(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
筒部品と、
この筒部品の空洞内に挿入され、筒部品の軸方向に貫通する導通孔を有したセンサチップと、
このセンサチップと所定間隔を置いて前記筒部品の空洞を軸方向に仕切るように配置され、前記筒部品の内壁と接合または一体化された構造体とを備え、
前記構造体は、前記筒部品の軸方向に貫通し、前記センサチップ側の開口部を出口とする貫通孔を有し、
この貫通孔の前記出口と前記センサチップの前記導通孔とは対向しているとともに、
前記貫通孔の前記出口外周には、前記貫通孔とは隔てられ、前記構造体と前記筒部品内壁との間で形成される空間を有する細胞電気生理センサ用デバイス。
【請求項２】
前記センサチップの前記構造体との対向面には、
半球形状の凹部が形成され、
この凹部の最深部から前記センサチップを前記筒部品の軸方向に貫通する前記導通孔が形成されている請求項１に記載の細胞電気生理センサ用デバイス。
【請求項３】
前記筒部品内壁と前記センサチップ側面とは、熱溶着されている請求項１または２に記載の細胞電気生理センサ用デバイス。
【請求項４】
前記筒部品はガラスからなる請求項１から３のいずれか一つに記載の細胞電気生理センサ用デバイス。
【請求項５】
前記筒部品の内壁は、
前記構造体との接合面から前記センサチップに向けて湾曲する湾曲面を有し、
この湾曲面において前記筒部品の内径は、前記構造体側から前記センサチップ側に向けて徐々に小さくなっている請求項１から４のいずれか一つに記載の細胞電気生理センサ用デバイス。
【請求項６】
前記筒部品と前記構造体とは紫外線硬化樹脂からなる接着剤にて接合された請求項１から５のいずれか一つに記載の細胞電気生理センサ用デバイス。
【請求項７】
前記構造体は板状体であって、
その両側面は前記筒部品内壁と接合されている請求項１から６のいずれか一つに記載の細胞電気生理センサ用デバイス。
【請求項８】
請求項１から７のいずれか一つに記載の細胞電気生理センサ用デバイスと、
この細胞電気生理センサ用デバイスのセンサチップ上方および下方に配置された電解槽と、これらの電解槽に注入される電解液とそれぞれ電気的に接続される電極とを備えた細胞電気生理センサ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬剤に対する細胞の反応等を測定するための細胞電気生理センサ用デバイスおよびこれを用いた細胞電気生理センサに関する。
【背景技術】
【０００２】
電気生理学におけるパッチクランプ法は、細胞膜に存在するイオンチャネルを測定する方法として知られており、このパッチクランプ法によってイオンチャネルの様々な機能が解明されてきた。そして、イオンチャネルの働きは細胞学において重要な関心ごとであり、これは薬剤の開発にも応用されている。
【０００３】
しかし、一方でパッチクランプ法は測定技術に微細なマイクロピペットを１個の細胞に高い精度で挿入するという極めて高い能力を必要としているため、熟練作業者が必要であり、高いスループットで測定を必要とする場合には適切な方法でない。
【０００４】
このため、微細加工技術を利用した平板型プローブの開発がなされており、これらは個々の細胞についてマイクロピペットの挿入を必要としない自動化システムに適している。
【０００５】
例えば図１０に示す従来の細胞電気生理センサは、平板１に複数の導通孔２を設けたデバイスと、このデバイスの上下に配置された電解槽３、４と、これらの電解槽３、４内にそれぞれ配置された電極５、６とを備えている。
【０００６】
そしてこの細胞電気生理センサは、それぞれの電解槽３、４に電解液を注入し、次に上方の電解槽３に細胞７を投入し、その後導通孔２下方から電解液ごと細胞７を吸引して導通孔２開口部（入口）に細胞７を密着させ、電極５、６で電解槽３、４間の電位差を検出するものである。
【０００７】
ここでこの電位差は、細胞７に薬剤を投与したり、物理化学的刺激を印加したりすることによって変動する。
【０００８】
したがってこの細胞電気生理センサは、薬剤に対する細胞７の反応あるいは細胞７が発する電気生理現象によって生じる電気化学的変化を測定するために用いられる。
【０００９】
なお、この出願の発明に関連する先行技術文献情報としては、例えば、特許文献１、２が知られている。
【特許文献１】特表２００２−５１８６７８号公報
【特許文献２】特表２００３−５２７５８１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
従来の細胞電気生理センサ用デバイスでは、細胞電気生理センサの測定精度が低いという課題があった。
【００１１】
すなわち、電解液を注入する際、導通孔２の出口２Ａ近傍に気泡が発生することがあり、この気泡が滞留すると細胞７を吸引しにくくなる。そしてその結果、細胞電気生理センサの測定精度が低くなるのであった。
【００１２】
そこで本発明は、細胞電気生理センサの測定精度を向上させることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
そしてこの目的を達成するために本発明は、筒部品と、この筒部品の空洞内に挿入されたセンサチップと、このセンサチップと所定間隔を置いて筒部品の空洞内に配置され、筒部品の内壁と接合または一体化された構造体とを備え、前記センサチップは、筒部品の軸方向に貫通する導通孔を有し、構造体は、筒部品の軸方向に貫通し、センサチップ側の開口部を出口とする貫通孔を有し、この貫通孔の出口とセンサチップの導通孔とは対向しているとともに、貫通孔の出口外周には、構造体と筒部品内壁との間で形成される空間を有するものとした。
【発明の効果】
【００１４】
これにより本発明は、細胞電気生理センサの測定精度を向上させることができる。
【００１５】
その理由は、センサチップの導通孔近傍の気泡を低減できるからである。
【００１６】
すなわち本発明は、センサチップの導通孔と構造体の貫通孔の出口とが対向しているため、貫通孔から電解液を注入すると、導通孔近傍には大きな水圧がかかり、気泡を移動させることができる。
【００１７】
したがって細胞を吸引しやすくなり、結果として細胞電気生理センサの測定精度を向上させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
（実施の形態１）
図１（ａ）に示すように本実施の形態における細胞電気生理センサ用デバイスは、筒部品８と、この筒部品８の空洞９内上端部に挿入されたセンサチップ１０と、このセンサチップ１０と所定間隔を置いて筒部品８の空洞９内に挿入され、図１（ｂ）に示すように、筒部品８の内壁と接合されるとともに、空洞９Ａ内を筒部品８の軸方向に仕切る構造体１１とを備えている。
【００１９】
また図２に示すように、センサチップ１０は、薄板１２とこの薄板１２上に形成された枠体１３とからなり、薄板１２と枠体１３とはシリコンで形成されている。
【００２０】
そして薄板１２の表面１２Ａ（構造体１１との対向面）には半球形状の凹部１４が形成されている。
【００２１】
またこの凹部１４の最深部から筒部品８の軸方向に貫通する導通孔１５を有し、この導通孔１５は、構造体１１側の開口部を後述の電解液の出口１５Ａとしている。この導通孔１５は一つの薄板１２に対し一個形成してもよく複数個形成してもよい。本実施の形態では、凹部１４の直径は約３０μｍ、導通孔１５の直径は１〜３μｍとした。
【００２２】
さらに構造体１１は、筒部品８の軸方向に貫通し、センサチップ１０側の開口部を出口１６Ａとする貫通孔１６を有している。貫通孔１６の直径は５０μｍ以下とした。
【００２３】
そしてこの貫通孔１６の出口１６Ａと導通孔１５の出口１５Ａとは対向している。
【００２４】
また本実施の形態では、筒部品８はガラスよりなり、この筒部品８は図１（ｂ）に示したように断面が円形の円柱状である。
【００２５】
この筒部品８のガラス材料としては、ホウケイ酸ガラス、アルミノケイ酸塩ガラスまたはホウケイ酸鉛ガラスなどが挙げられる。
【００２６】
そしてこの筒部品（図１（ａ）の８）内壁とセンサチップ１０側面とは熱溶着されている。これは筒部品８のガラス成分を加熱して一旦溶融させたものである。
【００２７】
これにより本実施の形態では、筒部品８内壁とセンサチップ１０側面との気密性が高まる。
【００２８】
そしてセンサチップ１０の薄板１２部分で筒部品８の上部と下部とが仕切られ、導通孔１５を通してのみ、上部と下部の空間が連通することになり、細胞電気生理センサの測定精度を向上させることが出来る。
【００２９】
また構造体１１は、図１（ａ）に示すように、貫通孔１６を中心に有する直方体の平板である。本実施の形態では、この構造体１１の長さは、筒部品８の長さに対して少なくとも５００μｍ短くなっている。
【００３０】
この構造体１１の下端部１１Ａは筒部品８の下端部８Ａと略同一面にあり、構造体１１の長手方向の両側面と筒部品８内壁とは接合されている。
【００３１】
そして本実施の形態の構造体１１は樹脂からなり、その材料としてはアクリル、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリオレフィン、環状ポリオレフィンポリマー、および環状ポリオレフィンコポリマーのうち少なくともいずれか一つを主成分として含む熱可塑性樹脂が挙げられる。
【００３２】
そして図２に示すように、筒部品８の内壁は、構造体１１との接合面からセンサチップ１０の薄板１２表面１２Ａに向けて湾曲するドーム状の湾曲面１７を有し、この湾曲面１７において筒部品８の内径は、構造体１１側からセンサチップ１０側に向けて徐々に小さくなっている。
【００３３】
また本実施の形態では、図１（ａ）に示すように、筒部品８と構造体１１とを紫外線硬化樹脂からなる接着剤１８で接合している。
【００３４】
そして図１（ａ）に示す本実施の形態の細胞電気生理センサは、前述の細胞電気生理センサ用デバイスを備え、枠体１３内およびセンサチップ１０上方を上側の電解槽として用い、センサチップ１０下方の筒部品８の空洞９と、構造体１１の貫通孔１６出口１６Ａ外周から空洞９を介して構造体１１の外表面と筒部品８の内壁間に形成される空洞（図１（ｂ）に示す９Ａ）とは下方の電解槽として用いている。
【００３５】
すなわち本実施の形態では、上下の電解槽間はセンサチップ１０の薄板１２で仕切られた構成である。そしてこれらの電解槽に注入される電解液（後述の細胞内液、細胞外液など）とそれぞれ電気的に接続される電極１９、２０とを備えている。
【００３６】
次に、本実施の形態１における細胞電気生理センサを用いて、細胞電気生理現象を測定する方法について図面を用いて説明する。
【００３７】
まず、図３に示したように貫通孔１６下部の入口１６Ｂより直径５０μｍ以下（貫通孔１６の直径以下）のピークチューブ２１を貫通孔１６の半分程度まで挿入し、このピークチューブ２１を介して細胞内液２２（電解液）を注入し、センサチップ１０の下方に相当する筒部品８の空洞９と図１（ｂ）の空洞９Ａ（電解槽）全体に充填する。
【００３８】
ここで哺乳類筋細胞の場合、代表的な細胞内液２２としては、Ｋ+イオンが４ｍＭ程度、Ｎａ+イオンが１４５ｍＭ程度、Ｃｌ-イオンが１２３ｍＭ程度添加された電解液が挙げられる。
【００３９】
この時、構造体１１の貫通孔１６自体もピークチューブ２１同様に、注入路として機能するため、この貫通孔１６にピークチューブ２１を挿入すれば、ピークチューブ２１をセンサチップ１０近傍まで接近させる必要がなく、ピークチューブ２１の接触によるセンサチップ１０の破壊を防ぐことが可能となる。これにより、センサチップ１０破壊による測定不良を減少させることができる。
【００４０】
その後、図４に示すようにセンサチップ１０上部に細胞外液２３を貯留する。ここで哺乳類筋細胞の場合、代表的な細胞外液２３としてはＫ+イオンが１５５ｍＭ、Ｎａ+イオンが１２ｍＭ程度、Ｃｌ-イオンが４．２ｍＭ程度添加された電解液が挙げられる。
【００４１】
そして次に図５に示すようにセンサチップ１０上方（電解槽部分）とセンサチップ１０下方であって図１（ｂ）に示す空洞９Ａ（電解槽）とに電極１９、２０をそれぞれ挿入し、電極１９、２０間に計測器２４を接続すると、センサチップ１０によって仕切られた細胞外液２３と細胞内液２２の間の電気的性質（電流、抵抗値、電圧など）が測定される。
【００４２】
この状態では、導通孔１５を介して細胞外液２３および細胞内液２２が導通する電気的回路が構成されており、その特性として、例えば電気抵抗、Ｉ−Ｖ特性として観測され、通常、１ＭΩ程度の電気抵抗を持つ。
【００４３】
次に、図６に示すように細胞外液２３に被検体細胞２５を投入する。そして、筒部品８下部より減圧吸引することで、被検体細胞２５は導通孔１５の入口１５Ｂに引き付けられ、被検体細胞２５が導通孔２５の入口１５Ｂを塞ぐことによって、細胞外液２３、細胞内液２２間が１ＧΩ以上の十分に高い電気抵抗を持つ（ギガシールと呼ぶ）。
【００４４】
このギガシール状態において、吸引圧力をさらに高めることで被検体細胞２５の細胞膜部分に微小の細胞膜穴を形成する。
【００４５】
これによって、被検体細胞２５の全細胞膜に埋め込まれたイオンチャネルの流れる数ｎＡ程度の微小電流を測定できるようになり、各種イオンチャネルの電気特性、薬剤に対する反応特性、その他外的刺激に対する反応などを測定することができる。
【００４６】
次に、本実施の形態における効果を以下に説明する。
【００４７】
本実施の形態では、細胞電気生理センサの測定精度を向上させることができる。
【００４８】
その理由は、導通孔１５の出口１５Ａ近傍の気泡を低減できるからである。
【００４９】
すなわち本実施の形態では、図１（ａ）に示すように、導通孔１５の出口１５Ａ直下に構造体１１の貫通孔１６出口１６Ａが対向しているため、貫通孔１６の入口１６Ｂから細胞内液等の電解液を注入する際、導通孔１５の出口１５Ａ近傍に液流が集中して大きな水圧がかかり、気泡を移動させることができる。また、残存した気泡も、細胞内液の注入圧力を上げ、液体の流れを強めることで押し出すことができ、気泡の除去が容易となる。
【００５０】
したがって細胞を吸引しやすくなり、結果として細胞電気生理センサの測定精度を向上させることができる。
【００５１】
また図３に示すように、貫通孔１６の下部入口１６Ｂから注入され、上端の出口１６Ａから流出した細胞内液２２は、その後筒部品８内部の空洞９を介して図１（ｂ）の空洞９Ａを上から下へと流れ出ていく。
【００５２】
したがって導通孔１５出口１５Ａ近傍から移動した気泡はこの細胞内液２２の流れに伴い出ていくため、導通孔１５の出口１５Ａ近傍の気泡をさらに低減することができる。
【００５３】
さらに本実施の形態では、細胞内液２２の注入を貫通孔１６入口１６Ｂから行うため、貫通孔１６の出口１６Ａ付近には、この貫通孔１６内径より大きな気泡は発生しにくくなる。
【００５４】
また本実施の形態では、図２に示すように、筒部品８の内壁は、構造体１１との接合面からセンサチップ１０に向けて湾曲する湾曲面１７を有し、この湾曲面１７において筒部品８の内径は、構造体１１側からセンサチップ１０側に向けて徐々に小さくなっている。そして構造体１１は直方体の平板であり、その両側面は筒部品８内壁と接合されている。
【００５５】
したがって、構造体１１の水平断面における長辺を、この湾曲面１７における筒部品８の内径よりも長くすることによって、構造体１１は湾曲面１７部分までは挿入されない。したがって、構造体１１挿入時に構造体１１がセンサチップ１０に当たるのを防ぎ、繊細なセンサチップ１０が損傷するのを抑制することができる。
【００５６】
なお、本実施の形態では、センサチップ１０は非常に厚みの薄い薄板１２を有しており、この薄板１２と構造体１１とが対向する構造であることから、本実施の形態の構成はセンサチップ１０（薄板１２）の損傷防止に効果的である。
【００５７】
またこの湾曲面１７によって、貫通孔１６出口１６Ａから流出した細胞内液が滑らかに筒部品８の空洞９、９Ａへと流れ出ていくため、細胞内液の充填が容易になる。さらにこの湾曲面１７では、角部が無く、その組成は親水性の高いガラスのため、気泡が発生しにくくなる。
【００５８】
また本実施の形態では、図２に示すように、薄板１２の表面１２Ａ（構造体１１との対向面）に半球形状の凹部１４を形成したため、構造体１１の貫通孔１６出口１６Ａから薄板１２の導通孔１５出口１５Ａに向けて流路の断面積変化が緩やかになるとともに、凹部１４内壁を湾曲させることによって液体の流動性が向上する。
【００５９】
したがって、細胞内液等を導通孔１５出口１５Ａまで行き渡らせることができ、結果として気泡の発生を抑制することができる。
【００６０】
なお、被検体細胞として直径１０μｍ〜２０μｍの細胞を用いた場合、導通孔１５の適切な直径を１μｍ〜３μｍ程度とすることによって吸引しやすくなるが、樹脂からなる構造体１１に同様の微細な貫通孔１６を形成することは非常に難しい。
【００６１】
したがって、本実施の形態では、この凹部１４によって、導通孔１５の直径と貫通孔１６の直径との差を緩衝することができ、結果として細胞電気生理センサの測定精度向上に寄与する。
【００６２】
また本実施の形態では、筒部品８はガラスからなるため、親水性が高く、気泡の発生を抑制することができる。そしてガラスは一般に紫外線透過率が高いため、構造体１１との接合に、紫外線硬化樹脂を用いることができ、成形が容易となる。
【００６３】
なお、本実施の形態では、筒部品８はガラスから形成したが、樹脂でもよく、その場合は、図７に示すように、筒部品８と構造体１１とを射出成形等により一体化して成形してもよい。これにより構造体１１部分と筒部品８部分との界面が無くなり、気泡の発生をより低減することができる。
【００６４】
また筒部品８および構造体１１双方を紫外線透過性の高い樹脂を用いて別々に形成し、紫外線硬化樹脂からなる接着剤で接合してもよい。
【００６５】
さらには筒部品８および構造体１１のいずれもが熱可塑性樹脂からなる場合は、別々に成形した後、熱溶着してもよい。
【００６６】
また、本実施形態では、筒部品８は円柱形状であるため、図８に示すように筒部品８を市販のパッチクランプ用電極ホルダー２６に挿入することも可能である。パッチクランプ用電極ホルダー２６は筒部品８を保持する挿入口２７と吸引口２８とを備え、電極２０が電極端子２９に繋がっている。そして筒部品８をパッチクランプ用電極ホルダー２６に挿入するとリングシール３０によって筒部品８の下部が密閉され、吸引口２８を通して下部の圧力を容易に変更することができる。
【００６７】
なお、本実施の形態では図２に示すように、筒部品８の内壁の湾曲面１７は、構造体１１との接合面からセンサチップ１０の薄板１２表面１２Ａ（構造体１１との対向面）に向けて形成されているが、筒部品８の内径がセンサチップ１０の外径よりも大きい場合、図９に示すようにセンサチップ１０側面１０Ａに向けて湾曲面１７を形成してもよい。このような湾曲面１７は、センサチップ１０側面１０Ａと筒部品８との接合部分を局所的に加熱することによって形成することができる。
【００６８】
またこの場合は、薄板１２表面１２Ａがガラス成分で汚れにくくなるため、薄板１２表面１２Ａの凹凸を抑制し、気泡の発生を抑制することができる。
【００６９】
なお、本実施の形態では、構造体１１は平板状としたが、この形状に限らず、例えば三又形状であってもよい。
【産業上の利用可能性】
【００７０】
本発明は、導通孔近傍の気泡を低減することができ、細胞電気生理センサの測定精度を向上させるのに有効である。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】（ａ）本発明の一実施形態における細胞電気生理デバイスの垂直断面図、（ｂ）同水平断面図（図１（ａ）のＸＸ断面）
【図２】本発明の一実施形態における細胞電気生理デバイスの要部拡大垂直断面図
【図３】本発明の一実施形態における細胞電気生理デバイスの動作工程を示す垂直断面図
【図４】同垂直断面図
【図５】同垂直断面図
【図６】同要部拡大垂直断面図
【図７】本発明の一実施の形態における細胞電気生理センサ用デバイスの垂直断面図
【図８】本発明の一実施の形態における細胞電気生理センサの垂直断面図
【図９】本発明の一実施の形態における細胞電気生理センサの要部拡大垂直断面図
【図１０】従来の細胞電気生理センサの垂直断面図
【符号の説明】
【００７２】
８  筒部品
８Ａ  下端部
９  空洞（電解槽）
９Ａ  空洞（電解槽）
１０  センサチップ
１０Ａ  側面
１１  構造体
１１Ａ  下端部
１２  薄板
１２Ａ  表面
１３  枠体
１４  凹部
１５  導通孔
１５Ａ  出口
１５Ｂ  入口
１６  貫通孔
１６Ａ  出口
１６Ｂ  入口
１７  湾曲面
１８  接着剤
１９  電極
２０  電極
２１  ピークチューブ
２２  細胞内液
２３  細胞外液
２４  計測器
２５  被検体細胞
２６  パッチクランプ用電極ホルダー
２７  挿入口
２８  吸引口
２９  電極端子
３０  リングシール
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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