【手続補正書】
【提出日】平成15年8月20日(2003.8.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ヒト脂肪組織由来の分離された間質細胞と、
（ｂ）（ｉ）成熟した軟骨細胞の表現型につながる任意の細胞の形質導入経路を活性化させることができる軟骨誘導薬剤と、（ｉｉ）抗生物質と、（ｉｉｉ）栄養分補給剤と、（ｉｖ）アスコルビン酸エステルまたは関連のあるビタミンＣ類似体と、（ｖ）グルココルチコイドまたは、該細胞のグルココルチコイド受容体を活性化することができる他の化学物質とを有する化学的に規定された培養培地と
を含む組成物。
【請求項２】
前記軟骨誘導薬剤が、グルココルチコイド、トランスフォーミング成長因子βスーパーファミリーの一員、コラーゲン性細胞外マトリックス分子、ビタミンＡ類似体からなる群から個別に、または組み合わせて選択される請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記抗生物質がペニシリンである請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記抗生物質がストレプトマイシンである請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記ペニシリンの濃度が約１０〜約２００単位／ｍｌである請求項３に記載の組成物。
【請求項６】
前記ストレプトマイシンの濃度が約１０〜約２００μｇ／ｍｌである請求項４に記載の組成物。
【請求項７】
前記軟骨誘導薬剤がヒドロコルチゾンである請求項２に記載の組成物。
【請求項８】
前記軟骨誘導薬剤がデキサメタゾンである請求項２に記載の組成物。
【請求項９】
前記デキサメタゾンの濃度が約１〜約１００ｎＭである請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記ヒドロコルチゾンの濃度が約１〜約１００ｎＭである請求項７に記載の組成物。
【請求項１１】
前記トランスフォーミング成長因子βが、骨形態形成タンパク質２、骨形態形成タンパク質４、ＴＧＦ−β１（トランスフォーミング成長因子β１）、ＴＧＦ−β２（トランスフォーミング成長因子β２）、ＴＧＦ−β３（トランスフォーミング成長因子β３）、ＩＧＦ（インスリン様成長因子）、ＰＤＧＦ（血小板由来成長因子）、ＥＧＦ（表皮性成長因子）、ａＦＢＦ（酸性線維芽細胞成長因子）、ｂＦＢＦ（塩基性線維芽細胞成長因子）、ＨＧＦ（肝細胞成長因子）、ＫＧＦ（角膜実質細胞成長因子）、インヒビンＡ、軟骨形成刺激因子（chondrogenic stimulating factor）からなる群から選択されることを特徴とする請求項２に記載の組成物。
【請求項１２】
前記トランスフォーミング成長因子βの濃度が約１〜１００  ｎｇ／ｍｌである請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
ＴＧＦ−β１の濃度が約１ｎｇ／ｍｌ〜約１０ｎｇ／ｍｌである請求項１１に記載の組成物。
【請求項１４】
前記コラーゲン性細胞外マトリックス分子がＩ型コラーゲンである請求項２に記載の組成物。
【請求項１５】
前記ビタミンＡ類似体がレチン酸である請求項２に記載の組成物。
【請求項１６】
前記レチン酸の濃度が約０．１ｎｇ／ｍｌ〜約１μｇ／ｍｌである請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
ａ）培地を含有する無菌管中で、５０，０００〜５００万の間の細胞数で２〜２０分間、５００Ｘｇで遠心分離することにより、間質細胞をペレット化するステップと、
ｂ）分化用培地に５００〜２０，０００細胞／ｃｍ2の密度で分離された間質細胞を置くステップと、
ｃ）（ｉ）  成熟した軟骨細胞の表現型につながる任意の細胞の形質導入経路を活性化させることができる軟骨誘導薬剤と、
（ｉｉ）  抗生物質と、
（ｉｉｉ）  １〜２０％のウシ胎児血清または１〜２０％のウマ血清、または、任意の他の生物学的なタンパク質類または合成タンパク質類の等価の組み合わせにより補給される栄養分と、
（ｉｖ）  アスコルビン酸エステルまたは関連のあるビタミンＣ類似体と、
（ｖ）  グルココルチコイドまたは細胞のグルココルチコイド受容体を活性化させることができる他の化学的薬剤と
を該培地に補給するステップと、
ｄ）約３１℃〜３７℃にて約３〜４週間、５％のＣＯ2と１％から２０％の間の酸素との中で該細胞をインキュベーションするステップと、
ｅ）分離された該細胞の分化の程度を決定するステップと
を含む脂肪組織由来の間質細胞の軟骨細胞への分化方法。
【請求項１８】
ａ）カルシウムアルギナート中または、３次元形態において軟骨形成を支えることができる任意の他の生体適合性のある格子またはマトリックス中に、５０万〜１０００万細胞／ｍｌの密度で間質細胞と前脂肪細胞とを懸濁するステップと、
ｂ）３５ｍｍの培養皿に細胞を移し、
（ｉ）  成熟した軟骨細胞の表現型につながる任意の細胞の形質導入経路を活性化させることができる軟骨誘導薬剤と、
（ｉｉ）  抗生物質と、
（ｉｉｉ）  １〜２０％のウシ胎児血清または１〜２０％のウマ血清、または、任意の他の生物学的タンパク質または合成タンパク質の等価の組み合わせにより補給される栄養分と、
（ｉｖ）  アスコルビン酸エステルまたは関連のあるビタミンＣ類似体と、
（ｖ）  グルココルチコイド、または細胞のグルココルチコイド受容体を活性化させることができる他の化学的薬剤と
を有するかまたはこれらにより補給されている化学的に規定されている培養培地を含む分化用培地に、５００〜２０，０００細胞／ｃｍ2の密度で細胞を置くステップと、
ｃ）約３１℃〜３７℃にて約３〜４週間、５％のＣＯ2と１％〜２０％の酸素との中で該細胞をインキュベーションするステップと
ｄ）分離された該細胞の分化の程度を決定するステップと
を含む脂肪組織由来の間質細胞の軟骨細胞への分化方法。
【請求項１９】
ａ）誘導されて、軟骨細胞の少なくとも一つの特性を示す分離されたヒト脂肪組織由来の間質細胞と、
ｂ）生体適合性マトリックスと
を含む組成物。
【請求項２０】
前記マトリックスが、軟骨形成を支持する請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
前記マトリックスが、カルシウムアルギナート、アガロース、フィブリン、およびコラーゲンからなる群から選択される請求項１９に記載の組成物。
【請求項２２】
誘導されて、軟骨細胞の少なくとも一つの特性を示す分離されたヒト脂肪組織由来の間質細胞であって、外来核酸が導入されている間質細胞。
【請求項２３】
誘導されて、軟骨細胞の少なくとも一つの特性を示す分離されたヒト脂肪組織由来の間質細胞を含む合成軟骨パッチ。
【請求項２４】
前記パッチが、事前成形された培養ウェルで成長して特定の寸法のパッチを形成する請求項２３に記載の軟骨パッチ。
【請求項２５】
前記パッチが、軟骨形成細胞が該細胞と接触する表面に付着するのを阻止する分子でコートされている培養ウェルで成長する請求項２３に記載の軟骨パッチ。
【請求項２６】
前記コートしている分子が、ジクロロジメチルシランおよびポリテトラフルオロエチレンを主成分とする試薬からなる群から選択される請求項２５に記載の軟骨パッチ。
【請求項２７】
前記培養ウェルが、細胞を付着させない柔軟な生体適合性材料または成形可能な生体適合性材料から製造される請求項２３に記載の軟骨パッチ。
【請求項２８】
前記柔軟な生体適合性材料または成形可能な生体適合性材料が、アガロース、ガラス、未処理の細胞培地プラスチック、およびポリテトラフルオロエチレンからなる群から選択される請求項２７に記載の培養ウェル。
【請求項２９】
前記培養ウェルが、約２５ｃｍ2の断面の表面積を有する請求項２４に記載の培養ウェル。
【請求項３０】
前記培養ウェルが、約０．３ｃｍの軟骨パッチを形成するのに十分な深さを有する請求項２４に記載の培養ウェル。
【請求項３１】
所望の治療箇所に移植する前に、誘導されて、軟骨細胞の少なくとも一つの特性を示す分離された脂肪組織由来の間質細胞の有効量を投与するステップを含む軟骨疾患を治療する方法。
【請求項３２】
誘導されて、軟骨細胞の少なくとも一つの特性を示す分離されたヒト脂肪由来の間質細胞。
【請求項３３】
インビボで移植される請求項３２に記載の細胞。