(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリマー表面および該ポリマー表面に固定化されたリンカー-作用物質-コンジュゲートを含有する血液適合性表面であって、
該ポリマー表面がポリアルキルメタクリレート表面であり、
該リンカーが、水素ブリッジ結合を形成し得る構造要素としてヒドロキシル基を有するポリアルキレングリコールであり、
該作用物質としてポリオルガノシロキサンがリンカーに結合した血液適合性表面。
【請求項２】
作用物質としてジメチルポリシロキサンを使用する請求項１記載の表面。
【請求項３】
別のリンカー-作用物質-コンジュゲートを固定するための付加的な自由な配位部位を含む請求項１または２記載の表面。
【請求項４】
付加的なリンカー-作用物質-コンジュゲートが表面の作用物質に血液適合性と共に生活性を付与する請求項１から３いずれかに記載の表面。
【請求項５】
請求項１から４いずれかに記載の血液適合性表面を有するプラスチック製品。
【請求項６】
請求項１から４いずれかに記載の血液適合性表面を有する医療用装置または器具。
【請求項７】
試験容器、血液チューブ、カテーテル、透析器または構成部品の形態である請求項６記載の装置または器具。
【請求項８】
請求項１から４いずれかに記載の血液適合性表面を有するステント(stent)材料または移植材料。
【請求項９】
ポリマー表面をリンカー-作用物質-コンジュゲートと接触させることを含む請求項１から４いずれかに記載の血液適合性表面の製造方法。
【請求項１０】
リンカー-作用物質-コンジュゲートの溶液中でポリマー表面をインキュベートすることを含む請求項９記載の方法。
【請求項１１】
リンカー-作用物質-コンジュゲートの濃度を、得られる血液適合性表面が自由な配位部位を有するように調整する請求項９または１０記載の方法。
【請求項１２】
表面の被覆中または被覆後に、被覆密度を高めるために、付加的に外部からエネルギーを供給する請求項９または１０記載の方法。
【請求項１３】
エネルギーの供給を高圧下での加熱またはγ-線照射によっておこない請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
請求項１から４いずれかに記載の血液適合性表面を有する材料の使用であって、ヒトの体外でのヒト血液の貯蔵、輸送または検査における該材料の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（背景技術）
合成樹脂は、医療において種々の形態で用いられている。従って、合成樹脂表面と生体の細胞の間の交換作用および合成樹脂表面の生体適合性の改善についての研究は、３０年以上前からの集中的研究活動の対象であった。しかし、ポリマーの表面を、血液および血液構成要素がポリマー表面に結び付かないように作ることは、未だに成功していない。これは、合成樹脂表面に付着した後に特に血液凝固などの活性化過程に至る例えば血小板などの極めて活性な血液細胞に関係する。
【０００２】
（発明の開示）
（発明が解決しようとする技術的課題）
表面電荷を変化させたり、マイクロドメイン構造を形成したり、あるいは新しいポリマー混合物およびコポリマーを導入することによって、この分野で幾らかの進歩が達成されている。しかし、必要とされる血液および蛋白質に適合した持続的な表面の供給の実現は、未だ達成されていない。この目的を達成するには、公開国際出願WO 98/46648号で知られた相互作用システムに関する発明が役に立ち、この相互作用システムは、例えばバイオアティブな物質を、特別なリンカーによって適合する合成樹脂表面に結合させることを可能にする。その際、リンカーを用いることによってポリマー材料上に固定される血小板および細胞の活性化を阻止するインヒビターを用いることが、上述の血液および蛋白質に適合した境界層を供給するための重要な前提となる。このような材料を合成樹脂表面に塗布することによって、特に蛋白質が、沈積物を形成するのを阻止できる。シリコンポリマーは、ガラスの表面に塗布されることによって、ガラスに高い血液適合性を与えることが知られている。その際用いられるシリコン油を有効な形態で合成樹脂表面に固定する試みは、今のところ失敗に終わっている。
【０００３】
（その解決方法）
本発明の境界層の形成を可能にする機能的な合成樹脂表面は、公開国際出願WO 98/46648にも述べられている。重合しうる二重結合または重縮合しうる機能基と共に、重合反応に関与しない、ケトンまたはカルボン酸誘導体の形態の更なるカルボニル基を含有する少なくとも１つのモノマータイプが製造に用いられるホモポリマーまたはコポリマーが用いられる。このポリマーは、構造式(Ａ)の構造要素を有するのが好ましい。
【化１】
0004837215.tif 000002
ここで、残基Ｒは、同じでも異なってもよく、アルキルまたはアリル残基あるいは水素原子を有する。アルキル残基は、直線状または分岐であり、１〜２０の炭素原子を有するのが好ましい。アリル残基は、６〜１８の、特に６〜１２の炭素原子を有するのが好ましい。残基Ｘは、任意基でＯ、Ｎ、ＣＨ2を表わす。Ｘ＝Ｎの場合、Ｘは、構造式(Ａ)に記した残基に加えて、先の定義とは無関係に定義される更なる残基Ｒを有する。
【０００４】
アルキル残基は、直鎖または分岐した、必要なら例えばメチル、エチル、プロピル残基などの置換されたＣ1-8-アルキル残基であるのが好ましい。必要に応じて存する置換基の例は、たとえばフッ素、塩素、臭素または沃素あるいはヒドロキシル基、Ｃ1-6-アルキル残基またはＣ1-6-アルコキシ残基またはＣ1-6-アルキルチオール残基を含む。アリル残基は、単環または２環、必要によって置換された１つまたは複数のヘテロ原子を含み得るアリル残基であるのが特に好ましい。このようなアリル残基の例は、フェニル、１-または２-ナフチル、インデニル-またはイソインデニル残基である。ヘテロ原子を含むアリル残基の例は、Ｃ3-9-ヘテロアリル残基、酸素、硫黄、窒素原子のうちから選んだヘテロ原子を含む。単環のヘテロアリル残基は、例えばピロリル、フリル、ティエニル、イミダゾリル、Ｎ-メチルイミダゾリル、Ｎ-エチルイミダゾリル、ベンゾチアゾリルキナゾリニル、ナフチルピリジニル、キノリニル、イソキノリニルおよびテトラゾリル残基を含む。
【０００５】
（発明を実施するための最良の形態）
本発明の範囲内で適用できる好ましいポリマーは、例えばポリメチルメタクリレート(ＰＭＭＡ)、ポリエチルメタクリレート(ＰＭＭＡ)、ポリアクリルメタクリレート(ＰＥＭＡ)またはポリプロピルメタクリレートなどの好ましくは１〜６の炭素を含むアルキル残基を有するポリアルキルメタクリレート(ＰＡＭＡ)である。さらに、ポリビニルアセテート、ポリシクロヘキシルメタクリレートまたはポリフェニルメタクリレートを用いることができる。しかし、本発明の血液に適合した境界層は、ポリメチルメタクリレートを備えるのが好ましい。
【０００６】
コポリマーあるいは上記ポリマーを任意の混合比で混ぜた、または例えばポリスチロール、ポリアクリルニトリルまたはポリアミデンなどの１つまたは複数の付加ポリマー成分をもつポリマー混合物を用いることもできる。カルボニル基、好ましくは上記構造要素(Ａ)を有するモノマーまたは構造単位の割合は、上記混合物またはコポリマーにおいて少なくとも２０％、特に好ましくは少なくとも４０％、最も好ましくは少なくとも６０％である。
【０００７】
適用される表面の形態は、国際出願ＷＯ98/46648号に述べられているように決して制限されず、例えば平坦な構造、中空体、微小粒子または毛細管などを用いることができる。リンカーと作用物質との共役体の形成を容易化する微細多孔質の合成樹脂表面が、好んで用いられる。勿論、医療への適用では、用いられる合成樹脂の生理学的な適合性に留意されなければならない。
【０００８】
医療に用いられる物品や機器の多くは、上述のポリマーから作られ、それ故ここで説明した境界層を塗布した後、血液に適合した形態に準備されることができる。ここで、該当する製品の多様性は、合成樹脂粒子、血液バルーンシステム、カテーテル材料、透析器および透析膜のほか、代替外科で重要なステント材料や移植材料を含む。人体内および人体外で血液循環に曝される装置と並んで、試料血液と接触する表面または上記試料の更なる処理に用いられる(例えば試料容器や攪拌機の)表面は、塗布されることができる。上記製品や材料は、使用の直前あるいは既に製造直後に、血液に適合した境界層で被覆されうる。
【０００９】
活性化阻止体または凝集化阻止体を固定するために用いられる本発明によるリンカーは、同じまたは異なる少なくとも２つの機能基Ｌ１、Ｌ２を有する。この機能基の１つ(Ｌ１)は、水素架橋を形成できて、リンカーのポリマー表面への結合を可能にするものでなければならないが、このことは、適合した電子的または空間的構造を有するリンカーの他の下位ユニットが、上記結合の形成に関与することを除外しない。機能基Ｌ２は、リンカーと有効物質との結合を作ることが出来るように選ばれる。種々の有効物質をポリマー表面に同時に固定するために、種々の基Ｌ２をもつ多くのリンカーを同時に用いることが可能である。しかし、同じあるいは異なる２つまたはより多くの基Ｌ２をもつタイプのリンカーを用いる可能性も存在する。同様に、多くの同じまたは異なる基Ｌ１をもつリンカーを用いることもできる。Ｌ１とＬ２を特に酸素原子などのヘテロ原子で中断された分岐した、あるいは直線状のアルキル鎖で繋ぐのが好ましい。
【００１０】
構造要素Ｌ１は、例えばＯＨ-、ＳＨ-、ＮＨ-、ＰＨ-結合に存在する極性水素原子であるのが好ましい。用いられるリンカーは、構造要素Ｌ１としてヒドロキシル基を有するのが好ましい。この構造要素は、リンカーとしての十分に水溶性の結合に好ましく存在する。Ｌ１は、リンカーの末端に付加されるのが好ましい。
【００１１】
好ましくは共有結合物質である有効物質をリンカーに結合させることができる機能基(Ｌ２)は、例えばヒドロキシル-またはカルボキシル基あるいはスクシンイミジルスクシネート、スクシンイミジルプロピオナート、ニトロフェニルカーボナート、トリシラート、エポキシド、アルデヒド、イソシアネートまたはマレインイミドである。バイオアクティブな物質への結合のリンカーを変態させあるいは活性化させることができる機能基Ｌ２は、例えば35801米国アリゾナ州ハンツビル、スプリングブランシュ2307番に在るシアーウオーター・ポリマー社のカタログに記載されている。
【００１２】
例えば、生活性物質としての酵素とは異なり、本発明において血液適合性を得るためには、使用するポリオルガノシロキサンも安定である。ポリオルガノシロキサンは、末端に簡単な官能基を有していてもよいリンカー、例えば、ポリアルキレングリコールとその活性を失うことなく結合することができる。生活性物質とリンカーとの結合後、両方の成分間にエーテル結合またはエステル結合が形成されるのが好ましい。、
【００１３】
リンカーとしては、ポリアルキレングリコール、ポリアルキレンイミン、ポリアルキレンアミン、ポリアルキレンスルフィドおよびポリオキサジリンが好ましく、特にポリアルキレングリコールが好ましい。この種の化合物の平均重合度は好ましくは５０以下、特に好ましくは３０以下であり、下限は一般に１０、好ましくは２０である。この場合、上記の好ましい重合度はリンカーの構成成分の選択によって変化させることができる。ポリエチレングリコール（PEG）を使用するのが特に好ましい。この場合、L１およびL２はヒドロキシル基である。上記のリンカーは１〜５０kDaの分子量を有するのが好ましい。
【００１４】
プラスチック表面に対して所望の血液適合性を保証する有効な化合物としては、本発明の範囲内においては、直鎖状または分枝状であってもよいポリオルガノシロキサンが使用される。R3SiO(R2SiO)nSiR3で表されるポリ（ジアルキルシロキサン）を使用するのが好ましい。この式において、Rは同一もしくは異なっていてもよい基であって、水素原子または炭素原子数が１〜８、好ましくは１〜４、特に好ましくは１〜２のアルキル基を示す。nは、シロキサンの粘度が１０〜２５０００、好ましくは５００〜５０００mm2/sになるようにように選択される自然数を示す。既知の良好な生理学的適合性の観点からは、ジメチルポリシロキサン（Dimeticon）を使用するのが特に好ましい。この場合、上記の式において、RはCH3を示し、nは好ましくは１〜５０、特に好ましくは１〜２０の数を示す。
【００１５】
血小板または細胞の活性化に対する上記インヒビターは上述のリンカーと結合され、次いで、リンカー-作用物質-コンジュゲートとポリマー表面を接触させる。この場合、ジメチルポリシロキサンを添加するのが有利である。この理由は、該化合物のポリエチレングリコール化合物が既に市販されているからであり、このような市販品としては、ヒュルズ社製の製品「MN４２２１」、「MN４２１７」、「MN４２０５」および「MN４２１１」が例示される。
【００１６】
活性化抑制物質にリンカーを結合させた後、生成するコンジュゲートをポリマー表面へ結合させる。この結合は、リンカー-作用物質-コンジュゲートに適当なポリマー表面を単に接触させるだけで形成される。この場合、昇温または触媒もしくはその他の反応促進性試薬は不用である。このような結合は、例えば、ポリマー物質をコンジュゲートの好ましくは水溶液中でインキュベートすることによって形成させることができる。溶液中のコンジュゲートの最適濃度は、例えば、使用する成分の溶解度および目的とする表面被覆度等によって左右される。しかしながら、この濃度は、０．１μg/ml〜１００mg/ml、好ましくは、１〜１０mg/mlにする場合が多い。接触処理を数分間おこなった後、所望により生理的食塩水または緩衝溶液を用いてすすぐことによって表面のシリコン処理を完了する。
【００１７】
生成する界面で形成される結合は優れた安定性を有するので、水溶液中においては、pHを２〜１３の範囲で変動させても溶解しない。この結合は、高いイオン強度を有する塩溶液（２nグリシン、２n尿素）を用いる洗浄に対しても耐性を示す。従って、該結合は生理学的条件下において不可逆的に存在することができる。
【００１８】
被覆された表面上の結合密度は、リンカー-作用物質-コンジュゲートとの通常の条件下、例えば、室温条件下での接触後においても、著しく高い。この種の前処理プラスチックは、細胞状血液成分、特に血小板の活性化並びにその表面へのフィブリノーゲンやその他の蛋白質の結合を完全に防止する。別の実験によれば次のことが判明した。即ち、外部からのエネルギーを、例えば、オートクレーブ内での熱的処理（高温と加熱蒸気）、昇圧処理または照射殺菌装置内でのγ線照射処理によって供給する場合には、通常の条件下で達成される場合に比べて、驚くほど高い被覆密度と結合強度が達成される。
【００１９】
さらに、次のことが判明した。即ち、本発明による表面は、リガンド-作用物質-コンジュゲートで部分的に被覆した場合でも、血液に対して必要な中性表面をゆうする。この場合、リガンドを有する別の作用物質の上記の原理に従う結合が妨げられることはない。従って、通常の条件下で得られる最大の被覆密度に比べて多くても５０％の被覆密度の場合であっても、処理された表面の優れた血液適合性は保証される。最適な結果は、使用するシロキサンの構造に応じて、被覆密度が明らかに低いとき（約１０〜２０％）に得られる。非常に低い濃度のコンジュゲート溶液を使用する場合には、例えば、被覆反応の濃度制限によって、被覆密度は限定される。これによって、生体内の全血中での使用に対して重要な生適合性表面が得られる。このような表面は、国際公開公報WO９８/４６６４８に開示されている提案および/または別のリンカー-作用物質-コンジュゲートの除去に適用できる。従って、例えば、血液からペジル化された作用物質を取り出すことができる。この場合、曝された表面上での血液の凝固を伴うことはない。付加的な生活性な作用物質または認識物質としては、蛋白質、核酸、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ホルモン、酵素、抗体、炭水化物、その他の細胞状シグナル物質および問題となる免疫伝達物質等が例示される。
【００２０】
本発明による表面は、移植医療においても、使用する材料の適合性を著しく改善することに寄与する。この理由は、該表面の使用によって、組織と血液の界面において有害な反応、例えば、非特異的な炎症反応等が防止されるからである。リンカーと結合した作用物質がバイオミクロ環境を同時に提供するという可能性は、この種の材料の長期間使用に対して全く新しい手がかりをもたらす。
【００２１】
長期間の使用に対して特有の血液耐性と蛋白質耐性を示す本発明による表面は、医療製品だけでなく、衣料用の装置や器具に対しても重要である。従って、本発明によれば、この種の装置、例えば、長期用カテーテルの蛋白質化を防止することができる。該蛋白質化はバクテリアに対して理想的な培地を提供するので、付随的な感染を助長する。本発明による境界層は、適当なプラスチック材料を菌または微生物に対して耐性を示すように改良された形態で使用に供することを可能にする。
【００２２】
蛋白質含有試料、特に血液試料または循環する全血に対して完全な適合性を示すだけでなく、本発明による改良されたプラスチック表面は、固定化された作用物質の提供並びにリンカーに結合した作用物質もしくは認識構造体の結合および/または除去にも適している。従って、作用物質は、血路中へ直接的に導入でき、また、対応するリンカーと結合した後、血路から除去することができる。本発明による表面は、治療学や診断学の分野だけでなく、食餌療法学のような関連分野、および多様な新しい適応症や応用分野において新規な道を開拓するものである。
【００２３】
以下の実施例は、本発明による表面被覆層の有効性を例示的に説明するものである。実施例においては、ポリメチルケタクリレート粒子「モノディスパース」（粒径：５．９〜６．１μm；マイクロパーティックルズ社（ベルリン）製）、市販の透析器「BK 05 シリーズ」（トーレインダストリーズ社（東京）製；OF：０．５m2）および実験室用透析器｛表面積：１００cm2）を使用した。
【００２４】
試験例１
５％ポリメチルメタクリレート粒子溶液（粒子直径＝５．９−６．１μｍ）の５０μｌが、ＰＥＧジメチルポリシロキサン（ＭＮ４２０５）と、ロール振動機で１μｇ／ｍｌの濃度に１０分間混合される。その後、１０００ｇで３分間の短い遠心作用により粒子が沈降し、残った溶液が除去される。その後、粒子は、各々、１ｍｌのチロード（Tyrode）溶液で吸収されて、短時間攪拌され、沈降後にもう一回チロードで洗浄されて、更に使用するために、チロード溶液に収容される。
【００２５】
Ｒ−ヒルディン（R-Hirudin）が、試験管内で１０ｍｌの完全血と３００μｇ／ｍｌの濃度に混合される。この新鮮に分離された人血は、前にＰＥＧジメチルポリシロキサンと混合された沈降粒子と混合される。１５、２０、３０及び４０分後に、ロールミキサー内でよくかき混ぜた試料が、血小板測定のために、セルディン２０００分析器にかけられて、血小板数が検出される。比較のために、ＰＥＧジメチルポリシロキサンで被覆されていない粒子が使用される。被覆されていない粒子を有する懸濁液においては、多数の循環する血小板が結合していることが示される。次に、最初の１０分間以内に、試料内の血小板数が急激に減少し、血小板数は、この細胞数の底の後に逆方向の分解事象により再び上昇する。
それにもかかわらず、血液試料内で最大数の血小板がポリマー表面に付着している（＞９０％）。それに反して、ジメチルポリシロキサンで被覆された粒子を有する懸濁液では、この血小板数変化が明白でない。全試験時間中、血小板数は出力値の高さで示される。
【００２６】
試験例２
血液が反凝固された点を除いて例１と同じ試験条件で、別の試験が行われた。図１に、対応する結果が示されている。ＰＥＧジメチルポリシロキサン被覆のない粒子懸濁液において、血小板は、ＰＥＧヒルディン反凝固血液に対する追加後１０−１５分間以内に粒子に殆ど完全に付着する。３０分間以内に試料が凝固する。何故なら、ＰＥＧヒルディンが粒子と完全に結合するからである。
【００２７】
粒子とＰＥＧジメチルポリシロキサンの前処理において、血小板の減少が完全に阻止されるが、この試験においても、よく混合された試料は約４０分後に流れる。試料内のヒルディン濃度の測定において、６０分間を超える全試験時間中に２５−３０μｇ／ｍｌＲ−ヒルディンの一定のヒルディン血液濃度が明白であるＲ−ヒルディンを取扱う試料に反して、ＰＥＧヒルディン試料では、ＰＥＧヒルディン濃度の連続的な減少が明白であることが分る。３０分後にＰＥＧヒルディン濃度は３μｇ／ｍｌに減少し、４０分後に試料内にはＰＥＧヒルディンは全く含まれていない。
【００２８】
ここに記した試験から、微粒子とＰＥＧジメチルポリシロキサンの前処理により、０．１と１μｇ／ｍｌの間の濃度範囲において血小板の吸着が阻止されることが明らかである。それにもかかわらず、粒子表面に対するヒルディンの結合が妨害されない。ＰＥＧヒルディンが微粒子懸濁液に印加されるビトロ試験と比較して、ＰＥＧジメチルポリシロキサンの前処理によるＰＥＧヒルディン結合能力の減少は明白でない。更に、ＰＥＧジメチルポリシロキサンの前処理の後に付加的にＰＥＧヒルディンを結合した粒子に対するトロンビン結合が維持されるか否かが試験された。この試験例は図２に示されている。トロンビン親和性が殆ど完全に維持されていることが疑いなく示されている。
【００２９】
試験例３
１００ｃｍ２の表面を有する実験ＰＭＭＡ−透析器が、ビトロ循環装置を使って１μｇ／ｍｌの濃度のジメチルポリシロキサンで洗浄され、その後、チロード懸濁液で洗浄される。その後、毛管透析器が、ＰＥＧヒルディン反凝固の完全血（５０μｇ／ｍｌ）で再循環モデルに取扱われる。この試験においても、毛管表面に対するＰＥＧヒルディンの結合にもかかわらず、血小板数の減少が成立することが疑いなく示される。ＰＥＧヒルディンは大部分、透析器のＰＭＭＡ表面に結合するけれども、システムを３０分間を越えてかなりの圧力上昇を伴わずに再循環し得る。
【図面の簡単な説明】
【図１】  前処理されたPMMA粒子に対する血小板の経時的な被覆作用を示すグラフである。
【図２】  前処理されたPMMA粒子に対するトロンビンの経時的な結合作用を示すグラフである。
【図１】
0004837215.tif 000003
【図２】
0004837215.tif 000004