(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）Ｆｉｇ１（配列番号：２）のアミノ酸残基１〜４３３の配列を持つｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子；又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖；
に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するＤＮＡを含んでなる単離された核酸であって、該核酸によりコードされるポリペプチドがＧｌｉ、Ｇｌｉ２もしくはＧｌｉ３と結合することのできる核酸。
【請求項２】
Ｆｉｇ６Ａ−６Ｂ（配列番号：１）の７４〜１３７２のヌクレオチド位置の配列を含んでなる請求項１に記載の単離された核酸。
【請求項３】
Ｆｉｇ６Ａ−６Ｂ（配列番号：１）の配列を含んでなる請求項１に記載の単離された核酸。
【請求項４】
（ａ）ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１２７（ＤＮＡ３３４５５−１５４８）のヒトタンパク質ｃＤＮＡにコードされるのと同じ成熟ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子である配列番号：１のＤＮＡ分子；又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖；
に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するＤＮＡを含んでなる単離された核酸分子であって、該核酸によりコードされるポリペプチドがＧｌｉ、Ｇｌｉ２もしくはＧｌｉ３と結合することのできる核酸分子。
【請求項５】
ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１２７（ＤＮＡ３３４５５−１５４８）のヒトタンパク質ｃＤＮＡにコードされるのと同じポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなる請求項４に記載の単離された核酸分子。
【請求項６】
（ａ）Ｆｉｇ１（配列番号：２）のアミノ酸残基１〜４３３の配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ；又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡの相補鎖；
を含んでなる単離された核酸分子であって、該核酸によりコードされるポリペプチドがＧｌｉ、Ｇｌｉ２もしくはＧｌｉ３と結合することのできる核酸分子。
【請求項７】
（ａ）Ｆｉｇ１（配列番号：２）のアミノ酸残基１〜４３３の配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ；又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡの相補鎖；を含んでなる請求項６に記載の単離された核酸分子。
【請求項８】
請求項１に記載の核酸を含んでなるベクター。
【請求項９】
該ベクターで形質転換された宿主細胞に認識されるコントロール配列に作用可能に結合した請求項８に記載のベクター。
【請求項１０】
請求項９に記載のベクターを含んでなる宿主細胞。
【請求項１１】
前記細胞がＣＨＯ細胞である請求項１０に記載の宿主細胞。
【請求項１２】
前記細胞が大腸菌である請求項１０に記載の宿主細胞。
【請求項１３】
前記細胞が酵母細胞である請求項１０に記載の宿主細胞。
【請求項１４】
請求項１に記載の核酸によりコードされるｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチドの製造方法であって、請求項１０に記載の宿主細胞を、前記ｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチドの発現に適した条件下で培養し、細胞培養物から前記ｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチドを回収することを含んでなる方法。
【請求項１５】
請求項１に記載のＤＮＡによりコードされた単離されたｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチドであって、Ｇｌｉ、Ｇｌｉ２もしくはＧｌｉ３と結合することのできるｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチド。
【請求項１６】
Ｆｉｇ２（配列番号：２）のアミノ酸残基１〜４３３の配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するポリペプチドを含んでなる単離されたｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチドであって、Ｇｌｉ、Ｇｌｉ２もしくはＧｌｉ３と結合することのできるｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチド。
【請求項１７】
Ｆｉｇ２（配列番号：２）のアミノ酸残基１〜４３３のアミノ酸残基を含んでなる請求項１６に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１８】
Ｆｉｇ１（配列番号：２）のアミノ酸残基１〜４３３の配列を含んでなる単離されたｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチド、又は抗ｈＳｕ（ｆｕ）抗体のための結合部位を提供するのに十分なその断片。
【請求項１９】
ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１２７（ＤＮＡ３３４５５−１５４８）として寄託されたベクターのｃＤＮＡ挿入断片によりコード化される単離されたｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチド。
【請求項２０】
（ｉ）（ａ）Ｆｉｇ１（配列番号：２）のアミノ酸残基１〜４３３の配列を有するｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子；又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖；に緊縮性条件下で試験ＤＮＡ分子をハイブリダイズさせ、上記試験ＤＮＡ分子が（ａ）又は（ｂ）に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する場合に、（ｉｉ）上記ポリペプチドの発現に適した条件下で上記試験ＤＮＡ分子を含んでなる宿主細胞を培養し、（ｉｉｉ）細胞培養物から上記ポリペプチドを回収することにより製造される単離されたポリペプチドであって、Ｇｌｉ、Ｇｌｉ２もしくはＧｌｉ３と結合することのできるポリペプチド。
【請求項２１】
異種アミノ酸配列に融合した請求項１５ないし２０の何れか一項に記載のｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチドを含んでなるキメラ分子。
【請求項２２】
上記異種アミノ酸配列がエピトープタグ配列である請求項２１に記載のキメラ分子。
【請求項２３】
上記異種アミノ酸配列が免疫グロブリンのＦｃ領域である請求項２１に記載のキメラ分子。
【請求項２４】
請求項１５ないし２０の何れか一項に記載のポリペプチドに特異的に結合する抗体。
【請求項２５】
上記抗体がモノクローナル抗体である請求項２４に記載の抗体。
【請求項２６】
上記抗体がヒト化抗体である請求項２４に記載の抗体。
【請求項２７】
請求項１ないし４、６又は７に記載の核酸の何れか一つに対するアンチセンスヌクレオチドを含んでなる、請求項１ないし４、６又は７に記載の核酸の何れか一つによりコードされるｈＳｕ（ｆｕ）発現のアンタゴニスト。
【請求項２８】
請求項１５ないし２０の何れか一項に記載のポリペプチドのＧｌｉ、Ｇｌｉ２もしくはＧｌｉ３への結合あるいはＧｌｉの不活性化のアンタゴニスト又はアゴニストをスクリーニングする方法において、
（ａ）培地中で、請求項１５ないし２０の何れか一項に記載のポリペプチドを発現する標的細胞を候補化合物に暴露し、
（ｂ）処理した細胞における前記ポリペプチドのＧｌｉ、Ｇｌｉ２もしくはＧｌｉ３への結合活性、あるいはＧｌｉの不活性化を評点化し、
候補化合物に暴露していない対照細胞と該結果を比較することを含んでなる方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、一般的に、細胞増殖及び分化に関連するヘッジホッグ（Ｈｈ）シグナル経路に関与する分子に関する。さらに、本発明は、ｆｕｓｅｄのヒトサプレッサー（「ｈｕＳｕ（ｆｕ）」）をコードするＤＮＡと相同性を有する新規ＤＮＡの同定及び単離、またここでｈＳｕ（ｆｕ）あるいはｈＳｕ（ｆｕ）と命名した新規ポリペプチドの組換え生産に関する。
【０００２】
多細胞生物の発育は少なくとも部分的に、細胞、組織、又は器官のパターンの位置的情報を特定、指揮又は維持するメカニズムに依存している。種々の分泌されたシグナル伝達分子、例えばトランスフォーミング成長因子-ベータ（ＴＧＦ-β）、Ｗｎｔ、繊維芽成長因子及びヘッジホッグファミリーのメンバー等は、ショウジョウバエ及び脊椎動物における様々な細胞及び構造のパターン形成に関連している。Perrimon, Cell: 80: 517-520 (1995)。
ヘッジホッグ（Ｈｈ）は、キイロショウジョウバエにおける遺伝子スクリーニングによりセグメントポラリティ遺伝子として最初に同定され、Nusslein-Volhard等, Roux. Arch. Dev. Biol. 193: 267-282 (1984)、広範な発達機能を果たす（Perrimon,
上掲）。１つのショウジョウバエＨｈ遺伝子しか同定されていないが、３つのヒトＨｈ相同体：ソニックＨｈ（ＳＨｈ）、デザートＨｈ（ＤＨｈ）及びインディアンＨｈ（ＩＨｈ）が単離されている（Echelard等, Cell 75, 1417-30 (1993)；Riddle等, Cell 75: 1401-16 (1993)）。ＳＨｈは発育中の脊椎動物胚の脊索及び底板で高レベルで発現される。インビトロ外植片アッセイ並びにトランスジェニック動物におけるＳＨｈの異所性発現は、ＳＨｈが神経管パターン形成において鍵となる役割を果たすことを示している、Echelard等,
上掲, Ericson等, Cell 81: 747-56 (1995); Marti等, Nature 375: 322-5 (1995);
Krauss等, Cell 75, 1432-44 (1993); Riddle等, Cell 75: 1401-16 (1993); Roelink等
Cell 81:445-44 (1995), 上掲; Hynes等, Neuron 19: 15-26 (1997)。また、Ｈｈは、肢（Krauss等, Cel 75: 1431-44 (1993); Laufer等, Cell 79, 993-1003 (1994)）、体節（Fan 及びTessier-Lavigne, Cell 79, 1175-86 (1994); Johnson等, Cell 79: 1165-73 (1994)）、肺（Bellusci等, Develop. 124: 53-63 (1997)）及び皮膚（Oro等, Science 276: 817-21 (1997)）の発達においても役割を果たす。同様に、ＩＨｈ及びＤＨｈは骨、腸及び胚細胞発育に関連する、Apeqvist等, Curr. Biol. 7: 801-4 (1997); Bellusci等,
Dev. Suppl. 124: 53-63 (1997); Bitgood等, Curr. Biol. 6: 298-304 (1996); Roberts等, Development 121: 3163-74 (1995)。ＳＨｈノックアウトマウスは、ＳＨｈが脊椎動物発生の多くの面に重要であるという考えを更に強めた、Chiang等, Nature 383: 407-13 (1996)。 これらのマウスは、脊索及び底板といった正中線における異常、神経管の腹側細胞型の不存在、末端肢構造の不存在、単眼症、及び脊柱及び殆どの肋骨における不存在を示す。
【０００３】
細胞表面において、Ｈｈシグナルは、１２膜貫通ドメインタンパク質Ｐａｔｃｈｅｄ（Ｐｔｃｈ）(Hooper及びScott, Cell 59: 751-65 (1989); Nakano等, Nature 341: 508-13 (1989))及びＧ-タンパク質結合様レセプターＳｍｏｏｔｈｅｎｅｄ（Ｓｍｏ）(Alcedo等, Cell 86: 221-232 (1996); van den Heuval及びIngham, Nature 382: 547-551 (1996))にリレーされると考えられている。遺伝子的及び生化学的証拠が、Ｐｔｃｈ及びＳｍｏが多成分レセプター複合体の一部であるレセプターモデルを支持している、Chen及びStruhl, Cell 87: 553-63 (1996); Marigo等, Nature 384: 176-9 (1996); Stone等, Nature 384: 129-34 (1996)。ＨｈのＰｔｃｈへの結合に際し、ＰｔｃｈのＳｍｏに対する平常の阻害効果が解除され、Ｓｍｏが細胞質膜を通したＨｈシグナルの伝達を可能にする。Ｐｔｃｈ遺伝子における機能変異の喪失が、多発性基底細胞癌（ＢＣＣ）を特徴とする遺伝病である基底細胞母斑症候群（ＢＣＮＳ）の患者で同定された。また、機能障害Ｐｔｃｈ遺伝子変異は、多くの割合で散在性基底細胞癌腫を伴っていた（Chidambaram等, Cancer Research 56:
4599-601 (1996); Gailani等, Nature Genet. 14: 78-81 (1996); Hahn等, Cell 85: 841-51 (1996); Johnson等, Science 272: 1668-71 (1996); Unden等, Cancer Res. 56:
4562-5; Wicking等, Am. J. Hum. Genet. 60: 21-6 (1997)）。Ｐｔｃｈ機能の喪失は、基底細胞癌における制御不能なＳｍｏシグナル伝達を起こすと考えられる。同様に、Ｓｍｏ変異の活性化が散在性ＢＣＣ腫瘍で同定され（Xie等, Nature 391: 90-2 (1998)）、ＳＨｈのレセプター複合体におけるシグナル伝達サブユニットとしてのＳｍｏの役割を強調している。しかしながら、ＰｔｃｈがＳｍｏを制御することによる正確な機構は未だ明らかになっていない。
重要なことに、シグナル伝達機構が、レセプターから下流の標的に伝達されることによるシグナル伝達機構も明確にされねばならない。ショウジョウバエにおける遺伝子上位分析は、幾つかのセグメントポラリティ遺伝子を同定し、それらはＨｈシグナル伝達経路の成分として機能することがわかった（Ingham, Curr. Opin. Genet. Dev. 5: 492-8 (1995); Perrimon,
上掲）。これらは、キネシン様分子、Ｃｏｓｔａｌ-２（Ｃｏｓ-２）（Robbins等, Cell 90: 225-34 (1997); Sisson等, Cell 90: 235-45 (1997)）、ｆｕｓｅｄと命名されたタンパク質（Preat等, Genetics 135: 1047-62
(1990); Therond等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 4224-8 (1996)）、及びＺｎフィンガータンパク質Ｃｉ．（Alexandre等, Genes
Dev. 10: 2003-13 (1996); Dominguez等, Science 272: 1621-5 (1996); Orenic等, Genes Dev. 4: 1053-67 (1990)）を含む。Ｈｈシグナル伝達に関係する更なる成分は、転写因子ＣＢＰ［Akimaru等, Nature 386: 735-738 (1997)］、ネガティブレギュレータｓｌｉｍｂ［Jiang及びStruhl, Nature 391: 493-496 (1998)］及びＳＨｈ応答成分ＣＯＵＰ-ＴＦＩＩ［Krishnan等, Science 278: 1947-1950 (1997)］を含む。さらに、ｆｕｓｅｄのサプレッサとして示された分子［Pham等, Genetics 140: 587-98 (1995); Preat, Genetics 132: 725-36 (1992)］は、ショウジョウバエで見出されたもので、Ｈｈシグナル伝達経路の構成要素であると考えられている。
【０００４】
これらＨｈ経路の分子の機能的役割及び相互作用は、ある部分においては、遺伝学的、構造学的分析に基づいて示唆されてきた。Ｃｏｓ-２における変異は胚致死性であり、各セグメントの中心成分及びＨｈ応答性遺伝子の拡張ドメインの複製を含むＨｈ過剰発現に類似のフェノタイプを提示する。これに対して、ｈＳｕ（ｆｕ）及びＣｉについての変異胚は、各セグメント後部の欠失及び前部の鏡像様複製の置換を含むＨｈ機能の喪失に類似のフェノタイプを示す、Busson等, Roux. Arch. Dev. Biol. 197: 221-230 (1988)。Ｃｉの分子キャラクタリゼーションは、それがＷｉｎｇｌｅｓｓ及びＤｐｐなどのＨｈ応答性遺伝子を直接活性化する転写因子であることを示唆した、Alexandre等, (1996), 上掲;Dominguez等,(1996), 上掲）。同様に、ｆｕｓｅｄの分子解析により、セリン、トレオニンキナーゼと関連性があり、インタクトなＮ末端キナーゼドメイン及びＣ末端制御領域がその適切は機能に必要であることが明らかになった（Preat等,
Nature 347:87-9 (1990); Robbins等, (1997) 上掲；Therond等, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 93: 4224-8 (1996)）。Ｃｏｓ-２及びｆｕｓｅｄの推定反対機能に一致して、ｆｕｓｅｄ変異はＣｏｓ-２変異体によって、及びｆｕｓｅｄ変異体のサプレッサによって抑制される、Preat等, Genetics 135: 1047-62 (1993)。しかしながら、ｆｕｓｅｄ無しの変異及びＮ-末端キナーゼドメイン変異は、ｆｕｓｅｄ変異のサプレッサによって完全に抑制されるが、ｆｕｓｅｄのＣ-末端変異はｆｕｓｅｄのサプレッサのバックグラウンドにおいて強いＣｏｓ-２フェノタイプを示す。このことは、ｆｕｓｅｄキナーゼドメインが、ｆｕｓｅｄのサプレッサが存在しない場合にＳＨｈシグナル伝達の構成アクチベータとして作用することを示唆している。最近の研究は、９２ｋＤａショウジョウバエｆｕｓｅｄ、Ｃｏｓ-２及びＣｉが微小管結合性多タンパク質複合体として存在し、Ｈｈシグナル伝達が微小管からのこの複合体の解離を導くことを示した、Robbins等, Cell 90: 225-34 (1997); Sisson等, Cell 90: 235-45 (1997)。ｆｕｓｅｄ及びＣｏｓ-２の両方ともがＨｈ処理に応答してリン酸化されるが、Robbins等, 上掲; Therond等, Genetics 142: 1181-98 (1996)、この活性の原因となるキナーゼの性質決定は未だ行われていない。
【０００５】
今日までに、これらの成分について知られている脊椎動物相同体は、Ｇｌｉタンパク質ファミリー（例えば、Ｇｌｉ-１、Ｇｌｉ-２及びＧｌｉ-３）のみである。これらは、Ｃｉに構造的に関連するＺｎフィンガー推定転写因子である。これらの中で、Ｇｌｉ-１はＳＨｈシグナルのメディエータ候補であることが示され［Hynes等, Neuron 15: 35-44 (1995), Lee等, Development 124: 2537-52 (1997); Alexandre等, Genes Dev. 10: 2003-13 (1996)］、Ｈｈに応答する遺伝子活性化の機構がハエと脊椎動物の間で保存されることを示唆している。Ｈｈカスケードにおける他のシグナル伝達因子が進化的に保存されるか否かを決定し、生化学レベルでのＨｈシグナル伝達におけるｆｕｓｅｄの機能を調べるために、ヒトｆｕｓｅｄ
ｃＤＮＡが単離され特性決定された（米国仮出願06/076072、1998年２月２６日出願、ここにその全体を取り込む）。マウスにおいて、ｆｕｓｅｄはＳＨｈ応答性組織で発現される。生化学的研究は、ｆｕｓｅｄが機能性キナーゼであることを示した。機能的研究は、ｆｕｓｅｄがＧｌｉのアクチベータであり、ｆｕｓｅｄのドミナントネガティブ形態がアフリカツメガエル胚におけるＳＨｈシグナル伝達を阻止できるという証拠を提供する。これらのデータをまとめて、Ｃｏｓ−２とｆｕｓｅｄの両方がＨｈシグナル伝達に直接的に関連していることが示された。
【０００６】
最近、ショウジョウバエにおいてｆｕｓｅｄタンパク質のサプレッサーが同定され、新規ＰＥＳＴ-包含タンパク質であることが示された（Monnier等, Curr. Biol. 8: 583-586 (1998), Pham等, Genetics 140: 587-598 (1995), Preat等, Genetics 135: 1047-1062 (1993)及びPreat, Genetics 132: 725-736(1992)）。ＰＥＳＴドメインはプロリン、グルタミン酸、（又はアスパラギン酸）、セリン及びトレオニン（一文字コードでそれぞれ、Ｐ、Ｅ、Ｓ、及びＴ）に富む短い配列で、低疎水性指数のもので組み合わされている。それらは、短い（２時間以内）細胞内半減期をもつ多くのタンパク質に見出される（40）。出願人は、ここにおいて、サプレッサーポリペプチドと相同性のあるポリペプチドをコードするＤＮＡを同定し、記述し、ここにおいてｆｕｓｅｄヒトサプレッサー（「ｈＳｕ（ｆｕ）」）と、あるいはｈＳｕ（ｆｕ）と命名した。体細胞において必要であるｐａtｃｈｅｄ遺伝子の変異は、基底細胞癌腫、原発性乳癌腫、髄芽腫、髄膜腫を含む散発性腫瘍において同定された。目下のところ、ｐａtｃｈｅｄはガン抑制因子として作用し、これらの変異はｐａtｃｈｅｄ遺伝子産物における機能欠損を引き起こすことが信じられている。従って、ｈｅｄｇｅｈｏｇ/ｐａｔｃｈｅｄシグナル伝達経路は、腫瘍形成における要因であるかもしれない。細胞増殖の増強及び腫瘍形成に至る遺伝的変化を検出することは、臨床医学にとって非常に興味深いことである。細胞増殖変調に至る特異的な変化を同定することは診断の改善及び関連腫瘍に対する治療可能性へのチャンスになるかもしれない。
【０００７】
（発明の概要）
「ｈＳｕ（ｆｕ）」又はＰＲＯ１２８０と命名された新規ポリペプチドをコードするｃＤＮＡクローン（ＤＮＡ３３４５５）（配列番号：１）が同定された。一実施態様では、本発明はｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチドをコードする核酸配列を含んでなる単離された核酸分子を提供する。
一実施態様では、単離された核酸は、（ａ）Ｆｉｇ１のｈＳｕ（ｆｕ）のアミノ酸１〜４３３の配列（配列番号：２）のアミノ酸配列を持つｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチドをコードする核酸分子、又は（ｂ）（ａ）の核酸分子の相補鎖に対して少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％、さらにより好ましくは少なくとも９８％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有する配列により構成される。他の実施態様では、核酸はＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ-１２７のヒトタンパク質ｃＤＮＡ（ＤＮＡ３３４５５-１５４８と命名）にコードされるのと同じ成熟ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子又はその相補鎖と相同性を有する。好適な実施態様では、核酸はＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ-１２７のヒトタンパク質ｃＤＮＡ（ＤＮＡ３３４５５-１５４８）にコードされるのと同じ成熟ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子又はその相補鎖を含む。
本発明は、さらに、Ｆｉｇ６Ａ-６Ｂの約７４から約１３７２残基間の核酸（配列番号：1）の相補鎖にハイブリダイズ化する核酸配列を含み、ｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチドをコードする単離された核酸分子に関する。好ましくは、ハイブリダイゼーションは緊縮性のハイブリダイゼーション及び洗浄の条件下で行われる。
さらに、本発明はＦｉｇ１のｈＳｕ（ｆｕ）のアミノ酸１〜４３３の配列（配列番号：２）のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％、さらにより好ましくは少なくとも９８％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸配列又はその相補鎖を含む単離された核酸分子に関する。
更なる場合には、本発明は少なくとも１００ヌクレオチドを有し、（ａ）Ｆｉｇ１のｈＳｕ（ｆｕ）のアミノ酸１〜４３３の配列（配列番号：２）のアミノ酸配列を有するｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）の相補鎖と緊縮性の条件下で試験ＤＮＡ分子とハイブリダイズ化することにより生産される単離された核酸に関し、そのＤＮＡ分子が少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を有する場合には、その試験ＤＮＡ分子を単離することに関する。
特定の場合には、本発明は開始メチオニンを有する、もしくは有さないｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチドをコードするＤＮＡ又はそのコード化ＤＮＡの相補鎖により構成される核酸分子を提供する。
他の面においては、本発明は、（ａ）Ｆｉｇ１のｈＳｕ（ｆｕ）のアミノ酸１〜４３３の配列（配列番号：２）のアミノ酸配列と比較した時、少なくとも約８０％のポジティブ、好ましくは少なくとも約８５％のポジティブ、より好ましくは少なくとも約９０％のポジティブ、最も好ましくは少なくとも約９５％のポジティブのスコアを示すポリペプチドをコードする核酸又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡの相補鎖により構成される単離された核酸分子に関する。
他の実施態様は、ハイブリダイゼーションプローブとしての利用を見出すことができるｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチドをコードする配列断片を対象としている。そのような核酸断片は約２０から約８０ヌクレオチド長で、好ましくは約２０から約６０ヌクレオチド長、さらに好ましくは約２０から約５０ヌクレオチド長、もっとも好ましくは約２０から約４０ヌクレオチド長であり、配列番号：1に示されるヌクレオチド配列から誘導し得る。
【０００８】
他の実施態様では、本発明はｈＳｕ（ｆｕ）又はその変異体をコードする核酸を含むベクターを提供する。そのベクターはここで同定された単離された核酸分子のいくつかを含む。
そのようなベクターを含む宿主細胞も提供される。例えば、宿主細胞はＣＨＯ細胞、大腸菌又は酵母でよい。さらに、宿主細胞を、ｈＳｕ（ｆｕ）の発現に適した条件下で培養し、細胞培養物からそれを回収することを含んでなるｈＳｕ（ｆｕ）の製造方法も提供される。
【０００９】
さらに他の実施態様では、本発明は上述の如く同定された単離核酸のいずれかによってコードされた単離ｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチドを提供する。
特に、本発明は単離された天然配列ｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチドを提供し、それは一実施態様においてＦｉｇ１の残基１〜４３３（配列番号：２）を含んでなるアミノ酸配列を含むｈＳｕ（ｆｕ）である。
他の場合には、本発明は単離されたｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチドで、Ｆｉｇ１の残基１〜４３３（配列番号：２）のアミノ酸配列と少なくとも約８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも約８５％の配列同一性、さらに好ましくは約９０％の配列同一性、最も好ましくは約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列によって構成されるものに関する。
さらなる場合には、本発明は単離されたｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチドで、Ｆｉｇ１の残基１〜４３３（配列番号：２）のアミノ酸配列と少なくとも約８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも約８５％の配列同一性、さらに好ましくは約９０％の配列同一性、最も好ましくは約９５％のポジティブスコアを示すアミノ酸配列によって構成されるものに関する。
さらに他の場合において、本発明は単離されたｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチドで、Ｆｉｇ１の残基１〜４３３（配列番号：２）のアミノ酸配列又は抗ｈＳｕ（ｆｕ）抗体に対する結合部位を提供するのに充分な前述配列の断片により構成されるものに関する。好ましくは、ｈＳｕ（ｆｕ）断片は天然ｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチドの定性的生物活性を保持する。
更なる場合には、本発明は（i）緊縮性の条件下で試験ＤＮＡ分子と（ａ）配列番号：２の約１から約４３３番のアミノ酸配列を有するｈＳｕ（ｆｕ）をコード化する試験ＤＮＡ、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖をハイブリダイズ化することにより生産されるポリペプチド、及びその試験ＤＮＡ分子が（ａ）又は（ｂ）と少なくとも約８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも約８５％の配列同一性、さらに好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を有する場合、（ii）ポリペプチドの発現にとって適切な条件下で試験ＤＮＡ分子を含む宿主細胞を培養し、（iii）細胞培養物からポリペプチドを回収することにより生産されるポリペプチドを提供する。
他の実施態様では、本発明は異質性ポリペプチド又はアミノ酸配列と融合したｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチドを含むキメラ分子を提供する。そのようなキメラ分子の例には、エピトープタグ配列又はイムノグロブリンのＦｃ領域と融合したｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチドを含む。
他の実施態様では、本発明はｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチドと特異的に結合する抗体を提供する。場合によっては、その抗体はモノクローナル抗体である。
さらに他の実施態様では、本発明は天然ｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチドのアゴニスト及びアンタゴニストに関する。特別な実施態様では、そのアゴニスト又はアンタゴニストは抗ｈＳｕ（ｆｕ）抗体である。
更なる実施態様では、本発明は天然ｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチドを候補分子に接触させ、当該ポリペプチドによって仲介される生物学的な活性を検出することにより天然ｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストを同定する方法に関する。好ましい実施態様において、生物学的活性はヘッジホッグシグナル経路においてｆｕｓｅｄポリペプチドの活性を抑制するものである。
さらなる実施態様では、本発明は製薬的に受容可能な担体と組み合わせて、ｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチドもしくは上述に定義したようなアゴニスト又はアンタゴニストを含んでなる組成物に関する。
他の実施態様では、本発明はｈＳｕ（ｆｕ）によるヘッジホッグシグナル伝達調節の促進に対するアンタゴニストもしくはアゴニストを開発するための化合物及び方法を提供する。特に、生物有機化学的小分子及びアンチセンスヌクレオチドを含む、ＳＨシグナル伝達経路においてｈＳｕ（ｆｕ）の正常な機能発現を阻止、防止、阻害、及び／又は、中和するｈＳｕ（ｆｕ）のアンタゴニストである。
【００１０】
さらに他の実施態様において、本発明は、ヒトｈＳｕ（ｆｕ）の選択的スプライシングされた変異体を提供する。
またさらに他の実施態様では、本発明は、ヘッジホッグシグナル伝達のｈＳｕ（ｆｕ）による調節を転調させる分子を同定するためのスクリーニング又はアッセイ方法を提供する。好ましくは、その分子は、ｈＳｕ（ｆｕ）のその結合性複合体（ｆｕｓｅｄのような）形成タンパク質との相互作用を阻止するか、複合体の分解を阻止又は阻害するかのいずれかである。このアッセイは、ｈＳｕ（ｆｕ）及び基質を含む混合物の候補分子とのインキュベーション、及びｈＳｕ（ｆｕ）によるヘッジホッグシグナル伝達を調節する候補分子の能力の検出を含む。スクリーニングされた分子は、好ましくは小分子薬候補である。
他の実施態様では、この方法は、特定の疾患がヘッジホッグシグナル伝達によって調節されるか否かを決定する診断方法に関係し、
（ａ）試験細胞又は組織を培養し；
（ｂ）ｈＳｕ（ｆｕ）によるヘッジホッグシグナル伝達調節を阻害できる化合物を投与し；そして
（ｃ）ヘッジホッグシグナル伝達が変調されるかどうか決定する：
ことを含む。
【００１１】
（好適な実施態様の詳細な説明）
Ｉ．定義
ここで使用される際の「ｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチド」、「ｈＳｕ（ｆｕ）タンパク質」及び「ｈＳｕ（ｆｕ）」という用語は、天然配列ｈＳｕ（ｆｕ）及びｈＳｕ（ｆｕ）の生物学的活性を有するｈＳｕ（ｆｕ）変異体（ここで更に詳細に定義する）を含む。ｈＳｕ（ｆｕ）は、ヒト組織型又は他の供給源といった種々の供給源から単離してもよく、あるいは組換え及び/又は合成方法によって調製してもよい。
「天然配列ｈＳｕ（ｆｕ）」は、天然由来のｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチドと同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでいる。このような天然配列ｈＳｕ（ｆｕ）は、自然から単離することもできるし、組換え及び/又は合成手段により生産することもできる。「天然配列ｈＳｕ（ｆｕ）」という用語には、特に、ｈＳｕ（ｆｕ）の自然に生じる切断形態、分泌形態（例えば、細胞外ドメイン配列）、自然に生じる変異形態(例えば、選択的にスプライシングされた形態)及びｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチドの自然に生じる対立遺伝子変異体が含まれる。本発明の一実施態様において、天然配列ヒトｈＳｕ（ｆｕ）は、Ｆｉｇ１に示す配列番号：２のアミノ酸１〜４３３を含有する成熟又は全長天然ｈＳｕ（ｆｕ）である。
【００１２】
「ｈＳｕ（ｆｕ）変異体」とは、ｈＳｕ（ｆｕ）についてＦｉｇ１に示した推定アミノ酸配列（配列番号：２）を有するｈＳｕ（ｆｕ）のアミノ酸残基１から４３３番目と少なくとも約８０％のアミノ酸配列相同性を有し、以下に定義されるような活性を有するｈＳｕ（ｆｕ）を意味する。このようなｈＳｕ（ｆｕ）変異体は、例えば、Ｆｉｇ１(配列番号：２)の配列のＮ-又はＣ-末端において一又は複数のアミノ酸残基が付加、もしくは欠失されたｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチドを含む。通常、ｈＳｕ（ｆｕ）変異体は、Ｆｉｇ１に示す配列番号：２のアミノ酸１〜４３３番目までのアミノ酸配列と、少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約８５％、さらにより好ましくは少なくとも約９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、よりさらに好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有する。変異体は、天然配列もしくはＦｉｇ１（配列番号；４）に示されているショウジョウバエのｆｕｓｅｄサプレッサーのような既知のサプレッサーを含まない。
【００１３】
ｈＳｕ（ｆｕ）配列に対してここで同定されている「パーセント(％)アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした、ｈＳｕ（ｆｕ）配列のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。ここで用いられるパーセント同一性値は、入手可能WＵ-BLAST-2（Altschul等, Methods in Enzymology, 266: 460-480 (1996);またここに参考文献として記載してある http://blast.wustl/edu/blast/README.html, を参照のこと ）を使用することにより達成可能である。WＵ-BLAST-2はその多くが初期設定値に対してセットされるようなサーチパラメータを利用する。適切なパラメータは以下の値を有する組である：オーバーラップ  スパン=1, オーバーラプ フラクション=0.125, ワード  閾値(T)=11である。
【００１４】
上述のように実施される配列比較の文脈における「ポジティブ（陽性）」という用語は、比較された配列において同一であるばかりでなく類似の性質を有するものも含む（例えば、結果として保存的な置換となるような）。ポジティブ％値は上記定義のように、より長い配列における全残基数により除したＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスにおけるポジティブ値のスコアされるアミノ酸残基の画分によって決定される。
同様に、ここで同定されているｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチドのコード配列に関して「パーセント(％)核酸配列同一性」は、ｈＳｕ（ｆｕ）コード配列中のヌクレオチド残基と同一である候補配列中のヌクレオチド残基のパーセントとして定義される。ここで使用される同一性値は、オーバーラップ  スパンと オーバーラプ フラクションがそれぞれ１及び0.125である組み合わせをもつ、初期設定値に対するWＵ-BLAST-2セットのBLASTINモジュールにより算出される。
【００１５】
「単離された」とは、ここで開示された種々のポリペプチドを記述するために使用するときは、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は回収されたポリペプチドを意味する。その自然環境の狭雑成分とは、そのポリペプチドの診断又は治療への使用を典型的には妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様において、ポリペプチドは、(１)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５残基のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列を得るのに充分なほど、あるいは、(２) 非還元あるいは還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥを行い、クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色によって、均一になるまで精製される。単離されたポリペプチドには、ｈＳｕ（ｆｕ）の自然環境の少なくとも１つの成分が存在しないため、組換え細胞内のインサイツのタンパク質が含まれる。しかしながら、通常は、単離されたポリペプチドは少なくとも１つの精製工程により調製される。
「単離された」ｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチド核酸分子は、同定され、ｈＳｕ（ｆｕ）核酸の天然源に通常付随している少なくとも１つの汚染核酸分子から分離された核酸分子である。単離されたｈＳｕ（ｆｕ）コード化核酸分子は、天然に見出される形態あるいは設定以外のものである。ゆえに、単離されたｈＳｕ（ｆｕ）コード化核酸分子は、天然の細胞中に存在するｈＳｕ（ｆｕ）核酸分子から区別される。しかしながら、ｈＳｕ（ｆｕ）をコードする単離された核酸分子は、例えば、核酸分子が天然の細胞の場合とは異なる染色体上の位置に存在するような、通常ｈＳｕ（ｆｕ）を発現している細胞に含まれるようなｈＳｕ（ｆｕ）-コード化核酸分子を包含する。
【００１６】
「コントロール配列」という表現は、特定の宿主生物において作用可能に結合したコード配列を発現するために必要なＤＮＡ配列を指す。例えば原核生物に好適なコントロール配列は、プロモーター、場合によってはオペレータ配列、及びリボソーム結合部位を含む。真核生物の細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーを利用することが知られている。
核酸は、他の核酸配列と機能的な関係にあるときに「作用可能に結合し」ている。例えば、プレ配列あるいは分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に参画するプレタンパク質として発現されているなら、そのポリペプチドのＤＮＡに作用可能に結合している；プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼすならば、コード配列に作用可能に結合している；又はリボソーム結合部位は、もしそれが翻訳を容易にするような位置にあるなら、コード配列と作用可能に結合している。一般的に、「作用可能に結合している」とは、結合したＤＮＡ配列が近接しており、分泌リーダーの場合には近接していて読み枠の合った状態にあることを意味する。しかし、エンハンサーは必ずしも近接している必要はない。結合は簡便な制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合は、従来の手法に従って、合成オリゴヌクレオチドアダプターあるいはリンカーが使用される。
【００１７】
「抗体」という用語は最も広い意味において使用され、特に単一の抗ｈＳｕ（ｆｕ）抗体モノクローナル抗体(アゴニスト、アンタゴニスト及び中和抗体を含む)、及び多エピトープ特異性を持つ抗体組成物を包含している。ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団、すなわち、構成する個々の抗体が、少量存在しうる自然に生じる可能性のある突然変異を除いて同一である集団から得られる抗体を指す。
【００１８】
ハイブリッド形成反応の「緊縮性」は、当業者によって容易に決定され、一般的にプローブ長、洗浄温度、及び塩濃度に依存する経験的な計算である。一般に、プローブが長くなると適切なアニーリングのための温度が高くなり、プローブが短くなると温度は低くなる。ハイブリッド形成は、一般的に、相補的鎖がその融点より低い環境に存在する場合における変性ＤＮＡの再アニールする能力に依存する。プローブとハイブリッド形成可能な配列との間の所望の相同性の程度が高くなると、使用できる相対温度が高くなる。その結果、より高い相対温度は、反応条件をより緊縮性にするが、低い温度は緊縮性を低下させる。さらに、緊縮性は塩濃度に逆比例する。ハイブリッド形成反応の緊縮性の更なる詳細及び説明は、Ausubel等, Current Protocols in Molecular Biology,
Wiley Interscience Publishers, (1995)を参照のこと。
ここで定義される「緊縮性条件」、「高緊縮性条件」は、（１）洗浄のために低イオン強度及び高温度、例えば、５０℃において０．０１５Ｍの塩化ナトリウム／０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％のドデシル硫酸ナトリウムを用いるもの；（２）ハイブリッド形成中にホルムアミド等の変性剤、例えば、４２℃において５０％（vol/vol）ホルムアミドと０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％フィコール／０．１％のポリビニルピロリドン／５０ｍＭのｐＨ６．５のリン酸ナトリウムバッファー、及び７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウムを用いるもの；（３）４２℃における５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（０．７５ＭのＮａＣｌ、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％のピロリン酸ナトリウム、５ｘデンハード液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、及び１０％デキストラン硫酸を４２℃で用い、洗浄を０．２ｘＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）及び０．１％ＳＤＳ中で４２℃で行うもの；もしくは（４）１０％のデキストラン硫酸と２ｘＳＳＣ及び５５℃での５０％ホルムアミド、ついで５５℃におけるＥＤＴＡを含む０．１ｘＳＳＣからなる高緊縮性洗浄を用いるものによって同定される。
「中程度の緊縮性条件」は、Sambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual、New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press,
1989、に記載されているように同定され、上記の緊縮性より低い洗浄溶液及びハイブリッド形成条件（例えば、温度、イオン強度及び％ＳＤＳ）の使用を含む。中程度の緊縮性条件は、２０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５ｘデンハード液、１０％デキストラン硫酸、及び２０ｍｇ／ｍＬの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中の３７℃での終夜インキュベーション、ついで１ｘＳＳＣ中３７−５０℃でのフィルターの洗浄といった条件である。当業者であれば、プローブ長などの因子に適合させる必要に応じて、どのようにして温度、イオン強度等を調節するかを認識するであろう。
【００１９】
「エピトープタグ」なる用語は、ここで用いられるときは、「タグポリペプチド」に融合したｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチドを意味する。タグポリペプチドは、その抗体が産生され得るエピトープを提供するに十分な残基を有しているが、ｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチドの活性を阻害しないよう充分に短い。また、タグポリペプチドは、好ましくは、抗体が他のエピトープと実質的に交差反応をしないようにかなり独特である。適切なタグポリペプチドは、一般に、少なくとも６のアミノ酸残基、通常は約８〜約５０のアミノ酸残基(好ましくは約１０〜約２０の残基)を有する。
【００２０】
ここで用いられる「イムノアドヘシン」なる用語は、異種タンパク質（「アドヘシン」）の結合特異性と免疫グロブリン定常ドメインとを結合した抗体様分子を指す。構造的には、イムノアドヘシンは、所望の結合特異性を持ち、抗体の抗原認識及び結合部位以外である（即ち「異種の」）アミノ酸配列と、免疫グロブリン定常ドメイン配列との融合物を含む。イムノアドヘシン分子のアドへシン部分は、典型的には少なくともレセプター又はリガンドの結合部位を含む隣接アミノ酸配列である。イムノアドヘシンの免疫グロブリン定常ドメイン配列は、ＩｇＧ-１、ＩｇＧ-２、ＩｇＧ-３又はＩｇＧ-４サブタイプ、ＩｇＡ（ＩｇＡ-１及びＩｇＡ-２を含む）、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭなどの任意の免疫グロブリンから得ることができる。
【００２１】
「変調」又は「変調する」という語句は、シグナル伝達経路のアップレギュレーション又はダウンレギュレーションを意味する。シグナル伝達の制御下での細胞プロセスは、これらに限られないが、特定遺伝子の転写；代謝、増殖、分化、接着、アポトーシス及び生存などの正常な細胞機能、並びに、形質転換、分化及び転移の阻止といった異常なプロセスを含みうる。
「ポリメラーゼ連鎖反応」又は「ＰＣＲ」の技術は、ここで用いられる場合、一般に核酸、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡの特定の切片の少量が1987年7月28日発行の米国特許第4,683,195号に記載されたように増幅される方法を意味する。一般的に、対象とする領域の両末端から又は利用可能の必要な部分をカバーする配列情報は、オリゴヌクレオチドプライマーの設計を可能にし；これらのプライマーは増幅されるテンプレートの反対鎖の配列と同一又は類似している。２つのプライマーの５’末端ヌクレオチドは増幅された物質の末端と一致する。ＰＣＲ配列は、全ゲノムＤＮＡ、及び全細胞性ＲＮＡから転写されたｃＤＮＡ、バクテリオファージ、又はプラスミド配列等を形成する。一般的に、Mullis等, Cold Spring Harbor Symp. Quant Biol. 51: 263 (1987); Erlich, Ed., PCR Technology, (Stockton Press, NY, 1989)を参照のこと。ここで用いられるように、ＰＣＲは、プライマーとして公知の核酸を、そして核酸の特定の切片を増幅又は生成するために核酸ポリメラーゼを使用することを含む核酸試験試料の唯一ではない一例であると考えられる。
【００２２】
ここで意図している「活性な」及び「活性」とは、天然又は天然発生ｈＳｕ（ｆｕ）の生物学的及び／又は免疫学的活性を保持するｈＳｕ（ｆｕ）の形態を意味する。好ましい活性は、例えば、ヘッジホッグシグナル伝達経路を調節する能力、最も好ましくはｆｕｓｅｄの活性を調節し、活性化し、抑制する能力を含む。
【００２３】
ここで用いられる「アンタゴニスト」なる用語は、最も広い意味において、ここに開示の天然ｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチドの生物学的活性を阻止、防止、阻害、中和する任意の分子を含む。同様に、ここで用いられる「アゴニスト」なる用語は、最も広い意味において、ここに開示の天然ｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチドの生物学的活性を模倣するいかなる分子をも含む。特に、適切なアゴニスト又はアンタゴニスト分子には、アゴニスト又はアンタゴニスト抗体、天然ｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチド、ペプチド、小分子有機的分子の断片もしくはアミノ酸配列上の変異体等が含まれる。
「処置」は、治療的処置及び予防的又は防護的処置の両方を意味し、目的は、対象である病的な状態、疾患を防ぎ、進行を遅らせる（減少させ）ことである。治療を必要とする対象には、既に障害を受けているもの並びに障害を予防されるべきものが含まれる。
「慢性的」投与とは、長期的に初期の治療効果（活性）を維持するために、急性的な機序に対して連続的な薬剤の投与をすることを意味する。「断続的な」投与とは、中断することなしに連続的にということではなく、むしろ自然なサイクルでの治療のことである。
治療の対象となる「哺乳動物」とは、ヒト、イヌ，ウマ，ネコ，ウシのような家庭及び農場の家畜、動物園の動物、スポーツ用の動物、又はペット動物を含む、哺乳類として分類されるあらゆる動物を意味する。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
一又は複数の薬剤とさらに「組み合わせて」の投与とは、同時に（併用して）そして任意な順序での断続的な投与を含む。
【００２４】
ＩＩ.  本発明の組成物と方法
分泌性シグナル伝達タンパク質であるヘッジホッグ（ＨＨ）ファミリーのメンバーは、脊椎動物及び無脊椎動物の初期胚発生期の多数組織のパターン化現象において重要な役割を果たす（1、2）。ショウジョウバエハッジホッグ（Ｈｈ）シグナル伝達は、幼虫の適切な分節化、及び成虫おける成育及び羽及びその他の外肢形成において必要とされる。哺乳動物ＨＨタンパク質ファミリーには３つのメンバー、ソニックヘッジホッグ（Ｓｈｈ）、インディアンハッジホッグ（Ｉｈｈ）、デザートヘッジホッグ（Ｄｈｈ）が含まれる。これら３つのタンパク質は組織特異的に発現され、多くの発生過程において重要な役割を果たしている：中枢神経系における腹側細胞の特定化、左右非対称性の制御、体節、肢の生育及びパターン化、軟骨の分化、器官形成、精子形成を含む。多くの脊椎動物ＨＨ経路のシグナル伝達因子における遺伝子の変異は、ヒトのガン、発達障害と関連性が認められており（３に総説されている）、従って正常細胞の増殖制御におけるこの経路の重要な役割が確立されている。
Ｈｈシグナル伝達機構は充分に理解されてはいない。しかしながら、ショウジョウバエにおける遺伝学的研究により、Ｈｈシグナル伝達経路における特異的因子として役割を果たしている、多くの膜貫通及び細胞内タンパク質が同定されてきた（3、4、5に総説されている）。この経路はキュビタス  インターラプタス（Ｃｉ）（6,7）、脊椎動物のＧｌｉタンパク質のジンクフィンガー転写因子ホモログ（8）の活性化によって最高潮に達する。Ｈｈシグナル伝達機構が保存されているという事実は、アフリカツメガエルもしくはヒトのＧｌｉ（ｈＧｌｉ）を異所的に発現させたものが、カエル（9）及びマウス（10）の底板特異的マーカー及と腹側神経細胞の誘導において、Ｓｈｈの機能を模倣し得るといる能力により示唆された。サイクリックＡＭＰ依存的プロテインキナーゼ（ＰＫＡ）は、ハエ（11,12）及びげっ歯類（13-16）に双方におけるＨＨシグナル伝達に対して、共通の負の制御効果を発揮する。遺伝学的解析によりＨｈよりも下流のシグナル伝達を阻害するように機能することが明らかとなり（18,19）となった複数膜透過性膜貫通タンパク質であるショウジョウバエではＰａｔｃｈｅｄに対して脊椎動物のホモログが同定され（17）、さらに７回膜貫通タンパク質であって、Ｈｈシグナル伝達過程において絶対的に必要とされる（18,21）ショウジョウバエのＳｍｏｏｔｈｅｎｅｄの脊椎動物ホモログも同定された（20）。脊椎動物の系から得られる生化学的なデータとショウジョウバエにおける遺伝学的分析結果を合わせると、Ｐａｔｃｈｅｄはリガンド結合因子として、Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄはシグナル伝達因子としてＨＨタンパク質に対する多数サブユニット受容体複合体中に存在していることが予想される（20,22-24）。以上の結果を総合すると、進化上保存されているという証拠により、他に同定されたショウジョウバエのシグナル伝達経路におけるメンバーが脊椎動物のカウンターパートであるであろうことが示唆される。
【００２５】
ｆｕｓｅｄのショウジョウバエサプレッサー（ｄＳｕ（ｆｕ））は新規細胞質性ＰＥＳＴタンパク質であり（25）、野生型のバックグラウンドにおいて変異した場合、構成的なＨｈシグナルを示唆するような中間的表現型を与える（26）。さらに、同様の変異は、Ｈｈシグナル伝達において必要とされるセリン-トレオニンキナーゼである幼虫及び成虫のＦｕｓｅｄ（Ｆｕ）（28）における突然変異の表現型を完全に抑制する（27）。ｄＳｕ（ｆｕ）はＦｕ及びＣｉと物理的に相互作用し（29）、後者の相互作用はＣｉを細胞質に取り込むことにより、及び/又は活性化状態に移行することを防ぐことにより（26）、Ｃｉを不活性な状態に維持していると予想されているものである。Ｈｈシグナル伝達が存在しない場合、おそらく、ＰＫＡによるリン酸化Ｃｉ（23）をＦボックスタンパク質であるＳｌｉｍｂ（31）によるユビキチン-プロテアソーム経路にターゲットすることを通じて、アミノ末端の７５ｋＤａの転写抑制形（30）を産生するように、全長のＣｉはタンパク的に切断される。Ｈｈシグナルを受容すると、Ｆｕを活性化し、ｄＳｕ（ｆｕ）を不活性化することが予想され、さらに下流の諸現象を誘引し、最終的にはＣｉをＨｈ標的遺伝子に対する転写活性化因子に変換することになる。
【００２６】
ＨＨシグナル伝達におけるＳｕ（ｆｕ）の役割に対する生化学的、機能的な見識をさらに得るために、このタンパク質ヒトホモログを取得し、発生過程及び成体における発現パターンが調べられた。さらに、ｈＳｕ（ｆｕ）と脊椎動物のＧｌｉタンパク質ファミリー及び脊椎動物のＳｌｉｍｂホモログ等を含むＨＨ経路における他のシグナル伝達構成因子との間における物理的な相互作用が解析され、これら相互作用における機能的意味が確定された。
ショウジョウバエのｆｕｓｅｄ（Ｓｕ（ｆｕ））サプレッサーは、４６８アミノ酸残基で構成される新規細胞質タンパク質であり、遺伝学的な解析によりヘッジホッグのセグメントポラリティー経路における負の制御因子として機能することが明らかとなっている。ここにおいて、脊椎動物のＳｕ（ｆｕ）−ヒトＳｕ（ｆｕ）の生化学的及び機能的解析と共に、その一次構造と組織分布について報告する。ここで明らかにしたように、ヒトＳｕ（ｆｕ）は予想される分子量48ｋＤａの４３３アミノ酸残基で構成されるＰＥＳＴタンパク質で、相当するショウジョウバエのタンパク質と全体で37.7％の同一性（63％の相同性）を有するものである。ラットＳｕ（ｆｕ）に対するメッセンジャーＲＮＡは、神経板、体節、精巣、腸、皮膚を含む胎児のヘッジホッグ応答組織において広く発現されていた。成体においては、増殖能が残っていることが知られている精巣及び脳の領域において強くその発現が残存していた。ヒトＳｕ（ｆｕ）遺伝子座は、染色体10ｑ24-ｑ25にマップされ、その領域はグリア芽細胞腫、前立腺癌、悪性メラノーマ及び子宮内膜癌においては欠失している。ヒトＳｕ（ｆｕ）は、脊椎動物においてヘッジホッグシグナル伝達を媒介するジンクフィンガーモチーフを有する転写活性化因子Ｇｌｉによる転写活性化を阻害し、物理的にＧｌｉ、Ｇｌｉ２、及びＧｌｉ３と相互作用することが見出された。また、ヒトＳｕ（ｆｕ）は、Ｆボックスタンパク質であり、ハエにおいてハエＧｌｉホモログの分解をＳｌｉｍｂと促すことである程度ヘッジホッグ反応を抑制する因子であるＳｌｉｍｂと複合体を形成している。以上を総合すると、ここに示されたデータは（実施例を参照のこと）、Ｓｕ（ｆｕ）が脊椎動物のヘッジホッグシグナル伝達経路における主要な負の制御因子であるとの仮説に対する生化学的、機能的証拠を提供する。さらに、本データはＳｕ（ｆｕ）が、ＧｌｉをＳｌｉｍｂ依存的プロテアーソム的分解経路へ誘導するようなアダプタータンパク質として役に立つことと同様に、Ｇｌｉと結合しＧｌｉ媒介転写活性化を阻害することにより作用しうる事を示す。
【００２７】
ここに開示のものは、以下の実施例において示すように、ｄＳｕ（ｆｕ）に対して６３％の相同性を示し、発生における発現プロフィールは脊椎動物のＨＨシグナル伝達における役割と一致する。ｈＳｕ（ｆｕ）は、ｄＳｕ（ｆｕ）における保存された潜在的なリン酸化部位を含み、それらの３個所の部位はＰＫＡリン酸化部位の候補であり、さらにそのＣ末端半分側には低スコアーのＰＥＳＴ領域を含んでいる。ＰＥＳＴ領域はアスパラギン酸、プロリン、グルタミン酸、セリン、トレオニンに富む短い配列であり、低い疎水性インデックスで混成されている。それらは、細胞内における短い半減期（２時間以内）を有する多くのタンパク質において見出される（４０）。ヒト及びショウジョウバエＳｕ（ｆｕ）タンパク質において同定されたＰＥＳＴ領域は、最低限のスコアのみ（それぞれ、2.56及び1.48で、５以上が有意なスコアと考えられる）を受けている；それ故、それらはこのような観点からは機能的に関連し得ない。ＦＩＳＨ解析により、ｈＳｕ（ｆｕ）遺伝子は染色体10ｑ24−25（以下の実施例を参照のこと）にマップされた。興味深いことに、癌抑制遺伝子における２箇所の遺伝子座が10ｑ.２3-ｑｔｅｒ間に存在し、そのことは、グリア芽細胞腫の多形体、前立腺癌、悪性ミエローマ、子宮内膜癌を含む多くの腫瘍におけるヘテロ接合性欠失に基づく（44-47）。この観点から、多くのガンにおいて変異が見出されている２つの候補となるガン抑制遺伝子も、この領域にマップされるものとして最近記述された：10ｑ23.3におけるＭＭＡＣ１/ＰＴＥＮ（48、49）及び10ｑ25.3-26.1におけるＤＭＢＴ１（悪性脳腫瘍において欠損されている）（５０）。ｈＳｕ（ｆｕ）の染色体上の局在は、ｈＳｕ（ｆｕ）が活発な細胞増殖領域において高度に発現されており、ＨＨシグナル伝達の阻害因子であるという事実と合わせて考えると、ＰａｔｃｈｅｄのようなｈＳｕ（ｆｕ）は腫瘍のサプレッサーである可能性がかなり高いという事を示している。
【００２８】
インサツハイブリダイズ化分析により（以下の実施例を参照のこと）、胎児の組織において、げっ歯類のＳｕ（ｆｕ）ｍＲＮＡはかなり偏在的に発現しており、それはラットＳｍｏｏｔｈｅｒｎｅｄのｍＲＮＡを連想させるような発生過程における発現プロフィールである（20：データは示さず）。Ｓｈｈ応答胎児性神経褶及び神経管（1、2）、前原体節中胚葉及び体節、胎性前腸、食道及び肺（51、52）、Ｉｈｈ応答軟骨（53）、及びＤｈｈ応答精巣（41）を含む多くのＨＨ応答組織は、顕著にＳｕ（ｆｕ）のｍＲＮＡを発現する（Ｆｉｇ．３Ｄを参照のこと）。さらに、調査された多くの組織においてＳｕ（ｆｕ）のｍＲＮＡは発生過程において下方制御される一方で、発現は成体の精巣、及び海馬の錐体、顆粒細胞、小脳顆粒、プルキンエ細胞、嗅球顆粒細胞、において維持されており、依然として分裂が活発であり、又はそのような活性を維持している領域はＳｕ（ｆｕ）の連続した発現を必要とする。成体ラット脳において、Ｓｕ（ｆｕ）の発現はＳｈｈ、Ｓｍｏｏｔｈｅｒｎｅｄ、及びＰａｔｃｈｅｄのｍＲＮＡの小脳プルキンエ細胞における発現と重複していた（Ｆｉｇ．3Ｊ）（Traiffort等, 1998）。変異体Ｐａｔｃｈｅｄ遺伝子に対するヘテロ接合体が小脳髄様上皮腫において発達しているという事実により、これらの発見は成体小脳におけるＳｈｈシグナル伝達の潜在的な役割を示唆する。精巣において、Ｄｈｈは発育中の一次及び二次精母細胞と非常に近接して存在するセルトリー細胞（41）において発現されている。生殖細胞におけるＳｕ（ｆｕ）のｍＲＮＡの発現は、Ｐａｔｃｈｅｄと相同性のある第二の脊椎動物ＨＨ結合タンパク質であるＰａｔｃｈｅｄ２のｍＲＮＡ（55）、及び脊椎動物Ｆｕホモログ（55）のｍＲＮＡの発現と重複していた。さらに、Ｇｌｉ及びＧｌｉ３の双方は、発育中の精母細胞において発現されており（56）；総合すると、このデータはこれらの細胞が機能的なＨＨシグナル伝達系を保持し、Ｓｕ（ｆｕ）はこの系において不可欠な部分であることを示唆する。細胞内でＤｈｈレセプターが３つの仮想的細胞内ＨＨシグナル伝達タンパク質と同一の個所に局在をすることから、セルトリー細胞由来のＤｈｈ（41）がＰａｔｃｈｅｄ２受容体を通した発育中の生殖細胞に直接影響を与えているという仮説を、さらに支持することになる。Ｓｕ（ｆｕ）は、腸のレイディッグ細胞、成体の精巣におけるＰａｔｃｈｅｄ遺伝子の発現部位には見出されない（41、55）。Ｓｈｈ，Ｉｈｈ，及びＤｈｈに応答する組織にＳｕ（ｆｕ）のｍＲＮＡが存在するということは、同様な伝達因子及び伝達機構が全ての哺乳動物のＨＨファミリーのメンバーによって利用しうるということを示唆する。
【００２９】
脊椎動物のＨＨシグナル伝達おけるｈＳｕ（ｆｕ）の役割に一致して、培養細胞における共発現されたｈＳｕ（ｆｕ）とｈＧｌｉ免疫組織的な局在により、２つのタンパク質がお互いに微小管上に共局在していることが明らかになった（Ｆｉｇ．５Ａ及び、データは示さず）。これらの結果はショウジョウバエＨｈシグナル伝達因子Ｃｉ及びＦｕの細胞内局在と相関し、それらの微小管との相互作用はキネシン関連タンパク質Ｃｏｓｔａｌ２（57,58）によって仲介されている。Ｈｈ非存在下において、Ｃｏｓｔａｌ２はシグナル伝達装置（ＦｕはｄＳｕ（ｆｕ）及びＣｉと複合体を形成して）を細胞骨格に繋ぎとめることによりシグナル伝達を抑制していると考えられる。脊椎動物のＣｏｓｔａｌ２に対するホモログは未だに記述されてない。
関連する生化学的実験によると（実施例を参照のこと）、２通りの異なる系においてｈＧｌｉが物理的にｈＳｕ（ｆｕ）と相互作用することが見出された。まず一つに、エピトープタグを付与したｈＳｕ（ｆｕ）に対する抗体もしくはエピトープタグを付与したｈＧｌｉを用いることで、ｈＳｕ（ｆｕ）及びｈＧｌｉを共形質転換させたＮＩＨ-３Ｔ３細胞から共免疫沈降させることができた（Ｆｉｇ．５Ｂ）。二つには、インビトロにおいて翻訳された35Ｓ標識化ｈＧｌｉは、特異的にＧＳＴ融合ｈＳｕ（ｆｕ）タンパク質とインビトロ結合分析において結合することが示された（Ｆｉｇ．５Ｃ）。これらのデータはショウジョウバエＣｉとｄＳｕ（ｆｕ）の間の類似の相互作用を証明したMonnierと同僚（29）のものを補完する。酵母のＴｗｏハイブリッドシステムを用いることで、セリントレオニンキナーゼであるＦｕの制御ドメインであると予想されるカルボキシ末端がｄＳｕ（ｆｕ）と直接的に、Ｃｉと間接的に結合し三分子複合体を形成している（29）ことがわかる。後者の結合はｄＳｕ（ｆｕ）がリンカー分子として機能することに依存している。結果として、Ｆｕの活性化がｄＳｕ（ｆｕ）とＣｉとの分離の引き金となり、それはおそらくｄＳｕ（ｆｕ）におけるＰＥＳＴ配列のリン酸化その結果として生じるｄＳｕ（ｆｕ）の分解を通じて行われているというモデルが得られた。内在性のＳｈｈ受容体を発現している形質転換体ＮＩＨ-３Ｔ３細胞（Marigo等, 1996）からの共免疫沈降することにより、Ｓｈｈの存在下にてｈＳｕ（ｆｕ）とｈＧｌｉとの相互作用の僅かな減少しかここにおいて見られていない（実施例を参照のこと）。しかしながら、ここにおいて免疫組織化学的なデータがｈＳｕ（ｆｕ）はｈＧｌｉと核内において共局在し得る（Ｆｉｇ．５Ａ参照）ことを示しているため、ＧｌｉからＳｕ（ｆｕ）が分離することは、Ｓｈｈに誘導されるＧｌｉの活性化に対して必要ではないようである。その代わりに、シグナル伝達は、Ｓｕ（ｆｕ）の翻訳後修飾（リン酸化）により伝達され得るのである。
【００３０】
ジンクフィンガー転写因子であるＧｌｉのさらなる２つのメンバーのＧｌｉ２及びＧｌｉ３がｈＳｕ（ｆｕ）と相互作用する能力は、ここにおいて決定された（実施例参照のこと）。３つのＧｌｉタンパク質は、それらの異なる発現パターン（59）、及びＧｌｉ２、Ｇｌｉ３変異体マウスの観察された表現型（60-63）により証拠づけられるように、Ｈｈ媒介の発育過程において、特異的及び重複的な機能を補足的に発揮しているようにみえる。ｍＧｌｉ２及びｈＧｌｉ３はＧＳＴ-ｈＳｕ（ｆｕ）タンパク質と我々のインヴィトロにおける結合解析において特異的に結合していることが分かった（Ｆｉｇ．５Ｃ）。従って、我々のデータはＧｌｉタンパク質ファミリーの全てのメンバーの活性制御における、ｈＳｕ（ｆｕ）の役割を支持する。
これまでの遺伝学的な研究により、ｄＳｕ（ｆｕ）とＣｉの相互作用がＣｉの活性型の転写活性因子を阻害するように機能することができ（26,29）、その阻害はＨｈシグナルを受容することにより解除されると考えられる。ここにおいて、ｈＳｕ（ｆｕ）がＧｌｉの転写活性化レポーターアッセイにおいてｈＧｌｉ活性を阻害し得るかどうか、結論づけられた（24）。ｈＧｌｉがレポーターの発現を１００倍近く活性化することができ、この誘導はｈＳｕ（ｆｕ）によって劇的に抑制されることが見出された（実施例及びＦｉｇ．５Ｄ参照）。逆に言うと、共発現されたｈＧｌｉ非存在下において、ｈＳｕ（ｆｕ）はレポターの発現の増加を誘発することも見出された。これらの結果は、Ｇｌｉ活性化の負の内在性制御因子（例えば、Ｓｌｉｍｂ，Ｃｏｓｔａｌ２もしくはＰＫＡ）を希釈するような過発現されたｈＳｕ（ｆｕ）の能力を示す。この解釈は、細胞の応答を決定する際に、Ｈｈシグナル伝達カスケードにおいてＣｉとｄＳｕ（ｆｕ）の間のストイキオメトリカルな比率の重要性を示すショウジョウバエの遺伝学的研究（26）に由来する証拠によって支持される。
【００３１】
Ｇｌｉファミリーメンバーに加えて、ｈＳｕ（ｆｕ）はそれ自身及びＳｌｉｍｂの脊椎動物のホモログと結合することが見出された（Ｆｉｇ．５Ｃ）。前者の相互作用は、酵母２ハイブリッドスクリーンにおいて独立に同定されたもので、そのスクリーニングに用いたヒト精巣のライブラリーに由来するｈＳｕ（ｆｕ）はベイトとして用いた全長のｈＳｕ（ｆｕ）タンパク質の結合相手として単離された（データは示さず）。関連する共免疫沈降実験において、ｍＳｌｉｎｂはｈＧｌｉとの物理的な複合体中にも見出される事が分かった。この相互作用は間接的であり、リンカータンパク質としての内在性のｈＳｕ（ｆｕ）を利用している。ＨＩＶ-１タンパク質であるＶｐｕはβＴｒＣｐと関連していることが示され、明らかにヒトＳｌｉｍｂの選択特異的スプライシング型（33）、及び同様な方法によるＣＤ４である（34）。ｈＳｕ（ｆｕ）の二量体化により、Ｓｕ（ｆｕ）Ｇｌｉ活性を制御する異なるエフェクタータンパク質を引き合わせる事を可能ならしめ、一方、Ｓｌｉｍｂとの結合は、Ｓｕ（ｆｕ）たＧｌｉの分解を制御することを可能にしている。
Ｓｌｉｍｂは、Ｆボックス及び幾つかのＷＤ４０リピートドメイン（64-66）を含み、それぞれユビキチン結合Ｅ２タンパク質分解複合体の構成因子に対する結合領域、（34,65）及びタンパク質-タンパク質相互作用領域として（64）機能している。ショウジョウバエでは、Ｓｌｉｍｂの欠失が、細胞におけるインタクトなＣｉの自己蓄積（26,31）、活性なＨｈシグナルの示唆的な効果を誘導する。さらに、ショウジョウバエのＴＧＦβホモログであるdecepentaplegic（ｄｐｐ）及びＷｎｔファミリーメンバーであるwingless（ｗｇ）、これらは二つのＨｈ応答遺伝子であるが、そのような変異体の前-後軸において異所的に発現されている（31,33）。データを総合すると、Ｓｌｉｍｂは通常Ｃｉ/Ｇｌｉを分解を促進することにより、リガンドの非存在下、Ｈｈシグナルを抑えるように機能することができることが示される。我々の知見は、ｈＳｕ（ｆｕ）及び/又はｈＧｌｉの細胞内活性を制御することに脊椎動物のＳｌｉｍｂが潜在的に関与していることに一致する。しかしながら、これに関連してＳｌｉｍｂの正確な役割において明確にすべきことが残されている。Ｃｉとは異なり、Ｇｌｉの活性化/抑制化機能の制御においてタンパク質分解に対する役割は報告されていなかった。Yoon及び共同実験者は（67）、Ｇｌｉが転写抑制因子に変換するような条件を見出すことができなかった。本発明者は、培養細胞において過発現されたｈＧｌｉの異なるカルボキシ末端欠失切断産物を見出したが、これらの切断産物がＳｈｈによって制御されていること示すことができなかった。にもかかわらず、Ｓｌｉｍｂ/Ｇｌｉ/Ｓｕ（ｆｕ）の相互作用が、ある程度Ｇｌｉ及びＳｕ（ｆｕ）の定常状態レベルを維持し、直接的にＨＨシグナル伝達には関与していない可能性もある。
【００３２】
要するに、ここに示されるｈＳｕ（ｆｕ）とＧｌｉファミリーメンバーとの生化学的相互作用は、Ｇｌｉ活性アッセイから得られる結果と共に、ショウジョウバエにおける遺伝学的研究を補完し、Ｓｕ（ｆｕ）はGliの直接的な負の制御因子であることを示すものである。これらの研究は、HHファミリーメンバーに対する細胞内応答を決定するにあたり、様々なシグナル伝達因子の相対的な細胞内濃度の重要性をさらに強調するものである。これらの結果および腫瘍サプレッサー遺伝子座として知られている染色体上へｈＳｕ（ｆｕ）が局在していという観点から、ｈＳｕ（ｆｕ）における突然変異が発ガン過程において重要な役割を担っている可能性がある。ここでの発見は、Ｈｈシグナル伝達構成因子及び機構の保存性（いくつかの顕著な相違はあるものの）をショウジョウバエからヒトへと拡張するものである。
【００３３】
Ａ．全長ｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチド
本発明は、本出願においてｈＳｕ（ｆｕ）（ＵＮＱ650）と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に、以下に示す実施例においてされに詳細に開示するように、ｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチドをコードするｃＤＮＡが同定され、単離された。異なる発現ラウンドで生成されたタンパク質は異なるＰＲＯ番号が与えられるが、ＵＮＱ番号は任意の与えられたＤＮＡ及びコードされたタンパク質に独特であり変化しない。しかしながら、単純化のために、本明細書では、DNA３３４５５−１５４８によりコードされるタンパク質並びに前述のｈＳｕ（ｆｕ）定義に含まれる更なる天然相同体及び変異体は、それらの起源又は調製方法に関わらず「ｈＳｕ（ｆｕ）」と呼ばれる。
ＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、ヒトｈＳｕ（ｆｕ）の全長配列（Ｆｉｇ２に示す（配列番号：２））の一部がショウジョウバエ  メラノガスターのｆｕｓｅｄタンパク質のサプレッサーに対するヒトホモログ（S５５６９５）の一部と３９％のアミノ酸配列同一性を有することが見出された。従って、現在では、本出願で開示されるヒトｈＳｕ（ｆｕ）がヘッジホッグシグナル伝達カスケードの新たに同定されたメンバーであり、ショウジョウバエｆｕｓｅｄタンパク質のサプレッサーポリペプチドの典型的な活性を有することができると考えられている。
【００３４】
Ｂ．ｈＳｕ（ｆｕ）変異体
ここに記載した全長天然配列ｈＳｕ（ｆｕ）に加えて、ｈＳｕ（ｆｕ）変異体も調製できると考えられる。ｈＳｕ（ｆｕ）変異体は、公知のｈＳｕ（ｆｕ）ＤＮＡに適当なヌクレオチド変化を導入することにより、及び/又は所望のｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチドを合成することにより調製できる。当業者は、適切なアミノ酸変化が、グリコシル化部位の番号を変えたりもしくは膜固着特性を変更するようなｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチドの翻訳後プロセスを変えうることを理解するであろう。
天然全長配列ｈＳｕ（ｆｕ）又はここに記載したｈＳｕ（ｆｕ）の種々のドメインにおける変異は、例えば、米国特許第5,364,934号に記載されている保存的及び非保存的変異についての任意の技術及び指針を用いてなすことができる。変異は、結果として天然配列ｈＳｕ（ｆｕ）と比較してｈＳｕ（ｆｕ）のアミノ酸配列が変化するｈＳｕ（ｆｕ）をコードする一又は複数のコドンの置換、欠失又は挿入であってよい。場合によっては、変異は少なくとも１つのアミノ酸のｈＳｕ（ｆｕ）一又は複数のドメインの任意の他のアミノ酸による置換である。いずれのアミノ酸残基が所望の活性に悪影響を与えることなく挿入、置換又は欠失されるかの指針は、ｈＳｕ（ｆｕ）の配列を相同性の知られたタンパク質分子の配列と比較し、相同性の高い領域内でなされるアミノ酸配列変化を最小にすることによって見出される。アミノ酸置換は、一のアミノ酸を類似した構造及び／又は化学特性を持つ他のアミノ酸で置換した結果、例えばロイシンのセリンでの置換、即ち保存的アミノ酸置換とすることができる。挿入及び欠失は、場合によっては１から５のアミノ酸の範囲内とすることができる。許容される変異は、配列においてアミノ酸の挿入、欠失又は置換を系統的に作成し、全長配列又は成熟天然配列により示される活性に対して、得られる変異体を試験することにより決定される。
【００３５】
変異は、オリゴヌクレオチド媒介（部位特異的）突然変異誘発、アラニンスキャンニング、及びＰＣＲ突然変異誘発等のこの分野で周知の技術を用いてなすことができる。部位特異的突然変異誘発［Carter等, Nucl. Acids Res., 13: 4331 (1986); Zoller等, Nucl. Acids Res., 10: 6487 (1987)］、カセット突然変異誘発［Wells等, Gene, 34: 315 (1985)］、制限的選択突然変異誘発［Wells等, Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317: 415 (1986)］又は他のこの分野で知られた技術をクローニングしたＤＮＡに実施して、ｈＳｕ（ｆｕ）変異体ＤＮＡを作成することもできる。
また、隣接配列に沿って一又は複数のアミノ酸を同定するのにスキャンニングアミノ酸分析を用いることができる。中でも好ましいスキャンニングアミノ酸は、比較的小さく、中性のアミノ酸である。そのようなアミノ酸は、アラニン、グリシン、セリン、及びシステインを含む。アラニンは、ベータ炭素を越える側鎖を排除し変異体の主鎖構造を変化させにくいので、この群の中で典型的に好ましいスキャンニングアミノ酸である［Cunningham及びWells,
Science, 244: 1081-1085 (1989)］。また、アラニンは最もありふれたアミノ酸であるため典型的には好ましい。さらに、それは埋もれた及び露出した位置の両方に見られることが多い［Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150: 1 (1976)］。アラニン置換が十分な量の変異体を生じない場合は、アイソテリック(isoteric)アミノ酸を用いることができる。
【００３６】
Ｃ．ｈＳｕ（ｆｕ）の修飾
ｈＳｕ（ｆｕ）の共有結合的修飾は本発明の範囲内に含まれる。共有結合的修飾の一型は、ｈＳｕ（ｆｕ）の標的とするアミノ酸残基を、ｈＳｕ（ｆｕ）の選択された側鎖又はＮ又はＣ末端残基と反応できる有機誘導体化試薬と反応させることである。二官能性試薬での誘導体化が、例えばｈＳｕ（ｆｕ）を水不溶性支持体マトリクスあるいは抗ｈＳｕ（ｆｕ）抗体の精製方法又はその逆で用いるための表面に架橋させるのに有用である。通常用いられる架橋剤は、例えば、１，１-ビス（ジアゾアセチル）-２-フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば４-アジドサリチル酸、３，３’-ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）等のジスクシンイミジルエステルを含むホモ二官能性イミドエステル、ビス-Ｎ-マレイミド-１，８-オクタン等の二官能性マレイミド、及びメチル-３-[(ｐ-アジドフェニル)-ジチオ]プロピオイミダート等の試薬を含む。
他の修飾は、グルタミニル及びアスパラギニル残基の各々対応するグルタミル及びアスパルチルへの脱アミノ化、プロリン及びリシンのヒドロキシル化、セリル又はトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニン、及びヒスチジン側鎖のα-アミノ基のメチル化[T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp.79-86 (1983)]、Ｎ末端アミンのアセチル化、及び任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化を含む。
本発明の範囲内に含まれるｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチドの共有結合的修飾の他の型は、ポリペプチドの天然グリコシル化パターンを変更することを含む。「天然グリコシル化パターンの変更」とは、ＨＳＵ（ＦＵ）に見出される１つ又は複数の炭水化物部分の欠失（存在するグリコシル化部位の除去又は化学的及び／又は酵素的手段によるグリコシル化の削除による）、及び／又はｈＳｕ（ｆｕ）に存在しない１つ又は複数のグリコシル化部位の付加を意味する。さらに、この語句は、存在する種々の炭水化物部分の性質及び比率の変化を含む、天然タンパク質のグリコシル化の定性的変化を含む。
【００３７】
ｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチドへのグリコシル化部位の付加は、アミノ酸配列の変更によって達成されうる。この変更は、例えば、ｈＳｕ（ｆｕ）への一又は複数のセリン又はスレオニン残基の付加、又はこれによる置換によってもなされる(Ｏ-結合グリコシル化部位の場合)。場合によっては、ｈＳｕ（ｆｕ）アミノ酸配列はＤＮＡレベルでの変化によって、特に所望のアミノ酸に翻訳されるコドンが産生されるように予め選んだ塩基でｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチドをコードしているＤＮＡを突然変異させることによって変更される。
ｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチド上の炭水化物部分の数を増加させる他の手段は、ポリペプチドへのグリコシドの化学的又は酵素的結合による。これらの方法は1987年9月11日公開の国際特許出願第WO 87/05330号及びAplin及びWriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp259-306 (1981)に記載されている。
ｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチド上に存在する炭水化物部分の除去は、化学的又は酵素的あるいはグリコシル化の標的となるアミノ酸残基をコードするコドンの突然変異的置換によりなされる。例えば、化学的脱グリコシル化技術は、この分野で知られており、例えば、Hakimuddin等, Arch. Biochem Biophys., 259:52 (1987)及びEdge等, Anal. Biochem., 118:131 (1981)により記載されている。ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素的開裂は、Thotakura等, Meth. Enzymol., 138:350 (1987)に記載されているように種々のエンド-及びエキソ-グリコシダーゼを使用して達成することができる。
【００３８】
ｈＳｕ（ｆｕ）の共有結合的修飾の他の型は、ｈＳｕ（ｆｕ）ポリぺプチドの、種々の非タンパク質様ポリマー、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレンの一つへの、米国特許第4,640,835号；第4,496,689号；第4,301,144号；第4,670,417号；第4,791,192号又は第4,179,337号に記載された方法での結合を含む。
また、本発明のｈＳｕ（ｆｕ）は、他の異種ポリペプチド又はアミノ酸配列に融合したｈＳｕ（ｆｕ）を含むキメラ分子を形成する方法で修飾してもよい。
【００３９】
一実施態様では、このようなキメラ分子は、抗-タグ抗体が選択的に結合できるエピトープを提供するタグポリペプチドとｈＳｕ（ｆｕ）との融合を含む。エピトープタグは、一般的にはｈＳｕ（ｆｕ）のアミノ-又はカルボキシル-末端に位置する。このようなｈＳｕ（ｆｕ）のエピトープタグ形態の存在は、タグポリペプチドに対する抗体を用いて検出することができる。また、エピトープタグの提供は、抗タグ抗体又はエピトープタグに結合する他の型の親和性マトリクスを用いたアフィニティ精製によってｈＳｕ（ｆｕ）を容易に精製できるようにする。種々のタグポリペプチド及びそれら各々の抗体はこの分野で良く知られている。例としては、ポリ-ヒスチジン（poly-his）又はポリ-ヒスチジン-グリシン（poly-his-gly）タグ；flu HAタグポリペプチド及びその抗体１２ＣＡ５［Field等, Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)］；c-mycタグ及びそれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７及び９Ｅ１０抗体［Evan等, Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)］；及び単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ（gD）タグ及びその抗体［Paborsky等, Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)］を含む。他のタグポリペプチドは、Flag-ペプチド［Hopp等, BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)］；ＫＴ３エピトープペプチド［Martin等, Science, 255:192-194 (1992)］；α-チューブリンエピトープペプチド［Skinner等, J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)］；及びＴ７遺伝子１０タンパク質ペプチドタグ［Lutz-Freyermuth等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397 (1990)］を含む。
これに換わる実施態様では、キメラ分子はｈＳｕ（ｆｕ）の免疫グロブリン又は免疫グロブリンの特定領域との融合体を含んでもよい。キメラ分子の二価形態（「イムノアドヘシン」とも呼ばれる）については、そのような融合体はＩｇＧ分子のＦｃ領域であり得る。Ｉｇ融合体は、好ましくはＩｇ分子内の少なくとも１つの可変領域に換えてｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチドの可溶化（膜貫通ドメイン欠失又は不活性化）形態を含む。特に好ましい実施態様では、免疫グロブリン融合体は、ＩｇＧ分子のヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３、又はヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含む。免疫グロブリン融合体の製造については、1995年6月27日発行の米国特許第5,428,130号を参照のこと。
【００４０】
Ｄ．ｈＳｕ（ｆｕ）の調製
以下の説明は、主として、ｈＳｕ（ｆｕ）核酸を含むベクターで形質転換又は形質移入された細胞を培養することにより特定のｈＳｕ（ｆｕ）を生産する方法に関する。もちろん、当該分野においてよく知られている他の方法を用いてｈＳｕ（ｆｕ）を調製することはできると考えられる。例えば、ｈＳｕ（ｆｕ）配列、又はその一部は、固相技術を用いた直接ペプチド合成によって生産してもよい［例えば、Stewart等, Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969)；Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154 (1963)参照］。手動技術又は自動によるインビトロタンパク質合成を行ってもよい。自動合成は、例えば、アプライド・バイオシステムズ・ペプチド合成機（Foster City, CA）を用いて、製造者の指示により実施してもよい。ｈＳｕ（ｆｕ）の種々の部分を、別々に化学的に合成し、化学的又は酵素的方法を用いて結合させて全長ｈＳｕ（ｆｕ）を生産してもよい。
【００４１】
１．ｈＳｕ（ｆｕ）をコードするＤＮＡの単離
ｈＳｕ（ｆｕ）をコードするＤＮＡは、ｈＳｕ（ｆｕ）ｍＲＮＡを保有していてそれを検出可能なレベルで発現すると考えられる組織から調製されたｃＤＮＡライブラリから得ることができる。従って、ヒトｈＳｕ（ｆｕ）ＤＮＡは、実施例に記載されるように、ヒトの組織から調製されたｃＤＮＡライブラリから簡便に得ることができる。またｈＳｕ（ｆｕ）コード化遺伝子は、ゲノムライブラリから又はオリゴヌクレオチド合成により得ることもできる。
ライブラリは、対象となる遺伝子あるいはその遺伝子によりコードされるタンパク質を同定するために設計されたｈＳｕ（ｆｕ）に対する抗体又は少なくとも約２０−８０塩基のオリゴヌクレオチド等の)プローブによってスクリーニングできる。選択されたプローブによるｃＤＮＡ又はゲノムライブラリのスクリーニングは、例えばSambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)に記載されている標準的な手順を使用して実施することができる。ｈＳｕ（ｆｕ）をコードする遺伝子を単離する他の方法はＰＣＲ法を使用するものである［Sambrook等,上掲；Dieffenbach等, PCR Primer：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)］。
【００４２】
下記の実施例は、ｃＤＮＡライブラリのスクリーニング技術を記載している。プローブとして選択されたオリゴヌクレオチド配列は、充分な長さで、疑陽性が最小化されるよう充分に明瞭でなければならない。オリゴヌクレオチドは、スクリーニングされるライブラリ内のＤＮＡとのハイブリッド形成時に検出可能であるように標識されていることが好ましい。標識化の方法は当該分野において良く知られており、３２Ｐ標識されたＡＴＰのような放射線標識、ビオチン化あるいは酵素標識の使用が含まれる。中程度の緊縮性及び高度の緊縮性を含むハイブリッド形成条件は、上掲のSambrook等に与えられている。
このようなライブラリースクリーニング法において同定された配列は、GenBank等の公共データベース又は個人の配列データベースに寄託され公衆に利用可能とされている周知の配列と比較及びアラインメントすることができる。分子の一定の領域内又は全長に渡っての（アミノ酸又は核酸レベルのいずれかでの）配列同一性は、相同性測定のための種々のアルゴリズムを用いるＡＬＩＧＮ、ＤＮＡｓｔａｒ、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ-２及びＩＮＨＥＲＩＴ等のコンピュータソフトウェアプログラムを用いた配列アラインメントを通して決定することができる。
タンパク質コード化配列を有する核酸は、初めてここで開示された推定アミノ酸配列を使用し、また必要ならば、ｃＤＮＡに逆転写されなかったｍＲＮＡの生成中間体及び前駆体を検出する上掲のSambrook等に記述されているような従来のプライマー伸展法を使用することにより得られる。
【００４３】
２．宿主細胞の選択及び形質転換
宿主細胞を、ここに記載したｈＳｕ（ｆｕ）生成のための発現又はクローニングベクターで形質移入又は形質転換し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適当に変性された常套的栄養培地で培養する。培養条件、例えば培地、温度、ｐＨ等々は、過度の実験をすることなく当業者が選ぶことができる。一般に、細胞培養の生産性を最大にするための原理、プロトコール、及び実用技術は、Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M.Butler編 (IRL Press, 1991)及びSambrook等, 上掲に見出すことができる。
形質移入の方法、例えば、ＣａＰＯ４及びエレクトロポレーションは当業者に知られている。用いられる宿主細胞に応じて、その細胞に対して適した標準的な方法を用いて形質転換はなされる。前掲のSambrook等に記載された塩化カルシウムを用いるカルシウム処理又はエレクトロポレーションが、原核生物又は実質的な細胞壁障壁を含む他の細胞に対して用いられる。アグロバクテリウム・トゥメファシエンスによる感染が、Shaw等, Gene, 23:315 (1983)及び1989年6月29日公開のWO 89/05859に記載されているように、或る種の植物細胞の形質転換に用いられる。このような細胞壁のない哺乳動物の細胞に対しては、Graham及びvan der Eb, Virology, 52:456-457 (1978)のリン酸カルシウム沈降法が好ましい。哺乳動物細胞の宿主系形質転換の一般的な態様は米国特許第4,399,216号に記載されている。酵母菌中への形質転換は、典型的には、Van
Solingen等, J. Bact., 130:946 (1977)及びHsiao等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:3829 (1979)の方法に従って実施される。しかしながら、ＤＮＡを細胞中に導入する他の方法、例えば、核マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、無傷の細胞、又はポリカチオン、例えばポリブレン、ポリオルニチン等を用いる細菌プロトプラスト融合もまた用いることもできる。哺乳動物細胞を形質転換するための種々の技術については、Keown等, Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990)及び Mansour等, Nature, 336:348-352 (1988)を参照のこと。
【００４４】
ここに記載のベクターにおいてＤＮＡをクローン化あるいは発現するために適切な宿主細胞は、原核生物、酵母菌、又は高等真核生物細胞である。適切な原核生物は、限定するものではないが、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物体、例えば大腸菌のような腸内細菌科を含む。種々の大腸菌株が公衆に利用可能であり、例えば、大腸菌Ｋ１２株ＭＭ２９４（ATCC31,446）；大腸菌Ｘ１７７６（ATCC31,537）；大腸菌株Ｗ３１１０（ATCC27,325）及びＫ５７７２（ATCC53,635）である。
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、ｈＳｕ（ｆｕ）をコードするベクターのための適切なクローン化又は発現宿主である。サッカロミセス・セレヴィシアは、通常用いられる下等真核生物宿主微生物である。
ｈＳｕ（ｆｕ）の発現に適切な宿主細胞は、多細胞生物から誘導される。無脊椎動物細胞の例としては、ショウジョウバエＳ２及びスポドスペラＳｆ９等の昆虫細胞並びに植物細胞が含まれる。有用な哺乳動物宿主株化細胞の例は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）及びＣＯＳ細胞を含む。より詳細な例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株 (COS-7, ATCC CRL 1651);ヒト胚腎臓株（293又は懸濁培養での増殖のためにサブクローン化された293細胞、Graham等, J. Gen Virol., 36:59 (1977)）;チャイニーズハムスター卵巣細胞／-ＤＨＦＲ(CHO, Urlaub及びChasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980))；マウスのセルトリ細胞（TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)）；ヒト肺細胞 (W138, ATCC CCL 75)；ヒト肝細胞 (Hep G2, HB 8065)；及びマウス乳房腫瘍細胞 (MMT 060562, ATTC CCL51)を含む。適切な宿主細胞の選択は、この分野の技術常識内にある。
【００４５】
３．複製可能なベクターの選択及び使用
ｈＳｕ（ｆｕ）をコードする核酸(例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ)は、クローニング(ＤＮＡの増幅)又は発現のために複製可能なベクター内に挿入される。様々なベクターが公的に入手可能である。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス粒子、又はファージの形態とすることができる。適切な核酸配列が、種々の手法によってベクターに挿入される。一般に、ＤＮＡはこの分野で周知の技術を用いて適当な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。ベクター成分としては、一般に、これらに制限されるものではないが、一又は複数のシグナル配列、複製開始点、一又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列を含む。これらの成分の一又は複数を含む適当なベクターの作成には、当業者に知られた標準的なライゲーション技術を用いる。
ｈＳｕ（ｆｕ）は直接組換え的に生産されるだけではなく、シグナル配列あるいは成熟タンパク質あるいはポリペプチドのＮ末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドである異種性ポリペプチドとの融合ペプチドとしても生産される。一般に、シグナル配列はベクターの成分であるか、ベクターに挿入されるｈＳｕ（ｆｕ）-コード化ＤＮＡの一部である。シグナル配列は、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐあるいは熱安定なエンテロトキシンIIリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列であってよい。酵母の分泌に関しては、シグナル配列は、例えば酵母インベルターゼリーダー、アルファ因子リーダー(酵母菌属(Saccharomyces)及びクルイベロマイシス(Kluyveromyces)α因子リーダーを含み、後者は米国特許第5,010,182号に記載されている)、又は酸ホスフォターゼリーダー、白体(C.albicans)グルコアミラーゼリーダー(1990年4月4日発行のEP 362,179)、又は1990年11月15日に公開された国際特許出願第WO 90/13646号に記載されているシグナルであり得る。哺乳動物細胞の発現においては、同一あるいは関連する種の分泌ポリペプチド由来のシグナル配列、ウイルス分泌リーダーのような他の哺乳動物のシグナル配列をタンパク質の直接分泌に使用してもよい。
【００４６】
発現及びクローニングベクターは共に一又は複数の選択された宿主細胞においてベクターの複製を可能にする核酸配列を含む。そのような配列は多くの細菌、酵母菌及びウイルスに対してよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２に由来する複製開始点は大部分のグラム陰性細菌に好適であり、２：プラスミド開始点は酵母菌に適しており、様々なウイルス開始点(ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ又はＢＰＶ)は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。
【００４７】
発現及びクローニングベクターは、典型的には、選択マーカーとも称される選択遺伝子を含む。典型的な選択遺伝子は、(a)アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートあるいはテトラサイクリンのような抗生物質あるいは他の毒素に耐性を与え、(b)栄養要求性欠陥を補い、又は(c)例えばバシリに対する遺伝子コードＤ-アラニンラセマーゼのような、複合培地から得られない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。
哺乳動物細胞に適切な選択マーカーの他の例は、ＤＨＦＲあるいはチミジンキナーゼのように、ｈＳｕ（ｆｕ）核酸を取り込むことのできる細胞成分を同定することのできるものである。野生型ＤＨＦＲを用いた場合の好適な宿主細胞は、Urlaub 等により, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)に記載されているようにして調製され増殖されたＤＨＦＲ活性に欠陥のあるＣＨＯ株化細胞である。酵母菌中での使用に好適な選択遺伝子は酵母菌プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒｐ１遺伝子である［Stinchcomb等, Nature, 282：39(1979)；Kingman等, Gene, 7：141(1979)；Tschemper等, Gene, 10：157(1980)］。ｔｒｐ１遺伝子は、例えば、ＡＴＣＣ第４４０７６号あるいはＰＥＰ４-１のようなトリプトファン内で成長する能力を欠く酵母菌の突然変異株に対する選択マーカーを提供する［Jones, Genetics, 85:12 (1977)］。
【００４８】
発現及びクローニングベクターは、通常、ｈＳｕ（ｆｕ）核酸配列に作用可能に結合し、ｍＲＮＡ合成を制御するプロモーターを含む。種々の可能な宿主細胞により認識される好適なプロモーターが知られている。原核生物宿主での使用に好適なプロモーターは  -ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系［Chang等, Nature, 275:615 (1978)； Goeddel等, Nature, 281:544 (1979)］、アルカリホスファターゼ、トリプトファン(trp)プロモーター系［Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); EP 36,776］、及びハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃプロモーター［deBoer 等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983)］を含む。細菌系で使用するプロモータもまたｈＳｕ（ｆｕ）をコードするＤＮＡと作用可能に結合したシャイン・ダルガーノ(S.D.)配列を有する。
酵母菌宿主と共に用いて好適なプロモーター配列の例としては、３-ホスホグリセラートキナーゼ［Hitzeman 等, J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)］又は他の糖分解酵素［Hess 等, J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968)；Holland, Biochemistry, 17：4900(1978)］、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース-６-リン酸イソメラーゼ、３-ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオセリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼが含まれる。
【００４９】
他の酵母菌プロモーターとしては、成長条件によって転写が制御される付加的効果を有する誘発的プロモーターであり、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロムＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝と関連する分解性酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、及びマルトース及びガラクトースの利用を支配する酵素のプロモーター領域がある。酵母菌での発現に好適に用いられるベクターとプロモータはEP 73,657に更に記載されている。
哺乳動物の宿主細胞におけるベクターからのｈＳｕ（ｆｕ）転写は、例えば、ポリオーマウィルス、伝染性上皮腫ウィルス(1989年7月5日公開のUK 2,211,504)、アデノウィルス(例えばアデノウィルス２)、ウシ乳頭腫ウィルス、トリ肉腫ウィルス、サイトメガロウィルス、レトロウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス及びサルウィルス４０(SV40)のようなウィルスのゲノムから得られるプロモーター、異種性哺乳動物から得られるプロモーター、例えばアクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター、及び熱衝撃プロモーターから得られるプロモーターによって、このようなプロモーターが宿主細胞系に適合し得る限り制御される。
【００５０】
より高等の真核生物によるｈＳｕ（ｆｕ）をコードしているＤＮＡの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによって増強され得る。エンハンサーは、通常は約１０から３００塩基対で、プロモーターに作用してその転写を増強するＤＮＡのシス作動要素である。哺乳動物遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトプロテイン及びインスリン)。しかしながら、典型的には、真核細胞ウィルス由来のエンハンサーが用いられるであろう。例としては、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー(１００−２７０塩基対)、サイトメガロウィルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウィルスエンハンサーが含まれる。エンハンサーは、ｈＳｕ（ｆｕ）コード化配列の５’又は３’位でベクター中にスプライシングされ得るが、好ましくはプロモーターから５’位に位置している。
また真核生物宿主細胞(酵母菌、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、又は他の多細胞生物由来の有核細胞)に用いられる発現ベクターは、転写の終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列も含む。このような配列は、真核生物又はウィルスのＤＮＡ又はｃＤＮＡの通常は５’、時には３’の非翻訳領域から取得できる。これらの領域は、ｈＳｕ（ｆｕ）をコードしているｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。
組換え脊椎動物細胞培養でのｈＳｕ（ｆｕ）の合成に適応化するのに適切なさらに他の方法、ベクター及び宿主細胞は、Gething等, Nature, 293:620-625 (1981); Mantei等, Nature, 281:40-46 (1979); EP 117,060; 及びEP 117,058に記載されている。
【００５１】
４．遺伝子増幅／発現の検出
遺伝子の増幅及び／又は発現は、ここで提供された配列に基づき、適切に標識されたプローブを用い、例えば、従来よりのサザンブロット法、ｍＲＮＡの転写を定量化するノーザンブロット法［Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,77:5201-5205 (1980)］、ドットブロット法(ＤＮＡ分析)、又はインサイツハイブリッド形成法によって、直接的に試料中で測定することができる。あるいは、ＤＮＡ二本鎖、ＲＮＡ二本鎖及びＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二本鎖又はＤＮＡ-タンパク二本鎖を含む、特異的二本鎖を認識することができる抗体を用いることもできる。ついで、抗体を標識し、アッセイを実施することができ、ここで二本鎖は表面に結合しており、その結果二本鎖の表面での形成の時点でその二本鎖に結合した抗体の存在を検出することができる。
あるいは、遺伝子の発現は、遺伝子産物の発現を直接的に定量する免疫学的な方法、例えば細胞又は組織切片の免疫組織化学的染色及び細胞培養又は体液のアッセイによって、測定することもできる。試料液の免疫組織化学的染色及び／又はアッセイに有用な抗体は、モノクローナルでもポリクローナルでもよく、任意の哺乳動物で調製することができる。簡便には、抗体は、天然配列ｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチドに対して、又はここで提供されるＤＮＡ配列をベースとした合成ペプチドに対して、又はｈＳｕ（ｆｕ）ＤＮＡに融合し特異的抗体エピトープをコードする外因性配列に対して調製され得る。
【００５２】
５．ポリペプチドの精製
ｈＳｕ（ｆｕ）の形態は、培地又は宿主細胞の溶解液から回収することができる。膜結合性であるならば、適切な洗浄液(例えばトリトン-X100)又は酵素的切断を用いて膜から引き離すことができる。ｈＳｕ（ｆｕ）の発現に用いられる細胞は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破壊、又は細胞溶解剤などの種々の化学的又は物理的手段によって破壊することができる。
ｈＳｕ（ｆｕ）を、組換え細胞タンパク又はポリペプチドから精製することが望ましい。適切な精製手順の例である次の手順により精製される：すなわち、イオン交換カラムでの分画；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカ又はカチオン交換樹脂、例えばＤＥＡＥによるクロマトグラフィー；クロマトフォーカシング；ＳＤＳ-ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿；例えばセファデックスＧ-７５を用いるゲル濾過;ＩｇＧのような汚染物を除くプロテインＡセファロースカラム；及びｈＳｕ（ｆｕ）のエピトープタグ形態を結合させる金属キレート化カラムである。この分野で知られ、例えば、Deutcher, Methodes in Enzymology, 182 (1990)；Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982)に記載された多くのタンパク質精製方法を用いることができる。選ばれる精製過程は、例えば、用いられる生産方法及び特に生産されるｈＳｕ（ｆｕ）の性質に依存する。
【００５３】
Ｅ．ｈＳｕ（ｆｕ）の用途
ｈＳｕ（ｆｕ）をコードする核酸配列（又はそれらの補体）は、ハイブリッド形成プローブとしての使用を含む分子生物学の分野において、染色体及び遺伝子マッピングにおいて、及びアンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡの生成において種々の用途を有している。また、ｈＳｕ（ｆｕ）核酸は、ここに記載される組み換え技術によるｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチドの調製にも有用であろう。
全長天然配列ｈＳｕ（ｆｕ）遺伝子（配列番号：１）、又はその一部は、全長遺伝子の単離又はＦｉｇ１（配列番号：１）に開示されたｈＳｕ（ｆｕ）配列に対して所望の配列同一性を持つ更に他の遺伝子（例えば、ｈＳｕ（ｆｕ）の天然発生変異体又は他の種からのｈＳｕ（ｆｕ）をコードするもの）の単離のためのｃＤＮＡライブラリ用のハイブリッド形成プローブとして使用できる。場合によっては、プローブの長さは約２０〜約５０塩基である。ハイブリッド形成プローブは、配列番号：１の核酸配列から、又は天然配列ｈＳｕ（ｆｕ）のプロモーター、エンハンサー成分及びイントロンを含むゲノム配列から誘導され得る。例えば、スクリーニング法は、ｈＳｕ（ｆｕ）遺伝子のコード化領域を周知のＤＮＡ配列を用いて単離して約４０塩基の選択されたプローブを合成することを含む。ハイブリッド形成プローブは、３２Ｐ又は３５Ｓ等の放射性ヌクレオチド、又はアビジン／ビオチン結合系を介してプローブに結合したアルカリホスファターゼ等の酵素標識を含む種々の標識で標識されうる。本発明のｈＳｕ（ｆｕ）遺伝子に相補的な配列を有する標識されたプローブは、ヒトｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡのライブラリーをスクリーニングし、それらのライブラリーの何れのメンバーがプローブにハイブッド形成するかを決定するのに使用できる。ハイブリッド形成技術は、以下の実施例において更に詳細に記載する。
また、プローブは、ＰＣＲ技術に用いて、密接に関連したｈＳｕ（ｆｕ）配列の同定のための配列のプールを作成することができる。
【００５４】
また、ｈＳｕ（ｆｕ）をコードする核酸配列は、そのｈＳｕ（ｆｕ）をコードする遺伝子のマッピングのため、及び遺伝子疾患を持つ個体の遺伝子分析のためのハイブリッド形成プローブの作成にも用いることができる。ここに提供される核酸配列は、インサイツハイブリッド形成、既知の染色体マーカーに対する結合分析、及びライブラリーでのハイブリッド形成スクリーニング等の周知の技術を用いて、染色体及び染色体の特定領域にマッピングすることができる。
本発明は、Ｈｈ関連腫瘍、好ましくはｈＳｕ（ｆｕ）に関連するものを検出するために使用することができる。異常なＨＨシグナル伝達を伴うことが疑われる腫瘍を持つ患者からのＤＮＡについて、ｈＳｕ（ｆｕ）遺伝子中の発癌性突然変異の有無を分析する。散発性腫瘍の遺伝的特徴付けには、一般に、簡便には細胞診試料を用いた腫瘍細胞ＤＮＡ又はＲＮＡの分析が必要となる。ここに提示した正常な配列と比較して、核酸について、発癌性突然変異の有無をスクリーニングする。Ｈｈシグナル伝達の変化を伴う散発性腫瘍には、基底細胞癌、メラノーマ、扁平上皮癌、乳癌、移行膀胱細胞癌、髄膜腫、心臓及び卵巣の線維腫、肺、大腸、卵巣、腎臓及び食道癌、及び多の腸の癌が含まれる。
ここに教示するものを含み、ゲノムＤＮＡ配列を分析するための多くの方法が利用できる。多量のＤＮＡが利用できる場合にはゲノムＤＮＡを直接用いる。あるいは、対象領域を適当なベクター中にクローニングし、分析のために十分な量になるように増殖させ、あるいはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のような一般的な方法により増幅させることができる。異常なｈＳｕ（ｆｕ）タンパク質の有無についての腫瘍細胞の分析は、以下に検討するイムノアッセイにより実施することができる。
【００５５】
ｈＳｕ（ｆｕ）のコード配列が他のタンパク質に結合するタンパク質をコードするときは（例、ｈＳｕ（ｆｕ）がレセプターである場合）、ｈＳｕ（ｆｕ）は結合相互作用に関与する他のタンパク質又は分子を同定するアッセイにおいて使用することができる。このような方法により、レセプター／リガンド結合相互作用のインヒビターを同定することができる。このような結合相互作用に関与するタンパク質はまた結合相互作用のペプチドもしくは小分子インヒビター又はアゴニストをスクリーニングするために使用することもできる。また、レセプターｈＳｕ（ｆｕ）は相関するリガンド（類）を単離するために使用することができる。スクリーニングアッセイは、ｈＳｕ（ｆｕ）のレセプター又は天然ｈＳｕ（ｆｕ）の生物活性を模倣するリード化合物を見出すように構築することができる。このようなスクリーニングアッセイには、化学ライブラリの高性能スクリーニングに受け入れられるアッセイが含まれ、小分子薬物候補を同定するためにこれを特に適したものにする。考えられる小分子には、合成の有機もしくは無機化合物が含まれる。アッセイは、当該分野において十分に特徴付けられているタンパク質間結合アッセイ、生化学スクリーニングアッセイ、イムノアッセイ及び細胞ベースアッセイを含む様々な形態で実施することができる。
【００５６】
ｈＳｕ（ｆｕ）又はその修飾形態をコードする核酸は、トランスジェニック動物又は「ノックアウト」動物を産生するのに用いることができ、該動物は順に治療的に有用な試薬の開発とスクリーニングに有用である。トランスジェニック動物（例えば、マウス又はラット）は、出生前、例えば胚段階で、その動物又はその動物の祖先に導入された導入遺伝子を含む細胞を有する動物である。導入遺伝子とは、トランスジェニック動物が発生する細胞のゲノムに組み込まれたＤＮＡである。一実施態様では、ｈＳｕ（ｆｕ）をコードするｃＤＮＡを、確立された技術によりｈＳｕ（ｆｕ）をコードするゲノムＤＮＡをクローン化するために使用することができ、ゲノム配列を、ｈＳｕ（ｆｕ）をコードするＤＮＡを発現する細胞を含むトランスジェニック動物を産生するために使用することができる。特にマウス又はラット等のトランスジェニック動物を産生する方法は当該分野において常套的になっており、例えば米国特許第4,736,866号や第4,870,009号に記述されている。典型的には、特定の細胞を組織特異的エンハンサーでのｈＳｕ（ｆｕ）導入遺伝子の導入の標的にする。胚段階で動物の生殖系列に導入されたｈＳｕ（ｆｕ）をコードする導入遺伝子のコピーを含むトランスジェニック動物は、ｈＳｕ（ｆｕ）をコードするＤＮＡの増大した発現の影響を調べるために使用できる。このような動物は、例えばその過剰発現を伴う病理的状態に対して保護をもたらすと思われる試薬のテスター動物として使用できる。発明のこの側面においては、動物を試薬で処理し、導入遺伝子を有する未処理の動物に比べ病状の発病率が低ければ、疾患に対する治療的処置の可能性が示される。
【００５７】
あるいは、ｈＳｕ（ｆｕ）の非ヒト相同体は、動物の胚性細胞に導入されたｈＳｕ（ｆｕ）をコードする変更ゲノムＤＮＡと、ｈＳｕ（ｆｕ）をコードする内在性遺伝子との間の相同的組換えによって、ｈＳｕ（ｆｕ）をコードする欠陥又は変更遺伝子を有するｈＳｕ（ｆｕ）「ノックアウト」動物を作成するために使用できる。例えば、ｈＳｕ（ｆｕ）をコードするｃＤＮＡは、確立された技術に従い、ｈＳｕ（ｆｕ）をコードするゲノムＤＮＡのクローニングに使用できる。ｈＳｕ（ｆｕ）をコードするゲノムＤＮＡの一部を欠失したり、組み込みを監視するために使用する選択可能なマーカーをコードする遺伝子等の他の遺伝子で置換することができる。典型的には、ベクターは無変化のフランキングＤＮＡ(５'と３'末端の両方)を数キロベース含む［例えば、相同的組換えベクターについてはThomas and Capecchi, Cell, 51:503 (1987)を参照のこと］。ベクターは胚性幹細胞に(例えば電気穿孔法等によって)導入し、導入されたＤＮＡが内在性ＤＮＡと相同的に組換えられた細胞を選択する［例えば、Li等, Cell, 69:915 (1992)参照］。選択された細胞は次に動物(例えばマウス又はラット)の胚盤胞内に注入され、集合キメラを形成する［例えば、Bradley, Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), pp. 113-152参照］。その後、キメラ性胚を適切な偽妊娠の雌性乳母に移植し、「ノックアウト」動物を作ると言われる。胚細胞に相同的に組換えられたＤＮＡを有する子孫は標準的な技術により同定され、それらを利用して動物の全細胞が相同的に組換えられたＤＮＡを含む動物を繁殖させることができる。ノックアウト動物は、ｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチドが不在であることによるある種の病理的状態及び病理的状態の進行に対して防御する能力によって特徴付けられる。
【００５８】
ｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチドをコードする核酸はまた遺伝子療法に使用することができる。遺伝子療法の用途では、例えば欠陥遺伝子の置換のために治療的有効量の遺伝子産物のインビボ合成を達成するために遺伝子が細胞に導入される。「遺伝子療法」には、持続効果が単一の治療によって達成される一般的な遺伝子療法と、治療的有効量のＤＮＡ又はｍＲＮＡの一回又は繰り返し投与を含む遺伝子治療剤の投与の双方が含まれる。アンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡを、ある種の遺伝子のインビボでの発現を阻止するための治療剤として使用することができる。短いアンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞膜によるその制限された取り込みにより引き起こされるその低細胞内濃度にもかかわらず、阻害剤として作用する細胞中に移入されうることは既に示されている。（Zamecnik等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:4143-4146 [1986]）。オリゴヌクレオチドは、例えば負に荷電したホスホジエステル基を無電荷基により置換することにより、その取り込みを亢進するように修飾することができる。
一実施態様では、製薬組成物は、遺伝子療法のための腫瘍抑制活性を有するｈＳｕ（ｆｕ）の非突然変異型をコード化するヌクレオチド配列を含む。当該分野において知られているように、腫瘍又は他の疾患は、細胞が癌抑制遺伝子の双方の機能性コピーを失うか、あるいは欠陥型に突然変異した一又は複数のコピーを有しているときにしばしば進化する。そのような場合、ｈＳｕ（ｆｕ）の機能性コピーを導入すると状態を改善するのに役立ちうる。
【００５９】
生細胞中に核酸を導入するために利用できる様々な技術がある。その技術は、核酸がインビトロで培養細胞中に移されるか、意図した宿主の細胞中にインビボで移されるかどうかに依存して変わる。哺乳動物細胞へのインビトロでの核酸の移送に好適な技術には、リポソームの使用、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥ-デキストラン、リン酸カルシウム沈殿法等々が含まれる。現在好適なインビボでの遺伝子移送技術には、ウィルス（典型的にはレトロウィルス）ベクターでの形質移入とウィルスコートタンパク質−リポソーム媒介形質移入（Dzau等, Trends in Biotechnology 11:205-210[1993]）が含まれる。ある状況では、核酸源に標的細胞をターゲッティングする薬剤、例えば細胞表面膜タンパク質又は標的細胞に対して特異的な抗体、標的細胞上のレセプターに対するリガンドを提供することが望ましい。リポソームが用いられる場合、エンドサイトーシスに関連する細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質は、例えば特定の細胞型向けのキャプシドタンパク質又はその断片、サイクリングにおいて内部移行を受けるタンパク質の抗体、細胞内局在化を標的にし細胞内半減期を亢進するタンパク質を標的とする、及び／又は取り込みを容易にするために使用しうる。レセプター媒介エンドサイトーシスの方法は、例えばWu等, J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987);及びWagner等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:3410-3414(1990)に記載されている。遺伝子標識及び遺伝子療法プロトコールのレビューについてはAnderson等,
Science 256:808-813 (1992)を参照されたい。
【００６０】
本発明のｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチドは、製薬的に有用な組成物を調製するための既知の方法で製剤化することができ、それにより、本ｈＳｕ（ｆｕ）産物は製薬的に許容可能な担体ビヒクルと混合して組み合わされる。治療用製剤は、所望の純度を持つ活性成分を、任意の生理学的に許容される担体、賦形剤又は安定化剤（Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th ed., Osol, A.編, (1980)）と混合することにより、凍結乾燥製剤又は水溶液として調製されて保存される。許容可能な担体、賦形剤又は安定化剤は、用いられる用量及び濃度で受容者に非毒性であり、例えばホスファート、シトラート及び他の有機酸のような緩衝液；アスコルビン酸を含む抗酸化剤；低分子量（約１０残基以下）のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、免疫グロブリンのようなタンパク質；ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリジンのようなアミノ酸；グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖類、二糖類及び他の炭水化物；ＥＤＴＡのようなキレート剤；マンニトール又はソルビトールのような糖アルコール；ナトリウムのような塩形成対イオン；及び／又はトゥイーン（Tween）、プルロニクス（Pluronics）又はＰＥＧのような非イオン性界面活性剤を含む。インビボ投与のために使用される製剤は殺菌したものでなければならない。これは、凍結乾燥及び再構成に先だって、又はその後に、滅菌濾過膜を通す濾過によって容易に達成される。
ここに記載する治療用組成物は、一般に、無菌のアクセスポート、例えば、静脈内溶液バッグ又は皮下注射針が貫通可能なストッパーを備えたバイアルに入れられる。
投与経路は、既知の方法、例えば、静脈内、腹膜内、脳内、筋肉内、眼内、動脈内、又は病巣内経路での注射又は注入、局所投与、あるいは徐放システムに従う。
本発明の製薬組成物の容量と所望される薬物濃度は考えられる特定の用途に依存して変わりうる。適切な用量と投与経路の決定は通常の医師の技量の範囲内である。動物実験はヒトの治療のために効果的な用量を決定するための信頼のある指針を提供する。有効用量の種間スケーリングは、Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobi等, 編, Pergamon Press, New York 1989, pp. 42-96のMordenti, J.とChappell, W.「The use of interspecies scaling in toxicokinetics」に記載された原理に従って実施できる。
【００６１】
Ｆ．抗ｈＳｕ（ｆｕ）抗体
本発明は、さらに抗ｈＳｕ（ｆｕ）抗体を提供するものである。抗体の例としては、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、二重特異性及びヘテロ抱合体抗体が含まれる。
１．ポリクローナル抗体
本発明の抗ｈＳｕ（ｆｕ）抗体はポリクローナル抗体を含む。ポリクローナル抗体の調製方法は当業者に知られている。哺乳動物においてポリクローナル抗体は、例えば免疫化剤、及び所望するのであればアジュバントを、一又は複数回注射することで発生させることができる。典型的には、免疫化剤及び／又はアジュバントを複数回皮下又は腹腔内注射により、哺乳動物に注射する。免疫化剤は、ｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチド又はその融合タンパク質を含みうる。免疫化剤を免疫化された哺乳動物において免疫原性が知られているタンパク質に抱合させるのが有用である。このような免疫原タンパク質の例は、これらに限られないが、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン及び大豆トリプシンインヒビターが含まれる。使用され得るアジュバントの例には、フロイント完全アジュバント及びＭＰＬ-ＴＤＭアジュバント(モノホスホリル脂質Ａ、合成トレハロースジコリノミコラート)が含まれる。免疫化プロトコールは、過度の実験なく当業者により選択されるであろう。
【００６２】
２．モノクローナル抗体
あるいは、抗ｈＳｕ（ｆｕ）抗体はモノクローナル抗体であってもよい。モノクローナル抗体は、Kohler及びMilstein, Nature, 256:495 (1975)に記載されているようなハイブリドーマ法を使用することで調製することができる。ハイブリドーマ法では、マウス、ハムスター又は他の適切な宿主動物を典型的には免疫化剤により免疫化することで、免疫化剤に特異的に結合する抗体を生成するかあるいは生成可能なリンパ球を誘発する。また、リンパ球をインビトロで免疫化することもできる。
免疫化剤は、典型的にはｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチド又はその融合タンパク質を含む。一般にヒト由来の細胞が望まれる場合には末梢血リンパ球(「ＰＢＬ」)が使用され、あるいは非ヒト哺乳動物源が望まれている場合は、脾臓細胞又はリンパ節細胞が使用される。ついで、ポリエチレングリコール等の適当な融合剤を用いてリンパ球を不死化株化細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する［Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103］。不死化株化細胞は、通常は、形質転換した哺乳動物細胞、特に齧歯動物、ウシ、及びヒト由来の骨髄腫細胞である。通常、ラット又はマウスの骨髄腫株化細胞が使用される。ハイブリドーマ細胞は、好ましくは、未融合の不死化細胞の生存又は成長を阻害する一又は複数の物質を含有する適切な培地で培養される。例えば、親細胞が、酵素のヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HGPRT又はHPRT)を欠いていると、ハイブリドーマの培地は、典型的には、ヒポキサチン、アミノプチリン及びチミジンを含み(「ＨＡＴ培地」)、この物質がＨＧＰＲＴ欠乏性細胞の増殖を阻止する。
【００６３】
好ましい不死化株化細胞は、効率的に融合し、選択された抗体生成細胞による安定した高レベルの抗体発現を支援し、ＨＡＴ培地のような培地に対して感受性のものである。より好ましい不死化株化細胞はマウス骨髄腫株であり、これは例えばカリフォルニア州サンディエゴのSalk Institute Cell Distribution Centerやメリーランド州ロックビルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションより入手可能である。ヒトモノクローナル抗体を生成するためのヒト骨髄腫及びマウス-ヒト異種骨髄腫株化細胞も開示されている［Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984)、Brodeur等, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51-63］。
ついでハイブリドーマ細胞が培養される培養培地を、ｈＳｕ（ｆｕ）に対するモノクローナル抗体の存在について検定する。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって生成されたモノクローナル抗体の結合特異性は免疫沈降又はラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)や酵素結合免疫測定法(ＥＬＩＳＡ)等のインビトロ結合検定法によって測定する。このような技術及びアッセイは、当該分野において公知である。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばMunson及びPollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980)によるスキャッチャード分析法によって測定することができる。
所望のハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンを制限希釈工程によりサブクローニングし、標準的な方法で成長させることができる［Goding, 上掲］。この目的のための適当な培地には、例えば、ダルベッコの改変イーグル培地及びＲＰＭＩ-１６４０倍地が含まれる。あるいは、ハイブリドーマ細胞は哺乳動物においてインビボで腹水として成長させることもできる。
サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ−セファロース法、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー法、ゲル電気泳動法、透析法又はアフィニティークロマトグラフィー等の従来の免疫グロブリン精製方法によって培養培地又は腹水液から単離又は精製される。
【００６４】
また、モノクローナル抗体は、組換えＤＮＡ法、例えば米国特許第4,816,567号に記載された方法により作成することができる。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、常套的な方法を用いて(例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用して)、容易に単離し配列決定することができる。本発明のハイブリドーマ細胞はそのようなＤＮＡの好ましい供給源となる。ひとたび単離されたら、ＤＮＡは発現ベクター内に配することができ、これが宿主細胞、例えばサルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、あるいは免疫グロブリンタンパク質を生成などしない骨髄腫細胞内に形質移入され、組換え宿主細胞内でモノクローナル抗体の合成をすることができる。また、ＤＮＡは、例えば相同マウス配列に換えてヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード配列を置換することにより［US. Patent No.4,816,567；Morrison等, 上掲］、又は免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の一部又は全部を共有結合することにより修飾することができる。このような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメインの代わりに置換するか、本発明の抗体の一つの抗原結合部位の可変ドメインの代わりに置換し、キメラ性二価抗体を産生することができる。このような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメインに置換でき、あるいは本発明の抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインに置換でき、キメラ性二価抗体を生成する。
抗体は一価抗体であってもよい。一価抗体の調製方法は当該分野においてよく知られてる。例えば、一つの方法は免疫グロブリン軽鎖と修飾重鎖の組換え発現を含む。重鎖は一般的に、重鎖の架橋を防止するようにＦｃ領域の任意のポイントで切断される。あるいは、関連するシステイン残基を他のアミノ酸残基で置換するか欠失させて架橋を防止する。
一価抗体の調製にはインビトロ法がまた適している。抗体の消化による、その断片、特にＦａｂ断片の生成は、当該分野において知られている慣用的技術を使用して達成できる。
【００６５】
３．ヒト化抗体
本発明の抗ｈＳｕ（ｆｕ）抗体は、さらにヒト化抗体又はヒト抗体を含む。非ヒト(例えばマウス)抗体のヒト化形とは、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖あるいはその断片(例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')２あるいは抗体の他の抗原結合サブ配列)であって、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むものである。ヒト化抗体はレシピエントの相補性決定領域(ＣＤＲ)の残基が、マウス、ラット又はウサギのような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種(ドナー抗体)のＣＤＲの残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)を含む。幾つかの例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によって置換されている。また、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入されたＣＤＲもしくはフレームワーク配列にも見出されない残基を含んでいてもよい。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいはほとんど全てのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいはほとんど全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、最適には免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含んでなる［Jones等, Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann等, Nature, 332:323-329 (1988); 及びPresta, Curr. Op Struct. Biol., 2:593-596 (1992)］。
【００６６】
非ヒト抗体をヒト化する方法はこの分野でよく知られている。一般的に、ヒト化抗体には非ヒト由来の一又は複数のアミノ酸残基が導入される。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と称される。ヒト化は基本的に齧歯動物のＣＤＲ又はＣＤＲ配列でヒト抗体の該当する配列を置換することによりウィンター(winter)及び共同研究者［Jones等, Nature, 321:522-525 (1986)；Riechmann等, Nature, 332:323-327 (1988)；Verhoeyen等, Science, 239:1534-1536 (1988)］の方法に従って、齧歯類ＣＤＲ又はＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列に置換することにより実施される。よって、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体(米国特許第4,816,567号)である。実際には、ヒト化抗体は典型的には幾つかのＣＤＲ残基及び場合によっては幾つかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似する部位からの残基によって置換されたヒト抗体である。
また、ヒト抗体は、ファージ表示ライブラリ［Hoogenboom及びWinter, J. Mol. Biol., 227:381
(1991)；Marks等, J. Mol. Biol., 222:581 (1991)］を含むこの分野で知られた種々の方法を用いて作成することもできる。また、Cole等及びBoerner等の技術も、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用することができる［Cole等, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss. p.77(1985)及びBoerner等, J. Immunol., 147(1)：86-95(1991) ］。同様に、ヒト抗体はヒト免疫グロブリン座位をトランスジェニック動物、例えば内在性免疫グロブリン遺伝子は部分的又は完全に不活性化されたマウスに導入することにより産生することができる。投与の際に、遺伝子再配列、組立、及び抗体レパートリーを含むあらゆる観点においてヒトに見られるものに非常に類似しているヒト抗体の生産が観察される。このアプローチは、例えば米国特許第5,545,807号；同第5,545,806号；同第5,569,825号；同第5,625,126号；同第5,633,425号；同第5,661,016号、及び次の科学文献：Marks等, Bio/Technology 10, 779-783 (1992); Lonberg等, Nature 368 856-859 (1994); Morrison, Nature 368, 812-13 (1994); Fishwild等, Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996); Lonberg及びHuszar, Intern. Rev. Immunol. 13 65-93 (1995)に記載されている。
【００６７】
４．二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体、好ましくはヒトもしくはヒト化抗体である。本発明の場合において、結合特異性の一方はｈＳｕ（ｆｕ）に対してであり、他方は任意の他の抗原、好ましくは細胞表面タンパク質又はレセプター又はレセプターサブユニットに対してである。
二重特異性抗体を作成する方法は当該技術分野において周知である。伝統的には、二重特異性抗体の組換え生産は、二つの重鎖が異なる特異性を持つ二つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の同時発現に基づく［Milstein及びCuello, Nature, 305:537-539 (1983)］。免疫グロブリンの重鎖と軽鎖を無作為に取り揃えるため、これらハイブリドーマ(クアドローマ)は１０種の異なる抗体分子の潜在的混合物を生成し、その内一種のみが正しい二重特異性構造を有する。正しい分子の精製は、アフィニティークロマトグラフィー工程によって通常達成される。同様の手順が1993年5月13日公開のWO 93/08829、及びTraunecker等, EMBO J.,10:3655-3656 (1991)に開示されている。
所望の結合特異性(抗体-抗原結合部位)を有する抗体可変ドメインを免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合できる。融合は、好ましくは少なくともヒンジ部、ＣＨ２及びＣＨ３領域の一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとのものである。少なくとも一つの融合には軽鎖結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域(ＣＨ１)が存在することが望ましい。免疫グロブリン重鎖融合をコードするＤＮＡ、及び望むのであれば免疫グロブリン軽鎖を、別々の発現ベクターに挿入し、適当な宿主生物に同時形質移入する。二重特異性抗体を作成するための更なる詳細については、例えばSuresh等, Methods in Enzymology, 121:210(1986)を参照されたい。
【００６８】
５．ヘテロ抱合体抗体
ヘテロ抱合抗体もまた本発明の範囲に入る。ヘテロ抱合抗体は、２つの共有結合した抗体からなる。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に対してターゲティングさせるため［米国特許第4,676,980号］及びＨＩＶ感染の治療のために［WO 91/00360; WO 92/200373; EP 03089］提案されている。この抗体は、架橋剤に関連したものを含む合成タンパク化学における既知の方法を使用して、インビトロで調製することができると考えられる。例えば、ジスルフィド交換反応を使用するか又はチオエーテル結合を形成することにより、免疫毒素を作成することができる。この目的に対して好適な試薬の例には、イミノチオレート及びメチル-４-メルカプトブチリミデート、及び例えば米国特許第4,6767,980号に開示されているものが含まれる。
【００６９】
Ｇ．抗ｈＳｕ（ｆｕ）抗体の用途
本発明の抗ｈＳｕ（ｆｕ）抗体は様々な有用性を有している。例えば、抗ｈＳｕ（ｆｕ）抗体は、ｈＳｕ（ｆｕ）の診断アッセイ、例えばその特定細胞、組織、又は血清での発現の検出に用いられる。競合的結合アッセイ、直接又は間接サンドウィッチアッセイ及び不均一又は均一相で行われる免疫沈降アッセイ［Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc. (1987) pp. 147-158］等のこの分野で知られた種々の診断アッセイ技術が使用される。診断アッセイで用いられる抗体は、検出可能な部分で標識される。検出可能な部分は、直接的にか又は間接的に検出可能なシグナルを発生することができなければならない。例えば、検出可能な部分は、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ又は１２５Ｉ等の放射性同位体、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン又はルシフェリン等の蛍光又は化学発光化合物、あるいはアルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ又はセイヨウワサビペルオキシダーゼ等の酵素であってよい。Hunter等 Nature, 144:945 (1962)；David等, Biochemistry, 13: 1014 (1974)；Pain等, J. Immunol. Meth., 40:219 (1981) ;及びNygren, J. Histochem. and Cytochem., 30:407 (1982)に記載された方法を含む、抗体を検出可能な部位に抱合するためにこの分野で知られた任意の方法が用いられる。
より好ましくは、異常なｈＳｕ（ｆｕ）タンパク質の有無のための腫瘍細胞の分析はイムノアッセイによって実施することができる。Ｈｈ関連腫瘍を疑われる患者から試料を採取する。ここで使用される試料としては、生物学的体液、例えば血液、脳脊髄液、涙、唾液、リンパ液、透析液等々；器官又は組織培養由来の流体；及び生理組織から抽出した流体が含まれる。該用語にまた含まれるのは、このような流体の誘導体及びフラクションである。皮膚損傷、器官組織断片等々の生検試料が特に興味深い。転移が疑わしい場合には、血液試料が好適となりうる。試料中の細胞の数は一般に少なくとも１０３、通常は少なくとも１０４、より通常は少なくとも１０５である。細胞は、固形組織の場合には分離でき、あるいは組織切片を分析してもよい。あるいは細胞の溶解物を調製することができる。
【００７０】
診断は多くの方法によって実施することができる。異なる方法は全て発癌性突然変異を有することが疑われる患者の細胞における異常なｈＳｕ（ｆｕ）の有無を決定する。ここで検討した本発明の組成物と方法を用いることができる。例えば、一般的な方法に従って実施される無傷の細胞又は組織切片の染色を利用することができる。対象の抗体を細胞試料に加え、エピトープへの結合を可能にするのに十分な時間、通常は少なくとも約１０分の間、インキュベートする。抗体は放射性同位元素、酵素、蛍光剤、化学発光剤、又は他の直接検出用の標識で標識することができる。あるいは、第二段階の抗体又は試薬を用いてシグナルを増幅させる。このような試薬は当該分野においてよく知られている。例えば、一次抗体は第２段階の試薬として添加される西洋わさびペルオキシダーゼコンジュゲートアビジンを用いて、ビオチンにコンジュゲートさせることができる。最終の検出はペルオキシダーゼの存在下で色彩変化を受ける基質を検出する。抗体結合の有無は、解離細胞のフローサイトメトリー、顕微鏡検査、放射線写真撮影、シンチレーション計数等々を含む様々な方法により決定することができる。
診断の更に他の代替方法は、腫瘍細胞が活性なｈＳｕ（ｆｕ）タンパク質を分泌（又は細胞死のときに放出）しうる細胞溶解物、上清又は他の流体中における抗体とｈＳｕ（ｆｕ）の間の結合のインビトロでの検出に依存する。試料又はそのフラクション中のｈＳｕ（ｆｕ）結合濃度の測定は、ここで検討した様々な特定のアッセイによって達成できる。一般的なサンドイッチ型のアッセイを使用することができる。例えば、サンドイッチアッセイは、最初にｈＳｕ（ｆｕ）特異的抗体を不溶性表面又は支持体に付着させうる。結合の特定の形式は、それが本発明の試薬と全体的な方法と適合性がある限り、重要ではない。それらはプレートに共有的に又は非共有的に、好ましくは非共有的に結合されうる。不溶性支持体はポリペプチドが結合しうる任意の組成物であり得、それは可溶性物質から容易に分離され、方法全体と適合性等がある。そのような支持体の表面は中実か多孔性であり得、任意の一般的な形状であり得る。レセプターが結合させられる好適な不溶性支持体の例としては、ビーズ、例えば磁性ビーズ、膜及びマイクロタイタープレートが含まれる。これらは典型的にはガラス、プラスチック（例えばポリスチレン）、多糖類、ナイロン又はニトロセルロースである。マイクロタイタープレートは、少量の試薬と試料を使用して、非常に多数のアッセイを同時に行うことができるので、特に好都合である。
抗ｈＳｕ（ｆｕ）抗体はまた組換え細胞培養もしくは天然源からのｈＳｕ（ｆｕ）のアフィニティー精製に対して有用である。この方法では、ｈＳｕ（ｆｕ）に対する抗体を、当該分野に置いてよく知られた方法を用いてセファデックス樹脂又は濾過紙のような適当な支持体上に固定化する。ついで、固定化した抗体を、精製されるｈＳｕ（ｆｕ）を含む試料に接触させ、ついで支持体を、固定化抗体に結合するｈＳｕ（ｆｕ）を除く試料中の実質的に全ての物質を取り除く適当な溶媒で洗浄する。最後に、抗体からｈＳｕ（ｆｕ）を切り離す他の好適な溶媒で支持体を洗浄する。
【００７１】
Ｈ．ｈＳｕ（ｆｕ）アンタゴニスト及びアゴニスト
最近、ヒトのヘッジホッグシグナル伝達経路における興味は、発育異常と度重なる皮膚癌により特徴づけられた希な常染色体優性疾患である基底細胞母斑症候群を持つ患者における遺伝した継ぎ接ぎ(patched)遺伝子突然変異の発見によって掻き立てられた。patched遺伝子の体細胞性に獲得した変異が、基底細胞癌、一次性乳癌、髄芽細胞腫及び髄膜種を含む散発性癌において特定されている。継ぎ接ぎは腫瘍サプレッサーとして作用し、これらの突然変異が継ぎ接ぎ遺伝子産物における機能の喪失を引き起こしていると現在は考えられている。従って、ヘッジホッグ／patchedシグナル伝達経路は腫瘍形成の因子でありうる。増加した細胞成長と腫瘍形成に至る遺伝子改変の検出は臨床医学にとって非常に興味深い。改変した細胞成長に至る特定の変化を特定することは関連した腫瘍の改良された診断と可能な治療法への扉を開ける可能性がある。
本発明のｈＳｕ（ｆｕ）アンタゴニスト及びアゴニスト化合物を生成するのに幾つかの方法を好適に用いることができる。アンタゴニスト分子が細胞内部に標的化でき、変異体ｈＳｕ（ｆｕ）（例えば、腫瘍形成に本質的な、腫瘍抑制機能を喪失した変異体）を作用から阻害又は防止する任意の方法が好適である。例えば、ドミナント変異体等の変異体ｈＳｕ（ｆｕ）を含む競合的阻害剤は、欠陥性又は構成的ｈＳｕ（ｆｕ）を補足してＧｌｉネガティブ調節の正常なｈＳｕ（ｆｕ）機能を回復させ、もってＨｈシグナル伝達を阻止する。膜貫通輸送に適したサイズ、電荷及び疎水性等の、かかるアンタゴニスト又はアゴニスト分子の更なる特性は、当業者によって容易に決定される。
ｈＳｕ（ｆｕ）の模倣物又は他の相同体が同定され評価される場合、細胞を試験化合物に暴露し、ヒトｈＳｕ（ｆｕ）のみに暴露したポジティブ対照、化合物にも天然リガンドにも暴露していないネガティブ対照と比較する。ｈＳｕ（ｆｕ）シグナル変調のアンタゴニスト又はアゴニストを同定死評価する場合は、細胞を天然リガンドの存在下で本発明の化合物に暴露し、試験化合物に暴露していない対照と比較する。
本発明のスクリーニングアッセイは、化学的ライブラリの高スループットスクリーニングに適用でき、特に、小分子薬剤候補の同定に適している。
【００７２】
１.  アンタゴニスト及びアゴニスト分子
正常なｈＳｕ（ｆｕ）タンパク質のアンタゴニストは、不十分なＨｈシグナル伝達経路活性に特徴付けられる状態、又はＨｈシグナル伝達の増加が望ましい場合に治療的に投与することができる。ヘッジホッグ生物活性には、胎児の頭、肢、肺、中枢神経系又は中胚葉パターン形成を含む、様々な組織の生成と分化を誘発もしくは変調等する能力が含まれる。増殖はまた多数の組織のＨｈによって変調される。このような変調はインビトロ、エキソビボ又はインビボの状態で達成することができる。例えば、創傷治癒、骨形成、低増殖性又は過剰増殖性皮膚疾患の治療、分化の誘発は対象のアンタゴニストの投与に影響を受ける。
Ｈｈは運動神経誘発活性、神経分化誘発活性又は神経生存促進活性のような神経形成を調節することができる。Ｈｈはまた軟骨細胞誘発能力又は精子形成における関与を含む、幹細胞又は胚細胞分化の誘発及び器官形成を調節する。関節炎、例えば骨関節炎、関節リウマチ等々の治療は、ｈＳｕ（ｆｕ）アンタゴニストの投与と、続く軟骨細胞及び軟骨形成の誘発により恩恵を受けうる。Ｈｈは毛鞘中の細胞の成長を変調することにより毛髪の成長を調節することができ、この目的のためにｈＳｕ（ｆｕ）アンタゴニストを投与することができる。
ＨＨの投与は、ＴＧＦβファミリーのメンバー、骨形成タンパク質、及び線維芽細胞成長因子ファミリーのような二次シグナル伝達分子の発現を誘発するので、ｈＳｕ（ｆｕ）のアンタゴニストが同じことをしうる。
多くの神経性疾患がニューロン要素の離散集合の変性に関連しており、アンタゴニストによって治療されうる。特定の疾患には、外傷、卒中から生じる虚血症から生じる損傷、神経系の感染症及び／又は炎症から生じる損傷、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、筋萎縮性側索硬化症、脊髄小脳失調、及び中枢神経系の慢性免疫疾患、例えば多発性硬化症が含まれる。アンタゴニストはまた末梢神経系の自律神経障害、例えば心臓の横紋筋を神経支配する神経の変性状態から生じる心房心不整脈又は頻脈を治療するのにも有用である。
【００７３】
また興味があるのはインビトロ及びエキソビボでの用途であり、そこでは、特定の細胞培養物、例えば神経前駆細胞に加えられるＨｈはニューロンとグリアに末期的に分化しうることが予想されもしくは知られている。Ｈｈは当該分野で知られているように、適切な培地と組み合わされて、培養中のそのような細胞の再生産を維持する。ｈＳｕ（ｆｕ）のアンタゴニストを同様に使用することができる。
本発明の化合物の投与に対してはここで検討されたように様々な方法を使用することができる。
薬物スクリーニングは、異常な細胞におけるｈＳｕ（ｆｕ）機能の代替品を提供する薬剤を同定する。腫瘍サプレッサーとしてのｈＳｕ（ｆｕ）の役割は、その機能にアゴニズする（又は腫瘍抑制活性を失った突然変異ｈＳｕ（ｆｕ）型の機能をアンタゴナイズする）薬剤が腫瘍形成プロセスを阻害することを示す。逆に、正常なｈＳｕ（ｆｕ）機能をアンタゴナイズする薬剤は調節された成長と治癒を刺激することができる。特に興味深いものは、ヒト細胞に対して低毒性の薬剤に対するスクリーニングアッセイである。標識インビトロタンパク質間結合アッセイ、電気泳動度シフトアッセイ、タンパク質結合、酵母ハイブリッド系等のイムノアッセイを含む広範なアッセイをこの目的に対して使用することができる。ここで使用される「薬剤」という用語は所望の生理的機能を変化もしくは模倣する能力を持つ任意の分子、例えばタンパク質又は医薬を記述する。一般に、複数のアッセイ混合物を異なった薬剤濃度で平行して流して、様々な濃度に対する差次的な応答を得る。典型的には、これらの濃度の一つが負の対照、つまりゼロ濃度又は検出レベル以下である。
【００７４】
候補薬剤は無数の化学クラスを包含するが、典型的には有機分子、好ましくは５０を越え約２５００ダルトン未満の分子量を有する小有機分子である。候補薬剤はタンパク質との構造的な相互作用、特に水素結合に必要な官能基を含み、典型的には少なくともアミン、カルボニル、ヒドロキシルもしくはカルボキシル基、好ましくは少なくとも２つの官能化学基を含む。候補薬剤はしばしば環状炭素又は複素環構造及び／又は芳香族又は多芳香族構造で、一又は複数の上記官能基で置換されているものを含む。候補薬剤はまたペプチド、糖、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、それらの誘導体、構造類似体又は組み合わせを含む生体分子から見出される。
候補薬剤は、合成又は天然の化合物のライブラリを含む広範な供給源から得ることができる。例えば、無作為化オリゴヌクレオチド及びオリゴペプチドの発現を含む無数の手段が、広範な有機化合物及び生体分子の無作為及び定方向合成のために利用できる。あるいは、細菌、真菌、植物及び動物抽出物の形態の天然化合物のライブラリが利用できもしくは直ぐに作り出せる。また、天然又は合成的に作られたライブラリと化合物は通常の化学的、物理的及び生化学的手段によって容易に変更され、コンビナトリアルライブラリを作るのに使用することができる。既知の薬物に、定方向もしくは無作為化学修飾、例えばアシル化、アルキル化、エステル化、アミド化等々を施して構造類似体を作ってもよい。
【００７５】
スクリーニングアッセイが結合アッセイである場合、一又は複数の分子を標識に結合させることができ、標識が検出可能なシグナルを直接的に又は間接的に提供しうる。様々な標識には放射性元素、蛍光剤、化学発光剤、酵素、特異的結合分子、粒子、例えば磁性粒子等々が含まれる。特異的結合分子には、対、例えばビオチンとストレプトアビジン、ジゴキシンと抗ジゴキシン等々が含まれる。特異的結合メンバーに対して、相補的メンバーは、通常は、既知の手順に従って、検出をもたらす分子で標識される。
様々な他の試薬がスクリーニングアッセイにおいて含まれうる。これらには、最適なタンパク質間結合塩類を容易にし、及び／又は非特異的又はバックグラウンド相互作用を低減するために使用される中性タンパク質、例えばアルブミン、洗浄剤等々のような試薬が含まれる。プロテアーゼインヒビター、ヌクレアーゼインヒビター、抗菌剤等々のようなアッセイの効率を改善する試薬を使用してもよい。成分の混合物は、必要な結合をもたらす任意の順序で添加される。インキュベーションは、任意の好適な温度、典型的には４℃と４０℃の間で実施される。インキュベーション時間は最適な活性が得られるように選択されるが、また高速の高性能スクリーニングを容易にするために最適化することもで、典型的には０．１時間と１時間の間とするのが十分であろう。
所望の薬理活性を有する化合物は、Ｈｈ経路機能又はｈＳｕ（ｆｕ）の不足に帰する癌又は発達異常の治療のために宿主に生理的に許容可能な担体にて投与されうる。
ｈＳｕ（ｆｕ）は、転写活性化因子Ｇｌｉの負の調節に関与しているＨｈのずっと下流のモジュレータであるので、本発明の候補分子は非常に多くの状況、例えば上流の経路分子に欠陥があり腫瘍形成に至るか、又は不十分な成長及び治癒に至るときに、有用であるという利点を有する。本発明の化合物はＨｈ経路の重要な転写工程に影響を及ぼすことによってこれらの妨害と欠陥を克服することができる。従って、本発明の化合物は、創傷治癒、加齢、腫瘍形成等々におけるヘッジホッグ経路機能を亢進（又はＨｈ経路の上流の欠陥を解消する）ために使用することができる。ここで検討したように、薬剤は、様々な形で、経口的に、局所的に、非経口的に、例えば皮下的に、腹腔内に、ウィルス感染により、血管内等々に投与することができる。
【００７６】
ｈＳｕ（ｆｕ）シグナル伝達のアンタゴニスト及び／又はアゴニストをスクリーニングするために、アッセイ混合物を、候補となる製薬剤の存在下であるが、ｈＳｕ（ｆｕ）が参照活性でヘッジホッグシグナル伝達を誘発する条件下でインキュベートする。混合物成分は、必要なヘッジホッグ活性を与えるために任意の順序で添加できる。インキュベーションは、最適な結合を促進する任意の温度、典型的には４℃から４０℃、より通常は１５℃から４０℃で実施する。インキュベーション時間も同様に最適結合のために選択されるが、迅速で高スループットのスクリーニングを促進するために最小化され、典型的には約０．１から１０時間、好ましくは５時間未満、より好ましくは２時間未満である。インキュベーションの後、候補製薬剤のｈＳｕ（ｆｕ）シグナル伝達に対する効果を任意の便利な方法で決定する。無細胞結合型アッセイでは、結合及び非結合成分を分離するための分離工程がしばしば用いられる。分離は、例えば、沈殿（例えばＴＣＡ沈殿、免疫沈降など）、固定化（例えば、固体基体上）によってなされ、ついで洗浄される。結合したタンパク質は、それに結合した検出可能な標識により、例えば放射活性放出、光学又は電子密度を測定することにより、あるいは、例えば抗体抱合を用いて間接的な検出により検出される。
例えば、ｈＳｕ（ｆｕ）アンタゴニスト及び／又はアゴニストに適したスクリーニング方法は、ｈＳｕ（ｆｕ）発現組織における候補アンタゴニスト及び／又はアゴニストの存在下又は不存在下でのインサイツハイブリッド形成の比較、並びにｈＳｕ（ｆｕ）変調細胞成長の不存在の確認を含む。このようなｈＳｕ（ｆｕ）結合リガンドを同定するために、ｈＳｕ（ｆｕ）を細胞表面で発現させ、合成候補化合物又は（例えば、血清又は細胞などの内因性供給源からの）天然に生じる化合物のライブラリのスクリーニングに用いることができる。
【００７７】
ｈＳｕ（ｆｕ）のタンパク質−タンパク質相互作用に影響する好適な分子及びその結合タンパク質は、後者の断片又は相互作用及び正しい複合体形成を阻害する小分子、例えばペプチド模倣物を含む。そのような小分子は、通常１０Ｋ分子量未満であり、細胞に等価しやすいので治療薬として好適であり、種々の細胞機構による分解を受けにくく、タンパク質のように免疫を生じやすくない。小分子は、これらに限られないが、合成有機又は無機化合物を含む。多くの製薬会社が、そのような分子のライブラリを有しており、それは本発明のアッセイを用いて便利にスクリーニングできる。非限定的な例は、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、グリコペプチド、糖脂質、多糖類、オリゴ糖、核酸、生物有機分子、ペプチド模倣物、薬理学的試薬、及びそれらの代謝物、転写及び翻訳制御配列等を含む。
ｈＳｕ（ｆｕ）に結合する分子の同定に好ましい技術は、アッセイ用プレートのウェルなどの固相に結合したキメラ基質（例えば、エピトープタグｈＳｕ（ｆｕ）又はｈＳｕ（ｆｕ）イムノアドヘシン）を利用する。場合によっては標識された（例えば放射性標識された）候補分子の、固定化レセプターへの結合が測定できる。あるいは、Ｇｌｉの活性化についての競合が測定できる。アンタゴニスト及び／又はアゴニストのスクリーニングにおいて、ｈＳｕ（ｆｕ）はｈＳｕ（ｆｕ）基質に暴露され、ついで推定アンタゴニスト及び／又はアゴニスト、又はｈＳｕ（ｆｕ）結合タンパク質及びアンタゴニスト及び／又はアゴニストが同時に添加され、アンタゴニスト及び／又はアゴニストのｈＳｕ（ｆｕ）活性化を阻止する能力が評価される。
【００７８】
２. 検出アッセイ
ｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチドは、ｈＳｕ（ｆｕ）ヘッジホッグシグナル伝達を変調させる治療的活性薬のためのリード化合物を同定するアッセイにおいて有用である。特に、腫瘍成長を生じる欠陥性ｈＳｕ（ｆｕ）の場合には、ｈＳｕ（ｆｕ）シグナル伝達複合体の生成を防止するか又はｈＳｕ（ｆｕ）変調ヘッジホッグシグナル伝達を防止又は減弱し（例えば、ｈＳｕ（ｆｕ）自身又は基質に結合し）−よってＧｌｉ活性をダウンレギュレーションする−リード化合物が簡便に同定できる。特に、候補化合物を、Ｇｌｉへの結合とＧｌｉのダウンレギュレーションに対する活性でスクリーニングすることができる。このような候補分子はＧｌｉとの結合について正常なｈＳｕ（ｆｕ）と競合すべきで、Ｇｌｉ結合に対するｈＳｕ（ｆｕ）の破壊を測定するアッセイで容易に同定することができる。この分野で知られた種々の方法が、本発明のｈＳｕ（ｆｕ）タンパク質の活性阻害の同定、評価又は検定に使用できる。
【００７９】
（ａ）生化学的検出技術
生化学的分析技術は種々の技術によって評価できる。本発明で使用できる一つの典型的なアッセイ混合物は、ｈＳｕ（ｆｕ）及び通常はｈＳｕ（ｆｕ）に付随するタンパク質（例えばＧｌｉ）を、通常は単離された、部分的に純粋又は純粋な形態で含有する。これらの成分の一方又は両方は、例えばアッセイ条件下でタンパク質−タンパク質結合を提供又は促進し、安定性を向上させる他のペプチド又はポリペプチドに融合してよい。さらに、成分の一方は、通常検出可能な標識を含むかそれに結合している。標識は、放射活性、蛍光、光学又は電子密度等の測定による直接検出、あるいはエピトープタグ、酵素等の間接的検出を提供する。アッセイ混合物は候補製薬剤をさらに含み、場合によっては、結合を促進し、安定性を向上させ、非特異的又はバックグラウンド相互作用を減少させ、又はアッセイの効率又は感度を向上させる種々の他の成分、例えば塩、バッファー、担体タンパク質、例えばアルブミン、洗浄剤、プロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、抗微生物剤等を含む。
以下の検出方法は、シグナル伝達基質分子及びｈＳｕ（ｆｕ）を含む細胞溶解物が本発明の化合物と混合された無細胞系で使用できる。結果は、化合物を添加しない反応混合物で得られた結果と比較する。無細胞系は、天然リガンド又はその同定の知識を必要としない。無細胞系は、化合物を添加しない混合物を必要としない。無細胞系は、天然リガンド又はその同定の知識を必要としない。
【００８０】
（ｂ）生物学的検出技術
本発明のアンタゴニスト／アゴニスト化合物の、それ自身がヘッジホッグシグナル伝達を変調するｈＳｕ（ｆｕ）の活性を変調させる能力は、リガンド結合に伴う形態又は機能変化についての評点化によって測定することができる。当該分野で知られている任意の定性的又は定量的技術を、ｈＳｕ（ｆｕ）の制御下で起こる細胞プロセスを観察し測定するために利用できる。また、本発明の化合物の活性は、ヘッジホッグシグナル伝達の機能不全によって生ずるか又はそれに関連する疾患の実験的モデルを用いて動物で評価することもできる。例えば、マウスにおける効果のないＤＨｈヘッジホッグシグナル伝達は、生存できるが繁殖できないマウスを導く。また、変異体ｈｆｕｓｅｄ-ＤＮの効果も、ＩＨｈ発現によって調節される腸の発達に影響する。さらに、正しいＳＨｈシグナル伝達は、脊索及び底板、神経管、末端肢構造、脊柱及び肋骨におけるマウス胚成長に重要である。また、不正なＳＨｈシグナル伝達は単眼症に相関している。これらのフェノタイプ特性の何れも、ｈＳｕ（ｆｕ）アンタゴニスト及び／又はアゴニストについてのスクリーニングアッセイにおいて評価され定量化される。ヘッジホッグの過剰発現に伴う疾患状態は、基底細胞癌に関連するが、不活性なソニックヘッジホッグシグナル伝達は、異常な神経発達に至る。
本発明の基礎は、ｈＳｕ（ｆｕ）タンパク質が生理的条件下でＧｌｉ及び／又はＳｌｉｍｂタンパク質と複合体を形成するという驚くべき知見である。この知見は、ｈＳｕ（ｆｕ）タンパク質がＧｌｉ及び／又はＳｌｉｍｂ機能のモジュレーターとなり、Ｈｈシグナル経路を変調することを示している。従って、Ｇｌｉ及び／又はＳｌｉｍｂへのｈＳｕ（ｆｕ）の結合を阻害又は増強する薬剤の能力を検出するアッセイは、ｈＳｕ（ｆｕ）又はＧｌｉ及び／又はＳｌｉｍｂアンタゴニスト又はアゴニストを同定するための薬剤バンク（例えば、化合物ライブラリ、ペプチドライブラリ等々）の容易な高性能スクリーニング法を提供する。このようなｈＳｕ（ｆｕ）又はＧｌｉ及び／又はＳｌｉｍｂアンタゴニスト及びアゴニストはｈＳｕ（ｆｕ）及び／又はＳｌｉｍｂ活性を変調することができ、よってアポトーシスを変調できる。
【００８１】
ｈＳｕ（ｆｕ）／Ｇｌｉ及び／又はＳｌｉｍｂ複合体形成又はｈＳｕ（ｆｕ）／Ｇｌｉ及び／又はＳｌｉｍｂ複合体形成を特異的に阻害可能な有効量の薬剤の患者への投与は、ｈＳｕ（ｆｕ）及び／又はＧｌｉ及び／又はＳｌｉｍｂ活性を変調することにより効果的に治療される病理状態（例えば、癌、炎症、リンパ増殖性疾患、自己免疫疾患、神経変性疾患等々）を治療するための治療もしくは予防方法として使用することができる。
結合アッセイは一般に二つの形態のうち一つを取る：固定化ｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチド（類）が標識Ｇｌｉ及び／又はＳｌｉｍｂポリペプチド（類）を結合するために使用されうるか、逆に、固定化されたＧｌｉ及び／又はＳｌｉｍｂポリペプチド（類）が標識ｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチド類を結合するために使用されうる。あるいは、ｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチドが結合してｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチドとホモ二量体を形成することを検出するために結合アッセイを実施することができる；典型的には、標識ｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチドを水性結合条件下で固定化ｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチドと接触させ、結合の度合いを固定化標識ｈＳｕ（ｆｕ）の量を測定することによって決定する。それぞれの場合、標識ポリペプチドを、ポリペプチドが特異的に結合して、添加される薬剤がない状態でｈＳｕ（ｆｕ）のＧｌｉ及び／又はＳｌｉｍｂとの複合体の形成が可能になる条件下で固定化ポリペプチドに接触させる。特定の水性条件は一般的な方法に従って実務家によって選択されうる。一般的な目安としては、次の緩衝水性条件を使用することができる：１０−２５０ｍＭのＮａＣｌ、５−５０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ５−８で、二価カチオン及び／又は金属キレート剤及び／又は非イオン性洗浄剤及び／又は膜フラクションが任意に添加される。付加、欠失、修飾（例えばｐＨ）及び置換（例えばＮａＣｌにＫＣｌを置換又は緩衝液の置換）をこれらの基本的条件に加えることができることは当業者により理解されるであろう。ｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチド（類）のＧｌｉ及び／又はＳｌｉｍｂポリペプチドに対する特異的結合がコントロール反応において生じる限り、基礎的結合反応条件に修飾を行うことができる。ある実施態様では、アッセイがｈＳｕ（ｆｕ）／ｈＳｕ（ｆｕ）ホモ二量体の形成を検出する場合、ｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチドのｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチドに対する特異的結合がコントロール反応において生じる限り、基礎的結合反応条件に修飾を行うことができる。コントロール反応（薬剤を含まず）において特異的結合を生じない条件は結合アッセイでの使用には適していない。予め決められたポリペプチド配列に結合するポリペプチド配列を同定するアプローチは、その予め決められたポリペプチド配列が融合タンパク質に存在しているいわゆる「ツーハイブリッド(two-hybrid)」系を使用することである（Chien等, (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 88:9578）。このアプローチは転写活性化因子、酵母Ｇａ１４転写タンパク質の再構成を通して（Fields S及びSong O (1989) Nature 340:245）インビボでのタンパク質間相互作用を同定する。典型的には、該方法は、ＤＮＡ-結合と転写活性化の役割を担う分離可能なドメインからなる酵母Ｇａｌ４転写タンパク質の特性に基づく。一つが既知のタンパク質のポリペプチド配列に融合した酵母Ｇａｌ４ ＤＮＡ-結合ドメインからなり、他方が第二のタンパク質のポリペプチド配列に融合したＧａｌ４活性化ドメインからなる二つのハイブリッドタンパク質をコードするポリヌクレオチドを作成し、酵母宿主細胞中に導入する。二つの融合タンパク質間の分子間結合が、Ｇａｌ４活性化ドメインを持つＧａｌ４ ＤＮＡ-結合ドメインを再構成し、これがＧａｌ４結合部位に作用可能��結合したレポーター遺伝子（例えば、ｌａｃＺ、ＨＩＳ３）の転写活性化に至る。典型的には、ツーハイブリッド法は、既知のタンパク質と相互作用をする新規なポリペプチド配列を同定するために使用される（Silver S C及びHunt S W (1993) Mol. Biol. Rep. 17:155；Durfee等 (1993) Genes Devel. 7;555；Yang等 (1992) Science 257:680；Luban等 (1993) Cell 73: 1067；Hardy等 (1992) Genes Devel. 6; 801；Bartel等 (1993) Biotechnipues 14:920；及びVojtek等(1993) Cell 74:205）。しかし、ツーハイブリッド法の変形法は第二の既知のタンパク質への結合に影響を及ぼす既知のタンパク質の突然変異を同定するために使用されている（Li B及びFields S(1993) FASEB J. 7:957；Lalo等 (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 90: 5524；Jackson等 (1993) Mol. Cell. Biol. 13; 2899；及びMadura等(1993) J. Biol. Chem. 268: 12046）。ツーハイブリッド法はまた二つの既知のタンパク質の相互作用している構造ドメイン（Bardwell等 (1993) med. Microbiol. 8: 1177；Chakraborty等 (1992) J. Biol. Chem. 267: 17498；Staudinger等 (1993) J. Biol. Chem. 268: 4608；及びMilne GT及びWeaver DT (1993) Genes Devel. 7; 1755）又は単一のタンパク質のオリゴマー形成の役割を担うドメイン（Iwabuchi等 (1993) Oncogene 8; 1693；Bogerd等 (1993) J. Virol. 67: 5030）を同定するために使用されている。ツーハイブリッド系の変形系はタンパク質分解酵素のインビボ活性を研究するために使用されている（Dasmahapatra等(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 89: 4159）。あるいは、大腸菌／ＢＣＣＰ相互作用的スクリーニング系（Germino等 (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A) 90: 933；Guarente L (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A) 90: 1639）を用いて相互作用するタンパク質配列（すなわち、ヘテロ二量体化するか又はより高次のヘテロ多量体を形成するタンパク質配列）を同定することができる。
【００８２】
これらのツーハイブリッド法の各々は二つのＧａｌ４融合タンパク質間のポジティブな会合に依存し、もって機能性Ｇａｌ４転写活性化因子を再構成し、これがついでＧａｌ４結合部位に作用可能に結合したレポーター遺伝子の転写を誘発する。レポーター遺伝子の転写は、（１）熱量酵素アッセイにより同定できる酵素活性（例えば、β-ガラクトシダーゼ）としてか、（２）決まった媒質上の向上した細胞成長（例えば、ＨＩＳ３）として典型的には現れるポジティブな読み出しをつくる。ポジティブな読み出し条件は一般には次の検出可能な条件の一又は複数として特定される：（１）予め決められたレポーター遺伝子の転写速度の増加、（２）典型的には、インビボで容易にアッセイできる酵素のような、予め決められたレポーター遺伝子によりコードされるポリペプチド産物の濃度の増加又は豊富さ、及び／又は（３）逆ツーハイブリッド系を有する生物（例えば酵母）における選択可能な又は他の同定可能なフェノタイプの変化。一般には、ポジティブな読み出し条件を特徴づける選択可能な又は他の同定可能なフェノタイプの変化が生物体に、決まった媒質への選択性成長効果、接合フェノタイプ、特徴ある形態又は発達段階、薬物耐性、又は検出可能な酵素活性（例えば、β-ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ等々）を付与する。転写活性化因子は特異的遺伝子の発現をポジティブに調節するタンパク質である。それらは、特異的ＤＮＡ配列に結合して特異性を付与する一つの領域と、基本遺伝子発現機構のタンパク質成分に結合する活性化ドメインと称される他の領域の二つの構造ドメインに機能的に分割できる（Ma及びPtashne (1988) Cell 55:443）。これらの二つのドメインは転写活性化因子として機能するためには物理的に連結される必要がある。ツーハイブリッド系は、単離されたＤＮＡ結合ドメインを一タンパク質（タンパク質Ｘ）につなぎながら、単離された活性化ドメインを他のタンパク質（タンパク質Ｙ）につなぐことにより、この知見を利用する。ＸとＹが有意な程度に相互作用するとき、ＤＮＡ結合及び活性化ドメインが今度は連結され転写活性化因子の機能が再構成される（Fields及びSong (1989) Nature 340: 245）。酵母宿主株は、再構成された転写活性化因子がＨＩＳ３又はｌａｃＺのような特定のレポーター遺伝子を発現させるように操作され、これがタンパク質間の相互作用の読み出しをもたらす（上掲のField及びSong (1989)；上掲のChien等
(1991)）。タンパク質間相互作用を監視するためのツーハイブリッド系の一つの利点は物理的に弱いが生理的に重要なタンパク質間相互作用の検出の感度である。しかして、これは、タンパク質間相互作用を検出するための他の方法に対して顕著な利点を提供する。
【００８３】
本発明は、典型的には第一のハイブリッドタンパク質、第二のハイブリッドタンパク質、及びレポーター遺伝子をコードするポリヌクレオチドの形態のｈＳｕ（ｆｕ）関連タンパク質ツーハイブリッド系を有する宿主生物体（典型的には単細胞生物）をまた提供し、ここで、上記ポリヌクレオチドは一過性発現のために導入されるか安定に複製される。ある実施態様では、宿主生物は酵母細胞（例えば、サッカロミセス・セレビシエ）であり、そこでは、レポーター遺伝子転写調節配列がＧａｌ４応答性プロモーターを含む。（１）ｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチドに結合可能なＧｌｉ及び／又はＳｌｉｍｂの結合断片に融合したＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメイン（又はＧＡＬ４活性化ドメイン）をコードする発現カセット、（２）Ｇｌｉ及び／又はＳｌｉｍｂポリペプチドに結合可能なｈＳｕ（ｆｕ）の結合断片に融合したＧＡＬ４ ＤＮＡ活性化ドメイン（又はそれぞれＧＡＬ４結合ドメイン）をコードする発現カセット、及び（３）シス結合ＧＡＬ４転写応答要素を含むレポーター遺伝子（β-ガラクトシダーゼ）を含む酵母を薬剤スクリーニングに使用することができる。このような酵母は試験薬剤と共にインキュベートされ、レポーター遺伝子（例えば、β-ガラクトシダーゼ）の発現が決定される；対照培養物と比較してレポーター遺伝子の発現を阻害する薬剤の能力は、候補Ｇｌｉ調節薬剤又はｈＳｕ（ｆｕ）調節薬剤として薬剤を同定する。酵母ツーハイブリッド系を用いて哺乳動物（典型的にはヒト）ｃＤＮＡ発現ライブラリをスクリーニングすることができ、そこでは、ｃＤＮＡがＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメイン又は活性化ドメインに融合し、ｈＳｕ（ｆｕ）又はＧｌｉ及び／又はＳｌｉｍｂポリペプチド配列の何れかはＧＡＬ４活性化ドメイン又はＤＮＡ結合ドメインにそれぞれ融合される。このような酵母ツーハイブリッド系はｈＳｕ（ｆｕ）又はＧｌｉ及び／又はＳｌｉｍｂ配列に結合するタンパク質をコードするｃＤＮＡをスクリーニングすることができる。例えば、ＤＮＡライブラリを、ヒト成熟Ｂ細胞（Namalwa）系統（Ambrus等, (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A)）又は他の適切な細胞型からのｍＲＮＡからつくり出すことができる。酵母ツーハイブリッド発現系（Chien等, (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A)88:9578）においてクローニングされたこのようなｃＤＮＡライブラリを、ｈＳｕ（ｆｕ）又はＧｌｉ及び／又はＳｌｉｍｂと相互作用するタンパク質をコードし、それによってＧＡＬ４-依存性レポーター遺伝子の発現を生じるｃＤＮＡｓを同定するために使用することができる。ｈＳｕ（ｆｕ）又はＧｌｉ及び／又はＳｌｉｍｂと相互作用するポリペプチドは、また、抗体と共にｈＳｕ（ｆｕ）又はＧｌｉ及び／又はＳｌｉｍｂの免疫沈降と共沈種の同定によって同定することができる。更に、ｈＳｕ（ｆｕ）又はＧｌｉ及び／又はＳｌｉｍｂと結合するポリペプチドを、ｈＳｕ（ｆｕ）又はＧｌｉ及び／又はＳｌｉｍｂポリペプチドでペプチドライブラリ（例えば、バクテリオファージペプチドディスプレイライブラリ、空間的に定まったＶＬＳＩＰＳペプチドアレイ等々）をスクリーニングすることによって同定することができる。
【００８４】
本発明は（１）第一のｈＳｕ（ｆｕ）関連ポリペプチドと転写活性化因子活性化ドメインを含む第一のハイブリッドタンパク質、（２）第二のｈＳｕ（ｆｕ）関連ポリペプチドと転写活性化因子ＤＮＡ-結合ドメインを含む第二のハイブリッドタンパク質を有するツーハイブリッド系、宿主細胞、及び指示マニュアルを含んでなるキットをまた提供する。このようなキットは第一及び第二ハイブリッドタンパク質間の分子間結合を変える能力を試験する薬剤パネルを任意に含んでもよい。
これらの細胞培養アッセイ及び動物実験で得られたデータは、ヒトで使用するための用量範囲の処方に用いられる。本発明の化合物の用量は、毒性を殆ど又は全く持たない循環濃度の範囲内になければならない。用量は、用いる投与形態と投与経路に依存してこの範囲内で変わりうる。
【００８５】
３．アンチセンスヌクレオチド
アンタゴニストの他の好ましい部類は遺伝子治療技術の使用を含み、アンチセンスヌクレオチドの投与を含む。適用可能な遺伝子治療技術は、治療的に有効なＤＮＡ又はｍＲＮＡの一回又は複数回投与を含む。アンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡは、インビボでの或る種の遺伝子の発現を阻止するための治療薬として使用できる。短いアンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞に移入でき、それらは、細胞膜による制限された取り込みによって引き起こされる低い細胞内濃度にも関わらず、阻害剤として作用する、Zamecnik等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 4143-4146 (1986)。オリゴヌクレオチドは、例えば負に荷電したホスホジエステル基を不荷電基で置換することにより、それらの取り込みを促進させるように修飾することができる。
生存細胞に核酸を導入するために知られた種々の技術がある。該技術は、核酸がインビトロ、エキソビボ、又はインビトロで培養された細胞に、又はインビボで対象とする宿主の細胞に移されるかに応じて変わる。インビトロで哺乳動物細胞に核酸を移行するのに適した技術は、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥ-デキストラン、リン酸カルシウム沈殿法などの使用を含む。現在好ましいインビボ遺伝子移行技術は、ウイルス（典型的にはレトロウイルス）ベクターでの形質移入及びウイルスコートタンパク質−リポソーム媒介形質移入を含む、Dzau等, Trends Biotech. 11: 205-210 (1993)。幾つかの状況では、核酸供給源に標的細胞をターゲティングする試薬を提供するのが好ましく、例えば、エンドサイトーシスを伴う細胞表面膜タンパク質に特異的な抗体をターゲティング及び／又は取り込みの促進のために用いてもよく、例えば、特定の細胞型向性のカプシドタンパク質又はその断片、サイクリングで内部移行を受けるタンパク質の抗体、及び細胞内局在化をターゲティングし細胞内半減期を向上させるタンパク質である。レセプター媒介エンドサイトーシスの技術は、例えば、Wu等, J. Biol. Chem. 262:
4429-4432 (1987); Wagner等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 3410-3414 (1990)に記載されている。既知の遺伝子標識及び遺伝子治療プロトコールのレビューについては、Anderson等, Science 256: 808-813 (1992)を参照のこと。
一実施態様では、ｈＳｕ（ｆｕ）アンタゴニスト及び／又はアゴニスト分子は細胞の内因性リガンドに結合するのに用いることができ、それにより、特に細胞内のｈＳｕ（ｆｕ）のレベルが正常な生理的レベルを越える場合、細胞をｈＳｕ（ｆｕ）野生型に非応答性とする。また、内因性ｈＳｕ（ｆｕ）基質、又は望ましくない細胞反応（腫瘍細胞の増殖など）を活性化する複合体形成剤に結合するのが有利であろう。
本発明の更なる実施態様では、ｈＳｕ（ｆｕ）発現は、ｈＳｕ（ｆｕ）タンパク質の発現を低下させるのに有効な量のｈＳｕ（ｆｕ）アンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡをｈＳｕ（ｆｕ）発現細胞に提供することにより低下させうる。
【００８６】
腫瘍形成ｈＳｕ（ｆｕ）遺伝子、例えば本発明の遺伝子配列を使用して容易に同定され単離される腫瘍抑制活性に欠陥のある変異体遺伝子に特異的なアンチセンス分子を用いて、ｈＳｕ（ｆｕ）関連腫瘍が疑われるか有していることが示された細胞における発現をダウンレギュレートする。アンチセンス分子の投与は腫瘍形成ｈＳｕ（ｆｕ）活性を減少させる効果を有している。アンチセンス配列は標的とされる欠陥性ｈＳｕ（ｆｕ）遺伝子のｍＲＮＡに相補的であり、標的遺伝子産物の発現を阻害する。
アンチセンス分子は合成オリゴヌクレオチドでありうる。そのようなアンチセンスオリゴヌクレオチドは一般に少なくとも約７、通常は少なくとも約１２、より通常は少なくとも約２０のヌクレオチド長で、約５００以下、通常は約５０以下、より通常は約３５ヌクレオチド長以下であり、ここで長さは交差反応性の不存在を含む特異性、阻害効果等々により支配される。７から８の塩基長の短いオリゴヌクレオチドは遺伝子発現の強い選択的な阻害剤となりうることが見いだされた（Wagner等, Nature Biotechnology 14:840-844(1996)を参照）。内在性有意鎖ｍＲＮＡ配列の特異的領域又は領域群は、好ましくはｈＳｕ（ｆｕ）突然変異を包含するアンチセンス配列により補完されるように選択される。インビトロか動物モデルでの標的遺伝子の発現の阻害について候補配列をアッセイする。配列の組み合わせもまた使用でき、そこではｍＲＮＡ配列の幾つかの領域がアンチセンス相補性に対して選択される。アンチセンス分子及び／又は他の阻害薬剤が、進入を可能にする条件下で腫瘍細胞と接触させることによって投与される。該分子は、例えばリポソーム懸濁液のような、溶液又は投与のための任意の他の薬理学的に好適な形態で提供されうる。細胞による核酸の取り込みを向上させるための当該分野で既知の多くの送達方法が存在する。有用な送達系は、センダイウィルス-リポソーム送達系（Rapaport及びShai J. Biol. Chem. 269:15124-15131(1994)を参照）、カチオン性リポソーム、ポリマー送達ゲル又はマトリックス、多孔性気球カテーテル（Shi等, Circulation 90:955-951(1994)；及びShi等, Gene Therapy 1:408-414(1994)）、レトロウィルス発現ベクター等々を含む。送達ビヒクルとしてのリポソームの使用は興味ある方法の一つである。リポソームは標的部位の細胞と融合し、細胞内腔の内容物を細胞内に送達する。リポソームは、接触を維持する種々の手段、例えば隔離、結合剤等々を使用して、融合に十分な時間の間、細胞との接触が維持される。リポソームは、センダイウィルス又はインフルエンザウィルス等々のような膜の融合を媒介する精製タンパク質又はペプチドで調製されうる。脂質は、例えばホスファチジルコリンのようなカチオン性脂質を含む既知のリポソーム形成脂質の任意の有用な組み合わせでありうる。残りの脂質は通常は中性脂質、例えばコレステロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール等々である。
【００８７】
Ｉ．診断的用途
ここに記載した本発明の化合物（例えば、ヒト及び脊椎動物ｈＳｕ（ｆｕ）、脊椎動物ｈＳｕ（ｆｕ）変異体及び抗脊椎動物ｈＳｕ（ｆｕ）抗体）の他の用途は、ｈＳｕ（ｆｕ）又はヘッジホッグシグナル伝達により疾患が幾分導かれたかどうかの診断を助けることである。例えば、基底細胞癌細胞は活性なヘッジホッグシグナル伝達に関連している。
ヘッジホッグシグナル伝達によって特定の疾患が導かれるかどうかを決定する診断アッセイは以下の工程を用いて実施される：（１）細胞又は組織の培養；（２）ｈＳｕ（ｆｕ）変調ヘッジホッグシグナル伝達を阻害可能な化合物の投与；及び（３）ヘッジホッグシグナル伝達が対照に対して変調されている度合いの測定。これらの工程は、本開示に基づいて標準的な技術を用いて実施することができる。例えば、細胞又は組織の単離と培養又はインビボに標準的な技術を使用できる。
【００８８】
以下の実施例は例示するためにのみ提供されるものであって、決して本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
本明細書で引用した全ての特許及び文献の全体を、出典明示によりここに取り込む。
（実施例）
実施例で言及されている市販試薬は、特に示さない限りは製造者の使用説明に従って使用した。ＡＴＣＣ受託番号を用いて以下の実施例と明細書全体を通して特定されている細胞の供給源はバージニア州マナッサスのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションである。
【００８９】
実施例１．ヒトｈＳｕ（ｆｕ）をコードするｃＤＮＡクローンの単離
公的な配列データベース（Genbank）を検索して、ショウジョウバエのメラノガスターのｆｕｓｅｄタンパク質のサプレッサーと相同性を示すマウスＥＳＴを同定した（ＡＡ２２３６３７）。マウスＥＳＴの想定される推定アミノ酸配列はｄＳｕ（ｆｕ）タンパク質の８４のアミノ酸の６４に一致した。ついで、このＥＳＴ配列を公的なＥＳＴデータベース（例えば、GenBank）と企業のＥＳＴデータベース（例えば、LIFESEQ(登録商標)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA）を含む様々なＥＳＴデータベースと比較して、相同性ＥＳＴ配列を同定した。比較は、コンピュータプログラムＢＬＡＳＴ又はＢＬＡＳＴ２［Altschul等, Methods in Enzymology, 266: 460-480 (1996)］を用いて実施した。既知のタンパク質をコードせず、ＢＬＡＳＴスコア７０（又はある場合には９０）又はそれ以上を持つ比較物は、プログラム「phrap」（Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington）でクラスター形成してコンセンサスＤＮＡ配列に構築した。このコンセンサス配列はＦｉｇ７（配列番号：３）に示され、ここでＤＮＡ３３４５４と命名される。
Ｆｉｇ７（配列番号：３）に示されたＤＮＡ３３４５４コンセンサス配列に基づいて、１）ＰＣＲにより対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリを同定するために、及び２）ｈＳｕ（ｆｕ）の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして用いるために、オリゴヌクレオチドを合成した。正方向及び逆方向ＰＣＲプライマーは一般に２０から３０のヌクレオチドの範囲であり、しばしば約１００−１０００ｂｐ長のＰＣＲ産物をもたらすように設計される。プローブ配列は、典型的には４０−５５ｂｐ長である。ある場合には、コンセンサス配列が約１−１．５ｋｂｐより大きいときに更なるオリゴヌクレオチドが合成される。全長クローンについて幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを、Ausubel等, Current Protocols in Molecular Biology に従って、ＰＣＲプライマー対でのＰＣＲ増幅によりスクリーニングした。ついで、ポジティブライブラリをプローブオリゴヌクレオチド及びプライマー対の一方を用いて対象とする遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。
ＰＣＲプライマー（正及び逆）を合成した：
正方向ＰＣＲプライマー  ５'-CAGCCGAACCCGCTCCAGGTTAC-３'（配列番号：６）逆方向ＰＣＲプライマー  ５'-CATGGACTCTGTTGTCACCATAGAG-３'（配列番号：７）
さらに、ヒト胎児肺ｐＲＫ５哺乳動物発現ライブラリを、次のヌクレオチド配列を持つコンセンサスＤＮＡ３３４５４配列から作成された合成オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブでスクリーニングした：  ハイブリダイゼーションプローブ
５'-GAGCACTGGCACTACATCAGCTTTGGCCTGAGTGATCTCT-３'（配列番号：８）
【００９０】
ｃＤＮＡライブラリの作成のためのＲＮＡはヒト胎児肺組織から単離した。ｃＤＮＡクローンの単離に用いたｃＤＮＡライブラリは、カリフォルニア州サンジエゴのInvitrogen からのもの等の市販試薬を用いて標準的な方法によって作成した。ｃＤＮＡは、ＮｏｔＩ部位を含むオリゴｄＴでプライムし、平滑末端でＳａｌＩヘミキナーゼ化アダプターに結合させ、ＮｏｔＩで切断し、ゲル電気泳動法で適当にサイズ分類し、適切なクローニングベクター（ｐＲＫＢ又はｐＲＫＤ等；ｐＲＫ５ＢはＳｆｉＩ部位を含まないｐＲＫ５Ｄの前駆体である；Holmes等, Science, 253: 1278-1280 (1991)参照）に、独特のＸｈｏＩ及びＮｏｔＩ部位において、所定の方向でクローニングした。
上述のようにして単離されたクローンのＤＮＡ配列決定により、ｈＳｕ（ｆｕ）の全長ＤＮＡ配列（ここでＤＮＡ３３４５５−１５４８と命名［Ｆｉｇ６Ａ−６Ｂ、配列番号：１］）（ＵＮＱ６５０とも命名）と、ｈＳｕ（ｆｕ）の誘導タンパク質配列（配列番号：２；Ｆｉｇ１）が得られた。クローンＵＮＱ６５０（ここでＤＮＡ３３４５５−１５４８と命名）は１９９９年３月５日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１２７が付与された。
ＵＮＱ６５０（ＤＮＡ３３４５５−１５４８）の全ヌクレオチド配列はＦｉｇ６Ａ−６Ｂ（配列番号：１）に示す。クローンＵＮＱ６５０（ＤＮＡ３３４５５−１５４８）はヌクレオチド位置７４−７６に見かけの転写開始部位を持ちヌクレオチド位置１３７３−１３７５の停止コドンで終端する単一のオープンリーディングフレームを含む（Ｆｉｇ６Ａ−６Ｂ）。予想されたポリペプチド前駆体は４３３アミノ酸長である（Ｆｉｇ１）。Ｆｉｇ１に示される全長ｈＳｕ（ｆｕ）タンパク質は約４７９３２ダルトンの推定分子量と約５．６６のＰＩを有する。Ｆｉｇ１（配列番号：２）に示された全長ｈＳｕ（ｆｕ）配列の分析により次のものの存在が明らかになった：約アミノ酸２６５から約アミノ酸２６８の潜在的なＮ-グリコシル化部位。ｈＳｕ（ｆｕ）をｄＳｕ（ｆｕ）とアラインメントさせることにより、アミノ酸レベルで３７．７％の同一性が明らかになり（Ｆｉｇ１）、保存的アミノ酸置換を考慮に入れると６３％まで増加した。Prositeデータベースに対してｈＳｕ（ｆｕ）を検索した結果、１５の潜在的なリン酸化部位が明らかになり、その幾つかが種間で保存されていた（Ｆｉｇ１に示す）。Prositeの検索により３つの候補ＰＫＡリン酸化部位がｈＳｕ（ｆｕ）に同定され、ｄＳｕ（ｆｕ）では何も同定されなかった。しかし、検索方策に幾つかの活性が少ない潜在的なＰＫＡリン酸化部位モチーフを含めることにより、ｈＳｕ（ｆｕ）に二つ（２）の更なる部位が同定され、ｄＳｕ（ｆｕ）に５つのそのような部位が同定された（Ｆｉｇ１）。ＰＥＳＴアルゴリズム（４０）により、辺縁ＰＥＳＴ配列が同定され、これはアミノ酸３４４−３５８にスパンしていた。ｈＳｕ（ｆｕ）遺伝子をＦＩＳＨ解析により染色体１０、領域ｑ２４−ｑ２５にマッピングした（Ｆｉｇ２）。
Ｆｉｇ１（配列番号：２）に示された全長配列のＷＵ−ＢＬＡＳＴ２配列アラインメント分析を使用した、Dayhoffデータベース（version 35.45 SwissProt 35）の解析により、ｈＳｕ（ｆｕ）アミノ酸配列と以下のDayhoff配列：S55695, A45983, PAC4_RAT, P_R93246, S49624, CA39_CHICK, S30127, MTCI28_32, MTV043_60及びLEG3_CRILOとの間の有意な相同性が証明された。
【００９１】
実施例２．ハイブリダイゼーションプローブとしてのｈＳｕ（ｆｕ）の使用
以下の方法は、ｈＳｕ（ｆｕ）をコードするヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションプローブとしての使用を記載する。
全長又は成熟ｈＳｕ（ｆｕ）（Ｆｉｇ６Ａ−６Ｂ、配列番号：１に示す）のコード配列を含むＤＮＡは、ヒト組織ｃＤＮＡライブラリ又はヒト組織ゲノムライブラリにおける相同ＤＮＡ類（ｈＳｕ（ｆｕ）の天然に生じる変異体をコードするものなど）のスクリーニングのためのプローブとして用いられる。
何れかのライブラリＤＮＡを含むフィルターのハイブリダイゼーションと洗浄は、以下の高緊縮性条件下で実施した。放射性標識ｈＳｕ（ｆｕ）誘導プローブのフィルターへのハイブリダイゼーションは、５０％ホルムアルデヒド、５ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．８、２ｘデンハード液、及び１０％デキストラン硫酸の溶液中で４２℃において２０時間行った。フィルターの洗浄は、０．１ｘＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳの水溶液中、４２℃で行った。
ついで、全長天然配列ｈＳｕ（ｆｕ）をコードするＤＮＡと所望の配列同一性を有するＤＮＡは、当該分野で知られている標準的な方法を用いて同定できる。
【００９２】
実施例３．インサイツハイブリダイゼーションのためのハイブリダイゼーションプローブとしてのｈＳｕ（ｆｕ）の使用
齧歯類Ｓｕ（ｆｕ）ｍＲＮＡへのインサイツハイブリダイゼーションを実施した。胎齢８．５日（Ｅ８．５）のマウス胚に対するホールマウントインサイツハイブリダイゼーションを（３７）に記載されているようにして実施した。プローブは、ヒト配列のヌクレオチド１１６−３９０（ヌクレオチド１＝イニシエータＡＴＧのＡ）に対応する、マウスＳｕ（ｆｕ）ｃＤＮＡ ＰＣＲ鋳型とＴ７ＲＮＡポリメラーゼで合成したジゴキシゲニン標識ＲＮＡであった。組織切片へのインサイツハイブリダイゼーションに対しては、ラットＥ１１．５及びＥ１５．５全胚と、出生後１日（Ｐ１）のラット脳を、４％パラホルムアルデヒド中４℃で終夜浸漬固定し、１５％スクロース中で終夜凍結保護し、Ｏ.Ｔ.Ｃ.（VWR Scientific）に包埋し、液体窒素で凍結させた。成体マウス脳を粉末ドライアイスで新鮮凍結させた。成体ラット脊髄及びマウス精巣をＯ.Ｔ.Ｃ.に包埋し、液体窒素で凍結させた。切片を１６μｍで切断し、過去に記載されているようにして（３８）インサイツハイブリダイゼーションのために加工した。記載されたようにして（３９）、３３Ｐ-ＵＴＰで標識したＲＮＡプローブを産生した。センス及びアンチセンスプローブを、ヒト配列のヌクレオチド９７−４２４を包含するｈＳｕ（ｆｕ）ｃＤＮＡ ＰＣＲ断片からＴ７ＲＮＡポリメラーゼで合成した。
ホールマウントインサイツハイブリダイゼーションにより、調べた最も早い発育時点において、Ｓｕ（ｆｕ）ｍＲＮＡがＥ８．５マウスに広く発現されていることが明らかになった（Ｆｉｇ３Ａ−３Ｂ）。標識は発育中の神経板の全体にわたって一様に強く見えた。心臓の原基のみがこの段階で特に標識されていなかった（Ｆｉｇ３Ｂ）。Ｅ１１．５のラットでは、Ｓｕ（ｆｕ）メッセージが中枢神経系、脊髄及び体節の全体にわたって広範に残っていた（Ｆｉｇ３Ｃ）。Ｅ１１．５及びＥ１５．５ラットの脊髄の横断面には、活性な細胞増殖の領域である室領域の発育中の神経上皮内に顕著なシグナルが明らかになった（Ｆｉｇ３Ｅ及び３Ｆ）。脳、脊髄、腸、肺、および精巣を含むＥ１５．５胚全体の組織がＳｕ（ｆｕ）に対して標識された；肝臓はほんの僅かなシグナルを示していた（Ｆｉｇ３Ｄ）。Ｐ１ラットの脳においては、Ｓｕ（ｆｕ）ｍＲＮＡが広く発現され、神経上皮、副脳室領域、及び海馬神経細胞フィールドにわたる顕著なシグナルを示した（Ｆｉｇ３Ｇ）。メッセージは成体脳においては大いにダウンレギュレートされていたが、全体にわたってなお弱く検出できた；比較的高い発現が海馬、小脳顆粒及びプルキンエ細胞層、及び嗅球に観察された（Ｆｉｇ３Ｈ−３Ｊ）。
Ｄｈｈは精巣に特異的に発現され精子形成のために重要であるので（４１）、成体マウス精巣についてまたＳｕ（ｆｕ）ｍＲＮＡを調べた。精巣の断面には、Ｓｕ（ｆｕ）ｍＲＮＡが精細管の部分集合に強く発現しており、その転写が胚芽細胞の分化段階によって調節されうることを示唆している（Ｆｉｇ４Ａ）。Ｓｕ（ｆｕ）メッセージが発達中の精母細胞の領域にわたって銀色顆粒の輪として観察された（Ｆｉｇ４Ｃ及び４Ｄ）。尿細管内の多くの部位では、最も高い発現が中央に集中しており、そこでは胚芽細胞分化の最後の段階が生じている（Ｆｉｇ４Ｅ）。有意鎖対照プローブの隣接組織切片へのハイブリダイゼーションではバックグラウンドを越えるシグナルは見られなかった（Ｆｉｇ４Ｂ）。
【００９３】
実施例４．ｈＳｕ（ｆｕ）遺伝子の染色体位置をマッピングするためのハイブリダイゼーションプローブとしてのｈＳｕ（ｆｕ）の使用
ｈＳｕ（ｆｕ）遺伝子の染色体の局在化を決定した。ヒト血液から単離したリンパ球を、３７℃で６８−７２時間の間、１０％のウシ胎仔血清とフィトヘマグルチニンを補填したアルファＭＥＭ中で培養した。培養物をＢｒｄＵ（０．１８ｍｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）で処理して細胞集団を同調させ、ついで無血清培地で３ｘ洗浄し、チミジン（２．５ｍｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）を含むアルファＭＥＭにて３７℃で６時間の間、再培養した。細胞を収集し、標準的な手順によってスライドを調製し、低張処理、固定及び空気乾燥を施した。全長ｈＳｕ（ｆｕ）ｃＤＮＡをＢｉｏＮｉｃｋ標識キット（Gibco BRL）を使用して１５℃で２ｈ、ｄＡＴＰの存在下にてビオチン標識した。蛍光インサイツハイブリダイゼーション（FISH）を記載されたようにして実施した（３５，３６）。簡単には、スライドを５５℃で１ｈの間、焼き、ＲＮＡ分解酵素で処理し、２ｘＳＳＣ中の７０％のホルムアミドで２分間（７０℃）変性させ、エタノール中で脱水した。プローブを、５０％のホルムアミドと１０％のデキストラン硫酸からなるハイブリダイゼーション混合物中で５分間７５℃にて変性させた。変性させた染色体調製物をプローブと終夜ハイブリダイズさせ、洗浄し、蛍光抗ビオチン抗体とＤＡＰＩ染色で標識した。各染色体拡散体のＤＡＰＩバンド形成パターンとＦＩＳＨシグナルを別個に記録し、ついで重ね合わせてｈＳｕ（ｆｕ）マッピング位置をあてがった。
上記のＦＩＳＨ分析により、ｈＳｕ（ｆｕ）遺伝子は染色体１０ｑ２４−２５にマッピングされた。興味深いことに、多形性膠芽腫、前立腺癌、悪性メラノーマ及び子宮内膜癌を含む多くの腫瘍における異型接合性の喪失（ＬＯＨ）分析に基づいて、区間１０ｑ.２３-qter内に腫瘍抑制遺伝子に対する二つの遺伝子座が提案された（４４−４７）。この点において、多くの癌において突然変異していることが見いだされ、この領域にまたマッピングする二つの候補腫瘍サプレッサー遺伝子：１０ｑ２３.３でのＭＭＡＣ１／ＰＴＥＮ（４８，４９）と１０ｑ２５.３−２６.１でのＤＭＢＴ１（悪性脳腫瘍において欠失）（５０）が、最近記載されている。ｈＳｕ（ｆｕ）の染色体局在化は、ｈＳｕ（ｆｕ）が活性な細胞増殖の領域に高度に発現され（Ｆｉｇ３Ｆ−Ｊを参照）、ＨＨシグナル伝達のインヒビターであるという知見と組み合わされて、ｈＳｕ（ｆｕ）がPatchedのように腫瘍サプレッサーである可能性が極めて高いことを示している。
【００９４】
実施例５：大腸菌におけるｈＳｕ（ｆｕ）の発現
この実施例は大腸菌中における組換え発現によるｈＳｕ（ｆｕ）の未グリコシル化型の調製を例証する。
ｈＳｕ（ｆｕ）をコードするＤＮＡ配列（配列番号：１）を、選択したＰＣＲプライマーを用いて最初に増幅した。プライマーは、選択された発現ベクターの制限酵素部位に対応する制限酵素部位を含まなければならない。種々の発現ベクターを用いることができる。好適なベクターの例は、ｐＢＲ３２２（大腸菌由来のもの；Bolivar等, Gene, 2:95 (1977)を参照）であり、これはアンピシリン及びテトラサイクリン耐性のための遺伝子を含む。ベクターは、制限酵素で消化され脱リン酸される。ＰＣＲ増幅配列を、ついでベクターに結合させる。ベクターは、好ましくは抗生物質耐性遺伝子、ｔｒｐプロモーター、ｐｏｌｙｈｉｓリーダー（最初の６つのＳＴＩＩコドン、ｐｏｌｙｈｉｓ配列、及びエンテロキナーゼ切断部位を含む）、ｈＳｕ（ｆｕ）コード化領域、ラムダ転写終結区、及びａｒｇＵ遺伝子を含む。
ライゲーション混合物は、ついで、上掲のSambrook等に記載された方法を用いて選択した大腸菌を形質転換するのに使用される。形質転換体は、それらのＬＢプレートで成長する能力により同定され、ついで抗生物質耐性クローンが選択される。プラスミドＤＮＡが単離され、制限分析及びＤＮＡ配列決定で確認される。
選択されたクローンは、抗生物質を添加したＬＢブロスのような液体培地で終夜成長させることができる。終夜培養物は、続いて大規模培養の播種に用いられる。次に細胞を所望の至適密度まで成長させ、その間に発現プロモーターが作動される。
更に数時間の培養の後、細胞を遠心分離により収集することができる。遠心分離で得られた細胞ペレットは、当該分野で知られた種々の試薬を用いて可溶化され得、ついで可溶化されたｈＳｕ（ｆｕ）タンパク質を金属キレート化カラムを用いてタンパク質を緊密に結合させる条件下で精製する。
【００９５】
実施例６：哺乳動物細胞におけるｈＳｕ（ｆｕ）の発現
この実施例は哺乳動物細胞中での組換え発現によるｈＳｕ（ｆｕ）の潜在的にグリコシル化された型の調製を例証する。
発現ベクターとしてベクターｐＲＫ５（1989年3月15日公開のEP307,247を参照）を用いた。場合によっては、上掲のSambrook等に記載されたようなライゲーション方法を用いて、ｈＳｕ（ｆｕ）ＤＮＡを選択した制限酵素でｐＲＫ５に結合させて、ｈＳｕ（ｆｕ）ＤＮＡの挿入を行う。得られたベクターは、ｐＲＫ５−ｈＳｕ（ｆｕ）と呼ばれる。
一実施態様では、選択された宿主細胞は２９３細胞とすることができる。ヒト２９３細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １５７３）は、ウシ胎児血清及び場合によっては滋養成分及び／又は抗生物質を添加したＤＭＥＭなどの培地中で組織培養プレートにおいて成長させて集密化した。約１０μｇのｐＲＫ５−ｈＳｕ（ｆｕ）ＤＮＡを約１μｇのＶＡ ＲＮＡ遺伝子をコードするＤＮＡ［Thimmappaya等, Cell, 31:543 (1982))］と混合し、５００μｌの１ｍＭトリス-ＨＣｌ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、０．２２７ＭのＣａＣｌ２に溶解させた。この混合物に、滴下して、５００μｌの５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３５）、２８０ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのＮａＰＯ４を添加し、２５℃で１０分間析出物を形成させた。析出物を懸濁し、２９３細胞に加えて３７℃で約４時間静置した。培地を吸引し、２ｍｌのＰＢＳ中２０％グリセロールを３０秒間添加した。２９３細胞をついで無血清培地で洗浄し、新鮮培地を添加し、細胞を約５日間インキュベートした。
形質移入後約２４時間で、培地を除去し、培地（単独）又は２００μＣｉ／ｍｌの３５Ｓ-システイン及び２００μＣｉ／ｍｌの３５Ｓ-メチオニンを含む培地で置換した。１２時間のインキュベーション後、条件培地を収集し、スピンフィルターで濃縮し、１５％ＳＤＳゲルに充填した。処理したゲルを乾燥させ、ｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチドの存在を現す選択された時間の間フィルムに露出した。形質転換した細胞を含む培養物に、更なるインキュベーションを施し（無血清培地中で）、培地を選択されたバイオアッセイで試験した。
これに換わる技術では、ｈＳｕ（ｆｕ）は、Somparyac等, Proc. Natl. Acad. Sci.,12:7575 (1981)に記載されたデキストラン硫酸法を用いて２９３細胞に一過性に導入される。２９３細胞は、スピナーフラスコ内で最大密度まで成長させ、７００μｇのｐＲＫ５−ｈＳｕ（ｆｕ）ＤＮＡを添加する。細胞は、先ずスピナーフラスコから遠心分離によって濃縮し、ＰＢＳで洗浄した。ＤＮＡ−デキストラン沈殿物を細胞ペレット上で４時間インキュベートした。細胞を２０％グリセロールで９０秒間処理し、組織培養培地で洗浄し、組織培養培地、５μｇ／ｍｌウシインスリン及び０．１μｇ／ｍｌウシトランスフェリンを含むスピナーフラスコ中に再導入した。約４日後に、条件培地を遠心分離し、濾過して細胞及び細胞片を除去した。ついで発現されたｈＳｕ（ｆｕ）を含む試料を濃縮し、透析及び／又はカラムクロマトグラフィー等の任意の選択された方法によって精製した。
【００９６】
他の実施態様では、ｈＳｕ（ｆｕ）をＣＨＯ細胞中で発現させることができる。ｐＲＫ５-ｈＳｕ（ｆｕ）は、ＣａＰＯ４又はＤＥＡＥ-デキストランなどの既知の試薬を用いてＣＨＯ細胞中に形質移入することができる。上記したように、細胞培地をインキュベートし、培地を培養培地（単独）又は３５Ｓ-メチオニン等の放射性標識を含む培地に置換することができる。ｈＳｕ（ｆｕ）ポリペプチドの存在を決定した後、培地を無血清培地に置換することができる。好ましくは、培地を約６日間インキュベートし、ついで条件培地を収集する。ついで、発現されたｈＳｕ（ｆｕ）を含む培地を濃縮して、任意の選択される方法によって精製することができる。
また、エピトープタグｈＳｕ（ｆｕ）は、宿主ＣＨＯ細胞において発現させることができる。ｈＳｕ（ｆｕ）はｐＲＫ５ベクターからサブクローニングした。サブクローン挿入物にＰＣＲを施して、バキュロウイルス発現ベクター中のｐｏｌｙ-ｈｉｓタグ等の選択されたエピトープタグと枠内で融合させる。ｐｏｌｙ-ｈｉｓタグｈＳｕ（ｆｕ）挿入物を、ついで、安定なクローンの選択のためのＤＨＦＲ等の選択マーカーを含むＳＶ４０誘導ベクターにサブクローニングできる。最後に、ＣＨＯ細胞をＳＶ４０誘導ベクターで（上記のように）形質移入することができる。発現を実証するために、上記のように標識化を行ってもよい。発現されたｐｏｌｙ-ｈｉｓタグｈＳｕ（ｆｕ）を含む培地を、ついで濃縮し、Ｎｉ２＋-キレートアフィニティクロマトグラフィー等の任意の選択される方法により精製できる。
タンパク質間相互作用を研究すべく、様々なサブクローンとｃＤＮＡ作成物をｈＳｕ（ｆｕ）と多のタンパク質の生産のためにつくり出した。ｈＳｕ（ｆｕ）ｃＤＮＡをＣＭＶ-系発現ベクター（ｐＲＫ）中にサブクローニングし、そのカルボキシ末端をｆｌａｇペプチドでエピトープタグ化し、Ｆｉｇ１０に提示されたｈＳｕ（ｆｕ）-ｆｌａｇ-エピトープタンパク質をコードする挿入物を含むｐＲＫ.ｈＳｕ（ｆｕ）を作った（配列番号：１０）。（Ken Kinzler博士により提供された）ヒトＧｌｉ ｃＤＮＡを同じ発現ベクターにクローニングし、９Ｅ１０ｃ-ｍｙｃエピトープをアミノ末端（最初のＡＴＧの直ぐ後）に導入してｐＲＫ.ｈＧｌｉを作った。（Mike Ruppert博士により提供された）ヒトＧｌｉ ３をｐＲＫにまたクローニングした。挿入物の３'末端からの配列決定により、公開された配列（３２）と比較して位置４７００に「Ｔ」ヌクレオチドが失われていて、タンパク質の早発の切断が生じていることが明らかにされた。部位特異的突然変異誘発（Muta-Geneファージミドインビトロ突然変異誘発システム, Bio-Rad）を用いてこの位置に「Ｔ」を加えてｐＲＫ.ｈＧｌｉ３を作った。マウスＧｌｉ２のコード領域を、鋳型としてMarathon ReadyマウスＥ１１ｃＤＮＡ（Clontech）を用いてＴａｋａｒａＬＡポリメラーゼ（宝酒造株式会社）でのＰＣＲにより得て、ｐＲＫにクローニングしてｐＲＫ.ｈＧｌｉ２を得た。ヒトＳｌｉｍｂ配列（３３）と比較して最初の２２のアミノ酸を失っているマウスｃＤＮＡＳｌｉｍｂをGenome Systemsから取得し（クローン＃１０６８７４２）５'ＲＡＣＥによって伸長させた。幾つかの異なった５'ＲＡＣＥ産物を回収したところ、遺伝子がその５'末端に選択的スプライシングを受けていることが示唆された（（３３）と（３４）も参照）。公開されたヒトＳｌｉｍｂのアミノ末端に最も密接に一致する配列を単離し、ｐＲＫ中にクローニングしてｐＲＫ.ｍＳｌｉｍｂを作った。ｍＳｌｉｍｂ ｃＤＮＡによって予測されるタンパク質はそのヒト対応物（３３）からの５７２のアミノ酸の９だけで異なっていた。グルタチオン-Ｓ-トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）-ｈＳｕ（ｆｕ）発現作成物（ｐＧＥＸ.ｈＳｕ（ｆｕ））を、ファーマシアｐＧＥＸベクター系を使用して作製した。（ＧＳＴ）-ｈＳｕ（ｆｕ）（配列番号：１１）の発現されたアミノ酸配列はＦｉｇ１１に示している。
【００９７】
実施例７：酵母菌でのｈＳｕ（ｆｕ）の発現
以下の方法は、酵母菌中でのｈＳｕ（ｆｕ）の組換え発現を記載する。
最初に、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーターからのｈＳｕ（ｆｕ）の細胞内生産又は分泌のための酵母菌発現ベクターを作成する。プロモーター及びｈＳｕ（ｆｕ）をコードするＤＮＡを選択したプラスミドの適当な制限酵素部位に挿入してｈＳｕ（ｆｕ）の細胞内発現を方向付ける。分泌のために、ｈＳｕ（ｆｕ）をコードするＤＮＡを選択したプラスミドに、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーターをコードするＤＮＡ、天然ｈＳｕ（ｆｕ）シグナルペプチド又は他の哺乳動物シグナルペプチド、あるいは例えば酵母菌アルファ因子もしくはインベルターゼ分泌シグナル／リーダー配列、及び（必要ならば）ｈＳｕ（ｆｕ）の発現のためのリンカー配列と共にクローニングすることができる。
酵母菌株ＡＢ１１０等の酵母菌は、ついで上記の発現プラスミドで形質転換し、選択された発酵培地中で培養できる。形質転換した酵母菌上清は、１０％トリクロロ酢酸での沈降及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離で分析し、ついでクマシーブルー染色でゲルの染色をすることができる。
続いて組換えｈＳｕ（ｆｕ）は、発酵培地から遠心分離により酵母菌細胞を除去し、ついで選択されたカートリッジフィルターを用いて培地を濃縮することによって単離及び精製できる。ｈＳｕ（ｆｕ）を含む濃縮物は、選択されたカラムクロマトグラフィー樹脂を用いて更に精製することができる。
【００９８】
実施例８：バキュロウイルス感染昆虫細胞でのｈＳｕ（ｆｕ）の発現
以下の方法は、バキュロウイルス感染昆虫細胞中におけるｈＳｕ（ｆｕ）の組換え発現を記載する。
ｈＳｕ（ｆｕ）をコードする配列は、バキュロウイルス発現ベクターに含まれるエピトープタグの上流に融合させた。このようなエピトープタグは、ｐｏｌｙ-ｈｉｓタグと免疫グロブリンタグ（ＩｇＧのＦｃ領域など）を含む。ｐＶＬ１３９３（Novagen）などの市販プラスミドから誘導されるプラスミドを含む種々のプラスミドを用いることができる。簡単には、ｈＳｕ（ｆｕ）又はｈＳｕ（ｆｕ）のコード配列の所望部分、例えば成熟タンパク質をコードする配列が、５'及び３'領域に相補的なプライマーでのＰＣＲにより増幅される。５'プライマーは、隣接する（選択された）制限酵素部位を包含することができる。生成物は、ついで、その選択された制限酵素で消化され、発現ベクターにサブクローニングされる。
組換えバキュロウイルスは、上記のプラスミド及びBaculoGoldＴＭウイルスＤＮＡ（Pharmingen）を、スポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda)（「Ｓｆ９」）細胞（ATCC CRL 1711）中にリポフェクチン（GIBCO-BRLから市販）を用いて同時形質移入することにより産生される。２８℃で４−５日インキュベートした後、放出されたウイルスを収集し、更なる増幅に用いた。ウイルス感染及びタンパク質発現は、O'Reilley等, Baculovirus expression vectors: A Laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994)に記載されているように実施した。
【００９９】
ついで、発現されたｐｏｌｙ-ｈｉｓタグｈＳｕ（ｆｕ）は、例えば、Ｎｉ２＋-キレートアフィニティクロマトグラフィーにより以下のように精製できる。抽出物は、Rupert等, Nature, 362:175-179 (1993)に記載されているように、ウイルス感染した組換えＳｆ９細胞から調製した。簡単には、Ｓｆ９細胞を洗浄し、超音波処理用バッファー（２５ｍＬのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．９；１２．５ｍＭのＭｇＣｌ２；０．１ｍＭのＥＤＴＡ；１０％のグリセロール；０．１％のＮＰ-４０；０．４ＭのＫＣｌ）中に再懸濁し、氷上で２回２０秒間超音波処理した。超音波処理物を遠心分離で透明化し、上清を添加液（５０ｍＭのリン酸塩、３００ｍＭのＮａＣｌ、１０％のグリセロール、ｐＨ７．８）で５０倍希釈し、０．４５μｍフィルターで濾過した。Ｎｉ２＋-ＮＴＡアガロースカラム（Qiagenから市販）を５ｍＬの総容積で調製し、２５ｍＬの水で洗浄し、２５ｍＬの添加液で平衡化させた。濾過した細胞抽出物は、毎分０．５ｍＬでカラムに充填した。カラムを、分画回収が始まる点であるＡ２８０のベースラインまで添加液で洗浄した。次に、カラムを、結合タンパク質を非特異的に溶離する二次洗浄バッファー（５０ｍＭのリン酸塩；３００ｍＭのＮａＣｌ、１０％のグリセロール、ｐＨ６．０）で洗浄した。Ａ２８０のベースラインに再度到達した後、カラムを二次洗浄バッファー中で０から５００ｍＭのイミダゾール勾配で展開した。１ｍＬの分画を回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び銀染色又はアルカリホスファターゼ（Qiagen）に複合したＮｉ２＋-ＮＴＡでのウェスタンブロットで分析した。溶離したＨｉｓ１０−タグｈＳｕ（ｆｕ）を含む分画をプールし、添加液で透析した。
あるいは、ＩｇＧタグ（又はＦｃタグ）ｈＳｕ（ｆｕ）の精製は、例えば、プロテインＡ又はプロテインＧカラムクロマトグラフィーを含む既知のクロマトグラフィー技術を用いて実施できる。
【０１００】
実施例９：ｈＳｕ（ｆｕ）に結合する抗体の調製
この実施例はｈＳｕ（ｆｕ）に特異的に結合できるモノクローナル抗体の調製を例示する。
モノクローナル抗体を生産する技術は当該分野で知られており、例えば、上掲のGodingに記載されている。用いられ得る免疫原は、精製ｈＳｕ（ｆｕ）、ｈＳｕ（ｆｕ）を含む融合タンパク質、及び細胞表面に組換えｈＳｕ（ｆｕ）を発現する細胞を含む。免疫原の選択は、当業者が過度の実験をすることなく、なすことができる。
Ｂａｌｂ／ｃ等のマウスを、完全フロイントアジュバントに乳化して皮下又は腹腔内に１−１００マイクログラムで注入したｈＳｕ（ｆｕ）免疫原で免疫化する。あるいは、免疫原をＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（Ribi Immunochemical Researh, Hamilton, MT）に乳化し、動物の後足蹠に注入される。免疫化したマウスは、ついで１０から１２日後に、選択したアジュバント中に乳化した付加的免疫源で追加免疫する。その後、数週間、マウスを更なる免疫化注射で追加免疫する。抗ｈＳｕ（ｆｕ）抗体の検出のためのＥＬＩＳＡアッセイで試験するために、レトロオービタル出血からの血清試料をマウスから周期的に採取することができる。
【０１０１】
適当な抗体力価が検出された後、抗体に「陽性」な動物に、ｈＳｕ（ｆｕ）の静脈内注射の最後の注入をすることができる。３から４日後、マウスを屠殺し、脾臓を取り出した。ついで脾臓細胞を（３５％ポリエチレングリコールを用いて）、ＡＣＴＴから番号ＣＲＬ１５９７で入手可能なＰ３Ｘ６３ＡｇＵ．１等の選択されたマウス骨髄腫株化細胞に融合させた。融合によりハイブリドーマ細胞が生成され、ついで、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジン）培地を含む９６ウェル組織培養プレートに蒔き、非融合細胞、骨髄腫ハイブリッド、及び脾臓細胞ハイブリッドの増殖を阻害した。
ハイブリドーマ細胞は、ｈＳｕ（ｆｕ）に対する反応性についてのＥＬＩＳＡでスクリーニングされる。ｈＳｕ（ｆｕ）に対する所望のモノクローナル抗体を分泌する「陽性」ハイブリドーマ細胞の決定は、当業者の技量の範囲内である。
陽性ハイブリドーマ細胞を同系のＢａｌｂ／ｃマウスに腹腔内注入し、抗ｈＳｕ（ｆｕ）モノクローナル抗体を含む腹水を生成させる。あるいは、ハイブリドーマ細胞を、組織培養フラスコ又はローラーボトルで成長させることもできる。腹水中に生成されたモノクローナル抗体の精製は、硫酸アンモニウム沈降、それに続くゲル排除クロマトグラフィ−を用いて行うことができる。あるいは、抗体のプロテインＡ又はプロテインＧへの結合に基づくアフィニティクロマトグラフィーを用いることができる。
【０１０２】
実施例１０．ｈＳｕ（ｆｕ）に結合する抗体の使用
抗ｈＳｕ（ｆｕ）抗体での免疫細胞化学。ｈＳｕ（ｆｕ）ポリクローナル抗体を、精製したＧＳＴ-ｈＳｕ（ｆｕ）融合タンパク質でのウサギの免疫化により産生した。得られた抗体をプロテインＡカラムでのアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。
ProNectin F（Stratagene）被覆ガラスチャンバースライド中のサブコンフルエントなＣＯＳ-７細胞に、ＤＥＡＥ-デキストランに続いてＤＭＳＯショックを使用して、ｐＲＫ.ｈＳｕ（ｆｕ）、ｐＲＫ.ｈＧｌｉ、又は双方のプラスミドの何れかを一過性に形質移入した。２４時間後に、細胞を４％のパラホルムアルデヒド中で１０分間固定し、０．１％のトリトン-Ｘ１００中で５分間透過処理し、ブロックバッファー（ＰＢＳ中５％のヤギ血清）中でブロックし、抗ｈＳｕ（ｆｕ）ポリクローナル（以下を参照）及び／又は抗ｃ−ｍｙｃモノクローナル抗体（ジェネンテク；ブロックバッファー中３μｇ／ｍｌで１時間）からなる一次抗体と反応させた。細胞を洗浄し、それぞれ、ブロックバッファー中で１時間、ｃｙ３−抗ウサギＩｇＧ（１：３５０）及び／又はｃｙ２-抗マウスＩｇＧ（１：１００；Jackson ImmunoResearch）の何れかで標識した。スライドを洗浄し、Fluoromount-G（Southern Biotechnology Assoc., Inc.）においてカバーガラスをした。
【０１０３】
実施例１１．ｈＳｕ（ｆｕ）を含むタンパク質間相互作用
インビトロ共沈アッセイを実施してタンパク質間相互作用を研究した。ＮＩＨ-３Ｔ３細胞を、１０％ウシ胎仔血清と１００単位／ｍｌのペンストレップ（成長培地）を含むＤＭＥＭ中で、１０ｃｍ組織培養皿中で３０％の集密度まで成長させた。全体で１０μｇのＤＮＡ／皿、３６μｌのリポフェクタミン及び５ｍｌのoptiＭＥＭ（Gibco BRL）を用いて製造者のプロトコル（Gibco BRL）に従って、リポフェクタミンを細胞に一過性に形質移入した。二つのプラスミドを同時に形質移入するとき、各々の５μｇを使用した。４２時間後、細胞をＰＢＳ（４℃）中で２ｘ洗浄し、（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％のＮＰ-４０、それぞれ５μｇ／ｍｌのロイペプチンとアプロチニン、１ｍＭのＰＭＳＦ、及び２５０μＭのオルトバナデートを含む）１ｍｌの氷冷溶解バッファー中に直接溶解させた。可溶化液を４℃で２０分間回転させ、ついで１４０００ｒｐｍにて２０分間遠心分離し、上清を、２μｌの抗ｆｌａｇＭ２モノクローナル抗体（Kodak IBI）又は２μｌの抗ｍｙｃモノクローナル抗体（９Ｅ１０；ジェネンテク）の何れかでの終夜（４℃）の免疫沈降を施した。プロテインＡセファロース（Pharmacia）を４℃にて１時間、添加した（溶解バッファー中２５μｌの５０：５０スラリー）。ビーズを３ｘ溶解バッファーで、また１ｘ０．５ＭのＮａＣｌで洗浄し、２ｘＳＤＳ添加液を添加し、試料を煮沸させ（５分）、８％の変性ＳＤＳポリアクルルアミドゲル（Novex）上で電気泳動させた。ＥＣＬ検出システム（Amersham）を使用して、タンパク質を、ニトロセルロースへのブロッティング、ｆｌａｇ又はｍｙｃエピトープへの抗体での探索により検出した。
ＧＳＴ-融合タンパク質インビトロ結合アッセイを実施した。ｐＧＥＸ.ｈＳｕ（ｆｕ）をＤＨ１２Ｓ細菌細胞に形質転換し、５００ｍｌの終夜培養物を、製造者のプロトコル（Pharmacia）に従ってＧＳＴ-ｈＳｕ（ｆｕ）融合タンパク質の精製のために処理した。融合タンパク質を過剰の還元グルタチオンでビーズから溶出させ、溶出させたタンパク質を、変性ＳＤＳ-ポリアクルルアミドゲル上でのＯＤ２８０測定と可視化によって定量化した（データは示さず）。グルタチオンセファロースビーズに４μｇの融合タンパク質又はＧＳＴ（Sigma）を４℃にて２時間の間、負荷し、ついで結合バッファーで３ｘ洗浄した。２５μｌのビーズ（５０：５０スラリー）を、５０μｌ結合バッファー中に入った２−８μｌのの３５Ｓ-標識インビトロ翻訳ｈＧｌｉ、ｍＧｌｉ２、ｈＧｌｉ３、ｍＳｌｉｍｂ、又はｈＳｕ（ｆｕ）と共に４℃にて２時間の間インキュベートした。ビーズを３ｘ溶解バッファーで洗浄し、ＳＤＳ-ＰＡＧＥのために処理した。ゲルを続いて固定し、ＥＮ３ＨＡＮＣＥ（Dupont NEN）において増幅し、乾燥させ、Kodak X-ARフィルムに曝した。結合バッファーは５０ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ及びプロテアーゼインヒビターである（上述の通り）。５０μｌの反応容積中において２０μＣｉ[３５Ｓ]-メチオニン（Amersham）及びＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼで、ＴＮＴ結合網状赤血球溶解液系（Promega）を使用して、ｐＲＫ.ｈＧｌｉ、ｐＲＫ.ｍＧｌｉ２、ｐＲＫ.ｈＧｌｉ３、ｐＲＫ.ｍＳｌｉｍｂ、ｐＲＫ.ｈＳｕ（ｆｕ）及びＳＰ６-ルシフェラーゼ対照プラスミドを転写し、インビトロで翻訳した。およそのタンパク質の定量のために、各反応物の１μｌに変性ＳＤＳ-ＰＡＧＥを施した。各タンパク質の等価量を結合アッセイにおいて使用した。
【０１０４】
Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega, Inc)を使用して、ルシフェラーゼレポーターアッセイを、記載されているようにして（２４）、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞において実施した。同時形質移入されたRenillaルシフェラーゼ内部標準の活性に対してホタルルシフェラーゼレポーターの活性を基準化することにより、形質移入効率の差を修正した。
ｈＳｕ（ｆｕ）の生化学相互作用と生物活性を決定した。過去の研究はショウジョウバエＧｌｉ相同体であるＣｉに対するｄＳｕ（ｆｕ）の結合を証明したので（２９）、我々は類似の相互作用がそのヒトタンパク質対応物の間に存在するかどうかを試験した。我々は免疫細胞化学を用いて、形質移入したＣＯＳ-７細胞における一過性に過剰発現されたｈＳｕ（ｆｕ）及びｈＧｌｉの細胞下局在化を可視化した。個々に発現されると、ｈＳｕ（ｆｕ）とｈＧｌｉは細胞質全体にわたって広く分散し、核内にしばしば検出された（Ｆｉｇ５Ａ、上部パネル）。また、それらはβ-チューブリン（データを示さず）のものと同様の染色パターンを示しており、それらが微小管と共存していることを示唆している。細胞をｈＳｕ（ｆｕ）及びｈＧｌｉで同時形質移入したとき、二重標識化がその染色パターンにおける広範なオーバラップを明らかにした。更に、ｈＧｌｉは細胞質の全体にわたってもはや見いだされず、代わりに点状の密に染色された領域に集まっており、これはまたｈＳｕ（ｆｕ）に対しても強く標識された（Ｆｉｇ５Ａ、下方パネル）。これらの密に染色された領域は、ｈＳｕ（ｆｕ）だけを過剰発現する細胞には見られず、常に両方のタンパク質に対して染色されていたが、ｈＳｕ（ｆｕ）によるｈＧｌｉの細胞質隔離を表しているかもしれない。
ｈＳｕ（ｆｕ）によるｈＧｌｉの細胞下隔離が二つのタンパク質間の生化学的相互作用によるものであるかどうかを調べるために、我々はｈＧｌｉでｈＳｕ（ｆｕ）の共免疫沈降を調べた。ＮＩＨ-３Ｔ３細胞にｆｌａｇエピトープ-タグｈＳｕ（ｆｕ）（ｐＲＫ.ｈＳｕ（ｆｕ））及びｃ−ｍｙｃエピトープ-タグｈＧｌｉ（ｐＲＫ.ｈＧｌｉ）のための発現プラスミドを一過性に形質移入し、細胞を４２時間後に溶解し、溶解したタンパク質複合体を抗ｆｌａｇ又は抗ｍｙｃ抗体の何れかで免疫沈降させ、ついで交互抗体を用いてウェスタンブロットにかけた。ｈＳｕ（ｆｕ）又はｈＧｌｉだけを発現する細胞からは共免疫沈降タンパク質は検出されなかった（Ｆｉｇ５Ｂ）。これに対して、両方のタンパク質を同時発現する細胞から、ｈＳｕ（ｆｕ）がｈＧｌｉで直ぐに共免疫沈降させられ、ｈＧｌｉがｈＳｕ（ｆｕ）で直ぐに共免疫沈降させられた（Ｆｉｇ５Ｂ）。ｈＳｕ（ｆｕ）-ｈＧｌｉの相互作用はインビトロ結合アッセイを使用して確認された。この目的のために、細菌により生産されたＧＳＴ-ｈＳｕ（ｆｕ）タンパク質をグルタチオンセファロースビーズに負荷し、インビトロ翻訳３５Ｓ-標識ｈＧｌｉを保持する能力を調べた。ｈＧｌｉはＧＳＴ-ｈＳｕ（ｆｕ）グルタチオンセファロースビーズ上に特異的に保持されたが、ＧＳＴだけが負荷されたビーズには保持されなかった（Ｆｉｇ５Ｃ）。
【０１０５】
更なる実験において、我々は、ｈＳｕ（ｆｕ）と相互作用するＧｌｉ相同体であるＧｌｉ２及びＧｌｉ３の能力を調べた。３５Ｓ-標識ｍＧｌｉ２及びｈＧｌｉ３はＧＳＴ-ｈＳｕ（ｆｕ）-結合ビーズによって特異的に保持されたが、ルシフェラーゼ、負の対照は保持されなかった（Ｆｉｇ５Ｃ）。９Ｅ１０ｃ-ｍｙｃエピトープがタンパク質の端のカルボキシ末端に融合しているｈＧｌｉ３の型はこのアッセイにおいてｈＳｕ（ｆｕ）には結合せず（データは示さず）、Ｇｌｉ３のカルボキシ末端領域が相互作用のためには重要であることを示している。
ここに提示された結合データは、脊椎動物Ｇｌｉの活性がＳｕ（ｆｕ）との相互作用によって負に調節されることを示している。よって、機能性ＧｌｉレポーターアッセイにおいてｈＧｌｉの活性をｈＳｕ（ｆｕ）が阻害できるかどうかを調べた。このために、Ｇｌｉ結合部位（４２）の９のコピーを単純ヘルペスウィルスチミジンキナーゼ最小プロモーターに結合させたが、これがレポーターホタルルシフェラーゼ遺伝子の転写を方向付ける。この作成物からのルシフェラーゼ遺伝子の発現はＧｌｉ及びＳｈｈレセプターの成分（２４）によって特異的に調節されることが分かった。過去に実証されているように（２４）、無関係なタンパク質をコードする発現プラスミド（ｐＲＫ.ＥＧＦＰ）とルシフェラーゼレポーター作成物とのＣ３Ｈ１０Ｔ１／２の同時形質移入は、非常に低いレベルのルシフェラーゼ活性という結果になった（Ｆｉｇ５Ｄ）。これに対して、ｈＧｌｉ発現プラスミドとのレポーター遺伝子の同時形質移入は、ルシフェラーゼ活性のレベルがおよそ１００倍増加する結果となった（Ｆｉｇ５Ｄ）。重要なことに、ｄＳｕ（ｆｕ）がＣｉの負の制御因子であるという考えと一致して、ｈＧｌｉ活性化レポーター発現が同時発現ｈＳｕ（ｆｕ）の存在下で有意に抑制されたが無関係なタンパク質ではそうではない（Ｆｉｇ５Ｄ）。興味深いことには、バックグラウンドを越えるルシフェラーゼ活性の増加は、ｈＳｕ（ｆｕ）が外因性ｈＧｌｉの不在下でレポーター遺伝子と同時発現されたときに検出された（Ｆｉｇ５Ｄ）。併せて考えると、我々の知見は、ｈＳｕ（ｆｕ）のｈＧｌｉとの物理的な相互作用がその転写活性の不活性化に導くことを示している。
ｈＳｕ（ｆｕ）作用の可能な機構の調査を開始するために、我々はｈＳｕ（ｆｕ）と、Ｓｌｉｍｂ／βＴｒＣＰの脊椎動物相同体である、Ｃｉと他のタンパク質のユビキチン-プロテアソーム分解経路へのターゲティングに関係しているＦ-ボックス含有タンパク質との間の相互作用を調べた（３１，３４，４３）。我々は、インビトロ翻訳３５Ｓ-標識ｍＳｌｉｍｂは確かにＧＳＴ-ｈＳｕ（ｆｕ）-抱合グルタチオンセファロースビーズに特異的に結合するが、ＧＳＴ-抱合ビーズ単独には結合しないことを見いだした（Ｆｉｇ５Ｃ）。如何なる特定の作用機構によっても限定されることを望むものではないが、ｈＳｕ（ｆｕ）はおそらく部分的にはｈＧｌｉとＳｌｉｍｂの双方とのその物理的相互作用を通してＳｌｉｍｂ／βＴｒＣＰ-依存プロテアソーム分解経路までｈＧｌｉをターゲティングすることにより、ｈＧｌｉを不活性化することが提案される。あるいは、ｈＳｕ（ｆｕ）自体がＳｌｉｍｂ-媒介分解の標的であり得、その分解がｈＧｌｉを機能させるようにできる。何れの場合でも、ｈＳｕ（ｆｕ）はＺｎフィンガー転写因子Ｇｌｉを通してのヘッジホッグシグナル伝達の負の制御因子である。興味深いことに、３５Ｓ-標識Ｓｕ（ｆｕ）はまたＧＳＴ-ｈＳｕ（ｆｕ）に結合し（Ｆｉｇ５Ｃ）、ｈＳｕ（ｆｕ）は２-ハイブリッドアッセイにおいてそれ自身に結合することが見いだされており（データは示さず）、ｈＳｕ（ｆｕ）が二量体として機能する可能性が非常に高いことを示している。
【０１０６】
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【０１０７】
材料の寄託
次の材料をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション, １０８０１ユニバーシティ・ブルーバード、バージニア州２０１１０−２２０９、米国(ＡＴＣＣ)に寄託した：
材料                   ATCC寄託番号         寄託日
DNA33455-1548           PTA-127           1999年3月5日
この寄託は、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約及びその規則(ブダペスト条約)の規定に従って行われた。これは、寄託の日付から３０年間、寄託の生存可能な培養が維持されることを保証するものである。寄託物はブダペスト条約の条項に従い、またジェネンテク社とＡＴＣＣとの間の合意に従い、ＡＴＣＣから入手することができ、これは、どれが最初であろうとも、関連した米国特許の発行時又は任意の米国又は外国特許出願の公開時に、寄託培養物の後代を永久かつ非制限的に入手可能とすることを保証し、米国特許法第１２２条及びそれに従う特許庁長官規則(特に参照番号８８６ＯＧ６３８の３７ＣＦＲ第１．１４条を含む)に従って権利を有すると米国特許庁長官が決定した者に子孫を入手可能とすることを保証するものである。
【０１０８】
本出願の譲受人は、寄託した培養物が、適切な条件下で培養されていた場合に死亡もしくは損失又は破壊されたならば、材料は通知時に同一の他のものと即座に取り替えることに同意する。寄託物質の入手可能性は、特許法に従いあらゆる政府の権限下で認められた権利に違反して、本発明を実施するライセンスであるとみなされるものではない。
上記の文書による明細書は、当業者に本発明を実施できるようにするために十分であると考えられる。寄託した態様は、本発明のある側面の一つの説明として意図されており、機能的に等価なあらゆる作成物がこの発明の範囲内にあるため、寄託された作成物により、本発明の範囲が限定されるものではない。ここでの物質の寄託は、ここに含まれる文書による説明が、そのベストモードを含む、本発明の任意の側面の実施を可能にするために不十分であることを認めるものではないし、それが表す特定の例証に対して請求の範囲を制限するものと解釈されるものでもない。実際、ここに示し記載したものに加えて、本発明を様々に改変することは、前記の記載から当業者にとっては明らかなものであり、添付の請求の範囲内に入るものである。
【図面の簡単な説明】
【Ｆｉｇ１】  天然ｈＳｕ（ｆｕ）の誘導アミノ酸配列（配列番号：２）を示す。ヒトＳｕ（ｆｕ）とショウジョウバエＳｕ（ｆｕ）（配列番号：４）の推定タンパク質配列のアラインメントが提示されている。同一の残基はボックスで囲み、灰色に塗り潰した領域は保存された潜在的プロテインキナーゼＣリン酸化部位を示し、星印は保存された潜在的なカゼインキナーゼＩＩリン酸化部位を示し、細い黒のバーはｈＳｕ（ｆｕ）（上のバーの配列）又はｄＳｕ（ｆｕ）（下のバーの配列）における候補ＰＫＡリン酸化部位を示し、黒地に白の文字の部分はＰＥＳＴドメインを示している。ニードルマン-ウェンチ(Needleman-Wench)アルゴリズム（Needleman及びWunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443）をアラインメントに用い、二つのタンパク質間の３７．７％の同一性と６３％のポジティブ度が明らかになった。４３３のアミノ酸配列ヒトタンパク質は４７９３２の分子量と５．６６のｐＩ（非グリコシル化）を有していると予想される。潜在的なＮ-グリコシル化部位は２６５の位置にある、ＮＬＳＧ配列。図面と本出願全体を通して用いた省略符号は次のものを含む：ａａ、アミノ酸（類）；ｂｐ、塩基対（類）；ｃＤＮＡ、ＲＮＡに相補的なＤＮＡ；ＢＬＡＳＴ、ベーシックローカルアラインメントサーチツール；ＯＲＦ、オープンリーディングフレーム；ＵＴＲ、非翻訳領域；ＨＨ、ヘッジホッグタンパク質ファミリー；Ｈｈ、ショウジョウバエヘッジホッグタンパク質；Ｓｈｈ、ソニックヘッジホッグタンパク質；Ｄｈｈ、デザートヘッジホッグタンパク質；Ｉｈｈ、インディアンヘッジホッグタンパク質；ｄＳｕ（ｆｕ）；ｆｕｓｅｄタンパク質のショウジョウバエサプレッサー；ｈＳｕ（ｆｕ）、ｆｕｓｅｄタンパク質のヒトサプレッサー；Ｆｕ、ショウジョウバエＦｕｓｅｄタンパク質；ｈＧｌｉ、ヒトＧｌｉタンパク質；ｍＧｌｉ２、マウスＧｌｉ２タンパク質；ｈＧｌｉ３、ヒトＧｌｉ３タンパク質；Ｃｉ、ショウジョウバエ・キュビタス・インターラプタス（Drosophila Cubitus interruptus）タンパク質；Ｓｌｉｍｂ、ショウジョウバエＳｌｉｍｂタンパク質；ｍＳｌｉｍｂ、マウスＳｌｉｍｂタンパク質；ＰＫＡ、ｃＡＭＰ-依存性プロテインキナーゼ；ＦＩＳＨ、蛍光インサイツハイブリダイゼーション；ＰＣＲ、ポリメラーゼ連鎖反応；ＥＳＴ、発現配列タグ；ＧＳＴ、グルタチオン-Ｓ-トランスフェラーゼタンパク質；ＭＥＭ、最少基本培地；Ｅ、胎齢；及び、ＰＡＧＥ、ポリアクリルアミドゲル電気得泳動法。
【Ｆｉｇ２Ａ−２Ｂ】  ヒトＳｕ（ｆｕ）遺伝子の染色体局在化を示す。Ｆｉｇ２Ａはビオチン化ｈＳｕ（ｆｕ）プローブのＦＩＳＨ局在化を示す。染色体１０の長腕への割当ては同じ有糸分裂像のＤＡＰＩ-染色像を重ね合わせることにより達成した（Ｆｉｇ２Ｂ中）。Ｆｉｇ２ＢはＦＩＳＨマッピングの結果を示す図である。各ドットは単一の染色体拡散上の二重のＦＩＳＨシグナルを表している。分析した全体で１００の細胞の内、７２が特異的に標識された。
【Ｆｉｇ３Ａ−３Ｊ】  胚性及び成体齧歯類組織におけるＳｕ（ｆｕ）ｍＲＮＡの組織分布を示す。Ｆｉｇ３Ａは、ホールマウント８．５日の胎齢（Ｅ８．５）のマウスに対するマウスＳｕ（ｆｕ）プローブを用いたインサイツハイブリダイゼーションの背部の図を示し、Ｆｉｇ３Ｂは側部の図を表す。Ｆｉｇ３Ｃ−３Ｊは、示した年齢での、ラット全胚（Ｆｉｇ３Ｃ及び３Ｄ）、神経管（Ｆｉｇ３Ｅ及び３Ｆ）、又は脳（Ｆｉｇ３Ｇ、３Ｈ、３Ｉ及び３Ｊ）の矢状切片（Ｆｉｇ３Ｃ、Ｆｉｇ３Ｄ、Ｆｉｇ３Ｉ及びＦｉｇ３Ｊ）又は冠状切片（Ｆｉｇ３Ｅ−３Ｈ）に対するＳｕ（ｆｕ）のインサイツハイブリダイゼーションを示す。Ｆｉｇ３ＪはＦｉｇ３Ｉの小脳の更に高倍率の図を示す。スケールバー＝０．２７ｍｍ（Ｆｉｇ３Ａ及び３Ｂ）、０．５ｍｍ（Ｆｉｇ３Ｃ）；１．６７ｍｍ（Ｆｉｇ３Ｄ）、０．１６ｍｍ（Ｆｉｇ３Ｅ）；０．５９ｍｍ（Ｆｉｇ３Ｆ）；１．１４ｍｍ（Ｆｉｇ３Ｇ）；５．３３ｍｍ（Ｆｉｇ３Ｈ）；１０ｍｍ（Ｆｉｇ３Ｉ）；及び１．０３ｍｍ（Ｆｉｇ３Ｊ）。省略符号は次のものを含む：ｐｓ、原始線条；ｎｐ；神経板；ｈｂ、後脳；ｍｂ、中脳；ｆｂ、前脳；ｍｅｓ、中胚葉；ｓｏｍ、体節；ａｌｌ、尿膜；ｍａｎ、第一大動脈弓の下顎骨成分；ｓｃ、脊髄；ｃｔｘ、皮質；ｄｉ、間脳；ｃｅｒ、小脳；ｔｏｎ、舌；ｅｓｏ、食道；ｌｉｖ、肝臓；ｇｔ、性器結節；ｌｕ、肺；ｄｉｓ、椎間板；ｍｇ、中腸；ｎｔ、神経管；ｅｐｅｎ、上衣；ｎｎ、新皮質神経上皮；ｈｉｐ、海馬体；ｓｓｚ、線条体副脳室領域；ｔｈ、視床；ｃａｕ、尾状核；ｈｙｐ、視床下部；ｏｌｆ、嗅球；ｉｃ、下丘；ｓｕｃ、上丘。
【Ｆｉｇ４Ａ−４Ｅ】  成体マウス精巣におけるＳｕ（ｆｕ）の組織分布を示す。Ｆｉｇ４ＡはＳｕ（ｆｕ）プローブにハイブリダイズした成体精巣の断面を示す。より高い倍率の図（Ｆｉｇ４Ｃ−４Ｅ）は、発達中の精母細胞（Ｆｉｇ４Ｃ及び４Ｄ）への、又は幾つかの領域では、精細管の中心（Ｆｉｇ４Ｅ）へのＳｕ（ｆｕ）ｍＲＮＡの局在化を証明しており、そこでは、胚芽細胞分化の最後の段階が生じている。Ｆｉｇ４Ｂはセンス鎖対照プローブでの精巣のハイブリダイゼーションを示している。スケールバーは１．０ｍｍ（Ｆｉｇ４Ａ及び４Ｂ）と０．０６５ｍｍ（Ｆｉｇ４Ｃ−４Ｅ）を表している。省略符号は次のものを含む：ｓｔ、精細管；ｔａ、白膜；ｓｇ、精原細胞；ｓｃ、精母細胞；ｌｃ、ライディッヒ細胞；ｓｍ、成熟精子；ｌｕ、細胞内腔。
【Ｆｉｇ５Ａ−５Ｄ】  ｈＳｕ（ｆｕ）の免疫細胞化学、生化学相互作用、及び生物活性を示している。Ｆｉｇ５Ａは形質移入ＣＯＳ-７細胞中でのｈＳｕ（ｆｕ）及びｈＧｌｉの共存を示す。Ｆｉｇ５Ａに示したように細胞を、ｐＲＫ.ｈＳｕ（ｆｕ）（Ｆｉｇ５Ａ１）か、ｐＲＫ.ｈＧｌｉ（Ｆｉｇ５Ａ３）か、又は二つのプラスミドの双方（Ｆｉｇ５Ａ２及び５Ａ４）で、形質移入した；タンパク質を２４時間後に免疫化学的に染色し、蛍光顕微鏡で可視化した。形質移入した細胞を固定し、膜透過化処理し、抗ｈＳｕ（ｆｕ）及び抗ｃ−ｍｙｃ一次抗体を使用し、続いてｃｙ３抱合抗ウサギＩｇＧ又はｃｙ２抱合抗マウスＩｇＧそれぞれを用いて、ｈＳｕ（ｆｕ）（赤；Ｆｉｇ５Ａ１及び５Ａ２）及び／又はｈＧｌｉ（緑；Ｆｉｇ５Ａ３及び５Ａ４）に対して標識した。底部パネル（Ｆｉｇ５Ａ２及び５Ａ４）は同時形質移入され両方のタンパク質に対して二重標識された細胞を示している。倍率：４００ｘ。Ｆｉｇ５Ｂは一過性に形質移入したＮＩＨ-３Ｔ３細胞におけるｈＧｌｉとｈＳｕ（ｆｕ）の共免疫沈降を示す。細胞を、示されたプラスミド（全１０μｇ）で形質移入し、４２時間後に溶解し、溶解物を抗ｆｌａｇＭ２抗体（ｆｌａｇタグｈＳｕ（ｆｕ）に対して）又は抗ｃ−ｍｙｃ抗体（ｍｙｃ-タグｈＧｌｉに対して）で免疫沈降させた。タンパク質複合体に８％ゲル上で変性ＳＤＳ-ＰＡＧＥを施し、ニトロセルロースに移し、示されたように、抗ｍｙｃ又は抗ｆｌａｇ抗体でプローブ化した。ＥＣＬ検出によって抗体を可視化した。Ｆｉｇ５ＣはＧＳＴ-融合タンパク質結合アッセイを示している。タンパク質をインビトロ転写-翻訳によって３５Ｓで標識し、ＧＳＴ-ｈＳｕ（ｆｕ）又はＧＳＴの何れかに結合したグルタチオンセファロースビーズと共に４℃で２時間の間、インキュベートした。洗浄後、結合したタンパク質をＳＤＳ-泳動用バッファー中での煮沸により溶出させ、試料に１０％又は８％（ｈＳｕ（ｆｕ）のみ）の変性ＳＤＳ-ＰＡＧＥを施した。ゲルを固定し、増幅し、乾燥させてフィルムに露出した。各反応に使用された標識タンパク質の量は入力（「ｉｎ」）レーンに示したものの４倍であった。「Ｌｕｃｉｆ」はルシフェラーゼを示している。Ｆｉｇ５ＤはＧｌｉ活性化レポーターアッセイを示している。６ウェルのプレート中のＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞を、ｈＳｕ（ｆｕ）、ｈＧｌｉ、ｈＳｕ（ｆｕ）＋ｈＧｌｉのための発現作成物、又は空のベクター（ｐＲＫ５）（それぞれ０．５μｇ）と共に、ルシフェラーゼレポータープラスミド（１μｇ）で二通りに一過性に形質移入した；形質移入したＤＮＡの全量をｐＲＫ.ＥＧＦＰで２μｇにした。細胞溶解物中の相対的ルシフェラーゼ活性を形質移入後４８時間で測定し、レニラルシフェラーゼ活性（ｐＲＬ-ＴＫ；０．００２５μｇ／ウェル）に規準化した。データは３つの中の代表的な実験からの二通りの決定の平均＋／−ＳＤを表している。
【Ｆｉｇ６Ａ−６Ｂ】  天然配列ｈＳｕ（ｆｕ）をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を示す。ヌクレオチド配列（配列番号：１）は天然ｈＳｕ（ｆｕ）をコードするヌクレオチド配列（ヌクレオチド７４から１３７２）（配列番号：２）を含み、ここでヌクレオチド配列（配列番号：１）はここで「ＵＮＱ６５０」及び／又は「ＤＮＡ３３４５５−１５４８」と命名されたクローンである。開始コドンはヌクレオチド７４から７６にあり、「Ｏ］と表された停止コドンはヌクレオチド１３７３から１３７５にある。
【Ｆｉｇ７】  コンセンサス配列として構築された、ここでＤＮＡ３３４５４（配列番号：３）と命名されたヌクレオチド配列を示す。下線の配列は融合体のマウスサプレッサーと相同なプライマー配列を示している。
【Ｆｉｇ８】  ワシントン大学ＨＨＭＩマウスＥＳＴプロジェクトを経由してMarra等により提供された、GenBank受託番号ＡＡ０６１３９１のＦｕｓｅｄ遺伝子のマウスサプレッサーのＥＳＴマウス精巣ｃＤＮＡの２７５ｂｐのヌクレオチド配列（配列番号：５）を示す。
【Ｆｉｇ９】  Ｆｕｓｅｄ遺伝子のサプレッサーと類似性を持つＮＴ２ニューロン前駆体９３７２３０ｃＤＮＡ（GenBank受託番号ＡＡ２２３６３７）として同定されたＥＳＴヒト脳ｃＤＮＡの３４６ｂｐのヌクレオチド配列（配列番号：３）を示す。ＥＳＴはワシントン大学ＨＨＭＩマウスＥＳＴプロジェクトを経由してHillier等により提供された。
【Ｆｉｇ１０】  ｈＳｕ（ｆｕ）エピトープタグｆｌａｇタンパク質のアミノ酸配列（配列番号：９）を示す。
【Ｆｉｇ１１】  ｈＳｕ（ｆｕ）-ＧＳＴタンパク質のアミノ酸配列（配列番号：１０）を示す。
【図１】
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【図２Ａ−２Ｂ】
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【図３Ａ−３Ｊ】
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【図４Ａ−４Ｅ】
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【図５Ａ−５Ｄ】
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【図６Ａ−６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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