(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
メグルミン、ソルビトールリジン、マンニトールリジンおよびガラクチトールリジンよりなる群から選択される少なくとも１個の活性剤を含んでなり、且つ、水不溶性担体材料を含まない、糖尿病性腎障害、糖尿病性網膜症、糖尿病性末梢神経障害、糖尿病性高血圧、糖尿病性卒中、神経変性障害、＿アテローム性動脈硬化症、骨関節炎、白内障および老化による一般的な衰弱効果よりなる群から選択される疾患の治療のための医薬組成物。
【請求項２】
アルツハイマー型の老人性痴呆である神経変性障害の治療のための請求項１記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§２０２（ｃ）に従い、これにより、国立衛生研究所からの基金により一部作成された本明細書に記載する発明において、米国政府がある特定の権利を有することを承認する（登録番号ＤＫ４４０５０、ＤＫ５０３１７およびＤＫ５０３６４）。
発明の背景
本発明は、糖尿病の治療、特に、糖尿病性合併症または関連のある病因の他の障害の発症を予防、減少または遅延させるための治療薬およびそれらの使用に関する。より詳細には、本発明は、フルクトースリジン（ＦＬ）のフルクトース−リジン−３−リン酸（ＦＬ３Ｐ）への酵素的変換を阻害し、糖尿病性合併症に至る生物化学的メカニズムにおける重要な段階であると考えられる、ある種の酵素インヒビターに関する。本発明は、また、糖尿病患者の糖尿病性合併症を併発する危険性を評価する方法、ならびに糖尿病性合併症の発症の予防、減少または遅延における治療介入の効果を決定する方法にも関する。
糖尿病の４つの特に重い合併症、すなわち、糖尿病性腎障害または腎臓疾患；網膜の破壊のため失明を引き起こす糖尿病性網膜症；末梢神経機能の喪失を含む糖尿病性神経障害；および毛細管の損傷に起因する循環性の問題が存在する。網膜症および腎障害のどちらも、該病態に付随した一般的な循環性の問題のサブセットであると考えられる。後期糖尿病における微小血管機能不全の役割が近年、要約された（Tooke, Diabetes, 44: 721（1995））。該開示を通して、「糖尿病に付随した病状」なる語はおよび類義語は、種々のよく知られた網膜症、神経障害、腎障害、マクロ脈管障害ならびに糖尿病の他の合併症を包含することを意味する。
糖尿病から発生する病状と老化による病状との間の類似性は、多数報告されている。研究は、多くの糖尿病に付随した病状が通常の老化に付随した病状に臨床上、非常に類似するということを明らかにした。例えば、糖尿病において、動脈および関節が早期にこわばり、肺の弾力性および肺活量が早期に減少することが明らかにされた。さらに、アテローム性動脈硬化症、心筋梗塞および卒中は、同じ年齢の非糖尿病性の個体におけるよりも頻繁に糖尿病患者において起こる。糖尿病患者はまた、より感染されやすく、非糖尿病患者よりも若年で、高血圧、骨喪失の促進、骨関節炎およびＴ細胞機能の障害を有するようである。
糖尿病に付随した病状と老化の間の類似性は、共通のメカニズム原理を示すようである。種々のメカニズムが糖尿病に付随した病状と老化の両方に関する共通の生物化学的基礎として提案された。ヒト対象由来のデータにより最も強く支持される仮説は非酵素的グリコシル化メカニズムを前提とする。該仮説は、前記のような老化過程および糖尿病に付随した病状が少なくとも一部、グルコースおよびメイラード反応を介するグルコース誘導代謝産物によるタンパク質修飾および架橋によって引き起こされることを示す（Monnierら、Proc. Natl. Acad. Sci；USA, 81: 583（1984）およびLeeら、Biochem. Biophys. Res. Comm., 123: 888（1984））。かかるグリコシル化反応により得られる修飾タンパク質を本明細書では、進行性糖化終末産物修飾タンパク質（（advanced glycation end product modified proteins）ＡＧＥタンパク質）という。３−デオキシグルコソン（３ＤＧ）がＡＧＥタンパク質形成を導く多工程反応経路において鍵となる中間物質であることが広く認められている。３ＤＧは、タンパク質と反応してコラーゲンおよび基底膜のような細胞内および細胞外タンパク質の両方の架橋を導くことができる、グルコース誘導の代謝産物である。
糖尿病性合併症の場合、ＡＧＥタンパク質に至る反応は、該疾患に付随した慢性高血糖により速度論的に加速されると考えられる。該メカニズムを支持する証拠には、糖尿病対象由来のコラーゲンおよび水晶体のような長命のタンパク質が同じ年齢の正常な対照由来のタンパク質よりも有意に多くのＡＧＥタンパク質を含有することを示すデータが包含される。したがって、比較的若年での糖尿病患者における白内障の異常な発病率は、水晶体の修飾および架橋率の増加によって説明できる。同様に、糖尿病患者に見られる関節および動脈硬化、ならびに肺活量の喪失の初期の発症は、重要な構造タンパク質であるコラーゲンの修飾および架橋率の増加によって説明される。これらのタンパク質は長命なので、修飾の結果が累積する傾向にある。
糖尿病性合併症と高血糖の間の原因および効果の関係を明らかにするもう一つ別の因子は、高血糖性記憶である。該現象の特に著しい一例は、最初、糖尿病であって、次いで、正常な血中グルコースレベルに戻るように治療したイヌが重篤な網膜症を発病することである。イヌの目は治療の期間、組織学的に正常であったが、時間が経ち、グルコース濃度が正常化したにもかかわらず、これらの動物は糖尿病性網膜症を発病した（Engermanら、Diabetes, 36: 808（1987））。したがって、目に対する潜在的な損傷は、臨床症状が現れる前に、初期の高血糖症の期間に不可逆的に起こった。
糖尿病のヒトおよび動物は、正常より高い濃度の初期および後期糖修飾ＡＧＥタンパク質を有することが明らかにされた。実際、ＡＧＥタンパク質の増加は、血中グルコースレベルの増加よりも大きい。ＡＧＥタンパク質の濃度は、糖分子の何パーセントかが転位してタンパク質結合蛍光分子を生成するので、蛍光測定によって測定できる。
ＡＧＥタンパク質の病原的役割は、糖尿病に限らない。タンパク質糖化（glycation）は、アルツハイマー病に関係する（Harringtonら、Nature, 370: 247（1994））。タンパク質蛍光の増加は、また、老化とともに見られる。さらに、いくつかの学説は、老化過程が酸化的損傷および糖に誘導されるタンパク質修飾の組み合わせであることを明らかにしている。したがって、ＡＧＥタンパク質生成を減少させる治療はまた、他の病因学的に類似したヒトの病態の治療にも有用であり、おそらく、老化過程を減速させるかもしれない。
一般に、ＡＧＥタンパク質の形成はタンパク質アミノ基と糖、主としてグルコースの反応で開始すると仮定されている。１の典型的な参考文献は、「リジン残基のε−アミノ基の糖化により形成される最初の付加生成物は、アマドリ化合物、フルクトースリジン．．．である。糖化は、集合的にメイラードまたは褐変反応として知られる複雑な一連の反応における開始工程であり、最終的に、架橋された、沈殿した、酸化した、褐色の蛍光タンパク質の形成に至る。」と述べている（K. J. Knechtら、Archives of Biochem. Biophys., 294; 130（1992））。
糖からのＡＧＥタンパク質の形成は、フルクトース−リジン含有タンパク質を生成するための初期に糖との不可逆的反応を含む多工程プロセスである。次いで、これらの修飾タンパク質は、反応し続けて、不可逆的に修飾されたＡＧＥタンパク質を生成する。ＡＧＥタンパク質に対して作成された抗体がフルクトース−リジンと反応しないので、ＡＧＥタンパク質が糖化リジン残基を含有するタンパク質と同一でないことは、明らかである。また、ＡＧＥタンパク質が多数の化学種として存在することも明らかであるが；ほとんど同定されていない。化学種（ε−アミノ−（カルボキシメチル）リジンは、近年の研究において、１つの重要な最終的なＡＧＥタンパク質構造として同定された（Reddyら、Biochem., 34: 10872（1995）およびIkedaら、Biochemistry, 35: 8075（1996））。該研究は、約５０％の修飾部位を作成する別のＡＧＥタンパク質エピトープを化学的に同定できなかった。リボースからのＡＧＥタンパク質生成の速度論を研究する方法は、近年、発展してきた（Khalifahら、Biochemistry, 35: 4645（1996））。しかしながら、該研究は、リボースがＡＧＥタンパク質生成において重要な生理学的役割を果たし得ることを示唆し、後記に挙げる糖化リジンおよびフルクトース−リジンの比較的幅広い定義を支持する。
他の参考文献は、糖化リジン残基を含有するタンパク質とＡＧＥタンパク質との間の定義、「シッフ塩基およびアマドリ生産物は、各々、数時間および数週で平衡レベルに達する。初期のグリコシル化産物の全量は、非常に長命のタンパク質上であっても、短期間で定常期に到達するので、該生成物の可逆的に平衡な性質は重要である。．．．慢性糖尿病において、これらの初期のグリコシル化産物は、何年にもわたってコラーゲンおよび他の安定な組織タンパク質上に蓄積し続けないので、それらの濃度が糖尿病性網膜症の存在または重篤度のいずれかと相関しないことは驚くべきことではない．．．しかしながら、脈管壁のコラーゲンおよび他の長命なタンパク質上の初期のグリコシル化産物のいくつかは、解離しない。その代わり、それらは、ゆっくりとした複雑な一連の化学的転位を行って、不可逆的な進行性糖化終末産物を生成する」と示している（M. Brownleeら、New England Journal of Medcine, 318: 1315（1988））。科学文献に記載されたこれらの修飾タンパク質を生成する唯一の経路は、タンパク質と糖分子間の開始反応を含む。
多数の参考文献は、ＡＧＥタンパク質の生成が多工程経路によって起こり、３−デオキシグルコソン（３−ＤＧ）が該経路の鍵となる中間物質であることを示す（M. Brownlee, Diabetes, 43: 836（1994）；M. Brownlee, Diabetes Care, 15: 1835（1992）；T. Niwaら、Nephron, 69: 438（1995）；W. L. Dills, Jr., Am. J. Clin. Nutr., 58: S779（1993）；H. Yamadatら、J. Biol. Chem., 269: 20275（1994）；N. Igakiら、Clin. Chem., 36: 631（1990））。糖とタンパク質の反応からの３ＤＧの形成に関して一般に受け入れられた経路を図１に説明する。図１に示すように、糖（グルコース）分子は、最初、タンパク質−リジンアミノ基（Ｉ）とシッフ塩基を形成する。次いで、得られたシッフ塩基が転位して、フルクトース−リジン修飾タンパク質（ＩＩ）を生成する。（ＩＩ）に至るまでの反応は、自由で可逆的である。（ＩＩ）が転位して、３ＤＧおよび遊離のタンパク質リジンを生成することができる。３ＤＧとタンパク質の間のその後の反応は、ＡＧＥタンパク質形成における第１の不可逆的工程である。
知られる限りでは、３ＤＧが別の経路でも生成できると報告されておらず、あるいは実際、３ＤＧの主源が、図１に示される非触媒的反応よりもむしろ、酵素触媒代謝経路由来であることも報告されていない。
糖尿病患者は、非糖尿病患者よりも有意に多くの３ＤＧを血清中に有する（１２．７８±２．４９μＭ対１．９４±０．１７μＭ）（Toshimitsu Niwaら、Nephron, 69: 438（1995））。それにもかかわらず、この毒性化合物は、正常な健康な個体において見出される。したがって、身体が該分子の無毒化経路を発達させたことは驚くべきことではない。これらの反応の１つは、アルデヒド還元酵素により触媒され、尿中に効率よく排出される３−デオキシフルクトース（３ＤＦ）に還元することによって３ＤＧを無毒化する（Takahashiら、Biochem, 34: 1433（1995））。別の無毒化反応は、オキソアルデヒド脱水素酵素によって３ＤＧを３−デオキシ−２−ケトグルコン酸（ＤＧＡ）に酸化する（Fujiiら、Biochem. Biophys. Res. Comm., 210: 852（1995））。
現在までの研究の結果は、これらの酵素の少なくとも１種類、アルデヒド還元酵素の有効性が糖尿病において悪影響を及ぼすことを明らかにしている。正常なラット肝臓から単離される場合、該酵素のフラクションは、リジン６７、８４および１４０において部分的に糖化され、正常な非修飾酵素と比べて低い触媒効率を有する（Takahashiら、Biochem., 34: 1433（1995））。糖尿病患者は、正常な血糖の個体よりも高い割合の糖化タンパク質を有するので、より高レベルの３ＤＧを有し、３ＤＦへの還元によって該反応性分子を無毒化する能力が減少しているようである。
アルデヒド還元酵素のメカニズムは、研究されてきた。これらの研究は、この重要な無毒化酵素がアルドース還元酵素インヒビター（ＡＲＩ）によって阻害されることを決定した（Barskiら、Biochem., 34: 11264（1995））。ＡＲＩは、現在、糖尿病性合併症を減少させる可能性について臨床研究の下にある。これらの化合物は、ある特定の種類として、短期の糖尿病性合併症に対するいくつかの効果を明らかにされた。しかしながら、それらは、長期の糖尿病性合併症に対する臨床上の効果が欠けており、それらは、高タンパク質食餌を与えられたラットにおける腎臓機能を悪化させる。後記に明らかにされるように、この知見は、本発明の基礎となる新たに見出されたリジン回収のための代謝経路と一致する。高タンパク質食餌は、腎臓リジン回収経路（lysine recovery pathway）により３ＤＧへの変換を行うフルクトース−リジンの消費を増加させるであろう。得られた３ＤＧの３ＤＦへの還元による無毒化は、ＡＲＩを受けていないラットと比べて結果として腎臓損傷の増加を導くＡＲＩ治療により阻害されるであろう。これは、ＡＲＩによるアルドース還元酵素の阻害が、３ＤＧおよび３ＤＦを還元するためのアルドース還元酵素の有効性を減少させたためである。
ヒト疾患に関与する３ＤＧの役割は、後記に要約される特許の論評から明らかになるように、以前に研究されていた。
Ulrichらによる米国特許第５，４７６，８４９号は、アミノ−安息香酸および誘導体を用いるＡＧＥタンパク質の生成を阻害する方法を記載している。これらの化合物は、おそらく、３ＤＧがタンパク質と反応してＡＧＥタンパク質生成の不可逆的段階を開始する前に、３ＤＧと反応し、該系からそれを除去することによって作用する。
Ceramiらによる米国特許第４，７９８，５８３号および第５，１２８，３６０号は、ＡＧＥタンパク質生成および糖尿病に誘導される動脈壁タンパク質架橋を予防するためのアミノグアニジンの使用を記載している。アミノグアニジンは、初期グリコシル化産物と反応することが明らかにされた。この初期産物は、本明細書に定義されるような３ＤＧである。これらの特許は、３ＤＧの生成を阻害する可能性を予測してはいない。それらは、専ら、該毒性分子の複合体形成に集中している。
Franceらによる米国特許第５，４６８，７７７号は、口腔におけるタンパク質の非酵素的褐変によって引き起こされる歯の変色を予防する方法および薬剤を記載している。システインおよびシステイン誘導体は、該適用において特に有用であると記載されている。
Ulrichらによる米国特許第５，３５８，９６０号は、アミノ置換イミダゾールを用いてＡＧＥタンパク質生成を阻害する方法を記載している。これらの化合物は、初期グリコシル化産物（３ＤＧ）と反応することが明らかにされた。該特許において、３ＤＧの代謝源が存在し得るという記載はない。該特許は、３ＤＧが専ら、タンパク質の非酵素的褐変における中間物質として生成されると考えている。
Ulrichらによる米国特許第５，３３４，６１７号は、ＡＧＥタンパク質生成のインヒビターとして有用なアミノ酸を記載している。リジンおよび他の二官能性アミノ酸は、この点に関して特に有用であるとして記載される。これらのアミノ酸は、グルコースとタンパク質の反応由来の初期グリコシル化産物と反応するとして記載される。該特許に記載される初期グリコシル化産物は３ＤＧであるようである。
Ulrichらによる米国特許第５，３１８，９８２号は、阻害剤として１，２，４−トリアゾールを用いるＡＧＥタンパク質生成の阻害を記載している。該特許に記載されるインヒビターは、３ＤＧと反応し複合体を形成するように配置されたジアミノ置換基を含有する。該特許は、これらの化合物を初期グリコシル化産物（本明細書に定義されるような３ＤＧ）と反応するとして記載している。
Ulrichらによる米国特許第５，２７２，１６５号は、ＡＧＥタンパク質生成のインヒビターとしての２−アルキリデン−アミノグアニジンの使用を記載している。該特許に記載されたインヒビターは、３ＤＧとよく反応するといわれる。該特許において、３ＤＧの代謝生成を阻害するという記載はない。
Ulrichらによる米国特許第５，２６２，１５２号は、ＡＧＥタンパク質生成を阻害するためのアミドラゾンおよび誘導体の使用を記載している。該特許に記載された化合物は、α−効果アミンである。W.P. Jencks, 第３版、McGraw Hill, New York。該カテゴリーの化合物は、ジカルボニル化合物、例えば、３ＤＧと反応することが知られている。
Ulrichらによる米国特許第５，２５８，３８１号は、ＡＧＥタンパク質生成を阻害するための２−置換−２−イミダゾリンの使用を記載している。該特許に記載された化合物は、３ＤＧと容易に反応できる隣接したアミノ基を含有する。
Ulrichらによる米国特許第５，２４３，０７１号は、ＡＧＥタンパク質生成を阻害するための２−アルキリデン−アミノグアニジンの使用を記載している。該特許に記載された化合物は、３ＤＧとよく反応し、この反応性の毒性分子を複合体化することによって機能する。
Ulrichらによる米国特許第５，２２１，６８３号は、ＡＧＥタンパク質生成を阻害するジアミノピリジン化合物の使用を記載している。特に有用であるとして記載されたジアミノピリジン化合物は、３ＤＧと反応して、安定な６員環を含有する複合体を形成するであろう。
Ulrichらによる米国特許第５，１３０，３３７号は、ＡＧＥタンパク質生成を阻害するためのアミドラゾンおよび誘導体の使用を記載している。該特許に記載されたインヒビターは、３ＤＧと迅速に反応し、安定な複合体を形成するであろう、当該分野で周知のα−効果アミンである。
Ulrichらによる米国特許第５，１３０，３２４号は、ＡＧＥタンパク質生成を阻害するための２−アルキリデン−アミノグアニジンの使用を記載している。該特許に記載された化合物は、グルコースとタンパク質の反応から生じる初期グリコシル化産物（３ＤＧ）と反応することによって機能する。
Ulrichらによる米国特許第５，１１４，９４３号は、ＡＧＥタンパク質生成を阻害するためのアミノ置換ピリミジンの使用を記載している。該特許に記載された化合物は、３ＤＧと迅速に反応し、無毒化するといわれる。
前記特許のいずれも、糖尿病性合併症を予防するための治療介入の手段として３ＤＧの代謝生成の阻害を提唱するものはない。さらに、これらの特許のいずれも、３ＤＧ生産における酵素的経路の関与を提唱すらしない。
Ulrichらによる米国特許第５，１０８，９３０号は、生物学的試料中のアミノグアニジンのレベルを検出する方法を記載している。該アッセイは、アミノグアニジン排出時間を測定することによって腎臓機能を決定する潜在的な有用性を有するものとして記載される。該特許に記載されたアッセイ方法に向けられた主な有用性は、ＡＧＥタンパク質生成を阻害するのに十分な投与量を動物およびヒト研究において維持できるように、アミノグアニジンの組織レベルを測定することにある。該特許において、尿３ＤＧ、３ＤＦまたはＤＧＡ比を用いて糖尿病患者の合併症の危険性を決定するという記載はない。
Szwergoldらによる米国特許第５，２３１，０３１号は、糖尿病に付随した病状の危険性を評価し、これらの合併症に対する治療の効力を決定する方法を記載している。該特許は、糖尿病患者の赤血球中の２つのリン酸化化合物の測定を記載している。これらの２つの化合物は、該特許において化学的に同定されなかった。しかしながら、どちらの化合物も、そのレベルが本発明の診断的具体例において尿中において測定される３ＤＧまたは３ＤＦではなかった。
グリコシル化終末産物の測定によって糖尿病患者における代謝制御をモニターする方法が知られている。グリコシル化ヘモグロビンの濃度は、先の数週間の平均血中グルコース濃度を反映することが知られる。A. Ceramiらによる米国特許第４，３７１，３７４号は、尿中のグリコシル化タンパク質の分解産物、より詳細には、非酵素的にグリコシル化されたアミノ酸およびペプチドの定量によってグルコースレベルをモニターする方法を記載している。該方法は、グリコシル化終末産物に見られる同一平面上のシス−ジオール基と特異的複合体を形成することに対するアルカリ性ホウ酸のアフィニティーを利用して、かかる終末産物を分離し、定量することすることを意味する。
A. Ceramiによる米国特許第４，７６１，３６８号は、褐変したポリペプチド、例えば、ウシ血清アルブミンおよびポリ−Ｌ−リジンに存在する発色団の単離および精製を記載している。発色団、２−（２−フロイル）−４（５）−２（フロイル）−１Ｈ−イミダゾール（ＦＦＩ）は、グルコースの２分子と２つのリジン由来のアミノ基の縮合から誘導される複合複素環である。さらに、該特許は、タンパク質試料中において「老化」（進行性グリコシル化の度合い）を測定する方法であって、試料中の前記の発色団の量を測定し、次いで、該測定値を標準と比較することによって試料「老化」が決定される方法におけるＦＦＩの使用を記載している（タンパク質試料は、試料の「老化」に相関したＦＦＩ量を有する）。
糖尿病患者の現存する治療計画には、治療介入によって糖尿病に付随した病状の発症を予防、減少または遅延させ、かかる治療介入の利益を決定するために、かかる病状を発現する危険性のある患者を同定する有効な方法に対して長年にわたる満たされていない要求がある。
発明の概要
本発明は、ＦＬのＦＬ３Ｐへの酵素介在変換を含み、糖尿病によって影響を及ぼされた器官において比較的高濃度の３−デオキシグルコソン（３ＤＧ）を生成する代謝経路を見出したことから生まれたものである。この新たに見出された経路のその後の生物学的機能の研究は、該経路が糖尿病性腎疾患の病因において重要な役割を果たすことを示すのに役立つ。また、該経路は様々な既知の糖尿病に付随した病状の発病に関与することが推測される。
この知見により、一の態様において、酵素阻害活性を有し、フルクトース−リジンのフルクトース−リジン−３−リン酸への酵素的変換を阻害するのに有効な一連の化合物を提供する、本発明において実用的な用途が見出された。本発明の化合物の関連した酵素阻害活性は、アッセイによって容易に測定できる。アッセイ方法は、フルクトース−リジン、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、フルクトース−リジン−３−リン酸キナーゼの供給源および阻害活性を明らかにするのに十分な量の本発明の化合物の水溶液を準備し、前記のキナーゼ、フルクトース−リジンおよびアデノシン三リン酸の相互反応の生産物としてフルクトース−リジン−３−リン酸およびアデノシン二リン酸の形成を促進する条件下に得られた溶液を付し、かかる生産物の少なくとも１種類の生成を測定することからなり、本発明の化合物は、同じ相対量のフルクトース−リジン、アデノシン三リン酸およびフルクトース−リジン−３−リン酸キナーゼの供給源を含み、本発明の化合物を含まない水溶液と比べて、かかる生産物の量を減少させる。ここに記載のアッセイ方法もまた、本発明の範囲内にある。
もう一つ別の態様によると、本発明は、糖尿病患者において糖尿病性合併症の発症を予防、減少または遅延させる製剤であって、活性剤として、前記のような本発明の化合物および医薬上許容されるビヒクルを含んでなる製剤を提供する。
本発明のさらなる態様によると、糖尿病性合併症を発病する危険性のある患者において糖尿病性合併症の発症を予防、減少または遅延させる方法であって、該患者にフルクトース−リジンのフルクトース−リジン−３−リン酸への酵素的変換を阻害するのに有効な量の本発明の化合物を投与することからなる方法が提供される。該方法は、さらに後記されるように、他の病因学的に類似した病態の予防または治療に使用してもよい。
まだ別の態様によると、本発明は、糖尿病患者の糖尿病に付随した病状を併発する危険性を評価する方法を提供する。該方法は、所定量の糖化リジン残基を付与する量にて糖化リジン残基の供給源を患者に投与し、患者から得られた生物学的試料中の３−デオキシグルコソンの３−デオキシフルクトースに対する割合を、正常な対象、すなわち、非糖尿病対象または糖尿病の臨床症状のない対象における３−デオキシグルコソンの３−デオキシフルクトースに対する割合を基準として測定することからなる。無症候性の対象の割合と比べて、糖尿病患者の試料中の３−デオキシグルコソンの３−デオキシフルクトースに対する高い割合は、糖尿病患者が糖尿病に付随した病状を併発するより危険な状態にあることを示す。
本発明は、また、糖尿病性合併症の予防において治療介入の効果を評価する方法も提供する。該方法は、治療介入の開始前および開始後の両方の糖尿病患者から得られた生物学的試料中の３−デオキシグルコソン、３−デオキシフルクトースおよびフルクトース−リジン濃度を測定することを含む。次いで、３−デオキシグルコソンおよび３−デオキシフルクトース濃度の和を試料中のフルクトース−リジン濃度と比較する。治療介入の開始前に得られた生物学的試料中で測定したフルクトース−リジン濃度に相対的な３−デオキシグルコソンおよび３−デオキシフルクトース濃度の和と比べて、治療介入の開始後に得られた生物学的試料中のフルクトース−リジン濃度に相対的な３−デオキシグルコソンおよび３−デオキシフルクトース濃度の和における減少は、治療介入の効果を示す。
本発明のまた別の態様の場合、糖尿病に付随した病状の発病に関与する可能性のある食品を糖尿病患者に通告する方法が提供される。該方法は、食品中の糖化リジン残基含量を測定し、例えば、食品のパッケージ上または糖尿病患者が利用するための出版物において、該情報を糖尿病患者に提供することを含む。
図面の簡単な記載
図１は、不可逆的に修飾されたＡＧＥタンパク質を導く多工程反応に含まれる開始工程を示す。
図２は、リジン回収経路に含まれる反応を示す。
図３は、２ｇのＦＬを与えられた単一の個体由来の３ＤＦ、３ＤＧおよびＦＬの経時的変化を示し、２４時間追跡した尿プロフィールのグラフである。
図４は、２ｇのフルクトースリジンを与えられた７人のボランティア由来の３ＤＦの時間に対する尿中排出のグラフである。
図５は、対照動物群と０．３％糖化タンパク質を含有する食餌を維持した実験群との間の３ＤＦおよびＮ−アセチル−β−グルコサミニダーゼ（ＮＡＧ）の比較のグラフである。
図６は、対照食餌かまたは糖化タンパク質に富む食餌のいずれかを与えられたラットの尿中３ＤＦおよび３ＤＧレベル間の直線関係を示すグラフである。
図７Ａおよび７Ｂは、正常および糖尿病患者の空腹時の尿中３ＤＧレベルを空腹時の３ＤＦレベルに対してプロットしたグラフである。
発明の詳細な説明
以下の定義は、さらに詳細に後記するように、本発明の理解を容易にするために提供される：
１．糖化リジン残基
本明細書で使用される場合、「糖化リジン残基」なる表現は、還元糖とリジン含有タンパク質の反応によって生成される安定な付加生成物の修飾リジン残基をいう。
タンパク質リジン残基の大部分は、陽電荷アミノ酸に関して予想されるようにタンパク質の表面に位置する。したがって、血清または他の生物学的液体と接触するタンパク質上のリジン残基は、溶液中で自由に糖分子と反応できる。該反応は、多数の段階において起こる。開始段階は、リジン遊離アミノ基と糖ケト基間のシッフ塩基の形成を含む。次いで、この開始生成物がアマドリ転位を受けて、安定なケトアミン化合物を生成する。
この一連の反応は、種々の糖で起こり得る。関与する糖がグルコースの場合、開始のシッフ塩基生成物は、グルコースのＣ−１上のアルデヒド基とリジンε−アミノ基間のイミン形成を伴うであろう。アマドリ転位の結果、本明細書ではフルクトース−リジンまたはＦＬという、フルクトースのＣ−１炭素に結合したリジン、１−デオキシ−１−（ε−アミノリジン）−フルクトースが生成するであろう。
同様な反応が、他のアルドース糖、例えば、ガラクトースおよびリボースで起こるであろう（Dills, Am. J. Clin. Nutr., 58: S779（1993））。本発明の目的の場合、いずれかの還元糖とタンパク質リジンのε−アミノ残基との反応の初期生成物は、修飾糖分子の正確な構造にかかわらず、意義的に糖化リジン残基に包含される。
また、糖化リジン残基、糖化タンパク質およびグリコシル化タンパク質またはリジン残基なる語は、本明細書において互換可能に使用され、それは、科学雑誌においてかかる表現がしばしば互換可能に使用される最近の慣習と一致する。
２．フルクトース−リジン
「フルクトース−リジン」（ＦＬ）なる語は、タンパク質／ペプチドに取り込まれるかまたはタンパク質分解消化によりタンパク質／ペプチドから放出されたいずれかの糖化リジンを意味するために本明細書で使用される。この語は、特に、タンパク質リジン残基とグルコースの反応から生成されることが報告された、一般にフルクトース−リジンと呼ばれる化学構造に限定されない。前記のように、リジンアミノ基は、多種多様な糖と反応できる。さらに、ある報告では、グルコースが試験した１６の異なる糖の群の中で最も反応性の低い糖であることを示す（Bunnら、Science, 213: 222（1981））。したがって、グルコースと同様にガラクトースおよびリジンから形成されるタガトース−リジンは、天然または非天然の全ての他の糖の縮合物と同様に、本明細書の記載においてフルクトース−リジンなる語が挙げられている場合には必ず包含される。本明細書の記載から、タンパク質−リジン残基と糖との間の反応は多数の反応段階を含むことが理解されるであろう。この一連の反応における最終工程は、タンパク質の架橋およびＡＧＥタンパク質として知られ、そのいくつかが蛍光性である多量体種の生成を含む。かかる修飾タンパク質のタンパク質分解消化は、糖分子に共有結合したリジンを生じない。したがって、これらの種は、本明細書で使用される場合の「フルクトース−リジン」の意味に包含されない。
３．フルクトース−リジン−３−リン酸
該化合物は、ＡＴＰからＦＬへの高エネルギーリン酸基の酵素的転移によって生成する。本明細書で使用される場合、フルクトース−リジン−３−リン酸（ＦＬ３Ｐ）なる語は、遊離かまたはタンパク質に結合して酵素的に形成され得る全てのリン酸化フルクトース−リジン部分を包含することを意味する。
４．フルクトース−リジン−３−リン酸キナーゼ
この語は、高エネルギーリン酸塩の供給源を付加的に与えるとき、前記のようにＦＬをＦＬ３Ｐに酵素的に変換できる１以上のタンパク質をいう。
５．３−デオキシグルコソン
３−デオキシグルコソン（３ＤＧ）は、１，２−ジカルボニル−３−デオキシ糖（また、３−デオキシヘキスロソンとしても知られる）であり、遊離のリジンおよび無機リン酸を生じるＦＬ３Ｐの分解において生成される。本発明の目的の場合、３−デオキシグルコソンなる語は、前記のＦＬ３Ｐの幅広い定義を有するＦＬ３Ｐの分解において生成される全ての可能なジカルボニル糖を包含することを意味する。
６．ＦＬ３Ｐリジン回収経路
リジン回収経路は、ヒト腎臓あるいは他の組織に存在し、遊離のアミノ酸としてかまたはポリペプチド鎖に組み込まれた非修飾リジンを再生する。さらに後記に説明するように、該経路は、糖尿病の合併症に関与する重要な因子である。
７．ＡＧＥタンパク質
「ＡＧＥタンパク質」（進行性糖化終末産物修飾タンパク質）なる語は、糖とタンパク質との間の反応の最終生成物を示すために、科学雑誌に使用され、本明細書に用いられる（Brownlee, Diabetes Care, 15: 1835（1992）およびNiwaら、Nephron, 69: 438（1995））。例えば、タンパク質リジン残基とグルコース間の反応がフルクトース-リジンの生成をもって終止しないことは明らかである。ＦＬは、複数の脱水および転位反応を介して非酵素的３ＤＧを生成することができ、それは遊離アミノ基とさらに反応して関連するタンパク質の架橋および褐変をもたらす。実際に、本明細書に前記したように、３ＤＧが該修飾反応における中心的中間物質であるという妥当な証拠がある。
９．糖化食餌
本明細書で使用する場合、この表現は、一定の割合の通常のタンパク質が糖化タンパク質で取り替えられるいずれの食餌をもいう。「糖化食餌」および「糖化タンパク質食餌」なる表現は、本明細書では互換可能に使用される。
少なくともいくつか、あるいは全ての糖尿病の合併症は、グルコースおよび他の反応性の糖によるタンパク質の共有結合修飾に起因する（M. Brownlee, Diabetes, 43: 836（1994））。前記のように、糖尿病のヒトおよび動物は、正常よりも高濃度の糖修飾タンパク質を有することが明らかになった。実際、糖尿病に付随したＡＧＥタンパク質における増加は、血中グルコースレベルの増加より大きい。
以前には、イン・ビボでの３ＤＧの起源は糖化リジン残基を含有するタンパク質の分解に由来すると、一般に認識されていた。また、これらの糖化リジンはアミノ酸供給源として使用できないと、一般に考えられていた。後記で明らかにするように、この上記の考えは間違っていた。
前記のように、本発明は、酵素触媒反応において３ＤＧを生成する以前に知られていなかった代謝経路を見出したことから発展した。該酵素的経路は、酵素的阻害ができ、それにより、毒性３ＤＧの生成を減少させることができる。
糖尿病性腎臓における一連の研究の過程の間、ストレプトゾトシン（streptozotoxin）誘導化糖尿病ラットから得た腎臓の過塩素酸抽出液の31Ｐ ＮＭＲスペクトル試験は、ＮＭＲスペクトルにおいて異常な新規のピークを表した。本発明者らによる以前の研究では、ラット水晶体およびヒト赤血球においてフルクトース−３−リン酸の存在を明らかにした（A. Petersenら、Biochem. J., 284: 363-366（1992）；Lalら、Arch. Biochem. Biophys., 318: 191（1995）；Szwergoldら、Science, 247: 451（1990）およびLalら、Investigative Opthalmology and Visual Science, 36（5）：969（1995））。より初期の研究では、ラット水晶体において他の異常なリン酸化糖を同定した（Szwergoldら、Diabetes, 44: 810（1995）およびKapplerら、Metabolism, 44: 1527（1995））。したがって、この新たに同定されたピークは別のリン酸化糖であると仮定することが理にかなっていた。さらに多くの研究室の研究では、この新規な化合物が単純な糖ではなく、むしろ、フルクトース成分の３位でリン酸化されたフルクトース-リジンであることを明らかにした。
該同定は、２つの方法で確認された。標準のフルクトース-リジン−３−リン酸（ＦＬ３Ｐ）を後記実施例２に開示の手法によって合成し、31Ｐ ＮＭＲスペクトルにおいて糖尿病ラット腎臓におけるピークと互いに共鳴することを明らかにした。また、合成フルクトース-リジンを非糖尿病ラットに注射した。これらのラットは、注射後に、腎臓においてＦＬ３Ｐレベルの実質的な増加を示した。
ＦＬ３Ｐが酵素触媒反応においてＦＬから直接誘導されることを証明するために、２つの実験を行った。フルクトース部分のＣ３位を重水素で標識したフルクトース-リジンを合成し、ラットに注射した。注射して３時間後に、これらのラットの腎臓を取り出し、過塩素酸で抽出した。ＮＭＲ分光法は、これらのラットから単離したＦＬ３Ｐ物質がフルクトース部分のＣ３位に重水素標識を含有することを示した。さらに、ラット腎臓ホモジネートは、ＡＴＰおよびフルクトース−リジンの両方を必要とする反応においてＦＬ３Ｐを生成できることを明らかにする。この最後に記載した実験は、フルクトースリジンおよびＡＴＰのみを生理学的条件下で一緒にインキュベートする場合、ＦＬ３Ｐが形成されないので、特異的ＦＬ３Ｐキナーゼの存在を確認するものである。腎臓皮質のフラクションを含むさらなる実験は、該キナーゼ活性が腎臓において一様に分散されるのではなく、ヒトおよび動物の糖尿病の腎臓において損傷を示す最も初期の解剖部位の１つである近位尿細管領域に濃縮されることを証明した。
ＦＬ３Ｐは、水性溶液中において不安定である。それは迅速に分解して、３ＤＧ、リジンおよび無機リン酸塩を生成する。また、該反応はイン・ビボでも起こる。ＦＬ３Ｐのイン・ビボでの分解が自然発生的または酵素触媒反応であるかどうかは、現在、知られていない。しかしながら、フルクトース−リジンからの３ＤＧの生成は無傷腎臓において非常に迅速に起こるので、酵素的触媒反応が関与していると大いに推測される。
ＦＬ３Ｐリジン回収経路における反応工程は、図２に示す。第１工程において、フルクトース-リジンおよびＡＴＰをＦＬ３Ｐキナーゼ触媒反応にて反応させ、フルクトース−リジン−３−リン酸（ＦＬ３Ｐ）およびＡＤＰを生成する。フルクトース部分の３−位にリン酸化が起こり、フルクトースリジン分子の不安定化を導く。次いで、得られたＦＬ３Ｐが分解して、３−デオキシグルコソン（３ＤＧ）、無機リン酸塩およびタンパク質合成において利用可能な、修飾されていない遊離の再利用可能なリジンを生成する。アルデヒド還元酵素は、尿中に排出される３−デオキシフルクトース（３ＤＦ）への還元によって３ＤＧを無毒化する。
図２は、最も一般に行われている糖化リジン、フルクトース−リジンを用いる該経路を説明するが、多種多様な同様の分子が該経路を流れることができることは、当業者にとって容易に明らかであろう。さらに詳細に後記に説明するように、むしろ、ＦＬ３Ｐリジン回収経路の基質選択性は非常に広く、前記の用語の幅広い定義を正当化するものである。
付加的な実験は、リジン回収経路が、ヒツジ、ブタ、イヌ、ウサギ、ウシ、マウスおよびニワトリを包含する多種多様な動物種に見出されることを明らかにした。該経路は、また、ヒトにも存在する。ＦＬ３Ｐリジン回収経路の遍在は、リジンが大抵の食物に比較的低濃度で存在する必須アミノ酸であることにより理解できる。さらに、食物中におけるリジン残基のかなりの割合が、糖化形態で存在し、該修飾リジンの割合は、食物を調理するときに増加するであろう。これらの糖化リジン残基はタンパク質合成に利用できないので、リジンの回収経路は、大いに有用性があり、それを有する生物に選択的な利点を提供する。
糖尿病はリジン回収経路に２つの影響を及ぼす。血中タンパク質は、非糖尿病個体よりも糖尿病患者から単離された場合に高い濃度の糖化リジンを含有する。したがって、糖尿病患者は、非糖尿病患者よりもより多くの流量がリジン回収経路を介することとなる。そのうえ、糖尿病患者および正常体の尿中の３ＤＧおよび３ＤＦの比率における予備的な観察から、糖尿病患者は、該経路を経て生成される３ＤＧを無毒化する能力が減少するようである。これらの２つの因子が合わさって、糖尿病患者においてより高い尿中濃度の３ＤＧが生じる（図７参照；また、Lalら、Arch. Biochem. and Biophys., 342（1）：254-60（1997）参照）。
リジン回収経路に関わる物質は、腎臓のほかにも他の組織、特に赤血球、水晶体および末梢神経組織において同定された。これらの組織の全ては、糖尿病の合併症によって影響を受ける。赤血球中における所在は、糖尿病の微小血管合併症、例えば、糖尿病性網膜症に相関し、腎臓における所在は、糖尿病性腎障害に相関し、一方、末梢神経における所在は、糖尿病性末梢神経障害に相関する。これらの物質は、また、膵臓においても見出される。皮膚におけるこれらの物質の存在を測定するための実験がなされている。存在することが見出されると、コラーゲン架橋を防止するために適当なビヒクル中の本発明の阻害物質を用いる典型的な治療によってそれらの心身に有害な影響を改善し、それにより皮膚の弾力性を改善し得ると考えられる。
ヒトが３ＤＧおよび３ＤＦの両方を経口的に摂取した糖化リジン残基含有タンパク質から生成することを証明するための実験が行われた。詳細に後記されるこれらの実験は、リジン回収経路がヒトに存在することを納得のゆくように立証する。これらの実験は、また、混乱する現象、すなわち、糖尿病性合併症を発病する糖尿病患者もいれば、不十分な血糖調節であっても、かかる合併症を発病しない糖尿病患者もいるという現象を解明する。該現象の理由は、本明細書に与えられたデータから明らかである。糖尿病患者は、３ＤＧを無毒化するための異なる能力を有する。糖尿病集団のあるサブセットは、多数の糖尿病患者よりも比較的高いアルデヒド還元酵素活性を有するようである。それゆえ、これらの個体は、正常レベルよりも高いレベルの３ＤＧを効率よく無毒化することによってリジン回収経路を通る流量の増加を処理することができる。その能力の減少した者は、それらの増加した３ＤＧレベルをほとんど無毒化できず、それゆえ、糖尿病性合併症を発病するより危険な状態にある。
より詳細に後記されるように、リジン回収経路の刺激を糖化タンパク質食餌の使用によって起こすことができることが、実験的に立証された。前記のＦＬを用いる場合、ＦＬ３Ｐ、３ＤＧおよび３ＤＦの増加が、糖化タンパク質食餌を与えられた試験動物において観察された。
本発明の酵素インヒビター化合物は、リジン回収経路を遮断し、ＦＬ３Ｐからの毒性３ＤＧの生成を防止する。
後記に、本発明の実施における使用に適当な酵素インヒビターが示すべき一連の広範囲な特徴、ならびにいずれかの推定インヒビターがこれらの特徴を兼ね備えるかどうかを決定するためのある特定の試験を記載する。本発明にしたがって使用するための候補キナーゼインヒビターは、植物または微生物から単離された天然物であってもよい。別法で、それらは、酵素的反応およびそのメカニズムの合理的知見から誘導された合成分子であってもよい。インヒビターは、また、コンビナトリアル法によって合成されてもよい。コンビナトリアルライブラリーは、ランダムな開始点から生成してもよい。さらに、コンビナトリアル法を利用して、以前に同定された標的ＦＬ３Ｐキナーゼのインヒビターに関連した多種多様な化合物を生成することができる。
推定インヒビターの供給源にかかわらず、後記に挙げる特徴の全てを兼ね備えない化合物は、リジン回収経路を阻害し、それにより、糖尿病性合併症または関連する病因の障害の発症を予防、減少または遅延させることができる有用な治療薬とは考えられない。
１．インヒビターは、小型分子であって、細胞によって容易に吸収されるべきである。該特徴を兼ね備えるために、インヒビターは２，０００未満、より典型的には、約１，０００ダルトン以下の分子量を有さなければならない。
２．インヒビターは、ＦＬ３Ｐキナーゼの拮抗的、非拮抗的、不可逆的または自殺的阻害を示さなければならない。インヒビターが拮抗的または非拮抗的インヒビターならば、阻害定数Ｋｉは、約１ｍＭ未満でなければならない。典型的には、それは、１００μＭ未満、より典型的には、約４０μＭ以下でなければならない。インヒビターが自殺的または他の不可逆的阻害を示すならば、阻害定数に対する該要求は議論の余地がある。
３．インヒビターは、水性溶液に溶解でき、生理学的ｐＨで水性溶液中で安定でなければならない。溶解性に対する要求は、インヒビターまたはインヒビターの塩が生理食塩水または血清中に１０μＭ以上の濃度で溶解できる場合のみ、満たされる。該安定性要求は、３７℃で生理食塩水中に溶解したインヒビター溶液が１時間インキュベーション後に５０％以上の活性を保持する場合にのみ、満たされる。典型的には、インヒビターは１日以上のインキュベーションにおいて５０％より大きい活性を保持しなければならない。
４．インヒビターは、許容できる薬物動力学を示さなければならない。すなわち、それは、該物質の投与後少なくとも１時間、治療的に有効な濃度で残存しなければならない。典型的には、それは、少なくとも８時間有効濃度を維持すべきである。より典型的には、１日に１回の投与が、インヒビターの治療的濃度を維持するために必要とされる全てであるべきである。該要求は、初めの投与後に、インヒビターが治療的濃度を確立することができなければならないことを意味しない。成功した製薬の多くの例が、医学的効果が長時間の投与においてのみ見られるものに存在する。特徴は、効果のある濃度に達するとすぐに、該物質の最後の投与後１時間より長く該濃度を維持できるべきであることを意味する。治療効果に関する試験を本明細書に記載する。
５．インヒビターは非毒性でなければならない。該特徴は、治療用量で投与される場合、インヒビターがヒトに毒性を示さないことを要求する。典型的には、インヒビターが治療効果に必要な２倍の血中および／または標的組織レベルで存在する場合、毒性は顕性であるべきではない。より典型的には、治療範囲の６倍以上のレベルではっきりとした毒性があるべきではない。糖尿病性合併症は、長期のインヒビター治療によって予防できるのみである。したがって、非毒性に対する要求は、延長した長期の使用によって顕性になるかもしれない急性毒性および慢性毒性の両方を包含しなければならない。候補分子の毒性は、よく確立された動物研究を用いて容易に評価できる。ヒト毒性は、第１段階臨床試験において評価される。
本発明の実施における有用な化合物の中でも、式：
0004738554.tif 000002
［式中、Ｘは−ＮＲ’−または−Ｏ−であり、ここでＲ’は、Ｈ、および直鎖または分枝鎖アルキル基（Ｃ1−Ｃ4）および非置換または置換アリール基（Ｃ6−Ｃ10）もしくはアラルキル基（Ｃ7−Ｃ10）よりなる群から選択され；Ｒは、Ｈ、アミノ酸残基、ポリアミノ酸残基、ペプチド鎖、置換されていないかまたは少なくとも１個の窒素もしくは酸素−含有置換基で置換されている直鎖または分枝鎖脂肪族基（Ｃ1−Ｃ8）、置換されていないかまたは少なくとも１個の窒素−もしくは酸素−含有置換基で置換され、少なくとも１個の−Ｏ−、−ＮＨ−もしくは−ＮＲ’’−部分によって割り込まれた直鎖または分枝鎖脂肪族基（Ｃ1−Ｃ8）よりなる群から選択される置換基であり、ここでＲ’’は、直鎖または分枝鎖アルキル（Ｃ1−Ｃ6）および非置換または置換アリール基（Ｃ6−Ｃ10）もしくはアラルキル基（Ｃ7−Ｃ10）であり、但し、Ｘが−ＮＲ’−を示すならば、ＲおよびＲ’はそれらが結合する窒素原子と一緒になって、５〜７個の環原子を有する置換または非置換複素環式環を示してもよく、少なくとも１個の窒素および酸素が該環において唯一のヘテロ原子であり、該アリール基（Ｃ6−Ｃ10）またはアラルキル基（Ｃ7−Ｃ10）および該複素環式環置換基は、Ｈ、アルキル（Ｃ1−Ｃ6）、ハロゲン、ＣＦ3、ＣＮ、ＮＯ2および−Ｏ−アルキル（Ｃ1−Ｃ6）よりなる群から選択され；
Ｒ1は、１〜４個の直鎖炭素原子を有するポリオール部分であり、Ｙはカルボニル部分
0004738554.tif 000003
またはヒドロキシメチレン部分
0004738554.tif 000004
のいずれかであり；
Ｚは、−Ｈ、−Ｏ−アルキル（Ｃ1−Ｃ6）、−ハロゲン、−ＣＦ3、−ＣＮ、−ＣＯＯＨおよび−ＳＯ3Ｈ2および所望により−ＯＨよりなる群から選択される］
で示される化合物ならびに該化合物の異性体および医薬上許容される塩が包含される。
窒素または酸素含有”Ｒ”置換基の実例は、γ−アミノ−α−ヒドロキシ酪酸（−（ＣＨ2）2−ＣＨＯＨ−ＣＯＯＨ）、１，２，４トリアミノブタン（−（ＣＨ2）2−ＣＨＮＨ2−ＣＨ2ＮＨ3）、３，６−ジアミノ−５−ヒドロキシヘプタン酸（−ＣＨ2−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ2−ＣＨ（ＮＨ2）−ＣＨ2−ＣＯＯＨ）などから誘導される置換基を包含する。
式Ｉの構造は不斉中心を有し、ラセミ化合物、ラセミ混合物および種々の立体異性体ならびにその混合物として生じ、かかる異性体形態の全てが本発明の範囲内にある。
前記の式Ｉの構造を有するある特定の化合物は以前に知られていたが、その他のものは新規であると考えられ、イン・ビボでの３ＤＧの酵素触媒的生成を阻害するための式Ｉの全ての化合物の使用と同様に、それ自体、本発明の範囲内にある。
前記の式のインヒビターは、適当な糖、例えば、グルコース、ガラクトース、マンノース、リボース、キシロース、またはその誘導体とアミノ酸または他の適当な第１もしくは第２アミンを反応させることによって調製して、カルボニル部分を有するインヒビター（すなわち、Ｙ＝−Ｃ（＝Ｏ）−）を得てもよい。別法で、糖、例えば、グルコース、ガラクトース、マンノース、リボース、キシロースなどを本明細書に記載の型のアミノ−またはヒドロキシル−置換反応物とＮａＢＨ3ＣＮのような選択的にシッフ塩基中間物質をアミンに還元する試薬の存在下で反応させ、それにより、アルコール部分を有するインヒビター（すなわち、Ｙ＝−ＣＨ（−ＯＨ）−）を生成してもよい。アミノ酸反応物を使用する場合、アミノ酸反応物の反応性部分は、α−炭素におけるアミン基または酸側鎖におけるアミン基もしくはヒドロキシル基であってもよい。適当なアミノ酸は必須アミノ酸を包含する。特定の例は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、メチオニン、アスパラギン酸、フェニルアラニン、チロシン、ヒスチジンおよびトリプトファンを限定することなく包含する。他の適当な反応物は、より幅広い種類のアミノカルボン酸、例えば、ピログルタミン酸、ベータ−アラニン、ガンマ−アミノ酪酸、イプシロン−アミノカプロン酸など由来である。前記アミノ酸のＮ−アシル誘導体、例えば、ホルミルリジンもまた、所望により使用してもよい。
他の適当な反応物は、限定するものではないが、非置換または置換基がアルキル（Ｃ1−Ｃ3）、アルコキシ、カルボキシ、ニトロもしくはハロゲン基であってもよい置換アリール（Ｃ6−Ｃ10）化合物、非置換または置換基が少なくとも１個のアルコキシ基であってもよい置換アルカン；あるいは非置換または置換基がアルキル（Ｃ1−Ｃ3）、アリール（Ｃ6−Ｃ10）、アルコキシ、カルボキシ、ニトロもしくはハロゲン基であってもよい置換含窒素複素環式化合物を包含する。最後に記載した反応物群の実例は、ｍ−メチル−、ｐ−メチル−、ｍ−メトキシ−、ｏ−メトキシ−およびｍ−ニトロ−アミノベンゼン、ｏ−およびｐ−アミノ安息香酸；ｎ−プロピルアミン、ｎ−ブチルアミン、３−メトキシプロピルアミン；モルホリンおよびピペリジンを包含する。
前記の式を有する代表的なインヒビター化合物を添付の表Ａに示す。本発明の実施においてインヒビターとして使用してもよい既知化合物の例は、限定するものではないが、メグルミン、ソルビトールリジンおよびマンニトールリジンを包含する。
本明細書に記載のインヒビター化合物は、種々の無機または有機酸または塩基と医薬上許容される塩を形成できる。適当な塩基は、例えば、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、アンモニウム、置換されたアンモニウムおよび他のアミン塩を包含する。適当な酸は、例えば、塩酸、臭化水素酸およびメタンスルホン酸を包含する。
式Ｉの化合物の医薬上許容される塩は、当業者によく知られている手法にしたがって調製できる。
化合物のＦＬ３Ｐキナーゼを阻害する能力は、多種多様なキナーゼ活性アッセイを用いて測定できる。一の有用なアッセイは、可能なインヒビターをフルクトース−リジンおよびＡＴＰと共に腎臓ホモジネートまたは他の酵素供給源の存在下でインキュベートすることを含む。典型的には、１ミリモル以下の本発明のインヒビター化合物、１−１０ミリモルの範囲の量のフルクトースリジン（ＦＬ）、０．１−１０ミリモルの範囲の量のＡＴＰおよびＦＬのフルクトースリジン−３−リン酸への変換に十分な量の酵素供給源を含有するアッセイ成分の溶液を調製する。インキュベーションは、ｐＨ４．５ないし９．５の範囲内、典型的には中性かまたは中性付近のｐＨで行うべきである。インキュベーションは、酵素活性に適合する温度、４〜４０度で行うべきである。典型的には、インキュベーションは、生理学的温度で行う。インキュベーション後、タンパク質の酸性沈殿によって反応を終止し、ＦＬ３Ｐの生成を31Ｐ−ＮＭＲ分光法によって測定する。インヒビターを含まない対照試料と比較して、インヒビター化合物を含有する試料において、ＦＬ３Ｐ生成が減少または消去するであろう。
他のアッセイは、酵素阻害の迅速な測定に対して有用性を有する。一のかかるアッセイは、フルクトース−リジンおよびγ−標識32Ｐまたは33Ｐ−ＡＴＰの使用を含む。ＦＬ３ＰはＤｏｗ−１に結合しないが、ＡＴＰおよび他のほとんどのリン酸塩は結合するので、予め決定した反応時間、典型的には１０分後にＤｏｗ−１樹脂のカラムにアッセイ溶液を通過させることによって、生成ＦＬ３Ｐを残りの反応混合物から分離することが可能である。得られた溶液をシンチレーション液、例えば、Ｅｃｏｓｃｉｎｔ Ａの容器に添加し、カウントして、生じた放射能の量を測定する。
大量のヒト組織を入手するのは困難なので、イー・コリ（E. Coli）のような発現系中でクローン化されたキナーゼの組換え型を使用するのが望ましい。クローン化キナーゼは、組織特異的ｃＤＮＡライブラリーの「ショットガン」クローニングから容易に得ることができる。かかるライブラリーは、市場から容易に入手できる。例えば、それらをカリフォルニア州パロアルトのクロンテック（Clontech）から入手してもよい。構想されるショットガンクローニングは、カリフォルニア州サンディエゴにあるストラタジェン（Stratagen）から商業上入手可能なラムダクローニングシステムを用いて行ってもよい。該クローニングキットは、その使用に関する詳細な説明書を含む。
本発明の製剤は、活性成分として１以上の前記の化合物を医薬上許容される担体媒質または補助剤と共に含んでなる。
これらの成分は、液体および固体の両方を包含する投与のための種々の形態で調製してもよい。したがって、製剤は、錠剤、キャプレッツ、丸剤または糖衣錠の形態であってもよく、あるいはカプセルのような適当な容器中に充填でき、または、懸濁液の場合、瓶に充填できる。本明細書で使用される場合、「医薬上許容される担体媒質」なる語は、個々の所望の投薬形態に適するような、いずれかおよび全ての溶媒、希釈剤、または他の液体ビヒクル、分散または懸濁補助剤、界面活性剤、等張剤、増粘または乳化剤、保存剤、固体結合剤、潤滑剤などを包含する。適当な担体媒質の代表例は、ゼラチン、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、タルク、植物性および動物性脂肪および油、ゴム、ポリアルキレングリコールなどを包含する。Remington’s Pharmaceutical Science、第１５版（Mack Publishing Co., Easton, PA 1975）においてE. W. Martinは、医薬組成物の処方において使用される種々の担体およびその調製のための既知技術を開示している。いずれかの従来の担体媒質が本発明の酵素インヒビターと、例えば、いずれかの望まれない生物学的効果を生じるか、またはそうでなくとも、製剤のいずれか他の成分と心身に有害な方法で相互作用することによって適合しない範囲を除いて、その使用は本発明の範囲内にあるとされる。
本発明の製剤において、活性剤は、もしあれば担体媒質および／または補助剤を包含する製剤の全重量を基準にして、少なくとも５重量％、一般には９８重量％以下の量で存在してもよい。好ましくは、活性剤の割合を組成物の６５重量％〜９５重量％に変化させる。
好ましい補足活性剤は、イン・ビボで３ＤＧに結合する化合物である。この種の化合物は、限定するものではないが、アミノグアニジン、アミノ安息香酸およびその誘導体、システインおよびその誘導体、アミノ置換イミダゾール、１，２−二置換ベンゾイミダゾール、置換１，２，４−トリアゾール、ジアミノピリジンおよびその誘導体、アミノ置換ピリミジン、アミノアルコール、ジアミンなどを包含する。特にアンギオテンシン−変換酵素（ＡＣＥ）インヒビターを包含する抗高血圧薬もまた、補足活性剤として本発明の製剤に包含され得る。
胃において活性化合物を酸分解から保護するかまたは活性化合物の血流への吸収を促進する化合物のような補助剤もまた、必要または所望ならば、製剤に組み込むことができる。かかる補助剤は、例えば、胃における酸性条件を部分的にオフセットするホウ酸塩または他の塩のような錯化剤などを包含し得る。活性化合物を脂肪酸の塩として（活性化合物が１以上の塩基性官能基を有する場合）デリバリーすることによって、吸収を増加できる。
いずれかの補足活性成分と一緒に本発明の化合物を、ＦＬ３Ｐリジン回収経路の阻害に有効ないずれかの量およびいずれかの投与経路を用いて投与してもよい。したがって、本明細書で使用される「治療上有効量」なる表現は、非毒性であるが、糖尿病性合併症を妨げるためまたは他の病因となる３ＤＧの代謝生成を阻害するための所望の治療を提供する、例えば、老化の影響またはＡＧＥタンパク質形成が原因となる他のヒトの病態を減少させるのに十分な量の酵素インヒビターをいう。要求される正確な量は、患者の種、年齢および一般的な条件、合併症の種類、個々の酵素インヒビターおよびその投与様式によって変化し得る。
本発明の化合物は、好ましくは、投与の容易さおよび投薬の均一性のための投薬形態で処方される。本明細書で使用される投薬単位形態とは、治療されるべき患者に適当な酵素インヒビターの物理的に分離した単位をいう。各投薬は、所望の治療効果を生じるように算出された量の活性物質をそれ自体でまたは選択された医薬担体媒質と一緒に含有すべきである。典型的には、本発明の化合物は、製剤の重量あたり約１ｍｇ〜約２，５００ｍｇの化合物を、好ましくは、約５ｍｇ〜約２５０ｍｇの範囲で含有する投薬単位で投与されるであろう。
本発明の化合物は、治療すべき糖尿病性合併症の種類によって、経口的、非経口的、例えば、筋内注射、腹膜内注射、静脈内点滴などによって投与してもよい。本発明の化合物は、所望の治療効果を得るために、１日に患者の体重あたり約０．７μｇ〜約２０ｍｇ、好ましくは、約３０μｇ〜約３．５ｍｇ／ｋｇの投薬レベルで、１日に１回以上、経口または非経口的に投与してもよい。
経口的に活性な酵素インヒビターが特に好ましく、供給される経口投与量は、治療上活性なインヒビターの血中および／または標的組織レベルを生じることができる。当業者は、血液、腎臓および他の標的組織の除タンパク質試料中の小型分子インヒビターのレベルを容易に測定することができる。これらの試料中のインヒビター濃度は、予め決定した阻害定数と比較することができる。阻害定数よりはるかに低い組織レベルは、治療活性の不足を示す。不可逆性インヒビターの場合、この不足は、各組織におけるＦＬ３Ｐキナーゼレベルのアッセイによって確認または異議を唱えることができる。全ての場合、ヒトまたは動物対象に糖化リジン残基またはフルクトース−リジンに富む食物を与え、食物摂取前および後の両方で、それらの尿中の３ＤＧおよび３ＤＦの量を測定することによって、治療活性を評価することができる。それらの系において治療上活性なインヒビターを有する対象は、さらに詳細に後記するように、インヒビター治療前のこれらの同一の対象による分泌レベルと比べて、３ＤＧおよび３ＤＦの両方の分泌が減少し、フルクトース−リジンの尿への分泌が増加するであろう。
本発明の化合物は、典型的には、選択された的確なインヒビターに依存して、１日に１回または１日に４−５回まで投与されるであろう。１日１回の投与計画が好ましいが、糖尿病患者は病態に細かい注意を払うことに慣れているので、前記の１日の投与量をデリバリーするように、必要ならば、より頻繁な投与計画を容易に受け入れるであろう。しかしながら、本明細書に記載の化合物および組成物の的確な投与計画は、必然的に、治療すべき患者個人の要求、投与される治療の型および担当する内科医の判断によるであろう。本明細書に使用される場合、「患者」なる語は、ヒトおよび動物の両方を包含する。
本明細書に記載のインヒビター化合物は、糖尿病性合併症、特に、糖尿病患者の４０％より多くが罹患し、透析および移植を必要とする末期腎疾患の主用な原因である糖尿病性腎障害を妨げるのに有用である。そのほか、これらのインヒビターは、ＡＧＥタンパク質の生成に関与する他の病状、例えば、高血圧、卒中、神経変性障害、例えば、アルツハイマー型の老人痴呆、循環性疾患、アテローム性動脈硬化症、骨関節炎、白内障および老化の一般的な衰弱する影響の予防または治療に用いてもよい。
予備実験は、重い健康を害する影響が糖化タンパク質の長期間の消費によるリジン回収経路の刺激の結果、生じることを示した。ＦＬを用いる場合、ＦＬ３Ｐ、３ＤＧおよび３ＤＦの増加が糖化タンパク質食餌を与えられた試験動物において観察された。表Ｂ参照のこと。後記の実施例１０においてさらに記載されるように、かかる食餌の８ヶ月後、糖尿病の腎臓に見られるものと類似する腎臓病状の明らかな証拠が、糖化タンパク質食餌における動物に見られた。また、３ＤＧおよび３ＤＦレベルの一時的な増加が、少量の糖化タンパク質を食べたヒトボランティアの尿中に観察された。
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新たに見出されたリジン回収経路の刺激は、全身の３ＤＧレベルの実質的な増加を導くので、糖化食餌が妊娠に対して有意な影響を引き起こすかどうかを決定するために研究が行われた。これまでに得られた結果は、後記の実施例において明らかなように、該経路のために非常に強い影響があることを示す。
さらに、ラットおよびマウスの感受性系統において、若い時期（離乳後）に動物に与えられる食餌は、１０％〜９０％の範囲の発病率で、１型糖尿病の発病率に対して著しく影響し得ることが知られている。過去１０年にわたってこの現象の研究に相当な努力がなされてきた。例えば、Diabetes, 46（4）：589-98（1997）およびDiabetes Metab. ReV., 12（4）：341-59（1996）ならびにそこに引用された参考文献を参照のこと。糖尿病の誘導のために両極端な２つの食餌に関する研究が本発明者らの幾人かによって行われた。ＡＩＮ−９３（Dyets, Inc.）は、最も低い糖尿病の発病率を引き起こし、今まで観察された最も低い比率の尿中３ＤＦ／クレアチニン（１．０）を生ずる。ピュリーナ５００は、最も高い糖尿病の発病率を誘導し、３ＤＦ／クレアチニン比において２．５倍増加を生ずる。ＦＬ３Ｐ、３ＤＧおよび３ＤＦはラットの膵臓において観察されたので、フルクトースリジンキナーゼおよび該代謝経路の代謝産物は、Ｉ型糖尿病の発現に関係するようである。この型の糖尿病に感受性の動物（ヒトにおけるインスリン依存またはＩ型糖尿病の有用なモデル）は、該動物を膵臓のβ細胞において発現する未知抗原に対して感受性にし、その結果、そのβ細胞における動物自身の免疫系による自己免疫攻撃を生じる異常な免疫系を有する。この結果、次いでそれらの破壊が生じ、それにより、動物からインスリンを製造する能力を奪う。タンパク質と反応する３ＤＧが新規な抗原部位を作成できることは、よく知られている。したがって、種々の食餌の抗原性の性質の起源は、膵臓においてフルクトースリジン−３−リン酸の分解によって生成される３ＤＧであるようである。
また、３ＤＧは一般にアミンと相互作用することが知られているので、それはＤＮＡと相互作用でき、架橋タンパク質と同様に、突然変異誘発および発癌の可能性を示すかもしれない。
ＦＬ３Ｐリジン回収経路の知見により、初めて、糖尿病の集団を区別することおよび該集団のサブセットが糖尿病性合併症を発現しそうであることを決定することが実用的になる。この決定は、都合のよいことに、試験対象の生物学的液体、例えば、血液フラクション（特に血漿または血清）、リンパ液、間質液などで行うことができる。
一晩絶食後、ヒト対象に比較的高濃度の糖化リジン残基を含有する食物供給源を与える。例として、該食物は、後記の実施例５に記載のようなカゼイン／糖「クッキー」、または糖化リジンもしくは合成フルクトース−リジンのいくつかの他の適当な供給源の形態であることができる。糖化リジン残基を含有するタンパク質を利用する場合、糖化リジン含量は、好ましくは、全タンパク質アミノ酸の０．０２〜１０％、またはより好ましくは、約０．２〜０．４％であるべきである。経口投与量において糖化リジン残基の全量は、約０．３グラムであるべきである。好ましくは、糖化リジン供給源の消費前に、次いで、１、３および５時間後にまたは個々の臨床状況によって保証され得るような他の適当な時間に尿試料を収集する。
これらの尿試料中の３ＤＧおよび３ＤＦレベルを測定し、これらの代謝産物比を算出する。該測定に利用した特別の方法論は、本発明の実施に必須ではない。後記の実施例５に記載のＧＣ法を所望により利用してもよい。当業者に明らかなように、別法では、比色または免疫学的アッセイ方法を使用できる。
近年完成した糖尿病調節（Diabetes Control）および合併症試験
（Complications Traial）によって明白に立証されたように、糖尿病患者が直面する主要な危険因子が血糖調節であることは明らかである。しかしながら、糖尿病性合併症の発病率は、単に血糖レベルによって説明できず；糖尿病性合併症の発病率を歴史的な血糖レベルと比較する場合、本当に幅広い分散が見られる。
糖尿病性合併症を発現する最も危険な状態にある糖尿病集団のサブセットを決定する一の方法は、本発明の特に有意な態様である。該方法は、糖化リジンの供給源を摂取する前および最適には、摂取した後でのＦＬ、３ＤＧおよび３ＤＦレベルの測定を含む。
例えば、正常な対象は、約０．０２５の空腹時の尿中３ＤＧ対３ＤＦ比を有するが、糖尿病患者は、５倍以上の高い比率を有する。このことは、正常な血糖者は０．０２５（１／３９．７７）の３ＤＧ／３ＤＦ比を該値周辺の本当に狭い分散とともに有するが、糖尿病患者は２倍より大きい平均比率（平均０．０６９）を平均値周辺の非常により大きな分散とともに有する図７のデータにより支持される。
本明細書で示されるように、糖尿病患者は、３ＤＧの生成が増加する。したがって、糖尿病性合併症に対する耐性は、該毒性代謝産物の非常に有効な除去を必要とする。本明細書に記載の方法で算出された３ＤＧの３ＤＦに対する比率により、３ＤＧ無毒化経路の効率を評価することができる。低い比率を有する個体は、一般に、糖尿病性合併症の発現に対して耐性であろう。正常な範囲内に含まれる比率を包含するより高い比率を有する個体は、より危険な状態にあるが、正常な範囲より上の高い比率を有する個体が、これらの合併症を発現する特に危険な状態にある。
４つの異なるラット系統の血漿および尿中におけるフルクトースリジン（ＦＬ）の最近の測定は、それら各々の腎臓が血中ＦＬを処理する方法においてかなりの変化性を示した。４系統のうち２つ（Long Evans, Brown Norway）において、クレアチニンに対する該化合物およびその代謝産物の比率に基づいて、腎臓によってろ過された事実上全てのＦＬが尿中に現れた。他の２つの系統（Sprague Dawley, Fischer）では、クレアチニンフラクションとの比較に基づいて、血漿中ＦＬの１０−２０％が尿中に現れた。これらの測定は、哺乳動物の腎臓におけるＦＬ処理の主要な変化性を強く示唆する。げっ歯類およびヒトの腎臓はほとんど機能的に同等であることがわかっているので、ＦＬ処理における同様の変化がヒトに存在するであろうと仮定することが理にかなっている。ＦＬは、フルクトースリジン回収経路への第１の投入物であるので、経路全体は、大量のＦＬを限外ろ過液から吸収したヒトにおいて実質的に刺激されているようであり、それは、腎臓ならびに全身に３−デオキシグルコソン（３ＤＧ）の高い局所的レベルを導く。この観察は、尿試料と同時に得られる血漿または血清の試料との比較によりＦＬの腎臓への流量および尿中に現れるその流量のフラクションを決定する診断試験の基礎として役立つかもしれない。次いで、この比率が実質的に１よりも低い個体は、限定するものではないが、糖尿病性腎障害、老齢における腎不全および腎臓癌を包含する種々の腎臓の病状を発現する危険な状態にある。
本発明のキナーゼインヒビターの治療効果は、リジン回収経路の試験を用いて容易に安全に決定することができる。試験プロトコールは、尿中３ＤＧおよび３ＤＦレベルに加えて尿中フルクトースリジンレベルを測定すること以外は、直前に前記したものと同一である。ＦＬ３Ｐキナーゼインヒビター治療の開始前および開始後の両方でこの試験を行うことが有用である。３ＤＧおよび３ＤＦの尿中レベルは各時点で合計し、同一の試料中で測定したフルクトースリジンのレベルと比較する。
糖化リジン残基に富む食物を摂取後に尿中に見られる３ＤＧおよび３ＤＦの最高レベルは、リジン回収経路の活性によって誘導される。これらの代謝産物濃度の非反応性フルクトース−リジン（ヒトの尿の通常の成分である）に対する比率は、該経路の活性を反映する。リジン回収経路の阻害は、排出される３ＤＧおよび３ＤＦ量の減少、およびフルクトース−リジンの排出量の増加を引き起こすであろう。したがって、キナーゼインヒビターの治療効果は、阻害治療後の（３ＤＧ＋３ＤＦ）／フルクトース−リジン比の減少を測定することによって定量することができる。該アッセイの解釈において、尿容量または代謝産物濃度が要因であるのではなく、代謝産物の比率のみが考慮されることに注目すべきである。
高濃度の糖化リジン残基を含有する経口的に消化される食物が腎臓および血清３ＤＧの生成を導くであろうことは、先の開示から認められよう。腎臓疾患の危険性のある個体、例えば、糖尿病患者に、これらを高濃度で有する食物を避けるように警告することが理にかなっている。糖化リジン残基の濃度は、多種多様な方法で測定できる。１のかかる測定法を後記の実施例４に記載する。しかしながら、正確に糖化リジン残基のレベルを測定するいずれかの適当な測定法を後記に例示したアッセイ方法の代わりに用いることができる。特に考えられるアッセイ方法の例は、限定するものではないが、比色および免疫学的方法を包含する。
用いる測定法にかかわらず、調理食品中の糖化リジン残基の含量を測定すること、および腎不全を発現する危険性のある個体が糖化リジン含量の高い食品を摂取することを控えるように、これらの測定値を該個体に通告することは、本発明の範囲内である。
以下の実施例は、本発明をさらに詳細に記載するために提供される。これらの実施例は実例となる目的のみに提供されるものであり、いかなる方法において、本発明を制限するものとして解釈されるべきではない。別記しない限り、実施例に与えられる全ての温度は摂氏である。
実施例１
ＦＬ３Ｐの単離および同定：
糖尿病ラット腎臓の過塩素酸抽出物の31Ｐ ＮＭＲ分析は、６．２４ｐｐｍに非腎臓組織では観察されず、非糖尿病腎臓では非常に低いレベルで存在する新規な糖一リン酸共鳴を示した。観察された共鳴の原因である化合物は、溶出液として１−ブタノール−酢酸−水（５：２：３）を用いる微結晶セルロースカラム上での抽出のクロマトグラフィーによって単離した。プロトン２Ｄ ＣＯＳＹによって、構造をフルクトース−リジン３リン酸であると決定した。このことは、後に、以前に記載されたように（Finot and Mauson, Helv. Chim. Acta, 52: 1488（1969））調製されたＦＬを動物に注射し、ＦＬ３Ｐへの直接のリン酸化を明らかにすることによって確かめられた。３−位を特異的に重水素化したＦＬを用いて、炭素−３でのリン酸塩の位置を確かめた。このことは、カップリングおよびデカップリングした両方の31Ｐ ＮＭＲスペクトルを分析することによって行った。通常のＰ−Ｏ−Ｃ−Ｈカップリングは、１０．３ＨｚのＪ値を有してＦＬ３Ｐにおいて２重線を生じるが、３−重水素化ＦＬ３Ｐの場合、Ｐ−Ｏ−Ｃ−Ｄはカップリングを有さず、カップリングおよびデカップリングした両方で１重線を生じる。ＦＬ３Ｐの独特の特性は、水素化ホウ素ナトリウムで処理したとき、マンニトールおよびソルビトール−リジン３リン酸に相当する５．８５および５．９５ｐｐｍの２つの新たな共鳴に変換されることである。
実施例２
ＦＬ３Ｐの合成：
１ミリモルのジベンジルグルコース３−リン酸および０．２５ミリモルのα−カルボベンゾキシ−リジンを５０ｍｌのＭｅＯＨ中で３時間還流した。溶液を１００ｍｌの水で希釈し、ピリジニウム形態でＤｏｗ−５０カラム（２．５ｘ２０ｃｍ）上のクロマトグラフィーに付し、最初に水（２００ｍｌ）で、次いで６００ｍｌのバッファー（０．１Ｍピリジンおよび０．３Ｍ酢酸）で溶出した。標的化合物は、水洗浄の終わりとバッファー洗浄の始めに溶出した。水素２０ｐｓｉにて５％Ｐｄ／Ｃを用いるｃｂｚおよびベンジルブロッキング基の除去により、６％収率でＦＬ３Ｐを得た。
実施例３
ＦＬおよびＡＴＰからＦＬ３Ｐへの酵素的生産ならびに、インヒビターをスクリーニングするためのアッセイ：
最初に、31Ｐ ＮＭＲを用いて、腎臓皮質におけるキナーゼ活性を示した。新鮮なブタ腎臓皮質の試料３ｇを、９ｍｌの１５０ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＤＴＴ、１５ｍＭ ＭｇＣｌ2を含有する５０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ７．５中でホモジネートした。これを１０，０００ｇで３０分間遠心分離し、次いで、上清を１００，０００ｇで６０分間遠心分離した。硫酸アンモニウムを６０％飽和まで添加した。４℃で１時間後、遠心分離によって沈殿を収集し、５ｍｌの元のバッファー中に溶解した。該溶液の２ｍｌアリコートを１０ｍＭ ＡＴＰおよび１０ｍＭのＦＬ（前記の実施例１のように調製した）とともに３７℃で２時間インキュベートした。３００μｌの過塩素酸で反応をクエンチし、遠心分離でタンパク質を除去し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ１０カラム（５ｘ１０ｃｍ）上で脱塩した。反応混合物の31Ｐ ＮＭＲ分析により、ＦＬ３Ｐの生成を検出した。
このように得られたキナーゼ活性の証明に基づいて、放射能アッセイを発展させた。該アッセイは、ＦＬ３ＰによるＤｏｗ−１陰イオン交換樹脂への結合がないことを利用するように設計された。ＦＬ３Ｐのこの特徴は、それを単離するよう努力する間に見出された。大抵のリン酸塩は該樹脂に結合するので、ＡＴＰと反応する全ての化合物はいずれかの過剰のＡＴＰと同様に結合され、溶液中にＦＬ３Ｐを残すと考えられた。第１の段階は、アッセイにおいてＡＴＰを除去するのに必要な樹脂の量を決定することであった。これは、混合物を０．９ｍｌＨ2Ｏ中２００ｍｇのＤｏｗ−１懸濁液中にピペットで入れ、ボルテックスし、遠心分離して樹脂をパック（pack）することによって達成された。これから上清０．８ｍｌをピペットで２００ｍｇの新しい乾燥樹脂上に移し、ボルテックスし、遠心分離した。０．５ｍｌ容量の上清をピペットで１０ｍｌのＥｃｏｓｃｉｎｔ Ａ中に入れ、カウントした。残留カウントは８５ｃｐｍであった。該手法をアッセイに用いた。粗皮質ホモジネートの６０％硫酸アンモニウム沈殿由来の沈殿を４℃でホモジネートバッファー中に再溶解した。アッセイは、５０ｍＭ トリス ＨＣｌ、ｐＨ７．５の０．１ｍｌ中における１０ｍＭ γ33Ｐ−ＡＴＰ（４０，０００ｃｐｍ）、１０ｍＭ ＦＬ、１５０ｍＭ ＫＣｌ、１５ｍＭ ＭｇＣｌ2、５ｍＭ ＤＴＴを含有する。ＦＬ３Ｐ生成と酵素濃度の間の関係は、１、２および４ｍｇのタンパク質を用いて３７℃で３０分間の３重測定を用いて決定する。ＦＬを含まずに行うブランクを減じ、データを記録した。観察された活性は、およそのＦＬ３Ｐ合成速度２０ナノモル／時間／ｍｇタンパク質に相当した。
実施例４
メグルミンおよび種々のポリオールリジンによる３−デオキシグルコソンの生成の阻害
ａ．一般的なポリオールリジン合成
糖（１１ミリモル）、α−カルボベンゾキシ−リジン（１０ミリモル）およびＮａＢＨ3ＣＮ（１５ミリモル）を５０ｍｌのＭｅＯＨ−Ｈ2Ｏ（３：２）中に溶解し、２５℃で１８時間攪拌した。溶液を過剰のＤｏｗ−５０（Ｈ）イオン交換樹脂で処理して、過剰のＮａＢＨ3ＣＮを分解した。該混合物（液体プラス樹脂）をＤｏｗ−５０（Ｈ）カラム（２．５ｘ１５ｃｍ）上に移し、水でよく洗浄して過剰の糖およびホウ酸を除去した。カルボベンゾキシ−ポリオールリジンを５％ＮＨ4ＯＨで溶出した。蒸発で得られた樹脂を水−メタノール（９：１）中に溶解し、木炭上の１０％パラジウム触媒を用いて水素ガス（２０ｐｓｉ）で還元した。ろ過および蒸発により、ポリオールリジンを得る。
ｂ．ソルビトールリジン、マンニトールリジンおよびガラクチトールリジンによる尿および血漿３−デオキシグルコソンの減少のための実験プロトコール
６匹のラットから３時間、尿を収集した。血漿試料も得た。次いで、動物に腹膜内注射によってソルビトールリジン、マンニトールリジンまたはガラクチトールリジンのいずれかを１０マイクロモル与えた。さらに３時間、尿を収集し、３時間の最後に血漿試料を得た。
後記の実施例５に記載のように、３−デオキシグルコソンをこれらの試料中で測定し、種々の容量をクレアチニンに対して標準化した。尿中３−デオキシグルコソンの平均減少は、ソルビトールリジンにより５０％、マンニトールリジンにより３５％およびガラクチトールリジンにより３５％であった。血漿３−デオキシグルコソンは、ソルビトールリジンにより４０％、マンニトールリジンにより５８％およびガラクチトールリジンにより５０％減少した。
ｃ．尿中３−デオキシグルコソンを減少させるためのメグルミンの使用
前記のリジン誘導体の代わりにメグルミン（１００マイクロモル）を腹膜内注射する以外は、前記のｂ）のとおりに３匹のラットを処理した。注射後３時間で尿中の平均３−デオキシグルコソン濃度が４２％減少した。
実施例５
糖化タンパク質の注射後のヒトにおける尿中ＦＬ、３ＤＧおよび３ＤＦの増加
ａ．糖化タンパク質含有食品の調製：
２６０ｇのカゼイン、１２０ｇのグルコースおよび７２０ｍｌの水を混合して、均一混合物を得た。該混合物を金属プレートに移し、６５℃で６８時間調理した。次いで、得られたケーキをコース（course）粉末になるまで砕いた。
ケルダール法によって測定すると、該粉末は６０％タンパク質を含有した。
ｂ．糖化リジン含量の測定：
前記の工程ａのように調製した粉末１ｇを６Ｎ ＨＣｌで２０時間還流することによって加水分解した。得られた溶液をＮａＯＨ溶液でｐＨ１．８に調整し、１００ｍｌに希釈した。フルクトースリジン含量は、フルクトースリジンの酸加水分解から得られた生成物、フロシン（furosine）としてアミノ酸分析器で測定した。該方法において、ケーキが５．５％（ｗ／ｗ）フルクトースリジンを含有したことを測定した。
ｃ．実験プロトコール：
ボランティアはフルクトースリジン無しの食事で２日間過ごし、次いで、本明細書に記載のように調製した食品２２．５ｇを消費し、したがって実際上、２ｇのフルクトースリジンの投与を受けた。１４時間、２時間間隔で尿を収集し、最後の収集を２４時間目に行った。
ｄ．尿中のＦＬ、３ＤＧおよび３ＤＦの測定：
ＦＬは、４６℃でＷａｔｅｒｓ Ｃ１８ Ｆｒｅｅ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄカラムおよび１ｍｌ／分でアセトニトリル−メチルアルコール−水（４５：１５：４０）からアセトリトリル−酢酸ナトリウム−水（６：２：９２）への勾配溶出系を用いるＷａｔｅｒｓ９９６ダイオードＡｒｒａｙでのＨＰＬＣによって測定した。定量は、メグルミンの内部標準を使用した。
３ＤＦは、試料の脱イオン化後にＨＰＬＣによって測定した。分析は、ＰＡ１カラム（Dionex）を用い、３２ｍＭ 水酸化ナトリウムを用いて１ｍｌ／分で溶出するＤｉｏｎｅｘ ＤＸ−５００ ＨＰＬＣシステムで行った。定量は、合成３ＤＦで１日に得られた標準曲線から行った。
３ＤＧは、試料の脱イオン化後にＧＣ−ＭＳによって測定した。３ＤＧは、ＰＢＳ中の１０倍過剰のジアミノナフタレンを用いて誘導された。酢酸エチル抽出により、塩を含まないフラクションを得、それをＴｒｉ−Ｓｉｌ（Pierce）でトリメチルシリルエーテルに変換した。分析は、Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ５８９０選択イオンモニタリングＧＣ−ＭＳシステムで行った。ＧＣは、以下の温度プログラム：注入口２５０℃、開始カラム温度１５０℃で１分間保持し、次いで、１６℃／分で２９０℃まで上昇させ、１５分間保持する、を用いる融解シリカキャピラリーカラム（ＤＢ−５，２５ｍｘ．２５ｍｍ）で行った。３ＤＧの定量は、Ｕ−１３Ｃ−３ＤＧの内部標準を用いる選択イオンモニタリングを用いた。
図３に示すグラフは、糖化タンパク質消費後の１ボランティアの尿中におけるＦＬ、３ＤＦおよび３ＤＧの生成を示す。３つの代謝産物全ての迅速な出現が明らかである。３ＤＦおよび３ＤＧの両方が、２４時間後でさえもわずかな上昇を示す。
図４に示すグラフは、７人の試験群のメンバー各々における３ＤＦの生成を示す。同様なパターンが全ての場合に見られる。図４に明らかなように、３ＤＦ排出は、ＦＬ食塊（bolus）後４時間で最高になり、食塊後２４時間でさえ３ＤＦのわずかな上昇があることに注目すべきである。
実施例６
摂食実験：
Ｎ−アセチル−β−グルコサミニダーゼ（ＮＡＧａｓｅ）は、糖尿病患者において高濃度で尿中に排出される酵素である。それは、管損傷の初期の目印であると考えられているが、尿中ＮＡＧａｓｅ増加の病状は、よく理解されていない。糖尿病患者におけるＮＡＧａｓｅの尿中産出の増加は、細胞の破壊よりもむしろ尿中への産出増加を伴う糖尿病によって誘導される近位尿細管におけるリソソームの活性化のためであると提案されている。
該実施例において得られた結果は、全ての比較において、３ＤＦおよびＮＡＧａｓｅレベルが対照と比べて実験群において上昇することを示す。したがって、糖化タンパク質を与えられた動物は、糖尿病患者で得られた結果と同様に、過剰のＮＡＧａｓｅを尿中に排出する。対照動物と比べてＮＡＧａｓｅ排出が約５０％増加する。これらの動物は、また、対照と比べて尿３ＤＦが５倍増加する。図５および６に見られるように、尿中３ＤＦは、３ＤＧと非常によく相関する。どちらの化合物も、再吸収されることなく糸球体ろ過値で血漿から除去されるようである。
実施例７
腎臓タンパク質のＳＤＳゲル：
２匹のラットに１日にＦＬまたはマンニトール（対照として使用される）のいずれか５マイクロモルを５日間注射した。動物を殺し、腎臓を取り出し、皮質および骨髄に解剖した。５容量の１５０ｍＭ ＫＣｌ、１５ｍＭ ＭｇＣｌ2および５ｍＭ ＤＴＴを含有する５０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ７．５中で組織をホモジネートした。細胞破片を１０，０００ｇで１５分間の遠心分離によって除去し、次いで、上清を１５０，０００ｇで７０分間遠心分離した。溶性タンパク質を１２％ポリアクリルアミドゲルならびに４−１５および１０−２０％濃度勾配ゲルのＳＤＳ ＰＡＧＥによって分析した。全ての場合、マンニトールを注射した動物と比べて、ＦＬを注射した動物の腎臓抽出液から、より低分子量のバンドがなくなるかまたは視覚的に減少した。
実施例８
３−Ｏ−メチルフルクトースリジンの合成：
３−Ｏ−メチルグルコース無水物１９．４ｇ（０．１モル）および重亜硫酸ナトリウム１ｇのメタノール３０ｍｌおよびグリセロール１５ｍｌ中懸濁液を３０分間還流し、次いで、０．０３５モルのα−カルボベンゾキシ−リジンおよび４ｍｌの酢酸を加えた。該溶液を３時間還流した。溶液を１容量の水で処理し、ピリジニウム形態でＤｏｗｅｘ−５０カラム（４ｘ５０ｃｍ）上のクロマトグラフィーに付し、最初は水、次いで酢酸ピリジニウムで溶出した。純粋な物質を含有するフラクションを合わせ、蒸発させた。得られた物質を５０ｍｌの水−メタノール（９：１）中に溶解し、木炭触媒上の１０％パラジウムを用いて水素ガス（２０ｐｓｉ）で還元した。ろ過および蒸発により、３−Ｏ−メチルフルクトースリジンを得た。
前記の式（Ｉ）の構造を有する他の特定の化合物は、例えば、選択された窒素または酸素含有出発物質、おそらく、アミノ酸、ポリアミノ酸、ペプチドなどをフルクトースのような糖化剤を用いて糖化することによって製造され、所望により、それを当業者に周知の手法によって化学的に修飾してもよい。
実施例９
ＦＬ３Ｐキナーゼ活性の付加的アッセイ：
ａ．貯蔵溶液の調製：
１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ８．０、１０ｍＭ ＡＴＰ、２ｍＭ ＭｇＣｌ2、５ｍＭ ＤＴＴ、０．５ｍＭ ＰＭＳＦであるアッセイバッファー溶液を調製した。２ｍＭフルクトシル−スペルミンＨＣｌであるフルクトシル−スペルミン貯蔵溶液を調製した。２ｍＭスペルミンＨＣｌであるスペルミン対照溶液を調製した。
ｂ．フルクトシル−スペルミンの合成：
フルクトシル−スペルミンの合成は、既知の手法（J. HodgeおよびB. Fisher, Methods Carbohydr. Chem., 2: 99-107（1963））の適用によって行った。スペルミン（５００ｍｇ）、グルコース（５００ｍｇ）およびピロ亜硫酸ナトリウム（８０ｍｇ）の混合物を５０ｍｌのメタノール−水（１：１）中モル比８：４：１（スペルミン：グルコース：ピロ亜硫酸塩）中で調製し、１２時間還流した。生成物を水で２００ｍｌまで希釈し、ＤＯＷ−５０カラム（５ｘ９０ｃｍ）上にロードした。非反応グルコースを２カラム容量の水によって除去し、生成物および非反応スペルミンを０．１Ｍ ＮＨ4ＯＨで除去した。生成物のプールしたピークフラクションを凍結乾燥し、フルクトシル−スペルミンの濃度を、生成物の定性13Ｃ ＮＭＲスペクトル（ＮＭＲデータは、４５°パルス、１０秒緩和遅延時間およびＮＯＥデカップリング無しで収集した）におけるＣ−２フルクトシルピーク全体を測定することによって決定した。
ｃ．精製のためのキナーゼのアッセイ：
１０μｌの酵素調製物、１０μｌのアッセイバッファー、１．０μＣｉの33Ｐ ＡＴＰ、１０μｌのフルクトシル−スペルミン貯蔵溶液および７０μｌの水を含むインキュベーション混合物を調製し、３７℃で１時間インキュベートした。インキュベーションの終わりに、９０μｌ（２ｘ４５μｌ）の試料を２つの２．５ｃｍ直径リン酸セルロースディスク（Whatman P-81）上にスポットし、乾燥させた。ディスクを水で広範囲に洗浄した。乾燥後、ディスクをシンチレーションバイアル中に置き、カウントした。
各酵素フラクションを適当なスペルミン対照を用いて２連でアッセイした。
実施例１０
糖化タンパク質食餌における試験動物に観察された腎臓病状
３匹のラットを糖化タンパク質食餌（２０％全タンパク質；３％糖化）で８ヶ月維持し、対照食餌で維持した同じ年齢の９匹のラットと比較した。主な知見は、糖化食餌の動物における損傷した糸球体の実質的な増加であった。これらの動物において観察された典型的な病変は、糸球体嚢（ボーマン嚢）の分節性硬化症、壁上皮（parietal epithelium）の尿細管形成異常および間質性繊維症であった。糖化タンパク質食餌の動物の３匹全ておよび対照食餌の動物の１匹のみが、１３％より大きい損傷糸球体を示した。これが起こる確立は２％未満である。糸球体において観察された病状に加えて、尿細管内にいくつかのヒアリン円柱が観察された。定量されていないが、これらのより多くが糖化食餌の動物に見られた。ＮＡＧａｓｅのレベルの増加もまた、糖化食餌の動物に観察された。
該実験の結果から、糖化食餌は、試験動物に、糖尿病の腎臓に見られるのと同様の一連の組織学的病変を発現させるようであった。
実施例１１
妊娠に対する糖化食餌の影響
予備実験において、５組のマウスが糖化食餌（１８％全タンパク質；３％糖化）を与えられ、７ヶ月間にわたって６回子を産んだ。得られた６回の妊娠は、１７、２３、１３、０、３および０匹の生存する子を生じた。第３の出産後の生存する子におけるこの激しい減少を考慮して、１０組からなる２団の各々に糖化食餌（１３％全タンパク質；３％糖化）かまたは対照食餌（１３％タンパク質、０％糖化）のいずれかを与えた。これまでは、２群の子が４回生まれ、両方の群において同様の結果を得た。第１の妊娠は４９／２０（糖化／対照）の子を生じ；第２は１８／４１；第３は３７／２７、第４は２０／３３であった。第５の妊娠、現在進行中である。マウスの組は、高血糖について試験された。血中グルコースレベルは、実験および対照群において、各々、１２０および１１２ｍｇ／ｄｌである。
マウスの尿における３ＤＦレベルの予備測定は、予想通り、本明細書に記載の糖化食餌の場合、全身の３ＤＦの実質的な増加（約５−１０倍）を示す。
実施例１２
フルクトースリジン経路の発癌効果
フルクトースリジン経路において生成される代謝産物の発癌性の可能性を調べるために、腎臓癌に高感受性のラット系統で実験を行った。４匹のラットに糖化食餌を与え、３匹のラットに対照食餌を与えた。食餌を与えて１０週後、動物を殺し、それらの腎臓を調べた。食餌を与えた４匹全てにおいて、１ｍｍよりも大きなサイズの腎臓癌が見られ、一方、対照動物においては、このような大きな病変は見られなかった。これが起こる確率は、２％未満である。データは、腎臓管状細胞（多くの腎臓癌の起源の細胞であることが知られている）において見られる動物食餌中の糖化タンパク質由来の過剰のフルクトースリジンによって引き起こされた３ＤＧレベルの上昇が、細胞ＤＮＡと相互反応し、種々の突然変異を導き、最終的に発癌事象を導くことができることを示す。腎臓および他の場所でのヒトの癌の発現において該過程が重要である可能性がある。
本発明のある特定の具体例は、前記に記載および／または例示されたが、種々の他の具体例は、前記の開示から当業者に明らかであろう。したがって、本発明は、記載および／または例示された特別の具体例に限定されず、以下の請求の範囲の範囲から逸脱することなく、変更および修飾を考慮することができる。
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【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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