(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、糖尿病、糖尿病性腎症または糖尿病性神経障害の予防・治療物質のスクリーニング方法：
（１）配列番号：２で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩と被験物質を接触させる工程、
（２）前記蛋白質の活性を測定する工程、
（３）被験物質を接触させない対照と比較する工程、及び
（４）糖尿病、糖尿病性腎症または糖尿病性神経障害の予防・治療物質として、活性を低下させる物質を選択する工程。
【請求項２】
以下の工程を含む、慢性閉塞性肺疾患の予防・治療物質のスクリーニング方法：
（１）配列番号：２で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩と被験物質を接触させる工程、
（２）前記蛋白質の活性を測定する工程、
（３）被験物質を接触させない対照と比較する工程、及び
（４）慢性閉塞性肺疾患の予防・治療物質として、活性を低下させる物質を選択する工程。
【請求項３】
（１）から（３）の工程が、配列番号：２で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩を産生する能力を有する細胞を被験物質の存在下および非存在下に培養し、両条件下における該蛋白質またはその塩の活性を比較することにより行われる、請求項１記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
（１）から（３）の工程が、配列番号：２で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩を産生する能力を有する細胞を被験物質の存在下および非存在下に培養し、両条件下における該蛋白質またはその塩の活性を比較することにより行われる、請求項２記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
以下の工程を含む、糖尿病、糖尿病性腎症または糖尿病性神経障害の予防・治療物質のスクリーニング方法：
（１）配列番号：２で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩を産生する能力を有する細胞に被験物質を接触させる工程、
（２）被験物質と接触させた細胞における前記蛋白質またはその塩をコードするｍＲＮＡの量を測定する工程、
（３）被験物質を接触させない対照と比較する工程、及び
（４）糖尿病、糖尿病性腎症または糖尿病性神経障害の予防・治療物質として、ｍＲＮＡの量を低下させる物質を選択する工程。
【請求項６】
以下の工程を含む、慢性閉塞性肺疾患の予防・治療物質のスクリーニング方法：
（１）配列番号：２で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩を産生する能力を有する細胞に被験物質を接触させる工程、
（２）被験物質と接触させた細胞における前記蛋白質またはその塩をコードするｍＲＮＡの量を測定する工程、
（３）被験物質を接触させない対照と比較する工程、及び
（４）慢性閉塞性肺疾患の予防・治療物質として、ｍＲＮＡの量を低下させる物質を選択する工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｓｉｇｎａｌ−ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ  ｋｉｎａｓｅ  １（ＡＳＫ１）、それをコードする核酸およびそれに対する抗体の新規用途、特に、アポトーシスまたは炎症関連疾患（例えば、糖尿病およびその合併症、または慢性閉塞性肺疾患）の予防・治療に有効な薬剤のスクリーニングのためのＡＳＫ１またはそれをコードする核酸の使用などに関する。
【背景技術】  Ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＭＡＰ）キナーゼカスケードは物理化学的ストレスや腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、インターロイキン−１（ＩＬ−１）などの炎症性サイトカインによって活性化されたＭＡＰキナーゼキナーゼキナーゼ（ＭＡＰＫＫＫ）が、ＭＡＰキナーゼキナーゼ（ＭＡＰＫＫ）、ＭＡＰキナーゼ（ＭＡＰＫ）を逐次活性化するシグナル伝達機構であり、細胞はこれらの刺激に応じて生存、増殖、分化、死（アポトーシス）などの表現型を示す。ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｋｉｎａｓｅ（ＪＮＫ）およびｐ３８  ＭＡＰ  ｋｉｎａｓｅ（ｐ３８）は、アポトーシスを誘導するシグナル伝達経路の一部を担うＭＡＰＫとして知られている（例えば、非特許文献１参照）。
ＪＮＫおよびｐ３８はＭＡＰＫＫであるＭＫＫ４／ＭＫＫ７およびＭＫＫ３／ＭＫＫ６によってそれぞれ活性化される。これらのＭＡＰＫＫはＡＳＫ１と呼ばれるＭＡＰＫＫＫによって活性化される（特許文献１、非特許文献２）。ＭＡＰＫＫＫはＡＳＫ１以外にも多数報告されているが、ＡＳＫ１は、ＪＮＫおよび／またはｐ３８の活性化を介したシグナル伝達を通じて、細胞にアポトーシスを誘導する能力を有することにより特徴づけられる。最近、ＡＳＫ１の活性化がケラチノサイトの分化やＰＣ１２細胞の神経突起伸長などの細胞分化にも関与することが示唆されており、ＡＳＫ１はアポトーシスに限らず細胞の運命のコントロールに重要な役割を果たしていることが明らかになってきている。
このように、ＡＳＫ１は細胞の以後の運命を左右する重要な分子であるが故に、その活性化／不活性化には様々な因子が関与し、複雑な制御を受けていると考えられる。例えば、ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ５（ＰＰ５）はＨ２Ｏ２刺激下でＡＳＫ１に直接結合し、スレオニンを脱リン酸化することで活性化されたＡＳＫ１を不活性状態に戻すと考えられている（非特許文献３）。また、レドックス制御因子であるチオレドキシンは、酸化ストレスのないときにはＡＳＫ１のＮ末端側ドメインと恒常的に結合してＡＳＫ１の活性化インヒビターとして働いており、酸化ストレスを与えるとＡＳＫ１から離れ、それによりＡＳＫ１の活性化が起こることや（非特許文献４）、１４−３−３蛋白質はＡＳＫ１のＣ末端側ドメインに結合することによりその活性化を阻害すること（非特許文献５）なども報告されている。
上述のように、ＡＳＫ１はＪＮＫ／ｐ３８経路を通じて細胞（特に不死化細胞）にアポトーシスを誘導し得ることから、該蛋白質が悪性腫瘍の形成／転移抑制に有効であることが示唆されている（特許文献１）。
一方、ＡＳＫ１ノックアウト（ＫＯ）マウスの細胞を小胞体ストレス誘発剤で処理すると、野生型マウスの細胞に比べてアポトーシスが有意に抑制されること、また、該ＫＯマウス細胞をＬＰＳで刺激すると、野生型マウス細胞に比べてサイトカイン・ケモカインの産生が有意に抑制されることから、ＡＳＫ１は小胞体ストレスによるアポトーシス誘導およびサイトカイン・ケモカイン産生と密接に関連しており、従って、上記のチオレドキシンや１４−３−３蛋白質等のＡＳＫ１阻害物質や、ＡＳＫ１ドミナントネガティブ変異体、ＡＳＫ１アンチセンスオリゴヌクレオチドなどは、神経変性疾患（例、ポリグルタミン病等）などの小胞体ストレス関連疾患および免疫疾患の予防・治療に有効であることが示唆されている（特許文献２、３）。
【特許文献１】特開平１０−９３号公報
【特許文献２】国際公開第０２／３８１７９号パンフレット
【特許文献３】国際公開第０３／００８２６号パンフレット
【非特許文献１】Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７０：１３２６（１９９５）
【非特許文献２】Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７５：９０−９４（１９９７）
【非特許文献３】ＥＭＥＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ，２０：６０２８−６０３６（２００１）
【非特許文献４】ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ，１７：２５９６−２６０６（１９９８）
【非特許文献５】Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＵＳＡ，９６：８５１１−８５１５（１９９９）
【発明の開示】
上述のように、ＡＳＫ１の生理的重要性や種々の疾患との関わりが次第に明らかになってきており、それらの疾患の予防・治療薬としての利用が提唱されている。しかしながら、ＡＳＫ１を創薬ターゲットとした上記疾患の予防・治療薬の探索手段については未だ報告がなされていない。従って、本発明の第一の目的は、ＡＳＫ１を用いた各種疾患の予防・治療薬のスクリーニング手段を提供することである。
また、上記した以外の疾患とＡＳＫ１との関連については未だ不明の点が多い（例えば、糖尿病やその合併症、あるいは慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）との関連性はこれまで報告されていない）。従って、本発明の第二の目的は、ＡＳＫ１とある疾患との未知の関連性を新たに見出し、それに基づいた当該疾患の新規予防・治療手段を提供することである。
糖尿病において高血糖の状態が長期間持続すると、糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症等の合併症を発症する。例えば、糖尿病性腎症の治療には、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤などが用いられているが、本薬剤は腎血行動態に影響を及ぼすために、高度の腎機能低下患者に用いることができない。また、糖尿病性神経障害の治療薬としてはアルドース還元酵素阻害剤が知られているが、発疹、下痢、肝・腎機能障害などの副作用を起こす場合があり、我が国以外では使用されていない。そのため、より安全且つ有効な糖尿病の合併症予防・治療薬の開発が望まれている。
従って、本発明の第三の目的は、糖尿病およびその合併症の新規予防・治療薬、並びにそのスクリーニング手段を提供することである。
慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）は、世界保健機関（ＷＨＯ）の統計では、現在、世界の死亡原因の第４位にランクされ（日本でも４０歳以上で５００万人を超える患者がいると推定されている）、今後さらに患者数の増加が予測されている。しかし、ＣＯＰＤの治療薬としては、抗コリン薬、β２刺激薬、テオフィリン製剤などの気管支拡張薬や、去痰薬あるいは急性増悪時におけるステロイド薬などが対症療法的に使用されているのみであり、根本的な病態改善を目的とした治療薬の開発が望まれている。
従って、本発明の第四の目的は、ＣＯＰＤの新規予防・治療薬、並びにそのスクリーニング手段を提供することである。
本発明者らは、上記の目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、ＡＳＫ１ノックアウトマウスにストレプトゾシンを投与して作製した糖尿病モデルでは、同様に処置した野生型マウスに比べて神経障害の進行が抑制されること、ＡＳＫ１ノックアウトマウスでは、野生型マウスに比べて高脂肪食下での血糖値上昇が有意に抑制されること、並びに糖尿病性腎症モデル（ｄｂ／ｄｂ）マウスでは、正常マウスに比べて腎臓でのＡＳＫ１発現量が増大していることを見出した。これらの結果は、ＡＳＫ１が糖尿病およびその合併症の発症・進行に深く関与しており、ＡＳＫ１の発現もしくは活性を阻害することは、糖尿病およびその合併症の予防および治療に有効であることを示すものである。
また、本発明者らは、ＡＳＫ１ノックアウトマウスをタバコ煙に曝露させて作製したＣＯＰＤモデルでは、同様に処置した野生型マウスに比べて肺における炎症性変化が抑制されることを見出した。さらに野生型マウスをタバコ煙に曝露することによって、肺における活性化ＡＳＫ１の発現量が増大していることを見出した。
本発明者らは、これらの知見に基づいてさらに研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、
［１］配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を用いることを特徴とする、アポトーシスまたは炎症関連疾患の予防・治療物質のスクリーニング方法、
［２］配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を用いることを特徴とする、糖尿病またはその合併症の予防・治療物質のスクリーニング方法、
［３］配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を用いることを特徴とする、慢性閉塞性肺疾患の予防・治療物質のスクリーニング方法、
［４］被験物質の存在下および非存在下における、配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を比較することを特徴とする、上記［１］〜［３］のいずれかに記載のスクリーニング方法、
［５］配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を産生する能力を有する細胞を被験物質の存在下および非存在下に培養し、両条件下における該蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を比較することを特徴とする、上記［４］記載のスクリーニング方法、
［６］配列番号：２で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を用いることを特徴とする、上記［１］〜［３］のいずれかに記載のスクリーニング方法、
［７］合併症が糖尿病性腎症または糖尿病性神経障害である上記［２］記載のスクリーニング方法、
［８］配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を産生する能力を有する細胞における該蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の発現を、被験物質の存在下と非存在下とで比較することを特徴とする、アポトーシスまたは炎症関連疾患の予防・治療物質のスクリーニング方法、
［９］配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を産生する能力を有する細胞における該蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の発現を、被験物質の存在下と非存在下とで比較することを特徴とする、糖尿病またはその合併症の予防・治療物質のスクリーニング方法、
［１０］配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を産生する能力を有する細胞における該蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の発現を、被験物質の存在下と非存在下とで比較することを特徴とする、慢性閉塞性肺疾患の予防・治療物質のスクリーニング方法、
［１１］配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質をコードする塩基配列またはその一部を含有する核酸、あるいは配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を用いることを特徴とする、上記［８］〜［１０］のいずれかに記載のスクリーニング方法、
［１２］細胞が配列番号：２で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を産生する能力を有するものである、上記［８］〜［１０］のいずれかに記載のスクリーニング方法、
［１３］合併症が糖尿病性腎症または糖尿病性神経障害である上記［９］記載のスクリーニング方法、
［１４］配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を含有してなるアポトーシスまたは炎症関連疾患の予防・治療剤、
［１５］配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体の有効量を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物におけるアポトーシスまたは炎症関連疾患の予防・治療方法、
［１６］アポトーシスまたは炎症関連疾患の予防・治療剤の製造のための、配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体の使用、
［１７］配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を含有してなる糖尿病またはその合併症の予防・治療剤、
［１８］配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体の有効量を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物における糖尿病またはその合併症の予防・治療方法、
［１９］糖尿病またはその合併症の予防・治療剤の製造のための、配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体の使用、
［２０］合併症が糖尿病性腎症または糖尿病性神経障害である上記［１７］記載の予防・治療剤、
［２１］配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を含有してなる慢性閉塞性肺疾患の予防・治療剤、
［２２］配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体の有効量を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物における慢性閉塞性肺疾患の予防・治療方法、
［２３］慢性閉塞性肺疾患の予防・治療剤の製造のための、配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体の使用、
［２４］配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質をコードする塩基配列と相補的な塩基配列またはその一部を含有する核酸を含有してなる２型糖尿病または糖尿病合併症の予防・治療剤、
［２５］配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質をコードする塩基配列と相補的な塩基配列またはその一部を含有する核酸の有効量を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物における２型糖尿病または糖尿病合併症の予防・治療方法、
［２６］２型糖尿病または糖尿病合併症の予防・治療剤の製造のための、配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質をコードする塩基配列と相補的な塩基配列またはその一部を含有する核酸の使用、
［２７］糖尿病合併症が糖尿病性腎症または糖尿病性神経障害である上記［２４］記載の予防・治療剤、
［２８］配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質をコードする塩基配列と相補的な塩基配列またはその一部を含有する核酸を含有してなる慢性閉塞性肺疾患の予防・治療剤、
［２９］配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質をコードする塩基配列と相補的な塩基配列またはその一部を含有する核酸の有効量を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物における慢性閉塞性肺疾患の予防・治療方法、
［３０］慢性閉塞性肺疾患の予防・治療剤の製造のための、配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質をコードする塩基配列と相補的な塩基配列またはその一部を含有する核酸の使用、
［３１］配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を含有してなるアポトーシスまたは炎症関連疾患の診断剤、
［３２］配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を用いることを含む、哺乳動物におけるアポトーシスまたは炎症関連疾患の診断方法、
［３３］アポトーシスまたは炎症関連疾患の診断剤の製造のための、配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体の使用、
［３４］配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を含有してなる糖尿病またはその合併症の診断剤、
［３５］配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を用いることを含む、哺乳動物における糖尿病またはその合併症の診断方法、
［３６］糖尿病またはその合併症の診断剤の製造のための、配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体の使用、
［３７］合併症が糖尿病性腎症または糖尿病性神経障害である上記［３４］記載の診断剤、
［３８］配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を含有してなる慢性閉塞性肺疾患の診断剤、
［３９］配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を用いることを含む、哺乳動物における慢性閉塞性肺疾患の診断方法、
［４０］慢性閉塞性肺疾患の診断剤の製造のための、配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体の使用、
［４１］配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質をコードする塩基配列またはその一部を含有する核酸を含有してなるアポトーシスまたは炎症関連疾患の診断剤、
［４２］配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質をコードする塩基配列またはその一部を含有する核酸の有効量を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物におけるアポトーシスまたは炎症関連疾患の診断方法、
［４３］アポトーシスまたは炎症関連疾患の診断剤の製造のための、配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質をコードする塩基配列またはその一部を含有する核酸の使用、
［４４］配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質をコードする塩基配列またはその一部を含有する核酸を含有してなる糖尿病またはその合併症の診断剤、
［４５］配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質をコードする塩基配列またはその一部を含有する核酸の有効量を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物における糖尿病またはその合併症の診断方法、
［４６］糖尿病またはその合併症の診断剤の製造のための、配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質をコードする塩基配列またはその一部を含有する核酸の使用、
［４７］合併症が糖尿病性腎症または糖尿病性神経障害である上記［４４］記載の診断剤、
［４８］配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質をコードする塩基配列またはその一部を含有する核酸を含有してなる慢性閉塞性肺疾患の診断剤、
［４９］配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質をコードする塩基配列またはその一部を含有する核酸の有効量を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物における慢性閉塞性肺疾患の診断方法、
［５０］慢性閉塞性肺疾患の診断剤の製造のための、配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質をコードする塩基配列またはその一部を含有する核酸の使用、
［５１］ＡＳＫ１阻害物質を含有してなる２型糖尿病または糖尿病合併症（糖尿病性神経障害を除く）の予防・治療剤、
［５２］ＡＳＫ１阻害物質の有効量を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物における２型糖尿病または糖尿病合併症（糖尿病性神経障害を除く）の予防・治療方法、
［５３］２型糖尿病または糖尿病合併症（糖尿病性神経障害を除く）の予防・治療剤の製造のための、ＡＳＫ１阻害物質の使用、
［５４］ＡＳＫ１阻害物質がＡＳＫ１のドミナントネガティブ変異体、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、ネフ、１４−３−３、チオレドキシンおよびＨＳＰ７２からなる群より選択される１以上の化合物である上記［５１］記載の予防・治療剤、
［５５］糖尿病合併症が糖尿病性腎症である上記［５１］記載の予防・治療剤、
［５６］ＡＳＫ１阻害物質を含有してなる慢性閉塞性肺疾患の予防・治療剤、
［５７］ＡＳＫ１阻害物質の有効量を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物における慢性閉塞性肺疾患の予防・治療方法、および
［５８］慢性閉塞性肺疾患の予防・治療剤の製造のための、ＡＳＫ１阻害物質の使用を提供する。
本発明のスクリーニング方法は、試験化合物のＡＳＫ１発現または活性調節作用を測定することにより、迅速かつ簡便にアポトーシスまたは炎症関連疾患の予防・治療に有効な化合物の候補を選択し得るという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】  図１は、Ｃ５７ＢＬ／ＫｓＪ  ｄｂ／ｄｂマウスおよびＣ５７ＢＬ／ＫｓＪ  ｄｂ／＋ｍマウスの腎組織におけるＡＳＫ１の発現量（パネルＡ）および活性（自己リン酸化活性）（パネルＢ）を示す。レーン１〜３：Ｃ５７ＢＬ／ＫｓＪ  ｄｂ／ｄｂマウス腎組織；レーン４〜６：Ｃ５７ＢＬ／ＫｓＪ  ｄｂ／＋ｍマウス腎組織；レーン７：ＨＥＫ２９３細胞（Ｈ２Ｏ２添加）；レーン８：ＨＥＫ２９３細胞（Ｈ２Ｏ２無添加）
図２は、タバコ煙曝露ＣＯＰＤモデルの肺組織におけるＡＳＫ１の発現量および活性（自己リン酸化活性）を示す。図２Ａはリン酸化ＡＳＫ１とＡＳＫ１のウェスタンブロッティングのイメージ（上パネル：リン酸化ＡＳＫ１、下パネル：ＡＳＫ１、各数値はタバコ煙曝露後の時間（ｈｒ）を示す）を、図２Ｂは、バンドを定量化（曝露前（ｐｒｅ）のバンド強度を１とした相対値）して、タバコ煙曝露後の時間（ｈｒ）に対してプロット（−◆−：リン酸化ＡＳＫ１、−■−：ＡＳＫ１）した結果をそれぞれ示している。
【発明を実施するための最良の形態】  本発明で用いられるＡＳＫ１は、配列番号：２に示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質である。
ＡＳＫ１は、温血動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマ、トリ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーなど）の細胞［例えば、肝細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、杯細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞、線維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくは癌細胞など］もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織［例えば、脳、脳の各部位（例、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉（例、骨格筋、平滑筋）、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、脂肪組織］などに由来する蛋白質であってよく、また、化学合成もしくは無細胞翻訳系で合成された蛋白質であってもよい。あるいは上記アミノ酸配列をコードする塩基配列を含有する核酸を導入された形質転換体から産生された組換え蛋白質であってもよい。
配列番号：２に示されるアミノ酸配列と「実質的に同一のアミノ酸配列」としては、配列番号：２に示されるアミノ酸配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上、特に好ましくは約９５％以上、最も好ましくは約９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。ここで「相同性」とは、当該技術分野において公知の数学的アルゴリズムを用いて２つのアミノ酸配列をアラインさせた場合の、最適なアラインメント（好ましくは、該アルゴリズムは最適なアラインメントのために配列の一方もしくは両方へのギャップの導入を考慮し得るものである）における、オーバーラップする全アミノ酸残基に対する同一アミノ酸および類似アミノ酸残基の割合（％）を意味する。「類似アミノ酸」とは物理化学的性質において類似したアミノ酸を意味し、例えば、芳香族アミノ酸（Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ）、脂肪族アミノ酸（Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ）、極性アミノ酸（Ｇｌｎ、Ａｓｎ）、塩基性アミノ酸（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ）、酸性アミノ酸（Ｇｌｕ、Ａｓｐ）、水酸基を有するアミノ酸（Ｓｅｒ、Ｔｈｒ）、側鎖の小さいアミノ酸（Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ）などの同じグループに分類されるアミノ酸が挙げられる。このような類似アミノ酸による置換は蛋白質の表現型に変化をもたらさない（即ち、保存的アミノ酸置換である）ことが予測される。保存的アミノ酸置換の具体例は当該技術分野で周知であり、種々の文献に記載されている（例えば、Ｂｏｗｉｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７：１３０６−１３１０（１９９０）を参照）。
本明細書におけるアミノ酸配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）を用い、以下の条件（期待値＝１０；ギャップを許す；マトリクス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；フィルタリング＝ＯＦＦ）にて計算することができる。アミノ酸配列の相同性を決定するための他のアルゴリズムとしては、例えば、Ｋａｒｌｉｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：５８７３−５８７７（１９９３）に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０）に組み込まれている（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５：３３８９−３４０２（１９９７））］、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４４−４５３（１９７０）に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラムに組み込まれている］、ＭｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒ，ＣＡＢＩＯＳ，４：１１−１７（１９８８）に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはＣＧＣ配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０）に組み込まれている］、Ｐｅａｒｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：２４４４−２４４８（１９８８）に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＦＡＳＴＡプログラムに組み込まれている］等が挙げられ、それらも同様に好ましく用いられ得る。
より好ましくは、「実質的に同一のアミノ酸配列」とは、配列番号：２に示されるアミノ酸配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上、特に好ましくは約９５％以上、最も好ましくは約９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列である。
配列番号：２に示されるアミノ酸配列と「実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質」としては、例えば、前記の配列番号：２に示されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号：２に示されるアミノ酸配列を含有する蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質などが好ましい。
「実質的に同質の活性」としては、例えば、ＡＳＫ１の自己リン酸化またはそのカスケードの下流に位置するキナーゼ群（例、ＭＫＫ４／ＭＫＫ７、ＭＫＫ３／ＭＫＫ６、ＪＮＫ、ｐ３８など）のリン酸化（活性化）促進活性、細胞のアポトーシス誘導活性などが挙げられる。実質的に同質とは、それらの性質が質的に（例、生理学的に、または薬理学的に）同様であることを示す。したがって、ＡＳＫ１カスケード活性化促進等の活性が同等であることが好ましいが、これらの活性の程度、蛋白質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい（例えば、活性については、約０．０１〜１００倍、好ましくは約０．１〜１０倍、より好ましくは０．５〜２倍の範囲内が挙げられる）。
ＡＳＫ１の自己リン酸化活性またはＡＳＫ１カスケード活性化促進活性の測定は、公知の方法、例えば、標識したリン酸基供与体を用いてＡＳＫ１の自己リン酸化またはそのカスケードの下流に位置するキナーゼ群（例、ＭＫＫ４／ＭＫＫ７、ＭＫＫ３／ＭＫＫ６、ＪＮＫ、ｐ３８など）等のＡＳＫ１の基質となり得る物質のリン酸化を検出することなどによって、また、アポトーシス誘導活性の測定は、細胞死誘導率の測定、細胞の形態学的観察、ＤＮＡ断片化の検出等によって行うことができる。
また、本発明で用いられるＡＳＫ１には、例えば、（１）配列番号：２に示されるアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜３００個程度、好ましくは１〜１００個程度より好ましくは１〜５０個程度、さらに好ましくは１〜１０個程度、最も好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（２）配列番号：２に示されるアミノ酸配列に１または２個以上（例えば１〜３００個程度、好ましくは１〜１００個程度より好ましくは１〜５０個程度、さらに好ましくは１〜１０個程度、最も好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、（３）配列番号：２に示されるアミノ酸配列に１または２個以上（例えば１〜３００個程度、好ましくは１〜１００個程度、より好ましくは１〜５０個程度、さらに好ましくは１〜１０個程度、最も好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、（４）配列番号：２に示されるアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜３００個程度、好ましくは１〜１００個程度、より好ましくは１〜５０個程度、さらに好ましくは１〜１０個程度、最も好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または（５）それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有する蛋白質も含まれる。
上記のようにアミノ酸配列が挿入、欠失または置換されている場合、その挿入、欠失または置換の位置は、ＡＳＫ１の活性［例：ＡＳＫ１の自己リン酸化またはその下流に位置するキナーゼ群（例、ＭＫＫ４／ＭＫＫ７、ＭＫＫ３／ＭＫＫ６、ＪＮＫ、ｐ３８など）のリン酸化（活性化）促進活性、細胞のアポトーシス誘導活性など］が保持される限り特に限定されない。
本発明で用いられるＡＳＫ１は、好ましくは、配列番号：２に示されるアミノ酸配列を有するヒトＡＳＫ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＢＡＡ１２６８４）もしくはそのアレル変異体［例、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＮＰ＿００５９１４（配列番号：２に示されるアミノ酸配列において１アミノ酸の欠失（ΔＡ９６０）と２アミノ酸の置換（Ｙ７６３Ｓ、Ｉ１３０９Ｔ）を有する）等］、または他の温血動物（例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマ、トリ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーなど）におけるそのオルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）［例、マウスオルソログとしては、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＢＡＡ２３６４８（配列番号：２に示されるアミノ酸配列と約９２％同一性を有する）等］である。
本明細書に記載される蛋白質およびペプチドは、ペプチド標記の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）である。配列番号：２に示されるアミノ酸配列を含有する蛋白質をはじめとするＡＳＫ１は、Ｃ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ−）、アミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）の何れであってもよい。
ここでエステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチルなどのＣ１−６アルキル基；例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ３−８シクロアルキル基；例えば、フェニル、α−ナフチルなどのＣ６−１２アリール基；例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ１−２アルキル基；α−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ１−２アルキル基などのＣ７−１４アラルキル基；ピバロイルオキシメチル基などが用いられる。
ＡＳＫ１がＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明のＡＳＫ１に含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。
さらに、ＡＳＫ１には、Ｎ末端のアミノ酸残基（例、メチオニン残基）のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ１−６アルカノイルなどのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、生体内で切断されて生成するＮ末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ１−６アルカノイル基などのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖蛋白質などの複合蛋白質なども含まれる。
本発明で用いられるＡＳＫ１の部分ペプチドは、上記したＡＳＫ１の部分アミノ酸配列を含有し、且つＡＳＫ１と実質的に同質の活性を有するペプチドである。ここで「実質的に同質の活性」とは上記と同意義を示す。また、「実質的に同質の活性」の測定は上記と同様にして行うことができる。本明細書においては、当該部分ペプチドを、以下「本発明の活性ペプチド」と称することとする。
本発明の活性ペプチドは、上記の性質を有する限り特に制限されないが、例えば、配列番号：２に示されるアミノ酸配列中約２５０アミノ酸以上、好ましくは約５００アミノ酸以上、より好ましくは約１０００アミノ酸以上からなる部分アミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドなどが挙げられる。該部分アミノ酸配列はＡＳＫ１のＮ末端側配列であっても、Ｃ末端側配列であってもよいし、内部配列であってもよい。あるいは、それらの部分配列の断続的な組み合わせであってもよい。好ましくは、本発明の活性ペプチドは、蛋白質リン酸化活性を有するセリン／スレオニン・プロテインキナーゼ触媒ドメイン（例えばヒトＡＳＫ１の場合、配列番号：２に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号６７８〜９３６で示される部分アミノ酸配列）を少なくとも含有するＡＳＫ１の部分ペプチドである。
一方、ＡＳＫ１の部分ペプチドの中には、ＡＳＫ１もしくは上記した本発明の活性ペプチドの（拮抗）阻害物質として機能し得るものが含まれる。かかる部分ペプチドとしては、例えば、ＡＳＫ１の基質蛋白質であるＭＫＫ４／ＭＫＫ７またはＭＫＫ３／ＭＫＫ６に対する親和性を有するが、該ＭＡＰＫＫを活性化し得ないものなどが挙げられる。具体的には、例えば、上記セリン／スレオニン・プロテインキナーゼ触媒ドメインの一部もしくは全部を欠失する部分ペプチドなどが挙げられる。ＡＳＫ１のキナーゼ触媒ドメインとしては、例えばヒトＡＳＫ１の場合、上記した部分アミノ酸配列が挙げられる。
本明細書においては、当該部分ペプチドを以下「本発明の阻害ペプチド」と称することとする。すなわち、本発明の阻害ペプチドは、配列番号：２に示されるアミノ酸配列の一部と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、且つＡＳＫ１シグナルカスケードの下流に位置するキナーゼ群を活性化しないペプチドである。
ＡＳＫ１の部分ペプチド（本発明の活性ペプチドおよび本発明の阻害ペプチドの両者を包含する；以下、このような場合には「本発明の部分ペプチド」と称することがある）は、Ｃ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ−）、アミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）の何れであってもよい。ここでエステルにおけるＲとしては、ＡＳＫ１について前記したと同様のものが挙げられる。これらのペプチドがＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明の部分ペプチドに含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。
さらに、本発明の部分ペプチドには、上記したＡＳＫ１と同様に、Ｎ末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基で保護されているもの、Ｎ端側が生体内で切断され生成したＧｌｎがピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなども含まれる。
ＡＳＫ１またはその部分ペプチドの塩としては、酸または塩基との生理学的に許容される塩が挙げられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。
ＡＳＫ１またはその塩は、前述した温血動物の細胞または組織から自体公知の蛋白質の精製方法によって調製することができる。具体的には、温血動物の組織または細胞をホモジナイズし、可溶性画分を逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー等で分離精製することによって、ＡＳＫ１またはその塩を製造することができる。
ＡＳＫ１またはその部分ペプチドは、公知のペプチド合成法に従って製造することもできる。
ペプチド合成法は、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれであってもよい。ＡＳＫ１を構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合し、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的とする蛋白質を製造することができる。
ここで、縮合や保護基の脱離は、自体公知の方法、例えば、以下の（１）〜（５）に記載された方法に従って行われる。
（１）Ｍ．ＢｏｄａｎｓｚｋｙおよびＭ．Ａ．Ｏｎｄｅｔｔｉ、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９６６年）
（２）ＳｃｈｒｏｅｄｅｒおよびＬｕｅｂｋｅ、Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９６５年）
（３）泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、丸善（株）（１９７５年）
（４）矢島治明および榊原俊平、生化学実験講座１、蛋白質の化学ＩＶ、２０５、（１９７７年）
（５）矢島治明監修、続医薬品の開発、第１４巻、ペプチド合成、広川書店
このようにして得られたＡＳＫ１またはその部分ペプチドは、公知の精製法により単離・精製することができる。ここで、精製法としては、例えば、溶媒抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、再結晶、これらの組み合わせなどが挙げられる。
上記方法で得られるＡＳＫ１またはその部分ペプチドが遊離体である場合には、該遊離体を公知の方法あるいはそれに準じる方法によって適当な塩に変換することができるし、逆にＡＳＫ１またはその部分ペプチドが塩として得られた場合には、該塩を公知の方法あるいはそれに準じる方法によって遊離体または他の塩に変換することができる。
ＡＳＫ１またはその部分ペプチドの合成には、通常市販の蛋白質合成用樹脂を用いることができる。そのような樹脂としては、例えば、クロロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、アミノメチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、ＰＡＭ樹脂、４−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセトアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル）フェノキシ樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃアミノエチル）フェノキシ樹脂などを挙げることができる。このような樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的とする蛋白質もしくはペプチドの配列通りに、自体公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合させる。反応の最後に樹脂から蛋白質（ペプチド）を切り出すと同時に各種保護基を除去し、さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフィド結合形成反応を実施し、目的の蛋白質（ペプチド）またはそのアミド体を取得する。
上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、蛋白質合成に使用できる各種活性化試薬を用いることができるが、特に、カルボジイミド類がよい。カルボジイミド類としては、ＤＣＣ、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドなどが用いられる。これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤（例えば、ＨＯＢｔ、ＨＯＯＢｔ）とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するか、または、対称酸無水物またはＨＯＢｔエステルあるいはＨＯＯＢｔエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活性化を行なった後に樹脂に添加することができる。
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒は、蛋白質縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドンなどの酸アミド類、塩化メチレン、クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素類、トリフルオロエタノールなどのアルコール類、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、ピリジンなどのアミン類、ジオキサン、テトラヒドロフランなどのエーテル類、アセトニトリル、プロピオニトリルなどのニトリル類、酢酸メチル，酢酸エチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。反応温度は蛋白質結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜選択され、通常約−２０℃〜５０℃の範囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は通常１．５〜４倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行うことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行なうことができる。反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはアセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化することができる。
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護および用いられる保護基、その保護基の脱離、並びに反応に関与する官能基の活性化などは、公知の基または公知の手段から適宜選択しうる。
原料のアミノ基の保護基としては、例えば、Ｚ、Ｂｏｃ、ターシャリーペンチルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、Ｃｌ−Ｚ、Ｂｒ−Ｚ、アダマンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロイル、ホルミル、２−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフィノチオイル、Ｆｍｏｃなどが用いられる。
カルボキシル基は、例えば、アルキルエステル化（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ターシャリーブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、２−アダマンチルなどの直鎖状、分枝状もしくは環状アルキルエステル化）、アラルキルエステル化（例えば、ベンジルエステル、４−ニトロベンジルエステル、４−メトキシベンジルエステル、４−クロロベンジルエステル、ベンズヒドリルエステル化）、フェナシルエステル化、ベンジルオキシカルボニルヒドラジド化、ターシャリーブトキシカルボニルヒドラジド化、トリチルヒドラジド化などによって保護することができる。
セリンの水酸基は、例えば、エステル化またはエーテル化によって保護することができる。このエステル化に適する基としては、例えば、アセチル基などの低級アルカノイル基、ベンゾイル基などのアロイル基、ベンジルオキシカルボニル基、エトキシカルボニル基などの炭酸から誘導される基などが用いられる。また、エーテル化に適する基としては、例えば、ベンジル基、テトラヒドロピラニル基、ｔ−ブチル基などである。
チロシンのフェノール性水酸基の保護基としては、例えば、Ｂｚｌ、Ｃｌ２−Ｂｚｌ、２−ニトロベンジル、Ｂｒ−Ｚ、ターシャリーブチルなどが用いられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、例えば、Ｔｏｓ、４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル、ＤＮＰ、ベンジルオキシメチル、Ｂｕｍ、Ｂｏｃ、Ｔｒｔ、Ｆｍｏｃなどが用いられる。
保護基の除去（脱離）方法としては、例えば、Ｐｄ−黒あるいはＰｄ−炭素などの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、また、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理や、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピペリジン、ピペラジンなどによる塩基処理、また液体アンモニア中ナトリウムによる還元なども用いられる。上記酸処理による脱離反応は、一般に約−２０℃〜４０℃の温度で行なわれるが、酸処理においては、例えば、アニソール、フェノール、チオアニソール、メタクレゾール、パラクレゾール、ジメチルスルフィド、１，４−ブタンジチオール、１，２−エタンジチオールなどのようなカチオン捕捉剤の添加が有効である。また、ヒスチジンのイミダゾール保護基として用いられる２，４−ジニトロフェニル基はチオフェノール処理により除去され、トリプトファンのインドール保護基として用いられるホルミル基は上記の１，２−エタンジチオール、１，４−ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、希水酸化ナトリウム溶液、希アンモニアなどによるアルカリ処理によっても除去される。
原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、例えば、対応する酸無水物、アジド、活性エステル〔アルコール（例えば、ペンタクロロフェノール、２，４，５−トリクロロフェノール、２，４−ジニトロフェノール、シアノメチルアルコール、パラニトロフェノール、ＨＯＮＢ、Ｎ−ヒドロキシスクシミド、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、ＨＯＢｔ）とのエステル〕などが用いられる。原料のアミノ基の活性化されたものとしては、例えば、対応するリン酸アミドが用いられる。
蛋白質（ペプチド）のアミド体を得る別の方法としては、例えば、まず、蛋白質（ペプチド）を構成する部分ペプチドの各Ｃ末端アミノ酸のα−カルボキシル基をアミド化して保護し、アミノ基側にペプチド鎖を所望の鎖長（隣接する部分ペプチドのＣ末端アミノ酸と連結されるべきアミノ酸）まで延ばした後、Ｃ末端側ペプチド鎖のＮ末端アミノ酸のα−アミノ基の保護基のみを除いたペプチドと、Ｎ末端側ペプチド鎖のＣ末端アミノ酸のカルボキシル基の保護基のみを除いたペプチドとを製造し、これらのペプチドを上記したような混合溶媒中で縮合させる方法が挙げられる。縮合反応の詳細については上記と同様である。縮合により得られた保護蛋白質（保護ペプチド）を精製した後、上記方法によって保護基を除去し、所望の粗蛋白質（粗ペプチド）を得ることができる。この粗蛋白質（粗ペプチド）は既知の各種精製手段を駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥することで所望の蛋白質（ペプチド）のアミド体を得ることができる。
蛋白質（ペプチド）のエステル体は、例えば、Ｃ末端アミノ酸のα−カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合してアミノ酸エステルとした後、上記のアミド体の場合と同様に処理して得ることができる。
本発明の部分ペプチドまたはその塩は、ＡＳＫ１またはその塩を適当なペプチダーゼで切断することによっても製造することができる。
さらに、本発明のＡＳＫ１またはその部分ペプチドは、それをコードする核酸を含有する形質転換体を培養し、得られる培養物からＡＳＫ１またはその部分ペプチドを分離精製することによって製造することもできる。
ＡＳＫ１またはその部分ペプチドをコードする核酸はＤＮＡであってもＲＮＡであってもよく、あるいはＤＮＡ／ＲＮＡキメラであってもよい。好ましくはＤＮＡが挙げられる。また、該核酸は二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ：ＲＮＡのハイブリッドでもよい。一本鎖の場合は、センス鎖（即ち、コード鎖）であっても、アンチセンス鎖（即ち、非コード鎖）であってもよい。
ＡＳＫ１またはその部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、ゲノムＤＮＡ、温血動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマ、トリ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーなど）のあらゆる細胞［例えば、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、線維芽細胞、線維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくは癌細胞などや血球系の細胞］、あるいはそれらの細胞が存在するあらゆる組織［例えば、脳、脳の各部位（例、嗅球、扁頭核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、視床下核、大脳皮質、延髄、小脳、後頭葉、前頭葉、側頭葉、被殻、尾状核、脳梁、黒質）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉（例、骨格筋、平滑筋）、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、末梢血球、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、脂肪組織など］由来のｃＤＮＡ、合成ＤＮＡなどが挙げられる。ＡＳＫ１またはその部分ペプチドをコードするゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡは、上記した細胞・組織より調製したゲノムＤＮＡ画分および全ＲＮＡもしくはｍＲＮＡ画分をそれぞれ鋳型として用い、Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（以下、「ＰＣＲ法」と略称する）およびＲｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ−ＰＣＲ（以下、「ＲＴ−ＰＣＲ法」と略称する）によって直接増幅することもできる。あるいは、ＡＳＫ１またはその部分ペプチドをコードするゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡは、上記した細胞・組織より調製したゲノムＤＮＡおよび全ＲＮＡもしくはｍＲＮＡの断片を適当なベクター中に挿入して調製されるゲノムＤＮＡライブラリーおよびｃＤＮＡライブラリーから、コロニーもしくはプラークハイブリダイゼーション法またはＰＣＲ法などにより、それぞれクローニングすることもできる。ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。
ＡＳＫ１をコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：１に示される塩基配列を含有するＤＮＡ、あるいは配列番号：１に示される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、前記した配列番号：２に示されるアミノ酸配列を含有する蛋白質と実質的に同質の活性（例、ＡＳＫ１カスケード活性化促進活性、アポトーシス誘導活性など）を有する蛋白質をコードするＤＮＡなどが挙げられる。
配列番号：１に示される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：１に示される塩基配列と約６０％以上、好ましくは約７０％以上、さらに好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
本明細書における塩基配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）を用い、以下の条件（期待値＝１０；ギャップを許す；フィルタリング＝ＯＮ；マッチスコア＝１；ミスマッチスコア＝−３）にて計算することができる。塩基配列の相同性を決定するための他のアルゴリズムとしては、上記したアミノ酸配列の相同性計算アルゴリズムが同様に好ましく例示される。
ハイブリダイゼーションは、自体公知の方法あるいはそれに凖じる方法、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，第２版（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、ハイブリダイゼーションは、該ライブラリーに添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。ハイブリダイゼーションは、好ましくは、ハイストリンジェントな条件に従って行なうことができる。
ハイストリンジェントな条件としては、例えば、ナトリウム塩濃度が約１９〜約４０ｍＭ、好ましくは約１９〜約２０ｍＭで、温度が約５０〜約７０℃、好ましくは約６０〜約６５℃の条件等が挙げられる。特に、ナトリウム塩濃度が約１９ｍＭで温度が約６５℃の場合が好ましい。当業者は、ハイブリダイゼーション溶液の塩濃度、ハイブリダゼーション反応の温度、プローブ濃度、プローブの長さ、ミスマッチの数、ハイブリダイゼーション反応の時間、洗浄液の塩濃度、洗浄の温度等を適宜変更することにより、所望のストリンジェンシーに容易に調節することができる。
ＡＳＫ１をコードするＤＮＡは、好ましくは配列番号：１に示される塩基配列を含有するヒトＡＳＫ１  ＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｄ８４４７６）もしくはそのアレル変異体（例、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＮＭ＿００５９２３）、または他の温血動物（例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマ、トリ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーなど）におけるそのオルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）［例、マウスオルソログとしては、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＢ００６７８７（配列番号：１に示される塩基配列と約８６％同一性を有する）等が挙げられる］である。
本発明の部分ペプチドをコードするＤＮＡは、配列番号：２に示されるアミノ酸配列の一部と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むものであればいかなるものであってもよい。また、ゲノムＤＮＡ、上記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、合成ＤＮＡのいずれでもよい。
具体的には、本発明の部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、
（１）配列番号：１に示される塩基配列を有するＤＮＡの部分塩基配列、または
（２）配列番号：１に示される塩基配列を有するＤＮＡとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、且つ
（ａ）該ＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を含む蛋白質と実質的に同質の活性（例、ＡＳＫ１カスケード活性化促進活性、アポトーシス誘導活性など）、または
（ｂ）該ＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を含む蛋白質の活性を阻害する活性（例、ＡＳＫ１カスケード活性化阻害活性、アポトーシス抑制活性など）
を有するペプチドをコードするＤＮＡなどが用いられる。
配列番号：１に示される塩基配列を有するＤＮＡとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、該塩基配列中の対応する部分と約６０％以上、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
ＡＳＫ１またはその部分ペプチドをコードするＤＮＡは、該蛋白質またはペプチドをコードする塩基配列の一部分を有する合成ＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ法によって増幅するか、または適当な発現ベクターに組み込んだＤＮＡを、本発明の蛋白質の一部あるいは全領域をコードするＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを標識したものとハイブリダイゼーションすることによってクローニングすることができる。ハイブリダイゼーションは、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，第２版（前述）に記載の方法などに従って行うことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、ハイブリダイゼーションは、該ライブラリーに添付された使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。
ＤＮＡの塩基配列は、公知のキット、例えば、ＭｕｔａｎＴＭ−ｓｕｐｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｋｍ（宝酒造（株））、ＭｕｔａｎＴＭ−Ｋ（宝酒造（株））等を用いて、ＯＤＡ−ＬＡ  ＰＣＲ法、Ｇａｐｐｅｄｄｕｐｌｅｘ法、Ｋｕｎｋｅｌ法等の自体公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って変換することができる。
クローン化されたＤＮＡは、目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化するか、リンカーを付加した後に、使用することができる。該ＤＮＡはその５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することができる。
上記のＡＳＫ１またはその部分ペプチドをコードするＤＮＡを含む発現ベクターで宿主を形質転換し、得られる形質転換体を培養することによって、該蛋白質またはペプチドを製造することができる。
ＡＳＫ１またはその部分ペプチドをコードするＤＮＡを含む発現ベクターは、例えば、ＡＳＫ１をコードするＤＮＡから目的とするＤＮＡ断片を切り出し、該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。
発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３）；枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４）；酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５）；λファージなどのバクテリオファージ；レトロウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルスなどの動物ウイルス；ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏなどが用いられる。
プロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。
例えば、宿主が動物細胞である場合、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、ＨＳＶ−ＴＫプロモーターなどが用いられる。なかでも、ＣＭＶプロモーター、ＳＲαプロモーターなどが好ましい。
宿主がエシェリヒア属菌である場合、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーター、Ｔ７プロモーターなどが好ましい。
宿主がバチルス属菌である場合、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなどが好ましい。
宿主が酵母である場合、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。
宿主が昆虫細胞である場合、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが好ましい。
発現ベクターとしては、上記の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）などを含有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ｄｈｆｒと略称する場合がある）遺伝子〔メソトレキセート（ＭＴＸ）耐性〕、アンピシリン耐性遺伝子（以下、Ａｍｐｒと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子（以下、Ｎｅｏｒと略称する場合がある、Ｇ４１８耐性）等が挙げられる。特に、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞を用い、ｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、目的遺伝子をチミジンを含まない培地によって選択することもできる。
また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列をコードする塩基配列（シグナルコドン）を、ＡＳＫ１またはその部分ペプチドをコードするＤＮＡの５’末端側に付加してもよい。宿主がエシェリヒア属菌である場合、ＰｈｏＡ・シグナル配列、ＯｍｐＡ・シグナル配列などが；宿主がバチルス属菌である場合、α−アミラーゼ・シグナル配列、サブチリシン・シグナル配列などが；宿主が酵母である場合、ＭＦα・シグナル配列、ＳＵＣ２・シグナル配列などが；宿主が動物細胞である場合、インシュリン・シグナル配列、α−インターフェロン・シグナル配列、抗体分子・シグナル配列などがそれぞれ用いられる。
宿主としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌としては、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ１２・ＤＨ１〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６０：１６０（１９６８）〕、ＪＭ１０３〔Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，９：３０９（１９８１）〕、ＪＡ２２１〔Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１２０：５１７（１９７８）〕、ＨＢ１０１〔Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，４１：４５９（１９６９）〕、Ｃ６００〔Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，３９：４４０（１９５４）〕などが用いられる。
バチルス属菌としては、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＭＩ１１４〔Ｇｅｎｅ，２４：２５５（１９８３）〕、２０７−２１〔Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，９５：８７（１９８４）〕などが用いられる。
酵母としては、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＡＨ２２、ＡＨ２２Ｒ−、ＮＡ８７−１１Ａ、ＤＫＤ−５Ｄ、２０Ｂ−１２、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ  ＮＣＹＣ１９１３、ＮＣＹＣ２０３６、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＫＭ７１などが用いられる。
昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがＡｃＮＰＶの場合、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ  ｃｅｌｌ；Ｓｆ細胞）、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉの中腸由来のＭＧ１細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉの卵由来のＨｉｇｈ  ＦｉｖｅＴＭ細胞、Ｍａｍｅｓｔｒａ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ由来の細胞、Ｅｓｔｉｇｍｅｎａ  ａｃｒｅａ由来の細胞などが用いられる。ウイルスがＢｍＮＰＶの場合、昆虫細胞としては、蚕由来株化細胞（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ  Ｎ細胞；ＢｍＮ細胞）などが用いられる。該Ｓｆ細胞としては、例えば、Ｓｆ９細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１７１１）、Ｓｆ２１細胞（以上、Ｖａｕｇｈｎ，Ｊ．Ｌ．ら、Ｉｎ  Ｖｉｖｏ，１３：２１３−２１７（１９７７））などが用いられる。
昆虫としては、例えば、カイコの幼虫などが用いられる〔前田ら、Ｎａｔｕｒｅ，３１５：５９２（１９８５）〕。
動物細胞としては、例えば、サル細胞ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ、チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ細胞と略記）、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ−）細胞と略記）、マウスＬ細胞、マウスＡｔＴ−２０、マウスミエローマ細胞、ラットＧＨ３、ヒトＦＬ細胞などが用いられる。
形質転換は、宿主の種類に応じ、公知の方法に従って実施することができる。
エシェリヒア属菌は、例えば、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９：２１１０（１９７２）やＧｅｎｅ，１７：１０７（１９８２）などに記載の方法に従って形質転換することができる。
バチルス属菌は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＆  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６８：１１１（１９７９）などに記載の方法に従って形質転換することができる。
酵母は、例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９４：１８２−１８７（１９９１）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５：１９２９（１９７８）などに記載の方法に従って形質転換することができる。
昆虫細胞および昆虫は、例えば、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６：４７−５５（１９８８）などに記載の方法に従って形質転換することができる。
動物細胞は、例えば、細胞工学別冊８  新細胞工学実験プロトコール．２６３−２６７（１９９５）（秀潤社発行）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２：４５６（１９７３）に記載の方法に従って形質転換することができる。
形質転換体の培養は、宿主の種類に応じ、公知の方法に従って実施することができる。
例えば、宿主がエシェリヒア属菌またはバチルス属菌である形質転換体を培養する場合、培養に使用される培地としては液体培地が好ましい。また、培地は、形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物などを含有することが好ましい。ここで、炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖などが；窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質が；無機物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどがそれぞれ挙げられる。また、培地には、酵母エキス、ビタミン類、生長促進因子などを添加してもよい。培地のｐＨは、好ましくは約５〜８である。
宿主がエシェリヒア属菌である形質転換体を培養する場合の培地としては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地〔Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，４３１−４３３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９７２〕が好ましい。必要により、プロモーターを効率よく働かせるために、例えば、３β−インドリルアクリル酸のような薬剤を培地に添加してもよい。
宿主がエシェリヒア属菌である形質転換体の培養は、通常約１５〜４３℃で、約３〜２４時間行なわれる。必要により、通気や撹拌を行ってもよい。
宿主がバチルス属菌である形質転換体の培養は、通常約３０〜４０℃で、約６〜２４時間行なわれる。必要により、通気や撹拌を行ってもよい。
宿主が酵母である形質転換体を培養する場合の培地としては、例えば、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ最小培地〔Ｂｏｓｔｉａｎ，Ｋ．Ｌ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４５０５（１９８０）〕や０．５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地〔Ｂｉｔｔｅｒ，Ｇ．Ａ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：５３３０（１９８４）〕などが挙げられる。培地のｐＨは、好ましくは約５〜８である。培養は、通常約２０℃〜３５℃で、約２４〜７２時間行なわれる。必要に応じて、通気や撹拌を行ってもよい。
宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する場合の培地としては、例えばＧｒａｃｅ’ｓ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｒａｃｅ，Ｔ．Ｃ．Ｃ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９５：７８８（１９６２））に非働化した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のｐＨは、好ましくは約６．２〜６．４である。培養は、通常約２７℃で、約３〜５日間行なわれる。必要に応じて通気や撹拌を行ってもよい。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する場合の培地としては、例えば、約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２：５０１（１９５２）〕、ＤＭＥＭ培地〔Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８：３９６（１９５９）〕、ＲＰＭＩ  １６４０培地〔Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，１９９：５１９（１９６７）〕、１９９培地〔Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，７３：１（１９５０）〕などが用いられる。培地のｐＨは、好ましくは約６〜８である。培養は、通常約３０℃〜４０℃で、約１５〜６０時間行なわれる。必要に応じて通気や撹拌を行ってもよい。
以上のようにして、形質転換体の細胞内または細胞外にＡＳＫ１またはその部分ペプチドを生成させることができる。
前記形質転換体を培養して得られる培養物から、ＡＳＫ１またはその部分ペプチドを自体公知の方法に従って分離精製することができる。
例えば、ＡＳＫ１またはその部分ペプチドを培養菌体あるいは細胞から抽出する場合、培養物から公知の方法で集めた菌体あるいは細胞を適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊した後、遠心分離やろ過により可溶性蛋白質の粗抽出液を得る方法などが適宜用いられる。該緩衝液は、尿素や塩酸グアニジンなどの蛋白質変性剤や、トリトンＸ−１００ＴＭなどの界面活性剤を含んでいてもよい。
このようにして得られた可溶性画分中に含まれるＡＳＫ１またはその部分ペプチドの単離精製は、自体公知の方法に従って行うことができる。このような方法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法；透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法；イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法；アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法；逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法；等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法；などが用いられる。これらの方法は、適宜組み合わせることもできる。
かくして得られるＡＳＫ１またはその部分ペプチドが遊離体である場合には、自体公知の方法あるいはそれに凖じる方法によって該遊離体を塩に変換することができ、該蛋白質またはペプチドが塩として得られた場合には、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により該塩を遊離体または他の塩に変換することができる。
なお、形質転換体が産生するＡＳＫ１またはその部分ペプチドを、精製前または精製後に適当な蛋白修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去することもできる。該蛋白修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダーゼなどが用いられる。
かくして得られるＡＳＫ１またはその部分ペプチドの存在は、特異抗体を用いたエンザイムイムノアッセイやウエスタンブロッティングなどにより確認することができる。
さらに、ＡＳＫ１またはその部分ペプチドは、それをコードするＤＮＡに対応するＲＮＡを鋳型として、ウサギ網状赤血球ライセート、コムギ胚芽ライセート、大腸菌ライセートなどからなる無細胞蛋白質翻訳系を用いてインビトロ翻訳することによっても合成することができる。あるいは、さらにＲＮＡポリメラーゼを含む無細胞転写／翻訳系を用いて、ＡＳＫ１またはその部分ペプチドをコードするＤＮＡを鋳型としても合成することができる。無細胞蛋白質（転写／）翻訳系は市販のものを用いることもできるし、それ自体既知の方法、具体的には大腸菌抽出液はＰｒａｔｔ  Ｊ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｌａｔｉｏｎ，１７９−２０９，Ｈａｍｅｓ  Ｂ．Ｄ．＆Ｈｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．ｅｄｓ．，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ（１９８４）に記載の方法等に準じて調製することもできる。市販の細胞ライセートとしては、大腸菌由来のものはＥ．ｃｏｌｉ  Ｓ３０  ｅｘｔｒａｃｔ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）やＲＴＳ  ５００  Ｒａｐｉｄ  Ｔｒａｎｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ社製）等が挙げられ、ウサギ網状赤血球由来のものはＲａｂｂｉｔ  Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ  Ｌｙｓａｔｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）等、さらにコムギ胚芽由来のものはＰＲＯＴＥＩＯＳＴＭ（ＴＯＹＯＢＯ社製）等が挙げられる。このうちコムギ胚芽ライセートを用いたものが好適である。コムギ胚芽ライセートの作製法としては、例えばＪｏｈｎｓｔｏｎ  Ｆ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１７９：１６０−１６１（１９５７）あるいはＥｒｉｃｋｓｏｎ  Ａ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，９６：３８−５０（１９９６）等に記載の方法を用いることができる。
蛋白質合成のためのシステムまたは装置としては、バッチ法（Ｐｒａｔｔ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９８４）前述）や、アミノ酸、エネルギー源等を連続的に反応系に供給する連続式無細胞蛋白質合成システム（Ｓｐｉｒｉｎ  Ａ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２：１１６２−１１６４（１９８８））、透析法（木川等、第２１回日本分子生物学会、ＷＩＤ６）、あるいは重層法（ＰＲＯＴＥＩＯＳＴＭ  Ｗｈｅａｔ  ｇｅｒｍ  ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｃｏｒｅ  ｋｉｔ取扱説明書：ＴＯＹＯＢＯ社製）等が挙げられる。さらには、合成反応系に、鋳型のＲＮＡ、アミノ酸、エネルギー源等を必要時に供給し、合成物や分解物を必要時に排出する方法（特開２０００−３３３６７３）等を用いることができる。
「配列番号：２に示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質をコードする塩基配列またはその一部」、あるいは「該塩基配列と相補的な塩基配列またはその一部」を含有する核酸とは、前述のＡＳＫ１またはその部分ペプチドをコードする核酸だけではなく、コドンの読み枠の合わない塩基配列をも含む意味で用いられる。
目的核酸の標的領域と相補的な塩基配列を含む核酸、即ち、目的核酸とハイブリダイズすることができる核酸は、該目的核酸に対して「アンチセンス」であるということができる。一方、目的核酸の標的領域と相同性を有する塩基配列を含む核酸は、該目的核酸に対して「センス」であるということができる。ここで「相同性を有する」または「相補的である」とは、塩基配列間で約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の同一性または相補性を有することをいう。
ＡＳＫ１をコードする塩基配列と相補的な塩基配列またはその一部を含有する核酸（以下、「本発明のアンチセンス核酸」ともいう）は、クローン化した、あるいは決定されたＡＳＫ１をコードする核酸の塩基配列情報に基づき設計し、合成しうる。そうした核酸は、ＡＳＫ１をコードする遺伝子の複製または発現を阻害することができる。即ち、本発明のアンチセンス核酸は、ＡＳＫ１をコードする遺伝子から転写されるＲＮＡとハイブリダイズすることができ、ｍＲＮＡの合成（プロセッシング）または機能（蛋白質への翻訳）を阻害することができる。
本発明のアンチセンス核酸の標的領域は、アンチセンス核酸がハイブリダイズすることにより、結果としてＡＳＫ１蛋白質への翻訳が阻害されるものであればその長さに特に制限はなく、該蛋白質をコードするｍＲＮＡの全配列であっても部分配列であってもよく、短いもので約１５塩基程度、長いものでｍＲＮＡまたは初期転写産物の全配列が挙げられる。合成の容易さや抗原性の問題を考慮すれば、約１５〜約３０塩基からなるオリゴヌクレオチドが好ましいがそれに限定されない。具体的には、例えば、ＡＳＫ１をコードする核酸の５’端ヘアピンループ、５’端６−ベースペア・リピート、５’端非翻訳領域、翻訳開始コドン、蛋白質コード領域、翻訳終止コドン、３’端非翻訳領域、３’端パリンドローム領域、および３’端ヘアピンループが標的領域として選択しうるが、ＡＳＫ１をコードする遺伝子内の如何なる領域も標的として選択しうる。例えば、該遺伝子のイントロン部分を標的領域とすることもまた好ましい。
さらに、本発明のアンチセンス核酸は、ＡＳＫ１をコードするｍＲＮＡもしくは初期転写産物とハイブリダイズして蛋白質への翻訳を阻害するだけでなく、二本鎖ＤＮＡであるＡＳＫ１をコードする遺伝子と結合して三重鎖（トリプレックス）を形成し、ＲＮＡの転写を阻害し得るものであってもよい。
アンチセンス核酸は、２−デオキシ−Ｄ−リボースを含有しているデオキシリボヌクレオチド、Ｄ−リボースを含有しているリボヌクレオチド、プリンまたはピリミジン塩基のＮ−グリコシドであるその他のタイプのヌクレオチド、あるいは非ヌクレオチド骨格を有するその他のポリマー（例えば、市販の蛋白質核酸および合成配列特異的な核酸ポリマー）または特殊な結合を含有するその他のポリマー（但し、該ポリマーはＤＮＡやＲＮＡ中に見出されるような塩基のペアリングや塩基の付着を許容する配置をもつヌクレオチドを含有する）などが挙げられる。それらは、２本鎖ＤＮＡ、１本鎖ＤＮＡ、２本鎖ＲＮＡ、１本鎖ＲＮＡ、さらにＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドであることができ、さらに非修飾ポリヌクレオチド（または非修飾オリゴヌクレオチド）、さらには公知の修飾の付加されたもの、例えば当該分野で知られた標識のあるもの、キャップの付いたもの、メチル化されたもの、１個以上の天然のヌクレオチドを類縁物で置換したもの、分子内ヌクレオチド修飾のされたもの、例えば非荷電結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、カルバメートなど）を持つもの、電荷を有する結合または硫黄含有結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）を持つもの、例えば蛋白質（ヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ・インヒビター、トキシン、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジンなど）や糖（例えば、モノサッカライドなど）などの側鎖基を有しているもの、インターカレント化合物（例えば、アクリジン、プソラレンなど）を持つもの、キレート化合物（例えば、金属、放射活性をもつ金属、ホウ素、酸化性の金属など）を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、修飾された結合を持つもの（例えば、αアノマー型の核酸など）であってもよい。ここで「ヌクレオシド」、「ヌクレオチド」および「核酸」とは、プリンおよびピリミジン塩基を含有するのみでなく、修飾されたその他の複素環型塩基をもつようなものを含んでいて良い。こうした修飾物は、メチル化されたプリンおよびピリミジン、アシル化されたプリンおよびピリミジン、あるいはその他の複素環を含むものであってよい。修飾されたヌクレオシドおよび修飾されたヌクレオチドはまた糖部分が修飾されていてよく、例えば、１個以上の水酸基がハロゲンとか、脂肪族基などで置換されていたり、あるいはエーテル、アミンなどの官能基に変換されていてよい。
好ましくは、アンチセンス核酸は、修飾されていてもよいＲＮＡまたはＤＮＡである。修飾された核酸（ＲＮＡ、ＤＮＡ）の具体例としては、核酸の硫黄誘導体やチオホスフェート誘導体、そしてポリヌクレオシドアミドやオリゴヌクレオシドアミドの分解に抵抗性のものが挙げられるが、それに限定されるものではない。本発明のアンチセンス核酸は次のような方針で好ましく設計されうる。すなわち、細胞内でのアンチセンス核酸をより安定なものにする、アンチセンス核酸の細胞透過性をより高める、標的とするセンス鎖に対する親和性をより大きなものにする、そしてもし毒性があるならアンチセンス核酸の毒性をより小さなものにする。こうした修飾は当該分野で数多く知られており、例えばＪ．Ｋａｗａｋａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍ  Ｔｅｃｈ  Ｊａｐａｎ，Ｖｏｌ．８，ｐｐ．２４７，１９９２；Ｖｏｌ．８，ｐｐ．３９５，１９９２；Ｓ．Ｔ．Ｃｒｏｏｋｅ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９９３などに開示されている。
アンチセンス核酸は、変化せしめられたり、修飾された糖、塩基、結合を含有していてもよく、リポソーム、ミクロスフェアのような特殊な形態で供与されたり、遺伝子治療において適用されたり、付加された形態で与えられることができうる。こうして付加形態で用いられるものとしては、リン酸基骨格の電荷を中和するように働くポリリジンのようなポリカチオン体、細胞膜との相互作用を高めたり、核酸の取込みを増大せしめるような脂質（例えば、ホスホリピド、コレステロールなど）といった疎水性のものが挙げられる。付加するに好ましい脂質としては、コレステロールやその誘導体（例えば、コレステリルクロロホルメート、コール酸など）が挙げられる。こうしたものは、核酸の３’端あるいは５’端に付着させることができ、塩基、糖、分子内ヌクレオシド結合を介して付着させることができうる。その他の基としては、核酸の３’端あるいは５’端に特異的に配置されたキャップ用の基で、エキソヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅなどのヌクレアーゼによる分解を阻止するためのものが挙げられる。こうしたキャップ用の基としては、ポリエチレングリコール、テトラエチレングリコールなどのグリコールをはじめとした当該分野で知られた水酸基の保護基が挙げられるが、それに限定されるものではない。
ＡＳＫ１をコードするｍＲＮＡもしくは初期転写産物を、コード領域の内部（初期転写産物の場合はイントロン部分を含む）で特異的に切断し得るリボザイムもまた、本発明のアンチセンス核酸に包含され得る。「リボザイム」とは核酸を切断する酵素活性を有するＲＮＡをいうが、最近では当該酵素活性部位の塩基配列を有するオリゴＤＮＡも同様に核酸切断活性を有することが明らかになっているので、本明細書では配列特異的な核酸切断活性を有する限りＤＮＡをも包含する概念として用いるものとする。リボザイムとして最も汎用性の高いものとしては、ウイロイドやウイルソイド等の感染性ＲＮＡに見られるセルフスプライシングＲＮＡがあり、ハンマーヘッド型やヘアピン型等が知られている。ハンマーヘッド型は約４０塩基程度で酵素活性を発揮し、ハンマーヘッド構造をとる部分に隣接する両端の数塩基ずつ（合わせて約１０塩基程度）をｍＲＮＡの所望の切断部位と相補的な配列にすることにより、標的ｍＲＮＡのみを特異的に切断することが可能である。このタイプのリボザイムは、ＲＮＡのみを基質とするので、ゲノムＤＮＡを攻撃することがないというさらなる利点を有する。ＡＳＫ１  ｍＲＮＡが自身で二本鎖構造をとる場合には、ＲＮＡヘリカーゼと特異的に結合し得るウイルス核酸由来のＲＮＡモチーフを連結したハイブリッドリボザイムを用いることにより、標的配列を一本鎖にすることができる［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９８（１０）：５５７２−５５７７（２００１）］。さらに、リボザイムを、それをコードするＤＮＡを含む発現ベクターの形態で使用する場合には、転写産物の細胞質への移行を促進するために、ｔＲＮＡを改変した配列をさらに連結したハイブリッドリボザイムとすることもできる［Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２９（１３）：２７８０−２７８８（２００１）］。
ＡＳＫ１をコードするｍＲＮＡもしくは初期転写産物のコード領域内の部分配列（初期転写産物の場合はイントロン部分を含む）に相補的な塩基配列を有する二本鎖オリゴＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）もまた、本発明のアンチセンス核酸に包含され得る。短い二本鎖ＲＮＡを細胞内に導入するとそのＲＮＡの一方の鎖に相補的なｍＲＮＡが分解される、いわゆるＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）と呼ばれる現象は、以前から線虫、昆虫、植物等で知られていたが、この現象が哺乳動物細胞でも起こることが確認されて以来［Ｎａｔｕｒｅ，４１１（６８３６）：４９４−４９８（２００１）］、リボザイムの代替技術として広く利用されている。ｓｉＲＮＡは標的となるｍＲＮＡの塩基配列情報に基づいて、市販のソフトウェア（例：ＲＮＡｉ  Ｄｅｓｉｇｎｅｒ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて適宜設計することができる。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド及びリボザイムは、ＡＳＫ１をコードするｃＤＮＡ配列もしくはゲノムＤＮＡ配列情報に基づいてｍＲＮＡもしくは初期転写産物の標的領域を決定し、市販のＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機（アプライド・バイオシステムズ社、ベックマン社等）を用いて、これに相補的な配列を合成することにより調製することができる。ＲＮＡｉ活性を有するｓｉＲＮＡは、センス鎖及びアンチセンス鎖をＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機でそれぞれ合成し、適当なアニーリング緩衝液中で、例えば、約９０〜約９５℃で約１分程度変性させた後、約３０〜約７０℃で約１〜約８時間アニーリングさせることにより調製することができる。また、相補的なオリゴヌクレオチド鎖を交互にオーバーラップするように合成して、これらをアニーリングさせた後リガーゼでライゲーションすることにより、より長い二本鎖ポリヌクレオチドを調製することもできる。
本発明のアンチセンス核酸の遺伝子発現阻害活性は、ＡＳＫ１をコードする核酸を含有する形質転換体、生体内や生体外のＡＳＫ１をコードする遺伝子発現系またはＡＳＫ１の生体内や生体外の翻訳系を用いて調べることができる。該核酸それ自体公知の各種の方法で細胞に適用できる。
本発明はまた、ＡＳＫ１またはその部分ペプチドに対する抗体（以下、「本発明の抗体」と略記する場合がある）を提供する。本発明の抗体は、該蛋白質またはペプチドに対して特異的親和性を有するものであれば、モノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよい。本発明の抗体は、ＡＳＫ１またはその部分ペプチドを抗原として用い、自体公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。
〔モノクローナル抗体の作製〕
モノクローナル抗体産生細胞の作製
ＡＳＫ１またはその部分ペプチドを、哺乳動物に対して、投与により抗体産生が可能な部位に、それ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与する。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は通常２〜６週毎に１回ずつ、計２〜１０回程度行われる。用いられる哺乳動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ等が挙げられるが、マウスおよびラットが好ましく用いられる。
例えば、抗原で免疫された哺乳動物、例えばマウスから抗体価の認められた個体を選択し、最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を同種または異種動物の骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。抗血清中の抗体価の測定は、例えば、後記の標識化ＡＳＫ１と抗血清とを反応させた後、抗体に結合した標識剤の活性を測定することにより行うことができる。融合操作は、既知の方法、例えば、ケーラーとミルスタインの方法〔Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）〕に従い実施することができる。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウィルスなどが挙げられるが、好ましくはＰＥＧが用いられる。
骨髄腫細胞としては、例えば、ＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０、ＡＰ−１などの哺乳動物の骨髄腫細胞が挙げられるが、Ｐ３Ｕ１が好ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は、１：１〜２０：１程度であり、ＰＥＧ（好ましくはＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６０００）が１０〜８０％程度の濃度で添加され、２０〜４０℃、好ましくは３０〜３７℃で１〜１０分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、例えば、抗原を直接あるいは担体とともに吸着させた固相（例、マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる）またはプロテインＡを加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法；抗免疫グロブリン抗体またはプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素などで標識したＡＳＫ１を加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法；などによりスクリーニングすることができる。
モノクローナル抗体の選別は、自体公知あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができる。モノクローナル抗体の選別は、通常ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞用培地で行うことができる。モノクローナル抗体の選別および育種用培地は、ハイブリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いてもよい。このような培地としては、例えば、１〜２０％、好ましくは１０〜２０％のウシ胎仔血清を含むＲＰＭＩ  １６４０培地、１〜１０％のウシ胎仔血清を含むＧＩＴ培地（和光純薬工業（株））あるいはハイブリドーマ培養用無血清培地（ＳＦＭ−１０１、日水製薬（株））などを用いることができる。培養温度は、通常２０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。培養時間は、通常５日〜３週間、好ましくは１週間〜２週間である。培養は、通常５％炭酸ガス下で行うことができる。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。
このようにして得られたモノクローナル抗体は、自体公知の方法、例えば、免疫グロブリンの分離精製法〔例、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例、ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相あるいはプロテインＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕に従って分離精製することができる。
〔ポリクローナル抗体の作製〕
ＡＳＫ１またはその部分ペプチドに対するポリクローナル抗体は、自体公知の方法に従って製造することができる。例えば、免疫抗原（ＡＳＫ１またはその部分ペプチド）自体、あるいはそれとキャリアー蛋白質との複合体を作製し、上記のモノクローナル抗体の製造法と同様に哺乳動物に免疫を行い、該免疫動物から本発明の抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行うことにより製造することができる。
哺乳動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアー蛋白質との複合体に関し、キャリアー蛋白質の種類およびキャリアーとハプテンとの混合比は、キャリアーに架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれば、どのようなものをどのような比率で架橋させてもよいが、例えば、ウシ血清アルブミンやウシサイログロブリン、ヘモシアニン等を重量比でハプテン１に対し、約０．１〜２０、好ましくは約１〜５の割合でカプリングさせる方法が用いられる。
また、ハプテンとキャリアーのカプリングには、種々の縮合剤、例えばグルタルアルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステル、チオール基、ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。
縮合生成物は、哺乳動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約２〜６週毎に１回ずつ、計約３〜１０回程度行われる。
ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された哺乳動物の血液、腹水など、好ましくは血液から採取することができる。
抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製法に従って行うことができる。
本発明の部分ペプチドを抗原として用いる場合、そのＡＳＫ１上の位置は特に限定されないが、例えば、各種温血動物間でよく保存された領域の部分アミノ酸配列を有するオリゴペプチドが挙げられる。具体的には、ヒトおよびマウス間で高度に保存されているキナーゼ触媒ドメイン（約９９％アミノ酸同一性を有する；全体では約９２％アミノ酸同一性）内の任意の部分ペプチドなどが好ましく例示される。
上記した（１）ＡＳＫ１または本発明の活性ペプチド、（２）ＡＳＫ１をコードする塩基配列またはその一部を含有する核酸、（３）本発明の抗体、（４）本発明のアンチセンス核酸、（５）本発明の阻害ペプチドは、例えば以下の用途を有する。
（１）アポトーシスまたは炎症関連疾患の予防・治療物質のスクリーニング
上述のように、ＡＳＫ１はアポトーシス誘導および炎症性サイトカインの産生を促進する。これらの事実は、ＡＳＫ１の発現または活性を調節（促進または阻害）し得る物質がアポトーシスまたは炎症関連疾患の予防・治療に有効であることを示すものである。ここで「アポトーシスまたは炎症関連疾患」とは、アポトーシス誘導もしくは炎症性サイトカイン産生の不全または異常亢進に起因するか、あるいは結果としてそのような状態を生じる疾患または病態をいう。アポトーシス誘導もしくは炎症性サイトカイン産生の異常亢進に関連する疾患としては、例えば、ウイルス感染症（例、ＡＩＤＳ、インフルエンザ、不明熱等）、内分泌疾患（例、ホルモン欠乏症、サイトカイン欠乏症等）、血液疾患（例、血球減少症、腎性貧血等）、臓器形成不全（例、甲状腺萎縮、口蓋裂等）、移植臓器拒絶、移植片対宿主病、免疫不全、神経変性疾患（例、ポリグルタミン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、プリオン病、小脳変性症等）、虚血性心疾患（例、狭心症、心筋梗塞等）、放射線障害、紫外線障害（例、日焼け等）、中毒性疾患（例、重金属による腎尿細管細胞傷害、アルコールによる肝細胞傷害等）、栄養障害（例、ビタミン、微量元素欠乏による胸腺の萎縮等）、炎症性疾患（例、急性膵炎、関節炎、歯周病、大腸炎等）、虚血性神経障害、血管系疾患（例、動脈硬化等）、呼吸器系疾患（例、間質性肺炎、肺線維症等）、軟骨疾患（例、変形性関節炎等）などが挙げられる。一方、アポトーシス誘導もしくは炎症性サイトカイン産生の不全に関連する疾患としては、癌（例、白血病、食道癌、胃癌、大腸癌、直腸癌、肺癌、肝臓癌、腎臓癌、乳癌、子宮癌、卵巣癌、前立腺癌、メラノーマ、骨髄腫、骨肉腫、脳腫瘍等）、自己免疫疾患（例、全身性エリテマトーデス、強皮症、慢性関節リウマチ、シェーグレン症候群、多発性硬化症、インスリン依存性糖尿病、乾癬、潰瘍性大腸炎、特発性血小板減少性紫斑病、クローン病、糸球体腎炎等）、ウイルス感染症（例、出血熱、Ｔ細胞白血病、カポジ肉腫、伝染性単核症、リンパ腫、上咽頭癌、子宮頚癌、皮膚癌、肝炎、肝癌等）、内分泌疾患（例、ホルモン過剰症、サイトカイン過剰症等）、血液疾患（例、血球増加症、Ｂ細胞リンパ腫、多血症等）、臓器過形成（例、半陰陽、停留睾丸、奇形腫、腎芽細胞癌、多発性嚢胞腎、心・大動脈奇形、合指症等）、血管形成術後再狭窄、癌切除術後の再発などが挙げられる。
後述の実施例において示される通り、ＡＳＫ１遺伝子の不活性化は高脂肪食に対する血糖上昇の感受性を低下させ、また、糖尿病モデルにおける神経障害の進行を抑制する。さらに、糖尿病性腎症モデルでは腎臓でのＡＳＫ１発現が増大している。従って、ＡＳＫ１の発現または活性を阻害し得る物質（以下、包括的に「ＡＳＫ１阻害物質」という場合がある）は、糖尿病およびその合併症（例：糖尿病性腎症、糖尿病性神経障害等）の予防・治療に特に有効である。また、ＡＳＫ１遺伝子の不活性化はタバコ煙曝露による肺での炎症性変化を抑制するので、ＡＳＫ１阻害物質は、ＣＯＰＤの予防・治療にも特に有効である。
従って、本発明は、ＡＳＫ１もしくは本発明の活性ペプチドまたはその塩（以下、これらを包括して「ＡＳＫ１類」（ＡＳＫ１ｓ）という場合がある）を用いることによるアポトーシスまたは炎症関連疾患、糖尿病またはその合併症、あるいはＣＯＰＤの予防・治療物質のスクリーニング方法を提供する。
より具体的には、本発明は、
（ａ）被験物質の存在下および非存在下における、ＡＳＫ１類の活性を比較することを特徴とする、アポトーシスまたは炎症関連疾患、糖尿病またはその合併症、あるいはＣＯＰＤの予防・治療物質のスクリーニング方法を提供する。
上記スクリーニング方法は、さらに
（ａ−１）単離されたＡＳＫ１類の活性を、被験物質の存在下と非存在下とで比較する方法と、
（ａ−２）ＡＳＫ１類を産生する能力を有する細胞を被験物質の存在下および非存在下に培養し、両条件下におけるＡＳＫ１類の活性を比較する方法とに大別される。
上記（ａ−１）のスクリーニング方法において用いられるＡＳＫ１もしくは本発明の活性ペプチドまたはその塩は、上記した方法を用いて単離・精製することができる。
上記（ａ−２）のスクリーニング方法において用いられるＡＳＫ１またはその塩を産生する能力を有する細胞としては、それを生来発現しているヒトもしくは他の温血動物細胞またはそれを含む生体試料（例：血液、組織、臓器等）であれば特に制限はないが、酸化ストレスなどの物理的または化学的刺激に応じてＡＳＫ１の発現が誘導されるものが好ましく、例えば、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞等が挙げられる。非ヒト動物由来の血液、組織、臓器等の場合は、それらを生体から単離して培養してもよいし、あるいは生体に被験物質を投与し、一定時間経過後にそれら生体試料を単離してもよい。
また、ＡＳＫ１もしくは本発明の活性ペプチドまたはその塩を産生する能力を有する細胞としては、上記の遺伝子工学的手法により作製された各種の形質転換体が例示される。
被験物質としては、例えば蛋白質、ペプチド、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などが挙げられ、これらの物質は新規なものであってもよいし、公知のものであってもよい。
上記（ａ−１）のスクリーニング方法におけるＡＳＫ１類の活性の測定は、基質蛋白質もしくはペプチドのリン酸化を検出することにより行うことができる。ＡＳＫ１は自己リン酸化活性を有するので、ＡＳＫ１類自体のリン酸化を検出すれば他の基質を反応系に添加することは必須ではないが、所望により、例えば、ＡＳＫ１の生理的な基質蛋白質であるＭＫＫ４／ＭＫＫ７やＭＫＫ３／ＭＫＫ６等のＭＡＰＫＫ、ＡＳＫ１もしくは前記基質蛋白質の標的リン酸化部位を含むフラグメント（例えば、配列番号：２で表されるアミノ酸配列中アミノ酸番号８３で示されるセリン残基を含むＡＳＫ１フラグメント等）、あるいはセリン／スレオニンキナーゼのアッセイ用基質として公知の各種合成ペプチドなどを用いることもできる。
リン酸化反応は、例えば、上述の方法により単離・精製されたＡＳＫ１類標品を、適当な緩衝液［例：リン酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ約４〜約１０、望ましくはｐＨ約６〜約８）等（必要に応じてＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ＣＨＡＰＳ、Ｔｗｅｅｎ−８０ＴＭ、ジギトニン、デオキシコレートなどの界面活性剤や、ＰＭＳＦ、ロイペプチン、バシトラシン、アプロチニン、Ｅ−６４（蛋白質研究所製）、ペプスタチンなどのプロテアーゼ阻害剤を添加することもできる）］に溶解し、被験物質を添加し（あるいは添加せずに）、さらにリン酸基供与体（例えば、ＡＴＰ等）および必要に応じて基質蛋白質（ペプチド）を添加して、通常約２０〜約４０℃、好ましくは約３０〜約３７℃で３０分〜数時間程度インキュベートすることにより行われる。
リン酸化の測定は、例えば、標識したリン酸基供与体（例えば、［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ等）を用いて反応を行わせ、ＡＳＫ１類および／または他の基質蛋白質（ペプチド）における標識量を検出する（例えば、［γ−３２Ｐ］ＡＴＰを用いた場合、反応液を電気泳動（例：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に付した後、ゲル上の蛋白質（ペプチド）の３２Ｐの取り込みをオートラジオグラフィーで測定する）ことにより行うことができる。あるいは、反応液を蛋白質（ペプチド）を吸着し得る素材（例：ＤＥ８１膜、セルロース膜、ＰＶＤＦ膜等）と接触させ、該素材に結合した標識量を測定することもできる。また、基質のリン酸化は総電荷の変化や分子量の変化を指標として検出することもできる。前者の例としては、基質として正味電荷が＋１となるような合成ペプチドを用いてリン酸化反応を行った後、反応液を電気泳動して陽極側に移動したペプチド（リン酸化した基質の正味電荷は−１であるため陽極側に移動する）における標識量を検出する方法などが挙げられる。一方、後者の例としては、質量分析を用いる方法や表面プラズモン共鳴を用いる方法等が挙げられる。
さらに、リン酸化基質に特異的な抗体が入手できる場合には、抗原抗体反応を用いて基質蛋白質（ペプチド）のリン酸化を検出することもできる。ＡＳＫ１、ＭＫＫ４、ＭＫＫ３等のリン酸化物に対する抗体は市販されている（例えば、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ．社等より入手可能）。抗リン酸化蛋白質（ペプチド）抗体を用いたリン酸化の検出には、後記（ｃ）のスクリーニング法と同様の種々の免疫学的測定法を用いることができる。
上記（ａ−２）のスクリーニング方法におけるＡＳＫ１類の活性の測定は、上記（ａ−１）のスクリーニング方法と同様に基質蛋白質（ペプチド）のリン酸化を検出することにより行うことができる他、アポトーシスまたは細胞死の誘導割合を測定することによっても行うことができる。
基質蛋白質（ペプチド）のリン酸化を指標とする場合、ＭＫＫ４、ＭＫＫ３のさらに下流にあるＪＮＫ、ｐ３８等のＭＡＰＫも基質蛋白質として利用することができる。リン酸化反応は、例えば、ＡＳＫ１類を産生する能力を有する細胞を適当な培地（例えば、上述の各種動物細胞用培地）または緩衝液［例：リン酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ約４〜約１０、望ましくはｐＨ約６〜約８）等（必要に応じてＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ＣＨＡＰＳ、Ｔｗｅｅｎ−８０ＴＭ、ジギトニン、デオキシコレートなどの界面活性剤や、ＰＭＳＦ、ロイペプチン、バシトラシン、アプロチニン、Ｅ−６４（蛋白質研究所製）、ペプスタチンなどのプロテアーゼ阻害剤を添加することもできる）］に懸濁し、被験物質を添加し（あるいは添加せずに）、さらにリン酸基供与体（例えば、ＡＴＰ等）および必要に応じて基質蛋白質（ペプチド）を添加して、通常約２０〜約４０℃、好ましくは約３０〜約３７℃で３０分〜数時間程度インキュベートすることにより行われる。
リン酸化の測定は、ＡＳＫ１類が細胞内に局在する場合は、細胞を適当な緩衝液に懸濁した後、超音波処理または凍結融解などによって細胞を破壊して得られる細胞破砕液を、ＡＳＫ１類が細胞外に分泌される場合には細胞培養上清を、それぞれ上記（ａ−１）のスクリーニング方法において記載したと同様の方法で処理することにより行うことができる。必要に応じて、破砕液や培養上清から、例えば本発明の抗体などを用いてＡＳＫ１類を分離・精製した後に測定を行ってもよい。
アポトーシス（細胞死）誘導を指標とする場合には、ＡＳＫ１類を産生する能力を有する細胞を適当な培地または緩衝液に懸濁し、被験物質を添加し（あるいは添加せずに）、さらに酸化ストレス（例：Ｈ２Ｏ２添加）等の刺激を加えて、通常約２０〜約４０℃、好ましくは約３０〜約３７℃で約６〜約７２時間インキュベートした後で、アポトーシス（細胞死）誘導率を測定する。
アポトーシス（細胞死）は、例えば、光学顕微鏡、位相差顕微鏡、蛍光顕微鏡などを用いた形態学的観察により膜のブレッビング（ｂｌｅｂｂｉｎｇ）、細胞サイズの縮小化、クロマチン凝縮、ＤＮＡ断片化等を検出することにより調べることができる。例えば、マルチウェルプレート中で細胞を培養し、プレートから剥離した細胞あるいは膜のブレッビングを生じた細胞を顕微鏡下で計数し、視野中の全細胞に占める死細胞の割合（％）を計算する。数視野で観察を行ってそれらの平均値を細胞死誘導率とする。また、トリパンブルー、エリスロシンＢ、ネグロシン、エオシンＹ、フルオレッセンジアセテート、アクリジンオレンジ、エチジウムブロマイド等の色素を用いて死細胞を染色、顕微鏡下で計数することによっても細胞死誘導率を導出することができる。さらに、ＤＡＰＩやヘキスト３３３４２等の蛍光色素を用いてＤＮＡを染色し、蛍光顕微鏡下でクロマチン凝縮の起こっている細胞を計数することもできる。あるいは、断片化されたＤＮＡの３’末端にターミナル・デオキシヌクレオチジル・トランスフェラーゼ（ＴｄＴ）を用いてビオチンや蛍光色素などで標識したｄＵＴＰを付加させ（ＴＵＮＥＬ法）、強く染色された細胞数を光学顕微鏡、蛍光顕微鏡などを用いて計数することにより、アポトーシス誘導率を算出することもできる。
また、粒子サイズ測定装置（例：Ｃｏｕｌｔｅｒ  ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ等）を用いて細胞サイズ分布を測定することにより縮小化・断片化した細胞数を計数し、アポトーシス誘導率を計算することができる。あるいは、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）を用いて細胞サイズの縮小・アポトーシス小体への断片化を検出することにより、生死細胞を分離、細胞死誘導率を算出することもできる。
さらには、常法を用いて細胞から染色体ＤＮＡを抽出し、ゲル電気泳動してＤＮＡの断片化の度合をデンシトメーターなどを用いて測定することにより、生化学的にアポトーシスを検出することもできる。あるいは、３−（４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−ｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ）−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌ  ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ（ＭＴＴ）が生細胞によりホルマザンに還元されることを利用して、マイクロプレートリーダーを用いて５７０−６３０ｎｍにおける吸光度の減少を測定することにより細胞死誘導率を算出することもできる。
上記（ａ）のスクリーニング法において、ＡＳＫ１類の活性を増大させた物質を「ＡＳＫ１活性促進物質」、活性を低下させた物質を「ＡＳＫ１活性阻害物質」としてそれぞれ選択することができる。ＡＳＫ１活性促進物質は、アポトーシス誘導もしくは炎症性サイトカイン産生の不全に関連する疾患［例えば、癌（例、白血病、食道癌、胃癌、大腸癌、直腸癌、肺癌、肝臓癌、腎臓癌、乳癌、子宮癌、卵巣癌、前立腺癌、メラノーマ、骨髄腫、骨肉腫、脳腫瘍等）、自己免疫疾患（例、全身性エリテマトーデス、強皮症、慢性関節リウマチ、シェーグレン症候群、多発性硬化症、インスリン依存性糖尿病、乾癬、潰瘍性大腸炎、特発性血小板減少性紫斑病、クローン病、糸球体腎炎等）、ウイルス感染症（例、出血熱、Ｔ細胞白血病、カポジ肉腫、伝染性単核症、リンパ腫、上咽頭癌、子宮頚癌、皮膚癌、肝炎、肝癌等）、内分泌疾患（例、ホルモン過剰症、サイトカイン過剰症等）、血液疾患（例、血球増加症、Ｂ細胞リンパ腫、多血症等）、臓器過形成（例、半陰陽、停留睾丸、奇形腫、腎芽細胞癌、多発性嚢胞腎、心・大動脈奇形、合指症等）、血管形成術後再狭窄、癌切除術後の再発など］の予防・治療剤として用いることができる。
一方、ＡＳＫ１活性阻害物質は、アポトーシス誘導もしくは炎症性サイトカイン産生の異常亢進に関連する疾患［例えば、ウイルス感染症（例、ＡＩＤＳ、インフルエンザ、不明熱等）、内分泌疾患（例、ホルモン欠乏症、サイトカイン欠乏症等）、血液疾患（例、血球減少症、腎性貧血等）、臓器形成不全（例、甲状腺萎縮、口蓋裂等）、移植臓器拒絶、移植片対宿主病、免疫不全、神経変性疾患（例、ポリグルタミン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、プリオン病、小脳変性症等）、虚血性心疾患（例、狭心症、心筋梗塞等）、放射線障害、紫外線障害（例、日焼け等）、中毒性疾患（例、重金属による腎尿細管細胞傷害、アルコールによる肝細胞傷害等）、栄養障害（例、ビタミン、微量元素欠乏による胸腺の萎縮等）、炎症性疾患（例、急性膵炎、関節炎、歯周病、大腸炎等）、虚血性神経障害、血管系疾患（例、動脈硬化等）、呼吸器系疾患（例、間質性肺炎、肺線維症等）、軟骨疾患（例、変形性関節炎等）など］の予防・治療剤として用いることができる。
また、ＡＳＫ１活性阻害物質は、糖尿病またはその合併症（例：糖尿病性腎症、糖尿病性神経障害等）、あるいはＣＯＰＤの予防・治療剤として好ましく用いることができる。
ＡＳＫ１活性促進もしくは阻害物質を上記予防・治療剤として使用する場合は、常套手段に従って製剤化することができる。
例えば、ＡＳＫ１活性促進もしくは阻害物質は、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、ＡＳＫ１活性促進もしくは阻害物質を、生理学的に認められる公知の担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（例、ポリソルベート８０ＴＭ、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。
また、上記予防・治療剤は、例えば、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填される。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトや他の温血動物（例えば、ラット、マウス、ハムスター、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジー、トリなど）に対して投与することができる。
ＡＳＫ１活性促進物質の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、癌患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常例えば、癌患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
ＡＳＫ１活性阻害物質の投与量も、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、糖尿病（もしくはその合併症）またはＣＯＰＤ患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常例えば、糖尿病（もしくはその合併症）またはＣＯＰＤ患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
ＡＳＫ１活性調節（促進または阻害）物質のスクリーニング方法の一例として、ＡＳＫ１類を産生する能力を有する細胞と抗リン酸化ＡＳＫ１抗体とを用いて、ＡＳＫ１類の自己リン酸化を測定する方法について、以下に具体的に説明する。本スクリーニング系は、抗ＡＳＫ１抗体を用いることによりＡＳＫ１の発現調節（促進または阻害）物質のスクリーニングにも使用することができる。
〔スクリーニング用試薬〕
１）培地
４．５ｍｇ／ｍＬグルコース含有ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を孔径０．４５μｍのフィルターで濾過滅菌し、４℃で保存したもの。
２）ヒトＡＳＫ１標品
ＨｅＬａ細胞またはＨＥＫ２９３細胞を上記１）の培地（１０％  ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）および１００単位／ｍＬペニシリンを添加）で４×１０４個／ｍＬとなるように懸濁し、９６ウェル培養プレートに１００μＬ／ウェル播種し、５％  ＣＯ２／９５％大気の雰囲気下、３７℃で１日間培養したもの。
３）２０×ＡＴＰ
３００μＭ水溶液を−２０℃で保存したもの。
４）細胞溶解用緩衝液
２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）［１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１％  デオキシコレート、１．５％  アプロチニンおよび１ｍＭ  ＰＭＳＦ含有］を４℃で保存したもの。
５）ウサギ抗ヒトＡＳＫ１ポリクローナル抗体
２ｍｇ／ｍＬとなるようＰＢＳ（０．０２％アジ化ナトリウム含有）に溶解し、４℃で保存したもの。
６）ウサギ抗ヒトリン酸化ＡＳＫ１ポリクローナル抗体
２ｍｇ／ｍＬとなるようＰＢＳ（０．０２％アジ化ナトリウム含有）に溶解し、４℃で保存したもの。
７）西洋ワサビパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ヤギ抗ウサギＩｇＧポリクローナル抗体
２ｍｇ／ｍＬとなるようＰＢＳ（０．０２％アジ化ナトリウム含有）に溶解し、４℃で保存したもの。
８）パーオキシダーゼ活性測定用化学発光基質
ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（登録商標）Ｗｅｓｔ  Ｆｅｍｔｏ  Ｍａｘｉｍｕｍ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＰＩＥＲＣＥ社）。４℃で保存。
〔測定法〕
ｉ）９６ウェル培養プレートにて培養したＨｅＬａ（またはＨＥＫ２９３）細胞を、上記１）の培地で２回洗浄した後、新鮮培地９０μｌを各ウェルに加える。
ｉｉ）１０−３〜１０−１０Ｍの被験物質溶液を５μｌ加えた後、２０×ＡＴＰを５μｌ加え、５％  ＣＯ２／９５％大気の雰囲気下、３７℃で２４時間培養する。
ｉｉｉ）培養液をチューブに回収し、遠心分離にて培養上清を除去、新鮮な培地で洗浄後、上記４）の細胞溶解緩衝液を加えて細胞を溶解、遠心分離にて上清を回収し、細胞ライセートとする。
ｉｖ）抗ＡＳＫ１抗体１μＬ（２μｇ）を添加して４℃で１時間インキュベートした後、プロテインＧを固定化したセファロースビーズを加えて、４℃で３０分間免疫沈降させ、遠心分離にて沈殿を回収する。
ｖ）沈殿を洗浄後、電気泳動用バッファー［４％  ＳＤＳ、１００ｍＭ  トリス−塩酸（ｐＨ８．８）、０．０１％  ブロモフェノールブルー、３６％  グリセロール］３０μＬを添加して１００℃で５分間煮沸し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルにロードして１５０Ｖで６０分間泳動する。
ｖｉ）ＰＶＤＦ膜に転写し、４℃で一晩ブロッキングした後、抗ＡＳＫ１抗体もしくは抗リン酸化ＡＳＫ１抗体（１０００倍希釈液）と４℃で一晩反応させ、さらにＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（１０００倍希釈液）と室温で６０分間反応させる。
ｖｉｉ）化学発光基質を加え、発光量を画像解析装置を用いて測定する。
上記のスクリーニング方法において、ＡＳＫ１産生細胞に被験物質を添加した際に抗リン酸化ＡＳＫ１抗体と反応するバンドのシグナル強度が増加した場合、該物質をＡＳＫ１活性促進物質として選択することができる。同様に、被験物質を添加した際に該シグナル強度が減少した場合、該物質をＡＳＫ１活性阻害物質として選択することができる。一方、ＡＳＫ１産生細胞に被験物質を添加した際に抗ＡＳＫ１抗体と反応するバンドのシグナル強度が増加した場合、該物質をＡＳＫ１発現促進物質として選択することができる。同様に、被験物質を添加した際に該シグナル強度が減少した場合、該物質をＡＳＫ１発現阻害物質として選択することができる。
上述のように、ＡＳＫ１の発現を調節（促進または阻害）する物質は、アポトーシスまたは炎症関連疾患の予防・治療に有効である。また、ＡＳＫ１発現阻害物質は、糖尿病またはその合併症、あるいはＣＯＰＤの予防・治療に特に有効である。
従って、本発明はまた、ＡＳＫ１類を産生する能力を有する細胞におけるＡＳＫ１類の発現を、被験物質の存在下と非存在下で比較することを特徴とする、アポトーシスまたは炎症関連疾患、糖尿病またはその合併症、あるいはＣＯＰＤの予防・治療物質のスクリーニング方法を提供する。
ＡＳＫ１の発現量は、ＡＳＫ１をコードする核酸とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸（即ち、前記したＡＳＫ１をコードする塩基配列またはその一部を含有する核酸または本発明のアンチセンス核酸；以下、包括的に「本発明の核酸」という場合がある）を用いてそのｍＲＮＡを検出することにより、転写レベルで測定することもできる。あるいは、該発現量は、前記した本発明の抗体を用いて蛋白質（ペプチド）を検出することにより、翻訳レベルで測定することもできる。
従って、より具体的には、本発明は、
（ｂ）ＡＳＫ１類を産生する能力を有する細胞を被験物質の存在下および非存在下に培養し、両条件下におけるＡＳＫ１類をコードするｍＲＮＡの量を、本発明の核酸を用いて測定、比較することを特徴とする、アポトーシスまたは炎症関連疾患、糖尿病またはその合併症、あるいはＣＯＰＤの予防・治療物質のスクリーニング方法、および
（ｃ）ＡＳＫ１類を産生する能力を有する細胞を被験物質の存在下および非存在下に培養し、両条件下におけるＡＳＫ１類の蛋白質（ペプチド）量を、本発明の抗体を用いて測定、比較することを特徴とする、アポトーシスまたは炎症関連疾患、糖尿病またはその合併症、あるいはＣＯＰＤの予防・治療物質のスクリーニング方法を提供する。
上記（ｂ）および（ｃ）のスクリーニング方法において、ＡＳＫ１類を産生する能力を有する細胞としては、上記（ａ−２）のスクリーニング方法において用いられるのと同様のものが好ましく用いられる。
例えば、ＡＳＫ１類のｍＲＮＡ量または蛋白質（ペプチド）量の測定は、具体的には以下のようにして行うことができる。
（ｉ）正常あるいは疾患モデル非ヒト温血動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サル、トリなど）に対して、薬剤（例えば、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１、Ｆａｓ、抗癌剤など）あるいは物理化学的ストレス（例えば、ＵＶ、活性酸素、虚血など）などを与え、一定時間経過した後に、血液、あるいは特定の臓器（例えば、脳、肝臓、腎臓など）、あるいは臓器から単離した組織または細胞を得る。
得られた細胞に含まれるＡＳＫ１のｍＲＮＡは、例えば、通常の方法により細胞等からｍＲＮＡを抽出し、例えば、ＲＴ−ＰＣＲなどの手法を用いることにより定量することができ、あるいは自体公知のノーザンブロット解析により定量することもできる。一方、ＡＳＫ１蛋白質量は、ウェスタンブロット解析や以下に詳述する各種イムノアッセイ法を用いて定量することができる。
（ｉｉ）ＡＳＫ１または本発明の活性ペプチドをコードする核酸を導入した形質転換体を上記の方法に従って作製し、該形質転換体に含まれるＡＳＫ１類またはそれをコードするｍＲＮＡを、上記（ｉ）と同様にして定量、解析することができる。
ＡＳＫ１類の発現量を変化させる物質のスクリーニングは、
（ｉ）正常あるいは疾患モデル非ヒト温血動物に対して、薬剤あるいは物理化学的ストレスなどを与える一定時間前（３０分前〜２４時間前、好ましくは３０分前〜１２時間前、より好ましくは１時間前〜６時間前）もしくは一定時間後（３０分後〜３日後、好ましくは１時間後〜２日後、より好ましくは１時間後〜２４時間後）、または薬剤あるいは物理化学的ストレスと同時に被験物質を投与し、投与から一定時間が経過した後（３０分後〜３日後、好ましくは１時間後〜２日後、より好ましくは１時間後〜２４時間後）、該動物から単離した細胞に含まれるＡＳＫ１類をコードするｍＲＮＡ量、または蛋白質（ペプチド）量を定量、解析することにより、あるいは
（ｉｉ）形質転換体を常法に従って培養する際に被験物質を培地中に添加し、一定時間培養後（１日後〜７日後、好ましくは１日後〜３日後、より好ましくは２日後〜３日後）、該形質転換体に含まれるＡＳＫ１類のｍＲＮＡ量または蛋白質（ペプチド）量を定量、解析することにより行うことができる。
被験物質としては、ペプチド、蛋白質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物などが挙げられ、これら物質は新規な物質であってもよいし、公知の物質であってもよい。
上記（ｃ）のスクリーニング方法におけるＡＳＫ１類の量の測定は、具体的には、例えば、
（ｉ）本発明の抗体と、試料液および標識化されたＡＳＫ１類とを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化されたＡＳＫ１類を検出することにより試料液中のＡＳＫ１類を定量する方法や、
（ｉｉ）試料液と、担体上に不溶化した本発明の抗体および標識化された別の本発明の抗体とを、同時あるいは連続的に反応させた後、不溶化担体上の標識剤の量（活性）を測定することにより、試料液中のＡＳＫ１類を定量する方法等が挙げられる。
上記（ｉｉ）の定量法においては、２種の抗体はＡＳＫ１類の異なる部分を認識するものであることが望ましい。例えば、一方の抗体がＡＳＫ１類のＮ端部を認識する抗体であれば、他方の抗体としてＡＳＫ１類のＣ端部と反応するものを用いることができる。
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、〔１２５Ｉ〕、〔１３１Ｉ〕、〔３Ｈ〕、〔１４Ｃ〕などが用いられる。上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが用いられる。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが用いられる。さらに、抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビオチン−（ストレプト）アビジン系を用いることもできる。
試料液としては、ＡＳＫ１類が細胞内に局在する場合は、細胞を適当な緩衝液に懸濁した後、超音波処理または凍結融解などによって細胞を破壊して得られる細胞破砕液が、ＡＳＫ１類が細胞外に分泌される場合には、細胞培養上清がそれぞれ用いられる。必要に応じて、破砕液や培養上清からＡＳＫ１類を分離・精製した後に定量を行ってもよい。また、標識剤の検出が可能である限り、無傷細胞を試料として用いてもよい。
本発明の抗体を用いるＡＳＫ１類の定量法は、特に制限されるべきものではなく、試料液中の抗原量に対応した、抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、ネフロメトリー、競合法、イムノメトリック法およびサンドイッチ法が好適に用いられる。感度、特異性の点で、例えば、後述するサンドイッチ法を用いるのが好ましい。
抗原あるいは抗体の不溶化にあたっては、物理吸着を用いてもよく、また通常蛋白質あるいは酵素等を不溶化・固定化するのに用いられる化学結合を用いてもよい。担体としては、アガロース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、あるいはガラス等があげられる。
サンドイッチ法においては不溶化した本発明の抗体に試料液を反応させ（１次反応）、さらに標識化した別の本発明の抗体を反応させ（２次反応）た後、不溶化担体上の標識剤の量もしくは活性を測定することにより、試料液中のＡＳＫ１類を定量することができる。１次反応と２次反応は逆の順序で行っても、また、同時に行ってもよいし、時間をずらして行ってもよい。標識化剤および不溶化の方法は前記のそれらに準じることができる。また、サンドイッチ法による免疫測定法において、固相化抗体あるいは標識化抗体に用いられる抗体は必ずしも１種類である必要はなく、測定感度を向上させる等の目的で２種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。
本発明の抗体は、サンドイッチ法以外の測定システム、例えば、競合法、イムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどにも用いることができる。
競合法では、試料液中のＡＳＫ１類と標識したＡＳＫ１類とを抗体に対して競合的に反応させた後、未反応の標識抗原（Ｆ）と、抗体と結合した標識抗原（Ｂ）とを分離し（Ｂ／Ｆ分離）、Ｂ、Ｆいずれかの標識量を測定することにより、試料液中のＡＳＫ１類を定量する。本反応法には、抗体として可溶性抗体を用い、ポリエチレングリコールや前記抗体（１次抗体）に対する２次抗体などを用いてＢ／Ｆ分離を行う液相法、および、１次抗体として固相化抗体を用いるか（直接法）、あるいは１次抗体は可溶性のものを用い、２次抗体として固相化抗体を用いる（間接法）固相化法とが用いられる。
イムノメトリック法では、試料液中のＡＳＫ１類と固相化したＡＳＫ１類とを一定量の標識化抗体に対して競合反応させた後、固相と液相を分離するか、あるいは試料液中のＡＳＫ１類と過剰量の標識化抗体とを反応させ、次に固相化したＡＳＫ１類を加えて未反応の標識化抗体を固相に結合させた後、固相と液相を分離する。次に、いずれかの相の標識量を測定し試料液中の抗原量を定量する。
また、ネフロメトリーでは、ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生じた不溶性の沈降物の量を測定する。試料液中のＡＳＫ１類の量がわずかであり、少量の沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメトリーなどが好適に用いられる。
これら個々の免疫学的測定法を本発明の定量方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えてＡＳＫ１類の測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる。
例えば、入江  寛編「ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和４９年発行）、入江  寛編「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和５４年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭和５３年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）（医学書院、昭和５７年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年発行）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ  Ｖｏｌ．７０（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ａ））、同書Ｖｏｌ．７３（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ｂ））、同書Ｖｏｌ．７４（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ｃ））、同書Ｖｏｌ．８４（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ｄ：Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ））、同書Ｖｏｌ．９２（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ｅ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ））、同書Ｖｏｌ．１２１（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ｉ：Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｔｅｃｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ））（以上、アカデミックプレス社発行）などを参照することができる。
以上のようにして、本発明の抗体を用いることによって、細胞におけるＡＳＫ１類の生産量を感度よく定量することができる。
上記（ｂ）および（ｃ）のスクリーニング法において、ＡＳＫ１類の発現量（ｍＲＮＡ量または蛋白質（ペプチド）量）を増加させた物質をＡＳＫ１発現促進物質、発現量を減少させた物質をＡＳＫ１発現阻害物質としてそれぞれ選択することができる。ＡＳＫ１発現促進物質は、アポトーシス誘導もしくは炎症性サイトカイン産生の不全に関連する疾患［例えば、癌（例、白血病、食道癌、胃癌、大腸癌、直腸癌、肺癌、肝臓癌、腎臓癌、乳癌、子宮癌、卵巣癌、前立腺癌、メラノーマ、骨髄腫、骨肉腫、脳腫瘍等）、自己免疫疾患（例、全身性エリテマトーデス、強皮症、慢性関節リウマチ、シェーグレン症候群、多発性硬化症、インスリン依存性糖尿病、乾癬、潰瘍性大腸炎、特発性血小板減少性紫斑病、クローン病、糸球体腎炎等）、ウイルス感染症（例、出血熱、Ｔ細胞白血病、カポジ肉腫、伝染性単核症、リンパ腫、上咽頭癌、子宮頚癌、皮膚癌、肝炎、肝癌等）、内分泌疾患（例、ホルモン過剰症、サイトカイン過剰症等）、血液疾患（例、血球増加症、Ｂ細胞リンパ腫、多血症等）、臓器過形成（例、半陰陽、停留睾丸、奇形腫、腎芽細胞癌、多発性嚢胞腎、心・大動脈奇形、合指症等）、血管形成術後再狭窄、癌切除術後の再発など］の予防・治療剤として用いることができる。
一方、ＡＳＫ１発現阻害物質は、アポトーシス誘導もしくは炎症性サイトカイン産生の異常亢進に関連する疾患［例えば、ウイルス感染症（例、ＡＩＤＳ、インフルエンザ、不明熱等）、内分泌疾患（例、ホルモン欠乏症、サイトカイン欠乏症等）、血液疾患（例、血球減少症、腎性貧血等）、臓器形成不全（例、甲状腺萎縮、口蓋裂等）、移植臓器拒絶、移植片対宿主病、免疫不全、神経変性疾患（例、ポリグルタミン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、プリオン病、小脳変性症等）、虚血性心疾患（例、狭心症、心筋梗塞等）、放射線障害、紫外線障害（例、日焼け等）、中毒性疾患（例、重金属による腎尿細管細胞傷害、アルコールによる肝細胞傷害等）、栄養障害（例、ビタミン、微量元素欠乏による胸腺の萎縮等）、炎症性疾患（例、急性膵炎、関節炎、歯周病、大腸炎等）、虚血性神経障害、血管系疾患（例、動脈硬化等）、呼吸器系疾患（例、間質性肺炎、肺線維症等）、軟骨疾患（例、変形性関節炎等）など］の予防・治療剤として用いることができる。
また、ＡＳＫ１発現阻害物質は、糖尿病またはその合併症（例：糖尿病性腎症、糖尿病性神経障害等）、あるいはＣＯＰＤの予防・治療剤として好ましく用いることができる。
ＡＳＫ１発現促進もしくは阻害物質を上記予防・治療剤として使用する場合は、前記したＡＳＫ１活性促進もしくは阻害物質の場合と同様にして製剤化することができる。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトや他の温血動物（例えば、ラット、マウス、ハムスター、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジー、トリなど）に対して投与することができる。
ＡＳＫ１発現促進物質の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、癌患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常例えば、癌患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
ＡＳＫ１発現阻害物質の投与量も、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、糖尿病（もしくはその合併症）またはＣＯＰＤ患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常例えば、糖尿病（もしくはその合併症）またはＣＯＰＤ患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
（２）アポトーシス誘導または炎症性サイトカイン産生の異常亢進に関連する疾患の予防・治療剤
上記のように、ＡＳＫ１は細胞にアポトーシスを誘導したり、炎症性サイトカインの産生を増大させるので、生体内においてＡＳＫ１またはそれをコードする核酸（例、遺伝子、ｍＲＮＡ等）に異常がある（高活性変異体の出現）場合、あるいはその発現量が異常に増加している場合、さらには、他の何らかの要因で細胞のアポトーシス誘導または炎症性サイトカイン産生が異常亢進している場合、例えば、ウイルス感染症、内分泌疾患、血液疾患、臓器形成不全、移植臓器拒絶、移植片対宿主病、免疫不全、神経変性疾患、虚血性心疾患、放射線障害、紫外線障害、中毒性疾患、栄養障害、炎症、虚血性神経障害、血管系疾患、呼吸器系疾患、軟骨疾患などの種々の疾病を発症する。
したがって、ＡＳＫ１の増加等により生体にとって必要な細胞までがアポトーシスによって失われている、あるいは炎症性疾患を発病している患者がいる場合に、ａ）本発明の抗体を該患者に投与してＡＳＫ１を不活性化したり、ｂ）（イ）本発明のアンチセンス核酸を該患者に投与して標的細胞内に導入する（および発現させる）ことによって、あるいは（ロ）単離した標的細胞に本発明のアンチセンス核酸を導入し発現させた後に、該細胞を該患者に移植することなどによって、患者の体内におけるＡＳＫ１の量を減少させ、本来必要な細胞のアポトーシス死や炎症反応を抑制することができる。
また、ＡＳＫ１遺伝子の不活性化は高脂肪食に対する血糖上昇の感受性を低下させ、また、糖尿病モデルにおける神経障害の進行を抑制するので、糖尿病およびその合併症を発病している患者に、上記ａ）またはｂ）の処置を施すことにより、患者の体内におけるＡＳＫ１の活性もしくは量を低減させ、当該疾患を治療し、進行を抑制することができる。
さらに、ＡＳＫ１遺伝子の不活性化はタバコ煙曝露による肺での炎症性変化を抑制するので、ＣＯＰＤを発病している患者に、上記ａ）またはｂ）の処置を施すことにより、患者の体内におけるＡＳＫ１の活性もしくは量を低減させ、当該疾患を治療し、進行を抑制することができる。
したがって、ａ）本発明の抗体またはｂ）本発明のアンチセンス核酸を、（ｉ）アポトーシス誘導または炎症性サイトカイン産生を抑制することが予防・治療上有効な疾患、例えばＡＳＫ１の過剰発現などに起因する疾患、具体的には、ウイルス感染症（例、ＡＩＤＳ、インフルエンザ、不明熱等）、内分泌疾患（例、ホルモン欠乏症、サイトカイン欠乏症等）、血液疾患（例、血球減少症、腎性貧血等）、臓器形成不全（例、甲状腺萎縮、口蓋裂等）、移植臓器拒絶、移植片対宿主病、免疫不全、神経変性疾患（例、ポリグルタミン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、プリオン病、小脳変性症等）、虚血性心疾患（例、狭心症、心筋梗塞等）、放射線障害、紫外線障害（例、日焼け等）中毒性疾患（例、重金属による腎尿細管細胞傷害、アルコールによる肝細胞傷害等）、栄養障害（例、ビタミン、微量元素欠乏による胸腺の萎縮等）、炎症（例、急性膵炎、関節炎、歯周病、大腸炎等）、虚血性神経障害、血管系疾患（例、動脈硬化等）、呼吸器系疾患（例、間質性肺炎、肺線維症等）、軟骨疾患（例、変形性関節炎等）などの疾患、（ｉｉ）糖尿病（特に２型糖尿病）または糖尿病合併症（例、糖尿病性腎症、糖尿病性神経障害等）、あるいは（ｉｉｉ）ＣＯＰＤの予防・治療剤として用いることができる。
本発明の抗体を上記予防・治療剤として使用する場合、前記したＡＳＫ１活性阻害物質の場合と同様にして製剤化することができる。
また、本発明のアンチセンス核酸を上記予防・治療剤として使用する場合、該核酸を単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って製剤化することができる。該核酸は、そのままで、あるいは摂取促進のための補助剤とともに、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与することができる。
例えば、本発明のアンチセンス核酸は、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、本発明のアンチセンス核酸を、生理学的に認められる公知の担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。
上記の生理学的に認められる公知の担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などの添加剤としては、前記したＡＳＫ１活性阻害物質の場合と同様のものが例示される。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトや他の温血動物（例えば、ラット、マウス、ハムスター、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジー、トリなど）に対して投与することができる。
本発明の抗体の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、糖尿病（もしくはその合併症）またはＣＯＰＤ患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常例えば、糖尿病（もしくはその合併症）またはＣＯＰＤ患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
本発明のアンチセンス核酸の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、２型糖尿病（もしくは糖尿病合併症）またはＣＯＰＤ患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常例えば、２型糖尿病（もしくは糖尿病合併症）またはＣＯＰＤ患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
前記したように、本発明の阻害ペプチドはＡＳＫ１の（拮抗）阻害物質として機能し得る。すなわち、該ペプチドはＡＳＫ１の基質蛋白質であるＭＡＰＫＫに対して親和性を有するがそれを活性化しないので、細胞に内在するＡＳＫ１とＭＡＰＫＫの接近およびそれによるＭＡＰＫＫの活性化（リン酸化）を競合的に阻害し得る。したがって、該部分ペプチドは、本発明の抗体や本発明のアンチセンス核酸と同様に、アポトーシス誘導または炎症性サイトカイン産生の異常亢進に関連する疾患、糖尿病またはその合併症、あるいはＣＯＰＤの予防・治療剤として用いることができる。
本発明の阻害ペプチドを上記予防・治療剤として使用する場合、前記したＡＳＫ１活性阻害物質の場合と同様にして製剤化することができる。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトや他の温血動物（例えば、ラット、マウス、ハムスター、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジー、トリなど）に対して投与することができる。
本発明の阻害ペプチドの投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、糖尿病（もしくはその合併症）またはＣＯＰＤ患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常例えば、糖尿病（もしくはその合併症）またはＣＯＰＤ患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
（３）遺伝子診断剤
前記した本発明の核酸は、プローブ等として使用することにより、ヒトまたは他の温血動物（例えば、ラット、マウス、ハムスター、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジー、トリなど）におけるＡＳＫ１をコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡの異常（遺伝子異常）を検出することができるので、例えば、該ＤＮＡの損傷もしくは突然変異やｍＲＮＡのスプライシング異常あるいは発現低下、あるいは該ＤＮＡの増幅やｍＲＮＡの発現過多などの遺伝子診断剤として有用である。ＡＳＫ１をコードする塩基配列の一部を含有する核酸は、プローブとして必要な長さ（例えば、約１５塩基以上）を有する限り特に制限されず、また、ＡＳＫ１の部分ペプチドをコードしている（即ち、ｉｎ  ｆｒａｍｅである）必要もない。
本発明の核酸を用いる上記の遺伝子診断は、例えば、自体公知のノーザンハイブリダイゼーション、定量的ＲＴ−ＰＣＲ、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法、アレル特異的ＰＣＲ、ＰＣＲ−ＳＳＯＰ法、ＤＧＧＥ法、ＲＮａｓｅプロテクション法、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法などにより実施することができる。
例えば、被験温血動物の細胞から抽出したＲＮＡ画分についてのノーザンハイブリダイゼーションや定量的ＲＴ−ＰＣＲの結果、ＡＳＫ１の発現低下が検出された場合や、ＲＮＡ画分もしくはゲノミックＤＮＡ画分についてＰＣＲ−ＳＳＣＰ法を実施した結果、ＡＳＫ１遺伝子の突然変異が検出された場合は、アポトーシス誘導または炎症性サイトカイン産生の不全に関連する疾患、例えば、癌（例、白血病、食道癌、胃癌、大腸癌、直腸癌、肺癌、肝臓癌、腎臓癌、乳癌、子宮癌、卵巣癌、前立腺癌、メラノーマ、骨髄腫、骨肉腫、脳腫瘍等）、自己免疫疾患（例、全身性エリテマトーデス、強皮症、慢性関節リウマチ、シェーグレン症候群、多発性硬化症、インスリン依存性糖尿病、乾癬、潰瘍性大腸炎、特発性血小板減少性紫斑病、クローン病、糸球体腎炎等）、ウイルス感染症（例、出血熱、Ｔ細胞白血病、カポジ肉腫、伝染性単核症、リンパ腫、上咽頭癌、子宮頚癌、皮膚癌、肝炎、肝癌等）、内分泌疾患（例、ホルモン過剰症、サイトカイン過剰症等）、血液疾患（例、血球増加症、Ｂ細胞リンパ腫、多血症等）、臓器過形成（例、半陰陽、停留睾丸、奇形腫、腎芽細胞癌、多発性嚢胞腎、心・大動脈奇形、合指症等）、血管拡張術後再狭窄、癌切除術後の再発などの疾患に罹患しているか、あるいは将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
一方、ノーザンハイブリダイゼーションや定量的ＲＴ−ＰＣＲによりＡＳＫ１の発現過多が検出された場合は、（ｉ）アポトーシス誘導または炎症性サイトカイン産生の異常亢進に関連する疾患、例えば、ウイルス感染症（例、ＡＩＤＳ、インフルエンザ、不明熱等）、内分泌疾患（例、ホルモン欠乏症、サイトカイン欠乏症等）、血液疾患（例、血球減少症、腎性貧血等）、臓器形成不全（例、甲状腺萎縮、口蓋裂等）、移植臓器拒絶、移植片対宿主病、免疫不全、神経変性疾患（例、ポリグルタミン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、プリオン病、小脳変性症等）、虚血性心疾患（例、狭心症、心筋梗塞等）、放射線障害、紫外線障害（例、日焼け等）、中毒性疾患（例、重金属による腎尿細管細胞傷害、アルコールによる肝細胞傷害等）、栄養障害（例、ビタミン、微量元素欠乏による胸腺の萎縮等）、炎症（例、急性膵炎、関節炎、歯周病、大腸炎等）、虚血性神経障害、血管系疾患（例、動脈硬化等）、呼吸器系疾患（例、間質性肺炎、肺線維症等）、軟骨疾患（例、変形性関節炎等）などの疾患、（ｉｉ）糖尿病またはその合併症（例、糖尿病性腎症、糖尿病性神経障害等）、あるいは（ｉｉｉ）ＣＯＰＤに罹患しているか、あるいは将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
前記した本発明の抗体は、ヒトまたは他の温血動物（例えば、ラット、マウス、ハムスター、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジー、トリなど）におけるＡＳＫ１またはその塩の量を測定することができるので、例えば、該蛋白質の発現低下または発現過多などの遺伝子診断剤として有用である。
本発明の核酸を用いる上記の遺伝子診断は、前記した本発明の抗体を用いるＡＳＫ１発現調節（促進もしくは阻害）物質のスクリーニング方法（（ｃ）のスクリーニング方法）において、ＡＳＫ１類を産生する能力を有する細胞として、被験温血動物から採取した生体試料（例、血液、血漿、尿、生検など）を用いてイムノアッセイを実施することにより行うことができる。
イムノアッセイの結果、該試料中のＡＳＫ１またはその塩の減少が検出された場合は、アポトーシス誘導または炎症性サイトカイン産生の不全に関連する疾患、例えば、癌（例、白血病、食道癌、胃癌、大腸癌、直腸癌、肺癌、肝臓癌、腎臓癌、乳癌、子宮癌、卵巣癌、前立腺癌、メラノーマ、骨髄腫、骨肉腫、脳腫瘍等）、自己免疫疾患（例、全身性エリテマトーデス、強皮症、慢性関節リウマチ、シェーグレン症候群、多発性硬化症、インスリン依存性糖尿病、乾癬、潰瘍性大腸炎、特発性血小板減少性紫斑病、クローン病、糸球体腎炎等）、ウイルス感染症（例、出血熱、Ｔ細胞白血病、カポジ肉腫、伝染性単核症、リンパ腫、上咽頭癌、子宮頚癌、皮膚癌、肝炎、肝癌等）、内分泌疾患（例、ホルモン過剰症、サイトカイン過剰症等）、血液疾患（例、血球増加症、Ｂ細胞リンパ腫、多血症等）、臓器過形成（例、半陰陽、停留睾丸、奇形腫、腎芽細胞癌、多発性嚢胞腎、心・大動脈奇形、合指症等）、血管拡張術後再狭窄、癌切除術後の再発などの疾患に罹患しているか、あるいは将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
一方、イムノアッセイの結果、該試料中のＡＳＫ１またはその塩の増加が検出された場合は、（ｉ）アポトーシス誘導または炎症性サイトカイン産生の異常亢進に関連する疾患、例えば、ウイルス感染症（例、ＡＩＤＳ、インフルエンザ、不明熱等）、内分泌疾患（例、ホルモン欠乏症、サイトカイン欠乏症等）、血液疾患（例、血球減少症、腎性貧血等）、臓器形成不全（例、甲状腺萎縮、口蓋裂等）、移植臓器拒絶、移植片対宿主病、免疫不全、神経変性疾患（例、ポリグルタミン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、プリオン病、小脳変性症等）、虚血性心疾患（例、狭心症、心筋梗塞等）、放射線障害、紫外線障害（例、日焼け等）、中毒性疾患（例、重金属による腎尿細管細胞傷害、アルコールによる肝細胞傷害等）、栄養障害（例、ビタミン、微量元素欠乏による胸腺の萎縮等）、炎症（例、急性膵炎、関節炎、歯周病、大腸炎等）、虚血性神経障害、血管系疾患（例、動脈硬化等）、呼吸器系疾患（例、間質性肺炎、肺線維症等）、軟骨疾患（例、変形性関節炎等）などの疾患、（ｉｉ）糖尿病またはその合併症（例、糖尿病性腎症、糖尿病性神経障害等）、あるいは（ｉｉｉ）ＣＯＰＤに罹患しているか、あるいは将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
（４）ＡＳＫ１阻害物質の用途
本発明はまた、ＡＳＫ１阻害物質（前記したことから明らかなように、該用語は上記ＡＳＫ１発現阻害物質とＡＳＫ１活性阻害物質とを包含する）を含有してなる（ｉ）２型糖尿病または糖尿病合併症（例、糖尿病性腎症等）、あるいは（ｉｉ）ＣＯＰＤの予防・治療剤を提供する。
ＡＳＫ１阻害物質としては、例えば、ＡＳＫ１のドミナントネガティブ変異体（例えば、上記特許文献１〜３参照）、グルタチオン  Ｓ−トランスフェラーゼ、ネフ、１４−３−３、チオレドキシン、ＨＳＰ７２（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，２２（２２）：７７２１−７７３０，２００２）、あるいは前記した本発明の各種スクリーニング方法により得られるＡＳＫ１発現もしくは活性阻害物質等が挙げられるが、それらに限定されない。
ＡＳＫ１阻害物質を上記予防・治療剤として使用する場合、前記したスクリーニング方法により得られるＡＳＫ１活性阻害物質の場合と同様にして製剤化することができる。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトや他の温血動物（例えば、ラット、マウス、ハムスター、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジー、トリなど）に対して投与することができる。
ＡＳＫ１阻害物質の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、２型糖尿病（もしくは糖尿病合併症）またはＣＯＰＤ患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常例えば、２型糖尿病（もしくは糖尿病性腎症）またはＣＯＰＤ患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
（５）ＡＳＫ１をコードするＤＮＡを導入した動物およびその用途
本発明は、ＡＳＫ１をコードする外来性のＤＮＡ（以下、本発明の外来性ＤＮＡと略記する）またはその変異ＤＮＡ（本発明の外来性変異ＤＮＡと略記する場合がある）を有する非ヒト哺乳動物の新規用途を提供する。
本発明で使用される非ヒト哺乳動物は、
〔１〕本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物、
〔２〕非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第〔１〕記載の動物、
〔３〕ゲッ歯動物がマウスまたはラットである第〔２〕記載の動物である。
本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物（以下、本発明のＤＮＡ転移動物と略記する）は、未受精卵、受精卵、精子およびその始原細胞を含む胚芽細胞などに対して、好ましくは、非ヒト哺乳動物の発生における胚発生の段階（さらに好ましくは、単細胞または受精卵細胞の段階でかつ一般に８細胞期以前）に、リン酸カルシウム法、電気パルス法、リポフェクション法、凝集法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、ＤＥＡＥ−デキストラン法などにより目的とするＤＮＡを転移することによって作出することができる。また、該ＤＮＡ転移方法により、体細胞、生体の臓器、組織細胞などに目的とする本発明の外来性ＤＮＡを転移し、細胞培養、組織培養などに利用することもでき、さらに、これら細胞を上述の胚芽細胞と自体公知の細胞融合法により融合させることにより本発明のＤＮＡ転移動物を作出することもできる。
非ヒト哺乳動物としては、例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウス、ラットなどが用いられる。なかでも、病体動物モデル系の作成の面から個体発生および生物サイクルが比較的短く、また、繁殖が容易なゲッ歯動物、とりわけマウス（例えば、純系として、Ｃ５７ＢＬ／６系統、ＤＢＡ２系統など、交雑系として、Ｂ６Ｃ３Ｆ１系統、ＢＤＦ１系統、Ｂ６Ｄ２Ｆ１系統、ＢＡＬＢ／ｃ系統、ＩＣＲ系統など）またはラット（例えば、Ｗｉｓｔａｒ、ＳＤなど）などが好ましい。
哺乳動物において発現しうる組換えベクターにおける「哺乳動物」としては、上記の非ヒト哺乳動物の他にヒトなどがあげられる。
本発明の外来性ＤＮＡとは、非ヒト哺乳動物が本来有しているＡＳＫ１をコードするＤＮＡではなく、いったん哺乳動物から単離・抽出されたＡＳＫ１をコードするＤＮＡをいう。
本発明の変異ＤＮＡとしては、元のＡＳＫ１をコードするＤＮＡの塩基配列に変異（例えば、突然変異など）が生じたもの、具体的には、塩基の付加、欠損、他の塩基への置換などが生じたＤＮＡなどが用いられ、また、異常ＤＮＡも含まれる。
該異常ＤＮＡとしては、異常なＡＳＫ１を発現させるＤＮＡを意味し、例えば、正常なＡＳＫ１の機能を抑制する異常ＡＳＫ１を発現させるＤＮＡなどが用いられる。
本発明の外来性ＤＮＡは、対象とする動物と同種あるいは異種のどちらの哺乳動物由来のものであってもよい。本発明の外来性ＤＮＡを対象動物に転移させるにあたっては、該ＤＮＡを動物細胞で発現させうるプロモーターの下流に結合したＤＮＡコンストラクトとして用いるのが一般に有利である。例えば、ヒトＡＳＫ１をコードするＤＮＡを転移させる場合、これと相同性が高いＡＳＫ１のＤＮＡを有する各種哺乳動物（例えば、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来のＤＮＡを発現させうる各種プロモーターの下流に、ヒトＡＳＫ１をコードするＤＮＡを結合したＤＮＡコンストラクト（例、ベクターなど）を対象哺乳動物の受精卵、例えば、マウス受精卵へマイクロインジェクションすることによってＡＳＫ１をコードするＤＮＡを高発現するＤＮＡ転移哺乳動物を作出することができる。
ＡＳＫ１の発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミド、λファージなどのバクテリオファージ、モロニー白血病ウィルスなどのレトロウィルス、ワクシニアウィルスまたはバキュロウィルスなどの動物ウイルスなどが用いられる。なかでも、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミドまたは酵母由来のプラスミドなどが好ましく用いられる。
上記のＤＮＡ発現調節を行うプロモーターとしては、例えば、（ｉ）ウイルス（例、シミアンウイルス、サイトメガロウイルス、モロニー白血病ウイルス、ＪＣウイルス、乳癌ウイルス、ポリオウイルスなど）に由来するＤＮＡのプロモーター、（ｉｉ）各種哺乳動物（ヒト、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来のプロモーター、例えば、アルブミン、インスリンＩＩ、ウロプラキンＩＩ、エラスターゼ、エリスロポエチン、エンドセリン、筋クレアチンキナーゼ、グリア線維性酸性蛋白質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、血小板由来成長因子β、ケラチンＫ１、Ｋ１０およびＫ１４、コラーゲンＩ型およびＩＩ型、サイクリックＡＭＰ依存蛋白質キナーゼβＩサブユニット、ジストロフィン、酒石酸抵抗性アルカリフォスファターゼ、心房ナトリウム利尿性因子、内皮レセプターチロシンキナーゼ（一般にＴｉｅ２と略される）、ナトリウムカリウムアデノシン３リン酸化酵素（Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅ）、ニューロフィラメント軽鎖、メタロチオネインＩおよびＩＩＡ、メタロプロティナーゼ１組織インヒビター、ＭＨＣクラスＩ抗原（Ｈ−２Ｌ）、Ｈ−ｒａｓ、レニン、ドーパミンβ−水酸化酵素、甲状腺ペルオキシダーゼ（ＴＰＯ）、ペプチド鎖延長因子１α（ＥＦ−１α）、βアクチン、αおよびβミオシン重鎖、ミオシン軽鎖１および２、ミエリン基礎蛋白質、チログロブリン、Ｔｈｙ−１、免疫グロブリン、Ｈ鎖可変部（ＶＮＰ）、血清アミロイドＰコンポーネント、ミオグロビン、トロポニンＣ、平滑筋αアクチン、プレプロエンケファリンＡ、バソプレシンなどのプロモーターなどが用いられる。なかでも、全身で高発現することが可能なサイトメガロウイルスプロモーター、ヒトペプチド鎖延長因子１α（ＥＦ−１α）のプロモーター、ヒトおよびニワトリβアクチンプロモーターなどが好適である。
上記ベクターは、ＤＮＡ転移哺乳動物において目的とするｍＲＮＡの転写を終結する配列（一般にターミネターと呼ばれる）を有していることが好ましく、例えば、ウイルス由来および各種哺乳動物由来の各ＤＮＡの配列を用いることができ、好ましくは、シミアンウイルスのＳＶ４０ターミネターなどが用いられる。
その他、目的とする外来性ＤＮＡをさらに高発現させる目的で各ＤＮＡのスプライシングシグナル、エンハンサー領域、真核ＤＮＡのイントロンの一部などをプロモーター領域の５’上流、プロモーター領域と翻訳領域間あるいは翻訳領域の３’下流に連結することも目的により可能である。
正常なＡＳＫ１の翻訳領域は、ヒトまたは各種哺乳動物（例えば、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来の肝臓、腎臓、甲状腺細胞、線維芽細胞由来ＤＮＡおよび市販の各種ゲノムＤＮＡライブラリーよりゲノムＤＮＡの全てあるいは一部として、または肝臓、腎臓、甲状腺細胞、線維芽細胞等由来のＲＮＡより公知の方法により調製された相補ＤＮＡを原料として取得することが出来る。また、外来性の異常ＤＮＡは、上記の細胞または組織より得られた正常なＡＳＫ１の翻訳領域を点突然変異誘発法により変異した翻訳領域を作製することができる。
該翻訳領域は転移動物において発現しうるＤＮＡコンストラクトとして、前記のプロモーターの下流および所望により転写終結部位の上流に連結させる通常のＤＮＡ工学的手法により作製することができる。
受精卵細胞段階における本発明の外来性ＤＮＡの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞のすべてに存在するように確保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞において、本発明の外来性ＤＮＡが存在することは、作出動物の後代がすべて、その胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性ＤＮＡを保持することを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性ＤＮＡを有する。
本発明の外来性正常ＤＮＡを転移させた非ヒト哺乳動物は、交配により外来性ＤＮＡを安定に保持することを確認して、該ＤＮＡ保有動物として通常の飼育環境で継代飼育することが出来る。
受精卵細胞段階における本発明の外来性ＤＮＡの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞の全てに過剰に存在するように確保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞において本発明の外来性ＤＮＡが過剰に存在することは、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性ＤＮＡを過剰に有することを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性ＤＮＡを過剰に有する。
導入ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該ＤＮＡを過剰に有するように繁殖継代することができる。
本発明の外来性正常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、本発明の正常ＤＮＡが高発現させられており、内在性の正常ＤＮＡの機能を促進することにより最終的にＡＳＫ１の機能亢進症を発症することがあり、その病態モデル動物として利用することができる。例えば、本発明の正常ＤＮＡ転移動物を用いて、ＡＳＫ１の機能亢進症や、ＡＳＫ１が関連する疾患の病態機序の解明およびこれらの疾患の治療方法の検討を行うことが可能である。
また、本発明の外来性正常ＤＮＡを転移させた哺乳動物は、ＡＳＫ１の増加症状を有することから、ＡＳＫ１の機能亢進に関連する疾患、例えば、糖尿病およびその合併症（例、糖尿病性腎症、糖尿病性神経障害等）、呼吸器系疾患（例、ＣＯＰＤ、間質性肺炎、肺線維症等）、ウイルス感染症（例、ＡＩＤＳ、インフルエンザ、不明熱等）、内分泌疾患（例、ホルモン欠乏症、サイトカイン欠乏症等）、血液疾患（例、血球減少症、腎性貧血等）、臓器形成不全（例、甲状腺萎縮、口蓋裂等）、移植臓器拒絶、移植片対宿主病、免疫不全、神経変性疾患（例、ポリグルタミン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、プリオン病、小脳変性症等）、虚血性心疾患（例、狭心症、心筋梗塞等）、放射線障害、紫外線障害（例、日焼け等）中毒性疾患（例、重金属による腎尿細管細胞傷害、アルコールによる肝細胞傷害等）、栄養障害（例、ビタミン、微量元素欠乏による胸腺の萎縮等）、炎症（例、急性膵炎、関節炎、歯周病、大腸炎等）、虚血性神経障害、血管系疾患（例、動脈硬化等）、軟骨疾患（例、変形性関節炎等）などの疾患に対する予防・治療薬のスクリーニング試験にも利用可能である。
一方、本発明の外来性異常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、交配により外来性ＤＮＡを安定に保持することを確認して該ＤＮＡ保有動物として通常の飼育環境で継代飼育することが出来る。さらに、目的とする外来ＤＮＡを前述のプラスミドに組み込んで原科として用いることができる。プロモーターとのＤＮＡコンストラクトは、通常のＤＮＡ工学的手法によって作製することができる。受精卵細胞段階における本発明の異常ＤＮＡの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞の全てに存在するように確保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞において本発明の異常ＤＮＡが存在することは、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性異常ＤＮＡを有することを意味する。導入ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該ＤＮＡを有するように繁殖継代することができる。
本発明の外来性異常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、本発明の異常ＤＮＡが高発現させられており、内在性の正常ＤＮＡの機能を阻害することにより最終的にＡＳＫ１の機能不活性型不応症（例えば、癌（例、白血病、食道癌、胃癌、大腸癌、直腸癌、肺癌、肝臓癌、腎臓癌、乳癌、子宮癌、卵巣癌、前立腺癌、メラノーマ、骨髄腫、骨肉腫、脳腫瘍等）、自己免疫疾患（例、全身性エリテマトーデス、強皮症、慢性関節リウマチ、シェーグレン症候群、多発性硬化症、インスリン依存性糖尿病、乾癬、潰瘍性大腸炎、特発性血小板減少性紫斑病、クローン病、糸球体腎炎等）、ウイルス感染症（例、出血熱、Ｔ細胞白血病、カポジ肉腫、伝染性単核症、リンパ腫、上咽頭癌、子宮頚癌、皮膚癌、肝炎、肝癌等）、内分泌疾患（例、ホルモン過剰症、サイトカイン過剰症等）、血液疾患（例、血球増加症、Ｂ細胞リンパ腫、多血症等）、臓器過形成（例、半陰陽、停留睾丸、奇形腫、腎芽細胞癌、多発性嚢胞腎、心・大動脈奇形、合指症等）など）となることがあり、その病態モデル動物として利用することができる。例えば、本発明の異常ＤＮＡ転移動物を用いて、ＡＳＫ１の機能不活性型不応症の病態機序の解明およびこの疾患を治療方法の検討を行なうことが可能である。
また、具体的な利用可能性としては、本発明の異常ＤＮＡ高発現動物は、ＡＳＫ１の機能不活性型不応症における異常ＡＳＫ１による正常ＡＳＫ１の機能阻害（ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｎｅｇａｔｉｖｅ作用）を解明するモデルとなる。
また、本発明の外来異常ＤＮＡを転移させた哺乳動物は、ＡＳＫ１の増加症状を有することから、ＡＳＫ１の機能不活性型不応症に対する治療薬スクリーニング試験にも利用可能である。
さらに、本発明のＤＮＡ転移動物を用いて、ＡＳＫ１の機能不活性型不応症を含む、ＡＳＫ１に関連する疾患の予防・治療薬の開発を行なうために、上述の検査法および定量法などを用いて、有効で迅速な該疾患予防・治療薬のスクリーニング法を提供することが可能となる。また、本発明のＤＮＡ転移動物または本発明の外来性ＤＮＡ発現ベクターを用いて、ＡＳＫ１が関連する疾患の遺伝子治療法を検討、開発することが可能である。
本明細書および図面において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによる略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
ＤＮＡ        ：デオキシリボ核酸
ｃＤＮＡ      ：相補的デオキシリボ核酸
Ａ        ：アデニン
Ｔ        ：チミン
Ｇ        ：グアニン
Ｃ        ：シトシン
ＲＮＡ        ：リボ核酸
ｍＲＮＡ      ：メッセンジャーリボ核酸
ｄＡＴＰ      ：デオキシアデノシン三リン酸
ｄＴＴＰ      ：デオキシチミジン三リン酸
ｄＧＴＰ      ：デオキシグアノシン三リン酸
ｄＣＴＰ      ：デオキシシチジン三リン酸
ＡＴＰ        ：アデノシン三リン酸
ＥＤＴ        ：エチレンジアミン四酢酸
ＳＤＳ        ：ドデシル硫酸ナトリウム
Ｇｌｙ        ：グリシン
Ａｌａ        ：アラニン
Ｖａｌ        ：バリン
Ｌｅｕ        ：ロイシン
Ｉｌｅ        ：イソロイシン
Ｓｅｒ        ：セリン
Ｔｈｒ        ：スレオニン
Ｃｙｓ        ：システイン
Ｍｅｔ        ：メチオニン
Ｇｌｕ        ：グルタミン酸
Ａｓｐ        ：アスパラギン酸
Ｌｙｓ        ：リジン
Ａｒｇ        ：アルギニン
Ｈｉｓ        ：ヒスチジン
Ｐｈｅ        ：フェニルアラニン
Ｔｙｒ        ：チロシン
Ｔｒｐ        ：トリプトファン
Ｐｒｏ        ：プロリン
Ａｓｎ        ：アスパラギン
Ｇｌｎ        ：グルタミン
ｐＧｌｕ      ：ピログルタミン酸
＊            ：終止コドンに対応する
Ｍｅ          ：メチル基
Ｅｔ          ：エチル基
Ｂｕ          ：ブチル基
Ｐｈ          ：フェニル基
ＴＣ          ：チアゾリジン−４（Ｒ）−カルボキサミド基
また、本明細書中で繁用される置換基、保護基および試薬を下記の記号で表記する。
Ｔｏｓ        ：ｐ−トルエンスルフォニル
ＣＨＯ        ：ホルミル
Ｂｚｌ        ：ベンジル
Ｃｌ２Ｂｚｌ  ：２，６−ジクロロベンジル
Ｂｏｍ        ：ベンジルオキシメチル
Ｚ            ：ベンジルオキシカルボニル
Ｃｌ−Ｚ      ：２−クロロベンジルオキシカルボニル
Ｂｒ−Ｚ      ：２−ブロモベンジルオキシカルボニル
Ｂｏｃ        ：ｔ−ブトキシカルボニル
ＤＮＰ        ：ジニトロフェノール
Ｔｒｔ        ：トリチル
Ｂｕｍ        ：ｔ−ブトキシメチル
Ｆｍｏｃ      ：Ｎ−９−フルオレニルメトキシカルボニル
ＨＯＢｔ      ：１−ヒドロキシベンズトリアゾール
ＨＯＯＢｔ    ：３，４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリアジン
ＨＯＮＢ      ：１−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミド
ＤＣＣ        ：Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド
本明細書の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。
［配列番号：１］
ヒトＡＳＫ１  ｃＤＮＡのアミノ酸コード領域の塩基配列を示す。
［配列番号：２］
ヒトＡＳＫ１のアミノ酸配列を示す。
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明の範囲はそれらによって何ら限定されるものではない。
【実施例１】  ストレプトゾシン誘発糖尿病モデルにおける糖尿病性神経障害に及ぼすＡＳＫ１遺伝子ノックアウトの効果
７週齢の雄性ＡＳＫ１ノックアウト（ＫＯ）マウス（上記特許文献２に記載の方法に準じて作製）および同週齢の雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（日本クレア）を用いた。２４時間の絶食を行い、絶食前後の体重およびその変化量がほぼ均等になるよう各動物を２群に分け、ストレプトゾシン（ＳＴＺ）１２５ｍｇ／ｋｇおよび１３５ｍｇ／ｋｇ投与群とした。無処置の６週齢Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを正常対照群とした。ＳＴＺ（Ｓｉｇｍａ）は溶媒（０．１Ｍクエン酸と生理食塩液の１：２混合液）に１２．５および１３．５ｍｇ／ｍｌの濃度になるよう投与直前に溶解し、エーテル麻酔下に１０ｍｌ／ｋｇの用量で腹腔内投与した。ＳＴＺ投与８及び１２週間後に眼底採血を行い、生化学自動分析装置（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，シンクロンＣＸ５△）を用いて血漿中グルコース濃度を測定した。尾の運動神経伝導速度はＳＴＺ投与後７、１０および１３週目にＮｅｕｒｏｐａｃｋ２（日本光電）により測定した。尚、データは１２５ｍｇ／ｋｇおよび１３５ｍｇ／ｋｇ投与群をあわせて解析した。
結果を表１及び表２に示す。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス、ＡＳＫ１  ＫＯマウスともＳＴＺの投与により血漿中グルコース濃度が上昇し、その程度は同等であった。ＳＴＺ処置Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスおよびＳＴＺ処置ＡＳＫ１  ＫＯマウスでは、ＳＴＺ処置７週間後において、正常対照マウスに比して尾運動神経伝導速度が有意に低下していた。ＳＴＺ処置Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスでは、１０および１３週間後に更に尾運動神経伝導速度は低下したが、ＳＴＺ処置ＡＳＫ１  ＫＯマウスでは、７週間後と同程度の値で推移した。
【表１】
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【表２】
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【実施例２】  高脂肪食負荷時のマウスにおける血糖上昇に及ぼすＡＳＫ１遺伝子ノックアウトの効果
５週齢の雄性ＡＳＫ１  ＫＯマウスおよび同齢の雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを用いた。体重測定、眼底採血を行い、生化学自動分析装置（Ｂｅｃｋｍａｎ，ＣＸ５△）を用いて血漿中グルコース濃度（Ｇｌｕ）を測定した。体重およびＧｌｕがほぼ均等となるよう、各マウスを正常食群および高脂肪食群の２群ずつに組分けた。正常食としてＣＥ−２（日本クレア）、高脂肪食として＃Ｄ１２４５１（４５ｋｃａｌ％  ｆａｔ，Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔｓ，Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ，ＮＪ，ＵＳＡ）を用いた。高脂肪食負荷後２、４、６、８および１０週目に体重測定、採血を行い、Ｇｌｕを測定した。
結果を表３及び表４に示す。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおいて、高脂肪食負荷後６週目から８週目にかけて、体重の増加傾向、２週目から１０週目にかけて、Ｇｌｕの有意な上昇が認められた。一方、ＡＳＫ１  ＫＯマウスでは、高脂肪食負荷後６週目から１０週目にかけて体重の有意な増加が認められた。また、高脂肪食負荷後２週および６週目にＧｌｕの有意な上昇が認められるものの、野生型（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）マウスに比して軽度であり、８および１０週目ではその差は消失した。
【表３】
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【表４】
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【実施例３】糖尿病性腎症モデルマウス（ｄｂ／ｄｂマウス）の腎臓組織におけるＡＳＫ１の発現および活性の上昇
インスリン非依存性糖尿病を呈し糖尿病性腎症を自然発症する雄性Ｃ５７ＢＬ／ＫｓＪ  ｄｂ／ｄｂマウス（３２週齢、日本クレア）およびその正常対照動物である同週齢の雄性Ｃ５７ＢＬ／ＫｓＪ  ｄｂ／＋ｍ（日本クレア）を用いた。マウスを放血致死させ、腎臓を摘出、液体窒素で凍結した後、組織を粉砕し、１ｍｌのホモジナイゼーションバッファー［２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１％  デオキシコレート、３ｍＭ  ジチオスレイトール、２ｍＭ  オルトバナジン酸ナトリウム、１２ｍＭ  β−グリセロリン酸、５０ｍＭ  ＮａＦ、プロテアーゼインヒビターカクテル（Ｒｏｃｈｅ）］を加えてポリトロンホモジナイザーでホモジナイズした。超音波破砕機で５秒間処理した後、１５０００ｒｐｍで１５分間遠心し、上清を別のチューブに移した。脂質を除去する目的で０．４５μｍの遠心フィルターにかけ（１５０００ｒｐｍ、１分）、通過液を新しいチューブに移した。蛋白質定量を行い、チューブあたり１０ｍｇ蛋白質となるようホモジナイゼーションバッファーで調整した。抗ＡＳＫ１抗体（ｓｃ−６３６８，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＵＳ）を２μｇ／チューブ加え、４℃で１時間転倒混和後、２０μＬのプロテイン−Ｇ−セファロース（ファルマシア）を加えて、４℃で３０分間転倒混和することにより免疫沈降を行った。１５０００ｒｐｍで１分間遠心し、沈殿を洗浄（３回）した後、チューブに３０μＬのＬＤＳサンプルバッファー（５０ｍＭ  ＤＴＴ含有、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加え、１００℃で５分間煮沸した。ＮｕＰＡＧＥ  ３−８％  Ｔｒｉｓ−Ａｃｅｔａｔｅ  Ｇｅｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、レーンあたり２０μＬのサンプルを泳動（１５０Ｖ、６０分）した。蛋白質をＰＶＤＦ膜に転写（セミドライ法）し、ブロックエース（大日本製薬）を用い、４℃で一晩ブロッキングを行った。抗リン酸化ＡＳＫ１抗体（２０００倍希釈）あるいは抗ＡＳＫ１抗体（ＤＡＶ抗体、１０００倍希釈）を４℃で一晩反応させた後、ＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ，ＨＲＰ−ｌｉｎｋｅｄ  Ｆ（ａｂ’）２  ｆｒａｇｍｅｎｔ、１０００倍希釈、アマシャム）を室温で６０分間反応させた。基質にはＳｕｐｅｒ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｍａｘｉｍｕｍ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ（ＰＩＥＲＣＥ）を用い、化学発光を画像解析装置（アトー）で検出した。陽性対照としてＡＳＫ１高発現ＨＥＫ２９３細胞由来のサンプルを用いた。
結果を図１に示す。３２週齢のＣ５７ＢＬ／ＫｓＪ  ｄｂ／ｄｂマウスの腎組織において、正常対照動物であるＣ５７ＢＬ／ＫｓＪ  ｄｂ／＋ｍマウスに比べてＡＳＫ１蛋白質量の増加が認められた（図１Ａ；レーン１〜６）。また、Ｃ５７ＢＬ／ＫｓＪ  ｄｂ／ｄｂマウスの腎組織では、リン酸化ＡＳＫ１量も増加していた（図１Ｂ；レーン１〜６）。
【実施例４】  タバコ煙曝露ＣＯＰＤモデルにおける気道炎症におよぼすＡＳＫ１遺伝子ノックアウトの効果
６週齢の雄性ＡＳＫ１ノックアウト（ＫＯ）マウス（上記特許文献２に記載の方法に準じて作製）および同週齢の野生型マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、雄性、日本クレア）をタバコ煙曝露実験に供した。ＡＳＫ１  ＫＯおよび野生型マウスをアクリル製チャンバーに収納し、５分毎にタバコ１本分の主流煙（タバコ銘柄：Ｋｅｎｔｕｃｋｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｉｇａｒｅｔｔｅ  １Ｒ１，タバコ主流煙濃度：１６％）をチャンバー内に注入することでタバコ煙曝露を行った。タバコ煙曝露は一日あたり３０分間（タバコ６本分）行い、これを３日間継続した。また対照群としては通常飼育室で同期間飼育した同週齢の雄性マウスを用いた。最終タバコ煙曝露２４時間後に肺胞洗浄液を回収し気道炎症の観察を行った。マウスをペントバルビタール麻酔により致死させ、気道内にカニューレを挿入後、０．５ｍｌ氷冷ＰＢＳの注入（計３回）することで肺胞洗浄液の回収を行った。肺胞洗浄液は３０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心後、上清は回収し好中球遊走因子であるＫＣの測定（ＫＣ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ，Ｇｅｎｚｙｍｅ社）に用いた。また遠心後の沈査は０．１ｍｌ  ＨＢＳＳで再懸濁し総細胞数の計測と白血球の分別測定に用いた。
結果を表５に示す。通常飼育室で飼育を行った対照群においては、肺胞洗浄液中の総細胞数、マクロファージ細胞数、好中球細胞数、ＫＣ量のいずれにおいても、野生型マウスとＡＳＫ１  ＫＯマウスの間で有意な差はみられなかった。次に野生型マウスとＡＳＫ１  ＫＯマウスのタバコ煙曝露後の気道炎症反応を比較したところ、総細胞数は野生型マウスで１２．０±０．９ｘ１０４個であったが、ＡＳＫ１  ＫＯマウスでは７．２±０．４ｘ１０４個と有意に減少し、好中球数も野生型マウスで６．５±０．７ｘ１０４個、ＡＳＫ１  ＫＯマウスでは２．２±０．４ｘ１０４個と６６％の有意な減少効果が観察された。一方、マクロファージ細胞数は野生型マウスとＡＳＫ１  ＫＯマウスの間で有意な差は見られなかった（５．３±０．２ｖｓ４．８±０．４ｘ１０４個、野生型ｖｓ  ＡＳＫ１  ＫＯマウス）。また、肺胞洗浄液中のＫＣ量を測定したところ、野生型マウスでは５７．０±４．３ｐｇ／ｍｌ、ＡＳＫ１  ＫＯマウスでは４１．６±２．０ｐｇ／ｍｌとＡＳＫ１  ＫＯマウスで有意な減少がみられた。
【表５】
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【実施例５】  タバコ煙曝露ＣＯＰＤモデルの肺組織におけるＡＳＫ１の発現および活性の上昇
６週齢の雄性マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、日本クレア）を実験に供した。マウスをアクリル製チャンバーに収納し、自動タバコ煙発生装置（柴田科学）を用いタバコ（タバコ銘柄：Ｋｅｎｔｕｃｋｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｉｇａｒｅｔｔｅ  ２Ｒ４Ｆ）主流煙（３％）をチャンバー内流入させ３０分間のタバコ煙曝露を行った。タバコ煙曝露終了３、６、９時間後にマウスを屠殺し、肺を液体窒素中で急速冷凍させた。肺組織を１ｍｌの氷冷ホモジネート  バッファー（ホスファターゼ阻害剤、プロテアーゼ阻害剤含）中でホモジナイズし、遠心後の上清の蛋白定量を行った。肺ホモジネート（５ｍｇ蛋白）に抗ＡＳＫ１抗体（Ｎ−１９、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社、４μｇ／ｔｕｂｅ）を２μｇ／チューブ加え、４℃で１時間転倒混和後、２０μＬのプロテイン−Ｇ−セファロース（ファルマシア）を加えて、４℃で３０分間転倒混和することにより免疫沈降を行った。免疫沈降物を洗浄後、ＳＤＳサンプルバッファーを加え１００℃で５分間煮沸した。ＮｕＰＡＧＥ  ４−１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  Ｇｅｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用い、レーンあたり１０μＬのサンプルを電気泳動（１５０Ｖ、９０分）した。蛋白質をＰＶＤＦ膜に転写後、ブロックエース（大日本製薬社）を用い４℃で一晩ブロッキングを行った。抗リン酸化ＡＳＫ１抗体（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社）あるいは抗ＡＳＫ１抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社）を４℃で一晩反応させた後、ＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ，ＨＲＰ−ｌｉｎｋｅｄ、アマシャム社）を室温で６０分間反応させた。基質にはＳｕｐｅｒ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｍａｘｉｍｕｍ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ（ＰＩＥＲＣＥ社）を用い、化学発光を画像解析装置（富士フィルム社）で検出した。
図２にリン酸化ＡＳＫ１とＡＳＫ１のウェスタンブロッティング（図２Ａ）とバンドを定量化（図２Ｂ）した結果を示す。ＡＳＫ１のリン酸化はタバコ煙暴露によって亢進し、３、６、９時間後ではｐｒｅ値と比較してそれぞれ１．８、２．７、２．６倍の増強が観察された。また、このときにＡＳＫ１の発現量もリン酸化ＡＳＫ１と同様のタイムコースで増加し、３、６、９時間後ではｐｒｅ値と比較してそれぞれ１．８、２．３、２．６倍の増強が観察された。以上の結果から、タバコ煙曝露刺激後の肺においてＡＳＫ１蛋白の発現量の増加に伴いＡＳＫ１リン酸化（活性化）も亢進していくことが判明した。
【産業上の利用可能性】  本発明のスクリーニング方法によれば、アポトーシスまたは炎症関連疾患、糖尿病またはその合併症、あるいは慢性閉塞性肺疾患に対して予防・治療効果を示す化合物を、迅速かつ簡便に選択することが可能であり、当該疾患の予防・治療薬の開発における薬効評価等のためのツールとして有用である。
本出願は、日本で出願された特願２００４−１３１７３１（出願日：２００４年４月２７日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【配列表】
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