【手続補正書】
【提出日】平成15年10月27日(2003.10.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
二本鎖DNA分子を順次連結する方法であって、
（ａ）突出末端が非回文配列である二本鎖DNA分子を固相に結合する工程、
（ｂ）固相に結合された二本鎖DNA分子に対し、両側の突出末端が非回文配列である二本鎖DNA分子を連結する工程、
（ｃ）固相に結合された二本鎖DNA分子に対して未反応の二本鎖DNA分子を反応系から除去する工程、および
（ｄ）必要に応じて、工程（ｂ）および（ｃ）を繰り返す工程、を含む方法。
【請求項２】
工程（ａ）において、互いに親和性を有する２つの分子の一方を二本鎖DNA分子に、他の一方を固相に結合させ、該親和性を利用して二本鎖DNA分子を固相に結合させる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
互いに親和性を有する２つの分子がアビジンとビオチンである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
工程（ｂ）において、リガーゼ反応により二本鎖DNA分子同士を連結する、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
二本鎖DNA分子の突出末端の非回文配列が制限酵素処理により形成されたものである、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
制限酵素がSfiI、BstXI、BbsI、BbvI、BglI、BsaI、BsmAI、BsmBI、BsmFI、BspMI、BstAPI、DraIII、EarI、FokI、HgaI、PfiMI、SfaNI、Van91Iからなる群より選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
３以上の二本鎖DNA分子を順次連結する、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
順次連結された二本鎖DNA分子を製造する方法であって、
（ａ）突出末端が非回文配列である二本鎖DNA分子を固相に結合する工程、
（ｂ）固相に結合された二本鎖DNA分子に対し、両側の突出末端が非回文配列である二本鎖DNA分子を連結する工程、
（ｃ）固相に結合された二本鎖DNA分子に対して未反応の二本鎖DNA分子を反応系から除去する工程、
（ｄ）必要に応じて、工程（ｂ）および（ｃ）を繰り返す工程、および
（ｅ）固相に結合した二本鎖DNA分子を固相から分離する工程、を含む方法。
【請求項９】
工程（ａ）において、互いに親和性を有する２つの分子の一方を二本鎖DNA分子に、他の一方を固相に結合させ、該親和性を利用して二本鎖DNA分子を固相に結合させる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
互いに親和性を有する２つの分子がアビジンとビオチンである、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
工程（ｂ）において、リガーゼ反応により二本鎖DNA分子同士を連結する、請求項８から１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
二本鎖DNA分子の突出末端の非回文配列が制限酵素処理により形成されたものである、請求項８から１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
制限酵素がSfiI、BstXI、BbsI、BbvI、BglI、BsaI、BsmAI、BsmBI、BsmFI、BspMI、BstAPI、DraIII、EarI、FokI、HgaI、PfiMI、SfaNI、Van91Iからなる群より選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
３以上の二本鎖DNA分子を順次連結する、請求項８から１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
請求項８から１４のいずれかに記載の方法により製造された二本鎖DNA分子。
【請求項１６】
請求項１５に記載の二本鎖DNA分子を含むベクター。
【請求項１７】
請求項１５に記載の二本鎖DNA分子または請求項１６に記載のベクターを保持する形質転換体。
【請求項１８】
請求項１５に記載の二本鎖DNA分子によりコードされるポリペプチド。
【請求項１９】
請求項１７に記載の形質転換体を培養し、該形質転換体またはその培養上清から発現させたポリペプチドを回収する工程を含む、請求項１８に記載のポリペプチドの製造方法。
【請求項２０】
二本鎖DNA分子を順次連結するための装置であって、
（ａ）突出末端が非回文配列である二本鎖DNA分子が結合される固相と、
（ｂ）該固相を保持する容器と、
（ｃ）突出末端が非回文配列である二本鎖DNA分子を含む液相、両側の突出末端が非回文配列である二本鎖DNA分子を含む少なくとも１種以上の液相、酵素を含む溶液及び洗浄液の各液相を独立して貯留する複数の容器と、
（ｄ）前記容器から前記固相を回収し、他の前記容器へと移送する固相移動手段と、
（ｅ）前記固相移動手段の駆動を制御する制御手段と
を備えてなることを特徴とする二本鎖DNA分子を順次連結するための装置。
【請求項２１】
前記固相が磁気ビーズであって、かつ前記固相移動手段が磁石である、請求項２０に記載の二本鎖DNA分子を順次連結するための装置。
【請求項２２】
前記二本鎖DNA分子の突出末端の非回文配列が制限酵素処理により形成されたものである、請求項２０または２１に記載の装置。
【請求項２３】
制限酵素がSfiI、BstXI、BbsI、BbvI、BglI、BsaI、BsmAI、BsmBI、BsmFI、BspMI、BstAPI、DraIII、EarI、FokI、HgaI、PfiMI、SfaNI、Van91Iからなる群より選択される、請求項２２に記載の装置。
【請求項２４】
二本鎖DNA分子を順次連結するための装置であって、
（ａ）突出末端が非回文配列である二本鎖DNA分子が結合される固相と、
（ｂ）該固相を保持し、液相の流入部と流出部を有する容器と、
（ｃ）突出末端が非回文配列である二本鎖DNA分子を含む液相、両側の突出末端が非回文配列である二本鎖DNA分子を含む少なくとも１種以上の液相、酵素を含む溶液及び洗浄液の各液相を独立して貯留し、該各液相の流出制御をする開閉弁を備えた液相貯留槽と、
（ｄ）前記容器の流入部と前記液相貯留槽の開閉弁と結ぶ液相供給流路と、液相を排出する排出流路と、
（ｅ）前記排出流路に設けられ、該排出流路の開閉を制御する開閉弁と、
（ｆ）前記排出流路中に設けられた液相駆動手段と、
（ｇ）前記開閉弁及び前記液相駆動手段の制御を行う制御手段と、
を備えてなることを特徴とする二本鎖DNA分子を順次連結するための装置。
【請求項２５】
二本鎖DNA分子を順次連結するための装置であって、
（ａ）突出末端が非回文配列である二本鎖DNA分子が結合される固相と、
（ｂ）該固相を保持し、液相の流入部と流出部を有する容器と、
（ｃ）突出末端が非回文配列である二本鎖DNA分子を含む液相、両側の突出末端が非回文配列である二本鎖DNA分子を含む少なくとも１種以上の液相、酵素を含む溶液及び洗浄液の各液相を独立して貯留し、該各液相の流出制御をする開閉弁を備えた液相貯留槽と、
（ｄ）前記容器の流入部と前記液相貯留槽の開閉弁と結ぶ液相供給流路と、液相を排出する排出流路と、前記容器の流出部と流入部とを結ぶ循環流路と、
（ｅ）前記排出流路に設けられ、前記循環流路と前記排出流路との選択的導通を可能とする流路切換弁と、
（ｆ）前記流出部と前記流路切換弁との間の排出流路中に設けられた液相駆動手段と、
（ｇ）前記開閉弁及び流路切換弁の制御とともに、該液相駆動手段の制御を行う制御手段と、
を備えてなることを特徴とする二本鎖DNA分子を順次連結するための装置。
【請求項２６】
前記固相がビーズであり、前記容器がカラム構造である、請求項２４または２５に記載の二本鎖DNA分子を順次連結するための装置。
【請求項２７】
前記液相駆動手段がポンプである、請求項２４から２６のいずれかに記載の二本鎖DNA分子を順次連結するための装置。
【請求項２８】
前記制御手段が前記開閉弁及び前記流路切換弁並びに前記液相駆動手段の駆動時間を制御する手段である、請求項２４から２７のいずれかに記載の二本鎖DNA分子を順次連結するための装置。
【請求項２９】
前記固相に結合された前記突出末端が非回文配列である二本鎖DNA分子は、固相に対する結合を切断するための切断部位を備えるものであって、かつ、該切断部位に作用して前記固相から連結済みの二本鎖DNA分子を断裂させる切断手段をさらに備える、請求項２４から２８のいずれかに記載の二本鎖DNA分子を順次連結するための装置。
【請求項３０】
前記固相に結合された前記突出末端が非回文配列である二本鎖DNA分子は、その前記切断部位にS-S結合を含むものであり、かつ、前記切断手段は、該S-S結合を切断する還元剤を前記容器内に流通させるものである、請求項２９に記載の二本鎖DNA分子を順次連結するための装置。
【請求項３１】
前記固相に結合された前記突出末端が非回文配列である二本鎖DNA分子は、前記切断部位に所定の波長の光を照射することにより切断される分子を含むものであり、かつ、前記切断手段は、前記固相に対して、該所定の波長の光を照射することができる光照射手段である、請求項２９に記載の二本鎖DNA分子を順次連結するための装置。
【請求項３２】
前記排出流路の下流部に、排出した液体が供給される電気泳動手段をさらに備える、請求項２４〜３１のいずれかに記載の二本鎖DNA分子を順次連結するための装置。
【請求項３３】
前記二本鎖DNA分子の突出末端の非回文配列が制限酵素処理により形成されたものである、請求項２４から３２のいずれかに記載の二本鎖DNA分子を順次連結するための装置。
【請求項３４】
制限酵素がSfiI、BstXI、BbsI、BbvI、BglI、BsaI、BsmAI、BsmBI、BsmFI、BspMI、BstAPI、DraIII、EarI、FokI、HgaI、PfiMI、SfaNI、Van91Iからなる群より選択される、請求項３３に記載の二本鎖DNA分子を順次連結するための装置。
【請求項３５】
少なくとも複数のアビジン化されたビーズを保持する反応容器であって、該ビーズには、ビオチン分子および切断部位を介して突出末端が非回文配列である二本鎖DNA分子が接合されていることを特徴とする二本鎖DNA分子を順次連結させるための反応容器。
【請求項３６】
前記ビーズに結合された前記突出末端が非回文配列である二本鎖DNA分子は、その切断部位にS-S結合を含むものであることを特徴とする請求項３５に記載の二本鎖DNA分子を順次連結するための反応容器。
【請求項３７】
少なくとも複数のシランコートされたビーズを保持する反応容器であって、該ビーズには、切断部位を介して前記突出末端が非回文配列である二本鎖DNA分子がアミド接合されていることを特徴とする二本鎖DNA分子を順次連結させるための反応容器。
【請求項３８】
前記ビーズに接合された突出末端が非回文配列である二本鎖DNA分子は、その切断部位に所定の波長の光を照射することにより切断される分子を含むものであることを特徴とする請求項３７に記載の二本鎖DNA分子を順次連結するための反応容器。
【請求項３９】
前記反応容器が、液相の流入口と流出口を有するカラム構造をなすことを特徴とする請求項３５から３８のいずれかに記載の二本鎖DNA分子を順次連結させるための反応容器。
【請求項４０】
前記二本鎖DNA分子の突出末端の非回文配列が制限酵素処理により形成されたものである、請求項３５から３９のいずれかに記載の反応容器。
【請求項４１】
制限酵素がSfiI、BstXI、BbsI、BbvI、BglI、BsaI、BsmAI、BsmBI、BsmFI、BspMI、BstAPI、DraIII、EarI、FokI、HgaI、PfiMI、SfaNI、Van91Iからなる群より選択される、請求項４０に記載の反応容器。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
即ち、本発明は、固相系において非回文配列を利用してDNA分子を順次連結させる方法に関し、より詳しくは、
（１）  二本鎖DNA分子を順次連結する方法であって、
（ａ）突出末端が非回文配列である二本鎖DNA分子を固相に結合する工程、
（ｂ）固相に結合された二本鎖DNA分子に対し、両側の突出末端が非回文配列である二本鎖DNA分子を連結する工程、
（ｃ）固相に結合された二本鎖DNA分子に対して未反応の二本鎖DNA分子を反応系から除去する工程、および
（ｄ）必要に応じて、工程（ｂ）および（ｃ）を繰り返す工程、を含む方法、
（２）  工程（ａ）において、互いに親和性を有する２つの分子の一方を二本鎖DNA分子に、他の一方を固相に結合させ、該親和性を利用して二本鎖DNA分子を固相に結合させる、（１）に記載の方法、
（３）  互いに親和性を有する２つの分子がアビジンとビオチンである、（１または２）に記載の方法、
（４）  工程（ｂ）において、リガーゼ反応により二本鎖DNA分子同士を連結する、（１）から（３）のいずれかに記載の方法、
（５）  二本鎖DNA分子の突出末端の非回文配列が制限酵素処理により形成されたものである、（１）から（４）のいずれかに記載の方法、
（６）  制限酵素がSfiI、BstXI、BbsI、BbvI、BglI、BsaI、BsmAI、BsmBI、BsmFI、BspMI、BstAPI、DraIII、EarI、FokI、HgaI、PfiMI、SfaNI、Van91Iからなる群より選択される、（５）に記載の方法、
（７）  ３以上の二本鎖DNA分子を順次連結する、（１）から（６）のいずれかに記載の方法、
（８）  順次連結された二本鎖DNA分子を製造する方法であって、
（ａ）突出末端が非回文配列である二本鎖DNA分子を固相に結合する工程、
（ｂ）固相に結合された二本鎖DNA分子に対し、両側の突出末端が非回文配列である二本鎖DNA分子を連結する工程、
（ｃ）固相に結合された二本鎖DNA分子に対して未反応の二本鎖DNA分子を反応系から除去する工程、
（ｄ）必要に応じて、工程（ｂ）および（ｃ）を繰り返す工程、および
（ｅ）固相に結合した二本鎖DNA分子を固相から分離する工程、を含む方法、
（９）  工程（ａ）において、互いに親和性を有する２つの分子の一方を二本鎖DNA分子に、他の一方を固相に結合させ、該親和性を利用して二本鎖DNA分子を固相に結合させる、（８）に記載の方法、
（１０）  互いに親和性を有する２つの分子がアビジンとビオチンである、（８または９）に記載の方法、
（１１）  工程（ｂ）において、リガーゼ反応により二本鎖DNA分子同士を連結する、（８）から（１０）のいずれかに記載の方法、
（１２）  二本鎖DNA分子の突出末端の非回文配列が制限酵素処理により形成されたものである、（８）から（１０）のいずれかに記載の方法、
（１３）  制限酵素がSfiI、BstXI、BbsI、BbvI、BglI、BsaI、BsmAI、BsmBI、BsmFI、BspMI、BstAPI、DraIII、EarI、FokI、HgaI、PfiMI、SfaNI、Van91Iからなる群より選択される、（１２）に記載の方法、
（１４）  ３以上の二本鎖DNA分子を順次連結する、（８）から（１３）のいずれかに記載の方法、
（１５）  （８）から（１４）のいずれかに記載の方法により製造された二本鎖DNA分子、
（１６）  （１５）に記載の二本鎖DNA分子を含むベクター、
（１７）  （１５）に記載の二本鎖DNA分子または（１６）に記載のベクターを保持する形質転換体、
（１８）  （１５）に記載の二本鎖DNA分子によりコードされるポリペプチド、
（１９）  （１７）に記載の形質転換体を培養し、該形質転換体またはその培養上清から発現させたポリペプチドを回収する工程を含む、（１８）に記載のポリペプチドの製造方法、
（２０）  二本鎖DNA分子を順次連結するための装置であって、
（ａ）突出末端が非回文配列である二本鎖DNA分子が結合される固相と、
（ｂ）該固相を保持する容器と、
（ｃ）突出末端が非回文配列である二本鎖DNA分子を含む液相、両側の突出末端が非回文配列である二本鎖DNA分子を含む少なくとも１種以上の液相、酵素を含む溶液及び洗浄液の各液相を独立して貯留する複数の容器と、
（ｄ）前記容器から前記固相を回収し、他の前記容器へと移送する固相移動手段と、
（ｅ）前記固相移動手段の駆動を制御する制御手段と
を備えてなることを特徴とする二本鎖DNA分子を順次連結するための装置、
（２１）前記固相が磁気ビーズであって、かつ前記固相移動手段が磁石である、（２０）に記載の二本鎖DNA分子を順次連結するための装置、
（２２）前記二本鎖DNA分子の突出末端の非回文配列が制限酵素処理により形成されたものである、（２０または２１）に記載の反応容器、
（２３）制限酵素がSfiI、BstXI、BbsI、BbvI、BglI、BsaI、BsmAI、BsmBI、BsmFI、BspMI、BstAPI、DraIII、EarI、FokI、HgaI、PfiMI、SfaNI、Van91Iからなる群より選択される、（２２）に記載の反応容器、
（２４）  二本鎖DNA分子を順次連結するための装置であって、
（ａ）突出末端が非回文配列である二本鎖DNA分子が結合される固相と、
（ｂ）該固相を保持し、液相の流入部と流出部を有する容器と、
（ｃ）突出末端が非回文配列である二本鎖DNA分子を含む液相、両側の突出末端が非回文配列である二本鎖DNA分子を含む少なくとも１種以上の液相、酵素を含む溶液及び洗浄液の各液相を独立して貯留し、該各液相の流出制御をする開閉弁を備えた液相貯留槽と、
（ｄ）前記容器の流入部と前記液相貯留槽の開閉弁と結ぶ液相供給流路と、液相を排出する排出流路と、
（ｅ）前記排出流路に設けられ、該排出流路の開閉を制御する開閉弁と、
（ｆ）前記排出流路中に設けられた液相駆動手段と、
（ｇ）前記開閉弁及び前記液相駆動手段の制御を行う制御手段と、
を備えてなることを特徴とする二本鎖DNA分子を順次連結するための装置、
（２５）  二本鎖DNA分子を順次連結するための装置であって、
（ａ）突出末端が非回文配列である二本鎖DNA分子が結合される固相と、
（ｂ）該固相を保持し、液相の流入部と流出部を有する容器と、
（ｃ）突出末端が非回文配列である二本鎖DNA分子を含む液相、両側の突出末端が非回文配列である二本鎖DNA分子を含む少なくとも１種以上の液相、酵素を含む溶液及び洗浄液の各液相を独立して貯留し、該各液相の流出制御をする開閉弁を備えた液相貯留槽と、
（ｄ）前記容器の流入部と前記液相貯留槽の開閉弁と結ぶ液相供給流路と、液相を排出する排出流路と、前記容器の流出部と流入部とを結ぶ循環流路と、
（ｅ）前記排出流路に設けられ、前記循環流路と前記排出流路との選択的導通を可能とする流路切換弁と、
（ｆ）前記流出部と前記流路切換弁との間の排出流路中に設けられた液相駆動手段と、
（ｇ）前記開閉弁及び流路切換弁の制御とともに、該液相駆動手段の制御を行う制御手段と、
を備えてなることを特徴とする二本鎖DNA分子を順次連結するための装置、
（２６）前記固相がビーズであり、前記容器がカラム構造である、（２４または２５）に記載の二本鎖DNA分子を順次連結するための装置、
（２７）前記液相駆動手段がポンプである、（２４から２６）のいずれかに記載の二本鎖DNA分子を順次連結するための装置、
（２８）前記制御手段が前記開閉弁及び前記流路切換弁並びに前記液相駆動手段の駆動時間を制御する手段である、（２４から２７）のいずれかに記載の二本鎖DNA分子を順次連結するための装置、
（２９）前記固相に結合された前記突出末端が非回文配列である二本鎖DNA分子は、固相に対する結合を切断するための切断部位を備えるものであって、かつ、該切断部位に作用して前記固相から連結済みの二本鎖DNA分子を断裂させる切断手段をさらに備える、（２４から２８）のいずれかに記載の二本鎖DNA分子を順次連結するための装置、
（３０）前記固相に結合された前記突出末端が非回文配列である二本鎖DNA分子は、その前記切断部位にS-S結合を含むものであり、かつ、前記切断手段は、該S-S結合を切断する還元剤を前記容器内に流通させるものである、（２９）に記載の二本鎖DNA分子を順次連結するための装置、
（３１）前記固相に結合された前記突出末端が非回文配列である二本鎖DNA分子は、前記切断部位に所定の波長の光を照射することにより切断される分子を含むものであり、かつ、前記切断手段は、前記固相に対して、該所定の波長の光を照射することができる光照射手段である、（２９）に記載の二本鎖DNA分子を順次連結するための装置、
（３２）前記排出流路の下流部に、排出した液体が供給される電気泳動手段をさらに備える、（２４から３１）のいずれかに記載の二本鎖DNA分子を順次連結するための装置、
（３３）前記二本鎖DNA分子の突出末端の非回文配列が制限酵素処理により形成されたものである、（２４から３２）のいずれかに記載の二本鎖DNA分子を順次連結するための装置、
（３４）制限酵素がSfiI、BstXI、BbsI、BbvI、BglI、BsaI、BsmAI、BsmBI、BsmFI、BspMI、BstAPI、DraIII、EarI、FokI、HgaI、PfiMI、SfaNI、Van91Iからなる群より選択される、（３３）に記載の二本鎖DNA分子を順次連結するための装置、
（３５）  少なくとも複数のアビジン化されたビーズを保持する反応容器であって、該ビーズには、ビオチン分子および切断部位を介して突出末端が非回文配列である二本鎖DNA分子が接合されていることを特徴とする二本鎖DNA分子を順次連結させるための反応容器、
（３６）前記ビーズに結合された前記突出末端が非回文配列である二本鎖DNA分子は、その切断部位にS-S結合を含むものであることを特徴とする（３５）に記載の二本鎖DNA分子を順次連結するための反応容器、
（３７）少なくとも複数のシランコートされたビーズを保持する反応容器であって、該ビーズには、切断部位を介して前記突出末端が非回文配列である二本鎖DNA分子がアミド接合されていることを特徴とする二本鎖DNA分子を順次連結させるための反応容器、
（３８）前記ビーズに接合された突出末端が非回文配列である二本鎖DNA分子は、その切断部位に所定の波長の光を照射することにより切断される分子を含むものであることを特徴とする（３７）に記載の二本鎖DNA分子を順次連結するための反応容器、
（３９）前記反応容器が、液相の流入口と流出口を有するカラム構造をなすことを特徴とする（３５から３８）のいずれかに記載の二本鎖DNA分子を順次連結させるための反応容器、
（４０）前記二本鎖DNA分子の突出末端の非回文配列が制限酵素処理により形成されたものである、（３５から３９）のいずれかに記載の反応容器、
（４１）制限酵素がSfiI、BstXI、BbsI、BbvI、BglI、BsaI、BsmAI、BsmBI、BsmFI、BspMI、BstAPI、DraIII、EarI、FokI、HgaI、PfiMI、SfaNI、Van91Iからなる群より選択される、（４０）に記載の反応容器を提供するものである。