(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換え宿主細胞であり、前記組換え宿主細胞は、酵素的に活性なヒアルロナンシンターゼをコードするコード領域を有する精製された核酸セグメントを含有する組換えベクターで形質転換された原核細胞であり、これにより、前記組換え宿主細胞がヒアルロナンを産生するところの組換え宿主細胞であって、前記精製された核酸セグメントが、
（ａ）配列番号１と少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列を有する核酸セグメント；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列をコードする核酸配列を有する核酸セグメント；及び、
（ｃ）６０℃でプレハイブリダイズし、QuikHyb（商標） Hybridization溶液中で８０℃でハイブリダイズし、次いで、室温で１５分間、2x SSCバッファーおよび0.1%(w/v)SDSを用いて洗浄し、次いで、６０℃で３０分間、0.1x SSCバッファーおよび0.1%(w/v)SDSを用いて洗浄することからなる条件下で配列番号１の補体にハイブリダイズすることができる核酸配列を有する核酸セグメント
からなる群から選択されることを特徴とする組換え宿主細胞。
【請求項２】
前記酵素的に活性なヒアルロナンシンターゼが、天然のヒアルロナン重合体に対して変更された構造を有するヒアルロナン重合体を産生することができる、請求項１記載の組換え宿主細胞。
【請求項３】
前記酵素的に活性なヒアルロナンシンターゼが、天然のヒアルロナン重合体に対して変更されたサイズ分布を有するヒアルロナン重合体を産生することができる請求項１記載の組換え宿主細胞。
【請求項４】
請求項１の組換え宿主細胞を提供する工程、
培地で前記組換え宿主細胞を培養して、ヒアルロナンを分泌させる工程、および
分泌された前記ヒアルロナンを回収する工程
を含むヒアルロナンを産生する方法。
【請求項５】
前記ヒアルロナンを回収する工程が、培地から分泌されたヒアルロナンを抽出することを含む、請求項４記載の方法。
【請求項６】
抽出された前記ヒアルロナンを精製する工程をさらに含む、請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記組換え宿主細胞を培養する工程において、前記組換え宿主細胞が、天然のヒアルロナン重合体に対して構造的に変更されたヒアルロナンを分泌する、請求項４記載の方法。
【請求項８】
前記組換え宿主細胞を培養する工程において、前記組換え宿主細胞が、天然のヒアルロナン重合体に対して変更されたサイズを有するヒアルロナンを分泌する、請求項４記載の方法。
【請求項９】
ＤＮＡ試料を入手する工程、
配列番号１の精製された、核酸配列を有する核酸セグメントと前記ＤＮＡ試料とを接触させる工程、
前記ＤＮＡ試料と前記精製された、核酸配列を有する核酸セグメントとをハイブリダイズし、それによりハイブリダイズされた複合物を形成する工程、および
複合物を検出する工程
を含むＤＮＡ種を検出する方法。
【請求項１０】
細菌細胞試料を入手する工程、
配列番号１の精製された、核酸配列を有する核酸セグメントと、前記細菌細胞試料からの少なくとも一つの核酸とを接触させる工程、
前記少なくとも一つの核酸と前記精製された、核酸配列を有する核酸セグメントとをハイブリダイズし、それによりハイブリダイズされた複合物を形成する工程、および
ハイブリダイズされた複合物を検出する工程
を含み、
ハイブリダイズされた前記複合物の存在が、ストレプトコッカス  エクイシミリスのヒアルロナンシンターゼをコードするｍＲＮＡを発現する細菌種を示していることを特徴とする、ストレプトコッカス  エクイシミリスのヒアルロナンシンターゼをコードするｍＲＮＡを発現する細菌細胞を検出する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
１．発明の技術分野
本発明は、酵素として活性のストレプトコッカス（連鎖球菌属）エクイシミリス（Streptococcus equisimilis)のヒアルロナンシンターゼ（seHAS）をコード化するコード領域セグメントを含む核酸セグメント、およびヒアルロナンシンターゼおよびヒアルロナン生成物を産生する組換え細胞を調製する際にこの核酸セグメントを使用することに関するものである。ヒアルロネートは、ヒアルロン酸またはヒアルロナンとしても知られている。
【０００２】
２．関連技術の簡単な説明
連鎖球菌感染の発生は、世界的に、特に発展途上国において主要な健康および経済問題である。この理由の一つは、連鎖球菌属の細菌が、体の貪食細胞、即ちマクロファージおよび多形核細胞（ＰＭＮ）によって検出されることなく成長する能力にある。これらの細胞は、外来の微生物を認識し、包囲する役割を担っている。この細菌が検閲を回避するのに有効な方法の一つは、多糖類のカプセル、例えばヒアルロナン（ＨＡ）カプセルによって細菌自身を被覆することによっている。ヒアルロナン（以下、「ＨＡ」という）の構造は、原核および真核細胞において同一である。ＨＡは一般的には免疫原性ではないので、カプセル化された細菌は免疫応答を引き起こさず、従って破壊の標的とはならない。更に、このカプセルはＰＭＮに対してインビトロで抗貪食作用をもたらし、連鎖球菌がマクロファージに付着するのを阻害する。まさにこのために、Ａ属およびＣ属の連鎖球菌においては、ＨＡカプセルは天然および実験的な感染に際して主要な病原性の因子となる。Ａ属の連鎖球菌は、咽頭炎、膿痂疹、深い組織感染、リューマチ熱および毒性のショック状症候群を含む多数のヒト疾患の原因となっている。Ｃ属のストレプトコッカス  エクイシミリスは、骨髄炎、咽頭炎、脳腫瘍および肺炎の原因となっている。
【０００３】
構造的には、ＨＡは、Ｎ−アセチルグルコサミン（GlcNAc）およびグルクロン酸（GlcA）からなる二糖類の単位を反復してなる高分子量の直鎖状多糖類である。ＨＡ分子中の二糖類の反復数が３０，０００を越え、Ｍｒ＞１０7となることがある。ＨＡは、哺乳類細胞と細菌細胞（特にＡ属およびＣ属の連鎖球菌およびＡ型のパスツレラ  ムルトシダ（Pasturella Multocida) との双方によって合成される唯一のグリコサミノグリカンである。これらの菌株が産生するＨＡは、ＨＡカプセルだけでなく培地中へも分泌される。これらの細菌がＨＡを合成する機構は広範な医学的興味の対象となっている。なぜなら、ＨＡカプセルの産生は、連鎖球菌が免疫系の検閲を逃れるために用いる非常に効率的かつ賢明な方法だからである。
【０００４】
ＨＡは、哺乳類および細菌細胞によって、その細胞膜に局在化した酵素ヒアルロナンシンターゼによって合成される。これらの微生物中のＨＡの合成は多段階のプロセスであると考えられる。開始段階は、初期前駆体であるUDP−GlcNAcまたはUDP−GlcAの結合が関与する。これに続く伸長では、成長中のオリゴ糖鎖への二種類の糖類の交互付加が関与する。この成長中の重合体は、細胞の細胞膜領域を横断し、細胞外空間へと伸長する。ＨＡの生合成系は、最初に研究された膜ヘテロ多糖類合成経路の一つであるけれども、ＨＡの合成機構はいまだ良く理解されていない。これは、現在までに開発されたインビトロ系が、ＨＡのデノボ生合成が達成されていないという点で不十分だからである。
【０００５】
ＨＡ重合体が成長する方向は、本分野において通常の知識を有するものの間でいまだ意見が一致しない事項である。単糖類は、成長中のＨＡ鎖の還元または非還元末端へと付加できる。更に、（i）新生短鎖がタンパク質へと、UDPへと、あるいは脂質中間体へと共有結合によって連結されているかどうか、（ii）鎖がプライマーを用いて開始されているかどうか、および（iii）成熟した重合体が、連鎖球菌の細胞膜を通して伸長しているかどうかについて、問題が残っている。ＨＡの生合成の機構を理解することによって、このプロセスに干渉することで、連鎖球菌およびパスツレラ感染を制御するための他の戦略の開発が可能となるかもしれない。
【０００６】
ＨＡは、脊椎動物のほとんどすべての組織中で同定されており、種々の臨床用途において広範に使用されており、最も注目すべき適切な用途は関節内マトリックス補剤および眼科手術である。また、化学文献の示すところによれば、当初の認識ではＨＡは主として幾つかの結合組織のマトリックス中および特定株の細菌のカプセル中の受動的な構造成分であったが、この到るところに存在する高分子が多くの生物プロセス（胚形成の間の細胞の遊走および分化調節から、細胞外マトリックスの機構および代謝の調節まで、および転移、傷の治癒および炎症の複雑なプロセスにおける重要な役割まで）に動的に関与しているという認識へと移行している。更に、ＨＡが高度に代謝活性であり、細胞がその合成および分解のプロセスに対して一層注意を払っていることが明らかになり始めている。例えば、組織中のＨＡの半減期は、軟骨における１−３週間から表皮における１日未満まで変動する。
【０００７】
現在明らかなように、一種類のタンパク質が両方の糖基質を利用してＨＡを合成している。ＨＡシンターゼの略号であるＨＡＳは、この類の酵素を指示するものとして広範囲の支持を得ている。マルコヴィッチ他は、ストレプトコッカス  ピオジェネスから得たＨＡＳの活性を特徴付けることに成功し、この酵素の膜への局在化と、糖ヌクレオチド前駆体およびＭｇ2+への要求を発見した。プレムは、Ｂ６細胞によって産生された伸長中のＨＡが、培地に添加されたヒアルロニダーゼによって消化されることを発見し、ＨＡＳが細胞膜に存在することを提案した。また、フィリップソンとシュワルツは、ＨＡＳの活性が、マウスオリゴデンドログリオーマ細胞中の膜マーカーと共に分画されていることを発見した。
【０００８】
グリコサミノグリカン合成が進行するのにつれて、ＨＡＳは、高いＭｒを有するＨＡを組み立て、ＨＡは同時に膜を貫通して細胞外空間へと伸長する（あるいは細菌の場合には細胞カプセルを製造する）。核酸、タンパク質および脂質は核、小胞体／ゴルジ、細胞質またはミトコンドリア中で合成されることから、この態様の生合成は高分子の間では特異である。また、成長中の鎖の細胞外空間への伸長によって、無束縛の重合体成長が可能となり、これによって例外的に大きなサイズのＨＡがもたらされ、一方ゴルジまたは後ゴルジコンパートメント内での合成の束縛によって、生成する重合体の全体の量および長さは制限され得る。また、束縛された管腔内のＨＡの濃度が高いことによって高粘度の環境がもたらされ、これは他のオルガネラ機能に対しては有害であるかもしれない。
【０００９】
ＨＡのカプセル被膜を製造する連鎖球菌の菌株から、および真核細胞から、ＨＡＳを可溶化し、同定し、および精製するために幾つかの試みがなされてきた。連鎖球菌およびマウスオリゴデンドログリオーマの酵素は洗剤への溶解に成功し、研究されているけれども、活性のＨＡＳを更なる研究用に、あるいは分子クローニング用に精製する努力は、数十年にわたって不成功に終わっている。プレムおよびモーソルフは、過ヨウ素酸酸化したUDP−GlcAまたはUDP−GlcNAcを用いて、ＨＡＳと同時に精製された連鎖球菌膜中の−５２ｋＤａのタンパク質をアフィニティー標識した。この結果、Ｃ属の連鎖球菌ＨＡＳがクローニングされたと述べる報告書がもたらされたが、これは不幸にも誤っていた。この研究では、活性シンターゼの発現を示すことに失敗しており、実際にはペプチドトランスポーターをクローニングしていたかもしれない。トリスコットとファン  デ  リジンは、ジギトニンを使用し、連鎖球菌膜からのＨＡＳを活性形で溶解した。ファン  デ  リジンおよびドレークは、４２、３３および２７ｋＤａの３種類の連鎖球菌膜タンパク質を５−アジド−UDP−GlcAによって選択的に放射線標識し、３３ｋＤａのタンパク質がＨＡＳであると示唆した。しかし、後に発見されたところによれば、ＨＡＳは実際には４２ｋＤａのタンパク質であることが判明した。
【００１０】
これらの努力にもかかわらず、ＨＡの合成の調節および機構の理解の進歩は、実質的に止まっていた。なぜなら、ＨＡＳのｍＲＮＡまたはＨＡＳタンパク質のための分子プローブが存在しなかったからである。主要なブレークスルーが１９９３年に起こり、このときデアンジェリス他は、タンパク質ＨａｓＡをコード化するＡ属の連鎖球菌遺伝子の分子クローニングとキャラクタリゼーションとを報告した。このタンパク質の機能は（現在はspHAS（Ｓ．ピオジェネスＨＡＳ）と表記されているが）未知であるけれども、この遺伝子は、部分的には細菌のＨＡ合成に必要なオペロンからなることが知られている。次いで、spHASはＨＡ伸長を担っていることが明らかになり、同定およびクローニングされ、次いで発現が成功した最初のグリコサミノグリカンシンターゼである。このＳ．ピオジェネスＨＡ合成オペロンは、二つの他のタンパク質をコード化している。ＨａｓＢはUDP−グルコースデヒドロゲナーゼであり、これは、ＨＡ合成の基質の一つであるUDP−GlcAへとUDP−グルコースを変換するのに必要である。ＨａｓＣはUDP−グルコースピロホスホリラーゼであり、これはグルコース１−ホスフェートおよびＵＴＰをUDP−グルコースに変換するのに必要である。ｈａｓＡおよびｈａｓＢ遺伝子を、無被膜性の連鎖球菌株またはエンテロコッカス  フェカリスのいずれかへと同時にトランスフェクションすると、これらにＨＡを合成してカプセルを生成する能力が付与される。これによって、ＨａｓＡがＨＡシンターゼであるという最初の強力な証拠がもたらされた。
【００１１】
この捕捉しがたいＨＡシンターゼ遺伝子は、最終的にはトランスポゾン変異発生アプローチによってクローニングされ、ここではＨＡ合成オペロンのトランスポゾンによる阻止を含む無被膜性の変異群Ａ株を生成させる。このトランスポゾンの既知の配列によって、連鎖球菌ＤＮＡに関連する領域を同定し、次いで野性型細胞からクローニングすることが可能となった。このコード化されたspHASは、酵母キチンシンターゼ属と５−１０％相同であり、（原腸形成の間に発生的に発現する）ゼノプス  ラエビス（Xenopus laevis) タンパク質ＤＧ４２と３０％一致する。この機能はその時点では未知であった。デアンジェリスおよびワイゲルは、大腸菌中で活性の組換えspHASを発現させ、この一つの生成された遺伝子産物が、UDP−GlcAおよびUDP−GlcNAcとインビトロでインキュベートしたときに、高いＭｒのＨＡを合成することを示し、これによって１９５９年に最初に提案されたように、ＨＡ合成に必要な双方のグリコシルトランスフェラーゼ活性が同じタンパク質によって触媒されていることを示した。これによって、１９９６年にほとんど同時に真核細胞のＨＡＳのｃＤＮＡを４箇所の研究室で同定するという段階が開かれ、ＨＡＳが相異なるイソ酵素をコード化する多遺伝子属であることが明らかになった。二種類の遺伝子（ＨＡＳ１およびＨＡＳ２）は哺乳類において早期に発見され（２９−３４）、第三の遺伝子ＨＡＳ３は後で発見された。第二の連鎖球菌seHASまたはストレプトコッカス  エクイシミリスヒアルロナンシンターゼをここで発見し、本発明として請求し、本明細書に開示する。
【００１２】
また、上記したように、我々はＣ属のストレプトコッカス  エクイシミリス（seHAS）から真正なＨＡＳ遺伝子を精製した：このseHASタンパク質は、spHAS酵素に対して高水準の相同性（ほぼ７０％）を有している。しかし、この相同性は興味深い。なぜなら、seHAS遺伝子は、spHAS遺伝子に対して交差ハイブリダイゼーションしないからである。
【００１３】
組換えseHASを発現する大腸菌から調製した膜は、双方の基質を提供したときにはＨＡを合成する。この結果によって、Ｃ属のＨＡＳをクローニングしたと主張するランシング他の以前の報告が誤っていたことが確認された。不幸なことに、幾つかの研究において、このキャラクタリゼーションされていない５２ｋＤａの連鎖球菌タンパク質に対する抗体を使用して、真核細胞のＨＡＳと考えられたものを研究していた。
【００１４】
イタノおよびキムラは、ＨＡを合成できない変異マウスの哺乳類腫瘍細胞系中の発現クローニングを採用し、最初の推定哺乳類ＨＡＳ  ｃＤＮＡ（mmHAS１）をクローニングした。ＨＡ合成に欠陥があるサブクローンは、染色体細胞融合実験におけるＨＡ合成に対して相補的な三種類の別々の属に別れており、少なくとも３種類のタンパク質が必要であることを示唆している。これらの属のうちの２つは幾つかのＨＡ合成活性を維持しており、一方１つは何も示さなかった。後者の細胞系は、親細胞から調製したｃＤＮＡを用いた一時的トランスフェクション実験において使用されており、ＨＡ合成活性を保存する単一のタンパク質を同定しようとした。配列分析が示すところによれば、予期された膜形態を有する約６５ｋＤａのタンパク質の推定一次構造は、spHASの構造に類似している。mmHAS１はspHASに対して３０％相同であり、ＤＧ４２に対して５５％相同である。この報告書が現れたのと同じ月に、他の三つのグループが、同じマウスおよびヒト酵素であると最初は思われていたものをコード化するｃＤＮＡを記載した論文を提出した。しかし、異常な環境によって、これら４つの研究室では、双方の種中の別々のＨＡＳイソ酵素を発見していた。
【００１５】
イタノおよびキムラのものと同様の機能性クローニングアプローチを使用して、シジャン他は、ＨＡＳ１のヒトホモログを同定した。腸間膜ｃＤＮＡライブラリーを使用してマウス粘膜Ｔリンパ球をトランスフェクションし、次いでこれをロゼットアッセイでの付着能によってスクリーニングした。一つのトランスフェクタントの付着は、既知の細胞表面ＨＡ結合タンパク質であるＣＤ４４に対する抗血清によって阻止され、ヒアルロニダーゼによる前処理によって直接に廃棄された。従って、このトランスフェクタントによるロゼッティングには、ＨＡの合成が必要である。これを担うｃＤＮＡのクローニングおよび配列決定によって、ｈｓＨＡＳ１が同定された。また、イタノおよびキムラは、ヒトＨＡＳ１のｃＤＮＡをヒト胎児脳ライブラリーから分離したことを報告した。しかし、これら２つのグループから報告されたｈｓＨＡＳ１のｃＤＮＡは長さが異なっており、これらは５７８または５４３のアミノ酸を有するタンパク質をコード化していた。ＨＡＳの活性は、この長い方の形態についてのみ示されていた。
【００１６】
正統的なＨＡシンターゼとしてのspHASと、ＤＧ４２、spHASおよびＮｏｄＣ（リゾビウム中のβ−GlcNAcトランスフェラーゼノジュレーション因子）の間の相同性の近接した領域との分子的同定に基づいて、スパイサー他は、変性ＲＴ−ＰＣＲアプローチを用いて、第二の異なる酵素をコード化するマウス胎児ｃＤＮＡをクローニングし、これをmmHAS２と表記した。mmHAS２のｃＤＮＡのＣＯＳ細胞へのトランスフェクションは、粒子排除アッセイによって検出されるＨＡ細胞被膜のデノボ産生を目的としており、これによってこのＨＡＳ２タンパク質がＨＡを合成し得ることを示す強力な証拠がもたらされた。ワタナベおよびヤマグチは、同様のアプローチを使用し、ヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングしてｈｓＨＡＳ２を同定した。ファロップ他は、独立して同様の戦略を採用し、実際にＨＡを合成する卵巣偏平（cumulus)細胞から分離されたＲＮＡ中のmmHAS２を同定し、ＨＡの合成は排卵前濾胞中での正常偏平卵巣の膨張に対して重大なプロセスである。偏平細胞−卵母細胞複合体を、排卵サイクルが開始した直後に、ＨＡの合成が始まる前にマウスから分離し、および後の時点でＨＡの合成がちょうど始まったとき（３時間目）あるいは既に明白となったとき（４時間目）に分離した。ＲＴ−ＰＣＲが示すところによれば、ＨＡＳ２のｍＲＮＡは初期には存在しないが、しかし３−４時間後には高水準で発現し、このプロセスにおいてＨＡ合成をＨＡＳ２の転写が制御していることを示唆している。双方のｈｓＨＡＳ２は、長さがアミノ酸５５２個であり、９８％相同である。mmHAS１は長さがアミノ酸５８３個であり、アミノ酸長が５７８であるｈｓＨＡＳ１に対して９５％相同である。
【００１７】
最近は、スパイサー他はＰＣＲアプローチを使用し、哺乳類中の第三のＨＡＳ遺伝子を同定した。このmmHAS３タンパク質はアミノ酸の長さが５５４であり、mmHAS１、mmHAS２、ＤＧ４２およびspHASに対してそれぞれ７１％、５６％、２８％相同である。また、スパイサー他はこれら３種類のヒトおよびマウス遺伝子を３種類の異なる染色体に局在化した（ＨＡＳ１をｈｓＣｈｒ  １９／ｍｍＣｈｒ１７へ：ＨＡＳ２をｈｓＣｈｒ  ８／ｍｍＣｈｒ１５へ：ＨＡＳ３をｈｓＣｈｒ
１６／ｍｍＣｈｒ８へ）。これら３種類のＨＡＳ遺伝子が異なる染色体上に局在化していること、および脊椎動物門の全体にＨＡが発現していることは、この遺伝子属が古いものであり、イソ酵素が脊椎動物の進化の初期に重複によって発現したことを示唆している。また、細菌および真核細胞ＨＡＳの間の相同性が高いこと（約３０％）は、これら２種類が共通の先祖遺伝子を有することを示唆している。たぶん、初期の細菌は、真核遺伝子の産物が大きくなり、一層複雑となる前に、初期の脊椎動物の祖先からのＨＡＳ遺伝子を利用していたのであろう。又は、細菌は一層大きな脊椎動物のＨＡＳ遺伝子を得ることができ、酵素活性には必須ではない制御配列を削除できたのかもしれない。
【００１８】
デビッドおよび共同研究者によるＸ．ラエビスＤＧ４２の発見は、このタンパク質がＨＡシンターゼであることは知られていなかったけれども、近年の前記の進歩に顕著な役割を果たしてきた。それにもかかわらず、ＤＧ４２とspHASとが３０％相同であることは、哺乳類のＨＡＳ２の同定を可能とするオリゴヌクレオチドを設計する上で重要であった。皮肉なことに、ＤＧ４２が真正のＨＡシンターゼであるという決定的な証拠は、哺乳類イソ酵素の発見の後にしか報告されておらず、このときデアンジェリスおよびアチウサンは酵母（ＨＡを合成できない生物）中で組換えタンパク質を発現させ、分離された膜に前記二種類の物質を供給した場合には、酵母がＨＡを合成することを示した。また、メイヤーおよびクレイルは、ＤＧ４２のｃＤＮＡによってトランスフェクションした細胞からの溶出物によって、ＨＡの合成水準が上昇することを示した。現在、ＤＧ４２の機能は知られており、従ってＸ１ＨＡＳと呼ぶことができる。
【００１９】
前記したすべてのＨＡＳタンパク質は、共通の予期された構造的特徴を共有しており、大きな中央ドメインと、タンパク質のアミノおよびカルボキシル末端の双方に２−３のトランスメンブランまたはメンブラン関連ドメインのクラスターを有する。この中央ドメインは、予期された細胞内ＨＡＳタンパク質配列の最大約８８％を含有しているが、おそらくは酵素の触媒領域を含有している。この予期された中央ドメインは、spHASにおいては２６４アミノ酸長であり（全タンパク質の６３％）、真核細胞ＨＡＳ属においては３０７−３２８残基数長さである（全タンパク質の５４−５６％）。メンブランドメインの正確な数と配向、および細胞外および細胞内ループのトポロジー的な構成とは、いずれのＨＡＳに対してもいまだ実験的に測定されていない。
【００２０】
spHASは、精製され、部分的にキャラクタリゼーションされたＨＡＳ属の種である。spHAS／アルカリ  ホスファターゼ融合タンパク質を使用した初期の研究では、spHASのＮ末端、Ｃ末端および大きな中央ドメインが、実際に細胞の内側にあることが示された。spHASは６個のシステインを有しており、一方ＨＡＳ１、ＨＡＳ２およびＨＡＳ３はそれぞれ１３、１４および１４個のシステイン残基を有する。spHAS中の６個のシステイン残基のうち２つは、ＨＡＳ１とＨＡＳ２とにおいて保存されており、相同である。これらすべてのＨＡＳ属の種において、一つの保存システイン残基のみが同じ部位に見いだされる（spHAS中のCys−225）。これは必須のＣｙｓであるかもしれず、これをスルフヒドリル毒によって修飾すると酵素活性が部分的に阻害される。ジスルフィド結合が存在する可能性、あるいは下記の複数のあらゆるＨＡＳ機能に必要な必須のＣｙｓ残基の同定は、いまだＨＡＳ属のすべての種に対しては解決されていない。
【００２１】
細胞膜での合成に対して提案された態様が特異であることに加えて、ＨＡＳ酵素属は、ＨＡの重合の全体に対して必要な多数の機能において極めて異常である。少なくとも６種類の異なる活性がＨＡＳ酵素内に存在する：２種類の異なる糖ヌクレオチド前駆体（UDP−GlcNAcおよびUDP−GlcA）の各々に対する結合部位、二種類の異なるグリコシルトランスフェラーゼ活性、成長中のＨＡ重合体を酵素へとアンカーする一つ以上の結合部位（おそらくＢ−Ｘ7 −Ｂモチーフに関連している）、および成長中の重合体を一度に一つの糖だけ移動させるラチェット様転移反応である。この後者の活性は、重合体が膜を通って段階的に進行することに符合しているようである。これらの機能のすべては、およびおそらくは他の未知の機能は、４１９（spHAS）から５８８（ｘＨＡＳ）のアミノ酸のサイズ中に入る比較的に小さいタンパク質中に存在する。
【００２２】
すべての入手可能な証拠は、spHASタンパク質のみが細菌中あるいはインビトロでのＨＡの生合成に必要であるという結論を支持しているけれども、一層大きな真核ＨＡＳ属の種が、複数成分を有する複合体の一部であるという可能性がある。真核ＨＡＳタンパク質はspHASよりも約４０％小さいので、この付加されたタンパク質ドメインは、一層精密な機能、例えば細胞内トラフィッキングおよび局在化、酵素活性の調節、および他の細胞成分との相互作用の媒介に関与しているかもしれない。
【００２３】
複数の脊椎動物ＨＡＳ遺伝子が、異なるシンターゼをコード化しているという予期せざる発見は、ＨＡが組織中の単なる構造的成分ではなく、細胞の挙動の重要な調節因子であると言う、現在生じつつあるコンセンサスを強く支持している。このように、６カ月未満で、本分野は、一種類の既知のクローニングされたＨＡＳ（spHAS）から、複数の遺伝子属の認識へと移行し、これはＨＡの合成と生物学とを理解する上で、迅速で、多数のかつ興奮すべき将来の進歩を約束するものである。
【００２４】
例えば、本明細書に後で開示するものは、（１）パスツレラ  ムルトシダからのおよび（２）パラメシウム  ブルサリア  クロレラウイルス（paramecium bursaria chlorella virus ：ＰＢＣＶ−１）からの２種類のＨＡＳ遺伝子の配列である。これらの２種類の系中のヒアルロナンシンターゼの存在、およびこれら２種類の異なる系からのヒアルロナンシンターゼの精製および使用は、多数の異なる真核およびウイルス源中の酵素活性を有するヒアルロナンシンターゼをコード化する核酸配列を精製し、分離できることを示している。
【００２５】
Ｃ属のストレプトコッカス  エクイシミリス株Ｄ１８１は、ＨＡを合成し、分泌する。研究者達は、この株とＡ属のストレプトコッカス  ピオジェネス株、例えばＳ４３およびＡ１１１を使用して、ＨＡの生合成を研究し、ＨＡ合成活性を、その二価カチオン要求量、前駆体（UDP−GlcNAcおよびUDP−GlcA）利用量および至適ｐＨという基準で特徴付けた。
【００２６】
伝統的には、ＨＡは、雄鶏のとさかか、あるいは連鎖球菌培養物からの細胞外培地のいずれかから分離することによって商業的に調製されていた。ＨＡを調製するために開発されてきた方法の一つは、ＨＡを精製する連鎖球菌の培養物を使用することによる。米国特許４，５１７，２９５号はこうした手順を記述しており、ここでＨＡを生成する連鎖球菌を嫌気性条件下で炭酸ガスに富んだ育成培地中で発酵させる。これらの条件下でＨＡを生成させ、ブロスから抽出できる。一般的には、雄鶏のとさかからＨＡを分離することは労力がかかり、困難であると感じられている。なぜなら、ＨＡがより純度が低い状態から開始されるからである。雄鶏のとさかから分離することによる利点は、生成したＨＡが一層高い分子量を有することである。しかし、細菌発酵によってＨＡを調製する方が容易である。なぜなら、一層高い純度のＨＡから開始されるからである。しかし、一般的には、このようにして生成したＨＡの分子量は、雄鶏のとさかから得られたものよりも小さい。従って、細菌発酵によって高い分子量のＨＡを生成することを可能とする技術は、既存の手順に対して改善をもたらすであろう。
【００２７】
より高い分子量を有するＨＡは、化粧品から眼科手術にわたる、広範囲の有用な用途がある。それが高い粘度と高い生体適合性とを有する可能性があることから、ＨＡは硝子体液の置換物として眼科手術に特別な用途を見いだしている。また、ＨＡは、ＨＡを関節内注射することによって競争馬の外傷性関節炎を治療するのに使用されており、シェービングクリームにおいて潤滑剤として使用されており、種々の化粧品製品において使用されており、これはＨＡの高い粘度の生理化学的特性と、長期間にわたって湿潤性を保持する性能によっている。実際、１９９７年の８月に、米国食品医薬品局は、高分子量ＨＡを、影響を受けた関節内へと直接に注射することによって、高分子量のＨＡを使用して重度の関節炎を治療することを認可した。一般的には、採用したＨＡの分子量が高いほど良好である。これは、ＨＡ溶液の粘度が、この溶液中の個々のＨＡ重合体分子の平均分子量と共に増加するからである。不幸なことに、非常に高い分子量のＨＡ、例えは最大１０7にわたるＨＡは、現在入手可能な分離プロセスによっては得ることが難しかった。
【００２８】
これらの問題点および他の問題点を解決するために、一種以上の特性の改善、例えば純度の向上や調製の容易化をもたらすＨＡを生成するのに使用できるような、新規な方法およびコンストラクトに対する要望がある。特に、現在商業的に可能なものに比べて、多量の相対的に高分子量および相対的に純粋なＨＡを生産するための方法を開発することが必要である。更に、変更されたサイズ分布（ＨＡ△size）を有するＨＡおよび変更された構造（ＨＡ△mod）を有するＨＡを産生できる方法を提供する必要がある。
【００２９】
本発明は、本分野における一種以上の欠点を解決する。組換えＤＮＡ技術を使用し、酵素活性を有するseHASをコード化するコード領域を含む精製された核酸セグメントを、酵素活性を有するＨＡシンターゼを産生する方法、更にＨＡＳおよびそのヒアルロナン産物を産生する組換え細胞を調製するのに際してこの核酸セグメントを使用する方法と共に開示し、クレームする。
【００３０】
ここで、本発明の目的は、酵素活性を有するＨＡＳをコード化するコード領域を含む精製された核酸セグメントを提供することである。
【００３１】
本発明の他の目的は、酵素活性を有するＨＡＳをコード化するコード領域を含む精製された核酸セグメントを含む組換えベクターを提供することである。
【００３２】
本発明の更に他の目的は、酵素活性を有するＨＡＳをコード化するコード領域を含む精製された核酸セグメントを含む組換えベクターを用いて形質転換された、組換え宿主細胞を提供することである。
【００３３】
本発明の更に他の目的は、ＨＡＳを形質発現する細菌細胞を検出する方法を提供することである。
【００３４】
本発明の他の目的は、ヒアルロナンシンターゼ遺伝子、例えばseHASから高分子量および／または低分子量のヒアルロナンを産生する方法を提供することであり、また変更されたサイズ分布および／または修飾された構造を有するＨＡを産生する方法を提供することである。
【００３５】
本発明のこれらの目的および他の目的は、添付した明細書、請求の範囲および図面を参照すると明らかとなるであろう。
【００３６】
発明の概要
本発明は、ＨＡを調製する分野における一種以上の問題点を解決するために、組換えＤＮＡ技術を適用することに係るものである。これらの問題点は、酵素活性を有するストレプトコッカス  エクイシミリス（seHAS）ヒアルロナンシンターゼ遺伝子、即ちＨＡ鎖の生合成を担う遺伝子をコード化するコード領域を含む核酸セグメントを分離し、使用することによって解決される。このseHAS遺伝子は、適切な細菌源のＤＮＡからクローニングし、処理して、ＨＡの調製用および多量のＨＡＳ酵素自体の調製用に有用な組換えコンストラクトにした。
【００３７】
本発明は、新規な遺伝子であるseHASを包含する。この遺伝子の発現は、貪食作用および免疫検閲を回避する手段を与えることによって、Ａ属およびＣ属の連鎖球菌株の病原性に関連している。「ヒアルロン酸シンターゼ」「ヒアルロネートシンターゼ」「ヒアルロナンシンターゼ」および「ＨＡシンターゼ」の各用語は、互いに交換可能に使用されており、交互に現れるグルクロン酸とＮ−アセチルグルコサミン糖とからなり、β１，３およびβ１，４連結されているグルコサミノグリカン多糖類鎖を重合させる酵素を記述するものである。「seHAS」という用語は、ストレプトコッカス  エクイシミリスに由来するＨＡＳ酵素を記述するものである。
【００３８】
本発明は、ヒアルロネートまたはヒアルロン酸シンターゼ遺伝子、即ち、ヒアルロナンシンターゼ遺伝子、ｃＤＮＡおよび遺伝子産物（ＨＡＳ）の分離およびキャラクタリゼーションに関するものであり、グルクロン酸とＮ−アセチルグルコサミンとをグリコサミノグリカンヒアルロナンへと重合させるのに使用できる。本発明は、このseHASの遺伝子座を同定し、ストレプトコッカス  エクイシミリスからの酵素活性を有するseHAS遺伝子をコード化する核酸配列を開示する。また、このＨＡＳ遺伝子は、ヒアルロナンを産生するための細菌試料の可能性を評価するための新規なプローブを提供する。
【００３９】
本明細書に記載する技術および知識の用途を通して、本分野の当業者は、seHAS遺伝子をコード化する核酸セグメントを得ることができる。本分野の当業者が認識できるように、本明細書の開示に基づいて、これらの利点は、ＨＡＳ遺伝子の発現を制御し、産生されるseHAS遺伝子産物であるseHAS酵素の性質を制御できるという点で著しく有用である。
【００４０】
従って、本発明は、酵素活性を有するＨＡＳをコード化するコード領域を含む精製された核酸セグメントの分離に関するものであり、ここでＨＡＳは真核あるいは原核のいずれかに由来する。これが可能であるのは、この酵素、および実際にこの遺伝子が、真核および幾つかの原核細胞の双方の中に見いだされるものであるからである。また、真核細胞はＨＡを産生することが知られており、従って本発明によって使用できるＨＡシンターゼ遺伝子を含んでいる。
【００４１】
本発明のＨＡシンターゼをコード化する核酸セグメントは、全染色体またはゲノムＤＮＡから遊離して分離されているものとして定義され、これによってセグメントを組換えＤＮＡ技術によって容易に操作できる。従って、本明細書で使用する際には、「精製された核酸セグメント」という節は、非関連染色体またはゲノムＤＮＡから遊離して分離されており、組み換え技術の実施に有用に利用できる状態で保持されているＤＮＡセグメントを指しており、例えば別に分離されたＤＮＡフラグメント、あるいはこのフラグメントを含むベクター（例えば、プラスミド、ファージまたはウイルス）の形のＤＮＡを指す。
【００４２】
本発明の好適な実施形態は、酵素活性を有するＨＡＳをコード化するコード領域を含む、精製された核酸セグメントである。特に、この精製された核酸セグメントは配列番号２のseHASをコード化しているか、あるいは精製された核酸セグメントは、配列番号１によるヌクレオチド配列を含む。
【００４３】
本発明の他の形態は、酵素活性を有するＨＡＳをコード化するコード領域を含む精製された核酸セグメントを含んでおり、精製された核酸セグメントは、配列番号１のヌクレオチド配列に対してハイブリダイゼーションする能力を有する。
【００４４】
また、本発明は、プラスミド、コスミド、ファージまたはウイルスベクターからなる天然又は組換えベクターである。組換えベクターも、酵素活性を有するＨＡＳをコード化するコード領域を含む核酸セグメントを含んでよい。
【００４５】
特に、精製された核酸セグメントが配列番号２のseHASをコード化しているか、または精製核酸セグメントが配列番号１によるヌクレオチド配列を含んでいる。もしこの組換えベクターがプラスミドである場合には、それは更に発現ベクターを含んでよい。また、この発現ベクターは、酵素活性を有するseHASをコード化する領域に操作可能なように連結されたプロモーターを含む。
【００４６】
本発明の他の好適な実施形態は、組換えベクターによって形質転換された組換え宿主細胞、例えば原核細胞からなる。この組換えベクターは、酵素活性を有するＨＡＳをコード化するコード領域を含む精製された核酸セグメントを含んでいる。特に、この精製された核酸セグメントが配列番号２のseHASをコード化するか、あるいは精製された核酸セグメントは、配列番号１によるヌクレオチド配列を含む。
【００４７】
また、本発明は、組換えベクターによってトランスフェクションされた組換え宿主細胞、例えば真核細胞であり、組換えベクターは、酵素活性を有するＨＡＳをコード化するコード領域を含む精製された核酸セグメントを含んでいる。特に、この精製された核酸セグメントが配列番号２のseHASをコード化しているか、あるいは精製された核酸セグメントは配列番号１によるヌクレオチド配列を含んでいる。この概念は、修飾された構造または変更されたサイズ分布を有するヒアルロナン重合体を産生できる酵素として活性のＨＡＳをコード化する、特に修飾されたseHAS遺伝子を生成させることである。
【００４８】
更に、本発明は組換え宿主細胞に関するものであり、これをエレクトロポレートすることで、組換えベクターをこの組換え宿主細胞へと導入する。この組換えベクターは、酵素活性を有するＨＡＳをコード化するコード領域を含む精製された核酸セグメントを含んでいてよい。特に、精製された核酸セグメントが配列番号２のseHASをコード化するか、あるいは精製された核酸セグメントが配列番号１によるヌクレオチド配列を含んでいる。また、この酵素活性を有するＨＡＳは、変更された構造または変更されたサイズ分布を有するヒアルロナン重合体を産生する能力を有していてよい。
【００４９】
本発明の更に他の実施形態は、組換えベクターによって転換された組換え宿主細胞であり、組換えベクターは、酵素活性を有するＨＡＳをコード化するコード領域を含む精製核酸セグメントを含んでいる。特には、精製された核酸セグメントは配列番号２のseHASをコード化し、あるいは精製された核酸セグメントは配列番号１によるヌクレオチド配列を含んでいる。また、この酵素活性を有するＨＡＳは、変更された構造または変更されたサイズ分布を有するヒアルロナン重合体を産生する能力を有する。
【００５０】
また、本発明は精製された組成物であり、ここで精製された組成物は、酵素活性を有するＨＡＳをコード化するコード領域を含み、更に配列番号２によるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含有する。
【００５１】
本発明の他の実施形態では、ＤＮＡ種を検出する方法を提供し、本方法は、（１）ＤＮＡ試料を得るステップ、（２）配列番号１による精製された核酸セグメントをこのＤＮＡ試料と接触させるステップ、（３）このＤＮＡ試料と、精製された核酸セグメントとをハイブリダイゼーションさせ、これによってハイブリダイゼーション複合体を生成させるステップ、および（４）この複合体を検出するステップを含んでいる。
【００５２】
また、本発明は、seHASをコード化するｍＲＮＡを発現する細菌細胞を検出する方法であり、本方法は、（１）細菌細胞の試料を得るステップ、（２）この細菌細胞の試料からの少なくとも一種の核酸を、配列番号１による精製された核酸セグメントと接触させるステップ、（３）少なくとも一種の核酸を、精製された核酸セグメントとハイブリダイゼーションさせることによって、ハイブリダイゼーション複合体を生成させるステップ、および（４）このハイブリダイゼーションした複合体を検出するステップを含んでおり、ここでこのハイブリダイゼーション複合体の存在が、seHASをコード化するｍＲＮＡを発現する細菌株の指標となる。
【００５３】
また、本発明は、細胞中でseHASまたはspHASのいずれかの存在を検出する方法である。特に、本方法は、配列番号３−８に記載されたオリゴヌクレオチドをプローブとして使用することを含む。これらのオリゴヌクレオチドによって、実務家が、細胞中のseHASまたはspHASの存在を探索し、検出することが可能となる。
【００５４】
更に、本発明は、ヒアルロナンを産生する方法であり、本方法は、（１）酵素活性を有するＨＡＳをコード化するコード領域を含む精製された核酸セグメントを宿主生物中へと導入するステップ（ここで宿主生物は、UDP−GlcNAcおよびUDP−GlcAを産生する酵素をコード化する核酸セグメントを含んでいる）、（２）この宿主生物を培地中で育成させてヒアルロナンを分泌させるステップ、および（３）分泌されたヒアルロナンを回収するステップを含む。
【００５５】
また、本方法は、培地から、分泌されたヒアルロナンを抽出するステップを含んでいてよく、抽出されたヒアルロナンを精製するステップを含んでいてよい。更に、この宿主生物は、構造的に修飾されたヒアルロナンまたはサイズが変更されたヒアルロナンを分泌してよい。
【００５６】
更に、本発明は、予め選択された薬剤と、組換えＨＡＳによって産生された有効量のヒアルロナンとを含有する薬剤組成物である。この薬剤組成物は、変更された分子量を有するヒアルロナンを含有していてよく、この薬剤組成物は免疫反応を回避する能力を有する。また、こうして変更された分子量によって、この変更された分子量の薬剤組成物に対して親和性を有する患者内の特定の組織または細胞型を標的とできる薬剤組成物を生成させ得る。
【００５７】
また、本発明は、酵素活性を有するseHASをコード化する、精製および分離された核酸配列であり、ここでこの核酸配列は、（ａ）配列番号１による核酸配列であり、（ｂ）配列番号１による核酸配列に相補的な核酸配列であり、（ｃ）配列番号１による核酸に対してハイブリダイゼーションし得る核酸配列であり、および（ｄ）配列番号１に相補的な核酸配列に対してハイブリダイゼーションし得る核酸配列である。
【００５８】
更に、本発明は、実質的に、酵素活性を有するＨＡＳをコード化する核酸セグメントからなる、精製および分離された核酸セグメントである。
【００５９】
また、本発明は、seHASをコード化する核酸セグメントから実質的に構成される分離された核酸セグメントであり、seHASは配列番号１による核酸セグメントと十分に重複する核酸セグメントを含んでおり、これによって酵素活性を有するＨＡＳをコード化する生物学的特性の保持が可能となっている。
【００６０】
また、本発明は、酵素活性を有するＨＡＳをコード化するコード領域を含む精製された核酸セグメントであり、ここで精製された核酸セグメントは、配列番号１によるヌクレオチド配列とハイブリダイゼーションする能力を有する。
【００６１】
発明の詳細な説明
本発明の少なくとも一つの実施形態を詳細に説明する前に、次の説明文または図面の中の説明に記載した構成の詳細および要素配置には、本発明の適用は制限されないものであることが理解されるべきである。本発明は、他の実施形態であってよく、あるいは種々の方法で実施し、実行され得る。また、本明細書における文節表現および用語は、説明の便宜のためのものであり、本発明を制限するものとして見なされてはならないことが理解されるべきである。
【００６２】
本明細書で使用する際には、「核酸セグメント」および「ＤＮＡセグメント」という用語は交換可能なように使用されており、特定種の全ゲノムＤＮＡから遊離して分離されたＤＮＡ分子を指す。従って、本明細書で使用する「精製された」ＤＮＡまたは核酸セグメントは、ヒアルロナンシンターゼ（ＨＡＳ）コード配列を含むＤＮＡセグメントを指しており、非関連ゲノムＤＮＡ、例えばストレプトコッカス  エクイシミリスの全体、あるいは例えば哺乳類宿主ゲノムＤＮＡから分離された、あるいは遊離して精製されたものを指す。本明細書に含まれる「ＤＮＡセグメント」という用語は、ＤＮＡセグメントおよびこのセグメントの一層小さいフラグメントであり、また例えばプラスミド、コスミド、ファージ、ウイルスなどを含む組換えベクターである。
【００６３】
同様に、分離あるいは精製されたseHAS遺伝子を含有するＤＮＡセグメントは、他の自然発生した遺伝子やタンパク質をコード化する配列から実質的に離れて分離された、ＨＡＳをコード化する配列を含むＤＮＡセグメントを指している。この点において、「遺伝子」という用語は、単純化のために機能性タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドをコード化する単位を指すために使用されている。本分野の者には理解されるであろうように、この機能的な用語には、ゲノム配列、ｃＤＮＡ配列またはその組み合わせが含まれる。「他のコード領域から実質的に離れて分離された」とは、目的とする遺伝子が、この場合にはseHASが、ＤＮＡセグメントのコード領域の大部分を形成しており、このＤＮＡセグメントが、自然発生するコード化ＤＮＡの大部分、例えば大きな染色体フラグメントまたは他の機能性遺伝子またはＤＮＡコード化領域を含有していないことを意味する。もちろん、これは最初に分離されたＤＮＡセグメントを指しているが、後で付加された遺伝子またはコード領域を排除しておらず、あるいは人間の手によってこのセグメント中へと意図的に残されたコード領域を排除していない。
【００６４】
原核生物源を使用することによる特定の利点によって、原核生物、例えばＡ．ピオジェネス、Ｓ．エクイシミリス、あるいはＰ．プルトシダからのＨＡＳ遺伝子を分離することに最も利益があることを認識できそうである。こうした利点の一つは、典型的には、真核酵素には、真核宿主中でしか実現できない顕著な翻訳後修飾を必要とし得ることである。これによって、得られたあらゆる真核ＨＡシンターゼ遺伝子の用途が制限される傾向がある。更に、本分野の当業者は、時間の点と、原核酵素遺伝子を採用しようとしている遺伝子操作の容易さの点で、更なる利点を認識しそうである。これらの更なる利点として、（ａ）ゲノムのサイズが比較的に小さいことによって、原核生物の遺伝子の分離が容易であり、従って、対応するゲノムライブラリーのスクリーニングの量が減少し、（ｂ）原核生物の遺伝子のコード領域の全体のサイズが、イントロンがないことによって著しく小さいことから、操作が容易であることが挙げられる。更に、もしseHAS遺伝子の産物（例えば酵素）に翻訳後修飾が必要である場合には、これは遺伝子が由来する原核細胞環境（宿主）中で最も良く実現できる。
【００６５】
好ましくは、本発明によるＤＮＡ配列には、更に選択された組換え宿主中の配列の発現を可能とする遺伝子制御領域を含ませることができる。もちろん、採用する制御領域の性質は、一般的には、計画する特定の用途（例えばクローニング用宿主）に依存して変化するであろう。
【００６６】
本発明の特定の実施形態は、seHAS遺伝子をコード化するＤＮＡ配列を包含する分離ＤＮＡセグメントおよび組換えベクターに関するものであり、これはそのアミノ酸配列の中に、配列番号２によるアミノ酸配列を含んでいる。更に、本発明の他の特定の実施形態は分離ＤＮＡセグメントおよび組換えベクターに関するものであり、ＤＮＡセグメントおよび組換えベクターは、ＨＡＳ遺伝子またはストレプトコッカス  エクイシミリスＨＡＳに対応するＤＮＡ、特にはＨＡＳ遺伝子またはｃＤＮＡのアミノ酸配列を、そのアミノ酸配列中に含む遺伝子をコード化するＤＮＡ配列を包含している。例えば、このＤＮＡセグメントまたはベクターが全長ＨＡＳタンパク質をコード化する場合には、あるいはＨＡＳタンパク質の発現に使用することを意図している場合には、好適な配列は、実質的に配列番号２に記載された配列である。
【００６７】
ＨＡシンターゼとしての活性を有する核酸セグメントは、本明細書に記載した方法によって分離できる。「実質的に配列番号２に記載した配列」という用語は、この配列が配列番号２の一部分に実質的に対応しており、配列番号２のアミノ酸と同一ではない、あるいは生物学的機能が等価である比較的に少数のアミノ酸を有していることを意味する。「生物学的な機能が等価」という用語は、本分野において良く知られており、本明細書において更に詳細に定義すると、実質的に配列番号２に記載の配列を有する遺伝子であり、原核細胞がＨＡまたはヒアルロン酸被膜、即ち、ヒアルロナン被膜を産生する能力に関連している。
【００６８】
例えば、seHASおよびspHASコード配列は約７０％相同であり、アデニン塩基（Ａ）およびチミン（Ｔ）塩基に富んでいる。seHASにおける塩基含有量は、Ａが２６．７１％であり、Ｃが１９．１３％であり、Ｇが２０．８１％であり、Ｔが３３．３３％である（Ａ／Ｔ＝６０％）。一方、spHASでは、Ａが３１．３４％であり、Ｃが１６．４２％であり、Ｇが１６．３４％であり、Ｔが３５．８％である（Ａ／Ｔ＝６７％）。本分野における当業者は、７０％の相同性にもかかわらず、seHASコード配列がspHAS遺伝子とハイブリダイゼーションせず、逆もまた真であることに驚かされるであろう。この予期せざる交差ハイブリダイゼーションの不可能性は、オープンリーディングフレームの全体にわたってミスマッチ塩基が短期の阻止をもたらすことに起因しているかもしれない。spHASとseHASとが交差ハイブリダイゼーションできないことを図１に示す。seHASおよびspHASコード配列の双方に共通の相同ヌクレオチドの最も長いストレッチは、僅かに２０ヌクレオチドである。更に、非常にＡ−Ｔに富んだ配列は、Ｇ−Ｃに富んだ配列に比べて安定性の低いハイブリダイゼーション複合体しか生成しないであろう。他の可能な説明は、双方の配列中のＡｓまたはＴｓの幾つかのストレッチが、誤配向した状態あるいは不安定な状態でハイブリダイゼーションし得るということであるかもしれない。これによって、seHASおよびspHAS遺伝子配列が相互に枠の外側へと置かれることになり、これによって産生ハイブリダイゼーションの蓋然性が減少する。
【００６９】
７０％相同であるタンパク質をコード化する二つの遺伝子が互いに交差ハイブリダイゼーションできないという特異な現象のために、クレームされた核酸セグメントをその機能の観点から考慮することが有益である：即ち、酵素活性を有するヒアルロナンシンターゼをコード化する核酸セグメントであるという観点である。本分野の当業者であれば、酵素活性を有するヒアルロナンシンターゼをコード化する核酸セグメントは、配列番号１および２に記載の配列に対して保存されたあるいは半保存された置換物を含有していてよく、なお本発明の範囲内に入ることを了解できる。
【００７０】
特に、本分野は、実務家がある核酸セグメントへと構造的変化をもたらし（即ち、保存された、あるいは半保存されたアミノ酸置換をコード化し）、しかもその酵素としてあるいは機能的な活性を保持できるという実例に溢れている。例えば、（１）リスラー他「構造的に関連するタンパク質におけるアミノ酸置換：パターン認識的アプローチ（Amino Acid Substitutions in Structurally Related
Proteins: A Pattern Recognition Approach)」（J. Mol. Biol. )204:1019-1029、1988年参照：「アミノ酸側鎖の交換可能性の観測に従うと、四種類のグループだけが記述できた：（ｉ）ＩｌｅおよびＶａｌ；（ii）ＬｅｕおよびＭｅｔ；（iii）Ｌｙｓ、ＡｒｇおよびＧｌｎ；および（iv）ＴｙｒおよびＰｈｅである」（２）ニーファインド他「主鎖折り畳みアノリに由来するタンパク質モデリングおよび配列アラインメントに対するアミノ酸の類似係数（Amino Acid Similarlity Coefficients for Protein Modeling and Sequence Alignment Derived from Main-Chain Folding Anoles) 」（J. Mol. Biol. )219:481-497(1991 年) 参照「類似性パラメーターによって、アミノ酸の置換を設計することが可能となる」：および（３）オヴァリントン他「環境特異的なアミノ酸置換表：ターシャリー鋳型とタンパク質の折り畳みの予測（Environment-Specific Amino Acid Substitution Tables: Tertially Templates and Prediction of Protein Folds) 」(Protein Science) 1: 216-226 (1992年) 参照「局所的環境の関数として観測した置換のパターンを分析したところ、顕著なパターンがあることを発見した・・・適合性のある変化をもたらすことができる。」
これらの文献および無数の他の文献は、本分野の当業者であれば、ある核酸配列を与えれば、その機能を変化させることなしにその核酸配列に対して置換および変更を加えることができることを示している。また、置換された核酸セグメントは高度に相同性であり、その変化していない親についての酵素活性を保持し、しかも未だこれに対してハイブリダイゼーションしないものであってよい。
【００７１】
本発明で開示する核酸セグメントは、酵素活性を有するヒアルロナンシンターゼ−seHASおよびspHASをコード化する。seHASとspHASとは７０％相同であり、双方が酵素活性を有するヒアルロナンシンターゼをコード化しているけれども、これらは交差ハイブリダイゼーションしない。ここで、本分野の当業者は、配列番号１に列記したseHASの核酸セグメントに対して、本発明のクレームの範囲外へと出ることなしに、置換を行うことができることを了解できる。標準化され、許容されている機能的に等価なアミノ酸置換を表１に示す。
【００７２】
【表１】
0004731013.tif 000002
【００７３】
本発明の他の好適な実施形態は、配列番号２によるタンパク質をコード化する精製された核酸セグメントであり、組換えベクターとして更に定義する。本明細書で使用する際には、「組換えベクター」という用語は、ＨＡＳタンパク質をコード化する核酸セグメントあるいはそのフラグメントを含むように修飾されたベクターを指す。この組換えベクターは、前記ＨＡＳをコード化する核酸セグメントに操作可能なように連結されたプロモーターを含む発現ベクターとして更に定義できる。
【００７４】
本発明の更に好適な実施形態は、ＨＡＳ遺伝子を含む組換えベクターによって組換え体とされた宿主細胞である。好適な組換え宿主細胞は、原核細胞であってよい。他の実施形態においては、この組換え宿主細胞は真核細胞である。本明細書で使用する際には、「処理された」あるいは「組換え」細胞という用語は、組換え遺伝子、例えばＨＡＳをコード化する遺伝子が内部へと導入された細胞を指すことを意図している。従って、処理された細胞は、組み換え体として導入された遺伝子を含有しない自然発生的な細胞とは区別できる。このように処理された細胞は、人間の手によって導入された一つあるいは複数の遺伝子を有する細胞である。組み換えによって導入された遺伝子は、ｃＤＮＡ遺伝子の形であってよく、ゲノム遺伝子の形であってよく、あるいは特に導入された遺伝子に天然では関連していないプロモーターに隣接して配置された遺伝子を含有している。
【００７５】
組換えＨＡシンターゼを産生するために使用する場合のように、連鎖球菌以外の宿主を使用することを望む場合には、大腸菌、Ｂ．サブティリス、ラクトコッカス  ｓｐ．のような原核系を採用することが有利であり、あるいは酵母、中国ハムスターの卵巣、アフリカミドリザルの人造細胞、ＶＥＲＯ細胞などのような真核系でさえも採用することが有利であり得る。もちろん、これを採用した場合には、一般的には選択された他の宿主中で機能する配列の制御下でＨＡシンターゼ遺伝子を運ぶことが望ましい。適切なＤＮＡ制御配列、およびその構成および使用方法は、一般的に本分野において既知であり、本明細書において一層詳細に議論する。
【００７６】
好適な実施形態においては、ＨＡシンターゼをコード化するＤＮＡセグメントは、更に本分野において複製の原型あるいは「レプリコン」として機能が知られているＤＮＡ配列を含有しており、これによって特定の宿主による連続的な配列の複製が可能となる。こうした原型によって、染色体外に局在化し、複製するキメラセグメントまたはプラスミドを調製することが可能となり、これらに対してＨＡシンターゼＤＮＡ配列を連結させる。一層好適な場合には、採用した原型が、バイオテクノロジー用途に適した細菌宿主中で複製可能なものである。しかし、クローニングされたＤＮＡセグメントを一層汎用性とするためには、（例えばシャトルベクターにおけるように）使用を企図する他の宿主系が認識する原型を、代わりにあるいは付加的に採用することが望ましい場合がある。
【００７７】
ＳＶ４０、ポリオーマまたはウシパピローマウイルス源のような他の複製源を分離し、使用することは、多数の高等生物におけるクローニングまたは発現に採用できるが、本分野の当業者には良く知られている。従って、特定の実施形態においては、本発明は組換え形質転換ベクターとして定義され、ベクターは、適切な複製源と共に、選択された制御領域の制御下にあるＨＡシンターゼをコード化する遺伝子配列を含む。
【００７８】
ここで、本分野の当業者であれば評価できるように、本明細書の開示に基づいて、他の手段をＨＡＳ遺伝子またはｃＤＮＡを得るために採用できる。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応またはＲＴ−ＰＣＲ法によって産生された、ｃＤＮＡライブラリーのような、多数の源からの遺伝子またはｃＤＮＡの全補体を含有するＤＮＡフラグメントを得ることができ、源には連鎖球菌の他の株または真核源が含まれる。実質的にあらゆる分子クローニングのアプローチを、本発明によるＤＮＡフラグメントの生成に利用できる。このように、ＤＮＡを分離するために採用される特定方法に対する一般的な制限は、分離された核酸が生物学的機能が等価なＨＡシンターゼをコード化しなければならない点だけである。
【００７９】
いったんこのＤＮＡが分離されると、ＤＮＡは選択されたベクターと連結される。実質的にあらゆるクローニングベクターを採用し、本発明による利点を実現できる。典型的な有用なベクターとしては、原核生物用のプラスミドおよびファージがあり、真核生物用のウイルスベクターさえも挙げられる。例としては、ｐＫＫ２２３−３、ｐＳＡ３、組換えラムダ、ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ウシパピローマウイルスおよびレトロウイルスがある。しかし、ラクトコッカスまたはバシラス株と大腸菌との双方において複製能力を有するベクターを採用したときに、特に利益が最終的に実現されるものと考えられる。
【００８０】
ダオおよびフェレッティのｐＳＡ３ベクターあるいはトリュー−クオット他のｐＡＴ１９ベクターによって例示されるような、例えばこれらのベクターによって、大腸菌のような容易に操作可能な宿主中でクローンコロニーの選択を実施することができ、次いでＨＡを産生させるために食品等級のラクトコッカスまたはバシラス株へと引き続いて戻すことができる。これらは、バイオテクノロジー産物および特定食品を生産する際に使用される、良性で良く研究された生物である。これらが有利であるのは、ラクトコッカスまたはバシラス株がＨＡを合成する能力を遺伝子投与（即ち、ＨＡシンターゼ遺伝子の更なるコピーを複製によって供給すること）によって増加させることができると言う点にあり、および／または、付加的な遺伝子を含有させることによってＨＡ前駆体の利用可能性を改善できるという点にある。また、細菌がＨＡを合成する固有の能力は、ＨＡシンターゼ遺伝子を担持するプラスミドの別のコピーの生成、あるいは複製によって増大させることができる。この複製によって、プラスミドのコピー数、従って、ＨＡシンターゼ遺伝子のコピー数が最大１０倍に上昇することを説明できる。
【００８１】
ＨＡシンターゼ遺伝子のコピー数を更に増大させるであろう他の手順は、遺伝子の複数のコピーをプラスミド中へと挿入することである。他の技術としては、ＨＡＳ遺伝子を染色体ＤＮＡ中へとインテグレートすることが挙げられる。この更なる複製は特に実現できそうである。なぜなら、細菌性のＨＡシンターゼ遺伝子のサイズは小さいからである。幾つかのシナリオにおいては、この染色体ＤＮＡ連結ベクターを採用して、クローンスクリーニングの目的のために選択した宿主、例えば大腸菌を、選択された宿主中で挿入ＤＮＡを発現できるベクターを用いてトランスフェクションする。
【００８２】
真皮、滑膜繊維芽細胞または雄鶏のとさかの細胞のような真核源を採用した場合には、最初はｃＤＮＡライブラリーを調製することから始めようと望むであろう。これを実施する際には、最初に上記の細胞からｍＲＮＡを分離し、次いで逆転写酵素活性を有する酵素を用いて二本鎖ｃＤＮＡを調製し、選択されたベクターと連結する。二本鎖ｃＤＮＡを調製するためには本分野において多数の可能性があり、既知であり、すべてのこうした技術は適用可能であると考えられる。好適な技術としては逆転写が挙げられる。いったん二本鎖ｃＤＮＡの集団を得たら、選択された宿主中で、許容される技術、例えば適切なベクター中への連結または適切な宿主中での複製によってｃＤＮＡライブラリーを調製する。多数のクローンが得られること、および多数のクローンを本明細書に記載の技術によってスクリーニングするのが比較的に容易なことから、ｃＤＮＡクローンをクローニングおよび発現スクリーニングする際に、ファージ発現ベクター、例えばλｇｔ１１、λｇｔ１２、λＧｅｍ１１、および／またはλＺＡＰの採用が望ましい場合がある。
【００８３】
ある他の具体例において、本発明は、実質的に配列番号１に記載された核酸配列をその配列内に含む単離されたＤＮＡセグメントおよび組換えベクターに関する。「実質的に配列番号１に記載された」という用語は、前記されたのと同一意味で使用され、核酸配列が配列番号１の一部と実質的に対応し、配列番号１のコドンと同一または機能的に同等ではない比較的少ないコドンを有することを意味する。「機能的に同等のコドン」という用語は、ここでは、表Ｉに記載されたように、アルギニンまたはセリンについての６個のコドンのような、同一アミノ酸をコードするコドンをいい、また、生物学的に同等のアミノ酸をコードするコドンをいう。
【００８４】
また、アミノ酸および核酸配列は、さらなるＮ−もしくはＣ−末端アミノ酸または５’もくしは３’核酸配列のような、さらなる残基を含むことができ、配列が、依然として、蛋白質発現および酵素活性に関する場合に生物学的蛋白質活性の維持を含めた、前記した基準に合致する限りは、実質的にここに開示した配列のうちの１つに記載されていることも理解されるであろう。末端配列の付加は、特に、例えば、コード領域の５’または３’部分いずれかに近接してそれを挟む種々の非コーディング配列を含むことができるか、あるいは遺伝子内に起こることが知られている種々の内部配列を含むことができる核酸配列に適用される。特に、真核生物におけるＨＡＳ遺伝子のアミノ酸配列は原核生物で見出されるよりも４０％大きいようである。
【００８５】
遺伝コードの縮重ならびに保存されたおよび半保存された置換を可能とすると、配列番号１のヌクレオチドと同一であるヌクレオチドの約４０％および約８０％の間；またはより好ましくは約８０％および約９０％の間；またはさらにより好ましくは約９０％および約９９％の間を有する配列は「実質的に配列番号１に記載されている」配列であろう。配列番号１に記載されたものと実質的に同一である配列は、標準的なまたはよりストリンジェントではないハイブリダイジング条件下で配列番号１の補体を含有する核酸セグメントにハイブリダイズすることができる配列と機能的に定義することもできる。適当な標準的ハイブリダイゼーション条件は当業者によく知られており、本明細書に明瞭に記載される。
【００８６】
本明細書で用いる「標準的なハイブリダイゼーション条件」という用語は、実質的に相補的な核酸セグメントが標準的なワトソン−クリック塩基対合を形成するであろう条件を記載するのに使用される。ｐＨ、温度、塩濃度、ホルムアミドおよびジメチルスルホキシドのような剤の存在、ハイブリダイズするセグメントの長さ等のような、結合またはハイブリダイゼーションの特異性を決定する多数の因子が知られている。より短い核酸セグメント、例えば、約１４および約１００ヌクレオチドの間の断片がハイブリダイゼーションで使用されることが考えられる場合、ハイブリダイゼーションについての塩および温度の好ましい条件は４０〜５０℃における１．２〜１．８×ＨＰＢを含むであろう。
【００８７】
当然に、本発明は、配列番号１に記載された配列と相補的であるまたはそれと実質的に相補的であるＤＮＡセグメントも含む。「相補的」である核酸配列は、標準的なワトソンークリック相補性則に従って塩基対合できるものである。本明細書で用いるように、「相補的配列」という用語は、前記した同一ヌクレオチド比較によって評価できるように、あるいは配列番号１の核酸セグメントにハイブリダイズできるものと定義されるように、実質的に相補的である核酸配列を意味する。
【００８８】
コーディング配列それ自体の長さに拘わらず、本発明の核酸セグメントは、それらの総じての長さがかなり変化できるように、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、さらなる制限酵素部位、多重クローニング部位、エピトープタグ、ポリヒスチジン領域、他のコーディングセグメント等のような、他のＤＮＡ配列と組み合わせることができる。従って、ほとんどいずれの長さの核酸断片も使用することができると考えられ、全長は好ましくは調製の容易性および意図した組換えＤＮＡプロトコルにおける使用によって制限される。
【００８９】
当然に、本発明は、配列番号１および２の特別の核酸およびアミノ酸配列に限定されないことも理解されるであろう。従って、組換えベクターおよび単離されたＤＮＡセグメントは、ＨＡＳコード領域それ自体、選択された改変または修飾を基本的コード領域中に担持するコード領域を種々に含むことができ、あるいはそれらはそれにも拘わらずＨＡＳコード領域を含むより大きなポリペプチドをコードすることができるか、あるいは変異体アミノ酸配列を有する生物学的に機能的同等蛋白質またはペプチドをコードすることができる。
【００９０】
例えば、本発明者らは、２つの他の系：（ａ）グラム陰性菌Pasturella multocida（配列番号１９）；および（ｂ）クロレラウイルスＰＢＣＶ−１（配列番号：７および８）においてヒアルロナンシンターゼを見出し、特徴付け、そして精製した。これらの２つの系におけるヒアルロナンシンターゼおよびこれらの２つの系からのヒアルロナンシンターゼを精製し、それを使用する本発明者らの能力は、酵素的に活性なヒアルロナンシンターゼをコードする核酸配列を精製し、単離する本発明者らの能力を示す。
【００９１】
Carter型ＡのP. multocida（配列番号１９）の莢膜は、長い間、ヒアルロン酸−ＨＡ、即ち、ヒアルロナンを含有すると疑われてきた。P. multocidaのＨＡ合成の特徴は、それとseHASおよびspHAS蛋白質の間の興味深い酵素学的差異に導いた。
【００９２】
P. multocida細胞は容易に目に見える細胞外ＨＡ莢膜を生じ、２つのstreptococcal HASは膜蛋白質であるので、家禽コレラ病原体の膜調製物をテストした。初期のトライアルにおいて、streptococcal HAS活性を測定するためのものと同様の条件下でアッセイすると、超音波処理に由来する粗製膜画分は単独でＨＡへの非常に低レベルのUDP−GlcNAc−依存性UDP−［14Ｃ］GlcA取り込み［〜０．２pmolのGlcA導入（蛋白質μｇ）-1ｈ-1］を保有した。組換えｈａｓＡプラスミドを持つ大腸菌からの酵素もまた最初単離しにくかった。これらの結果は、同様の方法によって、streptococcusから得られた容易に検出できる量とは対照的であった。
【００９３】
超音波処理と組み合わせたプロテアーゼ阻害剤の存在下での氷冷リソソーム処理を用いる別の調製プロトコルは、グラム陰性菌の両種からのＨＡＳ活性の実質的回収を可能した。５〜１０pmolのGlcAが導入されたＨＡＳについての特異的活性（蛋白質μｇ）-1ｈ-1は、新しい方法で野生型P. multocidaの粗製膜につきルーチン的に得られた。UDP−GlcNAcの不存在下では、UDP−［14Ｃ］GlcAからの放射能は、より高い分子量の物質に実質的には取り込まれなかった（両糖前駆体での同一アッセイの＜１％）。無莢膜突然変異体ＴｎＡから調製された膜は、両糖ヌクレオチド前駆体を補足した場合、検出可能なＨＡＳ活性は保有しなかった（データは示さず）。Sephacryl S-200カラムを用いるゲル濾過分析は、イン・ビトロで合成された14Ｃ−標識生成物の大部分の分子量が２８×１０4Ｄａであることを示す。というのは、該物質はボイド容量に溶出するので、このような値は少なくとも４００モノマーよりなるＨＡ分子に対応するからである。この生成物はStreptomycesヒアルロニダーゼ消化に感受性であるが、プロテアーゼ処理に対しては抵抗性である。
【００９４】
ＨＡＳアッセイのパラメーターを変化させて、P. multocida膜によるUDP−糖の多糖への取り込みを最大化した。Streptococcal spHASはＭｇ2+を要し、従って、この金属イオンは、P. multocida膜の最初のアッセイに含まれた。P. multocida HAS(pmHAS)は、トリス型緩衝液中でｐＨ６．５ないし８．６で比較的活性であり、ｐＨ７で最適である。ＨＡＳ活性は、少なくとも１時間、中性ｐＨにて、インキュベーション時間に対して直線的であった。より高いイオン強度ではpmHASは見かけ上活性が低かった。何故ならば、５０ｍＭトリス、ｐＨ７および２０ｍＭ  ＭｇＣｌ2を含有する反応への１００ｍＭ  ＮａＣｌの添加は〜５０％だけ糖取り込みを減少させたからである。
【００９５】
pmHASの金属イオン特異性はｐＨ７で評価した。ＥＤＴＡの存在下における金属フリー条件下では、多糖への放射標識前駆体の取り込みは検出できなかった（最大シグナルの＜０．５％）。Ｍｎ2+は、テストした金属（Ｍｇ、Ｍｎ、Ｃｏ、Ｃｕ、およびＮｉ）についての最低イオン濃度での最高取り込みを与えた。Ｍｇ2+は１０倍高い濃度におけるを除きＭｎ2+刺激の約５０％を与えた。１０ｍＭにおいてＣｏ2+またはＮｉ2+は、より低いレベルの活性（１ｍＭ  Ｍｎ2+アッセイの、各々、２０％および９％）を支持したが、１０ｍＭ  Ｃｕ2+が供給された膜は不活性であった。事実、１０ｍＭ  Ｃｕ2+および２０ｍＭ  Ｍｇ2+と膜調製物との混合の結果、標識は多糖にほとんど取り込まれなかった（Ｍｇのみの値の＜０．８％）。
【００９６】
pmHASの最初の特徴付けは、Ｍｇ2+の存在下で行った。その糖ヌクレオチド前駆体についての酵素の結合親和性は、見掛けのＫM値を測定することによってアッセイした。［14Ｃ］GlcAまたは［3Ｈ］GlcNAcの多糖への取り込みは、各々、UDP−GlcNAcまたはUDP−GlcAの変化した濃度でモニターした。Ｍｇ2+−含有緩衝液において、UDP−GlcAについての〜２０μＭおよびUDP−GlcNAcについての〜７５μＭの見掛けのＫM値は、滴定データのHanse−Woolfプロット（［Ｓ］／ｖ−対−［Ｓ］）を利用して決定した。両糖についてのＶmax値は同一であった。何故ならば、Hanse−Woolfプロットに対応する傾きは同等だったからである。Ｍｇ2+でのアッセイからの結果と比較すると、UDP−GlcNAcについてのＫM値は、約２０−５０％だけ〜１０５μＭまで増加し、ＶmaxはＭｎ2+の存在下で２−３倍だけ増加した。
【００９７】
P. multocida、S. equisimilisまたはS. pyogenesいずれかからのＨＡシンターゼ酵素はUDP−糖を利用するが、それらはｐＨおよび金属イオン依存性およびＫM値に関して幾分異なった反応速度最適を保有する。酵素はｐＨ７で最も活性であり；しかしながら、pmHASは、報告されているところでは、わずかに酸性のｐＨでより活性を呈し、ｐＨ７．４を超えると比較的不活性である。pmHASはイン・ビトロアッセイ条件下では、Ｍｇ2+よりも効果的にＭｎ2+を利用するが、細菌細胞における生理学的金属共因子の同一性は知られていない。比較すると、streptococcal酵素での従前の研究では、Ｍｇ2+はＭｎ2+よりもかなり良好であったが、それにも拘わらず、Ｍｎ2+のより小さい効果は、最適Ｍｇ2+濃度よりも−１０倍低い濃度において最大であった。pmHASは、明らかに、spHASよりもしっかりとUDP−糖に結合する。粗い膜中においてpmHASについての測定されたＫM値は、streptococcal膜で見出されたＨＡＳから得られたものよりも各基質につき約２〜３倍低かった：各々、UDP−GlcAにつき５０または３９μＭおよびUDP−GlcNAcにつき５００または１５０μＭ。
【００９８】
速度論的解析によって、pmHASのＶmaxはＭｇ2+よりもＭｎ2+の存在下で２〜３倍高かったが、前者のイオンでのアッセイにおいては、UDP−GlcNAc  ＫM値はわずかに増加した。見掛けの低下した親和性のこの観察は、増大した重合速度は、Ｍｎ2+イオン／糖ヌクレオチド複合体の酵素活性部位（類）への良好な結合によるものではなかった。従って、Ｍｎ2+はいくつかの他の反応工程を増強させ、もう１つの部位／酵素の構造を改変し、あるいはリン脂質膜環境を修飾する可能性がある。pmHASの遺伝子配列および蛋白質配列を配列番号１９に示す。
【００９９】
クロレラウイルスＰＢＣＶ−１は、多糖、ヒアルロナン［ヒアルロン酸、ＨＡ］を合成できる機能的グリコシルトランスフェラーゼをコードする。この知見は、ウイルスは、（ａ）宿主細胞グリコシルトランスフェラーゼを利用して新しい炭水化物構造を作り出すか、または（ｂ）ビリオン成熟の間に宿主細胞グリココンジュゲートを蓄積するかのいずれかであるという一般的観察に反する。さらに、ＨＡは、一般に、動物および少数のそれらのビルレント細菌病原体に限定れるとみなされてきた。多くの植物炭水化物が特徴付けられてきたが、ＨＡも関連アナログも従前には植物または原生生物の細胞では検出されていない。
【０１００】
脊椎動物ＨＡＳ酵素（ＤＧ４２、ＨＡＳ１、ＨＡＳ２、ＨＡＳ３）およびstreptococcal HasA酵素（spHASおよびseHAS）は、配列同様性のいくつかの領域を有する。ウイルスＰＢＣＶ−１［Paramecium bursariaクロレラウイルス］の二本鎖ＤＮＡゲノムを配列決定すると、種々のＨＡＳに対して２８ないし３３％アミノ酸同一性を持つ５６７残基蛋白質をコードするＯＲＦ［オープンリーディングフレーム］、Ａ９８Ｓ（受入番号＃４４２５８０）が発見された。この蛋白質はｃｖＨＡＳと命名された（クロレラウイルスＨＡシンターゼ）。ＰＢＣＶ−１をコードする遺伝子配列およびその蛋白質配列は配列番号：７および８に示される。
【０１０１】
ＰＢＣＶ−１は、ある種の単細胞、真核生物クレラ−様緑藻中で複製する大きな（１７５−１９０ｃｍ直径）多角体プラーク形成ウイルスのファミリー（Phycodnarviridae）のプロトタイプである。ＰＢＣＶ−１ビリオンは、外方糖蛋白質キャプシド内側に位置する少なくとも５０の異なる蛋白質および脂質成分を含有する。ＰＢＣＶ−１ゲノムは、共有結合閉環ヘアピン末端を持つ線状の変更されていない３３０−ｋｂ  ｄｓＤＮＡ分子である。
【０１０２】
推定されたアミノ酸配列に基づき、Ａ９８Ｒ遺伝子産物は、一体的膜蛋白質であるはずである。この仮説を検定するために、組換えＡ９８ＲをEscherichia coli中で産生させ、膜画分をＨＡＳ活性につきアッセイした。UDP−GlcAおよびUDP−GlcNAcは、対照細胞からの試料（平均特異的活性＜0.001pmole GlcA導入／μｇ蛋白質／分）によってではなく、プラスミドｐＣＶＨＡＳ上のＡ９８Ｒ遺伝子を含有する細胞に由来する膜画分（平均特異的活性２．５pmolｅ  GlcA導入／μｇ蛋白質／分）によって、多糖に取り込まれた。ｐＣＶＨＡＳで形質転換した細胞の可溶性画分で活性は検出されなかった。UDP−GlcAおよびUDP−GlcNAcが重合に同時に要求された。活性は１０ｍＭ  ＭｎＣｌ2の存在下でｐＨ７．２のＨｅｐｅｓ緩衝液中で最適であり、他方、金属イオンを省くと、活性は検出されなかった。Ｍｇ2+およびＣｏ2+は同様の濃度においてＭｎ2+の〜２０％程度効果的であった。pmHASは同様の金属要件を有するが、他のＨＡＳはＭｇ2+を好む。
【０１０３】
組換えＡ９８Ｒ酵素は、イン・ビトロで組換えspHASまたはＤＧ４２  ｘｌＨＡＳによって合成されたＨＡのそれよりも小さい３〜６×１０6Ｄａの平均分子量を持つ多糖を合成した（各々、〜１０7  Ｄａおよび〜５−８×１０6Ｄａ；１３、１５）。該多糖はSpreptomyces hyaluronitricus ＨＳリアーゼ（ＨＡを脱重合する酵素によって完全に分解されたが、ヘパリンおよびコンドロイチンのような構造的に関連するグリコサミノグリカンによってはそうではなかった。
【０１０４】
ＰＢＣＶ−１感染クロレラ細胞はＡ９８Ｒ遺伝子発現につき調べた。〜１，７００−ヌクレオチドＡ９８Ｒ転写体は〜１５分感染後に出現し、感染６０分後に消失し、これはＡ９８Ｒが初期遺伝子であることを示す。結果として、未感染およびＰＢＣＶ−１感染クロレラ細胞からの膜画分は、ＨＡＳ活性につき、感染後５０および９０分にアッセイした。未感染細胞ではなく感染細胞は活性を有した。細菌に由来する組換えＡ９８Ｒ酵素のように、放射標識のUDP−［14Ｃ］GlcAから多糖への取り込みは、Ｍｎ2+およびUDP−GlcNAcの双方に依存する。この放射標識生成物もまたＨＡリアーゼによって分解された。破壊されたＰＢＣＶ−１ビリオンはＨＡＳ活性を有しなかった。
【０１０５】
高度に特異的な125Ｉ−標識ＨＡ−結合蛋白質を用い、ＰＢＣＶ−１感染クロレラ細胞をＨＡ多糖につき分析した。感染後５０および９０分の細胞からの抽出物は、実質的量のＨＡは含有したが、未感染藻または破壊したＰＢＣＶ−１ビリオンからの抽出物は含有しなかった。標識ＨＡ−結合蛋白質は感染後５０および９０分に無傷感染細胞と相互作用したが、健康な細胞は相互作用しなかった。従って、新たに合成されたＨＡ多糖のかなりの部分が、感染藻の外方細胞表面で固定化された。細胞外ＨＡは、ウイルスおよびその藻類宿主の間の相互作用でいずれの明白な役割も演じない。何故ならば、ＰＢＣＶ−１プラークアッセイの頂部寒天中の精巣ヒアルロニダーゼ（４６５ユニット／ｍｌ）または遊離ＨＡ多糖（１００μｇ／ｍｌ）いずれかを含めることによって、プラークサイズもプラーク数も変化しなかったからである。
【０１０６】
また、ＰＢＣＶ−１ゲノムは、DUP−Glcデヒドロゲナーゼ（UDP−Glc ＤＨ）およびグルタミン：フラクトース−６−リン酸アミノトランスフェラーゼ（ＧＦＡＴ）をコードするさらなる遺伝子を有する。UDP−Glc ＤｈはUDP−GlcをUDP−GlcA（ＨＡ生合成に必要な前駆体）に変換する。ＧＦＡＴはフラクトース−６−リン酸をグルコサミン−６−リン酸（UDP−GlcNAc代謝経路における中間体）に変換する。Ａ９８Ｒ  ＨＡＳと同様に、これらのＰＢＣＶ−１遺伝子は共に感染の初期に発現され、酵素的に活性な蛋白質をコードする。ＨＡ生合成経路における複数酵素の存在は、クロレラウイルスのライフサイクルにおける重要な機能として働くにちがいないことを示す。
【０１０７】
Streptococcus、脊椎動物、およびＰＢＣＶ−１のＨＡ合成は、同一の相対的順序で起こる２ないし４残基の多くのモチーフを保有する。これらの保存されたモチーフは、恐らくは、図２に示すようなＨＡ生合成に非常に重要なドメインを反映する。グループＣ  seHAS、グループＡ  spHAS、ネズミＨＡＳ１、ＨＡＳ２、ＨＡＳ３およびカエルＨＡＳの蛋白質配列を図２に整列させて示す。図２の整列はＤＮＡｓｉｓマルチプル整列プログラムを用いて達成された。（示さないがヒトＨＡＳ１および２を含めた）他の公知のＨＡＳファミリーメンバーにおいて同一のseHAS中の残基は、シェーディングおよび星印によって示される。ドットによって示されるアミノ酸は、より大きなβ−グリコシルトランスフェラーゼファミリーの全てのメンバーで保存されている。菱形の記号は、酵素活性で臨界的であり得る高度に保存されたシステイン残基を示す。予測される膜ドメインＭＤ１ないしＭＤ７のほぼ中央点は矢印で示される。Ｘ１はXenopus leavisを示し、ＭＭはMus musculisを示す。
【０１０８】
ＨＡＳおよびDUP−糖前駆体からβ−結合多糖を合成する他の酵素の間の同様性の領域もまた、より多くのグリコシルトランスフェラーゼが配列決定されるに従って発見されつつある。例は、細菌セルラーゼシンターゼ、菌類および細菌キチンシンターゼ、および種々のＨＡＳを含む。これらの同様の構造モチーフの重要性は、グリコシルトランスフェラーゼの三次元構造が蓄積されるに従ってより明らかとなるであろう。
【０１０９】
図３は、公知のヒアルロナンシンターゼ間の革新的関係を示す。図３の系統樹は、ＤＮＡｓｉｓマルチプル整列プログラムを用いてHiggins-Sharpアルゴリズムによって創製された。計算されたマッチングパーセンテージはデンドログラムの各バッチに示される。
【０１１０】
本発明のＤＮＡセグメントは生物学的機能同等ＨＡＳ蛋白質およびペプチドを含む。このようなセグメントは、核酸配列およびこのようなコードされた蛋白質内で天然で起こることが知られているコドン縮重および機能的同等性の結果として生起し得る。別法として、機能的同等蛋白質またはペプチドは、組換えＤＮＡ技術の適用を介して創製することができ、そこでは、蛋白質構造の変化は、交換すべきアミノ酸の特性の考慮に基づいて作成することができる。ヒトによって設計された変化は、部位特異的突然変異誘発技術の適用を介して導入することができ、例えば、酵素活性に対してまたはＨＡＳ蛋白質の抗原性に対して改良を導入することができ、または分子レベルでＨＡシンターゼ活性を調べるためにＨＡＳ突然変異体をテストすることができる。
【０１１１】
また、ＨＡＳコーディング配列に対する特異的変化の結果、修飾されたサイズ分布または構造的立体配置を有するＨＡの生産ができる。当業者であれば、異なるポリマーサイズおよび／または機能的能力を有するヒアルロナンを生産できる改変されたヒアルロナンシンターゼを生産するようにＨＡＳコーディング配列を操作することができるのを認識するであろう。例えば、ＨＡＳコーディング配列は、ヒアルロナンシンターゼが従前に取り込まれなかった糖または糖誘導体のような異なる構造を取り込む新しいヒアルロナンを創製するように、改変された糖基質特異性を有する方法で改変することができる。この新しく取り込まれた糖の結果、異なる機能的特性を有する修飾されたヒアルロナン、より小さいまたはより大きいポリマーサイズ／分子量を有するヒアルロナン、あるいは双方が得られ得る。当業者に認識されるように、ＨＡＳコーディング配列が与えられれば、これらの所望の特性および／またはサイズ修飾が達成できるように、変化および／または置換をＨＡＳコーディング配列になすことができる。表ＩＩは組換えseHASの糖ヌクレオチド特異性およびマグネシウムイオン要件をリストする。
【０１１２】
【表２】
0004731013.tif 000003
【０１１３】
本明細書で用いる「修飾された構造」という用語は、天然に生じるＨＡ多糖で通常見出されない糖または誘導体を含有するヒアルロナンポリマーを示す。「変更されたサイズ分布」という用語は、天然酵素で通常見出されないサイズ分布のヒアルロナン分子の合成をいい、作成されたサイズは正常よりもかなり小さいかまたは大きい。
【０１１４】
異なるサイズの種々のヒアルロナン生成物は、薬物送達の領域で適用を有し、改変された構造の酵素の創製は異なるサイズのヒアルロナンと組み合わせることができる。アンジオゲネシスおよび創傷治癒における適用は、もし約２０の単糖が良好な量で作成することができるならば、潜在的に大きい。小ヒアルロナンオリゴ糖のもう１つの特別の適用は、医療目的で使用される組換えヒト蛋白質の安定化におけるものである。このような蛋白質に関する主要な問題は、血液からのそのクリアランスおよび短い生物学的半減期である。この問題に対する１つの現在の解決は、蛋白質が循環から余りにも迅速に一掃されるのを妨げる小分子保護をカップリングさせることである。非常に小さな分子量のヒアルロナンはこの役割によく適合し、非免疫原性であって生体適合性であろう。薬物または蛋白質に付着したより大きな分子量のヒアルロナンを用いて、ヒアルロナン用のエンドサイトーシス受容体を有する網内皮細胞系を標的化することができる。
【０１１５】
当業者であればこの開示が与えられれば、ヒアルロナンシンターゼによって作成されたヒアルロナンポリマーのサイズ分布を調整して異なるサイズを得るいくつかの方法があることを認識するであろう。まず、生成物サイズの反応速度制御は、温度を低下させ、酵素作用の時間を減少させ、１または双方の糖ヌクレオチド基質の濃度を減少させることによって改変することができる。これらの変数のいずれかまたは全てを減少させると、小量で小さなサイズのヒアルロナン生成物を与えるであろう。これらのアプローチの不利は、生成物の収率もまた減少し、日によってまたバッチによって再現性を達成するのが困難であり得ることである。
【０１１６】
第２に、大きなヒアルロナン生成物を合成する酵素の固有の能力の改変である。蛋白質に対する変化は、特異的アミノ酸の置換、欠失および付加（または代謝プロセッシングを介する補欠基の導入さえ）含めた組換えＤＮＡ技術によって作成することができる。固有により遅い酵素の結果となるこのような変化は、従って、反応速度手段によってヒアルロナンサイズのより再現性のある制御を可能とする。最終的なヒアルロナンサイズ分布は、配列中の特定のアミノ酸に頼る酵素のある種の特徴によって決定される。streptococcal酵素および真核生物ヒアルロナンシンターゼの間で絶対的に保存された残基の２０％の中で、酵素が作成することができるヒアルロナンポリマーのサイズを制御し、それに大いに影響するユニークな位置におけるアミノ酸の組がある。これらの残基のいずれかにおける特異的変化は、修飾されたサイズ分布を有するＨＡ生成物を生じる修飾されたＨＡＳを生じ得る。ヒアルロナンが放出される前に酵素が作成することができるヒアルロナンの固有のサイズを減少させるseHAS、spHAS、pmHASまたはcvHASに対する作成された変化は、天然酵素よりも小さいまたは潜在的に大きいサイズのヒアルロナン生成物を生じさせる強力な手段を提供するであろう。
【０１１７】
最後に、作成されたより大きな分子量のヒアルロナンは、特異的ヒアルロニダーゼによって分解されて、より小さな分子量のヒアルロナンを作成する。しかしながら、この実施は再現性よく達成するのは非常に困難であり、細心にヒアルロナンを再精製して、ヒアルロニダーゼおよび望まない消化産物を除去しなければならない。
【０１１８】
図４に示すように、ヒアルロナンシンターゼを作成して、特に、正常野生型酵素よりも小さな異なるサイズのヒアルロナンポリマーを生成させることができる。図は、その各々が、天然酵素から単一アミノ酸変化を有するように部位特異的突然変異誘発によって作成された、一連のspHAS酵素についての（ダルトン（分子量の尺度）の１００万部での）ＨＡサイズの分布を示す。各々は、アラニンで置き換えられた異なるシステイン残基を有する。塗りつぶしていない記号を持つ５つの曲線のクラスターは以下のspHAS蛋白質：野生型Ｃ１２４Ａ、Ｃ２６１Ａ、Ｃ３６６ＡおよびＣ４０２Ａを表す。塗りつぶした丸は、部分的にのみ活性な貧弱に発現されたＣ２２５Ａ蛋白質を表す。
【０１１９】
塗りつぶした三角はC289A spHAS蛋白質であり、これは、正常酵素または示された他の変異体よりもかなり小さな範囲のＨＡポリマーを合成することが判明した。この実施は、所望の範囲のＨＡ生成物サイズを合成するヒアルロナンシンターゼ酵素を作成するのが可能であることを示す。ヒアルロナンシンターゼをコードするseHAS、pmHASおよびcvHAS遺伝子もまた部位特異的突然変異誘発によって操作して、所望の範囲のＨＡ生成物サイズを合成する酵素を生じさせることもできる。
【０１２０】
構造的に修飾されたヒアルロナンは、所望のＨＡＳまたはspHASにおいて特定のアミノ酸を変化させることによって、ヒアルロナン生成物のサイズ分布を改変することと概念的に異ならない。Ｎ−アセチル基が失われたDUP−GlcNであるか、もう１つの化学的に有用な基で置き換えられたDUP−GlcNAcの誘導体は特に有用であると予測される。強い基質特異性は、２０％に保たれたもののうちアミノ酸の特異サブセットに頼らなければならない。１以上のこれらの残基に対する特異的変化は、天然酵素よりも１以上の基質と特異性低く相互作用する機能的シンターゼを創製する。従って、この改変された酵素は、以下の目的：（ｉ）一般的または標的化された薬物送達、放射線学手法等のための構造的に修飾されたヒアルロナンへ特異的薬物、蛋白質またはトキシンを共有結合ップリングさせること、（ii）より強い物理的特性を持つゲルまた他の三次元生体材料を得るためのヒアルロナンのまたは他の支持体への共有結合架橋、および（iii）生体適合性フイルムまたは単層を生じさせるためのヒアルロナンの表面への共有結合で化学者が異なる化学を使用するのを可能とするように設計された糖誘導体を取り込むために別の天然または特別の糖ヌクレオチドを利用することができる。
【０１２１】
また、ヒアルロナンを生成する細菌を作成することもできる。例えば、本発明者らは、spHAS遺伝子、ならびに糖ヌクレオチド前駆体の１つについての遺伝子を含有するB. subtilisの株を創製した。本発明者らは、この細菌はヒト用途の生成物の生産のためにバイオテクノロジー産業でしばしば使用されているので選択した。これらの細菌は、野生型天然株を用いて現在利用できるものよりも大量にヒアルロナンを生産できる細菌の創製のための第１世代プロトタイプとして意図された。本発明者らは、これらの遺伝子の複数コピーを入れた。
【０１２２】
例えば、３つのBacillus subtilis株を構築して、ヒアルロナンシンターゼ（spHAS）およびUDP−グルコースデヒドロゲナーゼのためのStreptococcus pyogenes遺伝子の１つまたは双方を含有させ、その結果を表ＩＩ−Ｂに示す。ＨＡを検出し、定量する感受性の市販のラジオメトリックアッセイに基づいて、両遺伝子を持つ株（株＃３）はＨＡを作成し、培地に分泌すると判断された。親株またはデヒドロゲナーゼ遺伝子を丁度持つ株（株＃１）はＨＡを作成しない。spHAS遺伝子単独を丁度含有する株＃２はＨＡを作成するが、株＃３が作成する１０％に過ぎない。アガロースゲル電気泳動は、株＃３によって培地に分泌されたＨＡが非常に高分子量であることを示した。
【０１２３】
【表３】
0004731013.tif 000004
【０１２４】
これらの実験は、蛋白質発現を駆動するのにこれらの遺伝子で通常見い出されれるstreptococcalプロモーターを使用した。B. subtilisプロモーターの制御下でspHASまたはseHASリーディングフレームを持つ株の構築は、より優れた結果さえ生じるであろうと予測される。使用するベクターは、B. subtilis中の中程度コピー数および（B. subtilisで８μｇ／ｍｌおよび大腸菌で１７５μｇ／ｍｌまでの耐性を可能とする）エリスロマイシン耐性についての遺伝子を有するグラム陽性／大腸菌シャトルベクターである。使用するB. subtilis宿主株はＢＧＳＣからの１Ａ１であり、これは、トリプトファン要件を有し、そうでなければ野生型であり、胞子形成できる。細胞増殖およびＨＡ生産は、Spizizens最小培地＋トリプトファン、グルコース、微量元素およびエリスロマイシン（８μｇ／ｍｌ）中であった。増殖は、培地が消費されるまで（〜３６時間）激しく撹拌しつつ３２℃であった。
【０１２５】
これは、通常はヒアルロナンを作成しないであろうこれらのバイオ作成細胞が、spHAS遺伝子で形質転換するとそうするように競合するようになることを示す。また、spHASは、非ヒアルロナン生産細菌に取り込まれて、ヒアルロナンを生産できるバイオ作成細菌株を創製することもできる。
【０１２６】
本発明の好ましい具体例は、配列番号：２のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む精製された組成物である。本明細書で用いる「精製された」という用語は、ＨＡＳ蛋白質組成物をいうことが意図され、ここに、ＨＡＳ蛋白質または（例えば、［ＨＩＳ］6テイルを含有する）適当に修飾されたＨＡＳ蛋白質は、その天然に得られる状態に対して、すなわち、この場合は、原核生物細胞抽出物内のその純度に対して、いずれかの程度精製される。ＨＡＳ蛋白質は、本開示に徴し、当業者に知られているように、Streptococcus、Pasturella、chlorellaウイルス、患者検体、組換え細胞、感染組織、細胞外マトリックス中に高レベルのヒアルロナンを含有する組織の単離された亜集団から単離することができる。例えば、組換えseHASまたはspHAS蛋白質は大腸菌の全膜蛋白質のほぼ１０％を占める。従って、精製されたＨＡｓ蛋白質組成物は、それが天然で起こり得る環境から遊離された配列番号：２のアミノ酸配列を有するポリペプチドともいう（図５）。
【０１２７】
ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡからのものであるかに拘わらず、seHASの発現に転じると、ＨＡＳ蛋白質の組換え調製のために発現系を調製するよう進めることができる。原核生物または真核生物系における発現用のＤＮＡセグメントの作成は、組換え発現における当業者に一般的に知られている技術によって行うことができる。
【０１２８】
ＨＡＳは、真核生物発現系で首尾よく発現させることができるが、本発明者らは、細菌発現系を全ての目的でＨＡＳの調製で使用できると断言する。細菌発現は結局は使用の容易性、生産コスト、およびそれにより得られる物質の質の点で真核生物発現よりも利点を有するであろう。
【０１２９】
streptococcalヒアルロナンシンターゼ（seHASおよびspHAS）の精製は表ＩＩＩおよび図６に示す。精製スキームの種々の段階からの画分を１２．５％ゲル上のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、これを次いでクーマシーブリリアントブルーＲ−２５０で染色した。レーン：分子量マーカー；１、組換えseHAS−Ｈ６を含有する全大腸菌膜；２、膜の洗剤可溶化後の不溶性画分；３、洗剤可溶化画分；４、Ｎｉ−ＮＴＡクロマトグラフィー樹脂からのフロースルー；５−９、カラムの５つの順次の洗浄（各々、２カラム容量）；１０、単一バンドである溶出した純粋なＨＡシンターゼ。
【０１３０】
【表４】
0004731013.tif 000005
【０１３１】
ＨＡＳをコードするＤＮＡセグメントでの宿主細胞の形質転換は、ＨＡＳ蛋白質を得るための便宜な手段を提供するであろうと提案される。また、ｃＤＮＡ、ゲノム配列、およびその組合せは、宿主細胞が勿論蛋白質への翻訳のための機能的ｍＲＮＡを生じさせるためのゲノム転写体を保有するので、真核生物発現に適する。
【０１３２】
本発明のもう１つの具体例は、配列番号：２の、または保存されたもしくは半保存アミノ酸変化を持つ機能的に同様のアミノ酸配列を含む蛋白質をコードするベクターを含む組換え宿主細胞を増殖させることを特徴とする蛋白質組成物を調製する方法である。核酸発現および蛋白質生産、続いてこのような生産された蛋白質の回収を可能とする条件下で宿主細胞を増殖させる。宿主細胞を含めたＨＡＳおよび結局はＨＡの生産、核酸発現、蛋白質生産および回収を可能とする条件は、seHAS遺伝子、およびseHAS遺伝子蛋白質産物ＨＡＳの本開示に徴し、および本明細書に記載された方法によって、当業者に知られている。
【０１３３】
ヒアルロナンの発現用の好ましい宿主は、S. equisimilisおよびStreptococcus種の他の適当なメンバーのような原核生物である。しかしながら、ＨＡは、Bacillus、Enterococcus、またはEscherichia属さえの種メンバーのような、組換えＨＡシンターゼを発現する異種宿主細胞によって合成することができることも知られている。本発明のＨＡシンターゼの発現用の最も好ましい宿主は、Lactococcus種、Bacillus subtilisまたは大腸菌のような、本発明のＨＡＳ遺伝子で形質転換した細菌である。
【０１３４】
ほとんどいずれの真核生物発現系も、例えば、バクロウイルス−ベースの、ジルタミンシンターゼ−ベースの、ジヒドロ葉酸レダクターゼ−ベースの系、ＳＶ−４０ベースの、アデノウイルス−ベースの、サイトメガロウイルス−ベースの、酵母ベースのもの等、ＨＡＳの発現で用いることができると同様に考えられる。このような発現では、コーディング配列をプロモーターに隣接させ、その制御下に置くであろう。コーディング配列をこのようなプロモーターの制御下とするには、蛋白質の転写リーディングフレームの転写開始部位の５’末端を選択されたプロモーターから「下流」（すなわち、３’側）約１および約５０ヌクレオチドの間に位置させると当該分野で理解されている。また、ｐＹＥＳ２のようなSaccharomyces cevevisiae酵母発現ベクター系は、図７に示すように、ＧＡＬプロモーターの制御下でＨＡＳを生産するであろう。図７は、spHAS酵素がｐＹＥＳ２プラスミドを用いて組換え酵母で生産されたことを示す。UDP−GlcAおよびUDP−GlcNAcを供給すると、該酵素は高分子量ＨＡを作成する。
【０１３５】
真核生物発現を考える場合、もしそれが元のクローン化セグメントに含まれていないならば、ＨＡＳ遺伝子またはＤＮＡ、適当なポリアデニル化部位（例えば、５’−ＡＡＴＡＡＡ−３’）を含む転写単位に組み込むことが典型的には望まれるであろう。典型的には、ポリＡ付加部位は、転写終止に先立つ位置の終止部位から「下流」約３０ないし２０００ヌクレオチドに置かれる。
【０１３６】
実質的にいずれの通常使用される宿主細胞も、ここにＨＡＳの発現と組み合わせて使用することができると考えられる。本発明のＨＡＳ  ｃＤＮＡのための好ましい細胞系の例は、２３９、ＡｔＴ−２０、ＨｅｐＧ２、ＶＥＲＯ、ＨｅＬａ、ＣＨＯ、ＷＩ  ３８、ＢＨＫ、ＣＯＳ−７、ＲＩＮおよびＭＤＣＫ細胞系のような真核生物発現で典型的には使用される細胞系を含む。これは、一般に、ＨＡＳ酵素をコードする組換えＤＮＡセグメントを担持し、該酵素を発現できる組換え宿主を生産し；クローン化ＨＡＳ遺伝子またはｃＤＮＡの転写、および適当にはヒアルロナンの生産を可能とする条件下、組換え宿主を培地中で培養し、組換え宿主からのＨＡＳ酵素または分泌されたヒアルロナンを精製する工程を含む。
【０１３７】
一般に、クローン化ＨＡＳ遺伝子またはｃＤＮＡの発現に適した条件は、プロモーター、ベクター、および使用される宿主系に依存する。例えば、ｌａｃプロモーターを用いる場合、イソプロピルチオガラクトシドのような、ｌａｃ転写を刺激するであろう物質を含めることを通じて転写を誘導することが望まれるであろう。例えば、本発明のクローン化seHAS遺伝子は、図５に示すように、大腸菌中でＨＩＳ含有蛋白質として発現される。他のプロモーターが使用される場合、転写を誘導し、またはそうでなければそれを上昇調節するには、異なる物質が必要であり得る。
【０１３８】
図５は、大腸菌における組換えseHASおよびspHASの共発現を示す。還元条件下で、１０％（ｗ／ｖ）ゲルを用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、膜蛋白質（レーン当たり５ｍｇ）を分画した。ゲルをクーマシーブルーＲ−２５０で染色し、写真を取り、スキャンし、Molecular Dynanicsパーソナルデンシトメーター（モデルＰＤＳＩ  Ｐ６０）を用いて定量した。ＨＡシンターゼの部分は矢印によってマークされる。レーンＡは天然spHASであり（グループＡ）；レーンＣは天然seHASであり；レーンＥは組換えseHASであり；レーンＰは組換えspHASであり；レーンＶはベクター単独である。使用した標準はＢｉｏ−ｒａｄ低分子量であり、ｋＤａで示す。
【０１３９】
シンターゼの発現を得るに加えて、好ましくは、糖ヌクレオチド前駆体の生合成に必要な酵素をコードする適当な遺伝子を含めることによって、あるいはＮ−アセチルグルコサミンまたはグルコサミン（GlcNAcまたはGlcＮＨ2）およびグルコース（Glc）のような前駆体供給酵素のための基質を含有する増殖培地を用いることによって、ＨＡ合成に誘導する環境を供することが望まれる。
【０１４０】
さらに、酵素によって合成された生成物が培地中で分解しないように、酵素ヒアルロニダーゼを欠く宿主に遺伝子を組み込むことが望まれる。さらに、宿主は、ＨＡの生産を最適化するように選択されるであろう。例えば、適当な宿主は、大量の糖ヌクレオチド前駆体を生産して、ＨＡＳ酵素を支持し、それが大量のＨＳを生産するようにするものであろう。このような宿主は天然に見出すことができるか、あるいは突然変異誘発または組換えＤＮＡ技術を含めた種々の技術によって作成することができる。糖ヌクレオチド合成酵素、特に、UDP−ＨｌｃＡを生産するのに必要なUDP−Glcデヒドロゲナーゼについての遺伝子を単離し、ＨＡＳ遺伝子またはｃＤＮＡと共にベクターに組み込むこともできる。本発明の好ましい具体例は、これらの補助的組換え遺伝子またはｃＤＮＡを含有する宿主であり、これらの遺伝子産物の増幅は、それにより、ＨＡの増大された生産を可能とする。
【０１４１】
宿主細胞を培養するのに使用される手段は、特に臨界的であるとは考えられない。有用な詳細については、米国特許第４，５１７，２９５号；第４，８０１，５３９号；第４，７８４，９９０号；または第４，７８０，４１４号が引用され、出典明示して全部をここに含ませることとする。S. equisimilisのような原核細胞宿主を使用する場合、ＣＯ2リッチのブロス増殖培地中、嫌気性条件下で、細菌の発酵を使用することが望まれる。これは、好気性条件下よりも大きいＨＡの生産を可能とする。もう１つの考慮は、嫌気的に増殖したstreptococcus細胞は発熱性エキソトキシンを生成しないということである。適当な増殖条件は、本開示に徴して、当業者に知られているように、他の原核生物宿主で慣用化することができる。
【０１４２】
一旦適当な宿主が構築され、ＨＡの生産に適した条件下で培養すれば、このような生産されたＨＡを分離することが望まれる。典型的には、分泌されるか、そうでなければ、組換え生物によって周囲の培地に放出され、公知の技術によって培地からのＨＡの容易な単離を可能とする。例えば、濾過によって、およびエタノールのようなアルコールによる沈殿によっての培地からの分離と組み合わせて、ＨＡを細胞および夾雑物から分離することができる。他の沈殿剤は、アセトンのような有機溶媒または塩化セチルピリジニウム（ＣＰＣ）のような第四級有機アンモニウム塩を含む。
【０１４３】
ＨＡの単離のための好ましい技術は、ここに出典明示して本明細書の一部とみなす米国特許第４，５１７，２９５号に記載されており、そこでは、発酵の最後に有機カルボン酸、トリクロロ酢酸を細菌懸濁液に添加する。トリクロロ酢酸は細菌細胞が凝集し、死滅することを引き起こし、ＨＡ（所望の生成物）からこれらの細胞および関連夾雑物を分離するのを容易とする。清澄化された上清を濃縮し、透析して、有機酸を含有する低分子量汚染物を除去する。前記手法は、０．２２μｍポアサイズのフィルターを含有するフィルターカセットを通す濾過を利用する。溶液の導電率がほぼ０．５メガオームまで低下するまで透析濾過を継続する。
【０１４４】
濃縮されたＨＡは、過剰の試薬エタノールまたは他の有機溶媒を添加することによって沈殿させ、次いで、沈殿したＨＡは、エタノールで洗浄することによって乾燥し、真空乾燥し、凍結乾燥してアルコールを除去する。次いで、ＨＡをホウ酸緩衝液ｐＨ８に再溶解させ、４℃にて、ＣＰＣまたはＣＥＴＡＢ、混合臭化トリメチルアンモニウム溶液のようなある種の他の有機アンモニウム塩で沈殿させる。引用した前記引用特許にさらに記載されているように、沈殿したＨＡを粗い濾過によって回収し、１Ｍ  ＮａＣｌに再懸濁し、透析濾過し、濃縮する。得られたＨＡを濾過滅菌し、所望の目的用途に応じて、適当な塩、乾燥粉末または滅菌溶液に容易に変換される。
【０１４５】
Ａ．代表的な使用可能な遺伝子工学手法
優れた細胞膜バリアの無い細胞が宿主細胞として用いられた場合、トランスフェクションは、当業者に良く知られているリン酸カルシウム沈殿法により行われる。しかしながら、核注入、カチオン脂質、エレクトロポレーション、プロトプラスト融合、もしくはデュポン社により開発されたバイオリスティックバイオパーティクルデリバリシステム(BiolisticTM Bioparticle delivery system、1989)による方法などの他の方法もまた、ＤＮＡを細胞内に導入するために用いられた。デュポンシステムを用いる利点は、高い形質転換効率である。原核細胞、もしくは実質的な細胞壁構造を含む細胞が用いられた場合、好ましいトランスフェクションの方法は、受容能もしくはエレクトロポレーションを誘発するために塩化カルシウムを用いたカルシウム処理である。
【０１４６】
所望のコーディングもしくは制御配列を含む好ましいベクターの構築は、標準的なライゲーション技術が用いられた。単離されたプラスミドもしくはＤＮＡフラグメントが、要求されるプラスミドを構築するために必要な形状に、開裂され、調整され、再結合された。開裂は、好ましいバッファー内で制限酵素を用いて処理することにより行われる。一般に、約１μｇのプラスミドもしくはＤＮＡフラグメントが、約２０μｌのバッファー溶液中における約１ユニットの酵素と共に用いられる。特定の制限酵素のための好ましいバッファーおよび基質の量は、製造業者により特定される。約１時間のインキュベーション時間により行われる。
【０１４７】
インキュベーションの後、タンパクはフェノールおよびクロロホルムにより抽出されることにより除去される。そして、核酸はエタノールでの析出により水分画から回収される。平滑末端が必要とされる場合、試料は、１０ユニットのポリメラーゼＩ(Klenow)と共に１５分間１５℃で処理され、フェノール−クロロホルムで抽出され、そしてエタノールで析出される。ライゲーションのために、約等モル量の所望の成分、好ましくは正確な適合をもたらすために末端に調整された成分が、０．５μｇのＤＮＡ当たり約１０ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼで処理される。開裂されたベクターが成分として用いられる場合は、細菌性アルカリフォスファターゼにより開裂されたベクターの再結合を防止することが望ましい。
【０１４８】
構築されたプラスミド内の機能的な配列の確認のための分析のため、第１ステップは、３０〜３２℃での形質転換を行うことにより、特定成分であるE. coli SURE細胞(Stratagene)内にクローニングすることにより、プラスミドＤＮＡを増殖させることである。次に、組み換えプラスミドは、UDP−GlcA前駆体を産生することができるE. coli K5株 Bi8337-41にトランスフォームされ、そして良好な形質転換体が抗生物質耐性により好適なものとして選択される。次いで、プラスミドは、形質転換体のライブラリーから、ＨＡの産生を示す細菌のコロニーによりスクリーニングされる。これらのコロニーは、選び取られ、増殖され、そしてプラスミドを分離し、制限酵素地図により分析される。次いで、機能性HAS遺伝子の兆候を示すプラスミドは、当業者に良く知られている配列分析技術の幾種類かにより特徴付けられる。
【０１４９】
Ｂ．起源、宿主細胞培養、およびベクター類
一般に、原核生物は、ＤＮＡ配列の初期のクローニング、および本発明に有用なベクターの構築のために用いられる。好ましい起源はグラム陽性細胞、特にグループＣのStreptococcal株から誘導されたものが好ましいと思われている。例えば、StaphylococciおよびStreptococciといった単一膜であるが厚い細胞壁の細菌は、グラム陽性菌である。E. coliのようなグラム陰性菌は、細胞を取り囲む膜より、むしろ二つの個別の膜を有する。グラム陰性生物は、より薄い細胞壁を有する傾向にある。グラム陽性生物の単一膜は、グラム陰性細菌の内部の原形質膜に類似する。好ましい宿主細胞は、Streptococcus株であり、これはヒアルロニダーゼ陰性もしくは他の抑制となるように変異される(EP144019, EP266578,EP244757)。特に有用なStreptococcus株としては、S. equisimilisおよびS. zooepidemicusである。
【０１５０】
原核生物は、また発現体のためにも用いられる。高分子量ＨＡシンターゼに適合するのに最も適当な形状においてＨＡシンターゼを発現するために、S. equisimilisもしくはS. zooepidemicusといったStreptococcus種を用いることが望まれる。上述した株は、E. coli W3110(F−、ラムダ−、原栄養性、ATCC No. 273325)、Bacillus subtilisといったバチルス、もしくは、Serratia marcescensといった他の腸内細菌と同様に、「超」HAS含有宿主を発生するために用いることができる。
【０１５１】
一般に、宿主細胞と適合性のある種から導かれた複製および制御配列の起源を含むプラスミドベクターは、これらの宿主と関連して用いられる。形質転換された細胞において表現型の選択を導くことが可能であるマーキング配列と同様に、通常、ベクターは複製の開始点に運搬される。例えば、E. coliは、代表的にはE. coli種から導かれるプラスミドであるpBR322を用いて形質転換される。pBR322は、アンピシリンおよびテトラサイクリン耐性のための遺伝子を含み、よって形質転換された細胞の特定のために容易な手段を提供する。ｐBRプラスミドもしくはｐUCプラスミド、または他の微生物プラスミドもしくはファージもまた、それ自身のタンパクの発現のための微生物組織により用いられることができるプロモータ類を含む、もしくは含むように修正される必要がある。
【０１５２】
最も一般的に組み換えＤＮＡ構築物に用いられるそれらのプロモータは、lacZプロモータ、tacプロモータ、Ｔ７バクテリオファージプロモータ、およびトリプトファン(trp)プロモータシステムを含むものである。これらは最も一般的に用いられるものであると同時に、他の微生物プロモータが発見され、用いられている。そしてそれらの核酸配列に関する詳細は公開されており、機能的にプラスミドベクターとそれらを連結することは当業者であれば可能である。本発明を用いる場合にも、統合されたベクターを用いることができる。
【０１５３】
原核生物に加えて、例えば酵母培養物等の真核微生物もまた用いることができる。他の多くの株が一般に利用可能であるにもかかわらず、Saccharomyces cerevisiaeもしくは通常のパン屋の酵母が真核微生物の中でも最も一般的に用いられる。Saccharomycesにおける発現のために、例えばプラスミドYRｐ７が通常用いられる。例えばATCC No. 44076もしくはPEP4-1のようなトリプトファン無しでは成育する可能性を欠く酵母の変異株のための選択マーカーとして提供されるtrp1遺伝子を、このプラスミドは既に含んでいる。そして、酵母宿主細胞ゲノムの特徴としてのtrp1領域の存在は、トリプトファンの欠乏における成育により、形質転換の検出のために効果的な環境を提供した。酵母ベクターにおいて好適なプロモータ配列は、ガラクトース利用遺伝子のためのプロモータ、３−フォスフォグリセレートカイネース、もしくは、エノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−フォスフェート  デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスフォフルクトキナーゼ、グルコース−６−フォスフェート  イソメラーゼ、３−フォスフォグリセレート  ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコース  イゾメラーゼ、およびグルコキナーゼといった他の解糖酵素のためのプロモータを含むものである。
【０１５４】
構築する際に好適な発現プラスミドにおいて、これらの遺伝子に連結する終止配列は、ｍＲＮＡのポリアデニレーションおよび終止を提供するために、発現されることが望まれる配列の発現ベクターの３’側に連結される。成育条件により制御される転写のさらなる利点を有する、他のプロモータとしては、アルコールデヒドロゲナーゼ２、チトクロームＣ、アシドフォスファターゼ、窒素代謝を助ける分解性酵素、および上述したグリセラルデハイド−３−フォスフェート  デヒドロゲナーゼ、およびマルトースおよびガラクトースを利用するために必要な酵素等のためのプロモータ領域である。酵素適用性のプロモータ、反復領域のオリジン、および終止配列を含むいかなるプラスミドベクターも好適である。
【０１５５】
微生物に加えて、多細胞生物から誘導された細胞の培養物も宿主として用いることができる。原則的に、脊椎動物であるか非脊椎動物の培養物であるかにかかわらず、いかなるこのような細胞培養物は機能する。しかしながら、脊椎動物細胞に対する関心が最も高く、また培養における脊椎動物細胞の増殖は近年においてルーチン作業となっている。このような有用な宿主細胞系統は、VEROおよびHeLa細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞系統、およびＷＩ38、BHK、COS、およびMDCK細胞系統である。
【０１５６】
哺乳類の細胞を用いるため、発現ベクターにおける制御機能が、しばしばウィルス材料により提供される。例えば、一般的に用いられているプロモータは、ポリオーマ、アデノウィルス２、ウシ乳頭腫ウィルス、および最も頻繁にはシミアンウイルス４０から誘導される。ＳＶ４０ウィルスの初期のもしくは最近のプロモータは、両者がＳＶ４０のウィルスの複製の開始点をも含むフラグメントとしてウィルスから容易に得られることから、特に有用である。より小さい、もしくはより大きいＳＶ４０のフラグメントもまた用いられ、ウィルスの複製の開始点において位置するBglＩサイトに対するHind IIIサイトから延びる約２５０ｂｐ配列を含むものとして提供される。
【０１５７】
さらに、所望の遺伝子配列と正常に連結されるプロモータもしくは制御配列を用いることが可能であり、しばしば望ましい。このような制御配列は、宿主細胞系に適合するものとして提供される。複製の開始点は、例えばＳＶ４０もしくは他のウィルス（例えば、ポリローマ、アデノ、BPV）源から誘導された、外因性の開始点を含むベクターの構築物、もしくは宿主細胞の染色体複製の機構により提供されるもののいずれかにより提供されてもよい。ベクターが宿主細胞の染色体内に一体化された場合は、後者の機構でしばしば十分とされる。
【０１５８】
Ｃ．グループＣのStreptococcus equisimilisの高カプセル化された株からの真正ＨＡシンターゼの単離
コードされたタンパク、指定されたseHASは、４１７アミノ酸（算出された分子量：47,778、およびPI：9.1）、であり、いままで確認されたHASファミリーの中で最も小さいメンバーである（図２）。seHASは、またSDS-PAGE(Mr-42 kDa)において、異常に速く移動した(図５および８)。
【０１５９】
図８は、組換えseHASの特定の抗体を用いたウェスターンブロット分析をグラフに示したものである。組換えseHAS（Ｅ；レーン２、７、および９）もしくはspHAS（Ｐ；レーン３、６、８、および１０）を含む、グループＣ（Ｃ；レーン１）もしくはグループＡ（Ａ；レーン４）のストレプトコッカル膜およびE. coli膜（９mg／レーン）は、還元SDS-PAGEおよびニトロセルロースへのエレクトロトランスファにより分画された。ニトロセルロースのストリップは、プローブとされ、以下のspHAS領域に生じた精製IgG分画を用いたアプリケーションにおいて描写されたものとして現像された。中央ドメインペプチドＥ147−Ｔ161（レーン１−４）；Ｃ−末端ペプチド（レーン５−６）；完全タンパク（レーン７および８）；組換え中央ドメイン（レーン９および１０）。非免疫IgGもしくはベクターだけで形質転換された細胞からの膜は、レーン５におけるようにステインが得られなかった。
【０１６０】
seHASおよびspHASタンパク（以前、米国出願第08/899,940号において確認された。）をコードする配列は、７２％同一であった。seHASの推定されるタンパク配列は、合成タンパク抗体との反応性により確認された(図８)。E. coli内で発現された組換えseHASは、主たるタンパクとして膜内で回収され（図８）、インビトロでUDP-GlcNAcおよびUDP-GlcAの存在下、非常に大きな分子量のＨＡを合成した(図９)。
【０１６１】
図９は、seHASおよびspHASにより産生されたＨＡのサイズの分布の反応速度分析を示す。同じ量のseHASもしくはspHASタンパクを含有するE. coli膜は、アプリケーションに記載されたように、３７℃で1.35ｍＭのUDP-[14Ｃ]GlaA（1.3×１０3dpm／nmol）および3.0mMのUDP-GlcNAcと共に培養された。これらの基質濃度は、それぞれのＫｍ値の１５倍より大きいものである。０．５、１．０、および６０分経過の試料はSDSで処理され、Sephacryl S400 HRでクロマトグラフィーされた。ＨＡタンパクは、カラムの分画範囲（分画１２−２４）内のＨＡタンパクは、各分画内の全ＨＡのパーセントで標準化された。表の上の矢印の上の値は、ダウンマルチアングルレーザー光スキャッタリング装置（Wyatt Technology Corp.）を用いた別の実験において直接決定されたＨＡの分子量（１００万単位）である。seHASにより（黒丸、黒四角、および黒三角）およびspHAS（白丸、白三角、  ）により、０．５分（白丸、黒丸）、１．０分（白四角、黒四角）および６０分( 、黒三角)で合成されたＨＡのサイズの分布が、表示されるように示されている。seHASおよびspHASは、合成するＨＡ鎖の大きさの分布において本質的に等しいことが分析で示された。seHASは、ＨＡ産生の機能において、spHASの２倍の速さである。
【０１６２】
Ｃ．１  細菌株およびベクター
ムコイドグループＣ株Ｄ１８１；(streptococcus equisimilis)は、ロックフェラー大学コレクションから入手した。E. coli宿主株SureおよびXL1-Blue MRF'は、Strategeneから、Top10Ｆ'株はInvitrogenからのものである。他に注釈が無い限り、StreptococciはTHY内で培養し、E. coliは株はＬＢ培地で培養された。PKK−223発現ベクターは、Pharmaciaから、PCR2.1クローニングベクターはInvitrogenからのものである。そして、前消化されたλ ZapTM Bam HI/CIAPベクターは、Strategeneからのものである。
【０１６３】
Ｃ．２  組換えＤＮＡおよびクローニング
CaparonおよびScottの方法（当業者において公知）により単離されたstreptococcus equisimilisからの高分子質量のゲノムＤＮＡは、Sau3A1で平均サイズが２〜１２ｋＢに部分消化された。消化されたＤＮＡは、エタノールで沈殿され、洗浄され、Bam HI/CIAPλ Zap 発現ベクターに連結された。連結されたＤＮＡは、Promegaから入手したPackageneTM抽出物と共にファージ内に収容された。収納されたファージライブラリの力価は、宿主としてのXL1-Blue MRF' E. coliを用いてチェックした。
【０１６４】
Ｃ．３  ディジェネレイトＰＣＲ増幅
ディジェネレイトオリゴヌクレオチドは、spHAS(Streptococcus pyogenes)、DG42(Xenopus laevis HAS; 19)およびnodC(Rhizobium meliloti nodulation 因子)の中の保存された配列を基礎として設計され、鋳型としてのD181ゲノムＤＮＡと共にＰＣＲ増幅のために用いた。増幅の条件は、３４サイクルで、９４℃１分間、４４℃１分間、７２℃1.5分間であり、その後、７２℃１０分間で最後の伸長とした。オリゴヌクレオチドHADRF1．５‘−GAY MGA YRT YTX ACX AAT TAY GCT ATH GAY TTR GG−３’（配列番号２０；センスストランド）は、配列Ｄ259RCLTNYAIDL（配列番号９：spHAS）に相当する。オリゴヌクレオチドHACTR1，５‘−ACG WGT WCC CCA NTC XGY ATT TTT NAD XGT RCA−３’（配列番号２１；アンチセンスストランド）は、領域Ｃ404TIKNTEWGTR（配列番号１０；spHAS）に相当する。いくつかの位置における塩基の縮退は、表IVに列記する、縮退塩基のためのコードにおいて、IUPACにより採用された標準名称により示されている。
【０１６５】
【表５】
0004731013.tif 000006
【０１６６】
これら二つのオリゴヌクレオチドは４５９ｂｐＰＣＲ産物を提供した。それはアガロースゲル上で分離され、そしてBIO−101 Genecleanキットを用いて精製された。次いで、このフラグメントは、製造者の指示にしたがって、宿主としてTOP 10F'細胞を用い、PCR2.1ベクター内にクローニングされた。ダブルストランドプラスミドＤＮＡは、QIAfilterプラスミドMidiキット(Qiagen)を用いてE. coli(TOP 10 F')から単離された。以下に示す二つの他の縮退センスプライマーもまた合成された。HAVAF1, 5'−GTN GCT GCT GTW RTX CCW WSX TWT AAY GAR GA−3'（配列番号２２、spHASの領域V66AAVIPSYNE（配列番号１１）に相当）およびHAVDF1、5'−GTX RWT GAY GGN WSX WSN RAX GAT GAX GC−3'（配列番号２３、spHASのV100DDGSSNTD（配列番号１２）を基礎とする）。二つの固有のアンチセンスプライマーが459bpのPCR産物の配列を基礎として合成された。これらは以下の通りである。D181.2，5'−GAA GGA CTT GTT CCA GCG GT−3'（配列番号１３）およびD181.4，5'−TGA ATG TTC CGA CAC AGG GC−3'（配列番号１４）。D181ゲノムＤＮＡを増幅するためにD181.2もしくはD181.4のいずれかと共に用いられた場合、二つの縮退センスプライマの各々は、予想されるサイズのＰＣＲ産物を与えた。四つのＰＣＲ産物はクローニングされ、上記と同様のストラテジを用いて配列決定された。各ＰＣＲ産物のために、６つの異なるクローンから入手した配列は、共通塩基配列を得るために比較された。したがって、我々は、spHASと高いホモロジーを有する連続ORFと共に1042bpの配列を入手した。
【０１６７】
Ｃ．４  ライブラリスクリーニング
二つの分子プローブはライブラリをスクリーニングするために用いられた。クローニングされた459bpのPCR産物と、オリゴヌクレオチドD181.5（5'−GCTTGATAGGTCACCAGTGTCACG−3'（配列番号１５）；1042bp配列から誘導されたもの）である。459bpのPCR産物は、Prime-It 11ランダムプライマー標識キット(Strategene)を用い、製造者の指示にしたがって、放射線標識を行った。オリゴヌクレオチドは、[γ32P]ATPを用い、Kinace-It Kinasing Kit(Stratagene)により標識した。放射線標識された産物は、NucTrap Pushカラム(Stratagene)において非標識物から分離された。オリゴプローブは、サザーンブロット上でのD181ゲノム消化物と特異的にハイブリダイズされた。λファージライブラリをスクリーニングするために、吸着されたファージを含むニトロセルロース膜上の宿主（3000プラーク／プレート）が、６０℃でプレハイブリダイズされ、そして5'末端を標識されたオリゴヌクレオチドD181.5と、QuikHyb Hybridization溶液(Stratagene)中、８０℃で指示にしたがってハイブリダイズされる際に、XLBLUE MRF'は用いられた。
【０１６８】
次いで、膜は、室温で１５分間、2x SSCバッファーおよび0.1%(w/v)SDSを用いて洗浄され、６０℃で３０分間、0.1x SSCバッファーおよび0.1%(w/v)SDSを用いて洗浄され、乾燥され、そして−７０℃で一夜、Bio-Max MSフィルムにさらされた。陽性のプラークは、リプレートされ、そして２度再スクリーニングされた。純粋な陽性のファージは、クロロホルムと共にＳＭバッファー内に貯蔵された。ベクタープライマーと共にこれらのファージにおけるＰＣＲは、３つの異なる導入物サイズを明らかにした。
【０１６９】
ベクタープライマーとクローニングされた１０４２ｂｐの配列の異なる領域からのプライマーとの組み合わせでのPCRは、三つの異なるファージの内の一つだけが、完全なHAS遺伝子を有することを明らかにした。このファージ中の導入物サイズは、6.5ｋｂであった。プラスミド内への導入物のサブクローニングの試みは、クローニングが失敗した選択されたファージライブラリからの自動的な切除によりなされた。したがって、PCRストラテジは、ORFの5'および３‘末端を得るために、純粋な陽性ファージＤＮＡにおいて再度適用された。オリゴヌクレオチドプライマーD181.3(5'−GCCCTGTGTCGGAACATTCA−3'（配列番号１６）)およびＴ３（ベクタープライマー）は、３kbの産物を増幅し、そしてオリゴヌクレオチドD181.5およびＴ７（ベクタープライマー）は2.5bpの産物を増幅した。ORFの5'および3'末端配列は、これら二つの上記産物を配列決定することにより得られた。全てのPCR産物の配列の分析は、1254bpのseHAS遺伝子のORFを再構築することを可能とした。
【０１７０】
Ｃ．５  seHASの発現クローニング
プライマー類は、センスオリゴヌクレオチドにおけるEcoR1制限サイト(5'−AGGATCCGAATTCATGAGAACATTAAAAAACCTC−3'（配列番号１７）)、およびアンチセンスオリゴヌクレオチドにおけるPst1サイト(5'−AGAATTCTGCAGTTATAATAATTTTTTACGTGT−3'（配列番号１８）)を含むために、seHASの開始および終止コドンで設計された。これらのプライマーは、純粋なハイブリダイゼーション陽性のファージと同様に、D181ゲノムＤＮＡからの1.2kdPCR産物を増幅した。この1.2kb産物は、アガロースゲル電気泳動により精製され、Pst1およびEcoR1で消化され、Pst1−およびEcoR1−で消化されたpKK223ベクター内に、指向的にクローニングされた。ライゲートされたベクターは、E. coli SURE細胞内に導入され、そして３０度で培養された。このステップは、実際には重要である。なぜなら、他の宿主細胞もしくはより高い温度ではクローニングされた導入物が削除されてしまうからである。コロニーは単離され、そのpDNAは精製された。６つのコロニー（a,b,c,d,e,およびfとする）の内、５つが正しいサイズの挿入物を有したが、一つは挿入物がなかった。
【０１７１】
Ｃ．６  ＨＡシンターゼ活性
ＨＡシンターゼ活性は、５つの上記クローンから調製された膜においてアッセイされた。新鮮なログフェイズ細胞が3000ｇ採取され、４℃でPBSにより洗浄され、そして膜は当業者において良く知られているプロトプラスト法を修正した方法により単離された。Streptococcus pyogenesおよび Streptococcus equismilisからの膜の調製もまた、異なるプロトプラスト手順の修正した方法により入手された。膜は、３７℃で、50mMリン酸ナトリウムおよびカリウム、２０ｍＭのMgCl2でｐＨ7.0、１ｍＭDTE、120μＭUDP−GlcAおよび300μＭUDP−GlcNAc中で、培養された。糖質の含有は、UDP−[14Ｃ]GlcA(318mCi／mmol；ICN)および／またはUDP−［3Ｈ］GlaNAc(29.2Ci/mmol NEN)を用いることによりモニターされた。反応は、最終濃度が２％(w/v)までのＳＤＳの添加により終了させた。産物のＨＡは、下降流ペーパークロマトグラフィにより前駆体から分離され、起源において含まれる放射線活性を検出することにより測定される。
【０１７２】
Ｃ．７  ゲル濾過分析
組換えseHASもしくはspHASを含む膜によりインビトロで産生された、放射線標識されたＨＡは、Sephacryl S500 HR(Pharmacia Biotech Inc.)のカラム（0.9×40cm）によるクロマトグラフィによって分析された。試料(200mM NaCl, 5mM Tris-Hcl, pH 8.0, さらに0.5%SDS中に0.4ml)が、200mM, NaCl 5mM Tris-HCl,およびpH8.0で溶出され、0.5mlの画分が、14Ｃおよびまたは3Ｈの放射線活性を評価された。真正のＨＡ多糖類が、37℃３時間、Streptomyces hyalurolyticus(EC 4.2.2.1)のＨＡ特異的ヒアルロナンリアーゼで、別個に同一の試料の処理により評価された。そして消化は、ゲル濾過に施された。
【０１７３】
Ｃ．８  ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスターンブロット
SDS-PAGEは、Laemmli法により行われた。ニトロセルロースへのエレクトロトランスファーは、Bio-Radミニトランスブロットデバイスを用いて、２０％メタノールと共に標準ブロッティングバッファー内で行われた。ブロットはTBS内で２％BSAと共にブロックされた。プロテインA/Gアルカリフォスファターゼ接合物(Pierce)およびp-ニトロブルーテトラゾリウム／５−ブロモ−４−クロロ−３インドリル  フォスフェート  ｐ−トルイジン塩が、検出のために用いられた。
【０１７４】
Ｃ．９  ＤＮＡ配列および分析
プラスミドは蛍光標識されたベクタープラスミドを用いて両ストランド共配列決定された。配列決定反応は、蛍光標識プライマー（７−deazaGと共に）のために、ThermosequenaseTMキットが用いられて行われた。試料は、ファーマシアALFエクスプレスDNAシーケンサー上で電気泳動され、データは、ALFマネージャーソフトv3.02により分析された。挿入物の内部領域は、ABIプリズム377（ソフトウェアーバージョン2.1.1）を用いてインターナルプライマーと共に配列決定された。遊走性の領域は、SequenaseTMの7-deaza−ＤＮＡポリメラーゼ、7-deaza GTPマスターミックス(USB)、および[α−35Ｓ]dATP(Amersham Life Sciences）を用いて手動で配列決定した。得られた配列は、DNASIS, v2.1(ヒタチ  ソフトウェアー  エンジニアリングCo., Ltd.)により分析されコンパイルされた。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列はジェンバンクおよび他のデータベースにおける他の配列と比較された。
【０１７５】
Ｃ．１０  seHASの同定
seHASの同定は、spHAS、DG42（開発の規制されたX. leavis HASであることが現在知られており、xlHASとして示される。）およびNodC（Rhizobium β-GlcNAcトランスフェラーゼ）の中の高い同一性のあるいくつかの部分を基礎としたオリゴヌクレオチドプライマーで、ＰＣＲアプローチを利用することにより行われた。XlHASおよびNodCタンパクは、spHASに対し、それぞれ〜50%および〜10%同一である。このストラテジは、spHASと66.4%同一の配列を有する459bpPCR産物を得、これはグループＡ(spHAS)ＨＡシンターゼ遺伝子のグループＣホモロガス(seHAS)が同定されたことを示す。そして、遺伝子の完全なコード領域は、同様のＰＣＲを基礎としたストラテジを用いて再構築された。そしてPCRプライマーの最終セットは、ゲノムＤＮＡから完全なORFを増幅するために用いられた。この1.2kbのPCRフラグメントが発現ベクターpKK223内に含まれており、そしてE. coli SURE細胞内に導入された際に、ＨＡ合成活性が、試験された５つのコロニーの５つから、単離された膜内において実証された。
【０１７６】
再構築された遺伝子のORFは、新規な予想された417アミノ酸のタンパクをコードしており、これはデータベースになく、そしてspHASより二個のアミノ酸分短いものであった。二つの細菌性のタンパクは、７２％同一であり、そして核酸配列においては７０％同一であった。seHASタンパクの予想された分子量は、47,778であり、予想された等電点は、ｐＨ9.1である。３つの近年同定された哺乳類のHAS類(muHAS1, muHAS2, muHAS3, 図２)は、バクテリアタンパクと同一である。二つのグループ間の全体としの相同性は、〜28−31%であり、さらにseHASにおける多くのアミノ酸が、真核性のHAS類のそれと高い保存性を有する（例えば、K/RもしくはD/E置換）。A98R、PBCY-1HASは哺乳類HAS類に対して28-33パーセントの相同性を有し、そして脂質膜における同様のトポロジーを有する。哺乳類種内において、同じファミリーのメンバーは、ほとんど完全に相同である（例えば、muHAS1とhuHAS1は９５％の相同性があり、muHAS2とhuHAS2とは９８％の相同性を有する。）。しかしながら、そして図３に示すように、同じ種内であっても、異なるHASファミリーメンバーでは、より異なる（例えば、muHAS1とmuHAS2とは、５３％の相同性であり、muHAS1とmuHAS3とでは５７％の相同性であり、muHAS2とmuHAS3とは71%の相同性である。）。
【０１７７】
図１０は、seHASのためのハイドロパシープロットと予想される膜トポロジーを示すものである。StreptococcalグループＣのHASのための親水性プロットは、KyteおよびDoolittleの方法(J. Mol. Biol. 157, 105, 1982)により、DNAsisを用いて生じたものであった。タンパクは、不可欠な膜タンパクであることが予想された。
【０１７８】
図１１は、膜内のseHASのトポロジー的組織のためのモデルを示すものである。タンパクのために提案されたトポロジーは、チャージインルール(charge-in rule)にしたがい、大きな中央のドメインを内側に入れている。このドメインは、結合しそして酵素としての触媒作用を示す基質のほとんどを含んでいると思われる。全てのHASファミリーのメンバーにおいて保存されている、seHAS中のCys226は、他の３つのシステインと同様に、中央のドメイン中に見られる。Cys281は、重要な残基であり、その置換は、酵素により合成されるＨＡ産物のサイズの分布を劇的に変更させる。
【０１７９】
seHASのために予想される全体の膜のトポロジーは、spHASおよび今まで報告されている真核性のHAS類のものと同様である。タンパクは、アミノ末端において二つの推定上の膜間ドメインを有し、カルボキシ末端において2-3の膜結合もしくは膜間ドメインを有する。二つのSteptoccocal酵素のためのハイドロパシープロットが、事実上同一であり、そしてseHASにおけるＫ313−Ｒ406（spHASにおけるＫ313−Ｋ405）での〜９０残基の極めて疎水性の領域におけるトポロジーの予想の困難性が描かれている。
【０１８０】
seHASは、E. coli 細胞内で効果的に発現した。SDS-PAGEゲルの染色(図５)による評価として、全膜タンパクの概略１０％がseHASである。42kDでの顕著なseHASバンドが、ベクターのみのコントロールレーンにおいて、量的に失われている。膜タンパクのためのこの通常でない高いレベルでの発現もまた、SURE細胞内の同様のベクターを用いた、spHASにおいても見出されている。約８％の膜タンパクが、E. coli SURE細胞内のspHASである。一方、グループＣの膜内のseHASの量は、全膜タンパクの１％未満である。グループＡ膜のspHASは、かろうじて検出される。E. coli SURE細胞内において発現される組換えseHASは、インビボでＨＡを合成しない。これは、これらの細胞が、要求される基質の一つであるUDP−GlcAを欠乏している細胞だからである。しかしながら、組換えseHASタンパクを含有する膜は、基質UDP-GlcNAcおよびUDP-GlcAを提供された場合は、ＨＡを合成する（図１２）。
【０１８１】
図１２は、組換えseHASによる真正なＨＡの合成を示すものである。組換えseHASを含む細胞もしくはベクターのみ含む細胞から調製されたE. coli膜（69μg）は、３７℃１時間、700μＭのUDP-[3Ｈ]GlcNAc(2.78×103dpm／nmol、白四角、黒四角)、および300μMのUDP[14Ｃ]GlcA（3.83×103dpm/nmol、白丸、黒丸）をここで記載したように２００μｌの最終容積において、培養する。酵素反応は、最終濃度２５mMのEDTAの添加により停止される。反応混合物の半分は、３７℃３時間、Streptomycesのヒアルロニダーゼと処理された。SDS(2%、w/v)は、ヒアルロニダーゼ処理（白丸、白四角）および未処理試料（黒丸、黒四角）に添加され、９０℃１時間加熱された。試料は、カラムバッファー(5mM Tris, 0.2M NaCl,pH8.0)で５００μｌへ希釈され、遠心分離により透明化され、そして２００μlはSephacryl S-500 HRカラム上にインジェクトされた。分画(1ml)は収集され、そして放射性活性が測定された。BDが、ブルーデキストランのピーク溶出位置である（〜２×106ＤＡ、Pharmacia）。Ｖｏは排除する体積を記し、Ｖｉは含まれる体積を記す。カラム内のＨＡ分画の全量中に含まれる[14Ｃ]GlcA：[3Ｈ]GlcNAcの比率は、１．４であり、これは二つの基質の特定の活性の比率と同一である。したがって、産物内に含まれる糖類のモル比は、真正なＨＡで予想されるものと同様の１：１である。ベクター単独でトランスフォームされた細胞からの膜は、ＨＡを合成しなかった。
【０１８２】
120μＭのUDP−GlcAおよび300μＭのUDP−GlcNAcを用いた場合、ＨＡ合成は膜タンパク（≦0.2μｇにおいて）と直線関係であり、それは少なくとも１時間の間である。また、形質転換されていない細胞から、もしくはベクターのみの形質転換である細胞から調製された膜は、検出可能なＨＡ活性を有さない。Ｍｇ+2がEDTAとキレート化（コントロールの＜５％）する場合、もしくは二つの基質のいずれかが除外された（コントｔロールの〜２％）場合、ＨＡ合成は無視される。組換えseHASもまた、糖ヌクレオチド基質への期待される特異性を示し、二つの通常の基質（表II）のいずれかと共に、UDP−GalA、UDP−Glc、もしくはUDP−GalNAcのいずれかと共重合できない。
【０１８３】
ゲル濾過分析を基礎として、単離された膜におけるseHASにより合成されるＨＡの平均量は5-10×106Daである。組換えseHASの産物は、等モル含まれる両糖類を基礎とした真正ＨＡであること、および特定のStreptomycesのヒアルロニダーゼにより分解される感度で判断される(図１２)。全てのＨＡ合成のための条件が最適でないにもかかわらず（なぜなら、一つの基質の〜90％が産物内に含まれていた。）、酵素はＨＡ鎖の長さの幅広い分布を生じさせた。ピークの分画は、約36,000の単独の糖類を含むポリマーである7.5×106DaのＨＡ量に相当する。ＨＡサイズの分布は、2-20×106Daの領域のこのカラムにより分析された。
【０１８４】
seHASの推定されるタンパクの配列は、グループＣタンパクと交差反応するためのspHASタンパクの抗体の能力により確認される(図８)。全てのspHASタンパクに対する、もしくはspHASの中央ドメインだけに対するポリクローナル抗体もまた、seHASタンパクと反応する。seHASのＣ末に対するアンチペプチド抗体は、seHASタンパクにおけるこのいくらか異なる部位と交差反応しない。しかしながら、spHASの配列のＥ147−Ｔ161に対するアンチペプチド抗体は、seHASにおける同じであると予想される配列を認識した。アンチペプチド抗体もまた、Streptococcal膜において野生型のseHASおよびspHASタンパクと反応し、両種からの野生型および組換え酵素が同一のサイズであることを確認する。spHASタンパクのように、seHASはSDS-PAGE上を異常な速度で移動する。計算された量が47,778Daであるにもかかわらず、SDS-PAGEによるＭｒは一貫して〜42kDaである。
【０１８５】
二つの細菌性酵素における、配列の中央部分ドメインの配列の同一性および予想される構造の全体的な同一性のため、Ｅ147−Ｔ161領域に対するタンパク特異的抗体は、二つの異なる酵素の遺伝子で形質転換した細胞から調製された膜において発現するHASタンパクのために、標準化して用いることできる。このアプローチを用いると、組換えspHASもしくはseHASの本質的に同一である量と共に、膜は、ＨＡ合成の初期の速さおよびＨＡ産物のサイズの分布に関して比較された。
【０１８６】
spHASで示されるように、seHASによるＨＡ鎖の合成はプロセッシブである。酵素は、最終的な産物が放出されるまで、ＨＡ鎖と連結して止まることが明らかである。したがって、ＨＡ鎖合成の最初のラウンドの間、初期において製造されるＨＡ鎖のサイズの分布を検査することにより、seHASおよびspHASによるＨＡ伸長の速度を比較することは可能である。種々の場合におけるＨＡ産物のサイズのゲル濾過分析を基礎として、我々は、seHASによる平均伸長速度が、３７℃において約9,000単糖／分であることを確認している(図９)。５分間で、酵素は５−10×106DaのＨＡ鎖を重合することができる。したがって、６０分間の培養により、各酵素分子は、そのような大きさのＨＡ分子を５−８のレベルで、潜在的に、開始し、完了し、そして放出することができる。初期においては（例えば、≦１分）、最初のＨＡ鎖の長さを反映して、seHASにより産生されたＨＡのサイズの分布はspHASと比較して、長い種類の側に移行した。６０分までに、ＨＡ産物の大きさの二つの分布は、区別がつかなくなる。
【０１８７】
クローニングされたseHASは、真正グループＣのＨＡシンターゼを代表する。したがって、以前に報告され、開示された「グループＣ」タンパクは、真のグループＣのＨＡＳではない。seHASタンパクは、いまこの急激に成長するＨＡシンターゼファミリーに含まれるウィルス、細菌、および脊椎動物からの近年知られたＨＡシンターゼの９つに対し相同でである。この相同性は、図２に特に示されている。哺乳類において、HAS１、HAS２、およびHAS３で示される３つの遺伝子は単離され、ヒトおよびマウスの両者において三つの異なる染色体にマッピングされた。両生類においては、いままで単離された単一のHASタンパクが、開発上規制されるＤＧ４２であり、これは1988年にクローニングされ、そして近年酵母の膜において組換えタンパクの分析によりＨＡシンターゼ活性をコードすることが示された。おそらく、他のX. leavus HAS遺伝子もすぐに単離されるであろう。
【０１８８】
他の進化のモデルは、次の点を示唆する。すなわち、プリミティブな細菌性HAS前駆体は、脊椎動物の研究開発中の早期にその地位を奪われたかもしれず、もしくは、プリミティブな細菌を原始HAS中に捕らえた場合、ＨＡカプセルの作製という細菌病原性のストラテジが開発された。共通の構造的解答への細菌および真核生物HASの集中的な発展は、ありうそうにないように思われるが、生じる可能性はある。
【０１８９】
HASのための３つの哺乳類のアイソザイムのいずれも、それらのＨＡ産物サイズに関して、いまだ酵素的に特定されていない。少なくとも、１０個の識別されたＨＡＳタンパクが、同様なトポロジーで膜タンパクであることを予想される。ＨＡの合成は原形質膜で生じ、ＨＡは媒体内に放出されるか、もしくは細菌カプセルを形成するためもしくは真核性のペリセルラーコートを形成するために連結されて細胞に残留する。細胞質内の糖ヌクレオチド基質は、ＨＡ鎖を構築するのに用いられ、ＨＡ鎖は外界へ膜を介して突出する。
【０１９０】
HASタンパクの非常に疎水性の高いカルボキシルタンパクにおけるタンパクのトポロジーは、酵素がいかに成長するＨＡ鎖を伸ばすと同時に膜を介して突出させるかを理解する上で重要であることを明らかにする。例えば、先例の無い酵素の活性が、脂質二重層とタンパクとの通常でない、かつ複雑な相互作用を要求する可能性がある。spHAS−アルカリフォスファターゼ融合タンパクの分析に基づく事前の結果は、アミノおよびカルボキシル末端、および大きな中央のドメインは図１０および１１に示すように、全てが細胞内であることを示す。seHASタンパクもまた、大きな中央部ドメイン（全タンパクの〜６３％）を有し、これは二つの基質結合部位、およびＨＡ合成のために必要とされる二つのグリコシルトランスフェラーゼ活性部を含むことを明らかにする。近年のソフトウェアープログラムが、長いＣ末端の疎水性の伸長部内の膜結合ドメインの数および性質を信頼性高く予想することができないにもかかわらず、提案されたトポロジカルな配置は、現在の証拠と合致し、そして二つの追加の予測される膜間ドメインと共にタンパクのＣ末端の伸長のために〜４０％より長い、真核性の酵素にも同様に適用される。
【０１９１】
spHAS中の６つのCys残基のうちの４つは、seHA類と共に保存される。両細菌性の酵素内のCys225のみが、HASファミリーの全てのメンバーにおいて保存される。例えばp-マーキュロベンゾエイトもしくはNEMといった、スルフヒドリル反応剤は、HAS活性を大きく阻害するので、この保存されたCysが酵素の活性に必要もしくは重要である可能性が高い。しかしながら、部位特異的突然変異の研究からの初期の結果は、spHASのC225S変異体は不活性でなく、野生型の活性の5-10％を維持していることを示す。
【０１９２】
特異的なオリゴヌクレオチドを用いたseHAS単独、spHAS単独、もしくはspHASおよびspHASの両者をコードする核酸配列の認識は、図１３に示されている。３つのセンス−アンチセンスオリゴヌクレオチドの対は、配列番号１の配列およびspHASをコードする配列に基づいて設計された。seHASに基づく核酸セグメント（se1-se2およびsesp1-sesp2）は、図１４に示されている。これら３つのオリゴヌクレオチドの対は、グループＣ(seHAS)(レーン２、４、および６)もしくはグループＡ(spHAS)(レーン３、５、および７)のいずれかのstreptococciからのゲノムＤＮＡとの代表的なPCR反応の下でハイブリダイズされた。レーン１および８は、kb(キロベース)での分子量標準の位置を示す。PCR反応は、次に示す２５サイクルで、TaqDNAポリメラーゼ(Promegaより)を用いて行われた。DNAの変性を行うために、摂氏９４度で１分間、ハイブリダイゼイションを可能するために摂氏４８度（より小さい共通のsespプライマーのためには摂氏４２度）で１分間、そしてDNA合成のために摂氏７２度で1.5分間。PCR反応混合物は、次いで１％アガロースゲル上で電気泳動により単離された。
【０１９３】
se1-se2プライマー対は、グループＣのHAS(seHAS)のためにユニークで特異的に設計された。sp1-sp2プライマー対は、グループＡのHAS(spHAS)のためにユニークで特異的に設計された。sesp1-sesp2プライマー対は、グループＡおよびグループＣのHASの核酸配列の両者にハイブリダイズするように設計された。３つのプライマー対の全てが期待通りに作用し、交差的にハイブリダイズし、そして特異的および／またはユニークであるPCR産物の発生をサポートする好ましい能力を示した。
【０１９４】
特異的PCRもしくはハイブリダイゼーションのために用いられるオリゴヌクレオチドは、図１４に示される。配列番号３、４，５および６の合成オリゴヌクレオチドは、配列番号１の相当する領域内に示された。これらの領域は太字で示され、それぞれプライマーse1、se2、sesp1、およびsesp2としてマークがなされている。＃１は、センス方向におけるプライマーを示し、＃２はアンチセンス方向のプライマーを示す。４つのオリゴヌクレオチドの各々は、seHAS配列と特異的にハイブリダイズし、そして好ましいセンス／アンチセンスプライマーの対は図１３に示すように、ポリメラーゼ連鎖反応に用いるのに好適である。
【０１９５】
図７は、酵母の膜において発現する組換えHASにより合成されたヒアルロナンのゲル濾過分析を示すものである。spHAS（元のValコドンがMetにスイッチされている）に相当する419アミノ酸残基のオープンリーディングフレームをコードするDNAフラグメントは、pYES/HAを製造するためのpYES2酵母発現ベクター(Invitrogenより)内に標準的な方法によりサブクローニングされた。この構築物を有する細胞からの膜が、ガラスビーズで攪拌することにより調製された。実質的なＨＡ合成活性および「４２kDa」HASタンパクを含むpYES／HA構築物から誘導された試料が、特異的な抗体を用いてウェスターン分析により検出された。ベクターのみを有する細胞からの膜は、活性も免疫反応によるバンド（図示略）のいずれも有するものではなかった。膜（315μgタンパク）は、最初、担体の無いUDP-[14Ｃ]GlcA（１μCi14Ｃ）および９００μＭの標識されていないUDP-GlcNAcと共に、50mMのTris、pH７，20mMのMgCl2，1mMのDTT，および0.05MのNaCl（450μl反応容積）内で、摂氏３０度、1.5分間培養した。この後、次いでパルス−ラベル  ピリオド  ノンラジオラベルドUDP-GlcAが添加され、最終濃度が９００μＭとした。試料（100μL）が、「チェイス」後、1.5分（黒丸）、および１５（黒四角）、および４５（黒三角）分でのパルスの後、採取された。反応は、２％までのSDSの添加により終結され、１分間、摂氏９５度で加熱された。試料の半分が、0.2MのNaCl、5mMのTris、ｐＨ８で平衡とされたSephacryl s-500HRゲル濾過カラム(Pharmacia; １×５０cm)上にインジェクションされる前に、試料は遠心分離（10,000×ｇ、５分）により清澄化された。
【０１９６】
カラムは、0.5ml／分で溶出され、分画内の放射線活性は、BioSafeIIカクテル(4.5ml，Research Products Intl.)を添加した後、液体シンチレーション計数により定量された。溶媒容積および全体的に含まれる容積は、それぞれ14mlおよび35.5mlの溶出体積であった。ブルーデキストラン(平均２×106Da)のピークは、25-27mlの溶出であった。真核生物の酵母細胞において発現した組換えHASは、インビトロで高分子量のヒアルロナンを産生した。
【０１９７】
したがって、本発明は、酵素的な活性を有するHASをコードするコード領域を有する単離された核酸セグメント、seHAS遺伝子からヒアルロナンを産生する方法、そしてseHAS遺伝子によりコードされたHASから産生するヒアルロナンの使用を提供し、それらは十分に上述した目的および利点を充足するものであることは明らかである。本発明は、その特定の実施態様に関連して記載されたが、多くの置換、修正、および変更が当業者にとって自明であることは明白である。したがって、添付の請求の範囲の精神および幅広い範囲内のすべてのそのような置換、修正および変更は、本発明に包含されるものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、seHASとspHAS遺伝子との間で交差ハイブリダイゼーションが発生しなかったことを示す。
【図２】  図２は、細菌および真核ＨＡＳタンパク質に対するseHASの関連性を図示する。
【図３】  図３は、既知のヒアルロナンシンターゼの幾つかの間の進化上の関係を図示する。
【図４】  図４は、種々の処理された連鎖球菌ＨＡＳ酵素によって産生したＨＡのサイズ分布を示す。
【図５】  図５は、大腸菌中での組換えseHASとspHASとの過発現を図示する。
【図６】  図６は、連鎖球菌ＨＡシンターゼの精製を示す。
【図７】  図７は、酵母膜中で発現した組換え連鎖球菌ＨＡＳによって合成されたＨＡのゲル濾過分析を示す。
【図８】  図８は、特定の抗体を使用した組換えseHASのウエスタンブロット分析である。
【図９】  図９は、組換えseHASおよびspHASによって産生されたＨＡのサイズ分布の運動分析である。
【図１０】  図１０は、seHASと、予期されたメンブラン関連領域の親水性プロットを示すグラフである。
【図１１】  図１１は、膜中のseHASのトポロジー組織を図示する模型である。
【図１２】  図１２は、組換えseHASによる正統的なＨＡの合成を示す。
【図１３】  図１３は、seHASをコード化し、spHASをコード化し、あるいはseHASとspHASとの双方をコード化する核酸配列を、特異的なオリゴヌクレオチドおよびＰＣＲ法を使用して認識することを示す。
【図１４】  図１４は、特異的ＰＣＲハイブリダイゼーションに使用したオリゴヌクレオチドを示す。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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