(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
５’および３’末端に平滑末端を有する標的核酸の末端領域の一方のみに、アダプターを付加する方法であって、
前記標的核酸を含む試料に、ＲｅｃＡタンパク質と、当該アダプターを付加すべき末端領域とは反対側の末端領域と相同な核酸プローブとを添加することにより、前記ＲｅｃＡタンパク質を介して前記標的核酸に前記核酸プローブを結合させ、前記反対側の末端領域を三本鎖構造にする工程と；
前記標的核酸に結合した前記ＲｅｃＡタンパク質を前記標的核酸から解離させて、前記ＲｅｃＡタンパク質を介さずに前記核酸プローブが前記反対側の末端領域に結合した核酸を得る工程と；
該核酸に当該アダプターを添加し、ライゲートすることにより、標的核酸の末端領域の一方のみにアダプターを付加する工程と
を備えること；および
前記核酸プローブは、前記反対側の末端領域の終末端から、その３’末端を１塩基以上突出するように前記反対側の末端領域に結合すること；
を特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、標的核酸の末端領域の一方に、所望の処理を優先的に施す方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
遺伝子のクローニングや遺伝子ライブラリーの構築、ポリメラーゼ連鎖反応(以下ＰＣＲと称する)等の遺伝子工学的技術は、遺伝子の切断や連結、及び遺伝子へのマーカーやアダプターの付加等の基本的操作を組み合わせることによって行われる。
【０００３】
これらの操作は、遺伝子工学に不可欠な基礎的手法であるが、所望する特定の領域のみにこのような操作を行うことができれば、さらに多くの有用な手法を開発することができる。
【０００４】
例えば、遺伝子にアダプターを付加する場合、標的核酸の末端領域が等価であれば、両末端領域に同じアダプターが付加されてしまうが、５’ＲＡＣＥを実施するときには、片方の末端領域のみにアダプターを付加することができれば有用である。
【０００５】
所望する特定の領域のみに遺伝子工学的な操作を施す場合にも、ＰＣＲは多用されているが、標的核酸のサイズが大きい場合には、ＰＣＲによる操作は不可能である。
【０００６】
このため、所望する特定の領域や所望する特定の遺伝子のみに遺伝子工学的な操作を施すための、より汎用性のある方法が望まれていた。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、標的核酸の末端領域の一方に、所望の処理を優先的に施す方法を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
前記課題を解決するために、本発明は、
標的核酸の末端領域の一方に、所望の処理を優先的に施す方法であって、
前記標的核酸を含む試料に、ＲｅｃＡタンパク質と、前記処理を施すべき末端領域とは反対側の末端領域と相同な核酸プローブとを添加することにより、前記ＲｅｃＡタンパク質を介して前記標的核酸に前記核酸プローブを結合させ、前記反対側の末端領域を三本鎖構造にする工程と；
前記標的核酸に結合した前記ＲｅｃＡタンパク質を前記標的核酸から解離させて、前記ＲｅｃＡタンパク質を介さずに前記核酸プローブが前記反対側の末端領域に結合した核酸を得る工程と；
該核酸に前記処理を施すことにより、標的核酸の末端領域の一方に優先的に所望の処理を施す工程と
を備えた方法を提供する。
【０００９】
ここで、以下の発明の詳細な説明の理解を助けるために、図９を参照しながら、本発明の方法の概略を説明する。
【００１０】
本発明の方法の第一の工程では、標的核酸、一般的には標的ＤＮＡ１に、該ＤＮＡの一方の末端領域と相同な配列を有するプローブＤＮＡ２とＲｅｃＡタンパク質３とを添加して、三本鎖ＤＮＡ形成反応を行う。ＲｅｃＡタンパク質３は、プローブＤＮＡ２に結合してプローブＤＮＡ・ＲｅｃＡタンパク質複合体４を形成した後、標的ＤＮＡ１の末端領域に存在するプローブＤＮＡ２と相同な領域を検索し、プローブＤＮＡ２を該相同な領域に結合させる。このようなＲｅｃＡタンパク質の作用により、第一の工程では、標的ＤＮＡ１の一方の末端領域に、ＲｅｃＡタンパク質３を介してプローブＤＮＡ２が結合し、末端領域に三本鎖ＤＮＡ構造５が形成される。
【００１１】
第二の工程では、除タンパク反応を行い、プローブＤＮＡ２に結合したＲｅｃＡタンパク質３を除去する。プローブＤＮＡ２が末端領域に結合している場合には、ＲｅｃＡタンパク質３を除去した後でも三本鎖ＤＮＡ構造５が維持される。第二の工程において、三本鎖ＤＮＡ構造５からＲｅｃＡタンパク質３を除去することにより、三本鎖ＤＮＡ構造５に対して様々な処理を施すことが可能となる。
【００１２】
第三の工程では、ＲｅｃＡタンパク質３が除去された三本鎖ＤＮＡ構造５に、所望の処理（図では、アダプターＤＮＡのライゲーションが例示されている）を施す。三本鎖ＤＮＡ構造５を有する末端領域と二本鎖の末端領域とは構造が異なるので、本来等価であった二つの領域のうちの一方の領域のみに所望の処理を施すことができる。図９には、三本鎖ＤＮＡ構造５が形成されていない方の末端領域にアダプターＤＮＡ６がライゲーションされた様子が示されている。
【００１３】
なお、図に示されている具体的な反応や構造などは、あくまでも理解を容易にする目的で記載されているにすぎないので、実際には、それらの細部が図面と一致しない場合があり得る。すなわち、本発明者らは、本発明の方法の基礎となった本発明者らによる下記の発見の他には、いかなる特定の理論にも拘泥しない。
【００１４】
【発明の実施の形態】
本発明は、標的核酸の末端領域の一方に、所望の処理を優先的に施す方法を提供する。
【００１５】
本発明は、ＲｅｃＡタンパク質を介して形成される三本鎖構造が標的核酸の末端領域に形成される場合には、前記三本鎖構造からＲｅｃＡタンパク質を解離させた後にも前記三本鎖構造が維持されるという本発明者らの発見に基づいてなされたものである。ＲｅｃＡタンパク質、及びＲｅｃＡタンパク質を介して三本鎖構造が形成されることは公知である。
【００１６】
以下、本発明の方法の最も典型的な実施の態様について詳述する。
【００１７】
本発明の方法を実施するには、まず、その末端領域の一方に所望の処理を優先的に施すべき標的核酸を含む試料に、ＲｅｃＡタンパク質と、前記処理を施すべき末端領域とは反対側に位置する前記標的核酸中の末端領域と相同な核酸プローブとを添加する。
【００１８】
本明細書において、「標的核酸」は、任意の単純ヌクレオチド及び／又は修飾ヌクレオチドからなるポリヌクレオチドであり得、本方法の実施者が任意に選択し得る。標的核酸は、典型的には、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、及び合成ＤＮＡ等のＤＮＡ、並びにｍＲＮＡ、全ＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、及び合成ＲＮＡ等のＲＮＡである。「単純ヌクレオチド」には、アデニン、グアニン、チミン、シトシン、及びウラシルが含まれる。「修飾ヌクレオチド」には、例えば、イノシン、アセチルシチジン、メチルアデノシン、メチルグアノシンを含むリン酸エステルなどが含まれる。
【００１９】
「標的核酸を含む試料」は、生物から採取した未処置の試料、例えば、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、プラスミドを含む生物試料であり得る。また、「標的核酸を含む試料」は、前記未処置の試料に対して様々な操作又は処理を行った試料であり得る。このような操作又は処理は、核酸抽出操作、増幅操作、制限酵素、リガーゼ、ポリメラーゼ、ヌクレアーゼを含む酵素による処理、及び遺伝子工学の領域において周知であるその他の処理、並びにこれらの組み合わせであり得る。
【００２０】
「核酸抽出操作」は、フェノール抽出、エタノール沈殿であり得るが、これらに限定されない。
【００２１】
「増幅操作」は、典型的にはＰＣＲ、又はその変法、例えば、逆転写ＰＣＲ、逆ＰＣＲ、５‘ＲＡＣＥ、３’ＲＡＣＥであり得る。
【００２２】
あるいは、「標的核酸を含む試料」は、人工的に調製した核酸を含有する試料、又は該試料に前記各処理を施すことによって調製された試料であってもよい。
【００２３】
より具体的には、前記「標的核酸を含む試料」は、遺伝子のクローニングの各段階で得られる試料、例えば、ＤＮＡライブラリー、標的ｍＲＮＡを含む試料、１ｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡを含む試料、アダプターが付加された１ｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡを含む試料、ＰＣＲ産物がその中にサブクローニングされたプラスミドを含む試料であり得る。
【００２４】
本明細書において、「ＲｅｃＡタンパク質」とは、二本鎖核酸の一方のストランド中の任意の領域に、該領域と相同な一本鎖核酸を結合させることにより、前記領域に三本鎖構造を形成させ得るタンパク質を意味する。ＲｅｃＡタンパク質は、相同的組換え、ＤＮＡの修復、又は大腸菌のＳＯＳ遺伝子の発現などに関与することが知られている。ＲｅｃＡタンパク質の中では、大腸菌やλファージのＲｅｃＡタンパク質が最も有名である。しかしながら、大腸菌のＲｅｃＡタンパク質に類似した構造及び機能を有するタンパク質は、大腸菌以外の生物にも広く分布していることが知られており、これらのタンパク質は、一般に、ＲｅｃＡ類似タンパク質と呼称されている。本明細書において、「ＲｅｃＡタンパク質」には、大腸菌やλファージのＲｅｃＡタンパク質のみならず、ＲｅｃＡ類似タンパク質も含まれる。
【００２５】
前述のように、ＲｅｃＡタンパク質は、一本鎖核酸を二本鎖核酸にランダムに結合させるのではなく、二本鎖核酸の一方のストランド中に存在する相同な領域に結合させる。二つの核酸が「相同」であるということは、ＲｅｃＡタンパク質を介して特異的な三本鎖構造を形成し得る程度に、両核酸が同一である、又は類似していることを意味する。「類似」とは、例えば、二つの塩基配列が少なくとも５０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％、さらに好ましくは９５％以上の同一性であり得る。
【００２６】
前記核酸プローブは、三本鎖構造を形成しない部分を含んでもよい。該部分は、核酸プローブの中間及び／又は末端に位置し得る。
【００２７】
三本鎖構造を形成しない部分が、核酸プローブの末端に位置する場合には、核酸プローブは、例えば、前記末端が、標的核酸の末端領域から１塩基以上突出するように標的核酸に結合する。三本鎖構造を形成しない部分が、核酸プローブの中間に位置する場合には、核酸プローブは、ループ状の中間部を有するように標的核酸に結合する。
【００２８】
ＲｅｃＡタンパク質は上記のごとき機能を有しているので、前記試料に、ＲｅｃＡタンパク質及び相同な核酸プローブを添加すると、該核酸プローブは、標的核酸に、より正確には、標的核酸の一方のストランド中に存在する相同な部分に結合する。核酸プローブが結合した末端領域には三本鎖構造が形成されるので、該末端領域の構造は、核酸プローブが結合していないほうの末端領域の構造とは異なる。本発明の方法は、一方の末端領域に、一般的には、三本鎖構造が形成されていない方の末端領域に、優先的に所望の処理を施すためにこのような構造の相違を利用する。
【００２９】
一般的には、ＲｅｃＡタンパク質が末端領域に結合した状態では、標的核酸に所望の処理を行えないので、以下に記載されているように、ＲｅｃＡタンパク質は、最終的には、標的核酸から解離させる必要がある。
【００３０】
しかしながら、末端領域以外の領域に核酸プローブを結合させた場合には、標的核酸からＲｅｃＡタンパク質を解離させると、一旦形成された三本鎖構造が再び解消する。それ故、本発明の方法では、核酸プローブは標的核酸の末端領域に結合させなければならない。
【００３１】
所望の処理を施すべき標的領域が、末端領域に位置していないときには、該領域が末端領域に位置するように標的核酸の一部を切除してから、本発明の方法を適用すればよい。あるいは、一度環状の核酸にしてから、特定領域が末端領域にくるように再び切断してもよい。また、標的核酸が、環状の核酸であるときには、三本鎖核酸を形成させる前に、又は形成させた後に、所望の処理を施すべき領域が末端領域に位置するように環状の標的核酸を切断すればよい。
【００３２】
なお、本明細書において、標的核酸の「末端領域」とは、標的核酸の終末端と標的核酸の終末端から４００番目、より好ましくは２００番目、より好ましくは１５０番目、より好ましくは１００番目、より好ましくは８０番目、さらに好ましくは６０番目、さらに好ましくは５０番目、さらに好ましくは４０番目、さらに好ましくは２０番目、さらに好ましくは１０番目の塩基との間に位置する領域（各終末端を含む）を指すものとする。
【００３３】
末端領域の終末端の形状は、平滑末端と突出末端のうち何れでもよい。標的核酸に施すべき処理が、アダプターの付加等の終末端への付加反応である場合には、終末端の形状は突出末端であることが好ましい。
【００３４】
下記の実験例に詳述されているように、前記核酸プローブが、ＲｅｃＡタンパク質を介して試料中の標的核酸に結合する場合、核酸プローブの方向性によっては三本鎖構造を形成しないことがある。従って、適切な方向性を有する核酸プローブを使用しないと、三本鎖構造は形成されないことがあることに注意しなければならない。
【００３５】
典型的には、三本鎖構造を形成させるべき末端領域において５’末端を有するストランドと相同な配列を有する核酸プローブを使用すれば、三本鎖構造が形成される。
【００３６】
下記の実験例に詳述されているように、ＲｅｃＡタンパク質が解離した後にも三本鎖構造が安定に維持されるためには、前記核酸プローブの長さは、少なくとも１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上、好ましくは２０塩基以上、より好ましくは３０塩基以上、さらに好ましくは４０塩基以上、最も好ましくは６０塩基以上である。
【００３７】
安定な三本鎖構造を得るためには、三本鎖構造の両末端のうち外側（すなわち、標的核酸の終末端側）に存在する末端が、標的核酸の終末端から５０番目の塩基、より好ましくは３０番目の塩基、さらに好ましくは２０番目の塩基、さらに好ましくは１０番目の塩基よりも外側に位置することが好ましい。
【００３８】
ＲｅｃＡタンパク質は、本来、ＡＴＰの存在下において、相同的な組換えを触媒するタンパク質なので、前記試料中にＡＴＰが存在すると相同的組換えが進行して、三本鎖構造は直ぐに消滅してしまう。
【００３９】
従って、本発明の方法を実施する場合には、少なくとも三本鎖核酸を形成させているときと、三本鎖核酸を形成させた後には、試料中にＡＴＰが４．８ｍＭ以上存在してはならないことに注意しなければならない。好ましくは、ＡＴＰの濃度は、０．４８ｍＭ以下であり、ＡＴＰが試料中に存在しないことが最も好ましい。
【００４０】
ＲｅｃＡタンパク質を介して三本鎖構造を形成させるためには、ＡＴＰの機能を代替し得る物質、例えば、ＡＴＰγＳのような非分解性ＡＴＰ類似体を添加しなければならない。
【００４１】
ＲｅｃＡタンパク質を介して三本鎖構造を形成させる前工程に続いて、前記標的核酸に結合したＲｅｃＡタンパク質を解離させる工程を実施する。本工程において、標的核酸からＲｅｃＡタンパク質を解離させることによって、続く最後の工程で、標的核酸の末端領域の一方に所望の処理を施すことが可能となる。
【００４２】
前述のように、標的核酸の末端領域に形成された三本鎖構造は、ＲｅｃＡタンパク質が該領域から解離しても維持される。従って、本工程において、前記標的核酸からＲｅｃＡタンパク質を解離させれば、末端領域のうち一方のみに三本鎖構造が形成された標的核酸が得られる。
【００４３】
三本鎖構造が形成されている領域と形成されていない領域では、次工程で施すべき所望の処理の効率が異なるので、両末端領域のうちの一方に対して優先的に、より好ましくは選択的に所望の処理を施すことが可能となる。一般的には、優先的に所望の処理が施されるのは、三本鎖構造が形成されていないほうの末端領域である。
【００４４】
標的核酸からのＲｅｃＡタンパク質の解離は、トリクロロ酢酸、過塩素酸の添加等の除タンパク操作、ＳＤＳのような界面活性剤の添加、又はタンパク質分解酵素の添加のような簡易な操作によって行い得る。
【００４５】
次に、末端領域の一方だけが三本鎖構造となった標的核酸に所望の処理を与えれば、典型的には、三本鎖構造が形成されていないほうの末端領域に対して、優先的に、好ましくは選択的に所望の処理を施すことができる。
【００４６】
本明細書において、「優先的に」とは、一方の末端領域に対する処理の効率が、他方の末端領域に対する処理の効率を上回ることを意味する。「選択的に」とは、一方の末端領域のみに所望の処理が施されることを意味する。
【００４７】
本工程で与えるべき所望の処理は、ヌクレアーゼ、ポリメラーゼ、及びリガーゼ等を用いた酵素反応、化学的な修飾や付加を含む化学反応、ＤＮＡチップの基板などの固相担体への吸着や電荷の付与などの物理的な処理など核酸に対してなし得る任意の処理であり得る。該処理は、末端領域に形成された三本鎖構造が破壊されない条件で行わなければならない。
【００４８】
末端領域に施すべき所望の処理としては、例えば、アンカー配列の付加、アダプターの付加等を挙げることができる。これらの処理において使用されるリガーゼに対しては、両末端領域は等価なので、本発明の方法を用いなければ、両末端領域には共にアンカー配列、又はアダプターが付加される。
【００４９】
本発明の方法を用いて、一方の末端領域のみにアダプターを付加させる場合、標的核酸の長さは、ＰＣＲでアダプターを付加できないサイズ、具体的には、４０ｋｂ以上、例えば、５０ｋｂ、７５ｋｂ、１００ｋｂ、１５０ｋｂ、又は２００ｋｂのサイズであり得る。
【００５０】
一方の末端領域に対して、優先的に、あるいは選択的にアダプターを付加するためには、核酸プローブは、その一端が核酸塩基の終末端から一ヌクレオチド以上突出するように標的核酸に結合するものを選択することが好ましい。このような核酸プローブは、標的核酸の終末端の一方のみに優先的に所望の処理を施す場合に、一般的に有用であろう。
【００５１】
さらに、本発明の方法は、ＤＮＡ組み換え反応を利用した、クローニング技術にも有用である。この技術は、遺伝子、ゲノムＤＮＡ、ＰＣＲ産物などのＤＮＡ断片を、制限酵素やリガーゼ連結の使用なしで、ベクターＤＮＡにクローニングすることができる技術である。そこでは、λファージの部位特異的組換え系を使っているため、目的ＤＮＡ断片の両端に組換えに必要な異なるDNA配列を付加する必要がある。それ故、本発明の方法は、特に、ＰＣＲを使用できないような長いＤＮＡ断片を、この方法によりクローニングする際に有用である。
【００５２】
このように、本発明の方法を用いれば、標的核酸の末端領域の一方に、所望の処理を優先的に施すことができる。それ故、末端領域の一方に所望の処理が優先的に施すことによって、末端領域が非対称的に修飾された核酸、及びこのような核酸を製造する方法も本発明の範囲に属する。
【００５３】
末端領域が非対称的に修飾された核酸としては、一方の末端領域のみが制限酵素、ヌクレアーゼ、リガーゼなどで処理された核酸、一方の末端領域のみにアダプターが付加された核酸、一方の末端領域のみに固相担体（ＤＮＡチップなどの基板）が結合した核酸が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５４】
末端領域が非対称的に修飾された核酸を製造するには、前記本発明の方法の各工程を行えばよい。
【００５５】
以上が、本発明の方法の基本的な操作であるが、以下に示すように、これらの各操作を改変した操作を行ってもよく、さらに、上記各操作に新たな操作を適宜付加してもよい。
【００５６】
新たな操作を付加する場合、上記基本的な操作を行って標的核酸の末端領域の一方に優先的に所望の処理を施した後に、前記反対側の末端領域に形成された前記三本鎖構造を解消させ、該反対側の末端領域に前記処理とは異なる処理を施してもよい。このような操作を行えば、標的核酸中の等価な領域に対して異なる二種類の処理を施すことが可能になる。
【００５７】
このような操作を行えば、標的核酸の一方の終末端に第一のアダプターを付加した後、他方の終末端に前記第一のアダプターとは異なる第二のアダプターを付加することができる。これによって、現在、ＰＣＲではアダプターを付加できないサイズが大きな標的核酸にも、異なるアダプターを付加することが可能となる。
【００５８】
三本鎖構造を解消させるためには、例えば、熱処理、アルカリ処理、酵素処理（ＤＮＡポリメラーゼなど）を使用し得る。あるいは、三本鎖構造を解消させやすくするために、変異が導入された核酸プローブを使用することも有用である。変異が導入された核酸プローブは、標的核酸への結合性が弱いために三本鎖構造を解消させやすい。
【００５９】
さらに、本発明は、ＲｅｃＡタンパク質などのタンパク質を介さずに、二本鎖核酸の末端領域の一方又は双方に、該末端領域と相同な一本鎖核酸を結合することにより、末端領域の一方又は双方に三本鎖構造が形成された末端被修飾核酸を製造する方法、及びこのような末端被修飾核酸も提供する。
【００６０】
一方の末端領域のみに三本鎖構造が形成された末端被修飾核酸を作成するためには、本発明の方法の第一の工程と第二の工程を実施すればよい。双方の末端領域に三本鎖構造が形成された末端被修飾核酸を作成するためには、前記第一の工程において、二種類のプローブ、すなわち、一方の末端領域と相同な核酸プローブと他方の末端領域と相同な核酸プローブとを添加すればよい。
【００６１】
以下、実験例及び実施例に従って、本発明をさらに詳細に説明するが、いかなる意味においても本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【００６２】
［実験例１］
本実験例では、図１を参照しながら、三本鎖構造の形成における各反応成分の依存性について記載する。
【００６３】
まず、標的核酸として、Ｍ１３ｍｐ１８ＲＦ  ＤＮＡを制限酵素ＳｎａＢＩで直鎖状にしたものと、前記標的核酸の末端領域と相同な配列を有する６０マーの核酸プローブ１（配列番号１）を用意した。核酸プローブ１は、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼと［γ−３２Ｐ］ＡＴＰを用いて、３２Ｐで５’末端を標識した。前記標的核酸と標識された核酸プローブ１との間に三本鎖を形成させるために、１ｐｍｏｌの標識核酸プローブ１、３．０μｇのＲｅｃＡタンパク質、４．８ｍＭ  ＡＴＰ−γＳ、２００ｎｇの標的核酸を、２０ｍＭ  酢酸マグネシウム、３０ｍＭ  酢酸トリス（ｐＨ７．２）中にて、３７℃で３０分間保温した。以下、本実験例、及び実験例２〜４において、該反応条件を標準反応条件と称する。
【００６４】
反応後に、０．５％（Ｗ／Ｖ）ＳＤＳ、０．７ｍｇ／ｍＬプロテイナーゼＫを加え、３７℃で３０分間保温することにより、除タンパクを行い、その半分量を１％アガロースゲル電気泳動に供した。泳動後に、エチジウムプロミドでゲルを染色し、ＤＮＡの写真を記録した。結果を図１（Ｂ）に示す。
【００６５】
図１（Ｂ）から、全てのレーン（各レーンの反応条件は、以下に記載されている）で、標的核酸が正しく泳動されていることが分かる。
【００６６】
次に、ゲルを濾紙の上に載せてゲル乾燥器で乾燥させた後、ゲルのオートラジオグラムをとり、標識核酸プローブ１からのシグナルをＸ線フィルム上に記録した。結果を図１（Ａ）に示す。
【００６７】
図１（Ａ）中、レーンＭは、ＤＮＡサイズマーカーであり、図面の左端にはそれらのサイズが示されている。このサイズマーカーは、λＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄIIIで切断し、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼと［γ―３２Ｐ］ＡＴＰを用いて、３２Ｐで５’末端標識したものである。
【００６８】
レーン２は、前記標準反応条件からＲｅｃＡタンパク質を除いた条件を用いて、三本鎖形成反応を行った場合の結果である。
【００６９】
レーン３は、前記標準反応条件からＡＴＰ−γＳを除いた条件を用いて、三本鎖形成反応を行った場合の結果である。
【００７０】
レーン４は、前記標準反応条件からＲｅｃＡタンパク質とＡＴＰ−γＳを除いた条件を用いて、三本鎖形成反応を行った場合の結果である。
【００７１】
レーン５は、前記標準反応条件において、３２Ｐ標識核酸プローブ１に代えて、３２Ｐ標識核酸プローブ２（配列番号２）を用いた条件で、三本鎖形成反応を行った場合の結果である。
【００７２】
レーン６は、前記標準反応条件において、３２Ｐ標識核酸プローブ１に代えて、３２Ｐ標識核酸プローブ３（配列番号３）を用いた条件で、三本鎖形成反応を行った場合の結果である。
【００７３】
レーン７は、前記標準反応条件において、標的核酸として、ｐＢＲ３２２ＤＮＡを制限酵素ＳｃａＩで切断したものを使用し、且つ該標的核酸の末端領域と相同な配列を有する前記３２Ｐ標識核酸プローブ４（配列番号４）を用いた条件で、三本鎖形成反応を行った場合の結果である。
【００７４】
図１（Ａ）のレーン２〜４では、三本鎖が全く形成されていないので、三本鎖形成反応には、ＲｅｃＡタンパク質とＡＴＰ−γＳが不可欠であることが分かる。また、標的核酸と相同でない核酸プローブを用いたレーン５とレーン６では、三本鎖は形成されなかったので、三本鎖は、ＲｅｃＡタンパク質を介した特異的な反応によって形成されることが明らかである。
【００７５】
レーン１とレーン７では、三本鎖が形成されたので、標的核酸と相同な核酸プローブを用いれば、任意の標的核酸に三本鎖が形成されることが分かった。
【００７６】
［実験例２］
本実験例では、三本鎖形成反応において使用すべきオリゴヌクレオチドの方向性について検討した。以下、図２を参照しながら、本実験例について説明する。
【００７７】
図２（Ａ）の各レーンは、実験例１と同様に、標的核酸に結合した標識核酸プローブを検出したものである。
【００７８】
レーン１は、標準反応条件を用いて三本鎖形成反応を行った後に、実験例１に記載されている除タンパク操作及び電気泳動を行った場合の結果である。
【００７９】
レーン２は、標準反応条件において、核酸プローブ１に代えて、核酸プローブ２を用いた場合の結果である。
【００８０】
レーン３は、標準反応条件において、核酸プローブ１に代えて、核酸プローブ５（配列番号５）を用いた場合の結果である。
【００８１】
レーン４は、標準反応条件において、核酸プローブ１に代えて、核酸プローブ６（配列番号６）を用いた場合の結果である。
【００８２】
核酸プローブ１及び２は、前記標的核酸中の一方の末端領域において三本鎖核酸を形成する。これに対して、核酸プローブ５及び６は、核酸プローブ１及び２が三本鎖核酸を形成する末端領域とは反対側の末端領域において三本鎖核酸を形成する。
【００８３】
また、核酸プローブ１及び５は、標的核酸の各ストランドの５’末端と相同性を有するのに対して、核酸プローブ２及び６は、標的核酸の各ストランドの３’と相同性を有する。
【００８４】
図２の（Ａ）から明らかなように、核酸プローブ１（レーン１）と核酸プローブ５（レーン３）は、標的核酸と三本鎖を安定に形成することができたが、核酸プローブ２（レーン２）と核酸プローブ６（レーン４）は、標的核酸と三本鎖を安定に形成することができなかった。
【００８５】
図２の（Ｂ）は、エチジウムブロミドで全てのＤＮＡを染色した結果を示している。図２の（Ｂ）では、全てのレーンで標的核酸が泳動されているので、核酸プローブ２と核酸プローブ６は、標的核酸が存在しているにもかかわらず、標的核酸と安定に三本鎖を形成し得なかったことが分かる。
【００８６】
本実験例によって、安定な三本鎖を形成するためには、一般に、標的核酸の各ストランドの５’末端と相同な核酸プローブを使用すべきであることが明らかとなった。
【００８７】
［実験例３］
本実験例では、三本鎖の形成に必要な核酸プローブの長さについて調べた。
【００８８】
反応は、前記標準反応条件において、核酸プローブ１に代えて、核酸プローブ７、８、９、１０、及び１１（配列番号７、８、９、１０、及び１１）を用いた条件下で行った。
【００８９】
核酸プローブ７、８、９、１０、及び１１は、それぞれ、核酸プローブ１の５‘末端から、１０、２０、３０、４０、及び５０個のヌクレオチドを除去したものである。
【００９０】
本実験例の結果を図３に示す。
【００９１】
図３（Ａ）に示されているように、核酸プローブが長いほど、より多くの三本鎖を形成することができた。核酸プローブ９は、ほとんど三本鎖を形成することができなかった（レーン４）。核酸プローブ１０、及び１１は、三本鎖を形成することができなかった（レーン５、及び６）。核酸プローブ８は、ある程度三本鎖を形成することができた。これに対して、核酸プローブ７と核酸プローブ１は、大量の三本鎖を形成することができた。
【００９２】
図３（Ｂ）は、エチジウムブロミド染色で染色した標的核酸を表している。
【００９３】
本実験例から、三本鎖を形成するためには、一定の長さ以上の長さを有する核酸プローブを用いることが必要であることが明らかとなった。
【００９４】
［実験例４］
本実験例では、三本鎖が形成される位置と三本鎖の形成量との関係について調べた。
【００９５】
同一の長さ（６０マー）を有する４種類の核酸プローブ１、１２（配列番号１２）、１３（配列番号１３）、及び１４（配列番号１４）を調製した。核酸プローブ１２、１３、及び１４の３’末端は、それぞれ、Ｍ１３ｍｐ１８ＲＦ標的核酸のストランドの５’末端から１０、２０、及び３０番目のヌクレオチドと結合する。結果を図４（Ａ）及び４（Ｂ）に示す。
【００９６】
図４（Ａ）に示されているように、三本鎖が標的核酸の終末端から近い位置に形成される核酸プローブを用いると、三本鎖の形成量が多かった。
【００９７】
図４（Ａ）において、レーン１〜３は、それぞれ、核酸プローブ１、１２、及び１３を用いたときの結果を示している。
【００９８】
標的核酸の終末端から３０番目のヌクレオチドに、３’末端が結合する核酸プローブ１４は、全く三本鎖を形成しなかった（レーン４）。
【００９９】
本実験例でも、エチジウムブロミド染色によって、各レーンに標的ＤＮＡが存在することが確認された（図４Ｂ）。
【０１００】
本実験例の結果から、三本鎖を効率よく形成させるためには、できる限り、標的核酸の末端付近に三本鎖を形成させるべきであることが明らかとなった。
【０１０１】
[実施例１]
本実施例では、図５を参照しながら、標的核酸の一方の末端にアダプターＤＮＡをライゲーションする方法について説明する。
【０１０２】
本実施例では、標的核酸として、ｐＢＲ３２２ＤＮＡを制限酵素ＳｃａＩで直鎖状にしたものと、該標的核酸の末端領域の一方と相同な配列を有する６０マーの核酸プローブ１５（配列番号１５）を用意した。
【０１０３】
標的核酸と核酸プローブ１５との間の三本鎖形成反応は、１０ｐｍｏｌの核酸プローブ１５、５．０μｇのＲｅｃＡタンパク質、４．８ｍＭ  ＡＴＰ−γＳ、１００ｎｇの標的核酸を、２０ｍＭ酢酸マグネシウム、３０ｍＭ酢酸トリス（ｐＨ７．２）中で、３７℃で３０分間保温した。反応後に、０．５％（Ｗ／Ｖ）ＳＤＳ、０．７ｍｇ／ｍＬプロテイナーゼＫを加え、３７℃で３０分間保温することにより、除タンパクを行った。
【０１０４】
その後、４０μＬのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）を加え、６０μＬとして、フェノール・クロロホルム抽出を１回、クロロホルム抽出を１回行った後、エタノール沈殿を行った。
【０１０５】
乾燥させたＤＮＡペレットを、１０μＬの蒸留水に溶かした。続いて、１ｐｍｏｌの３２Ｐ標識アダプターを加え、ライゲーションキット（タカラ酒造）を用いて、１６℃で６０分間保温することにより、ライゲーション反応を行った。ここで用いたアダプターＤＮＡは、オリゴヌクレオチド１（配列番号１６）とオリゴヌクレオチド２（配列番号１７）を０．１×ＳＳＣ中にて、８０℃で１０分間保温し、２時間かけて徐々に冷却して二本鎖にすることによって調製した。
【０１０６】
ライゲーション反応後に、フェノール・クロロホルム抽出を１回、クロロホルム抽出を１回行った後、エタノール沈殿を行った。
【０１０７】
乾燥させたＤＮＡペレットを、８μＬの蒸留水に溶かした後、２μＬの、ゲルローディング  バッファー（０．２５％  ブロモフェノールブルー、  ０．２５％キシレン  シアノール  ＦＦ、  １５％  フィコール  （タイプ  ４００；ファルマシア）ｉｎ  ｗａｔｅｒ）を混ぜ、その半分量について、３７℃で６０分間保温した。その半分量について、１％アガロースゲル電気泳動を行った。
【０１０８】
泳動後に、ゲルをエチジウムブロミド染色し、ＤＮＡの写真を記録した（図５（Ｂ））。また、ゲルを濾紙の上に載せてゲル乾燥器で乾燥させた後、ゲルのオートラジオグラムをとり、標識核酸アダプターからのシグナルをＸ線フィルム上に記録した。その結果を図５（Ａ）に示す。
【０１０９】
レーン１は、標的核酸にさらなる処理を行わずに、三本鎖を形成させた場合の結果を示している。
【０１１０】
レーン２は、前記標的核酸の一ヶ所を制限酵素で切断して得られた産物の半分量をゲルにかけ、核酸プローブ１５を用いて該産物を検出した場合の結果を示している。制限酵素による切断は、エタノール沈殿後の前記乾燥ＤＮＡペレットを、８μＬの蒸留水に溶かした後、１０Ｕｎｉｔｓの制限酵素ＰｙｕIIを加えて、３７℃で６０分間保温することによって行った。
【０１１１】
核酸プローブ１５は、レーン２のサイズが小さいほうのバンドに相当する断片と三本鎖を形成することができる。
【０１１２】
レーン３は、レーン２に存在するバンドのうちサイズが大きいほうのバンドに相当する断片と三本鎖を形成することができる核酸プローブ１６（配列番号１８）を用いた場合の結果を示す。
【０１１３】
レーン４は、レーン２と同様に、標的核酸の一ヶ所を制限酵素で切断して得られた産物の半分量をゲルにかけた場合の結果を示している。レーン４では、核酸プローブ１６を使用した。
【０１１４】
レーン５は、標的核酸を制限酵素で切断せずにゲルにかけた場合の結果を示している。レーン５では、核酸プローブ１５と１６を使用した。
【０１１５】
レーン６は、レーン２と同様に、標的核酸の一ヶ所を制限酵素で切断して得られた産物の半分量をゲルにかけた場合の結果を示している。レーン６では、核酸プローブ１５と１６を使用した。
【０１１６】
レーン７〜１２では、それぞれ、標的核酸の終末端からその末端が１塩基突出するように標的核酸と三本鎖を形成する核酸プローブ１７（配列番号９；レーン７及び８）、核酸プローブ１８（配列番号２０；レーン９及び１０）、及び核酸プローブ１７と核酸プローブ１８の両者（レーン１１及び１２）を使用した。核酸プローブ１７は、レーン８のサイズが小さいほうの断片と三本鎖を形成することができ、核酸プローブ１８は、レーン８のサイズが大きいほうの断片と三本鎖を形成することができる。
【０１１７】
レーン７、９、及び１１では、標的核酸を制限酵素で処理せずにゲルにかけた。レーン８、１０、及び１２では、レーン２と同様に、標的核酸を制限酵素で処理した後にゲルにかけた。
【０１１８】
レーン１〜６では、標的核酸の終末端から、その末端が突出しないように三本鎖を形成する核酸プローブ１５及び１６（以下、非突出プローブという）を使用したので、標識アダプターの付加を効率的に阻害することができなかった。
【０１１９】
これに対して、標的核酸の終末端から、その末端が突出するように三本鎖を形成する核酸プローブ１７及び１８（以下、突出プローブ）を使用すると、標識アダプターの付加を効率的に阻害することができた。レーン８、１０、及び１２の対応するバンドが薄くなっていることから、核酸プローブ１７、１８、及び両者を用いたときに、それぞれ、小さいほうの断片への標識アダプターの付加、大きいほうの断片への標識アダプターの付加、及び両断片への標識アダプターの付加が効率的に阻害されたことが分かる。
【０１２０】
本実施例により、本発明の方法を用いると、標的核酸の末端へのアダプターの付加を阻害できることが明らかとなった。本実施例により、標的核酸の終末端から、その末端が突出するような核酸プローブを用いると、アダプターの付加を効率的に阻害できることも明らかとなった。
【０１２１】
［実施例２］
本実施例では、図６を参照しながら、標的核酸へのアダプター付加の阻害における、各反応成分への依存性について説明する。
【０１２２】
図６のレーン１は、実施例１における図５のレーン８と同じ反応を行ったときの結果を示している。
【０１２３】
レーン２は、ＲｅｃＡタンパク質を添加せずに、レーン１と同じ反応を行ったときの結果を示している。
【０１２４】
レーン３は、図５のレーン８で使用した反応工程において、エタノール沈殿後の乾燥ＤＮＡペレットを、８μＬの蒸留水に溶かした後に、８５℃で１０分間熱処理を行い、その後は同じ処理を行ったときの結果を示している。
【０１２５】
レーン４は、ＡＴＰ−γＳとＲｅｃＡタンパク質をともに添加せずに、レーン１と同じ反応を行った結果を示している。
【０１２６】
レーン５は、核酸プローブを添加せずに、レーン１と同じ反応を行ったときの結果を示している。
【０１２７】
レーン６は、標的核酸と相同な配列を持たない核酸プローブ１（配列番号１）を用いて、レーン１と同じ反応を行ったときの結果を示している。
【０１２８】
図６の（Ａ）から、標的核酸へのアダプターの付加を阻害するためには、ＡＴＰ−γＳ、ＲｅｃＡタンパク質、標的核酸と相同な核酸プローブを使用しなければならないことが明らかとなった。
【０１２９】
図６の（Ａ）のレーン３では、標的核酸のアダプターの付加が阻害されているので、標的核酸と核酸プローブとによって形成される三本鎖は、熱処理に対して比較的安定であることも明らかとなった。
【０１３０】
図６の（Ｂ）は、エチジウムブロミドで全てのＤＮＡを染色した結果を示している。
【０１３１】
［実施例３］
本実施例では、図７を参照しながら、標的核酸へのアダプターの付加の阻害に対する、標的核酸の末端の形状の効果について説明する。
【０１３２】
図７の（Ａ）のレーン１は、実施例１における図５のレーン８と同じ反応を行ったときの結果を示している。
【０１３３】
レーン２は、核酸プローブを添加せずに、レーン１と同じ反応を行ったときの結果を示している。
【０１３４】
レーン３は、標的核酸として、ｐＢＲ３２２ＤＮＡを制限酵素ＰｓｔＩで切断したものを用いたことと、核酸プローブ１９（配列番号２１）を用いたこと以外は、図５のレーン８と同じ反応を行ったときの結果を示している。
【０１３５】
レーン４は、核酸プローブを添加せずに、レーン３と同じ反応を行ったときの結果を示している。
【０１３６】
レーン１とレーン３では、ともに、アダプターの付加が阻害されているが、突出末端を有する標的核酸を使用したレーン１のほうが、平滑末端を有する標的核酸を使用したレーン３に比べて、より効率的に、アダプターの付加が阻害されることが分かった。
【０１３７】
核酸プローブを添加しなかったレーン２とレーン４では、アダプターの付加は全く阻害されなかった。
【０１３８】
図７の（Ｂ）は、エチジウムブロミドで全てのＤＮＡを染色した結果を示している。
【０１３９】
本実施例から、標的核酸の末端の形状が、アダプターの付加の阻害効率に影響を与えることが明らかとなった。
【０１４０】
［実施例４］
本実施例では、図８を参照しながら、本発明の方法によるアダプター付加の阻害の経時変化について説明する。
【０１４１】
図８（Ａ）のレーン１は、実施例１における図５のレーン２で使用した条件（非突出プローブを使用）において、三本鎖形成反応を３０秒行ったときの結果を示している。
【０１４２】
レーン２、３、４、及び５は、レーン１と同一の条件下で、それぞれ、３０、６０、１２０、及び１８０分間、三本鎖形成反応を行ったときの結果を示している。
【０１４３】
レーン６は、図５のレーン８で使用した条件（突出プローブを使用）において、三本鎖形成反応を３０秒行ったときの結果を示している。
【０１４４】
図８（Ｃ）は、図８（Ａ）のレーン１〜５のシグナル強度を、ＢＡＳ  ２０００  Ｉｍａｇｅ  ａｎａｌｙｚｅｒを用いて測定し、これをグラフ化したものである。
【０１４５】
レーン７、８、９、及び１０は、レーン６と同一の条件下で、三本鎖形成反応を、それぞれ、３０、６０、１２０、及び１８０分間行ったときの結果を示している。
【０１４６】
図８（Ｄ）は、図８（Ａ）のレーン６〜１０のシグナル強度を、ＢＡＳ  ２０００  Ｉｍａｇｅ  ａｎａｌｙｚｅｒを用いて測定し、これをグラフ化したものである。
【０１４７】
図８（Ｃ）と（Ｄ）の横軸は反応時間であり、縦軸は標的核酸に付加された放射能のパーセントである。アダプター中の放射能の総量が１００％である。
【０１４８】
図８（Ａ）のレーン１〜５、及び図８（Ｃ）から明らかなように、三本鎖形成反応に、非突出プローブを使用すると、三本鎖の形成は殆ど進行しないために、アダプター付加及びこれに続くライゲーション反応が阻害されなかった。
【０１４９】
図８（Ａ）のレーン６〜１０、及び図８（Ｄ）から明らかなように、三本鎖形成反応に、突出プローブを使用すると、三本鎖の形成は殆ど進行しないために、アダプター付加及びこれに続くライゲーション反応が経時的に阻害された。
【０１５０】
図８（Ｂ）は、エチジウムブロミドで全てのＤＮＡを染色した結果を示している。
【０１５１】
本実施例から、突出プローブを用いると、三本鎖が経時的に形成され、アダプター付加及びライゲーション反応が経時的に阻害されるのに対して、非突出プローブを用いると、殆ど三本鎖が形成されず、このため、アダプター付加及びライゲーション反応が殆ど阻害されないことが明らかとなった。
【０１５２】
【発明の効果】
本発明によれば、標的核酸の末端領域の一方に、所望の処理を優先的に、又は選択的に施すことができる。
【０１５３】
本発明によれば、標的核酸の末端領域の一方のみに、アダプターなどの配列を付加することができる。あるいは、標的核酸の末端領域に、それぞれ異なるアダプターを付加することができる。
【０１５４】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】実験例１の結果を示す電気泳動。
【図２】実験例２の結果を示す電気泳動。
【図３】実験例３の結果を示す電気泳動。
【図４】実施例４の結果を示す電気泳動。
【図５】実施例１の結果を示す電気泳動。
【図６】実施例２の結果を示す電気泳動。
【図７】実施例３の結果を示す電気泳動。
【図８】実施例４の結果を示すグラフと電気泳動。
【図９】本発明の方法の基本的操作の概略を示した模式図。
【符号の説明】
１  標的ＤＮＡ
２  プローブＤＮＡ
３  ＲｅｃＡタンパク質
４  プローブＤＮＡ・ＲｅｃＡタンパク質複合体
５  三本鎖ＤＮＡ構造
６  アダプターＤＮＡ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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