(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗CD81抗体を有効成分とする、炎症性腸疾患（inflammatory bowel disease; 以下IBD）の予防、改善または治療剤。
【請求項２】
抗CD81抗体が哺乳類のCD81に対する抗体である、請求項１記載のIBDの予防、改善または治療剤。
【請求項３】
抗CD81抗体がモノクローナル抗体である請求項１または請求項２記載のIBDの予防、改善または治療剤。
【請求項４】
IBDが潰瘍性大腸炎である請求項１〜請求項３のいずれかに記載のIBDの予防、改善または治療剤。
【請求項５】
IBDがクローン病である請求項１〜請求項３のいずれかに記載のIBDの予防、改善または治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は炎症性腸疾患（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｂｏｗｅｌ  ｄｉｓｅａｓｅ；以下「ＩＢＤ」と略する場合もある）の予防、改善または治療に有効な物質をスクリーニングする方法、並びに該方法によって得られる上記物質や抗ＣＤ８１抗体を有効成分とするＩＢＤの予防、改善または治療薬に関する。
また本発明は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）診断に有用な疾患マーカー、およびかかる疾患マーカーを利用したＩＢＤの検出方法（診断方法）に関する。
【背景技術】  腸は、生体の生命活動に必須である栄養分・水分を消化吸収する器官である。一方で病原体などの異物を排除するための免疫防御機能も備えており相反する性質をバランスよく制御することで生命の維持を担っている器官でもある。しかしこれら機能バランスに異常が生じると、この動的平衡状態が破綻し様々な腸疾患が引き起こされることが知られている。特に近年患者数が増加してきている炎症性腸疾患（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｂｏｗｅｌ  ｄｉｓｅａｓｅ；ＩＢＤと略される）は、スルファサラジン等の５−アミノサリチル酸製剤やステロイド等の薬物療法では満足できる治療効果が得られておらず、そのため腸切除手術、白血球除去等で治療している状態であり、よりよい薬物が必要とされている。
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）は、その病態から潰瘍性大腸炎（ｕｌｃｅｒａｔｉｖｅ  ｃｏｌｉｔｉｓ；ＵＣと略される）とクローン病（Ｃｒｏｈｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ；ＣＤと略される）とに分類されている。近年、抗ＴＮＦ抗体などのタンパク製剤がクローン病の治療剤として有効であることが知られている（Ｌａｎｃｅｔ．３４２，１７３−１７４，１９９３）。しかしながら高価な薬剤でありステロイド耐性の患者のみの適応であり、また潰瘍性大腸炎に対する効果も弱いことから、未だ満足できる医療状況に無いのが現状である。炎症性腸疾患は緩解と再燃を繰り返す病気であり、ＱＯＬ（＝Ｑｕａｌｉｔｙ  Ｏｆ  Ｌｉｆｅ）が非常に悪く、薬物療法の満足度が未だに低い疾患である。そのため有効な治療薬の開発が医療現場において渇望されている。
さらに、個々の患者によって薬物療法への反応が異なっており、現在用いられている治療薬すべてにおいて薬物療法に反応しない炎症性腸疾患（ＩＢＤ）患者が存在している。また、遺伝子多型と疾患感受性の解析からインターロイキン−１の多型やＮＯＤ２遺伝子の多型が疾患原因遺伝子と考えられるケースがあり、基礎医学的な研究においても個々の患者による病態発症の遺伝的背景に差異のあることが明らかになりつつある（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ＆  Ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ  Ｄｒｕｇｓ．２，２７２−２７４，２０００）。
最近の医療現場では、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）に限らず、個々の患者の症状に合わせて治療法を的確に選択することが望まれるようになってきている。高齢化社会でのＱＯＬ（Ｑｕａｌｉｔｙ  ｏｆ  ｌｉｆｅ）向上の必要性が認識されてきた近年では、特に、万人に共通した治療ではなく、個々の患者の症状に合わせて適切な治療が施されることが強く求められている。このような所謂テイラーメイド治療を行うためには、個々の疾患について患者の症状やその原因（遺伝的背景）を的確に反映する疾患マーカーが有用であり、その探索並びに開発を目指した研究が精力的に行われているのが現状である。
ＣＤ８１は、広範な細胞に発現している２６ｋＤａの表面分子であり、Ｂ細胞上ではＣＤ２１、ＣＤ１９、Ｌｅｕ１３と複合体を形成してＢ細胞活性化の閾値を下げる作用がある。Ｔ細胞はＣＤ４、ＣＤ８と会合し細胞内に刺激情報を伝達する。これらのことからＣＤ８１は、異種抗原に対する免疫応答に重要な働きをしていると考えられる。また、各種インテグリン類と生理的かつ機能的に関与しており、Ｂ細胞上のＶＬＡ−４（α４β１インテグリン）や、胸腺細胞上のＬＦＡ−１（αＬβ２インテグリン）を活性化させる。
ＣＤ８１と関連のある疾患としてはＣ型肝炎が挙げられる。Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のエンベロープ蛋白Ｅ２領域をプローブとしてヒトＴリンパ種（Ｅ２との結合性が高い細胞クローン）由来ｃＤＮＡ発現ライブラリーからＥ２結合分子のスクリーニングが行われ、ヒトＣＤ８１分子がＥ２と結合することや、かかるＣＤ８１分子上のＥ２結合領域がＨＣＶのＲＮＡと結合し、この結合がＨＣＶ感染を中和する抗体により阻害されることが報告されている（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２，９３８−９４１，１９９８）。つまりＣＤ８１がＨＣＶの受容体として働きＣ型肝炎の発症に関与することが知られている。
また、ＨＣＶ感染により自己免疫疾患が重症化することが知られており、ＣＤ８１が慢性的ＨＣＶ感染における重症度と関連していること、更にＣＤ８１がリウマチ因子と関連していることが報告されている（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ＆  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．１２８（２）：３５３−８，２０００）。ＨＣＶ感染が炎症性腸疾患の危険因子となりうるとの報告もある（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｉｅ  Ｃｌｉｎｉｑｕｅ  ｅｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｑｕｅ．２４（１）：７７−８１，２０００）。
【発明の開示】
本発明は、炎症性腸疾患の予防、改善または治療に有用な薬物をスクリーニングする方法、並びに該疾患の予防、改善または治療剤を提供することを目的とする。
さらに本発明は炎症性腸疾患の診断や治療に有用な疾患マーカー、および該疾患マーカーを利用した炎症性腸疾患の検出方法（遺伝子診断方法）を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行っていたところ、従来は炎症性腸疾患（ＩＢＤ）との関連が明らかではなかったＣＤ８１遺伝子が、ＩＢＤ惹起性細胞においてＩＢＤ非惹起性細胞と比較して有意に発現上昇していることを見出した。実施例に記載のように、ＩＢＤ惹起細胞とは正常動物に移入することでＩＢＤを引き起こす能力を有する細胞集団を意味し、ＩＢＤ非惹起細胞とは正常動物に移入してもＩＢＤを引き起こさない細胞集団を意味する。具体的には、例えば、ＩＢＤ惹起細胞とは、ＩＢＤ発症マウス由来リンパ系細胞をＳｔａｐｈｙｌｏｃｃｏｃａｌ  ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ  Ｂ（ＳＥＢ）で刺激培養した細胞が挙げられ、ＩＢＤ非惹起細胞とは、ＩＢＤ発症マウス由来リンパ系細胞を無刺激培養、あるいはＩＢＤ惹起能を抑制する活性が知られている特開２００２−１６１０８４の化合物である３−ｃｈｌｏｒｏ−２−［１−（４−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎ−４−ｙｌｐｈｅｎｙｌ）ｃｙｃｌｏｂｕｔｙｌ］−４，５，６，７−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｐｙｒａｚｏｌｏ［１，５−ａ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ（以下、「化合物Ａ」と略する場合もある。）の存在下でＳＥＢにて刺激培養した細胞が挙げられる。
更に、本発明者らは、化合物ＡがＣＤ３陽性Ｔ細胞の中のＣＤ８１陽性細胞内の炎症性サイトカインであるインターフェロンγ生成を抑制することを見出し、また、抗ＣＤ８１抗体が炎症性腸疾患モデル動物の治療に有効であることも明らかにした。
以上のように、本発明者らは、ＣＤ８１遺伝子の発現抑制、当該遺伝子によりコードされるタンパク質の発現抑制または機能（活性）抑制を指標としたスクリーニング系は、新たなメカニズムに基づく炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の予防、改善または治療薬の探索に有効であることを明らかにした。また、抗ＣＤ８１抗体が炎症性腸疾患の予防、改善または治療剤として有用であり、ＣＤ８１遺伝子若しくはＣＤ８１の発現産物（タンパク質）が、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の優れた疾患マーカーであるとの知見も得た。
本発明はかかる知見を基礎にして完成するに至ったものである。
すなわち本発明は、下記に掲げるものである：
（１）  下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む、ＣＤ８１遺伝子の発現を減少させる物質のスクリーニング方法：
（ａ）被験物質とＣＤ８１遺伝子を発現可能な細胞とを接触させる工程、
（ｂ）被験物質を接触させた細胞におけるＣＤ８１遺伝子の発現量を測定し、該発現量を被験物質を接触させない対照細胞における上記に対応する遺伝子の発現量と比較する工程、
（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、ＣＤ８１遺伝子の発現量を減少させる被験物質を選択する工程、
（２）  下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む、ＣＤ８１の発現量を減少させる物質のスクリーニング方法：
（ａ）被験物質とＣＤ８１を発現可能な細胞とを接触させる工程、
（ｂ）被験物質を接触させた細胞におけるＣＤ８１の発現量を測定し、該発現量を被験物質を接触させない対照細胞における上記タンパク質の発現量と比較する工程、
（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、ＣＤ８１の発現量を減少させる被験物質を選択する工程、
（３）  下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む、ＣＤ８１の機能（活性）を抑制する物質のスクリーニング方法：
（ａ）被験物質をＣＤ８１に接触させる工程、
（ｂ）上記（ａ）の工程に起因して生じるＣＤ８１の機能（活性）を測定し、該機能（活性）を被験物質を接触させない場合のＣＤ８１の機能（活性）と比較する工程、
（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、ＣＤ８１の機能（活性）を抑制する被験物質を選択する工程、
（４）  ＣＤ８１の機能（活性）が、フィブロネクチン結合活性であることを特徴とする、前記（３）記載のスクリーニング方法、
（５）  ＣＤ８１の機能（活性）が細胞接着活性であることを特徴とする、前記（３）記載のスクリーニング方法、
（６）  ＣＤ８１発現細胞であるＢ細胞を用いることを特徴とする前記（３）乃至（５）のいずれかに記載のスクリーニング方法、
（７）  ＩＢＤの予防、改善または治療剤の有効成分を探索するための方法である、前記（１）乃至（６）のいずれかに記載のスクリーニング方法、
（８）  ＣＤ８１遺伝子の発現を減少させる物質を有効成分とする、ＩＢＤの予防、改善または治療剤、
（９）  ＣＤ８１遺伝子の発現を減少させる物質が前記（１）記載のスクリーニング法により得られるものである、前記（８）記載のＩＢＤの予防、改善または治療剤、
（１０）  ＣＤ８１の発現量または機能（活性）を抑制する物質を有効成分とする、ＩＢＤの予防、改善または治療剤、
（１１）  ＣＤ８１の発現量または機能（活性）を抑制する物質が、前記（２）乃至（６）のいずれかに記載のスクリーニング法により得られるものである、前記（１０）記載のＩＢＤの予防、改善または治療剤、
（１２）  抗ＣＤ８１抗体を有効成分とする前記（１０）記載のＩＢＤの予防、改善または治療剤、
（１３）  抗ＣＤ８１抗体が哺乳類のＣＤ８１に対する抗体である、前記（１２）記載のＩＢＤの予防、改善または治療剤、
（１４）  ＣＤ８１の塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有するアンチセンスポリヌクレオチドを有効成分とする、前記（８）記載のＩＢＤの予防、改善または治療剤、
（１５）  ＣＤ８１遺伝子の塩基配列において、連続する少なくとも１５塩基を有するポリヌクレオチド及び／または該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドからなる、炎症性腸疾患（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｂｏｗｅｌ  ｄｉｓｅａｓｅ；以下ＩＢＤ）の疾患マーカー、
（１６）  ＩＢＤの検出においてプローブまたはプライマーとして使用される前記（１５）記載の疾患マーカー、
（１７）  下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む、ＩＢＤの検出方法：
（ａ）被験者の生体試料から調製されたＲＮＡまたはそれから転写された相補的ポリヌクレオチドと前記（１５）または（１６）記載の疾患マーカーとを結合させる工程、
（ｂ）該疾患マーカーに結合した生体試料由来のＲＮＡまたは該ＲＮＡから転写された相補的ポリヌクレオチドを、上記疾患マーカーを指標として測定する工程、
（ｃ）上記（ｂ）の測定結果に基づいて、ＩＢＤの罹患を判断する工程、
（１８）  工程（ｃ）におけるＩＢＤの罹患の判断が、被験者について得られる測定結果を正常者について得られる測定結果と対比して、疾患マーカーへの結合量が増大していることを指標として行われる、前記（１７）に記載のＩＢＤの検出方法、
（１９）  ＣＤ８１を認識する抗体を含有する、ＩＢＤの疾患マーカー、
（２０）  ＩＢＤの検出においてプローブとして使用される前記（１９）記載の疾患マーカー、
（２１）  下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含むＩＢＤの検出方法：
（ａ）被験者の生体試料から調製されたタンパク質と前記（１９）または（２０）記載の疾患マーカーとを結合させる工程、
（ｂ）該疾患マーカーに結合した生体試料由来のタンパク質を、上記疾患マーカーを指標として測定する工程、
（ｃ）上記（ｂ）の測定結果に基づいて、ＩＢＤの罹患を判断する工程、
（２２）  工程（ｃ）におけるＩＢＤの罹患の判断が、被験者について得られる測定結果を正常者について得られる測定結果と対比して、疾患マーカーへの結合量が増大していることを指標として行われる前記（２１）記載のＩＢＤの検出方法。
上記のように、本発明によれば、ＣＤ８１遺伝子の発現を減少させる物質のスクリーニング系、ＣＤ８１の発現または機能（活性）を抑制する物質のスクリーニング系、これらのスクリーニング系で見出された物質を有効成分とするＩＢＤの予防、改善または治療剤、および抗ＣＤ８１抗体を有効成分とするＩＢＤの予防、改善または治療剤が提供される。また、ＩＢＤの疾患マーカー、該疾患の検出系も提供される。
本発明は、前述するように、ＩＢＤ非惹起性細胞に比べて、ＩＢＤ惹起性細胞のＣＤ８１遺伝子の発現が上昇しており、抗ＣＤ８１抗体が炎症性腸疾患モデル動物に対して治療効果を示すという知見に基づく。
従って、ＣＤ８１の遺伝子およびその発現産物並びにそれらからの派生物（例えば、遺伝子断片、抗体など）は、ＣＤ８１遺伝子の発現を減少させる物質のスクリーニング、あるいはＣＤ８１発現または機能（活性）を抑制する物質のスクリーニングに有用であり、該スクリーニングによって得られる物質は、炎症性腸疾患の予防、改善および治療薬として有効である。また、抗ＣＤ８１抗体やＣＤ８１遺伝子のアンチセンス核酸（アンチセンスヌクレオチド）は炎症性腸疾患の予防、改善および治療薬として有用である。
更にＣＤ８１遺伝子及びその発現産物〔タンパク質、（ポリ）（オリゴ）ペプチド〕は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の解明、診断、予防及び治療に有効に利用することができ、かかる利用によって医学並びに臨床学上、有用な情報や手段を得ることができる。個体（生体組織）における、上記遺伝子の発現またはその発現産物の検出、または該遺伝子の変異またはその発現異常の検出は、炎症性腸疾患の解明や診断に有効に利用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、本明細書において、アミノ酸、（ポリ）ペプチド、（ポリ）ヌクレオチドなどの略号による表示は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢの規定〔ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ  ｏｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１３８：９（１９８４）〕、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作成のためのガイドライン」（日本国特許庁編）、および当該分野における慣用記号に従う。
本明細書において「遺伝子」または「ＤＮＡ」とは、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖といった各１本鎖ＤＮＡを包含する趣旨で用いられる。またその長さによって特に制限されるものではない。従って、本明細書において遺伝子（ＤＮＡ）とは、特に言及しない限り、ヒトゲノムＤＮＡを含む２本鎖ＤＮＡおよびｃＤＮＡを含む１本鎖ＤＮＡ（正鎖）並びに該正鎖と相補的な配列を有する１本鎖ＤＮＡ（相補鎖）、およびこれらの断片のいずれもが含まれる。また当該「遺伝子」または「ＤＮＡ」には、特定の塩基配列（配列番号：１）で示される「遺伝子」または「ＤＮＡ」だけでなく、これらによりコードされるタンパク質と生物学的機能が同等であるタンパク質（例えば同族体（ホモログやスプライスバリアントなど）、変異体及び誘導体）をコードする「遺伝子」または「ＤＮＡ」が包含される。かかる同族体、変異体または誘導体をコードする「遺伝子」または「ＤＮＡ」としては、具体的には、後述の（３−１）項に記載のストリンジェントな条件下で、前記の配列番号：１の特定塩基配列の相補配列とハイブリダイズする塩基配列を有する「遺伝子」または「ＤＮＡ」を挙げることができる。
例えばヒト由来のタンパク質のホモログをコードする遺伝子としては、当該タンパク質をコードするヒト遺伝子に対応するマウスやラットなど他生物種の遺伝子が例示でき、これらの遺伝子（ホモログ）は、ＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅ／）により同定することができる。具体的には、特定ヒト塩基配列をＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５８７７，１９９３、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）にかけて一致する（Ｓｃｏｒｅが最も高く、Ｅ−ｖａｌｕｅが０でかつＩｄｅｎｔｉｔｙが１００％を示す）配列のアクセッション番号を取得する。そのアクセッション番号をＵｎｉＧｅｎｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＵｎｉＧｅｎｅ／）に入力して得られたＵｎｉＧｅｎｅ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  ＩＤ（Ｈｓ．で示す番号）をＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅに入力する。結果として得られた他生物種遺伝子とヒト遺伝子との遺伝子ホモログの相関を示したリストから、特定の塩基配列で示されるヒト遺伝子に対応する遺伝子（ホモログ）としてマウスやラットなど他生物種の遺伝子を選抜することができる。
なお、遺伝子またはＤＮＡは、機能領域の別を問うものではなく、例えば発現制御領域、コード領域、エキソン、またはイントロンを含むことができる。
本明細書において「ＣＤ８１遺伝子」または「ＣＤ８１のＤＮＡ」といった用語を用いる場合も、特に言及しない限り、特定塩基配列（配列番号１）で示されるヒトＣＤ８１遺伝子（ＤＮＡ）や、その同族体、変異体及び誘導体などをコードする遺伝子（ＤＮＡ）を包含する趣旨で用いられる。具体的には、配列番号：１に記載のヒトＣＤ８１遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿００４３５６）や、そのマウスホモログおよびラットホモログなどが包含される。
本明細書において「ポリヌクレオチド」とは、ＲＮＡおよびＤＮＡのいずれをも包含する趣旨で用いられる。なお、上記ＤＮＡには、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、及び合成ＤＮＡのいずれもが含まれる。また上記ＲＮＡには、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、及び合成のＲＮＡのいずれもが含まれる。
本明細書において「タンパク質」または「（ポリ）ペプチド」には、特定のアミノ酸配列（配列番号：２）で示される「タンパク質」または「（ポリ）ペプチド」だけでなく、これらと生物学的機能が同等であることを限度として、その同族体（ホモログやスプライスバリアント）、変異体、誘導体、成熟体及びアミノ酸修飾体などが包含される。ここでホモログとしては、ヒトのタンパク質に対応するマウスやラットなど他生物種のタンパク質が例示でき、これらはＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅ／）により同定された遺伝子の塩基配列から演繹的に同定することができる。また変異体には、天然に存在するアレル変異体、天然に存在しない変異体、及び人為的に欠失、置換、付加または挿入されることによって改変されたアミノ酸配列を有する変異体が包含される。なお、上記変異体としては、変異のないタンパク質または（ポリ）ペプチドと、少なくとも７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９５％、さらにより好ましくは９７％相同なものを挙げることができる。またアミノ酸修飾体には、天然に存在するアミノ酸修飾体、天然に存在しないアミノ酸修飾体が包含され、具体的にはアミノ酸のリン酸化体が挙げられる。
本明細書において「ＣＤ８１タンパク質」または単に「ＣＤ８１」といった用語を用いる場合、特に言及しない限り、特定アミノ酸配列（配列番号２）で示されるヒトＣＤ８１やその同族体、変異体、誘導体、成熟体及びアミノ酸修飾体などを包含する趣旨で用いられる。具体的には、配列番号：２（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｐ１８５８２）に記載のアミノ酸配列を有するヒトＣＤ８１や、そのマウスホモログおよびラットホモログなどが包含される。
本明細書でいう「抗体」には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、またはＦａｂフラグメントやＦａｂ発現ライブラリーによって生成されるフラグメントなどのように抗原結合性を有する上記抗体の一部が包含される。
本明細書において「抗ＣＤ８１抗体」とは、ＣＤ８１を特異的に認識する抗体であればよく、具体的には、ＣＤ８１遺伝子の発現産物（タンパク質）（これを本明細書においては「ＣＤ８１」ともいう）を特異的に認識することのできる抗体であればよい。
本明細書において「ＩＢＤ」とは、ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｂｏｗｅｌ  ｄｉｓｅａｓｅの略であり、日本では炎症性腸疾患と呼ばれる。炎症性腸疾患は、病態から潰瘍性大腸炎（ｕｌｃｅｒａｔｉｖｅ  ｃｏｌｉｔｉｓ：ＵＣと略される）とクローン病（Ｃｒｏｈｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ：ＣＤと略される）を含む疾患である。
さらに本明細書において「疾患マーカー」とは、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の罹患の有無、罹患の程度若しくは改善の有無や改善の程度を診断するために、また炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の予防、改善または治療に有用な候補物質をスクリーニングするために、直接または間接的に利用されるものをいう。これには、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の罹患に関連して生体内、特に大腸組織において、発現が変動する遺伝子またはタンパク質を特異的に認識し、また結合することのできる（ポリ）（オリゴ）ヌクレオチドまたは抗体が包含される。これらの（ポリ）（オリゴ）ヌクレオチドおよび抗体は、上記性質に基づいて、生体内、組織や細胞内などで発現した上記遺伝子及びタンパク質を検出するためのプローブとして、また（オリゴ）ヌクレオチドは生体内で発現した上記遺伝子を増幅するためのプライマーとして有効に利用することができる。
さらに本明細書において診断対象となる「生体組織」とは、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）に伴い本発明のＣＤ８１遺伝子の発現が上昇する組織を指す。具体的には大腸組織及びその周辺組織などを指す。
以下、ＣＤ８１遺伝子（ポリヌクレオチド）並びにこの発現産物（ＣＤ８１）、およびそれらの派生物（抗ＣＤ８１抗体など）について、具体的な用途を説明する。
（１）候補薬のスクリーニング方法
（１−１）遺伝子発現レベルを指標とするスクリーニング方法
本発明は、ＣＤ８１遺伝子の発現を減少させる物質のスクリーニング方法を提供する。
本発明のスクリーニング方法は次の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む：
（ａ）被験物質とＣＤ８１遺伝子を発現可能な細胞とを接触させる工程、
（ｂ）被験物質を接触させた細胞におけるＣＤ８１遺伝子の発現量を測定し、該発現量を被験物質を接触させない対照細胞における上記に対応する遺伝子の発現量と比較する工程、
（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、ＣＤ８１遺伝子の発現量を減少させる被験物質を選択する工程。
かかるスクリーニングに用いられる細胞としては、内在性および外来性を問わず、ＣＤ８１遺伝子を発現する培養細胞全般を挙げることができる。ＣＤ８１遺伝子の発現は、公知のノーザンブロット法やＲＴ−ＰＣＲ法にてこれらの遺伝子発現を検出することにより、容易に確認することができる。当該スクリーニングに用いられる細胞としては、具体的には、例えば、（Ａ）炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の動物モデルより単離、調製した腸管組織やリンパ系組織由来の細胞、（Ｂ）種々の刺激剤で処理又は未処理の腸管組織やリンパ系組織由来の細胞、（Ｃ）本発明遺伝子のいずれかを導入した細胞を挙げることができる。
ここで前記（Ａ）のＩＢＤの動物モデルとしては、ＩＢＤの動物モデルとして周知であるれば如何なる動物モデルをもよく、具体的には、自然発症ＩＢＤモデル（Ｃ３Ｈ／ＨｅＪＢｉｒマウス、Ｃｏｔｔｏｎ  ｔｏｐ  ｔａｍａｒｉｎｓ等）、化学物質誘発モデル（ジニトロクロロベンゼン誘発モデル（ラット）、酢酸モデル（ラット）、トリニトロスルホン酸誘発モデル（マウス、ラット、ウサギ）、デキストラン硫酸誘発モデル（マウス、ラット、ハムスター）、カラゲナン誘発モデル（ラット、モルモット）、インドメタシン誘発モデル（ラット）等）、トランスジェニック／ミュータント（ＩＬ−２ノックアウトマウス、ＩＬ−１０ノックアウトマウス、ＴＣＲノックアウトマウス等）、または移入モデル（ＣＤ４５ＲＢｈｉ移入ＳＣＩＤマウス等）等を挙げることができる。また腸管組織由来の細胞としては、好ましくは大腸（結腸）由来の初代培養細胞などを挙げることができる。
前記（Ｂ）の腸管組織由来の細胞としては、大腸（結腸）由来の株化細胞が好ましく、具体的にはＣａｃｏ−２細胞（ヒト結腸腺癌由来、ＡＴＣＣ株番号ＨＴＢ−３７）、ＨＴ−２９細胞（ヒト結腸腺癌由来、ＡＴＣＣ株番号ＨＴＢ−３８）またはＣＯＬＯ  ２０５細胞（ヒト結腸腺癌由来、ＡＴＣＣ株番号ＣＣＬ−２２２）等を挙げることができる。またリンパ系組織由来の細胞としては、リンパ球、単球、マクロファージ、好中球、好酸球およびそれらの株化細胞が好ましく、具体的にはＲＡＷ  ２６４．７細胞（マウス単球由来、ＡＴＣＣ株番号ＴＩＢ−７１）、Ｕ−９３７細胞（ヒト組織球性リンパ腫由来、ＡＴＣＣ株番号ＣＲＬ−１５９３．２）、ＴＨＰ−１細胞（ヒト単球由来、ＡＴＣＣ株番号ＴＩＢ−２０２）またはＪｕｒｋａｔ細胞（ヒトＴ細胞リンパ腫由来、ＡＴＣＣ株番号ＴＩＢ−１５２）等を挙げることができる。刺激剤は、具体的にはリポポリサッカライド（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ：ＬＰＳ）、ホルボールエステル（ＰＭＡ等）、カルシウムイオノフォア、サイトカイン（ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＴＮＦα、ＩＦＮγ等）等を挙げることができる。これら刺激剤で刺激することにより、細胞は炎症部位の環境により近い活性化状態になることが知られている。
前記（Ｃ）の本発明遺伝子導入細胞としては、前記（Ａ）（Ｂ）の細胞の他、通常遺伝子導入に用いられる宿主細胞、すなわちＬ−９２９（結合組織由来、ＡＴＣＣ株番号ＣＣＬ−１）、Ｃ１２７Ｉ（乳癌組織由来、ＡＴＣＣ株番号ＣＲＬ−１６１６）、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４（骨髄腫由来、ＡＴＣＣ株番号ＣＲＬ−１５８１）、ＮＩＨ３Ｔ３（胎児組織由来、ＡＴＣＣ株番号ＣＲＬ−１６５８）等のマウス由来細胞、ラット由来細胞、ＢＨＫ−２１（シリアンハムスター仔腎組織由来、ＡＴＣＣ株番号ＣＣＬ−１０）、ＣＨＯ−Ｋ１（チャイニーズハムスター卵巣由来、ＡＴＣＣ株番号ＣＣＬ−６１）等のハムスター由来細胞、ＣＯＳ１（アフリカミドリザル腎組織由来、ＡＴＣＣ株番号ＣＲＬ−１６５０）、ＣＶ１（アフリカミドリザル腎組織由来、ＡＴＣＣ株番号ＣＣＬ−７０）、Ｖｅｒｏ（アフリカミドリザル腎組織由来、大日本製薬株式会社）等のサル由来細胞、ＨｅＬａ（子宮けい部癌由来、大日本製薬株式会社）、２９３（胎児腎由来、ＡＴＣＣ株番号ＣＲＬ−１５７３）等のヒト由来細胞、およびＳｆ９（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、Ｓｆ２１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）等の昆虫由来細胞などを挙げることができる。
さらに、本発明のスクリーニング方法に用いられる細胞には、細胞の集合体である組織なども含まれる。
本発明スクリーニング方法によってスクリーニングされる被験物質（候補物質）は、制限されないが、核酸（ＣＤ８１遺伝子のアンチセンスヌクレオチドを含む）、ペプチド、タンパク質、有機化合物、無機化合物などであり、本発明スクリーニングは、具体的にはこれらの被験物質またはこれらを含む試料（被験試料）を上記細胞および／または組織と接触させることにより行われる。かかる被験試料としては、被験物質を含む細胞抽出液、遺伝子ライブラリーの発現産物、合成低分子化合物、合成ペプチド、天然化合物などが挙げられるが、これらに制限されない。
また本発明スクリーニングに際して、被験物質と細胞とを接触させる条件は、特に制限されないが、該細胞が死滅せず且つＣＤ８１遺伝子を発現できる培養条件（温度、ｐＨ、培地組成など）を選択するのが好ましい。
実施例に示すように、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）惹起性細胞において、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）非惹起性細胞に比して、特異的にＣＤ８１遺伝子が発現上昇しており、抗ＣＤ８１抗体はＩＢＤモデル動物に対して治療効果を示す。この知見から、ＣＤ８１遺伝子の発現は炎症性腸疾患（ＩＢＤ）と因果関係があると考えられる。よって本発明のスクリーニング方法には、このＣＤ８１遺伝子の発現レベルを指標として、ＣＤ８１遺伝子の発現を減少させる物質（発現レベルを正常レベルに戻す物質）を探索する方法が包含される。このスクリーニング方法によって、ＩＢＤの緩和／抑制作用を有する（ＩＢＤに対して改善／治療効果を発揮する）候補物質を提供することができる。
すなわち本発明のスクリーニング方法は、ＣＤ８１遺伝子の発現を減少させる物質を探索することによって、ＩＢＤの予防、改善薬または治療薬の有効成分となる候補物質を提供するものである。
候補物質の選別は、具体的には、被験物質を添加した細胞のＣＤ８１遺伝子の発現レベルが、被験物質を添加しない細胞のそのレベルに比して低くなることを指標にして行うことができる。また、ＣＤ８１遺伝子の発現に発現誘導物質を必要とする細胞を用いる場合は、発現誘導物質［例えばリポポリサッカライド（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ：ＬＰＳ）、ホルボールエステル（ＰＭＡ等）、カルシウムイオノフォア、サイトカイン（ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＴＮＦα、ＩＦＮγ等）等］の存在下において誘導される発現が候補物質の存在によって抑制されること、すなわち発現誘導条件下で候補物質を接触させた細胞のＣＤ８１遺伝子の発現が、発現誘導物質存在下で被験物質を接触させなかった対照細胞（正のコントロール）に比して低くなることを指標として行うことができる。
このような本発明のスクリーニング方法における遺伝子発現レベルの検出及び定量は、前記細胞から調製したＲＮＡまたは該ＲＮＡから転写された相補的ポリヌクレオチドと本発明の疾患マーカーとを用いて、後述の（４−１）項に記述するように、公知の方法であるノーザンブロット法、ＲＴ−ＰＣＲ法、あるいはＤＮＡチップなどを利用する方法に従って実施できる。指標とする遺伝子発現レベルの変動（抑制、減少）の程度は、被験物質（候補物質）を接触させた細胞におけるＣＤ８１遺伝子の発現が、被験物質（候補物質）を接触させない対照細胞における発現量と比較して１０％、好ましくは３０％、特に好ましくは５０％以上の低下（抑制、減少）を例示することができる。
またＣＤ８１遺伝子の発現レベルの検出及び定量は、ＣＤ８１遺伝子の発現を制御する遺伝子領域（発現制御領域）に、例えばルシフェラーゼ遺伝子などのマーカー遺伝子をつないだ融合遺伝子を導入した細胞株を用いて、マーカー遺伝子由来のタンパク質の活性を測定することによっても実施できる。本発明のＣＤ８１遺伝子の発現抑制物質のスクリーニング方法には、かかるマーカー遺伝子の発現量を指標として標的物質を探索する方法も包含されるものであり、この意味において、請求項１、請求項５および請求項６に記載する「ＣＤ８１遺伝子」の概念には、ＣＤ８１遺伝子の発現制御領域とマーカー遺伝子との融合遺伝子が含まれる。
なお、上記マーカー遺伝子としては、発光反応や呈色反応を触媒する酵素の構造遺伝子が好ましい。具体的には、上記のルシフェラーゼ遺伝子のほか、分泌型アルカリフォスファターゼ遺伝子、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ遺伝子、βグルクロニダーゼ遺伝子、βガラクトシダーゼ遺伝子、及びエクオリン遺伝子などのレポーター遺伝子を例示できる。
また、ここでＣＤ８１遺伝子の発現制御領域は、例えば該遺伝子の転写開始部位上流約１ｋｂ、好ましくは約２ｋｂを用いることができる。ＣＤ８１遺伝子の発現制御領域は、例えば（ｉ）５’−ＲＡＣＥ法（例えば、５’ｆｕｌｌ  Ｒａｃｅ  Ｃｏｒｅ  Ｋｉｔ（宝酒造社製）等を用いて実施される）、オリゴキャップ法、Ｓ１プライマーマッピング等の通常の方法により、５’末端を決定するステップ；（ｉｉ）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｗａｌｋｅｒ  Ｋｉｔ（クローンテック社製）等を用いて５’−上流領域を取得し、得られた上流領域について、プロモーター活性を測定するステップ；を含む手法等により同定することができる。また融合遺伝子の作成、およびマーカー遺伝子由来の活性測定は公知の方法で行うことができる。
本発明のスクリーニング方法により選別される物質は、ＣＤ８１遺伝子の遺伝子発現抑制剤として位置づけることができる。これらの物質は、ＣＤ８１遺伝子の発現を抑制することによって、大腸組織障害の発症、進行を抑制し、よって、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を予防、改善または治療する薬物の有力な候補物質となる。
（１−２）タンパク質の発現量を指標とするスクリーニング方法
本発明は、ＣＤ８１（ＣＤ８１タンパク質）の発現を減少させる物質をスクリーニングする方法を提供する。
本発明スクリーニング方法は、次の工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を含む：
（ａ）被験物質とＣＤ８１を発現可能な細胞とを接触させる工程、
（ｂ）被験物質を接触させた細胞におけるＣＤ８１の発現量を測定し、該発現量を被験物質を接触させない対照細胞における上記タンパク質の発現量と比較する工程、
（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、ＣＤ８１の発現量を減少させる被験物質を選択する工程。
本発明スクリーニングに用いられる細胞は、内在性および外来性を問わず、ＣＤ８１遺伝子を発現し、発現産物としてのＣＤ８１を有する培養細胞全般を挙げることができる。ＣＤ８１の発現は、遺伝子産物であるタンパク質を公知のウエスタン法にて検出することにより、容易に確認することができる。該細胞としては、具体的には、前記（１−１）項に示されるような細胞などが挙げられる。また当該細胞には、その細胞膜画分、細胞質画分、細胞核画分なども含まれる。
実施例に示すように、ＩＢＤ惹起性細胞では、ＩＢＤ非惹起性細胞に比して、特異的にＣＤ８１遺伝子が発現上昇しており、抗ＣＤ８１抗体はＩＢＤモデル動物に対して治療効果を示す。これらの知見から、ＣＤ８１の発現は炎症性腸疾患（ＩＢＤ）と因果関係があると考えられる。よって本発明のスクリーニング方法には、ＣＤ８１のタンパク発現レベルを指標として、その発現量を減少させる物質（発現レベルを正常に戻す物質）を探索する方法が包含される。このスクリーニング方法によって、ＩＢＤの緩和／抑制作用を有する（ＩＢＤに対して改善／治療効果を発揮する）候補物質を提供することができる。
すなわち本発明のスクリーニング方法は、ＣＤ８１のタンパク発現量を減少させる物質を探索することによって、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の予防薬、改善薬または治療薬の有効成分となる候補物質を提供するものである。
候補物質の選別は、具体的にはＣＤ８１を発現産生している細胞を用いる場合は、被験物質（候補物質）を添加した細胞におけるＣＤ８１のタンパク量（レベル）が、被験物質（候補物質）を添加しない細胞のその量（レベル）に比して低くなることを指標として行うことができる。また、ＣＤ８１の発現産生に発現誘導物質を必要とする細胞を用いる場合は、発現誘導物質［例えばリポポリサッカライド（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ：ＬＰＳ）、ホルボールエステル（ＰＭＡ等）、カルシウムイオノフォア、サイトカイン（ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＴＮＦα、ＩＦＮγ等）等］によって誘導される当該タンパクの産生が被験物質の存在によって抑制されること、すなわち発現誘導物質の存在下で被験物質を接触させた細胞のＣＤ８１遺伝子の発現が、発現誘導物質存在下で被験物質を接触させなかった対照細胞（正のコントロール）に比して低くなることを指標として選別を行うことができる。
本発明のスクリーニング方法にかかるＣＤ８１の産生量は、前述したように、例えば本発明疾患マーカーなどの抗体（例えばヒトＣＤ８１タンパク質またはそのホモログを認識する抗体）を用いたウエスタンブロット法などの公知方法に従って定量できる。ウエスタンブロット法は、一次抗体として本発明疾患マーカーを用いた後、二次抗体として１２５Ｉなどの放射性同位元素、蛍光物質、ホースラディッシュペルオキシターゼ（ＨＲＰ）などの酵素等で標識した一次抗体に結合する抗体を用いて標識し、これら標識物質由来のシグナルを放射線測定器（ＢＡＳ−１８００ＩＩ：富士フィルム社製など）、蛍光検出器などで測定することによって実施できる。また、一次抗体として本発明疾患マーカーを用いた後、ＥＣＬ  Ｐｌｕｓ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（アマシャム  ファルマシアバイオテク社製）を利用して、該プロトコールに従って検出し、マルチバイオイメージャーＳＴＯＲＭ８６０（アマシャム  ファルマシアバイオテク社製）で測定することもできる。
本発明スクリーニング方法によってスクリーニングされる被験物質（候補物質）は、制限されないが、核酸（ＣＤ８１遺伝子のアンチセンスポリヌクレオチドを含む）、ペプチド、タンパク質、有機化合物、無機化合物などであり、本発明スクリーニングは、具体的にはこれらの被験物質またはこれらを含む試料（被験試料）を上記細胞や細胞膜画分と接触させることにより行われる。かかる被験試料としては、被験物質を含む細胞抽出液、遺伝子ライブラリーの発現産物、合成低分子化合物、合成ペプチド、天然化合物などが挙げられるが、これらに制限されない。
（１−３）タンパク質の機能（活性）を指標とするスクリーニング方法
本発明は、ＣＤ８１の機能（活性）を抑制する物質をスクリーニングする方法を提供する。
本発明のスクリーニング方法は次の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む：
（ａ）被験物質をＣＤ８１に接触させる工程、
（ｂ）上記（ａ）の工程に起因して生じるＣＤ８１の機能（活性）を測定し、該機能（活性）を被験物質を接触させない場合のＣＤ８１の機能（活性）と比較する工程、
（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、ＣＤ８１の機能（活性）を抑制する被験物質を選択する工程。
本発明のスクリーニング方法おいては、ＣＤ８１の公知の機能・活性に基づく如何なる機能・活性測定方法をも利用することができる。すなわち、ＣＤ８１の公知の機能・活性測定系に被験物質を添加し、当該ＣＤ８１の公知の機能・活性を抑制・阻害する被験物質を、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）に対して改善／治療効果を有する候補物質として選択するスクリーニング方法であれば、本発明のスクリーニング方法の範疇に含まれる。
前記本発明のスクリーニングは、ＣＤ８１を含む細胞または該細胞から調製した細胞画分と、被験物質とを接触させることにより行うことができる。
また、本発明のスクリーニング方法に用いられる細胞としては、内在性及び外来性を問わず、ＣＤ８１を発現し得る細胞を挙げることができる。該細胞としては、具体的には、前記（１−１）項に示されるような細胞などを用いることができる。また細胞画分とは、上記細胞に由来する各種の画分を意味し、これには、例えば細胞膜画分、細胞質画分、細胞核画分などが含まれる。
前記スクリーニングにおいて用いられるＣＤ８１は公知のタンパク質であり、ＣＤ８１遺伝子の配列情報（配列番号１）に基づいて、ＤＮＡクローニング、各プラスミドの構築、宿主へのトランスフェクション、形質転換細胞の培養、および必要に応じて培養物からのタンパク質の回収の操作により得ることができる。これらの操作は、当業者に既知の方法、あるいは文献記載の方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＣＳＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８３），ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ＤＭ．Ｇｌｏｖｅｒ，ＩＲＬ  ＰＲＥＳＳ（１９８５））などに準じて行うことができる。
具体的には、ＣＤ８１をコードする遺伝子が所望の宿主細胞中で発現できる組み換えＤＮＡ（発現ベクター）を作製し、これを宿主細胞に導入して形質転換し、該形質転換体を培養して、得られる培養物から、目的タンパク質を回収することによって、ＣＤ８１タンパク質を得ることができる。
実施例に示すように、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）惹起性細胞では、ＩＢＤ非惹起性細胞に比して、特異的にＣＤ８１遺伝子が発現上昇しており、抗ＣＤ８１抗体はＩＢＤモデル動物に対して治療効果を示す。この知見から、ＣＤ８１の機能（活性）亢進は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）と関連していると考えられる。よって本発明のスクリーニング方法には、ＣＤ８１の機能（活性）を指標として、ＣＤ８１の機能（活性）を抑制する物質を探索する方法が包含される。本発明スクリーニング方法によれば、ＣＤ８１の機能（活性）を抑制する物質を探索でき、かくして炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の緩和／抑制作用を有する（ＩＢＤに対して改善／治療効果を発揮する）候補物質が提供される。
すなわち本発明のスクリーニング方法は、ＣＤ８１の機能（活性）を抑制する物質を探索することによって、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の予防剤、改善剤または治療剤の有効成分となる候補物質を提供するものである。
候補物質の選別は、具体的には、ＣＤ８１タンパク質の機能（活性）を抑制（低下）させる物質の探索は、ＣＤ８１を含む細胞または該細胞から調製した細胞画分に被験物質を接触させた場合に得られるタンパク質の機能（活性）が、被験物質を添加しない対照の細胞または細胞画分の上記タンパク質の機能（活性）に比して低くなることを指標として行うことができる。
本発明スクリーニング方法によってスクリーニングされる被験物質（候補物質）は、制限されないが、核酸、ペプチド、蛋白質（ＣＤ８１に対する抗体を含む）、有機化合物、無機化合物などであり、本発明スクリーニングは、具体的にはこれらの被験物質またはこれらを含む試料（被験試料）を上記水溶液、細胞または細胞画分と接触させることにより行われる。被験試料としては、被験物質を含む、細胞抽出液、遺伝子ライブラリーの発現産物、合成低分子化合物、合成ペプチド、天然化合物などが挙げられるが、これらに制限されない。
本発明のＣＤ８１の機能（活性）に基づくスクリーニング方法として、具体的には以下に述べる方法が例示される。
（Ａ）結合阻害活性を指標とするスクリーニング−１
ＣＤ８１は細胞表面分子であり、その結合物質としてはフィブロネクチンが知られている。従って、この公知の性質に基づいて、ＣＤ８１の機能（活性）の変動をもたらす被験物質（候補物質）のスクリーニングを行うことができる。すなわち、本発明タンパク質であるＣＤ８１と、フィブロネクチンなどのＣＤ８１に結合する物質（以下「ＣＤ８１結合物質」と称する場合がある。）との結合を指標として行うことができる。この場合、具体的には、ＣＤ８１タンパク質とＣＤ８１結合物質との結合を阻害する被検物質を候補物質として選択することができる。
すなわち結合阻害活性に基づく本発明のスクリーニング方法は、次の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含むものが例示される：
（ａ）被験物質の存在下で、ＣＤ８１とＣＤ８１結合物質とを接触させる工程、
（ｂ）上記反応の結果生じた結合量を測定し、当該結合量を、被験物質非存在下で上記（ａ）を行うことによって生じる結合量（対照結合量）と比較する工程、
（ｃ）上記（ｂ）の結果に基づいて、対照結合量に比して結合量を変動させる被験物質を選択する工程。
この場合、結合物質とＣＤ８１との結合阻害あるいは増強は、（ｉ）結合物質に結合することによって、ＣＤ８１と結合物質の結合を阻害あるいは増強する態様のもの、（ｉｉ）ＣＤ８１に結合することによって、ＣＤ８１と結合物質の結合を阻害あるいは増強する態様のもの、を例示することができるが、結合を阻害あるいは増強するものであれば特に限定されない。
（Ｂ）結合阻害活性を指標とするスクリーニング−２
ＣＤ８１は別名ＴＡＰＡ−１とも称され、リンパ球の分化、増殖、活性化や接着の機能があり、その発現にはインテグリンと生理的かつ機能的に関与している。抗ＣＤ８１抗体を用いた検討でＢ細胞上のインテグリンα４β１（ＶＬＡ−４）を活性化する事やＢ細胞に抗原提示されたＴ細胞からのＩＬ−４産生を増加することが報告されている。インテグリンα４β１は、細胞外基質フィブロネクチンと結合することから、ＣＤ８１はＢ細胞のフィブロネクチンへの結合を促す（Ｂｅｈｒ  Ｓ  ａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８２：１１９１−１１９９（１９９５））。
従って、ＣＤ８１の公知の性質であるインテグリンα４β１依存性Ｂ細胞のフィブロネクチン結合活性を測定することによって、ＣＤ８１の機能（活性）を抑制する抑制物質または候補物質をスクリーニングすることができる。この場合、候補物質は、具体的には例えば被検物質（候補物質）の存在下で、抗ＣＤ８１抗体を接触させることによるＢ細胞のフィブロネクチン結合活性が、被検物質（候補物質）の非存在下で抗ＣＤ８１抗体を接触させることによるＢ細胞のフィブロネクチン結合に比して減少する（抑制される）場合に、選択することができる。
すなわちＣＤ８１の細胞接着活性に基づくスクリーニング方法としては、次の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含むものが例示される：
（ａ）被験物質の存在下で、ＣＤ８１発現細胞と抗ＣＤ８１抗体を接触させる工程、
（ｂ）上記（ａ）における、Ｂ細胞のフィブロネクチン結合活性を測定し、当該活性値を、被験物質非存在下で前記細胞と抗ＣＤ８１抗体を接触させることによって得られるフィブロネクチン結合活性値（対照活性値）と比較する工程、
（ｃ）上記（ｂ）の結果に基づいて、対照活性値に比して活性値を減少させる被験物質を選択する工程。
ＣＤ８１の機能（活性）に基づくスクリーニング方法である前記（Ａ）と（Ｂ）のスクリーニングは、ＣＤ８１を発現している細胞や該細胞画分などを用いて実施することができる。ＣＤ８１を発現している細胞とは、具体的には、前記（１−１）項に示される細胞、ＣＤ８１を天然に発現している細胞、およびＣＤ８１をコードする遺伝子を細胞に導入して作製した形質転換細胞などが挙げられる。（Ｂ）のスクリーニング方法で用いられるＣＤ８１発現細胞はＢ細胞であってもよい。
ＣＤ８１発現細胞の細胞膜を用いる場合は、例えば、細胞に低張バッファーを添加し、細胞を低張破壊した後、ホモジナイズし、遠心分離することにより細胞膜画分の沈殿物を得る。そしてこの沈殿物をバッファーに懸濁することにより、受容体を含有する細胞膜画分を得ることができる。得られた細胞膜画分は、抗体を結合させたカラム等により常法で精製することもできる。
当該形質転換細胞は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  Ｅｄｔ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）等の基本書に従い、当業者にとって公知の方法で調製することができる。例えば、ＣＤ８１のｃＤＮＡをｐＣＡＧＧＳ（Ｇｅｎｅ  １０８，１９３−１９９（１９９１））、ｐｃＤＮＡ１．１、ｐｃＤＮＡ３．１誘導体（インビトロジェン社）などの公知の発現ベクターに挿入する。その後、適当な宿主に導入し、培養することにより、導入したＣＤ８１のＤＮＡに対応するタンパク質を発現させた形質転換細胞を作製することができる。宿主としては、一般的に広く普及している、ＣＨＯ細胞、Ｃ１２７細胞、ＢＨＫ２１細胞、ＣＯＳ細胞などを用いることができるが、これに限定されることなく、酵母、細菌、昆虫細胞などを用いることもできる。
ＣＤ８１のｃＤＮＡを有する発現ベクターの宿主細胞への導入方法としては、公知の発現ベクターの宿主細胞への導入方法であれば、どのような方法でもよく、例えばリン酸カルシウム法（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，５２，４５６−４６７（１９７３））、ＬＴ−１（Ｐａｎｖｅｒａ社製）を用いる方法、遺伝子導入用リピッド（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ；Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社製）を用いる方法などが挙げられる。
本発明タンパクは、そのままで用いても良いし、任意の標識物質で標識されたものを用いることもできる。ここで標識物質としては、放射性同位体（３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、１２５Ｉ等）、蛍光物質（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社Ａｌｅｘａ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔｓ等）、化学発光物質（Ａｓｓａｙ  Ｄｅｓｉｇｎｓ社Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ等）、ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ社ＥＺ−Ｌｉｎｋ  Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔｓ等）、マーカータンパク質、またはペプチドタグなどを例示することができる。マーカータンパク質としては、例えばアルカリフォスファターゼ（Ｃｅｌｌ，６３，１８５−１９４，１９９０）、抗体のＦｃ領域（Ｇｅｎｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｍ８７７８９）、またはＨＲＰ（Ｈｏｒｓｅ  ｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）などの従来公知のマーカータンパク質を挙げることができる。またペプチドタグとしては、例えばＭｙｃタグ、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグなどの従来公知のペプチドタグを挙げることができる。
また、抗ＣＤ８１抗体は、例えば市販の抗ＣＤ８１抗体（ファーミンジェン社製）を購入することによって入手できる。
フィブロネクチン結合活性は、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ，１９９５，１８２：１１９１−１１９９を参考にして容易に測定することができる。
かくして選抜取得される被験物質は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を緩和、抑制（予防、改善、治療）する薬物の有力な候補となる。
上記（１−１）〜（１−３）に記載する本発明のスクリーニング方法によって選別された候補物質は、さらにＩＢＤのモデル動物である（１）自然発症ＩＢＤモデル（Ｃ３Ｈ／ＨｅＪＢｉｒマウス、Ｃｏｔｔｏｎ  ｔｏｐ  ｔａｍａｒｉｎｓ等）、（２）化学物質誘発モデル（ジニトロクロロベンゼン誘発モデル（ラット）、酢酸モデル（ラット）、トリニトロスルホン酸誘発モデル（マウス、ラット、ウサギ）、デキストラン硫酸誘発モデル（マウス、ラット、ハムスター）、カラゲナン誘発モデル（ラット、モルモット）、インドメタシン誘発モデル（ラット）等）、（３）トランスジェニック、ミュータント（ＩＬ−２ノックアウトマウス、ＩＬ−１０ノックアウトマウス、ＴＣＲノックアウトマウス等）、または（４）移入モデル（ＣＤ４５ＲＢｈｉ移入ＳＣＩＤマウス等）を用いた薬効試験、安全性試験、さらにＩＢＤ患者への臨床試験に供してもよく、これらの試験を実施することによって、より実用的なＩＢＤの改善または治療薬を取得することができる。このようにして選別された物質は、さらにその構造解析結果に基づいて、化学的合成、生物学的合成（発酵）または遺伝子学的操作によって、工業的に製造することができる。
上記動物モデルはいずれも当業者にとって公知であり、例えば「Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ」Ｄ．Ｗ．Ｍｏｒｇａｎら編（１９９９、Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ  Ｂａｓｅｌ／Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）に記載された動物モデルを用いることができる。具体的には、自然発症ＩＢＤモデル（Ｃ３Ｈ／ＨｅＪＢｉｒマウス、Ｃｏｔｔｏｎ  ｔｏｐ  ｔａｍａｒｉｎｓ等）は、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、１０７巻、１７２６−１７３５頁（１９９４）等に記載の方法により作製することができる。また、化学物質（２，４，６−ニトロベンゼンスルホン酸等が用いられる。）誘発モデルは、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、９６巻、７９５−８０３頁（１９８９）等に記載の方法により作製することができる。
なお、上記（１−１）〜（１−３）に記載するスクリーニング方法は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の改善または治療薬の候補物質を選別するのみならず、ＩＢＤの改善または治療薬（候補薬）が、ＣＤ８１遺伝子の発現を減少させるか否か、あるいはＣＤ８１の発現若しくは機能・活性を抑制するか否かを評価、確認するために用いることができる。すなわち本発明のスクリーニング方法の範疇には、候補物質の探索のみならず、このような評価あるいは確認を目的とするものも含まれる。
（２）炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の改善・治療剤
（２−１）本発明の抗ＣＤ８１抗体
本発明はＩＢＤの予防、改善または治療に有効である抗ＣＤ８１抗体を提供する。本発明で使用される抗ＣＤ８１抗体は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の予防、改善または治療効果を示すものであればよく、何ら限定はされない。
本発明で使用される抗ＣＤ８１抗体は、公知の手段を用いてポリクローナル又はモノクローナル抗体として得ることができる。本発明で使用される抗ＣＤ８１抗体として、特に哺乳動物由来のモノクローナル抗体が好ましい。哺乳動物由来のモノクローナル抗体としては、ハイブリドーマに産生されるもの、および遺伝子工学的手法により抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主に産生されるものがある。この抗体はＣＤ８１と結合することにより、ＣＤ８１発現細胞の除去、ＣＤ８１の生物学的活性の細胞内への伝達を遮断あるいは活性化する。
抗ＣＤ８１抗体産生ハイブリドーマは、基本的には公知技術を使用し、以下のようにして作製できる。すなわち、ＣＤ８１を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞をスクリーニングすることによって作製できる。
具体的には、抗ＣＤ８１抗体を作製するには次のようにすればよい。例えば、抗体取得の感作抗原として使用されるヒトＣＤ８１は、公知の方法によって得られる。
ＣＤ８１の遺伝子配列を公知の発現ベクター系に挿入して適当な宿主細胞を形質転換させた後、その宿主細胞表面のＣＤ８１を感作抗原として用いればよい。また、ＣＤ８１発現細胞、例えば全てのリンパ系細胞を感作抗原として用いてもよい。
感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定されるものではないが、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般的にはげっ歯類の動物、例えば、マウス、ラット、ハムスター等が使用される。
感作抗原を動物に免疫するには、公知の方法にしたがって行われる。例えば、一般的方法として、感作抗原を哺乳動物の腹腔内又は、皮下に注射することにより行われる。具体的には、感作抗原をＰＢＳや生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものを所望により通常のアジュバント、例えば、フロイント完全アジュバントを適量混合し、乳化後、哺乳動物に４−２１日毎に数回投与するのが好ましい。また、感作抗原免疫時に適当な担体を使用することができる。
このように免疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、哺乳動物から免疫細胞が取り出され、細胞融合に付される。細胞融合に付される好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が挙げられる。
前記免疫細胞と融合される他方の親細胞としての哺乳動物のミエローマ細胞は、すでに、公知の種々の細胞株、例えば、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３（Ｋｅａｒｎｅｙ，Ｊ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｎｏｌ．（１９７９）１２３，１５４８−１５５０）、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９７８）８１，１−７）、ＮＳ−１（Ｋｏｈｌｅｒ．Ｇ．ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９７６）６，５１１−５１９）、ＭＰＣ−１１（Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ．Ｄ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ（１９７６）８，４０５−４１５）、ＳＰ２／０（Ｓｈｕｌｍａｎ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７８）２７６，２６９−２７０）、Ｆ０（ｄｅ  Ｓｔ．Ｇｒｏｔｈ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９８０）３５，１−２１）、Ｓ１９４（Ｔｒｏｗｂｒｉｄｇｅ，Ｉ．Ｓ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９７８）１４８，３１３−３２３）、Ｒ２１０（Ｇａｌｆｒｅ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７９）２７７，１３１−１３３）等が適宜使用される。
前記免疫細胞とミエローマ細胞の細胞融合は基本的には公知の方法、たとえば、ミルステインらの方法（Ｋｏｈｌｅｒ．Ｇ．ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８１）７３，３−４６）等に準じて行うことができる。
より具体的には、前記細胞融合は例えば、細胞融合促進剤の存在下に通常の栄養培養液中で実施される。融合促進剤としては例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、センダイウイルス（ＨＶＪ）等が使用され、更に所望により融合効率を高めるためにジメチルスルホキシド等の補助剤を添加使用することもできる。
免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は、例えば、ミエローマ細胞に対して免疫細胞を１−１０倍とするのが好ましい。前記細胞融合に用いる培養液としては、例えば、前記ミエローマ細胞株の増殖に好適なＲＰＭＩ１６４０培養液、ＭＥＭ培養液、その他、この種の細胞培養に用いられる通常の培養液が使用可能であり、さらに、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできる。
細胞融合は、前記免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を前記培養液中でよく混合し、予め、３７℃程度に加温したＰＥＧ溶液、例えば、平均分子量１０００−６０００程度のＰＥＧ溶液を通常、３０−６０％（ｗ／ｖ）の濃度で添加し、混合することによって目的とする融合細胞（ハイブリドーマ）が形成される。続いて、適当な培養液を逐次添加し、遠心して上清を除去する操作を繰り返すことによりハイブリドーマの生育に好ましくない細胞融合剤等を除去できる。
当該ハイブリドーマは、通常の選択培養液、例えば、ＨＡＴ培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液）で培養することにより選択される。当該ＨＡＴ培養液での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間、通常数日〜数週間継続する。ついで、通常の限界希釈法を実施し、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングおよびクローニングが行われる。
また、ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイブリドーマを得る他に、ヒトリンパ球をｉｎ  ｖｉｔｒｏで所望の抗原蛋白質又は抗原発現細胞で感作し、感作Ｂリンパ球をヒトミエローマ細胞、例えばＵ２６６と融合させ、所望の抗原又は抗原発現細胞への結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる（特公平１−５９８７８参照）。さらに、ヒト抗体遺伝子のレパートリーを有するトランスジェニック動物に抗原又は抗原発現細胞を投与し、前述の方法に従い所望のヒト抗体を取得してもよい（国際特許出願公開番号ＷＯ  ９３／１２２２７、ＷＯ  ９２／０３９１８、ＷＯ  ９４／０２６０２、ＷＯ  ９４／２５５８５、ＷＯ  ９６／３４０９６、ＷＯ  ９６／３３７３５参照）。
このようにして作製されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培養液中で継代培養することが可能であり、また、液体窒素中で長期保存することが可能である。
当該ハイブリドーマからモノクローナル抗体を取得するには、当該ハイブリドーマを通常の方法にしたがい培養し、その培養上清として得る方法、あるいはハイブリドーマをこれと適合性がある哺乳動物に投与して増殖させ、その腹水として得る方法などが採用される。前者の方法は、高純度の抗体を得るのに適しており、一方、後者の方法は、抗体の大量生産に適している。
本発明には、モノクローナル抗体として、抗体遺伝子をハイブリドーマからクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させた組換え型抗体を用いることができる（例えば、Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ  Ｃ．Ａ．Ｋ．ａｎｄ  Ｌａｒｒｉｃｋ  Ｊ．Ｗ．ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ  ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ  ｂｙ  ＭＡＣＭＩＬＬＡＮ  ＰＵＢＬＩＳＨＥＲＳ  ＬＴＤ，１９９０参照）。
具体的には、目的とする抗体を産生する細胞、例えばハイブリドーマから、抗体の可変（Ｖ）領域をコードするｍＲＮＡを単離する。ｍＲＮＡの単離は、公知の方法、例えば、グアニジン超遠心法（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９７９）１８，５２９４−５２９９）、ＡＧＰＣ法（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８７）１６２，１５６−１５９）等により全ＲＮＡを調製し、ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）等を使用してｍＲＮＡを調製する。また、ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ  ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）を用いることによりｍＲＮＡを直接調製することができる。
得られたｍＲＮＡから逆転写酵素を用いて抗体Ｖ領域のｃＤＮＡを合成する。ｃＤＮＡの合成は、ＡＭＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ等を用いて行うことができる。また、ｃＤＮＡの合成および増幅を行うには５’−Ａｍｐｌｉ  ＦＩＮＤＥＲ  ＲＡＣＥ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）およびＰＣＲを用いた５’−ＲＡＣＥ法（Ｆｒｏｈｍａｎ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８８）８５，８９９８−９００２、Ｂｅｌｙａｖｓｋｙ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９８９）１７，２９１９−２９３２）を使用することができる。得られたＰＣＲ産物から目的とするＤＮＡ断片を精製し、ベクターＤＮＡと連結する。さらに、これより組換えベクターを作成し、大腸菌等に導入してコロニーを選択して所望の組換えベクターを調製する。目的とするＤＮＡの塩基配列を公知の方法、例えば、デオキシ法により確認する。
目的とする抗体のＶ領域をコードするＤＮＡが得られれば、これを所望の抗体定常領域（Ｃ領域）をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターへ組み込む。又は、抗体のＶ領域をコードするＤＮＡを、抗体Ｃ領域のＤＮＡを含む発現ベクターへ組み込んでもよい。
本発明で使用される抗体を製造するには、後述のように抗体遺伝子を発現制御領域、例えば、エンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込む。次に、この発現ベクターにより宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させることができる。
本発明では、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ抗体、ヒト型化抗体を使用できる。これらの改変抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。
キメラ抗体は、前記のようにして得た抗体Ｖ領域をコードするＤＮＡをヒト抗体Ｃ領域をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得られる（欧州特許出願公開番号ＥＰ  １２５０２３、国際特許出願公開番号ＷＯ  ９２−１９７５９参照）。この既知の方法を用いて、本発明に有用なキメラ抗体を得ることができる。
ヒト型化抗体は、再構成（ｒｅｓｈａｐｅｄ）ヒト抗体とも称され、ヒト以外の哺乳動物、例えばマウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている（欧州特許出願公開番号ＥＰ  １２５０２３、国際特許出願公開番号ＷＯ  ９２−１９７５９参照）。
具体的には、マウス抗体のＣＤＲとヒト抗体のフレームワーク領域（ＦＲ；ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｒｅｇｉｏｎ）を連結するように設計したＤＮＡ配列を、末端部にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドからＰＣＲ法により合成する。得られたＤＮＡをヒト抗体Ｃ領域をコードするＤＮＡと連結し、次いで発現ベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させることにより得られる（欧州特許出願公開番号ＥＰ  ２３９４００、国際特許出願公開番号ＷＯ  ９２−１９７５９参照）。
ＣＤＲを介して連結されるヒト抗体のＦＲは、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（Ｓａｔｏ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（１９９３）５３，８５１−８５６）。
キメラ抗体、ヒト型化抗体には、ヒト抗体Ｃ領域が使用される。ヒト抗体Ｃ領域としては、Ｃγが挙げられ、例えば、Ｃγ１、Ｃγ２、Ｃγ３又はＣγ４を使用することができる。また、抗体又はその産生の安定性を改善するために、ヒト抗体Ｃ領域を修飾してもよい。
キメラ抗体はヒト以外の哺乳動物由来抗体の可変領域とヒト抗体由来のＣ領域からなり、ヒト型化抗体はヒト以外の哺乳動物由来抗体の相補性決定領域とヒト抗体由来のフレームワーク領域およびＣ領域からなり、ヒト体内における抗原性が低下しているため、本発明に使用される抗体として有用である。
前記のように構築した抗体遺伝子は、公知の方法により発現させ、取得することができる。哺乳類細胞の場合、常用される有用なプロモーター、発現される抗体遺伝子、その３’側下流にポリＡシグナルを機能的に結合させたＤＮＡあるいはそれを含むベクターにより発現させることができる。例えばプロモーター／エンハンサーとしては、ヒトサイトメガロウイルス前期プロモーター／エンハンサー（ｈｕｍａｎ  ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ  ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ／ｅｎｈａｎｃｅｒ）を挙げることができる。
また、その他に本発明で使用される抗体発現に使用できるプロモーター／エンハンサーとして、レトロウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）等のウイルスプロモーター／エンハンサーやヒトエロンゲーションファクター１α（ＨＥＦ１α）などの哺乳類細胞由来のプロモーター／エンハンサーを用いればよい。
例えば、ＳＶ４０プロモーター／エンハンサーを使用する場合、Ｍｕｌｌｉｇａｎらの方法（Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｒ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７９）２７７，１０８−１１４）、また、ＨＥＦ１αプロモーター／エンハンサーを使用する場合、Ｍｉｚｕｓｈｉｍａらの方法（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ，Ｓ．ａｎｄ  Ｎａｇａｔａ，Ｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９９０）１８，５３２２）に従えば容易に実施することができる。
大腸菌の場合、常用される有用なプロモーター、抗体分泌のためのシグナル配列、発現させる抗体遺伝子を機能的に結合させて発現させることができる。例えばプロモーターとしては、ｌａｃＺプロモーター、ａｒａＢプロモーターを挙げることができる。ｌａｃＺプロモーターを使用する場合、Ｗａｒｄらの方法（Ｗａｒｄ，Ｅ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８９）３４１，５４４−５４６、Ｗａｒｄ，Ｅ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．ＦＡＳＥＢ  Ｊ．（１９９２）６，２４２２−２４２７）、ａｒａＢプロモーターを使用する場合、Ｂｅｔｔｅｒらの方法（Ｂｅｔｔｅｒ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２４０，１０４１−１０４３）に従えばよい。
抗体分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、ｐｅｌＢシグナル配列（Ｌｅｉ，Ｓ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ  Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９８７）１６９，４３７９−４３８３）を使用すればよい。ペリプラズムに産生された抗体を分離した後、抗体の構造を適切にリフォールド（ｒｅｆｏｌｄ）して使用する（例えば、ＷＯ９６／３０３９４を参照）。
複製起源としては、ＳＶ４０、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）等の由来のものを用いることができ、さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクターは選択マーカーとして、アミノグリコシドホスホトランス
フェラーゼ（ＡＰＨ）遺伝子、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｅｃｏｇｐｔ）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）遺伝子等を含むことができる。
本発明で使用される抗体の製造のために、任意の産生系を使用することができる。抗体製造のための産生系は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの産生系がある。ｉｎ  ｖｉｔｒｏの産生系としては、真核細胞を使用する産生系や原核細胞を使用する産生系が挙げられる。
真核細胞を使用する場合、動物細胞、植物細胞、又は真菌細胞を用いる産生系がある。動物細胞としては、（１）哺乳類細胞、例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ミエローマ、ＢＨＫ（ｂａｂｙ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｋｉｄｎｅｙ）、ＨｅＬａ、Ｖｅｒｏなど、（２）両生類細胞、例えば、アフリカツメガエル卵母細胞、あるいは（３）昆虫細胞、例えば、ｓｆ９、ｓｆ２１、Ｔｎ５などが知られている。植物細胞としては、ニコチアナ・タバクム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）由来の細胞が知られており、これをカルス培養すればよい。真菌細胞としては、酵母、例えば、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、糸状菌、例えばアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、例えばアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）などが知られている。
原核細胞を使用する場合、細菌細胞を用いる産生系がある。細菌細胞としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、枯草菌が知られている。
これらの細胞に、目的とする抗体遺伝子を形質転換により導入し、形質転換された細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養することにより抗体が得られる。培養は、公知の方法に従い行う。例えば、培養液として、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ＩＭＤＭを使用することができ、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできる。また、抗体遺伝子を導入した細胞を動物の腹腔等へ移すことにより、ｉｎ  ｖｉｖｏにて抗体を産生してもよい。
一方、ｉｎ  ｖｉｖｏの産生系としては、動物を使用する産生系や植物を使用する産生系が挙げられる。動物を使用する場合、哺乳類動物、昆虫を用いる産生系などがある。
哺乳類動物としては、ヤギ、ブタ、ヒツジ、マウス、ウシなどを用いることができる（Ｖｉｃｋｉ  Ｇｌａｓｅｒ，ＳＰＥＣＴＲＵＭ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，１９９３）。また、昆虫としては、カイコを用いることができる。植物を使用する場合、例えばタバコを用いることができる。
これらの動物又は植物に抗体遺伝子を導入し、動物又は植物の体内で抗体を産生させ、回収する。例えば、抗体遺伝子をヤギβカゼインのような乳汁中に固有に産生される蛋白質をコードする遺伝子の途中に挿入して融合遺伝子として調製する。抗体遺伝子が挿入された融合遺伝子を含むＤＮＡ断片をヤギの胚へ注入し、この胚を雌のヤギへ導入する。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギ又はその子孫が産生する乳汁から所望の抗体を得る。トランスジェニックヤギから産生される所望の抗体を含む乳汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトランスジェニックヤギに使用してもよい。（Ｅｂｅｒｔ，Ｋ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９４）１２，６９９−７０２）。
また、カイコを用いる場合、目的の抗体遺伝子を挿入したバキュロウイルスをカイコに感染させ、このカイコの体液より所望の抗体を得る（Ｍａｅｄａ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８５）３１５，５９２−５９４）。さらに、タバコを用いる場合、目的の抗体遺伝子を植物発現用ベクター、例えばｐＭＯＮ  ５３０に挿入し、このベクターをＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのようなバクテリアに導入する。このバクテリアをタバコ、例えばＮｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍに感染させ、本タバコの葉より所望の抗体を得る（Ｊｕｌｉａｎ，Ｋ．−Ｃ．Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）２４，１３１−１３８）。
上述のようにｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏの産生系にて抗体を産生する場合、抗体重鎖（Ｈ鎖）又は軽鎖（Ｌ鎖）をコードするＤＮＡを別々に発現ベクターに組み込んで宿主を同時形質転換させてもよいし、あるいはＨ鎖およびＬ鎖をコードするＤＮＡを単一の発現ベクターに組み込んで、宿主を形質転換させてもよい（国際特許出願公開番号ＷＯ  ９４−１１５２３参照）。
本発明で使用される抗体は、本発明に好適に使用され得るかぎり、抗体の断片やその修飾物であってよい。例えば、抗体の断片としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ又はＨ鎖とＬ鎖のＦｖを適当なリンカーで連結させたシングルチェインＦｖ（ｓｃＦｖ）が挙げられる。
具体的には、抗体を酵素、例えば、パパイン、ペプシンで処理し抗体断片を生成させるか、又は、これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させる（例えば、Ｃｏ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）１５２，２９６８−２９７６、Ｂｅｔｔｅｒ，Ｍ．＆  Ｈｏｒｗｉｔｚ，Ａ．Ｈ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８９）１７８，４７６−４９６、Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ，Ａ．＆  Ｓｋｅｒｒａ，Ａ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８９）１７８，４７６−４９６、Ｌａｍｏｙｉ，Ｅ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８９）１２１，６５２−６６３、Ｒｏｕｓｓｅａｕｘ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８９）１２１，６６３−６６９、Ｂｉｒｄ，Ｒ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，ＴＩＢＴＥＣＨ（１９９１）９，１３２−１３７参照）。
ｓｃＦｖは、抗体のＨ鎖Ｖ領域とＬ鎖Ｖ領域を連結することにより得られる。このｓｃＦｖにおいて、Ｈ鎖Ｖ領域とＬ鎖Ｖ領域はリンカー、好ましくは、ペプチドリンカーを介して連結される（Ｈｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８８）８５，５８７９−５８８３）。ｓｃＦｖにおけるＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域は、上記抗体として記載されたもののいずれの由来であってもよい。Ｖ領域を連結するペプチドリンカーとしては、例えばアミノ酸１２−１９残基からなる任意の一本鎖ペプチドが用いられる。
ｓｃＦｖをコードするＤＮＡは、前記抗体のＨ鎖又は、Ｈ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ、およびＬ鎖又は、Ｌ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡを鋳型とし、それらの配列のうちの所望のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ部分を、その両端を規定するプライマー対を用いてＰＣＲ法により増幅し、次いで、さらにペプチドリンカー部分をコードするＤＮＡおよびその両端を各々Ｈ鎖、Ｌ鎖と連結されるように規定するプライマー対を組み合せて増幅することにより得られる。
また、一旦ｓｃＦｖをコードするＤＮＡが作製されれば、それらを含有する発現ベクター、および該発現ベクターにより形質転換された宿主を常法に従って得ることができ、また、その宿主を用いて常法に従って、ｓｃＦｖを得ることができる。これら抗体の断片は、前記と同様にしてその遺伝子を取得し発現させ、宿主により産生させることができる。本願特許請求の範囲でいう「抗体」にはこれらの抗体の断片も包含される。
抗体の修飾物として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の各種分子と結合した抗体を使用することもできる。本願特許請求の範囲でいう「抗体」にはこれらの抗体修飾物も包含される。このような抗体修飾物を得るには、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。これらの方法はこの分野においてすでに確立されている。
前記のように産生、発現された抗体は、細胞内外、宿主から分離し均一にまで精製することができる。本発明で使用される抗体の分離、精製はアフィニティークロマトグラフィーにより行うことができる。アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、例えば、プロテインＡカラム、プロテインＧカラムが挙げられる。プロテインＡカラムに用いる担体として、例えば、Ｈｙｐｅｒ  Ｄ、ＰＯＲＯＳ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．等が挙げられる。その他、通常のタンパク質で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。
例えば、上記アフィニティークロマトグラフィー以外のクロマトグラフィー、フィルター、限外濾過、塩析、透析等を適宜選択、組み合わせれば、本発明で使用される抗体を分離、精製することができる。クロマトグラフィーとしては、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲルろ過等が挙げられる。これらのクロマトグラフィーはＨＰＬＣ（Ｈｉｇｈ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）に適用し得る。また、逆相ＨＰＬＣを用いてもよい。
上記で得られた抗体の濃度測定は吸光度の測定又はＥＬＩＳＡ等により行うことができる。すなわち、吸光度の測定による場合には、ＰＢＳ（−）で適当に希釈した後、２８０ｎｍの吸光度を測定し、１ｍｇ／ｍｌを１．３５ＯＤとして算出する。また、ＥＬＩＳＡによる場合は以下のように測定することができる。すなわち、０．１Ｍ重炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）で１μｇ／ｍｌに希釈したヤギ抗ヒトＩｇＧ（ＴＡＧＯ製）１００μｌを９６穴プレート（Ｎｕｎｃ製）に加え、４℃で一晩インキュベーションし、抗体を固相化する。ブロッキングの後、適宜希釈した本発明で使用される抗体又は抗体を含むサンプル、あるいは標品としてヒトＩｇＧ（ＣＡＰＰＥＬ製）１００μｌを添加し、室温にて１時間インキュベーションする。洗浄後、５０００倍希釈したアルカリフォスファターゼ標識抗ヒトＩｇＧ（ＢＩＯ  ＳＯＵＲＣＥ製）１００μｌを加え、室温にて１時間インキュベートする。洗浄後、基質溶液を加えインキュベーションの後、ＭＩＣＲＯＰＬＡＴＥ  ＲＥＡＤＥＲ  Ｍｏｄｅｌ  ３５５０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ製）を用いて４０５ｎｍでの吸光度を測定し、目的の抗体の濃度を算出する。
本発明の抗ＣＤ８１抗体は、前述の（１）項に記載するＣＤ８１の発現変動を検出するためのスクリーニングツール、または後述の（３）項に記載の診断薬（疾患マーカー）としても用いることができる。
（２−２）本発明のアンチセンスポリヌクレオチド
本発明はＩＢＤの予防、改善または治療に有効である、ＣＤ８１の塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有するアンチセンスポリヌクレオチドを提供する。
本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、ＣＤ８１遺伝子の塩基配列に相補的な、または実質的に相補的な塩基配列またはその一部を有するものであり、ＣＤ８１遺伝子の発現を抑制し得る作用を有するものであれば、いずれのアンチセンスポリヌクレオチドであってもよく、アンチセンスＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡなどが含まれる。
ここで、実質的に相補的な塩基配列とは、例えば、ＣＤ８１遺伝子の塩基配列に相補的な塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列などが挙げられる。特に、ＣＤ８１遺伝子の塩基配列のＮ末端部位をコードする部分の塩基配列（例えば、開始コドン付近の塩基配列など）の相補鎖と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアンチセンスポリヌクレオチドが好適である。具体的には、配列番号１に記載の塩基配列に相補的な、もしくは実質的に相補的な配列、またはその一部分を有するアンチセンスポリヌクレオチドなどが挙げられる。
アンチセンスポリヌクレオチドは通常、１０〜１０００個程度、好ましくは１５〜５００個程度、更に好ましくは１６〜３０個程度の塩基から構成される。ヌクレアーゼなどの加水分解酵素による分解を防ぐために、アンチセンスＤＮＡを構成する各ヌクレオチドのリン酸残基（ホスフェート）は、例えば、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホロジチオネートなどの化学修飾リン酸残基に置換されていてもよい。これらのアンチセンスポリヌクレオチドは、公知のＤＮＡ合成装置などを用いて製造することができる。
かかるアンチセンスポリヌクレオチドは、ＣＤ８１遺伝子のＲＮＡとハイブリダイズすることができ、該ＲＮＡの合成または機能を阻害することができるか、あるいは該ＲＮＡとの相互作用を介してＣＤ８１遺伝子の発現を調節・制御することができる。
本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、生体内および生体外で本発明のタンパク質遺伝子の発現を調節・制御するのに有用であり、また病気などの治療に有用である。タンパク質遺伝子の５’端ヘアピンループ、５’端６−ベースペア・リピート、５’端非翻訳領域、ポリペプチド翻訳開始コドン、タンパク質コード領域、ＯＲＦ翻訳終止コドン、３’端非翻訳領域、３’端パリンドローム領域または３’端ヘアピンループなどは、好ましい対象領域として選択しうるが、タンパク質遺伝子内の如何なる領域も対象として選択しうる。目的核酸と、対象領域の少なくとも一部に相補的なポリヌクレオチドとの関係については、目的核酸が対象領域とハイブリダイズすることができる場合は、その目的核酸は、当該対象領域のポリヌクレオチドに対して「アンチセンス」であるということができる。
アンチセンスポリヌクレオチドは、２−デオキシ−Ｄ−リボースを含有しているポリヌクレオチド、Ｄ−リボースを含有しているポリヌクレオチド、プリンまたはピリミジン塩基のＮ−グリコシドであるその他のタイプのポリヌクレオチド、非ヌクレオチド骨格を有するその他のポリマー（例えば、市販のタンパク質核酸および合成配列特異的な核酸ポリマー）または特殊な結合を含有するその他のポリマー（但し、該ポリマーはＤＮＡやＲＮＡ中に見出されるような塩基のペアリングや塩基の付着を許容する配置をもつヌクレオチドを含有する）などが挙げられる。それらは、２本鎖ＤＮＡ、１本鎖ＤＮＡ、２本鎖ＲＮＡ、１本鎖ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドであってもよく、さらに非修飾ポリヌクレオチド（または非修飾オリゴヌクレオチド）、公知の修飾の付加されたもの、例えば当該分野で知られた標識のあるもの、キャップの付いたもの、メチル化されたもの、１個以上の天然のヌクレオチドを類縁物で置換したもの、分子内ヌクレオチド修飾のされたもの、例えば非荷電結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、カルバメートなど）を持つもの、電荷を有する結合または硫黄含有結合（例、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）を持つもの、例えばタンパク質（例、ヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ・インヒビター、トキシン、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジンなど）や糖（例、モノサッカライドなど）などの側鎖基を有しているもの、インターカレント化合物（例、アクリジン、ソラレンなど）を持つもの、キレート化合物（例えば、金属、放射活性をもつ金属、ホウ素、酸化性の金属など）を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、修飾された結合を持つもの（例えば、αアノマー型の核酸など）であってもよい。ここで「ヌクレオシド」、「ヌクレオチド」および「核酸」とは、プリンおよびピリミジン塩基を含有するのみでなく、修飾されたその他の複素環型塩基をもつようなものを含んでいて良い。このような修飾物は、メチル化されたプリンおよびピリミジン、アシル化されたプリンおよびピリミジン、あるいはその他の複素環を含むものであってよい。修飾されたヌクレオチドおよび修飾されたヌクレオチドはまた糖部分が修飾されていてよく、例えば、１個以上の水酸基がハロゲンとか、脂肪族基などで置換されていたり、またはエーテル、アミンなどの官能基に変換されていてよい。本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、ＤＮＡまたは修飾された核酸（ＲＮＡ、ＤＮＡ）である。修飾された核酸の具体例としては、核酸の硫黄誘導体、チオホスフェート誘導体、ポリヌクレオシドアミドやオリゴヌクレオシドアミドの分解に抵抗性のものなどが挙げられる。
本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、例えば、以下のように設計されうる。すなわち、細胞内でのアンチセンスポリヌクレオチドをより安定なものにする、アンチセンスポリヌクレオチドの細胞透過性をより高める、目標とするセンス鎖に対する親和性をより大きなものにする、また、もし毒性があるような場合はアンチセンスポリヌクレオチドの毒性をより小さなものにする。このような修飾は、例えばＰｈａｒｍ  Ｔｅｃｈ  Ｊａｐａｎ，８巻，２４７頁または３９５頁，１９９２年、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９９３年などで数多く報告されている。
本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、リポゾーム、ミクロスフェアのような特殊な形態で供与されたり、遺伝子治療により適合した、付加された形態で供与されてもよい。こうして付加形態で用いられるものとしては、リン酸基骨格の電荷を中和するように働くポリリジンのようなポリカチオン体、細胞膜との相互作用を高めたり、核酸の取込みを増大せしめるような脂質（例、ホスホリピド、コレステロールなど）などの疎水性のものが挙げられる。付加するに好ましい脂質としては、コレステロールやその誘導体（例、コレステリルクロロホルメート、コール酸など）が挙げられる。こうしたものは、核酸の３’端または５’端に付着させることができ、塩基、糖、分子内ヌクレオシド結合を介して付着させることができうる。その他の基としては、核酸の３’端または５’端に特異的に配置されたキャップ用の基で、エキソヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅなどのヌクレアーゼによる分解を阻止するためのものが挙げられる。こうしたキャップ用の基としては、ポリエチレングリコール、テトラエチレングリコールなどのグリコールをはじめとした当該分野で知られた水酸基の保護基が挙げられるが、それに限定されるものではない。アンチセンスポリヌクレオチドの阻害活性は、本発明のスクリーニング方法を用いて調べることができる。
本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、前述のように２本鎖であってもよく、ＣＤ８１をコードするＲＮＡに結合し、該ＲＮＡを破壊またはその機能を抑制するものであればよい。すなわち、ＣＤ８１をコードするＲＮＡの一部とそれに相補的なＲＮＡを含有する２本鎖ＲＮＡ等も本発明のアンチセンスポリヌクレオチドに含まれる。
（２−３）本発明の炎症性腸疾患の予防、改善または治療剤
本発明は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の予防、改善または治療剤を提供するものである。
本発明は、ＣＤ８１がＩＢＤ惹起性細胞に高発現しており、抗ＣＤ８１抗体がＩＢＤモデル動物に対して治療効果を示すという新たな知見から、ＣＤ８１遺伝子発現を抑制する物質、ＣＤ８１の発現量または機能（活性）を低下させる物質、および抗ＣＤ８１抗体が炎症性腸疾患の予防、改善または治療に有効であるという考えに基づくものである。
したがって、本発明が提供するＩＢＤの予防、改善および治療剤は、ＣＤ８１遺伝子の発現を抑制する物質、ＣＤ８１の発現若しくは機能（活性）を抑制する物質または抗ＣＤ８１抗体を有効成分とするものである。
当該有効成分となる、ＣＤ８１遺伝子の発現を抑制する物質、あるいはＣＤ８１の発現若しくは機能（活性）を抑制する物質は、上記のスクリーニング方法を利用して選別されたもののみならず、選別された物質に関する情報に基づいて定法に従って工業的に製造されたものであってもよい。また、ＩＢＤモデル動物を用いた薬効試験、安全性試験、更にＩＢＤに罹患した患者への臨床試験に供してもよく、これらの試験を実施することによって、より実用的なＩＢＤの改善または治療薬を取得することができる。このようにして選別された物質は、さらにその構造解析結果に基づいて、化学的合成、生物学的合成（発酵）または遺伝子学的操作によって、工業的に製造することができる。
ＣＤ８１遺伝子発現を抑制する物質、あるいはＣＤ８１の発現量もしくは機能（活性）を低下させる物質は、そのままもしくは自体公知の薬学的に許容される担体（賦形剤、増量剤、結合剤、滑沢剤などが含まれる）や慣用の添加剤などと混合して医薬組成物として調製することができる。当該医薬組成物は、調製する形態（錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤などの経口投与剤；注射剤、点滴剤、外用剤、坐剤などの非経口投与剤）等に応じて経口投与または非経口投与することができる。また投与量は、有効成分の種類、投与経路、投与対象または患者の年齢、体重、症状などによって異なり一概に規定できないが、通常、１日投与用量として、数ｍｇ〜２ｇ程度、好ましくは数十ｍｇ程度を、１日１〜数回にわけて投与することができる。
本発明には、ＣＤ８１タンパク質の機能（活性）を抑制する活性を有する抗ＣＤ８１抗体を有効成分として含有する炎症性腸疾患の予防、改善または治療剤も含まれる。
抗ＣＤ８１抗体を有効成分として含有する薬剤は、経口、非経口投与のいずれでも可能であるが、好ましくは非経口投与であり、具体的には、注射剤型、経鼻投与剤型、経肺投与剤型、経皮投与型などが挙げられる。注射剤型の例としては、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などにより全身または局部的に投与することができる。
抗ＣＤ８１抗体を有効成分として含有する薬剤自体は、公知の製剤学的方法により製剤化した薬剤として投与を行う。例えば、水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、又は懸濁液剤の注射剤の形で使用できる。また、例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、ベヒクル、防腐剤などと適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することが考えられる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。
注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のようなベヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えばＤ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート８０ＴＭ、ＨＣＯ−５０と併用してもよい。
油性液としてはゴマ油、大豆油があげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールと併用してもよい。また、緩衝剤、例えばリン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、無痛化剤、例えば、塩酸プロカイン、安定剤、例えばベンジルアルコール、フェノール、酸化防止剤と配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填させる。
また、患者の年齢、症状により適宜投与量を選択することができる。例えば、一回につき体重１ｋｇあたり０．０００１ｍｇ〜１０００ｍｇの範囲で選ぶことが可能である。あるいは、例えば、患者あたり０．００１〜１０００００ｍｇ／ｂｏｄｙの範囲で投与量を選ぶことができる。しかしながら、本発明の治療薬はこれらの投与量に制限されるものではない。
本発明には、ＣＤ８１タンパク質の発現を抑制するためのヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体を有効成分として含有する炎症性腸疾患の予防、改善または治療剤も含まれる。前述のＣＤ８１遺伝子発現を抑制する物質、あるいはＣＤ８１の発現量もしくは機能（活性）を低下させる物質がＤＮＡによりコードされるものであれば、該ＤＮＡを遺伝子治療用ベクターに組み込み、遺伝子治療を行うことも考えられる。更に、上記有効成分物質がＣＤ８１遺伝子に対するアンチセンスヌクレオチドの場合は、そのままもしくは遺伝子治療用ベクターにこれを組込むことにより、遺伝子治療を行うこともできる。これらの場合も、遺伝子治療用組成物の投与量、投与方法は患者の体重、年齢、症状などにより変動し、当業者であれば適宜選択することが可能である。
上記アンチセンスポリヌクレオチドを利用する遺伝子治療につき詳述すれば、該遺伝子治療は、通常のこの種の遺伝子治療と同様にして、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその化学的修飾体を直接患者の体内に投与することにより目的遺伝子の発現を制御する方法、もしくはアンチセンスＲＮＡを患者の標的細胞に導入することにより該細胞による目的遺伝子の発現を抑制する方法により実施できる。
アンチセンスポリヌクレオチドまたはその化学的修飾体は、細胞内でセンス鎖ｍＲＮＡに結合して、目的遺伝子の発現、即ちＣＤ８１の発現を抑制することができ、かくしてＣＤ８１の機能（活性）を抑制することができる。
アンチセンスポリヌクレオチドまたはその化学的修飾体を直接生体内に投与する方法において、用いられるアンチセンスポリヌクレオチドまたはその化学修飾体は、好ましくは１０〜１０００塩基、さらに好ましくは１５〜５００塩基、最も好ましくは１６〜３０塩基の長さを有するものとすればよい。その投与に当たり、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその化学的修飾体は、通常慣用される安定化剤、緩衝液、溶媒などを用いて製剤化され得る。
アンチセンスＲＮＡを患者の標的細胞に導入する方法において、用いられるアンチセンスＲＮＡは、好ましくは１０〜１０００塩基、さらに好ましくは１５〜５００塩基、最も好ましくは１６〜３０塩基の長さを有するものとすればよい。また、この方法は、生体内の細胞にアンチセンス遺伝子を導入するｉｎ  ｖｉｖｏ法および一旦体外に取り出した細胞にアンチセンス遺伝子を導入し、該細胞を体内に戻すｅｘ  ｖｉｖｏ法を包含する（日経サイエンス，１９９４年４月号，２０−４５頁、月刊薬事，３６（１），２３−４８（１９９４）、実験医学増刊，１２（１５），全頁（１９９４）など参照）。この内ではｉｎ  ｖｉｖｏ法が好ましく、これには、ウイルス的導入法（組換えウイルスを用いる方法）と非ウイルス的導入法がある（前記各文献参照）。
上記組換えウイルスを用いる方法としては、例えばレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、センダイウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルスなどのウイルスゲノムに本発明のアンチセンスポリヌクレオチドを組込んで生体内に導入する方法が挙げられる。この中では、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルスなどを用いる方法が特に好ましい。非ウイルス的導入法としては、リポソーム法、リポフェクチン法などが挙げられ、特にリポソーム法が好ましい。他の非ウイルス的導入法としては、例えばマイクロインジェクション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法なども挙げられる。
遺伝子治療用製剤組成物は、上述したアンチセンスポリヌクレオチドまたはその化学修飾体、これらを含む組換えウイルスおよびこれらウイルスが導入された感染細胞などを有効成分とするものである。該組成物の患者への投与形態、投与経路などは、治療目的とする疾患、症状などに応じて適宜決定できる。例えば注射剤などの適当な投与形態で、静脈、動脈、皮下、筋肉内などに投与することができ、また患者の疾患対象部位に直接投与、導入することもできる。ｉｎ  ｖｉｖｏ法を採用する場合、遺伝子治療用組成物は、本発明のアンチセンスポリヌクレオチドを含む注射剤などの投与形態の他に、例えば本発明のアンチセンスポリヌクレオチドを含有するウイルスベクターをリポソームまたは膜融合リポソームに包埋した形態（センダイウイルス（ＨＶＪ）−リポソームなど）とすることができる。これらのリポソーム製剤形態には、懸濁剤、凍結剤、遠心分離濃縮凍結剤などが含まれる。また、遺伝子治療用組成物は、上記本発明のアンチセンスポリヌクレオチドを含有するベクターを導入されたウイルスで感染された細胞培養液の形態とすることもできる。これら各種形態の製剤中の有効成分の投与量は、治療目的である疾患の程度、患者の年齢、体重などにより適宜調節することができる。通常、ＣＤ８１遺伝子に対するアンチセンスポリヌクレオチドの場合は、患者成人１人当たり約０．０００１〜１００ｍｇ、好ましくは約０．００１〜１０ｍｇが数日ないし数カ月に１回投与される量とすればよい。アンチセンスポリヌクレオチドを含むレトロウイルスベクターの場合は、レトロウイルス力価として、１日患者体重１ｋｇ当たり約１×１０３ｐｆｕ〜１×１０１５ｐｆｕとなる量範囲から選ぶことができる。アンチセンスポリヌクレオチドを導入した細胞の場合は、１×１０４細胞／ｂｏｄｙ〜１×１０１５細胞／ｂｏｄｙ程度を投与すればよい。
さらに、本発明は、（ｉ）本発明のタンパク質をコードするＲＮＡの一部とそれに相補的なＲＮＡを含有する二重鎖ＲＮＡ、（ｉｉ）前記二重鎖ＲＮＡを含有してなる医薬、（ｉｉｉ）本発明のタンパク質をコードするＲＮＡの一部を含有するリボザイム、（ｉｖ）前記リボザイムを含有してなる医薬、（ｖ）前記リボザイムをコードする遺伝子（ＤＮＡ）を含有する発現ベクターなども提供する。上記アンチセンスポリヌクレオチドと同様に、二重鎖ＲＮＡ、リボザイムなども、本発明のＤＮＡから転写されるＲＮＡを破壊またはその機能を抑制することができる。本発明のＣＤ８１またはそれをコードするＤＮＡの機能を抑制することができる二重鎖ＲＮＡ、リボザイムなどは、生活習慣病、特に糖尿病の予防・治療剤などとして使用することができる。
二重鎖ＲＮＡは、公知の方法（例、Ｎａｔｕｒｅ，４１１巻，４９４頁，２００１年）に準じて、本発明のポリヌクレオチドの配列を基に設計して製造することができる。リボザイムは、公知の方法（例、ＴＲＥＮＤＳ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，７巻，２２１頁，２００１年）に準じて、本発明のポリヌクレオチドの配列を基に設計して製造することができる。例えば、公知のリボザイムの配列の一部を本発明のタンパク質をコードするＲＮＡの一部に置換することによって製造することができる。本発明のタンパク質をコードするＲＮＡの一部としては、公知のリボザイムによって切断され得るコンセンサス配列ＮＵＸ（式中、Ｎはすべての塩基を、ＸはＧ以外の塩基を示す）の近傍の配列などが挙げられる。上記の二重鎖ＲＮＡまたはリボザイムを上記予防・治療剤として使用する場合、アンチセンスポリヌクレオチドと同様にして製剤化し、投与することができる。また、前記（ｖ）の発現ベクターは、公知の遺伝子治療法などと同様に用い、上記予防・治療剤として使用する。
（３）炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の疾患マーカーおよびその応用
（３−１）ポリヌクレオチド
本発明におけるＣＤ８１遺伝子は、ＴＡＰＡ−１遺伝子とも呼ばれる公知遺伝子である。例えばヒト由来のＣＤ８１遺伝子としては、配列番号１に示すポリヌクレオチドが知られており（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿００４３５６）、その取得方法についてもＰｒａｓａｄ  ＳＳら，Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．，６３９，７３−８４，１９９４に記載されるように公知である。
本発明は、前述するように、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）惹起性細胞において、ＩＢＤ非惹起性細胞に比して、ＣＤ８１遺伝子が特異的に発現上昇しているという知見を発端に、この遺伝子発現の有無や発現の程度を検出することによって上記ＩＢＤの罹患の有無や罹患の程度が特異的に検出でき、該疾患の診断を正確に行うことができるという知見に基づくものである。
上記ポリヌクレオチドは、従って、被験者における上記遺伝子の発現の有無またはその程度を検出することによって、該被験者が炎症性腸疾患（ＩＢＤ）に罹患しているか否かまたはその罹患の程度を診断することのできるツール（疾患マーカー）として有用である。
また上記ポリヌクレオチドは、前述の（１−１）項に記載するような炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の予防、改善または治療に有用な候補物質のスクリーニングにおいて、ＣＤ８１遺伝子の発現変動を検出するためのスクリーニングツール（疾患マーカー）としても有用である。
本発明の疾患マーカーは、前記ＣＤ８１遺伝子の塩基配列において、連続する少なくとも１５塩基を有するポリヌクレオチド及び／またはそれに相補的なポリヌクレオチドからなることを特徴とするものである。
具体的には、本発明の疾患マーカーは、配列番号１に記載のＣＤ８１遺伝子の塩基配列において、連続する少なくとも１５塩基を有するポリヌクレオチド及び／またはそれに相補的なポリヌクレオチドからなるものを挙げることができる。
ここで相補的なポリヌクレオチド（相補鎖、逆鎖）とは、前記ＣＤ８１遺伝子の塩基配列からなるポリヌクレオチドの全長配列または該塩基配列において、少なくとも連続した１５塩基長の塩基配列を有するその部分配列（ここでは便宜上、これらを「正鎖」ともいう）に対して、Ａ：ＴおよびＧ：Ｃといった塩基対関係に基づいて、塩基的に相補的な関係にあるポリヌクレオチドを意味するものである。ただし、かかる相補鎖は、対象とする正鎖の塩基配列と完全に相補配列を形成する場合に限らず、対象とする正鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズすることができる程度の相補関係を有するものであってもよい。なお、ここでストリンジェントな条件は、Ｂｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｋｉｍｍｅｌ（１９８７，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１５２，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ）に教示されるように、複合体或いはプローブを結合する核酸の融解温度（Ｔｍ）に基づいて決定することができる。例えばハイブリダイズ後の洗浄条件として、通常「１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、３７℃」程度の条件を挙げることができる。相補鎖はかかる条件で洗浄しても対象とする正鎖とハイブリダイズ状態を維持するものであることが好ましい。特に制限されないが、より厳しいハイブリダイズ条件として「０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」程度、さらに厳しいハイブリダイズ条件として「０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」程度の洗浄条件を挙げることができる。具体的には、このような相補鎖として、対象の正鎖の塩基配列と完全に相補的な関係にある塩基配列からなる鎖、並びに該鎖と少なくとも９０％、好ましくは９５％の相同性を有する塩基配列からなる鎖を例示することができる。
ここで、正鎖側のポリヌクレオチドには、前記ＣＤ８１遺伝子の塩基配列またはその部分配列を有するものだけでなく、上記相補鎖の塩基配列に対してさらに相補的な関係にある塩基配列からなる鎖を含めることができる。
さらに上記正鎖のポリヌクレオチド及び相補鎖（逆鎖）のポリヌクレオチドは、各々一本鎖の形態で疾患マーカーとして使用されても、また二本鎖の形態で疾患マーカーとして使用されてもよい。
本発明の炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の疾患マーカーは、具体的には、ＣＤ８１遺伝子の塩基配列（全長配列）からなるポリヌクレオチドであってもよいし、その相補配列からなるポリヌクレオチドであってもよい。またこれら前記本発明遺伝子もしくは該遺伝子に由来するポリヌクレオチドを選択的に（特異的に）認識するものであれば、上記全長配列またはその相補配列の部分配列からなるポリヌクレオチドであってもよい。この場合、部分配列としては、上記全長配列またはその相補配列の塩基配列から任意に選択される少なくとも１５個の連続した塩基長を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。
なお、ここで「選択的に（特異的に）認識する」とは、例えばノーザンブロット法においては、ＣＤ８１遺伝子、またはこれに由来するポリヌクレオチドが特異的に検出できること、またＲＴ−ＰＣＲ法においては、ＣＤ８１遺伝子、またはこれに由来するポリヌクレオチドが特異的に生成されることを意味するが、それに限定されることなく、当業者が上記検出物または生成物がこれらの遺伝子に由来するものであると判断できるものであればよい。
本発明の疾患マーカーは、例えば配列番号１で示されるＣＤ８１遺伝子の塩基配列をもとに、例えばｐｒｉｍｅｒ３（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｐｒｉｍｅｒ／ｐｒｉｍｅｒ３．ｃｇｉ）あるいはベクターＮＴＩ（Ｉｎｆｏｍａｘ社製）を利用して設計することができる。具体的には前記ＣＤ８１遺伝子の塩基配列をｐｒｉｍｅｒ３またはベクターＮＴＩのソフトウエアにかけて得られる、プライマーまたはプローブの候補配列、若しくは少なくとも該配列を一部に含む配列をプライマーまたはプローブとして使用することができる。
本発明の疾患マーカーは、上述するように連続する少なくとも１５塩基の長さを有するものであればよいが、具体的にはマーカーの用途に応じて、長さを適宜選択し設定することができる。
（３−２）プローブまたはプライマーとしてのポリヌクレオチド
本発明において炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の検出（診断）は、被験者の生体組織、特に大腸組織等におけるＣＤ８１遺伝子の発現の有無または発現レベル（発現量）を評価することによって行われる。この場合、上記本発明の疾患マーカーは、上記遺伝子の発現によって生じたＲＮＡまたはそれに由来するポリヌクレオチドを特異的に認識し増幅するためのプライマーとして、または該ＲＮＡまたはそれに由来するポリヌクレオチドを特異的に検出するためのプローブとして利用することができる。
本発明疾患マーカーを炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の検出（遺伝子診断）においてプライマーとして用いる場合には、通常１５ｂｐ〜１００ｂｐ、好ましくは１５ｂｐ〜５０ｂｐ、より好ましくは１５ｂｐ〜３５ｂｐの塩基長を有するものが例示できる。また検出プローブとして用いる場合には、通常１５ｂｐ〜全配列の塩基数、好ましくは１５ｂｐ〜１ｋｂ、より好ましくは１００ｂｐ〜１ｋｂの塩基長を有するものが例示できる。
本発明の疾患マーカーは、ノーザンブロット法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダーゼーション法などといった、特定遺伝子を特異的に検出する公知の方法において、常法に従ってプライマーまたはプローブとして利用することができる。該利用によって炎症性腸疾患（ＩＢＤ）におけるＣＤ８１遺伝子の発現の有無または発現レベル（発現量）を評価することができる。
測定対象試料としては、使用する検出方法の種類に応じて、被験者の大腸組織の一部をバイオプシ等で採取するか、若しくは腸管洗浄液等から回収し、そこから常法に従って調製したｔｏｔａｌ  ＲＮＡを用いてもよいし、さらに該ＲＮＡをもとにして調製される各種のポリヌクレオチドを用いてもよい。
また、生体組織におけるＣＤ８１遺伝子の遺伝子発現レベルは、ＤＮＡチップを利用して検出あるいは定量することができる。この場合、本発明の疾患マーカーは当該ＤＮＡチップのプローブとして使用することができる（例えば、アフィメトリックス社のＧｅｎｅ  Ｃｈｉｐ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｕ９５  Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅの場合、２５ｂｐの長さのポリヌクレオチドプローブとして用いられる）。かかるＤＮＡチップを、生体組織から採取したＲＮＡをもとに調製される標識ＤＮＡまたはＲＮＡとハイブリダイズさせ、該ハイブリダイズによって形成された上記プローブ（本発明疾患マーカー）と標識ＤＮＡまたはＲＮＡとの複合体を、該標識ＤＮＡまたはＲＮＡの標識を指標として検出することにより、生体組織中での本発明遺伝子の発現の有無または発現レベル（発現量）が評価できる。
上記ＤＮＡチップは、ＣＤ８１遺伝子と結合し得る１種または２種以上の本発明疾患マーカーを含んでいれば良い。複数の疾患マーカーを含むＤＮＡチップの利用によれば、ひとつの生体試料について、同時に複数の遺伝子の発現の有無または発現レベルの評価が可能である。
本発明の疾患マーカーは、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の診断、検出（罹患の有無や罹患の程度の診断）に有用である。具体的には、該疾患マーカーを利用した炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の診断は、被験者の生体組織と正常者の生体組織におけるＣＤ８１遺伝子の遺伝子発現レベルの違いを判定することによって行うことができる。この場合、遺伝子発現レベルの違いには、発現のある／なしの違いだけでなく、被験者の生体組織と正常者の生体組織の両者ともに発現がある場合でも、両者間の発現量の格差が２倍以上、好ましくは３倍以上の場合が含まれる。
具体的にはＣＤ８１遺伝子が、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）惹起性細胞において、ＩＢＤ非惹起性細胞と比較して有意に発現上昇しているので、被験者の生体組織で発現しており、該発現量が正常者の生体組織の発現量と比べて２倍以上、好ましくは３倍以上多ければ、被験者について炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の罹患が疑われる。
（３−３）抗体
本発明は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の疾患マーカーとして、ＣＤ８１遺伝子の発現産物（タンパク質）（これを本明細書においては「ＣＤ８１」ともいう）を特異的に認識することのできる抗体を提供する。
当該抗体として、具体的には、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するＣＤ８１タンパク質を特異的に認識することのできる抗体を挙げることができる。前記（２−１）項に記載の抗体を用いることもできる。
本発明は、前述するように、ＣＤ８１遺伝子がＩＢＤ惹起性細胞においてＩＢＤ非惹起性細胞と比較して有意に発現上昇しているという知見を発端に、この遺伝子の発現産物（タンパク質）の有無やその発現の程度を検出することによって上記炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の罹患の有無や罹患の程度が特異的に検出でき、該疾患の診断を正確に行うことができるという発想に基づくものである。
上記抗体は、従って、被験者における上記タンパク質の発現の有無またはその程度を検出することによって、該被験者が炎症性腸疾患（ＩＢＤ）に罹患しているか否かまたはその疾患の程度を診断することのできるツール（疾患マーカー）として有用である。
また上記抗体は、前述の（１−２）項に記載するような炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の予防、改善または治療に有用な候補物質のスクリーニングにおいて、ＣＤ８１の発現変動を検出するためのスクリーニングツール（疾患マーカー）としても有用である。
ヒト由来のＣＤ８１も公知のタンパク質であり、その取得方法についても文献（ＢＲＥＮ  ＤＡＮ  Ｊ．ＣＬＡＳＳＯＮら，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ，１６９，１４９７−１５０２，１９８９）に記載されるように公知である。
本発明の抗体は、その形態に特に制限はなく、ＣＤ８１を免疫抗原とするポリクローナル抗体であっても、またそのモノクローナル抗体であってもよい。さらにこれら本発明タンパク質のアミノ酸配列のうち少なくとも連続する、通常８アミノ酸、好ましくは１５アミノ酸、より好ましくは２０アミノ酸からなるポリペプチドに対して抗原結合性を有する抗体も、本発明の抗体に含まれる。
これらの抗体の製造方法は、すでに周知であり、本発明の抗体もこれらの常法に従って製造することができる（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １１．１２〜１１．１３（２０００））。具体的には、本発明の抗体がポリクローナル抗体の場合には、常法に従って大腸菌等で発現し精製したＣＤ８１を用いて、あるいは常法に従ってこれら本発明タンパク質の部分アミノ酸配列を有するオリゴペプチドを合成して、家兎等の非ヒト動物に免疫し、該免疫動物の血清から常法に従って得ることが可能である。一方、モノクローナル抗体の場合には、常法に従って大腸菌等で発現し精製したＣＤ８１、あるいはこれらタンパク質の部分アミノ酸配列を有するオリゴペプチドをマウス等の非ヒト動物に免疫し、得られた脾臓細胞と骨髄腫細胞とを細胞融合させて調製したハイブリドーマ細胞の中から得ることができる（Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｅｄｉｔ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｐｕｂｌｉｓｈ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ．Ｓｅｃｔｉｏｎ  １１．４〜１１．１１）。
抗体の作製に免疫抗原として使用されるＣＤ８１は公知のタンパク質であり、例えば前記（１−３）項に記載したように、本発明により提供される遺伝子の配列情報（配列番号：１）に基づいて、ＤＮＡクローニング、各プラスミドの構築、宿主へのトランスフェクション、形質転換体の培養および培養物からのタンパク質の回収の操作により得ることができる。これらの操作は、当業者に既知の方法、あるいは文献記載の方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＣＳＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８３），ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ＤＭ．Ｇｌｏｖｅｒ，ＩＲＬ  ＰＲＥＳＳ（１９８５））などに準じて行うことができる。
また、ＣＤ８１の部分ペプチドは、本発明により提供されるアミノ酸配列の情報（配列番号：２）に従って、一般的な化学合成法（ペプチド合成）によって製造することもできる。
なお、本発明のＣＤ８１には、配列番号：２に示す各アミノ酸配列に関わるタンパク質のみならず、その相同物も包含される。該相同物としては、上記配列番号：２で示されるアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、且つ改変前の元のタンパク質と免疫学的に同等の活性を有するタンパク質を挙げることができる。
ここで同等の免疫学的活性を有するタンパク質としては、適当な動物あるいはその細胞において特定の免疫反応を誘発し、かつＣＤ８１に対する抗体と特異的に結合する能力を有するタンパク質を挙げることができる。
なお、タンパク質におけるアミノ酸の変異数や変異部位は、その免疫学的活性が保持される限り制限はない。免疫学的活性を喪失することなくアミノ酸残基が、どのように、何個置換、挿入あるいは欠失されればよいかを決定する指標は、当業者に周知のコンピュータプログラム、例えばＤＮＡ  Ｓｔａｒ  ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて見出すことができる。例えば変異数は、典型的には、全アミノ酸の１０％以内であり、好ましくは全アミノ酸の５％以内であり、さらに好ましくは全アミノ酸の１％以内である。また置換されるアミノ酸は、置換後に得られるタンパク質がＣＤ８１と同等の免疫学的活性を保持している限り、特に制限されないが、タンパク質の構造保持の観点から、残基の極性、電荷、可溶性、疎水性、親水性並びに両親媒性など、置換前のアミノ酸と似た性質を有するアミノ酸であることが好ましい。例えば、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ及びＴｒｐは互いに非極性アミノ酸に分類されるアミノ酸であり、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ及びＧｌｎは互いに非荷電性アミノ酸に分類されるアミノ酸であり、Ａｓｐ及びＧｌｕは互いに酸性アミノ酸に分類されるアミノ酸であり、またＬｙｓ、Ａｒｇ及びＨｉｓは互いに塩基性アミノ酸に分類されるアミノ酸である。ゆえに、これらを指標として同群に属するアミノ酸を適宜選択することができる。
本発明抗体は、また、ＣＤ８１の部分アミノ酸配列を有するオリゴペプチドを用いて調製されるものであってよい。かかる抗体の製造のために用いられるオリゴ（ポリ）ペプチドは、機能的な生物活性を有することは要しないが、ＣＤ８１と同様な免疫原特性を有するものであることが望ましい。好ましくはこの免疫原特性を有し、且つＣＤ８１のアミノ酸配列において少なくとも連続する８アミノ酸、好ましくは１５アミノ酸、より好ましくは２０アミノ酸からなるオリゴ（ポリ）ペプチドを例示することができる。
かかるオリゴ（ポリ）ペプチドに対する抗体の製造は、宿主に応じて種々のアジュバントを用いて免疫学的反応を高めることによって行うこともできる。限定はされないが、そのようなアジュバントには、フロイントアジュバント、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル、並びにリゾレシチン、プルロニックポリオル、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン及びジニトロフェノールのような表面活性物質、ＢＣＧ（カルメット−ゲラン桿菌）やコリネバクテリウム−パルヴムなどのヒトアジュバントが含まれる。
本発明の抗体は、ＣＤ８１に特異的に結合する性質を有することから、該抗体を利用することによって、被験者の組織内に発現した上記タンパク質を特異的に検出することができる。すなわち、当該抗体は被験者の組織内におけるＣＤ８１のタンパク発現の有無を検出するためのプローブとして有用である。
具体的には、被験者の大腸組織の一部をバイオプシ等で採取、もしくは腸管洗浄液等から回収し、そこから常法に従って調製した組織抽出物やタンパク質を用いて、例えばウェスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ法など公知の検出方法において、本発明抗体を常法に従ってプローブとして使用することによって、ＣＤ８１を検出することができる。
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の診断に際しては、被験者の生体組織におけるＣＤ８１と正常な生体組織におけるこのタンパク質との量の違いを判定すればよい。この場合、タンパク量の違いには、タンパクのある／なし、あるいはタンパク量の違いが２倍以上、好ましくは３倍以上の場合が含まれる。具体的には、ＣＤ８１遺伝子が、ＩＢＤ惹起性細胞においてＩＢＤ非惹起性細胞と比較して発現が増加しているので、被験者の前記生体組織においてＣＤ８１が存在しており、該量が正常な生体組織での量と比べて２倍以上、好ましくは３倍以上多いことが判定されれば、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の罹患が疑われる。
（４）炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の検出方法（診断方法）
本発明は、前述した本発明疾患マーカーを利用した炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の検出方法（診断方法）を提供するものである。
具体的には、本発明の検出方法（診断方法）は、被験者の大腸組織の一部をバイオプシ等で採取するか、もしくは腸管洗浄液等から回収し、そこに含まれる炎症性腸疾患（ＩＢＤ）に関連するＣＤ８１遺伝子の遺伝子発現レベル、およびこの遺伝子に由来するタンパク質（ＣＤ８１）を検出し、その発現量またはそのタンパク質量を測定することにより、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の罹患の有無またはその程度を検出（診断）するものである。また本発明の検出（診断）方法は、例えば炎症性腸疾患（ＩＢＤ）患者において、該疾患の改善のために治療薬を投与した場合における、該疾患の改善の有無またはその程度を検出（診断）することもできる。
本発明の検出方法は次の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の工程を含むものである：
（ａ）被験者の生体試料と本発明の疾患マーカーを接触させる工程、
（ｂ）生体試料中のＣＤ８１遺伝子の遺伝子発現レベル、またはＣＤ８１のタンパク質の量を、上記疾患マーカーを指標として測定する工程、
（ｃ）（ｂ）の結果をもとに、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の罹患を判断する工程。
ここで用いられる生体試料としては、被験者の生体組織（大腸組織及びその周辺組織など）から調製される試料を挙げることができる。具体的には、該組織から調製されるＲＮＡ含有試料、若しくはそれからさらに調製されるポリヌクレオチドを含む試料、または上記組織から調製されるタンパク質を含む試料を挙げることができる。かかるＲＮＡ、ポリヌクレオチドまたはタンパク質を含む試料は、被験者の大腸組織の一部をバイオプシ等で採取するか、もしくは腸管洗浄液等から回収し、そこから常法に従って調製することができる。
本発明の診断方法は、測定対象として用いる生体試料の種類に応じて、具体的には下記のようにして実施される。
（４−１）測定対象の生体試料としてＲＮＡを利用する場合
測定対象物としてＲＮＡを利用する場合、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の検出は、具体的に下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む方法によって実施することができる：
（ａ）被験者の生体試料から調製されたＲＮＡまたはそれから転写された相補的ポリヌクレオチドと、前記本発明の疾患マーカー（ＣＤ８１遺伝子の塩基配列において連続する少なくとも１５塩基を有するポリヌクレオチド及び／又は該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド）とを結合させる工程、
（ｂ）該疾患マーカーに結合した生体試料由来のＲＮＡまたは該ＲＮＡから転写された相補的ポリヌクレオチドを、上記疾患マーカーを指標として測定する工程、
（ｃ）上記（ｂ）の測定結果に基づいて、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の罹患を判断する工程。
測定対象物としてＲＮＡを利用する場合は、本発明の検出方法（診断方法）は、該ＲＮＡ中のＣＤ８１遺伝子の発現レベルを検出し、測定することによって実施される。具体的には、前述のポリヌクレオチドからなる本発明の疾患マーカー（ＣＤ８１遺伝子の塩基配列において連続する少なくとも１５塩基を有するポリヌクレオチド及び／又はその相補的なポリヌクレオチド）をプライマーまたはプローブとして用いて、ノーザンブロット法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＤＮＡチップ解析法、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション解析法などの公知の方法を行うことにより実施できる。
ノーザンブロット法を利用する場合は、本発明の上記疾患マーカーをプローブとして用いることによって、ＲＮＡ中のＣＤ８１遺伝子の発現の有無やその発現レベルを検出、測定することができる。具体的には、本発明の疾患マーカー（相補鎖）を放射性同位元素（３２Ｐ、３３Ｐなど：ＲＩ）や蛍光物質などで標識し、それを、常法に従ってナイロンメンブレン等にトランスファーした被験者の生体組織由来のＲＮＡとハイブリダイズさせた後、形成された疾患マーカー（ＤＮＡ）とＲＮＡとの二重鎖を、疾患マーカーの標識物（ＲＩ若しくは蛍光物質）に由来するシグナルを放射線検出器（ＢＡＳ−１８００ＩＩ、富士フィルム社製）または蛍光検出器で検出、測定する方法を例示することができる。また、ＡｌｋＰｈｏｓ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用いて、該プロトコールに従って疾患マーカー（プローブＤＮＡ）を標識し、被験者の生体組織由来のＲＮＡとハイブリダイズさせた後、疾患マーカーの標識物に由来するシグナルをマルチバイオイメージャーＳＴＯＲＭ８６０（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）で検出、測定する方法を使用することもできる。
ＲＴ−ＰＣＲ法を利用する場合は、本発明の上記疾患マーカーをプライマーとして用いることによって、ＲＮＡ中のＣＤ８１遺伝子の発現の有無や発現レベルを検出、測定することができる。具体的には、被験者の生体組織由来のＲＮＡから常法に従ってｃＤＮＡを調製して、これを鋳型として標的のＣＤ８１遺伝子の領域が増幅できるように、本発明の疾患マーカーから調製した一対のプライマー（上記ｃＤＮＡ（−鎖）に結合する正鎖、＋鎖に結合する逆鎖）をこれとハイブリダイズさせて、常法に従ってＰＣＲ法を行い、得られた増幅二本鎖ＤＮＡを検出する方法を例示することができる。なお、増幅された二本鎖ＤＮＡの検出は、上記ＰＣＲを予めＲＩや蛍光物質で標識しておいたプライマーを用いて行うことによって産生される標識二本鎖ＤＮＡを検出する方法、産生された二本鎖ＤＮＡを常法に従ってナイロンメンブレン等にトランスファーさせて、標識した疾患マーカーをプローブとして使用してこれとハイブリダイズさせて検出する方法などを用いることができる。なお、生成された標識二本鎖ＤＮＡ産物はアジレント２１００バイオアナライザ（横河アナリティカルシステムズ社製）などで測定することができる。また、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）で該プロトコールに従ってＲＴ−ＰＣＲ反応液を調製し、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）で反応させて、該反応物を検出することもできる。
ＤＮＡチップ解析を利用する場合は、本発明の上記疾患マーカーをＤＮＡプローブ（１本鎖または２本鎖）として貼り付けたＤＮＡチップを用意し、これに被験者の生体組織由来のＲＮＡから常法によって調製されたｃＲＮＡとハイブリダイズさせて、形成されたＤＮＡとｃＲＮＡとの二本鎖を、本発明の疾患マーカーから調製される標識プローブと結合させて検出する方法を挙げることができる。また、上記ＤＮＡチップとして、ＣＤ８１遺伝子の遺伝子発現レベルの検出、測定が可能なＤＮＡチップを用いることもできる。かかる遺伝子の発現レベルを検出、測定することができるＤＮＡチップとしては、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社のＧｅｎｅ  Ｃｈｉｐ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｕ９５  Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅを挙げることができる。かかるＤＮＡチップを用いた、被験者ＲＮＡ中のＣＤ８１遺伝子の遺伝子発現レベルの検出、測定については、実施例において詳細に説明する。
（４−２）測定対象の生体試料としてタンパク質を用いる場合
測定対象物としてタンパク質を用いる場合は、本発明の炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の検出方法（診断方法）は、生体試料中のＣＤ８１を検出し、その量を測定することによって実施される。具体的には下記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を含む方法によって実施することができる：
（ａ）被験者の生体試料から調製されたタンパク質と抗体に関する本発明の疾患マーカー（ＣＤ８１を認識する抗体）とを結合させる工程、
（ｂ）該疾患マーカーに結合した生体試料由来のタンパク質を、上記疾患マーカーを指標として測定する工程、
（ｃ）上記（ｂ）の測定結果に基づいて、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の罹患を判断する工程。
より具体的には、抗体に関する本発明の疾患マーカーとして抗体（ＣＤ８１を認識する抗体）を用いて、ウエスタンブロット法などの公知方法で、ＣＤ８１を検出、定量する方法を挙げることができる。
ウエスタンブロット法は、一次抗体として本発明疾患マーカーを用いた後、二次抗体として１２５Ｉなどの放射性同位元素、蛍光物質、ホースラディッシュペルオキシターゼ（ＨＲＰ）などの酵素等で標識した標識抗体（一次抗体に結合する抗体）を用い、得られる標識化合物の放射性同位元素、蛍光物質などに由来するシグナルを放射線測定器（ＢＡＳ−１８００ＩＩ：富士フィルム社製など）、蛍光検出器などで検出し、測定することによって実施できる。また、一次抗体として本発明疾患マーカーを用いた後、ＥＣＬ  Ｐｌｕｓ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（アマシャム  ファルマシアバイオテク社製）を用いて、該プロトコールに従って検出し、マルチバイオイメージャーＳＴＯＲＭ８６０（アマシャム  ファルマシアバイオテク社製）で測定することもできる。
なお、上記において測定対象とするＣＤ８１の機能（活性）は、既に知られており、該タンパク質の量と機能乃至活性とは一定の相関関係を有している。従って、上記タンパク質の量の測定に代えて、該タンパク質の機能（活性）の測定を行うことによっても、本発明の炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の検出（診断）を実施することができる。すなわち本発明は、ＣＤ８１の公知の機能（活性）を指標として、これを公知の方法（具体的には前述の（１−３）項を参照）に従って測定、評価することからなる、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の検出（診断）方法をも包含する。
（４−３）炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の診断
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の診断は、被験者の生体組織（大腸組織など）におけるＣＤ８１遺伝子の遺伝子発現レベル、もしくはこれらの遺伝子の発現産物であるタンパク質（ＣＤ８１）の量、機能若しくは活性（以下これらを合わせて「タンパク質レベル」ということがある）を、正常な生体組織（大腸組織など）における当該遺伝子発現レベルまたは当該タンパク質レベルと比較し、両者の違いを判定することによって行うことができる。
この場合、正常な生体組織から採取調製した生体試料（ＲＮＡまたはタンパク質を含む試料）が必要であるが、これらは炎症性腸疾患（ＩＢＤ）に罹患していない人の生体組織（大腸組織など）をバイオプシ等で採取するか、もしくは腸管洗浄液等から回収することによって取得することができる。なお、ここでいう「炎症性腸疾患（ＩＢＤ）に罹患していない人」とは、少なくとも炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の自覚症状がなく、好ましくは他の検査方法、例えば内視鏡検査や、注腸Ｘ腺検査、消化管の生検などの結果、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）でないと診断された人をいう。なお、当該「炎症性腸疾患（ＩＢＤ）に罹患していない人」を以下、本明細書では単に正常者という場合もある。
被験者の生体組織と正常な生体組織（炎症性腸疾患（ＩＢＤ）に罹患していない人の生体組織）との遺伝子発現レベルまたはタンパク質の量（レベル）の比較は、被験者の生体試料と正常者の生体試料を対象とした測定を並行して行うことで実施できる。並行して行わない場合は、複数（少なくとも２つ、好ましくは３以上、より好ましくは５以上）の正常な生体組織を用いて均一な測定条件で測定して得られたＣＤ８１遺伝子の遺伝子発現レベル、若しくはこれらの遺伝子の発現産物であるタンパク質（ＣＤ８１）の量（レベル）の平均値または統計的中間値を、正常者の遺伝子発現レベル若しくはタンパク質の量として、比較に用いることができる。
被験者が炎症性腸疾患（ＩＢＤ）であるかどうかの判断は、該被験者の生体組織におけるＣＤ８１遺伝子の遺伝子発現レベル、またはその発現産物であるタンパク質レベルが、正常者のそれらのレベルと比較して２倍以上、好ましくは３倍以上多いことを指標として行うこともできる。
また、被験者のＣＤ８１遺伝子の遺伝子発現レベルまたはタンパク質レベルが、正常者のそれらのレベルに比べて多ければ、該被験者は炎症性腸疾患（ＩＢＤ）であると判断できるか、該疾患の罹患が疑われる。
次に、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。しかし、本発明はこれらの実施例になんら限定されるものではない。
【実施例】［実施例１］
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）病態惹起性細胞の調製
２，４，６−Ｔｒｉｎｉｔｒｏｂｅｎｚｅｎｅ  ｓｕｌｐｈｏｎｉｃ  ａｃｉｄ（ＴＮＢＳ）誘発ＩＢＤ動物モデルはＧａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、９６巻、７９５−８０３頁（１９８９）等に記載の方法を参考にして作製することができる。
（１）感作液の作成
０．５ｇ卵白アルブミン（Ｓｉｇｍａ社製）と０．５ｇ  Ｋ２ＣＯ３（ナカライテスク社製）を２５ｍｌ注射用蒸留水に溶解した（卵白アルブミン溶液）。２５ｍｌの０．１Ｍ  Ｋ２ＣＯ３に０．５ｇ  ＴＮＢＳ（ナカライテスク社製）を溶解した（ＴＮＢＳ溶液）。卵白アルブミン溶液とＴＮＢＳ溶液を混合し、室温で一晩攪拌した。攪拌した溶液を透析膜（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  ＭＷＣＯ：１０，０００、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．社製）で０．０１Ｍ  ＮａＨＣＯ３（ナカライテスク社製）に透析した。透析した溶液をＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｉｅｒｃｅ社製）でタンパク定量した。２ｍｇ／ｍｌ溶液を感作液として冷凍保存し使用時に溶解して用いた。
（２）ＴＮＢＳ誘発炎症性腸疾患モデル
４−６週齢のＳＪＬ／Ｊマウス（日本チャールズリバー社から購入した）背部に完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ：Ｄｉｆｃｏ社製）と２ｍｇ／ｍｌ感作液を乳化液として、０．１ｍｌ／ｈｅａｄで皮下注射（感作）した。感作７日後に１０ｍｇ／ｍｌ  ＴＮＢＳ  ５０％エタノール（ナカライテスク社製）溶液をエーテル麻酔下で直腸内投与（０．２ｍｌ／ｈｅａｄを肛門より３ｃｍまでゾンデを挿入して注入：チャレンジ）し大腸炎症状は便の状態（正常便（スコアー：０）、軟便（スコアー：１）、下痢（スコアー：２））でスコアー判定し、大腸炎を発症しているマウスをチャレンジ６日後に安楽死させ、脾臓と腸間膜リンパ節を摘出した。
（３）細胞培養
腸間膜リンパ節細胞と溶血剤処理した脾臓細胞を培養フラスコ（７５Ｔフラスコ；岩城硝子社製）に１０％胎児牛血清（ＢＩＯＷＨＩＴＴＡＫＥＲ社製）、１％Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ含有Ｄ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）中で１０８個播種し、以下の３種類の条件下で４８時間細胞培養した。細胞培養は５％ＣＯ２、３７℃でＣＯ２インキュベーター内で行い、培養後の細胞を回収し、ＴＲＩＺＯＬ（ＬＩＦＥ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥ社製）で溶解し−８０℃で保存した。なお、化合物Ａとは、ＩＢＤ動物モデルに投与して大腸炎を治癒する活性とＩＢＤ惹起能を抑制する活性を有する化合物で特開２００２−１６１０８４に記載の化合物、３−ｃｈｌｏｒｏ−２−［１−（４−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎ−４−ｙｌｐｈｅｎｙｌ）ｃｙｃｌｏｂｕｔｙｌ］−４，５，６，７−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｐｙｒａｚｏｌｏ［１，５−ａ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅである。
Ａ：添加剤なし
Ｂ：０．２μｇ／ｍｌ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｃｏｃａｌ  ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ  Ｂ（Ｓｉｇｍａ社製）添加
Ｃ：０．２μｇ／ｍｌ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｃｏｃａｌ  ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ  Ｂ（Ｓｉｇｍａ社製）と化合物Ａ１０μＭ添加）
条件ＡとＣの細胞は、正常マウスに移入しても、正常マウスが腸炎症状を引き起こさないＩＢＤ非惹起細胞であるが、条件Ｂの細胞は、正常マウスに移入する事で腸炎症状を引き起こすＩＢＤ惹起細胞である。つまり、Ａ、Ｃの細胞に対するＢの細胞の遺伝子変化を検出することで大腸炎の病態を惹起する原因因子を見出すことができる。
［実施例２］
ＩＢＤ惹起細胞およびＩＢＤ非惹起細胞のＤＮＡチップ利用による遺伝子発現解析
（１）トータルＲＮＡからｃＤＮＡの調製
実施例１で得られたＴＲＩＺＯＬ抽出液から添付プロトコールに従いトータルＲＮＡを調製した。このトータルＲＮＡをＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）で精製した後に、以下のｃＤＮＡ合成を行った。５００ｎｇのトータルＲＮＡからＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  Ｃｈｏｉｃｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン社製）を利用してｃＤＮＡを合成した。ただし、プライマーには１００ｐｍｏｌのＴ７−（２４）ｄＴプライマー（アマシャムファルマシアバイオテック社製）を用いた。合成したｃＤＮＡをＤＮＡ精製カラム（キアゲン社製）で精製し、エタノール沈殿で濃縮した後、当該ｃＤＮＡを鋳型にｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写（ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ  Ｔ７  Ｋｉｔ：アンビオン社製）によりｃＲＮＡを合成した。ｃＲＮＡをＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）で精製し、このｃＲＮＡをもとに再度ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  Ｃｈｏｉｃｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン社製）を利用してｃＤＮＡを合成した。この２回目のｃＤＮＡ合成では、ファーストストランド（センス）合成時のプライマーにランダムヘキサマーを、セカンドストランド（アンチセンス）合成時にＴ７−（２４）ｄＴプライマーを用いた（注：ｃＲＮＡ＝アンチセンス）。合成したｃＤＮＡをＤＮＡ精製カラムで精製後、濃度を測定した。以上の操作により実施例１で調製した各トータルＲＮＡから、各ｃＤＮＡを取得した。
（２）ｃＤＮＡからラベル化ｃＲＮＡの調製
各ｃＤＮＡ２００ｎｇ相当量に、ＤＥＰＣ処理水を加え２２μＬとし、ＢｉｏＡｒｒａｙ  Ｈｉｇｈ  Ｙｉｅｌｄ  ＲＮＡ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＥＮＺＯ社製）に含まれる１０×ＨＹ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  ４μＬ、該キットに含まれる１０×Ｂｉｏｔｉｎ  Ｌａｂｅｌｅｄ  Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ４μＬ、該キットに含まれる１０×ＤＴＴ  ４μＬ、該キットに含まれる１０×ＲＮａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｍｉｘ  ４μＬ、該キットに含まれる２０×Ｔ７  ＲＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ２μＬを混合し、３７℃で５時間反応させて、ラベル化ｃＲＮＡを調製した。反応後、該反応液にＤＥＰＣ処理水６０μＬを加えたのち、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＧＩＡＧＥＮ社製）を用いて添付プロトコールに従い、調製したラベル化ｃＲＮＡを精製した。
（３）ラベル化ｃＲＮＡのフラグメント化
各ラベル化ｃＲＮＡ  ２０μｇを含む溶液に、５×Ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（２００ｍＭトリス−酢酸  ｐＨ８．１（Ｓｉｇｍａ社製）、５００ｍＭ酢酸カリウム（Ｓｉｇｍａ社製）、１５０ｍＭ酢酸マグネシウム（Ｓｉｇｍａ社製））８μＬを加えた反応液４０μＬを、９４℃で３５分間加熱した後、氷中に置いた。これによって、ラベル化ｃＲＮＡをフラグメント化した。
（４）フラグメント化ｃＲＮＡとプローブアレイとのハイブリダイズ
各フラグメント化ｃＲＮＡ  ４０μＬに、５ｎＭ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｏｌｉｇｏ  Ｂ２（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）４μＬ、１００×Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｃＲＮＡ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ  ４μＬ、Ｈｅｒｒｉｎｇ  ｓｐｅｒｍ  ＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）４０μｇ、Ａｃｅｔｙｌａｔｅｄ  ＢＳＡ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社製）２００μｇ、２×ＭＥＳ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（２００ｍＭ  ＭＥＳ、２Ｍ［Ｎａ＋］，４０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０（Ｐｉｅｒｃｅ社製）、ｐＨ６．５〜６．７）２００μＬ、及びＤＥＰＣ処理水１４４μＬを混合し、４００μＬのハイブリカクテルを得た。得られた各ハイブリカクテルを９９℃で５分間加熱し、更に４５℃で５分間加熱した。加熱後、室温で１４，０００ｒｐｍ、５分間遠心分離し、ハイブリカクテル上清を得た。
一方、１×ＭＥＳハイブリダイゼーションバッファーで満たしたＨｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｅ  Ｕ９５プローブアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）を、ハイブリオーブン内で、４５℃、６０ｒｐｍで１０分間回転させた後、１×ＭＥＳハイブリダイゼーションバッファーを除去してプローブアレイを調製した。上記で得られたハイブリカクテル上清２００μＬを該プローブアレイにそれぞれ添加し、ハイブリオーブン内で４５℃、６０ｒｐｍで１６時間回転させ、フラグメント化ｃＲＮＡとハイブリダイズしたプロープアレイを得た。
（５）プローブアレイの染色
上記で得られたハイブリダイズ済みプローブアレイそれぞれからハイブリカクテルを回収除去した後、Ｎｏｎ−Ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ  Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒ（６×ＳＳＰＥ（２０×ＳＳＰＥ（ナカライテスク社製）を希釈）、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０、０．００５％Ａｎｔｉｆｏａｍ０−３０（Ｓｉｇｍａ社製））で満たした。次にＮｏｎ−Ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ  Ｗａｓｈ  ＢｕｆｆｅｒおよびＳｔｒｉｎｇｅｎｔ  Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ  ＭＥＳ、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０）をセットしたＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｆｌｕｉｄｉｃｓ  Ｓｔａｔｉｏｎ４００（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）の所定の位置にフラグメント化ｃＲＮＡとハイブリダイズしたプローブアレイを装着した。その後染色プロトコールＥｕＫＧＥ−ＷＳ２に従って、１次染色液（１０μｇ／ｍＬ  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ（ＳＡＰＥ）（ＭｏｌｅｃμＬａｒ  Ｐｒｏｂｅ社製）、２ｍｇ／ｍＬ  Ａｃｅｔｙｌａｔｅｄ  ＢＳＡ、１００ｍＭ  ＭＥＳ、１Ｍ  ＮａＣｌ（Ａｍｂｉｏｎ社製）、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、０．００５％Ａｎｔｉｆｏａｍ０−３０）、２次染色液（１００μｇ／ｍＬ  Ｇｏａｔ  ＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ社製）、３μｇ／ｍＬ  Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ  Ａｎｔｉ−Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）、２ｍｇ／ｍＬ  Ａｃｅｔｙｌａｔｅｄ  ＢＳＡ、１００ｍＭ  ＭＥＳ、１Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、０．００５％Ａｎｔｉｆｏａｍ０−３０）により染色した。
（６）プローブアレイのスキャン、及び（７）遺伝子発現量解析
染色した各プローブアレイをＨＰ  ＧｅｎｅＡｒｒａｙ  Ｓｃａｎｎｅｒ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）に供し、染色パターンを読み取った。染色パターンをもとにＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）によってプローブアレイ上の遺伝子の発現を解析した。次に、解析プロトコールに従ってＮｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎを行ったのち、各サンプルにおける各プローブ（各遺伝子）の発現量（ａｖｅｒａｇｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ）を算出した。同一のプローブにつき、サンプルの種類ごとに遺伝子発現量の平均値を求め、さらに各サンプル種類間における発現量の変化率を求めた。
［実施例３］
発現変動解析
実施例２で行ったＤＮＡチップ解析による遺伝子発現の解析結果から、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｃｏｃａｌ  ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ  Ｂ（以下「ＳＥＢ」と略する場合もある。）を添加しない炎症性腸疾患（ＩＢＤ）非惹起細胞に比べて、ＳＥＢを添加した炎症性腸疾患（ＩＢＤ）惹起細胞において発現が増加あるいは減少しているプローブセットを最初に選び出した。
その中から、ＳＥＢで刺激したＩＢＤ惹起細胞と比して、ＳＥＢと化合物Ａを添加したＩＢＤ非惹起細胞で発現が減少あるいは増加している４８６プローブを選択した。
次にこれら４８６プローブの中から、より病態との関連性の高いプローブを選択する目的で、免疫・炎症関連遺伝子、細胞表面分子、成長因子遺伝子である５６プローブを選び出した。さらにこれら５６プローブの中からＩＢＤの病態に関与し、解析した細胞の中に含まれる細胞集団の変動に限局することで薬剤ターゲットとなる機能を有する遺伝子を選別した。
その結果、ＩＬ−１７遺伝子、ＩＬ−９遺伝子、Ｌｙｍｐｈｏｔｏｘｉｎα遺伝子、ＩＬ−１０  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  β遺伝子、ＤＡＰ１２遺伝子、ＴＣＲ  Ｖγ４遺伝子、Ｉｎｔｅｇｒｉｎβ１遺伝子、ＣＤ８１遺伝子、ＣＤｗ４０遺伝子およびＰａｉｒｅｄ−Ｉｇ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ａ１遺伝子の、計１０遺伝子が選択された（表１）。
無刺激で培養したＩＢＤ非惹起細胞は、ＳＥＢ刺激をすることにより病態惹起能が亢進してＩＢＤ惹起細胞となるが、このＩＢＤ惹起細胞に化合物Ａを添加すると病態惹起能が抑制されてＩＢＤ非惹起細胞となる。そのため、ＳＥＢ刺激で遺伝子発現量が増加し、当該化合物を添加することにより遺伝子発現量が減少したＩＬ−１７遺伝子、ＩＬ−９遺伝子、ＴＣＲ  Ｖγ４遺伝子、ＣＤ８１遺伝子およびＣＤｗ４０遺伝子は（表１）、炎症性腸疾患を反映した疾患マーカーとして応用可能な遺伝子であると考えられ、これらの遺伝子の発現あるいはこれらの遺伝子によりコードされるタンパクの発現や機能（活性）を減少させることで炎症性腸疾患の発症や病態の進行を抑制あるいは改善することができると考えられた。また、ＳＥＢ刺激で遺伝子発現量が減少し、当該化合物を添加することにより遺伝子発現量が増加したＬｙｍｐｈｏｔｏｘｉｎα遺伝子、ＩＬ−１０  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  β遺伝子、ＤＡＰ１２遺伝子、Ｉｎｔｅｇｒｉｎβ１遺伝子およびＰａｉｒｅｄ−Ｉｇ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ａ１遺伝子についても（表１）、炎症性腸疾患を反映した疾患マーカーとして応用可能な遺伝子であると考えられ、これらの遺伝子の発現あるいはこれらの遺伝子によりコードされるタンパクの発現や機能（活性）を増加させることで炎症性腸疾患の発症や病態の進行を抑制あるいは改善することができると考えられた。表中において、「Ｃｏｎｔ」は添加剤なしの細胞、「ＳＥＢ」はＳＥＢ添加した細胞、「ＳＥＢ＋化合物」はＳＥＢと化合物Ａを添加した細胞のＧｅｎｅ  ｃｈｉｐ解析結果を表わしている。
0004749861.tif 000002
［実施例４］
細胞内ＩＦＮ−γに対する化合物Ａの作用
実施例３で選出した１０遺伝子（ＩＬ−１７遺伝子、ＩＬ−９遺伝子、Ｌｙｍｐｈｏｔｏｘｉｎα遺伝子、ＩＬ−１０  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  β遺伝子、ＤＡＰ１２遺伝子、ＴＣＲ  Ｖγ４遺伝子、Ｉｎｔｅｇｒｉｎβ１遺伝子、ＣＤ８１遺伝子、ＣＤｗ４０遺伝子およびＰａｉｒｅｄ−Ｉｇ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ａ１遺伝子）の他に炎症性腸疾患の病原因子として既知であるインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ：Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ  １８２：１２８１−１２９０（１９９５））も、ＤＮＡチップ解析による遺伝子発現の解析結果では、ＳＥＢを添加しないＩＢＤ非惹起細胞に比べて、ＳＥＢを添加したＩＢＤ惹起細胞において発現が増加していた。さらにＳＥＢで刺激したＩＢＤ惹起細胞と比して、ＳＥＢと化合物Ａを添加したＩＢＤ非惹起細胞で発現が減少している因子であった。
次に化合物Ａが作用する細胞集団が、化合物Ａによって炎症性腸疾患（ＩＢＤ）惹起能が抑制される細胞集団と同じであるという仮説を立てて、ＩＢＤ惹起細胞集団を見い出す検討を行った。具体的には、細胞内ＩＦＮ−γは検出が容易であることから、実施例３で選出した因子のいずれかを発現する各細胞集団に化合物Ａを作用させ、細胞内ＩＦＮ−γ量を指標とすることにより、実施例３で選出した因子のうちどの因子が実際にＩＢＤ惹起能に深く関与しているのか検討した。
なお、細胞内ＩＬ−９と細胞内Ｌｙｍｐｈｏｔｏｘｉｎαの検出は解析試薬等がなく検討出来なかった。ＩＬ−１７は、抗ＩＬ−１７抗体が大腸炎モデルの症状を悪化させる事が報告され（日本消化器関連学会週間（ＤＤＷ−Ｊａｐａｎ２００３）、消化器病ポスター３３７、滋賀医大・消化器内科）、ＩＬ−１７は大腸炎を改善する因子であることが示唆されたため、目的である大腸炎惹起因子の探索とは逆の作用を示すことが分かり解析対象から除外した。さらに細胞表面分子であるＩｎｔｅｇｒｉｎβ１は発現細胞が多種多様であり、解析結果から化合物Ａの作用する細胞集団の同定は出来ないと判断して解析対象から除外した。細胞表面分子であるＤＡＰ１２は、解析試薬等がないので検討ができなかった。
（１）細胞の調製と培養
実施例１の方法で腸間膜リンパ節細胞と溶血剤処理した脾臓細胞を調製し、培養フラスコ（２５Ｔフラスコ；岩城硝子社製）に１０％胎児牛血清（ＢＩＯＷＨＩＴＴＡＫＥＲ社製）、１％Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ含有Ｄ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）中で３．３ｘ１０７個播種し、以下の２種類の条件下で４８時間細胞培養した。培地に４．５ｕｌ  ＢＤ  ＧｏｌｇｉＳｔｏｐ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を添加し、さらに１２時間培養した。細胞培養は５％ＣＯ２、３７℃でＣＯ２インキュベーター内で行った。培養後の細胞を回収しＣＤ８１陽性Ｔ細胞内ＩＦＮ−γを測定した。
Ａ：１μｇ／ｍｌ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｃｏｃａｌ  ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ  Ｂ（Ｓｉｇｍａ社製）添加
Ｂ：１μｇ／ｍｌ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｃｏｃａｌ  ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ  Ｂ（Ｓｉｇｍａ社製）と特開２００２−１６１０８４の化合物１０μＭ添加）
（２）細胞内ＩＦＮ−γの測定
細胞を回収し、染色バッファー（０．０９％アジ化ナトリウム、１％牛血清アルブミン含有リン酸バッファー）に懸濁した。トリパンブルーで生細胞数を計測し、細胞１０６個／１００ｕｌをエッペンドルフチューブに入れ、抗ＣＤ１６／ＣＤ３２抗体を１ｕｌ添加し、４℃、１５分間インキュベーションした。細胞洗浄後、ＦＩＴＣ（フルオロイソチオシアネート）標識抗体とビオチン標識抗抗体を１ｕｇ／１０６ｃｅｌｌｓ（染色バッファー５０ｕｌ中）で細胞に添加し、４℃、１５分間インキュベーションした。ＦＩＴＣ標識抗体としては、抗ＴＣＲＶγδ抗体、抗ＣＤ４抗体、抗ＴＣＲＶβ３抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ４０抗体、抗ＣＤ４９ｄ抗体を使用し、ビオチン標識抗体としては、抗ＣＤ４０Ｌ抗体、抗ＣＤ８１抗体、抗ＩＬ−１０Ｒ抗体を使用した。細胞洗浄後、１ｕｌストレプトアビジン標識ＰｅｒＣＰを１ｕｇ／１０６ｃｅｌｌｓ（染色バッファー５０ｕｌ中）で細胞に添加し、４℃、１５分間インキュベーションした。洗浄後の細胞を遠心分離して、ＢＤ  Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍを０．１ｍｌ／ｔｕｂｅ添加し、２０分間、４℃でインキュベーションした。１ｘＢＤ  Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  １ｍｌ／ｔｕｂｅで２回洗浄した後にペレットとした。５０ｕｌの１ｘＢＤ  Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ中でＰＥ（フィコエリトリン）標識抗ＩＦＮ−γ抗体を１ｕｇ／１０６ｃｅｌｌｓで細胞に添加し、４℃、３０分間インキュベーションした。１ｘＢＤ  Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  １ｍｌ／ｔｕｂｅで２回洗浄した後に上清を捨て遠心分離で沈殿した細胞をほぐし、染色バッファーに置換後にＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）で解析した。遠心分離は、４，０００ｒ．ｐ．ｍ．、３ｍｉｎ、４℃（遠心機：ＴＯＭＹ  ＭＲＸ−１５２、ローター：ＴＭＡ−６）で行った。ＦＩＴＣはＦＬ１、ＰＥはＦＬ２、ＰｅｒＣＰはＦＬ３で、それぞれの蛍光強度を測定した。用いた抗体はビオチン標識抗ＩＬ−１０Ｒ抗体はＢｉｏｌｅｇｅｎｄ社製であり、その他の抗体は全てＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製を用いた。
その結果を表２に記載した。各種細胞表面マーカーを有している細胞集団の存在率（％）と化合物Ａにより減少した細胞内ＩＦＮ−γ陽性細胞を１００としたときに、各細胞集団内に存在する化合物Ａにより減少した細胞内ＩＦＮ−γ陽性細胞の割合（表中の「化合物反応細胞」）、および各種細胞集団１％あたりの化合物反応細胞の割合（表中の「化合物反応細胞÷存在率」、化合物Ａにより減少した細胞内ＩＦＮ−γ陽性細胞の存在頻度）を示した。遺伝子発現変動で見出されたＴＣＲＶγ４陽性細胞を調べるための実験では入手できる試薬である抗ＴＣＲＶγδ抗体を、ＣＤｗ４０陽性細胞を調べるための実験では入手できる試薬である抗ＣＤ４０抗体を、ＩＬ−１０Ｒβ陽性細胞を調べるための実験では入手できる試薬である抗ＩＬ−１０Ｒ抗体を使用した。ＩＬ−１０Ｒ陽性細胞は、明確な細胞集団として検出できなかったため、結果が得られなかった。
0004749861.tif 000003
表２の結果から、ＣＤ３細胞（＝Ｔ細胞）が、化合物Ａが作用する細胞集団の全てであることが分かった（表中の化合物反応細胞が細胞表面マーカーＣＤ３では１０３．４％）。さらにＣＤ３陽性細胞の中のＣＤ８１陽性細胞が化合物Ａにより最も細胞内ＩＦＮ−γが減少する細胞集団を高頻度に含んでいることも分かった（表中の化合物反応細胞／存在率が細胞表面マーカーＣＤ８１  ｉｎ  ＣＤ３では１１．１）。化合物ＡはＩＢＤの病態惹起能を抑制することから、ＣＤ３陽性ＣＤ８１陽性細胞が炎症性腸疾患の病態を発症させる細胞であった。これらの検討結果から、ＣＤ８１がＴ細胞上の病態惹起細胞マーカーであり、炎症性腸疾患の病態を引き起こし、進展させる病原因子であることが明らかとなった。
［実施例５］
抗ＣＤ８１抗体のＴＮＢＳ（２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸）誘発マウス大腸炎モデルに対する薬理効果
（１）ＴＮＰ−ＯＶＡの調製
０．５ｇ卵白アルブミン（ＯＶＡ：Ｓｉｇｍａ社製）と０．５ｇ  Ｋ２ＣＯ３（ナカライテスク社製）を２５ｍｌ注射用蒸留水に溶解した（ＯＶＡ溶液）。２５ｍｌの０．１Ｍ  Ｋ２ＣＯ３に０．５ｇ  ２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ：ナカライテスク社製）を溶解した（ＴＮＢＳ溶液）。ＯＶＡ溶液とＴＮＢＳ溶液を混合し、室温で一晩攪拌した。攪拌した溶液を透析膜（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐ  ｏｒ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  ＭＷＣＯ：１０，０００、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．社製）で０．０１Ｍ  ＮａＨＣＯ３（ナカライテスク社製）に透析した。透析した溶液をＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｅｉｒｃｅ社製）でタンパク定量した。
（２）群分け、感作、チャレンジおよび投薬
５週齢のマウス（ＳＪＬ／ＪｏｒｌＩｃｏＣｒｊ、♂、日本チャールス．リバー社製）背部に完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ：Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）と２ｍｇ／ｍｌ  ＴＮＰ−ＯＶＡの１：１乳化液を０．１ｍｌ／ｈｅａｄで皮下注射（感作）した。感作７日後に１０ｍｇ／ｍｌ  ＴＮＢＳ  ５０％エタノール溶液をエーテル麻酔下で注腸（０．２ｍｌ／ｈｅａｄを肛門より３ｃｍまでゾンデを挿入して注入：チャレンジ）した。チャレンジ５日後の体重と症状スコアーで１群８匹、３群で群分けした。
群は０．１ｍｇ（０．２ｍｌ）／ｈｅａｄ抗ＣＤ８１抗体溶液（Ｃｌｏｎｅ：２Ｆ７、Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｉｏｔｅｃｈ社製）投与群、０．２ｍｌ／ｈｅａｄ溶媒投与病態コントロール群、２００ｍｇ／ｋｇスルファサラジン（ＳＳＺ：Ｓｉｇｍａ社製）投与群を設定した。投薬は抗体投与群と病態コントロール群には群分け日と群分け２日後に腹腔内投与し、ＳＳＺは群分け日から１日１回連日経口投与した。群分け５日後に実験を終了した。ＳＳＺ溶液は０．５％メチルセルロース（ナカライテスク社製）溶液に懸濁した。
（３）体重測定および症状スコアー判定
群分け日から群分け５日後までの腸炎症状観察を行った。腸炎症状は便の状態（正常便（スコアー：０）、軟便（スコアー：１）、下痢（スコアー：２））でスコアー判定した。死亡個体は結果より除いた。統計処理はＳｔｅｅｌの検定で病態コントロール群、抗ＣＤ８１抗体投与群とＳＳＺ投与群での総当りの多群比較を行った（＊；０．０１＜ｐ＜０．０５、＊＊；ｐ＜０．０１）。
（４）大腸の長さ測定
実験終了日に高濃度ＣＯ２で安楽死させた後に大腸を摘出し、長さを測定した。各群の大腸の長さは、Ｂａｒｔｌｅｔｔの検定後にＤｕｎｎｅｔの検定で病態コントロール群、抗ＣＤ８１抗体投与群とＳＳＺ投与群での総当りの統計処理を行った（＊；０．０１＜ｐ＜０．０５、＊＊；ｐ＜０．０１）。
その結果を表３に示した。抗ＣＤ８１抗体によりＴＮＢＳ誘発大腸炎マウスの腸炎症状と腸管長の短縮はＳＳＺと同等に改善されていた。この結果により、抗ＣＤ８１抗体は炎症性腸疾患の予防、改善および治療剤となり得ることが明らかとなった。
0004749861.tif 000004
［実施例６］
ＣＤ８１遺伝子発現抑制剤のスクリーニング
Ｊｕｒｋａｔ細胞（ヒトＴ細胞リンパ腫由来）、ＮＣ−３７細胞（ヒト末梢リンパ芽球由来、ＡＴＣＣ株番号ＣＣＬ−２１４）、ＣＣＲＦ−ＳＢ細胞（ヒト急性リンパ芽球性白血病Ｂ細胞由来、ＡＴＣＣ株番号ＣＣＬ−１２０）、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞（ヒト急性リンパ芽球性白血病Ｔ細胞由来、ＡＴＣＣ株番号ＣＣＬ−１１９）、ＭＯＬＴ−３細胞（ヒト急性リンパ芽球性白血病Ｔ細胞由来、ＡＴＣＣ株番号ＣＲＬ−１５５２）、ＣＣＲＦ−ＨＳＢ−２細胞（ヒト急性リンパ芽球性白血病Ｔ細胞由来、ＡＴＣＣ株番号ＣＣＬ−１２０．１）、ＩＭ−９細胞（ヒト末梢リンパ芽球由来、ＡＴＣＣ株番号ＣＣＬ−１５９）、ＥＢ−３細胞（ヒトバーキットリンパ腫由来、ＡＴＣＣ株番号ＣＣＬ−８５）、ＣＡ４６細胞（ヒトバーキットリンパ腫由来、ＡＴＣＣ株番号ＣＲＬ−１６４８）、Ｄａｕｄｉ細胞（ヒトバーキットリンパ腫由来、ＡＴＣＣ株番号ＣＣＬ−２１３）、Ｎａｍａｌｗａ細胞（ヒトバーキットリンパ腫由来、ＡＴＣＣ株番号ＣＲＬ−１４３２）、Ｒａｊｉ細胞（ヒトバーキットリンパ腫由来、ＡＴＣＣ株番号ＣＣＬ−８６）、Ｒａｍｏｓ（ＲＡ１）細胞（ヒトバーキットリンパ腫由来、ＡＴＣＣ株番号ＣＣＬ−１５９６）、ＲＰＭＩ  １７８８細胞（ヒト末梢リンパ球由来、ＡＴＣＣ株番号ＣＣＬ−１５６）、ＲＰＭＩ  ６６６６細胞（ヒトホジキン病リンパ芽球由来、ＡＴＣＣ株番号ＣＣＬ−１１３）、Ｕ−９３７細胞（ヒト組織球性リンパ腫由来、ＡＴＣＣ株番号ＣＲＬ−１５９３）、Ｂ−ＡＴＬ１細胞（ヒト成人Ｔ細胞白血病患者Ｂ細胞由来）、Ｂ−ＡＴＬ２細胞（ヒト成人Ｔ細胞白血病患者Ｂ細胞由来）、Ｂ−ＡＴＬ７細胞（ヒト成人Ｔ細胞白血病患者Ｂ細胞由来）、Ｂ−ＡＴＬ８細胞（ヒト成人Ｔ細胞白血病患者Ｂ細胞由来）、ＯＫＭ−２Ｔ細胞（ヒト成人Ｔ細胞白血病患者Ｔ細胞由来）またはＯＫＭ−３Ｔ細胞（ヒト成人Ｔ細胞白血病患者Ｔ細胞由来）（いずれも大日本製薬株式会社より購入することができる）、またはヒト末梢血リンパ球を、１０％不活性化牛胎児血清、２ｍＭグルタミン、５０ＩＵ／ｍｌペニシリン、５０ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン含有Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ培地を用い、３７℃、ＣＯ２濃度５％の条件下で培養する。
計数した細胞を２４穴組織培養プレートに０．６−１．２ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２で播種し、３７℃、ＣＯ２濃度５％で培養する。これらの細胞に対して刺激剤（ホルボール１２−ミリステート１３アセテート、コンカナバリン、リポポリサッカライド、サイトカイン（インターフェロン類、Ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ、インターロイキン類）、抗Ｔ細胞表面抗原抗体、抗Ｂ細胞表面絵抗原抗体、あるいはＢｕｔｙｒａｔｅ）の存在下で被験物質含有溶液（１００μＭ、１０μＭ、および１μＭの各濃度の被験物質を含む溶液）を添加する。ここで対照実験として、被験物質無添加の細胞についても同様の培養を行う（コントロール）。
これらの各培養細胞より抽出したＲＮＡを用いて実施例２に記載された方法で遺伝子発現量を解析する。その結果、ＣＤ８１遺伝子の発現を、被験物質（候補物質）を接触させない対照細胞における発現量と比較して１０％、好ましくは３０％、特に好ましくは５０％以上の低下（抑制、減少）させる被験物質を、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を緩和、制御（改善、治療）する候補化合物として選択する。
［実施例７］
ＣＤ８１の機能（活性）抑制剤のスクリーニング
フィブロネクチン（Ｓｉｇｍａ）をコートするために、２４穴培養プレート（Ｆａｌｃｏｎ  Ｌａｂｗａｒｅ社製）にＰＢＳで１０μｇ／ｍｌの濃度に調製したフィブロネクチンを３７℃、３時間吸着させた後にＰＢＳで３回洗浄する。抗ＣＤ８１抗体を反応させたヒトＢ細胞（Ｄａｕｄｉ細胞（ヒトバーキットリンパ腫由来、ＡＴＣＣ株番号ＣＣＬ−２１３、大日本製薬株式会社社製）、Ｎａｍａｌｗａ細胞（ヒトバーキットリンパ腫由来、ＡＴＣＣ株番号ＣＲＬ−１４３２、大日本製薬株式会社社製）、Ｒａｊｉ細胞（ヒトバーキットリンパ腫由来、ＡＴＣＣ株番号ＣＣＬ−８６、大日本製薬株式会社社製）、Ｒａｍｏｓ（ＲＡ１）細胞（ヒトバーキットリンパ腫由来、ＡＴＣＣ株番号ＣＣＬ−１５９６、大日本製薬株式会社社製））を洗浄後に１ｘ１０５個／ウエルでプレートに播種し３７℃、２０分間インキュベーションしてからＰＢＳで３回洗浄し３％グルタルアルデヒドで固定化する。プレートに結合した細胞は約４００倍の顕微鏡観察下で計測して求める。抗ＣＤ８１抗体は市販品（ファーミンジェン等）として入手できる。
被験物質のＢ細胞フィブロネクチン結合活性の抑制率は、以下の式：
｛［（被験物質非存在下での細胞数）−（被験物質存在下での細胞数）］／（被験物質非存在下での細胞数）｝ｘ１００％で表される。
Ｂ細胞フィブロネクチン結合活性の抑制率が１０％、好ましくは３０％、特に好ましくは５０％以上変動した系に添加していた被験物質を、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を緩和、制御（改善、治療）する候補化合物として選択する。
【産業上の利用可能性】  本発明によって、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）惹起性細胞において、ＩＢＤ非惹起性細胞と比較してＣＤ８１遺伝子が特異的に発現増大していること、および抗ＣＤ８１抗体が炎症性腸疾患の治療に有効であることが明らかとなった。
抗ＣＤ８１抗体を有効成分とする薬剤は、炎症性腸疾患患者に該疾患の治療剤として利用することができる。また、ＣＤ８１遺伝子の発現と炎症性腸疾患（ＩＢＤ）との関連性から、ＣＤ８１遺伝子の発現の抑制、または当該遺伝子がコードするタンパク質の発現や機能（活性）の抑制を指標とすることによって、炎症性腸疾患の治療薬となり得る候補薬をスクリーニングし選別することが可能である。
更にＣＤ８１遺伝子は、炎症性腸疾患の遺伝子診断に用いられるマーカー遺伝子（プローブ、プライマー）として有用であり、かかるマーカー遺伝子によれば炎症性腸疾患であるかどうかを明らかにすることができ（診断精度が向上）、これによりより適切な治療を施すことが可能となる。
【配列表】
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