(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類の上皮系細胞への分化制御機能を有する歯胚間葉系細胞を継代培養して細胞系列を作製する工程と、
該細胞系列をフィーダー細胞として前記哺乳類と同種の胚性幹細胞を、誘導因子の存在下で共に培養して混合細胞群を作製する工程と、
該混合細胞群を単一化する工程と、
該単一化された混合細胞群を誘導因子の存在下で浮遊培養する工程とを有し、前記誘導因子は、アクチビン、骨誘導因子４、インスリン成長因子１、繊維芽細胞成長因子２又は、トランスフォーミング増殖因子β１である、象牙芽細胞及びエナメル芽細胞に分化誘導可能であり、歯の形成に使用できる細胞塊の作製方法。
【請求項２】
請求項１に記載の作製方法で得られた細胞塊を、アクチビン、骨誘導因子４、トランスフォーミング増殖因子β１、インスリン成長因子１及び繊維芽細胞成長因子２のいずれも存在しない血清培地中で接着培養する工程を有する歯の形成方法。
【請求項３】
請求項１に記載の作製方法で得られた細胞塊を、アクチビン、骨誘導因子４、トランスフォーミング増殖因子β１、インスリン成長因子１又は繊維芽細胞成長因子２の存在下で接着培養する工程と、アクチビン、骨誘導因子４、トランスフォーミング増殖因子β１、インスリン成長因子１及び繊維芽細胞成長因子２のいずれの因子も存在しない血清培地中で接着培養する工程を有する歯の形成方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法で作製した、象牙芽細胞及びエナメル芽細胞に分化誘導可能であり、歯の形成に使用できる細胞塊。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳類の歯の再生法に関し、より詳細には、同種哺乳類の未分化細胞と歯胚間葉系細胞との細胞塊を利用した歯の形成法に関し、さらにより詳細には、当該方法を利用する再生医学、歯の再生医療及び診断、並びに医薬品開発に関する。
【背景技術】
【０００２】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで哺乳類の歯を再生する試みや、哺乳類の歯の再生機構を解明して、そこから得られる知見を活用してヒトの歯を再生しようとする試みが、長年にわたり続けられている。「歯」は外胚葉由来の上皮系細胞（歯胚上皮）と頭部神経冠由来の間葉系細胞（歯胚間葉系）から形成される。歯胚上皮は、胎生初期に口腔上皮の一部が陥入したものであり、一方、歯胚間葉系は、神経提由来の未分化細胞を含む間葉系細胞が歯胚上皮下に集積したものである。歯の形成の全過程において、歯胚における上皮系と間葉系細胞との間の相互作用が重要な役割を担っている（例えば、非特許文献１参照）。歯胚上皮系細胞が分泌する繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）ファミリー（例えば、非特許文献２参照）、骨形成因子４（ＢＭＰ４）、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）などの誘導因子が、歯胚間葉系細胞にＭｓｘ１、Ｍｓｘ２、Ｄｌｘ１、Ｄｌｘ２、Ｌｅｆ１、Ｂａｒｘ１などのホメオボックス遺伝子の発現を誘導し、その結果、マウスでは、歯胚間葉系細胞は、胎生１１乃至１４日齢（ＥＤ１１−１４）で、歯冠の形や歯の位置を決定する機能や、上皮系細胞の分化を制御する機能を持つようになると考えられている（例えば、非特許文献３参照）。ＳＨＨは分泌性の蛋白質であり、体軸形成に関わる因子として知られている。歯の形成の過程では歯胚上皮細胞が分泌し、ＢＭＰを介して歯胚間葉系細胞に様々なシグナルを伝達する特に重要な因子と考えられている（例えば、非特許文献４参照）。これまで、マウスやラットの歯、歯胚部分、歯髄などを直接生体に移植したり、これらの組織をそのまま培養して（器官培養）生体移植したり、細胞単位まで単一化（つまり、バラバラに）して培養した細胞を用いた歯の再生実験が数多く報告されているが、歯が形成された明確な証拠が認められる例は存在していない。これまでの試みは以下に示すように、大きく３つの方向に分けられる。
１）：生体内で歯形成に関与している組織（歯乳頭、歯髄、歯根膜など）を利用する方法。
１）−１、歯胚、歯髄、歯根膜などの組織をそのまま移植する（例えば、非特許文献５参照）。
１）−２、歯胚を上皮系細胞と間葉系細胞とに分離して各々培養し、それぞれからエナメル芽細胞、象牙芽細胞を分化誘導してｉｎ  ｖｉｔｒｏで歯の形成を試みる。
１）−３、分離培養した歯胚上皮細胞と間葉系細胞を再度混合し、マウス皮下などの生体組織に移植して、歯の形成を試みる。（例えば、非特許文献６参照。）
２）：胚性幹細胞や間葉性幹細胞など、多分化能を持つ未分化細胞を利用する方法。【０００３】
未分化細胞を培養シャーレ上で適当な誘導物質とともに培養し、３次元培養法などを用いて歯の形成を誘導する。
３）：１）と２）の双方を利用する方法。【０００４】
この３）の方法は、１）や２）に比べて新しい試みである。実際に、１０日齢（ＥＤ１０）のマウス胎仔の歯胚上皮を手術により取り出し、ＦＧＦ８やＢＭＰ４存在下でマウス胚性幹細胞、骨髄幹細胞などの上に積層して培養し、マウス上顎内に移植して歯が形成された報告がある（例えば、非特許文献７、８参照）。しかし、この事例は、後述するように、エナメル基質形成の証拠がないので、完全な歯の形成の成功例とは認められていない。【０００５】
歯形成の組織学的根拠としては、ａ）カルシウムの沈着（石灰化、すなわち、象牙質化）と、ｂ）エナメル基質形成及びｃ）セメント質の形成があげられる。エナメル質は歯の強度や虫歯抵抗性を保つうえで重要な役割を担い、かつ、形成後再生が行われない。象牙質化の確認には、ｖｏｎ  Ｋｏｓｓａ、Ａｌｉｚａｒｉｎ  ｒｅｄ  Ｓなどの組織染色法と、骨シアロプロテイン（ｂｏｎｅ  ｓｉａｌｏｐｒｏｔｅｉｎ、ＢＳＰ）、オステオポンチン（ＯＰＮ；ＢＳＰ−１）、歯シアロプロテイン（ｄｅｎｔａｌ  ｓｉａｌｏｐｒｏｔｅｉｎ、ＤＳＰ）などの蛋白質や遺伝子の発現確認が必要である。エナメル基質形成の確認には、エナメル基質の構成蛋白質であるアメロジェニン、エナメリン、アメロブラスチンなどの遺伝子や蛋白質の発現の確認が必要である（図１）。これまで歯再生研究のなかで、石灰化（象牙質化）や骨化の報告が多いが、いずれも、エナメル基質の形成を、アメロジェニン、エナメリン、アメロブラスチンなどで確認した事例はなかった。【０００６】
“エナメル質”は歯の強度や虫歯抵抗性を保つうえで重要な役割を担い、かつ、形成後再生が行われない。エナメル形成の有無は、上述のごとく、エナメル構成物質であるアメロジェニンやエナメリン、アメロブラスチンのなどの遺伝子や蛋白質の発現により確認することができる。エナメル質の形成が歯の形成の証拠となるので、アメロジェニン、エナメリン、アメロブラスチンなどの確認が歯再生の鍵となる。
【非特許文献１】I. Thesleff. Epithelial-mesenchymal signaling regulating toothmorphogenesis. J. Cell Sci. (2003), 116, 1647-1648.
【非特許文献２】M. Mandler, A. Neubuser. FGF signaling is necessary for thespecification of the odontogenic mesenchyme. Dev. Biol. (2001) 240, 548-559.
【非特許文献３】A.S. Tucker, K.L. Matthews, P.T. Sharpe. Transformation of tooth type induced byinhibition of BMP signaling. Science (1998) 282, 1136-1138.
【非特許文献４】P. Maye, S. Becker, H. Siemen, J.Thorne, N. Byrd, J. Carpentino, L. Grabel. Hedgehog signaling is required forthe differentiation of ES cells into neuroectoderm. Dev. Biol. (2004) 265,276-290.
【非特許文献５】E. Koyama, C. Wu, T. Shimo, M. Pacifici. Chick limbs with mouseteeth: an effective in vivo culture system for tooth germ development andanalysis. Dev. Dyn. (2003) 226, 149-154.
【非特許文献６】M.J. Tabata, T, Matsumura, T. Fujii, M. Abe, K. Kurisu. Fibronectinaccelerates the growth and differentiation of ameloblast lineage cells invitro. J. Histol. Cyto. (2003) 51, 1673-1679.
【非特許文献７】A. Ohazama, S.A. Modino, I.Miletich, P.T. Sharpe. Stem-cell-based tissue engineering of murine teeth. J. Dent.Res. (2004) 83, 518-522.
【非特許文献８】S.A.C. Mondino, P.T. Sharpe. Tissueengineering of teeth using adult stem cells. Archiv. Oral Biol. (2005) 50,255-258.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上述したように、従来の歯を再生する手法において、胚性幹細胞や体性幹細胞などの未分化細胞を使用する方法がある。このような多分化能をもつ未分化細胞は、未分化のまま生体移植すると腫瘍化するという不利な点を有するが、適当な条件下であれば培養して大量に増やすことが可能であること、添加する誘導因子により様々な器官や組織に誘導できるなどの利点も多い。そのため、歯の再生のための細胞供給源として、多分化能を有する未分化細胞を利用する研究開発に大きな期待が寄せられており、近年、歯を再生するために、胚性幹細胞、体性幹細胞、骨髄幹細胞などの多分化能をもつ未分化細胞を積極的に活用した歯の再生工学が注目されている（例えば、非特許文献７、８参照）。【０００８】
しかしながら、上述のごとく、この事例では、ｉｎ  ｖｉｖｏでもｉｎ  ｖｉｔｒｏでも、歯の形成に不可欠なエナメル質である、アメロジェニン、エナメリン、アメロブラスチンなどの基質形成は確認されていない。【０００９】
したがって、本発明は上述に鑑みてなされたものであり、同種哺乳類の未分化細胞と歯胚間葉系細胞とを用いて細胞塊を作製し、さらに、作製された細胞塊を３次元マトリックス上で培養することによって、新規な歯の形成方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
哺乳類の生体において、歯の形成は、その形成の全過程において、外胚葉由来の上皮系細胞（歯胚上皮系細胞）と神経堤由来の間葉系細胞（歯胚間葉系細胞）との間の相互作用によって形成されることが分かっている。したがって、歯の形成には、歯胚由来の上皮系細胞系列と間葉系細胞系列が必要であることが考えられたが、歯胚上皮系細胞は単独で安定して細胞系列となりにくく、また、歯胚そのもの、歯胚上皮のみ、歯胚間葉系細胞のみ、歯胚上皮と歯胚間葉系細胞との混合細胞群によって歯の完全な再生は得られていなかった。そこで、本発明者らは、歯胚の間葉系細胞は未分化細胞や上皮細胞支持活性を維持した状態で細胞系列を作製できるという実験結果に着目して、歯胚上皮系細胞の代替としてマウス胚性幹細胞を利用することによって、歯胚間葉系細胞との相互作用により、歯胚上皮細胞を分化誘導できるという知見に基づき鋭意検討した結果、歯胚間葉系細胞上で胚性幹細胞を培養した後、これらの混合細胞を単一化（つまり、バラバラに）し、低接着性のプラスチックプレート上に播種して、新規な細胞塊を作製し、さらに、この新規な細胞塊を三次元マトリクス上で培養することによる歯の形成に非常に独特な製造方法を開発した。
【００１１】
即ち、上記目的は、請求項１に記載されるがごとく、哺乳類の上皮系細胞への分化制御機能を有する歯胚間葉系細胞を継代培養して細胞系列を作製する工程と、該細胞系列をフィーダー細胞として前記哺乳類と同種の胚性幹細胞を、誘導因子の存在下で共に培養して混合細胞群を作製する工程と、該混合細胞群を単一化する工程と、該単一化された混合細胞群を誘導因子の存在下で浮遊培養する工程とを有し、前記誘導因子は、アクチビン、骨誘導因子４、インスリン成長因子１、繊維芽細胞成長因子２又は、トランスフォーミング増殖因子β１である、象牙芽細胞及びエナメル芽細胞に分化誘導可能であり、歯の形成に使用できる細胞塊の作製方法によって達成される。
【発明の効果】
【００２９】
本発明によれば、同種哺乳類の未分化細胞と歯胚間葉系細胞とを用いて細胞塊を作製し、さらに、作製された細胞塊を３次元マトリクス上で培養することによって、新規な歯の形成方法を提供することができる。例えば、抜歯部分にｉｎ  ｖｉｔｒｏで再生した象牙芽細胞とエナメル芽細胞を持った本発明の生物材料、つまり歯様構造体形成の基質を分泌する細胞群を埋め込み、縫合して完全な歯の再生を行なうなど、生体の再生機能を活用する再生医療の手法が提供できる可能性がある。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】歯の形成過程を示す図である。
【図２】本発明の歯の形成法を説明する概略図である。
【図３】マウス歯胚から分離した間葉系細胞の培養と各種マーカーの確認の図である。
【図４】ＭＤＵ１の各種マーカー遺伝子発現と蛋白質発現を示す図である。
【図５】細胞塊作製過程を示す位相差顕微鏡像である。
【図６】各種誘導因子の存在下で作製した細胞塊のｉｎ ｖｉｔｒｏでの遺伝子発現を示す図である。
【図７】各種誘導因子の存在下で作製した細胞塊のｉｎ ｖｉｔｒｏカルシウム沈着試験を示す図である。
【図８】各種誘導因子の存在下で作製した細胞塊を生体マウスに移植した試料のカルシウム沈着試験を示す図である。
【図９】各種誘導因子の存在下で作製した細胞塊を生体マウスに移植した試料のマーカー蛋白質の発現を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
本発明の一つの好ましい態様について詳述して説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。【００３２】
本発明は、哺乳類において、多種多様な細胞や、組織に分化することができる、胚性幹細胞（以下、ＥＳ細胞という）を含む、すべての幹細胞である未分化細胞と、歯胚間葉系細胞とを用いて細胞塊を作製し、さらに、作製された細胞塊を３次元マトリクス上で培養することによって、新規な歯の形成方法を導く。ここで注目すべきことは、これまでＥＳ細胞と生体由来の組織を共に培養することは知られていたが、本発明のように、ＥＳ細胞と他の細胞とを培養して細胞塊を作製する方法は知られておらず、ましてや、それによって作製した細胞塊を利用する手法は全く知られていなかったことである。
【００３３】
したがって、本発明の歯の形成方法は、同種の哺乳類の「未分化細胞と歯胚間葉系細胞との細胞塊を誘導因子の存在下で培養して作製するステップ」と、さらに、「作製された細胞塊を３次元マトリクス上で培養するステップ」との組み合わせからなることを特徴とする。
【００３４】
図２は、マウスにおいて本発明の歯の形成法を説明する図である。【００３５】
本発明を概要すると、図２に示されるように、はじめに、上皮系細胞への分化制御機能を有するようになる１４日齢（ＥＤ１４）のマウス胎仔の歯胚間葉系細胞を採取し継代培養して、安定な細胞系列を作製する。次いで、この細胞系列をフィーダー細胞として同種マウスのＥＳ細胞を誘導因子の存在下で共に培養して、マウスの歯胚間葉系細胞とＥＳ細胞との「混合細胞群」を作製する。次いで、混合細胞群を単一化（つまり、バラバラに）し、低接着性のプラスチックプレートに播種して細胞塊を作製する。この低接着性のプラスチックプレートに播種する過程は、低接着性９６穴プラスチックプレートに１日培養し、次いで、低接着性２４穴プラスチックプレートに移して、誘導因子で４日間培養する過程からなる。このようにして、「未分化細胞と歯胚間葉系細胞との細胞塊を誘導因子の存在下で培養して作製するステップ」がなされて細胞塊が作製される。次いで、「作製された細胞塊を３次元マトリクス上で培養するステップ」がなされる。すなわち、作製した細胞塊を多孔質コラーゲン製の３次元マトリクス上に播種して培養し誘導因子を除いた血清培地で３日間培養する。また、より好ましい培養条件として、作製した細胞塊を上記同様に、多孔質コラーゲン製の３次元マトリクス上に播種して、誘導因子存在下で２日間培養し、誘導因子を除いた血清培地で３日間培養することもできる。したがって、本発明は、細胞塊を作製するステップと、作製された細胞塊を培養するステップとにより、歯を形成することを特徴とする。
【００３６】
ここで本発明で使用する幹細胞について説明する。本発明に係る幹細胞は、ある細胞に変化するようにという指示を受けると特定の細胞に変身、すなわち分化する能力を有する細胞であり、また、変化を遂げる前の未分化の状態で長期間にわたって自らを複製、再生する能力も備えている細胞である。幹細胞には階層性があり、より未分化な幹細胞は自己複製能が高く、非常に広範な細胞系列に分化できるが、幹細胞も下位になるに従い自己複製能は失われ、分化できる細胞系列が限定されてくる。ＥＳ細胞は受精卵に次いで上位に位置する幹細胞である。哺乳類の臓器には、組織特異的な幹細胞（すなわち、体性幹細胞、別名組織幹細胞）が存在する。体性幹細胞は固有の系列への分化能を有するとともに、分裂した際自己と同じ能力を持った細胞を再生（自己複製）することにより、それぞれの組織を維持していると考えられている。つまり、胚からは胚性幹細胞、すなわちＥＳ細胞、成人からは体性幹細胞、胎児からは胚生殖細胞を取り出すことができる。【００３７】
特に、ＥＳ細胞は、ある一定の培養条件下で未分化な状態を保持しながら半永久的に自己複製し、生殖細胞系列を含むあらゆる種類の細胞に分化できる全能性、多分化能を有する細胞として知られている。【００３８】
ＥＳ細胞は、受精した胚、つまり、受精卵が分化して胎児に発展するまでの状態である胚の初期段階から採り出されるもので、身体のどのような細胞にも成長できる性質を有するため多能性幹細胞とも呼ばれている。ＥＳ細胞は、受精後２．５日目の胚盤胞の内層細胞（内部塊細胞）から採り出して培養され、人体から採り出される体性幹細胞と違って、培養によって実験室において無限に増殖させることができ、かつ、どのような細胞にも変化できる万能性を有することから、事故や病気によって機能を損なわれた細胞や組織、臓器などの取って代わるための各種細胞を作り出すことのできる“素材”として研究されている。理論上、ＥＳ細胞から分化させた細胞に遺伝子治療の技術を用いて免疫関係の遺伝子を入れ替えたり、患者の遺伝情報を持つ胚を作り、そこからＥＳ細胞を取り出して目的の細胞に誘導したりすることによって、拒絶反応を起こさずに臓器を移植する方法も考えられる。【００３９】
一方、体性幹細胞とは、体の中にすでにかたちづくられた組織の中から採り出される分化する前の状態の細胞をいう。組織内には、その組織における特定の働きを担う、すでに分化を終えた細胞が多数存在しているが、中にはそうした特定の働きを持つ細胞へと分化する前の未分化細胞、すなわち幹細胞が混じって存在している。体性幹細胞は、自らと同じ細胞を複製し、製造する能力を持つとともに、分化によって、それが存在していた組織内のあらゆる個別細胞を作り出すことができる。【００４０】
特定の組織に分化することがわかっているためにすでに多くの治療に活かされ、白血病などの治療に必要な骨髄移植に用いられる骨髄幹細胞などが代表的な例である。【００４１】
したがって、上述したような機能を有する幹細胞を用いることによって、本発明を達成することが可能である。本発明の好ましい実施態様では、１４日齢（ＥＤ１４）のマウス胎仔の下顎臼歯の歯胚から間葉系細胞を採取し、培養した間葉系細胞と同種マウスのＥＳ細胞とを誘導因子の存在下で共に培養して、マウスの歯胚間葉系細胞とＥＳ細胞との細胞塊を作製したが、同種哺乳類において、上記した細胞塊の作製を導くものであれば、使用する幹細胞はＥＳ細胞に限定されず、体性幹細胞、骨髄幹細胞などの多分化能を有する、すべての幹細胞のいずれか一種を使用してよい。
【００４２】
また、上記マウスの歯胚間葉系細胞とＥＳ細胞との細胞塊を作製するために使用される誘導因子は、下記の実施例でも詳述するが、アクチビン（味の素）、骨誘導因子４（ｂｏｎｅ
ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ−４、ＢＭＰ−４；ＳＩＧＭＡ）、インスリン成長因子１（ｉｎｓｕｌｉｎ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−１、ＩＧＦ−１；ＴＯＹＯＢＯ）、繊維芽細胞成長因子２（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ
ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−２、ＦＧＦ−２；ＴＯＹＯＢＯ）及びトランスフォーミング増殖因子β１（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−β１、ＴＧＦ−β１；ＴＯＹＯＢＯ）を適切に使用することができる。
【００４３】
また、マウスの歯胚間葉系細胞とマウスＥＳ細胞との共存培養による細胞塊の好ましい作製方法は、下記の実施例にも詳述するが、以下の手法によってなされる。すなわち、培養した細胞がシャーレ上を約７０〜８０％覆った状態、つまりｃｏｎｆｌｕｅｎｔ
ｇｒｏｗｔｈになる前の歯胚間葉系細胞にマウスＥＳ細胞を加えて約５日間培養し、当該ＥＳ細胞を十分に分化させる。この細胞塊の作製過程において、マウスの歯胚間葉系細胞とマウスＥＳ細胞との細胞混合比は、約２：１であり、具体的には、本実施態様において培養した上記マウスの歯胚間葉系細胞１．７ｘ１０４個に対しマウスＥＳ細胞８ｘ１０３個であった。共存培養１日後に上記の誘導因子を加えたＭＳＣＧＭ培地を用い、３７℃、５％ＣＯ２下で上述のように計５日間培養を行う。その後、トリプシンとＥＤＴＡの処理により細胞を回収してプラスチックフィルターを通してシングル化し、低接着性の９６穴プラスチックプレートに播種し、次いで２４穴プラスチックプレートに播種して誘導因子の存在下で培養して、マウスＥＳ細胞とマウスの歯胚間葉系細胞との細胞塊を作製する。
【００４４】
次に、作製した細胞塊をさらに培養することによって、歯を形成する方法を説明する。上述の方法で作製した細胞塊を３次元マトリクス上にて培養する。例えば、作製した細胞塊を１乃至２ｘ１乃至２ｘ１乃至２ｍｍのコラーゲン担体上で培養し、上述した誘導因子を除いた血清培地で３日間培養する。また、より好ましい培養条件として、例えば、作製した細胞塊を１乃至２ｘ１乃至２ｘ１乃至２ｍｍのコラーゲン担体上で培養し、上述した誘導因子存在下で２日間培養し、誘導因子を除いた血清培地で３日間培養する。
【００４５】
このように、作製した細胞塊をさらなる培養によって処理することで生じた生物材料は、図１に示される歯の形成過程と同様に、担体上で石灰化が起こり、オステオポンチンと骨シアロプロテイン、歯シアロプロテインの遺伝子と蛋白質を発現し、さらに、エナメル基質であるアメロジェニンとエナメリンの遺伝子と蛋白質を発現することが分かった。
【００４６】
したがって、本実施態様において、マウス胎仔歯胚由来の間葉系細胞とマウスＥＳ細胞との細胞塊を作製し、さらに当該細胞塊を３次元マトリックス上で培養することによって、歯構成物質である象牙質とエナメル質のそれぞれの分泌細胞である、象牙芽細胞とエナメル芽細胞を同時に誘導できた。これにより、本発明では、マウスＥＳ細胞が歯胚間葉系細胞により上皮系細胞（エナメル芽細胞）へと分化することが示され、歯の再生にはじめて成功したことが認識できる。
【００４７】
また、本発明に係る歯の形成方法によって得られた生物材料は、歯の生産、または再生に利用することができる。【００４８】
ここでいう、歯の生産とは、哺乳類の生体の内外において、新たに歯を作製することをいう。また、歯の再生とは、虫歯などの疾患によって生じた歯の損傷等を、生体の内外において回復させ、歯を再生させることをいう。すなわち、本発明に係る生物材料は、いわゆる再生医療に利用可能である。【００４９】
なお、ここではマウスを用いた実施態様を示したが、本発明は、ヒトを含めた哺乳類全てにおいて実施可能である。
【実施例】
【００５０】
以下、実施例により本発明の方法にしたがって実施した具体例を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。なお、本発明の趣旨及び範囲を逸脱しない限り、その細部については様々な態様が可能である。【００５１】
まず、歯胚間葉系細胞系列の確立について説明する。【００５２】
１４日齢（ＥＤ１４）のマウス胎仔７匹分の下顎臼歯の歯胚を取り出し、Ｈａｎｋｓ液中で洗浄し、氷上で４時間ディスパーゼ処理をして組織を十分にほぐし、間葉系細胞塊を分離した。１２，０００ｒｐｍで３分間遠心洗浄した後、それを１０ｃｍfのプラスティックディッシュに移し１０％ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）加α−ＭＥＭ培地（Ｇｉｂｒｏ社）で３７℃、５％  ＣＯ２下で１日間培養した。翌日、培地をＭＳＣＧＭ培地（Ｃｈａｍｂｒｅｘ社）に置換して、同様に３７℃、５％  ＣＯ２下で培養を行った。以後、細胞がシャーレ上を約７０〜８０％覆った状態、つまりｃｏｎｆｌｕｅｎｔ  ｇｒｏｗｔｈになる前に継代培養して安定化した間葉系細胞系列を作った。市販のマウスＥＳ−Ｄ３細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、米国）は、あらかじめ０．１％のゼラチンをコートした２５ｍＬ培養用フラスコにフィーダー細胞なしで播種し、未分化を維持しながら培養した。培地は、１５％  ＫＳＲ（Ｇｉｂｃｏ社）、０．１ｍＭβ−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ社）、０．１ｍＭ非必須アミノ酸（Ｓｉｇｍａ社）、８ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ｓｉｇｍａ社）、および１，０００Ｕ／ｍｌ白血病抑制因子（Ｌｌｅｕｋｅｍｉａ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ、ＬＩＦ；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社）を含むＫｎｏｃｋＯｕｔ  ＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ社）を用い１日おきに交換した。【００５３】
図３左グラフに示したように、この細胞系列は、２０日間の培養を過ぎた時点で一時的に分裂能力の低下が見られたが、３０日を越えた時点から再び活発に分裂を行なうようになり、以後、安定して継代培養できる細胞系列が得られた。図３中央に見られるように、４週間培養した細胞（２継代）では、未分化マーカーであるネスチン（ｎｅｓｔｉｎ）陽性細胞がおよそ７０％確認でき、歯胚上皮系細胞マーカーであるサイトケラチン１４（ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ  １４）陽性細胞は認められなかった（図は示さない）。また、図３右に示すように、８週間培養した細胞（７継代）でも、ネスチン陽性細胞（図は示さない）と、別の未分化マーカーであるアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）陽性細胞が確認できた。この結果、７０日以上継代培養した歯胚由来の間葉系細胞は、歯胚上皮系細胞を含まず、かつ、未分化細胞を維持した細胞系列であることが示唆された。以下、この細胞系列をＭＤＵ１と呼ぶ。【００５４】
次いで、この細胞系列の特性を、遺伝子発現レベル（リアルタイムＰＣＲ法）と蛋白質発現レベル（免疫染色法）で調べた。その結果、図４左グラフに示すように、ＭＤＵ１は８週間培養細胞で４週間培養細胞よりもＳＨＨの遺伝子発現が増加し、歯シアロプロテイン（ＤＳＰ）、ＡＬＰ遺伝子の発現も亢進していた。また、図４右の免疫染色像からも、８週間培養細胞は未分化マーカーであるＯｃｔ３／４とネスチン陽性細胞をそれぞれ〜１％と〜７０％維持し、間葉系マーカーであるビメンチンを発現、ＳＨＨ、ＤＳＰ陽性細胞と若干のＡＭＧ、ＥＮＬ陽性細胞が確認できた。これらの結果から、ＭＤＵ１は継代によっても間葉系細胞の性質を強く維持し、未分化性を失わず、かつ、長期培養実験により石灰化の傾向を示すことから象牙芽細胞への分化誘導能も維持していることが分かった。したがって、この細胞系列は、強い歯の誘導能を持つことが示唆された。【００５５】
なお、歯胚間葉系細胞系列を確立する試みと並行して、歯胚から分離した上皮系細胞についても継代培養を試みたが、この細胞系は培養５日目で増殖が止まり、継代が不可能になったことから、安定した細胞系列はできにくいことが分かった。その理由として、上皮系細胞は間葉系細胞から分離されると、分裂能力や非誘導能力を急速に失うことが考えられた。すなわち、上皮系細胞の安定培養には間葉系細胞が必須であることが考えられる。【００５６】
次に、マウスＥＳ細胞と歯胚間葉系細胞系列との細胞塊の作成について説明する。
【００５７】
生体においては、歯胚の上皮系細胞と間葉系細胞との相互作用により歯が形成されることが分かっている。したがって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで歯の再生機構を検討するためには、安定して得られる歯胚由来の上皮細胞系列と間葉系細胞系列が必要であると考えられる。しかし、上に述べたように、歯胚上皮系細胞は単独では安定した細胞系列が作りにくいことが明らかになった。また、これまで歯胚そのもの、歯胚上皮のみ、歯胚間葉系細胞のみ、歯胚上皮と歯胚間葉系細胞との混合細胞群を移植し歯再生を試みた実験が報告されているが、完全な歯が再生できたという報告はなかった。発明者は、歯胚の間葉系細胞は未分化細胞や上皮細胞支持活性を維持した状態で細胞系列を作製できることから（例：ＭＤＵ１）、歯胚上皮系細胞の代替として、マウスＥＳ細胞を利用することを試みた。【００５８】
図５に示したように、細胞がシャーレ上を約７０〜８０％覆った状態、つまりｃｏｎｆｌｕｅｎｔ
ｇｒｏｗｔｈになる前の歯胚間葉系細胞にマウスＥＳ細胞を加え５日間培養し、ＥＳ細胞を十分に分化させた（図５左）。細胞混合比はＭＤＵ１
１．７ｘ１０４個に対しマウスＥＳ細胞８ｘ１０３個であった（図５中央）。誘導因子非存在下で１日共存培養をした後、培地に種々の誘導因子を加えたＭＳＣＧＭ培地を用い、３７℃、５％
ＣＯ２下で計５日間培養を行った。使用した誘導因子は、アクチビン（味の素）、骨誘導因子４（ｂｏｎｅ
ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ−４、ＢＭＰ−４；ＳＩＧＭＡ）、インスリン成長因子１（ｉｎｓｕｌｉｎ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−１、ＩＧＦ−１；ＴＯＹＯＢＯ）、繊維芽細胞成長因子２（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ
ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−２、ＦＧＦ−２；ＴＯＹＯＢＯ）、トランスフォーミング増殖因子β１（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−β１、ＴＧＦ−β１；ＴＯＹＯＢＯ）だった。その後トリプシン−ＥＤＴＡ処理（ＧＩＢＣＯ）により細胞を回収してプラスチックフィルターを通してシングル化し、低接着性の９６穴プラスチックプレート（Ｎｕｎｃ社）に播種して１日培養し、次いで、低接着性の２４穴プラスチックプレート（Ｎｕｎｃ社）に移して上記の誘導因子の存在下で４日間培養して、細胞塊を作製した。つまり、この過程を説明すると、歯胚間葉系細胞とマウスＥＳ細胞との混合細胞を回収してシングル化し、低接着性９６穴プラスチックプレートに播種して１日培養した時点で混合細胞は丸くなるが、この混合細胞はまだ小さくて細胞数が十分ではないので、低接着性２４穴プラスチックプレートに移して栄養（すなわち、血清培地と誘導因子）を十分に与えて大きくし、ほぼ１００〜２００ｍｉｃｒｏ径の細胞塊が作製された時点（すなわち、４日間培養）で終了する。
【００５９】
次に、細胞塊の３次元マトリクス上の培養と生体マウスへの移植について説明する。
【００６０】
作製した細胞塊を１〜２ｘ１〜２ｘ１〜２ｍｍのコラーゲン担体（Ｃｏｌｌａｇｅｎ
Ｓｐｏｎｇｅ ＨｏｎｅｙｃｏｍｂＴＭ）上で、上記の誘導因子を除いた血清培地で３日間培養した。コラーゲン担体に接着した細胞塊は、ハニカム構造をしたコラーゲン担体の梁部分に接着し伸展していることが分かった（図５右）。
【００６１】
さらに、上記と同様のコラーゲン担体上で、別の培養条件を用いて、作製した細胞塊を上記の誘導因子存在下で２日間培養し、誘導因子を除いた血清培地で３日間培養した。この培養条件によって、コラーゲン担体に接着した細胞塊は、ハニカム構造をしたコラーゲン担体の梁部分に良好に接着し伸展していることが分かった。細胞塊を吸着したコラーゲン担体の一部は、そのまま固定してパラフィン包埋し組織染色を行って観察し、残りは生体マウスの頭蓋上皮下および背部筋膜下に移植して４２日後に取り出しパラフィン包埋試料、電顕試料を作製した。以後、コラーゲン担体の梁部分をスキャフォルド、空間部分をマトリクスと呼ぶ。
【００６２】
はじめに、図６に示すように、リアルタイムＰＣＲ法で細胞塊がどのようなマーカー遺伝子を発現しているかを検討した。対照は、各種誘導因子を添加せず、マウスＥＳ細胞を含まない胚様体（ｃｏｎｔｒｏｌ（−ＥＳ））と各種誘導因子を添加せず、マウスＥＳ細胞を含む細胞塊（ｃｏｎｔｒｏｌ（＋ＥＳ））であり、マーカー遺伝子発現の割合を、ｃｏｎｔｒｏｌ（−ＥＳ）に対する相対値として表示した。その結果、アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）に関しては、発現が、いずれもほぼ一定のレベルで推移し、歯胚間葉系細胞内の未分化細胞の数はほぼ一定に保たれている可能性が考えられた。アメロジェニン（ＡＭＧ）、エナメリン（ＥＮＬ）、歯シアロプロテイン（ＤＳＰ）、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）に関しては、ＴＧＦ−β１添加によりもっとも発現が増加し、ＦＧＦ２によってもＡＭＧの発現上昇が確認された。その他、アクチビン、ＢＭＰ４、ＩＧＦ１添加試料に関しても、マーカー遺伝子の発現上昇が観察された。また、歯胚間葉系細胞にＥＳ細胞を加えただけでも、これらの遺伝子の発現上昇が見られた。この結果から、細胞塊では、象牙芽細胞形成だけでなく、エナメル芽細胞形成も同時に進んでいることが示唆された。
【００６３】
次に、同じ試料で象牙質化（石灰化）の程度を、カルシウム沈着特異的組織染色（ｖｏｎ Ｋｏｓｓａ−Ｋｅｒｎｅｃｈｔｒｏｔ法）で調べた。この染色法では、細胞はピンク色に、カルシウム沈着部位は褐色に染色される。対照は細胞塊に誘導因子を加えないものである。その結果、対照も含め、どの試料でも、コラーゲン担体のスキャフォルドに、カルシウムの沈着が生じていることが分かった。その中でも、特に、ＩＧＦ−１を作用した試料は強くカルシウム沈着が生じることが分かった。生体内でも歯形成はコラーゲン繊維の石灰化から始まることが知られている。
【００６４】
同じ試料を、生体マウスの頭蓋上皮下および背部筋膜下に移植し、４２日間経過した後に取り出して、カルシウムの沈着の有無を、ｖｏｎ  Ｋｏｓｓａ−Ｋｅｒｎｅｃｈｔｒｏｔ染色法とアリザリンレッドＳ染色法を使って調べた。なお、アリザリンレッドＳ染色法では、カルシウムは赤色に染色されるが、細胞は染色されない。【００６５】
調べた試料の中でも特にＩＧＦ−１を作用した試料は、コラーゲン担体のスキャフォルドに沿って強く、また、マトリクス内部にもカルシウム沈着が起こっていることが確認された。【００６６】
次に、免疫染色法でマーカー蛋白質の発現を調べた。【００６７】
図９の結果から、石灰化したコラーゲン担体のスキャフォルドは、どの試料でも染色されず、コラーゲン担体のマトリクスがアメロジェニン、オステオポンチンまたは骨シアロプロテインで染色されていた。また、マトリクス内には細胞質が無機質で埋まり核のみが見えるような細胞も観察された。対照では、石灰化したコラーゲン担体のスキャフォルドに沿ってアメロジェニン、オステオポンチン、が染色されたが、マトリクスはいずれも殆ど変化が見られなかった。アクチビン、ＢＭＰ４、ＴＧＦ−β１を作用させたコラーゲン担体のマトリクスでは、アメロジェニンとオステオポンチンが染色され、骨シアロプロテインの染色は見らなかった。一方、ＩＧＦ−１を作用させたコラーゲン担体では、マトリクス全体がアメロジェニンとオステオポンチンで強力に染色され、骨シアロプロテインではわずかに染色されていた。これらの結果から、コラーゲン担体マトリクスは骨様ではなく、象牙質様の石灰化が起こっていることが明らかになった。【００６８】
上述したように、マウス胎仔歯胚由来の間葉系細胞を継代培養した細胞系列を作成し、それにマウスＥＳ細胞を加えて混合培養したのち、細胞を単一化（つまり、バラバラに）して、低接着性プラスチックプレートに播種し細胞塊を作製した。この細胞塊をコラーゲン担体上で培養すると、接着した細胞塊はコラーゲン担体のスキャフォルドを石灰化し、マトリクス部分はアメロジェニン陽性でエナメル基質形成がみられた。さらに遺伝子解析からもアメロジェニン、エナメリン、歯シアロプロテイン、オステオポンチン、あるいは骨シアロプロテインの遺伝子発現の上昇が確認された。また、免疫染色の結果から、これらの蛋白質が実際に発現していることが明らかになった。したがって、マウス胎仔歯胚由来の間葉系細胞とマウスＥＳ細胞の細胞塊から、歯構成物質である象牙質とエナメル質の両方の分泌細胞（象牙芽細胞、エナメル芽細胞）を誘導することができた。この系では、マウスＥＳ細胞は、歯胚間葉系細胞により上皮系細胞（エナメル芽細胞）へと分化することが示唆された。また、この系に対して適切な誘導因子（ＦＧＦ２やＴＧＦ−β１など）を作用させると、歯への分化が強く促進された。
【００６９】
なお、本実施例では、マウス胎仔歯胚由来の間葉系細胞とマウスＥＳ細胞の細胞塊から、歯構成物質である象牙芽細胞と、エナメル芽細胞とを誘導することができたが、本発明はマウスに限定したものではなく、哺乳類一般に対して実施可能であり、ヒトを含めた哺乳類の歯の再生に適用可能である。また、本発明で使用する未分化細胞は、ＥＳ細胞に限ったものでなく、すべての幹細胞が本発明に対して適用可能である。
【００７０】
以上本発明の好ましい実施例について詳述したが、本発明はかかる特定の実施形態に限定されるものではなく、特許請求の範囲に記載された本発明の趣旨の範囲内において、種々の変形・変更が可能である。
【産業上の利用可能性】
【００７１】
哺乳類の幹細胞を活用して象牙質とエナメル質を再生することができれば、虫歯などで削られた穴にこれらの細胞群を詰め、密封して歯再生を行なう再生医療や、抜歯部分にｉｎ  ｖｉｔｒｏで再生した象牙芽細胞とエナメル芽細胞を持った生物材料、つまり歯様構造体形成の基質を分泌する細胞群を縫合して完全な歯の再生を行なうなど、内側から生体の再生機能を活用する再生医療に適用する方法が開発できる可能性がある。その他、歯の疾患を詳細に診断するための診断学への応用や評価系（アッセイ系）、医薬品開発の実験に供する可能性など活用範囲は広いと考えられる。したがって、本発明は、上に述べたすべての可能性を拓くものであり、その実用化の見通しと産業上の利用価値は極めて高い。【００７２】
本国際出願は、２００５年７月２９日に出願した日本国特許出願２００５−２２１６６８号に基づく優先権を主張するものであり、２００５−２２１６６８号の全内容を本国際出願に援用する。
【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図２】
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【図５】
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