(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）全血試料と、赤血球よりも小さく、免疫感作した不溶性担体粒子とを混合して免疫凝集反応を行わせ、
（ｂ）得られた凝集反応混合物をフローセルに導き、フローセルを通過する粒子にレーザー光を照射し、それによって生じる散乱光を検出し、
（ｃ）工程（ｂ）で検出した散乱光の強度に基づき、未凝集粒子と凝集粒子とを弁別するための第１閾値よりも小さい散乱光強度を示す粒子を未凝集粒子として計数し、凝集粒子と赤血球とを弁別するための第２閾値よりも小さく、且つ、第１閾値よりも大きい散乱光強度を示す粒子を凝集粒子として計数し、前記第２閾値よりも大きい散乱光強度を示す粒子を赤血球として計数する免疫測定方法。
【請求項２】
さらに、（ｄ）未凝集粒子数と凝集粒子数とから凝集度を算出し、凝集度を、予め求めておいた検量線から全血試料中の抗原または抗体濃度に換算することからなる請求項１に記載の免疫測定方法。
【請求項３】
さらに、（ｅ）工程（ｃ）で得られた赤血球数に基づいて抗原または抗体濃度を補正する請求項２に記載の免疫測定方法。
【請求項４】
赤血球数に基づく補正が、以下の式
Ｃ＝Ｃ０／（１−Ｂ／Ａ）
（式中、Ｃは補正値、Ｃ０は全血試料中の抗原または抗体濃度、Ｂは赤血球数、Ａは定数を示す）
によって行われる請求項３に記載の免疫測定方法。
【請求項５】
さらに、（ｆ）全血試料中の平均赤血球容積（ＭＣＶ）を求め、全血試料中の抗原または抗体濃度を、得られたＭＣＶ測定値と赤血球数に基づいて補正する請求項１又は２に記載の免疫測定方法。
【請求項６】
平均赤血球容積（ＭＣＶ）が、前記第１閾値および前記第２閾値に基づいて、工程（ｂ）で検出した散乱光から得られる請求項５に記載の免疫測定方法。
【請求項７】
ＭＣＶ測定値と赤血球数に基づく補正が、以下の式
Ｃ＝Ｃ０／｛１−（Ｂ／Ａ）×（ＭＣＶ／Ｄ）｝
（式中、Ｃ、Ｃ０、Ａ及びＢは上記と同じ、ＭＣＶは試料のＭＣＶ測定値、Ｄは定数を示す）によって行われる請求項５又は６に記載の免疫測定方法。
【請求項８】
不溶性担体粒子の大きさが、０．１μｍ〜１．０μｍである請求項１〜７のいずれか１項に記載の免疫測定方法。
【請求項９】
全血試料と、赤血球よりも小さく、免疫感作した不溶性担体粒子とを混合して免疫凝集反応を行わせるための反応部、
反応部で得られた凝集粒子と未凝集粒子とを含む免疫凝集反応混合物をフローセルに導くための分注機構、
フローセルを通過する粒子にレーザー光を照射するためのレーザー、
レーザー光を照射された粒子から生じる散乱光を受光して電気信号に変換する受光手段、及び、
受光手段で変換された前記電気信号に基づき、未凝集粒子と凝集粒子とを弁別するための第１閾値よりも小さい散乱光強度を示す粒子を未凝集粒子として計数し、凝集粒子と赤血球とを弁別するための第２閾値よりも小さく、且つ、第１閾値よりも大きい散乱光強度を示す粒子を凝集粒子として計数し、前記第２閾値よりも大きい散乱光強度を示す粒子を赤血球として計数するためのデータ処理手段を備えてなる免疫測定装置。
【請求項１０】
さらに、前記未凝集粒子数と凝集粒子数とから凝集度を算出し、該凝集度を、あらかじめ求めておいた検量線から全血試料中の抗原または抗体濃度に換算し、全血試料中の抗原または抗体濃度を、赤血球数に基づいて補正するための演算手段を備える請求項９に記載の免疫測定装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は、免疫測定方法及び免疫測定装置に関し、より詳細には、免疫凝集反応に付した試料を、フローサイトメトリを利用して検出する免疫測定方法及び免疫測定装置に関する。
【０００２】
技術背景
感染症関連項目の免疫検査では、測定試料として血清を使用していた。しかし、全血から血清を得るまでには、血液凝固時間と、その後の遠心分離時間を合わせ、血清分離に少なくとも約30分の処理時間が必要である。
【０００３】
代表的な免疫検査法の例として、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、エンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）、粒子凝集免疫測定法、カウンティングイムノアッセイ法が利用される。しかし、ＲＩＡ及びＥＩＡでは、抗原抗体反応を行った後、Ｂ(Bound form)／Ｆ(Free form)分離を行う必要があり、測定結果が出るまで、手間と時間がかかる。
【０００４】
粒子凝集法は、抗体又は抗原を感作した不溶性担体粒子（例えば、ラテックス）懸濁液と測定試料とを混合するだけでよいため、Ｂ／Ｆ分離を行う必要がなく、簡便な操作で実施できるという点で有利である。
【０００５】
また、カウンティングイムノアッセイ法は、一般に、血清又は血漿を用いて、粒子凝集の程度を検出する方法として知られており、抗原又は抗体結合ラテックス粒子と、試料中の抗体又は抗原とが反応すると、抗原又は抗体の量に応じてラテックス粒子が凝集するため、凝集したひとつひとつの粒子の大きさを弁別してカウントするものである。凝集していないラテックス粒子のカウント数をM(monomer:モノマー)、2個以上のラテックス粒子が凝集したもののカウント数をP(polymer:ポリマー)、MとPとの和をT(トータル)とし、P／Tを凝集度として算出する。あらかじめ既知濃度の抗原又は抗体の凝集度を測定して検量線を求めておけば、試料の凝集度から抗原又は抗体量を知ることができる（新改悦郎他：PAMIAの測定原理、Sysmex  J.  Vol.２０、No.１、ｐ７７〜７８（１９９７））。この方法では、凝集した粒子を直接カウントするので、測定試料全体の光学的変化を検出する免疫比濁法と比較して感度が高い。
【０００６】
しかし、近年、例えば、緊急手術等の場合には、早急にウィルス性肝炎やHIVなどの感染症患者かそうでないかを判断することが必要となり、採血から測定結果が出るまでの検査時間のさらなる短縮化、測定結果の高精度化を実現した簡便な免疫検査法が求められている。
【０００７】
検査時間の短縮化を考えた場合、免疫検査の測定試料として血清を用いるよりも、患者から採取した全血をそのまま用いる方が望ましい。
【０００８】
例えば、特開平10-48214号に、従来のラテックス凝集法を用いた全血測定法が提案されている。この方法によれば、全血試料を溶血させた後、得られた試料の免疫反応を、ラテックス免疫比濁法にて検出する。このような方法により、簡便かつ迅速に測定結果が得られる。
【０００９】
しかし、この方法では、全血を溶血させるため、ヘモグロビン又は溶血した血球断片の影響によって、免疫比濁法のような光学的手段による測定感度に限界がある。したがって、感染症関連項目のような比較的高精度の性能が要求される場合には不向きであるという問題がある。
【００１０】
全血には、血球成分がヘマトクリット値で通常約４0〜50％含まれているため、全血を試料として用いた場合、血清を用いて測定する場合と同じ量の試料を用いると、血球成分量（血球容積比分）を反映して測定値が低値になる。従って、血清測定時と同等の測定値を得るためには、血球容積比分を補正する必要がある。
【００１１】
そこで、特開平10-48214号では、別途血球計数器でヘマトクリット値を測定し、得られたヘマトクリット値に基づいて、測定値を補正している。
【００１２】
しかし、測定値の補正のために、別に血球を測定するのは煩雑である。これを回避するために、一台の免疫測定装置に血球計数部と免疫測定部とを設けるという方法もあるが、装置が複雑かつ高価になるという問題があり、免疫測定部のみで血球の影響を予測又は補正することができる方法が期待されている。
【００１３】
また、従来使用されている多くの全自動免疫測定装置は、血清（または血漿）試料を測定するように設計されている。したがって、全血試料を測定するために必要な攪拌機を搭載していないものが多い。このような装置を用いて全血試料の免疫測定をすると、血球成分が沈殿して、上清だけを吸引することとなり、ヘマトクリット値の影響を受けない場合もある。よって、測定値は必ずしも低値に乖離するとは限らない。
【００１４】
この場合、特開平10-48214号のように、全血試料を用いた場合の血球計数器によって別途測定されたヘマトクリット値に基づいて測定値を補正すると、補正値が高値に乖離することとなり、結局、高精度な測定ができないことになる。
【００１５】
あるいは、すでに市販されている全血にも血清試料にも対応できる装置を用いる場合、通常、全血を測定試料とする際に、装置の操作パネル上で、「全血測定」を指定することによって、測定シーケンスや解析プログラム等を「全血」用に変更しているが、全血を測定試料とするたびに「全血」を指定することは、検体数が多い場合には手間がかかる。また、全血試料と血清試料とが混在する場合には、試料の種類が変わるごとに指定しなおす必要があり、手間がかかる。さらに、試料の指定を誤った場合には、正確な測定結果が得られないという問題もある。
【００１６】
発明の開示
本発明は、全血試料を、溶血せずに又は血清分離せずに、高精度かつ簡便に免疫測定することができる方法、また、簡便にヘマトクリット分を補正することができる方法を提供することを目的とする。
【００１７】
すなわち、本発明によれば、（ａ）全血試料と、赤血球よりも小さく、免疫感作した不溶性担体粒子とを混合して免疫凝集反応を行わせ、
（ｂ）得られた凝集反応混合物をフローセルに導き、フローセルを通過する粒子にレーザー光を照射し、それによって生じる散乱光を検出し、
（ｃ）工程（ｂ）で検出した散乱光の強度に基づき、未凝集粒子と凝集粒子とを弁別するための第１閾値よりも小さい散乱光強度を示す粒子を未凝集粒子として計数し、凝集粒子と赤血球とを弁別するための第２閾値よりも小さく、且つ、第１閾値よりも大きい散乱光強度を示す粒子を凝集粒子として計数し、前記第２閾値よりも大きい散乱光強度を示す粒子を赤血球として計数する免疫測定方法を提供する。
【００１８】
また、本発明は、全血試料と、赤血球よりも小さく、免疫感作した不溶性担体粒子とを混合して免疫凝集反応を行わせるための反応部、
反応部で得られた凝集粒子と未凝集粒子とを含む免疫凝集反応混合物をフローセルに導くための分注機構、
フローセルを通過する粒子にレーザー光を照射するためのレーザー、
レーザー光を照射された粒子から生じる散乱光を受光して電気信号に変換する受光手段、及び、
受光手段で変換された前記電気信号に基づき、未凝集粒子と凝集粒子とを弁別するための第１閾値よりも小さい散乱光強度を示す粒子を未凝集粒子として計数し、凝集粒子と赤血球とを弁別するための第２閾値よりも小さく、且つ、第１閾値よりも大きい散乱光強度を示す粒子を凝集粒子として計数し、前記第２閾値よりも大きい散乱光強度を示す粒子を赤血球として計数するためのデータ処理手段を備えてなる免疫測定装置を提供する。
【００１９】
発明を実施するための最良の形態
本発明の免疫測定法は、まず、工程（ａ）において全血試料と不溶性担体粒子とを混合して免疫凝集反応を行わせる。本発明における免疫測定とは、通常、抗原又は抗体の凝集度、抗原又は抗体の濃度等を測定することを意味する。全血試料とは、通常ヒト又は他の動物から採取した血液であって、血清や血漿を分離する処理を行っていないものを意味する。ただし、本発明の方法の実施に際して、抗凝固処理されたもの及び／又は反応緩衝液によって希釈されたものであってもよい。
【００２０】
抗凝固処理に使用する抗凝固剤は、例えば、EDTA塩やクエン酸塩等血液検査で通常使用されるものが使用される。反応緩衝液としては、例えば、リン酸塩緩衝液、Tris-塩酸緩衝液等が挙げられる。反応緩衝液のｐＨは、ｐＨ６〜8.5程度が適当であり、浸透圧は、赤血球を溶解させない程度であることが適当であり、150mOsm/kg以上であることが好ましい。反応緩衝液には、非特異反応を抑制するための物質や、増感剤なども必要に応じて添加することができる。反応緩衝液を全血と混合することによって、後に続く免疫凝集反応の環境を整えることができる。全血を反応緩衝液で希釈する場合の希釈倍率は、5〜100倍程度（容量）が適当であり、好ましくは10〜50倍である。全血を反応緩衝液と混合する場合の温度は、20〜50℃程度が適当であり、混合時間は1〜5分間程度とすることができる。
【００２１】
不溶性担体粒子としては、免疫感作、すなわち、抗原又は抗体によって感作された粒子であり、粒子の材料としては、合成高分子、代表的にはポリスチレンラテックス等が挙げられる。この粒子は、血球、特に赤血球と区別することができるサイズを有していればよい。赤血球は、通常平面像におけるサイズとして、平均粒径が約７〜８μｍ、厚さが約2.2μｍ程度であることから、不溶性担体粒子は、直径約0.1〜１.0μｍ程度のものが好適である。この粒子は、均一であることが好ましい。
【００２２】
不溶性担体粒子の免疫感作の方法は、当該分野で公知の方法により行うことができ、例えば、物理吸着法、化学結合法等が挙げられる。免疫感作を行う場合に用いる抗原又は抗体としては、抗原抗体反応を利用して検出可能なものであれば特に限定されない。不溶性担体粒子は、通常、懸濁液として使用される。この場合の溶媒は、水、上記緩衝液等が適当であり、不溶性担体粒子と溶媒との混合割合は、0.1〜1w/v%程度が適当である。
【００２３】
免疫凝集反応は、例えば、反応緩衝液で任意に希釈した全血試料にラテックス懸濁液を添加し、抗原抗体反応を行わせる。ここで、上記の懸濁液は、意図する凝集反応が十分行われるような過剰量が用いられる。反応温度は20〜50℃、反応時間は15秒〜20分間が適当である。
【００２４】
工程（ｂ）において、得られた凝集反応混合物の散乱光を検出する。
散乱光を検出するためには、血球計数のための散乱光を検出することができる装置を用いることが適当であり、血球成分が反応系に影響を与えない免疫測定法と、血球計数が同時に行える装置を用いることが好ましい。例えば、シスメックス株式会社のPAMIAシリーズは、フローサイトメトリの原理を利用したカウンティングイムノアッセイ用の測定装置であり、以下の手順によって測定を行えば、一台の装置で免疫反応（ラテックス凝集）の測定と、血球数の測定が可能になるため、適当である。
【００２５】
具体的には、本願発明の方法を実現するための装置は、図１０に示すように、粒子検出部Ａ、信号処理部Ｂ及びデータ処理部Ｃとから構成される。
【００２６】
粒子検出部Ａは、試料液送出部ａ及び光学式粒子検出手段ｂとから主として構成される。
【００２７】
試料送出部ａは、反応プレート１、血液試料と不溶性担体粒子と任意に希釈液とをそれぞれ反応プレートのウェルに分注するためのピペット等の分注機構２、３を備え、任意に、反応プレートを攪拌するための偏心モータ等の攪拌機構４などを備えている。さらに、反応混合物をチャンバ19に分注するための分注機構20、チャンバ内の試料を光学式粒子検出手段ｂに導くためのシースシリンジ等の試料供給手段21が備えられている。
【００２８】
光学式検出手段ｂは、主として、図１に示したように、フローセル６と、半導体レーザー７と、ビームストッパ８と、レンズと、受光素子１０とを備えている。
【００２９】
信号処理部Ｂは、必要に応じて、フィルタバッファ１１、関数増幅回路１２、エミッタ１３、アンプ１４等を備えており、関数増幅回路は、リニア増幅器１２ａ及び対数増幅器１２ｂ等をスイッチにより切り替え可能に構成したものとしてもよい。
【００３０】
データ処理部Ｃは、必要に応じて、弁別回路１５、マイクロコンピュータ（例えば、弁別した粒子の大きさ別の信号の数を計数する手段、粒子大きさ別の信号数から凝集度を算出する演算手段、試料液等の制御手段、粒子検出部の駆動制御手段等を含む）１６、表示装置１７、印刷回路１８等から構成される。
【００３１】
言い換えると、本発明の方法を実現する免疫測定装置は、
全血試料と、赤血球よりも小さく、免疫感作した不溶性担体粒子とを混合して免疫凝集反応を行わせるための反応プレート、
得られた凝集反応混合物をフローセルに導くための分注機構
フローセルを通過する粒子にレーザー光を照射するためのレーザー、それに  よって生じる散乱光を検出するための受光素子、
光信号を電気信号に変換する信号処理手段、
その散乱光強度に基づく信号について、未凝集粒子と凝集粒子とを弁別するための閾値及び凝集粒子と血球とを弁別するための閾値を設定し、各閾値に基づいて、未凝集粒子、凝集粒子及び血球を弁別、計数するためのデータ処理手段とを備えてなる。
【００３２】
この装置は、さらに、未凝集粒子数と凝集粒子数とから凝集度を算出し、この凝集度をあらかじめ求めておいた検量線から全血試料中の抗原または抗体濃度に換算し、全血試料中の抗原または抗体濃度を、血球数に基づいて補正するための演算手段を備えている。
【００３３】
凝集反応混合物の散乱光を検出する方法として、例えば、まず、反応混合物を希釈し、カウントに適切な粒子濃度に調整する。次いで、フローセルの中に形成されたシース液の層流中に、希釈された反応混合物を少しずつ押し出すと、粒子は一列になって、ひとつずつフローセルの中央を通過する。フローセルを通過する粒子に対し、理想的にはフローセルに垂直な方向から、例えば、レーザダイオード７によりレーザ光を照射する。レーザ光はフローセル６を透過した後、ビームストッパ8で止められ、散乱光が受光素子10、例えば、フォトダイオードで受光される（図１）。レーザ光としては、３１０〜１２８５ｎｍ程度の波長範囲の光、具体的には、４８８、６８０、７８０、８６０、９８０ｎｍ等の光を利用することができる。散乱光の検出は、前方散乱光、側方散乱光を検出してもよいし、その両方を検出してもよい。
【００３４】
粒子がレーザ光を横切るとき、粒子の体積に応じた強さの散乱光パルスが発生し、そのパルスが受光素子によって受光される。通常、受光された散乱光パルスは、電気パルスに変換される（図２）。これにより、粒子の粒度分布の情報を得ることができる。つまり、この電気パルスは、レーザ光の中に入った粒子が凝集せず、１個のとき、凝集して２個のとき又は凝集して３個のとき、あるいは血球であるとき等、その体積（容積）に応じた強さとなり、図３に示すような粒度分布を示す。
【００３５】
工程（ｃ）において、その散乱光強度に基づいて、未凝集粒子、凝集粒子及び血球を弁別するための閾値を設定する。つまり、全血試料を用いる場合は、未凝集粒子と凝集粒子とを弁別するだけでは、凝集粒子に血球情報が含まれてしまい、正しく凝集度を求めることができない。これら未凝集粒子、凝集粒子、血球は、その粒子サイズの違いから前方散乱光強度が異なり、区別することができる。よって、未凝集粒子と凝集粒子との間及び凝集粒子と血球との間で、前方散乱光強度によって、未凝集粒子と凝集粒子とを、凝集粒子と血球とを、それぞれ区別するための閾値（L1, L2）を設定する(図３参照)。
ここでの閾値の設定は、測定対象である全血試料自体の散乱光強度を測定しながら、同時にそのデータに基づいて、その場で閾値を設定してもよいし、データが得られた後、そのデータに基づいて、閾値を設定してもよいし、既知の情報あるいは過去のデータの蓄積等から、あらかじめ予想される閾値を設定してもよい。なかでも、測定誤差や再現性等を考慮すると、散乱光強度を測定しながら、同時にそのデータに基づいて、その場で閾値を設定することが好ましい。
【００３６】
工程（ｄ）において、各閾値に基づいて、未凝集粒子、凝集粒子、血球をそれぞれ弁別、計数する。
【００３７】
例えば、凝集粒子と血球との間の閾値(L2)以上の情報から血球数を求めることができ、この血球数を、未凝集粒子と凝集粒子との間の閾値(L1)以上の粒子数としてカウントされた値から除くことにより、凝集粒子数Pを正確に求めることができる。また、未凝集粒子数Mは、L1未満の粒子数を計数することによって求めることができる。これらの値から、後述する方法を利用するなどして、全血試料における抗原又は抗体の有無を判断することが可能になる。
【００３８】
試料中に乳び粒子等の測定対象外粒子が存在すると、測定対象として測定される不溶性担体粒子の粒度分布図に対象外粒子の分布が現れる。この場合には、対象外粒子の粒度分布をスプライン関数で補間して推定し、対象粒子と対象外粒子を含む粒度分布から対象外粒子の粒度分布を差し引くことにより、対象粒子のみを近似した補正データを得、補正データから凝集粒子数と未凝集粒子数を求めることによってより正確な値を得ることができる。（日本特許第2912413号参照）
【００３９】
本発明においては、さらに工程（ｅ）において、凝集度を算出し、この凝集度から、さらに抗原又は抗体濃度を求めてもよい。
凝集度は、Ｐ／（M＋P）として求めることができる。ここで、Ｐは、上記で得られた凝集粒子数であり、Ｍは、上記で得られた未凝集粒子数Ｍである。凝集度は、カウントされた全ての粒子のうち、抗原抗体反応に関与した凝集した粒子の割合である。
【００４０】
抗原又は抗体濃度は、測定しようとする抗原又は抗体について、既知の抗原又は抗体濃度における凝集度を測定して（濃度を変化させて複数の凝集度を測定することが好ましい）、その関係をあらかじめ求めた検量線を利用することによって、求めることができる。
【００４１】
また、工程（ｆ）において、全血試料中の抗原又は抗体濃度を、血球数に基づいて補正してもよい。つまり、工程（ｅ）において求めた抗原又は抗体濃度は、全血試料のヘマトクリット値分を反映して、血清を用いて測定する場合と比較して低くなっている。そこで、ヘマトクリット値分を補正する。
【００４２】
補正に際しては、上記で除外した血球数を使用する。例えば、以下の補正式を用いて補正を行うことができる。
Ｃ＝Ｃ０／（１−Ｂ／Ａ）   （I）
（式中、Ｃは補正値(すなわち補正後の値)、Ｃ０は全血試料中の抗原または抗体濃度、Ｂは血球数（凝集粒子と血球との閾値以上で計数された値）、Ａは定数を示す。）
なお、定数Ａは、凝集粒子と血球との閾値以上で計数される値とヘマトクリット値との相関関係から実験的に求めることができる。定数Ａは、ヘマトクリット値が100％になった（すなわち、全血試料の全てが血球成分）と仮定したときの計数値に相当する。Ｂ／Ａを算出することによって、採取した全血試料中の血球成分の割合を知ることができる。
【００４３】
全血試料の血球成分が沈殿し、全自動免疫測定装置が上清の血漿成分のみを吸引してしまった場合には、上記Ｃ０はヘマトクリットの影響をほとんど受けず、補正は不要である。この時には吸引した血漿成分中の血球数（Ｂ）が小さくなるため、上式中のＢ／Ａが０に近づき、補正はほとんどかからない。このように本法を使用することにより、全血試料状態にかかわらず、正しい測定値を算出することが可能になる。
【００４４】
上記補正式は、免疫測定部だけで免疫測定と血球数とを測定する場合だけでなく、免疫測定部と血球計数部との両方を備えた装置で測定を行う場合にも適用することができる。
【００４５】
また、工程（ｇ）において、全血試料中の抗原または抗体の濃度を赤血球のＭＣＶ（平均赤血球容積）と血球数に関して補正してもよい。ＭＣＶは、例えば、工程（ｃ）で設定した各閾値に基づいて、工程（ｂ）で検出した散乱光から得ることができる。補正は、以下の補正式を用いて行うことができる。
Ｃ＝Ｃ０／｛１−（Ｂ／Ａ）×（MCV／D）｝    （II）
（式中、C、C0、A、Bは前述と同じ、MCVは試料のMCV測定値、Dは定数を示す。）
Dは標準的なMCVの測定値であり90fl前後であるが、例えば正常検体のMCVを測定しその平均値を用いてもよい。
【００４６】
通常、MCVは82〜99flの範囲にあるため、MCVによる補正は通常は必要ない。しかし、この範囲を外れる検体があり、このような検体の場合には、血球数のみで補正(式(I))してもまだ誤差が生じる。上記の補正式(式（II）)によってMCVによる補正をさらに加えて検体毎のMCVを考慮すれば、MCV異常検体であってもより正確に測定値を得ることができるようになる。
【００４７】
さらに、本発明では、全血試料のみならず、種々のタイプの血液試料を対象とすることができる。ここでの試料は、血清、血漿等が含まれる。好ましくは、血清試料を含む複数の全血試料による測定試料である。
【００４８】
つまり、血清試料は、凝集度の測定のために上記工程（ａ）から（ｄ）、（ａ）から（ｅ）、工程（ａ）から（ｆ）または（ａ）から（ｅ）と（ｇ）に対応する工程に付すことができる。
【００４９】
血清試料を用いて、上記工程に対応する工程を行い、凝集度を測定する場合、通常、血清中には血球が存在しないので、血球数はほとんどカウントされないか、カウントされたとしても非常に小さな値になる。このような場合には、血清用解析プログラムを用いて血清分析が行われる。ここで血清用解析プログラムとは、未凝集粒子数をＭ、免疫反応に関係した凝集粒子数をＰ、ＭとＰとの和をＴとし、Ｐ／Ｔを凝集度として算出するためのプログラム、あるいは、さらに、あらかじめ既知濃度の抗原または抗体の凝集度を測定することによって求めた検量線を用いて試料の凝集度から試料中の抗原または抗体量を算出するためのプログラムを意味する。
【００５０】
血清用解析プログラムと全血解析プログラムとのいずれかの選択は、免疫凝集反応の初期に行うことが好ましい。通常は、免疫凝集反応が十分に進行してから選択しても問題ないが、試料中の抗原あるいは抗体濃度が非常に高い場合は、凝集粒子が血球に紛れ込む可能性がある。しかし、免疫凝集反応の初期においては、反応がまだ十分に進行していないため、凝集粒子が血球に紛れ込むことを抑えることができ、迅速に判断できる。ここで免疫凝集反応の初期とは、反応開始から反応が進行して平衡に達するまでの間を意味する。
【００５１】
血清解析プログラムを用いる場合、血清または全血のいずれかを認定するための境界血球数を設定することが好ましく、血球数が設定した境界数より小さいまたは以下の場合には血清であることを認定する。
【００５２】
一方、全血試料を用いた場合には、相当の血球数がカウントされる。よって、この場合には、全血解析は、全血解析プログラムを用いて、（ａ）〜（ｄ）の工程、（ａ）〜（ｅ）の工程、（ａ）〜（ｆ）の工程または（ａ）から（ｅ）の工程と（ｇ）の工程とにより行うことができる。ここで、全血用解析プログラムとは、単に試料の凝集度から抗原または抗体量を算出するためでは全血試料中の血球容積比分を反映して低値になる測定値に、さらに血球容積比分の補正を加えて血清測定時と同等の抗原または抗体量に換算するプログラムである。
【００５３】
より詳しくは、上記（ａ）〜（ｄ）の工程、（ａ）〜（ｅ）の工程又は（ａ）〜（ｆ）の工程により、凝集度を求め、任意に抗原又は抗体濃度を測定し、さらに血球数に基づく補正を行うことができるプログラムである。
【００５４】
以下に、本発明の免疫測定法の実施例を示す。
実施例１
測定装置としてPAMIA-50（シスメックス（株））を用い、ランリーム(登録商標）HBsAg（シスメックス（株））と、HBsAg陰性の全血及び血清検体とを用いて測定した。ランリームHBsAgはHBs抗原測定用の試薬キットであり、ラテックス試薬、緩衝液、検体希釈液、キャリブレータから構成される。このうち、本実施例では、ラテックス試薬と緩衝液とを使用した。ラテックス試薬は、抗HBs抗体を感作した0.8μｍのポリスチレンラテックスの０．５%(w/v)懸濁液である。
【００５５】
試料10μlを緩衝液（ｐＨ6）80μｌと混合し、１分間45℃でインキュベーションした。これに抗HBs抗体感作ラテックス試薬10μl加えて45℃で反応を開始した。なお、全血検体を用いる場合は、ヘマトクリット分を考慮して試料を13μlとした。
【００５６】
反応を開始してから約20秒後に、19μlの反応混合物を950μlのシース液に加えて51倍に希釈した。希釈された反応混合物を、PAMIA-50の光学検出部に導き、凝集度Ｐ／Ｔ（％）（Ｔ１）を測定した。
反応を開始してから約15分後に、凝集度Ｐ／Ｔ（％）（Ｔ１）の測定と同様にして凝集度Ｐ／Ｔ（％）（Ｔ２）を測定した。
Ｔ１は反応初期の凝集度であり、試料が測定範囲内にあるかどうか確認する際に利用されるもので、通常はＴ２を試料の凝集度（凝集率）として採用する。
【００５７】
測定を行った結果、未凝集粒子の前方散乱光強度のピークは約30chであった。なお、前方散乱光強度は、チャンネル数(ch)であらわす。前方散乱光強度分布から、前方散乱光強度62chを未凝集粒子と凝集粒子を弁別するための閾値とした。
【００５８】
全血測定の場合、前方散乱光強度255ch以上に強い信号が認められた。しかし、同じ血清測定の場合、255ch以上にはほとんど信号は認められなかった。従って、全血で全ての信号データを基に凝集度合いを判定した場合、陽性判定となるが、255ch以上のデータを除いて凝集度合いを判定した場合、正しく陰性判定された(表１)。
【００５９】
【表１】
0004796265.tif 000002
これらの結果から、凝集粒子と血球との閾値を255chに設定し、255ch以上のデータは血球と判断して凝集粒子数（未凝集粒子と凝集粒子との間の閾値(L1)以上の粒子数）からは除外し、全血と血清（対照）との凝集度の測定比較を行った。その結果を表２に示した。なお、カットオフ値は1.5%とした。
【００６０】
【表２】
0004796265.tif 000003
上記表の通り、全血、血清で判定は一致し、良好な結果が得られた。
【００６１】
実施例２
測定装置としてPAMIA-50（シスメックス（株））を用い、測定試薬としてランリームFRN（シスメックス（株））を用いて全血試料の測定を行った。ランリームFRNはフェリチン（FRN）抗原測定用の試薬キットであり、ラテックス試薬、緩衝液、検体希釈液、キャリブレータから構成される。ラテックス試薬は、抗FRN抗体を感作した0.8μｍのポリスチレンラテックスの０．５%(w/v)懸濁液である。
【００６２】
試料10μlを緩衝液（ｐＨ6）80μｌと混合し、１分間45℃でインキュベーションした。これに抗FRN抗体感作ラテックス試薬10μl加えて45℃で反応を開始した。
【００６３】
反応を開始してから約20秒後に、19μlの反応混合物を950μlのシース液に加えて51倍に希釈した。希釈された反応混合物を、PAMIA-50の光学検出部に導き凝集度Ｐ／Ｔ（％）（Ｔ１）を測定した。
反応を開始してから約15分後に、凝集度Ｐ／Ｔ（％）（Ｔ１）の測定と同様にして凝集度Ｐ／Ｔ（％）（Ｔ２）を測定した。
【００６４】
測定を行った結果、未凝集粒子の前方散乱光強度のピークは約30chであった。前方散乱光強度分布から、前方散乱光強度62chを未凝集粒子と凝集粒子を弁別するための閾値とした。
また、全血測定の場合、前方散乱光強度255ch以上に強い信号が認められたが、同じ血清測定の場合、255ch以上にはほとんど信号は認められなかったことから凝集粒子と血球との閾値を255chに設定し、255ch以上のデータは血球とし、未凝集粒子、凝集粒子及び血球の各粒子数を計数し、未凝集粒子数と凝集粒子数からＰ／Ｔ（％）を求めた。
【００６５】
別途検体希釈液を濃度０のキャリブレータとし、また既知濃度のFRNを含むキャリブレータを用いて、同様に測定を行ってあらかじめ検量線を作成した。
【００６６】
上記で求めたＰ／Ｔ（％）を、作成した検量線を用いて全血試料中のFRN濃度（全血濃度）に換算した。
次に以下の式を用いて補正を行った。
Ｃ＝Ｃ０／（１−Ｂ／Ａ）
ここでＡは、あらかじめ求めておいたヘマトクリット値と血球数との相関関係から45000であった。表３に20検体の測定結果を示す。
【００６７】
【表３】
0004796265.tif 000004
検体No.6は、血球成分が沈殿し、上清を吸引してしまったものであるが、補正によって高値になることなく良好であった。
【００６８】
図４に血清濃度（対象）と全血濃度との相関図を示す。相関は良好であるが、血清濃度に対し、全血濃度は低くなる。
図５に血清濃度と補正値の相関図を示す。相関は良好であり、かつ血清とほぼ同じ値が得られる。
【００６９】
実施例３
ランリームHBsAg（シスメックス（株））を用い、全血と血清検体とを、PAMIA-50（シスメックス（株））を用いて測定した。ランリームHbsAg及びラテックス試薬は実施例１と同様のものである。
キャリブレータは、既知濃度のHBsAgを含む溶液で、血清試料と同様に扱うことができる。
【００７０】
試料10μlを緩衝液（ｐＨ6）80μｌと混合し、１分間45℃でインキュベーションした。これに抗HBs抗体感作ラテックス試薬10μl加えて45℃で反応を開始した。
【００７１】
反応を開始してから約20秒後に、19μlの反応混合物を950μlのシース液に加えて51倍に希釈した。希釈された反応混合物を、PAMIA-50の光学検出部に導き凝集度Ｐ／Ｔ（％）（Ｔ１）を測定した。
反応を開始してから約15分後に、凝集度Ｐ／Ｔ（％）（Ｔ１）の測定と同様にして凝集度Ｐ／Ｔ（％）（Ｔ２）を測定した。
【００７２】
あらかじめキャリブレータ及び全血試料の測定を行い、前方散乱光強度分布から前方散乱光強度62チャンネル（ch）を未凝集粒子と凝集粒子を弁別するための閾値とした。また、凝集粒子と血球との閾値を255chに設定した。
なお、血清用解析プログラムと全血用解析プログラムを選択するための血球数（255ch以上の計数値）の設定値は200とした。
【００７３】
また、血清用解析プログラムと全血用解析プログラムを選択するための血清／全血の判定は、免疫凝集反応が十分進行してから行ってもよいが、本実施例では、Ｔ１測定時に判定を行った。Ｔ１測定時には、反応初期であるため免疫凝集反応が進行しておらず、特に試料中の抗原あるいは抗体濃度が非常に高い場合に255ch以上に免疫反応による凝集粒子が紛れ込む可能性が低く、反応初期に判定をするのが好都合である。
【００７４】
次に、全血検体５検体及び血清５検体を順不同で測定し、判定を行った。その結果を表４に示す。なお、血清と判定し、血清用解析プログラムにより解析を行う場合には「血清」、また全血と判定し、全血用解析プログラムにより解析を行う場合には「全血」と記した。
【００７５】
【表４】
0004796265.tif 000005
上記に示したように、全検体とも「血清」及び「全血」の判定が正しくなされた。この判定に基づいて、使用する解析プログラムを選択し、選択されたプログラムを用いて凝集度の算出を行った。
【００７６】
実施例４
実施例２と同様にして、MCV異常検体を含む全血検体21例について測定を行った。さらに、MCV値とHct（ヘマトクリット）値を全自動血球分析装置XE-2100（シスメックス株式会社）を用いてあらかじめ求めておいた。
【００７７】
なお、測定値は以下のように処理した。
−補正無し（血清濃度）
−血球数のみで補正（C=C0／(1−B／A)）(血球数で補正)
−ヘマトクリット値を用いて補正（C=C0／(1−Hct)）（ＨＴＣで補正）
−MCV値と血球数で補正（Ｃ＝Ｃ０／｛１−（Ｂ／Ａ）×（MCV／D）｝）（ＭＣＶ及び血球数で補正）
本実施例においては、Aはヘマトクリット値と血球数との相関関係から46000と計算された。またDは90とした。
【００７８】
測定結果を以下の表5に示す。
【００７９】
【表５】
0004796265.tif 000006
血清濃度を対照とした各相関図を図６〜図９に示す。
補正前の相関図（図６）では、血球成分の影響を受け、傾きが低くなっている。血球成分が沈殿した検体が高値に乖離している。
血球数のみで補正した場合の相関図（図７）では、ヘマトクリット値の影響が補正できており、傾きが1に近くなっている。この結果によると、実用上問題はない。ただし、MCV低値検体で若干高値に、MCV高値検体で若干低値になる傾向が認められる。
【００８０】
ヘマトクリット値で補正した場合の相関図（図８）では、ヘマトクリット値の影響が補正できており、傾きが1に近くなっている。ただし、血球成分が沈殿した検体に起因して、値に乖離する検体が認められる。
MCV値と血球数で補正した場合の相関図（図９）では、ヘマトクリット値の影響が補正できており、傾きが1に近くなっている。また、相関が最もよく、MCV異常や血球成分が沈殿した検体でも正しく補正されている。
【００８１】
本発明によれば、全血を前処理なしにそのまま試料として使用でき、高精度で簡便な免疫測定を実施することができる。
また、本発明によれば、全血免疫測定において、別途ヘマトクリット値を測定することなく、簡単に全血中の抗原または抗体濃度を血清濃度とほぼ同じ値に補正することができる。
さらに、試料の血球成分が沈殿しているような場合でも、その影響を受けずに補正することができる。
【００８２】
また、全血試料中の抗原または抗体濃度及び血球数を同時に測定し、前記血球数を利用した補正式により該抗原または抗体濃度を補正することにより、測定試料中の血球容積のために血漿成分が減少し、抗原または抗体濃度が低値に算出される影響を解消することができ、正確な測定値を得ることができる。
【００８３】
さらに本発明によれば、ユーザーは全血・血清という試料の種類の違いを気にすることなく測定を行うことが可能になる。また、検体の種類を入力する必要がなくなるため入力ミスを防ぐことができるとともに、それぞれの検体に合った解析プログラムを確実に選択することができ、測定結果の信頼性及び精度を向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明の全血免疫測定法の測定原理を示した図である。
【図２】  本発明の全血免疫測定法における、粒子がレーザー光を通過するときに生じる散乱光の電気パルスの模式図である。
【図３】  本発明の全血免疫測定法における凝集粒子の粒度分布を示した模式図である。
【図４】  本発明の実施例２における、血清濃度（対照）と全血濃度との相関図（補正を行わない場合）である。
【図５】  本発明の実施例２における、血清濃度（対照）と補正値の相関図（補正を行った後の相関図）である。
【図６】  本発明の実施例４における、血清濃度（対照）と全血濃度との相関図（補正を行わない場合）である。
【図７】  本発明の実施例４における、血清濃度（対照）と全血濃度との相関図（血球数のみで補正を行った後の相関図）である。
【図８】  本発明の実施例４における、血清濃度（対照）と全血濃度との相関図（ヘマトクリット値で補正を行った後の相関図）である。
【図９】  本発明の実施例４における、血清濃度（対照）と全血濃度との相関図（ＭＣＶ値と血球数とで補正を行った後の相関図）である。
【図１０】  本発明の免疫測定方法を実現するための装置の概略ブロック図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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