(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ソホロースリピッドの精製方法であって、
培養で得られた不溶性のソホロースリピッドを含む酸性の培養液を中和して、該ソホロースリピッドを可溶化する工程；
該培養液を固液分離に供し、該培養液中の固形物を除去する工程；
該培養液を酸性にし、該ソホロースリピッドを再び不溶化する工程；および
該ソホロースリピッドを沈降させ、上澄を除去する工程
を包含し、これにより、高濃度のソホロースリピッド含水物が得られる、
精製方法。
【請求項２】
前記ソホロースリピッド含水物を水を用いて１回以上洗浄する工程、および得られた上澄を除去する工程をさらに包含する、請求項１に記載の精製方法。
【請求項３】
培養終了時にｐＨ２．０〜３．５である培養液が用いられる、請求項１または２に記載の精製方法。
【請求項４】
培養終了時に、炭素源として添加した油性基質の残留が、ｎ−ヘキサン抽出物として、培養終了液の重量基準で０．２％以下である培養液を用いる、請求項１から３のいずれか一項に記載の精製方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、培養で生成されたソホロースリピッドの精製方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
微生物により産生される界面活性剤であるバイオサーファクタントは、化学合成による界面活性剤と同等の性能を示し、かつ生分解性が高く低毒性であるため、様々な産業分野での応用が期待されている。
【０００３】
その中でもカンジダ  ボンビコラ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｂｏｍｂｉｃｏｌａ）あるいはカンジダ  アピコラ（Ｃ．ａｐｉｃｏｌａ）などのカンジダ属酵母により産生されるソホロースリピッド（Ｓｏｐｈｏｒｏｓｅ  ｌｉｐｉｄｓ；「ソホロリピッド」ともいわれる；以下、ＳＬとも称する）は、比較的安価な原料から生成されることおよび生産性の高さから、より広い商業利用への期待が大きい。
【０００４】
ＳＬは、上記菌株を、適当な液体培地を用いて通気攪拌培養することにより、培養液中に蓄積される。炭素源としては、グルコースおよび油脂類が頻繁に使用される。通常、１週間程度のバッチ培養で、乾燥物として１００ｇ／Ｌ以上のソホロースリピッドが得られる。これは、他のバイオサーファクタントの生産性が数ｇ／Ｌ程度のものが多いのに比べると、際だって高いといえる。
【０００５】
しかしながら、化学合成による界面活性剤と比較した場合の価格差は未だ歴然としており、商業利用をコストパフォーマンスの高い物に限定する要因となっている（Ｋｏｚａｒｉｃ編、ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  ｓｃｉｅｎｃｅ  ｓｅｒｉｅｓ  ｖｏｌ．４８，Ｂｉｏｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ  ｐｐ．３７８−３８２（１９９３））。生産コストを引き上げている要因の一つは、培養終了液からの分離精製工程である。
【０００６】
培養の進行と共に培地が酸性化すると、生成したＳＬは分散状態で存在するが、攪拌を停止すれば、このＳＬは、粘稠性の含水物として速やかに沈殿する性質を持つ。そのため、培養終了液を静置あるいは遠心分離することにより、他の液体成分からは簡便に分離できるものの、この方法では、菌体などの固形成分がＳＬ層の直上にあるか層内に混入するため、濾過による除去が必要となる。ところが、上述したように、ＳＬは、粘稠性であるため、濾材を透過しにくく、濾過助剤を用いてもあまり改善されない。
【０００７】
もう１つの方法として、有機溶媒による抽出法がある。この方法において、培養終了液をノルマルヘキサン（ｎ−ヘキサンとも称する）で洗浄して未反応の残留油脂類を除去し、次いで酢酸エチルと混合してＳＬを溶解させて水相から分離し、溶剤を加熱減圧により揮発除去する。この方法では、菌体などの固形成分が除去されるが、培養液の数倍容量の有機溶媒を使用する必要がある。ここで得られたＳＬ含水物から有機溶媒を除去回収したり、有機溶媒を含む廃液を処理したりするには、専用の設備およびエネルギーが必要となり、生産コストの上昇につながる。さらに、有機溶媒の使用は、一般的に環境への負荷および作業者の健康面への影響という観点からも好ましいものではない。
【０００８】
従って、有機溶媒を用いることなく、さらに菌体などの固形成分をも除去できる、簡便な精製法が求められている。このような精製方法によれば、ＳＬは、より安価に、かつより少ない環境負荷をもって、市場に提供されることになり、産業上極めて有利となり得る。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明は、有機溶媒を用いることなく、培養終了液から液体および固形成分を除去し、高濃度のＳＬ含水物を得る方法を提供する。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、酸性下で不溶性のソホロースリピッドを含有する培養終了液を、攪拌しながら、アルカリを添加して中和すると、ＳＬ成分全体が、可溶化あるいは安定した分散状態になることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
本発明は、ソホロースリピッドの精製方法であって、以下の工程を包含する方法を提供する。すなわち、本発明のソホロースリピッドの精製方法は、
培養で得られた不溶性のソホロースリピッドを含む酸性の培養液を中和して、上記ソホロースリピッドを可溶化する工程；
上記培養液を固液分離に供し、該培養液中の固形物を除去する工程；
上記培養液を酸性にし、該ソホロースリピッドを再び不溶化する工程；および
上記ソホロースリピッドを沈降させ、上澄を除去する工程
を包含し、これにより、高濃度のソホロースリピッド含水物が得られる、方法である。
【００１２】
１つの実施形態では、上記精製方法は、上記ソホロースリピッド含水物を水を用いて１回以上洗浄する工程、および得られた上澄を除去する工程をさらに包含する。
【００１３】
別の実施形態では、上記精製方法は、培養終了時にｐＨ２．０〜３．５である培養液を用いる。
【００１４】
なお別の実施形態では、上記精製方法は、培養終了時に、炭素源として添加した油性基質の残留が、ｎ−ヘキサン抽出物として、培養終了液の重量基準で０．２％以下である培養液を用いる。
【００１５】
【発明の実施の形態】
本発明は、ソホロースリピッドを含む培養液中から、夾雑固形物をほとんど含まない高濃度のソホロースリピッド含水物を分離精製するための、簡便であり、かつ有機溶媒を用いることのない方法を提供する。
【００１６】
ソホロースリピッド（ＳＬ）は、ソホロースあるいはヒドロキシル基が一部アセチル化したソホロースと、ヒドロキシ脂肪酸とからなる糖脂質である。ソホロースとは、β１→２結合した２分子のブドウ糖からなる糖である。ヒドロキシ脂肪酸は、ヒドロキシル基を有する脂肪酸である。ソホロースリピッドはまた、ヒドロキシ脂肪酸のカルボキシル基が遊離した酸型と分子内のソホロースと結合したラクトン型とに大別される。以下にそれぞれの構造式を表す（右側、酸型；左側、ラクトン型）：
【００１７】
【化１】
0004714377.tif 000002
（ここで、各構造式において、Ｒ1およびＲ2はそれぞれ、独立して、水素またはアセチル基であり、ｎは、一般に、１１〜２０の整数であり、より通常には、１３〜１７、さらにより通常には１４〜１６である）。
【００１８】
ＳＬは、カンジダ属酵母を培養することにより生成され得る。培養生成されたＳＬは、複数分子種の混合物であって、通常、ラクトン型を５０％以上含む。従って、本明細書中では、ソホロースリピッド（ＳＬ）とは、単一の物質のみならず、複数分子種の混合物をも意味する。
【００１９】
培養に使用される酵母としては、カンジダ  ボンビコラ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｂｏｍｂｉｃｏｌａ）、カンジダ  アピコラ（Ｃ．ａｐｉｃｏｌａ）、カンジダ  ペトロフィラム（Ｃ．ｐｅｔｒｏｐｈｉｌｕｍ）、およびカンジダ  ボゴリエンシス（Ｃ．ｂｏｇｏｒｉｅｎｓｉｓ）が挙げられる。これらは、保存機関から分譲された菌株またはその継代培養であり得る。
【００２０】
ＳＬは、上記のような菌株を、適当な液体培地を用いて培養することにより、培養液中に蓄積される。
【００２１】
使用され得る液体培地の組成について、以下に説明する。
【００２２】
炭素源としては、糖類および油性基質が用いられ得る。糖類としては、グルコース、フルクトース、ガラクトースなどの単糖類、およびスクロース、マルトースなどの二糖類が挙げられる。好ましくは、グルコースが使用される。培養初発濃度は、３０〜１５０ｇ／Ｌ、好ましくは９０〜１２０ｇ／Ｌである。油性基質としては、培養によるＳＬ産生に使用され得ることが報告されているいずれの油性基質もが使用可能であり、このような油性基質として、植物性油脂（Ｚｈｏｕら、Ｊ．Ａｍ．Ｏｉｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、６９：８９−９１（１９９２）など）、動物性油脂（Ｄｅｓｈｐａｎｄｅら、Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．，５４：１４３−１５０（１９９５））、脂肪酸（Ａｓｍｅｒら、Ｊ．Ａｍ．Ｏｉｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，６５：１４６０−１４６６（１９８８）など）、脂肪酸エステル（Ｄａｖｉｌａら  Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３８：６−１１（１９９２））、ｎ−アルカン（Ｔｕｌｌｏｃｈら、Ｃａｎ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．，４６：３３３７−３３５１（１９６８）などが報告されている。好ましくは、植物性油脂または脂肪酸、あるいは植物油脂を原料とする脂肪酸エステルが使用され得る。植物性油脂として、通常、食用植物油が使用され得る。使用される植物油としては、例えば、ダイズ油、ナタネ油、綿実油、ヒマワリ油、カポック油、ゴマ油、コーン油、コメ油、落花生油、ベニバナ油、オリープ油、アマニ油、キリ油、ヒマシ油、パーム油、パーム核油、ヤシ油など、またはこれらの混合物が挙げられる。ダイズ油、ナタネ油、ヒマワリ油、ベニバナ油、またはこれらの混合物が好ましい。このような脂肪酸の炭素数は、６〜２４、好ましくは、１２〜２０の範囲であり、さらにそれぞれの分子内に０〜３箇所の不飽和結合を含んでもよい。用いられる脂肪酸としては、カプロン酸、カプリル酸、カプリン酸、ウンデカン酸、ラウリン酸、トリデカン酸、ミリスチン酸、ペンタデカン酸、パルミチン酸、マルガリン酸、ステアリン酸、ノナデカン酸、アラキジン酸、ベへン酸、およびリグノセリン酸のような飽和脂肪酸、ならびにトウハク酸、リンデル酸、ツズ酸、ミリストレイン酸、パルミトレイン酸、ペトロセリン酸、オレイン酸、エライジン酸、バクセン酸、エルカ酸、リノール酸、γ−リノレン酸、およびリノレン酸のような不飽和脂肪酸、ならびにこれらの混合物が挙げられる。脂肪酸エステルとしては、前出の脂肪酸のエステルが挙げられる。培養の開始時に添加され得る油性基質の濃度は、５０〜２００ｇ／Ｌ、好ましくは１００〜１５０ｇ／Ｌの範囲である。連続的に供給される場合、上記濃度に相当する量の油性基質が、培養期間中に均等速度で培養系に添加される。
【００２３】
窒素源としては、２〜５ｇ／Ｌの酵母エキス、０．５〜２ｇ／Ｌの尿素などが添加され得るが、これらに限定されない。
【００２４】
さらに、酵母の生育に必要な各種有機物および無機塩類（リン酸塩、マグネシウム塩を含む）が適当量で添加され得る。
【００２５】
培養形態は、上記のような液体培地を用いたバッチ培養、または培養系に油性基質を連続添加する流加培養であり得、通気攪拌することが望ましい。培養ｐＨ条件は、開始時にｐＨ約３．５〜約６．０であり、好ましくは、約４．０〜約５．５である。通常、培養中、ｐＨは、外部から調節されない。培養温度は、上記菌株が、ソホロースリピッド産生して生育し得るのに適当な温度であり、通常、２０〜３５℃であり、好ましくは２８〜３０℃である。５Ｌ〜５ｋＬ容量の培養の場合、通気攪拌の速度は、０．１〜２．０ｖｖｍ、１００〜６００ｒｐｍであり得る。攪拌速度に関して、培養槽が大きくなるにつれて、同じ溶存酸素条件を作るために必要とされる攪拌速度は遅くなる。このような攪拌は、培養液中に十分な溶存酸素条件を提供するために行われ得、従って、酵母の培養に適切な溶存酸素条件を与えるような、いずれの攪拌速度も望ましい。
【００２６】
培地中の糖類と油性基質とは、培養過程で同時に利用され、時間の経過と共に濃度が低下する。糖類が先に完全消費される。ＳＬの生成は、培地中の油性基質が全て消費されると停止する。培地に残留している油性基質は、培養液を湯浴中で加熱後、遠心分離することで油層となって分離するため、ＳＬの生成の終点を、培養中の培養液を一部、分取して上記操作を行い、油層の消失を確認することによって、容易に知ることができる。従って、ＳＬの生成を、培地に残留している油性基質の量を測定することによりモニタリングすることにより、最大収量のＳＬを含有する培養液を滅菌処理して菌体を殺菌した後、本精製方法に供し得る。
【００２７】
また、精製したＳＬを製品への配合において利用するために、精製の過程における油性基質の残留はできるだけ少ないことが望ましい。従って、本精製方法に用いる培養液は、炭素源として添加した油性基質の残留が、ｎ−ヘキサン抽出物として、培養終了液の重量基準で０．５％以下であることが望ましい。炭素源として添加した油性基質の残留は、好ましくは０．２％以下、さらにより好ましくは０．１％以下である。残留する油性基質の測定は、以下の手順で行われ得る。培養液を密栓容器に取り、この培養液と実質的に等量のｎ−ヘキサンを添加して激しく振り混ぜた後、遠心分離（例えば、１，０００×ｇで１０分間）し、分離したヘキサン層を回収する。この工程は３回以上繰り返され得る。ヘキサン層を回収して、ヘキサン溶媒を揮発除去し、残留物の重量を測定する。
【００２８】
上記菌株を培養する場合、培養の進行と共に培養液が酸性化する傾向がある。従って、培養を終了する時点で、培養液は酸性化されている。この培地のｐＨの範囲は、５．５未満であり得、しばしば、４．０以下、より頻繁には、３．５以下であり、一方、しばしば下限が２．０、より頻繁には、２．５であり得る。培養終了時点での培養液のｐＨは、培養に使用した培地の組成、培養条件などに依存し得る。本精製方法においては、代表的には、出発培養液として、ｐＨが２．０〜３．５である培養液が使用され得る。従って、通常、含水グルコース８０〜１２０ｇ、酵母エキス１〜５ｇ、リン酸一カリウム５〜１５ｇ、硫酸マグネシウム７水和物５〜１５ｇ、塩化ナトリウム０．５〜２ｇ、ダイズ油８０〜１２０ｇ、尿素０．５〜２ｇ（量は全て培地１ｋｇ当たりの量である）の組成の培地を用いて、温度約３０℃、通気攪拌０．５〜１．０ｖｖｍ、２５０〜６００ｒｐｍ、初発ｐＨ４．０〜５．０、培養期間４〜１２日間で、上記菌株が培養され得る。
【００２９】
酸性化した培養液中において、生成したＳＬは分散状態で存在するが、攪拌を停止すれば、このＳＬは、粘稠性の含水物として速やかに沈殿する性質を持つ。すなわち、培養の進行に伴って酸性化した培養液中では、ＳＬは、難溶性または不溶性であり、静置状態では沈殿している。これは、酸型ＳＬのカルボキシル基が酸性下で非解離型になっていること、ならびにラクトン型ＳＬがもともと疎水的な分子構造を持っているためと考えられる。
【００３０】
本精製方法では、上述のような酸性化した培養液を、アルカリを添加することによって中和し、上述のような不溶化ＳＬを可溶化する。好ましくは、培養液を高温（例えば、８０〜９５℃）に加熱して殺菌して培養を終了し、室温まで冷却して静置（例えば、室温下で半日〜１日間）し、生じた上澄を取り除き、そして取り除いた上澄と実質的に等しい量の水（例えば、工業用水または井水）を添加し、これを精製のために用いる。中和の条件は、ｐＨ５．５以上、より好ましくはｐＨ６．０〜７．５の範囲である。アルカリは、中和のために添加されるものであればいずれでもよく、このようなアルカリとしては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸アンモニウム、リン酸ナトリウムなどが挙げられる。好ましくは、水酸化ナトリウムである。通常、４８％水酸化ナトリウムが使用され得る。上記アルカリを、培養液のｐＨが上記範囲になるようにモニタリングしながら添加する。好ましくは、上記アルカリを攪拌しながら添加する。ラクトン型ＳＬは中性下ではなお難水溶性であると考えられるが（Ｉｎｏｕｅら、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４４：２２２１−２２２３（１９８０））、本工程によって、ラクトン型ＳＬを含むＳＬ成分全体が、中性下において可溶化あるいは安定した分散状態になる。
【００３１】
本精製方法では、次いで、上記工程により得られた、中和状態の溶液を固液分離し、溶液中の固形分を除去する。この固液分離のための技術としては、濾過または遠心分離が挙げられる。濾過は、そのままでも可能であるし、水を加えて粘度を下げることで、濾過速度をより速くすることもできる。本工程で使用され得る濾過は、加圧濾過（例えば、板枠型圧濾過器を用いる）、減圧濾過（例えば、回転円筒真空濾過器を用いる）が好ましい。ラボスケールでは、ブフナロートなどを用いる減圧濾過もまた可能である。濾過は、当該分野で一般に使用されている装置を用いて実施され得る。遠心分離は、当該分野で一般に使用されている装置を用いて実施され得る。例えば、連続遠心分離機による連続的な遠心分離が使用され得る。連続遠心分離機としては、かご型遠心分離機、ディスク型遠心分離機などが挙げられる。連続遠心分離の場合、連続的に液を流し込むことにより、分離に供され得る。例えば、約２ｋＬ／時で流し込まれ得る。バッチ型の遠心分離の場合、例えば、１０００×ｇで１５分間で実施され得る。上記のような濾過または遠心分離によって、固形分と、可溶化した状態のＳＬを含む溶液とを容易に分離することができる。この固形分には、菌体および、培養におけるＳＬの生成において生じた不純物が含まれ得る。
【００３２】
次いで、固形分を除去したＳＬ溶液を、酸を添加することにより酸性化し、ＳＬを再び不溶化する。添加する酸としては、無機酸（例えば、塩酸、フッ化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸など）、および有機酸（例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、グルクロン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、安息香酸、タンニン酸、アルギン酸、ポリグルタミン酸、ナフタレンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、ポリガラクツロン酸など）が挙げられる。なお、有機物と反応することのない酸が好ましい。塩酸および硫酸が好ましい。例えば、５％〜３６％の塩酸、２０〜９８％の硫酸が用いられ得る。酸性化の条件は、ｐＨ５．５以下、より好ましくはｐＨ４．０以下、より好ましくはｐＨ３．５以下、さらにより好ましくはｐＨ３．０以下であって、下限がｐＨ２．０である範囲である。通常、ｐＨ２．５〜４．０の範囲が使用され得る。上記酸を、培養液のｐＨが上記範囲になるようにモニタリングしながら添加する。好ましくは、上記酸を攪拌しながら添加する。
【００３３】
次いで、再不溶化したＳＬを沈降させ、上澄を取り除く。再不溶化したＳＬの沈降は、静置あるいは遠心分離により生じ得る。この静置は、通常、室温下で半日〜２日間、行われ得る。遠心分離は、数十〜数百×ｇで１０分から１時間で実施され得る。沈降物と上澄との分離は、デカンテーションなどで可能である。したがって、高濃度のＳＬを比較的容易に含水物として得ることができる。上記により得られたＳＬ生成物は、酸型ＳＬおよびラクトン型ＳＬの混合物に加えて水分を含む、含水物である。この水分は、ＳＬを高温または減圧下に置いたとき失われ得る。
【００３４】
上記ＳＬ含水物中に存在し得る、ＳＬ以外の不純物をさらに取り除くために、上記ＳＬ含水物に水を添加して攪拌し、次いで、例えば、静置または遠心分離を行うことによりＳＬを沈降させ、例えば、デカンテーションにより上澄を除去し、ＳＬを回収し得る。例えば、上記ＳＬ含水物に、例えば、蒸留水（または脱イオン水または工業用水もしくは井水）がＳＬ含水物と実質的に等しい量で添加され、５０〜２５０ｒｐｍで攪拌される。次いで、ＳＬを沈降させるために、例えば、室温で半日〜２日間、静置され得る。あるいは、ＳＬを沈降させるために、例えば、室温で５００×ｇで約３０分の遠心分離に供され得る。上澄の除去のためには、デカンテーションを行い得る。上記の手順は、必要に応じて、繰り返され得る。これにより、このＳＬ含水物に含まれ得る、培地中の、あるいは精製過程で添加したアルカリ、酸などに由来する少量の混入物（例えば、水溶性（無機）塩類、低分子および高分子の水溶性有機物など）が、ＳＬをほとんど損失することなく除去され得る。
【００３５】
本発明の精製方法により得られたＳＬ含水物は、そのまま原料として、製品に配合され得る。ＳＬ含水物はまた、種々の誘導体の出発物質として利用され得る。ＳＬは、ラクトン型と酸型に分離することなく混合物の形態で十分に利用され得る。ソホロースリピッドは、小麦製品の品質改良において利用されることが公知である（特開昭６１−２０５４４９号公報）。ソホロースリピッド誘導体は、化粧品の湿潤剤（油化学、３６、７４８−７５３（１９８７））、およびゲル化剤（特公平７−１７６６８号公報）として利用されている。
【００３６】
本発明の精製方法で得られたＳＬ含水物のメタノール溶液、および中和処理前のＳＬ含水物をメタノールに溶解した後フィルター濾過で不溶物を除いたものを、ＨＰＬＣで分析すると、基本的に同一のクロマトグラムが得られる。これは、本精製方法における工程において、酸型ＳＬだけでなく、本来難水溶性のラクトン型ＳＬもまた、可溶化および再不溶化沈殿で回収され、特定のＳＬ成分が大量に分解および損失することはないことを示している。
【００３７】
本発明の精製方法で使用される化学薬品は、基本的にアルカリおよび酸のみであり、必要な設備は、処理槽と、固液分離に必要な装置（例えば、連続遠心分離機あるいは菌体除去に使われ得る一般的な濾過装置）程度である。また、本発明の精製方法は、有機溶媒を使用しない。
【００３８】
従って、本発明により、培養液からのＳＬ分離精製に必要なコストを低減するだけでなく、環境および作業者への負荷を軽減することで、ＳＬは、より安価にかつより安全に市場に提供され得る。
【００３９】
以下、本発明を実施例により説明するが、本発明はこれに限定されない。本実施例で使用した材料、試薬、装置などは、他に特定のない限り、商業的な供給源から入手可能である。使用され得る試薬は、工業的に利用可能な等級の試薬である。
【００４０】
【実施例】
（実施例１）
２Ｌ容量の三角フラスコに２０ｇ／Ｌ含水グルコース、１０ｇ／Ｌポリペプトンおよび５ｇ／Ｌ酵母エキスからなる液体培地８００ｍｌ（ｐＨ４．６）を調製し、通気性のある蓋をして蒸気滅菌した。ここにカンジダ  ボンビコラ  ＡＴＣＣ２２２１４株１白金耳を植菌し、スターラーで攪拌しながら３０℃にて５０時間培養した。これを前培養液とする。３０Ｌ容量の培養槽（ファーメンテーター）に、１００ｇ／Ｌ含水グルコース、１００ｇ／Ｌダイズ油、２．５ｇ／Ｌ酵母エキス、１０ｇ／Ｌリン酸一カリウム、１０．２５ｇ／Ｌ硫酸マグネシウム７水和物、１ｇ／Ｌ塩化ナトリウムおよび１ｇ／Ｌ尿素からなる液体培地１８ｋｇ（ほぼ１８Ｌ）を調製し、塩酸を使用してｐＨを４．５に調整してから蒸気滅菌した。ただし不溶物の生成を避けるため尿素は別溶液として蒸気滅菌し、冷却後に混合した。混合後の培地のｐＨは４．６であった。１時間以上通気攪拌を行ってから、この培地に、前述の前培養液８００ｍｌを添加した。これを、３０℃で１０日間、通気攪拌培養（１．０ｖｖｍ、２５０ｒｐｍ）した。
【００４１】
ここで、培地由来の残留油脂量を調べた。培養液を密栓容器に取り、この培養液と等量のｎ−ヘキサンを添加して激しく振り混ぜた後、１，０００×ｇで１０分間遠心分離し、分離したヘキサン層を回収した。この工程を３回繰り返した。ヘキサン層を回収して、ヘキサン溶媒を６０〜８０℃程度の湯浴上にて揮発除去し、残留物の重量を測定した。培地由来の残留油脂は、ｎ−ヘキサン抽出物として、上記培養液の重量の約０．１％であった。
【００４２】
次いで、培養液を９０℃で１５分処理し、培養終了液を得た。この培養終了液は、ｐＨ２．７であった。この培養終了液は、室温で半日〜１日間の静置により、下から順に、液状の褐色沈殿物層、主に菌体と思われる乳白色の固形物層、上澄の３層に分離した。よく混合均一化した培養終了液を一部分取し、分取した培養終了液と等容量のｎ−ヘキサンでこの培養終了液を洗浄した後、２倍容量の酢酸エチルで３回抽出し、溶媒および水分を加熱減圧下で除去した。この結果、この培養終了液は、１４％のＳＬを含有すると見積もられた。
【００４３】
培養終了液１５ｋｇを室温で半日〜１日間静置し、生じた上澄を除去した後、工業用水または井水を、除去した上澄に等しい量で添加した。得られた培養終了液に攪拌しながら４８重量％の水酸化ナトリウム溶液を徐々に加え、ｐＨ６．５とし、ＳＬを可溶化した。連続遠心分離機（ウェストファリア（ウェストファリアセパレーターＡＧ製））を用いて２ｋＬ／時で処理することにより、この乳白色の固形物を沈殿させ、上澄を回収した。回収した上澄に攪拌しながら７８重量％の硫酸を徐々に加え、ｐＨ３．０とし、ＳＬを再不溶化した。室温で２日間静置後、デカンテーションにより上澄を可能な限り除去し、ＳＬ含水物３．９７ｋｇを得た。
【００４４】
このＳＬ含水物は、室温で１日以上静置すると、濁りのない液状の褐色沈殿物と若干量の上澄とに分離し、これら二層の界面において固形物はほとんど認められなかった。よく混合均一化したものの一部分取を分析した結果、得られたＳＬ含水物は、１０５℃乾燥による重量の減少から５３％の水分を含むと見積もられた。
【００４５】
次いで、上述の手順に従って、培地由来の残留油脂量を調べた。培地由来の残留油脂は、ｎ−ヘキサン抽出物として、ＳＬ含水物の乾燥重量に対し０．５％含んでいた。
【００４６】
次いで、水溶性塩類の混入を調べた。ビーカーおよび濾紙の重量を正確に測定しておいた。濾紙は１０５℃で１時間以上乾燥した後、デシケーター内で放冷したものを使用した。ビーカーにＳＬ含水物約１０ｇを正確に量り取り、エタノールを試料水分の２０倍重量以上で添加して湯浴上で加熱溶解した。この溶液を上述の濾紙を用いて濾過した。ビーカー内の不溶物を、熱エタノールを用いて２〜３回洗い出すことにより、完全に濾紙上に移した。濾紙を１０５℃の乾燥機で１時間乾燥し、デシケーターで放冷後、重量を正確に測定した。次式から、エタノール不溶分を算出した：エタノール不溶分（重量％）＝濾紙上残留物重量（ｇ）／［ＳＬ含水物重量（ｇ）×（１００−水分量（％））］×１０，０００。このＳＬ含水物における水溶性塩類の混入は、エタノール不溶分として２．３％であった。
【００４７】
また、このＳＬ含水物は、上述した方法（ｎ−ヘキサン洗浄−酢酸エチル抽出−溶媒・水分除去）を用いて、４８％のＳＬを含有すると見積もられた。
【００４８】
（実施例２）
実施例１で得られたＳＬ含水物に等重量（３．９ｋｇ）の蒸留水を添加し、２５０ｒｐｍで３０分、攪拌した。次いで、これを、室温で半日間、静置した。デカンテーションを行うことにより、上澄を除去した。この手順を、３回、繰り返した。
【００４９】
実施例１と同様に、このＳＬ含水物の組成について分析した。得られたＳＬ含水物は、５１％の水分を含むと見積もられた。培地由来の残留油脂を、ｎ−ヘキサン抽出物として、ＳＬ含水物の乾燥重量に対し０．５％含んでいた。また水溶性塩類の混入は、エタノール不溶分として０．１％であった。
【００５０】
また、このＳＬ含水物は、実施例１の方法（ｎ−ヘキサン洗浄−酢酸エチル抽出−溶媒・水分除去）を用いて、５０％のＳＬを含有すると見積もられた。
【００５１】
【発明の効果】
従って、本発明により、有機溶媒を用いることなく、培養終了液から液体および固形成分を除去し、高濃度のＳＬ含水物を得る方法が提供される。