(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤＲのすべてが、ＡＴＣＣ  ＨＢ１１４２３として寄託された細胞系から産生されるＬＯ−ＣＤ２ａに由来するヒト化抗体であって、
前記ヒト化抗体の重鎖可変領域のフレームワークは、
図５５および５６に記載されるヒトＡｍｕ５−３のフレームワークにおいて、
アミノ酸４７、６７、７０、７２、７６、８５、８７と、アミノ酸１２、１３、２８、４８のうちの１個、２個、３個あるいは４個を、前記ＬＯ−ＣＤ２ａのアミノ酸に置換したものであることを特徴とするヒト化抗体。
【請求項２】
請求項１記載のヒト化抗体であって、前記ヒト化抗体の重鎖可変領域のフレームワークは、図５５および５６に記載されるヒトＡｍｕ５−３のフレームワークにおいて、アミノ酸１２、１３、２８、４７、４８、６７、７０、７２、７６、８５および８７を、前記ＬＯ−ＣＤ２ａのアミノ酸に置換したものであることを特徴とするヒト化抗体。
【請求項３】
請求項１記載のヒト化抗体であって、前記ヒト化抗体の軽鎖可変領域のフレームワークは、図３９に記載されるヒトＨＵＭ５４００のフレームワークにおいて、１個もしくはそれ以上のアミノ酸９、１２、４１、４２、５０、５１および８２を、前記ＬＯ−ＣＤ２ａのアミノ酸に置換したものであることを特徴とするヒト化抗体。
【請求項４】
請求項３記載のヒト化抗体であって、前記ヒト化抗体の軽鎖可変領域のフレームワークは、図３９に記載されるヒトＨＵＭ５４００のフレームワークにおいて、アミノ酸９、１２、４１、４２、５０、５１および８２を、前記ＬＯ−ＣＤ２ａのアミノ酸に置換したものであることを特徴とするヒト化抗体。
【請求項５】
請求項１記載のヒト化抗体であって、ヒト化抗体の重鎖可変領域が図５５および５６のアミノ酸配列を持つことを特徴とするヒト化抗体。
【請求項６】
請求項３記載のヒト化抗体であって、ヒト化抗体の軽鎖可変領域が図３９のアミノ酸配列を持つことを特徴とするヒト化抗体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
この発明は抗体（あるいは断片もしくはその誘導体）に関し、また望ましくはヒトリンパ球に結合する抗体（あるいは断片もしくはその誘導体）に関する。より詳細には、この発明はそのような抗体（あるいは断片もしくはその誘導体）の患者への投与を通じて患者における進行中の免疫応答を予防しおよびもしくは阻害することに関する。望ましくは、この発明はそのような抗体あるいは断片もしくはその誘導体の患者への投与を通じてＴ細胞の活性化および増殖を予防しあるいは阻害することに関する。
【０００２】
（背景技術）
従来の技術は移植片拒絶反応を阻害するＣＤ２抗原に対する抗体の使用の可能性を開示した。一般に従来の技術は移植片拒絶反応を阻害するのに多分有用であるものとしてＣＤ２抗原に結合する抗体の使用を開示する。オルト・ファーマシューティカル・コーポレイション、合衆国特許番号４，３６４，９７３号、４，６１４，７２０号、４，５１５，８９３号、４，７４３，６８１号、および４，７９８，８０６号を参照されたい。
【０００３】
前記の引用例でもそのような抗体がヒト患者あるいは非ヒト霊長類における移植片拒絶反応を阻害するのに有用であることは知られていなかった。下記の引用例、Ｊ．Ｖ．ジオルジ、他、サル同種異系移植片受容体におけるＯＫＴ１１Ａモノクローナル抗体の免疫抑制作用および免疫原性、移植紀要、１５巻、１号、１９８３年３月、およびＰ．Ｊ．サーロー、他、モノクローナル抗チンパンジーＴ細胞抗体、移植、３６巻、３号、２９３−２９８ページに例示されている通りである。
【０００４】
従って、移植片拒絶反応を阻害するＣＤ２抗原に対する抗体がヒトあるいは非ヒト霊長類におけるＴ細胞の活性化および増殖を阻害し、あるいはＴ細胞の活性化および増殖を刺激する作用薬を投与する前あるいは後で抗体を加えた時にも移植片拒絶反応を阻害することに関して開示は行われていない。
【０００５】
この発明は前記の事情を考慮して、ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１１４２３の細胞系から産生されるモノクローナル抗体ＬＯ−ＣＤ２ａからのヒト化抗体を提供し、またそれにより免疫応答を阻害する方法ならびに移植片拒絶を阻害する方法も提供することを目的とする。
【０００６】
（発明の開示）
この発明は下記の構成を備えることにより前記の課題を解決できるものである。
【０００７】
（１）ＬＯ−ＣＤ２ａからのＣＤＲよりなる一つのヒト化抗体であって、前記ヒト化抗体はヒト化抗体の重鎖可変領域のフレームワークに図５５および５６で示されるようにラットＬＯ−ＣＤ２ａ重鎖可変領域のアミノ酸４７、６７、７０、７２、７６、８５および８７と、アミノ酸１２、１３、２８および４８の内１個、２個、３個あるいは４個よりなることを特徴とするヒト化抗体。
【０００８】
（２）前項（１）記載のヒト化抗体であって、ここで前記ヒト化抗体がヒト化抗体の重鎖可変領域のフレームワークに図５５および５６で示されるようにラットＬＯ−ＣＤ２ａ重鎖可変領域のアミノ酸１２、１３、２８、４７、４８、６７、７０、７２、７６、８５および８７を含むことを特徴とするヒト化抗体。
【０００９】
（３）前項（１）記載のヒト化抗体であって、ここで前記ヒト化抗体がヒト化抗体の軽鎖可変領域のフレームワークに図３９で示されるようにラットＬＯ−ＣＤ２ａ軽鎖可変領域の１個もしくはそれ以上のアミノ酸９、１２、４１、４２、５０、５１および８２を更に含むことを特徴とするヒト化抗体。
【００１０】
（４）前項（３）記載のヒト化抗体であって、ここで前記ヒト化抗体がヒト化抗体の軽鎖可変領域のフレームワークに図３９で示されるようにラットＬＯ−ＣＤ２ａ軽鎖可変領域のアミノ酸９、１２、４１、４２、５０、５１および８２を含むことを特徴とするヒト化抗体。
【００１１】
（５）前項（１）記載のヒト化抗体であって、ここでヒト化抗体の重鎖可変領域が図５５および５６のアミノ酸配列を持つことを特徴とするヒト化抗体。
【００１２】
（６）前項（３）記載のヒト化抗体であって、ここでヒト化抗体の軽鎖可変領域が図３９のアミノ酸配列を持つことを特徴とするヒト化抗体。
【００１３】
（７）患者にある免疫応答を阻害する一つの方法であって、患者を前項（１）記載の抗体で処置することよりなることを特徴とする方法。
【００１４】
（８）患者にある移植片の拒絶を阻害する一つの方法であって、患者を前項（１）記載の抗体で処置することよりなることを特徴とする方法。
【００１５】
（発明を実施するための最良の形態）
この発明をより詳細に説述するために、以下で添付する図面に従って実施例でこれを説明する。
【００１６】
この発明の一つの見地に従って、ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１１４２３として寄託された細胞系により産生されたモノクローナル抗体と同じのヒトリンパ球のエピトープ（あるいはその部分）に結合する分子（望ましくはモノクローナル抗体あるいはその断片）が提供される。その寄託細胞系で産生される抗体は以下時々ＬＯ−ＣＤ２ａとして引用される。「分子」あるいは「ＬＯ−ＣＤ２ａとして同じエピトープに結合する抗体」という用語はＬＯ−ＣＤ２ａを含む。「ＬＯ−ＣＤ２ａ」という用語は寄託細胞系ＡＴＣＣ  ＨＢ１１４２３により産生される抗体および例えば組換え技術により生産されるそれと同一のものを含む。
【００１７】
この発明の分子あるいは抗体はヒトＴ細胞の活性化および増殖を阻害し、また出願人はＴ細胞の活性化を刺激する作用薬の前あるいは後のいずれかで分子あるいは抗体を加えた時にそのような阻害を達成できることを発見した。
【００１８】
この発明の分子あるいは抗体はＣＤ２抗原（ＣＤ２正ヒトＴ細胞）のエピトープに結合する特徴を持つが、しかしＴ細胞の活性化あるいは増殖を阻害するためのそのような分子あるいは抗体の能力はＣＤ２正細胞への結合を通じてもたらされあるいはそうでない場合もあり、作用の機構がＣＤ２正細胞への分子あるいは抗体の結合を伴うものと出願人は現在信じている。
【００１９】
この発明のも一つの見地に従って、以下でＬＯ−ＣＤ２ａ（あるいは断片もしくはその誘導体）として引用する抗体あるいはそのような抗体あるいは誘導体もしくはその断片を模倣するいずれかの分子をヒト患者に投与することを通じて、ヒト患者における進行中の免疫応答を予防しおよびもしくは阻害する一つの方法が提供される。
【００２０】
ＬＯ−ＣＤ２ａを産生する細胞系は１９９３年７月２８日、２０８５２  メリーランド、ロックビル、パークローン  ドライブ  １２３０１にあるアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託され、ＡＴＣＣアクセス番号ＡＴＣＣ  ＨＢ１１４２３が与えられた。この抗体はラットモノクローナル抗体である。
【００２１】
出願人はこの発明をいずれかの理論的類推に限定しようとするものではないが、この発明のモノクローナル抗体をして免疫応答の発病度を予防しあるいは減少させ、またＴ細胞の活性化および増殖を阻害することを可能にする機構（メカニズム）は、ＬＯ−ＣＤ２ａ抗体がＴ細胞表面で発現されるＣＤ２の密度を減少させ従ってＣＤ２−Ｔリンパ球の数を減少させるか、およびもしくは顕著な形質導入に作用する事実であると考えられる。これらの作用機構は免疫応答の予防だけでなく、進行中の免疫応答の減少にも原因となるものと考えられる。加えて、ＬＯ−ＣＤ２ａ抗体はここで例示されるように、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞試験管内活性を阻害する。これはこの発明にとって適切である。というのはＮＫ細胞活性などのような非ＭＨＣ制約細胞毒機構が対宿主性移植片病に影響してきたものと考えられるからである。
【００２２】
この発明の一見地に従って、ＬＯ−ＣＤ２ａ抗体のようにヒトリンパ球に対する同じエピトープ（あるいはそのいずれかの部分）に結合する分子（望ましくは抗体）の有効量をヒト患者に投与することにより、患者にあるＴ細胞の当初あるいは更なる活性化および増殖を阻害する一つの方法が提供される。望ましい分子はＬＯ−ＣＤ２ａあるいはキメラおよびもしくはそのヒト化形態のものである。このような分子は、例えばＬＯ−ＣＤ２ａ抗体と同じ相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むであろう。
【００２３】
この出願を通じてここで使用される「阻害する」という用語は、移植片拒絶反応の予防、あるいは阻害、もしくは発病度の減少、あるいは耐性の誘導、もしくは逆転を意味することを意図している。この出願の目的でここで使用される「移植」という用語は必ずしもそれに限定されないが、同種異系移植片および異種移植片移植を含むいずれかまたはすべての移植を意味するものとなる。このような移植は実施例によって必ずしもそれに限定されないが、細胞、骨髄、組織、固体器官、骨、等の移植を含む。
【００２４】
ここで使用される「免疫応答」という用語は、細胞作用およびＴ細胞依存型抗体の両方を含むＴ細胞の活性化および増殖に依存する免疫応答を意味することを意図するものであり、それは実施例で制限とするものではなくて（ｉ）移植片、（ii）対宿主性移植片病、および（iii ）実施例によって必ずしもそれに限定されないが、慢性関節リウマチ、全身性狼瘡、多発性硬化症、真性糖尿病、等の自己免疫疾病に帰着する自己抗原などへの応答で引き出されるものである。
【００２５】
この発明で使用される分子は、ＬＯ−ＣＤ２ａモノクローナル抗体と同じエピトープ（あるいはこのエピトープの一部）と結合するものである。「ＬＯ−ＣＤ２ａモノクローナル抗体と同じエピトープと結合する」という用語は、ＬＯ−ＣＤ２ａモノクローナル抗体を説明するだけでなく、またＬＯ−ＣＤ２ａモノクローナル抗体と同じそのようなエピトープと結合する他の抗体、断片あるいはその誘導体もしくは分子を説明することを意図するものである。
【００２６】
そのような他の抗体は、実施例によってまたそれに限定されないがラット、ネズミ、ブタ、ウシ、ヒト、キメラ、ヒト化抗体、あるいは断片もしくはその誘導体を含む。
【００２７】
ここで使用される「誘導体」という用語はキメラあるいはヒト化抗体、一本鎖抗体、二重特異性抗体あるいはＬＯ−ＣＤ２ａモノクローナル抗体により認識されるのと同じエピトープ（あるいはその部分）と結合するような他の抗体を意味する。
【００２８】
ここで使用される「断片」という用語は抗体の部分を意味し、実施例により抗体のそのような部分は必ずしもそれに限定されないが、ＣＤＲ、Ｆａｂ、あるいはＬＯ−ＣＤ２ａにより認識されるのと同じエピトープあるいはそのいずれかの部分と結合するそのような他の部分を含む。
【００２９】
ここで使用される「抗体」という用語はポリクローナル、モノクローナル抗体、同じく抗体断片、誘導体同じくキメラあるいはヒト化抗体など組換え技術により調製される抗体、モノクローナル抗体ＬＯ−ＣＤ２ａにより認識されるのと同じエピトープあるいはその部分と結合する単鎖もしくは二重特異性抗体を含む。「分子」という用語は実施例により必ずしも限定されないが、ペプチド、オリゴヌクレオチド、もしくは抗体を模倣しあるいは抗体断片もしくはその誘導体と同じエピトープあるいはその部分と結合するいずれかの源から誘導される他のそのような化合物を含む。
【００３０】
この発明のも一つの実施例は、ＬＯ−ＣＤ２ａ抗体、あるいは抗体もしくは誘導体、あるいはその断片もしくはＬＯ−ＣＤ２ａ抗体と同じエピトープ（もしくはその部分）と結合する分子よりなるグループから選択される少くとも１個の部材の有効量で移植片移植を受けるべきもしくは受けた患者を処置する一つの方法を提供する。この処置は望ましくは全ＬＯ−ＣＤ２ａ抗体あるいは無傷ＬＯ−ＣＤ２ａ抗体で実行される。
【００３１】
前に記載の通りこの発明のモノクローナル抗体は、ここで開示された技術と同様にケーラーおよびミルシュタイン（ネイチャー２５６巻、４９５−４９７ページ、１９７５年）に記載されたような従来公知の技術により産生することができる。モノクローナルＬＯ−ＣＤ２ａ抗体の調製はこの出願の実施例１により詳細に記載される。前に示されたように、ＬＯ−ＣＤ２ａ抗体はまた従来公知の手順を用いて組換え技術により産生することもできる。組換え抗体は更にキメラ抗体の形をとることもあり、ここでＬＯ−ＣＤ２ａラット抗体の可変領域はも一つの種の抗体の定常部と組み合される。かくして例えば、モノクローナル抗体は、ラットＬＯ−ＣＤ２ａモノクローナル抗体のＣＤＲ領域をヒト抗体のＶ領域、フレームワーク領域および定常部と組合せてキメラヒト−ラットモノクローナル抗体を提供することによりヒト化される。
【００３２】
一つの実施例において、抗体はヒト抗体の定常部、および軽鎖ならびに重鎖可変領域のフレームワーク領域およびＣＤＲ領域から構築されるＬＯ−ＣＤ２ａ抗体のヒト化形態であり、ここで軽鎖および重鎖可変領域のフレームワーク領域はヒト抗体の軽鎖および重鎖可変領域のフレームワーク領域から誘導され、またＣＤＲ’ｓはラットＬＯ−ＣＤ２ａ、ＣＤＲ’ｓである。一つの実施例において、軽鎖および重鎖可変領域のフレームワーク領域の１個もしくはそれ以上のアミノ酸残基は、ラットＬＯ−ＣＤ２ａフレームワーク領域からのアミノ酸残基である。このようなラットフレームワーク領域からの残基はヒト化抗体内に保持され、何故ならこのような残基はＬＯ−ＣＤ２ａの結合特異性を維持するからである。かくしてヒト化抗体を産生する際に、この発明の望ましい見地に従って、ヒト抗体のＣＤＲ’ｓは、とりわけＦＲ１、ＦＲ２およびＦＲ３からのＬＯ−ＣＤ２ａの軽鎖可変部分のある種のアミノ酸およびとりわけＦＲ−２およびＦＲ−３からのＬＯ−ＣＤ２ａの重鎖可変部分のある種のアミノ酸がヒト化抗体を構築する際に保持される付加因子を持つＬＯ−ＣＤ２ａのＣＤＲ’ｓで置換される。すなわちヒトフレームワークの対応するアミノ酸はラットＬＯ−ＣＤ２ａフレームワークからの指摘されたアミノ酸で置換される。図３９に関連して指摘されるように、ラットＬＯ−ＣＤ２ａの軽鎖可変領域のフレームワークにあるアミノ酸９、１２、４１、４２、５０、５１および８２は保持され、また図４３で指摘されるように、ラットＬＯ−ＣＤ２ａの重鎖可変領域のフレームワークにあるアミノ酸４７、６７、７０、７２、７６、８５および８７はヒト化抗体に保持される。このようなヒト化抗体の構築の特異的な実施例が下記の実施例７で与えられる。
【００３３】
も一つの実施例において、ヒト化抗体で重鎖可変部において、ＦＲ１、ＦＲ２およびＦＲ３領域のある種のアミノ酸はヒト化抗体を構築する際に保持される。とりわけ図５５および５６で指摘されるように、ラットＬＯ−ＣＤ２ａの重鎖可変部のフレームワークにあるアミノ酸４７、６７、７０、７２、７６、８５および８７、またアミノ酸１２、１３、２８および４８の１個、２個、３個あるいは４個はヒト化抗体に保持される。望ましい実施例において、ラットＬＯ−ＣＤ２ａの重鎖可変部のフレームワークにあるアミノ酸１２、１３、２８、４７、４８、６７、７０、７２、７６、８５および８７はヒト化抗体に保持される。も一つの望ましい実施例において、ヒト化抗体にあるラットＬＯ−ＣＤ２ａの重鎖可変部のフレームワークにある前記アミノ酸の保持に加えて、ヒト化抗体は更にヒト化抗体の軽鎖可変領域のフレームワーク内に図３９で示されるようにラットＬＯ−ＣＤ２ａ軽鎖可変領域の１個もしくはそれ以上のアミノ酸９、１２、４１、４２、５０、５１および８２を含んでいる。望ましくは、ラットＬＯ−ＣＤ２ａの軽鎖可変部にある各アミノ酸９、１２、４１、４２、５０、５１および８２がヒト化抗体に保持される。
【００３４】
もっとも望ましい実施例において、ヒト化抗体はヒト化抗体の重鎖可変領域のフレームワーク内に、図５５および５６で示されるようにラットＬＯーＣＤ２ａの重鎖可変領域のアミノ酸１２、１３、２８、４７、４８、６７、７０、７２、７６、８５および８７を含んでいる。ヒト化抗体はまたヒト化抗体の軽鎖可変領域のフレームワーク内に、図３９で示されるようにラットＬＯ−ＣＤ２ａ軽鎖可変領域のアミノ酸９、１２、４１、４２、５０、５１および８２を含んでいる。このような抗体は以下時々ＭＥＤＩ−５０７として引用され、その構造は以下にある実施例１１に説明されている。
【００３５】
も一つの実施例において、この発明はヒト定常部およびラットＬＯ−ＣＤ２ａからの可変領域よりなるキメラ抗体に関し、またその用途に関する。
【００３６】
この発明の抗体あるいは分子は、望ましくは（ｉ）フローサイトメトリーで分析されるリンパ球の２色染色により示されるように、すべてのＴリンパ球ならびにヌル細胞とは結合するがＢリンパ球とは結合しない（図２９，３０および３１，３２）；（ii）（抗ＣＤ３抗体Ｌｅｕ４での染色で決定されるように）すべてのＴ細胞、Ｌｅｕ３ａおよびＬｅｕ２ｂ抗体それぞれで定義されるようにすべてのＣＤ４およびＣＤ８正細胞、ならびにＣＤ3 負（ヌル細胞）であるいくつかのリンパ球と結合する；（iv）ＮＫ細胞のマーカーであるＬｅｕ１１で検出されるＣＤ１６正細胞の染色により確証されるように、ヌル細胞と結合する。（図２９，３０）；抗ＣＤ１９結合により定義されるように、Ｂ細胞の染色はＬＯ−ＣＤ２ａと一緒には見られなかった。（図３１，３２）。ＬＯ−ＣＤ２ａ抗体は、また望ましくはその抗体がヒトヌル細胞と結合する特性を持ち、更に二色染色によりＣＤ２＋およびＣＤ１６＋両方であるヒト細胞への染色よりもＣＤ２＋およびＣＤ４＋両方であるヒト細胞への染色のより高い強度を持ち、またＣＤ２＋およびＣＤ１６＋両方であるヒト細胞に対するよりもＣＤ２＋およびＣＤ８＋の両方であるヒト細胞の染色のより高い強度を持つ。
【００３７】
ＣＤ２と結合するＬＯ−ＣＤ２ａはＣＯＳ細胞でのＣＤ２を一過的に発現することにより確証された。
【００３８】
ＣＯＳ細胞はピーターソンＡ．およびシードＢ．、ネイチャー３２９巻、１９８７年１０月２９日、８４２−８４６ページで記載されるように、全ＣＤ２分子をコード化する遺伝子を含むπＨ３ＭＣＤ２プラスミドで一過的に形質移入された。
【００３９】
形質移入はＤＥＡＥ−デキストラン法で達成された。細胞は採取され、染色の正の対照としてＭＨＣクラスＩへの抗体であるネズミＷ６３２および対応するアイソタイプ付合対照と共に、抗ＣＤ２モノクローナル抗体Ｌｅｕ５ｂ（ベクトン−ディキンソン）およびＬＯ−ＣＤ２ａで染色された。反応性の特異性は関係のないプラスミドで形質移入されたＣＯＳ細胞に対するモノクローナル抗体の同一パネルの結合を評価することで立証された。
【００４０】
一過的に発現された天然ＣＤ２に対するこれらモノクローナル抗体の染色パターン（図３３）は、ＣＤ２での形質移入が両抗体の結合に導き、ＬＯ−ＣＤ２ａがＣＤ２と結合する能力を支持したことを示している。
【００４１】
この発明の目的のために適切なＬＯ−ＣＤ２ａモノクローナル抗体の調製はここでの教示から従来の技術に熟練した人にとっては明らかであるに違いない。
【００４２】
前に記載した型の抗体あるいは断片もしくはその誘導体あるいは分子は、この発明に従ってＴ細胞の活性化および増殖を阻害し、また細胞表面でのＣＤ２発現の密度を減少させ、それによりＣＤ２+ Ｔリンパ球の数を減少させるために生体内で投与することができる。
【００４３】
かくして例えば、生体内手順で、このようなＬＯ−ＣＤ２ａ抗体は免疫応答を予防しおよびもしくは阻害し、これによりＴ細胞の活性化および増殖を阻害するために投与される。
【００４４】
前に記載した型の抗体あるいは断片もしくはその誘導体あるいは分子は、この発明に従って細胞表面でのＣＤ２+ 発現の密度を減少させかくして供与体細胞のＣＤ２+ 細胞の数を減少させるために生体外で投与することができる。実施例によりかつ制限することなしに、生体外手順において、このような抗体あるいは断片もしくはその誘導体あるいは分子は、移植に際して対宿主性移植片病の発症を予防するために、移植に先立ち供与体骨髄に注入されるであろう。
【００４５】
このような生体内あるいは生体外技術において、抗体あるいは断片もしくはその誘導体あるいは分子は薬理許容担体内で投与されるであろう。このような担体の代表的な例として等張食塩溶液、緩衝液等が言及される。このような薬理許容担体は従来の技術で公知であり、また適切な担体の選択はここに含まれる教訓から従来の技術に習熟した人の範囲内にあるものと見做される。
【００４６】
この発明のＬＯ−ＣＤ２ａ抗体あるいは他の分子は生体内静脈内あるいは筋肉内投与により投与される。
【００４７】
前に示されたように、この発明のＬＯ−ＣＤ２ａ抗体あるいは他の分子は移植片拒絶反応を阻害するのに有効な量で生体内投与される。この出願の目的のための「有効な量」という用語は、望ましい作用、すなわち移植片拒絶反応の阻害あるいはＴ細胞の活性化の阻害を産生することのできるモノクローナル抗体の量を意味するものとする。一般に、このような抗体は少くとも１ｍｇの量で投与される。加えて最初の処置後に、前に記載された量は、もし何もなければ続く処置の間に減少される。かくしてこの発明の範囲はそのような量により限定されるものではない。
【００４８】
この実施例に従って、このような抗体はＴ細胞の活性化および移植片拒絶反応の阻害を維持するために投与される。かくして実施例によりまたそれにより限定されずに、抗体は１−２時間にわたり生理許容担体懸濁液で約１ｍｇ／用量乃至約５０ｍｇ／用量の量で１日１回乃至２回、必要とあれば約８日もしくはそれ以上の期間にわたり静脈内注入により投与される。移植片拒絶反応のためのこのような処置は、望ましくは移植開始時、あるいは移植直前、もしくは移植直後、あるいは移植片拒絶反応が起こる時である。処置は移植片に選択的な低応答状態を導入するために、移植の時点で開始された時１日あるいは２日ほどの少ない期間に、１日１回乃至２回与えることができた。この発明に従って、抗体あるいは断片もしくはその誘導体あるいは分子の投与と関連する自己免疫疾病に対するこのような処置は、手当てをする医師が病理免疫応答を阻害することが望ましいと決定した時に開始される。
【００４９】
かくしてこの発明の一つの見地に従って、移植の時点および殆どの場合その後の短い期間この発明に基づく抗体を投与することにより、移植組織あるいは器官に低応答性を導入することができ、これにより更なる拒絶反応の繰返される症状の出現を予防しあるいは阻害することができる。
【００５０】
Ｔ細胞の活性化を阻害するためのこの発明の技術は、単独で、あるいはＴ細胞の活性化を阻害しもしくは移植片拒絶反応あるいは対宿主性移植片病を阻害するための他の技術、薬剤あるいは化合物と併用して用いることができる。
【００５１】
この発明は下記の実施例と関連して更に記述されるが、それらは実証的ではあるがこの発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【００５２】
実施例で用いられる細胞、培養、ｍＡｂｓおよびミトゲンは従来の普通の技術を持つ者に公知でありかつ実施される方法および手順により調製され使用される。下記のものはそれに続く実施例で使用される細胞、培養、ｍＡｂｓおよびミトゲンの調製および用途で使用される。
【００５３】
細胞および培養
ＰＢＭＣが地方の血液供与センターから得られたヘパリン化血液のフィコール−ハイパーク（スエーデン、ファルマチア）沈降法により得られた。分離されたＰＢＭＣは富化培地：ペニシリン１００Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌ、Ｌ−グルタミン２０ｍＭ、および２０％貯留ヒトＡＢ血清あるいは１５％熱不活性化胎仔ウシ血清で補充されたＲＰＭＩ１６４０培地（ベルギー、ジブコ）で再懸濁された。ＰＢＭＣは最終量２００μｌの培養培地／ウエルになるように９６Ｕ−ウエル・マイクロ平板（ファルコン）で１×１０5 細胞／ウエルで培養された。二方向ＭＬＣが前に記した通り培養培地の同一量で各供与体／ウエルで１×１０5 細胞を用いて実行された。すべての培養は三つ組みで作られた。その結果で示された時点の８時間前に培養は３H −Ｔ（ベルギー、エイマシャム；２４７．９  ＧＢｑ／ｍｍｏｌ；６．７Ｃｉ／ｍｍｏｌ）の２．０μＣｉ／ウエルでパルス標識され、培養に組み込まれた放射性同位元素がベータカウンター（ベックマンＬ５  ６０００ＳＥ）の液体シンチレーションにより計量された。阻害の割合は以下のように計算された：阻害％＝［１−（試験培養の平均ｃｐｍ／対照培養の平均ｃｐｍ）］×１００。すべての結果は３個の個別培養の平均値で表される。標準偏差はそれらの値がグラフで示された場合のものを除き常に平均値の１５％以下であった。
【００５４】
サイトフルオロメトリー分析がコンソート３０プログラムを備えたヒューレット・パッカードハードウェアでファクスキャン・サイトフルオログラフ（ベクトン・ディキンソン）を用いて行われた。リンパ球および芽細胞の染色についての個別の分析は、サイズおよび粒度で定義される差動ゲーティングを使用して可能となった。２５，０００事象が各サンプルで分析された。これらの実験において、ＬＯ−ＣＤ２ａ最終濃度は指示された場合を除き２００ｎｇ／ｍｌであった。
【００５５】
Ｍａｂｓおよびミトゲン
ＬＯ−ＤＲＡおよびＬＯ−Ｔａｃｔ−１（いずれもＦＩＴＣ標識されたもの）は我々の研究室で産生されたラットｍＡｂｓである（公開引用例、Ｈ．バザン（編集）１９９０年、２８７ページ）。ＬＯ−Ｔａｃｔ−１はＩＬ−２受容体のｐ５５鎖に対し指向される（公開引用例、Ｈ．バザン、免疫学、１９８４年、およびジャンセン、Ｍ．、バック、Ｄ．およびメイノー、Ｖ．Ｃ．、白血球型別ＩＶ、白血球分化抗原、Ｗ．ナップ（編）、オクスフォード・ユニバーシティ・プレス、１９８９年、４０３ページ）。マウス抗ヒト−ＣＤ２および抗ＣＤ３ｍＡｂｓ（Ｌｅｕ−５ｂおよびＬｅｕ−４ａ−ＦＩＴＣ標識）はベクトン・ディキンソン（ベルギー）から得られた。マウス抗ヒトＣＤ４あるいは抗ヒトＣＤ８ｍＡｂｓ（フィコエリスリン標識）、およびマウスＩｇＧ  ＦＩＴＣ−あるいはフィコエリスリン標識（負の対照）はコールターから得られた。ＯＫＴ３（オルト−シラーグ、ベルギー）が最終濃度１００ｎｇ／ｍｌで使用された。フィトヘムアグルチニンＡ（植物性赤血球凝集素）（ＰＨＡ：ウエルカム・ラブス、英国）およびコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ；カルバイオケム・カンパニー、アメリカ合衆国）はそれぞれ最終濃度１および１０μｇ／ｍｌで使用された。
【００５６】
ＬＯ−ＣＤ２ａのビオチン化。精製ＬＯ−ＣＤ２ａの濃度は０．１Ｍの重炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ８．４で１ｍｇ／ｍｌに調節された。ＮＨＳ−ビオチン（ベーリンガー・マンハイム１００８  ９６０）が１．５ｍｇ／ｍｌの濃度でＤＭＳＯに溶解された。各ＭＡＢに対し、０．１ｍｌのＮＨＳビオチン溶液が付加された。混合物は２時間周囲温度で回転された。反応は抗体各ｍｌに対して２Ｍトリス−塩酸、ｐＨ８．０の０．１ｍｌを加え（周囲温度で１０分）、次いで抗体各ｍｌに対し食塩加リン酸緩衝液（ＰＢＳ）内でのＢＳＡ１％の１ｍｌを加えることで完成された。遊離ビオチンを除去するために、この溶液は一晩４℃で１０００容積のＰＢＳで透析された。ビオチン化反応および接合ｍＡｂの両方はアルミホイルで包んで光から隠された。
【００５７】
赤血球（ＲＢＣ）の溶解。ＲＢＣは塩化アンモニウムを用いる溶解で全血液から除去された。１０Ｘの株溶液がＮＨ4 Ｃ１、９０ｇ、ＫＨＣＯ3 、１０ｇ、ＥＤＴＡ３７０ｍｇ、および１００ｍｌｓの量になる水よりなるよう調製された。１Ｘ塩化アンモニウム４０ｍｌｓが血液各１０ｍｌｓに付加され、１０分室温で保温された。混合物は次いで１２００ｒｐｍで１０分遠心分離され、またペレットはアジ化物０．１％で１０ｍｌのＰＢＳに再懸濁された。
【００５８】
末梢血の染色
染色は底部の丸い９６ウエル・クラスター平板（コスター＃３７９０）で４℃で行われた。単一色染色のために、１０μｌのｍＡｂが０．２ｍｇのヒト免疫グロブリンを含むＰＢＳに適切に希釈され、各ウエルに付加された。赤血球除去血液はウエル当り９０μｌの量で平板に分配された。細胞およびｍＡｂはゆるやかなたたきで混合され３０分保温された。５０μｌの冷却ＰＢＳが各ウエルに加えられ、平板は１９００ｒｐｍで２分遠心分離された。上澄みは転置および平板のゆるやかなたたきにより除去された。細胞は平板をカウンターでたたくことで分散された。洗浄手順は冷却ＰＢＳ２００μｌの付加により２回繰返された。ヤギＦ（ａｂ′）2 抗ラット１ｇ−ＦＩＴＣの１／２０希釈物１０μｌが各ウエルの分散細胞に加えられ、暗がりで３０分保温された。細胞は冷却ＰＢＳ１８０μｌの各ウエルへの付加で洗浄され、次いで１９００ｒｐｍで２分遠心分離された。上澄みは除去され、細胞は分散され、また２００μｌの０．５％冷却パラホルムアルデヒドが各ウエルに加えられた。細胞は管（ファルコン＃２０５４）に移され、０．５％パラホルムアルデヒドで約０．５ｍｌｓに希釈された。サンプルはリシスIIソフトウエアを用いてベクトン−ディキンソン・ファクスキャン機で評価された。
【００５９】
二色染色が類似の実験記録により行われた。細胞は一次ｍＡｂおよびＦＩＴＣ−接合抗ラット試薬で保温され、１／５希釈の標準マウス血清が抗ラット試薬のいずれかの残存部位を遮断するために加えられた。１５分の保温（洗浄なし）に続き、既知のＣＤ決定因子に特異的な２０μｌのＰＥ−標識ｍＡｂが加えられ、３０分保温された。細胞は洗浄され単一染色で記載されたように固定された。
【００６０】
〔実施例１〕
ＬＯ−ＣＤ２ａは文献のいずれかで示された通り、我々の研究室で産生され特徴付けられたラット（ＩｇＧ２ｂ−カッパ）抗ＣＤ２モノクローナル抗体である（下記の引用例を参照されたい：シーア、Ｈ．、ラベット、Ａ．Ｍ．、ラタンヌ、Ｄ．、ニナンヌ、Ｊ．、ド・ブリュイエール、Ｍ．、ソーカル、Ｇ．およびバザン、Ｈ．、−Ｈ．バザン（編）、ラット・ハイブリドーマおよびラットモノクローナル抗体、ＣＲＣプレス、，インコーポレイテッド、ボカ・レイトン、１９９０  フロリダ、３０９ページ、およびラベット、Ａ．Ｍ．、ラタンヌ、Ｄ．、セガーズ、Ｊ．、マヌーブリーズ、Ｐ．、ニナンヌ、Ｊ．、ド・ブリュイエール、Ｍ．、バザン、Ｈ．、およびソーカル、Ｇ．、−Ｈ．バザン（編）、ラット・ハイブリドーマおよびラットモノクローナル抗体、ＣＲＣプレス，インコーポレイテッド、ボカ・レイトン、１９９０  フロリダ、２８７ページ）。ＬＯ−ＣＤ２ａは産生されるハイブリドーマを受け入れるラットの免疫グロブリンと、後者により分泌されるｍＡｂとの間に存在するアロタイプ差異の利点を利用する免疫アフィニティークロマトグラフィーにより腹水から精製された（バザン、Ｈ．、コーモント、Ｆ．およびデクラーク、Ｌ．、免疫学方法論ジャーナル、１９８４年、７１巻：９ページ）。これはマウスｍＡｂ  Ｌｅｕ−５ｂ（ＦＩＴＣ標識）により染色された全集団、図１およびマウスＴ１１（ローダミン標識）ｍＡｂにより標識された集団の約９０％を認識する（データは示されていない）。ＣＤ２分子上のＬＯ−ＣＤ２ａにより認識されたエピトープは抗ＣＤ２マウスｍＡｂｓ  Ｌｅｕ−５ｂおよびＴ１１で認識されたエピトープとは異なる（図２および３）。
【００６１】
〔実施例２〕
ＬＯ−ＣＤ２ａはＰＢＭＣに対し調節作用は示すがミトゲン作用は示さない
休止リンパ球に対するラットｍＡｂ  ＬＯ−ＣＤ２ａの作用を決定するために、ＰＢＭＣがこのｍＡｂの増加する濃度での存在下で保温された。付表１で見られるように、ＬＯ−ＣＤ２ａの存在下で６日間保温されたＰＢＭＣは、対照培養に比べて 3Ｈ−Ｔとり込みの割合に著しい変化を示していない。この期間の終りでの細胞の生存度は変化したが、トリパンブルー排除により評価されるように平均約８０％であった。休止ＰＢＭＣがＬＯ−ＣＤ２ａの存在下で保温された時、フローサイトメトリーで評価されるように、いくつかの膜マーカーの表現型発現には著しい変化がなかった。休止成熟Ｔ細胞の細胞マーカー（例えばＣＤ３、ＣＤ４およびＣＤ８など）は６日間の培養でＬＯ−ＣＤ２ａの存在下あるいは不在下で同一の変化のパターンを示し、またＣＤ２５（ＩＬ−２Ｒ／ｐ５５）などの活性化分子はこれらの実験条件では発現されず、あるいはＤＲ抗原決定因子の場合にあるようにＬＯ−ＣＤ２ａにより修飾されない（図４）。
【００６２】
ＰＢＭＣが６日間ＬＯ−ＣＤ２ａの存在下で保温された時、Ｌｅｕ−５ｂ＋ゲート化リンパ球の割合の著しい減少が観察された（図５）。ＣＤ４−およびＣＤ８−リンパ球の割合は培養６日間にＬＯ−ＣＤ２ａの存在により影響されず、それはＣＤ２保持リンパ球の観察された減少がこれら細胞の排除に帰因することはできず、かえってＣＤ２分子の消失あるいはＬＯ−ＣＤ２ａの結合により産生されたこの糖タンパク質における立体配座変化によるものであることを示している。
【００６３】
Ｌｅｕ−５ｂ−リンパ球での観察された減少が、ＬＯ−ＣＤ２ａの結合後のＣＤ２の立体配座変化によるものかあるいはこの分子の消失（内在化あるいは放出）によるものであったかどうかを確証するために、ＰＢＭＣがＬＯ−ＣＤ２ａの５００ｎｇ／ｍｌの存在下で培養され、Ｌｅｕ−５ｂ（ＦＩＴＣ標識）、Ｔ１１−ＲＤ１（ローダミン標識）およびＭＡＲＫ−３（ＦＩＴＣ標識）を用いて６日間にわたりフローサイトメトリーで分析された。図６で示されるように、Ｌｅｕ−５ｂあるいはＴ１１ｍＡｂｓはＬＯ−ＣＤ２ａの存在下で２乃至４日の培養後ＰＢＭＣに結合できない。これらの条件の下で、マウス抗ラットカッパ鎖ｍＡｂ  ＭＡＲＫ−３は培養の６日目に細胞の５０％を標識し、それはもとのＣＤ２保持細胞の僅か３５％がその表面にＬＯ−ＣＤ２ａを全然示さず、しかしＬｅｕ−５ｂ−ＦＩＴＣおよびＴ１１−ＲＤ１染色が２日目に著しく減少したことを指示している。これは結合に利用できないＬｅｕ５ＢおよびＴ１１のエピトープを供給するＣＤ２の立体配座変化がＬＯ−ＣＤ２ａに応答して起こることを示唆する。
【００６４】
ＣＤ２＋細胞の平均蛍光の分析は、このマーカーの発現密度がＬＯ−ＣＤ２ａの存在下で時間と共に減少したことを示した。同じような現象が、Ｌｅｕ−５ｂ  ＦＩＴＣ標識あるいは（ＭＡＲＫ−１  ＦＩＴＣ標識で明らかにされた）ＬＯ−ＣＤ２ａのいずれかがＣＤ２＋リンパ球を検出するため使用されたかどうかを観察された。同一ＰＢＭＣのアリコートがＬｅｕ−５ｂ（培養培地で最終濃度１：２でＰＢＳに対し透析された商業的に利用できるｍＡｂ）の存在下で培養された。図５ｂで示されるように、これらの実験条件下で、すべてのＣＤ２の保持細胞は（ヤギ抗マウス−ＦＩＴＣで明らかにされるように）Ｌｅｕ−５ｂ  ｍＡｂにより被覆される。Ｔ１１−ＲＤ１による染色は著しく減少し、一方より小さくよりゆっくりとした減少がＬＯ−ＣＤ２ａ−ＦＩＴＣ  ｍＡｂにより認識されたエピトープを提出する細胞の割合で観察された。これらの結果をまとめると、ＣＤ２分子はＬＯ−ＣＤ２ａに応答してその立体配座を部分的に変化させ、またＣＤ２／ＬＯ−ＣＤ２ａのゆるやかな調節が起こるということを示している。
【００６５】
ＬＯ−ＣＤ２ａはＭＬＲを阻害する
ラットｍＡｂの増加する濃度の存在下で、ＭＬＣが（６日以上の期間）行われた時（３Ｈ−チミジン（ 3Ｈ−Ｔ）とり込みにより測定されるように）、ＭＬＲの著しい阻害が１２５ｎｇ／ｍｌほどの低いｍＡｂの濃度で観察された。図６ａにおいて、我々はＬＯ−ＣＤ２ａによるＭＬＲ阻害の用量−応答曲線の典型的な例を示す。この図６ａで見ることができるように、ＬＯ−ＣＤ２ａは２５０ｎｇ／ｍｌで（培養６日の）ＭＬＲの８０％の阻害を誘導し、この阻害の割合は広い範囲の濃度（０．２５乃至５．０μｇ／ｍｌのｍＡｂ）にわたり殆ど一定もしくは８０％以上に留まる。図７は培養０日から６日までのＭＬＲに対するＬＯ−ＣＤ２ａの異なった濃度の阻害作用の時間経過を示す。（ＬＯ−ＣＤ２ａの存在下あるいは不在下で）、ＭＬＣに対する 3Ｈ−Ｔとり込みの典型的な例が図６ｃで示され、ここでＬＯ−ＣＤ２ａは２００ｎｇ／ｍｌの最終濃度で加えられた。
【００６６】
図７では、（２００ｎｇ／ｍｌでの）このｍＡｂがＭＬＣの開始後異なった時間で加えられる時のＭＬＲに対するＬＯ−ＣＤ２ａの作用が示される。（ 3Ｈ−Ｔとり込みで測定されるように）、ＭＬＲの９０％以上の阻害が、このｍＡｂが０日で加えられた時に得られ、またこの阻害作用は、ＭＬＣの開始４日後にＬＯ−ＣＤ２ａが加えられる時に（この実施例では４５％の）阻害作用がまだ存在する。（示されてはいないが）同様の結果がＬＯ−ＣＤ２ａの（０．２０乃至５．０μｇ／ｍｌの）より高い濃度で得られた。
【００６７】
ＬＯ−ＣＤ２ａはＩＬ−２Ｒ発現の経路を遮断する
細胞蛍光写真撮影分析がＭＬＣのリンパ芽球サブセットについて行われた時（図８ａおよび８ｂ）、下記の観察が行われた：ａ）ＭＬＣの開始時に既に存在した芽細胞の数（分析された２５，０００事象の約３００−５００芽細胞）が対照培養内で４日から６日までに急激に上昇した（分析された２５，０００事象から１２００芽細胞以上）；ｂ）ＬＯ−ＣＤ２ａの存在下で行われたＭＬＣで、培養全期間中芽細胞の数に著しい変化はなく、また６日目では芽細胞数は０日での最初の芽細胞数より絶えず低いかあるいは殆ど同じ位である（図８ａ）；ｃ）ＣＤ２５芽細胞の割合はＬＯ−ＣＤ２ａなしで保温された細胞の中で急激に上昇した（図８ｂ）；ｄ）この割合はｍＡｂの存在下で保温されたＭＬＣからの小数の芽細胞の中で２０％以下に留まり（図８ｂ）、また平均蛍光（ＣＤ２５発現の尺度としてのもの）は対照培養で存在する芽細胞と比較して７５％減少した（結果は示されていない）；ｅ）ｍＡｂの不在下では、ＣＤ３−芽細胞の割合は培養の最初の４日間は一定に留まり（図８ｂ）、また６日目にはＣＤ３細胞の割合は９０％に増加し、一方ＬＯ−ＣＤ２ａの存在下ではＣ３−の割合はゆっくりと上昇し６日目でようやく約４５％に達した。これらの結果は、ＬＯ−ＣＤ２ａの存在がＩＬ−２受容体（ＣＤ２５）の発現により特徴付けられる活性化の経路でこれらの細胞の入場を阻害することを示している。ＣＤ２＋芽細胞の数はＬＯ−ＣＤ２ａの存在下では一定に留まるかもしくは減少し、またこの膜マーカーの発現密度はこれらの条件の下では強く減少する（データは示されていない）。
【００６８】
表現型分析がＭＬＣの休止（非芽細胞）リンパ球サブセットに関し６日を通じて行われた時、図４で示されたものに類似の結果が得られた：ＬＯ−ＣＤ２ａの存在下では、対照培養と比較してＣＤ３＋、ＣＤ４＋あるいはＣＤ８＋リンパ球の割合には何ら著しい変化が検出できなかった；培養の６日間でＬＯ−ＣＤ２ａの存在下あるいは不在下に拘らずＣＤ２５発現（活性化マーカー）は検出できなかった（図９）。これらの結果は、ＬＯ−ＣＤ２ａがもしあるとしてもＭＬＣでＴリンパ球の休止サブセットに非常に弱い作用しか持たないことを示唆している；すなわちＴ細胞が活性化の過程で拘束されない。同時に、図８ｂで示されるように、ＬＯ−ＣＤ２ａはＭＬＣの間ＣＤ２＋リンパ球の割合の著しい減少を誘導する。これらの結果は、非刺激培養（図６）およびＭＬＣの両方において、ＬＯ−ＣＤ２ａの作用はＣＤ２の発現を減少させ、およびもしくはその構造に立体配座変化を誘導することである。
【００６９】
ＬＯ−ＣＤ２ａは、ＴｃＲ／ＣＤ３複合体あるいはミトゲン受容体に依存するＴ細胞活性化の経路を遮断することができる。
【００７０】
ＬＯ−ＣＤ２ａがミトゲン活性化ＰＢＭＣに付加された時、 3Ｈ−Ｔとり込みの著しい阻害が観察された。培養の開始０時間あるいは１時間後のいずれかで加えられるＬＯ−ＣＤ２ａの存在下あるいは不在下で、ミトゲン（ＯＫＴ３、ＣｏｎＡおよびＰＨＡ）で保温されたＰＢＭＣの３個の実験の一つであった。第一の場合、ミトゲンは１時間後に加えられた。ＬＯ−ＣＤ２ａが培養の開始１時間後に加えられた時、ミトゲンは０時間で加えられた。これはミトゲンあるいはＬＯ−ＣＤ２ａでのＰＢＭＣの前保温が、二次試薬の追加で影響され得る事象を誘発できたかどうかを知るために行われた。培養は 3Ｈ−Ｔでパルス標識（６時間）の後、９６時間で収集された。 3Ｈ−Ｔとり込みの５０％以上の阻害がそれが最初にあるいはミトゲンの後で加えられるかどうか、ＬＯ−ＣＤ２ａの存在下で観察された（図１１）。細胞がＭＬＣの開始４日後に収集されミトゲンに露出された時同じ作用が観察された（データは示されていない）。ミトゲンのみを受け入れる同じ培養と比較して、ミトゲンおよびＬＯ−ＣＤ２ａ両方を受け入れた培養において、 3Ｈ−Ｔとり込みの劇的な減少がＭＬＣの開始２日後に観察された（結果は示されていない）。ミトゲン追加前のＬＯ−ＣＤ２ａでのＭＬＣの前保温は、ＯＫＴ３なしでのＭＬＣでの比較できる値に3 Ｈ−Ｔ−とり込みを下げた。
【００７１】
ＬＯ−ＣＤ２ａはまた、ミトゲン誘導増殖の開始１日後に加えられたならば、ミトゲン誘導増殖を阻害することができた。２個の供与体で行われた実験の結果が図１０で示される。ＰＢＭＣはミトゲン（ＯＫＴ３、ＣｏｎＡおよびＰＨＡ）と共に保温された。これらの実験で、ＬＯ−ＣＤ２ａは培養開始前時間０（０日）、２４時間（１日）あるいは４８時間（２日）の時点で加えられた。ＬＯ−ＣＤ２ａによるＯＫＴ３およびＣｏｎＡに応答する増殖の阻害は、０時点でミトゲンの追加２４時間後に加えられたならば著しいものがあった。
【００７２】
〔実施例３〕
ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）活性の阻害
ＰＢＭＣはフィコール・ハイパーク沈降法によりヘパリン化血液から分離された。洗浄の後、富化培地に懸濁されたエフェクター細胞は（付着により）単核細胞を除去するために、ファルコン平板に１×１０6 ／ｍｌの濃度で一晩保温された。
【００７３】
標的細胞（Ｋ５６２細胞系）は51クロム51Ｃｒ（３×１０6 ／ｍｌでの細胞懸濁液の０．９ｍｌ＋５ｍＣｉ／ｍｌ51Ｃｒの溶液からの０．０２ｍｌ、エイマシャム）で一晩保温することにより標識された。
【００７４】
１６時間保温の後、エフェクター細胞および標的細胞は４回洗浄され、計数され、異なったＥ／Ｔ比（エフェクター細胞／標的細胞比）：２００／１（４×１０6 ／ｍｌエフェクター細胞の懸濁液１００ｕｌに２×１０4 ／ｍｌ標的細胞１００ｕｌ）、１００／１、５０／１および２５／１で９６Ｖ底マイクロ平板で保温された。
【００７５】
４時間保温の後、51Ｃｒの放出はガンマカウンターで各ウエルからの上澄み１００μｌを計数することで測定された。
【００７６】
最大（標的細胞＋ＨＣＬＩＮ）および自発放出（標的細胞＋富化培地）が比溶解度を計算するために使用された：
【００７７】
【数１】
0004808841.tif 000002
【００７８】
２個の正常供与体でのＮＫ検定での５ｕｇ／ｍｌ、１ｕｇ／ｍｌ、および０．５ｕｇ／ｍｌでのＬＯ−ＣＤ２ａの細胞含有物（図１０ａおよび１０ｂ）が抗体のすべての試験された濃度およびすべての試験されたＥ／Ｔ比率にわたり約５０％の細胞毒性の阻害に導いた。これは０．２５ｕｇ／ｍｌの用量であるいはそれ以上の用量のＭＬＲでの増殖の基本的に完全な阻害と比較したものである。
【００７９】
〔実施例４〕
非ヒト霊長類での生体内研究
材料と方法
モノクローナル抗体
ＭＡＲＫ３−ＦＩＴＣはＦＩＴＣで接合されたラットＩｇカッパ１ｂアロタイプに対して指向されたマウスｍＡｂである。ＭＡＲＧ２ｂ−ビオチンはビオチンで接合されたマウス抗ラットＩｇＧ２ｂ免疫グロブリンｍＡｂである。これら２個のｍＡｂｓが我々の研究室で産生され標識された。免疫蛍光試験のために、これらのｍＡｂｓは２．５μｇ／ｍｌの最終濃度で使用された。Ｌｅｕ−５ｂ−ＦＩＴＣ（ベクトン−ディキンソン）およびＴ１１ローダミン（コールター）は２個のマウス抗ヒトＣＤ２ｍＡｂｓである。Ｔ４−およびＴ８−ローダミン標識（コールター）はそれぞれマウス抗ヒトＣＤ４およびＣＤ８ｍＡｂｓである。
【００８０】
表現型分析
抗ヒトＴ細胞ｍＡｂｓ（抗−ＣＤ２、−ＣＤ４、−ＣＤ８、前記参照）が全血の１００μｌサンプルに加えられ、４℃で４５分保温された。赤血球はトリス緩衝塩化アンモニウム溶解緩衝液（塩化アンモニウム１４４ｍＭ／トリス１７ｍＭ、ｐＨ７．２）で溶解され、リンパ球はＰＢＳ／ＦＣＳ２％／ＮａＮ３、０．２％で洗浄された。非標識ｍＡｂｓの検出のために、第二ｍＡｂ（ＦＩＴＣ−あるいはビオチン−接合体）が２．５μｇ／ｍｌの最終濃度に加えられた。４℃で４５分保温の後、細胞はＰＢＳ／ＦＣＳ／ＮａＮ３で洗浄された。ビオチン化ｍＡｂｓのために、ストレプトアビジン−フィコエリスリン接合体での保温（１５分）が行われた。標識ヒトあるいはサルリンパ球が２％ホルマリン溶液に再懸濁され、サイズ対粒度の関数としてリンパ球をゲート化するための溶解IIプログラムを備えたファクソン・サイトフルオロメーター（ベクトン・ディキンソン）で分析された。非特異的染色のための対照として、細胞のアリコートがＦＩＴＣ−あるいはフィコエリスリン接合マウスＩｇｓ（コールター）で保温された。
【００８１】
循環Ａｂｓのレベル
血清のＬＯ−ＣＤ２ａが、マウス抗ラット１ｇＧ２ｂ  ｍＡｂ（我々の研究所で産生されたＭＡＲＧ２ｂ−８）を第一層（被覆物）としまた検出のためにホースラディッシュペルオキシダーゼに結合されたマウス抗ラットカッパ鎖（ＭＡＲＫ−３）ｍＡｂを用いてエリザで定量された。要約すると、マイクロタイタ平板（ファルコン）がＭＡＲＧ２ｂ−８（５μｇ／ｍｌ）の１００μＬ／ウエルで一晩保温され、プラスチックの未占有部位が粉ミルク（ウシ）５％を含むＰＢＳで飽和された。室温で１時間保温の後、平板はトウィーン−２０、０．１％を持つＰＢＳで洗浄され、また希釈サルあるいはヒト血清の１００μｌ／ウエルで保温された。未結合材料を洗い出した後、平板は１時間１００μｌ／ウエルのＭＡＲＫ３−ペルオキシダーゼ（ＰＢＳ内で２μｇ／ｍｌ）で保温された。再度洗浄の後、平板は過酸化水素０．０３％を含むクエン酸塩−リン酸塩緩衝液でＯＰＤ（Ｏ−フェニレンジアミン−ジヒドロクロライド、０．４ｍｇ／ｍｌ、シグマ・ケミカルズ）で保温された。染色反応産物は４９２ｎｍで検出された。標準曲線は対照サルあるいはヒト血清のプールで連続希釈された精製ＬＯ−ＣＤ２ａの既知の濃度と平行して作られた。
【００８２】
サルあるいはヒト抗ＬＯ−ＣＤ２ａ抗体の検出は、ＬＯ−ＣＤ２ａ（５μｇ／ｍｌ）で被覆された９６ウエルマイクロタイタ平板を用いるエリザにより実行された。平板に結合する抗ＬＯ−ＣＤ２ａヒトあるいはサル抗体は、ラット抗ヒトＩｇＭ（ＬＯ−ＨＭ−７）あるいはＩｇＧ（ＬＯ−ＨＧ−２２）ｍＡｂｓで標識されたホースラディッシュペルオキシダーゼにより明らかにされた。
【００８３】
Ａ．シノモルグスサル
一匹のシノモルグスサルが３連続日にわたりＬＯ−ＣＤ２ａを１０ｍｇ／日受けた。モノクローナル抗体は充分に耐性であった。
【００８４】
リンパ球喪失が最初の注射後に観察されたが、２回および３回目の注射後には非常に僅かの追加喪失があったに過ぎなかった。
【００８５】
第二のサルは１０日にわたり２０ｍｇ／日を受けた。ｍＡｂは同じく充分に耐性であった。用量投与後副作用は観察されず、そこで動物は活性があり、用心深く、よく餌を食べ同時に嘔気あるいは胃腸障害の証拠はなかった。
【００８６】
第二のサルのリンパ球の総数および細胞集団は図１５および１６で要約される。ＮＫ活性は１０回注射後に僅かではあるが減少した（図１７）。ＭＡｂの循環レベルは非常に高く（図１８）、また免疫化は処置の終りに生じた（図１９）。
【００８７】
Ｂ．ヒヒ
ＬＯ−ＣＤ２ａに対するヒヒの耐性を決定し、またこのｍＡｂのヒヒリンパ球の膜マーカーのいくつかに対する作用を分析しかつ血清におけるＬＯ−ＣＤ２ａの半減期を決定するためにここで記載された実験が始められた。
【００８８】
ＬＯ−ＣＤ２ａでのヒヒ細胞の染色は染色ヒト細胞のそれよりも著しく低い平均蛍光強度で正の細胞が２０％以下に帰着する。この染色パターンはヒヒ細胞とのＦｃ相互作用を経由する弱い交差感受性あるいは結合を反映する。
【００８９】
この研究は８．８Ｋｇの体重の雄ヒヒ（パピオ・モルモン）について行われた。ＬＯ−ＣＤ２ａの各注射の前に、サルは麻酔された。麻酔は第１回目はケテーラー（２ｍｌ）およびプラジン（０．５ｍｌ）、第２回目はケテーラーのみで続く回にはケテーラーおよびプラジン（０．３ｍｌ）であった。ＬＯ−ＣＤ２ａは生理食塩水１００ｍｌで希釈されて、静脈内（ｉ．ｖ．１０分）で注射された。リンパ球の表現型分析および循環抗体（注射されたＬＯ−ＣＤ２ａ、新しく形成された抗ＬＯ−ＣＤ２ａ抗体、および前から存在していた交差反応性ヒヒ抗ＬＯ−ＣＤ２ａ抗体）の測定のために、血液サンプル（１０ｍｌ）が、２個の管に取られた。リンパ球型別のための管はＥＤＴＡを含んでいた。サンプルは基準線レベルを決定するために最初の処置の前に採取された。
【００９０】
ＬＯ−ＣＤ２ａの最初の用量（１０ｍｇ）が研究の０日に投与された。続く４個の用量（１０ｍｇ／用量）は７、８、９、および１０の日に投与された。血液サンプルは各ＬＯ−ＣＤ２ａ用量後２−３分で採取された。７日および９日に（ＥＤＴＡ含有管で）補足血液サンプルが同じくＬＯ−ＣＤ２ａ注射の前に採取された。血液サンプルは１、２、１１、１２、１３、１６および２４日に採取された。
【００９１】
ＬＯ−ＣＤ２ａ注射の期間あるいはこの研究の期間を通じて異常な活性の反応あるいは食餌習慣は観察されなかった。動物の体重は０日に測定された約８．８Ｋｇに留まった（下記の表を参照されたい）。
【００９２】
０日から２４日までのヒヒの体重（Ｋｇ）
日      ０    ７    ８    ９    10    12    13    16    24
体重   8.8   8.9   9.1   9.1   8.8   9.0   9.1   8.9   8.9
表現型および循環ｍＡｂの分析
このヒヒの末梢血リンパ球の蛍光染色はいくつかの興味深い特性を明らかにした：
ａ）ＬＯ−ＣＤ２ａの作用の下で、リンパ球のＣＤ２−正サブセットは、ＬＯ−ＣＤ２ａの第５回投与の終結の際に、つまり血液中でｍＡｂの最大の累積の時点で（２個の異なった抗ＣＤ２ｍＡｂｓにより明らかにされたように）著しく減少した（図２０ａおよび２０ｂを参照されたい）。リンパ球のＣＤ４＋およびＣＤ８＋サブセットがこの期間に減少しないという仮定で（図２２）、またＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞が大抵のＣＤ２保持リンパ球を含むために、ＣＤ２+ 細胞における減少は立体配座において減少しているかあるいは変化するものはリンパ球よりも膜マーカー発現であることを示している。
【００９３】
（図２０ａ）で見ることができるように、ＬＯ−ＣＤ２ａの最初の用量後にＣＤ２＋（Ｌｅｕ−５ｂ+ あるいはＴ１１+ ）正リンパ球の僅かな減少が観察される。この最初の用量の２日後に、ＣＤ２正細胞（Ｔ１１+ のＬｅｕ５ｂ+ ）のレベルは出発時の値に上昇した。
【００９４】
ＬＯ−ＣＤ２ａの４回２４時間間隔をあけた用量の終結時点（７日−１０日）で、ＣＤ２正細胞（Ｌｅｕ５ｂ+ あるいはＴ１１+ ）の割合は急激に減少し、またＬＯ−ＣＤ２ａ投与の終結３日後にゆっくり上昇を開始した。
【００９５】
ｂ）同時に、ＬＯ−ＣＤ２ａ正細胞の割合、すなわち、循環ｍＡｂにより結合された細胞の割合はＬＯ−ＣＤ２ａの第２回用量（７日）の後２２％に上昇し、次いで、抗ＣＤ２ｍＡｂｓ  Ｌｅｕ５ｂおよびＴ１１により明らかにされたＣＤ２+ 細胞がそうであったように減少した（図２０）。ＬＯ−ＣＤ２ａ＋細胞の減少はＭＡＲＫ−３ＦＩＴＣ  ｍＡｂにより明らかにされた（図２１）。
【００９６】
ＬＯ−ＣＤ２ａ＋細胞の減少は、ＭＡＲＫ３−ＦＩＴＣにより、あるいはＭＡＲＧ２ｂ−８−ビオチン接合ｍＡｂｓにより検出された細胞に存在するＬＯ−ＣＤ２ａの検出により決定された（図２１ａ）。同じ現象は、もしも細胞が循環ｍＡｂにより占められていないすべての部位を飽和するために２．５μｇ／ｍｌでＬＯ−ＣＤ２ａでまず保温されたかどうかが観察された。ＬＯ−ＣＤ２ａはＭＡＲＫ−３−ＦＩＴＣあるいはＭＡＲＧ２ｂ−８−ビオチンにより検出された（図２１）。
【００９７】
ｃ）（図２２）で見ることができるように、ヒヒリンパ球のＴ４正サブセットは９日から１２日までの間に適度の上昇を示し、その後Ｔ４+ リンパ球の割合は当初の値に戻った。Ｔ４+ 細胞の上昇に附随して、Ｔ８正リンパ球の割合は９日から１１日までに上昇した。その日以後、この割合は当初の値に戻った。
【００９８】
ｄ）循環ｍＡｂ  ＬＯ−ＣＤ２ａのレベルは最初の注射３日後に目立たない値にまで減少した（図２０ｂ参照）。ＬＯ−ＣＤ２ａが４回の短時間間隔の用量を適用される時（７日から１０日）、血清ＬＯ−ＣＤ２ａのレベル（約３．７ｍｇ／ｍｌ、この期間での最大値）は最後の用量（１０日から１６日）後にゆっくり減少し、これはこの動物モデルでＡｂの半減期が相対的に長いことを示している。１１日，１２日，１３日，１６日および２４日に採取された血液サンプルではヒヒ抗ＬＯ−ＣＤ２ａ抗体は検出されなかった。
【００９９】
〔結論〕
ＬＯ−ＣＤ２ａはシノモルグスサルヒヒで明らかな反応の不在により示されるように、非ヒト霊長類により十分寛容であるように見える。ＬＯ−ＣＤ２ａはヒヒにおいて相対的に長い半減期を持つように見える。ＬＯ−ＣＤ２ａの最初の用量の２４時間後（図２７の１日目）、ＭＡｂの最大検出レベルの５０％がまだ血清に存在していた。ＬＯ−ＣＤ２ａの最後の用量の３日後（図２７の１３日目）、ｍＡｂの最大検出レベルの５０％がまだ血清に存在していた。
【０１００】
非ヒト霊長類での染色パターンがヒト細胞に対するＣＤ２で観察されたものと一致しないけれども、ＣＤ２正リンパ球の割合の減少に続き細胞のこの割合のゆるやかな上昇は、ＬＯ−ＣＤ２ａの存在下で培養されたヒトＰＢＭＣ単核細胞で観察されたものと類似している。
【０１０１】
〔実施例５〕
ＬＯ−ＣＤ２ａで処置された患者
思いやりのある基礎に基づくＬＯ−ＣＤ２ａで処置された患者
患者＃１（Ｍｂ．Ｅ．）
これは末期腎不全のために腎同種異系移植を処置された慢性腎盂腎炎を持つ女性の患者であった。拒絶発症が起こり、１０日間ＯＫＴ３で処置された。クレアチニンレベルは２乃至１．４ｍｇ／ｄｌまで低下した。約４ケ月後、拒絶発症は２ｍｇ／ｄｌのクレアチニンレベルおよび適度の拒絶を示す生検により診断された。患者はソルメドロール１．５ｇおよび続く８日間ＡＴＧのコースで処置され、その時点でクレアチニンレベルは１．６５ｍｇ／ｄｌであった。処置７日後、生検が行われ、それは細胞拒絶および適度な血管拒絶を示した。生検（０日）の２日後、患者は２．４ｍｇ／ｄｌのクレアチニンレベルで無尿症となった。同日患者はＬＯ−ＣＤ２ａ、１０ｍｇ、コルチコステロイド・ソルメドロール１．５ｇ、プラス、ポラリミン１ｇ（抗ヒスタミン）およびダファルガン１ｇ（アセトアミノフェン）を受けた。コルチコステロイド、デキスクロロフェニルアミンおよびアセトアミノフェンでの処置は移植社会により「適用範囲」（ｃｏｖｅｒａｇｅ）として引用される。副作用は認められなかった。２３時間の終りまでに、患者は７００ｍｌの尿を出し、クレアチンは２．７２ｍｇ／ｄｌであった。次の９日間に、彼女はＬＯ−ＣＤ２ａを１０ｍｇ／日受けた。患者は１１日の時点で追跡生検を受けることなく病院を離れた。
【０１０２】
ＡＴＧ処置の間および続くＬＯ−ＣＤ２ａ処置の間での血清クレアチニンレベルの測定は、クレアチニンレベルがＡＴＧ処置にも拘らず上昇し、次いで下降してＬＯ−ＣＤ２ａで安定化されたことを示した（図３１，３２）。
【０１０３】
白血球総数はＬＯ−ＣＤ２ａでの処置の期間に、１０，０００個の最高水準から２０００個まで低下し２１日目の最終の測定まで低下を続けた（図２３）。リンパ球総数は低く観察の期間中に変化していた。
【０１０４】
ＬＯ−ＣＤ２ａの血清レベルは各処置に続き直ちに２．０−３．０μｇ／ｍｌの最大値に上昇し、各処置の間で約１．０μｇ／ｍｌの最低値に低下した（図２４）。９日目の最後の処置で、このレベルは２４時間に５０％低下し、１４日目には０になった。この患者は４０日に外来に戻った。
【０１０５】
患者のクレアチニンレベルは４０日で２．２７、５０日で２．４８であり、６６日では３．１１まで上昇し、この時点で生検が激しい細胞拒絶および間隙出血と一致する最初の報告と共に得られた（以下を参照のこと）。患者は腎に１５０Ｒの照射、３×１２５ｍｇのソルメドロールで処置され、一方シクロスポリンおよび１２．５ｍｇ／日のステロイドでの薬物維持療法が続けられた。クレアチニンレベルは続く期間中は上昇を続けた。７０日にクレアチニンレベルは３．３、８０日に５．６３、８４日には８．３５であった。８６日にはクレアチニンレベルは１０．８となり、移植腎摘出が８８日に行われた。この患者の１０日の排泄と６６日生検の間の期間の維持免疫抑制を伴う患者のコンプライアンスは疑問であり、また明らかに成功した救助であるにも拘らず腎の喪失が不確かなコンプライアンスの要因となるに違いない。
【０１０６】
（ii）患者＃２
この患者はＣ型肝炎を患った３８歳の男性であった。彼は慢性間隙性腎症（ネフロパシー）に帰因する末期腎不全の処置のために腎同種異系移植を受けた。１年３ケ月後、彼は一連のＯＫＴ３に耐性の急性細胞および血管拒絶のため移植腎摘出を受けた。
【０１０７】
移植腎摘出から１年１０ケ月に、彼は２回目の腎同種異系移植を受けた。３日後、彼のクレアチニンレベルは１．４ｍｇ／ｄｌであった。３日後彼はソルメドロール５００ｍｇを受けた。その日の後患者のクレアチニンは１．８ｍｇ／ｄｌであった。次の日彼はソルメドロールの５００ｍｇを受けた。クレアチニンは３．２５ｍｇ／ｄｌであった。次の日彼はソルメドロール５００ｍｇを受けた。彼のクレアチニンは２．９５ｍｇ／ｄｌであった。３日後彼のクレアチニンレベルは２．３ｍｇ／ｄｌであり、彼は生検を受けそれは３プラスの細胞性拒絶を示した。３日後彼はＬＯ−ＣＤ２ａ、１０ｍｇ、およびソルメドロール２００ｍｇポララミンおよびダルファガンを受けた。観察された副作用は眠気さに限定された。高熱あるいは高血圧は認められなかった。次の９日間彼は毎日ＬＯ−ＣＤ２ａ、１０ｍｇの処置を受けた。このような処置の終りの次の日生検は拒絶反応を示さなかった。
【０１０８】
患者はＬＯ−ＣＤ２ａのコースで十分な耐性を示し、どのような用量でも熱あるいは高血圧もなく臨床副作用の何らの徴候も示さなかった。処置のコースの間に得られたいつもの血液学および臨床化学実験室検査（ＬＦＴｓを含む）は、リンパ球総数が２９０／立方mmから１００／立方mmの最低値に減少し、また拒絶発症の消炎と関連するクレアチニンレベルの減少（ＬＯ−ＣＤ２ａの処置の開始で２．７ｍｇ／ｄｌからコース終期での１．１０への減少）したことを除き、抗体の投与に帰属する何らの変化も示さなかった。
【０１０９】
図２５はＬＯ−ＣＤ２ａの処置に続く日々に２．５から約１．０まで低下したこの患者の血清クレアチニンレベルを示す。患者は処置の前および処置の間リンパ球減少症であり、白血球数は処置によって何ら劇的な変化を示さなかった（図２６）。この患者では、ＬＯ−ＣＤ２ａの血清レベルは各処置後２．０μｇ／ｍｌ以上に上昇せずまた１．０から０．２５μｇ／ｍｌの最低値に低下した（図２７）。ＬＯ−ＣＤ２ａでの処置の８ケ月後、患者は正常な腎機能で身体が丈夫であり、再発性拒絶の徴候はなかった。
【０１１０】
患者２−生検＃１−診断：不確定
生検は目立たない約２０個の糸球を含んでいた。散在する単核性浸潤および少ない度合いの間隙性水腫があった。少ない度合いの管状浸入のみが見出されたが血管外傷はなかった。これらの発見は急性細胞性拒絶の診断には不十分である。小動脈にはまれに単核細胞が存在したがこれは疑わしく、しかし拒絶の診断の判定基準には合致しなかった。
【０１１１】
患者２−生検＃２、最初の生検の約２週間後のもの−診断上異常は認められなかった。
【０１１２】
この生検は前の生検に類似しているように見え、約１０個の糸球を含んでいた。浸潤は非常にまばらであり血管外傷は確認されなかった。
【０１１３】
（iii ）患者＃３
この患者はフォン・ヴィレブランド病にかかった１９歳の男性であり、慢性腎盂腎炎に起因する末期腎不全の処置のため腎同種異系移植を受けた。６日コースのＯＫＴ３が失敗した後で二次高血圧での急性血管拒絶のため移植片は１７日後に除去された。
【０１１４】
５ケ月半後に彼は第二回目の腎同種異系移植を受けた。１０日後彼のクレアチニンレベルは６ｍｇ／ｄｌであった。その翌日クレアチニンレベルは７ｍｇ／ｄｌであり生検は３プラス細胞性拒絶および血管拒絶（壊死あるいは血栓症のない増殖性動脈内膜炎）を示した。その同日、彼はＬＯ−ＣＤ２ａ、１０ｍｇ、ソルメドロールおよびポララミンならびにダファルガン４０ｍｇを受けた。副作用は観察されなかった。次の９日間、彼は毎日、他の薬剤あるいは副作用なしでＬＯ−ＣＤ２ａ、１０ｍｇの処置を受けた。処置の完了の２日後、彼のクレアチニンレベルは１．７５ｍｇ／ｄｌであり、生検は間隙性壊死および１個所慢性拒絶の病巣はあったが、急性拒絶の徴候は示さなかった。
【０１１５】
臨床的副作用（ＢＰあるいは温度の変化）は観察されなかった。日常の血液学および臨床化学実験室試験（ＬＦＴｓを含む）は、拒絶発症の消炎に伴うクレアチニンレベルの減少（ＬＯ−ＣＤ２ａの処置開始時の７．１０ｍｇ／ｄｌから１０日間コースの終期での１．７５ｍｇ／ｄｌ）を除き、抗体の投与に帰属する変化を示さなかった。リンパ球数は処置前３４０／立方mmであり、処置中に２２０／立方mmの最低値に低下し、ＬＯ−ＣＤ２ａでの処置の中止９日後に６９０／立方mmに上昇しまた処置終期の２３日後に１０００／立方mmにまで上昇した。
【０１１６】
この患者の白血球数は処置により著しく変化しなかった（図２８）。血清クレアチニンレベルは処置で劇的に低下した（図２８）。ＬＯ−ＣＤ２ａでの最初の処置７ケ月後に、患者は正常な腎機能で身体は丈夫になり、再発性拒絶の徴候は存在しなかった。
【０１１７】
患者３−生検＃１−診断：小動脈およびそれより低い度合いで間隙ならびに糸球に影響する危険な細胞拒絶
弓状型動脈は弾性線維の破壊を伴う内膜への著しい単核浸潤を示した。時々細管に侵入した間隙にまばらな浸潤巣が存在した。間隙は拡散した軽い間隙水腫を示した。約７個の糸球が存在した。これらは単核細胞での細胞過剰症および内皮腫脹を示した。全体に、このパターンは重い急性細胞拒絶の症状を示した。
【０１１８】
患者３−生検＃２、最初の生検約２週後−診断：処置された拒絶と一致
生検は時々ムコイド物質を持ちしかしごく少量の細胞浸潤巣を持つ内膜線維症を示す２、３の小動脈を示した。間隙は微細な拡散線維症および最少の単核浸潤巣を示した。細管は局部的に萎縮性であったがそれ以外は目立たなかった。活性細胞拒絶の徴候は存在しなかった。
【０１１９】
患者の免疫抑制療法でコンプライアンスに留まった第２および第３の患者の追跡治療での２８ケ月間にはその後拒絶症状の出現は報告されなかった。
【０１２０】
（iv）患者＃４
同種異系骨髄移植の後、重い対宿主性移植片病（高用量のプレドニゾン投与に対し耐性である重い皮膚、消化管、腎および中枢神経系毒性）を患う患者が１２日間ＬＯ−ＣＤ２ａを１０ｍｇ／日を受けた。彼の症状は改善した。腎機能は正常に戻り、下痢は止まり、皮膚は改善されまた錯乱状態は消散した。４日後抗体は停止され、症状は再発し、患者は抗体の第２回コースの開始にも拘らず死亡した。
【０１２１】
ＬＯ−ＣＤ２ａは、かくして外部組織（同種異系および異種、というのはそれが同種異系ＭＬＲと同じように異種ＭＬＲを阻害するためである）に対する進行中の免疫応答を逆転するために使用することができた。抗体は１０日から１４日にわたり、１日１回乃至２回静脈内注入により与えられるであろう。それはまた器官移植に続いて直ちに誘導実験記録の一部としてＴ細胞の活性化を阻害するために予防的に使用することができるかもしれない。
【０１２２】
２回目の実験、フェーズＩ安全性、において、薬物動態および用量決定臨床試験が、急性拒絶症状の出現を証明された最初の生検を受けた腎同種異系移植片受容体で開始された。この試験で使用された抗体調製物は細胞培養で生産されたＬＯ−ＣＤ２ａである。
【０１２３】
抗体の思いやりのある使用は副作用を示さず、また１０日間１０ｍｇ／日の用量で急性移植片拒絶を逆転するのに有効であることを示唆した。チンパンジーを用いる予備臨床研究は、類似の生体内効果が明らかな副作用なしで０．１−１００ｍｇ／日にわたるヒト用量に等しい用量で観察されたことを示唆した。従ってこのフェーズＩ試験の目的は、最小有効量の目安を得るために、１０日間（選択肢の延長として追加の５日間）１０ｍｇ／日で開始するＬＯ−ＣＤ２ａの用量レベルを減少することを調査することであった。前に記載した思いやり使用患者において副作用がステロイドの「適用範囲」で観察されなかったため、ステロイドの適用範囲なしで鎮痛薬および抗ヒスタミン薬の最小予備処置のみの投与が決定された。これはＬＯ−ＣＤ２ａにより誘導される副作用を予言的に特徴付けるために行われた。
【０１２４】
１１名の患者がこれまでのこのプロトコルの下で登録された。４名の患者は１０ｍｇ／日で処置され、５名の患者は５ｍｇ／日で処置され、また２名の患者は２．５ｍｇ／日で処置された。
【０１２５】
登録された１１名の患者の間で、９名の患者は生検で確認された急性拒絶の逆転あるいは部分的逆転を経験した。その９名は、１０ｍｇ／日でＬＯ−ＣＤ２ａで処置された４名すべての患者、５ｍｇ／日で処置された３名の患者、および２．５ｍｇ／日で処置された２名の患者であった。５ｍｇ／日で処置された患者の１人（下記参照、患者８）は最初の処置の後自発的に研究から退き、また第２の患者（患者９）は劣った応答を示した。
【０１２６】
表１はこのプロトコルの下でＬＯ−ＣＤ２ａで処置された腎拒絶患者で得られた結果を要約したものである。
【０１２７】
【表１】
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【０１２８】
多分サイトカインの一過性放出の結果として、悪心、嘔吐、発熱、悪寒、および高血圧を含むステロイドの適用範囲なしでのＬＯ−ＣＤ２ａで処置の間副作用が観察された。これらの事象の大多数（７０％以上）は最初の用量の投与の間に観察され、それの事象は制限された範囲および継続期間のものであった。例えば、４０℃以上の発熱は観察されず、事象の殆どは発症の時間内に消散した。高血圧あるいは重い下痢症状は観察されなかった。これらの事象の強さおよび出現率ならびに抗体用量との間には明らかな関係がなかった。これらの症状が明らかに不快であったにも拘らず緊急蘇生手段を必要とする事象は存在しなかった。
【０１２９】
第３の実験において、急性腎同種異系移植拒絶の１０名の患者は以下の通りＬＯ−ＣＤ２ａでのステロイドの適用範囲なしで思いやりのある基礎に基づいて処置された。
【０１３０】
２名は１０ｍｇ／日、４名は５ｍｇ／日、また４名は２．５ｍｇ／日で処置された。すべての思いやり使用患者は１０ｍｇ／日および５ｍｇ／日で処置され、２．５ｍｇ／日で処置された患者１人を除いてすべては生検および他の臨床徴候により完全なあるいは部分的拒絶消散の証拠を示した。これらの思いやり使用患者の有害事象プロフィールは、制限された持続時間および範囲の第１用量症状でここで支配的に見られるものと類似していた。
【０１３１】
第４の実験において、ステロイド耐性対宿主性移植片病を持つ６名の患者および１名の肝移植受容者が思いやりのある基礎に基づいてＬＯ−ＣＤ２ａを受けた。これらの患者に対して副作用は報告されなかった。これらの患者に関する短い物語は以下の通りである。
【０１３２】
ＧｖＨＤ（対宿主性移植片病）患者６名のすべてが、１０日連続でＬＯ−ＣＤ２ａ、１０ｍｇの用量を毎日処置され、１時間にわたり静脈内投与された。これに付随して、シクロスポリンおよびステロイドの投与が続けられた。１人を除きすべての人がＧｖＨＤ症状の改善を示した。ＧｖＨＤ症状の消散はｍＡｂ療法の開始３−６日後に始まった。ｍＡｂ療法の下で肝臓ＧｖＨＤの徴候の向上が２名の患者で観察された。ＧｖＨＤの徴候の再発は評価される３名の患者の内２名で見られた。
【０１３３】
７番目の患者は供与体の肝臓を受け入れたが、不幸にもシクロスポリン毒性のため腎不全に伴う手術合併症の結果として敗血症を起こし、骨髄機能を著しく低下させた。彼女の疾患状態のため、外科医は誘導のための現在利用できる免疫抑制剤（ＯＫＴ３、モフェティル、ＦＫ５０６、シクロスポリンおよびＡＴＧ）を用いることにより、割当てられた第２の肝臓で患者にリスクをとらせることを望まなかった。患者は肝移植を受け、移植器官の鉗子利用に先立ち手術開始の間注入される最初の用量として５ｍｇ／日で７日間ＬＯ−ＣＤ２ａの処置を受けた。これに続く用量は低用量のステロイドが与えられた。処置期間の間患者の腎機能は開始されるべき従来の免疫抑制処方に対し十分な改善をみた。患者は移植８週後に何らの拒絶徴候も見せなかった。
【０１３４】
この発明は望ましい実施例において移植片拒絶反応の阻害に向けられるけれども、この発明の範囲はそれに限定されるべきでなく、また目的の何れかおよびすべてでＴ細胞活性化の阻害に一般に有用であることは理解されるべきである。
【０１３５】
〔実施例６〕
キメラ抗体の構築および発現
Ａ．ＬＯ−ＣＤ２ａのＶH およびＶL のクローニングおよび配列化
全ＲＮＡがチャーグウィンの方法（バイオケミストリー、１８巻、５２９４ページ、１９７９年）に従って細胞系ＬＯ−ＣＤ２ａ（ＡＴＣＣ  ＨＢ１１４２３）から分離された。ｍＲＮＡが次いでオリゴテックス−ｄＴ  ｍＲＮＡキット（カリフォルニア、チャッツワース、キアジェン）を用いて調製された。約２００−３００ｎｇのｍＲＮＡがパーキン−エルマー・シータス（コネチカット、ノーフォーク）のＲＮＡ−ＰＣＲキットを用いて逆転写された。反応は４２℃で１時間行われた。ＶH およびＶL 遺伝子の増幅に必要なオリゴヌクレオチド・プライマーは下記の引用例を用いて選択された：１）免疫関連タンパク質の配列、キャバット、他、第５版、１９９１年、２）オーランディ、他、全米科学アカデミー紀要（アメリカ合衆国）、８６巻：３８３３−３８３７（１９８９年）。
【０１３６】
【数２】
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【０１３７】
番号はキャバット、他、１９９１年で示されたアミノ酸残基を引用する。
【０１３８】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が下記の条件を用いてパーキン−エルマーＤＮＡサーマル・サイクラー４８０で行われた：９４℃で５分。９４℃で１分、６０℃で２分、および７２℃で２分よりなる３０サイクル、これに７２℃で５分が続いた。ＤＮＡ断片はキエックス・ゲル抽出キット（カリフォルニア、チャッツワース、キアジェン）を用いてアガロース１％からゲル精製された。断片は次いでカナンゴおよびパンディ、バイオテクニクス、１４巻：９１２−９１３ページ（１９９３年）の方法に従って平滑末端化され、ブルースクリプトＫＳＩＩ- （カリフォルニア、ラホーラ、ストラータジーン）のＳｍａＩ部位に連結された。多重クローンはシーケナーゼTMＴ７ポリメラーゼ・キット（オハイオ、クリーブランド、ユー・エス・バイオケミカル）を用いるジデオキシ鎖終結法により配列された。
【０１３９】
ＰＣＲに固有の潜在的誤り率の故で、少くとも３回異なった反応が行われた。ＬＯ−ＣＤ２ａ  ＶL およびＶH 遺伝子でもっとも普通に観察される配列は図３４、３５、３６および図３７、３８で示され、ここで図３４、３５、３６は天然リーダー配列を含むＬＯ−ＣＤ２ａ  ＶL 鎖のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示している。図３７、３８は天然リーダー配列を含むＬＯ−ＣＤ２ａ  ＶH 鎖のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す。
【０１４０】
図３４、３５、３６で示されるように、リーダー配列はアミノ酸残基−２０乃至−１である。フレームワーク１はアミノ酸残基１乃至２３である。ＣＤＲ１はアミノ酸残基２４乃至３９である。フレームワーク２はアミノ酸残基４０乃至５４である。ＣＤＲ２はアミノ酸残基５５乃至６１である。フレームワーク３はアミノ酸残基は６２乃至９３である。ＣＤＲ３はアミノ酸残基９４乃至１０２である。フレームワーク４はアミノ酸残基１０３乃至１１２である。
【０１４１】
図３７、３８で示されるように、リーダー配列はアミノ酸残基−１９乃至−１である。フレームワーク１はアミノ酸残基１乃至３０である。ＣＤＲ１はアミノ酸残基３１乃至３５である。フレームワーク２はアミノ酸残基３６乃至４９である。ＣＤＲ２はアミノ酸残基５０乃至６６である。フレームワーク３はアミノ酸残基６７乃至９８である。ＣＤＲ３はアミノ酸残基９９乃至１０７である。フレームワーク４はアミノ酸残基１０８乃至１１８である。
【０１４２】
Ｂ．一過性発現のためのベクターへの挿入
２個のベクターがＬＯ−ＣＤ２ａのキメラ軽鎖および重鎖それぞれの発現のため、ロンドンのメディカル・リサーチ・カウンシル（ＭＲＣ）からライセンスされた。９．２キロベース軽鎖ベクター（ｈｃｍｖ−ｖ１１ｙｓ−ｋｒ−ｎｅｏ）はＨｉｎｄＩＩＩ−Ｂａｍ  ＨＩ断片としてヒトカッパ定常部および抗リゾチームのヒト化ＶL 領域のゲノムクローンを含む。８．６キロベース重鎖ベクター（ｈｃｍｖ−ＶｈＬｙｓ−ｇａｍｍａｌ−ｎｅｏ）はＨｉｎｄ  ＩＩＩ−Ｂａｍ  ＨＩ断片としてヒトγ１定常部および抗リゾチームのヒト化ＶH 領域のゲノムクローンを含む。これらのベクターは前田、他、ヒト抗体ハイブリドーマ、２巻：１２４−１３４ページ（１９９１年）により詳細に記述されている。
【０１４３】
天然シグナルペプチドを含むＤＮＡ断片は利用不可能であるため、ＬＯ−ＣＤ２ａのＶ領域はＭＲＣベクターに既に存在するシグナルの背後にクローンされた。シグナル断片を持つ軽鎖Ｖ領域は下記の通り個別のＰＣＲ反応からそれぞれ誘導された２個の断片から構築された：
反応１：ＤＮＡ鋳型はＭＲＣ軽鎖ベクターであった。増幅された断片はシグナルペプチドに加えてフレームワーク（ＦＲ）１の一部を含んでいた。使用された２個のペプチドは以下の通りであった。
【０１４４】
【数３】
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【０１４５】
アンチセンスプライマーは抗リゾチームのＭＲＣベクターでは見出されなかったＬＯ−ＣＤ２ａのＦＲ１配列を含んでいた。ＰＣＲ反応は０．１５キロベースのＨｉｎｄ  ＩＩＩ−Ｔｔｈ  ＩＩＩ断片を産生した。
【０１４６】
反応２：ＤＮＡ鋳型はブルースクリプト内のＬＯ−ＣＤ２ａ  ＶL クローンであった。増幅された断片は（Ｔｔｈ  ＩＩＩ部位から）ＦＲ４の末端までにＬＯ−ＣＤ２ａ  ＦＲ１を含んでいた。ＭＲＣ軽鎖ベクターで見出される３′未翻訳領域はアンチセンス・オリゴヌクレオチドを用いてＬＯ−ＣＤ２ａの３′末端に付加された。使用された２個のオリゴヌクレオチドは以下のものであった。
【０１４７】
【数４】
0004808841.tif 000006
【０１４８】
この反応は０．３５キロベースのＴｔｈＩＩＩ−Ｂａｍ  ＨＩ断片を産生した。双方のＰＣＲ産物はキアックスを用いてゲル精製され、適切な酵素を用いて制限された。ＨｉｎｄＩＩＩ−Ｔｔｈ  ＩＩＩ断片プラスＴｔｈＩＩＩ−Ｂａｍ  ＨＩ断片は次いで３方向連結でブルースクリプトのＨｉｎｄ  ＩＩＩおよびＢａｍ  ＨＩ部位の間で連結された。ＬＯ−ＣＤ２ａの全ＶL 領域プラスＭＲＣシグナルペプチドを含むこの構築物は次いで配列された。
【０１４９】
重鎖ＬＯ−ＣＤ２ａ  Ｖ領域構築物はその５′末端でＭＲＣシグナル配列、および同じくＭＲＣ重鎖ベクターから誘導された長３′未翻訳領域を含んでいる。最終構築物は以下に述べる３種の異なったＰＣＲ反応から作られた：
反応１：ＤＮＡ鋳型はＭＲＣ重鎖ベクターであった。抗リゾチームのＶL およびＶH 遺伝子が同じシグナルを使うために、センスプライマーはＬＯ−ＣＤ２ａ  ＶL 構築物に使用されたもの、すなわち５′ＶL ｌｙｓｓｉｇと同じであった。アンチセンスプライマーは３′ＶH ｌｙｓｓｉｇ：以下のものであった。
【０１５０】
【数５】
0004808841.tif 000007
【０１５１】
この反応はＭＲＣシグナルに加えＬＯ−ＣＤ２ａのＦＲ１の一部を含む０．１６キロベースのＨｉｎｄ  ＩＩＩ−Ｐｓｔ  Ｉ断片を産生した。断片はゲル精製され、制限され、配列化のためＨｉｎｄ  ＩＩＩ−Ｐｓｔ  Ｉ切断ブルースクリプトに連結された。
【０１５２】
反応２：ＤＮＡ鋳型はブルースクリプトのＬＯ−ＣＤ２ａ  ＶH 領域であった。この反応はＶH 領域の殆どを含む０．３キロベースのＰｓｔ  Ｉ−Ｓｔｙ  Ｉ断片を産生した。ＬＯ−ＣＤ２ａのＦＲ３に内部Ｐｓｔ  Ｉ部位があったために、Ｐｓｔ  Ｉ−Ｓｙｔ  Ｉ断片は以下に示す２種のＰＣＲ反応から構築されねばならなかった。
【０１５３】
【数６】
0004808841.tif 000008
【０１５４】
上で示された鋳型ＤＮＡはブルースクリプト内のＬＯ−ＣＤ２ａ  ＶH 、クローン８２−８である。
【０１５５】
反応Ａ：プライマーとしてオリゴ１および２として引用されるオリゴヌクレオチドを用いて、０．２キロベース断片を産生する。
【０１５６】
【数７】
0004808841.tif 000009
【０１５７】
反応Ｂ：プライマーとしてオリゴ３およびオリゴ４を用いて０．１キロベースの断片を産出する。
【０１５８】
【数８】
0004808841.tif 000010
【０１５９】
前記のオリゴ２および３はＬＯ−ＣＤ２ａのアミノ酸配列を変化させることなく、内部Ｐｓｔ  Ｉ部位を除去するヌクレオチド配列での変化を含む。前記の反応ＡおよびＢのオーバーラップ産物のアリコート（２−５μｌ）は組合され、第３ＰＣＲ反応のための鋳型として役立った。この反応のためのオリゴヌクレオチドプライマーは前記ダイアグラムの番号１および４であった。０．３キロベースの産物はキアックスによりゲル精製され、Ｐｓｔ  ＩおよびＳｔｙ  Ｉで制限された。断片は無傷のままに留まったため、内部Ｐｓｔ  Ｉ部位は成功裡に突然変異された。
【０１６０】
反応３：最終ＶH 断片はＭＲＣ重鎖ベクターを鋳型として用いて産生された。この０．２３キロベースＳｔｙ  Ｉ−Ｂａｍ  ＨＩ断片はＬＯ−ＣＤ２ａのＦＲ４の一部、およびＭＲＣベクターからの全３′未翻訳領域を含んでいた。使用されたプライマーは以下のものであった：
【０１６１】
【数９】
0004808841.tif 000011
【０１６２】
生成断片はゲル精製され、Ｓｔｙ  ＩおよびＢａｍ  ＨＩで制限された。Ｐｓｔ  Ｉ−Ｓｔｙ  ＩおよびＳｔｙ  Ｉ−Ｂａｍ  ＨＩ断片は次いで配列化のためにＰｓｔ  Ｉ−Ｂａｍ  ＨＩ切断ブルースクリプトに連結された。
【０１６３】
すべてのオリゴヌクレオチドはアプライド・バイオシステムズ合成機で合成された。すべての配列反応はシーケナーゼTMＴ７ポリメラーゼキット（オハイオ、クリーブランド、ユー・エス・バイオケミカル）を用いて実行された。すべてのＰＣＲS は下記のプロトコルを使用して実行された：９５℃で５分。９４℃で１分、５０℃で１分、７２℃で２分よりなる３５サイクル、７２℃で５分の最終延長。
【０１６４】
正しい配列を含むＬＯ−ＣＤ２ａＶL およびＶH 断片はブルースクリプトから除去され、ＭＲＣ軽鎖および重鎖ベクターそれぞれのＨｉｎｄ  ＩＩＩおよびＢａｍ  ＨＩ部位の間にクローンされた。重鎖に対しては、５′Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ−Ｐｓｔ  Ｉ断片はまずブルースクリプト内での構築物（Ｐｓｔ  Ｉ−Ｂａｍ  ＨＩ）の残部に結合された。全Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ−Ｂａｍ  ＨＩ断片は次いでＭＲＣベクターにクローンされた。
【０１６５】
Ｃ．ＶH およびＶL のＮ−末端アミノ酸配列化
Ｎ末端アミノ酸配列分析は、ＲＮＡ−ＰＣＲを用いて得られた配列を確認するために、ＬＯ−ＣＤ２ａ重鎖および軽鎖のサンプルについて、マサチューセッツ、ケンブリッジにあるハーバード・マイクロケミストリー・ラボラトリーにより実行された。サンプルは以下のように調製された：
ＬＯ−ＣＤ２ａの２００μｇがＢ−メルカプトエタノールの存在下で１２％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル走行全体にわたり適用された。電気泳動に続き、タンパク質はウエスタン移転機器を用いてＰＶＤＦ膜に移された。膜は短時間でポンソーＳで染色され、１％酢酸内で脱色され、また軽鎖および重鎖帯は真空下で乾燥されアミノ酸分析およびＮ末端配列化に送られた。
【０１６６】
ＬＯ−ＣＤ２ａ  ＶH の最初の２０残基のアミノ酸配列はクローン配列と完全に一致した。しかしＦＲ１の２、３、７残基が、クローン遺伝子によりコード化されたものと異なっていることをＶL の配列が示した。これらの差異すべては、これまでに引用した文献から得られた最良の推定配列にもとづき、クローニング目的のために使用されるＰＣＲプライマーに存在する。
【０１６７】
Ｄ．Ｎ末端アミノ酸配列のＤＮＡ配列確認およびその補正
この配列を補正しまた同時にＬＯ−ＣＤ２ａのＶL およびＶH 双方の天然シグナルペプチドをクローンするために、ＲＡＣＥ−ＰＣＲ（ｃＤＮＡ、Ｅｎｄｓ末端のＲａｐｉｄ急速Ａｎｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ増幅−ＰＣＲ）が採用された。ＬＯ−ＣＤ２ａ細胞からのｍＲＮＡは逆転写され、生成ｃＤＮＡはｄＧＴＰの存在下でターミナルトランスフェラーゼを用いてその３′末端でＧ尾部につなげられた。ｃＤＮＡは次いでＧ尾部に相補的な特異的３′オリゴヌクレオチドおよび５′オリゴヌクレオチドを用いて増幅された。サブクローニングを単純化するために、適切な制限部位が各オリゴヌクレオチドの５′末端に加えられた。
【０１６８】
ｃＤＮＡの調製のために使用されたオリゴヌクレオチドは下記のものであった。
【０１６９】
【数１０】
0004808841.tif 000012
【０１７０】
ＲＡＣＥ−ＰＣＲのオリゴヌクレオチドは下記の通りであった：
【０１７１】
【数１１】
0004808841.tif 000013
【０１７２】
ＲＡＣＥ−ＰＣＲ反応は下記のプロトコルを用いて行われた：９４℃で５分。９４℃で３０秒、５０℃で３０秒、および７２℃で５０秒の４０サイクル、続いて７２℃で５分の延長。
【０１７３】
ＬＯ−ＣＤ２ａ、ＶL およびＶH で得られたＰＣＲ産物はキアックスを用いてゲル抽出された。ＶH 断片はＸｈｏ  ＩおよびＳｔｕ  Ｉで制限され、Ｘｈｏ  Ｉ−Ｓｍａ  Ｉ切断ブルースクリプトに連結された。ＶL 断片は平滑末端化されＳｍａ  Ｉ切断ブルースクリプトに連結された。数多くのクローンが軽鎖および重鎖Ｖ両領域に配列され、シグナル配列が確認された。
【０１７４】
免疫グロブリン遺伝子で見出されるシグナル配列が一般にイントロンを持っているために、これらは発現に重要となるであろう。ＶL およびＶH リーダー配列を含むゲノムクローンは同様に確認された。ゲノムＤＮＡは以下の通り調製された：４×１０7 ＬＯ−ＣＤ２ａ細胞が回転され、冷却ＰＢＳで洗浄され、回転され、ＰＢＳで再度洗浄された。細胞は（新鮮追加プロテイナーゼＫを持つ）消化緩衝液０．４ｍｌに再懸濁された。この混合物は振動させながら５０℃で１２−１５時間保温され、等量のフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールで抽出され、１７００ｘｇで回転された。水相は清浄な管に移され、１／２量の酢酸アンモニウム７．５Ｍおよび２量の９５％エタノールが加えられた。ＤＮＡは２分間、１７００ｘｇの回転でペレット化された。ペレットは７０％エタノールで洗浄され、空気乾燥された。ペレットは８０ｍｌのＴＥ、ｐＨ８．０に再懸濁された。
【０１７５】
鋳型として細胞系ＬＯ−ＣＤ２ａから得られたゲノムＤＮＡを用いて、下記のオリゴヌクレオチドがＶL およびＶH 両方のゲノムリーダー配列、同じくユニーク制限部位（ＶL ではＳｐｈ  Ｉ、ＶH ではＰｓｔ  Ｉ）で終結するフレーワーク領域の部分を増幅するために指定された。
【０１７６】
【数１２】
0004808841.tif 000014
【０１７７】
ＰＣＲ反応は以下の通り行われた：ＬＯ−ＣＤ２ａ細胞からのゲノムＤＮＡ１００ｎｇ、オリゴＬＶＬおよびＢＫＡ（ＶL 断片用）それぞれ２００ｐｍｏｌあるいはＬＶＨおよびＰＶＨＡ（ＶH 断片用）それぞれ２００ｐｍｏｌ、１mm、ｄＮＴＰｓ１０μｌ、１０×Ｐｆｕ緩衝液１０μｌ。Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（カリフォルニア、ラホーラ、ストラータジーン）１μｌ（２．５単位）、１００μｌまでの脱イオン水。Ｐｆｕが使用された理由は、それがＴａｑポリメラーゼよりも精度が高いためであった。
【０１７８】
反応条件は以下の通りであった：９４℃５分、５０℃５分。９４℃１分、５０℃で１分、７２℃１分の３５サイクル、次いで７２℃で５分。ＰＣＲ産物はゲル精製され、制限され、配列化のためブルースクリプトに連結された。正しい配列を含むクローンが一度確認されると、これらのクローンを含むブルースクリプトベクターはＨｉｎｄ  ＩＩＩおよびＳｐｈ  Ｉ（ＶL ）あるいはＨｉｎｄ  ＩＩＩおよびＰｓｔ  Ｉ（ＶH ）で切断され、断片はゲル分離された。０．７５キロベースのＨｉｎｄ  ＩＩＩ−Ｓｐｈ  Ｉ断片は次いでもとのＬＯ−ＣＤ２ａ  ＶL 構築物を含むブルースクリプトに連結され、それからＨｉｎｄ  ＩＩＩ−Ｓｐｈ  Ｉ断片が除去された。新しい構築物は天然ＬＯ−ＣＤ２ａシグナルプラスイントロンおよび補正ＦＲ１配列（Ｎ末端配列と合致するもの）を含んでいた。０．１６キロベースＨｉｎｄ  ＩＩＩ−Ｐｓｔ  Ｉ断片はもとのＬＯ−ＣＤ２ａ  ＶH 構築物を含むブルースクリプトに連結され、それからＨｉｎｄ  ＩＩＩ−Ｐｓｔ  Ｉ断片が除去された。新しい構築物は天然シグナル＋イントロンを含んでいた。新しく構築されたＶL およびＶH 断片は次いでＨｉｎｄ  ＩＩＩおよびＢａｍ  ＨＩでの消化によりブルースクリプトから除去され、ＣＯＳ細胞での発現のためにＭＲＣ軽鎖および重鎖ベクターそれぞれにクローンされた。
【０１７９】
Ｅ．ＣＯＳ細胞での一過性発現
ＣＯＳ７細胞はＡＴＣＣ（アクセス番号ＣＲＬ−１６５１）から得られ、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）１０％を持つダルベッコ最小必須培地（ＤＭＥＭ）で成長した。最適形質移入は付着細胞の約５０％密集で達成された。形質移入の調製において、プラスミドＤＮＡがニューセラムおよびＤＥＡＥ−デキストラン／二リン酸クロロキンを含むＤＭＥＭに加えられた。ＣＯＳ細胞培地は除去され、ＤＮＡ混合物が加えられ、細胞は３時間３７℃で保温された。この培地が次いで除去され、ＰＢＳ内１０％のＤＭＳＯが細胞に２分間加えられ次いで除去された。ＦＢＳ１０％を持つＤＭＥＭが細胞に加えられた。一晩保温の後、培地は取り替えられ細胞は２日間３７℃で保温された。上澄みがキメラ抗体の分泌のためのエリザによる検定のために採取された。
【０１８０】
Ｆ．エリザによる分泌キメラ抗体の検出
キメラ抗体の分泌は、ヒト抗体（あるいはその部分）の存在を検出するために設計されたエリザでの形質移入ＣＯＳ細胞からの上澄みの検定により確認された。ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）は食塩加リン酸緩衝液（ＰＢＳ）に５μｇ／ｍｌの濃度に希釈され、エリザマイクロタイタ平板のウエルに１晩４℃での保温で付着された。平板は３回エリザ平板洗浄器を用いて洗浄された。
【０１８１】
残った遊離部位はウシ胎仔血清アルブミン１％を含むＰＢＳ２００μｌ（ＰＢＳ−ＢＳＡ）を１／２時間室温で加えることにより遮断された。上澄みおよび正の対照引用標準（精製ヒトＩｇＧ１Ｋ）のＰＢＳ−ＢＳＡでの２倍希釈液が用意された。培地のみおよびもしくはＰＢＳ−ＢＳＡのみが負の対照を構成した。抗体希釈液および対照はウエルに加えられ、室温で１．５時間保温された。平板は次いでトウィーン２０の０．０５％を含むＰＢＳ内で平板洗浄器で３回洗浄された。ヤギ抗ヒトＩｇＧ（ガンマ鎖特異的）−ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）接合抗体あるいはヤギ抗ヒトカッパ軽鎖−ＨＲＰ接合抗体の適切な希釈液が各ウエルに加えられ室温で１時間保温された。平板は前に記載の通りＰＢＳ−トウィーン２０で洗浄され、その後過酸化水素を含む成長基質（ＡＢＴＳ）が加えられた。結合抗体は４０５ｎｍの波長での吸光度を読み取ることで検出された。
【０１８２】
Ｇ．分泌キメラ抗体の結合特異性
キメラ抗体の結合特異性がＣＤ２発現突然変異体ジャーカット細胞系ＪＲＴ３−Ｔ３−５に結合する抗体のフローサイトメトリー分析により評価された。キメラ抗体（ヒトＩｇＧ１）の結合プロフィルは天然ラット抗体（ＩｇＧ２ｂ）および無関係の（非−ＣＤ−２）結合特異性を示すアイソタイプ付合対照ＭＡＢS （ヒトＩｇＧ１およびラットＩｇＧ２ｂ）の結合プロフィルと比較された。
【０１８３】
ＪＲＴ３−Ｔ３−５（ジャーカット）細胞系の調製
ジャーカット細胞系はＡＴＣＣ（アクセス番号ＴＩＢ−１５３）から得られ、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）１０％、アミノ酸補足物（ＮＣＴＣ）１０％、およびＬ−グルタミン６ｍＭを含むＤ−ＭＥＭ（完全培地）で増殖された。細胞は３７℃、炭酸ガス１０％で維持され、１：４の比率（継代での細胞濃度が約３×１０6 ／ｍｌになるように）で週当り３回継代された。ジャーカット細胞は収穫され、消費培地を除去するために遠心分離され、ＤＭＥＭで洗浄された。細胞は次いでアジ化ナトリウム（ＮａＡｚ）０．１％を持つ食塩加リン酸緩衝液（ＰＢＳ）に再懸濁され、細胞計量のためにアリコートが取りわけられた。生菌数はトリパンブルー排除により決定された。
【０１８４】
ジャーカット細胞の間接染色
細胞面染色が９６ウエルＵ型底部マイクロタイタ平板で行われた。９０μｌの量の約６×１０5 細胞がマイクロタイタ平板の各ウエルに分配された。試験される抗体の希釈液はＮａＡｚ、０．１％を持つＰＢＳで調製され、１０μｌの量で適切なウエルに分配された。細胞は抗体と共に１５分室温で保温され、その後細胞はＮａＡｚ、０．１％を持つＰＢＳを各ウエルに加え２分間１９００ｒｐｍ（ソーバルＲＴ６０００Ｄ）で遠心分離して３回洗浄された。細胞の再懸濁は平板を緩やかにたたいて達成された。適切なフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）接合二次抗体（抗ヒトＩｇあるいは抗ラットＩｇ）のアリコート１０ｕｌが適切なウエルに加えられ、室温で暗闇で１５分保温された。平板は前に記載の通りＮａＡｚ０．１％を持つＰＢＳで３回洗浄された。染色細胞はＰＢＳ内でパラホルムアルデヒド０．５％の２００μｌを追加することで固定され４℃で（１週間まで）貯蔵された。
【０１８５】
染色ジャーカット細胞のフローサイトメトリー分析
染色細胞はベクトン−ディキンソン・ファクスキャンを用いるデータ取得のために１２×１７mmポリスチレン管に移された。データ取得および分析はリシス−ＩＩソフトウエアを用いて行われた。ＣＤ２発現ジャーカット細胞はＬＯ−ＣＤ２ａ（ラットＩｇＧ２ｂ）ＭＡＢ、ＬＯ−ＣＤ２ａ（ヒトＩｇＧ１）のキメラ版、および対応するアイソタイプ付合対照と共に保温された。結合抗体は前に記載したプロトコルに従って適切なＦＩＴＣ接合二次抗体を用いて検出された。分析は天然ラットＬＯ−ＣＤ２ａおよびキメラヒト−ラットＬＯ−ＣＤ２ａの類似の結合パターンを示している。
【０１８６】
Ｈ．ＮＳＯ細胞における安定発現
安定した形質移入体にキメラ抗体を発現するために、グルタミン合成酵素遺伝子増幅システムがセルテック・リミテッド（英国、バークシャー）から得られた。このシステムはベビントン、他、バイオテクノロジー、１０巻、１６９−１７５ページ（１９９２年）に記載されている。使用された発現ベクターはｐＥＥ６ｈＣＭＶ−ＢおよびｐＥＥ１２であった。このようなベクターは公開ＰＣＴ出願番号ＷＯ８６／０５８０７、ＷＯ８７／０４４６２、ＷＯ８９／０１０３６、およびＷＯ８９／１０４０４に記載されている。これらベクターのいずれもがＣカッパあるいはＣガンマ１を含まないために、これら遺伝子のゲノムクローンはそれぞれＭＲＣ軽鎖および重鎖ベクターから得られた。両定常部クローンは制限地図を得るため配列された。２個の構築物はｐＥＥ１２内で作られた。第１のものは軽鎖（Ｖ＋Ｃ）５′から重鎖（Ｖ＋Ｃ）までを含んでいた。第２の構築物は重鎖５′から軽鎖までを含んでいた。
【０１８７】
軽鎖を伴う戦略は以下の通りであった。
【０１８８】
１．ｐＥＥ６ｈＣＭＶ−ＢおよびｐＥＥ１２それぞれはＸｍａ  ＩおよびＥｃｏ  ＲＩで消化された。
【０１８９】
２．キメラ軽鎖の５′、１．９３キロベース部分はＨｉｎｄ  ＩＩＩおよびＥｃｏ  ＲＩを用いてＭＲＣベクターから除去された。この断片は以下に述べるようにＰＣＲ突然変異誘発の鋳型として使用された。
【０１９０】
【数１３】
0004808841.tif 000015
【０１９１】
制限部位はアンダーラインされている。
【０１９２】
ＰＣＲは５′制限部位をＨｉｎｄ  ＩＩＩからＸｍａ  Ｉに変更し、コザックコンセンサス配列を構築物の５′末端に加えるために行われた。これは効果的な翻訳にとっては必須である（コザック、Ｍ．細胞生物学ジャーナル、１０８巻：２２９ページ、１９８９年）。３′ＰＣＲオリゴは続くクローニング段階に干渉する内部Ｂａｍ  ＨＩおよびＥｃｏ  ＲＩ部位を除去するために使用される。ＰＣＲ突然変異誘発の最終産物は０．８５キロベースＸｍａ  Ｉ−Ｍｓｃ  Ｉ断片である。ＰＣＲS はＴＡクローニングキット（カリフォルニア、サンジェゴ、インバイトロジェン）で提供された指示に従って行われた。下記の条件がＰＣＲに使用された：９４℃で２分。続いて９４℃で１分、５５℃で２分、および７２℃で２分の３０サイクル。これは７２℃で５分の延長に続けられた。連結反応および形質転換がキット指示事項に従って行われた。数多くのクローンが前に記載の通り、ジデオキシ鎖終結法により配列された。補正クローンはＸｍａ  ＩおよびＭｓｃ  Ｉでの消化によりＴＡクローニングベクターから除去された。この断片はキアックスを使ってゲル精製された。
【０１９３】
３．２．７キロベースＣカッパ断片がＭｓｃ  ＩおよびＥｃｏ  ＲＩでの消化によりＭＲＣベクターから除去された。この断片はキアックスを使ってゲル精製された。
【０１９４】
２個の異なった３方向連結反応を用いて、完全キメラ軽鎖、すなわち０．８５キロベースＸｍａ  Ｉ／Ｍｓｃ  Ｉ断片＋２．７キロベースＭｓｃ  Ｉ／Ｅｃｏ  ＲＩ断片がｐＥＥ６ｈＣＭＶ−ＢおよびｐＥＥ１２両方に連結され、そのそれぞれがＸｍａ  Ｉ／Ｅｃｏ  ＲＩで切断された。
【０１９５】
重鎖を伴う戦略は以下の通りであった。
【０１９６】
１．ｐＥＥ６ｈＣＭＶ−ＢおよびｐＥＥ１２の両方が大腸菌菌株ＤＭ１に形質移入された。両ベクターはＥｃｏ  ＲＩおよびＢｃ１Ｉで消化された（Ｂｃ１Ｉはもしもプラスミドがメチラーゼマイナス菌内で増殖するならば切断するだけであろう）。
【０１９７】
２．キメラ重鎖はＨｉｎｄ  ＩＩＩおよびＥｃｏ  ＲＩでの消化によりＭＲＣベクターから除去された。生成２．７キロベース断片はキアックスを用いてゲル精製された。この断片はＮｈｅ  ＩおよびＢｇ１  ＩＩで消化された。これは０．７キロベースＨｉｎｄ  ＩＩＩ／Ｎｈｅ  Ｉ断片および２キロベースＮｈｅ  Ｉ／Ｂｇ１  ＩＩ断片を産生する。両断片はゲル精製された。０．７キロベース断片は次いでＰＣＲ突然変異誘発の鋳型として使用された。
【０１９８】
【数１４】
0004808841.tif 000016
【０１９９】
制限部位はアンダーラインされている。
【０２００】
このＰＣＲは５′制限部位をＨｉｎｄ  ＩＩＩからＥｃｏ  ＲＩに変更し更にコザックコンセンサス配列を加えるために行われた。３′オリゴは続くクローニング段階に干渉すると思われる内部Ｂａｍ  ＨＩ部位を除去するために使用される。ＰＣＲｓ、連結反応および形質転換は前に記載された通りに行われた。
【０２０１】
２個の異なった３方向連結反応を用いて、完全キメラ重鎖、すなわち０．７キロベースＥｃｏ  ＲＩ／Ｎｈｅ  Ｉ断片＋２．０キロベースＮｈｅ  Ｉ／Ｂｇ１  ＩＩ断片がｐＥＥ６ｈＣＭＶ−ＢおよびｐＥＥ１２両方に連結され、それぞれはＥｃｏ  ＲＩ／Ｂｃ１  Ｉで切断された。
【０２０２】
（Ｂｃ１  ＩおよびＢｇ１  ＩＩは両立できる制限部位である）。
【０２０３】
キメラ軽鎖および重鎖両方を含むｐＥＥ１２での最終構築物は下記の通り作られた。
【０２０４】
軽鎖５′から重鎖まで：キメラ重鎖を運ぶｐＥＥ６ｈＣＭＶ−ＢがＢｇ１  ＩＩ／Ｂａｍ  ＨＩで消化された。重鎖プラスｈＣＭＶプロモーターを含む５．１キロベース断片はゲル精製され、キメラ軽鎖を含むｐＥＥ１２のＢａｍ  ＨＩ部位に連結された。正しい配向はＳａｌ  Ｉ／Ｂａｍ  ＨＩでの消化により照合された。０．２８キロベース断片の存在は正しい配向を示している。
【０２０５】
重鎖５′から軽鎖まで：キメラ軽鎖を運ぶｐＥＥ６ｈＣＭＶ−ＢがＢｇｌ  ＩＩ／Ｂａｍ  ＨＩで消化された。軽鎖プラスｈＣＭＶプロモーターを含む５．９キロベース断片はゲル精製され、キメラ重鎖を含むｐＥＥ１２のＢａｍ  ＨＩ部位に連結された。配向は前に記載の通りＳａｌ  Ｉ／Ｂａｍ  ＨＩでの消化により照合された。
【０２０６】
ＮＳ／Ｏ細胞（ガルファー、他、酵素学での方法論、７３巻（Ｂ）、３−４６ページ（１９８１年）、ヨーロッパ動物細胞培養収集所に寄託されたＥＣＡＣＣカタログ番号８５１１０５０３）が電気穿孔法により形質移入された。形質移入細胞はグルタミン無し培地での成長により選別された。ＣＤ２−発現ジャーカット細胞に対する抗体産生および結合活性は下記に記載されたように確認された。
【０２０７】
ヒト−ラットキメラ抗体の機能分析は、その機能性がラットＬＯ−ＣＤ２ａ抗体のそれと類似していることを示している。両抗体は抗体の１２０ｎｇ／ｍｌまでのナノグラム量が培養に加えられた時一次混合白血球反応（ＭＬＲ）を阻害する。更にキメラ抗体の一次ＭＬＲへの追加は、もとの同種異系抗原あるいは第三者同種異系抗原に攻撃するために応答個体集団に低応答性の状態を誘導する。低応答性はミトゲンあるいは破傷風トキソイドへの攻撃が増殖応答を誘導することで同種異系抗原に特異的である。
【０２０８】
〔実施例７〕
ヒト化抗体の構築および発現
Ａ．ヒト化軽鎖の構築
ＬＯ−ＣＤ２ａと相同性を分ち合いＨＵＭ５４００（ＥＭＢＬアクセスＸ５５４００）として名付けられたヒトＶカッパ遺伝子からのフレームワーク領域が軽鎖Ｖ領域のヒト化のために選ばれた。以下はＬＯ−ＣＤ２ａとＨＵＭ５４００のフレームワークの間の比較である：
【０２０９】
【数１５】
0004808841.tif 000017
【０２１０】
ラットＬＯ−ＣＤ２ａの軽鎖可変領域配列、相同性ヒト可変領域、ＨＵＭ５４００、およびヒト化ＬＯ−ＣＤ２ａの比較が図３９で示される。完全アミノ酸配列がＬＯ−ＣＤ２ａ可変領域のために与えられ、残基はラット配列に従って数が付けられている。ヒト化配列とＨＵＭ５４００配列で対応する位置にあるラットのそれと同一の残基は水平のダッシュ線で示され、一方同一でない残基は文字コードで与えられる。ヒト化ＬＯ−ＣＤ２ａ軽鎖可変領域はＨＵＭ５４００フレームワーク領域、ラットＬＯ−ＣＤ２ａ  ＣＤＲ′ｓ（アンダーライン付き）、および７個のラットＬＯ−ＣＤ２ａフレームワーク残基（ラット配列の上に＊で指定されたもの）よりなり、これらはそのような残基がＬＯ−ＣＤ２ａの結合特異性を維持することに関連するため選ばれた。
【０２１１】
図３９で示されるように、フレームワーク１はアミノ酸残基１乃至２３までである。ＣＤＲ１はアミノ酸残基２４乃至３９である。フレームワーク２はアミノ酸残基４０乃至５４である。ＣＤＲ２はアミノ酸残基５５乃至６１である。フレームワーク３はアミノ酸残基６２乃至９３である。ＣＤＲ３はアミノ酸残基９４乃至１０２である。フレームワーク４はアミノ酸残基１０３乃至１１２である。リーダー配列はアミノ酸残基−２０乃至−１である（図４０、４１、４２）。フレームワーク領域内に保持されるラットアミノ酸残基はフレームワーク１のアミノ酸残基９および１２、フレームワーク２のアミノ酸残基は４１、４２、５０および５１、またフレームワーク３のアミノ酸残基は８２である。
【０２１２】
ヒト化軽鎖は、ＬＯ−ＣＤ２ａのＣＤＲｓおよびＨＵＭ５４００の可変領域フレームワークを含むように構築されたが、ただ７個の異常残基（＊）はＬＯ−ＣＤ２ａのフレームワークから保持された。５′領域はキメラ軽鎖構築物から得られた。この０．４３キロベースＨｉｎｄ  ＩＩＩ／Ｈｐｈ  Ｉ断片は、天然シグナルプラスイントロンおよびラットとヒトフレームワークで同一であるフレームワーク１の最初の３個のアミノ酸残基をコード化する配列を含む。可変領域の最初の３個のアミノ酸を除くすべてのアミノ酸をコード化するヌクレオチドを含む構築物（０．３７キロベース）の残部（すなわち３′末端）は、６３−８１ヌクレオチドの大きさにわたる７個のオーバーラッピングオリゴヌクレオチドからＰＣＲにより合成された。これらの長いオリゴヌクレオチドは、それより短い５′および３′外部ＰＣＲオリゴヌクレオチド（長さ２１−２６のヌクレオチド）の鋳型として役立った。すべての場合で、鋳型５ｐｍｏｌがそれぞれの外部ＰＣＲオリゴヌクレオチド１００ｐｍｏｌと共に使用された。すべてのＰＣＲｓはより大きな適合度を達成するために、Ｐｆｕポリメラーゼを用いて行われた。その手順は以下の通りであった：９５℃で５分。続いて９４℃で２分、５５℃で２分および７２℃で２分を含んだ２５サイクル。これはその後７２℃で５分の追加延長が続けられた。すべての合成は４段階で達成された。第１段階では、最初の長いオリゴヌクレオチドが０．４３キロベースＨｉｎｄ  ＩＩＩ−Ｈｐｈ  Ｈ断片に加えられた。次の３組のオーバーラッピングオリゴヌクレオチドは、次いでＰＣＲを用いて連続的に加えられた。全０．８キロベース構築物の合成が完成された後、それはキアックスを用いてゲル精製され、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩおよびＢａｍ  ＨＩで制限され、再びキアックスでゲル精製され、更にＨｉｎｄ  ＩＩＩ／Ｂａｍ  ＨＩ切断ブルースクリプト  ＫＳ  ＩＩに連結された。数多くのクローンが正しい版のものが得られるまで配列された。クローンは次いでＨｉｎｄ  ＩＩＩおよびＢａｍ  ＨＩでの消化によりブルースクリプトから除去された。生成断片はキアックスでゲル精製され、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ／Ｂａｍ  ＨＩで切断されたＭＲＣ軽鎖ベクターに連結された。ヒト化ＬＯ−ＣＤ２ａ軽鎖Ｖ領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は図４０、４１、４２で示される。
【０２１３】
ヒト化軽鎖の合成で使用されたオーバーラッピングオリゴヌクレオチドおよびその用途についての説明は以下の通りである。
【０２１４】
【数１６】
0004808841.tif 000018
【０２１５】
オリゴヌクレオチド１、３、５、および７は逆補体配列である。
【０２１６】
オリゴヌクレオチド２、４、および６はセンス鎖配列である。
【０２１７】
オリゴヌクレオチド＃１はキメラ軽鎖構築物から誘導された０．４３キロベースＨｉｎｄ  ＩＩＩ／Ｈｐｈ  Ｉ断片をオーバーラップする。このオリゴヌクレオチドは、下記のＰＣＲオリゴを用いてＰＣＲにより０．４３キロベース断片に加えられた：
【０２１８】
【数１７】
0004808841.tif 000019
【０２１９】
同じようなやり方で、オリゴヌクレオチド＃２および＃３が下記のＰＣＲオリゴを用いてＰＣＲによりお互いに縫い込まれた：
【０２２０】
【数１８】
0004808841.tif 000020
【０２２１】
ＰＣＲの後、両産物はキアックスを用いてゲル精製され、次いで第３回のＰＣＲを用いて一緒に接合された。第３回のＰＣＲは下記のオリゴを必要とした：
【０２２２】
【数１９】
0004808841.tif 000021
【０２２３】
生成断片はキアックスによりゲル精製された。オリゴヌクレオチド＃４および＃５は次いで下記のオリゴを用いるＰＣＲにより一緒に接合された：
【０２２４】
【数２０】
0004808841.tif 000022
【０２２５】
断片はゲル精製され、ＰＣＲオリゴを用いてこれまでの構築物に加えられた：
【０２２６】
【数２１】
0004808841.tif 000023
【０２２７】
最終断片はオリゴヌクレオチド＃６および＃７ならびにＰＣＲオリゴを用いて構築された：
【０２２８】
【数２２】
0004808841.tif 000024
【０２２９】
ゲル精製後、この断片はオリゴを用いるＰＣＲによりヒト化軽鎖構築物の残部に加えられた。
【０２３０】
【数２３】
0004808841.tif 000025
【０２３１】
Ｂ．ヒト化重鎖の構築
ヒト抗体クローンＡｍｕ５−３（ジェンバンク・アクセス番号Ｕ００５６２）のフレームワーク領域がヒト化重鎖の生成のために使用された。下記はＬＯ−ＣＤ２ａのフレームワークおよびＡｍｕ５−３のそれとの比較である：
【０２３２】
【数２４】
0004808841.tif 000026
【０２３３】
図４３はラットＬＯ−ＣＤ２ａの重鎖可変領域配列、相同性ヒト可変領域Ａｍｕ５−３、およびヒト化ＬＯ−ＣＤ２ａ（ヒト化Ｖｈ）を示す。完全アミノ酸配列がＬＯ−ＣＤ２ａに与えられ、残基はラット配列に従って番号を付される。ヒト化配列およびＡｍｕ５−３配列内の対応する位置にあるラットのそれと同一の残基は水平のダッシュ線で示され、一方同一でない残基は文字コードで与えられる。ヒト化ＬＯ−ＣＤ２ａ  ＶｈはＡｍｕ５−３フレームワーク領域、ラットＬＯ−ＣＤ２ａ  ＣＤＲｓ、および７個のラットＬＯ−ＣＤ２ａフレームワーク残基（ラット残基上の＊により指定されたもの）よりなり、それらはＬＯ−ＣＤ２ａの結合特異性を維持するために関係があるということで選択された。ラットおよびヒト化配列のＣＤＲ３での垂直線は３個の配列を整列するために必要であった空間を表しており、何故ならＡｍｕ５−３はラットおよびヒト化領域より長いＣＤＲ３を有していたからである。
【０２３４】
図４３で示されるように、フレームワーク１はアミノ酸残基１乃至３０である。ＣＤＲ１はアミノ酸残基３１乃至３５である。フレームワーク２はアミノ酸残基３６乃至４９である。ＣＤＲ２はアミノ酸残基５０乃至６６である。フレームワーク３はアミノ酸残基６７乃至９８である。ＣＤＲ３はアミノ酸残基９９乃至１０７である。フレームワーク４はアミノ酸残基１０８乃至１１８である。リーダー配列はアミノ酸残基−１９乃至−１である（図４４、４５、４６）。
【０２３５】
フレームワーク領域に保持されるラットＬＯ−ＣＤ２ａアミノ酸残基はフレームワーク２のアミノ酸残基４７であり、またフレームワーク３のアミノ酸残基６７、７０、７２、７６、８５および８７である。
【０２３６】
単一のヒト化重鎖構築物が作られた。この構築物は、ＬＯ−ＣＤ２ａから保持される７個の残基（＊）という例外はあるが、ＬＯ−ＣＤ２ａのＣＤＲｓおよびＡｍｕ５−３のフレームワークを含む。この構築物はヒト軽鎖のそれと同じやり方で産生された。この場合、６９−８８のヌクレオチドのサイズにわたる１２個のオーバーラッピング鋳型オリゴヌクレオチドがあった。１２個の外部ＰＣＲオリゴヌクレオチドは２１−２６のサイズにわたっていた。合成は各段階で１対のオーバーラッピング鋳型オリゴヌクレオチドを加えて６段階で達成された。最終構築物（０．７キロベース）は前に記載した通りキアックスを用いてゲル精製され、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩおよびＢａｍ  ＨＩで消化され、再びゲル精製され、前に記載した通りに配列化のためにブルースクリプトに連結された。正しいクローンが確認されると、それはＨｉｎｄ  ＩＩＩ／Ｂａｍ  ＨＩでの制限によりブルースクリプトから除去され、次いで同じ酵素で消化されたＭＲＣ重鎖ベクターに連結された。ヒト化ＬＯ−ＣＤ２ａ重鎖Ｖ領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列が図４４、４５、４６で示される。
【０２３７】
ヒト化重鎖の合成に使用されたオーバーラッピングオリゴヌクレオチドおよびその用途の説明が以下に続く。
【０２３８】
【数２５】
0004808841.tif 000027
【０２３９】
オーバーラッピングオリゴヌクレオチド＃１および＃２は下記のＰＣＲオリゴを用いてＰＣＲにより一緒に接合された：
【０２４０】
【数２６】
0004808841.tif 000028
【０２４１】
生成断片はゲル精製された。
【０２４２】
オーバーラッピングオリゴヌクレオチド＃３および＃４は下記のＰＣＲオリゴを用いてＰＣＲにより一緒に接合された：
【０２４３】
【数２７】
0004808841.tif 000029
【０２４４】
断片はゲル精製された。
【０２４５】
オリゴヌクレオチド＃５および＃６は下記のＰＣＲオリゴを用いてＰＣＲにより一緒に接合された：
【０２４６】
【数２８】
0004808841.tif 000030
【０２４７】
ゲル精製後、この断片は下記のオリゴでＰＣＲによりオリゴヌクレオチド＃３および＃４で産生された断片に接合された：
【０２４８】
【数２９】
0004808841.tif 000031
【０２４９】
生成断片はゲル精製された。
【０２５０】
オリゴヌクレオチド＃７および＃８は下記のＰＣＲオリゴを用いてＰＣＲにより一緒に接合された：
【０２５１】
【数３０】
0004808841.tif 000032
【０２５２】
生成断片はゲルに精製され、オリゴヌクレオチド＃３から＃６までを接合して作られた構築物に加えられた。これはＰＣＲオリゴを用いて実現された。
【０２５３】
【数３１】
0004808841.tif 000033
【０２５４】
オリゴヌクレオチド＃３から＃８までを接合することにより作られた生成断片はゲル精製された。構築物（オリゴヌクレオチド＃１＋＃２）の５′末端が次いでＰＣＲオリゴを用いて加えられた。
【０２５５】
【数３２】
0004808841.tif 000034
【０２５６】
この断片はゲル精製され、次の断片（３′）がオリゴヌクレオチド＃９および＃１０を用いて加えられた。
【０２５７】
オリゴヌクレオチド＃９および＃１０は下記のＰＣＲオリゴを用いてＰＣＲにより接合された：
【０２５８】
【数３３】
0004808841.tif 000035
【０２５９】
ゲル精製後、この３′断片はＰＣＲオリゴを用いて構築物の残部に加えられた。
【０２６０】
【数３４】
0004808841.tif 000036
【０２６１】
生成断片はゲル精製され、構築物の残部に加えられた。
【０２６２】
オリゴヌクレオチド＃１１および＃１２は下記のＰＣＲオリゴを用いてＰＣＲにより接合された：
【０２６３】
【数３５】
0004808841.tif 000037
【０２６４】
ゲル精製後、この最終３′断片はオリゴ（５′）ＰＣＲ４Ｈ（センス）および（３′）ＰＣＲ６Ｊ′（アンチセンス）を用いて構築物の残部に加えられた。生成０．７キロベース最終構築物は前に指示された通り、ゲル生成され、配列化され、ＭＲＣ重鎖ベクターにクローンされた。
【０２６５】
ＣＯＳ細胞の一過性発現および分泌抗体の検出はキメラ抗体に対して前に記載された通り行われた。ヒト化抗体はアフィニティークロマトグラフィーにより精製された（タンパク質Ａ）。ジャーカット細胞に関する結合研究はＬＯ−ＣＤ２ａのヒト化形態とラット形態の間で類似の結合パターンを示している（図４７）。ＣＤ２を発現するジャーカット細胞系は、ラットＬＯ−ＣＤ２ａ、ヒト化ＬＯ−ＣＤ２ａ（ＬＯ−ＣＤ２ａＨｕ）あるいはラットＩｇＧ２ｂもしくはヒトＩｇＧ対照と共に染色された。抗体濃度は０乃至４μｇ／ｍｌであった。ＬＯ−ＣＤ２ａのラットおよびヒト化形態はジャーカット細胞と類似の結合パターンで結合するが、一方ラットおよびヒトアイソタイプ対照抗体はそうではない。結合抗体はアイソタイプ特異的ＦＩＴＣ接合抗血清で検出された。図４７で示される結果は、前に述べられた濃度の範囲にわたり抗体で正に染色された細胞の割合として表現される。ヒト化抗体は更に一次ＭＬＲを阻害できることを機能研究が示している。ＬＯ−ＣＤ２ａ、ＬＯ−ＣＤ２ａＨｕ、ラットＩｇＧ２ｂ対照、あるいはヒトＩｇＧ１対照のナノグラム量が、指定された応答体および刺激体（照射細胞）からのヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の等数を含む培養ウエルに加えられた。対照ウエルは抗体を全然含んでいなかった。培養は５日間保温され、次いで一晩トリチウム化されたチミジン（ 3ＨＴ）でパルスされた。増殖は 3ＨＴの取り込みで検出される。以下の表２で与えられるように、結果はベータ平板リーダーで記録された平均ＣＰＭ（１分間当り放射能カウント数）で表現される。
【０２６６】
【表２】
0004808841.tif 000038
【０２６７】
ヒト化抗体はまた、（無関係の特異性を持つ）アイソタイプ対照がヒト抗体と置換される時ではなく、これらのＴ細胞が同種異系抗原およびヒト化ＬＯ−ＣＤ２ａの存在下で一次ＭＬＲで培養される時に（平均ＣＰＭで 3ＨＴの取り込みで測定されるように）Ｔ細胞にある同種異系抗原を攻撃するための低応答状態を誘導する（図４８）。ヒト化抗体の機能特性はラットＬＯ−ＣＤ２ａのそれと類似する。
【０２６８】
〔実施例８〕
ＬＯ−ＣＤ２ａは同種異系抗原特異的低応答性を引き出す
一次培養のみへのＬＯ−ＣＤ２ａの追加に続き二次ＭＬＲにおける同種異系抗原を認識するＴ細胞の能力が試験された。一次ＭＬＲ培養がＬＯ−ＣＤ２ａ、対照抗体（ＬＯ−ＤＮＰ１１、マサチューセッツ、チャールズタウン、バイオトランスプラント，インコーポレイテッド）の存在下で、あるいは無抗体の下で応答個体細胞および照射刺激細胞を含み、７日間保温された。細胞は次いで洗浄され、追加の３日間培地のみで休止された。休止期間の後、培養細胞はもとの刺激細胞あるいは異なった供与体から得られた細胞（「第三者」細胞）で再攻撃された。
【０２６９】
これらの研究からの代表的な実験結果が図４９で図示される。パネルＡでは、応答個体細胞が２００ｎｇ／ｍｌで対照抗体の存在下で培養された時に一次応答が観察されたが、ＬＯ−ＣＤ２ａが２００ｎｇ／ｍｌでの存在下で培養された場合には応答は監視されず、これはこれまでに報告されたデータと合致した。応答の動態は３日、５日、および７日に培養を収穫して測定された。データは個別ウエルからのｃｐｍが平均値の１０％以内にあった各データ時点で三つ組ウエル運転の平均値として提供された。
【０２７０】
図４９ｂで描かれているように、ＬＯ−ＣＤ２ａあるいは対照抗体のいずれかで処置された培養からの応答個体細胞は、二次ＭＬＲに何らの抗体も存在せずに１：１の割合で刺激細胞を運ぶ同種異系抗原に再攻撃された。応答の動態は３日、５日、および７日に培養を収穫して測定された。ＬＯ−ＣＤ２ａあるいは対照抗体のいずれかで一次ＭＬＲで培養された細胞の応答は対照として含まれる。データは個体ウエルからのｃｐｍが平均値の１０％以内であった各データ時点で三つ組ウエル運転の平均値として提示される。データは図４９ａで描かれた同じ実験からのものである。
【０２７１】
図５０Ｃで示されるように、ＬＯ−ＣＤ２ａあるいは対照抗体の存在下で特異的同種異系抗原で一次ＭＬＲ内で刺激された細胞は、次いで二次培養に存在する何らの抗体の存在なしで１：１の比率で第三者供与体からの細胞を運ぶ同種異系抗原で攻撃された。応答の動態は３日、５日、および７日に培養を収穫して測定された。対照抗体あるいはＬＯ−ＣＤ２ａで一次ＭＬＲ内で培養された自己由来刺激細胞に対する細胞の応答は対照として含まれる。データは個々のウエルからのｃｐｍが平均値の１０％以内であった各データ時点で三つ組ウエル運転の平均値として提示される。データは図４９ａおよびｂで描かれた同じ実験からのものである。
【０２７２】
一次培養で対照抗体の存在下で培養された細胞は、一次培養でのそれと同じ同種異系刺激細胞による再攻撃に応答性であり（パネルｂ）、また第三者細胞による刺激に対しても応答性であった（パネルｃ）。それに反して、一次ＭＬＲの間でＬＯ−ＣＤ２ａの存在下で培養された細胞は、一次同種異系刺激細胞での再攻撃（パネルＢ）あるいは第三者細胞による刺激（パネルｃ）のいずれに対しても応答性でなかった。ＬＯ−ＣＤ２ａを含む培養での細胞は生存でき、同種異系抗原以外の刺激に応答性であった。例えばＰＨＡあるいは可溶ＯＫＴ３のいずれかによる刺激は、ＬＯ−ＣＤ２ａ対照抗体、あるいは新鮮自己由来ＰＢＭＣで培養された細胞で同等の増殖応答を引き起こした（データは示されていない）。休止後のこれらの細胞のフローサイトメトリー分析は細胞表面でのＬＯ−ＣＤ２の検出を果せなかった（データは示されていない）。かくしてこれらのデータは、ＬＯ−ＣＤ２ａおよび同種異系抗原への露出が続く同種異系抗原低応答性、すなわち耐性の状態を誘導することができることを示している。
【０２７３】
同種異系抗原刺激の間に、ＬＯ−ＣＤ２ａにより誘導された低応答性の明らかな同種異系抗原特異性にアドレスするために、同種異系抗原刺激の後に培養から得られた細胞は、可溶タンパク質抗原、すなわち破傷風トキソイドに応答するために攻撃された。可溶抗原応答は７日後に同種異系抗原刺激培養で喪失した生存可能な抗原提示細胞（ＡＰＣ）の存在を必要とする。従ってこれらの研究では、ＡＰＣの新鮮源が照射自己由来ＰＢＭＣを二次検定培養に加えることにより培養細胞に提供された。図３８Ａで描かれるように、ＬＯ−ＣＤ２ａあるいは対照抗体のいずれかで処置された培養からの応答個体細胞は、二次ＭＬＲに存在するいずれの抗体の存在もなしで１：１の比率で刺激細胞を運ぶ同種異系抗原で再攻撃された。応答の動態は３日、５日、および７日での収穫培養で測定された。ＬＯ−ＣＤ２ａあるいは対照抗体のいずれかで一次ＭＬＲで培養された自己由来刺激細胞に対する細胞の応答はまた対照として含まれる。データは個別のウエルからのｃｐｍが平均値の１０％以内にあった各データの時点で三つ組ウエル運転の平均値として提示される。
【０２７４】
図５１ｂで描かれるように、ＬＯ−ＣＤ２ａあるいは対照抗体のいずれかで処置された培養からの応答個体細胞は、二次培養に存在するいずれの抗体もなしで７．５μｇ／ｍｌの破傷風トキソイドで再攻撃された。応答の動態は３日、５日、および７日での収穫培養により測定された。抗体および自己由来刺激細胞なしの一次培養で培養された細胞の応答は、破傷風トキソイドに対する応答の対照として役立った。
【０２７５】
図５１ａおよびｂで示される結果は、一次ＭＬＲ内でＬＯ−ＣＤ２ａプラス同種異系抗原で培養された細胞が二次ＭＬＲ内での同種異系抗原に対し低応答性であったけれども、この細胞は新鮮ＡＰＣにより提示された時には破傷風トキソイドに対し応答性であったことを示している。
【０２７６】
〔実施例９〕
ＬＯ−ＣＤ２ａのＦｃ部分の役割にアドレスするために、Ｆ（ａｂ′）2 断片の機能作用を全抗体と比較する研究が行われた。
【０２７７】
図５２で示されるように、ＰＢＭＣが照射エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）形質転換Ｂ細胞系と共に応答個体細胞対刺激細胞２：１の割合でまたＬＯ−ＣＤ２ａあるいはそのＦ（ａｂ′）2 断片の用量を増加させながら６日間培養された。このグラフは４人の異なった供与体の応答に対するＦ（ａｂ′）2 断片の作用を描き、また各時点は各データ時点での三つ組ウエル運動の平均値である。結果は対照応答の割合として報告される。グラフを明確にするために、全ＬＯ−ＣＤ２ａ抗体を追加したものからのデータは示されていない。全ＬＯ−ＣＤ２ａの３０ｎｇ／ｍｌの用量で、供与体の応答は：対照に対し供与体１−１８％、供与体２−６．６％、供与体３−３．７％、および供与体４−１２％であった。試験された個体からの存在する抗体なしの細胞応答は、平均値が５６，６９０ｃｐｍから４０４，８４３ｃｐｍにわたり、また個体ウエルからのｃｐｍは平均値の１０％以内であった。
【０２７８】
Ｆ（ａｂ′）2 断片の潜在阻害性を更に評価するために、Ｆ（ａｂ′）2 断片の用量滴定が、可溶ＯＫＴ３（ＡＰＣ依存性応答）で刺激された未分画ＰＢＭＣに加えられた。図５３で示されるように、ＰＢＭＣは可溶ＯＫＴ３（１００ｎｇ／ｍｌ）で３日間刺激された。ＬＯ−ＣＤ２ａの無傷抗体あるいはＦ（ａｂ′）2 断片のいずれかが用量を増加して０日に加えられた。結果はアイソタイプ付合対照モノクローナル抗体の存在下でＯＫＴ３に対する細胞の増殖応答の割合で表現される。各データ時点は個体ウエルからのｃｐｍが平均値の１０％以内であった三つ組ウエルの平均値である。抗体なしでの刺激されたＰＢＭＣに対する平均ｃｐｍは６０，１１７であった。
【０２７９】
図５３の結果はＯＫＴ３に対するＴ細胞の増殖が、Ｆ（ａｂ′）2 断片が使用された時には阻害されなかったことを示している。
【０２８０】
〔実施例１０〕
ＡＰＣは試験管内培養におけるＬＯ−ＣＤ２ａの阻害性を必要とする
ＬＯ−ＣＤ２ａの阻害性でＡＰＣの役割の問題をアドレスするために、ＰＢＭＣのＴ細胞集団は免疫磁性選別によりＣＤ１４、ＣＤ５６、ＣＤ１９およびＨＬＡ−ＤＲ正細胞を喪失された。精製細胞のフローサイトメトリー技術による分析は、ＡＰＣ集団が９５％以上喪失したことを示した（データは示されていない）。可溶ＯＫＴ３に対するこれら精製Ｔ細胞の増殖（ＡＰＣ依存性応答）はこの喪失により未分画ＰＢＭＣの増殖の１％以下に減少した（データは示されていない）。精製Ｔ細胞あるいは未分画ＰＢＭＣは、ＬＯ−ＣＤ２ａの存在下あるいは不在下で平板結合ＯＫＴ３（Ｔ細胞刺激のＡＰＣ非依存性方法）により刺激された。Ｔ細胞活性化を阻害するＬＯ−ＣＤ２ａの能力はＡＰＣが除去された時に取り除かれた（図５４）。図５４で示されるように、ＰＢＭＣあるいは免疫磁性技術によりＡＰＣを喪失させたＰＢＭＣは、ＯＫＴ３（１０μｇ／ｍｌ）で被覆された９６ウエル平板で平板培養され、３日間培養された。ＬＯ−ＣＤ２ａは培養の開始時に加えられた。結果はアイソタイプ付合対照モノクローナル抗体の存在下でＯＫＴ３に対する細胞の増殖応答の割合として表現される。プロットされたデータは３種の実験を表わしており、ここで各データ時点は個別ウエルからのｃｐｍが平均値１０％以内にあった三つ組のウエルの平均値である。
【０２８１】
〔実施例１１〕
第二世代ヒト化ＬＯ−ＣＤ２ａ（ＭＥＤＩ−５０７）の構築と分析
ベクターの構築
ヒト化ＬＯ−ＣＤ２ａ（実施例７Ｂ）重鎖の第一世代の追加突然変異誘発が抗体の結合性質を改良するために実施された。４個の追加ラットフレームワーク残基が実施例７に記載された分子に保持された７個に加えて保持された。これら４個のアミノ酸変化は３個のＰＣＲ突然変異誘発実験を用いて行われた（ＰＣＲｓの１個は２個のアミノ酸が変化されるよう導いた）。
【０２８２】
すべてのＰＣＲはＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（カリフォルニア，ラホーラ，ストラーダジーン）および下記のプログラムを用いて行われた：９５℃で５分。７２℃で５分。９４℃で１分、５５℃で１分、更に７２℃で１分の２５サイクル。次いで７２℃で５分の延長。鋳型ＤＮＡは第一世代ヒト化ＬＯ−ＣＤ２ａＶH 領域から分離された７０１塩基対（確認されたい）ｈｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩ  ＤＮＡ断片であった。使用されたオリゴヌクレオチドは下記の表３でリストされている。
【０２８３】
【表３】
0004808841.tif 000039
【０２８４】
反応＃１はオリゴヌクレオチド８７７と１００７を含み１８５塩基対ＤＮＡ断片を生成し、これは２個の追加ラットＬＯ−ＣＤ２ａ抗体残基をアミノ酸（ＡＡ）１２と１３（Ｇｌｎ１２とＡｒｇ１３）でフレームワークＦＲ１に保持した。（残基はキャバット他、免疫学関連タンパク質の配列、第４版、１９８７年、保健社会福祉省、公衆衛生総局、ナショナル・インスティチュート・オブ・ヘルスに従って番号を付された）。
【０２８５】
反応＃２はオリゴヌクレオチド１００６と８７５を含み５１５塩基対ＤＮＡ断片を生成し、これはまたＡＡｓＧｌｎ１２とＡｒｇ１３で２個のラット残基を保持した。
【０２８６】
反応＃３はオリゴヌクレオチド８７７と１０１２を含み２９０塩基対ＤＮＡ断片を生成し、これは位置４８でラットＬＯ−ＣＤ２ａ残基を保持した。
【０２８７】
反応＃４はオリゴヌクレオチド１０１１と８７５を含み同じ位置４８でラット残基を保持する断片を生成した。
【０２８８】
すべての反応産物はキアックス（カルフォルニア，チャッツワース，キアージェン）を用いて精製された。反応産物は次いで以下の通り７０１塩基対ＶH 断片を生成するために追加のＰＣＲを受けた。反応＃５は反応＃１と＃２の反応産物、およびオリゴヌクレオチド８７７と８７５を含んでいた。反応＃６は反応＃３と＃４の反応産物、およびオリゴヌクレオチド８７７と８７５を含んでいた。
【０２８９】
位置２８で突然変異を得るために、（イソロイシン）ＰＣＲが反応＃５（すなわちＧｌｎ１２，Ａｒｇ１３を含む）から鋳型を使用して設定された。反応＃７はオリゴヌクレオチド８７７と１０２０を含み、２３０塩基対ＤＮＡ断片を生成し、それは位置２８でラット残基を保持した。反応＃８はオリゴヌクレオチド１００８と８７５を含み同じく位置２８でラット残基を保持する４７０塩基対ＤＮＡ断片お生成した。キアックス（カリフォルニア，チャッツワース，キアージェン）を用いる反応産物の精製に続き、反応産物は次いで７０１塩基対ＶH 断片を生成するために追加のＰＣＲを受け、続くＤＮＡ配列化のためにピーブルースクリプト／Ｓｍａ（カリフォルニア，ラホーラ，ストラータジーン）にクローンされた。
【０２９０】
配列分析に続き、２個の断片はキアックス（カリフォルニア，チャッツロース，キアージェン）を用いてゲル分離された：（１）４個の新しいアミノ酸変化の内３個を含む２７０塩基対ＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＮＩ（Ｈｕ  Ｖｈ  ｍｕｔ  １＋２Ａ）、および（２）第４のアミノ酸変化を含む４３０塩基対ＥｃｏＮＩ／ＢａｍＨＩ（Ｈｕ  Ｖｈ  ｍｕｔ  ３Ｄ）、である。断片は次いで実施例６Ｂで説明されたＭＲＣ重鎖ベクターに連結され、これは最終クローンであるクローン＃２５７−２０を産生するためにＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩ部位の間にヒト重鎖定常部を含んでいた。軽鎖発現ベグダは第一世代発現ベクター（２０２−２）で使用されたものと同じであった。
【０２９１】
図５７はモデル化過程で使用されたラット抗体とヒト重鎖可変配列と平行に整列された第二世代ヒト化ＬＯ−ＣＤ２ａＶＨ断片（ＭＥＤＩ−５０７）のアミノ酸配列を示す。
【０２９２】
ＭＲＣベクターを用いるＣＯＳ細胞での一過性発現
２個のベクターがそれぞれヒト化軽鎖・重鎖の発現のためにメディカル・リサーチ・カウンシル（英国，ロンドン，ＭＲＣ）からライセンスされた（図５７）。９．２キロベース軽鎖ベクター（ｈｃｍｖ−ｖｌｌｙｓ−ｋｒ−ｎｅｏ）はＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ断片として抗リゾチームのヒトカッパ定常部をヒト化ＶL 領域のゲノムクローンを含む。８．６キロベース重鎖ベクター（ｈｃｍｖ−ＶｈＬｙｓ−ｇａｍｍａｌ−ｎｅｏ）はＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ断片として抗リゾチームのヒトγ１定常部とヒト化ＶH 領域のゲノムクローンを含む（前田、他、１９９１年、ヒト抗体ハイブリドーマ、２巻、１２４−１３４ページ）。抗リゾチームＶL およびＶH 領域は制限消化により除去され、ヒト化ＶL 及びＶH 構築物はその適所に挿入された。２個のプラスミドは次いでＣＯＳ−７細胞に同時形質移入された。
【０２９３】
ＣＯＳ−７細胞はＡＴＣＣ（アクセス番号ＣＲＬ−１６５１）から得られ、２個の表面積１７００cm2 波形プラスチックローラーボトル（ニューヨーク，コーニング，コーニング）で４０−６０％密集になるまでＦＢＳ／ＤＭＥ培地で成長した。すべての培地は除去され、３７℃で形質移入培地で置換された〔ヌーセラム１０％（マサチューセッツ，ウォルサム，コラボレイティブ・リサーチ，インコーポレイテッド）、ＤＥＡＥ−デキストラン・クロロキン２リン酸、ヒト化ＬＯ−ＣＤ２ａ重鎖ＤＮＡ、０．２５ｍｇ，軽鎖ＤＮＡ、０．２５ｍｇを持つＤＭＥＭ〕。ローラーボトルは保温器およびローラーボトル設備１２３時間戻され、その後すべての培地で除去され３７℃でＰＢＳ内ＤＭＳＯ１０％で置換された。接触の２乃至５分後、ＤＭＳＯ溶液は除去されＦＢＳ／ＤＭＥＭで置換された。ローラーボトルは保温器およびローラーボトル設備に１日３７℃戻され、その後培地は除去され処分され（タンパク質の集積はこの時点では収穫にはあまりにも低すぎると考えられ）、次いで新鮮な同じ培地で置換された。３７℃で２、３日間保温された後、各ローラーボトルの培地の半分が除去され新鮮同一培地で置換された。この過程は約３回の収穫が得られるまで繰り返された（その時点以後は収穫量は減少した）。収穫された上澄みはエリザでヒト化ＩｇＧの存在を検定された。
【０２９４】
生成する抗体はアフィニティークロマトグラフィーで形質移入ＣＯＳ細胞から精製された（タンパク質Ａ）。このヒト化抗体の試験管内活性が３個の実験方式：ジャーカット細胞との結合、一次混合リンパ球反応（ＭＬＲ）の阻害、および二次ＭＬＲのアロ抗原（同種異系抗原）への低応答性の誘導、を用いてラットＬＯ−ＣＤ２ａの活性と比較された。一過性発現で産生されたヒト化抗体の機能性はラットＬＯ−ＣＤ２ａのそれと類似しており、後にＮＳＯ細胞での安定抗体発現で確認された。
【０２９５】
セルテックベクターを用いるＮＳＯ細胞での安定発現
臨床用途のための組換え哺乳類遺伝子産物の生物産生は、タンパク質の適切な処理と安全な生物学的活性を達成するためにより高次の真核細胞の使用を一般に必要とする。不死化げっ菌類細胞は、費用のかからない培地で高密度で成長する能力、高い生産性、および移植後処理の適合度に起因してこの目的のための現在選択のシステムである。２個の望ましいシステムは、１）マウス骨髄腫ＮＳＯ細胞でのグルタミンシンテターゼ（ＧＳ）、選択（ベビントン、他、１９９２年、バイオ／テクノロジー、１０巻、１６９−１７５ページ）、および２）チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ−ＤＨＦＲ  マイナス）細胞でのジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）増幅（カウフマンおよびシャープ、１９８２年、分子生物学ジャーナル、１５９巻、６０１−６２１ページ）である。
【０２９６】
ＮＳＯ細胞でのグルタミンシンテターゼシステムは第二世代ヒト化ＬＯ−ＣＤ２ａ（ＭＥＤＩ−５０７）の安定発現と結果として生じる産生に利用された。ＮＳＯ細胞は生存のために付加グルタミンに、あるいは外因性ＧＳ遺伝子の導入に絶対必要なグルタミン栄養要求体である（ベビントン、他、１９９２年）。発現システムはグルタミン欠損培地でＧＳ遺伝子と免疫グロブリン遺伝子を運ぶ細胞を選択するためにこの性質を利用する（コケット、他、１９９０年、バイオテクノロジー（ニューヨーク）、８巻、６６２−６６７ページ）。細胞がグルタミンシンテターゼのレベルを増加できる一つの方法は、隣接遺伝子のコピー数の付随増幅を用いてＤＮＡ増幅の遺伝子コピー数を増加させることである。増加遺伝子用量に潜在するものは、遺伝子産物、この場合グルタミンシンテターゼと免疫グロブリン両方の産生の増加である。
【０２９７】
使用されたセルテック発現ベクター（図４４）はｐＥＥ６ＣＭＶ−ＢとｐＥＥ１２であった（公開ＰＣＴ出願番号ＷＯ８６／０５８０７，ＷＯ８７／０４４６２、ＷＯ８９／０１０３６、およびＷＯ８９／１０４０４に記載されている）。これらのベクターいずれもＣカッパあるいはＣガンマ１を含んでいなかったため、これらの遺伝子のためのゲノムクローンはそれぞれＭＲＣ軽鎖および重鎖ベクターから得られた。両方の定常部クローンは制限地回を得るため配列化された。
【０２９８】
ＭＲＣベクターとセルテックベクターの間の差（軽鎖と重鎖のＭＲＣベクターは別個であり、セルテックベクターでは重鎖が軽鎖の後につきｈＣＭＶプロモーター領域で分離されている）の故で、軽鎖と重鎖の構築物に以下の変更を行うことが必要であった。
【０２９９】
一過性発現ヒト化ＢＴＩ−３２２軽鎖構築物をセルテックベクターにクローンするために、以下の変更が行われた。軽鎖クローン、クローン＃２０２−２はＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＨＩで消化され、１．９３キロベース断片がゲル精製された。この断片は５′制限部位をＸｍａＩに変更し翻訳開始コンセンサス配列を加えるためにＰＣＲ突然変異誘発の鋳型として役立った（コザック，１９９８年，点突然変異は真核リボソームによる翻訳を調節するＡＵＧ開始コドンに隣接する配列を定義する。細胞４４巻、２８３−２９２ページ）。このＰＣＲ反応はまた後でのクローニング段階を可能とするために内部ＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩ部位を除去するために使用された。生成０．８５キロベースＰＣＲ産物は配列化され、次いでＸｍａＩ／ＭｓｃＩで消化された。クローン＃２０２−２は次いでＭｓｃＩ／ＥｃｏＲＩで消化され、２．７キロベース断片はゲル分離された。０．８５キロベース断片と、２．７キロベース断片の３方向連続はそれらをポリリンカーのＸｍａＩとＥｃｏＲＩ部位の間でｐＥＥ１２に挿入することで実行された。生成クローンはクローン＃２３７−４と名付けられた。
【０３００】
重鎖構築物のセルテックベクターへの挿入は下記の変更を必要とした：クローン＃２５７−２０はＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩで消化され、全２．７キロベース重鎖はゲル分離された。この断片は次いで更に０．７キロベースＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｈｅＩ断片と、２．０キロベースＮｈｅＩ／Ｂｇ１ＩＩ断片を産生するためにＮｈｅＩ／Ｂｇ１ＩＩで消化された（Ｂｇ１ＩＩ部位はもとのクローンの３′末端に非常に近く、つまりＥｃｏＲＩ部位から２０塩基対離れている）。０．７キロベースＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｈｅＩ断片は次いで５′制限部位をＨｉｎｄＩＩＩからＥｃｏＲＩに変更し、また翻訳開始コンセンサス配列を加えるためにＰＣＲ突然変異誘発の鋳型として使用された（コザック、１９８６年、細胞、４４巻、２８３−２９２ページ）。３′末端もまた内部ＢａｍＨＩ部位を除去することで変更された。生成断片は配列化された。正しいクローンが発見された時、３方向連続は以下の通り行なわれた：０．７キロベースＥｃｏＲＩ／ＮｈｅＩ断片と、２．０キロベースＮｈｅＩ／Ｂｇ１ＩＩ断片はポリリンカーのＥｃｏＲＩとＢｃ１Ｉ部位の間でｐＥＥ６ｈＣＭＶ−Ｂに連続された（Ｂｃ１ＩとＢｇ１ＩＩは適合部位である）。成功裡に細菌形質転換がＰＣＲにより確認された後、これらのクローンの一つ、クローン＃６と指定されたものが最終発現ベクターを構築するために使用された。
【０３０１】
これを行うために、ヒト化重鎖プラスそのｈＣＭＶプロモーターを含むクローン＃６から誘導された６キロベースＢｇ１ＩＩ／ＢａｍＨＩ断片がｐＥＥ１２／ヒト化軽鎖ベクター２３７−４のＢａｍＨＩ部位に挿入された。大腸菌への形質転換の後、正しい配向に軽鎖と重鎖の両方を含むクローンを確認するために、５分間煮沸された細菌コロニー（コロニーＰＣＲ）から得られた鋳型ＤＮＡを使用してＰＣＲで行われた。２個のオリゴヌクレオチドＰＣＲプライマーが軽鎖の３′末端から重鎖の５′末端にわたる領域を増幅するよう設計された。クローン＃１２は正しいと確認された。このクローンが軽鎖と重鎖の挿入片を適切な配向で含んでいることを更に確認するために、プラスミドＤＮＡはこのクローンから分離されＤＮＡはＢａｍＨＩ／ＳａＩＩで消化された。小さな０．２５キロベース断片のクローン＃１２からの放出は、重鎖およびｈＣＭＶプロモーターを含む６キロベースＢｇ１ＩＩ／ＢａｍＨＩ断片で正しい５′から３′への配向にあることを指示していた（もし配向が逆転していたなら、ＢａｍＨＩ／Ｓａ１Ｉ消化は６．３キロベース断片を産生していた筈であったであろう。
【０３０２】
ＮＳＯ細胞系での安定発現
Ｓａ１Ｉで線型化されたクローン＃１２ＤＮＡは、セルテックのグルタミンシンテターゼ遺伝子増幅システム−操作手順マニュアルに従ってＮＳＯ細胞の形質転換のために使用された（第２版：骨髄腫細胞での使用のために、改訂版５、６−１４ページ、１９９２年１１月５日）。細胞は３μＦ、１５００ボルト、２パルスで電気穿孔された（１０7 ＮＳＯ細胞当り４０μｇが形質移入された）。電気穿孔の後、細胞はＦＢＳ／ＤＭＥ１０％の５０μＬ／ウエルでウエル当りそれぞれ１６，０００、４，０００、および１０００個の細胞の４−６平板上で平板培養された。次の日、１０％透析ＦＢＳを持つグルタミン無しＩＭＤＭの１５０μＬ／ウエルが平板に加えられた。コロニーがグルタミン無し培地で９６個のウエル平板上で成長していることが確認されるとコロニーは標識された（ＭＥＤＩ−５０７抗体遺伝子の遺伝子に結合されたグルタミンシンテターゼの遺伝子をそれらが取り込んだことを示唆している）。形質移入が前に記載のＤＮＡで実行されたことから、全体で２０４コロニーがエリザでスクリーンされ、最高の力価で選択された。約１／３のコロニーは４８個のウエル平板での抗張のために選択され、５日保温され、次いでＴ−２５フラスコで抗張された。著しい細胞成長がどれか特定のＴ−２５フラスコで（更に通常３−６日の内に）生じた時、そのフラスコは更に２，３個のＴ−２５フラスコそれぞれに５×１０4 生存可能細胞／ｍｌに分割された。これらフラスコの一つはフラスコが妨げられることなく２−３週間成長できるようにして抗体産生を調べるために使用された。他のフラスコは細胞成長率を測定し、どの細胞系が抗体産生、細胞成長、および無血清培地成長への適応性に基づいて更に検査しクローニングする価値があるかどうかを決定できるまで各種細胞系を増殖させるために使用された。この時点で約５週間にわたり、細胞は各継代の前に必ずしも細胞計数を行わないで、細胞系がフラスコからフラスコに単に継代するよう増殖のために使用された。この期間の終りに、サブクローニングが前に説明された基準により決定されて、もっとも有望な細胞系のいくつかで開始された。ＭＥＤＩ−５０７ｈｕ２．２．４０４は１６Ｋ細胞／ウエル平板で藩主された平板からのものであった。サブクローニングは０．５および５細胞／ウエルでそれぞれ２個の平板上でクローンＭＥＤＩ−５０７ｈｕ２．２．２０４．Ｘについて行われ、約３週保温するようにされた。
【０３０３】
クローン＃２０４．１１と標識されたサブクローンは５細胞／ウエル平板上で生成された（もともと開始生存細胞密度を計算していた）。この特定平板は９６ウエルの３３個で成長した。（全平板からの）２９個のクローンは標識されエリザでスクリーンされた。２９個の内５個のクローンは４８個のウエル平板に、次いで保温のため続く５−７日Ｔ−２５フラスコに抗張のために選別された。全部で５個のクローンが更に５−７日保温され、次いでＴ−７５フラスコで抗張された。５−７日後、これらのフラスコからの細胞は各クローンの凍結ガラスビンを準備するために使用され、細胞の残りは抗体産生率、成長率、および無血清培地への適応性を検査するために使用された。スクリーニング過程が終了した後、最良細胞系の最良クローンの凍結ガラスビンのものが解凍され、それぞれのいくつかのガラスビンを定住のために拡張され、更に培養で評価された。
【０３０４】
ヒト化ＭＥＤＩ−５０７とラットＬＯ−ＣＤ２ａの試験管内機能性と生物学的性質の比較
相対的結合親和性、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）の阻害、二次ＭＬＲでアロ抗原に低応答性を誘導する能力、およびＨｕ−ＣＤ２遺伝子導入マウスにおけるＣＤ２細胞喪失によるラットＬＯ−ＣＤ２ａのそれに対するヒト化ＭＥＤＩ−５０７の機能活性および生物学的活性を比較する研究が行われた。その結果は２個の抗体が類似に行動することを示す。
【０３０５】
ジャーカット細胞への相対的結合
ジャーカット細胞ベースの結合検定がヒトＭＥＤＩ−５０７（ロット、ＰＡ１１２８９５）の研究ロットの競合結合をラットＬＯ−ＣＤ２ａ（ロットＳＯ８２／８３）のそれと比較するために実施された。１．３×１０6 細胞／ｍｌの細胞密度でジャーカット細胞３００μＬが４℃で 125Ｉ−標識ラットＬＯ−ＣＤ２ａの４ｍＭ溶液２０μＬおよび冷却（未標識）ラットＬＯ−ＣＤ２ａあるいはヒト化ＭＥＤＩ−５０７の８０μＬと共に保温された。標識ラットＬＯ−ＣＤ２ａの有効濃度は０．２ｎＭであった。未標識ラットＬＯ−ＣＤ２ａおよびヒト化ＭＥＤＩ−５０７は２ｎＭから０ｎＭまで変化した。冷却ＬＯ−ＣＤ２ａの有効濃度は２０ｎＭを含む管が非特異的結合のための対照として役立った。
【０３０６】
４℃で３０分保温の後、この反応混合物２４０μＬは細いポイプロピレン管でシリコン油混合物５０μＬ（ＡＲ−２００の２：１（ｖ／ｖ）：トーマス・シリコン・オイル）の最上部に層状に置かれ、微小遠心分離機で１４，０００×ｇ、５分遠心分離された。標識抗体の結合抗体からの分離は細胞をオイルプラグを通して沈澱させることで達成された。油層は切断され計数された。分離前の反応混合物１００μＬが全投入ｃｐｍを決定するために直接計数された。検定の分析はラットＬＯ−ＣＤ２ａとヒト化ＭＥＤＩ−５０７の間で類似の結合パターンを示している。
【０３０７】
ＭＬＲの阻害
混合リンパ球反応を阻害するラットＬＯ−ＣＤ２ａ（ロットＳＯ８２／８３）と２個の異なった研究ロットのヒト化ＭＥＤＩ−５０７（ロットＱＡＳとＡＳＱ）の能力が試験された。照射ヒト刺激体ＰＢＭＣがラットＬＯ−ＣＤ２ａ、ヒト化ＭＥＤＩ−５０７、および適切なアイソタイプ対照の１０乃至６０ｎｇ／ｍＬにわたる濃度での存在下で異なった供与体からのヒト応答個体ＰＢＭＣと共に保温された。５日間３７℃の保温で、培養は 3Ｈ−チミジンでパルスされ、チミジン取り込みが決定された。この結果（図４６）は、ラットＬＯ−ＣＤ２ａとヒト化ＭＥＤＩ−５０７の両方が用量依存の方式で同じようにＭＬＲを阻害することを示している。
【０３０８】
低応答性の誘導
ラットＬＯ−ＣＤ２ａの重要な生物学的性質は試験管内アロ抗原特異的低応答性を誘導する能力である。低応答性を誘導するヒト化ＭＥＤＩ−５０７（ロットＱＡＳとＡＳＱ）の能力でラットＬＯ−ＣＤ２ａ（ロットＳＯ８２／８３）のそれと比較された。
【０３０９】
一次ＭＬＲｓがヒト化ＭＥＤＩ−５０７、ラットＬＯ−ＣＤ２ａ，あるいは適切なアイソタイプ対照、および無抗体の対照培養で１０ｎｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌおよび２００ｎｇ／ｍｌの存在下で実行された。７−８日保温後、細胞は培養から分離され、フィコール液に入れられ、洗浄され、培養培地で再懸濁されまた３７℃で３−４日「休止」を許された。これらの培養からの細胞はもとの供与体からの照射刺激体細胞を含む二次ＭＬＲ培養で応答固体細胞として使用された。培養は次いで追加で４８時間保温され、 3Ｈ−チミジンでパルスされ、またチミジン取り込みが決定された。結果の分析（図６１）はヒト化ＭＥＤＩ−５０７もアロ抗原の攻撃に対し低応答性の状態を誘導することを示している。
【０３１０】
ＣＤ２細胞喪失
マウス（Ｈｕ−ＣＤ２遺伝子導入マウス）に移植されたヒトＣＤ２受容体に対するヒト化ＭＥＤＩ−５０７とラットＬＯ−ＣＤ２ａの作用が比較された。２５匹のＨｕ−ＣＤ２遺伝子導入マウスが５グループの一つに割当てられ、ヒト化ＭＥＤＩ−５０７（０．１２ｍｇ／ｋｇあるいは０．００６ｍｇ／ｋｇ）、ラットＬＯ−ＣＤ２ａ（０．１２ｍｇ／ｋｇあるいは０．０６ｍｇ／ｋｇ）、もしくは緩衝液対照（５匹のマウス／グループ）を受けた。マウスは０日（用量を受ける前）、１、３、７、１４、２１、２８、３６および４４の各日に採血され、血液はＣＤ２リンパ球を分析された。
【０３１１】
全血液はヘパリンを含む管に収集された。２０μＬアリコート４個が９６ウエル、円底組織培養平板に分配され、適切な抗体で染色され、赤血球を溶解し染色細胞を固定するためにＦＡＣＳライスで処置された。非結合抗体と細胞破片を除去するための洗浄の後、残存リンパ球集団がフローサイトメトリーで分析された。
【０３１２】
図６２は、低用量のヒト化ＭＥＤＩ−５０７とラットＬＯ−ＣＤ２ａ（０．００６ｍｇ／ｋｇ、これらのマウスでそれは０．１５μｇ用量になる）がＣＤ２細胞総数に何ら検出可能な作用を与えなかったことを示した。これらのマウスは１４日の時点以後は検査されなかった。高用量のヒト化ＭＥＤＩ−５０７とラットＬＯ−ＣＤ２ａ（０．１２ｍｇ／ｋｇ、これらのマウスでそれは３．０μｇ用量になる）はＣＤ２細胞総数に大きな喪失作用を与えた。ヒト化およびラット抗体を高用量で処置した遺伝子導入マウスにおけるＣＤ２保持細胞の補充も比較できた。
【０３１３】
（産業上の利用可能性）
以上のように、この発明はヒトあるいは非ヒト霊長類におけるＴ細胞の活性化および増殖を阻害して移植片拒絶反応を阻害するＬＯ−ＣＤ２ａからのヒト化抗体を産生し、合せて、免疫応答を阻害しまた移植片拒絶を阻害する方法も開示される。
【０３１４】
この発明の数多くの修飾および変更が前記教訓を考慮して可能であり、また従って、前に記載した請求の範囲内でこの発明は特に記載されたもの以外にも実施可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】  ビオチン化ＬＯ−ＣＤ２ａおよびＬｅｕ−５ｂＰＥを用いる末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の２色染色
この染色のために下記のパラメータが続いた。
【図２】  ヒトＰＢＭＣがＬＯ−ＣＤ２ａ−ＦＩＴＣで染色され、次いでａ）フィコエリスリン（ＰＥ）に接合されたＴ１１−ＰＥ（ＣＤ２に対するコールター抗体）、あるいはｂ）フィコエリスリン（ＰＥ）に接合されたＬｅｕ−５Ｂ−ＰＥ（ＣＤ２に対するベクトン・ディキンソン抗体）で染色された。いずれの場合もＬＯ−ＣＤ２ａでの前処理により変更された二次抗体による染色はなかった。
【図３】  ヒトＰＢＭＣがＬＯ−ＣＤ２ａ−ＦＩＴＣで染色され、次いでａ）フィコエリスリン（ＰＥ）に接合されたＴ１１−ＰＥ（ＣＤ２に対するコールター抗体）、あるいはｂ）フィコエリスリン（ＰＥ）に接合されたＬｅｕ−５Ｂ−ＰＥ（ＣＤ２に対するベクトン・ディキンソン抗体）で染色された。いずれの場合もＬＯ−ＣＤ２ａでの前処理により変更された二次抗体による染色はなかった。
【図４】  膜マーカーに対するＬＯ−ＣＤ２ａの作用。２×１０6 細胞／ｍｌでのＰＢＭＣがＬＯ−ＣＤ２ａ（２００ｎｇ／ｍｌ）の不在下（実線）あるいは存在下（破線）で培養された。図面で示された時間で、細胞は採取されサイトフルオロメーター分析のために処理された。ａ）およびｂ）；ＰＢＭＣは抗ＣＤ３（Ｌｅｕ−４ａ−ＦＩＴＣ）、抗ＣＤ４（Ｔ４−ＲＤ）ｍＡｂｓ、抗クラスＩＩ抗原（ＬＯ−ＤＲａ−ＦＩＴＣ）あるいは抗ＣＤ８（Ｔ８−ＲＤ）モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）で標識された。商業用マウスｍＡｂｓのための負の対照はＦＩＴＣあるいはローダミン標識マウスＩｇＧｓで染色された同一細胞のアリコートであった。ラットｍＡｂｓの負の対照は標準ラット血清、続いてＦＩＴＣ標識マウス抗ラットｍＡｂ（ＭＡＲＫ−ＦＩＴＣ）により保温された細胞であった。結果は正の細胞の割合として示される。
【図５】  ＬＯ−ＣＤ２ａの追加ありおよび追加なしでのＬＯ−ＣＤ２ａの膜マーカーおよびヒト血液リンパ球培養に対する作用。１×１０6 細胞／ｍｌでのリンパ球培養が、ａ）抗ＣＤ２（Ｌｅｕ−５ｂ−ＦＩＴＣ）、抗ＣＤ４（Ｔ4 −ＲＤ１）ｍＡｂ、あるいは抗ＣＤ８（Ｔ８−ＲＤ）ｍＡｂで指示された時点で標識された。商業用マウスｍＡｂのための負の対照はＦＩＴＣあるいはローダミン標識マウスＩｇＧｓで染色された同一細胞のアリコートであった。ラットｍＡｂｓのための負の対照は標準ラット血清で、次いでＦＩＴＣ標識マウス抗ラットｍＡｂ（ＭＡＲＫ−ＦＩＴＣ）で保温された細胞であった。結果は正細胞の割合として示される。
【図６】  ＣＤ２発現に対するＬＯ−ＣＤ２ａおよびＬｅｕ−５ｂの作用。ヒトＰＢＭＣが、ａ）ＬＯ−ＣＤ２ａ（２００ｎｇ／ｍｌ）あるいはｂ）Ｌｅｕ−５ｂ（ＰＢＳに対して透析され、１：２に希釈されたもの）で指示された時点で保温され、ａ）ＣＤ２（Ｌｅｕ−５ｂ−ＦＩＴＣおよびＴ１１−ＲＤ１）の発現、およびＬＯ−ＣＤ２ａ（Ｍａｒｋ−３−ＦＩＴＣ）の結合、あるいはｂ）ＣＤ２（ＬＯ−ＣＤ２ａ−ＦＩＴＣ、Ｔ１１−ＲＤ１）およびＬｅｕ−５ｂヤギ抗マウス（ＧＡＭ−ＦＩＴＣ）の発現のために染色された。
【図７】  ＭＬＲに対するＬＯ−ＣＤ２ａの作用。ａ）０時点で付加されたＬＯ−ＣＤ２ａの増加する濃度の存在下で６日保温された混合リンパ球培養におけるＭＬＲの阻害。培養は６日で採取された。ｂ）０時点で付加されたＬＯ−ＣＤ２ａの異なった濃度で保温された混合リンパ球培養におけるＭＬＲの阻害。培養は２４時間間隔で採取された。ｃ）ＬＯ−ＣＤ２ａ（２００ｎｇ／ｍｌ）の不在下（実線）あるいは存在下（破線）で混合リンパ球培養による 3Ｈ−チミジン（Ｈ−Ｔ）取り込み（ｃｐｍ）。ｄ）保温開始後異なった時点で付加されたＬＯ−ＣＤ２ａ（２００ｎｇ／ｍｌ）によるＭＬＲの阻害。培養は６日に採取された。すべての培養は最終量２００μｇ／ウエルで三つ組み（各供与体／ｍｌの１×１０6 細胞）が作られた。培養採取の８時間前に 3Ｈ−チミジンが加えられた。ｃ）の結果は指示された時点で採取されたウエル当り取り込まれたｃｐｍ×１０3 として示される。ａ），ｂ）およびｄ）の結果は対照培養（ＬＯ−ＣＤ２ａなしのもの）と比較した三つ組み培養（平均値±標準偏差）のＭＬＲの阻害割合として示される。
【図８】  ＭＬＣの間の芽細胞に対するＬＯ−ＣＤ２ａの作用。末梢血単核細胞がＬＯ−ＣＤ２ａの２００ｎｇ／ｍｌの付加もしくは付加なしでの混合リンパ球培養で培養された。指示された時点で細胞は除去され、ＣＤ２（Ｌｅｕ５ｂ−ＦＩＴＣ）に対する抗体で染色された後フローサイトメトリーにより分析された。芽細胞は前方および側面散乱でゲート化され、指示マーカーの発現は芽細胞で計量された。
【図９】  ＭＬＣの間の休止細胞に対するＬＯ−ＣＤ２ａの作用。ヒトリンパ球がＬＯ−ＣＤ２ａ（２００ｎｇ／ｍｌ）の付加ありあるいは付加なしで培養された。指示された時点で細胞は除去され、ＣＤ３（Ｌｅｕ４ａ−ＦＩＴＣ）、ＣＤ４（Ｔ４−ＲＤ１）、ＣＤ８（Ｔ８−ＲＤ１）あるいはＣＤ２５（ＬＯ−ＴＡＣＴ−１−ＦＩＴＣ）で染色された。休止リンパ球はサイズおよび粒度に対する差動ゲート化により確認され、結果は指示された抗体での全休止リンパ球染色の割合で示される（図９）。ＬＯ−ＣＤ２ａありおよび無しの培養でＬｅｕ−５ｂにより正に染色された休止細胞の割合は図１０で示される。
【図１０】  ＭＬＣの間の休止細胞に対するＬＯ−ＣＤ２ａの作用。ヒトリンパ球がＬＯ−ＣＤ２ａ（２００ｎｇ／ｍｌ）の付加ありあるいは付加なしで培養された。指示された時点で細胞は除去され、ＣＤ３（Ｌｅｕ４ａ−ＦＩＴＣ）、ＣＤ４（Ｔ４−ＲＤ１）、ＣＤ８（Ｔ８−ＲＤ１）あるいはＣＤ２５（ＬＯ−ＴＡＣＴ−１−ＦＩＴＣ）で染色された。休止リンパ球はサイズおよび粒度に対する差動ゲート化により確認され、結果は指示された抗体での全休止リンパ球染色の割合で示される（図９）。ＬＯ−ＣＤ２ａありおよび無しの培養でＬｅｕ−５ｂにより正に染色された休止細胞の割合は図１０で示される。
【図１１】  ミトゲン刺激リンパ球に対するＬＯ−ＣＤ２ａの作用。ＰＢＭＣがＯＫＴ３（１００ｎｇ／ｍｌ）、Ｃｏｎ−Ａ（１０μｇ／ｍｌ）およびＰＨＡ（１μｇ／ｍｌ）の不在下あるいは存在下で９６時間培養された。平行培養において、ＬＯ−ＣＤ２ａ（２００ｎｇ／ｍｌ）がミトゲンの１時間後（グレー棒）あるいはミトゲンの１時間前（白地棒）に加えられた。格子模様棒はＬＯ−ＣＤ２ａのみの存在下で行われた培養を表す。（三つ組みの）培養は保温の最後の８時間に 3Ｈチミジンでパルス標識された。
【図１２】  ＰＭＢＣのミトゲン駆動活性化に対するＬＯ−ＣＤ２ａの作用。２個の供与体からのＰＭＢＣS がＯＫＴ３（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＣＯＮ−Ａ（１０μｇ／ｍｌ）およびＰＨＡ（１μｇ／ｍｌ）の存在下で９６時間培養された。平行培養において、ＬＯ−ＣＤ２ａ（２００ｎｇ／ｍｌ）が培養開始０日（０時間）、１日（２４時間）、あるいは２日（４８時間）で付加された。グラフは各供与体におけるミトゲン誘導増殖のＬＯ−ＣＤ２ａによる阻害の割合を示す。
【図１３】  ＬＯ−ＣＤ２ａの存在下でエフェクター細胞および標的細胞（51ＣＲ標識Ｋ５６２細胞）の保温によるＮＫ活性の阻害。ＬＯ−ＣＤ２ａの３種の濃度：５μｇ／ｍｌ，１μｇ／ｍｌ，０．５μｇ／ｍｌが試験された。ＮＫ活性の末梢血リンパ球であったエフェクター細胞は標識標的細胞の溶解度パーセントで示される。２個の標準被験材料が３種のＥ／Ｔ比率：２００／１，１００／１，５０／１で試験された。
【図１４】  ＬＯ−ＣＤ２ａの存在下でエフェクター細胞および標的細胞（51ＣＲ標識Ｋ５６２細胞）の保温によるＮＫ活性の阻害。ＬＯ−ＣＤ２ａの３種の濃度：５μｇ／ｍｌ，１μｇ／ｍｌ，０．５μｇ／ｍｌが試験された。ＮＫ活性の末梢血リンパ球であったエフェクター細胞は標識標的細胞の溶解度パーセントで示される。２個の標準被験材料が３種のＥ／Ｔ比率：２００／１，１００／１，５０／１で試験された。
【図１５】  １０日間（０日−９日）にわたりＬＯ−ＣＤ２ａを２０ｍｇ／日受けたシノモルグスサル（Ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ  ｍｏｎｋｅｙ）の末梢血のμｌ当り全リンパ球。
【図１６】  １０日間（０日−９日）にわたり２０ｍｇ／日でＬＯ−ＣＤ２ａを受けたシノモルグスサルのＰＢＭＣがＣＤ２（Ｌｅｕ−５ｂ）、ＣＤ４（Ｌｅｕ３ａ）、ＣＤ８（Ｌｅｕ２ａ）、ナチュラルキラー細胞（ＣＤ８およびＣＤ１１ｂ）、およびＢ細胞（抗−ＩｇＭ）に対するモノクローナル抗体で指示された日に染色され、フローサイトメトリーにより分析された。結果は血液のマイクロリットル当り染色細胞全数の割合で示される。
【図１７】  １０日間（０日−９日）にわたり２０ｍｇ／日でＬＯ−ＣＤ２ａを受けたシノモルグスサルのＮＫ活性。ＮＫ活性は１１日および２２日で検定され、２５／１、５０／１および１００／１のＥ／Ｔでの溶解度％で示された。
【図１８】  １０日間（０日−９日）にわたり２０ｍｇ／日で抗体を受けたシノモルグスサルのＬＯ−ＣＤ２ａの血清濃度。モノクローナル抗体が本文に記載された通りエリザにより測定されまたμｇ／ｍｌで表現された。
【図１９】  １０日間（０日−９日）にわたりＬＯ−ＣＤ２ａを２０ｍｇ／日受けたシノモルグスサルにおけるＬＯ−ＣＤ２ａに対するＩｇＧ抗体の推移。モノクローナル抗体に対する抗体が本文に記載されたサンドイッチエリザにより指定された日に引き出された血清の連続希釈で測定され、４９２ｎｍの光学密度（吸光度）で示される。
【図２０】  ヒヒリンパ球に対するＬＯ−ＣＤ２ａの作用。
ａ）指示された日に血液がヒヒから得られ、結合ＬＯ−ＣＤ２ａを検出するために、細胞が抗ＣＤ２抗体Ｔ１１−ＲＤ１およびＬｅｕ−５ｂ−ＦＩＴＣ、ＬＯ−ＣＤ２ａおよびＭＡＲＫ３−ＦＩＴＣ、ＦＩＴＣに結合されたマウス抗ラットカッパ１ｂ抗体で染色された。
ｂ）指示された日に採取された血清サンプルがエリザによりＬＯ−ＣＤ２ａのレベルを評価された。
【図２１】  ヒヒリンパ球に対するＬＯ−ＣＤ２ａの作用。
指示された日に血液が採取され、結合ＬＯ−ＣＤ２ａを検出するために細胞がＰＥ−接合ストレプトアビジンで検出されるＭＡＲＫ３−ＦＩＴＣおよびＭＡＲＫ２ｂ−８−ビオチン（ビオチンに接合されたマウスモノクローナル抗ラットＩｇＧ２ｂ抗体）で染色された。
ａ）細胞の前処理なし。
ｂ）循環抗体で占有されていないいずれかの部位を検出するために染色に先立つＬＯ−ＣＤ２ａ、２．５μｇ／ｍｌでの保温。
【図２２】  ヒヒリンパ球に対するＬＯ−ＣＤ２ａの作用。
指示された日に血液サンプルが採取されＴ４−ＲＤ１（ＣＤ４）、Ｔ８−ＲＤ１（ＣＤ８）あるいはＭＡＲＫ３−ＦＩＴＣ（ＬＯ−ＣＤ２ａに結合）で染色された。
【図２３】  同種移植片拒絶反応のためＡＴＧ次いでＬＯ−ＣＤ２ａで処置された患者＃１の白血球、リンパ球およびクレアチニン。
【図２４】  患者＃１における処置中および処置後のＬＯ−ＣＤ２ａの血清レベル。
【図２５】  ＬＯ−ＣＤ２ａでの処置前、処置中および処置後の患者＃２におけるクレアチニン。
【図２６】  ＬＯ−ＣＤ２ａでの処置前、処置中および処置後の患者＃２における白血球数およびリンパ球数。
【図２７】  各注射の直前および２．５時間後に取り出された患者＃２におけるＬＯ−ＣＤ２ａの血清レベル。
【図２８】  腎同種移植片拒絶反応に関しＬＯ−ＣＤ２ａを受けた患者＃３における白血球数、リンパ球数および血清クレアチニンレベル。
【図２９】  ＬＯ−ＣＤ２ａおよび（２）Ｌｅｕ５ｂ、（３）Ｌｅｕ４（ＣＤ３）、（４）Ｌｅｕ３ａ（ＣＤ４）、（５）Ｌｅｕ２ｂ（ＣＤ８）および（６）Ｌｅｕ１１（抗ＣＤ１６）ＮＫ細胞のマーカーでの二色染色。ＬＯ−ＣＤ２ａ結合はヤギ抗ラットＩＧ−ＦＩＴＣで検出された。２色ヒストグラムの上部セット（１−６）は二色染色を示す。下部セット（７−１２）は各抗体での単一染色を示す。
【図３０】  ＬＯ−ＣＤ２ａおよび（２）Ｌｅｕ５ｂ、（３）Ｌｅｕ４（ＣＤ３）、（４）Ｌｅｕ３ａ（ＣＤ４）、（５）Ｌｅｕ２ｂ（ＣＤ８）および（６）Ｌｅｕ１１（抗ＣＤ１６）ＮＫ細胞のマーカーでの二色染色。ＬＯ−ＣＤ２ａ結合はヤギ抗ラットＩＧ−ＦＩＴＣで検出された。２色ヒストグラムの上部セット（１−６）は二色染色を示す。下部セット（７−１２）は各抗体での単一染色を示す。
【図３１】  ＬＯ−ＣＤ２ａに対するラットアイソタイプ対照（ファーミンゲン、精製ラットＩｇＧ２ｂ、カッパ）、あるいはＬＯ−ＣＤ２ａとＣＤ４（ｃ，ｄ）、ＣＤ８（ｅ，ｆ）、ＣＤ１６（ｇ，ｈ）、ＣＤ１９（ｉ，ｊ）およびＣＤ２（ｋ，ｌ）に対するフィコエリスリン接合抗体でのヒトＰＢＬの２色染色。ＬＯ−ＣＤ２ａおよびアイソタイプ対照はＦＩＴＣ接合アフィニティー精製Ｆ（ａｂ′）２抗ラット免疫グロブリン（サザン・バイオテクノロジー）で検出された。ＣＤ抗原に対する抗体はすべてベクトン・ディキンソンから得たフィコエリスリン接合抗体であった〔ＣＤ４（Ｌｅｕ３ａ）、ＣＤ８（Ｌｅｕ２ａ）、ＣＤ１６（Ｌｅｕ−１１ｂ）、ＣＤ１９（Ｌｅｕ１２）およびＣＤ２（ＬｅｕＳｂ）〕。それぞれの場合アイソタイプ対照での染色は第一ヒストグラムでまたＬＯ−ＣＤ２ａは第二ヒストグラムで示される。ヒストグラムａはアイソタイプ対照でのパターンをまたｂはＬＯ−ＣＤ２ａでのパターンを示す。
【図３２】  ＬＯ−ＣＤ２ａに対するラットアイソタイプ対照（ファーミンゲン、精製ラットＩｇＧ２ｂ、カッパ）、あるいはＬＯＣＤ２ａとＣＤ４（ｃ，ｄ）、ＣＤ８（ｅ，ｆ）、ＣＤ１６（ｇ，ｈ）、ＣＤ１９（ｉ，ｊ）およびＣＤ２（ｋ，ｌ）に対するフィコエリスリン接合抗体でのヒトＰＢＬの２色染色。ＬＯ−ＣＤ２ａおよびアイソタイプ対照はＦＩＴＣ接合アフィニティー精製Ｆ（ａｂ′）２抗ラット免疫グロブリン（サザン・バイオテクノロジー）で検出された。ＣＤ抗原に対する抗体はすべてベクトン・ディキンソンから得たフィコエリスリン接合抗体であった〔ＣＤ４（Ｌｅｕ３ａ）、ＣＤ８（Ｌｅｕ２ａ）、ＣＤ１６（Ｌｅｕ−１１ｂ）、ＣＤ１９（Ｌｅｕ１２）およびＣＤ２（ＬｅｕＳｂ）〕。それぞれの場合アイソタイプ対照での染色は第一ヒストグラムでまたＬＯ−ＣＤ２ａは第二ヒストグラムで示される。ヒストグラムａはアイソタイプ対照でのパターンをまたｂはＬＯ−ＣＤ２ａでのパターンを示す。
【図３３】  野生型ＣＤ２で形質移入されたＣＯＳ細胞の染色の細胞蛍光間接撮影分析。左側パネルはＣＤ２を含まない対照ベクターで形質移入されたＣＯＳ細胞の染色のヒストグラム、右側のセットのパネルは完全ＣＤ２分子を含むベクターで一過性形質移入されたＣＯＳ細胞の染色のヒストグラムを示す。各セットにおいて、上部ヒストグラムはネズミＷ６３２（ＣＯＳ細胞により発現されるものとして知られるクラスＩに対する抗体）、および７６−２−１１（ネズミＷ６３２のためのアイソタイプ対照）での染色を示す。中位パネルはＬｅｕ５ｂ（ベクトン・ディキンソンからの抗ＣＤ２）および７６−２−１１、Ｌｅｕ５ｂ染色のためのアイソタイプ付合対照での染色を示し、下部パネルはＬＯ−ＣＤ２ａおよびＬＯ−ＣＤ２ａのためのラットアイソタイプ付合対照での染色を示す。
【図３４】  キメラＬＯ−ＣＤ２ａ  ＶL 鎖のヌクレオチドおよびアミノ酸配列。
【図３５】  キメラＬＯ−ＣＤ２ａ  ＶL 鎖のヌクレオチドおよびアミノ酸配列。
【図３６】  キメラＬＯ−ＣＤ２ａ  ＶL 鎖のヌクレオチドおよびアミノ酸配列。
【図３７】  キメラＬＯ−ＣＤ２ａ  ＶH 鎖のヌクレオチドおよびアミノ酸配列。
【図３８】  キメラＬＯ−ＣＤ２ａ  ＶH 鎖のヌクレオチドおよびアミノ酸配列。
【図３９】  ラットＬＯ−ＣＤ２ａ、ヒトＨＵＭ５４００およびヒト化ＬＯ−ＣＤ２ａの軽鎖可変領域のアミノ酸配列。
【図４０】  ヒト化ＬＯ−ＣＤ２ａ可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列。
【図４１】  ヒト化ＬＯ−ＣＤ２ａ可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列。
【図４２】  ヒト化ＬＯ−ＣＤ２ａ可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列。
【図４３】  ラットＬＯ−ＣＤ２ａ、ヒトＡｍｕ５−３、およびヒト化ＬＯ−ＣＤ２ａの重鎖可変領域のアミノ酸配列。
【図４４】  ヒト化ＬＯ−ＣＤ２ａの重鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列。
【図４５】  ヒト化ＬＯ−ＣＤ２ａの重鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列。
【図４６】  ヒト化ＬＯ−ＣＤ２ａの重鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列。
【図４７】  ラットＬＯ−ＣＤ２ａ、ヒト化ＬＯ−ＣＤ２ａのジャーカット細胞への結合。
【図４８】  ラットＬＯ−ＣＤ２ａ、ヒト化ＬＯ−ＣＤ２ａ、および対照ラットならびにヒト免疫グロブリンによる試験管内低応答性の誘導。
【図４９】  ＬＯ−ＣＤ２ａによる一次ＭＬＲの阻害および一次ＭＬＲ内でのＬＯ−ＣＤ２ａで培養されたＴ細胞の二次ＭＬＲ内での抗原あるいはＭＬＲ内での第三者刺激体に対する応答。
【図５０】  ＬＯ−ＣＤ２ａによる一次ＭＬＲの阻害および一次ＭＬＲ内でのＬＯ−ＣＤ２ａで培養されたＴ細胞の二次ＭＬＲ内での抗原あるいはＭＬＲ内での第三者刺激体に対する応答。
【図５１】  一次ＭＬＲ内でＬＯ−ＣＤ２ａで培養されたＴ細胞の二次ＭＬＲ内での抗原あるいは二次培養内での破傷風トキソイドに対する応答。
【図５２】  ＭＬＲに対するＬＯ−ＣＤ２ａのＦ（ａｂ′）2 断片の作用。
【図５３】  無傷ＬＯ−ＣＤ２ａ抗体とＬＯ−ＣＤ２ａのＦ（ａｂ′）2 断片の可溶ＯＫＴ３によるＰＢＭＣの増殖に対する阻害性の比較。
【図５４】  ＬＯ−ＣＤ２ａの阻害性についてのＡＰＣS の平板結合ＯＫＴ３により誘導される増殖に対する作用。
【図５５】  ラットＬＯ−ＣＤ２ａ、ヒト化抗体ＭＥＤＩ−５０７、およびヒトＡｍｕ５−３の重鎖可変領域のアミノ酸配列。
【図５６】  ラットＬＯ−ＣＤ２ａ、ヒト化抗体ＭＥＤＩ−５０７、およびヒトＡｍｕ５−３の重鎖可変領域のアミノ酸配列。
【図５７】  ｈｃｍｖ−Ｖ１１ｙｓ−ｋｒ−ｎｅｏおよびｈｃｍｖ−ＶｈＬｙｓ−ｇａｍｍａｌ−ｎｅｏのプラスミド地図。
【図５８】  ｐＥＥ６ｈＣＭＶ−ＢおよびｐＥＥ１２のプラスミド地図。
【図５９】  結合測定法に基づくラットＬＯ−ＣＤ２ａとジャーカット細胞のヒト化ＭＥＤＩ−５０７抗体との比較。
【図６０】  リンパ球混合反応を阻害するためのＬＯ−ＣＤ２ａ、ヒト化ＭＥＤＩ−５０７抗体、およびヒトＩｇＧの能力の比較。１個の応答体／刺激体対のＭＬＲ応答がラットＬＯ−ＣＤ２ａあるいはＭＥＤＩ−５０７による応答の相対的阻害の例として示される。ラットＩｇＧ２ｂあるいはヒトＩｇＧはアイソタイプ対照である。
【図６１】  低応答性検定でのラットＬＯ−ＣＤ２ａ及びヒト化ＭＥＤＩ−５０７抗体の比較。要約すると、全部で７日のＭＬＲがラットＬＯ−ＣＯ２ａ、ＭＥＤＩ−５０７あるいは対照ラットもしくはヒトＩｇＧの存在下で６ウエル平板で実行された。培養は死亡細胞を除去するためにフィコールにされ、３乃至４日培地に置かれた。細胞は次いでもとの異形刺激体を持つ二次攻撃に対し増殖する能力を評価された。外因性抗体を受けなかった一次ＭＬＲの再攻撃された培養に関連する増殖の対照％が示される。この「培地」処置培養は１００％応答と測定される。
【図６２】  ＣＤ２細胞総数に対するラットＬＯ−ＣＤ２ａおよびヒト化ＭＥＤＩ−５０７抗体の作用の比較。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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