(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）または（ＩＩ）
【化１】
0004757492.tif 000014
の化合物またはそれらの塩、溶媒和物もしくは塩の溶媒和物。
【請求項２】
医薬を製造するための請求項１に記載の化合物の使用。
【請求項３】
医薬を製造するための選択的ＰＤＥ９Ａ阻害剤としての請求項１に記載の化合物の使用。
【請求項４】
知覚力、集中力、認知過程、学習力および／または記憶力の改善のための請求項２または請求項３に記載の使用。
【請求項５】
知覚力、集中力、認知過程、学習力および／または記憶力の欠陥の予防および／または処置のための、請求項２ないし請求項４のいずれかに記載の使用。
【請求項６】
欠陥が、痴呆、卒中、頭蓋大脳外傷、アルツハイマー病、パーキンソン病、鬱病または前頭葉変性を伴う痴呆の群から選択される障害の結果である、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
欠陥が、痴呆、卒中、頭蓋大脳外傷、アルツハイマー病、前頭葉変性を伴う痴呆、レビー小体痴呆、血管性痴呆、注意欠陥症候群、注意および集中の欠陥、パーキンソン病、統合失調症、鬱病、情動障害、精神病、神経症、不安、躁病もしくは躁鬱病、ピック病、疼痛およびてんかんからなる群から選択される障害の結果である、請求項５に記載の使用。
【請求項８】
請求項１に記載の化合物、および、不活性、非毒性の医薬的に適する賦形剤を含む、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、知覚力、集中力、学習力および／または記憶力の改善用の医薬を製造するための、選択的ホスホジエステラーゼ９Ａ（ＰＤＥ−９Ａ）阻害剤の使用に関する。
【０００２】
アデニル酸シクラーゼおよびグアニル酸シクラーゼの細胞内活性化は、各々ＡＴＰおよびＧＴＰの５'−３'環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）および５'−３'環状グアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）への環化をもたらす。これらの環状ヌクレオチド（ｃＡＭＰおよびｃＧＭＰ）は、重要な第２メッセンジャーであり、それ故に細胞のシグナル伝達カスケードにおいて中心的な役割を果たす。それらの各々は、なかんずく、しかし排他的にではなく、タンパク質キナーゼを再活性化する。ｃＡＭＰにより活性化されるタンパク質キナーゼは、タンパク質キナーゼＡ（ＰＫＡ）と呼ばれ、ｃＧＭＰにより活性化されるタンパク質キナーゼは、タンパク質キナーゼＧ（ＰＫＧ）と呼ばれる。活性化されたＰＫＡおよびＰＫＧは、今度は数々の細胞内エフェクタータンパク質をリン酸化できる（例えば、イオンチャネル、Ｇタンパク質共役型受容体、構造タンパク質）。このようにして、第２メッセンジャーであるｃＡＭＰおよびｃＧＭＰは、幅広い器官において幅広い生理過程を制御することが可能である。しかしながら、これらの環状ヌクレオチドはまた、エフェクター分子に直接作用することもできる。このように、例えば、ｃＧＭＰがイオンチャネルに直接作用でき、かくして細胞内イオン濃度に影響を及ぼすことができると知られている（Wei et al., Prog. Neurobiol., 1998, 56: 37-64 に総説）。ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）類は、ｃＡＭＰおよびｃＧＭＰの活性を、従って次いでこれらの生理過程を、制御するための制御メカニズムである。ＰＤＥ類は、これらの環状一リン酸を不活性な一リン酸であるＡＭＰおよびＧＭＰに加水分解する。少なくとも２１種のＰＤＥ遺伝子が現在までに記載されてきた（Exp. Opin. Investig. Drugs 2000, 9, 1354 3784）。これらの２１種のＰＤＥ遺伝子は、それらの配列相同性に基づいて１１個のＰＤＥファミリーに分けられる（提唱されている命名法について、http://depts.washington.edu/pde/Nomenclature.html.を参照）。ファミリー内の個々のＰＤＥ遺伝子は、文字により区別される（例えば、ＰＤＥ１ＡおよびＰＤＥ１Ｂ）。遺伝子内に異なるスプライシング変異体も生じる場合、これらは、文字の後に付加された番号により示される（例えば、ＰＤＥ１Ａ１）。
【０００３】
図面：
図１：実施例２による処置後の初代ラット（Ｅ１８）大脳皮質培養における細胞内ｃＧＭＰ濃度。細胞を一定濃度の実施例２と２０分間インキュベートした。培地対照は、非処置細胞におけるｃＧＭＰレベルを示す。ＤＭＳＯ含量は、培地対照および物質処置細胞において、０.２％であった。ｃＧＭＰ濃度をｆｍｏｌ／１５００００細胞でプロットする。
【０００４】
図２：弱いテタヌス後の局限（focal）興奮性シナプス後電位（ｆＥＰＳＰ）の増強に対する実施例２（１０μＭ）の効果。実施例２は、弱いテタヌスの１０分前から３０分後まで流すと（黒い記号）、ｆＥＰＳＰの増大を有意に拡大させる。対照は、０.０１％ＤＭＳＯで処置した（白い記号）。＊：ｐ＜０.０５；用量（０および１０μＭ）および試験時間の要素による変数の、測定時間の要素による解析。
【０００５】
図３：社会的認識試験における相互作用時間の短縮率（試行２／試行１）に対する実施例２の効果（平均＋Ｓ.Ｅ.Ｍ.）。動物は、最初の遭遇（試行１）の直後に、媒体（１０％エタノール、２０％ Solutol、７０％生理塩水）または０.１ｍｇ／ｋｇ、０.３ｍｇ／ｋｇ、１.０ｍｇ／ｋｇもしくは３.０ｍｇ／ｋｇの実施例２の腹腔内注射を受けた。統計分析：＊ｐ＜０.０５。
【０００６】
ＰＤＥ９Ａ−発見、特性、分布
ヒトＰＤＥ９Ａ（GenBank/EMBL 受託番号 NM_002606、ｃＤＮＡ配列は、配列表の配列番号１を参照）は、１９９８年にクローニングされ、配列決定された。他のＰＤＥ類とのアミノ酸同一性は３４％（ＰＤＥ８Ａ）を超えず、２８％（ＰＤＥ５Ａ）より低くはない。ＰＤＥ９Ａは、ｃＧＭＰに高い親和性を有し、ミカエリス−メンテン定数（Ｋｍ）１７０ｎＭである。加えて、ＰＤＥ９Ａは、ｃＧＭＰに選択的である（ｃＡＭＰについてのＫｍ＝２３０μＭ）。ＰＤＥ９Ａは、ｃＧＭＰ結合ドメイン（ＧＡＦドメイン）を持たず、このことは、ｃＧＭＰによるアロステリック酵素調節を示唆している。ウエスタンブロット分析で、ＰＤＥ９Ａがヒトで、なかんずく精巣、脳、小腸、骨格筋、心臓、肺、甲状腺および脾臓において発現されていることが示された。最大の発現は、脳、小腸、心臓および脾臓で見出された（Fisher et al., J. Biol. Chem., 1998, 273 (25): 15559-15564）。ヒトＰＤＥ９Ａの遺伝子は、染色体２１ｑ２２.３に位置し、２１個のエクソンを含む。今日までに、２０種のＰＤＥ９Ａの選択的スプライシング変異体が同定されている（Guipponi et al., Hum. Genet., 1998, 103: 386 392; Rentero et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 2003, 301: 686-692）。古典的なＰＤＥ阻害剤は、ヒトＰＤＥ９Ａを阻害しない。従って、ＩＢＭＸ、ジピリダモール、ＳＫＦ９４１２０、ロリプラムおよびビンポセチンは、１００μＭまでの濃度でこの単離された酵素に対する阻害を示さない。ザプリナストについて、ＩＣ５０３５μＭが立証された（Fisher et al., J. Biol. Chem., 1998, 273 (25): 15559-15564）。
【０００７】
マウスＰＤＥ９Ａは、１９９８年に、Soderling らによりクローニングされ、配列決定された（J. Biol. Chem., 1998, 273 (19): 15553-15558）。これは、ヒト型と同様に、ｃＧＭＰに高い親和性を有し、Ｋｍ７０ｎＭである。特に高い発現は、マウスの腎臓、脳、肺および心臓で見出された。マウスＰＤＥ９Ａもまた、ＩＢＭＸにより２００μＭより低い濃度では阻害されず；ザプリナストのＩＣ５０は２９μＭである（Soderling et al., J. Biol. Chem., 1998, 273 (19): 15553 15558）。ＰＤＥ９Ａは、ラットの脳のいくつかの領域で強く発現されることが見出された。これらには、嗅球、海馬、皮質、大脳基底核および前脳基底核が含まれる（Andreeva et al., J. Neurosci., 2001, 21 (22): 9068-9076）。海馬、皮質および前脳基底核は、特に、学習および記憶の過程において重要な役割を果たす。
【０００８】
ＰＤＥ９Ａは、ｃＧＭＰに対して特に高い親和性を有することにより際だっている。ｃＧＭＰへのＫｍは、１７０μＭである（Fisher et al., J. Biol. Chem., 1998, 273 (25): 15559 - 15564）。それ故に、ＰＤＥ９Ａは、ＰＤＥ２Ａ（Ｋｍ＝１０μＭ；Martins et al., J. Biol. Chem., 1982, 257: 1973-1979）、ＰＤＥ５Ａ（Ｋｍ＝４μＭ；Francis et al., J. Biol. Chem., 1980, 255: 620-626）、ＰＤＥ６Ａ（Ｋｍ＝１７μＭ；Gillespie and Beavo, J. Biol. Chem., 1988, 263 (17): 8133-8141）およびＰＤＥ１１Ａ（Ｋｍ＝０.５２μＭ；Fawcett et al., Proc. Nat. Acad. Sci., 2000, 97 (7): 3702-3707）と対照的に、低い生理的濃度であっても活性である。ＰＤＥ２Ａ（Murashima et al., Biochemistry, 1990, 29: 5285-5292）と対照的に、ＰＤＥ９Ａの触媒活性は、ｃＧＭＰにより増大しない。なぜなら、それはＧＡＦドメインを持たないからである（Beavo et al., Current Opinion in Cell Biology, 2000, 12: 174-179）。従って、ＰＤＥ９Ａ阻害剤は、ベースラインのｃＧＭＰ濃度の増大を導く（図１参照）。驚くべきことに、このベースラインのｃＧＭＰ濃度の増大は、社会的認識試験において学習力および記憶力の改善を導いた。
【０００９】
驚くべきことに、ＰＤＥ９Ａ阻害剤が中枢神経系の機能に対して効果を有することが立証された。この度、特に、選択的ＰＤＥ９Ａ阻害剤が、知覚力、集中力、学習力または記憶力を改善するための医薬の製造に適することが判明した。
【００１０】
本発明のためのＰＤＥ９Ａ阻害剤は、下記で示す条件下で、１０μＭより小さい、好ましくは１μＭより小さいＩＣ５０でヒトＰＤＥ９Ａを阻害する化合物である。
【００１１】
本発明のための選択的ＰＤＥ９Ａ阻害剤は、下記に示す条件下で、ヒトＰＤＥ９Ａを、ヒトＰＤＥ１Ｃ、ＰＤＥ２Ａ、ＰＤＥ３Ｂ、ＰＤＥ４Ｂ、ＰＤＥ５Ａ、ＰＤＥ７Ｂ、ＰＤＥ８Ａ、ＰＤＥ１０ＡおよびＰＤＥ１１よりも強く阻害する化合物である。ＩＣ５０（ＰＤＥ９Ａ）／ＩＣ５０（ＰＤＥ１Ｃ、ＰＤＥ２Ａ、ＰＤＥ３Ｂ、ＰＤＥ４Ｂ、ＰＤＥ５Ａ、ＰＤＥ７Ｂ、ＰＤＥ８Ａ、ＰＤＥ１０ＡおよびＰＤＥ１１Ａ）は、好ましくは、０.２より小さい。
【００１２】
選択的ＰＤＥ９Ａ阻害剤は、特に、軽度認知障害、加齢関連学習記憶障害、加齢関連記憶喪失、血管性痴呆、頭蓋大脳性外傷、卒中、卒中後に発生する痴呆（後卒中痴呆）、外傷後の痴呆、一般的集中障害、学習記憶に問題をもつ小児の集中障害、アルツハイマー病、レビー小体痴呆、ピック病を含む前頭葉変性を伴う痴呆、パーキンソン病、進行性核麻痺、皮質基質変性を伴う痴呆、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン病、多発性硬化症、視床変性、クロイツフェルト・ヤコブ病痴呆、ＨＩＶ痴呆、痴呆を伴う統合失調症またはコルサコフ精神病などの症状／疾患／症候群において生じるもののような認知障害後の、知覚力、集中力、学習力または記憶力の改善に特に適する。
【００１３】
本発明は、知覚力、集中力、認知過程、学習力および／または記憶力の改善用医薬を製造するための選択的ＰＤＥ９Ａ阻害剤の使用に関する。
【００１４】
さらに、本発明は、知覚力、集中力、認知過程、学習力および／または記憶力の障害の予防および／または処置のための選択的ＰＤＥ９Ａ阻害剤の使用に関する。
【００１５】
これに関して、障害は、なかんずく、痴呆、卒中、頭蓋大脳外傷、アルツハイマー病、パーキンソン病、鬱病または前頭葉変性を伴う痴呆の群から選択される疾患の結果であり得る。
【００１６】
本発明はさらに、ｃＧＭＰレベルに影響を与えることによる治療が効きやすい（amenable）中枢神経系の疾患を処置するための、ＰＤＥ９Ａ阻害剤の使用に関する。従って、本発明は、例えば、痴呆、卒中、頭蓋大脳外傷、アルツハイマー病、前頭葉変性を伴う痴呆、レビー小体痴呆、血管性痴呆、注意欠陥症候群、注意および集中の欠陥、パーキンソン病、統合失調症、鬱病、情動障害、精神病、神経症、不安、躁病もしくは躁鬱病、ピック病、疼痛およびてんかんの処置に関する。
【００１７】
本発明は、好ましくは、式
【化１】
0004757492.tif 000002
のＰＤＥ９Ａ阻害剤の本発明に従う使用に関する。
【００１８】
式（Ｉ）および（ＩＩ）の化合物は、それらの塩、溶媒和物またはそれらの塩の溶媒和物の形態であってもよい。生理的に許容し得る塩が、本発明のために好ましい。
【００１９】
生理的に許容し得る塩は、本発明の化合物の無機酸または有機酸との塩であり得る。例えば、塩酸、臭化水素酸、リン酸もしくは硫酸などの無機酸との塩、または、例えば、酢酸、マレイン酸、フマル酸、リンゴ酸、クエン酸、酒石酸、乳酸、安息香酸もしくはメタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、トルエンスルホン酸もしくはナフタレンスルホン酸などの有機カルボン酸またはスルホン酸との塩が好ましい。
【００２０】
生理的に許容し得る塩は、同様に、本発明の化合物の金属またはアンモニウム塩であり得る。アルカリ金属塩（例えば、ナトリウムまたはカリウム塩）、アルカリ土類金属塩（例えば、マグネシウムまたはカルシウム塩）およびアンモニアまたは有機アミン類（例えば、エチルアミン、ジ−もしくはトリエチルアミン、ジ−もしくはトリエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、ジメチルアミノエタノール、アルギニン、リジン、エチレンジアミンまたは２−フェニルエチルアミン）から誘導されるアンモニウム塩が特に好ましい。
【００２１】
ＷＯ９８／４０３８４は、優れたＰＤＥ１、２および５の阻害剤であり、心血管および脳血管障害並びに泌尿生殖器系の障害の処置に用いることができるピラゾロピリミジン類を開示している。
【００２２】
ＣＨ３９６９２４、ＣＨ３９６９２５、ＣＨ３９６９２６、ＣＨ３９６９２７、ＤＥ１１４７２３４、ＤＥ１１４９０１３、ＧＢ９３７,７２６は、冠血管拡張効果を有し、心筋血流の障害の処置に用いることができるピラゾロピリミジン類を記載している。
【００２３】
ＵＳ３,７３２,２２５は、抗炎症および血糖低下効果を有するピラゾロピリミジン類を記載している。
ＤＥ２４０８９０６は、例えば浮腫の処置用の抗菌および抗炎症剤として用いることができるスチレンピラゾロピリミジン類を記載している。
【００２４】
本発明の化合物は、下記の合成スキームにより製造できる：
【化２】
0004757492.tif 000003
【００２５】
場合による続く式（Ｉ）および（ＩＩ）の化合物と、適切な（ｉ）溶媒および／または（ｉｉ）塩基もしくは酸との反応は、対応する塩、溶媒和物および／または塩の溶媒和物をもたらす。
【００２６】
本有効成分は、全身的および／または局所的効果を有し得る。そのために、それは、例えば、経口、非経腸、経肺、鼻腔、舌下、経舌、頬側、直腸、皮膚、経皮、結膜もしくは耳経路により、またはインプラントとしてなど、適するやり方で投与できる。
本有効成分は、これらの投与経路に適する投与形で投与できる。
【００２７】
経口投与に適する投与形は、例えば、錠剤（非被覆または被覆錠剤、例えば、胃液耐性被覆を有するもの）、カプセル剤、糖衣錠剤、顆粒剤、ペレット剤、粉末剤、乳剤、懸濁剤または液剤などの、当技術の現状に準じて機能し、本有効成分を迅速におよび／または修飾されたやり方で送達するものである。
【００２８】
非経腸投与は、吸収段階を回避して（静脈内、動脈内、心臓内、脊椎内または腰椎内）、または吸収を含めて（筋肉内、皮下、皮内、経皮または腹腔内）行うことができる。非経腸投与に適する投与形は、なかんずく、液剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥剤または滅菌粉末剤の形態の注射および点滴用製剤である。
【００２９】
他の投与経路に適する例は、吸入用医薬形態（なかんずく、粉末吸入器、ネブライザー）、点鼻薬／液、スプレー；舌、舌下または頬側投与用錠剤またはカプセル剤、坐剤、耳または眼用製剤、膣カプセル剤、水性懸濁剤（ローション、震盪混合物）、親油性懸濁剤、軟膏、クリーム、ミルク、ペースト、フォーム、散剤またはインプラントである。
【００３０】
本有効成分は、それ自体知られているやり方で、上述の投与形に変換できる。これは、不活性、非毒性の医薬的に適する賦形剤の使用により行う。これらには、なかんずく、担体（例えば、微結晶性セルロース）、溶媒（例えば、液体ポリエチレングリコール類）、乳化剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム）、分散剤（例えば、ポリビニルピロリドン）、合成および天然バイオポリマー（例えば、アルブミン）、安定剤（例えば、アスコルビン酸などの抗酸化剤）、着色剤（例えば、酸化鉄などの無機色素）および風味および／または臭気隠蔽剤が含まれる。
【００３１】
一般的に、非経腸投与で体重の約０.００１ないし３０ｍｇ／ｋｇの量を投与するのが、有効な結果を達成するために有利であることが証明された。経口投与量は、体重の約０.０１ないし１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約０.１ないし３０ｍｇ／ｋｇである。
【００３２】
それでもやはり、特に体重、投与経路、有効成分に対する個体の挙動、製剤のタイプおよび投与を行う時間または間隔の関数として、上述の量から逸脱することが必要であり得る。
【００３３】
ＰＤＥ阻害
組換えＰＤＥ１Ｃ（GenBank/EMBL 受託番号: NM_005020, Loughney et al. J. Biol. Chem. 1996 271, 796-806）、ＰＤＥ２Ａ（GenBank/EMBL 受託番号: NM_002599, Rosman et al. Gene 1997 191, 89-95）、ＰＤＥ３Ｂ（GenBank/EMBL 受託番号: NM_000922, Miki et al. Genomics 1996, 36, 476-485）、ＰＤＥ４Ｂ（GenBank/EMBL 受託番号: NM_002600, Obernolte et al. Gene. 1993, 129, 239-247）、ＰＤＥ５Ａ（GenBank/EMBL 受託番号: NM_001083, Loughney et al. Gene 1998, 216, 139-147）、ＰＤＥ７Ｂ（GenBank/EMBL 受託番号: NM_018945, Hetman et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2000, 97, 472-476）、ＰＤＥ８Ａ（GenBank/EMBL 受託番号: AF_056490, Fisher et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1998 246, 570-577）、ＰＤＥ９Ａ（GenBank/EMBL 受託番号 NM_002606、ｃＤＮＡ配列は、配列表、配列番号１を参照、Fisher et al., J. Biol. Chem, 1998, 273 (25): 15559-15564）、ＰＤＥ１０Ａ（GenBank/EMBL 受託番号: NM_06661, Fujishige et al. J Biol Chem. 1999, 274, 18438-45）、ＰＤＥ１１Ａ（GenBank/EMBL 受託番号: NM_016953, Fawcett et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 2000, 97, 3702-3707）を、Ｓｆ９細胞にｐＦＡＳＴＢＡＣバキュロウイルス発現系を利用して発現させた（GibcoBRL）。感染の４８時間後、細胞を回収し、２０ｍＬ（培養物１Ｌにつき）の溶解緩衝液（５０ｍＭ ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７.４、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１.５ｍＭ ＥＤＴＡ、１０％グリセロール、プラス、プロテアーゼ阻害剤カクテルセットＩＩＩ［CalBiochem, La Jolla, CA USA］２０μＬ）に懸濁する。細胞を４℃で１分間超音波処理し、続いて１００００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離する。上清（ＰＤＥ調製物）を回収し、−２０℃で保存する。
【００３４】
試験物質を、それらのＰＤＥ９Ａに対するインビトロでの効果を測定するために、１００％ＤＭＳＯに溶解し、連続希釈する。典型的に、２００μＭないし１.６μＭの連続希釈物を調製する（結果的なアッセイ中の最終濃度：４μＭないし０.０３２μＭ）。希釈した物質溶液２μＬ分を、マイクロタイタープレートのウェルに導入する（Isoplate; Wallac Inc., Atlanta, GA）。次いで、上記のＰＤＥ９Ａ調製物の希釈物５０μｌを添加する。ＰＤＥ９Ａ調製物の希釈は、７０％より少ない基質が後のインキュベーションの間に変換されるように選択する（典型的な希釈：１：１００００；希釈緩衝液：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ７.５、８.３ｍＭ ＭｇＣｌ２、１.７ｍＭ ＥＤＴＡ、０.２％ＢＳＡ）。基質である［８−３Ｈ］グアノシン３',５'−環状リン酸（１μＣｉ／μＬ；Amersham Pharmacia Biotech., Piscataway, NJ）を、アッセイ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ７.５、８.３ｍＭ ＭｇＣｌ２、１.７ｍＭ ＥＤＴＡ）で、１：２０００に、０.０００５μＣｉ／μＬの濃度まで希釈する。最後に、希釈基質５０μＬ（０.０２５μＣｉ）の添加により酵素反応を開始させる。アッセイ混合物を室温で６０分間インキュベートし、アッセイ緩衝液に溶解したＰＤＥ９Ａ阻害剤（例えば、製造実施例１由来の阻害剤、最終濃度１０μＭ）２５μｌの添加により反応を停止させる。その直後に、１８ｍｇ／ｍＬの Yttrium Scintillation Proximity Beads (Amersham Pharmacia Biotech., Piscataway, NJ）を含有する懸濁液２５μＬを添加する。マイクロタイタープレートをフィルムで密封し、室温で６０分間静置する。次いで、プレートを１ウェル当たり３０秒間、Microbeta scintillation counter (Wallac Inc., Atlanta, GA）で測定する。物質濃度対阻害率のグラフのプロットから、ＩＣ５０値を決定する。
【００３５】
組換えＰＤＥ３Ｂ、ＰＤＥ４Ｂ、ＰＤＥ７Ｂ、ＰＤＥ８Ａ、ＰＤＥ１０ＡおよびＰＤＥ１１Ａに対する試験物質のインビトロでの効果は、以下の調節を加えて、ＰＤＥ９Ａについて上記したアッセイプロトコールに従って測定する：［５',８−３Ｈ］アデノシン３',５'−環状リン酸（１μＣｉ／μＬ；Amersham Pharmacia Biotech., Piscataway, NJ）を基質として使用する。反応を停止させるための阻害剤溶液の添加は不要である。代わりに、基質とＰＤＥのインキュベーションに続いて直ちにイットリウムシンチレーション近接（proximity）ビーズを添加し、かくして反応を停止させる。組換えＰＤＥ１Ｃ、ＰＤＥ２ＡおよびＰＤＥ５Ａの相応する効果を測定するために、プロトコールをさらに以下のように調節する：ＰＤＥ１Ｃには、さらに１０−７Ｍカルモジュリンおよび３ｍＭ ＣａＣｌ２を反応混合物に添加する。このアッセイにおいて、ＰＤＥ２Ａを１μＭ ｃＧＭＰの添加により刺激し、ＢＳＡ濃度０.０１％でアッセイする。ＰＤＥ１ＣおよびＰＤＥ２Ａに用いる基質は、［５',８−３Ｈ］アデノシン３',５'−環状リン酸（１μＣｉ／μＬ；Amersham Pharmacia Biotech., Piscataway, NJ）であり、ＰＤＥ５Ａには、［８−３Ｈ］グアノシン３',５'−環状リン酸（１μＣｉ／μＬ；Amersham Pharmacia Biotech., Piscataway, NJ）である。
【００３６】
実施例２によるＰＤＥアイソザイムの阻害
【表１】
0004757492.tif 000004
【００３７】
実施例１のＰＤＥ９Ａ阻害効果は、ＩＣ５０＝５ｎＭのＩＣ５０により実験的に確認できる。
【００３８】
細胞培養における細胞内ニューロン性ｃＧＭＰ濃度の増大
ＰＤＥ９Ａ阻害剤は、培養した初代大脳皮質ニューロンの細胞内ニューロン性ｃＧＭＰを増加させる。
ラットの胚（胚日齢（embryonic day）Ｅ１７−Ｅ１９）を断頭し、解剖培地（ＤＭＥＭ、ペニシリン／ストレプトマイシン；両方とも Gibco より）を満たした解剖皿に頭部を移した。頭皮および頭蓋頂部を除去し、露出した脳を解剖培地を有する別のペトリ皿に移した。双眼顕微鏡と２本のピンセットを使用して、大脳（大脳皮質）を単離し、氷で４℃に冷却した。次いで、この大脳皮質ニューロンの解剖と単離を、標準的なプロトコールに従い、パパインキット（Worthington Biochemical Corporation, Lakewood, New Jersey 08701, USA）を使用して実行した（Huettner et al. J. Neurosci. 1986, 6, 3044-3060）。機械的に単離した大脳皮質のニューロンを、１５００００細胞／ウェルで、２００μｌ神経基礎（neurobasal）（培地／ウェル（神経基礎; B27 添加；２ｍＭ Ｌ−グルタミン；ペニシリン／ストレプトマイシンの存在下；全試薬は、Gibco より）中、９６ウェルプレート（ポリ−Ｄ−リジン／１００μｇ／ｍｌで３０分間予処理した）で、標準条件下（３７℃、５％ＣＯ２）、７日間培養した。７日後、培地を除去し、細胞をＨＢＳＳ緩衝液（ハンクス平衡塩溶液、Gibco/BRL）で洗浄した。その後、ＨＢＳＳ緩衝液に溶解した実施例２の試験物質（予め１００％ＤＭＳＯに溶解した：１０ｍＭ）１００μｌを細胞に載せた。次いで、実施例２の試験物質の最終濃度が図１に示した通りになるように、さらに１００μｌのＨＢＳＳ緩衝液を添加し、３７℃で２０分間インキュベートした。次いで、アッセイ緩衝液を完全に除去した。その後、細胞を２００μｌの溶解緩衝液（ｃＧＭＰキットコード RPN 226; Amersham Pharmacia Biotech.より）に溶解し、製造業者が定めた通りにｃＧＭＰ濃度を測定した。全測定は、３重に実行した。統計分析は、Prism Software Version 2.0 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA USA）を使用して行った。
【００３９】
実施例２と共に初代ニューロンをインキュベートすると、ｃＧＭＰ含有量の増加が導かれた（図１）。
【００４０】
長期増強
長期増強は、学習および記憶の過程に対する細胞の相関現象と見なされる。以下の方法を使用して、ＰＤＥ９阻害が長期増強に影響を与えるか否かを判定した：
ラットの海馬を切断刃（包丁）に対して約７０度の角度に置いた。厚さ４００μｍの海馬切片を調製した。非常に柔らかい、入念に湿らせた刷毛（テンの毛）を使用して切片を刃から取り、９５％Ｏ２／５％ＣＯ２ガス供給した冷たい栄養溶液（１２４ｍＭ ＮａＣｌ、４.９ｍＭ ＫＣｌ、１.３ｍＭ ＭｇＳＯ４ｘ７Ｈ２Ｏ、２.５ｍＭ無水ＣａＣｌ２、１.２ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、２５.６ｍＭ ＮａＨＣＯ３、１０ｍＭグルコース、ｐＨ７.４）の入ったガラス容器に移した。測定の間、温度制御チャンバー中、高さ１−３ｍｍの液体レベルで切片を維持した。流速は２.５ｍｌ／分であった。予備的なガス供給は、わずかな加圧下（約１ａｔｍ）で、微小針（microneedle）を通して、前チャンバー（prechamber）中で行った。切片用チャンバーは、小循環（minicirculation）を維持できるようなやり方で前チャンバーに連結した。小循環は、微小針を通って流れ出す９５％Ｏ２／５％ＣＯ２により押し進める。新たに調製した海馬切片を、切片用チャンバー中、３３℃で、少なくとも１時間順応させた。
【００４１】
刺激レベルは、局限（focal）興奮性シナプス後電位（ｆＥＰＳＰ）が、最大興奮性シナプス電位（ＥＰＳＰ）の３０％であるように選択した。シャファー側枝の局所的刺激のために、ラッカー塗装したステンレススチールからなる単極刺激電極および定電流二相性刺激生成機（AM Systems 2100）を使用した（電圧：１−５Ｖ、一極性のパルス幅０.１ｍｓ、総パルス０.２ｍｓ）。通常栄養液を満たしたガラス電極（フィラメントを有するホウケイ酸ガラス、１−５ＭＯｈｍ、直径：１.５ｍｍ、先端の直径：３−２０μｍ）を使用して、放線状層からの興奮性シナプス後電位（ｆＥＰＳＰ）を記録した。電場電位を、切片用チャンバーの端に位置する塩素処理した銀照合電極に対して、ＤＣ電圧増幅器を使用して測定した。電場電位を、低域通過フィルター（low-pass filter）（５ｋＨｚ）を通してフィルターがけする。ｆＥＰＳＰの勾配（slope）（ｆＥＰＳＰ勾配）を、実験の統計分析のために測定した。実験の記録、分析および制御は、the Leibniz Neurobiology Institute, Magdeburg の神経生理学部門（the Department of Neurophysiology）で開発されたソフトウェアプログラム（ＰＷＩＮ）を利用して行った。各時点の平均ｆＥＰＳＰ勾配の生成および図表の構築は、適切なマクロによる自動データ記録を用い、ＥＸＣＥＬソフトウエアを利用して行った。
【００４２】
対照実験では、ベースラインのシナプス性伝達を最初に６０−１２０分間記録した。続いて、２回の二重パルスを２００ｍｓ間隔で４回与え、二重パルスのパルス間の間隔は１０ｍｓであり、個々のパルス幅は０.２ｍｓであった（弱いテタヌス）（図２の時間＝０分）。生じるＥＰＳＰの増強を、少なくとも６０分間記録した。記載した実験における刺激の１０分前から３０分後までの間、実施例２を流し込んだ。
【００４３】
実施例２の１０μＭ溶液による海馬切片の灌流は、有意なＬＴＰの増大を導いた（図２）。
【００４４】
社会的認識試験
社会的認識試験は、学習力および記憶力の試験である。それは、ラットが同種の既知メンバーと未知メンバーを区別する能力を測定する。従って、この試験は、試験物質の学習力または記憶力の改善効果を調べるのに適している。
【００４５】
社内飼育した成体のラットを、試験開始３０分前に、一匹ずつ試験ケージに入れた。試験開始４分前に、試験動物を観察箱に入れた。この適応時間の後、幼若動物を試験動物と共に入れ、成体動物が年少動物を調べる絶対的時間を２分間にわたり測定した（試行１）。明らかに年少動物に対して向けられた全行動、即ち、その間年長動物が年少動物から１ｃｍ以上離れずにした、肛門性器の調査、追跡および毛繕い、を測定した。その後幼若動物を取り出し、成体を実施例２または媒体で処置し、その後それを自分のケージに戻した。２４時間の保留時間の後に、試験を繰り返した（試行２）。試行１と比較して短縮された社会的相互作用時間は、成体ラットが年少動物を覚えていることを示す。
【００４６】
成体動物は、試行１の直後に、媒体（１０％エタノール、２０％ Solutol、７０％生理塩水）、または、１０％エタノール、２０％ Solutol、７０％生理塩水に溶解した０.１ｍｇ／ｋｇ、０.３ｍｇ／ｋｇ、１.０ｍｇ／ｋｇもしくは３.０ｍｇ／ｋｇの実施例２のいずれかの腹腔内注射を受けた。媒体処置ラットは、試行１と比較して、試行２において社会的相互作用時間の短縮を示さなかった。従って、それらは、年少動物と既に接触したことを忘れてしまっていた。驚くべきことに、実施例２で処置した後の二回目のランにおける社会的相互作用時間は、媒体で処置したものと比較して、有意に短縮された。このことは、この物質で処置したラットが幼若動物を覚えており、従って実施例２が学習力および記憶力の改善効果を発揮したことを意味する。
【００４７】
使用する略号：
【表２】
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【００４８】
例示的実施態様：
実施例１
６−（シクロヘキシルメチル）−１−シクロペンチル−１,５−ジヒドロ−４Ｈ−ピラゾロ［３,４−ｄ］ピリミジン−４−オン
【化３】
0004757492.tif 000006
【００４９】
工程１ａ）
５−アミノ−１−シクロペンチル−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボニトリル
【化４】
0004757492.tif 000007
シクロペンチルヒドラジン（６.５ｇ、６４.９ｍｍｏｌ）を、メタノール１００ｍｌ中のエトキシメチレンマロノニトリル（７.９３ｇ、６４.９ｍｍｏｌ）の溶液に室温、アルゴン下でゆっくりと添加し、続いて還流下で３時間加熱し、次いで室温で終夜撹拌する。溶媒を回転エバポレーター中で除き、残渣をジエチルエーテルで撹拌する。固体を吸引濾過し、ジエチルエーテルで洗浄し、高真空下で乾燥させる。
収量：７.２４ｇ（理論値の６３％）
ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ＝１７７（Ｍ＋Ｈ）＋
1H-NMR (200 MHz CDCl3): δ = 7.5 (s, 1H), 4.45 (br. s, 2H), 4.35 (m, 1H), 2.2-1.55 (m, 6H) ppm.
【００５０】
工程１ｂ）
５−アミノ−１−シクロペンチル−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボキサミド
【化５】
0004757492.tif 000008
３０％強度過酸化水素溶液８５ｍｌを、エタノール３００ｍｌと濃縮水性アンモニア溶液３７１ｍｌの混合物中の５−アミノ−１−シクロペンチル−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボニトリル（６.７４ｇ、３８.３ｍｍｏｌ）の溶液に室温で添加し、室温で終夜撹拌する。次いで、非水性溶媒を回転エバポレーター中で除く。生成物は、残存している混合物から固体として沈殿し、それを吸引濾過し、ジエチルエーテルで洗浄し、高真空下で乾燥させる。
収量：５.３１ｇ（理論値の７１％）
ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ＝１９５（Ｍ＋Ｈ）＋
1H-NMR (200 MHz, CdCl3): δ = 7.5 (s, 1H), 5.67-4.8 (幅広い, 4H), 4.35 (m, 1H), 2.2-1.55 (m, 8H) ppm.
【００５１】
工程１ｃ）
６−（シクロヘキシルメチル）−１−シクロペンチル−１,５−ジヒドロ−４Ｈ−ピラゾロ［３,４−ｄ］ピリミジン−４−オン
【化６】
0004757492.tif 000009
アルゴン下で、５−アミノ−１−シクロペンチル−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボキサミド７５ｍｇ（０.３９ｍｍｏｌ）およびメチルシクロヘキシルアセテート１８３ｍｇ（１.１６ｍｍｏｌ、３当量）を無水エタノール１.５ｍｌに導入する。０℃で、水素化ナトリウム５４ｍｇ（鉱油中６０％分散；１.３５ｍｍｏｌ、３.５当量）を、アルゴンの向流（countercurrent）中でゆっくりと添加する。生じる混合物をゆっくりと加熱し、還流下で１８時間撹拌する。後処理に、水２０ｍｌを添加し、混合物を酢酸エチルで数回抽出する。合わせた有機相を硫酸ナトリウムで乾燥させ、真空で濃縮する。粗生成物を分取ＨＰＬＣにより精製する。
収量：３６ｍｇ（理論値の３１％）
ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ＝３０１（Ｍ＋Ｈ）＋
ｍ.ｐ.：１４７℃
1H-NMR (300 MHz, DMSO-d6): δ = 11.95 (s, 1H), 8.0 (s, 1H), 5.1 (m, 1H), 2.5 (d, 2H), 2.15-1.75 (m, 7H), 1.75-1.55 (m, 7H), 1.3-0.9 (m, 5H) ppm.
【００５２】
実施例２
６−（シクロヘキシルメチル）−１−（１−エチルプロピル）−１,５−ジヒドロ−４Ｈ−ピラゾロ［３,４−ｄ］ピリミジン−４−オン
【化７】
0004757492.tif 000010
【００５３】
工程２ａ）
５−アミノ−１−（１−エチルプロピル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボニトリル
【化８】
0004757492.tif 000011
実施例１／工程１ａ）の方法と同様に製造を行う。
ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ＝１７９（Ｍ＋Ｈ）＋
1H-NMR (300 MHz, DMSO-d6): δ = 7.55 (s, 1H), 6.45 (s, 2H), 4.0 (m, 1H), 1.8-1.55 (m, 4H), 0.65 (t, 6H) ppm.
【００５４】
工程２ｂ）
５−アミノ−１−（１−エチルプロピル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボキサミド
【化９】
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実施例１／工程１ｂ）の方法と同様に製造を行う。
ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ＝１９７（Ｍ＋Ｈ）＋
1H-NMR (300 MHz, DMSO-d6): δ = 7.65 (s, 1H), 6.9 (br. s, 2H), 6.1 (s, 2H), 3.9 (m, 1H), 1.85-1.6 (m, 4H), 0.7 (t, 6H) ppm.
【００５５】
工程２ｃ）
６−（シクロヘキシルメチル）−１−（１−エチルプロピル）−１,５−ジヒドロ−４Ｈ−ピラゾロ［３,４−ｄ］ピリミジン−４−オン
【化１０】
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実施例１／工程１ｃ）と同様に、５−アミノ−１−（１−エチルプロピル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボキサミド２００ｍｇ（１.０２ｍｍｏｌ）およびメチルシクロヘキシルアセテート４８２ｍｇ（３.０６ｍｍｏｌ）から出発して生成物を得る。
収量：１４６ｍｇ（理論値の４７％）
ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ＝３０３（Ｍ＋Ｈ）＋
ｍ.ｐ.：１２２℃
1H-NMR (200 MHz, DMSO-d6): δ = 12.0 (s, 1H), 8.0 (s, 1H), 4.45 (m, 1H), 2.5 (m, 2H), 2.0-1.5 (m, 10H), 1.4-0.9 (m, 5H), 0.6 (t, 6H, J = 7.5 Hz) ppm.
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】実施例２による処置後の初代ラット（Ｅ１８）大脳皮質培養における細胞内ｃＧＭＰ濃度。
【図２】弱いテタヌス後の局限興奮性シナプス後電位（ｆＥＰＳＰ）の増強に対する実施例２（１０μＭ）の効果。
【図３】社会的認識試験における相互作用時間の短縮率（試行２／試行１）に対する実施例２の効果。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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