危険性は、５〜９％と推定される。
エリスロウィルスＢ１９による慢性感染は、免疫が抑制されている被験者（慢性骨髄性白血病、体液性および細胞性免疫不全、組織あるいは骨髄の移植、エイズによる疾病）に主にみられる。
ＨＩＶ−１血清反応陽性の患者において、エリスロウィルスＢ１９による慢性感染は慢性貧血の原因となるが、他の系列にも作用する（好中球減少症、特に血小板減少症）。これらの患者に十分な体液性免疫反応が欠如していることから、慢性的にエリスロウィルスを血液中に保有する状態になる。この体液性免疫反応の欠如は、慢性赤芽球減少症の発症ならびに湿疹や関節痛等の他の症状がないことを説明する。
【０００４】
エリスロウィルスＢ１９は、約５.４ｋｂの一本鎖ＤＮＡゲノムを有するウィルスである。それは、現在のところ分類された唯一のエリスロウィルスである。配列が決定された株および配列ライブラリー（GenBankまたはEMBL）で公表の対象となった株の全ての遺伝子的変異性は低い（全ゲノムにわたって９８％の核酸配列類似性、ＶＰ１領域にわたって９６％の類似性）（R.O. SHADE, J. Virol., 1986, 58, 3, 921-936, B19-AU）。
エリスロウィルスＢ１９感染のウィルス学的診断は、培養が常套方法で実行できない限りにおいて、主にウィルスのゲノムの検出に基づく。
エリスロウィルスＢ１９の急性感染（一次感染）については、この検出は遺伝子増幅（PCR）によって実行できるが、一次感染時は通常きわめて高い（血清１mlにつき1014まで）ウィルスの力価を考慮するとハイブリダイゼーション（ドット-ブロット）でも可能である。しかしながら、慢性感染時はウィルスの力価がずっと低く、遺伝子増幅検出法しか考えられない。
【０００５】
これらの検出手法は,試験対象ウィルスの遺伝子的変異性しだいであって、公知のエリスロウィルスＢ１９配列から調製した試薬では、遺伝子増幅によっても或いはＢ１９血清診断によっても変異体エリスロウィルス感染の検出はできない。
実際、現行の血清診断試験はエリスロウィルスＢ１９に特異的である（国際出願PCT WO 91/12269; 国際出願PCT WO 96/09391 (IDEIAR パルボウィルスB19 IgG 及びIgM、DAKO; パルボウィルスB19 IgG 及びIgM 酵素イムノアッセイ、BIOTRIN)）。
その結果、上記の検出手法は、核酸レベルにおいても抗体反応に関しても陰性の結果を出す危険がある。
【０００６】
新しい変異体を同定することおよび考慮に入れることは下記の開発に重要である：
−十分に感受性でかつ特異的な、即ち偽陽性または偽陰性の結果を導かないヒトのエリスロウィルス感染の検出および診断（血清診断、PCR、ハイブリダイゼーション）用試薬、
−すべてのエリスロウィルス感染を防ぐことができる組成物（ワクチン）、および
−変異体エリスロウィルス感染を治療することができる組成物（血清療法、モノクローナル抗体）。
従って、発明者は変異体、即ちエリスロウィルスB１９から遺伝子的に距離のあるエリスロウィルス（エリスロウィルスタイプＶ９と呼ばれる）の検出ができるエリスロウィルス由来配列を提供することを目標とした。
【０００７】
本発明の主題は、下記からなる群から選択されることを特徴とする核酸配列である：
−エリスロウィルスＢ１９に関して全ゲノムにわたって１０％以上の遺伝子的差異あるいは距離（９０％未満の類似性）を示すので分子的にはエリスロウィルスB１９配列とは認められないエリスロウィルス由来の配列であって、配列SEQ ID NO:1に関して６％に等しいか、それより低い遺伝子的差異（９４％を越える類似性）を示すもの、
−配列SEQ ID NO:1、および
−前記配列ID NO:1とストリンジェントな条件のもとでハイブリッドできるヌクレオチド配列。
【０００８】
この変異体エリスロウィルスはタイプＶ９変異体と呼ばれる。
ストリンジェントな条件とは、本発明の目的では下記の条件を意味すると理解される：
・４２℃、５０％のホルムアミドを含む１xＳＳＣ緩衝液中で３〜２４時間ハイブリダイゼーション、および
・６０℃、２xＳＳＣ緩衝液の中で１５分３回洗浄。
配列SEQ ID NO:1は、エリスロウィルスタイプＶ９のゲノムの約９５％に相当し全てのコード配列を含み、特にBamHI部位（部位なし）、 HINDIII部位（１部位のみ）及び PvuII（５部位）に関してＢ１９エリスロウィルスとは異なる制限酵素地図を有する。
【０００９】
より具体的には、配列SEQ ID NO:1は、特に下記の制限部位によってエリスロウィルスＢ１９とは異なる制限プロフィールを有する： AccI、AflIII、AlwI、 AlwNI、ApaI、AvaI、AvaII、AvrII、BamHI、BanI、BanII、BbeI、BbsI、BceFI、BcgI、BcnI、BglII、BsgI、BsiEI、BsmI、BsmAI、Bsp120I、BspHI、BspMI、BsrFI、Bst1107I、BstEII、BstUI、Bsu36I、DpnI、DraIII、DsaI、EaeI、EagI、EarI、Ec1136I、EcoNI、Eco109I、EcoRI、EheI、FokI、HaeI、HaeIII、HgaI、HgiAI、HhaI、HincII、HindIII、HinPI、HpaI、KasI、MaeII、MboI、McrI、MscI、MunI、NarI、NciI、NcoI、NsiI、NspI、Nsp7524I、NspBII、 NspCI、PflMI、PmeI、Ppu10I、PpuMI、PstI、PvuII、SacI、Sau3AI、ScaI、SfaNI、SfcI、SmaI、SpeI、SphI、SspI、StuI、StyI、SwaI、Tth111I、XbaI、XmaI およびそのアイソシゾマー。
【００１０】
本発明の主題はまた、エリスロウィルスＶ９の検出を可能にできる配列ID NO:1のフラグメントであって、下記からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むことを特徴とする：
a) SEQ ID NO:1の位置328-2340に相当しNS1タンパク質をエンコードする配列（SEQ ID NO:81）,
b) SEQ ID NO:１の位置1796-2017に相当し7.5 kDa タンパク質をエンコードする配列（SEQ ID NO:83）、
c) SEQ ID NO:1の位置2336-4678に相当しVP1タンパク質をエンコードする配列（SEQ ID NO:85）、
d) SEQ ID NO:1の位置2336-3016に相当しVP1uをエンコードする配列（SEQ ID NO:87）、
e) SEQ ID NO:1の位置2523-2828に相当しXタンパク質をエンコードする配列（SEQ ID NO:89）、
f) SEQ ID NO:1の位置3017-4678に相当しVP2をエンコードする配列（SEQ ID NO:91）、
g) SEQ ID NO:1の位置4488-4883に相当し11 kDaタンパク質をエンコードする配列（SEQ ID NO:93）、
h) 配列SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:91 または SEQ ID NO:93のうちの1つとハイブリッドできるヌクレオチド配列、
i) 配列SEQ ID NO:2〜80、
j) 配列SEQ ID NO:105 (E1905f)、106 (E1987r)、107 (E2076f)、108 (E2151r)、109 (E2406r)、110 (E2149rs)、111 (E2717f)、112 (E2901r)、113 (e1855f)、114 (e2960r)、115 (e1863f)、116 (e2953)、117 (e2435fStul/BglII)、118 (e4813rEcoRI)、119 (e3115fBamHI)、120 (e4813rBamHI) および 121 (e1954fp) 、および
k) 上記の配列に相補的な配列、上記の配列由来であって少なくとも１７個のヌクレオチドからなる配列またはそれらの相補的配列。
【００１１】
本発明の文脈では、核酸配列またはヌクレオチド配列（DNAまたはRNA配列）は、上に定義したような配列およびそれらの相補的配列（アンチセンス配列）ならびに前記配列またはそれらのフラグメントの１つかそれ以上を含む配列の１つを意味すると理解される。
発明はまた、上記フラグメントに相補的なヌクレオチドフラグメント、ならびに上記フラグメントに対しその長さの約１５％の割合でのヌクレオチドの除去または付加によって修飾および／またはヌクレオチドの性質のレベルで修飾されたフラグメントを含む。ただし、修飾ヌクレオチドフラグメントが、対応する未変更フラグメントが示すものと類似の、エリスロウィルスＶ９DNAまたはRNA配列とのハイブリダイゼーション能力を保持するものとする。
【００１２】
これらのフラグメントの中には、特異的であってプローブまたはプライマーとして用いられるものがある。それらは、エリスロウィルスＶ９または関連エリスロウィルスに特異的にハイブリッドする。エリスロウィルスV９に関係するウィルスとは、６％に等しいか、それより低い遺伝子的差異を示すエリスロウィルスを意味すると理解される。これらのフラグメントは、配列SEQ ID NO:45〜80、NO:108および110またはそれらの相補的配列、これらの配列由来であって少なくとも１７個のヌクレオチドからなる配列、前記配列を含む配列からなる群から選択され、エリスロウィルスV９或いは関連エリスロウィルスの特異的同定にその用途が見出される。
これらのフラグメントの中には、配列SEQ ID NO:1のような、エリスロウィルスタイプＶ９或いは関連ウィルス由来の配列の増幅のためのプライマーとして用いられるものもある。これらのプライマーは、配列SEQ ID NO:2〜44および配列SEQ ID NO:105〜109 と111〜121またはそれらの相補的配列、これらの配列由来であって少なくとも１７個のヌクレオチドからなる配列からなる群から選択される。
【００１３】
前記フラグメントはまた、プライマーの場合、アンチセンス配列も含む。
そのような配列は、上記に定義したようなプローブおよび／または適切な制限酵素と組み合せてエリスロウィルス（エリスロウィルスＢ１９とエリスロウィルスＶ９）の識別同定に用途を見出す。
前記プライマーは、１７〜３０個のヌクレオチドからなるのが好ましい。好ましいプライマーは下記のものである：配列SEQ ID NO:105（配列SEQ ID NO:1の位置1797-1815）−配列SEQ ID NO:10に相当、配列SEQ ID NO:106 (配列SEQ ID NO:1の位置1899-1879)−配列SEQ ID NO:11のアンチセンス配列のフラグメントに相当、配列SEQ ID NO:107（配列SEQ ID NO:1の位置1968-1987）−配列SEQ ID NO:13のフラグメントに相当、配列SEQ ID NO:108（配列SEQ ID NO:1の位置2061-2043）−配列SEQ ID NO:58のアンチセンス配列のフラグメントに相当、配列SEQ ID NO:109（配列SEQ ID NO:1の位置2317-2298）−配列SEQ ID NO:16のアンチセンス配列のフラグメントに相当、配列SEQ ID NO:111（配列SEQ ID NO:1の位置2609-2627）−配列SEQ ID NO:19のフラグメントに相当、および配列SEQ ID NO:112（配列SEQ ID NO:1の位置2812-2793）−配列SEQ ID NO:23のアンチセンス配列のフラグメントに相当。
【００１４】
好ましいプライマー対は以下のものである：
−ペアＡ：プライマーSEQ ID NO:111とSEQ ID NO:112；
−ペアＢ：プライマーSEQ ID NO:105とSEQ ID NO:106；
−ペアＣ：配列SEQ ID NO:2〜44、105、106、107、109、111または112の中から１つと配列SEQ ID NO:45〜80、108または110の中から１つ；
−ペアＤ：プライマーSEQ ID NO:107とプライマーSEQ ID NO:109；
−ペアＥ：配列SEQ ID NO:2〜44、105、106、107、109、111または112から選択される２つのプライマー；
−ペアＦ：配列SEQ ID NO:45〜80、108または110から選択される２つのプライマー。
これらの様々なプライマーは、増幅されるフラグメントに応じてセンスプライマーまたはアンチセンスプライマーとして用いることができる。
【００１５】
本発明の主題はまた変異体エリスロウィルスであって、そのゲノムは分子的にエリスロウィルスＢ１９とは認めることができず、上記に定義したような配列SEQ ID NO:1に対し６％に等しいか、それより低い変異を示し、そのゲノムは上記に定義したようなストリンジェントな条件の下で上記に定義したような配列SEQ ID NO:45〜80、108および110の１つと特異的にハイブリッドすることを特徴とする。
本発明の主題はまたプラスミドであって、それは、エリスロウィルスＢ１９とは分子的に認めることができず、エリスロウィルスＢ１９に対して全ゲノムにわたり１０％を越える遺伝子差異を示し配列SEQ ID NO:1とは６％に等しいか、それより低い差異を示す、エリスロウィルスＶ９またはそのフラグメントと呼ばれる変異体エリスロウィルス株のウィルスゲノムを含むことを特徴とする。
【００１６】
前記エリスロウィルスＶ９のウィルスゲノムは、エリスロウィルスＢ１９から遺伝子的に距離があると考えられる。
前記プラスミドの有利な実施態様によれば、それは配列SEQ ID NO:1を含む(PCD.V9.C22)。
本発明の主題はまた、タイプＶ９エリスロウィルスの識別検出のための診断試薬であって、配列SEQ ID NO:45〜80、108および110から選択され任意に適切なマーカーで標識付けされていることを特徴とする。
適切なマーカーには、放射性同位体、酵素、蛍光色素、化学マーカー（ビオチン等）、ハプテン類（ジゴキシゲニン等）および抗体または適切な塩基類似体があげられる。
【００１７】
本発明の主題は、原材料として生物学的試料を用いてハイブリダイゼーションおよび／または遺伝子増幅によってエリスロウィルスを迅速に識別検出するための方法であって、この方法は下記からなることを特徴とする：
（１）分析対象生物学的試料を配列SEQ ID NO:45〜80、108または110の少なくとも１つのプローブと接触させる工程、および
（２）エリスロウィルスヌクレオチド配列プローブ相互作用によって生じた産物を適切な手段で検出する工程。
好ましくは、ハイブリダイゼーションは、５〜６０％のホルムアミド、１〜５x SSC、２％のブロッキング試薬（ブロッキング緩衝液、Boehringer Mannheim, Meylan, France）、０.１％ のN−ラウリルサルコシン、０.０１〜５％のSDSを含む緩衝液中で、４０〜７０°Cで９０分間行われる予備ハイブリダイゼーションを含み、その後、同じ組成の緩衝液３mlに１０(lの標識プローブを加え４０〜７０°Cで１〜３０時間ハイブリダイゼーションを行う。
【００１８】
前記の方法によれば、工程（１）に先立って下記の工程を含んでもよい：
・ウィルスゲノムに属する、生物学的試料に存在するかもしれない検出対象核酸を抽出する工程、および
・少なくとも１つの遺伝子増幅サイクル。
遺伝子増幅工程は、特に下記の遺伝子増幅手法の１つを利用して行われる：Q(−レプリカーゼでの増幅（I. Haruna ら、Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1965, 54, 579-587）、PCR (ポリメラーゼ連鎖反応) (R.K. Saiki ら、1986, Nature, 324:163-6)、LCR (リガーゼ連鎖反応) (F. Barany, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1991, 88, 189-193)、ERA (エンドラン (end-run) 増幅) (C. Adams ら、1994, Novel amplification technologies for DNA/RNA-based diagnostics meeting, San Francisco, CA, United States)、CPR (サイクリングプローブ反応) (P. Duck ら、Biotechniques, 1990, 9, 142-147) 或いはSDA (鎖置換増幅) (GT. Walker, 1994, SDA: novel amplification technologies for DNA/RNA-based diagnostics meeting, San Francisco, CA, United States)。
【００１９】
前記方法の有利な実施態様によれば、増幅サイクルは、配列SEQ ID NO:2〜44、105〜109および111〜112ならびにこれらの配列のフラグメント、好ましくは上記に定義したようなプライマーペアから選択される1対のプライマーを利用して実行される。
ペアAが用いられる場合、増幅産物は制限酵素ApaI (GGGCCC)の作用によってスクリーニングすることに利点がある。Ｂ１９ゲノムの増幅産物はApaIによって開裂する（149塩基対(bp)と55 塩基対(bp)の2つのフラグメントを生じる）が、一方、Ｖ９ゲノムの増幅産物はApaIによって開裂しない（204 bpの１つのフラグメント）。アガロースまたはアクリルアミドゲル電気泳動法により、これらの制限フラグメントを識別することができる。
【００２０】
ペアBが用いられる場合、増幅産物は下記の制限酵素の１つの作用によってスクリーニングすることに利点がある：BglII (AGATCT)または MunI (CAATTG)；従って、エリスロウィルスＶ９またはＢ１９が関与しているかどうかによって、異なるフラグメントが得られる。BglII制限部位を含むフラグメントは上記のとおり変異体エリスロウィルスＶ９に特異的であるが、一方、Ｂ１９エリスロウィルスはこの領域にMunI部位を有する。Ｂ１９ゲノムの増幅産物はMunIによって開裂し (36 bpと67 bpの２つのフラグメントを生じる) 、BglIIによっては開裂しない (103 bpの１つのフラグメント)。一方、Ｖ９ゲノムの増幅産物はBglIIによって開裂し (19 bpと 84 bp の２つのフラグメント)、MunIによっては開裂しない (103 bpの１つのフラグメント)。 アガロースまたはアクリルアミドゲル電気泳動法により、これらの異なる制限フラグメントを識別することができる。
ペアC（全てのエリスロウィルスとハイブリッドできるプライマーとエリスロウィルスＶ９と特異的にハイブリッドできるプライマー）が用いられた場合、またはペアF（エリスロウィルスＶ９と特異的にハイブリッドできる2つのプライマー）が用いられた場合、Ｖ９ゲノムは増幅されるが、Ｂ１９ゲノムについては特異的な増幅はない。
【００２１】
ペアDが用いられた場合、増幅産物は、配列SEQ ID NO:58〜60および110から選択される、エリスロウィルスＶ９に特異的な標識プローブとのハイブリダイゼーション、好ましくは配列SEQ ID NO:110のプローブとのハイブリダイゼーションによってスクリーニングすることに利点がある。Ｖ９ゲノムの増幅産物は、これらのプローブ、特に配列SEQ ID NO:110のプローブと特異的にハイブリッドするが、一方、Ｂ１９ゲノムの増幅産物は上記のプローブとハイブリッドしない。
ペアEが用いられた場合、増幅産物は、配列SEQ ID NO:45〜80、108および110から選択される、エリスロウィルスＶ９に特異的なプローブとのハイブリダイゼーション法のいずれかによってスクリーニングされる。この場合、Ｖ９ゲノムの増幅産物はこのプローブとハイブリッドするが、Ｂ１９ゲノムの増幅産物はしない。
【００２２】
発明の主題はまた、上記の配列、これらの配列由来のフラグメントまたはそれらの相補的配列を、エリスロウィルス核酸配列のハイブリダイゼーション法または遺伝子増幅法を実行するために使用することであり、これらの方法は、個人のエリスロウィルスタイプＶ９による潜在的感染の生体外診断に用いることができる。
本発明の主題はまた、エリスロウィルスＶ９または関連ウィルスのスクリーニングおよび分類方法であって、配列SEQ ID NO:45〜80、108および110からなる群から選択され、任意に標識付けされたプローブを分類対象ウィルスの核酸と接触させ、得られた核酸−プローブハイブリッドを検出することを含むことを特徴とする。
【００２３】
本発明の主題はまた、上記に定義したヌクレオチド配列によってエンコードされていることを特徴とする翻訳産物である。
本発明の主題はまた、特に上記に定義したような配列SEQ ID NO:81、83、85、87、89、91および93ならびにそれらに由来する7〜50個のアミノ酸からなるペプチドからなる群から選択されるヌクレオチド配列を利用して発現され得ることを特徴とする、タンパク質である。
ペプチドは今後、上記に定義したようなタンパク質とペプチドの両方を意味すると理解される。
そのようなペプチドは、特に、エリスロウィルスＶ９に誘導された抗体によって認識し、かつ／または抗エリスロウィルスＶ９抗体の産生を誘導することができる。
【００２４】
前記ペプチドは、特に、配列SEQ ID NO:82 (NS1タンパク質)、SEQ ID NO:86 (VP1タンパク質)、SEQ ID NO:88 (単VP1 タンパク質)、SEQ ID NO:92 (VP2 タンパク質) およびSEQ ID NO:95-104、即ち、VP1タンパク質のフラグメント[VP1aペプチド (SEQ ID NO:95)；VP1bペプチド (SEQ ID NO:96)；VP1cペプチド (SEQ ID NO:97)；ペプチドVP1d (SEQ ID NO:98)；ペプチドVP1e (SEQ ID NO:99) およびペプチドVP1f (SEQ ID NO:100)]、またはVP2タンパク質のフラグメント[ペプチドVP2a (SEQ ID NO:101)；ペプチドVP2b (SEQ ID NO:102)；ペプチドVP2c (SEQ ID NO:103)；ペプチド VP2d (SEQ ID NO:104)]ならびにそれらに由来する７〜５０個のアミノ酸からなるペプチドから選択される。
【００２５】
発明の主題はまた、特に合成手段によって得られた、発明によるヌクレオチド配列の１つまたはそれ以上の翻訳産物および／または上記に定義したようなペプチドの１つを含む免疫原性組成物である。
発明の主題はまた、上記のペプチドの１つまたはそれ以上に対する抗体と、それら抗体を特に個人のエリスロウィルスによる感染の生体外識別診断法を実行するために使用することである。
発明の主題はまた、エリスロウィルスＶ９感染の免疫学的検出法であって、
−抗エリスロウィルスＶ９抗体の検出のために、生物学的試料を発明によるペプチドと接触させること（血清診断法）と、
−エリスロウィルスV９ウィルスタンパク質の検出のために、生物学的試料を発明による抗体に接触させることを含み、
結果の読取が適切な手段、特にEIA、ELISA、RIA、蛍光によって明らかにされることを特徴とする。
【００２６】
実例として、発明によるそのような生体外診断法は、患者から採取した生物学的試料を発明による抗体または発明によるペプチドと接触させ、適切ないずれかの方法を利用して、特に標識抗免疫グロブリンを利用して、生物学的試料中に存在するかもしれないエリスロウィルスの抗原または抗体と前記抗体または前記ペプチドとの間でそれぞれ形成される免疫学的複合体を検出することを含む。
発明による試薬は、妊婦、貧血および／または慢性血小板減少症に罹っているHIV陽性患者、組織または骨髄被移植者及び中枢急性貧血（central acute anaemia）の患者でエリスロウィルスＢ１９検出試験が陰性である患者におけるＶ９エリスロウィルスおよび関連ウィルスの検出に特に有用である。
発明の主題は、これらに加えて、発明による少なくとも１つの試薬（プローブ、プライマーペア、ペプチドまたは抗体）を含むことを特徴とするエリスロウィルス診断キットである。
【００２７】
上記の特徴に加えて発明はさらに他の特徴を有するが、それらの特徴は、本発明の主題である方法の例示として下記に記載の実施態様ならびに添付図面から明らかになるであろう。
しかしながら、これらの例は発明の主題の例示としてのみ記載されたものであって何ら限定を加えるものではないことを理解すべきである。
【００２８】
実施例1: 本発明による配列の形成
事実上V9変異体の全ゲノム(95%)を表す5028 bpのAatII/AatII制限フラグメントを、以下の方法によってシーケンシングベクターpcDNA2.1 (Invitrogen, オランダ)にクローンした。
1本鎖ウィルスDNAを、QIAamp血液キットカラム（Qiagen S.A.,フランス）を用いて急性赤芽球減少症発作患者の血清から抽出した。56℃の50mM NaCl緩衝液中で16時間のハイブリダイゼーションにより、ウィルスDNAを2本鎖DNAに変換する。次に、1.3μgの2本鎖ウィルスDNAにAatII制限酵素（18U）を37℃で2時間作用させ、次いで制限酵素を65℃で15分間不活性化する。Millipore(登録商標)VSWPO13000酢酸セルロースおよび硝酸エステル膜で、生成物を水に対して2時間透析する。このようにして調製した2本鎖ウィルスDNA AatII/AatII制限フラグメントを、連結反応工程を待つ状態で−20℃で凍結する。
【００２９】
AatIIフラグメントを受容するように、部位特異的挿入変異によってベクターpcDNA2.1を修飾する: 多数のクローニング部位のEagI制限部位を除去し、AatII部位で置換した。このようにしてつくったベクターpcDNA2.1aを細菌培養物中で増やし、QIAfilterプラスミド  マキシ  キット(Maxi Kit)(Qiagen S.A., フランス)を用いて精製した。次に、3μgのベクターpcDNA2.1aを酵素AatIIを用いて37℃で1時間制限作用に付し、エビのアルカリホスファターゼ(Boehringer Mannheim, Meylan, フランス)で脱リンする。酵素は、65℃で15分間不活性化する。
【００３０】
連結反応は、ベクター/ウィルスDNA挿入モル比1/1で行う。つまり上記のように調製した50 ngのベクターと100 ngのウィルスDNAインサートで、1 UのT4リガーゼ(Life Technologies, フランス)を用いて24℃で16時間行う。1/2に希釈した後、T4リガーゼを不活性化させるために連結生成物を65℃で熱し、次いで氷上で冷却する。エレクトロコンピテント細菌Sure(登録商標)(Stratagene, ハイデルベルク, ドイツ)を、2または4μlのこの連結溶液を用いてエレクトロポレートさせ(1500 V、50 μF、200 Ω)、次いで1 mlのSOC培地 (Life Technologies, フランス)で1時間インキュベートした後、100 μg/mlのアモキシリン、15 μg/mlのテトラサイクリン、100 μg/mlのIPTGおよび50 μg/mlのX-galを含有するルリアブロス寒天培地(Life Technologies, フランス)に塗布する。
24個の(組換え)白色コロニーを選択し、それらのプラスミドをDNAのミニプレップによって抽出し、概略の制限酵素地図(AatII、AatII + BamHI、BamHI、BamHI + BglII、HindII)によって、V9ウィルスインサートに大きさと制限酵素地図が適合しているインサートを含む2つの組換えクローンを選択することができた。
【００３１】
これら2つのクローン(2および22)は、自動シークエンサーABI 377 (Perkin Elmer、フランス)を用いて配列決定した。これらは実際に5028 bpのインサートを有しており  、2つの配列は位置1165以外で同一である(クローン2及び22について、それぞれクロ  ーンAおよびG)。V9ウィルスDNAの直接配列により、位置1165のGが正しいことが決定  できた。したがって、配列がSEQ ID NO:1に相当するクローン22(PCD.V9.C22)が選択さ  れた。
図1から6は、エリスロウィルスV9とエリスロウィルスB19との遺伝的距離を示す。これらの図において、種々のエリスロウィルス配列はGenBankの記憶用コード(mnemonic)(1997年10月発売の103.0)によって示している。
【００３２】
実施例2: 特定のプローブを用いたDNAハイブリダイゼーション(ドットブロット、スロットブロットまたはマイクロプレート)によるV9タイプエリスロウィルスの診断
ウィルスDNAを、例えばQIAamp血液キットカラム(Qiagen S.A. フランス)、または核酸を抽出する他のいずれかの方法によって生物学的試料(血液、血清、血漿、羊水、骨髄、組織)から抽出する。溶液中のDNAを95℃で2分間変性させ、次いで氷上で冷却し、吸引濾過によってナイロン膜または硝酸セルロース膜上に移し、その後固定(膜を80℃で1時間加熱)する。次に、ストリンジェントな条件下で、例えば配列SEQ ID NO:1またはその相補的配列、またはそのフラグメント、特に配列SEQ ID NO:45〜SEQ ID NO:80および110とそれらの相補的配列、または適切に標識したこれらの配列のフラグメントなどのV9に特異なDNAプローブまたはRNAプローブを用いて膜をハイブリダイズする。この標識は、放射性元素(32P, 33P, 35S, 3H, 14Cまたは別の放射性同位元素)、低温標識(ビオチン)、蛍光マーカー、ジゴキシゲニン、またはDNAあるいはRNAフラグメントに結合するかまたは組み込まれてもよく、かつ特定の抗体またはルテニウムキレートで検出可能なその他の分子を用いた標識付けでもよい。放射活性元素を標識する場合には、オートラジオグラフィまたは放射性同位元素の放出を検出できるその他の方法(例えばPhosphorimager, Molecular Dynamics, Bondoufle, フランス)によって視覚化することができる。ビオチン標識の場合には、酵素/ストレプトアビジン複合体および適当な視覚化基質を用いて視覚化することができる。蛍光標識では、fluoro-Imager (Molecular Dynamics, Bondoufle, フランス)または蛍光放射を検出できる他のいずれかの装置を用いて視覚化することができる。ジゴキシゲニン(または他の抗原)を用いた標識では、視覚化は酵素(アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼまたはいずれかの他の酵素)に直接結合した抗ジゴキシゲニン抗体(または標識に使用した抗原に特異的な抗体)を用いるか、または間接的に、抗ジゴキシゲニン抗体(または標識に使用した抗原に特異的な抗体)と酵素に結合した抗体とを用いて行われる。視覚化には、複合体の酵素に適した基質が用いられる。ルテニウムキレート(TBRなど)を用いた標識の場合には、エレクトロ-ケミルミネッセンス反応(G.F. Blackburnら., Clin. Chem., 1991, 37:1534-1539)によって視覚化される。
【００３３】
この方法の変形は、ウィルスDNAをマイクロプレートまたは他の固形支持体に固定し、上記の標識プローブとハイブリダイズすることからなる。
この方法の別の変形は、未標識プローブをマイクロプレートまたは他の固形支持体に固定し、予め標識した試料のウィルスDNAとハイブリダイズすることからなる。
【００３４】
実施例 3: 遺伝子増幅(PCRつまりポリメラーゼ連鎖反応)およびハイブリダイゼーションによるV9タイプエリスロウィルスの診断
ウィルスDNAを、QIAamp血液キットカラム(Qiagen S.A., フランス)またはいずれかの他の核酸抽出法によって生物学的試料(血液、血清、血漿、羊水、骨髄、組織)から抽出する。
PCRはSaikiらに記載の方法(Nature, 1986, 324: 163-66)に基づき、最終容量100μlの反応混合物(50 mMのKCl; 10 mMのTris-HCl pH 8.3; 2.5 mMのMgCl2; 200μMのdNTP; 25 pmolのセンスオリゴヌクレオチドおよびアンチセンスオリゴヌクレオチド)中の10 μlのDNA溶液と1.5 IUのAmpliTaq GoldTM (Perkin Elmer, フランス)を用いて行う。増幅プライマーは、V9変異体DNAのみを増幅ように選択した20〜25 マーのオリゴヌクレオチドである。2つのプライマー(センスおよびアンチセンス)がV9に特異的な配列(SEQ ID NO:45〜80、 108および110)またはそれらの相補的配列のフラグメントであるか、またはプライマーの一方がV9に特異的な配列(SEQ ID NO:45〜80、108および110)またはそれらの相補的配列から選択され、もう一方のプライマーがB19エリスロウィルスおよびV9エリスロウィルスのいずれをもハイブリダイズすることができる配列(SEQ ID NO:2〜44, 105〜107, 109および111〜112)またはそれらの相補的配列から選択される。温度サイクルは、以下のプログラムに従ってサーモサイクラー(T9600、Perkin Elmer,フランス)により反応混合物に適用される。
【００３５】
1サイクル：  95℃で6分
5サイクル：  95℃で60秒、
60℃で30秒、
72℃で30秒
45サイクル：  95℃で30秒、
60℃で30秒、
72℃で30秒
1サイクル：  72℃で5分間
【００３６】
従来技術(Sambrook J.ら, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor)にしたがって、増幅生成物を1.3%アガロースゲル上に置いて電気泳動分離に付し、装填したナイロン膜に毛管作用によって転移する。
プローブは20〜30マーのオリゴヌクレオチドであり、V9に特異的な配列(SEQ ID NO:45〜80、108および110)またはそれらの相補的配列のフラグメントである。これは、DIGオリゴヌクレオチド追跡キット(Boehringer Mannheim, Meylan, フランス)を用いてDIG-dUTPで3'に標識する。
転移膜は、50% ホルムアミド; 5x SSC; 2%の阻止試薬(Boehringer Mannheim, Meylan, フランス); 0.1%のN-ラウリルサルコシン; 0.02%のSDSからなる緩衝液中、42℃で90分間予めハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションは、同組成の3mlの緩衝液中、10μlの標識プローブを用いて42℃で16時間行う。0.1% SDS含有2x SSC緩衝液中、60℃で10分間膜を2回洗浄し、次いで0.1% SDS含有1x SSC 緩衝液中、60℃で10分間2回洗浄する。その後、膜をDIG蛍光検出キット (Boehringer Mannheim, Meylan, フランス)およびオートラジオグラフィで視覚化する。
【００３７】
実施例4: 遺伝子増幅およびハイブリダイゼーションによるB19タイプおよびV9タイプエリスロウィルスの集団診断および識別診断
ウィルスDNAを生物学的試料 (血液、血清、血漿、羊水、骨髄、組織)からQIAamp血液キットカラム(Qiagen S.A., フランス)またはその他のいずれかの核酸抽出法によって抽出する。
PCRは、Saikiらに記載の方法(上記に引用のNature, 1986)に基づき、最終容量100μlの反応混合物(50 mMのKCl; 10 mMのTris-HCl pH 8.3; 2.5 mMのMgCl2; 200μMのdNTP; 25 pmolのセンスオリゴヌクレオチドおよびアンチセンスオリゴヌクレオチド)中、10μlのDNA溶液と1.5 IUのAmpliTaq GoldTM (Perkin Elmer, フランス)を用いて行う。増幅プライマーは、B19DNAおよびV9変異体DNAを増幅するように選択した20〜25マーのオリゴヌクレオチドである。2つのプライマー(センスおよびアンチセンス)は、B19エリスロウィルスおよびV9エリスロウィルスのいずれをもハイブリダイズできる配列(SEQ ID NO:2〜44、105〜107、109および111〜112)またはそれらの相補的配列のフラグメントである。温度サイクルは、以下のプログラムに従ってサーモサイクラー(T9600, Perkin Elmer, フランス)で反応混合物に適用される。
【００３８】
1サイクル：  95℃で6分
5サイクル：  95℃で60秒
60℃で30秒
72℃で30秒
45サイクル：  95℃で30秒
60℃で30秒
72℃で30秒
1サイクル：  72℃で5分
【００３９】
従来技術(上記に引用のSambrook J.ら, 1989)にしたがって、増幅生成物を1.3%アガロースゲル上に置いて電気泳動分離に付し、装填したナイロン膜に毛管作用によって転移する。
プローブは20〜30マーのオリゴヌクレオチドで、V9に特異的な配列(SEQ ID NO:45〜80、108および110)もしくはそれらの相補的配列のフラグメントであるか、またはB19に特異的な配列のフラグメントであるか、最終的にはまたは、集団診断の実施を目的とする場合にはB19とV9のいずれをもハイブリダイズする配列(SEQ ID NO:2〜44または105〜107、109、111〜112)のフラグメントである。これは、DIGオリゴヌクレオチド追跡キット(Boehringer Mannheim, Meylan, フランス)を用いてDIG-dUTPで3'に標識する。
転移膜は実施例3に記載した条件下で予めハイブリダイズし、その後ハイブリダイズする。
【００４０】
実施例 5: 遺伝子増幅および制限酵素によるB19タイプおよびV9タイプエリスロウィルスの集団診断および識別診断
QIAamp血液キットカラム(Qiagen S.A., フランス)またはその他のいずれかの核酸抽出法による生物学的試料(血液、血清、血漿、羊水、骨髄、組織)からのウィルスDNAの抽出。
NS1a PCRは、Saikiらによる記載の方法にしたがって、最終容量50 μlの反応混合物(50 mMのKCl; 10 mMのTris-HCl pH 8.3; 2.5のmM MgCl2; 200μMのdNTP; 12.5 pmolのセンスオリゴヌクレオチドおよびアンチセンスオリゴヌクレオチド)中の5μlのDNA溶液、1.5 IUのAmpliTaq GoldTM (Perkin Elmer, フランス)および一対のプライマーB(センスプライマーe1905f、SEQ ID NO:105; およびアンチセンスプライマーe1987r、SEQ ID NO:106)を用いて以下の温度サイクルで行う (サーモサイクラーT9700, Perkin Elmer, フランス):
【００４１】
1 サイクル：  94℃で6分
5 サイクル：  94℃で30秒
55℃で1分
72℃で1分
45 サイクル：  94℃で30秒
60℃で30秒
72℃で30秒
1 サイクル：  72℃で7分
【００４２】
従来技術(上記に引用のSambrook J.ら, 1989)にしたがって、増幅生成物のアリコート(10μl)を2%アガロースゲル上に置いて電気泳動分離に付し、装填したナイロン膜に毛管作用によって転移する。36 マー、e1954fp (SEQ ID NO:121)のオリゴヌクレオチドプローブ: 配列SEQ ID NO:11のフラグメントACCAGTATCAGCAGCAGTGGTGGTGAAAGCTCTGAAと膜をハイブリダイズした。このプローブによって、B19タイプおよびV9タイプのエリスロウィルスを検出することができる。
増幅生成物のアリコート(10μl)を制限酵素MunIの作用に2時間付し、次いで2%アガロースゲル上で電気泳動分離に付した。上記のように、開裂があればエリスロウィルスのタイプはB19であり、開裂がなければV9である。
【００４３】
NS1a PCRの結果:
旧B19 PCR(Lefrereら, Transfusion, 1995, 35:389-391)で中程度または微弱な陽性を示すことがわかった79個の試料を、新NS1a PCR(コンセンサスエリスロウィルス、本発明による配列)を用いてスクリーニングした。スクリーニングした79個の試料のうち、31個が陽性であり、制限酵素MunIによって分類された。このうち、18個(58%)がB19タイプ、13個(42%)がV9タイプであった。
NS1a PCRで陽性だった試料は、30サイクルの第1増幅工程(PCRS1)でプライマー対e1855f (SEQ ID NO:113)とe2960r (SEQ ID NO:114)を使用し、50 サイクルの第2増幅工程(PCRS2)でプライマー対e1863f (SEQ ID NO:115)とe2953r (SEQ ID NO:116)を使用することにより、反復(nested)PCR(S1S2 PCR)で1100 bpに増幅することができた。15個の試料が S1S2 PCRで陽性を示すことが分かり、1110 bpで配列決定された(NS1A PCRによる13個のB19タイプ、2個の変異体タイプ)。配列分析から、以下のことが示された:
【００４４】
-  Bプライマー(センスプライマーe1905f、SEQ ID NO:105；およびアンチセンスプライマーe1987r、SEQ ID NO:106)は、15個の配列(B19タイプおよび変異体タイプ)のすべて、ならびに公知のB19配列のすべてにおいて完全に保存されている。このことは、B19およびV9のコンセンサス診断検査法におけるこれらの使用の重要性を立証している。
-  配列SEQ ID NO:11のフラグメントであるプローブe1954fp (SEQ ID NO:121)は、15個の配列および公知のB19配列すべてにおいて同様に完全に保存されている。
-  B19配列は、それら(GenBank の7個のB19配列およびこの研究での13個のB19配列)のあいだに差異が1.2%以下の完全に均質な基を形成する。
-   最終的に、MunI消化でのNS1a PCRによって変異体エリスロウィルスに分類された2個の配列において、V9で4.5%以下の差異が認められる。
【００４５】
実施例6: V9のキャプシド遺伝子VP1およびVP2のバキュロウィルス発現ベクターへのクローニング
第1の工程:
‐VP1遺伝子の細菌プラスミドへのクローニング
最終容量100 μlの反応混合物(20 mM Tris-HCl pH 8.8; 10 mM  KCl、10 mM (NH4)2SO4; 2 mM MgSO4; 0.1% トリトンX-100; 0.1 mg/ml BSA; 0.2 mM dNTP; 25 pmolのセンスプライマー (e2435fStuI/BglII:
AAAGGCCTAGATCTTGTAGATTATGAGTAAAAC、SEQ ID NO:117)およびアンチセンスプライマー(e4813rEcoRI:GGGAATTCGGTGGGTGACGGTTCCTG、SEQ ID NO:118))中の10 μlのV9ウィルスDNA 10-2希釈液および2.5 UのPfu TurboTM (Stratagene, フランス)を用いて、Saikiらに記載の方法(Nature, 1986, 324:163-166)にしたがってV9のVP1遺伝子をPCRで増幅する。増幅プライマーは V9配列のVP1遺伝子のいずれかの側から選択し、その5'末端はクローニングを容易にするように制限部位(名称中に示す)を加えて修飾した。反応混合物に対して適用された温度サイクルは、以下の通りである。
【００４６】
1サイクル：  94℃で1分
20サイクル：  94℃で1分
55℃で1分
72℃で2.5分
1 サイクル：  72℃で10分
【００４７】
VP1遺伝子の増幅生成物をシリカカラム(QIAquick PCR精製キット, Qiagen, フランス)を用いて精製し、次いで制限酵素StuIおよびEcoRIの作用に付した。制限酵素の熱不活性化後(65℃で20分間)、0.025μmのフィルター(VSWP01300, Millipore)上で水に対して透析することにより、VP1遺伝子フラグメントを精製した。プラスミドpBacPAK8 (Clontech, フランス)を制限酵素StuIおよびEcoR1の作用に付し、次いでベクターをエビのアルカリホスフォターゼ(Boehringer, フランス)で脱リンする。制限酵素の熱不活性化後(65℃で20分間)、プラスミドをQIAquick PCR精製キット(Qiagen)で精製した。
【００４８】
連結は、50 ngのプラスミドpBacPAK8と100 ngのVP1フラグメント(上記のように調製)とT4リガーゼ(Life Technologies, フランス)を用いて行う。T4リガーゼの熱不活性化後(65℃で10分間)、水で1/2に希釈した2μlの連結生成物を25μlのエレクトロ-コンピテント細菌(Epicurian Coli Sure エレクトロポレーション-コンピテント細胞、Strategene)を用いてエレクトロポレートさせる。エレクトロポレートした細菌を直ちに1 mlのSOC培地(2%トリプトン, 0.5%の酵母エキス、10 mMのNaCl, 2.5 mMのKCl, 10 mMのMgCl2, 10 mMのMgSO4 および20 mMのグルコース)中に採取し、攪拌しながら37℃で1時間インキュベートする。次に、10μl、100μlおよび890μlの形質転換細菌を、50μg/mlのアンピシリンを含有するレノックス寒天の皿(10 g/lのペプトン、5 g/lの酵母エキス、5 g/lのNaClおよび13 g/lの寒天)にプレートする。37℃で24時間インキュベートした後、コンストラクト当たり24個のコロニーを5 mlの50 μg/mlアンピシリン含有レノックス培地で副培養し、攪拌しながら37℃で24時間インキュベートする。
【００４９】
プラスミドDNAをQIAprep 8 Turbo ミニプレップキット(Qiagen)を用いてアルカリ性ミニライシス(minilysis)で抽出し、Stu1/EcoRIおよびKpnI/HindIII制限部位によって分析し、インサートの存在とその方向性を確定する。クローンpB8-VP1.C5を選択し、組換えプラスミドをシーケンシングによって調べた。
- VP2遺伝子の細菌プラスミドへのクローニング
V9のVP2遺伝子を、Saikiらに記載の方法(Nature, 1986, 324:163-166)にしたがって、最終容量100 μlの反応混合物(20 mMのTris-HCl pH 8.8; 10 mMのKCl, 10 mMの(NH4)2SO4; 2 mMのMgSO4; 0.1%のトリトン X-100; 0.1 mg/mlのBSA; 0.2 mMのdNTP; 25 pmolのセンスプライマー(e3115fBamHI:
CACGGATCCATACCCCAGCATGACTTCAG, SEQ ID NO:119)およびアンチセンスプライマー(e4813rBamHI: CACGGATCCGGTGGGTGACGGTTCCTG, SEQ ID NO:120))中の10 μlのV9ウィルスDNA 10-2 希釈液と2.5 UのPfu TurboTM (Stratagene, フランス)とを用いてPCRで増幅させる。増幅プライマーはV9配列のVP2 遺伝子のいずれかの側で選択し、その5'末端はクローニングを容易にするために制限部位(名称中に示す)を加えて修飾した。反応混合物に適用された温度サイクルは、以下の通りである:
【００５０】
1サイクル：  94℃で1分
20サイクル：  94℃で1分
60℃で1分
72℃で2.5分
1サイクル：  72℃で10分
【００５１】
VP2遺伝子の増幅生成物をシリカカラム(QIAquick PCR精製キット、Qiagen, フランス)を用いて精製し、次いで制限酵素BamHIの作用に付した。VP2遺伝子フラグメントは、QIAquick PCR精製キット(Qiagen)で精製した。
プラスミドpBacPAK8 (Clontech, フランス)を制限酵素BamHIの作用に付し、次いでベクターをエビのアルカリホスファターゼ(Boehringer, フランス)を用いて脱リンする。エビのアルカリホスファターゼを熱不活性化した後(65℃で20分間)、プラスミドをフェノール/クロロホルム抽出で精製し、エタノールで沈澱させる。
連結は、50 ngのプラスミドpBacPAK8と100 ngのVP2フラグメント(上記のように調製)と、T4リガーゼ(Life Technologies, フランス)を用いて行う。T4リガーゼの熱不活性化後(65℃で10分間)、水で2/1に希釈した2μlの連結生成物を、25μlのエレクトロ-コンピテント細菌(Epicurian Coli Sure エレクトロポレーション-コンピテント細胞、Stratagene)を用いてエレクトロポレートする。エレクトロポレートした細菌を直ちに1 mlのSOC培地中に採取し、攪拌しながら37℃で1時間インキュベートする。次に、10μl、100μlおよび890μlの形質転換細菌を、50μg/mlアンピシリン含有レノックス寒天の皿で培養する。37℃で24時間インキュベートした後、コンストラクト当たり24個のコロニーを5 mlの50μg/mlアンピシリン含有レノックス培地で副培養し、攪拌しながら37℃で24時間インキュベートする。
【００５２】
QIAprep 8 Turbo ミニプレップキット(Qiagen)を用いてアルカリミニライシスでプラスミドDNAを抽出し、BamHIとSacIの制限部位によって分析し、インサートの存在とその方向性を決定する。クローンpB8-VP2.C20を選択し、組換えプラスミドをシーケンシングで調べた。VP2のイニシエーターATGのすぐ上流で除かれた塩基Aが確認できるが、この変異は無視できるものである。これは、VP2の発現を生じさせない。
【００５３】
第2の工程:
-VP1を発現する組換えバキュロウィルスの構築
プラスミドpB8-VP1.C5を、Bsu361(BacPAKTM バキュロウィルス発現系、Clontech)で線状化したバキュロウィルスBacPAk6とともに、リポフェクチンを用いてSF9昆虫細胞に形質移入する。溶菌プラーク法で2回の分離を行い、分離したプラークをニトロセルロース膜に転移し、次いでこの膜をV9のVP1遺伝子に特異的なDNAプローブでハイブリダイズする。
組換えバキュロウィルスBacPAK6-pB8-VP1.C4.2は、このようにして選択した。VP1タンパク質の発現は、この組換えバキュロウィルスに感染させたSF9細胞の細胞ペレットでウエスタンブロッティングすることによって確認された。バンドは予想された大きさのVP1 (約80 kDa)で確認されたが、これは抗-VP1-B19モノクローナル抗体(Argene, フランス)では認められない。このモノクローナル抗体は、V9のVP1タンパク質と交差反応しない可能性がある。
【００５４】
バキュロウィルスへのクローニングは、プライマーBac1とBac2(Clontech)を用いたPCRの後にシーケンシングして確認された。
-VP2を発現する組換えバキュロウィルスの構築
プラスミドpB8-VP2.C20を、Bsu361(BacPAKTM バキュロウィルス発現系、Clontech)で線状化したバキュロウィルスBacPAk6とともに、リポフェクチンを用いてSF9昆虫細胞に形質移入する。溶菌プラーク法で2回の分離を行い、分離したプラークをニトロセルロース膜に転移し、次いでこの膜をV9のVP2遺伝子に特異的なDNAプローブを用いてハイブリダイズする。
【００５５】
組換えバキュロウィルスBacPAK6-pB8-VP2.C1.3が、選択される。VP2タンパク質の発現は、この組換えバキュロウィルスに感染させたSF9細胞の細胞ペレットでウエスタンブロッティングすることによって確認した。抗-VP2-B19モノクローナル抗体(Argene, フランス)は、アクリルアミドゲル上でも明確に見ることができる見かけの分子量が約58 kDaのタンパク質を実際に検出する。電子顕微鏡では、V9のVP2タンパク質を発現する組換えバキュロウィルス感染後のSF9細胞の培養上清に、直径が約20〜30 nmのウィルス様粒子が確認される。得られたウィルス様粒子の大きさと外観は、あらゆる点でB19について記述のものと一致している。この観察から、V9のVP2タンパク質がバキュロウィルスから天然形態で産生されたことが確認される。というのは、これは自己集合によって中空キャプシドを形成することができるためである。
バキュロウィルスへのクローニングは、プライマーBac1とBac2(Clontech)を用いたPCRの後にシーケンシングすることによって確認された。
【００５６】
第3の工程:
バキュロウィルスで発現されたV9のタンパク質VP1とVP2は、精製すると、V9エリスロウィルス感染を診断するための新しい血清学的試験の標的抗原として使用されるであろう。
上記より明らかなように、本発明は単に明示的に記載した実施例、具体例および用途に限定されるものではない。本発明はそれどころか、本発明の範疇又は範囲から逸脱しないで当業者がなし得る全ての変形を包含するものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】  エリスロウィルスＶ９の系統樹で、完全エリスロウィルス配列の系統樹を示す。
【図２】  エリスロウィルスＶ９の系統樹で、エリスロウィルスNS1遺伝子の系統樹を示す。
【図３】  エリスロウィルスＶ９の系統樹で、エリスロウィルスVP1遺伝子の系統樹を示す。
【図４】  完全エリスロウィルス配列についての遺伝子の距離を示す。
【図５】  エリスロウィルスNS1遺伝子についての遺伝子の距離を示す。
【図６】  エリスロウィルスVP1遺伝子についての遺伝子の距離を示す。
【図７】  配列ID NO:1の制限酵素地図を表す。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図７．１】
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【図７．２】
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【図７．３】
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