(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アクリジンオレンジを用いて血液中の細胞を分類する粒子分類方法において、
アクリジンオレンジを用いて血液中の細胞を染色するステップと、
血液中の細胞に光を照射するステップと、
血液中の血小板を染色の指標として染色具合を判断するステップと、
血液中の細胞を分類するステップと、を有することを特徴とする粒子分類方法。
【請求項２】
アクリジンオレンジを用いて血液中の細胞を分類する粒子分類方法において、
アクリジンオレンジを用いて血液中の細胞を染色するステップと、
血液中の細胞に光を照射するステップと、
それぞれの細胞の蛍光強度をそれぞれの散乱光による細胞の大きさや形状で規格化して、それぞれの細胞の蛍光濃度を求めるステップと、
規格化により求められたそれぞれの細胞の蛍光濃度に基づいて血液中の細胞を分類するステップと、
を有することを特徴とする粒子分類方法。
【請求項３】
アクリジンオレンジを用いて血液中の細胞を分類する粒子分類方法において、
アクリジンオレンジを用いて血液中の細胞を染色するステップと、
血液中の細胞に光を照射するステップと、
それぞれの細胞の蛍光強度をそれぞれの散乱光による細胞の大きさや形状で規格化して、それぞれの細胞の蛍光濃度を求めるステップと、
血液中の血小板を染色の指標として染色具合を判断するステップと、
規格化により求められたそれぞれの細胞の蛍光濃度に基づいて血液中の細胞を分類するステップと、
を有することを特徴とする粒子分類方法。
【請求項４】
血液中の血小板を染色の指標として染色具合を判断するステップは、血小板のオレンジ蛍光成分および／または緑蛍光成分から判断することを特徴とする請求項１又は３記載の粒子分類方法。
【請求項５】
血液中の細胞に光を照射して発生した散乱光および蛍光を電気信号として検出し、検出された電気信号に基づいて赤血球のＲＮＡヒストグラムを作成し、前記ＲＮＡのハーフピークの右側アドレスを検出すると共にその２倍のアドレスを検出し、この右側の集団を網赤血球として分類することを特徴とする請求項１ないし４のいずれかに記載粒子分類方法。
【請求項６】
血液中の細胞に光を照射し発生した前方散乱光および蛍光を電気信号として検出し、細胞の緑およびオレンジの蛍光強度を細胞の大きさや形状で規格化したスキャッタグラムを用いて、細胞や破砕細胞などの細胞由来粒子および非細胞由来粒子を分類することを特徴とする請求項１ないし５のいずれかに記載の粒子分類方法。
【請求項７】
血液中の細胞に照射される光の波長の中心波長は、４０８ｎｍ、４４５ｎｍ、４７３ｎｍまたは４８８ｎｍであることを特徴とする請求項１ないし６のいずれかに記載の粒子分類方法。
【請求項８】
アクリジンオレンジを用いて血液中の細胞を染色するステップは、アクリジンオレンジと緩衝液を含む染色試薬と血液検体を混合させて調整された試料を所定の温度に設定し、所定時間染色することを特徴とする請求項１ないし７のいずれかに記載の粒子分類方法。
【請求項９】
分類される細胞が、赤血球、血小板、破砕赤血球、有核赤血球、マラリア原虫、ハウエルジョリー小体であることを特徴とする請求項１ないし８のいずれかに記載の粒子分類方法。
【請求項１０】
血液中の細胞に光を照射する光源と、
試料を流すフローセルと、
前方散乱光を検出する前方散乱光検出器と、
側方散乱光を検出する側方散乱光検出器と、
蛍光を検出する蛍光検出器と、
血小板の染色具合によって、試料全体の染色の良否を判断する染色判断手段と、
網赤血球または血小板を判断する手段と、
から構成することを特徴とする粒子分類装置。
【請求項１１】
血液中の細胞に光を照射する光源と、
試料を流すフローセルと、
前方散乱光を検出する前方散乱光検出器と、
側方散乱光を検出する側方散乱光検出器と、
蛍光を検出する蛍光検出器と、
それぞれの細胞の蛍光強度をそれぞれの散乱光による細胞の大きさや形状で規格化して、それぞれの細胞の蛍光濃度を求める規格化手段と、
規格化により求められたそれぞれの細胞の蛍光濃度に基づいて血液中の細胞および非細胞由来粒子を分類する手段と、
から構成することを特徴とする粒子分類装置。
【請求項１２】
血液中の細胞に光を照射する光源と、
試料を流すフローセルと、
前方散乱光を検出する前方散乱光検出器と、
側方散乱光を検出する側方散乱光検出器と、
蛍光を検出する蛍光検出器と、
それぞれの細胞の蛍光強度をそれぞれの散乱光による細胞の大きさや形状で規格化して、それぞれの細胞の蛍光濃度を求める規格化手段と、
血小板の染色具合によって、試料全体の染色の良否を判断する染色判断手段と、
規格化により求められたそれぞれの細胞の蛍光濃度に基づいて血液中の細胞および非細胞由来粒子を分類する手段と、
から構成することを特徴とする粒子分類装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液中の細胞分類に関するものであって、特に網赤血球、赤血球および血小板を測定する粒子分類方法および装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
白血球分類と網赤血球測定を、蛍光染料であるアクリジンオレンジを用いて染色することにより、１台の装置で測定することが提案されている（特許文献１参照）。【０００３】
さらには、白血球分類と網赤血球測定と血球計数を、蛍光染料であるアクリジンオレンジを用いて染色することにより、１台の装置で測定することが提案されている（特許文献２参照）。【０００４】
【特許文献１】特開平４−３２６０６１号公報
【特許文献２】特開平５−３２２８８２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、従来においては、アクリジンオレンジによる染色の良否の判定について検討されておらず、過染色または染色不十分であると網赤血球数など細胞の測定が正確に行えないという問題があった。
また、従来のフローサイトメータを使用した血液分析装置においては、染色試薬を使用した試料の作成に際して、染色時間が例えば３０分以上必要となる問題があった。
さらに、細胞浮遊液にゴミなどの非細胞由来粒子の存在により、計測装置のバックグランドが上昇してしまうことがあった。【０００６】
従って、本発明の目的は、アクリジンオレンジを用いて血小板を染色の指標として赤血球および/または血小板を正確に測定することにある。【０００７】
また、本発明の目的は、アクリジンオレンジを用いて細胞を染色し、細胞の蛍光強度を細胞の大きさや形状で規格化された値に基づいて血液中の細胞および非細胞由来粒子を分類して、赤血球数および血小板数を正確に測定することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の請求項１に記載のアクリジンオレンジを用いた血液中の細胞を分類する粒子分類方法は、アクリジンオレンジを用いて血液中の細胞を染色するステップと、血液中の細胞に光を照射するステップと、血液中の血小板を染色の指標として染色具合を判断するステップと、血液中の細胞を分類するステップと、を有することを特徴とする。【０００９】
本発明の請求項２に記載のアクリジンオレンジを用いた血液中の細胞を分類する粒子分類方法においては、アクリジンオレンジを用いて血液中の細胞を分類する粒子分類方法において、アクリジンオレンジを用いて血液中の細胞を染色するステップと、血液中の細胞に光を照射するステップと、それぞれの細胞の蛍光強度をそれぞれの散乱光による細胞の大きさや形状で規格化して、それぞれの細胞の蛍光濃度を求めるステップと、規格化により求められたそれぞれの細胞の蛍光濃度に基づいて血液中の細胞を分類するステップと、を有することを特徴とする。
【００１０】
本発明の請求項３に記載のアクリジンオレンジを用いて血液中の細胞を分類する粒子分類方法においては、アクリジンオレンジを用いて血液中の細胞を分類する粒子分類方法において、アクリジンオレンジを用いて血液中の細胞を染色するステップと、血液中の細胞に光を照射するステップと、それぞれの細胞の蛍光強度をそれぞれの散乱光による細胞の大きさや形状で規格化して、それぞれの細胞の蛍光濃度を求めるステップと、血液中の血小板を染色の指標として染色具合を判断するステップと、規格化により求められたそれぞれの細胞の蛍光濃度に基づいて血液中の細胞を分類するステップと、を有することを特徴とする。
【００１１】
本発明の請求項４に記載のアクリジンオレンジを用いた血液中の細胞を分類する粒子分類方法において、血小板を染色の指標として染色具合を判断するステップは、血小板のオレンジ蛍光成分および／または緑色蛍光成分から判断することを特徴とする。すなわち、検出された電気信号に基づいて緑色に蛍光染色された部分（緑蛍光成分）とオレンジ色に蛍光染色された部分（オレンジ蛍光成分）をそれぞれ細胞の大きさ（ＦＳ）または形状（ＳＳ）で規格化し、その規格化データから赤血球と血小板の分布の中心値を計測し、その距離を算出することにより染色具合を判断する。なお、アクリジンオレンジによる蛍光染色では、２本鎖ＤＮＡに対しては、塩基対間にインターカレートすることにより５３０ｎｍを中心とした蛍光（緑）を、またＲＮＡ等１本鎖核酸に対しては、静電相互作用によりスタッキングを起こして６４０ｎｍを中心とした蛍光（オレンジ）を発するので、オレンジ蛍光成分と緑蛍光成分を判断基準として用いることが可能となる。【００１２】
本発明の請求項５に記載のアクリジンオレンジを用いた血液中の細胞を分類する粒子分類方法においては、血液中の細胞に光を照射して発生した散乱光および蛍光を電気信号として検出し、検出された電気信号に基づいて赤血球のＲＮＡヒストグラムを作成し、前記ＲＮＡのハーフピークの右側アドレスを検出すると共にその２倍のアドレスを検出し、この右側の集団を網赤血球として分類することを特徴とする。【００１３】
本発明の請求項６に記載のアクリジンオレンジを用いた血液中の細胞を分類する粒子分類方法においては、血液中の細胞に光を照射し発生した前方散乱光および蛍光を電気信号として検出し、細胞の緑およびオレンジの蛍光強度を細胞の大きさや形状で規格化したスキャッタグラムを用いて、赤血球、網赤血球、血小板などの細胞および破砕細胞などの細胞由来粒子および浮遊液中のゴミなどの非細胞由来粒子を分類することを特徴とする。【００１４】
本発明の請求項７に記載のアクリジンオレンジを用いた血液中の細胞を分類する粒子分類方法においては、血液中の細胞に照射される光の波長の中心波長は、４０８ｎｍ、４４５ｎｍ、４７３ｎｍまたは４８８ｎｍであることを特徴とする。【００１５】
本発明の請求項８に記載のアクリジンオレンジを用いた血液中の細胞を分類する粒子分類方法においては、アクリジンオレンジを用いて血液中の細胞を染色するステップは、アクリジンオレンジと緩衝液を含む染色試薬と血液検体を混合させて調整された試料を所定の温度に設定し、所定時間染色することを特徴とする。【００１６】
本発明の請求項９に記載のアクリジンオレンジを用いた血液中の細胞を分類する粒子分類方法においては、分類される細胞が、赤血球、血小板、破砕赤血球、有核赤血球、マラリア原虫、ハウエルジョリー小体であることを特徴とする。【００１７】
本発明の請求項１０に記載の粒子分類装置においては、血液中の細胞に光を照射する光源と、試料を流すフローセルと、前方散乱光を検出する前方散乱光検出器と、側方散乱光を検出する側方散乱光検出器と、蛍光を検出する蛍光検出器と、血小板の染色具合によって、試料全体の染色の良否を判断する染色判断手段と、網赤血球または血小板を判断する手段と、から構成することを特徴とする。
【００１８】
本発明の請求項１１に記載の粒子分類装置においては、血液中の細胞に光を照射する光源と、試料を流すフローセルと、前方散乱光を検出する前方散乱光検出器と、側方散乱光を検出する側方散乱光検出器と、蛍光を検出する蛍光検出器と、それぞれの細胞の蛍光強度をそれぞれの散乱光による細胞の大きさや形状で規格化して、それぞれの細胞の蛍光濃度を求める規格化手段と、規格化により求められたそれぞれの細胞の蛍光濃度に基づいて血液中の細胞および非細胞由来粒子を分類する手段と、から構成することを特徴とする。
【００１９】
本発明の請求項１２に記載の粒子分類装置においては、血液中の細胞に光を照射する光源と、試料を流すフローセルと、前方散乱光を検出する前方散乱光検出器と、側方散乱光を検出する側方散乱光検出器と、蛍光を検出する蛍光検出器と、それぞれの細胞の蛍光強度をそれぞれの散乱光による細胞の大きさや形状で規格化して、それぞれの細胞の蛍光濃度を求める規格化手段と、血小板の染色具合によって、試料全体の染色の良否を判断する染色判断手段と、規格化により求められたそれぞれの細胞の蛍光濃度に基づいて血液中の細胞および非細胞由来粒子を分類する手段と、から構成することを特徴とする。
【発明の効果】
【００２０】
本発明の請求項１に記載の粒子分類方法においては、細胞が良好に染色された細胞を測定するため、正確に血液中の細胞、特に網赤血球、赤血球および血小板を分類し、測定することができる。【００２１】
本発明の請求項２および請求項３に記載の粒子分類方法においては、規格された値に基づいて細胞を測定するため、精度よく血液中の細胞を分類し、測定することができる。【００２２】
本発明の請求項４に記載の粒子分類方法においては、血小板を染色の指標として用いることにより、細胞が良好に染色された細胞を測定するため、正確に血液中の細胞、特に網赤血球および血小板を分類し、測定することができる。【００２３】
本発明の請求項５に記載の粒子分類方法においては、網赤血球を正確に分類し、測定することが可能となる。【００２４】
本発明の請求項６に記載の粒子分類方法においては、血液中の細胞および非細胞由来粒子を分類して赤血球数および血小板数を正確に分類し、測定することが可能となる。【００２５】
本発明の請求項７に記載の粒子分類方法においては、血液中の細胞に照射される光の中心波長は、４０８ｎｍ、４４５ｎｍ、４７３ｎｍまたは４８８ｎｍであることにより、赤血球の自家蛍光の影響をなくし、Ｓ／Ｎの良好な検出をすることが可能となる。【００２６】
本発明の請求項８に記載の粒子分類方法においては、アクリジンオレンジと緩衝液を含む染色試薬と血液検体を混合させて調整された試料を所定の温度に設定し、所定時間染色することにより、速やかに染色することが可能となる。【００２７】
本発明の請求項９に記載の粒子分類方法においては赤血球、血小板、破砕赤血球、有核赤血球、マラリア原虫、ハウエルジョリー小体を正確に分類することが可能となる。【００２８】
本発明の請求項１０に記載の粒子分類装置においては、良好に染色された細胞を測定するため、正確に血液中の細胞、特に網赤血球および血小板を分類し、測定することができる。【００２９】
本発明の請求項１１および請求項１２に記載の粒子分類装置においては、細胞の蛍光強度を細胞の大きさや形状で規格化された値に基づいて、血液中の細胞および非細胞由来粒子を分類して、赤血球数および血小板数を正確に測定することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
次に、本発明に係る粒子分類方法および装置の実施例として、血液成分中の細胞の分類を行う方法および装置について、図面を参照しながら以下詳細に説明する。【００３１】
図１は、測定試料の調整を示す概略図である。まず、本発明に係る粒子分類方法においては、血液中の細胞を含む血液成分からなる試料と染色試薬とを混合し反応させて試料を調製し、前記試料を検出領域において光を照射して試料に含まれる細胞から発生する散乱光および蛍光を電気信号として検出し、検出された電気信号に基づいて血液成分中の細胞の分析を行うように設定される。【００３２】
［測定試料の調製］
本発明においては、測定を行う試料として、血液成分として採取した試料の調製を行う。この場合、図１に示すように、所要量の染色試薬１０を一定量に分注する時に、２０〜５０℃の範囲に加温し、この加温され分注された染色試薬１０Ａに、血液成分からなる所定量の試料２０を添加して、５〜１０秒間攪拌し、このようにして得られた試料３０を２０〜５０℃の範囲に保温して、１０〜４０秒間保持する。この結果、本発明においては、前記試料３０の調製を、１５〜６０秒間において完了することができる。【００３３】
しかるに、本実施例においては、前記染色試薬１０を１ｍＬに分注し、この分注された染色試薬１０Ａに対し、測定目的細胞数が１×１０7 個／μＬ程度に調製した前記試料２０を２μＬ添加する。また、前記染色試薬１０としては、色素濃度はｐＨ７.４のトリス緩衝液で調整した０.５〜１.５ｍｇ／ｄＬのアクリジンオレンジを使用する。特に、色素濃度が０.７５ｍｇ／ｄＬが好適であり、この染色試薬１０を１ｍＬに分注すると共にその分注時に４５℃に加温し、加温した１ｍＬの染色試薬１０Ａに２μＬの前記試料２０を添加して５秒間攪拌し、得られた試料を４５℃に保温して３０秒間保持することにより、適正な試料３０を調製できる。また、別途乾燥凍結したアクリジンオレンジにｐＨ６.４〜ｐＨ８.２のリン酸緩衝液やトリス緩衝液などの緩衝液と血液検体２０を順次加えることにより調製してもよい。【００３４】
［調製された試料の測定および分析］
図２は、本発明に係る血液成分中の細胞分類方法を実施するための装置としてのシステム構成を示すものである。すなわち、図２において、参照符号４０は前述した試料の調製を行う試料調製手段を示す。そして、参照符号５０はフローサイトメータであって、前記試料調製手段４０で調製された試料３０を、検出領域において光を照射する光照射手段と、光照射された試料に含まれる細胞から発生する散乱光および蛍光を電気信号として検出する細胞のパラメータ検出手段と、検出された細胞のパラメータに基づいて血液成分中の細胞の分析を行う細胞分析手段とを備えたものとして構成される。またプロセッサ７０により染色具合の判断や規格化が行なわれる。なお、フローサイトメータの場合、前記検出領域は、フローセルとして設定される。【００３５】
図３は、本発明に係る血液成分中の細胞分類方法を実施するための装置の一実施例としてのフローサイトメータの概略を示す系統図である。図３において、参照符号５１は調製された試料の検出領域となるフローセルを示す。そして、このフローセル５１に対してレーザ光源５２が照射光集光レンズ５３を介して配置されている。前記フローセル５１において試料に照射されて得られる前方への散乱光は、散乱光集光レンズ５４を介して、それぞれ前方小角散乱光検出器（ＦＳｓ）６１および前方大角散乱光検出器（ＦＬｓ）６２によりそれぞれ検出されるように構成される。また、前記フローセル５１において試料に照射されて得られる側方への散乱光および蛍光は、ビームスプリッタ５５を介して側方散乱光検出器（ＳＳ）６３により検出されると共に、それぞれビームスプリッタ５６，５７および波長選択フィルタ５８，５９を介して、第１蛍光検出器（ＦＬ１）６４および第２蛍光検出器（ＦＬ２）６５により検出されるように構成される。なお、ビームスプリッタの代りにダイクロイックミラーを用いてもよい。【００３６】
そこで、前記構成からなるフローサイトメータ５０を使用して、本発明に係る血液成分中の血液分析方法について、図４に示すフローチャートを参照しながら説明する。【００３７】
最初に、前述した試料調整手段４０により調整された血液成分としての試料を、フローサイトメータ５０のフローセル５１に供給して、試料の校正を開始する（ＳＴＥＰ−１）。そこで、前方小角散乱光検出器（ＦＳｓ）６１と側方散乱光検出器（ＳＳ）６３、第１蛍光検出器（ＦＬ１）６４および第２蛍光検出器（ＦＬ２）６５により検出される電気信号に基づいて、赤血球と血小板の大きさ（ＦＳ）と、顆粒の量（ＳＳ）、ＤＮＡ量（ＦＬ１）とＲＮＡ量（ＦＬ２）を測定する（ＳＴＥＰ−２）。そして、ＤＮＡ量およびＲＮＡ量をそれぞれそのＦＳやＳＳで規格化してスキャッタグラムを作成する。大きさで規格化した場合のスキャッタグラムは、細胞内ＤＮＡ濃度（ｃＤＮＡｃ: ｃｅｌｌ ＤＮＡ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）及び細胞内ＲＮＡ濃度（ｃＲＮＡｃ: ｃｅｌｌ ＲＮＡ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）のスキャッタグラムを表している。そのスキャッタグラムに、ある閾値を設けて、赤血球と血小板（血液中の細胞）、細胞由来粒子および非細胞由来粒子を分類する（ＳＴＥＰ−３）。【００３８】
このとき、例えば試料中に破砕赤血球、有核赤血球、マラリア原虫、ハウエルジョリー小体が存在する場合は、図６の（ｄ）では４つの分布（赤血球、破砕赤血球、血小板、ゴミ）が存在する。図６の（ａ）〜（ｃ）に示すように、染色試料が良好な染色である場合、規格化ＤＮＡ／規格化ＲＮＡのスキャッタグラムにおいて血小板の分布と網赤血球を含む赤血球の分布はある一定の距離関係にある。また、染色が良好であれば、規格化ＤＮＡ／規格化ＲＮＡのスキャッタグラムにおいて、血小板の分布位置が一定である〔図６の（ｂ）〕。しかし、染色が不良で薄かったり〔図６の（ａ）〕、濃かったり〔図６の（ｃ）〕すると、血小板の分布位置が変動する。この血小板の分布位置が一定であることを確認することで、試料の染色の良・不良の確認判定を行う（ＳＴＥＰ−４およびＳＴＥＰ−５）。【００３９】
規格化ＤＮＡ／規格化ＲＮＡのスキャッタグラムにおいて、網赤血球は赤血球分布のｃＲＮＡｃが高い領域に出現する。破砕赤血球は、赤血球分布および血小板分布の中間部分に多く出現する。有核赤血球は核を持ちＤＮＡ成分を多く有するため、規格化ＤＮＡ／規格化ＲＮＡのスキャッタグラムにおいて、赤血球および血小板とは異なる領域に現れる。同様に、ハウエルジョリー小体はＤＮＡで構成される核断片であるため、赤血球および血小板とは異なる領域に現れる。また、全てのマラリア原虫は蛍光を発するため、規格化ＤＮＡ／規格化ＲＮＡのスキャッタグラムにおいて、赤血球および血小板とは異なる領域に現れる。【００４０】
前記試料の染色の良・不良の確認判定により、染色が不良であれば、再度試料を作り直して前述したＳＴＥＰ−１からの測定を行うように設定される（ＳＴＥＰ−５およびＳＴＥＰ−６）。染色の結果が良好であれば、調製された試料を前記フローサイトメータ５０のフローセル５１に流して、試料の測定を開始する（ＳＴＥＰ−７）。なお、このような試料の染色の良・不良の確認判定の指標については、後述する。【００４１】
まず、前方小角散乱光検出器（ＦＳｓ）６１と側方散乱光検出器（ＳＳ）６３、第１蛍光検出器（ＦＬ１）６４および第２蛍光検出器（ＦＬ２）６５により検出される電気信号に基づいて、赤血球と血小板の大きさ（ＦＳ）と、顆粒の量（ＳＳ）、ＤＮＡ量（ＦＬ１）とＲＮＡ量（ＦＬ２）を測定する（ＳＴＥＰ-８）。そして、ＤＮＡ量およびＲＮＡ量をそれぞれその大きさで規格化してスキャッタグラムを作成する。そのスキャッタグラムにある閾値を設けて、赤血球と血小板を分類して、その数を算出する（ＳＴＥＰ−９）。赤血球のＲＮＡヒストグラムを作成する（ＳＴＥＰ−１０）。図５は、この場合に得られるＲＮＡヒストグラムの一例である。そこで、前記ＲＮＡヒストグラムの成熟赤血球集団のハーフピークの右側のアドレスＨＰaddを検出し、そのアドレスの２倍のアドレス２ＨＰaddを検出する（ＳＴＥＰ−１１）。これにより、前記２倍のアドレス２ＨＰaddより右側の集団を、網赤血球として算出することができる（ＳＴＥＰ−１２）。また、前記算出された網赤血球から、網赤血球中のＲＮＡ量の多さ毎に幼若度具合の指標となるパラメータを算出することができる（ＳＴＥＰ−１３）。さらに、前方大角散乱光検出器（ＦＬｓ）６２により検出される電気信号に基づいて、網赤血球中の凝集物を測定することができる（ＳＴＥＰ−１４）。以上により、一連の測定を終了する。【００４２】
次に、本発明に係る血液成分中の血小板分析方法について、図４に示すフローチャートを参照しながら説明する。前述したＳＴＥＰ−１〜ＳＴＥＰ−６までの試料の染色の良・不良の確認判定を行う工程は同じであるので省略する。そこで、試料の染色の良・不良の確認判定を行った結果（ＳＴＥＰ−５）、染色が良好であれば、血小板数測定の設定を行う（ＳＴＥＰ−１５）。次いで、調製された試料を前記フローサイトメータ５０のフローセル５１に流して、試料の測定を開始する（ＳＴＥＰ−１６）。まず、前方小角散乱光検出器（ＦＳｓ）６１と側方散乱光検出器（ＳＳ）６３、第１蛍光検出器（ＦＬ１）６４および第２蛍光検出器（ＦＬ２）６５により検出される電気信号に基づいて、赤血球と血小板の大きさ（ＦＳ）と、顆粒の量（ＳＳ）、ＤＮＡ量（ＦＬ１）とＲＮＡ量（ＦＬ２）を測定する（ＳＴＥＰ-１７）。そして、ＤＮＡ量およびＲＮＡ量をそれぞれそのＦＳやＳＳで規格化してスキャッタグラムを作成する。そのスキャッタグラムにある閾値を設けて、赤血球と血小板、その他の粒子を分類する（ＳＴＥＰ−１８）。そして、血小板のヒストグラムを作成して血小板数を算出する（ＳＴＥＰ−１９）。また血小板のＲＮＡヒストグラムからＲＮＡ量の多さごとに幼若度具合の指標となる網血小板数を測定する（ＳＴＥＰ−２０）。この方法によって正確に血小板数、網血小板数を測定することができる。【００４３】
図６の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）は、前述した試料の染色の良・不良の確認判定を行うための血小板の分布状態を示す血液成分細胞のスキャッタグラムである。縦軸を規格化ＤＮＡとし、横軸を規格化ＲＮＡとしてスキャッタグラムを作成する。それぞれ染色が不十分な状態〔図６の（ａ）〕、良好な染色状態〔図６の（ｂ）〕、過染色状態〔図６の（ｃ）〕を示す。なお、図中において、Ｒetiは網赤血球、Ｐltは血小板、ＲＢＣは赤血球、ＧＲは白血球顆粒球、ＭＯは単球、ＬＹはリンパ球、ＡＬＹは異型リンパ球をそれぞれ示す。【００４４】
白血球の好酸球（ＥＯＳ）や好中球（ＮＥＵＴ）などの２次顆粒の染まり具合は、染色の良否に関係なく、アクリジンオレンジにより鮮やかなオレンジ色に染まる。一方、網赤血球のアクリジンオレンジによりオレンジ色に染まった蛍光成分（以下、「オレンジ蛍光成分」とする）と、血小板のオレンジ蛍光成分の染まり具合は、網赤血球に比べて微弱であり、その２つの染まり方は比例している。例えば、染色が不十分な場合において、網赤血球、血小板のオレンジ蛍光成分は染まっていない。すなわち、網赤血球と血小板の染色態度は、染色の良否を反映しているということができる。そこで、アクリジンオレンジ染色における染色の良否判定は、以下に説明するように血小板の染色態度を指標にするとよい。【００４５】
（１）〔図６の（ａ）〕は、染色が不十分な状態の規格化ＤＮＡ／規格化ＲＮＡのスキャッタグラムである。この場合、網赤血球中のＲＮＡ成分の染色が不十分なため成熟赤血球と同じ染色態度となり、その赤血球分布自体が左下側にシフトする。同時に、血小板のオレンジ蛍光成分も染色不良となり、血小板分布も左下方向にシフトする。もし、染色不十分であることに気が付かずに、網赤血球カウントをしたら、網赤血球数は偽低値となる。
（２）〔図６の（ｃ）〕は、染色が過染色な状態の規格化ＤＮＡ／規格化ＲＮＡのスキャッタグラムである。この場合、バックグラウンドが上がり、成熟赤血球の蛍光が擬似的に過剰となるため、網赤血球としてカウントされてしまう。このため、網赤血球数は偽高値となる。また赤血球の分布が右上方向にシフトする。これと同時に、同様の理由で血小板分布も右上方向にシフトする。
（３）そこで、血小板の染色態度を指標にする。良好な染色状態〔図６の（ｂ）〕においては、規格化ＤＮＡ／規格化ＲＮＡのスキャッタグラムにおいて、血小板と赤血球の分布とその距離は一定である。そこで、染色が良好であれば、血小板と赤血球、網赤血球の分布位置は安定しているし、染色が不良であってもその分布距離は一定であり、同じように変動することから、網赤血球の染色の良否は規格化ＤＮＡ／規格化ＲＮＡのスキャッタグラムにおける血小板の分布位置と、血小板と赤血球、網赤血球の分布距離で確認できる。【００４６】
細胞浮遊液にゴミ（Ｄust）などの非細胞由来粒子の存在により、計測装置のバックグランドが上昇してしまうことがある。この場合には、細胞の緑およびオレンジの蛍光強度を細胞の大きさや形状で規格化したスキャッタグラム（規格化ＤＮＡ／規格化ＲＮＡのスキャッタグラム）を用いて、図６の（ｄ）に示すように、規格化ＤＮＡ／規格化ＲＮＡのスキャッタグラムにおいて、非細胞粒子は血液中の細胞と比較して緑とオレンジの両方の蛍光成分が非常に小さいことを利用し、赤血球、網赤血球、血小板などの細胞および破砕赤血球（ＦＲＣ）などの破砕細胞などからなる細胞由来粒子と、浮遊液中のゴミ（Ｄust）などの非細胞由来粒子とを、容易に分類することができることがわかる。【００４７】
以上、本発明の好適な実施例について説明したが、本発明は前記実施例に限定されることなく、本発明の精神を逸脱しない範囲内において多くの設計変更を行うことが可能である。例えば、側方散乱（ＳＳ）には、形状と顆粒の量の情報を含むことは当業者にとって明らかであり、本記載において、形状（ＳＳ）や顆粒の量（ＳＳ）との記載は必ずしも一方の情報のみを示すことはないことはいうまでもない。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】測定試料の調整を示す概略説明図である。
【図２】本発明に係る粒子分類方法を実施する装置としてのシステム構成を示す説明図である。
【図３】本発明に係る粒子分類方法を実施するための装置の一実施例としてのフローサイトメータの概略を示す系統図である。
【図４】図３に示す本発明に係る粒子分類装置を構成するフローサイトメータにより血液成分中の細胞分析方法を実施するプログラムを示すフローチャート図である。
【図５】本発明に係る粒子分類方法としての血液成分中の細胞分析方法において検出および測定される赤血球集団から得られる網赤血球の分布を示すＲＮＡヒストグラムである。
【図６】（ａ）、（ｂ）、（ｃ）はそれぞれ本発明に係る粒子分類方法としての血液成分中の細胞分析方法において調整された試料の染色状態のそれぞれ指標を示す血小板の分布状態を示す血液成分細胞のスキャッタグラム、（ｄ）は本発明に係る粒子分類方法としての血液成分中の細胞分析方法において、細胞および非細胞由来粒子が分類された状態を示すスキャッタグラムである。
【符号の説明】
【００４９】
１０  染色試薬
１０Ａ  分注された染色試薬
２０  血液成分としての試料
３０  調製された試料
４０  試料調製手段
５０  フローサイトメータ
５１  フローセル
５２  レーザ光源
５３  照射光集光レンズ
５４  散乱光集光レンズ
５５、５６、５７  ビームスプリッタ
５８、５９  波長選択フィルタ
６１  前方小角散乱光検出器（ＦＳｓ）
６２  前方大角散乱光検出器（ＦＬｓ）
６３  側方散乱光検出器（ＳＳ）
６４  第１蛍光検出器（ＦＬ１）
６５  第２蛍光検出器（ＦＬ２）
７０  プロセッサ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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