(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
表示装置に画像を生成するかまたは処理および分析を行なうために、試料から放出される光が画像取込装置によって画像化されて映像信号を生成する装置であって、
−  試料を搭載するための手段と、
−  励起光を生成するための光源と、
−  共焦点走査システムとを含み、前記共焦点走査システムは励起光を一方向に向けることにより試料の或る区域を走査するよう適合され、また、励起光が当該試料上に照射された結果別の方向に放出される光を伝達するよう適合され、これにより、使用時に前記試料の対象区域を走査するよう作動し、前記装置はさらに、
−  画像取込装置を含み、前記画像取込装置は空間的に離散した感光領域を有し、その上において、前記試料から放出される光は、前記走査システムを通じて前記別の方向に伝達された後に焦点が合わされて画像を形成し、前記装置はさらに、
−  制御手段を含み、前記制御手段はホストコンピュータおよびコントローラを含み、前記コントローラは、状態カウンタと、状態メモリと、クロック信号を受ける期間ダウンカウンタとを有する状態機械として機能するようプログラミングされ、前記コントローラはさらに、各画像が前記画像取込装置に形成されるようにするために、前記試料からの光が、ｎ回（ｎは１以上の整数）対象区域を走査するのに前記走査システムが必要とするのと等しい特定の期間にわたって前記画像取込装置に入射するように、前記走査システム、前記励起光および前記画像取込装置を制御するよう適合される、装置。
【請求項２】
前記試料が照射される場合を除いて、使用時に前記励起源からの光を遮るよう前記制御手段からの信号によって作動させられるシャッタ手段をさらに含み、前記シャッタ手段は音響光学要素を含む、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記走査システムと前記画像取込装置との間に第２のシャッタ手段をさらに含み、前記第２のシャッタ手段は、リン光、残光、迷光反射または前記取込装置に到達する他の作用による光から発生し得るエラーを減ずる目的で、励起光が前記試料に入射する特定の期間を除いて、使用時に光が画像取込装置センサの少なくとも一部に達するのを防ぐように前記制御手段からの信号によって作動させられる、請求項２に記載の装置。
【請求項４】
使用時に前記励起光によって照射されるべき前記試料の区域を含む面の位置が前記試料に対して調整され得るように、直線軸（Ｚ軸）に沿って前記試料、前記走査システム、または前記走査システム内における光学系の要素を移動させるよう適合される駆動手段をさらに含む、請求項１から３のいずれかに記載の装置。
【請求項５】
使用時に、前記駆動手段を制御する制御システムは、前記直線軸に沿った運動を、前記画像取込装置への光の到達を妨げる期間に制限するよう作動する、請求項４に記載の装置。
【請求項６】
前記駆動手段を制御する制御システムは、前記励起源の光が妨げられるかまたは前記試料に到達するのが妨げられる期間中に前記直線軸に沿った運動だけをもたらすよう動作可能である、請求項４または５に記載の装置。
【請求項７】
前記試料または前記走査システムまたは前記光学系の要素の直線軸運動は連続的であり、前記装置はさらに、前記画像取込装置における画像、または、前記画像取込装置からの信号によって生成され、前記連続した運動のためにぼやけた画像を再度鮮明にするために、当該画像信号にデコンボルーションを適用する手段を含む、請求項４に記載の装置。
【請求項８】
使用時に、励起光の波長は露光ごとに異なり、前記装置は２つ以上の励起光源を含み、各々は、異なる波長をもつ励起光を生成し、前記制御手段は、使用時に各露光に対する適切な波長の光を供給するように前記源を選択するよう適合される、請求項１から７のいずれかに記載の装置。
【請求項９】
使用時に、励起光の波長は露光ごとに異なり、前記装置は異なる波長の光を生成するよう調整可能な励起光の単一の源を含み、前記制御手段は、各露光に必要とされる波長を有する光を生成するように前記源を調整するよう適合される、請求項１から７のいずれかに記載の装置。
【請求項１０】
前記励起光源は同時に２つ以上の波長の光を生成するよう動作可能である、請求項１から９のいずれかに記載の装置。
【請求項１１】
単一の励起光源が用いられ、そこから放出される光の波長が変更可能であり、前記制御手段は、所望の波長の光を生成するように前記源を調整するよう適合され、前記光源は音響光学チューナブルフィルタ（ＡＯＴＦ）結晶を含むレーザ光源であり、前記制御手段は、放出された光の波長を制御するために結晶に与える周波数制御信号を替えるように信号を供給するよう適合される、請求項１から７、９および１０のいずれかに記載の装置。
【請求項１２】
前記励起光源が光のパルスを生成するよう動作可能である、請求項１から１１のいずれかに記載の装置。
【請求項１３】
励起光の強度は減衰要素によって制御され、前記制御手段は、使用時に必要に応じて前記減衰要素を制御するよう適合される、請求項１から１２のいずれかに記載の装置。
【請求項１４】
前記減衰要素はＡＯＴＦまたはＬＣＤシャッタである、請求項１３に記載の装置。
【請求項１５】
前記制御手段は、各波長のために前記試料に対する所定の照射強度を与えるように照射の強度を変えるよう適合されて、波長ごとの強度の変動を取除く、請求項１から１４のいずれかに記載の装置。
【請求項１６】
前記制御手段は、露光ごとに前記励起光源へのパワーを調整しかつ／またはそこから出てくる光の減衰を制御するよう適合されて、実質的に一定の強度の発光をもたらして、励起光の波長が異なるために画像取込装置センサに入射する光の強度の変動を減じるか、もしくは波長に関係なく類似の強度をもつ発光のために光を放出させるか、またはこの両方を行なう、請求項１から１５のいずれかに記載の装置。
【請求項１７】
装置を用いて試料からの光を画像化する方法であって、当該装置においては、励起光が共焦点走査システムを介して一方向から前記試料に伝わり、前記試料の発光によって放出される光が前記走査システムを介して別の方向に進んで画像取込装置に伝わり、前記画像取込装置は空間的に離散した感光領域を有するセンサを有し、前記走査システムは前記試料の対象区域全体を走査するよう作動させられ、前記装置は制御手段を含み、前記制御手段はホストコンピュータとコントローラとを含み、前記コントローラは、状態カウンタと、状態メモリと、クロック信号を受ける期間ダウンカウンタとを有する状態機械として機能するようプログラミングされ、前記走査システム、前記励起光および前記画像取込装置は、各画像が前記画像取込装置に形成されるようにするために、前記試料から放出される光が、ｎ回（ｎは１以上の整数）前記対象区域全体を走査するのに必要とされるのと等しい特定の期間にわたって前記画像取込装置に入射するよう前記コントローラによって制御される、方法。
【請求項１８】
リン光、残光、迷光反射または取込装置センサに到達する他の作用から生じる光から発生し得るエラーを減ずる目的で、励起光が試料に入射する前記特定の期間を除いて、前記画像取込装置センサの少なくとも一部に光が到達するのを防ぐよう作動するシャッタ手段が設けられる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記試料は少なくとも部分的に透明であり、複数の画像は、空間的に離れた複数の異なる面において試料を走査することによって形成される、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記励起光は２つ以上の異なる波長を有する光で構成される、請求項１７から１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
音響光学チューナブルフィルタ（ＡＯＴＦ）結晶を含む単一の励起光源が用いられ、放出された光の波長は必要に応じて結晶に与える周波数制御信号を替えることによって変えられる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記励起光がパルス化される、請求項１７から２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
前記入射する励起光の強度は、ＮＤフィルタを介在させるか、光路における虹彩絞りを開いたり閉じたりするか、光源へのパワーを調整するか、またはＡＯＴＦもしくはＬＣＤシャッタなどの減衰要素を用いるか、またはそのいずれかの組合せを用いることによって露光ごとに調整される、請求項１７から２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
前記試料は異なる波長の光によって照射され、前記強度は、各波長のために前記試料に対する所定のレベルの励起強度を生成するよう調整される、請求項１７から２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
前記調整により、各々の異なる波長のために前記試料に対する実質的に同様のレベルの強度がもたらされる、請求項２４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
この発明は、分析のために試料またはサンプルの発光要素を画像化することのできる方法および装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
レーザ励起共焦点イメージング、（マイクロレンズ高度ディスクスキャナであり得る）ニポウ（Nipkow）ディスクスキャナおよびデジタルカメラを用いて２次元の画像データを供給することが公知であり、制御されたＺ軸運動がまたもたらされる場合、３次元の画像データを得ることができる。発光要素が時間とともに変化する場合、４次元（すなわち面積、深さおよび時間）のデータを供給するために一連の画像を得ることができる。可能であれば、励起波長、発光波長、偏光および／または発光寿命を含む他のパラメータがまた変更または観察され得る。
【０００３】
細胞や組織サンプルなどの微視的な試料についてこのようなデータを提供することのできる１つのシステムは、パーキン・エルマー・ライフ・サイエンス（Perkin Elmer Life Sciences）によって製造および供給されるUltraVIEW Live Cell Imagerである。このシステムは、カワムラ（Kawamura）、ネギシ（Negishi）、オオツキ（Otsuki）およびトモサダ（Tomosada）により横河技報（Yokogawa Technical Report）Ｎｏ．３３（２００２）英語版および横河の特許ＥＰ  ０５３９６９１、ＷＯ  ９８０４９４６に発表された「共焦点レーザ顕微鏡およびＣＣＤカメラ（“Confocal Laser Microscope and CCD Camera”）」と題された論文に記載されるような共焦点レーザ顕微鏡およびＣＣＤカメラ画像化システムを用いる。
【０００４】
アトー（Atto）によるＵＳ  ６１４７７９８に記載されるように、共焦点性を実現するために１つ以上のレンズ無しのディスクを用いることも公知である。ここでは、レンズ無しのディスクの回転はニポウディスクの回転に対応する。
【０００５】
ＵＳ  ５２４８８７６およびＷＯ  ０３／０１９２４２は、固定されたパターンのピンホールを用いて線形に走査する別の共焦点走査プロセスを説明する。ピンホールアレイを用いる１回の完全な走査はニポウディスクの回転に対応する。
【０００６】
ＵＳ  ５０３４６１３（デンク（Denk））は、活性化される焦平面を制限し、共焦点性を達成する２光子プロセスとして公知の別のプロセスを説明する。ここでは、励起源からの１パルスはニポウディスクの回転に等しい。
【０００７】
別のピンホールベースの共焦点走査システムが、ベレスドルフ（Beresdorf）他による「多焦点多光子顕微鏡法（“Multifocal Multiphoton Microscopy”）」と題された報告書（１９９８、Ｏｐｔ−Ｌｅｔｔ２３（９）：６５５〜６５７）に説明される。ここでは、ピンホールを用いる１回の完全な走査はニポウディスクの回転に対応する。
【０００８】
さらなる共焦点走査システムが、ＵＳ  ２００２／０２４００７、ＥＰ  ０９１１６６７、ＵＳ  ５，５８７，８３２およびＵＳ  ６，４８３，６４１／ＥＰ  １２０７４１５に記載される。このシステムは制御可能なミラーのアレイを用いてピンホールのアレイを合成する。また、ピンホールの１回の完全な走査はニポウディスクの回転に対応する。
【０００９】
最後に、ランダムまたは擬似ランダムのパターンに配置された透過要素および反射要素が、ＷＯ  ９７／３１２８２およびＷＯ  ００４３８１９（ウィルソン（Wilson）他）に記載されるように共焦点走査のために用いられてもよい。また、透過要素および反射要素の１回の完全な走査はニポウディスクの回転に対応する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
この発明の目的は、現在用いられているシステム、特に、現在のＵｌｔｒａＶＩＥＷシステムや、上述の横河技報Ｎｏ．３３（２００２）ならびに関連する特許ＥＰ  ０５３９６９１、ＷＯ  ９８０４９４６、ＥＰ  １２４５９８６、ＵＳ  ５，６３３，７５１およびＵＳ  ６，３８８，８０８に記載されるシステムに優る改善例である画像化システムを提供することである。
【００１１】
この発明の目的はまた、画像化およびデータ取込プロセスをより正確に制御するための制御システムとこのようなシステムの動作方法とを提供することである。
【００１２】
この発明の目的はまた、サンプルまたは試料における発光要素から光を取込み、取込まれた光をデータに変換して、分析および／もしくは表示および／もしくは後の表示のために記憶するために処理し、ならびに／または分析のために処理するための改善された方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
発明の概要
この発明の一局面に従うと、試料からの光を画像化する方法においては、励起光が走査システムを介して試料に伝わり、試料の発光によって放出される光が別の方向に進み走査システムを介して画像取込装置に伝わり、当該画像取込装置は空間的に離散していて明瞭な感光領域を有し、当該走査システムは試料の対象区域全体を走査するように作動させられ、励起光および／または画像取込装置は、試料から放出される光が、対象区域全体をｎ回走査するのに必要とされるのと等しい特定の期間だけ画像取込装置に入射するように制御される（ｎは１以上の整数である）。
【００１４】
対象区域は試料のうちの視認可能な区域全体またはその一部であってもよく、当該区域のいくらかまたはその全体を走査することを可能にするために寸法および位置が可変であるウィンドウが走査システムによって作り出されてもよく、たとえば、寸法および位置が可変であるサブアレイが用いられてもよい。
【００１５】
好ましい構成においては、当該走査システムは回転するニポウディスクスキャナを含み、励起光がディスクにおける開口部を通って一方向に進み、試料の発光によって放出される光が開口部を通って反対方向に進んで画像取込装置において画像を形成し、開口部のパターンは、ディスクのＡ°の回転により対象区域全体を走査するようなものであり、特定の期間はディスクのｎＡ°の回転に対応するよう選択される（ｎは１以上の整数である）。
【００１６】
便宜上、画像取込装置はＣＣＤカメラである。
【００１７】
単一のニポウディスクが用いられてもよいが、より好ましくは、２ディスクの構成が用いられ、横河技報Ｎｏ．３３（２００２）に記載されるように一方が開口部を含み、他方がマイクロレンズを含む。ここに参照されるディスク（またはディスク手段もしくはディスク構成）は、当該技報に記載されるような複数のディスクアセンブリ、ならびに文脈によりそのように認められる単一ディスクの構成を含むことが意図されている。
【００１８】
代替的には、（たとえば米国特許６１４７７９８に記載されるように）１つ以上のレンズ無しのディスクが用いられてもよい。この場合、レンズ無しのディスクの回転はニポウディスクの回転に対応する。
【００１９】
代替的には、（たとえば米国特許５２４８８７６およびＷＯ  ０３／０１９２４２に記載されるように）１つのピンホールまたは固定パターンのいくつかのピンホールを用いるラスタ走査技術などの線形プロセスを用いて光が走査されてもよく、この場合、ピンホールの１回の完全な線形走査はニポウディスクの回転に対応する。
【００２０】
代替的には、（たとえばＵＳ  ６０３８０７６に記載されるように）走査スリットスキャナが用いられてもよく、この場合、スリットの走査はニポウディスクの回転に対応する。
【００２１】
代替的には、共焦点性は、活性化される焦平面を制限する２光子プロセスによって達成されてもよく（米国特許５０３４６１３の記載を参照）、この場合、２光子励起源の１パルスはニポウディスクの回転に対応する。
【００２２】
代替的には、（「多焦点多光子顕微鏡（“Multifocal Multiphoton Microscope”）」（１９９８  Ｏｐｔ  Ｌｅｔｔ．  ２３（９）：６５５〜６５７）と題されたビューワースドルフ（Bewersdorf）、ピック（Pick）およびヘル（Hell）による論文に記載されるように）共焦点性は時間遅延多重化プロセスによって得られてもよく、この場合、ピンホールの１回の完全な走査がニポウディスクの回転に対応する。
【００２３】
代替的には、独立して制御可能なミラーのアレイを用いて、ピンホールを合成してもよく（たとえばＥＰ  ０９１１６６７およびＵＳ  ２００２，０２４００７を参照）、この場合、ミラーを用いる完全な走査は画像またはサブ画像を作り出し、ニポウディスクの回転に対応する。
【００２４】
代替的には、（ＷＯ  ９７／３１２８２およびＷＯ  ００４３８１９に記載されるように）透過要素および反射要素上のランダムまたは擬似ランダムのパターンが走査されてもよく、この場合、透過要素および反射要素の１回の完全な走査はニポウディスクの回転に対応する。
【００２５】
この発明の別の局面に従うと、空間的に離散していて明瞭な感光領域を含むセンサを含む画像取込装置を用いて試料からの光を画像化する方法においては、一連の別個の特定の期間の各々にわたって励起源以外からの光が試料に到達するのを防止する走査装置が用いられ、画像取込装置は当該期間の各々の終わりに読出され、次の当該期間が始まる前にリセットされ、励起光源からの光が当該特定の期間の各々に正確に等しい時間にわたって供給され、その後消されるので、画像取込装置の露光期間は、励起光源が活性化状態である時間だけ制御される。
【００２６】
この発明を実施する一方法においては、露光期間を制御するよう励起光源がオンやオフに切換えられる。
【００２７】
代替的または付加的には、試料が走査されるべき場合を除いて励起源からの光を遮断するためにシャッタ手段が設けられてもよく、励起光源は、継続的に、または当該特定の期間よりも長い期間にわたって動作可能である。
【００２８】
代替的または付加的には、固有の（電子）シャッタが用いられてもよい。
【００２９】
代替的または付加的には、励起光を遮断するために光チョッパが用いられてもよい。
【００３０】
代替的には、音響光学光遮断要素が用いられてもよい。
【００３１】
シャッタ手段は、励起光が試料に入射する特定の期間を除いて光が取込装置センサのすべてまたは一部に到達するのを防ぐよう走査システムと画像取込装置との間に設けられてもよく、これにより、リン光、残光、迷光反射または他の作用から生じ、当該装置に到達する光から発生し得るエラーを減じ得る。
【００３２】
シャッタ手段が励起源および画像取込装置の両方のために設けられる場合、これらは機械的または電気的手段などによって好ましくは同期的に作動するか、もしくは電子擬似シャッタ手段が用いられ得るか、またはそのいずれかの組合せが用いられ得る。
【００３３】
試料は、その大部分が透明である場合、空間的に離れた好ましくは互いに対して平行でもある別々の面で走査および画像化され得る。
【００３４】
複数の画像が短期間（たとえば１分〜６０分）または長期間（たとえば２４〜７２時間）ならびにその中間の期間（たとえば１〜２４時間）にわたって集められてもよい。このような画像はしばしば画像の積重ねと称される。
【００３５】
こうして、当該方法は試料と走査装置との間の相対運動を含み得る。これは、たとえば、画像化されるべき走査面に対して垂直な軸（典型的にはそのＺ軸）に沿って走査装置をずらすことによって達成することができ、これにより、入射光の焦点をその軸に沿って異なる点に合わせることができ、各々の点が異なる焦平面に位置（およびこれを規定）することにより、間隔をあけて平行に配置された別々の面において試料を走査および画像化することが可能となる。好ましくは、運動は、少なくとも励起光が試料に入射しない期間、および／または、画像取込装置がまた試料の発光による光に反応しない期間に制限される。
【００３６】
代替的には、光学経路は、対物レンズまたは試料を動かすことにより、典型的には試料を収容するホルダを動かすことにより、異なる面を規定するよう変更され得る。
【００３７】
こうして、好ましい構成においては、試料キャリアは間隔をあけて配置された画像平面を規定するようずらされる。
【００３８】
変位の軸は焦平面に対して９０°以外の角度であってもよい。
【００３９】
典型的には、Ｚ軸運動は、当該期間の各々の終わり、またはＮ個のこのような連続する期間の後に実行される（Ｎは１以上の整数である）。当該運動は、走査装置または光学系要素と試料との間の距離を増やしたり減らしたりするようなものであり得る。
【００４０】
露光ごとの各Ｚ軸運動は同じサイズであり得るか、またはその前および／もしくはその後で異なり得る。
【００４１】
Ｚ軸運動は好ましくは別個のステップでなされ、各々は予め定められた等しいサイズであり、その場合、露光ごとの各Ｚ軸運動はＭ個の別個のステップで構成され得る（Ｍは１以上の整数である）。
【００４２】
代替的にはＺ軸運動は連続的であり得る。これにより、Ｚ機構が据付けられるのを待た
なくてもＺ位置間におけるより高速な運動が可能となる。この不利点は、Ｚ位置が画像化中に変わることにより画像がＺにおいてぼやけるおそれがあることである。しかしながら、これは、画像を再度鮮明にするようデコンボルーションを適用することによって補償され得る。
【００４３】
Ｚ軸間隔を変えるのに必要な時間が露光間に必要な最小限の時間よりも長い場合、当該方法は、好ましくは、十分な期間が経過した後または所望のＺ軸運動が達成された後にだけ励起照射および露光が開始されるように露光間の時間を調整するかまたはＺ軸運動に対して照射および画像取込装置露光を制御するステップを含む。
【００４４】
励起光は２つ以上の異なる波長を有する光で構成され得る。
【００４５】
当該方法は露光ごとの励起光の波長の変動を含み、当該方法はまた、好ましくは、１回の露光の終わりと次の露光の初めとの間で励起光の波長を変えるステップを含む。
【００４６】
試料の同じ面に光を集中させる間に励起光の波長の変動がもたらされる（すなわち、一連の露光を構成する一連の２回以上の励起および露光ステップの各々の間にＺ軸運動がないが、但し、各々が励起光の１つの波長または２つ以上の異なる波長を同時に用いる）場合、Ｚ軸運動は各々の完全な一連の露光が実行された後にしか開始されず、次の一連のこのようなステップは各Ｚ軸運動が完了した後にしか開始されない。
【００４７】
加えて、当該システムで用いられ試料を保持する顕微鏡のステージは、サンプルの他の部分、たとえば同じスライド上の他の細胞または組織もしくはサンプルの他の領域などを見えるようにするためにより大規模なＸまたはＹ運動（１０ミクロン〜１０ｍｍ）をもたらし得る。
【００４８】
いくつかのサンプルがマルチウェルプレートのウェル（窪み）に保持され得る。当該サンプルはすべて類似していてもよいが異なっていてもよく、たとえば成分、濃度または経時のために異なっている可能性がある。マルチウェルプレートは顕微鏡ステージ上に搭載され得、当該顕微鏡ステージは、異なるウェルを整合させるかまたは単一のサンプルのうちの別々の部分をウェルのうちの１つに整合させるように動かされる。
【００４９】
加えて、Ｚ運動は、時間を節約するために一方向へ、次に別の方向へと交互になされ得る。
【００５０】
波長の変動は、異なるピーク波長をもつ２つ以上の光源を用い、かつ当該源を選択的に作動させるか、または、当該源からの光を必要に応じて選択的に走査装置および試料に向けることによって達成され得る。
【００５１】
使用される光源は、より複雑なスペクトル特性（たとえば、主線が４８８ｎｍであり、付加的な線が４７６ｎｍおよび４９６ｎｍであるアルゴンイオンレーザから得られる複数のピーク）を有し得る。
【００５２】
２つ以上の波長を持つ光が同時に生成される場合、当該波長は単一のコードによって（たとえば４つの波長のうち１つをコード００、０１、１０、１１として選択する２本の線）、または個々の信号線の組として（たとえば４つの波長に対する４本の線）選択され得る。このようにして、数本の線が同時に活性化され得る。
【００５３】
この発明の好ましい特徴にしたがうと、励起光は１つ以上のレーザ光源から得ることができる。
【００５４】
代替的には、当該光源は、直接駆動されるレーザダイオードを含み得る。
【００５５】
好ましい構成においては、音響光学チューナブルフィルタ（ＡＯＴＦ）結晶を含む単一の光源が用いられ、放出される光の波長は、必要に応じて周波数制御信号を結晶に替えることによって変更される。このような構成は、単一のレーザ源、または出力が光学的に結合され得る２つ以上のレーザ光源を含み得る。
【００５６】
好ましくは、制御信号の周波数のいずれの変更も露光の合間にもたらされる。
【００５７】
励起光はパルス化され得る。
【００５８】
励起光は偏光され得る。
【００５９】
発光源または白熱光源が励起光源として用いられてもよく、当該源によって放出される光の波長を制御するために光学フィルタまたはモノクロメータが用いられてもよい。
【００６０】
代替的には、１つ以上の発光要素を含み得る発光ダイオード（ＬＥＤ）源が用いられてもよい。
【００６１】
試料に入射する励起光の強度が露光ごとに調整されるべき場合、当該方法は、好ましくは、露光の合間に入射する照射の強度を調整するステップを含む。
【００６２】
これは、たとえば、ＮＤ（neutral density）フィルタを介在させるか、光路における虹彩絞りを開いたり閉じたりするか、光源へのパワーを調整するか、ＡＯＴＦもしくはＬＣＤシャッタなどの減衰要素を用いるか、またはこのいずれかの組合せによって達成され得る。
【００６３】
たとえば、源ごとに、または制御された励起光源の動作モードごとに固有の強度のばらつきがあるために起り得るように、ある一波長で試料に入射する励起光の強度が別の波長で入射する場合とは異なる場合、波長ごとの励起照射の強度は、各波長ごとに試料に対して所定の強度で照射するよう調整され得る。
【００６４】
典型的には、但し以下に限られないが、波長の変動に応じて露光ごとに行なわれるパワー調整は、波長とは関係なく各々の露光を構成する走査中に試料に対して実質的に同様のレベル（すなわち強度）で照射することを確実にするようなものである。
【００６５】
サンプルからの発光が発光の波長に応じて異なる場合、類似の技術が用いられてもよく、（波長に関係なく）放出された光を類似の強度にするために、露光ごとのパワーの調整および／または減衰が、その上またはその代わりに、その波長に関係なく実質的に一定の強度の発光をもたらすよう調整され得る。
【００６６】
好ましくは、この発明を実現する方法を実行するシステムはコントロールセンタなどの単一の制御手段から制御され、当該制御手段は典型的にはプログラム可能なコンピュータと１つ以上のインターフェイスとを含み、これにより、コンピュータによって生成される信号が、ドライブへのパワーの供給を駆動もしくは制御するかまたはデバイスへのパワーを制御するのに適した信号へと変換されて、当該方法の別々のステップで必要とされる運動および回転がもたらされる。
【００６７】
好ましい画像取込装置はＣＣＤカメラである。このようなカメラは、アナログ形式また
はデジタル形式で画像信号を供給し得る。好ましくは、デジタル形式で画像信号を生成するカメラが選択される。
【００６８】
画像取込装置がＣＣＤカメラである場合、好ましくは、カメラ出力信号のＳ／Ｎ比を上げるよう冷却される。
【００６９】
使用され得る代替的な画像取込装置は、感光センサ、ＣＭＯＳカメラ、ＣＩＤ（電荷注入素子）カメラ、増倍またはゲート式カメラ、光電子増倍管アレイ、フォトダイオードアレイ、もしくはアドレス指定可能なマイクロクロノメータアレイを用いる画像取込装置であるか、または化学フィルムカメラが用いられてもよい。
【００７０】
画像取込装置に与えられる光が画像を形成することができるので、当該光は、その代わりにまたはその上、画像を人の目で見ることを可能にするアイピースに向けられ得るか、または、画像をスクリーン上に見えるように投射するよう適合された光学装置に向けられ得る。
【００７１】
画像取込装置への光路は、光を画像取込装置、アイピースまたは投射システムの間で分割する（または分ける）ことのできるビーム分割装置またはビーム配向装置を含み得る。
【００７２】
複数の画像取込装置が用いられてもよく、その各々は光が試料から供給されており、その各々は同じ種類の装置であり得るかまたは他の装置とは異なり得る。
【００７３】
カメラはセンサと置換えられてもよい。
【００７４】
１つ以上の画像取込装置が設けられる場合、それへの光路は必要に応じてビーム分割手段またはビーム配向手段を含み得る。
【００７５】
光画像は、ファイバ束を介して（センサであり得る）画像取込装置に伝送され得る。
【００７６】
画像取込装置からの信号は、たとえば好適にプログラミングされたコンピュータを用いてリアルタイムで処理および／または分析され得る。
【００７７】
画像取込装置からの信号は、コンピュータによるその後の分析のためにたとえばフレーム記憶装置に記憶され得るか、または、信号から生成された画像の目視検査および分析のためにリアルタイムで（もしくは記憶装置から信号を読出すことによりその後）表示され得る。
【００７８】
当該システムは、暗視野照明もしくはラインベルク照明、位相差照明、または微分干渉コントラスト（ＤＩＣ）照明を用いて作動し得る。
【００７９】
当該システムは使用可能なホフマン変調コントラストを利用し得る。
【００８０】
照射は斜めもしくは軸方向であってもよく、照射光は偏光されてもよく、および／または赤外光などのスペクトルの非可視部分からであってもよい。
【００８１】
表示装置に画像を生成するかまたは処理および分析を行なうための映像信号を生成するために、典型的には試料のうちの異なる部分の蛍光により試料から放出される光を画像取込装置に画像化するための装置は、
−  試料を搭載するための手段と、
−  励起光を生成するための光源と、
−  走査システムとを含み、当該走査システムは、（励起光を一方向に向け、これにより試料の区域を走査することにより）励起光で試料を走査するよう適合され、さらに、別の（典型的には逆の）方向の励起光が当該試料に当たった結果として試料から放出される光を伝達するよう適合され、当該システムは使用時に試料の対象区域を（典型的には繰返し）走査するよう作動し、当該装置はさらに、
−  画像取込装置を含み、当該画像取込装置は空間的に離散していて明瞭な感光領域を有し、その上に試料から放出された光の焦点が合わされて、走査システムを通して上記別の方向に伝達された（すなわち通過した）後に画像が形成され、当該装置はさらに、
−  制御手段を含み、当該制御手段は、対象区域をｎ回走査するために（ｎは１以上の整数）当該走査システムが必要とするのに等しい期間にわたって試料からの光が画像取込装置に入射するように励起光および／または画像取込装置を制御するよう適合される。
【００８２】
対象区域は試料の視認可能な区域全体であってもよい。代替的には、寸法および位置が可変であるウインドウが走査システムによって生成されることにより、当該区域の一部（所望の場合その全部）を走査することが可能となる。したがって、寸法および位置が可変であるサブアレイが用いられてもよい。
【００８３】
走査システムは好ましくは共焦点システムである。
【００８４】
好ましい構成においては、当該走査システムは回転するニポウディスクスキャナを含み、この場合、励起光がディスクにおける開口部を通って一方向に進み、試料の蛍光によって放出される光が当該開口部を通って逆方向に進んで、画像取込装置上に画像を形成する。開口部のパターンは、ディスクのＡ°の回転により対象区域全体がスキャンされるようなものであり、上記期間はディスクのｎＡ°の回転に対応するよう選択される（ｎは１以上の整数である）。
【００８５】
単一のニポウディスクが用いられてもよいが、より好ましくは、横河技報Ｎｏ．３３（２００２）に記載のとおりディスクのうちの１つが開口部にマイクロレンズを含んでいるものを含む２ディスクの構成が用いられる。この明細書中に引用されるディスク（またはディスク手段またはディスク構成）は、上記技報に記載されるような複数のディスクアセンブリ、ならびに文脈によりそのように認められる単一ディスクの構成を含むことが意図されている。
【００８６】
代替的には、（たとえば米国特許６１４７７９８に記載されるように）１つ以上のレンズ無しのディスクが用いられてもよい。この場合、レンズ無しのディスクの回転はニポウディスクの回転に対応する。
【００８７】
当該走査システムは、（たとえば米国特許５２４８８７６およびＷＯ  ０３／０１９２４２に記載されるように）１つのピンホールまたはいくつかのピンホールを固定パターンに組込み得るが、この場合、ピンホール（またはピンホールアレイ）の１回の完全な走査はニポウディスクの回転に対応する。
【００８８】
代替的には、当該走査システムは、（たとえばＵＳ  ６０３８０７６に記載されるように）走査スリットスキャナを組込んでもよく、この場合、スリットの走査はニポウディスクの回転に対応する。
【００８９】
共焦点性は２光子プロセスによって達成され得る。当該２光子プロセスは２光子励起源を含み、活性化される焦平面を制限する（米国特許５０３４６１３の記載を参照）。２光子励起源の１パルスがニポウディスクの回転に対応する。
【００９０】
代替的には、（「多焦点多光子顕微鏡（“Multifocal Multiphoton Microscope”）」（１９９８  Ｏｐｔ  Ｌｅｔｔ．  ２３（９）：６５５〜６５７）と題されたBewersdorf、PickおよびHellによる論文に記載されるように）共焦点性はピンホールを含む時間遅延多重化プロセスによって獲得され得る。ピンホールの１回の完全な走査はニポウディスクの回転に対応する。
【００９１】
代替的には、当該走査システムは、独立して制御可能なミラーのアレイと制御手段の制御下でこれを調整するための手段とを用いることにより、使用時にこれらがピンホールのアレイを合成する（たとえばＥＰ  ０９１１６６７およびＵＳ  ２００２，０２４００７を参照）。ミラーを用いて画像またはサブ画像を作成する１回の完全な走査はニポウディスクの回転に対応する。
【００９２】
代替的には、当該走査システムは、（ＷＯ  ９７／３１２８２およびＷＯ  ００４３８１９に記載されるように）画像を生成するよう走査される透過要素および反射要素のランダムまたは擬似ランダムのパターンを含み得る。透過要素および反射要素の１回の完全な走査はニポウディスクの回転に対応する。
【００９３】
好ましくは、励起源以外からの光が試料に到達するのを防ぎ、走査システムを介する試料以外からの光が画像取込装置に到達するのを防ぐための手段が設けられる。
【００９４】
好ましくは、制御手段はまた画像取込装置の動作を制御し、これにより、当該動作が各々の上記期間の終わりに読出され、次の上記期間が始まる前にリセットされる。
【００９５】
好ましくは、励起光源からの光を各々の特定の期間に正確に等しい期間にわたって試料に入射させる手段が設けられる。
【００９６】
一構成においては、当該制御手段は励起光源をオンやオフに切換えて露光時間を制御し、画像取込装置の露光は、励起光源が活性化状態である時間だけ管理または制御される。
【００９７】
代替的または付加的には、シャッタ手段が設けられてもよく、当該シャッタ手段は使用の際に制御手段からの信号によって作動させられて、試料が照射されるべき場合を除き励起源からの光を遮る。
【００９８】
代替的または付加的には、光は固有の（電子）シャッタによって制御されてもよい。
【００９９】
代替的または付加的には、光チョッパを用いて光を制御することができる。
【０１００】
代替的には、音響光学要素を用いてシャッタ機能を実行することができる。
【０１０１】
代替的または付加的には、第２のシャッタ手段は走査システムと画像取込装置との間に設けられてもよく、当該第２のシャッタ手段は制御手段からの信号によって作動し、これにより、取込装置に到達するリン光、残光、迷光反射または他の作用による光から発生し得るエラーを減ずる目的で、励起光が試料に入射する特定の期間を除いては使用時に画像取込装置センサの少なくとも一部に光が到達するのが防止される。
【０１０２】
シャッタ手段が励起源および画像取込装置の両方のために設けられる場合、好ましくは、使用時にこれらを同期的に作動させる手段が設けられる。
【０１０３】
同期手段は、機械的もしくは電気的であり得るかまたはその両方であり得る。
【０１０４】
使用の際に、当該走査システムは好ましくは、励起光によって照射されるべき試料の区域を含むかまたは当該区域を備え、一般には対象区域を含む面に励起光を集中させる。
【０１０５】
試料の大部分が透明であれば、当該装置はまた、試料、走査システムまたは当該走査システム内における光学系の要素を直線軸（Ｚ軸）に沿って移動させるよう適合された駆動手段を含んでいてもよく、これにより、使用時に当該面がＺ軸に沿って異なる点に位置決めされて、空間的に離れた（典型的には平行な）別々の面において当該試料を走査することが可能となり得る。
【０１０６】
好ましくは、直線軸駆動手段はまた、制御手段からの信号によって制御される。
【０１０７】
好ましくは、当該制御システムは、使用時に直線軸運動が少なくとも励起光が抑制される（または試料に到達するのが妨げられる）期間に制限され、好ましくは画像取込装置が光に反応しなくなる期間に制限されるように動作する。
【０１０８】
典型的には、当該制御手段は、各々の上記期間の終わりに、または一連のＮ個のこのような期間（Ｎは１以上の整数）の後に直線軸運動をもたらすように使用時に直線軸駆動装置を制御する。当該運動は、試料と走査システム、または当該走査システムの要素、または当該走査システム内の光学系の要素との間の距離を増やしたり減らしたりするようなものであり得る。
【０１０９】
制御システムは、好ましくは、露光の合間に直線軸に沿って移動する距離を制御するよう適合される。
【０１１０】
直線軸に沿った各運動は同じサイズであり得るか、または、その前および／もしくは後ではサイズが異なり得る。
【０１１１】
好ましくは、制御システムは、所定の等しいサイズの別個のステップで移動するように直線軸駆動装置を制御するよう適合され、その場合、露光の合間の各直線軸運動は上記別個のステップのうち１つまたは２つ以上で構成され得る。
【０１１２】
代替的には、直線軸運動は連続的であってもよい。これにより、当該機構が据付けられるのを待たなくても異なる画像位置間でより高速に運動することが可能となる。この不利点は、画像平面が画像化プロセス中に変化し、その結果、画像がぼやけるおそれがあることである。しかしながら、これは、画像を再度鮮明にするためにデコンボルーションを適用することによって補償され得る。
【０１１３】
直線軸間隔を変えるのに必要な時間が露光の合間に必要とされる最小限の時間よりも長い場合、制御手段は、励起照射および露光が十分な期間の経過後または所望の直線軸運動の達成後にしか開始されないように、露光と露光との間の時間を制御するかまたはＺ軸運動を基準にして照射および画像取込装置露光を制御するよう適合される。
【０１１４】
複数の画像が短期間（たとえば１分〜６０分）または長期間（たとえば２４〜７２時間）ならびにその中間の期間（たとえば１〜２４時間）にわたって集められ得る。このような画像はしばしば画像の積重ねと称される。
【０１１５】
当該方法が露光ごとに励起光の波長の変動を含む場合、当該装置は、各々が当該または各々の他の源から波長の異なる光を生成する２つ以上の励起光源を含み得るか、または、波長の異なる光を生成するよう調整可能な単一の源を含み得、当該制御手段は源を選択するかまたは単一の源を制御するよう適合されることにより、好ましくは１回の露光の終わ
りと次の露光の始めとの間で励起光の波長を変える。
【０１１６】
試料の同じ面に光を集中させる間に照射波長の変動がもたらされる（すなわち、一連の上記ステップを構成する一連の２つ以上の露光ステップの各々の間に直線軸運動が存在しないが、ただし、各々が１つ（または同時に２つ以上）の異なる波長の励起光を用いる）場合、当該制御手段は、直線軸運動が各々の完全な一連の上記ステップの実行後にしか開始されず、かつ次の一連の上記ステップが各々の直線軸運動の完了後にしか開始されないように直線軸駆動手段を制御するよう適合され得る。
【０１１７】
典型的には、試料は顕微鏡ステージによって搬送され、ステージ駆動装置が設けられ、ステージ（および試料）をＸおよびＹに移動させることにより、サンプルの他の部分、たとえば同じスライド上の他の細胞、またはマルチウェルプレートにおける他のサンプル、または組織もしくは単一のサンプルの他の領域などを見えるようにする。このために、ＸおよびＹのステップは１０ミクロン〜１０ｍｍの範囲であり得る。
【０１１８】
いくつかのサンプルがマルチウェルプレートのウェルに保持され得る。当該サンプルはすべて類似していてもよいが異なっていてもよく、たとえば成分、濃度または年齢のために異なっていてもよい。
【０１１９】
直線駆動装置は、時間を節約するために直線運動を一方向に、次に別の方向にと交互にもたらすように制御され得る。
【０１２０】
波長の変動は、ピーク波長の異なる２つ以上の光源を用い、かつ、源を選択的に作動させるか、または、当該源からの光を必要に応じて選択的に走査装置および試料に向けることによって達成され得る。
【０１２１】
光源のスペクトルが（１つの波長の光を生成するものとして指定される場合でも）実際にはいくつかの波長の光を含み、指定された波長の光およびその波長付近の光の強度が源スペクトルにおいて光の他の成分よりもはるかに高いことが理解されるべきである。この場合、当該源は指定された波長でピークに達すると言われている。
【０１２２】
こうして、この発明を実行するために装置において用いられる光源はより複雑なスペクトル特性を有し得、たとえば、主線が４８８ｎｍであり、付加的な線が４７６ｎｍおよび４９６ｎｍであるアルゴンイオンレーザから得られる複数のピークを有し得る。
【０１２３】
励起光源が同時に２つ以上の波長の光を生成する場合、個々の（ピーク）波長は単一のコードによって（たとえばコード００、０１、１０、１１として４つの波長のうちの１つを選択する２本の線）、または個々の信号線の組として（たとえば４つの波長に対する４本の線）選択され得、これにより、いくつかの線が同時に活性化され得る。
【０１２４】
この発明の好ましい特徴に従うと、励起光源は、１つまたは２つ以上のレーザを含み得るレーザ光源を含み得る。
【０１２５】
単一の励起光源が用いられてもよく、その放出された波長は変更可能であり、制御手段は、使用時に当該源に変更を加えて所望の波長を生成するよう適合され得る。
【０１２６】
好ましくは、音響光学チューナブルフィルタ（ＡＯＴＦ）結晶を含むレーザ光源が用いられ、制御手段は、放出された光の波長を制御するために、露光の合間に周波数制御信号を結晶に替えるように使用時に信号を供給するよう適合される。
【０１２７】
当該光源は直接駆動されるレーザダイオードであり得る。
【０１２８】
好ましくは、制御信号の周波数の変更はいずれも露光の合間に行なわれる。
【０１２９】
励起光は、源をパルス化することによってパルス化され得る。
【０１３０】
励起光は、偏光された光源を用いるかまたは偏光フィルタを用いることによって偏光され得る。
【０１３１】
励起光源は発光源または白熱源であってもよく、光学フィルタまたはモノクロメータが、使用時に当該源によって放出される光の波長を制御するのに用いられてもよい。
【０１３２】
代替的には、１つ以上の発光要素を含み得る発光ダイオード（ＬＥＤ）源が励起光源として用いられてもよい。
【０１３３】
試料に入射する励起照射の強度が露光ごとに調整されるべき場合、制御手段は、好ましくは露光の合間に試料に入射する励起照射の強度を使用時に調整するよう適合され得る。
【０１３４】
この変動は、たとえば、光路に異なるＮＤフィルタを介在させることによって達成され得る。
【０１３５】
したがって、装置は複数のＮＤフィルタと制御手段に制御される手段とを含み得、これが、使用時に（好ましくは露光の合間の時間間隔中に）フィルタのうちの１つ以上を当該光路に選択的に位置決めして濃度の変化を達成し得る。
【０１３６】
代替的には、当該装置は、光路における調節可能な虹彩絞りと、好ましくは露光の合間の時間間隔に必要に応じて虹彩を開いたり閉じたりするよう制御手段によって動作させられる駆動手段とを含み得る。
【０１３７】
代替的にかつ好ましくは、励起光の強度は、励起光源に供給されるパワーを調整することによって制御され得、この目的のために、制御手段は、励起光源に対する電源または必要に応じてそこへのパワーの転送を制御するための信号を生成するよう適合され得る。
【０１３８】
試料に入射する励起光の強度を制御するのにＡＯＴＦまたはＬＣＤシャッタなどの減衰要素が用いられてもよく、当該ＡＯＴＦまたはＬＣＤシャッタは制御手段からの信号によって制御される。
【０１３９】
励起光の強度は、２つ以上のこのような強度変更技術を組合せて、典型的には連続して用いることによって制御され得る。
【０１４０】
１つの波長での励起照射の強度が別の波長でのそれとは異なる場合、これは、たとえば、源ごとの、またはＡＯＴＦ結晶レーザなどの制御された励起光源の異なる動作モード間、または励起による結晶の異なる発光モード間での固有の強度変動によるものであり得るが、制御手段は使用時に波長ごとに照射の強度を変えるよう適合されて、各波長ごとに試料に対して所定の強度で照射し、他の場合に発生する可能性のある波長ごとの強度の変動を実質的に除去し得る。
【０１４１】
典型的には、但し以下に限られないが、制御手段は、波長の変化に応じて使用時に露光ごとに励起光源へのパワーを制御するよう適合され、これにより、各々の露光中に試料に対する励起照射（強度）のレベルが実質的に同様になることが確実にされる。このレベル
は波長とは無関係である。
【０１４２】
サンプルからの発光が放出される発光（luminescence）の波長に応じて異なる場合、類似の技術が用いられてもよく、（波長に関係なく）類似の強度を有する光を放出させるために、励起光源に関する露光ごとのパワー調整および／または減衰は、その上またはその代わりに、用いられる波長に関係なく実質的に一定の強度発光をもたらすよう調整され得る。
【０１４３】
画像取込装置は便利ないかなる感光センサをも含み得る。
【０１４４】
好ましい画像取込装置はＣＣＤカメラである。好ましくは、アナログ形式とは対照的にデジタル形式で画像信号を供給するＣＣＤカメラが選択される。
【０１４５】
画像取込装置がＣＣＤカメラである場合、好ましくは、カメラ出力信号のＳ／Ｎ比を上げるよう冷却される。
【０１４６】
使用され得る代替的な画像取込装置は、ＣＭＯＳカメラ、ＣＩＤ（電荷注入素子）カメラ、増倍またはゲート式カメラ、光電子増倍管アレイ、フォトダイオードアレイ、もしくはアドレス指定可能なマイクロクロノメータアレイを用いる画像取込装置であるか、または化学フィルムカメラが用いられてもよい。
【０１４７】
画像取込装置にもたらされる光が画像を形成することができるので、画像取込装置に供給されるべき光は、その代わりに（またはその上）、当該画像を人の目に見えるようにするアイピースに向けられ得るか、または画像をスクリーン上に見えるように投射するよう適合された投射装置に向けられ得る。
【０１４８】
この目的のために、画像取込装置への光路は、光を画像取込装置および／またはアイピースおよび／または投射システムの間で分割する（かまたは分ける）ことのできるビーム分割装置またはビーム配向装置を含み得る。
【０１４９】
１つ以上の画像取込装置が用いられてもよく、その各々は同じ種類の装置であり得るかまたは異なり得る。３つ以上の画像取込装置が用いられる場合、少なくとも１つは他の装置のうちの１つ以上とは種類が異なっていてもよく、すべてが異なっていてもよい。
【０１５０】
カメラはセンサと置き換えられてもよい。
【０１５１】
１つ以上の画像取込装置が設けられる場合、それへの光路は必要に応じてビーム分割手段またはビーム配向手段を含み得る。
【０１５２】
光は、光ファイバ束を介して当該または各々の画像取込装置センサに伝送され得る。
【０１５３】
当該装置はデータ記憶手段を含んでいてもよく、当該データ記憶手段は、コンピュータによるその後の分析のために画像取込装置からの信号を記憶するよう適合されるか、または、記憶された信号を読出すことによって生成される画像の目視検査または分析のためにスクリーン上に表示され得る。
【０１５４】
当該装置はまたコンピュータ手段を含んでいてもよく、当該コンピュータ手段は、画像取込装置またはデータ記憶手段から信号を受信するよう適合されて、画像信号の処理および分析を可能にする。
【０１５５】
画像取込装置またはコンピュータから表示装置への信号経路は、処理の前および／または後に画像取込装置の出力または記憶手段に記憶されたデータもしくはコンピュータからのデータを用いて画像を形成することができるように設けられ得る。
【０１５６】
励起光を制御するために、レーザおよびＡＯＴＦまたはシャッタの代わりに、ビーム制御が組込まれたダイオードレーザ源が用いられ得ることが理解されるべきである。この文脈では、シャッタについての記載はダイオードレーザ源の切換または調節を指すと考えられてもよい。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１５７】
この発明が、添付の図面に関連して例示のために説明される。
【０１５８】
ＣＳＵ１０共焦点走査システムの動作を説明するために、横河技報Ｎｏ．３３（２００２）、特に当該技報の図１〜図３およびそれに関連する説明が参照される。
【０１５９】
図１においては、共焦点走査システム１０は（モデルＣＳＵ１０またはより最近のモデルＣＳＵ２１であり得る）横河（Yokogawa）の共焦点スキャナを含み得、ステージ１２上のサンプル（図示せず）を見えるようにセットし、カメラ１４に光を供給して、その上で、ＡＯＴＦレーザ源１６からのレーザ光によってサンプルの励起から生じる蛍光の画像を形成し得る。
【０１６０】
コントローラ１８は、アイテム１０、１２、１４および１６の動作を行なわせるかまたは当該動作を制御するためにコンピュータ２０からの信号を制御信号に変換し、必要に応じてこれらのアイテムからのデータをコンピュータ２０に伝送し得る。図示のソフトウェア２２はコンピュータにロードされており、これにより、当該コンピュータが、サンプルまたは実行されるべき実験に依存して様々な方法で特定のタスクを実行するかまたはアイテム１０〜１６を制御するよう命令することが可能となる。代替的には、必要に応じて異なるソフトウェアをロードすることにより、当該システムが様々なタスクまたは実験を行なうことが可能となり得る。
【０１６１】
図２は、図１のシステムの動作例を構成するよう相互接続され得る独自仕様（proprietary）のハードウェアのさまざまなアイテムを示す。図１のコントローラ１８は図２の同期回路１８′および制御盤１８″で構成され、コンピュータ２０はDell Dimension  ＧＸ２６０として識別され、基本オペレーティングシステムとしてウインドウズ（Windows）（登録商標）２０００がロードされ、２．４ＧＨｚプロセッサと２ＧＢのＲＡＭとＷＤ  Ｃａｖｌａｒドライブとを有し、２つのディスプレイモニタ２１および２３を駆動するためのデュアルモニタカードを備えている。
【０１６２】
顕微鏡１２は典型的にはニコン（Nikon）のエクリプスモデル（eclipse model）ＴＥ３００であり、図１に関連して述べられるように、共焦点走査ユニットは横河のモデルＣＳＵ１０またはＣＳＵ２１を含む。Ｚ軸調整はフィジック・インスツルメント（Physik Instrument）の圧電ドライバ２２を用いて達成されるが、当該圧電ドライバ２２は、１８からアナログ制御信号が供給されている独自仕様の制御ユニット２４によって制御される。。
【０１６３】
レーザ励起光源は、ＮＥＯＳ（フロリダ州（Florida））のＡＯＴＦ結晶およびコントローラで作動する、メレスグリオ・レーザ・グループ（Melles Griot Laser Group）（カリフォルニア州（California））によって供給されるオムニクロームシリーズ（Omnichrome Series）４３（３波長）レーザである。当該レーザの光強度は制御盤１８″から制御可能であり、当該制御盤１８″は（上述のように）同期ユニット１８′とともに図１のコ
ントローラ１８を構成する。ドライバ２６はレーザ１６のためにＡＯＴＦ制御２８を制御する。当該レーザ１６の電源は３０に示される。
【０１６４】
カメラ１４は浜松（Hamamatsu）のＯｒｃａ  ＥＰ  ＣＣＤカメラである。
【０１６５】
ドライバ２６のための電源が３２で示され、カメラ１４のための電源およびインターフェイスが３４で示される。
【０１６６】
同期回路１８′はＵＳＢ接続３６を介してコンピュータ２０に接続される。
【０１６７】
図３は、アルゴンイオンレーザ３８および補助レーザ４０を含むＡＯＴＦレーザの詳細を示す。ＡＯＴＦ結晶４２は、ファイバ４４およびＣＳＵ１０ファイバポートを介して放出される光の波長を制御する。
【０１６８】
結晶４２はコントローラ４６からのＲＦ信号によって制御され、当該コントローラ４６は、ＴＴＬと、回路１８′およびドライバ２６（図２を参照）を介するコンピュータ２０からのアナログ信号とによって制御される。
【０１６９】
図４の状態図は、１ＫＨｚクロック信号がシステムに必要な様々な動作をいかに制御するかを示す。
【０１７０】
図４は、ラインオン／オフ（４８）、レーザライン（５０）、Ｚ位置（５２）、カメラ（５４）およびヘッド同期（５６）と明示された１組の出力レジスタと、期間ダウンカウンタ（５８）と、状態カウンタ（６０）と、複数の別個のビットパターンを含むメモリ６２とを含む状態図である。上述の各パターンは所望の機械状態のうちの１つを規定する。出力レジスタのうちのいくつかのビット出力はこのような信号によって制御可能な装置、たとえばレーザラインオン／オフ接続４８システム、カメラトリガおよびＣＳＵ走査ディスクシステム同期入力などの上にあるデジタルポートに直接接続される。出力レジスタ５０および５２からのデジタル信号がＤＡＣ６４、６６によってデジタル信号からアナログ信号に変換されて、ＡＯＴＦシステムおよび圧電ステージ駆動装置上のアナログポートにアナログ信号を供給する。当該圧電ステージ駆動装置は典型的には２つの異なる軸に沿ってステージを駆動する。
【０１７１】
典型的には１ＫＨｚのクロック信号が期間ダウンカウンタ５８に供給される。
【０１７２】
典型的には、状態データはホストコンピュータ２０に記憶され、ホストコンピュータからメモリ６２にロードされる。
【０１７３】
初期設定の際に、状態カウンタ６０に状態の数がロードされる。第１の状態はメモリ６２における第１のラインから出力レジスタ４８〜５６に転送されて、そこから制御信号が供給されている装置の状態がセットされる。第１の状態の所期の期間は、状態期間メモリ６８から状態期間ダウンカウンタ５８に数としてロードされる。
【０１７４】
次のクロックパルスにおいて、期間カウンタ５８に保持される数値が１ずつ減らされ、その新しい値が０と比較される。０でない場合、出力レジスタ４８〜５６の状態が維持される。
【０１７５】
期間カウンタ５８における数値が０に達すると、状態カウンタ６０が１ずつクロックされ、メモリ６２における次の状態ビットパターンに向かう。この次の状態が６２から出力レジスタ４８〜５６に転送されると、これらが制御する装置の状態が、機械に必要とされ
る新しい条件にセットされ、この次の状態に対する期間が６８から期間カウンタ５８に転送されるとこの次の状態の期間が制御され、これは、期間カウンタ５８の数値が０に達するたびにメモリ６２からの次の状態と置換えられる。
【０１７６】
状態カウンタ６０が０に減じられ、この時点で動作が止まるまでシステム動作が１つの状態から次の状態に進む。停止信号がこの時点で生成されてもよく、当該システムは、この停止信号が生成されると再び開始するよう設定され得る。
【０１７７】
異なる動作／状態に関連するメッセージが以下のように説明される。
【０１７８】
ＵＳＢメッセージタイプ
問いかけ
このメッセージは、ＵＳＢ業者ＩＤの欠けたイニシャルに対処する次善策である。ＵＳＢマスタは、それがどのようなタイプであるかを見出すために各ユニットに問いかけを行なう。
【０１７９】
【表１】
0004829499.tif 000002
【０１８０】
同期装置が以下のように応答する：
【０１８１】
【表２】
0004829499.tif 000003
【０１８２】
初期設定
このメッセージは実験の実施前に送信されて、デフォルト出力状態および共焦点ヘッドパラメータをセットする。
【０１８３】
【表３】
0004829499.tif 000004
【０１８４】
Ｚ軸駆動
Ｚ軸駆動位置が以下によって与えられる：
Ｐｚ／（１００μｍ／２16）
または
Ｐｚ／（１．５２６ｎｍ）
ここで、Ｐｚは所望のＺ位置であり、１０μｍ／ｖｏｌｔの感度および１０ボルトの出力間隔が想定される。この値には１６ビットまでが利用可能であるが、記載されている実施例は、２５ｎｍの解像度を与える最上位の１２ビットにしか応答しない。
【０１８５】
セクタ時間同期
同期パルス時間、セクタの数およびカメラ露光時間はすべて、セクタ時間に同期されるべきすべての事象に対する要件によって制限される。
【０１８６】
たとえば、１２セクタディスクは以下のパラメータを有し得る。
【０１８７】
【表４】
0004829499.tif 000005
【０１８８】
横河のＣＳＵ１０およびＣＳＵ２１システムは、現在の設計では１セクタ当り３ｍｓに制限されるだろう。
【０１８９】
状態データヘッダおよびフッタ
以下のメッセージは、状態データのリストの前（ヘッダ）および後（フッタ）に送られる。既に記憶された状態データはいずれも、当該ヘッダが受信されるとクリアされる。当該メッセージは、同期装置が実行していれば無視される。当該メッセージは状態リストヘッダおよび状態リストフッタと称される。
【０１９０】
【表５】
0004829499.tif 000006
【０１９１】
状態データ
状態データは状態リストヘッダに直ちに従うべきである。同期装置は、実行前に正確な数の状態が受信されることをチェックするようセットされる。
【０１９２】
【表６】
0004829499.tif 000007
【０１９３】
実験制御
状態データがダウンロードされると、システムは実験を行なうよう制御され得る。
【０１９４】
【表７】
0004829499.tif 000008
【０１９５】
即値データ
取込がライブモードで始められる場合、デジタル出力、ＡＯＴＦ消去（blanking）およびＺステッパが自由に変更され得る。カメラトリガビット（デジタル出力ビット７）はすべての即値データにおいて無視される。
【０１９６】
【表８】
0004829499.tif 000009
【０１９７】
ＡＯＴＦ／ＤＡＣ制御
このメッセージが送信されるとＡＯＴＦチャネルパワーがセットされる。これは、実験中のＡＯＴＦレベルの変化を検知し得ないが、簡略化のために、同期装置は常にそれらに応答するだろう。これによりライブモードの間に当該レベルを微調整することが可能となる。
【０１９８】
【表９】
0004829499.tif 000010
【０１９９】
状態機械サンプル内容
当該システムは、この時間にわたって所与の値で持続する「カウント」クロックチック（ticks）および出力のために所与の状態を実行する。
【０２００】
上述のように、この発明は、Ｚ軸駆動装置を有するニポウディスクレーザ走査共焦点顕微鏡イメージングシステムを配列するために制御システムまたは同期装置を備える。当該システムはホストコンピュータ（２０）およびコントローラ（１８）を必要とし、広範囲のタスクを実行するようプログラム可能であり、ＵＳＢ接続などの通信線を介してニポウディスク共焦点顕微鏡ハードウェアに接続可能である。
【０２０１】
コントローラ（１８）は、図４に関連して記載される状態機械として機能するようプログラミングされる８０５１マイクロコントローラを用いて、図５に示されるように構成されてもよい。ユニット（１８）は以下のとおりクロック入力６９、ＤＡＣ６４および６６、ならびに出力ポートを含む（ただし、他のいかなる好適なマイクロプロセッサまたはプログラム可能な論理素子を用いてもサブシステムを制御し得ることが理解されるべきである）。すなわち、
・  ＵＳＢポート７０  −  構成、タイミングおよびパワーのための１つのポート。
【０２０２】
・  同期出力ポート７２  −  可変の０−３Ｖpk-pk、１ｍｓ単位で増分するプログラム可能な高周期および低周期。これは初期設定に関連して記載されるとおりである。
【０２０３】
・  ＴＴＬ出力ポート７４  −  ＡＯＴＦ切換に対する８ビット；６７はカメラトリガ、シャッタ制御および／または汎用の用途のために最高８ビットまでを用いる；（たとえば、１ビットはカメラトリガ専用であり得、残りはライブモード時に非同期的に制御され得る）；７２はディスクセクタ速度を同期させるためのものである。
【０２０４】
・  ＤＡＣ６４からのアナログ出力  −  ８チャネル、０〜５ボルト、８ビットの解像度。ＡＯＴＦパワー設定および／または一般用途向け。同期されないが非同期的または同期的に制御され得る。
【０２０５】
・  ＤＡＣ６６からのアナログ出力  −  ０〜１０ボルト、１２ビットの解像度。典型的にはディスクセクタ速度に同期されるが、ライブモード時には非同期的に制御され得る。
【０２０６】
図６Ａ、図６Ｂおよび図６Ｃの制御信号プロトコル図においては、制御信号の値は、図２〜図５に関連して記載されるような典型的なシステムとして示される。
【０２０７】
トリガ／イネーブル信号はカメラの起動を制御するが、これにより、活動状態の「オン」と非活動状態の「オフ」とが交互にされる。
【０２０８】
「走査同期の終わり」は、ディスクの一回転に対応するピンホール走査シーケンスの終わりを示し、各ディスクはいくつかのセクタで構成されている。
【０２０９】
「波長選択」は、励起のために選択された異なる波長を示す。
【０２１０】
「パワーレベル」は、パワーがいつオンでありオフであるかを示す。これは典型的にはＯＦＦから公称パワーレベル「ｐ」に切換えられる。
【０２１１】
図６Ａの「Ｚ位置」波形は、波長が一定のままである間、Ｚ軸における異なるサンプル走査面を決定する制御信号が、次の走査シーケンスに備えてＺ０位置に戻る前にＺ１からＺ２およびＺ３へのステップをいかに増大させ得るかを示す。
【０２１２】
図６Ｂにおいては、Ｚ位置決定信号はＺ０からＺ（すなわちＸ３）に対する最大値にまで一定のペースで増大し、次の走査に備えて値をＸ０に減ずる。
【０２１３】
図６Ｃは、２回の連続した走査中にＺ位置信号がＺ１とＺ３との間でいかに変動するかを示す。その間に、波長がパワーオフ間隔中にＸ１からＸ２に変えられる。
【０２１４】
図７は、ディスク回転パルスの固有周波数付近で位相ロックループとして動作する場合における図２〜図５のシステムなどのシステムの状態を示す。この場合、ディスク回転速度はＣＳＵコントローラによって設定される。このシステムにおいては、カウンタに対するクロックレートは実際のディスク回転レートによって調整される。ディスク同期信号が位相ロックループクロック７６に供給され、当該位相ロックループクロック７６が図４の１ＫＨｚクロックの代わりに期間カウンタ５８を制御する。
【０２１５】
代替的な構成に関する図８Ａおよび図８Ｂにおいては、さらなる制御信号がコントローラ１８および顕微鏡１２から伝わって、確認信号経路７８によって示されるようにステージおよび対物レンズの制御などの他の制御機能を果たす。
【０２１６】
図２〜図５のシステムの別の変更例に関する図９Ａおよび図９Ｂにおいては、さらなる制御信号がカメラ１４からコントローラ１８に伝わって、経路８０に沿った承認信号のようにトリガを承認する。
【０２１７】
図１０Ａおよび図１０Ｂは、コントローラ１８がいかに外部からトリガされ得るか、または経路８２に沿って外部の装置からいかにイネーブル入力を受信し得るかを示す。
【図面の簡単な説明】
【０２１８】
【図１】共焦点顕微鏡システムを示す概略図である。
【図２】この発明の方法の実行を可能にする、図１のコンピュータベースのコントローラに接続可能な独自仕様のハードウェアの詳細を示すシステム図である。
【図３】ＡＯＴＦレーザ制御システムを示す概略図である。
【図４】図２のシステムがいかに一連の異なる機械状態を通じて切換えられるかを示す概略ブロック図である。
【図５】制御盤を示す概略ブロック図である。
【図６Ａ】異なるオペレーティングシステムに対する制御信号プロトコルを示す波形図である。
【図６Ｂ】異なるオペレーティングシステムに対する制御信号プロトコルを示す波形図である。
【図６Ｃ】異なるオペレーティングシステムに対する制御信号プロトコルを示す波形図である。
【図７】位相ロックループとして作動するシステムを示す状態図である。
【図８Ａ】さらなる制御信号がコントローラによって生成されるシステムおよびシステムの状態図である。
【図８Ｂ】さらなる制御信号がコントローラによって生成されるシステムおよびシステムの状態図である。
【図９Ａ】カメラのトリガによってコントローラに対するフィードバックのためのトリガ承認信号が生成されるシステムおよびシステムの状態図である。
【図９Ｂ】カメラのトリガによってコントローラに対するフィードバックのためのトリガ承認信号が生成されるシステムおよびシステムの状態図である。
【図１０Ａ】コントローラが外部からトリガされるかまたは外部の装置に対する入力の使用を可能にし得るシステムおよびシステムの状態図である。
【図１０Ｂ】コントローラが外部からトリガされるかまたは外部の装置に対する入力の使用を可能にし得るシステムおよびシステムの状態図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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