(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
くろずもろみ末とカルシウム材粉末とを主原料とする骨粗鬆症の予防及び治療を促進する薬剤。
【請求項２】
くろずもろみ末とカルシウム材粉末とを、重量比で２〜３対１に混合し、かつカルシウム材粉末として牛骨粉又は貝殻粉を使用する請求項１に記載の薬剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は骨粗鬆症の予防及び治療を促進する薬剤に関する。さらに詳しくは、くろずもろみ末を主原料とするか又はくろずもろみ末とカルシウム材粉末とを主原料とする骨粗鬆症の予防及び治療を促進する薬剤に関する。本発明に係る骨粗鬆症の予防及び治療を促進する薬剤は、おだやかな効き目を呈し、副作用を生じさせないで、生体内のカルシウム吸収性と利用性を向上させ、骨粗鬆症の予防及び治療を促進することができる。
【０００２】
骨粗鬆症は、骨の中から、その構成成分であるカルシウムなどが減少し、骨がもろくなって、いつ折れてもおかしくない粗い状態になってしまう病気である。医学的には「単位体積あたりの骨量の減少が異常に進行した状態になる」ことをいう。骨粗鬆症は、ちょうど大根にスが入ったように、骨の中に小さな孔がたくさんあくことから、以前は「骨多孔症」とも言われていた。
ヒトの骨の中に含まれるカルシウムの量は、成長とともに増加し、２０歳代から３０歳代にかけて最高となり、それ以降はしだいに減少に向かう。特に女性の場合は、閉経後、急速に骨量の減少が起こる。
【０００３】
骨粗鬆症は、老化に伴って起こる生理的な骨の脆弱化が病気を引き起こすほどになった状態であるが、その原因は、たんに加齢によるだけではなく、日常生活でのカルシウム摂取不足や運動不足が、その発症に大きく関与している。
骨粗鬆症になると、背中や腰が曲がって身長が縮んだり、慢性的な腰骨痛に悩まされるという事態が生ずる。また骨が弱く、もろくなっているので、ちょっとした外部の圧力で骨折を起こしやすい。
【０００４】
骨粗鬆症の予防ないし治療のためには、日常生活において、カルシウム分を十分に摂ることが必要である。しかし、成人一日あたりのカルシウム摂取量の目安は６００ｍｇとされていて、実際問題として、これだけの量のカルシウムを食品などから摂取するのは容易なことではない。またせっかくカルシウム含量の多い食品を食しても、その食品に含まれているカルシウム分が常に効率よく体内に吸収されるとは限らない。特に日本人に多い塩分の摂り過ぎは、体内のカルシウムの吸収を阻害する大きな原因となる。また高齢者になるほど、腸管からのカルシウム吸収率が低下する傾向にある。このようなことから、カルシウムの吸収性を促進して骨粗鬆症の予防ないし治療を促進でき、しかも日常安心して服用できる安全な薬剤の開発が望まれている。
【０００５】
従来から骨粗鬆症の治療薬としては、骨量の減少を防ぐ作用がある薬として、各種のものが開発され使用されている。しかし、これらの薬剤は、使用法が限定的である上、強い副作用を有するものが多い。すなわち、従来の骨粗鬆症の治療薬を常用していると、副作用として、発疹やかゆみなどのアレルギー症状を起こしたり、悪心、嘔吐、腹痛、下痢、めまい、白血球・赤血球減少、肝障害、だるさなどの現象を多々生じやすい。このようなことから、長期間にわたって、また大量に投与しても、副作用が生じない骨粗鬆症の予防及び治療を促進する薬剤の開発が強く望まれている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
上記の事情に鑑み、本発明者は、カルシウムの吸収性を向上させ、さらにカルシウムの生体内利用性を改善でき、長期間にわたって投与しても、また大量に摂取しても副作用を生じることがない、骨粗鬆症の新規な治療促進剤ないし予防促進剤を開発することを志し、種々の生理活性作用を有するくろずもろみ末に着目し、これを原料として研究を続け、本発明を完成するに至った。
【０００７】
本発明は上記のようにしてなされたものであって、その発明としての課題は、カルシウムの吸収性を向上させ、カルシウムの生体内利用性を改善し、しかもおだやかな効果を呈し、長期間にわたって摂取し続けてもまた大量に服用しても、副作用を生じることなく、骨粗鬆症の治療及び予防を促進できる新規な薬剤を提供することである。
【０００８】
【課題を達成するための手段】
上記の課題を達成するための本発明は、くろずもろみ末とカルシウム材粉末とを主原料とする骨粗鬆症の予防及び治療を促進する薬剤である。
【０００９】
また本発明は、くろずもろみ末とカルシウム材粉末とを、重量比で２〜３対１に混合し、かつカルシウム材粉末として牛骨粉又は貝殻粉を使用しこれらを主原料とする骨粗鬆症の予防及び治療を促進する薬剤である。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明では、くろず（黒酢）の製造時に副産物として得られるくろずもろみ末を主原料として使用する。くろずは、伝統的に、鹿児島の福山地方を中心として生産されており、最近では健康飲料や健康食品の原料としても注目されている。くろずは、その一般的な製法を説明すると、野天に並べた醸造用のカメに米麹と蒸米と水とを仕込んで、太陽エネルギーの力で、糖化、アルコール発酵、酢酸発酵を同一のカメの中で進行させる。そうすると、長い熟成期間を経ることによって、独特の風味と各種の有用成分を有するくろずもろみが生成されるので、これを圧搾、ろ過してくろずとして生産される。
【００１１】
本発明において、くろずもろみとは、上記のようにくろず原料を発酵・熟成させた発酵物、すなわち、くろずを混和している状態の発酵物のことをいう。くろずは、上記のように伝統的な製法に則って製造されるので、通常の食酢に比べ、原料米を６〜７倍量多く使用する。そのために、くろずもろみは、くろずの製造工程において少量得ることができる。またくろずもろみ末とは、くろずもろみから液体であるくろずを除去した残渣を乾燥させ粉末状にしたものをいう。くろずもろみ末は、従来から知られている種々の方法で製造することができ、例えば、特開昭６１−５８５７７号公報などに記載されている方法で製造したものを使用することができる。
【００１２】
くろずやくろずもろみ末には、食欲増進作用、消化吸収促進作用、殺菌力・防腐作用、漂白作用など通常の酢が有する一般的効能の他、肩こり、五十肩、高血圧、便秘、動脈硬化、糖尿病、肥満、慢性肝炎、神経痛、リウマチ、眼底出血などに効果があるとされている。最近は、血糖、血中脂質、血清コレステロール含量を低下させる作用があることも発表されている。またくろずの成分には、タンパク質、遊離アミノ酸、オリゴペプタイドなどが含まれていることが解明されている。さらに、本発明者は、先にくろず及びくろずもろみ末に抗炎症作用があることを見いだし、発明として完成させた。この発明は、現在、くろず又はくろずもろみ末の有機溶媒抽出物の乾燥物を有効成分とする抗炎症剤として、特許出願がなされている（特願平１０−２９７６１５号）。
【００１３】
本発明に係る骨粗鬆症の予防及び治療を促進する薬剤には、主原料として、くろずもろみ末、すなわち、くろずもろみを圧搾してその搾り粕を乾燥し粉末化したものを使用する。本発明に係る薬剤の原料としては、くろずもろみ末だけを使用してもよいが、その他に、通常の薬剤製造時に使用される甘味剤、増粘剤、賦形剤などを併用しても差し支えない。
【００１４】
本発明に係る骨粗鬆症の予防及び治療を促進する薬剤を使用する場合は、カルシウム含量の多い食品、例えば、牛乳、チーズ、ヨーグルトなどの乳製品、緑黄色野菜、小魚又はそのすり身、海草類などを摂取する前後にこの薬剤を服用すると、効果的である。しかし、本発明に係る骨粗鬆症の予防及び治療を促進する薬剤は、カルシウム材粉末と共に使用すると、骨粗鬆症の予防及び治療を促進する効果はさらに大きくなる。カルシウム材粉末としては、カルシウム含量が多く、カルシウム吸収性のよいものをであれば種類に限定はないが、例えば、牛骨、卵殻、貝殻、サンゴなどに由来する粉末を使用することが好ましい。その中でも、腸管吸収性の点で、牛骨粉を使用するのが好ましい。また、コーラル（サンゴ）カルシウム、乳清カルシウム、ドロマイト（食用のもの）、グルコン酸カルシウム、クエン酸カルシウム、リンゴ酸カルシウム、炭酸カルシウム、燐酸カルシウムなどの形で市販されているカルシウム製剤を使用してもよい。したがって、この場合の本発明に係る薬剤の使用方法としては、患者に対して、本発明に係るくろずもろみ末を主原料とする薬剤と共に、上記のカルシウム材粉末を併用するように投与するとよい。具体的には、本発明に係る薬剤とカルシウム材粉末とを混合して散剤として投与するか、又は本発明に係る薬剤とカルシウム材粉末とを同時に服用するように投与するか、もしくは本発明に係る薬剤とカルシウム材粉末をあまり時間をおかないでそれぞれ別々に服用するように投与するか、いずれの方法を採っても差し支えない。
【００１５】
また本発明に係る骨粗鬆症の予防及び治療を促進する薬剤は、くろずもろみ末と共にカルシウム材粉末を主原料として使用し、製剤化すると、さらに効果がある。この場合は、その他の原料として、通常の薬剤製造時に使用される甘味剤、増粘剤、賦形剤などを使用しても差し支えない。くろずもろみ末とカルシウム材粉末とは、重量比で２〜３対１程度に混合して使用するのがよい。
したがって、この場合の本発明に係る薬剤は、くろずもろみ末とカルシウム材粉末とを主原料として、例えば、顆粒状ないしカプセル状に製剤してもよいし、錠剤として打錠してもよい。またくろずもろみ末とカルシウム材粉末とを主原料として混合して散剤としてもよい。その他、いろんな形態に製剤化して差し支えない。
【００１６】
本発明の骨粗鬆症の予防及び治療を促進する薬剤の使用は、通常、経口投与によって行なわれる。その投与量は、年齢、性別、症状、投与する目的などによって異なるが、くろずもろみ末換算で、４０歳代の女性の場合、１日に１ｇ〜２ｇを１回ないし数回に分けて服用するとよい。
【００１７】
本発明の骨粗鬆症の予防及び治療を促進する薬剤の有効成分は、くろず又はくろずもろみ末として従来から飲食に供されているものであるので、急性毒性は存在しないことはもちろん、副作用も生じない。本発明の骨粗鬆症の予防及び治療を促進する薬剤は、カルシウムの生体内への吸収を促進させると共に、体外へのカルシウム排泄量を抑え、骨強度・骨密度を増加させるなど生体内のカリシウム利用性を向上させる作用を奏する。
【００１８】
【実施例１】
《くろずもろみ末の製造例》
くろずもろみ（坂元醸造（株) 製）を濾過圧搾機で圧搾し、搾り液（くろず）と搾り粕に分離した。得られた搾り粕を裁断機で裁断後、間接熱風乾燥機に入れて８０〜１００℃で５時間乾燥した。得られた乾燥搾り粕をさらに高速粉砕機にかけて、くろずもろみ末を得た。
【００１９】
【実施例２】
《くろずもろみ末を主原料とする顆粒状製剤の製造例》
実施例１で製したくろずもろみ末、澱粉、小麦胚芽をそれぞれ乾燥機に入れ、１００℃で２０分間静置状態のまま加熱して乾燥・殺菌した。各原料を計量後、流動造粒乾燥機に入れて混合し、１％澱粉溶液を噴霧し造粒した。さらに６０℃で２時間乾燥した。でき上がった顆粒状くろずもろみ末製剤をフルイにかけて選別し、スティック分包機にかけて４ｇづつスティック袋に分包した。このスティック袋３０本をひとまとめにして脱酸素剤と共にポリエチレン製の袋に入れ、シュリンク包装して小箱に詰め製品とした。
【００２０】
【実施例３】
《くろずもろみ末とカルシウム材粉末とを主原料とする錠剤の製造例》
実施例１で製したくろずもろみ末、微粉砕状食用牛骨粉、還元麦芽糖水飴、乳糖、結晶セルロースを計量後、流動造粒乾燥機に入れて混合し、水を噴霧し造粒した。さらに６０℃で２０分間乾燥した。でき上がった顆粒状くろずもろみ末製剤をフルイにかけて整粒し、ＤＫエステルと混合後、打錠機で２５０ｍｇ錠を打錠した。割れ・欠けを検査後、錠剤を瓶に充填し、ラベルを貼って化粧箱に入れ製品とした。
【００２１】
以下、試験例をもって、本発明の薬理作用について、さらに詳しく説明する。尚、以下の試験例による試験結果は、それぞれ表に示すが、各表の数値は、統計的手法に基づいて、それぞれ有意差検定（Studnt's-t）を行ない、平均値±標準偏差で表している。
【００２２】
【試験例１】
実験的骨粗鬆症モデルとして卵巣摘出ラットを用い、28日間、くろずもろみ末に牛骨粉を混合して投与した場合の牛骨粉の体内利用性について、骨代謝試験を中心に試験を行ない、比較検討した。その結果は、以下の表１〜表９に示すとおりである。
【００２３】
(1) 供試動物
６週齢のラット（雌）を以下の各群について、それぞれ６匹宛供試した。
予備飼育期間内に、Moromi群、Calcium 群及び Control群については、卵巣摘出処置を施し、発情休止を確認できたものに低カルシウム飼料（Ca＝0.5%：日本クレア（株）製）を給餌した。
またNormal群は、正常群として卵巣摘出処置を施さず、固形飼料CA-1（日本クレア（株）製）を給餌した。
(2) 試験群の設定
Moromi群    くろずもろみ末30mgと牛骨粉10mgの混合粉末／日
Calcium 群  牛骨粉10mg／日
Control 群  蒸留水
Normal群    （無投与）
(3) 被験物質の調製及び投与
成人（体重60kg） 1日あたりのカルシウム所要量は600mg とされているので、ラット体重に対するカルシウム量は体重換算により2mg/日となる。そこで、試験対象物の牛骨粉について、カルシウム2mg に相当する量は10mgであることから、本飼育期間では、各 1匹あたり、Moromi群についてはくろずもろみ末30mgと牛骨粉10mgの混合粉末を、Calcium 群については牛骨粉10mgを、それぞれ蒸留水 1mlで調製し、胃ゾンデを用いて28日間連続投与した。Control 群については蒸留水 1mlを同条件で投与した。Normal群は無投与とした。
被験物質のうち、くろずもろみ末は、鹿児島市上之園町の坂元醸造（株）の製品を使用した。また牛骨粉は、シーデーフーズ（株）製のものを使用した。
【００２４】
(4) 体重及び摂取量の測定
体重は、被験物質投与前に測定を行ない、摂取量については 1日おきに測定した。その結果を表１と表２に示す。
(5) 出納試験
本飼育終了前 5日間に代謝ケージを用いて尿と糞を採取し、下記の処理を施して分析試料とした。
▲１▼尿中カルシウム分析試料の調製
採取した尿は、蒸留水を用いて10ml単位で原尿量に近くなるように定容後40mlをるつぼに採取し、乾燥機にて蒸発乾固した。次に 550℃、48時間マッフル炉にて灰化後、塩酸処理し、50mlに定容後カルシウム分析に供した。
▲２▼糞中カルシウム分析試料の調製
採取した糞は、凍結乾燥した後混入したラットの被毛などを除き、ミルにて粉砕した。次にるつぼに0.5gを採取し、550 ℃、48時間マッフル炉にて灰化後、塩酸処理し、50mlに定容後カルシウム分析に供した。
(6) 解剖
本飼育終了後に、一晩絶食後ネンブタール（40mg/ kg）麻酔下にて開腹し、腹大動脈より採血を行ない、その血液を遠心分離(4℃、3000 rpm、20分) して血清を採取した。次に、肉眼的観察を行なった後、心臓、腎臓（左右）、大腿骨（左右）を摘出し、重量測定を行なった。その結果を表９に示す。
【００２５】
(7) 生化学検査
▲１▼血清
採取した血清は、市販キットを用いてカルシウム濃度、アルカリフォスファターゼ活性、骨型アルカリフォスファターゼ活性について測定した。その結果を表３に示す。
▲２▼尿
本飼育終了の 7日前に代謝ケージを用いて採取した尿を、HPLC法によって遊離型ピリジノリン、遊離型デオキシピリジノリンについて測定した。尿の採取は、午前 7時から翌日の午前 9時までの間とした。その結果を表４に示す。
【００２６】
(8) 骨代謝の観察（大腿骨）
▲１▼骨強度測定
摘出した右大腿骨を、 3点曲げ試験法に基づいて、下記の条件下で測定した。
測定条件
測定温度：        23℃
フルスケール：    50kgf
テストスピード：  10mm/ 分
チャートスピード：500mm/分
支点間距離：      19mm
その結果を表６に示す。
▲２▼骨灰分重量測定及びカルシウム分析試料の調製
上記の測定を終了した右大腿骨は骨髄を蒸留水で洗い流し、ジエチルエーテルにて 3日間脱脂を行なった後、るつぼを用いて 550℃、48時間マッフル炉にて灰化した。灰化重量を測定した後、塩酸処理し、50mlに定容後カルシウム分析に供した。
▲３▼骨密度測定
摘出した左大腿骨は、骨密度測定装置pQCTを用いて、大腿骨遠位端のエンドプレートから 3mmと12mmの 2箇所の部位を測定した。その結果を表８に示す。
【００２７】
(9) 原子吸光光度法によるカルシウム測定
上記(5) により調製した尿中カルシウム分析試料、糞中カルシウム分析試料、及び上記(8) にて調製した骨灰分重量測定及びカルシウム分析試料について、夾雑物などによる阻害防止のためストロンチウムを5%になるように添加した後、原子吸光光度法にて尿中カルシウム排泄量、糞中カルシウム排泄量を測定した。その結果を表５に示す。また、大腿骨カルシウム濃度を測定した。その結果を表７に示す。
【００２８】
【表１】
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【００２９】
【表２】
0004681091.tif 000003
【００３０】
＜表１と表２についての考察＞
投与期間中における体重増加量については、投与 7日目まで差異は認められなかったが、投与14日目以降は、Calcium 群＞Moromi群＞Control 群の順に、増加傾向が観察された。摂餌量については、各群間に顕著な差異は認められなかったが、投与28日目でMoromi、Control の 2群は、Calcium 群に対してやや低い値を示した。すなわち、卵巣を摘出していないNormal群は、飼料の摂取量が少なく体重の増加も少ないが、他の 3群は、群間に有意差はないが肥満して行く傾向を示した。
【００３１】
【表３】
0004681091.tif 000004
【００３２】
＜表３についての考察＞
血清中のカルシウム量は、本来、生体恒常性によりラットの場合、8.4 〜11.0mg/dl と安定している。今回のMoromi群は、Control 群、Calcium 群に対して有意に血清カルシウム量が高い結果が得られた。値としては一応ほぼ正常値の範囲内なので問題はないと考えられる。
尚、試験例２のカルシウム吸収試験により、くろずもろみ末はカルシウム吸収性を増加させることが証明されているが、表３の結果を併せると、正常値範囲内で最大の血清カルシウムレベルが得られたものと考えられる。
【００３３】
またアルカリフォスファターゼと骨型アルカリフォスファターゼは、骨形成活性を示す指標であり、この数値が高いほど骨形成が行なわれていることを示す。両フォスファターゼは、骨芽細胞の細胞膜や基質小胞に多く存在し、基質の石灰化との関係が想定される物質であり、一部は血中に遊出するため、その測定によって骨形成活性を推測できるのである。今回のデータは有意差は出ていないが、かなり低い数値になっている。一見骨形成が低下しているようにみえるが、28日間投与した後の測定であり、後記の骨密度・骨重量などの結果から総合して考察すると、骨形成が投与期間中になされたため、28日間後の測定時には減少しているものと考えられる。
【００３４】
【表４】
0004681091.tif 000005
【００３５】
＜表４についての考察＞
尿中ピリジノリンとデオキシピリジノリンは、コラーゲン分子間に架橋を形成することでコラーゲン線維の安定性に寄与している物質とされているが、これらの架橋は骨形成時には存在せず、骨吸収時の破壊により放出されることが明らかとなっている。すなわち、ピリジノリンとデオキシピリジノリンは、骨吸収のパラメータであり、この数値が高いと骨からカルシウムが血清中に溶けだし骨がスカスカになっている状態を示す。今回のデータは有意差はないが、若干低い傾向になっている。
【００３６】
【表５】
0004681091.tif 000006
【００３７】
＜表５についての考察＞
生体内におけるカルシウムの体内留保量を確認するために行なった出納試験では、尿中カルシウム排泄量は、Moromi群が、Calcium 群とConrol群に対して低い値を示した。また糞中カルシウム排泄量においては、Moromi群は尿中カルシウムと同様に低い値を示したが、Calcium 群についてはControl 群よりも高い値が観察された。すなわち、尿中と糞中のカルシウム含量にほとんど有意差はないが、Moromi群は、尿・糞中のカルシウム含量が低下しているので、ラットの生体内で利用されていると考えられる。
【００３８】
【表６】
0004681091.tif 000007
【００３９】
＜表６についての考察＞
今回のテストで有意差はないが、Control 群よりCalcium 群の方が、Calcium 群よりMoromi群の方が、大腿骨を折るのにより大きな力を要し、骨強度が高いことを示した。またMoromi群は、骨のしなやかさが向上していると言える。
【００４０】
【表７】
0004681091.tif 000008
【００４１】
＜表７についての考察＞
Moromi群は、Control 群とCalcium 群よりも大腿骨の灰分量とカルシウム含量が増加している。Moromi群は正常であるNormal群の数値までほぼ回復している。灰分含量に関しては、Moromi群、Calcium 群は、Control 群に対して有意に増加している。
【００４２】
【表８】
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【００４３】
＜表８についての考察＞
骨は海綿骨（骨の外側）と皮質骨（骨の内側）からなるが、骨粗鬆症は海綿骨の密度の減少が関係すると言われている、今回のMoromi群は、有意にControl 群より海綿骨、皮質骨、全骨で密度が増加している。またMoromi群は、皮質骨に関してはCalcium 群に対しても、有意に増加している。
骨密度測定装置pQCTで有意差が出ることは大変すばらしいことである。
【００４４】
【表９】
0004681091.tif 000010
【００４５】
＜表９についての考察＞
本飼育試験終了後の解剖時に行なった肉眼的観察では、各群とも異常は認められず、腎臓の石灰化も観察されなかった。肉眼的観察後に摘出した心臓、腎臓、大腿骨の重量測定では、Moromi群の心臓重量がCalcium 群に対して有意に高い値を示した。またMoromi群は、大腿骨重量についても有意に増加しており、Normal群の重量まで回復している。Calcium 群に対して有意差が得られたことは特筆すべきことである。
【００４６】
＜試験例１についての総合所見＞
今回くろずもろみ末を添加したMoromi群には、血清アルカリフォスファターゼ活性、骨型アルカリフォスファターゼ活性、及び尿中の遊離型ピリジノリンの低下が認められ、骨形成を促進する作用があることが確認された。さらに出納試験において観察された尿中及び糞中のカルシウム排泄量の低下や、大腿骨の灰分重量、骨塩量、骨強度及び骨密度の増加は、カルシウムの体内利用性の向上を示すものである。
特に今回の試験において注目すべき点は、くろずもろみ末を添加したMoromi群の大腿骨骨密度である。ラットでの卵巣摘出による骨量減少は海綿骨の多い骨端部から起こり、皮質骨の多い骨幹部では起こりにくいことが報告されている（日薬理誌：104,101-109,1994）が、Moromi群において、海綿骨、皮質骨の両骨密度の有意な上昇が認められたことから、くろずもろみ末の添加は、骨粗鬆症に対する予防効果作用があるものと判断できる。
【００４７】
【試験例２】
牛骨粉にくろずもろみ末を添加することによる腸管吸収性を、以下の試験群について小腸還流法(in situ) に基づいて試験し比較検討した。その結果を表１０に示す。
(1) 供試動物
８週齢のラット（雄）を以下の各群について、それぞれ３匹宛供試した。
(2) 試験群の設定
Moromi(2:1) 群  重量比でくろずもろみ末２対牛骨粉１の割合の混合粉末
Moromi(1:1) 群  重量比でくろずもろみ末１対牛骨粉１の割合の混合粉末
Control 群      牛骨粉のみ
(3) 被験物質の調製
試験対象物の牛骨粉について、カルシウム 2mgに相当する量は10mgであることから、カルシウム 2mgに相当する牛骨粉の量を１とし、それに対して、くろずもろみ末を各群の比率で混合し、試験対象物とした。被験物質のうち、くろずもろみ末は、鹿児島市上之園町の坂元醸造（株）の製品を使用した。また牛骨粉は、シーデーフーズ（株）製のものを使用した。
(4) 試験方法
▲１▼還流溶液の調製
試験対象物のカルシウム量として 2mg相当量を人工胃液（塩化ナトリウム2.0gに希塩酸24.0ml及び蒸留水を加えて1000mlに調製）10mlに溶解させ、30分後にその全量を人工腸液（0.2Mリン酸二水素カリウム溶液250ml に0.2N水酸化ナトリウム溶液 118ml及び蒸留水を加えて1000mlに調製した。pH約6.8 ）10mlに移し、pHを6.5 に調製した後、その全量を正確に 100mlにあわせて還流溶液とした。
▲２▼小腸還流法による吸収試験
（術式）24時間絶食させたラットをウレタン（カルバミン酸エチル:1.2g/kg）麻酔下で腹部正中切開し、胆汁の影響を除くために総胆管を十二指腸近位で結索の後、幽門部より50cm（十二指腸・空腸・回腸）下部を還流小腸域として用いた。還流始点部並びに終点部にＬ字管を装着し、それぞれ縫合糸で結索後、37℃に加温した生理食塩水を始点部Ｌ字管より流し腸内の洗浄を行なった。腸内洗浄処置後ラットの体温低下を防止する目的でライトスタンドを適宜に近づけた。
（還流）先に調製した還流溶液を、あらかじめ37℃に設定したホットスターラーで攪拌しながら保温した。次に、小腸と両カニューレ間にペリスタポンプ及び上記の各試験群を含む還流溶液を入れたリザーバーを配してループ（小腸・カニューレ・還流溶液・ペリスタポンプ・カニューレ・小腸のループ）を形成し、還流溶液を始点部幽門側より下部方向へ1.0ml/分の還流速度で循環させながら、一定時間ごとに、還流溶液中のカルシウム濃度（カルシウムの減少量）を測定した。カルシウム濃度測定用試料の採取時間は、還流開始直後、10、20、30、40、50、60分とし、採取量は1.0ml とした。
▲３▼分光光度計によるカルシウム濃度の測定
還流溶液より採取した試料溶液 0.5mlは、カルシウムC −テストワコー（和光純薬工業（株）を用い、分光光度計にて測定した。
【００４８】
【表１０】
0004681091.tif 000011
【００４９】
＜表１０についての考察＞
ラット腸管におけるカルシウム吸収率の経時的変化について観察すると、還流開始から20分時まで、Moromi(2:1) 群とMoromi(1:1) 群はControl 群に対して吸収率の上昇傾向が認められ、Moromi(1:1) 群が最も高い値を示していたが、30分時ではMoromi(2:1) 群が1.43±0.25% ,Moromi(1:1)群が1.43±2.15% と、くろずもろみ末を混合した２群がほぼ同値を示した。還流開始後40分時以降、Moromi(1:1) 群は1.26±1.35% 、1.17±1.50% 、2.24±2.88% と40分及び50分時で吸収率の減少が観察されたことに対して、Moromi(2:1) 群は2.07±0.65% 、2.47±0.68% 、3.95±0.98% と安定した吸収率の上昇が認められた。
また、Moromi(2:1) 群とControl 群における還流時間60分間の腸管吸収率の経時的変化をみると、それぞれ安定した吸収傾向を示しており、Moromi(2:1) 群はControl 群に対して約２倍の吸収率を維持する傾向が観察された。
【００５０】
小腸還流試験（in situ)は小腸でのカルシウム吸収を比較検討する際に用いられる方法の一つで、還流域については十二指腸域、小腸全域などが選択される。今回の試験では小林らの方法に準じて小腸全域を用いて試験を行なった結果、くろずもろみ末を添加したMoromi(2:1) 群が他の２群に対して最も高い吸収率を有し、くろずもろみ末が牛骨粉カルシウムの腸管吸収性を促進させる作用があることが確認された。
【００５１】
【試験例３】
牛骨粉以外のカルシウム材（乳酸カルシウム、炭酸カルシウム、卵殻カルシウム）の粉末について、くろずもろみ末を添加することによるカルシウムの腸管吸収性を、以下の試験群について小腸還流法(in situ) に基づいて試験し、比較検討した。その結果を表１１と表１２に示す。
(1) 供試動物
８週齢のラット（雄）を以下の各群について、それぞれ３匹宛供試した。
(2) 試験群の設定
0004681091.tif 000012
(3) 被験物質の調製
くろずもろみ末添加カルシウム群は、各カルシウム材粉末のカルシウム 2mg相当量に対する重量を１とし、それに対して重量比でくろずもろみ末２をそれぞれ混合し、試験対象物とした。被験物質のうち、くろずもろみ末は、鹿児島市上之園町の坂元醸造（株）の製品を使用した。また、乳酸カルシウム粉末は和光純薬工業（株）製のものを、炭酸カルシウム粉末は関東化学（株）製のものを、卵殻カルシウム粉末はキユーピー（株）製の「カルホープ」を使用した。
(4) 試験方法
▲１▼還流溶液の調製
試験対象物のカルシウム量として 2mg相当量を人工胃液（塩化ナトリウム2.0gに希塩酸24.0ml及び蒸留水を加えて1000mlに調製した。pH約 1.2）10mlに溶解させ、30分後にその全量を人工腸液（0.2Mリン酸二水素カリウム溶液250ml に0.2N水酸化ナトリウム溶液 118ml及び蒸留水を加えて1000mlに調製した。pH約6.8 ）10mlに移し、pHを6.5 に調製した後、その全量を正確に 100mlにあわせて還流溶液とした。
▲２▼小腸還流法による吸収試験
（術式）（還流）とも、試験例２と同じ方法で試験した。
▲３▼分光光度計によるカルシウム濃度の測定
試験例２と同じ方法で測定した。
【００５２】
【表１１】
0004681091.tif 000013
【００５３】
【表１２】
0004681091.tif 000014
【００５４】
＜表１１と表１２についての考察＞
ラット腸管におけるカルシウム吸収率の経時的変化について観察すると、還流開始から20分時まで、各試験群間に差異は認められなかったが、30分時以降は、くろずもろみ末添加カルシウム群は無添加カルシウム群に対して、いずれも吸収率の上昇傾向が認められ、特にMoromi＋CaL 群では、その傾向が顕著であった。また各試験群における還流60分間の腸管吸収率の経時的変化をみると、くろずもろみ末添加カルシウム群は、それぞれ安定した吸収傾向を示しており、無添加カルシウム群に対して、約 1.3倍の吸収率を維持する傾向が観察された。また、この試験の結果から、くろずもろみ末には、牛骨カルシウムに限らず、各種カルシウム材の腸管吸収性を促進させる作用があることが確認された。
【００５５】
以上、試験例１〜試験例３の結果から、カルシウム材粉末にくろずもろみ末を配合した場合には、カルシウムの吸収を改善する作用だけではなく、カルシウムの生体内利用性の亢進作用が確認されると共に、明らかな骨代謝の改善が観察されたことより、くろずもろみ末が骨粗鬆症の予防及び治療に役立つことが判明した。またくろずもろみ末は、どのカルシウム材粉末に対しても有効であることが確認された。
【００５６】
【発明の効果】
以上詳しく説明のとおり、本発明に係る骨粗鬆症の予防及び治療を促進する薬剤は、カルシウムの生体内吸収性を向上させると共に、カルシウムの生体内利用性を改善し、骨代謝の促進に寄与し、骨粗鬆症の予防及び治療に役立つものである。しかも種々の生理活性作用を有する食品であるくろずから採ったくろずもろみ末を主原料としているので、おだやかな効き目を奏し、その上副作用の生じるおそれがない。したがって、本発明に係る骨粗鬆症の予防及び治療を促進する薬剤は、高齢者はもとより、あらゆる年齢層の者を対象とすることができ、また日常生活において気軽に服用することができるので、国民の健康改善に大きく寄与することができる。