(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
リン脂質であって、
（Ａ）下記式（１）で表される構成単位Ａ、
（Ｂ）下記式（２Ａ）及び／又は下記式（２Ｂ）で表される構成単位Ｂ、並びに
（Ｃ）下記式（３）で表される構成単位Ｃ：
【化１】
0004808403.tif 000010
〔式（１）中、Ｒ1及びＲ2はそれぞれ独立に水素原子又はメチル基を示すが、Ｒ1及びＲ2が同時にメチル基になることはなく；Ｒ3は炭素数１〜３の２価の炭化水素基を示し；ＡＯはそれぞれ独立に炭素数２〜４のオキシアルキレン基を示し；ｍはオキシアルキレン基の平均付加モル数を示し、４≦ｍ≦１００の範囲の数であり；Ｒ4は水素原子、炭素数１〜２０の炭化水素基、又は炭素数１〜２０のアシル基を示し、式（２Ａ）中、Ｘはそれぞれ独立に水素原子、アルカリ金属原子、アンモニウム、又は有機アンモニウムを示し、式（３）中、Ｒ5ＣＯ及びＲ6ＣＯはそれぞれ独立に炭素数８〜２４のアシル基を示し；Ｒ7は炭素数２〜４の２価の炭化水素基を示し；Ｘは水素原子、アルカリ金属原子、アンモニウム、又は有機アンモニウムを示し；Ｙは水素原子、アルカリ金属原子、アンモニウム、又は有機アンモニウムを示す〕を必須構成単位として含む共重合体であって、構成単位Ａと構成単位Ｂ及び構成単位Ｃの合計とのモル比が７／３〜３／７であり、かつ構成単位Ｃを共重合体１モル中に１〜５モルの割合で含み、共重合体中に含まれる構成単位Ａ、構成単位Ｂ、及び構成単位Ｃの総数が３以上で、かつ１５０以下であるリン脂質誘導体。
【請求項２】
共重合体中に含まれる構成単位Ａ、構成単位Ｂ、及び構成単位Ｃの総数が５以上で、かつ５０以下である請求項１に記載のリン脂質誘導体。
【請求項３】
Ｒ1が水素原子であり、Ｒ2が水素原子又はメチル基であり、Ｒ3がメチレン基である請求項１又は２に記載のリン脂質誘導体。
【請求項４】
Ｒ7がエチレン基である請求項１ないし３のいずれか１項に記載のリン脂質誘導体。
【請求項５】
請求項１ないし４のいずれか１項に記載のリン脂質誘導体を含む界面活性剤。
【請求項６】
脂質膜構造体の脂質膜成分として用いるための請求項１ないし４のいずれか１項に記載のリン脂質誘導体。
【請求項７】
脂質膜構造体がリポソームである請求項６に記載のリン脂質誘導体。
【請求項８】
脂質膜構造体が医薬を保持した脂質構造体である請求項６又は７に記載のリン脂質誘導体。
【請求項９】
医薬が抗腫瘍剤である請求項８に記載のリン脂質誘導体。
【請求項１０】
請求項１ないし４のいずれか１項に記載のリン脂質誘導体の製造方法であって、構成単位Ａと構成単位Ｂとを７／３〜３／７のモル比で含む共重合体に対して下記の式（４）：
【化２】
0004808403.tif 000011
（式中、Ｒ5ＣＯ、Ｒ6ＣＯ、Ｒ7、及びＹは上記と同義である）
で表される化合物を反応させる工程を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はリン脂質誘導体に関する。より具体的には、本発明は、アルケニルエーテル−無水マレイン酸共重合体とリン脂質とを反応させて得ることができるリン脂質誘導体に関する。
【背景技術】
【０００２】
リポソーム製剤に代表される微粒子性薬物キャリアー及び蛋白製剤等のポリペプチドは静脈内に投与すると血液中での滞留性が悪く、肝臓、脾臓などの細網内皮系組織（Reticuloendothelial system：以下「ＲＥＳ」と略する。）に捕捉されやすいことが知られている。ＲＥＳの存在は、ＲＥＳ以外の臓器への薬物を送達させるターゲッティング型製剤や長時間にわたって血液中に製剤を滞留させ、医薬の放出をコントロールする徐放型製剤として微粒子性薬物キャリアーを利用するに際して大きな障害となる。
【０００３】
従来から、上記製剤に微小循環性を有するような研究がなされてきた。例えば、リポソームの脂質二分子膜の物理化学的性質を比較的容易に調整可能であることから、リポソームのサイズを小さくすることで血中濃度を高く維持する例（バイオキミカ・エト・バイオフィジカ・アクタ、761巻、142頁、1983年）、相転移温度の高いレシチンを利用する例（バイオケミカル・ファーマコロジー、32巻、3381頁、1983年）、レシチンの代わりにスフィンゴミエリンを用いる例（バイオケミカル・ファーマコロジー、32巻、3381頁、1983年）、リポソームの膜成分としてコレステロールを添加する例（バイオキミカ・エト・バイオフィジカ・アクタ、761巻、142頁、1983年）などが提案されている。
【０００４】
また、その他の解決方法として、リポソームの膜表面を糖脂質、糖蛋白質、アミノ酸脂質、ポリエチレングリコール脂質などで修飾し、微小循環性を付与するとともにＲＥＳを回避する研究が行われている。例えば、グリコフォン（日本薬学会第106年会講演要旨集、336頁、1986年）、ガングリオシドGM1（FEBSレター、223巻、42頁、1987年）、フォスファチジルイノシトール（FEBSレター、223巻、42頁、1987年）、グリコフォンとガングリオシドGM3（特開昭63-221837号公報）、ポリエチレングリコール誘導体（FEBSレター、268巻、235頁、1990年）、グルクロン酸誘導体（ケミカル・アンド・ファーマシューティカル・ブレタン、38巻、1663頁、1990年）、グルタミン酸誘導体（バイオキミカ・エト・バイオフィジカ・アクタ、1108巻、257頁、1992年）、ポリグリセリンリン脂質誘導体（特開平6-228012号公報）などがその修飾物質として報告されている。
【０００５】
ポリペプチドを修飾する場合には、その結合点を減らしてポリペプチド中のリジン残基等の活性基の残存量を上げる目的で、トリアジンを用いて２分子の水溶性高分子を導入させた報告等がある。リポソーム製剤においても、水溶性高分子の分子量を上げる目的でトリアジンに2分子の水溶性高分子を導入し、それを用いてリポソーム表面を修飾した報告がある。しかしながら、リポソーム表面の水溶性高分子の鎖の数を増やすためには、トリアジンを用いて水溶性高分子を導入する場合には、トリアジン環には２本しか水溶性高分子を導入できないため、トリアジンに２本の水溶性高分子を含む化合物を多く配合する必要がある。
【０００６】
しかし、その場合、多く配合することにより、本来薬剤と反応させる活性点を消費してしまい、設計すべき薬剤が限定されてしまうといった問題があった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、リポソームなどの修飾に利用可能なリン脂質誘導体を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、アルケニルエーテル−無水マレイン酸共重合体とリン脂質とを反応させて新規なリン脂質誘導体を提供すべく鋭意研究を行った結果、下記に示すリン脂質を提供することに成功した。
すなわち、本発明は、リン脂質であって、
（Ａ）下記式（１）で表される構成単位Ａ、
（Ｂ）下記式（２Ａ）及び／又は下記式（２Ｂ）で表される構成単位Ｂ、並びに
（Ｃ）下記式（３）で表される構成単位Ｃ：
【化１】
0004808403.tif 000002
〔式（１）中、Ｒ1及びＲ2はそれぞれ独立に水素原子又はメチル基を示すが、Ｒ1及びＲ2が同時にメチル基になることはなく；Ｒ3は炭素数１〜３の２価の炭化水素基を示し；ＡＯはそれぞれ独立に炭素数２〜４のオキシアルキレン基を示し；ｍはオキシアルキレン基の平均付加モル数を示し、４≦ｍ≦１００の範囲の数であり；Ｒ4は水素原子、炭素数１〜２０の炭化水素基、又は炭素数１〜２０のアシル基を示し、式（２Ａ）中、Ｘはそれぞれ独立に水素原子、アルカリ金属原子、アンモニウム、又は有機アンモニウムを示し、式（３）中、Ｒ5ＣＯ及びＲ6ＣＯはそれぞれ独立に炭素数８〜２４のアシル基を示し；Ｒ7は炭素数２〜４の２価の炭化水素基を示し；Ｘは水素原子、アルカリ金属原子、アンモニウム、又は有機アンモニウムを示し；Ｙは水素原子、アルカリ金属原子、アンモニウム、又は有機アンモニウムを示す〕を必須構成単位として含む共重合体であって、構成単位Ａと構成単位Ｂ及び構成単位Ｃの合計とのモル比が７／３〜３／７であり、かつ構成単位Ｃを共重合体１モル中に１〜５モルの割合で含むリン脂質誘導体を提供するものである。
【０００９】
本発明の好ましい態様によれば、共重合体中に含まれる構成単位Ａ、構成単位Ｂ、及び構成単位Ｃの総数が３以上で、かつ１５０以下である上記のリン脂質誘導体；共重合体中に含まれる構成単位Ａ、構成単位Ｂ、及び構成単位Ｃの総数が５以上で、かつ５０以下である上記のリン脂質誘導体；Ｒ1及びＲ2が水素原子である上記のリン脂質誘導体；及びＲ7がエチレン基である上記のリン脂質誘導体が提供される。
【００１０】
別の観点からは、本発明により、上記のリン脂質誘導体を含む界面活性剤；上記のリン脂質誘導体を含む可溶化剤；上記のリン脂質誘導体を含む分散剤、好ましくは化粧料用の分散剤；上記のリン脂質誘導体を含有する脂質膜構造体、好ましくはリポソームが提供される。また、医薬を保持した上記の脂質膜構造体又はリポソームが本発明により提供され、その好ましい態様として抗腫瘍剤を保持した上記の脂質膜構造体又はリポソームが提供される。
【００１１】
さらに別の観点からは、上記のリン脂質誘導体の製造方法であって、構成単位Ａと構成単位Ｂとを７／３〜３／７のモル比で含む共重合体に対して下記の式（４）：
【化２】
0004808403.tif 000003
（式中、Ｒ5ＣＯ、Ｒ6ＣＯ、Ｒ7、及びＹは上記と同義である）
で表される化合物を反応させる工程を含む方法が提供される。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明のリン脂質誘導体は、式（１）で示されるアルケニルエーテルからなる構成単位Ａと、マレイン酸若しくはその塩又は無水マレイン酸に由来する式（２Ａ）及び／又は式（２Ｂ）で表される構成単位Ｂとを含む共重合体であって、さらにリン脂質化合物の残基を有する式（３）で表される構成単位Ｃを含むことを特徴としている。
【００１３】
Ｒ1及びＲ2はそれぞれ独立する水素原子又はメチル基を示すが、Ｒ1及びＲ2が同時にメチル基になることはない。好ましくはＲ1が水素原子、Ｒ2が水素原子又はメチル基であり、Ｒ3がメチレン基である。Ｒ3は炭素数１〜３の２価の炭化水素基であり、より具体的には、例えば、−ＣＨ2−、−ＣＨ2ＣＨ2−、−ＣＨ（ＣＨ3）ＣＨ2−、−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2−などの炭化水素基を挙げることができ、好ましくは−ＣＨ2−（メチレン基）である。
【００１４】
ＡＯで表されるオキシアルキレン基は炭素数２〜４のオキシアルキレン基であり、例えばオキシエチレン基、オキシプロピレン基、オキシトリメチレン基、オキシブチレン基、オキシテトラメチレン基などが挙げられる。これらのうち、オキシエチレン基又はオキシプロピレン基が好ましく、特にオキシエチレン基が好ましい。ＡＯであらわされるｍ個の炭素数２〜４のオキシアルキレン基は１種又は２種以上でもよい。２種以上のオキシアルキレン基を含む場合には、その組み合わせ方には制限はなく、ブロック状であってもランダム状であってもよい。構成単位Ａにおいて、ＡＯで示されるオキシアルキレン基としてオキシエチレン基を含むことが好ましく、オキシエチレン基の割合がオキシアルキレン基中の５０〜１００質量％以上であることが好ましく、７０〜１００質量％がより好ましく、１００質量％がさらに好ましい。オキシエチレン基の割合が５０質量％より少ないと、リン脂質誘導体の親油性が高くなり、乳化分散性が低下する場合がある。
【００１５】
ｍはオキシアルキレン基の平均付加モル数であり、ｍは４〜１００、好ましくは６〜４６の数である。ｍが４より小さいと共重合体の大きさに比べてポリオキシアルキレン鎖の鎖長が相対的に短くなって水溶性が低下し、リン脂質誘導体をドラックデリバリーシステムに使用した場合の効果が小さくなる場合がある。また、ｍが１００より大きいとオキシアルキレン基からなるポリアルキレングリコール鎖の数が相対的に少なくなり、リン脂質誘導体をドラックデリバリーシステムに使用した場合の優位性が小さくなる場合がある。
【００１６】
Ｒ4は水素原子又は炭素数１〜２０の炭化水素基又はアシル基を示す。炭化水素基としては、例えば、炭素数１〜２０の脂肪族炭化水素基及び炭素数１〜２０の芳香族炭化水素基を挙げることができる。炭素数１〜２０の脂肪族炭化水素基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、tert−ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、ヘキシル基、イソヘプチル基、２−エチルヘキシル基、オクチル基、イソノニル基、デシル基、ドデシル基、イソトリデシル基、テトラデシル基、ヘキサデシル基、イソセチル基、オクタデシル基、イソステアリル基、オクタデセニル基、オクチルドデシル基、ドコシル基及びデシルテトラデシル基などを挙げることができ、炭素数１〜２０の芳香族炭化水素基としては、ベンジル基、トリル基、ブチルフェニル基、ジブチルフェニル基、オクチルフェニル基、ノニルフェニル基、ドデシルフェニル基、ジオクチルフェニル基及びジノニルフェニル基などを挙げることができる。
【００１７】
炭素数１〜２０のアシル基としては、酢酸、プロピオン酸、酪酸、イソ酪酸、カプリル酸、２−エチルヘキサン酸、イソノナン酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、イソパルミチン酸、ステアリン酸、イソステアリン酸、アラキン酸、ベヘン酸、パルミトレイン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、エルカ酸、安息香酸、ヒドロシキ安息香酸、桂皮酸、及び没食子酸などに由来するアシル基が挙げられる。Ｒ4としては、炭素数１〜４の炭化水素基又はアシル基が好ましく、炭素数１〜４の炭化水素基がさらに好ましい。式（１）で表される各構成単位ＡにおけるＲ4はそれぞれ独立であり、１種又は２種以上であってもよい。
【００１８】
式（２Ａ）、（２Ｂ）、又は式（３）で表される構成単位はマレイン酸若しくはその塩又は無水マレイン酸に由来する構成単位である。塩としては、アルカリ金属原子、アンモニウム又は有機アンモニウムの塩が挙げられ、例えばナトリウム、カリウム等のアルカリ金属塩、カルシウム、マグネシウム等のアルカリ金属塩、アンモニア由来のアンモニウム塩、トリエチルアミン、ピリジン、ジメチルアミノピリジン由来の有機アンモニウム塩が挙げられる。マレイン酸若しくはその塩又は無水マレイン酸をそのまま共重合させてもよいが、共重合させた後に塩に変換してもよい。
【００１９】
Ｒ5ＣＯ及びＲ6ＣＯはそれぞれ独立に炭素数８〜２４のアシル基を示すが、このアシル基としては通常の脂肪酸に由来するアシル基を用いることができる。Ｒ5ＣＯ及びＲ6ＣＯとしては、例えばカプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸、イソステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、アラキン酸、ベヘン酸、エルカ酸、リグノセリン酸などの飽和及び不飽和の直鎖又は分岐の脂肪酸由来のアシル基をあげることができる。一の構成単位中に含まれるＲ5ＣＯ及びＲ6ＣＯは同一であっても異なっていてもよい。また、それぞれの構成単位中におけるＲ5ＣＯ又はＲ6ＣＯはそれぞれ独立であり、１種又は２種以上であってもよい。Ｒ5ＣＯ及びＲ6ＣＯは好ましくは炭素数１０〜２２のアシル基である。炭素数が２４を越えると水相への分散が悪く反応性が下がる場合があり、炭素数が８より少ないと精製工程での結晶性が悪く純度が低くなる場合がある。
【００２０】
Ｘは、水素原子、アルカリ金属原子、アンモニウム又は有機アンモニウムの塩が挙げられ、例えばナトリウム、カリウム等のアルカリ金属塩、カルシウム、マグネシウム等のアルカリ金属塩、アンモニア由来のアンモニウム塩、トリエチルアミン、ピリジン、ジメチルアミノピリジン由来の有機アンモニウム塩が挙げられる。Ｙは水素原子、アルカリ金属原子、アンモニウム、又は有機アンモニウムを示し、好ましくは水素原子又はアルカリ金属原子である。より具体的には、アルカリ金属原子としてナトリウム及びカリウムを挙げることができ、有機アンモニウムとしてはトリエチルアミン由来の有機アンモニウムなどを挙げることができる。Ｒ7は炭素数２〜４の２価の炭化化水素基であり、より具体的には−ＣＨ2ＣＨ2−、−ＣＨ（ＣＨ3）ＣＨ2−、−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2−、−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2−、−ＣＨ（ＣＨ3）ＣＨ2ＣＨ2−、−ＣＨ2ＣＨ（ＣＨ3）ＣＨ2−、−ＣＨ（ＣＨ2ＣＨ3）ＣＨ2−などの炭化水素基を挙げることができ、好ましくは−ＣＨ2ＣＨ2−であるエチレン基である。
【００２１】
本発明のリン脂質誘導体において、共重合体中に含まれる式（１）で表される構成単位Ａ、式（２Ａ）及び／又は式（２Ｂ）で表される構成単位Ｂ（構成単位Ｂは式（２Ａ）又は式（２Ｂ）のいずれかで表される構成単位のみからなるものであってもよく、あるいは式（２Ａ）及び式（２Ｂ）の構成単位の両者を含むものであってもよい）、及び式（３）で表される構成単位Ｃの総数は３以上で、かつ１５０以下である。ｋIを構成単位Ａのモル数、ｋIIを構成単位Ｂのモル数、ｋIIIを構成単位Ｃのモル数とした場合、ｋI、ｋII、及びｋIIIは以下の関係：１≦ｋIII≦５、３≦ｋI＋ｋII＋ｋIII≦１５０、ｋI／（ｋII＋ｋIII）＝７／３〜３／７を満たし、好ましくは、以下の関係：１≦ｋIII≦４、５≦ｋI＋ｋII＋ｋIII≦１００、ｋI／（ｋII＋ｋIII）＝６／４〜４／６を満たし、より好ましくは、以下の関係：１≦ｋIII≦２、５≦ｋI＋ｋII＋ｋIII≦１００、ｋI／（ｋII＋ｋIII）＝６／４〜４／６を満たす。本発明のリン脂質誘導体の分子末端は、水素原子又は重合開始又は連鎖移動により共重合体末端に結合する残基である。構成単位Ｃが分子中にランダム状に存在していることが好ましい。
【００２２】
本発明のリン脂質誘導体は、上記の構成単位Ａ、構成単位Ｂ、構成単位Ｃのほか、これらの構成単位と共重合可能な他の単量体に由来する構成単位を含んでいてもよい。例えば、共重合可能な単量体としては、スチレン、酢酸ビニル、アクリロニトリル、メタクリロニトリル、アクリルアミド、メタクリルアミド、アクリル酸、メタクリル酸、アクリル酸メチル、メタクリル酸メチルなどを挙げることができる。他の共重合可能な単量体に由来する構成単位の割合は、構成単位Ａに対して１０モル％以下であることが好ましい。
【００２３】
本発明のリン脂質誘導体は、構成単位Ａと構成単位Ｂとを含む共重合体に対して、上記の式（４）で表されるリン脂質化合物を反応させることによって製造することができる。構成単位Ａと構成単位Ｂとを含む共重合体は公知の重合体であり、公知の方法（例えば特開平２−１６３１０８号公報、特開平９−２５５７４０号公報等に記載の方法）を用いて製造することができる。該共重合体は、例えば、構成単位Ａを与える適宜の単量体と、マレイン酸若しくはその塩又は無水マレイン酸とを、有機溶剤中又は水系溶剤中で溶液重合するか、あるいは無溶剤で塊状重合することにより製造することができるが、有機溶剤中での溶液重合又は無溶剤での塊状重合が好ましく、無溶剤での塊状重合がより好ましい。該共重合体において、式（Ｉ）で表される構成単位Ａは、重合体中にランダム状又はブロック状のいずれの形態で存在していてもよいが、好ましくはランダム状である。また、式（２Ａ）及び／又は式（２Ｂ）で表される構成単位は重合体中にランダム状又はブロック状のいずれの形態で存在していてもよいが、好ましくはランダム状である。
【００２４】
構成単位Ｂが無水マレイン酸に由来する場合には、有機溶剤中又は無溶媒で塊状重合した場合は、該共重合体中の構成単位Ｂは式（２Ｂ）で表される構成単位として得ることができる。水系溶剤中で重合を行った場合はマレイン酸又はその塩の構成単位（式（２Ａ）で表される構成単位）として得られる。上記の反応で構成単位Ｂが無水物であっても、あるいはカルボン酸又はその塩であってもリン脂質を導入することができる。
【００２５】
重合反応に用いる重合開始剤としては、例えばベンゾイルペルオキシドなどの過酸化物系開始剤、２，２’−アゾビスイソブチロニトリルなどのアゾ系開始剤等が挙げられ、仕込量は単量体の合計仕込量に対して通常０．００１〜０．１モル％、好ましくは０．００５〜０．１モル％である。また、必要に応じて連鎖移動剤を併用して重合を行うこともできる。反応条件は、通常反応温度０〜１２０℃、反応時間１〜５０時間であり、好ましくは反応温度２０〜１００℃、反応時間２〜２５時間である。共重合体における構成単位Ａと構成単位Ｂとの構成モル比は７／３〜３／７であり、好ましくは６／４〜４／６であり、より好ましくは５／５である。また、該共重合体の質量平均分子量は１０，０００〜１，０００，０００であり、好ましくは１０，０００〜２００，０００である。
【００２６】
構成単位Ａと構成単位Ｂとを含む共重合体に対して上記の式（４）で表されるリン脂質化合物を反応させるにあたり、塩基性触媒又は、脱水縮合触媒の存在下で反応を行うことが好ましい。また、有機溶媒中で反応を行うことも好ましい。塩基性触媒の種類は特に限定されないが、例えば、窒素含有物質としてはトリエチルアミン、ピリジン、ジメチルアミノピリジン、酢酸アンモニウム等が、有機塩としてはリン酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、ホウ酸ナトリウム及び酢酸ナトリウム等が挙げられる。また、脱水縮合触媒としては、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩等が挙げられる。触媒の量は、例えば上記のリン脂質化合物１モルに対して０．５〜１０倍モル、好ましくは１〜５倍モルである。反応温度は通常２０〜９０℃、好ましくは４０〜８０℃である。反応時間は１時間以上、好ましくは２〜８時間である。２０℃より低温では反応率が低い場合があり、９０℃より高温では反応に用いる式（４）で表されるリン脂質化合物のアシル基が加水分解する場合がある。
【００２７】
式（４）で表されるリン脂質化合物の添加量は、構成単位Ａと構成単位Ｂからなる共重合体（ＣＰ）の平均分子量に対して１〜５モル、好ましくは１〜４モル、より好ましくは１〜２モルである。リン脂質化合物の添加量が多すぎると、該共重合体に結合するリン脂質が増えてリポソームの形成が困難になる場合があり、界面活性剤としてはミセルの構成が困難になる場合がある。また、リン脂質化合物の添加量が少なすぎると界面活性剤として親油性基の割合が少なくなりすぎるので、界面活性剤としてのミセルの構成が期待できなくなる場合がある。
【００２８】
本発明のリン脂質誘導体は、脂溶性物質のため界面活性剤として可溶化、乳化、又は分散を行うことができ、あるいは化粧料分野における界面活性剤として用いることができ、さらには脂質膜構造体を形成するためのリン脂質として用いることができる。脂質膜構造体として、リポソームとして用いることが好適である。可溶化できる脂溶性物質は特に限定されないが、例えば高級アルコール、エステル油、トリグリセリン、トコフェロール、及び高級脂肪酸等が挙げられる。化粧料分野における分散剤としての使用形態も特に限定されないが、例えば、アスコルビン酸等の水溶性物質を脂質二重膜に保持しておく場合などにおいて、本発明の化合物を脂質膜構造形成剤として用いることにより、より安定に対象物質を水溶液中に分散できる。界面活性剤及び分散剤として用いる場合、添加量としては可溶化、分散、乳化などの対象となる物質の全質量に対して０．１〜２０質量％、好ましくは０．５〜７質量％、より好ましくは０．５〜５質量％である。
【００２９】
また、本発明のリン脂質誘導体は、ｐＨ感受性リン脂質として、例えば分散剤として使用することができる。カチオン性の物質、例えばカチオン性の生理活性物質等や塩基性物質などを水中に分散する場合、例えばカチオン性物質又は塩基性物質を含む微粒子等の表面を上記化合物で被覆することにより、水中に安定に分散することができる。本発明のリン脂質誘導体は、ポリアニオン性基を有するのでイオン結合により安定に分散することができる。
【００３０】
脂質膜構造体中への本発明のリン脂質誘導体の配合量は、医薬の薬効を生体内で有効に発現させるのに充分な量であればよく、特に限定されることはない。例えば、脂質膜構造体に保持させるべき医薬の種類、治療や予防などの用途、脂質膜構造体の形態などにより適宜選択可能である。本発明により提供される脂質膜構造体に保持される医薬の種類は特に限定されないが、例えば、抗腫瘍剤として用いられる化合物が好ましい。これら化合物としては、例えば、塩酸イリノテカン、塩酸ノギテカン、エキサテカン、ＲＦＳ−２０００、Ｌｕｒｔｏｔｅｃａｎ、ＢＮＰ−１３５０、Ｂａｙ−３８３４４１、ＰＮＵ−１６６１４８、ＩＤＥＣ−１３２、ＢＮ−８０９１５、ＤＢ−３８、ＤＢ−８１、ＤＢ−９０、ＤＢ−９１、ＣＫＤ−６２０、Ｔ−０１２８、ＳＴ−１４８０、ＳＴ−１４８１、ＤＲＦ−１０４２、ＤＥ−３１０等のカンプトテシン誘導体、ドセタキセル水和物、パクリタキセル、ＩＮＤ−５１０９、ＢＭＳ−１８４４７６、ＢＭＳ−１８８７９７、Ｔ−３７８２、ＴＡＸ−１０１１、ＳＢ−ＲＡ−３１０１２、ＳＢＴ−１５１４、ＤＪ−９２７等のタキサン誘導体、イホスファミド、塩酸ニムスチン、カルボコン、シクロホスファミド、ダカルバジン、チオテパ、ブスルファン、メルファラン、ラニムスチン、リン酸エストラムスチンナトリウム、６−メルカプトプリンリボシド、エノシタビン、塩酸ゲムシタビン、カルモフール、シタラビン、シタラビンオクホスファート、テガフール、ドキシフルリジン、ヒドロキシカルバミド、フルオロウラシル、メトトレキサート、メルカプトプリン、リン酸フルダラビン、アクチノマイシンＤ、塩酸アクラルビシン、塩酸イダルビシン、塩酸エビルビシン、塩酸ダウノルビシン、塩酸ドキソルビシン、塩酸ピラルビシン、塩酸ブレオマイシン、ジノスタチンスチマラマー、ネオカルチノスタチン、マイトマイシンＣ、硫酸ブレオマイシン、硫酸ペプロマイシン、エトポシド、酒石酸ビノレルビン、硫酸ビンクリスチン、硫酸ビンデシン、硫酸ビンブラスチン、塩酸アムルビシン、ゲフィニチブ、エキセメスタン、カペシタビン、ＴＮＰ−４７０、ＴＡＫ−１６５、ＫＷ−２４０１、ＫＷ−２１７０、ＫＷ−２８７１、ＫＴ−５５５５、ＫＴ−８３９１、ＴＺＴ−１０２７、Ｓ−３３０４、ＣＳ−６８２、ＹＭ−５１１、ＹＭ−５９８、ＴＡＴ−５９、ＴＡＳ−１０１、ＴＡＳ−１０２、ＴＡ−１０６、ＦＫ−２２８、ＦＫ−３１７、Ｅ７０７０、Ｅ７３８９、ＫＲＮ−７００、ＫＲＮ−５５００、Ｊ−１０７０８８、ＨＭＮ−２１４、ＳＭ−１１３５５、ＺＤ−０４７３等を挙げることができる。
【００３１】
また、本発明の脂質膜構造体には遺伝子などを封入してもよい。遺伝子としては、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ及びＲＮＡのいずれでもよく、特に形質転換等のイン・ビトロにおける導入用遺伝子や、イン・ビボで発現することにより作用する遺伝子、例えば、遺伝子治療用遺伝子、実験動物や家畜等の産業用動物の品種改良に用いられる遺伝子を挙げることができる。遺伝子治療用遺伝子としては、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、酵素、サイトカイン等の生理活性物質をコードする遺伝子等を挙げることができる。
【００３２】
上記の脂質膜構造体は、さらにリン脂質、コレステロール、コレスタノール等のステロール類、その他の炭素数８〜２４の飽和及び不飽和のアシル基を有する脂肪酸類、α−トコフェロール等の酸化防止剤を含んでいてもよい。リン脂質としては、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファリジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、スフィンゴミエリン、セラミドホスホリルエタノールアミン、セラミドホスホリルグリセロール、セラミドホスホリルグリセロールホスファート、１、２−ジミリストイル−１，２−デオキシホスファチジルコリン、プラスマロゲン及びホスファチジン酸等を挙げることができ、これらは１種又は２種以上を組み合わせて用いることができる。これらのリン脂質の脂肪酸残基は特に限定されないが、例えば、炭素数１２から２０の飽和又は不飽和の脂肪酸残基を挙げることができ、具体的には、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸等の脂肪酸由来のアシル基を挙げることができる。また、卵黄レシチン及び大豆レシチンのような天然物由来のリン脂質を用いることもできる。
【００３３】
本発明の脂質膜構造体の形態及びその製造方法は特に限定されないが、存在形態としては、例えば、乾燥した脂質混合物形態、水系溶媒に分散した形態、さらにこれを乾燥させた形態や凍結させた形態等を挙げることができる。乾燥した脂質混合物の形態の脂質膜構造体は、例えば、使用する脂質成分をいったんクロロホルム等の有機溶媒に溶解させ、次いでエバポレータによる減圧乾固や噴霧乾燥機による噴霧乾燥を行うことによって製造することができる。脂質膜構造体が水系溶媒に分散した形態としては、一枚膜リポソーム、多重層リポソーム、Ｏ／Ｗ型エマルション、Ｗ／Ｏ／Ｗ型エマルション、球状ミセル、ひも状ミセル、不定型の層状構造物などを挙げることができるが、これらのうちリポソームが好ましい。分散した状態の脂質膜構造体の大きさは特に限定されないが、例えば、リポソームやエマルションの場合には粒子径が５０ｎｍから５μｍであり、球状ミセルの場合、粒子径が５ｎｍから１００ｎｍである。ひも状ミセルや不定型の層状構造物の場合は、その１層あたりの厚みが５ｎｍから１０ｎｍでこれらが層を形成していると考えればよい。
【００３４】
水系溶媒（分散媒）の組成も特に限定されず、例えば、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝化生理食塩液等の緩衝液、生理食塩水、細胞培養用の培地などであってもよい。これらの水系溶媒に対して脂質膜構造体を安定に分散させることができるが、さらにグルコース、乳糖、ショ糖などの糖水溶液、グリセリン、プロピレングリコールなどの多価アルコール水溶液等を加えてもよい。この水系溶媒に分散した脂質膜構造体を安定に長期間保存するには、凝集などの物理的安定性の面から、水系溶媒中の電解質を極力なくすことが望ましい。また、脂質の化学的安定性の面から、水系溶媒のｐＨを弱酸性から中性付近（ｐＨ３．０から８．０）に設定したり、窒素バブリングにより溶存酸素を除去することが望ましい。さらに凍結乾燥保存や噴霧乾燥保存をする場合には、例えば糖水溶液を凍結保存するに際して糖水溶液や多価アルコール水溶液をそれぞれ用いると効果的な保存が可能である。これらの水系溶媒の濃度は特に限定されるべきものではないが、例えば、糖水溶液においては、２〜２０％（Ｗ／Ｖ）が好ましく、５〜１０％（Ｗ／Ｖ）がさらに好ましい。また、多価アルコール水溶液においては、１〜５％（Ｗ／Ｖ）が好ましく、２〜２．５％（Ｗ／Ｖ）がさらに好ましい。緩衝液においては、緩衝剤の濃度が５〜５０ｍＭが好ましく、１０〜２０ｍＭがさらに好ましい。水系溶媒中の脂質膜構造体の濃度は特に限定されないが、脂質膜構造体における脂質総量の濃度は、０．１ｍＭ〜５００ｍＭが好ましく、１ｍＭ〜１００ｍＭがさらに好ましい。
【００３５】
脂質膜構造体が水系溶媒に分散した形態は、上記の乾燥した脂質混合物を水系溶媒に添加し、さらにホモジナイザー等の乳化機、超音波乳化機、高圧噴射乳化機等により乳化することで製造することができる。また、リポソームを製造する方法としてよく知られている方法、例えば逆相蒸発法などによっても製造することもでき、分散体の製造方法は特に限定されることはない。脂質膜構造体の大きさを制御したい場合には、孔径のそろったメンブランフィルター等を用いて、高圧下でイクストルージョン（押し出し濾過）を行えばよい。
【００３６】
上記の水系溶媒に分散した脂質膜構造体を乾燥させる方法としては、通常の凍結乾燥や噴霧乾燥を挙げることができる。この際の水系溶媒としては、上記したように糖水溶液、好ましくはショ糖水溶液、乳糖水溶液を用いるとよい。水系溶媒に分散した脂質膜構造体をいったん製造した上でさらに乾燥すると、脂質膜構造体の長期保存が可能となるほか、この乾燥した脂質膜構造体に医薬水溶液を添加すると、効率よく脂質混合物が水和されるために医薬を効率よく脂質膜構造体に保持させることができるといったメリットがある。例えば、脂質膜構造体に医薬を添加することにより医薬組成物を製造することができ、該脂質膜構造体は疾病の治療及び／又は予防のための医薬組成物として用いることができる。医薬が遺伝子の場合は、遺伝子導入用キットとして用いることも可能である。
【００３７】
医薬組成物の形態としては、脂質膜構造体と医薬とが混合された形態のほか、該脂質膜構造体に医薬が保持された形態でもよい。ここでいう保持とは、医薬が脂質膜構造体の膜の中、表面、内部、脂質層中、及び／又は脂質層の表面に存在することを意味する。医薬組成物の存在形態及びその製造方法は、脂質膜構造体と同様に特に限定されることはないが、例えば、存在形態としては、混合乾燥物形態、水系溶媒に分散した形態、さらにこれを乾燥させた形態や凍結させた形態が挙げられる。
【００３８】
脂質類と医薬との混合乾燥物は、例えば、使用する脂質類成分と医薬とをいったんクロロホルム等の有機溶媒で溶解させ、次にこれをエバポレータによる減圧乾固や噴霧乾燥機による噴霧乾燥を行うことにより製造することができる。脂質膜構造体と医薬との混合物が水系溶媒に分散した形態としては、多重層リポソーム、一枚膜リポソーム、Ｏ／Ｗ型エマルション、Ｗ／Ｏ／Ｗ型エマルション、球状ミセル、ひも状ミセル、不定形の層状構造物などを挙げることができるが、特に限定されることはない。混合物としての大きさ（粒子径）や水系溶媒の組成なども特に限定されることはないが、例えばリポソームの場合には５０ｎｍ〜２μｍ、球状ミセルの場合は５〜１００ｎｍ、エマルジョンを形成する場合は５０ｎｍ〜５μｍである。混合物としての水系溶媒における濃度も特に限定はされることはない。なお、脂質膜構造体と医薬との混合物が水系溶媒に分散した形態の製造方法としてはいくつかの方法が知られており、通常は脂質膜構造体と医薬との混合物の存在様式に応じて下記のように適宜の製造方法を選択する必要がある。
【００３９】
製造方法１
上記の脂質類と医薬との混合乾燥物に水系溶媒を添加し、さらにホモジナイザー等の乳化機、超音波乳化機、高圧噴射乳化機等による乳化を行う方法である。大きさ（粒子径）を制御したい場合には、さらに孔径のそろったメンブランフィルターを用いて、高圧力下でイクストルージョン（押し出し慮過）を行えばよい。この方法の場合には、まず脂質類と医薬との混合乾燥物を作るために、医薬を有機溶媒に溶解する必要があるが、医薬と脂質膜構造体との相互作用を最大限に利用できるメリットがある。すなわち、脂質膜構造体が層状構造を有する場合にも、医薬は多重層の内部にまで入り込むことが可能であり、一般的にこの製造方法を用いると医薬の脂質膜構造体への保持率を高くすることができる。
【００４０】
製造方法２
脂質類成分を有機溶媒でいったん溶解後、有機溶媒を留去した乾燥物に、さらに医薬を含む水系溶媒を添加して乳化する方法である。大きさ（粒子径）を制御したい場合には、さらに孔径のそろったメンブランフィルターを用いて、高圧力下でイクストルージョン（押し出し慮過）を行えばよい。有機溶媒には溶解しにくいが、水系溶媒には溶解する医薬に適用できる。脂質膜構造体がリポソームの場合、内水相部分にも医薬を保持できる長所がある。
【００４１】
製造方法３
水系溶媒に既に分散したリポソーム、エマルション、ミセル、又は層状構造物などの脂質膜構造体に、さらに医薬を含む水系溶媒を添加する方法である。この方法の適用は水溶性の医薬に限定される。既にできあがっている脂質膜構造体に外部から医薬を添加する方法であるため、医薬が高分子の場合には、医薬は脂質膜構造体内部には入り込めず、脂質膜構造体の表面に結合した存在様式をとる場合がある。脂質膜構造体としてリポソームを用いた場合、この製造方法３を用いると、医薬がリポソーム粒子同士の間に挟まったサンドイッチ構造（一般的には複合体あるいはコンプレックスと呼ばれている。）をとることが知られている。この製造方法では、脂質膜構造体単独の水分散液をあらかじめ製造するため、乳化時の医薬の分解を考慮する必要がなく、大きさ（粒子径）の制御もたやすいので、製造方法１や製造方法２に比べて比較的製造が容易である。
【００４２】
製造方法４
水系溶媒に分散した脂質膜構造体をいったん製造した上でさらに乾燥させた乾燥物に、さらに医薬を含む水系溶媒を添加する方法である。この場合も製造方法３と同様に医薬は水溶性のものに限定される。製造方法３と大きく違う点は、脂質膜構造体と医薬との存在様式にある。すなわち、この製造方法４では、水系溶媒に分散した脂質膜構造体をいったん製造した上でさらに乾燥させた乾燥物を製造するために、この段階で脂質膜構造体は脂質膜の断片として固体状態で存在する。この脂質膜の断片を固体状態に存在させるために、前記したように水系溶媒として糖水溶液、好ましくはショ糖水溶液や乳糖水溶液を用いるのが好ましい。ここで、医薬を含む水系溶媒を添加すると、固体状態で存在していた脂質膜の断片は水の侵入とともに水和を速やかに始め、脂質膜構造体を再構成することができる。この時に、医薬が脂質膜構造体内部に保持された形態の構造体が製造できる。
【００４３】
製造方法３では、医薬が高分子の場合には、医薬は脂質膜構造体内部には入り込めず、脂質膜構造体の表面に結合した存在様式をとるが、製造方法４はこの点で大きく異なっている。この製造方法４は、脂質膜構造体単独の水分散液をあらかじめ製造するため、乳化時の医薬の分解を考慮する必要がなく、大きさ（粒子径）の制御もたやすいので、製造方法１や製造方法２に比べて比較的製造が容易であることが挙げられる。また、この他に、凍結乾燥あるいは噴霧乾燥を行うため、製剤としての保存安定性を保証しやすいこと、乾燥製剤を医薬水溶液で再水和しても大きさ（粒子径）を元にもどせること、高分子の医薬の場合でも脂質膜構造体内部に医薬を保持させやすいことなどが長所として挙げられる。
【００４４】
脂質膜構造体と医薬との混合物が水系溶媒に分散した形態を調製するための他の方法としては、リポソームを製造する方法としてよく知られる方法、例えば逆相蒸発法などを別途用いてもよい。大きさ（粒子径）を制御したい場合には、さらに孔径のそろったメンブランフィルターを用いて、高圧力下でイクストルージョン（押し出し慮過）を行えばよい。また、上記の脂質膜構造体と医薬との混合物が水系溶媒に分散した分散液をさらに乾燥させる方法としては、凍結乾燥や噴霧乾燥が挙げられる。この時の水系溶媒としては、脂質膜構造体単独の場合と同様に糖水溶液、好ましくはショ糖水溶液や乳糖水溶液を用いるとよい。上記の脂質膜構造体と医薬との混合物が水系溶媒に分散した分散液をさらに凍結させる方法としては、通常の凍結方法が挙げられるが、この時の水系溶媒としては、脂質膜構造体単独の場合と同様に、糖水溶液や多価アルコール水溶液を用いるとよい。
【００４５】
医薬組成物において配合し得る脂質は、使用する医薬の種類などに応じて適宜選択すればよいが、例えば、医薬が遺伝子以外の場合には医薬１質量部に対して０．１から１０００質量部が好ましく、０．５から２００質量部がより好ましい。また、医薬が遺伝子の場合には、医薬（遺伝子）１μｇに対して、１から５００ｎｍｏｌが好ましく、１０から２００ｎｍｏｌがより好ましい。
【００４６】
本発明の脂質膜構造体を含む医薬組成物の使用方法は、その形態に応じて適宜決定することが可能である。ヒト等に対する投与経路は特に限定されず、経口投与又は非経口投与のいずれでもよい。経口投与の剤形としては、例えば、錠剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤、カプセル剤、内服液剤等を挙げることができ、非経口投与の剤形としては、例えば、注射剤、点滴剤、点眼剤、軟膏剤、座剤、懸濁剤、パップ剤、ローション剤、エアゾール剤、プラスター剤等を挙げることができる。医薬の分野においては、これらのうち注射剤又は点滴剤が好ましく、投与方法としては、静脈注射、皮下注射、皮内注射などのほか、標的とする細胞や臓器に対しての局所注射が好ましい。また、化粧料の分野においては、化粧料の形態としては、具体的には、ローション、クリーム、化粧水、乳液、フォーム剤、ファンデーション、口紅、パック剤、皮膚洗浄剤、シャンプー、リンス、コンディショナー、ヘアトニック、ヘアリキッド、ヘアクリーム等を挙げることができる。
【実施例】
【００４７】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されるものではない。
【００４８】
製造例１  共重合体（ＣＰ）の製造
下記の化合物を攪拌装置と冷却管を備えた２Ｌフラスコ中で１Ｌのトルエンに溶解し、窒素雰囲気下に８０±２℃で７時間加熱し重合反応を行った。
ＣＨ2＝ＣＨＣＨ2Ｏ（Ｃ2Ｈ4Ｏ）11ＣＨ3  ５５６ｇ（１．０モル）
無水マレイン酸  １０３ｇ（１．０５モル）
ｔｅｒｔ−ブチルペルオキシ−２−エチルヘキサノエート  ４．３ｇ（０．０２モル）
次いで、トルエン及び未反応の無水マレイン酸を１．３〜４．０ＫＰａの減圧下に１００±１０℃で留去し、５２８ｇの共重合体Ｎｏ．１を得た。得られた共重合体Ｎｏ．１は茶色で透明な液体であり、動粘度は１００℃で２０６ｃＳｔ、鹸化価は１８２ＫＯＨｍｇ／ｇであった。
【００４９】
製造例２
下記の化合物を攪拌装置と冷却管を備えた５Ｌフラスコ中で２Ｌのトルエンに溶解し、窒素雰囲気下に８０±２℃で９時間加熱して重合を行った。
ＣＨ2＝ＣＨＣＨ2Ｏ（Ｃ2Ｈ4Ｏ）33ＣＨ3  １５２４ｇ（１．０モル）
無水マレイン酸  １０３ｇ（１．０５モル）
ｔｅｒｔ−ブチルペルオキシ−２−エチルヘキサノエート  １０．８ｇ（０．０５モル）
次いで、トルエン及び未反応の無水マレイン酸を１．３〜４．０ＫＰａの減圧下に１１０±１０℃で留去し、１５１８ｇの共重合体Ｎｏ．２を得た。得られた共重合体Ｎｏ．２は２５℃において茶色の固体であり、鹸化価は４９．２ＫＯＨｍｇ／ｇであった。
【００５０】
製造例３〜８
表１に示された式（１）で示される化合物ならびに表２に示された無水マレイン酸及び触媒を表１及び表２で示されたモル比とした以外は製造例２と同様にして共重合体Ｎｏ．３〜Ｎｏ．８を調製した。共重合体Ｎｏ．３〜Ｎｏ．８の質量平均分子量、鹸化価、形状及び有機溶剤に対する溶解性などの特性を表３に示す。
【００５１】
【表１】
0004808403.tif 000004
【００５２】
【表２】
0004808403.tif 000005
【００５３】
【表３】
0004808403.tif 000006
【００５４】
実施例１
共重合体Ｎｏ．１−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（１ｍｏｌ）付加体の合成
ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン７４８ｍｇ（１ｍｍｏｌ）を、攪拌装置を備えた１００ｍＬのフラスコ中で、トルエン５０ｍＬを加えて４０℃で攪拌し、さらに酢酸ナトリウム８２ｍｇ（１ｍｍｏｌ）を添加し、共重合体Ｎｏ．１を２１．９ｇ（０．９８ｍｍｏｌ）加えて４０℃で５時間反応を行った。反応終了の確認はＴＬＣにより行い、ニンヒドリン発色にてジステアロイルホスファチジルエタノールアミンが検出されなくなる点とした。冷却後、ろ過して未反応のジステアロイルホスファチジルエタノールアミンと酢酸ナトリウムとを除去し、トルエンを減圧留去することにより共重合体Ｎｏ．１−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン１９．８ｇを得た。
【００５５】
生成物の同定は、シリカゲルプレートを用いた薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によって行った。展開溶媒にはクロロホルムとメタノールの混合比が８５：１５体積比の混合溶媒を用い、ヨウ素蒸気にて発色させて既知量の標準物質との比較により含有物質の定量を行った。ＴＬＣにてＲｆ値０．０５付近に認められるジステアロイルホスファチジルエタノールアミンのスポットが消失した。生成物の確認はＩＲスペクトルにおいて、ホスファチジルエタノールアミンのアミノ基が共重合体Ｎｏ．１とアミド結合することにより、アミノ基の２９６０ｃｍ-1のピークが消失し、新たに２級アミドのピークが１７４０ｃｍ-1に見られることにより確認した。
【００５６】
実施例２
共重合体Ｎｏ．１−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（２ｍｏｌ）付加体の合成
ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン７４８ｍｇ（１ｍｍｏｌ）を、攪拌装置を備えた１００ｍLのフラスコ中で、トルエン５０ｍＬを加えて４０℃で攪拌し、さらに酢酸ナトリウム８２ｍｇ（１ｍｍｏｌ）を添加し、共重合体Ｎｏ．１を１１．０ｇ（０．５ｍｍｏｌ）加えて４０℃で５時間反応を行った。反応終了の確認は下記のＴＬＣにより行い、ニンヒドリン発色にてジステアロイルホスファチジルエタノールアミンが検出されなくなる点とした。冷却後、ろ過して未反応のジステアロイルホスファチジルエタノールアミンと酢酸ナトリウムを除去し、トルエンを減圧留去することにより共重合体Ｎｏ．１−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン１０．４ｇを得た。
【００５７】
生成物の同定は、シリカゲルプレートを用いた薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によって行った。展開溶媒にはクロロホルムとメタノールの混合比が８５：１５体積比の混合溶媒を用い、ヨウ素蒸気にて発色させて既知量の標準物質との比較により含有物質の定量を行った。ＴＬＣにてＲｆ値０．０５付近に見られるジステアロイルホスファチジルエタノールアミンのスポットが消失した。生成物の確認はＩＲスペクトルにおいて、ホスファチジルエタノールアミンのアミノ基が共重合体Ｎｏ．１とアミド結合することにより、アミノ基の２９６０ｃｍ-1のピークが消失し、新たに２級アミドのピークが１７４０ｃｍ-1に見られることにより確認した。
【００５８】
実施例３
共重合体Ｎｏ．２−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（１ｍｏｌ）付加体の合成
ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン７４８ｍｇ（１ｍｍｏｌ）を、攪拌装置を備えた１００ｍLのフラスコ中で、トルエン５０ｍＬを加えて４０℃で攪拌し、さらに酢酸ナトリウム８２ｍｇ（１ｍｍｏｌ）を添加し、共重合体Ｎｏ．２を２０．９ｇ（０．９９ｍｍｏｌ）加えて４０℃で５時間反応を行った。反応終了の確認は下記のＴＬＣにより行い、ニンヒドリン発色にてジステアロイルホスファチジルエタノールアミンが検出されなくなる点とした。冷却後、ろ過して未反応のジステアロイルホスファチジルエタノールアミンと酢酸ナトリウムを除去し、トルエンを減圧留去したのち、トルエン２０ｍＬを加え溶解し、ヘキサン１００ｍＬに滴下し、共重合体Ｎｏ．２−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミンの結晶を得た。結晶はろ過し真空乾燥することにより１９．３ｇの目的物の乾燥結晶を得た。
【００５９】
生成物の同定は、シリカゲルプレートを用いた薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によって行った。展開溶媒にはクロロホルムとメタノールの混合比が８５：１５体積比の混合溶媒を用い、ヨウ素蒸気にて発色させて既知量の標準物質との比較により含有物質の定量を行った。ＴＬＣにてＲｆ値０．０５付近に見られるジステアロイルホスファチジルエタノールアミンのスポットが消失した。生成物の確認はＩＲスペクトルにおいて、ホスファチジルエタノールアミンのアミノ基が共重合体Ｎｏ．１とアミド結合することにより、アミノ基の２９６０ｃｍ-1のピークが消失し、新たに２級アミドのピークが１７４０ｃｍ-1に見られることにより確認した。
【００６０】
実施例４
共重合体Ｎｏ．２−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（２ｍｏｌ）付加体の合成
ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン７４８ｍｇ（１ｍｍｏｌ）を、攪拌装置を備えた１００ｍLのフラスコ中で、トルエン５０ｍＬを加えて４０℃で攪拌し、さらに酢酸ナトリウム８２ｍｇ（１ｍｍｏｌ）を添加し、共重合体Ｎｏ．２を１０．５ｇ（０．５ｍｍｏｌ）加えて４０℃で５時間反応を行った。反応終了の確認は下記のＴＬＣにより行い、ニンヒドリン発色にてジステアロイルホスファチジルエタノールアミンが検出されなくなる点とした。冷却後、ろ過して未反応のジステアロイルホスファチジルエタノールアミンと酢酸ナトリウムを除去し、トルエンを減圧留去したのち、トルエン２０ｍＬを加え溶解し、ヘキサン１００ｍＬに滴下し、共重合体Ｎｏ．２−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミンの結晶を得た。結晶はろ過し真空乾燥することにより１０．０ｇの目的物の乾燥結晶を得た。
【００６１】
生成物の同定は、シリカゲルプレートを用いた薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によって行った。展開溶媒にはクロロホルムとメタノールの混合比が８５：１５体積比の混合溶媒を用い、ヨウ素蒸気にて発色させて既知量の標準物質との比較により含有物質の定量を行った。ＴＬＣにてＲｆ値０．０５付近に見られるジステアロイルホスファチジルエタノールアミンのスポットが消失した。生成物の確認はＩＲスペクトルにおいて、ホスファチジルエタノールアミンのアミノ基が共重合体Ｎｏ．１とアミド結合することにより、アミノ基の２９６０ｃｍ-1のピークが消失し、新たに２級アミドのピークが１７４０ｃｍ-1に見られることにより確認した。
【００６２】
実施例５
共重合体Ｎｏ．５−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（２ｍｏｌ）付加体の合成
ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン７４８ｍｇ（１ｍｍｏｌ）を、攪拌装置を備えた１００ｍLのフラスコ中で、トルエン５０ｍＬを加えて４０℃で攪拌し、さらに酢酸ナトリウム８２ｍｇ（１ｍｍｏｌ）を添加し、共重合体Ｎｏ．５を１０．４ｇ（０．４９ｍｍｏｌ）加えて４０℃で５時間反応を行った。反応終了の確認は下記のＴＬＣにより行い、ニンヒドリン発色にてジステアロイルホスファチジルエタノールアミンが検出されなくなる点とした。冷却後、ろ過して未反応のジステアロイルホスファチジルエタノールアミンと酢酸ナトリウムを除去し、トルエンを減圧留去することにより共重合体Ｎｏ．５−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン１０．１ｇを得た。
【００６３】
生成物の同定は、シリカゲルプレートを用いた薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によって行った。展開溶媒にはクロロホルムとメタノールの混合比が８５：１５体積比の混合溶媒を用い、ヨウ素蒸気にて発色させて既知量の標準物質との比較により含有物質の定量を行った。ＴＬＣにてＲｆ値０．０５付近に見られるジステアロイルホスファチジルエタノールアミンのスポットが消失した。生成物の確認はＩＲスペクトルにおいて、ホスファチジルエタノールアミンのアミノ基が共重合体Ｎｏ．１とアミド結合することにより、アミノ基の２９６０ｃｍ-1のピークが消失し、新たに２級アミドのピークが１７４０ｃｍ-1に見られることにより確認した。
【００６４】
実施例６
共重合体Ｎｏ．５−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（１ｍｏｌ）付加体の合成
ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン７４８ｍｇ（１ｍｍｏｌ）を、攪拌装置を備えた１００ｍLのフラスコ中で、トルエン５０ｍＬを加えて４０℃で攪拌し、さらに酢酸ナトリウム８２ｍｇ（１ｍｍｏｌ）を添加し、共重合体Ｎｏ．４を９０．９ｇ（０．９９ｍｍｏｌ）加えて４０℃で８時間反応を行った。反応終了の確認は下記のＴＬＣにより行い、ニンヒドリン発色にてジステアロイルホスファチジルエタノールアミンが検出されなくなる点とした。冷却後、ろ過して未反応のジステアロイルホスファチジルエタノールアミンと酢酸ナトリウムを除去し、トルエンを減圧留去することにより共重合体Ｎｏ．４−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン８５．４ｇを得た。
【００６５】
生成物の同定は、シリカゲルプレートを用いた薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によって行った。展開溶媒にはクロロホルムとメタノールの混合比が８５：１５体積比の混合溶媒を用い、ヨウ素蒸気にて発色させて既知量の標準物質との比較により含有物質の定量を行った。ＴＬＣにてＲｆ値０．０５付近に見られるジステアロイルホスファチジルエタノールアミンのスポットが消失した。生成物の確認はＩＲスペクトルにおいて、ホスファチジルエタノールアミンのアミノ基が共重合体Ｎｏ．１とアミド結合することにより、アミノ基の２９６０ｃｍ-1のピークが消失し、新たに２級アミドのピークが１７４０ｃｍ-1に見られることにより確認した。
【００６６】
実施例７：化粧水の調整（可溶化剤としての評価）
合成例６の共重合体Ｎｏ．５−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（１ｍｏｌ）付加物を使用して化粧水を作成した。表４の組成からなる基材のうち精製水にグリセリン、プロピレングリコールを加え均一に溶解した。その他の基材をエタノールに加え均一にした後、前述の精製水相部に攪拌しながら添加し可溶化し化粧水を得た。
【００６７】
【表４】
0004808403.tif 000007
【００６８】
実施例８：リポソーム乳液の調整（化粧料用分散剤としての評価）
リポソーム調製法
大豆水添ホスファチジルコリン６４５ｍｇ、コレステロール２９９ｍｇ及びミリスチン酸２３ｍｇ（モル比１：１：０．１）及び共重合体Ｎｏ．２−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（１ｍｏｌ）付加物を混合脂質濃度５ｍｏｌ％となるように加えて、予め６０℃に加温した生理食塩水１０〜１１ｍＬを混合脂質濃度１０質量％となるように加えて攪拌し、さらに６０℃の水浴中でホモゲナイザーにて１０分間混合しリポソーム溶液を得た。そのリポソーム溶液を用いて表５の組成からなる基材のうち乳化剤を含む油相部を６０℃に加温し均一に溶解した後、攪拌しながら水相部を同温度で添加しリポソーム乳液を得た。
【００６９】
【表５】
0004808403.tif 000008
【００７０】
実施例９：血中滞留性リポソームとしての評価
（１）リポソームの調製
表６に示した膜組成比率（処方例１〜６、対照例１〜２）の脂質を各々秤取し、クロロホルム・メタノール混液（２：１）に溶解させた後、エバポレーターにより有機溶媒を留去し、さらに１時間減圧乾固させた。次に、この脂質乾燥物（リピドフィルム）に、予め６５℃に加温しておいた１５５ｍＭ硫酸アンモニウム水溶液（ｐＨ５．５）１０ｍＬを加え、湯浴につけながらボルテックスミキサーにて軽く撹拌した（ナスフラスコから脂質が剥がれる程度まで）。この脂質分散液をホモジナイザーに移して、１０ｓｔｒｏｋｅホモジナイズした後、種々孔径のポリカーボネートメンブレンフィルターを用いてサイジング（０．２μｍ×３回、０．１μｍ×３回、０．０５μｍ×３回及び０．０３μｍ×３回）を行い、粒子径１００ｎｍ前後の空リポソーム分散液を調製した。
【００７１】
この空リポソーム分散液４ｍＬを生理食塩水で２．５倍希釈し、この希釈したリポソーム分散液を超遠心用チューブに入れ、６５,０００ｒｐｍで１時間遠心分離した後、上清を捨て、生理食塩水で遠心前のリポソーム分散液量１０ｍＬになるように再懸濁させた（この時点で、トータル脂質濃度として５０ｍＭとなるよう調整した）。上記の外水相を生理食塩水に置換した空リポソーム分散液（トータル脂質濃５０ｍＭ）及びドキソルビシン溶液（医薬濃度：３．３ｍｇ／ｍＬ 生理食塩水）を予め６０℃に加温しておき、容量比で空リポソーム分散液４に対しドキソルビシン溶液６を加えた後(最終医薬濃度は２．０ｍｇ／ｍＬ、最終脂質濃度は２０ｍＭ)、１時間、６０℃でインキュベートした。次いでこれを室温にて冷却し、ドキソルビシン含有リポソーム分散液とした。
【００７２】
（２）リポソームの物性
ドキソルビシンのリポソームへの保持率は、上記リポソーム分散液の一部を取ってゲル濾過（セファデックスＧ−５０；移動相は生理食塩水）を行い、ボイドボリュームに溶出したリポソーム分画中のドキソルビシンを液体クロマトグラフィーにて定量することにより求めた。また粒子径は、上記リポソーム分散液の一部を取って準弾性光散乱（ＱＥＬＳ）法にて測定した。その結果、表６に示すように、処方例４及び５以外のリポソームでは、主薬ドキソルビシンの保持率がほぼ１００％であったため、元のリポソーム分散液をそのまま用い、以下に示すラットでの血中滞留性実験用に生理食塩水にて４／３倍希釈した（最終医薬濃度は１．５ｍｇ／ｍＬ、最終脂質濃度は１５ｍＭ）。また、処方例４及び５のリポソームは、超遠心分離（６５,０００ｒｐｍ、１時間）操作を行い、上清の未封入薬物を除去した後、生理食塩水にて最終薬物濃度が１．５ｍｇ／ｍＬとなるように調製した（最終脂質濃度は処方例４が約１７．２ｍＭ、処方例５が約１７．９ｍＭ）。なお、いずれのリポソームもその粒子径は５０〜１００ｎｍであった。
【００７３】
（３）ラットでの血中滞留性実験
上記処方例１〜６、対照例１〜２を用いて、ＳＤ系雄性ラット（６週令）における血中滞留性実験を行った。エーテル麻酔下でラット頸静脈より各リポソーム分散液を投与し（１群５匹；投与量は７．５ｍｇドキソルビシン／５ｍＬ／ｋｇ）、その後、各採血時点（２、４、８、２４、４８、７２、１２０、１６８時間）でエーテル麻酔下、頸静脈よりヘパリン採血（０．５〜１ｍＬ）を行い、血漿分離を行った。その後、常法に従い、前処理してＨＰＬＣ法にて血漿中医薬濃度を測定した。各リポソーム分散液処方の血漿中医薬濃度から台形法にてＡＵＣ（０〜∞）を算出した。表６に示すように、対照例１の本発明の脂質誘導体を含まないリポソーム、あるいは対照例２の本発明の脂質誘導体のリン脂質部分（ＤＳＰＥ；ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン）のみを添加したリポソームのＡＵＣに比して、本発明のリン脂質誘導体を含むリポソーム処方（処方例１〜６）では１オーダー以上大きなＡＵＣが得られ、明らかに高い血中滞留性が認められた。
【００７４】
【表６】
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【産業上の利用可能性】
【００７５】
本発明のリン脂質誘導体は生体に対して安全性が高く、化粧料の分野などにおける界面活性剤、可溶化剤、又は分散剤として有用である。また、本発明のリン脂質誘導体は、リポソームなどの脂質膜構造体の製造のために用いることができ、本発明のリン脂質誘導体を含む脂質膜構造体、好ましくはリポソームは、血中滞留性に優れるという特徴がある。