(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
不均質な核酸集団を分析する方法であって、
（ａ）前記集団中の核酸分子をマイクロアレイ形態で固体表面に固定化すること、
（ｂ）前記マイクロアレイを、ハイブリダイズ条件下で、既知の核酸配列または前記集団に存在すると想像される配列から作製された標識プローブのプールに曝すこと、
（ｃ）前記プローブプールに弱くハイブリダイズするかまたはハイブリダイズしない前記マイクロアレイ上の一つまたはそれ以上の不一致の核酸分子を検出し、前記一つまたはそれ以上の不一致の核酸分子のアイデンティティを決定すること、ここで、前記不一致の核酸分子は、前記ハイブリダイゼーションが０.５以下のシグナル−ノイズ（Ｓ／Ｎ）比を有するハイブリダイゼーションシグナルを生じた場合に、前記プローブプールに弱くハイブリダイズしたとみなされる、
（ｄ）前記（ｃ）の一つまたはそれ以上の不一致の核酸分子をシークエンスすること、
（ｅ）前記一つまたはそれ以上の不一致の核酸分子の各々に対応する標識プローブを前記プローブプールに追加し、プローブプールを拡張すること、
（ｆ）前記プローブプールの代わりに前記拡張プローブプールを用いて（ａ）〜（ｅ）を一回またはそれ以上繰り返すこと、
を含む、方法。
【請求項２】
前記一つまたはそれ以上の不一致の核酸分子が同定され、選択され、そしてマイクロアレイ形態で固定化され、それによってユニジーンセットが生成される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記核酸分子がＤＮＡを含む請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＤＮＡがゲノムＤＮＡである請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ＤＮＡがライブラリーからのクローンである請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記核酸分子がＲＮＡを含む請求項１または２に記載の方法。
【請求項７】
前記核酸分子が増幅されたものである請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記核酸分子がＰＣＲ増幅によって増幅される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記標識が蛍光性標識、発光性標識、および放射性標識からなる群より選択される請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記標識プローブプールが、公共のデータベースから入手できる配列を有する一つまたはそれ以上の核酸分子を含む、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記固体表面がガラス表面である、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の分野】
本発明は、核酸類に関し、より詳しくは非重複性ｍＲＮＡおよび新規ゲノム配列の同定および単離方法に関する。
【０００２】
【発明の背景】
生体細胞の正常な機能を指示する機構の解明には、完全なゲノムのすべてにコードされた情報の詳細な理解が要求される。典型的には、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）配列を用いて様々な生物のゲノムに含まれる遺伝子をマップしたり、シークエンスしたりする。その配列情報を用いて、興味ある特定の細胞または生物の遺伝的構成を評価する。しかしながら、ｍＲＮＡは異なる細胞タイプ内の様々なレベルで、そして成長の異なる時点の間に生成される。ＭＲＮＡタイプの分布、それらの発生および細胞タイブ特異的に制御された発現、並びにタンパク質への翻訳によって特定の細胞タイプにユニークな性質が得られる。
【０００３】
メッセンジャーＲＮＡのような核酸分子類の集団は、典型的にはクローン化された核酸ライブラリーを用いて調べる。ライブラリーは、ゲノムライブラリーを含むことができ、これらは１つの全ゲノムの無作為に切断したＤＮＡ断片を適当なクローニングベクターに入れることによって作製できる。哺乳動物ゲノムＤＮＡから作製されたライブラリーについては、ほとんどのランダムゲノムクローンが非コードＤＮＡ、高度に反復するＤＮＡまたはそれらの両方を含む。
【０００４】
第２のタイプのライブラリーは、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）分子から作製される。これらのライブラリーは、興味ある供給元から単離したｍＲＮＡから逆転写されたＤＮＡから作製される。従って、ｃＤＮＡライブラリーは主として遺伝子をコードするＤＮＡを含む。
【０００５】
異なる種類のｍＲＮＡは、所定の１つの細胞中で等しく代表されるわけではない。その代わり、ｍＲＮＡ分子は、頻度により３つのクラスに分類される。すなわち、(１)極広く分布（superprevalent）（約10〜15mRNAからなり、これらは共にトータルmRNA量の10〜20％を占める）、(２)中間（intermediate）（約1〜2,000mRNAからなり、これらは共にトータルmRNA量の40〜45％を占める）、そして(３)複雑（complex）（約15〜20,000mRNAからなり、これらは共にトータルmRNA量の40〜45％を占める）。Davidson and Britten, SCIENCE 204: 1052-1059 (1979)。
【０００６】
１つの細胞内に極広い分布および中度の複雑性ＲＮＡ分子が存在することは、低存在量ｍＲＮＡ種の同定とシークエンスの障害となり得る。シークエンスに適する核酸ライブラリーの創製において、極広い分布のｍＲＮＡは、低存在量のｍＲＮＡの単離および解析を邪魔する。ｃＤＮＡライブラリーから単離されるクローンの大部分は、極広い分布および中度の分布のｍＲＮＡからのものであるために、かなりの時間と努力が既知の広く分布するｍＲＮＡ種の再シークエンスに費やされており、低存在量のｍＲＮＡ種を単離、分析するためには多数のｍＲＮＡ種をシークエンスしなければならない。かくして、ライブラリーからの遺伝子発見の速度は、所定の細胞に存在するｍＲＮＡの重複性によって制限され得る。高存在量のｍＲＮＡの存在もまた、関連する組織型の異なる細胞、成長の異なる過程での細胞で観察される活性遺伝子の差異、刺激の効果、および正常に機能する細胞と異常な細胞との間の差異的な遺伝子発現（例えば、腫瘍組織と比較して正常組織からの細胞）を比較するのに障害となる。
【０００７】
【発明の要約】
本発明は、核酸分子の集団において重複性（redundancy）を同定および除去するための非常に効率よい、高スループットの方法を発見したことに一部基づいている。
【０００８】
前記方法は、核酸断片のランダムサンプルを用意すること、その核酸断片のランダムサンプルをマイクロアレイに固定化すること、そして以前にアレイされたか、またはシークエンスされた断片に対応する１個以上の標識プローブをハイブリダイズさせることを含む。標識プローブにハイブリダイズする断片を検出し、そして標識プローブにハイブリダイズしなかったか、または弱くハイブリダイズした少なくとも１個の断片を同定し、さらに所望ならばそれをシークエンスする。
【０００９】
前記核酸断片は、ＲＮＡもしくはＤＮＡであり、選択肢としてベクターにクローニングされていてもよい。いくつかの実施の形態では、核酸断片がｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーの一員である。そのライブラリーは、規格化されていてもよいし、されていなくてもよい。他の実施の形態では、核酸断片がＰＣＲ断片である。いくつかの実施の形態では、核酸断片がＰＣＲ等によって増幅されている。
【００１０】
前記核酸断片を続いて固体表面（例えば、マイクロアレイ中）に固定化する。その固体表面は、好適にはガラスである。以前にアレイされたか、またはシークエンスされた断片に対応する標識プローブ（すなわち、サブトラクションプローブ）を固定化された核酸断片にハイブリダイズさせる。核酸標識は、蛍光性、発光性、または放射性ラベル、ビオチン化、ハプテン化、または標識プローブの容易な検出を可能にする他の化学タグである。一般的に、ハイブリダイズしなかったプローブを除去する。標識プローブにハイブリダイズしなかったか、または弱くハイブリダイズした核酸断片を単離し、次いで前記以前のプローブセットとともにプールして新しい、より大きなプローブセットを作成する。通常、その新たに単離された断片をシークエンスして、それらの配列を配列データベース中に見つかるものと比較する。
【００１１】
本発明の方法は、核酸分子の集団から非重複性（non-redundant）核酸断片を同定、単離するサブトラクションプロトコールを伴う。所望ならば、そのプロトコールを繰り返して、その結果、継続的に繰り返す毎に、以前に特徴付けられていない遺伝子に対して、より片寄った断片のセットを創製する。従って、サブトラクションのラウンド毎に、新たに単離された断片に対応するプローブを標識して、以前のサブトラクションプローブに加える。この新しいサブトラクションプローブを無作為にピックした核酸断片を含む次のマイクロアレイにハイブリダイズさせる。好ましくは、前記新たに同定した配列をサブトラクションプローブに加えることを伴って、この手順を数回繰り返す。かくして、その方法によって、非重複性の、もしくは最小限しか重ならない核酸断片を興味ある供給元から同定し、単離することが可能となり、新規遺伝子の発見速度が増す。好適な実施の形態では、本発明の方法を用いて単離された非重複性クローンを同定、選択して、新しいマイクロアレイに固定化して、ユニジーン（unigene）セットを得る。
【００１２】
本明細書で説明する方法について、数々の応用が考え得る。例えば、前記方法は、興味ある配列類の濃縮（enrichment）が望まれるいかなる応用にも用いることができる。代わりに、その方法を用いて核酸分子の集団から望ましくない核酸断片を除去することができる。用途の非制限的なセットには、以下のものが包含される。
【００１３】
Ｉ．発現されたｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ配列を発見する速度を増加させ、核酸分子の集団中に少量で存在するメッセージを同定するための核酸分子のセットの作製を容易にする、マイクロアレイに基づく方法。この方法は、発現されたｃＤＮＡの発見を増加させ、ユニークなｃＤＮＡセットの作製を促進することを可能にする。
【００１４】
II．ゲノム配列を発見する速度を増加させ、全ゲノムまたは興味ある部分領域に対応するＤＮＡ断片の単離を容易にする、マイクロアレイに基づく方法。この応用において、前記方法はゲノムクローンの発見の増加、および非重複性もしくは最小限しか重ならないゲノムクローンの作製を促進することをもたらす。興味ある領域をマップするクローンの発見の増加、ゲノム中の興味ある領域におけるゲノムクローンセットの作製の促進、およびゲノムマップ中のギャップを埋めることの促進ももたらされる。これは、例えば疾病遺伝子のマッピングおよび疾病遺伝子の同定を容易にするのに有用である。
【００１５】
III．別の集団と比較して1つの集団にユニークなＤＮＡ配列を濃縮および／または単離する、マイクロアレイに基づく方法。また、本発明は別の生物に対して1つの生物にユニーク、または新規な配列の同定をも可能にし、これは異なる菌株（例えば、病原菌株対非病原菌株、および異なる種）からの核酸分子を含む。それらの配列は、例えばｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ、あるいはゲノム性、染色体性、プラスミド、またはウイルス性の核酸であり得る。
【００１６】
IV．関連するＤＮＡ配列の発見を増加する、マイクロアレイに基づく方法。反対に、その方法は、密接にもしくは遠縁で関連する生物間における関連配列を同定することを可能にする。それらの配列は、例えばｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ、あるいはゲノム性、染色体性、プラスミド、またはウイルス性の核酸であり得る。
【００１７】
Ｖ．核酸分子の集団から望ましくない配列を除去する速度を増加する、マイクロアレイに基づく方法。別の実施の形態において、本発明は望ましくないＤＮＡ配列の除去をもたらし、これは夾雑ＤＮＡ配列および以前に同定されたものに密接に関連する配列を含む。
【００１８】
VI．２つの異なる核酸集団中において、1個以上のＤＮＡ配列のコピー数の変化を確認する、マイクロアレイに基づく方法。
【００１９】
別に定義しない限り、本明細書で用いられるすべての技術、科学用語は、本発明が属する技術分野の通常の熟練者によって普通に理解されているのと同一の意味をもつ。本明細書に記載されているものと同様もしくは均等である方法および材料を本発明の実施および試験において使用することができるけれども、適切な方法および材料を以下に記載する。本明細書中に挙げられる、すべての印刷物、特許出願、特許および他の参考文献は、それら全体が引用によって組み込まれる。疑いが生じた場合は、定義を含めて本明細書が優先することになる。さらに、材料、方法および実例は例示のためだけのものであり、制限することを意図しない。
本発明の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【００２０】
【発明の詳述】
便宜上、本明細書で使用する特定の用語および表現の意図する意味を以下に定義する。
「既知の遺伝子」または「既知の配列」とは、それらの配列が公共のまたは非公開の配列データベースに見出すことができるものである。
「新規な遺伝子」または「新規な配列」とは、それらの配列が例えば、公共のまたは非公開のいかなる配列データベースにも見出されない等で公的に入手できない核酸分子である。
「不均質」とは、そのセットが配列の異なる少なくとも２個の核酸分子を含む核酸分子のセットを意味する。不均質な核酸分子は、例えば細胞、組織および／または生物から単離されたＲＮＡ集団を含む。
【００２１】
本明細書で定義する「弱く」ハイブリダイズするとは、０.５以下（Array Visionソフトウエアのデータ解析システムを用いて確認）のシグナル−ノイズ（Ｓ／Ｎ）比を有するハイブリダイゼーションシグナルを指す。Ｓ／Ｎは、バックグランド強度の標準偏差によって割った点シグナルのバックグランドを差し引いた強度の尺度である。
【００２２】
「非重複性核酸」とは、核酸分子の集団（例えば、核酸分子の不均質な集団）中、以前に同定されていなかった核酸である。いくつかの実施の形態では、非重複性核酸が核酸分子の集団中に小さいコピー数で存在する配列である。
【００２３】
「ユニークな遺伝子セット」とは、そのセットの各メンバーが細胞集団中で小さいコピー数で表される配列に対応する遺伝子セットである。例えば、ユニークな遺伝子セットは、細胞当たり数コピー存在する配列に対応する。ユニークな遺伝子セットは、別の言い方をすれば減少した存在数の遺伝子セットと呼ぶことができる。いくつかの実施の形態では、ユニークな遺伝子セットは、細胞当たり１００、５０、２５、１５、１０、５、２コピー、さらに１コピーで存在するメンバーを含む。このように、特定の細胞タイプまたは集団からのユニークな遺伝子セットは、いくつかの実施の形態においてその細胞タイプに発現される各遺伝子の1つのコピーを含むであろう。
【００２４】
「複合（complex）プローブ」とは、多くの異なるＤＮＡもしくはＲＮＡを含むものである。本明細書で使用する、その複合プローブは、既知の配列に相補的な核酸配列を含む。
【００２５】
本発明によって、複合プローブプールを用いるサブトラクティブハイブリダイゼーションを伴う反復選択とマイクロアレイ技術を利用する核酸分子の集団中の重複性を同定、および除去するための非常に効率的、高スループット方法が提供される。クローニングライブラリーから選択された、無作為選択の核酸断片をマイクロアレイに配列し、ハイブリダイズ条件下、既知の配列（例えば、Genebank、pubEST等の公共データベースから得られた配列）から作製した複合標識プローブに曝す。この第１プローブプールに弱くハイブリダイズするか、またはハイブリダイズしないクローンのみをシークエンスする。この第１プローブプールにハイブリダイズするクローンは、シークエンスしない。このステップで得られた配列を以前に同定された核酸分子の公共データベース（例えば、BLAST、pubEST、Genbank NR）と比較する。これらの配列を最初のプローブプールに加えて、第２のサブトラクティブプローブプールを作製する。このサブトラクティブプローブプールを前記ライブラリーからの無作為選択の第２グループにハイブリダイズさせる。プローブは、前記最初の公知配列の核酸、並びにハイブリダイゼーションの第１ラウンドで同定された核酸に相補的な核酸にハイブリダイズする。ハイブリダイゼーションのラウンドを続けた後、プローブプールを拡張する手順は、実質的にすべての無作為選択クローンが標識プローブにハイブリダイズするまで繰り返し、これは以前に特徴付けられていなかったクローンのすべてがシークエンスされたことを示す。従って、本発明の方法は、公知の他の方法の効率を低減させる問題である既知のクローンを再シークエンスする必要をなくする。
【００２６】
第１のステップは、核酸分子の不均質な集団を単離することを伴う。それら核酸分子は、全長ＲＮＡもしくはＤＮＡ分子の断片であり得る。いくつかの実施の形態において、核酸分子の不均質な集団は、核酸分子の集団から無作為に選択された核酸断片を包含する。これらの断片は、ＲＮＡもしくはＤＮＡであり、選択肢としてベクターにクローニングされていてもよい。好適な実施の形態において、前記核酸分子は、既知でない配列の核酸ライブラリーからのｃＤＮＡを包含する。１つの実施の形態では、そのライブラリーがゲノムライブラリーである。別の実施の形態では、そのライブラリーが、ｃＤＮＡライブラリーである。いずれの実施の形態でも、ライブラリーが、規格化されていてもよいし、されていなくてもよい。代わりに、核酸断片の集団は、ライブラリー（例えば、ＰＣＲ断片）の一部でよい。
【００２７】
いくつかの実施の形態では、前記核酸がＰＣＲまたは他の増幅方法を用いて、増幅される。次いで、ＤＮＡを好ましくはガラスであるマイクロアレイの表面上に固定化する。ある実施の形態では、そのアレイされたＤＮＡがガラス上の合成オリゴヌクレオチドを包含する。好ましい実施の形態では、ＰＣＲ断片がマイクロアレイスポッターを用いてアレイ（配列）される。
【００２８】
次いで、ハイブリダイゼーションを許容する条件下、既知もしくは定義された配列の核酸分子を含む標識プローブプールに固定化されたＤＮＡ分子を接触させる。核酸類の標準的な標識プロトコールは、例えばSambrookら; Kambaraら, BIOTECHNOLOGY 6: 816-821 (1988); Smithら、NUC. ACIDS RES. 13: 2399-2412 (1985)に記載されている。核酸標識は、蛍光性、発光性、または放射性ラベル、ビオチン化、ハプテン化、あるいは標識プローブの容易な検出を可能にするその他の化学タグである。蛍光性標識は、本明細書に記載する方法には有利である、というのはこれらは多重サンプルの同時高スループット解析のための自動化機器とともに日常的に使用されているからである。MetzkerおよびGibbsは、改良された分光特性をもつCy発蛍光団に基づく蛍光的にタグされたヌクレオチドのファミリーを最近開示した。例えば、本明細書に援用される米国特許第5,728,529号を参照。発蛍光団の別の組としては、ローダミン型発蛍光団、TARAM、ROX、JOE、およびFAM、BigDYe発蛍光団（登録商標）（Applied Biosystems, Inc.）、ダンシル基、フルオレセインや置換フルオレセイン誘導体、アクリジン誘導体、クマリン誘導体、フタロシアニン、テトラメチルローダミン、Texas Red(登録商標)、９−(カルボキシエチル)−３−ヒドロキシ−６−オキソ−６Ｈ−キサンテン、DABCYL（登録商標）、BODIPY（登録商標）発蛍光団（Molecular Probes社、ユージーン、オレゴン州）が挙げられる。
【００２９】
ハイブリダイゼーションステップに続いて、マイクロアレイ（例えば、ＤＮＡマイクロアレイ）中の各位置で標識量を検出する。Brown and Bostein, NAT. GENET. 21: 33-37(1999)を参照。マイクロアレイとは、支持材料上に空間的に離れた構成で配置された2本鎖もしくは1本鎖ＤＮＡの整列したアレイである。典型的にはニトロセルロースの大きなシートであるフィルター「マクロアレイ」と対照的に、マイクロアレイは１０,０００個までのＤＮＡ分子が通常、１〜４cm2の領域に合うようにより密度高く充填された構成でＤＮＡを配置する。フィルターアレイのニトロセルロースに基づく材料とは対照的に、マイクロアレイは被覆されたガラスを典型的に用いる。ＤＮＡサンプルの整列したアレイをもつことによって、各サンプルの位置は追跡でき、それからアレイ上のＤＮＡが生成された元のサンプルに結びつけることができる。マイクロアレイを調製する方法および装置は、既に報告されている。例えば、共に本明細書に援用する米国特許5,445,934号および5,800,992号を参照。
【００３０】
マイクロアレイを創製する工程は、ｃＤＮＡライブラリーを含むバクテリアコロニーのセットを処理して、いずれか１つのバクテリアコロニー中に保持されたベクターの挿入片に由来する精製ＤＮＡの増幅した断片を得る一連のステップを伴う。その一連のステップは、手動でまたはロボットワークステーション（例えば、ＰＣＲ機器および液体を扱うロボット）の使用を経るかのいずれかで実施することができる。好適な方法において、前記ステップは９６穴、３８４穴、または１５３６穴からなる多重穴プレートを用いて実施できる。しかしながら、その他の構成も可能である。マイクロアレイは、ロボットスポッターを用いて作製されるが、これは例えばMolecular Dynamics社またはStanford University（上掲）のPatrick Brown研究室で開発された機器である。マイクロアレイ工程の別の特徴は、データ解析がArray Vision等のデータ解析ソフトウエアを用いて、自動的に実行されることである。シークエンスのために処理されるバクテリアコロニーが容易く同定され得るように、クローンのトラッキング、マイクロアレイ作製から結果への全工程は完全に統合されている。
【００３１】
様々な実施の形態において、本発明のマイクロアレイは１００、１,０００、１０,０００、または実に１００,０００個以上のＤＮＡサンプルを含有する。
マイクロアレイ上のＤＮＡサンプルを標識された、例えば蛍光標識されたＲＮＡもしくはＤＮＡプローブとハイブリダイズさせて、そのプローブサンプルが該マイクロアレイ上のＤＮＡサンプルと類似または同一であるかどうかを確認する。好適な実施の形態では、複合プローブがマイクロアレイにハイブリダイズし得る。複合プローブとは、数多くの異なるＤＮＡもしくはＲＮＡ分子を含むものである。
【００３２】
プローブ分子とマイクロアレイ上の同一または、ほぼ同一のＤＮＡ分子との間でハイブリット形成を許容する条件下で、プローブ分子は、マイクロアレイ上のＤＮＡ分子とハイブリダイズする。ＤＮＡ−プローブハイブリッド分子の存在は、例えば蛍光検出機器によって検出される。特定のＤＮＡ部位でハイブリダイゼーションシグナルが弱いか、または存在しない場合、プローブ中に対応するＤＮＡもしくはＲＮＡ分子は存在しない。様々な実施の形態において、１、２、３または４個以上のプローブ分子が同時に使用される。
【００３３】
いくつかの実施の形態では、マイクロアレイ作製、ハイブリダイゼーションおよび解析の反復ラウンドによって前記工程が達成される。その方法は、所定サイズのユニークな遺伝子セットを得るシークエンス量を減らす。様々な実施の形態では、該方法を使用して、二重ＤＮＡなど反復するＤＮＡ、バクテリアまたはミトコンドリアＤＮＡを有するサンプル、およびｃＤＮＡ挿入片がないサンプルを除去することができる。
【００３４】
フィルターアレイ法に対して、マイクロアレイに基づくサブトラクションには数々の利点がある。例えば、本方法はシークエンスに先立ってバクテリア中のクローンを増殖する必要なしですませる。例えば、フィルター法は一般にクローン化ＤＮＡが含まれているバクテリアコロニーをアレイする。ＤＮＡを遊離させ、かつＤＮＡをフィルター上に固定するためには、それらのコロニーを数日にわたって増殖し、細胞溶解せねばならない。コロニーのフィルターアレイへのハイブリダイゼーションは、バクテリアの残骸および該コロニーから遊離されるＤＮＡの量が少ないため妨げられ得る。
【００３５】
本方法の第２の利点は、バクテリアクローンを用いるフィルターアッセイよりもマイクロアレイでより速やかにその反復を実行することができることである。バクテリア中でクローンを増殖し、解析するのに数日を要することがある。対照的に、アレイの解析が完了した後、次のマイクロアレイのプロービングを２４時間以内で開始することができる。
【００３６】
マイクロアレイの別の利点は、蛍光標識プローブを使用することができることである。これにより、ハイブリダイゼーション検出のための非放射性方法が提供される。対照的に、フィルターハイブリダイゼーションは通常放射性リンまたは硫黄で標識されたプローブを用いる。マイクロアレイは、多重プローブに同時にハイブリダイズされ得る。対照的に、フィルターアレイは、一度に１個のプローブしかハイブリダイズされ得ない。
【００３７】
マイクロアレイのさらなる利点は、ハイブリダイゼーションシグナルの再現性と感度である。通常、マイクロアレイではフィルターアレイに対してハイブリダイゼーションシグナルが大きくかつ感度も大である。これにより、マイクロアレイではプローブをより複雑にでき、しかもポジティブなハイブリダイゼーションシグナルを得ることが可能である。さらに、フィルターアレイは、そのフィルター上でのプローブとＤＮＡ間の結果を示すハイブリダイゼーションに無関係である擬似バックグランドシグナルをしばしば示す。
【００３８】
さらに、他の方法に対して、マイクロアレイに基づくサブトラクションによってユニークな遺伝子セットを作成する数々の利点がある。例えば、ｃＤＮＡ規格化またはサブトラクション手順に使用される、溶液での選択的ハイブリダイゼーションを用いる方法は、通常ある種の低存在量クローンのロスをもたらす。対照的に、反復マイクロアレイに基づくサブトラクションアプローチを用いることによって、ライブラリー中の全てのクローンが同定可能である。複数回のハイブリダイゼーション反復ラウンドの後、低存在量のｃＤＮＡクローンが見出されることになる。ｃＤＮＡのユニークなセットを調製するためのマイクロアレイに基づくアプローチの別の利点は、得られるｃＤＮＡクローンが全長に近い傾向がよりあることである。対照的に、サブトラクションと規格化のための他の方法は、しばしば短い不完全なｃＤＮＡを濃縮にする。
【００３９】
アレイの特定の位置での弱いシグナルまたはシグナルが全く無いことは、一般的にプローブプールにある配列にハイブリダイズしなかったか、または弱くハイブリダイズしたＤＮＡの存在に対応する。弱いシグナルまたはシグナルが全く無いクローンをシークエンスする。シークエンシングは、周知のＤＮＡシークエンス法を用いて実行することができる。例えば、本明細書に援用されるMaxam and Gilbert、PROC NATL ACAD SCI USA 74: 560-564 (1977); Sangerら、 PROC NATL ACAD SCI USA 74: 5463-5467 (1977);および米国特許第5,821,058号を参照。
【００４０】
ゲルまたはキャピラリー中の断片の自動解析は、配列情報を収集し、処理するのに係わる労力をかなり減らしてきた。例えば、Proberら、SCIENCE 238: 336-341 (1987); Smithら、NATURE 321: 674-679 (1986); Luckeyら、NUCLEIC ACIDS RES 18: 4417-4421 (1990); Dovichi, ELECTROPHORESIS 18: 2393-2399 (1997)を参照。このステップで単離、シークエンスした核酸を最初のプローブプールに加える。しばしば、これらの断片をまずシークエンスして、マイクロアレイ中の非重複性核酸の存在を決定する。それらの配列を以前に同定された核酸分子の公共データベースと比較する（例えば、公衆が入手可能なデータベースの配列と比較する）。
【００４１】
ライブラリーから無作為に選択された異なる群から作製された第２のマイクロアレイを巻き込むハイブリダイゼーションの次のラウンドに、第２のサブトラクティブプローブを使用する。前記サブトラクティブプローブに新たに同定した核酸断片を加えることによって、ライブラリーから無作為に選択されたクローンの次のマイクロアレイをより多数の標識プローブに曝す。従って、本発明の方法は、既知クローンの再シークエンシングをなくする。
【００４２】
標識プローブの数が継続的反復で増加するにつれて、標識された「既知」クローンの数も増加して、より少ないクローンが標識されないことになる。結局、反復が十分であると、所定のライブラリーから無作為に選択されたクローンのマイクロアレイ中、クローンの全てがシークエンスされたことになるのでクローンの全てが標識されることになる。
【００４３】
本発明の１つの側面では、低存在量のｍＲＮＡが濃縮されたクローニングライブラリーが作製される。本方法の延長で、それら低存在量の配列を低存在量のｍＲＮＡに対応する核酸を含むチップの作製に使用する。これらのチップを次の実験（例えば、示差表示（differential display）実験）に使用することができる。新規な遺伝子発見のための戦略の概要を図１に示す。本発明のさらなる実施の形態において、夾雑核酸をクローニングライブラリーから除去する。
【００４４】
別の側面で、本発明は核酸分子のサンプル中の重複性を減少させる方法を提供する。その方法は、核酸分子の不均質なサンプルを用意し、その核酸分子のサンプルをマイクロアレイに固定化することを含む。次いで、以前にアレイされたか、またはシークエンスされた核酸分子に対応する１個以上の標識プローブを固定化サンプル中の核酸分子にハイブリダイズさせる。好ましくは、それらプローブは前記核酸分子のサンプルに存在することが知られている配列を含む。また、その方法は標識プローブにハイブリダイズする少なくとも１個の固定化分子を同定して、サンプルにハイブリダイズする固定化核酸もしくは核酸類を特異的に認識する第２の核酸分子を提供することをも含む。所望ならば、その第２の核酸分子を標識してプローブ分子として使用することができる。そのサンプルを新たに加えたプローブ分子を含むプローブ分子もしくは分子類と再ハイブリダイズすることもできる。所望ならば、この工程を繰り返して、核酸分子の集団中の既に同定された核酸分子を順次除去することができる。
【００４５】
また、本発明に包含されるのは、核酸分子の不均質なサンプルを用意し、マイクロアレイにその核酸分子のサンプルを固定化し、そしてそのサンプルに１個以上の標識プローブにハイブリダイズさせることによって、核酸集団中の複数の非重複性配列を同定する方法である。それら標識プローブは、サンプル中の１個以上の以前に同定された核酸分子に対応する。標識プローブに弱くハイブリダイズするか、またはハイブリダイズしない、固定化サンプルの少なくとも１個の固定化された核酸分子を同定する。所望ならば、複数の非重複性配列が同定されるまで、その工程を繰り返す。また、本発明はこの方法に従って、同定された配列、並びにそれら複数の配列を包含するマイクロアレイをも包含する。
【００４６】
本発明は、実行者が興味ある配列を濃縮するか、興味のない配列を除去することを望むようないかなる目的にも適合され得る。例示的な用途は、以下を含むが限定はされない。
【００４７】
Ｉ．発現されたｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ配列を発見する速度を増加させ、ユニークな、または低存在量の転写物に対応する配列セットの作製を容易にする、マイクロアレイに基づく方法
1つの側面において、本発明は発現されたｃＤＮＡから新規な遺伝子発見を増加させ、セットの作製を促進することを提供する。これは、以下によって達成され得る：
【００４８】
(ａ)核酸断片のランダムサンプルを増幅し（ＰＣＲまたは核酸分離手順によって）、用意すること;
(ｂ)前記ランダム核酸をマイクロアレイ形態の固体表面に固定化すること、
(ｃ)ＤＮＡ供給元からの標識プローブを前記固定化され、マイクロアレイに配列されたＤＮＡ断片にハイブリダイズさせること;
(ｄ)標識プローブにハイブリダイズしたＤＮＡ断片を検出し、ハイブリダイズしないか、弱くハイブリダイズする、少なくとも１個の断片を同定すること（すなわち、サブトラクション）;
(ｅ)ＤＮＡシークエンシング、ハイブリダイゼーション、またはその他の分析的なアプローチによってＤＮＡ断片のアイデンティティを決定すること;そして
(ｆ)付加的な配列を同定し、ユニークな遺伝子セットを増加させるために、前記プローブセット中で以前に同定された配列を用いて、ステップ(ｂ)または(ｃ)から(ｅ)を繰り返すこと。
【００４９】
II．ゲノム配列を発見する速度を増加させ、全ゲノムまたは興味ある部分領域に対応するＤＮＡ断片の単離を容易にする、マイクロアレイに基づく方法
ゲノム配列の場合、「最小限にタイルされた」クローン、すなわち最小量の重なり合う配列が可能なクローンのセットを作製することが望ましいだろう。このようにして、本発明はゲノムクローンを発見する速度を増加させ、非重複性クローン、または最小限しか重ならないゲノムクローンのセットの作製を促進し、興味ある遺伝子をマッピングするクローンを発見する速度を増加させることを可能にする。また、その方法はゲノム中の興味ある領域におけるゲノムクローンのセットの作製をも促進することができる。ゲノム中で興味ある領域に容易くクローンをマップする能力によって、実行者はさらにゲノムマップ中のギャップを容易く埋めて、疾病遺伝子のマッピングおよび疾病遺伝子の同定を容易にできる。
前記方法は、以下を含む:
【００５０】
(ａ)ゲノム核酸断片のランダムサンプルを増幅し（ＰＣＲまたは核酸分離手順によって）、用意すること;
(ｂ)前記ランダム核酸をマイクロアレイ形態の固体表面に固定化すること;
(ｃ)ＤＮＡ供給元からの標識プローブ（プールされているか、または単一の）を前記固定化され、マイクロアレイに配列されたＤＮＡ断片にハイブリダイズさせること（プローブは、ｃＤＮＡ／ｍＲＮＡまたはゲノム配列であり得る）;
(ｄ)標識プローブにハイブリダイズするＤＮＡ断片を検出すること;
(ｅ)ＤＮＡシークエンシング、ハイブリダイゼーション、またはその他の分析的なアプローチによってＤＮＡ断片のアイデンティティを決定すること;  そして
(ｆ)付加的な配列を同定し、ユニークな遺伝子セットを増加させるために、前記プローブセット中で以前に同定された配列を用いて、ステップ(ｂ)または(ｃ)から(ｅ)を繰り返すこと。
【００５１】
特に、以前に同定された配列の末端領域をプローブとして使用して、「ウォークし」、そして側面に位置するクローンを同定できる。
【００５２】
III．別の集団と比較して１つの集団にユニークであるＤＮＡ配列（ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ、ゲノム性、染色体性、プラスミドおよびその他の全て）を濃縮および／または単離する、マイクロアレイに基づく方法
本発明の別の用途は、別の生物に対して１つの生物にユニーク、または新規な配列（発現されたｃＤＮＡまたはゲノム性）の同定用である。これは別の菌株に対して１つの菌株（すなわち、病原菌株対非病原菌株）にユニークな核酸の同定のみならず密接に関連した種およびより遠縁の関連した種からのユニークな遺伝子セットの比較を含む。
1つより多い供給元生物からの核酸をこの応用に用いるので、その方法の特定のステップは、いくぶん異なっており、そして以下を含む:
【００５３】
(ａ)核酸断片のランダムサンプルを増幅し（ＰＣＲまたは核酸分離手順によって）、用意すること;
(ｂ)前記ランダム核酸をマイクロアレイ形態の固体表面に固定化すること;
(ｃ)第１の供給元および第２の供給元からの標識プローブを前記固定化され、マイクロアレイに配列されたＤＮＡ断片にハイブリダイズさせること（プローブは、ｃＤＮＡ／ｍＲＮＡまたはゲノム配列であり得る）;
(ｄ)第１の供給元からの標識プローブにハイブリダイズするが、第２の供給元からの標識プローブにハイブリダイズしない、またはその逆のＤＮＡ断片を検出すること;そして
(ｅ)ＤＮＡシークエンスシング、ハイブリダイゼーション、またはその他の分析的なアプローチによってＤＮＡ断片のアイデンティティを決定すること。
【００５４】
IV．関連する（または保存された）ＤＮＡ配列（ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ、ゲノム性、染色体性、プラスミドおよびその他の全て）の発見を増加させるためのマイクロアレイに基づく方法
上記の方法に正反対の方法によって、様々な種において関連する配列（相違よりもむしろ）の発見が可能であるが、これは異なる菌株および遠縁で関連する生物を含む。その方法は、以下を含む。
【００５５】
(ａ)核酸断片のランダムサンプルを増幅し（ＰＣＲまたは核酸分離手順によって）、用意すること;
(ｂ)前記ランダム核酸をマイクロアレイ形態の固体表面に固定化すること;
(ｃ)標識プローブ（単一か、またはプールされた）を前記固定化され、マイクロアレイに配列されたＤＮＡ断片に、特にハイブリダイゼーションの減少したストリンジェンシーでハイブリダイズさせること（プローブは、ｃＤＮＡ／ｍＲＮＡまたはゲノム配列であり得る）;
(ｄ)標識プローブにハイブリダイズするＤＮＡ断片（時々、より弱いシグナルの）を検出すること;
(ｅ)ＤＮＡシークエンシング、ハイブリダイゼーション、またはその他の分析的なアプローチによってＤＮＡ断片のアイデンティティを決定すること;そして
(ｆ)得られたＤＮＡ配列を他の入手できるＤＮＡ配列と比較して他の既知の配列にホモロジーを示すが、それらと同一ではない配列を検出すること。
【００５６】
Ｖ．望ましくない配列を除去する速度を増加するためのマイクロアレイに基づく方法
また、本発明は、望ましくないＤＮＡ配列（ｃＤＮＡまたはゲノム性）をアレイＤＮＡのいかなる集団からも除去することを提供する。これは、夾雑ＤＮＡのみならず興味のないいかなるＤＮＡ（例えば、既に同定されたものに密接に関連する配列）をも含む。本方法は、以下を含む:
【００５７】
(ａ)核酸断片のランダムサンプルを増幅し（ＰＣＲまたは核酸分離手順によって）、用意すること;
(ｂ)前記ランダム核酸をマイクロアレイ形態の固体表面に固定化すること;
(ｃ)除去の標的配列である標識プローブを前記固定化され、マイクロアレイに配列されたＤＮＡ断片にハイブリダイズさせること;
(ｄ)標識プローブにハイブリダイズしたＤＮＡ断片を検出し、ハイブリダイしないか、または弱くハイブリダイダイズする少なくとも１個の断片を同定すること（すなわち、サブトラクション）;
(ｅ)ＤＮＡシークエンシング、ハイブリダイゼーション、またはその他の分析的なアプローチによってＤＮＡ断片のアイデンティティを決定すること;そして
(ｆ)断片の集団から望ましくない配列を除去するために、前記プローブセット中で以前に同定された配列を用いて、ステップ(ａ)、(ｂ)または(ｃ)から(ｅ)を繰り返すこと。
【００５８】
VI．核酸の異なる供給元間でＤＮＡ配列（ゲノム性、染色体性、プラスミドおよび他の全て）のコピー数（過少に、または過剰に表現された）の変化を確認する、マイクロアレイに基づく方法
本発明によって、核酸の異なる供給元間でＤＮＡ配列（ゲノム性、染色体性、プラスミドおよび他の全て）のコピー数（過少に、または過剰に表現された）の変化を確認する、マイクロアレイに基づく方法もまた提供される。その方法は、以下を含む:
【００５９】
(ａ)所定の供給元からの核酸断片のランダムなサンプルを増幅（ＰＣＲまたは核酸単離手順によって）し、用意すること;
(ｂ)ランダムな核酸をマイクロアレイ形態の固体表面に固定化すること;
(ｃ)別の供給元からの標識プローブ（単一もしくはプールされた、いかなる種類の核酸、すなわちｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ、ゲノム性、染色体性、プラスミドおよび他の全てであるが、一般にアレイされた核酸の種類に対応する）を前記固定化され、マイクロアレイに配列されたＤＮＡ断片にハイブリダイズさせること;
(ｄ)標識プローブに対して、ハイブリダイゼーションの不在、より有意に少ないハイブリダイゼーション、あるいはより有意に多いハイブリダイゼーションを示す、ＤＮＡ断片を検出すること（シグナル強度のこのような変化は、存在量の変化を反映することになる）;そして
(ｄ)ＤＮＡシークエンシング、ハイブリダイゼーション、またはその他の分析的アプローチによってＤＮＡ断片のアイデンティティを決定すること。
【００６０】
【実施例】
実施例１  ｃＤＮＡマイクロアレイの作製
１.１  ｃＤＮＡ増幅
周知の手法によってｃＤＮＡライブラリーを生成させた。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて、バクテリア性クローンからｃＤＮＡ挿入片を単離した。ＰＣＲマスターミックス［10xPCRバッファー 1000μl、2.5mM dNTP 800μl、T3プライマー（5pmole／μl）400μl、T7プライマー（5pmole／μl）400μlおよび組換えTaqポリメラーゼ10μlを含む］からの３８４穴マイクロタイタープレートの各穴に２５μlのＰＣＲミックスを添加した。ＰＣＲプレートは、約１μlをトランスファーするために３８４ピンツールを用いて、一夜培養プレートから接種した。プレートをMicroseal Aで密封して、MJ Research ４組（tetrad）ＰＣＲ機のαユニットに配置した。反応液を９５℃で４分間、予熱し、３５サイクルの増幅を続けた（95℃で45秒間、55℃で１分間、そして72℃で2.5分間）。
【００６１】
ｃＤＮＡ挿入片の増幅をアガロースゲル電気泳動で検証したが、そこで２μlの各ＰＣＲ反応液を５００ng／μlエチジウムブロミドを含有する１%アガロースゲル上に装填した。サイズ決定と増幅の定量化のために５００ngの分子量基準（１Kbラダー、Promega社）を各ゲルに加えた。サンプルを１ＸＴＡＥ（Trisアセテート、EDTA）中、150ミリアンペアで30分間、電気泳動にかけた。
【００６２】
３８４穴ガラスファイバー濾板中で、増幅されたｃＤＮＡ挿入片を取り込まれなかったヌクレオチド類およびプライマーから次のようにして精製した。９６ピンCyclone液体ハンドラーを用いて、７０μlの５Ｍグアニジウムイソシアネート（Sigma社）を各プレートに加えた。ＰＣＲマイクロタイタープレートから２５μlのＰＣＲ反応液をガラスファイバー濾板にトランスファーして、室温で２分間インキュベートした。その濾板を真空多岐管（vaccum manifold）に配置して、乾燥させた。濾板を７０μlの８０％イソプロパノールで２回洗浄して、真空多岐管上で２分間乾燥させた。５０μlの水を加えることによって、精製したＰＣＲ産物をガラスファイバー濾板から３８４穴回収板に溶出し、室温で５分間インキュベートし、そして３０００rpmで５分間遠心分離した。精製ＰＣＲ産物をspeed-vac中、ハイで乾燥状態になるまで、４５分から１時間凍結乾燥した。精製産物を３０μlの５０％DMSO／水中に再懸濁した。
【００６３】
１.２  サンプルの固定化
Amersham / Molecular Dynamics製のGeneration III (Gen III) マイクロアレイスポッターを用いて、最大数４６０８個の異なるＰＣＲ断片をガラススライド上に重複して（二重に）スポットした。１２の３８４穴Ｕ底マイクロタイタープレートを前記Gen IIIスポッターの収容部に配置した。そのスポッターに３６枚までのガラススライドを配置し、スポッター室のスポット時湿度を５５％に維持しながらＤＮＡでスポットした。ソースプレート入口当たり６枚のスライドをスポットした。次のＰＣＲテンプレートのセットにアクセスする前に、その１２のペンカセットを以下のようにして洗浄した。すなわち、０.２M KOH中で1秒間、９５％エタノール中で１秒間、そして蒸留水中で２秒間であった。スホッティング後、スライドを室温で１時間風乾した。Stratalinker（Stratagene社）中、５０００ジュールでＵＶ架橋することによって、前記ＰＣＲ断片をガラスに架橋させた。
【００６４】
実施例２  プローブ合成
ＰＣＲ反応液容積が５０μlであったことを除いて、３８４穴プレートについて以前に説明したように配列が確認されているクローンのＤＮＡ挿入片を９６穴ＰＣＲプレート中で増幅した。以前に説明したように、増幅をアガロースゲル電気泳動で検証した。９６穴カーボンファイバー濾板およびＤＮＡ結合レジンを用いて、次のようにＰＣＲ断片を精製した。すなわち、１２チャンネルピペッターを用いて、９６穴濾板の各穴に１００μlのWizard PCR精製レジン（Promega社）を添加した。そのレジンに５０μlのＰＣＲ反応液を添加して、室温で１分間インキュベートした。それから、プレートを真空多岐管に１分間乾燥するまで配置した。その溶液が真空多岐管によって除去されるまでに、２００μlの８０%イソプロパノールで短時間、洗浄した。濾板を真空で十分乾燥した。５０μl滅菌蒸留水を加え、続いて３０００rpmで5分間遠心分離することによって精製ＰＣＲ産物を９６穴回収板に溶出した。精製ＰＣＲ反応液をプールして、１００μgのプールしたＰＣＲ反応液をQuiagen PCR精製カラム上で精製した。再度精製したＰＣＲプールを以前に説明したようにゲル電気泳動で検証した。そのプールしたＰＣＲの濃度を分光学的に測定し、その濃度を滅菌蒸留水で１００ng／μlに調節した。
【００６５】
前記ＰＣＲ断片プールをインビトロ転写反応において、ＲＮＡ合成のテンプレートとして使用した。精製したＰＣＲ反応液（500 ng）を１Ｘ転写バッファー、０.５mMの各ｒＮＴＰ、および３７mM ＤＴＴ、Ｔ７たはＴ３ＤＮＡポリメラーゼ１０単位を含む反応液２０μlに加えた。反応液を３７℃で、９０分間インキュベートした。ＲＱ１ＤＮＡｓｅ１単位を加えることによってＤＮＡテンプレートを除去して、３７℃で、３０分間インキュベートした。RNA Easy Column（Qiagen社）上で精製することにより取り込まれていないヌクレオチドを除いた。
【００６６】
以下のようにして、第１鎖標識反応において前記インビトロ合成したＲＮＡテンプレートから蛍光性プローブを合成した。ＲＮＡテンプレート１００ngをランダムヘキサマー０.５μgと最終体積１０μl中、７０℃で１０分間インキュベートした。その反応液を氷上で５分間冷やし、続いて１Ｘ逆転写バッファー（20mM Tris pH8.4、50mM KCl、2.5mM MgCl2）、１０mM DTT、１００M dGTP、dTTP、dATP、５０μM dCTP、５０μM Cye３ dCTPまたはCye５ dCTP、Superscript II（Gibco BRL社, 18089-011番） ２００単位を含む反応混合液を加えた。その反応液を４２℃で、９０分間インキュベートした。５Ｍ NaOH １μlを加えることによってＲＮＡテンプレートを加水分解して、１３７℃で、１０分間インキュベートした。M MOPS（遊離酸）１０μlを加えて前記NaOHを中和した。GFX column（Pharmacia社）上で精製することにより取り込まれていないヌクレオチド類およびプライマーを除いた。プローブを凍結乾燥して、５０%ホルムアミド、５XSSSC、０.２％ SDS、１X Denhart's 、１００μg／mlサケ精液ＤＮＡおよびoligo-dA（80）１μgを含むハイブリダイゼーションバッファー３０μl中に再懸濁した。
【００６７】
実施例３  新規な遺伝子の同定
新規な遺伝子を同定する手順を図２に示す。
３.１  ハイブリダイゼーション
プローブを１００℃で１０分間変性させて、マイクロアレイスライドに添加した。スライドをガラスカバースリップ（Corning社）で覆い、湿気のある室中４２℃で、１８〜２４時間インキュベートした。ハイブリダイズしたスライドを室温で１０分間、０.１% SDSを含む２XSSC中、２回洗浄し、続いて４２℃で１０分間、０.１％ SDSを含む０.１XSSC中、２回洗浄した。スライドを蒸留水中に数回つけて、フィルターをかけた高圧空気下で乾燥した。蛍光性プローブのハイブリダイゼーションは、Generation III（Gen III）g共焦点スキャナー（Amersham / Molecular Dynamics社）中、スライドを走査することにより検出した。
【００６８】
３.２  データ取得
スライド画像は、Array Vision画像解析ソフトウェア（Imaging Research社）を用いてスポット解析、局在化バックグランド測定、スポットにおけるシグナル強度の分布およびＳＮ比を解析した。データをタブデリミットファイルとして、送りOracleデータベースへ転送した。規格化および統計的評価は、データ解析ツールのウェブに基づくセットを用いて実行し、データをHoechst-Ariadゲノムセンターで開発されたウェブブラウザーツールで解析した。データをＳＮ比に基づき、分類して、バックグランド以上であるが、ＳＮ比の閾値以下のシグナルを有するＤＮＡをさらにＥＳＴシークエンシングによって特徴付けた。
【００６９】
３.３  シークエンシングおよび既知のライブラリーとの比較
ステップ３.１でハイブリダイズしなかったクローンは、周知の手法を用いてＥＳＴ（expressed sequence tag）シークエンシングのターゲットとした。Adamsら, SCIENCE 252: 1651-1656 (1991)。公開されているｄｂＥＳＴ、マウスＥＳＴおよびLifeseq(Incyte社)データベースに対して、配列を検索した。続くハイブリダイゼーション間に同一の遺伝子が多重に同定されることを防ぐために、新たに特徴づけられたか、または以前から既知である配列として同定された全てのクローンをプローブプール（サブトラクション）に加えた。
【００７０】
３.４  反復サブトラクティブハイブリダイゼーション
無作為にピックしたクローンを含む次のマイクロアレイは、以前の全てのクローンを含み、さらにＥＳＴシークエンスから同定された全ての新しいクローンをも含む新しいプローブにハイブリダイズさせた。この方法から同定されたクローンは、他の供給元（例えば、公共データベース）から以前に同定されたクローンと同様に以前に記載されていなかった新規クローンを含むユニークな遺伝子セット（Ermolaevaら、NAT. GENET. 20: 19-23 (1998)）を構築するのに使用された。
【００７１】
実施例４  低存在量ｍＲＮＡの選択
反復に基づくサブトラクションプロトコールを用いて、ｃＤＮＡライブラリーから無作為にピックした１５００個の異なるｃＤＮＡを含むマイクロアレイを作製した。第１のマイクロアレイに６４個の管理的リポゾーム遺伝子をコードするｃＤＮＡを含むサブトラクションプローブをハイブリダイズさせた。ハイブリダイズしないクローンをＥＳＴシークエンスシングによって解析した。以前のサブトラクションプローブに存在しなかった全てのプローブを現存のサブトラクションプローブに加えて、無作為にピックしたｃＤＮＡクローンを含む次のマイクロアレイにハイブリダイズさせた。この手順を１７回繰り返して、その結果、合計２６,１１２個のｃＤＮＡがマイクロアレイに配列された。ハイブリダイゼーションのデータに基づき、７,７００個のクローンのみをESTシークエンシング用に選択した。クラスタリング後、４,４００個の異なるｃＤＮＡクローンを同定した。この群のクローンは、低存在量の転写物について、高度に濃縮されていた。さらに、重複する高存在量のメッセンジャーＲＮＡを除去することによって、マイクロアレイに基づくサブトラクションはＥＳＴシークエンス努力を70％減少させた。
【００７２】
実施例５  ユニークなまたは低存在量のメッセージを同定するためのチップの作製、示差的表示への使用
マウス頭蓋冠に低コピー数で存在するメッセンジャーＲＮＡを同定するためのチップを図３に要約した手順に従って、作製した。アレイは、規格化されたマウス頭蓋冠ライブラリーからの２７,６４８個のクローンから生成されていた。２７,６４８個の全てのクローンをＰＣＲで増幅して、１８のマイクロアレイに配置した。サブトラクティブハイブリダイゼーション（上記に要約した）の結果、１８ラウンドのハイブリダイゼーションの後で７,７９０個のｃＤＮＡをシークエンスした。これらの配列を既知の配列を含むデータベースと比較して、増幅とマイクロアレイへ配置するのに４,６０８個のクローンを選択した。それから、このチップを示差的遺伝子発現実験に使用して、ＢＭＰ２（骨形成蛋白２）によって変調された遺伝子を同定した。
【００７３】
実施例６  ライブラリー汚染の除去
本発明によって記載されるサブトラクティブハイブリダイゼーションプロトコールは、クローニングライブラリーから高存在量の遺伝子の混入を除去することが実証された。図４に示されるように、最初のライブラリーは３５％のミトコンドリア遺伝子によって汚染されていた。９ラウンドのハイブリダイゼーション後、この量は２〜３％に減少した。これによって、核酸の出発集団から高存在量の配列を除去するのに本発明が有用であることが証明された。
【００７４】
均等
上記本発明の特定の実施形態の詳細な説明から、遺伝子単離のユニークな方法が記載されてきたことは明白であるはずである。本明細書で特定の実施形態が詳しく開示されてきたけれども、これは例示のためだけの実例としてなされたものであり、以下に続く付帯する請求項の範囲に関して制限的であることを意図しない。特に、それら請求項によって定義される本発明の精神および範囲から逸脱することなしに様々な置換、改変および修正を本発明に施してもよいことが、本発明者によって考慮されている。例えば、核酸の特定の供給元、特定の標識、または特定のプローブプールの選択は、本明細書に記載された実施の形態の知識をもってすれば当業者には日常的な事柄であると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  遺伝子発見の戦略の概要を示すフローチャートである。
【図２】  新規遺伝子の同定に使用されるマイクロアレイを示す図である。
【図３】  マウス頭蓋冠ユニジーンチップの作製を示すフローチャートである。
【図４】  ライブラリーから夾雑ミトコンドリア遺伝子の除去を示す線グラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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