(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面被覆用細胞外基質組成物であって、
前記組成物のｐＨが、７．８と８．５の間にあり、
前記組成物が、
細胞外基質、
ならびに、
組成物の２００ｍｇ／ｍｌから８００ｍｇ／ｍｌの濃度で存在するヘパリン、
組成物の５ｍｇ／ｍｌから２０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在するフィブロネクチン、
および
組成物の１ｍｇ／ｍｌから１０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在するラミニン、
からなる群から選択される少なくとも１種の外生成分とを含むことを特徴とする表面被覆用細胞外基質組成物。
【請求項２】
前記細胞外基質が、基底膜タンパク質抽出物を含むことを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
さらに塩基性ｐＨ範囲に緩衝化するのに十分な濃度のトリス・バッファーを含むことを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記トリス・バッファーが、組成物に対して０．０１〜０．０５Ｍの濃度で存在することを特徴とする請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
さらに塩化ナトリウムを含むことを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記塩化ナトリウムが、組成物に対して０．０３Ｍから０．１５Ｍの濃度で存在することを特徴とする請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記細胞外基質が、組成物の１０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在することを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
細胞外基質ならびに、外生のフィブロネクチンおよびヘパリンとを含む、表面被膜用細胞外基質組成物であって、細胞外基質は１０ｍｇ／ｍｌの濃度を有し、フィブロネクチンは５ｍｇ／ｍｌから２０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在し、ヘパリンは２００ｍｇ／ｍｌから８００ｍｇ／ｍｌの濃度で存在することを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
基材と該基材上の被覆とを含み、該被覆は、請求項１〜８のいずれかに記載の細胞外基質組成物からなることを特徴とする細胞培養システム。
【請求項１０】
前記基材が、セルロース膜、多孔性ポリカーボネート、多孔性ポリテトラフルオロエチレン、ナイロン膜、ガラスフィルタ、多孔性ポリエチレンテレフタレート、ポリメチルペンタン、ポリプロピレン、ポリエチレンおよびこれらの組み合わせからなる群から選択されることを特徴とする請求項９に記載のシステム。
【請求項１１】
（ａ）細胞外基質を用意する工程；および、
（ｂ）用意した細胞外基質を、
組成物の２００ｍｇ／ｍｌから８００ｍｇ／ｍｌの濃度で存在するヘパリン、
組成物の５ｍｇ／ｍｌから２０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在するフィブロネクチン、
および
組成物の１ｍｇ／ｍｌから１０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在するラミニン
からなる群から選択される少なくとも１種の外生成分と組み合わせる工程、
及び
（ｃ）組成物のｐＨを７．８と８．５の間に調節する工程、
を含むことを特徴とする表面被覆用細胞外基質組成物の製造方法。
【請求項１２】
組成物に塩化ナトリウムを加える工程をさらに含むことを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
（ａ）請求項１〜８のいずれかに記載の細胞外基質組成物を用意する工程；
（ｂ）基材に組成物を塗布する工程；および
（ｃ）塗布した組成物をインキュベートしてその重合をさせる工程
を含むことを特徴とする細胞培養システムの製造方法。
【請求項１４】
前記インキュベーションが、２２℃から３７℃の温度で行なわれることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記組成物が、塩基性ｐＨ範囲に緩衝化するのに十分な濃度のトリス・バッファーをさらに含むことを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記組成物が、さらに塩化ナトリウムを含むことを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記基材が、セルロース膜、多孔性ポリカーボネート、多孔性ポリテトラフルオロエチレン、ナイロン膜、ガラスフィルタ、多孔性ポリエチレンテレフタレート、ポリメチルペンタン、ポリプロピレン、ポリエチレンおよびこれらの組み合わせからなる群から選択されることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概括的に言えば、可能性のある刺激物質または阻害物質の様々な細胞培養に対する効果を評価可能とするための、細胞外基質（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ）組成物および細胞培養システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
組織培養により生体外で（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）維持および増殖させるための組織からの細胞収集は、医学および生化学研究における主要な手段である。組織培養は、調合した栄養素環境において、生物体（植物または動物）に由来する組織または細胞を増殖させ、かつ／または代謝を支援する技術または方法である。一旦、温和な組織解離によって分離した細胞は、生命機能を支持し得る栄養培地中でインキュベートされる。少数の例外を除けば、正常な代謝機能を遂行し、増殖および分裂するためには、細胞が基層（ｓｕｂｓｔｒａｔｕｍ）に接着する必要がある。組織中では、基層（それは細胞増殖の支持体となる）は、基底膜または間質性基質（ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ  ｍａｔｒｉｘ）である。基底膜は、物理的な骨格（ｐｈｙｓｉｃａｌ  ｓｃａｆｆｏｌｄｓ）および分子フィルターとして機能するだけでなく、接着、運動性および分化を含む様々な細胞プロセスの固相調整装置の役割を果たす。また、基底膜は、成長因子の貯蔵場所としての役割を果たすことにより、およびそれらの生体内での（ｉｎ  ｖｉｖｏ）半減期を延ばすことにより細胞の増殖を調整できる。
【０００３】
基底膜は、ある種の細胞外基質であり、主にラミニンおよびＩＶ型コラーゲンから構成される。基底基質に特有な４つの主な基質成分には、ラミニン、ＩＶ型コラーゲン、エンタクチン（ｅｎｔａｃｔｉｎ）、ニドジェン（ｎｉｄｏｇｅｎ）およびヘパラン硫酸プロテオグリカン類（ＨＳＰＧ）が含まれる。また、基底膜は、ＥＧＦ、ＩＧＦ−１、ＰＤＧＦ、ＴＧＰベータ、ＶＥＧＦおよびｂＦＧＦなどの相当数の成長因子も含んでいる。市販の基底膜由来細胞外基質の例としては、例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社によるＥＣＭゲルやＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社によるＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）が挙げられる。これはＥｎｇｌｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍ（ＥＨＳ）マウス腫瘍から抽出される。このマウス腫瘍は基底膜タンパク質に富んでいる。Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）基質は室温でゲル化して再構成（ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅｄ）基底膜を形成し、これは、構造、組成、物理的性質、および生体内の基底膜に典型的な機能特性を保持する能力が類似している。
【０００４】
Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）基質は、内皮細胞、上皮細胞、神経細胞、肝細胞を含む多数のタイプの細胞分化をサポートする。内皮細胞をＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）上に播種すると、細胞は増殖を停止し、高い運動性と細胞間コミュニケーションを示す。さらに、細胞は整列して、管状または導管状構造の三次元のネットワークを形成する。これらの構造の形成は、血管新生カスケードの最終ステップはもとより、内皮細胞の分化のモデルとして使用されている。
【０００５】
内皮細胞管腔形成アッセイにおけるＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）の使用は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）基質の生体外での主な使用例のうちの１つである。このアッセイでは、内皮細胞の管長の範囲を測定して、内皮細胞管腔形成の指標として用いる。典型的な細胞外基質細胞上での分化の場合、基質中に成長因子が存在するため、外部から成長因子を与えなくても、細胞管腔形成が起こり得る。これは、阻害効果に関係する研究に細胞外基質を適用する上での制約となっている。特に、バックグラウンドでの管腔形成が高すぎるため、刺激作用の効果を調べることは困難であった。その結果、管腔形成アッセイは、これまで、刺激作用研究を行なうには十分な感度を有するものではなかった。
【０００６】
【特許文献１】米国特許第４，８２９，０００号明細書
【非特許文献１】Kleinman et al., Biometer. Sci.Polymer Edn., 5:1-11, (1993)
【非特許文献２】Sporn and Roberts, Peptide Growth Factors and Their Receptors I. Springer-Verlag, NewYork (1990)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、本発明の１つの目的は、基質構造の改変および／または組成物中の成長因子の細胞への接近可能性の封鎖もしくはブロッキングによって、成長因子の添加がない状態でのバックグラウンドの細胞管腔形成を低減するための、改変再構成（ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅｄ）基底膜由来の細胞外基質組成物を提供することである。
【０００８】
本発明の別の目的は、阻害物質（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）はもちろんのこと、可能性のある血管新生刺激物質（ａｎｇｉｏｎｅｎｅｓｉｓ  ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ）の、内皮細胞およびその他のタイプの細胞の細胞管腔形成に対する効果の直接的評価を可能にする細胞培養システムを提供することである。これらの刺激物質および阻害物質の作用経路を研究するためのアッセイシステムを提供することも有益であろう。
【０００９】
さらに、本発明の目的は、迅速で費用効率が良く、信号のダイナミックレンジを大きく増大させるアッセイシステムを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、可能性のある刺激物質および／または阻害物質の様々な細胞培養に対する効果を評価可能とするための、改変再構成細胞外基質組成物および細胞培養システムに関する。いくつかの実施形態においては、細胞外基質組成物は、改変再構成基底膜組成物である。本発明の組成物は、細胞外基質ならびに、ヘパリン、フィブロネクチンおよびラミニンから選択される少なくとも１種の外生成分とを含む。組成物のｐＨは塩基性ｐＨに調整できる。本明細書によって提供される細胞外基質組成物は、細胞培養基材の表面などの表面を被覆するのに有用である。被覆した基材は、例えば内皮細胞管腔形成アッセイシステムで使用できる。
【００１１】
いくつかの実施形態において、本発明は、細胞外基質ならびに、外生のフィブロネクチンおよびヘパリンを含む塩基性ｐＨを有する細胞外基質組成物であって、細胞外基質は約１０ｍｇ／ｍｌの濃度を有し、外生フィブロネクチンは約５ｍｇ／ｍｌから約２０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在し、外生ヘパリンは約２００ｍｇ／ｍｌから約８００ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する組成物を提供する。
【００１２】
さらに、いくつかの実施形態において、本発明は、細胞外基質と外生ラミニンとを含む塩基性ｐＨを有する細胞外基質組成物であって、細胞外基質は約１０ｍｇ／ｍｌの濃度を有し、外生ラミニンが約１ｍｇ／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する組成物を提供する。
【００１３】
本発明の別の態様は、基材被覆用組成物として本明細書が提供する本発明の組成物を使用する細胞培養システムを対象とする。このシステムは、基材とその上の被覆とを含み、該被覆は、細胞外基質ならびに、ヘパリン、フィブロネクチンおよびラミニンから選択される少なくとも１種の外生成分を含む被覆組成物からなる。該基材は、例えば、重合体材料、ガラス、金属および微細孔フィルターのうちの任意のものから形成される細胞培養基材とすることができる。
【００１４】
さらに、本発明は、本発明の組成物の製造方法を提供する。この方法は、細胞外基質を用意すること；用意した細胞外基質をヘパリン、フィブロネクチンおよびラミニンから選択される少なくとも１種の外生成分と組み合わせることを含む。この方法は組成物のｐＨを塩基性ｐＨに調整し、および／または組成物に塩化ナトリウムを加えることをさらに含んでもよい。
【００１５】
本発明の別の態様は、本発明の細胞培養システムの製造方法を対象とする。この方法は細胞外基質ならびにヘパリン、フィブロネクチンおよびラミニンから選択される少なくとも１種の外生成分を含む細胞外基質組成物を用意すること；そして、基材に該組成物を塗布することを含む。この方法は、その重合を可能にするために塗布した組成物をインキュベートすることをさらに含んでもよい。
【００１６】
本発明の組成物およびシステムは、阻害物質はもちろんのこと、細胞管腔形成に影響する可能性のある刺激物質の能力評価を可能にする。さらに、本発明の組成物は、細胞管腔形成アッセイシステムにおける信号のダイナミックレンジを大きく増大させる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
血管新生研究および薬物の開発においては、迅速で用途の広い内皮細胞管腔形成アッセイシステムが非常に望ましい。現行のアッセイシステムは血液新生阻害物質の研究には有効であるが、刺激物質に関する研究には有効ではない。本発明は、アッセイシステムにおいて使用した時、血管新生の活性化および阻害の両方の研究に有効な、改変再構成細胞外基質組成物を対象とする。本発明の組成物は、細胞ベースのアッセイシステムに使用した場合、信号のダイナミックレンジを大きく増大させ、内皮細胞毛細血管様構造形成の直接評価を強化できる事が判明した。本発明は、様々な被覆基材上の細胞管腔形成刺激物質および阻害物質の直接評価用培地を提供する。
【００１８】
いくつかの実施形態において本発明は、固化したゲル構造を改変し、および／または外生の刺激物質が存在しない状態では細胞管腔形成（細胞分化）が最小となるように、組成物内で成長因子の細胞に対する接近容易性を改変する成分を含む、改変再構成基底膜を対象とする。
【００１９】
本発明は、細胞外基質ならびに、ヘパリン、フィブロネクチンおよびラミニンから選択される少なくとも１種の外生成分とを含む細胞外基質組成物を提供する。１つの実施形態では、細胞外基質は基底膜タンパク質抽出物である。
【００２０】
いくつかの実施形態において、本発明の組成物は塩基性ｐＨを有する。組成物のｐＨは、好ましくは約７．８から約８．５の間、より好ましくは約８．０である。ｐＨはトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンバッファー（トリス  バッファー、Ｔｒｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ）によって維持してよい。もっとも、本発明の意図する充分範囲内にあるものとして、約７．８〜８．５のｐＨ範囲内に組成物を維持できる任意のバッファー成分も適切である。ｐＨ８．０となし得る可能性のあるバッファーシステムとしては、ジエタノールアミン；トリエタノールアミン；１，３−ビス［トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ］プロパン；３−［Ｎ、Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸、すなわちＤＩＰＳＯ；Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（４−ブタンスルホン酸）、すなわちＨＥＰＢＳ；Ｎ−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジン］エタンスルホン酸、すなわちＨＥＰＥＳ；３−（Ｎ−モルホリノ）ブタンスルホン酸、すなわちＭＯＢＳ；ピペラジン‐Ｎ、Ｎ’−ビス−（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）、すなわちＰＯＰＳＯ；Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸、すなわちＴＡＰＳ；３−［Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸、すなわちＴＡＰＳＯ；Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸、すなわちＴＥＳ；Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルグリシン、すなわちＴｒｉｃｉｎｅ；Ｎ−エチルモルホリン；ジメチルロイシルグリシン、５，５−ジエチルバルビツール酸ナトリウムおよび２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオールが挙げられる（但し、これらに限定されない）。
【００２１】
いくつかの実施形態においては、本発明の組成物は、塩基性ｐＨ範囲内に緩衝化するのに十分な濃度でトリス・バッファーを含むことができる。トリス・バッファーを含有させる場合は、好ましくは組成物全体の約０．０１Ｍ〜約０．０５Ｍの濃度で含有させる。トリス塩基は、例えば、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏ．（Ｈａｎｏｖｅｒ、イリノイ州）およびＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ、ミズーリ州）から販売されている。
【００２２】
さらに、いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、塩化ナトリウムなどの塩を含む。塩化ナトリウムを含有させる場合は、好ましくは、約０．０３Ｍから約０．１５Ｍの濃度で含有させる。何らかの特定の理論に拘束されるものではないが、ｐＨおよび塩濃度は、重合した基底膜ゲルの密度および強度に影響し得ると考えられる。
【００２３】
１つの実施形態では、本発明の組成物は細胞外基質、外生ヘパリン、および外生フィブロネクチンを含む塩基性ｐＨを有する組成物である。この組成物はさらに塩化ナトリウムを含んでもよい。
【００２４】
別の実施形態では、組成物は細胞外基質および外生ラミニンを含む塩基性ｐＨを有する組成物である。この組成物はさらに塩化ナトリウムを含んでもよい。
【００２５】
本明細書での定義によれば、「細胞外基質」（基底膜はその中のある特定のタイプである）は、細胞によって作られ、周囲の媒体に分泌される任意の物質である。本明細書では「細胞外基質」という用語は「基底膜」という用語と相互に交換可能なものとして使用する。細胞外基質は細胞によって分泌され得るもので、間質基底膜を形成し、これが細胞が接着する骨組みを形成する。基底膜は、細胞を間葉（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ）結合組織から分離し、また、空間的な向きを与え、さらに細胞の成長および分化のために必要な安定性をもたらす。細胞外基質分子または基底膜もまた、組織に対する成長因子の隔離、貯蔵および提示に関わっている。
【００２６】
基底膜は様々な成分を含む。しかし、その主な成分は、ラミニン、次いでＩＶ型コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン類、エンタクチン（ｅｎｔａｃｔｉｎ）およびニドジェン（ｎｉｄｏｇｅｎ）である。これらの成分は、再溶解し、そして再構成可能となった時、一定の割合で重合する。
【００２７】
細胞外基質分子または基底膜は当技術分野で知られており、市販されている。例えば、ＥＨＳマウス肉腫腫瘍由来の細胞外基質は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｃｏｒｐ．，  Ｍｅｄｆｏｒｄ、  マサチューセッツ州）、ＥＣＭゲル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．，Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ、ミズーリ州）およびＣｕｌｔｒｅｘ（登録商標）（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ，  Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、メリーランド州）として入手可能である。
【００２８】
「細胞外基質」という用語は当技術分野で認識されている。その成分は、以下のタンパク質の１種または複数種を含む。すなわち、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、テナスシン（ｔｅｎａｓｃｉｎ）、エンタクチン、トロンボスポンディン（ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ）、エラスチン、ゼラチン、コラーゲン、フィブリリン（ｆｉｂｒｉｌｌｉｎ）、メロシン（ｍｅｒｏｓｉｎ）、アンコリン（ａｎｃｈｏｒｉｎ）、コンドロネクチン（ｃｈｏｎｄｒｏｎｅｃｔｉｎ）、リンク・タンパク質（ｌｉｎｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、骨シアロタンパク質、オステオカルシン（ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ）、オステオポンチン（ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎ）、エピネクチン（ｅｐｉｎｅｃｔｉｎ）、ヒアルロネクチン（ｈｙａｌｕｒｏｎｅｃｔｉｎ）、アンヂュリン（ｕｎｄｕｌｉｎ）、エピリグリン（ｅｐｉｌｉｇｒｉｎ）およびカリニン（ｋａｌｉｎｉｎ）である。他の細胞外基質分子は、非特許文献１に記載されており、本明細書に参照によって組み込まれる。「細胞外基質」という用語は、現時点では知られていないが将来発見される未知の細胞外基質をも包含するものである。これは、細胞外基質としてのその特性決定は当業者であれば容易に決定できるからである。
【００２９】
上記のように、本発明の組成物は、細胞外基質成分を含む。１つの望ましい実施形態では、細胞外基質は、特許文献１（これは参照によってその全内容が本明細書に組み込まれる）に開示されるような基底膜タンパク質抽出物として提供される。タンパク質抽出物は加熱により、硬い安定ゲル（つまり３次元基質）へと重合できる。特に、約１５〜４０℃（好ましくは約２２〜３７℃からの）の温度で、十分な時間、インキュベートすると、細胞外基質タンパク質は重合する。タンパク質は、組成物の温度をこの範囲より低く維持することにより、可溶状態のままとすることもできる。さらに、塩化ナトリウムその他の塩類を組成物に添加してもよく、これにより、タンパク質を可溶状態で維持でき、および／または重合された基底膜ゲルの密度および強度に影響を与えることができる。好ましくは、細胞外基質成分は、組成物全体に対して約ｌ０ｍｇ／ｍｌの濃度で維持される。
【００３０】
いくつかの実施形態にあっては、組成物は、フィブロネクチン（これは細胞外基質成分に対して外因的に加える）を含む。好ましくは、外生フィブロネクチンはヒトのフィブロネクチンである。外生フィブロネクチンは、組成物全体の約５ｍｇ／ｍｌから約２０ｍｇ／ｍｌの濃度、好ましくは組成物全体の約８ｍｇ／ｍｌから１２ｍｇ／ｍｌの濃度で含有させる。フィブロネクチンは、ＩＶ型コラーゲンに結合することが知られており、おそらく細胞外基質の他の成分にも結合し得ることが知られている。したがって、何らかの特定の理論に拘束されるものではないが、フィブロネクチンが該基質へ導入され、その結果、その構造を変化させると思われる。例えば、ヒトのフィブロネクチンは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社（Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ、ミズーリ州）から販売されている。
【００３１】
さらに、いくつかの実施形態において、外生ヘパリンが本発明の組成物中に含まれる。外生ヘパリンは、組成物全体に対し約２００ｍｇ／ｍｌから約８００ｍｇ／ｍｌの濃度で好ましくは組成物全体に対し約３００ｍｇ／ｍｌから約６００ｍｇ／ｍｌの濃度に維持される。ヘパリンはＶＥＧＦやｂＦＧＦなどの様々な成長因子に結合することが知られている。さらに、ヘパリンはＩＶ型コラーゲンおよびラミニンに結合することが知られている。したがって、何らかの特定の理論に拘束されるものではないが、ヘパリンは、細胞外基質の構造を撹乱するとともに組成物中の成長因子の細胞への接近可能性を封鎖またはブロッキングすることにより作用すると思われる。ヘパリンの販売元としては、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、カリホルニア州）およびＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社（Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ、ミズーリ州）が挙げられる。
【００３２】
さらに、実施形態によっては、本発明の組成物は外生ラミニンを含む。外生ラミニンは、組成物全体に対し約１ｍｇ／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍｌの濃度、好ましくは組成物全体に対し約２ｍｇ／ｍｌから約４ｍｇ／ｍｌの濃度で含有される。ラミニンはＩＶ型コラーゲンに結合することが知られている。さらに、ラミニンはヘパリンに対する結合部位を含むことが知られている。したがって、何らかの特定の理論に拘束されるものではないが、ラミニンが細胞外基質成分の構造を撹乱すると思われる。望ましい実施形態では、ラミニンはヒトのラミニンである。例えば、ヒトのラミニンはＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社（Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ、ミズーリ州）から入手可能である。
【００３３】
上記成分に加えて、本発明の組成物はさらに様々な他の成分を含んでもよく、該成分は基質中の成長因子の細胞への接近可能性に影響でき、および／または基質の構造に影響する。これらの成分としては、塩類、希釈剤類、ヘパラン硫酸プロテオグリカン類および／または中和抗体（ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）が挙げられる（但し、これらに限定されない）。さらに、組成物の適切な成分としては当技術分野で知られているものであって、下記の１つまたは複数の機能を有するものが挙げられる。すなわち、組成物中のタンパク質を約２２℃から約３７℃の温度で重合する場合に、ネットワーク密度および強度に影響する機能、または基質中の成長因子の細胞への接近可能性を封鎖もしくはブロックする機能、重合された基質の架橋状態を改変する機能、または細胞接着を助ける機能である。
【００３４】
希釈剤は、細胞培養と適合する条件をもたらす任意の細胞培養培地を含むことができる。上皮細胞の増殖と分化に適する希釈剤としては、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＭＥＭ、Ｍ−１９９およびＲＰＭＩが挙げられる（但し、これらに限定されない）。当技術分野で知られているように補充剤（ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ）を培地に加えてもよく、該補充剤としては、血清（例えばＦＢＳまたは子牛血清）、血清含有補充剤（ＮＵ−ＳＥＲＵＭ）および無血清補充剤（ＭＩＴＯ＋）が挙げられる。腸上皮細胞の好ましい細胞培養培地は、ＭＩＴＯ＋Ｓｅｒｕｍ  Ｅｘｔｅｎｄｅｒ（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，  Ｂｅｄ  ｆｏｒｄ、マサチューセッツ州）を添加したＤＭＥＭであり、充分に明確な（ｆｕｌｌｙ  ｄｅｆｉｎｅｄ）無血清細胞培養環境を提供する。さらに、多数の慣用の培地が上皮肝細胞の培養に用いられてきた。これらのいくつかの例は、Ｌｉｅｂｏｖｉｔｚ  Ｌ−１５、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２、ＲＰＭＩ  １６４０、ＷａｙｍｏｕｔｈのＭＢ７５２／１およびウィリアムズ培地Ｅである。肝細胞は、さらに、Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ培地と名づけられた無血清培地［Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社（Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ、ミズーリ州）から入手可能］中でも培養できる。
【００３５】
内皮細胞を増殖させるのに適当な希釈剤としては、ＤＭＥＭ、ＨＵＶＥＣ培地およびＥＧＭ２−ＭＶ培地が挙げられる（但し、これらに限定されない）。例えば、ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ：Ｈｕｍａｎ  Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  Ｖｅｉｎ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌ）は、ＨＵＶＥＣ培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ミズーリ州））中で培養できる。さらに、ヒト臍帯内皮細胞（Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｐｏｒｔｌａｎｄ、オレゴン州）は、ＥＧＭ２−ＭＶｍｅｄｉｕｍ（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ社，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  カリホルニア州，  Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒの事業部門）中で培養できる。
【００３６】
適当な中和抗体は、それらを徐々に増量添加することで成長因子を中和するか（ｔｉｔｒａｔｉｎｇ  ｏｕｔ）、または成長因子の有効性をブロックすることにより、細胞外基質中に本来含まれる成長因子に影響する化合物を含む。適切な中和抗体としては、ＴＧＦベータ、ＥＧＦ、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ｂＦＧＦおよびＩＧＦ−１のうちの１つに対する抗体が挙げられる（但し、これらに限定されない）。
【００３７】
生理活性タンパク質を含む種々様々の他の材料を、本発明の細胞外基質組成物と共重合してもよい。該材料としては、細胞、抗体、酵素、受容体、成長因子、細胞外基質の追加成分、サイトカイン、ホルモンおよび薬剤が挙げられる（但し、これらに限定されない）。細胞外基質タンパク質の重合はそのような材料を結合し得る。さらに、細胞外基質タンパク質は、これらの材料と共重合できる。これらの生物活性な材料は、それが含有される場合、培養細胞に対して、それらの特性または挙動を修正ないし調節するように容易に利用可能である。
【００３８】
本発明は、再構成基底膜組成物などの細胞外基質組成物を製造する方法を提供する。本発明の組成物は、細胞培養基材の表面などの表面を被覆するのに有用である。製造方法は、細胞外基質を用意すること；用意した細胞外基質を、ヘパリン、フィブロネクチンおよびラミニンから選択される少なくとも１種の外生成分と組み合わせることを含む。この方法は組成物のｐＨを塩基性ｐＨに調整することをさらに含んでもよい。この方法は組成物に塩化ナトリウムなどの塩を加えることをさらに含んでもよい。上記のように、ｐＨおよび塩濃度は、重合された基底膜ゲルの密度および強度に影響し得ると考えられる。
【００３９】
本発明の組成物の製造方法は概ね以下のように行なわれる。最初に、Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｄｕｃｅｄ  Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｃｏｒｐ．，  Ｍｅｄｆｏｒｄ、  マサチューセッツ州）などの凍結された基底膜タンパク質抽出物を氷上で解凍する。基底膜組成物が解凍したら、ヘパリン、フィブロネクチンおよびラミニンから選択される少なくとも１種の外生成分を加える。組成物のｐＨは塩基性ｐＨに調整できる。基底膜は、望ましくは最終生産物の約１０ｍｇ／ｍｌの濃度に維持する。ある実施形態では、基底膜組成物を解凍した後、フィブロネクチンとヘパリンを加える。いくつかの実施形態では、基底膜組成物を解凍した後、ラミニンを加える。組成物は、被覆用には約４℃の温度に維持する。
【００４０】
上記のように、いくつかの実施形態では、組成物は細胞外基質成分、外生フィブロネクチンおよび外生ヘパリンを含む。組成物は塩基性ｐＨを有してもよい。いくつかの実施形態では、細胞外基質成分（例えば基底膜タンパク質抽出物）を解凍した後、フィブロネクチンを加える。次いで、塩基性ｐＨに合わせるため、外生フィブロネクチンを含む組成物を適当な冷透析バッファー（ｃｏｌｄ  ｄｉａｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ）に対して透析することができる。例えば、組成物は次の透析バッファーに対して透析できる。すなわち、追加の４０ｍＭ  ＮａＣｌ／１０ｍＭＴｒｉｓおよび５０μｇ／ｍｌゲンタマイシンを添加したｐＨ８．０に調整したＤＭＥＭ（ＮａＨＣＯ３不含有）である。特に、フィブロネクチンを含む組成物を透析バッグに入れ、約１８〜２０時間無菌的に透析してよい。次いで、内容物を取り出し、ヘパリンを加える。あるいは、透析を行なう前にヘパリンを加えてもよい。最終生産物中の細胞外基質成分の濃度は、約１０ｍｇ／ｍｌが望ましく、外生フィブロネクチンの濃度は約５ｍｇ／ｍｌから約２０ｍｇ／ｍｌが、外生ヘパリンの濃度は約２００ｍｇ／ｍｌから約８００ｍｇ／ｍｌが望ましい。組成物は、被覆用には約４℃の温度に維持する。
【００４１】
別の実施形態では、本発明の組成物は、細胞外基質成分および外生ラミニンを含む。組成物は塩基性ｐＨを有してもよい。上記のように、細胞外基質成分が解凍したらラミニンを加える。ラミニンは透析ステップの前に、またはそのステップの後に加えてもよい。例えば、実施形態によっては、まず最初に、Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｄｕｃｅｄ  Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｃｏｒｐ．，  Ｍｅｄｆｏｒｄ、  マサチューセッツ州）などの細胞外基質成分を、以下の透析バッファーに対して透析する。すなわち追加の４０ｍＭ  ＮａＣｌ／１０ｍＭＴｒｉｓおよび５０μｇ／ｍｌゲンタマイシンを添加したｐＨ  ８．０に調節したＤＭＥＭ（ＮａＨＣＯ３不含有）である。１８〜２０時間の無菌透析後、次いで、最終生産物中の外生ラミニンの濃度が約１ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌとなるようにラミニンを加えてもよい。組成物は、被覆用には約４℃の温度に維持する。
【００４２】
本発明は、さらに、以下のものを含む細胞培養システムを提供する。すなわち、基材および被覆組成物からなる該基材上の被覆である。該被覆組成物は、細胞外基質ならびにヘパリン、フィブロネクチンおよびラミニンから選択される少なくとも１種の外生成分を含む。いくつかの実施形態においては、外生成分を加える細胞外基質成分は、該被覆組成物が改変再構成基底膜組成物となるような基底膜成分である。該被覆組成物は塩基性ｐＨを有してもよく、好ましくは、ｐＨは約８．０である。
【００４３】
従来の細胞培養研究用基材は、プラスチック、ガラスおよび微細多孔性フィルター（例えばセルロース、ナイロン、ガラス繊維、ポリエステルおよびポリカーボネート）を含む。バッチまたは連続的な細胞培養または遺伝子工学で使用されるバイオリアクター用基材としては、中空ファイバー管またはミクロ・キャリア・ビーズ（ｍｉｃｒｏ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｂｅａｄｓ）が挙げられる。血管または骨移植のための基材は、ポリテトラフルオロエチレン（Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標））、セラミックスおよび関連する重合体材料などの物質を含む。
【００４４】
いくつかの実施形態では、基材は次のものから選ばれる。すなわち、セルロース膜、多孔性ポリカーボネート、多孔性ポリテトラフルオロエチレン、ナイロン膜、ガラスフィルタ、多孔性ポリエチレンテレフタレート、ポリメチルペンタン、ポリプロピレン、ポリエチレンおよびこれらの組み合わせである。
【００４５】
本発明で意図される好ましい基材構成は、（２４−ウエルおよび９６−ウエルプレートなどの）マルチウエル・プレート（ｍｕｌｔｉｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅｓ）、（ペトリ皿などの）皿、培養フラスコなどを含む。
【００４６】
本発明は、細胞培養システムを製造する方法を提供する。この方法は、細胞外基質と、ヘパリン、フィブロネクチンおよびラミニンから選択される少なくとも１つの外生成分とを含む細胞外基質組成物を用意すること、および基材に組成物を塗布することを含む。また、この方法は、塗布した組成物をインキュベートしてそれを重合させることを含む。例えば、被覆するための適当な基材は上記のものから選択できる。基材に塗布した組成物は塩基性ｐＨ（それは約７．８から約８．５が望ましい）を有し得る。例えば、いくつかの実施形態においては、被覆組成物は、塩基性ｐＨ範囲に緩衝化するのに十分な濃度のトリス・バッファーを含む。さらに、いくつかの実施形態においては、塗布した組成物は、約０．０３Ｍから約０．１５Ｍの濃度で塩化ナトリウムを含むことが望ましい。
【００４７】
被覆操作は一般に以下のように行なわれる。被覆組成物（望ましくは、約４℃）を６−ウエル・マルチウエル・プレート中のウエル（ｗｅｌｌ）に対しては、およそ０．５〜２．０ｍｌを、２４−ウエル・プレート中のウエルに対しては約０．２５〜１．０ｍｌを、また、９６−ウエル・プレート中のウエルに対しては、約５０μｌ〜１００μｌを塗布する。さらに、３５ｍｍ皿では約０．５〜２．０ｍｌを、６０ｍｍ皿では０．５〜４．０ｍｌを、１００ｍｍ皿では約２．０〜１２．０ｍｌを塗布する。所望であれば、使用前に被覆した基材を凍結して−２０℃で保存し、次いで解凍後に、被覆組成物成分の重合を行なうこともできる。基材構成がマルチウエル・プレートである実施形態では、蓋をする前に表面が乾燥しないようにマット・カバー（ｍａｔ  ｃｏｖｅｒ）を用いて各プレートを封止してもよい。市販のマット・カバーとしては、ＳＵＮ−ＳＲＩ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ノースカロナイナ州）から供給されているものが挙げられる。
【００４８】
塗布後、本発明の組成物をインキュベートして、組成物中の細胞接着物質を基材表面に吸着させ、また、組成物中のタンパク質を重合させる。特に、被覆基材を、約２２℃から約３７℃の温度で、約３０分から約４時間にわたってインキュベートして組成物成分の重合を達成することが望ましい。所望であれば、被覆溶液をこの範囲の温度で、望ましくは４０〜６０％の相対湿度で乾燥させることによって揮発させ、次いで、室温で約２時間細胞培養培地または別の無菌培地（例えば無菌の水）で再水和してもよい。次いで、再水和溶液をアッセイの開始直前に取り出す。最終的に被覆した基材は、バックグラウンドの細胞管腔形成または細胞分化が低いという点で、阻害剤はもちろんのこと、刺激物質についても、それが有し得る効果を評価するのに有用である。
【００４９】
本発明の組成物および細胞培養システムは、細胞外基質およびアッセイシステムとして当技術分野で知られているものを含めて、様々な用途に使用できる。これらは、生体内での適用ならびに生体外での適用を含む。例えば、主な生体外適用のうちの１つは、外生的に添加した刺激物質および／または阻害物質に応じた内皮細胞管腔形成アッセイにおける本発明組成物の使用を含む。内皮細胞管腔形成は、血管新生カスケードの最終ステップであるとともに内皮細胞分化のモデルとして使用されている。これまで、従来の細胞外基質組成物を使用するアッセイにおいては、バックグラウンドの細胞管腔形成が高すぎた。このため、細胞分化および／または血管新生の可能性のある阻害物質が関与する研究では従来技術の組成物の適用には限界があった。これに対し、本発明の細胞外基質組成物は、阻害物質の研究ならびに刺激物質の研究にも有用である。例えば、本発明の組成物を用いれば、外生の刺激物質が存在しない状態では、バックグラウンドの細胞管腔形成はわずかである。したがって、ｂＦＧＦおよびスフィノシン−１−リン酸塩（ｓｈｉｎｏｓｉｎｅ−１−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）など外生添加した刺激物質に応じた内皮細胞管腔形成および他のタイプの細胞による管腔形成をモニターできる。さらに、本発明の組成物を使用すれば、乳房上皮細胞の腺房形成の細胞分化または神経突起増殖の研究が可能である。生体内での用途に関して言えば、本発明の組成物は、血管新生刺激物質、阻害物質および／またはプラグ・アッセイ（ｐｌｕｇ  ａｓｓａｙ）における腫瘍細胞と混合して、（例えば刺激物質で）生体内での血管成長を誘導するか、（例えば阻害物質で）阻害するために使用できる。
【００５０】
本発明のアッセイシステムにより、細胞研究において様々な阻害物質または刺激物質を試験して、それらの有効性を決定することができる。刺激物質は、当技術分野で知られている成長因子を含むことができる。例えば、これらは血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、例えば、ＰＤＧＦ  ＡＡ、ＰＤＧＦ  ＢＢ；インシュリン様成長因子（ＩＧＦ）、例えば、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ；繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、例えば酸性ＦＧＦ、塩基性ＦＧＦ、β−内皮細胞成長因子、ＦＧＦ  ４、ＦＧＦ  ５、ＦＧＦ  ６、ＦＧＦ  ７、ＦＧＦ  ８、ＦＧＦ  ９；  形質転換成長因子（ＴＧＦ）、例えばＴＧＦ−Ｐ１、ＴＧＦβ１．２、ＴＧＦ−β２およびＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β５；骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）、例えばＢＭＰ  １、ＢＭＰ  ２、ＢＭＰ  ３、ＢＭＰ  ４；脈管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、例えば、ＶＥＧＦ、胎盤成長因子；表皮成長因子（ＥＧＦ）、例えば、ＥＧＦ、アンフィレギュリン（ａｍｐｈｉｒｅｇｕｌｉｎ）、ベータセリュリン（ｂｅｔａｃｅｌｌｕｌｉｎ）、ヘパリン結合ＥＧＦ；インターロイキン、例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−ｌｌ、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えば、ＣＳＦ−Ｇ、ＣＳＦ−ＧＭ、ＣＳＦ−Ｍ；神経成長因子（ＮＧＦ）；幹細胞因子；肝細胞成長因子および繊毛神経栄養因子の１種または複数種を含み得る。その他の成長因子は、非特許文献２に記載されており、これは参照によって本明細書によって組み込まれる。「成長因子」という用語は、今後発見されるかもしれない現在、未知の成長因子を包含するように意図される。成長因子としてのそれらの特性決定は当業者によって容易に決定できるためである。
【００５１】
多数の成長因子が、Ｓｉｇｍａ−Ｃｈｅｍｉｃａｌ社（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ミズーリ州）、Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｌｏｓ  Ａｌｔｏｓ，カリホルニア州）；  Ｇｅｎｚｙｍｅ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，マサチューセッツ州）；Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ（独）；  Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，  ミネソタ州）；Ｇｅｎｅｔｅｃｈ（Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，カリホルニア州）；およびＧＩＢＣＯ（  Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ニューヨーク州）などの供給メーカーから市販されている。市販の成長因子は天然のものでも組換えの形で得られるものでもよい。
【００５２】
以下の例は説明の目的のためのものであり、本発明の実施形態および用途を何らにも制限するものではない。
（実施例）
【実施例１】
【００５３】
（改変細胞外基質組成物の製造）
本発明の改変再構成基底膜組成物は、以下のように製造した。すなわち、凍結したＧｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｄｕｃｅｄ  Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｃｏｒｐ．，  Ｍｅｄｆｏｒｄ、  マサチューセッツ州）を氷上で解凍した。解凍後、ヒトフィブロネクチンを最終生産物中の濃度が約８ｍｇ／ｍｌから約１２ｍｇ／ｍｌになるように添加した。外生フィブロネクチンを含む組成物を以下の透析バッファーに対して透析した。すなわち、４０ｍＭ  ＮａＣｌ／１０ｍＭトリスおよび５０μｇ／ｍｌゲンタマイシンを添加したｐＨ８．０に調節したＤＭＥＭ（ＮａＨＣＯ３不含有）である。特にフィブロネクチンを含む組成物を透析バッグに入れ、約１８〜２０時間無菌的に透析した。次いで、内容物を取り出し、ヘパリンを加えた。最終生産物中の細胞外基質成分の濃度は約１０ｍｇ／ｍｌであった。また、外生ヘパリンのそれは約３００ｍｇ／ｍｌから約６００ｍｇ／ｍｌであった。組成物は細胞培養基材を被覆するに先立って約４℃の温度に維持した。
【実施例２】
【００５４】
（一般的な被覆操作）
マルチウエル・プレートを以下のように準備した。実施例１に記載した改変再構成基底膜組成物または標準のＧｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｄｕｃｅｄ  Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｃｏｒｐ．，  Ｍｅｄｆｏｒｄ，  マサチューセッツ州）のいずれかの溶液（４℃）のおよそ５０μｌをＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ  黒／透明９５−ウエル・マイクロ・プレートに加えた。蓋をする前に各プレートを密閉するためにマット・カバーを使用した。プレートを凍らせ、使用前に−２０℃で保存した。
【実施例３】
【００５５】
（内皮細胞管腔形成アッセイのための一般的な操作）
図１に示すように、本発明の組成物および細胞培養システムを使用して血管新生刺激物質についてＨＵＶＥＣ管腔形成を強化する能力を評価できる。特に、図１は、９６−ウエルプレートの被覆されたウエル表面上で刺激物質を評価している様子を示す。ウエルの底面は、図示するように、本発明の改変基質組成物で被覆されている。日１において、可能性のある血管新生刺激物質を、細胞培地中の内皮細胞とともに被覆表面に加える。図１に示すように、本発明の組成物および細胞培養システムは阻害物質研究でも使用できる。阻害物質研究では、可能性のある阻害物質が、少なくとも１種類の既知の刺激物質および細胞培地中の内皮細胞とともにウエル内に含まれている。３７℃／５％ＣＯ２（日２）で適当なインキュベーション期間（典型的には２４時間）後、ウエルの画像を得、また、管長を細胞管腔形成の指標として計測する。
【実施例４】
【００５６】
（刺激物質研究）
本発明の基底膜組成物を従来の基底膜組成物と対比評価するために、既知の刺激物質を選んだ。選択した刺激物質はｂＦＧＦおよびスフィノシン−１−リン酸塩（Ｓ１Ｐ）であった。上記実施例２に記載したように製造した被覆プレートを、約４〜５時間の間、約４℃で解凍した。次いで、組成物の成分をアッセイ開始の直前およそ３０分間に３７℃、５％ＣＯ２で重合させた。刺激物質研究のために、ＨＵＶＥＣ（Ｐ３−Ｐ５）を約７０％の細胞コンフルエンス（ｃｅｌｌ  ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）で収集した。血管新生刺激物質を添加または添加しないで、０．１％ＦＢＳ／ＥＢＭ−２培地中、４×１０５／ｍｌの細胞約５０μｌを、事前に固化（つまり、重合）した改変再構成基底膜組成物（本発明）または標準のＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）基質［ＢＤ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｄｕｃｅｄ  Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）Ｍａｔｒｉｘ］を含む９６−ウエル・プレートに播種した。組み立てたアッセイ試料を、５％ＣＯ２を含む３７℃インキュベーター中でおよそ１６〜１８時間インキュベートした。化合物はメーカーの使用説明書に従ってＤＭＦまたは水に溶かした。
【００５７】
各アッセイの終わりに、アッセイ培地を取り出し、プレートをＨＢＳＳで１度洗浄した。ＨＢＳＳ中８μｇ／ｍｌのカルセイン（Ｃａｌｃｅｉｎ）ＡＭを５０μｌ、各ウエルに加え、プレートを３５分間３７℃／５％ＣＯ２にてインキュベーター内でインキュベートした後、ＨＢＳＳで１度洗浄した。画像は、自動Ｇｅｎ−１  Ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（登録商標））上の２倍対物レンズで得た。各ウエルの全管長を（従前から）改訂されたＭｅｔａＭｏｒｐｈ（登録商標）Ｊｏｕｒｎａｌを使用して測定した。エクセルデータを取り込み、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｌａｂｗａｒｅ製ＢＤ  Ｇｅｎｔｅｓｔ  ＭＰＭ／ＡＤＭＥＴ  ソフトウェアプログラムを使用して分析した。
【００５８】
図２に示すように、ＨＵＶＥＣの管長（細胞管腔形成の指標）を、刺激物質、ｂＦＧＦおよびＳ１Ｐの存在下で異なる基質を使用して比較した。結果は、本発明の組成物（改変基質）は標準の基底膜組成物（標準の基質）よりも信号のダイナミックレンジを増大させることを示す。刺激物質、ｂＦＧＦおよびＳ１Ｐを基質上に示す濃度でＨＵＶＥＣとともにインキュベートした。各棒は平均値＋／−標準偏差（ｎ＝４）を表わす。図２は、本発明の改変基質を使用すると、標準のマトリクスに対し信号のダイナミックレンジが全面的に増大したことを示す。
【００５９】
図３Ａおよび３Ｂに示すように、アッセイシステムにより、出願人はＨＵＶＥＣ管腔形成の誘発においてｂＦＧＦ（図３Ａ）およびＳ１Ｐ（図３Ｂ）のＥＣ５０値を求めることができた。管腔形成誘発における刺激物質の用量反応（ｄｏｓｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）を、改変基質（本発明）上で示された濃度において得た。刺激物質は、示された濃度で、各ウエルに加えた。各データポイントは平均値＋／−標準偏差（ｎ＝４）を表わす。結果は、ｂＦＧＦ（図３Ａ）およびＳ１Ｐ（図３Ｂ）による毛細管状構造形成の用量依存性の刺激作用を示す。本発明の細胞培養システムにより、１．５ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦに対するＥＣ５０値、３１８．９  ｎＭのＳ１Ｐに対するＥＣ５０値を決定することができた。
【実施例５】
【００６０】
（阻害物質研究）
概ね実施例４に記載したようにして阻害物質研究を行った。但し、これらの研究については、既知の刺激物質に加えてアッセイに阻害物質を含めた。改変基質（本発明）上のデータを得た。図４に示すように、刺激物質、ｂＦＧＦまたはＳ１Ｐに誘発された全管長（ｔｏｔａｌ  ｔｕｂｅ  ｌｅｎｇｔｈ）を、様々な濃度の阻害物質（スラミン）存在下で測定した。刺激物質、ｂＦＧＦまたはＳ１Ｐは、２０ナノグラム／ｍｌおよび１μＭでＨＵＶＥＣにそれぞれ加えた。該混合物を各ウエルに加えるのに先立ち、ｂＦＧＦまたはＳ１Ｐ中のＨＵＶＥＣに、示された濃度のスラミンを加えた。各データポイントは平均値＋／−標準偏差（ｎ＝４）を表わす。図４は、スラミンが、別個のＩＣ５０値を備えたｂＦＧＦまたはＳ１Ｐ活性経路によって誘発されたＨＵＶＥＣ管腔形成を阻害したことを示す。特に、ｂＦＧＦによって刺激される管腔形成のスラミン阻害ＩＣ５０値は、７．３μＭであり、Ｓ１Ｐによって刺激される管腔形成のスラミン阻害ＩＣ５０値は、１０．６μＭであった。
【００６１】
図５を参照すると、刺激物質（ｂＦＧＦおよびＳ１Ｐ）によって誘発されるＨＵＶＥＣ管腔形成に対する阻害物質（ＳＵ５４０２およびスラミン）の効果が示されている。データは改変基質（本発明）上で得た。刺激物質、ｂＦＧＦまたはＳ１Ｐは、０．１％のＦＢＳ  を含むＥＢＭ−２中、２０ナノグラム／ｍｌおよび１μＭの最終濃度でＨＵＶＥＣにそれぞれ加えた。混合物を各ウエルに加える前に、１５μＭ（培地中）のスラミンまたは２５μＭ（０．１％ＤＭＦ中）のＳＵ５４０２を、０．１％ＦＢＳ中ＨＵＶＥＣ、ｂＦＧＦまたはＳ１Ｐに加えた。図５に示すように、ＳＵ５４０２（ＦＧＦＲ１チロシンキナーゼ阻害物質）は、Ｓ１Ｐによって誘発された管腔形成を部分的に阻害し、ｂＦＧＦの誘発がＳ１Ｐ作用の１つのメカニズムである可能性を提起している。さらに、ＳＵ５４０２は、ｂＦＧＦによって刺激された管腔形成を完全に阻害した。さらに、グラフは、スラミンがＳ１ＰおよびｂＦＧＦに誘発された管腔形成の両方を阻害したことを示す。各棒は平均値＋／−標準偏差（ｎ＝４）を表わす。
【産業上の利用可能性】
【００６２】
本発明の改変再構成基底膜は、刺激物質および阻害物質の両方の効果のダイナミックレンジを増大させ、その評価を可能にした。本発明のアッセイシステムによれば、ＨＵＶＥＣ管腔形成誘発における刺激物質のＥＣ５０値、および刺激物質によって刺激された管腔形成の阻害物質のＩＣ５０値の決定を可能にした。このアッセイシステムは、内皮細胞管腔形成中の血管新生修飾物質（ｍｏｄｕｌａｔｏｒ）の作用経路を研究する機会を提示する。
【００６３】
ある好ましい実施形態または代表的な実施形態を参照して本発明を説明してきたことは明らかであろう。本明細書で記載した好ましい実施形態または代表的な実施形態は、本発明の意図、精神および範囲から逸脱することなく、修正、変更、付加または改変し得るものであり、すべてのそのような付加、修正、変更および／または改変は添付する特許請求の範囲内に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】本発明の細胞外基質組成物（改変基質）でウエルを被覆した９６−ウエル・フォーマットの内皮細胞組成物アッセイの概略図である。
【図２】標準的細胞外基質と対比して、本発明の改変細胞外基質の上における細胞管腔形成に対する刺激剤（ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  ａｇｅｎｔ）の各種濃度での効果を示すグラフである。
【図３Ａ】本発明の改変細胞外基質上でＨＵＶＥＣ管腔形成を誘発する際におけるｂＦＧＦの用量反応を示すグラフである。
【図３Ｂ】本発明の改変細胞外基質上でＨＵＶＥＣ管腔形成を誘発する際におけるスフィノシン−１−ホスフェート（Ｓ１Ｐ）の用量反応を示すグラフである。
【図４】本発明の改変細胞外基質上に、刺激物質であるｂＦＧＦおよびＳ１Ｐによって誘発されたＨＵＶＥＣ管腔形成を誘発する際におけるスラミン（Ｓｕｒａｍｉｎ）の用量反応を示すグラフである。
【図５】本発明の改変細胞外基質上に、刺激物質であるｂＦＧＦおよびＳ１Ｐによって誘発されたＨＵＶＥＣ管腔形成を誘発する際における阻害物質であるＳＵ５４０２およびスラミンの効果を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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