(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃｒｅタンパク質／ｌｏｘＰ配列、ＦＬＰタンパク質／ＦＲＴ配列、及び、ｐＳＲ１リコンビネース／ｐＳＲ１リコンビネース標的配列、からなる群から選択される、リコンビネースタンパク質／リコンビネース標的配列システムの利用により、リコンビネースタンパク質の発現に応じてゲノム中のセリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子のＤＮＡ領域の一部または全部を改変することにより、時期特異的及び／又は組織特異的にスフィンゴ脂質合成の一部又は全部を不活化した、非ヒト  コンディショナルノックアウト哺乳動物。
【請求項２】
リコンビネースタンパク質がＣｒｅタンパク質であり、リコンビネース標的配列がｌｏｘＰである、請求項１に記載のコンディショナルノックアウトマウス哺乳動物。
【請求項３】
セリンパルミトイルトランスフェラーゼのサブユニットをコードする遺伝子Ｌｃｂ２の一部または全部が改変されている、請求項１または２に記載のコンディショナルノックアウト哺乳動物。
【請求項４】
セリンパルミトイルトランスフェラーゼのサブユニットをコードする遺伝子Ｌｃｂ２のエクソン３の一部または全部が改変されている、請求項１ないし３のいずれか１項に記載のコンディショナルノックアウト哺乳動物。
【請求項５】
表皮細胞特異的にスフィンゴ脂質合成の一部又は全部を不活化した、請求項１ないし４のいずれか１項に記載のコンディショナルノックアウト哺乳動物。
【請求項６】
Ｔ細胞特異的にスフィンゴ脂質合成の一部又は全部を不活化した、請求項１ないし４のいずれか１項に記載のコンディショナルノックアウト哺乳動物。
【請求項７】
マウスである、請求項１ないし６のいずれか１項に記載のコンディショナルノックアウト哺乳動物。
【請求項８】
時期特異的及び／又は組織特異的に、スフィンゴ脂質合成の一部又は全部を不活化した、非ヒト  コンディショナルノックアウト哺乳動物の作製方法であって、
１）セリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子のゲノムＤＮＡ領域の一部又は全部をリコンビネース標的配列で挟んだ配列を有し、前記配列でセリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子のゲノムＤＮＡ領域の一部又は全部を相同組換えすることを特徴とするターゲティングベクターを作製し；
２）胚性幹細胞に前記ターゲティングベクターを形質導入し、セリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子のゲノムＤＮＡ領域の一部又は全部の相同組換えを生じさせ、
３）前記相同組換えを生じた胚性幹細胞を用いて、リコンビネース標的配列を含む改変セリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子を有する遺伝子改変動物を作製し；そして
４）前記遺伝子改変動物を、時期特異的及び／又は組織特異的にリコンビネースタンパク質を発現するリコンビネース発現遺伝子改変動物と交配して、セリンパルミトイルトランスフェラーゼタンパク質の発現が時期特異的及び／又は組織特異的に抑制される非ヒト哺乳動物を得る
ことを含む前記作製方法。
【請求項９】
リコンビネースタンパク質がＣｒｅタンパク質であり、リコンビネース標的配列がｌｏｘＰである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ターゲティングベクターが、さらにターゲティングベクターが染色体に導入された胚性幹細胞のみを選別するための配列、及び／又は、非相同組換えを生じた胚性幹細胞を選択的に除くための配列を含む、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
工程３）が、ターゲティングベクターが導入された染色体に胚性幹細胞のみを選別するための配列を、染色体ＤＮＡから削除する工程を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項８ないし１１のいずれか１項の作製方法に使用するための、リコンビネース標的配列を含む改変セリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子を有する遺伝子改変動物。
【請求項１３】
時期特異的及び／又は組織特異的に、スフィンゴ脂質合成の一部又は全部を不活化した、非ヒト  コンディショナルノックアウト哺乳動物の作製方法に使用するためのターゲティングベクターであって、セリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子のゲノムＤＮＡ領域の一部又は全部をリコンビネース標的配列で挟んだ配列を含み、前記配列でセリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子のゲノムＤＮＡ領域の一部又は全部を相同組換えすることを特徴とする、前記ターゲティングベクター。
【請求項１４】
さらにターゲティングベクターが染色体に導入された胚性幹細胞のみを選択するための配列、及び／又は、非相同組換えを生じた胚性幹細胞を除くための選択のための配列を含む、請求項１３に記載のターゲティングベクター。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、スフィンゴ脂質合成のコンディショナルノックアウト哺乳動物およびその作製方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
スフィンゴ脂質
スフィンゴ脂質は、スフィンゴリピドとも言われ、スフィンゴシンなど長鎖塩基をもつ脂質の総称であり、グリセロールを含む脂質、即ちグリセロ脂質と大別して用いられる。主としてスフィンゴ糖脂質とスフィンゴリン脂質から成る、下等動物から高等動物に至るまで広く分布する脂質である。脂肪酸が、スフィンゴシン糖の長鎖塩基のＣ−２位のアミノ基と酸アミド結合しているのが特徴的である。グリセロ脂質と異なりリパーゼなどに対して極めて安定であり、また特にクロロホルム−メタノール混合溶液に可溶である。
【０００３】
スフィンゴ糖脂質は、スフィンゴ脂質のうち分子内に糖を含む一群（糖脂質）である。スフィンゴ糖脂質は糖と長鎖脂肪酸の他に長鎖塩基であるスフィンゴシンまたはフィトスフィンゴシン、その他を含む。比較的単純なスフィンゴ糖脂質は脳や腎臓などで見出されるセレブロシドである。さらにそれに硫酸基のついたスルファチド、中性糖が数分子ついたセラミドオリゴヘキソシド、アミノ糖のついたグロボシド、シアル酸のついたガングリオシドの類も、スフィンゴ糖脂質の範疇に含まれる。
【０００４】
スフィンゴリン脂質は、スフィンゴ脂質の一群で、特に、リン（リン酸、ホスホン酸等）を含有するものを総称する。主にセラミド１−リン酸の誘導体とセラミド１−ホスホン酸の誘導体に分けられる。例えば、前者にはスフィンゴミエリン、後者にはセラミドシリアチン（セラミドアミノエチルホスホン酸）が含まれる。狭義には、前者のみをスフィンゴリン脂質とし、後者をスフィンゴホスホノ脂質として区別する場合もある。
【０００５】
スフィンゴ脂質の生合成
スフィンゴ脂質の生合成経路は、よく研究されている（図１）。先ず、セリンとパルミトイルＣｏＡを出発物質とし、４段階の工程を経てセラミド（Ｎ−アシルスフィンゴシン）が合成される。次いで、セラミドに、先ずグルゴシルトランスフェラーゼ（ＧｌｃＴ−１）によりＵＤＰグルコースからグルコースが転移されることで、グルコシルセラミドが合成される。グルコシルセラミドを出発物質としてスフィンゴ糖脂質の生合成が始まり、ガラクトシルトランスフェラーゼ（Ｇａｌ−Ｔ）に代表される種々の糖転移酵素の働きを順次受けて、ガングリオ系列（Ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅｓ）、グロボ系列（Ｇｌｏｂｏｓｉｄｅｓ）、ラクト系列（Ｌａｃｔｏｓｉｄｅｓ）等のスフィンゴ糖脂質が得られる。また、セラミドに初めにグルコースの代わりに、ＵＤＰガラクトース：セラミドガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧＣＴ）によってガラクトースが転移された場合には、ガラクトシルセラミドが得られる。一方、スフィンゴリン脂質も、セラミドを出発物質として、例えば、その第一級アルコール性ヒドロキシル基にコリンリン酸（例えば、ホスファチジルコリン由来）がスフィンゴミエリン合成酵素によってリン酸ジエステル結合することにより、スフィンゴミエリンが得られる。
【０００６】
スフィンゴ脂質の機能
スフィンゴ脂質の現在知られている機能としては、主に１）細胞膜構成成分としての機能、そして２）シグナル伝達物質としての機能が含まれる。
【０００７】
１）細胞膜構成成分としての機能
スフィンゴ脂質は、細胞膜構成成分、特に情報伝達の場を提供するための細胞膜構成成分としての機能を有する。
【０００８】
細胞は細胞膜によって外界から隔離されたユニットと捉えることができる。細胞膜は細胞ごとに変動はあるものの、おおむね約５０％の脂質と約５０％のタンパク質から構成されている。細胞膜を構成する脂質には、リン脂質、糖脂質、ステロールがある、リン脂質としては、フォスファチジルコリン等のグリセロール骨格を有するフォスフォグリセリドの他に、本発明に関するスフィンゴ脂質が含まれる。また、糖脂質としてもスフィンゴシンを骨格としてグルコース、ガラクトースなどの糖を含む、若しくはシアル酸による修飾を受けている、スフィンゴ糖脂質が含まれる。リン脂質、糖脂質、ステロール等の脂質は、非極性基を互いにつきあわせて極性基を外に向けた二重膜構造を形成している。
【０００９】
細胞膜の脂質構成は一定でなく、不均一性が存在していることが知られている。例えば、上皮細胞の頂端部と側底部側の細胞膜の脂質構成には違いがあり、糖脂質は頂端部に多く分布している。特に近年、より局所的に脂質構成を有する細胞膜のドメインの存在が知られるようになった。そのような局在性ドメインの代表例としてカベオラとラフトがある。
【００１０】
「カベオラ」は、上皮細胞など種々の細胞の細胞膜直下に存在する細胞内構築物である。５０−１００ｎｍ程度のフラスコ状、または細胞膜に開口した陥入状構造をとる。分泌顆粒や貧食顆粒と異なり常に細胞膜下にとどまって存在し、細胞膜上のミクロドメインの形成にも重要と考えられている。生化学的には界面活性剤であるトリトンＸ−１００の不溶画分として精製され、細胞膜と異なる特徴的な物質組成を有し、脂質ではスフィンゴミエリンに、タンパク質（カベオリン）はグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ：ｇｌｙｃｏｓｙｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ  ｉｎｏｓｉｔｏｌ）アンカー型タンパク質に富む。カベオラの機能としては、葉酸トランスポーターやｃＡＭＰ結合タンパク質等の低分子の取り込み（ポトサイトーシス）、細胞表面でのシグナル変換・伝達、細胞内コントロール輸送等への関与が示唆されている。
【００１１】
「ラフト」は、スフィンゴ脂質とコレステロールに富み、タンパク質の選別に関与する膜ドメインとして提唱された。スフィンゴ脂質は脂肪酸部分（アシル鎖）が飽和型であることが多く、脂質二重層の中で固くパックしていると考えられる。一方、リン脂質はシス型の不飽和アシル鎖をもっており、この部分がねじれているためにリン脂質同士はパックしにくい状態になっていて、流動性の高い相を形成している。その上、コレステロールのステロイド環は飽和アシル鎖と相互作用しやすいため、コレステロールは不飽和アシル鎖をもつリン脂質よりも飽和アシル鎖をもつスフィンゴ脂質により結合しやすい。スフィンゴ脂質は互いの糖鎖間、スフィンゴシン骨格間でファンデルワールス力および水素結合力によって結合している。スフィンゴ脂質間の間隙は飽和脂肪酸によって非共有結合で相互作用するコレステロールによって埋められている。即ち、リン脂質が多い環境下でスフィンゴ脂質とコレステロールは固くパックされたマイクロドメインを形成すると考えられている。
【００１２】
ラフトはその構造から、非イオン性の界面活性剤に溶けにくく、比重が軽いという性質を示す。そのため、細胞を界面活性剤で可溶化後、ショ糖密度勾配法を用いて遠心すると、ラフトは低比重の画分に浮上し、他の可溶性の細胞膜構成成分からこのドメインを分画することができる。これまでショ糖密度勾配法での分画により、ラフトの脂質およびそこに存在するタンパク質の解析がなされている。ＧＰＩアンカー型タンパク質をはじめ、膜に存在する細胞質タンパク質であるＳｒｃ型チロシンキナーゼなど、特徴ある分子が局在することが示されている。このラフトの性質から細胞膜上のマイクロドメインに特定の分子群を集めてその他の分子を除外する働きを有することが示唆されている。即ち、ラフトにはシグナル伝達物質などの様々な蛋白質が局在していて、細胞内の物質の移動や情報伝達の場として機能している、と考えられている。
【００１３】
カベオラとラフトは、その脂質組成や可溶化剤に不溶性の性質を示すなど、性質の似た構造を示す。また、密度勾配遠心法を利用した精製においても、カベオラとラフトは類似の挙動を示すため、両者が完全に分離しているとは考えにくい。よって、両者が示すと考えられている機能の関係については、充分には解明されていない段階である。但し、リンパ球については、カベオラの構造維持に必須のカベオリンタンパク質を有せず、カベオラは認められない。一方、ラフトはリンパ球にも認められる。よって、ラフトはカベオラ内にもカベオラ外の細胞膜にも存在するものと考えられている。
【００１４】
「カベオラとラフト」藤本ら、細胞工学  Ｖｏｌ．１８，Ｎｏ．８，１９９９，ｐ．１１５５−１１６１；「Ｔ細胞抗原受容体シグナル伝達におけるラフトの役割」安田ら、蛋白質  核酸  酵素  Ｖｏｌ．４５，Ｎｏ．１１（２０００），ｐ．１８１２−１８２２。
【００１５】
２）シグナル伝達物質としての機能
スフィンゴ脂質の代謝産物（セラミド及びスフィンゴシン１−リン酸）は、生存、細胞死や分化等における細胞間あるいは細胞シグナル分子として大変注目されている。
【００１６】
具体的には、セラミドは様々なストレス又は薬剤（例えば、抗癌剤）によるアポトーシスにおける脂質メディエーターとして重要な役割を果たしている。スフィンゴシン１−リン酸は、血管内皮細胞表面上にその特異的レセプター（血管内皮細胞分化遺伝子（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｇｅｎｅ）（Ｅｄｇファミリー））が発現しており、血管形成等で重要な働きをすることがわかっている。
【００１７】
スフィンゴ脂質合成機能のノックアウト
上述したように、スフィンゴ脂質は細胞膜構成成分として、又は、シグナル伝達物質として重要な生体機能を担っていると考えられている。しかしながら、実際の個体レベルでの機能に関してはほとんど調べられていない。
【００１８】
Ｈａｎａｄａら（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．２６７，１９９２，ｐ．２３５２７−２３５３３）はＣＨＯ細胞由来の温度感受性変異株ＳＰＢ−１を用いて、細胞内でのスフィンゴ脂質全体の合成の役割を記載している。具体的は、本明細書の図１において、スフィンゴ脂質合成の一番最初の工程として、セリンパルミトイルトランスフェラーゼ酵素（ＳＰＴ）によって、パルミトイルＣｏＡと非必須アミノ酸Ｌ−セリンが縮重合し、３−ケトスフィンガニンが合成される。ＳＰＴは、Ｌｃｂ１とＬｃｂ２の２種のサブユニットからなるヘテロダイマーである。Ｈａｎａｄａらは、これらのうちサブユニットＬｃｂ１サブユニットが、非許容温度になると機能しなくなるような変異株を樹立した。Ｌｃｂ１変異遺伝子を有する温度変異株ＳＰＢ−１は、非許容温度下におくと細胞死が引き起こされた。
【００１９】
個体レベルでのスフィンゴ脂質の機能を解析するためには、スフィンゴ脂質の合成を支配している酵素の遺伝子を人為的に破壊した、いわゆるノックアウト動物を作成することが考えられる。しかしながら、上記Ｈａｎａｄａらの論文からも示唆されるように、スフィンゴ脂質は細胞の生存に必須な膜構成成分であることから、スフィンゴ脂質全体の合成を支配している酵素のＳＰＴ遺伝子（Ｌｃｂ１又は２）を不活化したノックアウト動物は胎生致死であると予想される。その為、スフィンゴ脂質合成を時期特異的にあるいは組織特異的に（コンディショナルに）制御可能なノックアウト動物の作成が必要となる。
【００２０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、スフィンゴ脂質合成のコンディショナルノックアウト哺乳動物を提供することを目的とする。本発明のコンディショナルノックアウト哺乳動物は、ゲノム中のセリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子のＤＮＡ領域の一部または全部を改変することにより、時期特異的及び／又は組織特異的にスフィンゴ脂質合成の一部又は全部を不活化したことを特徴とする。
【００２１】
本発明のコンディショナルノックアウト哺乳動物は、好ましくは、リコンビネースタンパク質／リコンビネース標的配列システムの利用により、リコンビネースタンパク質の発現に応じてゲノム中のセリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子のＤＮＡ領域の一部または全部を改変することによって作製される。
【００２２】
本発明のコンディショナルノックアウト哺乳動物は、好ましくはマウスである。
本発明はまた、時期特異的及び／又は組織特異的に、スフィンゴ脂質合成の一部又は全部を不活化した、非ヒト  コンディショナルノックアウト哺乳動物の作製方法を提供することを目的とする。本発明の作製方法は、
１）セリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子のゲノムＤＮＡ領域の一部又は全部をリコンビネース標的配列で挟んだ配列を有し、前記配列でセリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子のゲノムＤＮＡ領域の一部又は全部を相同組換えすることを特徴とするターゲティングベクターを作製し；
２）胚性幹細胞に前記ターゲティングベクターを形質導入し、セリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子のゲノムＤＮＡ領域の一部又は全部の相同組換えを生じさせ、
３）前記相同組換えを生じた胚性幹細胞を用いて、リコンビネース標的配列を含む改変セリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子を有する遺伝子改変動物を作製し；そして
４）前記遺伝子改変動物を、時期特異的及び／又は組織特異的にリコンビネースタンパク質を発現するリコンビネース発現遺伝子改変動物と交配して、セリンパルミトイルトランスフェラーゼタンパク質の発現が時期特異的及び／又は組織特異的に抑制された非ヒト哺乳動物を得る
ことを含むことを特徴とする。
【００２３】
本発明はさらに、前記コンディショナルノックアウト哺乳動物の作製方法に使用するための、リコンビネース標的配列を含む改変セリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子を有する遺伝子改変動物を提供することを目的とする。
【００２４】
本発明はさらにまた、前記非ヒト  コンディショナルノックアウト哺乳動物の作製方法に使用するためのターゲティングベクターを提供することを目的とする。本発明のターゲティングベクターは、セリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子のゲノムＤＮＡ領域の一部又は全部をリコンビネース標的配列で挟んだ配列を含み、前記配列でセリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子のゲノムＤＮＡ領域の一部又は全部を相同組換えすることを特徴とする。
【００２５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記問題を解決するために鋭意研究に努めた結果、スフィンゴ脂質の生合成を組織特異的もしくは時期特異的に停止させるノックアウトマウスを作製することに成功し、本発明を相当した。
【００２６】
スフィンゴ脂質合成のコンディショナルノックアウト哺乳動物
本発明は、スフィンゴ脂質合成のコンディショナルノックアウト哺乳動物を提供する。本発明のコンディショナルノックアウト哺乳動物は、ゲノム中のセリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子のＤＮＡ領域の一部または全部を改変することにより、時期特異的及び／又は組織特異的にスフィンゴ脂質合成の一部又は全部を不活化していることを特徴とする。
【００２７】
本明細書において、「セリンパルミトイルトランスフェラーゼ」は、スフィンゴ脂質合成の一番最初の工程において、パルミトイルＣｏＡと非必須アミノ酸Ｌ−セリンとを縮重合し、３−ケトスフィンガニンを合成する酵素である。セリンパルミトイルトランスフェラーゼは、ＳＰＴは、Ｌｃｂ１とＬｃｂ２の２種のサブユニットからなるヘテロダイマーである。Ｌｃｂ１については、例えば、Ｈａｎａｄａ，Ｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．２７２（５１），  １９９７，  ｐ．３２１０８−３２１１４にマウスＬｃｂ１のｃＤＮＡ配列がＧｅｎｅ  ｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＦ００３８２３して寄託されたことが記載されており、推定アミノ酸配列が開示されている。Ｌｃｂ２は、例えば、Ｎａｇｉｅｃ，Ｍ．Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １９９６  Ｏｃｔ  ２４；１７７（１−２）：２３７−４１には、マウスＬｃｂ２のｃＤＮＡ配列がＧｅｎｅ  ｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｕ２７４５５として寄託されたことが記載されており、推定アミノ酸配列が開示されている。本明細書において後述する配列表中において、Ｌｃｂ２のアミノ酸配列を配列番号１、ｃＤＮＡの塩基配列を配列番号２として各々記載する。また、前述のＮａｇｉｅｃ，Ｍ．Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １９９６は、ヒトＬｃｂ２とマウスＬｃｂ２のアミノ酸配列を、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓ．ｐｏｍｂｅ等の酵母由来のＬｃｂ２と併せて比較している。スフィンゴ脂質は下等動物から高等動物に至るまで広く分布する脂質であり、ＳＰＴのサブユニットＬｃｂ２も酵母からヒトまで存在し、高い相同性を示す。
【００２８】
Ｌｃｂ２は、ＳＰＴの酵素活性を担っている、即ち活性部位を含むサブユニットであり、そして、Ｌｃｂ１は、活性を制御するサブユニットであると考えられている。よって、本発明においてＳＰＴを不活化するためには、Ｌｃｂ２をコードする遺伝子の一部または全部に変異を施すのが好ましいが、これに限定されない。前述のＨａｎａｄａらの論文（１９９２）では、Ｌｃｂ１サブユニットをコードする遺伝子に変異を施した温度変異株で細胞死が引き起こされたことからも、Ｌｃｂ１に変異を施してＳＰＴを不活化させることも可能である。
【００２９】
セリンパルミトイルトランスフェラーゼが実質的に不活化されれば、本発明において改変されるのは、ゲノム中のセリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子のＤＮＡ領域の全部であっても一部であってもよい。変異が導入される部分がＬｃｂ１遺伝子またはＬｃｂ２遺伝子の３’側であって、Ｌｃｂ１遺伝子またはＬｃｂ２遺伝子の５’側部分は正常に転写、翻訳される場合、Ｌｃｂ１またはＬｃｂ２のＮ末端側は機能可能なように発現する、即ち、セリンパルミトイルトランスフェラーゼ活性が一部残存する可能性がある。よって、限定されるわけではないが、変異が導入される部分は、Ｌｃｂ１遺伝子またはＬｃｂ２遺伝子の５’側が好ましい。
【００３０】
一方、開始コドンを含む５’側上流の部分、即ち、ゲノム中の転写または翻訳を制御するための核酸配列を含む部位、例えば、転写プロモーター、オペレーター、又はエンハンサー、ｍＲＮＡリボソーム結合部位、及び、その他、転写および翻訳の開始を調節する部位を含む領域に変異を施すと、Ｌｃｂ１またはＬｃｂ２遺伝子がコンディショナルにではなく完全に不活化して全く発現しなくなる場合がありうる。これは、一定条件下、即ち、時期特異的及び／又は組織特異的にのみスフィンゴ脂質合成の一部又は全部を不活化した、コンディショナルノックアウトされた非ヒト哺乳動物を得るという本発明の目的を達成できなくなる。よって、限定されるわけではないが、このような領域に変異を導入するのは好ましくない。
【００３１】
以上より、非限定的に、Ｌｃｂ１遺伝子またはＬｃｂ２遺伝子のゲノム中、開始部位より下流において、好ましくは半分より５’上流側、より好ましくは１／３より上流側に変異を施す。例えば、Ｌｃｂ２ゲノムはエクソン１からエクソン１２からなると推定されているが、好ましくはエクソン１−エクソン６の範囲内において、より好ましくはエクソン３−エクソン５の範囲内において変異を導入する。本明細書において後述する実施例においてはマウスＬｃｂ２ゲノムのエクソン３を改変するように変異を導入することによって、時期特異的及び／又は組織特異的にのみスフィンゴ脂質合成の一部又は全部を不活化した、コンディショナルノックアウトマウスを得ることに成功した。
【００３２】
また、本明細書においては、スフィンゴ脂質合成の一番最初の工程において、パルミトイルＣｏＡと非必須アミノ酸Ｌ−セリンとを縮重合し、３−ケトスフィンガニンを合成する酵素、セリンパルミトイルトランスフェラーゼ酵素に変異を施してスフィンゴ脂質合成の一部又は全部を不活化させた。３−ケトスフィンガニンより続いてセラミドが合成されるまでの経路は、全てのスフィンゴ脂質合成に共通する経路である（図１）。よって、図１において、３−ケトスフィンガニンよりスフィンガニンが合成される工程、スフィンガニンからＮ−アシルスフィンガニンが合成される工程そしてＮ−アシルスフィンガニンからセラミド合成する工程の、各工程に関与する各酵素をコードする遺伝子を改変することによっても、同様にスフィンゴ脂質合成の一部又は全部を不活化させることが可能である。
【００３３】
本発明において、「ゲノム中のセリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子のＤＮＡ領域の一部または全部を改変する」とは、セリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子のゲノムＤＮＡの一部に変更、削除、置換を生じさせること、あるいは特定の範囲の領域の逆位をさせること等を言う。セリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子を機能不能にするためには、セリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子に対して、変更、削除、挿入または置換のうち２またはそれ以上の方法を同時に使用してもよい。また、改変を生じさせるセリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子は、１つの遺伝子のみに限られず、２以上の遺伝子、例えばＬｃｂ１及びＬｃｂ２遺伝子の双方について同時に改変を生じさせてもよい。
【００３４】
本発明において、ゲノムＤＮＡの「変更」とは、セリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子のゲノムＤＮＡ配列中に１またはそれ以上の塩基置換を導入し、当該変更したセリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子の発現産物がセリンパルミトイルトランスフェラーゼとして機能しないようにすることをいう。本発明においてゲノムＤＮＡの「削除」とは、セリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子のゲノムの一部または全部を欠失させることにより、セリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子の発現産物がセリンパルミトイルトランスフェラーゼとして機能しないかまたは存在しないようにすることをいう。本発明において、ゲノムＤＮＡに対して「挿入」とは、セリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子中に、セリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子以外の配列を有するＤＮＡを挿入することにより、当該セリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子以外のＤＮＡを挿入したセリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子の発現産物がセリンパルミトイルトランスフェラーゼとして機能しないようにすることをいう。本発明において、ゲノムＤＮＡの「置換」とは、セリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子のゲノムの一部または全部をセリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子とは関連しない別個の配列により置換し、セリンパルミトイルトランスフェラーゼの発現産物がセリンパルミトイルトランスフェラーゼとして機能しないかまたは存在しないようにすることをいう。
【００３５】
本発明のノックアウトマウスは、特に、時期特異的及び／又は組織特異的に、即ち、コンディショナルにスフィンゴ脂質合成の一部又は全部を不活化させていることを特徴とする。時期特異的及び／又は組織特異的に遺伝子の発現を制御するする一般的な方法として、例えば、Ａ）リコンビネースタンパク質／リコンビネース標的配列システムを利用した遺伝子組換え誘導型の方法、Ｂ）テトラサイクリンアクティベーターなどを用いた遺伝子発現制御型の方法、並びにＡ）及びＢ）を組み合わせた方法などが知られている（例えば、別冊  実験医学  ザ・プロトコールシリーズ  「ジーンターデティングの最新技術」（２０００年、羊土社）コンディショナルターゲティング法ｐ．１１５−１２０；バイオマニュアルシリーズ８  「ジーンターゲティング」−ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製（１９９５年、羊土社）ｐ．７１−７７）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，第３版，ＣＯＬＤ  ＳＰＲＩＮＧ  ＨＡＲＢＯＲ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＰＲＥＳＳ，２００１年，４．８２−４．８５）。
【００３６】
Ａ）のリコンビネースタンパク質／リコンビネース標的配列システムを利用した、遺伝子組換え誘導型の方法は、特定のリコンビネースタンパク質がリコンビネース標的配列を認識し、その部分でＤＮＡの組換えを起こすことを利用するものである。リコンビネース標的配列は特定のリコンビネースが存在しない限り組換えを起こさない。よって、リコンビネースタンパク質を時期特異的及び／又は組織特異的発現させた非ヒト遺伝子改変哺乳動物と、リコンビネース標的配列が導入された同種の非ヒト遺伝子改変哺乳動物とを掛け合わせ、リコンビネースによる組換えを時期特異的及び／又は組織特異的に生じさせ、所期の遺伝子を時期特異的及び／又は組織特異的に制御することを可能にする。限定されるわけではないが、バクテリオファージＰ１由来のＣｒｅリコンビネースタンパク質とＣｒｅタンパク質によって認識される３４塩基対のｌｏｘＰ配列を利用したＣｒｅ／ｌｏｘＰシステムが好ましい。その他、酵母由来のＦＬＰ／ＦＲＴシステム（Ｊｕｎｇ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６５，ｐ．１０３−、１９９４）（哺乳動物細胞、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）でも相同組換えを生じる）、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｕｘｉｉのｐＳＲ１リコンビネース（酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅで機能しうる）等も知られている。リコンビネースタンパク質／リコンビネース標的配列システムを利用したコンディショナルノックアウトされた非ヒト哺乳動物の作製方法については、作製方法の項でさらに詳述する。
【００３７】
Ｂ）の遺伝子発現制御型の方法は、特定遺伝子欠損哺乳動物に、欠損させた遺伝子を改変遺伝子の導入によりレスキューさせる方法を利用する。遺伝子発現系をレスキューする際、テトラサイクリンアクティベーター（ＴＥＴ−Ａ）等のトランスアクティベーター制御下で、欠損させた遺伝子そのものを発現させる。その際、ＴＥＴ−Ａ遺伝子は、欠損遺伝子と同じ発現様式をもつことが必要となるので、ジーンターゲティングの際ノックインにより、ＴＥＴ−Ａ遺伝子を導入する。このノックインされたＴＥＴ−Ａ遺伝子は遺伝子欠損させられた遺伝子の発現系を利用して発現したＴＥＴ−Ａが、トランスジェニックで導入したｔｅｔプロモーターに働き、欠損遺伝子を発現する。即ち、特定遺伝子発現をＴＥＴ−Ａとｔｅｔプロモーターを介して行わせるマウスを作製する。ＴＥＴ−Ａは外部よりテトラサイクリンを添加することにより、ｔｅｔプロモーターに作用できなくなり、よってテトラサイクリンの添加する組織および時期で特定遺伝子を欠損させることができるというものである。この方法は、テトラサイクリンの人為的な導入を工夫することにより、遺伝子欠損を調節でき、またテトラサイクリンの添加を止めることにより遺伝子発現を回復させることができるため、パルスとして遺伝子欠損を行わせるなどの系が可能となる。
【００３８】
本発明は、特に、表皮細胞特異的にスフィンゴ脂質合成の一部又は全部を不活化したコンディショナルノックアウト哺乳動物、及びＴ細胞特異的にスフィンゴ脂質合成の一部又は全部を不活化したコンディショナルノックアウト哺乳動物を含む。これらは、例えば、リコンビネースタンパク質／リコンビネース標的配列システムを利用し、表皮細胞特異的に、又はＴ細胞特異的にリコンビネースを発現する遺伝子改変動物を利用することにより得ることが可能である。
【００３９】
本発明のコンディショナルノックアウト哺乳動物は、非ヒトの哺乳動物であり、好ましくはマウス、ラット、ヤギ、ウシ、ブタ、ウサギ、ヒツジ等である。取扱いが容易で、実験系が確立しているマウスが最も好ましい。また、本発明のノックアアウト哺乳動物は成体のみならず、ＥＳ細胞、受精卵、８細胞期から胚盤胞形成そして出生直前までの胚、卵、精子、組織・器官培養物、キメラ動物等の全ての態様を含む。これらは、保存のため、必要に応じ冷凍されて状態であってもよい。
【００４０】
非ヒト  コンディショナルノックアウト哺乳動物の作製方法
本発明はさらに、時期特異的及び／又は組織特異的に、スフィンゴ脂質合成の一部又は全部を不活化した、非ヒト  コンディショナルノックアウト哺乳動物の作製方法を提供する。本発明の作製方法は、
１）セリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子のゲノムＤＮＡ領域の一部又は全部をリコンビネース標的配列で挟んだ配列を有し、前記配列でセリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子のゲノムＤＮＡ領域の一部又は全部を相同組換えすることを特徴とするターゲティングベクターを作製し；
２）胚性幹細胞に前記ターゲティングベクターを形質導入し、セリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子のゲノムＤＮＡ領域の一部又は全部の相同組換えを生じさせ、
３）前記相同組換えを生じた胚性幹細胞を用いて、リコンビネース標的配列を含む改変セリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子を有する遺伝子改変動物を作製し；そして
４）前記遺伝子改変動物を、時期特異的及び／又は組織特異的にリコンビネースタンパク質を発現するリコンビネース発現遺伝子改変動物と交配して、セリンパルミトイルトランスフェラーゼタンパク質の発現が時期特異的及び／又は組織特異的に抑制される非ヒト哺乳動物を得る
ことを含む
ことを特徴とする。
【００４１】
上述した本発明の非ヒト  コンディショナルノックアウト哺乳動物は、限定されるわけではないが、好ましくは、リコンビネースタンパク質／リコンビネース標的配列システムを利用した本発明の作製方法によって作製される。限定されるわけではないが、本発明の説明のために、本発明のリコンビネースタンパク質／リコンビネース標的配列システムを利用したコンディショナルノックアウトの例の概念図を図２に示す。
【００４２】
１．セリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子のゲノムＤＮＡ
ゲノムＤＮＡは、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）の相同組換えを行うための、ターゲティングベクターを構築するために使用する。従って、ゲノムＤＮＡは、相同組換えを行うときにより効率よく組換えが生じるよう、作製しようとするＥＳ細胞が由来する動物種と同一の動物種から単離、使用することが望ましい。より望ましくは、相同組換えの効率をさらに上げるために、ＥＳ細胞が由来する同一種の動物のうち同じ系統の動物から、ゲノムＤＮＡを単離して使用する。同種であっても系統が異なるとゲノム中にＤＮＡの配列変異が散在し、それらの変異が相同組換えの確率を下げる可能性があるからである。
【００４３】
例えば、マウス  セリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子（Ｌｃｂ１又はＬｃｂ２）のゲノムクローンを採取する場合には、マウス由来のｃＤＮＡプローブまたはゲノムＤＮＡプローブを使用して、マウスゲノムライブラリーからスクリーニングすることができる。ｃＤＮＡプローブを使用する場合は、目的とする  セリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子についてのｃＤＮＡの全長を使用しても、その一部を使用してもよい。あるいは、既知のマウス  セリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子の配列に基づいて作製した合成オリゴヌクレオチドをプローブとしてもよい。
【００４４】
具体的には、Ｌｃｂ１については、例えば、Ｈａｎａｄａ，Ｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．２７２（５１），  １９９７，  ｐ．３２１０８−３２１１４にマウスＬｃｂ１のｃＤＮＡ配列がＧｅｎｅ  ｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＦ００３８２３して寄託されたことが記載されており、推定アミノ酸配列が開示されている。Ｌｃｂ２は、例えば、Ｇｅｎｅ  ｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｕ２７４５５としてマウスＬｃｂ２のアミノ酸配列およびｃＤＮＡの塩基配列が開示されている。本明細書において後述する配列表中において、マウスＬｃｂ２のアミノ酸配列を配列番号１、ｃＤＮＡの塩基配列を配列番号２として各々記載する。また、Ｎａｇｉｅｃ，Ｍ．Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １９９６  Ｏｃｔ  ２４；１７７（１−２）：２３７−４１は、ヒトＬｃｂ２とマウスＬｃｂ２のアミノ酸配列を、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓ．ｐｏｍｂｅ等の酵母由来のＬｃｂ２と併せて比較している。これらの配列に基づいてｃＤＮＡの全長若しくは一部を利用したｃＤＮＡプローブ、または合成オリゴヌクレオチドプローブを作製し、ゲノムライブラリーをスクリーニングすることができる。
【００４５】
プローブ結合性を示したセリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子ゲノムＤＮＡ断片を制限酵素で切り出し、市販のクローニング用ベクター中に挿入する。クローニング用ベクターとしては、市販されているｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣなどのいずれのプラスミドを用いてもよい。このようにして単離されたゲノムクローンを部分配列決定することにより、単離されたゲノムクローンが目的とするセリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子についてのゲノムクローンであることを確認することができる。
【００４６】
２．ターゲティングベクターの構築
ターゲティングベクターは、セリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子のゲノムＤＮＡ領域の一部又は全部をリコンビネース標的配列で挟んだ配列を有し、前記配列でセリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子のゲノムＤＮＡ領域の一部又は全部を相同組換えするために使用するものである。従って、本発明におけるセリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子のターゲティングベクターは、セリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子のゲノムＤＮＡ領域の一部又は全部をリコンビネース標的配列で挟んだ配列を含むことを特徴とする。リコンビネース標的配列で挟まれた配列が相同組換えによりゲノム中に挿入された場合、標的配列を認識する対応するリコンビネースタンパク質の酵素活性により、リコンビネース標的配列で挟まれた配列がゲノムから削除、逆位等の改変を受ける。リコンビネース活性が存在しない場合には配列の削除等は生ぜず、セリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子のゲノムＤＮＡの転写、翻訳はリコンビネース標的配列の存在にかかわらず野生型と同様に行われ、機能的なセリンパルミトイルトランスフェラーゼタンパク質が得られ、スフィンゴ脂質合成が正常に行われる。よって、リコンビネースタンパク質の発現を時期特異的及び／又は組織特異的に制御することによって、スフィンゴ脂質合成の一部又は全部を時期特異的及び／又は組織特異的に不活化させることが可能になる。
【００４７】
本発明によって利用しうるリコンビネースタンパク質／リコンビネース標的配列システムは、バクテリオファージＰ１由来のＣｒｅリコンビネースタンパク質とＣｒｅタンパク質によって認識される、Ｐ１中の組換えのホットスポットｌｏｘＰ配列を利用したＣｒｅ−ｌｏｘＰシステム、酵母由来のＦＬＰ／ＦＲＴシステム（Ｊｕｎｇ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６５，ｐ．１０３−、１９９４）（哺乳動物細胞、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）でも相同組換えを生じる）、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｕｘｉｉのｐＳＲ１リコンビネース（酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅで機能しうる）等が含まれる。
【００４８】
限定されるわけではないが、Ｃｒｅ／ｌｏｘＰシステムが好ましい。ｌｏｘＰは、以下の３４塩基対を有し、８塩基対のスペーサーによって隔てられた１３ｂｐの逆方向反復配列（ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｒｅｐｅａｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）からなる。
【００４９】
【化１】
5’-ataacttcgtata  atgt｜atgc  tatacgaagttat-3’
3’-tattgaagcatat  taca｜tacg  atatgcttcaata-5’
逆方向反復配列  スペーサー  逆方向反復配列
（配列番号３）
ｌｏｘＰ部位における組換えは、Ｐ１のｃｒｅ遺伝子によってコードされる３４３アミノ酸リコンビネースタンパク質であるＣｒｅによって触媒される。各ｌｏｘＰ部位は、１３塩基対の繰り返しと隣接する４塩基対のスペーサーからなる、２つのＣｒｅ結合部位からなる。各繰り返し配列のもっとも遠位の２塩基対は、組換え頻度を変化させることなく修飾可能である。各ｌｏｘＰ部位に１個づつ合計２個のＣｒｅ分子が結合する。次いで、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ複合体は、同一の核酸分子（ＤＮＡ等）上に存在する第２のｌｏｘＰ部位と対合する。スペーサー領域中のＤＮＡの非対称的な切断に続いて、対合したｌｏｘＰパートナー間の鎖交換が誘導される。スペーサー領域の非対照性のため、同一の核酸分子上に位置するｌｏｘＰ間の組換えは極性を有する。即ち、同一方向のｌｏｘＰ間の組換えは、２カ所の部位間のＤＮＡの切り出し（削除）を生じさせ、反対方向のｌｏｘＰ間の組換えは、２カ所の部位間の介在ＤＮＡの逆位をもたらす。
【００５０】
Ｃｒｅタンパク質は細菌（大腸菌等）中だけでなく、酵母及び哺乳動物細胞中でも組換え現象を触媒する。よって、Ｃｒｅリコンビネースタンパク質は、酵母及び哺乳動物細胞中において、染色体にプラスミドの部位特異的挿入を引き起こすことも、また、複数（好ましくは２カ所）のｌｏｘＰ部位に挟まれたＤＮＡ領域の削除を引き起こすことも可能である。酵母及び哺乳動物細胞中のゲノムはｌｏｘＰ部位を有しないと考えられている。さらに、Ｃｒｅタンパク質の発現は、特に高発現させなければ哺乳動物細胞に毒性でなく、また、例えばマウスのメタロチオネインＩプロモーター若しくはサイトメガロウイルスプロモーター等のプロモーター等の制御下にｃｒｅ遺伝子を有する遺伝子改変マウスは、発生、成長、生殖の各過程において影響を受けない。
【００５１】
Ｃｒｅタンパク質によって認識される配列は上述した配列番号３に限定されず、塩基配列に若干の変異があってもＣｒｅタンパク質によって認識され、同様に組み換えを生じうる。例えば、限定されるわけではないが、各繰り返し配列のもっとも遠位の２塩基対は、組換え頻度を変化させることなく修飾可能である。また、スペーサー配列５’−ａｔｇｔａｔｇｃ−３’中の一番５’側のｔ塩基をｇに変異させると、形質転換された哺乳動物細胞中の組換え頻度が実質的に上昇するという報告もある。よって、本明細書において、このような変異を含むＣｒｅタンパク質によって認識される配列も、本発明において利用しうる「ｌｏｘＰ」配列に含む。
【００５２】
複数（好ましくは２カ所）のｌｏｘＰ部位に挟まれたＤＮＡ領域の削除は、染色体上のｌｏｘＰ部位へのｌｏｘＰプラスミドの部位特異的挿入よりも高頻度で生じうる。染色体の特定の位置にｌｏｘＰ部位を含む、遺伝子工学的に得られた哺乳動物（例えば、マウス）の系を、Ｃｒｅを発現する遺伝子改変動物を交配することにより、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰシステムを利用して、所期の遺伝子のヌルアリル（ヌル対立遺伝子群）を作成させることが可能である。よって、好ましくは、本発明のターゲティグベクターは、セリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子のゲノムＤＮＡ領域の一部又は全部を、同一方向の複数（好ましくは、２個）のｌｏｘＰ配列で挟む。相同組換えによって前記配列がゲノムに組み込まれるとＣｒｅタンパク質の存在により、複数のｌｏｘＰ配列で挟まれたセリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子のゲノムＤＮＡ領域の一部又は全部が削除（切り出し）される。また、セリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子を反対方向の複数のｌｏｘＰ配列に含んだ場合、特定の染色体部位の逆位および削除等を生じうる。よって、このような態様も、セリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子のゲノムＤＮＡ領域の一部又は全部に改変を生じうるため本発明に含みうる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，第３版，ＣＯＬＤ  ＳＰＲＩＮＧ  ＨＡＲＢＯＲ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＰＲＥＳＳ，２００１年，４．８２−４．８５）。
【００５３】
限定されるわけではないが、一般に、ターゲティングベクターによってゲノムＤＮＡの相同組換えが効率よく起こるためには、相同領域が長いほどよい。一方、ターゲティングベクターの種類によって、挿入し取り扱える好ましいＤＮＡの長さは一定に制限される。よって、前述したように得られたセリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子ゲノムＤＮＡ中の、好ましくは１ｋｂ−２０ｋｂ、より好ましくは５ｋｂ−２０ｋｂ、最も好ましくは１０ｋｂ−２０ｋｂをターゲティングベクターに含ませる。そのうち、適用するリコンビネースタンパク質／リコンビネース標的配列システムによって、削除（切り出し）等の改変が生じやすい長さの配列を、２個以上のリコンビネース標的配列によって挟むように設計する。限定されるわけではないが、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰシステムを適用する場合、好ましくは１ｋｂ−１００ｋｂ、より好ましくは１ｋｂ−１０ｋｂ、最も好ましくは１．２ｋｂ−３．５ｋｂの長さの配列を２個以上のｌｏｘＰ配列によって挟む。本明細書において後述する実施例のターゲティングベクターでは、マウスＬｃｂ２ゲノムのエクソン３を挟むゲノム配列（長さ約１．２ｋｂ）を２個のｌｏｘＰで挟む構造とした。
【００５４】
リコンビネース標的配列を組み込んだ改変セリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子が導入される、本発明のターゲティングベクターの基本骨格となるベクターは特に限定されず、形質転換を行う細胞（例えば、大腸菌）中で自己複製可能なものであればよい。例えば、市販のｐＢｌｕｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、ｐＺＥｒＯ  １．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ｐＧＥＭ−１（Ｐｒｏｍｅｇａ社）等が使用可能である。
【００５５】
本発明の方法は、リコンビネース標的配列を組み込んだ改変セリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子を含むターゲティングベクターで、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）を形質転換し、相同組換えを生じさせる。ターゲティングベクターの構築についてデザインする場合、後の工程において行わなければならない相同組換え体のスクリーニングを、より容易に行うことができるように考慮することが望ましい。例えば、相同組換え体のスクリーニングは、（１）ターゲティングベクターにより組換え体内に導入したポジティブ選別、ネガティブ選別等の選別用の遺伝子を用いて、培養中で行う細胞レベルの第一段階のスクリーニング、そして（２）第一段階のスクリーニングにより選択された組換え体について、さらにＰＣＲ法、サザンブロットハイブリダイゼーション法などを行うことからなるＤＮＡレベルの第二段階のスクリーニングの２工程により行うことが好ましい。従って、この２工程のスクリーニングの一方または双方をより容易に行うことができるようにターゲティングベクターをデザインすることが好ましい。
【００５６】
ポジティブ選別とは、ターゲティングベクターが染色体に導入された胚性幹細胞のみを選別することを意味する。一般に形質転換に用いられるエレクトロポレーション法により、導入した遺伝子ＤＮＡが染色体に組み込まれる確率は、１０3−１０4個の細胞に１個程度の頻度であるため、遺伝子ＤＮＡが導入された細胞のみを選び出すための配列（ポジティブ選別）をまず考えなければならない。
【００５７】
ポジティブ選別用マーカー遺伝子としては、ネオマイシン耐性遺伝子（Ｇ４１８によって選別）、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ＢＰＨ）遺伝子（ハイグロマイシン−Ｂによって選別）、ブラスティシジンＳデアミナーゼ遺伝子（ブラスティシジンＳによって選別）、ピューロマイシン耐性遺伝子（ピューロマイシンによって選別）等が使用可能である。ネオマイシン耐性遺伝子が最も好ましい。
【００５８】
ネガティブ選別とは、非相同組換えを生じた胚性幹細胞を選択的に除くことを意味する。これは、特に対象とする遺伝子がＥＳ細胞で発現していないか、発現量が低い場合に、利用しうる。相同組換えは相同領域で生じるが、非相同組換えは多く直線化した導入ＤＮＡの両末端で生じる。ネガティブ選別は導入ＤＮＡの一端に、これが組み込まれると細胞に毒性を持つ遺伝子を付加することによって行う。ネガティブ選別としては、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）のチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子、ジフテリア毒素Ａフラグメント（ＤＴ−Ａ）遺伝子を用いる方法等が知られている。細胞内在性のチミジンキナーゼ（ＴＫ）に比し、ＨＳＶ由来のＴＫは、より高率にＦＩＡＵ、ガンサイクロビアなどの核酸類似体をリン酸化する。ｔｋ選別は、非相同組換えでＨＳＶｔｋ遺伝子が導入されるとＦＩＡＵなどを加えた場合、これがリン酸化されて染色体ＤＮＡ中に取り込まれＤＮＡ合成が阻害されることを利用したものである。ＤＴ−Ａは、細胞内で伸長因子ＩＩをｐｏｌｙＡＤＰリボシル化してタンパク質合成を阻害する。ＥＳ細胞で高い発現活性を有するプロモーターと連結したＤＴ−Ａ遺伝子を用いれば、非相同組換えでこれが染色体に組み込まれた細胞は死滅すると期待される。翻訳レベルの選別で、選択剤を必要としない、という利点を有する。従来、染色体ＤＮＡへの組み込み以前に、エピゾーマル（染色体外にある状態）でＤＴ−Ａが発現し、細胞をランダムに死滅させてしますおそれが危惧されていたが、特に一過性の発現により細胞死はＥＳ細胞では起こりにくいことが明らかになりつつある。必要であれば、後述するｐｏｌｙＡ選別と組み合わせて、即ちｐｏｌｙＡ付加シグナルをつけないでベクターを作製しもよい。
【００５９】
ＥＳ細胞中で強い発現活性を有するプロモーターとしてはホスホグリセリン酸キナーゼ−１（ＰＧＫ−１）プロモーター、伸長因子２（ＥＦ−２）プロモーター、ＭＣ−１プロモーターなどを使用することができる。ターゲティングを行う遺伝子座、およびそのＤＮＡ領域により、プロモーター活性は大きく影響されるため、一般にはプロモーターは強力であるほどよい。従ってより望ましくは、ＰＧＫ−１プロモータを使用する。ただし、ネガティブ選別用にＤＴ−Ａを用いる場合は、染色体ＤＮＡへの組み込み前のランダムな細胞死が危惧されるため、発現活性のやや劣るプロモーター、例えばＭＣ−１プロモーターを使用するのが好ましい。
【００６０】
プロモーターと連結した選択マーカー遺伝子は、たとえばネオマイシン耐性遺伝子カセット（ｎｅｏカセット、ｐＫＪ２として供与）、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子カセット（ｈｐｈカセット）、チミジンキナーゼ遺伝子カセット（ｔｋカセット、ｐＭＣｔｋとして供与）、ジフテリア毒素Ａ遺伝子断片カセット（ＤＴ−Ａカセット、ｐＭＣＤＴ−ＡまたはｐＭＣ１ＤＴＡｐＡとして供与）、ｌａｃＺ遺伝子カセット（例えば、ｐＢＳｌａｃＺとして供与）などの、プラスミドに挿入された状態で市販されている選択マーカー遺伝子を使用してもよい。ターゲティングベクターは、これらのプロモーターを連結した選択マーカーのうち、どの選択マーカーを使用して構築してもよい。後述の実施例では、Ｎａｋａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １９９９  Ｊｕｌ；１１（７）：２５７７−８１に記載のプラスミドｌｏｘＰ−ｆｌａｎｋｅｄ−ｐＧＫ−ｎｅｏ）（例えば、本発明者の大阪大学医学部  竹田潤二より入手可能）より得たｐＧＫ−ｎｅｏ断片、並びに、プラスミドｐＭＣ１ＤＴＡｐＡ（Ｙａｇｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３；Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２１４；７７−８６）（大阪大学細胞生体工学センター  八木健教授より入手可能）より得たＭＣ１ＤＴＡｐＡ断片を使用した。
【００６１】
好ましくは、ポジティブ選別用、ネガティブ選別用の配列は（存在する場合にはそのプロモーターとともに）セリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子と同一方向（順方向）にターゲティングベクターに挿入させる。
【００６２】
ターデティグベクターが、ターゲティングベクターが導入された胚性幹細胞のみを選択するための配列、即ちポジティブ選別用配列を含む場合、ターデティグベクターが導入された染色体はポジティブ選別用配列が挿入されている。ポジティブ選別用配列が残ったままでは、最終的に得られるコンディショナルノックアウト動物において、Ｌｃｂ２遺伝子そのものの発現を撹乱させる、初期発生期に限らず発育障害を生じる等の悪影響を及ぼす可能性がある。好ましくは、ポジティブ選別用配列を染色体ＤＮＡから削除する工程を含む。ネガティブ選別用の配列の削除を容易にするために、セリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子に関して上述したリコンビネースタンパク質／リコンビネース標的配列システムを利用することができる。よって、限定されるわけではないが、ポジティブ選別用配列を２個の同一方向のリコンビネース標的配列で挟んでターゲティグベクターに含ませるのが好ましい。ポジティブ選別用配列を削除するための方法については、後述の「６．ポジティブ選別用配列の削除」の項において詳述する。
【００６３】
さらに利用可能な選別としては、プロモーター選別、ｐｏｌｙＡ選別などが知られている。プロモーター選別は対象となる遺伝子が組換えを生じさせる細胞中で発現している場合に利用可能である。この場合、ポジティブ選別用配列にプロモーターをつけず、相同組換えを起こした場合、対象遺伝子の発現調節領域からポジティブ選別用配列が発現するようベクターを設計し、プロモーター選別を行うことによって、ポジティブ選択で陽性の非相同組換え体の数を減らすことが可能となる。また、ｐｏｌｙＡ選別は、ポジティブ選別用遺伝子にｐｏｌｙＡ付加シグナルを付けず、相同組換えが起こった時にのみ対象遺伝子のｐｏｌｙＡ付加シグナルを利用できるようベクターを設計し、これにより非相同組換え体を除去するものである。ネガティブ選別などと組み合わせたときに特に有用である。
【００６４】
前述した時期特異的及び／又は組織特異的に、スフィンゴ脂質合成の一部又は全部を不活化した、非ヒト  コンディショナルノックアウト哺乳動物の作製方法に使用するためのターゲティングベクター自体も、本発明によって新たに得られたものであり、含まれる。本発明のターゲティングベクターは、セリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子のゲノムＤＮＡ領域の一部又は全部をリコンビネース標的配列で挟んだ配列を含み、前記配列でセリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子のゲノムＤＮＡ領域の一部又は全部を相同組換えすることを特徴とする。
【００６５】
３．ターゲティングベクターによる相同組換え
次いで、上記の方法により作製したターゲティングベクターを使用して、相同組換えを行う。本発明において「セリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子の相同組換え」とは上記改変セリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子を、対応するゲノム上に、人工的に組換えさせることをいう。
【００６６】
一般に、所期の遺伝子の相同組換えが起こる頻度は１０-6程度であることが知られている。したがって目的とする相同組換え体を得るためには、理論上１０6以上の細胞に組換え操作を行う必要があり、少なくとも数十ないし数百検体の組換え体をスクリーニングする必要がある。しかしながら、１０6個の受精卵を使用することは事実上不可能であることから、受精卵に変わるものとして、受精卵と同様の多分化能を有し、かつｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養することが可能な細胞を使用することが必要である。このような目的を達成することができる方法として、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）を用いる方法、クローン動物作成技術を用いた方法などを使用することができるが、これだけに限定されるものではない。
【００６７】
現在確立されている遺伝子ターゲティング法では、ＥＳ細胞を使用することが望ましい。現時点では、ヒト、ミンク、ハムスター、ブタ、ウシ、マーモセット、アカゲザル等の複数の哺乳動物でＥＳ細胞が樹立されている。将来さらに多種の動物で同様なＥＳ細胞が樹立されれば、同様な方法を用いて遺伝子改変動物を作製することができる。
【００６８】
遺伝子改変マウス作製用のＥＳ細胞株は、公知のマニュアルを使用して自己で作製してもよいが、既存の樹立されたＥＳ細胞株が入手可能であり、好ましい。現在使用することができるマウス由来のＥＳ細胞は、ＴＴ２細胞、ＡＢ−１細胞、Ｊ１細胞、Ｒ１細胞、Ｅ１４．１細胞、ＲＷ−４細胞などがある。遺伝子改変動物を作出するために、これらのうちいずれのＥＳ細胞を用いるかは、採取したゲノムＤＮＡの由来するマウス系統、キメラ動物の選別方法など、実験の目的や方法により任意に決定することができる。所期のＥＳ細胞株は必要に応じ、各々特定の研究機関より入手可能である。例えば、本明細書中の実施例で使用したＲ１細胞は、マウス系統１２９ＳＶＪに由来し、例えば、Ａｎｄｒａｓ  Ｎａｇｙ，Ｓａｍｕｅｌ  Ｌｕｎｅｎｆｅｌｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，  Ｍｏｕｎｔ  Ｓｉｎａｉ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ，  （６００  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ａｖｅｎｕｅ，ＴｒｏｎｔｏＭ５Ｇ  １Ｘ５  Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）より入手可能である。
【００６９】
前記２の項で作製した、セリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子のゲノムＤＮＡ領域の一部又は全部をリコンビネース標的配列で挟んだ配列を含むターゲティングベクターをＥＳ細胞中に導入する。そしてＥＳ細胞中の目的とするセリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子のゲノムＤＮＡ配列を、ターゲティングベクター中のリコンビネース標的配列で挟んだセリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子配列による相同組換えによって置換する。相同組換えは、セリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子のゲノムＤＮＡ配列と、ターゲティングベクター中の非改変部分の配列との相同性を利用して、確率的に生じさせることができる。
【００７０】
ターゲティングベクターをＥＳ細胞に導入する方法としては、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン法など公知の方法を使用することができる。効率、作業の容易性などを考慮して、エレクトロポレーション法を用いることが好ましい。エレクトロポレーションの方法は、例えば、（Ｎａｋａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １９９９  Ｊｕｌ；１１（７）：２５７７−８１に記載の方法を使用可能である。
【００７１】
４．相同組換え体のスクリーニング
得られた組換えＥＳ細胞を、ネオマイシン耐性の初代培養細胞からなるフィーダー細胞レイヤー上、マイトマイシンＣ−処理したＮＨＬ７細胞等の選別用プレートにプレーティングする。そしてＥＳ培養液中で、相同組換えによってＥＳ細胞に導入されたポジティブ選別用マーカー及び／又はネガティブ選別用マーカーにより、第一段階のスクリーニングである選択培養を行う。当該第一段階の選択工程においては、前述した選択マーカーのうち、複数の選択マーカー遺伝子を用いることもできる。ＥＳ細胞を培養するための培養液は毎日交換するとよい。培養液中には、選択マーカー遺伝子の種類に依存して、たとえばネオマイシン（Ｇ４１８，  ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）やハイグロマイシンＢ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）が含まれている。選択培養６−８日目に生存するコロニーを耐性クローンとして採取する。
【００７２】
耐性クローンをピックアップし、増殖させる。その後、目的とするセリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子がターゲティングされているかどうか、即ち相同組換えを起こした形質転換体を確実に選択するため、第二段階のスクリーニングを行うことができる。第二段階のスクリーニングは、ＤＮＡレベルで目的とするセリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子がターゲティングされたかどうかを確認する工程である。このような方法としては、ＰＣＲ法、サザンブロットハイブリダイゼーション法などが存在するが、そのうちのいずれを用いてもよく、またその中から２以上の方法を組み合わせて用いてもよい。
【００７３】
本発明においては、まず、第一段階のスクリーニングにより選択されたＥＳ細胞クローンのプールのそれぞれからゲノムＤＮＡを調製し、このゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法を行うことで、ＥＳ細胞について第二段階のスクリーニングをする。このＰＣＲ法を用いたスクリーニングにより組換えが起こったクローンを単離する。
【００７４】
ＰＣＲプライマーは、ターゲティングにより目的とするゲノムＤＮＡ領域を外来性の遺伝子により置換することができたか否かをより効率的に確認できるように設計することが望ましい。そのためにはターゲティングベクターの配列のうち目的とする遺伝子の外側のゲノムＤＮＡ領域上と、選択マーカー遺伝子カセット領域上とに設定し、挿入部位を増幅することができるように設計するとよい。本明細書中の実施例３では、前者として５’側プライマーＵ３／１０５、後者として３’側プライマーｐＧＫ−１を合成してＰＣＲプライマーとして使用した。
【００７５】
第二段階のスクリーニングにおいて、ＥＳ細胞が相同組換え体であることを確認するため、ＥＳ細胞クローンに対してサザンブロットハイブリダイゼーション法による解析を行うことことができる。サザンブロットハイブリダイゼーション解析は、ターゲティングベクターに含まれないゲノム領域を認識するプローブとターゲティングベクター中に存在する領域を認識するプローブを併用して行うことが望ましい。二種類のプローブを用いることにより相同組換えのほかに非相同組換えが存在するか否かを知ることができ、目的とするゲノム領域に相同組換えが起こったことをより正確に確認することができるからである。あるいは、ターゲティングベクターが導入された変異型ゲノムと野生型ゲノムとで、サザンブロットにおいて長さの違うバンドが認識されるように、プローブを作製してもよい。
【００７６】
これらのプローブをどのように設計するかは、ターゲティングベクターを構築する際にどの選択マーカーを使用するかにより、個々具体的に異なる。本発明のセリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子についてのサザンブロットハイブリダイゼーション解析においては、プローブとして、ゲノムクローンを適宜制限酵素処理することにより得られるゲノムＤＮＡ断片と、選択マーカーとして使用するポジティブ選別用遺伝子に対するプローブとを使用してもよい。このようにサザンブロットハイブリダイゼーションの条件は、当業者が適宜改変を加えることができ、必要に応じてサザンブロットハイブリダイゼーション解析に用いるプローブ数を増やして、さらに確実に相同組換え体を選択することもできる。サザンブロットハイブリダイゼーションは、32Ｐ等の放射性同位元素を使用する方法、ディゴキシゲニン等の非放射性ラベルを使用する方法等、公知の方法を用いて行うことができる。感度、簡便性の観点より、ディゴキシゲニンを用いる方法が好ましい。
【００７７】
ターゲティグベクターでＥＳ細胞を形質転換させ、相同組換え体を選別した後に、染色体異常がないことを確認するために、核型分析を行うことが好ましい。核型分析は、例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ  Ｅ．  Ｊ．  （１９８７）  ｉｎ  Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ａｎｄ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  −ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ，  ｅｄ．  Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，  Ｅ．  Ｊ．  （ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ），  ｐｐ．１０８−１１２等に記載の公知の方法を用いて行うことができる。例えば、マウスの正常な核型は２ｎ＝４０である。好ましくは、ターゲティグベクターで形質転換を行う前も、使用するＥＳ細胞の核型を確認する。
【００７８】
５．改変セリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子を有する遺伝子改変動物の作製
次いで、相同組換えの結果得られた組換えＥＳ細胞を、８細胞期または胚盤胞の胚内に移植する。このＥＳ細胞移植胚を偽妊娠仮親の子宮内に移植して出産させることによりキメラ動物を作製することができる。ノックアウト（ＫＯ）動物は、現在主にマウスについて作製されている。しかし将来的に種々の動物について受精卵または胚の遺伝子組換え技術が使用できる用になった場合には、それぞれの動物についても作出することができる。
【００７９】
ＥＳ細胞を胚内に移植する方法としては、たとえばマイクロマニピュレーション法、アグリゲーション（凝集）法（例えば、Ｋｏｎｄｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９，  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  ３９，  １３７−１４２に記載）などが知られているがいずれを用いてもよい。また移植する方法は当業者が適宜改変することができる。マウスの場合、まず、ホルモン剤（たとえば、ＦＳＨ様作用を有するＰＭＳＧおよびＬＨ作用を有するｈＣＧを使用）により過排卵処理を施した雌マウスを、雄マウスと交配させる。その後、８細胞期胚を用いる場合には受精から２．５日目に、胚盤胞を用いる場合には受精から３．５日目に、それぞれ子宮から初期発生胚を回収する。このように回収した胚に対して、ターゲティングベクターを用いて相同組換えを行ったＥＳ細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて注入し、キメラ胚を作製する。
【００８０】
一方、仮親にするための偽妊娠雌マウスは、正常性周期の雌マウスを、精管結紮などにより去勢した雄マウスと交配することにより得ることができる。作出した偽妊娠マウスに対して、上述の方法により作成したキメラ胚を子宮内移植し、妊娠・出産させることによりキメラ動物を作製することができる。キメラ胚の着床、妊娠がより確実に起こるようにするために、受精卵を採取する雌マウスと仮親になる偽妊娠マウスとを、同一の性周期にある雌マウス群から作出することが望ましい。
【００８１】
このようなキメラマウスの中から、ＥＳ細胞移植胚由来の雄マウスを選択する。選択したＥＳ細胞移植胚由来のオスのキメラマウスが成熟した後、このマウスを純系マウス系統の雌マウスと交配させ、そして次世代産仔にＥＳ細胞由来の被毛色が現れることにより、ＥＳ細胞がキメラマウスの生殖系列へ導入されたことを確認することができる。ＥＳ細胞が生殖系列へ導入されたことを確認するためには、様々な形質を指標として用いることができるが、確認の容易さを考慮して、被毛色により行うことが望ましい。マウスにおいては、野ネズミ色（ａｇｏｕｔｉ）、黒色（ｂｌａｃｋ）、黄土色（ｃｉｎｎａｍｏｎ）、チョコレート色（ｃｈｏｃｏｌａｔｅ）、および白色（アルビノ、ａｌｂｉｎｏ）の被毛色が知られているが、使用するＥＳ細胞の由来系統を考慮して、キメラマウスと交配させるマウス系統を適宜選択することができる。例えば本発明においては、野ネズミ色（ａｇｏｕｔｉ）系統（１２９マウス）由来のＥＳ細胞を使用して作出したオスのキメラマウスを、黒色であるＣ５７ＢＬ／６メスマウスと交配させる。そして次世代産仔の被毛色が野ネズミ色（ａｇｏｕｔｉ）であることにより、ＥＳ細胞がキメラマウスの生殖系列へ導入されたことを確認することができる。このように、胚内に移植された組換えＥＳ細胞が生殖系列に導入された動物を選択し、そのキメラ動物を繁殖することにより目的とする遺伝子を欠損する個体を得ることができる。得られたセリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子欠損ヘテロ接合体マウス同士を交配させることにより、目的とする遺伝子欠損ホモ接合体マウスを得ることができる。
【００８２】
一般に実験動物を用いて研究するためには、系統として確立された動物、すなわち遺伝的にホモの状態の動物を用いることが望ましい。このような動物では、遺伝的背景が詳細に調べられているため、かかる既知の遺伝的背景のもとで、当該動物に施した処置の効果のみを特定できるからである。一方、雑種動物においては種々の遺伝子がヘテロの状態で存在するため、当該動物に対する処置の結果生じた効果が、当該処置にのみ由来するものかまたは遺伝的背景に由来するものかを判別することが困難である。
【００８３】
ＫＯマウスを含む、遺伝子改変マウスの作成の過程では、ＥＳ細胞が生殖系列に導入されたか否かを被毛色の違いを指標にして確認するために、交雑を行い雑種子孫を作製することが工程を必ず行う必要がある。したがって、多くの遺伝子がヘテロの状態で存在するため、結果としてセリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子が欠損することのみによる特有の効果を調べることが困難となってしまう。そこで、遺伝子欠損の特有の効果のみを抽出するために、得られた遺伝子欠損マウスを純系のマウス系統と戻し交配し、ターゲティングを行った遺伝子を含むすべての遺伝子について可能な限り遺伝的にホモの状態にすることが好ましい。目的とする遺伝的構成の動物を得るためには、５世代〜８世代程度同一系統と戻し交配を行うことが好ましい。戻し交配に用いるマウスは当業者が適宜選択することができる。使用することができるマウスとしては、例えばＢＡＬＢ／ｃ、Ｃ５７ＢＬ／６、ＤＢＡ１１、ＩＣＲなどが挙げられるが、これらに限定されない。また、自然交配のみにより戻し交配を行うと長い年月がかかる場合があるので、世代交代を早めたい場合には適宜体外受精技術を用いることもできる。
【００８４】
このようにして得られたリコンビネース標的配列を含む改変セリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子を有する遺伝子改変動物は、公知の若しくは作製した時期特異的及び／又は組織特異的にリコンビネースタンパク質を発現するリコンビネース発現遺伝子改変動物と交配させることによって、セリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子のコンディショナルノックアウト動物の作製を可能とする（後述の７項等）。よって、このような遺伝子改変動物（その卵、精子、受精卵、胚組織・器官培養物等を含む）は、有用であり、本発明の範囲に含まれる。
【００８５】
６．ポジティブ選別用配列の削除
ターデティグベクターが、ターゲティングベクターが導入された胚性幹細胞のみを選択するための配列、即ちポジティブ選択用配列を含む場合、ターデティグベクターが導入された染色体はポジティブ選別用配列が挿入されている。ポジティブ選別用配列が残ったままでは、最終的に得られるコンディショナルノックアウト動物において、Ｌｃｂ２遺伝子そのものの発現を撹乱させる、初期発生期に限らず発育障害を生じる等の悪影響を及ぼす可能性がある。よって、本発明の方法は、好ましくは、ポジティブ選別用配列を染色体ＤＮＡから削除する工程を含む。
【００８６】
ポジティブ選別用の配列の削除を容易にするために、セリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子に関して上述したリコンビネースタンパク質／リコンビネース標的配列システムを利用することができる。よって、限定されるわけではないが、ターゲティグベクターにおいてポジティブ選別用配列を２個の同一方向のリコンビネース標的配列で挟んで含ませ、これを染色体ゲノムに導入する。そして、前項５によって得られた改変セリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子を有する遺伝子改変動物を、リコンビネースタンパク質を発現する同種の動物と交配させることによって、リコンビネース活性によってポジティブ選別用配列を削除させることができる。この際、リコンビネースタンパク質は、同様にリコンビネース標的配列で挟まれたセリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子（の全部又は一部）は削除せず、ポジティブ選別用配列のみを選択に削除させる必要がある。
【００８７】
具体的な方法論は、例えばＤｙｎｅｃｋｉ，  Ｓ．Ｍ．ら（２０００、Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  −ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ，  ２ｎｄ    ｅｄｉｔｉｏｎ，  ｅｄ．  Ｊｏｙｎｅｒ，  Ａ．Ｌ．  （Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ．  Ｐｒｅｓｓ），  ｐｐ．６８−７３）に記載されている。
【００８８】
もっとも効率的な方法の１つとしては、ポジティブ選択用配列を挟み込むリコンビネース標的配列を、改変セリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子に用いたリコンビネース標的配列とは別のリコンビネース由来のものにしておき、目的に応じてそれぞれ異なるリコンビネースを発現する遺伝子改変動物と交配することが考えられる。具体的には、ポジティブ選択用配列を酵母由来のＦＲＴで、改変セリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子をバクテリオファージ由来のｌｏｘＰで挟んでおく。これをマウス又はＥＳ細胞においてＦＲＴを標的とするリコンビネースｆｌｐを作用させて、ポジティブ選択用配列だけを削除できる。このとき、ｆｌｐはｌｏｘＰに作用できないために、改変セリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子は削除されない。
【００８９】
これに対し、本明細書で後述する実施例２で作成したターデティングベクターは、２つのリコンビネース標的配列でポジティブ選択用配列を挟み、さらに同種のもう１つのリコンビネース標的配列でセリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子の一部（第３エクソン）を挟んだ「３リコンビネース標的配列型」である。この場合、リコンビネースの種類の相違を利用する上記の方法は使えない。但し２種類のリコンビネース標的配列を使う上記の方法に比べ、ターゲッティングベクターの構築が簡単なる利点がある。この場合、哺乳動物個体又はＥＳ細胞において対応するリコンビネースを限定的に発現させ、ポジティブ選択用配列だけが削除されたものを選択することが可能である。
【００９０】
例えば、本明細書の実施例６では、Ｌａｋｓｏ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９３，  ５８６０−５８６５に記載のＥＩＩａＣｒｅトランスジェニックマウス（例えば、米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）（ＵＳＡ）のＨｅｉｍｅｒ  Ｗａｓｔｐｈａｌ博士より入手可能）を使用した。ＥＩＩａＣｒｅトランスジェニックマウスは、以下のような機構により、ポジティブ選別用配列のみを削除させたものを得ることが可能である。
【００９１】
ＥＩＩａＣｒｅトランスジェニックマウスは生殖細胞及びそれら受精卵においてもＣｒｅリコンビネースが発現するとされている（Ｌａｋｓｏ，  Ｍ．  ｅｔａｌ．，  １９９６，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，上記）。しかしながら、実際に２つのｌｏｘＰ  （ｆｌｏｘ）を含むマウスと交配させた結果得られる子供（Ｆ１）では２つのｌｏｘＰ間配列の削除型は全身でモザイク状である。さらにＦ１と野生種を交配させて得られ、かつＥＩＩａＣｒｅ遺伝子を含まないＦ２において単一の削除型になることから、その発現量・状態は個体間、もしくは同一組織内細胞間においても大きく異なると考えられている（未発表データ）。「３リコンビネース標的配列型（３ｌｏｘＰ型）」の場合は、例えばこの性質を利用して、ＥＩＩａＣｒｅトランスジェニックマウスと交配することでポジティブ選択用配列だけが削除されたマウスを得ることができる。
【００９２】
さらに、ポジティブ選別用配列の削除のためにはリコンビネース活性が必要であるが、次項の７．セリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子のコンディショナルノックアウト動物の作製に使用するためには、リコンビネース遺伝子がセリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子と同一ゲノム上に存在しないのが好ましい。よって、好ましくは、交配を行って得られた第一世代（Ｆ１）の遺伝子改変マウスを野生型のマウスと戻し交配し、そして、第２世代（Ｆ２）において、ポジティブ選別用配列が削除されて存在せず、かつ、リコンビネース遺伝子を有しないヘテロ接合体を選択する。好ましいヘテロ接合体の選択は、上記４項のスクリーニングに用いた、ＰＣＲ法、サザンブロッティング法等を用いた行うことができる。
【００９３】
また、ポジティブ選別用配列を削除させたヘテロ接合体を得た後に、５の項で詳述したように遺伝的にホモの状態の動物を得るために、必要に応じて交配を行ってもよい。
【００９４】
あるいは、ポジティブ選別用配列の削除は、前記４において得られた相同組換えされたＥＳ細胞を、哺乳動物に形質転換させる前に、ＥＳ細胞のレベルで行うことも可能である。例えば、以下のように行うことができる。
【００９５】
概念は、例えばＤｙｎｅｃｋｉ，  Ｓ．Ｍ．ら（２０００、Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  −ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ，  ２ｎｄ    ｅｄｉｔｉｏｎ，  ｅｄ．  Ｊｏｙｎｅｒ，  Ａ．Ｌ．  （Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ．  Ｐｒｅｓｓ），  ｐｐ．６８−７３）に記載されている。以下は、例示としてＴａｎｉｇｕｃｈｉ，  Ｍ  ら（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １９９８  Ｊａｎ  １５；２６（２）：６７９−８０．）に記載されている。
【００９６】
具体的には、３リコンビネース標的配列型（３ｌｏｘＰ型）の改変ＥＳ細胞に、先ず、選択マーカーとしてピューロマイシンＮ−アセチル転移酵素（ピューロマイシン耐性遺伝子）をもつＣｒｅ発現ベクター（ｐＣｒｅ−ｐａｃ）を、後述の実施例３で挙げるような方法で形質導入する。導入後、例えば２日間のみピューロマイシンでＣｒｅが発現したものだけをポジティブ選択する。次いで、ＰＣＲ法、サザンブロッティング法等を用いて、ポジティブ選択用配列のみが削除されたクローンを選び出すことが可能となる。
【００９７】
７．セリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子のコンディショナルノックアウト動物の作製
次いで、前記遺伝子改変動物を、時期特異的及び／又は組織特異的にリコンビネースタンパク質を発現するリコンビネース発現遺伝子改変動物と交配し、セリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子のコンディショナルノックアウト動物を得る。
【００９８】
リコンビネースタンパク質自体は、特に個体に毒性を示さないため、時期特異的及び／又は組織特異的にリコンビネースタンパク質を発現するリコンビネース発現遺伝子改変動物は例えば、以下のようにして作製させることができる。
【００９９】
概念は、例えばＤｙｎｅｃｋｉ，  Ｓ．Ｍ．ら（２０００、  Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  −ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ，  ２ｎｄ    ｅｄｉｔｉｏｎ，  ｅｄ．  Ｊｏｙｎｅｒ，  Ａ．Ｌ．  （Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ．  Ｐｒｅｓｓ），  ｐｐ．７５−８１）に記載されている。
【０１００】
一般的には、時期特異的及び／又は組織特異的に発現を可能とするプロモーター配列にリコンビネース発現配列をつないだ遺伝子をもつ遺伝子改変動物を作製する。この遺伝子改変動物の作製法としては、トランスジェニック法とノックイン法が存在する。トランスジェニック法は、前記の遺伝子を外部から導入する方法で、遺伝子を受精卵に直接注入する事で得る。ノックイン法は内在性プロモーターの後ろに相同組換えでリコビネース発現配列を導入する方法で、該当プロモーターのターゲッティングベクターを構築しＥＳ細胞に形質転換し、適当な改変ＥＳ細胞を選び出し、それから遺伝子改変動物を作製する。
【０１０１】
トランスジェニック法はノックイン法に比べると実験過程が少なくより迅速に遺伝子改変動物を得ることができるが、外部から導入したプロモーターは内在性プロモーターに比べて特異性が落ちるために標的とした時期及び／又は組織においてリコビネースタンパク質が発現しない場合がある。またトランスジェニック法特有の現象として、外部から導入された遺伝子が上手く発現しないことがあり、最近ではノックイン法が主流になりつつある。
【０１０２】
あるいは、時期特異的及び／又は組織特異的にリコンビネースタンパク質を発現するリコンビネース発現遺伝子改変動物として研究機関より入手可能なもの、または市販されているものを利用することも可能である。特にＣｒｅ−ｌｏｘＰシステムについては研究がすすんでいる。その多くは、Ｓａｍｕｅｌ  Ｌｕｎｅｎｆｅｌｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｍｏｕｎｔ  ＳｉｎａｉＨｏｓｐｉｔａｌ，  Ｔｏｒｏｎｔ，  Ｏｎｔａｒｉｏ，  Ｃａｎａｄａ）のＡｎｄｒａｓ  Ｎａｇｙ博士のホームページ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｓｈｒｉ．ｏｎ．ｃａ／ｎａｇｙ／）にて紹介されている。
【０１０３】
例えば、本明細書の実施例で使用したＣｒｅを表皮のみで特異的に発現するＫ５−ＣｒｅＴｇトランスジェニックマウス、及びＴ細胞のみで特異的に発現するｌｃｋ−Ｃｒｅトランスジェニックマウスは、本発明者の大阪大学医学部  竹田潤二より入手可能である。さらに、Ｃｒｅを神経細胞特異的に発現するネスチン（ｎｅｓｔｉｎ）−Ｃｒｅトランスジェニックマウス、Ｂ細胞特異的に発現するＣＤ１９−Ｃｒｅトランスジェニックマウス等も知られている。遺伝子改変動物において、リコンビネース遺伝子はホモの状態で存在してもヘテロの状態で存在していてもよい。
【０１０４】
またリコンビネース発現遺伝子改変動物の代替として、リコビネース発現ベクターもしくはリコビネースタンパク質を、リコンビネース標的配列を組み込んだ所期の遺伝子改変動物に、ウイルス、金粒子を細胞に直接打ち込むパーティクル銃、軟膏等を介した方法により限定的に導入する方法も本発明において利用可能である。
【０１０５】
上記時期特異的及び／又は組織特異的にリコンビネースタンパク質を発現するリコンビネース発現遺伝子改変動物を、先の５項（または６項）で得られた、リコンビネース標的配列を含む改変セリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子を有する遺伝子改変動物のホモ接合体またはヘテロ接合体と交配し、セリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子のコンディショナルノックアウト動物を得る。
【０１０６】
具体的は、まず、リコンビネース発現遺伝子改変動物においてホモの状態で野生型のセリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子が存在する場合には、これをヘテロの状態で欠失させる工程が必要である。上述したようにセリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子がホモで欠失し、完全に不活化すると胎生致死である可能性が高い。よって、まずリコンビネース発現遺伝子改変動物であって、セリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子をヘテロの状態で欠失した遺伝子改変動物を得る必要がある。これは、生殖細胞でリコンビネースを発現する遺伝子改変動物（例えば、ＥＩＩａ−Ｃｒｅトランスジェニックマウス、ＣＡＧ−Ｃｒｅトランスジェニックマウス）を、先の５項（または６項）で得られた、本発明のリコンビネース標的配列を含む改変セリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子を有する遺伝子改変動物のホモ接合体またはヘテロ接合体（好ましくはホモ接合体）と交配する。そして、先の６項と同様にＰＣＲ法、サザンブロッティング法等を用いて、セリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子をヘテロの状態で欠失した好ましいヘテロ接合体を選別することができる。このヘテロ接合体は、リコンビネースが発現する特定の時期及び／又は組織において、セリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子をヘテロの状態で欠失している。
【０１０７】
あるいは、セリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子をヘテロの状態で欠失させるという目的においては、本発明のリコンビネース標的配列を含む改変セリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子を有する遺伝子改変動物と交配させるという手法に限定されない。公知のノックアウト遺伝子改変動物作製のための手法を用いて、セリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子をヘテロの状態で欠失したノックアウト遺伝子改変動物を得ることが可能である。
【０１０８】
次いで、セリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子をヘテロの状態で欠失したノックアウト遺伝子改変動物をさらに、先の５項（または６項）で得られた、リコンビネース標的配列を含む改変セリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子を有する遺伝子改変動物のホモ接合体またはヘテロ接合体（好ましくはホモ接合体）と交配する。すると、前者に由来するセリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子を欠失した染色体と、後者に由来するリコンビネース標的配列を含む改変セリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子を有する染色体を有する子孫が一定の割合で得られる。これは、リコンビネースが時期特異的及び／又は組織特異的に発現することにより、セリンパルミトイルトランスフェラーゼタンパク質の発現が時期特異的及び／又は組織特異的に抑制される非ヒト哺乳動物、即ちセリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子のコンディショナルノックアウト動物を提供する。
【０１０９】
また、本発明における実験は、動物実験に対する研究所内倫理ガイドラインおよび遺伝子操作実験に対する安全性ガイドラインに基づいて行う。
【０１１０】
【発明の効果】
本発明のコンディショナルノックアウト哺乳動物は、生体膜機能を始めとした哺乳類におけるスフィンゴ脂質の生理的機能の研究に関し、非常に有力な道具を提供する。本発明のコンディショナルノックアウト哺乳動物では、セリンパルミトイルトランスフェラーゼタンパク質の発現が時期特異的及び／又は組織特異的に制御する。よって、スフィンゴ脂質が発生・成長におけるどの時期に、生体のどの場所で、どのような生理的機能を果たしているかを、セリンパルミトイルトランスフェラーゼタンパク質の発現を欠失させる時期及び／又は組織を、様々に、例えば、系統的に制御することによって調べることが初めて可能となった。
【０１１１】
例えば、スフィンゴ脂質生合成機能を個体全体、即ち受精卵のレベルから欠失した場合、マウス個体は初期発生を乗り越えられないことが示された（実施例７）。
【０１１２】
また、スフィンゴ脂質生合成機能を表皮特異的に欠失するマウスは、体毛が全く生えない、生える場合でも野生型に比べて少ないことが観察された（実施例８）。そして、４週齢までに全て死亡してしまった。また、炎症をおこしている思われるマウスも散見された。この、スフィンゴ脂質生合成機能を表皮特異的に欠失するノックアウトマウスは、特にスフィンゴ脂質は細胞膜構成成分として機能の研究に有用である。また、体毛が野生型と比較して少ない、又はほとんどない性質から、皮膚移植の研究、医薬組成物、化粧品、栄養補助食品、生活改善製品等の組成物若しくは化合物の皮膚への影響を研究するためのモデル動物として有用である。
【０１１３】
さらに、スフィンゴ脂質生合成機能をＴ細胞特異的に欠失するマウスは、Ｔ細胞の分化および成熟度が低下することが観察された（実施例９）。このマウスは、特にＴ細胞が関連する免疫系の研究、例えば、免疫機能撹乱を伴う遺伝的疾患とアレルギーの機序解析及び治療法の確立、免疫抑制剤の開発等に有用である。
【０１１４】
スフィンゴ脂質、特にガングリオシド（スフィンゴ糖脂質）は、脳を代表とする神経系組織に多く含まれる脂質として分類されている。その組成は各神経組織によって大きく異なることから、古くから各機能との関連性が示唆されている。よって本発明において得られるスフィンゴ脂質生合成機能を各神経組織特異的に欠失させた遺伝子改変哺乳動物は、近年進展が著しい脳機能研究において多いに有用であると期待される。
参考文献
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【０１１５】
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７．  バイオマニュアルシリーズ８  「ジーンターゲティング」−ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製（１９９５年、羊土社）ｐ．７１−７７）
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１１．  Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ  Ｅ．  Ｊ．  （１９８７）  ｉｎ  Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ａｎｄ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ−ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ，  ｅｄ．  Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，  Ｅ．  Ｊ．  （ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ），  ｐｐ．１０８−１１２
１２．  Ｋｏｎｄｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９，  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  ３９，  １３７−１４２
１３．  Ｄｙｎｅｃｋｉ，  Ｓ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，２０００、Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  −ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ，  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  ｅｄ．  Ｊｏｙｎｅｒ，  Ａ．Ｌ．  （Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ．  Ｐｒｅｓｓ），  ｐｐ．６８−７３
１４．  Ｌａｋｓｏ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９３，  ５８６０−５８６５
１５．  Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，  Ｍ  ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １９９８  Ｊａｎ  １５；２６（２）：６７９−８０
１６．  Ｄｙｎｅｃｋｉ，  Ｓ．Ｍ．ｅｔａｌ．，  ２０００、  Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  −ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ，  ２ｎｄｅｄｉｔｉｏｎ，  ｅｄ．  Ｊｏｙｎｅｒ，  Ａ．Ｌ．  （Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ．  Ｐｒｅｓｓ），  ｐｐ．７５−８１
１７．  Ｏｓｕｋａ，Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔ  １９９８；８２（３−４）：２２２−３
１８．  Ｎａｇｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０；８４２４−８４２８
１９．  Ｔａｎｉｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１９９５  １４：３６６４−３６７８
２０．  松崎有未他著（１９９９）、フローサイトメトリー自由自在、中内啓光監修（秀潤社）ｐｐ３−１３
【０１１６】
【実施例】
以下、実施例によって本発明を説明するが、実施例は例証のためのものであり、本発明を制限するものではない。本発明の範囲は、請求の範囲の記載に基づいて判断される。さらに、当業者は本明細書の記載に基づいて、容易に修正、変更を加えることが可能である。
【０１１７】
実施例１  マウスＬｃｂ２遺伝子のエクソン３を含むゲノムＤＮＡのスクリーニング
まずマウスＬｃｂ２タンパク質の全長アミノ酸配列（Ｎａｇｉｅｃ，Ｍ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １９９６  Ｏｃｔ  ２４；１７７（１−２）：２３７−４１）をコードするｃＤＮＡ（配列番号：２）を、ランダムプライムラベル法により32Ｐ−ｄＣＴＰ存在下でラベルした。これをプローブとし、１２９ＳＶＪマウスゲノムライブラリーをスクリーニングした。
【０１１８】
陽性ファージクローンの制限酵素切断部位および塩基配列を調べたところ、別個の独立した２種類のＬｃｂ２遺伝子の染色体ＤＮＡ断片（Ｌｃｂ２−Ａ，Ｌｃｂ２−Ｂ）をもつファージクローン（Ａ，Ｂ）が得られた。Ｌｃｂ２−ＡおよびＬｃｂ２−Ｂの制限酵素地図を図３に記載する。
【０１１９】
マウスのＬｃｂ２タンパク質をコードするｃＤＮＡの塩基配列は公知であり、例えば、Ｇｅｎｅ  ｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｕ２７４５５に開示されている（配列番号：２）。Ｌｃｂ２−Ａはエクソン２（配列番号２のｃＤＮＡの塩基１４８ないし３４２に相当）のみを含む全長約１２．６ｋｂの断片、Ｌｃｂ２−Ｂはエクソン３（ｃＤＮＡの塩基３４３ないし４９７に相当）、４（ｃＤＮＡの塩基４９８ないし６４６）、５（ｃＤＮＡの塩基６４７ないし７７１）、６（ｃＤＮＡの塩基７７２ないし８６５）まで含む全長約１３ｋｂの断片であった。
【０１２０】
このうち染色体ＤＮＡ断片Ｌｃｂ２−ＢをプローブとしてＦＩＳＨ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）を行った。その結果、マウスＬｃｂ２遺伝子が１２番染色体のＥ領域に存在する１染色体あたり１コピーの遺伝子であることが確認された（Ｏｓｕｋａ，Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔ  １９９８；８２（３−４）：２２２−３）。
【０１２１】
実施例２  ターゲティングベクターの作製
図４に示した戦略に沿って、ターゲティングベクターを作製した。
１）ｐＢＳ−Ｌｃｂ２Ｂ（１）ｆｌｏｘｅｄ  ｐＧＫ−ｎｅｏの作成
前記ファージクローンＢよりＤＮＡを抽出し、ＮｏｔＩで切断後、１％アガロースゲル電気泳動を行い、Ｌｃｂ２−Ｂ（約１３ｋｂ）を回収し、これをＮｏｔＩで切断したプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）とＴ４リガーゼを用いて結合させ、大腸菌ＤＨ５α（ＴＯＹＯＢＯ等より入手可能）を形質転換してプラスミド「ｐＢＳ−Ｌｃｂ２Ｂ」を得た。
【０１２２】
前記プラスミドｐＢＳ−Ｌｃｂ２ＢをＮｏｔＩとＸｈｏＩで切断し、１％アガロースゲル電気泳動を行った。約５ｋｂに相当するＤＮＡ断片を回収し、ＮｏｔＩとＸｈｏＩで切断したプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）とＴ４リガーゼを用いて結合させた。次いで、これを用いて大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、プラスミド「ｐＢＳ−Ｌｃｂ２Ｂ（１）」を得た。
【０１２３】
一方、プラスミドｌｏｘＰ−ｆｌａｎｋｅｄ−ｐＧＫ−ｎｅｏ（Ｎａｋａｎｏｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １９９９  Ｊｕｌ；１１（７）：２５７７−８１）（本発明者の大阪大学医学部  竹田潤二より入手可能）をＮｏｔＩで切断し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑末端化した。次いで、１％アガロースゲル電気泳動を行い、ｐＧＫ−ｎｅｏ発現ユニットがｌｏｘＰで挟まれた部分に相当する、約２．３ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。これを前記プラスミドｐＢＳ−Ｌｃｂ２Ｂ（１）をＥｃｏＯ１０９Ｉで切断し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑末端化したものとＴ４リガーゼを用いて結合した。次いで、これを用いて大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、プラスミド「ｐＢＳ−Ｌｃｂ２Ｂ（１）ｆｌｏｘｅｄ  ｐＧＫ−ｎｅｏ」を得た。
【０１２４】
但し、この方法ではｐＧＫ−ｎｅｏ発現ユニットがｐＢＳ−Ｌｃｂ２Ｂ（１）ｆｌｏｘｅｄ  ｐＧＫ−ｎｅｏに対して両方向に入る可能性がある。順方向に挿入されたものはＥｃｏＲＩで切断したときに４．３ｋｂに相当するＤＮＡフラグメントが得られる。そこで前項で得られたプラスミドをＥｃｏ  ＲＩで切断し１％アガロースゲル電気泳動を行い、４．３ｋｂのバンドが得られたものをｐＢＳ−Ｌｃｂ２Ｂ（１）ｆｌｏｘｅｄ  ｐＧＫ−ｎｅｏとして、以降使用した。
【０１２５】
２）ｐＢＳ−Ｌｃｂ２Ｂ（２）ｌｏｘＰの作成
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ＋をＨｉｎｄＩＩＩで切断し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑末端化した。次いで、１％アガロースゲル電気泳動を行い、Ｔ４リガーゼを用いて結合した。次いで、これを用いて大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、プラスミドｐＢＫＳ（ＨｉｎｄＩＩＩ（−））を得た。
【０１２６】
１）の工程中で得られたプラスミドｐＢＳ−Ｌｃｂ２Ｂ（１）をＥｃｏＲＶ及びＸｈｏＩで切断した。切断反応物を１％アガロースゲル電気泳動し、約１．９ｋｂに相当するＤＮＡ断片を回収した。当該ＤＮＡ断片を、ＥｃｏＲＶとＸｈｏＩで切断した前記プラスミドｐＢＫＳ（ＨｉｎｄＩＩＩ（−））とＴ４リガーゼを用いて結合した。次いで、これを用いて大腸菌を形質転換してプラスミド「ｐＢＳ−Ｌｃｂ２Ｂ（２）」を得た。
【０１２７】
まず下に挙げる２つの合成プライマーを作製し、Ｔ４  ＤＮＡキナーゼによりそれぞれの５’末端をリン酸化した；
【０１２８】
【化２】
0004714368.tif 000002
その後、両者を５μＭになるよう混合し、９５℃、２０分煮沸し後一晩かけて室温に冷却することで、それぞれの相補部分間で会合して合成２本鎖ＤＮＡ「ｌｏｘＰ−ＨｉｎｄＩＩＩ（ＥｃｏＴ２２Ｉ）」を作製した。ｌｏｘＰ−ＨｉｎｄＩＩＩ（ＥｃｏＴ２２Ｉ）は、中央に３４塩基配列からなるｌｏｘＰ配列（下線部分）を持ち、３’末端側にＨｉｎｄＩＩＩ切断部位（ａａｇｃｔｔ）、また両末端にはＥｃｏＴ２２Ｉ（ＮｓｉＩ）切断部位に相当する４塩基（ｔｇｃａ）からなる突出末端を持つ。
【０１２９】
次に、前記プラスミドｐＢＳ−Ｌｃｂ２Ｂ（２）をＥｃｏＴ２２Ｉで切断し、１％アガロースゲル電気泳動を行った。５ｋｂに相当するバントを回収後、これに前記２本鎖合成ＤＮＡ「ｌｏｘＰ−ＨｉｎｄＩＩＩ（ＥｃｏＴ２２Ｉ）」をＴ４リガーゼを用いて結合させた。次いで、これを用いて大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、プラスミド「ｐＢＳ−Ｌｃｂ２Ｂ（２）ｌｏｘＰ」を得た。
【０１３０】
但し、この方法ではｌｏｘＰ−ＨｉｎｄＩＩＩ（ＥｃｏＴ２２Ｉ）が多重にかつ順・逆方向に挿入される。ｐＢＳ−Ｌｃｂ２Ｂ（２）ｌｏｘＰの塩基配列を決定することで、ｌｏｘＰ−ＨｉｎｄＩＩＩ（ＥｃｏＴ２２Ｉ）が一つのみ順方向（即ち、ＨｉｎｄＩＩＩがｐＢＳ−Ｌｃｂ２Ｂ（２）内のＬｃｂ２遺伝子の下流にそろうように）に挿入されたものを選択した。
【０１３１】
３）プラスミドＬｃｂ２ＴＶ３ＤＴＡｐＡ（ターゲティングベクター）の作成
１）で作成したプラスミドｐＢＳ−Ｌｃｂ２Ｂ（１）ｆｌｏｘｅｄ  ｐＧＫ−ｎｅｏをＸｂａＩとＮｄｅＩで切断し、１％アガロースゲル電気泳動を行い、約４．８ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。同様の操作を行い、２）で作成したプラスミドｐＢＳ−Ｌｃｂ２Ｂ（２）ｌｏｘＰをＮｄｅＩとＸｈｏＩで切断し約１．７ｋｂのＤＮＡ断片を得た。また、１）の工程中で得られたプラスミドｐＢＳ−Ｌｃｂ２Ｂ（１）をＸｈｏＩとＡｓｐ７１８Ｉで切断して約５ｋｂのＤＮＡ断片を、そしてプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ＋をＡｓｐ７１８ＩとＸｂａＩで約３ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。次にこれら４つのＤＮＡ断片をＴ４リガーゼを用いて結合させ、大腸菌ＤＨ５αを形質転換してプラスミド「Ｌｃｂ２ＴＶ３」を得た。
【０１３２】
一方、プラスミドｐＭＣ１ＤＴＡｐＡ（Ｙａｇｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３；Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２１４；７７−８６）（大阪大学  細胞生体工学センター  八木健教授より入手）をＮｏｔＩで切断後、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑末端化した。次に、ＸｈｏＩにて切断した。さらに１％アガロースゲル電気泳動を行い約１．３ｋｂに相当するＤＮＡ断片を回収し、これを「ＭＣ１ＤＴＡｐＡ」とする。
【０１３３】
次に、別途プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ＋をＡｓｐ７１８Ｉで切断後Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑末端化した。次に、ＸｈｏＩで切断し、１％アガロースゲル電気泳動を行い、約３．０ｋｂに相当するＤＮＡ断片を回収した。これを前記ＭＣ１ＤＴＡｐＡとＴ４リガーゼを用いて結合させ、大腸菌を形質転換してプラスミド「ｐＢＳ／ＭＣ１ＤＴＡｐＡ」を得た。
【０１３４】
前記プラスミドＬｃｂ２ＴＶ３とプラスミドｐＢＳ／ＭＣ１ＤＴＡｐＡを各々Ａｓｐ７１８Ｉで切断後Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑末端化し、次にＮｏｔＩにて切断した。さらに１％アガロースゲル電気泳動を行い、それぞれ約４．２ｋｂと約１１．５ｋｂに相当するＤＮＡ断片を回収した。両者をＴ４リガーゼを用いて結合し、大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、プラスミド「Ｌｃｂ２ＴＶ３ＤＴＡｐＡ」を得た。以降、プラスミド「Ｌｃｂ２ＴＶ３ＤＴＡｐＡ」をＬｃｂ２ノックアウト（ＫＯ）作成用ターゲティングベクターとして使用した。
【０１３５】
実施例３  ＥＳ細胞へのターゲティングベクターの導入
ＥＳ細胞は、Ｎａｇｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０；８４２４−８４２８に記載のＲ１細胞（Ａｎｔｒａｓ  Ｎａｇｙ，Ｓａｍｕｅｌ  Ｌｕｎｅｎｆｅｌｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，  Ｍｏｕｎｔ  Ｓｉｎａｉ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ，  （６００  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ａｖｅｎｕｅ，ＴｒｏｎｔｏＭ５Ｇ  １Ｘ５）より入手可能）を使用した。以下の実施例で細胞の培養は、全て３７℃の５％ＣＯ2培養器中で行った。
【０１３６】
２０％ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ：ウシ胎児血清、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈ社等）及び１０００単位／ｍｌのｍＬＩＦ（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ）（商品名：ＥＳＧＲＯ（商標））（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社製）を添加したＤＭＥＭ培地（ダルベッコ修正イーグル培地）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈ社等）（以下、「ＥＳ用培地」と言う）で維持しているＲ１細胞に対し、実施例２で作成したＬｃｂ２ＫＯターゲティングベクター（「Ｌｃｂ２ＴＶ３ＤＴＡｐＡ」）をＮｏｔＩで切断したものを２０μｇ使用し、エレクトロポレーション法（Ｎａｋａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １９９９  Ｊｕｌ；１１（７）：２５７７−８１）により導入した。
【０１３７】
具体的には、エレクトロポレーションを実施する前日に、新鮮なＥＳ用培地と交換したＲ１細胞を集め、エレクトロポレーション用溶液（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，  ｐＨ７．０５，１３７ｍＭ  ＮａＣｌ，５ｍＭ  ＫＣｌ，  ０．７ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4，  ６ｍＭ  デキストロース）で洗浄した。１０7個のＲ１細胞を、ＮｏｔＩで線状化した２０μｇのターゲッティングベクター「Ｌｃｂ２ＴＶ３ＤＴＡｐＡ」と０．８ｍｌのエレクトロポレーション用溶液を用い、エレクトロポレーション用キュベットの中で混合した。その後ｍＢｉｏ−Ｒａｄ  ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ（バイオラッド社製）を使用して、２４０Ｖ、５００μＦの条件で電気パルスを与えた。
【０１３８】
１０ｍｌのＥＳ用培地に懸濁後、遠心分離によりＥＳ細胞を回収し、６ｍｌのＥＳ用培地に懸濁し、予め８ｍｌのＥＳ用培地中にフィーダー細胞を播いてある１０ｍｌディッシュ１枚あたりにこのＥＳ細胞懸濁液を２ｍｌを加え、１２−１８時間後に力価１５０μｇ／ｍｌのＧ４１８（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ社製）を添加して、１週間培養した。
【０１３９】
なお、フィーダー細胞としては、本発明者がＨＳ１ノックアウトマウス（Ｔａｎｉｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１９９５  １４：  ３６６４−３６７８）の雄と野生型のＩＣＲ系統の雌と交配し、１２日ないし１３日胚から分離して樹立した繊維牙細胞を使用した。
【０１４０】
実施例４  相同組換えを起こしたＥＳ細胞の選択
実施例３において、Ｇ４１８の添加後７日間培養して生じてきたＥＳ細胞のコロニーを採取した。ＬＣＢ２ＣＫＯターゲッティングベクターにネガティブ選択用にジフテリア毒素Ａ（ＤＴＡ）サブユニット発現カセットを組み込んでいるために、非相同組換え体の多くはコロニー形成以前に除去される。
【０１４１】
各コロニーを二分し、一方は培養を継続した。もう一方は所期の相同組換えを起こしているクローンを選択するためにＰＢＳ−にて洗浄し、Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ処理を行った後、染色体ＤＮＡを回収してＰＣＲによりクローンを選択した。
【０１４２】
ＰＣＲにおいて用いた合成プライマーの塩基配列は次の通り；
【０１４３】
【化３】
プライマー  Ｕ３／１０５（配列番号：６）：
５’−ｇｔｇｃｔｇｃｔａｇｇｇｔｔｔｃｃａｔｔｔｃａｇｃｃａｃａｔ−３’
（構築したターゲッティングベクターの外側にある塩基配列）
プライマー  ｐＧＫ−１（配列番号：７）：
５’−ｔａｇｔｇａｇａｃｇｔｇｃｔａｃｔｔｃｃａｔｔｔｇｔｃａｃｇ−３’
（ｎｅｏ遺伝子発現ユニットの外の塩基配列）
ＰＣＲの実験条件は、９４℃１分、６０℃１分、６８℃３分を１サイクルとして３０サイクル行い、ＰＣＲ産物を１％アガロースゲル電気泳動を行い、正しく相同組換えを行った際に予想されるＰＣＲ産物（約２．２ｋｂ）に相当する位置にバンドを生じたクローンを陽性と判断した。この方法により採取した２２４個のクローンのうち１６個に陽性が認められた。
【０１４４】
相同組換えをより正確に確認するために、前項で陽性が認められた１６クローンおのおのについて培養を継続し、増殖したＥＳ細胞の一部から染色体ＤＮＡを抽出し、以下のようにサザンブロッティング法を行った。
【０１４５】
染色体ＤＮＡ２０μｇをＨｉｎｄＩＩＩで切断後、１％アガロースゲル電気泳動を行い、ナイロンメンブレンＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋（アムシャム・ファルマシア・バイオテク社製）に対して１０ｘＳＳＣ溶液でキャピラリー法により転写した。構築したターゲッティングベクターのすぐ５’外側にあるＸｂａＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断した染色体ＤＮＡ断片（４３３ｂｐ、「５’プローブ」）をプローブとし、染色体ＤＮＡ転写膜に対しｄディゴキシゲニン（ＤＩＧ）ハイブリダイゼーションシステム（ロッシュ・ダイアグノスティック社製）によりザザンブロッティングを行った。
【０１４６】
変異が導入されなかった野生体は約５．９ｋｂのバンドを、正しく相同組換えを行ったものは約２．５ｋｂのバンド予想がされる。１６クローン全てに約５．９ｋｂと約２．５ｋｂのバンドが１：１で認められた（ヘテロ接合体）。
【０１４７】
染色体ＤＮＡ２０μｇをＳａｃＩで切断後、０．８％アガロースゲル電気泳動を行い、ナイロンメンブレンＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋へキャピラリー法により１０ｘＳＳＣ溶液で転写した。前記５’プローブを使用して転写膜に対しＤＩＧハイブリダイゼーションシステムによりザザンブロッティングを行った。
【０１４８】
正しく相同組換えを行ったものは約１０．５ｋｂのバンドを示すが、変異が導入されなかった野生体は約８．５ｋｂのバンドを、そして非相同組換え体を含む場合はこれ以外のサイズのバンドを示す。上記１６クローンのうち、４クローンに非相同組換え体を示唆するサイズのバンドが認められた。
【０１４９】
染色体ＤＮＡ２０μｇをＨｉｎｄＩＩＩで切断後、１％アガロースゲル電気泳動を行い、ナイロンメンブレンＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋へキャピラリー法により１０ｘＳＳＣ溶液で転写した。ネオマイシン耐性遺伝子の全長に相当するプローブにより転写膜に対しＤＩＧハイブリダイゼーションシステムによりザザンブロッティングを行った。
【０１５０】
エクソン３の３’側のｌｏｘＰ配列が正しく挿入された相同組換えを行っていれば、約３．４ｋｂに相当するバンドが確認される。一方３’側のｌｏｘＰ配列が挿入されていない場合は約５．９ｋｂのバンドが認められる。
【０１５１】
非相同組換え体を含まない相同組換え体１２クローンに対し、７クローンに３’側のｌｏｘＰ配列が正しく挿入されていることが確認された。
この７クローンに対し、染色体異常が無いことを確認するために核型分析を行った（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ  Ｅ．  Ｊ．  （１９８７）  ｉｎ  Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ａｎｄ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  −ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ，  ｅｄ．  Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，Ｅ．  Ｊ．  （ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ），  ｐｐ．１０８−１１２）。このうち５クローンについて正常な核型（２ｎ＝４０）が認められた。
【０１５２】
実施例５  改変セリンパルミトイルトランスフェラーゼ遺伝子を有する遺伝子改変動物の作製
以上の工程から得られた相同組換え体ＥＳクローンと同じ染色体ＤＮＡを持つマウスの作製をアグリゲーション法（Ｋｏｎｄｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９，  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  ３９，  １３７−１４２）により行った。
【０１５３】
相同組換えを起こしていることが確認されたＥＳ細胞の培養を、約２４時間毎に継代し４日間継続した後、細胞をトリプシン処理によりばらばらに分散した。マウスＢＤＦ１系統の雄を掛け合わした同系統の雌より８細胞期胚を取出した。前記胚より透明帯を外した後、バラバラにした上記ＥＳ細胞を接着させた（２０ＥＳ細胞／８細胞期胚１個）。これを偽妊娠処理した雌マウスの子宮に移し、胎児の発生を継続させることによりキメラマウスを得た。
【０１５４】
このキメラマウスの雄を黒色であるＣ５７ＢＬ／６の雌と交配し、生まれてきた仔マウスのうち野ネズミ色（ａｇｏｕｔｉ）のものを選び、その尾の一部を切断した試料から染色体ＤＮＡを抽出した。実施例４で述べたサザンブロッティング法（ＨｉｎｄＩＩＩ切断・「５’プローブ」検出）により遺伝子変異が全身に導入されたマウスを確認した。
【０１５５】
上述した方法により、５つの相同組換え体ＥＳクローンから、先ず計２６匹のキメラマウスを作出した。そのうち１０匹を交配し、７４匹の仔マウスを得た。サザンブロット法によりそのうち２７匹に遺伝子変異が全身に導入されたものを確認し、変異Ｌｃｂ２遺伝子について「ヘテロ」接合体を得た。さらに、前記「ヘテロ」接合体同士を交配して、変異Ｌｃｂ２遺伝子「Ｌｃｂ２ｔａｒｇｅｔ」について「ホモ」接合体を得た。
【０１５６】
実施例６  Ｎｅｏ遺伝子の削除
この段階でマウス染色体上のマウスＬｃｂ２遺伝子に導入された変異には、ネオマイシン遺伝子発現カセットが挿入されている。この発現カセットを削除する目的でＥＩＩａＣｒｅトランスジェニックマウス（Ｌａｋｓｏ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９３，  ５８６０−５８６５）（米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）（ＵＳＡ）のＨｅｉｍｅｒ  Ｗａｓｔｐｈａｌ博士より入手）と交配した。ＥＩＩａＣｒｅ遺伝子発現カセットにより発現されたＣｒｅリコンビネースの活性により、ｌｏｘＰに挟まれたｎｅｏ遺伝子発現カセットが切り出される。
【０１５７】
具体的には、実施例５で得られた変異Ｌｃｂ２遺伝子を持つマウス（雄）（ホモ接合体）とホモ接合ＥＩＩａＣｒｅトランスジェニックマウス（雌）を交配し、ｎｅｏ遺伝子発現カセットが削除された第一世代（Ｆ１）マウスを得た。得られたマウスにおいて、ｎｅｏ遺伝子発現カセットの削除が認めれるマウスを実施例４に記載のサザンブロッティング（ＨｉｎｄＩＩＩ切断・「５’プローブ」検出）によりスクリーニングした。具体的には、ｎｅｏ遺伝子発現カセットのみが削除された場合（「Ｌｃｂ２ｆｌｏｘ」）には約３．６ｋｂのバンドが確認される。一方、ＥＩＩａＣｒｅ遺伝子発現カセットの検出には、尾の一部から抽出した染色体ＤＮＡに対してサザンブロッティングを行った。染色体ＤＮＡ２０μｇをＢａｍＨＩＩで切断後、１％アガロースゲル電気泳動を行い、キャピラリー法によりナイロンメンブレンＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋に１０ｘＳＳＣ溶液で転写した。Ｃｒｅ遺伝子の一部に相当するＤＮＡ断片（ＥｃｏＲＩ切断による１．１ｋｂｐ，Ｃｒｅプローブ）をプローブとし、転写膜に対しＤＩＧハイブリダイゼーションシステムによりザザンブロッティングを行った。ＥＩＩａＣｒｅ遺伝子を持つマウスは、約５．５、４．５、２．５ｋｂのバンドが認められる。
【０１５８】
上記の方法により変異Ｌｃｂ２遺伝子を持つマウス（雄）（ホモ接合体）とホモ接合ＥＩＩａＣｒｅトランスジェニックマウス（雌）１組から計１０匹（雄３匹、雌７匹）のキメラマウスＦ１が得られた。そのうち、雄１匹にｎｅｏ遺伝子発現カセットの削除が強く認められ、また、ＥＩＩａＣｒｅ遺伝子がヘテロで存在した。
【０１５９】
次に、前記キメラマウス（雄）を野生型のＣ５７ＢＬ／６マウス（雌）と交配し、第二世代（Ｆ２）（「ヘテロ」接合体）を９匹（雄４匹、雌５匹）得た。このうち、ＨｉｎｄＩＩＩ切断・５’プローブ検出のサザンブロッティングによりＬｃｂ２ｆｌｏｘバンド（約３．６ｋｂ）と野生型のバンド（約５．９ｋｂ）を１対１で示すものを選別した。サザンブロットによりＬｃｂ２ｆｌｏｘと野生型のバンドが１対１に近いものが雄２匹において認められたが、全てＥＩＩａＣｒｅ遺伝子をヘテロにて持っていた。
【０１６０】
ＥＩＩａＣｒｅ遺伝子発現カセットはゲノム中に組み込まれていない方が好ましい。そこで、雄１匹を再度野生型のＣ５７ＢＬ／６（雌）と交配させ、Ｆ３を１０匹（雄４匹、雌６匹）を得た。このうち、前記サザンブロットを利用したＣｒｅ遺伝子の検出法により、ＥＩＩａＣｒｅ遺伝子発現カセットを持たないマウスを所期のヘテロ接合体として選別した。その結果、Ｌｃｂ２ｆｌｏｘと野生型のバンドが完全に１対１でかつＥＩＩａＣｒｅ遺伝子を持たないものが雌３匹得られた。
【０１６１】
さらに、前記選別されたヘテロ接合体同士を交配して、ｎｅｏ遺伝子が削除された変異Ｌｃｂ２遺伝子「Ｌｃｂ２ｆｌｏｘ」について「ホモ」接合体を得た。
実施例２−６に記載した、本発明のコンディショナルノックアウトマウス作製の戦略の流れを図５に示した。
【０１６２】
実施例７  ＣＡＧ−Ｃｒｅトランスジェニックマウスを用いたスフィンゴ脂質生合成の受精卵レベルでの検討
本実施例では、スフィンゴ脂質生合成機能を個体全体、即ち受精卵のレベルから欠失する場合、どのような影響があるかを調べた。具体的には図６に示した戦略に従った。
【０１６３】
Ｃｒｅタンパク質を個体全体で発現するＣＡＧ−Ｃｒｅトランスジェニックマウスは、大阪大学  医学部  宮崎純一教授より入手した。これより、先ず以下の交配によりＬｃｂ２遺伝子をヘテロに欠失し、また、Ｃｒｅ遺伝子もヘテロに有するノックアウトマウスを得た。
【０１６４】
具体的には、実施例５で得られた変異Ｌｃｂ２遺伝子を持つマウス（雌）（ホモ接合体）とヘテロ接合ＣＡＧ−Ｃｒｅトランスジェニックマウス（雄）とを交配した。それらの子供について尻尾の一部を採取し、ゲノムＤＮＡを抽出した。Ｌｃｂ２遺伝子の確認には実施例４で述べたＳａｃＩ切断による５’プローブを用いたサザンブロッティングを、ＣＡＧ−Ｃｒｅ遺伝子の確認には実施例６で述べたＢａｍＨＩ切断によるＣｒｅプローブを用いたサザンブロッティングを行った。なお、Ｌｃｂ２遺伝子の確認では野生型（「＋」）の場合は８．５ｋｂが、欠失型（「−」）の場合は７．５ｋｂのバンドが認められ、ＣＡＧ−Ｃｒｅ遺伝子の確認においては、３．０と１．５ｋｂのバンドが認められる。その結果、一組の交配から１６匹の子（雄：８匹、雌：８匹）が得られ、このうち雄２匹、雌３匹が遺伝型が「＋／−，ＣＡＧ−Ｃｒｅ／０」であった。
【０１６５】
上記「＋／−，ＣＡＧ−Ｃｒｅ／０」ノックアウトマウスを、実施例５で作製したＮｅｏ遺伝子を含んだ変異Ｌｃｂ２遺伝子「Ｌｃｂ２ｔａｒｇｅｔ」の「ホモ」接合体と交配し、それから得られた子孫の遺伝子型を調べた。その結果を図６に示した。図６において、「ｔａｒｇｅｔ」は変異Ｌｃｂ２遺伝子「Ｌｃｂ２ｔａｒｇｅｔ」を有すること、「＋」は野生型のＬｃｂ２遺伝子を有すること、「−」はＬｃｂ２遺伝子が欠失していること、「Ｃｒｅ」はＣｒｅ遺伝子が存在することを意味する。図６に示されるように、（＋／ｔａｒｇｅｔ，０／０）が２８個体、（−／ｔａｒｇｅｔ，０／０）が３４個体、（＋／−，Ｃｒｅ／０）が２０個体得られた。しかしながら、メンデルの法則に従えば上記３種と同程度で得られるはずの（−／−，Ｃｒｅ／０）の遺伝子型を有する個体は一つも得られなかった。
【０１６６】
よって、スフィンゴ脂質生合成機能を個体全体、即ち受精卵のレベルから欠失する場合、初期発生を乗り越えられないことが示された。
実施例８  Ｋ５−Ｃｒｅトランスジェニックマウスを用いたスフィンゴ脂質生合成の表皮特異的欠損の検討
本実施例では、スフィンゴ脂質生合成機能を表皮特異的に欠失する場合、どのような影響があるかを調べた。コンディショナルノックアウトマウスの作製は、実施例７と同様に行った。但し、ＣＡＧ−Ｃｒｅトランスジェニックマウスの代わりに、Ｃｒｅタンパク質を表皮特異的にに発現するＫ５−Ｃｒｅトランスジェニックマウスを用いた。Ｋ５−Ｃｒｅトランスジェニックマウスは、本発明者の大阪大学医学部  竹田潤二より入手可能である。また、実施例５で作製したＮｅｏ遺伝子を含んだ変異Ｌｃｂ２遺伝子「Ｌｃｂ２ｔａｒｇｅｔ」の「ホモ」接合体を用いた。
【０１６７】
得られた本発明のノックアウトマウスの生後１２時間の写真を図７に示す。図７に示されるように、本発明のコンディショナルノックアウトマウスは、対照の野生型マウスと比較して表皮に湿潤感がなく、全体にザラザラした状態であった。
【０１６８】
図８に、得られた本発明のノックアウトマウスの３週齢の写真を示す。図８よりもわかるように、野生型の対照と比較して全体に体毛が薄く、特に耳の後ろは毛が薄くはれていた。また、髪の毛の生え変わるサイクルも、一般に野生型よりも遅く、体毛がほとんど生えないものも存在した。
【０１６９】
図９に、３週齢の本発明のノックアウトマウスと野生型の対照の表皮切片断面の顕微鏡写真（倍率１００）を示す。図９に示すように、本発明のノックアウトマウスは濾胞を形成していた。さらに、図９において黒い点のように見えるものはリンパ球であり、これが数多く存在することより、炎症を起こしている可能性が考えられる。
【０１７０】
本実施例のスフィンゴ脂質生合成機能を表皮特異的に欠失したノックアウトマウスは、４週齢までに全て死亡してしまった。
実施例９  Ｌｃｋ−Ｃｒｅトランスジェニックマウスを用いたスフィンゴ脂質生合成のＴ細胞特異的欠損の検討
本実施例では、スフィンゴ脂質生合成機能をＴ細胞特異的に欠失する場合、どのような影響があるかを調べた。コンディショナルノックアウトマウスの作製は、実施例７と同様に行った。但し、ＣＡＧ−Ｃｒｅトランスジェニックマウスの代わりに、Ｃｒｅタンパク質をＴ細胞特異的にに発現するＬｃｋ−Ｃｒｅトランスジェニックマウスを用いた。Ｌｃｋ−Ｃｒｅトランスジェニックマウスは、本発明者の大阪大学医学部  竹田潤二より入手可能である。また、実施例５で作製したＮｅｏ遺伝子を含んだ変異Ｌｃｂ２遺伝子「Ｌｃｂ２ｔａｒｇｅｔ」の「ホモ」接合体を用いた。
【０１７１】
得られた本発明のノックアウトマウスについてＴ細胞への影響を調べた。手法は、例えば松崎有未他著（１９９９）、フローサイトメトリー自由自在、中内啓光監修（秀潤社）ｐｐ３−１３にて詳細に解説されている。具体的には６週令の雄ノックアウトマウスより胸腺および脾臓を摘出し、それぞれＰＥ標識抗ＣＤ４抗体及びＡＰＣ標識抗ＣＤ８抗体にて染色を施した。次いで、ＦＡＣＳ  Ｖａｎｔａｇｅ（Ｂｅｃｔｏｎ，  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ社製）を用いて、ＣＤ４およびＣＤ８に関する２次元解析による細胞選別を行った。蛍光色素ＰＥ，ＡＰＣに関してはそれぞれ検出器ＦＬ２（励起／検出波長、４８８ｎｍ／５７５ｎｍ）とＦＬ４（５９８ｎｍ／６６０ｎｍ）にて検出、その強度と細胞数に関して数値化した。対照として野生型マウスについても同様に細胞選別を行った。
【０１７２】
結果を図１０に示す。図１０においてＣＤ４のみ陽性の細胞はヘルパーＴ細胞、ＣＤ８のみ陽性の細胞はキラーＴ細胞に相当する。Ｔ細胞は未分化の状態では、ＣＤ４およびＣＤ８双方とも陰性、次いで、双方とも陽性になり、さらに分化が進むとＣＤ４のみ陽性（ヘルパーＴ細胞）、またはＣＤ８のみ陽性（キラーＴ細胞）となる。図１０において胸腺では本発明のノックアウトマウスは野生型と比較して特に、ＣＤ８のみ陽性（キラーＴ細胞）が４．６％から２．３％と顕著に減少した。脾臓ではさらに顕著な影響が観察され、胸腺と同様にＣＤ８のみ陽性（キラーＴ細胞）が１２．４％から３．０％と１／４以下に減少した。
【０１７３】
さらに、キラー細胞まで分化したＴ細胞について、その成熟度を調べた。具体的には、図１０に示した胸腺由来のＴ細胞でＣＤ８のみ陽性を示した細胞（キラーＴ細胞）（全体の２．３％）について、抗ＣＤ３ｅ抗体  １４５−２Ｃ１１（Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ社より入手可能）を用いて、細胞表面のＣＤ３ｅ発現量を調べた。細胞表面のＣＤ３ｅ発現量は、Ｔ細胞が教育を受けると観察され、成熟度の目安となる。結果を図１１に示す。図１１は、本発明のノックアウトマウスの胸腺由来のキラーＴ細胞には、細胞表面のＣＤ３ｅ発現量が野生型の場合と比較して少ない細胞、即ち成熟度の低い細胞が存在すること（キラーＴ細胞の４３％程度）を示している。
【０１７４】
よって、本実施例のスフィンゴ脂質生合成機能をＴ細胞特異的に欠失させたノックアウトマウスは、Ｔ細胞の分化、特にキラーＴ細胞への分化が減少し、さらに、キラーＴ細胞へ分化した細胞のうちでも、その成熟度が低いものが成熟度の低いものが存在することが示された。
【０１７５】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、スフィンゴ脂質の生合成経路を示す。
【図２】  図２は、リコンビネースタンパク質／リコンビネース標的配列システムを利用したコンディショナルノックアウトの例の概念を示す。
【図３】  図３は、Ｌｃｂ２−ＡおよびＬｃｂ２−Ｂの制限酵素地図を示す。
【図４】  図４は、本発明のターゲティングベクターを作製の戦略を示す。
【図５】  図５は、本発明のコンディショナルノックアウトマウスの作製戦略の流れ図である。
【図６】  図６は、ＣＡＧ−Ｃｒｅトランスジェニックマウスを用いたスフィンゴ脂質生合成の受精卵レベルでの検討の戦略と結果を示す。
【図７】  図７は、Ｋ５−Ｃｒｅトランスジェニックマウスを用いたスフィンゴ脂質生合成の表皮特異的欠損ノックアウトマウスの生後１２時間の写真を示す。
【図８】  図８は、Ｋ５−Ｃｒｅトランスジェニックマウスを用いたスフィンゴ脂質生合成の表皮特異的欠損ノックアウトマウスの３週齢の写真を示す
【図９】  図９は、Ｋ５−Ｃｒｅトランスジェニックマウスを用いたスフィンゴ脂質生合成の表皮特異的欠損ノックアウトマウスの３週齢の表皮切片断面の顕微鏡写真を示す。
【図１０】  図１１は、Ｌｃｋ−Ｃｒｅトランスジェニックマウスを用いたスフィンゴ脂質生合成のＴ細胞特異的欠損ノックアウトマウスの、ＣＤ４およびＣＤ８を示標にしたＴ細胞の細胞選別の結果を示す。
【図１１】  図１１は、Ｌｃｋ−Ｃｒｅトランスジェニックマウスを用いたスフィンゴ脂質生合成のＴ細胞特異的欠損ノックアウトマウスのキラーＴ細胞における細胞表面のＣＤ３ｅ発現量を調べた結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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