(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナマコ類あるいはヒトデ類に含有されている可溶成分を除去して得られた不溶性コラーゲンスポンジ。
【請求項２】
ナマコ類あるいはヒトデ類に機械的粉砕を行った後、還元剤と塩を含んだ中性溶液で処理し、しかる後、この処理によって可溶化された成分を除去した後、得られた不溶性成分を精製、凍結、乾燥することを特徴とするナマコ類あるいはヒトデ類コラーゲンからなるスポンジの製造方法。
【請求項３】
前記中性溶液に更にキレート剤を加えることを特徴とする請求項２記載のナマコ類あるいはヒトデ類コラーゲンからなるスポンジの製造方法。
【請求項４】
請求項２または請求項３のいずれかの項記載の製造方法において、得られた不溶性成分をｐＨ１３のアルカリ溶液で洗浄することを特徴とするナマコ類あるいはヒトデ類コラーゲンからなるスポンジの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は無脊椎動物で棘皮動物に属するナマコ類あるいはヒトデ類のコラーゲン、さらには具体的にはナマコ類あるいはヒトデ類体内の分子間架橋を保ったままの高分子量コラーゲンからなるスポンジ及びその製造方法に関する。
【０００２】
【従来技術】
棘皮動物の一属であるナマコ類としては約１１００種が知られており、そのうち例えばマナマコ、クロナマコはそのまま、素干品あるいは煮干品食用に利用されるが、他のナマコ類、例えばキンコ等は食用としての価値が乏しいために採集されることも無く、ほぼ無尽蔵な資源ということができる。また同様に棘皮動物の一種類であるヒトデ類は食用にされないだけでなく、更に貝に被害を与えるために水産業者にとってはやっかいな存在である。
近年、細胞外マトリックスであるコラーゲンを化粧品原料、培養用基材、治療用埋植材として用いることが行われているが、通常は多量に製造することが可能で、かつ変性温度が高いことから哺乳動物のコラーゲン、特にウシ、ブタが使われている。しかし最近は哺乳動物以外に魚類（例えば特願平０５−５０２０１３、特願２０００−１４８５２３等）、鳥類（例えば特願平１１−２０２６６０）のコラーゲンを利用することも試みられている。
棘皮動物であるナマコ類あるいはヒトデ類においても体壁に多量のコラーゲンが含まれていることが知られており、このコラーゲンの抽出に関する研究もなされている。しかしナマコ類あるいはヒトデ類のコラーゲンは多くの天然の分子間架橋が形成されているために高度に不溶化しており、コラーゲンの単離・精製には多くの手間と時間がかかり、このことが利用する場合の問題となっていた。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らは、ナマコ類あるいはヒトデ類のコラーゲンの利用について鋭意検討した結果、ナマコ類あるいはヒトデ類に含まれる高度に不溶化したコラーゲンを可溶化すること無く精製し、それをスポンジとして利用することを見出して本発明を完成したもので、本発明の目的はナマコ類あるいはヒトデ類より得られるコラーゲンスポンジ及びその製造方法を提供することである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明の要旨はナマコ類あるいはヒトデ類に含有されている可溶成分を除去して得られた不溶性コラーゲンのスポンジであり、ナマコ類あるいはヒトデ類を機械的粉砕した後、還元剤と塩を含んだ中性溶液で処理し、しかる後、この処理によって可溶化された成分を除去し、不溶性成分を精製、冷凍、乾燥することを特徴とするナマコ類あるいはヒトデ類コラーゲンからなるスポンジの製造方法である。また、不溶性成分を精製するに当たり、アルカリ溶液により処理することが好ましい。そして、前記の中性溶液に更にキレート剤を加えることもできる。
すなわち、本発明はナマコ類あるいはヒトデ類に含まれる高度に不溶化したコラーゲンを可溶化すること無く精製し、それを冷凍、乾燥することによってスポンジとして利用するものであって、このスポンジを更に可溶化して、抽出されたコラーゲン（分子状に単分散コラーゲン）からなるスポンジ、あるいはそれを後処理によって分子間架橋を導入したスポンジに比べ、機械的強度、熱的安定性、水分保持能に優れ、水分を素早く吸収し、感触の良いスポンジを得ることができたのである。
【０００５】
以下に本発明を詳細に説明する。
原料として用いるナマコ類は棘皮動物門、ナマコ綱に属するナマコ類であれば制限はない。具体的には楯手目、板足目、樹手目、隠足目、無足目に含まれるナマコ類で食用となるマナマコ、クロナマコ、ジャノメナマコ、アカミシキリ、フジナマコ、トラフナマコ、ハナジナマコ、バイカナマコ、オキナマコ等、及び食用としてあまり利用されることのないニセクロナマコ、ユメナマコ、キンコ（フジコとも呼ばれる）、イシコ、グミ、ゴカクキンコ、シロナマコ、シリブトイモナマコ、オオイカリナマコ、ホソイカリナマコ、ムラサキクルマナマコ等をあげることができる。
またヒトデ類は、ヒトデ綱に属するヒトデ類であれば制限はない。具体的にはモミジガイ科のヒラモミジガイ、モミジガイ、トゲモミジガイ、スナヒトデ科のスナヒトデ、アカヒトデ科のアカヒトデ、トゲヒトデ科のヌノメイトマキ、イトマキヒトデ、ヌメハダヒメヒトデ、キヒトデ科のキヒトデ、エゾヒトデ、イトマキヒトデ科のイトマキヒトデ、ホウキボシ科のアカヒトデ等をあげることができる。
使用する部位としては消化管など内臓を取り除いた、残りの部位である体壁部を用いる。
【０００６】
本発明にかかるコラーゲンスポンジはナマコ類、ヒトデ類の体内に含有されている可溶性成分を除去したものであって、コラーゲンを主成分としたスポンジで、このコラーゲンはナマコ類、ヒトデ類の体内で存在する分子間架橋を残したことを特徴とするスポンジである。
そして、このコラーゲンスポンジの製造方法について具体的に述べる。まず最初に原料とする使用部位を機械的に粉砕、切断しミンチ状、小片状にする。例えば内臓を取り除いたナマコ類あるいはヒトデ類の体壁をホモジナイザー、カッター等を用いてミンチ状、小片等にする。ミンチ、小片化の程度として、あまり十分でない場合には、次の中性溶液の処理で単離・精製することが出来ない。またこの処理をしすぎた場合には、出来たスポンジの強度が落ちてしまう。具体的に望ましいミンチ、小片化の状態としては水を加えずに粉砕した結果、挽肉状となる程度が望ましい。
次にこのミンチ、小片化物に還元剤と塩を含んだ中性溶液、具体的には還元剤としてメルカプトトエタノールまたはチオグリコール酸、塩としてＮａＣｌ等を加えてpHを６〜９とし、それを０〜４０℃で１日以上放置する。なおこの処理時間は温度、ミンチ、小片化の状態によって異なるが、１日以上は処理することは必要である。
またこの中性溶液にキレート剤を加えることによってＣａ等の無機物を除去することができる。キレート剤としてEDTA（ethylenediaminetetraacetic acid）、NTA(nitrilotriaceteic acid)、HIDA(hydroyethyliminodiacetic acid)、HEDTA(hydroxyethylene ethylenediaminetriacetic acid)、DTRP(diethylene triamine pentaacetic acid)、TTHA(triethylene tetraminehexaacetic acid)、GLDA(dicarboxymethyleglutamic acid tetrasodium salt)、DHEG(dihydroxyethyl glycine)、PDTA(1.3-propane diaminetetraacetic acid)、DPTA-OH(1,3-Diamino-2-hydroxypropane tetraacetic acid)、HEDP(hydroxyethylidene diphosphonicacid)、NTMP(nitrilotris(methylene phosphonic acid)、PBTC（phosphonobutane tricaroxylic Acid）等を用いることができる。特にヒトデ類の場合にはナマコ類の場合に比べ高い濃度でＣａが体壁に含まれるため、中性溶液にキレート剤を加えることが望ましい。
この中性溶液での処理によってコラーゲン以外のタンパク質、多糖類を遊離の状態に溶液に抽出することができ、同時にナマコ類あるいはヒトデ類の体壁の色もこの処理により大部分は取り除くことができる。この処理液より遠心分離、あるいはデカンテーションにより精製された不溶化コラーゲンを０．５％〜２％程度の濃度で得ることができるが、遠心分離により単離する方が濃度を高く、更に確実に集めることができる。
【０００７】
更にこの処理の後に、酢酸等酸性の溶液を加え、ｐHを２〜５にすることにより、より濃度の高い精製された不溶化コラーゲンを得ることができる。これはこの処理によって不溶性コラーゲンが凝集するためである。
このように中性の条件下、還元剤と塩或いはキレート剤による処理によって遊離したコラーゲン以外のタンパク質、多糖類は沈殿することなく、高度に不溶化したコラーゲンのみを沈殿させ得ることができる。この得られた沈殿をSDS-PAGEにより分子量の測定を行うことを試みたが、ゲル濃度３％のアッパーゲルにも入る成分は無く、このことからこの沈殿として得られた高度に不溶化したコラーゲンは多数のコラーゲン分子（分子量：約３０万）が結合していると考えられる。
なおこのSDS-PAGEはコラーゲンを熱変性後に電気泳動させるもので、コラーゲン分子の構成成分である分子量１０万のα鎖を観察できるが、今回の発明によるコラーゲンは高度に不溶化して、構成成分も大きな分子量を持つために変性後であってもゲル内に入ることがなかった。またコラーゲン以外のタンパク質はこのSDS-PAGEで観察されることはなく、不溶性コラーゲンは十分に精製されていることが確認された。
また以上の処理によって得られた沈殿を、更に高いpHで処理することにより柔らかいスポンジが得られることを見いだした。すなわち先の沈殿を０．１ＮａＯＨ溶液に冷蔵条件下、３日間入れた後に遠心分離、あるいはデカンテーションで再度沈殿を集めた後に、水で十分に沈殿を洗うことで柔らかいスポンジの原料となることを見いだした。
【０００８】
以上の処理によって得られた沈殿を水にて洗浄後、凍結乾燥させることによってスポンジを得ることができる。またこの沈殿を凍結乾燥の際に必要に応じて水で希釈することによって、できあがるスポンジの密度を調整することができる。得られたスポンジは原料となっている高度に不溶化したコラーゲンがナマコ類あるいはヒトデ類体内の天然の分子間架橋に由来しているため、高い機械的強度を持つスポンジである。また一般に哺乳類のコラーゲンに比べ、それ以外のコラーゲンは熱変性温度が低く、そのことはアミノ酸分析によるコラーゲン特有のアミノ酸であるハイドリキシプロリンの含量の低さからも予想されるが、この発明になるスポンジは高度に形成された天然の分子間架橋によって高い変性温度を持っており、得られたスポンジの変性温度は５２℃であった。
このスポンジは、パック用スポンジ、フェーシャルマスク等の化粧用途、細胞培養用担体等の研究用途、創傷カバー剤等の医療用途等、このスポンジの特長を生かした利用が可能である。
【０００９】
【実施例】
以下の実施例を示し本発明を具体的に示すがこれによって本発明が限定されるものではない。
実施例１
キンコの体壁を開き内蔵を取り除き５ｍｍ角程度に切断した後に、この体壁を主成分とした切断片（５０ｇ）を、中性溶液（ＮａＣｌ  ２９．２２ｇ）、２−メルカプトエタノール（１５．６３ｇ）、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（１２．１２ｇ）を水に溶かし、全量を１Ｌとする）１Ｌに加え、スターラーにて、冷蔵庫中３日間の攪拌による処理を行った。この処理により得られたドロドロの乳濁液を、遠心分離（１００００回転、３０分）することによって不溶性コラーゲン１０００ｇを沈殿として回収した。なおこの沈殿のコラーゲンの濃度は約０．５％であった。この沈殿をトレーに移し、凍結乾燥することによりナマコのコラーゲンからなるスポンジ５ｇを得た。
得られたスポンジの変性温度を測定した。スポンジを十分吸水させた後にＤＳＣにより変性温度を測定したところ５２℃にビークが認められた。またこのスポンジに水を垂らしたところ、スポンジ上の水滴は直ちにスポンジに吸収された。以上のことからこのスポンジは高い熱安定性、高い吸水性を持つことが分かった。
実施例２
実施例１の中性溶液にEDTA・２Na（１８．６１ｇ）を加え、同様の処理の後に、凍結乾燥することによりナマコのコラーゲンからなるスポンジを得た。
実施例３
実施例１の処理によって得られたコラーゲン濃度が約０．５％の不溶性コラーゲン５００ｇを０．１Ｍ  ＮａＯＨ溶液５Ｌにて４℃にて３日間攪拌処理を行った。このアルカリ溶液より遠心分離により不溶性コラーゲンを沈殿として回収した。この沈殿を水にて十分洗浄した後に、この洗浄の済んだ沈殿をトレーに移し、凍結乾燥することによりナマコのコラーゲンからなるスポンジを得た。ここで得られたスポンジは、実施例１あるいは２で得られたスポンジに比べて、より白くまた柔軟性に富むものであった。
実施例４
イトマキヒトデを原料（体壁として５０ｇを使用）として実施例２と同様の処理によってヒトデのコラーゲンからなるスポンジ４．５ｇを得た。
【００１０】
【発明の効果】
以上述べたように、本発明は従来利用価値に乏しい棘皮動物に属するナマコ類あるいはヒトデ類のコラーゲンを可溶成分を除去するという簡単な操作によって、ナマコ類あるいはヒトデ類体内の分子間架橋を保ったままの高分子量コラーゲンスポンジを得ることができ、得られたコラーゲンスポンジはナマコ類あるいはヒトデ類体内の天然の分子間架橋に由来しているため高い機械的強度、高い吸水能、高い熱変性温度を有する。