【手続補正書】
【提出日】平成15年6月20日(2003.6.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００３】
ところで、ヒト細胞においては、遺伝子の発現により生成したポリペプチドは細胞内酵素によるプロセッシングを受け、ポリペプチドの一部が切断されたり、糖鎖が付加したりすると言われている。医薬品に配合するポリペプチドとしては、ヒト細胞におけると同様のプロセッシングを受けたものが望ましいところ、特開平９−２８９８９６号公報（特願平８−２６９１０５号明細書）に記載されているように、ヒト細胞株は一般に当該ポリペプチドの産生量が少ないという問題がある。したがって、現時点で当該ポリペプチドを大量に入手しようとすると、組換えＤＮＡ技術を適用せざるを得ない。組換えＤＮＡ技術を適用しつつ、ポリペプチドにヒト細胞におけると同様なプロセッシングを受けさせるには、宿主に哺乳類由来の細胞を用いることとなる。


【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
宿主細胞としては、例えば、３Ｔ３細胞、Ｃ１２７細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＶ−１細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＭＯＰ細胞及びそれらの変異株を始めとする、斯界において宿主として慣用されるヒト、サル、マウス及びハムスター由来の上皮系細胞、間質系細胞及び造血系細胞であっても、当該ポリペプチドを本来的に産生するヒトのリンパ芽球、リンパ球、単芽球、単球、骨髄芽球、骨髄球、顆粒球、マクロファージなどの造血系細胞や、例えば、肺癌、大腸癌、結腸癌などの固形腫瘍由来の上皮系細胞や間質系細胞であってもよい。後者の造血系細胞の具体例としては、例えば、ジュン・ミノワダ『キャンサー・レビュー（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｖｉｅｗ）』、第１０巻、１乃至１８頁（１９８８年）などに記載されている骨髄性白血病、前骨髄性白血病、単球性白血病、成人Ｔ細胞白血病及びヘアリー細胞白血病を含む白血病又はリンパ腫由来のＨＢＬ−３８細胞、ＨＬ−６０細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２４０）、Ｋ−５６２細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２４３）、ＫＧ−１細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２４６）、Ｍｏ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ８０６６）、ＴＨＰ−１細胞（ＡＴＣＣ  ＴＩＢ２０２）、Ｕ−９３７細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５９３）などの白血病細胞株及びそれらの変異株が挙げられる。これらの白血病細胞及び変異株は当該ポリペプチドをプロセッシングする性質が顕著なので、宿主細胞として用いると、生理活性の高いポリペプチドが容易に得られる特徴がある。


【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
前述のとおり、この発明の方法により得られるポリペプチドは、有用な生理活性蛋白質であるＩＦＮ−γの産生を誘導する性質と、キラー細胞の細胞障害性を増強したり、キラー細胞の生成を誘導する性質を兼備するので、ＩＦＮ−γ及び／又はキラー細胞に感受性を有する各種疾患の治療・予防に著効を発揮する。さらに、この発明の方法により得られるポリペプチドは強力なＩＦＮ−γ誘導能を有することから、一般に少量で所期のＩＦＮ−γを産生でき、また、毒性が極めて低いことから、多量投与しても重篤な副作用を惹起することがない。したがって、この発明の方法により得られるポリペプチドは、使用に際して用量を厳密に管理しなくても、所望のＩＦＮ−γ産生を迅速に誘導できる利点がある。なお、当該ポリペプチドの感受性疾患剤としての用途は、同じ特許出願人による特開平９−１５７１８０号公報（特願平８−２８７２２号明細書）に詳述されている。


【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４８】
次に、常法にしたがって、サイトメガロウイルスプロモーターを含んでなるインビトロジェン製プラスミドベクターｐＲｃ／ＣＭＶを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＮｏｔＩで切断し、得られた約５，５００塩基対のベクター断片に上記で得られた約５，９００塩基対のＤＮＡ断片と約５，６００塩基対のＤＮＡ断片をそれぞれ加え、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを作用させて２種類のＤＮＡ断片をプラスミドベクターｐＲｃ／ＣＭＶに挿入した。得られた組換えＤＮＡを用い、実施例１−１と同様にして大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した後、コロニーハイブリダイゼーション法によりプラスミドベクターｐＲＣ／ＣＭＶが導入された形質転換体のコロニーを選別した。この組換えＤＮＡは『ｐＢＧＨｕＧＦ』と命名され、この組換えＤＮＡにおいては、図１に示すように、当該ポリペプチドをコードする染色体ＤＮＡである配列表における配列番号１３に示す塩基配列のＤＮＡが制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩによる切断部位の下流に連結されていた。


【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５３】
【実施例４−１】
〈形質転換体によるポリペプチドの製造〉
実施例３の方法により得られた形質転換体ＢＧＨｕＧＦを４００μｇ／ｍｌ  Ｇ−４１８を含み、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を補足したＨａｍ’ｓ  Ｆ１２培地（ｐＨ７．２）に接種し、５％  ＣＯ２  雰囲気下、３７℃で１週間培養して増殖させた。増殖細胞を採取し、ＰＢＳで洗浄した後、マシュー・ジェー・コスラら『プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・ユー・エス・エー（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｔｈｅ  ＵＳＡ）』、第８６巻、５，２２７乃至５，２３１頁（１９８９年）に記載された方法に準じて１０ｍＭ塩化カリウム、０．１ｍＭエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩を含む１０倍容の氷冷２０ｍＭヘペス緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄し、３倍容の新鮮な同一緩衝液中、氷冷下で２０分間静置し、−８０℃で凍結した後、解凍して細胞を破砕し、破砕物を遠心分離し、上清を採取した。


【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５６】
【参考例】
〈大腸菌での発現〉
同じ特許出願人による特開平８−１９３０９８号公報に開示され、宿主としての大腸菌に配列表の配列番号２に示す塩基配列を含むｃＤＮＡを導入してなる形質転換体ｐＫＨｕＧＦをアンピシリンを５０μｇ／ｍｌ含むＴ−ブロス培地（ｐＨ７．２）に接種し、３７℃で１８時間通気攪拌培養した。遠心分離により培養物から菌体を採取し、１３９ｍＭ塩化ナトリウム／７ｍＭ燐酸水素ナトリウム／３ｍＭ燐酸水素二ナトリウム混液（ｐＨ７．２）に浮遊させ、常法にしたがって超音波を印加して菌体を破砕した。破砕物を遠心分離し、上清を実施例４−１の方法に準じて精製したところ、精製ポリペプチドの固状物が培養物１ｌ当り５ｍｇの収率で得られた。


【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６４】
【実施例４−２（ｂ）】
〈分子量〉
実施例４−１の方法により得たポリペプチドをユー・ケー・レムリが『ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）』、第２２７巻、６８０乃至６８５頁（１９７０年）に報告している方法に準じて、還元剤としての２％（ｗ／ｖ）ジチオトレイトール存在下でＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動したところ、分子量約１８，０００乃至１９，５００ダルトンに相当する位置にＩＦＮ−γ誘導能ある蛋白質の主バンドが観察された。なお、このときの分子量マーカーは、ウシ血清アルブミン（６７，０００ダルトン）、オボアルブミン（４５，０００ダルトン）、カーボニックアンヒドロラーゼ（３０，０００ダルトン）、大豆トリプシンインヒビター（２０，１００ダルトン）及びα−ラクトアルブミン（１４，０００ダルトン）であった。