(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１若しくは配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドまたは該ポリペプチドの塩の、リガンドとしてのリノレン酸、ドコサヘキサエン酸、及びパルミトレイン酸からなる群より選ばれる１種の遊離脂肪酸を有効成分とするＧＬＰ−１分泌促進剤。
【請求項２】
配列番号１若しくは配列番号２で表されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドまたは該ポリペプチドの塩の、リガンドとしてのリノレン酸、ドコサヘキサエン酸、及びパルミトレイン酸からなる群より選ばれる１種の遊離脂肪酸を有効成分とするＧＬＰ−１分泌促進剤。
【請求項３】
前記遊離脂肪酸が、αリノレン酸である請求項１又は２に記載のＧＬＰ−１分泌促進剤。
【請求項４】
配列番号１または配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドもしくは該ポリペプチドの塩と、該ポリペプチド若しくは該ポリペプチドの塩のアゴニスト候補物質とを接触させる工程；
ＧＬＰ−１を定量する工程；及び
ＧＬＰ−１が増加していれば、前記候補物質が、前記ポリペプチド若しくは該ポリペプチドの塩のアゴニストであると決定する工程；
を含む配列番号１または配列番号２で表されるポリペプチドのアゴニストのスクリーニング方法。
【請求項５】
インスリン分泌誘導物質のスクリーニング方法であって、
インスリン分泌誘導物質の候補物質と、配列番号１または配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドもしくは該ポリペプチドを含有する細胞とを接触させる工程；
ＧＬＰ−１を定量する工程；及び
ＧＬＰ−１が増加していたとき、前記候補物質をインスリン分泌誘導物質であると決定する工程
を含むインスリン分泌誘導物質のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血糖値を低下せしめ、糖尿病の予防または治療に供される医薬組成物に関する。
また、本発明は、摂食障害を治療するための医薬組成物に関する。
さらにまた、本発明は、合理的なダイエットに用いられる栄養補助組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
現代社会において、糖尿病患者数の増加は著しく、その治療のために必要とされる社会的、経済的コストは莫大な金額にのぼり、医療分野における重大問題として、早期解決が望まれている。【０００３】
糖尿病は、血液中に存在するグルコースを正常に代謝することができず、いわゆる高血糖状態を持続させ、身体機能に様々な悪影響を及ぼすものである。糖尿病の主な合併症として、網膜症、腎症、神経障害、動脈硬化などが挙げられるが、これらの合併症はさらに、失明、尿毒症、脳卒中、心筋梗塞などの深刻な病態を招く危険性を有している。
糖尿病の治療方法としては、食事療法、運動療法などにより代謝機能の正常化を図る方法の他、グルコース代謝に必要とされるインスリンを注射により投与する方法が行われている。
また、近年、インスリンを直接投与する方法の他にも、インスリンの生成、インスリンの分泌などを促進することにより、血糖値の低下を実現させる方法などの研究も活発に行われている。【０００４】
インスリン分泌を調節するペプチドホルモンとしてＧＬＰ−１（glucagon-like peptide-1；グルカゴン様ペプチド１）が注目を浴びつつある。ＧＬＰ−１は、回腸、大腸などに存在する腸内分泌細胞であるＬ細胞において生成されるプログルカゴンから翻訳後プロセッシングされて生じるペプチドホルモンである（Drucker, 1998）。グルコース濃度に応答してインスリンの分泌を誘導することから、特にＩＩ型（インスリン非依存型）糖尿病の治療に効果を示す可能性が指摘されてきた（Drucker, 2001；Thorens及びWaeber, 1993）。さらに、β細胞の増殖、又は幹細胞からのβ細胞の新生を誘導する効果なども報告されており、ＩＩ型糖尿病におけるβ細胞のアポトーシスの遅延や、Ｉ型糖尿病に対する膵島移植の効果継続に有効であると推測される。
また、インスリン分泌の調節作用の他にも、中枢の視床下部に作用して「満腹感」の刺激、及び摂食の低減を誘導することが明らかとなっており（Turton等, 1996；Flint等, 1998）、糖尿病のみならず、肥満症を含む摂食障害への治療効果が期待されている。最近の研究によると、脂肪細胞から遊離される脂肪酸やＴＮＦなどの物質がインスリンの作用を妨害することが明らかにされてきており、肥満による血糖値の上昇が促進される機構も解明されつつある。従って，インスリンの分泌を促進するだけでなく、肥満化をも抑制する効果を併せ持つＧＬＰ−１は糖尿病治療に対する画期的な治療剤を提供すると考えられる。【０００５】
しかし、ＧＬＰ−１を糖尿病の治療に適用するにあたり、生体内におけるＧＬＰ−１の半減期が非常に短いこと（Drucker, 2001；Thorens及びWaeber, 1993）、ペプチド性であるが故に投与に際し注射による方法を取らざるを得ない点などが障害となっていた。
このような問題点を克服する方法として、内在性のＧＬＰ−１の分泌を促進することでインスリン分泌の調節を図ることが考えられる。
これまでに、ＧＬＰ−１の分泌促進には脂肪酸が関係するとの指摘がされている。例えば、ラットに対してモノ不飽和脂肪酸を与えるとＧＬＰ−１の分泌が促進され（非特許文献１）、また、オレイン酸、パルミチン酸によりヒト腸管細胞株（ＮＣＩ−Ｈ７１６）からのＧＬＰ−１分泌が促進される（非特許文献２）などの報告が行われている。しかしながら、その一方では、ポリ不飽和脂肪酸またはモノ不飽和脂肪酸はＧＬＰ−１を介したインスリン分泌に影響を与えない（非特許文献３）、また、短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）の血液への注入によって、血漿中のＧＬＰ−１濃度に変化は生じなかった（非特許文献４）など、前出の報告とは相反する結果も報告されている。さらに、ある種の脂肪酸がＧＬＰ−１の分泌を促進するとした場合において、その作用機序については全く明らかにされておらず、この点においても、脂肪酸とＧＬＰ−１促進との関連性における信憑性が疑問視されていた。【０００６】
本発明に係る組成物にはＧタンパク質共役型レセプターであるＧＴ０１タンパク質、およびにＧＴ０１タンパク質と特異的に結合するリガンドが含まれる。Ｇタンパク質共役型レセプターは、７個の膜貫通領域を有することから７回膜貫通型受容体（７ＴＭＲ）と称されており（図１を参照のこと）、共役しているグアニンヌクレオチド結合タンパク質（以下、Ｇタンパク質と称する）の活性化を通じて、細胞内のシグナル伝達に関与している。
Ｇタンパク質共役型レセプターは、生体内の各機能細胞表面に存在し、それらの機能を調節するリガンド分子の標的となっており、該リガンド分子との結合を介して細胞内にシグナルを伝達している。伝達されたシグナルを受け取った細胞は、その細胞機能の活性化又は抑制化を受け、その結果、種々の生体内反応を惹起していく。従って、Ｇタンパク質共役型レセプターの機能を明らかにしていくことは、生体内反応をうまく調整する医薬を開発する点においても、非常に重要なこととなっている。
近年、膨大な量のゲノム及びｃＤＮＡ情報が入手可能となり、多くのＧタンパク質共役レセプターが同定されてきたが、未だ機能及びその特異的リガンドが明らかにされていないものも多く、その解析の進展が待たれている。
ヒトＧＴ０１タンパク質は、ＧＰＲ１２０と称され、NP_859529としてGenBankに登録されているアミノ酸配列と同一である。しかしながら、ＧＰＲ１２０の機能に関しては全く言及されておらず、生物学的役割については不明である（非特許文献５）。
また、Ｇタンパク質共役レセプターである１４２７３レセプターと９５％のアミノ酸同一性を有する。しかしながら、１４２７３レセプターはそのリガンドが特定されておらず、その作用機序の詳細は明らかになっていない。また、該１４２７３レセプターは、心臓において発現が認められ、該レセプターをコードする遺伝子によるトランスジェニックマウスの解析から、１４２７３レセプターは心臓疾患に関与するものとして同定されている。従って、本発明において開示されるＧＴ０１ポリペプチドと１４２７３レセプターはアミノ酸配列上の同一性は高いものの、その機能の比較から（後述する）、生理学的に全く異なる役割を担っている可能性が考えられる（特許文献１または２を参照のこと）。【０００７】
すでに、本発明の発明者らは、本発明に係るＧＴ０１タンパク質およびそのリガンドの作用により、摂食制御に機能するＣＣＫの分泌を促進することを見出している（特願２００３−１８０３７５）。そして、さらに本発明において、ＧＴ０１タンパク質およびそのアゴニストの作用により血糖値の低下に機能するＧＬＰ−１の分泌が促進され、さらに、インスリンの分泌も促進されることを見出した。従って、本発明に係るＧＴ０１タンパク質およびそのリガンドは摂食制御、血糖値の低下を可能ならしめることにより、肥満化を防止または軽減させ、併せて血糖値の低下を実現することにより糖尿病の治療に効果を発揮することが期待される。
【特許文献１】米国特許第６，４４８，００５Ｂ１号（全文）
【特許文献２】特表２００２−５３６９９７号公報（全文）
【非特許文献１】Ｒｏｃｃａ，Ａ．Ｓ．等，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １４２：１１４８−１１５５，２００１
【非特許文献２】Ｒｅｉｍｅｒ，Ｒ．Ａ．等，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｂｙ  １４２：４５２２−４５２８，２００１
【非特許文献３】Ｃｕｃｈｅ，Ｇ．等，Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ  Ｌｉｖｅｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７９：Ｇ９２５−９３０，２０００
【非特許文献４】Ｂｒｙｎｅｓ，Ａ．Ｅ．，Ａｍ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｎｕｔｒ  ７２：１１１１−１１１８，２０００．
【非特許文献５】Ｆｒｅｄｒｉｋｓｓｏｎ，Ｒ．等，ＦＥＢＳ  ５５４：３８１−３８８，２００３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
そこで、本発明においては、インスリンの分泌を促進することによりＩ型およびＩＩ型糖尿病の治療において有用な内在性ＧＬＰ−１の分泌を誘導ならしめる医薬組成物を提供することを目的とする。
さらに、ＧＬＰ−１の分泌およびインスリンの分泌に好適なＧＴ０１タンパク質に対するリガンドを同定する方法、該リガンドとＧＴ０１タンパク質との結合性を変化させる化合物を得るためのスクリーニング方法、該スクリーニング用キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者等は、上記事情に鑑み、ＧＴ０１ポリペプチド（例えば、配列番号１及び２）の機能を解析し、そのリガンドとなる化合物を同定すべく、鋭意研究を行った結果、ＧＴ０１ポリペプチドはヒト腸内分泌細胞表面に分布し、インスリン分泌の制御に機能するＧＬＰ−１の分泌を促進する機能を有し、さらには、実際にインスリン分泌が促進されることをここで初めて明らかにし、併せて、ＧＴ０１ポリペプチドのリガンド、特にアゴニストとなる化合物を明らかにした。
なお、本明細書中においては、「ポリペプチド」と「タンパク質」なる用語は特に注記しないかぎり、同じ意味に用いられるものとする。
すなわち、本発明のＧＬＰ−１分泌促進剤は、配列番号１または配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドもしくは該ポリペプチドの塩、あるいは配列番号１または配列番号２で表されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドもしくは該ポリペプチドの塩のリガンドとしてのリノレン酸、ドコサヘキサエン酸、及びパルミトレイン酸からなる群より選ばれる１種の遊離脂肪酸を有効成分とする。前記遊離脂肪酸としては、αリノレン酸が好ましい。
本発明のインスリン分泌誘導剤は、上記本発明のＧＬＰ−１分泌促進剤により分泌されたＧＬＰ−１が、インスリンの分泌を誘導するものである。
本発明の医薬組成物は、上記本発明のＧＬＰ−分泌促進剤を有効成分として含んで成り、糖尿病に伴う高血糖値を低下させるためのものである。また、上記本発明のインスリン分泌誘導剤を有効成分として含んでなる医薬組成物も対象とする。
本発明の配列番号１または配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはその塩のアゴニストのスクリーニング方法は、当該ポリペプチドまたはその塩のアゴニストであるリノレン酸と、配列番号１または配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはその塩とを接触させたときの特異的結合能を調べる工程；配列番号１または配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはその塩のアゴニスト候補物質を添加して、前記リノレン酸と前記ポリペプチドまたはその塩との結合性の変化を調べる工程；及び前記結合性が変化していれば、前記候補物質が、前記ポリペプチドのアゴニストであると決定する工程を含む。
本発明の別の態様のアゴニストのスクリーニング方法は、配列番号１または配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドもしくは該ポリペプチドの塩と、該ポリペプチド若しくは該ポリペプチドの塩のアゴニスト候補物質とを接触させる工程；ＧＬＰ−１を定量する工程；及びＧＬＰ−１が増加していれば、前記候補物質が、前記ポリペプチド若しくは該ポリペプチドの塩のアゴニストであると決定する工程を含む。
本発明のＧＬＰ−１の分泌促進物質のスクリーニング方法は、配列番号１または配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドもしくは該ポリペプチドの塩のアゴニストであるリノレン酸と、配列番号１または配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドもしくは該ポリペプチドとを接触させたときの特異的結合能を調べる工程；さらに、ＧＬＰ−１の分泌促進物質の候補物質を添加して、前記アゴニストと前記ポリペプチドまたはその塩との結合性の変化を調べる工程；及び前記結合性が変化していれば、前記候補物質が、ＧＬＰ−１分泌促進物質であると決定する工程を含む。
本発明のインスリン分泌誘導物質のスクリーニング方法は、インスリン分泌誘導物質の候補物質と、配列番号１または配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドもしくは該ポリペプチドを含有する細胞とを接触させる工程；ＧＬＰ−１を定量する工程；及びＧＬＰ−１が増加していたとき、前記候補物質をインスリン分泌誘導物質であると決定する工程を含む。
ここで「細胞」とは、特に注記しない限り哺乳動物細胞のことであり、特に、限定はしないが、生体内に存在して、ＧＬＰ−１を放出する能力を有する細胞（例えば、腸内分泌細胞であるＬ細胞など）、又はｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてＧＬＰ−１を放出する能力を有する株化細胞（例えば、ＳＴＣ−１細胞、ＮＣＩ−Ｈ７１６細胞、ＧＬＵＴａｇ細胞）などを指す（本明細書中において以下同様）。
ここで、「配列同一性」とは、比較されるアミノ酸配列（例えば、ここでは配列番号１または配列番号２）とのアミノ酸一致率が最大になるようにギャプ等を導入して、比較するアミノ酸配列と比較されるアミノ酸配列を整列させた場合、同一となるアミノ酸数の比較されるアミノ酸配列に対する１００分率のことである。配列番号１と配列番号２で表されるアミノ酸配列をアミノ酸の一致率が最大になるように、ギャップ等を導入して両配列を整列させた場合、配列番号１で表されるアミノ酸の８３％が配列番号２で表されるアミノ酸配列と同一であった。配列番号１はヒトＧＴ０１のアミノ酸配列、配列番号２はマウスＧＴ０１のアミノ酸配列を表すことから、各々のアミノ酸配列と少なくとも８３％以上の同一性を有するポリペプチドは、他の生物種におけるＧＴ０１ホモログであることが予想される。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により提供される医薬組成物を用いることにより、細胞からのＧＬＰ−１の分泌およびインスリンの分泌を促進させることができる。その結果、膵臓のβ細胞からのインスリンの分泌の促進、β細胞の増殖、幹細胞からのβ細胞の新生誘導などの効果が期待できる。
また、ＩＩ型糖尿病におけるβ細胞のアポトーシスの遅延、Ｉ型糖尿病に対する膵島移植の効果継続の効果が期待できる。
さらに、本発明により初めて明らかにされたＧＴ０１ポリペプチドに対するリガンドである遊離脂肪酸を含む医薬組成物を用いることで、ＧＴ０１ポリペプチドを発現する腸内細胞からのＣＣＫ放出を調節することが可能となる。その結果、末梢又は中枢におけるＣＣＫ応答性の摂食制御機構の調節が可能となり、摂食障害及びそれに伴う疾患等の症状の改善を達成し得る。
さらにまた、本発明のＧＴ０１ポリペプチドに対するリガンドである遊離脂肪酸を含有する栄養補助剤を摂取することにより、合理的なダイエットの達成又は食欲増進効果を期待し得る。【００１１】
また、本発明により提供される医薬組成物を用いることにより、「満腹感」を生じさせ、摂食の低減を誘導することが可能となるため、糖尿病の症状を亢進すると考えられる肥満をも抑制し、血糖値の低減を介した糖尿病の治療にさらなる効果が期待できる。【００１２】
さらに、本発明により提供されるリガンドの決定方法、またはリガンドとＧＴ０１との結合性を変化させる物質のスクリーニング方法を用いることで、ＧＬＰ−１の分泌を効果的に制御し得る新規化合物の同定が可能となり、血糖値の低減を介した糖尿病の治療剤の開発が期待できる。【００１３】
さらにまた、、本発明により提供されるスクリーニング方法、またはスクリーニングキットを用いることで、ＧＴ０１に対する既存のリガンドの結合様式を調節し得る新規化合物を同定することが可能となり、血糖値の低減を介した糖尿病の治療剤の開発が期待できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
１．ＧＴ０１ポリペプチドをコードする遺伝子のクローニング
本発明における「ＧＴ０１ポリペプチド」とは、配列番号１または配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するＧタンパク質共役型レセプター、または配列番号１もしくは配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、腸内分泌細胞（例えば、Ｌ細胞、）若しくは腸内分泌細胞株（例えば、ＳＴＣ−１、ＮＣｌ−Ｈ７１６細胞、ＧＬＵＴａｇ細胞株等）表面に分布し、そのリガンドの結合により、ＧＬＰ−１の分泌のためのシグナルを細胞内に伝達するＧタンパク質共役型レセプターのことである。【００１５】
本発明におけるＧＴ０１ポリペプチド遺伝子は、公的なデータベース（ＮＣＢＩ）に登録されている配列情報（登録番号；NM_181748（マウス）、NM_181745（ヒト）など）に基づいて作製されたＰＣＲプライマーを用いて、ｃＤＮＡライブラリー、ゲノムＤＮＡライブラリー等からクローニングすることができる。
ＰＣＲプライマーの設計は、primer3
（Whitehead
Institute for Biomedical Research.）等のプライマー設計ソフトを用いて行うことができる。また、ＰＣＲプライマー合成は、標準的な合成技術、例えば、自動ＤＮＡ合成装置などを用いて行うことができるが、商業的に入手してもよい。ＰＣＲ反応によって増幅が予想される増幅産物の長さは、増幅効率およびその後のアガロースゲルによる分離能および塩基配列解析が容易であるような長さが好ましく、例えば、８０〜２００塩基になるようにデザインするのがよい。作成したＰＣＲプライマーを用いて、ｃＤＮＡライブラリー等を鋳型にしてＰＣＲ反応を行い、増幅産物が目的の産物であることを、配列決定を行うなどして確認する。【００１６】
ここで用いられる、ｃＤＮＡライブラリーはヒトを含むあらゆる動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、モルモット、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ウシ、サル、ヒツジ、イヌ、ネコなど）の細胞、限定はしないが、例えば、免疫系細胞、血球系細胞、線維芽細胞、脾細胞、肝細胞、骨髄細胞、すい臓細胞、ランゲルハンス細胞、上皮細胞、筋細胞、神経細胞、グリア細胞、脂肪細胞、若しくはこれらの株化細胞、若しくはこれらの前駆細胞などから調製したものでもよく、又はあらゆる動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、モルモット、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ウシ、サル、ヒツジ、イヌ、ネコなど）の組織、限定はしないが、例えば、脳、脊髄、下垂体、胸腺、抹消血、脾臓、リンパ組織、下垂体、胃、すい臓、腎臓、生殖腺、甲状腺、胆嚢、睾丸、精巣、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋などから調製したものでもよい。ｃＤＮＡライブラリーの調製は、当該技術分野における通常の技術を用いて行うことができる（例えば、Sambrook等, 1989などを参照のこと）。【００１７】
２．ＧＴ０１ポリペプチドに対するリガンド
本明細書中の「リガンド」とは、受容体に適合する化学分子のことで、「アゴニスト」および「アンタゴニスト」の両方の概念が含まれる。
また、本明細書中における「アゴニスト」には、内在性のＧＴ０１ポリペプチドの生物学的活性（リガンドの結合により、ＧＬＰ−１の分泌のためのシグナルを細胞内に伝達する活性）を誘導する分子のいずれもが含まれる。一方「アンタゴニスト」には、アゴニストと競合することで、内在性ＧＴ０１ポリペプチドの生物学的活性の一部または全てを阻害し、中和させる分子のいずれもが含まれる。本発明の「アゴニスト」は、限定はしないが、特に、ＧＬＰ−１の分泌を促進する効果を有すると考えられる。
（１）リガンドの同定
ＧＴ０１ポリペプチドの生物学的活性（リガンドの結合により、ＧＬＰ−１分泌のためのシグナルを細胞内に伝達する活性）を検出ためのアッセイ系に試験されるべき化合物等を添加した場合、ＧＴ０１ポリペプチドの生物学的活性が促進されれば、該化合物はアゴニストであり、逆に活性が抑制されれば、該化合物はアンタゴニストである。具体的には、限定はしないが、例えば、後述の実施例にて示す細胞内カルシウム濃度の測定において、該アッセイで使用する細胞に試験化合物を接触させた場合に、細胞内カルシウム濃度が上昇すれば、該試験化合物はアゴニストであり、アゴニストの存在下においても細胞内カルシウム濃度の上昇を阻害すれば、該試験化合物はアンタゴニストであると判断することができる。【００１８】
（２）リガンドの同定方法
本発明のリガンド決定方法においては、本発明のＧＴ０１タンパク質またはその部分ペプチドと候補物質（試験物質）とを接触させた場合のＧＴ０１タンパク質または該部分ペプチドに対する候補物質の結合量や、細胞刺激活性などを測定することを特徴とする。より具体的には、本発明は、（ｉ）標識した試験化合物を、ＧＴ０１タンパク質もしくはその塩、またはＧＴ０１の部分ペプチドもしくはその塩に接触させた場合における、標識した候補物質のＧＴ０１もしくはその塩、またはＧＴ０１の部分ペプチドもしくはその塩に対する結合量を測定することを特徴とするＧＴ０１タンパク質またはその塩に対するリガンドの同定方法、（ｉｉ）標識した候補物質を、ＧＴ０１タンパク質を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合における、標識した候補物質の該細胞または該膜画分に対する結合量を測定することを特徴とするＧＴ０１に対するリガンドの同定方法、（ｉｉｉ）標識した候補物質を、ＧＴ０１タンパク質をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現したＧＴ０１タンパク質に接触させた場合における、標識した候補物質のＧＴ０１タンパク質またはその塩に対する結合量を測定することを特徴とするＧＴ０１に対するリガンドの同定方法、（ｉｖ）ＧＴ０１タンパク質を含有する細胞に、候補物質を接触させた場合における、ＧＴ０１タンパク質を介した細胞刺激活性（例えば、細胞内カルシウム濃度など）を測定することを特徴とするＧＴ０１タンパク質またはその塩に対するリガンドの同定方法、ならびに（ｖ）候補物質を、ＧＴ０１をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによってその細胞膜上に発現した受容体タンパク質に接触させた場合における、受容体タンパク質を介する細胞刺激活性（例えば、細胞内カルシウム遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内タンパク質リン酸化など）を測定することを特徴とする本発明のＧＴ０１タンパク質またはその塩に対するリガンドの同定方法を提供する。
本発明のリガンド同定方法に用いられるＧＴ０１タンパク質としては、ＧＴ０１タンパク質またはその部分ペプチドを含有するものであればいずれであってもよいが、動物細胞を用いて大量発現させたＧＴ０１タンパク質が特に好ましい。【００１９】
（３）アンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡ
ＧＴ０１遺伝子に対する、アンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡは有効なアンタゴニストとして作用する可能性がある。アンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡ分子は標的のｍＲＮＡに対してハイブリダイズして翻訳を阻害することにより標的因子の機能を阻害する。アンチセンスＲＮＡは、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてｍＲＮＡとハイブリダイズし、ｍＲＮＡからＧＴ０１ポリペプチドへの翻訳を阻害するようにデザインされる（Okano等, 1991）。また、ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、例えば、ＧＴ０１遺伝子の転写開始領域に対して相補的となるようにデザインされ、その結果ＧＴ０１の発現を阻害する（Cohen, 1989）。
これらのアンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡがＧＴ０１ポリペプチドの発現を阻害するようｉｎ  ｖｉｖｏにおいて発現し得るように細胞へ導入することができる。アンチセンスＤＮＡが用いられる場合には、例えば、標的遺伝子配列の約−１０と＋１０の間の位置に結合するオリゴヌクレオチドであることが望ましい。【００２０】
（４）抗ＧＴ０１ポリペプチド抗体
本発明は、ＧＴ０１ポリペプチドと特異的に結合する抗体、及びＦａｂ又は（Ｆａｂ）２などの抗体断片を含む。
本明細書中の「抗体」（抗ＧＴ０１；アゴニスト、アンタゴニスト及び中和抗体を含む）には、ＧＴ０１ポリペプチドに対するモノエピトープ特異的抗ＧＴ０１ポリペプチド抗体、ポリエピトープ特異的抗ＧＴ０１ポリペプチド抗体、単一鎖抗体、及びこれらの断片が含まれる。
これらの抗体には、例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト化抗体などが含まれる。
（４）−１．ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体は、例えば、哺乳類宿主動物に対して、免疫原及びアジュバントの混合物をインジェクトすることにより調製することができる。通常は、免疫原及び／又はアジュバントを宿主動物の皮下又は腹腔内へ複数回インジェクトする。免疫原にはＧＴ０１ポリペプチド及びその異種ポリペプチドとの融合体又はこれらの断片が含まれる。アジュバントの例には、完全フロイントアジュバント及びモノホスホリル脂質Ａ合成−トレハロースジコリノミコレート（ＭＰＬ−ＴＤＭ）が含まれる。免疫応答を増強するために、免疫原は、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、血清アルブミン、ウシチログロブリン及び大豆トリプシンインヒビターなどの免疫原性を有するタンパク質に結合させたのち、インジェクトしてもよい。
あるいは、ＩｇＹ分子を産生するニワトリを用いて調製してもよい（Schade等, 1996）。
抗体産生方法の詳細は、例えば、Ausubel等, 1987又はHarlow及びLane, 1988を参照のこと。【００２１】
（４）−２．モノクローナル抗体
抗ＧＴ０１ポリペプチドモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法を用いて調製される（Milstein及びCuello, 1983）。
この方法には以下に示す４つの工程が含まれる：（ｉ）宿主動物または、宿主動物由来のリンパ球を免疫する、（ｉｉ）モノクローナル抗体分泌性（又は潜在的に分泌性）のリンパ球を回収する、（ｉｉｉ）リンパ球を不死化細胞に融合させる、（ｉｖ）所望のモノクローナル抗体（抗ＧＴ０１ポリペプチド）を分泌する細胞を選択する。
マウス、ラット、モルモット、ハムスター、又は他の適当な宿主動物が免疫動物として選択され、免疫原がインジェクトされる。あるいは、免疫動物から取得したリンパ球をｉｎ  ｖｉｔｒｏで免疫化してもよい。ヒト細胞が望ましい場合には、末梢血リンパ球（ＰＢＬｓ）が一般に使用される。しかしながら、他の哺乳類由来の脾臓細胞又はリンパ球がより一般的で好ましい。免疫原には、ＧＴ０１ポリペプチド及びその異種ポリペプチドとの融合体又はこれらの断片が含まれる。
免疫後、宿主動物から得られたリンパ球はハイブリドーマ細胞を樹立するために、ポリエチレングリコールなどの融合剤を用いて不死化細胞株と融合される（Goding, 1996）。融合細胞としては、トランスフォーメーションによって不死化された齧歯類、ウシ、又はヒトのミエローマ細胞が使用されるか、ラットもしくはマウスのミエローマ細胞株が使用される。細胞融合を行った後、融合しなかったリンパ球及び不死化細胞株の成長又は生存を阻害する一又は複数の基質を含む適切な培地中で細胞を生育させる。通常の技術では、酵素のヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ）を欠く親細胞を使用する。この場合、ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンがＨＧＰＲＴ欠損細胞の成長を阻害し、ハイブリドーマの成長を許容する培地（ＨＡＴ培地）に添加される。【００２２】
モノクローナル抗体の調製にあたり、好ましい不死化細胞株はマウスミエローマ株で、アメリカンタイプカルチャーコレクション（Manassas, VA）より入手可能である。ヒトミエローマ及びマウス−ヒトヘテロミエローマ細胞株による、ヒトモノクローナル抗体産生に関しては、Kozbor等, 1984を参照のこと。
ハイブリドーマ細胞は細胞外に抗体を分泌するため、ＧＴ０１ポリペプチドに対するモノクローナル抗体の産生の有無に関し、培養液を用いて確認することができる。産生されたモノクローナル抗体の結合特異性は、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）又は酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）などの免疫沈降又はｉｎ  ｖｉｔｒｏでの結合アッセイにより評価することができる（Harlow及びLane, 1988；Harlow及びLane, 1999）。
抗ＧＴ０１ポリペプチドモノクローナル抗体分泌性ハイブリドーマ細胞は限界希釈法及びサブカルチャーにより単一クローンとして単離することができる（Goding, 1996）。適切な培地にはダルベッコ改変イーグル培地、ＲＰＭＩ−１６４０、場合によっては、タンパク質を含まない培地もしくは無血清培地などが含まれる（例えば、Ｕｌｔｒａ  ＤＯＭＡ  ＰＦ、またはＨＬ−１；Biowhittaker;Walkersville, MD）。また、ハイブリドーマ細胞は、適切な宿主動物の腹水中で増殖させてもよい。【００２３】
モノクローナル抗体は、培地又は腹水からプロテインＡセファロース、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、硫安沈殿又はアフィニティークロマトグラフィー（Harlow及びLane, 1988；Harlow及びLane, 1999）などの当業者にとって周知の方法によって単離及び精製される。
また、モノクローナル抗体は遺伝子組換え技術によっても作製することができる（米国特許第４，１６６，４５２号）。抗ＧＴ０１ポリペプチド抗体を分泌するハイブリドーマ細胞株から目的のモノクローナル抗体ポリペプチドをコードする遺伝子を同定するのに、例えば、マウスの重鎖及び軽鎖抗体遺伝子と特異的に結合するオリゴヌクレオチドプローブを用いてもよい。その結果、抗体重鎖及び軽鎖遺伝子が取得された場合は、その遺伝子の配列を決定することにより目的の抗体遺伝子を同定することができる。同定され、単離された抗体遺伝子のＤＮＡ断片は、モノクローナル抗体を発現させるために、適当な発現ベクターに導入し、該ベクターを他のＩｇタンパク質を生産しないｓｉｍｉａｎ  ＣＯＳ−７細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、又はミエローマ細胞などのホスト細胞中へトランスフェクトする。単離されたＤＮＡ断片は、例えば、ヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインに対するコード化配列を相同なマウス配列と置換することにより（米国特許第４，８１６，５６７号；Morrison等, 1987）、又は非Ｉｇポリペプチドをコードする配列の全て又は一部とＩｇコード化配列を融合することにより、修飾することができる。そのような非Ｉｇポリペプチドは、キメラ二価抗体を作製するために、抗体の定常ドメインと置換することが可能であり、又は抗原結合部位の定常ドメインと置換することができる。【００２４】
（４）−３．ヒト化及びヒト抗体
抗ＧＴ０１ポリペプチド抗体には、ヒト化又はヒト抗体が含まれる。非ヒト抗体のヒト化型は、非ヒトＩｇ由来の最小配列を含むキメラＩｇｓ、Ｉｇ鎖又は断片（Ｆｖ，Ｆａｂ，  Ｆａｂ’，Ｆ（ａｂ’）２又は他の抗体の抗原結合領域など）である。
一般に、ヒト化抗体は非ヒト由来のＩｇから導入された一又は複数のアミノ酸残基を持つ。これらの非ヒトアミノ酸残基は、多くの場合、可変ドメインから選ばれる。ヒト化抗体は、例えばマウスのＣＤＲｓ又はＣＤＲ配列と対応するヒト抗体配列とを置換することにより作製することができる（Jones等, 1986；Riechmann等, 1988；Verhoeyen等, 1988）。つまり、ヒト化抗体とは、典型的には、ヒトＩｇ中の特定のＣＤＲ残基がマウスの相当部位由来のＣＤＲ残基と置換されているヒト抗体のことである。ヒト化抗体には、マウス、ラット又はウサギなどの非ヒト種のＣＤＲであって、抗原に対する所望の特異的親和性を持つ残基により、置換されるヒトＩｇｓが含まれる。また、非ヒト由来の残基によって、ヒトＩｇのＦｖフレームワーク残基が置換される場合もある（Jones等, 1986；Presta, 1992；Riechmann等, 1988）。【００２５】
（５）ＧＴ０１ポリペプチドに対するリガンド
リガンドを決定する方法においては、ＧＴ０１受容体タンパク質と試験化合物（候補リガンド）とを接触させた場合の、例えば、該受容体タンパク質の細胞内移行を確認する方法、該受容体タンパク質を発現する細胞の刺激活性を測定する方法などが使用可能であり、当業者における通常の技術常識の範囲内において実施可能である。【００２６】
具体的には、例えば、本発明におけるＧＴ０１受容体タンパク質と蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＣＦＰ、ＹＦＰ又はＤｓＲＥＤなど）とのキメラ融合タンパク質を発現するための発現ベクターを試験細胞表面上に発現させ、試験化合物と接触させた場合の該キメラタンパク質の細胞内移行を蛍光顕微鏡等で観察することにより、試験化合物がリガンド（アゴニスト又はアンタゴニスト）として機能し得るか否か検討することができる。蛍光タンパク質とのキメラ融合タンパク質を発現させるベクターは、市販品（例えば、ｐＤｓＲｅｄ、ｐＥＧＦＰ、ｐＣＦＰなど、Clontech社）などの蛍光タンパク質遺伝子が挿入されたベクターに本発明のＧＴ０１遺伝子のフレームが合うように挿入することで、構築することができる。
また、ＧＴ０１受容体タンパク質を細胞表面上に発現させる細胞と試験化合物を接触させた場合において、受容体タンパク質を介して細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ２＋遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、イノシトールリン酸産生など）を検出することによっても候補リガンドを同定することができる。本発明においては、細胞内の遊離Ｃａ２＋濃度を測定する方法が用いられる。細胞内Ｃａ２＋濃度の測定は、当業者にとって周知の技術を用いることで実施することが可能である。例えば、Ｃａ２＋と結合することで蛍光を発する蛍光物質を用いる方法が一般的によく用いられる。
本発明において好ましいリガンド同定の方法は、蛍光タンパク質とＧＴ０１受容体タンパク質のキメラ融合体を用いた細胞内移行による方法、及び細胞内Ｃａ２＋濃度変化を検出する方法である。【００２７】
３．細胞培養
本発明のＧＴ０１ポリペプチドのリガンドを同定するために、適切な細胞表面上に該ポリペプチドを機能し得る状態で発現させる必要がある。
ここで使用可能な細胞には、哺乳動物細胞及びその株化細胞であれば利用可能である。適切な細胞又は細胞株は、当業者であれば容易に選択することができる。例えば、ＣＨＯ細胞、ＳＴＣ−１細胞、ＧＬＵＴａｇ細胞又はＨＥＫ細胞などが利用可能である。
細胞を培養する際、培地としては、例えば、約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地等が用いられ、必要に応じてグルコース、グルタミン、抗生物質等が適宜添加される。ｐＨは約６〜８であるのが好ましく、温度は約３７℃、ＣＯ２濃度は約５％が望ましい。【００２８】
４．ＧＴ０１ポリペプチドの哺乳動物細胞内での発現
本発明のリガンドを同定するために、ＧＴ０１ポリペプチドを、適切な哺乳動物細胞内で発現させ、該細胞表面上に分布させる必要がある。
ＧＴ０１ポリペプチドの安定発現株を得るために、適切なベクター（ｐＣＤＮなど）に本発明のＧＴ０１ポリペプチド（実質的に同一なポリペプチド及びそれらの部分ペプチドも含む。本明細書中において同様）のみ、又は他のタンパク質（例えば、ＧＦＰ、Ｇ１６など）との融合体ポリペプチドをコードするＤＮＡを挿入し、該ベクターを目的の細胞内へ導入する。
動物細胞へのベクターの導入方法としては、ＤＥＡＥデキストラン法（Lopata等, 1984）、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法（Chen及びOkayama, 1988）、カチオン性脂質による方法（Elroy-Stein及びMoss, 1990）等が挙げられる。
また、安定にトランスフォームされた組換体細胞を選択するためのマーカーとしては、限定はしないが、ハイグロマイシン耐性マーカー（Ｈｙｇｒ）、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（ｄｈｆｒ）、アンピシリン耐性遺伝子（Ａｍｐｒ）、カナマイシン耐性遺伝子（Ｋａｎｒ）、ネオマイシン耐性遺伝子（Ｎｅｏｒ，Ｇ４１８）などが利用可能である。【００２９】
５．ＧＴ０１ポリペプチドに対するアゴニスト又はアンタゴニストを含む医薬組成物
ＧＴ０１ポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストは、薬理学的に受容可能な担体と共に、生体に対して悪影響を及ぼさない医薬組成物の形態で治療剤として使用され得る。
「薬理学的に受容可能な坦体」は、溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌及び抗真菌剤、アイソトニックに作用して吸着を遅らせる薬剤及びその類似物を含み、薬剤的投与に適するもののことである（Gennaro, 2000）。該担体及び該担体を希釈するために好ましいものの例には、限定はしないが、水、生理食塩水、フィンガー溶液、デキストロース溶液、及び５％のヒト血清アルブミンが含まれる。また、リポソーム及び不揮発性油などの非水溶性媒体も用いられる。さらに、本発明のＧＴ０１ポリペプチド及び抗ＧＴ０１ポリペプチド抗体を含む該ポリペプチドに対するアゴニスト又はアンタゴニストの活性を保護又は促進するような、特定の化合物も該組成物中に取り込まれ得る。【００３０】
（１）医薬組成物の調製
本発明の医薬組成物は、静脈内、経口への投与、胃への直接投与を含む、治療上適切な投与経路に適合するように製剤化される。静脈内への投与、または胃への直接投与に使用される溶液又は懸濁液には、限定はしないが、注射用の水などの滅菌的希釈液、生理食塩水溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、又は他の合成溶媒、ベンジルアルコール又は他のメチルパラベンなどの保存剤、アスコルビン酸又は亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなどの無痛化剤、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）などのキレート剤、酢酸塩、クエン酸塩、又はリン酸塩などの緩衝剤、塩化ナトリウム又はデキストロースなど浸透圧調製のための薬剤を含んでもよい。
ｐＨは塩酸又は水酸化ナトリウムなどの酸又は塩基で調整することができる。非径口的標品はアンプル、ガラスもしくはプラスチック製の使い捨てシリンジ又は複数回投与用バイアル中に収納される。【００３１】
（２）注射可能な製剤
注射に適する医薬組成物には、滅菌された注射可能な溶液又は分散媒であって、使用時に調製するための滅菌水溶液（水溶性の）又は分散媒及び滅菌されたパウダー（凍結乾燥されたタンパク質、核酸などを含む）が含まれる。静脈内の投与に関し、適切な担体には生理食塩水、静菌水、ＣＲＥＭＯＰＨＯＲ  ＥＬＴＭ(BASF, Parsippany, N.J.)、又はリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）が含まれる。注射剤として使用する場合、組成物は滅菌的でなくてはならず、また、シリンジを用いて投与されるために十分な流動性を保持していなくてはならない。該組成物は、調剤及び保存の間、化学変化及び腐食等に対して安定でなくてはならず、細菌及び真菌などの微生物由来のコンタミネーションなどが生じてはならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、及び適切な混合物を含む溶媒又は分散媒培地を使用することができる。例えば、レクチンなどのコーティング剤を用い、分散媒においては必要とされる粒子サイズを維持し、界面活性剤を用いることにより適度な流動性が維持される。種々の抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、及びチメロサールなどは、微生物のコンタミネーションを防ぐために使用可能である。また、糖、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール及び塩化ナトリウムのような等張性を保つ薬剤が組成物中に含まれてもよい。吸着を遅らせることができる組成物には、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンなどの薬剤が含まれる。
滅菌的な注射可能溶液は、必要な成分を単独で又は他の成分と組み合わせた後に、適切な溶媒中に必要量の活性化合物を加え、滅菌することで調製される。一般に、分散媒は、基本的な分散培地及び上述したその他の必要成分を含む滅菌的媒体中に活性化合物を取り込むことにより調製される。滅菌的な注射可能な溶液の調製のための滅菌的なパウダーの調製方法には、活性な成分及び滅菌溶液に由来する何れかの所望な成分を含むパウダーを調製する真空乾燥及び凍結乾燥が含まれる。【００３２】
（３）経口組成物
通常、経口組成物には、不活性な希釈剤又は体内に取り込んでも害を及ぼさない担体が含まれる。経口組成物には、例えば、ゼラチンのカプセル剤に包含されるか、加圧されて錠剤化される。経口的治療のためには、活性化合物は賦形剤と共に取り込まれ、錠剤、トローチ又はカプセル剤の形態で使用される。また、経口組成物は、流動性担体を用いて調製することも可能であり、流動性担体中の該組成物は経口的に適用される。さらに、薬剤的に適合する結合剤、及び／又はアジュバント物質などが包含されてもよい。
錠剤、丸薬、カプセル剤、トローチ剤及びその類似物は以下の成分又は類似の性質を持つ化合物の何れかを含み得る：微結晶性セルロースのような賦形剤、アラビアゴム、トラガント又はゼラチンなどの結合剤；スターチ又はラクトース、アルギン酸、ＰＲＩＭＯＧＥＬ、又はコーンスターチなどの膨化剤；ステアリン酸マグネシウム又はＳＴＲＲＯＴＥＳなどの潤滑剤；コロイド性シリコン二酸化物などの滑剤；スクロース又はサッカリンなどの甘味剤；又はペパーミント、メチルサリシル酸又はオレンジフレイバーなどの香料添加剤。【００３３】
（５）全身投与
また、全身投与は経粘膜的又は経皮的に行うことができる。経粘膜的又は経皮的投与について、標的のバリアーを透過することができる浸透剤が選択される。経粘膜浸透剤は界面活性剤、胆汁酸塩、及びフシジン酸誘導体が含まれる。経鼻スプレー又は坐薬は経粘膜的な投与に対して使用することができる。経粘膜的投与に対して、活性化合物はオイントメント、軟膏、ジェル又はクリーム中に製剤化される。
また、化合物は、直腸への送達に対して、坐薬（例えば、ココアバター及び他のグリセリドなどの基剤と共に）又は滞留性の浣腸の形態で調製することもできる。
（６）担体
本発明のＧＴ０１ポリペプチド及び抗ＧＴ０１ポリペプチド抗体を含む該ポリペプチドに対するアゴニスト又はアンタゴニストは、植込錠及びマイクロカプセルに封入された送達システムなどの制御放出製剤として、体内から即時に除去されことを防ぎ得る担体を用いて調製することができる。エチレンビニル酢酸塩、ポリエチレングリコール、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸などの、生物分解性、生物適合性ポリマーを用いることができる。このような材料は、ALZA Corporation(Mountain View, CA)及びNOVA  Pharmaceuticals, Inc.(Lake Elsinore, CA)から入手することが可能で、また、当業者によって容易に調製することもできる。また、リポソームの懸濁液も薬学的に受容可能な坦体として使用することができる。有用なリポソームは、限定はしないが、ホスファチジルコリン、コレステロール及びＰＥＧ誘導ホスファチジルエタノール（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物として、使用に適するサイズになるように、適当なポアサイズのフィルターを通して調製され、逆相蒸発法によって精製される。例えば、抗体のＦａｂ’断片などは、ジスルフィド交換反応を介して、リポソームに結合させてもよい（Martin及びPapahadjopoulos, 1982）。詳細な調製方法は、例えば、Eppstein等, 1985；Hwang等, 1980中の記載を参照のこと。【００３４】
（７）投与量
本発明のＧＴ０１ポリペプチド又は該ポリペプチドをコードする遺伝子等による特定の疾患の治療又は予防において、適切な投与量レベルは、投与される患者の状態、投与方法等に依存するが、当業者であれば、容易に最適化することが可能である。
注射投与の場合は、例えば、一日に患者の体重あたり約０．１μｇ／ｋｇから５００ｍｇ／ｋｇを投与するのが好ましく、一般に一回又は複数回に分けて投与され得るであろう。好ましくは、投与量レベルは、一日に約０．１μｇ／ｋｇから約２５０ｍｇ／ｋｇであり、より好ましくは一日に約０．５〜約１００ｍｇ／ｋｇである。
経口投与の場合は、組成物は、好ましくは１．０から１０００ｍｇの活性成分を含む錠剤の形態で提供され、好ましくは治療されるべき患者に対する投与量に含まれる有効活性成分は、１．０，  ５．０，  １０．０，  １５．０，  ２０．０，  ２５．０，  ５０．０，  ７５．０，  １００．０，  １５０．０，  ２００．０，  ２５０．０，  ３００．０，  ４００．０，  ５００．０，  ６００．０，  ７５０．０，  ８００．０，  ９００．０，及び１０００．０ｍｇである。化合物は１日に１〜４回の投与計画で、好ましくは１日に１回又は２回投与される。【００３５】
（８）単位投与量
医薬組成物又は製剤は、一定の投与量を保障すべく、均一単位投与量により構成されなくてはならない。単位投与量とは、患者の治療に有効な一回の投与量を含み、薬学的に受容可能な担体と共に製剤化された一単位のことである。本発明の単位投与量を決定する場合には、製剤化される化合物（例えば、遊離脂肪酸、抗ＧＴ０１ポリペプチド抗体など）の物理的、化学的特徴、期待される治療上の効果、及び該化合物に特有な製剤化における留意事項等により影響を受ける。【００３６】
６．遺伝子治療組成物
本発明において開示される核酸分子（例えば、ＧＴ０１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが挿入されたベクターなど）を患者の細胞に導入するために、ｉｎ  ｖｉｖｏ及びｅｘ  ｖｉｖｏという２つの主要な方法がある。ｉｎ  ｖｉｖｏ送達においては、治療が必要とされる患者の部位に直接注入される。ｅｘ  ｖｉｖｏ処理では、治療が必要とされる患者の部位の細胞を単離し、単離された細胞に製剤化した核酸分子を導入し、導入された細胞を患者に直接又は、例えば、患者に埋め込まれる多孔性膜にカプセル化して投与することができる（米国特許第４，８９２，５３８号及び第５，２８３，１８７号参照）。核酸分子を生細胞に導入するために利用可能な技術は、培養細胞等にｉｎ  ｖｉｔｒｏで導入するか、又は患者にｉｎ  ｖｉｖｏで導入するかに依存して選択される。哺乳動物細胞にｉｎ  ｖｉｔｒｏで核酸分子を導入するのに適した技術としては、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、トランスフェクション、細胞融合、ＤＥＡＥ−デキストラン法、リン酸カルシウム法などが挙げられる。トランスフェクションには、組換えウイルス（好ましくはレトロウイルス）粒子の細胞レセプターとの結合、次いで粒子に含まれる核酸分子の細胞への導入が含まれる。遺伝子のｅｘ  ｖｉｖｏ送達に通常用いられるベクターはレトロウイルスである。【００３７】
現在、ｉｎ  ｖｉｖｏ核酸移入技術で好ましいのは、ウイルス又は非ウイルスベクター（アデノウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスＩウイルス、又はアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ））、及びカチオン性脂質ベースの系（遺伝子の脂質媒介移入に有用な脂質は、例えば、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ、及びＤＣ−Ｃｈｏ１である；例えば、Tonkinson等, Cancer Investigation, 14(1): 54-65 (1996) 参照）を利用した系が含まれる。遺伝子治療で使用するために最も好ましいベクターはウイルスであり、その中でも、最も好ましくはアデノウイルス、ＡＡＶ、レンチウイルス又はレトロウイルスである。レトロウイルスベクター等のウイルスベクターには、少なくとも１つの転写プロモーター／エンハンサー又は位置決定因子などが含まれる。さらに、レトロウイルスベクター等のウイルスベクターは、例えば、ＧＴ０１ポリペプチドをコードする遺伝子を含んだ状態で転写される場合、該コード化遺伝子の翻訳を可能とするシスエレメント、即ち翻訳開始配列として機能する核酸配列を含む。このようなベクター構築物は、用いるウイルスに適したパッケージングシグナル、末端反復配列（ＬＴＲ）又はその一部を含む。場合によっては、ベクター構築物は、ポリアデニル化並びに翻訳終結配列も含む。例えば、５’ＬＴＲ、ｔＲＮＡ結合部位、パッケージングシグナル、ＤＮＡ合成の開始点、及び３’ＬＴＲ又はその一部を含む。非ウイルス性の他のベクターは、例えばカチオン性脂質、ポリリジン、及びデンドリマーを用いることもできる。
場合によっては、治療に用いる核酸を目的の細胞にターゲティングする試薬、例えば、細胞表面膜タンパク質を特異的な抗体などと共に提供するのが望ましい。現在知られている遺伝子標識化及び遺伝子治療プロトコールの概説については、Anderson等, Science, 256:808-813 (1992)を参照のこと。好適な遺伝子治療及びレトロウイルス粒子及び構造タンパク質の作成方法は、米国特許第５，６８１，７４６号を参照のこと。【００３８】
７．医薬組成物に関するキット
医薬組成物はキット、容器、パック中に投与の説明書と共に含めることができる。本発明に係る医薬組成物がキットとして供給される場合、該医薬組成物のうち異なる構成成分が別々の容器中に包装され、使用直前に混合される。このように構成成分を別々に包装するのは、活性構成成分の機能を失うことなく、長期間の貯蔵を可能ならしめるためである。
（１）容器
キット中に含まれる試薬は、構成成分が活性を長期間有効に持続し、容器の材質によって吸着されず、変質を受けないような何れかの種類の容器中に供給される。例えば、封着されたガラスアンプルは、窒素ガスのような中性で不反応性ガスの下において包装されたバッファーを含む。アンプルは、ガラス、ポリカーボネート、ポリスチレンなどの有機ポリマー、セラミック、金属、又は試薬を保持するために通常用いられる他の何れかの適切な材料などから構成される。他の適切な容器の例には、アンプルなどの類似物質から作られる簡単なボトル、及び内部がアルミニウム又は合金などのホイルで裏打ちされた包装材が含まれる。他の容器には、試験管、バイアル、フラスコ、ボトル、シリンジ、又はその類似物が含まれる。容器は、皮下用注射針で貫通可能なストッパーを有するボトルなどの無菌のアクセスポートを有する。
（２）使用説明書
また、キットには使用説明書も添付される。当該医薬組成物からな成るキットの使用説明は、紙又は他の材質上に印刷され、及び／又はフロッピー（登録商標）ディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ−ＲＯＭ、Ｚｉｐディスク、ビデオテープ、オーディオテープなどの電気的又は電磁的に読み取り可能な媒体として供給されてもよい。詳細な使用説明は、キット内に実際に添付されていてもよく、あるいは、キットの製造者又は分配者によって指定され又は電子メール等で通知されるウェッブサイトに掲載されていてもよい。【００３９】
８．ＧＴ０１ポリペプチドに対するアゴニスト又はアンタゴニストを含む栄養補助組成物又は栄養補助食品
ＧＴ０１ポリペプチドに対するアゴニスト又はアンタゴニストを用いて、本発明に係る新規栄養補助組成物又は栄養補助食品とする場合、通常、食品の形態は特には限定されず、通常の食品として長期間摂取することができる形状としたものが良く、例えば、錠剤、顆粒状、散剤、清涼飲料水、菓子、パン、マーガリン等を例示することができる。また、通常食品に用いられている添加物、増量剤、香料、甘味料、増粘剤等を本発明の効果が損なわれない範囲で適宜混合することができる。【００４０】
９．ＧＴ０１タンパク質及びその部分ペプチドのその他の医学薬学的応用
本発明に係るＧＴ０１タンパク質およびその部分ペプチドまたはそれらの塩、ならびにそれらをコードするポリヌクレオチドは、（ｉ）ＧＴ０１タンパク質に対するリガンド（アゴニスト）の決定、（ｉｉ）ＧＴ０１タンパク質の機能不全に関連する疾患の予防および／または治療剤、（ｉｉｉ）遺伝子診断剤、（ｉｖ）ＧＴ０１タンパク質に対するリガンドの定量、（ｖ）ＧＴ０１タンパク質とリガンドとの結合性を変化させる化合物のスクリーニング、（ｖｉ）ＧＴ０１タンパク質とリガンドとの結合性を変化させる化合物を含有する各種疾病の予防および／または治療剤、（ｖｉｉ）ＧＴ０１タンパク質またはその部分ペプチドの定量、（ｖｉｉｉ）ＧＴ０１タンパク質またはその部分ペプチドに対する抗体による中和、（ｉｘ）ＧＴ０１タンパク質をコードする遺伝子を有する非ヒト動物の作成などに用いることができる。特に、本発明の組換型ＧＴ０１タンパク質の発現系を用いた受容体結合アッセイ系を用いることによって、ヒトや哺乳動物に特異的なＧＴ０１たんぱく質に対するリガンドの結合性を変化させる物質（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト）をスクリーニングすることができ、該アゴニストまたはアンタゴニストを各種疾病の予防・治療剤などとして使用することができる。【００４１】
具体的には、本発明のＧＴ０１タンパク質もしくはその部分ペプチド、またはそれらの塩は、ＧＴ０１タンパク質に対するリガンド（アゴニスト）またはアンタゴニストをスクリーニングし、または同定するための試薬として有用である。これらの試薬は、ＧＴ０１タンパク質に対するリガンドの結合性を変化させる物質のスクリーニング用キットの構成要素とすることが可能である。以上のように、本発明は、ＧＴ０１タンパク質もしくはその部分ペプチド、またはそれらの塩と、試験物質との接触させることを特徴とするＧＴ０１タンパク質に対するリガンド（アゴニスト）またはアンタゴニストの決定方法を提供する。試験物質としては、ヒトまたは哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ブタ、ウシ、ヒツジ、サルなど）の組織抽出物、細胞培養上清、人工的に合成した化合物等が挙げられる。【００４２】
本発明のＧＴ０１タンパク質またはその塩に対するリガンドを決定する方法を実施するためには、適当なＧＴ０１タンパク質画分と、標識した試験物質が用いられる。ＧＴ０１タンパク質画分としては、天然のＧＴ０１タンパク質画分、またはそれと同等の活性を有する組換型ＧＴ０１タンパク質画分等が好ましい、例えば、ＧＴ０１タンパク質またはその塩に対するリガンドの決定を行うには、まずＧＴ０１タンパク質を含有する細胞または細胞の膜画分を、決定方法に適したバッファーに懸濁することによりＧＴ０１標品を調製する。バッファーとしては、リン酸バッファー、トリス−塩酸バッファーなどのリガンドと受容体タンパク質との結合を阻害しないバッファーであればいずれでもよい。また、非特異的結合を低減させる目的で、ＣＨＡＰＳ、Ｔｗｅｅｎ−８０、デオキシコレートなどの界面活性剤や、ウシ血清アルブミンやゼラチン等のタンパク質をバッファーに加えることもできる。ＧＴ０１タンパク質を含む溶液に、一定量の放射性標識した試験物質を共存させる。非特異的結合量を知るために大過剰の未尿式の試験化合物を加えた反応チューブも用意する。反応は焼く４〜５０℃、好ましくは約４℃〜３７℃で、約１０分〜２４時間、望ましくは約３０分〜３時間行う。反応後、ろ過し、適量の同バッファーで洗浄した後、ろ紙に残存する放射活性を液体シンチレーションカウンター等で計測する。全結合量から非特異的結合量を引いたカウントが０ｃｐｍを越える試験物質を本発明のＧＴ０１タンパク質またはその塩に対するリガンド（アゴニスト）として選択することができる。【００４３】
以下の実施例は例示するためにのみ提供されるものであって、本発明の範囲を決して限定することを意図するものではない。
本明細書で引用した全ての特許及び参考文献の全体を、出典明示によりここに取り込む。
【実施例１】
【００４４】
ＧＴ０１遺伝子のクローニング
ヒト臓器ＲＮＡパネル中の回腸ｔｏｔａｌＲＮＡ、および、マウス回腸から抽出したｔｏｔａｌＲＮＡ  ５μｇから、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ（Invitrogen社）に添付の方法で、Ｒａｎｄｏｍ  ｐｒｉｍｅｒ（Takara社）を用いてＴｏｔａｌＲＮＡ  ５μｇから逆転写を行い、ｃＤＮＡを作成した。反応後、５’側プライマー（５’−ＡＴＧＴＣＣＣＣＴＧＡＡＴＧＣＧＣＧＣＧＧＧ−３’）（配列番号３）及び３’側プライマー（５’−ＧＣＣＡＧＡＡＡＴＡＡＴＣＧＡＣＡＡＧＴＣＡ−３’）（配列番号４）を使用し、ＴａＫａＲａ  ＥＸ  Ｔａｑ（Takara社）を用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は、ｃＤＮＡの変性を９５℃で２分間行った後、９６℃３０秒間、５２℃３０秒間、７２℃２分間のサイクル反応を３５回行い、ＰＣＲ産物を増幅させた。そして、産物の伸長反応を７２℃で５分間行い、４℃に冷却して反応を停止した。ＰＣＲ断片を  ｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙ（Promega社）ベクターにサブクローニングした後、塩基配列を決定した。ヒト、マウスのそれぞれの断片を、制限酵素で切り出し、全体を、発現ベクターｐＩＲＥＳ（Clonetech社） ベクターのプロモーター下流に載せ、全長を発現するものとした。また、ＰＣＲする際に、ストップコドンを除去したプライマーを作成し同様の手順で全長のｃＤＮＡを作成した。得られたｃＤＮＡは、ｐＥＧＦＰ−Ｎ３（Clonetech社）発現ベクターと、又は当該発現ベクターのＥＧＦＰ配列部分をＧ１６に置換した発現ベクターへ導入することで、ＥＧＦＰまたはＧ１６との融合タンパクを作成できる発現ベクターとした。
【実施例２】
【００４５】
ＧＴ０１遺伝子発現の組織分布  
（１）組織の調製
雄Ｃ５７ＢＬ／６系マウスをエーテルで麻酔し、４％パラホルムアルデヒド／０．１Ｍリン酸バッファーｐＨ７．４を用いて灌流固定を行った。そして、結腸の一部を採取し、冷リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で内容物を除去した後、４℃で１日固定した。その後、４℃にて２日間以上２０％ショ糖／０．１Ｍリン酸バッファーｐＨ７．４に置換した。置換された試料はＯ．Ｃ．Ｔ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄを用いて液体窒素で凍結させ、使用時まで−８０℃で保存した。新鮮凍結試料の作成については、以下のように行った。同系統の雄マウスをエーテルで麻酔し、空腸、結腸の一部採取した後、冷ＰＢＳで腸管内容物を洗浄した。試料は軽く水気を切り、速やかにＯ．Ｃ．Ｔ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄで包埋し、液体窒素で凍結させ、使用時まで−８０℃で保存した。【００４６】
（２）ＲＴ−ＰＣＲ
採取したマウス各臓器から、ＩＳＯＧＥＮ（日本ジーン）を用いてＴｏｔａｌＲＮＡを抽出した。得られたＴｏｔａｌＲＮＡ  ５ｍｇから、Ready-To-Go You Prime First-Strand Beads（Amersham Bioscience社、Sweden）を用いてＲＴ反応を行いｃＤＮＡを作成した。反応後、５’側プライマー（５’−ＣＧＣＡＣＣＣＧＣＴＴＴＣＣＣＴＴＣＴＴＣＴＣ−３’（配列番号３））及び３’側プライマー（５’−ＡＧＣＴＣＴ  ＴＴＣＣＴＴＧＡＴＧＣＣＴＴＴＧＴＧＡ−３’（配列番号４））を使用し、ＴａＫａＲａ  ＥＸ  Ｔａｑ（Takara社）を用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は、ｃＤＮＡの変性を９５℃で２分間行った後、９６℃３０秒間、５２．３℃３０秒間、７２℃２分間のサイクル反応を３５回行い、ＰＣＲ産物を増幅させた。そして、産物の伸長反応を７２℃で５分間行い、４℃に冷却して反応を停止した。【００４７】
（３）サザンハイブリダイゼーション
ＲＴ−ＰＣＲ反応後、２％アガロースゲルを用いて電気泳動を行い、泳動産物をニトロセルロース膜に転写させた。サザンハイブリダイゼーションのプローブを作成するため、まずｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ（Takara社）に組み込まれたマウスのＧＴ０１遺伝子の配列（配列番号５）を制限酵素ＢｓｓＨＩ、ＢｇｌＩＩでそれぞれ切断し、１％アガロースゲルで泳動を行った。目的のバンドを切り出した後、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＩＩ（Q-BIO gene社、USA）でＤＮＡを精製し、これをプローブ作成の為の鋳型とした。マウスのＧＴ０１遺伝子特異的ＤＮＡプローブは、３２Ｐ標識ｄＣＴＰ（NEN社、USA）を用い、Random Primer DNA labeling Kit Ver.2（Takara社）により作成した。サザンブロットを行った膜に、ハイブリダイゼーションバッファー（５ｘＳＳＣ、５ｘＤｅｎｈａｒｔ’ｓ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、０．５％  ＳＤＳ）中で３２Ｐ標識ＤＮＡプローブを加え、５５℃にて一晩反応させた。ハイブリダイゼーション後、５５℃、１０分間にて２  ｘ  ＳＳＣ／０．１％  ＳＤＳ、続いて０．２  ｘ  ＳＳＣでプローブの洗浄を行った。これを富士イメージングプレート（富士フィルム社）に露光し、画像解析装置（STORM 860、Amersham Bioscience社、Sweden）によりスキャニングを行った。【００４８】
（４）結果
ＧＴ０１遺伝子発現の組織分布の結果は図１に示す。盲腸、大腸、において高頻度に発現されており、脳、肺でも比較的多くの発現がみられ、直腸、膵臓、島細胞にも発現がみられた。また、腸内分泌細胞株であるＳＴＣ−１細胞においても多く発現されていることが確認された。これに対し、心臓、肝臓、腎臓における発現は少なかった（図２）。
【実施例３】
【００４９】
ＣＣＫ免疫組織化学（特願２００３−１８０３７５明細書参照）
マウス空腸新鮮凍結切片をクリオスタット（LEICA CM1800; Leica）を用いて８  ｍｍに剥切し、ＡＰＳコートスライドグラス（松浪ガラス）に張り付け−２０℃で風乾した。そして、切片をＺａｍｂｏｎｉ液で３０分固定し、流水洗浄を１０分行った。内因性ペルオキシターゼの阻止のために、０．５％メタ過ヨウ素酸ナトリウム処理を１０分行い、１０分流水にて洗浄した。抗ＣＣＫ抗体の非特異反応のブロッキングは抗体希釈液（１％正常ウマ血清、０．４％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００、ＰＢＳ希釈）で１時間行い、ＰＢＳで洗浄した。スライドグラスを湿潤箱に移し、ウサギ抗ＣＣＫ抗体（1:4000、 AB1972、Chemicon、USA）を室温で一晩反応させた。反応後、ＰＢＳで５分３回洗浄し、ビオチン標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（1:2000、Cat. No. 55701、ICN Pharmaceuticals、USA）を室温にて２時間反応させ、ＰＢＳで５分３回洗浄した。続いてａｖｉｄｉｎ−ｂｉｏｔｉｎ−ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ複合体（VECTASTAIN ABC KIT、Vector Labs、USA）を４０分間反応させ、ＰＢＳで５分３回洗浄した。その後、ＤＡＢ反応液（０．０２％  ３，３−ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、０．０６％  過酸化水素水を含む５０ｍＭ  トリス緩衝液  ｐＨ７．６）で発色させた。発色後、流水洗浄を１０分行い、エタノール・キシレン系列で脱水・透徹を行った後、標本用封入剤（MP500、松浪ガラス）を用いて試料を封入した。
【実施例４】
【００５０】
インサイツ（ｉｎ  ｓｉｔｕ）ハイブリダイゼーション
（１）ｃＲＮＡプローブの作成
ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ（TaKaRa）に組み込まれたマウスＧＴ０１の配列をｓｅｎｓｅプローブ作成用に制限酵素ＳｐｅＩ、並びにａｎｔｉ  ｓｅｎｓｅプローブ作成用として制限酵素ＮｃｏＩを用いて、それぞれ切断した。得られた各直鎖状プラスミドＤＮＡは、それぞれ１ｍｇをｃＲＮＡプローブ合成に使用し、DIG RNA Labeling Kit（Roche Diagnostics、Switzerland）を用いて反応混合液（プラスミドＤＮＡ、１  ｘ  ＤＩＧ  ＲＮＡ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｍｉｘ、１  ｘ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ、１  Ｕ／ｍｌ  ＲＮａｓｉｎ、２  Ｕ／ｍｌ  Ｔ７又はＳＰ６ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ  ｄＨ２Ｏ）は全量２０ｍｌとした。この反応液を３７℃で２時間反応させ、ＤＮａｓｅを用いてプラスミドＤＮＡを分解し、０．５  Ｍ  ＥＤＴＡ  １  ｍｌで反応を停止した。合成されたｃＲＮＡプローブをエタノール沈殿し、遠心（１５０００ｒｐｍ、４℃にて１５分間）によって得られたペレットを乾燥させた後、アルカリ加水分解液（４０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、６０ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３，ｐＨ  １０．２）に溶解し、６０℃にて９分間、断片化処理を行った。処理後再びエタノール沈殿を行い、沈殿物をＤＥＰＣ水（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水を０．１％  ＤＥＰＣで一晩処理し、オートクレーブにて１２１℃、４０分間加熱して無毒化したもの）に溶解した。【００５１】
（２）インサイツ（ｉｎ  ｓｉｔｕ）ハイブリダイゼーション
４％  Ｐａｒａｆｏｒｍ  ａｌｄｅｈｙｄｅにて固定を行ったマウス結腸の凍結試料を、クリオスタット（LEICA CM1800; Leica）を用いて厚さ２０ｍｍの切片を作成し、４×ＳＳＣ  （０．６Ｍ  ＮａＣｌ，  ０．６Ｍ  Ｓｏｄｉｕｍ  Ｃｉｔｒａｔｅ）に浮かべた。得られた切片をＰＢＳで洗浄し、１  ｍｇ／ｍｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ（０．１  Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ  ８．０／５０  ｍＭ  ＥＤＴＡ希釈）で３７℃、２０分間処理した。４％  Ｐａｒａｆｏｒｍ  ａｌｄｅｈｙｄｅを用いて１０分間後固定し、ＰＢＳで洗浄した。０．２５％  無水酢酸（０．１  Ｍ  Ｔｒｉｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎ希釈）で１０分間室温にて静置、再びＰＢＳで洗浄した。そしてｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ  （５０％  ｆｏｒｍａｍｉｄｅ、１０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ  ７．６、１  ｘ  Ｄｅｎｈａｒｄｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、０．２  ｍｇ／ｍｌ  Ｙｅａｓｔ  ｔＲＮＡ、１０％  Ｄｅｘｔｒａｎ  Ｓｕｌｆａｔｅ、６００  ｍＭ  ＮａＣｌ、０．２５％  ＳＤＳ、０．５  Ｍ  ＥＤＴＡ  ｐＨ  ８．０）にプローブを２００  ｎｇ／ｍｌの濃度になるように加え、６０℃で一晩（約１６時間）反応させた。ハイブリダイゼーション反応後、２  ｘ  ＳＳＣ／５０％  ｆｏｒｍａｍｉｄｅで６０℃、３０分間プローブの洗浄を行い、ＴＮＥ  （１０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ  ７．６、５００  ｍＭ  ＮａＣｌ、１  ｍＭ  ＥＤＴＡ）に１０分間置換した後、２０  ｍｇ／ｍｌ  ＲＮａｓｅ（ＴＮＥ希釈）で過剰プローブを分解した。ＴＮＥにて１０分洗浄した後、２  ｘ  ＳＳＣ、１  ｘ  ＳＳＣ、０．５  ｘ  ＳＳＣで２０分間の洗浄を５５℃で行った。シグナル検出のため、ＴＢＳ  （１００  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ  ７．５、１５０  ｍＭ  ＮａＣｌ）に５分間置換し、１．５％  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＴＢＳ希釈）で３７℃１時間、ＤＩＧ抗体のブロッキング反応を行った。ＴＢＳで５分間洗浄し、ヒツジ抗ＤＩＧ抗体（Roche Diagnostics、Switzerland）、１：５００（１．５％  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｒｅａｇｅｎｔ希釈）をもちいて、室温１時間にて抗体反応を行った。ＴＢＳＴ（１００  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１５０  ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０）で洗浄して抗体を除去し、ＮＴＭ  （１００  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ９．５、１００  ｍＭ  ＮａＣｌ、５０  ｍＭ  ＭｇＣｌ２）に３分間置換した。そして、０．３４  ｍｇ／ｍｌ  ＮＢＴ、０．１８％  ＢＣＩＰ  （ＮＴＭ希釈）にて検鏡しながら発色を行い、反応停止液（１０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１  ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ  ８．０）にて１０分処理し、発色反応を停止させた。発色後、切片はＰＢＳ中でスライドグラスにのせ、９０％  ｇｌｙｃｅｒｏｌ（ＰＢＳ希釈）で封入し、光学顕微鏡で検鏡した。
【実施例５】
【００５２】
安定発現細胞の作製
目的の遺伝子ＤＮＡが挿入されたベクターを得るためにｐＥＧＦＰ−Ｎ３（Invitrogen社）のＥＧＦＰを制限酵素ＫｐｎＩ、ＮｏｔＩ(Takara社)を用いて切り出し、TaKaRa
Ligation Kit ver.2（Takara社）を用いてＧ１６の配列を挿入した。さらにマウスＧＴ０１の配列を制限酵素、ＫｐｎＩ（Takara社）、TaKaRa Ligation Kit ver.2（Takara社）を用いてＧ１６の上流側に挿入した。
細胞へのＤＮＡ導入はエレクトロポレーション法を用いた。細胞（ＨＥＫ−２９３（ヒト胎児腎臓由来）、２，５００，０００個）を培地（Dulbecco's Modified Eagle Medium,high glucose,GIBCO社）に懸濁し、ＤＮＡ溶液（ＤＮＡ量は１０−１５μｇ）を加えて１０分間静置した後、Bio Rad Capacitance Pulse Controller Gene Pulser を用いて２４０Ｖ、９７５−μＦの条件で導入した。
受容体ＤＮＡを導入した細胞は薬剤入り培地（Ｇ４１８：１．０ｍｇ／ｍＬ、ペニシリン：１００ｕｎｉｔ／ｍＬ、ストレプトマイシン：１００μｇ／ｍＬ、１０％ＦＣＳ）を用いて３７℃  ５％ＣＯ２で培養し、セレクションを行った。１０日後、コロニーをピックアップし、薬剤入り培地（Ｇ４１８  ０．５ｍｇ／ｍＬ、ペニシリン：１００ｕｎｉｔ／ｍＬ、ストレプトマイシン：１００μｇ／ｍＬ、１０％ＦＣＳ）で培養した。
【実施例６】
【００５３】
レセプター（ＧＴ０１ポリペプチド）の細胞内移行を用いた計測
（１）アッセイ用プレートのＥ−Ｃ−Ｌコーティング
E-C-L Cell
Attachment Matrix （Upstate社）を５μｇ／ｍＬ含む無菌ＰＢＳ（１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、  ８．１ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、２．６８ｍＭ  ＫＣｌ、１．４７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４）をＶｉｅｗＰｌａｔｅ−９６（Packard社）に各穴１００μＬとなるように加え、３７℃で１時間または４℃で一晩培養し、これを以下のアッセイに用いた。
（２）細胞のプレートへの播種
キメラ受容体安定発現細胞（ＨＥＫ細胞）をトリプシンで細胞を剥がし、１０％ＦＣＳ  入り培地に懸濁させた。Ｅ−Ｃ−Ｌコーティングしたプレートに各穴の液量が１００μＬで、かつ細胞数が５×１０４となるように細胞をまいて、３７℃、５％ＣＯ２条件下で一晩培養した後、培地を除き、無血清培地を各穴１００μＬに加えた。
（３）アゴニスト（又はアンタゴニスト）のアッセイ
細胞に発現しているキメラ受容体のアゴニスト（又はアンタゴニスト）と推定される脂質を各穴１μＬとなるように加え、３７℃、５％  ＣＯ２条件下で１時間培養した。
<細胞の固定・染色>
培養後、培地を除き、固定染色液（１０μｇ／ｍＬ  Ｈｏｅｃｈｓｔ  Ｎｏ．３３３４２（SIGMA社）、２％パラホルムアルデヒド（ナカライ社）を含有）を各穴１００μＬ加えた後、暗所で３０分静置した。
このプレートの穴を完全に覆うようにＥＬＩＳＡ  ＴＡＰＥ（ＩＷＡＫＩ社）を貼った。【００５４】
（４）アッセイ
解析には、Cellomics社製ArrayScan Systemを使用した。核をＨｏｅｃｈｓｔにより染色し、また受容体にＧＦＰを結合させキメラ受容体とすることによって、薬物処理に伴う受容体の挙動をＧＦＰの挙動として追跡した。細胞膜上にある局在するＧタンパク質共役型受容体はリガンド刺激により、細胞質内へと内在化するものがあることが知られている。核から一定距離にあるキメラ受容体を内在化したものとして判定し、受容体の内在化が起こった細胞数の全細胞数に占める割合を各穴ごとに算出した。この算出された値をもとに、使用した脂質がマウスＧＴ０１レセプターのアゴニスト（又はアンタゴニスト）であるかを判定した（図３）。
【実施例７】
【００５５】
細胞内Ｃａ２＋濃度の測定
（１）ＦＬＩＰＲによる測定
細胞内カルシウム濃度の測定は次のように行った。目的の受容体を安定発現させた細胞（ＨＥＫ細胞；１ウェル当たり２００，０００個）を９６穴プレート（Collagen・Cell ware 96-well Black / Clear Plate, Becton dickinson）上で２０時間、３７℃、５％ＣＯ２の条件で培養した。バッファー（ＨＥＰＥＳ／Ｈａｎｋｓ、ｐＨ７．４）で希釈したFLIPR Calcium Assay Kit（Molecular Devices）を加え、１時間、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。バッファー（同上）で希釈した試験薬（各種遊離脂肪酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、ペンタデカノイン酸、オクタン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキン酸、ベヘン酸、マルガリン酸、パルミトレイン酸、エイコサトリエノイン酸、エライジン酸、ペトロセリニン酸、オレイン酸、αリノレン酸、γリノレン酸、ホモγリノレン酸、アラキドン酸、エイコサジエン酸、エイコサトリエン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸、リノール酸、エイコサテトラエン酸、バクセン酸などを含む）を加え、FLIPR（Fluorometric Imaging Plate Reader,Molecular Devices）を用いて４８８ｎｍの励起光に対する５１０〜５７０ｎｍの蛍光強度を測定した（図４）。図５に種々の遊離脂肪酸を加えた場合のＨＥＫ細胞内Ｃａ２＋濃度の上昇におけるｐＥＣ５０を示す。図５のデータに示される脂肪酸は、ミリスチン酸（Ｃ１４：０）、ペンタデカノイン酸（Ｃ１５：０）、パルミチン酸（Ｃ１６：０）、パルミトレイン酸（Ｃ１６：１）、マルガリン酸（Ｃ１７：０）、ステアリン酸（Ｃ１８：０）、オレイン酸（Ｃ１８：１）、αリノレン酸（Ｃ１８：３）、エイコサジエン酸（Ｃ２０：２）、エイコサトリエン酸（Ｃ２０：３）、エイコサテトラエン酸（Ｃ２０：４）である。その他、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸、なども同等のｐＥＣ５０を示した。【００５６】
（２）ＣＡＦによる測定
目的の受容体を安定発現させた細胞（２，５００，０００個）を５ｍＬバッファー（１３５ｍＭＮａＣｌ，５ｍＭＫＣｌ，１０ｍＭグルコース，１０ｍＭＨＥＰＥＳ，１．２ｍＭＣａＣｌ２，１ｍＭＭｇＣｌ２）で懸濁し、ｆｕｒａ２−ＡＭ  １５μＬを加えた後、３７℃、４０分、浸透培養した。その後試験薬を加え、ＣＡＦ−１１０（Jasco）を用いて３４０ｎｍ，３８０ｎｍの二励起光対する５００ｎｍの蛍光強度比を測定した。
（２）−１．顕微鏡下での測定
カバーグラスを底面に貼った３５ｍｍ培養デッシュで、細胞（ＳＴＣ−１細胞）を培養する。Ｃａ−ｔｙｒｏｄｅ溶液で洗浄後、  ２μＭ  ｆｕｒａ２−ＡＭを含むＣａ−ｔｙｒｏｄｅ溶液を加え室温で２０分間おく。Ｃａ−ｔｙｒｏｄｅ溶液で２回洗浄後、１ｍＬのＣａ−ｔｙｒｏｄｅ溶液を加え、室温で、ＡＲＧＵＳ２００  （３４０／３８０ｎｍ計測）対物レンズ４０Ｘ  １５ｓｅｃ間隔で画像の取り込みを行う。取り込んだ画像のそれぞれについてｒａｔｉｏを計測する。１０分後２０分後にそれぞれ、リガンドと対照となる刺激（ボンベシン）を行う。
ＲＮＡｉベクター導入時には、同時に導入したＧＦＰによる蛍光を測定し、ＧＦＰ蛍光があり、かつ、対照でのＣａ２＋上昇が認められる細胞についての経時的なＣａ２＋反応を定量し、表示した（図６）。ここで用いた脂肪酸は、αリノレン酸（Ｃ１８：３）である。
（２）−２．ＲＮＡｉベクターの作製と導入
Ambion社製ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ２．１−Ｕ６ｓｙｓｔｅｍを用いた。添付の方法に従って、目的遺伝子から選択したオリゴを合成、アニーリングした後上記のベクターにライゲーションした。得られたコンストラクトはシークエンスにて確認した。
ＳＴＣ−１細胞への遺伝子導入はLipofectamine plusを用いて行ったのち、細胞内Ｃａ２＋を顕微鏡下で測定した（図６下図）。結果は、ＧＴ０１に対して特異的なＲＮＡｉを行うと、αリノレン酸の添加により観察されたカルシウム濃度上昇のピーク（図６上図）が消失した（図６下図）。従って、αリノレン酸はＧＴ０１を介して細胞内カルシウム濃度を上昇させていることが分かった。
【実施例８】
【００５７】
ＣＣＫの測定（特願２００３−１８０３７５明細書参照）
ＳＴＣ−１細胞は２４穴プレートに８  ｘ  １０４  ａｎｄ  １  ｘ  １０５  ｃｅｌｌｓｃｍ−２で培養した。２４−４８時間後にｃｈｏｌｅｃｙｓｔｏｋｉｎｉｎ  ｏｃｔａｐｅｐｔｉｄｅ  （２６−３３，  Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−ＮＨ２）の定量を行った。細胞は、３回ハンクス緩衝液  （ＨＢＢＳ）で洗浄後０．５ｍＬのハンクス中、各種遊離脂肪酸の薬物と濃度で３７℃６０分間反応させた。培養上清を回収し、５分間遠心して（約５０００  ｇ）細胞片を除き、上清について、ＣＣＫ（２６−３３）特異的なＥＩＡ法のキット(Phoenix Pharmaceuticals Inc., Belmont, CA)を用いて測定した（図７）。ここでは、リノレン酸（Ｃ１８：３）、オレイン酸（Ｃ１８：１）、ステアリン酸（Ｃ１８：０）、ペラルゴン酸（Ｃ９：０）を用いた。
【実施例９】
【００５８】
ＧＬＰ−１の測定
ＳＴＣ−１細胞は２４穴プレートに８ｘ１０４および１ｘ１０５細胞ｃｍ−２で培養した。２４−４８時間後にＧＬＰ−１の定量を行った。細胞は、３回ハンクス緩衝液  （ＨＢＢＳ）で洗浄後０．５ｍＬのハンクス中、各種遊離脂肪酸（１０、３０、１００μＭ）で３７℃６０分間反応させた。培養上清を回収し、５分間遠心して（約５，０００ｇ）細胞片を除き、上清について、ＧＬＰ−１特異的なＥＩＡ法のキット（Phoenix Pharmaceuticals Inc., Belmont, CA）を用いて測定した（図８）。ここでは、αリノレン酸、ドコサヘキサエン酸、パルミトレイン酸、オレイン酸、ステアリン酸、オクタン酸、およびαリノレン酸メチルエステルを用いた（図８）。
【実施例１０】
【００５９】
インサイツ（ｉｎ  ｓｉｔｕ）ハイブリダイゼーション
（１）ｃＲＮＡプローブの作成
マウスおよびヒトＧＴ０１、並びにマウスおよびヒトＧＬＰ−１の配列から、インビトロトランスクリプション法により標識プローブの作製を行った。ジゴキシゲニンの標識には、DIG RNA Labeling Kit（Roche Diagnostics、Switzerland）を使用し、反応混合液（プラスミドＤＮＡ、１ｘＤＩＧ  ＲＮＡ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｍｉｘ、１ｘ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ、１Ｕ／ｍｌＲＮａｓｉｎ、２Ｕ／ｍｌ  Ｔ７又はＳＰ６ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ  ｄＨ２Ｏ）は全量２０ｍｌとして行った。この反応液を３７℃で２時間反応させ、ＤＮａｓｅを用いてプラスミドＤＮＡを分解し、０．５ＭＥＤＴＡ  １ｍｌで反応を停止した。合成されたｃＲＮＡプローブをエタノール沈殿し、遠心（１５０００ｒｐｍ、４℃にて１５分間）によって得られたペレットを乾燥させた後、アルカリ加水分解液（４０ｍＭＮａＨＣＯ３、６０ｍＭＮａ２ＣＯ３、ｐＨ１０．２）に溶解し、６０℃にて９分間、断片化処理を行った。処理後再びエタノール沈殿を行い、沈殿物をＤＥＰＣ水（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水を０．１％  ＤＥＰＣで一晩処理し、オートクレーブにて１２１℃、４０分間加熱して無毒化したもの）に溶解した。【００６０】
（２）インサイツ（ｉｎ  ｓｉｔｕ）ハイブリダイゼーション
マウス（Ｃ５７ＢＬ／６，オス、８週齢）結腸を固定液（Genostaff社）で潅流固定したのち結腸を採取し、再度、同じ固定液による固定を行いパラフィン包埋ブロックを作製した。得られたパラフィン包埋ブロックから４μｍの切片を作成したのち、ＧＴ０１およびＧＬＰ−１のプローブを用いてインサイツハイブリダイゼーションを行った。染色は、  Genostaff社の方法に基づいて行った。ハイブリダイゼーション反応後、プローブの洗浄を行い、ＴＮＥ（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ  ７．６、５００ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ）に１０分間置換した後、２０ｍｇ／ｍｌ  ＲＮａｓｅ（ＴＮＥ希釈）で過剰プローブを分解した。ＴＮＥにて１０分洗浄した後、２ｘＳＳＣ、１ｘＳＳＣ、０．５ｘＳＳＣで２０分間の洗浄を５５℃で行った。シグナル検出のため、ＴＢＳ（１００  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ  ７．５、１５０  ｍＭ  ＮａＣｌ）に５分間置換し、１．５％  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＴＢＳ希釈）で３７℃１時間、ＤＩＧ抗体のブロッキング反応を行った。ＴＢＳで５分間洗浄し、ヒツジ抗ＤＩＧ抗体（Roche Diagnostics、Switzerland）、１：５００（１．５％  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｒｅａｇｅｎｔ希釈）をもちいて、室温１時間にて抗体反応を行った。ＴＢＳＴ（１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．５、１５０ｍＭＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）で洗浄して抗体を除去し、ＮＴＭ（１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ９．５、１００ｍＭＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２）に３分間置換した。そして、０．３４ｍｇ／ｍｌ  ＮＢＴ、０．１８％  ＢＣＩＰ  （ＮＴＭ希釈）にて検鏡しながら発色を行い、反応停止液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１  ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ  ８．０）にて１０分処理し、発色反応を停止させた。発色後、切片はＰＢＳ中でスライドグラスにのせ、９０％  グリセロール（ＰＢＳ希釈）で封入し、光学顕微鏡で検鏡した（図９）。
上記と同様の方法を用いて、ヒト結腸サンプルについても観察を行なった（図１０）。
観察の結果、ＧＴ０１とＧＬＰ−１の発現部位がほぼ一致していることが分かった。
【実施例１１】
【００６１】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＧＴ０１に対するリガンドのＧＬＰ−１放出への影響
ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＧＬＰ−１の放出に対する、ＧＴ０１のリガンド（遊離脂肪酸）の影響を検討した。
１００ｎｍｏｌｇ−１量の脂肪酸（αリノレン酸、ステアリン酸、オクタン酸）を担体としてポリエチレングリコールに包含させ、２４時間断食後のオスの８週齢Ｃ５７／Ｂ６マウス（Sankyo Lab）に対し、チューブを介して胃に直接与えた。脂肪酸の投与後、０．５時間、または２時間後にジエチルエーテルで麻酔したのち、ヘパリナイズしたシリンジを用いて門脈より血液を採取した。血漿は、ヘパリン化された血液を、４℃、２０分、１，２００ｘｇで遠心することで調製し、ＧＬＰ−１の酵素免役アッセイ（
矢内原研究所）を行った。全ての実験は施設の認可されたガイドラインに従って行った。その結果、特に、αリノレン酸、ステアリン酸を与えた場合に、ＧＬＰ−１の分泌が顕著であった（図１１）。
また、同様の方法により、門脈と下大静脈より採取した血漿中のＧＬＰ−１濃度の測定を行なった（図１２）。
【実施例１２】
【００６２】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＧＴ０１に対するリガンドのインスリン放出への影響
ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるインスリンの放出に対する、ＧＴ０１のリガンド（遊離脂肪酸）の影響を検討した。
１００ｎｍｏｌｇ−１量の脂肪酸（αリノレン酸）を担体としてポリエチレングリコールに包含させ、２４時間断食後のオスの８週齢Ｃ５７／Ｂ６マウス（Sankyo Lab）に対し、チューブを介して胃に直接与えた。脂肪酸の投与後、２時間ジエチルエーテルで麻酔したのち、ヘパリナイズしたシリンジを用いて門脈より血液を採取した。血漿は、ヘパリン化された血液を、４℃、２０分、１，２００ｘｇで遠心することで調製し、インスリンの酵素免役アッセイキット（ MORINAGA）を用いてインスリンの定量を行った。全ての実験は施設の認可されたガイドラインに従って行った。その結果、門脈から採取した血漿中に下大静脈血漿よりも高い濃度のインスリンの分泌が検出された（図１３）。【００６３】
参考文献
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【産業上の利用可能性】
【００６４】
本発明は、糖尿病などにおける上昇した血糖値の低下およびその上昇の予防のための製剤の開発に役立つ。特に、肥満症状が著しい患者の治療に適した製剤の開発も可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】図１は、７回膜貫通型受容体の模式図を示す。
【図２】図２は、マウスＧＴ０１遺伝子発現の組織特異性を示したものである。ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド三リン酸脱水素酵素）は、発現比較のコントロールとして用いた。
【図３】図３は、ＧＴ０１ポリペプチドにリガンドが結合した結果、該ポリペプチドがリガンドと共に細胞内へ移行していく様子を示す蛍光顕微鏡像を示す。
【図４】図４は、遊離脂肪酸によって誘導された細胞内カルシウム濃度の上昇を、ＦＬＩＰＲ(Fluorometric Imaging Plate Reader,Molecular Devices)を用いて４８８ｎｍの励起光に対する５１０〜５７０  ｎｍの蛍光強度を検出することにより測定した結果を示す。
【図５】図５は、種々の遊離脂肪酸を加えた場合のＨＥＫ細胞内Ｃａ２＋濃度の上昇におけるｐＥＣ５０を示す。
【図６】図６は、αリノレン酸によって誘導される細胞内カルシウム濃度の上昇に対するヒトＧＴ０１のアンチセンスの影響を示す。
【図７】図７は、各種遊離脂肪酸によって誘導されるＣＣＫ放出の遊離脂肪酸濃度依存性を示す。
【図８】図８は、各種脂肪酸（αリノレン酸（α-Linolenic acid）、ドコサヘキサエン酸（DHA）、パルミトレイン酸（Palmitolenic acid）、オレイン酸（Oleic acid）、ステアリン酸（Steric acid）、オクタン酸（Octanoic acid）、αリノレン酸メチルエステル（α-Linolenic acid-methyl ester））によって誘導されるＧＬＰ−１放出量（縦軸）を示す。脂肪酸濃度は、１０μＭ、３μＭ、１００μＭ（横軸）で行った。
【図９】図９は、ＧＴ０１およびＧＬＰ−１に関する、マウス結腸におけるインサイツハイブリダイゼーションの結果を示す。
【図１０】図１０は、ＧＴ０１およびＧＬＰ−１に関する、ヒト結腸におけるインサイツハイブリダイゼーションの結果を示す。
【図１１】マウスに各種脂肪酸（αリノレン酸（α-Linolenic acid）、ステアリン酸（Steric acid）、オクタン酸（Octanoic acid））を与えたことによる、マウス門脈（portal vein）中のＧＬＰ−１濃度の変動を示す。ネガティブコントロールとして、脂肪酸および担体を与えなかった場合（Control）、担体（Vehicle）のみを与えた場合について測定した。
【図１２】マウスにαリノレン酸（α-LA）を与えた後、０．５時間（0.5hr）または２時間（2hr）後における、マウス門脈（portal vein）または下大静脈（inferior vena cava）中のＧＬＰ−１濃度を示す。ネガティブコントロールとして、脂肪酸および担体を与えなかった場合（Control）、担体（Vehicle）のみを与えた場合について測定した。
【図１３】マウスにαリノレン酸（α-LA）を与えた後、０．５時間（0.5hr）または２時間（2hr）後における、マウス門脈（portal vein）または下大静脈（inferior vena cava）中のインスリン濃度を示す。ネガティブコントロールとして、脂肪酸および担体を与えなかった場合（Control）、担体（Vehicle）のみを与えた場合について測定した。
【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図３】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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