(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
親水性セグメントおよび荷電性セグメントを含むブロック共重合体と高分子電解質とから形成されるコア−シェル構造のポリイオンコンプレックスミセルの安定化方法であって、コア部を形成するブロック共重合体荷電性セグメントに少なくとも１個のチオール残基を担持させ、該荷電性セグメント間で、それらに担持させたチオール残基を介するジスルフィド結合の架橋を形成させることを含むとともに、
ブロック共重合体が一般式（Ｉ）
【化１】
0004659937.tif 000009
（式中、ＡＩは水素原子またはアニオン重合開始剤の有機残基を示し、Ｚは水素原子または式−Ｌ−ＳＨの残基を示し、ＬはＣ1-20アルキレン、Ｃ1-6アルキル−フェニル、Ｃ1-6アルキル−フェニレン−Ｃ1-6アルキル、フェニレンおよびカルボニル−Ｃ1-20アルキルからなる群より選ばれる連結基を示し、ｎは５〜２０,０００の整数であり、ｍは５〜１０,０００の整数であり、そしてｘの単位とｙの単位の割合は２０：１〜１：２である）で表される安定化方法。
【請求項２】
一般式（Ｉ）
【化２】
0004659937.tif 000010
（式中、ＡＩは水素原子またはアニオン重合開始剤の有機残基を示し、Ｚは水素原子または式−Ｌ−ＳＨの残基を示し、ＬはＣ1-20アルキレン、Ｃ1-6アルキル−フェニル、Ｃ1-6アルキル−フェニレン−Ｃ1-6アルキル、フェニレンおよびカルボニル−Ｃ1-20アルキルからなる群より選ばれる連結基を示し、ｎは５〜２０,０００の整数であり、ｍは５〜１０,０００の整数であり、そしてｘの単位とｙの単位の割合は２０：１〜１：２である）で表されるブロック共重合体と高分子電解質とから形成されたコア−シェル構造のポリイオンコンプレックスミセルであって、水性媒質中でコア部を形成する該ブロック共重合体のポリアミンセグメント（式（Ｉ）でｍの繰り返り単位を持つセグメント）と高分子電解質とがイオン対を形成しており、そして該セグメント内の少なくとも１個のチオール残基を介して該共重合体が架橋していることを特徴とするポリイオンコンプレックスミセル組成物。
【請求項３】
請求項１に記載の安定化方法または請求項２に記載のポリイオンコンプレックスミセル組成物に適用されるブロック共重合体であって、
一般式（Ｉ）
【化３】
0004659937.tif 000011
（式中、ＡＩは水素原子またはアニオン重合開始剤の有機残基を示し、Ｚは水素原子または式−Ｌ−ＳＨの残基を示し、ＬはＣ1-20アルキレン、Ｃ1-6アルキル−フェニル、Ｃ1-6アルキル−フェニレン−Ｃ1-6アルキル、フェニレンおよびカルボニル−Ｃ1-20アルキルからなる群より選ばれる連結基を示し、ｎは５〜２０,０００の整数であり、ｍは５〜１０,０００の整数であり、そしてｘの単位とｙの単位の割合は２０：１〜１：２である）で表されるブロック共重合体。
【請求項４】
一般式（Ｉ）におけるＡＩが水素原子あるいは式
【化４】
0004659937.tif 000012
（上記式中、（ｉ）ｐは０〜１０の整数であって、かつＲ1およびＲ2は、独立して、水素原子、Ｃ1-10アルコキシ、アリールオキシもしくはアリール−Ｃ1-3アルキルオキシ基を示すか、または、Ｒ1およびＲ2は、一緒になって、Ｃ1-6アルキルで置換されていてもよいエチレンジオキシ（−Ｏ−ＣＨ(Ｒ′)−ＣＨ−Ｏ−：ここでＲ′は水素原子またはＣ1-6アルキルである）もしくはオキシ（＝Ｏ）基を示すか、または（ii）ｐは０または１であって、かつＲ1およびＲ2は、一緒になって単糖もしくはその誘導体の残基を構成する原子団を示す）の基である請求項３記載の共重合体。
【請求項５】
一般式（Ｉ）におけるＬがカルボニル−Ｃ2-6アルキルである請求項３または４記載の共重合体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、コア−シェル構造を持つポリイオンコンプレックスミセルの安定化方法および安定化された該ミセル、ならびに該ミセルの調製に使用できる特定のブロック共重合体に関する。該コア−シェル構造は、そのコア部がブロック共重合体の荷電性セグメントと高分子電解質のポリイオンコンプレックスからなり、そしてシェル部がブロック共重合体の親水性セグメントからなる。
【０００２】
【従来の技術】
カチオン性のブロック共重合体であるポリ（エチレングリコール）−ブロック−ポリ（Ｌ−リシン）［以下、ＰＥＧ−Ｐ(Ｌｙｓ）という場合あり］と、天然もしくは合成アニオン性単独重合体は、両者の間に働く静電的相互作用によって水中で自律的に会合し、球形のミセルを形成する。このミセルは粒径が数十ナノメーターで、内核のポリイオンコンプレックスをＰＥＧ外殻が覆ったコア−シェル構造を持っており、ポリイオンコンプレックスミセル（ＰＩＣミセル）と呼ばれている（Harada and Kataoka, Macromolecules,１９９５，２８，５２９４−５２９９；Kataoka et al., Macromolecules, １９９６，２９，８５５６−８５５７；Harada et al., Macromolecules, １９９８，３１，２８８−２９４；Kabanov et al., Macromolecules, １９９６，２９，６７９７−６８０２）。
【０００３】
これらのＰＩＣミセルは、内核に種々のアニオン性高分子を保持することができる上、数十ナノメーターという粒径とコア−シェル構造により生体の異物認識機構を回避することが期待できるため、アンチセンスＤＮＡや遺伝子治療のためのプラスミドＤＮＡの運搬体として利用することが考えられている。一般的にこれらのＰＩＣミセルは、生理的条件下で相当安定であるが、実際の使用に際しては、静脈注射による投与後の希釈によってＰＩＣミセルが解離してしまうことや、血清タンパク質との相互作用すること、生理条件下での安定性が十分でない場合も存在する。このため、確実に目的部位へ到達するまで解離せず安定に存在するように、ＰＩＣミセルの性質を改変する必要がある。ＰＩＣミセルを安定化する目的で、共有結合による内核（コア）や外殻（シェル）を架橋することが提案されている（Guo et al., Macromolecules, １９９６，２９，２４８７−２４９３；Thurmond et al., J. Am. Chem, Soc., １９９６，１１８，７２３９−７２４０）。しかし、期待する薬効を得るためには、目的の細胞内の環境に応答して架橋が開裂し、ＰＩＣミセルが解離することにより、内包されたＤＮＡを放出しなければならない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、本発明の目的は、殊に、ＰＩＣミセルが少なくとも動物の細胞内に送達されるまでは安定であるが、細胞内ではＰＩＣミセルが容易に解離されるようなＰＩＣミセルの安定化手段を提供するにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、従来の共有結合による架橋に代え、ジスルフィド（−ＳＳ−）結合を介する架橋を利用すると、細胞外では安定に保持できるが、細胞内ではＰＩＣミセルが容易に解離しうることを見出した。理論により拘束されるものでないが、このような作用・効果は、動物細胞の内部が、一般的に、血流中と比較してより強い還元的環境であることから（例えば、Huang et al., Bioconjugate Chem. １９９８，９，６１２−６１７参照）、ジスルフィド結合が細胞内ではチオールに還元され開裂することに起因するものと考えられる。
【０００６】
したがって、本発明は、親水性セグメントおよび荷電性セグメントを含むブロック共重合体と高分子電解質とから形成されるコア−シェル構造のポリイオンコンプレックスミセルの安定化方法であって、コア部を形成するブロック共重合体の荷電性セグメントに少なくとも１個のチオール残基を担持させ、該荷電性セグメント間でそれらに担持させたチオール残基を介するジスルフィド結合の架橋を形成させることを特徴とする前記安定化方法、に関する。
【０００７】
また本発明は、かような安定化方法によって調製することのできる、例えば、一般式（Ｉ）
【０００８】
【化５】
0004659937.tif 000002
【０００９】
式中 、ＡＩは水素原子またはアニオン重合開始剤の有機残基を示し、
Ｚは水素原子または式−Ｌ−ＳＨの残基を示し、
ＬはＣ1-20アルキレン、Ｃ1-6アルキル−フェニル、Ｃ1-6アルキル−フェニレン−Ｃ1-6アルキル、フェニレンおよびカルボニル−Ｃ1-20アルキルからなる群より選ばれる連結基を示し、
ｎは５〜２０,０００、（好ましくは５０〜２０,０００）の整数であり、
ｍは５〜１０,０００の整数であり、そして
ｘの単位とｙの単位の割合は２０：１〜１：２である、
で表されるブロック共重合体と高分子電解質とから形成されたコア−シェル構造のポリイオンコンプレックスミセルであって、水性媒質中でコア部を形成する該ブロック共重合体のポリアミンセグメント（式（Ｉ）でｍの繰り返り単位を持つセグメント）と高分子電解質とがイオン対を形成しており、そして該セグメント内の少なくとも１個メルカプトを介して該共重合体の２分子以上が架橋していることを特徴とするポリイオンコンプレックスミセル組成物に関する。
【００１０】
またさらに、本発明は、上記一般式（Ｉ）で表されるブロック共重合体にも関する。
【００１１】
以下、本発明をより具体的に説明する。
【００１２】
本発明のコア−シェル構造のポリイオンコンプレックスミセルの安定化方法は、上述のようなジスルフィド結合を介してミセルが安定化されるものである限り、使用するブロック共重合体および高分子電解質は、それらの種類に制限されることなくすべて本発明に包含される。かようなブロック共重合体は、それ自体既知の親水性セグメントと荷電性セグメントからなる共重合体に、必要により、適当な化学的手段でチオール残基を共有結合させたものが使用できる。親水性セグメントは、主として、ポリ（エチレングリコール）からなるものが好ましい。「主として」とは、ポリ（エチレングリコール）が、分子量比で、セグメント中の８０％以上を占めるものであればよい。他方、荷電性セグメントは、いずれかのｐＨ、好ましくは、ｐＨ３.０〜８.５の水性媒質（または水溶液）中で、カチオンまたはアニオンのいずれかに荷電しうる基を繰り返し単位中に少なくとも１個含むセグメントを意味する。カチオンに荷電しうる基としては、アミノ基またはイミノ基、さらには第四級アミノ基を挙げることができ、これらの基は、高分子側鎖に存在するか、さらにイミノ基もしくは第四級アミノ基にあっては高分子主鎖に存在していてもよい。アニオンに荷電しうる基としてはカルボキシル基もしくはスルホ基または硫酸基を挙げることができ、これらの基は、それらの基を高分子側鎖とする繰り返し単位を有するそれ自体既知の重合体を利用して、あるいはそのような重合体の製造方法を利用して、ブロック共重合体中に組み込むことができる。
【００１３】
本発明に従えば、これらの荷電性セグメント（ω−末端を含む）には少なくとも１個のチオール残基が担持されていることが必要である。ここでチオール残基とは、チオール化合物に由来する残基を意味し、これらの残基は例えば、上記アミノまたはイミノ基に保護されていてもよいメルカプト基含有アルキル化剤またはアシル化剤を用い、あるいはカルボキシル基の場合には、カルボキシル基に保護されていてもよいメルカプト基含有アミンまたはアルコールを用い、常法により導入することができる。
【００１４】
限定されるものでないが、親水性セグメントがポリ（エチレングリコール）であり、荷電性セグメントの荷電しうる基がアミノ基またはイミノ基であるブロック共重合体としては、上記、Kataoka（片岡）et al．に記載されたＰＥＧ−Ｐ(Ｌｙｓ）や、Kabanov et al., Bioconj. Chem. １９９５，６，６３９に記載されたポリ（エチレングリコール）−ポリスペルミン共重合体や、また、本願と同時に係属する特願平１１−２２１０２６号明細書に記載されるオキサゾリン由来のポリアミン単位を有するブロック共重合体が挙げられる。これらの共重合体の荷電性セグメントへのチオール残基の導入は、例えば、詳細には後述する、活性エステル型のＮ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネートやこれらの類似物を用いて、アミノ基またはイミノ基をアシル化し、次いで、ピリジルチオ基を還元開裂することにより実施することができる。
【００１５】
したがって、本発明の好ましい態様としては、上記一般式（Ｉ）で表されるブロック共重合体を用いる安定化されたＰＩＣミセルが提供される。一般式（Ｉ）で表されるブロック共重合体はそれ自体新規化合物である。
【００１６】
一般式（Ｉ）で表されるブロック共重合体におけるＡＩを規定するアニオン重合開始剤に有由する有機残基は具体的には、式
【００１７】
【化６】
0004659937.tif 000003
【００１８】
（上記式中、
（ｉ）  ｐは０〜１０の整数であって、かつＲ1およびＲ2は、独立して、水素原子、Ｃ1-10アルコキシ、アリールオキシもしくはアリール−Ｃ1-3アルキルオキシ基を示すか、または、
Ｒ1およびＲ2は、一緒になって、Ｃ1-6アルキルで置換されていてもよいエチレンジオキシ（−Ｏ−ＣＨ(Ｒ′)−ＣＨ−Ｏ−：ここでＲ′は水素原子またはＣ1-6アルキルである）もしくはオキシ（＝Ｏ）基を示すか、または
（ii）  ｐは０または１であって、かつＲ1およびＲ2は、一緒になって単糖もしくはその誘導体の残基を構成する原子団を示す、
の基である。
【００１９】
このような
【００２０】
【化７】
0004659937.tif 000004
【００２１】
セグメントを形成する方法は、例えば、上述の Kataoka et al.，や、ＷＯ ９６／３２４３４、ＷＯ ９６／３３２３３、ＷＯ ９７／０６２０２等に具体的に記載されている。これらの記載は、引用することによって本明細書に組み込まれる。また、かような親水性セグメントに、荷電性セグメント、例えば、
【００２２】
【化８】
0004659937.tif 000005
【００２３】
を導入する方法は上述の Kataoka  et al．や、そこで引用されている文献に詳細に記載されている方法に従えばよい。
【００２４】
本発明によれば、荷電性セグメントにチオール残基が例えば下記反応スキームに従って、共有結合的に導入される。
【００２５】
【化９】
0004659937.tif 000006
【００２６】
（上式中、ＬはＣ1-20アルキレン、Ｃ1-6アルキル−フェニル、Ｃ1-6アルキル−フェニレン−Ｃ1-6アルキル、フェニレンおよびカルボニル−Ｃ1-20アルキルからなる群より選ばれる連結基であり、好ましくはカルボニル−Ｃ2-6アルキルであり、そして
ｘの単位とｙの単位の最適な割合は、ｍ値によっても変動しうるので限定されないが、通常、２０：１〜１：２の範囲内にある。また、ｘの単位とｙの単位は、それぞれブロックを形成してもよいが、好ましくはランダムに配列される。）
上記の反応スキームは、それ自体既知の反応、例えば、対応するモノ−ハロゲン化チオールを用いるアルキル化、対応する活性エステルを用いるアシル化によって実施できる。
【００２７】
こうして、製造された、チオール残基を担持するブロック共重合体は新規化合物であり、本発明の一態様である。
【００２８】
本発明に従うＰＩＣミセルの調製は、上記  Harada and Kataoka や Kataoka et al., に記載のそれ自体既知の方法により、親水性セグメントおよび荷電性セグメントとを含み、さらに電荷性セグメント中に少なくとも１個のチオール残基を担持させたブロック共重合体と高分子電解質とを水性媒質中で処理することにより行うことができる。処理法の具体例については、後述の実施例で説明するので参照することができる。
【００２９】
本発明のＰＩＣミセル中に内包される高分子電解質は、荷電性セグメントに応じてそれぞれ選ぶことができるが、一般的に、水性媒質（または水）中でイオン解離する基を有するポリマーを意味する。しかし、本明細書では、所謂、オリゴマーと称される範疇に入るものも「ポリ」の接頭辞を付していることに注意されたい。したがって、高分子電解質として、ポリペプチド、オリゴペプチド、プソイドペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチドを挙げることができ、これらの直鎖状または環状であってもよい。ペプチド類には、それ自体既知の各種生理活性ペプチド、生理活性プソイドペプチド、などが包含され、ポリヌクレオチドには、ＤＮＡ断片、ＲＮＡ断片、アンチセンスＤＮＡ、環状ＤＮＡ、などが包含される。これらのペプチド類またはポリヌクレオチド類は、通常、ｐＨによて、カチオンまたはアニオンに荷電しうる場合があるので、ＰＩＣミセル調製条件を選ぶことにより、荷電性基がカチオンを生じるかまたはアニオンを生じるかのいずれのブロック共重合体と共に使用することもできる。しかし、ポリヌクレオチド類を用いる場合には、カチオンを生じるブロック共重合体、特に、一般式（Ｉ）で表されるブロック共重合体を用いてＰＩＣミセルを調製することが好ましい。
【００３０】
本発明に従えば、ＰＩＣミセルが形成された後、ブロック共重合体の荷電性セグメントに担持させたチオール残基を介するジスルフィド結合による架橋が形成されることに特徴がある。かようなジスルフィド結合は、ＰＩＣミセル含有水性媒質を酸化条件下に置くことにより形成できる。通常、酸化条件は周囲環境下への放置ないしは空気酸化される条件下に置くのがよい。本発明に関していう水性媒質とは、一般に、水、適当な緩衝剤また、場合によって電解質、さらには水混和性の勇気溶媒をも含む水溶液を意味する。
【００３１】
本発明に従う安定化されたＰＩＣミセルは電解質がかなり含まれる水性媒質中でも安定に存在することができるが、還元条件下の、特に一定濃度の電解質を含む水性媒質中では解離しうる。
【００３２】
したがって本発明によれば、特に高分子電解質を生体内に運搬または送達するために適する手段が提供できる。
【００３３】
【実施例】
以下、具体例を挙げて本発明をさらに説明するが、これらは本発明の理解を容易にするためのものであり、本発明をこれらに限定することを意図するものではない。
製造例：チオール残基が導入されたＰＥＧ−Ｐ(Ｌｙｓ）の製造
（１）  ＰＥＧ−Ｐ(Ｌｙｓ）の製造
【００３４】
【化１０】
0004659937.tif 000007
【００３５】
上述の Kataoka et al．に記載の方法に従って得られたα−メトキシ−ω−アミノポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ、Ｍｗ＝５０００）を開始剤として用い、ε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リシンのＮ−カルボン酸無水物（ＮＣＡ）を開環重合することによってポリ（エチレングリコール）−ブロック−ポリ（ε−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リシン）（ＰＥＧ−Ｐ(Ｌｙｓ(Ｚ）））を製造した。こうして得られたＰＥＧ−Ｐ(Ｌｙｓ(Ｚ））のベンジルオキシカルボニル基（Ｚ基）を３０％ＨＢｒ／ＡｃＯＨで脱保護してＰＥＧ−Ｐ(Ｌｙｓ）を得た。
【００３６】
他方、高分子電解質のモデル化合物としてのポリ(Ｌ−アスパラギン酸）（Ｐ(Ａｓｐ））は、β−ベンジル−Ｌ−アスパルテートのＮＣＡの開環重合により重合したポリ(β−ベンジル−Ｌ−アスパルテート）（開始剤ｎ−ブチルアミン）をアルカリ脱保護して得た。
【００３７】
ＰＥＧ−Ｐ(Ｌｙｓ）のポリリシンセグメントおよびＰ(Ａｓｐ）の重合度は、1Ｈ−ＮＭＲ測定から、それぞれ２２と１５と求められた。
（２）  ＰＥＧ−Ｐ(Ｌｙｓ）へのチオール残基の導入
【００３８】
【化１１】
0004659937.tif 000008
【００３９】
ＰＥＧ−Ｐ(Ｌｙｓ）へのピリジルジチオプロピオニル基ＰＤＰ基）の導入を行った。この導入は、Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）を用いて行った。ＰＥＧ−Ｐ(Ｌｙｓ）は臭素酸塩のものを０.１Ｎ、ｐＨ６.５の酢酸緩衝液に溶解させ、同緩衝液に対して透析し、対イオンを酢酸イオンに交換して用いた。ＰＥＧ−Ｐ(Ｌｙｓ）酢酸塩（２００ｍｇ）とＳＰＤＰ（５６ｍｇ、リジン残基に対して０.５モル当量）を５ｍｌのＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ、５ｗｔ％の塩化リチウムを添加し脱気したもの）に溶解させた。この溶液に０.５ｍｌのＮ.Ｎ.ジイソプロピルエチルアミンを、アミンを脱プロトン化するために添加し、反応を開始した。反応液は、室温で１時間撹拌し、反応の追跡は逆相クロマトグラフィーによって行った。
【００４０】
反応の終了後、反応液をＰＥＧの貧溶媒であるエーテルに滴下し再沈した。粗生成物をメタノールに溶解させた後、エーテルに再沈する操作を繰り返し、水に不要な不純物を取り除いた。過剰の塩は、生成物を０.１Ｎの酢酸水溶液に溶解させ、蒸留水に対して１時間透析することによって取り除いた。最終精製物は、凍結乾燥し回収した。収量は１５０ｍｇであった（ポリマーのモル数から計算した収量は６９％）。
【００４１】
得られたポリマーの構造は1Ｈ−ＮＭＲ測定によって確認した（スペクトラムは図１参照）。ＰＤＰ基の置換度は、1Ｈ−ＮＭＲ測定とＵＶ測定によって決定した。1Ｈ−ＮＭＲ測定ではＤ2Ｏを溶媒として用い、ＰＤＰ基のピリジル基のプロトン（Ｃ3Ｈ4Ｎ：７.６ｐｐｍ）とＰＥＧのメチレン基のプロトン（ＯＣＨ2ＣＨ2：３.５ｐｐｍ）のピークの強度比から、置換度は６.８と求められた。ＵＶ測定では、ＰＤＰ基をジチオスレイトール（ＤＴＴ）によって還元したときに遊離する２−チオピリドンの吸光度（λmax＝３４３ｎｍ．ε＝７.０６×１０3）から、置換度６.７と計算された。異なる二つの方法で求められた置換度は良く一致しており、リジンのアミノ基の約３０％にＰＤＰ基が導入されたことが示された。
製造例２：ジスルフィド（ＳＳ）結合で内核を架橋したＰＩＣミセルの調製
内核をＳＳ結合で架橋したＰＩＣミセルの調製は以下の方法で行った。まず、上記の方法でＰＤＰ基を導入したＰＥＧ−Ｐ(Ｌｙｓ）（ＰＥＧ−Ｐ（Ｌｙｓ）−ＰＤＰ）を、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７.４）に溶解させた後、０.１−μｍのフィルターで濾過しゴミを除いた。次に、ＤＴＴをＰＤＰ基に対して３倍の濃度となるように加えて１５分間撹拌し、ＰＤＰ基をチオール残基に還元した。この溶液にＰ(Ａｓｐ）をＰＥＧ−Ｐ(Ｌｙｓ）−ＰＤＰの正電荷とＰ(Ａｓｐ）の負電荷の比が１となるように添加しＰＩＣミセルを形成させた。ここで、ＰＥＧ−Ｐ(Ｌｙｓ）−ＰＤＰのアミノ基とＰ（Ａｓｐ）のカルボキシル基は、ＰＥＧ−Ｐ(Ｌｙｓ）とＰ(Ａｓｐ）の測定結果に基づいて、全てイオン化していると仮定した。
【００４２】
両ポリマーを混合し、２時間静置したあと、分画分子量６０００−８０００の透析膜を用いて、１Ｌの１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７.４）に対して透析し、ＤＴＴや２−チオピリドンを除いた。透析は３日間続け、この間、空気中の酸素によって、チオールをＳＳ結合に酸化し架橋させた。３日間の透析後、未酸化のチオールが存在しないことは、Ellman 法によって確認した。ＰＩＣミセルの溶液は、透明で沈殿は認められなかった。
特性試験：光散乱法による架橋ミセルの特性解析
架橋したＰＩＣミセルの構造は、動的光散乱測定法（ＤＬＳ）によって評価した。ミセル溶液に対してＤＬＳ測定を行い、ヒストグラム法によってデータを解析して得られた結果から、架橋したＰＩＣミセルの粒径の分布は単峰性であり、分布の程度もかなり小さいことが示された（ｄｗ／ｄｎ＝１.１０）（図２参照）。拡散係数の測定角度依存性はなく、ミセルが球形であることも示唆された。
また、測定の範囲内（高分子濃度０.５−４.０ｍｇ／ｍｌ）で拡散係数の濃度依存性はなく、二次的な凝集は認められなかった。無限希釈に外挿しもとめた拡散係数の値から、Stokes-Einstein の式を用いて、ミセルの流体力学的半径は１６.１ｎｍと計算された。キュムラント法によって求められた多分散度は０.０８であり、天然のウィルスにも匹敵する値となった。
【００４３】
また、透析前、チオールをＳＳ結合に酸化する前のミセルの粒径は１５.７ｎｍであった。透析前後ＰＩＣミセルの粒径がほぼ同程度であるという結果は、ＳＳ結合の形成がミセルの構造に大きな影響を与えていないということを示唆している。少なくとも２週間、ＰＩＣミセルの粒径に目立った変化はなかった。これは、ＰＩＣミセルの内核が親水性のＰＥＧ層によって覆われており、それらの立体反発のため、コロイド粒子としての高い安定性を持っているためであると考えられる。
【００４４】
ＳＳ架橋のＰＩＣミセルの安定性に対する影響は、種々のＮａＣｌ濃度に対するミセルの見かけの分子量を静的光散乱法によって測定し評価した（図３参照）。チオールを導入しておらず架橋されていないＰＩＣミセルの場合は、ＮａＣｌ濃度の増加とともに見かけの分子量は急激に減少する挙動がみられ、ミセルが解離した。一方、架橋ミセルの見かけの分子量の減少は、ＮａＣｌ濃度０.５Ｍにおいても非常に小さかった。また、ＤＬＳから求めたキュムラント粒径は、評価したＮａＣｌの濃度の範囲内で３２.０ｎｍから３５.２ｎｍであり、ミセルがＮａＣｌ濃度に対して著しく安定化していることが確認できた。
【００４５】
ＰＩＣミセルの安定化が、ＳＳ結合の架橋の形成によるものであることを確認するために、還元剤を添加し散乱光強度の変化を追った（図４参照）。安定化がＳＳ結合のために起こっているならば、高塩濃度下で、ＳＳ結合を選択的に開裂させる還元試薬であるＤＴＴを添加するとＰＩＣミセルの解離が起こるはずである。実際に、ＤＴＴ添加後の測定角度９０°の散乱光強度を追跡した結果、散乱光強度の急激な減少が見られた。この減少は、ミセルの解離に対応していると考えられ、安定化がＳＳ結合の形成によることが確認された。また、解離速度はＤＴＴの添加濃度依存的であり、２ｍＭでは、５０分程度でミセルは完全に解離した。また、このＰＩＣミセルの解離と同調して、内包されたＰ(Ａｓｐ）は、溶液中に放出されると考えられる。
【００４６】
動物細胞中に最も大量に存在するＳＳ結合の還元剤は、グルタチオンという低分子チオールであり、その濃度は細胞内では３ｍＭ程度であるのに対し、血流中では、その３００分の１の１０μＭのオーダーであることが知られている。このように、細胞内と細胞外で濃度が大きく異なり、ＳＳ結合の解離速度は還元剤の濃度に依存することから、ＳＳ結合で安定化したＰＩＣミセルを、ＤＮＡを含む生理活性をもつ高分子電解質、例えばポリアニオンの、細胞内への運搬体として利用することが可能であると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【図１】製造例１で得られたチオール残基の導入されたＰＥＧ−Ｐ(Ｌｙｓ）の1Ｈ−ＮＭＲスペクトラムである。
【図２】製造例２で調製されたチオール化したＰＥＧ−Ｐ(Ｌｙｓ）とＰ(Ａｓｐ）から形成させたポリイオンコンプレックスミセルのｚ−平均粒径分布を示すグラフである。透析３日後、測定角度９０°；温度２５℃；ブロック共重合体濃度２ｍｇ／ｍｌ；溶媒１０ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ７.４）の条件に従う。
【図３】架橋ミセル（黒丸）および架橋をしていないミセル（白抜き丸）のＮａＣｌ濃度に対する見かけの分子量の変化を示すグラフである。ブロック共重合体濃度１ｍｇ／ｍｌ；濃度２５℃；溶媒１０ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ７.４）の条件に従う。
【図４】本発明に従うＰＩＣミセル溶液へジチオスレイトール（ＤＴＴ）添加した後の散乱光強度の変化を示すグラフである。ＤＴＴ添加濃度：０.５ｍＭ（丸）、１.０ｍＭ（四角）、２.０ｍＭ（三角）；ブロック共重合体濃度１.０ｍｇ／ｍｌ；ＮａＣｌ濃度０.３Ｍ；濃度２５℃；溶媒１０ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ７.４）の条件に行う。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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