(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
過剰な皮下脂肪の低減を意図した化粧組成物を調製するための、フィトスフィンゴシン又はその化粧品に許容される塩の１種のスリミング剤としての化粧的使用。
【請求項２】
過剰な皮下脂肪の低減を意図した化粧組成物を調製するための、フィトスフィンゴシン又はその化粧品に許容される塩の１種の、脂肪細胞によるレプチンの合成を刺激する活性成分としての化粧的使用。
【請求項３】
前記フィトスフィンゴシン又はその塩の１種は、前記組成物の全重量に対して０．００１重量％〜１重量％の濃度である
ことを特徴とする請求項１又は２に記載の化粧的使用。
【請求項４】
前記フィトスフィンゴシン又はその化粧品に許容される塩は、化粧品に許容される脂肪分解剤の少なくとも１種と組み合わせて、前記組成物を調製するために使用される
ことを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５】
前記脂肪分解剤は、環状アデノシン３’，５’−一リン酸（ｃＡＭＰ）、又は、その化粧品に許容される誘導体である
ことを特徴とする請求項４に記載の使用。
【請求項６】
前記ｃＡＭＰ又はその誘導体は、前記組成物の全重量に対して０．００１重量％〜５重量％の濃度で使用される
ことを特徴とする請求項５に記載の使用。
【請求項７】
前記脂肪分解剤はアデニル酸シクラーゼ活性化剤である
ことを特徴とする請求項４に記載の使用。
【請求項８】
前記アデニル酸シクラーゼ活性化剤は、フォルスコリン又はこれを含む植物抽出物である
ことを特徴とする請求項７に記載の使用。
【請求項９】
前記フォルスコリン又はこれを含む植物抽出物は、前記組成物の全重量に対して０．００１重量％〜１重量％の濃度で使用される
ことを特徴とする請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
前記フォルスコリンを含む抽出物は、コレウス・フォルスコリ（Ｃｏｌｅｕｓ ｆｏｒｓｋｏｈｌｉｉ）又はプレクトランサス・バルバトス（Ｐｌｅｃｔｒａｎｔｈｕｓ ｂａｒｂａｔｕｓ）の抽出物である
ことを特徴とする請求項８又は９に記載の使用。
【請求項１１】
前記アデニル酸シクラーゼ活性化剤は植物テフロジア・プルプレア（Ｔｅｐｈｒｏｓｉａ ｐｕｒｐｕｒｅａ）の抽出物であり、前記組成物の全重量に対して０．００１重量％〜５重量％の濃度である
ことを特徴とする請求項７に記載の使用。
【請求項１２】
前記脂肪分解剤はホスホジエステラーゼ阻害剤である
ことを特徴とする請求項４に記載の使用。
【請求項１３】
前記ホスホジエステラーゼ阻害剤は、キサンチン誘導体、カフェイン又はテオフィリンである
ことを特徴とする請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
前記キサンチン誘導体は、前記組成物の重量に対して０．００１重量％〜１０重量％の濃度で使用される
ことを特徴とする請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
人体に対するスリミング効果を得ることを意図した化粧処置の方法であって、
フィトスフィンゴシン又はその化粧品に許容される塩の１種を含む化粧組成物の有効量を前記効果を必要とする身体部分に塗布することである方法。
【請求項１６】
前記化粧組成物は、化粧品に許容される脂肪分解剤の少なくとも１種を更に含む
ことを特徴とする請求項１５に記載の化粧処置の方法。
【請求項１７】
前記脂肪分解剤は、ｃＡＭＰ並びにその誘導体からなる群より選択され、
前記脂肪分解剤は、前記組成物中に請求項６、９又は１４に記載の濃度で含まれる
ことを特徴とする請求項１６に記載の化粧処置の方法。
【請求項１８】
過剰な皮下脂肪の低減を意図した化粧組成物であって、
活性成分として、
―フィトスフィンゴシン又はその化粧品に許容される塩の１種、並びに、
―ｃＡＭＰ及びその化粧品に許容される脂肪分解性誘導体、アデニル酸シクラーゼ活性化剤及びホスホジエステラーゼ阻害剤からなる群より選択される脂肪分解剤の少なくとも１種
を化粧品に許容される媒体中に含む
ことを特徴とする化粧組成物。
【請求項１９】
フィトスフィンゴシン又はその化粧品に許容される塩の１種を、０．００１重量％〜１重量％含む
ことを特徴とする請求項１８に記載の化粧組成物。
【請求項２０】
前記脂肪分解剤は、ｃＡＭＰ、又は、その化粧品に許容される誘導体の１種である
ことを特徴とする請求項１８又は１９に記載の化粧組成物。
【請求項２１】
ｃＡＭＰ又はその脂肪分解性誘導体は、前記組成物の全重量に対して０．００１重量％〜５重量％の濃度で含まれる
ことを特徴とする請求項２０に記載の化粧組成物。
【請求項２２】
前記脂肪分解剤はアデニル酸シクラーゼ活性化剤である
ことを特徴とする請求項１８に記載の化粧組成物。
【請求項２３】
前記アデニル酸シクラーゼ活性化剤は、フォルスコリン又はこれを含む植物抽出物である
ことを特徴とする請求項２２に記載の化粧組成物。
【請求項２４】
前記フォルスコリン又はこれを含む抽出物は、前記組成物の全重量に対して０．００１重量％〜１重量％の濃度で含まれる
ことを特徴とする請求項２３に記載の化粧組成物。
【請求項２５】
前記植物抽出物は、コレウス・フォルスコリ又はプレクトランサス・バルバトスの抽出物である
ことを特徴とする請求項２３又は２４に記載の化粧組成物。
【請求項２６】
前記アデニル酸シクラーゼ活性化剤は、植物テフロジア・プルプレアの抽出物である
ことを特徴とする請求項２２に記載の化粧組成物。
【請求項２７】
前記テフロジア・プルプレアの抽出物は、前記組成物の全重量に対して０．００１重量％〜５重量％の濃度で含まれる
ことを特徴とする請求項２６に記載の化粧組成物。
【請求項２８】
前記脂肪分解剤はホスホジエステラーゼ阻害剤である
ことを特徴とする請求項１８に記載の化粧組成物。
【請求項２９】
前記ホスホジエステラーゼ阻害剤は、キサンチン誘導体、カフェイン又はテオフィリンである
ことを特徴とする請求項２８に記載の化粧組成物。
【請求項３０】
前記キサンチン誘導体は、前記組成物の全重量に対して０．００１重量％〜１０重量％の濃度で含まれる
ことを特徴とする請求項２９に記載の化粧組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フィトスフィンゴシンのスリミング剤としての新規の化粧的使用、及び、フィトスフィンゴシンを含む化粧組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
フィトスフィンゴシンは次の式で示される。
【０００３】
【化１】
0004681230.tif 000002
【０００４】
フィトスフィンゴシンの分子式はＣ１８Ｈ３９ＮＯ３で、ＣＡＳ番号は次の通りである：ＲＮ１００  ０００  ４０３−１９−８。この物質は、（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−２−アミノ−１，３，４−オクタデカントリオールの名称でも知られる。フィトスフィンゴシンは、皮膚中に生来存在するスフィンゴイド塩基３種のうちの１種、角質層中に存在するフィトスフィンゴシンに相当する、市販の物質である。
【０００５】
フィトスフィンゴシン及びその塩（特に塩酸塩）の用途は、皮膚科の分野において既に知られている。フィトスフィンゴシンは事実上本質的にその抗菌活性及び「セカンドメッセンジャー」としての活性で知られ、この活性により皮膚の感受性を低下させる。より具体的には、フィトスフィンゴシンは、ニキビの治療における活性、皮膚上の微生物の増殖を阻害する活性、及び、皮膚上で観察される様々な炎症を軽減する活性で知られる。
【０００６】
本発明者らは、全く驚くべき方法で、フィトスフィンゴシン及びその化粧品に許容される塩（特に塩酸塩）のスリミング剤としての新規の使用を発見した。また、本発明者らは、この新規の使用は、少なくとも部分的に、フィトスフィンゴシン及びその塩の、皮膚の脂肪細胞によるレプチンの合成を促進するという全く予想外の特性に関与していることを明らかにした。
【０００７】
また、この分野において研究を続けるうちに、本発明者らは、フィトスフィンゴシン又はその化粧品に許容される塩の組み合わせのいくつかが上記の新規使用において結局は特に興味深いということも明らかにした。
【０００８】
近年、マウス由来のレプチンが、「ｏｂ遺伝子」の産物であるとして１９９４年に同定された（非特許文献１、２）。ヒトレプチン（又はヒトＯＢタンパク質）の構造及び動物の体重調節におけるその使用が、特許文献１中に記載されている。レプチンは、脂肪の蓄積状態を脳に通知する脂肪細胞によって分泌されるタンパク質であり、特に視床下部に位置する膜受容体を介して作用する。レプチンはまずげっ歯動物において、その後人間において研究され、体重の調節に重要な役割を果たしている。
【０００９】
ｏｂ／ｏｂマウスでは、（レプチンをコードする）ｏｂ遺伝子の変異によって血清中のレプチンが欠失すると、重度の肥満が引き起こされる。レプチンについての人間における最初の研究は、肥満かつ／又は糖尿病の患者を対象としたものであった。
【００１０】
実際、脂肪細胞はトリグリセリドを多く蓄積するとレプチンをより多く生産し、その逆も起こる（非特許文献３）。従って、肥満の人においては２つの状態が発生し得る。すなわち、レプチン遺伝子が変異して（特に脳内受容体に対して）機能しなくなっているか、又は、血液脳関門においてレプチンが十分に運搬されていない状態である。
【００１１】
肥満又は体重過剰の患者に合成レプチンを毎日注射する実験が行われ、決定的な結果が示された。すなわち、ある型の肥満患者において体重が著しく減少した（非特許文献４）。実際、レプチンは、満腹現象を誘発することにより、食物摂取の減少を引き起こし、かつ、食物摂取の頻度を減少させる。脂肪量が増加すると、脂肪組織によって生産されたレプチンが食物摂取を阻害してエネルギー消費が刺激されるであろう。レプチンは、このように過度の体重増加に対して抵抗作用を示すであろう。従って、このタンパク質は脂肪量の調節因子であり、その第一の役割は過剰な脂肪蓄積の阻害であると考えてもよい。
【００１２】
レプチンによる局所的阻害作用が知られている（非特許文献５）。
【００１３】
また、脂質の蓄積を導くある遺伝子（分化遺伝子）の発現におけるレプチンの役割もまた、脂肪分解を調節するという範囲内において公知である。レプチンは、一方では、脂質の蓄積を導くある遺伝子（分化遺伝子）の発現を抑制する。これは脳の関与なしで起こる。他方では、レプチンは、直接脂肪細胞に対して脂肪分解を誘導する。これは、マウスの脂肪細胞においてｉｎ  ｖｉｔｒｏで観察された（非特許文献６）。脂肪細胞の脂肪分解に対するレプチンの効果は特異的で、白色脂肪組織中に存在する受容体を介して機能する。
【００１４】
レプチンは、（脂質蓄積を増加させるホルモンである）循環血液中のエストロンを、「スリミング」因子と考えられるオレイルエストロンに変換する。この因子の出現により、脂肪分解及び熱発生が全身で誘導される（非特許文献７）。オレイルエストロンを肥満の又は正常なラットに投与すると、脂肪量の減少が引き起こされる。
【特許文献１】イギリス特許ＧＢ２２９２３８２
【非特許文献１】Ｚｈａｎｇ，ｙら、Ｎａｔｕｒｅ，１９９４年，３７２：４２５
【非特許文献２】Ｔａｒｔａｇｌｉａ  Ｌ．Ａ．，１９９７年，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：６０９３
【非特許文献３】Ｍｅｄｅｃｉｎｅ／Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９９８年，ｎ°８−９，１４，８５８−８６４，Ｇ．Ａｉｌｈａｕｄ：Ｌ’ａｄｉｐｏｃｙｔｅ，ｃｅｌｌｕｌｅ  ｓｅｃｒｅｔｒｉｃｅ  ａｎｄ  ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  （“Ｔｈｅ  ａｄｉｐｏｃｙｔｅ，ａ  ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  ａｎｄ  ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  ｃｅｌｌ”）
【非特許文献４】タフツ大学（アメリカ）で行われ、会議で発表された研究：米国糖尿病協会：ジーン・マイヤー米国加齢人類栄養学研究センター（Ｊｅａｎ  Ｍａｙｅｒ，ＵＳＡ  Ｈｕｍａｎ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｎ  Ａｇｉｎｇ）
【非特許文献５】Ｓｙｓｔｅｍｉｃａｌｌｙ  ａｎｄ  Ｔｏｐｉｃａｌｌｙ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ  Ｌｅｐｔｉｎ  Ｂｏｔｈ  Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅ  Ｗｏｕｎｄ  Ｈｅａｌｉｎｇ  ｉｎ  Ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｏｂ／ｏｂ  Ｍｉｃｅ．  Ｂ．Ｄ．Ｒｉｎｇ，Ｓ．Ｓｃｕｌｌｙ，Ｃ．Ｒ．Ｄａｖｉｓ，Ｍ．Ｂ  Ｂａｋｅｒ，Ｍ．Ｊ．Ｃｕｌｌｅｎ，Ｍ．Ａ．Ｐｅｌｌｅｙｍｏｕｎｔｅｒ，Ｄ．Ｄａｎｉｌｅｎｋｏ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，２０００年  ｖｏｌ．１４１，ｎ°１，ｐ．４４６−４４９
【非特許文献６】Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｌｉｐｏｌｙｔｉｃ  Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  Ｌｅｐｔｉｎ  ｏｎ  Ｍｏｕｓｅ  Ａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ：Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ａ  ｐｏｓｓｉｂｌｅ  Ａｕｔｏｃｒｉｎｅ／Ｐａｒａｃｒｉｎｅ  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｌｅｐｔｉｎ，  Ｇ．Ｆｒｕｈｂｅｃｋ，Ｍ．Ａｇｕａｄｏ，Ｊ．Ａ．Ｍａｒｔｉｎｅｚ，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  １９９７年：２４０，ｐ．５９０−５９４
【非特許文献７】Ｌｅｐｔｉｎ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｔｈｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｏｌｅｙｌ−ｅｓｔｒｏｎｅ  ｆｒｏｍ  ｅｓｔｒｏｎｅ  ｉｎ  ｗｈｉｔｅ  ａｄｉｐｏｓｅ  ｔｉｓｓｕｅ，  Ｍ．Ｅｓｔｅｖｅ，Ｊ．Ｖｉｒｇｉｌｉ，Ｈ．Ａｇｕｉｌａｒ，Ｆ．Ｂａｌａｄａ，Ｊ．Ａ．Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｌｏｐｅｚ，Ｗ．Ｒｅｍｅｓａｒ，Ｍ．Ａｌｅｍａｎｙ，  Ｅｕｒ  Ｊ．Ｎｕｔｒ．１９９９年，３８，ｐ．９９−１０４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
従って、レプチンの合成に影響を与えるために使用できる方法、特に、
−皮膚中の受容体を介して皮膚に直接影響を与えることができる、
−脂肪分解の誘導において脂肪組織に影響を与えることができる、
−体重調節因子として働く因子、すなわちオレイルエストロンに影響を与えることができる
方法を得ることが最も重要である。
【００１６】
本発明の範囲内で行った、ネズミ脂肪細胞の培養及びヒト脂肪細胞の培養についての試験によって、上記培養細胞をフィトスフィンゴシン又はその塩の１種（特に塩酸塩）で処理することにより、上記脂肪細胞によるレプチンの合成を刺激できることを実証でき、このことから、フィトスフィンゴシン又はその塩をスリミング剤として使用できることが予測される。この効果を確認することができた。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
従って、第一の態様によれば、本発明は、過剰な皮下脂肪の低減を意図した化粧組成物を調製するための、フィトスフィンゴシン又はその化粧品に許容される塩の１種（特に塩酸塩）のスリミング剤としての新規の化粧的使用に関する。
【００１８】
第二の態様によれば、本発明は、過剰な皮下脂肪の低減を意図した化粧組成物を調製するための、フィトスフィンゴシン又はその化粧品に許容される塩の１種（特に塩酸塩）の、脂肪細胞によるレプチンの合成を刺激する活性成分としての新規の化粧的使用に関する。
【００１９】
第三の態様によれば、本発明は、人体に対するスリミング効果を得ることを意図した化粧処置の方法に関し、この方法によれば、フィトスフィンゴシン又はその化粧品に許容される塩の１種（特に塩酸塩）を含む化粧組成物の有効量を上記効果を必要とする身体部分に塗布する。
【００２０】
更に、本発明の上記３つの態様によれば、上記に定義するように、フィトスフィンゴシン又はその化粧品に許容される塩の１種（特に塩酸塩）の特定の組み合わせが、上記特定の組み合わせを含む組成物の任意の１種を使用することによって得られるスリミング効果の改善に結局は特に興味深いということが報告されている。
【００２１】
より詳しくは、フィトスフィンゴシン又はその化粧品に許容される塩の１種と、脂肪細胞中で脂肪分解を誘導する物質（以下、脂肪分解剤と称する）１種以上との組み合わせが、以下で詳しく説明するように、本発明の範囲内で結局は特に興味深いということが報告されている。
【００２２】
特に、上記組み合わせを作るための化粧品に許容される脂肪分解剤の少なくとも１種は、環状アデノシン３’，５’−一リン酸（ｃＡＭＰ）及びその誘導体、アデニル酸シクラーゼ活性化剤及びホスホジエステラーゼ阻害剤からなる群より選択できる。フォルスコリン、又は、コレウス・フォルスコリ（Ｃｏｌｅｕｓ  ｆｏｒｓｋｏｈｌｉｉ）若しくはプレクトランサス・バルバトス（Ｐｌｅｃｔｒａｎｔｈｕｓ  ｂａｒｂａｔｕｓ）等のフォルスコリンを含む植物抽出物、更には植物テフロジア・プルプレア（Ｔｅｐｈｒｏｓｉａ  ｐｕｒｐｕｒｅａ）の抽出物は、アデニル酸シクラーゼ活性化剤として有利に選択できる。ホスホジエステラーゼ阻害剤として、３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）、カフェイン又はテオフィリン等のキサンチン誘導体を使用できるであろう。
【００２３】
上記組み合わせを含む化粧組成物（それ自体新規である）は、本発明の第四の態様を構成する。本発明の範囲内の化粧用途全てに好ましく使用できるのは、以下に定義される上記組成物である。従って、この第四の態様によれば、本発明は、（特に過剰な皮下脂肪の低減を意図した）化粧組成物であって、
活性成分として、
―フィトスフィンゴシン又はその化粧品に許容される塩の１種（特に塩酸塩）、並びに、
―ｃＡＭＰ及びその化粧品に許容される誘導体、アデニル酸シクラーゼ活性化剤及びホスホジエステラーゼ阻害剤からなる群より選択される化粧品に許容される脂肪分解剤の少なくとも１種
を化粧品に許容される媒体中に含む
ことを特徴とする化粧組成物に関する。
【００２４】
本発明の範囲内の様々な用途における手段として好ましい組成物でもある本発明の新規組成物において、フィトスフィンゴシン又はその化粧品に許容される塩の１種（特に塩酸塩）は、上記組成物の全重量に対して０．００１重量％〜１重量％、好ましくは０．０５重量％〜０．５重量％の濃度で上記組成物中に含まれる。
【００２５】
上記化粧組成物は、ｃＡＭＰ及びその脂肪分解性誘導体、アデニル酸シクラーゼ活性化剤及びホスホジエステラーゼ阻害剤からなる群より選択される少なくとも１種の脂肪分解活性化剤を更に含む。
【００２６】
上記化粧組成物において、ｃＡＭＰ又はその誘導体は、上記組成物の全重量に対して０．００１重量％〜５重量％の濃度で有利に使用されるであろう。ｃＡＭＰの化粧品に許容される誘導体、特に塩及びアシル化誘導体、とりわけモノ−又はジブチリル誘導体をｃＡＭＰ誘導体として選択できるであろう。
【００２７】
上記組成物の全重量に対して好ましくは０．００１重量％〜１重量％、より好ましくは０．０５重量％〜０．２５重量％の濃度のフォルスコリン又はこれを含む植物抽出物は、アデニル酸シクラーゼ活性化剤として有利に選択できる。コレウス・フォルスコリ又はプレクトランサス・バルバトスの抽出物を、フォルスコリンを含む抽出物として好ましく選択できる。このような抽出物は、国際出願ＷＯ９１／０２５１６に記載されるような抽出方法によって得られる。植物テフロジア・プルプレアの抽出物を、上記組成物の全重量に対して０．００１重量％〜５重量％、好ましくは０．０１重量％〜５重量％の濃度で、アデニル酸シクラーゼ活性化剤として使用することもできる。このような抽出物は、国際出願ＷＯ９５／０３７８０に記載されるような抽出方法によって得られる。
【００２８】
最後に、上記に記載したように、別の変形形態によれば、本発明の好ましい組成物は、ホスホジエステラーゼ阻害剤、特にキサンチン誘導体、とりわけ３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）、カフェイン又はテオフィリンを、上記組成物の重量に対して好ましくは０．００１重量％〜１０重量％、より好ましくは０．０１〜１重量％の濃度で含む。
【００２９】
本発明において使用され、フィトスフィンゴシン又はその塩の１種とｃＡＭＰ及びその脂肪分解性誘導体、アデニル酸シクラーゼ活性化剤及びホスホジエステラーゼ阻害剤等の脂肪分解剤との組み合わせを含む好ましい組成物は、２種の構成成分がもたらす相乗効果のために結局は特に興味深い。
【００３０】
本発明者らは、観察された相乗効果が上記説明によって完全に限定できていないと考えるため、妥当な解釈を下記に示す。
【００３１】
実際、例えばコレウス抽出物等の脂肪細胞中で脂肪分解を促進する物質が、一般に顕著な脂肪分解力と脂肪細胞の成熟抑制活性とを兼ねた著しい生物学的有効性を有することが既に観察されている。脂肪分解剤で処理した後で脂質液胞の体積及び数が顕著に減少すると、レプチンの生産が減少する。上記のことから、脂肪分解剤で処理したために脂肪細胞近傍で局所的に消失したレプチンは、レプチン合成を刺激する物質の影響によって、この場合はフィトスフィンゴシン又はその塩の影響によって補われる可能性が高い。こうして、脂肪細胞近傍に十分な濃度のレプチンを維持できれば、脂肪量の増加に抵抗できる。従って、脂肪細胞が信号を発して、トリグリセリドの形態での貯蔵を減らす必要があると逆制御作用（ｒｅｔｒｏ−ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｐｅｒａｔｉｏｎ）により通知したかのように全てが起こるようである。このようにして、フィトスフィンゴシン又はその塩の１種と他の脂肪分解剤の少なくとも１種との相乗効果によって、スリミング効果が増大し、より長く持続する。
【００３２】
この仮説は、フィトスフィンゴシンとコレウス・フォルスコリ抽出物との組み合わせに関する、本発明の実施例２及び４の範囲内で得られた結果によって完全に確認されるようである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
以下の実施例は、本発明を説明するためにのみ記載される。この実施例には図１〜６が付随しており、これらはそれぞれ、
−図１：実施例２中で実施した様々な処理が脂質生成に及ぼす効果、
−図２〜４：実施例２の処理の異なる段階におけるマウス脂肪細胞の形態、
−図５：（実施例３の）コントロール溶液について、１８日目におけるヒト脂肪細胞の形態、及び、
−図６：本発明の（実施例３の）組み合わせによる処理について、１８日目におけるヒト脂肪細胞の形態
を示す。
【００３４】
以下の実施例において、別に示す場合以外は、割合は重量％で示す。
【実施例１】
【００３５】
マウス培養脂肪細胞のレプチン生産に対するフィトスフィンゴシンの刺激活性の実証。
１．試験の原理
分泌された循環因子によって脂肪量が制御される概念は非常に興味深い。この試験の原理は、脂肪細胞によるレプチン分泌の調節である。
【００３６】
２．材料と方法
３Ｔ３−Ｆ４４２Ａ細胞の培養
トリグリセリドを多量に蓄積できるクローンを、マウス３Ｔ３前駆脂肪細胞の確立された細胞系から単離した。脂肪分解剤はこの蓄積を減少させる。従って、脂肪分解剤である可能性のある物質を３Ｔ３−Ｆ４４２Ａマウス前駆脂肪細胞系に対して試験することは重要であると考えられる。この前駆脂肪細胞（ＧＲＥＥＮ  Ｈ．及びＫＥＨＩＮＤＥ  Ｏ．“Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  Ｈｅｒｉｔａｂｌｅ  Ｃｈａｎｇｅｓ  Ｌｅａｄｉｎｇ  ｔｏ  Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  Ａｄｉｐｏｓｅ  Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｉｎ  ３Ｔ３  Ｃｅｌｌｓ”Ｃｅｌｌ  Ｖｏｌ．７，１０５−１１３，１９７６年）は、成熟脂肪細胞の分化後の機能に特徴的な形態学上及び生化学上の表現型を獲得することにより増殖及び分化できる。この細胞は、指数増殖期において繊維芽細胞のような外観を呈し、細長い形態で支持体に非常によく付着する。コンフルエンスにおいて、条件によっては、非常に早熟期の形態変化により丸い形態となる。
【００３７】
こうして細胞はクローン増幅する。上記形態変化に加えて、脂質生成酵素の活性が増加し、かつ、脂質生成及び脂肪分解に影響を与えるホルモン／因子に対する上記細胞の反応が増加する。
【００３８】
このように、３Ｔ３−Ｆ４４２Ａ前駆脂肪細胞は、成長過程で形態及び代謝が変化するために、脂肪分解の優れた研究モデルである（Ｐａｉｒａｕｌｔ  Ｊ及びＬａｓｎｉｅｒ  Ｆ：「３Ｔ３−Ｆ４４２Ａ細胞の脂質生成性分化のレチノイン酸、デキサメタゾン及びインスリンによる調節“Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ａｄｉｐｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ３Ｔ３−Ｆ４４２Ａ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｒｅｔｉｎｏｉｃ  ａｃｉｄ，ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ  ａｎｄ  ｉｎｓｕｌｉｎ”」：ａ  ｔｏｐｏｇｒａｐｈｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｊ．ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９８７年，１３２，２７９−８６）。
【００３９】
先行技術によれば、レプチンは、脂肪細胞中に貯蔵された後、培地中に分泌される（Ｗａｂｉｔｓｃｈ  Ｍら，Ｄｉａｂｅｔｅｓ，１９９６年，ｖｏｌ  ４５，Ｂｏｒｎｓｔｅｉｎ  Ｓ．ら，Ｄｉａｂｅｔｅｓ，２０００年，ｖｏｌ  ４９，Ｆｒｉｅｄｍａｎ  ＪＭ，Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，１９９８年，ｖｏｌ  ５６  ｎ°２）。
【００４０】
３Ｔ３−Ｆ４４２Ａ細胞において、ｏｂ遺伝子の発現について特に研究が行われた（Ｌｅｒｏｙ  Ｐら，Ｊ．ｏｆ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，１９９６年，ｖｏｌ  ２７１  ｎ°５，ｐｐ．２３６５−２３６８，Ｃｏｎｓｉｄｉｎｅ  ＲＶら，Ｈｏｒｍ．Ｒｅｓ．１９９６年，４６：２４９−２５６）。
【００４１】
３Ｔ３−Ｆ４４２Ａ前駆脂肪細胞を０日目（Ｄ０）に３５ｍｍペトリ皿（コーニング社）中に播種し、３７℃のオーブン中に、空気−ＣＯ２（９５−５）雰囲気下で静置する。細胞は、増殖期の間、仔ウシ血清（ＣＳ）（ＢＩＯＭＥＤＩＡ（Ｒ））５％及びウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯ）５％を添加したダルベッコ改変イーグル最小必須培地（Ｅａｇｌｅ  ｍｉｎｉｍｕｍ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｍｅｄｉｕｍ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ａｃｃｏｒｄｉｎｇ  ｔｏ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）（グルコース４．５０ｇ／Ｌ）（ＤＭＥＭ−ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）中で培養する。培地は２日目と４日目に交換する。
【００４２】
細胞がコンフルエンスになった時点（７日目）で培地を交換する：
基本培地はそのまま（ＤＭＥＭ）であるが、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）１０％及びインスリン（５μｇ／ｍＬ）（ＳＩＧＭＡ社）を添加する。培地はその後、９日目と１１日目に交換する。
【００４３】
１４、１６及び１８日目に、レプチン合成に対する有効性を検証したい組成物で処理する。プロトコールを下記に要約する：
０日目：ＤＭＥＭ、ＣＳ５％、ＦＣＳ５％の中への３Ｔ３−Ｆ４４２Ａの播種。細胞密度＝２ｘ１０４個／３５ｍｍペトリ皿。
２日目：培地の交換。
４日目：培地の交換。
７日目：コンフルエンス。培地はＤＭＥＭ、ＦＣＳ１０％、インスリン（母液は５００μｇ／ｍＬ）１％。
９日目及び１１日目：培地の交換。
１４日目：試験する組成物による処理。
１６日目及び１８日目：試験する組成物による処理。
２１日目：細胞上清の回収。
【００４４】
３．レプチンの測定
Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  Ｍ  マウスレプチンイムノアッセイキットを用いてサンドイッチＥｌｉｓａ法を繰り返し行い、分泌されたレプチンの量を測定する。このＥＬＩＳＡ測定には、大腸菌中で発現した組み換えマウスレプチン及び抗組み換えマウスレプチン抗体を使用する。この試験には「サンドイッチ」酵素抗体法を用いる。マイクロプレートウェルにマウスレプチンポリクローナル抗体を一列に並べる。
【００４５】
標準、コントロール及び試料をウェル中に注入する。この際、存在するレプチンは全て固定化抗体に結合している。ペルオキシダーゼ酵素結合マウス抗レプチン抗体を用いて結合しているレプチンを検出した後、基質溶液をウェル中に添加する。酵素反応によって溶液は青くなり、停止液を添加すると黄色くなる。
【００４６】
色の強度を測定する。これは存在するレプチンの量に比例する。光学密度の読み取りは分光光度計を用いて４５０ｎｍにおいて行う。測定値は、「組み換え」Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  Ｍ  標準について得られた標準曲線と平行な、天然レプチンの測定に関する添加量−反応曲線から得られる。従って、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  Ｍ  キットを用いると、天然マウスレプチンに対する相対的な質量値を測定できる。
【００４７】
４５０ｎｍにおいて測定した光学密度は固定化抗体の量に比例し、この量自体は最初に存在するレプチンの量と比例する。結果は、細胞上清中のレプチンのｐｇ／ｍＬで示す。試料は３回試験した。
【００４８】
４．結果
フィトスフィンゴシン又はその塩酸塩をそれぞれ０．２５、１及び２μｇ／ｍＬ含む３種の組成物について試験した。
【００４９】
何の処理もしない培地中で培養している３Ｔ３−Ｆ４４２Ａ脂肪細胞については、培養上清中のレプチンの量が経時的に（４日目に１６．４ｐｇ／ｍＬ、１１日目に８０２ｐｇ／ｍＬ、２０日目に２，６２３ｐｇ／ｍＬ）顕著に増加する。この結果は生物学的データ（Ｌｅｒｏｙ  Ｐ．１９９６年，Ｃｏｎｓｉｄｉｎｅ  ＲＶ．１９９６年）と一致し、次の通りである：基本条件下において、マウス脂肪細胞によるレプチン分泌量は、成熟する間中増加し続ける。このように、本発明者らは、成熟脂肪細胞が前駆脂肪細胞より多量にレプチンを分泌することを確認した。
【００５０】
上清中のレプチン量は、下記表１中に示す。略語ＰＳはフィトスフィンゴシンを表す。
【００５１】
【表１】
0004681230.tif 000003
【００５２】
７日間処理した後、すなわち２１日目に、フィトスフィンゴシンは処理脂肪細胞のレプチン分泌を増加させ、この効果は濃度０．２５μｇ／ｍＬで最大となる。この濃度における増加量は、１８％よりわずかに多い。
【００５３】
フィトスフィンゴシン塩酸塩もまた、同じ条件下で試験した際、レプチン分泌を刺激できる：１μｇ／ｍＬにおいて＋５２％、２μｇ／ｍＬにおいて＋２６％、０．２５μｇ／ｍＬにおいて＋１８％。塩酸塩についての結果を下記表２中に示す。
【００５４】
【表２】
0004681230.tif 000004
【００５５】
このように、フィトスフィンゴシンは、ヒト脂肪細胞に非常に近いモデルである３Ｔ３−Ｆ４４２Ａ脂肪細胞における脂肪細胞のレプチン基礎分泌を増加させることができる。従って、フィトスフィンゴシンは、脂肪量の安定性の制御において重要な役割を果たすことができる。
【実施例２】
【００５６】
マウス培養脂肪細胞中の脂質生成の減少を促進するための、フィトスフィンゴシンとコレウス・フォルスコリ抽出物等のアデニル酸シクラーゼ活性化剤との組み合わせの重要性の検証。
１．研究の原理
この研究は、活性成分２種、すなわちコレウス・フォルスコリ（プレクトランサス・バルバトス）（ＰＢ）及びフィトスフィンゴシン（ＰＳ）の組み合わせの、新しい脂肪細胞の増殖に対する効果に関する。
【００５７】
白色脂肪組織の成長は、生涯継続する過程を表わしていることが知られている（ＡＩＬＨＡＵＤ  Ｇ．，ＧＲＩＭＡＬＤＩ  Ｐ．，ＮＥＧＲＥＬ  Ｒ．，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，（１９９４年）５（３）１３２−６）。脂肪細胞は脂肪組織中で、内皮細胞、毛細管、神経繊維及び脂肪繊維芽細胞（ｆｉｂｒｏａｄｉｐｏｂｌａｓｔ）前駆体をも含む豊富な細胞外マトリックスと関連している。成熟脂肪細胞は、脂肪細胞前駆体の分化に由来する細胞の表現型を示す。前駆脂肪細胞は上記と同様に脂肪組織中に存在し、生存中どの段階においても増殖でき、新しい脂肪細胞を産生する：体重増加においては、臨界点に達するまで、第一段階として脂肪細胞の体積が増加し、その後新しい細胞が増殖する（Ｂｊｏｒｎｔｏｒｐ  Ｐ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｂｅｓｉｔｙ，（１９９１年）１５  ６７−８１）。増殖して脂肪細胞に分化するという前駆脂肪細胞の本質的な能力は、脂肪量増加の決定要因である。すなわち、繊維芽細胞と関連のあるこの細胞が過剰に形成されると、脂肪組織が増加する。
【００５８】
従って、成熟脂肪細胞をまずＰＢとＰＳとで処理する。次に、この脂肪細胞に対して条件付けた培地を前駆脂肪細胞と接触するように配置すると、この前駆脂肪細胞はその後脂肪細胞へ成熟する。コントロール細胞は処理開始時から分化し始め、体積が増加し、脂質小滴の数及び大きさが増加し、脂質生成酵素の活性が増加する等、幾らか変化する。
【００５９】
トリグリセリドの合成過程における鍵酵素はグリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ３ＰＤＨ）である：この酵素の比活性が成熟中に大幅に増加することから、これを使用して脂肪細胞の転換を正確かつ高い感度で測定できる（Ｐａｉｒａｕｌｔ  Ｊ．，Ｇｒｅｅｎ  Ｈ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，（１９７９年）７６，５１３８−４２；Ｋｏｅｋｅｍｏｅｒ  Ｔ．Ｃ．ら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．（１９９５年）２７，６２５−３２）。この酵素の活性の増加を追跡して、脂肪細胞の分化状態を測定した。
【００６０】
Ｇ３ＰＤＨは水溶性の酵素であるため、破砕細胞の上清中で適切な基質（ＮＡＤＨ、ＴＥＡ（トリエタノールアミン）−ＥＤＴＡ、５０ｍＭ、１ｍＭ）の存在下においてその活性を測定する。
【００６１】
比活性は上記測定から計算する。処理した細胞とコントロール細胞とを比較する。Ｇ３ＰＤＨは細胞の分化状態を反映しているので、その比活性が高くなるとより多くの細胞が分化していることになる。また、その逆もいえる：試験した物質によって脂肪貯蔵量が抑えられると、Ｇ３ＰＤＨ活性が低下するであろう。
【００６２】
標準偏差に対する３回の測定の平均から、比活性の平均値が得られる。その後、コントロールと比較して、上記物質によって産生したＧ３ＰＤＨの活性の阻害について、阻害率を計算する。
【００６３】
抗脂質生成剤として良好かどうかを裏付ける尺度は、一方では酵素の阻害率が５０％を超えるかどうかであり、他方では粗データがコントロールと著しく異なるかどうかである。
【００６４】
２．材料と方法
ａ）培養と処理
前駆脂肪細胞とも呼ばれる、実施例１のプロトコールにおいて７日目で得られたあまり成熟していない分化過程の脂肪細胞を、分化した成熟脂肪細胞に対して条件付けた培地で処理し、下記プロトコール中で示すように、ＰＢ又はＰＳで、及び、ＰＢとＰＳとの組み合わせで８日間（９日目と１１日目に培地を交換）の処理をする又は処理しない。
【００６５】
フィトスフィンゴシンは、最終濃度０．２５、０．５０及び１μｇ／ｍＬで試験した。
【００６６】
抽出物ｄｅ  Ｐｌｅｃｔｒａｎｔｈｕｓ  ｂａｒｂａｔｕｓ（ＰＢ）（バッチＮｏ．０Ｂ２、ＩＮＤＥＮＡ社）を、アデニル酸シクラーゼのエフェクターであると認められる分子であるフォルスコリン８０％で滴定する（Ｓｅａｍｏｎ  Ｋ．ら，Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．  ＵＳＡ，（１９８１年）７８  ３３６３−６７）。研究で使用したＰＢの濃度は２５μｇ／ｍＬであり、２０ｍｇ／ｍＬのエタノール溶液である母液から調製した。
【００６７】
ｂ）細胞抽出物の調製
細胞の断片をＰＢＳバッファーで２回洗浄し、細胞を２５ｍＭのＴＲＩＳ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．５、ＥＤＴＡを１ｍＭ含む、４℃）中でかき取って回収する。細胞をすりつぶし、１０，０００ｇで１０分間、４℃において遠心分離してホモジナイズする。
【００６８】
その後のプロトコールを下記に要約する。
０日目：３Ｔ３−Ｆ４４２Ａの播種。細胞密度＝２ｘ１０４個／３５ｍｍペトリ皿。
培地はＤＭＥＭ、５％ＦＣＳ／５％ＣＳ。
２日目：培地の交換。
４日目：培地の交換。
７日目：コンフルエンス。培地はＤＭＥＭ、ＦＣＳ１０％、インスリン（母液は５００μｇ／ｍＬ）１％。条件付けた培地による処理：ＰＢ：０．２５μｇ／ｍＬ：ＰＳ：０．５及び１μｇ／ｍＬ。
９日目−１１日目：培地の交換。同じ培地＋処理。
１４日目：処理、同じ培地。
１６日目：上清の回収及びＧ３ＰＤＨ測定。
【００６９】
ｃ）グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ３ＰＤＨ）活性の測定
Ｇ３ＰＤＨ活性の測定は、Ｋｏｚａｋ及びＪｅｎｓｅｎの方法で行う（Ｋｏｚａｋ及びＪｅｎｓｅｎ，１９７４年，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４９，７７７５−７７８１）。
【００７０】
Ｇ３ＰＤＨは次の反応を触媒する：
ジヒドロキシアセトンリン酸（ＤＨＡＰ）＋ＮＡＤＨ、Ｈ＋  →  グリセロール−３−リン酸＋ＮＡＤ＋
Ｇ３ＰＤＨ
【００７１】
時間当たりのＮＡＤＨの消費量を、分光光度計（ＫＯＮＴＲＯＮ社）を用いて３４０ｎｍにおいて測定する。こうして吸光度変化／分（ΔＡｂｓ／分）を計算することができ、この値は酵素反応の初期速度と一致する。結果は比活性（ＳＡ）、すなわち転換されたＮＡＤＨ（ｎｍｏｌｅ）／分／タンパク質（ｍｇ）で示す。全タンパク質濃度は、ＢＣＡ法（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ−ＰＩＥＲＣＥ社）によって評価する。
ＳＡ＝８１．２５ｘΔＡｂｓ／分ｘ（１／タンパク質（ｍｇ））
【００７２】
３．結果
グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ３ＰＤＨ）活性の測定
培地の処理について、８日後のＮＡＤ＋の量を下記表３中に示す。
【００７３】
【表３】
0004681230.tif 000005
【００７４】
上記表３の結果は図１中にも示す。
【００７５】
成熟脂肪細胞に対して条件付けた培地と接触させて８日後、ＰＢを含む培地について前駆脂肪細胞の成熟の減速（Ｇ３ＰＤＨ活性の阻害）が観察された。このことは、前駆脂肪細胞の増殖の阻害に相当し、成熟マーカー酵素のＧ３ＰＤＨ活性は７５％まで阻害される。
【００７６】
この抗脂質生成特性はフィトスフィンゴシンにより変化しない：Ｇ３ＰＤＨ活性はＰＳとＰＢとの組み合わせにより７４〜７９％阻害され、１μｇ／ｍＬのＰＳと２５μｇ／ｍＬのＰＢとの組み合わせによれば成熟過程の上記前駆脂肪細胞の脂質生成までが減速し、この減速はＰＢ単独よりもわずかに大きい。
【００７７】
ｂ）脂肪細胞の形態調査
同時に、脂肪細胞の形態を、ペトリ皿の中の細胞を逆位相顕微鏡（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｈａｓｅ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）（Ｏｌｙｍｐｕｓ社、ＢＨ２）で直接観察して調べた。縁が円形になって細胞質が脂質小滴で満たされた際に、形態分析により細胞は分化しているとみなす。逆に、形態が細長くなって脂質液胞の量が減少すると、この成熟が減速したことになる。
【００７８】
ＰＳとＰＢとの組み合わせの存在下において、細胞は、脂肪細胞が非常に著しく脱脂質化（ｄｅｌｉｐｉｄａｔｉｏｎ）するという特徴を示し、これは、前に測定したＧ３ＰＤＨ酵素の活性の低下と一致する。
【００７９】
図２、３及び４はそれぞれ下記のことを示す。
図２：７日目におけるコントロール培養の細胞。この培養では細胞はあまり分化しておらず、脂質液胞はそう多くない。ここから処理を開始する。
図３：２１日目におけるコントロール培養の細胞。細胞内に脂質液胞が詰まっている。
図４：２５μｇ／ｍＬのＰＢと１μｇ／ｍＬのＰＳとの組み合わせで処理して培養した細胞。
【００８０】
ｃ）結論
この研究により、成熟脂肪細胞をＰＢとＰＳとの組み合わせで処理すると、前駆脂肪細胞中のトリグリセリドの蓄積を全体的に減速できるような情報が得られることが分かった。脂質生成酵素Ｇ３ＰＤＨの活性が低下すると、細胞内の脂質小滴が著しく減少する。
【００８１】
レプチンの分泌を刺激できるフィトスフィンゴシンを添加しても、脂質を顕著に減少させるというＰＢの作用は阻害されなかった。
【００８２】
脂肪細胞近傍にレプチンを維持すると、レプチンは脂肪量の増加に抵抗するシグナル分子として作用できた。レプチンの逆制御信号を発し続けていて、含有するトリグリセリドが脂肪分解により一部消失している細胞を含む細胞集団が、皮下脂肪の脂肪貯蔵を減少させるのに寄与しているであろうと考えてよいかもしれない。
【実施例３】
【００８３】
ヒト培養脂肪細胞における、フィトスフィンゴシンの、及び、フィトスフィンゴシンとコレウス・フォルスコリ抽出物との組み合わせの、レプチン生産及び脂肪分解に対する活性の実証。
ＺＥＮ−ＢＩＯ社（アメリカ）から市販されている、４１歳女性の形成手術に由来するヒト脂肪細胞を成熟進行段階で使用した。この培養細胞の反応は播種して１６日後に起こる。この細胞は、いずれの処理をする間も、その分化を保証する特定の培地中で培養する。
【００８４】
−１６日目：播種。
０日目：コレウス（ＰＢ）及び／又はフィトスフィンゴシン（ＰＳ）抽出物による処理の開始。
６日目〜１８日目：様々なパラメーターの測定。
【００８５】
まず、３Ｔ３−Ｆ４４２Ａマウス脂肪細胞に対するコレウスの上記特性を、このヒト細胞について確認した：グリセリン及び非エステル化脂肪酸の放出の測定による脂肪分解活性の確認。
【００８６】
下記表４は、コントロール培養及びＰＢで処理した培養において放出されたグリセリンの値を示す。
【００８７】
【表４】
0004681230.tif 000006
【００８８】
コレウスが脂肪細胞の脂肪分解を非常に強く刺激することが非常にはっきりと分かる（１８日におけるグリセリンの放出がコントロールと比較して＋１２８％の増加である）。
【００８９】
また、放出された非エステル化脂肪酸の測定により、コレウスを２５μｇ／ｍＬ投与するとグリセリンと同時に大量の非エステル化脂肪酸が放出されることから、コレウスが脂肪細胞のトリグリセリドの加水分解を強く引き起こしていることも観察される。
【００９０】
別の試験により、マウス脂肪細胞におけるのと同様にヒト脂肪細胞においてフィトスフィンゴシンがレプチンの分泌の増加を誘導し、最も効果的な投与量はヒト脂肪細胞におけるものの方が少ないことが示される。
【００９１】
フィトスフィンゴシンは、レプチンの放出と同時に、投与量６ｎｇ／ｍＬにおいて、非エステル化脂肪酸の放出を伴わずにグリセリンの経時的な放出を引き起こす。この観察は、文献に既に記載されているレプチン特有の脂肪分解の新しい形態に相当するかもしれない。
【００９２】
図５及び６は、すぐ上に記載した条件下における細胞の形態の進展を示す。
【００９３】
図５は、１８日目におけるヒト脂肪細胞のコントロール培養を示す。多量の脂肪液胞がはっきりと見られる。
【００９４】
図６は、コレウス（２５μｇ／ｍＬ）とフィトスフィンゴシン（６ｎｇ／ｍＬ）との組み合わせで処理した後の、１８日目におけるヒト脂肪細胞の培養を示す。フィトスフィンゴシンとコレウスとの組み合わせにより、それ程多くない小さな脂質小滴が相当量目立って減少することがはっきりと分かる。同時に、あまり成熟していない細胞の（細長い形態で脂質液胞がないという）外観を呈する細胞がより多い。
【００９５】
従って、これら２種の活性成分の組み合わせによって脂肪の貯蔵が顕著に減少するため、ヒト脂肪細胞近傍のレプチンの調節はこの作用において重要な手段である。
【実施例４】
【００９６】
＜水／アルコール性スリミング製剤＞
水                                                ｑｓｐ．１００％
変性アルコール                                              ４２％
ＰＰＧ−３ミリスチルエーテル                                １０％
香料                                                          ０．２０％
フィトスフィンゴシン                                          ０．１０％
【実施例５】
【００９７】
＜液状スリミングエマルション＞
酢酸ＰＰＧ−２−イソセテス−２０                              ２％
ポロキサマー（Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ）４０７                      ０．５０％
酢酸ＰＧ−イソセテス−３                                    １５％
ペンタシクロメチコン                                        １５％
水                                                ｑｓｐ．１００％
ブチレングリコール                                            ３％
防腐剤                                                    ｑ．ｓ．
コレウス・フォルスコリ抽出物（フォルスコリン８０％）          ０．１％
キサンタンガム                                                ０．０５％
アクリル酸／アクリル酸アルキル（Ｃ１０−３０）クロスポリマー  ０．０４％
中和剤                                                    ｑ．ｓ．
ポリアクリルアミド／Ｃ１３−１４イソパラフィン／ラウレス−７  ０．５０％
香料                                                          ０．２０％
フィトスフィンゴシン                                          ０．０５％
【実施例６】
【００９８】
＜スリミングクリーム＞
ステアレス−２                                                ０．５０％
ステアレス−２１                                              １．７５％
セチルアルコール                                              ０．３０％
ステアリルアルコール                                          ０．３０％
ステアリン酸                                                  ０．５０％
ステアリン酸２−エチルヘキシル                                ４．００％
セテアリルイソノナノエート                                    ３．００％
スクアラン                                                    ４．００％
ＩＢＭＸ                                                      １．００％
ジメチコン                                                    ０．４０％
水                                                ｑｓｐ．１００．００％
グリセリン                                                    ２．００％
ブチレングリコール                                            ３．００％
防腐剤                                                    ｑ．ｓ．
アクリル酸／アクリル酸アルキル（Ｃ１０−３０）クロスポリマー  ０．３５％
キサンタンガム                                                ０．１０％
ヒアルロン酸ナトリウム                                        ０．０２％
中和剤                                                    ｑ．ｓ．
ポリアクリルアミド／Ｃ１３−１４イソパラフィン／ラウレス−７  ０．５０％
変性アルコール                                                ５．００％
香料                                                          ０．２０％
フィトスフィンゴシン                                          ０．００２％
【図面の簡単な説明】
【００９９】
【図１】実施例２中で実施した様々な処理が脂質生成に及ぼす効果。
【図２】実施例２の処理の異なる段階におけるマウス脂肪細胞の形態。
【図３】実施例２の処理の異なる段階におけるマウス脂肪細胞の形態。
【図４】実施例２の処理の異なる段階におけるマウス脂肪細胞の形態。
【図５】（実施例３の）コントロール溶液について、１８日目におけるヒト脂肪細胞の形態。
【図６】本発明の（実施例３の）組み合わせによる処理について、１８日目におけるヒト脂肪細胞の形態。
【図１】
0004681230.tif 000007
【図２】
0004681230.tif 000008
【図３】
0004681230.tif 000009
【図４】
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【図５】
0004681230.tif 000011
【図６】
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