(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含む免疫原。
【請求項２】
配列番号３２に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【請求項３】
ヒト被験体に対する投与に適切な無菌形態の免疫原であって、以下の構造の一つ：
（ａ）ＮＨ２−ｐ２４−ｐ１７−ＣＴＬポリペプチド−ＣＯＯＨ；
（ｂ）ＮＨ２−ｐ２４−ｐ１７−ｔａｔ−ＣＴＬポリペプチド−ＣＯＯＨ；
（ｃ）ＮＨ２−ｐ２４−ｐ１７−ＣＴＬポリペプチド−ｔａｔ−ＣＯＯＨ；または
（ｄ）ＮＨ２−ｐ２４−ｐ１７−Ｃｐｏｌ−ｒｅｖ−ｔａｔ−ｎｅｆ−Ｎｐｏｌ−ＣＴＬポリペプチド−ＣＯＯＨ；
の合成ポリペプチドを含み、前記ＣＴＬポリペプチドが表１に同定されるヒトＣＴＬエピトープの少なくとも１０個を含む、免疫原。
【請求項４】
ｐ１７がＮ末端ミリスチル化を阻害するように改変されている、請求項３に記載の免疫原。
【請求項５】
前記合成ポリペプチドに存在する前記ヒトＣＴＬエピトープの少なくともいくつかが重複している、請求項３に記載の免疫原。
【請求項６】
前記合成ポリペプチドに存在する前記ヒトＣＴＬエピトープの少なくとも５０％が重複している、請求項３に記載の免疫原。
【請求項７】
前記合成ポリペプチドに存在する前記ヒトＣＴＬエピトープの少なくともいくつかが隣接している、請求項３に記載の免疫原。
【請求項８】
前記ヒトＣＴＬエピトープの少なくともいくつかが、非エピトープ性アミノ酸配列によって分離されている、請求項３に記載の免疫原。
【請求項９】
１つ以上の実験室試験哺乳動物によって認識される少なくとも１つのエピトープを含む、請求項３に記載の免疫原。
【請求項１０】
前記１つ以上の実験室試験哺乳動物によって認識されるエピトープがＣＴＬエピトープである、請求項９に記載の免疫原。
【請求項１１】
前記合成ポリペプチドが、表１に同定されるヒトＣＴＬエピトープの少なくとも１５個を含む、請求項３に記載の免疫原。
【請求項１２】
前記合成ポリペプチドが、表１に同定されるヒトＣＴＬエピトープの少なくとも２０個を含む、請求項３に記載の免疫原。
【請求項１３】
前記合成ポリペプチドが、表１に同定されるヒトＣＴＬエピトープの少なくとも２３個を含む、請求項３に記載の免疫原。
【請求項１４】
請求項３に記載の免疫原を含む細菌。
【請求項１５】
ヒト被験体に対する投与に適切な弱毒化病原である、請求項１４に記載の細菌。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、ヒト被験体において抗ＨＩＶ免疫応答（特に細胞媒介性応答）を惹起するために設計された免疫原、この免疫原をコードする核酸分子、この免疫原および／またはこの核酸分子を含む組成物に関し、そしてヒト被験体において抗ＨＩＶ免疫応答（特に細胞媒介性応答）を誘導するための方法に関する。
【０００２】
（発明の背景）
効果的なヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ワクチンの開発は、現在の後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）研究の主要な目的の１つである。ＨＩＶ感染を処置するための、予防的かつ強力な薬物の組み合わせにおける進歩にかかわらず、毎日、１６，０００人が感染していると推計される。新しい感染の９０％以上が開発途上国において生じており、ここには現在の医学的発展はすぐには適用されないか、または経済的に手が届かない。これらの国にとって最も望ましいのは有効で入手し易いＨＩＶワクチンの開発である。ＡＩＤＳワクチンが可能になり得るという期待が現在、科学者の間で大きくなっている（ＭｃＭｉｃｈａｅｌ＆Ｈａｎｋｅ  １９９９  Ｎａｔ．Ｍｅｄ．５，６１２〜６１４；Ｇｏｌｄ  １９９９  ＩＡＶＩ  Ｒｅｐｏｒｔ  ４，１〜２、８〜９、１５〜１６および１８頁）。
【０００３】
理想的な予防用ワクチンは、曝露後にウイルスが身体内で決して検出されないように、殺菌的な免疫を誘導しなければならない。しかし、これはおそらく非現実的な目標である。むしろ、達成可能な目的は、限局的かつ一過性のウイルス複製を生じ、その後ウイルスが検出不能になり、疾患の兆候も他の個体への伝染もない、ワクチン誘導免疫であり得る。あるいは、可能性として首尾よいワクチンは、ＡＩＤＳへの進行および伝染の両方とも完全にまたは実質的に防ぐ、検査の際ウイルスをかなり低いレベルに少なくとも維持する免疫応答を誘導し得る。殺菌的な免疫を誘導するために、予防用ワクチンは、体液性免疫応答および細胞媒介性免疫応答の両方を惹起する必要があるだろう。ＨＩＶが、単離されそして配列決定されてから、中和抗体（ｎＡｂ）を誘導するエピトープに基づく（エピトープベースの）ワクチンを開発するにはかなりの労力を要した。しかし、これは、非常に困難であることが証明されている（ＨｅｉｌｍａｎおよびＢａｌｔｉｍｏｒｅ  １９９８  Ｎａｔ．Ｍｅｄ．４（４  Ｓｕｐｐｌ．）５３２〜５３４）。実験的ＨＩＶ株に対するｎＡｂを誘導するのにはいくつかの成功例が報告されているが（Ｂｅｒｍａｎら、１９９０  Ｎａｔｕｒｅ  ３４５、６２２〜６２５；Ｆｕｌｔｚら、１９９２  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６、１６８７〜１６９０）、主な単離物を中和することは非常に困難であった（Ｔｒｋｏｌａら、１９９８  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２，１８７６〜１８８５；Ｈａｙｎｅｓ  １９９６  Ｌａｎｃｅｔ  ３４，９３３〜９３７）。最初の１５年間の相対的な失敗に関する説明は、コアｇｐ１２０の結晶構造によって提供された。コアｇｐ１２０は複数の機構を示し、これによってＨＩＶはｎＡｂの効率的な誘導を妨害する（Ｗｙａｔｔら、１９９８  Ｎａｔｕｒｅ  ３９３、７０５〜７１１；Ｋｗｏｎｇら、１９９８  Ｎａｔｕｒｅ  ３９３、６３８〜６５９）。これらの困難の結果、多くのワクチンの設計者の注目は、細胞傷害性Ｔリンパ球によって（優先的に）媒介される、細胞媒介性免疫応答の誘導に移った。
【０００４】
細胞傷害性リンパ球（ＣＴＬ）は、通常ＣＤ８＋細胞であり、そして少なくとも２つの異なる方法で器官の防御に加わる；ＣＴＬは、ウイルス感染細胞を殺傷し；そしてＣＴＬは、種々のサイトカインおよびケモカインを分泌してウイルス複製の抑制に直接または間接的に寄与する。ワクチン接種後のＣＴＬ媒介性防御は、循環中に存在するＣＴＬのレベルに依存し得、そしておそらく、複製サイクルの後期に発現されるタンパク質（構造タンパク質）ではなく、初期に発現されるタンパク質（調節性タンパク質）に特異的である。
【０００５】
ＣＤ８＋Ｔ細胞応答の誘導および維持は、ＣＤ４＋Ｔリンパ球（ヘルパーＴ細胞）によって得られる「ヘルプ（助け）」を必要とする。いくつかのＨＩＶ感染個体では、高レベルのＨＩＶ特異的ヘルパー応答が検出されている。
【０００６】
強力なＣＤ８＋Ｔ細胞応答の誘導のための方法の同定により、ＨＩＶ感染の過程を形成する際のそのＴ細胞の役割を研究するためのツールが提供され、有効なＨＩＶワクチンへの進歩が刺激され得る。以前には、マウス、マカク、およびヒトのＣＴＬによって認識される一連の部分的に重複するエピトープとして、プロトタイプのＨＩＶワクチンが構築された。これは、ヒトに用いるのに安全かつ受容可能なワクチンビヒクルによって、ＤＮＡベクターおよび改変ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）ベクターによって送達された（Ｈａｎｋｅら、１９９８  Ｖａｃｃｉｎｅ  １６，４２６〜４３５；Ｈａｎｋｅら、１９９８  Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７９，８３〜９０）。マウスでは、ＣＴＬの誘導の最も強力なプロトコールは、ＤＮＡプライミングとその後のＭＶＡブースト（ブースティング）（すなわち、関連ポリペプチドをコードする核酸でマウスをプライミングし、その後、この関連のエピトープを発現する改変ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ（「ＭＶＡ」）ベクターをこのマウスにブーストすること）であることが見出された（Ｈａｎｋｅら、１９９８  Ｖａｃｃｉｎｅ  １６，４３９〜４４５；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら、１９９８  Ｎａｔ．Ｍｅｄ．４，３９７〜４０２）。
【０００７】
ＷＯ  ９８／５６９１９は、「プライム−ブースト（ｐｒｉｍｅ−ｂｏｏｓｔ）」ワクチン接種ストラテジーを開示する。このストラテジーには、以下（ｉ）薬学的に受容可能なキャリアとともに、標的抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープの供給源を含む組成物を用いたプライミング、および（ｉｉ）標的抗原の１つ以上のＴ細胞エピトープ（プライミング組成物のＴ細胞エピトープと同じである少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含む）の供給源を含む組成物を用いたブーストが挙げられる。
【０００８】
本発明は、とりわけ、ヒトにおいてＨＩＶ特異的応答を惹起するのに有用であり得る免疫原を供給することが目的である。本明細書において言及される全ての書類および刊行物は参考として本明細書に援用される。
【０００９】
（発明の要旨）
第１の局面において、本発明は、ヒト被験体への投与に適した滅菌形態の免疫原を提供し、この免疫原は、ＨＩＶのｇａｇタンパク質の少なくとも１部分；および複数のアミノ酸配列を含む合成ポリペプチドを含み、ここで、このｇａｇタンパク質は、ＨＩＶクレード由来であるか、または１つ以上のＨＩＶクレードのコンセンサス配列を有し、そしてｐ１７およびｐ２４の少なくとも１部を含み、この複数のアミノ酸配列の各配列は、ＨＩＶタンパク質のヒトＣＴＬエピトープを含み、そしてここで、複数のＨＩＶタンパク質が、合成ポリペプチド中に提示され、このＣＴＬエピトープは、目的の１つ以上のＨＩＶクレードに対して免疫応答を刺激するように選択されている。
【００１０】
本発明の目的に関して「滅菌」は、ウイルス、細菌、真菌、酵母、クラミジア、マイコプラズマ、および上記のいずれかの胞子（特に、ヒトにおいて病原性である胞子）が一般的にないことをいう。しかし、免疫原は、ヒト被験体においてｇａｇタンパク質および／または合成ポリペプチドを発現するために機能する、１つ以上の特定の公知の微生物（例えば、ウイルスまたは細菌）ベクターを含み得る。このようなベクターは、当業者に周知であり、そして例えば、アノデウイルスおよびポックスウイルスのようなウイルス（これらは、ヒトにおいて本来非病原性であるか、またはヒトにおいてこれらを非病原性にさせるための遺伝子操作もしくは他の改変に供されている）が挙げられる。特に好ましいのは、ワクチンウイルス、特に、改変ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）である。他の特定の好ましいウイルスベクターとしては、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）およびシンドビスウイルスが挙げられる（Ｓｍｅｒｄｏｎ  ＆  Ｌｉｌｊｅｓｔｒｏｎ  ２０００，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．Ｒｅｇｕｌ．１，１−３１を参照のこと）。適切な細菌ベクターとしては、ＢＣＧ、およびサルモネラ種の弱毒化菌株（特に、下痢疾患のためのワクチンとして開発されたサルモネラの「ダブルアロ（ｄｏｕｂｌｅ  ａｒｏ）」変異体）、および赤痢菌属が挙げられる（Ｓｈａｔａら、２０００  Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．Ｔｏｄａｙ  ６，６６−７１を参照のこと）。
【００１１】
免疫原を産生するのに有用であり得る他の発現系としては、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）発現ベクター（Ｐａｌｍｅｒら、１９９９  Ａｒｃｈ．Ｖｉｏｌ．１４４，１３４５−６０）およびブルータングウイルスのＮＳ１細管（Ａｄｌｅｒら、１９９８  Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（Ｂｅｒｌ．）１８７，９１−９６）が挙げられる。
【００１２】
用語「合成」は、本明細書中に使用される場合、その全体が、任意の天然に存在するＨＩＶ単離体中に存在しないポリペプチドをいうことが意図される。用語「合成」は、ポリペプチドが、固相ペプチド合成の従来の化学技術によって必ず合成されることを示すとは、意図されない。「合成」は１つの可能性を示すが、一般的に、ポリペプチドは合成ペプチドをコードする適切な核酸分子から転写および／または翻訳によって合成されることが、好ましい。このような合成方法は当業者に周知であり、そして本発明の一部を形成しない。
【００１３】
ｇａｇタンパク質（またはその一部分）および合成ポリペプチドは、何れかの方法で単一実体上で連結されることが好ましい。例えば、ウイルスベクターは、このｇａｇタンパク質および合成ポリペプチドの両方を、免疫原の別の成分として発現し得る。あるいは、この免疫原の両方の成分は、互いにかまたは共通のキャリア実体（例えば、リポソーム、ＩＳＣＯＭまたは分子）に、共有結合的に結合または連結され得る。好ましい実施形態において、この免疫原のｇａｇタンパク質および合成ポリペプチド成分の両方は、単一ポリペプチドまたは融合タンパク質として存在する。このような融合タンパク質において、ｇａｇタンパク質および合成ポリペプチドは、本質的に提示される唯一の成分であり得る。あるいは、融合タンパク質は、他のＨＩＶ抗原（またはその部分）に対応し得るかまたは他の供給源由来であり得る他の成分を含み得る。従って、いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、合成ポリペプチドに実質的に隣接した（すなわち、１０未満の介入アミノ酸残基）ｇａｇタンパク質の一部分を含む。他の実施形態において、ｇａｇタンパク質の一部分および合成ポリペプチドは、１つ以上の介入成分によって分離され得（すなわち、１０以上の介入アミノ酸残基）、これは、代表的に、１つ以上のさらなるＨＩＶ抗原を含む。
【００１４】
免疫原が全ｇａｇタンパク質アミノ酸配列を含まないことがまた、一般的に好ましい。代表的に、５５％と９５％との間のｇａｇタンパク質が存在し、好ましくは６５％と８５％との間、最も好ましくは約７５％のｇａｇタンパク質が存在する。
【００１５】
野生型ＨＩＶ  ｇａｇタンパク質は、ｐ１７、ｐ２４およびｐ１５と呼ばれる３つの部分からなることが、公知である。これらは、ｐ１７をＮ末端に有する単一ポリタンパク質として感染細胞中で合成される。通常、ＨＩＶ感染細胞において、ｐ１７のＮ末端は、ミリスチル化されている。
【００１６】
免疫原のｇａｇ部分が、ｐ１７およびｐ２４の少なくとも一部を含むことが望ましいが、一般的に、ｐ１７成分が、何れかの方法でミリスチル化を回避するように改変されることが好ましい。好都合なことに、これは、免疫原中のｐ１７成分およびｐ２４成分の順序を逆転することによって達成され得、その結果、ｐ１７は、もはや遊離Ｎ末端ではなく、従って、ミリスチル化され得ない。本発明者らは、本方法が、免疫原由来のペプチドの、被験体の免疫系への提示効率を改善し得ると考える。
【００１７】
免疫原のｇａｇタンパク質成分は、一般的に、少なくとも１つの、Ｔヘルパー細胞のＨＬＡ  クラスＩＩ拘束ペプチドエピトープを含み、そして好ましくは、多数のこのようなエピトープを含む（好ましくはこの結果、多数の異なるＨＬＡ  クラスＩＩ拘束対立遺伝子が、ｇａｇ成分において提示される）。ｇａｇタンパク質成分はまた、代表的に、１つ以上のＣＴＬ  ＨＬＡ  クラスＩ拘束ペプチドエピトープを含む。
【００１８】
免疫原の合成ポリペプチド成分は、好都合なことに、ひも状形態のＣＴＬエピトープをとり、各々は、約８〜１２アミノ酸の各配列によって示されるか、またはこれらの各配列内に含まれる。望ましくは、エピトープの少なくともいくらか（好ましくはほとんど）は、部分的に重複している（その結果、１つのエピトープの１つ以上のアミノ酸はまた、隣接エピトープの配列内に含まれる）。いくつかの「非エピトープ」アミノ酸配列は、隣接エピトープ間に存在し得るが、これは、一般的に回避される。
【００１９】
隣接エピトープ間の非エピトープアミノ酸配列は、好ましくは２０アミノ酸残基未満、より好ましくは１０残基未満、そして最も好ましくは１〜５アミノ酸残基である。このような非エピトープアミノ酸配列が、合成ポリペプチドの発現レベルを最適化するかまたはその免疫原性を最適化するリンカー、スペーサーなどを含み得ることは明らかである。
【００２０】
従って、１つの極端な実施形態において、合成ポリペプチド中のヒトＣＴＬエピトープの全ては、重複し得、そして他の極端な場合、全てのエピトープは、少なくともいくつかの非エピトープアミノ酸配列によってその隣接物と分離され得る。一般的に、少なくとも５０％のヒトＣＴＬエピトープが重複することが、好ましい。
【００２１】
重複エピトープに加えて、合成ポリペプチドは、少なくともいくつかの「隣接エピトープ」を含み得る。用語、隣接エピトープは、重複していないが、いずれの介在非エピトープアミノ酸配列によっても分離されていないエピトープをいう。
【００２２】
従って、好ましい実施形態において、合成ポリペプチドは、異なるＨＩＶタンパク質の小さな（代表的に約１０〜２０アミノ酸残基）フラグメントが継ぎ合わされたモザイクを含み、このフラグメントは、代表的に、１、２または３つの既知の隣接および／または重複ヒトＣＴＬエピトープを含む。多数のフラグメントが同じＨＩＶタンパク質由来の合成ポリペプチド中に存在する場合、このフラグメントは、代表的に、タンパク質の不連続部分から選択され、その結果、合成ポリペプチドが特定のＨＩＶタンパク質の２０〜２５より多く連続するアミノ酸残基に対応する配列を含む可能性は低い。一般的に、合成ポリペプチドは、任意のヒトＣＴＬエピトープを含むことが既知ではないＨＩＶタンパク質の部分を本質的に省くように設計される。
【００２３】
多数の異なるＨＩＶタンパク質が、好ましくは、合成ポリペプチド中で示される。合成ポリペプチドは、任意のＨＩＶ抗原中に存在するエピトープを含み得るが、好ましくは、以下：ｐ２４；ｐｏｌ；ｇｐ４１；ｇｐｌ２０；およびｎｅｆのうちの１つ以上に存在する少なくとも１つのエピトープを含む。１つの好ましい実施形態において、合成ポリペプチドは、上述のＨＩＶタンパク質の各々に存在する少なくとも１つのＣＴＬエピトープを含む。合成ポリペプチドは、さらに、以下のＨＩＶタンパク質：ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｖｉｆ（そして特に）ｔａｔおよびｒｅｖの各々に存在する少なくとも１つのＣＴＬエピトープを含み得る。
【００２４】
用語「ヒトＣＴＬエピトープ」は、本明細書中に使用される場合、エピトープが由来するタンパク質の起源に対して言及されるのではなく、エピトープが少なくとも一部分のヒト集団のＣＴＬによって認識され応答されることを示すことが、理解される。代表的に、ヒトＣＴＬエピトープは、世界中のヒト集団のうちの、少なくとも０．０１％、好ましくは０．１％、およびより好ましくは少なくとも１％によって認識される。
【００２５】
１つの好ましい実施形態において、免疫原は、代表的に、ヒト免疫系によって一般的に認識されるｅｎｖタンパク質由来の任意のエピトープを除外する。最近使用される診断試験は、ＨＩＶ  ｅｎｖ特異的免疫応答の検出に基づき、これは、ｅｎｖ成分を免疫原から排除することによって、ウイルスでの感染から生じる免疫応答と免疫原での接種から生じる免疫応答との間を区別することが可能である。
【００２６】
１つの実施形態において、合成ポリペプチド中に存在するＣＴＬエピトープは、ＨＩＶクレードＡに対する免疫応答が生成されるように選択される。しかし、好ましくは、合成ポリペプチドは、十分に大きく、そしてＣＴＬエピトープは、異なるＨＩＶクレードに対して交差反応する免疫応答が刺激されるように適切に選択される。これは、異なるＨＩＶクレード間で保存される１つ以上のＣＴＬエピトープを排除することによって好都合に達成され得る。いくつかのこのようなエピトープは、当業者に公知である（以下の表１を参照のこと）。
【００２７】
好ましい実施形態において、免疫原は、１つ以上の実験室試験哺乳動物（例えば、マウスおよび／またはマカクザル）によって認識される少なくとも１つのエピトープ（好都合には、ＣＴＬエピトープ）を含む。このようなエピトープは、合成ポリペプチド内に容易に組込まれ得る。この種類のエピトープの含有は、実験室試験哺乳動物（例えば、マウスまたはサル）を用いる力価アッセイにおいてアッセイされる、異なるバッチの免疫原の品質、再現および／または安定を可能にする。このようなエピトープの例としては、アミノ酸配列  ＡＣＴＰＹＤＩＮＱＭＬ（配列番号１；サル免疫不全ウイルス由来のドミナントエピトープ、ＳＩＶ、ｇａｇ  ｐ２７を含み、アカゲザルＣＴＬによって認識される）およびＲＧＰＧＲＡＦＶＴＩ（配列番号２；ＨＩＶ  ｅｎｖタンパク質由来のＨ−２Ｄｄ−拘束ＣＴＬマウスエピトープ）が挙げられる。
【００２８】
合成ポリペプチドへの含有に適した約２３個のヒトＣＴＬエピトープの列挙は、表１に示される。この列挙は網羅的ではない。好ましい免疫原は、このようなヒトＣＴＬエピトープの少なくとも１０個、より好ましくは少なくとも１５個、最も好ましくは少なくとも２０個を含む。好ましい実施形態において、表１に列挙される２３個のヒトＣＴＬエピトープの各々は、合成ポリペプチド中に示され、必要に応じて、マカクエピトープおよびマウスエピトープ（これらもまた、表１に列挙される）と一緒に示される。
【００２９】
望ましくは、免疫原は、小さなタグまたはマーカーをさらに含み得る。このようなタグまたはマーカーは、免疫原中に存在する異質物質の量を最小化するために、可能な限り小さくあるべきである。好都合なタグまたはマーカーは、免疫原の発現の検出および／または免疫原の量の定量を可能にする。適切なタグとしては、モノクローナル抗体Ｐｋによって認識されるエピトープが挙げられる（Ｈａｎｋｅら、１９９２  Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７３、６５３−６６０）。
【００３０】
本発明の免疫原は、好都合なことに、ワクチン組成物を提供するために他の物質と混合される。例えば、ワクチン組成物は、１つ以上の以下：アジュバント（例えば、ａｌｕｍ）、リポソーム、または免疫促進複合体（ＩＳＣＯＭ）をさらに含み得る。ワクチンはまた、一般的に、滅菌希釈剤、賦形剤またはキャリア（例えば、生理学的に受容可能な液体（例えば、生理食塩水またはリン酸緩衝化整理食塩水溶液））を含む。ワクチンは、液体として存在し得るか、またはより好ましくは、凍結乾燥固体（これは、投与前に生理学的受容可能な液体中に懸濁されるかまたは溶解される）として存在し得る。
【００３１】
免疫原をヒト被験体に投与する方法は、当業者に明らかである。このような方法としては、特に、筋内注射、皮下注射、または注射針のない注入デバイスによる皮膚を介した送達が挙げられる。あるいは、ワクチン（特に、細菌ベクター（弱毒化サルモネラまたは赤痢菌属種）を含むワクチン）が、経口的、鼻腔内的または任意の他の適切な経路で提供され得る。免疫原の適切な用量は、代表的に１〜５００ｍｇ、代表的に１０〜１００ｍｇであり得、免疫原の大きさ、レシピエントの体重などに依存する。適切な用量は、必要である場合、異なる用量の免疫原が提供される異なる群の被験体を用いた日常的な試行錯誤、および最適な用量サイズを決定するためにアッセイされる免疫原に対する被験体の免疫応答によって確認され得る。被験体の免疫応答は、従来の免疫学的技術（例えば、被検体の血液サンプルから得られた末梢血リンパ球を用い、ペプチドパルスまたはウイルス感染されたクロム標識標的細胞に対して行うクロム放出アッセイ）によってアッセイされ得る。
【００３２】
第２の局面において、本発明は、融合タンパク質をコードする核酸分子を提供し、この融合タンパク質は、上記の本発明の第１の局面に従って、免疫原を含む。
【００３３】
核酸分子は、好ましくは、ヒト被験体への投与に適した単離された滅菌形態である。核酸分子は、好ましくは「ヒト化され」、すなわち、ＨＩＶによって使用されるコドンの代わりに、特定のアミノ酸をコードするコドン（このコドンは、高度に発現されるヒト遺伝子中で頻繁に使用される）を使用する（Ａｎｄｒｅら、１９９８  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２、１４９７−１５０３）。
【００３４】
望ましくは、核酸分子は、ベクター内に含まれ、免疫原をコードする配列は、ヒト細胞において活性なプロモーター配列に作動可能に連結される。好都合なことに、このプロモーターは、強いウイルスプロモーター（例えば、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来のプロモーター）である。好ましくは、このベクターはまた、ヒト細胞において機能的であるエンハンサーおよびポリアデニル化シグナルを含む。理想的には、安定性を最大にするために、ベクターは、ベクターの所望されない複製を回避するために、ヒト細胞中で機能的ないずれの複製起点も含むべきではない。
【００３５】
ベクターは、被験体に、基本的に「裸の」核酸（好ましくはＤＮＡ）として単離体で投与され得るか、あるいは、送達手段（例えば、ウイルス、細菌、リポソーム、または金で覆われた粒子など）内にパッケージングされ得る。１つの適切な送達手段は、改変ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）であり：免疫原の遺伝子またはオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、ＭＶＡの例えば、チミジンキナーゼ座位に挿入され得る。
【００３６】
ベクターが、免疫原をコードする核酸を含み得ること（従って、核酸は、本発明の第２の局面に従う）、およびベクターがまた、本発明の第１の局面に従って、ポリペプチド免疫原をその表面または内部に保有し得ることは、当業者によって理解される。
【００３７】
裸の核酸として投与されても送達手段内にパッケージングされるとしても、投与された核酸の少なくともいくらかは、被験体の細胞に侵入し、転写され（必要な場合）そして翻訳され、その被験体において免疫原のインサイチュ合成をもたらし、この被験体は次いで、この免疫原に対する免疫応答を発生する。
【００３８】
免疫原調製物それ自身を用いる場合、免疫原をコードする核酸は、多数の公知の経路（例えば、皮下注射もしくは筋内注射、経口送達、または注射針なしの注入器手段による皮膚を通した送達）のいずれかによってヒト被験体に投与され得る。注射針なしの注入デバイスによる投与の特定の例は、ＷＯ  ９７／３４６５２およびＷＯ  ９７／４８４８５に開示される。核酸の適切な用量は、１０μｇ〜１０ｍｇ、代表的に１００μｇ〜１ｍｇであり得、核酸分子の大きさ、投与経路、レシピエントの体重などに依存する。また、日常的な試行錯誤（本教示の利益を用いて）によって、当業者は、核酸の最適用量を決定し得る。
【００３９】
ＤＮＡの動物組織への好首尾な送達は、カチオン性リポソームによって［Ｗａｔａｎａｂｅら、Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．３８：２６８−２７４（１９９４）；Ｓｈａｒｋｅｙら、ＷＯ  ９６／２００１３］、裸のＤＮＡの、動物の筋組織への直接的な注射によって［Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、Ｖａｃｃ．１１：９５７−９６０（１９９３）；Ｈｏｆｆｍａｎら、Ｖａｃｃ．１２：１５２９−１５３３；（１９９４）；Ｘｉａｎｇら、Ｖｉｒｏｌ．１９９：１３２−１４０（１９９４）；Ｗｅｂｓｔｅｒら、Ｖａｃｃ．１２：１４９５−１４９８（１９９４）；Ｄａｖｉｓら、Ｖａｃｃ．１２：１５０３−１５０９（１９９４）；およびＤａｖｉｓら、Ｈｕｍ．Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎ．２：１８４７−１８５１（１９９３）］、および胚によって［Ｎａｉｔｏら、Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．３９：１５３−１６１（１９９４）；およびＢｕｒｄｏｎら、Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．３３：４３６−４４２（１９９２）］、または「遺伝子銃」技術を用いたＤＮＡの皮内注射によって［Ｊｏｈｎｓｔｏｎら、Ｍｅｔｈ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．４３：３５３−３６５（１９９４）］達成されている。
【００４０】
ＤＮＡベースのワクチン接種に関して、裸のプラスミドＤＮＡの注射による送達によって、体液性免疫応答および細胞性免疫応答の両方を誘導することに対する、マウスモデルにおける可能性が示された。しかし、大きな動物において、ワクチン接種のためにＤＮＡ送達を用いることは、大量のＤＮＡを必要とすること、または抗原に対する寛容を発生するための潜在能力を有する抗原の持続性の発現を誘導することによって妨害されている。Ｂｅｒｇｌｕｎｄは、真核生物発現カセット中に組換えセムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）レプリコンを有するαウイルスＤＮＡ発現ベクターを含むプラスミドＤＮＡをマウスに注射することによって、免疫応答を誘導または増強する戦略を報告した［Ｂｅｒｇｌｕｎｄら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：５６２−５６５（１９９８）］。真核生物発現カセットは、ＳＦＶレプリコンの一次核転写物の発現を制御した。このＳＦＶレプリコン転写物（異種抗原をコードする）は、細胞質に輸送され、そして自己コードされる（ｓｅｌｆ−ｅｎｃｏｄｅｄ）ＳＦＶレプリカーゼ複合体によって増幅される。この増幅されたＲＮＡレプリコンは、異種抗原をコードするｍＲＮＡの高レベルの産生を導く。類似の結果が、Ｐｏｌｏおよび彼らのグループによって記載された［Ｐｏｌｏら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：５１７−５１８（１９９８）；Ｈａｒｉｈａｒａｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：９５０−９５８（１９９８）］。両方のグループは、強い免疫応答が、少量の投入プラスミドＤＮＡを用いて誘導され得ることを見出した。
【００４１】
あるいは、ＤＮＡを動物に送達する、従来の送達方法の不利益を克服する方法は、発現される遺伝子をコードする真核生物発現カセットを有する細菌ＤＮＡベクターを含む、弱毒化された侵襲性細菌を投与することによる方法である。例えば、Ｐｏｗｅｌｌらの米国特許第５，８７７，１５９号は、豊富な感染を確立することも疾患を引き起こすこともなく動物細胞に侵入し得、これによって、動物細胞によって発現され得る抗原をコードする真核生物発現カセットを導入するための生きた細菌を記載している。
【００４２】
第３の局面において、本発明は、ヒト被験体において抗ＨＩＶ免疫応答を刺激する方法を提供し、この方法は、本発明の第１の局面に従う免疫原もしくは本発明の第２の局面に従う核酸分子を調製する工程；およびこの免疫原もしくは核酸分子を被験体に投与する工程を包含する。
【００４３】
好都合なことには、本方法は、免疫原および核酸分子の両方を投与することを含む。特に、この方法は、好ましくは、核酸分子の１回以上の投与（「プライミング」）、続いて適切な間隔での（例えば、１週間〜４ヶ月）免疫原の１回以上の投与（「ブースト」）を含む。ブーストは、例えば、免疫原および／または免疫原をコードする核酸分子を含む、複製コンピテント（例えば、弱毒化ウイルスまたは細菌）または非複製ベクターを投与することによって実施され得る。好ましくは、ブーストは、ＭＶＡウイルス粒子の一部として免疫原を投与することによって達成され、この粒子は、免疫原をコードする核酸を有利に含み得る。
【００４４】
好ましい実施形態において、この方法の実施は、被験体において防御免疫応答の生成をもたらし、この結果、（この被験体が、引き続きＨＩＶ感染に曝露されても）この被験体は、ＨＩＶ感染と関連するＡＩＤＳの症状を発生しない。
【００４５】
第４の局面において、本発明は、ヒト被験体におけるＨＩＶ感染を予防または処置するための医薬の調製における、本発明の第１の局面に従う免疫原および／または本発明の第２の局面に従う核酸の使用を提供する。
【００４６】
第５の局面において、本発明は、図８Ａに示されるアミノ酸配列をコードする核酸配列を提供する。好都合なことに、この核酸は、図８Ｂに示されるヌクレオチド配列を含むか、あるいは本質的にこれらからなる。
【００４７】
第６の局面において、本発明は、図８Ａに示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。
【００４８】
第５の局面の核酸および／または第６の局面のポリペプチドは、本発明の別の局面に関連して記載されるように、免疫原／ワクチン組成物に使用され得、従ってこのような免疫原およびワクチンは、本発明の範囲内であると考えられ、そして上記のようなベクターなど（特に、ＭＶＡ）を含み得る。第７の局面において、本発明はさらに、ヒト被験体における抗ＨＩＶ免疫応答を刺激する方法を提供し、この方法は、被験体に、本発明の第５の局面に従う核酸および／または本発明の第６の局面に従うポリペプチドを投与する工程を包含する。最後に、本発明は、ヒト被験体におけるＨＩＶ感染を予防または処置するための医薬の調製における、本発明の第５の局面に従う核酸および／または本発明の第６の局面に従うポリペプチドの使用を提供する。
【００４９】
（実施例）
（実施例１）
この実施例は、ＣＤ４＋ヘルパーおよびＣＤ８＋エフェクターＴリンパ球の協調的な作用により媒介される細胞免疫応答の誘導に注がれるワクチンにおいての使用のための免疫原に関する。ＨＩＶＡと命名された免疫原（Ｈａｎｋｅ  ＆  ＭｃＭｉｃｈａｅｌ  Ｎａｔ．Ｍｅｄ．６９５１−９５５）は、ケニア、ナイロビで第ＩＩＩ相有効性試験が行なわれることが計画された。図１Ａは、ＨＩＶＡを含む種々の免疫源の概略図である。ＨＩＶＡは、ＨＩＶ−１クレードＡ（ナイロビでの顕著なＨＩＶクレード）の配列に由来し、そして約７３％が一列の２５の部分的に重複するＣＴＬエピトープと融合されたｇａｇタンパク質からなる。ＨＩＶＡのｇａｇドメインは、ウイルスｇａｇ  ｐ１７−ｐ２４−ｐ１５ポリタンパク質に対して逆向きの順序で、ｐ２４およびｐ１７を含む。この再配置は、ｐ１７のＮ末端のミリストイル化を防ぎ、組換えタンパク質を細胞膜に向かわせ、従ってクラスＩ主要組織適合複合体（ＭＨＣ）提示に必要なペプチドの効果的な分解を防止し得る。
【００５０】
図１Ｂは、ＨＩＶＡ免疫原のアミノ酸配列（配列番号２６）を示す。この遺伝子を構築するために用いられる制限エンドヌクレアーゼ部位に対応するアミノ酸は、太字で示される（ＢａｍＨＩに対応するＧＳ、ＫｐｎＩに対応するＧＴ、およびＥｃｏＲＩに対応するＥＦ）。
【００５１】
ｇａｇドメインのアミノ酸配列は、ＨＩＶ−１クレードＡのタンパク質データベースコンセンサス配列から得られた（Ｋｏｒｂｅｒら、「Ｈｕｍａｎ  ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  ＡＩＤＳ；ａ  ｃｏｍｐｉｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ａｎｄ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」１９９７）。利用可能なケニア株（Ｋｅｎｙａｎ  ｓｔｒａｉｎ）配列の非存在下で、アミノ酸クレードＡへの強い優先度を有さない領域は、ウガンダ単離体（Ｕｇａｎｄａｎ  ｉｓｏｌａｔｅｓ）の方に偏っていた。ＨＩＶ−１  ｇａｇタンパク質は、重要なＭＨＣクラスＩ拘束エピトープだけでなく、ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞を刺激するクラスＩＩ拘束エピトープも含有した。
【００５２】
ＨＩＶＡタンパク質のＣ末端は、マルチＣＴＬエピトープの合成ポリペプチドとして設計された。ＨＩＶＡに含まれるＣＴＬエピトープは、ケニアで蔓延するＨＩＶ−１クレードＡ株で感染された患者のＣＴＬにより認識され、８〜１０アミノ酸長であり、そしてｇａｇ、ｐｏｌ、ｎｅｆ、またはｅｎｖタンパク質から生じた（Ｒｏｗｌａｎｄ−Ｊｏｎｅｓら、１９９８  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０２、１７５８−１７６５；Ｄｏｒｒｅｌｌら、１９９９  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３、１７０８−１７１４）。これらのエピトープの多くは、免疫優性であり、そして他のＨＩＶ−１クレード間で比較的保存されている（表１）（したがって、クレードＡ以外のクレードのＨＩＶウイルスと交差反応する免疫応答を惹起し得る）。これらは、異なる１７のＨＬＡ対立遺伝子により提示され、アフリカ人に頻出する対立遺伝子ならびにほとんどの民族集団に共通の対立遺伝子の両方を含む。９つの共通のＨＬＡ対立遺伝子により提示される最適に選択されたエピトープは、民族の血統とは無関係な一般的な集団を網羅し得ると推定された（Ｓｙｄｎｅｙら、１９９６  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  １７、２６１−２６６）。従って、大部分のＨＩＶ感染ドナーがｇａｇ  ｐ１７／ｐ２４に対するＣＴＬの応答をなす場合、ワクチン接種を受けた各人は、ＨＩＶＡタンパク質に存在する少なくとも２または３のＣＴＬエピトープに応答し得る能力を有するはずである。
【００５３】
ＨＩＶＡ合成ポリペプチドはまた、それぞれマカクおよびマウスＣＴＬに認識されるＳＩＶ  ｇａｇおよびＨＩＶ  ｅｎｖエピトープを含むので、その結果、臨床バッチの質、再現性、および安定性は、マウス（または必要な場合はマカク）力価アッセイにおいて容易に評価され得た。モノクローナル抗体エピトープＰｋ（Ｈａｎｋｅら、１９９２  Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７３、６５３−６６０）を、全長タンパク質の容易な検出および発現レベルの評価のためにＨＩＶＡのＣ末端に付加した。３つの非ＨＬＡエピトープが、ワクチン接種を受けた個体の健康を害すると考える理由はない。
【００５４】
【表１】
0004805511.tif 000002
【００５５】
ａ−エピトープは、ポリエピトープ中で見られる順番で列挙されている（配列番号３−２５、１、２）。
ｂ−特有のエピトープ配列が、配列決定されたＨＩＶクレード単離体の約５０％（小文字）または９０％（大文字）に存在する。
ｃ−「＝」は、エピトープがＮ末端クレードＡ  ｇａｇドメインに存在することを示す。
ｄ−それぞれＮ末端およびＣ末端のＡｌａおよびＬｅｕに隣接するＳＩＶ  ｇａｇ  ｐ２７由来の優性エピトープは、アカゲザルマカクＣＴＬに認識された。そしてこれは、アカゲザルマカクの力価の研究に用いられ得る。
ｅ−マウスＭＨＣクラスＩにより提示されたＣＴＬエピトープを、マウス力価アッセイのために用いた。
【００５６】
「プライム／ブースト（ｐｒｉｍｅ／ｂｏｏｓｔ）」プロトコル（プライミングは、核酸の投与により達成された）を用いることを意図していたので、ヒト細胞におけるＨＩＶＡの発現を増大させるためにＨＩＶＡ免疫原をコードする核酸の配列を設計することが望ましかった。第一に、最初のメチオニンコドンからの有効な翻訳開始を確実にするために、ＨＩＶＡオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の前に１２ヌクレオチド長のＫｏｚａｋコンセンサス配列を置いた（Ｋｏｚａｋ  １９８７  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５、８１２５−８１４８）。第二に、ほとんどのＨＩＶ−１由来のコドンを、ヒト高発現遺伝子で頻繁に用いられるコドンと置換することにより、得られたｍＲＮＡの翻訳を最適化した（Ａｎｄｒｅら、１９８８、上述）。ＨＩＶＡ  ＯＲＦは、１，６０８塩基対長の二本鎖ＤＮＡ  ＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩフラグメントの一部である（図２Ａは、ＨＩＶＡ  ＯＲＦを含むＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩインサートのヌクレオチオド配列を示す；配列番号２７）。図２Ａにおいて、部分的なＰＣＲ産物を構築するために用いられたエンドヌクレアーゼ部位が含まれる（ヌクレオチド１−６＝ＨｉｎｄＩＩＩ；３１９−３２４＝ＢａｍＨＩ；７１２−７１７＝ＫｐｎＩ；１１３５−１１４０＝ＥｃｏＲＩ；および１６０３−１６０８＝ＸｂａＩ）。
【００５７】
プラスミドＤＮＡを標準的なプロトコル（Ｓａｍｂｒｏｏｋら「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」第二版；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ）を用いて調製および処理した。ＨＩＶＡ遺伝子を、インビトロで（図２Ｂに示されるように）４分割で構築した。それぞれの部分を、７０−９０塩基長の重複する正または負のオリゴデオキシヌクレオチド鎖から組み立てることにより調製した。この合成オリゴデオキシヌクレオチドを、ＥｃｏｎｏＰｕｒｅＴＭ  Ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用い、製造者の説明書に従って精製し、ＰＣＲ構築に続いてアニールおよび連結した。ＰＣＲ産物をそれぞれの工程の後にゲル精製して、予定の固有の末端制限エンドヌクレアーゼ部位を有するフラグメントを得た。これらの４つの産物をクローニングおよび配列決定し、そしてこれらを連結して完全なＨＩＶＡ遺伝子を生成した。次いでＨＩＶＡ遺伝子を、後述するように、ｐＴＨｒ構築物およびＭＶＡワクチンベクターに挿入した。
【００５８】
（ｐＴＨｒベクター）
直接的な遺伝子転移のためのベクターｐＴＨｒを、機能的エレメントの数、したがって投与されるために必要なＤＮＡの量を最小にする目的をもって設計した。
【００５９】
ｐＴＨの構築は、以前に記載されていた（Ｈａｎｋｅら、１９９８  Ｖａｃｃｉｎｅ  １６、４２６−４３５）。これには、ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）株ＡＤ１６９ゲノムの発現に有効なエンハンサー／プロモーター／イントロンＡカセットを含む（Ｗｈｉｔｔｌｅら、１９８７  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１、４９９−５０５；Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ  １９９１  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２、１３６−１４５）。このプロモーター領域の後に、ｐＲｃ／ＣＭＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）由来ポリリンカーおよびウシ成長ホルモン遺伝子のポリアデニル化シグナルが続く。形質転換された細菌にアンピシリン耐性を与えるβ−ガラクトシダーゼ遺伝子および原核生物の二本鎖ＤＮＡ複製起点ＣｏｌＥ１は、共にプラスミドｐＵＣ１９に由来する。ｐＴＨは、哺乳動物中で複製するための起点を含まない。ｐＴＨポリリンカーへのＨＩＶＡ  ＤＮＡの挿入後、ＭｌｕＩ部位とＤｒａＩ部位との間のβ−ラクタマーゼ遺伝子フラグメントを除去し、そして得られた構築物ｐＴＨｒ．ＨＩＶＡ（図３）を、Ｃｏｂｒａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｌｔｄ．（Ｋｅｅｌｅ、ＵＫ）により開発されたリプレッサー−滴定系（この系により、プラスミド中に抗生物質耐性遺伝子が存在する必要性なしに、プラスミドを保有する細菌が選択される（Ｗｉｌｌｉａｍｓら、１９９８  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２６、２１２０−２１２４））を用いて細菌中で増殖させた。したがって、ＤＮＡワクチン接種は、ワクチン接種を受けたヒトに多量の抗生物質耐性遺伝子のコピーを導入しない。ｐＴＨｒ．ＨＩＶＡ構築物は、図３で図解により説明される（ＣＭＶ  ｅ／ｐ／ｉ＝ヒトＣＭＶ  エンハンサー／プロモーター／イントロンＡカセット；ＢＧＨｐＡ＝ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル；ＣｏｌＥ１＝細菌でのｄｓＤＮＡ複製起点；矢印の頭の記号は、リプレッサー結合配列を示す）。
【００６０】
２９３細胞およびニワトリ胚繊維芽細胞［ＣＥＦ］を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ；Ｇｉｂｃｏ）；２ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよびペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ改変Ｅａｇｌｅ’ｓ培地（ＤＭＥＭ；Ｇｉｂｃｏ）中で維持した。細胞を、加湿インキュベーター内で３７℃、５％  ＣＯ２中で培養した。２９３Ｔ細胞を、ＤＥＡＥ−デキストラン−クロロキン法（Ｈａｎｋｅら、１９９８、Ｖａｃｃｉｎｅ  １６、４２６−４３５）を用いて、ｐＴＨｒ．ＨＩＶＡで一時的にトランスフェクトした。簡単にいうと、２．５×１０５個の２９３Ｔ細胞を、６ウェル組織培養プレートのカバーガラス上で一晩培養した。翌日、細胞を５ｇ／ウェルのＤＮＡを用いてトランスフェクトした。４８時間後、トランスフェクトした細胞を固定し、これらの膜を透過化処理し、そしてＳＶ５−Ｐ−ｋ  ｍＡｂ、続いて抗マウスＦＩＴＣ結合抗体を用い、発現された組換えタンパク質を検出した。
【００６１】
標本の結果を示す顕微鏡写真を図４に示す。この図は、３つのトランスフェクトされた細胞および１つのバックグラウンドのトランスフェクトされなかった細胞（左上）を示す。
【００６２】
追加免疫（ブースト）は、ＨＩＶＡ免疫原を発現するＭＶＡベクターを投与することにより、達成された。ＭＶＡは、臨床適用に安全な弱毒化されたワクシニアウイルスであり、ヒト細胞で複製する能力をほとんど失っている（Ｍａｙｒら、１９７５  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  １０５、６−１４）。ワクチンビヒクルとしてのＭＶＡの使用および弱毒化ポックスウイルスベクターの中から魅力的な選択をさせたその特徴（例えば、Ｓｕｔｔｅｒら、１９９４  Ｖａｃｃｉｎｅ  １２、１０３２−１０４０；およびＭｏｓｓら、１９９６  Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．３９７、７−１３）は、広範に記載されている。
【００６３】
ＨＩＶＡ遺伝子を、プラスミドｐＳＣ１１に連結し、親のＭＶＡのチミジンキナーゼ遺伝子座内にこの遺伝子を向かわせた（Ｃａｒｒｏｌｌ  ＆  Ｍｏｓｓ  １９９５  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １９、３５２−３５６）。この組換えＭＶＡのバルクストックを、主に、特定病原体フリーの一群の卵から得られたＣＥＦで増殖した。ＭＶＡを、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＳＷ２８ローターを用い、３６％（ｗ／ｖ）スクロースクッションを通じた細胞質抽出物の遠心分離（１３，５００ｒｐｍ、８０分間）により精製した。β−ガラクトシダーゼ遺伝子を同時挿入した利点を生かし、ウイルスストックの力価を、感染細胞の単層を適切な基質と共にインキュベートした後のブループラークの数から決定した。
【００６４】
（ワクチン力価アッセイ）
ＤＮＡおよびＭＶＡの力価を、Ｈ−２Ｄｄ−拘束エピトープの存在という利点を有するＢａｌｂ／ｃマウスの集団で試験した（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、１９９３  Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５、８４９−８５７）。ｐＴＨｒ．ＨＩＶＡ  ＤＮＡワクチンについて、マウスを筋肉内に１００μｇのＤＮＡを針注射したか、またはＰｏｗｄｅｒＪｅｃｔ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  Ｉｎｃ．（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）のＤｅｒｍａｌ  ＸＲ遺伝子送達デバイスを用い、合計２μｇのＤＮＡを用いて３週間間隔で２回経皮内で免疫した。最後の免疫の１０日後または２１日後にマウスを屠殺した。免疫されたマウス由来の脾臓を回収し、そして２ｍｌシリンジラバープランジャーを用いて細胞濾過器（Ｆａｌｃｏｎ）を通して個々に圧縮した。この脾細胞を洗浄し、そして二分割した。第１の半分をテトラマー分析のために凍結し、そして第２の半分を５ｍｌのリンパ球培地（Ｒ１０、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳおよび１５ｍＭ  β−メルカプトエタノール）に懸濁し、そしてインビトロで、２μｇ／ｍｌのＲＧＰＧＲＡＦＶＴＩ（配列番号２）ペプチドを用いて、５％  ＣＯ２、３７℃の加湿インキュベーターで５日間再刺激した。
【００６５】
エフェクター細胞を、Ｕ型底面ウェル（９６ウェルプレート；Ｃｏｓｔａｒ）上で、エフェクター：標的の比が１００：１から始めて２倍希釈した。次いで、１０−６Ｍペプチドを含まないかまたは補給された培地中の５，０００個の５１Ｃ標識Ｐ８１５標的細胞を、エフェクターに加え、そして３７℃で５次間インキュベートした。自然発生の遊離およびクロム遊離の総量をウェルから評価した。標的細胞は、それぞれ単独でかまたは５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む培地中で維持された。特異的な溶解のパーセンテージを、［（サンプルの遊離−自発的な遊離）／（総遊離−自発的な遊離）］×１００のように計算した。自発的な遊離は、総ｃ．ｐ．ｍの５％未満であった。
【００６６】
代表的なアッセイの結果を図５Ａ−Ｃに示す。この図は、エフェクター：標的比に対する溶解比（％）のグラフである。図５Ａは、１００μｇのｐＴＨｒ．ＨＩＶＡ  ＤＮＡを用いて１回免疫されたマウスから得られた脾細胞の結果を示す。図５Ｂは、ｐＴＨｒ．ＨＩＶＡ  ＤＮＡを用いて経皮内で２回免疫されたマウスから得られ結果を示す。図５Ｃは、１０７  ｐｆｕのＭＶＡ．ＨＩＶＡを用いて経皮内で免疫されたマウスから得られた結果を示す。図５Ａ〜５Ｃのそれぞれにおいて、それぞれの線は単一のマウスを表わす。ペプチドパルスされた標的の溶解は、黒塗りの記号により、パルスされていない標的は、白抜きの記号により示される。
【００６７】
ｐＴＨｒ．ＨＩＶＡベクター送達の両方の様式は、すべての免疫された動物において高い免疫原性を有し、そして高い細胞溶解活性を誘導した（図５Ａ  ＆  Ｂを参照のこと）。同様に、ＭＶＡ．ＨＩＶＡの１０７個のプラーク形成ユニットの１回の筋肉内針注射は、すべてのワクチンを接種した人において、培養再刺激後に測定された強いペプチド特異的な溶解活性を誘発した（図５Ｃ）。
【００６８】
（実施例２）
さらに、ＨＩＶＡに基くが、ＨＩＶ抗原の構成成分をさらに含むポリタンパク質免疫原をコードする核酸構築物を調製した。これらのさらなる構築物およびこれらのコードされた免疫原を、ＨＩＶＴＡおよびＨＩＶＡｅＴと呼び、これを図１Ａに示す。ＰＰＡと呼ばれる構築物／免疫原もまた示される。関連のＤＮＡ／アミノ酸配列を、それぞれ図６Ａ／Ｂ−８Ａ／Ｂに示すが、図７Ａは、ＨＩＶＴＡのアミノ酸配列に付加的なＨＩＶＡｅＴのアミノ酸配列のその部分（ｔａｔに起因する）のみを示す（このＤＮＡ配列の５’および３’末端のＨｉｎｄＩＩＩ部位およびＸｂａＩ部位の配列は図６Ｂ、７Ｂ、および８Ｂに示されていないことに注意）。この構築物をＨＩＶＡについて上述されたものと同様の様式で調製した。
【００６９】
ＨＩＶＴＡおよびＨＩＶＡｅＴは、ＨＩＶＡと同じ設計上の根拠を共有するが、ＨＩＶ−１クレードＡ  ｔａｔ配列をさらに含み、これは内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）の含有により、ｇａｇおよびポリエピトープの合成ポリペプチドとの融合タンパク質の一部として発現される（ＨＩＶＴＡの場合、ｔａｔ配列は、ｇａｇと合成ポリペプチドとの間に位置する）か、または、同じ構築物に存在するが、別々のポリペプチドとして発現される（ＨＩＶＡｅＴの場合）のいずれかである。
【００７０】
それぞれの核酸分子は、ＨＩＶＡ  ＤＮＡに関して上述されたものと同様の様式で、免疫対象として用いられ得る。同様に、この分子は、適切なベクター（特にＭＶＡ、繰り返すと、これは実施例１で上述されている）に導入され得、そして得られたベクターは、被験体を免疫するために用いられる。個々のＨＩＶ単離体およびワクチン設計についてのその関連の間の遺伝的な多様性の重要性が、長く示されてきた。欧州および北米における優性なＨＩＶ−１クレードはクレードＢであり、これはまた最も研究されているクレードである。中央アフリカおよび東アフリカにおいて、優性な蔓延しているＨＩＶ−１株はクレードＡであり、一方、クレードＣは南アフリカ、インドおよび中国で蔓延している。一般に、クレード特異的なワクチンの設計は、ＣＴＬについてよりもｎＡｂの誘導についてより注意深い考慮を要求する。ＣＴＬエピトープにおいていくつかの重要なクレード間の相違が存在するが、多くのエピトープは、構造／機能の制限に一部起因して、クレード間で保存されている。しかし、有効性研究の解釈を容易にするために、交差防御が達成されない場合、任意の首尾良いアプローチを他のクレードについて採用し得るという観点で、ワクチンが、試験した集団内で蔓延する地域の株に適合するように試みるべきである。
【００７１】
ここで本発明は、実例によりそして添付の図面に関してさらに記載される。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】  図１Ａは、本発明に関連する免疫原ＨＩＶＡ、ＨＩＶＴＡ、およびＨＩＶＡｅＴ；ならびに免疫原ＰＰＡの概略図である。
【図１Ｂ】  図１Ｂは、ＨＩＶ  Ａ免疫原のアミノ酸配列（配列番号２６）を示す。
【図２Ａ】  図２Ａは、ＨＩＶＡ免疫原をコードする核酸（「ＨＩＶＡ遺伝子」と呼ばれる）のヌクレオチド配列（配列番号２７）を示す。
【図２Ｂ】  図２Ｂは、ＨＩＶＡ遺伝子を構築するために用いる方法の概略図である。
【図３】  図３は、本発明に関連するＤＮＡベクター分子（ｐＴＨｒ．ＨＩＶＡ）およびその構築方法の概略図である。
【図４】  図４は、ｐＴＨｒ．ＨＩＶＡを用いたトランスフェクション後のマウス細胞によるＨＩＶＡ発現の免疫蛍光検出を示す顕微鏡写真である。
【図５】  図５は、本発明に関連するＤＮＡ分子または免疫原を用いて接種されたマウスから得られた脾細胞を用いるクロム遊離アッセイの結果を示すグラフである。
【図６Ａ】  図６Ａは、ＨＩＶＴＡ免疫原のアミノ酸配列（配列番号２８）を示す。
【図６Ｂ】  図６Ｂは、ＨＩＶＴＡ免疫原をコードする核酸分子のヌクレオチド配列（配列番号２９）を示す。
【図７Ａ】  図７Ａは、ＨＩＶＡｅＴ免疫原中に存在するｔａｔポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号３０）を示す。
【図７Ｂ】  図７Ｂは、ＨＩＶＡｅＴ免疫原をコードする核酸分子のヌクレオチド配列（配列番号３１）を示す。
【図８Ａ】  図８Ａは、本発明の６番目の局面に関連するＰＰＡ免疫原のアミノ酸配列（配列番号３２）を示す。
【図８Ｂ】  図８Ｂは、ＰＰＡ免疫原をコードする（本発明の５番目の局面に関連する）核酸分子のおヌクレオチド配列（配列番号３３）を示す。
【配列表】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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