(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料を励起し非線形蛍光信号を発生させるための放射を提供する短パルスレーザ、
前記非線形蛍光信号と試料からの放射の反射信号およびレーザ放射の平均出力に相当する参照信号、または前記非線形蛍光信号と前記反射信号および前記参照信号のいずれかを検出する検出器、
および前記非線形蛍光信号と前記試料からの放射の反射信号との比、または前記非線形蛍光信号と前記レーザ放射の平均出力またはパルス長の調整に使用される参照信号との比に依存するプレチャープユニット、
とからなり、
前記比が、試料にレーザ相互作用をする位置におけるレーザのパルス長となること
を特徴とする顕微鏡のレーザ出力およびまたはパルス長を調整する装置。
【請求項２】
前記レーザー放射の平均出力を記録するため、レーザー光が、レーザーに後置されたモニターダイオードへ偏向される、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
レーザー走査型顕微鏡内における、請求項１または２に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
パルスレーザーによって試料内に非線形過程（多光子吸収、SHG、OBIC、時間高分解能蛍光証明等）を励起するには、できるだけ大きいパルスピーク出力Ｐpeakが必要である。
パルスピーク出力（強度I）は、次のように計算される。
Ｐpeak ＝
ＰＡｖｇ／（τ・ｆ・Ａ）                          （１）
【０００２】
従って、ピーク出力を大きくするには、それだけパルス長τが試料のところで短くなければならない。しかし、短いパルスはパルス長に応じてある決まったスペクトル幅Δλを持つ。Ａとｆはそれぞれ繰り返し率と対試料相互作用面積である。ＰＡｖｇはレーザー放射の平均出力である。波長成分の分散によって、パルスは光学媒質（試料を含む）通過時に広くなる。加えて、SPMのような非線形効果が現れ、スペクトルに、従ってまたパルス長に作用する。このため、パルス長と平均出力を対試料レーザー相互作用の位置で最適にする必要がある。
【０００３】
【従来の技術】
１ns未満の短パルスは、その短さのために直接電気的な方法では測定できない。このため、例えば自己相関器を用いてパルスの自己相関関数を決定する。続いて、この自己相関関数からパルス長を推定する。しかしこれらの測定器では、一般に、求めるレーザー光が平行光線であることが必要である。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
このため、大口径対物レンズを用いたときに直接パルス長を決定するのには適合できない。原則として、試料内へ進入する深さに依存するパルス長の決定・最適化には適合していない。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
請求項記載の手順を介して、対試料レーザー相互作用の位置におけるパルス長を測定し、パルスピーク出力を最適化することができる。このため、非線形相互作用と線形相互作用とを組み合わせ、生物標本に適用する。
【０００６】
非線形相互作用は一般に次のように書くことができる。
ＳＮＬ ＝ Ｃ・Ｐnpeak ＝ Ｃ・PnＡｖｇ／（τ・ｆ・Ａ）ｎ          （２）
ここで、Ｃは比例係数であり、ｎは非線形の次数を示す。
定数Ｃは標本の特性に依存する。非線形の試料相互作用は、例えば２光子顕微鏡法（ｎ＝２）、第２高調波の発生（ｎ＝２）、３光子吸収（ｎ＝３）等である。
【０００７】
線形の試料相互作用は一般に次式によって与えられる。
ＳＬ ＝ Ｃ１・ＰＡｖｇ                                          （３）
ここで、Ｃ１は比例係数であり、ここでも試料特性に依存する。
線形相互作用には、例えば標本からの反射、１光子蛍光による励起または出力測定装置による平均出力の測定がある。２つの過程（線形・非線形）で同時に測定し、両信号の比
Ｒ ＝ ＳＮＬ／ＳＬｎ                                          （３.１）
を決定すると、
【０００８】
例えば２光子吸収については次の関係となる。
式（２）／式（３）
Ｒ ＝ ＳＮＬ／ＳＬ２ ＝ Ｃ／（Ｃ１２・ｆ２・Ａ２）・１／τ２
＝ Const・１／τ２      （４）
ここで、ｆおよびＡはパルス長に依存しない。比例係数（Ｃ，Ｃ１）は通常は同様にパルス長に依存しない。非線形・線形信号の比Ｒは、２光子の場合パルス長に反比例し、平均出力に依存しない。定数（Const）は使用している標本と検出装置に依存する。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明をここで模範例として２光子吸収に基づき説明する。
実施例として、２基の検出器Ｄ１およびＤ２（図１）を配置し、反射・平均出力および２光子蛍光を同時に（順次）記録するようにすることが必要である。続いて計算機で比Ｒを計算し、グラフ表示する。
【００１０】
図１の装置１ａは、検出器Ｄ２における線形信号として、レーザーＬによって照明されている試料Ｐの反射が対物レンズＯおよび、主カラースプリッターHFTおよび副カラースプリッターNFTを通じて検出される構成を示す。
この反射信号から、適合したダイクロイックミラーNFTを用いて蛍光放射が分離され、短波透過フィルターKPを通じてＤ１に到達する。
【００１１】
装置１ｂは、検出器として用いたモニターダイオードMDのところでレーザー放射の平均出力を検出する構成を示す。このモニターダイオードは、一定割合でビーム分割されたレーザー光を供給される。この装置が望ましいというのは、こうすれば反射信号が標本の反射特性に依存しないからである。主カラースプリッターHFTとしては、両装置とも短波透過フィルターを用いる。これはNIR波長領域の光を反射させ、VIS‐UV領域の光を透過させる。
【００１２】
図２は比Ｒをパルス長の関数として表す。
パルス長が最小のとき、すなわち試料の位置でパルスピーク出力が最大のとき、式（４）に従って最大が起きる。したがって、パルス長の最適化はプレチャープユニットを調整することによって実現できる。この種の調整可能なプレチャープユニットはＤＥ特許１９６２２ ３５９．Ａ１に記載されている。
【００１３】
特に有利なのは、無次元数・比Ｒの測定値が第１近似で平均出力（すなわちガラス繊維への結合効率、レーザーが最適化されたときの平均出力変化等）に依存しないことである。この無次元数は専らパルス長のみに依存する。しかし平均出力がもっと大きくなると、使用中の光学系（ガラス繊維結合の場合ガラス繊維）内で非線形過程（自己位相変調など）が励起される可能性がある。これによって（超）短レーザーパルスのスペクトル帯域幅が変化し、同時にパルス長も変化し、これによってパルスピーク出力が小さくなる。この効果は避けるべきで、すなわち平均出力は制限すべきである。平均出力の閾値を求めるために前記手順が同様に利用される。
【００１４】
図３は、プレチャープユニットを無変化に調整した（パルス長がプレチャープユニットを通ったとき変化しない）とき、この比が平均出力にどのように依存するかを示す。使用中の光学系の非線形効果による前記パルス長の前記変化は、式（４）によって一定であることが期待される。この比が折れ曲がっていることによって図中に表されている。
【００１５】
図４は、短パルスレーザーKPL、プレチャープユニットPCE、光ファイバーＦおよび顕微鏡ＭＩ特にレーザー走査型顕微鏡LSMから成る全装置を示す。
【図面の簡単な説明】
【図１】  LSMにおける実施例
【図２】比Ｒをパルス長の関数として表す
【図３】プレチャープユニットを調整したときの比の平均出力への依存率を示す
【図４】装置
【符号の説明】
Ｄ１,Ｄ２    検出器
Ｌ    レーザー
Ｐ  試料
Ｏ    対物レンズ
HFT    主カラースプリッター
NFT    副カラースプリッター
MD    モニターダイオード
KPL    短パルスレーザー
PCE    プレチャープユニット
Ｆ    光ファイバー
ＭＩ    顕微鏡
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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