(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
経皮薬剤又は経皮候補薬剤を溶解した溶液を、皮膚切片で皮下組織側と表皮側とに区画されたチャンバー内のいずれか一方に注入し、他方に所定の溶液を注入して、前記皮膚切片の生存条件下、所定時間後に前記経皮薬剤又は経皮候補薬剤の皮膚トランスポーターを介しての皮膚透過性の程度を測定・評価することを特徴とする経皮薬剤又は経皮候補薬剤の皮膚透過性の検定方法。
【請求項２】
皮下組織側の溶液を体温に、表皮側の溶液を室温に維持し、所定時間後に経皮薬剤又は経皮候補薬剤の皮膚トランスポーターを介しての皮膚透過性の程度を測定・評価することを特徴とする請求項１記載の経皮薬剤又は経皮候補薬剤の皮膚透過性の検定方法。
【請求項３】
皮膚透過性の程度の測定・評価が、皮膚透過の飽和性、阻害効果、方向指向性及びエネルギー依存性の１又は２以上の測定・評価であることを特徴とする請求項１又は２記載の経皮薬剤又は経皮候補薬剤の皮膚透過性の検定方法。
【請求項４】
経皮薬剤又は経皮候補薬剤として、放射性同位体又は蛍光物質で標識した経皮薬剤又は経皮候補薬剤を用いることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の経皮薬剤又は経皮候補薬剤の皮膚透過性の検定方法。
【請求項５】
経皮薬剤又は経皮候補薬剤を溶解した溶液として、皮下組織側が経皮薬剤又は経皮候補薬剤を溶解したエネルギー源を含有する溶液を、表皮側が経皮薬剤又は経皮候補薬剤を溶解した多価アルコール含有溶液を、それぞれ用いることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の経皮薬剤又は経皮候補薬剤の皮膚透過性の検定方法。
【請求項６】
多価アルコールが、プロピレングリコールであることを特徴とする請求項５記載の経皮薬剤又は経皮候補薬剤の皮膚透過性の検定方法。
【請求項７】
経皮薬剤又は経皮候補薬剤を溶解した溶液が、皮下組織側及び表皮側ともに経皮薬剤又は経皮候補薬剤を溶解したエネルギー源を含有する溶液であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の経皮薬剤又は経皮候補薬剤の皮膚透過性の検定方法。
【請求項８】
エネルギー源を含有する溶液が、ハンクス液であることを特徴とする請求項５〜７のいずれか記載の経皮薬剤又は経皮候補薬剤の皮膚透過性の検定方法。
【請求項９】
非標識の経皮薬剤又は経皮候補薬剤を皮下組織側と表皮側とに共に用いて、放射性同位体又は蛍光物質で標識した経皮薬剤又は経皮候補薬剤の飽和性経皮浸透を調べることを特徴とする請求項１〜８のいずれか記載の経皮薬剤又は経皮候補薬剤の皮膚透過性の検定方法。
【請求項１０】
表皮側の溶液のｐＨを変化させることを特徴とする請求項１〜８のいずれか記載の経皮薬剤又は経皮候補薬剤の皮膚透過性の検定方法。
【請求項１１】
ＮａＮ３及びＮａＦを皮下組織側と表皮側とに共に用いて、経皮薬剤又は経皮候補薬剤の浸透が、エネルギー依存性であるかどうかを調べることを特徴とする請求項１〜８のいずれか記載の経皮薬剤又は経皮候補薬剤の皮膚透過性の検定方法。
【請求項１２】
経皮薬剤又は経皮候補薬剤を溶解した溶液、及び、経皮薬剤又は経皮候補薬剤と被検物質とを溶解した溶液を、皮膚切片で皮下組織側と表皮側とに区画されたチャンバー内の皮下組織側に注入し、他方に所定の溶液を注入して、前記皮膚切片の生存条件下、所定時間後に前記経皮薬剤又は経皮候補薬剤の皮膚トランスポーターを介しての皮膚透過性の程度をそれぞれ測定し、皮膚透過性の程度を比較評価することを特徴とする経皮薬剤又は経皮候補薬剤の皮膚透過性促進又は抑制物質のスクリーニング方法。
【請求項１３】
皮下組織側の溶液を体温に、表皮側の溶液を室温に維持し、所定時間後に前記経皮薬剤又は経皮候補薬剤の皮膚トランスポーターを介しての皮膚透過性の程度をそれぞれ測定することを特徴とする請求項１２記載の経皮薬剤又は経皮候補薬剤の皮膚透過性促進又は抑制物質のスクリーニング方法。
【請求項１４】
皮膚透過性の程度の測定・評価が、皮膚透過の飽和性、阻害効果、方向指向性及びエネルギー依存性の１又は２以上の測定・評価であることを特徴とする請求項１２又は１３記載の経皮薬剤又は経皮候補薬剤の皮膚透過性促進又は抑制物質のスクリーニング方法。
【請求項１５】
経皮薬剤又は経皮候補薬剤として、放射性同位体又は蛍光物質で標識した経皮薬剤又は経皮候補薬剤を用いることを特徴とする請求項１２〜１４のいずれか記載の経皮薬剤又は経皮候補薬剤の皮膚透過性促進又は抑制物質のスクリーニング方法。
【請求項１６】
経皮薬剤又は経皮候補薬剤を溶解した溶液として、皮下組織側が経皮薬剤又は経皮候補薬剤を溶解したエネルギー源を含有する溶液を、表皮側が経皮薬剤又は経皮候補薬剤を溶解した多価アルコール含有溶液を、それぞれ用いることを特徴とする請求項１２〜１５のいずれか記載の経皮薬剤又は経皮候補薬剤の皮膚透過性促進又は抑制物質のスクリーニング方法。
【請求項１７】
多価アルコールが、プロピレングリコールであることを特徴とする請求項１６記載の経皮薬剤又は経皮候補薬剤の皮膚透過性の検定方法。
【請求項１８】
経皮薬剤又は経皮候補薬剤を溶解した溶液が、皮下組織側及び表皮側ともに経皮薬剤又は経皮候補薬剤を溶解したエネルギー源を含有する溶液であることを特徴とする請求項１２〜１５のいずれか記載の経皮薬剤又は経皮候補薬剤の皮膚透過性促進又は抑制物質のスクリーニング方法。
【請求項１９】
エネルギー源を含有する溶液が、ハンクス液であることを特徴とする請求項１６〜１８のいずれか記載の経皮薬剤又は経皮候補薬剤の皮膚透過性促進又は抑制物質のスクリーニング方法。
【請求項２０】
非標識の経皮薬剤又は経皮候補薬剤を皮下組織側と表皮側とに共に用いて、放射性同位体又は蛍光物質で標識した経皮薬剤又は経皮候補薬剤の飽和性経皮浸透を測定・評価することを特徴とする請求項１２〜１９のいずれか記載の経皮薬剤又は経皮候補薬剤の皮膚透過性促進又は抑制物質のスクリーニング方法。
【請求項２１】
表皮側の溶液のｐＨを変化させることを特徴とする請求項１２〜１９のいずれか記載の経皮薬剤又は経皮候補薬剤の皮膚透過性促進又は抑制物質のスクリーニング方法。
【請求項２２】
ＮａＮ３及びＮａＦを皮下組織側と表皮側とに共に用いて、経皮薬剤又は経皮候補薬剤の浸透が、エネルギー依存性であるかどうかを測定・評価することを特徴とする請求項１２〜１９のいずれか記載の経皮薬剤又は経皮候補薬剤の皮膚透過性促進又は抑制物質のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、経皮薬剤又は経皮候補薬剤の皮膚透過性の検定方法、詳しくは皮膚切片で皮下組織側と表皮側とに区画されたチャンバーを用いて、経皮薬剤又は経皮候補薬剤の皮膚トランスポーター（皮膚組織に備わるトランスポーター）を介しての皮膚透過性の程度を測定・評価する経皮薬剤又は経皮候補薬剤の皮膚透過性の検定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
経皮ドラッグデリバリーは、効力ある低分子量の治療薬の投与経路としてしばしば用いられ、錠剤や注射などの従来からの投与形態と比べて、初回通過代謝の回避、痛みの減少、薬の徐放性の可能性などを含む、優れた効果を発揮している。例えば、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）の経皮ルートでの投与は、胃腸の炎症や潰瘍化などの経口ルートの欠点を避けるために導入された（例えば、J. Pharm. Sci. 86:503-508, 1997参照）。しかし、経皮デリバリーは、皮膚の浸透率が低いために、適用が制限されている。【０００３】
皮膚は、物理的及び生化学的、両面におけるバリアーである。皮膚の最外側層である角質層（ＳＣ）が、物理的構造により、さまざまな物質が浸透するときの、最大のバリアーであるとされている。さらに、皮膚内の異物代謝酵素が、２番目の生化学的なバリアーとなっている。例えば、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）Ｐ１−１の発現及び活性が、ヒトの表皮細胞において検出されている（例えば、J. Dermatol. Sci. 30: 205-214, 2002参照）。異物代謝酵素の発現が、ヒト正常ケラチノサイトでも検出され、恒常的な活性が観察されている（例えば、J. Invest. Dermatol. 102:970-975, 1994、J. Biol. Chem. 273:32071-32079, 1998、J. Invest. Dermatol. 112: 337-342, 1994参照）。【０００４】
近年、皮膚におけるいくつかのトランスポーターの発現が報告された。神経細胞グルタミン酸トランスポーターＥＡＡＣ１及びグリアグルタミン酸トランスポーター（ＧＬＴ−１）がケラチノサイトで検出され（例えば、J. Invest. Dermatol. 112: 337-342, 1994参照）、ナトリウム依存性マルチビタミントランスポーター（ＳＭＶＴ）が皮膚において発現することが見い出されている（例えば、J. Invest. Dermatol. 120: 428-433, 2003参照）。グルタミン酸及びビオチンは、正常な細胞機能に必須であるので、かかるトランスポーターの存在が、皮膚内の基質に対する役割を支持することを明らかにした。他方、異物トランスポーター（xenobiotics transporter）の発現も、近年報告された。これらは、数多くの有機イオン薬剤を輸送し、ヒトの正常なケラチノサイト内に存在する、多剤耐性関連タンパク質（ＭＲＰ）（例えば、J. Invest. Dermatol. 116: 541-548, 2001参照）及び有機アニオン輸送ポリペプチド（ＯＡＴＰ）ファミリーメンバー（例えば、J. Invest. Dermatol. 120: 285-291, 2003参照）を含む。かかるトランスポーターの皮膚内での発現は、薬剤が経皮浸透するときの、能動的なバリアーとなるかもしれない。しかし、現在のところ、薬剤の経皮浸透においてトランスポーターの関与は明らかになっていない。【０００５】
他方、ＮＳＡＩＤであるインドメタシンは、経皮投与され、経皮デリバリーにおける新規エンハンサーを調べるための疎水性のモデル化合物として用いられている（例えば、J. Pharm. Sci. 84:482-488, 1995、J. Control Release 90: 335-343, 2003、J. Control Release 88: 243-252, 2003参照）。実際に、その効率的な経皮浸透を促進するために、いくつかのアプローチが行われている（J. Control Release 75: 155-166, 2001、Biol. Pharm. Bull. 25: 779-782, 2002）。また、マンニトールも、傍細胞マーカーとして用いられていた。【０００６】
本発明の課題は、治療薬の経皮浸透に担体輸送（carrier-mediated transport）が関与することを明らかにした上で、経皮薬剤又は経皮候補薬剤の皮膚トランスポーターを介しての皮膚透過性の程度を測定・評価する経皮薬剤又は経皮候補薬剤の皮膚透過性の検定方法を提供することにある。【０００７】
本発明者らは、経皮輸送のメカニズムの特徴を調べるために、経皮輸送されているＮＳＡＩＤであるインドメタシンを、疎水性のモデル薬剤として用いた。［１４Ｃ］インドメタシン及び［３Ｈ］マンニトールの経皮浸透性を、吸収及び分泌の両方向から測定したところ、［１４Ｃ］インドメタシンの経皮輸送は、傍細胞マーカーである［３Ｈ］マンニトールより、かなり高いことを見い出し、［１４Ｃ］インドメタシンの経皮輸送が、傍細胞輸送ではなく、経細胞輸送であることを見い出した。また、［１４Ｃ］インドメタシン及び［３Ｈ］マンニトールの浸透性に対する非標識のインドメタシンの効果を比較し、［１４Ｃ］インドメタシンの経皮浸透が飽和性であるかどうか調べた。非標識インドメタシン（５００μＭ）を添加すると、［１４Ｃ］インドメタシンの分泌方向の浸透性が増加するが、［３Ｈ］マンニトールの浸透性には影響しないことが明らかになり、非標識インドメタシンの効果が、［１４Ｃ］インドメタシンに特異的であること、［１４Ｃ］インドメタシンの経皮浸透性には、飽和性過程の関与することを見い出した。さらに、［１４Ｃ］インドメタシンの飽和性の浸透が、エネルギー依存性であるかどうかを調べるために、ＮａＮ３及びＮａＦによる効果を観察した。その結果、［１４Ｃ］インドメタシンの浸透は、ＮａＮ３及びＮａＦによっても増加し、吸収方向の浸透段階がＡＴＰ依存性であることを見い出した。［１４Ｃ］インドメタシンの、一方向性、ＡＴＰ依存性及び飽和性の浸透に関するこれらの結果は、インドメタシンの経皮浸透に、トランスポーター（１又は複数の）が関与している可能性を示した。本発明者らは、また、ヘアレスマウス皮膚と正常ヒト皮膚とにおける、さまざまな異物トランスポーターの発現を比較した。本発明は以上の知見に基づき完成するに至ったものである。
【発明の開示】
【０００８】
すなわち本発明は、（１）経皮薬剤又は経皮候補薬剤を溶解した溶液を、皮膚切片で皮下組織側と表皮側とに区画されたチャンバー内のいずれか一方に注入し、他方に所定の溶液を注入して、前記皮膚切片の生存条件下、所定時間後に前記経皮薬剤又は経皮候補薬剤の皮膚トランスポーターを介しての皮膚透過性の程度を測定・評価することを特徴とする経皮薬剤又は経皮候補薬剤の皮膚透過性の検定方法や、（２）皮下組織側の溶液を体温に、表皮側の溶液を室温に維持し、所定時間後に経皮薬剤又は経皮候補薬剤の皮膚トランスポーターを介しての皮膚透過性の程度を測定・評価することを特徴とする上記（１）記載の経皮薬剤又は経皮候補薬剤の皮膚透過性の検定方法に関する。
【０００９】
また本発明は、（３）皮膚透過性の程度の測定・評価が、皮膚透過の飽和性、阻害効果、方向指向性及びエネルギー依存性の１又は２以上の測定・評価であることを特徴とする上記（１）又は（２）記載の経皮薬剤又は経皮候補薬剤の皮膚透過性の検定方法や、（４）経皮薬剤又は経皮候補薬剤として、放射性同位体又は蛍光物質で標識した経皮薬剤又は経皮候補薬剤を用いることを特徴とする上記（１）〜（３）のいずれか記載の経皮薬剤又は経皮候補薬剤の皮膚透過性の検定方法や、（５）経皮薬剤又は経皮候補薬剤を溶解した溶液として、皮下組織側が経皮薬剤又は経皮候補薬剤を溶解したエネルギー源を含有する溶液を、表皮側が経皮薬剤又は経皮候補薬剤を溶解した多価アルコール含有溶液を、それぞれ用いることを特徴とする上記（１）〜（４）のいずれか記載の経皮薬剤又は経皮候補薬剤の皮膚透過性の検定方法や、（６）多価アルコールが、プロピレングリコールであることを特徴とする上記（５）記載の経皮薬剤又は経皮候補薬剤の皮膚透過性の検定方法や、（７）経皮薬剤又は経皮候補薬剤を溶解した溶液が、皮下組織側及び表皮側ともに経皮薬剤又は経皮候補薬剤を溶解したエネルギー源を含有する溶液であることを特徴とする上記（１）〜（４）のいずれか記載の経皮薬剤又は経皮候補薬剤の皮膚透過性の検定方法や、（８）エネルギー源を含有する溶液が、ハンクス液であることを特徴とする上記（５）〜（７）のいずれか記載の経皮薬剤又は経皮候補薬剤の皮膚透過性の検定方法や、（９）非標識の経皮薬剤又は経皮候補薬剤を皮下組織側と表皮側とに共に用いて、放射性同位体又は蛍光物質で標識した経皮薬剤又は経皮候補薬剤の飽和性経皮浸透を調べることを特徴とする上記（１）〜（８）のいずれか記載の経皮薬剤又は経皮候補薬剤の皮膚透過性の検定方法や、（１０）表皮側の溶液のｐＨを変化させることを特徴とする上記（１）〜（８）のいずれか記載の経皮薬剤又は経皮候補薬剤の皮膚透過性の検定方法や、（１１）ＮａＮ３及びＮａＦを皮下組織側と表皮側とに共に用いて、経皮薬剤又は経皮候補薬剤の浸透が、エネルギー依存性であるかどうかを調べることを特徴とする上記（１）〜（８）のいずれか記載の経皮薬剤又は経皮候補薬剤の皮膚透過性の検定方法に関する。
【００１０】
さらに本発明は、（１２）経皮薬剤又は経皮候補薬剤を溶解した溶液、及び、経皮薬剤又は経皮候補薬剤と被検物質とを溶解した溶液を、皮膚切片で皮下組織側と表皮側とに区画されたチャンバー内の皮下組織側に注入し、他方に所定の溶液を注入して、前記皮膚切片の生存条件下、所定時間後に前記経皮薬剤又は経皮候補薬剤の皮膚トランスポーターを介しての皮膚透過性の程度をそれぞれ測定し、皮膚透過性の程度を比較評価することを特徴とする経皮薬剤又は経皮候補薬剤の皮膚透過性促進又は抑制物質のスクリーニング方法や、（１３）皮下組織側の溶液を体温に、表皮側の溶液を室温に維持し、所定時間後に前記経皮薬剤又は経皮候補薬剤の皮膚トランスポーターを介しての皮膚透過性の程度をそれぞれ測定することを特徴とする上記（１２）記載の経皮薬剤又は経皮候補薬剤の皮膚透過性促進又は抑制物質のスクリーニング方法に関する。
【００１１】
本発明はまた、（１４）皮膚透過性の程度の測定・評価が、皮膚透過の飽和性、阻害効果、方向指向性及びエネルギー依存性の１又は２以上の測定・評価であることを特徴とする上記（１２）又は（１３）記載の経皮薬剤又は経皮候補薬剤の皮膚透過性促進又は抑制物質のスクリーニング方法や、（１５）経皮薬剤又は経皮候補薬剤として、放射性同位体又は蛍光物質で標識した経皮薬剤又は経皮候補薬剤を用いることを特徴とする上記（１２）〜（１４）のいずれか記載の経皮薬剤又は経皮候補薬剤の皮膚透過性促進又は抑制物質のスクリーニング方法や、（１６）経皮薬剤又は経皮候補薬剤を溶解した溶液として、皮下組織側が経皮薬剤又は経皮候補薬剤を溶解したエネルギー源を含有する溶液を、表皮側が経皮薬剤又は経皮候補薬剤を溶解した多価アルコール含有溶液を、それぞれ用いることを特徴とする上記（１２）〜（１５）のいずれか記載の経皮薬剤又は経皮候補薬剤の皮膚透過性促進又は抑制物質のスクリーニング方法や、（１７）多価アルコールが、プロピレングリコールであることを特徴とする上記（１６）記載の経皮薬剤又は経皮候補薬剤の皮膚透過性の検定方法や、（１８）経皮薬剤又は経皮候補薬剤を溶解した溶液が、皮下組織側及び表皮側ともに経皮薬剤又は経皮候補薬剤を溶解したエネルギー源を含有する溶液であることを特徴とする上記（１２）〜（１５）のいずれか記載の経皮薬剤又は経皮候補薬剤の皮膚透過性促進又は抑制物質のスクリーニング方法や、（１９）エネルギー源を含有する溶液が、ハンクス液であることを特徴とする上記（１６）〜（１８）のいずれか記載の経皮薬剤又は経皮候補薬剤の皮膚透過性促進又は抑制物質のスクリーニング方法や、（２０）非標識の経皮薬剤又は経皮候補薬剤を皮下組織側と表皮側とに共に用いて、放射性同位体又は蛍光物質で標識した経皮薬剤又は経皮候補薬剤の飽和性経皮浸透を測定・評価することを特徴とする上記（１２）〜（１９）のいずれか記載の経皮薬剤又は経皮候補薬剤の皮膚透過性促進又は抑制物質のスクリーニング方法や、（２１）表皮側の溶液のｐＨを変化させることを特徴とする上記（１２）〜（１９）のいずれか記載の経皮薬剤又は経皮候補薬剤の皮膚透過性促進又は抑制物質のスクリーニング方法や、（２２）ＮａＮ３及びＮａＦを皮下組織側と表皮側とに共に用いて、経皮薬剤又は経皮候補薬剤の浸透が、エネルギー依存性であるかどうかを測定・評価することを特徴とする上記（１２）〜（１９）のいずれか記載の経皮薬剤又は経皮候補薬剤の皮膚透過性促進又は抑制物質のスクリーニング方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】第１図は、ヘアレスマウス皮膚を用いたUssing-type Chamber法によるインドメタシンの経皮透過実験の概要を示す図である。
【図２】第２図は、ヘアレスマウス皮膚における［１４Ｃ］インドメタシン（Ａ）及び［３Ｈ］マンニトール（Ｂ）の経皮浸透の結果を示す図である。
【図３】第３図は、［１４Ｃ］インドメタシン（Ａ）及び［３Ｈ］マンニトール（Ｂ）の経皮浸透に対する非標識インドメタシンの影響を示す図である。
【図４】第４図は、［１４Ｃ］インドメタシン（Ａ）及び［３Ｈ］マンニトール（Ｂ）の分泌方向の経皮浸透に対する、ＮａＮ３及びＮａＦの影響を示す図である。
【図５】第５図は、［１４Ｃ］インドメタシン（白）及び［３Ｈ］マンニトール（黒）に対する、ｐＨ値の影響を示す図である。
【図６】第６図は、［１４Ｃ］インドメタシンの、吸収方向の非直線的な経皮浸透性を示す図である。
【図７】第７図はヘアレスマウス皮膚におけるＦｌｕｏ−３の経皮浸透の結果を示す図である。
【図８】第８図は、ヘアレスマウス皮膚及び正常ヒト皮膚内のトランスポーターのｍＲＮＡ発現結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明の経皮薬剤又は経皮候補薬剤の皮膚透過性の検定方法としては、経皮薬剤又は経皮候補薬剤を溶解した溶液を、皮膚切片で皮下組織側と表皮側とに区画されたチャンバー内のいずれか一方に注入し、他方に所定の溶液を注入して、前記皮膚切片の生存条件下、所定時間後に前記経皮薬剤又は経皮候補薬剤の皮膚トランスポーターを介しての皮膚透過性の程度を測定・評価する方法であれば、特に制限されるものではなく、また、皮下組織側や表皮側の溶液の温度（液温）についても特に制限されず、例えば、皮下組織側の溶液を体温に、表皮側の溶液を室温に維持したり、あるいは皮下組織側及び表皮側の溶液の温度を共に体温に維持して、所定時間後に経皮薬剤又は経皮候補薬剤の皮膚トランスポーターを介しての皮膚透過性の程度を測定することができるが、皮下組織側の溶液を体温に、表皮側の溶液を室温に維持することが好ましい。さらに、上記の皮膚透過性の程度の測定・評価としては、皮膚透過の飽和性、阻害効果、方向指向性及びエネルギー依存性の１又は２以上の測定・評価を好適に挙げることができるが、他の高感度検出器を用いて低濃度で経皮薬剤又は経皮候補薬剤を測定・評価する方法も本発明に含まれる。【００１４】
上記経皮薬剤又は経皮候補薬剤としては、既存の経皮薬剤に限らず経口剤として用いられるものや、今後経皮薬剤として開発される候補物質を挙げることができ、これら経皮薬剤又は経皮候補薬剤は、化学物質であっても、動植物や微生物の抽出物等の組成物であってもよい。例えば、中枢作用薬（鎮静薬・抗癲癇薬・脳代謝改善薬、抗不安薬、など）、鎮痛、鎮痒、収斂、抗炎症薬（NSAID、ステロイドなど）、オータコイド類、尿失禁治療薬、気管支拡張薬、抗生物質及び副腎皮質ホルモン混合製剤、抗真菌剤、抗ウイルス剤、循環器系薬、寄生性皮膚疾患用薬、抗悪性腫瘍薬、局所麻酔薬、点眼・点鼻薬、末梢血管拡張薬（ひえ性など）、外皮用殺菌消毒薬、創傷皮膚科用薬、ホルモン薬、抗ヒスタミン薬、化膿性皮膚疾患用薬、外用酵素薬、皮膚潰瘍薬、化粧品、育毛剤、養毛剤、動植物からの抽出物、生薬、核酸、ポリペプチドなどを挙げることができる。以下、これら経皮薬剤又は経皮候補薬剤の一例を示す。【００１５】
鎮痛、鎮痒、収斂、抗炎症薬（NSAID、ステロイドなど）としては、アムシノニド、吉草酸酢酸プレドニゾロン、吉草酸ジフルコルトロン、吉草酸デキサメタゾン、吉草酸ベタメタゾン、酢酸ジフロラゾン、酢酸ヒドロコルチゾン、ジフルプレドナート、ジプロピオン酸ベタメタゾン、デキサメタゾン、トリアムシノロンアセトニド、ハルシノニド、ピバル酸フルメタゾン、フランカルボン酸モメタゾン、フルオシノニド、フルオシノロンアセトニド、フルドロキシコルチド、プレドニゾロン、プロピオン酸アルクロメタゾン、プロピオン酸クロベタゾール、プロピオン酸デキサメタゾン、プロピオン酸デプロドン、プロピオン酸ベクロメタゾン、酪酸クロベタゾン、酪酸ヒドロコルチゾン、酪酸プロピオン酸ヒドロコルチゾン、酪酸プロピオン酸ベタメタゾン、酢酸プレドニゾロン、亜鉛華デンプン、亜鉛華、イブプロフェンピコノール、インドメタシン、ウフェナマート、ケトプロフェン、グリチルレチン酸、酸化亜鉛、ジクロフェナクナトリウム、スプロフェン、ピロキシカム、フェルビナク、ブフェキサマク、フルルビプロフェン、ベンダザック、ヘパリン類似物質ゲル、ヒドロコルチゾン・クロタミトンなどを挙げることができる。【００１６】
抗生物質及び副腎皮質ホルモン混合製剤としては、塩酸オキシテトラサイクリン・ヒドロコルチゾン、塩酸テトラサイクリン・酢酸ヒドロコルチゾン、吉草酸ベタメタゾン・ゲンタマイシン、吉草酸ベタメタゾン・フラジオマイシン、トリアムシノロン・フラジオマイシン配合剤、フラジオマイシン・フルオシノロンアセトニド、硫酸フラジオマイシン・プレドニゾロン、エリスロマイシン、ピマリシン、アシクロビル、硫酸ブレオマイシン、ヒドロコルチゾン・フラジオマイシン配合剤、塩酸オキシテトラサイクリン・硫酸ポリミキシンＢ、クロラムフェニコ−ル・フラジオマイシン配合剤、などを挙げることができる。【００１７】
寄生性皮膚疾患用薬・抗真菌剤・抗ウイルス剤としては、サリチル酸、塩酸クロコナゾール、塩酸ネチコナゾール、クロトリマゾール、ケトコナゾール、硝酸イソコナゾール、硝酸エコナゾール、硝酸オキシコナゾール、硝酸スルコナゾール、硝酸ミコナゾール、ビホナゾール、ラノコナゾール、シッカニン、オフロキサシン、塩酸ミノサクリン、塩酸テルビナフィン、塩酸ブテナフィン、トルナフタート、ナジフロキサシン、アシクロビル、ビダラビンなどを挙げることができる。【００１８】
また、局所麻酔剤・眼科用剤としては、リドカイン、アミノ安息香酸エチル、硫酸アトロピン、硫酸ナファゾリンを、血管拡張剤としては、硝酸イソソルビド、ニトログリセリンを、気管支拡張剤としては、ツロブテロールを、化膿性皮膚疾患用剤としては、スルファジアジン、硫酸カナマイシン、エリスロマイシン、塩酸テトラサイクリン、クロラムフェニコール、硫酸ゲンタマイシン、硫酸フラジオマシン、コリスチン・フラジオマイシン、バシトラシン・硫酸フラジオマイシンを、それぞれ挙げることができる。【００１９】
さらに、抗ヒスタミン薬としては、ジフェンヒドラミン、ラウリル硫酸ジフェンヒドラミン、クロタミトンを、ホルモン薬としては、エストラジオールを、外皮用殺菌消毒薬としては、ポピドンヨード、ヨウ素を、外用酵素薬としては、塩化リゾチーム、ブロメラインを、抗悪性腫瘍薬としては、フルオロウラシルを、皮膚潰瘍薬としては、白糖・ポビドンヨード配合剤、アルプロスタジルアルファデクスを、その他の経皮薬剤又は経皮候補薬剤としては、塩酸クロルヘキシジン・ジフェンヒドラミン配合剤、吉草酸ジフルコルトロン・リドカイン、シコンエキス配合剤、トリベノシド・リドカイン、尿素、タクロリムス水和物、ゼラチン、酢酸ヒドロコルチゾン・ヒノキチオール配合剤、エトレチナート、カルシポトリオール、タカルシトールをそれぞれ挙げることができる。【００２０】
上記経皮薬剤又は経皮候補薬剤の剤型としては、ハップ剤、テープ剤、プラスター剤、軟膏剤、クリーム剤、液剤、ローション剤、散布剤、ムースタイプ、エアロゾルタイプ等を挙げることができる。【００２１】
使用する皮膚切片としては、ヘアレス皮膚の切片が好ましく、その由来は特に制限されないが、マウス、ラット、イヌ、ウシ、ヒト等の哺乳動物の皮膚切片、中でも調製の簡便なヘアレスマウスの皮膚切片が好ましい。皮膚切片は、切除した皮膚の皮下脂肪を軽く分離するなど常法により調製することができる。また、皮膚切片として、特定の皮膚トランスポーターの発現が抑制された皮膚切片や、特定の皮膚トランスポーターの発現が増幅された皮膚切片を用いることもできる。【００２２】
皮膚切片で皮下組織側と表皮側とに区画されたチャンバーとしては、垂直方向に皮膚切片を装着できるUssing-type Chamberを好適に例示することができる。これら区画されたチャンバーの皮下組織側か表皮側のいずれか一方には、経皮薬剤又は経皮候補薬剤を溶解した溶液が、他方には所定の溶液が収容されるが、皮下組織側の溶液は体温（約３６〜３７℃）に、表皮側の溶液は室温に維持される。また、チャンバーの両側の溶液に、９５％Ｏ２／５％ＣＯ２のガスを供給するなど、皮膚切片の生存条件下で皮膚透過性の程度が測定・評価される。【００２３】
皮膚透過性の測定を容易ならしめるために、放射性同位体又は蛍光物質等で標識した経皮薬剤又は経皮候補薬剤を有利に用いることができ、例えば、経皮薬剤又は経皮候補薬剤として、３Ｈ 、１４Ｃ、１２５Ｉ若しくは１３１Ｉ等の放射性同位体で標識した経皮薬剤化学物質又は経皮候補薬剤化学物質を有利に用いることができる。その他、皮膚透過性の測定を共焦点顕微鏡法により実施するために、細胞膜マーカーとしてＦＭ４−６４等の蛍光色素を共存させることもできる。【００２４】
経皮薬剤又は経皮候補薬剤を溶解した皮下組織側の溶液としては、エネルギー源を含有する溶液、すなわちグルコースその他のエネルギー源となる栄養素を含有した液が好ましく、中でも体液にその組成が類似しているものが好ましく、ハンクス液、リンゲル液、クレブス・ヘンゼライト液を具体的に例示することができ、また、経皮薬剤又は経皮候補薬剤を溶解した表皮側の溶液としては、経皮薬剤又は経皮候補薬剤を溶解しうる液であれば特に制限されないが、上記エネルギー源を含有する溶液の他、プロピレングリコール、グリセロール、エチレングリコール、ソルビトール等の多価アルコール含有液や、エタノール含有液を具体的に例示することができ、中でもプロピレングリコール含有液やハンクス液を有利に用いることができる。したがって、好ましい態様として、経皮薬剤又は経皮候補薬剤を溶解した溶液として、皮下組織側が経皮薬剤又は経皮候補薬剤を溶解したエネルギー源を含有する溶液を、表皮側が経皮薬剤又は経皮候補薬剤を溶解した多価アルコール含有溶液を、それぞれ用いる経皮薬剤又は経皮候補薬剤の皮膚透過性の検定方法や、経皮薬剤又は経皮候補薬剤を溶解した溶液が、皮下組織側及び表皮側ともに経皮薬剤又は経皮候補薬剤を溶解したエネルギー源を含有する溶液である経皮薬剤又は経皮候補薬剤の皮膚透過性の検定方法を挙げることができる。【００２５】
経皮薬剤又は経皮候補薬剤の皮膚透過性の検定に際しては、後述の実施例に記載されているように、非標識の経皮薬剤又は経皮候補薬剤を皮下組織側と表皮側とに共に用いて、放射性同位体又は蛍光物質等で標識した経皮薬剤又は経皮候補薬剤の飽和性経皮浸透を調べることや、表皮側の溶液のｐＨを変化させ、ｐＨの相違による皮膚透過性の影響を調べることや、ＮａＮ３及びＮａＦを皮下組織側と表皮側とに共に用いて、経皮薬剤又は経皮候補薬剤の浸透が、エネルギー依存性であるかどうかを調べることが好ましい。【００２６】
次に、本発明の経皮薬剤又は経皮候補薬剤の皮膚透過性促進又は抑制物質のスクリーニング方法としては、経皮薬剤又は経皮候補薬剤を溶解した溶液、及び、経皮薬剤又は経皮候補薬剤と被検物質とを溶解した溶液を、皮膚切片で皮下組織側と表皮側とに区画されたチャンバー内の皮下組織側に注入し、他方に所定の溶液を注入して、前記皮膚切片の生存条件下、所定時間後に前記経皮薬剤又は経皮候補薬剤の皮膚トランスポーターを介しての皮膚透過性の程度をそれぞれ測定し、皮膚透過性の程度を比較評価する方法であれば特に制限されるものではなく、上記被検物質としては、化学物質であっても、動植物や微生物の抽出物等の組成物であってもよく、例えば、上皮細胞基底側に存在する有機酸（アニオン）輸送担体阻害剤であるプロベネシド（probenecid）、ミトコンドリアの酸化的リン酸化を脱共役させるＦＣＣＰ（カルボニルシアニドｐ−トリフルオロメトキシフェニルヒドラゾン）、アドレナリン及びコリン作動神経の遮断薬ＴＥＡ（テトラエチルアンモニウム）などを挙げることができる。また、皮下組織側や表皮側の溶液の温度（液温）は特に制限されず、例えば、皮下組織側の溶液を体温に、表皮側の溶液を室温に維持したり、あるいは皮下組織側及び表皮側の溶液の温度を共に体温に維持して、所定時間後に経皮薬剤又は経皮候補薬剤の皮膚トランスポーターを介しての皮膚透過性の程度を測定することができるが、皮下組織側の溶液を体温に、表皮側の溶液を室温に維持することが好ましい。さらに、上記の皮膚透過性の程度の測定・評価としては、皮膚透過の飽和性、阻害効果、方向指向性及びエネルギー依存性の１又は２以上の測定・評価を好適に挙げることができるが、他の高感度検出器を用いて低濃度で経皮薬剤又は経皮候補薬剤を測定・評価する方法も本発明に含まれ、評価に際しては、被検物質不存在下における対照と比較評価することが好ましい。【００２７】
本発明の経皮薬剤又は経皮候補薬剤の皮膚透過性促進又は抑制物質のスクリーニング方法においても、経皮薬剤又は経皮候補薬剤として、放射性同位体又は蛍光物質等で標識した経皮薬剤又は経皮候補薬剤を用いることが好ましい。また、経皮薬剤又は経皮候補薬剤を溶解した溶液として、上記本発明の検定方法におけると同様に、皮下組織側が経皮薬剤又は経皮候補薬剤を溶解したハンクス液等のエネルギー源を含有する溶液を有利に用いることができ、表皮側が経皮薬剤又は経皮候補薬剤を溶解したプロピレングリコール等の多価アルコール含有液やハンクス液等のエネルギー源を含有する溶液を有利に用いることができる。さらに、スクリーニングに際して、上記本発明の検定方法におけると同様に、非標識の経皮薬剤又は経皮候補薬剤を皮下組織側と表皮側とに共に用いて、放射性同位体又は蛍光物質等で標識した経皮薬剤又は経皮候補薬剤の飽和性経皮浸透を測定・評価することや、表皮側の溶液のｐＨを変化させ、ｐＨの相違による皮膚透過性の影響を測定・評価することや、ＮａＮ３及びＮａＦを皮下組織側と表皮側とに共に用いて、経皮薬剤又は経皮候補薬剤の浸透が、エネルギー依存性であるかどうかを測定・評価することが好ましい。【００２８】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。実施例において、全てのデータは、平均値±標準誤差で示し、統計学的解析をStudent’s t testで行った。平均値間の相違は、ｐ値が０．０５未満であるときに有意とした。
【実施例１】
【００２９】
［材料と動物］
［１４Ｃ］インドメタシン（７４０ＭＢｑ／ｍｏｌ）及び［３Ｈ］マンニトール（７４０ＧＢｑ／ｍｏｌ）は、PerkinElmer Life Sciences, Inc.及びAmerican Radiolabeled Chemicals Inc.から、それぞれ購入した。Ｆｌｕｏ−３−ＡＭとＦＭ４−６４は、それぞれ株式会社同仁化学研究所及びMolecular Probe 社から購入した。SUPERSCRIPTTMII RNase H-はInvitrogen Corp.から購入した。正常ヒト成人皮膚ｃＤＮＡは、Invitrogen Corp. 及びBioChain Institute Inc.から購入した。また、５週齢から７週齢のオスのヘアレスマウス（ＨＲ−１）を日本エスエルシー株式会社から、５週齢から７週齢のオスのヘアレスマウス（ＦＶＢ）を日本クレア株式会社から購入した。ＦＶＢ／Ｍｒｐ１（−／−）マウスは、文献（Nature Med.3:1275-1279,1997）記載の方法に準じて作製した。動物実験は、金沢大学宝町キャンパスの動物実験に関する指針に従って行われた。
［逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）］
ヘアレスマウスの皮膚を採取し、β−メルカプトエタノールを加えたＲＬＴ緩衝液を入れ、RNeasy Mini Kit（QIAGEN社製）を用いて全ＲＮＡを抽出した。１マイクログラムの全ＲＮＡを、オリゴ（ｄＴ）１２−１８(Life technologies)及びSUPERSCRIPTTM II RNase H- Reverse Transcriptase 200 Uを用いて逆転写しｃＤＮＡを作製した。反応後の混合物に、適切なセットのマウスプライマー（表１）及びヒトプライマー（表２）を用いて、ＰＣＲを３０サイクル行った。ＰＣＲ産物を、２％のアガロースゲル上に電気泳動し、臭化エチジウムで染色した。ＰＣＲの各生成物の量を、ＡＥ−６９５５Light Capture instrument（ATTO社製）で測定した。【００３０】
【表１】
0004714807.tif 000002
【００３１】
【表２】
0004714807.tif 000003
【００３２】
［Ussing‐type Chamber Methodによる浸透実験］
浸透実験を、文献（J. Pharm. Pharmacol. 49: 108-112, 1997、J. Pharm. Sci. 92: 1502-1508, 2003）記載の方法で行った。簡潔に言うと、ヘアレスマウスを安楽死させ、直に皮膚を切除して皮下脂肪を軽く分離した皮膚切片を、０．７６６ｃｍ２の露出区域（exposed area）を有するUssing-type Chamber内に縦方向に装着した。図１に示すように、皮膚切片で区画された皮下組織側のチャンバー内に、ハンクス液（ＨＢＳＳ、１３６．７ｍＭのＮａＣｌ、５．３６ｍMのＫＣｌ、０．９５２ｍＭのＣａＣｌ２、０．８１２ｍＭのＭｇＳＯ４、０．４４１ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、０．３８５ｍＭのＮａ２ＰＯ４、２５ｍＭのＤ−グルコース及び１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）１．２ｍＬを、表皮側のチャンバー内に、プロピレングリコール：水（１：１）の混合溶液１．２ｍＬをそれぞれ添加し、溶液の温度を、皮下組織側では３７℃に、表皮側では室温に維持した。皮膚組織の生存度を維持するために、チャンバーの両側の溶液に、９５％Ｏ２／５％ＣＯ２のガスを、輸送実験中に供給した。Ｏ２／ＣＯ２の気泡は、組織に酸素を供給しただけではなく、組織の周囲の溶液を混和した。【００３３】
［１４Ｃ］インドメタシンと［３Ｈ］マンニトールとの経皮浸透性を測定するために、テスト化合物を皮下組織側又は表皮側に用いて、所定の時間に、０．４ｍＬの溶液を反対側から採取し、同量の新鮮な溶液と交換した。採取したサンプルを液体シンチレーションカウンターで測定した。また、［１４Ｃ］インドメタシンの経皮浸透に対するｐＨの効果を調べるために、皮下組織側ではハンクス液（ｐＨ７．４）としたのに対し、表皮側での試験溶液をプロピレングリコール：２０ｍＭのリン酸緩衝液（１：１）で構成した。浸透性係数の値（μＬ／ｃｍ2／ｈｒ、Ｐｓｅｃ及びＰａｂｓ）は、時間（ｈｒ）に対する浸透性のプロットの直線部の傾きから求めた（μＬ／ｃｍ2）。
［薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）方法］
ＴＬＣを用いて、インドメタシングルクロニドが実験中に発生するかどうかを文献（Pharm. Res. 17: 432-438, 2000）記載の方法に準じて調べた。簡潔に言うと、［１４Ｃ］インドメタシンの経皮浸透実験の後、テスト化合物の反対側の培地を、ジエチルエーテル（６ｍＬ）で抽出した。抽出物が乾燥するまで蒸発させ、残留物をエタノールに溶解し、この溶液をＴＬＣプレート上にプロットした。代謝物を、クロロホルム：酢酸（９５：５ｖ／ｖ）の混合液で分離し、ラジオアイソトープスキャナーを用いて定量した。得られた強度と、標準の［１４Ｃ］インドメタシンのものとを比較した。
［共焦点顕微鏡法］
ヘアレスマウスと脱毛クリームで脱毛し２４時間回復させたＦＶＢ及びＦＶＢ／Ｍｒｐ１（−／−）マウスの皮膚を、それぞれ氷上にてマイクロスライサー（ＤＴＫ−２０００，Dosaka EM Co., LTD.）で皮膚切片（厚さ：１００μｍ）を作製した。皮膚切片はＦｌｕｏ−３−ＡＭ（１０μＭ）とＦＭ４−６４（１μＭ）を添加した４°Ｃのハンクス液（ｐＨ７．４）に２時間浸透させた後、皮膚切片をLabTek chambered micro cover glass（２４Ｘ６０ｍｍ）にのせ、共焦点顕微鏡（Zeiss Axiovert 100M LSM510）に装着し、室温（２０〜２２°Ｃ）で、４８８ｎｍと５４３ｎｍレーザーを使用し、水浸レンズ（６３０倍）で蛍光を観察した。
［インドメタシンの方向性経皮浸透］
［１４Ｃ］インドメタシン（４７μＭ）及び［３Ｈ］マンニトール（０．２５μＭ）の経皮浸透性を、Ussing-type chamber methodを用いて、皮下から表皮側に向って（四角）、及び表皮から皮下組織側に向って（丸）４時間、ヘアレスマウス皮膚で調べた。結果を図２に示す（各点は、３〜４回の実験における平均値±標準誤差を表す。）。［１４Ｃ］インドメタシンの経皮浸透は、直線的であり、分泌方向の浸透性（皮下組織側から表皮側；Ｐｓｅｃ）は、吸収方向（表皮から皮下組織側；Ｐａｂｓ）と比較して、４倍高かった（図２−Ａ）。これに対し、［３Ｈ］マンニトールの経皮浸透では、一方向性の輸送は観察されなかった（図２−Ｂ）。［１４Ｃ］インドメタシンの浸透性は、［３Ｈ］マンニトールと比べて、かなり高かった（５倍以上）。
［反対側に現れる放射能は、主として親化合物によるものである。］
インドメタシングルクロニドは、ｃＭＯＡＴ／ＭＲＰ２の基質であり（Pharm. Res. 17: 432-438, 2000）、インドメタシンはＯＡＴ１（J. Pharmacol. Exp. Ther. 303:534-539, 2002）、ＯＡＴ２（J. Pharmacol. Exp. Ther. 298:1179-1184, 2001）、ＯＡＴ３（J. Pharmacol. Exp. Ther. 303:534-539, 2002）及びＮＰＴ１（Biochem. Biophys. Res. Commun. 270: 254-259, 2000）により輸送されるが、ｃＭＯＡＴ／ＭＲＰ２（Pharm. Res. 17: 432-438, 2000）によっては輸送されない。インドメタシンが、経皮浸透実験中に代謝したかどうかを調べるために、［１４Ｃ］インドメタシンを皮下組織側に添加した後、表皮側に現れた放射能を、６時間の薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）により分離した。［１４Ｃ］インドメタシンの回収率は、８０％以上であった。標識化合物の９５％以上は、［１４Ｃ］インドメタシンであった。したがって、本実験におけるインドメタシンの代謝は、ごくわずかであるとみなされた。
［インドメタシンの飽和性経皮浸透］
能動輸送の重要な特徴の一つは飽和性にあるので、［１４Ｃ］インドメタシンの経皮浸透が飽和性であるかどうか調べた。［１４Ｃ］インドメタシン（４７μＭ）及び［３Ｈ］マンニトール（０．２５μＭ）の経皮浸透を、Ussing type chamberの両側に添加した非標識インドメタシン（５００μＭ）の存在下（白柱）、非存在下（黒柱）で４時間調べた結果を図３に示す（各柱は、３〜４回の実験における平均値±標準誤差を表す。）。その結果、非標識インドメタシン（５００μＭ）は［１４Ｃ］インドメタシンのＰｓｅｃを増加させたが、Ｐａｂｓには影響しなかった（図３―Ａ）。これに対し、［３Ｈ］マンニトールの浸透性に対する非標識インドメタシンの効果は、観察されなかった（図３−Ｂ）。したがって、非標識インドメタシンの効果は、［１４Ｃ］インドメタシンの浸透に特異的であり、［１４Ｃ］インドメタシンの経皮浸透は、分泌方向に飽和性である。
［インドメタシンのＡＴＰ依存性経皮浸透］
［１４Ｃ］インドメタシンの浸透が、エネルギー依存性であるかどうか調べるために、［１４Ｃ］インドメタシンの浸透に対するＡＴＰ消費（depletor）の効果を調べた。Ussing-type chamberの両側に、ＮａＮ３及びＮａＦ（１０ｍＭ）を負荷してから３０分後、［１４Ｃ］インドメタシン（４７μＭ）及び［３Ｈ］マンニトール（０．２５μＭ）の経皮浸透性を、添加したＮａＮ３及びＮａＦ（１０ｍＭ）の存在下（白円）及び非存在下（黒円）で４時間後に観察した結果を図４に示す（各点は、４〜５回の実験における平均値±標準誤差を表す。）。その結果、［１４Ｃ］インドメタシンのＰｓｅｃが、ＮａＮ３及びＮａＦの存在下で増加すること（図４−Ａ）を見い出したが、［３Ｈ］マンニトールの浸透性に対しては、何の効果も観察されなかった（図４−Ｂ）。これらの結果は、吸収方向の［１４Ｃ］インドメタシンの浸透が、エネルギー依存性であることを示した。
［インドメタシンの経皮浸透に対するｐＨの効果］
皮膚の環境が、弱酸性であるため、［１４Ｃ］インドメタシンの経皮浸透性に対するｐＨの効果を確認した。ヘアレスマウス皮膚のｐＨは、比較的一定のままであり（ｐＨ５．９）（J. Investig. Dermatol. Symp. Proc. 3: 110-113, 1998）、ヒトの皮膚のｐＨに類似していた（ｐＨ４−６）（２１）。チャンバーの表皮側で［１４Ｃ］インドメタシン（４７μＭ）及び［３Ｈ］マンニトール（０．２５μＭ）の経皮浸透性の係数を、異なるｐＨ値（ｐＨ５．０、６．０、７．４）で、吸収方向（Ａ）及び分泌方向（Ｂ）で観察した結果を図５に示す（各柱は、４〜５回の実験における平均値±標準誤差を表す。）。インドメタシンのｐＫａ値は４．５であるので、表皮側の培地のｐＨ（５．０、６．０及び７．４）の変化は、インドメタシンのイオン化程度を変更させた。表皮側のｐＨ値が減少すると、［１４Ｃ］インドメタシンのＰａｂｓが上昇することを見い出した。これに対して、［３Ｈ］マンニトールのＰａｂｓには何の変化も観察されなかった（図５−Ａ）。反対に、表皮側において、［１４Ｃ］インドメタシン又は［３Ｈ］マンニトールのＰｓｅｃに、ｐＨの効果は観察されなかった（図５−Ｂ）。その結果、［１４Ｃ］インドメタシンの一方向性の浸透は、表皮側においてｐＨ値の減少につれて消失した。
［表皮側における、ｐＨ５．０でのインドメタシンの飽和性浸透］
表皮側において、ｐＨ５．０での［１４Ｃ］インドメタシンのＰａｂｓを、非標識インドメタシンの非存在下又は存在下で調べた。［１４Ｃ］インドメタシン（４７μＭ）及び［３Ｈ］マンニトール（０．２５μＭ）（Ｂ）の経皮浸透性を、Ussing-type chamberの両側に添加した非標識インドメタシン（５００μＭ）の存在下（白）及び非存在下（黒）で４時間後に調べた結果を図６に示す（各点は、３〜５回の実験における平均値±標準誤差を表す。）。なお、非標識インドメタシンの存在下及び非存在下とも、チャンバーの表皮側のｐＨ値は、５．０に保たれた。その結果、表皮側において、ｐＨ５．０で、［１４Ｃ］インドメタシンのＰａｂｓは、非標識インドメタシン（５００μＭ）によって増加した（図６−Ａ）。しかし、［３Ｈ］マンニトールのＰａｂｓに対する、非標識インドメタシン（５００μＭ）の効果は観察されなかった（図６−Ｂ）。［１４Ｃ］インドメタシンの吸収方向の浸透は飽和性であるとみなされた。
［Ｆｌｕｏ−３の方向性経皮浸透］
Ｆｌｕｏ−３の方向性経皮浸透を、Ｆｌｕｏ−３のカルボキシル基を脂溶性のアセトキシメチルエステル体にして細胞膜透過性とし、細胞内のエステラーゼにより加水分解されてＦｌｕｏ−３となるＦｌｕｏ−３−ＡＭ（1-[2-Amino-5-(2,7-dichloro-6-hydroxy-3- 
oxo-9-xanthenyl)phenoxy]-2-(2-amino-5-methylphenoxy)ethane-N,N,N',N'-tetraacetic acid, pentaacetoxymethyl ester；１０μＭ）と蛍光色素ＦＭ４−６４（１μＭ）を添加したハンクス液を浸透させ、Ussing-type chamberに設置し、チャンバーの両側から排泄されたＦｌｕｏ−３を調べた。また、Ｆｌｕｏ−３−ＡＭに、それぞれプロベネシド（probenecid）５ｍＭ、ＦＣＣＰ５μＭ、ＴＥＡ５ｍＭを加えた検体についても同様にＦｌｕｏ−３の方向性経皮浸透を調べた。結果を図７に示す。その結果、皮膚組織内で生成されたＦｌｕｏ−３の経皮浸透は、直線的であり、吸収方向（皮膚組織内から皮下組織側；図７左のコントロール）は、分泌方向の浸透性（皮膚組織内から表皮側；図７右のコントロール）と比較して、５０倍高かった。また、プロベネシド、ＦＣＣＰ、ＴＥＡの中では、ＦＣＣＰを共存させた場合、Ｆｌｕｏ−３単独に比べて、約２倍の吸収を示した。
［皮膚内におけるトランスポーターの発現］
ヘアレスマウス皮膚の全ＲＮＡ（パネルＡ）と、正常ヒト皮膚のｃＤＮＡ（パネルＢ）にそれぞれ、ＲＴ−ＰＣＲ及びＰＣＲを行った。ヒトｃＤＮＡは、年齢８０歳／女性（パネルＢ−Ｉ）、年齢４４歳／男性（パネルＢ−II）及び年齢４４歳／男性、年齢５８歳／女性、年齢６５歳／女性の３人の混合物（パネルＢ−III）を用いた。ＰＣＲ生成物は、２％アガロースゲル電気泳動により分析し、臭化エチジウムで染色した。結果を図８に示す。【００３４】
パネルＡの１〜３２レーンは、１，Ｍｄｒ１ａ；２，Ｍｄｒ１ｂ；３，Ｍｒｐ１；４，Ｍｒｐ２；５，Ｍｒｐ３；６，Ｍｒｐ４；７，Ｍｒｐ５；８，Ｍｒｐ６；９，Ｓｍｖｔ；１０，ＰｅｐＴ１；１１，ＰｅｐＴ２；１２，Ｍｃｔ１；１３，Ｍｃｔ２；１４，Ｍｃｔ３；１５，Ｍｃｔ４；１６，Ｎｐｔ１；１７，Ｏａｔｐ１；１８，Ｏａｐｔ２；１９，Ｏａｐｔ３；２０，Ｏａｔｐ４；２１，Ｏａｔｐ５；２２，Ｏａｔｐ１１；２３，Ｏａｔｐ１４；２４，ｍＰＧＴ；２５，Ｏｃｔ１；２６，Ｏｃｔ２；２７，Ｏｃｔ３；２８，Ｏｃｔｎ１；２９，Ｏｃｔｎ２；３０，Ｏｃｔｎ３；３１，Ｏａｔ１；３２，Ｏａｔ２をそれぞれ示す。【００３５】
また、パネルＢの１〜３８レーンは、１，β−アクチン；２，Ｕｒａｔ１；３，Ｍｒｐ１；４，Ｍｒｐ２；５，Ｍｒｐ３；６，Ｍｒｐ４；７，Ｍｒｐ５；８，Ｍｒｐ６；９，Ｍｒｐ７；１０，Ｏａｔ１；１１，Ｏａｔ２；１２，Ｏａｔ３；１３，Ｏａｔ４；１４，Ｏａｔｐ−Ａ；１５，Ｏａｔｐ−Ｂ；１６，Ｏａｔｐ−Ｃ；１７，Ｏａｔｐ−Ｄ；１８，Ｏａｔｐ−Ｅ；１９，Ｏａｔｐ８；２０，Ｍｄｒ１；２１，Ｏｃｔ１；２２，Ｏｃｔ２；２３，Ｏｃｔ３；２４，Ｏｃｔｎ１；２５，Ｏｃｔｎ２；２６，Ｎｐｔ１；２７，Ｎｐｔ；２８，Ｐｅｐｔ１；２９，Ｐｅｐｔ２；３０，Ａｅ２；３１，Ｎｈｅ３；３２，Ｇｌｕｔ５；３３，Ｅｎｔ１；３４，Ｍｃｔ１；３５，Ｍｃｔ２；２６，Ｍｃｔ３；３７，Ｍｃｔ４；３８，Ｍｃｔ５をそれぞれ示す。【００３６】
ヘアレスマウス皮膚で、ＭＲＰ１、ＭＲＰ３、ＭＲＰ４、ＭＲＰ５、ペプチドトランンスポーター１（ＰＥＰＴ１）、ＰＥＰＴ２、モノカルボン酸トランスポーター１（ＭＣＴ１）、ＭＣＴ２、ＭＣＴ４、ＯＡＴＰ３、ＯＡＴＰ１１、プロスタグランジントランスポーター（ＰＧＴ）、有機カチオントランスポーター３（ＯＣＴ３）、有機カチオン／カルニチントランスポーター１（ＯＣＴＮ１）、ＯＣＴＮ２及びＯＣＴＮ３の発現を観察した（図８−Ａ）。【００３７】
また、正常ヒト皮膚（ResGen Invitrogen 社製及びBiochain Institute社製）のｃＤＮＡ内で、トランスポーターの発現を観察した。正常ヒト皮膚で、ＭＲＰ１、ＭＲＰ３、ＭＲＰ４、ＭＲＰ５、ＭＲＰ６、ＧＬＵＴ５、ＡＥ２、ＭＣＴ１、ＭＣＴ４、ＭＣＴ５、ＯＡＴＰ−Ｂ、ＯＡＴＰ−Ｄ、ＯＡＴＰ−Ｅ、ＯＣＴＮ１、ＯＣＴＮ２及びＥＮＴ１の発現を観察した（図８−Ｂ）。ＭＲＰ２、ＭＤＲ１、ＰＥＰＴ１、ＰＥＰＴ２、ＭＣＴ２、ＭＣＴ３、ＯＣＴ１、ＯＣＴ３及びＵＲＡＴ１の発現は、ドナーによっては検出され、発現に個体差のあることが示唆された。
［考察］
非標識インドメタシン（５００μＭ）による飽和は、分泌方向において、明らかに観察されたが、［１４Ｃ］インドメタシンの飽和された浸透は、表皮区画において、低ｐＨで、吸収方向においても見い出された。これらの結果は、インドメタシン輸送に複数の輸送システムが関与しているのであれば説明できる。経皮吸収の効率の点からは、このような吸収方向の非直線の動態学は重要である。吸収方向のインドメタシンの経皮浸透を飽和するために、インドメタシンを経皮投与したときの皮膚表面における濃度は、上記実施例で用いた非標識インドメタシンの濃度（５００μM）と比較すると、通常とても高い。このように、上記実施例の結果は、経皮投与した薬剤の浸透性は、投与した濃度に左右されることを示唆している。【００３８】
表皮区画におけるｐＨ値の減少は、［１４Ｃ］インドメタシンのＰａｂｓを増加させるが、Ｐｓｅｃに影響しないことを見い出した。その結果、表皮区画において、ｐＨ５．０で［１４Ｃ］インドメタシンの一方向性の浸透は消失する。Ｐａｂｓがこのように増加した一つの可能性として、角質層（ＳＣ）内において非イオン化した［１４Ｃ］インドメタシンが分配されて増加したことが挙げられる。それにより、角質層（ＳＣ）から皮下組織側への高濃度勾配を引き起こし、［１４Ｃ］インドメタシンの非直線Ｐａｂｓを導く（図６−Ａ）。しかし、プロトン依存性輸送システムが［１４Ｃ］インドメタシンのＰａｂｓに関与しているという、別の仮説もある。以前の研究で、本発明者らは、モノカルボン酸トランスポーター１（ＭＣＴ１）が、ｐＨ依存性方式で、弱有機酸の腸管吸収に関与していることを証明した（Biochem. Biophys. Res. Commun. 214: 482-489, 1995、J. Pharm. Pharmacol. 51: 1113-1121, 1999）。一方で、有機アニオン性化合物を輸送するＯＡＴＰファミリーのトランスポーターの発現も確認された。【００３９】
［１４Ｃ］インドメタシンの経皮浸透に関与している可能性があるトランスポーター（１つ又は複数）を同定するために、ヘアレスマウス皮膚におけるトランスポーターの発現をＲＴ−ＰＣＲで調べた。ＭＲＰ１、ＭＲＰ３、ＭＲＰ４及びＭＲＰ５の発現を確認したほか、ＰＥＰＴ１、ＰＥＰＴ２、ＭＣＴ１、ＭＣＴ２、ＭＣＴ４、ＯＡＴＰ３、ＯＡＴＰ１１、ｍＰＧＴ、ＯＣＴ３、ＯＣＴＮ１、ＯＣＴＮ２及びＯＣＴＮ３の発現もヘアレスマウス皮膚で観察した（図８）。インドメタシンが、ＯＡＴ１（J. Pharmacol. Exp. Ther. 303:534-539, 2002）、ＯＡＴ２（J. Pharmacol. Exp. Ther. 298:1179-1184, 2001）及びＯａｔ３（J. Pharmacol. Exp. Ther. 303:534-539, 2002）の基質であり、ＮＰＴ１の低基質（Biochem. Biophys. Res. Commun. 270: 254-259, 2000）であることが、以前報告されている。しかし、本実施例の結果においては、ＯＡＴ１、ＯＡＴ３及びＮＰＴ１の発現は検出されず、他のトランスポーターがインドメタシンの浸透に関与している可能性を示唆した。【００４０】
正常ヒト皮膚におけるトランスポーターの発現も調べ、ヘアレスマウス皮膚と比較した。ヘアレスマウス皮膚におけるＭＲＰ、ＭＣＴ及びＯＣＴＮファミリーメンバーの発現は、正常ヒト皮膚における発現と類似であり、ヘアレスマウス皮膚は、これらのトランスポーターの機能を調べるためのよいモデルとなりうることを示唆した。近年の研究と同様、ＭＲＰ２以外のＭＲＰファミリーメンバーの発現を、全ての個体で検出した（J. Invest. Dermatol. 116: 541-548, 2001）。ヘアレスマウス皮膚でも、Ｍｒｐ１、Ｍｒｐ３、Ｍｒｐ４及びＭｒｐ５の発現を観察したが、Ｍｒｐ２は観察されず、発現の特徴がヒト皮膚と類似であることが示された。ヒト皮膚においてＯＡＴＰ−Ｂ、ＯＡＴＰ−Ｄ及びＯＡＴＰ−Ｅの発現を全ての個体で観察した。この結果は、最近の報告（J. Invest. Dermatol. 120: 285-291, 2003）と一致した。ＯＡＴＰ−Ｂは、基質として、ステロイドの硫酸抱合体やプラバスタチン、フェキソフェナジン等の薬物は受け入れるが、グルクロニド抱合体は受け入れず、アニオン性化合物の胃腸吸収を媒介することが提案されている（J. Pharmacol. Exp. Ther. 306:703-708, 2003）。ＯＡＴＰ−Ｃは、ステロイド抱合体の両方の型を輸送するとみなされていた（Pharm. Res. 18: 1262-1269, 2001）が、ＯＡＴＰ−Ｄは特別な組織及び細胞に、プロスタグランジンをトランスロケートするときに重要な役割を演じている（Am. J. Physiol. Renal Physiol 285:F1188-1197, 2003）。免疫組織化学による染色により、ＯＡＴＰ−Ｂが、表皮の全ての層で発現するが、皮下では発現しないことが明らかになった。さらに、正常なヒト表皮ケラチノサイトによるエストロン硫酸の取り込みが、ＯＡＴＰファミリーの基質である、タウロコール酸によって３３％低下した（J. Invest. Dermatol. 120: 285-291, 2003）。これらの研究成果は、有機アニオン輸送システムが、ケラチノサイトによる、その基質の取り込みに関連している可能性を示唆し、かかるトランスポーターが、薬剤の経皮輸送に重要な役割を演じているかどうか明らかにするために、さらなる解析の必要性を示唆している。ＭＣＴ１、ＭＣＴ２及びＭＣＴ５の発現を、ヒト皮膚で検出したが、ＭＣＴ２及びＭＣＴ３の発現は、いくつかのケースでしか検出できなかった（図８）。ＭＣＴ１及びＭＣＴ４を、皮膚由来の複数の細胞株で検出し、ＭＣＴが、メラノーマにおけるｐＨ調整の主要な決定因子であることを示唆した（Mol. Cancer Ther. 1:617-628, 2002）。以前の研究で、本発明者らはＭＣＴ１が、安息香酸及び小腸及び脳内の乳酸などの外因性及び内因性の弱有機酸を含む、モノカルボン酸の輸送に重要な役割を演じていることを報告した（Biochem. Biophys. Res. Commun. 214: 482-489, 1995、J. Pharm. Pharmacol. 51: 1113-1121, 1999、Pharm. Res. 17:55-62, 2000）。皮膚内のＭＣＴの発現は、皮膚のｐＨ調節及び弱有機酸の輸送の役割を示すかもしれない。ＯＣＴＮファミリーメンバーの発現を、全ての個体で観察した（図８）。ＯＣＴＮファミリーは、長鎖脂肪酸の酸化に必須な補助因子であるカルニチンの輸送に関与している。ヒト培養皮膚繊維芽細胞におけるインビトロのカルニチン輸送システムが特徴づけられた。カルニチンの取り込み用のＫｍは５μＭであり、ヒトＯＣＴＮ２の値に近かった（N. Engl. J. Med. 319: 1331-1336, 1988、Pediatr. Res. 28: 247-255, 1990、Biochem. Pharmacol. 55:1729-1732, 1998）。ＯＣＴＮ１は、プロトン／有機カチオンアンチポーター及び／又は、有機カチオン／カチオン交換体として、腎臓頂端膜及び他の組織で機能しうる、多選択性でｐＨ依存性の有機カチオントランスポーターであることが機能的に示された（J. Pharmacol. Exp. Ther. 289:768-773, 1999）。これに対し、ＯＣＴＮ２は、有機カチオン輸送もカルニチン輸送も媒介する多選択性のトランスポーターであるように考えられている（J. Biol. Chem. 275: 40064-40072, 2000）。皮膚内のＯＣＴＮファミリーメンバーは、カルニチン又は有機カチオン化合物の取り込みに関与しているかもしれない。このように、皮膚内の機能に関するさらなる研究が必要ではあるが、これらのトランスポーターの皮膚内の発現が、皮膚の能動的なバリアシステムとして、基質の輸送に関与する可能性を示している。
【産業上の利用可能性】
【００４１】
本発明により、インドメタシン等の経皮薬剤又は経皮候補薬剤の経皮浸透においてトランスポーター（１つ又は複数）が関与していることが明らかにされた。また、ＭＲＰ、ＯＡＴＰ、ＭＣＴ及びＯＣＴＮファミリーの複数のトランスポーターのｍＲＮＡ発現を、ヘアレスマウス皮膚と正常ヒト皮膚との両方で観察したことから、これら皮膚内のトランスポーターの発現の生理学的な意味はさらに解明する必要があるが、このように多様なトランスポーターの種類の存在は、能動的なバリアとして、生体異物の経皮浸透をコントロールするにあたっての、役割の可能性を示している。本発明により、皮膚内のトランスポーターの生理学的な役割のさらなる解明が進展するばかりでなく、経皮薬剤や化粧品の優れた経皮デリバリーシステムの開発が可能となる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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