(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
繊維状コラーゲン、繊維分解剤、および多官能的に活性化した親水性の合成重合体を含有する生体接着剤組成物であって、ここで、該繊維分解剤は、pH７で該繊維状コラーゲンを非繊維状にするのに充分な量で存在し、得られる非繊維状の該コラーゲンおよび該合成重合体は、共有結合して、コラーゲン−合成重合体結合物を形成する、生体接着剤組成物。
【請求項２】
前記繊維分解剤が、生体適合性アルコール、アミノ酸、無機塩および炭水化物からなる群から選択される、請求項１に記載の生体接着剤組成物。
【請求項３】
前記繊維分解剤が、グリセロールおよびプロピレングリコールからなる群から選択される生体適合性アルコールである、請求項２に記載の生体接着剤組成物。
【請求項４】
前記多官能的に活性化した親水性の合成重合体が、多官能的に活性化したポリエチレングリコールである、請求項１に記載の生体接着剤組成物。
【請求項５】
前記多官能的に活性化したポリエチレングリコールが、二官能的に活性化したSG-PEGおよび二官能的に活性化したSE-PEGからなる群から選択される、請求項４に記載の生体接着剤組成物。
【請求項６】
第一の表面を第二の表面に非外科手術的に付着させるための医薬の製造における、繊維状コラーゲン、および多官能的に活性化した親水性の合成重合体の使用であって；
該繊維状コラーゲンと繊維分解剤とをpH７で、該繊維状コラーゲンを非繊維状にするのに充分な量で混合し；
得られた非繊維状の該コラーゲンと該合成重合体との間で実質的な架橋が起こすように混合し；
該医薬は、該非繊維状コラーゲンおよび該合成重合体が、該第一の表面に適用するように処方され；および
該第一の表面は、該第二の表面と接触され、該第一の表面と該第二の表面との間で癒着を起こす、使用。
【請求項７】
前記第一の表面および第二の表面の一方が、天然組織の表面である、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
前記第一の表面および第二の表面の一方が、天然組織の表面であり、そして前記第一および第二の表面の他方が、非天然組織の表面および合成移植片の表面から選択される、請求項６に記載の使用。
【請求項９】
前記第一の表面および第二の表面の両方が共に、天然組織の表面である、請求項６に記載の使用。
【請求項１０】
前記繊維分解剤が、生体適合性アルコール、アミノ酸、無機塩および炭水化物からなる群から選択される、請求項６に記載の使用。
【請求項１１】
前記繊維分解剤が、グリセロールおよびプロピレングリコールからなる群から選択される生体適合性アルコールである、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
前記コラーゲンが、微粒子状の架橋した繊維状コラーゲン、および架橋していない繊維状コラーゲンの混合物を含有する、請求項６に記載の使用。
【請求項１３】
前記微粒子状の架橋した繊維状コラーゲンが、グルタルアルデヒドで架橋したコラーゲンを含有する、請求項６に記載の使用。
【請求項１４】
前記微粒子状の架橋した繊維状コラーゲンが、前記医薬の25重量％と95重量％の間の量を構成し、そして前記架橋していない繊維状コラーゲンが、前記医薬の５重量％と75重量％の間の量を構成する、請求項１２に記載の使用。
【請求項１５】
外科手術後の癒着の形成を防止するための医薬の製造における、繊維状コラーゲン、および多官能的に活性化した親水性の合成重合体の使用であって；
該繊維状コラーゲンと繊維分解剤とをpH７で、該繊維状コラーゲンを非繊維状にするのに充分な量で混合し；
得られた非繊維状該コラーゲンと該合成重合体との間で架橋が起こるように、該非繊維状コラーゲンおよび該合成重合体を混合し；
該医薬は、非繊維状コラーゲンと該合成重合体との間の架橋が起こる前に外科手術部位を含む組織、それを取り囲む組織またはそれに隣接した組織に適用するように処方され；平衡的な架橋が達成されるまで、その場で引き続き架橋をさせ；それにより該外科手術部位の閉鎖を行う、使用。
【請求項１６】
前記コラーゲンが、微粒子状の架橋した繊維状コラーゲン、および架橋していない繊維状コラーゲンの混合物を含有する、請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
前記微粒子状の架橋した繊維状コラーゲンが、グルタルアルデヒドで架橋したコラーゲンを含有する、請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
前記微粒子状の架橋した繊維状コラーゲンが、前記医薬の25重量％と95重量％の間の量を構成し、そして前記架橋していない繊維状コラーゲンが、前記医薬の５重量％と75重量％の間の量を構成する、請求項１７に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本願の対応米国特許は、1995年６月７日に出願された米国特許出願第08/476,825号の部分継続出願であり、この米国特許出願第08/476,825号は、1993年11月３日に出願され特許査定された米国特許出願第08/147,227号の部分継続出願であり、この米国特許出願第08/147,227号は、1994年７月12日に発行された米国特許第5,328,955号の部分継続出願であり、この米国特許第5,328,955号は、1992年11月10日に発行された米国特許第5,162,430号の部分継続出願であり、この米国特許第5,162,430号は、1988年11月21日に出願され、続いて放棄された米国特許出願第07/274,071号の部分継続出願である。これらの出願および特許の内容は、本明細書中で参考として援用されており、本願出願人は、現在審査中の出願に対して、米国特許法第120条により、優先権を主張する。
【０００２】
【発明の属する技術分野】
本発明は、一般に、生体粘着剤または外科手術用粘着剤として有用な組成物に関する。さらに特定すると、本発明は、多官能的に活性化した親水性の合成重合体を用いて架橋したコラーゲンを含有する生体粘着性組成物に関し、そしてこのような組成物を用いて第一の表面と第二の表面との間で癒着を起こす方法（ここで、この第一の表面および第二の表面の少なくとも一方は、好ましくは、天然組織の表面である）、およびこのような組成物を用いて外科手術後の癒着の形成を防止する方法に関する。
【０００３】
【従来の技術】
1991年６月18日にNesburnに発行された米国特許第5,024,742号は、アミノ酸含有重合体を、光活性化可能なヘテロ二官能性架橋剤で架橋する方法を開示し、この架橋剤は、光活性化可能な部位および通常部位を有し、該方法は、i)１種またはそれ以上のアミノ酸含有重合体を選択すること；およびii)この架橋剤上の通常部位がこの重合体と結合し、この光活性化可能な部位が結合しないように、この重合体をこの架橋剤と配合することを包含する。光活性化すると、この光活性部位が他のアミノ酸含有重合体と結合するとき、架橋が形成される。得られる架橋したコラーゲン組成物は、目または他の傷口を縫合せずに閉鎖するための生体粘着剤として、使用され得る。
【０００４】
1992年10月20日にSawyerに発行された米国特許第5,156,613号は、生体組織を接合するかまたは再構成する方法を開示しており、該方法は、充填剤物質を提供しつつ、この組織にエネルギーを適用すること、およびこの物質および隣接する生体組織をこのエネルギーで変性するかまたは融解して、この変性したまたは融解した充填剤物質および組織を混合し、それにより、この組織を接合するかまたは再構成することを包含する。生体組織を接合するかまたは再構成する方法もまた、請求されており、該方法は、この生体組織にコラーゲン充填剤物質を与えつつ、光学エネルギーまたは高周波エネルギーを適用すること；適用したエネルギーで、このコラーゲンおよび隣接組織を変性するかまたは融解して、この変性したまたは融解したコラーゲンおよび組織を混合すること；およびこの組織を接合するかまたは再構成することを包含する。
【０００５】
1992年11月10日にRheeらに発行された米国特許第5,162,430号(これは、本願と同じ譲渡人が所有している)は、親水性の合成重合体(例えば、ポリエチレングリコールの種々の誘導体)にコラーゲンを共有結合することにより調製したコラーゲン−合成重合体結合物を開示している。
【０００６】
1993年３月９日にTingに発行された米国特許第5,192,316号は、目の光学特性を矯正するための、生体角膜のボーマン膜に直接移植するためのレンズを開示している。このレンズは、水に透過性でヒドロゲルを形成する合成重合体から作製されている。このレンズは、好ましくは、このレンズの角膜に対する癒着性を増しおよび／または上皮細胞の成長を刺激する添加剤を含有する。この添加剤は、フィブロネクチン、コラーゲン、細胞固定タンパク質、抗ゼラチン因子、生体活性ぺプチド、寒冷不溶性グロブリン、コンドロネクチン、ラミニン、上皮成長因子(EGF)、またはそれらの混合物であり得る。
【０００７】
1993年５月11日にBassらに発行された米国特許第5,209,776号は、分離した組織を共に結合する組成物、あるいは組織または補てつ物質を被覆する組成物を開示しており、この組成物は、i)天然ペプチドまたは合成ペプチド、および変性した、架橋した、開裂したまたは短絡した変種または誘導体から選択した少なくとも１種の第一の成分；およびii)第一の成分を支持して、第一の成分と共にマトリックス、ゾルまたはゲルを形成するための第二の成分を含有し、第二の成分は、第一の成分とは異なる。第一の成分は、例えば、アルブミン、α−グロブリン、β−グロブリン、γ−グロブリン、トランスチレチン(transthyretin)、フィブリノーゲン、トロンビン、コラーゲン、エラスチン、ケラチン、フィブロイン、フィブリン、またはフィブロネクチンであり得る。第二の成分は、例えば、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コラーゲン、フルクトース、デキストラン、アガロース、アルギン酸、ペクチン、メチルセルロース、ヒドロキシセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、CMC、グリセリン、マンニトール、ソルビトール、ポリビニルアルコール、またはポリエチレングリコールであり得る。
【０００８】
DeVoreらに1993年６月15日に発行された米国特許第5,219,895号は、粘着剤として医学用途に有用なコラーゲン組成物を開示しており、ここで、この組成物は、アシル化剤および／またはスルホン化剤で変性した誘導体化コラーゲンの重合により形成される。この重合は、爆発的なUV照射、蛍光光線および／または開始剤により、行われる。このアシル化剤は、無水グルタル酸、無水コハク酸、無水ラウリン酸、無水ジグリコール酸、無水メチルコハク酸、無水メチルグルタル酸、無水ジメチルグルタル酸、または無水エキソ-3,6-エポキシ-1,2,3,4-テトラヒドロフタル酸であり得る。柔軟組織の結合には、第一および第二の組織の少なくとも一方の表面の少なくとも一部に、重合可能なコラーゲン組成物を適用すること；この組織表面を開始剤に晒して、このコラーゲンを重合すること；および２個の組織を接触させて、その間に結合を形成することを包含する。
【０００９】
Brownらに1994年３月１日に発行された米国特許第5,290,552号は、水性媒体中に、フィブリノーゲン、第XIII因子、コラーゲン、トロンビンおよびCa2+イオンを含有する外科手術用の粘着剤組成物を開示している。このコラーゲンは、繊維状であり、約５のpH値で不溶であり、流動可能であり、コラーゲン原繊維の天然らせん構造を有し、そしてこの粘着剤のゲル化を起こすことができる。このトロンビンおよびCa2+は、このフィブリノーゲンの重合を触媒して凝塊物を形成するのに充分な量で、存在する。
【００１０】
Rheeらに1994年７月12日に発行された米国特許第5,328,955号(これは、本願と同じ譲渡人が所有している)は、種々の活性化形状のポリエチレングリコールおよび種々の結合を開示しており、これらは、一定範囲の物理的特性および化学的特性を有するコラーゲン−合成重合体結合物を製造するために、使用され得る。
【００１１】
Matrix Pharmaceuticals, Inc.のヨーロッパ特許公報第341007号は、外科手術用の粘着剤組成物を開示しており、この組成物は、水性組成にて、治療する患者に由来の血漿、この組成物を増粘するのに充分な量(例えば、約５〜30 mg/mlの濃度)のコラーゲン、およびこの血漿中に存在するフィブリノーゲンの重合を触媒して凝塊物を生成するのに充分な量のトロンビン(例えば、約１〜1000のN1Huのトロンビン)を含有する。
【００１２】
Bausch & Lomb Inc.,のヨーロッパ特許公報第466383号は、外科手術用途に適切な粘着剤組成物を開示しており、この組成物は、35〜45℃のメルトインデックス温度を有する天然コラーゲン水溶液を含有する。この組成物は、密に架橋したコラーゲンおよび架橋していないコラーゲンの配合物を含有する。密に架橋したコラーゲンは、熱架橋により得られる。Bausch & Lomb Inc.,のPCT公報第WO 9213578号は、外科手術用の粘着剤組成物を開示しており、この組成物は、33〜60℃のメルトインデックス温度(MIT)を有するコラーゲンまたはゼラチン水溶液を含有する。傷口の少なくとも１個の表面を、以下のa)またはb)を含有する組成物と接触させることにより、傷口の治癒が促進される：a)コラーゲン水溶液中で培養した上皮細胞の分散体、またはb)天然に生じる精製した生体重合体および成長因子を含有する水溶液。ここで、この組成物は、33〜60℃のMIT、およびこのMITの10℃以上で50,000 cP未満の粘度を有する。
【００１３】
Flamel Technologiesのヨーロッパ特許公報第575273号は、架橋可能なコラーゲン誘導体を開示しており、この誘導体は、水および／または極性の非プロトン性有機溶媒に溶解性であり、そしてシステイン残基またはシステイン誘導体残基上に、遊離の−SH基または置換した−SH基を含有しており、これらの残基は、少なくとも一部でスペーサー基を介してコラーゲン分子に結合している。不溶性の架橋したコラーゲンもまた開示されており、このコラーゲンでは、分子間鎖架橋の少なくとも一部は、システイン残基により形成されたジスルフィド結合であり、これらのシステイン残基は、少なくとも一部でスペーサー基を介してコラーゲン分子に結合している。請求された組成物は、生体粘着剤または外科手術用粘着剤として、有用である。
【００１４】
日本特許公報第6070972号は、以下のi)およびii)からなる、生体組織を付着するための組成物を開示している：i)コラーゲンタンパク質の部分加水分解産物、水および多価フェノール化合物を含有する粘着剤成分；およびii)ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドおよびグリセロールアルデヒドの少なくとも１種を含有する水溶液からなる硬化成分。
【００１５】
1993年11月３日にRheeらが出願し特許査定された米国特許出願第08/147,227号(これは、本願と同じ譲渡人が所有している)は、化学的に変性したコラーゲンを含有するコラーゲン−重合体結合物を開示しており、このコラーゲンは、pH７で実質的に非繊維形状であり、親水性の合成重合体に共有結合して、眼科用途または他の医学用途に使用するための光学的に透明な物質を生成する。
【００１６】
上で引用した各出版物およびその中に引用したものは、引用した課題を記載および開示するために、全体として本明細書中で参考として援用されている。
【００１７】
本発明者らはまた、本発明の好ましい実施態様の詳細な説明を開示し、これには、多官能的に活性化した親水性の合成重合体を用いて架橋したコラーゲンを含有する生体粘着剤組成物、およびこれらの組成物を用いて第一の表面と第二の表面との間で癒着を起こす方法が含まれ、ここで、第一の表面および第二の表面の少なくとも一方は、天然組織の表面である。
【００１８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、生体粘着剤または外科手術用粘着剤として有用な組成物を提供することである。本発明の他の目的は、多官能的に活性化した親水性の合成重合体を用いて架橋したコラーゲンを含有する生体粘着性組成物を提供することである。本発明のさらに他の目的は、このような組成物を用いて第一の表面と第二の表面との間で癒着を起こす方法、およびこのような組成物を用いて外科手術後の癒着の形成を防止する方法を提供することである。
【００１９】
【課題を解決するための手段】
本発明は、生体粘着剤としての使用に適した組成物を開示しており、この組成物は、繊維状コラーゲン、繊維分解剤、および多官能的に活性化した親水性の合成重合体を含有し、ここで、この繊維分解剤は、pH７で、このコラーゲンを実質的に非繊維状にするのに充分な量で存在し、そしてこのコラーゲンおよび合成重合体は、共有結合して、コラーゲン−合成重合体結合物を形成する。本発明の特に好ましい組成物は、繊維状コラーゲン、生体適合性アルコール、および多官能的に活性化した親水性の合成重合体を含有し、ここで、この生体適合性アルコールは、pH７で、このコラーゲンを実質的に非繊維状にするのに充分な量で存在し、このコラーゲンおよび合成重合体は、共有結合して、コラーゲン−合成重合体結合物を形成する。
【００２０】
第一の表面を第二の表面に結合する一般的な方法では、コラーゲン、および多官能的に活性化した親水性の合成重合体が混合されて、架橋が開始され、このコラーゲン−合成重合体混合物は、このコラーゲンと合成重合体との間で実質的な架橋が起こる前に、第一の表面に適用され、次いで、第二の表面が第一の表面と接触される。第一の表面および第二の表面の少なくとも一方は、好ましくは、天然組織の表面である。
【００２１】
第一の表面を第二の表面に結合する特に好ましい方法では、非繊維状コラーゲン、および多官能的に活性化した親水性の合成重合体が混合されて、架橋が開始され、この非繊維状コラーゲン−合成重合体混合物は、このコラーゲンと合成重合体との間で実質的な架橋が起こる前に、第一の表面に適用され、次いで、第二の表面が第一の表面と接触される。第一の表面および第二の表面の少なくとも一方は、好ましくは、天然組織の表面である。
【００２２】
外科手術後の癒着の形成を防止する一般的な方法では、コラーゲン、および多官能的に活性化した親水性の合成重合体が混合されて、架橋が開始され、このコラーゲン−合成重合体の混合物は、このコラーゲンと合成重合体との間で実質的な架橋が起こる前に、外科手術部位を含む組織、それを取り囲む組織またはそれに隣接する組織に適用され、このコラーゲン−合成重合体の混合物は、平衡的な架橋が達成されるまで、その場で引き続き架橋され、そしてこの外科手術部位は、通常の方法により、閉鎖される。
【００２３】
本発明の非繊維状コラーゲンベースの粘着剤組成物は、光学的に透明であり、それにより、本発明の組成物および方法は、光学的な透明性が必要とされる眼科用途で使用するのに、特に好都合である。さらに、本発明の組成物は、生体適合性で非免疫原性の成分から構成され、これらの成分は、適用される組織部位において、毒性、潜在的な炎症性または免疫原性の反応生成物を残さない。
【００２４】
本発明者らはまた、この多官能的に活性化した親水性の合成重合体自体が、２個の表面(両表面は共に、求核性基を含む)間での結合が望ましいとき、コラーゲンなしで、生体粘着剤として効果的であることを発見した。第一の表面を第二の表面に結合する方法(ここで、第一の表面および第二の表面の両方は共に、求核性基を含む)では、多官能的に活性化した親水性の合成重合体は、第一の表面に適用され、次いで、第二の表面が第一の表面と接触される。この多官能的に活性化した親水性の合成重合体は、第一の表面および第二の表面の両方の表面上の求核性基と共有結合され、それにより、この２個の表面間で癒着が起こる。この多官能的に活性化した親水性の合成重合体は、溶液形状または乾燥形状(例えば、圧縮した膜)であり得る。
【００２５】
１実施態様において、上記繊維分解剤は、生体適合性アルコール、アミノ酸、無機塩および炭水化物からなる群から選択される。
【００２６】
他の実施態様において、上記繊維分解剤は、グリセロールおよびプロピレングリコールからなる群から選択される生体適合性アルコールである。
【００２７】
さらに他の実施態様において、上記多官能的に活性化した親水性の合成重合体は、多官能的に活性化したポリエチレングリコールである。
【００２８】
さらに他の実施態様において、上記多官能的に活性化したポリエチレングリコールは、二官能的に活性化したSG-PEGおよび二官能的に活性化したSE-PEGからなる群から選択される。
【００２９】
さらに他の実施態様において、上記多官能的に活性化したポリエチレングリコールは、二官能的に活性化したSG-PEGおよび二官能的に活性化したSE-PEGからなる群から選択される。
【００３０】
さらに他の実施態様において、上記第一の表面および第二の表面の一方は、天然組織の表面であり、そして上記第一および第二の表面の他方は、非天然組織の表面および合成移植片の表面から選択される。
【００３１】
さらに他の実施態様において、上記第一の表面および第二の表面の両方は共に、天然組織の表面である。
【００３２】
さらに他の実施態様において、上記コラーゲンは、非繊維状コラーゲンである。
【００３３】
さらに他の実施態様において、上記非繊維状コラーゲンは、繊維状コラーゲンと繊維分解剤とをpH７で、該繊維状コラーゲンを実質的に非繊維状にするのに充分な量で混合することにより調製される。
【００３４】
さらに他の実施態様において、上記非繊維状コラーゲンは、化学的に変性したコラーゲンである。
【００３５】
さらに他の実施態様において、上記化学的に変性したコラーゲンは、メチル化コラーゲンである。
【００３６】
さらに他の実施態様において、上記非繊維状コラーゲンは、IV型コラーゲン、VI型コラーゲンおよびVII型コラーゲンからなる群から選択される。
【００３７】
さらに他の実施態様において、上記コラーゲンは、繊維状コラーゲンである。
【００３８】
さらに他の実施態様において、上記コラーゲンは、非繊維状コラーゲンおよび繊維状コラーゲンの混合物である。
【００３９】
さらに他の実施態様において、上記コラーゲンは、微粒子状の架橋した繊維状コラーゲン、および架橋していない繊維状コラーゲンの混合物を含有する。
【００４０】
さらに他の実施態様において、上記微粒子状の架橋した繊維状コラーゲンは、グルタルアルデヒドで架橋したコラーゲンを含有する。
【００４１】
さらに他の実施態様において、上記微粒子状の架橋した繊維状コラーゲンは、前記混合物の約25重量％と約95重量％の間の量を構成し、そして前記架橋していない繊維状コラーゲンは、前記混合物の約５重量％と約75重量％の間の量を構成する。
【００４２】
さらに他の実施態様において、上記コラーゲンは、変性したコラーゲンである。
【００４３】
【発明の実施の形態】
本発明に従って、生体粘着剤または外科手術用粘着剤としての使用に適切な組成物は、多官能的に活性化した親水性の合成重合体でコラーゲンを架橋することにより、調製される。本明細書中で使用する用語「生体粘着剤」および「外科手術用粘着剤」とは、２種の天然組織の表面間で、または天然組織の表面と非天然組織の表面または合成移植片の表面との間で、一時的結合または恒久的結合を生じ得る生体適合性の組成物を表わすために、交換可能に用いられる。
【００４４】
本発明の生体粘着剤組成物を調製するためには、まず、コラーゲンおよび多官能的に活性化した親水性の合成重合体を提供する必要がある。本明細書中で使用する用語「コラーゲン」とは、いずれかの原料に由来の全てのタイプのコラーゲンを包含することを意図しており、これには、組織から抽出するか組換え的に生産したコラーゲン、コラーゲン類似物、コラーゲン誘導体、改質したコラーゲン、および変性したコラーゲン(例えば、ゼラチン)が含まれるが、これらに限定されない。
【００４５】
コラーゲンは、動物の骨、軟骨、皮膚および結合組織の主要なタンパク質成分である。天然形状のコラーゲンは、典型的には、約300ナノメーター(nm)の長さおよび1.5 nmの直径の剛性棒状形状の分子である。コラーゲンは、堅い三重らせんを形成する３種のコラーゲンポリペプチドから構成される。これらのコラーゲンポリペプチドは、-Gly-X-Y-の繰り返し配列を有する長い中央部分に特徴があり、ここで、XおよびYは、しばしば、「テロペプチド」領域により各末端で結合したプロリンまたはヒドロキシプロリンであり、この「テロペプチド」領域は、この分子の約５パーセント(％)未満を構成する。このコラーゲン鎖のテロペプチド領域は、典型的には、鎖間の架橋およびタンパク質の免疫原性の原因となる。
【００４６】
本発明の組成物を調製するには、一般に、あらゆる種の原料に由来のコラーゲンが使用され得、例えば、コラーゲンは、ヒトまたは他の哺乳類源(例えば、ウシまたはブタの真皮およびヒト胎盤)から抽出され精製され得るか、または組換えまたは他の方法により、生成され得る。ウシの皮膚からの、精製した実質的に非抗原性コラーゲンの溶液中の調製は、基本的には、1979年２月20日にLuckらに発行された米国特許第4,140,537号、および1984年12月18日にLuckらに発行された米国特許第4,488,911号(これらの内容は、本明細書中で参考として援用されている)に記述されているように、可溶化、酵素処理および精製を含む３段階方法からなる。1992年７月29日に出願され特許査定された米国特許出願第07/921,810号(これは、本願と同じ譲渡人が所有している)は、ヒト胎盤からコラーゲンを抽出し精製する方法を開示している。1992年１月18日に出願された米国特許出願第08/183,648号(これは、本願と同じ譲渡人が所有している)は、遺伝子導入動物(遺伝子導入ウシを含めて)のミルクにて、ヒト組換えコラーゲンを製造する方法を開示している。本明細書中で使用する用語「コラーゲン」または「コラーゲン物質」とは、全ての形状のコラーゲン(処理したものまたは変性したものを含めて)を意味する。
【００４７】
I型、II、III型、IV型またはそれらの組み合わせ(これらに限定されないが)を含めたいずれかのタイプのコラーゲンは、使用可能であるが、Ｉ型が一般に好ましい。アテロペプチド含有コラーゲンまたはテロペプチド含有コラーゲンのいずれかが使用可能であるが、異種移植源に由来のコラーゲン(例えば、ウシコラーゲン)を用いるときには、アテロペプチドコラーゲンが一般に好ましい。なぜなら、アテロペプチドコラーゲンは、テロペプチド含有コラーゲンと比較して、その免疫原性が低いからである。
【００４８】
熱、光照射または化学的架橋剤のような方法であらかじめ架橋されていないコラーゲンは、本発明を実施する際に出発物質として用いるのに好ましいが、あらかじめ架橋したコラーゲンも使用され得る。架橋していないアテロペプチド繊維状コラーゲンは、それぞれ、35 mg/mlおよび65 mg/mlのコラーゲン濃度で、Zyderm(登録商標) I CollagenおよびZyderm II Collagenの商標で、Collagen Corporation(Palo Alto, CA)から市販されている。グルタルアルデヒドで架橋したアテロペプチド繊維状コラーゲンは、35 mg/mlのコラーゲン濃度で、Zyplast(登録商標) Collagenの商標で、Collagen Corporationから市販されている。
【００４９】
本発明で使用するコラーゲンは、一般に、約20 mg/mlと約120 mg/mlの間の濃度、好ましくは、約30 mg/mlと約90 mg/mlの間の濃度で、水性懸濁液中に存在する。
【００５０】
非繊維状コラーゲンは、本発明を実施する際に使用するのに好ましい。なぜなら、非繊維状コラーゲンは、粘稠性があり、一般に、(一定の同一コラーゲンタンパク質濃度で)、繊維状コラーゲンよりも粘性が高く、生体粘着剤として使用することを意図した組成物には、特に有用であるからである。用語「非繊維状コラーゲン」とは、コラーゲンの水性懸濁液の光学的な透明性により示されるように、pH７で実質的に非繊維形状のいずれかの変性コラーゲン物質または非変性コラーゲン物質を意味する。
【００５１】
本発明の生体粘着剤組成物で使用するコラーゲンは、典型的には、最初は繊維形状で開始し、次いで、１種またはそれ以上の繊維分解剤の添加により、非繊維状にされる。この繊維分解剤は、上記のように、このコラーゲンをpH７で実質的に非繊維状にするのに充分な量で存在しなければならない。本発明で使用する繊維分解剤には、種々の生体適合性アルコール、アミノ酸、無機塩および炭水化物が挙げられるが、これらに限定されず、生体適合性アルコールが特に好ましい。好ましい生体適合性アルコールには、グリセロールおよびプロピレングリコールが挙げられる。生体適合性でないアルコール(例えば、エタノール、メタノール、およびイソプロパノール)は、それを与えた患者の体に悪影響を与える可能性があるために、本発明での使用には好ましくない。好ましいアミノ酸には、アルギニンが挙げられる。好ましい無機塩には、塩化ナトリウムおよび塩化カリウムが挙げられる。炭水化物(例えば、スクロースを含めた種々の糖)は、本発明を実施する際に使用され得るものの、それらは、生体内で細胞毒性効果を有し得るので、他のタイプの繊維分解剤ほど好ましくはない。
【００５２】
既に非繊維形状であるコラーゲンもまた、本発明の組成物の調製に使用され得る。本明細書中で使用される用語「非繊維状コラーゲン」とは、天然形状で非繊維状のタイプのコラーゲン、および中性またはほぼ中性のpHで非繊維形状であるように化学的に変性したコラーゲンを包含することを意図している。天然形状で非繊維状(または微細繊維状)であるタイプのコラーゲンには、IV型、VI型およびVII型が含まれる。
【００５３】
中性のpHで非繊維形状であるように化学的に変性したコラーゲンには、スクシニル化コラーゲンおよびメチル化コラーゲンが含まれ、共に、1979年８月14日にMiyataらに発行された米国特許第4,164,559号(その内容は、全体として本明細書中で参考として援用されている)に記述の方法に従って、調製され得る。本発明者らの実験により、メチル化コラーゲンは、その固有の粘着性のために、生体粘着性組成物で使用するのに特に好ましいことが明らかとなった(以下の実施例３〜５を参照)。
【００５４】
繊維状コラーゲンもまた、本発明の方法で使用され得るが、一般に、非繊維状コラーゲンより不透明で粘着性が低いので、それほど好ましくない。しかしながら、繊維状コラーゲン、または非繊維状コラーゲンおよび繊維状コラーゲンの混合物は、光学的な透明性が必要でないなら、生体内で長期間持続することを意図している粘着剤組成物での使用に好ましいかも知れない。本発明者らは、親水性の合成重合体で架橋したメチル化(非繊維状)コラーゲンおよび繊維状コラーゲンの混合物が、生体粘着剤として有用であることを発見した(以下の実施例５を参照)。
【００５５】
1994年11月23日にRheeらが出願した米国特許出願第08/344,040号(これは、本願と同じ譲渡人が所有しており、本願出願時に審査中である)に開示されている、微粒子状の架橋した繊維状コラーゲンおよび架橋していない繊維状コラーゲンの混合物を含有する組成物はまた、本発明を実施する際に使用され得る。この微粒子状の架橋した繊維状コラーゲンは、好ましくは、グルタルアルデヒドで架橋した繊維状コラーゲンであり、好ましくは、最終組成物の約25重量％〜約95重量％、さらに好ましくは、約60重量％〜約80重量％を構成する。この架橋していない非繊維状コラーゲンは、好ましくは、最終組成物の約５重量％〜約75重量％、さらに好ましくは、約20重量％〜約40重量％を構成する。この微粒子状の架橋した繊維状コラーゲンおよび架橋していない繊維状コラーゲンは、まず、配合され、次いで、親水性の合成重合体を用いて、共に架橋される。
【００５６】
変性コラーゲン(これは、通常、ゼラチンとして知られている)もまた、本発明の方法で有用であることが分かっている。
【００５７】
本発明のコラーゲンベースの生体粘着剤組成物はまた、組織の癒着または癒着した組織の治癒を促進するために、生体活性剤を含有するように製剤され得る。本明細書中で使用する用語「生体活性剤」または「活性剤」とは、生体内で生体効果を示す有機分子を意味する。活性剤の例には、酵素、受容体アンタゴニストまたはアゴニスト、ホルモン、成長因子、自原性骨髄、抗生物質、抗菌剤および抗体が包含されるが、これらに限定されない。用語「活性剤」はまた、本発明の組成物に混合され得る種々のタイプの細胞を包含することを意図している。用語「活性剤」はまた、上で定義した２種またはそれ以上の活性剤の配合物または混合物を包含することを意図している。
【００５８】
本発明の組成物で使用する好ましい活性剤には、成長因子、例えば、形質転換成長因子(TGF)、繊維芽細胞成長因子(FGF)、血小板由来成長因子(PDGF)、表皮成長因子(EGF)、結合組織活性化ペプチド(CTAP)、骨原性因子、およびこのような成長因子の生体活性類似物、断片および誘導体が挙げられる。形質転換成長因子(TGF)の超遺伝子ファミリー(これは、多機能性の調節タンパク質である)の構成要素は特に好ましい。TGF超遺伝子ファミリーの構成要素には、β形質転換成長因子(例えば、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3)；骨形態形成タンパク質(例えば、BMP-1、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、BMP-8、BMP-9)；ヘパリン結合成長因子(例えば、繊維芽細胞成長因子(FGF)、表皮成長因子(EGF)、血小板由来成長因子(PDGF)、インシュリン様成長因子(IGF))；インヒビン(例えば、インヒビンA、インヒビンB)；成長分化因子(例えば、GDF-1)；およびアクチビン(例えば、アクチビンA、アクチビンB、アクチビンAB)が挙げられる。
【００５９】
成長因子は、生または天然原料(例えば、哺乳類の細胞)から単離され得るか、または例えば、組換えDNA技術により、または種々の化学方法により、合成的に調製され得る。さらに、これらの因子の類似物、断片または誘導体は、その天然分子の生体活性の少なくとも一部を示すという条件で、使用され得る。例えば、部位特異的な突然変異誘発または他の遺伝子工学技術によって改質した遺伝子の発現により、類似物が調製され得る。
【００６０】
生体活性剤は、混合により、このコラーゲンに含入され得る。他方、この生体活性剤は、架橋剤(例えば、官能的に活性化したポリエチレングリコール)を用いて、このコラーゲンに共有結合されるか、または結合配位子を用いて、このコラーゲンに親和結合され得る。親水性の合成重合体(例えば、官能的に活性化したポリエチレングリコール)を用いて、生体活性剤(例えば、成長因子)をコラーゲンに共有結合する方法は、1992年11月10日にRheeらに発行された米国特許第5,162,430号(これは、本願と同じ譲渡人に譲渡された)に記述されている。結合配位子(例えば、ヘパリン)によって、生体活性剤をコラーゲンに親和結合する方法は、1995年３月16日にSchroederらが出願した米国特許出願第08/405,320号(これは、本願と同じ譲渡人に所有され、本願出願時に審査中である)に開示されている。
【００６１】
生体活性剤は、一般に、コラーゲンを繊維分解剤と混合した後、このコラーゲンに取り入れられる。用いる活性剤の種類および量は、他の因子のうち、処理される特定の部位および状態、および選択した活性剤の生体活性および薬物動態に依存する。
【００６２】
本発明の組成物に生体活性剤を混合するとき、生体適合性アルコール(特にグリセロール)は、好ましい繊維分解剤である。なぜなら、特定の種の成長因子(例えば、形質転換成長因子β)は、グリセロールを含む組成物にて、その活性を保持することが分かっているからである。
【００６３】
本発明のコラーゲンベースの生体粘着剤組成物を調製するためには、コラーゲンは、多官能的に活性化した親水性の合成重合体を用いて架橋される。用語「多官能的に活性化した」とは、他の分子(例えば、コラーゲン)上で求核性基(例えば、第一級アミノ基(−NH2)またはチオール基(−SH))と反応できる２個またはそれ以上の官能基(これらは、その重合体鎖に沿った種々の部位に位置している)を有するか、またはそれらを有するように化学的に変性した親水性の合成重合体を意味する。多官能的に活性化した親水性の合成重合体上の各官能基は、コラーゲン分子と共有結合でき、それにより、これらのコラーゲン分子間で架橋が起こる。多官能的に活性化した親水性の合成重合体のタイプには、二官能的に活性化した重合体、四官能的に活性化した重合体、および星形に分枝した重合体が挙げられる。
【００６４】
多官能的に活性化したポリエチレングリコール(特に、二官能的に活性化したポリエチレングリコール)は、本発明の組成物を調製する際に使用するのに好ましい親水性の合成重合体である。用語「二官能的に活性化した」とは、他の分子(例えば、コラーゲン)上の求核性基と反応できる２個の官能基を有するか、またはそれらを有するように化学的に変性した親水性の合成重合体分子を意味する。二官能的に活性化した親水性の合成重合体上の２個の官能基は、一般に、この重合体鎖の反対の末端に位置している。二官能的に活性化した親水性の合成重合体分子上の官能的に活性化した各基は、コラーゲン分子と共有結合でき、それにより、これらのコラーゲン分子間で架橋が起こる。
【００６５】
本発明における使用のためには、ポリエチレングリコール(PEG)の分子は、このPEG分子の長さに沿って２個またはそれ以上の部位に官能基を与えるように化学的に変性され、その結果、このPEGとコラーゲン分子上の反応基との間で、共有結合が起こり得る。ある種の活性化した特定形状のPEGは、二官能的に活性化した形状のPEGとコラーゲンとを反応させることにより得られる一般化した反応生成物と同様に、構造的に以下に示される。式１〜８では、用語COLとは、コラーゲンを表わす；用語PEGとは、繰り返し構造(OCH2CH2)nを有する重合体を表わす。
【００６６】
第一の活性化したPEGは、二官能的に活性化したPEGスクシンイミジルグルタレートであり、本明細書では、(SG-PEG)と呼ぶ。この分子の構造式、およびこれとコラーゲンとを反応させることにより得られる反応生成物を、式１に示す。
【００６７】
SG-PEG：二官能的に活性化したPEGスクシンイミジルグルタレート
【００６８】
【化１】
0004831848.tif 000002
【００６９】
他の二官能的に活性化した形状のPEGは、PEGスクシンイミジル(S-PEG)と呼ばれる。この化合物の構造式、およびそれとコラーゲンとを反応させることにより得られる反応生成物を、式２に示す。この化合物の一般構造式では、添字３は、「ｎ」に置き換えられる。式１で示した１実施態様では、このPEGのいずれかの側に３個の繰り返しCH2基が存在するという点で、ｎ＝３である。
【００７０】
式２の構造により、加水分解を受けにくい「エーテル」結合を含む結合物が得られる。これは、式１で示す結合物とは異なっており、式１の結合物では、エステル結合が得られる。このエステル結合は、生理学的な条件下にて、加水分解を受ける。
【００７１】
SE-PEG、ｎ＝３：二官能的に活性化したPEGスクシンイミジル(エーテル結合)
【００７２】
【化２】
0004831848.tif 000003
【００７３】
さらに他の二官能的に活性化した形状のポリエチレングリコール(ここで、ｎ＝２)を、この活性化したPEGとコラーゲンとを反応させることにより形成した結合物と同様に、式３に示す。
【００７４】
SE-PEG、ｎ＝２：二官能的に活性化したPEGスクシンイミジル(エーテル結合)
【００７５】
【化３】
0004831848.tif 000004
【００７６】
ｎ＝１のとき、式２および式３の化合物と類似した本発明の他の好ましい実施態様が得られる。その構造式、および得られるコラーゲン−合成重合体結合物を、式４に示す。この結合物は、エーテル結合およびペプチド結合の両方を含有することを記しておく。これらの結合は、生理学的な条件下にて、安定である。
【００７７】
SE-PEG、ｎ＝１：二官能的に活性化したPEGスクシンイミジル(エーテル結合)
【００７８】
【化４】
0004831848.tif 000005
【００７９】
他の二官能的に活性化した形状のPEGは、PEGスクシンイミジルスクシンアミド(SSA-PEG)と呼ばれる。この化合物およびそれとコラーゲンとを反応させることにより得られる反応生成物の構造式を、式５に示す。式５に示した構造では、ｎ＝２である。しかしながら、関連した化合物(ここで、ｎ＝１またはｎ＝３〜10である)もまた、本発明を実施する際に使用され得る。
【００８０】
式５の構造により、「アミド」結合を含む結合物が得られ、このアミド結合は、先に示したエーテル結合と同様に、加水分解を受けにくく、従って、エステル結合よりも安定である。
【００８１】
SSA-PEG、ｎ＝２：二官能的に活性化したPEGスクシンイミジルスクシンアミド
【００８２】
【化５】
0004831848.tif 000006
【００８３】
ｎ＝０のとき、さらに他の二官能的に活性化した形状のPEGが得られる。この化合物は、PEGスクシンイミジルカーボネート(SC-PEG)と呼ばれる。この化合物の構造式、およびSC-PEGとコラーゲンとを反応させることにより形成した結合物を、式６に示す。
【００８４】
SC-PEG、ｎ＝０：二官能的に活性化したPEGスクシンイミジルカーボネート
【００８５】
【化６】
0004831848.tif 000007
【００８６】
式１〜６で描いた全ての活性化したポリエチレングリコール誘導体は、スクシンイミジル基を含有する。しかしながら、このPEG分子の長さに沿った部位において、異なる活性基を結合させてもよい。例えば、PEGは誘導体化されて、二官能的に活性化したPEGプロピオンアルデヒド(A-PEG)を形成し得、これは、A-PEGとコラーゲンとの反応により形成した結合物と同様に、式７に示す。式６で示す結合は、−(CH2)n−NH−結合と呼ばれ、ここで、ｎ＝１〜10である。
【００８７】
A-PEG：二官能的に活性化したPEGプロピオンアルデヒド
【００８８】
【化７】
0004831848.tif 000008
【００８９】
さらに他の形状の活性化したポリエチレングリコールは、二官能的に活性化したPEGグリシジルエーテル(E-PEG)であり、これは、これとコラーゲンとを反応させることにより形成した結合物と同様に、式８に示す。
【００９０】
E-PEG：二官能的に活性化したPEGグリシジルエーテル
【００９１】
【化８】
0004831848.tif 000009
【００９２】
上記の活性化した形状のポリエチレングリコールの多くは、現在、Shearwater Polymers(Huntsville, Alabama)およびUnion Carbide(South Charleston, West Virginia)から市販されている。一定範囲の物理的特性および化学的特性を有するコラーゲン−合成重合体結合物を生成するために使用し得る、種々の活性化した形状のポリエチレングリコールおよび種々の結合は、1994年７月12日にRheeらに発行された米国特許第5,328,955号(これは、本願と同じ譲渡人が所有している)に、さらに詳細に記述されている。
【００９３】
本発明の組成物を調製するのに使用される多官能的に活性化した親水性の合成重合体の濃度は、多くの要因に依存して変えられ、これらの要因には、用いる合成重合体の種類および分子量、およびコラーゲン懸濁液のコラーゲンタンパク質濃度が含まれる。一般に、本発明者らは、最終組成物の約0.1〜約10重量％の範囲の合成重合体濃度が、本発明の組成物および方法に使用するのに好ましいことを発見した。例えば、全重量が１グラム(1000ミリグラム)の最終組成物は、約１〜約100ミリグラムの間の多官能的に活性化した合成重合体を含有する。
【００９４】
本発明で使用するのに好ましい多官能的に活性化したポリエチレングリコールには、二官能的に活性化したSG-PEG(式１で表わされる)および二官能的に活性化したSE-PEG(式２〜４で示される)がある。
【００９５】
本発明の好ましい生体粘着剤組成物を調製する一般的な方法では、繊維状コラーゲンの水性懸濁液は、pH７でコラーゲンを実質的に非繊維状にするのに充分な量で、繊維分解剤と混合される。得られた非繊維状コラーゲンは、次いで、このコラーゲンと合成重合体との間で架橋を開始させるために、多官能的に活性化した親水性の合成重合体と混合される。
【００９６】
使用および適用
第一の表面を第二の表面に結合させる一般的な方法では：1)コラーゲン、および多官能的に活性化した親水性の合成重合体が提供される；2)このコラーゲンおよび合成重合体は共に混合されて、このコラーゲンと合成重合体との間で架橋が開始される；3)このコラーゲンと合成重合体との間で実質的な架橋が起こる前に、このコラーゲン−合成重合体の混合物は、第一の表面に適用される；そして4)第一の表面が第二の表面と接触されて、第一の表面と第二の表面との間で癒着が起こる。第一の表面および第二の表面の少なくとも一方は、好ましくは、天然組織の表面である。
【００９７】
例えば、コラーゲンおよび多官能的に活性化した親水性の合成重合体は、一般に、別々の注射器に供給され、それらの内容物は、次いで、第一の表面に送達する直前に、注射器−注射器の混合方法を用いて共に混合される。上記のように、コラーゲンは、非繊維状コラーゲンまたは繊維状コラーゲンであり得るが、好ましくは、非繊維状コラーゲンである。非繊維状コラーゲンは、化学的に変性したコラーゲン(例えば、メチル化コラーゲン)；天然状態の非繊維形状または微小繊維形状のコラーゲン(例えば、IV型コラーゲン)；またはpH７でコラーゲンを実質的に非繊維状にするのに充分な量の繊維分解剤と配合した繊維状コラーゲンであり得る。この合成重合体は、一般に、加水分解(これは、典型的には、親水性重合体を水性媒体に晒したときに、起こる)による架橋能力の損失を防止するために、殺菌した乾燥形状で用いられる(このことは、1994年８月８日に出願された米国特許出願第08/287,549号(これは、本願と同じ譲渡人に譲渡され、本願出願時に審査中である)に記述されている)。
【００９８】
コラーゲンおよび合成重合体は、好ましくは、この乾燥重合体とコラーゲンとを充分に確実に混合するために、最低で20回(さらに好ましくは、少なくとも30回)のパスで混合される。コラーゲンと合成重合体との間の架橋は、一般に、混合工程中に開始するので、混合後、できるだけ早く、このコラーゲン−合成重合体の反応混合物を第一の表面に送達することが重要である。
【００９９】
コラーゲン−合成重合体の反応混合物は、注射器または他の適切な押出装置の開口部から、第一の表面に押出され得る。適用に続いて、押出したコラーゲン−合成重合体の反応混合物は、必要であれば、スパチュラを用いて、第一の表面に展開され得る。他方、この非繊維状コラーゲンおよび合成重合体は、適切な混合皿または混合容器で共に混合され、次いで、スパチュラを用いて、第一の表面に適用され得る。
【０１００】
反応混合物を調製する別の方法では、コラーゲンおよび合成重合体は、ノズル付きの噴霧缶または噴霧瓶または他の適切な噴霧装置の別のチャンバーに入れられる。この状況では、コラーゲンおよび合成重合体は、噴霧装置のノズルから一緒に吐き出されるまで、事実上、混ざらない。
【０１０１】
コラーゲン−合成重合体の反応混合物の適用に続いて、第一の表面が第二の表面と接触される。この２個の表面がこのコラーゲンと合成重合体との間で実質的な架橋が起こる前に接触されるならば、この合成重合体の分子はまた、これらの表面のいずれかまたは両方に存在するコラーゲン分子上のリシン残基と共有結合されて、粘着性が改良される。
【０１０２】
これらの２個の表面は、架橋反応が完結に向けて進行している間、手でまたは他の適切な手段を用いて結合され得る。コラーゲンと合成重合体との間の架橋は、典型的には、このコラーゲンを合成重合体と混合した後、20〜60分間以内に完結する。
【０１０３】
この第一の表面および第二の表面の少なくとも一方は、好ましくは、天然組織の表面である。ここで使用する用語「天然組織」とは、治療される特定の患者の体に備わっている生体組織を意味する。本明細書中で使用する用語「天然組織」とは、患者の体の他の部分に移植するために、同じ患者の体の一部から突出させるかまたは取り出した生体組織(例えば、骨の自己移植片、皮膚弁の自己移植片など)を含むことを意図している。例えば、本発明の組成物は、火傷患者の場合のように、患者の体の一部に由来の皮膚片を体の他の部分に癒着させるのに、使用され得る。
【０１０４】
他の表面は、天然組織の表面、非天然組織の表面、または合成移植片の表面であり得る。本明細書中で使用する用語「非天然組織」とは、受容患者の体内に移植するために、提供者(受容患者と同じ種または異なる種であり得る)の体から取り出した生体組織を意味する(例えば、組織移植および臓器移植)。例えば、本発明の架橋重合体組成物は、提供者の角膜を受容患者の目に癒着させるのに使用され得る。
【０１０５】
本明細書中で使用する用語「合成移植片」とは、患者の体に移植することを意図したいずれかの生体適合性の物質を意味し、これは、天然組織または非天然組織についての上記定義に包含されない。合成移植片には、例えば、合成の血管、心臓弁、人工臓器、骨補てつ物、移植可能な微小レンズ(lenticules)などが挙げられる。
【０１０６】
本発明の非繊維状コラーゲンベースの生体粘着性組成物は、その光学的な透明性のために、眼科用途での使用に、特に適している。例えば、視力の矯正のための合成の微小レンズは、本発明の方法を用いて、患者の目の角膜のボーマン層に付着され得る。1993年11月３日にRheeらが出願し特許査定された米国特許出願第08/147,227号(これは、本願と同じ譲渡人に譲渡されており、本願の優先権を主張している)に開示されているように、pH７で実質的に非繊維状の化学的に変性したコラーゲン(例えば、スクシニル化コラーゲンまたはメチル化コラーゲン)は、親水性の合成重合体を用いて架橋され、次いで、所望の微小レンズ形状に成形され、そして架橋が完結され得る。得られる架橋したコラーゲン微小レンズは、次いで、本発明の方法を用いて、患者の目の上皮組織を除いた角膜のボーマン層に付着され得る。この非繊維状コラーゲン−合成重合体の反応混合物を角膜の前方表面に適用し、次いで、コラーゲンと合成重合体との間で実質的な架橋が起こる前に、この角膜の前方表面を微小レンズの後方表面と接触させることにより、この合成重合体はまた、この角膜組織および微小レンズの両方にて、コラーゲン分子と共有結合して、この微小レンズを一定位置に堅く固定する。(他方、この反応混合物は、まず、この微小レンズの後方表面に適用され、次いで、この角膜の前方表面と接触してもよい)。
【０１０７】
共に、求核性基(例えば、第一級アミノ基(−NH2)またはチオール基(−SH))を含む２個の表面間で癒着を起こす別の方法では、多官能的に活性化した親水性の合成重合体が第一の表面に適用され、次いで、第二の表面が第一の表面と接触される。この多官能的に活性化した親水性の合成重合体は、第一の表面および第二の表面の両方の求核性基と共有結合して、この２個の表面の間で癒着を起こす。
【０１０８】
この合成重合体は、水溶液(例えば、水またはリン酸緩衝溶液(PBS))中に存在するか、または非水性溶液(例えば、生体適合性のオイル)中に存在し得る。溶液中の合成重合体の濃度は、好ましくは、溶液１ミリリットルあたり、約10〜約400ミリグラムの合成重合体の範囲内である。水溶液が用いられるとき、この合成重合体は、好ましくは、この合成重合体の加水分解による粘着性の損失を防止するために、癒着を必要とする表面に適用する直前に、水性溶媒と混合される。
【０１０９】
他方、この多官能的に活性化した合成重合体は、乾燥形状で使用され得る。殺菌した乾燥形状の、多官能的に活性化した親水性の合成重合体を調製する方法は、1995年６月30日に出願された米国特許出願第08/497,573号(これは、本願と同じ譲渡人に譲渡され、本願出願時に審査中である)に示されている。例えば、この乾燥した合成重合体は、薄いシートまたは膜に圧縮成形され、これは、次いで、γ線照射、または好ましくは、電子線照射を用いて、殺菌され得る。得られる乾燥した膜またはシートは、所望のサイズに切断され、次いで、上記方法で用いる第一の表面に適用されて、２個の表面間で癒着が起こる。
【０１１０】
本発明の組成物はまた、外科手術または負傷後に、内部の組織または器官に癒着が形成されるのを防止するために、組織を被覆するのに使用され得る。外科手術後の癒着の形成を防止するために組織を被覆する一般的な方法では、このコラーゲンおよび多官能的に活性化した親水性の合成重合体が混合され、次いで、このコラーゲンと多官能的に活性化した親水性の合成重合体との間で実質的な架橋が起こる前に、この反応混合物の薄層は、外科手術部位を含む組織、それを取り囲む組織またはそれに隣接する組織に適用される。この反応混合物の組織部位への適用は、押出、はけ塗り、噴霧(上記のように)、または他のいずれかの好都合な手段により、行われ得る。
【０１１１】
この反応混合物の外科手術部位への適用に続いて、外科切開部位の閉鎖の前に、その場で架橋が続けられる。一旦、このコラーゲンと多官能的に活性化した合成重合体との間で「平衡的な」(すなわち、完全な)架橋が起こると、本発明の組成物で被覆された組織に接触している組織は、この被覆組織には付着しない。この時点で、この外科手術部位は、通常方法(縫合など)を用いて閉鎖され得る。
【０１１２】
平衡的な架橋が達成される時点は、本明細書では、この組成物が、ねばねばした触感がもはや感じられない時点として定義される。一般に、比較的に短時間(すなわち、このコラーゲンと合成重合体との混合後、５〜15分間)以内に完全に架橋される組成物は、外科手術の癒着の防止に使用するのに好ましく、その結果、その外科手術部位は、この外科手術手順が完了した後、比較的に早く閉鎖され得る。
【０１１３】
米国特許出願第(            )号(代理人整理番号：94-021；これは、本願と同じ譲渡人に譲渡され、本願出願時に審査中であり、その内容は、本明細書中で参考として援用されている)に記述のように、本発明の組成物は、哺乳類被検体の体内の種々の管腔または空孔を遮断しまたは充填するのに使用され得る。この組成物はまた、組織または構造(例えば、血管)の内部にて、裂溝を密封する生体封鎖剤として、または血液または他の生体液体の漏出を防止するための、隣接組織または構造間の接合部として使用され得る。
【０１１４】
【実施例】
以下の実施例は、本発明の結合物、組成物および装置の好ましい実施態様をいかに作成するかの完全な開示および記述を、当業者に提供するために提示しており、本発明者らが本発明と見なす範囲を限定することを意図していない。使用する数値(例えば、量、温度、分子量など)に関して、正確を期すべく努力がなされているが、ある程度の実験誤差および偏差は、考慮すべきである。他に指示がなければ、部は重量部であり、分子量は数平均分子量であり、温度は摂氏であり、そして圧力は大気圧またはそれに近い。
【０１１５】
実施例１
(PEGで架橋したスクシニル化コラーゲンの調製)
溶液中コラーゲン(CIS)(pH２のHCl中の３ mg/mlのコラーゲン)６リットルを、室温にて0.1 MのNaOHを用いて、pH ９まで調整して、繊維状コラーゲンを生成した。この繊維状コラーゲンに、無水コハク酸粉末1.35グラムを加え、そのpHを8.5と９の間に維持して、スクシニル化コラーゲンを形成した。このスクシニル化コラーゲンのpHを7.2に調整し、次いで、0.1 MのHClを用いて、4.2に調整して、このスクシニル化コラーゲンを沈殿させた。このスクシニル化コラーゲンを、次いで、遠心分離し、その上清を捨てた。そのペレットのpHを、0.1 MのNaOHを用いて、7.2に調整した。このスクシニル化コラーゲンペレットを水で希釈し、得られたスクシニル化コラーゲン溶液のコラーゲン濃度を20 mg/mlと決定した。
【０１１６】
二官能的に活性化したSG-PEG(3800MW)のPBS溶液を、以下のような異なる濃度で調製した：0.1 mlのPBS中の10 mgのSG-PEG、0.1 mlのPBS中の20 mgのSG-PEG、0.1 mlのPBS中の50 mgのSG-PEG、および0.2 mlのPBS中の100 mgのSG-PEG。４つの架橋剤溶液のそれぞれを、注射器−注射器混合を用いて、0.9 mlの20 mg/mlスクシニル化コラーゲンと混合した。この４個のスクシニル化コラーゲン−SG-PEG組成物は、それぞれ、10 mg/ml、20 mg/ml、50 mg/mlおよび91 mg/mlの最終SG-PEG濃度を有していた。これらの試料の最終コラーゲン濃度は、約18 mg/mlであった。
【０１１７】
これらの４つの調製物を、混合後５分および２時間の時点で、架橋の徴候について、目視観察した。表１に示すように、50 mg/mlおよび91 mg/mlのSG-PEGを含有するスクシニル化コラーゲン調製物は、混合後５分で架橋の徴候を示した。４個の調製物の全ては、混合後２時間で、著しい架橋を示し、光学的に透明なゲルを形成した。
【０１１８】
【表１】
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【０１１９】
10 mg/ml、20 mg/ml、50 mg/mlおよび91 mg/mlのSG-PEGを含有するスクシニル化コラーゲン調製物(それぞれ、試料Ｂ、ＣおよびＤ)の融解温度を、示差走査熱量測定(DSC)を用いて測定し、架橋していないスクシニル化コラーゲン(試料Ａ)の融解温度と比較した。DSCは、ゲル安定性を評価するために通常使用される架橋度の尺度である。
【０１２０】
DSCの結果を図１に示す。架橋した調製物(Ｂ、ＣおよびＤ)の融解温度は、架橋していないスクシニル化コラーゲン(A)の融解温度より、著しく高かった。
【０１２１】
実施例２
(PEGで架橋したメチル化コラーゲンの調製)
リドカインなしのZyderm(登録商標) II Collagen(Collagen Corporation、Palo Alto, CA)90ミリリットル(これは、20 mg/mlのコラーゲン濃度まで調整した)を凍結乾燥して、凍結乾燥コラーゲンを形成した。この凍結乾燥コラーゲンを、次いで、小さな部分に切断した。
【０１２２】
濃塩酸8.3ミリリットルおよび硫酸ナトリウム30グラムをメタノールに加えて、無水の酸性メタノールを生成した。この無水の酸性メタノールから、次いで、硫酸ナトリウムを濾過して取り除いた。約１リットルの酸性化した無水のメタノールを、引き続いて、この切断した凍結乾燥コラーゲンと混合した。
【０１２３】
室温で７日間インキュベーションした後、メチル化コラーゲンを形成した。過剰のメタノールを蒸発させて除いた。得られた物質を、引き続いて、凍結乾燥し、透析し、そして0.02 M Na2HPO4/0.13 M NaCl(pH 7.3)を添加することにより、そのコラーゲン濃度を20 mg/mlに調整した。
【０１２４】
二官能的に活性化したSG-PEG(3800 MW)のPBS溶液を、以下のような異なる濃度で調製した：0.15 mlのPBS中の３ mgのSG-PEG、0.15 mlのPBS中の９ mgのSG-PEG、0.15 mlのPBS中の15 mgのSG-PEG、0.15 mlのPBS中の30 mgのSG-PEG、0.15 mlのPBS中の45 mgのSG-PEG、0.15 mlのPBS中の75 mgのSG-PEG、0.2 mlのPBS中の111 mgのSG-PEG、および0.2 mlのPBS中の165 mgのSG-PEG。これらの架橋剤溶液のそれぞれを、注射器−注射器混合を用いて、1.35 mlの20 mg/mlメチル化コラーゲンと混合した。これらのメチル化コラーゲン−SG-PEG組成物は、それぞれ、２ mg/ml、６ mg/ml、10 mg/ml、20 mg/ml、30 mg/ml、50 mg/ml、72 mg/mlおよび106 mg/mlの最終SG-PEG濃度を有していた。これらの試料の最終コラーゲン濃度は、約18 mg/mlであった。
【０１２５】
得られた調製物の可塑性およびゲル強度について、定性分析した。表２に示すように、30 mg/mlおよび50 mg/mlのSG-PEGを含有する調製物は、混合後すぐに、架橋の徴候を示した。２ mg/ml、６ mg/ml、10 mg/mlおよび20 mg/mlのSG-PEGを含有する組成物は、架橋に５〜10分間を要した。72 mg/mlおよび106 mg/mlのSG-PEGを含有する組成物は、ゲル形成に10分間より長い時間を要し、弱い非可塑性のゲルを形成した。２〜20 mg/mlのSG-PEGを含有する組成物からは、最も強く最も可塑性のあるゲルが得られた。30 mg/mlのSG-PEGを含有する組成物は、強度は良好であるが可塑性の低いゲルを形成し、このゲルは、可塑性が好ましい特性ではない用途に有用であり得る。30 mg/mlより多いSG-PEGを含有するメチル化コラーゲンの組成物は、可塑性およびゲル強度に乏しかった。全てのゲルは、光学的に透明であった。
【０１２６】
２ mg/ml、10 mg/ml、30 mg/mlおよび72 mg/mlのSG-PEGを含有するメチル化コラーゲン調製物(それぞれ、試料Ｅ、Ｆ、ＧおよびＨ)の融解温度を、示差走査熱量測定(DSC)を用いて測定し、そして架橋していないメチル化コラーゲンの融解温度と比較した。これらの架橋していない試料および架橋した試料のDSC結果を、それぞれ、図２および図３に示した。融解曲線の輪郭は、架橋した調製物が不均質な分子集団を含むことを示しており、これらの分子のほとんどは、架橋していないコラーゲンよりも高い温度で融解する。
【０１２７】
表２に示すように、架橋した調製物の融解温度は、架橋していないメチル化コラーゲンの融解温度よりも著しく高かった。
【０１２８】
【表２】
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【０１２９】
実施例３
(その場で重合可能な微小レンズのウシ角膜への生体内送達および付着)
30 mg/mlのコラーゲン濃度を有するメチル化コラーゲンを、実施例２に記述のようにして調製した。切開したウシの目の角膜の上皮層を、先の丸い金属製スパチュラを用いて除去した。上皮を剥離した後、この角膜をPBSで洗浄し、そしてスポンジを用いて完全に乾燥した。
【０１３０】
10 mgの二官能的に活性化したSG-PEG(3800 MW)の0.1 mlのPBSの溶液を調製した。この架橋剤溶液を、注射器−注射器混合を用いて、0.9 mlの30 mg/mlメチル化コラーゲンと混合した。混合後すぐに、約0.2 mlのメチル化コラーゲン−SG-PEG物質を、1.0 ccの注射器の開口部から、上皮剥離したウシ角膜の表面に押出した。
【０１３１】
このメチル化コラーゲン−SG-PEG物質を、ポリメチルメタクリレート(PMMA)またはポリスルホンの型を用いて、この角膜上の一定位置で成形した。約３分間以内に、このコラーゲン−重合体の架橋およびゲル形成が起こり、ウシ角膜上のその場で微小レンズを形成した。
【０１３２】
ゲル形成に続いて、この型を、このコラーゲン−重合体物質から取り除いた。その場で形成した微小レンズの表面を、PBSで灌注した。この微小レンズは固定化されており、この灌注によっても移動しなかった。この微小レンズをスパチュラで穏やかに掻き裂いたところ、この微小レンズは、この角膜にうまく付着していることが分かった。この微小レンズは、スパチュラで「剥離」することにより、除去できた。
【０１３３】
このメチル化コラーゲン−SG-PEG微小レンズの除去前および除去後のウシ角膜上について、組織学的な検査(100倍の倍率)を行った。微小レンズの除去前の組織学的な検査では、この微小レンズと角膜との間の密接な界面が示された。この微小レンズを除去した後も、この角膜の表面には、明らかな損傷または異常は認められなかった。
【０１３４】
36％レベルのスクシニル化および30 mg/mlのコラーゲン濃度のスクシニル化コラーゲンから調製した物質を用いて、上記実験を繰り返した。20ミリグラムの二官能的に活性化したSG-PEGを、0.1 mlのPBSに溶解した。この架橋剤溶液を、引き続いて、注射器−注射器混合を用いて、0.9 mgの30 mg/mlスクシニル化コラーゲンと混合し、次いで、上皮剥離したウシ角膜に分配した。このコラーゲン−重合体物質の角膜への送達に続いて、約10分間以内に、ゲルの形成が起こった。定性的な比較により、このメチル化コラーゲン−SG-PEG物質は、このスクシニル化コラーゲン−SG-PEG物質よりも良好に角膜に付着していることが明らかとなった。
【０１３５】
実施例４
(PEGで架橋したメチル化コラーゲンの生体粘着剤としての使用)
メチル化コラーゲン(種々のコラーゲン濃度)および種々の濃度の二官能的に活性化したSG-PEG(3800 MW)を用いて、以下の調製物を調製した。これらの調製物を、あらかじめ屠殺した(sacrificed)ウサギの出血した傷口部位への癒着について、定性評価した。
【０１３６】
調製物Ａ：
33 mg/mlのコラーゲン濃度を有するメチル化コラーゲン(これは、実施例１に記述のように調製した)900マイクロリットル(μl)を、150μlのPBS(リン酸緩衝溶液)中で、約13.5 mgの二官能的に活性化したSG-PEG(3800 MW)と混合した(SG-PEGとコラーゲンとの40：１のモル比)。この物質を、あらかじめ屠殺したウサギの肝臓上の出血した傷口部位に押出し、１分間ゲル化させた。次いで、その皮膚をゲルの上部に置き、一定位置で１分間保持した。この皮膚を除去し、このゲルの状態を検査した。このメチル化コラーゲン−SG-PEGのゲルは、この肝臓に非常に良好に癒着したが、皮膚にはよく癒着しなかった。
【０１３７】
調製物Ｂ：
33 mg/mlのコラーゲン濃度を有するメチル化コラーゲン900マイクロリットル(μl)を、150μlのPBS中において、約27 mgの二官能的に活性化したSG-PEG(3800 MW)と混合した(SG-PEGとコラーゲンとの80：１のモル比)。この物質を、あらかじめ屠殺したウサギの筋肉上の出血した傷口部位に押出し、１分間ゲル化させた。その皮膚を、次いで、このゲルの上部に置き、一定位置で１分間保持した。この皮膚を除去し、このゲルの状態を検査した。このメチル化コラーゲン−SG-PEGのゲルは、この傷口部位に非常に良好に癒着したが、皮膚にはよく癒着しなかった。
【０１３８】
調製物Ｃ：
64 mg/mlのコラーゲン濃度を有するメチル化コラーゲン4.5ミリリットル(ml)を、0.5 mlのPBS中において、約325 mgの二官能的に活性化したSG-PEG(3800 MW)と混合した(SG-PEGとコラーゲンとの100：１のモル比)。この物質を、あらかじめ屠殺したウサギの出血した傷口部位に押出し、１分間ゲル化させた。その皮膚を、次いで、このゲルの上部に置き、一定位置で１分間保持した。この皮膚を除去し、このゲルの状態を検査した。このメチル化コラーゲン−SG-PEGのゲルは、この傷口部位に非常に良好に癒着したが、皮膚にはよく癒着しなかった。
【０１３９】
調製物Ｄ：
35 mg/mlのコラーゲン濃度を有するメチル化コラーゲン1.8ミリリットル(ml)を、250μlのPBS中において、71.4 mgの二官能的に活性化したSG-PEG(3800 MW)と混合した(SG-PEGとコラーゲンとの100：１のモル比)。この物質を、注射器間の物質を30回パスする注射器−注射器混合を用いて混合し、次いで、あらかじめ屠殺したウサギの出血した傷口部位に押出した。すぐに、SG-PEGとコラーゲンとを２：１のモル比で含むコラーゲン−SG-PEG膜(およその直径：4.5 cm)を、この押出したSG-PEG−コラーゲン物質の上部に置き、これを１分間ゲル化させた。その皮膚を、次いで、この膜の上部に置き、一定位置で１分間保持した。この皮膚を除去し、このゲルおよび膜の状態を検査した。このメチル化コラーゲン−SG-PEGのゲルは、この傷口部位および膜に非常に良好に癒着した。
【０１４０】
調製物Ｅ：
35 mg/mlのコラーゲン濃度を有するメチル化コラーゲン1.8ミリリットル(ml)を、250μlのPBS中において、71.4 mgの二官能的に活性化したSG-PEG(3800 MW)と混合した(SG-PEGとコラーゲンとの100：１のモル比)。この物質を、注射器間で物質を30回パスする注射器−注射器混合を用いて混合し、次いで、あらかじめ屠殺したウサギの出血した傷口部位に押出し、次いで、１分間ゲル化させた。その皮膚を、次いで、このゲルの上部に置き、一定位置で１分間保持した。この皮膚を除去し、このゲルの状態を検査した。このメチル化コラーゲン−SG-PEGのゲルは、この傷口部位に非常に良好に癒着したが、皮膚にはよく癒着しなかった。
【０１４１】
実施例５
(PEGで架橋したメチル化コラーゲンおよび繊維状コラーゲンの混合物を含有する生体粘着剤調製物)
PEGで架橋した繊維状コラーゲンのウシの目(Ferara Meats, Santa Clara, CAから得た)への癒着を評価するために、以下の実験を行った。これらの実験は、屠殺した動物から目を採取した後、24時間以内に行った。これらの目は、PBSで洗浄しすすいだ。
【０１４２】
３つの目の上皮を剥離し、PBSで洗浄し、次いで、乾燥した。以下のようにして、３個の調製物を評価した：
繊維状コラーゲン(68 mg/mlのコラーゲン濃度)を、二官能的に活性化したSG-PEG(3800 MW)と、SG-PEGとコラーゲンとの20：１のモル比で混合し、すぐに、上皮剥離した目に適用した。
【０１４３】
繊維状コラーゲン(68 mg/mlのコラーゲン濃度)を、二官能的に活性化したSG-PEGと、SG-PEGとコラーゲンとの20：１のモル比で混合し、この調製物を遠心分離して、気泡を除去し、次いで、混合後約２分間で、上皮剥離した目に適用した。
【０１４４】
メチル化コラーゲン(37.2 mg/mlのコラーゲン濃度)を、二官能的に活性化したSG-PEGと、SG-PEGとコラーゲンとの20：１のモル比で混合し、すぐに、上皮剥離した目に適用した。繊維状コラーゲン(68 mg/mlのコラーゲン濃度)を、二官能的に活性化したSG-PEGと、SG-PEGとコラーゲンとの20：１のモル比で混合し、すぐに、このメチル化コラーゲン−SG-PEG調製物の上部に適用した。
【０１４５】
室温で２時間後、このコラーゲン−SG-PEG調製物の目への付着を定性評価した。繊維状コラーゲンおよびSG-PEGを含有する組成物は、上皮剥離した目への付着がないことが分かった。メチル化コラーゲンおよびSG-PEGを含有する組成物は、この上皮剥離した目に非常によく癒着することが分かった。
【０１４６】
繊維状コラーゲン(37.2 mg/mlのコラーゲン濃度)とメチル化コラーゲン(37.2 mg/mlのコラーゲン濃度)とを混合し、次いで、0.4％(重量/容量)の二官能的に活性化したSG-PEG(3800 MW)を用いて架橋することにより、以下の表３で示す調製物を調製した。
【０１４７】
【表３】
0004831848.tif 000012
【０１４８】
これらの６個の調製物のそれぞれを、上皮剥離したウシの目に適用した。これらの調製物の全ては、上皮剥離した目に良好に癒着した。しかしながら、この調製物のメチル化コラーゲン含量が増えるにつれて(すなわち、繊維状コラーゲン含量が減るにつれて)、付着強度が上がることが分かった。
【０１４９】
実施例６
(種々のコラーゲンベースの調製物の生体内癒着)
あらかじめ屠殺したブタの膀胱を切開し、以下の表４に示す種々のコラーゲンベースの調製物の各0.2 ccを、１ ccの注射器から、27ゲージの注射針を通して、その膀胱内壁に注射した。ブタ膀胱を、次いで、組織の湿潤を保持するために、湿ったタオルで覆い、37℃で約１時間インキュベートした。
【０１５０】
移植片の上部表面を覆っている組織を切開して、この移植片を暴露した。各移植片の下部組織への付着を、以下の表４に示すように、定性評価した。
【０１５１】
【表４】
0004831848.tif 000013
【０１５２】
これらのPEG架橋した調製物の全ては、組織への付着を示したが、繊維状コラーゲンを含有するPEG架橋調製物は、PEG架橋した非繊維状(メチル化)コラーゲン調製物よりも強い付着を示し、このことは、この実験で用いたDSE-PEGとメチル化コラーゲンとの比が最適ではないことを示している。
【０１５３】
実施例７
(コラーゲンベースの生体粘着剤組成物の調製)
グリセロール(Sigma St. Louis, MOから得た)１ミリリットルを、殺菌のためにオートクレーブにかけた。１ mlのZyderm(登録商標) II Collagen(65 mg/mlのコラーゲンタンパク質濃度、Collagen Corporation, Palo Alto, CAから得た)を含む３ ccの注射器を、三路ストップコックを介して、グリセロールを含む注射器に取り付けた。このグリセロールおよびコラーゲンを、次いで、注射器−注射器混合を用いて、約100回のパスで混合した。
【０１５４】
スクロース(Sigma, St. Louis, MOから得た)１グラムを、舟形秤(weigh boat)に入れて重量を計った。舟形秤において、このスクロースに、１ミリリットルのZyderm II Collagenを加えた。このスクロースおよびコラーゲンを、コラーゲンが透明になるまで、混合した。このコラーゲン−スクロース混合物を、３ ccの注射器に充填した。
【０１５５】
これらのグリセロール−コラーゲン混合物およびスクロース−コラーゲン混合物を、次いで、注射器−注射器の混合を用いて、種々の量の殺菌し乾燥し二官能的に活性化したSG-PEG(DSG-PEG、3800 MW；これは、３ ccの注射器内に含有されている)と混合した。このコラーゲン調製物およびDSG-PEGを充分に混合したとき、得られた組成物を表面に押出し、次いで、第二の表面と接触させて、２個の表面間で癒着させることができる。
【０１５６】
実施例８
(コラーゲンベースの生体粘着剤組成物の特性付け)
上記の実施例に記述の方法に従って、表５で挙げた調製物を調製し、癒着特性(すなわち、粘稠性)および形状(すなわち、取扱い性)を定性評価した。これらの調製物を、０〜３の尺度で評点し、３の評点は、その調製物が非常に粘稠であるかまたは良好な形状を有することを示し、０の評点は、その調製物が粘稠性または形状に乏しいことを示す。
【０１５７】
【表５】
0004831848.tif 000014
【０１５８】
これらのスクロース/コラーゲン/DSG-PEG調製物およびグリセロール/コラーゲン/DSG-PEG調製物の全ては、優れた癒着特性および取扱い性を示した。このメチル化コラーゲン/DSG-PEG調製物は、それほど良好な癒着特性および取扱い性を示さず、このことは、この実験で用いたDSG-PEGとメチル化コラーゲンとの比が最適ではないことを示している。
【０１５９】
実施例９
(上皮剥離したウサギの角膜における二官能的に活性化したSE-PEG溶液の生体粘着剤としての生体内評価)
以下の方法に従って、あらかじめ形成した微小レンズを調製した：メチル化コラーゲン(53 mg/mlのコラーゲン濃度)を、40 mgの二官能的に活性化したSG-PEG(DSG-PEG、3800 MW、Shearwater Polymers, Huntsville, ALから得た)と混合し、約250μmの厚さの湾曲した薄膜に形成した。この薄膜から、直径７〜８ mmの円形の微小レンズを切り取った。これらの微小レンズを、２ mlのPBSまたは２ mlの0.2％グルタルアルデヒド中に80 mgのDSG-PEGを含有する溶液に入れ、一晩インキュベートさせた。
【０１６０】
数匹の雄のニュージーランド産の白ウサギの角膜を、ジル(gill)ナイフを用いて上皮剥離した。200μlのPBS中に40 mgの二官能的に活性化したSE-PEG(DSE-PEG、3800 MW、Shearwater Polymers, Huntsville, ALから得た)を含有する溶液を、上記のように調製しあらかじめ形成した微小レンズの凹形部分に適用した。２分間以内に、過剰のDSE-PEG溶液をピペットを用いて吸引した。あらかじめ形成したコラーゲン微小レンズを、次いで、この上皮剥離した角膜の表面にすぐに適用した。
【０１６１】
このあらかじめ形成した微小レンズは、DSE-PEG「粘着剤」を有する上皮剥離した角膜組織によく癒着することが分かった。これらの微小レンズは、ジルナイフを用いた穏やかな操作により、容易に除去できた。
【０１６２】
実施例10
(上皮剥離したウサギの角膜における二官能的に活性化したSE-PEGの粘着剤としての生体内評価)
数匹の雄のニュージーランド産の白ウサギの角膜を、ジルナイフを用いて上皮剥離した。200μlのPBS中に40 mg、53 mgまたは66 mgの二官能的に活性化したSE-PEG(DSE-PEG、3800 MW、Shearwater Polymers, Huntsville, ALから得た)を含有する溶液を、この上皮剥離したウサギ角膜の凹形部分に適用した。２分間以内に、過剰のDSE-PEG溶液をピペットを用いて吸引した。あらかじめ形成したコラーゲン微小レンズ(Imedex, Lyon, Franceから得た)を、次いで、この上皮剥離した角膜の表面にすぐに適用した。
【０１６３】
このあらかじめ形成した微小レンズは、DSE-PEG「粘着剤」を有する上皮剥離した角膜組織によく癒着することが分かった。これらの微小レンズは、ジルナイフを用いた穏やかな操作により、容易に除去できた。
【０１６４】
７日後、53 mg/mlのDSE-PEG溶液を用いてウサギ角膜に癒着した微小レンズを観察した。この特定の微小レンズの中心部は、角膜に対して、良好な付着性を有することが分かった。しかしながら、この微小レンズの端部は、この角膜に堅く癒着していなかった。この角膜の中心部は、僅かに不透明であることが認められた。この微小レンズと角膜との間に、タンパク質沈殿物が存在し得、このDSE-PEGは、沈殿したタンパク質に共有結合して、この角膜の表面の一定位置で保持している結果、目の中心部で不透明性が認められたと考えられる。
【０１６５】
実施例11
(上皮剥離した霊長類の角膜における二官能的に活性化したSE-PEG溶液の粘着剤としての生体内評価)
マカクザル(Macaca cynomologous)の角膜を、ジルナイフを用いて上皮剥離した。PBS中に40 mgの二官能的に活性化したSE-PEG(DSE-PEG、3800 MW、Shearwater Polymers, Huntsville, ALから得た)を含有する溶液を、あらかじめ形成したコラーゲンの微小レンズ(Imedex, Lyon, Franceから得た)の凹形部分に適用した。２分間以内に、過剰のDSE-PEG溶液をピペットを用いて吸引した。このあらかじめ形成したコラーゲンの微小レンズを、次いで、上皮剥離した角膜組織の表面にすぐに適用した。
【０１６６】
３週間後、この微小レンズは、このサルの角膜に堅く付着していることが分かった。角膜の不透明性は認められなかった。この操作に続いた第１週では、最小限度の炎症しか認められなかった。しかしながら、この炎症は、２週目までに沈静した。
【０１６７】
【発明の効果】
組織癒着または合成移植材料への組織の癒着に有用なコラーゲンベースの組成物が開示されている。この組成物は多官能的に活性化した親水性の合成重合体を用いて架橋したコラーゲンを含む。特に好ましい組成物は、繊維状コラーゲン、繊維分解剤および多官能的に活性化した親水性の合成重合体を含む。この組成物を用いて、天然組織を他の天然組織、非天然組織または合成移植片に付着させる方法が開示されている。この組成物を用いて、外科手術後の癒着の形成を防止する方法も開示されている。
【０１６８】
本発明によれば、生体粘着剤または外科手術用粘着剤として有用な組成物が提供される。また、本発明によれば、多官能的に活性化した親水性の合成重合体を用いて架橋したコラーゲンを含有する生体粘着性組成物が提供される。さらに、本発明によれば、このような組成物を用いて第一の表面と第二の表面との間で癒着を起こす方法、およびこのような組成物を用いて外科手術後の癒着の形成を防止する方法が提供される。
【０１６９】
本発明は、最も実用的で好ましい実施態様であると考えられることについて、本明細書中で示され記述されている。しかしながら、本発明の範囲内にあって、それらから逸脱する事項も作成でき、また当業者は、本開示を読めば、本発明の明らかな改良を想起することが認められる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、架橋していない繊維状コラーゲン(試料Ａ)、および10 mg/ml、20 mg/ml、50 mg/mlおよび90 mg/mlの二官能的に活性化したSG-PEG(それぞれ、試料Ｂ、ＣおよびＤ)の示差走査熱量測定(DSC)の結果を示す。
【図２】図２は、２ mg/ml、10 mg/ml、30 mg/mlおよび72 mg/mlの二官能的に活性化したSG-PEG(それぞれ、試料Ｅ、Ｆ、ＧおよびＨ)を含有するメチル化コラーゲン調製物のDSC結果を示す。
【図３】図３は、架橋していないメチル化コラーゲンのDSC結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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