(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、
水溶性カルボジイミド、および
アミンまたはカルボキシル残基を含んでいる標識
を含んでいる単一容器であって、これらの成分はｐＨ約７での再水和に適した乾燥形で単一容器中に存在している単一容器。
【請求項２】
標的残基へ標識を抱合させる方法であって、
ａ．標識、ＮＨＳおよびカルボジイミドが下記工程（ｃ）において互いに反応するまで、互いに反応しないように容器中に当該三つの成分を配置し；
ｂ．該成分を乾燥形で保存し；および
ｃ．成分を水和し、そしてそれらが互いに接触することを可能にすることにより、それらの間で反応を開始させ、そして同時にか又は続いて標的残基を上記の反応させた成分に加え、それにより標的部分が標識へ抱合される
ことを含む、上記方法。
【請求項３】
成分が水和される時点で標的が加えられる請求項２に記載の方法。
【請求項４】
成分の水和の後で標的が加えられる請求項２に記載の方法。
【請求項５】
標的残基へ標識を抱合させる方法であって、
ａ．ＮＨＳエステルヘテロ二官能性試薬の一つの官能基との反応により標識を誘導体化し；
ｂ．誘導体化標識およびカルボジイミドが下記工程（ｃ）において互いに反応するまで、互いに反応しないように、カルボジイミドと共に容器へ誘導体化標識を配置し；
ｃ．標識およびカルボジイミドを水和し、そしてそれらが互いに接触することを可能にすることにより、それらの間で反応を開始させ；
ｄ．標的残基の存在下でカルボジイミドを除去し、それにより標的残基が標識へ抱合される
ことを含む上記方法。
【請求項６】
標的残基へ標識を抱合させる方法であって、
ａ．第一級または第二級アミンを含んでいる標識をマレイミド官能基により誘導体化し；
ｂ．当該マレイミド誘導体化標識を還元体が入った容器中へ乾燥形で配置し；
ｃ．標識および還元体を水和し；および
ｄ．標的残基の存在下で還元体を除去し、それにより標的残基は標識へ抱合される
ことを含む上記方法。
【請求項７】
ＮＨＳエステルヘテロ二官能性試薬の一つの官能基で誘導体化された標識およびカルボジイミドを含んでいる単一容器であって、これらの成分は再水和に適した乾燥形で単一容器中に存在している、上記単一容器。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は遊離アミノ基を含んでいる分子（例えば、タンパク質、核酸およびアミノ糖）、特異的結合部位を持っている分子への検出可能標識の結合に関しており、それにより、標識された分子により特異的に結合された残基へ標識を方向付ける方法を提供する。
【０００２】
背景技術
Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルは反応性アシル化剤を作り出すための最も普通の活性化化学の一つを提供する。ホモ二官能性ＮＨＳエステルは１９７０年代初期に反応性架橋剤として最初に導入されており、市販品として広く入手可能である。［Ｂｒａｇｇ，Ｐ．，＆  Ｈｏｕ，Ｃ．（１９７５），”大腸菌および鼠チフス菌のＣａ2+およびＭｇ2+活性化アデノシン三リン酸のサブユニット組成物、機能および空間配置”Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０６，４９５−５０３，Ｌｏｍａｎｔ，Ａ．＆  Ｆａｉｒｂａｎｋｓ，Ｇ．（１９７６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１０４，２４３−２６１．］。ＮＨＳエステルはヘテロ二官能性架橋剤を経てタンパク質をお互いに（例えば、ＮＨＳ側面を持つすべてのＰｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ”二重試薬”；Ｍｕｒａｍｏａ  Ｋ，Ｋａｍｉｙａ  Ｈ（１９８８）、”タンパク質のための切断可能で光活性化可能な二官能性蛍光試薬の製造および特徴付け”Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５２，５４７−５５４を参照されたい）、または色素と（アクリジニウムのような；Ｚｏｍｅｒ  Ｇ．，Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇ  Ｒ．Ｈ．，Ｊａｎｓｅｎ  Ｅ．Ｈ．Ｊ．Ｍ．（１９８８）”アクリジニウムエステルによるタンパク質の最適標識”Ａｎａｌ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，２０５，２６７−２７）結合させるためにルーチン的に使用されている。
【０００３】
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）化学
ＮＨＳエステルはカルボジイミド存在下、カルボン酸とＮＨＳとの反応により  形成される。安定なエステルを製造するには、反応を非水環境で行わなければならず、さもなければ非生産的な反応で分解されるであろう；水性で製造されたエステルは不安定であり、最良の条件下でも数時間内に分解する。ＮＨＳエステル−またはスルホ−ＮＨＳエステル−含有反応体は求核試薬と反応してＮＨＳまたはスルホ−ＮＨＳ脱離基の放出を伴ってアシル化生成物を形成する。反応はイミダゾリル環窒素、スルフヒドラルまたはヒドロキシル基に対しては非生産的であり、水性分解されたエステルまたはチオエステル結合を形成する。第一級および第二級アミンとの反応では、各々安定なアミドおよびイミド結合が生成される。
【０００４】
タンパク質において、これらの試薬は主としてＮ末端のアルファアミンおよびリジン側鎖のエプシロンアミンと反応する。水性媒質中、本来の場所ですぐに標的分子と反応させてＮＨＳエステルを生成させることが可能である（Ｓｔａｒｏｓ，Ｊ．，Ｗｒｉｇｈｔ，Ｒ．＆  Ｓｗｉｎｇｅｌ，Ｄ．（１９８６），Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１５６，２２０−２２２；Ｓｔａｒｏｓ，Ｊ．（１９８２），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２１，３９５０−３９５５）。ＮＨＳエステルはｐＨ７の水性環境下、数時間程度の半減期を持っている（０℃、ｐＨ７．０で４−５時間；Ｌｏｍａｎｔ，Ａ．＆  Ｆａｉｒｂａｎｋｓ，Ｇ．（１９７６），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１０４，２４３−２６１）。
【０００５】
カルボジイミドはカルボン酸およびアミンまたはリン酸およびアミン間の各々アミドまたはホスホロアミデート結合の形成を媒介するゼロ長架橋剤である。（Ｃｈｕ，Ｂ．，Ｋｒａｍｅｒ，Ｆ．＆  Ｏｒｇｅｌ，Ｌ．（１９８６），”バイオアッセイのための増幅可能レポーターＲＮＡの合成”Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１４，５５９１−５６０３；Ｈｏａｒｅ，Ｄ．＆  Ｋｏｓｈｌａｎｄ，Ｄ．Ｅ．（１９６６）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８８，２０５７）。カルボジイミドはカルボン酸と反応して高度に反応性なＯ−アシルイソ尿素を形成し、それは非常に短寿命であるが求核試薬と反応してアミド結合を形成する。水と反応してカルボン酸基を再生するような、いくつかの競合するおよび非生産的である反応が存在する。この反応はｐＨ４．５から７．５の間で効率よく進行する。オリゴヌクレオチド上の５’リン酸のようなリン酸基を持つ分子もカルボジイミド反応を使用することによりアミン含有基と反応できる。
【０００６】
ＤＣＣＤ（カルボジイミド）およびＮＨＳはマイクロプレート表面を活性化するために使用されており、プレートは続いて洗浄されウェルにタンパク質が加えられる（プレートへのタンパク質の共有結合を容易にするため）（Ｄａｇｅｎａｉｓ  Ｐ．，Ｄｅｓｐｒｅｚ  Ｂ．，Ａｌｔｅｒｔ  Ｊ．，Ｅｓｃｈｅｒ  Ｅ．（１９９４），Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２２２，１４９−１５５）。
【０００７】
ＥＤＡＣカルボジイミド）およびスルホ−ＮＨＳを使用する方法はＨｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９６６、に要約されている。
【０００８】
タンパク質／標識複合体は、それがタンパク質輸送体へ結合された場合にそこで複合体形成し、輸送体位置の可視化を可能にするようにＮＨＳ誘導体として作製されている。これは基本的に活性ＮＨＳを持つ活性化タンパク質／色素複合体である（Ｆａｎ  Ｊ．，Ｐｏｐｅ  Ｌ．Ｅ．，Ｖｉｔｏｌｓ  Ｋ．Ｓ．，Ｈｕｅｎｎｅｋｅｎｓ  Ｆ．Ｍ．（１９９１），”フルオレセイン−メトトレキセートｇ異性体のＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミド  エステルによる葉酸輸送タンパク質のアフィニティー標識”Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３０，４５７３−４５８０）。ＮＨＳ活性化色素はまた市販品としても販売されている（例えば、ＦｌｕｏｒｏＬｉｎｋTMＣｙ５TMまたはＦｌｕｒｏｌｉｎｋTMＣｙ５．５TMのような、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈから販売されている活性化シアニン色素を参照されたい）。
【０００９】
４−ヒドロキシテストステロン−４−ヘミグルタレートのＮＨＳエステルはカルボジイミドおよびＮＨＳによる処理により製造されている。これは西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）またはβ−ガラクトシダーゼと混合されて酵素標識された４ＨＴ−４−ＨＧが製造された。この酵素標識ヒドロキシテストステロンはトレーサー研究に使用された（Ｈｏｓａｄａ  Ｈ．，Ｋａｒｕｂｅ  Ｔ．，Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  Ｎ．，Ｎａｍｂａｒａ  Ｔ．（１９８５），”Ｎ−スクシンイミジルエステル法によるステロイドの酵素標識。酵素イムノアッセイで使用するための西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗原の製造”，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，３３，２４９−２５５）。
【００１０】
発明の要約
本発明は特定の標的部分に標識をカップリングさせるための簡便化された方法に関している。そのようなカップリングは高度に反応性の活性化化学物質による標識、標的部分またはその両方を活性化することにより達成される。通常のカップリングプロトコールは、活性化化学物質が望ましくない副産物を生成する制御不可能な反応を起こしやすく、あるいは非常に急速な反応は望まれるカップリングを起こすことなしに活性化化学物質の消失を生じるので問題がある。本発明に従ったカップリング反応は従来の方法の物理的間隔の代わりに、反応の開始および終結を制御するために相変化による反応体の時間的間隔を使用している（例えば、急速凍結による）。
【００１１】
例えば、ＮＨＳエステルをその場所で発生する技術（凍結乾燥なしで、ただ試薬を加えるだけで）はＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓに記載されている。  本発明は別の分子に結合された標識を得ることと同一の化学および同一の考えを使用しているが、その相違は容易に使用できる形式である（即ち、”一本の試験管形式”）。この方法においてすべての反応体は別々に調製され、続いて、それらは架橋化学物質を活性化するために標的化化合物が加えられるまではお互いに反応しないような方法で一緒にされる。一つのそのような様式は反応体の瞬間凍結水性溶液を連続的に調製し、一つのユニットとして一緒に凍結乾燥する（例えば、微量遠心管中で）。本発明の別の様式において、凍結乾燥またはその他の方法で乾燥された成分が別々に調製され、水溶性成分が標識されるべき化合物（水性の形で）の添加まではお互いに反応しない条件下にあるように、乾燥形でまたは空間的に離れた様式（例えば、隔てられた部分に仕切られている微量遠心管の上部で）で一緒にされる。
【００１２】
本発明はＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）化学を用いて特異的結合部分（例えば分析標的を選択するために有用である部分）へ標識を結合する改良された方法を提供する。特に、本発明は適切な緩衝液中で連続的または別々に凍結することにより達成された活性成分の分離および安定化を提供する（本質的には利用前の成分の空間的または時間的分離）。
【００１３】
別の様式において、本発明はＮＨＳ、水溶性カルボジイミド（例えば、ＥＤＡＣ）およびアミンまたはカルボキシル残基を含んでいる標識からなるキットを提供し、これらの成分は、すべての成分が活性化および架橋のために十分な活性を持つｐＨ７付近での再水和に適した乾燥形である。
【００１４】
フィコビリプロテインは抱合させるのがやっかいであると考えられているが、本発明は特異的標的結合タンパク質へ抱合された安定なフィコビリプロテインを迅速におよび容易に作製するための方法を提供する。ＳＭＣＣおよびＳＰＤＰ前活性化フィコピリタンパク質はいくつかの処方で入手可能である。しかしながら、本発明はより少ない工程しか必要とせずおよびより迅速である、抱合体を作成するためのより簡便な方法を提供する。実際、本発明ではカルボキシル含有標識を持つであろう特異的結合分子が何であれ（例えば、フィコビリプロテイン、酵素、ＰＢＸＬTMその他）、研究者は容易に標識が可能である。本方法の終わりに使用可能な抱合体を得るために、本キットを使用する作業者はタンパク質抱合の熟練者である必要ではない、抱合体を作製するためのキットも本発明は提供する。
【００１５】
発明の詳細な説明
本発明の方法は標識されるべき標的部分（例えば緩衝化溶液のタンパク質）へ検出可能な標識（フィコビリプロテイン、酵素、タンパク質またはＰＢＸＬTMフィコビリソーム色素の様な）、緩衝液、ＮＨＳおよびカルボジイミドを含んでいる乾燥粉末を加えることを可能にする。標識された標的部分はトレーサーとして直接的に使用できるか、または非結合色素およびクエンチング試薬を除くためにさらに精製でき高度に純粋な標的化合物が提供できる。
【００１６】
一つの態様において、本発明は凍結乾燥のＥＤＡＣ（カルボジイミド）、標識残基（例えばフィコビリプロテイン、フィコビリソームその他）およびＮＨＳを含んでいる反応容器から成るキットが提供される。これらの成分はお互いに反応しないが、各々の成分の安定性を維持するために各々に最適な緩衝液に連続的様式で加えられおよび凍結される（ＥＤＡＣおよびＮＨＳは異なったｐＨで安定であるので）。これらの試薬の最適条件にまたがるｐＨでの再水和により、反応を完了させるのを導く環境が創られ、使用に適した抱合体が生成される（環境はカルボジイミドまたはＮＨＳの両方には最適ではないけれども）。
【００１７】
これと同一の様式が、もし適した反応条件（適したｐＨ範囲を含んで）が応用される特定の化学に利用されるならば、使用前に標的分子が最初に修飾されていることが必要とされる他の型の架橋剤にも使用できる。例えば、問題とするタンパク質の標的への単純な架橋は、ＳＭＣＣ（スクシンイミジル  ４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート）または任意のその誘導体およびジチオスレイトール（ＤＴＴ）またはβ−メルカプトエタノールのような還元体の使用により達成されるであろう。これらの化学物質は連続的に凍結され、続いて凍結乾燥される。凍結乾燥材料は次に、抱合されるべきタンパク質を溶解した緩衝液で再水和される。このことは材料を活性化し、脱塩または透析により還元体が除かれると、お互いに架橋することが可能になる。最適な抱合にはタンパク質比の注意深い整合が必要とされる。緩衝液および標的化合物の連続的添加で、生じる生成物が改善できるであろう。本発明のこの態様はまたキットを含んでおり、ここで材料（タンパク質、オリゴヌクレオチドプローブその他）はマトリックス内で連続的に凍結され、それに所望の結合相手（標的部分）が加えられ、およびその後還元すると同時に還元体は徐々に除去されることを可能にし、それにより抱合反応が駆動され、所望のおよび特異的モル比の決められた抱合体が生じる。そのようなマトリックスは還元体および活性化タンパク質を含んでいる高分子量透析チューブのように単純であってもよいし、またはゲル濾過（即ち、脱塩）または化学的／熱的不活性化を経る、還元体の遅い空間的分離を可能にする反応容器のように複雑なものでもよい。
【００１８】
この方法の利点は、簡便であることであり、および研究者自身の抱合を行って迅速な成功が得られることに懐疑的であろう研究者に一つの道を提供する。その理論的な結論まで延長すると、反応停止がほとんどまたは全く必要とされず、混合し、インキュベートし、次ぎに標識を直接使用するように、比を均衡させることが可能である。もしくは、反応した抱合体はゲル濾過カラムまたは他の型の分離工程により精製され、高度に精製された抱合体が得られる。
【００１９】
実験作業の要約
本発明は、可能な限り使用者に使いやすいことを目標として、タンパク質（特には標識）と他のタンパク質または核酸とを結合するための安定なＮＨＳエステルまたは他の機能的な反応性架橋剤を発見する努力のなかで実施された実験作業から開発された。特に、二つのタンパク質の抱合のための簡単な一工程法を提供することが望まれた。いくつかの実験法が企てられた。
【００２０】
第一に、適切なカップリングのために適した条件および比を決定するため、液体ＮＨＳエステル抱合体がストレプトアビジン（ＳＡ）および種々の検出可能標識、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、安定化フィコビリソーム（ＰＢＸＬ−３）またはフィコエリスリン（ＰＥ）間で作製された。ＮＨＳエステルは、エステルの加水分解のため、中性付近の条件下では比較的短い半減期しか持っておらず、タンパク質へ架橋している活性ＮＨＳエステルの長期間の安定性は、少なくとも６ヶ月の在庫期間を必要とする製品では続かないことが観察された。
【００２１】
次の方法は凍結に対するフィコビリプロテインの安定性を促進するためにトレハロースを添加し、基本的には同一のプロトコールを使用して同一の活性ＮＨＳエステルタンパク質複合体が作製され、次に全複合体を完全に凍結するまで液体窒素に沈め、続いて全複合体を凍結乾燥させた。凍結乾燥複合体は次にストレプトアビジン溶液に再懸濁し、得られた抱合体は液体様式で作製された抱合体と比較された。結果は、凍結乾燥複合体の絶対結合能力の相当な損失を明瞭に示している。凍結乾燥活性ＮＨＳエステルタンパク質複合体は決して液体複合体より性能が優れてはいなかった。
【００２２】
長期間にわたって安定な複合体を維持するために試みられた別の方法として、複合体が検出可能標識およびＳＡと一緒にカップリングする準備ができるまでは複合体が形成されないプロトコールを発明者は研究した。材料は連続的に添加され、各々の添加時に凍結された；第一に標識、次にＥＤＡＣおよび最後にスルホ−ＮＨＳ。しかしながら、試薬は凍結により分離されているので、この添加の順序は重要ではない。ほとんど瞬間的な層の凍結および非常に低い温度は、本質的にお互いに関して材料を不活性なものにする。凍結された組成物は次に凍結乾燥された。抱合体は水性タンパク質溶液が凍結乾燥粉末に加えられた時に形成された。生じた抱合体は液体で形成されたものと非常に類似して働き、ＢＳＡ−ビオチンマイクロプレートアッセイで試験された場合、同様のシグナルを発生する能力を持っていた。
【００２３】
ＮＨＳ活性化色素の生成
本発明は三つの成分（標識部分、ＮＨＳおよびカルボジイミド）を望まれるまでお互いに反応することなく一緒にすることによりこれらの利点を提供する。典型的には、このことは図１に示したように、試薬の連続的添加および急速凍結、続いての凍結乾燥工程により達成される。このことはまた、各々の成分を別々に凍結乾燥（またはその他の乾燥）し、それぞれを湿気のない条件下、バルク試薬として適した比で混合できる均質な粉末となすことによっても達成できる。
【００２４】
標識の型−
適した標識は遊離カルボキシル基を持つ検出可能な残基である。好適には標識残基は遊離アミンを持っていないが、すべての場合において標識−標識の架橋を最少にするように標識の濃度を調節しなければならない（アミンがあってもなくても）。起こりうる色素内架橋を防止するために、アミンをカルボキシル基（無水酢酸の場合）またはチオール（例えば、ＳＡＴＡ）のようなＮＨＳと反応しない他の基へ変換するために無水酢酸のようなアシル化剤が使用されるであろう。標的は、特異的結合対の片方の半分とひとたび結合すると、モニターされるべきいくつかの特性を持っていなければならない。これは蛍光、発色性、放射活性、酵素活性、物理的密度などであろう。便宜上、活性化標識は”色素”と称されるが、光吸収に関わらず、ＮＨＳ化学により結合できる任意の検出可能残基が使用されるであろう。典型的な標識には以下に掲げたものが含まれるが、これらに限定されるわけではない：
・フィコビリプロテイン（例えば、アロフィコシアニン、フィコシアニン、フィコエリスリン、フィコエリスロシアニン、ＣｒｙｐｔｏＦｌｕｏｒTM色素）、フィコビリプロテインのサブユニット（例えば、フィコエリスリンのアルファ、ベータおよびガンマサブユニット）
・フィコビリソーム（青緑色細菌または紅藻類）、フィコビリソーム亜複合体（杆体およびコア）を含んで、
・安定化フィコビリソーム、安定化フィコビリソーム亜複合体（杆体およびコア）を含んで、またはポルフィリジウム  クルエンタムまたはアルトロスピラ  プラテンシスから単離されたもの（例えば、各々ＰＢＸＬ−１またはＰＢＸＬ−３）のような化学的に安定化されたフィコビリソーム、またはこれらの化学的に安定化されたフィコビリソームおよびＣｙ５．５を含んでいるタンデム色素（例えば、各々ＰＢＸＬ−２またはＰＢＸＬ−４）、
・酵素（西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ）、
・ラテックスビーズ（例えば、天然、染色、活性化）
・核酸（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＰＮＡ）、
・修飾核酸（例えば、メチル化、ビオチニル化、アミン終結）
・アガロースビーズ（例えば、ＳｅｐｈａｒｏｓｅTM、ＳｅｐｈａｄｅｘTM）、・活性化ガラスビーズ（例えば、修飾ＣＰＧビーズ）、
・磁気ビーズ（例えば、ＢｉｏＭａｇTM）、
・ランタニド含有キレート、クリプテートのような（例えば、ユーロピウム、テルビウム）、遊離カルボキシル基または遊離アミンを含むように修飾されている、
・遊離アミンを持つ有機色素−アミン含有アミノフルオレセイン誘導体のような（例えば、フルオレセイン−５−チオセミカルバゾール、５−（（（２−（カルボヒドラジノ（カルボヒドラジノ）メチル）チオ）アセチル）−アミノフルオレセイン、またはローダミン、
・緑蛍光タンパク質、赤蛍光タンパク質、青蛍光タンパク質、および黄色蛍光タンパク質。
【００２５】
ＮＨＳの型−
・Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド
・スルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド
・水溶性ＮＨＳ類似体
水溶性カルボジイミドの型−
［ＥＤＡＣ］  １−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド
［ＣＭＣ］  １−シアノヘキシル−３−（２−モルホリノ−４−エチル）−カルボジイミド
［ＤＣＣ］  ジシクロヘキシル  カルボジイミド
［ＤｌＣ］  ジイソプロピル  カルボジイミド
他の可能な架橋剤−
［ウッドワード試薬  Ｋ］  Ｎ−エチル−３−フェニルイソキサソリウム−３’−スルホネート
［ＣＤＩ］  Ｎ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾール
反応性粉末の製造法−
試薬はお互いから反応体を分離するために連続的様式で乾燥され、一方、化合物を可能な限り最良の形で維持するのに適した環境（例えば、ｐＨ）が維持されている。例えば、標識は水性の形で添加され、液体窒素中で凍結され、次ぎにこの上部にＮＨＳが加えられて即座に凍結され、次ぎにＥＤＡＣが加えられて即座に凍結される。この全構築物は凍結乾燥され、得られたチューブは必要になるまで乾燥下で保存される。標識およびその他の必要な反応体を含んでいる粉末を調製するための別の方法には以下の方法が含まれる：
・凍結乾燥／相の時間的分離−連続的に液体を加えおよび凍結し、それにより異なったｐＨおよび試薬を混合しない凍結部分として分離する。次ぎに、全体が凍結乾燥される。（実際）
・試薬保存溶液を独立して凍結し、凍結乾燥して湿気のない環境下で微粉末とする。これを別々にチューブへ加えるか、または使用のためのチューブ内へ分配する前に他の試薬と適した比で混合する。
・連続的に凍結乾燥されるというよりもむしろ、乾燥化学薬品を一つの成分としてチューブ内へ分配する。それらは水の添加により混合され、標識の活性化が開始される。適したインキュベーション時間の後、化合物（アミン含有）が加えられ、カルボジイミド活性化カルボキシルと反応する。得られた物質は適当な重量で反応チューブへ分配される。
・乾燥化学物質が緩衝液を作るように混合され、反応チャンバーへ分配された。乾燥ＮＨＳおよびカルボジイミドを適切な比率で反応混合物へ加える。すべてを使用するまで湿気のない環境に、好適には真空下で封をする。（予想）
添加する順序は上記のプロトコールを使用する結果には関係しない。材料を急速に凍結させ、先行する層を有意に融解させないことを確実にすることが重要である。このことは液体を入れるチューブを非常に低い（液体窒素またはドライアイス）温度に保ち、および添加には非常に冷たい溶液を用いることで達成される。最初に最も多い容量の材料を加え、次ぎにより少ない容量を加えるのが簡単である。チューブ側面は、層が出会う前から凍結を実行するのに使用できる。
【００２６】
材料は上記のような層積の代わりに凍結乾燥または急速乾燥粉末として前もって混合できる。この場合、少量の材料を各々のチューブに加えなければならないので、より小さなチューブを作ることがより難しくなるであろう。しかしながら、一度混合されたら、自動化分配機は非常に規定された様式でチューブ内へ材料を秤量することができる。
【００２７】
キット形
好適な様式において、所望の標的残基へのカップリングのための検出可能標識を含んでいる反応性粉末は、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（スルホ−ＮＨＳ）、水溶性カルボジイミド（例えば、ＥＤＡＣ）およびアミンまたはカルボキシル残基を含んでいる標識から成るキットで提供され、ここでこれらの成分は６．０から８．０のｐＨ範囲での再水和に適した乾燥形である。典型的なキットは以下のものを含んでいるであろう：
【００２８】
キット１：
−粉末化ＮＨＳ、カルボジイミドおよび標識を含んでいるバイアル、好適には梱包に含まれている乾燥パックで、
−停止試薬を含んでいるバイアル
−使用されなかった標識および停止試薬から抱合体の分離のためのカラム
−抱合体の充填および溶出のための乾燥粉末化緩衝液を含んでいる瓶（使用される分離法に依存して一つ以上であろう）
キット２：
−粉末化ＮＨＳ、カルボジイミドおよび標識を含んでいるバイアル、好適には梱包に含まれている乾燥パックで、
−停止試薬を含んでいるバイアル
キット３：
−粉末化ＮＨＳ、カルボジイミドおよび標識を含んでいるバイアル、好適には梱包に含まれている乾燥パックで。多標識のためのセット。
【００２９】
標識された抱合体の製造−
未反応標識、ＮＨＳおよびカルボジイミドの混合物を標的残基（典型的には特異的結合対の一つ）との反応のために再水和し、標的残基に標識を抱合させる。
特異的結合相手の型−
最終”標的”成分の添加までは反応しないような様式で別々の材料を混合することは、非常に一般的な、およびフィコビリプロテイン、ＰＢＸＬTM色素、酵素またはまったく任意のカルボキシル含有標識に応用できる組成物を構成する。加えて、多くの有機色素は標準的有機化学を使用してカルボキシルを含むように修飾できる。例えば、アリール環構造へカルボキシル基を導入するために、フリーデル−クラフト触媒存在下でホスゲンが使用できる。３月  １９８５  Ｊ．Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ。
【００３０】
適した標的残基には：レセプター、アプトマー、核酸、修飾核酸、抗体（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、Ｆｃフラグメント、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）2フラグメント）、リガンド、孔形成化合物、レクチン、ペプチド、細胞抽出物、分子の混合物、合成抗体および人工抗体および反応部位を提供できる遊離カルボキシル基または遊離アミンを含んでいるコンビナトリー化学で生成された物質などが含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【００３１】
本発明の一つの方法において、試薬の凍結乾燥混合物は小さなチューブ中に提供され、使用者は問題とする標的分子を直接的にかまたはタンパク質の最上の活性化を得るために短いプレインキュベーション後に加え、３０分から一夜の間インキュベートした後に反応停止試薬を加える。抱合体はそのままかまたはゲル濾過カラムを通して精製される。凍結乾燥混合物は１ｍｇ抱合体のための小さなバイアルで提供されるであろう。
【００３２】
プロセスパラメータ
試薬の連続的添加および不活性な状態での各々の隔離は一工程で抱合体を作成することを可能にする。しかしながら、反応が再水和により同時に起こるので、緩衝液（特にｐＨ）、提供モル比（反応混合物へ加えられた種々の反応体の）、および二つの相手（即ち、酵素に対する抗体）間およびスルホ−ＮＨＳおよびＥＤＡＣ間の反応の時間のような抱合条件に対してある種の制限が強いられる。
【００３３】
最適な標識に対して適切なｐＨを見いだすために実験が行われた。ＥＤＡＣは酸性ｐＨでより反応性が高く、およびスルホ−ＮＨＳはより塩基性ｐＨでより反応性が高いので、有効な抱合には狭いｐＨ範囲（好適にはｐＨ６．８−７．４）しか存在しない。ＥＤＡＣが非常に反応性であり、およびスルホ−ＮＨＳの反応性が低いｐＨ６．０で行われた実験では、これらの条件下ではＡＰＣおよびストレプトアビジン間に抱合体は形成されないことが示された。
【００３４】
結合相手に対するタンパク質（即ち、標的に対する標識）の提供モル比は好適には抱合相手の各々の組に対して実験的に最適化されるであろう。例えば、ＳＡに対するＰＢＸＬ色素の好適な比（１：２５）はＳＡに対するＡＰＣの比（１．２：１）とは異なっている。別の例はウサギＩｇＧに対するＰＢＸＬ−３の抱合であり、１ＰＢＸＬ−３分子に対して２０のＩｇＧの提供比が使用された。
【００３５】
反応の時間は最適化されるであろう。ＳＡに対するＡＰＣ抱合については、一夜標識が２時間標識時間よりも有効である。しかしながら、２時間標識がほとんどの研究者にとってより都合がよい。
【００３６】
スルホ−ＮＨＳおよびＥＤＡＣ間の反応の時間が、結合相手を再水和色素複合体へ添加する前に重要である。いくつかの色素（標識）は異なった速度で再水和することが知られている。しかしながら、中性ｐＨ付近でのＥＤＡＣの短い半減期は、活性化を可能にし、および標識のお互いの架橋を防止するため、即座の標識の再水和または少なくともかなり均質な溶液が得られることを必要とする。
実施例
本発明のより完全な理解を容易にするため、以下にいくつかの実施例が提供されている。しかしながら、本発明の範囲はこれらの実施例に記載されている特定の実施態様に制限されるわけではなく、それらは例示のためのみを目的としている。
【００３７】
実施例１  直接（標準同時法）または凍結乾燥試薬（連続凍結法）からの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノ−プロピル）カルボジイミド（ＥＤＡＣ）／  Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（スルホ−ＮＨＳ）を経たフィコエリスリンおよびストレプトアビジンの抱合
方法：抱合体を製造する二つの方法が以下に概説するようなプロトコールに従って実施された。第一の方法において（標準同時法または標準法）、フィコエリスリン（ＰＥ）はストレプトアビジン（ＳＡ）と、緩衝液中で二つのタンパク質（ＰＥ  ＆  ＳＡ）とＥＤＡＣおよびスルホ−ＮＨＳを同時に混合することにより抱合された。混合物を室温で２時間インキュベートすると抱合体が得られた。第二の方法において（連続的凍結法または本発明の方法）、規定した含量のＰＥ＋Ｄ−（＋）−トレハロース、ＥＤＡＣおよびスルホ−ＮＨＳ溶液を化学物質の相互作用を防止するために連続的に瞬間凍結して凍結乾燥した。凍結乾燥された後、凍結乾燥物質はストレプトアビジン含有リン酸緩衝液に再懸濁した。反応体は室温で少なくとも２時間反応させた。生じた抱合体はゲルろ過により精製した。抱合体の濃度および結合較差が決定され、以下に説明される詳細なプロトコールに続くデータ表に報告されている。
【００３８】
標準同時法  −  Ｂ−フィコエリスリン（Ｂ−ＰＥ）は０．０５％アジ化ナトリウムを含んでいる１Ｌの１００ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ＝６．８）に対して透析した。この緩衝液は３時間の間１時間ごとに交換し、Ｂ−ＰＥの濃度はその吸光係数を用いて決定された。約３ｍｇ／ｍＬのＢ−ＰＥ溶液へストレプトアビジンを２対１（Ｂ−ＰＥ／ＳＡ）の比で加えた。１Ｍ  ＥＤＡＣを上で使用したものと同一の緩衝液で調製し、０．０５Ｍ  ＥＤＡＣの最終濃度が得られるように反応混合物へ加えた。次に、０．１Ｍスルホ−ＮＨＳ溶液を上と同一の緩衝液を使用して調製した。０．００５Ｍスルホ−ＮＨＳの最終濃度が得られるようにスルホ−ＮＨＳを反応混合物へ加えた。反応は室温で２時間行われた。抱合体は溶出緩衝液として１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび０．０５％アジ化ナトリウム（ｐＨ７．２）を使用するＳＥＰＨＡＤＥＸ  ３００（ＡＭＥＲＳＨＡＭ  ＰＨＡＲＭＡＣＩＡ  ＢＩＯＴＥＣＨ）で精製した。
【００３９】
連続凍結法  −  Ｂ−ＰＥは上記のように０．０５％アジ化ナトリウムを含んでいる１Ｌの１００ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ＝６．８）に対して透析した。この緩衝液は３時間の間１時間ごとに交換した。Ｂ−ＰＥの濃度はその吸光係数を用いて決定された。０．１Ｍトレハロースの最終濃度が得られるように１ｍＬの３ｍｇ／ｍＬのＢ−ＰＥ溶液へＤ−（＋）−トレハロース粉末を加えた。混合物は粉末が溶解するまでボルテックスし、微量遠心チューブ中、１ｍＬを液体窒素中で瞬間凍結した。次に１Ｍ  ＥＤＡＣおよび０．１Ｍスルホ−ＮＨＳ保存溶液を上と同一の緩衝液を使用して調製した。ＥＤＡＣ保存液は、１ｍＬに再構築した場合０．０５Ｍ  ＥＤＡＣの最終濃度が得られるような容量で色素を含んでいる凍結試薬上へ層積し、瞬間凍結した。スルホ−ＮＨＳは、１ｍＬに再構築した場合、０．００５Ｍスルホ−ＮＨＳの最終濃度が得られるような容量で上記凍結試薬中へ加え、瞬間凍結した。連続的凍結の順序は決定的ではない；しかしながら、試薬の急速な凍結は、加えられている試薬の活性維持、ならびに再水和工程前の試薬の相互作用を防止するための両方に決定的である。次に凍結試薬は一夜凍結乾燥した。次の日、チューブに加えた場合にＳＡに対してＢ−ＰＥが２／１のモル比になるように、ＳＡを含んでいる１ｍＬの蒸留水を調製した。凍結乾燥混合物を１ｍＬのＳＡ溶液に懸濁して溶解させた。反応を室温で２時間行わせた後、一夜４℃で保存した。抱合体は溶出緩衝液として１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび０．０５％アジ化ナトリウム（ｐＨ７．２）を使用するＳＥＰＨＡＤＥＸ  ３００（ＡＭＥＲＳＨＡＭ  ＰＨＡＲＭＡＣＩＡ  ＢＩＯＴＥＣＨ）で精製した。
【００４０】
結合較差アッセイ。  黒色の９６ウェルマイクロタイタープレート（ＤＹＮＥＸ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ）をウェル当たり１００μＬの１００μｇ／ｍＬビオチニル化ＢＳＡを用い、３７℃で４時間、受動的に被覆した。プレートはウェル当たり２００μＬのシングル強度のＰＢＳ緩衝液（１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、１５０ｍＭ塩化ナトリウムおよび０．０５％アジ化ナトリウム）で５回洗浄した。プレートは次にウェル当たり１００μＬの半強度のＰＢＳで希釈したＭＢＢブロッキング緩衝液（１．５％ＢＳＡ、１％カゼイン、０．５％  ゼラチンおよび０．１％トゥイーン２０）を用いＲＴで２時間ブロックした。抱合体は指定された濃度で、１００ｎｇビオチン／１００μＬを含む（またはビオチンを含まない）０．０５％アジ化ナトリウム含有１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝６．８）と混合し、室温で２０分間プレインキュベートした。次に、１００μＬの試料（競合的ビオチンを添加してまたは添加しないで）をＢＳＡ−ビオチン前被覆プレートのウェルに加えた。これらは室温で１時間放置して反応させた。次にプレートを１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％ＮａＮ3（ｐＨ７．２）で３回洗浄し、各々の洗浄にはウェル当たり２００μＬの溶液が用いられた。湿ったプレートは５５０ｎｍ励起および５９０ｎｍ発光のフィルターの組を使用してＦＬＵＯＲＯＬＩＴＥ１０００プレートリーダー（ＤＹＮＥＸ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ）にて読みとった。
特異的結合に対する標的タンパク質対色素比（Ｆ／Ｐ）の影響。  この実験において、標的タンパク質に対する蛍光色素比（Ｆ／Ｐ）を凍結乾燥試料で変化させてより良好な抱合体が生成されるかどうかを観察した。凍結乾燥試料に対し、凍結乾燥に先立って冷凍保護剤として１００ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）緩衝液に０．５Ｍトレハロースが加えられた。凍結乾燥は最初の実験で１６時間実施された。連続凍結法および標準同時法両方での生成抱合体に対し、ＥＤＡＣの量は０．０５Ｍであり、およびスルホ−ＮＨＳの量は０．００５Ｍであった。材料は調製後直ちに使用された。アッセイは室温で２時間実施され、続いて試料は結合アッセイに先だって４℃で一夜保存された。
【００４１】
データから、標準同時法抱合体では最適化された抱合化性能はまだ良好ではないが、連続凍結法では試薬のさらなる最適化をしなくても比較的良好に働いているようである（≧７８％結合較差）。しかしながら、凍結乾燥材料に対して、２のＦ／Ｐ比を使用したデータは３のデータよりもより良い結合較差を与えた。
【００４２】
【表１】
0004731018.tif 000002
【００４３】
実施例２．連続凍結法を用いる抱合体生成に対するより長い凍結乾燥時間の影響
液体材料に対する凍結乾燥形式により密接に関連した作業において、材料からすべての液体が除去されていることを確実にするためにこの実験ではより長いおよび徹底的な凍結乾燥が実施された（１６時間に対して６４時間）。すべての実験において、二つのみの抱合体濃度（１０および５μｇ／ｍＬ）が使用され、および２のＦ／Ｐ比が使用された。他の点では、すべての条件は実施例１に記載されているとおりである。凍結乾燥直後または−２０℃で１週間保存後の抱合のための色素を使用したものの間では相違は観察されなかった。達成された結合較差は以前に標準同時法抱合法で観察されたものと等しかった。完全乾燥はこれらの試薬の適切な性能に決定的であるようである。
【００４４】
【表２】
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【００４５】
実施例３．連続凍結／凍結乾燥Ｒ−ＰＥ活性化材料から生成される抱合体に対するｐＨの影響
このフォーマットからの抱合体生成に対する最適ｐＨ値を決定するため、ストレプトアビジンへのＲ−ＰＥ抱合体がＢ−ＰＥについて実施例２で記載されたように生成された、ただし、１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液は６．８から７．４の間の異なったｐＨ値に調整され、および室温での２時間の反応後に０．１Ｍリジンで反応停止された。
【００４６】
すべての色素は２のＦ／Ｐ比で提供され、試薬は凍結乾燥直後に抱合に使用された。抱合体の３つの濃度が用いられたが、これらの異なったｐＨ値での結合較差の相違はほとんど観察されなかった。ｐＨ６．８で最良のデータが得られたが、この相違はｐＨ７．４よりも本質的に良好ではなく、実際すべてが多分、抱合試薬として適切な性能を果たしているのであろう。
【００４７】
【表３】
0004731018.tif 000004
【００４８】
実施例４．−２０℃での保存における凍結乾燥試薬の機能的安定性
本発明に安定な生成物が必要であるのは明白である。生成物が急速に分解されるかどうかを決定するために短期間の研究が、実施例３に記載されたように（ただし、０．１Ｍトレハロースが凍結媒質に使用されている）作製および凍結乾燥されたＢ−ＰＥを使用して実施された。反応はｐＨ６．８で実施され、反応停止は行われなかった。少なくとも３週間までの保存では、これらの試薬により生成された抱合体に対してはほとんど影響はなく、有益な影響さえもあるように思われた。
【００４９】
【表４】
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【００５０】
実施例５．スルホ−ＮＨＳ／ＥＤＡＣ／Ｄ（＋）−トレハロース連続凍結法を使用するストレプトアビジンへの化学的に安定化したフィコビリソーム（ＰＢＸＬ−３；ＭＡＲＴＥＫ  ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ）の抱合
ＰＢＸＬ−３標識ストレプトアビジン抱合体の作製について連続凍結法が標準同時法と比較された。標準同時法において、ＰＢＸＬ−３をストレプトアビジン（ＳＡ）、ＥＤＡＣおよびスルホ−ＮＨＳと緩衝液中で混合し、文献の方法と類似の様式で同時に反応させた。混合物は室温で２時間インキュベートした。連続凍結法においては、以下の試薬を連続的に凍結乾燥した：規定の容量のＤ（＋）−トレハロースを加えた１００ｍＭリン酸ナトリウム中のＰＢＸＬ−３、１Ｍ  ＥＤＡＣおよび０．１Ｍスルホ−ＮＨＳ。凍結材料は一夜凍結乾燥し、乾燥粉末はストレプトアビジン含有の非常に低濃度のリン酸緩衝液に再懸濁した。室温で２時間放置して反応させた。抱合体は次にＳＥＰＨＡＲＯＳＥ  ６Ｂによるゲル濾過により精製した。抱合体の結合較差が決定され、抱合フォーマットの性能が比較された。
【００５１】
プロトコール：
標準同時法  −  ＰＢＸＬ−３は１Ｌの１００ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）に対して透析し、３時間の間１時間ごとに緩衝液を交換した。ＰＢＸＬ−３の濃度は６２０ｎｍでの吸光度により決定された（５Ａｕ／ｍｇＰＢＸＬ−３）。ＰＢＸＬ−３溶液へストレプトアビジンを０．４のＦ／Ｐ比またはＰＢＸＬ−３複合体当たり２５のＳＡで加えた。１Ｍ  ＥＤＡＣ保存液を上で使用したものと同一の緩衝液で調製し、０．０５Ｍの最終濃度が得られるように反応混合物へ加えた。０．１Ｍスルホ−ＮＨＳ溶液を上と同一の緩衝液を使用して調製し、０．００５Ｍの最終濃度が得られるように反応混合物へ加えた。室温で２時間反応させた。抱合体は溶出緩衝液として１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび０．０５％アジ化ナトリウム（ｐＨ７．２）を使用するＳＥＰＨＡＲＯＳＥ  ＣＬ６Ｂ（ＡＭＥＲＳＨＡＭ  ＰＨＡＲＭＡＣＩＡ  ＢＩＯＴＥＣＨ）で精製した。
【００５２】
連続凍結法  −  ＰＢＸＬ−３は１Ｌの１００ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）に対して透析し、この緩衝液は３時間の間１時間ごとに交換した。ＰＢＸＬ−３の濃度は６２０ｎｍでの吸光度により決定された（５Ａｕ／１ｍｇタンパク質）。この液は０．５Ｍの最終濃度が得られるようにＤ−（＋）−トレハロース粉末と混合し（ボルテックスすることにより）一部を微量遠心チューブに加え液体窒素中またはメタノール／ドライアイス浴上で瞬間凍結した。１Ｍ  ＥＤＡＣ保存溶液を上と同一の緩衝液を使用して調製し、凍結材料の上面へ０．０５Ｍの最終濃度（すべての試薬が混合された時）で送達されるような容量で加え、その間、加えられた材料がほとんど瞬間的に凍結するように液体窒素温度下である。０．１Ｍスルホ−ＮＨＳ保存溶液を上と同一の緩衝液を使用して調製し、加えられた材料がほとんど瞬間的に凍結するような液体窒素温度下、すべての試薬が混合された時０．００５Ｍの最終濃度で送達されるような容量で前の凍結試薬の上面へ加えた。種々のモル比でＳＡを含んでいる溶液を上記と同じ緩衝液を用いて調製した。このＳＡ溶液は凍結乾燥工程前に規定の容量に凍結乾燥混合物を再懸濁するために使用された（すべての試薬を規定の濃度に保つため）。再懸濁した試薬およびＳＡは室温で２時間一緒にして反応させた。得られた抱合体は溶出緩衝液として１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび０．０５％アジ化ナトリウム（ｐＨ７．２）を使用するＳＥＰＨＡＲＯＳＥ  ＣＬ６Ｂ（ＡＭＥＲＳＨＡＭ  ＰＨＡＲＭＡＣＩＡ）で精製した。
【００５３】
結合較差アッセイ。  黒色の９６ウェルマイクロタイタープレート（ＤＹＮＥＸ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ）をウェル当たり１００μＬの１００μｇ／ｍＬビオチニル化ＢＳＡを用い、３７℃で４時間、受動的に被覆した。プレートは前に記載したように１ｘＰＢＳ緩衝液で５回洗浄し、ＭＢＢブロッキング緩衝液でブロックした。プレートはウェル当たり２００μＬの１ｘＰＢＳで５回洗浄した。抱合体と１００ｎｇビオチン／１００μＬを（またはビオチン無しで）を表に示されたようにアッセイ緩衝液で一緒に混合し、ウェル内へ加える前に２０分間プレインキュベートした。プレインキュベートした材料は１００μＬ／ウェルで加え、室温で１時間放置して反応させた。プレートはウェル当たり２００μＬの１００ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％ＮａＮ3緩衝液で３回洗浄した。プレートは次に励起に５９０ｎｍフィルターおよび発光に６６０ｎｍフィルターを使用してＦＬＵＯＲＯＬＩＴＥ１０００（ＤＹＮＥＸ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ）にて読みとった（電圧は７．７Ｖにセットされた）。
【００５４】
【表５】
0004731018.tif 000006
【００５５】
実施例６．ＥＤＡＣ／スルホ−ＮＨＳ架橋のための標準同時法、およびその他の標準架橋法、ＳＭＣＣ／ＳＡＴＡとの連続凍結法の比較
実施例５に記載されているような二つのスルホ−ＮＨＳ／ＥＤＡＣ法（連続凍結および標準同時法）および標準ＳＭＣＣ／ＳＡＴＡ抱合法により作製された抱合体を比較する別の組の実験が行われた。類似の性能がこれらの方法により提供された。
【００５６】
【表６】
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実施例７．標準同時法と比較されたスルホ−ＮＨＳ／ＥＤＡＣ連続凍結法（発明）によるストレプトアビジンへのアロフィコシアニン（ＡＰＣ）の抱合
方法：  本発明の方法が機能性ＡＰＣ標識ストレプトアビジン抱合体を生成する能力で標準同時法と比較された。標準同時法において、ＡＰＣはストレプトアビジン（ＳＡ）、ＥＤＡＣおよびスルホ−ＮＨＳと同時に混合された。次に混合物は室温で２時間インキュベートして抱合体を形成させ、抱合体はゲル濾過により精製された。連続凍結法においては、ＡＰＣをＤ−（＋）−トレハロースと混合し、凍結した。凍結色素の上面に特定量のＥＤＡＣ溶液を層積して瞬間凍結し、次に凍結試薬の上面にスルホ−ＮＨＳの溶液を層積して瞬間凍結した。混合していない（瞬間凍結のため）凍結試薬は一夜凍結乾燥した。乾燥試薬はストレプトアビジン含有低リン酸緩衝液に再懸濁し、室温で少なくとも２時間反応させた。得られた抱合体はゲル濾過により精製した。抱合体の濃度および結合較差は特異的にビオチンを結合する能力で決定され、比較された。
【００５７】
プロトコール：
標準同時法  −  ＡＰＣは０．０５％アジ化ナトリウムを含んでいる１Ｌの１００ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）に対して透析し、３時間の間１時間ごとに緩衝液を交換した。ＡＰＣ濃度はその吸光係数を用いて決定された。３−５ｍｇ／ｍＬのＡＰＣ溶液へストレプトアビジンを１．２対１のＦ／Ｐ比（蛍光対標的タンパク質）で加えた。１Ｍ  ＥＤＡＣ溶液を上で使用したものと同一の緩衝液で調製し、０．０５Ｍ  ＥＤＡＣの最終濃度が得られるように反応混合物へ加えた。スルホ−ＮＨＳの０．１Ｍ保存溶液を上と同一の緩衝液で作製し、０．００５Ｍスルホ−ＮＨＳの最終濃度が得られるように反応混合物へ加えた。反応混合物は室温で少なくとも２時間インキュベートした。得られた抱合体は溶出緩衝液として１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび０．０５％アジ化ナトリウム（ｐＨ７．２）を使用するＳＥＰＨＡＤＥＸ  ３００（ＡＭＥＲＳＨＡＭ  ＰＨＡＲＭＡＣＩＡ）カラムで精製した。
【００５８】
連続凍結法  −  ＡＰＣは上記のように透析して定量した。０．５Ｍトレハロースの最終濃度が得られるように３−５ｍｇ／ｍＬのＡＰＣ溶液へトレハロース粉末を加えた。混合物は粉末が溶解するまでボルテックスした。これを分割して液体窒素またはメタノール／ドライアイスで瞬間凍結した。次に１Ｍ  ＥＤＡＣおよび０．１Ｍスルホ−ＮＨＳ保存溶液が前記のように調製された。再懸濁で０．０５Ｍの最終濃度が得られるような容量で色素を含んでいる凍結試薬上へＥＤＡＣ溶液の一部を層積し、その間、ＥＤＡＣ添加で瞬間凍結が得られるようにチューブは凍結溶液に浸されている。０．００５Ｍの最終濃度が得られるような容量でチューブ内ですでに凍結した試薬の上面にスルホ−ＮＨＳ保存溶液を加え、その間、スルホ−ＮＨＳ試薬の急速な凍結が得られるようにチューブは凍結溶液に浸されている。凍結試薬は一夜凍結乾燥した。１．２／１のＦ／Ｐ比が得られるように水性ＳＡ溶液が作製され、凍結乾燥試薬を１ｍＬに再懸濁するために使用された。これらは室温で２時間反応させ、一夜４℃で保存した。得られた抱合体は前記のように精製した。
【００５９】
結合較差アッセイ  −  ５９０ｎｍ励起および６６０ｎｍ発光のフィルターの組を使用してＰＢＸＬ−３で前に説明したように行われた。
【００６０】
本発明で説明されたＮＨＳ／ＥＤＡＣ仲介架橋のための連続凍結法が同時混合法と十分に対照され、競合するビオチン存在下または不在下で、ＢＳＡビオチンプレートへのＡＰＣ標識ストレプトアビジンの首尾一貫した高い結合較差を与えた。トレハロースは−２０℃での１週間までの保存には必要ないようである。
【００６１】
【表７】
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【００６２】
実施例８．スルホ−ＮＨＳ／ＥＤＡＣを経た連続凍結法（発明）を使用するヤギ抗ウサギＩｇＧへのＰＢＸＬ−３（ＭＡＲＴＥＫ  ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ）の抱合
この実験において、ＰＢＸＬ−３は前記のように透析され、定量された。Ｄ−（＋）−トレハロース粉末は０．５Ｍトレハロースの最終濃度が得られるように３ｍｇ／ｍＬ  ＰＢＸＬ−３溶液に加えられた。混合物は粉末が溶解するまでボルテックスした。これを分割して液体窒素浴で瞬間凍結した。次に１Ｍ  ＥＤＡＣおよび０．１Ｍスルホ−ＮＨＳ保存溶液が前記のように調製された。再懸濁（１ｍＬ）で０．０５Ｍの最終濃度が得られるような容量で凍結色素溶液上面へＥＤＡＣ溶液の一部を層積し、その間、ＥＤＡＣ添加で瞬間凍結が得られるようにチューブは凍結溶液にまだ浸されている。０．００５Ｍの最終濃度が得られるような容量でチューブ内ですでに凍結した試薬の上面にスルホ−ＮＨＳ保存溶液を加え、その間、スルホ−ＮＨＳ試薬の急速な凍結が得られるようにチューブは凍結溶液に浸されている。凍結試薬は一夜凍結乾燥した。２／１のＦ／Ｐ比を与えるように水性ヤギ抗ウサギＩｇＧ溶液を作製し、凍結乾燥試薬の１ｍＬでの再懸濁に使用した。これらは室温で２時間反応させ、一夜４℃で保存した。得られた抱合体は前記のように精製した。
結合較差アッセイ  −  ５９０ｎｍ励起および６６０ｎｍ発光のフィルターの組を使用してＰＢＸＬ−３で前に説明したように行われた。
【００６３】
この連続法はこの実施例では最適化されてはいなかったが、市販品として入手可能な抗体をＰＢＸＬ色素に結合できることが示されている。これらの抱合体は機能結合アッセイに使用できるであろう。
【００６４】
【表８】
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実施例９．連続凍結法として構成されたスルホ−ＮＨＳ／ＥＤＡＣ化学を使用する再懸濁された凍結乾燥試薬への標的タンパク質（ストレプトアビジン）添加のための最適時間の決定
図２のデータは、連続凍結法において、何時抱合相手を添加するのが最適時間であるのかを決定するために使用された時間変化の例を示している。本方法の使用の容易さのための本質的な問題は、それが一工程で（溶液のタンパク質加えるとそれでお終い）できるか、あるいは再水和し最適な時間後に添加するかである。もし、結合相手を加える前に標識を最初に活性化しなければ、不適切な試薬の制限できない架橋が起こるかもしれないと考えられていたので、どのくらい良好に抱合体が生成できるかを見るためにこの実験が行われた。
【００６５】
結合較差アッセイ  −  結合アッセイは５９０ｎｍ励起および６６０ｎｍ発光のフィルターの組を使用してＰＢＸＬ−３で前に説明したように行われた。図２は連続的に凍結した試料を再水和して３０分以内に結合相手を加えることの重要性を示している。抱合効率は、結合相手の添加に先立って化学反応体およびＰＢＸＬ−３を溶液中に持続して保つことにより大いに影響される。興味あることに、３０分後（この時色素は完全に活性化されている）に結合相手を添加することと直後に結合相手を添加することの間には機能的効率において大きな増加は存在しなかった。このことは予期されなかったことであり、連続凍結法に非常に単純なフォーマットを提供する（標的タンパク質の水性懸濁液による再水和、インキュベート、精製および使用）。
【００６６】
溶液相化学反応体は、結合相手の添加に先立ってより長く待つほど無効になるので、液体材料を保存するフォーマットはこの型の反応には適していないであろう。２４時間後、反応性基はもはや機能していない。このデータは連続凍結法により提供されたＮＨＳ、ＥＤＡＣおよびＰＢＸＬ−３間の空間的または時間的分離の有用性を示しており、有用な抱合体を作製するための簡便で迅速な方法が提供されている。
【００６７】
実施例１０．連続凍結法を使用して生成されたＰＢＸＬ−３標識ストレプトアビジンの安定性
連続凍結法で生成された標識タンパク質に適切な安定性が存在するかどうかを決定するため、ＰＢＸＬ−３標識ストレプトアビジン抱合体の安定性が評価された。結合アッセイが前記のように行われたが、これらの抱合体の安定性をよりよく評価するために、各々の時間点でビオチン応答曲線が描かれた。図３は、１ヶ月の経過にわたって（１日、７日、２８日）再水和された連続凍結法の一実験で作製された３つの試料に対応している３つのビオチン用量応答曲線を示しており、再水和の日には同一のロットのストレプトアビジンに抱合させた。３つの実質的に重なっている遊離ビオチン用量応答曲線は、本発明により説明された凍結乾燥試薬の１ヶ月の保存時間を通してストレプトアビジンへのＰＢＸＬ−３の標識はかなり首尾一貫していることを示している。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は本発明の方法の一つの態様に含まれる工程を示している概要図である。
【図２】図２は抱合相手の添加時間を最適化するために使用された時間経過の例を示している棒グラフである。
【図３】図３は３つの時間点で活性化された色素により描かれたビオチン用量応答曲線を示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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