(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト腸粘膜に付着する能力を有する、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＨＥＡＬ ９、ＤＳＭ １５３１２であるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍの分離されたタンナーゼ産生株。
【請求項２】
ヒト腸粘膜に付着する能力を有する、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＨＥＡＬ １９、ＤＳＭ １５３１３であるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍの分離されたタンナーゼ産生株。
【請求項３】
ヒト腸粘膜に付着する能力を有する、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＨＥＡＬ ９９、ＤＳＭ １５３１６であるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍの分離されたタンナーゼ産生株。
【請求項４】
新規食品の製造のための、タンニンと組み合わせた、ヒト腸粘膜に付着する能力を有する、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＨＥＡＬ ９、ＤＳＭ １５３１２、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＨＥＡＬ １９、ＤＳＭ １５３１３、及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＨＥＡＬ ９９、ＤＳＭ １５３１６から選択されるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍのタンナーゼ産生株の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗炎症特性を有し、且つ、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける腸微生物叢への影響及びｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける保存特性を制御する組成物に関し、該組成物は、ヒト腸粘膜に付着する明白な能力を有するＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍの任意の新規なタンナーゼ産生株を含有する。
【背景技術】
【０００２】
タンニン（水溶液からタンパク質を沈殿し得る水溶性フェノール性産物として定義される）は天然に存在する化合物である。タンニンの２つのクラス、没食子酸及びエラグ酸から誘導される加水分解性タンニン、並びに、縮合型タンニンすなわち、プロアントシアニジン（これらは、フラバノールのオリゴマー及びポリマーである）が存在する。タンニンは、多数の微生物の成長を妨げ、微生物の攻撃に対して耐性がある。（Ｃｈｕｎｇ，  Ｋ．Ｔ．，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８），  Ｔａｎｎｉｎｓ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  ｈｅａｌｔｈ：Ａ  ｒｅｖｉｅｗ．  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  ３８：４２１−４６４）。糸状菌類（ｍｏｕｌｄｓ）及び酵母及び数種の好気性細菌は、通常タンニンを分解するのに最適であるが、例えば、胃腸管中で嫌気的な分解も起こる（Ｂｈａｔ，  Ｔ．Ｋ．，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８），  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔａｎｎｉｎｓ  −  Ａ  ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ．  Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ９：  ３４３−３５７）。
【０００３】
タンニンは、栄養阻害物質（ａｎｔｉｎｕｔｒｉｅｎｔｓ）として知られ、すなわち、それらは、身体が消化された栄養物を新たな生体物質に変換する効率を低下させる。しかしながら、タンニンの健康に有利な効果（例えば、抗発ガン性作用、血圧を低下させる及び免疫応答を調節する能力）も報告されてきた。これらの効果は、タンニンの抗酸化（ａｎｔｏｘｉｄａｔｉｖｅ）特性に起因しているかも知れない（Ｃｈｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  １９９８）。報告された抗発ガン特性を有する有効な抗酸化タンニンは、エラグ酸である。非常に高い抗酸化能を有するタンニンの別のタイプは、例えばブドウやオリーブに存在するプロアントシアニジンである。このように、植物由来の食品中に様々な濃度で存在するタンニンは、ヒトの健康に大きな影響をもつ。タンニンはガン形成及び抗栄養活性を伴い得るので、大量のタンニンを摂取することは望ましくないが、少量の正しい種類のタンニンの摂取は、代謝酵素、免疫調節又はその他の機能に影響を及ぼすことにより、ヒトの健康に有利であり得る（Ｃｈｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  １９９８）。
【０００４】
しかしながら、胃腸管において産生されるような多くのタンニンの嫌気分解産物もまた、健康に有利な効果をもつ化合物を生成し得る（Ｂｈａｔ  ｅｔ  ａｌ．  １９９８）。このような分解化合物は、例えば、フェニルプロピオン酸又はフェニル酢酸の誘導体である（Ｂｈａｔ  ｅｔ  ａｌ．  １９９８）。ＧＩ管に吸収されるとき、これらの化合物は、抗炎症作用を示す。これらの化合物は、また、タンニンからの他の分解産物とともに、ＧＩ管における広範囲の抗微生物作用を有し、不要なバクテリアを抑制する。
先行技術
ほとんどのＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種がタンニンを分解することができないが、密接に関係する種Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌ．ｐｅｎｔｏｓｕｓ及びＬ．ｐａｒａｐｌａｎｔａｒｕｍの株はタンナーゼ活性を有し得る（Ｏｓａｗａ，  Ｒ．，  ｅｔ  ａｌ．  （２０００），  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔａｎｎｉｎ−ｄｅｇｒａｄｉｎｇ  ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎｓ  ａｎｄ  ｆｅｒｍｅｎｔｅｄ  ｆｏｏｄｓ，  Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ６６：３０９３−３０９７）。
【０００５】
幾つかのＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ株は、マンノースの存在によってブロックされるメカニズムによって、ヒト上皮細胞に接着する特有の能力を有する（Ａｄｌｅｒｂｅｒｔｈ，  Ｉ．，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９６），  Ａ  ｍａｎｎｏｓｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｄｈｅｒｅｎｃｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｉｎ  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ｃｏｎｆｅｒｒｉｎｇ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｃｏｌｏｎｉｃ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ＨＴ−２９．  Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ６２：２２４４−２２５１）。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明の要旨
ヒトの腸粘膜に付着する能力を有し且つタンナーゼを産生する能力を有するＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍの株が、タンニンを分解するときに、胃腸（ＧＩ）管における有害なバクテリアに対抗する（ｃｏｕｎｔｅｒａｃｔ）化合物を産生し、ＧＩ管において吸収されるときに、抗炎症作用を示すことが今や見出された。
発明の説明
本発明は、タンニンと組み合わせて、ヒトの腸粘膜に付着する能力を有するＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ又は密接に関係するＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．の１又はそれ以上のタンナーゼ産生株を含有する組成物に関する。前記組成物は、抗微生物及び抗炎症作用を有する化合物をｉｎ  ｖｉｖｏ産生し、且つ、保存効果を有する化合物をｉｎ  ｖｉｔｒｏ産生する。
【０００７】
本発明は、また、タンニン及びキャリアと組み合わせた、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの１又はそれ以上のタンナーゼ産生株を含有する組成物にも関する。
【０００８】
キャリアの例としては、オートミール粥、乳酸発酵食品、レジスタントスターチである。バクテリアの増殖を改善し且つ抗炎症性又は保存性の誘導体の産生を高めるために、組成物に食物繊維が添加され得る。フルクトオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、ラクツロース、マルトデキストリン、β−グルカン及びグァーガムのような食物繊維もまた、キャリアとして使用され得る。
【０００９】
本発明は、特に、ほぼ純粋なタンニン画分、例えば、エラグ酸、プロアントシアニジン及びアントシアニジンなどのフラボノイド又はリグナン、或いは、タンニンに富む食品成分、例えば、オート麦、大麦、紅いコーリャン（ｒｅｄ  ｓｏｒｇｈｕｍ）、松の木の内部の樹皮から作られたミール及び、ブドウ、柑橘類、コケモモ、ブルーベリー、ブラックカラント、クランベリー、イチゴ、ラズベリー、及びローズヒップからのジュース又は抽出物と共に、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓのタンナーゼ産生株を含有する食品組成物に関する。
【００１０】
本発明はまた、ほぼ純粋なタンニン画分、例えば、エラグ酸、プロアントシアニジン及びアントシアニジンのようなフラボノイド又はリグナン、或いは、タンニンの任意の他の薬学的に許容されるソースと共に、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓのタンナーゼ産生株を含有する薬学的組成物に関する。
【００１１】
本発明の組成物の予防又は治療効果を達成するために、タンニンの含量は、好ましくは、一日当たり約５００−１０００ｍｇである。例えば、ローズヒップ粉末の場合、これは、おおよそ１００ｇに相当し、或いは、ローズヒップスープの形態で４リットルである。
【００１２】
タンニンは、水溶液からタンパク質を沈殿し得る様々な分子量の水溶性フェノール性産物である。タンニンの２つのクラス、没食子酸及びエラグ酸から誘導される加水分解性タンニン、並びに、縮合型タンニン、すなわち、フラバノールのオリゴマー及びポリマーであるプロアントシアニジンが存在する。
【００１３】
いわゆる縮合型、あるいは、非加水分解性タンニンは、加水分解性タンニンよりも、微生物分解に対する耐性が高い。タンニンは、通常、ブドウ、リンゴ、バナナ、ブラックベリー、クランベリー、ラズベリー、イチゴ、オリーブ、豆類、コーリャン、オオムギ（ｂａｒｅｌｙ）及びシコクビエ（ｆｉｎｇｅｒ  ｍｉｌｌｅｔｓ））のグレイン、コカ、茶、及びコーヒーのような果実及び種子中に見られる。
【００１４】
本発明の組成物は、キャリアが食品である食品組成物であり得る。薬学的組成物においては、キャリアは、治療的に許容されるキャリアであるべきである。組成物は、ＧＩ由来の感染症（ＧＩ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ）、糖尿病、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）、癌又は心臓血管疾患のような結果として起こる将来の疾患を予防するために健康手段(keep-fit measure)を改善するよう、或いは、例示した疾患を和らげるため、平均的な消費者に与えられる。
【００１５】
本発明の薬学的組成物は、経口投与され得る、例えば、懸濁液、タブレット、カプセル及び粉末に処方され得る。前記製剤は、浣腸としても投与され得る。
【００１６】
本発明は、特に、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ２９９、ＤＳＭ  ６５９５、及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ２９９ｖ、ＤＳＭ  ９８４３を除外する（ｄｉｓｃｌａｉｍｉｎｇ）、Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．  ５９，  Ｎｏ．  ４，  Ａｐｒｉｌ  １９９３，  ｐ１２５１−１２５２においてＯｓａｗａとＷａｌｓｈによって記載される方法によって測定されるタンナーゼ活性を有することを特徴とする、ヒトの腸粘膜に付着する能力を有するＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ又は密接に関係するＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種のタンナーゼ産生株に関する。
【００１７】
好ましいタンナーゼ産生株は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ種に属し、胃腸（ＧＩ）管において生存する能力を有する。この文脈における生存とは、株が、暫くの間、ＧＩ管において代謝し且つ増殖する（生きる）能力を有することを意味する。
【００１８】
好ましい局面に従って、本発明は、全て２００２年の１１月２８日にＤｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨに寄託され且つ寄託番号が与えられた以下の新規な株、すなわち、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＨＥＡＬ  ９、ＤＳＭ  １５３１２、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＨＥＡＬ  １９、ＤＳＭ  １５３１３及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＨＥＡＬ  ９９、ＤＳＭ  １５３１６、並びに、本質的に同じＲＥＡパターンを有するその変異株に関する。
【００１９】
新規な株は、健常成人の結腸粘膜から分離され且つＲｏｇｏｓａ寒天上で培養することによって選択された。株は、続いて、ＲＥＡによって特徴付けられた。
【００２０】
別の局面に従って、本発明は、また、心臓血管疾患、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）、胃腸感染症、糖尿病、癌、アルツハイマー病、又は、自己免疫原因（ａｕｔｏ−ｉｍｍｕｎｅ  ｏｒｉｇｉｎ）を伴う疾患の予防的又は治療的処置のための薬剤の調製のための、タンニンと組み合わせた、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍのタンナーゼ産生株の使用に関する。タンナーゼ産生株の例としては、新規なＨＥＡＬ  ９、ＨＥＡＬ  １９及びＨＥＡＬ  ９９株だけでなく、以前から知られているＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ２９９、ＤＳＭ  ６５９５、及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ２９９ｖ、ＤＳＭ  ９８４３株も挙げられる。
【００２１】
本発明の組成物に使用されるタンナーゼ産生バクテリアの量は、好ましくは、１０９ｃｆｕ／一日用量よりも少なくない。
【００２２】
別の局面に従って、本発明は、食品を保存するための、タンニンと合わせたＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓのタンナーゼ産生株の使用に関する。タンナーゼ産生株の例としては、新規なＨＥＡＬ  ９、ＨＥＡＬ  １９及びＨＥＡＬ  ９９株だけでなく、以前から知られているＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ２９９、ＤＳＭ  ６５９５、及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ２９９ｖ、ＤＳＭ  ９８４３株も挙げられる。前記株は、タンニンの分解から、食品中に、直接、保存物質（ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｖｅｓ）を産生する。タンニンは、タンニンの純粋な画分を製品に補充するか、又は、タンニンに富む天然のあまり定義されていないサプリメント（例えば、ローズヒップ、紅いコーリャン又は松の内部の樹皮から作られたミール）を製品に補充することによって、確保され得る。
【００２３】
タンニンおよびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株を利用するタンニンの混合物は、治療目的のため、又は、心臓血管疾患、メタボリック症候群、糖尿病、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）、胃腸感染症、又は自己免疫原因を伴う疾患に対する危険因子を減らすための健康維持作用（ｋｅｅｐ−ｆｉｔ  ａｃｔｉｏｎ）として、与えられる。
【００２４】
Ｌ．  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＨＥＡＬ  ９、ＨＥＡＬ  １９  及びＨＥＡＬ  ９９株は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ２９９ｖ、ＤＳＭ  ９８４３株よりも、ヒトの結腸粘膜細胞に付着する高い能力を有する。
【実施例】
【００２５】
実験的
株の単離
４２の異なる新たに分離されたＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株を試験し、タンナーゼを産生する（即ち、タンニンを分解する）能力について、よく知られているプロバイオティックな参考株Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ２９９ｖ、ＤＳＭ  ９８４３と比較した。該株は、下記の第１表に列挙している。
スクリーニング方法
タンナーゼ活性を検出するために適用される方法は、Ｏｓａｗａ及びＷａｌｓｈ（１９９３）によって以前に記載されている。検出原理は、以下の手順によってタンニンの分解（メチルガレート）を測定することである：
被験バクテリウムを、３７℃にて２ｄの間ＭＲＳ寒天（Ｍｅｒｃｋ，  Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）上で嫌気的に培養し、次いで、細胞を回収し、５ｍｌの０．９％  （ｗ／ｖ）ＮａＣｌ中に懸濁する。細胞懸濁液を遠心し、細胞を１０ｍｌの０．９％ＮａＣｌに再懸濁し、６２０ｎｍにて吸光度を測定する（標準として０．９％  ＮａＣｌ溶液）。細胞懸濁液を、吸光度が０．１〜０．６になるまで希釈する（分光光度計，Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＯＢ，  Ｎｏｖａｓｐｅｃ  ＩＩ）。遠心後、細胞を１ｍｌメチルガレート緩衝液（３．７ｇ／ｌメチルガレート［Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｉｎｃ．，  Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，  ＷＩ，  ＵＳＡ］、４．５ｇ／ｌ  ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ＝５．０［フィルター滅菌された］）中に再懸濁し、試験管を２４ｈの間３７℃にてインキュベートする。４４０ｎｍにおける吸光度の測定（標準としてＮａＨＣＯ３緩衝液）の前に、１ｍｌのＮａＨＣＯ３緩衝液（１リットル当たり４２ｇ  ＮａＨＣＯ３、ｐＨ＝８．６）を添加し、溶液を室温にて１ｈの間インキュベートする。懸濁液の色を目視により測定する。
【００２６】
色は、陽性のタンナーゼ活性に伴って茶色又は緑色に等級付けされた。タンナーゼ活性の定量値は、メチルガレートとのインキュベーションの開始における細胞懸濁液の吸光度（Ａ６２０；細胞の量）と、メチルガレートとの２４ｈのインキュベーション後の吸光度（Ａ４４０；アルカリ条件において酸素に暴露した後の遊離没食子酸の呈色）との比によって得られた。
【００２７】
タンナーゼ活性を有するＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株についてのスクリーニング結果を第１表に示す。被験株の大多数は、タンナーゼ活性を有していなかった。しかしながら、１１の株は、陽性であり、第１表に示す。
【００２８】
第１表．異なるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株におけるタンナーゼ活性
【００２９】
【表１】
0004731469.tif 000002
【００３０】
＊陽性タンナーゼ活性は、アルカリ条件において酸素に長時間暴露した後に細胞懸濁液中の遊離没食子酸の緑色〜茶色の呈色として示される。
【００３１】
＊＊タンナーゼ活性は、メチルガレートとの２４ｈインキュベーションの開始における細胞懸濁液の６２０ｎｍにおける吸光度（Ａ６２０）と、メチルガレートとのインキュベーション後の４４０ｎｍにおける吸光度（Ａ４４０）との比として表される。
【００３２】
３つのタンナーゼ陽性Ｌ．  ｐｌａｎｔａｒｕｍ株は、よく知られているプロバイオティック株Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ２９９ｖ、ＤＳＭ  ９８４３よりも高いタンナーゼ活性を有する（即ち、Ｌ．  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＨＥＡＬ  ９、Ｌ．  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＨＥＡｌ  １９及びＬ．  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＨＥＡＬ  ９９）。これらは、健常人の腸粘膜から分離された。
ＲＥＡによるゲノタイプの同定
株は、「Ｓｔａｈｌ  Ｍ，  Ｍｏｌｉｎ  Ｇ，  Ｐｅｒｓｓｏｎ  Ａ，  Ａｈｒｎｅ  Ｓ  ＆  Ｓｔａｈｌ  Ｓ，  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，  ４０：１８９−１９３，  １９９０」に従い、さらに、Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ，  Ｍ−Ｌ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  ４５：６７０−６７５，  １９９５によって開発された制限エンドヌクレアーゼ分析−ＲＥＡ−を通じて染色体ＤＮＡの切断パターンについて調べられた。概略的に、ＲＥＡは、下記のとおり記載され得る。染色体ＤＮＡを研究されている株から調製し、そして、制限エンドヌクレアーゼによって切断させる。０．７５μｇの各ＤＮＡを、別々に、３７℃にて、４ｈの間、１０ユニットのＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄ  ＩＩＩで消化した；各エンドヌクレアーゼを別々に使用した。切断されたＤＮＡフラグメントを、サブマージ水平アガローススラブゲル（ｓｕｂｍｅｒｇｅｄ  ｈｏｒｉｚｏｎｔａｌ  ａｇａｒｏｓｅ  ｓｌａｂ  ｇｅｌｓ）を用いたゲル電気泳動によって、サイズに応じて分離した。ゲルは、１５０ｍｌの０．９％アガロース（ｕｌｔｒａｐｕｒｅ  ＤＮＡ  ｇｒａｄｅ；  ｌｏｗ  ｅｌｅｃｔｒｏ−ｅｎｄｏ  ｏｓｍｏｓｉｓ；  ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，  ＵＳＡ）からなり、スラブゲル（１５０×２３５ｍｍ）としてキャストした。０．２μｇの高分子量ＤＮＡマーカー（Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  ＭＤ，  ＵＳＡ）、並びに、０．５μｇのＤＮＡ分子量マーカーＶＩ（Ｒｏｃｈｅ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）を標準として使用した。最小のバンドゆがみ及び最大の鮮明さは、Ｆｉｃｏｌｌローディングバッファー（２ｇのＦｉｃｏｌｌ、８ｍｌの水、０．２５％のブロモフェノール）中のサンプルＤＮＡをアプライすることによって達成された。
【００３３】
約６−８℃にて、１８ｈの間、４０Ｖの定圧でゲルを泳動した。泳動時間の間、緩衝液（８９ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２３ｍＭ  Ｈ３ＰＯ４、２ｍＭ  ＥＤＴＡナトリウム、ｐＨ８．３）を再循環させた。その後、エチジウムブロマイド（２μｇ／ｍｌ）中で２０分間ゲルを染色し、蒸留水で脱染し、ＵＶトランスルミネーター（ＵＶＰ  Ｉｎｃ．，  Ｓａｎ  Ｇａｂｒｉｅｌ，  ＵＳＡ）を用いて３０２ｎｍにて視覚化し、写真を撮った。ゲル電気泳動を行うこの方法は、十分に広く分布し且つ１．２×１０６の分子量まで比較的十分に分離されたバンドを与えた。
【００３４】
分析の結果は、図に示される。
【００３５】
ＨＴ−２９細胞への付着
ヒト粘膜から単離された合計３２のＬ．  ｐｌａｎｔａｒｕｍ株を、マンノース特異的結合を有するヒト結腸癌腫細胞系ＨＴ−２９の腸上皮細胞への付着について、試験した（Ｗｏｌｄ，  Ａ，  ｅｔ  ａｌ，  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，  Ｏｃｔ．  １９８８，  ｐ．  ２５３１−２５３７により記載された方法）。ヒトの腺癌細胞系ＨＴ−２９の細胞を、１０％の胎児ウシ血清、２ｍＭのＬ−グルタミン及び５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシン（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，  Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ，  Ｍｏ，  ＵＳＡ）を補充したＥａｇｌｅ’ｓ培地中で培養した。細胞がコンフルエンス（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）に達した数日後、それらをＥＤＴＡ含有緩衝液（０．５４ｍＭ）で引き離し、洗浄し、５×１０６／ｍｌでＨａｎｋ’ｓ平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）中に懸濁した。バクテリアを回収し、洗浄し、そして、５×１０９／ｍｌでＨＢＳＳ中に懸濁した（５９７ｎｍにおける１．５の２×光学濃度）。細胞、バクテリア、ＨＢＳＳを比率１：１：３で混合し、４ＥＣにて３０分間、逆さまに回転させながら（ｅｎｄ−ｏｖｅｒ−ｅｎｄ  ｒｏｔａｔｉｏｎ）インキュベートした。氷冷ＰＢＳで細胞を１回洗浄し、中性緩衝ホルマリンで固定化した（Ｈｉｓｔｏｆｉｘ，  Ｈｉｓｔｏｌａｂ，  Ｇｏｔｅｂｒｏｇ，  Ｓｗｅｄｅｎ）。少なくとも４０の細胞の各々に付着したバクテリアの数を、干渉コントラスト顕微鏡（interference contrast microscopy）（５００×倍率、Ｎｉｃｏｎ  Ｏｐｔｏｐｈｏｔ、干渉コントラスト装置（Ｂｅｒｇｓｔｒｏｍ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，  Ｇｏｔｅｂｏｒｇ，  Ｓｗｅｄｅｎ）を備える）を用いて測定し、１細胞当たりのバクテリアの平均数を計算した。
【００３６】
３つのＨＥＡＬ株を除く全ての株は、０．３−１４の値を有していた（塩溶液における付着；メチル−マンノシドの存在下において対応する値は、それぞれ、０．５及び２．４である。）。ほとんどの株が、１０よりも低い値を有していた。結果を下記の第２表に示す。
第２表
【００３７】
【表２】
0004731469.tif 000003
【００３８】
実験マウスモデルにおける試験
方法
１５匹のＢａｌｂ／Ｃマウスを５つのグループに分け（１グループ当たり３匹のマウス）、通常の食物、ローズヒップ粉末（タンニンに富む）及びタンナーゼ陽性株Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ２９９ｖの異なる組み合わせを与えた。成分を水と混合し、かゆ状の堅さ（ｍｕｓｈｙ  ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｃｙ）にした。グループ１及び２には、通常のマウス用の食物を与え、グループ３は、ローズヒップ粉末（１日当たり１．６ｇ）を補充した通常の食物を摂取し、グループ４は、Ｌ．  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ２９９ｖ（１回用量当たり１０１０バクテリア）を補充した通常の食物を摂取し、グループ５は、ローズヒップ粉末とＬ．  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ２９９ｖの両方を補充した通常の食物を摂取した。マウスには、虚血／再灌流障害を誘導する前の６〜８日間、１日当たり１回食物を与えた。該障害は、以下の切開プロトコールに従ってなされた：マウスは、麻酔のため、皮下に、０．１５ｍｌのケタミン／キシラジン溶液（それぞれ、７．８５  ｍｇ／ｍｌ及び２．５７  ｍｇ／ｍｌ）を与えられた。正中腹部切開を行い、上腸間膜動脈を非外傷性血管ループ（atraumatic vessel loops）及び止血鉗子を用いて閉塞させた（ｏｃｃｌｕｄｅｄ）。急速輸液（fluid resuscitation）のため、腹膜腔へ１．０ｍｌ  ＰＢＳを注入した。血管ループと止血鉗子を取除く前に３０分間動脈を閉塞させ、即座の再灌流について組織を観察した。次いで、腹部をrunning vicryl 3-0縫合糸を用いて閉じた。動物を麻酔から目覚めさせ、ウォーミングパッドから移動させ、ケージの中に戻した。４ｈ１５ｍｉｎ後、動物に再び麻酔薬を与え、下記の順番で組織及び便サンプルを採取し、予め重量測定しておいた試験管に入れた：肝組織、腸骨腸間膜組織（ｉｌｉｕｍ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｙ  ｔｉｓｓｕｅ）及びバクテリアのサンプリングのための盲腸便（ｃｅｃｕｍ  ｓｔｏｏｌ）、さらに、脂質過酸化についての比色アッセイのための盲腸及び腸骨組織、さらに、組織学的検査のための盲腸及び腸骨組織。細菌学的評価のためのサンプルを、重量測定し、凍結媒体中に入れ、直ぐに−７０℃にて凍結した。比色アッセイのためのサンプル（ＬＰＯ５８６）を、ＰＢＳでリンスし、重量測定し、ホモジナイズし、分注し（ａｌｉｑｕｏｔｅｄ）、直ぐに−７０℃にて凍結した。
【００３９】
分析方法
３ｄの間３７℃にてＲｏｇｏｓａ−ａｇａｒ（Ｍｅｒｃｋ，  Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）、２４ｈの間３７℃にてＶＲＢＤ−ａｇａｒ（Ｍｅｒｃｋ，  Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）、及び、３ｄの間３７℃にてＢｒａｉｎ  ｈｅａｒｔ  ｉｎｆｕｓｉｏｎ  ａｇａｒ  （ＢＨＩ；  Ｏｘｏｉｄ，  Ｂａｓｉｎｇｓｔｏｋｅ，  Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ，  Ｅｎｇｌａｎｄ）上での嫌気的インキュベーション（ＢＢＬ  Ｇａｓ  Ｐａｋ  Ｐｌｕｓ，  Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｓｐａｒｋｓ，  ＭＤ，  ＵＳＡ）による生菌数測定（ｖｉａｂｌｅ  ｃｏｕｎｔ）により、細菌学的評価を行った。ＢＨＩ上での生菌数測定は、好気的にも行われた。
【００４０】
脂質過酸化についての比色アッセイを、スペクトロフォトメーター及び分析キットＢｉｏｘｙｔｅｃｈ（登録商標）ＬＰＯ−５８６ＴＭ  （ＯｘｉｓＲｅｓｅａｒｃｈＴＭ，  Ｏｘｉｓ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，  Ｉｎｃ．，Ｐｏｒｔｌａｎｄ）の助けを借りて行った。製造元の説明書に従って、分析を行った。
【００４１】
脂質過酸化は、細胞障害の十分に確立されたメカニズムであり、細胞及び組織における酸化ストレスの指標として使用される。脂質過酸化物は、不安定であり且つ分解して、反応性のカルボニル化合物を含む複雑な一連の化合物を形成する。多価不飽和脂肪酸過酸化物は、分解すると、マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）及び４−ヒドロキシアルケナール（ＨＡＥ）を生成する。ＭＤＡの測定は、脂質過酸化の指標として使用され得る。ＬＰＯ−５８６ＴＭは、ＭＤＡを定量するように設計された比色アッセイであり、４５℃におけるＭＤＡとの発色試薬（Ｎ−メチル−２−フェニルインドール）の反応に基づく。１分子のＭＤＡは、２分子のＮ−メチル−２−フェニルインドールと反応し、５８６ｎｍで最大吸光度を伴う安定な発色団を生成する。
【００４２】
結果
結腸組織１ｇ当たりのマロンジアルデヒド（ＭＤＡ）として測定される脂質過酸化は、別個に処理されたマウスにおいて測定され、その結果は、第３表に示される。虚血／再灌流は、ＭＤＡを増大させた。食物中のローズヒップ粉末（グループ３）又はＬ．  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ２９９ｖ（グループ４）を用いたマウスの前処理は、陽性コントロール（グループ２）と比べ、ＭＤＡを減少させた。しかしながら、ローズヒップ粉末及びＬ．  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ２９９ｖの併用された前処理の効果は、はるかに明白にＭＤＡを減少させた（グループ５）。
【００４３】
第３表．マウスにおける虚血／再灌流障害後の脂質過酸化
【００４４】
【表３】
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【００４５】
生菌数の結果を第４表に示す。虚血／再灌流障害は、ＢＨＩ及びＲｏｇｏｓａ  ａｇａｒ上での生菌数を１０倍増大させた（グループ１とグループ２との比較）。ローズヒップ粉末単独（グループ３）は、結果的に、他の摂食代替物（ｆｅｅｄｉｎｇ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ）よりも低い生菌数であった。Ｌ．  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ２９９ｖ及びローズヒップ粉末の両方を与えられたグループ（グループ５）は、より少ない腸内細菌（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａ）を除けば、ローズヒップ粉末を与えていない虚血／再灌流障害グループ（グループ２及び４）と同じ生菌数を示した。しかしながら、乳酸桿菌（ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）の生育を可能にする基質上での生菌数は、ここで（グループ５）、Ｌ．  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ２９９ｖで優位であった。
【００４６】
第４表  マウスにおける虚血／再灌流障害後の盲腸におけるバクテリア叢
【００４７】
【表４】
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【００４８】
結論
ローズヒップ中のタンニンは、障害マウスの腸におけるバクテリアの総量（ｔｏｔａｌ  ｌｏａｄ）を減少させたが、マウスがローズヒップと同時にＬ．  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ２９９ｖを投与された場合、その減少は緩和され、タンニンにより誘導される減少がＬ．  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ２９９ｖによって満たされた。このように、タンニンは、プロバイオティックな株にとって有利になるように、腸微生物叢のバランスを支えている。脂質の過酸化は、ローズヒップ粉末の投与によって緩和されたが、この効果は、ローズヒップ粉末と共にＬ．  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ２９９ｖが存在することによって高められた。
【００４９】
Ｌ．  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＨＥＡＬ  ９、ＨＥＡＬ  １９及びＨＥＡＬ  ９９株は、Ｌ．  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ２９９ｖよりも高いタンナーゼ活性を有し、さらに、ヒト結腸粘膜細胞へ付着する能力が、Ｌ．  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ２９９ｖよりも高い。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】図は、制限酵素ＥｃｏＲＩを用いて株Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＨＥＡＬ  ９（レーン２）、ＨＥＡＬ  １９（レーン３）、２９９ｖ  （レーン４）及びＨＥＡＬ  ９９（レーン５）の染色体ＤＮＡを切断させることによって得られた分離ＤＮＡフラグメントを示す。高分子量ＤＮＡマーカー（ＢＲＬ）及びＤＮＡ分子量マーカーＶＩ（Ｒｏｃｈｅ）をスタンダード(レーン１)として用いた。
【図１】
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