(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）最低１個の宿主細胞中で、（ｉ）モノネガウイルス目（Ｏｒｄｅｒ  Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉｒａｌｅｓ）の非分節の負センスの一本鎖ＲＮＡウイルスのゲノムもしくはアンチゲノムをコードするポリヌクレオチド配列を含んで成る単離された核酸分子を含んで成る転写ベクター、ならびに（ｉｉ）被包化、転写および複製に必要なトランスに作用するタンパク質をコードするもう１種の単離された核酸分子（１種もしくは複数）を含んで成る最低１種の発現ベクターを含んで成るレスキュー組成物の培地中でのトランスフェクションを、前記ベクター類の共発現および組換えウイルスの産生を可能にするのに十分な条件下で実施すること；ならびに、
ｂ）トランスフェクションされたレスキュー組成物を、組換えウイルスの回収を増大させるのに十分な条件下で有効な熱ショック温度に加熱すること、
を含んで成る、組換えモノネガウイルス目（Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉｒａｌｅｓ）ウイルスの産生方法。
【請求項２】
組換えウイルスを収穫することをさらに含んで成る、請求項１記載の方法。
【請求項３】
有効な熱ショック温度が３７℃より上である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
有効な熱ショック温度が、３７℃から５０℃までの範囲にある、請求項１記載の方法。
【請求項５】
有効な熱ショック温度が、３８℃から４９℃までの範囲にある、請求項１記載の方法。
【請求項６】
有効な熱ショック温度が、３９℃から４８℃までの範囲にある、請求項１記載の方法。
【請求項７】
有効な熱ショック温度が、４１℃から４７℃までの範囲にある、請求項１記載の方法。
【請求項８】
トランスフェクションされた細胞が、有効な熱ショック温度に５ないし３００分間さらされる、請求項１記載の方法。
【請求項９】
トランスフェクションされた細胞が、有効な熱ショック温度に１５ないし２４０分間さらされる、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
トランスフェクションされた細胞が、有効な熱ショック温度に１５ないし２００分間さらされる、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
段階（ｂ）の後に、トランスフェクションされたレスキュー組成物がベロ細胞の最低一層上に移される、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
ベロ細胞の層が単層である、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
モノネガウイルス目（Ｏｒｄｅｒ  Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉｒａｌｅｓ）のＲＮＡウイルスがヒト、ウシもしくはマウスのウイルスである、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
モノネガウイルス目（Ｏｒｄｅｒ  Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉｒａｌｅｓ）の非分節の負センスの一本鎖ＲＮＡウイルスのゲノムもしくはアンチゲノムをコードする単離された核酸分子が、１種以上のゲノムもしくはアンチゲノムの供給源のキメラである、請求項１記載の方法。
【請求項１５】
モノネガウイルス目（Ｏｒｄｅｒ  Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉｒａｌｅｓ）の非分節の負センスの一本鎖ＲＮＡウイルスのゲノムもしくはアンチゲノムをコードする単離された核酸分子が、弱毒化ウイルスもしくは感染性の形態の該ウイルスをコードする、請求項１記載の方法。
【請求項１６】
モノネガウイルス目（Ｏｒｄｅｒ  Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉｒａｌｅｓ）の非分節の負センスの一本鎖ＲＮＡウイルスのゲノムもしくはアンチゲノムをコードする単離された核酸分子が、感染性の形態の該ウイルスをコードする、請求項１記載の方法。
【請求項１７】
モノネガウイルス目（Ｏｒｄｅｒ  Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉｒａｌｅｓ）の非分節の負センスの一本鎖ＲＮＡウイルスのゲノムもしくはアンチゲノムをコードする単離された核酸分子が、弱毒化ウイルスをコードする、請求項１記載の方法。
【請求項１８】
モノネガウイルス目（Ｏｒｄｅｒ  Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉｒａｌｅｓ）の非分節の負センスの一本鎖ＲＮＡウイルスのゲノムもしくはアンチゲノムをコードする単離された核酸分子が、感染性の弱毒化ウイルスをコードする、請求項１記載の方法。
【請求項１９】
ＲＮＡウイルスがパラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）のウイルスである、請求項１記載の方法。
【請求項２０】
ＲＮＡウイルスがラブドウイルス科（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ）のウイルスである、請求項１記載の方法。
【請求項２１】
ＲＮＡウイルスがフィロウイルス科（Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ）のウイルスである、請求項１記載の方法。
【請求項２２】
ＲＮＡウイルスが、ＭＶ、ＲＳＶ、ＰＩＶおよびＢＰＶより成る群から選択されるウイルスである、請求項１記載の方法。
【請求項２３】
ＲＮＡウイルスがＭＶウイルスである、請求項１記載の方法。
【請求項２４】
ポリヌクレオチドが、ＲＳＶウイルスより成る群から選択されるＲＮＡウイルスのゲノムもしくはアンチゲノムをコードし、かつ、被包化、転写および複製に必要なトランスに作用するタンパク質がＮ、Ｐ、ＬおよびＭ２である、請求項１記載の方法。
【請求項２５】
ポリヌクレオチドがＭＶのゲノムもしくはアンチゲノムをコードし、かつ、被包化、転写および複製に必要なトランスに作用するタンパク質がＮ、ＰおよびＬである、請求項１記載の方法。
【請求項２６】
ポリヌクレオチドがＰＩＶ−３のゲノムもしくはアンチゲノムをコードし、かつ、被包化、転写および複製に必要なトランスに作用するタンパク質がＮＰ、ＰおよびＬである、請求項１記載の方法。
【請求項２７】
宿主細胞が原核生物細胞である、請求項１記載の方法。
【請求項２８】
宿主細胞が真核生物細胞である、請求項１記載の方法。
【請求項２９】
宿主細胞が脊椎動物細胞である、請求項１記載の方法。
【請求項３０】
宿主細胞が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である、請求項１記載の方法。
【請求項３１】
宿主細胞がヒト細胞由来である、請求項１記載の方法。
【請求項３２】
宿主細胞がヒト胚細胞由来である、請求項１記載の方法。
【請求項３３】
宿主細胞がヒト胚腎細胞由来である、請求項１記載の方法。
【請求項３４】
トランスフェクションされたレスキュー組成物を有効な熱ショック温度に加熱した後、該トランスフェクションされたレスキュー組成物を、プラーク拡大細胞の最低一層上に移すことを、さらに含んで成る、請求項１記載の方法。
【請求項３５】
プラーク拡大細胞の層が単層である、請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
組換えウイルスを収穫することをさらに含んで成る、請求項３４記載の方法。
【請求項３７】
プラーク拡大細胞が最低５０％コンフルエントである、請求項３４記載の方法。
【請求項３８】
プラーク拡大細胞が最低６０％コンフルエントである、請求項３４記載の方法。
【請求項３９】
プラーク拡大細胞が最低７５％コンフルエントである、請求項３４記載の方法。
【請求項４０】
トランスフェクションされた細胞が、プラーク拡大細胞の表面積がトランスフェクションされたウイルスを調製するために使用される表面積よりも大きいプラーク拡大細胞の１個もしくはそれ以上の容器上に置かれる、請求項３４記載の方法。
【請求項４１】
プラーク拡大細胞がベロ細胞である、請求項３４記載の方法。
【請求項４２】
転写ベクターがＴ７ポリメラーゼ遺伝子をさらに含んで成る、請求項１記載の方法。
【請求項４３】
レスキュー組成物が、未改変もしくは改変ヘルパーウイルスをさらに含んで成る、請求項１記載の方法。
【請求項４４】
ヘルパーウイルスが、非分節の負センスの一本鎖ＲＮＡウイルスのゲノムもしくはアンチゲノムをコードするポリヌクレオチド配列の転写にＴ７ポリメラーゼ遺伝子を提供し、ここで、該レスキュー組成物が改変ヘルパーウイルスをさらに含んで成る、請求項４３記載の方法。
【請求項４５】
Ｔ７ポリメラーゼ遺伝子が後期プロモーターもしくは初期／後期プロモーターの調節制御下にある、請求項４２記載の方法。
【請求項４６】
Ｔ７ポリメラーゼ遺伝子が初期／後期プロモーターの調節下にある、請求項４５記載の方法。
【請求項４７】
トランスフェクションがＤＮＡ合成阻害剤の存在下で実施される、請求項４２記載の方法。
【請求項４８】
トランスフェクションのための宿主細胞がベロ細胞である、請求項１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、モノネガウイルス（Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉｒａｌｅｓ）ウイルスと呼称される目の非分節の(nonsegmented)負センスの一本鎖ＲＮＡウイルスを産生するための改良方法に関する。好ましい態様は、麻疹ウイルス（ＭＶ）、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）およびヒトパラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）のような弱毒化および／もしくは感染性ウイルスのようなウイルスの産生方法に関する。該組換えウイルスはｃＤＮＡクローンから製造することができ、こうして、定義された変化をゲノム中に有するウイルスを得ることができる。
【０００２】
（発明の背景）
エンベロープをもつ(enveloped)負センスの一本鎖ＲＮＡウイルスが独特に組織化かつ発現されている。負センスの一本鎖ウイルスのゲノムＲＮＡは、ヌクレオキャプシドの情況で、２種の鋳型機能（すなわちメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の合成のための鋳型、およびアンチゲノム（＋）鎖の合成のための鋳型として）を供給する。負センスの一本鎖ＲＮＡウイルスは、それら自身のＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードしかつパッケージングする。メッセンジャーＲＮＡは、感染した細胞の細胞質にウイルスが侵入すると合成されるにすぎない。ウイルスの複製はｍＲＮＡの合成後に起こり、そしてウイルスタンパク質の継続的合成を必要とする。新たに合成されたアンチゲノム（＋）鎖は、（−）鎖のゲノムＲＮＡのさらなるコピーの発生のための鋳型としてはたらく。
【０００３】
ポリメラーゼ複合体は、ゲノムの３’端、とりわけプロモーター領域のシスに作用するシグナルをかみあわせる(engaging)ことにより転写および複製を起動かつ達成する。その後、ウイルス遺伝子が、その３’からその５’端まで一方向的にゲノム鋳型から転写される。それらの上流の隣接物（すなわち核タンパク質遺伝子（Ｎ））に関して常により少ない、下流の遺伝子（例えばポリメラーゼ遺伝子（Ｌ））から作成されるｍＲＮＡが存在する。従って、該ゲノムの３’端に関して遺伝子の位置に従ったｍＲＮＡの豊富の勾配が常に存在する。
【０００４】
こうした非分節ＲＮＡウイルスの分子遺伝学的分析は、最近まで困難と判明していた。なぜなら、裸のゲノムＲＮＡもしくはトランスフェクションされたプラスミドから細胞内で産生されるＲＮＡは感染性でないからである（ボイヤー（Ｂｏｙｅｒ）とヘンニ（Ｈａｅｎｎｉ）、１９９４）。この技術的問題は、組換えの非分節の負鎖ＲＮＡウイルスの単離を可能にする便利なｃＤＮＡレスキュー技術の開発により克服された（パットナイク（Ｐａｔｔｎａｉｋ）ら、１９９２；シュネル（Ｓｃｈｎｅｌｌ）、メバトゥション（Ｍｅｂａｔｓｉｏｎ）とコンゼルマン（Ｃｏｎｚｅｌｍａｎｎ）、１９９４）。これらの多様な負鎖ウイルスのレスキューのための技術は共通のテーマに従い、それぞれ首尾よくレスキューするための識別性の必須成分を有する（バロン（Ｂａｒｏｎ）とバレット（Ｂａｒｒｅｔｔ）、１９９７；コリンズ（Ｃｏｌｌｉｎｓ）ら、１９９５；ガルシン（Ｇａｒｃｉｎ）ら、１９９５；ホフマン（Ｈｏｆｆｍａｎ）とバネリエー（Ｂａｎｅｒｊｅｅ）、１９９７；ローソン（Ｌａｗｓｏｎ）ら、１９９５；ラデケ（Ｒａｄｅｃｋｅ）ら、１９９５；シュナイダー（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ）ら、１９９７；ヘ（Ｈｅ）ら、１９９７；シュネル（Ｓｃｈｕｎｅｌｌ）、メバトゥション（Ｍｅｂａｔｓｉｏｎ）とコンゼルマン（Ｃｏｎｚｅｌｍａｎｎ）、１９９４；ホエラン（Ｗｈｅｌａｎ）ら、１９９５）。ゲノムｃＤＮＡプラスミドのトランスフェクション後に、ファージＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ、およびベクターにコードされるリボザイム配列［ＲＮＡを切断して３’末端を形成する］の組み合わせられた作用により、ゲノムＲＮＡの正確な一コピーが産生される。このＲＮＡは、コトランスフェクションされた発現プラスミドにより最初は供給されるウイルスタンパク質によりパッケージングおよび複製される。麻疹ウイルス（ＭＶ）のレスキュー系（ラデケ（Ｒａｄｅｃｋｅ）ら、１９９５）の場合には、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼならびにＭＶのタンパク質Ｎ（ヌクレオキャプシドタンパク質）およびＰ（リンタンパク質ポリメラーゼサブユニット）を発現する安定な細胞系が製造された。従って、適切に配置されたＴ７ポリメラーゼプロモーターを含有するＭＶゲノムｃＤＮＡクローン、およびＭＶポリメラーゼ遺伝子（Ｌ）を含有する発現プラスミドを用いてこの細胞系をコトランスフェクションすることにより、ＭＶのレスキューを達成し得る。
【０００５】
成功裏の麻疹ウイルスｃＤＮＡレスキューは、明らかに、１）Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼによるゲノムＲＮＡの正確な完全長の合成およびリボザイム配列による３’端のプロセシング；２）複製を開始するのに適切なレベルでのウイルスのＮ、ＰおよびＬタンパク質の合成；３）転写的に活性かつ複製応答能のあるヌクレオキャプシド構造へのゲノムＲＮＡの新たなパッケージング；ならびに４）複製が進行するのに十分なレベルでの新たに形成されたヌクレオキャプシドからのウイルス遺伝子の発現、を包含する多数の分子事象がトランスフェクション後に起こることを必要とする。成功裏のレスキューでどの段階が律速であることができるかは正確には決定されていないが、しかし、レスキューの効率は、潜在的に、上に挙げられた段階のいずれか一を刺激することにより向上させることができる。
【０００６】
本発明は、ＭＶのような所望の組換えＲＮＡウイルスを回収する能力の向上を探求する。所望のウイルスの本来のゲノムおよびアンチゲノムをコードするポリヌクレオチドがますます改変される際に、複製するウイルスをレスキューから得る能力が低下するかも知れないことが提起されている。従って、本発明は、こうした障害物を克服することを探求する。なぜなら、これらの方法は、レスキュー処置から所望の組換えウイルスを得る見込みを本質的に向上させ得るからである。
【０００７】
（発明の要約）
本発明は、（ａ）最低１個の宿主細胞中で、（ｉ）モノネガウイルス目（Ｏｒｄｅｒ  Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉｒａｌｅｓ）の非分節の負センスの一本鎖ＲＮＡウイルスのゲノムもしくはアンチゲノムをコードするポリヌクレオチド配列を含んで成る単離された核酸分子を含んで成る転写ベクター、ならびに（ｉｉ）被包化、転写および複製に必要なトランスに作用するタンパク質をコードする最低１種の単離された核酸分子を含んで成る最低１種の発現ベクターを含んで成るレスキュー組成物のトランスフェクションを；これらのベクターの共発現および組換えウイルスの産生を可能にするのに十分な条件下で宿主細胞中で実施すること；（ｂ）トランスフェクションされたレスキュー組成物を、組換えウイルスの回収を増大させるのに十分な条件下で有効な熱ショック温度に加熱すること；ならびに、場合によっては（ｃ）生じる組換えウイルスを収穫すること、を含んで成る、モノネガウイルス目（Ｏｒｄｅｒ  Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉｒａｌｅｓ）からの組換えウイルスの生産方法を提供する。
【０００８】
付加的な一方法は、ａ）最低１個の宿主細胞中で、（ｉ）モノネガウイルス目（Ｏｒｄｅｒ  Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉｒａｌｅｓ）の非分節の負センスの一本鎖ＲＮＡウイルスのゲノムもしくはアンチゲノムをコードする単離された核酸分子を含んで成る転写ベクター、ならびに（ｉｉ）被包化、転写および複製に必要なトランスに作用するタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含んで成る最低１種の単離された核酸分子を含んで成る最低１種の発現ベクターを含んで成るレスキュー組成物のトランスフェクションを、前記ベクターの共発現および組換えウイルスの産生を可能にするのに十分な条件下で実施すること；ｂ）トランスフェクションされたレスキュー組成物を最低一層のベロ細胞上に移すこと；ならびに、場合によっては組換えウイルスを収穫すること、を含んで成る、組換えモノネガウイルス目（Ｏｒｄｅｒ  Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉｒａｌｅｓ）ウイルスを生産することに関する。
【０００９】
本発明のさらなる局面は、上の方法の重なり合わない段階を好ましい態様と一緒に組み合わせてさらなる改良された方法を創製する方法に関する。
【００１０】
代替の態様において、本発明は、弱毒化、感染性、もしくは双方であるモノネガウイルス目（Ｏｒｄｅｒ  Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉｒａｌｅｓ）のＲＮＡウイルスの作成方法を提供する。付加的な態様は、本発明の方法から産生されたウイルス、ならびにこうしたウイルスを含有するワクチンに関する。こうしたウイルスはヒト、またはマウスもしくはウシのような非ヒトであることができることが注目される。
【００１１】
上に同定された態様および本明細書で詳細に論考される付加的な態様は、本発明の目的を表す。
【００１２】
（発明の詳細な記述）
上に簡潔に示されたとおり、本発明は組換えＲＮＡウイルスの新規製造方法に関する。当該技術分野におけるこうした方法は「レスキュー」もしくは逆遺伝学的方法と称される。多様な非分節の負鎖ウイルスのための例示的なレスキュー方法は、以下の参考文献として引用される刊行物、すなわちバロン（Ｂａｒｏｎ）とバレット（Ｂａｒｒｅｔｔ）、１９９７；コリンズ（Ｃｏｌｌｉｎｓ）ら、１９９５；ガルシン（Ｇａｒｃｉｎ）ら、１９９５；ヘ（Ｈｅ）ら、１９９７；ホフマン（Ｈｏｆｆｍａｎ）とバネリェー（Ｂａｎｅｒｊｅｅ）、１９９７；ローソン（Ｌａｗｓｏｎ）ら、１９９５；ラデケ（Ｒａｄｅｃｋｅ）とビレター（Ｂｉｌｌｅｔｅｒ）、１９９７；ラデケ（Ｒａｄｅｃｋｅ）ら、１９９５；シュナイダー（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ）ら、１９９７；シュネル（Ｓｃｈｎｅｌｌ）、メバトゥション（Ｍｅｂａｔｓｉｏｎ）とコンゼルマン（Ｃｏｎｚｅｌｍａｎｎ）、１９９４；ホエラン（Ｗｈｅｌａｎ）ら、１９９５に開示される。レスキューに関する付加的刊行物は、ＭＶおよびパラミクソウイルス亜科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｎａｅ）の他のウイルスについての公開された国際特許出願第ＷＯ  ９７／０６２７０号およびＲＳＶのレスキューについての公開された国際特許出願第ＷＯ  ９７／１２０３２号を包含し；これらの出願はこれにより引用により組み込まれる。
【００１３】
ゲノムｃＤＮＡプラスミドのトランスフェクション後、ファージＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ、およびベクターにコードされるリボザイム配列［ＲＮＡを切断して３’末端を形成する］の組み合わせられた作用により、ゲノムＲＮＡの正確な一コピーが産生される。このＲＮＡは、コトランスフェクションされた発現プラスミドにより最初は供給されるウイルスタンパク質によりパッケージングかつ複製される。ＭＶのレスキュー系（ラデケ（Ｒａｄｅｃｋｅ）ら、１９９５）の場合には、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼならびにＭＶのタンパク質Ｎ（ヌクレオキャプシドタンパク質）およびＰ（リンタンパク質）を発現する安定な細胞系が製造された。従って、適切に配置されたＴ７ポリメラーゼプロモーターを含有するＭＶゲノムｃＤＮＡクローン、およびＭＶポリメラーゼ遺伝子（Ｌ）を含有する発現プラスミドを用いてこの細胞系をコトランスフェクションすることにより、ＭＶのレスキューを達成し得る。
【００１４】
最初のいくつかのレスキュー方法の一は麻疹ウイルスについて開示された。麻疹ウイルス（ＭＶ）は、パラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）のモルビリウイルス属（Ｍｏｒｂｉｌｌｉｖｉｒｕｓ）の一メンバーであり、そして、ＭＶは、この科の全メンバーと同様、非分節の負センスのＲＮＡゲノムを含有するエンベロープをもつウイルスである（ラム（Ｌａｍｂ）とコラコフスキ（Ｋｏｌａｋｏｆｓｋｙ）、１９９６）。この科のウイルスの分子遺伝学的分析は最近まで困難と判明していた。なぜなら、裸のゲノムＤＮＡ、もしくはトランスフェクションされたプラスミドから細胞内で産生されたＲＮＡは感染性でないからである（ボイヤー（Ｂｏｙｅｒ）とヘンニ（Ｈａｅｎｎｉ）、１９９４）。この技術的問題は、組換えの負鎖ＲＮＡウイルスの単離を可能にする便利なｃＤＮＡレスキュー技術の開発により克服された（パットナイク（Ｐａｔｔｎａｉｋ）ら、１９９２；ラデケ（Ｒａｄｅｃｋｅ）とビレター（Ｂｉｌｌｅｔｅｒ）、１９９７；シュネル（Ｓｃｈｎｅｌｌ）、メバトゥション（Ｍｅｂａｔｓｉｏｎ）とコンゼルマン（Ｃｏｎｚｅｌｍａｎｎ）、１９９４）。
【００１５】
これらのレスキュー方法の基本的一段階およびその中の組成物の簡潔な概要を以下にさらに記述する。すなわち
負センスの一本鎖ＲＮＡウイルスゲノムの転写および複製は、リボ核タンパク質コア（ヌクレオキャプシド）に作用する多量体タンパク質の酵素的活性により達成される。裸のゲノムＲＮＡは鋳型として作用し得ない。代わりに、これらのゲノム配列は、それらがＮタンパク質によりヌクレオキャプシド構造中に完全に被包化される場合にのみ認識される。ゲノムおよびアンチゲノム末端プロモーター配列が認識されて転写もしくは複製経路を開始するのはその情況においてのみである。
【００１６】
全部のパラミクソウイルスは、これらのポリメラーゼ経路を進行させるために３種のウイルスタンパク質、Ｎ、ＰおよびＬを必要とする。ＲＳＶを包含するニューモウイルスもまた、転写経路を効率的に進行させるのに転写伸長因子Ｍ２を必要とする。おそらくウイルスにコードされるＮＳ１およびＮＳ２タンパク質、ならびにおそらく宿主細胞にコードされるタンパク質を包含する付加的な補助因子もまたある役割を演じているかも知れない。
【００１７】
簡潔には、全部のモノネガウイルス目（Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉｒａｌｅｓ）のレスキュー方法を以下のとおり要約し得る。すなわち、それぞれは、適するＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼプロモーター（例えばＴ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター）と、適する転写ベクター（例えば、増殖可能な細菌プラスミド）中に挿入される自己切断性リボザイム配列（例えばδ型肝炎リボザイム）との間に置かれた所望のウイルスゲノムのクローン化されたＤＮＡ同等物を必要とする。この転写ベクターは容易に操作可能なＤＮＡ鋳型を提供し、ＲＮＡポリメラーゼ（例えばＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ）は、正確なもしくはほぼ正確な５’および３’末端をもつウイルスのアンチゲノム（もしくはゲノム）の一本鎖ＲＮＡの一コピーをそれから忠実に転写し得る。ウイルスゲノムＤＮＡのコピー、ならびに隣接するプロモーターおよびリボザイム配列の向きが、アンチゲノムもしくはゲノムＲＮＡ同等物が転写されるかどうかを決定する。裸の一本鎖ウイルスのアンチゲノムもしくはゲノムＲＮＡ転写物の機能的ヌクレオキャプシド鋳型、すなわち、ウイルスのヌクレオキャプシド（ＮもしくはＮＰ）タンパク質、ポリメラーゼ会合型リンタンパク質（Ｐ）ならびにポリメラーゼ（Ｌ）タンパク質への被包化に必要とされるウイルス特異的なトランスに作用するタンパク質が、新たなウイルスの子孫のレスキューにもまた必要とされる。これらのタンパク質は、このヌクレオキャプシドの鋳型を転写および複製の達成に従事させるに違いない、活性のウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを含んで成る。レスキューに選択されるある種のウイルスは、転写伸長因子のような付加的タンパク質を必要とすることができる。
【００１８】
従って、各方法においてレスキュー組成物を使用することができる。こうした組成物は当該技術分野で公知である。以下の記述は、本発明の方法で使用し得るレスキュー組成物の制限とならない。レスキュー組成物は、これらのベクターの共発現および組換えウイルスの産生を可能にするのに十分な条件下で、宿主細胞中に；（ｉ）モノネガウイルス目（Ｏｒｄｅｒ  Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉｒａｌｅｓ）の非分節の負センスの一本鎖ＲＮＡウイルスのゲノムもしくはアンチゲノムをコードするポリヌクレオチド配列を含んで成る単離された核酸分子を含んで成る転写ベクター、ならびに（ｉｉ）被包化、転写および複製に必要なトランスに作用するタンパク質をコードする最低１種の単離された核酸分子を含んで成る最低１種の発現ベクターを含んで成る。
【００１９】
該単離された核酸分子は、モノネガウイルス目（Ｏｒｄｅｒ  Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉｒａｌｅｓ）の非分節の負センスの一本鎖ＲＮＡウイルスの最低１種のゲノムもしくはアンチゲノムをコードする配列を含んで成る。ウイルスの分類学に関する国際委員会（ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ  ｏｆ  Ｖｉｒｕｓｅｓ）による１９９３年の改訂された再分類に基づき、モノネガウイルス（Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉｒａｌｅｓ）と呼称されるひとつの目が確立された。この目は、負の極性の（負センスの）一本鎖の非分節ＲＮＡゲノムを含む、エンベロープをもつウイルスの３科を含有する。これらの科は、パラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）、ラブドウイルス科（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ）およびフィロウイルス科（Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ）である。パラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）は２亜科、パラミクソウイルス亜科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｎａｅ）およびニューモウイルス亜科（Ｐｎｅｕｍｏｖｉｒｉｎａｅ）にさらに分割されている。パラミクソウイルス亜科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｎａｅ）は、３属、レスピロウイルス属（Ｒｅｓｐｉｒｏｖｉｒｕｓ）（以前はパラミクソウイルス属（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ）として知られていた）、ルブラウイルス属（Ｒｕｂｕｌａｖｉｒｕｓ）およびモルビリウイルス属（Ｍｏｒｂｉｌｌｉｖｉｒｕｓ）を含有する。ニューモウイルス亜科（Ｐｎｅｕｍｏｖｉｒｉｎａｅ）はニューモウイルス属（Ｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ）を含有する。
【００２０】
該新規分類は、形態学的基準、ウイルスゲノムの構成、生物学的活性、ならびに遺伝子および遺伝子産物の配列の関連に基づく。パラミクソウイルス亜科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｎａｅ）のエンベロープをもつウイルスのあいだの形態学的な識別する特徴は、ヌクレオキャプシドの大きさおよび形状（直径１８ｎｍ、長さ１μｍ、５．５ｎｍのピッチ）であり、これは左旋性らせんの対称を有する。生物学的基準は、１）一属のメンバー間での抗原の交差反応性、ならびに２）レスピロウイルス属（Ｒｅｓｐｉｒｏｖｉｒｕｓ）、ルブラウイルス属（Ｒｕｂｕｌａｖｉｒｕｓ）でのノイラミニダーゼ活性の存在、およびモルビリウイルス属（Ｍｏｒｂｉｌｌｉｖｉｒｕｓ）でのその非存在、である。加えて、ルブラウイルス（Ｒｕｂｌａｖｉｒｕｓｅｓ）での余分な遺伝子（ＳＨ）の存在がそうであるように、Ｐ遺伝子のコーディング能力の変動が考慮される。
【００２１】
ニューモウイルスは、それらが細いヌクレオキャプシドを含有するためにパラミクソウイルス亜科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｎａｅ）と形態学的に識別し得る。加えて、ニューモウイルスは、タンパク質をコードするシストロンの数（ニューモウイルスで１０個対パラミクソウイルス亜科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｎａｅ）で６個）、およびパラミクソウイルス亜科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｎａｅ）のものと非常に異なる接着タンパク質（Ｇ）に大きな差異を有する。パラミクソウイルスおよびニューモウイルスは、機能が対応するようである６種のタンパク質（Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｇ／Ｈ／ＨＮ、ＦおよびＬ）を有するとは言え、後者の２種のタンパク質のみが２亜科の間で有意な配列の関連を示す。いくつかのニューモウイルスタンパク質、すなわち非構造タンパク質ＮＳ１およびＮＳ２、小疎水性タンパク質ＳＨ、ならびに第二のタンパク質Ｍ２は、パラミクソウイルスの大部分で対照物を欠く。若干のパラミクソウイルスのタンパク質、すなわちＣおよびＶは、ニューモウイルスの対照物を欠く。しかしながら、ニューモウイルスおよびパラミクソウイルスの基本的なゲノムの構成は同一である。同じことがラブドウイルスおよびフィロウイルスについてもまた真実である。表１は、各属の例と一緒にこれらのウイルスの現在の分類学的分類を提示する。
表１
モノネガウイルス目（Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉｒａｌｅｓ）の非分節の負センスの一本鎖ＲＮＡウイルスの分類
パラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）
パラミクソウイルス亜科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｎａｅ）
レスピロウイルス属（Ｒｅｓｐｉｒｏｖｉｒｕｓ）（以前はパラミクソウイルス属（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ）として知られていた）
センダイウイルス（マウスパラインフルエンザタイプ１）
ヒトパラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）タイプ１および３
ウシパラインフルエンザウイルス（ＢＰＶ）タイプ３
ルブラウイルス属（Ｒｕｂｕｌａｖｉｒｕｓ）
ＳＶ５（ＳＶ５）（イヌパラインフルエンザウイルスタイプ２）
流行性耳下腺炎ウイルス
ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）（トリパラミクソウイルス１）
ヒトパラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ−タイプ２、４ａおよび４ｂ）
モルビリウイルス属（Ｍｏｒｂｉｌｌｉｖｉｒｕｓ）
麻疹ウイルス（ＭＶ）
イルカモルビリウイルス
イヌジステンパーウイルス（ＣＤＶ）
小反芻動物病ウイルス
アザラシジステンパーウイルス
牛疫ウイルス
ニューモウイルス亜科（Ｐｎｅｕｍｏｖｉｒｉｎａｅ）
ニューモウイルス属（Ｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ）
ヒトＲＳウイルス（ＲＳＶ）
ウシＲＳウイルス
マウス肺炎ウイルス
シチメンチョウ鼻気管炎ウイルス
ラブドウイルス科（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ）
リッサウイルス属（Ｌｙｓｓａｖｉｒｕｓ）
狂犬病ウイルス
ベシクロウイルス属（Ｖｅｓｉｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）
水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）
エフェメロウイルス属（Ｅｐｈｅｍｅｒｏｖｉｒｕｓ）
ウシ流行熱ウイルス
フィロウイルス科（Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ）
フィロウイルス属（Ｆｉｌｏｖｉｒｕｓ）
マールブルグウイルス
上に示されるとおり、該単離された核酸分子は、モノネガウイルス目（Ｏｒｄｅｒ  Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉｒａｌｅｓ）の非分節の負センスの一本鎖ＲＮＡウイルスの最低１種のゲノムもしくはアンチゲノムをコードする配列を含んで成る。単離された核酸分子は、ゲノム、アンチゲノムもしくはそれらの改変されたバージョン(version)をコードするポリヌクレオチド配列を含むことができる。一態様において、該ポリヌクレオチドは、操作可能に連結されたプロモーター、所望のゲノムもしくはアンチゲノム、および転写ターミネーターをコードする。
【００２２】
本発明の好ましい一態様において、ポリヌクレオチドは、ヌクレオチドの挿入、再配列、欠失もしくは置換により野性型ＲＮＡウイルスから改変されているゲノムもしくはアンチゲノムをコードする。本来のゲノムおよびアンチゲノムをコードするポリヌクレオチドがますます改変される際に、複製するウイルスをレスキューから得る能力が消失するかも知れないことが提起されている。こうした場合、本発明はとりわけ価値がある。なぜなら、これらの方法は組換えウイルスのレスキューの見込みを本質的に向上し得るからである。ゲノムもしくはアンチゲノム配列は、ヒトもしくは非ヒトのウイルスのもの由来であり得る。ポリヌクレオチド配列は、２種もしくはそれ以上の供給源からのゲノムもしくはアンチゲノムを組換え的に結合することから形成されたキメラゲノムをコードしてもまたよい。例えば、ＡグループのＲＳＶからの１種もしくはそれ以上の遺伝子が、ＢグループのＲＳＶの対応する遺伝子の代わりに挿入されるか；または、ウシＰＩＶ（ＢＰＩＶ）、ＰＩＶ−１もしくはＰＩＶ−２からの１種もしくはそれ以上の遺伝子が、ＰＩＶ−３の対応する遺伝子の代わりに挿入されるか；または、ＲＳＶがＰＩＶの遺伝子に取って代わることができる、などである。付加的な態様においては、該ポリヌクレオチドは、ヒト、ウシもしくはマウスのウイルスであるモノネガウイルス目（Ｏｒｄｅｒ  Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉｒａｌｅｓ）のＲＮＡウイルスのゲノムもしくはアンチゲノムをコードする。本発明の方法により形成される組換えウイルスは、診断的研究でのツールまたは治療的もしくは予防的ワクチンとして使用し得るため、該ポリヌクレオチドは、野性型もしくは弱毒化された形態の選択されたＲＮＡウイルスをコードしてもまたよい。多くの態様において、該ポリヌクレオチドは、弱毒化された感染性の形態のＲＮＡウイルスをコードする。とりわけ好ましい態様において、該ポリヌクレオチドは、これにより引用により組み込まれる公開国際特許出願第ＷＯ  ９８／１３５０１号により記述されるような、３’のゲノムプロモーター領域に最低１個の弱毒化突然変異を有しかつＲＮＡポリメラーゼ遺伝子中に最低１個の弱毒化突然変異を有するモノネガウイルス目（Ｏｒｄｅｒ  Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉｒａｌｅｓ）の非分節の負センスの一本鎖ＲＮＡウイルスのゲノムもしくはアンチゲノムをコードする。
【００２３】
組換えウイルスを産生する多様な必要性は変動することができる。従って、いずれかの特定の科、すなわちパラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）、ラブドウイルス科（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ）もしくはフィロウイルス科（Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ）からもうひとつのウイルスを選択することができる。
【００２４】
上述されたような、改変された形態の所望のゲノムおよびアンチゲノムをコードするポリヌクレオチド配列に加え、ポリヌクレオチド配列は、１種もしくはそれ以上の異種遺伝子と一緒に所望のゲノムもしくはアンチゲノムをコードしてもまたよい。異種遺伝子は所望されるように変動し得る。異種遺伝子は、所望の組換えウイルスの応用に依存して、補助因子、（インターロイキンのような）サイトカイン、Ｔヘルパーエピトープ、制限マーカー、アジュバントもしくは多様な微生物病原体（例えばウイルス、細菌もしくは真菌）のタンパク質、とりわけ保護的免疫応答を導き出すことが可能なタンパク質をコードしてよい。異種遺伝子はまた、遺伝子治療に使用される作用物質を提供するのに使用してもよい。好ましい態様において、異種遺伝子は、組換えウイルスの予防的もしくは治療的特徴を改良するのに選択される、インターロイキン−１２のようなサイトカインをコードする。
【００２５】
ウイルス性病原体の治療における改良されたワクチンおよび増大された順応性に対する現在の必要性のいくつかを考慮すれば、単離された核酸分子は、ＣＤＶ、ＶＳＶ、ＭＶ、ＲＳＶ、ＰＩＶ、流行性耳下腺炎ウイルスおよび狂犬病ウイルスより成る群から選択されるＲＮＡウイルスをコードするポリヌクレオチドを含んで成る。ＭＶ、ＲＳＶ、ＰＩＶおよびＢＰＶより成る群が、この組のＲＮＡウイルスのなかでさらに好ましい。
【００２６】
弱毒化ウイルスを使用する態様については、改変ウイルスを生じさせるための弱毒化突然変異の基本的導入方法と一緒に、多数の形態のこうしたウイルスが当該技術分野で公知である。化学的突然変異誘発物質が添加されている細胞培養物中でのウイルスの成長の間の化学的突然変異誘発、次いで、温度感受性および／もしくは低温適応突然変異を選択するための至適以下の(suboptimal)温度での継代にかけられるウイルスの選択、細胞培養物中で小さなプラークを生じさせる突然変異体ウイルスの同定、ならびに宿主域突然変異について選択するための異種宿主による継代のような慣習的手段が使用される。弱毒化突然変異の代替の一導入手段は、部位特異的突然変異誘発を使用して予め決められた突然変異を作成することを含んで成る。１種もしくはそれ以上の突然変異を導入してよい。その後、これらのウイルスの生物学的活性の減弱化についてそれらを動物モデルでスクリーニングする。弱毒化ウイルスをヌクレオチド配列決定にかけて、弱毒化突然変異の部位の位置を突き止める。
【００２７】
レスキューを実施するために必要とされる多様なトランスに作用するタンパク質もまた当該技術分野で公知である。麻疹ウイルスのレスキューに必要とされるトランスに作用するタンパク質は、被包化タンパク質Ｎ、ならびにポリメラーゼ複合体タンパク質、ＰおよびＬである。ＰＩＶ−３については、被包化タンパク質はＮＰと呼称され、また、ポリメラーゼ複合体タンパク質はまたＰおよびＬとも称される。ＲＳＶについては、ウイルス特異的なトランスに作用するタンパク質は、Ｎ、ＰおよびＬ、ならびにＲＳＶをコードする転写伸長因子である付加的タンパク質Ｍ２を包含する。
【００２８】
ウイルスのトランスに作用するタンパク質は、必要とされるタンパク質をコードする１種もしくはそれ以上の発現ベクター（例えばプラスミド）から生じさせ得るとは言え、必要とされるトランスに作用するタンパク質のいくつかもしくは全部は、安定な形質転換体としてこれらのウイルス特異的遺伝子および遺伝子産物を含有かつ発現するよう工作された選択された宿主細胞内で産生させることができる。
【００２９】
発現ベクター、ならびに被包化、転写および複製に必要なトランスに作用するタンパク質をコードする単離された核酸分子の選択は、所望のウイルスの選択に依存して変動し得る。選択された条件下での宿主細胞における転写ベクター（１種もしくは複数）とのそれらの共発現および組換えウイルスの産生を可能にするために、発現ベクターが調製される。
【００３０】
レスキューのための典型的な（とは言え必ずしも独占的でない）環境は、適切な哺乳動物細胞の環境を包含し、ここで、ウイルスゲノムのｃＤＮＡを含有する転写ベクターからアンチゲノム（もしくはゲノム）の一本鎖ＲＮＡの転写を駆動するようにＴ７ポリメラーゼが存在する。このウイルスアンチゲノム（もしくはゲノム）のＲＮＡ転写物は、共転写的にもしくはその後すぐにのいずれかで、ヌクレオキャプシドタンパク質により機能的鋳型に被包化され、そして、必要とされるウイルス特異的なトランスに作用するタンパク質をコードするコトランスフェクションされた発現プラスミドから付随して産生される必要とされるポリメラーゼ成分により束縛される。これらの事象および過程は、ウイルスｍＲＮＡの前もって必要な転写、新たなゲノムの複製および増幅、ならびにそれにより新規ウイルス子孫の産生すなわちレスキューにつながる。
【００３１】
狂犬病、ＶＳＶ、ＳＶ５およびセンダイのレスキューのためには、Ｔ７ポリメラーゼは組換えワクシニアウイルスＶＴＦ７−３により提供される。しかしながら、この系は、物理的もしくは生化学的手段、またはポックスウイルスに対し良好な宿主でない細胞もしくは組織中での反復する継代により、レスキューされるウイルスがワクシニアウイルスから分離されることを必要とする。ＭＶのｃＤＮＡのレスキューに関しては、Ｔ７ポリメラーゼならびにウイルスのＮおよびＰタンパク質を発現する細胞系を創製することにより、この要件が回避される。ゲノム発現ベクターおよびＬ遺伝子発現ベクターをヘルパー細胞系中にトランスフェクションすることにより、レスキューが達成される。好ましくは、ヘルパー細胞系は、哺乳動物細胞中で子孫のウイルスをほとんどもしくは全く産生せず、そして所望のＲＮＡウイルスもしくはウイルス類をレスキューするために活用し得る。Ｔ７ポリメラーゼ、例えばＭＶＡ／Ｔ７（以下に記述される）の供給源としてヘルパーウイルスを使用し得る。必要な被包化タンパク質の同時の発現後に、合成の完全長のアンチゲノムウイルスＲＮＡが被包化され、複製され、そしてウイルスのポリメラーゼタンパク質により転写され、そして複製されたゲノムが感染性のビリオン中にパッケージングされる。こうしたアンチゲノムに加え、今や、センダイおよびＰＩＶ−３についてゲノム類似物が成功裏にレスキューされている（加藤（Ｋａｔｏ）ら、および公開された国際特許出願第ＷＯ  ９８／５３７０８号）。
【００３２】
上に示されたとおり、ＭＶＡ／Ｔ７（ワクシニアウイルスの弱毒化突然変異体）は、ＲＮＡウイルスレスキューのレスキューで使用することができる改変ヘルパーウイルスの一例である。一般に、改変ヘルパーウイルスは、非許容細胞系中で減少されたウイルス活性を示すか、もしくはウイルス活性を示さないように野性型ウイルスから変えられているウイルスである。ＭＶＡの特徴は、改変ヘルパーウイルスで好ましい特徴を確立する。ワクシニアウイルスのＭＶＡ株は、より細胞障害性の株に対する魅力的な一代替を提供する。ＭＶＡは、トルコおよびドイツにおける天然痘根絶プログラムの間に、ニワトリ胚線維芽細胞での細胞障害性ワクシニアアンカラウイルスの連続的継代（＞５７０）により開発された。それは生物安全性レベル（Ｂｉｏｓａｆｅｔｙ  Ｌｅｖｅｌ）−１病原体にまで格下げされており、そして、ワクチン接種されていない実験室労働者により使用されてよい。ＭＶＡは、３０，０００を越える塩基対の喪失をもたらす６個の大きな欠失（ゲノムの＞１５％）を含有する（アントワヌ（Ａｎｔｏｉｎｅ）ら、１９９８）。ＭＶＡは、制限された数の細胞系中で複製し（キャロル（Ｃａｒｒｏｌｌ）とモス（Ｍｏｓｓ）、１９９７；ドレクスラー（Ｄｒｅｘｌｅｒ）ら、１９９８）、そして、非許容細胞中でウイルスの形態形成の後期段階で封鎖されている（サッター（Ｓｕｔｔｅｒ）とモス（Ｍｏｓｓ）、１９９２）。さらに、ＭＶＡは、野性型株で観察される重症の細胞障害性の影響（ＣＰＥ）を誘発しない。他の宿主が制限されるポックスウイルス（例えば、ＮＹＶＡＣ、ＡＬＶＡＣおよび鶏痘）を上回るＭＶＡの主要な一利点は、ウイルスＤＮＡ複製、および従ってほとんど全部の遺伝子分類（初期、中期および後期）の転写が損なわれないことである。全部の分類のプロモーター下で外来遺伝子を効率的に発現することができる。バクテリオファージＴ７−遺伝子１を発現する２種の組換えＭＶＡが報告されている。ＭＶＡ／Ｔ７ハイブリッドウイルスは、７．５Ｋの弱い初期／後期プロモーター（サッター（Ｓｕｔｔｅｒ）ら、１９９５）もしくは１１Ｋの強い後期プロモーター（ワイアット（Ｗｙａｔｔ）ら、１９９５）のいずれかの調節下に、組込まれた一コピーのＴ７遺伝子−１を含有する。双方が、一過性発現系で負鎖ＲＮＡウイルスを遺伝子的にレスキューするためのヘルパーウイルスとして使用されている（コリンズ（Ｃｏｌｌｉｎｓ）ら、１９９５；レイラー（Ｌｅｙｒｅｒ）ら、１９９８；シュナイダー（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ）ら、１９９７；バロン（Ｂａｒｒｏｎ，Ｍ．Ｄ．）とバレット（Ｂａｒｒｅｔｔ，Ｔ．）Ｒｅｓｃｕｅ  ｏｆ  ｒｉｎｄｅｒｐｅｓｔ  ｖｉｒｕｓ  ｆｒｏｍ  ａ  ｃｌｏｎｅｄ  ｃＤＮＡ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．７１（２）：１２６５−７１、１９９７年２月；ダーバン（Ｄｕｒｂｉｎ，Ａ．Ｐ．）、ホール（Ｈａｌｌ，Ｓ．Ｌ．）、シュー（Ｓｉｅｗ，Ｊ．Ｗ．）、ホワイトヘッド（Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ，Ｓ．Ｓ．）、コリンズ（Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｐ．Ｌ．）とマーフィ（Ｍｕｒｐｈｙ，Ｂ．Ｒ．）Ｒｅｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｈｕｍａｎ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  ３  ｆｒｏｍ  ｃ���ＮＡ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．２３５（２）：３２３−３３２；ヘ（Ｈｅ）ら、１９９７）。
【００３３】
ＭＶＡ／Ｔ７のような弱毒化ヘルパーウイルスのようなヘルパーウイルスの使用の利益にもかかわらず、ＭＶＡ／Ｔ７もしくは別のヘルパーウイルスの同時発生的複製周期は、異種組換えウイルスのレスキューに必要とされる遺伝的事象を抑制するかも知れない。従って、本発明の好ましい態様においては、ヘルパーウイルスを使用する場合、ＤＮＡ合成阻害剤もまた使用する。本態様はレスキュー系の改良をもたらす。ＤＮＡ合成阻害剤は、ヘルパーウイルスのＤＮＡ合成もまた阻害（もしくは本質的に阻害）する一方でレスキューを生じさせる。ＡｒａＣ（シトシンβ−Ｄ−アラビノフラノシド）およびヒドロキシ尿素のような例示的ＤＮＡ合成阻害剤は、ウイルスの生活環の決定的に重要な一点でヘルパーウイルスの複製周期を封鎖する。中期および後期のウイルス遺伝子転写は発生期のウイルスゲノムのみで開始するため、これら２種の遺伝子分類は、ＡｒａＣもしくはヒドロキシ尿素による封鎖の結果として表立ったものではない(silent)。ＡｒａＣはＤＮＡへの取込みにより複製を封鎖する一方、ヒドロキシ尿素はデオキシリボヌクレオチドの細胞のプールを還元するリボヌクレオチド還元酵素を阻害する。利用可能な多くの付加的ＤＮＡ合成阻害剤が存在する。付加的ＤＮＡ合成阻害剤は細胞のＤＮＡ合成を封鎖することが知られているが、しかし、それらはＭＶＡ複製の封鎖での使用に推奨されない。これらは、ＤＮＡポリメラーゼ阻害剤（アフィジコリンのような）、トポイソメラーゼ阻害剤（カンプトテシンのような例はタイプＩトポイソメラーゼを封鎖し；ノボビオシンおよびナリジクス酸はタイプＩＩトポイソメラーゼを封鎖する）、ならびにＤＮＡジャイレース阻害剤（ヘリキノマイシンのような）を包含する。細胞のＤＮＡ合成を封鎖するＤＮＡ合成阻害剤は、複製機能を実施するため細胞の酵素に甚だしく依存するヘルパーウイルスにとってより効果的であるとみられる。
【００３４】
遺伝子レスキュー事象の間にＤＮＡ合成阻害剤を使用することの明白な一利点は、改変ヘルパーウイルスでのレスキューされるＲＮＡウイルスの汚染が非常にわずかであるかもしくは全くないはずであることである。ＭＶＡにおいては、被許容細胞における複製周期が形態形成の非常に後期の段階で停止され、非感染性であるウイルス粒子をもたらす。半許容細胞の感染は制限されたウイルス成長をもたらし、これは、遺伝子レスキュー実験では禁忌を示される。ＡｒａＣもしくはヒドロキシ尿素により封鎖されて、後期のタンパク質合成の付随する阻害はウイルス粒子の完全な非存在をもたらす。レスキューされたウイルスは、ヘルパーウイルスの成長に対し許容性である細胞系中で直接増幅される。トランスフェクションに使用されるＤＮＡ合成阻害剤の量は、ヘルパーウイルスの成長を分析するための試験実験により容易に決定される。
【００３５】
ウイルスｃＤＮＡの組換えＲＮＡウイルスへの転化に必要とされる分子事象は、一般に、Ｔ７ポリメラーゼによる転写、および、３種もしくはそれ以上のウイルスのトランスに作用する因子（ＭＶの場合、Ｎ、ＰおよびＬ）による負もしくは正いずれかの鎖の完全長のゲノムの複製を必要とすることが理解されている。同時発生的なＭＶＡ複製は、レスキュー事象全体での細胞内および細胞外の供給源(resources)の枯渇をもたらし、おそらく若干の程度までそれを傷つける。中期および後期遺伝子の発現の封鎖は、これらの供給源の保存をもたらし、そして、おそらく、阻害剤の存在下での遺伝子のレスキューが高められる一理由である。
【００３６】
ウイルス感染により誘導される細胞障害性の影響（ＣＰＥ）は、野性型ウイルスに感染した細胞に比較してＭＶＡに感染した細胞で顕著に低下される。それは、ＤＮＡ合成阻害剤で処理された、ＭＶＡに感染した細胞でさらに低下される。感染した細胞の寿命の伸長はより広範な外来遺伝子の発現を可能にする。これは、改良された遺伝子レスキューについての別の有利な成分かも知れない。
【００３７】
Ｔ７発現を駆動するための他のプロモーター（強い初期、初期／中期、中期もしくは初期／後期）の使用は、好ましくはＤＮＡ複製阻害剤の存在下で、遺伝子レスキューを高める可能性がある。ワクシニアウイルスのプロモーターは本発明の方法に適する。
【００３８】
宿主細胞を、その後、最低２種の上述された発現ベクターで形質転換もしくはトランスフェクションする。宿主細胞は、感染性の弱毒化ウイルスを生じるようにこれらのベクターの共発現を可能にする条件下で培養する。
【００３９】
その後、レスキューされた感染性ウイルスを、最初にインビトロ手段により、その所望の表現系（温度感受性、低温適応、プラークの形態、ならびに転写および複製の減弱）について試験する。シスに作用する３’のゲノムプロモーター領域での突然変異もまた、ミニレプリコン系を使用して試験する。ミニレプリコン系では、必要とされるトランスに作用する被包化およびポリメラーゼ活性が、野性型もしくはワクチンのヘルパーウイルス、または、Ｎ、Ｐおよび遺伝子特異的弱毒化突然変異をもつ多様なＬ遺伝子を発現するプラスミドにより提供される（ラデケ（Ｒａｄｅｃｋｅ）ら（１９９５）およびシドゥ（Ｓｉｄｈｕ）ら（１９９５））。
【００４０】
弱毒化された表現系のレスキューされたウイルスが存在する場合は、適切な動物モデルを用いて攻撃実験を実施する。非ヒトの霊長類は、ヒト疾患の病状についての好ましい動物モデルを提供する。これらの霊長類を、最初に、弱毒化された組換え的に発生されたウイルスで免疫し、その後、野性型形態の該ウイルスで攻撃する。
【００４１】
本発明のレスキュー方法で使用し得る宿主細胞は、所望の組換えウイルスの産生に必要な必須の構成要素のベクターからの発現を許容するものである。こうした宿主細胞は、原核生物細胞もしくは真核生物細胞、および好ましくは脊椎動物細胞から選択し得る。一般に、好ましい宿主細胞は、ヒト胚腎細胞のようなヒト細胞由来である。ラデケ（Ｒａｄｅｃｋｅ）ら  １９９５は、２９３  ３−４６と呼称されるヒト胚腎細胞系由来である宿主細胞の使用を開示する。ベロ細胞、ならびに多くの他の型の細胞もまた宿主細胞として使用し得る。以下は、適する宿主細胞の例である。すなわち、（１）ヒト二倍体一次細胞系：例えばＷＩ−３８およびＭＲＣ５細胞；（２）サル二倍体細胞系：例えばＦＲｈＬ−胎児アカゲザル肺細胞；（３）準一次連続(quasi-primary continues)細胞系：例えばＡＧＭＫ−アフリカミドリザル腎細胞；（４）ヒト２９３細胞（制限された(qualified)）ならびに（５）ＣＨＯ、ＭＤＣＫ（メイディン−ダービイ（Ｍａｄｉｎ−Ｄｅｒｂｙ）イヌ腎）、一次ニワトリ胚線維芽細胞のような他の潜在的細胞系。二者択一的に好ましい態様においては、細胞によるＤＮＡの取込みを増大させるためにトランスフェクション促進試薬が添加される。これらの試薬の多くは当該技術分野で既知である。リポフェクテース（ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＣＥ）（ライフ  テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、メリーランド州ゲイタースバーグ）およびエフェクティーン（ＥＦＦＥＣＴＥＮＥ）（キアジェン（Ｑｉａｇｅｎ）、カリフォルニア州ヴァレンシア）が普遍的な例である。リポフェクテース（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｃｅ）およびエフェクティーン（Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ）は双方とも陽イオン性脂質である。それら双方はＤＮＡをコートし、かつ、細胞によるＤＮＡの取込みを高める。リポフェクテース（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｃｅ）はＤＮＡを取り巻くリポソームを形成する一方、エフェクティーン（Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ）はＤＮＡをコートするがしかしリポソームを形成しない。
【００４２】
本発明で使用されるＲＮＡウイルスの多くはヒト病原体であるため、こうした例では霊長類細胞が好ましく使用される。イヌジステンパーウイルスおよび非ヒトの哺乳動物を感染させる他のモルビリウイルスのような例外が存在する。これらのウイルスの全部は真核生物細胞のみを感染させる。麻疹ウイルスは主として霊長類の細胞型に限定される。若干の真核生物細胞系はウイルスの増殖について他者よりも良好にはたらき、また、若干の細胞系はいくつかのウイルスについて全くはたらかない。生存可能なウイルスのレスキューを容易に検出することができるために、検出可能な細胞障害性の影響を生じさせる細胞系が使用される。麻疹、および潜在的に他のウイルスの場合には、該ウイルスがベロ細胞上で迅速に広まりそして容易に検出可能なプラークを作成するため、トランスフェクションされた細胞をベロ細胞上で成長させる。これは本発明の別の重要な特徴である。一般に、選択されたウイルスの成長に対し許容性である宿主細胞を使用する。若干の例では、宿主細胞は「補完(complementing)細胞型」である。麻疹ウイルスの場合には、２９３−３−４６細胞（ラデケ（Ｒａｄｅｃｋｅ）ら、１９９５）が、麻疹ウイルスのＮおよびＰ遺伝子、ならびにＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を発現するため、それらを使用する。他の系は、全部の必要なウイルスタンパク質が発現プラスミドおよびＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを発現するワクシニアウイルスにより提供されるため、この制限を有しない。
【００４３】
転写ベクターおよび発現ベクターは、宿主細胞中での発現のために設計されたプラスミドベクターであり得る。被包化、転写および複製に必要なトランスに作用するタンパク質をコードする最低１種の単離された核酸分子を含んで成る発現ベクターは、同一の発現ベクターもしくは最低２種の異なるベクターからこれらのタンパク質を発現することができる。これらのベクターは基本的なレスキュー方法から公知であり、また、それらは本発明の改良された方法での使用のため変えられる必要はない。
【００４４】
本発明の改良された一方法においては、有効な熱ショック温度を使用する。有効な熱ショック温度は、組換えウイルスのレスキューの実施に示唆される標準温度より上の温度である。多くの例において、有効な熱ショック温度は３７℃より上である。あるレスキュー方法を有効な熱ショック温度で実施する場合、該レスキュー方法は、温度の増大の非存在下でレスキューが実施される場合の組換えウイルスの回収のレベルを越えた所望の組換えウイルスの回収の増大を生じさせる。有効な熱ショック温度および曝露時間は、使用されるレスキュー系に依存して変動してよい。こうした温度および時間の変動は、選択されたウイルスゲノムもしくは宿主細胞型の差異から生じる可能性がある。該温度は変動してよいとは言え、有効な熱ショック温度は、特定の組換えウイルスを用いていくつかの試験レスキュー処置を実施すること、そして温度および曝露の時間を変動させる際の所望の組換えウイルスの回収率のパーセントを確立することにより、容易に確かめ得る。確実に、レスキューを実施するためのいずれの温度範囲の上端も、トランスフェクションの成分が破壊される、もしくはトランスフェクションで機能するそれらの能力が激減もしくは減少される温度である。
【００４５】
温度範囲の例示的一覧を下に示す。すなわち
３８℃から約５０℃まで、３９℃から約４９℃まで、３９℃から約４８℃まで、約４０℃から約４７℃まで、約４１℃から約４７℃まで、約４１℃から約４６℃まで、約４２℃から約４６℃までがより好ましい。あるいは、４３℃、４４℃、４５℃および４６℃の熱ショック温度がとりわけ好ましいことが言及される。
【００４６】
以下により束縛されることなく、レスキューの間の熱ショック温度に上昇された温度を使用することは、熱ショックタンパク質（ｈｓｐと称される）に関連した細胞応答および合成を誘発することが、これにより理論づけられる。熱ショックが、細胞のストレス応答、および熱ショックタンパク質（ｈｓｐ）と呼ばれる一群の多機能タンパク質の合成を誘導することが認識される（クレイグ（Ｃｒａｉｇ）、１９８５；グンター（Ｇｕｎｔｈｅｒ）とウォルター（Ｗａｌｔｅｒ）、１９９４；リンドクィスト（Ｌｉｎｄｑｕｉｓｔ）、１９８６）。ｈｓｐの多く（しかし全部ではない）は、高度に誘導可能な遺伝子によりコードされ、そして、これらのタンパク質はストレスからの細胞の回収を助けるために、上昇されたレベルで合成される。誘導可能なｈｓｐは基礎レベルの細胞中にもまた存在し、これらのタンパク質が正常の細胞機能で演じる多様な役割を示す。ｈｓｐのいくつかは、それらが適正なタンパク質のフォールディングの補助で重要な役割を演じるため、シャペロンともまた呼ばれる（ゲティング（Ｇｅｔｈｉｎｇ）、１９９６；マーティン（Ｍａｒｔｉｎ）とハートル（Ｈａｒｔｌ）、１９９７）。ｈｓｐに帰される他の機能は、細胞中でのタンパク質転送(trafficking)、酵素およびタンパク質の機能の調節、ＤＮＡ複製への参画、ならびにウイルスの複製および病因論での関与における役割を包含する（フランケ（Ｆｒａｎｋｅ）、ヤウン（Ｙａｕｎ）とルバン（Ｌｕｂａｎ）、１９９４；フリードマン（Ｆｒｉｅｄｍａｎ）ら、１９８４；ゲティング（Ｇｅｔｈｉｎｇ）、１９９６；グリック（Ｇｌｉｃｋ）、１９９５；フ（Ｈｕ）、トフト（Ｔｏｆｔ）とゼーガー（Ｓｅｅｇｅｒ）、１９９７；ルント（Ｌｕｎｄ）、１９９５；マーティン（Ｍａｒｔｉｎ）とハートル（Ｈａｒｔｌ）、１９９７；プラット（Ｐｒａｔｔ）、１９９２；サントロ（Ｓａｎｔｏｒｏ）、１９９６）。
【００４７】
哺乳動物の熱ショックタンパク質７０（ｈｓｐ７０）のファミリーは、大きさがおよそ７０ｋＤのタンパク質の関連する一群である。主要な誘導可能な形態のｈｓｐ７０（ｈｓｐ７２）は、７２ｋＤの見かけの分子量を有する。７３ｋＤのｈｓｐ７０タンパク質（ｈｓｐ７３）は構成的に細胞中で発現され、そして熱ショックコグネイトタンパク質（ｈｓｃ７３、（グンター（Ｇｕｎｔｈｅｒ）とウォルター（Ｗａｌｔｅｒ）、１９９４））と命名されている。これらのタンパク質は上に挙げられた機能のいくつかに参画し、また、熱ショックに応答して本来の（レスキューされない）ＣＤＶ遺伝子発現を増大させる宿主細胞因子の一として関係している。Ｈｓｐ７２のアイソフォームは、高められたウイルス転写活性を含有するＣＤＶヌクレオキャプシドの画分とともに共精製する（オグルスビー（Ｏｇｌｅｓｂｅｅ）ら、１９９６）。
【００４８】
本明細書に記述されるようなわれわれの例示的結果を考慮すれば、ＣＤＶ遺伝子発現、および本明細書に記述される方法に従ってレスキューすることができる他のウイルスについての遺伝子発現に対する熱ショック温度の影響は、少なくとも部分的にＨｓｐ７０の誘導によることを推測し得る。従って、本発明の代替の態様は、ｈｓｐ、とりわけＨｓｐ７２のようなＨｓｐ７０の誘導を達成することが可能である有効な熱ショック温度の使用に関する。
【００４９】
選択された熱ショック温度を確立するための試験の実施においては、熱ショック処置を実施するための所望の時間もまた選択し得る。有効な熱ショック温度を適用するのに十分な時間は、レスキューを実施するために示唆される標準温度を越える温度の増大の非存在下でレスキューを実施する場合の組換えウイルスの回収のレベルを越える、所望の組換えウイルスの回収の増大がそれにわたって存在する時間である。時間の適切な長さはレスキュー系に基づいて変動してよい。時間のこうした変動は、選択されたウイルスゲノムもしくは宿主細胞型の差異からもまた生じる可能性がある。時間が変動してよいとは言え、有効な熱ショック温度を適用するための時間の量は、特定の組換えウイルスを用いて数回の試験レスキュー処置を実施すること、そして、温度および時間を変動させた際の所望の組換えウイルスの回収率もしくは回収パーセントを確立することにより容易に確かめることが可能である。確実に、レスキューの実施で使用されるいずれかの時間変数の上端は、トランスフェクションの成分が破壊される、またはトランスフェクションで機能するそれらの能力が激減もしくは減少される時間の量である。熱ショック処置のための時間の量は、組換えウイルスの回収の所望の増大が得られる限りは、数分から数時間まで変動してよい。
【００５０】
有効な熱ショック温度へのトランスフェクションされた細胞の曝露の時間は各レスキュー系とともに変動する可能性があるとは言え、曝露時間の範囲（分）の例示的一覧を以下に示す。すなわち
約５から約３００まで、約１５から約３００まで、１５から約２４０まで、約２０から約２００まで、約２０から約１５０まで、約３０から約１５０までが最も好ましい範囲である。
【００５１】
所望の組換えウイルスの改良された回収のレベルを決定するために多数の手段を使用し得る。本明細書の実施例に示されるとおり、組換えウイルスのレスキューをモニターするのに、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）レポーター遺伝子を使用し得る。レポーター遺伝子の対応する活性は、組換えウイルスの発現の基礎および改良されたレベルを確立する。他の方法は、得られた組換えウイルスのプラークの数を検出すること、そしてレスキューされたウイルスの産生を配列決定により確認することを包含する。改良された回収は、最低約２５％もしくは最低約４０％の増大を示すはずである。好ましくは、回収される組換えウイルスの増大は約２倍である。組換えウイルスの量の約５ないし１０倍の増大が観察されている。
【００５２】
所望の組換えウイルスの改良された回収のレベルの決定のために示唆される一方法は、多数の同一にトランスフェクションされた細胞培養物を調製すること、そしてそれらを多様な条件の熱ショック（時間および温度が変動する）に曝露すること、そしてその後３７℃の一定温度でトランスフェクションされかつ維持された対照細胞と比較することを必要とする。トランスフェクション後７２時間で、トランスフェクションされた細胞を、約７５％コンフルエントなベロ細胞（もしくは該組換えウイルスのプラーク形成の測定に選択すべき細胞型）の単層を含有する１０ｃｍプレートに移し、そしてプラークが見えるまでインキュベーションを継続する。その後、プラークを計数し、そして対照細胞から得られた値と比較する。至適の熱ショック条件はプラークの数を最大にするはずである。
【００５３】
本発明の別の態様において、宿主細胞（１個もしくは複数）中に存在するようなトランスフェクションされたレスキュー組成物を、プラーク拡大(plaque expansion)段階もしくは増幅段階にさらす。本発明の本局面は、組換えモノネガウイルス目（Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉｒａｌｅｓ）ウイルスを産生するための改良されたレスキュー方法を提供し、この方法は、（ａ）１個の宿主細胞中で、（ｉ）モノネガウイルス目（Ｏｒｄｅｒ  Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉｒａｌｅｓ）の非分節の負センスの一本鎖ＲＮＡウイルスのゲノムもしくはアンチゲノムをコードする単離された核酸分子を含んで成る転写ベクター、ならびに（ｉｉ）被包化、転写および複製に必要なトランスに作用するタンパク質をコードする最低１種の単離された核酸分子を含んで成る最低１種の発現ベクターを含んで成るレスキュー組成物のトランスフェクションを、前記ベクターの共発現および組換えウイルスの産生を可能にするのに十分な条件下で実施すること；（ｂ）トランスフェクションされたレスキュー組成物を、最低一層のプラーク拡大細胞（ＰＥ細胞）上に移すこと；ならびに、（ｃ）場合によっては組換えウイルスを収穫すること、を含んで成る。しばしば、トランスフェクションの実施で使用される宿主細胞は、所望の組換えウイルスの成長に好都合でない。トランスフェクションされた細胞からの組換えウイルスの回収は、天然のウイルスもしくは組換えウイルスが高められた成長を示すプラーク拡大細胞を選択することにより改良し得る。当該技術分野で既知の多様なプレートもしくは容器のいずれかをプラーク拡大段階に使用し得る。好ましくは、レスキュー組成物を含有するトランスフェクションされた細胞をＰＥ細胞の単層上に移す。とりわけ、ＰＥ細胞の該層は最低約５０％コンフルエントであるべきである。あるいは、ＰＥ細胞は最低約６０％コンフルエント、もしくは最低約７５％コンフルエントでさえある。プラーク拡大を達成するためには、ＰＥ細胞の表面積がトランスフェクションされたウイルスを調製するために使用される表面積よりも大きいようなＰＥ細胞の容器に、トランスフェクションされた細胞を移す。２：１から１００：１までの高められた表面積比を所望されるとおり使用し得る。最低１０：１の高められた表面積が好ましい。プラーク拡大細胞は、こうした細胞における天然のもしくは組換えウイルスの成功裏の成長に基づいて選択する。ベロ細胞は、本明細書で論考される例示的実験で十分にはたらき、そして、従って、それらはＰＥ細胞として好ましい。
【００５４】
付加的な改良されたレスキュー方法は、ベロ細胞でのプラーク拡大もしくは熱ショック処理の前もしくはそれらと同時にトランスフェクション培地を置き換えることにより達成する。培地交換は、プラーク拡大もしくは熱ショック温度の前の多様な時点で起こり得るが；しかしながら、トランスフェクションされた細胞のインキュベーションの約４ないし約２０時間後の培地の交換を開始点として後に続き得、そしてその後、その後に所望されるとおり、該レスキュー方法の試験実験を実施することから補正し得る。
分節の一本鎖のＲＮＡウイルス
本発明の重要な局面の一は、非分節の負センスの一本鎖ＲＮＡウイルスの回収でのこれらの改良された方法の応用であるとは言え、本発明の方法は、分節の負センスの一本鎖ＲＮＡウイルスを包含する多くの型のＲＮＡウイルスのレスキューを高めるのに有用であり得る。ウイルスの分類学に関する国際委員会（ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ  ｏｆ  Ｖｉｒｕｓｅｓ）による１９９３年の改訂された再分類に基づけば、後者の群のウイルスは３科のウイルスに属し、それらは、オルトミクソウイルス科（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）、ブニヤウイルス科（Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ）およびアレナウイルス科（Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ）である。
オルトミクソウイルス科（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）
インフルエンザ属（Ｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓ）Ａ、Ｂ
脊椎動物、インフルエンザＡ型ウイルス
インフルエンザ属（Ｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓ）Ｃ
脊椎動物、インフルエンザＣ型ウイルス
「命名されていないトゴトウイルスグループ（ｕｎｎａｍｅｄ，Ｔｈｏｇｏｔｏ−ｌｉｋｅ  ｖｉｒｕｓｅｓ）」属
脊椎動物：トゴトウイルス
ブニヤウイルス科（Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ）
ブニヤウイルス属（Ｂｕｎｙａｖｉｒｕｓ）
脊椎動物：ブニヤンベラウイルス
ナイロウイルス属（Ｎａｉｒｏｖｉｒｕｓ）
脊椎動物：ナイロビヒツジ病ウイルス
フレボウイルス属（Ｐｈｌｅｂｏｖｉｒｕｓ）
脊椎動物：シシリアサチショウバエウイルス
ハンタウイルス属（Ｈａｎｔａｖｉｒｕｓ）
脊椎動物：ハンタンウイルス
トスポウイルス属（Ｔｏｓｐｏｖｉｒｕｓ）
植物：トマト黄化えそウイルス
アレナウイルス科（Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ）
アレナウイルス属（Ａｒｅｎａｖｉｒｕｓ）
脊椎動物：リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス
テヌイウイルス属（Ｔｅｎｕｉｖｉｒｕｓ）
植物：イネ縞葉枯ウイルス
これらの分節ウイルスの科から、ヒトに対する潜在的な健康の危険を提示するウイルスがとりわけ興味深い。逆遺伝学（もしくはレスキュー）は、ビリオンＲＮＡを活性の転写酵素複合体と集成してゲノムに複製を開始させることにより組換えインフルエンザＡ型の産生経路を提供した（江波（Ｅｎａｍｉ）とパレイス（Ｐａｌａｓｅ））。該方法は、ｃＤＮＡコピーのインビトロ転写、（天然のもしくは突然変異された）所望のウイルス遺伝子分節をｖＲＮＡのコピーに創製すること、そしてウイルスを回収することを必要とする。ｖＲＮＡを、（精製されたビリオンから得られた）ＲＮＰタンパク質と混合し、そしてその後ヘルパーウイルス（例えば、所望の組換えウイルスに対応する野性型ウイルス）とともに細胞にトランスフェクションする。例えば、組換えインフルエンザＡ型の調製において、インフルエンザＡ型ウイルスを使用して、トランスフェクションされたＲＮＡ遺伝子を複製するタンパク質を提供する。組換えウイルスおよびヘルパーウイルスの混合物を形成する。ヘルパーウイルスは大過剰で存在するため、抗体選択系のような強い選択系を使用して子孫を選択的に分離する（江波（Ｅｎａｍｉ）とパレイス（Ｐａｌａｓｅ）、１９９１）。本発明の熱ショック処置を使用して、生じる混合物の体積、ならびに、適切なレスキュー組成物にさらすことにより得られた組換えウイルス、ＲＮＡ、ＲＮＰ、およびヘルパーウイルスを用いて共感染を実施する場合の活性の転写酵素複合体のようないずれかの付加的成分の量を増大させ得る。
【００５５】
とりわけ、本発明の熱ショック処置は、１０種のインフルエンザＡ型ウイルスにコードされるタンパク質のｃＤＮＡクローンを発現するワクシニア−Ｔ７ポリメラーゼによりＣＯＳ−細胞中で合成のインフルエンザ様のＣＡＴ：ＲＮＡミニゲノムをパッケージングすることによりウイルス様粒子を製造するのに使用される処置の効率を向上させるのにもまた使用し得る（メナ（Ｍｅｎａ）ら、１９９６）。付加的な一態様において、本発明の熱ショック処置は、ブニヤンベラブニヤウイルスの分節の負鎖のＲＮＡゲノムのレスキューについてのヘルパーに依存しない系の効率の向上で使用し得る（ブリジェン（Ｂｒｉｄｇｅｎ）とエリオット（Ｅｌｉｏｔｔ）、１９９６）。本系は、（分節のインフルエンザウイルスのレスキューについて記述されるものよりもむしろ）非分節の負センスのＲＮＡウイルスのレスキュー実験に使用されるものに類似である。３種のブニヤンベラブニヤウイルスのＲＮＡゲノムの分節の完全長のｃＤＮＡコピーを含有するプラスミドが構築され、そして、正確なゲノム末端をもつＲＮＡのゲノムのコピーを生じさせるように、Ｔ７プロモーターおよびリボザイム配列により隣接された。Ｔ７ポリメラーゼおよび組換えのブニヤンベラブニヤウイルスタンパク質を発現する細胞をこれらのプラスミドでトランスフェクションした場合、完全長のアンチゲノムＲＮＡが転写されかつ細胞内で被包化され、そしてこれらは順に複製されそして感染性のブニヤウイルス粒子にパッケージングされた。
【００５６】
ＣＤＶのＬポリメラーゼ活性がｈｓｐ７２により刺激される（オグルスビー（Ｏｇｌｅｓｂｅｅ）ら、１９９６）ことを示す結果と組み合わせられた、熱ショックが組換えＭＶのレスキューを高めかつＭＶミニレプリコンからのＣＡＴレポーター遺伝子の発現を増大させるという本明細書に記述される観察結果は、ｈｓｐ７２の誘導が本明細書に記述される熱ショックの影響の本質的原因であるかも知れないという確信を生じさせる。この可能性を、ＣＡＴミニレプリコン実験の間に発現ベクターからｈｓｐ７２の遺伝子の一を発現させることにより検査した。エピトープに標識をつけられたバージョンのｈｓｐタンパク質の発現がウェスタンブロット分析により確認された（実施例６）。ｈｓｐ発現ベクターの存在は、トランスフェクションされた細胞でのＣＡＴレベルを２０倍まで増加させた（実施例６）。これらの結果は、ｈｓｐ７２の高レベル発現がウイルスレスキューの効率を増大させるかも知れないことを示唆する。さらに、これらの結果は、高レベルのｈｓｐ７２を発現する安定な細胞系がレスキューに好都合かも知れないことを意味する。理想的には、安定な細胞系は、ｈｓｐ７２遺伝子の発現の量を調節し得るような誘導可能なプロモーターからｈｓｐ７２を発現するとみられる。これは、レスキューを最大限にしかつまたｈｓｐ遺伝子の構成的な高レベル発現の細胞系に対するいかなる潜在的な毒性の影響も回避するとみられる、誘導時間の持続期間および誘導レベルの選択を可能にするとみられる。
【００５７】
本発明の方法から産生される組換えウイルスを診断および治療の応答に使用し得る。好ましくは、本発明の方法から産生される組換えウイルスは、単独で、または医薬、抗原、免疫剤もしくはアジュバントとともに、ウイルス性疾患の予防もしくは改善におけるワクチンとして使用される。これらの有効成分は、慣習的手段、すなわち、希釈剤もしくは製薬学的に許容できる担体を使用することにより処方かつ送達し得る。
【００５８】
以下の実施例は具体的説明として提供され、そして、上述されるような本発明を制限するとして解釈されるべきでない。
実施例
方法および材料
細胞、ウイルスおよびトランスフェクション
２９３−３−４６細胞（ラデケ（Ｒａｄｅｃｋｅ）ら、１９９５）および２９３細胞（グレアム（Ｇｒａｈａｍ）ら、１９７７）を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）で補充されたダルベッコの改変最小必須培地（ＤＭＥＭ）中で維持した。２９３−３−４６細胞は、１ｍｌあたり１．５ｍｇのＧ４１８（ジェネティシン、ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）−ＢＲＬ）を含有する培地での選択を用いて成長させた。ベロ細胞は５％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ中で成長させ、また、ＨｅＬａ懸濁細胞は１０％ＦＢＳで補充された最小必須培地（ＳＭＥＭ）中で成長させた。ＭＶ（エドモンストン（Ｅｄｍｏｎｓｔｏｎ）Ｂ型）は、以前に記述されたとおり（ウデム（Ｕｄｅｍ）、１９８４）ＨｅＬａ懸濁培養物中で増殖させた。
【００５９】
トランスフェクションは、リン酸カルシウム沈殿法（アウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら、１９８７；グレアム（Ｇｒａｈａｍ）とファン・デル・エプ（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｅｂ）、１９７３）を使用して実施した。トランスフェクションに使用された２９３−３−４６もしくは２９３細胞は、６穴プレートに植え付け、そして約５０〜７５％コンフルエントまで成長させた。細胞は、トランスフェクションの１〜３時間前は、Ｇ４１８を欠く４．５ｍｌの新鮮な培地で養った。水中２２５μｌの最終体積中で適切なＤＮＡを組み合わせること、次いで２５μｌの２．５Ｍ  ＣａＣｌ2を添加することにより、トランスフェクション混合物を調製した。２５０μｌの２×ＨＥＰＥＳ緩衝生理的食塩水（２８０ｍＭ  ＮａＣｌ、１．５ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０５）をゆっくりと添加しつつ、ＤＮＡ−カルシウム混合物を穏やかにボルテックス攪拌した。沈殿を室温で２０分間そのままにさせ、その後細胞に添加した。細胞を一夜（１４〜１６時間）インキュベーションし、その後トランスフェクション培地を除去し、そして細胞をすすぎかつＧ４１８を欠く新鮮な培地で養った。トランスフェクション培地を除去した後に、細胞あたり５プラーク形成単位（ｐｆｕ）で、トランスフェクションされた細胞の感染を実施した。感染は、培地を交換する前に２時間インキュベーションした。この時点で、熱ショックされるはずであった細胞を含有する皿をパラフィルムで覆い、そして４４℃の水浴に移し、そして３７℃のインキュベーターに移す前に３時間インキュベーションした。細胞は、一過性の遺伝子発現の分析のためにトランスフェクションの開始４８時間後に収穫したか、またはレスキュー実験のために７２時間（もしくは別に本明細書に示されるとおり）で収穫した。クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）アッセイを、既に記述されたとおり（シドゥ（Ｓｉｄｈｕ）ら、１９９５、およびパークス（Ｐａｒｋｓ）とシェンク（Ｓｈｅｎｋ）、１９９６）実施した。
【００６０】
単層の上で培地を反復してピペットで出し入れして細胞をはがしかつ単層を小さな凝集塊に砕くことにより、ウイルスのレスキューのため収穫された細胞をウェルから取り出した。細胞解離剤は使用しなかった。１０ｃｍ皿上の１０ｍｌの培地中で成長するベロ細胞のコンフルエント近くの単層上に、細胞および５ｍｌの培地を直ちに分配した。４ないし５日後にプラークが見え、そして単層をプラーク計数のため染色したか、もしくは収穫して組換えウイルスストックを調製した。
【００６１】
ＲＮＡトランスフェクションは、以下の改変を伴い、ＤＮＡについて上述されたとおり実施した。メガスクリプト（Ｍｅｇａｓｃｒｉｐｔ）キット（アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ））のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ試薬を使用して、トランスフェクションのためのＲＮＡをインビトロで調製した。ＲＮＡ−リン酸カルシウム沈殿を２９３細胞とともに５〜６時間インキュベーションし、そしてその後除去した。トランスフェクションおよび感染は、トランスフェクション培地へのウイルスの添加により同時に実施した。トランスフェクション−感染培地を交換した後に、適切な細胞サンプルを４３〜４４℃で熱ショックした。トランスフェクション／感染の開始後２４〜４８時間で細胞を収穫した。
組換えＤＮＡ
完全長のＭＶのｃＤＮＡプラスミド（ｐ（＋）ＭＶ）およびＭＶのＬ遺伝子発現プラスミド（ｐＥＭＣ−Ｌａ）は、ビレター（Ｍａｒｔｉｎ  Ｂｉｌｌｅｔｅｒ）およびラデケ（Ｆｒａｎｋ  Ｒａｄｅｃｋｅ）（ラデケ（Ｒａｄｅｃｋｅ）ら、１９９５）により恵与された。ＣＡＴミニレプリコンの調製法は記述されている（シドゥ（Ｓｉｄｈｕ）ら、１９９５）。熱ショックされた２９３−３−４６細胞から抽出されたＲＮＡからのｃＤＮＡを増幅することにより、ｈｓｐ７０発現プラスミドをクローン化した（ハント（Ｈｕｎｔ）と森本（Ｍｏｒｉｍｏｔｏ）、１９８５）。モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、およびタイタン（Ｔｉｔａｎ）キット試薬（ベーリンガー  マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）で見出されるＰｗｏ  ＤＮＡポリメラーゼを含有する高忠実度酵素混合物を用いて、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ／ＰＣＲ）反応を実施した。ｈｓｐ７０のｃＤＮＡを発現プラスミドｐＣＧＮ（田中（Ｔａｎａｋａ）とヘル（Ｈｅｒｒ）、１９９０）にクローン化して、アミノ末端のコーディング領域にインフルエンザＨＡエピトープ標識(tag)を含有する発現構築物を生じさせた。
ＤＮＡ配列決定
ＲＴ／ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡを配列決定することにより、ＭＶの配列を決定した。グアニジウム−イソチオシアナート−フェノール−クロロホルム抽出法（コムチンスキ（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ）とサッキ（Ｓａｃｃｈｉ）、１９８７）により、ＭＶに感染した細胞からのＲＮＡを調製し、そして、タイタン（Ｔｉｔａｎ）キット（ベーリンガー  マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ））中の試薬を使用してＲＴ／ＰＣＲを実施した。増幅されたＤＮＡは低融点アガロースゲルでゲル精製した。色素ターミネーター反応（アプライド  バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））を使用してＰＣＲフラグメントを配列決定し、そしてＡＢＩ  プリズム［Ｐｒｉｓｍ］（商標）自動シークェンサー（パーキン−エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ））で分析した。プラスミドＤＮＡの配列の確認もまた自動シークェンサーで実施した。
実施例１
ｃＤＮＡレスキュープロトコル
本プロトコルを図１に要約する。
【００６２】
トランスフェクションを開始する前日に、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および１．５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８抗生物質で補充されたＤＭＥＭを使用して、２９３−３−４６細胞を６穴プレートに分割する。翌日の使用が期待される場合は、１個のコンフルエントの１０ｃｍプレートを６穴皿で分割する。組換えウイルスの回収の見込みを増大させるため、レスキュー実験あたり１２個のウェルをトランスフェクションする。
【００６３】
トランスフェクションの約１ないし３時間前に、１０％ＦＢＳ（Ｇ４１８なし）で補充された４．５ｍｌのＤＭＥＭで各ウェル中の培地を置き換え、そしてその後トランスフェクションを開始する。
リン酸カルシウム沈殿：
２２５μｌの体積中の水およびＤＮＡを滅菌の５ｍｌポリプロピレンチューブ中で組み合わせる。１トランスフェクションあたりに５μｇのｐ（＋）ＭＶおよび１００ｎｇのＬ発現プラスミド（ｐＥＭＣ−Ｌａ）を使用する。２５μｌの２．５Ｍ  ＣａＣｌ2を添加しかつ混合する。チューブを穏やかにボルテックス攪拌しながら２５０μｌの２×ＨＢＳを一滴ずつ添加する。ＨＢＳを添加した後、チューブを室温で１５〜２０分間そのままにする（ＨＢＳは、２×ＨＥＰＥＳ緩衝生理的食塩水、すなわち２８０ｍＭ  ＮａＣｌ、１．５ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０５である（アウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら、１９８７））。大量の母型(master)トランスフェクション混合物を作成するよりもむしろ各ウェルについて個々のトランスフェクションを設定することが役立つ。沈殿を一滴ずつ培地に添加し、そして細胞を約１２ないし１６時間、一夜インキュベーションする。
【００６４】
その後、培地を除去しかつ細胞を洗浄する。細胞はＨＥＰＥＳ／生理的食塩水溶液（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2、ｐＨ７．２）で２回すすぐ。細胞をインキュベーションする前に、５ｍｌの培地（ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、Ｇ４１８なし）を添加する。
【００６５】
熱ショック：上述されたとおり新鮮な培地を添加した後に、６穴プレートをパラフィルムで封止し、そして蓋のついたタッパーウェア（Ｔｕｐｐｅｒｗａｒｅ）容器に移す。該容器を４３〜４４℃の水浴に沈めそして３時間インキュベーションする。この熱ショック段階の後にパラフィルムをプレートから除去し、そして細胞を３７℃のインキュベーターに移す。細胞はトランスフェクションの開始後合計で約７２時間インキュベーションする。
【００６６】
インキュベーションが完了した後、ベロ細胞を用いてプラーク拡大段階を実施する。ベロ細胞は、１枚の１０ｃｍプレートを４もしくは５枚の１０ｃｍプレートに分割することにより、使用前日に調製する。一夜インキュベーションの後の細胞は約７５％コンフルエントである。トランスフェクションされたウェル１個あたり１枚のベロ細胞のプレートが存在するように十分なプレートを準備する。トランスフェクションの開始後約７２時間で、トランスフェクションされた２９３−３−４６細胞の各ウェルを、ベロ細胞を含有する１０ｃｍプレートに移す。５ｍｌの培養培地を細胞上で反復してピペットで出し入れしてそれらをウェルから移動させかつ単層を小さな細胞凝集塊に砕くことにより、２９３−３−４６細胞を移動させる。細胞の溶解を回避するがしかし細胞を移動させるのに十分力強くピペットで出し入れせよ。その後、トランスフェクションされた細胞凝集塊を含有する５ｍｌの培養培地を、既に１０ｍｌの培養培地を含有するベロ細胞の１０ｃｍプレートに分配する。レスキュー系に依存して、プラークを可視化するのに十分な時間（約４〜５日）を与えるべきである。細胞を掻き取りかつそれらを遠心分離により収集することにより、組換えウイルスを収穫する。細胞を、血清を欠く１ｍｌの血清を含まないＤＭＥＭ（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）−ＢＲＬ）に再懸濁し、そして１回凍結融解してウイルスを遊離させる。
実施例２
本実施例では、実施例１に記述されたレスキュー方法を、熱ショックを適用しなかった対照と一緒に６回反復した。６回の独立したレスキュー実験からの結果を図５に示す。全部の実験で使用されたＭＶのｃＤＮＡはエドモンストン（Ｅｄｍｏｎｓｔｏｎ）Ｂ型配列（ラデケ（Ｒａｄｅｃｋｅ）ら、１９９５）を含有した。上述されたとおりトランスフェクションを実施し、そして熱ショックインキュベーションは４４℃で３時間であった。実験１でプラスもしくはマイナスのプラークを評価し(scored)、そして残存する実験でプラークを計数した。本実施例で実施された実験は以下を示した。すなわち
慣習的レスキュー技術（ラデケ（Ｒａｄｅｃｋｅ）ら、１９９５）の２点の改変、すなわち１回の熱ショック段階および１回のプラーク拡大段階は、それぞれ、組換えウイルスを産生したトランスフェクションされた培養物の数の大きな増大で有効であった。これらの改変を使用する前には、トランスフェクションされた培養物の約２〜３％のみが組換えウイルスを産生した。上の処置において、トランスフェクションされた培養物の５０から約９０％までが組換えウイルスを産生した。
実施例３
プラーク拡大の改変
実施例１のレスキュープロトコルのプラーク拡大段階は、以下の型の実験から確立した。それらは熱ショック処理の非存在下で実施する。
【００６７】
ラデケ（Ｒａｄｅｃｋｅ）ら（１９９５）により概説された手順に従いつつ、実施例２のプラーク拡大段階を伴わずに実験を実施した。これらの実験では、トランスフェクションされた細胞を、６穴皿中の１個のウェルから１枚の１０ｃｍプレートに移して、４〜５日の付加的な細胞成長およびプラークが発生するための追加の時間を可能にした。この処置を使用してはプラークが検出されなかった。第二の型の実験においては、トランスフェクションされた細胞を掻き取りおよび遠心分離により収穫し、そして血清を含まないＯＰＴＩＭＥＭ（ライフ  テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、メリーランド州ゲイタースバーグ）培地に再懸濁した。細胞を１回の凍結融解周期にさらしてウイルスを遊離させ、そして、この細胞ライセートを、約７５％コンフルエントであったベロ細胞を含有する１枚の１０ｃｍ皿に適用した。４ないし５日後、ベロ細胞をプラークについて検査した。培養物の約２〜３％が麻疹ウイルスプラークについて陽性であった。実施例２に概説されたプラーク拡大プロトコルに従い、記述されたとおりの２％の成功率を上回る１０〜２０倍の向上が達成された。細胞が、実施例２に示されたようなプラーク拡大段階に先立ち凍結融解周期にさらされていないことが重要なようである。
実施例４
熱ショックはミニレプリコンからの発現を増大させる
熱ショック後の向上されたレスキューの結果の潜在的なメカニズムを検査するため、ＭＶミニレプリコンからの遺伝子発現に対する熱ショックの影響を試験した（結果については図２を参照されたい）。ミニレプリコンのプラスミド（ｐＭＶ１０７ＣＡＴ）は、ＭＶの末端により隣接されるＣＡＴ遺伝子の負センスのＲＮＡのコピーの、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ媒介性の合成を指図するように設計した（シドゥ（Ｓｉｄｈｕ）ら、１９９５）。本プラスミドを使用して、ミニレプリコンＲＮＡの細胞内合成のために２９３−３−４６細胞をトランスフェクションした。２９３−３−４６細胞におけるミニレプリコンＲＮＡの複製および発現は、感染により提供されるＭＶタンパク質での補完(complementation)により実施したか、もしくは、（該細胞がＮおよびＰタンパク質双方を提供するため）Ｌ発現プラスミドで補完した。２９３−３−４６細胞をＭＶ−ＣＡＴミニレプリコンプラスミドＤＮＡ（１μｇ）で一夜トランスフェクションした。若干のトランスフェクション（レーン３および７）はＬの補完を提供するためにＭＶのＬ遺伝子発現プラスミド（１００ｎｇ）もまた受領した。トランスフェクションの約１４時間後に培地を交換し、そして、該細胞を、細胞あたり５ｐｆｕ（プラーク形成単位）でＭＶに２時間感染させた（レーン４および８）。感染後、培地を交換し、そして適切な細胞培養物（レーン５〜８）を４４℃で３時間熱ショックした。トランスフェクションの開始４８時間後に細胞を収穫し、そしてＣＡＴアッセイを上の方法に記述されるとおり実施した。
【００６８】
該ミニレプリコンの発現に対する熱ショックの影響を検査する場合、熱ショックを使用するレスキューはＣＡＴ遺伝子活性の強い増大を生じさせた（図２）。図２に示される実験はミニレプリコンＤＮＡを用いて実施し、また、細胞をトランスフェクション４８時間後に収穫したことを除いてレスキュー実験に類似に実施した。トランスフェクション培地の除去後、トランスフェクションされた細胞を細胞あたり５ｐｆｕで感染させることにより、ウイルスによる補完を実施した。Ｌ発現プラスミドでの補完はミニレプリコンＤＮＡでのコトランスフェクションにより単純に行った。この結果は、いずれの形態の補完を使用した場合にも熱ショックが発現を刺激することを示す。複数の実験において、Ｌ発現プラスミドでの補完により生じられたＣＡＴ発現は、熱ショックにより２から１０まで倍増大した（レーン３および７を比較せよ）。同様に、ＣＡＴ活性は、ウイルス補完を使用した場合にもまた増大し、そして約５倍の増強をもたらした（レーン４および８）。期待されたとおり、ＣＡＴプラスミド（レーン１および５）もしくはＬ補完の供給源（レーン２および６）を受領しなかった陰性対照のトランスフェクションは、非常に低レベルの背景ＣＡＴ活性を生じた。
実施例５
ミニレプリコンの増大された発現が熱ショック後により高レベルのＴ７ポリメラーゼ活性に関連づけ得た可能性が存在した。より高いＴ７ポリメラーゼ活性は、熱ショック後の２９３−３−４６細胞での該遺伝子の増大された発現から生じるかも知れなかった。Ｔ７ポリメラーゼ遺伝子は２９３−３−４６細胞中でＣＭＶの前初期プロモーター／エンハンサーから発現され（ラデケ（Ｒａｄｅｃｋｅ）ら、１９９５）、また、ＣＭＶプロモーター／エンハンサーは熱ショックに応答することが示されている（アンドリュース（Ａｎｄｒｅｗｓ）、ニューバウンド（Ｎｅｗｂｏｕｎｄ）とレアモア（Ｌａｉｒｍｏｒｅ）、１９９７）。この可能性を排除するために、細胞をミニレプリコンＲＮＡでトランスフェクションし、そして実施例４で使用されたような熱ショック処理にかけた。加えて、本実施例では、熱ショックの影響が２９３−３−４６細胞系中に存在するＭＶ遺伝子の増大された発現に関連付けられた可能性を排除するために、ＲＮＡトランスフェクションを２９３細胞で実施した（グレアム（Ｇｒａｈａｍ）ら、１９７７）。２９３−３−４６細胞はいかなるＭＶ遺伝子も安定に発現しない。本実験で使用されたトランスフェクションプロトコルは、ＲＮＡトランスフェクションを適応させるように改変した（上の方法のセクションを参照されたい）。５μｇのＲＮＡをリン酸カルシウム処置によりトランスフェクションした。培地にトランスフェクション混合物を添加した直後にウイルスを添加することにより、適切な細胞のＭＶ感染を実施した。細胞に沈殿を添加した後に、ＭＶ（細胞あたり５ｆｐｕ、図３のレーン３および６）を培養培地に添加して直ちに感染を開始し、それがヌクレオキャプシド中にパッケージングされ得る前に細胞内のＲＮＡ分解の機会を小さくした。５〜６時間のトランスフェクション−感染のインキュベーション後に培地を交換し、そして、適切な細胞サンプルを、３７℃に戻す前に４４℃で２時間熱ショックした。ＣＡＴアッセイのため、トランスフェクション−感染の開始２４〜４８時間後に細胞抽出物を調製した。
【００６９】
ＲＮＡトランスフェクションからの結果はＤＮＡトランスフェクションの結果に類似であった。熱ショックは、感染した細胞でのＣＡＴの発現を本質的に増大させた（図３、レーン３および６を比較せよ）。ミニレプリコンＲＮＡ（レーン１および４）もしくはウイルス補完（レーン２および５）を受領しなかった細胞ではＣＡＴ活性は観察されなかった。ＲＮＡトランスフェクションの結果は、増大されたＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ活性が、図２に示されるＤＮＡトランスフェクション実験での熱ショックの影響の原因であった可能性もまた排除する。
実施例６
ミニレプリコン発現のＨｓｐ７０による刺激
オグルスビー（Ｏｇｌｅｓｂｅｅ）らは、誘導可能なｈｓｐ７０のアイソフォームｈｓｐ７２がＣＤＶヌクレオキャプシドとともに共精製すること、および、これらのヌクレオキャプシドは高められたインビトロ転写活性を示すことを決定した（オグルスビー（Ｏｇｌｅｓｂｅｅ）、リングラー（Ｒｉｎｇｌｅｒ）とクラコウカ（Ｋｒａｋｏｗｋａ）、１９９０；オグルスビー（Ｏｇｌｅｓｂｅｅ）ら、１９９６）。ｈｓｐ７２が上の実施例で観察された熱ショックの影響に関与したかどうかを評価するため、実施例１の熱ショック処理の代わりにｈｓｐ７０遺伝子の過剰発現を本質的に用いた実験を実施した（結果を図４に示す）。誘導可能なｈｓｐ７０のｃＤＮＡ（ハント（Ｈｕｎｔ）と森本（Ｍｏｒｉｍｏｔｏ）、１９８５、ウ（Ｗｕ）ら、１９８５）を、実施例２に従った熱ショックされた細胞から調製されたＲＮＡからクローン化した。該ｃＤＮＡを、ｆｌｕエピトープ標識と一緒にＣＭＶ発現ベクター、プラスミドｐＣＧＮ（田中（Ｔａｎａｋａ）、１９９０）にクローン化した。ｈｓｐ７０遺伝子のアミノ末端コーディング領域を、配列ＹＰＹＤＶＰＤＹＡを有するインフルエンザＨＡエピトープ標識に融合した（田中（Ｔａｎａｋａ）および３７５−３８６．、１９９０）。ＨＡエピトープを含有するアミノ末端をもつｈｓｐ７０タンパク質を発現するようにｈｓｐ７０のｃＤＮＡをクローン化した。このプラスミドの使用は、内在性のｈｓｐ７０アイソフォームの背景の存在下でさえ、インフルエンザ標識に対する抗体を使用してｈｓｐ７０のｃＤＮＡの発現をたどることを可能にする。トランスフェクションされた細胞から調製された全細胞抽出物を、エピトープ標識に特異的な抗体を使用するウェスタンブロッティング（パークス（Ｐａｒｋｓ）とシェンク（Ｓｈｅｎｋ）、１９９６）により分析した（図４Ａ）。トランスフェクションされた細胞からの抽出物のウェスタン分析は、発現プラスミド（図４Ａ）が、わずかにより大きい７０ｋＤの標識されたポリペプチドを生じさせることを示した。
【００７０】
Ｌ発現プラスミドおよびミニレプリコンＤＮＡと一緒のｈｓｐ７０発現ベクターでの２９３−３−４６細胞のコトランスフェクションは、ＣＡＴの増大された発現をもたらした（図４Ｂを参照されたい）。この一過性アッセイ系においては、ｈｓｐ７０の過剰発現は低レベルのＬ補完を２０倍程度増大させた。ｈｓｐ７０発現ベクターにより誘導されたＣＡＴ発現のこの増大は明白に特異的であった。なぜなら、それはＬポリメラーゼプラスミドの存在を必要とし、かつ、Ｌが非存在であるかもしくはＣＡＴプラスミドがトランスフェクションから省かれる場合に観察された背景のＣＡＴ活性を増大しないからである。これらの結果は、ｈｓｐ７０がミニゲノム発現に対する熱ショックの影響の少なくとも部分的原因であることを強く示唆する。
実施例７
ベロ細胞におけるミニレプリコン発現の熱ショックレスキュー
実施例４に対する追跡として、２９３−３−４６細胞をベロ細胞により置き換えた。
材料：ベロ細胞のトランスフェクション実験のため、麻疹タンパク質Ｎ、ＰおよびＬをプラスミドＤＮＡにより提供し、また、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼをＭＶＡ／Ｔ７（ワイアット（Ｗｙａｔｔ）ら）感染により提供する。トランスフェクションは、１００ｎｇのミニレプリコン、４００ｎｇのＮプラスミド、３００ｎｇのＰプラスミド、および以下の表２に示されたとおりのＬプラスミドの量を包含した。陰性対照トランスフェクションはＬプラスミドの支持を欠いた。加えて、トランスフェクション試薬としてリポフェクテース（ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＣＥ）（ライフ  テクノロジーズ  インク（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）、メリーランド州ゲイタースバーグから購入された）を用いてベロ細胞をトランスフェクションした。各試験について、トランスフェクション反応あたり２プラーク形成単位（ＰＦＵ）のＭＶＡ／Ｔ７（ワイアット（Ｗｙａｔｔ）ら）を使用する。２体積のリポフェクテース（ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＣＥ）を試験して、効率的なベロ細胞トランスフェクションに対する至適の量を決定した。トランスフェクションは、２種の異なる量のＬタンパク質発現プラスミドを用いて実施する。熱ショックのためには、細胞を４４℃の水浴に３時間移す。対照細胞は熱ショックしない。
ＭＶＡ／Ｔ７：ＭＶＡ／Ｔ７は、１１Ｋの強い後期プロモーターの調節下に、組込まれた一コピーのＴ７遺伝子−１を含有するハイブリッドウイルスである（ワイアット（Ｗｙａｔｔ）ら  １９９５）。
実験プラスミド：
Ｌプラスミドはラデケ（Ｒａｄｅｃｋｅ）とビレター（Ｂｉｌｌｅｔｅｒ）により提供された。基本的に、ラデケ（Ｒａｄｅｃｋｅ）ら（１９９５）により開示されたクローニング方法により、麻疹Ｌ遺伝子をｐＥＭＣプラスミドベクター（モス（Ｍｏｓｓ）ら、１９９０）にクローン化してプラスミドｐＥＭＣ−Ｌａを生じさせた。このベクターは、クローン化された遺伝子の真核生物細胞中での発現を助長するための内部リボソーム侵入部位および３’端のポリ−Ａ配列を包含する。同一のベクターを使用して、ＮおよびＰ遺伝子のそれぞれのついてのベクターを調製した。ＮおよびＰタンパク質のコーディング領域は、麻疹ウイルスゲノムのｃＤＮＡからＰＣＲにより増幅し（ラデケ（Ｒａｄｅｃｋｅ）ら、１９９５）、その後、ベクターｐＥＭＣのＮｃｏＩ部位とＢａｍＨＩ部位との間にクローン化してｐＴ７−ＮおよびｐＴ７−Ｐを生じさせた。
熱ショックのためのベロ細胞のプロトコル：
リポフェクテース（ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＣＥ）およびエフェクティーン（ＥＦＦＥＣＴＥＮＥ）について
リポフェクテース（ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＣＥ）：
ベロ細胞がおよそ５０〜８０％コンフルエントになるまでそれらを６穴培養皿で成長させる。この段階でそれらはなお迅速に分割しかつ健全であり、また、より高い細胞密度はトランスフェクション、ＭＶＡ／Ｔ７感染および熱ショックの間に被られる細胞死を相殺するのを助けるため、約７５％コンフルエントの細胞が望ましい。トランスフェクションのためのＤＮＡ−脂質混合物は、微小遠沈管中でＤＮＡ（Ｎ、Ｐ、ＬおよびＭＶミニレプリコン）ならびに２００μｌの血清を含まないＤＭＥＭを組み合わせることにより調製する。ＤＮＡ−培地混合物にリポフェクテース（ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＣＥ）（実験に依存して１２もしくは１５μｌ）を添加し、そして穏やかに混合し、次いで室温で２０分インキュベーションする。インキュベーションの終了時に、ＤＮＡ−リポフェクテース（ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＣＥ）混合物を、適切な量のＭＶＡ／Ｔ７を含有する８００μｌの血清を含まないＤＭＥＭと組み合わせて、細胞あたりおよそ２ＰＦＵの最終量を生じさせる。ベロ細胞培養物から培地を除去し、そしてＤＮＡ、リポフェクテース（ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＣＥ）およびＭＶＡ／Ｔ７を含有するトランスフェクション混合物で置き換える。５％ＣＯ2に設定された３７℃のインキュベーター中で細胞を２〜６時間インキュベーションする。ベロ細胞については、このインキュベーションは２〜３時間で至適であると思われる。このインキュベーション期間の終了時に、１０％ウシ胎児血清で補充された１ｍｌのＤＭＥＭを細胞に添加し、そして適切な細胞培養物を４４℃で２〜３時間熱ショックにかける（３時間がベロ細胞に至適なようである）。熱ショックを実施するために、６穴プレートをジップロック（Ｚｉｐｌｏｃｋ）プラスチック袋に移し、そしてその後４４℃の水浴に沈める。２〜３時間の熱ショック期間の終了時に、細胞をプラスチック袋から取り出し、そして一夜インキュベーションのため３７℃のインキュベーターに戻す。翌日、培地を、１０％ウシ胎児血清を含有する２ｍｌの新鮮なＤＭＥＭで置き換える。トランスフェクション後およそ４８時間で、細胞を収穫してＣＡＴアッセイのための抽出物を調製するか、もしくは、細胞を収穫し、そしてベロ細胞の単層を含有する１０ｃｍ皿に移してプラーク拡大を可能にする。
【００７１】
細胞をその後ＣＡＴ活性について分析した。１２μｌのリポフェクテース（ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＣＥ）および１００ｎｇのＬプラスミドの条件下で使用された場合、ＣＡＴ活性は熱ショックにより約７倍刺激された。１５μｌのリポフェクテース（ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＣＥ）および１００ｎｇのＬプラスミドの条件下で使用された場合は、ＣＡＴ活性が熱ショックにより約２倍刺激された。以下の表２を参照されたい。
【００７２】
【表１】
0004625915.tif 000002
【００７３】
実施例８
ベロ細胞における熱ショックレスキューのためのトランスフェクション促進試薬の比較
上の実験を、リポフェクテース（ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＣＥ）もしくはエフェクティーン（ＥＦＦＥＣＴＥＮＥ）（キアジェン  インク（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．）、カリフォルニア州ヴァレンシア）のいずれかを使用して反復した。
【００７４】
エフェクティーン（ＥＦＦＥＣＴＥＮＥ）についてのプロトコルは、ＤＮＡ−脂質混合物の調製を除き本質的に同一である。ＤＮＡは、エフェクティーン（ＥＦＦＥＣＴＥＮＥ）試薬とともに供給される緩衝生理的食塩水１００μｌと混合する。その後、８μｌのエフェクティーン（ＥＦＦＥＣＴＥＮＥ）濃縮試薬を添加し、そして該混合物を室温で５分間インキュベーションする。次に、２５μｌ（もしくは図で指定された量）のエフェクティーン（ＥＦＦＥＣＴＥＮＥ）を添加し、そして該混合物を追加の１５分間インキュベーションする。１５分のインキュベーション後に、ＤＮＡ−エフェクティーン（ＥＦＦＥＣＴＥＮＥ）複合体を、細胞あたりおよそ２ＰＦＵを提供するように、十分なＭＶＡ／Ｔ７を含有する９００μｌの血清を含まない培地と混合する。この段階で、細胞へのＤＮＡ−ＭＶＡ／Ｔ７混合物の適用および全部のその後の段階は、リポフェクテース（ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＣＥ）についてたどられた段階に同一である。
【００７５】
結果を以下の表３ａおよび３ｂに示す。（Ｌｉｐｏ＝リポフェクテース（ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＣＥ））。トランスフェクション後２時間で熱ショックを実施した場合は、ミニレプリコン活性が増大した。
【００７６】
【表２】
0004625915.tif 000003
【００７７】
【表３】
0004625915.tif 000004
【００７８】
実施例９
改変緩衝液技術を用いるベロ細胞のトランスフェクション
材料：ＢＥＳは：｛Ｎ，Ｎ−ビス［２−ヒドロキシエチル］−２−アミノエタンスルホン酸｝である。
ＢＥＳ／リン酸カルシウム処置を使用するレスキューのためのベロ細胞のトランスフェクション
ベロ細胞は、それらがおよそ５０〜８０％コンフルエントになるまで６穴培養皿で成長させる。この段階でそれらはなお迅速に分割しかつ健全であり、また、より高い細胞密度は、トランスフェクション、ＭＶＡ感染および熱ショックの間に被られる細胞死を相殺するのを助けるため、細胞は約７５％コンフルエントである。トランスフェクションの日、細胞をウェルあたり４．５ｍｌの培地で養い、そして３７℃（もしくは、温度感受性のウイルスをレスキューする場合は、温度についてより低い）および３％ＣＯ2に設定されたインキュベーターに移す。われわれにより慣例に使用される培地は、１０％ウシ胎児血清で補充されたＤＭＥＭである（他の培地が役に立つことができる）。細胞を養ったおよそ２ないし４時間後にトランスフェクションを開始する。トランスフェクションのためのＤＮＡ−リン酸カルシウム沈殿を５ｍｌのポリプロピレンチューブ中で調製する。Ｎ、ＰおよびＬのための発現プラスミドならびにＭＶレプリコンを包含するレスキューのためのＤＮＡを、２２５μｌの最終体積まで水と組み合わせる。次に、２５μｌの２．５Ｍ  ＣａＣｌ2を添加し、そしてチューブを穏やかに混合する。ＤＮＡ−ＣａＣｌ2混合物の全部を調製した後に、２５０μｌの２×ＢＥＳ緩衝生理的食塩水（２×ＢＢＳ：２８０ｍＭ  ＮａＣｌ、１．５ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4、５０ｍＭ  ＢＥＳ、ｐＨ６．９５−６．９８）を添加することにより沈殿を調製する。２×ＢＢＳは、ＢＢＳ添加の間継続的に穏やかにボルテックス攪拌しつつ、各チューブに１滴ずつ添加する。２×ＢＢＳを添加した後に、チューブを室温で２０分インキュベーションする。室温インキュベーションの終了時に、５００μｌの沈殿を細胞に１滴ずつ添加し、そしてプレートを穏やかに揺すって培地との沈殿の混合を確実にする。沈殿を添加した後に、およそ２プラーク形成単位（ｐｆｕ）のＭＶＡ／Ｔ７もしくはＭＶＡ／Ｔ７−ＧＫ１６を培地に直接添加し、そしてプレートを穏やかに揺すって混合する。ＧＫ１６を使用する場合は、ＤＮＡ合成阻害剤をこの段階で培地に添加する。シトシンアラビノシド（ａｒａＣ）もしくはヒドロキシ尿素（ＨＵ）のいずれかを、それぞれ１ｍｌあたり２０μｇもしくは１０ｍＭ培地に添加する。トランスフェクション後３時間で、細胞をプラスチックのジップロック袋に移し、そして熱ショックのため４４℃に設定された水浴に沈める。細胞を４４℃で２〜３時間（より持続される３時間が最良に作用するとみられる）インキュベーションし、その後、一夜インキュベーションのため、３％ＣＯ2に設定されたインキュベーターに戻す。翌日、培地およびトランスフェクション成分を細胞から除去し、そしてｈｅｐｅｓ緩衝生理的食塩水（２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2）で細胞を２回洗浄し、その後新鮮な培地を添加する。ＭＶＡ／Ｔ７−ＧＫ１６に感染した培養物にＡｒａＣもしくはＨＵを補給する。細胞を、標準的な３７℃および５％ＣＯ2に設定されたインキュベーター中で追加の１日インキュベーションする（温度感受性ウイルスをレスキューしている場合は、新鮮な培地の添加後に、細胞を適切なより低温で２日インキュベーションし得る）。その後、トランスフェクションされ��細胞をウイルスのレスキューのプラーク拡大段階のために収穫するか、もしくは、収穫してＣＡＴアッセイのため細胞抽出物を調製する。トランスフェクションされた細胞を培地中に掻き取り、そして、５０％コンフルエントのベロ細胞の単層（もしくは選択すべき他の許容細胞型）を含有する１０ｃｍプレートもしくはＴ２５フラスコのいずれかに移す。共培養される細胞を３７℃（もしくは上に示されたような適切な温度）で４ないし６時間インキュベーションし、その後培地を交換する。この段階での培地の交換は、トランスフェクションされた細胞がＤＮＡ合成阻害剤を含有した場合に、プラーク拡大段階の間の共培養物中での細胞の成長の阻害を回避するために不可欠である。プラーク拡大段階を開始した後およそ４ないし５日にプラークが見え、そして細胞を収穫してレスキューされたウイルスの凍結融解ライセートストックを生じさせ得る。ＣＡＴアッセイの結果を以下の表４ａおよび４ｂに示す。ＢＥＳ／リン酸カルシウム処置は活性を高めた。
【００７９】
【表４】
0004625915.tif 000005
【００８０】
【表５】
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【００８１】
上のトランスフェクション技術については、チェン（Ｃｈｅｎ）ら、１９８７およびトグノン（Ｔｏｇｎｏｎ）ら、１９９６を参照されたい。
実施例１０
ＤＮＡ合成阻害剤、および強い初期／後期プロモーターの制御下にバクテリオファージＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを合成する組換え改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）の使用に基づく改良されたレスキュー
前述に基づき、ヘルパーＭＶＡ／Ｔ７のウイルスＤＮＡ複製を特異的に阻害することにより、われわれは、１．全部のＭＶＡ／Ｔ７の成長を封鎖する、２．感染した細胞でのＣＰＥをさらに低下させる、そして３．ＲＮＡウイルスの遺伝子レスキューの効率を高めることが可能であることが提案された。阻害剤（シトシンβ−Ｄ−アラビノフラノシド、ＡｒａＣおよび／もしくはヒドロキシ尿素）は、ウイルスのＤＮＡ合成、そしてその後ウイルスの中期および後期の遺伝子発現を封鎖する。強い合成の初期／後期ワクシニアウイルスプロモーターの転写制御下に単一コピーのＴ７遺伝子−１を含有する組換えＭＶＡ／Ｔ７（ＭＶＧＫ１６）を工作した。予備研究［ここでは、麻疹ミニゲノムおよび完全長の麻疹のｃＤＮＡの遺伝子レスキューのためのヘルパーウイルスとしてＭＶＧＫ１６を使用した］は、ＡｒａＣもしくはヒドロキシ尿素での感染した細胞の処理が異種ウイルスの遺伝子レスキューの増強をもたらすことを示した（データは示されない）。プラスミドおよびウイルス。われわれは、この研究に、ワクシニアウイルスのｐＳＣ６５発現／組換えプラスミドを選んだ。このプラスミドは、遺伝子的に工作されたウイルスの初期／後期プロモーターの調節下の外来遺伝子の発現を見込み；それは、ウイルスの７．５Ｋプロモーターの調節下にｌａｃＺ選択マーカーもまた提供する。Ｔ７遺伝子−１（モファット（Ｍｏｆｆａｔｔ）ら、１９８４）を、ｐＴ７−ｎｅｏ（リー（Ｓａｌｌｙ  Ｌｅｅ）博士、ワイス−レダリー  ヴァクシンズ（Ｗｙｅｔｈ−Ｌｅｄｅｒｌｅ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ）により提供された）からＢａｍＨＩフラグメントとして摘出し、そしてｐＳＣ６５（シャクラバルティ（Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ）ら、１９９７）のＢｇｌＩＩ部位にサブクローニングしてｐＧＫ１６．２を生じさせた（図６）。色素ターミネーター循環配列決定および３７７ＡＢＩ  ＤＮＡシークェンサー（アプライド  バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））を使用して、組換えプラスミドを配列決定した。
【００８２】
細胞あたり０．５プラーク形成単位（ＰＦＵ）に等しい感染多重度（ＭＯＩ）で、ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ；スパファス（Ｓｐａｆａｓ））をＭＶＡに感染させ、そしてドタップ（ＤＯＴＡＰ）トランスフェクション促進試薬（ベーリンガー  マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ））を使用してｐＧＫ１６．２でトランスフェクションした。ＭＶＡのＤＮＡでの相同的組換えは、ウイルスのｔｋ遺伝子の中断、ならびにＴ７遺伝子−１およびｌａｃＺの挿入をもたらす。Ｘ−ｇａｌ比色プラークアッセイを使用して、組換えウイルス（ＭＶＧＫ１６）をＣＥＦ細胞上で連続して３回プラーク精製した。組換えＭＶＧＫ１６は、Ｔ７ポリメラーゼおよびワクシニアウイルスに対するウサギポリクローナル抗血清での免疫染色により明示されるとおり、３回の連続するプラーク精製および４回のＣＥＦでの増幅を通じて安定であった（データは示されない）。
遺伝子レスキュー。Ｔ７転写のための初期／後期プロモーターを含有する発現系ＭＶＡ／ＧＫ１６で、上のＢＥＳ／リン酸カルシウム処置を反復した。ＢＥＳ／リン酸カルシウムのための上のレスキュープロトコルに対する改変を本明細書に示す。ＧＫ１６を使用する場合、ＤＮＡ合成阻害剤をこの段階で培地に添加する。シトシンアラビノシド（ａｒａＣ）もしくはヒドロキシ尿素（ＨＵ）のいずれかを、それぞれ１ｍｌあたり２０μｇもしくは１０ｍＭで培地に添加する。３％ＣＯ2に設定されたインキュベーター中で細胞を一夜インキュベーションする。ＢＥＳの実施例についての上のプロトコルに従うことにより、トランスフェクションおよび熱ショックを完了する。ＡｒａＣもしくはＨＵは、ＭＶＡ／ＧＫ１６に感染した培養物に補給する。標準的な３７℃および５％ＣＯ2に設定されたインキュベーター中で、細胞を追加の１日インキュベーションする（温度感受性ウイルスをレスキューしている場合は、新鮮な培地の添加後に、細胞を適切なより低温で２日インキュベーションし得る）。その後、トランスフェクションされた細胞をプラーク拡大段階のために収穫する。トランスフェクションされた細胞を培地中に掻き取り、そして、５０％コンフルエントのベロ細胞の単層（もしくは選択すべき他の許容細胞型）を含有する１０ｃｍプレートもしくはＴ２５フラスコのいずれかに移す。共培養される細胞を３７℃（もしくは適切な温度）で４ないし６時間インキュベーションし、その後培地を交換する。トランスフェクションされた細胞がＤＮＡ合成阻害剤を含有した場合にこの段階で培地を交換することはとりわけ重要である。プラーク拡大段階の間の共培養物での細胞の成長の阻害は望ましくない。プラーク拡大段階を開始した後およそ４ないし５日でプラークが見えるはずであり、そして細胞を収穫してレスキューされたウイルスの凍結融解ライセートストックを生じさせ得る。
遺伝子レスキュー実験。上のプロトコルは、レスキューの陽性の表示を伴うウェルの数の一貫した向上をもたらした。以下の表５を参照されたい。実験は、ベロ細胞での組換えウイルスの第一継代後にプラス（＋）もしくはマイナス（−）を評価する。陽性ウェル中のプラーク数は１から５０までの範囲にわたった。全部の実験は、一夜トランスフェクション、およびＭＶＡ／Ｔ７−ＧＫ１６を使用した場合はその後２４時間インキュベーション期間の間に、培地中に２０μｇ／ｍｌのＡｒａＣを含有した。第９日の実験については、ａｒａＣ  ＤＮＡ合成阻害剤の代わりに１０ｍＭのヒドロキシ尿素を用いた。
【００８３】
【表６】
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【００８４】
以下に、本明細書に組み込まれた参考文献の一覧を提供する。
【００８５】
【表７】
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【００８６】
【表８】
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【００８７】
【表９】
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【００８８】
【表１０】
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【００８９】
【表１１】
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【００９０】
【表１２】
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【００９１】
【表１３】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  発明にかかる、改変レスキュー処置の流れ図を描く。本処置は、熱ショック段階の使用、およびベロ細胞の単層へトランスフェクションされた細胞を移すことを包含する。
【図２】  発明にかかる、ＣＡＴアッセイの使用による実施例４からのミニレプリコン遺伝子発現に対する熱ショックの影響を示すオートラジオグラムである。
【図３】  発明にかかる、実施例５のミニレプリコンＲＮＡトランスフェクション実験のＣＡＴアッセイの結果を示すオートラジオグラムである。
【図４Ａ】  発明にかかる、ｈｓｐ７０によるミニレプリコン遺伝子発現の刺激に関する、実施例６の実験でのＣＭＶ発現ベクターから発現されるエピトープ標識に特異的な抗体を使用するウェスタンブロットである。
【図４Ｂ】  発明にかかる、ｈｓｐ７０発現ベクター、ミニレプリコンＤＮＡおよびＬ発現プラスミドでの２９３−３−４６細胞のコトランスフェクションからのＣＡＴアッセイの結果を示すオートラジオグラムである。
【図５】  発明にかかる、実施例２に記述されるような熱ショックの影響を試験するため実施した６回の独立したレスキュー実験からのプラークカウントを描く表（表１）である。熱ショック処置の利点が明確に示される。
【図６】  発明にかかる、実施例１０からのＴ７遺伝子−１を含有するプラスミドｐＧＫ１６．２の図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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