(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
核ドナー細胞としてブタ由来の平滑筋様細胞（Myoid細胞）を用いることを特徴とし、平滑筋様細胞が、扁平状の細胞で、低いアルカリフォスファターゼ活性を示すことを指標として生殖細胞と区別することができる細胞であるブタクローン胚の作製方法。
【請求項２】
平滑筋様細胞が、精細管基底膜由来の細胞、又は血管壁由来の細胞であることを特徴とする請求項１に記載のブタクローン胚の作製方法。
【請求項３】
平滑筋様細胞の遺伝子が改変されていることを特徴とする請求項１又は２に記載のブタクローン胚の作製方法。
【請求項４】
以下の（１）〜（４）の工程を含むブタクローン胚の作製方法、
（１）除核したブタ由来の卵を調製する工程、
（２）ブタ由来の扁平状の細胞で、低いアルカリフォスファターゼ活性を示すことを指標として生殖細胞と区別することができる平滑筋様細胞（Myoid細胞）を調製する工程、
（３）除核したブタ由来の卵と平滑筋様細胞を融合させる工程、
（４）融合卵を培養し、ブタクローン胚を得る工程、
【請求項５】
平滑筋様細胞が、精細管基底膜由来の細胞、又は血管壁由来の細胞であることを特徴とする請求項４に記載のブタクローン胚の作製方法。
【請求項６】
平滑筋様細胞の遺伝子が改変されていることを特徴とする請求項４又は５に記載のブタクローン胚の作製方法。
【請求項７】
請求項１乃至６のいずれか一項に記載のブタクローン胚の作製方法によって作製されたブタクローン胚を仮親となるブタの卵管又は子宮に移植し、クローンブタを得ることを特徴とするクローンブタの作製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、平滑筋様細胞を核ドナー細胞として用いたクローン胚の作製方法、及びその方法によって作製されたクローン胚を用いたクローン動物の作製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
クローンブタなどの体細胞クローン動物の核ドナー細胞としては、現在、胎児繊維芽細胞が広く用いられている（非特許文献１、非特許文献２）。しかしながら、この細胞に遺伝子改変を施した場合、選択培養の過程で増殖性が低下したり、クローン胚の発生能が低下するなどの問題点が指摘されている（非特許文献１、非特許文献３）。
【０００３】
【非特許文献１】Onishi A et al. (Onishi A, Iwamoto M, Akita T, Mikawa S, Take K, Awata T, Hanada H, Perry AC) Pigcloning by microinjection of fetal fibroblast nuclei.Science. 2000 Aug 18;289 (5482):1188-90..
【非特許文献２】De Sousa PA, Dobrinsky JR, Zhu J, Archibald AL, Ainslie A, Bosma W, Bowering J, Bracken J, Ferrier PM, Fletcher J, Gasparrini B, Harkness L, Johnston P, Ritchie M, Ritchie WA, Travers A, Albertini D, Dinnyes A, King TJ, Wilmut I, Somatic cell nuclear transfer in the pig :control of pronuclear and integration with improved methods for activation and maintenance of pregnancy., Biol Reprod. 2002 Mar;66 (3):642-50.
【非特許文献３】Watanabe S, Iwamoto M, Suzuki S, Fuchimoto D, Honma D, Nagai T, Hashimoto M, Yazaki S, Sato M, Onishi A., A novel method for production of transgenic cloned pig :electroporation-mediated gene transfer to non-cultured cells and subsequent selection with puromycin. Biol Reprod. 2005 Feb;72 (2):309-15.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上述したように、現在核ドナー細胞として広く用いられている胎児繊維芽細胞は、遺伝子改変を施すことにより種々の問題が生じる。このため、胎児繊維芽細胞に代わる新たな核ドナー細胞が求められている。
本発明は、このような技術的背景の下になされたものであり、遺伝子改変を施した場合であっても、高確率でクローン胚を発生させることのできる新規な核ドナー細胞を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、平滑筋様細胞が核ドナー細胞として胎児繊維芽細胞とほぼ同等の胚盤胞への発生効率を示し、なおかつ外来遺伝子の導入効率が胎児繊維芽細胞よりも高いことを見出し、この知見に基づいて本発明を完成するに至った。
【０００６】
即ち、本発明は、以下の〔１〕〜〔９〕を提供するものである。
〔１〕核ドナー細胞として平滑筋様細胞を用いることを特徴とするクローン胚の作製方法。
〔２〕平滑筋様細胞が、精細管基底膜由来の細胞、又は血管壁由来の細胞であることを特徴とする〔１〕に記載のクローン胚の作製方法。
〔３〕平滑筋様細胞が、ブタ由来の細胞であることを特徴とする〔１〕又は〔２〕に記載のクローン胚の作製方法。
〔４〕平滑筋様細胞の遺伝子が改変されていることを特徴とする〔１〕乃至〔３〕のいずれかに記載のクローン胚の作製方法。
〔５〕以下の（１）〜（４）の工程を含むクローン胚の作製方法、
（１）除核した卵を調製する工程、
（２）平滑筋様細胞を調製する工程、
（３）除核した卵と平滑筋様細胞を融合させる工程、
（４）融合卵を培養し、クローン胚を得る工程、
〔６〕平滑筋様細胞が、精細管基底膜由来の細胞、又は血管壁由来の細胞であることを特徴とする〔５〕に記載のクローン胚の作製方法。
〔７〕平滑筋様細胞が、ブタ由来の細胞であることを特徴とする〔５〕又は〔６〕に記載のクローン胚の作製方法。
〔８〕平滑筋様細胞の遺伝子が改変されていることを特徴とする〔５〕乃至〔７〕のいずれかに記載のクローン胚の作製方法。
〔９〕〔１〕乃至〔８〕のいずれかに記載のクローン胚の作製方法によって作製されたクローン胚を仮親動物の卵管又は子宮に移植し、クローン動物を得ることを特徴とするクローン動物の作製方法。
【発明の効果】
【０００７】
本発明のクローン胚及びクローン動物の作製方法において用いる平滑筋様細胞は、核ドナー細胞として一般的に用いられている胎児繊維芽細胞よりも調製が容易であり、また、遺伝子導入効率も高い。更に、血清濃度の低い培地でも増殖することができる。従って、本発明の方法により、従来よりも効率的にクローン胚及びクローン動物を作製できるようになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のクローン胚の作製方法は、核ドナー細胞として平滑筋様細胞（Myoid細胞）を用いることを特徴とするものである。
平滑筋様細胞は、精細管基底膜、血管壁などに存在する扁平状の細胞で、精細管を構成する細胞の中で低いアルカリフォスファターゼ活性を示すことを指標として生殖細胞など他の細胞と区別することができる。
【０００９】
平滑筋様細胞としては、精細管基底膜由来の細胞、血管壁由来の細胞などを用いることができる。
精細管基底膜由来の平滑筋様細胞は、動物から精巣を摘出し、これをコラゲナーゼとトリプシンで処理することにより、採取することができる。
血管壁由来の平滑筋様細胞は、Leik CE らの報告（Leik CE, Willey A, Graham MF, Walsh SW) Isolation and culture of arterial smooth muscle cells from human placenta Hypertension. 2004 Apr;43(4):837-40. Epub 2004 Feb 16）に従い、胎盤組織から切除した動脈組織を細切して、10％ウシ胎児血清を含むダルベッコ修正イーグル培地中で4〜5週間培養することで得られる。
【００１０】
平滑筋様細胞は、遺伝子改変が施されていることが好ましい。ここでいう遺伝子改変には、外来性の遺伝子の導入、内在性の遺伝子の破壊（ノックアウト）、内在性の遺伝子の置き換え（ノックイン）などを含む。導入する外来性の遺伝子は特に限定されず、例えば、CYP3A4, CYP2A6, CYP2B6およびCYP1A2に代表されるヒト薬物代謝酵素遺伝子群あるいは、ヒトG-CSFなどのサイトカイン類やヒトアルブミンなど血清タンパク質の遺伝子を含む。破壊又は置き換える内在性の遺伝子も特に限定されず、例えば、ブタアルブミン遺伝子、α  1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子、SLA（ブタ主要組織適合抗原）クラスI, IIおよびIIIの各遺伝子およびブタ内在性レトロウイルス（PERV-A, PERV-BおよびPERV-C）に由来するGag, Pol, およびEnv等のウイルスタンパク質遺伝子を含む。
【００１１】
本発明のクローン胚の作製方法は、核ドナー細胞として平滑筋様細胞を用いること以外、通常のクローン胚の作製方法と同様に行うことができる。本発明のクローン胚の作製方法の一例として、以下の（１）〜（４）の工程を含む方法を挙げることができる。
【００１２】
工程（１）：この工程では、除核した卵を調製する。卵の除核は、クローン胚の作製に一般的に採用されている手法に従って行うことができる。このような方法としては、例えば、Polejaeva IAらの文献 （Polejaeva IA, Chen S-H, Vaught TD, Page RL, Mullins J, Ball S, Dai Y, Boone J, Walker S, Ayares D, Colman A, Campbell KH. Cloned pigs produced by nuclear transfer from adult somatic cells. Nature 2000; 407: 86-90.）に記載されている方法などを挙げることができる。使用する卵は、ヒト以外の動物の卵であればどのようなものでもよいが、工程（２）で使用する平滑筋様細胞と同じ種類の動物の卵を用いるのが好ましい。また、除核は未受精卵に対して行うことが好ましく、特に第一極体の放出後の成熟卵に対して行うのが好ましい。
【００１３】
工程（２）：この工程では、平滑筋様細胞を調製する。平滑筋様細胞は、上述したものを使用することができ、それぞれ上述した方法によって調製することができる。平滑筋様細胞は、ヒト以外の動物由来のものであればどのような動物のものでもよいが、哺乳動物、例えば、ヒツジ、ウシ、ヤギ、ブタ、マウス、ウサギ、イヌ、ネコ由来の平滑筋様細胞を使用するのが好ましく、ブタ等の有蹄類由来の平滑筋様細胞を使用するのが更に好ましく、ミニブタ由来の平滑筋様細胞を使用するのが最も好ましい。
【００１４】
調製した平滑筋様細胞は、血清飢餓培養法（Campbell KHS, McWhir J, Ritchie WA, Wilmut I. Sheep cloned by nuclear transfer from a cultured cell line. Nature 1996; 380: 64-66.）、接触阻止法（Onishi A, Iwamoto M, Akira T, Mikawa S, Takeda K, Awata T, Hanada H, Perry ACF. Pig cloning by microinjection of fetal fibroblast nuclei. Science 2000; 289: 1188-1190.）などにより、細胞周期を休止期に誘導する。
【００１５】
工程（３）：この工程では、除核した卵と平滑筋様細胞を融合させる。卵と平滑筋様細胞の融合は、クローン胚の作製に一般的に採用されている手法、例えば、電気融合法、注入法などによって行うことができる。電気融合法は、例えば、Polejaeva IAらの文献（Polejaeva IA, Chen S-H, Vaught TD, Page RL, Mullins J, Ball S, Dai Y, Boone J, Walker S, Ayares D, Colman A, Campbell KH. Cloned pigs produced by nuclear transfer from adult somatic cells. Nature 2000; 407: 86-90.）の記載に従って行うことができ、注入法はOnishi Aらの文献（Onishi A, Iwamoto M, Akira T, Mikawa S, Takeda K, Awata T, Hanada H, Perry ACF. Pig cloning by microinjection of fetal fibroblast nuclei. Science 2000; 289: 1188-1190.）の記載に従って行うことができる。電気融合法による電気刺激は、平滑筋様細胞の核が卵に移植され、正常な胚が形成され得る範囲内であれば特に限定されないが、例えば、直流パルスであれば電圧は100〜300V/mm、時間は10〜30 micro-sec、回数は1〜3回とするのが好ましく、交流であれば周波数は1〜5MHz、電圧は1〜10V、時間は1〜30secとするのが好ましい。
【００１６】
融合処理後の卵には、活性化処理を行うのが好ましい。活性化処理は、クローン胚の作製に一般的に採用されている手法、例えば、電気刺激や塩化ストロンチウム処理などにより行うことができる。電気刺激による活性化処理としては、電圧30〜200 V/mm、時間10〜200 micro-sec、1〜5 回の直流パルスを印加する方法などを例示できる。また、活性化処理は、融合処理から0〜6時間後に行うのが好ましい。
また、活性化処理後の卵には、極体放出抑制処理を行うのが好ましい。極体放出抑制処理は、サイトカラシンなどを用いて行うことができる。
【００１７】
工程（４）：この工程では、融合卵を培養し、クローン胚を得る。融合卵の培養は、クローン胚の作製に一般的に採用されている手法、例えば、Betthauser Jらの文献（Betthauser J, Forsberg E, Augenstein M, Childs L, Eilertsen K, Enos J, Forsythe T, Golueke P, Jurgella G, Koppang R, Lesmeister T, Mallon K, Mell G, Misica P, Pace M, Pfister-Genskow M, Strelchenko N, Voelker G, Watt S, Thompson S, Bishop M. Production of cloned pigs from in vitro systems. Nature Biotechnology 2000; 18: 1055-1059.）の記載に従って行うことができる。培地としては、NCNU23培地、TCM199、BECM、PZM培地などを使用することができる。
【００１８】
以上のように作製されたクローン胚を仮親動物の卵管あるいは子宮に移植し、クローン動物を得る。クローン胚の卵管あるいは子宮への移植は、クローン動物の作製に一般的に採用されている手法、例えば、Onishi Aらの文献（Onishi A, Iwamoto M, Akira T, Mikawa S, Takeda K, Awata T, Hanada H, Perry ACF. Pig cloning by microinjection of fetal fibroblast nuclei. Science 2000; 289: 1188-1190）やBetthauser Jらの文献（Betthauser J, Forsberg E, Augenstein M, Childs L, Eilertsen K, Enos J, Forsythe T, Golueke P, Jurgella G, Koppang R, Lesmeister T, Mallon K, Mell G, Misica P, Pace M, Pfister-Genskow M, Strelchenko N, Voelker G, Watt S, Thompson S, Bishop M. Production of cloned pigs from in vitro systems. Nature Biotechnology 2000; 18: 1055-1059.）の記載に従って行うことができる。仮親動物は、ヒト以外の動物であれば特に限定されないが、平滑筋様細胞を採取した動物と同じ種類の動物を用いることが好ましい。クローン胚は、正常なクローン動物に生育できるものであれば特に限定されないが、１細胞期から胚盤胞期の胚を使用するのが好ましい。
【実施例】
【００１９】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明する。
〔実施例１〕  平滑筋様細胞の採取
Ogawa T et al. (Ogawa T, Arechaga M J, Avarbock M R, Brinster R) Transplantation of testis germ cells into mouse seminiferous tubules. Int.J.Dev.Biol.41:111-122 (1997)に報告されている様に滅菌したろ紙の上で摘出した精巣から脂肪塊と白膜を除去した。抗生物質（ストレプトマイシンおよびペニシリン各100μ/ml）を含むPBS-で洗浄した後、37℃に加温したコラゲナーゼ溶液（5mg/ml）中で細切した精巣を培養した。この際、定期的に転倒混和することで精細管から間質細胞を分離した。試験管の底に沈澱した精細管を残してコラゲナーゼ溶液を捨て、精細管をハンクス液で2回洗浄した。次に、細精管の組織塊の10倍量の0.25%トリプシン溶液と2倍量のDNase I溶液(5mg/ml)を加えて37℃のインキュベータ内で培養した。培養後良くピペッテイングを加えて可能な限り細胞をバラバラにした。等量のハンクス液を加えて遠心（1,000 rpm）した後で、細胞を適当な濃度に調整しコラーゲン処理したスラントネックフラスコ（75 cm2）で1晩培養した後に付着細胞のみを分離し平滑筋様細胞として培養・継代を行なった。
平滑筋様細胞の写真を図１（付着状態）及び図２（浮遊状態）に示す。
【００２０】
〔実施例２〕  平滑筋様細胞の培養
実施例１で採取した平滑筋様細胞をFBS添加DMEM培地で培養した。平滑筋様細胞は、初代細胞としては高い増殖性を示し、2% FBS添加DMEM (37℃, 5%CO2)および15% FBS添加DMEMにおけるdoubling timeはそれぞれ48hおよび24hrであり、胎児繊維芽細胞の増殖速度を上回った。また、継代に対する染色体の安定性を調べたところ、3代継代時で80％以上の細胞が正常な染色体数（38+XY）を保持していることが確かめられた。
【００２１】
〔実施例３〕  平滑筋様細胞に対する外来遺伝子の導入
遺伝子導入試薬Superfect（QIAGEN）を用いて平滑筋様細胞に対する外来遺伝子の導入効率を調べた。遺伝子導入試薬に対するDNAの比率は、Superfect のprotocolに従って検討し、平滑筋様細胞で最も効果的であった比率2：1に設定した（繊維芽細胞でも同じ結果）。導入するレポーター遺伝子は、マーカー遺伝子としてGFP遺伝子とNeomycine耐性遺伝子が組み込まれたpGreen Lantern-1(GIBCO BRL)を用い、 6 well plate（1well当たりおよそ 1×105個の細胞）に播種した細胞に対してトランスフェクションを試みた。トランスフェクション後は、抗生物質G418（50〜100ng/ml）を添加したDMAM培地で2週間培養を行い、恒常的にGFPを発現する細胞を選択した。
トランスフェクションの結果、供試細胞のおよそ2％のGFP陽性細胞（図３）が得られた。さらに選択培養を行うことで、供試細胞のおよそ0.2％のGFP発現細胞（図４）が確保できた（表1）。この作出効率は、6x105個の平滑筋様細胞にトランスフェクションを行うことによって、1回の核移植実験に用いる遺伝子導入細胞（1〜5x102個）が得られる計算となる。
【表１】
0004830139.tif 000002
【００２２】
〔実施例４〕  平滑筋様細胞核由来のクローン胚の体外培養試験
平滑筋様細胞の核ドナー細胞としての可能性を検討するために、平滑筋様細胞核と体外成熟卵を用いてクローン胚を作出し、体外培養における胚盤胞期胚への発生率を調べた。
核ドナーとなる平滑筋様細胞は、あらかじめ0.5％血清添加DMEM培地中で血清飢餓培養を行った（細胞周期のG0同調）。
IVM(体外成熟卵)をレシピエント細胞質に用いた。ドナー細胞は、あらかじめ0.5％血清添加DMEM培地中で血清飢餓培養を行った。（細胞周期のG0同調）続いて、トリプシン・遠心処理した後、Hepes-buffered NCSU23を加えて懸濁し、実験に使用した。囲卵腔に挿入したドナー細胞とレシピエント細胞質を、電気刺激(28V)により融合した。融合後1.0〜1.5時間で、再構築胚に電気的活性化を付与した。核移植胚はPZM-5(IFP, 0410P)を基礎とする培地にて7日間培養し、正常分割率、胚盤胞形成率を記録した。なお、実験に用いたIVM卵の成熟率は84.7%(211/249)であった。
核移植の結果、クローン胚のおよそ10％（胎児繊維芽細胞：16%）が胚盤胞期胚へ発達し（図５）、平滑筋様細胞核が発生能力を保持していることが確認された。
【００２３】
〔実施例５〕  平滑筋様細胞の増殖性と添加血清濃度
24 well plateの1well当たり8.2x103個の平滑筋様細胞を播種して血清を0、0.5%、1%および15%の各濃度で添加したDMEM培地で細胞を培養して増殖性を比較検討した。
平滑筋様細胞は培地中の血清を完全に除くと増殖を停止したが、低血清濃度（0.5%）培地においては、若干の増殖性を示した。一方、高濃度（15%）の血清を添加した培地中では良く増殖し, doubling timeは24hに短縮した。
【表２】
0004830139.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】平滑筋様細胞の写真（付着状態）。
【図２】平滑筋様細胞の写真（浮遊状態）。
【図３】GFP陽性細胞の写真。
【図４】GFP発現細胞の写真。
【図５】脱出胚盤胞期胚の写真。
【図１】
0004830139.tif 000004
【図２】
0004830139.tif 000005
【図３】
0004830139.tif 000006
【図４】
0004830139.tif 000007
【図５】
0004830139.tif 000008