(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１もしくは配列番号２で示されるアミノ酸配列、又は配列番号１もしくは配列番号２で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる有機陰イオントランスポーターをコードするヌクレオチドを含むヌクレオチド製剤であって、導入した宿主細胞表面でジカルボン酸トランスポーターと共に発現させて、当該細胞に対して、有機アニオンとジカルボン酸との交換輸送能を付与するための、有機陰イオントランスポーターをコードするヌクレオチドを含むヌクレオチド製剤。
【請求項２】
発現プラスミドである請求項１記載のヌクレオチド製剤。
【請求項３】
請求項１又は２記載のヌクレオチド製剤が導入された形質転換細胞であって、当該細胞表面で有機陰イオントランスポーターと共にジカルボン酸トランスポーターが発現し、かつ有機アニオンとジカルボン酸との交換輸送能を有している形質転換細胞。
【請求項４】
請求項３に記載の形質転換細胞に対して被検物質を作用させ、当該細胞が有する有機陰イオンとジカルボン酸との交換輸送能力を観察する工程を含む、被検物質の有機陰イオントランスポーターに対する基質としての作用を検定する方法。
【請求項５】
請求項３に記載の形質転換細胞に対して被検物質を作用させ、当該細胞が有する有機陰イオンとジカルボン酸との交換輸送能力に対する被検物質の作用を検定する工程を含む、腎毒性を防止するための薬物をスクリーニングする方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は有機陰イオンの輸送に関与する遺伝子と、その遺伝子がコードするポリペプチドに関する。
【０００２】
【従来の技術】
腎臓は、生体異物や薬物の体外への排出に関して、重要な役割を果たしている。アニオン性の薬物は、担体を介した経路で腎臓近位尿細管から尿中へ排出されている。このような有機陰イオンの排出は、尿細管細胞がその側底膜を介して、有機陰イオンを尿細管周囲の血液から取り込むことから始まる。
【０００３】
側底膜における有機陰イオンの取り込みについては、例えば基質の有機陰イオンとしてパラアミノ馬尿酸を使い、摘出臓器かん流法や単離細胞膜小胞系などを用いた実験により研究されてきた。この研究の中で、有機陰イオンの取り込みには、有機陰イオントランスポーターが関与していること、また、側底膜における有機陰イオンの取り込みは、有機アニオンとジカルボン酸の交換輸送体によって介されると考えられてきた。
【０００４】
しかし、従来の手法では、尿細管における輸送機構の詳細、例えばトランスポーター間での輸送のネットワークや腎排泄過程における薬物間の相互作用などを解析することは困難であり、有機陰イオントランスポーターの遺伝子を単離して詳細な機能解析を可能とすることが望まれていた。
【０００５】
肝臓で発現している有機陰イオントランスポーター遺伝子については、種々の分子種がクローニングされている〔Hagenbuchら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第88巻、10629頁、1991年およびJacqueminら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第91巻、133頁、1994年〕。また、腎臓および肝臓に発現する有機陽イオントランスポータの一つであるＯＣＴ１の遺伝子クローニンングが報告されている〔Grundemannら、Nature、第372巻、549頁、1994年〕。
【０００６】
また、ジカルボン酸のトランスポーターとして、腎臓のナトリウム依存性ジカルボン酸トランスポーター（ＮａＤＣ−１）の遺伝子クローニングが報告されている〔Pajorら、J.Biol.Chem.、第270巻、5779頁、1995年〕。
【０００７】
また、最近、ナトリウム非依存性ラット肝有機陰イオントランスポータ（oatp）の類縁遺伝子として、ラットの腎尿細管に局在する有機陰イオントランスポータＯＡＴ−Ｋ１の遺伝子のクローニングが報告された〔Saitoら、J.Biol.Chem.、第270巻、20719頁、1996年〕。しかしながら、このＯＡＴ−Ｋ１については、その輸送機構が、有機アニオンとジカルボン酸の交換輸送によるものであるとは確認されていない。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、腎臓における有機陰イオン輸送に関与する新規な有機陰イオントランスポーター遺伝子及びその遺伝子がコードするポリペプチドである有機陰イオントランスポーターを提供することにある。その他の目的については、以下の記載より明らかである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ラット腎臓細胞から、有機陰イオンを輸送する能力を有する新規タンパク質の遺伝子をクローニングし、さらにヒトの相同遺伝子（ホモログ）をクローニングした。さらに、これら遺伝子の産物をアフリカツメガエルの卵母細胞中で発現させて有機陰イオンの輸送能を確認することに成功し、本発明を完成するにいたった。
【００１０】
すなわち、本発明は、以下の（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）及び（Ｄ）から選択されるタンパク質である。
（Ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ有機陰イオンを輸送する能力を有するタンパク質。
（Ｃ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｄ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ有機陰イオンを輸送する能力を有するタンパク質。
【００１１】
また、本発明は、以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）から選択されるＤＮＡからなる遺伝子である。
（ａ）配列番号１で示される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｂ）配列番号１で示される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ有機陰イオンを輸送する能力を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｃ）配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｄ）配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ有機陰イオンを輸送する能力を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００１２】
本発明の有機陰イオンを輸送する能力を有する新規タンパク質、すなわち有機陰イオントランスポーター（ＯＡＴ１：Organic Anion Transporter 1）は、生体内においては腎臓の尿細管で主に発現している。
【００１３】
また、有機陰イオントランスポーターＯＡＴ１は、その有機陰イオン輸送能（発現細胞への有機陰イオン取り込み）が細胞内ジカルボン酸の存在によって活性化される。このことから、有機アニオンとジカルボン酸の交換輸送を行うトランスポーターであると考えられる。また、交換輸送に際しては、ＯＡＴ１によって有機陰イオンと交換に細胞外にだされるジカルボン酸は、ナトリウム依存性ジカルボン酸トランスポーター（ＮａＤＣ−１）によって細胞に取り込まれ、リサイクルされると考えられる。
【００１４】
また、本発明の有機陰イオントランスポーターＯＡＴ１は、環状塩基、プロスタグランジン、尿酸のほか、抗生物質、非ステロイド系抗炎症薬、利尿薬、抗腫瘍薬等種々の異なる構造を持った薬物に対してこれらを輸送する（取り込む）能力を有する、非常に広い範囲の基質選択性を有するものである。
【００１５】
また、本発明の有機陰イオントランスポーターＯＡＴ１は、既に報告されているラット腎の有機陰イオントランスポータＯＡＴ−Ｋ１とは、相同性がなく、全く別の分子種であると考えられる。
【００１６】
【発明の実施の形態】
後記配列表の配列番号１は、ラットの腎臓由来の有機陰イオントランスポーター（ラットＯＡＴ１）の遺伝子の全長ｃＤＮＡ塩基配列（約２．２ｋｂｐ）、及びその翻訳領域にコードされたタンパク質のアミノ酸配列（５５１アミノ酸）を表す。
【００１７】
配列番号２は、ヒトの腎臓由来の有機陰イオントランスポーター（ヒトＯＡＴ１）の遺伝子の全長ｃＤＮＡ塩基配列（約２．２ｋｂｐ）、及びその翻訳領域にコードされたタンパク質のアミノ酸配列（５６３アミノ酸）を表す。
【００１８】
前記配列番号１及び２に示される塩基配列もしくはアミノ酸配列ついて、既知ＤＮＡデータベース（ＧｅｎＢａｎｋおよびＥＭＢＬ）及びプロテインデータベース（ＮＢＲＦ及びＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ）に含まれる全ての配列に対してホモロジー検索を行った結果、一致するものはなく、これら配列は、新規なものであると考えられる。
【００１９】
本発明のタンパク質としては、配列番号１又は２で示されたアミノ酸配列を有するもののほか、例えば配列番号１又は２で示されたアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有するものが挙げられる。アミノ酸の欠失、置換もしくは付加は、有機陰イオン輸送活性が失われない程度であればよく、通常１〜約１１０個、好ましくは１〜約５５個である。このようなタンパク質は、配列番号１又は２で示されたアミノ酸配列と通常、８０％以上、好ましくは９０％以上のアミノ酸配列のホモロジーを有する。
【００２０】
また、本発明の遺伝子としては、配列番号１又は２で示された塩基配列を有するＤＮＡを含むもののほか、配列番号１又は２で示された塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るＤＮＡを含むものが挙げられる。このようにハイブリダイズし得るＤＮＡは、そのＤＮＡにコードされるタンパク質が有機陰イオンを輸送する能力を有するものであればよい。このようなＤＮＡは、配列番号１又は２で示された塩基配列と、通常、７０％以上、好ましくは８０％以上の塩基配列のホモロジーを有する。このようなＤＮＡとしては、自然界で発見される変異型遺伝子、人為的に改変した変異型遺伝子、異種生物由来の相同遺伝子等が含まれる。
【００２１】
本発明において、ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションは、通常のストリンジェントな条件（ローストリンジェントな条件）では、ハイブリダイゼーションを、５ｘＳＳＣ又はこれと同等の塩濃度のハイブリダイゼーション溶液中、３７−４２℃の温度条件下、約１２時間行い、５ｘＳＳＣ又はこれと同等の塩濃度の溶液等で必要に応じて予備洗浄を行った後、１ＸＳＳＣ又はこれと同等の塩濃度の溶液中で洗浄を行うことにより実施できる。また、より高いストリンジェンシーを有する条件（ハイストリンジェントな条件）では、前記において、洗浄を０．１ｘＳＳＣ又はこれと同等の塩濃度の溶液中で行うことにより実施できる。
【００２２】
本発明の有機陰イオントランスポーター遺伝子は、適当な哺乳動物の腎臓の組織や細胞を遺伝子源として用いてスクリーニングを行うことにより単離取得できる。哺乳動物としては、イヌ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、サル、ブタ、ウサギ、ラット及びマウスなどの非ヒト動物のほか、ヒトが挙げられる。
【００２３】
遺伝子のスクリーニング及び単離は、発現クローニング法（Expression Cloning）などにより好適に実施できる。
【００２４】
例えば、ラット腎臓組織を遺伝子源として用い、これからｍＲＮＡ（ポリ（Ａ）+ＲＮＡ）を調製する。これを、分画し、各画分について、ラットナトリウム依存性ジカルボン酸塩トランスポーター（ｒＮａＤＣ−１）のｃＲＮＡとともに、アフリカツメガエルの卵母細胞に導入する。
【００２５】
ＮａＤＣ−１遺伝子のｃＤＮＡはすでに報告されている〔Pajorら、J.Biol.Chem.、第270巻、5779頁、1995年〕ので、この配列情報から、ＰＣＲ法などを用いて、容易にＮａＤＣ−１遺伝子のｃＤＮＡを得ることが可能である。得られたＮａＤＣ−１ｃＤＮＡから、Ｔ３又はＴ７ＲＮＡポリメラーゼ等を用いて、これに相補的なＲＮＡ（ｃＲＮＡ）（キャップ化されたもの）を合成できる。
【００２６】
ｍＲＮＡと、ＮａＤＣ−１ｃＲＮＡを導入した卵母細胞について、例えばパラアミノ馬尿酸などを基質（有機陰イオン）として、細胞内への基質の輸送（取込み）を測定し、高い取り込みを示したｍＲＮＡの画分を選択することにより、ＯＡＴ１のｍＲＮＡを濃縮できる。この濃縮されたｍＲＮＡをもとに、ｃＤＮＡライブラリを作製する。ライブラリのｃＤＮＡから、ｃＲＮＡ（キャップ化されたもの）を調製し、各々のクローンについて、前記と同様にして、ＮａＤＣ−１ｃＲＮＡとともに卵母細胞に導入し、基質の取り込み活性を指標として、陽性クローンを選択することにより、ＯＡＴ１遺伝子のｃＤＮＡを含むクローンを得ることができる。
【００２７】
得られたｃＤＮＡについては、常法により塩基配列を決定し、翻訳領域を解析して、これにコードされるタンパク質、すなわち、ＯＡＴ１のアミノ酸配列を決定することができる。
【００２８】
得られたｃＤＮＡが、有機陰イオントランスポーター遺伝子のｃＤＮＡであること、すなわち、ｃＤＮＡにコードされた遺伝子産物が有機陰イオントランスポーターであることは、例えば次のようにして検証することができる。すなわち、得られたＯＡＴ１遺伝子のｃＤＮＡから調製したｃＲＮＡを卵母細胞内に導入して発現させ、有機陰イオンを細胞内へ輸送する（取り込む）能力を、前記と同様、適当な有機陰イオンを基質とする通常の取込み試験（Kanai and Hediger、Nature、第360巻、467-471頁、1992年）により、細胞内への基質の取り込みを測定することにより確認できる。
【００２９】
また、発現細胞について、同様の取り込み実験を応用して、ＯＡＴ１の特性、例えば、ＯＡＴ１がジカルボン酸との交換輸送を行っているという特性や、ＯＡＴ１の基質特異性などを調べることができる。
【００３０】
得られたＯＡＴ１遺伝子のｃＤＮＡを用いて、異なる遺伝子源で作製された適当なｃＤＮＡライブラリー又はゲノミックＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、異なる組織、異なる生物由来の相同遺伝子や染色体遺伝子等を単離することができる。
【００３１】
また、開示された本発明の遺伝子の塩基配列（配列番号１および２に示された塩基配列、もしくはその一部）の情報に基づいて設計された合成プライマーを用い、通常のＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法によりｃＤＮＡライブラリー又はゲノミックＤＮＡライブラリーから遺伝子を単離することができる。
【００３２】
ｃＤＮＡライブラリー及びゲノミックＤＮＡライブラリー等のＤＮＡライブラリーは、例えば、「モレキュラークローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）」［Sambrook, J.,  Fritsch, E.F.及びManiatis, T. 著、Cold Spring Harbor Laboratory Pressより1989年に発刊］に記載の方法により調製することができる。あるいは、市販のライブラリーがある場合はこれを用いてもよい。
【００３３】
本発明の有機陰イオントランスポーター（ＯＡＴ１）は、例えば、有機陰イオントランスポーターをコードするｃＤＮＡを用い、遺伝子組換え技術により生産することができる。例えば、有機陰イオントランスポーターをコードするＤＮＡ（ｃＤＮＡ等）を適当な発現ベクターに組み込み、得られた組換えＤＮＡを適当な宿主細胞に導入することができる。ポリペプチドを生産するための発現系（宿主−ベクター系）としては、例えば、細菌、酵母、昆虫細胞および哺乳動物細胞の発現系等が挙げられる。このうち、機能タンパクを得るためには、昆虫細胞および哺乳動物細胞を用いることが好ましい。
【００３４】
例えば、ポリペプチドを哺乳動物細胞で発現させる場合には、有機陰イオントランスポーターをコードするＤＮＡを、適当な発現ベクター（例えば、レトロウイルス系ベクター、パピローマウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ＳＶ４０系ベクター等）中の適当なプロモーター（例えば、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、エロンゲーション１αプロモーター等）の下流に挿入して発現ベクターを構築する。次に、得られた発現ベクターで適当な動物細胞を形質転換し、形質転換体を適当な培地で培養することによって、目的とするポリペプチドが生産される。宿主とする哺乳動物細胞としては、サルＣＯＳ−７細胞、チャイニーズハムスターＣＨＯ細胞、ヒトＨｅＬａ細胞又は、腎臓組織由来の初代培養細胞やブタ腎由来ＬＬＣ−ＰＫ１細胞、フクロネズミ腎由来ＯＫ細胞等の細胞株等が挙げられる。
【００３５】
有機陰イオントランスポーターＯＡＴ１をコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号１及び２に示される塩基配列を有するｃＤＮＡを用いることができるほか、前記のｃＤＮＡ配列に限定されることなく、アミノ酸配列に対応するＤＮＡを設計し、ポリペプチドをコードするＤＮＡとして用いることもできる。この場合、ひとつのアミノ酸をコードするコドンは各々１〜６種類知られており、用いるコドンの選択は任意でよいが、例えば発現に利用する宿主のコドン使用頻度を考慮して、より発現効率の高い配列を設計することができる。設計した塩基配列を持つＤＮＡは、ＤＮＡの化学合成、前記ｃＤＮＡの断片化と結合、塩基配列の一部改変等によって取得できる。人為的な塩基配列の一部改変、変異導入は、所望の改変をコードする合成オリゴヌクレオチドからなるプライマーを利用して部位特異的変異導入法（site specific mutagenesis）［Mark, D. F. et al.、Proceedings of National Academy of Sciences、第81巻、第5662〜5666頁（1984年）］ 等によって実施できる。
【００３６】
本発明の有機陰イオントランスポーター遺伝子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド（オリゴヌクレオチドもしくポリヌクレオチド）は、有機陰イオントランスポーター遺伝子を検出するためのプローブとして使用できるほか、有機陰イオントランスポーター遺伝子の発現を変調させるために、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチドや、リボザイム、デコイとして使用することもできる。このようなヌクレオチドとしては、例えば、配列番号１又は２で示される塩基配列の中の通常、連続する１４塩基以上の部分配列もしくはその相補的な配列を含むヌクレオチドを用いることができ、ハイブリダイズをより特異的とするためには部分配列としてより長い配列、例えば２０塩基以上あるいは３０塩基以上の配列を用いてもよい。
【００３７】
また、本発明の有機陰イオントランスポーター又はこれと免疫学的同等性を有するポリペプチドを用いて、その抗体を取得することができ、抗体は、有機陰イオントランスポーターの検出や精製などに利用できる。抗体は、本発明の有機陰イオントランスポーター、その断片、またはその部分配列を有する合成ペプチド等を抗原として用いて製造できる。ポリクローナル抗体は、宿主動物（例えば、ラットやウサギ等）に抗原を接種し、免疫血清を回収する、通常の方法により製造することができる。また、モノクローナル抗体は、通常のハイブリドーマ法などの技術により製造できる。
【００３８】
以下、実施例をもって本発明をさらに詳しく説明するが、これらの実施例は本発明を制限するものではない。
【００３９】
なお、下記実施例において、各操作は特に明示がない限り、「モレキュラークローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）」［Sambrook, J.,  Fritsch, E.F.及びManiatis, T. 著、Cold Spring Harbor Laboratory Pressより1989年に発刊］に記載の方法により行うか、または、市販の試薬やキットを用いる場合には市販品の指示書に従って使用した。
【００４０】
【実施例】
実施例１  ラット有機陰イオントランスポーターのクローニング
（１）ラットジカルボン酸塩トランスポーターｃＤＮＡの単離とｃＲＮＡの調製ｃＤＮＡライブラリーは、ラットポリ(A)+RNAから、ｃＤＮＡ合成用キット（商品名：SuperScript Choice System、ギブコ社製）を使用して作成し、ファージベクターλＺｉｐｌｏｘ（ギブコ社製）の制限酵素ＥｃｏＲＩ切断部位に組み込んだ。ＰＣＲ法にて、ウサギのナトリウム依存性ジカルボン酸トランスポーターＮａＤＣ−１遺伝子〔Pajorら、J.Biol.Chem.、第270巻、5779頁、1995年〕の第１３２３−１７６３番目の塩基に相当するセグメントを32Ｐ−ｄＣＴＰでラベルし、これをプローブとして用いて、ラットのｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。ハイブリダイゼーションは、３７℃のハイブリダイゼーション用溶液中で一晩行い、フィルター膜は、３７℃で０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで洗浄した。ハイブリダイゼーション用溶液としては、５×ＳＳＣ、３×デンハード液（Ｄｅｎｈａｒｄ’ｓ液）、０．２％  ＳＤＳ、１０％硫酸デキストラン、５０％ホルムアミド、  ０．０１％Ａｎｔｉｆｏｒｍ  Ｂ（商品名、シグマ社製）（消泡剤）、０．２ｍｇ／ｍｌ  サーモン精子変性ＤＮＡ、２．５ｍＭ  ピロリン酸ナトリウム、２５ｍＭ  ＭＥＳを含むｐＨ６．５の緩衝液を用いた。λＺｉｐｌｏｘファージに組込まれたｃＤＮＡ部分を、塩基配列決定のために、プラスミドｐＺＬ１に組み込み、さらにプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ−（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）へサブクローン化した。
【００４１】
上記により得られたラットジカルボン酸塩トランスポーターのｃＤＮＡを含むプラスミドから、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いて、ｃＲＮＡ（ｃＤＮＡに相補的なＲＮＡ）を調製した。
【００４２】
得られたｃＲＮＡを、金井らの方法（Kanai and Hediger、Nature、第360巻、第467-471頁、1992年）に準じて、アフリカツメガエルの卵母細胞に注入し、この卵母細胞について、基質としてグルタル酸を用いる取り込み実験を行った。実験には、放射能ラベルした基質（14C-グルタル酸）を用い、また取り込み溶液として、ナトリウムイオンの影響を調べるためのナトリウムの取り込み溶液（９６ｍＭ塩化ナトリウム、２ｍＭ塩化カリウム、１．８ｍＭ塩化カルシウム、１ｍＭ塩化マグネシウム、５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）、塩化コリンイオンの影響を調べるための塩化コリン取り込み溶液（９６ｍＭ塩化コリン、２ｍＭ塩化カリウム、１．８ｍＭ塩化カルシウム、１ｍＭ塩化マグネシウム、５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）を用い、これらに14C-グルタル酸を１ｍＭ濃度で添加して試験液とした。コントロールにはＲＮＡを注入しない卵母細胞を用いた。
【００４３】
その結果を図１に示す。図１から明らかなように、塩化コリン取り込み溶液ではｒＮａＤＣ−１のｃＲＮＡを注入した卵母細胞とコントロールのいずれにおいてもグルタル酸の取り込みが認められなかった。これに対し、ナトリウム取り込み溶液ではｒＮａＤＣ−１のｃＲＮＡを注入した卵母細胞において著しいグルタル酸の取り込みが認められた。すなわちグルタミン酸の取り込みがナトリウム依存性であることが示され、クローニングしたｃＤＮＡがラットジカルボン酸塩トランスポーター遺伝子のものであることが確認できた。
【００４４】
（２）ラット腎臓有機陰イオントランスポーターＯＡＴ１のクローニング
金井らの方法（Kanai and Hediger、Nature、第360巻、第467-471頁、1992年）に準じて、発現クローニング法により以下のようにして行った。
【００４５】
ゲル電気泳動によりラット腎臓ポリ（Ａ）+ＲＮＡ  ４００μｇを分画した。
【００４６】
分画により得られた各画分を、上記（１）で得られたラットジカルボン酸塩トランスポーターのｃＲＮＡと共に卵母細胞に注入した。卵母細胞は、基質として１ｍＭ  グルタル酸を含むナトリウム取り込み溶液［９６ｍＭ  塩化ナトリウム、２ｍＭ  塩化カリウム、１．８ｍＭ  塩化カルシウム、１ｍＭ  塩化マグネシウム、５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４］中にて予め２時間前培養したものを用いた。
【００４７】
ＲＮＡ注入した卵母細胞について、基質としてパラアミノ馬尿酸（以下ＰＡＨと略す。）を用い、基質の取り込み実験を金井らの方法（Kanai and Hediger、Nature、第360巻、第467-471頁、1992年）に準じて、以下のようにして行った。基質として14Ｃ−ＰＡＨ（５０μＭ）を含みグルタル酸を含まないナトリウム取り込み溶液中にて１時間卵母細胞を培養して、細胞内に取り込まれた放射能のカウントで基質の取り込み率を測定した。その結果、図２に示すように、この系において、ラット腎臓のポリ(A)+RNA（mRNA）だけを注入した卵母細胞、および、ラットジカルボン酸塩トランスポーターのcRNAのみを注入した卵母細胞では、ＰＡＨの取り込みは見られなかったのに対して、ラット腎臓のポリ(A)+RNAとラットジカルボン酸塩トランスポーターのcRNAの両者を注入した卵母細胞ではＰＡＨの取り込みが認められることを確認した。コントロールにはＲＮＡを注入しない卵母細胞を用いた。
【００４８】
分画により得られた各ＲＮＡ画分のうちＲＮＡを注入した卵母細胞が、最も高いＰＡＨの取り込み率を示した画分を選択した。この画分のポリ(A)+RNA（１．８〜２．４ｋｂ）について、ｃＤＮＡ合成及びプラスミドクローニング用キット（商品名：Superscript Plasmid System、ギブコ社製）を使用して、ｃＤＮＡのライブラリーを作成した。これらＤＮＡはプラスミドｐＳＰＯＲＴ１（ギブコ社製）の制限酵素ＳａｌＩ及びＮｏｔＩ認識部位に組み込み、得られた組換えプラスミドＤＮＡを大腸菌ＤＨ１０Ｂ株のコンピテントセル（商品名：Electro Max DH10B Competent cell、ギブコＢＲＬ社製）に導入した。得られた形質転換体をニトロセルロース膜上で培養し、１プレート当たり約５００個のコロニーが得られた。これらコロニーから、プラスミドＤＮＡを調製し、これらを制限酵素ＮｏｔＩで切断した。得られたＤＮＡを用いて、in vitro転写により、キャップ化されたｃＲＮＡを合成した。
【００４９】
得られたｃＲＮＡ（約１０ｎｇ）を、上記（１）で得たラットジカルボン酸塩トランスポーターのｃＲＮＡ（２ｎｇ）と共に卵母細胞へ注入した。これら卵母細胞について、前記と同様にして、ＰＡＨの取り込み実験を行うことにより陽性クローンのスクリーニングを行った。スクリーニングに際しては、複数のクローンから抽出したＤＮＡをプールしたグループについて調べ、あるグループでＰＡＨの取り込みが確認された場合、さらにそれを複数のグループに分割し、さらにスクリーニングを行った。
【００５０】
スクリーニングの結果、８０００個のクローンから１つの陽性クローン（ｃＲＮＡを注入した卵母細胞で基質の取り込みが認められるクローン）が単離された。
【００５１】
得られたクローン、すなわち、ラット有機陰イオントランスポーターＯＡＴ１のｃＤＮＡを含むクローンについて、塩基配列決定のための欠失クローン作製用キット（商品名：Kilo-Sequense Deletion Kit、宝酒造社製）、合成プライマー、塩基配列決定用キット（商品名：Sequenase ver.2.0、アマシャム社製）を用いてダイデオキシ法により、ｃＤＮＡの塩基配列を決定した。
【００５２】
これにより、ラット有機陰イオントランスポーターＯＡＴ１遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列が得られた。また、ｃＤＮＡの塩基配列を常法により解析して、ｃＤＮＡ上の翻訳領域とそこにコードされるＯＡＴ１のアミノ酸配列を決定した。
【００５３】
これら配列を、後記配列表の配列番号１に示した。
【００５４】
疎水性プロット（Kyte-Doolittle hydropathy analysis）により、ＯＡＴ１のアミノ酸配列を解析した結果、図３に示すように、１２個の膜貫通領域（membrane-spanning domains）が予測された。また、５つの糖鎖付加部位が最初の親水性ループに予測された。６番目と７番目の膜貫通領域（transmembrane domains）の親水基のループにプロテインキナーゼC依存性のリン酸化部位と考えられる部位が４つあった。
【００５５】
（３）種々の組織におけるＯＡＴ１遺伝子の発現（ノーザンブロティングによる解析）
ラットＯＡＴ１遺伝子の全長ｃＤＮＡを32Ｐ−ｄＣＴＰでラベルし、これをプローブとして用いて、ラットの種々の組織から抽出したＲＮＡに対してノーザンブロッティングを以下のように行なった。３μｇのポリ(A)+RNAを１％アガロース／ ホルムアルデヒドゲルで電気泳動したのち、ニトロセルロースフィルターにトランスファーした。このフィルターを４２℃で、32Ｐ-dCTPでラベルした全長のＯＡＴ１ｃＤＮＡを含んだハイブリダイゼーション液で１晩ハイブリダイゼーションを行った。フィルターを、６５℃にて、０．１％ＳＤＳを含む０．１ｘＳＳＣで洗浄した。
【００５６】
ノーザンブロティングの結果、図４に示すように、腎臓において、2.4kb付近と3.9kbと4.2kbに相当する２つのバンドが検出され、発現が認められた。腎臓の皮質と髄質外層ではOAT1 mRNAの発現量が多く、髄質内層では少なかった。
【００５７】
さらに長時間の感光で、脳において2.4kb付近にかすかなバンドが検出されたが、その他の組織ではバンドは検出されず、発現は認められなかった。
【００５８】
（４）腎組織におけるＯＡＴ１遺伝子の発現（Ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによる解析）
Ｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーションを以下のように行った。すなわち、ラットの腎臓を４％  パラホルムアルデヒドで灌流することにより固定した後、これを細切り、４％  パラホルムアルデヒドでさらに固定した。得られたラット腎臓を５μｍの厚さに薄切し、得られた切片を、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションに用いた。
【００５９】
全長のＯＡＴ１ｃＤＮＡから、Ｔ７もしくはＴ３ＲＮＡポリメラーゼを用いて、35ＳでラベルしたセンスｃＲＮＡとアンチセンスｃＲＮＡを合成し、プローブとして用いた。切片をハイブリダイゼーション液で一晩プローブでハイブリダイゼーションを行ない、０．１×ＳＳＣで３０分、３７℃にて洗浄した。
【００６０】
In situ ハイブリダイゼーションの結果、ラット腎臓では、OAT1 mRNAは腎臓の皮質と髄質外層、特に皮質の髄放線の部分で発現することが示された。髄質内層では発現は検出されなかった。この結果は、有機陰イオントランスポーターＯＡＴ１が近位尿細管の中間部分で最も多く発現されることを示している。
【００６１】
実施例２  有機陰イオントランスポーターＯＡＴ１の特徴づけ
（１）ＯＡＴ１の輸送活性におけるグルタル酸の影響
ラットＯＡＴ１遺伝子ｃＲＮＡを注入した卵母細胞によるＰＡＨの取り込み実験においてグルタル酸とのプレインキュベーションの影響を調べた。
【００６２】
ＰＡＨの取り込み実験は、前記実施例１（２）記載方法に準じ、以下のように行った。すなわち、ラットＯＡＴ１遺伝子ｃＲＮＡもしくは、ラットＯＡＴ１遺伝子ｃＲＮＡとラットＮａＤＣ−１ｃＲＮＡを注入した卵母細胞を、1mM グルタル酸添加もしくは無添加のナトリウム取り込み溶液中で２時間前培養したあと、14Ｃ-ＰＡＨを添加して室温で１時間培養し放射能でラベルされた基質の取り込みを測定した。
【００６３】
その結果、図５に示すように、ＰＡＨの取り込みは、1mM グルタル酸で卵母細胞を前処置することによって増加した。また、ラットジカルボン酸塩トランスポーターとOAT1が発現している卵母細胞をグルタル酸で前処置すると，さらに14Ｃ-ＰＡＨの取り込みの増加が見られた。この結果に示されるグルタル酸の効果は、ＰＡＨ取り込みの細胞内ジカルボン酸濃度依存性を示しており、OAT1が有機アニオンとジカルボン酸の交換輸送体であると考えられた。コントロールにはＲＮＡを注入しない卵母細胞を用いた。
【００６４】
（２）ＯＡＴ１の輸送活性の塩依存性
ラットＯＡＴ１遺伝子ｃＲＮＡを注入した卵母細胞によるＰＡＨの取り込み実験において培養液に添加する塩の影響を調べた。
【００６５】
ＰＡＨの取り込み実験は、ラットＯＡＴ１遺伝子ｃＲＮＡを注入した卵母細胞を用い、前記（１）記載方法に準じて実施した。但し、取り込み溶液は、塩として塩化コリンイオンを添加した場合の影響をみる場合には、ナトリウム取り込み溶液にかえて、前記実施例１の（１）で用いたものと同じ塩化コリン取り込み溶液を用いた。
【００６６】
その結果、図６に示すように、細胞外のナトリウムをコリンと置換しても、ＰＡＨ取り込みに何ら影響を与えなかった。このことから、ＯＡＴ１はナトリウムイオン非依存性に働くトランスポータであることが示された。コントロールにはＲＮＡを注入しない卵母細胞を用いた。
【００６７】
（３）ＯＡＴ１のミカエリス−メンテンの動力学試験
基質ＰＡＨの濃度の違いによるＰＡＨの取り込み率の変化を調べることにより、有機陰イオントランスポーターのミカエリス−メンテンの動力学試験を行った。
【００６８】
ＰＡＨの取り込み実験は、ラットＯＡＴ１遺伝子ｃＲＮＡを注入した卵母細胞を用い、前記（１）記載方法に準じて実施した。但し、14C-ＰＡＨ取り込みは３分間測定した。その結果、図７に示すように、Ｋｍ値は約１４．３±２．９μＭであった。このＫｍ値は、既にin vivo 系で報告されている基底側の有機アニオントランスポート系のKm値(80μM)（Ulrich ら、Am. J. Physiol. 第254巻、F453-462頁、1988年）とほぼ同等であった。
【００６９】
（４）ＯＡＴ１の基質選択性（薬物添加による阻害試験）
ラットＯＡＴ１遺伝子ｃＲＮＡを注入した卵母細胞によるＰＡＨの取り込み実験において、系への各種薬物添加の影響を調べた。
【００７０】
ＰＡＨの取り込み実験は、ラットＯＡＴ１遺伝子ｃＲＮＡを注入した卵母細胞を用い、前記（１）記載方法に準じて実施した。但し、ナトリウム取り込み溶液を用い、2mM の各種化合物（非標識）の存在下及び非存在下（コントロール）で、ＰＡＨの取り込みを測定した。
【００７１】
その結果、図８に示すように、構造的に無関係の薬物の添加で、ｃｉｓ−阻害効果が観察された。セファロリジン（β−ラクタム系抗生物質）、ナリジクス酸（オールドキノロン）、フロセミドとエタクリン酸（利尿薬）、インドメタシン（非ステロイド系抗抗炎症剤）、プロベネシド（尿酸排泄薬）、バルプロ酸（抗てんかん薬）はＯＡＴ−１を介した14Ｃ−ＰＡＨの取り込みを強く阻害した（８５％＞）。抗腫瘍薬であるメトトレキセートはＰＡＨの取り込みを中等度に阻害した。プロスタグランジンＥ２、ｃ−ＡＭＰ、ｃ−ＧＭＰ、尿酸といった内因性化合物もＰＡＨの取り込みを阻害した。
【００７２】
（５）ＯＡＴ１の基質選択性（各種陰イオン性物質を基質とする取り込み試験）
各種陰イオン性物質を基質として、ＯＡＴ１による取り込みを調べた。
【００７３】
取り込み実験は、ラットＯＡＴ１遺伝子ｃＲＮＡを注入した卵母細胞を用い、前記（１）記載方法に準じて実施した。但し、基質としては、14Ｃ−ＰＡＨにかえて、放射能でラベルされた各種の化合物を用いた。コントロールにはＲＮＡを注入しない卵母細胞を用いた。
【００７４】
その結果、図９に示すように、メトトレキセート（3Ｈ標識物）、ｃ−ＡＭＰ（3Ｈ標識物）、ｃ−ＧＭＰ（3Ｈ標識物）、プロスタグランジンＥ2（3Ｈ標識物）、尿酸（14Ｃ標識物）、α−ケトグルタル酸（14Ｃ標識物）を基質とした場合に、卵母細胞への取り込みが認められた。一方、ＴＥＡ（14Ｃ標識物）とタウロコール酸では取り込みを示さなかった。
【００７５】
実施例３  ヒト有機陰イオントランスポーターのクローニング
実施例１の（２）にて得たラットＯＡＴ１遺伝子のｃＤＮＡ断片を標識し、これをプローブとして用いて、ヒトｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。ヒトｃＤＮＡライブラリーは、遺伝子源としてヒト腎ポリ(A)+RNA（クロンテク社製）を用いて作製したヒトｃＤＮＡライブラリーを用いた。
【００７６】
また、得られた陽性クローン、すなわち、ヒト有機陰イオントランスポーター（ヒトＯＡＴ１）ｃＤＮＡを含むクローンについて、実施例１と同様にして、塩基配列を決定し、得られたｃＤＮＡの塩基配列を常法により解析して、ｃＤＮＡ上の翻訳領域とそこにコードされるヒトＯＡＴ１のアミノ酸配列を決定した。
【００７７】
これらヒトＯＡＴ１の配列を、後記配列表の配列番号２に示した。
【００７８】
ラットＯＡＴ１とヒトＯＡＴ１とのホモロジーは、アミノ酸レベルで約８５％であった。また、ｃＤＮＡレベルでのホモロジーは、約７９％であった。
【００７９】
【発明の効果】
本発明の有機陰イオントランスポーターＯＡＴ１およびその遺伝子は、薬物排出や薬物と薬物の相互作用のインビトロでの分析など、薬物動態や毒物動態の分子レベルでの解明に有用と考えられる。また、βラクタム系抗生物質、利尿薬、非ステロイド系抗炎症薬のような腎不全の原因となる多くの薬物が、ＯＡＴ１によって輸送され、薬物が腎毒性を引き起こす原因はＯＡＴ１に起因する蓄積性による可能性が示唆されることから、ＯＡＴ１を用いて腎毒性を防止するのための薬物をスクリーニングする方法を開発し得ると考えられる。
【００８０】
【配列表】
0004678899.tif 000002
0004678899.tif 000003
0004678899.tif 000004
0004678899.tif 000005
0004678899.tif 000006
【００８１】
0004678899.tif 000007
0004678899.tif 000008
0004678899.tif 000009
0004678899.tif 000010
0004678899.tif 000011
【図面の簡単な説明】
【図１】  ラットのナトリウム依存性ジカルボン酸塩トランスポーター（ｒＮａＤＣ−１）遺伝子のｃＲＮＡを注入した卵母細胞によるグルタル酸の取り込み実験の結果を示す図。
【図２】  ラット腎組織由来ｍＲＮＡ及び／又はラットＮａＤＣ−１遺伝子のｃＲＮＡを注入した卵母細胞によるＰＡＨの取り込み実験の結果を示す図。
【図３】  ラット有機陰イオントランスポーターＯＡＴ１の疎水性プロットを示す図。
【図４】  ラットの各臓器組織におけるＯＡＴ１遺伝子ｍＲＮＡの発現をノーザンブロッティングにより解析した結果を示した電気泳動の写真。
【図５】  ラットＯＡＴ１遺伝子ｃＲＮＡを注入した卵母細胞によるＰＡＨの取り込み実験においてグルタル酸とのプレインキュベーションの影響およびｒＮａＤＣ−１との共発現の効果を調べた結果を示す図。
【図６】  ラットＯＡＴ１遺伝子ｃＲＮＡを注入した卵母細胞によるＰＡＨの取り込み実験において添加するナトリウム塩の影響を調べた結果を示す図。
【図７】  ラットＯＡＴ１遺伝子ｃＲＮＡを注入した卵母細胞によるＰＡＨの取り込み実験において基質ＰＡＨの濃度の影響を調べた結果を示す図。
【図８】  ラットＯＡＴ１遺伝子ｃＲＮＡを注入した卵母細胞によるＰＡＨの取り込み実験において、系への各種薬物添加の影響を調べた結果を示す図。
【図９】  基質として各種薬物を用いた場合の、ラットＯＡＴ１遺伝子のｃＲＮＡを注入した卵母細胞による放射能標識化合物の取り込み実験の結果を示す図。
【図１】
0004678899.tif 000012
【図２】
0004678899.tif 000013
【図３】
0004678899.tif 000014
【図４】
0004678899.tif 000015
【図５】
0004678899.tif 000016
【図６】
0004678899.tif 000017
【図７】
0004678899.tif 000018
【図８】
0004678899.tif 000019
【図９】
0004678899.tif 000020