(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載のプロモーター活性を示すＤＮＡ。
（ａ）配列番号１の配列からなるＤＮＡ。
（ｂ）配列番号１の配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
（ｃ）配列番号１の配列に対して、１または複数のヌクレオチドが置換、欠失、付加、及び／または、挿入された配列からなるＤＮＡ。
【請求項２】
請求項１に記載のＤＮＡを含有するベクターＤＮＡ。
【請求項３】
請求項１に記載のＤＮＡ、及び、該ＤＮＡがプロモーターとして機能する位置に組換えＤＮＡを含有するベクターＤＮＡ。
【請求項４】
請求項３に記載のベクターＤＮＡを保持する原核生物細胞。
【請求項５】
ブレビバチルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌である請求項４に記載の原核生物細胞。
【請求項６】
請求項４または請求項５に記載の原核生物細胞を培養する工程を含むことを特徴とするタンパク質またはポリペプチドを生産する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換えタンパク質生産、好ましくは、ブレビバチルス属細菌を宿主細胞に用いた組換えタンパク質生産において利用可能なプロモーター活性を有する新規ＤＮＡに関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子組換えによるタンパク質生産において、組換えタンパク質の生産量は様々な要素の影響を受ける。それらの要素の中でもプロモーターの活性は、特に重要な要素のひとつとして知られている。
【０００３】
プロモーターとは、遺伝子ＤＮＡの上流に位置し、遺伝子ＤＮＡのｍＲＮＡへの転写、すなわち、遺伝子の発現に関与する連続した領域である。したがって、プロモーターの活性は、組換えタンパク質生産の最初の段階である組換えＤＮＡの発現効率に直接影響する。そのため、これまでにも、組換えタンパク質の生産に用いられている大腸菌を初めとする様々な系において、プロモーターの検討による組換えＤＮＡの発現効率の向上、及び、そのことによる組換えタンパク質の生産効率の向上が図られてきた。
【０００４】
しかしながら、特にブレビバチルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌を宿主とする組換えタンパク質生産においては、利用されているプロモーターの種類はごく限られており、これまでプロモーターの検討による組換えＤＮＡの発現効率の向上、更には、そのことによる組換えタンパク質の生産効率の向上はほとんど図られていなかった。
【０００５】
ブレビバチルス属細菌を宿主とする組換えタンパク質生産において、これまで主に用いられてきたプロモーターは、ブレビバチルス属細菌の細胞壁タンパク質のプロモーター領域に由来するプロモーターである。ブレビバチルス属細菌の細胞壁タンパク質は培養時に大量に分泌生産され、そのプロモーター領域は強いプロモーター活性を有している。
【０００６】
この細胞壁タンパク質のプロモーター領域に由来するプロモーターとして最も広く用いられているのは、バチルス・ブレビス４７（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ  ４７）  （ＦＥＲＭ  Ｐ−７２２４）（現在はブレビバチルス属に分類されている。）の細胞壁タンパク質遺伝子のプロモーター領域に由来するプロモーター（ＭＷＰプロモーター）である（非特許文献１）。このＭＷＰプロモーターは、Ｐ１からＰ５の５つの個別のプロモーター配列を含む領域である。ＭＷＰプロモーターは、プロモーター領域全長、あるいは、必要に応じて、ＭＷＰプロモーターが含む５つのプロモーターの内、特にプロモーター活性が高いとされるＰ２プロモーターまたはＰ５プロモーターが単独で用いられている。
【０００７】
また、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓ  ＨＰＤ３１）（バチルス・ブレビスＨ１０２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０８７）と同一菌株）の細胞壁タンパク質（ＨＷＰ）遺伝子のプロモーター領域（ＨＷＰプロモーター）（特許文献１）も、プロモーター領域全長、あるいは、ＨＷＰプロモーターが含むプロモーターの内、プロモーター活性が高いとされるプロモーターが単独で用いられている。
【０００８】
なお、原核生物においては、プロモーター領域上の−３５領域及び−１０領域と呼ばれる領域がプロモーター活性に必須な領域とされている。この−３５領域は転写開始点の上流約３５塩基対付近に存在し通常６から８塩基対からなる領域であり、また、-１０領域は転写開始点の上流約１０塩基対付近に存在する通常６から８塩基対からなる領域である。
【特許文献１】特開平３−０９４６８３号
【非特許文献１】J. Bacteriol., 169 (3), 1239-1245 (1987)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
前述の通り、現在、ブレビバチルス属細菌を宿主とする組換えタンパク質生産に利用されているプロモーターの種類は、ごく限られている。
【００１０】
一般に、プロモーターと発現されるＤＮＡの間には相性があり、活性が強いプロモーターとして知られているものであっても、どのようなＤＮＡに対しても強いプロモーター活性を示すわけではない。
【００１１】
また、同一のＤＮＡに対してであっても培養条件の違いによりプロモーター活性に変化が見られることも知られている。
【００１２】
したがって、発現されるＤＮＡの種類や培養条件に応じて、もっとも活性が強いプロモーターを用いることができるようにするためには、より多くの種類のプロモーターが利用可能である必要がある。
【００１３】
また、プロモーターの活性は単に高いことのみが求められているわけではない。例えば、組換えタンパク質が宿主細胞に害を及ぼすものである場合に活性が強いプロモーターを用いた場合には、生産された組換えタンパク質により宿主細胞の生育が阻害されるため目的とするタンパク質が得られないなどの問題が生じる場合がある。このような場合には活性が比較的弱いプロモーターを用いて発現の好適化を図る必要があり、そのためにも異なった特性を有する多種類のプロモーターが利用可能である必要がある。
【００１４】
以上に述べた理由などにより、特にブレビバチルス属細菌を宿主とする組換えタンパク質生産において利用可能な、新規のプロモーター活性を有するＤＮＡの提供が望まれていた。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者は、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓ  ＨＰＤ３１−Ｓ５）（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ  ＨＰＤ３１−Ｓ５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６６２３）と同一菌株）を液体培地で培養した際に、培地中に大量に分泌される、分子量約２２  ｋＤの機能未知の新規タンパク質を発見した。本発明者は、このタンパク質をその分子量からＰ２２と命名した。このＰ２２タンパク質の分泌量は２日間の培養で約０．１ｇ／ｌに達し、この分泌量は、ブレビバチルス・チョウシネンシスが分泌するタンパク質としては細胞壁タンパク質（ＨＷＰ）に次ぐ量であることを見出した。
【００１６】
そのため、本発明者は、このＰ２２タンパク質は極めて大量に分泌生産されるタンパク質であることにはじめて着目し、そのプロモーター領域(Ｐ２２プロモーター)は高いプロモーター活性を持っており、組換えタンパク質生産、特に、ブレビバチルス属細菌を宿主とする組換えタンパク質生産においてプロモーターとして利用可能ではないかとの観点にはじめてたった。
【００１７】
そこで、本発明者は、Ｐ２２プロモーターとブレビバチルス属細菌を宿主とする組換えタンパク質生産に、従来用いられていた主要なプロモーターとのプロモーター活性の比較評価を行い、本発明のＰ２２プロモーターが、従来のプロモーターと同等かそれ以上のプロモーター活性を示すことをはじめて確認し本発明を完成させた。
【００１８】
本発明は、新規プロモーター、特にブレビバチルス属細菌細胞内で高いプロモーター活性を示す新規ＤＮＡであるＰ２２プロモーターを提供する。本プロモーターは、新規物質であって、その由来をブレビバチルス属細菌に求めることができる。
【００１９】
また、本発明は、Ｐ２２プロモーターを含有するベクターＤＮＡを提供するものであって、高発現ベクターを提供するものである。
更に、Ｐ２２プロモーター、及び、Ｐ２２プロモーターがプロモーターとして機能する位置に組換えＤＮＡを含有するベクターＤＮＡを提供する。
【００２０】
また更に、本発明は、該ベクターＤＮＡを保持する原核生物細胞を提供する。原核生物としては、各種の原核生物が広く包含されるが、例えば、細菌、好ましくはグラム陽性細菌、更に好ましくは、ブレビバチルス属細菌（例えば、ブレビバチルス・チョウシネンシス）が例示される。
【００２１】
また更に、本発明は、該原核生物細胞を培養する工程を含むタンパク質又はポリペプチドの生産方法を提供する。
【発明の効果】
【００２２】
本発明の新規ＤＮＡであるＰ２２プロモーターは、遺伝子組換えによるタンパク質生産においてプロモーターとして利用可能である。本プロモーターは、その活性の高いことが、実施例からも実証されており、本プロモーターを含有するベクターは高発現ベクターとしてきわめて有用である。
【００２３】
特に、ブレビバチルス属細菌を宿主細胞に用いた遺伝子組換えによるタンパク質生産において、本発明のＰ２２プロモーターをプロモーターに用いることにより、組換えＤＮＡの発現効率が向上あるいは好適化されるため、より一層効率的な組換えタンパク質またはポリペプチドの生産が可能になる。
【００２４】
また、本発明によって、効率的なプロモーター活性の評価システムが新たに開発された。したがって、本発明は、新しいプロモーターを開発するのにも多大な貢献をなすものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２６】
本発明のＰ２２プロモーターの配列を配列番号１(図１)に示す。本発明のＰ２２プロモーターは新規ＤＮＡであり、この配列番号１(図１)の配列と有意な相同性を有する配列は知られていない。また、本発明のＰ２２プロモーターは、配列番号２（図２）に示す−３５領域と推定される配列、及び、配列番号３（図３）に示す−１０領域と推定されるＤＮＡ配列を有しており、−３５領域と推定される配列と−１０領域と推定される配列の間隔は１７塩基対である。
【００２７】
更に、配列番号１（図１）に記載のヌクレオチド配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、プロモーター活性を示すＤＮＡも本発明のＰ２２プロモーターに包含される。前記のストリンジェントな条件とは、６Ｍ  尿素、０．４％  ＳＤＳ、０．５×ＳＳＣの条件、または０．１％  ＳＤＳ（６０℃、０．３ｍｏｌ  ＮａＣｌ、０．０３Ｍ  クエン酸ソーダ）の条件、より好ましくは、６Ｍ  尿素、０．４％  ＳＤＳ、０．１×ＳＳＣの条件、あるいはこれらと同等の条件である。
【００２８】
また更に、配列番号１のＤＮＡ配列に対して、１または複数のヌクレオチドが置換、欠失、付加、及び／または、挿入された配列からなり、かつ、プロモーター活性を示すＤＮＡも本発明のＰ２２プロモーターに包含される。前記の「１または複数のヌクレオシドが置換、欠失、付加、及び／または挿入された配列」とは、配列番号１（図１）のＤＮＡ配列と約５０％以上、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、最も好ましくは約９０％以上の相同性を有するＤＮＡ配列を意味している。
【００２９】
本発明のＰ２２プロモーターは、そのＤＮＡ配列を元に、当業者に公知の標準的な遺伝子組換え技術を適宜、選択し、組み合わせて用いることにより得ることができる。例えば、ブレビバチルス属細菌、特には、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５のゲノムＤＮＡライブラリーを作製し、このライブラリーに対して配列番号１で表されるＤＮＡ配列の一部を有するＤＮＡ断片をプローブとして用いたハイブリダイゼーション、もしくは、該ＤＮＡ断片をプライマーとして用いたＰＣＲを行うことにより調製することができる。あるいは、そのＤＮＡ配列を元に、当業者に公知の核酸化学合成法などによりＰ２２プロモーターを得ることも可能である。これらの操作の具体的な方法としては、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ．Ｅｄ．，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９９０）に記載の方法を例示することができる。
【００３０】
Ｐ２２プロモーターを含有するベクターＤＮＡの作製は、通常は既存のベクターＤＮＡにＰ２２プロモーターを含むＤＮＡ断片を組み込むことで行う。Ｐ２２プロモーターを組み込むベクターＤＮＡが既にプロモーターとして機能する配列を含有している場合には、当該プロモーターを含む領域を削除した上でＰ２２プロモーターを組み込む。
【００３１】
Ｐ２２プロモーターを組み込むベクターＤＮＡは、宿主細胞内で安定に保持され増殖が可能なものであるならば特に限定されないが、特にブレビバチルス属細菌を宿主細胞に用いる場合には、特に好ましいものとして、これまでにブレビバチルス属細菌を宿主に用いた組換えタンパク質生産において利用実績があるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ由来のプラスミドｐＵＢ１１０（ＧｅｎＢａｎｋ：  ＮＣ＿００１５６５）またはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ  ＨＰ９２６由来のプラスミドｐＨＴ９２６（特開平６−１３３７８２号、ＧｅｎＢａｎｋ：  Ｄ４３６９２）、あるいは、これらのプラスミドを元に必要に応じて改変を行ったベクターＤＮＡを挙げることができる。
【００３２】
また、Ｐ２２プロモーターを含有するベクターＤＮＡは、ＳＤ配列などの組換えＤＮＡの発現を制御する配列、Ｐ２２プロモーターの下流に組換えＤＮＡを組み込むためのマルチクローニングサイトなどの適当な制限酵素切断部位、及び、ベクターＤＮＡの宿主細胞への導入確認のために薬剤耐性遺伝子などの選択マーカーを含有していることが好ましい。
【００３３】
なお、ブレビバチルス属細菌を宿主細胞に用いた場合には、通常、生産されたタンパク質は宿主細胞内に蓄積されず細胞外の培地中に分泌されるため、Ｐ２２プロモーターを含有するベクターＤＮＡは、Ｐ２２プロモーターの下流側に分泌シグナルをコードするＤＮＡを含有する必要がある。該ＤＮＡがコードする分泌シグナルは宿主細胞内において機能するものであれば特に限定されないが、ブレビバチルス属細菌を宿主に用いる場合には、特に好ましいものとして、ＭＷＰの分泌シグナル部（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，  １６９（３），１２３９−１２４５（１９８７））、または、ＨＷＰの分泌シグナル部（特開平３−０９４６８３）を例示することができる。
【００３４】
Ｐ２２プロモーターを含有するベクターＤＮＡは、当業者に公知の標準的な遺伝子組換え技術を適宜、選択し組み合わせて用いることにより作製が可能である。具体的には、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ．Ｅｄ．，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９９０））に記載の方法を例示することができる。
【００３５】
また、Ｐ２２プロモーターを含有するベクターＤＮＡにおいて、Ｐ２２プロモーターの下流に組み込むＤＮＡは特に限定されない。例えば、サイトカイン、ケモカイン、酵素、ホルモンなどのタンパク質の遺伝子、もしくは、その他の任意のペプチドをコードするＤＮＡ断片などのいずれであってもよい。また、組換えＤＮＡは、そのコードするタンパク質またはポリペプチドの取得を目的としないものであっても構わない。
【００３６】
更に、生産された組換えタンパク質の用途も特に限定されない。その用途は医薬品、生化学試薬、産業用酵素などのいずれであってもよい。
【００３７】
Ｐ２２プロモーターを含有するベクターＤＮＡへの組換えＤＮＡの組み込みは、当業者が通常用いる一般的な方法により行うことが可能である。例えば、精製したＤＮＡを適当な制限酵素で処理することにより得たＤＮＡ断片をベクターＤＮＡのマルチクローニングサイトなどの適当な制限酵素切断部位に挿入するなどの方法により可能である。なお、Ｐ２２プロモーターの下流に組み込む組換えＤＮＡは、Ｐ２２プロモーターが組換えＤＮＡに対してプロモーターとして機能する位置に連結する必要がある。
【００３８】
更に、Ｐ２２プロモーターを含有し組換えＤＮＡが組み込まれたベクターＤＮＡを宿主細胞に導入し、宿主細胞の形質転換体を作製することが可能である。
【００３９】
該ベクターＤＮＡを導入する宿主細胞としては、その細胞内で、Ｐ２２プロモーターがプロモーターとして機能するものであれば特に限定されないが、通常は原核生物、好ましくは細菌であり、より好ましくはグラム陽性細菌であり、更に好ましくはブレビバチルス属細菌であり、より一層好ましくは、ブレビバチルス・チョウシネンシスである。また、ブレビバチルス・チョウシネンシスの中でも、特に好ましい菌株としてブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０８７）、及び、その変異株であるブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６６２３）を例示することができる。
【００４０】
更に、宿主細胞に該ベクターＤＮＡを導入する方法も特に限定されないが、特に、宿主細胞にブレビバチルス属細菌を用いる場合には、特に好ましい導入方法としてエレクトロポレーション法を挙げることができる。
【００４１】
また更に、該形質転換された宿主細胞を培養することによる組換えタンパク質またはポリペプチドの生産は、該形質転換された宿主細胞を適当な培地で培養し、培養終了後、生産されたタンパク質を回収・精製することにより行うことができる。
【００４２】
該形質転換された宿主細胞の培養条件も、該宿主細胞の増殖及び組換えＤＮＡの発現が可能なものであるならば特に限定されないが、特にブレビバチルス属細菌を宿主に使用する場合には、特に好ましい培養条件として、後述の実施例に示すＴＭ液体培地で３０℃、２〜４日間の条件を例示することができる。また必要に応じて、培地中に無機塩類を添加したり、培養中に攪拌や通気を行ってもよい。
【００４３】
更に、該宿主細胞の培養により生産された組換えタンパク質は、当業者が通常用いる一般的な方法を適宜選択し用いることにより回収することができる。
【００４４】
生産された組換えタンパク質が宿主細胞外に分泌される場合には、例えば、遠心分離、ろ過などの方法で、宿主細胞と分泌生産された組換えタンパク質を含む上清を分離することにより生産された組換えタンパク質を回収することができる。また、生産された組換えタンパク質が宿主細胞内に蓄積される場合には、例えば、培養終了後、培養液から遠心分離、ろ過などの方法により宿主細胞を採取し、次いで、この宿主細胞を超音波破砕法、フレンチプレス法などにより破砕し、また必要に応じて界面活性剤等を添加して可溶化することにより組換えタンパク質を回収することができる。
【００４５】
更に、回収した組換えタンパク質の分離、精製を行う場合にも、当業者が通常用いる一般的な方法、たとえば、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィーなどの各種クロマトグラフィー、電気泳動、溶媒抽出、限外濾過、塩沈、等電点沈殿などの方法を適宜、単独または組み合わせて用いることにより行うことができる。
【００４６】
なお、プロモーターのプロモーター活性の評価は、プロモーターの下流に検出可能なタンパク質をコードするＤＮＡ断片、すなわち、レポーター遺伝子を連結し、そのレポーター遺伝子の遺伝子産物の生産量（活性）を測定することにより可能である。レポーター遺伝子については、その遺伝子産物の検出法が存在すれば特に限定されないが、通常、当業者が利用するレポーター遺伝子として、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ＧＦＰ（ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＧＦＰｕｖ等のＧＦＰ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、ＣＡＴ（クロラムフェニコールアセチル転移酵素（Ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ  ａｃｅｔｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ））遺伝子、アルカリホスファターゼ遺伝子などを例示することができる。
【００４７】
また、プロモーター活性の評価は、レポーター遺伝子から転写されたｍＲＮＡの発現量を測定することにより行うことも可能である。
【実施例】
【００４８】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。しかしながら、本発明を実施例の場合に限定することを意図するものでない。
【００４９】
（実施例1：Ｐ２２タンパク質遺伝子及びＰ２２プロモーターのクローニング）
【００５０】
Ｐ２２タンパク質遺伝子及びＰ２２タンパク質のプロモーター領域（Ｐ２２プロモーター）を以下の手順でクローン化した。
【００５１】
まず、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓ  ＨＰＤ３１−Ｓ５）（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６６２３）をＴＭ液体培地（１％  ペプトン、０．５％  肉エキス、０．２％  酵母エキス、１％  グルコース）で３０℃、２０時間、振とう培養した後、培養上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。泳動終了後、ＰＶＤＦ膜に転写して染色し、ＰＶＤＦ膜の２２ｋＤの大きさに相当する染色バンドを切り出しアミノ酸配列の決定を行った。アミノ酸配列の決定は、Ｎ末端配列と２つの内部配列の合計３つの断片について行った。上記でアミノ酸配列を決定した配列の内、Ｎ末配列と内部配列のひとつを配列番号４（Ｎ末端アミノ酸配列：図４上段）及び配列番号５（内部アミノ酸配列：図４下段）としてそれぞれ示した。
【００５２】
次いで、上記のＮ末端アミノ酸配列と内部アミノ酸配列をもとに作製した下記の２種類のデジェネレートプライマー２２ＫＤＮ及び２２ＫＤＣをプライマーに用い、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５のゲノムＤＮＡを鋳型に用いたＰＣＲを行い、Ｐ２２タンパク質遺伝子の一部である約２００ｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。プライマー２２ＫＤＮを配列番号６（図５上段）及びプライマー２２ＫＤＣを配列番号７（図５下段）にそれぞれ示した。
【００５３】
（注）Ｂ＝Ｔ  ｏｒ  Ｃ  ｏｒ  Ｇ，  Ｓ＝Ｃ  ｏｒ  Ｇ，  Ｋ＝Ｔ  ｏｒ  Ｇ，  Ｙ＝Ｃ  ｏｒ  Ｔ，  Ｒ＝Ａ  ｏｒ  Ｇ，  Ｈ＝Ａ  ｏｒ  Ｔ  ｏｒ  Ｃ，  Ｗ＝Ａ  ｏｒ  Ｔ，  Ｎ＝Ａ  ｏｒ  Ｃ  ｏｒ  Ｇ  ｏｒ  Ｔ，  Ｄ＝Ａ  ｏｒ  Ｔ  ｏｒ  Ｇ，  Ｖ＝Ａ  ｏｒ  Ｃ  ｏｒ  Ｇ，  Ｍ＝Ａ  ｏｒ  Ｃ
【００５４】
更に、この約２００ｂｐのＤＮＡ断片を元にジーンウォーキングの手法で残りの部分のＤＮＡ配列を解読し、５９１ｂｐから成るＰ２２タンパク質遺伝子の全ＤＮＡ配列、及び、Ｐ２２プロモーターを含むＰ２２タンパク質遺伝子の上流域のＤＮＡ配列を決定した。以上により判明したＰ２２プロモーターのＤＮＡ配列を配列番号１（図１）に示す。
【００５５】
このＰ２２タンパク質は、公知のタンパク質と有意な相同性はなく、また、その機能も未知である。更に、Ｐ２２プロモーターのＤＮＡ配列についても、公知のＤＮＡ配列の中に有意な相同性があるものはなかった。
【００５６】
（実施例２：プロモーター活性評価用ベクターの作製）
ベクターＤＮＡ  ｐＮＹ３０１（特開平１０−２９５３７８号）を元に作製したプロモーター活性評価用ベクターを用いて、Ｐ２２プロモーターと、現在、ブレビバチルス属細菌を宿主細胞とする組換えタンパク質生産に用いられている主要なプロモーターとのプロモーター活性の比較評価を行った。
【００５７】
なお、ｐＮＹ３０１は、ブレビバチルス属細菌を宿主細胞とする組換えタンパク質生産に用いられている主要なベクターのひとつであり、プロモーター活性が高いとされているＭＷＰプロモーター由来のＰ５プロモーターを含有している。
【００５８】
１）ｐＮＦ１（プロモーターなし）の作製
対照として用いるプロモーターを含有しないプラスミドＤＮＡであるｐＮＦ１を以下の手順により作製した。
【００５９】
下記の２種類の合成ＤＮＡ  ＸＳＤＭ及びＸＸＲＶをプライマーに用い、ｐＮＹ３０１を鋳型に用いたＰＣＲを行い、ｐＮＹ３０１からＰ５プロモーターを除いた部分を増幅した。プライマーＸＳＤＭを配列番号８（図６上段）及びプライマーＸＸＲＶを配列番号９（図６下段）にそれぞれ示した。
【００６０】
次いで、上記で得たＤＮＡ断片を制限酵素ＮｄｅＩで処理し、得られた約３．３ｋｂｐのＤＮＡ断片の両端をＴ４  ＤＮＡリガーゼで連結し、プロモーターを含まないプラスミドＤＮＡを作製した。このプラスミドＤＮＡをｐＮＦ１とした。
【００６１】
２）ｐＮＦ１−ｂｇａ（プロモーターなし、β−ガラクトシダーゼ遺伝子のみ含有）（コントロール用）の作製
次いで、１）で得たｐＮＦ１を元に、レポーター遺伝子であるβ−ガラクトシダーゼ遺伝子が組み込まれているが、プロモーターを含有しないプラスミドＤＮＡであるｐＮＦ１−ｂｇａを作製した。
【００６２】
まず、ｐＮＦ１を制限酵素ＢｓｐＨＩとＢａｍＨＩで処理し、約３．３ｋｂｐのＤＮＡ断片を回収した。また、２種類の合成ＤＮＡ  ｂｇａＭ及びｂｇａＲＶをプライマーに用い、Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  のゲノムＤＮＡを鋳型とするＰＣＲを行い、Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（Ｈｉｒａｔａ，Ｈ．，  ｅｔ．ａｌ．，  Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，  １６６，７２２−７２７（１９８６）、ＧｅｎＢａｎｋ：  Ｍ１３４６６）を増幅した。プライマーｂｇａＭを配列番号１０（図７上段）及びプライマーｂｇａＲＶを配列番号１１（図７下段）にそれぞれ示した。
【００６３】
次いで、上記のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を制限酵素ＢｓｐＨＩとＢａｍＨＩで処理した約２ｋｂｐのＤＮＡ断片と、上記で得た３．３ｋｂｐのＤＮＡ断片をＴ４  ＤＮＡリガーゼで連結し、β−ガラクトシダーゼ遺伝子を含有するがプロモーターを含有しないプラスミドＤＮＡを作製した。このプラスミドＤＮＡをｐＮＦ１−ｂｇａとした。
【００６４】
また、このｐＮＦ１−ｂｇａをブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５に導入し、得られた形質転換体をブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５／ｐＮＦ１−ｂｇａとした。
【００６５】
３）ｐＮＦ２（Ｐ２プロモーター含有）の作製
１）と同様に、ＸＳＤＭ及びＸＸＲＶをプライマーに用いｐＮＹ３０１を鋳型に用いたＰＣＲを行うことでｐＮＹ３０１からＰ５プロモーターを除いた部分を増幅し、得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＮｄｅＩとＸｈｏＩで処理し、約３．３  ｋｂｐのＤＮＡ断片を回収した。
【００６６】
また、下記の２種類の合成ＤＮＡ  Ｐ２Ｍ１及びＰ２ＳＤＲＶ１をプライマーに用い、バチルス・ブレビス４７のゲノムＤＮＡを鋳型に用いたＰＣＲを行い、ＭＷＰプロモーターが含む５つのプロモーターの内のひとつであるＰ２プロモーターを含むＤＮＡ断片（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６９（３），１２３９−１２４５（１９８７））を増幅した。増幅したＤＮＡ断片を制限酵素ＮｄｅＩとＸｈｏＩで処理し、Ｐ２プロモーターを含有する１０３  ｂｐのＤＮＡ断片を回収した。プライマーＰ２Ｍ１を配列番号１２（図８上段）及びプライマーＰ２ＳＤＲＶ１を配列番号１３（図８下段）にそれぞれ示した。
【００６７】
更に、上記で得た約３．３ｋｂｐのＤＮＡ断片とＰ２プロモーターを含有する１０３  ｂｐのＤＮＡ断片をＴ４  ＤＮＡリガーゼで連結し、Ｐ２プロモーターを含有するベクターＤＮＡを得た。このベクターＤＮＡをｐＮＦ２とした。
【００６８】
４）ｐＮＦ２−ｂｇａ（Ｐ２プロモーター及びβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を含有）の作製
更に上記で得たｐＮＦ２を制限酵素ＢｓｐＨＩとＢａｍＨＩで処理して３．４  ｋｂｐの断片を回収した。また、２）と同様によりＰＣＲで増幅したβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を制限酵素ＢｓｐＨIIとＢａｍＨＩで処理し、約２  ｋｂｐのＤＮＡ断片を回収した。
【００６９】
次いで、上記で得た約３．４ｋｂｐのＤＮＡ断片と約２ｋｂｐのＤＮＡ断片をＴ４  ＤＮＡリガーゼで連結することにより、Ｐ２プロモーターとβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を有するベクターＤＮＡを得た。このベクターＤＮＡをｐＮＦ２−ｂｇａとした。
【００７０】
また、このｐＮＦ２−ｂｇａをブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５に導入し、得られた形質転換体をブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５／ｐＮＦ２−ｂｇａとした。
【００７１】
５）ｐＮＦ４（Ｐ２２プロモーターを含有）の作製
本発明のＰ２２プロモーターを含有するベクターＤＮＡであるｐＮＦ４を以下の手順により構築した。
【００７２】
１）と同様に、ｐＮＹ３０１からＰ５プロモーターを除いた部分をＰＣＲで増幅し、得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＮｄｅＩとＸｈｏＩで処理し約３．３ｋｂｐのＤＮＡ断片を回収した。
【００７３】
また、下記の２種類の合成ＤＮＡ  Ｐ２２Ｍ１及びＰ２２ＳＤＲＶ１をプライマーに用い、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５のゲノムＤＮＡを鋳型に用いてＰＣＲを行い、Ｐ２２プロモーターを含むＰ２２タンパク質遺伝子の上流域を増幅した。得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＮｄｅＩとＸｈｏＩで処理し、Ｐ２２プロモーターを含む約４００ｂｐのＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片と上記で得た約３．３ｋｂｐのＤＮＡ断片とをＴ４  ＤＮＡリガーゼで連結し、Ｐ２２プロモーターを含有するベクターＤＮＡを得た。このベクターＤＮＡをｐＮＦ４とした。プライマーＰ２２Ｍ１を配列番号１４（図９上段）及びプライマーＰ２２ＳＤＲＶ１を配列番号１５（図９下段）にそれぞれ示した。
【００７４】
６）ｐＮＦ４−ｂｇａ（Ｐ２２プロモーター及びβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を含有）の作製
上記のｐＮＦ４を制限酵素ＢｓｐＨＩとＢａｍＨＩで処理して約３．７ｋｂｐのＤＮＡ断片を回収した。更に、２）と同様の方法で得たβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を制限酵素ＢｓｐＨＩとＢａｍＨＩで処理し、前記の約３．７ｋｂｐのＤＮＡ断片とＴ４  ＤＮＡリガーゼで連結し、Ｐ２２プロモーターとβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を含有するベクターＤＮＡを作製した。このベクターＤＮＡをｐＮＦ４−ｂｇａとした。
【００７５】
また、このｐＮＦ４−ｂｇａをブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５に導入し、得られた形質転換体をブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５／ｐＮＦ４−ｂｇａとした。
【００７６】
７）ｐＮＹ３０１−ｂｇａ（Ｐ５プロモーター及びβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を含有）の作製
ｐＮＹ３０１を制限酵素ＢｓｐＨＩとＢａｍＨＩで処理し、ｐＮＹ３０１が含有しているＰ５プロモーターを含む３．４ｋｂｐのＤＮＡ断片を回収した。更に、２）と同様の方法で得たβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を制限酵素ＢｓｐＨＩとＢａｍＨＩで処理し、前記の３．４ｋｂｐのＤＮＡ断片とＴ４  ＤＮＡリガーゼで連結し、Ｐ５プロモーターとβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を含有するベクターＤＮＡを作製した。このベクターＤＮＡをｐＮＹ３０１−ｂｇａとした。
【００７７】
また、このｐＮＹ３０１−ｂｇａをブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５に導入し、得られた形質転換体をブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５／ｐＮＹ３０１−ｂｇａとした。
【００７８】
（実施例３：β−ガラクトシダーゼ遺伝子をレポーター遺伝子とするプロモーター活性の比較評価）
次いで、実施例２で作製したブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１-Ｓ５の形質転換体をそれぞれ培養し、プロモーター活性の比較評価を行った。なお、このプロモーター活性の比較評価では、生産されたβ−ガラクトシダーゼの活性値をプロモーター活性の指標として用いた。
【００７９】
まず、上記の実施例２で作製したブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５／ｐＮＦ１−ｂｇａ、ＨＰＤ３１−Ｓ５／ｐＮＦ２−ｂｇａ、ＨＰＤ３１−Ｓ５／ｐＮＹ３０１−ｂｇａ及びＨＰＤ３１−Ｓ５／ｐＮＦ４−ｂｇａのそれぞれを、５００ｍｌ三角フラスコ内で、ネオマイシン５０μｇ／ｍｌ含有ＴＭ液体培地１００ｍｌを用いて、３０℃で４８時間振とう培養した。培養終了後、各々の培養液を遠心分離し、その菌体画分のβ−ガラクトシダーゼ活性の測定を行った。β−ガラクトシダーゼの活性測定は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  １７．３５（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  （１９９０））に記載の方法を改変した方法により行った。この活性測定の結果を表１に示す。
【００８０】
【表１】
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【００８１】
表１が示すとおり、本発明のＰ２２プロモーターを含有するｐＮＦ４−ｂｇａを用いた場合に最も高いβ−ガラクトシダーゼ活性が得られており、その値は、Ｐ５プロモーターを含有するｐＮＹ３０１−ｂｇａやＰ２プロモーターを含有するｐＮＦ２−ｂｇａを用いた場合より明らかに高かった。
【００８２】
なお、対照として用いた、β−ガラクトシダーゼ遺伝子が組み込まれているがプロモーターを含有しないｐＮＦ１−ｂｇａについては、そのβ−ガラクトシダーゼ活性は８０  ｕｎｉｔ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ以下であった。
【００８３】
以上のプロモーター活性の比較評価により、本発明のＰ２２プロモーターが、従来のプロモーターと同等か、または、それ以上のプロモーター活性を持っていることが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】Ｐ２２プロモーターのＤＮＡ配列を示す。
【図２】Ｐ２２プロモーターの−３５領域と推定される配列を示す。
【図３】Ｐ２２プロモーターの−１０領域と推定される配列を示す。
【図４】Ｎ末端アミノ酸配列（上段）及び内部アミノ酸配列（下段）を示す。
【図５】プライマー２２ＫＤＮ（上段）及び２２ＫＤＣ（下段）を示す。
【図６】プライマーＸＳＤＭ（上段）及びＸＸＲＶ（下段）を示す。
【図７】プライマーｂｇａＭ（上段）及びｂｇａＲＶ（下段）を示す。
【図８】プライマーＰ２Ｍ１（上段）及びＰ２ＳＤＲＶ１（下段）を示す。
【図９】プライマーＰ２２Ｍ１（上段）及びＰ２２ＳＤＲＶ１（下段）を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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