(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
鎖の還元末端においてアルドン酸へと選択的に酸化されている多糖類または多糖誘導体のアルドン酸エステルであって、
前記多糖類または多糖誘導体が澱粉画分の誘導体であり、該誘導体がヒドロキシエチル澱粉（ＨＥＳ）であり、
前記ヒドロキシエチル澱粉画分の平均分子量Ｍｗが２〜３０００００ダルトンであり、置換レベルＭＳが０．１〜０．８であり、無水グルコースの炭素原子Ｃ２およびＣ６上の置換基のＣ２／Ｃ６比が２〜１５であり、
アルドン酸エステルのアルコール成分を与えるアルコールが、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドまたはスルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドである、アルドン酸エステル。
【請求項２】
前記澱粉画分がアミロペクチン分解画分である、請求項１に記載のアルドン酸エステル。
【請求項３】
前記アミロペクチン分解画分が、ワキシーコーン澱粉の酸分解および／またはα−アミラーゼによる分解により得られるものである、請求項２に記載のアルドン酸エステル。
【請求項４】
前記澱粉画分の平均分子量Ｍｗが２０００〜５００００ダルトンであり、平均分岐度が５〜１０ｍｏｌ％α−１，６−グリコシド結合である、請求項３に記載のアルドン酸エステル。
【請求項５】
前記澱粉画分の平均分子量Ｍｗが２０００〜５００００ダルトンであり、平均分岐度が＞１０〜２５ｍｏｌ％α−１，６−グリコシド結合である、請求項３に記載のアルドン酸エステル。
【請求項６】
前記澱粉画分誘導体が、ワキシーコーン澱粉分解画分のヒドロキシエチル誘導体である、請求項１に記載のアルドン酸エステル。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の少なくとも一種類のアルドン酸エステルを含んでなる、固体。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の少なくとも一種類のアルドン酸エステルを含んでなる、溶液。
【請求項９】
少なくとも一種類の有機溶媒を含んでなる、請求項８に記載の溶液。
【請求項１０】
０．５重量％以下の水を含んでなる、請求項９に記載の溶液。
【請求項１１】
少なくとも一種類の非プロトン性溶媒を含んでなる、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の溶液。
【請求項１２】
前記溶媒が、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ−メチルピロリドン、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）および／またはジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を含んでなるものである、請求項１１に記載の溶液。
【請求項１３】
非プロトン性溶媒中で、少なくとも一種類のアルドン酸および／またはアルドン酸誘導体を、少なくとも一種類のアルコール成分と反応させる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のアルドン酸エステルを製造する方法。
【請求項１４】
前記アルコール成分が、前記アルドン酸および／またはアルドン酸誘導体に対して５〜５０倍モル過剰で使用される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
少なくとも一種類の活性化試薬を使用して反応が行なわれる、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記活性化試薬が、少なくとも一種類のカルボジイミドを含んでなるものである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記活性化試薬が、前記アルドン酸および／またはアルドン酸誘導体に対して１〜３モル過剰で使用される、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記アルドン酸またはアルドン酸誘導体と反応させるためのアルコール成分を遊離させる化合物が使用される、請求項１３〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
炭酸ジエステルが使用される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
０〜４０℃の範囲の温度で反応が行なわれる、請求項１３〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
低い塩基活性において反応が行なわれる、請求項１３〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の少なくとも一種類のアルドン酸エステルと、少なくとも１つのアミノ基を有する医薬有効成分とを反応させる、多糖類または多糖誘導体と遊離アミノ基上で結合した医薬有効成分を製造する方法。
【請求項２３】
水性媒体中で反応が行なわれる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記水性媒体のｐＨが７〜９である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
０℃〜４０℃の範囲の温度で反応が行なわれる、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記医薬有効成分がポリペプチドまたはタンパク質である、請求項２２〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
本発明は、アルドン酸エステル、これらのエステルを含んでなる固体および溶液、ならびにその製造法に関するものである。さらに、本発明は、前記アルドン酸エステルを用いて行われる、多糖類または多糖誘導体と遊離アミノ基上で結合した医薬有効成分を製造するための方法、およびこれらの方法により得られる医薬有効成分に関する。
【０００２】
医薬有効成分、特にタンパク質と、ポリエチレングリコール誘導体との複合体（「ＰＥＧ化」）、またはデキストランもしくは特にヒドロキシエチル澱粉（「ＨＥＳ化」）などの多糖類との複合体は、バイオテクノロジー研究による医薬タンパク質の増加に伴って、近年その重要性が高まってきている。
【０００３】
このようなタンパク質の生物学的半減期は短すぎることが多いが、特にＰＥＧまたはＨＥＳなどの上述の高分子化合物に結合させることにより延長することができる。しかし、この結合はまた、タンパク質の抗原特性に有益な影響を与え得る。他の医薬有効成分の場合、結合により水中での溶解性を大幅に高めることが可能である。
【０００４】
ＤＥ１９６２８７０５明細書およびＤＥ１０１２９３６９明細書には、無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中のヒドロキシエチル澱粉を、ヒドロキシエチル澱粉の相当するアルドノラクトンを介して、それぞれヘモグロビンおよびアムホテリシンＢの遊離アミノ基と結合させるための方法について記載されている。
【０００５】
特にタンパク質の場合、溶解性またはタンパク質変性の理由から、無水、非プロトン性溶媒を使用できないことが多いため、水性媒体中においてＨＥＳと結合させる方法も利用することができる。例えば、鎖の還元末端がアルドン酸へと選択的に酸化されているヒドロキシエチル澱粉の結合は、水溶性カルボジイミドＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）の媒介により可能である（ＰＣＴ／ＥＰ０２／０２９２８）。しかし、このカルボジイミドの使用は、カルボジイミドが副反応として高頻度にタンパク質の分子間または分子内架橋を起こすために、不利益をもたらす頻度が高い。
【０００６】
核酸のようなリン酸基を含む化合物の場合、リン酸基が同様にＥＤＣと反応するため、結合が不可能となることが多い(S.S. Wong, Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking, CRC-Press, Boca Raton, London, New York, Washington D.C., 1993, page 199)。
【発明の開示】
【０００７】
上述の先行技術に鑑み、本発明の基礎となる目的は、前記の不利点を回避しながら、特に、純粋な水性系もしくは水を含む溶媒混合物中で、多糖類またはその誘導体をアミノ基を含む有効成分、特にタンパク質、に結合させることを可能とする化合物を提供することである。
【０００８】
さらに、このような化合物が、共有結合による有効成分の多糖類または多糖誘導体への結合ができるだけ定量的となるような特性を有することを意図した。
【０００９】
本発明はさらに、できるだけ穏和な条件下において、多糖類またはその誘導体の有効成分への結合を可能とする化合物を提供することを目的とした。従って、特に、この反応は、有効成分の構造、活性および耐容性をできるだけ変化させないものとすることを意図した。例えば、分子内および分子間の架橋反応は避けなければならなかった。加えてまた、リン酸基を有する有効成分に結合できるものとすることを意図した。
【００１０】
従って、本発明はまた、有効成分にできるだけ選択的に結合できる化合物を提供することを目的とした。このように、特にその複合体に特有の化学量論的組成を調節することが可能で、特にこれらの化合物の使用により１：１の複合体の調製を可能にすることを意図した。
【００１１】
最後に、本発明は、このような化合物ならびに多糖類または多糖誘導体と有効成分との結合生成物を調製するための、できるだけ簡単でコスト効率の良い方法を提供することを目的とした。
【００１２】
これらの目的、および逐語的に言及はされないが本明細書中で論じられた文脈から自明であると推定し得るか、またはそれから自動的に明らかな他の目的は、請求項１に記載のアルドン酸エステルにより達成される。本発明のこれらアルドン酸エステルの好都合な修飾、および複合体調製法で用い得る安定なアルドン酸エステルは、請求項１を引用する従属請求項２〜１９により保護されている。
【００１３】
アルドン酸エステルの製造法については、請求項２０〜２８によりその目的が達成される。
【００１４】
請求項２９〜３４には、多糖−有効成分複合体の製造法およびこれらの方法により得られる医薬有効成分が記載されている。
【００１５】
鎖の還元末端においてアルドン酸へと選択的に酸化されている多糖類または多糖誘導体から得られるアルドン酸エステルの提供により、前述の目的を達成する化合物の提供が可能となる。このようなエステルは、活性化された酸であると考えることができる。それらは水性媒体中で求核性のＮＨ２基と反応して（より安定な）アミドを生じる。
【００１６】
さらに、本発明により、とりわけ以下に示す利点がもたらされる。
【００１７】
本発明によるアルドン酸エステルは、共有結合による有効成分の多糖または多糖誘導体への結合を容易に可能にする。
【００１８】
本発明によるアルドン酸エステルは、穏和な条件下で有効成分と反応させることができる。この場合、その反応により、特に有効成分の構造、活性および耐容性はわずかしか変化しない。このようにして、とりわけ、特に分子内および分子間架橋反応を回避することができる。さらなる可能性は、リン酸基を有する医薬有効成分に、それらの基を変化させることなく結合することである。
【００１９】
本発明によるアルドン酸エステルは、有効成分への選択性の高い結合を可能にする。さらに、例えば所望の複合体の特有の化学量論的組成を調節でき、これらの化合物を使用すれば、特に１：１の複合体の調製が可能となる。
【００２０】
本発明はさらに、活性化アルドン酸エステルならびに多糖類または多糖誘導体と有効成分との結合生成物を調製するための、簡単でコスト効率の良い方法を提供する。
【００２１】
本発明によるアルドン酸エステルは、鎖の還元末端において選択的に酸化され得る多糖類または多糖誘導体から得られる。このタイプの多糖類およびそれから得られる誘導体は、当技術分野でも広く知られており、商業的に入手可能である。多糖類は、多数の（最小で１０より多く、通常かなり多い）単糖分子（グリコース）が共にグリコシド結合した、高分子炭水化物である。好ましい多糖類の重量平均分子量は、好ましくは１５００〜１００００００ダルトンの範囲、特に好ましくは２０００〜３０００００ダルトン、さらに好ましくは２０００〜５００００ダルトンの範囲である。この分子量Ｍｗは常法により測定される。これらには、例えば水性ＧＰＣ、ＨＰＬＣ、光散乱などが含まれる。
【００２２】
とりわけ、多糖残基の分子量を介して体内滞留時間を変えることが可能である。
【００２３】
好ましい多糖類には、澱粉、および加水分解により得られる澱粉画分があり、該澱粉画分は澱粉分解産物と考えることができる。澱粉は、通常、分岐度の異なるアミロースおよびアミロペクチンに分けられる。本発明では、特にアミロペクチンが好ましい。
【００２４】
ここで、まず、アミロペクチンは、非常に一般的に、グルコース分子間のａ−（１−４）およびａ−（１−６）結合を有する枝分かれした澱粉または澱粉産物を意味する。鎖の枝分かれはａ−（１−６）結合を介しておこる。天然アミロペクチンにおいては、これらの枝分かれは約１５〜３０グルコースセグメント毎に不規則に存在する。天然アミロペクチンの分子量は非常に大きく、１０７〜２’１０８ダルトンの範囲である。アミロペクチンはまた、一定の制限の下でらせんを形成すると推測されている。
【００２５】
分岐度は、アミロペクチンについて定義することができる。分岐度の尺度は、分岐点（ａ−（１−６）結合）を有する無水グルコースの分子数の、アミロペクチン中の無水グルコース分子の総数に対する比であり、この比はｍｏｌ％で表される。天然アミロペクチンの分岐度は約４ｍｏｌ％である。アルドン酸エステルを調製するために好適に用いられるアミロペクチンは、５〜１０ｍｏｌ％の範囲の平均分岐度を有する。
【００２６】
さらに、天然のアミロペクチンにおいて知られる分岐度を大幅に上回る、高度に分岐したアミロペクチンを使用することも可能である。ここで、アミロペクチンは多分散物質であるため、分岐度はどの場合においても平均値（平均分岐度）である。
【００２７】
このような高分岐アミロペクチンは、非修飾アミロペクチンまたはヒドロキシエチル澱粉と比較して、分岐無水グルコースのｍｏｌ％として表される分岐度が非常に高く、従ってその構造はグリコーゲンにより類似している。
【００２８】
高分岐アミロペクチンの平均分岐度は、通常、＞１０〜２５ｍｏｌ％の範囲である。このことは、これらのアミロペクチンが平均的に約１０〜４グルコース単位毎にａ−（１−６）結合、すなわち分岐点を有することを意味する。医学領域で使用し得る好ましいアミロペクチンのタイプは、１１〜１６ｍｏｌ％の分岐度により特徴づけられる。
【００２９】
さらに好ましい高分岐アミロペクチンは、１３〜１６ｍｏｌ％の範囲の分岐度を有するものである。
【００３０】
本発明に使用し得るアミロペクチンは、好ましくは２０００〜８０００００ダルトン、特に２０００〜３０００００、特に好ましくは２０００〜５００００ダルトンの範囲の重量平均分子量Ｍｗを有するものである。
【００３１】
上記の澱粉は商業的に入手することができる。さらに、それらの単離については文献により公知となっている。このように、澱粉は、特にジャガイモ、タピオカ、キャッサバ、米、小麦またはトウモロコシから単離できる。これらの植物から得られた澱粉は、多くの場合、最初に加水分解反応に供される。この間、分子量は約２０００００００ダルトンから数百万ダルトンに減少し、さらに分解されて上記の分子量となることも同様に知られている。本発明によるアルドン酸エステルを調製するためには、とりわけ、ワキシーコーン澱粉分解画分を用いることができ、また、特に好ましい。
【００３２】
上記の高分岐澱粉画分は、とりわけドイツ特許出願第１０２１７９９４号明細書に記載されている。
【００３３】
さらに、本発明によるアルドン酸エステルを調製するために多糖類の誘導体を使用することも可能である。これらには、特に、上記の澱粉、特にアミロペクチン、のヒドロキシアルキル化により得られる、ヒドロキシアルキル澱粉、例えばヒドロキシエチル澱粉およびヒドロキシプロピル澱粉がある。これらの中では、ヒドロキシエチル澱粉（ＨＥＳ）が好ましい。
【００３４】
本発明に好適に用いられるＨＥＳは、ワキシーコーン澱粉の９５％を超えるグルコース高分子であるアミロペクチンのヒドロキシエチル化誘導体である。アミロペクチンは、ａ−１，４−グリコシド結合の形で存在し、ａ−１，６−グリコシド分岐を有するグルコース単位からなる。
【００３５】
ＨＥＳは有利なレオロジー特性を有し、現在臨床において血液希釈療法のための容量補充剤として使用されている（Sommermeyer et al., Krankenhauspharmazie, Vol. 8(8, 1987)pages 271-278 and Weidler et al., Arzneimitrelforschung/Drug Res., 41,(1991)pages 494-498）。
【００３６】
ＨＥＳは、本質的に、重量平均分子量Ｍｗ、数平均分子量Ｍｎ、分子量分布および置換レベルによって特徴づけられる。エーテル結合によるヒドロキシエチル基での置換は、この場合、無水グルコース単位の炭素原子２、３および６で可能である。この置換レベルは、これに関してグルコース単位総数に対する置換グルコース分子の比率に基づくＤＳ（「置換度」）として、またはグルコース単位あたりのヒドロキシエチル基の平均数を表すＭＳ（「モル置換」）として記述される。
【００３７】
置換レベルＭＳ（モル置換）は、無水グルコース単位あたりのヒドロキシエチル基の平均数として定義される。それは、例えばエーテル開裂、次いでそれにより形成されたヨウ化エチルとエチレンの定量的測定を行うＭｏｒｇａｎ法により、サンプル中のヒドロキシエチル基の総数から測定される。
【００３８】
これに対して、置換レベルＤＳ（置換度）は、すべての無水グルコース単位に対する置換無水グルコース単位の比率として定義される。これは、サンプルの加水分解後の非置換グルコース量を測定することにより決定できる。これらの定義から、ＭＳ＞ＤＳであることは明らかである。単置換のみが存在する場合は、各々の置換無水グルコース単位はただ１つのヒドロキシエチル基を持つことになり、ＭＳ＝ＤＳとなる。
【００３９】
ヒドロキシエチル澱粉残基は、好ましくは０．１〜０．８の置換レベルＭＳを有する。特に好ましいヒドロキシエチル澱粉残基は、０．４〜０．７の置換レベルＭＳを有する。
【００４０】
非置換無水グルコース単位中の個々のヒドロキシ基の、ヒドロキシエチル化に関する反応性は、反応条件により異なる。これにより、個々に異なって置換された無水グルコースが個々のポリマー分子において無作為に分布している置換パターンに対して、一定の制限の下で影響を及ぼすことが可能である。Ｃ２位およびＣ６位が優先的にヒドロキシエチル化されることは有利であり、Ｃ６位は、よりアクセスしやすいためにより頻繁に置換される。
【００４１】
本発明の目的のためには、Ｃ２位が優先的に置換され、しかもできるだけ均質的に置換されているヒドロキシエチル澱粉（ＨＥＳ）を使用するのが好ましい。このようなＨＥＳの調製は、ＥＰ０４０２７２４Ｂ２公報に記載されている。それらは生理的に合理的な時間内に完全に分解されるが、一方で、制御可能な排泄パターンは示さない。優先的なＣ２置換により、ａ−アミラーゼによるヒドロキシエチル澱粉の分解が比較的難しくなる。完全な分解性を確実なものとするために、可能ならば、ポリマー分子内に連続した置換無水グルコース単位が生じない方が有利である。さらに、このようなヒドロキシエチル澱粉は、置換度が低いにもかかわらず、水性媒体中での溶解性が十分高いために、その溶液もまた長期間安定であり、凝集体またはゲルは形成されない。
【００４２】
ヒドロキシエチル澱粉残基は、無水グルコース単位のヒドロキシエチル基に対して、好ましくは２〜１５の範囲のＣ２：Ｃ６置換比を有する。Ｃ２：Ｃ６置換比は、特に好ましくは３〜１１である。
【００４３】
前記の多糖類または多糖誘導体のアルデヒド基のアルドン酸への選択的酸化は、それ自体公知である。これは、穏和な酸化剤、例えばＤＥ１９６２８７０５Ａ１公報によればヨウ素／水酸化カリウム、または酵素により行なうことができる。
【００４４】
この遊離アルドン酸を反応に用いることができる。また、さらに塩類を用いることも可能である。これらには、特にアルカリ金属塩、例えばアルドン酸のナトリウム塩および／またはカリウム塩などがある。
【００４５】
本発明によるアルドン酸エステルを調製するために、アルコールが用いられる。このアルコールという用語には、ＨＯ基を有する化合物が含まれる。これらのＨＯ基は、とりわけ、窒素原子またはフェニルラジカルに結合していてもよい。
【００４６】
当技術分野で公知の酸性アルコールを用いるのが好ましい。これらには、とりわけ、Ｎ−ヒドロキシイミド類、例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミドおよびスルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、置換フェノール類、ならびにヒドロキシアゾール類、例えばヒドロキシベンゾトリアゾールが含まれ、特に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドおよびスルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドが好ましい。
【００４７】
さらに、本発明によるアルドン酸エステルを調製するために適した酸性アルコールは、文献に詳しく記載されている(V.H.L. Lee, Ed., Peptide and Protein Drug Delivery, Marcel Dekker, 1991, p.65)。
【００４８】
本発明の特定の態様では、そのＨＯ基のｐｋａが６〜１２の範囲、好ましくは７〜１１の範囲のアルコールが用いられる。この値は２５℃で測定された酸解離定数を表し、この値は文献において何度も引用されている。
【００４９】
このアルコールの分子量は、好ましくは８０〜５００ｇ／ｍｏｌ、特に１００〜２００ｇ／ｍｏｌである。
【００５０】
このアルコールは、反応混合物に遊離型として加えることができる。また、水を加えるとアルコールを放出する反応化合物、適当ならば酸触媒を使用することも可能である。
【００５１】
本発明の特定の態様では、前記アルドン酸またはアルドン酸塩との反応のために、炭酸ジエステル（carbonic diesters）が用いられる。これらの化合物は、反応を特に迅速かつ穏和なものとすることが可能であり、炭酸もしくは炭酸塩、アルコールおよび所望のアルドン酸エステルのみを形成する。
【００５２】
好ましい炭酸ジエステルは、とりわけ、Ｎ’Ｎ−スクシンイミジルカーボネートおよびスルホ−Ｎ’Ｎ−スクシンイミジルカーボネートである。
【００５３】
これらの炭酸ジエステルは、比較的少量で使用することができる。従って、この炭酸ジエステルは、前記アルドン酸および／またはアルドン酸塩に対して、１〜３モル過剰、好ましくは１〜１．５モル過剰で用いることができる。炭酸ジエステルを用いる場合の反応時間は比較的短い。従って、その反応は、多くの場合、２時間後、好ましくは１時間後には完了し得る。
【００５４】
アルドン酸エステルを得る反応は、好ましくは無水非プロトン性溶媒中で行う。水分含量は、好ましくは０．５重量％を超えず、特に好ましくは０．１重量％を超えてはならない。好適な溶媒は、とりわけ、ジメルチスルホキシド(ＤＭＳＯ)、Ｎ−メチルピロリドン、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）および／またはジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）である。
【００５５】
エステル化反応はそれ自体公知であり、いずれの方法を用いることも可能である。アルドン酸エステルを得る反応は、とりわけ、活性化化合物を用いて行なうことができる。このような方法では、遊離アルコールを用いることが望ましい。この活性化化合物には、特にカルボジイミド、例えばジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）および１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）などがある。
【００５６】
遊離アルコールを使用する場合、これはモル過剰で用いることができる。本発明の特定の態様では、このアルコール成分は、アルドン酸および／またはアルドン酸誘導体に対して、好ましくは５〜５０倍モル過剰、特に好ましくは８〜２０倍過剰で使用される。
【００５７】
アルドン酸エステルを得る反応は、穏和な条件下で進行する。従って、前記の反応は、好ましくは０℃〜４０℃、特に好ましくは１０℃〜３０℃の範囲の温度で行うことができる。
【００５８】
本発明の特定の態様では、この反応は、低い塩基活性（base activity）において行なわれる。低い塩基活性は、反応混合物を１０倍過剰量の水に添加することにより測定できる。この場合、添加する前の水のｐＨは２５℃で７．０であり、水は本質的にバッファーを含まない。反応混合物の塩基活性は、反応混合物添加後に２５℃におけるｐＨを測定することにより得られる。添加後の混合物のｐＨは、好ましくは９．０以下、特に好ましくは８．０以下、さらに好ましくは７．５以下である。
【００５９】
ＨＥＳ−アルドン酸の反応、例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミドとの反応は、水を除いた脱水ＤＭＡ中で、ＥＤＣを用いて室温で速やかに進行し、ＨＥＳ−酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを生じる。ここで、極度に過剰に存在する無水グルコースのＯＨ基とＥＤＣとの反応を通して、ＨＥＳ分子の副反応が起こらず、ＥＤＣとアルドン酸から最初に形成されたＯ−アシルイソ尿素がこれに相当するＮ−アシル尿素へ転位する反応が抑制されることは、特に驚くべきことである。
【００６０】
前記の反応により得られた溶液は、アルドン酸エステルを単離することなく、結合反応に用いることができる。非プロトン性溶媒中の予め活性化されたアルドン酸の容量は、通常はバッファー容量中に溶解させた標的タンパク質と比較して少なく、ほとんどの場合、非プロトン性溶媒の量は妨害効果を持たない。好ましい溶液は、少なくとも１０重量％のアルドン酸エステル、好ましくは少なくとも３０重量％のアルドン酸エステル、特に好ましくは少なくとも５０重量％のアルドン酸エステルを含む。
【００６１】
このアルドン酸エステルは、非プロトン性溶媒、例えばＤＭＡ中の溶液から、既知の沈殿剤、例えば無水エタノール、イソプロパノールまたはアセトンにより沈殿させることができ、この手順を２回以上繰り返すことにより精製することができる。好ましい固体は、少なくとも１０重量％のアルドン酸エステル、好ましくは少なくとも３０重量％のアルドン酸エステル、特に好ましくは５０重量％のアルドン酸エステルを含む。
【００６２】
次いで、このようなアルドン酸エステルは、結合、例えばＨＥＳ化のための物質として単離できる。この間、前記のＥＤＣ−活性化酸との副反応は起こらない。
【００６３】
結合のためには、さらに、活性化アルドン酸溶液を、好ましくは好適なｐＨで緩衝化された医薬有効成分の水溶液に添加することができる。医薬有効成分は、反応によりアルドンアミドを生じ得る少なくとも１つのアミノ基を含む。好ましい有効成分には、タンパク質およびペプチドがある。
【００６４】
反応のｐＨは、有効成分の特性に依存する。ｐＨは、可能ならば、７〜９の範囲、特に７．５〜８．５が好ましい。
【００６５】
制限されるものではないが、一般に、結合は０℃〜４０℃の範囲、好ましくは１０℃〜３０℃の範囲の温度で起こる。反応時間は好適な方法により容易に確認できる。一般に、反応時間は１時間〜１００時間、好ましくは２０時間〜４８時間の範囲である。
【００６６】
アルドン酸エステルは、医薬有効成分に対して過剰量で用いることができる。アルドン酸エステルは、医薬有効成分に対して、好ましくは１〜５倍モル過剰、特に好ましくは１．５〜２倍過剰で用いられる。
【００６７】
本質的に、前記反応における唯一の副産物はアルコール、例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミドであり、例えば限外濾過により、容易に結合生成物から分離できる。起こり得る副反応は水による遊離酸および遊離アルコールへの加水分解である。従って、特に驚くべきは、本発明によるアルドン酸エステルの大部分が医薬有効成分と結合反応することである。これは実施例、特に図に示したクロマトグラムからも明らかである。
【００６８】
以下の実施例および比較例により、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に制限されるものではない。
【実施例および調製方法】
【００６９】
実施例１
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドを用いるＨＥＳ−１０／０．４−酸エステルの調製
ＤＥ１９６２８７０５公報に従って鎖の還元末端が選択的に酸化されている、平均分子量Ｍｗ＝１００００ダルトンおよび置換レベルＭＳ＝０．４を有する乾燥ヒドロキシエチル澱粉５ｇを、４０℃にて３０ｍｌの脱水ジメチルアセトアミドに溶解し、溶液を冷却後、１０倍モル量のＮ−ヒドロキシスクシンイミドを、水分を排除して添加する。次いで、ＨＥＳ酸と等モルのＥＤＣを少量ずつ加え、その反応混合物を、添加後２４時間、反応が完了するまで反応させる。次に、その反応生成物を脱水アセトンで沈殿させ、再沈殿を繰り返して精製する。
【００７０】
実施例２
Ｈｅｓ１０／０．４−酸結合ミオグロビンの調製
１５ｍｇのミオグロビンを２０ｍｌの蒸留水に溶解し、水酸化ナトリウム溶液を用いてｐＨを７．５に調整する。実施例１で調製したＨＥＳ１０／０．４−酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド１．５ｇを、その溶液に１時間かけて少量ずつ添加し、水酸化ナトリウム溶液を加えることによりｐＨを７．５で一定に保つ。
【００７１】
この溶液を攪拌しながら一晩放置する。
【００７２】
ＨＥＳ化ミオグロビンの形成は、ゲル浸透クロマトグラフィーにより測定したところ、収率は用いたミオグロビンに対して７０％である。
【００７３】
実施例３
Ｎ’Ｎ−ジスクシンイミジルカーボネートを用いるＨＥＳ１０／０．４−酸エステルの調製
０．０２ｍｍｏｌ（０．１４ｇに相当）の乾燥ＨＥＳ／０．４−酸を、２ｍｌの脱水ジメチルホルムアミドに、水分を排除して溶解させる。０．０２ｍｍｏｌのＮ’Ｎ−ジスクシンイミジルカーボネートをその溶液に添加し、室温にて１時間攪拌して反応を完了させる。
【００７４】
実施例４
ＨＥＳ１０／０．４−酸とウシ血清アルブミンとの結合生成物の調製
５０ｍｇのウシ血清アルブミン（０．７ｍｍｏｌに相当するＢＳＡ）を、ｐＨ８．４の０．３モル濃度（molar）の重炭酸塩溶液６ｍｌに溶解させる。実施例３から得られる混合物をこの溶液に添加し、室温にて２時間攪拌して反応を完了させる。
【００７５】
この反応が達成されたことは、多様な検出系（ＵＶ２８０ｎｍ、ＭＡＬＬＳ光散乱検出器（ＭＡＬＬＳ＝多角度レーザー光散乱）、ＲＩ検出器）を備えた低圧ＨＰＧＰＣにより実証する。
【００７６】
図１〜４に、未反応ＨＥＳ１０／０．４−スクシンイミジルエステル、開始物質ＢＳＡおよび反応混合物のクロマトグラムを比較のために示す。
【００７７】
反応の成功は、２８０ｎｍで検出される、ＢＳＡピークの大幅な減少と、より分子量の大きなピークの出現から明らかである。
【００７８】
実施例５
Ｎ’Ｎ−ジスクシンイミジルカーボネートを用いるＨＥＳ５０／０．７−酸エステルの調製
０．０２ｍｍｏｌ（０．５ｇ）の乾燥ＨＥＳ５０／０．７−酸を、２ｍｌの脱水ジメチルホルムアミドに、水分を排除して溶解させる。０．０２ｍｍｏｌのＮ’Ｎ−ジスクシンイミジルカーボネートをこの溶液に添加し、室温にて１時間攪拌して反応を完了させる。
【００７９】
実施例６
ＢＳＡを用いるＨＥＳ５０／０．７結合生成物の調製
５０ｍｇのウシ血清アルブミンＢＳＡ（０．７ｍｍｏｌ）を、ｐＨ８．４の０．３モル濃度（molar）の重炭酸塩溶液６ｍｌに溶解させる。実施例５から得られる活性化ＨＥＳ５０／０．７−酸の溶液をこの溶液に添加し、室温にて２時間攪拌して反応を完了させる。
【００８０】
反応混合物の分析モニタリングは、実施例４に記載の３つの検出系を備えた低圧ＨＰＧＰＣを用いて行なう。
【００８１】
反応の成功は、２８０ｎｍにおける未反応ＢＳＡのシグナルの減少、およびこれに対応するより高分子量へシフトした結合生成物のシグナルの出現から明らかである。ＨＥＳ酸の分子量が大きいために、このシフトは実施例４で見られるものよりも大きい。
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１】未反応ウシアルブミン（ＢＳＡ）のＭＡＬＬＳ−ＧＰＣクロマトグラム。単量体および二量体アルブミンが明確に分離されている。
【図２】未反応ＨＥＳ−１０／０．４−スクシンイミジルエステルのＭＡＬＬＳ−ＧＰＣクロマトグラム。
【図３】ＨＥＳ−１０／０．４−スクシンイミジルエステルとＢＳＡとの反応生成物のＭＡＬＬＳ−ＧＰＣクロマトグラム。示されたシグナルは、屈折指数（ＲＩ）の３倍検出、ＵＶ検出器および９０°における光散乱のものである。
【図４】時間に対して分子質量を表した、ＨＥＳ−１０／０．４−スクシンイミジルエステルとＢＳＡとの反応生成物のＭＡＬＬＳ−ＧＰＣクロマトグラム。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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