(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）非共有結合的に錯化しているアデノウイルスと
ｂ）式Ｉ：
【化１】
0004701169.tif 000027
〔式中、ｍは１〜１，０００の整数であり、ｉは２〜ｍの整数であってＸｉの位置を示し、Ｘ１、ＸｉおよびＸｍ＋１は独立して選択されたモノマーであり、前記モノマーは、（ｉ）第二級アミン類および第三級アミン類から選択されるアミンを含み、かつ（ｉｉ）少なくとも１つのモノマーはＱを含み、前記Ｑは、式ＩＩａおよび式ＩＩｂ：
【化２】
0004701169.tif 000028
（式中、Ｚは、ＯおよびＮＨからなる群から選択され、ｈは０または１の整数であり、Ｒ１は、ポリアルキレングリコール部位を含む）から選択される構造を有する〕の構造を有するコポリマーであって、交差重合を含まず、前記コポリマー中に少なくとも１個の窒素原子がプラスに帯電しており、前記コポリマーは、１２５ｋＤａと１５０ｋＤａとの間の平均分子量を有し、かつ、前記コポリマーの前記アデノウイルスに対する比率は、３，５００：１〜３０，０００：１であるコポリマーと、
を含む、錯体。
【請求項２】
Ｑが式ＩＩａであり、ｈが０であり、ＺがＯであり、前記モノマーが式ＩＩＩ：
【化３】
0004701169.tif 000029
（式中、ａは１〜１０の整数であり、ｂは１〜１０の整数である）の構造を含む、請求項１に記載の錯体。
【請求項３】
Ｑが式ＩＩａであり、ｈが０であり、ＺがＯであり、前記モノマーが式ＩＶ：
【化４】
0004701169.tif 000030
（式中、ｃは１〜１０の整数である）の構造を含む、請求項１に記載の錯体。
【請求項４】
Ｑが式ＩＩａであり、ｈが０であり、ＺがＯであり、前記コポリマーにおいて、
ａ）前記モノマーの少なくとも１個が式ＩＩＩ（式中、ａは１〜１０の整数であり、ｂは１〜１０の整数である）の構造を含み、
ｂ）前記モノマーの少なくとも１個が式ＩＶ（式中、ｃは１〜１０の整数である）の構造を含む、請求項１に記載の錯体。
【請求項５】
ａが２である、請求項４に記載の錯体。
【請求項６】
ｂが２である、請求項５に記載の錯体。
【請求項７】
ｃが２である、請求項６に記載の錯体。
【請求項８】
ａが３である、請求項４に記載の錯体。
【請求項９】
ｂが３である、請求項８に記載の錯体。
【請求項１０】
ｃが３である、請求項９に記載の錯体。
【請求項１１】
前記モノマーがエチレンイミンである、請求項４に記載の錯体。
【請求項１２】
Ｑが式ＩＩａであり、ｈが０であり、ＺがＯであり、前記モノマーが式Ｖ：
【化５】
0004701169.tif 000031
の構造を含む、請求項１に記載の錯体。
【請求項１３】
前記モノマーがリジンである、請求項１に記載の錯体。
【請求項１４】
Ｑが式ＩＩａであり、ｈが１であり、ＺがＮＨであり、前記モノマーが式ＶＩ：
【化６】
0004701169.tif 000032
（式中、Ｒ３はＨ、−（ＣＨ２ＣＨ２）ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ３）２および−（ＣＨ２ＣＨ２）Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ３）２から選択される基である）の構造を含む、請求項１に記載の錯体。
【請求項１５】
Ｒ３は、前記モノマーの３個のうちの２個についてはＨであり、前記モノマーの３個のうちの１個については、Ｒ３は−（ＣＨ２ＣＨ２）ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ３）２および−（ＣＨ２ＣＨ２）Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ３）２から選択される基である、請求項１４に記載の錯体。
【請求項１６】
前記モノマーがＤＥＡＥ−デキストランである、請求項１に記載の錯体。
【請求項１７】
Ｑが式ＩＩｂであり、前記コポリマーが、
ａ）式ＶＩ：
【化７】
0004701169.tif 000033
（式中、Ｒ３はＨ、−（ＣＨ２ＣＨ２）ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ３）２および−（ＣＨ２ＣＨ２）Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ３）２から選択される基である）の構造を含む少なくとも１個のモノマーと、
ｂ）式ＶＩＩ：
【化８】
0004701169.tif 000034
の構造を含む少なくとも１個のモノマーとを含む、請求項１に記載の錯体。
【請求項１８】
Ｒ３は、前記モノマーの３個のうちの２個についてはＨであり、前記モノマーの３個のうちの１個については、残りのＲ３は−（ＣＨ２ＣＨ２）ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ３）２および−（ＣＨ２ＣＨ２）Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ３）２から選択される基である、請求項１７に記載の錯体。
【請求項１９】
式ＶＩＩの構造を含む前記モノマーの割合が、５％と２５％との間である、請求項１７に記載の錯体。
【請求項２０】
式ＶＩＩの構造を含む前記モノマーの割合が５％と２５％との間である、請求項１８に記載の錯体。
【請求項２１】
Ｒ１が、式ＶＩＩＩ：
【化９】
0004701169.tif 000035
（式中、ｎは２〜２，０００の整数であり、ｐは１〜８の整数であり、Ｒ２は、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換３〜７員シクロアルキル、置換または非置換５〜７員ヘテロシクロアルキル、置換または非置換アリールおよび置換または非置換ヘテロアリールから選択される基である）の構造を含む、請求項１に記載の錯体。
【請求項２２】
ｐが２である、請求項２１に記載の錯体。
【請求項２３】
Ｑが、式ＩＸ：
【化１０】
0004701169.tif 000036
（式中、ｎは２〜２，０００の整数、ｐは１〜８の整数、Ｒ２は、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換３〜７員シクロアルキル、置換または非置換５〜７員ヘテロシクロアルキル、置換または非置換アリールおよび置換または非置換ヘテロアリールから選択される基である）の構造を有する、請求項４に記載の錯体。
【請求項２４】
Ｑで置換されているモノマーの割合が少なくとも１０％である、請求項１に記載の錯体。
【請求項２５】
Ｑで置換されているモノマーの割合が１５〜３０％である、請求項１に記載の錯体。
【請求項２６】
Ｑが、式ＩＸ（式中、ｎは２〜２，０００の整数であり、ｐは１〜８の整数であり、Ｒ２は、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換３〜７員シクロアルキル、置換または非置換５〜７員ヘテロシクロアルキル、置換または非置換アリールおよび置換または非置換ヘテロアリールから選択される基である）の構造を有する、請求項１２に記載の錯体。
【請求項２７】
Ｑが式Ｘ：
【化１１】
0004701169.tif 000037
〔式中、ｎは２〜２，０００の整数であり、ｐは１〜８の整数であり、ｆは０または１の整数であり、ｆが１の時、Ｒ４は式ＸＩ：
【化１２】
0004701169.tif 000038
（式中、Ｎ’がＮ＊に共有結合で結合し、ｇは１〜９の整数であり、Ｒ２は、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換３〜７員シクロアルキル、置換または非置換５〜７員ヘテロシクロアルキル、置換または非置換アリールおよび置換または非置換ヘテロアリールから選択される基である）の構造を有する〕の構造を有する、請求項１４に記載の錯体。
【請求項２８】
ｆが０である、請求項２７に記載の錯体。
【請求項２９】
ｆが１である、請求項２７に記載の錯体。
【請求項３０】
ｇが４である、請求項２９に記載の錯体。
【請求項３１】
Ｑが式ＸＩＩ：
【化１３】
0004701169.tif 000039
（式中、ｎは２〜２，０００の整数であり、ｐは１〜８の整数であり、Ｒ２は、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換３〜７員シクロアルキル、置換または非置換５〜７員ヘテロシクロアルキル、置換または非置換アリールおよび置換または非置換ヘテロアリールから選択される基である）の構造を有する、請求項１７に記載の錯体。
【請求項３２】
錯体の直径が、２０ｎｍと３００ｎｍとの間である、請求項１に記載の錯体。
【請求項３３】
錯体の直径が、８０ｎｍと１５０ｎｍとの間である、請求項１に記載の錯体。
【請求項３４】
Ｒ２が、置換および非置換アルキル、置換および非置換アリール、葉酸塩、トランスフェリン、ガラクトース、グルコース、抗体、抗体断片およびペプチドから選択されるものである、請求項２３に記載の錯体。
【請求項３５】
Ｒ２がメチルである、請求項３４に記載の錯体。
【請求項３６】
ｐが２であり、ａが２であり、ｂが２であり、ｃが２である、請求項３５に記載の錯体。
【請求項３７】
Ｒ２が、置換および非置換アルキル、置換および非置換アリール、葉酸塩、トランスフェリン、ガラクトース、グルコース、抗体、抗体断片およびペプチドから選択されるものである、請求項２６に記載の錯体。
【請求項３８】
Ｒ２がメチルである、請求項３７に記載の錯体。
【請求項３９】
ｐが２である、請求項３８に記載の錯体。
【請求項４０】
Ｒ２が、置換および非置換アルキル、置換および非置換アリール、葉酸塩、トランスフェリン、ガラクトース、グルコース、抗体、抗体断片およびペプチドから選択されるものである、請求項２８に記載の錯体。
【請求項４１】
Ｒ２がメチルである、請求項４０に記載の錯体。
【請求項４２】
ｐが２である、請求項４１に記載の錯体。
【請求項４３】
Ｒ２が、置換および非置換アルキル、置換および非置換アリール、葉酸塩、トランスフェリン、ガラクトース、グルコース、抗体、抗体断片およびペプチドから選択されるものである、請求項２９に記載の錯体。
【請求項４４】
Ｒ２がメチルである、請求項４３に記載の錯体。
【請求項４５】
ｐが２である、請求項４４に記載の錯体。
【請求項４６】
Ｒ２が、置換および非置換アルキル、置換および非置換アリール、葉酸塩、トランスフェリン、ガラクトース、グルコース、抗体、抗体断片およびペプチドから選択されるものである、請求項３０に記載の錯体。
【請求項４７】
Ｒ２がメチルである、請求項４６に記載の錯体。
【請求項４８】
ｐが２である、請求項４７に記載の錯体。
【請求項４９】
Ｒ２が、置換および非置換アルキル、置換および非置換アリール、葉酸塩、トランスフェリン、ガラクトース、グルコース、抗体、抗体断片およびペプチドから選択されるものである、請求項３１に記載の錯体。
【請求項５０】
Ｒ２がメチルである、請求項４９に記載の錯体。
【請求項５１】
ｐが２である、請求項５０に記載の錯体。
【請求項５２】
アデノウイルスに対するコポリマーの比が、３，５００：１と３０，０００：１との間である、請求項１に記載の錯体。
【請求項５３】
アデノウイルスに対するコポリマーの比が、３，６００：１と２０，０００：１との間である、請求項５２に記載の錯体。
【請求項５４】
アデノウイルスに対するコポリマーの比が、１０，０００：１と３０，０００：１との間である、請求項５２に記載の錯体。
【請求項５５】
コポリマーの分子量が、１５０ｋＤａと１７０ｋＤａとの間である、請求項１に記載の錯体。
【請求項５６】
ｍが、１０〜９００の整数である、請求項１に記載の錯体。
【請求項５７】
ｍが、５０〜６００の整数である、請求項５６に記載の錯体。
【請求項５８】
ｍが、７５〜３００の整数である、請求項５７に記載の錯体。
【請求項５９】
非共有結合的に錯化したアデノウイルスコポリマー錯体を製造する方法であって、
コポリマーをアデノウイルスに接触させることを含み、
前記コポリマーが、式Ｉ：
【化１３Ｂ】
0004701169.tif 000040
〔式中、ｍは１〜１，０００の整数であり、ｉは２〜ｍの整数であってＸｉの位置を示し、Ｘ１、ＸｉおよびＸｍ＋１は独立して選択されたモノマーであり、前記モノマーは、（ｉ）第二級アミン類および第三級アミン類から選択されるアミンを含み、かつ（ｉｉ）少なくとも１つのモノマーはＱを含み、前記Ｑは、式ＩＩａおよび式ＩＩｂ：
【化１４】
0004701169.tif 000041
（式中、Ｚは、ＯおよびＮＨからなる群から選択され、ｈは０または１の整数であり、Ｒ１は、ポリアルキレングリコール部位を含む）から選択される構造である〕の構造を含み、
前記コポリマーは交差重合を含まず、前記コポリマー中の少なくとも１個の窒素原子がプラスに帯電しており、コポリマーは、１２５ｋＤａと１５０ｋＤａとの間の平均分子量を有し、かつ、前記コポリマーの前記アデノウイルスに対する比率は、３，５００：１〜３０，０００：１である、方法。
【請求項６０】
Ｑが式ＩＩａであり、ｈが０であり、ＺがＯであり、前記モノマーは、
ａ）式ＩＩＩ（式中、ａは１〜１０の整数であり、ｂは１〜１０の整数である）の構造を有するモノマーを少なくとも１個と、
ｂ）式ＩＶ（式中、ｃは１〜１０の整数である）の構造を有するモノマーを少なくとも１個とを含み、
前記モノマーの少なくとも１０％は、式ＩＸ（式中、ｎは２〜２，０００の整数であり、ｐは１〜８の整数であり、Ｒ２は、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換３〜７員シクロアルキル、置換または非置換５〜７員ヘテロシクロアルキル、置換または非置換アリールおよび置換または非置換ヘテロアリールから選択される基である）の構造で置換されており、
前記コポリマーは交差重合を含まず、前記コポリマー中の少なくとも１個の窒素原子がプラスに帯電している、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
ｐが２であり、ａが２であり、ｂが２であり、ｃが２であり、Ｒ２がメチルである、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
Ｑが式ＩＩａであり、ｈが０であり、ＺがＯであり、前記モノマーが、式Ｖ〔式中、前記モノマーの少なくとも１０％が、式ＩＸ（式中、ｎは２〜２，０００の整数であり、ｐは１〜８の整数であり、Ｒ２は、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換３〜７員シクロアルキル、置換または非置換５〜７員ヘテロシクロアルキル、置換または非置換アリールおよび置換または非置換ヘテロアリールから選択される基である）の構造で置換されている〕の構造を含み、
前記コポリマーは交差重合を含まず、前記コポリマー中の少なくとも１個の窒素原子がプラスに帯電している、請求項５９に記載の方法。
【請求項６３】
ｐが２であり、Ｒ２がメチルである、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
Ｑが式ＩＩａであり、ｈが１であり、ＺがＮＨであり、前記モノマーが、式ＶＩ〔式中、Ｒ３は、前記モノマーの３個のうちの２個についてはＨであり、前記モノマーの３個のうちの１個については、Ｒ３は−（ＣＨ２ＣＨ２）ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ３）２および−（ＣＨ２ＣＨ２）Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ３）２から選択される基であり、Ｑで置換されているモノマーの割合は少なくとも１０％であり、Ｑは、式Ｘ（式中、ｎは２〜２，０００の整数であり、ｐは１〜８の整数であり、ｆは０であり、Ｒ２は、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換３〜７員シクロアルキル、置換または非置換５〜７員ヘテロシクロアルキル、置換または非置換アリールおよび置換または非置換ヘテロアリールから選択される基である）の構造を有している〕の構造を含み、
前記コポリマーは交差重合を含まず、前記コポリマー中の少なくとも１個の窒素原子がプラスに帯電している、請求項５９に記載の方法。
【請求項６５】
ｐが２であり、Ｒ２がメチルである、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
Ｑが式ＩＩａであり、ｈが１であり、ＺがＮＨであり、前記モノマーが、式ＶＩ〔式中、Ｒ３は、前記モノマーの３個のうちの２個についてはＨであり、前記モノマーの３個のうちの１個については、Ｒ３は−（ＣＨ２ＣＨ２）ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ３）２および−（ＣＨ２ＣＨ２）Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ３）２から選択される基であり、Ｑで置換されているモノマーの割合は少なくとも１０％であり、Ｑは、式Ｘ（式中、ｎは２〜２，０００の整数であり、ｐは１〜８の整数であり、ｆは１であり、Ｒ４は式ＸＩの構造を有し、ｇは４であり、Ｒ２は、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換３〜７員シクロアルキル、置換または非置換５〜７員ヘテロシクロアルキル、置換または非置換アリールおよび置換または非置換ヘテロアリールから選択される基である）の構造を有している〕の構造を含み、
前記コポリマーは交差重合を含まず、前記コポリマー中の少なくとも１個の窒素原子がプラスに帯電している、請求項５９に記載の方法。
【請求項６７】
ｐが２であり、Ｒ２がメチルである、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
Ｑが式ＩＩｂであり、前記コポリマーが、
ａ）式ＶＩ（式中、Ｒ３はＨ、−（ＣＨ２ＣＨ２）ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ３）２および−（ＣＨ２ＣＨ２）Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ３）２から選択される基である）の構造を含むモノマーを少なくとも１個と、
ｂ）式ＶＩＩの構造を含むモノマーを少なくとも１個とを含み、
Ｑで置換されているモノマーの割合が少なくとも１０％で、Ｑは、式ＸＩＩ（式中、ｎは２〜２，０００の整数であり、ｐは１〜８の整数であり、Ｒ２は、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換３〜７員シクロアルキル、置換または非置換５〜７員ヘテロシクロアルキル、置換または非置換アリールおよび置換または非置換ヘテロアリールから選択される基である）の構造を有し、
前記コポリマーは交差重合を含まず、前記コポリマー中の少なくとも１個の窒素原子がプラスに帯電している、請求項５９に記載の方法。
【請求項６９】
ｐが２であり、Ｒ２がメチルである、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
アデノウイルスを細胞中に導入する方法であって、
（ａ）コポリマーをアデノウイルスに非共有結合的に接触させ、
（ｂ）前記コポリマーと前記アデノウイルスとの錯体を細胞に接触させることを含み、
前記コポリマーは、式Ｉ：
【化１４Ｂ】
0004701169.tif 000042
〔式中、ｍは１〜１，０００の整数であり、ｉは２〜ｍの整数であってＸｉの位置を示し、Ｘ１、ＸｉおよびＸｍ＋１は独立して選択されたモノマーであり、前記モノマーは、（ｉ）第二級アミン類および第三級アミン類から選択されるアミンを含み、かつ（ｉｉ）少なくとも１つのモノマーはＱを含み、前記Ｑは、式ＩＩａおよび式ＩＩｂ：
【化１５】
0004701169.tif 000043
（式中、Ｚは、ＯおよびＮＨからなる群から選択され、ｈは０または１の整数であり、Ｒ１は、ポリアルキレングリコール部位を含む）から選択される構造である〕の構造を含み、
前記コポリマーは交差重合を含まず、前記コポリマー中の少なくとも１個の窒素原子がプラスに帯電しており、前記コポリマーは、１２５ｋＤａと１５０ｋＤａとの間の平均分子量を有し、かつ、前記コポリマーの前記アデノウイルスに対する比率は、３，５００：１〜３０，０００：１である、方法。
【請求項７１】
前記アデノウイルスが、コポリマーのないアデノウイルスより、感染性がより高い、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記アデノウイルスが、コポリマーのないものより、感染性が少なくとも２０％高い、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記アデノウイルスが、コポリマーのないものより、感染性が少なくとも１００％高い、請求項７１に記載の方法。
【請求項７４】
Ｑが式ＩＩａであり、ｈが０であり、ＺがＯであり、前記モノマーは、
ａ）式ＩＩＩ（式中、ａは１〜１０の整数であり、ｂは１〜１０の整数である）の構造を有するモノマーを少なくとも１個と、
ｂ）式ＩＶ（式中、ｃは１〜１０の整数である）の構造を有するモノマーを少なくとも１個とを含み、
前記モノマーの少なくとも１０％は、式ＩＸ（式中、ｎは２〜２，０００の整数であり、ｐは１〜８の整数であり、Ｒ２は、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換３〜７員シクロアルキル、置換または非置換５〜７員ヘテロシクロアルキル、置換または非置換アリールおよび置換または非置換ヘテロアリールから選択される基である）の構造で置換されており、
前記コポリマーは交差重合を含まず、前記コポリマー中の少なくとも１個の窒素原子がプラスに帯電している、請求項７０に記載の方法。
【請求項７５】
ｐが２であり、ａが２であり、ｂが２であり、ｃが２であり、Ｒ２がメチルである、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
Ｑが式ＩＩａであり、ｈが０であり、ＺがＯであり、前記モノマーが、式Ｖ〔式中、前記モノマーの少なくとも１０％が、式ＩＸ（式中、ｎは２〜２，０００の整数であり、ｐは１〜８の整数であり、Ｒ２は、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換３〜７員シクロアルキル、置換または非置換５〜７員ヘテロシクロアルキル、置換または非置換アリールおよび置換または非置換ヘテロアリールから選択される基である）の構造で置換されている〕の構造を含み、前記コポリマーは交差重合を含まず、前記コポリマー中の少なくとも１個の窒素原子がプラスに帯電している、請求項７０に記載の方法。
【請求項７７】
ｐが２であり、Ｒ２がメチルである、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
Ｑが式ＩＩａであり、ｈが１であり、ＺがＮＨであり、前記モノマーが、式ＶＩ〔式中、Ｒ３は、前記モノマーの３個のうち２個についてはＨであり、前記モノマーの３個のうちの１個については、Ｒ３は−（ＣＨ２ＣＨ２）ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ３）２および−（ＣＨ２ＣＨ２）Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ３）２から選択される基であり、Ｑで置換されているモノマーの割合は少なくとも１０％であり、Ｑは、式Ｘ（式中、ｎは２〜２，０００の整数であり、ｐは１〜８の整数であり、ｆは０であり、Ｒ２は、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換３〜７員シクロアルキル、置換または非置換５〜７員ヘテロシクロアルキル、置換または非置換アリールおよび置換または非置換ヘテロアリールから選択される基である）の構造を有している〕の構造を含み、
前記コポリマーは交差重合を含まず、前記コポリマー中の少なくとも１個の窒素原子がプラスに帯電している、請求項７０に記載の方法。
【請求項７９】
ｐが２であり、Ｒ２がメチルである、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
Ｑが式ＩＩａであり、ｈが１であり、ＺがＮＨであり、前記モノマーが、式ＶＩ〔式中、Ｒ３は、前記モノマーの３個のうちの２個についてはＨであり、前記モノマーの３個のうちの１個については、Ｒ３は−（ＣＨ２ＣＨ２）ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ３）２および−（ＣＨ２ＣＨ２）Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ３）２から選択される基であり、Ｑで置換されているモノマーの割合は少なくとも１０％であり、Ｑは、式Ｘ（式中、ｎは２〜２，０００の整数であり、ｐは１〜８の整数であり、ｆは１であり、Ｒ４は式ＸＩの構造を有し、ｇは４であり、Ｒ２は、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換３〜７員シクロアルキル、置換または非置換５〜７員ヘテロシクロアルキル、置換または非置換アリールおよび置換または非置換ヘテロアリールから選択される基である）の構造を有している〕の構造を含み、
前記コポリマーは交差重合を含まず、前記コポリマー中の少なくとも１個の窒素原子がプラスに帯電している、請求項７０に記載の方法。
【請求項８１】
ｐが２であり、Ｒ２がメチルである、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
Ｑが式ＩＩｂであり、前記コポリマーが、
ａ）式ＶＩ（式中、Ｒ３はＨ、−（ＣＨ２ＣＨ２）ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ３）２および−（ＣＨ２ＣＨ２）Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ３）２から選択される基である）の構造を含むモノマーを少なくとも１個と、
ｂ）式ＶＩＩの構造を含むモノマーを少なくとも１個とを含み、
Ｑで置換されているモノマーの割合が少なくとも１０％で、Ｑは、式ＸＩＩ（式中、ｎは２〜２，０００の整数であり、ｐは１〜８の整数であり、Ｒ２は、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換３〜７員シクロアルキル、置換または非置換５〜７員ヘテロシクロアルキル、置換または非置換アリールおよび置換または非置換ヘテロアリールから選択される基である）の構造を有し、
前記コポリマーは交差重合を含まず、前記コポリマー中の少なくとも１個の窒素原子がプラスに帯電している、請求項７０に記載の方法。
【請求項８３】
ｐが２であり、Ｒ２がメチルである、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
（ａ）式Ｉ
【化１５Ｂ】
0004701169.tif 000044
［式中、ｍは１〜１，０００の整数であり、
ｉは２〜ｍの整数であってＸｉの位置を示し、
Ｘ１、ＸｉおよびＸｍ＋１は独立して選択されたモノマーであり、前記モノマーは、
（ｉ）第二級アミン類および第三級アミン類から選択されるアミンを含み、かつ
（ｉｉ）少なくとも１つのモノマーはＱを含み、前記Ｑは、式ＩＩａおよび式ＩＩｂ：
【化１６】
0004701169.tif 000045
（式中、Ｚは、ＯおよびＮＨからなる群から選択され、ｈは０または１の整数であり、Ｒ１は、ポリアルキレングリコール部位を含む）のから選択される構造である）の構造を含む〕の構造を含むコポリマーであって、
交差重合を含まず、前記コポリマー中に少なくとも１個の窒素原子がプラスに帯電しており、前記コポリマーは、１２５ｋＤａと１５０ｋＤａとの間の平均分子量を有するコポリマーと、
（ｂ）アデノウイルスであって、前記コポリマーの前記アデノウイルスに対する比率は、３，５００：１〜３０，０００：１である、アデノウイルスと、
（ｃ）生理学的に許容しうる賦形剤と、
を含み、
前記コポリマーは、前記アデノウイルスと非共有結合錯体を形成する、生理学的製剤。
【請求項８５】
Ｑが式ＩＩａであり、ｈが０であり、ＺがＯであり、前記モノマーは、
ａ）式ＩＩＩ（式中、ａは１〜１０の整数であり、ｂは１〜１０の整数である）の構造を有するモノマーを少なくとも１個と、
ｂ）式ＩＶ（式中、ｃは１〜１０の整数である）の構造を有するモノマーを少なくとも１個とを含み、
前記モノマーの少なくとも１０％は、式ＩＸ（式中、ｎは２〜２，０００の整数であり、ｐは１〜８の整数であり、Ｒ２は、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換３〜７員シクロアルキル、置換または非置換５〜７員ヘテロシクロアルキル、置換または非置換アリールおよび置換または非置換ヘテロアリールから選択される基である）の構造で置換されており、
前記コポリマーは交差重合を含まず、前記コポリマー中の少なくとも１個の窒素原子がプラスに帯電している、請求項８４に記載の生理学的製剤。
【請求項８６】
ｐが２であり、ａが２であり、ｂが２であり、ｃが２であり、Ｒ２がメチルである、請求項８５に記載の生理学的製剤。
【請求項８７】
Ｑが式ＩＩａであり、ｈが０であり、ＺがＯであり、前記モノマーが、式Ｖ〔式中、前記モノマーの少なくとも１０％が、式ＩＸ（式中、ｎは２〜２，０００の整数であり、ｐは１〜８の整数であり、Ｒ２は、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換３〜７員シクロアルキル、置換または非置換５〜７員ヘテロシクロアルキル、置換または非置換アリールおよび置換または非置換ヘテロアリールから選択される基である）の構造で置換されている〕の構造を含み、
前記コポリマーは交差重合を含まず、前記コポリマー中の少なくとも１個の窒素原子がプラスに帯電している、請求項８４に記載の生理学的製剤。
【請求項８８】
ｐが２であり、Ｒ２がメチルである、請求項８７に記載の生理学的製剤。
【請求項８９】
Ｑが式ＩＩａであり、ｈが１であり、ＺがＮＨであり、前記モノマーが、式ＶＩ〔式中、Ｒ３は、前記モノマーの３個のうちの２個についてはＨであり、前記モノマーの３個のうちの１個については、Ｒ３は−（ＣＨ２ＣＨ２）ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ３）２および−（ＣＨ２ＣＨ２）Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ３）２から選択される基であり、Ｑで置換されているモノマーの割合は少なくとも１０％であり、Ｑは、式Ｘ（式中、ｎは２〜２，０００の整数であり、ｐは１〜８の整数であり、ｆは０であり、Ｒ２は、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換３〜７員シクロアルキル、置換または非置換５〜７員ヘテロシクロアルキル、置換または非置換アリールおよび置換または非置換ヘテロアリールから選択される基である）の構造を有している〕の構造を含み、
前記コポリマーは交差重合を含まず、前記コポリマー中の少なくとも１個の窒素原子がプラスに帯電している、請求項８４に記載の生理学的製剤。
【請求項９０】
ｐが２であり、Ｒ２がメチルである、請求項８９に記載の生理学的製剤。
【請求項９１】
Ｑが式ＩＩａであり、ｈが１であり、ＺがＮＨであり、前記モノマーが、式ＶＩ〔式中、Ｒ３は、前記モノマーの３個のうちの２個についてはＨであり、前記モノマーの３個のうちの１個については、Ｒ３は−（ＣＨ２ＣＨ２）ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ３）２および−（ＣＨ２ＣＨ２）Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ３）２から選択される基であり、Ｑで置換されているモノマーの割合は少なくとも１０％であり、Ｑは、式Ｘ（式中、ｎは２〜２，０００の整数であり、ｐは１〜８の整数であり、ｆは１であり、Ｒ４は式ＸＩの構造を有し、ｇは４であり、Ｒ２は、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換３〜７員シクロアルキル、置換または非置換５〜７員ヘテロシクロアルキル、置換または非置換アリールおよび置換または非置換ヘテロアリールから選択される基である）の構造を有している〕の構造を含み、
前記コポリマーは交差重合を含まず、前記コポリマー中の少なくとも１個の窒素原子がプラスに帯電している、請求項８４に記載の生理学的製剤。
【請求項９２】
ｐが２であり、Ｒ２がメチルである、請求項９１に記載の生理学的製剤。
【請求項９３】
Ｑが式ＩＩｂであり、前記コポリマーが、
ａ）式ＶＩ（式中、Ｒ３はＨ、−（ＣＨ２ＣＨ２）ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ３）２および−（ＣＨ２ＣＨ２）Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ３）２から選択される基である）の構造を含むモノマーを少なくとも１個と、
ｂ）式ＶＩＩの構造を含むモノマーを少なくとも１個とを含み、
Ｑで置換されているモノマーの割合が少なくとも１０％で、Ｑは、式ＸＩＩ（式中、ｎは２〜２，０００の整数であり、ｐは１〜８の整数であり、Ｒ２は、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換３〜７員シクロアルキル、置換または非置換５〜７員ヘテロシクロアルキル、置換または非置換アリールおよび置換または非置換ヘテロアリールから選択される基である）の構造を有し、
前記コポリマーは交差重合を含まず、前記コポリマー中の少なくとも１個の窒素原子がプラスに帯電している、請求項８４に記載の生理学的製剤。
【請求項９４】
ｐが２であり、Ｒ２がメチルである、請求項９３の生理学的製剤。
【請求項９５】
コポリマーとアデノウイルスとを含むキットであって、前記コポリマーとアデノウイルスとは非共有結合的に結合し、前記コポリマーは、式Ｉ：
【化１６Ｂ】
0004701169.tif 000046
〔式中、ｍは１〜１，０００の整数であり、ｉは２〜ｍの整数であってＸｉの位置を示し、Ｘ１、ＸｉおよびＸｍ＋１は独立して選択されたモノマーであり、前記モノマーは、（ｉ）第二級アミン類および第三級アミン類から選択されるアミンを含み、かつ（ｉｉ）少なくとも１つのモノマーはＱを含み、前記Ｑは、式ＩＩａおよび式ＩＩｂ：
【化１７】
0004701169.tif 000047
（式中、Ｚは、ＯおよびＮＨからなる群から選択され、ｈは０または１の整数であり、Ｒ１は、ポリアルキレングリコール部位を含む）から選択される構造である〕の構造を含み、
前記コポリマーは、交差重合を含まず、前記少なくとも１個の窒素原子がプラスに帯電しており、前記コポリマーは、１２５ｋＤａと１５０ｋＤａとの間の平均分子量を有し、かつ、前記コポリマーの前記アデノウイルスに対する比率は、３，５００：１〜３０，０００：１である、キット。
【請求項９６】
Ｑが式ＩＩａであり、ｈが０であり、ＺがＯであり、前記モノマーは、
ａ）式ＩＩＩ（式中、ａは１〜１０の整数であり、ｂは１〜１０の整数である）の構造を有するモノマーを少なくとも１個と、
ｂ）式ＩＶ（式中、ｃは１〜１０の整数である）の構造を有するモノマーを少なくとも１個とを含み、
前記モノマーの少なくとも１０％は、式ＩＸ（式中、ｎは２〜２，０００の整数であり、ｐは１〜８の整数であり、Ｒ２は、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換３〜７員シクロアルキル、置換または非置換５〜７員ヘテロシクロアルキル、置換または非置換アリールおよび置換または非置換ヘテロアリールから選択される基である）の構造で置換されており、
前記コポリマーは交差重合を含まず、前記コポリマー中の少なくとも１個の窒素原子がプラスに帯電している、請求項９５に記載のキット。
【請求項９７】
ｐが２であり、ａが２であり、ｂが２であり、ｃが２であり、Ｒ２がメチルである、請求項９６に記載のキット。
【請求項９８】
Ｑが式ＩＩａであり、ｈが０であり、ＺがＯであり、前記モノマーが、式Ｖ〔式中、前記モノマーの少なくとも１０％が、式ＩＸ（式中、ｎは２〜２，０００の整数であり、ｐは１〜８の整数であり、Ｒ２は、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換３〜７員シクロアルキル、置換または非置換５〜７員ヘテロシクロアルキル、置換または非置換アリールおよび置換または非置換ヘテロアリールから選択される基である）の構造で置換されている〕の構造を含み、
前記コポリマーは交差重合を含まず、前記コポリマー中の少なくとも１個の窒素原子がプラスに帯電している、請求項９５に記載のキット。
【請求項９９】
ｐが２であり、Ｒ２がメチルである、請求項９８に記載のキット。
【請求項１００】
Ｑが式ＩＩａであり、ｈが１であり、ＺがＮＨであり、前記モノマーが、式ＶＩ〔式中、Ｒ３は、前記モノマーの３個のうちの２個についてはＨであり、前記モノマーの３個のうちの１個については、Ｒ３は−（ＣＨ２ＣＨ２）ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ３）２および−（ＣＨ２ＣＨ２）Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ３）２から選択される基であり、Ｑで置換されているモノマーの割合は少なくとも１０％であり、Ｑは、式Ｘ（式中、ｎは２〜２，０００の整数であり、ｐは１〜８の整数であり、ｆは０であり、Ｒ２は、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換３〜７員シクロアルキル、置換または非置換５〜７員ヘテロシクロアルキル、置換または非置換アリールおよび置換または非置換ヘテロアリールから選択される基である）の構造を有している〕の構造を含み、
前記コポリマーは交差重合を含まず、前記コポリマー中の少なくとも１個の窒素原子がプラスに帯電している、請求項９５に記載のキット。
【請求項１０１】
ｐが２であり、Ｒ２がメチルである、請求項１００に記載のキット。
【請求項１０２】
Ｑが式ＩＩａであり、ｈが１であり、ＺがＮＨであり、前記モノマーが、式ＶＩ〔式中、Ｒ３は、前記モノマーの３個のうちの２個についてはＨであり、前記モノマーの３個のうちの１個については、Ｒ３は−（ＣＨ２ＣＨ２）ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ３）２および−（ＣＨ２ＣＨ２）Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ３）２から選択される基であり、Ｑで置換されているモノマーの割合は少なくとも１０％であり、Ｑは、式Ｘ（式中、ｎは２〜２，０００の整数であり、ｐは１〜８の整数であり、ｆは１であり、Ｒ４は式ＸＩの構造を有し、ｇは４であり、Ｒ２は、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換３〜７員シクロアルキル、置換または非置換５〜７員ヘテロシクロアルキル、置換または非置換アリールおよび置換または非置換ヘテロアリールから選択される基である）の構造を有している〕の構造を含み、
前記コポリマーは交差重合を含まず、前記コポリマー中の少なくとも１個の窒素原子がプラスに帯電している、請求項９５に記載のキット。
【請求項１０３】
ｐが２であり、Ｒ２がメチルである、請求項１０２に記載のキット。
【請求項１０４】
Ｑが式ＩＩｂであり、前記コポリマーが、
ａ）式ＶＩ（式中、Ｒ３はＨ、−（ＣＨ２ＣＨ２）ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ３）２および−（ＣＨ２ＣＨ２）Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ３）２から選択される基である）の構造を含むモノマーを少なくとも１個と、
ｂ）式ＶＩＩの構造を含むモノマーを少なくとも１個とを含み、
Ｑで置換されているモノマーの割合が少なくとも１０％で、Ｑは、式ＸＩＩ（式中、ｎは２〜２，０００の整数であり、ｐは１〜８の整数であり、Ｒ２は、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換３〜７員シクロアルキル、置換または非置換５〜７員ヘテロシクロアルキル、置換または非置換アリールおよび置換または非置換ヘテロアリールから選択される基である）の構造を有し、
前記コポリマーは交差重合を含まず、前記コポリマー中の少なくとも１個の窒素原子がプラスに帯電している、請求項９５に記載のキット。
【請求項１０５】
ｐが２であり、Ｒ２がメチルである、請求項１０４に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の背景）
（関連出願への相互参照）
本願は、２００３年６月３０日に出願した米国特許出願第６０／４８４，０６０号の利益を主張し、これら全ては参考として本明細書中に組み込まれる。
【０００２】
（連邦政府により支援された研究開発の下でなされた発明に対する権利に関する陳述）
適用なし。
【０００３】
（コンパクトディスクで提出した「配列表」、表、またはコンピュータプログラムを列挙した付録に対する参照）
適用なし。
【背景技術】
【０００４】
（発明の背景）
組換えアデノウイルスは、多種多様な増殖性および非増殖性細胞に遺伝子を送達することができるため、遺伝子治療においてベクターとして頻繁に使われている。しかし、アデノウイルスの全身送達は、例えば、血中半減期が短いこと（Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙら、Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｓｃｉ．６５：２６６−２７５（２００２）；Ａｌｅｍａｎｙら、Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．８１：２６０５−２６０９（２０００））、細網内皮組織（ＲＥＳ）による消失（Ｚｉｅｇｌｅｒら、ＨｕｍＧｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１３：９３５−９４５（２００２）；Ｔａｏら、Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．３：２８−３５（２００１））、先天性免疫応答の誘発（Ｚｈａｎｇら、Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．３：６９７−７０７（２００１）；Ｓｃｈｎｅｌｌら、Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．３：７０８−７２２（２００１））、未検出の抗体による中和反応（Ｒａｈｍａｎら、Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．３：７６８−７７８（２００１））、およびある組織および細胞タイプのアデノウイルス亜型の本来の親和性（Ｂｅｒｇｅｌｓｏｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５７：９７５−９７９（１９９９））など、いくつかの困難に直面する。さらに、アデノウイルスは強い体液性免疫応答を誘発するので、繰り返し投与するのは難しい（Ｒａｈｍａｎら、Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．３：７６８−７７８（２００１））。
【０００５】
これらの問題のいくつかを解決するために、例えば、ＰＥＧ（Ｏ’Ｒｉｏｒｄａｎら、Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１０：１３４９−１３５８（１９９９）；Ｃｒｏｙｌｅら、Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１１：１７１３−１７２２（２０００））またはｐＨＰＭＡ（Ｆｉｓｈｅｒら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．８：３４１−３４８（２００１））のような親水性ポリマーのアデノウイルスカプシドへの共有結合を使用して、繊維を遺伝的に再設計することによってウイルス表面を変化させたり（Ｈｉｄａｋａら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．１０３：５７９−５８７（１９９９））、ｒＡｄをカプセル化してリポソームにしたりする（Ｙｏｔｎｄａら、Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．５：２３３−２４１（２００２））者もいる。アデノウイルス表面を親水性ポリマー（例えば、ＰＥＧ）で修飾するやり方は、循環半減期が増大し、免疫原性が低下し、溶解性が上がり、インビボ生物活性が適切になることで、ＰＥＧでの共有結合修飾により酵素の治療有効性が改善されるという既知の発見に基づいている（Ｈａｒｒｉｓら、Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ．４０：５３９−５５１（２００１）；Ｗａｎｇら、Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ．５４：５４７−５７０（２００２））。
【０００６】
アデノウイルスとカプセル化するポリマーとの共有結合は、さらなる精製工程を必要とし、その後の化学収率が低下する。さらに、ＰＥＧを共有結合させた場合、アデノウイルスの感染力は通常低下する（Ｏ’Ｒｉｏｒｄａｎら、Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１０：１３４９−１３５８（１９９９）；Ｃｒｏｙｌｅら、Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１１：１７１３−１７２２（２０００））。本発明はこのおよび他の問題を解決するためになされた。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の開示）
本発明は、コポリマーとアデノウイルスとの非共有結合錯体を規定する。ＰＥＩ、ポリリジン、ＤＥＡＥ−デキストランおよびその誘導体のようなカチオンポリマーと、ＰＥＧおよびその誘導体のような非イオン性ポリマーとの組合せであるコポリマーは、細胞中のアデノウイルスの送達および導入遺伝子発現の両方を良好にすることができる。本発明の錯体は、カプセル化されていないアデノウイルスよりさらに治療的に効果があり、容易に製造できる材料を提供する。
【０００８】
第一の態様において、本発明は、コポリマーと非共有結合的に錯化されたアデノウイルスを含む錯体を提供する。前記コポリマーは、式Ｉ：
【０００９】
【化１８】
0004701169.tif 000002
（式中、ｍは１〜１，０００の整数である）で表される構造を含む。記号ｉは、２〜ｍの整数であり、Ｘｉの位置を示す。記号Ｘ１、ＸｉおよびＸｍ＋ｌは、独立して、次の要件を満たすモノマーから選択される。すなわち、該モノマーは、（ｉ）第二アミン類および第三アミン類から選択されるアミンを含み、かつ（ｉｉ）少なくとも１つのモノマーはＱを含む。Ｑは、式ＩＩａおよび式ＩＩｂ：
【００１０】
【化１９】
0004701169.tif 000003
（式中、Ｚは、ＯおよびＮＨからなる群から選択される）から選択される構造である。記号ｈは、０〜１の整数である。記号Ｒ１は、ポリアルキレングリコール部位を含む。また、本発明のコポリマーは、交差重合を含まず、生理的ｐＨでコポリマー中の少なくとも１個の窒素原子がプラスに帯電している。
【００１１】
第二の態様において、式Ｉのコポリマーは、非共有結合的に錯化したアデノウイルスコポリマー錯体を生成する方法に関与する。
【００１２】
第三の態様において、式Ｉのコポリマーは、アデノウイルスを細胞に導入する方法に関与する。この方法において、（ａ）アデノウイルスは非共有結合的にコポリマーに接触させられ、（ｂ）錯体は細胞に接触させられる。
【００１３】
第四の態様において、本発明は、（ａ）式Ｉのコポリマーと、（ｂ）非共有結合的錯体を形成するアデノウイルスと、（ｃ）生理学的に許容しうる賦形剤とを含む生理学的製剤提供する。
【００１４】
第五の態様において、本発明は、式Ｉのコポリマーとアデノウイルスとを含み、前記コポリマーと前記アデノウイルスとは非共有結合的に結合しているキットを提供する。
【００１５】
本発明の他の態様および実施形態は、以下の詳細な記載により明らかになるであろう。
【００１６】
（定義）
別段の定義がない限り、本明細書で使用されている全ての技術用語および科学用語は、通常、本発明が属する業界の当業者によって普通に理解されている意味と同じ意味を持つ。通常、本明細書で使用されている学名、ならびに以下に記載される細胞培養、分子遺伝学、有機合成、分析化学ならびに核酸化学およびハイブリダイゼーションにおける実験室法は、業界でよく知られかつ一般的に用いられているものである。技術および技法は、通常、業界における従来の方法およびこの明細書を通して挙げられる種々の一般的参照文献（一般的には、Ｋｎｉｐｅら、ＦＩＥＬＤＳ  ＶＩＲＯＬＯＧＹ，４ｔｈ  ｅｄ．（２００１）Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，を参照。これらは参考として本明細書に組み込まれる）に従って行われる。標準的な技術またはその変型が化学合成および分析のために使用される。
【００１７】
「核酸」は、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよびそのポリマーを言い、一本鎖型でも二本鎖型でもよい。これは遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドという語句を包含する。またこの語句は、修飾骨格残基または結合を有する合成の、自然発現の、および非自然発現のヌクレオチド類似体も包含する。これらのヌクレオチド類似体は、参照核酸と似た結合特性を持ち、あるいは、参照ヌクレオチドと似た方法で代謝する。このような類似体の例として、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、ホスホン酸メチル、キラルメチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボリボヌクレオチド、ペプチド−核酸（ＰＮＡ）挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００１８】
他に断らない限り、特定の核酸配列は、暗黙のうちに保存的に修飾された変異体（例えば、縮重コドン置換）および相補的な配列、さらに明示的に示された配列も包含する。具体的には、縮重コドン置換は、１またはそれ以上（または全て）のコドンの３文字目を混合基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列（Ｂａｔｚｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａら、Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ  ２６０：２６０５−２６０８（１９８５）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ８：９１−９８（１９９４））を産生することによって達成してもよい。
【００１９】
語句「細胞に接触」とは、本発明のアデノウイルスまたは錯体の細胞内への内部移行を言う。この語句は、例えば、ウイルスや錯体を静脈内投与や経口投与を経て、細胞内へ内部移行することを包含する。
【００２０】
語句「アデノウイルス」は、一般的に、アデノウイルスゲノムの全てまたは一部を含むポリヌクレオチドを含む。「アデノウイルス」は、ヒト、ウシ、ヒツジ、ウマ、イヌ、ブタ、マウス、およびサルアデノウイルス亜属を始めとするマストアデノウイルス属の動物アデノウイルスをまとめて言うが、これらの例示に限定されるものではない。特に、ヒトアデノウイルスとして、Ａ〜Ｆ亜属、これらの個々のセロタイプが挙げられ、個々のセロタイプおよびＡ〜Ｆ亜属として、ヒトアデノウイルス１型、２型、３型、４型、４ａ型、５型、６型、７型、８型、９型、１０型、１１（Ａｄ１１ＡおよびＡｄ１１Ｐ）型、１２型、１３型、１４型、１５型、１６型、１７型、１８型、１９型、１９ａ型、２０型、２１型、２２型、２３型、２４型、２５型、２６型、２７型、２８型、２９型、３０型、３１型、３２型、３３型、３４型、３４ａ型、３５型、３５ｐ型、３６型、３７型、３８型、３９型、４０型、４１型、４２型、４３型、４４型、４５型、４６型、４７型、４８および９１型が挙げられるが、これらに限定されない。本発明において有用なウシアデノウイルスとして、ウシアデノウイルス１型、２型、３型、４型、７型、および１０型が挙げられるが、これらに限定されない。イヌアデノウイルスとして、イヌ１型および２型が挙げられるが、これらに限定されない。興味深いウマアデノウイルスとして、ウマ１型および２型が挙げられるがこれらに限定されない。興味深いブタアデノウイルスとして、例えば、ブタ３型および４型が挙げられる。また、「アデノウイルス」は、核酸の欠失、挿入または突然変異から生成されるもののような、組換えアデノウイルスをまとめて言う。また、組換えアデノウイルスは、異なったセロタイプまたは亜属由来のＤＮＡを結合することから生成することもできる。
【００２１】
ここで使用される語句「非共有結合的」とは、イオン結合、静電的相互作用、水素結合、親水性−親水性相互作用、疎水性−疎水性相互作用、ファンデルワールス相互作用、あるいはこれらの組合せを介して物質同士が結合することを意味する。
【００２２】
ここで使用される語句「ポリマー」とは、通常、１００万までの繰り返し結合モノマーからなる高分子量の天然および合成化合物を言う。各モノマーは、比較的軽く簡単な分子である。
【００２３】
ここで使用される語句「ホモポリマー」とは、単一のタイプのモノマーから誘導されるポリマーを言う。
【００２４】
ここで使用される「コポリマー」とは、２種またはそれ以上の非類似のモノマーの併発重合によって製造されるポリマーを言う。
【００２５】
ここで使用される「交差重合」とは、ポリアルキレングリコール分子の対向端への２種またはそれ以上のポリアルキレンイミン部位の共有結合を言う。
【００２６】
置換基が従来の化学式によって記載されている場合、すなわち、左から右へ書かれている場合、それらの構造が右から左へ書かれたものもそれらと同じものとして包含される。例えば、−ＣＨ２Ｏ−は−ＯＣＨ２−と同じである。
【００２７】
それ自身または他の置換基における一部としての語句「アルキル」は、他に記載がない限り、直鎖または分岐鎖の、または環式の炭化水素基、またはこれらの組合せを意味し、これらは完全に飽和であっても、モノまたはポリ不飽和であってもよく、指定された炭素数を持つ（例えば、Ｃ１−Ｃ１０は１〜１０個の炭素を意味する）二価および多価の基を含み得る。飽和炭化水素基の例示として、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、シクロヘキシル、（シクロヘキシル）メチル、シクロプロピルメチルなどの基、例えば、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチルなどの同族体および異性体などが挙げられるが、これらに限定されない。不飽和アルキル基は、１またはそれ以上の二重結合または三重結合をもつ基である。不飽和アルキル基の例示として、ビニル、２−プロペニル、クロチル、２−イソペンテニル、２−（ブタジエニル）、２，４−ペンタジエニル、３−（１，４−ペンタジエニル）、エチニル、１−および３−プロピニル、３−ブチニル、および高級同族体および異性体が挙げられるが、これらに限定されない。語句「アルキル」は、他に断らない限り、「ヘテロアルキル」のような、以下でさらに詳しく定義するアルキル誘導体も含む。炭化水素基に限定されるアルキル基は、「ホモアルキル」と命名される。
【００２８】
それ自身または他の置換基における一部としての語句「アルキレン」は、アルカンから誘導される二価の基を意味し、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−が挙げられるが、これに限定されない。さらに、ヘテロアルキレンのような、以下で記載する基も含む。本発明において、アルキル（またはアルキレン）基は、通常１〜２４個の炭素原子を有し、１０個以下の炭素原子を有するのが好ましい。「低級アルキル」または「低級アルキレン」とは、短いアルキルまたはアルキレン鎖の基であり、一般的に８個以下の炭素原子を有する。
【００２９】
語句「アルコキシ」、「アルキルアミノ」および「アルキルチオ」（またはチオアルコキシ）は、慣用的意味で使用され、それぞれ、酸素原子、アミノ基またはイオウ原子を介して分子の残りの部分に結合するアルキル基を言う。
【００３０】
それ自身または他の語句と組み合わせての語句「ヘテロアルキル」は、他に記載がない限り、指定された数の炭素と、Ｏ、Ｎ、ＳｉおよびＳからなる群から選択される少なくとも１個のヘテロ原子とを有する、安定な直鎖または分岐鎖の、または環式の炭化水素基、またはその組み合わせを言い、これらの窒素原子およびイオウ原子は、場合によっては酸化されていてもよく、窒素ヘテロ原子は場合によっては、四級化されていてもよい。ヘテロ原子Ｏ、Ｎ、ＳおよびＳｉはヘテロアルキル基のどの内部位置に位置していてもよく、あるいはアルキル基が分子の残りの部分と結合している位置に位置していてもよい。これらの例示として、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ３、−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２、−Ｓ（Ｏ）−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ（Ｏ）２−ＣＨ３、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｏ−ＣＨ３、−Ｓｉ（ＣＨ３）３、−ＣＨ２−ＣＨ＝Ｎ−ＯＣＨ３、および−ＣＨ＝ＣＨ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ３が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、−ＣＨ２−ＮＨ−ＯＣＨ３および−ＣＨ２−Ｏ−Ｓｉ（ＣＨ３）３のように、２個までのヘテロ原子が連続して存在してもよい。同様に語句「ヘテロアルキレン」は、それ自身または他の置換基の一部として、ヘテロアルキルから誘導される二価の基を意味し、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−および−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２−が例示されるが、これらに限定されない。ヘテロアルキレン基では、ヘテロ原子が鎖の一末端または両端を占めることもできる（例えば、アルキレンオキシ、アルキレンジオキシ、アルキレンアミノ、アルキレンジアミノなど）。さらに、アルキレン結合基およびヘテロアルキレン結合基では、結合基の向きが該結合基の式が記載された方向によって決まることはない。例えば、式：−Ｃ（Ｏ）２Ｒ’−は、−Ｃ（Ｏ）２Ｒ’−も−Ｒ’Ｃ（Ｏ）２−も両方表す。
【００３１】
それ自身または他の語句と組み合わせての語句「シクロアルキル」および「ヘテロシクロアルキル」は、他に記載がない限り、それぞれ「アルキル」および「ヘテロアルキル」の環状の変形体を表す。したがって、シクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルは、飽和および不飽和環状結合基を含む。さらに、ヘテロシクロアルキルは、ヘテロ環が分子の残りの部分に結合している位置をヘテロ原子が占めることもできる。シクロアルキルの例示として、シクロペンチル、シクロヘキシル、１−シクロヘキセニル、３−シクロヘキセニル、シクロヘプチルなどが挙げられるが、これらに限定されない。ヘテロシクロアルキルの例示として、１−（１，２，５，６−テトラヒドロピリジル）、１−ピペリジニル、２−ピペリジニル、３−ピペリジニル、４−モルフォリニル、３−モルフォリニル、テトラヒドロフラン−２−イル、テトラヒドロフラン−３−イル、テトラヒドロチエン−２−イル、テトラヒドロチエン−３−イル、１−ピペラジニル、２−ピペラジニルなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３２】
本明細書において、語句「ポリアルキレングリコール」は、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリブチレングリコールおよびこれらの誘導体を言う。ポリアルキレングリコール誘導体の例示的な実施形態として、アジペートジヒドラジド−メトキシ−ポリエチレングリコールがある。他の例示的な実施形態として、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのカタログ”Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｇｌｙｃｏｌ  ａｎｄ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”（２００１）に列挙されたものがある。
【００３３】
語句「アリール」は、他に記載がない限り、ポリ不飽和芳香族炭化水素置換基を意味し、これは、単環または複数の環（好ましくは１〜３環）であり、互いに縮合あるいは共有結合で結合している。語句「ヘテロアリール」は、Ｎ、ＯおよびＳから選択される１〜４個のヘテロ原子を含むアリール基（または環）であって、該基中、窒素原子およびイオウ原子は、場合によっては、酸化されていてもよく、窒素原子は、場合によっては、四級化されていてもよいものを言う。ヘテロアリール基は、ヘテロ原子を介して分子の残りの部分に結合することができる。アリール基およびヘテロアリール基の限定ではない例示として、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、４−ビフェニル、１−ピロリル、２−ピロリル、３−ピロリル、３−ピラゾリル、２−イミダゾリル、４−イミダゾリル、ピラジニル、２−オキサゾリル、４−オキサゾリル、２−フェニル−４−オキサゾリル、５−オキサゾリル、３−イソキサゾリル、４−イソキサゾリル、５−イソキサゾリル、２−チアゾリル、４−チアゾリル、５−チアゾリル、２−フリル、３−フリル、２−チエニル、３−チエニル、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２−ピリミジル、４−ピリミジル、５−ベンゾチアゾリル、プリニル、２−ベンズイミダゾリル、５−インドリル、１−イソキノリル、５−イソキノリル、２−キノキサリニル、５−キノキサリニル、３−キノリルおよび６−キノリルが挙げられる。上記したアリール環およびヘテロアリール環の各環の置換基は、以下に記載する許容しうる置換基の群から選ばれる。
【００３４】
簡略化するために、他の語句と組み合わせて用いる時の語句「アリール」（例えば、アリールオキシ、アリールチオキシ、アリールアルキル）は、上記したアリール環もヘテロアリール環も含む。したがって、語句「アリールアルキル」は、該基中のアリール基が、アルキル基に結合した基（例えば、ベンジル、フェネチル、ピリジルメチルなど）であって、前記アルキル基は、該基中の炭素原子（例えばメチレン基）が、例えば、酸素原子によって置き換えられているもの（例えば、フェノキシメチル、２−ピリジルオキシメチル、３−（１−ナフチルオキシ）プロピルなど）も含むことを意味する。
【００３５】
ここで使用される語句「オキソ」は、二重結合で炭素原子と結合する酸素を意味する。
【００３６】
上記の各語句（例えば、「アルキル」、「ヘテロアルキル」、「アリール」および「ヘテロアリール」）は、示された基の置換された、および置換されていない両方の形を含むことを意味する。各タイプの基の例示的な置換基は、以下に記載する。
【００３７】
アルキル基およびヘテロアルキル基（アルキレン、アルケニル、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルケニルおよびヘテロシクロアルケニルとしてしばしば記載される基も含まれる）の置換基として、−ＯＲ’、＝Ｏ、＝ＮＲ’、＝Ｎ−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ”、−ＳＲ’、−ハロゲン、−ＳｉＲ’Ｒ”Ｒ”’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯ２Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ”、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ”、−ＮＲ”Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ’−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ”、−ＮＲ”Ｃ（Ｏ）２Ｒ’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ”Ｒ”’）＝ＮＲ””、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ”）＝ＮＲ”’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ”、−ＮＲＳＯ２Ｒ’、−ＣＮおよび−ＮＯ２の種々の基の１またはそれ以上を挙げることができるが、これらに限定されない。その数は、０〜（２ｍ’＋１）（式中、ｍ’は該基中の炭素原子の総数である）の範囲である。Ｒ’、Ｒ”、Ｒ”’およびＲ””は、それぞれ独立して、水素、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換アリール、例えば１〜３個のハロゲンで置換されたアリール、置換または非置換アルキル、アルコキシ基またはチオアルコキシ基、またはアリールアルキル基を言う。本発明の化合物が複数のＲ基を含む場合は、例えば、これらの基の複数が存在する場合の各Ｒ’、Ｒ”、Ｒ”’、Ｒ””と同様に、各Ｒ基は独立して選択される。Ｒ’およびＲ”が同一の窒素原子に結合する場合、それらは窒素原子といっしょになって５−、６−または７−員環を形成することができる。例えば、−ＮＲ’Ｒ”は、１−ピロリジニルおよび４−モルフォリニル（これらに限定されない）を含むことを意味する。置換基に関する以上の検討から、当業者であれば、語句「アルキル」は、ハロアルキル（例えば、−ＣＦ３および−ＣＨ２ＣＦ３）およびアシル（例えば、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＦ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＯＣＨ３など）のような水素以外の基に結合する炭素原子を含む基を含むことを理解するであろう。
【００３８】
アルキル基で記載した置換基と同様に、アリール基およびヘテロアリール基の置換基も種々あり、例えば、ハロゲン、−ＯＲ’、＝Ｏ、＝ＮＲ’、＝Ｎ−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ”、−ＳＲ’、−ハロゲン、−ＳｉＲ’Ｒ”Ｒ”’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯ２Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ”、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ”、−ＮＲ”Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ’−Ｃ（Ｏ）ＮＲ”Ｒ”’、−ＮＲ”Ｃ（Ｏ）２Ｒ’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ”Ｒ”’）＝ＮＲ””、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ”）＝ＮＲ”’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ”、−ＮＲＳＯ２Ｒ’、−ＣＮおよび−ＮＯ２、−Ｒ’、−Ｎ３、−ＣＨ（Ｐｈ）２、フルオロ（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシおよびフルオロ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルから選択される。その数は、０から芳香族環上の開放原子価の総数の範囲であり、Ｒ’、Ｒ”、Ｒ”’およびＲ””は、独立して水素、アルキル、ヘテロアルキル、アリールおよびヘテロアリールから選ばれる。本発明の化合物が複数のＲ基を含む場合は、例えば、これらの基の複数が存在する場合の各Ｒ’、Ｒ”、Ｒ”’、Ｒ””と同様に、各Ｒ基は独立して選択される。
【００３９】
アリールまたはヘテロアリール環の隣り合った原子上の２個の置換基は、場合によっては、式：−Ｔ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＲＲ’）ｑ−Ｕ−（式中、ＴおよびＵは、独立して、−ＮＲ−、−Ｏ−、−ＣＲＲ’−または単結合であり、ｑは０〜３の整数である）の置換基で置き換えられてもよい。あるいは、アリールまたはヘテロアリール環の隣り合った原子上の２個の置換基は、場合によっては、式：−Ａ−（ＣＨ２）ｒ−Ｂ−（式中、ＡおよびＢは、独立して、−ＣＲＲ’−、−Ｏ−、−ＮＲ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’−または単結合であり、ｒは１〜４の整数である）の置換基で置き換えられてもよい。そのように形成された新しい環の単結合の１つは、場合によっては、二重結合と置き換わってもよい。あるいは、アリールまたはヘテロアリール環の隣り合った原子上の２個の置換基は、場合によっては、式：−（ＣＲＲ’）ｓ−Ｘ−（ＣＲ”Ｒ”’）ｄ−（式中、ｓおよびｄは、独立して、０〜３の整数であり、Ｘは−Ｏ−、−ＮＲ’−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−または−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’−である）の置換基で置き換えられてもよい。置換基Ｒ、Ｒ’、Ｒ”およびＲ”’は、独立して、水素または置換もしくは非置換（Ｃ１−Ｃ６）アルキルから選択されるのが好ましい。
【００４０】
ここで使用される語句「ヘテロ原子」は、酸素（Ｏ）、窒素（Ｎ）、イオウ（Ｓ）およびケイ素（Ｓｉ）を含むことを意味する。
【００４１】
化合物の中性の形は、塩基または酸に塩が接触し、従来の方法で親化合物を分離することによって再生されることが好ましい。該親化合物は、極性溶剤中の溶解性のようなある物性に関し、種々の塩の形のものとは相違する。
【００４２】
本発明は、塩の形のものに加えて、プロドラッグの形の化合物も提供する。ここで記載する化合物のプロドラッグは、生理学的条件下で容易に化学反応を起こし、本発明の化合物を提供する化合物である。さらにプロドラッグは、エキソビボ環境で化学的または生化学的方法によって本発明の化合物に変換することができる。
【００４３】
ここで使用される語句「環」は、場合によってはその構成配置内にヘテロ原子を有する原子の環状構成配置を意味する。環は、置換または非置換シクロアルキル、置換または非置換ヘテロシクロアルキル、置換または非置換アリールおよび置換または非置換ヘテロアリールのような芳香族および非芳香族部位を含む。環中の原子の数は、通常、環を構成する員数によって規定される。例えば「５〜７員環」は、構成配置内に５〜７個の原子があることを意味する。各構成員は、場合によっては、ヘテロ原子であることもある。したがって、語句「５〜７員環」は、例えば、ピリジニル環、ピペリジニル環およびチアゾリル環を含む。環は、通常、添え字付きの括弧内に単一の明示的な置換基によって描かれる。添え字は通常１〜１０のような一連の整数を表す。該整数は、各置換基は場合によっては異なっていることもある環置換基の数を表す。例えば、置換基（Ｒ１）Ｓ（式中、ｓは２である）では、該環は、置換または非置換アルキルおよび置換または非置換ヘテロアルキルで置換されていてもよい。
【００４４】
ここで使用される語句「ポリ（多）」は、少なくとも２であることを意味する。例えば、多価金属イオンは少なくとも２価の金属イオンを意味する。
【００４５】
「部位」は、他の構造に結合する分子の基を言う。
【００４６】
記号
【００４７】
【化２０】
0004701169.tif 000004
は、それが結合として利用されていても結合に対して垂直に表示されていても、該表示部位が分子の残りの部分に結合している位置を示す。
【００４８】
本発明のある化合物は、不斉炭素原子（光学中心）または二重結合を有し、ラセミ体、ジアステレオマー、幾何異性体、および単一の異性体も本発明の範囲内に包含される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４９】
（発明の詳細な説明）
（Ｉ．序論）
本発明は、ウイルス粒子を非共有結合的にカプセル化し、錯体を形成するコポリマーに関する。該錯体は、容易に製造され（例えば、ウイルスとポリマーとを混合することによって）、細胞内で核酸を発現するために使用することができる。共有結合的に結合しているポリマーとは対照的に、アデノウイルスのような錯体生物学的材料の化学的修飾を必要とせず、それによって、発生可能な反応生成物の大きな特性確認を避けることができる。核酸の細胞への導入は、例えば、治療目的あるいは診断目的（例えば、レポーター遺伝子を使用すること）に有用である。例えば、数種の実験的癌治療にアデノウイルスまたはアデノウイルスベクターの多種の態様が利用されている。例えば、米国特許第５，８４６，９４５号、第５，８０１，０２９号、ＰＣＴ／ＵＳ９９／０８５９２号、米国特許第５，７４７，４６９号、ＰＣＴ／ＵＳ９８／０３５１４号およびＰＣＴ／ＵＳ９７／２２０３６号を参照。本発明のウイルス／ポリマー錯体は、インビトロ、インビボ、またはエキソビボのどの形態においても、興味深い核酸を異なるタイプの細胞に移動させるために使用することができる。
【００５０】
（ＩＩ．組成）
（Ａ．コポリマー）
第一の態様で、本発明は、コポリマーに非共有結合的に錯化したアデノウイルスを含む錯体を提供する。コポリマーは、式Ｉ：
【００５１】
【化２１】
0004701169.tif 000005
（式中、ｍは、１〜１，０００の整数である）の構造を含む。記号ｉは２〜ｍの整数であり、Ｘｉの位置を示す。記号Ｘ１、ＸｉおよびＸｍ＋１は、独立して、次の要件を満たすモノマーから選択される。すなわち、該モノマーは、（ｉ）第二アミン類および第三アミン類から選択されるアミンを含み、かつ（ｉｉ）該モノマーの少なくとも１つはＱを含む。Ｑは、式ＩＩａおよび式ＩＩｂ：
【００５２】
【化２２】
0004701169.tif 000006
（式中、Ｚは、ＯおよびＮＨからなる群から選択される）から選択される構造である。記号ｈは、０〜１の整数である。記号Ｒ１は、ポリアルキレングリコール部位を含む。また、本発明のコポリマーは、交差重合を含まず、生理的ｐＨでコポリマー中の少なくとも１個の窒素原子がプラスに帯電している。
【００５３】
例示的な実施形態において、前記モノマーの少なくとも１つはさらに、−ＮＨ２および−ＯＨから選択される化学的部位を含む。Ｑが式ＩＩａから選択される場合は、少なくとも１個のＱは、窒素および酸素から選択される原子を介して前記モノマーに共有結合で結合している。Ｑが式ＩＩｂから選択される場合は、少なくとも１個のＱは、炭素原子を介して前記モノマーに共有結合で結合している。
【００５４】
例示的な実施形態としては、Ｑは式ＩＩａであり、ｈは０であり、ＺはＯであり、前記モノマーは式ＩＩＩ：
【００５５】
【化２３】
0004701169.tif 000007
（式中、ａは１〜１０の整数であり、ｂは１〜１０の整数である）の構造を含む。他の例示的な実施形態としては、Ｑは式ＩＩａであり、ｈは０であり、ＺはＯであり、前記モノマーは式ＩＶ：
【００５６】
【化２４】
0004701169.tif 000008
（式中、ｃは１〜１０の整数である）の構造を含む。さらに他の例示的な実施形態としては、Ｑは式ＩＩａであり、ｈは０であり、ＺはＯであり、前記コポリマーは、ａ）式ＩＩＩ（式中、ａは１〜１０の整数であり、ｂは１〜１０の整数である）の構造を持つモノマーを少なくとも１個と、ｂ）式ＩＶ（式中、ｃは１〜１０の整数である）の構造を持つモノマーを少なくとも１個有する。さらに他の例示的な実施形態としては、ａは２である。他の例示的な実施形態としては、ｂは２である。例示的な実施形態としては、ｃは２である。さらに他の例示的な実施形態としては、ａは３である。他の例示的な実施形態としては、ｂは３である。例示的な実施形態としては、ｃは３である。他の例示的な実施形態では、前記モノマーはエチレンイミンである。
【００５７】
例示的な実施形態としては、Ｑは式ＩＩａ（式中、ｈは０であり、ＺはＯである）であり、前記モノマーは式Ｖ：
【００５８】
【化２５】
0004701169.tif 000009
の構造を含む。他の例示的な実施形態では、前記モノマーはリジンである。
【００５９】
例示的な実施形態としては、Ｑは式ＩＩａ（式中、ｈは１であり、ＺはＮＨである）であり、前記モノマーは、式ＶＩ：
【００６０】
【化２６】
0004701169.tif 000010
（式中、Ｒ３はＨ、−（ＣＨ２ＣＨ２）ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ３）２および−（ＣＨ２ＣＨ２）Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ３）２から選択される基である）の構造を含む。他の例示的な実施形態では、Ｒ３は、前記モノマーの３個のうちの約２個についてはＨであり、前記モノマーの３個のうちの約１個については、Ｒ３は、−（ＣＨ２ＣＨ２）ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ３）２および−（ＣＨ２ＣＨ２）Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ３）２から選択される基である。他の例示的な実施形態では、前記モノマーはＤＥＡＥ−デキストランである。
【００６１】
例示的な実施形態において、Ｑは式ＩＩｂであり、前記コポリマーは、ａ）式ＶＩ（式中、Ｒ３はＨ、−（ＣＨ２ＣＨ２）ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ３）２および−（ＣＨ２ＣＨ２）Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ３）２から選択される基である）の構造を含むモノマーを少なくとも１個、およびｂ）式ＶＩＩ：
【００６２】
【化２７】
0004701169.tif 000011
の構造を含むモノマーを少なくとも１個を含む。他の例示的な実施形態において、Ｒ３は、前記モノマーの３個のうちの約２個についてはＨであり、前記モノマーの３個のうちの約１個については、Ｒ３は、−（ＣＨ２ＣＨ２）ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ３）２および（ＣＨ２ＣＨ２）Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ３）２から選択される基である。他の例示的な実施形態において、式ＶＩＩの構造を含む前記モノマーの割合は、５％と２５％との間である。さらに他の例示的な実施形態では、前記モノマーの３個のうちの約２個はＨでありおよび前記モノマーの３個のうちの約１個はＨであり、残りのＲ３は、−（ＣＨ２ＣＨ２）ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ３）２および（ＣＨ２ＣＨ２）Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ３）２から選択される基であり、式ＶＩＩの構造を含む前記モノマーの割合は、５％と２５％との間である。
【００６３】
ある実施形態において、非イオン性ポリマーはポリアルキレングリコール部位であって、前記モノマーのいくつかと共有結合で結合している部位を含む。ある実施形態では、この共有結合は、第二級アミンまたは第三級アミン、アミド、ジヒドラジド、エステル、尿素、イソ尿素、カルバメートまたはウレタンを形成する。ポリアルキレングリコールの例示として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびその誘導体が含まれる。
【００６４】
一実施形態において、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような非イオン性ポリマーの、ＰＥＩ、ポリリジン、ＤＥＡＥ−デキストランおよびこれらの変種のようなカチオンポリマーへの付加は、コポリマーとウイルスとによって形成される錯体の沈殿および凝集を阻止し、したがって、錯体の溶解性を高くする。他の実施形態では、ＰＥＧはトランスフェクション効率を高めるように機能する。
【００６５】
他の例示的な実施形態において、Ｒ１は式ＶＩＩＩ：
【００６６】
【化２８】
0004701169.tif 000012
の構造を含む。記号ｎは２〜２，０００の整数である。記号ｐは１〜８の整数である。Ｒ２は、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換３〜７員シクロアルキル、置換または非置換５〜７員ヘテロシクロアルキル、置換または非置換アリールおよび置換または非置換ヘテロアリールから選択される基である。さらに他の例示的な実施形態では、ｐは２である。
【００６７】
本発明のコポリマーにおいて、カチオンポリマーのモノマーの非イオン性ポリマーによる置換の度合いは異なる。例えば、カチオンポリマーＰＥＩ中のエチレンイミンモノマーの１５％は、非イオン性ポリマーＰＥＧによって置換されている。非イオン性ポリマー置換の度合いは、１０％と２０％との間である場合もある。非イオン性ポリマー置換の度合いは、１０％と３０％との間である場合もある。非イオン性ポリマー置換の度合いは、１５％と２５％との間の場合もある。非イオン性ポリマー置換の度合いは、約２０％である場合もある。非イオン性ポリマー置換の度合いは、１０％と４０％との間の場合もある。
【００６８】
例示的な実施形態において、Ｑで置換されているモノマーの割合は、少なくとも１０％であり、Ｑは、式ＩＸ：
【００６９】
【化２９】
0004701169.tif 000013
の構造を持つ。記号ｎは２〜２，０００の整数である。記号ｐは１〜８の整数である。Ｒ２は、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換３〜７員シクロアルキル、置換または非置換５〜７員ヘテロシクロアルキル、置換または非置換アリールおよび置換または非置換ヘテロアリールから選択される基である。さらに他の例示的な実施形態では、ｐは２である。他の例示的な実施形態では、Ｑで置換されているモノマーの割合は、１５〜３０％である。さらに他の例示的な実施形態において、Ｑで置換されているモノマーの割合は、１７〜２２％である。
【００７０】
例示的な実施形態において、Ｑで置換されているモノマーの割合は、少なくとも１０％であり、Ｑは、式Ｘ：
【００７１】
【化３０】
0004701169.tif 000014
の構造を持つ。記号ｎは２〜２，０００の整数である。記号ｐは１〜８の整数である。記号ｆは０〜１の整数である。ｆが１の場合、記号Ｒ４は式ＸＩ：
【００７２】
【化３１】
0004701169.tif 000015
の構造を持つ。図式ＸＩ中、Ｎ’が共有結合でＮ＊に結合しており、ｇは１〜９の整数である。記号Ｒ２は、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換３〜７員シクロアルキル、置換または非置換５〜７員ヘテロシクロアルキル、置換または非置換アリールおよび置換または非置換ヘテロアリールから選択される基である。他の例示的な実施形態では、ｆは０である。さらに他の例示的な実施形態では、ｆは１である。さらに他の例示的な実施形態では、ｇは４である。他の例示的な実施形態では、Ｑで置換されているモノマーの割合は、１５〜３０％である。他の例示的な実施形態では、Ｑで置換されているモノマーの割合は、１７〜２２％である。
【００７３】
例示的な実施形態において、Ｑで置換されているモノマーの割合は、少なくとも１０％であり、Ｑは式ＸＩＩ：
【００７４】
【化３２】
0004701169.tif 000016
の構造を持つ。記号ｎは２〜２，０００の整数である。記号ｐは１〜８の整数である。Ｒ２は、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換３〜７員シクロアルキル、置換または非置換５〜７員ヘテロシクロアルキル、置換または非置換アリールおよび置換または非置換ヘテロアリールから選択される基である。他の例示的な実施形態では、Ｑで置換されているモノマーの割合は１５〜３０％である。他の例示的な実施形態では、Ｑで置換されているモノマーの割合は１７〜２２％である。
【００７５】
例示的な実施形態において、錯体の直径は約２０ｎｍと約３００ｎｍとの間である。他の例示的な実施形態では、錯体の直径は、約８０ｎｍと約１５０ｎｍとの間である。
【００７６】
例示的な実施形態において、Ｒ２は、置換および非置換アルキル、置換および非置換アリール、葉酸塩、トランスフェリン、ガラクトース、グルコース、抗体、抗体断片およびペプチドから選択されるものである。他の例示的な実施形態では、Ｒ２はメチルである。他の例示的な実施形態では、ｐは２である。他の例示的な実施形態では、ｐは２、ａは２、ｂは２、およびｃは２である。
【００７７】
例示的な実施形態において、コポリマーのアデノウイルスに対する比は、３，５００：１と３０，０００：１との間である。他の例示的な実施形態において、コポリマーのアデノウイルスに対する比は、３，６００：１と２０，０００：１との間である。さらに他の例示的な実施形態においては、コポリマーのアデノウイルスに対する比は、１０，０００：１と３０，０００：１との間である。
【００７８】
本発明のコポリマーは、ある範囲の物理的次元を有することができる。例えば、本発明のコポリマーのあるものの平均分子量は、約１００キロドルトン（ｋＤａ）と約３００ｋＤａとの間である。ある実施形態においては、該平均分子量は、１２５ｋＤａと２５０ｋＤａとの間である。他の実施形態においては、平均分子量は約１５０ｋＤａと約１７０ｋＤａとの間である。コポリマーの長さは、アデノウイルスと形成される錯体が実質的に電気的中性であれば、そう重大な意味は持たない。例示的な実施形態において、記号ｍは１０〜９００の整数である。他の例示的な実施形態では、記号ｍは５０〜６００の整数である。さらに他の例示的な実施形態では、記号ｍは７５〜３００の整数である。
【００７９】
（コポリマーの製造）
以下の例示的なスキーム１〜５で、本発明の化合物の製造方法を説明する。これらの方法は、挙げられた化合物の製造に限定されることはなく、同様に他の化合物を製造するために使用することもできる。また、本発明の化合物は、該スキームに明示的に記載されていない方法によっても製造することができる。化合物は、容易に入手しうる原料や公知の中間体を使用して製造することもできる。
【００８０】
最も一般的な形のコポリマーは、カチオンポリマーを、一末端を除いて非反応性基でキャッピングされた非イオン性ポリマーと反応させることによって形成する。例えば、コポリマーＰＥＩ−ｍＰＥＧは、カチオンポリマーＰＥＩと、一末端はメトキシ基でキャッピングされ、他末端にサクシンイミジルプロピオネート基を有する非イオン性ポリマーＰＥＧとの反応によって形成される。
【００８１】
（非イオン性ポリマー）
本発明で、ポリアルキレングリコールのような非イオン親水性ポリマーは、共有結合でカチオンポリマーに結合している。適切なポリアルキレングリコールが、アルドリッチケミカル社から市販されているプロピレングリコールおよびポリ（１，２−ブチレングリコール）、およびネクター・セラピューティックス社から市販されているポリエチレングリコールおよびその誘導体を始めとして、多くの供給元から市販されている。ポリアルキレングリコールサブユニットが、第二または第三級アミン、アミド、ジヒドラジド、エステル、尿素、イソ尿素、カルバメート、ウレタンまたはその組み合わせのような基を介してカチオンポリマーと共有結合で結合している場合もある。ポリアルキレングリコールサブユニットの数（ｎ）は、例えば、２〜２，０００の間の数でありえる。本発明の化合物のいくつかは、サブユニットの数が４５〜１，２００の間の数である。本発明の他の化合物のサブユニットの数は２５０〜１，０００の間の数である。
【００８２】
望ましくない副反応を減らすために、ポリアルキレングリコールを、例えば、アルコキシ基のようなエーテル結合形成基でキャッピングすることができる。本発明のある化合物においては、モノメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）がキャッピング基として使用される。キャッピング基の他の例示として、置換および非置換アルキル、置換および非置換アリール、葉酸塩、トランスフェリン、ガラクトース、グルコース、抗体、抗体断片およびペプチドが挙げられる。さらに他のＰＥＧ用キャッピング基の例示を、ネクター・セラピューティックス社（以前はシェアウォーター・ポリマーズ社）（バーミンガム、アラバマ）２００１年のカタログ（インターネット（ワールドワイドウェブ）ｎｅｋｔａｒ．ｃｏｍ上で入手可能）中に見つけることができる。これは参考として本明細書に組み込まれる。
【００８３】
ある実施形態では、カチオンポリマーへカップリングする前に、非イオン性ポリマーを化学的に活性化する。活性化ＰＥＧ（この例示ではｍＰＥＧ）の潜在的に有用な形として、例えば、塩化シアヌルｍＰＥＧ、サクシンイミジルサクシネートｍＰＥＧ、トレシルｍＰＥＧおよびサクシンイミジルプロピオネートｍＰＥＧ（ｍＰＥＧ−ＳＰＡ）が挙げられる。さらに他の活性化ＰＥＧ基の例示として、上記のネクター・セラピューティックス社のカタログ中に見つけ出すことができる。
【００８４】
（カチオンポリマー）
本発明のカチオンポリマーは、プラスに帯電しているモノマーを表す、記号Ｘ１、Ｘｉ、およびＸｍ＋１を含む。これらプラスに帯電しているモノマーは、カチオンポリマーを形成する。これらプラスに帯電しているモノマーは、第二アミンまたは第三級アミンを含み、同様に、第一アミンまたはアルコール官能基も含みうる。本発明のカチオンポリマーの平均分子量は、約８００ドルトンと約８００，０００ドルトンの間でありえる。ある実施形態では、平均分子量は、２，０００ドルトンと１００，０００ドルトンとの間である。他の実施形態では、平均分子量は約１５，０００ドルトンと約５０，０００ドルトンとの間である。さらに、ｍによって表されるカチオンポリマーの長さは、１と１０００との間で変更することができる。ある実施形態において、ｍは１０と９００との間の自然数である。他の実施形態では、ｍは５０と６００との間の自然数である。さらに他の実施形態で、ｍは７５と３００との間の自然数である。
【００８５】
例示的な実施形態において、カチオンポリマーは、ポリアルキレンイミン、ポリリジン、ＤＥＡＥ−デキストランおよびＤＥＡＥ−デキストラン変種である。
【００８６】
（カチオンポリマー：ポリアルキレンイミン）
例示的な実施形態において、カチオンポリマーはポリアルキレンイミンである。ポリアルキレンイミンは以下のモノマー：
【００８７】
【化３３】
0004701169.tif 000017
（式中、ａおよびｂは１〜１０の間の整数である）を含む場合がある。ある場合はａが２であり、ｂが２である。他の場合はａが３であり、ｂが３である。ポリアルキレンイミンは以下のモノマー：
【００８８】
【化３４】
0004701169.tif 000018
（式中、ｃは１〜１０の間の整数である）を含む場合もある。ある場合は、ｃは２である。他の場合ではｃは３である。さらに他の場合は、ポリアルキレンイミンは、上記したモノマーの混合物である。さらに他の場合では、ポリアルキレンイミンはポリエチレンイミン（ＰＥＩ）である。
【００８９】
例示的なポリエチレンイミン−ＰＥＧコポリマーは、スキーム１の方法によって製造される。
【００９０】
【化３５】
0004701169.tif 000019
このスキームにおいては、ＰＥＩ−ｍＰＥＧコポリマーを製造するために、ホウ酸塩緩衝液を含む水溶液中でＰＥＩを、メチル基でキャッピングされたサクシンイミド−活性化ＰＥＧに反応させる。ある実施形態においては、ポリアルキレンイミンは、スキーム１での構造であって、ｙに対するｘの比が１：１と５：１との間である構造のモノマーを含む。該比はまた、例えば、２：１または３：１もとりうる。適切なポリアルキレンイミンが、アルドリッチケミカル社から市販されているポリエチレンイミン、ポリサイエンス社から市販されているポリエチレンイミン、およびＢＡＳＦから市販されているＰＯＬＹＭＩＮポリ（エチレンイミン）およびＬＵＰＡＳＯＬ（登録商標）ポリ（エチレンイミン）を始めとして、多くの供給元から市販されている。
【００９１】
（カチオンポリマー：ポリリジン）
本発明で使用される他の例示的なカチオンポリマーは、ポリリジンである。ポリリジンは、シグマケミカル社を始めとして多くの供給元から市販されている。ポリリジンは以下の構造：
【００９２】
【化３６】
0004701169.tif 000020
を有するモノマーから構成される。
【００９３】
ポリリジン−ＰＥＧコポリマーは、スキーム２の方法によって製造される。
【００９４】
【化３７】
0004701169.tif 000021
このスキームにおいては、ポリリジン−ｍＰＥＧコポリマーを製造するために、ホウ酸塩緩衝液を含む水溶液中でポリリジンを、メトキシ基でキャッピングされたサクシンイミジルプロピオネート−活性化ＰＥＧに反応させる。
【００９５】
（カチオンポリマー：ＤＥＡＥ−デキストラン）
本発明で使用される他の例示的なカチオンポリマーは、ＤＥＡＥ−デキストランである。ＤＥＡＥ−デキストラン塩酸塩は、シグマケミカル社を始めとする多くの供給元から市販されている。ＤＥＡＥ−デキストランは、以下に列挙するモノマーの混合物を含むことができる。
【００９６】
【化３８】
0004701169.tif 000022
ＤＥＡＥ−デキストラン−ＰＥＧコポリマーは、スキーム３の方法によって製造される。
【００９７】
【化３９】
0004701169.tif 000023
このスキームにおいては、活性化サッカライドニトリルを製造するために、アセトン６０％、水３０％およびトリエチルアミン１０％の溶剤中、−１５℃でサッカライドを臭化シアンと反応させる。続けて、水性酢酸塩緩衝液中、４℃で２４時間、アミン置換ｍＰＥＧと混合して、ＤＥＡＥ−デキストラン−ｍＰＥＧイソ尿素を形成する。該実施形態においてＤＥＡＥ−デキストランがカチオンポリマーである場合、非置換グルコースサブユニットのＤＥＡＥ−置換グルコース（単数および複数ＤＥＡＥ−置換を含む）サブユニットに対する比は、１：１と５：１との間である。該比は、例えば、２：１または３：１も取りうる。
【００９８】
他の例示的な実施形態において、アジペートジヒドラジドリンカーを有するＤＥＡＥ−デキストラン−ＰＥＧコポリマーは、スキーム４の方法によって製造される。
【００９９】
【化４０】
0004701169.tif 000024
このスキームにおいて、活性化サッカライドニトリルを製造するために、アセトン６０％：水３０％：トリエチルアミンｌ０％溶剤中、−１５℃で、サッカライドを臭化シアンと反応させる。活性化ポリマーは、まず、アジピン酸ジヒドラジドと反応させ、続けて、シアノ水素化ホウ素ナトリウムの存在下でアルデヒド官能基を有するｍＰＥＧと反応させ、アジペートジヒドラジドリンカーを有するＤＥＡＥ−デキストラン−ＰＥＧコポリマーを得る。該実施形態においてＤＥＡＥ−デキストランがカチオンポリマーである場合、非置換グルコースサブユニットのＤＥＡＥ−置換グルコース（単数および複数ＤＥＡＥ−置換を含む）サブユニットに対する比は、１：１と５：１との間である。該比は、例えば、２：１または３：１もとりうる。
【０１００】
（カチオンポリマー：ＤＥＡＥ−デキストラン変種）
他の例示的な実施形態において、あるＤＥＡＥ−デキストラン−ＰＥＧコポリマー変種が製造される。ＤＥＡＥ−デキストラン変種は、上で列挙したモノマーを含むことができる。ＤＥＡＥ−デキストラン−ＰＥＧコポリマー変種は、スキーム５の方法によって製造される。
【０１０１】
【化４１】
0004701169.tif 000025
このスキームでは、隣接する水酸基をジアルデヒドに酸化するために、サッカライドを過ヨウ素酸と反応させる。引き続き、アミン−置換ｍＰＥＧと混合し、ＤＥＡＥ−デキストラン−ｍＰＥＧイミンコポリマー変種を形成する。続くシアノ水素化ホウ素ナトリウムでの還元によりＤＥＡＥ−デキストラン−ｍＰＥＧアミンコポリマー変種を製造する。
【０１０２】
（Ｂ．ウイルス）
ウイルスは、特定の細胞タイプに対する高い核酸送達効率を示すが、感染した宿主の免疫システムによっては、検出されない場合が多い。これらの特徴によって、あるウイルスは遺伝子治療での用途に遺伝子送達ビヒクルとして、魅力的な候補となる。レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）および単純ヘルペスウイルスが遺伝子治療において普通使用されるウイルスとして挙げられる例である。前記各ウイルスには、長所と限界があり、したがって、所定の遺伝子治療への適正に応じて選択することができる。
【０１０３】
外来ＤＮＡ送達用のベクターとしてのアデノウイルスは、近代分子生物学の道具として広範に使用されている。アデノウイルスの複製は、ほとんどのレトロウイルスベクターとは対照的に、受容宿主細胞が分裂することを必要としない。アデノウイルスは、哺乳動物細胞と発現たんぱく質に入るように設計することができるが、一方、感染性ウイルス子孫の産生には問題がある。
【０１０４】
アデノウイルスベクターは、増殖性感染に必要とされる種々の遺伝子において、複製コンピテントとしてあるいは条件付き欠損として産生することができる。例えば、アデノウイルス−ＳＶ４０組換えでの経験から、全アデノウイルスＥ３領域は、組織培養細胞内でのウイルスの増殖を大きくは変更せずに削除できることが突き止められた。この領域は、外来ＤＮＡによって置換することができる。得られたアデノウイルスは、野生型のアデノウイルス感染を許容するいかなる細胞株においても増殖することができる。Ｅ３−置換アデノウイルスは、遺伝子の挿入のために主として使用され、免疫付与用のたんぱく質を産生してきた。
【０１０５】
免疫化するエピトープの量を増やすためにウイルス複製が望まれる免疫付与のためのベクターとしての用途が構築されているアデノウイルスとは対照的に、遺伝子治療の道具として改変されたウイルスは、一般的に複製欠損として設計される。後者のベクター用の外来ＤＮＡのほとんどは、削除されたＥｌＡおよびＥ１Ｂ領域を置き換える。それは、種々のプロトコルによって構成されているが、外来ＤＮＡが挿入されているプラスミドを含み、アデノウイルス配列が隣接する。
【０１０６】
外来ＤＮＡの細胞への挿入を助けるために、アデノウイルスを使用することができる他の方法がある。エンドソームを介して進行し、最終的に核にＤＮＡが送達されるウイルスの結合のメカニズムは、アデノウイルス粒子の外側の外来ＤＮＡを内部に取り入れるために使用することができる。例えば、ポリリジンとのＤＮＡ錯体は、アデノウイルス粒子と接着し、内部に取り込むことができる。例えば、Ｃｏｔｔａｍ，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ６７：３７７７−３７８５（１９９３），Ｗａｇｎｅｒ，ＰＮＡＳ８８：４２５５−５２５９（１９９１）を参照。おそらく、錯体は繊維の推定受容体への結合によって細胞に入るのであろう。トランスフェリンのようなリガンドを含み、トランスフェリン受容体を用いる細胞への侵入を助けるこれらの技術の変更法がある。例えば、Ｗａｇｎｅｒ，ＰＮＡＳ８９：６０９９−６１０３（１９９２）を参照。培養中の細胞へのＤＮＡの侵入を効率的にするために、ウイルスと外部ＤＮＡとを結合する必要はない。例えば、Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ２６８：２３００−２３０３（１９９３）を参照。
【０１０７】
（Ｃ．錯体）
他の態様において、本発明は、アデノウイルスとコポリマーとを含む錯体を提供する。これらのコポリマーとしては、前記Ａ部で記載した種類のものを挙げることができる。これらの錯体において、アデノウイルスとコポリマーとは、互いに非共有結合的に錯体を形成している。
【０１０８】
本発明の錯体は、ある範囲の物理的次元を有することができる。例えば、錯体中のコポリマーの量対アデノウイルスの量は、変更することができる。ある実施形態では、アデノウイルスに対するコポリマーの比は、３，５００：１と３０，０００：１との間である。他の実施形態では、アデノウイルスに対するコポリマーの比は、３，６００：１と２０，０００：１との間である。さらに他の実施形態では、アデノウイルスに対するコポリマーの比は、１０，０００：１と３０，０００：１との間である。
【０１０９】
さらに、錯体の寸法も変更することができる。ある実施形態では、錯体は約２０ｎｍと約３００ｎｍとの間である。他の実施形態では、錯体は約８０ｎｍと約１５０ｎｍとの間である。
【０１１０】
（錯体の製造）
最も単純な形では、本発明のコポリマーが単純にアデノウイルスに接触あるいは混合している（実施例２参照）。錯体の形成は、ほとんど瞬時に起こり、さらに精製することも必要としない。次いで、本発明の錯体は、細胞と接触するために使用することができる。本発明の錯体を細胞に接触させて、ウイルスまたはウイルス核酸を細胞へ導入する。
【０１１１】
アデノウイルスとカチオン性ＰＥＩ−ＰＥＧコポリマーとが非共有結合的にカプセル化することで、インビトロおよびインビボでのウイルス感染と導入遺伝子発現を増大させつつ、ウイルス表面の電荷を完全にマスキングする。この表面修飾は、追加の処理工程なしで、単純な混合工程を経て達成された。ＰＥＩ−ＰＥＧは、どのような精製ウイルス製剤にも製剤化剤として加えることができ、そうすることによって、前もって生成したウイルスベクターとの使用を可能にする。
【０１１２】
ある実施形態では、細胞は錯体とインビトロで接触させられる。ある実施形態では、細胞はインビボで錯体と接触させられる。
【０１１３】
他の態様において、本発明は、非共有結合的に錯化したアデノウイルスコポリマー錯体を製造する方法を提供する。この方法では、コポリマーは、この項で記載したように、アデノウイルスと接触させられる。
【０１１４】
他の態様において、本発明は、アデノウイルスを細胞へ導入する方法を提供する。この方法では、コポリマーは非共有結合的にアデノウイルスに接触させられ、錯体を形成する。この錯体は次いで細胞と接触させられる。
【０１１５】
（ＩＶ  医薬的応用）
第四の態様において、本発明は、（ａ）コポリマーと、（ｂ）アデノウイルスであって、非共有結合錯体を形成するアデノウイルスと、（ｃ）生理学的に許容しうる賦形剤とを含む生理学的製剤を提供する。この生理学的製剤中のコポリマーは、式Ｉ（式中、ｍは１〜１，０００の整数である）の構造を含む。記号ｉは２〜ｍの整数であり、Ｘｉの位置を示す。記号Ｘ１、ＸｉおよびＸｍ＋１は、独立して、次の要件を満たすモノマーから選択される。すなわち、該モノマーは、（ｉ）第二アミン類および第三アミン類から選択されるアミンを含み、かつ（ｉｉ）少なくとも１つのモノマーはＱを含む。Ｑは、式ＩＩａおよび式ＩＩｂ（式中、Ｚは、ＯおよびＮＨからなる群から選択される）から選択される構造である。記号ｈは、０〜１の整数である。記号Ｒ１は、ポリアルキレングリコール部位を含む。また、本発明のコポリマーは、交差重合を含まず、生理的ｐＨでコポリマー中の少なくとも１個の窒素原子がプラスに帯電している。
【０１１６】
生理学的に許容しうる賦形剤として、例えば、担体、水、ｐＨ調整剤または緩衝剤、保存料、安定剤または他の成分のような物質が挙げられる。生理学的に許容しうる担体は、組換えアデノウイルスベクター送達系を安定させるように作用する、生理学的に許容しうる化合物を含むことができる。生理学的に許容しうる化合物としては、例えば、グルコース、サッカロースまたはデキストランのような炭水化物、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、アスコルビン酸またはグルタチオンのような酸化防止剤、キレート剤、水、低分子量たんぱく質、または他の安定剤や賦形剤が挙げられる。
【０１１７】
他の生理学的に許容しうる化合物として、例えば、湿潤剤、乳化剤、分散剤、または保存料であって、特に微生物の成長または作用を防止するものが挙げられる。多種の保存料がよく知られ、例えば、フェノールおよびアスコルビン酸が挙げられる。当業者の間では、生理学的に許容しうる担体は、投与の経路および組換えアデノウイルスベクター送達系の特定の生理化学的特徴に依存して選択されることは知られている。担体、安定剤またはアジュバントの例示が、Ｇｅｎｎａｒｏ，ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ：ＴＨＥ  ＳＣＩＥＮＣＥ  ＡＮＤ  ＰＲＡＣＴＩＣＥ  ＯＦ  ＰＨＡＲＭＡＣＹ，１９ｔｈ  ｅｄ．（１９９５）Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，中に見出すことができ、これは参考として本明細書に組み込まれる。
【０１１８】
本発明の化合物は、製造され、経口、非経口および局所投薬形態など多種多様に投与されうる。したがって、本発明の化合物は、注射、すなわち、静脈内注射、筋肉内注射、皮内注射、皮下注射、十二指腸内注射または腹腔内注射によって投与することができる。また、本明細書に記載された化合物は、吸入、例えば、鼻腔内に投与することもできる。さらに、本発明の化合物は、経皮的に投与することもできる。したがって、本発明は、生理学的に許容しうる賦形剤と、前記「コポリマー」の項で記載したコポリマーで構成される錯体と、前記「ウイルス」の項で記載したウイルスとを含む生理学的組成物も提供する。
【０１１９】
錯体の有効量は、生理食塩水、適切な緩衝液、保存料、安定剤など（ただしこれらに限定されない）の医薬的に許容しうる賦形剤中で組成物として患者に投与され、また、制嘔薬などの適切な剤と併用して投与してもよい。有効量は、有益なあるいは望ましい結果（臨床結果を含む）を発揮するのに充分な量である。有効量は、１回の投与でも複数回の投与でも投与することができる。本発明の目的から、錯体有効量は、病状の進行を緩和する、軽減する、安定化する、逆転させる、遅らせるまたは止めるのに、あるいは特定の組織や病状を診断するのに充分な量である。これらの治療に対して難治性の者もいるが、本方法は、これらの者に対する投与も包含すると理解される。与えられる量は、個人の状態、病気の程度、投与経路、何回を投与するか、および望ましい目的によって決められる。
錯体の送達は、一般的に、部位特異的な注射か静脈内注射のいずれかによって行う。ベクターの部位特異的注射には、例えば、腹腔内注射、胸膜内注射、動脈内注射、眼内注射、腫瘍内注射または、局所塗布が含まれてもよい。これらの方法は、必要に応じて、錯体と他の剤とを組み合わせて使う治療において簡単に行う。
【０１２０】
錯体は、リポソーム、リン酸カルシウム沈降法あるいはエレクトロポレーションのような当業界でよく知られている一般的なトランスフェクション方法、直接注射および静脈内注入のような、種々の方法で標的細胞に送達されるが、方法はこれらに限定されるものではない。送達手段は、大部分、特定の錯体（その形）および標的細胞のタイプと場所（例えば、細胞がインビトロにあるかインビボにあるか）に依る。投与経路に依って、ヒトに対するウイルスの用量は、１×ｌ０６〜１×１０１４の範囲で変化する。
【０１２１】
液状製剤としては、溶液、懸濁液、乳化液、例えば、水、または水／プロピレングリコール溶液があげられる。非経口注射用の液体製剤は、ポリエチレングリコール水溶液中の溶液状態で、製剤化することができる。
【０１２２】
（Ｖ．キット）
第五態様においては、本発明は、コポリマーとアデノウイルスとを含み、前記コポリマーとアデノウイルスとは非共有結合的に結合しているキットを提供する。キットのコポリマーは、式Ｉ（式中、ｍは１〜１，０００の整数である）の構造を含む。記号ｉは２〜ｍの整数であり、Ｘｉの位置を示す。記号Ｘ１、ＸｉおよびＸｍ＋１は、独立して、次の要件を満たすモノマーから選択される。すなわち、該モノマーは、（ｉ）第二アミン類および第三アミン類から選択されるアミンを含み、かつ（ｉｉ）少なくとも１つのモノマーはＱを含む。Ｑは、式ＩＩａおよび式ＩＩｂ（式中、Ｚは、ＯおよびＮＨからなる群から選択される）から選択される構造である。記号ｈは、０〜１の整数である。記号Ｒ１は、ポリアルキレングリコール部位を含む。また、本発明のコポリマーは、交差重合を含まず、生理的ｐＨでコポリマー中の少なくとも１個の窒素原子がプラスに帯電している。
【０１２３】
また、本発明は、例えば遺伝子治療のための細胞感染用ウイルスの製剤キットを提供する。該キットは、例えば、本発明のコポリマーを含む。場合によっては、該キットは、分離された容器内にアデノウイルスのようなウイルスを含むこともできる。該キットは、任意で、本発明の使用方法が記載された指示書を含むこともできる。アッセイの実行に役に立つ他の物質もキット内に含めることができる。例えば、試験管、ホールピペットなどが挙げられる。本発明のキットは、１回のアッセイに十分なだけの物質を含むことができるし、複数回のアッセイに十分なだけの物質を含むこともできる。
【０１２４】
以下の実施例は、説明のために記載されるもので、これによって本発明が限定されるものではない。
【実施例】
【０１２５】
ここで記載される実施例および実施形態は、説明の目的にのみあるものであり、当業者には、それに照らして多種の変更および改変が示唆され、本出願の精神および範囲内および添付の請求の範囲の範囲内に入るものと理解される。本明細書に挙げられた公報、特許および特許出願の全ては、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０１２６】
（一般説明）
以下の実施例において、特に明記しない限り、温度は摂氏温度（℃）であり、操作は室温あるいは周辺温度、「ｒｔ」、「ＲＴ」（通常約１８〜２５℃の範囲）で行った。溶剤の蒸発は、ロータリーエバポレータを使用して、減圧下（通常４．５〜３０ｍｍＨｇ）で、浴温６０℃までで行った。反応の進行は、通常、ＴＬＣで追跡し、反応時間は説明のためだけに提供する。収量は説明のためだけに提供する。以下の慣用の略記を使用する。Ｌ（リットル）、ｍＬ（ミリリットル）、ｍｍｏｌ（ミリモル）、ｇ（グラム）、ｍｇ（ミリグラム）、ｍｉｎ（分）およびｈ（時間）。
特に明記しない限り、合成に使用された全ての試薬は、シグマ（セントルイス、ミズリー）社から購入した。１Ｈ−ＮＭＲ分析は、Ｎｕｍｅｇａレゾナンス研究所（サンディエゴ、カリフォルニア）によって行われた。ＮＭＲ分析の前に、コポリマーは、１０，０００ＭＷＣＯ膜（Ｓｌｉｄｅ−ａ−Ｌｉｚｅｒ，ピアス社，ロックフォード，イリノイ）を使用して、脱イオン水に対して透析し、凍結乾燥した。ＣＭＶ即時初期プロモーター（ＢＧＣＧ）の制御下でＬａｃＺ融合たんぱく質（β−Ｇａｌ）遺伝子を発現する組換えアデノウイルスについては、以前に記載された（Ｗｉｌｌｓ，Ｋ．Ｎ．ら、Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．５：１０７９−１０８８（１９９４））。同じＣＭＶ即時初期プロモーター（ＧＦＣＢ）制御下で緑色蛍光たんぱく質（ＧＦＰ）遺伝子をコード化する組換えアデノウイルスについても、以前に記載された（Ｒａｈｍａｎ，Ａ．ら、Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．３：７６８−７７８（２００１））。記載されたように、ＢＧＣＧおよびＧＦＣＢを製造し精製した（Ｈｕｙｇｈｅ，Ｂ．Ｇ．ら、Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．６：１４０３−１４１６（１９９５））。
【０１２７】
サイズ排除クロマトグラフィーは、アクタＦＰＬＣシステムで、セファクリルＳ−２００樹脂（アマシャムバイオサイエンス社、ピスカタウェー、ニュージャージー）を詰めたＨｉＰｒｅｐカラム（１．６×６０ｃｍ）を使用して行った。逆相クロマトグラフィーは、ジュピター５ｕ  Ｃ４カラム（１５０×２ｍｍ，フェノメネックス社、トロント、カナダ）で、ウォーターズＨＰＬＣシステム（ウォーターズ社、ミルフォード、マサチューセッツ）とＳｅｄｅｘ７５蒸発光散乱検出器（セデックス，Ａｌｆｏｒｔｖｉｌｌｅ，フランス）とを使用して行った。錯体の粒径は、Ｎ４Ｐｌｕｓ粒径分析計（コールター社、マイアミ、フロリダ）で動的光散乱によって測定した。表面電荷（ゼータ電位）は、ＤＥＬＳＡ４４０ＳＸ（コールター社、マイアミ、フロリダ）で測定した。被覆ウイルス粒子は、リソースＱカラム（アマシャムバイオサイエンス社，ピスカタウェー、ニュージャージー）（Ｓｈａｂｒａｍ，Ｐ．Ｗ．ら、Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．８：４５３−４６５（１９９７））で、陰イオン交換クロマトグラフィーによって分析した。フローサイトメトリーはＦＡＣＳキャリバーフローサイトメーター（ベクトンディッキンソン社、サンノゼ、カルフォルニア）でおこなった。前方散乱（ＦＳＣ）、側方散乱（ＳＳＣ）およびＦＬ−１パラメーターは、合計５０，０００個の細胞について収集した。細胞および組織溶解物の総たんぱく含量は、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）標準に比較したＢＣＡ法（ピアス社、ロックフォード、イリノイ）によって測定した。
【０１２８】
（実施例１）
（ＰＥＩ−ｍＰＥＧポリマーの製剤）
ＰＥＩ（２５ｋＤａ）をアルドリッチ社（ミルウォーキー、ウィスコンシン）から購入し、メトキシＰＥＧ−ＳＰＡ（５ｋＤａ）はシェアウォーター社（ハンツビル、アラバマ）から得た。逆相ＨＰＬＣ（１００％水中０．１％ＴＦＡから１００％アセトニトリル中０．１％ＴＦＡの線形勾配、２０分、流速：０．４ｍＬ／分）による出発物質の分析は、１０分でＰＥＩの単一ピーク、１５分でｍＰＥＧの単一ピークを示した。
【０１２９】
ＰＥＧグラフトポリマーを、スキーム１に示すように、ＰＥＩとｍＰＥＧ−ＳＰＡとの反応によって合成した。スキーム１において、１ＭのＰＥＩ溶液は、２．１５５ｇのＰＥＩ（２５ｋＤａ）を１０ｍＬの水に溶解し、ｐＨを１ＮのＨＣ１で７．０に調整し、体積を水で５０ｍＬに調整することによって製造した。１５３．９ミリグラムのｍＰＥＧ−ＳＰＡ（３．０×１０−５モル）に、８００μＬのホウ酸塩緩衝液（２００ｍＭのホウ酸塩、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｌｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．４）中に希釈した４００μＬのＰＥＩ原液（１．２７×１０−４モル、１級アミン）を加えた。振盪しながら、反応を室温で１時間続けた。
【０１３０】
（ＰＥＩ−ｍＰＥＧポリマーの精製）
反応混合物をサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。画分を集め、ＰＥＩ−ｍＰＥＧコポリマーを含む画分をプールし、プールしたものを逆相クロマトグラフィーによって分析した。
【０１３１】
（ＰＥＩ−ｍＰＥＧポリマーの特性評価）
精製した反応生成物（ＰＥＩ−ｍＰＥＧコポリマー）の逆相クロマトグラフィーによる分析は、単一の広範なピークを示した。特徴的なＰＥＩピークとＰＥＧピークの欠乏は、出発物質が無くなったことを示していた。さらに、広範なＰＥＩ−ｍＰＥＧの溶離ピークは、コポリマー中のＰＥＩに対するＰＥＧの比の不均質な分布を示唆していた。
【０１３２】
コポリマー中のＰＥＩに対するＰＥＧの比は、ＰＥＧの−ＣＨ２−ＣＨ２−ＯプロトンとＰＥＩの−ＣＨ２ＣＨ２Ｎプロトンとの１Ｈ−ＮＭＲピーク面積を比較することによって測定した。このデータに基づき、ＰＥＩ−ｍＰＥＧコポリマーは、ＰＥＩ１分子当たり平均で２７．２個のＰＥＧ鎖を含んでいた。これは、１８．８％の１級アミンが修飾されたことに相当し、平均分子量は１６１ｋＤａに相当する。
【０１３３】
（実施例２）
（錯体の製造）
組換えアデノウイルスを、（１）アデノウイルスをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）またはｖＰＢＳ（１×ＰＢＳ、３％ｗ／ｖサッカロース、２ｍＭ塩化マグネシウム、ｐＨ７．５）で希釈し、最終濃度を１×１０１１個／ｍＬの粒子とし、（２）ＰＥＩ−ｍＰＥＧ原料を加え、（３）ピペッティングにより混合することによって、多種の比において、ＰＥＩ−ｍＰＥＧコポリマーで処理した。使用の前に、錯体の形成を室温で１５分間行った。追加の精製は必要でなかった。
【０１３４】
（錯体の特性評価）
カプセル化前と後のアデノウイルスの特性評価は以下の方法、すなわち、動的光散乱法、ゼータ電位測定法、陰イオン交換クロマトグラフィーおよび等密度ＣｓＣｌ密度勾配遠心法で分析した。分析に先立って、ＰＥＩ−ｍＰＥＧでカプセル化されたアデノウイルスを超純水で１０倍に希釈した。本発明の錯体の物性を表１に示す。
【０１３５】
【化４２】
0004701169.tif 000026
粒径は動的光散乱法によって測定した。報告されている流体学的径は、水性緩衝液中のアデノウイルス粒子のブラウン運動を測定することにより決定した。ＰＥＩ−ｍＰＥＧコポリマーの添加により、用量依存的様式において表面電荷が低減し、より高いポリマー濃度で、中性に近づいた。表面電荷をマスク化されたので、アデノウイルス粒子がＰＥＩ−ｍＰＥＧポリマーでカプセル化されたことが推定された。この結合は、ポリカチオン性ＰＥＩ骨格と負に帯電したウイルス表面との間の電荷相互作用によって起こった。
【０１３６】
動的光散乱法による粒径の分析は、より高いポリマー濃度で僅かな増加のみを示した。しかし、最も低い濃度で平均粒径が大きく増加するのが観察された。後者は、おそらく、ポリマーにより媒介される粒子凝集に依るものであり、これは、ウイルス粒子表面がポリマーで部分的にのみ飽和される濃度のポリマーにより起こりやすい。
【０１３７】
カプセル化されたアデノウイルスが血清の存在下で安定であるかどうかを判断するために、ＰＥＩ−ｍＰＥＧで処理されたアデノウイルスをＰＢＳ中の５０％ｖ／ｖウシ胎児血清（ＦＢＳ）中、室温で１時間インキュベートした。次いで、サンプルをリソースＱ  ＨＰＬＣ分析によって試験した。「典型的な」アデノウイルス保持時間にアデノウイルスのピークは観察されなかった。これは、ポリマーがＦＢＳによってｒＡｄから離れなかったことを示す。５０％ｖ／ｖＦＢＳ中でインキュベートされた、処理されていないコントロールアデノウイルスの保持時間は変化しなかった。
【０１３８】
ＰＥＩ−ｍＰＥＧで処理されたウイルスのアリコートを等密度ＣｓＣｌ密度勾配遠心法に供した。カラムで精製されたＢＧＣＧとＰＥＩ−ｍＰＥＧ中のＢＧＣＧはそれぞれ、マイナーな修飾をして、以前に記載されたように、ＣｓＣｌ段階濃度勾配にかけた（Ｐｒａｇｅ，Ｌ．ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．４９：７４５−７５７（１９７２））。各製剤から約５×１０１１個のウイルス粒子を、１０ｍＭのトリスＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．０、中の１．２５ｇｍ／ｍｌと１．４０ｇｍ／ｍｌのＣｓＣｌ段階濃度勾配に重ね合わせた。ウイルスサンプルを、８℃で１時間、約１５４，０００×ｇで、ベックマンＳＷ４１Ｔｉローターで遠心分離した。それぞれのチューブからのウイルスバンドを集め、１０ｍＭのトリス−ＨＣＩ、ｐＨ８．０中の１．３０ｇｍ／ｍｌのＣｓＣｌと混合した。遠心分離を一晩、８℃、約１９９，０００×ｇでＶＴｉ６５．３ローター中で続けた。各ウイルスバンドを集め、２ｍＭのＭｇＣｌおよび１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の３％サッカロース中で、ＭＷＣＯ５０，０００を有するＳｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ膜（スペクトラムメディカルインダストリーズ社、ヒューストン、テキサス）を使用して透析した。透析したウイルスを−８０℃で凍結して保存した。
【０１３９】
コントロールアデノウイルスと同じ浮遊密度を持つバンドがただ１つ見られた。単離したアデノウイルスバンドをｖＰＢＳ（１×ＰＢＳ、３％サッカロース、２ｍＭの塩化マグネシウム、ｐＨ７．５）に対して透析し、リソース−Ｑ−ＨＰＬＣによって分析した。標準クロマトグラフ条件を使用すると、ウイルスが典型的な保持時間で溶出した。これは、ＰＥＩ−ｍＰＥＧポリマーは、電荷相互作用によってウイルスに結合し、ＣｓＣｌ溶液の高いイオン強度によって排除されたことを示唆する。さらに、電子顕微鏡観察で、ＰＥＩ−ｍＰＥＧで被覆されたウイルスは、典型的な、二十面体アデノウイルス形態を示した。このデータは、ＰＥＩ−ｍＰＥＧポリマーとアデノウイルスとの相互作用は、可逆的で、かつウイルス粒子の完全性に影響を与えないということを示している。
【０１４０】
（実施例３）
（インビトロでの感染力のアッセイ）
感染力と導入遺伝子発現について、アデノウイルスをＰＥＩ−ｍＰＥＧポリマーでカプセル化する効果を、インビトロの２つの異なる細胞株、Ａ５４９およびＴ２４で調べた。Ａ５４９細胞、ヒト上皮肺癌細胞は、コクサキーアデノウイルス受容体（ＣＡＲ）を発現し、したがって、容易にアデノウイルスに感染する。Ａ５４９細胞を、７％ＣＯ２インキュベーター中３７℃で、１０％ＦＢＳを加えたＤＭＥＭ中に維持した。対照的にＴ２４細胞は、ＣＡＲネガティブで、Ａ５４９細胞に比べて感染性にかなり劣っている。Ｔ２４、ヒト上皮膀胱癌細胞を、１０％ＦＢＳを加えたＨａｍ’ｓ  Ｆ１２／ＤＭＥ高グルコースの１：１混合物中に維持し、同じインキュベーター中で増殖させた。培養物を、約８０％コンフルエントまでＴ−２２５ｃｍ２組織培養フラスコ内で成長させ、０．２５％トリプシンを使用して取り外し、６−ウェルプレート中に５×１０５細胞／ウェルで播種した。アデノウイルスまたはＰＥＩ−ｍＰＥＧでカプセル化されたアデノウイルスで感染させる前に、細胞を一晩（３７℃、７％ＣＯ２）維持した。感染力を、緑色蛍光たんぱく質（ＧＦＰ）を発現する組換えアデノウイルスを使用して調べた。形質導入の頻度、すなわち、ＧＦＰポジティブ（感染された）細胞のパーセンテージをフローサイトメトリーによって測定した。形質導入の頻度（ＧＦＰポジティブ細胞のパーセント）は、ＦＩＴＣ（ＦＬ−１）ポジティブ細胞の数を分析した細胞の総数で割ることによって計算した。
【０１４１】
両細胞株に関し、形質導入の頻度はＰＥＩ−ｍＰＥＧ濃度の増加に比例して増加した（図３Ａ）。Ｔ２４細胞に関し、非カプセル化アデノウイルスに対する増加は、ｒＡｄ−ＰＥＩ−ｍＰＥＧ  Ａ、ＢおよびＣについてそれぞれ１％、８９％および１０７％であった。Ａ５４９細胞に関して、カプセル化レベルＡについて−３％の減少が、カプセル化レベルＢおよびＣについてそれぞれ１０％および３１％の増加が観察された。
【０１４２】
カプセル化アデノウイルスのインビトロでの感染力は、使用した細胞株のＣＡＲ発現状況に関係なく増加した。基準レベルを超える増加（非カプセル化アデノウイルスで構築された）はＣＡＲネガティブ細胞（Ｔ２４）が僅かに高いが、最も高いトランスフェクションレベルは、ＣＡＲポジティブ細胞（Ａ５４９）によって達成された。これは、ウイルスのカプセル化が、受容体介在感染を弱めるどころか、かえって受容体非依存的様式において感染力を高めていることを示す。この観察は、インビトロ感染力における緩やかな減少から激しい減少は、使用したペグ化学に依存することが観察された、アデノウイルスの共有結合ペグ化反応（Ｏ’Ｒｉｏｒｄａｎら、Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１０：１３４９−１３５８（１９９９）；Ｃｒｏｙｌｅら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１１：１７１３−１７２２（２０００））で得られた結果とは対照的であった。
【０１４３】
インビトロにおける感染力の増加は、ＰＥＩ（ＰＥＧなし）および他のポリカチオンを被覆したアデノウイルスで報告されている（ＭｃＫａｙら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．７：６４４−６５２（２０００））。２００ｎｍを超える粒子は、脾臓に蓄積することが示され、したがって、循環から効率的に取り除かれる（Ｌｉｔｚｉｎｇｅｒら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１１９０：９９−１０７（１９９４））。さらに、固形腫瘍のようなある標的組織への管外遊出には、３００ｎｍ未満の粒径が必要である（Ｈｏｂｂｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９５：４６０７−４６１２（１９９８））。一方、ＰＥＩ−ＰＥＧコポリマーの製剤はアデノウイルス凝集を起こさなかった。
【０１４４】
（インビトロにおける導入遺伝子発現）
インビトロにおける導入遺伝子の発現を、β−ガラクトシダーゼを発現する組換えアデノウイルス（図３Ｂ）を使用して、２つの同じ細胞株で調べた。感染力のアッセイと同様の方法で、細胞を、ＰＥＩ−ｍＰＥＧでカプセル化されたＢＧＣＧまたはＢＧＣＧで感染した。細胞を溶解し、導入遺伝子発現を、化学発光β−ガラクトシダーゼ・レポーター遺伝子アッセイキット（ロッシュ、マンハイム、ドイツ）を使用して分析した。要約すると、２４ｈ感染終了細胞をＰＢＳで洗浄し、中性洗剤で室温下３０分かけて溶解した。遠心分離によって細胞の破片を取り除いた後、５０μｌの希釈細胞抽出物を９６−ウェル化学発光アッセイプレートに移した。これに１００μｌの化学発光基質（ガラクトン・プラス）を加え、室温で１時間インキュベートした。次いで、アッセイプレートをＴＲ７１７マイクロプレートルミノメーター（Ｔｒｏｐｉｘ社、ベッドフォード、マサチューセッツ）で分析した。β−ガラクトシダーゼ濃度を、β−ガラクトシダーゼ標準（キットで提供されている）と比較して決定し、溶解物の総たんぱく質含量で正規化した。両細胞株に関して、導入遺伝子発現の増加は、ＰＥＩ−ｍＰＥＧカプセル化アデノウイルスが非カプセル化アデノウイルスを上回っていたことが見られた。増加は、Ｔ２４細胞について、２７％（Ａ）、１５７％（Ｂ）および１３０％（Ｃ）であり、Ａ５４９細胞について、４０％（Ａ）、６７％（Ｂ）および１４４％（Ｃ）であった。
【０１４５】
（実施例４）
（生体内分布とインビボにおける導入遺伝子発現）
生体内分布と導入遺伝子発現を、組換えアデノウイルスまたはカプセル化アデノウイルスをＢＡＬＢ／ｃマウスの尾静脈へ静脈内注射した後評価した。注射後３日で器官／組織を採取し、アデノウイルスＤＮＡの存在を定量的ＰＣＲによって分析し、β−ガラクトシダーゼ酵素活性を化学発光β−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子アッセイキットを使用して分析した。
【０１４６】
（生体内分布とインビボにおける導入遺伝子発現）
メスのＢＡＬＢ／ｃマウスの尾静脈に、ゆっくりと（２０秒で３００μｌ）ＰＥＩ−ｍＰＥＧでカプセル化されたＢＧＣＧまたはＢＧＣＧを注射した。投与して３日後動物を致死させ、肝臓および組織を切除した。組織は直ちにＯＣＴ中に置き、−７０℃で素早く凍結した。６μｍの切片をカットし、次いで、Ｘ−ｇａｌで染色した。各組織の切片を液体窒素中で素早く凍結した。投与グループ１つにつき３匹の動物とした。
【０１４７】
アデノウイルスＤＮＡの最も高い濃度が肝臓および脾臓で発見された。一方、最も低い量は腎臓で観察された（図４）。このパターンはＰＥＩ−ｍＰＥＧでカプセル化されたアデノウイルスについても本質的に同じままであった。アデノウイルスＤＮＡ濃度は、非カプセル化およびカプセル化アデノウイルスの両方に関し、用量依存的様式で全ての器官において増加した。同じ粒子数の非カプセル化およびカプセル化アデノウイルスを投与された動物に関し、ウイルスＤＮＡ濃度を比較すると、組織１ｍｇに対するアデノウイルスＤＮＡのコピー数の増加は、カプセル化アデノウイルスを受けたグループに見られた。平均増加は、肝臓が１．８倍、脾臓が２．９倍、腎臓が１．５倍、肺が２．７倍であった。
【０１４８】
（インビボにおける導入遺伝子の発現）
組織サンプルにおけるβ−ガラクトシダーゼ酵素活性：組織サンプルを溶解基質チューブ（ＱＢｉｏｇｅｎｅ社、カールズバッド、カリフォルニア）に押し込め、組織１００ｍｇ当たり０．２ｍＬの洗剤溶解緩衝液にプロテアーゼ阻害剤カクテルを加えたもの（β−Ｇａｌキットとして提供されている）を加えた。組織サンプルをＦａｓｔＰｒｅｐ組織ホモジナイザー（ＱＢｉｏｇｅｎｅ社、カールズバッド、カリフォルニア）中で溶解した。３回の凍結溶解サイクルにかけた後、溶解物を５０℃で１時間インキュベートし、内因性β−ガラクトシダーゼ活性を不活性化した。溶解物を１４，０００×ｇで１０分間遠心分離することによって清澄にした。上澄み液を取り除き、希釈したアリコートを、β−Ｇａｌ酵素活性について、化学発光β−ガラクトシダーゼ・レポーター遺伝子アッセイキット（ロッシュ、マンハイム、ドイツ）を使用して分析した。
【０１４９】
ウイルスＤＮＡレベルの評価：ＤＮＡを製造業者のプロトコルに従って、Ｔｒｉ−Ｒｅａｇｅｎｔ（モレキュラーリサーチセンター社）を使用して、組織約１００ｍｇから抽出した。ウイルスＤＮＡの定量を、Ｔａｑポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性を使用するリアルタイム定量ＰＣＲを使用して行い、ＰＣＲアンプリコン（Ｗｅｎ，Ｓ．Ｆ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．７：１４６９−１４８０（２０００））を検出した。ＢＧＣＧに加えて、マウスＧＡＰＤＨ  ＤＮＡの相対定量を評価し、ＤＮＡの一貫性と品質を裏付けた。
【０１５０】
ＰＣＲで使用したプライマー配列およびプローブ配列は以下の通りであった。ＢＧＣＧフォワードプライマー、５’−ＡＡＣＧＧＴＡＣＴＣＣＧＣＣＡＣＣ−３’（配列番号１）；ＢＧＣＧリバース、５’−ＡＣＴＧＧＴＴＡＧＡＣＧＣＣＴＴＴＣＴＣＧＡ−３’（配列番号２）；およびＢＧＣＧプローブ、ＦＡＭ−ＴＣＣＧＣＡＴＣＧＡＣＣＧＧＡＴＣＧＧ−ＴＡＭＲＡ（配列番号３）；マウスＧＡＰＤＨフォワード、５’ＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＣＧＡＧＴＣ−３’（配列番号４）およびＧＡＢＤＨ  ＧＡＰＤＨリバース５’−ＧＡＡＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＧＡＴＴＴＣ−３’（配列番号５）。プローブはＦＡＭ−ＣＡＡＧＣＴＴＣＣＣＧＴＴＣＴＣＡＧＣＣ−ＴＡＭＲＡ（配列番号６）であった。ＰＣＲ熱プロフィルは、５０℃で２分、９５℃で１０分、および９５℃で１５秒と６２℃で１分のサイクルを４０回であった。ウイルスＤＮＡ定量のために、ＢＧＣＧから単離された、希釈ウイルスＤＮＡをウイルスＤＮＡ標準として使用した。Ｑ−ＰＣＲからのデータは、ウイルスコピーの数／組織１ｍｇとして表した。検出限界は、約１０個のコピー／組織１ｍｇであった。
【０１５１】
導入遺伝子発現は、採取した組織のアリコートから調製した抽出物中のβ−ガラクトシダーゼ酵素活性を測定することによって分析した（図５）。非カプセル化アデノウイルスについては、β−Ｇａｌ活性を３×１０１０粒子を除いて全ての用量についてバックグランドレベルとした。３×１０９粒子を投与した１動物からの肝臓サンプルは１例外であり、バックグランド発現のダブリング（１４．６ｎｇ／組織１ｇ）を示した。対照的に、ＰＥＩ−ｍＰＥＧでカプセル化されたアデノウイルスを投与された動物は、用量範囲を通して用量依存性発現を示した。非カプセル化アデノウイルスと同様に、発現は肝臓において最も高く、次いで脾臓、最も低かったのは腎臓および肺においてであった。非カプセル化アデノウイルスを同用量与えられたグループと比較すると、カプセル化ウイルスを投与された動物の全組織において、発現における増加が観察された。最も大きな増加は動物の肝臓組織において見られた。すなわち、３×１０１０粒子を投与された動物は９．１倍、１×１０１０粒子（ＬＯＱ基準）を投与された動物は２７．２倍を超え、３×１０９粒子を投与された動物は２．６倍であった。
【０１５２】
肝臓における導入遺伝子発現は、組織の低温切片の組織学的分析によって視覚化した。この分析は、インビボにおける形質導入の頻度を評価するための手段として使用した。マウス数匹にＢＧＣＧを種々の用量で注射し、他のマウスにはＰＥＩ−ｍＰＥＧ−ＢＧＣＧを種々の用量で注射した。３×１０１０粒子を投与した動物は、導入遺伝子を発現する細胞の数は殆ど等しかったが、他の用量レベルでは、ＰＥＩ−ｍＰＥＧカプセル化ウイルスで処理された動物に増加した発現が観察された。非カプセル化アデノウイルスを投与された動物の肝臓において、ごく少ないポジティブ細胞が検出され、一方、ＰＥＩ−ｍＰＥＧカプセル化ｒＡｄを注射した場合、多数のポジティブ細胞が検出された。
【０１５３】
組換えアデノウイルスの静脈内注射によって、多種の免疫コンピテントマウス株において、高い非線形用量応答が得られた。これは種々の器官で観察されたが、最も報告されたのは、肝臓、静脈内注射後最も高い発現を示した器官（Ｚｉｅｇｌｅｒら、Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１３：９３５−９４５（２００２），Ｔａｏら、Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．３：２８−３５（２００１））であった。この効果は、クッパー細胞と細網内皮系の他の部位（Ｔａｏら、Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．３：２８−３５（２００１））によるアデノウイルスの優先的な取り込みによって明らかにされる「生物学的フィルター」の存在が原因と考えられる。クッパー細胞の消耗によって肝細胞における発現が増加し、このことは、これらの細胞中でアデノウイルスが孤立し分解するという仮説（Ｚｉｅｇｌｅｒら、Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１３：９３５−９４５（２００２），Ｔａｏら、Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．３：２８−３５（２００１））を支持する。さらに、無関係のアデノウイルスを同時投与することによって、導入遺伝子の発現が増加した。このことは、ＲＥＳ系は、容量に限界があり、ウイルスの高用量によって飽和されうる（Ｚｉｅｇｌｅｒら、Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１３：９３５−９４５（２００２））ことを示唆している。
【０１５４】
ＰＥＩ−ＰＥＧコポリマーによるアデノウイルスのカプセル化は、組換えアデノウイルスとＲＥＳの相互作用を減らし、ベクター系の治療的可能性を改善する実用的な方針を提供する。薬剤の投与後７２時間で、ウイルスＤＮＡレベルは、非カプセル化ウイルスを同じ用量静脈内に注射したものと比べて、カプセル化アデノウイルスを投与されものは全ての組織においてより高い値を示した。これは、ＰＥＩ−ＰＥＧによるカプセル化がアデノウイルスをクリアランスから保護することを示唆している。同時に、全分析組織における発現は増加されており、特に、肝臓において最も大きい増加が見られた。これらの発見は、ＰＥＩ−ＰＥＧカプセル化がＲＥＳ系による組換えアデノウイルスの取り込みと分解を減らすという作用の機構と一致し、したがって、ｒＡｄを標的組織により近づける結果、より高いウイルスＤＮＡレベルとより高い発現レベルの両方を得る。さらに、ＰＥＩ−ＰＥＧカプセル化は、肝臓における形質導入事象の回数を増やす。この効果は、ＲＥＳ系がアデノウイルス粒子で飽和されていない、低いウイルス用量〜中間ウイルス用量でより顕著である。より高い発現を達成するための用量の増加は、しばしば用量依存性毒性によって使用不可となるので、これは価値のある発見である。まとめると、これらの結果は、ＰＥＩ−ＰＥＧポリマーでカプセル化されたアデノウイルスは、アデノウイルス遺伝子治療ベクターの治療効果を改良する興味深い方針を提供することを示す。
【０１５５】
前記実施例は、本発明の説明のために提供されたもので、本発明の範囲を限定するものではない。本発明の他の変形も当業者には容易に明らかであり、添付される請求の範囲に包含される。本明細書に挙げられた全ての公報、特許および特許出願は、全ての目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【０１５６】
【図１】ＰＥＩ−ｍＰＥＧコポリマー合成の図式的な概略。分子量２５ｋＤａの分岐鎖状のポリエチレンイミン（ｘ＝２およびｙ＝１、平均で）をｍＰＥＧ−ＳＰＡ（５ｋＤａ）に、１３３ｍＭのホウ酸塩、１００ｍＭの塩化ナトリウムおよび０．７ｍＭのＥＤＴＡ中、ｐＨ８．４で反応させた。
【図２】組換えアデノウイルス（パネルＡ）およびＰＥＩ−ｍＰＥＧでカプセル化されたアデノウイルス（パネルＢ、カプセル化度Ｃ）の原料−Ｑアニオン交換クロマトグラム。グラフは、時間の関数として２６０ｎｍでの吸収を示す。挿入部分は、アデノウイルスのピーク（パネルＡ、ＲＴ＝１０．３７分）と通過中のカプセル化されたアデノウイルスのピーク（パネルＢ、ＲＴ＝０．６４分）の吸収スペクトルを示す。クロマトグラフの条件は、以下の通りであった。流速：１ｍＬ／分、緩衝液Ａ：５０ｍＭのヘペス、ｐＨ７．５、緩衝液Ｂ：緩衝液Ａ＋１．５ＭのＮａＣｌ、勾配：１０分で２０％Ｂから４０％Ｂ。
【図３】組換えアデノウイルスおよびＰＥＩ−ｍＰＥＧでカプセル化されたアデノウイルスのインビトロ感染力とβ−ガラクトシダーゼ発現。使用した細胞株は、Ｔ２４膀胱癌（白いバー）およびＡ５４９肺癌（黒いバー）であった。ＧＦＰ（パネルＡ）またはβ−ガラクトシダーゼ（パネルＢ）を発現する組換えアデノウイルスは、表１に記載されたウイルス粒子（ｒＡｄ（ｅｎｃ）Ａ、ｒＡｄ（ｅｎｃ）ＢおよびｒＡｄ（ｅｎｃ）Ｃ）に対するポリマーの３つの異なった比を使用して、ＰＥＩ−ｍＰＥＧでカプセル化した。また、処理されていない細胞（ＵＴ）およびカプセル化されていないアデノウイルスに感染した細胞（ｒＡｄ）も示す。
【図４】アデノウイルスまたはカプセル化されたアデノウイルスを異なった用量で静脈内投与されたＢＡＬＢ／ｃマウスの肝臓（黒いバー）、脾臓（対角方向にハッチングしたバー）、腎臓（水平にハッチングしたバー）および肺（白いバー）における組換えアデノウイルスＤＮＡに関する定量的ＰＣＲ結果。ウイルスを、ウイルス粒子に対し最も高いＰＥＩ−ｍＰＥＧ比（表１中Ｃ）でカプセル化した。グループには、１匹の動物に３×１０１０、ｌ×１０１０、および３×１０９個のウイルス粒子を注射した。１グループにつき３匹の動物に投与した。
【図５】アデノウイルスまたはカプセル化されたアデノウイルスを異なった用量で静脈内投与されたＢＡＬＢ／ｃマウスの肝臓（黒いバー）、脾臓（対角方向にハッチングしたバー）、腎臓（水平にハッチングしたバー）および肺（白いバー）におけるβ−ガラクトシダーゼ活性。ウイルスを、ウイルス粒子に対し最も高いＰＥＩ−ｍＰＥＧ比（表１中Ｃ）でカプセル化した。グループには、１匹の動物に３×１０１０、ｌ×１０１０、および３×１０９個のウイルス粒子を注射した。１グループにつき３匹の動物に投与した。アッセイにおいてはバックグラウンドが異なるため、定量限界は、肝臓抽出物で７．７ｎｇ／ｇ組織、その他の組織は０．１ｎｇ／ｇとした。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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