(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
対称化学構造を有するデンドリマーまたは非対称ハイパーブランチポリマーであって、
３つ以上の化学結合を形成し得る化学元素の少なくとも１つの原子と、
前記少なくとも１つの原子に結合した種々の異なる末端官能基であって、該末端官能基は以下の官能基（ｉ）〜（ｉｖ）を含む末端官能基と
（ｉ）ヒドロキシ、カルボキシル、第４級アンモニウム基、およびグアニジニウム基から選択された少なくとも１つの基、
（ｉｉ）ポリアルキレングリコール、
（ｉｉｉ）炭水化物部分、葉酸、ＲＧＤ受容体、核酸塩基部分、およびバルビツル酸基から選択された少なくとも１つの基、
（ｉｖ）グアニジニウム部分、オリゴアルギニン、ポリアルギニン誘導体、およびポリプロピレンオキシド部分から選択された、担体と担体に封入されている薬物成分の細胞膜を介した輸送を促進する少なくとも１つの基、
を備え、
前記末端官能基は、共同で、
（ａ）低毒性または無毒性であり、
（ｂ）前記ポリマーの分子を細胞の相補的受容体が認識可能なものとし、
（ｃ）前記ポリマーを生物学的環境内で安定にし、かつ
（ｄ）細胞膜を介した前記ポリマーの輸送を促進する
ことを特徴とする末端官能基と
を含んでなるように修飾されていることを特徴とするデンドリマーまたは非対称ハイパーブランチポリマー。
【請求項２】
前記化合物を遺伝物質の担体とする場合、ＤＮＡとの複合体を形成するようにカチオン化される、請求項１に記載のデンドリマーまたは非対称ハイパーブランチポリマー。
【請求項３】
デンドリマーの末端基に、アンモニウム、第４級アンモニウムまたはグアニジニウム基が導入されてカチオン化される、請求項２に記載のデンドリマーまたは非対称ハイパーブランチポリマー。
【請求項４】
３つ以上の化学結合を形成し得る化学元素の原子が、窒素、炭素またはケイ素である、請求項１に記載のデンドリマーまたは非対称ハイパーブランチポリマー。
【請求項５】
修飾ジアミノブタンポリプロピレンイミノデンドリマー（ＤＡＢ）またはＰＡＭＡＭデンドリマーである、請求項１に記載の修飾デンドリマー。
【請求項６】
無水物と、ジアルキルアミンとの重縮合から誘導される、請求項１に記載の修飾非対称ハイパーブランチポリマー。
【請求項７】
エポキシド誘導体と１，１，１−トリヒドロキシアルキルプロパンとのアニオン重合から誘導される、請求項１に記載の修飾非対称ハイパーブランチポリマー。
【請求項８】
グリシドールと１，１，１−トリヒドロキシメチルプロパン（ＰＧ−５）とのアニオン重合から誘導される、請求項１に記載の修飾非対称ハイパーブランチポリマー。
【請求項９】
生物活性医薬化合物が封入されているか、または遺伝物質を担持している、請求項１〜８のいずれか１項に記載のデンドリマーまたは非対称ハイパーブランチポリマー。
【請求項１０】
生物活性医薬化合物がベタメタゾンまたはベタメタゾン誘導体である、請求項１〜８のいずれか１項に記載のデンドリマーまたは非対称ハイパーブランチポリマー。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の多機能性デンドリマーまたはハイパーブランチポリマーの合成法であって、これらのポリマーの表面を、
（ａ）該表面のアミノ基を、ヒドロキシ、カルボキシルもしくは第４級アンモニウム基で置換するステップと、
（ｂ）デンドリマー担体またはハイパーブランチポリマー担体を生体のＭＰＳ（単核食細胞系）から保護するために、これらのポリマーの表面に、ポリアルキレングリコールを導入するステップと、
（ｃ）グアニジニウム基、炭水化物部分、葉酸もしくはＲＧＤ受容体、核酸塩基部分およびバルビツル酸基から選択された、担体の標的化能力を強化するために、受容体または組織に相補的で認識可能な基を導入するステップと、
（ｄ）グアニジニウム部分、オリゴアルギニン、ポリアルギニン誘導体、およびポリプロピレンオキシド部分から選択された、担体と担体に封入されている薬物成分の細胞膜を介した輸送を促進する基を導入するステップと
を含んでなるステップで修飾することを特徴とする方法。
【請求項１２】
前記ポリアルキレングリコールはポリエチレングリコールである請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記炭化水素部分はマンノース、グリコース、およびガラクトースから選択される請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記核酸塩基部分はアデニン、チミン、グアニン、およびシトシンから選択される請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
先ず、デンドリマーまたはハイパーブランチポリマーの表面アミノ基またはヒドロキシ基を、一方の末端に反応基を持つ適切な保護ポリマーと反応させ、
次いで、毒性アミノ基を置換するために、得られたポリマーの大部分のアミノ基をエチルイソシアネートと反応させ、
次いで、アミノ基を前記認識可能な基に変換するために、先に得られたポリマーを反応させ、
次いで、細胞膜を介した担体輸送を促進するポリアルギニンおよびプロピレンオキシド鎖から選択された１つ以上の基を導入する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記反応基はイソシアネート、エポキシドおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミドから選択される請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記認識可能な基はグアニジニウム基である請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
ＤＮＡとの複合体を形成するために前記ポリマーをカチオン化することを特徴とする、請求項１１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
表面毒性基がアミノ基のとき、その置換基として、８個未満の炭素原子を有する脂肪族鎖を導入することを特徴とする、請求項１１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記脂肪族鎖が２または３個の炭素原子を有する請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の修飾多機能性デンドリマーまたは修飾多機能性非対称ハイパーブランチポリマー中に封入された生物活性医薬化合物または遺伝物質を含んでなることを特徴とする医薬製剤。
【請求項２２】
生物活性医薬化合物または遺伝物質を送達するための医薬製剤の製造法であって、請求項１１〜２０のいずれか１項に記載のポリマー合成法と、生物活性医薬化合物または遺伝物質を前記ポリマーで封入するステップとを含んでなる方法。
【請求項２３】
生物活性医薬化合物が封入されているか、または治療用の遺伝物質を担持している、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の修飾デンドリマーまたは修飾非対称ハイパーブランチポリマーの使用であって、医薬製剤を製造するための使用。
【請求項２４】
生物活性医薬化合物が封入されているか、または治療用の遺伝物質を担持している、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の修飾デンドリマーまたは修飾非対称ハイパーブランチポリマーの使用であって、前記生物活性医薬化合物または遺伝物質が治療に用いられるのと同じ病気または症状を治療するための薬剤の製造における使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は多機能性デンドリマーポリマーおよびハイパーブランチポリマーに関し、特に、薬物および遺伝子の効率的なデリバリーシステムとして使用できるように表面末端基が修飾されたデンドリマーポリマーおよびハイパーブランチポリマーに関するが、但しそれらに限定はされない。
【背景技術】
【０００２】
デンドリマーポリマーおよびハイパーブランチポリマー（樹状ポリマー）は、その構造的特徴、特に、内部にナノ空間が存在すること、または表面に数個の基が存在することによって、薬物および遺伝子デリバリーに極めて有用な候補となっている。ナノ空間内には生物活性医薬化合物を封入することができるし、表面基を適切に修飾して多機能性樹状ポリマーを調製することもできる。極く最近になって、デンドリマーの薬物担体としての利用が研究され、機能性デンドリマーが調製されている。これらのデンドリマーはナノ空間内に生物活性医薬分子を封入する。これは、ナノ空間内部の疎水性環境、または他の場合には親水性環境、に由来しており、該環境はそれぞれ親油性または親水性化合物を封入し得る。上述のような樹状ポリマーの構造的特徴は、組み込まれた生物活性化合物の制御放出を可能にする。
【０００３】
薬物担体として有効に機能するようにすべての所望特性を同時に示す多機能性樹状ポリマー、具体的に言えば、生体適合性および生物分解性を示し、長期間にわたって人体内で循環するように生物学的に安定であり、細胞受容体に結合するように標的化リガンドを有し、かつ封入された生物活性化合物の制御放出特性を有する多機能性樹状ポリマーを調製することは困難であった。上記特性のうち１つでも欠けると、薬物担体は機能しなくなる。したがって、いくつかの生物活性医薬化合物は、使用薬物担体が上述のような多機能性を示さなければ商品化することができない。
【０００４】
遺伝子治療においては、ウイルスベクターが遺伝物質の担体として広く用いられている。ウイルスベクターは、概して有効ではあるが、患者の健康に問題を引き起こすことがある。このために、最近、遺伝物質用の人工担体、例えば非ウイルスベクターが導入された。例えば、リポソームやデンドリマーは、ウイルス担体に比べて安全であるために、遺伝子治療における利用に大きな関心が寄せられている。特に、遺伝物質用の人工非ウイルス担体は、ゲノム遺伝子組換えのリスクが低い。また、人工非ウイルスベクターを用いたトランスフェクションも、細胞毒性が低く、再現性が高く、かつ使用が容易であることを特徴とする。
【０００５】
しかし、現在知られている人工ベクターは、一般にウイルスベクターに比べて有効性が低く、かつ標的化された遺伝子発現ができないという不利点を有している。具体的に言えば、有効な遺伝子発現のためには、遺伝子を細胞核内に導入しなければならず、遺伝子を細胞核内に導入するためには、細胞内および細胞外の一連の困難な問題をくぐり抜けることを必要とする。これらの問題には、細胞を標的化すること、担体と担体が担持する遺伝物質とを細胞膜を介して有効に輸送すること、およびエンドサイトーシス後にエンドソームから担体が放出される必要があることが挙げられる。
【０００６】
文献に記載されている人工担体に関しては、上記問題の一部またはすべてに対する取り組みが行われたが、所望の最終目標は達成されていない。本発明は、デンドリマーまたはハイパーブランチポリマーの表面に適切な官能基を導入することにより、上記問題を同時
に解決または処理することを目指す。上記問題は、遺伝物質を細胞核に輸送する新規かつ有効な担体の開発を必要とする。具体的に言えば、これらの担体は、標的化能力と、生物系内での安定性と、結合した遺伝物質を細胞膜を介して有効に輸送する能力と、遺伝物質との複合体がエンドサイトーシス後にエンドソームから放出される可能性とを同時に備えていなければならない。
【０００７】
そのような安定で有効な人工遺伝子担体はデンドリマーまたはハイパーブランチポリマーであり得る。デンドリマーおよびハイパーブランチポリマーは、通常不安定であるリポソームとは対照的に安定なナノ粒子として提供可能である。デンドリマーのサイズはその世代によって決まるが、デンドリマー表面に好都合に導入し得る官能基の多様性は、デンドリマーの特性、その結果としてデンドリマーの用途に大きな影響を与える。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、生物活性医薬化合物および遺伝物質用の有効な薬物担体として用い得る多機能性樹状ポリマーを調製することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
好ましい樹状ポリマーとしては、対称デンドリマーポリマーおよび非対称ハイパーブランチポリマーがある。これらの多機能性デンドリマーやハイパーブランチポリマー（デンドリマーポリマー）を用いることにより、従来の担体を用いた場合には不可能と思われる医薬化合物の商品化が可能になるであろう。さらに、遺伝子を遺伝子治療のために細胞に導入することができる。
【００１０】
ハイパーブランチポリマーは薬物担体としては頻繁に記載されてはいない。ハイパーブランチポリマーは、デンドリマーポリマーに比べて調製が容易であり、かつ安価であるという有意な利点を有するので、その利用は非常に興味深いものである。
【００１１】
デンドリマーポリマーおよびハイパーブランチポリマーの末端基は多機能性になるように適切に修飾することが可能であり、該ポリマーのナノ空間には医薬化合物を封入することができる。
【００１２】
デンドリマーポリマーやハイパーブランチポリマーの構造的特徴を適切に選択すると、これらの分子は同時に生体適合性かつ生物分解性になる。また、細胞受容体に結合するように適切な標的化リガンドをもたせると、これらの分子は生体液中を長期間循環するように生物学的安定性を示し得る。封入された医薬化合物の制御放出も可能になるであろう。
【００１３】
これらのポリマーの表面が正に帯電すると、オリゴヌクレオシドまたはＤＮＡと相互作用して複合体を形成し得る。
本発明は多機能性樹状ポリマーの製法を開示し、これらの樹状ポリマーは、負に荷電したＤＮＡとの複合体を形成する正に荷電した表面に加えて、以下に説明するような、遺伝物質の輸送を促進する官能基を有する。
【００１４】
とりわけ生物医学的用途に有用となる提案ポリマーの構造特性は以下の通りである。
（ａ）デンドリマーポリマーまたはハイパーブランチポリマーの表面に官能基が存在すること。これらの官能基は段階的に導入し得る。
（ｂ）ポリマー内部にナノ空間が存在し、ナノ空間内には、ナノ環境に応じて種々の化合物の封入が可能であること。これらの化合物のこのナノ環境特性によって、同化合物の薬物担体としての特定用途が決まる。
（ｃ）遺伝子デリバリーに用いる場合、これらのポリマーは、負に荷電したＤＮＡと相互
作用してそれぞれ複合体を形成するので、カチオン電荷の存在を必要とする。そのようにして形成された複合体は、エンドサイトーシスを介して遺伝子治療のために核内に導入され得る。
【００１５】
本発明により、対称化学構造を有するデンドリマーポリマーと非対称ハイパーブランチポリマーが提供され、これらのポリマーは、
３つ以上の化学結合を形成し得る化学元素の少なくとも１つの原子と、
上記少なくとも１つの原子に結合する種々の異なる末端官能基であって、共同で、（ａ）低毒性または無毒性であり、（ｂ）上記ポリマーの分子を細胞の相補的受容体が認識可能なものとし、（ｃ）上記ポリマーを生体の生物学的環境内で安定にし、かつ（ｄ）細胞膜を介した上記ポリマーの輸送を促進する末端官能基と
を呈示するように修飾されていることを特徴とする。
【００１６】
これらのポリマーは、遺伝子デリバリーシステム、例えば、遺伝物質担体とする場合、ＤＮＡとの複合体を形成するようにカチオン化するのが好ましい。
これらのポリマーは、デンドリマーの末端基に、アンモニウム基、第４級アンモニウム基またはグアニジニウム基を導入してカチオン化するのが便利である。
【００１７】
３つ以上の化学結合を形成し得る化学元素の原子は、窒素または他の適切な特性基、例えば、炭素またはケイ素であるのが有利である。
修飾デンドリマーポリマーは、ジアミノブタンポリプロピレンイミノ（ＤＡＢ）デンドリマー、または類似構造を有する他のデンドリマー分子、例えばＰＡＭＡＭデンドリマーであるのが好ましい。
【００１８】
修飾非対称ハイパーブランチポリマーは、無水物、例えば、無水コハク酸、無水フタル酸または無水テトラヒドロフタル酸と、ジアルキルアミン、例えば、ジイソプロピルアミンとの重縮合から誘導するのが便利である。
【００１９】
修飾非対称ハイパーブランチポリマーは、エポキシド誘導体と１，１，１−トリヒドロキシアルキルプロパンとのアニオン重合から誘導するのが有利である。
修飾非対称ハイパーブランチポリマーは、グリシドールと１，１，１−トリヒドロキシメチルプロパン（ＰＧ−５）とのアニオン重合から誘導するのが便利である。
【００２０】
修飾デンドリマーポリマーまたは修飾非対称ハイパーブランチポリマーは、表面に、多様な分子量の重合鎖、例えば、ポリアルキレングリコール、好ましくはポリエチレングリコールを含む官能基を有するのが便利である。
【００２１】
修飾デンドリマーポリマーまたは修飾非対称ハイパーブランチポリマーは、細胞の受容体部位に相補的な少なくとも１つの基、例えば、グアニジニウム基、炭水化物（例えば、マンノース、グリコース、ガラクトース）、葉酸、ＲＧＤ受容体、核酸塩基部分（例えば、アデニン、チミン、グアニン、シトシン）またはバルビツル酸を含む官能基を有するのが有利である。
【００２２】
修飾デンドリマーポリマーまたは修飾非対称ハイパーブランチポリマーは、該デンドリマーポリマーまたは修飾ハイパーブランチポリマーおよびそれらに封入された任意の活性薬物成分または遺伝物質の細胞膜を介した輸送を促進する少なくとも１つの基、例えば、グアニジニウム部分、オリゴアルギニンもしくはポリアルギニン誘導体またはポリプロピレンオキシド部分を含む官能基を有するのが有利である。
【００２３】
修飾デンドリマーポリマーまたは修飾非対称ハイパーブランチポリマーは、少なくとも
１つの標的化リガンド、例えば、グアニジニウム基、炭水化物（例えば、マンノース、グリコース、ガラクトース）、葉酸、ＲＧＤ受容体、核酸塩基部分（例えば、アデニン、チミン、グアニン、シトシン）またはバルビツル酸を含む官能基を有するのが便利である。
【００２４】
修飾デンドリマーポリマーまたは修飾非対称ハイパーブランチポリマーは、生物活性医薬化合物の薬物担体として、または遺伝物質を担持させるために用いるのが好ましい。
修飾デンドリマーポリマーまたは修飾非対称ハイパーブランチポリマーによって担持される生物活性医薬化合物は、ベタメタゾンまたはベタメタゾン誘導体であるのが便利である。
【００２５】
さらに、本発明は、生物活性医薬化合物の薬物担体として使用できるように多機能性デンドリマーおよびハイパーブランチポリマーを合成する方法を提供し、この方法は、これらのポリマーの表面を、
（ａ）該表面のアミノ基または他の毒性基を、ヒドロキシ、カルボキシルもしくは第４級アンモニウム基、または他の無毒性基で置換するステップと、
（ｂ）デンドリマー担体またはハイパーブランチポリマーを生体のＭＰＳ（単核食細胞系）から保護するために、これらのポリマーの表面に、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ化）などの多様な分子量の重合鎖を導入するステップと、
（ｃ）担体の標的化能力を強化するために、受容体または組織に相補的で認識可能な基、すなわち、グアニジニウム基、炭水化物（例えば、マンノース、グリコース、ガラクトース）、葉酸もしくはＲＧＤ受容体、核酸塩基部分（例えば、アデニン‐チミン、グアニン‐シトシン）またはバルビツル酸基を導入するステップと、
（ｄ）担体と担体に封入されている活性薬物成分の細胞膜を介した輸送を促進する基、例えば、グアニジニウム部分、オリゴアルギニンもしくはポリアルギニン誘導体またはポリプロピレンオキシド部分を導入するステップと
を含むステップで修飾することを特徴とする。
【００２６】
この方法は、
先ず、デンドリマーまたはハイパーブランチポリマーの表面アミノ基またはヒドロキシ基を、一方の末端に例えばイソシアネート、エポキシドまたはＮ−ヒドロキシスクシンイミドなどの反応基を持つ適切な保護ポリマーと反応させるステップと、
次いで、毒性アミノ基を置換するために、得られたポリマーの大部分のアミノ基をエチルイソシアネートと反応させるステップと、
次いで、アミノ基を例えばグアニジニウム基などの認識可能な基に変換するために、先に得られたポリマーを反応させるステップと、
次いで、細胞膜を介した担体輸送を促進する例えばポリアルギニンまたはプロピレンオキシド鎖などの１つ以上の基を導入するステップと
を含むのが好ましい。
【００２７】
上記ポリマーは、これらの化合物を遺伝子デリバリーシステム、例えば遺伝物質の担体とする場合には、ＤＮＡとの複合体を形成するようにカチオン化するのが便利である。
有利には、この方法は、表面の毒性基がアミノ基のとき、その代替物として、８個未満の炭素原子、好ましくは２または３個の炭素原子を有する短鎖脂肪族を導入することを特徴とする。
【００２８】
本発明は、修飾された多機能性デンドリマーポリマーまたは修飾された多機能性非対称ハイパーブランチポリマーに封入された生物活性医薬化合物または遺伝物質を含む医薬製剤を提供する。
【００２９】
本発明はさらに、生物活性医薬化合物または遺伝物質を送達するための医薬製剤の製造
法を提供し、この方法は、
対称デンドリマーまたは非対称ハイパーブランチポリマーの表面を、（ａ）表面のアミノ基または他の毒性基を、ヒドロキシ、カルボキシルもしくは第４級アンモニウム基または他の無毒性基で置換するステップと、（ｂ）デンドリマー担体またはハイパーブランチポリマーを生体のＭＰＳ（単核食細胞系）から保護するために、これらのポリマーの表面に、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ化）などの多様な分子量のポリマー鎖を導入するステップと、（ｃ）担体の標的化能力を強化するために、受容体または組織に相補的で認識可能な基、すなわち、グアニジニウム基、炭水化物部分（例えば、マンノース、グリコース、ガラクトース）、葉酸もしくはＲＧＤ受容体、核酸塩基部分（アデニン−チミン、グアニン−シトシン）またはバルビツル酸基を導入するステップと、（ｄ）担体と担体に封入された生物活性医薬化合物の細胞膜を介した輸送を促進する基、例えば、グアニジニウム部分、オリゴアルギニンもしくはポリアルギニン誘導体またはポリプロピレンオキシド部分を導入するステップとで修飾して、対称デンドリマーまたは非対称ハイパーブランチポリマーを合成するステップと、
生物活性医薬化合物または遺伝物質を上記修飾ポリマーで封入するステップと
を含む。
【００３０】
上記ポリマーは、これらの化合物を遺伝物質の担体とする場合、ＤＮＡとの複合体を形成するようにカチオン化するのが好ましい。
生物活性医薬化合物を封入するか、遺伝物質を担持する修飾デンドリマーポリマーまたは修飾非対称ハイパーブランチポリマーは治療に用いると便利である。
【００３１】
生物活性医薬化合物を封入するか、遺伝物質を担持する修飾デンドリマーポリマーまたは修飾非対称ハイパーブランチポリマーは医薬製剤の製造に用いると有利である。
生物活性医薬化合物を封入するか、遺伝物質を担持する修飾デンドリマーポリマーまたは修飾非対称ハイパーブランチポリマーは、前記医薬化合物または遺伝物質が治療に用いられるのと同じ病気または症状を治療するための薬剤の製造に用いると便利である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
１つの実施形態において、本発明は多機能性対称デンドリマーの合成に関する。該デンドリマーは、図１に示されている一般式（１）で図解されている。そのようなポリマーは、例えば、ジアミノブタンポリプロピレンイミノデンドリマーであり得る。
【００３３】
さらに、本発明は、多機能性非対称ハイパーブランチポリマーの合成にも関する。該ポリマーは、図２に示されている一般式（ＩＩ）および図３に示されている式（ＩＩＩ）で図解されている。そのような非対称ポリマーは、例えば、無水コハク酸、無水フタル酸もしくは無水テトラヒドロフタル酸とジイソプロピルアミンとの重縮合、またはグリシドールと１，１，１−トリヒドロキシメチルプロパンとのアニオン重合から得られるポリマーである。
【００３４】
式Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩにおいて、記号（●：黒く塗りつぶされた円）は、３つ以上の化学結合を形成し得る化学元素の原子、例えば窒素、または他の適切な特性基、例えば、第３級アミノ基であり、直線（─）は脂肪族鎖であり、表面官能基Ｘ、Ｙ、Ｚは、共同で、（ａ）上記ポリマーの分子を細胞の相補的受容体が認識可能なものとし、（ｂ）上記ポリマーを生物学的環境内で安定にし、かつ（ｃ）細胞膜を介したこれらのポリマーの輸送を促進し得る。
【００３５】
本発明に記載されているポリマーを特に生物医学用に有用にする構造的特性は、（ａ）例えば図４に示されているようにポリマー表面へ段階的に導入して得られる、デンドリマーまたはハイパーブランチポリマー表面における機能的特性基の存在、および（ｂ）ナノ
環境に応じて多様な化合物を封入し得るポリマー内部のナノ空間の存在である。
【００３６】
第１段階の正電荷の導入によるデンドリマーまたはハイパーブランチポリマーの表面修飾（デンドリマーポリマーまたはハイパーブランチポリマー表面の分子工学）は、これらのポリマーを負に荷電した遺伝物質（ＤＮＡ、プラスミド、オリゴヌクレオシド）との結合に適したものとし得る。そのようにして形成されたデンドリマーポリマーまたはハイパーブランチポリマー担体と遺伝物質との複合体は、最終的に、エンドサイトーシスを介して遺伝子治療のために核内に導入される。
【００３７】
本発明の目的であるそのような多機能性デンドリマーポリマーおよびハイパーブランチポリマーの調製には、市販のデンドリマー、例えば、ディー・エス・エム社（ＤＳＭ）からＤＡＢ−３２およびＤＡＢ−６４という商標名で販売されているものを購入して用いた。適当な反応装置内で、適切な実験条件下に、官能基を段階的に導入して、これらのポリマーの構造を修飾した。図４には、例えば多機能性デンドリマー薬物デリバリーシステムの合成反応図式が示されている。
【００３８】
本発明の別の実施形態においては、適当な反応装置内で、ＤＡＢの代わりにＰＡＭＡＭデンドリマーを同じように用い得る。
本発明では、先ず、デンドリマーまたはハイパーブランチポリマーのナノ空間内部に生物活性化合物を導入し得る一方、ナノサイズ担体を形成するために、ポリマーの外表面には適切な機能性官能基を導入した。該官能基は、共同で、低毒性または無毒性であり、生物学的環境内で安定であり、かつ特定細胞の標的化能力および特定細胞への輸送能力を保有するという特性を有する。
【００３９】
デンドリマーまたはハイパーブランチポリマーを遺伝物質（遺伝子デリバリー用）の適切な担体として用いる場合、負に荷電した遺伝物質（ＤＮＡ、プラスミド、オリゴヌクレオシド）に結合させるために、例えば、以下に説明するように、デンドリマーまたはハイパーブランチポリマーの末端基に、アンモニウム、第４級アンモニウムまたはグアニジニウムイオンを導入して正電荷を導入する。
【００４０】
次いで、最終的に細胞核内に遺伝物質を輸送するという目的で、デンドリマーまたはハイパーブランチポリマーの表面に種々の官能基を導入する。具体的には、無毒性デンドリマーまたはハイパーブランチポリマーを選択するか、または、別例として、出発化合物を無毒性かつ生体適合性となるように修飾する。
【００４１】
次いで、（ｉ）ＤＮＡ−担体複合体を生物学的環境内で安定にし、（ｉｉ）特定の細胞または組織を標的化するという特性を付与し、（ｉｉｉ）膜を介した複合体の輸送を促進し、かつ（ｉｖ）エンドサイトーシス後にエンドソームから放出される能力を有する官能基を導入する。
【００４２】
そのようにして形成されたデンドリマーまたはハイパーブランチポリマーと遺伝物質との複合体は、最終的に、エンドサイトーシスを介して細胞に導入され得る。遺伝物質は最後に細胞内プロセスを介して遺伝子治療のために核に導入される。
【００４３】
これらの特性はすべて、以下に述べるプロセスにより達成され、これらのプロセスに従って：
（ａ）毒性末端基、例えばアミノ基を、無毒性の、例えば、ヒドロキシ、カルボキシルまたは第４級アンモニウム基により置換することと、
（ｂ）デンドリマー担体またはハイパーブランチポリマーの表面に、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ化）などの多様な分子量の重合鎖を導入することにより、これらのポ
リマーを生体のＭＰＳ（単核食細胞系）から保護することと、
（ｃ）担体の標的化能力を強化するために、細胞の受容体に相補的で認識可能な基、例えば、グアニジニウム基、炭水化物部分（例えば、マンノース、グリコース、ガラクトース）、葉酸もしくはＲＧＤ受容体、核酸塩基部分（例えば、アデニン、チミン、グアニン、シトシン）またはバルビツル酸基を導入することと、
（ｄ）担体と担体に封入された薬物成分または遺伝子の細胞膜を介した輸送を促進する基、例えば、グアニジニウム部分、オリゴアルギニンもしくはポリアルギニン誘導体またはポリプロピレンオキシド部分を導入することと、遺伝物質（ＤＮＡ、プラスミド、オリゴヌクレオシド）との複合体を形成するために、例えば、アンモニウム、第４級アンモニウム、グアニジニウムなどの正に荷電した部分を導入することと、
を達成するために、デンドリマーまたはハイパーブランチポリマーの表面末端基を適切に修飾する（一連の適切な反応において確立された有機合成化学プロセスに従うデンドリマーポリマーまたはハイパーブランチポリマー表面の分子操作）。
【００４４】
そのような多機能性デンドリマーの合成は、市販のデンドリマーまたはハイパーブランチポリマーを用いて達成し得る。多機能性デンドリマーの合成ステップを示す指標となる例が図４に示されている。
【００４５】
先ず、デンドリマーまたはハイパーブランチポリマーの表面アミノ基またはヒドロキシ基を、反応基、例えば、イソシアネート、エポキシドまたはＮ−ヒドロキシスクシンイミド部分を有する選択された分子量のポリエチレングリコールポリマーと反応させ得る。この第１段階後、得られたデンドリマーの残留アミノ基の大部分が例えばエチルイソシアネートと反応して、表面の毒性第１級アミノ基の存在を減少させた。第３段階では、最後まで残っている第１級アミノ基を、標的基、例えばグアニジニウム基に変換し得る。別の段階では、薬物担体と担体に封入された活性成分の細胞膜を介した輸送を促進する基、例えば、オリゴアルギニンまたはポリアルギニン部分を導入してもよい。本発明の場合には、標的化リガンドとして導入されたグアニジニウム基が、活性薬物成分を封入するデリバリーシステムの細胞膜を介した輸送を促進し得る。細胞に導入される遺伝物質とそれぞれ安定な複合体を形成するために、負に荷電した遺伝物質を樹状ポリマーに結合させるには、デンドリマーまたはハイパーブランチポリマーのカチオン化が必要である。
【００４６】
上記反応は、室温下に水性溶媒中で行うことができる。生成物の精製は、副生成物を透析により半透膜に通すことにより実施した。
本発明に用い得る代表的なデンドリマーまたはハイパーブランチポリマーは、例えば、対称ジアミノブタンポリプロピレンイミノデンドリマーまたは非対称ハイパーブランチポリマー、例えば、無水コハク酸、無水フタル酸もしくは無水テトラヒドロフタル酸とジイソプロピルアミンとの重縮合またはグリシドールと１，１，１−トリヒドロキシメチルプロパンとのアニオン重合から得られるポリマーである。
【００４７】
デンドリマーの保護コーティングとして用い得るポリマーは、例えば、デンドリマーまたはハイパーブランチポリマーと反応させるための活性基、例えば、イソシアネート、エポキシドまたはＮ−ヒドロキシスクシンイミド部分を有する種々の分子量のポリエチレングリコールであり、例えば、平均分子量５，０００のメトキシポリエチレングリコールのイソシアネート誘導体を用いた。
【００４８】
毒性基、例えばアミノ基の置換または反応は、アルキルイソシアネートまたはアルキルエポキシドと反応させることにより達成し得る。第１級アミノ基は、アルキルイソシアネートまたはアルキルエポキシドと反応させると、第２級アミノアルコールに変換される。本発明においては、エチルイソシアネートが好ましい。というのは、エチルイソシアネートは第１級アミノ基と都合良く反応するからである。また、上記実施例ではグアニジニウ
ム基である標的化リガンドの導入に関しては、当該デンドリマーの表面第１級アミノ基をグアニジニウム基に変換するために１Ｈ−ピラゾロ−１−カルボキサミジンヒドロクロリドを用い得る。グアニジニウム基と同様オリゴアルギニンおよびポリアルギニン部分も細胞膜を介した担体の輸送を促進する。遺伝子デリバリーに関して、複合体の調製およびその輸送が図５に図式で示されている。
【００４９】
コルチコステロイド、例えば吉草酸ベタメタゾンのように完全に非水溶性の親油性生物活性化合物を用いて、デンドリマーを薬物担体として使用する実施例を実施した。これらの化合物は、多機能性デンドリマーの内部で最高１４．５％まで溶解することが判明した。これらの化合物は、ポリエチレングリコール鎖（ＰＥＧ）で保護され、標的化リガンドとしてグアニジニウム基を有し、グアニジニウム基により、このポリマーは細胞または組織の受容体を標的とし得るようになる。吉草酸ベタメタゾンは、酸性環境下でさえ、これらの多機能性デンドリマー内に封入されたままであることも立証された。しかし、生物活性コルチコステロイド化合物は、ＮａＣｌ水溶液を加えると、デンドリマーのナノ空間から放出される（図６）。
【００５０】
デンドリマーポリマーと、同じように多機能性のハイパーブランチポリマーとが、共通の構造的特徴を有しているために、多機能性ハイパーブランチポリマーが薬物担体として多機能性デンドリマー由来のものと類似またはほとんど同じ挙動および特性を示すであろうことは十分に予測される。市販のポリマー、例えばＰＧ−Ｓ５をベースとする多機能性ハイパーブランチポリマーの合成反応図式が図７に示されている。
【００５１】
本明細書において、以下の実施例に記載されている量は、特に断りのない限り、モル単位である。
【実施例】
【００５２】
［材料および方法］
出発デンドリマーポリマーとして、それぞれ表面に３２個および６４個のアミノ基を有する第４世代および第５世代のジアミノブタンポリプロピレンイミンデンドリマー（以下の図式に１として表示したＤＡＢ−３２およびＤＡＢ−６４、ディー・エス・エム・ファイン・ケミカルズ社（DSM Fine Chemicals））を用いた。
【００５３】
樹状ポリマーの多機能化には、メトキシポリエチレングリコール−イソシアネート（以下の図式に２として表示、ＭＷ５，０００、シアウォーター・ポリマーズ社（Shearwater
Polymers,INC ））、エチルイソシアネート（アルドリッチ社（Aldrich ））および１Ｈ−ピラゾロ−１−カルボキサミジンヒドロクロリド〔フルカ社（Fluka ）〕（以下の図式に３として表示）を用いた。
【００５４】
親油性薬物である吉草酸ベタメタゾン（以下の図式に４として表示）は、イタリアのイフェケム・エス・アール・エル社（EFFECHEM S.R.L. ）から入手し、封入／放出研究に用いた。
【００５５】
グリシジルトリメチルアンモニウムクロリド（以下の図式に５として表示）および葉酸（以下の図式に６として表示）はフルカ社から購入した。ハイパーブランチポリエーテルポリオール（以下の図式に７として表示、ＭＷ５，０００、ＰＧ−５）はハイパーポリマーズ社（Hyperpolymers GmbH）から購入し、凍結乾燥後に用いた。
【００５６】
上述の樹状ポリマーおよび基本的な出発有機化学物質は以下の図式に示されている。
【００５７】
【化１】
0004808610.tif 000002
【００５８】
Ａ．デンドリマーの多機能化
［実施例Ｉ］
（ステップ１）  市販されている第５世代（または他の任意の世代）のジアミノブタンポリプロピレンイミノデンドリマー０．００１モルと分子量５，０００のメトキシポリエチレングリコール−イソシアネート０．００４モルを水に溶解した。得られた溶液に少量のトリエチルアミン水溶液を添加して、ｐＨ１３の溶液を得た。この溶液を室温下に数時間攪拌した。次いで、反応混合物からすべての低分子量不純物を除去するために、半透膜を介して２４時間溶液を透析して精製した。ステップ１の結果生じたポリエチレングリコ
ール部分のデンドリマーへの導入はＮＭＲ分光法で証明された。
【００５９】
【化２】
0004808610.tif 000003
【００６０】
（ステップ２）  水に溶解した０．００１モルのＩに、これも水に溶かした０．０５２モルのエチルイソシアネートを加えた。４０％トリメチルアミン水溶液を添加して溶液のｐＨを１３に調整した。混合物を室温下に数時間反応させ、低分子量化合物を除去するために１２，４００カットオフ膜で透析し、最後に凍結乾燥して化合物ＩＩを得た。この第２ステップの機能化は、１Ｈおよび１３Ｃ  ＮＭＲで証明された。
【００６１】
【化３】
0004808610.tif 000004
【００６２】
（ステップ３）  ステップ１で調製し、無水ＤＭＦに溶かした０．００１モルのデンドリマーに、これも無水ＤＭＦに溶かした０．０１モルの１Ｈ−ピラゾロ−１−カルボキサミジンヒドロクロリドと０．０１モルのジイソプロピルエチルアミンを加えた。反応混合物を室温下に一晩反応させ、得られた生成物をジエチルエーテルで沈殿させて、遠心分離した。固体化合物を水に溶かし、１２，４００カットオフ膜で透析した。溶媒を除去し、残留物質を徹底乾燥して、化合物ＩＩＩを得た。グアニジニウム基の導入は、１Ｈおよび１３Ｃ  ＮＭＲで証明された。
【００６３】
【化４】
0004808610.tif 000005
【００６４】
［実施例ＩＩ］
（ステップ１：ジアミノブタンポリプロピレンイミンデンドリマーの４級化）
ポリプロピレンイミンデンドリマーの部分４級化は以下のように実施した。１０ｍｌの水に溶かした０．１１３ｍｍｏｌのＤＡＢ−３２（０．３９８ｇ）の溶液に、１．９３８ｍｍｏｌのグリシジルトリメチルアンモニウムクロリド（２６０μｌ）を加えた。混合物を一晩反応させた。次いで、未反応エポキシドを除去するために、１，２００カットオフ膜でＨ２Ｏに対して透析し、凍結乾燥した。第４級アンモニウムの導入は、Ｄ２Ｏ中で記録した１Ｈ  ＮＭＲおよび１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルで証明された。１Ｈ  ＮＭＲスペクトルでは２．６０ｐｐｍ、３．１６ｐｐｍ、３．３４ｐｐｍおよび４．２６ｐｐｍ、１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルでは５５．１ｐｐｍ、５６．９ｐｐｍ、６７．４ｐｐｍおよび７１．８ｐｐｍに予測された４つの新規シグナルが出現したことにより、４級化が生じたことが確認された。さらに、１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルでは、２８．０ｐｐｍおよび４９．５ｐｐｍに２つの新たなシグナルが出現したが、同シグナルは新規に形成された第２級アミノ基についてのαおよびβメチレン炭素に対応する。置換度は、デンドリマーの第３級、第２級および第１級アミノ基に結合したすべてのβメチレンプロトンに対応する１．５８ｐｐｍのシグナルに対する、第４級メチルプロトンに対応する３．１６ｐｐｍのシグナルの積分比から予測した。置換度は３３％であると判明した。
【００６５】
（葉酸活性エステルの合成）
これは、市販されていない有機中間体であり、以下の手順に従って多機能性デンドリマーを調製するための次のステップに必要である。７．５ｍｌの無水ＤＭＳＯに溶かした０．５９４ｍｍｏｌの葉酸を、１ｍｌの無水溶媒中０．５９５ｍｍｏｌのＴＥＡ（８２．５μｌ）および０．５９５ｍｍｏｌのＤＣＣ（０．１２３ｇ）とアルゴン雰囲気下に１時間反応させた。混合物に、１ｍｌの無水ＤＭＡＳＯ中０．５９４ｍｍｏｌのＮ−ヒドロキシスクシンイミドを加え、これを不活性条件下に一晩反応させた。ＤＣＵを濾去し、生成物を無水Ｅｔ２Ｏに沈殿させ、濾過回収した。活性エステルを真空下にほぼ２時間乾燥し、次いで、先に得た４級化ＤＡＢ−３２との反応に用いた。
【００６６】
（ステップ２：４級化ＤＡＢ−３２への葉酸の導入）
先に調製した葉酸活性エステルを、以下の手順に従ってデンドリマーに葉酸標的化リガンドを導入するための出発物質として用いる。７ｍｌの無水ＤＭＳＯに溶かした０．０１
３７ｍｍｏｌの４級化ＤＡＢ−３２の溶液を、１ｍｌの同じ無水溶媒に溶かした０．０４１３ｍｍｏｌの葉酸−ＮＨＳ活性エステルに加えた。５日後、生成物を無水Ｅｔ２Ｏに沈殿させ、１２００カットオフ膜を用いて、先ずｐＨ７．４のリン酸緩衝液、次いで、脱イオン水に対して透析し、凍結乾燥した。
【００６７】
１Ｈおよび１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルは共にＤ２Ｏ中で記録した。葉酸の存在は、プテリン環の７位のメチン基に対応する８．６ｐｐｍの特性シグナルと、ベンジル部分の芳香族プロトンに対応する６．７ｐｐｍおよび７．７ｐｐｍの２つの２重線によって確認された。共役体１個当たりの平均葉酸分子数は、オキシラン環の開環の結果生じたグリシジル試薬のヒドロキシル基を持つメチン基に対応する４．５４ｐｐｍのシグナルに対する、プテリン環の７位のプロトンに対応する８．６ｐｐｍのシグナルの積分比から予測した。デンドリマー誘導体中の平均葉酸残基数は３であると予測された。さらに、これらのデンドリマー中の葉酸含有量を、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中でＵＶ分光法により吸光係数値ε２８０＝７４６２０Ｍ−１ｃｍ−１を用いて測定した。これらの結果を１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルでさらに確認した。最終生成物は４級化され（カチオン電荷の導入）、かつ標的化葉酸リガンドにより機能化されたが、その一方で該生成物のアミノ基（第１級、第２級および第３級）は、このように緩衝能力を示す生物学的環境内でもプロトン化し得る。
【００６８】
Ｂ．ハイパーブランチポリマーの機能化
（ポリグリセロールＰＧ−５のＰＥＧ化）
ｐＨ１３のトリメチルアミン水溶液に溶かした水１０ｍｌ中０．０４０９４ｍｍｏｌのＰＧ−５の溶液に、水１０ｍｌに溶かした０．１６３９ｍｍｏｌのメトキシポリエチレングリコール−イソシアネートを加えた。混合物を不活性雰囲気下に約４日間反応させ、未反応ポリマーとＰＥＧ−イソシアネートを除去するために１２，４００カットオフ膜で透析し、最後に、凍結乾燥、真空乾燥して、ＰＥＧ化ＰＧ−５を得た。
【００６９】
１Ｈおよび１３Ｃ  ＮＭＲはＤ２Ｏ中で記録した。試薬の末端メチル基に対応する３．３２ｐｐｍのシグナルおよびアミド結合（ＣＯＮＨＣＨ２−）に関するα−ＣＨ２プロトンに対応する３．２５ｐｐｍのシグナルの出現により、ＰＥＧ部分の導入が確認された。ＰＥＧ化ハイパーブランチポリエーテルポリオールの形成は、１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルによっても立証された。置換度は、コア部分のメチル基に対応する０．８２ｐｐｍのシグナルに対する、アミド結合（ＣＯＮＨＣＨ２−）に関するα−ＣＨ２プロトンに対応する３．２４ｐｐｍのシグナルの積分比から予測した。ポリマー当たりの平均ｍ−ＰＥＧ部分数は２であった。
【００７０】
（ＮＨ２−ＰＥＧ−葉酸の合成）
１モル当量のジシクロヘキシルカルボジイミドおよびピリジンを含有する無水ジメチルスルホキシド中でポリオキシエチレン−ビス−アミン（ネクター（Nektar）、ＭＷ３，４００）を等モル量の葉酸と反応させて、ＮＨ２−ＰＥＧ−葉酸を合成した。反応混合物を室温下に暗所で一晩攪拌した。反応終了後、倍容量の水を加え、不溶性副生成物のジシクロヘキシル尿素を遠心分離により除去した。次いで、上澄みを５ｍＭのＮａＨＣＯ３緩衝液（ｐＨ９．０）、次いで脱イオン水に対して透析して、混合物中の未反応葉酸を除去した（１，２００カットオフ）。次いで、過剰な５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で予洗したセルロースリン酸カチオン交換樹脂を用いたバッチ吸着法により、微量の未反応ポリオキシエチレン−ビス−アミンを除去した。生成物ＮＨ２−ＰＥＧ−葉酸を再度水に対して透析して、凍結乾燥し、その１Ｈおよび１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルをＤ２Ｏ中で記録した。葉酸の存在は、生成物の１Ｈ  ＮＭＲスペクトル中、プテリン環７位のメチン基に対応する８．６４ｐｐｍの特性シグナルおよびベンジル部分の芳香族プロトンに対応する６．７４ｐｐｍおよび７．６０ｐｐｍの２つの２重線によって確認された。共役体１個当たりの平均葉酸分子数は、残留アミノ基の隣のα−メチレン基に対応する３．１５ｐｐｍの
シグナルに対する、８．６４ｐｐｍのシグナルの積分比から予測した。１３Ｃ  ＮＭＲスペクトル中で、α−メチレンのシグナルが３０．４ｐｐｍから３２．６ｐｐｍの新規ピークに入れ替わったことにより、葉酸のγ−カルボキシル基のみが反応した。
【００７１】
（ＰＧ５−ＰＥＧ−葉酸の合成）
ポリグリセロール  ＰＧ−５をＤＭＦ中過剰な無水コハク酸と微高温下に一晩反応させて、該ポリグリセロールのヒドロキシル基の５〜１０％が反応するように、ＰＧ５−ＰＥＧ−葉酸を合成した。反応生成物を水に対して透析し、その構造を１Ｈおよび１３Ｃ  ＮＭＲ実験で確認した。１Ｈ  ＮＭＲスペクトル中に、新規形成されたエステル結合に対するα−およびβ−メチレンに対応するそれぞれ２．５ｐｐｍと２．６ｐｐｍの２つの新規シグナルが出現した。さらに、上述のように、無水ＤＭＦ中、ジシクロヘキシルカルボジイミドおよびピリジンの存在下に、ＮＨ２−ＰＥＧ−葉酸を修飾ポリグリセロールＰＧ５と反応させてアミド結合を形成させた。反応生成物を水に対して透析し（５，０００カットオフ）、この場合も葉酸の導入を１Ｈおよび１３Ｃ  ＮＭＲ実験で確認した。ハイパーブランチポリマー上のＰＥＧ−葉酸の存在は、１Ｈ  ＮＭＲスペクトル中８．６４ｐｐｍの特性シグナルで確認された。共役体１個当たりの平均葉酸分子数は、ポリマーのコア基のメチル基に対応する０．８２ｐｐｍのシグナルに対する、８．６４ｐｐｍのシグナルの積分比から予測した。さらに、本発明の分子中の葉酸含有量も、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の該共役体の定量的ＵＶ分光分析により吸光係数値ε２８０＝７４６２０Ｍ−１ｃｍ−１を用いて測定した。
【００７２】
（ベタメタゾン誘導体の封入および放出）
実施例１で調製した多機能性デンドリマーへのベタメタゾン誘導体の封入は、以下の方法を用いて実施した。デンドリマーと吉草酸ベタメタゾン誘導体をクロロホルム／エタノール混合物に溶解させた。溶媒を蒸留して薄膜を得、これを水中に分散させた。化合物を封入したデンドリマーは水性相に取り込まれたが、非封入物質は水に不溶のままであったので、遠心分離して除去した。多機能性デンドリマー内に封入された吉草酸ベタメタゾンの割合が表１に示されている。表には、比較のために、例えば周知のプローブであるピレンの封入データが入っている。
【００７３】
【表１】
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【００７４】
例えば、吉草酸ベタメタゾンの放出は、塩化ナトリウム水溶液を徐々に添加することにより達成された（図６）。０．８ＭのＮａＣｌを添加すると、多機能性デンドリマーから生物活性化合物がほぼ完全に放出されたことが観察されている。
【００７５】
（遺伝物質を担持する多機能性デンドリマーの調製）
天然血清、塩化ナトリウム水溶液（３００ｍＭ）、ＰＰＭＩ−１６４０などの種々の媒体中で、正に荷電した多機能性デンドリマーをプラスミドＤＮＡ（３〜７ｍｇ）に加え、デンドリマーとＤＮＡの電荷比が３．５：１〜８．５：１となるようにした。
【００７６】
（図面の詳細な説明）
（図１）  本発明の１つの目的である対称デンドリマー構造を有する一般式Ｉの分子の構造を示す図。記号（●：黒く塗りつぶされた円）は、３つ以上の化学結合を形成し得る化学元素の原子（例えば窒素）、または適切な特性基であり、直線（─）は脂肪族鎖であり、表面官能基Ｘ、Ｙ、Ｚは、共同で、（ａ）上記ポリマーの分子を細胞の相補的受容体によって認識可能なものとし、（ｂ）上記ポリマーを生物学的環境内で安定にし、かつ（ｃ）これらのポリマーの細胞膜を介した輸送を促進する基である。
【００７７】
（図２および図３）  本発明の目的である２種の異なる非対称ハイパーブランチポリマーの分子構造を示す図。記号（●：黒く塗りつぶされた円）は、３つ以上の化学結合を形成し得る化学元素の原子（例えば窒素）、または適切な特性基であり、直線（─）は脂肪族鎖であり、表面官能基Ｘ、Ｙ、Ｚは、共同で、（ａ）上記ポリマーの分子を細胞の相補的受容体によって認識可能なものとし、（ｂ）上記ポリマーを生物学的環境内で安定にし、かつ（ｃ）これらのポリマーの細胞膜を介した輸送を促進する基である。
【００７８】
（図４）  本発明の１つの実施形態によるデンドリマー（またはハイパーブランチポリマー）表面上への官能基の段階的導入を示す図。すなわち、
第１段階では、デンドリマーの表面アミノ基またはヒドロキシ基を、例えばエポキシ−またはＮ−ヒドロキシスクシンイミドなどの反応基を持つ適切なポリマーと反応させる。
第２段階では、毒性アミノ基を置換するために、デンドリマー表面に残留するアミノ基の大部分を、例えばエチルイソシアネートと反応させる。
第３段階では、例えばグアニジニウム基などの認識基を導入する。
第４段階では、担体と担体に封入された化合物との細胞膜を介した移動を促進する基、例えば、グアニジニウム基、オリゴアルギニンまたはポリアルギニンなどを導入する。
【００７９】
（図５）  デンドリマー担体とＤＮＡまたはオリゴヌクレオチドとの複合体の形成およびその細胞膜を介した輸送の模式図。
（図６）  封入された吉草酸ベタメタゾンの放出を塩化ナトリウム水溶液の濃度の関数として示す図。
【００８０】
（図７）  本発明の１つの実施形態によるハイパーブランチポリマー表面上への官能基の導入を示す図。１ステップ反応で、末端ＯＨ基に結合した２つの官能基、例えば、保護ＰＥＧ鎖と葉酸標的化リガンドとが導入される。
【００８１】
本明細書および特許請求の範囲に用いられている用語「含んでなる」（「comprise」、「comprising」）およびその変形形態は、指定の特徴、ステップ、成分または整数値を含むことを意味する。これらの用語は、他の特徴、ステップ、成分または整数値の存在を排除するものと解釈してはならない。
【００８２】
上記説明、または特許請求の範囲、または添付図面に開示されている特徴は、特定の形態で、または開示されている機能を果たすための手段、または、必要に応じて、開示されている結果を達成するための方法もしくはプロセスに関して表現されているが、本発明をその多様な形態で実現するために、別々に利用することも、任意の組合せで利用することもできる。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】対称デンドリマーポリマーの一般式。
【図２】非対称ハイパーブランチポリマーの一般式。
【図３】ハイパーブランチポリマーＩＩＩの一般式。
【図４】ポリプロピレンイミンデンドリマーへの官能基の段階的導入を示す図。
【図５】ＤＮＡ−デンドリマーの複合体化および細胞膜との相互反応を示す模式図。
【図６】２．５  １０−５デンドリマー溶液中の吉草酸ベタメタゾン放出を添加されたＮａＣｌの関数としてプロットした図。
【図７】１段階で達成されたＰＧ５ハイパーブランチポリマーへの官能基の導入を示す図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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