(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
フラボノイドアグリコンとビタミンＣとを含有する抗酸化素材の製造方法であって、
前記フラボノイドアグリコンはエリオディクティオール及びジオスメチンであり、レモン搾汁残渣由来のエリオシトリン及びジオスミンを含有するレモンフラボノイド配糖体を含む原料をペニシリウム・マルチカラー由来のβ−グリコシダーゼによりアグリコン化処理することによってエリオディクティオール及びジオスメチンを製造することを特徴とする抗酸化素材の製造方法。
【請求項２】
前記アグリコン化処理時のｐＨは２．５〜３．５であることを特徴とする請求項１に記載の抗酸化素材の製造方法。
【請求項３】
前記アグリコン化処理後にフラボノイドアグリコンとビタミンＣとを混合する工程を経て製造することを特徴とする請求項１又は２に記載の抗酸化素材の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗酸化素材の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、レモン発酵物は、アスペルギルス・サイトイ（Aspergillus saitoi）を用いて、レモンの果皮、じょうのう膜及びさのうから選ばれる少なくとも１種の発酵原料を微生物発酵処理することによって得られることが知られている（特許文献１参照）。このレモン発酵物は、前記発酵原料中のヘスペリジンの微生物変換により８−ヒドロキシヘスペレチンを生成する反応を経て製造される。このレモン発酵物は、高い抗酸化作用を発揮するとともに、レモンの利用の拡大及び有効利用を容易に図ることができる。また、特許文献２には、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）又はアスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）を用いて、レモン果実又はその一部からなる発酵原料を微生物発酵処理することによって得られるレモン発酵物が開示されている。
【特許文献１】特開２００２−３５５００４号公報
【特許文献２】特開２００３−１０２４２９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
この発明は、本発明者らの鋭意研究により、前記従来のレモン発酵物によって期待される効果よりも高い抗酸化効果を発揮する抗酸化素材が開発されたことによりなされたものである。本発明の目的は、高い抗酸化作用を発揮することが容易な抗酸化素材の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
前記の目的を達成するため、本発明では、フラボノイドアグリコンとビタミンＣとを含有する抗酸化素材の製造方法が提供される。前記フラボノイドアグリコンは、エリオディクティオール及びジオスメチンであり、レモン搾汁残渣由来のエリオシトリン及びジオスミンを含有するレモンフラボノイド配糖体をペニシリウム・マルチカラー由来のβ−グリコシダーゼによりアグリコン化処理することによってエリオディクティオール及びジオスメチンを製造することを特徴とする。
【０００５】
前記アグリコン化処理時のｐＨは２．５〜３．５であることが好ましい。
また、抗酸化素材は、前記アグリコン化処理後にフラボノイドアグリコンとビタミンＣとを混合する工程を経て製造することが好ましい。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】本発明の実施例１のエリオシトリン等の濃度変化を示すグラフ。
【図２】実施例１のエリオシトリン等の濃度変化を示すグラフ。
【図３】実施例１のジオスミン等の濃度変化を示すグラフ。
【図４】実施例１のジオスミン等の濃度変化を示すグラフ。
【図５】実施例１のエリオシトリン等の濃度変化を示すグラフ。
【図６】実施例１のジオスミン等の濃度変化を示すグラフ。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
以下、本発明を具体化した実施形態を詳細に説明する。
実施形態の抗酸化素材は、柑橘類、例えばレモン由来のフラボノイドアグリコン（以下、アグリコンと記載する）と、ビタミンＣ（アスコルビン酸）とを有効成分として含有する。この抗酸化素材は、アグリコンとビタミンＣとの相乗効果により、有用な作用、例えば極めて高い抗酸化作用および劣化防止作用を発揮する。前記アグリコンは、前記柑橘類由来のフラボノイド配糖体を含む原料をアグリコン化処理することによって得られる。
【０００８】
この抗酸化素材は、前記アグリコン化処理によって得られたアグリコンと、ビタミンＣとを混合する混合工程を経て製造されることが好ましい。しかしながら、レモン果実のように前記原料中のビタミンＣの含有量が高く、且つ前記アグリコン化処理によるビタミンＣの減少が抑えられる場合には、前記混合工程を行う必要性は低い。即ち、この抗酸化素材中には、少なくとも公知の検出装置にて検出可能な量のビタミンＣが含有されている必要があり、前記混合工程にて混合されたビタミンＣが含有されていることが好ましい。この抗酸化素材の製造方法において、前記フラボノイド配糖体をアグリコン化処理する工程および前記混合工程以外の加工工程（例えば希釈工程、濃縮工程、抽出工程、精製工程、及び乾燥工程）が行われてもよい。
【０００９】
この抗酸化素材は、高い抗酸化作用を発揮する前記有効成分を含有することから、例えば活性酸素による生体構成成分の酸化変性を抑えて高い健康増進効果を発揮することができ、例えば飲食品（健康食品）、医薬品、医薬部外品、及び化粧品に含有されて利用される。また、抗酸化素材は、製品の様々な劣化、例えば油脂の酸化劣化、香料の劣化、色素の分解、及び色素の退色を効果的に抑えることができる。この抗酸化素材は、前記有効成分が高い抗酸化作用を有していることから、健康食品等の飲食品に含有されて利用されることが特に好ましい。前記飲食品は、スポーツドリンク、茶類飲料、茶葉、ハーブ、牛乳およびヨーグルト等の乳製品、ペクチンおよびカラギーナン等のゲル化剤含有食品、乳糖およびデキストリン等の賦形剤、香料、甘味料、油脂等の飲料品または食料品が挙げられる。また、飲食品は、様々な形状、例えば錠剤、散剤、顆粒剤、又はカプセル剤として加工されて利用されることもできるし、シロップ又はキャンディーとして利用されることもできる。
【００１０】
前記アグリコンは、エリオディクティオール（eriodictyol）及びジオスメチン（diosmetin）が用いられる。これらのアグリコンは、前記柑橘類の葉、果実又はその果実の構成成分を含有する原料に含まれるフラボノイド配糖体をアグリコン化処理することにより得られる。前記フラボノイド配糖体は、アグリコンと糖とがグリコシド結合で結合した構造を有する。即ち、前記アグリコンは、前記フラボノイド配糖体のグリコシド結合を切断する酵素反応（グリコシダーゼ反応）により生成（遊離）される。このとき、前記酵素反応の副産物である糖も同時に生成（遊離）される。
【００１１】
前記原料は、前記柑橘類の葉、果実、又はその果実の構成成分の一部を含有するものが用いられ、好ましくは前記柑橘類の果汁以外の成分からフラボノイド配糖体を抽出した抽出物が用いられる。また、前記原料は、前記柑橘類の果汁が用いられてもよいし、前記抽出物からフラボノイド配糖体を精製（単離）したものが用いられてもよい。前記抽出物を得るときに用いる溶媒は、好ましくは親水性溶媒、例えば水、アルコール（メタノール又はエタノール）、及び含水アルコールが用いられ、安価であることからより好ましくはメタノール、その水溶液又は水が用いられ、さらに好ましくは水が用いられる。柑橘類の果実は、主に果汁、果皮（アルベド、フラベド）、じょうのう膜及びさのうからなる。柑橘類の葉および果実における前記アグリコンの含有量は０．０１重量％未満であることから、柑橘類の葉および果実には前記アグリコンがほとんど含有されない。さらに、原料の製造に要する手間を省くとともに前記柑橘類の果実の有効利用を容易に図ることができることから、前記原料として前記柑橘類の果実から果汁を搾汁した後の搾汁残渣又はその抽出物が使用されることが最も好ましい。前記搾汁残渣には、果皮（アルベド及びフラベド）と、じょうのう膜と、さのうの一部と、搾汁しきれなかった極少量の果汁とが含まれており、前記フラボノイド配糖体が特に多量に含有されている。
【００１２】
前記フラボノイド配糖体は、前記アグリコンと、単糖類又は二糖類とがグリコシド結合で結合した構造を有している。このフラボノイド配糖体は、例えばエリオディクティオール（eriodictyol）とルチノース（Ｌ−ラムノシル−Ｄ−グルコース）との配糖体であるエリオシトリン（eriocitrin）、ジオスメチン（diosmetin）とルチノースとの配糖体であるジオスミン（diosmin）が挙げられる。これらのフラボノイド配糖体は高い抗酸化作用を有している。一方、前記アグリコンは、エリオディクティオール及びジオスメチンが挙げられる。これらのアグリコンの抗酸化作用及び体内吸収性は、前記フラボノイド配糖体の抗酸化作用及び体内吸収性に比べて大幅に向上している。
【００１３】
ビタミンＣを多量に含む原料がアグリコン化処理される場合には、ビタミンＣは、アグリコン化処理によってほとんど減少することなく抗酸化素材中に残存する。このため、ビタミンＣを含有している果実、フラボノイド配糖体の粗精製物、又は果汁を用いてアグリコン化処理が行われる場合には、得られたアグリコンは、別途用意されたビタミンＣが混合される混合工程が行われることなくビタミンＣとの相乗効果を発揮することができる。このような場合、柑橘類の果実が直接アグリコン化処理されたり、フラボノイド配糖体の粗精製物がアグリコン化処理されたり、果実又はフラボノイド配糖体の粗精製物に果汁が添加された原料がアグリコン化処理されたりすることが好ましい。逆に、純度が高いアグリコンが必要な場合には、高度に精製されて純度が高いフラボノイド配糖体がアグリコン化処理されることが好ましい。
【００１４】
前記アグリコン化処理は、グリコシダーゼ処理が挙げられる。
前記グリコシダーゼ処理は、前記原料にβ−グリコシダーゼを作用させ、該原料中に含まれるフラボノイド配糖体のグリコシド結合を切断する酵素反応を行う処理である。このとき、前記原料中のフラボノイド配糖体から、アグリコンと、前記酵素反応の副産物である糖とが生成される。このグリコシダーゼ処理は、該処理の効率を高めるために、果汁以外の柑橘類の果実の構成成分の抽出物（抽出液）、又は柑橘類の果汁にβ−グリコシダーゼを添加して前記酵素反応を行ことが好ましい。或いは、グリコシダーゼ処理として、酵素活性を有するβ−グリコシダーゼが固定化された担体と、前記果汁又は抽出物とを接触させることにより前記酵素反応が行われてもよい。前記柑橘類の果汁は、その濃縮液又は希釈液が用いられてもよい。
【００１５】
前記β−グリコシダーゼは、ペニシリウム・マルチカラー（Penicillium multicolor）が産生するβ−グリコシダーゼ（以下、第２のグリコシダーゼと称される）が用いられる。
【００１６】
第２のグリコシダーゼは、配糖体加水分解酵素であって、前記フラボノイド配糖体を構成するアグリコンとＤ−グルコースとの間のβ−１，６結合を切断する酵素活性を有している。さらに、第２のグリコシダーゼは、エリオシトリンからエリオディクティオール−７−グルコシドを生成した後にエリオディクティオールを生成させるとともに、ジオスミンからジオスメチン−７−グルコシドを生成した後にジオスメチンを生成させる酵素活性も有している。即ち、第２のグリコシダーゼは、Ｌ−ラムノースとＤ−グルコースとの間のβ−１，６結合を切断するルチノース分解酵素の特性も有している。また、第２のグリコシダーゼは、例えば、基質としての配糖体であるｐ−ニトロフェニル−β−プリメベロシド（para-Nitorophenyl-β-primeveroside；ｐＮＰＰ）と反応したときにｐＮＰを遊離させる酵素活性を有している。
【００１７】
第２のグリコシダーゼは、ペニシリウム・マルチカラーの培養上清又は菌体破壊物を出発原料とし、前記基質であるｐＮＰＰが分解されたときのｐＮＰの発色をマーカーにしながら精製されたものが使用可能である。或いは、ペニシリウム・マルチカラーの培養上清、又は該微生物の菌体を破壊した後に不溶解物を取り除いた菌体破壊物がそのまま用いられることが最も簡便である。前記菌体は前記基質又は前記フラボノイド配糖体の含有量が高い培地中で増殖されたものが好ましく、該培地は糖質を含有していないものが好ましい。
【００１８】
第２のグリコシダーゼを用いたグリコシダーゼ処理において、処理温度は、前記第２のグリコシダーゼ活性が容易に高められることから、好ましくは１０〜７０℃、より好ましくは４０〜６０℃であり、該酵素の温度安定性も考慮すると、最も効率良く、且つ安定的な処理効果が得られる５０℃程度の温度が最も好ましい。処理時間は、好ましくは０．２〜２４時間、より好ましくは０．５〜２時間である。また、グリコシダーゼ処理時のｐＨは、前記第２のグリコシダーゼ活性が容易に高められることから、好ましくは２〜９、より好ましくは４〜８、さらに好ましくは６〜８であるが、例えば前記柑橘類の果汁、及び搾汁残渣の溶液が示すｐＨ域（ｐＨ２．５〜３．５程度）でもよい。
【００１９】
第２のグリコシダーゼが原料中に添加された場合には、グリコシダーゼ処理終了後に該グリコシダーゼを失活させるか、或いは取り除くことが好ましい。一方、上記アグリコン化処理の前に、予め吸着剤を用いてフラボノイド配糖体を精製（濃縮）することにより、アグリコンの含有量が高められた抗酸化素材を得ることが容易となる。前記吸着剤は、好ましくは合成吸着剤、例えばオルガノ（株）社製アンバーライトＸＡＤが用いられる。また、前記アグリコン化処理の後に前記吸着剤を用いてアグリコンを精製（濃縮）することにより、アグリコンの含有量が高められた抗酸化素材を得ることが容易となる。前記吸着剤を利用した精製は、酵素処理が不十分であることに起因して抗酸化素材中に存在するフラボノイド配糖体を回収するために行われてもよい。さらに、前記吸着剤を利用した精製は、前記原料中の夾雑物を効果的に除去することができるという効果も奏する。
【００２０】
実施形態の飲食品である第１の飲食品（健康食品）は、上記抗酸化素材を含有するものであり、該抗酸化素材の有効成分、即ちアグリコン及びビタミンＣが発揮する高い抗酸化作用によって、例えば活性酸素による生体構成成分の酸化変性を抑えて高い健康増進効果を発揮する。第１の飲食品は、１日数回（２〜３回又はそれ以上）に分けて経口摂取されることが好ましく、酸化ストレスに晒されやすい状態、例えば激しい運動の前後、ストレスに晒された時、及び喫煙の前後に摂取されることが特に好ましい。
【００２１】
第１の飲食品が摂取される場合には、アグリコンは、成人１日当たり好ましくは０．１〜１０ｇ、より好ましくは０．５〜２ｇ摂取される。第１の飲食品において、アグリコンの１日当たりの摂取量が０．１ｇ未満の場合には、前記有効成分による抗酸化作用を効果的に高めることができないおそれがあり、逆に１０ｇを越える場合には不経済である。小人の場合には、アグリコンの摂取量は主に体重に依存して調整されるが、前記成人の半量が目安となる。同様に、第１の飲食品が摂取される場合には、ビタミンＣは、成人１日当たり好ましくは０．１〜１０ｇ、より好ましくは０．１〜２ｇ摂取される。第１の飲食品において、ビタミンＣの１日当たりの摂取量が０．１ｇ未満の場合には、前記有効成分による抗酸化作用を効果的に高めることができないおそれがあり、逆に１０ｇを越える場合には不経済である。また、第１の飲食品中に含まれるビタミンＣの濃度は、好ましくは１０ｐｐｍ以上、より好ましくは１００ｐｐｍ〜０．５重量％、さらに好ましくは１０００ｐｐｍ〜０．３重量％である。前記濃度が１０ｐｐｍ未満の場合には前記アグリコンとの相乗効果が十分に発揮されず、逆に０．５重量％を越える場合には不経済である。
【００２２】
実施形態の劣化防止剤は、上記抗酸化素材を含有するものであり、該抗酸化素材の有効成分、即ちアグリコン及びビタミンＣが発揮する高い劣化防止効果によって、製品の様々な劣化、例えば油脂の酸化劣化、香料の劣化、色素の分解、及び色素の退色を効果的に抑える。この劣化防止剤は、植物油、魚油等の熱劣化および酸化劣化を抑制するための油脂の酸化劣化防止剤、香料の熱劣化および酸化劣化を抑制するための香料の劣化防止剤、又は天然色素の熱劣化および光劣化を抑制するための色素の退色防止剤として利用される。
【００２３】
実施形態の飲食品である第２の飲食品は、前記劣化防止剤を含有するものであり、前記有効成分により保存性が高められている。また、第２の飲食品は、例えばアグリコンを含有する飲食品、又はその素材にビタミンＣが添加されることにより製造されてもよく、逆に例えばビタミンＣを含有する飲食品、又はその素材にアグリコンが添加されることにより製造されてもよい。第２の飲食品は、油脂製品、フレーバー製品、及び色素添加製品が挙げられる。第２の飲食品中に含まれるアグリコンの含有量は、好ましくは１０ｐｐｍ以上、より好ましくは１００ｐｐｍ〜０．５重量％、さらに好ましくは１０００ｐｐｍ〜０．３重量％である。前記含有量が１０ｐｐｍ未満の場合には劣化抑制効果が十分に発揮されないおそれがあり、逆に０．５重量％を超える場合には不経済であるうえ、飲食品の呈味および風味が大きく変化するおそれもある。一方、第２の飲食品中に含まれるビタミンＣの濃度は前記第１の飲食品の場合と同様である。
【００２４】
上記実施形態によって発揮される効果について、以下に記載する。
実施形態の抗酸化素材は、柑橘類由来のアグリコンとビタミンＣとを有効成分として含有する。このため、この抗酸化素材は、前記有効成分が発揮する高い抗酸化作用により、多岐に渡る用途、例えば健康食品、医薬品、医薬部外品、化粧品、抗酸化剤、及び活性酸素消去剤に利用されることができる。このとき、前記アグリコンは、体内吸収性、特に経口摂取されたときの吸収性に優れているとともに高い抗酸化作用を発揮することから、容易に高い健康増進効果を発揮する。この抗酸化素材が医薬品、医薬部外品又は化粧品に含有されて用いられる場合には、１日当たりのアグリコン及びビタミンＣの摂取量、投与量又は使用量は、好ましくは前記飲食品の場合の摂取量と同様である。また、この抗酸化素材は、油脂の酸化劣化、香料におけるフレーバーの劣化、及び色素の分解または退色を効果的に抑えることもできる。このため、この抗酸化素材は、油脂、香料又は色素を含有する飲食品中に添加されて該飲食品の保存性を容易に高めることができる。さらに、この抗酸化素材は、それ単独で熱劣化及び光劣化の両方を抑える作用があることから極めて有用かつ経済的である。
【００２５】
特に、抗酸化素材および飲食品に、柑橘類の果汁中に含まれるビタミンＣ濃度よりも高い濃度である５００ｐｐｍ以上、より好ましくは１０００ｐｐｍ以上のビタミンＣが含有される場合には、抗酸化作用を相乗的に高めることが容易となる。前記ビタミンＣは通常フラボノイド配糖体を含む原料中にも含有されているが、アグリコン精製過程で取り除かれてしまうことから、精製されたアグリコンと混合されることにより著しく高い抗酸化作用を発揮することができる。
【００２６】
アグリコンは、柑橘類由来のフラボノイド配糖体をアグリコン化処理（グリコシダーゼ処理）することにより、容易かつ適切に生成される。さらに、前記グリコシダーゼ処理においてペニシリウム・マルチカラー由来の第２のグリコシダーゼが用いられることにより、フラボノイド配糖体から極めて効率よくアグリコンが生成され得る。即ち、前記第２のグリコシダーゼは、レモンにおける含有量が高い特定のフラボノイド配糖体（エリオシトリン、ジオスミン）に対する基質特異性及び酵素反応性が市販（公知）の酵素と比べて著しく高く、極めて効率よくアグリコンを生成させることができる。このため、前記第２のグリコシダーゼが用いられることにより、前記フラボノイド配糖体からアグリコンへの変換率が容易に高められることから、該アグリコンの大量生産を容易に行うことができるうえ、製造コストを容易に低減させることができる。
【００２７】
フラボノイド配糖体を含む原料として、柑橘類の果実から果汁を搾汁した後の搾汁残渣、又は該搾汁残渣よりフラボノイド配糖体を抽出した抽出物を用いることにより、これらの柑橘類の果汁を用いる場合と比較して、極めて容易に大量のフラボノイド配糖体を得ることができる。さらに、前記搾汁残渣は、例えば前記柑橘類の果汁を含む飲料品を製造する際に大量に廃棄されるものであることから、極めて安価に入手され得るうえ、食品リサイクル法の観点からもより好ましい。
【００２８】
第２の飲食品は、抗酸化素材の有効成分が発揮する高い劣化抑制効果により、保存性に著しく優れている。このため、この飲食品では、品質の低下を著しく効果的に抑制できることから、より一層長い期間に渡っての保存が可能となるうえ、大幅に延長された新たな品質保持期間の設定を行うことも可能である。このことは、品質保持期間を超過したものを廃棄処分する量が著しく容易に削減されることから、コスト削減に大いに貢献する。また、飲食品製造後の品質保持を例えば低温での温度制御に頼る必要性も少ない。一方、この飲食品は、前記有効成分が天然物由来であるうえ体内吸収性に著しく優れていることから、食品添加物として利用され易い。
【実施例１】
【００２９】
（試料の調製１：グリコシダーゼ処理によるアグリコンの作製）
レモンの搾汁残渣を１０倍量（重量）のメタノールに２４時間浸漬することにより、レモンフラボノイド配糖体の抽出物を得た。得られた抽出物をエバポレーターにて減圧濃縮した後、アンバーライト樹脂（XAD16：オルガノ社製）に吸着させてペクチン、糖質等をできるだけ除去し、更に４０％含水メタノールで溶出させた溶出液を濃縮および凍結乾燥することにより、レモンフラボノイド配糖体混合粉末（比較例１のレモン配糖体）を得た。この粉末中には、エリオシトリンが約３０％、ジオスミンが約２〜５％含まれている。この比較例１のレモン配糖体を水に溶解し、下記分取用ＨＰＬＣシステム１を用いて下記ＨＰＬＣ条件１にてエリオシトリンを精製した後、精製したエリオシトリンを濃縮および凍結乾燥することにより、エリオシトリン粉末（比較例２のエリオシトリン）を得た。
＜分取用ＨＰＬＣシステム１＞
ポンプ：Shimadzu LC-8A、システムコントローラ：Shimadzu SCL-8A、オートインジェクタ：Shimadzu SIL-8A、検出器：Shimadzu SPD-8A,UV spectrophotometric detector、フラクションコレクタ：Shimadzu FCV-100B
＜ＨＰＬＣ条件１＞
カラム：YMC-Pack ODS-A（50i.d.×250mm）、溶出液：メタノール／水＝５０／５０（v/v）、流速：１００ｍｌ／ｍｉｎ、検出波長：２７０ｎｍ
（エリオシトリン及びジオスミンのグリコシダーゼ処理）
比較例２のエリオシトリン、又は和光純薬工業社製のジオスミンを、終濃度が５ｍＭとなるように２０ｍＭ酢酸ナトリウム−塩酸バッファーに溶解した。更に、このバッファーを添加することによってｐＨを３．０に調整した配糖体溶液と、ｐＨを５．０に調整した配糖体溶液とを作製した。前記ジオスミンは水に溶解し難いことから、予めジオスミンをジメチルスルホキシドに溶解させてから配糖体溶液を作製した。これらの配糖体溶液に１００ｐｐｍ又は１０ｐｐｍのβ−グリコシダーゼ（第２のグリコシダーゼ）を添加し、この反応液を約３０℃でスターラーにて攪拌しながらグリコシダーゼ処理を行った。前記β−グリコシダーゼは、本発明者らがペニシリウム・マルチカラー ＩＡＭ ７１５３の菌株からｐＮＰの発色をマーカーとして精製したβ−プリメベロシド分解酵素活性を有する酵素であり、１７３ｕｎｉｔ／ｇのβ−グリコシダーゼ活性を有する。１ｕｎｉｔは、３０℃及び１分間に１μｍｏｌのｐＮＰＰを加水分解してｐＮＰを遊離させる酵素量である。前記第２のグリコシダーゼを添加してから０、０．５、１、２、４、５及び８時間後に反応液を数ｍｌずつサンプリングし、９５℃で１０分間加熱して酵素を失活させたサンプルを急冷して冷凍保存した。得られたサンプルを下記分析用ＨＰＬＣシステム２を用いてＨＰＬＣ条件２にて分析し、グリコシダーゼ処理による各物質の濃度変化を確認した。結果を図１〜４に示す。
＜分析用ＨＰＬＣシステム２＞
ポンプ：S himadzu LC-10AD、システムコントローラ：Shimadzu SCL-10A、オートインジェクタ：Shimadzu SIL-10A、検出器：Shimadzu SPD-10A,UV spectrophotometric detector、カラムオーブン：Shimadzu CTO-10A
＜ＨＰＬＣ条件２＞
カラム：YMC-Pack ODS-A （4.6i.d.×250mm）、溶出液：メタノール／水＝４０／６０（v/v）、流速：１ｍｌ／ｍｉｎ、検出波長：２７０ｎｍ
図１〜４より、エリオシトリン（図１，２）及びジオスミン（図３，４）ともに、第２のグリコシダーゼ添加直後から急速に濃度の減少が見られ、それぞれのアグリコンであるエリオディクティオール及びジオスメチンの生成が確認された。エリオシトリンのエリオディクティオールへの変換率は約５０〜６０％であり、ジオスミンのジオスメチンへの変換率は８０％程度であり、高い変換率が得られた。この結果から、本酵素により極めてロスが少なく、且つ効率がよいアグリコン化が図られることが示された。また、第２のグリコシダーゼの至適ｐＨ域であるｐＨ５．０に調整された溶液中でも、ｐＨ３．０に調整された溶液中でもほぼ同じ効率でアグリコン化が進むことも確認された。例えばレモン、ライム及びスダチの果汁と、フラボノイド配糖体の抽出液とのｐＨは３付近であることから、本酵素の酵素活性がレモン、ライム及びスダチの果汁、又はこれらから得られたフラボノイド配糖体の溶液中でもほとんど損なわれず、これらの溶液中でも本酵素が利用可能であることが確認された。また、第２のグリコシダーゼを１０ｐｐｍ添加した場合でも、時間をかければ十分にアグリコン化が進むことも明らかとなった。そして、処理時間も考慮し、以下の処理では基質１ｍＭあたり１０ｐｐｍのβ−グリコシダーゼを添加することを目安として検討を実施した。
（レモンフラボノイドのアグリコン化及びその精製）
比較例１のレモン配糖体を、エリオシトリンの終濃度が１ｍＭとなるように２０ｍＭ酢酸ナトリウム−塩酸バッファーに溶解した。更に、このバッファーを添加することによってｐＨを３．０に調整した配糖体溶液と、ｐＨを５．０に調整した配糖体溶液とを作製した。これらの配糖体溶液に前記第２のグリコシダーゼを１０ｐｐｍ加え、この反応液を約３０℃でスターラーにて攪拌しながらグリコシダーゼ処理を実施した。前記第２のグリコシダーゼを添加してから０、０．５、１、２、４、５及び８時間後に反応液を数ｍｌずつサンプリングし、９５℃で１０分間加熱して酵素を失活させたサンプルを急冷して冷凍保存した。得られたサンプルを上記ＨＰＬＣ条件１にて分析し、グリコシダーゼ処理による各物質の濃度変化を確認した。結果を図５，６に示す。
【００３０】
図５，６より、レモンから抽出したフラボノイド配糖体であるエリオシトリン及びジオスミンはともに、２時間程度の処理で７０％近い高い変換率を示すことが確認された。また、ｐＨによる酵素活性の低下も見られないことから、レモン配糖体を処理する際のｐＨ調整も不要であることが確認された。次に、前記８時間後の反応液（ｐＨ３．０）を上記アンバーライト樹脂に吸着させた後、６０％含水メタノールにて溶出させて凍結乾燥した（試験例１の酵素処理アグリコン）。この溶出液（試験例１の酵素処理アグリコン）を上記ＨＰＬＣ条件２にて分析することによりアグリコンの精製度を調査したところ、前記吸着剤による精製により、アグリコンが極めて効果的に精製されることが確認された。
（酵素の基質特異性の検討）
上記第２のグリコシダーゼの有用性を確認するために、市販酵素によるアグリコン化の試験を実施した。使用した酵素は、天野エンザイム社製のセルラーゼ系酵素（セルラーゼＡ「アマノ」３、セルラーゼＴ「アマノ」４）、ペクチナーゼ系酵素（ペクチナーゼＧ「アマノ」、ペクチナーゼＰＬ「アマノ」）の４種及び上記第２のグリコシダーゼである。上記比較例１のレモン配糖体を、その濃度が５０ｐｐｍとなるように溶解させた水溶液（ｐＨ３．０に調整）に各酵素を５００ｐｐｍ又は５０ｐｐｍ添加し、室温（２５℃）で５時間酵素反応させた。これらの酵素反応後の各サンプルを９５℃で１０分間加熱して酵素を失活させた後、上記ＨＰＬＣ条件２にてエリオシトリン及びエリオディクティオールの濃度を定量してエリオシトリンの変換率を求めた。その結果、ペクチナーゼＰＬ「アマノ」を５００ｐｐｍ添加したときのエリオシトリンからエリオディクティオールへの変換率は２２％であり、第２のグリコシダーゼを５００ｐｐｍ、５０ｐｐｍ添加したときの同変換率はそれぞれ６７％、７４％であり、それ以外の試験における変換率はほぼ０％であった。従って、上記第２のグリコシダーゼの変換率は、市販酵素の変換率よりも著しく高いことが確認された。
（柑橘類果汁のグリコシダーゼ処理）
エリオシトリンの含有率が高いレモン果汁、ライム果汁、及びスダチ果汁に対し、上記第２のグリコシダーゼを添加してアグリコン化について検討した。上記３種の果汁として市販されている濃縮果汁を用い、それぞれBrix１０に調整した。いずれの果汁のｐＨも３付近であった。これらの果汁に上記第２のグリコシダーゼを終濃度が１０ｐｐｍになるように添加し、室温で５時間酵素反応させた。これらの酵素反応後の各サンプルを９５℃で１０分間加熱して酵素を失活させた後、上記ＨＰＬＣ条件２にてエリオシトリン及びエリオディクティオールの濃度を定量してエリオシトリンの変換率を求めた。その結果、レモン果汁、ライム果汁、及びスダチ果汁の変換率はそれぞれ、５４％、４９％、５６％であり、それらの変換率が高いことが確認された。従って、これらの柑橘類の果汁におけるアグリコン化においても上記第２のグリコシダーゼが有用であることが確認された。
（ラジカル捕捉活性の測定）
下記表１に示される各サンプルについて、ＤＰＰＨ（1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl）ラジカル捕捉活性を調べた。即ち、上記比較例１のレモン配糖体、比較例２のエリオシトリン、試験例１の酵素処理アグリコン、（株）フナコシより購入したエリオディクティオール、ネオエリオシトリン、ビタミンＣ又はα−トコフェロールをそれらの濃度が５００ｐｐｍとなるように溶解させた水溶液１００μｌに０．１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７．４）１ｍｌを加えた。α−トコフェロールの溶媒はメタノールである。また、前記各サンプル及びビタミンＣをそれらの濃度が５００ｐｐｍとなるように溶解させた水溶液１００μｌに、０．１Ｍトリス緩衝液１ｍｌを加えた。続いて、これらに２ｍｌのＤＰＰＨ溶液（ＤＰＰＨをその濃度が５００μＭとなるようにエタノールに溶解させたもの）を加えてよく混合した後、室温および暗所で２０分間放置して反応させた。各反応液（１０μｌ）中のＤＰＰＨ量を、下記分析用ＨＰＬＣシステム２を用いてＨＰＬＣ条件３で測定することにより定量した。ラジカル捕捉活性の評価法は、予め試料（配糖体及びアグリコン）無添加試験区（コントロール）におけるＤＰＰＨ残存量を１００％とし、各試料を添加した反応液中のＤＰＰＨ残存量を測定し、コントロール区のＤＰＰＨ量に対する百分率（％）で表した。エリオディクティオール及びビタミンＣ添加区分のラジカル捕捉活性はほぼ１００％であったことからサンプル量を半分にして再度試験を行った。即ち、エリオディクティオール及びビタミンＣをそれぞれ５００ｐｐｍとなるように溶解させた水溶液５０μｌに、０．１Ｍトリス緩衝液１ｍｌを加えた後、上記のようにラジカル捕捉活性を測定し、得られた数値を２倍することによりデータを補正した。結果を表１に示す。
＜分析用ＨＰＬＣシステム２＞
ポンプ：Shimadzu LC-10AD、システムコントローラ：Shimadzu SCL-10A、オートインジェクタ：Shimadzu SIL-10A、検出器：Shimadzu SPD-10A,UV spectrophotometric detector、カラムオーブン：Shimadzu CTO-10A
＜ＨＰＬＣ条件３＞
カラム：TSK-GEL octyl-80Ts (4.6i.d.×150mm)、溶出液：メタノール／水＝３０／７０(v/v)、流速：１ｍｌ／ｍｉｎ、検出波長：５１７ｎｍ
【００３１】
【表１】
0004659764.tif 000002
表１より、酵素処理アグリコン、エリオシトリン及びエリオディクティオールは、主に水系の条件において高い抗酸化活性を有しているが、ビタミンＣを混合した後に添加した区分では、酵素処理アグリコン、エリオシトリン及びエリオディクティオールの抗酸化活性が顕著に高められたことが明らかとなった。さらに、酵素処理アグリコン、エリオシトリン及びエリオディクティオールの抗酸化活性は、レモン配糖体においてもビタミンＣと混合することによって相乗的に高められたことが示された。また、精製品であるエリオシトリン又はエリオディクティオールにビタミンＣを添加した場合も、レモン配糖体又は酵素処理アグリコンにビタミンＣを添加した場合とほぼ同じ割合での相乗効果が発揮された。よって、前記レモン配糖体および酵素処理アグリコンで確認された相乗効果は、エリオシトリン又はエリオディクティオールとビタミンＣとの相乗効果によるものであることが確認された。従って、これらのフラバノン類とビタミンＣとを混合した抗酸化素材は、非常に高い抗酸化活性を有しており、酸化による劣化を抑制する抗酸化素材として有用であることが明らかとなった。また、ビタミンＣを含有する飲食品、例えば果汁に、前記酵素処理アグリコン又は劣化防止目的でエリオディクティオールが添加された場合には、それらの添加量から期待される劣化防止効果よりもより強い劣化防止効果が期待できることが容易に推測され得る。
（過酸化脂質生成抑制効果の測定）
上記表１に示される各サンプルについて、リノール酸メチルを基質とした過酸化脂質生成抑制効果を調べた。即ち、上記（ラジカル捕捉活性の測定）で用いた各水溶液１００μｌと、リノール酸メチル８９ｍｇ（１００μｌ）とを内径１４ｍｍの小型試験管に加えて十分に混合した。同時に、前記水溶液の代わりに、該水溶液の溶媒１００μｌのみを加えたもの（コントロール）も調製した。これらの混合液の溶媒を、減圧デシケーター内で真空ポンプを用いて完全に除去した後、４０℃の暗所に１８時間放置した。次に、０．０８％ＢＨＴ（２，６ジｔブチル４メチルフェノール）／ヘキサン溶液５ｍｌを加え、リノール酸メチルより生成した過酸化物量を以下に示す分析用ＨＰＬＣシステム２を用いてＨＰＬＣ条件４により測定した。抗酸化活性の測定および評価法は、まず、コントロール試験区のリノール酸メチルより生成した過酸化脂質（１３−ヒドロペルオキシド及び９−ヒドロペルオキシド）のＨＰＬＣピーク面積値の総和量を求め、その値を１００％とした後、各試料を添加した試験区の過酸化脂質のＨＰＬＣピーク面積値の総和量を求め、それを前記コントロールの総和量に対する百分率（％）で表すことにより、リノール酸メチル酸化抑制率を求めた。結果を上記表１に示す。
＜分析用ＨＰＬＣシステム２＞
ポンプ：Shimadzu LC-10AD、システムコントローラ：Shimadzu SCL-10A、オートインジェクタ：Shimadzu SIL-10A、検出器：Shimadzu SPD-10A,UV spectrophotometric detector、カラムオーブン：Shimadzu CTO-10A
＜ＨＰＬＣ条件４＞
カラム：Develosil SI 60-5 (4.6i.d.×250mm)、溶出液：n-hexane/1,4-dioxane/isopropylalchol = 98/1/1 (v/v/v)、流速：１ｍｌ／ｍｉｎ、検出波長：２３５ｎｍ
上記表１より、レモン配糖体、酵素処理アグリコン、エリオシトリン及びエリオディクティオールは、主に油系の条件において高い抗酸化活性を有しているが、ビタミンＣを混合した後に添加した区分では、レモン配糖体、酵素処理アグリコン、エリオシトリン及びエリオディクティオールの抗酸化活性が相乗的に発揮されたことが確認された。精製品であるエリオシトリン又はエリオディクティオールにビタミンＣを添加した場合も、レモン配糖体又は酵素処理アグリコンにビタミンＣを添加した場合とほぼ同じ割合での相乗効果が発揮された。よって、前記レモン配糖体および発酵処理アグリコンで確認された相乗効果はエリオシトリン又はエリオディクティオールとビタミンＣとの相乗効果によるものであることが確認された。従って、これらのフラバノン類とビタミンＣとを混合した抗酸化素材は、非常に高い抗酸化活性を有しており、酸化による劣化を抑制する抗酸化素材として有用であることが明らかとなった。
（リポソームを用いた生体膜酸化抑制効果の検証）
生体膜モデルである一枚膜のリポソーム（ＳＵＶ：Small Unilamellar Vesicle）を用いて抗酸化力を評価した。ＳＵＶの調製は、まず、卵黄レシチン１００ｍｇに１ｍｌのクロロホルムを加えて完全に溶解させた後に、ナスフラスコにてクロロホルムを完全に除去した。得られた脂質のフィルムに、比較例１のレモン配糖体、比較例２のエリオシトリン、試験例１の酵素処理アグリコン又はエリオディクティオール（フナコシ社製）を５００ｐｐｍ含有する１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を１０ｍｌ加えて膨化させ、よく振盪した後に超音波洗浄器にて完全に分散させた。コントロールとして脂質のフィルムを前記リン酸緩衝液１０ｍｌのみで膨化させたものも同様に試験した。次に、得られた多重層リポソームの溶液に窒素ガスを５分間バブリングした後に強力な超音波発生装置にて１８０Ｗ及び２０分間の超音波処理を行い、小さな一枚膜のリポソーム（ＳＵＶ）を調製した。
このようにして作製したＳＵＶにラジカル発生剤であるＡＡＰＨ（２，２’−アゾビス（２−アミノジプロパン））を加えることにより、該ＳＵＶに対する過酸化を強制的に促進させた。その結果、リポソーム中に一次生成物である過酸化物が生成され、さらには自動酸化の過程で二次生成物であるマロンジアルデヒド等が生成される。これにチオバルビツール酸（ＴＢＡ）試薬を加えると、アルデヒド類の反応生成物である赤色物質（ＴＢＡ陽性物質）が生成する。その呈色度を分光光度計にてλ＝５３５ｎｍで測定し、リポソーム膜酸化率（％）とした。
【００３２】
その結果、リポソーム膜酸化率は、比較例１のレモン配糖体では６０．５４％であったが、試験例１の酵素処理アグリコンでは１１．５６％であり、酵素処理アグリコンでは高い抗酸化活性が発揮されることが示された。α−トコフェロールの酸化率は７６．８７％であった。また、比較例２のエリオシトリン、エリオディクティオールのリポソーム膜酸化率はそれぞれ９．５２％、６．８０％であった。従って、レモンアグリコン及びエリオディクティオールは、生体膜においても高い酸化抑制効果を発揮しており、生体の細胞膜表面の酸化傷害を撲滅する生体膜酸化抑制剤として有用であることが明らかとなった。
（活性酸素消去率の測定）
キサンチンオキシダーゼ０．５ｍｌ（５．６ｕｎｉｔ）、１ｍＭキサンチン（和光純薬社製）０．３ｍｌ、０．２５ｍＭニトロブルーテトラゾリウム（和光純薬社製）０．３ｍｌ及び０．０５Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０．２）２．３ｍｌを混合した。前記キサンチンオキシダーゼとして、和光純薬社製の試薬を０．０５Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液にて１００倍希釈したものを用いた。この混合液に上記比較例１のレモン配糖体又は試験例１の酵素処理アグリコン０．１ｍｌ（濃度１０００ｐｐｍ）を加えてインキュベーションした。インキュベーション時間の経過と共に青色のホルマザンが産生されることから、インキュベーション開始３分後に分光光度計（HITACHI spectrophotometer U2000）を用いてλ＝５６０ｎｍにて吸光度を測定した。前記試料（配糖体及びアグリコン）無添加試験区をコントロールとした。また、ブランクテストとして前記キサンチンオキシダーゼの代わりに炭酸ナトリウム緩衝液を加えて同様の操作を行った。そして、各試料液を加えた際の吸光度から前記ブランクテストの吸光度を差し引いた値をコントロールの吸光度で除算することにより、活性酸素消去率（％）を求めた。その結果、活性酸素消去率は、比較例１のレモン配糖体では２６．７％であったが、試験例１の酵素処理アグリコンでは７４．８％であり、酵素処理アグリコンでは高い抗酸化活性が発揮されることが示された。α−トコフェロールの酸化率は２３８．２％であった。従って、レモンアグリコンは高い活性酸素消去能を有しており、生体内での活性酸素消去剤として有用であることが明らかとなった。
〔参考例２〕
（試料の調製２：微生物発酵処理によるアグリコンの作製）
レモンの搾汁残渣に、予め３０℃および暗所でポテトデキストロース-ブロス培地にて１週間予備培養したアスペルギルス・サイトイ ＩＡＭ ２２１０菌株を接種し、３０℃の恒温条件で１０日間微生物発酵処理を実施した。その後、前記菌株を含むレモンの搾汁残渣を１０倍量（重量）のメタノールに２４時間浸漬することにより、レモンアグリコンの抽出物を得た。得られた抽出物をエバポレーターにて減圧濃縮した後、アンバーライト樹脂（ＸＡＤ１６）に吸着させ、ペクチン、糖質等をできるだけ除去し、更に４０％含水メタノールで溶出させた溶出液を濃縮および凍結乾燥することにより、レモンアグリコン発酵処理粉末（比較例３の発酵処理アグリコン）を得た。上記比較例１のレモン配糖体及び比較例３の発酵処理アグリコンに含まれるフラボノイド組成（含有量）を、それぞれ下記分析用ＨＰＬＣシステム２を用いて下記ＨＰＬＣ条件５にて分析した。結果を表２に示す。表中の“trace”は下記ＨＰＬＣ条件５でほとんど検出できなかったことを示し、“nd”は検出不可能であったことを示す。
＜分析用ＨＰＬＣシステム２＞
ポンプ：Shimadzu LC-10AD、システムコントローラ：Shimadzu SCL-10A、オートインジェクタ：Shimadzu SIL-10A、検出器：Shimadzu SPD-10A,UV spectrophotometric detector、カラムオーブン：Shimadzu CTO-10A
＜ＨＰＬＣ条件５＞
カラム：YMC-Pack ODS-A （4.6i.d.×250mm）、溶出液：メタノール／水＝３０／７０（v/v）、流速：１ｍｌ／ｍｉｎ、検出波長：２７０ｎｍ
【００３３】
【表２】
0004659764.tif 000003
（培養上清のβ−グリコシダーゼ活性の測定）
下記表３に示される各菌株をポテトデキストロース-ブロス培地にて暗所および３０℃で２週間予備培養処理し、胞子形成が開始される時期の培地を遠心分離してその培養上清を集めて酵素液サンプル１とした。また、暗所および３０℃で４週間予備培養処理し、胞子形成が完了する時期の培地を遠心分離して培養上清と沈澱とに分けた。そして、前記培養上清を酵素液サンプル２とするとともに、前記沈澱に前記培養上清と同量の水を加えて懸濁させ、超音波処理することによって菌体を破壊した後、遠心分離により不溶解物を除去した菌体破砕物を酵素液サンプル３とした。
【００３４】
次に、０．１Ｍリン酸−クエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）に溶解させた１ｍＭ ｐＮＰＧ溶液２ｍｌを試験管に分注し、恒温水槽にて３０℃で５分間予備温盪した。この試験管中に前記各酵素液サンプル０．５ｍｌを加えて酵素反応させ、生成したｐＮＰ量を分光光度計（HITACHI spectrophotometer U2000）を用いてλ＝４２０ｎｍで測定した。コントロールとして、基質であるｐＮＰＧ溶液に予め炭酸ナトリウム溶液を加えた後、各酵素液サンプルを加えて同様の操作を行った。この条件下で１時間当たりに１μモルのｐＮＰを生成する酵素量を１単位（unit）とし、予めｐＮＰの標準溶液にて作製した検量線より酵素液サンプル０．５ｍｌ中のβ−グリコシダーゼ活性（unit）を以下の計算式により求めた。結果を表３に示す。
【００３５】
β−グリコシダーゼ活性（unit）＝吸光度（420nm）／0.223（unit）
【００３６】
【表３】
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表３より、ほとんど全ての菌株が、胞子形成完了時期（酵素液サンプル２及び３）に第１のグリコシダーゼによる強いβ−グリコシダーゼ活性を有していることが明らかとなった。また、A.awamori及びA.shirousamii IAM 2414は、胞子形成開始時期（酵素液サンプル１）の培養上清に強いβ−グリコシダーゼ活性を有していたことから、これらの菌株の培養液を除菌濾過することによりグリコシダーゼ処理用の酵素として利用され得ることが分かった。さらに、この胞子形成開始時期には、例えばヒドロキシラーゼの活性が極めて弱いことから、生成されたアグリコンの分解およびさらなる微生物変換反応が進行しにくく、より効率的にアグリコンを得ることが可能である。また、これらのA.awamori及びA.shirousamii IAM 2414を用いた微生物発酵処理を行う場合には、他の菌株を用いる場合と比べて微生物発酵期間を容易に短縮することも可能であることが容易に推測され得る。逆に、A.niger（特にATCC 10549）のように菌体外ではβ−グリコシダーゼ活性を余り示さないが菌体内で高い活性を持つものが微生物発酵処理への利用に適していることも分かった。
（香料劣化抑制効果試験）
ブドウ糖及びクエン酸を用いてBrix４．８、ｐＨ３．０に調整した水溶液にレモンエッセンス（高砂香料株式会社製）を０．１％添加してシロップ溶液を調製した。これに比較例１のレモン配糖体、比較例４の発酵処理アグリコン（表４中ではアグリコンと記載）、又はビタミンＣを添加した添加区分と、添加しない無添加区分とを作製し、これらを８７℃まで昇温して瞬間殺菌した後、無色透明のＰＥＴボトルに充填した。比較例１のレモン配糖体はエリオシトリン濃度が表４に示される添加濃度となるように添加し、比較例４の発酵処理アグリコンはエリオディクティオール濃度が表４に示される添加濃度となるように添加した。また、前記比較例４の発酵処理アグリコンの添加がシロップ溶液全体の風味に影響するか否かを調べたところ、エリオディクティオールが３０ｐｐｍ以下の添加では風味に大きな影響を及ぼすことはなかった。これらの各区分のサンプルを用いて、以下に記載する加温劣化試験及び紫外線劣化試験を行った。
【００３７】
加温劣化試験：試験１−１（３０ｐｐｍ）、試験１−２（３ｐｐｍ）
各区分のサンプルを、６０℃又は４℃（冷蔵）で４日間暗所にて静置保存した後、よく訓練されたパネラー１２名により官能評価を行った。評価方法は、冷蔵保存したサンプルを５点満点とし、パネラーにそれぞれの区分の点数を評価させ、その平均点を求めた。４回の官能評価試験については全て同一のパネラーを用い、同一の日に実施した。結果を表４に示す。
【００３８】
紫外線劣化試験：試験２−１（３０ｐｐｍ）、試験２−２（３ｐｐｍ）
各区分のサンプルを、スガ試験機株式会社製の紫外線ロングライフフェードメーターによる紫外線（ＵＶ）照射条件（６時間照射）又は暗所にて冷蔵保存した後、よく訓練されたパネラー１２名により官能評価を行った。評価方法は、暗所保存したサンプルを５点満点とし、パネラーにそれぞれの区分の点数を評価させ、その平均点を求めた。４回の官能評価試験については全て同一のパネラーを用い、同一の日に実施した。結果を表４に示す。
【００３９】
【表４】
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表４より、６０℃で４日間加温保存を行った場合、レモン配糖体添加区分は全ての評価項目において無添加区分よりも良い評価を受け、発酵処理アグリコン添加区分は全ての評価項目においてレモン配糖体添加区分よりも良い評価を受け、特に香りの強さでは顕著な効果があるとの評価を受けた。さらに、ビタミンＣを同時に添加した区分では、いずれも発酵処理アグリコンのみを添加した区分と比べて、全ての評価項目で良い評価を受けた。また、１ｐｐｍの濃度で添加した添加区分についても同様に実施したが、パネラーによる官能評価における有意差は見られなかった。以上の結果から、シロップ溶液中に３ｐｐｍ以上の濃度のエリオシトリン又はエリオディクティオールを添加することにより、熱によるフレーバーの劣化を有意に抑制する効果が得られ、さらにビタミンＣを同時に添加することにより前記効果が顕著に高められることが明らかとなった。
【００４０】
一方、紫外線照射を行った場合、レモン配糖体添加区分は全ての評価項目において無添加区分よりも良い評価を受け、発酵処理アグリコン添加区分は全ての評価項目においてレモン配糖体添加区分よりも良い評価を受け、紫外線によるフレーバー劣化の抑制に効果があることが明らかとなった。さらに、ビタミンＣを同時に添加した区分では、いずれも発酵処理アグリコンのみを添加した区分と比べて、全ての評価項目で同等又は良い評価を受けた。以上の結果から、シロップ溶液中に３ｐｐｍ以上の濃度でレモンアグリコンを添加することにより、紫外線よるフレーバーの劣化を有意に抑制する効果が得られることが明らかとなった。
【００４１】
さらに、前記試験１と２とを比べると、試験条件にもよるが熱よりも紫外線による劣化をより効果的に抑える傾向が見受けられた。前記パネラーからの回答として、前記添加区分は全体として後味がすっきりしているとの回答を得た。従って、比較例４の発酵処理アグリコン中に別途用意されたビタミンＣを添加することにより、個々の効果の合計よりも顕著に高い効果を示し、相乗効果が発揮されることが確認された。また、果汁等ビタミンＣを含有する飲食品に、別途用意されたエリオディクティオールを添加した場合には、添加量から期待される劣化防止効果よりもより強い劣化防止効果が期待できることが容易に推測され得る。
（色素退色防止効果試験）
ブドウ糖及びクエン酸を用いてBrix４．８、ｐＨ３．０に調整した水溶液にアントシアニン色素（赤キャベツ色素）を０．１重量％添加したシロップ溶液を調製した。これに比較例４の発酵処理アグリコンをエリオディクティオール濃度で３０ｐｐｍ添加した添加区分と、該アグリコン及びビタミンＣを添加した添加区分と、無添加区分とを作製し、これらを８７℃まで昇温して瞬間殺菌した後、無色透明のＰＥＴボトルに充填した。次に、これらの各区分のサンプルに対し、８時間紫外線照射した後に冷蔵保存、又は４５℃および暗所で２週間加温保存した後、分光光度計（HITACHI spectrophotometer U2000）にてλ＝４６０ｎｍの吸光度を測定して色素残存率（％）を求めた。結果を表５に示す。
【００４２】
【表５】
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表５より、植物から抽出された天然色素成分、例えばアントシアニン及びカロチノイドの劣化を抑える効果は、レモンアグリコンの添加により向上し、さらにビタミンＣを同時に添加することにより大幅に向上することが確認された。さらに、前記効果は紫外線照射の際に特に顕著であり、発酵処理アグリコン及びビタミンＣが天然着色料の劣化防止に有用であることが確認された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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