(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
導入目的物質を細胞内に導入する方法であって、前記細胞を前記導入目的物質の存在する液中、ゲル中若しくはゲル表面に配置し、前記液若しくはゲルに単発のパルスレーザー又は１Ｈｚ〜５００ｋＨｚの繰り返し周波数をもつパルスレーザーを集光させて照射し、それにより生じた衝撃波により前記物質を細胞内に導入することを特徴とし、
前記パルスレーザーは、フェムト秒レーザー及びピコ秒レーザーの少なくとも一方のレーザーであって、波長が６００ｎｍ〜１１００ｎｍであり、強度が１０〜１０００ｎＪ／ｐｕｌｓｅであるパルスレーザーであり、
前記パルスレーザーを、細胞からの距離が２０μｍ以内の位置に集光させることを含む、導入方法。
【請求項２】
前記パルスレーザーの集光部が、円形若しくは球形であり、前記円形若しくは球形の半径が、０を越え１００μｍ以内である請求項１記載の導入方法。
【請求項３】
前記パルスレーザーの光密度が、５×１０5（watt）以上１０18（watt）以下である請求項１又は２に記載の導入方法。
【請求項４】
前記細胞が、接着性細胞である請求項１から３のいずれかに記載の導入方法。
【請求項５】
前記細胞が、浮遊性細胞である請求項１から３のいずれかに記載の導入方法。
【請求項６】
前記導入目的物質が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチド、タンパク質、脂質、糖類及びこれらの誘導体からなる群から選択される少なくとも一つである請求項１から５のいずれかに記載の導入方法。
【請求項７】
前記導入目的物質が、微粒子又は修飾微粒子である請求項１から６のいずれかに記載の導入方法。
【請求項８】
前記微粒子又は修飾微粒子の直径が、１０ｎｍ〜１００μｍである請求項７に記載の導入方法。
【請求項９】
前記微粒子が、金属、無機物、有機高分子、タンパク質微結晶からなる群から選択される少なくとも一つからなる微粒子である請求項７又は８に記載の導入方法。
【請求項１０】
請求項７から９のいずれかに記載の導入方法において、前記細胞を前記導入目的物質の存在する液中、ゲル中若しくはゲル表面に配置することに代えて、前記細胞を液中、ゲル中若しくはゲル表面に配置した後に、前記微粒子又は修飾微粒子を、前記細胞に付着するように配置し、この状態で、前記液若しくはゲル又は前記細胞にパルスレーザーを集光させて照射する導入方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法において、前記液若しくはゲル又は前記細胞にパルスレーザーを集光させて照射することに代えて、前記微粒子又は修飾微粒子にパルスレーザーを集光させて照射する導入方法。
【請求項１２】
細胞外物質が導入された細胞の製造方法であって、請求項１から１１のいずれかに記載の導入方法により導入目的物質である前記細胞外物質を前記細胞内に導入する工程を含む製造方法。
【請求項１３】
細胞外物質が遺伝子を含む請求項１２に記載の製造方法。
【請求項１４】
形質転換細胞の製造方法であって、請求項１から１１のいずれかに記載の導入方法により導入目的物質である遺伝子を宿主細胞に導入して形質転換する工程を含む製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞外物質の細胞内への導入方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年の再生医学を中心とする医学・生物学分野の発展にともない、細胞への遺伝子導入技術は、重要な基盤技術の一つとなっている。細胞に遺伝子を導入する技術としては、例えば、下記（ａ）生化学的方法、（ｂ）パーティクルガン法、（ｃ）エレクトロポレーション法、及び（ｄ）マイクロインジェクション法があげられ、これらは、生物実験のプロトコルに組み込まれて使用されており、一般的な方法である。
（ａ）生化学的方法：脂質と遺伝子を混合し、遺伝子を内包したミセル（リポソーム）を形成させ、そのミセルを細胞に取り込ませる方法。
（ｂ）パーティクルガン：遺伝子を金ナノ粒子等に担持させ、その粒子を細胞に打ち付けて粒子ごと遺伝子を細胞内に導入する方法。
（ｃ）エレクトロポレーション：遺伝子と浮遊細胞を含む培養液に高電場を印加し、それにより細胞膜の結合をゆるめて遺伝子を導入する方法。
（ｄ）マイクロインジェクション：マイクロオーダーに先鋭化したマイクロピペットを用いて、顕微鏡下で細胞に直接差し込んで遺伝子を導入する方法。
【０００３】
この他に、最近では、下記の（ｅ）レーザートラップインジェクション法、（ｆ）可視及び紫外レーザー法、ならびに（ｇ）フェムト秒レーザー法が開発されている。
（ｅ）レーザートラップインジェクション法：光の放射圧による光ピンセットを用い、遺伝子を担持した無機粒子を補足したまま細胞内に導入する方法（例えば、特許文献１参照）。
（ｆ）可視及び紫外レーザーを用いた遺伝子導入方法：細胞を培養した容器の底に可視光若しくは紫外光を照射し、それによるストレス波により、細胞に遺伝子を導入する方法（例えば、非特許文献１及び２参照）。
（ｇ）フェムト秒レーザー法：フェムト秒高強度近赤外レーザーパルスを細胞に使用して細胞膜に小さく局所的な穿孔を作ることにより、さまざまな哺乳類細胞に、細胞構造を混乱させること無く、直接ＤＮＡをトランスファーする方法（例えば、非特許文献３参照）。
【特許文献１】特開２００３‐７０４６８号公報
【非特許文献１】Makoto Ogura, Shunichi Sato, Mitsuhiro Terakawa, Hitoshi Wakisaka, Maki Uenoyama, Tomosumi Ikeda, Hiroshi Ashida and Minoru Obara, 「単発ナノ秒レーザーパルスにより発生させたストレス波による細胞への光感応性材料の輸送（Delivery of Photosensitizer to Cells by the Stress Wave Induced by a Single NanosecondLaser Pulse）」（２００３）Jpn. J. Appl. Phys Vol.42: pp.L977-L979
【非特許文献２】Daniel J. McAuliffe, Shun Lee, Thomas J. Flotte, and Apostolos G. Doukas「インビトロにおけるストレス波に付随する細胞膜間の輸送(Stress-Wave-Assisted Transport Through the Plasma Membrane In Vitro)」（１９９７）Lasers in Surgery and Medicine 20:216-222
【非特許文献３】Uday K. Tirlapur, Karsten Konig 「フェムト秒レーザーによるターゲットトランスフェクション (Targeted transfection by femtosecond laser)」（２００３）Nature Vol.418: pp.290-291
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、従来の遺伝子導入方法は、つぎのような問題点がある。まず、前記（ａ）生化学的方法、（ｂ）パーティクルガン法、（ｃ）エレクトロポレーション法では、不特定多数の細胞への遺伝子導入が可能であるが、特定の標的細胞のみを遺伝子導入対象とすることができないという問題がある。そして、上記（ｄ）マイクロインジェクション法は、基板上の特定の標的細胞への遺伝子導入を可能とするが、顕微鏡下でマイクロピペットや光ピンセットを取り扱うことは、非常に高度なテクニックを要するため煩雑であるという問題がある。上記（ｆ）可視若しくは紫外レーザーを用いた遺伝子導入方法も、基板上の特定の標的細胞への遺伝子導入を可能とするが、紫外線を強く吸収するように基板を加工する必要性があり汎用性に欠ける。また、基板のレーザーアブレーションを利用するために細胞外物質導入が実現しても、その後の細胞の生育に支障をきたす可能性がある。上記（ｅ）レーザートラップインジェクション法も、基板上の特定の標的細胞への遺伝子導入を可能とする方法であるが、導入能力が低いこと、一般には細胞膜を軟化させるための酵素処理等が必要となること等が考えられ、操作が煩雑な上、細胞の活性に悪影響を与えるという問題がある。さらに、上記（ｇ）フェムト秒レーザー法も、基板上の特定の標的細胞への遺伝子導入を可能とする方法であるが、高周波（例えば、８０ＭＨｚ）のレーザー数百万発を細胞膜に直接照射し、細胞膜に小さな孔を開ける方法であるから、細胞への損傷が大きくなるおそれがある。
【０００５】
そこで、本発明は、細胞外物質（以下、導入目的物質ともいう。）を簡単に特定の細胞へ導入でき、細胞への損傷を少なくすることが可能な導入方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
前記目的を達成するために、本発明の導入目的物質を細胞内に導入する方法は、前記細胞を前記導入目的物質の存在する液中、ゲル中若しくはゲル表面に配置し、前記液若しくはゲル又は前記細胞にパルスレーザーを集光させて照射し、それにより生じた衝撃波により前記細胞の細胞膜の構造を一時的に変化させ、前記導入目的物質を細胞内に導入する方法である。
【発明の効果】
【０００７】
このように、本発明の導入方法は、パルスレーザーの集光による衝撃波を利用するから、例えば、パルスレーザーを細胞以外の液又はゲル中に集光させ、それにより生じた衝撃波を細胞に接触させることにより、細胞への損傷がより少ない導入方法とすることができる。また、本発明の導入方法において、例えば、顕微鏡等を用いてパルスレーザーの集光部の位置やその強度を調整すれば、例えば、培養細胞や培養組織の細胞の中から、単一細胞若しくはある一定範囲内の細胞を標的として、細胞外物質の導入が可能となる。さらに、本発明において、導入対象の細胞として、例えば、あらゆる基板、培養液の種類を用いた培養条件で培養された、あらゆる種類の細胞を使用できるから、本発明の導入方法は、非常に高い汎用性を示すことができる。さらにまた、パルスレーザーの操作は簡単であるため、本発明の導入方法は、簡単に実施可能な方法である。なお、本発明の導入方法は、前述のように特定の細胞に狙いを定めて細胞外物質を導入することが可能ではあるが、本発明はこれに制限されず、不特定多数の細胞に細胞外物質を導入してもよい。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明において、導入目的物質の導入対象となる細胞（以下、標的細胞ともいう。）は、特に制限されず、例えば、培養容器の底や基板等に接着して培養される接着性細胞でもよく、培養液中で浮遊した状態で培養される浮遊性細胞でもよい。また、本発明における標的細胞は、導入目的物質を含む液又はゲルと直接接する細胞であれば特に制限されず、例えば、単独の細胞であってもよいし、増殖して層状となった細胞でも良いし、組織の細胞であってもよい。また、本発明における標的細胞の種類は、特に制限されず、例えば、動物細胞、植物細胞、真核細胞、原核細胞、細菌等があげられる。
【０００９】
本発明において、標的細胞が配置される液又はゲルは、特に制限されず、例えば、前記細胞の培養に用いる培養液や培地（ゲル）に導入目的物質が添加されたものが使用できる。
【００１０】
本発明の方法により細胞に導入できる導入目的物質としては、特に制限されないが、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド、タンパク質、糖、脂質及びこれらの誘導体、並びに、これらを微粒子の表面に吸着させた修飾微粒子等があげられるが、これら以外の無機化合物や有機化合物も用いることができる。
【００１１】
微粒子又は修飾微粒子を導入目的物質として使用する場合、その微粒子を構成する物質としては、特に制限されないが、例えば、金属、無機物、有機高分子、生分解性高分子、タンパク質微結晶等があげられる。前記金属としては、例えば、金や銀等、前記無機物としては、例えば、ガラスやリン酸カルシウムの微結晶等、前記有機高分子としては、例えば、ポリスチレン、ポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）、ポリメタクリルアクリルアミド、ＰＥＴ等、前記生分解性高分子としては、例えば、脂肪族ポリエステル、澱粉ポリエステル、酢酸セルロース、改質セルロース、ポリエステルアミド等、前記タンパク質微結晶としては、例えば、細胞内活性をつかさどるタンパク質の微結晶や多角体ウイルス由来の改変多角体等が、それぞれ、あげられる。
【００１２】
また、前記微粒子又は修飾微粒子の形状も、特に制限されず、例えば、球、長球、扁球、立方体、直方体等の形状があげられる。前記微粒子又は修飾微粒子の大きさとしては、特に制限されず、例えば、前記微粒子等が球形の場合、直径が、１０ｎｍ〜１００μｍであって、好ましくは、１００ｎｍ〜１０μｍであり、より好ましくは、１００ｎｍ〜１μｍである。前記修飾微粒子の修飾物質としては、特に制限されず、細胞内や核内に導入したい物質があげられ、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド、タンパク質、糖、脂質及びこれらの誘導体や、これら以外の無機化合物や有機化合物があげられる。これらの修飾物質による微粒子への修飾の形態としては、例えば、前記微粒子表面への物理的吸着、化学結合、イオン結合等があげられ、その修飾方法は、特に制限されず、従来公知の方法を用いることができる。
【００１３】
前記導入目的物質は、前記液又はゲル中で溶解した状態でもよく、分散した状態でもよい。前記導入目的物質の前記液中又はゲル中濃度としては、例えば、１ｐｇ/μl〜１μｇ/μlであり、好ましくは、１ｎｇ/μl〜１μｇ/μlであり、より好ましくは、０.１〜１μｇ/μlである。また、前記導入目的物質が前記微粒子又は修飾微粒子である場合は、前記微粒子又は修飾微粒子は、分散した状態であってもよいが、標的細胞に付着するように配置した状態であってもよい。その場合、前記微粒子又は修飾微粒子は、前記濃度に関わらず、標的の１細胞あたり少なくとも１個を付着するように配置できればよい。ここで、標的細胞に微粒子又は修飾微粒子を付着するように配置するとは、前記液又はゲル中において、標的細胞上で微粒子又は修飾微粒子が静止するように配置できればよく、両者間の親和性や結合の有無は、特に制限されない。
【００１４】
本発明に使用するパルスレーザーは、集光させることで衝撃波を生じるものであれば特に制限されないが、例えば、ナノ秒未満の時間幅を有するパルスレーザーが好ましく、このようなレーザーとしては、例えば、フェムト秒チタンサファイアレーザー、フェムト秒ファイバーレーザー、フェムト秒イットリビウム(Ytterbium)レーザー、フェムト秒エキシマレーザー、ピコ秒ＹＡＧレーザー等があげられ、これらのなかでも、細胞に吸収のない波長で、効率的に衝撃波を発生させることができるという理由から、フェムト秒チタンサファイアレーザー、フェムト秒イットリビウムレーザー、フェムト秒ファイバーレーザーがより好ましい。ここで、衝撃波とは、前記パルスレーザーの集光部で誘起されるレーザーアブレーションにより発生する圧力波のことである。衝撃波は、集光部の周囲へ伝播するから、それによる力学的な摂動は、例えば、集光部周囲の物質の移動や振動により確認できる。例えば、集光部の大きさが１μｍの場合でも、その周囲の例えば数１０μｍの範囲にある物質の構造を、衝撃波による力学的な摂動により一時的に変化させることができる。ここで、衝撃波による細胞膜の構造の変化が一時的であるとは、衝撃波により引き起こされた細胞膜構造の変化は、細胞の細胞膜修復メカニズムにより修復されることを意味する。
【００１５】
なお、前述のように、従来のフェムト秒レーザー法（非特許文献３参照）は、フェムト秒レーザーを使用し、単発辺り１nJ/pulse程度のレーザーを80MHzの高周波数で数100万発照射する遺伝子導入方法であるが、本発明の導入方法とは照射するレーザー光において異なる。すなわち、本発明の導入方法は衝撃波を利用する方法であるのに対して、前記従来法におけるレーザー照射条件では、衝撃波は発生しないのである。
【００１６】
パルスレーザーの集光については、特に制限されず、集光部は、点状でも良いし、一定の面積をもった円形若しくは一定の体積を持った球形であってもよい。前記集光部が円形若しくは球形の場合、その半径は、例えば、０を越え１００μｍ以下であり、好ましくは、０を越え１０μｍ以下であり、より好ましくは、０を越え１μｍ以下である。なお、集光面積若しくは集光体積の大きさは、レンズや絞り等の光学系のシステムで調整可能である。
【００１７】
パスルレーザーを集光させる位置（以下、集光位置ともいう）は、標的細胞が配置される液又はゲルでもよく、前記標的細胞でもよい。ここで、パルスレーザーの集光位置が前記液又はゲルであるとは、集光部中心点が前記液又はゲルに位置することをいい、パルスレーザーの集光位置が標的細胞であるとは、集光部中心点が標的細胞上に位置することをいう。ここで、前記集光位置の設定は、当業者であれば容易に行うことができる。
【００１８】
集光位置を液又はゲルとする場合、パルスレーザーの集光部を標的細胞と接触させず、集光部から発生した衝撃波のみを標的細胞に接触させて導入することで、標的細胞に与える損傷をより低減できる。また、衝撃波は、パルスとして伝搬するが、パルスレーザーの集光部からの距離が離れるほど衝撃波のパルス形状は緩和するので、衝撃波の力は、集光部からの距離の２乗以上の関数に比例して減少する。したがって、衝撃波の力は、パルスレーザーの集光部から遠ざかるに従い急速に低下するから、パルスレーザーの強度と集光位置を適宜選択すれば、集光位置が液中やゲル中であっても、単一又は一定範囲の標的細胞に狙いを定めて衝撃波を接触させ、前記導入目的物質を導入することができる。前記標的細胞は、１個でもよいし、２個以上の複数個（例えば、３〜１０個程度）であってもよい。また、特定の細胞に狙いを定めず、不特定の複数（若しくは多数）の細胞に衝撃波を接触させることも可能である。
【００１９】
また、パルスレーザーの集光位置を標的細胞とする場合、集光部中心点は、標的細胞の細胞膜に位置させることが好ましい。パルスレーザーの集光位置が細胞膜であっても、衝撃波は発生する。集光位置を細胞膜とすれば、標的細胞の選択性のみならず、標的細胞における導入部位の選択性が向上する。すなわち、標的細胞のどの部位に前記導入目的物質を導入するかまで選択して導入することがより可能となる。
【００２０】
標的細胞とパルスレーザーの集光位置との距離としては、例えば、０以上１ｍｍ以下であって、０以上１００μｍ以下が好ましく、より好ましくは、０以上１μｍ以下である。ここで、標的細胞と集光位置との距離とは、集光部中心点から、集光部に最も近接した細胞の端までの距離であり、距離が０とは、パルスレーザーの集光位置が、標的細胞の細胞膜であることを示す。標的細胞の選択性及び標的細胞における導入部位の選択性の点からは、標的細胞とパルスレーザーの集光位置との距離は、短いほど好ましい。また、標的細胞の損傷をより低減する点からは、標的細胞とパルスレーザーの集光位置との距離は、標的細胞と集光部とが接しない距離であることが好ましい。
【００２１】
標的細胞に付着した微粒子又は修飾微粒子を導入する場合であって、パルスレーザーの集光位置が標的細胞の細胞膜である場合、前記細胞膜におけるパルスレーザーの集光位置としては、前記微粒子又は修飾微粒子の直下又はその近傍が好ましい。前記細胞膜に集光させた場合には、集光部で発生する衝撃波に加え、さらに、細胞膜におけるレーザーアブレーションも影響して、前記微粒子又は修飾微粒子が通過する孔が、前記細胞膜に形成されると考えられる。
【００２２】
なお、標的細胞に付着した微粒子又は修飾微粒子を導入する場合、パルスレーザーを液若しくはゲル又は標的細胞にパルスレーザーを集光させて照射することに代えて、パルスレーザーを前記微粒子又は修飾微粒子に集光させて照射してもよい。パルスレーザーの集光位置が、前記微粒子や修飾粒子であっても、同様に、衝撃波が発生すると考えられ、前記標的細胞内への導入が可能である。
【００２３】
本発明において、前記パルスレーザーの光密度（光子流量：photon flux）は、例えば、５×１０5（watt）以上であり、好ましくは、２×１０9（watt）以上である。パルスレーザーの光密度の上限は、特に制限されないが、例えば、１０18（watt）以下であり、好ましくは、１０15（watt）以下であり、より好ましくは、１０12（watt）以下である。
【００２４】
前記パルスレーザーの強度は、衝撃波が発生するように調整する。衝撃波の発生は、例えば、前述のとおり、例えば、集光部周囲の物質の移動や振動により確認できる。また、前記強度は、集光位置と細胞との距離の関係で、発生する衝撃波が標的細胞に接触するように調整することが好ましい。下記表１に、この関係の一例を示す。
【００２５】
（表１）                            パルスレーザー強度（nJ/pulse）
細胞と集光位置との距離    一般的強度      好ましい強度      より好ましい強度
1000μｍ以内               0.25〜0.25x109   0.25〜0.25x106    2.5〜0.12x106
２０μｍ以内               10-3〜106         1〜1000          10〜500 
０ｍ（細胞膜）             10-3〜106         1〜1000          10〜500       
前記パルスレーザーの波長は、例えば、１９０ｎｍ〜２０μｍのレーザーが使用でき、その中でも、直接的に強い吸収のある紫外線よりも、赤外光のほうが使用する培養器等の材料に関係なくレーザーの集光部で衝撃波を発生できることより、前記波長は、４００ｎｍ〜１１００ｎｍが好ましく、より好ましくは、６００ｎｍ〜１１００ｎｍである。
【００２６】
パルスレーザーの照射回数は、特に制限されず、例えば、１発（単発）から１０００万発であり、好ましくは単発から１０００発、より好ましくは単発から１０発であり、さらに好ましくは単発である。また、繰り返し複数発照射する場合のレーザーの繰り返し周波数は、例えば、１Ｈｚ〜５００ｋＨｚであり、好ましくは、１Ｈｚ〜１ｋＨｚであり、より好ましくは、１Ｈｚ〜２０Ｈｚである。
【００２７】
本発明の導入方法によれば、自然導入率が圧倒的に低い物質でも、それを超える確率で細胞に導入できる。例えば、導入目的物質がポリヌクレオチドの場合、本発明の方法による導入率は、例えば、２０％以上であって、好ましくは、５０％以上であって、より好ましくは、６０％以上であって、さらに好ましくは９０％以上である。なお、ポリヌクレオチドの自然導入率は、通常、例えば、５％以下である。
【００２８】
つぎに、本発明の細胞外物質の細胞内への導入方法の一例について、図面に基づき説明する。
【００２９】
図１に、本発明の方法に使用する細胞チャンバーの一例を示す。この細胞チャンバー１０は、接着性の細胞用であり、スライドガラス１の上に基板６が配置されており、この表面は薄膜５でコートされ、この薄膜５の上に接着性の標的細胞４が配置されている。スライドガラス１の上には、スペーサー２を介してカバーガラス３が配置されており、スライドガラス１とカバーガラス３との間に一定の空間が形成されており、この空間に、導入目的物質を含む液が充填される。
【００３０】
前記細胞チャンバー１０の内部の寸法は、特に制限されないが、例えば、全長５０ｍｍ〜１ｍｍ、幅５０ｍｍ〜１ｍｍ、高さ５ｍｍ〜０．１ｍｍ、容積１２．５ｍｌ〜１０-4ｍｌであって、好ましくは、全長１０ｍｍ〜１ｍｍ、幅１０ｍｍ〜１ｍｍ、高さ１ｍｍ〜０．１ｍｍ、容積０．１ｍｌ〜１０-4ｍｌであり、より好ましくは、全長１０ｍｍ、幅１０ｍｍ、高さ０．２ｍｍ、容積０．０２ｍｌである。
【００３１】
前記スライドガラス１及びカバーガラス３の材質は、ガラスでもよく、例えば、ポリスチレン、ＰＭＭＡ、ポリメタクリルアクリルアミド、ＰＥＴ等の透明樹脂であってもよい。また、前記スライドガラス１の大きさは、特に制限されないが、例えば、全長１００ｍｍ〜１ｍｍ、幅１００ｍｍ〜１ｍｍ、高さ１０ｍｍ〜０．１ｍｍであって、好ましくは、全長５０ｍｍ〜１ｍｍ、幅５０ｍｍ〜１ｍｍ、高さ５ｍｍ〜０．１ｍｍであり、より好ましくは、全長１０ｍｍ〜１ｍｍ、幅１０ｍｍ〜１ｍｍ、高さ１ｍｍ〜０．１ｍｍである。
【００３２】
前記スペーサー２の材質は、特に制限されないが、例えば、シリコンゴム、天然ゴム、テフロン（登録商標）、ポリスチレン、ＰＭＭＡ、ＰＥＴ等があげられる。また、前記スペーサー２の高さは、例えば、５ｍｍ〜０．１ｍｍであって、好ましくは１ｍｍ〜０．１ｍｍであり、より好ましくは、０．２ｍｍである。
【００３３】
前記基板６の材質は、特に制限されず、例えば、ガラス、ポリスチレン、ＰＭＭＡ、ポリメタクリルアクリルアミド、ＰＥＴ等が使用できる。また、前記基板６の大きさは、特に制限されないが、例えば、全長５０ｍｍ〜１ｍｍ、幅５０ｍｍ〜１ｍｍ、高さ５ｍｍ〜０．０２ｍｍであって、好ましくは、全長１０ｍｍ〜１ｍｍ、幅１０ｍｍ〜１ｍｍ、高さ１ｍｍ〜０．１ｍｍであり、より好ましくは、全長１０ｍｍ、幅１０ｍｍ、高さ０．１ｍｍである。なお、前記基板６の形状は、特に制限されず、例えば、矩形であってもよく、前記全長及び幅の寸法の範囲に収まる円形や不定形であってもよい。
【００３４】
前記薄膜５は、特に制限されず、例えば、接着性細胞の種類等に応じて適宜選択できる。前記薄膜５としては、例えば、コラーゲン薄膜、ポリスチレン薄膜、ポリメタクリルアクリルアミド薄膜、酸化チタン薄膜、ハイドロキシアパタイト薄膜等があげられる。
【００３５】
つぎに、本発明の導入方法を実施するための細胞外物質導入装置の一例を、図２に示す。図示のように、この装置は、正立顕微鏡１１及びパルスレーザー照射装置１７を主要構成要素としている。正立顕微鏡１１は、ステージ１２と、コンデンサーレンズ１３と、対物レンズ１４と、光源ランプ１５と、ＣＣＤカメラ１６と、ダイクロックミラー２１とを備えている。前記ステージ１２上には、細胞チャンバー１０等が配置される。正立顕微鏡１１のステージ１２の下方には、コンデンサーレンズ１３が配置され、その下には、光源ランプ１５が配置され、この光を検出するＣＣＤカメラ１６が顕微鏡１１上部に配置されている。正立顕微鏡１１の外部に、パルスレーザー照射装置１７が配置されており、正立顕微鏡１１及びパルスレーザー照射装置１７との間には、光学システムが配置されている。前記光学システムは、λ／２板１８、偏光子１９及びコリーメーターレンズ２０からなり、この順序で、発射されたパルスレーザー２２が通過する。正立顕微鏡１１内に導入されたパルスレーザー２２は、ダイクロイックミラー２１で反射され、対物レンズ１４を通して、細胞チャンバー１０に照射される。この装置では、前記λ／２板１８及び偏光子１９により、パルスレーザー２２の強度を調節でき、また、前記コリーメーターレンズ２０により、パルスレーザー２２を顕微鏡の結像面に集光するように調節でき、ステージ１２により、パルスレーザー２２の集光位置を調節できる。
【００３６】
この装置を使用した細胞外物質の細胞内への導入は、例えば、次のようにして行う。まず、細胞チャンバー１０（図１参照）内の薄膜５上に、標的細胞４を配置し、これを正立顕微鏡１１のステージ１２に乗せる。そして、ＣＣＤカメラ１６で、細胞チャンバー１０内の様子を観察し、標的とする細胞を決定する。そして、パルスレーザーの集光位置が適当な位置になるように、ステージ１２で調整する。ついで、パルスレーザー照射装置１７によりパルスレーザー２２を照射し、前記光学システムで強度等を調整して細胞チャンバー１０にレーザーを照射する。細胞チャンバーでは、パルスレーザーの集光部で、衝撃波が生じる。この状態を図３に示す。同図において図１と同一部分には同一符号を付している。図３Ａでは、標的細胞４から一定の距離の液中にパルスレーザー２２を集光させて照射した状態を示し、図３Ｂでは、標的細胞４の細胞膜にパルスレーザー２２を集光させて照射した状態を示す。パルスレーザー２２が集光した部分において衝撃波２３が生じ、これによって標的細胞４の細胞膜の構造が一時的に変化して細胞外の導入目的物質が中に取り込まれる。
【００３７】
また、層を形成している細胞や組織を形成している細胞の中から、特定の単一細胞を標的細胞として導入する場合は、例えば、図４Ａのようにして行うことができる。同図において、図１及び図３と同一部分には同一符号を付している。まず、細胞チャンバー１０内の薄膜５上に単一標的細胞８を含む細胞群４が配置された基板６をスライドガラス１上に配置し、前記スライドガラス１とスペーサー２とカバーガラス３とから形成される空間を導入する物質を含む液で満たす。そして、例えば、前述の細胞外導入装置（図２参照）等を用いてパルスレーザー２２を照射する。同図に示すように、前記パルスレーザー２２を、前記標的細胞８の上方で集光させ、それにより発生する衝撃波２３を前記標的細胞８のみに接触させると、細胞膜の構造が一時的に変化して細胞外の物質が細胞８内に取り込まれる。他方、層を形成している細胞や組織を形成している細胞の中から、特定範囲の細胞を標的細胞として導入する場合は、例えば、図４Ｂのようにして行うことができる。同図において、図４Ａと同一部分には同一符号を付している。図４Ｂに示すとおり、パルスレーザー２２の集光位置と、それから発生する衝撃波２３の大きさを調節することで、前記特定範囲の細胞に衝撃波２３を接触させれば、これらの細胞にのみ細胞外物質を導入できる。
【００３８】
なお、これらの例では、接着性細胞の例を取り上げたが、本発明はこれらに限定されず、浮遊性細胞にも当然適用可能である。例えば、図５に示すように、浮遊性細胞用の細胞チャンバー３０を用意し、これにパルスレーザー３４を照射すればよい。細胞チャンバー３０は、基板と薄膜を有さない他は、図１の細胞チャンバー１０と同様の構成であり、材質及びサイズも同様である。図示のように、パルスレーザー照射装置３３から照射されたパルスレーザー３４は、集光レンズ３５等の光学系を通過し、細胞チャンバー３０内の液３２中で集光する。すると、集光位置を中心として衝撃波３６が発生し、これが細胞３１に接触して細胞膜の構造が一時的に変化して細胞外物質が細胞内に取り込まれる。なお、浮遊性細胞に対しても図２に示す装置で細胞外物質を導入してもよい。その場合、図５に示すような浮遊性細胞用の細胞チャンバーを使用すればよい。
【００３９】
つぎに、導入目的物質として前記微粒子又は修飾微粒子を用いた場合の導入方法の一例を、図９Ｂの断面模式図を用いて説明する。同図において、図１及び図３と同一部分には同一符号を付している。まず、図９Ｂ-１に示すように、細胞チャンバー１０（図１参照）内の薄膜５でコートされた基板６上に、接着性の標的細胞４を配置し、さらに、導入目的物質である微粒子又は修飾微粒子４１を前記標的細胞４上に配置する。微粒子又は修飾微粒子４１は、同図において２個記載されているが、標的とする１細胞あたり少なくとも１個あればよい。つぎに、図９Ｂ-２に示すように、標的細胞４から一定の距離の液中にパルスレーザー２２を集光させて照射する。パルスレーザー２２の集光位置と、それから発生する衝撃波２３の大きさを調節し、微粒子又は修飾微粒子４１及び標的細胞４に衝撃波２３を接触させると、標的細胞４の細胞膜の構造が一時的に変化し、図９Ｂ-３及びＢ-４右図に示すように、微粒子又は修飾微粒子４１が、標的細胞４の中に取り込まれる。
【００４０】
前記微粒子又は修飾微粒子の導入方法のその他の例を、図１０Ｂの断面模式図を用いて説明する。同図において、図９Ｂと同一部分には同一符号を付している。図１０Ｂに示す導入方法は、前述の図９に示す導入方法において、前記微粒子又は修飾微粒子４１及び標的細胞４から離れた液中にパルスレーザー２２を集光させて照射することに代えて、図１０Ｂ-２に示すように、パスルレーザー２２を、前記微粒子又は修飾微粒子４１の直下又は近傍の細胞膜に集光させて照射する導入方法である。
【００４１】
従来、ＤＮＡを修飾した金微粒子（金ナノ粒子）を電圧により加速し、細胞内に導入するパーティクルガン法と呼ばれる遺伝子導入方法があるが、この方法では、特定の細胞のみに遺伝子を導入することが難しい。しかしながら、前記微粒子又は修飾微粒子を用いた本発明の導入方法であれば、ＤＮＡで修飾した金微粒子を用いて、特定の細胞に遺伝子を導入することが可能となる。
【００４２】
本発明の導入方法を用いれば、例えば、細胞外物質が導入された細胞を製造できる。そして、例えば、前記細胞外物質として遺伝子を用いれば、形質転換細胞を製造できる。前記遺伝子は、特に制限されないが、例えば、成長因子や分化因子等の遺伝子があげられる。
【００４３】
つぎに、本発明の実施例について比較例と併せて説明する。ただし、本発明は、以下の実施例には限定されない。
【実施例１】
【００４４】
（細胞チャンバー）
細胞チャンバーは、図１に示す接着性細胞用のものを使用した。スペーサー２はシリコンゴム製であり、高さが２００μｍである。
【００４５】
（細胞外物質導入層装置）
細胞外物質導入装置は、図２の構成の装置を使用した。パルスレーザー照射装置１７として、再生増幅付フェムト秒チタンサファイアレーザー（８００ｎｍ、１２０ｆｓ、米国Spectra-Physics社製）を用いた。対物レンズ１４は、倍率が１００倍であり、開口数が１．２４のもの（オリンパス株式会社製）を用いた。集光位置は、コリーメーターレンズ２０を用いて、顕微鏡１１の結像面に集光されるように調整した。パルスレーザー２２の集光部は、半径約１μｍの円形とした。前記レーザー２２の強度は、λ/２板１８及び偏光板１９で調節した。
【００４６】
（標的細胞）
標的細胞は、マウス由来の繊維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３株を使用した。この細胞を、前記細胞チャンバーの基板のコラーゲン薄膜（厚み約５００μｍ）上で培養した。その培地として、Dulbecco's modification of Eagle's medium (DMEM)を使用した。前記基板の材質は、ポリスチレンであった。
【００４７】
（導入するＤＮＡ）
前記細胞に導入するＤＮＡとして、アクチン-ＧＦＰプラスミド（pEGFP-Actin）を使用した。このプラスミドを０．１μｇ/μｌの濃度で前記細胞チャンバーの前記培養液に添加した。前記pEGFP-ActinプラスミドはBD Biosciences Clontech(No.632348)社から購入し、その一部を大腸菌DH5α株に形質転換して単一コロニーを単離した後、プラスミドの大量調製を行った。大量調製は市販のQUIAGEN Plasmid Maxi Kit(QUIAGEN No.12163)を用い、キットに添付のプロトコールに従って実施した。得られたプラスミドのうち50μgを採取し、再度エタノール沈殿を行った後、無菌的に風乾してNuclease-Free Water(Promega No.E111B)に0.1μg/μlとなるように溶解して、これを遺伝子導入に使用した。
【００４８】
（マルチタイムライムラプスシステム観察）
細胞の観察は、マルチタイムライムラプスシステムにより観察した。このシステムは、顕微鏡１１のステージ１２上に配置された前記細胞チャンバー１０内の細胞の二次元座標位置を記憶させ、前記電動ステージ１２と連動させることで、一定時間の間隔で各細胞の光学的視覚情報のピックアップを可能にするシステムである。このシステムについて、図６の模式図を用いて説明する。同図において、図１及び図２と同一部分には同一符号を付している。同図に示すように、顕微鏡の電動ステージ１２の上に細胞チャンバー１０を配置すると、最初は、二次元座標（ｘ、ｙ）＝（ａ1、ｂ1）に位置する細胞４に対して検出光３７が照射され、これによって前記細胞４が観察され（図６Ａ）、一定時間経過後、前記電動ステージが動いて、二次元座標（ｘ、ｙ）＝（ａ2、ｂ2）に位置する細胞４に対し検出光３７が照射され、これによって前記細胞４が観察される（図６Ｂ）。この一連の工程の中で、検出光３７の位置は固定されており、電動ステージ１２により観察対象の細胞４が移動する。このマルチタイムライムラプスシステムを用い、パルスレーザーを照射した細胞約１８０個を、約１０分間隔で順次観察することを繰り返すことにより、時間経過による細胞の変化を観察した。
【００４９】
（プラスミドＤＮＡの導入）
約１８０個のＮＩＨ３Ｔ３細胞を約３０個ずつのグループに分け、そのグループごとの６パターンの照射条件で、細胞から２０μｍ横方向の位置にフェムト秒チタンサファイアレーザーを照射し、集光させ、前記アクチン-ＧＦＰプラスミドの導入を行った。前記導入は、前記プラスミドが発現するＧＦＰの蛍光を観察することで確認した。前記観察は、前記マルチタイムライムラプスシステムで、レーザー照射後１２時間おこなった。その結果の一例を図７に示す。図７Ａ−１，Ａ−２，Ａ−３，Ａ−４（図７Ａグループ）及び図７Ｂ−１，Ｂ−２，Ｂ−３，Ｂ−４（図７Ｂグループ）の各図は、レーザー強度３６０ｎJ/pulseで細胞の端から２０μｍ横方向の位置に照射した細胞のうちの２つの細胞の観察結果の一例であって、図７Ａグループ及びＢグループのそれぞれにおいて、Ａ−１，Ｂ−１はレーザー照射前の透過像を示し、Ａ−２，Ｂ−２はレーザー照射直後の透過像を示し、Ａ−３，Ｂ−３はレーザー照射１２時間後の透過像を示し、Ａ−４，Ｂ−４は、レーザー照射１２時間後の蛍光像を示す。図７Ａ−２，Ｂ−２のそれぞれの図に示すように、照射後の細胞は、基板に接着しており外傷は観察されなかった。また、図７Ａ−４，Ｂ−４のそれぞれの図に示すように、強い蛍光を発する細胞と、弱い蛍光を発する細胞が観察されたが、これらは、導入した時の細胞周期の違いに起因すると考えられる。
【００５０】
結果として、レーザー強度が１８０ｎJ/pulseの場合に照射細胞３０個に対して、導入細胞１２個を得て、レーザー強度が３６０ｎJ/pulseの場合に照射細胞３５個に対して、導入細胞２０個を得た。したがって、導入確率は、それぞれ、４０％及び５７％であった。
【００５１】
（比較例）
レーザー照射を行わない他は、実施例１と同様にして細胞を観察した。その結果、約５％の細胞からプラスミドのＧＦＰに起因する発光が観察された。なお、観察時間は、プラスミドＤＮＡを含む培地を添加して細胞チャンバーを調製した時点を基準とした。観察１２時間後の結果の一例を図８に示す。図８Ａは、４０倍の対物レンズを使用して観察した透過像を示し、図８Ｂは、その蛍光像を示す。図８Ｂにおいて発光している細胞が、ＤＮＡの自然導入が行われた細胞である。このように、自然条件では、前記プラスミドＤＮＡが、前記細胞に導入される確率は著しく低いことが示された。
【実施例２】
【００５２】
（金微粒子の導入）
細胞に付着した金微粒子（BBInternational, EM. GC50）に対して、前記金微粒子から一定距離の培養液中にパルスレーザーを集光し、集光部で発生させた衝撃波を利用して、前記金微粒子の細胞内への導入を行った。なお、前記金微粒子の直径は、５０ｎｍであり、細胞チャンバー、細胞外物質導入層装置及び標的細胞は、実施例１と同様のものを使用した。
【００５３】
まず、金微粒子を培養液に分散させて前記標的細胞に付着させた。つぎに、金微粒子から約５μｍ離れた培養液中であって、細胞にレーザーがあたらない位置に集光するように、１μJ/pulseのフェムト秒レーザーを１kHzで５０shot照射した。その様子を図９に示す。
【００５４】
図９Ａの顕微鏡写真において、実線の囲いは、標的細胞４の輪郭を示し、破線の円は、金微粒子４１を示し、右下のスケールバーは、２０μｍを示す。図９Ｂは、左図の破線における断面模式図である。図９Ａ-１は、金微粒子４１が標的細胞４に付着しているレーザー照射前の顕微鏡写真の一例を示し、図９Ａ-２及びＡ-３は、それぞれ、培養液中の金微粒子近傍にフェムト秒レーザーを集光させて照射し、それにより衝撃波を発生させた直後及び１秒後の顕微鏡写真の一例を示す。図９Ａ-２及びＡ-３に示すとおり、前記衝撃波の発生後、顕微鏡の焦点位置（結像面）から前記金微粒子が消えた。そして、顕微鏡の焦点位置を前記標的細胞内に調節すると、図９Ａ-４に示すように、前記金微粒子が観察された（レーザー照射後５.６秒）。前記金微粒子の大きさは直径５０ｎｍであり、通常、光の波長より小さい物体を光学顕微鏡で観察することは困難な場合が多いところ、前記金微粒子は、その散乱係数が非常に高いため検出可能であり、前述のように、顕微鏡の焦点位置を利用することで金微粒子の導入を確認した。
【００５５】
この結果から、金微粒子が標的細胞に付着している場合に、金微粒子近傍の培養液中にフェムト秒レーザーを集光させて衝撃波を発生させ、その衝撃波を前記金微粒子及び前記標的細胞に接触させることにより、前記金微粒子を前記標的細胞内に導入できることが確認された。
【実施例３】
【００５６】
（細胞膜にレーザー集光させることによる金微粒子の導入）
フェムト秒レーザーの集光位置を、金微粒子から約５μｍ離れた培養液中に代えて、金微粒子直下の標的細胞の細胞膜とした以外は、実施例２と同様にして、標的細胞上に付着した金微粒子を細胞内に導入した。細胞上に付着したいくつかの金微粒子のうち、１つの金微粒子の直下の細胞膜にレーザーを集光させた。その様子を図１０に示す。
【００５７】
図１０Ａの顕微鏡写真において、実線の囲いは、標的細胞４の輪郭を示し、破線の円は、金微粒子４１を示し、右下のスケールバーは、２０μｍを示す。また、図１０Ｂは、図１０Ａのそれぞれに対応する断面模式図である。図１０Ａ-１は、金微粒子４１が標的細胞４に付着しているレーザー照射前の顕微鏡写真の一例を示す。同図のいくつかの金微粒子のうち、引き出し線が引かれている金微粒子４１の直下の細胞膜に、フェムト秒レーザー２２を集光させた。図１０Ａ-２及びＡ-３は、それぞれ、フェムト秒レーザー２２を照射して集光させて衝撃波を発生させた直後及び３．７秒後の顕微鏡写真の一例を示す。図１０Ａ-２及びＡ-３が示すとおり、前記レーザー照射の直後、集光位置の細胞膜に付着していた金微粒子４１が顕微鏡の焦点位置（結像面）から消えた。そして、顕微鏡の焦点位置を前記標的細胞内に調節すると、図１０Ａ-４の顕微鏡写真に示すように、前記金微粒子４１が観察された（レーザー照射後５.６秒）。
【００５８】
この結果から、金微粒子が標的細胞に付着している場合に、前記金微粒子が付着する細胞膜にフェムト秒レーザーを集光させて衝撃波を発生させることにより、前記金微粒子を前記標的細胞内に導入できることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００５９】
以上のように、パルスレーザーの集光により生じる衝撃波を利用した本発明の導入方法は、簡便であり、かつ、細胞に与える損傷を少なくすることができる導入方法である。また、本発明の導入方法は、特定の単独若しくは一定範囲の細胞を標的細胞として設定でき、さらに、標的細胞における導入部位も選択して設定できる。したがって、本発明は、例えば、細胞の形質転換等に有用であり、例えば、培養幹細胞の特定細胞に分化因子、成長因子等を導入でき、細胞から組織構築を人工的に行う再生医療の分野に有用である。また、本発明によれば、例えば、タンパク質製剤や遺伝子製剤を特定の単独若しくは一定範囲の細胞を標的細胞に導入して、その効果を単一細胞レベル又は局所レベルで評価することができるから、本発明は創薬の分野においても有用である。さらに、本発明は、例えば、組織細胞における特定局所領域に遺伝子を導入する場合にも有用であり、次世代のバイオテクノロジーの基板技術を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】図１は、本発明に使用する細胞チャンバーの一例を示す模式図である。
【図２】図２は、本発明に使用する細胞外物質導入装置の一例を示す模式図である。
【図３】図３Ａ及びＢは、本発明におけるパルスレーザー照射の一例を説明する模式図である。
【図４】図４Ａ及びＢは、本発明におけるパルスレーザー照射のその他の例を説明する模式図である。
【図５】図５は、本発明におけるパルスレーザー照射のさらなるその他の例を説明する模式図である。
【図６】図６Ａ及びＢは、マルチタイムライムラプスシステム観察の一例を示す図である。
【図７】図７Ａ-１〜Ａ-４及び図７Ｂ-１〜Ｂ-４は、本発明の導入方法のその他の例の細胞の観察結果を示す写真である
【図８】図８Ａ及びＢは、プラスミドＤＮＡの自然細胞導入の観察結果を示す写真である。
【図９】図９Ａ-１〜Ａ-４は、本発明の微粒子の導入方法の一例の顕微鏡写真であり、図９Ｂ-１〜Ｂ-４は、それぞれ、前記顕微鏡写真の破線における断面模式図である。
【図１０】図１０Ａ-１〜Ａ-４は、本発明の微粒子の導入方法のその他の例の顕微鏡写真であり、図１０Ｂ-１〜Ｂ-４は、それぞれ、前記顕微鏡写真の断面模式図である。
【符号の説明】
【００６１】
１  スライドガラス
２  スペーサー
３  カバーガラス
４  細胞
５  薄膜
６  基板
８  標的細胞
１０  細胞チャンバー
１１  顕微鏡
１２  ステージ
１３  コンデンサーレンズ
１４  対物レンズ
１５  光源ランプ
１６  ＣＣＤカメラ
１７  パルスレーザー照射装置
１８  λ/２板
１９  偏光板
２０  コリーメーターレンズ
２１  ダイクロイックミラー
２２  パルスレーザー
２３  衝撃波
３０  光学セル
３１  細胞
３２  導入する物質を含む液
３３  パルスレーザー照射装置
３４  パルスレーザー
３５  レンズ
３６  衝撃波
３７  検出光
４１  微粒子
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
0004681279.tif 000009
【図９】
0004681279.tif 000010
【図１０】
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