(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞捕捉プレートに設けられた捕捉孔を通して負圧吸引することで細胞を捕捉し、捕捉した細胞にキャピラリ針を突き刺して薬液を注入する自動マイクロインジェクション装置であって、
前記細胞捕捉プレートは、捕捉孔が２次元直交座標系の２つの座標軸方向に不等間隔に配置されていることを特長とする自動マイクロインジェクション装置。
【請求項２】
前記細胞捕捉プレートに設けられた捕捉孔の配置を記憶する記憶手段と、
前記記憶手段が記憶する配置情報に基づいて、前記キャピラリ針を薬液注入対象の細胞を捕捉した捕捉孔へ誘導する制御手段をさらに備えたことを特徴とする請求項１に記載の自動マイクロインジェクション装置。
【請求項３】
前記細胞捕捉プレートは、シリコンもしくはプラスチックを材料とすることを特徴とする請求項１または２に記載の自動マイクロインジェクション装置。
【請求項４】
前記細胞捕捉プレートは、捕捉孔が、他の捕捉孔と所定の値以上の距離を保ってランダムに配置されていることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一つに記載の自動マイクロインジェクション装置。
【請求項５】
細胞にキャピラリ針を突き刺して薬液を注入する自動マイクロインジェクション装置において細胞を捕捉保持するためにもちいられる細胞捕捉プレートであって、
細胞を捕捉保持するための貫通孔である捕捉孔が２次元直交座標系の２つの座標軸方向に不等間隔に配置されていることを特長とする細胞捕捉プレート。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、細胞への薬液の導入のためにもちいる自動マイクロインジェクション装置および細胞捕捉プレートに関し、特に、圧力破壊に対する耐性を向上させた細胞捕捉プレートおよびその細胞捕捉プレートを利用可能な自動マイクロインジェクション装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
ライフサイエンス分野等において、遺伝子、抗体、たんぱく質等の生体分子や化合物（以下、これらを総称して「薬液」という。）を細胞内へ導入する際に自動マイクロインジェクション装置がもちいられることが多い。
【０００３】
自動マイクロインジェクション装置は、細胞を保持する操作と、キャピラリ針と呼ばれる微細な中空のガラス針を細胞に突き刺してキャピラリ針の中に充填された薬液を細胞内に吐出する操作とを自動化したもので、大量の細胞に高速に薬液を導入することができる。
【０００４】
特許文献１〜４には、微細な貫通孔を設けた細胞捕捉プレートを用い、背面からの負圧吸引により細胞を捕捉孔に吸いよせて捕捉する細胞保持手法が開示されている。特許文献１では、個々の細胞が完全に収容される凹部を作り、その底部に貫通孔を設けた構造をもった細胞捕捉プレートが開示されている。また、特許文献２では、単純な貫通孔のみをもつ細胞捕捉プレートが開示され、特許文献３および４では、開口端がロート状になった捕捉孔をもつ細胞捕捉プレートが開示されている。
【０００５】
【特許文献１】特許第２６６２２１５号
【特許文献２】特許第２６２４７１９号
【特許文献３】米国特許第５２６２１２８号
【特許文献４】特許第３０３５６０８号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、自動マイクロインジェクション装置においてもちいられる細胞捕捉プレートには圧力破壊の可能性があるという問題がある。細胞保持のための捕捉孔は、非常に微細で、これらの微細な貫通穴を形成するために、捕捉孔周辺は１０μｍ程度の厚さの薄膜形状となっている。
【０００７】
自動マイクロインジェクション装置では、細胞を細胞捕捉プレートに吸引捕捉するのに先立って細胞捕捉プレートの周辺をリン酸緩衝食塩水等の緩衝液によって満たす必要があるが、この工程において細胞捕捉プレートに大きな圧力が印加され、薄膜形状が圧力破壊される可能性がある。
【０００８】
圧力破壊を回避するために、印加される圧力を低下させると、細胞捕捉プレートの周辺が緩衝液によって完全に満たされなくなり、キャピラリ針を細胞に精密に誘導して突き刺すことができなくなってしまう。
【０００９】
この発明は、上述した従来技術による問題点を解消するためになされたものであり、圧力破壊に対する耐性を向上させた細胞捕捉プレートおよびその細胞捕捉プレートを利用可能な自動マイクロインジェクション装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上述した課題を解決し、目的を達成するため、本発明は、細胞捕捉プレートに設けられた捕捉孔を通して負圧吸引することで細胞を捕捉し、捕捉した細胞にキャピラリ針を突き刺して薬液を注入する自動マイクロインジェクション装置であって、前記細胞捕捉プレートは、捕捉孔が２次元直交座標系の２つの座標軸方向に不等間隔に配置されていることを特徴とする。
【００１１】
また、本発明は、細胞にキャピラリ針を突き刺して薬液を注入する自動マイクロインジェクション装置において細胞を捕捉保持するためにもちいられる細胞捕捉プレートであって、細胞を捕捉保持するための貫通孔である捕捉孔が２次元直交座標系の２つの座標軸方向に不等間隔に配置されていることを特徴とする。
【００１２】
この発明によれば、細胞捕捉プレート上の捕捉孔を２次元直交座標系の２つの座標軸方向に不等間隔に配置するように構成したので、格子状配置に比べて直線上にならぶ孔の平均的なピッチが長くなり、圧力破壊に対する耐性を向上させることができる。
【００１３】
また、本発明は、上記の発明において、前記細胞捕捉プレートに設けられた捕捉孔の配置を記憶する記憶手段と、前記記憶手段が記憶する配置情報に基づいて、前記キャピラリ針を薬液注入対象の細胞を捕捉した捕捉孔へ誘導する制御手段をさらに備えたことを特徴とする。
【００１４】
この発明によれば、捕捉孔の配置を記憶手段に記憶しておき、この記憶手段に記憶された配置情報に基づいてキャピラリ針を捕捉孔へ誘導するように構成したので、捕捉孔が２次元直交座標系の２つの座標軸方向に不等間隔に配置されていてもインジェクション動作を自動制御することができる。
【００１５】
また、本発明は、上記の発明において、前記細胞捕捉プレートは、シリコンもしくはプラスチックを材料とすることを特徴とする。
【００１６】
この発明によれば、前記細胞捕捉プレートの材料としてシリコン以外にプラスチックをもちいることができるので、圧力破壊に対する耐性の高い細胞捕捉プレートを安価に提供することができる。
【００１７】
また、本発明は、上記の発明において、前記細胞捕捉プレートは、捕捉孔が、他の捕捉孔と所定の値以上の距離を保ってランダムに配置されていることを特徴とする。
【００１８】
この発明によれば、細胞捕捉プレート上の捕捉孔を他の捕捉孔と所定の値以上の距離を保ってランダムに配置するように構成したので、格子状配置に比べて直線上にならぶ孔の平均的なピッチが長くなり、圧力破壊に対する耐性を向上させることができる。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、細胞捕捉プレート上の捕捉孔を２次元直交座標系の２つの座標軸方向に不等間隔に配置するように構成したので、格子状配置に比べて直線上にならぶ孔の平均的なピッチが長くなり、圧力破壊に対する耐性を向上させることができるという効果を奏する。
【００２０】
また、本発明によれば、捕捉孔の配置を記憶手段に記憶しておき、この記憶手段に記憶された配置情報に基づいてキャピラリ針を捕捉孔へ誘導するように構成したので、捕捉孔が２次元直交座標系の２つの座標軸方向に不等間隔に配置されていてもインジェクション動作を自動制御することができるという効果を奏する。
【００２１】
また、本発明によれば、前記細胞捕捉プレートの材料としてシリコン以外にプラスチックをもちいることができるので、圧力破壊に対する耐性の高い細胞捕捉プレートを安価に提供することができるという効果を奏する。
【００２２】
また、本発明によれば、細胞捕捉プレート上の捕捉孔を他の捕捉孔と所定の値以上の距離を保ってランダムに配置するように構成したので、格子状配置に比べて直線上にならぶ孔の平均的なピッチが長くなり、圧力破壊に対する耐性を向上させることができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
以下に添付図面を参照して、本発明に係る自動マイクロインジェクション装置および細胞捕捉プレートの好適な実施の形態を詳細に説明する。
【実施例】
【００２４】
まず、自動マイクロインジェクション装置による薬液導入方式について説明しておく。図１は、自動マイクロインジェクション装置による薬液導入方式について説明するための説明図である。
【００２５】
同図に示すように、自動マイクロインジェクション装置による薬液導入方式おいてもちいられるシャーレユニット１００は、吸引チャネルを有したシャーレ１１０の上に細胞捕捉プレート１２０を乗せ、リン酸緩衝食塩水等の緩衝液によって満たしたものである。
【００２６】
細胞捕捉プレート１２０は、微細な貫通孔である捕捉孔１２１〜１２７を有し、吸引チャネルを通じて下方向より負圧吸引を受けることにより、上面に投入された細胞を捕捉孔１２１〜１２７に捕捉する。なお、図１では、図示の都合上、細胞捕捉プレート１２０上に存在する捕捉孔が７つの場合を示したが、実際には、後述するように非常に多数の捕捉孔が存在する。
【００２７】
自動マイクロインジェクション装置は、倒立光学系１８によって捕捉孔をシャーレユニット１００の裏面から観測し、薬液が充填されたキャピラリ針１２を観測中の捕捉孔へ誘導する。そして、そこに捕捉されている細胞にキャピラリ針１２を突き刺し、薬液を導入する。
【００２８】
図２は、倒立光学系の観測画像の一例を示すサンプル図である。このような画像により、自動マイクロインジェクション装置は、キャピラリ針１２の先端位置および捕捉孔の３次元的な位置をサブミクロン精度で観測することができ、それらの正確な位置合わせをおこなうことができる。
【００２９】
次に、細胞捕捉プレート１２０上の捕捉孔の配置について説明する。図１７は、従来の捕捉孔の配置の一例を示すサンプル図である。同図の例では、１．６ｍｍ四方の領域内に１０８９個の捕捉孔が設けられている。そして、これらの捕捉孔は、正方格子状に配置されている。このように、捕捉孔が正方格子状に配置されるのは、キャピラリ針１２の誘導が容易なためである。
【００３０】
図３は、本実施例に係る捕捉孔の配置の一例を示すサンプル図である。同図の例では、１．６ｍｍ四方の領域内に１０４３個が設けられている。そして、これらの捕捉孔は、ランダムに配置されている。このように、捕捉孔をランダムに配置しているのは、同一領域内に従来とほぼ同数の捕捉孔を配置しながら、圧力破壊に対する耐性を向上させるためである。
【００３１】
ここで、細胞捕捉プレート１２０が受ける圧力について説明する。細胞捕捉プレート１２０が最大の圧力を受けるのは、細胞捕捉プレート１２０上に緩衝液を投入し、細胞捕捉プレート１２０の背面から負の空圧により吸引し始める前吸引動作においてである。
【００３２】
図１に示したように、薬液の導入動作をおこなうにあたっては、シャーレユニット１００の裏面より倒立光学系１８によって捕捉孔を観察する必要があるが、倒立光学系１８の対物レンズは、緩衝液中に捕捉された細胞を精度よく観測できるように特性調整されたものであるため、細胞捕捉プレート１２０の背面の空間を緩衝液で満たして初めて分解能よく観測することができる。
【００３３】
図４は、緩衝液投入時のシャーレユニットを示すサンプル図である。同図に示すように、細胞捕捉プレート１２０上に緩衝液を投入しただけでは、捕捉孔のところで空気と液体の界面ができ、強い表面張力が働いて空間ができてしまう。そこで、細胞捕捉プレート１２０の背面から負の空圧により吸引をおこない、この空間を緩衝液で満たす必要がある。この動作が前吸引動作である。
【００３４】
自動マイクロインジェクション装置にて薬液を導入する対象は、人間の体細胞である場合が多いが、一般的な体細胞の直径は、浮遊化状態で１０〜２０μｍ程度である。このサイズの細胞を吸引捕捉するのに最適な捕捉孔の直径は、細胞直径の１／３〜１／５、すなわち、２〜４μｍ程度である。
【００３５】
捕捉孔の直径が大き過ぎれば、細胞が捕捉孔に吸い込まれてしまい保持がおこなわれない。また、小さ過ぎれば、十分な捕捉力が得られず、キャピラリ針を細胞へ挿入する際に細胞が移動してしまい、インジェクションできなくなってしまう。
【００３６】
直径数μmの貫通孔を大量に形成する場合、細胞捕捉プレートにシリコン基板をもちいて、半導体加工プロセスにより加工するのが現状では最適な手法である。そして、半導体加工プロセスをもちいて貫通孔を形成する場合、貫通孔部分のプレート厚さは、アスペクトレシオの制約から、せいぜい１０μｍ程度が上限となる。
【００３７】
したがって、細胞捕捉プレート１２０の裏面は大きくえぐられ、捕捉孔配置領域は、メンブレン（薄膜）構造とならざるを得ない。このメンブレン部に前吸引動作において大きな圧力がかかると図８のようにたわみが発生し、場合によってはメンブレン部が破壊されてしまう。
【００３８】
図５は、細胞捕捉プレート１２０の捕捉孔に発生する界面における表面張力を説明するための説明図である。同図に示すように、細胞捕捉プレート１２０の上方から緩衝液を投入すると、緩衝液は、捕捉孔下端において表面張力によって留まることになる。
【００３９】
このときの上向きの力は、以下の式で求められる。
【数１】
0004659553.tif 000002
ここで、Ｙは液体の表面張力（水の場合で０．０７２Ｎ／ｍ）であり、θはプレートの表面と液体の接触角（シリコンと水の場合において３０°）である。
【００４０】
一方、吸引圧Ｐによる下向きの力は、
【数２】
0004659553.tif 000003
であるから、下向きの力が上向きの力より大きくなる条件（ＦDOWN＞ＦUP）が満足される以下の圧力Ｐのとき図６のように液滴が成長する。
【数３】
0004659553.tif 000004
【００４１】
時間経過とともに液滴の大きさは増大し、その重量が液滴ネック部の張力を超えると液滴は落下する。あるいは、吸引圧Ｐが十分大きいときには、直ちに下部界面が破れ、図７のように直径２ｃｒh（ｃ＜１）の流束となる。ｃは流量係数と呼ばれる１より小さい定数である。
【００４２】
ここで、数式３が、前吸引操作に必要となる圧力であり、内径が小さいほど大きな圧力を必要とすることが分かる。たとえば、直径３μｍの捕捉孔の場合、前吸引圧としては４８ｋＰａが必要となる。
【００４３】
この圧力が厚さ１０μｍのメンブレン部に印加されるため、たとえば、シリンコンメンブレンの場合、中央部では、数１０μｍもたわむことになり、場合によってはメンブレン部が破壊されてしまう。
【００４４】
メンブレン部の破壊耐圧は、材料の機械的な特性だけではなく、メンブレンに設けられた多数の貫通孔の存在が大いに関係する。特に、従来のように、捕捉孔が正方格子状に規則正しく等間隔に配置された細胞捕捉プレートでは、貫通孔列が等間隔に縦横に一直線上に配置されているため、メンブレンの歪みに起因する捕捉孔周辺の応力集中部は一直線上に連結され帯状となり、ここを起点として破壊しやすい状態となる。
【００４５】
特に、シリコンメンブレンの場合には、単結晶基板であるため、捕捉孔の配列が劈開しやすい結晶軸と完全に一致することになり、破壊強度の低下は著しい。
【００４６】
シリコンメンブレンの破壊強度の算定例について、以下説明する。分布荷重Ｐを受ける長方形板のたわみｗは、次式の微分方程式を満足する（参考文献：「現代材料力学」、渋谷他、朝倉書店、ｐ２１１、１９８６）。
【数４】
0004659553.tif 000005
ここで、Ｄは厚さｔの板の曲げ剛性であり、
【数５】
0004659553.tif 000006
で与えられる。Ｅはヤング率であり、νはポアソン比である。
【００４７】
細胞捕捉プレートのメンブレン部は、等分布荷重を受ける４辺固定の正方形板（１辺の長さＬ、厚さｔ）とみなすことができ、この場合について数式４を解くと、最大たわみｗmaxはメンブレン部の中心位置に、最大応力σmaxはその表裏面に、それぞれ発生し、近似的に数式６および数式７で与えられる。ここで、ν＝０．３では、μ1＝０．００１２６、μ2＝０．０５１３である。
【数６】
0004659553.tif 000007
【数７】
0004659553.tif 000008
【００４８】
実際には、捕捉孔縁において応力集中が起こるので、プレートに加わる最大応力は式７より大きなものになることは間違いないが、その計算は簡単にはできない。そこで、円孔を有する帯板の曲げにおける応力集中係数αを乗じた数式８で見積もる。
【数８】
0004659553.tif 000009
孔直径／帯幅（ピッチ）を、１２／５０＝０．２４とすると、そのときの応力集中係数αは、１．４４となる（参考文献：「機械工学便覧」、Ａ４９−９８、２００１）。
【００４９】
メンブレン部の大きさを１辺がＬ＝１．７ｍｍの正方形で、厚さが１０μｍとすると、最大応力σmaxがシリコンの破壊応力を超えるときの分布荷重、すなわち破壊圧力Pmaxは−４０ｋＰａとなり、上述の前吸引で必要とされる圧力は破壊圧力をやや超過していることになる。
【００５０】
また、この圧力でのメンブレンの最大たわみ量は、３６μｍにも達する。このたわみは捕捉孔付近で大きな応力を発生する。従来の正方格子状に規則正しく配置されたメンブレンの場合、この応力集中部分が１列にそろった状態になり、メンブレンの破壊強度を著しく低下させる
【００５１】
なお、上記の算定において、シリコン面のプレートの場合、ヤング率Ｅ＝１３０．８Ｇｐａ、ポアソン比ν＝０．２８、破壊応力σ＝５００ＭＰａとした。
【００５２】
細胞捕捉プレート上の捕捉孔の数により、１枚の細胞捕捉プレートで１度に処理できる細胞の数が決まってしまうため、少なくとも１，０００個、できれば１０，０００個の貫通孔が必要になる。１０，０００個の捕捉孔の場合には、さらに大きな面積のメンブレン部が必要となり破壊の危険性はさらに高まる。
【００５３】
本発明にかかる細胞捕捉プレート１２０では、捕捉孔が２次元直交座標系における各座標軸方向に不等間隔に配置されるため、応力集中する場所が一直線に帯状に形成されることがなくなり、破壊強度が大きく改善される。特に、細胞捕捉プレートがシリコン基板で、捕捉孔が２次元ランダムに配置された場合には、シリコンの結晶軸に沿うような捕捉孔の配列を大きく減らすことが可能となり、破壊強度の改善度合いが大きい。
【００５４】
捕捉孔をランダム配置にした場合、ある直線上にならぶ孔の平均的なピッチが、格子状配置に比べてはるかに長くなる。図１７に示す従来の配置例における捕捉孔のピッチは５０μｍである。一方、図９に示すように、ランダム配置の場合について、いくつかの座標軸にそった直線上で、捕捉孔の平均ピッチを求めてみると、９０〜１６０μｍと、１．８〜３．２倍も長くなることが分かる。
【００５５】
このため、ランダム配置では貫通孔の存在の影響がかなり小さくなる。正方格子配置の場合、前吸引動作において必要とされる吸引圧と破壊強度がほぼ同程度であったが、ランダム配置では、破壊強度を前吸引動作では心配のない程度に強化することが可能となる。
【００５６】
次に、本実施例に係る捕捉孔の配置を設定するための処理手順について説明する。図１０は、本実施例に係る捕捉孔の配置の設定処理手順の一例を示すフローチャートである。
【００５７】
同図に示すように、まず、メンブレン部のＸ軸方向の寸法Ｍｘと、同Ｙ軸方向の寸法Ｍｙと、隣接する捕捉孔間の距離の許容最小値Ｌと、制限時間とを設定する（ステップＳ１０１）。なお、捕捉孔同士が近接しすぎると、インジェクションの際、隣の細胞に誤ってキャピラリ針を引っ掛ける恐れがあるため、許容最小値Ｌは対象とする細胞の直径の２〜３倍が適当である。
【００５８】
そして、第１の乱数を発生させ、これをＭｘで除算する等してメンブレン部の寸法へ変換した値を仮の捕捉孔のｘ座標値とする（ステップＳ１０２）。同様に、第２の乱数を発生させ、これをＭｙで除算する等してメンブレン部の寸法へ変換した値を仮の捕捉孔のｙ座標値とする（ステップＳ１０３）。
【００５９】
続いて、既存の捕捉孔と仮の捕捉孔との距離をすべて求め、その最小値をｄｍｉｎとする（ステップＳ１０４）。ここで、ｄｍｉｎが許容最小値Ｌよりも大きければ（ステップＳ１０５肯定）、仮の捕捉孔を正式な捕捉孔として追加し（ステップＳ１０６）、ステップＳ１０２に復帰して次の仮の捕捉孔の座標を求める。
【００６０】
ｄｍｉｎが許容最小値Ｌよりも小さければ（ステップＳ１０５否定）、処理開始からの経過時間が制限時間を超過しているかどうかを調べる。そして、超過していなければ（ステップＳ１０７否定）、ステップＳ１０２に復帰して次の仮の捕捉孔の座標を求め、超過していれば（ステップＳ１０７肯定）、処理を終了する。
【００６１】
こうして取得された捕捉孔の配置は、細胞捕捉プレート１２０の製作時および自動インジェクション動作時に利用される。
【００６２】
なお、上記の処理手順では、十分な数の捕捉孔が確保されない場合があるため、何度か処理を繰り返して最適な配置結果を選択するのが好ましい。また、他の処理手順で捕捉孔の配置を設定するものとしてもよい。
【００６３】
次に、本実施例に係る自動マイクロインジェクション装置の構成について説明する。図１１は、本実施例に係る自動マイクロインジェクション装置の構成を示す構成図である。
【００６４】
同図に示すように、本実施例に係る自動マイクロインジェクション装置は、ＸＹステージ１０と、ＸＹステージ制御ユニット１１と、キャピラリ針１２と、マニピュレータ１３と、吐出機構１４と、コンピュータ１５と、捕捉孔座標記憶装置１６と、照明１７と、倒立光学系１８と、カメラ１９と、空圧制御ユニット２０とを有する。
【００６５】
ＸＹステージ１０は、シャーレユニット１００を搭載する台座であり、ＸＹステージ制御ユニット１１の制御によりＸ軸方向およびＹ軸方向に移動することができる。ＸＹステージ制御ユニット１１は、コンピュータ１５の指示に従ってＸＹステージ１０の動きを制御する制御ユニットである。
【００６６】
キャピラリ針１２は、薬液を導入するための微細な中空のガラス管であり、マニピュレータ１３によって保持される。マニピュレータ１３は、キャピラリ針１２を保持し、繰り出し／繰り戻し動作を制御する装置である。吐出機構１４は、キャピラリ針１２に充填された薬液を先端から吐出させるための機構である。
【００６７】
コンピュータ１５は、自動マイクロインジェクション装置を全体制御する制御装置であり、各種の自動処理を実行する。たとえば、インジェクション処理においては、シャーレユニット１００上の細胞捕捉プレート１２０の各捕捉孔の座標情報を捕捉孔座標記憶装置１６から取得し、この情報に基づいてＸＹステージ１０を移動させる。そして、倒立光学系１８によって撮影される画像を観測して捕捉孔の正確な位置決めをおこない、キャピラリ針１２に薬液を導入させるという処理を順次自動で実行する。
【００６８】
捕捉孔座標記憶装置１６は、細胞捕捉プレート１２０の各捕捉孔の座標情報を記憶する装置である。従来の正方格子状の捕捉孔配置では、捕捉孔のピッチと行・列内の捕捉孔数さえ記憶しておけば、簡単な演算で、それぞれの捕捉孔の位置を導出することが可能であったが、本実施例に係る自動マイクロインジェクション装置では、捕捉孔がランダム配置されるため、各捕捉孔の座標情報を記憶することが必要になる。
【００６９】
なお、捕捉孔座標記憶装置１６は、全ての種類の細胞捕捉プレートの捕捉孔の座標情報を予め記憶していてもよいし、自動マイクロインジェクション処理の開始時にメモリカード等の記録媒体に記録された座標情報を読み出して保持してもよい。また、ネットワークを通じて座標情報をダウンロードして保持してもよい。
【００７０】
照明１７は、倒立光学系１８が撮影する画像を鮮明にするために、シャーレユニット１００の上方から捕捉孔周辺に光線を照射する照明である。倒立光学系１８は、シャーレユニット１００の下方から捕捉孔周辺の画像を撮影するための光学ユニットである。カメラ１９は、倒立光学系１８が撮影した画像をコンピュータ１５が認識できるように電子データ化する装置である。
【００７１】
空圧制御ユニット２０は、前吸引動作時および細胞捕捉動作時に必要な負圧の発生を制御する制御部である。
【００７２】
本実施例に係る自動マイクロインジェクション装置のＸＹステージ１０周辺の斜視図を図１２に示す。同図に示すように、インジェクション対象の細胞はシャーレユニット１００の上方から細胞懸濁液として投入され、細胞捕捉動作によって捕捉孔に捕捉される。
【００７３】
次に、本実施例に係る自動マイクロインジェクション装置の処理手順について説明する。図１３は、本実施例に係る自動マイクロインジェクション装置の処理手順を説明するための説明図である。
【００７４】
まず、細胞捕捉プレート１２０およびキャピラリ針１２の位置調整、緩衝液の投入、前吸引動作等を含むセットアップをおこなう。続いて、細胞懸濁液をスポイト等で滴下し、細胞捕捉プレート背面から適度な負圧（−数１００Ｐａ）を印加し、懸濁液中に浮遊する細胞を捕捉孔に捕捉し、動かないように保持する。そして、捕捉されずに残された不要な細胞を緩衝液により洗い流して除去した後に、捕捉された細胞に自動インジェクションを順次おこなう。
【００７５】
図１４は、本実施例に係る自動マイクロインジェクション装置のインジェクション順の一例を示すサンプル図である。同図に示すように、捕捉孔の位置をＸ軸方向に帯状の領域に区分した各領域ごとに各捕捉孔の座標データをソートしておくことでＸＹステージ１０の移動を最小限に抑えることができる。
【００７６】
捕捉された細胞すべてへのインジェクション操作が完了した後は、シャーレユニット１００ごと、培養や観測などの次の処理工程に回される。
【００７７】
上述してきたように、本実施例では、細胞捕捉プレート上の捕捉孔をランダムに配置するように構成したので、格子状配置に比べて直線上にならぶ孔の平均的なピッチが長くなり、圧力破壊に対する耐性を向上させることができる。
【００７８】
これにより、前吸引動作が容易になり、細胞捕捉の信頼性向上につながるとともに、より大きなメンブレン領域が使用できるようになるため、捕捉孔数を増大させることができ、より多くの細胞を一度に処理可能となる。特に、細胞捕捉プレートがシリコン基板である場合には、劈開しやすい結晶軸にならぶ捕捉孔間の平均間隔は大きくなることから、破壊強度向上効果は大きい。
【００７９】
また、ランダムな捕捉孔配置は、細胞が自然界に存在するときと類似の配置であることから、細胞の生存に好ましい影響を与えるという効果も期待できる。
【００８０】
なお、本実施例では、細胞捕捉プレートの破壊強度を向上させるために捕捉孔をランダムに配置した例について説明したが、捕捉孔を扇状もしくは同心円状に配置しても同様の効果を得ることができる。
【００８１】
図１５は、扇状に配置した捕捉孔の配置の一例を示すサンプル図である。同図は、細胞捕捉プレート上に細胞投入場所を要として捕捉孔を扇状にならべた配置を示している。捕捉孔は、この配置でも、直交する直線状に等間隔に並ぶことを避けることができ、細胞捕捉プレートの破壊強度向上に一定の効果がある。また、本実施例では、細胞投入後に自然に拡散していく流れにそって捕捉孔が配置されることから、細胞の捕捉率（実際の捕捉された細胞数／捕捉孔数）向上にも効果がある。
【００８２】
図１６は、同心円状に配置した捕捉孔の配置の一例を示すサンプル図である。このように同心円状、もしくは、らせん状に捕捉孔を配置した場合も、直交する２次元座標軸に関してみると、捕捉孔が等間隔には並ばないことから、細胞捕捉プレートの破壊強度向上に効果がある。また、細胞の投入を細胞捕捉プレートの中央からおこなった場合における細胞の自然な流れに沿った配置となっていることから、細胞の捕捉率向上にも効果がある。
【００８３】
また、本実施例では、細胞捕捉プレートの材料としてシリコンをもちいる場合を例にして説明したが、プラスチックをもちいた場合にも捕捉孔を同様に配置することで破壊強度を向上させることができる。プラスチックを材料として捕捉孔を２次元直交座標系の２つの座標軸方向に不等間隔に配置した場合、安価で圧力破壊への耐性が高い細胞捕捉プレートを得ることができる。
【００８４】
（付記１）細胞捕捉プレートに設けられた捕捉孔を通して負圧吸引することで細胞を捕捉し、捕捉した細胞にキャピラリ針を突き刺して薬液を注入する自動マイクロインジェクション装置であって、
前記細胞捕捉プレートは、捕捉孔が２次元直交座標系の２つの座標軸方向に不等間隔に配置されていることを特長とする自動マイクロインジェクション装置。
【００８５】
（付記２）前記細胞捕捉プレートに設けられた捕捉孔の配置を記憶する記憶手段と、
前記記憶手段が記憶する配置情報に基づいて、前記キャピラリ針を薬液注入対象の細胞を捕捉した捕捉孔へ誘導する制御手段をさらに備えたことを特徴とする付記１に記載の自動マイクロインジェクション装置。
【００８６】
（付記３）前記細胞捕捉プレートは、シリコンもしくはプラスチックを材料とすることを特徴とする付記１または２に記載の自動マイクロインジェクション装置。
【００８７】
（付記４）前記細胞捕捉プレートは、捕捉孔が、他の捕捉孔と所定の値以上の距離を保ってランダムに配置されていることを特徴とする付記１〜３のいずれか一つに記載の自動マイクロインジェクション装置。
【００８８】
（付記５）前記細胞捕捉プレートは、捕捉孔が、扇状に配置されていることを特徴とする付記１〜３のいずれか一つに記載の自動マイクロインジェクション装置。
【００８９】
（付記６）前記細胞捕捉プレートは、捕捉孔が、同心円状に配置されていることを特徴とする付記１〜３のいずれか一つに記載の自動マイクロインジェクション装置。
【００９０】
（付記７）前記細胞捕捉プレートは、捕捉孔が、らせん状に配置されていることを特徴とする付記１〜３のいずれか一つに記載の自動マイクロインジェクション装置。
【００９１】
（付記８）細胞にキャピラリ針を突き刺して薬液を注入する自動マイクロインジェクション装置において細胞を捕捉保持するためにもちいられる細胞捕捉プレートであって、
細胞を捕捉保持するための貫通孔である捕捉孔が２次元直交座標系の２つの座標軸方向に不等間隔に配置されていることを特長とする細胞捕捉プレート。
【００９２】
（付記９）前記細胞捕捉プレートは、シリコンもしくはプラスチックを材料とすることを特徴とする付記８に記載の細胞捕捉プレート。
【００９３】
（付記１０）前記細胞捕捉プレートは、捕捉孔が、他の捕捉孔と所定の値以上の距離を保ってランダムに配置されていることを特徴とする付記８または９に記載の細胞捕捉プレート。
【００９４】
（付記１１）前記細胞捕捉プレートは、捕捉孔が、扇状に配置されていることを特徴とする付記８または９に記載の細胞捕捉プレート。
【００９５】
（付記１２）前記細胞捕捉プレートは、捕捉孔が、同心円状に配置されていることを特徴とする付記８または９に記載の細胞捕捉プレート。
【００９６】
（付記１３）前記細胞捕捉プレートは、捕捉孔が、らせん状に配置されていることを特徴とする付記８または９に記載の細胞捕捉プレート。
【産業上の利用可能性】
【００９７】
以上のように、本発明に係る自動マイクロインジェクション装置および細胞捕捉プレートは、細胞への薬液の導入に有用であり、特に、圧力破壊に対する耐性を向上させた細胞捕捉プレートが必要な場合に適している。
【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１】自動マイクロインジェクション装置による薬液導入方式について説明するための説明図である。
【図２】倒立光学系の観測画像の一例を示すサンプル図である
【図３】本実施例に係る捕捉孔の配置の一例を示すサンプル図である。
【図４】緩衝液投入時のシャーレユニットを示すサンプル図である。
【図５】細胞捕捉プレートの捕捉孔に発生する界面における表面張力を説明するための説明図である。
【図６】細胞捕捉プレートの捕捉孔に発生する液滴の一例を示すサンプル図である。
【図７】細胞捕捉プレートの捕捉孔に発生する流束の一例を示すサンプル図である。
【図８】負圧吸引によるメンブレン部のたわみの一例を示すサンプル図である。
【図９】本実施例に係る捕捉孔の配置における捕捉孔の平均ピッチの一例を示すサンプル図である。
【図１０】本実施例に係る捕捉孔の配置の設定処理手順の一例を示すフローチャートである。
【図１１】本実施例に係る自動マイクロインジェクション装置の構成を示す構成図である。
【図１２】本実施例に係る自動マイクロインジェクション装置の斜視図である。
【図１３】本実施例に係る自動マイクロインジェクション装置の処理手順を説明するための説明図である。
【図１４】本実施例に係る自動マイクロインジェクション装置のインジェクション順の一例を示すサンプル図である。
【図１５】扇状に配置した捕捉孔の配置の一例を示すサンプル図である。
【図１６】同心円状に配置した捕捉孔の配置の一例を示すサンプル図である。
【図１７】従来の捕捉孔の配置の一例を示すサンプル図である。
【符号の説明】
【００９９】
１０  ＸＹステージ
１１  ＸＹステージ制御ユニット
１２  キャピラリ針
１３  マニピュレータ
１４  吐出機構
１５  コンピュータ
１６  捕捉孔座標記憶装置
１７  照明
１８  倒立光学系
１９  カメラ
２０  空圧制御ユニット
１００  シャーレユニット
１１０  シャーレ
１２０  細胞捕捉プレート
１２１〜１２７  捕捉孔
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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