(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１のタグを付したプロテインホスファターゼ２Ａ型酵素（ＰＰ２Ａ）の触媒サブユニットをコードするｃＤＮＡを組み込んだバキュロウイルスと、第２のタグを付したＰＰ２ＡのＡサブユニットをコードするｃＤＮＡを組み込んだバキュロウイルスとを、一緒に昆虫培養細胞に感染させて培養した後、当該培養細胞を破砕して細胞破砕液を得、この細胞破砕液を、第１のタグと結合する物質が担持された固相および第２のタグと結合する物質が担持された固相を用いて精製するＰＰ２Ａヘテロ２量体誘導体の製造方法において、バキュロウイルスが感染した昆虫細胞を、１６ないし２２℃の温度で培養することを特徴とするＰＰ２Ａヘテロ２量体誘導体の製造方法。
【請求項２】
ＰＰ２Ａの触媒サブユニットが、触媒αサブユニットまたは触媒βサブユニットである請求項第１項記載のＰＰ２Ａヘテロ２量体誘導体の製造方法。
【請求項３】
第１のタグが、ポリヒスチジンタグであり、第２のタグが、ＦＬＡＧタグである請求項１記載または第２項記載のＰＰ２Ａヘテロ２量体誘導体の製造方法。
【請求項４】
第１のタグと結合する物質が、Ｎｉであり、第２のタグと結合する物質が、抗−ＦＬＡＧ Ｍ２モノクローナル抗体である請求項第１項ないし第３項の何れかの項記載のＰＰ２Ａヘテロ２量体誘導体の製造方法。
【請求項５】
タグを付したＰＰ２Ａ触媒サブユニットをコードするｃＤＮＡを組み込んだバキュロウイルスを昆虫培養細胞に感染させて培養した後、当該培養細胞を破砕して細胞破砕液を得、この細胞破砕液を、前記タグと結合する物質が担持された固相を用いて精製するＰＰ２Ａ触媒サブユニット誘導体の製造方法において、バキュロウイルスが感染した昆虫細胞を、１６ないし２２℃の温度で培養することを特徴とするＰＰ２Ａ触媒サブユニット誘導体の製造方法。
【請求項６】
ＰＰ２Ａの触媒サブユニットが、触媒αサブユニットまたは触媒βサブユニットである請求項第５項記載のＰＰ２Ａ触媒サブユニット誘導体の製造方法。
【請求項７】
タグが、ポリヒスチジンタグである請求項５記載または第６項記載のＰＰ２Ａ触媒サブユニット誘導体の製造方法。
【請求項８】
タグと結合する物質が、Ｎｉである請求項第５項ないし第７項の何れかの項記載のＰＰ２Ａ触媒サブユニット誘導体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロテインホスファターゼ２Ａ型酵素（以下、「ＰＰ２Ａ」と略称する）のヘテロ二量体誘導体の製造方法に関し、更に詳細には、それぞれタグを付したＰＰ２Ａの触媒サブユニットおよびＡサブユニットよりなり、極めて高純度のＰＰ２ＡとすることのできるＰＰ２Ａヘテロ２量体誘導体の大量製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＰＰ２Ａは、タンパク質のセリン・トレオニン残基に結合した燐酸基を加水分解する酵素の中で最も基本的な酵素の一つであり、ＰＰ２Ａｃと呼ばれる触媒サブユニットとＡサブユニットおよびＢサブユニットとが結合した３量体からなる複合体を形成している。このうち、触媒サブユニット及びＡサブユニットにはαおよびβの２種類のアイソフォームが存在することが知られている。
【０００３】
このＰＰ２Ａは、生体内シグナル伝達に重要な役割を果たしており、生化学試薬として大きな需要があり、高価で市販されている。さらに、近年になって、海産二枚貝に蓄積する有毒成分のオカダ酸類や、湖沼中の有毒成分として規制の対象となる、らん藻毒（ミクロシスチン類、ノジュラリン類）の簡易測定キットの構成試薬としての需要が加わった。
【０００４】
現在、上記の目的のために使用されているＰＰ２Ａとしては、ヒト血球から調製されたＰＰ２Ａと呼ばれるＡサブユニットと触媒サブユニットとのヘテロダイマーが知られているのみである。
【０００５】
しかし、ヒト血球より精製されているＰＰ２Ａは、動物組織中から分離取得するためのその精製過程が煩雑で、大量精製が困難であり、高価となっていた。しかも、得られたＰＰ２Ａ自体、十分に純度が高いといえず、生化学試薬として使用する上で問題があった。また、基礎研究の面でも純粋なＰＰ２Ａを安価あるいは手軽に大量に得られないことは、ＰＰ２Ａが関わる多様な生命現象の解明に必要な研究を困難にしているという問題もあった。
【０００６】
本発明者らは、先にＰＰ２Ａの製造方法に関し検討を行った結果、バキュロウイルスを使用する遺伝子工学的手法により目的とするＰＰ２Ａの触媒サブユニットやＡサブユニットを産生するにあたり、これらのそれぞれにタグを付すことにより、他のタンパクと簡単に分離でき、高純度のものを得ることができることを見出した。そして特に、異なるタグを有するＰＰ２Ａの触媒サブユニットとＡサブユニットとを、同一の培養細胞中で産生させることにより、異なった２つのタグを有するＰＰ２Ａの触媒サブユニットとＡサブユニットのヘテロダイマーを得ることが可能であり、このものの有する２つのタグの利用で、目的とするヘテロダイマーのみが簡単に精製できることを見出し、特許出願した。
【０００７】
しかしながら、バキュロウイルス発現系を用いた場合、可溶性タンパクとしてよりも不溶性タンパクとして発現するＰＰ２Ａの割合が多いため、その高発現率にもかかわらず精製可能なＰＰ２Ａの割合が低いという問題があった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従って本発明は、バキュロウイルス発現系を用いた場合の、精製可能なＰＰ２Ａの割合が低いという問題を解決するための手段を提供することをその課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決すべく、特にバキュロウイルス感染後の昆虫細胞の培養条件について鋭意研究を行った結果、通常の培養条件より低い温度で昆虫細胞を培養することにより、精製可能な可溶性ＰＰ２Ａ量が格段に増加することを見出し、本発明を完成した。
【００１０】
すなわち本発明は、第１のタグを付したプロテインホスファターゼ２Ａ型酵素（ＰＰ２Ａ）の触媒サブユニットをコードするｃＤＮＡを組み込んだバキュロウイルスと、第２のタグを付したＰＰ２ＡのＡサブユニットをコードするｃＤＮＡを組み込んだバキュロウイルスとを、一緒に昆虫培養細胞に感染させて培養した後、当該培養細胞を破砕して細胞破砕液を得、この細胞破砕液を、第１のタグと結合する物質が担持された固相および第２のタグと結合する物質が担持された固相を用いて精製するＰＰ２Ａヘテロ２量体誘導体の製造方法において、バキュロウイルスが感染した昆虫細胞を、１６ないし２２℃の温度で培養することを特徴とするＰＰ２Ａヘテロ２量体誘導体の製造方法である。
【００１１】
また本発明は、タグを付したＰＰ２Ａ触媒サブユニットをコードするｃＤＮＡを組み込んだバキュロウイルスを昆虫培養細胞に感染させて培養した後、当該培養細胞を破砕して細胞破砕液を得、この細胞破砕液を、前記タグと結合する物質が担持された固相を用いて精製するＰＰ２Ａ触媒サブユニット誘導体の製造方法において、バキュロウイルスが感染した昆虫細胞を、１６ないし２２℃の温度で培養することを特徴とするＰＰ２Ａ触媒サブユニット誘導体の製造方法である。
【００１２】
更に本発明は、タグを付したＰＰ２ＡのＡサブユニットをコードするｃＤＮＡを組み込んだバキュロウイルスを昆虫培養細胞に感染させて培養した後、当該培養細胞を破砕して細胞破砕液を得、この細胞破砕液を、前記タグと結合する物質が担持された固相を用いて精製するＰＰ２ＡのＡサブユニット誘導体の製造方法において、バキュロウイルスが感染した昆虫細胞を、１６ないし２２℃の温度で培養することを特徴とするＰＰ２ＡのＡサブユニット誘導体の製造方法である。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、ＰＰ２Ａの活性を有するＰＰ２Ａヘテロ２量体誘導体を、従来の煩雑な抽出、精製過程を経ることなく、精製度が高い状態で簡単に大量に製造することができる。
【００１４】
従って、本発明により得られるＰＰ２Ａヘテロ２量体誘導体は、生化学試薬としての需要が増加することが期待されるＰＰ２Ａとして広く利用することが可能である。また、オカダ酸類等の簡易測定キットの開発のためにもその利用が期待される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本明細書における「誘導体」とは、主に本来の化合物にタグが付されたものであることを意味する。例えば、ＰＰ２Ａの触媒サブユニットに、ポリヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグ、ＧＳＴタグ、ＨＡタグ等を付したものをＰＰ２Ａの触媒サブユニット誘導体としている。
【００１６】
本発明方法を実施するには、まず、タグを付したＰＰ２Ａ触媒サブユニットや、ＰＰ２ＡのＡサブユニットをコードするｃＤＮＡを入手することが必要である。このｃＤＮＡの由来は特に限定されないが、ヒト、マウス、ラット等の動物由来のものが好ましく、特にヒト由来のものが好ましい。
【００１７】
このｃＤＮＡのうち、タグを付したＰＰ２Ａ触媒サブユニットを得るには、例えば、ＰＰ２Ａ触媒サブユニット（ＰＰ２Ａｃ）のα、β各アイソフォームをコードするｃＤＮＡを含んだプラスミドクローンおよびタグに対応するプライマーを入手し、プラスミドクローンを鋳型としてＰＣＲを行うことにより得ることができる。タグを付したＰＰ２ＡのＡサブユニットをコードするｃＤＮＡも、上記と同様にして、ＰＰ２ＡのＡサブユニットをコードするｃＤＮＡを含んだプラスミドクローンおよびタグに対応するプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより得ることができる。上記各サブユニットに対し、タグはそれぞれのＮ端側に付すようにすることが好ましい。
【００１８】
上記のようにして得られる、タグを付したＰＰ２Ａ触媒サブユニットや、ＰＰ２ＡのＡサブユニットをコードするｃＤＮＡは、それぞれバキュロウイルスに組み込まれ、これらのバキュロウイルスは、一緒に昆虫培養細胞に感染させた後、培養され、この培養物中から目的のＰＰ２Ａヘテロ２量体誘導体が得られる。本発明方法においては、このバキュロウイルスに感染された昆虫培養細胞の培養を、従来の培養温度（約２７℃）より低い温度で行うことが重要であり、これにより、ＰＰ２Ａヘテロ２量体誘導体の発現量が大幅に増加する。具体的には、１６ないし２２℃程度、より好ましくは１８ないし２０℃程度の温度で培養する。
【００１９】
本発明方法により、ＰＰ２Ａヘテロ２量体誘導体を得るには、例えば、以下の工程を含む方法を実施すればよい。
（１）ＰＰ２Ａの触媒サブユニットおよびＡサブユニットをコードするｃＤＮＡを、別
個にクローニングベクターに組み込む工程、
（２）上記各クローニングベクター中の各サブユニットをコードするｃＤＮＡを、別個
にバキュロウイルス発現システム用の組換えドナープラスミドに組み込む工程、
（３）上記各組み換えドナープラスミド中から、部位特異的トランスポジションにより
各サブユニットをコードするｃＤＮＡを、別個にバキュロウイルスシャトルベクタ
ー（Ｂａｃｍｉｄ）に組み込む工程、
（４）上記バキュロウイルスシャトルベクターから、各サブユニットをコードする
ｃＤＮＡを組み込んだバキュロウイルスを別個に作る工程、
（５）得られた各バキュロウイルスを、一緒に昆虫培養細胞に感染させてＰＰ２Ａヘテ
ロ２量体誘導体を発現させ、前記の従来の培養温度より低い温度で培養する工
程、
（６）発現されたＰＰ２Ａヘテロ２量体を二段階で精製する工程
【００２０】
上記方法のうち、工程（１）および（２）を図１に、工程（３）から（５）を図２に示す。
【００２１】
上記工程（１）において使用されるクローニングベクターとしては、ＴＯＰＯベクター等が使用される。また、工程（２）で用いるドナープラスミドとしては、ｐＤＥＳＴ８等が使用される。更に、工程（３）および（４）を実施するには、例えば、Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃバキュロウイルス発現システム等の市販のシステムを使用することができる。更に、各サブユニットをコードするｃＤＮＡを含むバキュロウイルスを感染させる宿主細胞としては、ヨトウガ細胞やカイコ細胞が利用され、特にＳｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞、Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ細胞が好ましい。
【００２２】
本発明の特徴は、上記工程（５）において、バキュロウイルスを感染させた昆虫培養細胞を、従来の培養温度（２７℃）より、低い１６ないし２２℃程度の温度、好ましくは１８〜２０℃程度の温度で培養する点にある。このような温度では、従来の培養温度に比べ、培養時間は若干長くする必要があるが、格段に高い収率で目的物であるＰＰ２Ａヘテロ２量体誘導体を得ることが可能となる。
【００２３】
そして、培養細胞中に産生されたＰＰ２Ａヘテロ２量体誘導体は、この培養細胞を破砕することにより得られる細胞破砕液から取得することができる。この培養細胞の破砕に当たっては、例えば、超音波処理、ホモジナイズ等の手段が用いられる。このようにして得られた細胞破砕液は、工程（６）において、各サブユニットに付されたタグを使用し、他の夾雑物から分離される。すなわち、ＰＰ２Ａの触媒サブユニットおよびＡサブユニットには、それぞれ別のタグが付されているので、それらのタグと結合する物質を担持した固相と順次接触させることにより、ＰＰ２Ａヘテロ２量体誘導体のみが得られる。
【００２４】
この２つのタグを用いた分離は、例えば、ＰＰ２Ａの触媒サブユニットに付されたタグがポリヒスチジンタグで、Ａサブユニットに付されたタグがＦＬＡＧタグである場合、まず、遠心分離し、細胞を破砕して得られる細胞破砕液を、ポリヒスチジンタグと結合する物質、例えばＮｉを担持する固相と接触させる。この固相としては、例えば、アガロース等が利用され、また、固相と培養液との接触は、バッチ方式であっても、通液方式であっても良い。
【００２５】
次いで、細胞破砕液と接触させた固相は、適当な溶媒で洗浄した後、ポリヒスチジンタグとの結合を解離することのできる処理液で処理し、溶出液を得る。この処理液の例としては、ポリヒスチジンに対する結合物がＮｉである場合は、１００〜２５０ｍＭのイミダゾール等が使用される。
【００２６】
更に、上記溶出物は、ＦＬＡＧタグと結合する物質を担持する固相と接触させる。このＦＬＡＧタグと結合する物質としては、抗−ＦＬＡＧ  Ｍ２モノクローナル抗体等が挙げられ、使用される固相や接触方式は、上記とほぼ同様でよい。
【００２７】
その後、溶出液と接触させた固相は、適当な溶媒で十分に洗浄した後、ＦＬＡＧタグの結合を解離できる処理液で処理し、溶出液を得る。この処理液としては、例えば、０.２ｍｇ／ｍｌのＦＬＡＧペプチドが挙げられる。
【００２８】
一方、ＰＰ２Ａの触媒サブユニットに付されたタグがＨＡタグで、Ａサブユニットに付されたタグがＧＳＴタグである場合、上記と同様にして得られる細胞破砕液を、ＨＡタグと結合する物質、例えば抗−ＨＡ抗体を担持する固相と接触させる。この固相としては、例えばアガロース等が利用され、また、固相と培養液との接触は、バッチ方式であっても、通液方式であっても良い。
【００２９】
次いで、細胞破砕液と接触させた固相は、適当な溶媒で洗浄した後、ＨＡタグとの結合を解離することのできる処理液で処理し、溶出液を得る。この処理液の例としては、ＨＡタグに対する結合物が抗−ＨＡ抗体である場合は、１ｍｇ／ｍｌのＨＡペプチド等が使用される。
【００３０】
更に、上記溶出物は、ＧＳＴタグと結合する物質を担持する固相と接触させる。このＧＳＴタグと結合する物質としては、グルタチオン等が挙げられ、使用される固相や接触方式は、上記とほぼ同様でよい。
【００３１】
その後、溶出液と接触させた固相は、適当な溶媒で十分に洗浄した後、ＧＳＴタグの結合を解離できる処理液で処理し、溶出液を得る。この処理液としては、例えば、５〜１０ｍＭの還元型グルタチオンが挙げられる。
【００３２】
以上のようにして得られた溶出液中には、有機物としてＰＰ２Ａヘテロ２量体誘導体のみが存在し、他の有機物は存在しないので、そのまま、あるいは凍結乾燥して試薬等として利用可能である。すなわち、上記のように２段の工程で精製したため、例えば、タグとしてポリヒスチジンタグとＦＬＡＧタグを用いた場合には、その両者を有する物質のみが残るが、このような条件を備えた物質は、本発明方法中では、ＰＰ２Ａヘテロ２量体誘導体しか存在し得ないからである。
【００３３】
かくすることにより、極めて純度の高いＰＰ２Ａヘテロ２量体誘導体が得られる。
【００３４】
なお、ＰＰ２Ａの触媒サブユニット誘導体を得るには、（５）工程のタグ付き触媒サブユニットをコードするｃＤＮＡを組み込んだバキュロウイルスを単独で昆虫細胞に感染させることと、（６）工程の精製を、この触媒サブユニットに付されたタグを用い、一段で行なう以外は、上記（１）ないし（６）の工程を単独で行えばよい。
【実施例】
【００３５】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら制約されるものではない。 また、実施例に記載した方法の態様を改変できるのは明らかであるから、このような改変は、本発明の範囲から逸脱するものと解してはならず、自明と考えられるすべての改変は、本発明の特許請求の範囲内に包含されるものである。
【００３６】
実  施  例  １
ヒトＰＰ２Ａ触媒サブユニット（ＰＰ２Ａｃ）のα、β各アイソフォームをコードするｃＤＮＡを含んだプラスミドクローン（インビトロゲン社から購入、クローンＩＤ  ３６０７８６２、４４５４９７２）を鋳型とし、ＰＣＲ法によりポリヒスチジンタグ付き触媒サブユニット（Ｈｉｓ−ＰＰ２Ａｃα及びＨｉｓ−ＰＰ２Ａｃβ）をコードするＤＮＡ断片を得た。
【００３７】
ＰＣＲ法の条件は、下記の通りであり、これに用いたプライマーは以下の通りである。
［ＰＣＲ条件］
下記（１）を１サイクル、次いで（２）を２５サイクル、最後に（３）を１サイクル行った。
（１）９４℃、２分
（２）９４℃、３０秒
↓
５５℃、１分
↓
７２℃、２分
（３）７２℃、２分
【００３８】
［使用プライマー］
プライマー１（αアイソフォーム用）：
５'−ＣＡＣＣＡＴＧＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＧＡＣＧＡＧＡＡＧ
ＧＴＧＴＴＣＡＣＣＡＡＧ−３'
プライマー２（αアイソフォーム用）：
５'−ＴＴＡＴＴＡＣＡＧＧＡＡＧＴＡＧＴＣＴＧＧＧ−３'
プライマー３（βアイソフォーム用）：
５'−ＣＡＣＣＡＴＧＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＧＡＣＧＡＣＡＡＧ
ＧＣＧＴＴＣＡＣＣＡＡＧ−３'
プライマー４（βアイソフォーム用）：
５'−ＴＴＡＴＴＡＴＡＧＧＡＡＧＴＡＧＴＣＴＧＧＧ−３'
【００３９】
ＰＣＲによって得られたＤＮＡ断片は、”ｐENTR  Directional  TOPO  Cloning  Kits”（インビトロゲン社）を使用して、ｐＥＮＴＲ／ＳＤ／Ｄ−ＴＯＰＯベクターへサブクローニングした。サブクローニングされたＤＮＡ断片の塩基配列と方向性は、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１００  ジェネティック・アナライザー（Genetic  Analyzer)（アプライド・バイオシステム社）を用いて調べることによって確認した。
【００４０】
サブクローニングされたＤＮＡ断片は、さらに  ”Baculovirus  Expression  System  with  Gateway  Technology  kit”（インビトロゲン社）を用いて、”Gateway  pDEST8  Vector”（インビトロゲン社）へ挿入され、組換えドナープラスミドを作成した。
【００４１】
作成した組換えドナープラスミドと、Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃバキュロウイルス発現システムを用いて組換えバキュロウイルスシャトルベクター（バクミド）を作成した後、昆虫培養細胞（Ｓｆ９細胞、インビトロゲン社より購入）を利用して組換えバキュロウイルスを作成した。
【００４２】
実  施  例  ２
ヒトＰＰ２ＡのＡサブユニット（ＰＲ６５α／Ａα）をコードするｃＤＮＡを含んだプラスミドクローン（インビトロゲン社から購入、クローンＩＤ  ＩＯＨ１３６７０）を鋳型にしたＰＣＲ法によりＦＬＡＧタグ付きＡサブユニット（ＦＬＡＧ−ＰＲ６５α／Ａα）をコードするＤＮＡ断片を得た。
【００４３】
ＰＣＲ法の条件は、下記の通りであり、これに用いたプライマーは以下の通りである。
［ＰＣＲ条件］
下記（１）を１サイクル、次いで（２）を２５サイクル、最後に（３）を１サイクル行った。
（１）９４℃、２分
（２）９４℃、３０秒
↓
５５℃、１分
↓
７２℃、３分
（３）７２℃、２分
【００４４】
［使用プライマー］
プライマー５
５'−ＣＡＣＣＡＴＧＧＡＣＴＡＣＡＡＧＧＡＴＧＡＣＧＡＴＧＡＣＡＡＧＧＣＧＧＣＧＧＣ
ＣＧＡＣＧＧＣＧＡＣＧＡＣ−３'
プライマー６
５'−ＴＴＡＴＣＡＧＧＣＧＡＧＡＧＡＣＡＧＡＡＣ−３'
【００４５】
ＰＣＲ法によって得られたＤＮＡ断片は、実施例１と同様にしてｐＥＮＴＲ／ＳＤ／Ｄ−ＴＯＰＯベクターへのサブクローニング、組換えドナープラスミドの作成、組換えバキュロウイルスシャトルベクター（Bacmid）の作成及び昆虫培養細胞を利用した組換えバキュロウイルスの作成を行い、組換えバキュロウイルスを含む培養上清１.５ｍＬを得た。
【００４６】
実  施  例  ３
ＰＰ２Ａの触媒サブユニットをコードするｃＤＮＡを組み込んだ組換えバキュロウイルスを、２００ｍＬのハイ・ファイブ（High  Five）細胞（２ｘ１０６個／ｍｌ、１Ｌスピナーフラスコ）に感染させ、１９℃で４日間培養した。培養後、細胞を回収し、以下の方法により組換えタンパクを精製した。
［００４７］
すなわち、まず、回収した細胞をＰＢＳで再懸濁し、遠心分離によって細胞を集め、上清を取り除いた後２０ｍＬのバッファーＡ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．５ｍＭ  Ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ、０．５ｍＭ  ＤＴＴ、１０％  ｇｌｙｃｅｒｏｌ）を加え再び懸濁した。懸濁液中の細胞を超音波破砕した後、小型冷却遠心機を使って遠心分離し（１５，０００ｒｐｍ、２０分、４℃）、上清を回収した。
［００４８］
得られた上清５μＬをＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ＰＰ２Ａ触媒サブユニットの発現をウェスタンブロットによって確認した。可溶性タンパクとして発現したＰＰ２Ａ触媒サブユニットを含んだ上清に５倍量のエタノールを加え、素早く混合した後、遠心分離した（４２００ｘｇ、１５分）。
［００４９］
遠心分離後、上清を除き、沈殿物に２０ｍＬのバッファーＡを加え懸濁した。この懸濁液を遠心分離し（１０，０００ｘｇ、２０分、４℃）、上清を回収し、回収した上清にバッファーＡで平衡化したＮｉ−ＮＴＡ  アガロース（ＱＬＡＧＥＮ社）を８００μＬ加え、４℃で１時間穏やかに撹拌した。
［００５０］
１時間後、Ｎｉ−ＮＴＡ  アガロースを回収し、バッファーＡで洗浄後、溶出液（２５０ｍＭのイミダゾールを含んだバッファーＡ）を２．４ｍＬ加え、４℃で３０分穏やかに撹拌した。３０分後、Ｎｉ−ＮＴＡ  アガロースが混ざらないように注意して溶出液を回収した。
［００５１］
回収した溶出液中に精製された組換え蛋白が含まれていることをＳＤＳ−ＰＡＧＥ（０．２μｇ蛋白；１０％ＳＤＳ−ゲル）で確認した。また、精製したタンパクの活性を、ｐ−ニトロフェニルリン酸を基質に用いた活性測定方法（Ｔａｋａｉ  ｅｔ  ａｌ  １９９５，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．３０６：６５７−６６５）に従って測定した。
［００５２］
ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図３に、ｐ−ニトロフェニルリン酸に対する活性を図４にそれぞれ示す。なお、図４において、２７℃とあるのは、組換えバキュロウイルス感染細胞を、２７℃で３日間培養する以外は、実施例３と同様にして得たＰＰ２Ａのタグ付き触媒ユニット（比較例）を示す。また、図３中、両端のレーンは、マーカー、左から２番目のレーンは、２７℃で培養することにより得られたＰＰ２Ａのタグ付き触媒ユニット、左から３番目のレーンは、１９℃の培養で得られたＰＰ２Ａのタグ付き触媒ユニットである。
［００５３］
図３からは、１９℃の培養で得られたＰＰ２Ａのタグ付き触媒ユニットの方が目的以外の物質の産生が少ないことが認められる。また図４の結果からは、組換えバキュロウイルス感染細胞の培養温度を２７℃から１９℃に変えることにより、ＰＰ２Ａのタグ付き触媒ユニットの活性が６倍以上になることが示された。なお、それぞれの全体のタンパク質収量も、１９℃で培養した場合は、２４０μｇ／４×１０８個 Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ細胞であったのに対し、２７℃の培養の場合は、８８μｇ／４×１０８個 Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ細胞であった。
【００５４】
実  施  例  ４
（１）実施例２で作成した組換えバキュロウイルスについても、２×１０７個／ｍｌの細胞を用いる以外は、実施例３と同様にウイルスの増幅及び感染を行い、ウイルス感染細胞を回収し、組換え蛋白の精製を行った。回収した細胞は、実施例３と同様にＰＢＳで洗浄後、ホモジナイズし、その後の遠心分離によって上清を得た。得られた上清にバッファーＡで平衡化した抗−ＦＬＡＧ  Ｍ２アフィニティ・ゲル（ＳＩＧＭＡ社）を４０μＬ加え、４℃で１時間穏やかに撹拌する。１時間後、抗−ＦＬＡＧ  Ｍ２  アフィニティ・ゲルを回収し、バッファーＡで洗浄後、溶出液（０.２ｍｇ／ｍＬのＦＬＡＧ  ペプタイドを含んだバッファーＡ）を１２０μＬ加え、４℃で３０分穏やかに撹拌する。３０分後、抗−ＦＬＡＧ  Ｍ２  アフィニティ・ゲルが混ざらないように注意して溶出液を回収する。回収した溶出液中に精製された組換え蛋白が含まれていることをＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した。
【００５５】
（２）実施例３で得たヒトＰＰ２Ａのポリヒスチジンタグ付き触媒サブユニット及び上記（１）で得たヒトＰＰ２ＡのＦＬＡＧタグ付きＡサブユニットの精製を確認後、実施例３及び実施例４で使用したウイルスを２×１０７個のＨｉｇｈ  Ｆｉｖｅ細胞に同時感染させ、１９℃で４日間培養後、細胞を回収し、Ａサブユニットと触媒サブユニットで形成されたヘテロ２量体（Ｈｉｓ−ＰＰ２Ａｃα／ＦＬＡＧ−ＰＲ６５α及びＨｉｓ−ＰＰ２Ａｃβ／  ＦＬＡＧ−ＰＲ６５α）組換えタンパクの精製に用いた。精製方法の詳細は以下の通りである。
【００５６】
まず、実施例３と同様に回収した細胞をＰＢＳで洗浄後、ホモジナイズし、その後の遠心分離によって上清を得た。得られた上清にバッファーＡで平衡化したＮｉ−ＮＴＡ  アガロース（ＱＩＡＧＥＮ社）を４０μＬ加え、４℃で１時間穏やかに撹拌する。１時間後、Ｎｉ−ＮＴＡ  アガロースを回収し、バッファーＡで洗浄後、溶出液（２５０ｍＭのイミダゾールを含んだバッファーＡ）を１２０μＬ加え、４℃で３０分穏やかに撹拌する。３０分後、Ｎｉ−ＮＴＡ  アガロースが混ざらないように注意して溶出液を回収する。溶出の操作を２回繰り返し、１回目の溶出液１２０μＬと２回目の溶出液１２０μＬを混ぜ合わせ、合計２４０μＬの溶出液を得る。
【００５７】
この溶出液に、バッファーＡで平衡化した抗−ＦＬＡＧ  Ｍ２  アフィニティ・ゲル（ＳＩＧＭＡ社）を４０μＬ加え、４℃で１時間穏やかに撹拌する。１時間後、抗−ＦＬＡＧ  Ｍ２  アフィニティ・ゲルを回収し、バッファーＡで洗浄後、溶出液（０.２ｍｇ／ｍＬのＦＬＡＧ  ペプタイドを含んだバッファーＡ）を１２０μＬ加え、４℃で３０分穏やかに撹拌する。３０分後、抗−ＦＬＡＧ  Ｍ２  アフィニティ・ゲルが混ざらないように注意して溶出液を回収する。回収した溶出液中に精製された組換え蛋白が含まれていることをＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認する。また、精製したタンパクの活性をｐ−ニトロフェニルリン酸を基質に用いた活性測定方法（Takai  et  al  1995,  Biochem  J.  306:657-665）に従って測定する。
【００５８】
実施例４で精製された、ＰＰ２ＡのＡサブユニットと触媒サブユニットのタグ付きヘテロ２量体（Ｈｉｓ−ＰＰ２Ａｃ／ＦＬＡＧ−ＰＲ６５）について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。この結果を図５に示す。図中、レーン１は、１９℃で培養して得られたＰＰ２Ａのタグ付きヘテロ２量体、レーン２は、２７℃で培養して得られたＰＰ２Ａのヘテロ２量体である。また図６は、それらのｐ−ニトロフェニルリン酸に対する活性を調べた結果を示す図面である。これらの結果から、本発明方法により、通常の２７℃での培養に比べ、より多量の純粋なＰＰ２Ａのタグ付きヘテロ２量体が得られることが分かる。
【産業上の利用可能性】
【００５９】
本発明方法により、ＰＰ２Ａのタグ付き触媒サブユニットや、ＰＰ２ＡのＡサブユニットと触媒サブユニットのタグ付きヘテロ２量体を大量に生産することが可能となった。しかもこれらは、極めて純度が高いものであるので、オカダ酸類やミクロシスチン類、ノジュラリン類のＰＰ２Ａ活性阻害効果を調べる目的に有利に使用することができる。また、上記ヘテロ２量体は、動物細胞抽出液中のＰＰ２ＡのＢサブユニットと結合することが可能であり、ＰＰ２Ａを用いた基礎研究の分野で幅広い活用が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】本発明方法の前半を示す図面である。
【図２】本発明方法の後半（精製工程を除く）を示す図面である。
【図３】実施例３のＰＰ２Ａのタグ付き触媒サブユニットのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図面（写真）である。
【図４】実施例３のＰＰ２Ａのタグ付き触媒サブユニットのｐ−ニトロフェニルリン酸に対する活性を示す図面である。
【図５】実施例３のＰＰ２Ａのタグ付きヘテロ２量体のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図面（写真）である。
【図６】実施例３のＰＰ２Ａのタグ付きヘテロ２量体のｐ−ニトロフェニルリン酸に対する活性を示す図面である。
【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図６】
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【図３】
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【図５】
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【配列表】
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