(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
菌体濃度が１％（ｖ／ｖ）以下であり、酵素濃度がタンパク量として１％（ｗ／ｖ）以上である酵素含有液から精密濾過により酵素を回収する方法であって、該酵素含有液にカチオン性界面活性剤を０．０１〜１％（ｗ／ｖ）添加して精密濾過を行うことを特徴とする酵素の製造方法。
【請求項２】
菌体濃度が１％（ｖ／ｖ）超の発酵培養液から菌体を分離し、得られた酵素含有液を限外濾過により精製・濃縮し、得られた菌体濃度が１％（ｖ／ｖ）以下であり、酵素濃度がタンパク量として１％（ｗ／ｖ）以上である酵素含有液にカチオン性界面活性剤を０．０１〜１％（ｗ／ｖ）添加して精密濾過を行うことを特徴とする酵素の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は酵素の製造方法に関し、詳しくは酵素含有液から効率良く酵素を回収する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発酵液を濾過し、発酵液中の微粒子、培養細胞および胞子などの不溶解物質を除去して目的とする酵素等の発酵生産物を回収する方法は公知である。ところが、濾過操作中に分離膜細孔の大きさに近い粒子によって分離膜の目詰まりを起こし、さらに膜面上に不溶解物質が堆積し、濾過効率の低下を招く問題がある。従来、こうした分離膜の物理的目詰まりや膜面上の不溶解物質の堆積に対し、膜面上を掃流しながら濾過を行う等の操作により、目詰まりや不溶解物質の堆積を避けていたが、高濃度菌体を含有する発酵液の場合には、発酵液の粘度が高いため、掃流する際の圧力損失が大きく、濾過圧力が増大し、不溶解物質の膜面上での圧密化をもたらし、かえって濾過効率の低下を招く問題があった。
このような問題を解決するため、ＪＰ−Ａ１１−３１８４８２では、精密濾過に際し高濃度の菌体を含有する発酵培養液にカチオン性界面活性剤を添加し、発酵液の粘度を低下させることにより、掃流する際の圧力損失と濾過圧力の増大を抑制し、濃縮率の向上により発酵生産物の回収率を向上している。またＪＰ−Ａ４−３５４５８５では、発酵液の処理に際し発酵培養液に凝集剤（カチオン系高分子物質）を添加することが提案されている。  しかしこれらの高分子凝集剤は分子量が数十万あり、繰り返し使用するうちに逆に膜がカチオン系の高分子により目詰まりを起こし、膜の洗浄回復が不能になる可能性があるという問題点があった。
【発明の開示】
【０００３】
本発明は、菌体濃度が１％（ｖ／ｖ）以下であり、酵素濃度が１％（ｗ／ｖ）以上である酵素含有液から精密濾過により酵素を回収する方法であって、該酵素含有液にカチオン性界面活性剤を０．０１〜１％（ｗ／ｖ）添加して精密濾過を行うことを特徴とする酵素の製造方法、並びに菌体濃度が１％（ｖ／ｖ）超の発酵培養液から菌体を分離し、得られた酵素含有液を限外濾過により精製・濃縮し、得られた菌体濃度が１％（ｖ／ｖ）以下であり、酵素濃度が１％（ｗ／ｖ）である酵素含有液にカチオン性界面活性剤を０．０１〜１％（ｗ／ｖ）添加して精密濾過を行うことを特徴とする酵素の製造方法である。
発明の詳細な説明
プロテアーゼ等の酵素の醗酵生産に際しては、まず発酵培養液から菌体を精密濾過等により分離し、次に菌体を分離して得られた酵素含有液を限外濾過により精製・濃縮する手法が用いられることが多い。
この方法により、菌体濃度が１％（ｖ／ｖ）以下、酵素濃度が１％（ｗ／ｖ）以上という高濃度の酵素含有液が得られるが、酵素生産菌の完全阻止、精製過程で発生する雑菌の除去、酵素溶液を高濃度化することにより発生する不溶物、残存する少量の夾雑物の完全除去等の観点から、この高濃度酵素含有液を更に精製・分離する要望が高まっている。
この高濃度酵素含有液の精製・分離には、精密濾過膜を用いることが考えられるが、このような高濃度酵素含有液の場合、菌体濃度が低く、発酵液の粘度が問題にならない溶液であるにも関わらず、高タンパク濃度であるため精密濾過の際の酵素透過率、透過流束が劣り、生産効率が非常に悪いという問題があることが判明した。
また一般的に高タンパク質溶液の精密ろ過による精製では、除去すべき混在するウイルス等の不純物は少量であっても、夾雑するｐｐｂオーダーのＤＮＡ等により膜透過における透過流束が減少すること、タンパク質溶液の透過率が悪いこと、といった問題点を有している。このような問題を解決する手段として、ＪＰ−Ａ  ２００４−８９１５５では、タンパク質溶液を膜によりろ過する際にタンパク質溶液をＤＮＡ分解酵素、ＤＮａｓｅで処理した後に、あるいはＤＮａｓｅ処理しつつ濾過する方法が提案されている。しかし、高濃度のプロテアーゼの発酵液中ではＤＮａｓｅ自身もタンパク質であるため、プロテアーゼにより容易に分解されてしまい効果が期待できない。
以上の通り、高濃度酵素含有液の最終的な精製・分離である精密ろ過による精製においては、十分な酵素透過率、透過流束を発現するのは非常に困難であり、生産効率が非常に悪いという問題点があることが判明した。
本発明者らは、精密濾過膜を用いた高濃度酵素含有液の最終的な精製・分離において十分に大きな酵素透過率、透過流束を実現する方法を検討した結果、前記の本発明を完成した。
本発明においては、菌体濃度が１％（ｖ／ｖ）以下であり、酵素濃度がタンパク量として１％（ｗ／ｖ）以上である酵素含有液を対象とし、これを精密濾過することにより酵素を回収する。菌体濃度は、更に０．５％（ｖ／ｖ）以下、特に０〜０．３％（ｖ／ｖ）であることが、精密濾過での負荷低減の点から好ましい。酵素濃度は、更に２％（ｗ／ｖ）以上、特に２〜１０％（ｗ／ｖ）であることが、処理液量と濾過速度による濾過の効率、酵素の溶解性の点から好ましい。菌体濃度は遠心効果１２０００Ｇ、沈降時間５ｍｉｎの条件で遠心分離した際の酵素含有液量に対する菌体の占める容積の比率として定義される。
本発明における酵素は、プロテアーゼ、エステラーゼ、カルボヒドラーゼ等をあげることができる。プロテアーゼの具体例としては、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン、コラゲナーゼ、ケラチナーゼ、エラスターゼ、スプリシチン、パパイン、アミノペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼ等を挙げることができる。エステラーゼの具体例としては、ガストリックリパーゼ、パンクレアチックリパーゼ、植物リパーゼ類、ホスホリパーゼ類、コリンエステラーゼ類、ホスホターゼ類等が挙げられる。カルボヒドラーゼとしては、セルラーゼ、マルターゼ、サッカラーゼ、アミラーゼ、ペクチナーゼ、α−及びβ−グリコシダーゼ等が挙げられる。また、酵素の等電点が７〜１３、更に８〜１２、特に９〜１１であることが、本発明の効果が大きい点から好ましい。また本発明における酵素は、酵素の有用性、本発明の効果が大きい点から、プロテアーゼが好ましく、更にアルカリプロテアーゼが好ましい。
酵素濃度は、タンパク量として定義される。
本発明における精密濾過は、精密濾過膜を使用して行う。精密濾過膜の形式は、膜面上を掃流して濾過を行う形式であれば特に制限はなく、平膜、中空糸状膜、チューブ状膜等のいずれであっても良い。膜の材質は例えば、アルミナ、チタニア、ジルコニア等のセラミック、ガラス、金属等の無機膜、または、酢酸セルロース系、ニトロセルロース系、脂肪族ポリアミド系、ポリスルホン系、ポリオレフィン系、ポリアクリロニトリル系、ポリエーテルスルホン系、ポリ塩化ビニル系、ポリビニルアルコール系、フッ素系高分子等の有機膜が挙げられる。
分離膜面上の掃流の観点からは、膜面速度が大きいほど膜面上の掃流効果が大きくなる。しかし、ある速度以上では、圧力損失が大きくなり、膜近傍でのゲル層の圧密化が起こり、膜透過流束および酵素含有液中の酵素の回収率が低下する。また、膜面速度が低過ぎると圧力損失は低下し、圧密化は回避されるが、ゲル層の剥離効果が低下し、酵素含有液中の酵素の回収率が低下する。これらの点から膜面速度は０．５〜３ｍ／ｓ、更に０．５〜１．５ｍ／ｓとすることが好ましい。
本発明において精密濾過により分離する際における膜間差圧は、入口と出口の平均膜間差圧をいい、通常０．２ＭＰａ以下が好ましく、より好ましくは０．０２〜０．１５ＭＰａである。膜間差圧が０．０２ＭＰａより小さいと透過流束が低下し、処理性が悪化する傾向がある。また、膜間差圧が０．２ＭＰａを超えると膜面でのゲル層の圧密化等により膜閉塞が生じて透過流束が低下する場合があるので好ましくない。また、膜間差圧の与え方は、原液側加圧式、透過液側減圧式あるいは両者の組み合わせでも良い。操作温度は、通常０〜４０℃であり、好ましくは５〜３０℃である。操作温度が０℃未満では酵素含有液の粘度が大きくなるため膜透過流束が低下することがあり、また４０℃を超えると酵素含有液の性状が悪化し、好ましくない。
本発明における運転方法としては、上述するような一定の圧力をかけて透過流束は成り行きとなる定圧濾過方式だけでなく、一定流量で透過液を抜き出す定流量濾過方式も採用される。また、膜の濾過性を高く維持するために、膜の透過側から定期的に透過液を逆流させる操作（逆洗）を行っても良い。
本発明においては、精密濾過を行う前に、上記酵素含有液にカチオン性界面活性剤を０．０１〜１％（ｗ／ｖ）添加することが必要である。本発明で使用するカチオン性界面活性剤は特に限定はされないが、モノ又はジ長鎖アルキル基を有する第４級アンモニウム塩型の化合物が作用効果の点から好ましく、具体的には平均炭素数８〜１８の直鎖アルキル基を含むモノアルキルトリメチルアンモニウムクロリド、モノアルキルトリメチルアンモニウムブロマイド、ジアルキルジメチルアンモニウムクロリド、ジアルキルジメチルアンモニウムブロマイド、モノアルキルジメチルベンジルアンモニウムクロリド（塩化ベンザルコニウム塩）等が挙げられる。平均炭素数は、更に１０〜１８、特に１２〜１８であることが酵素含有液への溶解性、作用効果の点から好ましい。
カチオン性界面活性剤の添加量は、純分で定義される。カチオン性界面活性剤の酵素含有液への添加量は、酵素含有液中の濃度として０．０１〜１％（ｗ／ｖ）、更に０．０２〜０．５％（ｗ／ｖ）、特に０．０３〜０．３％（ｗ／ｖ）であることが、酵素透過性の向上、透過流束の向上の点から好ましい。添加方法は特に限定されないが、酵素含有液に充分に作用させることができる点から、カチオン性界面活性剤を水あるいはイソプロピルアルコール等の溶剤に予め溶解した状態で酵素含有液に添加し、何らかの手段（例えば攪拌モータによる攪拌やポンプによる液循環）により１０分程度、撹拌、混合することが好ましい。
本発明におけるカチオン性界面活性剤の添加量は、酵素含有液の種類や性状により異なる。酵素含有液の種類や性状に対応して適したカチオン性界面活性剤の添加量を、下記のような方法で求めることが好ましい。適した添加量を求めるには種々添加量を変えて濾過をそれぞれ単独で行ってもよいが、手間がかかることから、以下のような簡便な濾過方法により、一度で必要な添加量を求めることができる。すなわち、所定の条件で全循環で濾過を行い（原液の活性が変わらないように透過液をそのまま原液に戻す。）、透過液の濾過速度、酵素濃度が一定になるまでに約２時間濾過を行う。透過液の濾過速度、酵素濃度が一定となったら透過液のサンプリングを行い、透過液中の酵素濃度及び透過流束を測定する。透過液はサンプリング後、すぐに原液に戻し、原液の酵素濃度、液量が極力変わらないようにする。一定になった後、装置を一旦停止し、原液に所定量のカチオン性界面活性剤を添加し、１５分間混合し、再度同様に１５分間濾過を行い、透過液中の酵素濃度及び透過流束を測定する。その後、同様にカチオン性界面活性剤を添加し活性剤濃度を増やし、活性剤濃度と酵素の透過率、透過流束の関係を調べる。以上のような操作により、適した添加量を簡便に求めることができる。
本発明においては、菌体濃度が１％（ｖ／ｖ）超の発酵培養液から菌体を分離し、得られた酵素含有液を限外濾過により精製・濃縮し、得られた菌体濃度が１％（ｖ／ｖ）以下であり、酵素濃度がタンパク量として１％（ｗ／ｖ）以上である酵素含有液にカチオン性界面活性剤を０．０１〜１％（ｗ／ｖ）添加して精密濾過を行うことが好ましい。
本発明における発酵培養液とは、発酵生産物、即ち微生物が有機物を分解し、その代謝物として蓄積される生産物を含有する液をいう。発酵培養液は、例えば細菌、放線菌、カビ、酵母等の微生物を培養したものでも良く、動物あるいは植物の細胞を培養したものでも良い。具体的には、アルコール発酵、醤油、食酢等の食品発酵、抗生物質および抗ガン物質の発酵、有機酸発酵、アミノ酸発酵、酵素の発酵等が挙げられる。発酵培養液は、菌体濃度が１％（ｖ／ｖ）超、更に３％（ｖ／ｖ）以上、特に１０〜２０％（ｖ／ｖ）のものである。なお、発酵培養液中の酵素濃度は０．１〜２％（ｗ／ｖ）程度である。本発酵終了時点の発酵培養液中には、微生物等の菌体が高濃度で存在するため、まず菌体を分離することが好ましい。本発明における発酵培養液からの菌体の分離法は、例えば精密濾過法、遠心分離、フルタープレス等が挙げられ、これらの方法を組み合わせても良いが、精密濾過膜を使用して行うことが好ましい。
発酵培養液からの菌体の分離すなわち発酵生産物の回収を行った後、通常、限外濾過により濃縮を行うことが好ましい。限外濾過とは、膜口径が例えば０．１ｎｍ〜２ｎｍの範囲ないし分画分子量が５００〜１０万の範囲の限外濾過膜を用いて濾過し、これより大きな粒子や高分子物質が濾過膜により阻止され、低分子物質を、濾過膜を透過させることにより除去するプロセスをいう。当該操作により発酵生産物中の酵素濃度が０．１〜２％（ｗ／ｖ）であったものを１〜２０％（ｗ／ｖ）程度に濃縮することができる。
本発明に使用する限外濾過膜の形式・材質については、前記した精密濾過膜の場合と同様である。限外濾過膜により濃縮を行う際の膜面上の掃流を行うための膜面速度は大きいほど掃流効果が大きいが、０．５〜３ｍ／ｓが適当である。膜間差圧は大きいほど濾過速度は大きくなるが、あまり大きすぎると膜近傍でゲル層が圧密化するため、濾過速度は向上しなくなる。したがって００．５〜０．３ＭＰａが適当である。操作温度は０〜４０℃であり、好ましくは５〜３０℃である。操作温度が０℃未満では発酵生産物含有液の粘度が大きくなり、操作性が悪化する。また４０℃を超えると発酵生産物の活性が低下するため好ましくない。
限外濾過の操作条件としては１次濃縮の後、更に精製度を上げるために加水して更に濃縮を行う加水精製を行ってもよい。その際、発酵液の塩濃度が低下すると酵素の溶解度が低下する場合があり、加水精製には塩化カルシウム水や硫酸ナトリウム水溶液等を用いることもできる。また、限外濾過終了後の濃縮液にこれらの塩を添加しても良い。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、界面活性剤濃度と酵素透過率、膜透過流束の関係を示したグラフである。
【実施例】
【０００５】
次の実施例は本発明の実施について述べる。実施例は本発明の例示について述べるものであり、本発明を限定するためではない。
実施例１〜７、及び比較例１、２
バチルス  エスピーＫＳＭ−９８６５（ＦＥＭ−Ｐ１８５６６号）のアルカリプロテーゼ（等電点９．５付近）の発酵液（菌体濃度１０．８％（ｖ／ｖ））１００Ｌを有効膜面積０．４１ｍ２、細孔径０．１μｍ、糸内径１．９ｍｍφの中空糸精密濾過膜（旭化成（株）、ＰＳＰ−１１３Ｌ）により、１０℃にて精密濾過（ＭＦ）を行った。３倍に濃縮の後、濃縮液量に対して等量の脱イオン水を添加し、再度濃縮を行う操作を３回繰り返し、計１６８ＬのＭＦ透過液を得た。得られたＭＦ透過液を分画分子量６０００の限外濾過膜（旭化成（株）、ＡＩＰ−２０１３，膜面積１ｍ２）にて限外濾過濃縮（ＵＦ）を行った。７倍濃縮の後、濃縮液量に対して、等量の０．４％（ｖ／ｖ）塩化カルシウム水溶液を添加し、再度濃縮を行う操作を９回行い、タンパク濃度４．８％（ｗ／ｖ）のＵＦ濃縮液を２３．５Ｌ得た。このときのＵＦ濃縮液中の菌体濃度は０％（ｖ／ｖ）であった。その後、ＵＦ濃縮液に２％（ｖ／ｖ）の濃度になるように硫酸ナトリウムを溶解した。
上記液１．５Ｌを有効膜面積０．０１５ｍ２、細孔径０．２５μｍ、糸内径０．７ｍｍφモジュール長１３０ｍｍ糸本数１００本の中空糸精密濾過膜（旭化成（株）、ＰＳＰ−００３）により、１０℃にて精密濾過を行った。処理条件は、循環流量１．８Ｌ／ｍｉｎ（膜内線速度０．８ｍ／ｓ）、平均圧力０．０６Ｍｐａで行い、１５分間隔で膜の透過側から逆洗を行い、逆洗直後から次の逆洗までの間の１５分間の平均の酵素の透過率及び透過流束を測定し、一定になるまで約２時間濾過を行った。透過液はサンプリング後、すぐに原液タンクに戻し、原液の酵素濃度、液量が極力変わらないようにした（以下、「全循環操作」という）。酵素透過率が一定になった後、装置を一旦停止し、表１に示した界面活性剤を、それぞれ表１に示した量添加し、１５分間混合し、再度同様に逆洗の後１５分間濾過を行い、透過液中の酵素透過率及び透過流束を測定した。その後、同様にカチオン性界面活性剤を添加し活性剤濃度を増やしてゆき、活性剤濃度と酵素の透過率、透過流束の関係を調べた。酵素の透過率は次の（１）式で定義した。
酵素透過率（％）＝透過液活性（単位）／原液活性（単位）×１００  （１）
〔酵素活性測定法−カゼイン法〕
カゼイン１％（ｖ／ｖ）（ｈａｎｍｅｒｓｔｅｉｎ、メルク社）を含む５０ｍＭホウ酸緩衝溶液（ｐＨ１０）１．０ｍｌを３０℃で５分間保温した後、０．１ｍｌの酵素溶液を加え、１５分間反応を行った。反応停止液（０．１１Ｍトリクロロ酢酸−０．２２Ｍ酢酸ナトリウム−０．３３Ｍ酢酸）を２．０ｍｌ加え、室温で１０分間放置したのち、濾過（Ｎｏ１濾紙、アドバンテック東洋）を行い、濾液中の酸可溶タンパク質をＬｏｗｒｙらの方法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９３，２６５−２７５，１９８１）により次のように定量した。０．５ｍｌの濾液にアルカリ性銅液［１％酒石酸ナトリウムカリウム：１％硫酸銅：１％炭酸ナトリウム＝１：１：１００］を２．５ｍｌ添加し、３０℃にて１０分間放置後、希釈フェノール液（フェノール試薬（関東化学）を脱イオン水で２倍希釈）０．２５ｍｌを添加して３０分間恒温したのち、６６０ｎｍにおける吸光度を測定した。酵素１単位は、上記反応にて１分間に１ｍｍｏｌのチロシンに相当する酸可溶タンパク質分解物を遊離させるのに必要な酵素量とした。
〔タンパク質濃度の測定法〕
上記Ｌｏｗｒｙらの方法により、牛血清アルブミンをスタンダードとし、タンパク質濃度を測定した。
【表１】
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表１の結果から、カチオン性界面活性剤を添加することにより、精密濾過における酵素の透過率及び透過流束が大幅に向上することが分かった。また、アニオン性界面活性剤は、カチオン性界面活性剤に比べて酵素透過率向上効果が小さく、透過流束向上効果がないことが分かった。
実施例８、及び比較例３、４
上記実施例１で使用したアルカリプロテアーゼのＵＦ濃縮液（タンパク濃度４．８％（ｗ／ｖ））に硫酸ナトリウムを２％濃度になるように溶解した液２３．５Ｌを、有効膜面積０．２ｍ２、細孔径０．２５μｍ、糸内径０．７ｍｍφ、モジュール長３４７ｍｍ、糸本数４００本の中空糸精密濾過膜（旭化成（株）製、ＰＭＰ−１０２）により、１０℃にて全循環操作にて精密濾過を行った。処理条件は、循環流量７．２Ｌ／ｍｉｎ（膜内線速度０．８ｍ／ｓ）、平均圧力０．０５Ｍｐａで行い、実施例１と同様な操作を行った。酵素濃度が一定になった後、装置を一旦停止し、原液に表２に示した界面活性剤を、それぞれ表２に示した量添加し、１５分間混合し、再度同様に逆洗の後１５分間濾過を行い、透過液中の酵素濃度及び透過流束を測定した。また、それぞれの界面活性剤の濃度に対する効果の違いを図１に示した。
【表２】
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表２及び図１の結果から、膜のスケールが変わっても、同様にカチオン界面活性剤を添加することにより、精密濾過における酵素の透過率および透過流束が大幅に向上することが分かった。また、ノニオン性界面活性剤は、カチオン性界面活性剤に比べて酵素透過率向上効果が小さく、透過流束向上効果が小さいことが分かった。
実施例９、及び比較例５
比較例１、実施例４−１において、バチルス  エスピーＫＳＭ−９８６５（ＦＥＭ−Ｐ１８５６６号）のアルカリプロテーゼ（等電点９．５付近）に代えて、バチルス  エスピーＫＳＭ−Ｋ１６のアルカリプロテアーゼ（等電点１０．２付近）のＵＦ濃縮液（菌体濃度０％（ｖ／ｖ）、タンパク濃度５．６％（ｗ／ｖ））を用いる以外は、比較例１、実施例４−１と同様の操作を行った。結果を表３に示す。
【表３】
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表３より、異なる酵素においても、カチオン性界面活性剤を添加することにより、精密濾過における酵素の透過率及び透過流束が大幅に向上することが分かった。
【図１】
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