(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
付与領域（２）、及び検出領域（３）を含むシート状クロマトグラフィー装置（１）であって、前記検出領域（３）が分析対象物特異的なオリゴヌクレオチドとコンジュゲートされたハプテン又はペプチド（８）を特異的に認識する少なくとも一つの捕獲試薬（５）を含み、前記付与領域（２）が少なくとも一つのラベルされたプローブ（６）コンジュゲートを含み、前記コンジュゲートが、分析対象物の分子増幅から得られる増幅生成物又はポリヌクレオチド（７）に対して特異的であり、かつ特異的シグナルを生成することによって前記増幅生成物又はポリヌクレオチド（７）の検出を可能にすることを特徴とするシート状クロマトグラフィー装置。
【請求項２】
付与領域（２）がコンジュゲートパッドを有すること、検出領域（３）が制御領域を有すること、及びシート状クロマトグラフィー装置が吸着領域（４）をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載のシート状クロマトグラフィー装置。
【請求項３】
前記分析対象物特異的なオリゴヌクレオチドが分析対象物の分子増幅のために用いられるプライマーの一つと同一であることを特徴とする請求項１又は２に記載のシート状クロマトグラフィー装置。
【請求項４】
前記装置がテスト面（１１）及びコントロール面（１２）をさらに含む両面ニトロセルロースラミネートから作られており、前記テスト面（１１）が関心のある標的ポリヌクレオチド配列（７）の特異的な検出のための試薬を含み、前記コントロール面（１２）が真性の内部増幅コントロールの特異的な検出のための試薬を含むことを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載のシート状クロマトグラフィー装置。
【請求項５】
前記コントロール面（１２）が（内部）コントロールプローブコンジュゲート（１４）に対して相補的なコントロールオリゴヌクレオチド配列（１３）から作られるクロマトグラフィーコントロール手段を含むことを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載のシート状クロマトグラフィー装置。
【請求項６】
前記試薬（５）がポリクローナル又はモノクローナル抗体又は超可変性抗体フラグメント又は前記ハプテン又はペプチド（８）に結合することができるいかなる他の分子であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載のシート状クロマトグラフィー装置。
【請求項７】
前記特異的なラベルされたプローブコンジュゲート（６，１４）が直接的ラベル（１５）にコンジュゲートされたオリゴヌクレオチド配列であり、関心のある標的ヌクレオチド配列（７）に対して特異的であるか又はコントロールのオリゴヌクレオチド配列（１３）に対して特異的であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか一項に記載のシート状クロマトグラフィー装置。
【請求項８】
前記ラベル（１５）がコンジュゲートされた金属コロイド、コンジュゲートされたラテックス粒子及び特異的な特定の色を有する微粒子からなる群から選択されることを特徴とする請求項７に記載のシート状クロマトグラフィー装置。
【請求項９】
ディップスティック及び横方向流動装置からなる群から選択されることを特徴とする請求項１〜８のいずれか一項に記載のシート状クロマトグラフィー装置。
【請求項１０】
堅固な固体支持体（１７）上に積層されたポリマー物質からなることを特徴とする請求項１〜９のいずれか一項に記載のシート状クロマトグラフィー装置。
【請求項１１】
固体支持体（１７）がポリマー支持体であることを特徴とする請求項１０に記載のシート状クロマトグラフィー装置。
【請求項１２】
前記付与領域（２）がポリエステル製のコンジュゲートパッドを有するガラス繊維から作られた膜を含み、前記検出領域（３）がニトロセルロース、ナイロン又はポリエーテルスルホン膜（捕食者（ｐｒｅｄａｔｏｒ））から作られた膜を限定なしに含み、前記吸着領域（４）がセルロースから作られた膜を含むことを特徴とする請求項２〜１１のいずれか一項に記載のシート状クロマトグラフィー装置。
【請求項１３】
前記付与領域（２）とコンジュゲートパッドが同一材料から作られていることを特徴とする請求項２〜１２のいずれか一項に記載のシート状クロマトグラフィー装置。
【請求項１４】
標的ポリヌクレオチド配列（７）の存在又は不在を検出することによって生物学的サンプル中の少なくとも一つの分析対象物を検出及び／又は定量する方法であって、前記ポリヌクレオチド配列（７）が請求項１〜１３のいずれか一項に記載のシート状クロマトグラフィー装置（１）と接触させられることを特徴とする方法。
【請求項１５】
標的ポリヌクレオチド配列（７）が分析対象物の分子増幅から得られたものであることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生物学的サンプル中の分析対象物を検出するための方法及び装置に関する。本発明は「ディップスティック（ｄｉｐｓｔｉｃｋ）」、「横方向流動（ｌａｔｅｒａｌ  ｆｌｏｗ）」装置及び「フロースルー（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）」装置を含む迅速なテスト及び典型的な迅速なテストに関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫クロマトグラフィーを介して研究室での日常的な診断のために生物学的サンプル中の分析対象物を検出するためのいくつかのアプローチが開発されている。
【０００３】
ＥＰ  ００８８６３６，ＥＰ  ０１８６７９９，ＥＰ  ０２８４２３２及びＷＯ  ８８／０８５３４は少なくとも第一及び第二領域を含むシート状クロマトグラフィー装置を開示する。これらの文献に開示されている従来技術の装置は以下のものを含む：
−  特異的試薬をコートされた感作領域に液体が移動することを可能とする多孔質の活性材料を含む第一領域。この第一領域はサンプルパッドと称され、その上で乾燥された又はその中に含浸された検出試薬を含む。それは付与領域及び／又は吸着（サブ）領域をさらに含むことができる。サンプルパッド領域は付与領域と一般的に称される；
−  特異的試薬が吸着される多孔質の活性材料からなる、検出領域とも称される第二領域。装置の第二領域の線上に噴霧されたこれらの試薬のいくつかは、検出されるべき分析対象物に対して直接的に又は間接的に特異的であり、サンプル分析対象物−ラベル試薬複合体と反応すべきであり、一方、第二領域のさらなる線上に結果として噴霧される他の非特異的試薬は過剰の検出試薬と反応する役割を有する。この第二領域は好ましくはニトロセルロースから作られ、コントロール線、好ましくは検出領域の後ろのコントロール線を含むことができる；及び
−  所望により、第一及び第二領域を通して来る過剰の液体を吸収する役割を有する多孔質材料からなる第三領域。この領域は一般的に吸着又は吸収領域と称される。
【０００４】
当該技術分野で公知の他のいくつかの検出技術は分析対象物の分子又は遺伝子増幅の如き予備工程後に生成される分子の検出に関する。
【発明の開示】
【０００５】
発明の目的
本発明は所望により分子増幅工程後に得られるポリヌクレオチド分子を検出するための新規で進歩性のある技術を提供することを目的とする。
【０００６】
本発明のさらなる目的は取扱いが容易で迅速かつ正確な検出及び／又は診断を可能にする装置を提供することである。
【０００７】
定義
プライマー：分析対象物特異的なオリゴブクレオチド（増幅のために使用され、ラベルされて捕獲試薬と反応させられる）。
【０００８】
コンジュゲート：分析対象物特異的なプローブであって、直接的粒子ラベルと結合されているプローブ。
【０００９】
捕獲試薬：ラベルされた分析対象物特異的なオリゴヌクレオチドと特異的に反応する試薬。
【００１０】
吸収パッド：第一領域又はサンプルパッド。
【００１１】
コンジュゲートパッド：乾燥されたコンジュゲートを含む領域。
【００１２】
発明の概要
本発明はシート状クロマトグラフィー装置、特にディップスティック、フロースルー及び横方向流動装置に関し、前記装置は
−  付与領域（所望によりコンジュゲートパッドを有する）、
−  検出領域（所望によりコントロール部分（例えばコントロール線）を有する）、及び
−  所望により吸収領域
を有する。検出領域は分析対象物特異的なオリゴヌクレオチドとコンジュゲートされた又はこのオリゴヌクレオチドに結合されたハプテン又はペプチドを特異的に認識する少なくとも一つの捕獲試薬を含み；付与領域は少なくとも一つの特異的なラベルされたコンジュゲート（直接的ラベル又は間接的ラベルと）を含み、このコンジュゲートは好ましくは分析対象物と特異的にハイブリダイズし、一般的にプローブと称されるオリゴヌクレオチド（ＤＮＡ，ＲＮＡ，ＰＮＡ，ＬＮＡ）である。陽性反応の場合には、即ち複合体が前記特異的（捕獲）試薬と前記ハプテン又はペプチドに結合された特異的分析対象物であって前記特異的コンジュゲートとハイブリダイズされた分析対象物との間に形成される場合には、シグナルが生成される。このシグナルは特異的シグナルとも称される。分析対象物特異的なオリゴヌクレオチドは分析対象物の分子増幅のために用いられるプライマーの一つである。
【００１３】
本発明の特別な実施態様では、コントロール線は特異的コンジュゲートプローブとハイブリダイズするオリゴヌクレオチド配列から作られる。
【００１４】
捕獲試薬はポリクローナル又はモノクローナル抗体又は超可変性抗体フラグメント又は分析対象物特異的なオリゴヌクレオチドとコンジュゲートされる又はこのオリゴヌクレオチドに結合されるいかなる分子であることができる。検出ラベルは直接的粒子ラベルであることが好ましく、コンジュゲートされた金属コロイド、コンジュゲートされたラテックス粒子及び特定の色を有する微粒子からなる群から選択されることが好ましい。
【００１５】
好ましくは、シート状クロマトグラフィー装置は堅固なポリマー上に積層されたポリマー物質からなる。好ましい実施態様では、付与領域はポリエステル製のコンジュゲートパッドを有するガラス繊維から作られた膜を含み、検出領域はニトロセルロースから作られた膜を含み、吸着領域はセルロースから作られた膜を含む。他の実施態様によれば、付与領域とコンジュゲートパッドは同一材料から作られている。
【００１６】
本発明は上述の装置（オリゴクロマトグラフィー装置とも称される）のいずれか一つを利用した検出方法にさらに関し、この方法は好ましくは増幅後の標的オリゴヌクレオチド配列の存在をチェックするために用いられることができる。検出は裸眼で及び／又は分析対象物又は増幅物の検出及び／又は定量のためのストリップ読取り器及び特定のソフトウェアプログラムの助けを借りて自動的に行われることができる。
【００１７】
本発明は添付の図面を参照して以下の非限定的実施例及び実施態様によってさらに説明される。
【００１８】
図面の簡単な記述
図１は本発明の検出装置を用いて得られる陽性テストを表す。
【００１９】
図２ａ及び図２ｂは本発明の方法のさまざまな検出ステップを表す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明は特に、改良された横方向流動又はディップスティック装置の如きクロマトグラフィー装置又はフロースルーシステムである改良された分析対象物検出装置（１）及び所望によりクリーンな（ｃｌｅａｎ）液体サンプルの如きサンプル中に存在する分析対象物の検出におけるそれらの装置の使用に関する。好ましい装置は付与領域（２）、検出領域（３）、及び所望により当該技術分野では公知の吸着領域（４）を含む。検出領域（３）は一以上の規定された部分、好ましくは線を含むことができ、そのそれぞれは一つの特定の分析対象物又は分析対象物の群を検出する役割を有する。所望によりいくつかの部分（線）を含むコントロール領域が含められてもよい。本発明の装置は一片のシート状装置であってもよいし、又は相互に毛細管接触するいくつかの部分からなっていてもよい。フロースルー装置は本発明のためのツールとしても考慮されるべきである。
【００２１】
本発明による装置は多孔質のポリマー物質からなり、この物質は好ましくは装置を取扱いやすくする機械的強度を与えるために堅固な又は半堅固なポリマー上に積層される。ポリマー物質の多孔度は、再水和されたコンジュゲートに沿って動く流体及びその成分のスティックの底部から上部への毛細管移動がいかなる妨害なしに可能であるようなものであるべきである。これらの特徴はこれらのポリマーの親水性の特性によって可能となる。好ましいポリマーの例はセルロース、ニトロセルロース、酢酸セルロース、ガラス繊維、ナイロン、アクリルコポリマー／ナイロン、ポリエーテルスルホン及びポリエステルである。
【００２２】
特異的なラベルされた試薬（６）は分析対象物に対して特異的であり、所望によりクリーンな液体サンプル中に存在する分析対象物を検出及び／又は定量する役割を有する。特異的なラベルされた試薬（６）は分析対象物と複合体を形成し、この複合体は次に特異的な捕獲試薬（５）によって捕獲される。この捕獲試薬（５）はポリクローナル又はモノクローナル抗体又は当該技術分野で公知のいかなる超可変性抗体フラグメント又はラベルされた分析対象物と特異的に反応することができるハプテン、ペプチド又はタンパク質（８）の如き相補的分子に対して特異的に結合することができるいかなる他の分子であることができる。これらの試薬は遺伝子工学を介して製造されることができる。
【００２３】
様々な検出システムが当該技術分野で公知である。当該技術分野で公知の着色された又は可視的な（直接的）粒子ラベルは、ラテックスポリマーから作られた粒子（１５）又は金、炭素、リポソームの如き金属コロイドを含み、これらは検出されるべき分析対象物と正常に反応する結合試薬（６）とコンジュゲートされることができる。両方のシステムを用いて定量及び／又は半定量が可能である。
【００２４】
本発明は好ましくは分析対象物の分子増幅後に標的核酸生成物（７）の存在を迅速かつ特異的に検出する方法に関する。ＰＣＲ，ＲＴ−ＰＣＲ，ＬＣＲ又はＮＡＳＢＡを含むがこれらに限定されないいかなる分子増幅技術も増幅生成物（７）を生成させるために用いられることができる。核酸生成物はとりわけ一本鎖、二本鎖又は部分的に二本鎖のＤＮＡ，ＲＮＡ分子などを含む。分子の骨格は修飾されることができ及び／又はヌクレオチド又はヌクレオシド類似物を含有することができる。
【００２５】
本発明の好ましい実施態様では、特異的なプローブコンジュゲートは、特異的な標的配列（７）と特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチド配列（ＤＮＡ，ＲＮＡ，ＰＮＡ，ＬＮＡ）（６）とコンジュゲートされた可視的な（直接的）ラベル（１５）を含む。「特異的なハイブルダイゼーション」はコンジュゲートされたポリヌクレオチド配列が液体中に存在するであろう分析対象物と（当業者には周知である）特定条件下でハイブリダイズし、他の核酸配列とはハイブリダイズしないことを意味する。これにより、所望によりいくつかの他の分析対象物を含む化合物の混合物内で特定の分析対象物を検出することが可能である。関心のあるオリゴヌクレオチド配列（７）と特異的なプローブコンジュゲートとの間に形成される複合体は第二領域（３）の膜（好ましくはニトロセルロース）中に移動し、捕獲試薬（５）に到達する（この捕獲試薬はポリクローナル又はモノクローナル抗体又は当該技術分野で公知のいかなる超可変性抗体フラグメント又は上にコートされたラベルされた分析対象物と特異的に反応することができるハプテン、ペプチド又はタンパク質でありうるいかなる分子であることができる）。複合体（６〜１５）と膜上にコートされたその特異的試薬（５）との間の反応は可視化されるであろう。なぜなら、粒子（１５）は蓄積して可視的なシグナルを生成するからである。このシグナルは、重合化が正確に行われたかどうか、そして増幅工程が行われた場合は重合化が特異的に行われたかどうかを使用者が評価することを可能にする。
【００２６】
従って、本発明は特に、特異的分子増幅が行われたかどうかを使用者が数分以内にチェックすることを可能にする装置に関する。この装置は生成された増幅物の量の定量又は半定量をさらに可能とすることができる。
【００２７】
以下、本発明による特定のオリゴクロマトグラフィー装置の一般的な側面及び好ましい構成及び構造に関するさらに詳細な説明が与えられる。
【００２８】
本発明による装置は付与領域（２）、検出領域（３）及び吸収領域（４）及び所望により一以上のコントロール線を有するコントロール領域（内部コントロール）を含む。
【００２９】
好ましい実施態様では、付与領域（２）の膜はポリエステル製のコンジュゲートパッドを有するガラス繊維から作られており、検出領域の膜はニトロセルロースから作られており、例えばＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｍｉｃｒｏｄｅｖｉｃｅｓ  Ｐｖｔ，Ｌｔｄ．からのものである。別の供給者（例えばＳｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ，Ｐａｌｌ又はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ）からの膜も用いられることができる。吸収領域の膜はセルロールから作られることが好ましい。特定の実施態様では、付与領域及びコンジュゲートパッドは同一材料から作られることができる。しかし、コンジュゲートは付与領域上に直接吸着されることもできる。
【００３０】
別の好ましい実施態様では、付与領域（２）は堅固なポリマーから作られており、そこにガラス繊維製の被覆吸収パッドが接着されており、サンプル液体を吸収して検出領域へと案内する。ガラス繊維は乾燥形態でコンジュゲートを含むポリエステル製のコンジュゲートパッドをさらに被覆してもよい。また、このパッドはコンジュゲートがサンプル液体によって容易に水和されて水和されたコンジュゲートの完全な除去を可能とし、コンジュゲート試薬とこれらの特異的な分析対象物との特異的な反応を可能にするような特徴を有すべきである。
【００３１】
コンジュゲートパッドはサンプルパッドによって完全に又は部分的に被覆されることができる。サンプルパッドとコンジュゲートパッドの両方は同一物質又は材料から作られることができる。この場合、コンジュゲートはサンプル液体を吸収するために用いられるポリマー上に直接噴霧されることができる。
【００３２】
コンジュゲートパッドはいくつかの化合物でコートされた粒子で含浸され、これらの化合物はタンパク質、ペプチド、ハプテン、多糖類、リポ多糖類、核酸、ＰＮＡ又はＬＮＡ又はＤＮＡ及び／又はＲＮＡと特異的にハイブリダイズすることができる他のポリマー分子を含むことができる。これらの化合物は分析されるべきサンプル中に存在することがありうる分析対象物とどこかで特異的に反応するであろう。粒子の例はコロイド金粒子、コロイド硫黄粒子、コロイドセレン粒子、コロイド硫酸バリウム粒子、コロイド硫酸鉄粒子、金属ヨウ化物粒子、ハロゲン化銀粒子、シリカ粒子、コロイド金属（水和）酸化物粒子、コロイド金属硫化物粒子、コロイド鉛セレン化物粒子、コロイドカドミウムセレン化物粒子、コロイド金属リン酸塩粒子、コロイド金属フェライト粒子、有機又は無機層、タンパク質又はペプチド分子でコートされた上述のコロイド粒子のいずれか、リポソーム、着色された微粒子又は有機ポリマーラテックス粒子を含む。
【００３３】
好ましい実施態様では、粒子は直径約５〜約４０ｎｍのコロイド金粒子である。好ましくは、直径約２０ｎｍ又は約４０ｎｍの粒子が用いられる。カルボキシル基、アミン基、ヒドロキシル基及びメルカプト基の如きいくつかの化学官能基で活性化されたポリスチレンラテックスビーズが用いられることができる。一つの好ましい実施態様では、カルボキシル化アミノ又はメルカプト（限定なしに）ラテックス粒子が用いられる。
【００３４】
代わりに、着色された微粒子が用いられることができる。マルチプレックスＰＣＲ又はいかなる他の異なるヌクレオチド配列の多色検出を行うために、オリゴヌクレオチドプローブは異なって着色された微粒子に結合されることができる。各オリゴヌクレオチドプローブは一つの特定の標的核酸に対して特異的であり、このプローブは次に一つの特定の色（例えば分析対象物Ａに対しては赤、分析対象物Ｂに対しては青）と関連させられるであろう。
【００３５】
微粒子上に存在する官能基の変性されたオリゴヌクレオチドへの特異的な結合のためにいくつかの架橋試薬が利用可能である。一つの方法はアミノ変性されたオリゴヌクレオチドのＣＯＯＨ変性された微粒子への共有結合であり、これらの微粒子はいくつかの製造業者から購入されることができ、様々な色及び直径で存在する。アミノ変性されたオリゴヌクレオチドは例えばカルボジイミドの如き特定の結合剤を（ヒドロキシスクシンイミドエステルあり又はなしで）使用することにより、これらのＣＯＯＨ変性された微粒子に結合されることができる。例えばカルボキシル基、アミノ基又はメルカプト基（天然に存在する又は化学的に合成されたもの）を有する分子のホモ又はヘテロ二官能性架橋試薬を使用した結合は当該技術分野では良く記述されている。
【００３６】
本発明のオリゴクロマトグラフィー装置で用いられるべき粒子は、検出されるべき分析対象物と特異的に結合する化合物でコートされるか又は検出領域上にコートされた試薬と反応する化合物と特異的に結合する化合物でコートされる。好ましい実施態様では、検出されるべき分析対象物は核酸増幅された配列からなる。
【００３７】
増幅された生成物の検出を可能にするプライマーとしてのラベルされたオリゴヌクレオチド（例えばハプテン、ビオチン又はジゴキシゲニンでラベルされたオリゴヌクレオチド）の使用は当該技術分野でも周知である。また、ペプチドでラベルされたオリゴヌクレオチドも記述されている。本発明では、ペプチド又はハプテンでラベルされたオリゴヌクレオチドは核酸増幅反応又は分子増幅工程でプライマーとして用いられ、前記ハプテン又はペプチドに対して指向された試薬は次にテストサンプル中の分析対象物の存在の指標としての増幅物形成を検出するために用いられる。
【００３８】
抗原ペプチド又はハプテンに対して特異的な免疫試薬をどのようにして作成するかは当該技術分野で公知である。ジゴキシゲニン及びビオチンの如きハプテンに対して指向されたモノクローナル抗体は当該技術分野で容易に利用可能である。
【００３９】
コーティングは試薬を適切な緩衝液に希釈してそれを接触システム（例えばＩｍａｇｅｎ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙからのＩｓｏＦｌｏｗ）を用いて膜（好ましくはニトロセルロース）上へ分配させることによって行われることが好ましい。分配速度は約５０ｍｍ／秒から約１０ｍｍ／秒まで変化することができるが、好ましくは約４０ｍｍ／秒に固定されており、より好ましくは約３０ｍｍ／秒に固定されている。分配される材料の容量は約０．５μｌ／ｃｍから約３μｌ／ｃｍまで変化するが、好ましくは約０．７μｌ／ｃｍ〜約２μｌ／ｃｍであり、より正確には約１μｌ／ｃｍ〜約２μｌ／ｃｍである。
【００４０】
試薬濃度は約０．１ｍｇ／ｍｌから約５ｍｇ／ｍｌまで変化し、好ましくは約１ｍｇ／ｍｌである。本発明の好ましい実施態様では、このコーティングのために用いられる緩衝液はリン酸で約ｐＨ７．２に緩衝された食塩水溶液（ＮａＣｌ）からなる。
【００４１】
本発明の一つの実施態様では、装置は、毛細管作用によりニトロセルロースの端部にまで移送された溶液を吸引する吸収領域を含む。物質の例はセルロース及びガラス繊維である。セルロース（ＭＤＩ）又はホウ硅酸塩ガラス繊維（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｎｅｌｌ）が好ましく使用されている。
【００４２】
本発明による特定の実施態様では、金コンジュゲートはポリエステル又はナイロンであることができる固型の不活性膜に含浸される。前記膜はポリエステルであることが好ましい。ここで用いられるポリエステル膜は２７×２６０ｍｍのサイズを有し、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍｉｃｒｏｄｅｖｉｃｅｓ  Ｐｖｔ，Ｌｔｄ（Ｉｎｄｉａ）からのものである。膜は、テストが実行されるときに液体サンプルとの最適の再水和を与えるための特異的緩衝液中への希釈工程の後、金コンジュゲートで含浸される。Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  ＳｃｈｕｅｌｌからのＡｃｃｕＦｌｏｗ  Ｇ膜はこの目的のために有用であり、コンジュゲートがサンプルマトリックス上に直接噴霧されるという利点を与える。
【００４３】
Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍｉｃｒｏｄｅｖｉｃｅｓ  Ｐｖｔからのポリエステル膜を用いる場合、膜は約１．６ｍｌの最終容量（この容量は用いられる含浸システムに応じて１．３ｍｌまで減少されることができる）を有する適切なバイアル中への浸漬によって含浸される。膜は室温で一晩乾燥される。膜は次に約５５℃のオーブンで約２０分間乾燥される。乾燥後、これらの膜は乾燥剤を有する特別な箱中に最大１０％の相対湿度下で貯蔵される。膜は５ｍｍ幅の片に切断され、ラミネートの接着部分上に積み重ねられる。次に、ガラス繊維製の吸収紙又は他の吸収物質が、ポリエステル膜をしっかりと被覆して液体がコンジュゲートを再水和してコンジュゲートがサンプル中に存在する抗原と反応することを可能にするようにストリップの接着部分上に積重ねられる。
【００４４】
ＡｃｃｕＦｌｏｗ  Ｇ膜が用いられる場合、コンジュゲートはＩｍａｇｅｎ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙからのＩｓｏＦｌｏｗ  Ａｔｏｍｉｚｉｎｇ  Ｎｏｚｚｌｅシステムを用いて噴霧される。この場合、コンジュゲートは１〜２０ｐｓｉの範囲の圧力で０．８μｌ／ｍｍ〜１．６７μｌ／ｍｍの範囲の噴霧量について５０ｍｍ／秒の速度で噴霧される。
【００４５】
本発明によるさらに特定の実施態様では、オリゴヌクレオチドはコロイド金粒子に結合される。金粒子のサイズは約５ｎｍから約６０ｎｍまで変化することができるが、好ましくは約２０ｎｍ〜約４０ｎｍである。この明細書では約２０ｎｍの粒子が用いられた。オリゴヌクレオチドコンジュゲートは次にポリエステルコンジュゲートパッド上に又は上述のような同一材料上に直接処理されて乾燥される。
【実施例】
【００４６】
実施例１：トキソプラスマ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ）の検出
コロイド金粒子の調製
約２０ｎｍのコロイド金粒子はクエン酸ナトリウムを用いたテトラクロロ金酸の還元によって調製された。約６０ｍｇのＨＡｕＣｌ４・３Ｈ２Ｏを含む２００ｍｌの超純水は沸騰するまで加熱され、約５ｍｌの４％二水和クエン酸ナトリウム溶液が添加された。沸騰は暗赤色の溶液が得られるまで数分間続けられた。溶液は使用前に室温で平衡化された。溶液中の粒子濃度を評価するためにＯＤ５２０ｎｍが測定された。
【００４７】
コロイド金粒子へのオリゴヌクレオチドの結合
コロイド金粒子にオリゴヌクレオチドを結合させることは当該技術分野では周知である。チオールでラベルされたオリゴヌクレオチドはコロイド金粒子と反応させられる。今回の場合、５’アミノ変性されたオリゴヌクレオチドはＮ−スクシンイミジルＳ−アセチルプロピオネート（ＳＡＴＰ）によって変性され、保護されたメルカプト（チオール）基を有するオリゴヌクレオチドが得られた。この保護されたメルカプト基はさらに脱保護された。これらの反応は本質的にＳＡＴＰの製造業者（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）によって記述されるようにして行われた。二つのオリゴヌクレオチドがトキソプラスマ症オリゴクロマトグラフィー装置でプローブとして用いられた：一つはトキソプラスマ標的遺伝子に対して特異的であり（５’  ＣＣＣＴＣＴＧＣＴＧＧＣＧＡＡＡＡＧＴＧ  ３’）もう一つは内部コントロールに対して特異的である（５’  ＡＧＧＧＴＣＴＡＣＴＡＣＴＧＧＧＴＴＡＣＣＴＧ  ３’）。
【００４８】
簡潔に述べると、５０ｍＭリン酸ナトリウム、１ｍＭ  ＥＤＴＡ緩衝液、ｐＨ７．５中の５−アミノ変性オリゴヌクレオチドは１０倍モル過剰のＳＡＴＰと混合され、反応は室温で３０分間進行させられる。過剰のＳＡＴＰは排除クロマトグラフィーカラム（ＮＡＰ−５，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上で製造業者の指示に従って脱塩を行うことによって除去される。ＳＡＴＰでラベルされたオリゴヌクレオチドは５０ｍＭリン酸ナトリウム、１ｍＭ  ＥＤＴＡ緩衝液、ｐＨ７．５中に溶出される。ＳＡＴＰでラベルされたオリゴヌクレオチドは必要なときまで−２０℃で保存されることができる。脱保護はヒドロキシルアミン（０．５Ｍの最終濃度）を室温で２時間添加することによって続いて行われた。過剰のヒドロキシルアミンは脱塩によって除去された。生じたチオールでラベルされたオリゴヌクレオチドはコロイド金粒子（４．２  ＯＤ５２０／ｍｌの最終濃度）と２４時間混合された。リン酸ナトリウム（ｐＨ７．０，１０ｍＭの最終濃度）及びＮａＣｌ（０．１Ｍの最終濃度）が次に添加された。混合物はもう２４時間インキュベートされた。次にＮａＣｌが０．２Ｍの最終濃度で添加され、混合物は１６時間インキュベートされた。過剰のオリゴヌクレオチドは遠心分離によって除去され、１０ｍＭのリン酸ナトリウム、０．３ＭのＮａＣｌ緩衝液、ｐＨ７．０を用いたペレット化された金粒子の２回の連続的な洗浄が行われた。オリゴヌクレオチド−金コンジュゲートは同一緩衝液中に最終的に保存される。
【００４９】
オリゴクロマトグラフィー装置
本実施例で用いられたオリゴクロマトグラフィー装置（１）はプラスチック要素の如き固体支持体（１７）からなり、その上に付与領域（２）（好ましくはＭＤＩからのポリエステルコンジュゲートパッドから作られている）、検出領域（３）（好ましくはニトロセルロースから作られている）、及び吸着領域（４）（好ましくはセルロースから作られている）が配置されている。これらの材料は支持プラスチック（１７）の両面（１１，１２）に存在することが有利である。テスト面（１１）と称される一方の面は（トキソプラスマ）標的ポリヌクレオチドを検出する役割を有する。コントロール面（１２）と称される他方の面は内部コントロールの増幅を検出する役割を有し、移動コントロール（１６）要素も有する。
テスト面（１１）では、ニトロセルロース膜は中性（ｎｅｕｔｒａｌｉｔｅ）アビジンで感作されることが好ましい。（トキソプラスマ）特異的オリゴヌクレオチドプローブコンジュゲートはこのテスト面（１１）の付与領域（２）のポリエステル膜（ＭＤＩ）に含浸されている。
コントロール面（１２）では、ニトロセルロース膜は２本の線（１９，１８）を有する。下部の内部コントロール増幅テスト線（１８）は中性アビジンで感作されることが好ましい。好ましくは上部の移動テスト線（１９）は移動コントロールオリゴヌクレオチドで感作されており、その配列（５’  ＣＡＧＧＴＡＡＣＣＣＡＧＴＡＧ  ３’）は内部コントロールプローブの配列に対して逆平行である。このコーティングのため、５’−ビオチニル化移動コントロールオリゴヌクレオチドはキャリアタンパク質として用いられる中性アビジンと混合される。内部コントロールに対して特異的なオリゴヌクレオチドプローブコンジュゲート（１４，１５）はこのコントロール面（１２）の付与領域（２）のポリエステル膜（ＭＤＩ）に含浸される（図２ｂ）。
【００５０】
内部コントロールの増幅
内部コントロールは陰性のトキソプラスマテスト結果が真の陰性であることを示すように、即ち陰性の結果がテストされたサンプル中にひょっとして存在するかもしれない増幅阻害物質によるものではないように設計される。この内部コントロールは増幅前に反応混合物に添加されるテンプレートであり、阻害物質がサンプル中に存在しない限り、少なくともトキソプラスマ標的遺伝子の不在下で増幅されるべきである。内部コントロールテンプレートは以下の基準で設計されるオリゴヌクレオチドである：
−  標的増幅物と（ほぼ）同一の長さ
−  標的増幅物と（ほぼ）同一のＧ／Ｃ含有量
−  標的増幅物と同一のオリゴヌクレオチドプライマーで増幅される
−  この内部コントロールテンプレートの内部部分でトキソプラスマ標的遺伝子プローブの配列が内部プローブの配列によって置換される。
このようにして、トキソプラスマ特異的なプローブは内部コントロール増幅物にハイブリダイズせず、内部コントロールプローブはトキソプラスマ標的遺伝子増幅物にハイブリダイズしない。これらの規準に従って、Ｔｏｘｏ内部コントロールテンプレートの配列は以下のようである：５’  ＧＧＴＴＧＣＡＧＴＣＡＣＴＧＡＣＧＡＧＣＴＣＡＧＧＧＴＣＴＡＣＴＧＧＧＴＴＡＣＣＴＧＡＡＡＧＴＣＡＴＧＡＧＴＡＴＣＴＧＴＧＣＡＡＣＴＴＴＧＧＴＧＴＡＴＴＣＧＣＡＧＡＴＴＧＧＴＣＧ  ３’（下線を引いた部分が内部コントロールプローブの配列である）。
増幅混合物に添加されるべきＴｏｘｏ内部コントロールテンプレートの量はサンプルの不在下で全ての場合（２４／２４）でこの内部コントロールの増幅を可能にするように決定された。発明者は穏やかな阻害剤として用いられる０．０１％のＳＤＳの存在下で内部コントロールはＰＣＲ後もはや検出されなかったことも示した。
【００５１】
ＤＮＡ抽出
トキソプラスマを含むサンプルからのＤＮＡの抽出は「ＥＸＴＲＡｃｅｌｌ  ＤＮＡ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ」キット（Ｂｉｏｌｉｎｅ，Ｔｏｒｉｎｏ，Ｉｔａｌｙ）を製造業者の指示に従って用いて実現した。ＤＮＡは商業的に利用可能な又は科学文献に記載されたいかなる他の方法によって抽出されることもできる。抽出されたＤＮＡは抽出後直ちに使用されるか又は使用するまで−２０℃で保存される。
【００５２】
標的ＤＮＡの増幅
トキソプラスマのＢ１遺伝子増幅はビオチンでラベルされたリバースプライマーを用いてＰＣＲによって行われた。
増幅混合物（反応あたり４５μｌ）は以下の材料を含む（最終濃度は５μｌのサンプルを含む混合物について示されている）：
−  それぞれ０．１ｍＭの最終濃度での四つのｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ）
−  ＭｇＣｌ２を含むＰＣＲ緩衝液（１×の最終濃度（Ｓｉｇｍａ））
−  Ｔａｑポリメラーゼ（２  Ｕｎｉｔ，Ｓｉｇｍａ）
−  内部コントロールオリゴヌクレオチドテンプレート（１，６７  １０−２２モル）。
【００５３】
フォワードプライマー（５’  ＧＧＴＴＧＣＡＧＴＣＡＣＴＧＡＣＧＡＧＣ  ３’）は０．１μＭの最終濃度で用いられ、ビオチンでラベルされたリバースプライマー（５’  ＣＧＡＣＣＡＡＴＣＴＧＣＧＡＡＴＡＣＡＣＣ  ３’）は０．４μＭの最終濃度で用いられた。
【００５４】
５μｌまでの抽出されたＤＮＡが増幅を行うために用いられることができる。５μｌ未満の量が用いられる場合、分子生物学的グレードの水が添加されて５０μｌの全反応容量に達する。
【００５５】
増幅は以下の熱サイクルで行われる：
−  ９４℃で５分間
−  ４５サイクル（９４℃で２０秒間、５５℃で２０秒間、７２℃で３０秒間）
−  ７２℃で１分間
−  ９４℃で３０秒間。
増幅された生成物はさらなる使用まで４℃で保存される。
【００５６】
トキソプラスマの検出
４０〜５０μｌの増幅された生成物がこの容量の３倍のオリゴクロマトグラフィー緩衝液（５５℃で予め平衡化されたもの）を含有するチューブにピペットされる。オリゴクロマトグラフィースティックがチューブに直ちに入れられ、アッセイチューブは閉じられる。クロマトグラフィーは１０分まで進行する（チューブは加熱ブロック又は他の装置中で５５℃に維持される）。増幅された生成物はスティックに移動し、乾燥した金コンジュゲート化オリゴヌクレオチドプローブは再水和される。スティックのテスト面ではプローブはトキソプラスマ標的遺伝子増幅生成物と特異的にハイブリダイズする。複合体は次にニトロセルロースに移動し、複合体は増幅された生成物中に存在するビオチンによるラベルを通して固定された中性アビジンによって捕獲される（増幅のリバースオリゴヌクレオチドはビオチンでラベルされている）。複合体の捕獲は陽性シグナル、即ちコロイド金粒子が蓄積してピンクから紫色を呈する線を生じる。スティックのコントロール面では内部プローブコンジュゲートは内部コントロール増幅生成物と特異的にハイブリダイズする。複合体は次にニトロセルロースに移動し、複合体は固定された中性アビジンによって捕獲される（内部コントロールは同一のビオチンでラベルされたリバースオリゴヌクレオチドで増幅される）。複合体の捕獲は陽性シグナルを生じる。残りの非反応性内部コントロールプローブコンジュゲートはさらに移動して移動コントロール線に到達し、そこでそれは固定された移動コントロールオリゴヌクレオチドとハイブリダイズして陽性シグナルを生じる。
【００５７】
実施例２：大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）  Ｏ１５７：Ｈ７の毒素ＳＴＸ１及びＳＴＸ２の検出
ＤＮＡ抽出
ｓｔｘ１及びｓｔｘ２遺伝子を有するか又は有さない大腸菌の培養物のサンプルからのＤＮＡの抽出は「ＥＸＴＲＡｃｅｌｌ  ＤＮＡ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ」キット（Ｂｉｏｌｉｎｅ，Ｔｏｒｉｎｏ，Ｉｔａｌｙ）を製造業者の指示に従って用いて実現した。ＤＮＡは商業的に利用可能な又は科学文献に記載されたいかなる他の方法によって抽出されることもできる。抽出されたＤＮＡは抽出後直ちに使用されるか又は使用するまで−２０℃で保存される。テストされた大腸菌株はそれぞれ陽性及び陰性コントロールとしてＡＴＣＣ株Ｎｏ．３５１５０，４３８９０及び２５９２２（ここに参考文献として組入れる）を含んでいた。
【００５８】
ｓｔｘ１−ｓｔｘ２オリゴクロマトグラフィースティック
増幅されたｓｔｘ１及びｓｔｘ２遺伝子の特異的な検出のためのオリゴクロマトグラフィー（ディップ）スティックは、ｓｔｘ１及びｓｔｘ２増幅生成物に対して特異的な二つのコロイド金ラベルされたオリゴヌクレオチドプローブが混合されてコンジュゲートパッドで乾燥されたことを除いては、増幅されたトキソプラスマＢ１遺伝子の特異的な検出のためのオリゴクロマトグラフィースティックのテスト面と同様に構成された。オリゴヌクレオチドプローブの配列は以下の通りである：
Ｎ−ＳＴＸ１−Ｆ２：５’−ＣＴＴＣＴＴＡＴＣＴＧＧＡＴＴＴＡＡＴＧ−３’（配列番号１）（増幅されたｓｔｘ１遺伝子の検出用）
Ｎ−ＳＴＸ２−Ｆ３：５’−ＴＣＴＧＴＧＴＡＴＡＣＧＡＴＧＡＣＧＣＣ−３’（配列番号２）（増幅されたｓｔｘ２遺伝子の検出用）
【００５９】
両方のオリゴヌクレオチドはアミンを５’位に含む。コロイド金粒子に結合するためにこのアミンをチオール基に変性することは上述のようにして実現された。
【００６０】
ｓｔｘ１及びｓｔｘ２遺伝子の増幅
シガトキシン様の毒素Ｉ及びＩＩをそれぞれコードするｓｔｘ１及びｓｔｘ２大腸菌遺伝子の両方を検出するため、これらの遺伝子の内部配列はＰａｔｏｎ及びＰａｔｏｎ（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，Ｆｅｂ．１９９８，ｖｏｌ．３６（２）：５９８−６０２）によって記載されているオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅された。ｓｔｘ１の増幅のためのフォワード及びリバースパライマーはそれぞれｓｔｘ１−Ｆ（５’−ＡＴＡＡＡＴＣＧＣＣＡＴＴＣＧＴＴＧＡＣＴＡＣ−３’，配列番号３）及びｓｔｘ１−Ｒ−ｂｉｏｔ（５’−ＡＧＡＡＣＧＣＣＣＡＣＴＧＡＧＡＴＣＡＴＣ−３’，配列番号４）である。
【００６１】
プライマーｓｔｘ１−Ｒ−ｂｉｏｔは５’位でビオチン化される。ｓｔｘ２の増幅のためのフォワード及びリバースパライマーはそれぞれｓｔｘ２−Ｆ（５’−ＧＧＣＡＣＴＧＴＣＴＧＡＡＡＣＴＧＣＴＣＣ−３’，配列番号５）及びｓｔｘ２−Ｒ−ＤＩＧ（５’−ＴＣＧＣＣＡＧＴＴＡＴＣＴＧＡＣＡＴＴＣＴＧ−３’，配列番号６）である。プライマーｓｔｘ２−Ｒ−ＤＩＧは５’位にジゴキシゲニン基を含む。
【００６２】
増幅混合物（反応あたり５０μｌ）は以下の材料を含む：
−  それぞれ０．３ｍＭの最終濃度での四つのｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ）
−  ＰＣＲ緩衝液（１×の最終濃度（Ｓｉｇｍａ））
−  Ｔａｑポリメラーゼ（１  Ｕｎｉｔ，Ｓｉｇｍａ）。
【００６３】
それぞれのフォワードプライマーは０．１μＭの最終濃度で用いられ、それぞれのリバースプライマーは０．５μＭの最終濃度で用いられた。
【００６４】
５μｌまでの抽出されたＤＮＡが増幅を行うために用いられることができる。
【００６５】
増幅は以下の熱サイクルで行われる：
−  ９４℃で５分間
−  ３５サイクル（９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で４５秒間）
−  ７２℃で２分間
−  ９４℃で３０秒間。
増幅された生成物はさらなる使用まで４℃で保存される。
【００６６】
ｓｔｘ１及びｓｔｘ２遺伝子のためのオリゴクロマトグラフィーテスト
ｓｔｘ１及び／又はｓｔｘ２の増幅された遺伝子の検出のためのオリゴクロマトグラフィーテストは特異的なｓｔｘ１−ｓｔｘ２スティックが用いられたことを除いては増幅されたトキソプラスマＢ１遺伝子の検出と同様にして行われる。このスティックでは二つの「受容体」がニトロセルロース上にコートされる：一つの抗体はジゴキシゲニンに特異的に結合し、ｓｔｘ２コロイド金ラベルされたプローブを有する複合体中にｓｔｘ２の増幅された遺伝子を含むすべてのジゴキシゲニンでラベルされた分子を捕獲するであろう。第二の受容体は中性アビジンであり、ビオチンに特異的に結合し、ｓｔｘ１コロイド金ラベルされたプローブを有する複合体中にｓｔｘ１の増幅された遺伝子を含むすべてのビオチンラベルされた分子を捕獲するであろう。
【００６７】
５０μｌの増幅された生成物が５５℃に加熱された同容量（５０μｌ）のオリゴクロマトグラフィー緩衝液を含有するチューブにピペットされる。ｓｔｘ１−ｓｔｘ２免疫クロマトグラフィースティックがチューブに直ちに入れられ、クロマトグラフィーは１０分まで進行する（チューブは加熱ブロック又は他の装置中で５５℃に維持される）。増幅された生成物はスティックに移動し、二つの乾燥した金コンジュゲート化オリゴヌクレオチドプローブは再水和され、プローブは増幅された生成物と特異的にハイブリダイズする。複合体は次にニトロセルロースに移動し、複合体はハプテンラベルを通して固定された抗ハプテン抗体によって特異的に捕獲される。ｓｔｘ１複合体の捕獲は陽性シグナル、即ちコロイド金粒子が蓄積してピンクから紫色を呈するバンドを中性アビジンでコートされた線上に生じる。ｓｔｘ２複合体の捕獲は陽性シグナル、即ちコロイド金粒子が蓄積してピンクから紫色を呈するバンドを抗ジゴキシンでコートされた線上に生じる。
【００６８】
オリゴクロマトグラフィー方法によって得られた全ての結果はアガロースゲル上でのＰＣＲ増幅物の分析によって得られた結果と、及び参考文献及び他のテストされた株の公知の現状と一致した。
【００６９】
第二の実施例はＳＡＲＳ−ＣｏＶ  ＲＮＡの検出を示す。
実施例３：ＳＡＲＳ−ＣｏＶウイルスの検出
コロイド金粒子の調製
約２０ｎｍのコロイド金粒子は上述のようにして調製された。
【００７０】
コロイド金粒子へのオリゴヌクレオチドの結合
ＳＡＲＳ−ＣｏＶオリゴクロマトグラフィー装置でプローブとして用いられたオリゴヌクレオチドは上述のようにしてコロイド金粒子に結合された。これらのオリゴヌクレオチドは以下のものであった：一つはＳＡＲＳ−ＣｏＶ標的遺伝子に対して特異的なものであり（５’  ＣＣＣＴＣＴＧＣＴＧＧＣＧＡＡＡＡＧＴＧ  ３’）、もう一つは内部コントロールに対して特異的なものであり、トキソプラスマの内部コントロールに対するものと同一であった（５’  ＡＧＧＧＴＣＴＡＣＴＡＣＴＧＧＧＴＴＡＣＣＴＧ  ３’）。
【００７１】
オリゴクロマトグラフィー装置
本実施例で用いられたオリゴクロマトグラフィー装置はトキソプラスマ増幅物の検出のために用いられた装置と極めて良く似ている。コントロール面はトキソプラスマオリゴクロマトグラフィースティックのコントロール面と同一である。テスト面にはニトロセルロース膜が中性アビジンで感作されている。ＳＡＲＳ−ＣｏＶ特異的なオリゴヌクレオチドプローブコンジュゲートはこのテスト面の付与領域のポリエステル膜（ＭＤＩ）に含浸される。
【００７２】
ＳＡＲＳ−ＣｏＶ  ＲＴ−ＰＣＲ内部コントロール
内部コントロールは陰性のＳＡＲＳ−ＣｏＶテスト結果が真の陰性であることを示すように、即ち陰性の結果がテストされたサンプル中にひょっとして存在するかもしれない増幅阻害物質によるものではないように設計される。この内部コントロールはＲＴ−ＰＣＲ前に反応混合物に添加されるＲＮＡテンプレートであり、阻害物質がサンプル中に存在しない限り、少なくともＳＡＲＳ−ＣｏＶ標的遺伝子の不在下で逆転写されて増幅されるべきである。内部コントロールテンプレートはＲＮＡテンプレートである。このＲＮＡは内部コントロール増幅物が以下の基準に合うように設計された：
−  標的増幅物と同一の長さ
−  標的増幅物と同一のＧ／Ｃ含有量
−  標的増幅物と同一のオリゴヌクレオチドプライマーで逆転写されかつ増幅される
−  この内部コントロールテンプレートの内部部分でＳＡＲＳ−ＣｏＶ標的遺伝子プローブの配列が内部プローブの配列によって置換される。
このようにして、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ特異的なプローブは内部コントロール増幅物にハイブリダイズせず、内部コントロールプローブはＳＡＲＳ−ＣｏＶ標的遺伝子増幅物にハイブリダイズしない。内部コントロールテンプレートＲＮＡはＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを製造業者（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）によって記述されるようにして用いるインビトロ転写によって作成された。
このインビトロ転写のために用いられたテンプレートはＴ７  ＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーター配列及びそれに続く作成されるべき内部コントロールＲＮＡテンプレートの配列を含む二本鎖ＤＮＡである。この二本鎖ＤＮＡの配列は以下の通りであった（ＲＮＡ転写物に相当する配列は下線を引かれている）：５’  ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＧＣＡＣＣＣＧＣＧＡＡＧＡＡＧＣＴＡＴＴＣＴＴＴＡＧＧＧＴＣＴＡＣＴＧＧＧＴＴＡＣＣＴＧＣＣＧＧＡＴＧＴＡＧＡＧＧＧＣＴＧＴＣＡＴＧＣＡＡ  ３’
ＲＴ−ＰＣＲ混合物に添加されるべきＳＡＲＳ−ＣｏＶ内部コントロールテンプレートＲＮＡの量はサンプルの不在下で全ての場合においてこの内部コントロールの逆転写及び増幅を可能にするものでなければならない。
【００７３】
ＤＮＡ抽出
ＳＡＲＳ−ＣｏＶを含むと疑われるサンプルからのＲＮＡの抽出は商業的に利用可能な又は科学文献に記載されたいかなる方法によって実現されることもできる。抽出されたＲＮＡは抽出後直ちに使用されるか又は使用するまで−８０℃で保存される。
【００７４】
標的ＲＮＡの増幅
ＳＡＲＳ−ＣｏＶ標的遺伝子増幅はビオチンでラベルされたリバースプライマー（配列：５’  ＴＴＧＣＡＴＧＡＣＡＧＣＣＣＴＣＴＡＣＡＴＣ  ３’）及びラベルされていないフォワードプライマー（配列５’  ＣＡＣＣＣＧＣＧＡＡＧＡＡＧＣＴＡＴＴＣ  ３’）を用いるＲＴ−ＰＣＲによって行われた。リバースプライマーは標的特異的な逆転写のためのプライマーとして及び増幅のためのプライマーとして作用し、一方フォーワードプライマーは増幅反応のためのみに作用する。ＲＴ−ＰＣＲはＱｉａｇｅｎからの“Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲキット”を製造業者の指示に本質的に従って用いて行われた。
簡単に述べると、５０μｌのＲＴ−ＰＣＲ反応液は以下の成分を含む：
−  Ｑｉａｇｅｎ  Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ緩衝液、５×の最終濃度：１０μｌ
−  ＱｉａｇｅｎキットからのｄＮＴＰｍｉｘ  １０ｍＭ：２μｌ
−  オリゴフォワード：０．１５μＭの最終濃度
−  オリゴリバース：０．６μＭの最終濃度
−  Ｑｉａｇｅｎキットからの酵素混合物：２μｌ
−  内部コントロールＲＮＡテンプレート：ＲＮＡの各バッチについて決定されるべきインビトロで転写されたＲＮＡからの希釈物
−  サンプル（抽出されたＲＮＡ）：１μｌ〜５μｌ
−  分子生物学的グレードの水（ＲＮＡｓｅ及びＤＮａｓｅ非含有）：５０μｌの最終容量にする。
反応混合物はＲＴ−ＰＣＲの開始まで氷上で維持される。熱サイクラーはＲＴ−ＰＣＲチューブを配置する前に５０℃に予備加熱される。
【００７５】
ＲＴ−ＰＣＲは以下の熱サイクルで行われる：
−  ５０℃で３０分間
−  ９４℃で１５分間
−  ４５サイクル（９４℃で２０秒間、５５℃で２０秒間、７２℃で３０秒間）
−  ７２℃で１分間
−  ９４℃で３０秒間。
増幅された生成物はさらなる使用まで４℃で保存される。
【００７６】
ＳＡＲＳ−ＣｏＶ検出
検出はトキソプラスマ増幅生成物の検出と同様に行われた。
両面ニトロセルロースラミネートは免疫クロマトグラフィー目的のために、いわゆるマルチプレックス検出モードで多数の異なる分析対象物を検出するためにも有用である。
【配列表フリーテキスト】
【００７７】
配列番号１はトキソプラスマＮ−ＳＴＸ１−Ｆ２オリゴヌクレオチドプローブである。
配列番号２はトキソプラスマＮ−ＳＴＸ２−Ｆ３オリゴヌクレオチドプローブである。
配列番号３はトキソプラスマｓｔｘ１−Ｆフォワードプライマーである。
配列番号４はトキソプラスマｓｔｘ１−Ｒ−ｂｉｏｔリバースプライマーであり、５’位でビオチン化されている。
配列番号５はトキソプラスマｓｔｘ２−Ｆフォワードプライマーである。
配列番号６はトキソプラスマｓｔｘ２−Ｒ−ＤＩＧリバースプライマーであり、５’位でジゴキシゲニン化されている。
配列番号７はトキソプラスマ標的遺伝子のためのオリゴヌクレオチドプローブである。
配列番号８は内部コントロールのためのオリゴヌクレオチドである。
配列番号９は移動コントロールオリゴヌクレオチドである。
配列番号１０はＴｏｘｏの内部コントロールテンプレートである。
配列番号１１はトキソプラスマＢ１遺伝子のフォワードプライマーである。
配列番号１２はトキソプラスマＢ１遺伝子のリバースプライマーであり、ビオチンラベルされている。
配列番号１３は内部コントロールテンプレートである。
配列番号１４はＳＡＲＳ−ＣｏＶ標的遺伝子のリバースプライマーであり、ビオチンラベルされている。
配列番号１５はＳＡＲＳ−ＣｏＶ標的遺伝子のフォワードプライマーである。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】本発明の検出装置を用いて得られる陽性テストを表す。
【図２】図２ａ及び図２ｂは本発明の方法のさまざまな検出ステップを表す。
【図１】
0004659734.tif 000002
【図２】
0004659734.tif 000003