(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
顕微鏡の視野内で高さ方向にばらつきのある複数の被検体に対して微小針を用いて微細操作を行うマイクロマニピュレーションシステムにおいて、
前記微小針を少なくとも前記顕微鏡の光軸方向に移動させるマニピュレータ駆動手段と、
前記微小針の先端部が対物レンズの焦点に合う位置を基準位置として、微細操作を開始する前記微小針の位置である微細操作開始位置を決定する微細操作開始位置決定手段と、
前記被検体と前記対物レンズとの位置を相対的に移動させる被検体移動手段と、
前記微小針の先端部が対物レンズの焦点に合う位置を基準位置として、前記顕微鏡の表示画像上での前記被検体毎にインジェクション開始位置を決定するインジェクション開始位置決定手段と、
前記被検体移動手段による前記被検体の相対的な移動に応じて、前記インジェクション開始位置決定手段により設定した前記被検体のインジェクション開始位置毎に前記対物レンズの焦点の合う位置を示す合焦位置を検出する合焦位置検出手段と、
前記合焦位置検出手段による検出結果に基づいて、前記対物レンズの合焦位置毎に前記被検体移動手段の動作を制御する被検体移動制御手段と、
前記被検体移動制御手段により前記被検体を、前記被検体のインジェクション開始位置に対応する前記合焦位置に移動させ、かつ、前記微小針を前記微細操作開始位置に移動させた状態で、前記微細操作処理を行う微細操作制御手段と、
を備えることを特徴とするマイクロマニピュレーションシステム。
【請求項２】
前記合焦位置検出手段は、
前記顕微鏡の光軸方向への前記被検体の移動に応じて、前記顕微鏡の視野内の画像を取得する画像取得手段と、
前記画像取得手段により取得した前記画像のコントラストの高低を示すコントラスト値を算出するコントラスト値算出手段と、
前記画像取得手段により取得した複数の画像のうち、前記コントラスト値が最大の画像の検出を行う最大コントラスト値画像検出手段と、
を備えることを特徴とする請求項１に記載のマイクロマニピュレーションシステム。
【請求項３】
前記マイクロマニピュレーションシステムは、さらに、
前記被検体の種類、サイズ、及び周囲環境のうち少なくともいずれか１つに応じて、前記マニピュレータ駆動手段の制御による前記微小針の移動量を補正する補正手段
を備えることを特徴とする請求項１に記載のマイクロマニピュレーションシステム。
【請求項４】
前記合焦位置検出手段は、前記被検体に照射された光の反射光の強度を検出することを特徴とする請求項１に記載のマイクロマニピュレーションシステム。
【請求項５】
前記コントラスト値算出手段は、前記画像の所定領域のコントラスト値を算出し、該所定領域は、前記被検体に微細操作を行う部位が撮像された領域を含む画像領域であることを特徴とする請求項２に記載のマイクロマニピュレーションシステム。
【請求項６】
前記マイクロマニピュレーションシステムは、さらに、
前記コントラスト値算出手段により算出した前記コントラスト値と所定の閾値との大小を判定する判定手段、を備え、
前記最大コントラスト値画像検出手段は、前記判定結果に基づいて前記検出を行うことを特徴とする請求項２に記載のマイクロマニピュレーションシステム。
【請求項７】
前記コントラスト値は、以下のコントラスト評価式
【数１】
0004831972.tif 000004
（ただし、fはコントラスト値、Nは整数、顕微鏡画像の画素数をn×m画素とし、M(i,j)は画素(i,j)の輝度値とする。）
によって与えられることを特徴とする請求項２に記載のマイクロマニピュレーションシステム。
【請求項８】
前記マイクロマニピュレーションシステムは、さらに、
前記光軸に対して垂直な方向である水平方向への前記被検体の移動と連動して前記被検体の位置を逐次検出する被検体水平位置検出手段、を備え、
前記コントラスト値算出手段は、被検体水平位置検出手段により検出された位置の情報に基づいて、前記画像上に表示された被検体の所定領域の前記コントラスト値を算出することを特徴とする請求項２に記載のマイクロマニピュレーションシステム。
【請求項９】
前記微細操作開始位置決定手段は、前記被検体の合焦位置と実際の微細操作位置との差分に基づいて、前記基準位置を補正することにより、前記微細操作開始位置を決定することを特徴とする請求項１に記載のマイクロマニピュレーションシステム。
【請求項１０】
前記微細操作開始位置決定手段は、前記被検体移動手段が対物レンズ移動方式の場合には、前記被検体へ合焦させるための前記被検体移動手段の移動による移動量に基づいて、前記基準位置を補正することを特徴とする請求項１に記載のマイクロマニピュレーションシステム。
【請求項１１】
顕微鏡の視野内で高さ方向にばらつきのある複数の被検体に対して微小針を用いて微細操作を行うマイクロマニピュレーションシステムを制御する処理を、コンピュータに実行させるマイクロマニピュレーションシステム制御プログラムにおいて、
前記微小針を少なくとも前記顕微鏡の光軸方向に移動させるマニピュレータ駆動処理と、
前記微小針の先端部が対物レンズの焦点に合う位置を基準位置として、前記顕微鏡の表示画像上での被検体毎に微細操作開始位置を決定する微細操作開始位置決定処理と、
前記被検体と前記対物レンズとの位置を相対的に移動させる被検体移動処理と、
前記被検体移動処理による前記被検体の相対的な移動に応じて、前記微細操作開始位置決定処理により設定した前記被検体の微細操作開始位置毎に前記対物レンズの焦点の合う位置を示す合焦位置を検出する合焦位置検出処理と、
前記合焦位置検出処理より得られた合焦位置毎に前記被検体移動処理の動作を制御する被検体移動制御処理と、
前記被検体移動制御処理により前記被検体を前記被検体の微細操作開始位置に対応する前記合焦位置に移動させ、かつ、前記微小針を前記微細操作開始位置に移動させた状態で、前記被検体毎に前記微細操作処理を行う微細操作制御処理と、
を、コンピュータに実行させるマイクロマニピュレーションシステム制御プログラム。
【請求項１２】
前記合焦位置検出処理は、
前記顕微鏡の光軸方向への前記被検体の移動に応じて、前記顕微鏡の視野内の画像を取得する画像取得処理と、
前記画像取得処理により取得した前記画像のコントラストの高低を示すコントラスト値を算出するコントラスト値算出処理と、
前記画像取得処理により取得した複数の画像のうち、前記コントラスト値が最大の画像の検出を行う最大コントラスト値画像検出処理と、
を、コンピュータに実行させる請求項１１に記載のマイクロマニピュレーションシステム制御プログラム。
【請求項１３】
前記マイクロマニピュレーションシステム制御プログラムは、さらに、
前記コントラスト値算出処理により算出した前記コントラスト値と所定の閾値との大小を判定する判定処理、
を、コンピュータに実行させ、
前記最大コントラスト値画像検出処理は、前記判定結果に基づいて前記検出を行う
ことを特徴とする請求項１２に記載のマイクロマニピュレーションシステム制御プログラム。
【請求項１４】
前記マイクロマニピュレーションシステム制御プログラムは、さらに、
前記光軸に対して垂直な方向である水平方向への前記被検体の移動と連動して前記被検体の位置を逐次検出する被検体水平位置検出処理
を、コンピュータに実行させ、
前記コントラスト値算出処理は、被検体水平位置検出処理により検出された位置の情報に基づいて、前記画像上に表示された被検体の所定領域の前記コントラスト値を算出する
ことを特徴とする請求項１２に記載のマイクロマニピュレーションシステム制御プログ
ラム。
【請求項１５】
顕微鏡の視野内で高さ方向にばらつきのある複数の被検体に対して微小針を用いて微細操作を行うマイクロマニピュレーションシステム制御方法において、
前記微小針を前記顕微鏡の光軸方向に移動させ、
前記微小針の先端部が対物レンズの焦点に合う光軸方向位置を基準位置として、前記顕微鏡の表示画像上での被検体毎に微小操作を開始する前記微小針の光軸方向位置である微小操作開始位置を決定し、
前記被検体の微小操作開始位置毎に前記被検体が前記対物レンズの焦点に合う位置を示す合焦位置を検出し、
前記検出より得られた結果に基づいて、前記合焦位置毎に前記被検体と前記対物レンズとの位置を相対的に移動させて、前記被検体を前記対物レンズに合焦させ、
前記微小針を前記微小操作開始位置に移動させ、
前記被検体毎に前記微細操作の実行制御を行う
ことを特徴とするマイクロマニピュレーションシステム制御方法。
【請求項１６】
前記検出では、
前記顕微鏡の光軸方向への前記被検体の移動に応じて、前記顕微鏡の視野内の画像を取得し、
前記画像のコントラストの高低を示すコントラスト値を算出し、
前記取得した複数の画像のうち、前記コントラスト値が最大の画像の検出を行う
ことを特徴とする請求項１５に記載のマイクロマニピュレーションシステム制御方法。
【請求項１７】
マイクロマニピュレーションシステム制御方法において、さらに、
前記光軸に対して垂直な方向への前記被検体の移動と連動して前記被検体の位置を逐次検出し、
該検出された位置の情報に基づいて、前記画像上に表示された被検体の所定領域の前記コントラスト値を算出する
ことを特徴とする請求項１６に記載のマイクロマニピュレーションシステム制御方法。
【請求項１８】
顕微鏡の視野内で高さ方向にばらつきのある複数の被検体に対して微小針を用いて微細操作を行うマイクロマニピュレーションシステムにおいて、
前記微小針を前記顕微鏡の光軸方向と該光軸方向に対して垂直方向とに移動させるマニピュレータ駆動手段と、
前記微小針の先端部が対物レンズの焦点に合う位置を基準位置として、前記顕微鏡の表示画像上での前記被検体毎にインジェクション開始位置を決定するインジェクション開始位置決定手段と、
前記被検体が載置され、前記顕微鏡の対物レンズにより該被検体が観察できるように移動可能であるステージと、
前記ステージの移動による前記顕微鏡の光軸方向への前記被検体の移動に応じて、前記顕微鏡の視野内の画像を取得するカメラと、
前記カメラにより取得した前記画像のコントラストの高低を示すコントラスト値を算出するコントラスト値算出手段と、
今回取得した画像について前記コントラスト値算出手段により算出した前記コントラスト値と、前回取得した画像について前記コントラスト値算出手段により算出した前記コントラスト値との比較を繰り返すことにより、複数の前記画像のうち前記コントラスト値が最大の画像の検出を行う最大コントラスト値画像検出手段と、
前記ステージの移動を制御して、前記最大コントラスト値画像検出手段より得られた検出結果に基づいて、前記コントラスト値が最大の画像が取得された位置に該ステージを移動させる顕微鏡制御手段と、
前記顕微鏡制御手段により前記コントラスト値が最大の画像が取得された位置毎に前記ステージを移動させ、かつ、前記微小針を前記インジェクション開始位置に移動させた状態で、前記被検体毎に前記インジェクション処理を行うインジェクション制御手段と、
を備えることを特徴とするマイクロマニピュレーションシステム。
【請求項１９】
前記コントラスト値算出手段は、前記画像の所定領域のコントラスト値を算出し、
該所定領域は、前記被検体にインジェクションを行う部位を中心とする所定の面積を有する画像領域である
ことを特徴とする請求項１８に記載のマイクロマニピュレーションシステム。
【請求項２０】
前記インジェクション開始位置決定手段は、前記被検体の合焦位置と実際のインジェクション位置との差分に基づいて、前記基準位置を補正することにより、前記インジェクション開始位置を決定する
ことを特徴とする請求項１８に記載のマイクロマニピュレーションシステム。
【請求項２１】
顕微鏡の視野内で高さ方向にばらつきのある複数の被検体に対して微小針を用いて微細操作を行うマイクロマニピュレーションシステムにおいて、
前記微小針を前記顕微鏡の光軸方向と該光軸方向に対して垂直方向とに移動させるマニピュレータ駆動手段と、
前記微小針の先端部が対物レンズの焦点に合う位置を基準位置として、インジェクションを開始する前記微小針の位置であるインジェクション開始位置を決定するインジェクション開始位置決定手段と、
前記被検体が載置されるステージと、
前記被検体に合焦させるために前記光軸方向に移動可能である対物レンズと、
前記対物レンズの移動による前記顕微鏡の光軸方向への前記被検体の移動に応じて、前記顕微鏡の視野内の画像を取得するカメラと、
前記カメラにより取得した前記画像のコントラストの高低を示すコントラスト値を算出するコントラスト値算出手段と、
今回取得した画像について前記コントラスト値算出手段により算出した前記コントラスト値と、前回取得した画像について前記コントラスト値算出手段により算出した前記コントラスト値との比較を繰り返すことにより、複数の前記画像のうち前記コントラスト値が最大の画像の検出を行う最大コントラスト値画像検出手段と、
前記対物レンズの移動を制御して、前記最大コントラスト値画像検出手段による検出結果に基づいて、前記コントラスト値が最大の画像が取得された位置に該対物レンズを移動させる顕微鏡制御手段と、
前記顕微鏡制御手段により前記顕微鏡の表示画像上での前記被検体の前記コントラスト値が最大の画像が取得された位置毎に前記対物レンズを移動させ、かつ、前記微小針を前記インジェクション開始位置に移動させた状態で、前記被検体毎に前記インジェクション処理を行うインジェクション制御手段と、
を備えることを特徴とするマイクロマニピュレーションシステム。
【請求項２２】
前記コントラスト値算出手段は、前記画像の所定領域のコントラスト値を算出し、
該所定領域は、前記被検体にインジェクションを行う部位を中心とする所定の面積を有する画像領域である
ことを特徴とする請求項２１に記載のマイクロマニピュレーションシステム。
【請求項２３】
前記インジェクション開始位置決定手段は、前記被検体の合焦位置と実際のインジェクション位置との差分に基づいて、前記基準位置を補正することにより、前記インジェクション開始位置を決定する
ことを特徴とする請求項２１に記載のマイクロマニピュレーションシステム。
【請求項２４】
前記インジェクション開始位置決定手段は、前記被検体へ合焦させるための前記対物レンズの移動による移動量に基づいて、前記基準位置を補正する
ことを特徴とする請求項２１に記載のマイクロマニピュレーションシステム。
【請求項２５】
前記マイクロマニピュレーションシステムは、さらに、
前記光軸に対して垂直な方向である水平方向に移動する前記ステージの移動に連動して前記被検体の位置を逐次検出する被検体水平位置検出手段、
を備え、
前記コントラスト値算出手段は、前記逐次検出された位置の情報に基づいて、前記画像上に表示された被検体の所定領域の前記コントラスト値を算出する
ことを特徴とする請求項２１に記載のマイクロマニピュレーションシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロマニピュレーションシステム、特に、顕微鏡と顕微鏡の視野内で微小針の３次元移動と注入／吸引等の微小操作をするマイクロマニピュレータとを備えたマイクロマニピュレーションシステムに関する。
【背景技術】
【０００２】
例えば、細胞や卵等の試料にＤＮＡ溶液の注入処理を施す場合、マイクロマニピュレータと顕微鏡とを備えたマイクロマニピュレーションシステムが用いられる。そのマイクロマニピュレータは、その試料にＤＮＡ溶液等を注入するための微小針を配置したものである。その顕微鏡は、そのインジェクション処理を観察するためのものである。
【０００３】
一般的なマイクロマニピュレーションシステムでは、顕微鏡視野内で微小針等の微小器具を操作してその映像をＣＲＴディスプレイ等に表示する。そして、表示内容を観察しながらシャーレ等の容器内に入れられた細胞や卵等の微小試料に微小針を挿し込み、所定の処理を施すようになっている。
【０００４】
従来、これらの処理は手作業によって行われてきた。しかしながら、対象となる微小試料が多くなると、試料及び微小針の位置を合わせて試料へ微小針を差し込むといった精密な作業を連続的に行わなければならなかった。そのため、作業者の負担が大きいため操作性の改善が望まれている。
【０００５】
特にＺ軸方向の位置関係を調節するには、顕微鏡画像での試料や微小針の焦点ボケの具合から判断するしかない。このため、この高さ方向の位置関係を調節するのに熟練を要し、多くのオペレータにとって、操作上の障害となっている。
【０００６】
これら微小針や試料の位置調節の操作性を向上するために、これまでに電動化された試料ステージやマイクロマニピュレータを用いて、位置調節を自動的に行う技術が提示されている。
【０００７】
例えば、特許文献１では、モニタ上で試料像の位置を指示すると、試料の存在するステージ座標を算出し、試料の位置調節及び微小針の差し込みを自動的に行う技術が開示されている。また、特許文献２では、マイクロマニピュレータの高さ位置をモニタ上に表示することで、試料及び微小針の高さ調整を簡素化するための技術が提案されている。
【特許文献１】特開平０１−３５６０号公報
【特許文献２】特開平０６−１０９９７９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、特許文献１では、試料及び微小針の高さ調節の手段については、何ら考慮されておらず、被検体毎に高さのばらつきがある試料については針挿し込みの精度が悪くなるといった問題がある。また、特許文献２では、微小試料の高さを調整するのは手作業で行わなければならず、自動化についての手段は何ら提示されていない。
【０００９】
上記の課題に鑑み、本発明では、高さ方向にばらつきのある複数個の標本においても一括して自動でのマニピュレータ操作を可能とすることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明に係る顕微鏡の視野内で高さ方向にばらつきのある複数の被検体に対して微小針を用いて微細操作を行うマイクロマニピュレーションシステムは、前記微小針を少なくとも前記顕微鏡の光軸方向に移動させるマニピュレータ駆動手段と、前記微小針の先端部が対物レンズの焦点に合う位置を基準位置として、微細操作を開始する前記微小針の位置である微細操作開始位置を決定する微細操作開始位置決定手段と、前記被検体と前記対物レンズとの位置を相対的に移動させる被検体移動手段と、前記微小針の先端部が対物レンズの焦点に合う位置を基準位置として、前記顕微鏡の表示画像上での前記被検体毎にインジェクション開始位置を決定するインジェクション開始位置決定手段と、前記被検体移動手段による前記被検体の相対的な移動に応じて、前記インジェクション開始位置決定手段により設定した前記被検体のインジェクション開始位置毎に前記対物レンズの焦点の合う位置を示す合焦位置を検出する合焦位置検出手段と、前記合焦位置検出手段による検出結果に基づいて、前記対物レンズの合焦位置毎に前記被検体移動手段の動作を制御する被検体移動制御手段と、前記被検体移動制御手段により前記被検体を、前記被検体のインジェクション開始位置に対応する前記合焦位置に移動させ、かつ、前記微小針を前記微細操作開始位置に移動させた状態で、前記微細操作処理を行う微細操作制御手段と、を備えることを特徴とする。
【００１１】
前記合焦位置検出手段は、前記顕微鏡の光軸方向への前記被検体の移動に応じて、前記顕微鏡の視野内の画像を取得する画像取得手段と、前記画像取得手段により取得した前記画像のコントラストの高低を示すコントラスト値を算出するコントラスト値算出手段と、前記画像取得手段により取得した複数の画像のうち、前記コントラスト値が最大の画像の検出を行う最大コントラスト値画像検出手段と、を備えることを特徴とする。
【００１２】
前記マイクロマニピュレーションシステムは、さらに、前記被検体の種類、サイズ、及び周囲環境のうち少なくともいずれか１つに応じて、前記マニピュレータ駆動手段の制御による前記微小針の移動量を補正する補正手段を備えることを特徴とする。
【００１３】
前記合焦位置検出手段は、前記被検体に照射された光の反射光の強度を検出することを特徴とする。
【００１４】
前記コントラスト値算出手段は、前記画像の所定領域のコントラスト値を算出し、該所定領域は、前記被検体に微細操作を行う部位が撮像された領域を含む画像領域であることを特徴とする。
【００１５】
前記マイクロマニピュレーションシステムは、さらに、
前記コントラスト値算出手段により算出した前記コントラスト値と所定の閾値との大小を判定する判定手段、を備え、前記最大コントラスト値画像検出手段は、前記判定結果に基づいて前記検出を行うことを特徴とする。
前記コントラスト値は、以下のコントラスト評価式
【数１】
0004831972.tif 000002
（ただし、fはコントラスト値、Nは整数、顕微鏡画像の画素数をn×m画素とし、M(i,j)は画素(i,j)の輝度値とする。）によって与えられることを特徴とする。
【００１６】
前記マイクロマニピュレーションシステムは、さらに、前記光軸に対して垂直な方向である水平方向への前記被検体の移動と連動して前記被検体の位置を逐次検出する被検体水平位置検出手段、を備え、前記コントラスト値算出手段は、被検体水平位置検出手段により検出された位置の情報に基づいて、前記画像上に表示された被検体の所定領域の前記コントラスト値を算出することを特徴とする。
【００１７】
前記微細操作開始位置決定手段は、前記被検体の合焦位置と実際の微細操作位置との差分に基づいて、前記基準位置を補正することにより、前記微細操作開始位置を決定することを特徴とする。
【００１８】
前記微細操作開始位置決定手段は、前記被検体移動手段が対物レンズ移動方式の場合には、前記被検体へ合焦させるための前記被検体移動手段の移動による移動量に基づいて、前記基準位置を補正することを特徴とする。
【００１９】
本発明に係る顕微鏡の視野内で高さ方向にばらつきのある複数の被検体に対して微小針を用いて微細操作を行うマイクロマニピュレーションシステムを制御する処理を、コンピュータに実行させるマイクロマニピュレーションシステム制御プログラムは、前記微小針を少なくとも前記顕微鏡の光軸方向に移動させるマニピュレータ駆動処理と、前記微小針の先端部が対物レンズの焦点に合う位置を基準位置として、前記顕微鏡の表示画像上での被検体毎に微細操作開始位置を決定する微細操作開始位置決定処理と、前記被検体と前記対物レンズとの位置を相対的に移動させる被検体移動処理と、前記被検体移動処理による前記被検体の相対的な移動に応じて、前記微細操作開始位置決定処理により設定した前記被検体の微細操作開始位置毎に前記対物レンズの焦点の合う位置を示す合焦位置を検出する合焦位置検出処理と、前記合焦位置検出処理より得られた合焦位置毎に前記被検体移動処理の動作を制御する被検体移動制御処理と、前記被検体移動制御処理により前記被検体を前記被検体の微細操作開始位置に対応する前記合焦位置に移動させ、かつ、前記微小針を前記微細操作開始位置に移動させた状態で、前記被検体毎に前記微細操作処理を行う微細操作制御処理と、を、コンピュータに実行させる。
【００２０】
前記合焦位置検出処理は、前記顕微鏡の光軸方向への前記被検体の移動に応じて、前記顕微鏡の視野内の画像を取得する画像取得処理と、前記画像取得処理により取得した前記画像のコントラストの高低を示すコントラスト値を算出するコントラスト値算出処理と、前記画像取得処理により取得した複数の画像のうち、前記コントラスト値が最大の画像の検出を行う最大コントラスト値画像検出処理と、を、コンピュータに実行させる。
【００２１】
前記マイクロマニピュレーションシステム制御プログラムは、さらに、前記コントラスト値算出処理により算出した前記コントラスト値と所定の閾値との大小を判定する判定処理、を、コンピュータに実行させ、前記最大コントラスト値画像検出処理は、前記判定結果に基づいて前記検出を行うことを特徴とする。
【００２２】
前記マイクロマニピュレーションシステム制御プログラムは、さらに、前記光軸に対して垂直な方向である水平方向への前記被検体の移動と連動して前記被検体の位置を逐次検出する被検体水平位置検出処理を、コンピュータに実行させ、前記コントラスト値算出処理は、被検体水平位置検出処理により検出された位置の情報に基づいて、前記画像上に表示された被検体の所定領域の前記コントラスト値を算出することを特徴とする。
【００２３】
本発明に係る顕微鏡の視野内で高さ方向にばらつきのある複数の被検体に対して微小針を用いて微細操作を行うマイクロマニピュレーションシステム制御方法は、前記微小針を前記顕微鏡の光軸方向に移動させ、前記微小針の先端部が対物レンズの焦点に合う光軸方向位置を基準位置として、前記顕微鏡の表示画像上での被検体毎に微小操作を開始する前記微小針の光軸方向位置である微小操作開始位置を決定し、前記被検体の微小操作開始位置毎に前記被検体が前記対物レンズの焦点に合う位置を示す合焦位置を検出し、前記検出より得られた結果に基づいて、前記合焦位置毎に前記被検体と前記対物レンズとの位置を相対的に移動させて、前記被検体を前記対物レンズに合焦させ、前記微小針を前記微小操作開始位置に移動させ、前記被検体毎に前記微細操作の実行制御を行うことを特徴とする。
【００２４】
前記検出では、前記顕微鏡の光軸方向への前記被検体の移動に応じて、前記顕微鏡の視野内の画像を取得し、前記画像のコントラストの高低を示すコントラスト値を算出し、前記取得した複数の画像のうち、前記コントラスト値が最大の画像の検出を行うことを特徴とする。
【００２５】
前記マイクロマニピュレーションシステム制御方法において、さらに、前記光軸に対して垂直な方向への前記被検体の移動と連動して前記被検体の位置を逐次検出し、該検出された位置の情報に基づいて、前記画像上に表示された被検体の所定領域の前記コントラスト値を算出することを特徴とする。
【００２６】
本発明に係る顕微鏡の視野内で高さ方向にばらつきのある複数の被検体に対して微小針を用いて微細操作を行うマイクロマニピュレーションシステムは、前記微小針を前記顕微鏡の光軸方向と該光軸方向に対して垂直方向とに移動させるマニピュレータ駆動手段と、前記微小針の先端部が対物レンズの焦点に合う位置を基準位置として、前記顕微鏡の表示画像上での前記被検体毎にインジェクション開始位置を決定するインジェクション開始位置決定手段と、前記被検体が載置され、前記顕微鏡の対物レンズにより該被検体が観察できるように移動可能であるステージと、前記ステージの移動による前記顕微鏡の光軸方向への前記被検体の移動に応じて、前記顕微鏡の視野内の画像を取得するカメラと、前記カメラにより取得した前記画像のコントラストの高低を示すコントラスト値を算出するコントラスト値算出手段と、今回取得した画像について前記コントラスト値算出手段により算出した前記コントラスト値と、前回取得した画像について前記コントラスト値算出手段により算出した前記コントラスト値との比較を繰り返すことにより、複数の前記画像のうち前記コントラスト値が最大の画像の検出を行う最大コントラスト値画像検出手段と、前記ステージの移動を制御して、前記最大コントラスト値画像検出手段より得られた検出結果に基づいて、前記コントラスト値が最大の画像が取得された位置に該ステージを移動させる顕微鏡制御手段と、前記顕微鏡制御手段により前記コントラスト値が最大の画像が取得された位置毎に前記ステージを移動させ、かつ、前記微小針を前記インジェクション開始位置に移動させた状態で、前記被検体毎に前記インジェクション処理を行うインジェクション制御手段と、を備えることを特徴とする。
【００２７】
前記コントラスト値算出手段は、前記画像の所定領域のコントラスト値を算出し、該所定領域は、前記被検体にインジェクションを行う部位を中心とする所定の面積を有する画像領域であることを特徴とする。
【００２８】
前記インジェクション開始位置決定手段は、前記被検体の合焦位置と実際のインジェクション位置との差分に基づいて、前記基準位置を補正することにより、前記インジェクション開始位置を決定することを特徴とする。
【００２９】
本発明に係る顕微鏡の視野内で高さ方向にばらつきのある複数の被検体に対して微小針を用いて微細操作を行うマイクロマニピュレーションシステムは、前記微小針を前記顕微鏡の光軸方向と該光軸方向に対して垂直方向とに移動させるマニピュレータ駆動手段と、前記微小針の先端部が対物レンズの焦点に合う位置を基準位置として、インジェクションを開始する前記微小針の位置であるインジェクション開始位置を決定するインジェクション開始位置決定手段と、前記被検体が載置されるステージと、前記被検体に合焦させるために前記光軸方向に移動可能である対物レンズと、前記対物レンズの移動による前記顕微鏡の光軸方向への前記被検体の移動に応じて、前記顕微鏡の視野内の画像を取得するカメラと、前記カメラにより取得した前記画像のコントラストの高低を示すコントラスト値を算出するコントラスト値算出手段と、今回取得した画像について前記コントラスト値算出手段により算出した前記コントラスト値と、前回取得した画像について前記コントラスト値算出手段により算出した前記コントラスト値との比較を繰り返すことにより、複数の前記画像のうち前記コントラスト値が最大の画像の検出を行う最大コントラスト値画像検出手段と、前記対物レンズの移動を制御して、前記最大コントラスト値画像検出手段による検出結果に基づいて、前記コントラスト値が最大の画像が取得された位置に該対物レンズを移動させる顕微鏡制御手段と、前記顕微鏡制御手段により前記顕微鏡の表示画像上での前記被検体の前記コントラスト値が最大の画像が取得された位置毎に前記対物レンズを移動させ、かつ、前記微小針を前記インジェクション開始位置に移動させた状態で、前記被検体毎に前記インジェクション処理を行うインジェクション制御手段と、を備えることを特徴とする。
【００３０】
前記コントラスト値算出手段は、前記画像の所定領域のコントラスト値を算出し、該所定領域は、前記被検体にインジェクションを行う部位を中心とする所定の面積を有する画像領域であることを特徴とする。
【００３１】
前記インジェクション開始位置決定手段は、前記被検体の合焦位置と実際のインジェクション位置との差分に基づいて、前記基準位置を補正することにより、前記インジェクション開始位置を決定する。
【００３２】
前記インジェクション開始位置決定手段は、前記被検体へ合焦させるための前記対物レンズの移動による移動量に基づいて、前記基準位置を補正する。
【００３３】
前記マイクロマニピュレーションシステムは、さらに、前記光軸に対して垂直な方向である水平方向に移動する前記ステージの移動に連動して前記被検体の位置を逐次検出する被検体水平位置検出手段、を備え、前記コントラスト値算出手段は、前記逐次検出された位置の情報に基づいて、前記画像上に表示された被検体の所定領域の前記コントラスト値を算出することを特徴とする。
【発明の効果】
【００３４】
本発明によれば、多数の標本に対して正確にかつ短時間で微細操作を行うことが可能となり、インジェクションの操作性を向上できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３５】
＜第１の実施形態＞
本発明では、高さ方向にばらつきのある複数個の標本においても一括して自動でのマニピュレータ操作を可能とする。そのため、初期処理として、対物レンズのピント位置に微小針の先端が合う位置をマニピュレータ駆動部のＺ方向基準位置として登録しておく。
【００３６】
本実施形態では、標本毎に高さのばらつきがある場合に、標本のインジェクション位置の高さを正確に調節するために、合焦処理として標本画像データ全体でコントラスト値が最大となるように高さ制御を行う。
【００３７】
図１は、本実施形態におけるマイクロマニピュレーションシステムの全体構成を示す。このシステムは、主に、顕微鏡部１０、マイクロマニピュレータ部（３０，３１，３２，３３）、カメラ部３４、コンピュータ１００、及び画像モニタ１１３から構成される。
【００３８】
顕微鏡部１０は、卵や細胞などの標本を入れる試料容器Ｑから所望の倍率で光学的に顕微鏡画像を取り出すものである。マイクロマニピュレータ部（３０，３１，３２，３３）は、顕微鏡視野内で微小針の３次元移動と注入／吸引の操作をするものである。カメラ部３４は、標本の観察像を画像信号に変換する。コンピュータ１００は、それらの画像信号から高倍率画像を形成し、画像を元に各部の制御信号を出力する。画像モニタ１１３は、形成された画像と操作画面を表示する。
【００３９】
上記顕微鏡部１０は、操作すべき標本Ｋの入った試料容器Ｑを載置する標本ステージ５を有している。標本ステージ５の下方には、透過用フィルタユニット２０、透過視野絞り２１、透過開口絞り２２、コンデンサ光学素子ユニット２３、及び例えばハロゲンランプからなる透過照明用光源１が配置されている。透過照明用光源１は、上記標本ステージ５上の試料容器Ｑを下方から照明する。
【００４０】
また、この標本ステージ５の上方で観察光路内の光軸上には、レボルバ４と観察用ビームスプリッタ６が配置されている。レボルバ４は、複数個の対物レンズ３ａ〜３ｆを交換可能に装着してある。観察用ビームスプリッタ６は観察試料像を分岐するものである。この観察用ビームスプリッタ６により観察光路を分けることができる。そして、一方の観察光路に接眼レンズ７が配置され、他方の観察光路にカメラヘッド８が設けられている。また顕微鏡部１０は、上記の構成要素全体を制御する顕微鏡制御ユニット１９を備える。
【００４１】
このように構成された顕微鏡部１０においては、透過照明用光源１で発生した照明光をコレクタレンズ２で集光して透過用フィルタユニット２０に入射させ、その照明光を透過用フィルタユニット２０で調整する。そして、調整された照明光は、透過視野絞り２１、透過開口絞り２２、コンデンサ光学素子ユニット２３を通して、標本ステージ５の照明用開口部の下方から標本（試料容器Ｑ）を照明する。
【００４２】
標本ステージ５は、顕微鏡制御ユニット１９によって、試料容器Ｑの観察部位変更のために、光軸と直交する平面内での２次元水平移動及びピント合わせのために光軸方向への移動の制御が行われるとともに、各方向の位置座標を検出することができる。
【００４３】
そして標本（試料容器Ｑ）を透過し、対物レンズ３により集光された光（観察標本像）は、観察用ビームスプリッタ６を経由してカメラヘッド８に導かれる。カメラ部３４は、カメラヘッド８及びカメラ制御ユニット９からなる。カメラヘッド８は、固体撮像素子と結像光学系とを有する。固体撮像素子は、例えばＣＭＤ（Ｃｈａｒｇｅ  Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  Ｄｅｖｉｃｅ）からなる。結像光学系は、標本を透過した光をＣＭＤに結像させるものである。
【００４４】
また、カメラ制御ユニット９には、入射光量対出力電圧のゲインを自動調節するＡＧＣ（Ａｕｔｏｍａｔｉｃ  Ｇａｉｎ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ）アンプが備えられている。そしてカメラヘッド８の制御を行うカメラ制御ユニット９は、カメラヘッド８からのアナログ画像データを画像処理ボード１１０に転送する。
【００４５】
画像処理ボード１１０は、画像データをＪＰＥＧ圧縮してデジタル化して格納する。格納されたデジタル画像データは、画像表示用メモリ１１２に転送され、モニタ１１３に表示される。
【００４６】
一方、上記のマイクロマニピュレータ部（３０，３１，３２）には、先端に器具ホルダ３０を有するアーム３１が操作台側に突設されている。器具ホルダ３０は、インジェクションピペットや吸着用ピペット等の微小器具を保持するものである。
【００４７】
また、マイクロマニピュレータ部には、器具ホルダ３０に保持された微小器具を移動するために、水平方向（Ｘ，Ｙ軸方向）及び上下方向（Ｚ軸方向）の駆動機構３３が設けられている。この駆動機構は、Ｘ軸ステッピングモータ、Ｙ軸ステッピングモータ、Ｚ軸ステッピングモータ、及びガイドレールから構成されている。Ｘ軸ステッピングモータは、Ｘ軸方向に駆動するものである。Ｙ軸ステッピングモータは、Ｙ軸方向に駆動するものである。Ｚ軸ステッピングモータはＺ軸方向に駆動するものである。ガイドレールは、各モータの駆動に伴ってＸ，Ｙ，Ｚ各軸方向に器具ホルダ３０を案内するものである。この駆動機構３３は、各方向の座標位置を検出できる。
【００４８】
マイクロマニピュレータ操作ユニット３２には、ジョイスティックが設けられている。このジョイスティックは、鉛直軸方向に対して３６度傾斜可能となっており、マイクロマニピュレータの水平方向（Ｘ，Ｙ軸方向）の制御量を指示することができる。
【００４９】
また、ジョイスティックの上部には回転ダイアルが設けられている。この回転ダイアルを操作することによって、マイクロマニピュレータの上下方向（Ｚ軸方向）の制御量を与えることが可能となっている。マイクロマニピュレータ操作ユニット３２には、手動モードとＰＣ制御モードを切替えるキースイッチが設けられている。手動モード時には、上記ジョイスティックによるマイクロマニピュレータの制御を行うことができる。またＰＣ制御モードではマイクロマニピュレータ操作ユニット３２に接続されたコンピュータ１００からの信号を受け、制御を行うことができる。
【００５０】
コンピュータ１００は、記憶装置１０１、メモリ１０５、ＣＰＵ１０２、入力装置１０３、通信装置１０４、画像表示用メモリ１１２、画像処理ボード１１０から構成される。
記憶装置１０１やメモリ１０５は、種々のシステム動作や処理を行うためのプログラム及び制御情報が格納されている。ＣＰＵ１０２では、画像処理が行われる。入力装置１０３は、例えばマウスやキーボードなどである。通信装置１０４は、顕微鏡に対してレボルバ回転の指示、及び標本ステージ５移動、及びマイクロマニピュレータ部に対するＸ，Ｙ，Ｚ軸方向への移動等、それぞれの指示を送出する。顕微鏡制御ユニット１９は、コンピュータ１００の通信装置１０４から上記各種指示を受けて対応する顕微鏡内の各構成要素（例えば、ステージ５のＸＹＺ軸方向への移動動作等）を制御している。
【００５１】
画像処理ボード１１０は、上述の通り、画像データをＪＰＥＧ圧縮してデジタル化して格納する。格納されたデジタル画像データは、画像表示用メモリ１１２に転送され、モニタ１１３に表示される。
【００５２】
図２は、本実施形態における処理フローを示す。同図では、標本と微小針が焦点の合った同じ高さの状態でインジェクションを行うために、微小針に焦点の合った位置をマニピュレータ駆動の基準位置として保存している。そして、インジェクション時における微小針の合焦位置への復帰を可能としている。また、標本の高さを制御しながら顕微鏡画像のコントラスト値が最大となる高さを自動検出している。それでは、以下、同図を参照して、本実施形態について説明する。
【００５３】
図３は、本実施形態における標本及び微小針への合焦処理を説明するための図である。まず、微小針Ｌをマイクロマニピュレータの駆動機構３３により水平移動させて、図３（ａ）に示すように、微小針Ｌの先端がモニタ１１３に表示される顕微鏡画像の中心付近に見えるようにする。
【００５４】
次に、顕微鏡画像を観察しながら、マイクロマニピュレータの駆動機構３３により微小針ＬをＺ軸方向に移動させて、微小針の先端に焦点を合わせる。このとき、図３（ｂ）に示すように針の先端部の高さ方向の位置は、合焦面Ｆに移動することになる。ここで求めた微小針Ｌの合焦位置Ｐｎにおけるマイクロマニピュレータの駆動機構３３のＸＹＺ座標値を基準位置として記憶しておく（Ｓ０１）。これによって、標本へのインジェクション時に位置Ｐｎを再現することができる。
【００５５】
次に、図３（ａ）に示すように、モニタ１１３上に表示されている顕微鏡画像において、標本Ｋに微小針Ｌを挿入する位置（以下、インジェクション位置）Ｃ０にマウスを移動し、そのマウスをクリックしてその位置Ｃ０を指定する。そして、ＣＰＵ１０２は、位置Ｃ０（マウスのクイック位置）のモニタ上での表示座標データを取得し、それをステージ５の座標データヘと変換する（Ｓ０２）。ここで、Ｓ０２の処理は標本が広い範囲に複数個ある場合には、まず低倍率で全体像を撮影し、その画像上に表示された複数の標本を一度に指定する方が効率的である。そして、ステージ５の移動前に微小針をマイクロマニピュレータの駆動機構３３で退避させる。
【００５６】
Ｓ０２で指定された標本のインジェクション位置Ｃ０が顕微鏡画像の中心Ｃとなるように、Ｓ０２で変換されたＸＹ座標データを用いてステージ５をＸＹ平面内で移動させる（Ｓ０３）。
【００５７】
次に、ステージ５の高さを調節し、標本の高さが合焦面Ｆとなるようにする。そのために、顕微鏡のコントラストが最も高くなる合焦位置を求める処理を行う。コントラストの定量的な評価は、顕微鏡画像データから下記の式（１）で決められたコントラスト評価式を使用する。
【００５８】
図４は、本実施形態におけるコントラスト値を計算する処理を説明するための図である。コントラスト値は、同じ走査ライン内にある隣接画素データ間の輝度値の差分を複数乗し、それを顕微鏡画像全体について加算したものである。このコントラスト値が高いほど、コントラストが高いと判断する。同図において、ｎ×ｍ画素からなる顕微鏡画像があり、そのうち隣接する画素（ｉ，ｊ）と（ｉ＋１，ｊ）の輝度値Ｍの差は、｜Ｍ（ｉ，ｊ）−Ｍ（ｉ＋１，ｊ）｜となる。よって、これを複数乗して、顕微鏡画像全体について加算すると、コントラスト評価式（１）（以下の式において、Ｎ：正数、ｆ：コントラスト値）は、以下のようになる。
【００５９】
【数２】
0004831972.tif 000003
合焦位置の探索処理は、予め指定したサーチ範囲内についてコントラスト値ｆを求めな
がら少しずつＺ移動（Ｚ軸方向（光軸方向）へ移動すること、以下同じ）させ、コントラ
スト値が最大となる位置を検出する。まず、はじめにＺ軸方向のサーチ範囲の最下位置に
ステージ５を移動させ、式（１）よりコントラスト値ｆを求め、コントラストの初期値と
する（Ｓ０４）。
【００６０】
次に、ステージ５を上方（Ｚ軸方向）に微小移動して、コントラスト値を計算する（Ｓ０５）。このとき、この合焦位置検出に対して最適な微小移動量ΔＺは、使用する対物レンズの焦点深度等の値から予め決定しておく。ステージ５を微小移動させた後に、Ｓ０４の処理と同様にそのＺ位置（Ｚ軸方向におけるステージ５が停止している位置（座標）、以下同じ）でのコントラスト値を求める。
【００６１】
次に、前のＺ位置でのコントラスト値（初回の場合は初期値）と比較する（Ｓ０６）。本実施形態では、一定間隔の高さ毎に停止してコントラスト値を評価しているが、もちろん、標本を一定スピードでＺ移動し、一定時間毎に取得した画像データでのコントラスト値を評価してもよい。
【００６２】
Ｓ０６において、コントラスト値が前回より大きい場合には、まだ合焦位置には達していないものと判断し、Ｓ０５の処理に戻る。また、Ｓ０６において、コントラスト値が前回より小さくなった場合には前回の位置がコントラスト値の最大で、合焦位置Ｐｓ（Ｐｓはステージ５のＺ位置を示す）と判断し、Ｚ位置を前回の位置に戻す（Ｓ０７）。そして、ステージ５の移動が終わったら、マイクロマニピュレータの駆動機構３３により退避させていた微小針を再び基準位置Ｐｎに戻す。
【００６３】
このようにして標本の合焦位置Ｐｓが検出できたら、微小針Ｌを標本Ｋに差込みインジェクションを実行する（Ｓ０８）。マイクロマニピュレータの駆動機構３３を用いて、針をＸ方向に移動させて標本に針を差し込んで、インジェクション処理を行う。ここで、次にインジェクションする標本があるかを判断する（Ｓ０９）。未処理の標本がある場合には、Ｓ０３の処理に戻り、上記と同様にＳ０３〜Ｓ０９の処理を行い、全ての標本についてこれらの処理が終わるまで繰り返す。
【００６４】
対物レボルバ４がＺ移動することにより標本のピント合わせを行う構成のシステムでは、次の補正を行う（Ｓ１００）。この場合には、標本に対する合焦処理として対物レボルバ４をＺ移動する（この場合には、Ｓ０４，Ｓ０５，Ｓ０７では、対物レボルバ４がＺ移動する）と、微小針の合焦面Ｐｎが移動する。したがって、標本に対する合焦処理時における対物レボルバ４のＺ移動量と同じ距離だけ微小針をＺ方向に動かして高さ補正することによって同様な効果が得られる。
【００６５】
また、標本に厚みがあり標本へのインジェクション位置（標本に微小針を挿入する位置）が標本の合焦位置と異なる場合には、その差分量も合わせて記憶し、この差分量の補正をしてもよい（Ｓ１０１）。このような標本については、標本の種別毎にその差分量（この差分量は、理論的に求めたものでもよいし、実験的に求めたものでもよい）を予め記憶しておくことで、この差分量だけ微小針のＺ位置を補正することができる。なお、この差分量は、標本の種別毎や標本のサイズ、または周囲の環境（例えば、温度、湿度、気圧、空気中、不活性ガス気流下、培養液の種類や濃度  等）に応じて決定しても良い。
【００６６】
上記より、Ｓ０１の作業は、微小針を交換してＰｎの位置がずれた時や装置の再起動により位置Ｐｎの座標がクリアされた時にのみ行えばよい。
また、なお、本実施形態では、標本への合焦処理として顕微鏡像のコントラスト状態を使用したが、これに限らず、赤外レーザー等を用いて合焦してもよい。すなわち、標本に対して赤外レーザー等を照射し、その反射光強度を計測して合焦位置を検出する方式で標本や標本が載っている容器等に合焦させてもよい。ここで、その容器に合焦させる場合には、標本の厚みを加味してインジェクション位置を決める必要があるのは言うまでもない。反射光強度を検出する方式は、上述のコントラストを検出する方式に比べて合焦位置を早く検出でき、処理の時間短縮を図ることが可能となる。
【００６７】
このように、標本へのインジェクションの高さ方向の位置を自動的に調整することができるので、高さ方向にばらつきのある複数個の標本においても一括して自動でのマニピュレータ操作を可能とする。また、コントラスト値の最大の画像を撮影した位置を合焦位置とすることができる。また、標本の種類等によって、随時差分量の補正をすることができる。また、反射光強度を検出する方式でも対応させることができる。
【００６８】
以上より、本実施形態によれば、標本の高さとインジェクション針の高さを自動的に調節することができ、インジェクション処理の操作性を向上させ、かつ処理時間の短縮を図ることができる。
【００６９】
＜第２の実施形態＞
本実施形態では、標本毎に高さのばらつきがある場合に、標本のインジェクション位置の高さを正確に調節するために、合焦処理では、標本のインジェクション位置の周辺領域の画像データでコントラスト値が最大となるように高さ制御を行う。すなわち、第１の実施形態では、顕微鏡画像全体のコントラスト値が最大となる場合を合焦位置としていたが、本実施形態では顕微鏡画像のうち所定の範囲のコントラスト値が最大となる場合を合焦位置とするものである。
【００７０】
図５は、本実施形態におけるインジェクション位置Ｃを中心とした領域Ａを示す。本実施形態では、インジェクション位置Ｃ（ＸＹ座標系でのインジェクション位置）を中心とした領域Ａの画像データを対象にコントラストを取得し、それにより合焦位置を算出するものである。
【００７１】
図６は、本実施形態における処理フローを示す。Ｓ１１〜Ｓ１３までのインジェクション位置の指定から標本に針を差込む位置を画面の中心に移動するところまでは、図２のＳ０１〜Ｓ０３までの処理と同じである。
【００７２】
次に、標本にインジェクションする位置Ｃの高さが合焦面Ｆの高さとなるようにする。そのために、顕微鏡画像中のインジェクション位置Ｃ（ＸＹ座標系でのインジェクション位置）を中心とした周辺領域Ａ（例えば、縦横約１００ピクセル四方の領域）の画像データを抽出する（Ｓ１４）。
【００７３】
以降、標本毎にＳ１４で抽出した領域Ａの画像データのコントラストが最も高くなる合焦位置を求める。その後、インジェクションを行う処理Ｓ１５〜Ｓ２０は、図２のＳ０４〜Ｓ０９の処理と同様である。
【００７４】
なお、対物レボルバ４がＺ移動する構成のシステムでは、Ｓ１５，Ｓ１６，Ｓ１８では、対物レボルバ４がＺ移動する。
また、補正処理Ｓ１１０，Ｓ１１１は、それぞれ図２のＳ１００，Ｓ１０１と同様である。
【００７５】
このように、顕微鏡画像のうち所定の画像領域をコントラスト値の算出対象とすることで、例えばＣＰＵやメモリ等の資源を有効に活用することができ、処理の高速化が図れる。
【００７６】
以上より、本実施形態によれば、高さにばらつきのある多数の標本にインジェクション処理を行う場合にも、標本毎の高さ調整を自動的に行うことができ、インジェクション処理の操作性を向上させ、かつ処理時間の短縮を図ることができる。
【００７７】
＜第３の実施形態＞
本実施形態は、標本毎で合焦処理を始める前にコントラスト値を求め、この値が予め設定した値よりも大きい場合には、合焦処理を行わずにインジェクションを実行する。すなわち、コントラスト値が規定値よりも大きければ、そのＺ位置を合焦位置とみなして、インジェクションを行う。
【００７８】
図７は、本実施形態における処理フローを示す。Ｓ２１〜Ｓ２４までのインジェクション位置の指定から標本の針を差込む位置を画面の中心に移動してコントラスト評価を行う領域を指定するところまでは、図６のＳ１１〜Ｓ１４までの処理と同じである。
【００７９】
Ｓ２４で設定した領域Ａにおけるコントラスト値を算出し、予め設定した規定値と比較する（Ｓ２５）。ここで、規定値は実験により求めた合焦位置でのコントラスト値から決定するか、あるいは、最初の標本での合焦位置でのコントラスト値に対する割合で決定してもよい。
【００８０】
ここで、算出したコントラスト値が規定値よりも小さい場合には、このＺ位置は、合焦位置からまだ遠いと判断し、Ｓ２６〜Ｓ２９の合焦位置検出処理を行う。この合焦位置検出処理については、図６のＳ１５〜Ｓ１８の処理と同じである。
【００８１】
また、算出したコントラスト値が規定値よりも大きい場合には、画像のコントラストが高いので合焦位置近辺にあると判断し、Ｓ２６〜Ｓ２９の合焦位置検出処理を行わずに、Ｓ３０のインジェクションを実行する。全ての標本についての処理が終わるまでＳ２３〜Ｓ３０を繰り返し行う（Ｓ３１）。
【００８２】
なお、対物レボルバ４がＺ移動する構成のシステムでは、Ｓ２６，Ｓ２７，Ｓ２９では、対物レボルバ４がＺ移動する。
また、補正処理Ｓ１２０，Ｓ１２１は、それぞれ図２のＳ１００，Ｓ１０１と同様である。
【００８３】
このように、閾値以上は、合焦位置とみなすことで処理の高速化が図れる。
以上より、本実施形態によれば、高さがある程度同じ標本に移動した場合には、合焦処理を行わずにインジェクションを行うことができ、第１の実施形態よりも処理時間の短縮を図ることができる。
【００８４】
＜第４の実施形態＞
本実施形態は、各標本に対してインジェクション位置を画面の中心へ移動する動作と合焦処理を同時に行う。
【００８５】
図８は、本実施形態における処理フローを示す。Ｓ５１，Ｓ５２の各標本に対してインジェクション位置を決定する処理までは、図６のＳ１１、Ｓ１２の処理と同じである。次に、Ｚ軸方向の最下位置にステージ５を移動する（Ｓ５３）。次にインジェクション位置が画面の中心となるようにステージ５の移動を開始する（Ｓ５４）。
【００８６】
図９は、ステージ５の移動によって、それに載置された標本Ｋが矢印の方向へと移動する場合に、標本画像中においてインジェクション位置Ｃ及びその周辺領域Ａが、変位していく様子を説明するための図である。同図において、インジェクション位置Ｃは、Ｃ１，Ｃ２，Ｃ３，・・・へと移動する。また、周辺領域Ａは、Ａ１，Ａ２，Ａ３，・・・へと移動する。
【００８７】
ステージ５の移動途中には、ステージ５の座標をリアルタイムに検出してゆき、その座標値から表示画像上でのインジェクション位置を求める。図９のＧ１，Ｇ２，Ｇ３は、ステージ５の移動に伴い実行された合焦処理毎における標本の位置である。ここで、最初の合焦処理で標本がステージ位置Ｇ１にあるときにはインジェクション位置としてＣ１の座標を取得しておく。
【００８８】
そして、この位置Ｃ１を中心とした周辺領域Ａ１を、コントラスト値を求める領域として設定する。この設定された領域Ａ１の画像データをもとにコントラスト値を求める（Ｓ５５）。
【００８９】
次にステージ５を上方（Ｚ軸方向）に微小移動させる（Ｓ５６）。その後、現在のステージ位置Ｇ２を検出する。顕微鏡画像中のインジェクション位置Ｃ２を抽出する。そして、その周辺領域Ａ２のコントラスト値を算出する（Ｓ５７）。
【００９０】
ここで、Ｃ２の位置は、Ｃ１の座標とステージ５の移動量から算出することができる。そうすると、周辺領域Ａ２を表す座標の範囲も求まり、この座標の範囲に相当する当該顕微鏡画像内の周辺領域Ａ２が得られる。そして、この当該顕微鏡画像内の周辺領域Ａ２からコントラスト値を算出する。そして、前の顕微鏡画像（ステージ位置Ｇ１の画像）の周辺領域Ａ１と当該顕微鏡画像の周辺領域Ａ２とのコントラスト値と比較する（Ｓ５８）。
【００９１】
Ｓ５８において、コントラスト値が前回より大きい場合にはＳ５６に戻り、新たにステージ５の座標Ｇ３を検出する。そして、表示画像上でのインジェクション位置Ｃ３を算出して、周辺領域Ａ３を設定し直してから、周辺領域Ａ３のコントラスト値を求める。
【００９２】
また、Ｓ５８において、コントラスト値が前回より小さくなった場合には前回の位置のコントラスト値が最大ということになる。よって、その前回のステージ位置が合焦位置であると判断し、その前回のＺ位置に戻す（Ｓ５９）。ここで、ステージ５の水平方向への移動が完了するのを待つ（Ｓ６０）。
【００９３】
また、補正処理Ｓ１３０，Ｓ１３１は、それぞれ図２のＳ１００，Ｓ１０１と同様である。
ステージ５の移動が完了して、標本の合焦位置が検出されたら、微小針を標本に差し込みインジェクションを実行する（Ｓ６１）。さらに、次にインジェクションする標本があるかを調べる（Ｓ６２）。他に標本が存在する場合にはＳ５３に戻り、存在しない場合には本フローは終了する。
【００９４】
なお、対物レボルバ４がＺ移動する構成のシステムでは、Ｓ５３，Ｓ５６，Ｓ５９では、対物レボルバ４がＺ移動する。
このように本実施形態は、ステージ５がＸＹ平面内を移動するのに伴い各顕微鏡画像から抽出される領域の座標が異なってしまうが、抽出対象となる部分（インジェクション位置周辺）は同一であるので、ステージ５が移動しても常にインジェクション位置周辺の画像を抽出するようにしたものである。
【００９５】
上記のフローで説明したように、Ｓ５２で取得したインジェクション位置の座標を追跡（この座標とステージ５の移動量より算出）することで、ステージ５の移動後を撮影した顕微鏡画像のどのあたりの座標がインジェクション位置を示すのかを把握することができる。抽出する領域を特定することができれば、後は第２の実施形態と同様である。
【００９６】
このように、被検体の水平移動と被検体の特定部位に対する正確な合焦処理を同時に行うことが可能となる。
以上より、本実施形態によれば、標本のインジェクション位置を画面の中心とするためのステージ移動と同時に、合焦処理を行うことができ、インジェクション処理時間の短縮を図ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１】第１の実施形態におけるマイクロマニピュレーションシステムの全体構成を示す。
【図２】第1の実施形態における処理フローを示す。
【図３】第1の実施形態における標本と微小針の高さ調節を説明する図である。
【図４】第1の実施形態におけるコントラスト値の計算処理を説明する図である。
【図５】第２の実施形態におけるインジェクション位置Ｃを中心とした領域Ａを示す。
【図６】第２の実施形態における処理フローを示す。
【図７】第３の実施形態における処理フローを示す。
【図８】第４の実施形態における処理フローを示す。
【図９】第４の実施形態におけるコントラスト評価領域を標本像の移動に合わせて更新する処理を説明する図である。
【符号の説明】
【００９８】
１      透過照明用光源
２      コレクタレンズ
３      対物レンズ
４      レボルバ
５      標本ステージ
６      観察用ビームスプリッタ
７      接眼レンズ
８      カメラヘッド
９      カメラ制御ユニット
１０    顕微鏡部
２０    透過用フィルタユニット
２１    透過視野絞り
２２    開口絞り
２３    コンデンサ光学素子ユニット
３０    器具ホルダ
３１    マニピュレータアーム
３２    マニピュレータ操作ユニット
３３    駆動機構
３４    カメラ部
１００  コンピュータ
１０１  記録媒体
１０２  ＣＰＵ
１０３  入力装置
１０４  通信装置
１０５  メモリ
１１０  画像処理ボード
１１２  画面表示用メモリ
１１３  入力装置
１１５  ＣＰＵバス
１１３  モニタ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図４】
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