(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
リグナンをラクトバチルス・アシドフィラスとともに培養することを特徴とするエストロゲン様活性中間体の製造方法。
【請求項２】
リグナンがピノレジノールまたはメディオレジノールである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
リグナンが杜仲リグナンである、請求項１記載の方法。
【請求項４】
エストロゲン様活性中間体がセコイソラリシレジノールである、請求項１−３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
リグナンをラクトバチルス・アシドフィラスとともに培養した発酵物を有効成分として含有する更年期障害予防・改善剤。
【請求項６】
リグナンをラクトバチルス・アシドフィラスとともに培養した発酵物を有効成分として含有する更年期障害予防・改善用機能性飲食品。
【請求項７】
杜仲リグナンをラクトバチルス・アシドフィラスとともに培養した発酵物を含む更年期障害予防・改善剤。
【請求項８】
杜仲リグナンをラクトバチルス・アシドフィラスとともに培養した発酵物。
【請求項９】
ピノレジノールまたはメディオレジノールを含有する植物をラクトバチルス・アシドフィラスとともに培養した培養物を有効成分として含有する更年期障害予防・改善剤。
【請求項１０】
ピノレジノールまたはメディオレジノールを含有する植物をラクトバチルス・アシドフィラスとともに培養した培養物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、更年期に伴って発症する様々な症状の予防・改善作用を得るための更年期障害予防・改善剤および機能性飲食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
更年期障害は、閉経前後における卵巣からの女性ホルモン（エストロゲン）分泌量の低下が原因となって起こる、身体的・精神的不定愁訴である。その後年齢とともに、皮膚の老化、高脂血症、骨粗鬆症、脳機能低下等、様々な症状が現れてくる。【０００３】
このような症状に対しては、女性ホルモンを投与するホルモン補充療法（ＨＲＴ）が効果的であるとされていた。しかしながら、２００２年７月に、ＷＨＩ（Woman's  Health  Initiative）から発表された使用５年時点での中間結果では、エストロゲン投与による乳がん発生率の増加等のリスクが報告された。このため、現在、より安全な更年期治療が求められている。【０００４】
日本人は、更年期障害の症状が欧米人と比較して軽いことが知られている。その理由として、大豆や大豆発酵食品の摂取が関与しているとの報告がある。すなわち、大豆に含まれるイソフラボンに、エストロゲン様活性があるためと考えられている。大豆の他に、種々の植物が摂取したときにエストロゲン様活性を示すことが知られている。摂取したときにエストロゲン様活性を示す植物としては、ゴマ、亜麻仁、杜仲等が知られており、実際に、これらの植物を原料としたサプリメント等が市販されている。また、Milderら（Ivon  E.J.Milder  et  al.,Br.J.Nutr.,93,393-402  (2005)）は、植物由来の各種の食品中における４種類のリグナン（ラリシレジノール、ピノレジノール、セコイソラリシレジノール、メタイレジノール）の含有量を測定した結果を報告している。【０００５】
摂取したときにエストロゲン様活性を示すリグナンを含有する杜仲の更年期障害諸症状改善効果については従来より報告があり、中薬大辞典、中華人民共和国薬典に「肝腎を補う、筋骨を強める、胎を安らげる効能があり、腰、背の酸痛、足膝衰弱（膝の麻痺）、残尿、女性の不正出血、早流産、高血圧を治す」などと記載されている。また、具体的には特許文献１において抗高脂血症機能について示されている。【０００６】
リグナンの１種であるピノレジノール・ジグルコサイドは、腸内細菌の作用により、糖が除かれ、ピノレジノール、ラシリレジノール、セコイソラリシレジノールなどを経て、最終的にエンテロジオール、エンテロラクトンまで代謝されて、エストロゲン様活性を現すと考えられている（図１）（Li-Hua  Xie,et  al.,Chem.Pharm.Bull.51  (5)508-515  (2003)）。しかし、これまでのところ、どのような細菌もしくは細菌群がリグナンを代謝する活性を有しているのか、ならびに種々の代謝中間体のどの成分がエストロゲン様活性を有するかについては、ほとんど明らかにされていない。【０００７】
ゴマ、亜麻仁、杜仲、またはこれらを原料としたサプリメントを摂取することによって得られる効果の度合いは個人によって様々である。その原因のひとつとして、各個人により腸内細菌叢が違うことが影響していると考えられる。すなわち、ヒトが生薬を摂取したときには、その生薬に含まれる有効成分が腸内細菌によって代謝・活性化され、効果を現すものが多いが、腸内細菌の種類や菌数によっては、有効成分の代謝・活性化が進まず、摂取してもその効果が得られない場合もある。【０００８】
このため、更年期障害の予防・改善を目的としてエストロゲン様活性作用を得るためには、植物中に含まれるリグナンをそのままの形で摂取するよりも、リグナンを予め代謝・活性化し、これを摂取することにより、更に高い効果が期待できる。【０００９】
一方、リグナンを化学的に変換して、選択的により活性の高いエストロゲン用活性中間体を得ることは簡単ではない。したがって、更年期障害の予防・改善作用を得るためには、リグナンを生物学的な方法により予め代謝・活性化する方法を開発することが有用であると考えられる。【００１０】
本明細書において引用される参考文献は以下のとおりである。これらの文献に記載される内容はすべて本明細書の一部としてここに引用する。これらの文献のいずれかが、本明細書に対する先行技術であると認めるものではない。
【特許文献１】特許第３４３５４１５号公報
【非特許文献１】Ivon  E.J.Milder  et  al.,Br.J.Nutr.,93,393-402  (2005)
【非特許文献２】Li-Hua  Xie  et  al.,Chem.Pharm.Bull.51(5),508-515  (2003)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、更年期障害を予防・改善するために有用な薬剤および機能性飲食品を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、ラクトバチルス・アシドフィラス（Lactobacillus  acidophilus）がリグナンを代謝してエストロゲン様活性中間体を生成しうることを見出して、本発明を完成させた。すなわち、本発明によれば、リグナンをラクトバチルス・アシドフィラスとともに培養することを特徴とする、エストロゲン様活性中間体を製造する方法が提供される。好ましくは、リグナンはピノレジノールまたはメディオレジノールである。また好ましくは、リグナンは杜仲リグナンである。また好ましくは、エストロゲン様活性中間体はセコイソラリシレジノールである。【００１３】
別の態様においては、本発明は、ラクトバチルス・アシドフィラスとともに培養したリグナンを有効成分として含有する更年期障害予防・改善剤ならびに更年期障害予防・改善用機能性飲食品を提供する。
【発明の効果】
【００１４】
ラクトバチルス・アシドフィラスとともに培養したリグナンを摂取することにより、あるいはラクトバチルス・アシドフィラスとリグナンとを同時に摂取することにより、更年期障害を予防または改善することができる。本発明の更年期障害予防・改善剤およびこれを含む機能性飲食品は、既にその安全性が確認され経口摂取されているリグナンを有効成分とするので、安全に経口摂取することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、リグナンの１種であるピノレジノール・ジグルコサイドの腸内細菌による想定代謝経路を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、本発明を更に詳細に説明する。
本発明の更年期障害予防・改善剤は、ラクトバチルス・アシドフィラスとともに培養することにより代謝・活性化されたリグナンを有効成分として含み、その効果は、代謝・活性化する前のリグナンを摂取するより高いものである。リグナンとしては、例えば、杜仲リグナン、亜麻仁リグナン、ゴマリグナン等が挙げられる。好ましくは、リグナンは杜仲リグナンである。リグナンは、ラクトバチルス・アシドフィラスによりまずリグナン配糖体からアグリコンに変換される。さらに、ピノレジノール、メディオレジノールはラクトバチルス・アシドフィラスにより代謝・活性化されて、種々のエストロゲン様活性中間体に変換される。本明細書において、エストロゲン様活性中間体とは、その物質自体がエストロゲン様活性をもつ物質、および摂取されたときに生体内でさらに代謝されてエストロゲン様活性をもつ物質に変換される物質の両方を含む。エストロゲン様活性中間体には、ラシリレジノールおよびセコイソラリシレジノール等が含まれる。本発明において好ましくは、エストロゲン様活性中間体はセコイソラリシレジノールである。【００１７】
後述の実施例において示されるように、本発明においては、リグナンがラクトバチルス・アシドフィラスで代謝されて、エストロゲン様活性中間体が生ずること、ならびにこのエストロゲン様活性中間体が実際にエストロゲンレセプターへの結合能を有することが見いだされた。【００１８】
ラクトバチルス・アシドフィラスの菌株としては、特に限定されるものではないが、例えば、ラクトバチルス・アシドフィラスＣＬ−００６２株（独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−４９８０、寄託日１９９４年３月４日）、ラクトバチルス・アシドフィラスＬ９２株（独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−４９８１、寄託日１９９４年３月４日）等が挙げられる。【００１９】
ラクトバチルス・アシドフィルスＣＬ−００６２株は、以下の菌学的性質を有する。
１．形態学的性質
１）細胞の形状：桿菌、２）運動性：なし、３）胞子の有無：なし、４）グラム染色性：陽性。
２．生理学的性質
１）カタラーゼ：陰性、２）インドール生成：陰性、３）硝酸塩の還元：陰性、４）酸素に対する態度：通性嫌気性菌、５）１５℃で生育：なし、６）グルコースからホモ乳酸発酵によりＤＬ（−）乳酸を生成し、ガスの産生はない。
７）各種炭水化物の分解性：グルコース；＋、ラクトース；＋、マンノース；＋、フラクトース；＋、ガラクトース；＋、シュークロース；＋、アラビノース；−、マルトース；＋、キシロース；−、ラムノース；−、セルビオース；＋、トレハロース；＋、メルビオース；＋、ラフィノース；＋、マンニトール；−、ソルビトール；−、エスクリン；＋、サリシン；＋、Ｎ−アセチルグルコサミン；＋、アミグダリン；＋、ゲンチオビオース；＋、メレチトース；−、デキストリン；＋、スターチ；−。【００２０】
ラクトバチルス・アシドフィラスＬ９２株は、以下の菌学的性質を有する。
１．形態学的性質
１）細胞の形状：桿菌、２）運動性：なし、３）胞子の有無：なし、４）グラム染色性：陽性。
２．生理学的性質
１）カタラーゼ：陰性、２）インドール生成：陰性、３）硝酸塩の還元：陰性、４）酸素に対する態度：通性嫌気性菌、５）１５℃で生育：なし、６）グルコースからホモ乳酸発酵によりＤＬ（−）乳酸を生成し、ガスの産生はない。
７）各種炭水化物の分解性：グルコース；＋、ラクトース；＋、マンノース；＋、フラクトース；＋、ガラクトース；＋、シュークロース；＋、アラビノース；−、マルトース；＋、キシロース；−、ラムノース；−、セルビオース；＋、トレハロース；＋、メルビオース；−、ラフィノース；＋、マンニトール；−、ソルビトール；−、エスクリン；＋、サリシン；＋、Ｎ−アセチルグルコサミン；＋、アミグダリン；＋、ゲンチオビオース；＋、メレチトース；−、デキストリン；−、スターチ；−。【００２１】
リグナンは、ゴマ、亜麻仁、杜仲などから容易に得ることができる。リグナンとして特に好ましいものは杜仲リグナンである。杜仲リグナンは、杜仲の樹皮若しくは葉の抽出液、または抽出液を適宜、分画、濃縮、精製等して用いることができる他、該抽出液やその濃縮物を凍結乾燥、噴霧乾燥等により粉末として用いることもできる。【００２２】
リグナンをラクトバチルス・アシドフィラスとともに培養するためには、リグナンを含む培地にラクトバチルス・アシドフィラスの菌体を添加し、通常静置若しくは撹拌培養により、例えば、温度２５℃〜４５℃、好ましくは３０℃〜４５℃で培養する。リグナンは、例えばMeOH溶液等の形で、終濃度０．０１−１０ｍＭで添加することができる。あらかじめＭＲＳ培地、ＧＡＭ培地、乳培地等で３７℃、２０〜２４時間前培養したラクトバチルス・アシドフィラス菌体をスターターとして用いることが好ましい。初発菌数は、好ましくは１０5−１０9個／ｍｌ程度である。培養時間は、３〜１６８時間、好ましくは１２〜９６時間である。乳酸酸度が１．５以上になった時点で培養を停止することができる。好気／嫌気条件は、用いる菌種によって適宜選択することができる。【００２３】
リグナンをラクトバチルス・アシドフィラスとともに培養することにより得られるリグナン代謝中間体がエストロゲン様活性を示すためには、代謝中間体のエストロゲンレセプターへの結合が必須である。エストロゲンレセプター結合能は、例えば、ＭＣＦ−７細胞の増殖活性評価を行うことにより、または酵母を用いたエストロゲンレセプターアッセイを行うことにより、調べることができる。【００２４】
また、リグナン代謝中間体の生体における作用を調べるためには、ラクトバチルス・アシドフィラスとともに培養したリグナンを、卵巣を摘出した更年期モデル動物に経口投与し、その動物の骨密度や血中コレステロール等を指標として、その効果を確認することができる。【００２５】
本発明の更年期障害予防・改善剤は、ラクトバチルス・アシドフィラスとともに培養したリグナンを、当業者に公知の方法で医薬製剤として調製することにより製造することができる。例えば、乳酸菌とともに培養したリグナンを薬学的に許容しうる担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤などと適宜組み合わせて混和することによって製剤化することができる。経口投与用には、錠剤、丸薬、糖衣剤、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液等として処方することができる。本発明の更年期障害予防・改善剤は、有効成分として乳酸菌とともに培養したリグナンの他に、他の更年期障害予防・改善作用を有する公知の成分を含んでいてもよい。【００２６】
本発明の更年期障害予防・改善剤の経口摂取量は、投与期間やその継続性等に応じて所望の効果が得られるよう適宜選択できる。投与量は、年齢、体重、症状、治療効果、投与方法、処理時間等により異なるが、通常成人一人あたり、１回に１ｍｇ〜１０００ｍｇの範囲で、１日１回から数回経口投与することができる。なお、リグナンおよび乳酸菌はいずれも食用可能であるため、安全性からみた投与量の制限はない。【００２７】
本発明の更年期障害予防・改善剤の投与は、更年期に伴う諸症状が生じた後であってもよく、また、そのような症状を予防する時期に継続して毎日、若しくは断続的に投与してもよい。【００２８】
本発明の別の態様においては、乳酸菌とともに培養したリグナンを含む機能性飲食品が提供される。本発明の機能性飲食品において、乳酸菌とともに培養したリグナンの配合割合は、機能性飲食品の形態や摂取継続性等に応じて適宜選択することができ、特に限定されない。【００２９】
前記機能性飲食品の形態としては、例えば、ヨーグルト、乳酸菌飲料等の発酵乳製品、発酵乳ホエー、またはその濃縮物等を配合した各種加工飲食品、茶飲料、乾燥粉末、錠剤、カプセル剤、顆粒剤等が挙げられる。【００３０】
前記機能性飲食品には、糖類、タンパク質、脂質、ビタミン、ミネラル、フレーバー、またはこれらの混合物等の添加物を添加することもできる。また、植物リグナンの抽出液をさらに含んでいてもよい。【００３１】
本発明の機能性飲食品は、本発明の更年期障害予防・改善剤を含む食品および飲料であって、更年期に伴う諸症状の予防や改善を訴求した、例えば、特定保健用食品等とすることができる。【００３２】
本発明の機能性飲食品の摂取量および摂取時期については特に限定されず、例えば、更年期障害の各症状に対して改善効果が必要な状況等に接する前に継続的若しくは断続的に、さらには、そのような状況に接した後に、継続的または断続的に摂取することができる。【００３３】
本明細書において明示的に引用される全ての特許および参考文献の内容は全て本明細書の一部としてここに引用する。また，本出願が有する優先権主張の基礎となる出願である日本特許出願2005-221984号の明細書および図面に記載の内容は全て本明細書の一部としてここに引用する。
【実施例】
【００３４】
以下、実施例を参照して本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されない。【００３５】
実施例１．ラクトバチルス・アシドフィラスのリグナン代謝能
各種微生物のリグナン代謝能を評価した。下記の表１−３に示される各種の微生物を、ＭＲＳ培地若しくはＧＡＭ培地を用いて３７℃で２０−２４時間前培養し、１０ｍｌのＭＲＳ培地若しくはＧＡＭ培地に１−３％で植菌した。培地中の最終濃度が０．５ｍＭになるように杜仲リグナン（ピノレジノールおよびメディオレジノール）を添加し、３７℃で培養を続けた。経時的にサンプリングを行い、添加したリグナンが代謝されてセコイソラリシレジノールに変わる様子をHPLCにより定量的に測定した。リグナンが５０％以上変換されたものを○、ほとんど変換されなかったものを×として表した。結果を表１−３に示す。【００３６】
【表１】
0004808715.tif 000002
【００３７】
【表２】
0004808715.tif 000003
【００３８】
【表３】
0004808715.tif 000004
【００３９】
表１−３に示されるように、ラクトバチルス・アシドフィラスは、ピノレジノールからセコイソラリシレジノールを生成する能力を有していることが明らかになった。さらに、少なくとも今回測定したラクトバチルス・アシドフィラスの菌株については、メディオレジノールからセコイソラリシレジノールを生成する能力を有していることが示された。これらの結果は、ラクトバチルス・アシドフィラスがリグナンを代謝・活性化してエストロゲン様活性中間体に変換する能力を有することを表す。【００４０】
実施例２．リグナン及びその代謝産物のエストロゲンレセプターへの結合
1mMの試験試料（ピノレジノール・ジグルコシド、ピノレジノール、セコイソラリシレジノール）と0.5nMのトリチウムラベルしたエストラジオールを、組換え発現させたヒト型エストロゲンレセプターαまたはβを含むpH7.4の10mMトリスバッファー（0.1%  BSA,10%  Glycerol,1mM  DTT含有）中で、２５度にて２時間反応させた。反応終了後、レセプターを回収・洗浄して、定法にしたがって、レセプターに結合しているトリチウムラベルされたエストラジオール量を測定した。0.5nM  [3H]Estradiolのレセプターへの結合を100%として、それぞれのリグナンまたは代謝中間体を添加したときの[3H]Estradiolの結合度を算出し、それを100から引いた値を結合阻害率とした。結果を下表に示す。【００４１】
【表４】
0004808715.tif 000005
【００４２】
以上のことから、リグナン及びその代謝産物がエストロゲンレセプターへの結合能を有することが確認された。また、実際にラクトバチルス・アシドフィラスにおいて、ピノレジノール・ジグルコシド  →  ピノレジノール  →  セコイソラリシレジノールと代謝されるのに伴って、エストロゲンレセプターへの結合能が強くなり、セコイソレラリシレジノールはピノレジノール・ジグルコシドと比較してエストロゲンレセプターへの結合阻害率が１０倍程度高いことがわかった。このことから、リグナンがラクトバチルス・アシドフィラスで代謝され、その後に起こるターゲット遺伝子の発現を介して様々な作用を発揮することにより、更年期障害予防・改善効果が得られると期待される。
【産業上の利用可能性】
【００４３】
本発明は、更年期障害の予防・改善に有用である。
【図１】
0004808715.tif 000006