(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
分離比歪み（Transmission Ratio Distortion）を生じるt-レスポンダー活性を有する、RNAおよびポリペプチドから選択される発現産物を規定する、以下のもの、
(a)  図4aまたは9に示す核酸分子を含む核酸分子；
(b)  (a)の核酸分子の対立遺伝子変異体である核酸分子；
(c)  (a)あるいは(b)の核酸分子に相補的な核酸分子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子；および
(d)  (a)、(b)あるいは(c)の核酸分子に、遺伝暗号の縮重によって関係づけられる核酸分子；
からなる群から選択される、核酸分子。
【請求項２】
野生型レスポンダータンパク質の量を減少させ、それにより野生型レスポンダータンパク質の量の低下が分離比歪み（Transmission Ratio Distortion）を生じる以下のもの、
(a)  図7a、7b、7dに示す核酸分子または図7cに示す核酸のアンチセンス転写産物の核酸分子を含む核酸分子；および
(c)  (a)あるいは(b)の核酸分子に相補的な核酸分子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子；
からなる群から選択される、核酸分子。
【請求項３】
DNA分子である、請求項1または2の核酸分子。
【請求項４】
請求項1から3のいずれか1項おいて定義される核酸分子の発現を調節することができる、図11に示す配列のヌクレオチド930から3576までを含むプロモーターを含むかあるいは図11に示す配列のヌクレオチド930から3576までを含むプロモーターである、前記核酸分子に対応する遺伝子の制御領域。
【請求項５】
天然に存在する制御領域あるいは遺伝学的に作り出されたその誘導体である、請求項4の制御領域。
【請求項６】
請求項1から3のうちのいずれかの核酸分子を、請求項4または5のいずれか1項の制御領域および／または精子形成／精子完成の間の発現を可能にする制御領域とともにを含む、組換えDNA分子。
【請求項７】
前記制御領域が異種のDNA分子に機能可能なように連結されている、請求項6の組換えDNA分子。
【請求項８】
前記異種のDNA分子がペプチド、ポリペプチド、アンチセンスRNA、センスRNA、毒素および／またはリボザイムを規定する、請求項7の組換えDNA分子。
【請求項９】
前記ペプチド、ポリペプチド、アンチセンスRNA、センスRNA、毒素および／またはリボザイムが細胞死を引き起こすことができる、請求項8の組換えDNA分子。
【請求項１０】
前記あるいは追加のペプチドまたはポリペプチドがエフェクター（ポリ）ペプチドである、請求項8の組換えDNA分子。
【請求項１１】
前記エフェクター（ポリ）ペプチドが、固体支持体に選択的に結合する、あるいはあらかじめ選択された抗原決定基に結合する、イオンを可溶状態にとどめておくことができるものであるか、あるいは毒素、リボザイム、酵素、標識あるいは遠隔的に検出できる部分である、請求項10の組換えDNA分子。
【請求項１２】
前記エフェクター（ポリ）ペプチドが、カルモジュリン、メタロチオネイン、その断片、緑色蛍光タンパク質（GFP）、β-ラクタマーゼ、hCD24、myc、FLAG、ヘムアグルチニンあるいは、グルタミン酸、アスパラギン酸、リジン、ヒスチジンまたはアルギニンのうちの少なくとも1つに富んだアミノ酸配列である、請求項11の組換えDNA分子。
【請求項１３】
請求項1から3のいずれか1項の核酸分子、請求項4または5のいずれか1項の制御領域あるいは請求項6から12のいずれか1項の組換えDNA分子を含むベクター。
【請求項１４】
異種のプロモーターを含む、請求項13のベクター。
【請求項１５】
異種のプロモーターが精子形成および／または精子完成において遺伝子発現を調節する、請求項14のベクター。
【請求項１６】
異種のプロモーターがc-kitあるいはACEの精巣プロモーターである、請求項15のベクター。
【請求項１７】
請求項1から3のいずれか1項の核酸分子、請求項6から12のいずれか1項の組換えDNA分子あるいは請求項13から16のいずれか1項のベクターで形質転換される、あるいは形質導入される非ヒト宿主細胞または非ヒト宿主生物。
【請求項１８】
請求項1から3および6から16のいずれか1項によって定義される通りの発現産物を組み換えによって作出する方法であって、そのタンパク質の発現を引き起こすための条件下で請求項17の非ヒト宿主細胞を培養する段階および前記タンパク質を培養物から回収する段階を含む前記方法。
【請求項１９】
請求項1から3および6から17のいずれか1項の核酸分子によって規定される、あるいは請求項18の方法によって得ることができる、RNAおよびポリペプチドから選択される発現産物。
【請求項２０】
請求項19の発現産物を特異的に認識する抗体。
【請求項２１】
請求項1から3のいずれか1項の核酸分子と、あるいは請求項4または5のいずれか1項の制御領域と、あるいはその相補鎖と、ストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする核酸分子。
【請求項２２】
請求項1から3のいずれか1項の核酸分子、請求項4または5のいずれか1項の制御領域、請求項6から12のいずれか1項の組換えDNA分子、請求項13から16のいずれか1項のベクター、請求項17の非ヒト宿主細胞、請求項19の発現産物、請求項20の抗体、あるいは請求項21の核酸分子、あるいはプライマーのうちの1つが請求項21の核酸分子である前記プライマー対を含む、レスポンダー遺伝子の遺伝子型を決定するための組成物。
【請求項２３】
請求項1から3のいずれか1項の核酸分子、請求項4または5のいずれか1項の制御領域、請求項6から12のいずれか1項の組換えDNA分子、または請求項13から16のいずれか1項のベクターを、生殖細胞、胚細胞または卵細胞あるいはそれらに由来する細胞の染色体に導入することを含む、トランスジェニック非ヒトほ乳類、魚類あるいは鳥類を作出する方法。
【請求項２４】
前記染色体がX染色体あるいは鳥類あるいは魚類における対応する性染色体、あるいは常染色体である、請求項23の方法。
【請求項２５】
前記染色体がY染色体あるいは鳥類あるいは魚類における対応する性染色体である、請求項23の方法。
【請求項２６】
請求項1から3のいずれか1項の核酸分子、請求項4または5のいずれか1項の制御領域、請求項6から12のいずれか1項の組換えDNA分子、請求項13から16のいずれか1項のベクター、精子完成における発現を調節する異種のプロモーターおよび／または請求項10または11において定義される通りのエフェクター（ポリ）ペプチドをコードするDNA配列が、前記Y染色体に挿入される、請求項25の方法。
【請求項２７】
請求項1から3のいずれか1項の核酸分子、請求項4または5のいずれか1項の制御領域、請求項6から12のいずれか1項の組換えDNA分子、請求項13から16のいずれか1項のベクター、精子完成における発現を調節する異種のプロモーターおよび／または請求項10または11において定義される通りのエフェクター（ポリ）ペプチドをコードするDNA配列が、単独あるいは組合わさってlox P部位あるいはFRT部位に隣接されている、請求項26の方法。
【請求項２８】
Tcd-1（D1）、Tcd-2（D2）、およびTcd-3（D3）からなる群から選択される少なくとも1つのディストーター（Distorter）をコードする核酸分子を同一のあるいは異なる染色体に導入すること、あるいはその少なくとも1つのディストーターを含む染色体断片を前記細胞に導入することをさらに含む、請求項23から27のいずれか1項の方法。
【請求項２９】
前記ディストーターがD2および／またはD1である、請求項28の方法。
【請求項３０】
請求項1から3のいずれか1項の核酸分子、請求項4または5のいずれか1項の制御領域、請求項6から12のいずれか1項の組換えDNA分子、請求項13から16のいずれか1項のベクター、精子完成における発現を調節する異種のプロモーターおよび／または請求項10から12のいずれか1項において定義される通りのエフェクター（ポリ）ペプチドをコードするDNA配列が発現可能性に関して活性な状態でそのY染色体に挿入されている、オスのトランスジェニック非ヒトほ乳類、魚類あるいは鳥類を作出する方法であって、前記オスのトランスジェニック非ヒトほ乳類、魚類あるいは鳥類由来の精子を用いたin vitro受精を含む前記方法。
【請求項３１】
前記エフェクター（ポリ）ペプチドを発現させること、および、前記エフェクター（ポリ）ペプチドを発現し、したがって前記Y染色体を含む精子を選択すること、をin vitro受精に先立ってさらに含む、請求項30の方法。
【請求項３２】
請求項1から3のいずれか1項の核酸分子、請求項4または5のいずれか1項の制御領域、請求項6から12のいずれか1項の組換えDNA分子、請求項13から16のいずれか1項のベクターがそのゲノム中に安定に挿入されているか、あるいは請求項17の非ヒト宿主細胞から再生される、あるいは請求項23から31のうちのいずれか1項の方法によって得ることができる、トランスジェニック非ヒトほ乳類、魚類または鳥類。
【請求項３３】
オスは請求項26から31のいずれか1項によって定義される通りのトランスジェニック動物であり、メスはそのゲノムDNA中に部位特異的なDNA組換え酵素をコードする核酸分子が安定に挿入されているトランスジェニック動物である、一対のトランスジェニック非ヒトほ乳類、魚類または鳥類。
【請求項３４】
前記DNA組換え酵素がCreまたはflpである、請求項33の一対の動物。
【請求項３５】
前記DNA組換え酵素が精子形成の前に活性である制御エレメントによって調節される、請求項33または34の一対の動物。
【請求項３６】
請求項32から35のいずれか1項によって定義されるオスのトランスジェニック非ヒトほ乳類、魚類または鳥類から得ることができる精子。
【請求項３７】
エフェクター（ポリ）ペプチドを発現させることおよび前記（ポリ）ペプチドが存在するあるいは存在しないことに関して選別することを含む、請求項36の精子を選別する方法。
【請求項３８】
以下の、
（a）請求項9の組換えDNA分子の発現を可能にすること；および
（b）生存可能な精子を選別すること；
を含む、請求項37の精子に対する選別の方法。
【請求項３９】
子孫を作出するための、請求項36の精子あるいは請求項37または38の方法によって得ることができる精子の使用。
【請求項４０】
避妊薬の開発および／または製造用に卵細胞の誘引物質を認識する精子表面受容体を単離するための、請求項1から3のいずれか1項の核酸分子、請求項4または5のいずれか1項の制御領域、請求項6から12のいずれか1項の組換えDNA分子、請求項13から16のいずれか1項のベクター、請求項17の非ヒト宿主細胞、請求項19の発現産物、請求項20の抗体あるいは請求項21の核酸分子の使用。
【請求項４１】
レスポンダー／ディストーターシグナルカスケードの（未成熟）活性化あるいは阻害の引き金を引くことができる化学物質あるいは生物化合物を同定するための、請求項1から3のいずれか1項の核酸分子、請求項4または5のいずれか1項の制御領域、請求項6から12のいずれか1項の組換えDNA分子、請求項13から16のいずれか1項のベクター、請求項17の非ヒト宿主細胞、請求項19の発現産物、請求項20の抗体あるいは請求項21の核酸分子の使用。
【請求項４２】
請求項19の発現産物が結合し得る、レスポンダー／ディストーターシグナルカスケードの受容体分子あるいは他のメンバーを単離するための、請求項1から3のいずれか1項の核酸分子、請求項4または5のいずれか1項の制御領域、請求項6から12のいずれか1項の組換えDNA分子、請求項13から16のいずれか1項のベクター、請求項17の非ヒト宿主細胞、請求項19の発現産物、請求項20の抗体あるいは請求項21の核酸分子の使用。
【請求項４３】
請求項1から3のいずれか1項の核酸分子、請求項4または5のいずれか1項の制御領域、請求項6から12のいずれか1項の組換えDNA分子、請求項13から16のいずれか1項のベクターまたはそれらの一部分、あるいはRNAおよびポリペプチドから選択される本発明の発現産物、または前記DNA分子またはベクターによって規定される請求項32のトランスジェニック非ヒトほ乳類、魚類または鳥類におけるRNAおよびポリペプチドから選択される異なる発現産物またはその一部、を同定することを含む、請求項1から3のいずれか1項の核酸分子、請求項4または5のいずれか1項の制御領域、請求項6から12のいずれか1項の組換えDNA分子、請求項13から16のいずれか1項のベクター、請求項32のトランスジェニック非ヒトほ乳類、魚類または鳥類あるいはそれらの一部を検出するための方法。
【請求項４４】
レスポンダー／ディストーターシグナルカスケードのうちのメンバーであってT66Bk-2（図7aに示されるもの）、T66k-8（図7bに示されるもの）、T66k-7（図7cに示されるもの）のアンチセンス転写産物、およびT66k-20（図7dに示されるもの）からなる群から選択されるものの配列あるいは発現レベルを操作すること、および前記メンバーの操作された形の発現を、それを有する精子に選択的あるいは完全に限定させることを含む、ヒトを除く哺乳動物の遺伝的特性のトランスミッション比を歪める方法。
【請求項４５】
組み換えによって操作され改変された配列あるいは発現レベルのレスポンダー／ディストーターシグナルカスケードのメンバーであってT66Bk-2（図7aに示されるもの）、T66k-8（図7bに示されるもの）、T66k-7（図7cに示されるもの）のアンチセンス転写産物、およびT66k-20（図7dに示されるもの）からなる群から選択されるものを有し、前記メンバーの発現がそれを有する精子に選択的あるいは完全に限定されている、非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項４６】
前記メンバーがレスポンダーではない、請求項45のトランスジェニック動物。
【請求項４７】
精子形成／精子完成の間に精子の運動性および／または受精に関与する遺伝子であってT66Bk-2（図7aに示されるもの）、T66k-8（図7bに示されるもの）、T66k-7（図7cに示されるもの）のアンチセンス転写産物、およびT66k-20（図7dに示されるもの）からなる群から選択されるものを発現させることを含む、ヒトを除くオスの哺乳動物からその子孫への遺伝的特性のトランスミッションを非メンデル比に歪めるための方法。
【請求項４８】
前記遺伝的特性が性を決定する、請求項47の方法。
【請求項４９】
前記遺伝子が精子形成／精子完成の間の発現を可能にするようなプロモーターの調節下にある、請求項47あるいは48の方法。
【請求項５０】
前記プロモーターが、前記遺伝子を有する精子における前記遺伝子の選択的あるいは限定的な発現を可能にする、請求項49の方法。
【請求項５１】
前記遺伝子が、その野生型の対立遺伝子の機能あるいは精子の運動性および／または受精に関与する他の遺伝子の機能を妨げるように作り出され、前記遺伝子が精子の運動性および／または受精に関与する１つあるいはそれ以上の遺伝子の機能を阻害する、および／または前記遺伝子が、それを発現する精母細胞／精子細胞において細胞死を引き起こす、および／または前記遺伝子が、そのタグを有する精子のin vitroにおける選別を可能にするようなタグをコードする、請求項47から50のいずれか1項の方法。
【請求項５２】
前記遺伝子がcAMP依存性タンパク質キナーゼAの阻害物質をコードする、請求項47から51のいずれか1項の方法。
【請求項５３】
前記阻害物質がPKIあるいはその機能的に活性な誘導体または断片である、請求項52の方法。
【請求項５４】
請求項47から53のいずれか1項によって定義されるとおりの遺伝子を含む非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項５５】
請求項54の非ヒトトランスジェニック動物から得ることができる精子。
【発明の詳細な説明】
本発明は、トランスミッション比の歪みという現象に寄与するレスポンダー機能に関わる発現産物をコードする、核酸分子に関連する。本発明は、前記核酸分子に対応する遺伝子の制御領域にも関連する。本発明は、前記核酸分子および／または制御領域を含む組換えDNA分子およびベクター、それらによって形質転換された宿主細胞にもさらに関連する。加えて、本発明は、前記核酸分子、組換えDNA分子あるいはそのゲノム中に安定に挿入されたベクターを含む、トランスジェニック動物に関連する。本発明の様々な態様は、遺伝的特性および、特に性別の特異的な選別を可能にすることにより、繁殖戦略に重大な影響を持つ。さらに、本発明は避妊薬の開発における応用を提供する。
【０００１】
マウスT/t-複合体は、17番染色体の近位部分上のおよそ12 cMの遺伝的距離の領域であり、協奏的に作用してトランスミッション比の歪み（TRD）と呼ばれる現象を引き起こすいくつかの遺伝子座を含む。後者の名称は、この染色体領域のいわゆるt-ハプロタイプ型が、99％までの非メンデル比で子孫に伝わるという点で野生型に対して選択的な利点を有しているという事実を示している。非メンデル比でのこのトランスミッションは、いわゆるディストーターTcd-1（D1）、Tcd-2（D2）およびTcd-3（D3）、およびレスポンダーTcr（Rt）の、主に4つの遺伝子座の協奏的な作用によって達成される（Lyon 1984）。さらに2つのディストーターが他の著者により仮定されている（Silver and Remis 1987）。
【０００２】
これらの遺伝子座の遺伝的相互作用を正式に説明しているLyonのモデル（Lyon 1986）によれば、ディストーターD1、D2およびD3は、このレスポンダーの野生型対立遺伝子座に対しては強力かつ有害に、そしてこのレスポンダーのt型（Rt）に対しては弱く作用し、Rtの方を選ぶような歪みを誘導する。Rtはそれを有する精子をこのディストーターの有害な作用から保護し得る。レスポンダーがシスに作用するのに対し、このディストーターはトランスに作用する。これは、Rtを含む染色体が非メンデル比で子孫に伝わるということを意味する。D2あるいは全てのディストーターが存在する場合は、Rtを含む染色体は50％以上99％までの頻度で子孫に伝わる。しかし、ディストーターが存在しないか、あるいはD1またはD3のみが存在する場合は、Rtを含む染色体は50％以下で子孫に伝わる（“低”表現型）。Rtが位置しているのと同じ染色体上に位置している場合は、ディストーターは50％を超える比で伝わるにとどまる。Rtのシス作用により、精子細胞がもはやシンシチウムの状態に結合していない時である精子完成の段階でRtは発現している可能性があるということが示唆される（Willison and Ashworth 1987）。これは、Rtの産物がt-ハプロタイプ型のR遺伝子座を含む精子に限定されるだろうということを確実にするだろう。伸長している精子細胞あるいは成熟した精子における発現は、この必要性と矛盾しないということが期待される。ディストーターおよびレスポンダーのそれぞれトランス作用およびシス作用の特性は、上に挙げた遺伝子座のサブセットのみを有するいわゆる部分的t-ハプロタイプのトランスミッション比の特性によって示された（図1）。
【０００３】
部分的t-ハプロタイプに対する分子マーカーの遺伝的マッピングにより、D1、D2、D3およびRtのT/t-複合体のサブ領域への、そしてこれらの分子マーカーとの相対的な、多少正確な位置推定が可能になった（Lyon 1984；Fox et al. 1985；Herrmann et al. 1986；Silver and Remis 1987；Bullard et al. 1992）。わずか１つの遺伝子座Rtを、いわゆるT66B領域であるおよそ200 kbの領域に極めて正確にマップすることができた（Fox et al. 1985；Schimenti et al. 1987；Nadeau et al. 1989；Rosen et al. 1990；Bullard et al. 1992）。T66B領域は、プローブTu66で検出されるt-特異的制限酵素断片長多型により同定されたt-ハプロタイプの染色体片を表している（Fox et al. 1985）。T66B領域は、部分的t-ハプロタイプであるth44およびth51には存在しないが、部分的t-ハプロタイプであるtlow、th2、th49、t6中およびtw5またはtw12などの完全t-ハプロタイプ中には存在する（図1）。別の部分的t-ハプロタイプであるtw71Jr1 （略語 tJr1）はT66Aおよび、T66Bの一部を含む。染色体th44、th51およびtJr1は、Rt機能を含まないのに対し、上に挙げた他の部分的および完全t-ハプロタイプは含む。Rt機能を含むt-ハプロタイプはt-型のRを有しているはずであるのに対し、ハプロタイプth44、th51およびtJr1は野生型を有していると期待される。ゲノム領域T66Bは、分子クローニングされ解析されている。そのおよそ154 kbを包含する部分的な制限酵素地図が公表されている（Schimenti et al. 1987；Rosen et al. 1990；Bullard et al. 1992）。
【０００４】
精子形成の間に発現する遺伝子に関するこの領域の広範かつ慎重な検索により、単一の遺伝子であるT66B-aあるいはTcp-10btが得られた（Schimenti et al. 1988）。さらなるマッピング研究により、“異なった（differential）レスポンダー活性に関わる配列”が、Tcp-10btを含むT66B領域のテロメア側末端の40 kbの区間に位置推定された（Bullard et al. 1992）。他のいかなる転写単位も、これらの著者らによってこの10年のうちにはT66B領域内に同定されなかった。Tcp-10btはRtの候補であると主張されたが、慎重な解析により、それはレスポンダー特性をコードしていないことが示された（Schimenti et al. 1988；Cebra-Thomas et al. 1991；Bullard and Schimenti 1990；Ewulonu et al. 1996）。
【０００５】
したがって、先行技術を複合した教示は、レスポンダー現象に関わる遺伝エレメントがいかに同定され得るかについていかなる手がかりをも提供しなかった。より重要なのは、上に言及した解析はレスポンダーは転写単位であるという先行技術の議論に異論を唱えていることである。それゆえ、それらは、レスポンダーをコードする転写単位はT66B領域内に位置しているだろうという可能性から離れたことを教示した。したがって、本発明の基礎をなす技術的な問題は、これらの長い間存在する先行技術の困難を克服し、レスポンダー機能をコードする遺伝的実体を提供することである。
【０００６】
前記技術的な問題の解決は、本請求項において特徴づけられる態様を提供することにより達成される。
【０００７】
それゆえ、本発明は、他のキナーゼと同様にMARK2キナーゼ（Drewes et al., 1997）とも相同性を有するキナーゼをその5'部分にコードし、そのヌクレオチド配列の3'部分はrsk3キナーゼ（Zhao et al., 1995）と高い相同性を有するような転写単位を含む核酸分子、さらにその発現産物にも関連する。本発明にしたがって用いられる用語“相同性”は、アミノ酸レベルで25％以上、好ましくは約38％の同一性と関連する。したがって、本発明にしたがい38％の同一性が、MARK2と図4aまたは9に示す核酸分子によってコードされるタンパク質との間で291アミノ酸の領域に認められた。好ましくは、5'部分によってコードされるキナーゼ遺伝子は、好ましくは非翻訳領域である3'末端を欠いており、一方で3'部分によってコードされるキナーゼ遺伝子は5'末端を欠いておりかつ好ましくは翻訳されない。
【０００８】
好ましくはあるいは選択的には、本発明は、トランスミッション比の歪みという現象に寄与するレスポンダー表現型に関わる発現産物をコードする核酸部分であって、以下のもの：
(a)  図4a、9、7a、7b、7c、7dに示す核酸分子あるいはその断片、を含む核酸分子；
(b)  (a)の核酸分子の対立遺伝子変異体あるいは相同体である核酸分子；
(c)  (a)あるいは(b)の核酸分子に相補的な核酸分子にハイブリダイズする核酸分子；および
(d)  (a)、(b)あるいは(c)の核酸分子に、遺伝暗号の縮重によって関係づけられる核酸分子；
からなる群から選択される核酸分子に関連する。
【０００９】
本発明にしたがって用いられる用語“レスポンダー”あるいは“R”は、野生型と同様に変異型のレスポンダー遺伝子座にも関連する。
【００１０】
本発明にしたがって用いられる用語“レスポンダー表現型に関わる”は、図4a、9、7a、7b、7dに示す全ての遺伝子の転写産物および7cのアンチセンス転写産物は完全t-ハプロタイプを有する精巣において検出されるが、一方で図4aまたは9および7aに示す遺伝子のt-レスポンダー領域へのマッピングは、遺伝子4aまたは9および／または7aはt-レスポンダー活性をコードするものであるということを示唆しているという事実に関連している。本明細書中に記載のさらなる生物学的データ、とりわけトランスジェニック動物に関連したデータによれば、図4aまたは9に示す遺伝子はt-レスポンダー活性をコードしている。全体的なデータは、レスポンダー（T66Bk）遺伝子ファミリーのうちのいくつかの遺伝子は、t-ハプロタイプを有する精子細胞および／または精子内で同時に作用する可能性があり、それゆえレスポンダー表現型に関わると推定されるということを示唆しており、それによってt-レスポンダー産物はt-ディストーター遺伝子の負の効果に拮抗する可能性があり、レスポンダー遺伝子に由来するアンチセンス転写産物はt-レスポンダーを有するレスポンダー遺伝子がコードする産物の活性も、野生型あるいはほぼ野生型のレスポンダー活性と同様に減少させる可能性があるとみられている。後者の産物はt-ディストーター遺伝子の負の作用を容認し得る。さらに、本発明にしたがい、1つのmRNA転写産物由来の別の翻訳産物もレスポンダー表現型に関与し得るとみられる（例えば、図13などを参照）。
【００１１】
特に、図4aまたは9に示すT66BkのcDNA配列には、MARKキナーゼおよびrsk3キナーゼ相同性領域が含まれる。図7aに示すT66Bk-2のcDNA配列には、MARKキナーゼ相同性領域のみが含まれる。図7bに示すT66k-8のcDNA配列には、フレームシフトをもたらすヌクレオチド位置1508と1509との間の一塩基欠失を除き、T66Bk-2の完全な配列が含まれる。図7cに示すT66k-7のcDNA配列は、T66Bkファミリーのメンバーのアンチセンス転写産物に対応する。図7dに示すT66k-20のcDNA配列は、T66Bk遺伝子ファミリーのうちの上のメンバーと強い類似性を示す。
【００１２】
本発明の核酸分子と関連して用いられる場合に、用語“断片”は、レスポンダー機能を維持している断片に関連する。好ましくは、前記断片は、上に述べたMARKキナーゼと相同性を有する核酸分子の部分あるいはその一部を含む。
【００１３】
上に示したように、本発明の核酸分子の一態様においては前記発現産物はアンチセンスRNAである。
【００１４】
用語“対立遺伝子変異体あるいは相同体”には、最適なトランスミッション比の歪み効果を達成するおよび／または用いる繁殖計画の特異的な要求にそれを適合させ、それにより遺伝的特性の選択性を改善するために、in vitroで操作されるレスポンダー“遺伝子”の野生型あるいはt-対立遺伝子の形が含まれる。レスポンダー（ポリ）ペプチド上のリン酸化部位（Ser、Thr、Tyr）の酸性または中性（Ala）アミノ酸残基との交換、活性中心の変異生成、前記遺伝子の過剰発現あるいはノックアウト変異生成、ATPおよび／またはGTP結合部位の変異生成による低次形態の（ポリ）ペプチドの構築、前記（ポリ）ペプチド上のリン酸化部位の欠失、レスポンダー／ディストーターシグナルカスケードに関わる他の（ポリ）ペプチドの結合部位の欠失、アンチセンスRNAの合成、N-末端あるいはC-末端の短縮、そのタンパク質のアミノ酸配列の一部を改変するようなフレームシフトの導入などをもたらす、ヌル、低次形態、構成的に活性、抗形態あるいはドミナントネガティブな対立遺伝子のいずれかをもたらすものといった、この技術分野で知られている多数の標準的な操作を考慮している。トランスミッション比の歪みは、上に示唆される操作された形のレスポンダー遺伝子のうちの全てではないにしてもいくつかによって達成できるということも考えられている。したがって、トランスミッション比に最も効果的に影響する、操作されたレスポンダー対立遺伝子は、細胞培養系における活性測定を用いることおよびトランスジェニック動物系を用いることにより経験的に同定されるはずであろう。
【００１５】
T66Bkキナーゼ遺伝子ファミリーのうちの1つあるいはいくつかのメンバーが、すべての精子に遺伝子産物を分布させることができるような精子形成の二倍体あるいは初期半数体の段階の間に発現するならば、ディストーターとして機能し得るか、あるいはディストーターとして機能するようにin vitroで改変し得るということも考えられている。後者は、レスポンダー（ポリ）ペプチド上のリン酸化部位（Ser、Thr、Tyr）の酸性または中性（Ala）アミノ酸残基との交換、N-末端あるいはC-末端の短縮、フレームシフト、リン酸化部位の欠失、他の（ポリ）ペプチドの結合部位の欠失、活性中心の変異生成、あるいは前記遺伝子またはアンチセンス転写産物の過剰発現をもたらす、構成的に活性、低次形態、抗形態あるいはドミナントネガティブな遺伝子産物および、例えばPgk2プロモーターの調節下など、すべての精子に遺伝子産物を分布させることができるような精子形成の二倍体あるいは初期半数体の段階の間の前記遺伝子産物の発現をもたらすものといったin vitroの操作によって達成され得る。これらの操作は、精子の運動性および／または受精能に負の効果を持つと考えられている。そこで、この負の効果を、反対の効果を有するレスポンダー構築物によって釣り合わせ得る。後者は、レスポンダー遺伝子プロモーターの調節下でそれを発現することによってその構築物を有する精子に限定され得る。両方の種類の精子が、精子形成の二倍体の段階に発現するディストーター構築物によって負に影響されるであろう一方で、精子形成の際に発現するレスポンダー構築物をさらに有する精子は、その中で発現する（ポリ）ペプチドによって部分的にあるいは完全に保護され、それゆえ他の精子よりも精子の運動性および／または受精能の点で利点を獲得するであろうと考えられている。これは、“保護された”精子の方を選択するようなトランスミッション比の歪みを導くだろう。好ましくは、両方の種類の精子において発現するディストーター構築物は、高次形態あるいは構成的に活性な（ポリ）ペプチドをコードするであろう一方で、それを有する精子においてのみ発現するレスポンダー構築物は、低次形態、抗形態あるいはドミナントネガティブな（ポリ）ペプチドをコードするはずである。両方の構築物は、同一あるいは異なる染色体に挿入され得る。好ましくは、両方の構築物は共にXあるいはY染色体に挿入され、X染色体あるいはY染色体の選択的あるいは限定的なトランスミッションをもたらし、それゆえ選択的あるいは限定的にそれぞれメスあるいはオスの子孫の父親となるだろう。
【００１６】
本発明と関連して用いられる場合に用語“ハイブリダイズする”は、厳しいあるいは厳しくないハイブリダイズ条件と関連する。好ましくは、厳しい条件と関連する。前記ハイブリダイズ条件は、例えばSambrook、"Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y.、Ausubel, "Current Protocols in Molecular Biology", Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989)、あるいはHiggins and Hames (eds) "Nucleic acid hybridization, a practical approach" IRL Press oxford, Washington DC, (1985)などに記載の慣習的なプロトコールしたがって確立し得る。厳しいハイブリダイズ条件は、例えば、6 x SSC、5 x Denhardt's試薬、0.5％SDS、および100 μg/mlの65℃で変性させたDNA中でのハイブリダイズおよび、0.1 x SSC、0.1％ SDS中、65℃での洗いなどである。
【００１７】
本発明にしたがい、先行技術の教示とは対照的に、驚くべきことにレスポンダー表現型の原因となる核酸配列はT66B領域のセントロメアに近い部分に含まれているということを見出した。それは、レスポンダー機能に期待されるであろういくつかの基準、すなわち、
a）T66B領域内に位置する；
b）精巣で発現する；および
c）精子形成の間に発現する；
に適合する。
【００１８】
本発明にしたがい、さらに、必ずしもB領域内に位置していない付加的な発現産物が、上に示したようにレスポンダー機能に寄与し得ると考えられる。
【００１９】
上に示したように、レスポンダー（R）表現型に寄与する転写単位のうちの1つ（すなわちT66Bk）は、2つの短縮された遺伝子から生じているように見える。前記遺伝子のうちの1つは、rsk3遺伝子と高い相同性を有し、第二のものは、最近同定されたMARKキナーゼ（Drewes et al., 1997）と相同性を有する。R表現型に寄与すると考えられる別の転写単位であるT66Bk-2も、MARKキナーゼと相同性を有するが、上に示すようにrsk3遺伝子との相同性を持たない。R表現型の元にある遺伝的基礎の同定により、将来的に簡便に行われるであろう、とくに繁殖計画との関連した多数の遺伝操作が可能になる。そのような計画は、本明細書中で以下にさらに詳細に扱われるだろう。
【００２０】
本発明にしたがい、本発明の核酸分子によってコードされる発現産物は、いくつかの異なった方法でレスポンダー表現型に寄与し得ると考えられる。したがって、一態様においては、上に示した発現産物のうちの1つは、それ自体でトランスミッション比を歪めるのに十分である。別の態様においては、前記発現産物のすべてあるいはそれらの組み合わせを、トランスミッション比を歪めるために提供したが、ある組み合わせは頼りもより効果的であった。本発明のさらに別の態様においては、前記発現産物は付加的あるいは共同的な方法で作用し得る。なおさらなる態様においては、T66Bk遺伝子ファミリーのうちの1つあるいはいくつかの遺伝子に由来するアンチセンス転写産物は、1つあるいはいくつかのT66Bk遺伝子のmRNAの低量あるいは消失をもたらし、それゆえ前記mRNA分子から翻訳される対応する（ポリ）ペプチドの低量あるいは消失をもたらす、t-レスポンダー機能に寄与し得ると考えられる。そのようなアンチセンス転写産物の一例を図7cに示す。さらに、R表現型に関わる発現産物をコードする、特異的に同定された核酸配列は、レスポンダー表現型の原因となる唯一のものではないだろうということが示唆される。したがって、上に議論したものと協奏的に作用し、レスポンダー表現型に寄与し得るような発現産物をコードする、さらなる核酸がゲノムに含まれると考えられる。加えて、本発明にしたがい、本発明の核酸分子は、例えばT66A、T66BおよびT66C領域などに含まれるさらなる配列と共にレスポンダー表現型を発揮するあるいは増強すると考えられる。好ましくは、前記付加的な領域はMARK関連キナーゼをコードする。
【００２１】
また、当業者であれば、本発明の教示に基づき、レスポンダー表現型に寄与する核酸を遺伝的に操作する立場となるだろう。彼はさらに、本発明にしたがい教えられるレスポンダーのゲノム構成に基づき、レスポンダー機能をコードする付加的な核酸配列に関して、目的の生物あるいは細胞のゲノムをスクリーニングする立場となるだろう。本明細書中に提供される特異的な技術からさらなる苦労もなく誘導可能な態様の全ても、本発明に包含される。
【００２２】
本発明にしたがい、さらに、レスポンダーは精子の運動性および／または卵母細胞の受精に関わるシグナルカスケードの構成物として作用し得ると考えられる。t-レスポンダーは、t-型のレスポンダーを有する精子をt-ディストーターの負の作用から保護するように作用し得る一方で、野生型のレスポンダーを有する精子は“だめにされる”（Lyon 1986参照）。それゆえ、t-型のレスポンダーの作用はどうにかしてt-ディストーター機能を妨げ、そのことはディストーターは同じシグナルカスケードの一部であるということを示唆している。したがって、野生型の遺伝子あるいはそのシグナルカスケードのあらゆるメンバーの産物は、ひとたび分子が分かったなら、ドミナントアクティブあるいはドミナントネガティブのいずれかの形を発現する精子を“だめにする”ように、あるいは前記シグナルカスケードのあらゆるメンバーの遺伝子機能を過剰発現、減弱、あるいは破壊することによって操作され得ると考えられる。そこで、遺伝的特性の選別は、そのシグナルカスケードのあらゆるメンバーのアミノ酸配列、活性あるいは発現レベルを操作することおよび、レスポンダー機能に関する場合と同様に、操作された形の発現をそれを有する精子に選択的あるいは完全に制限させることによって容易に達成し得る。レスポンダーのプロモーターあるいは精子形成の二倍体段階の間に遺伝子発現を活性化する他のプロモーターが、この制限を達成するための適切手段であろう。
【００２３】
したがって、本発明は、前記シグナルカスケードの他のあらゆるメンバーの発現レベルあるいはタンパク質活性を操作することによってトランスミッション比に影響する方法にも関連する。本発明の目的に関しては、前記カスケードは“レスポンダー／ディストーターシグナルカスケード”と呼ばれる。本発明にしたがい、レスポンダー／ディストーターシグナルカスケードの他にも精子の運動性および／または受精能に関わり得る他のシグナルカスケードが存在し得るとさらに考えられる。したがって、本発明にしたがい、前記他のシグナルカスケードに関わる１つあるいはそれ以上のタンパク質の発現レベルおよび／または活性も、トランスミッション比に影響するために操作され得ると考えられる。トランスミッション比に影響するとは、前期比が増強されるあるいは減弱され得ることを意味する。前記発現レベルあるいは前記タンパク質活性を操作するための方法は、この技術分野で知られており、アミノ酸配列および／または例えばプロモーターの強さなどを操作する、あるいは前記シグナルカスケードのあらゆるメンバーの阻害物質を発現させる方法を含む。あるいは、発現レベルはトランスミッションレベル、プレ-mRNAプロセッシングのレベル、mRNAの輸送および／または安定性、および／または翻訳レベルに関して制御され得ると考えられる。好ましくは、エレメントの修飾および／または置換は、発現単位の組織特異性あるいは発生段階に関する特異性を変えない。本発明にしたがい、宿主生物の遺伝的背景、挿入の部位、および／または導入遺伝子構築物の挿入されたコピー数が前記導入遺伝子構築物の発現効率に影響しうるということも考えられる。１つあるいはそれ以上の前記メンバーの発現レベルは、（有意に）改変あるいは増強され、（有意に）減弱あるいは破壊され得る。前記メンバーにはディストーターも含まれる。本発明のこれらの方法は、単独あるいは以下に記載する他の方法と共に、トランスジェニック動物の作出に都合良く用いることができる。前記トランスジェニック動物は、前記発現レベルあるいは前記タンパク質活性を操作するための上に述べた方法が成功したかどうかを試すための適切なアッセイシステムを提供する。そのようなシステムを実施例6において記載する。さらに、前記トランスジェニック動物は以下に扱う繁殖計画のうちのいずれにも用いられ得る。
【００２４】
本発明の別の好ましい態様においては、前記核酸分子はDNA分子である。
【００２５】
本発明の核酸配列からアミノ酸配列を予想することにより、そのポリペプチドがレスポンダー表現型に寄与する発現産物であると結論できる。しかし、mRNAが前記レスポンダー表現型に寄与するあるいはその引き金を引くということは無視されない。また、本発明にしたがい、前記遺伝子の発現レベル、精子形成の間の発現の段階、あるいはコピー数がレスポンダー表現型をもたらすあるいはそれに寄与すると考えられる。それゆえ、本発明の核酸分子の好ましい態様においては、前記発現産物はRNAあるいは（ポリ）ペプチドである。
【００２６】
本発明のさらに好ましい態様は、前記レスポンダー機能がマウス-t-複合体レスポンダー機能である、核酸分子である。
【００２７】
本発明にしたがい提供されるレスポンダーの遺伝子構造に基づいて、マウス以外の動物において変異したあるいは野生型のレスポンダーを同定することは容易には可能でないが、マウスt-複合体レスポンダーは、他の動物に導入された場合にも、例えば繁殖において応用され得る。レスポンダー機能の特異的な応用は、本明細書中で以下に扱う。
【００２８】
本発明はさらに、本発明の核酸分子の発言を制御することができる、前記核酸分子に対応する遺伝子の制御領域に関連する。
【００２９】
本発明にしたがって用いられる場合に、用語“対応する”は、その遺伝子が本発明の核酸分子あるいはその断片を含むということをも意味する。
本出願における用語“制御領域”とは、例えば、細胞および／または組織特異性を与えるという意味において、発現の特異性および／またはレベルに影響するような配列のことを言う。そのような領域は、転写開始部位の上流に位置し得るが、例えば転写されたリーダー配列内あるいはイントロン内など、その下流にも位置し得る。
【００３０】
用語“核酸分子に対応する遺伝子の制御領域”とは、本明細書中では“遺伝子”とも呼ばれる、二部に分かれた核酸分子の発現を制御する、上に述べた能力を有する領域のことを言う。
【００３１】
真核細胞、好ましくはほ乳類細胞における発現を買う実にする制御エレメントは、当業者には十分に知られている。それらには通常、転写の開始を確実にするプロモーターおよび、任意に、転写の終結および転写産物の安定化を確実にするポリAシグナルが含まれる。さらなる制御エレメントには、転写エンハンサーも翻訳エンハンサーも含まれ得る。
【００３２】
好ましくは、前記制御領域は天然に存在する制御領域あるいは遺伝学的に作り出されたその誘導体である。
【００３３】
より好ましくは、前記制御領域はプロモーターを含むか、あるいはプロモーターである。前記プロモーターは、好ましくは組織特異的であり、例えば精子形成の間などに発現を付与する。
【００３４】
用語“プロモーター”とは、転写開始すなわちRNAポリメラーゼ結合に必要なヌクレオチド配列のことを言い、例えばTATAボックスなども含む。
【００３５】
一態様においては、前記プロモーターは最小プロモーターであるか、あるいはそれを含む。
【００３６】
本発明にしたがい、マウス遺伝子の制御配列あるいはプロモーターに機能的に相同であるような他種由来のプロモーター、あるいは精子細胞に発現するという意味で同一の発現パターンを示すプロモーターを用い得る。上に概説したように、当業者であれば、既知のマウス核酸を助けとして例えばヒトなどの他種から対応する遺伝子を単離することが可能である。これは、例えば、本発明の核酸分子をハイブリダイズのプローブとして用いることにより、あるいは適切なPCRプライマーを設計することによってなど、この技術分野で知られている慣習的な手法によってなし得る。次に、慣習的な手法により対応するプロモーター領域を単離し、その発現パターンに関して分析することが可能である。この目的のために、例えば、そのプロモーターをlacZ遺伝子あるいは緑色蛍光タンパク質（GFP）といったレポーター遺伝子と融合させ、トランスジェニックマウスにおけるレポーター遺伝子の発現を評価することなどが可能である。
【００３７】
本発明は、マウスのプロモーターあるいは相同遺伝子のプロモーターあるいはその一部分と実質的に同一であり、かつ精子細胞における特異的な発現を付与することができるようなプロモーター領域の使用にも関連する。
【００３８】
そのようなプロモーターは、上に述べたプロモーターとは１つあるいはそれ以上の位置で異なるが依然として同じ特異性を有している、すなわちそれらは上に記載した発現パターンの原因となる同一のあるいは類似した配列モチーフを含む。好ましくは、そのようなプロモーターは上に述べたプロモーターのうちの１つと、最も好ましくは厳しい条件下で、ハイブリダイズする。特に好ましいのは、上に述べたプロモーターのうちの１つと、少なくとも85％、より好ましくは90-95％、最も好ましくは96-99％の配列同一性を有し、同じ特異性を持ったプロモーターである。そのようなプロモーターは、例えば、欠失、挿入、置換、付加、および／または組み換えおよび／またはこの技術分野で知られている他のあらゆる修飾の単独あるいは組み合わせによって、上に記載したヌクレオチド配列と比較して改変されているものをも含む。そのような修飾を本発明のプロモーターのヌクレオチド配列に導入するための方法は、当業者には十分に知られている。当業者には、さらなる制御配列を本発明のプロモーターに付加し得るということも即座に明白である。例えば、本発明のプロモーターの誘導された発現を可能にするような転写エンハンサーおよび／または配列を用い得る。適切な誘導可能なシステムは、GossenおよびBujard（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992), 5547-5551）およびGossenら（Trends Biotech. 12 (1994), 58-62）などに記載されてような、例えばテトラサイクリンに制御される遺伝子発現などである。
【００３９】
最も好ましくは、前記制御領域は図11に示す配列のヌクレオチド930から3576までの断片を含む。
【００４０】
上の配列の断片あるいは変異体も含まれ、前記断片あるいは変異体の制御機能は本質的に維持されているかあるいは改善されてさえいる。これは、本明細書の教示と組み合わせてこの技術分野で十分に知られている方法にしたがって試し得る。
【００４１】
本発明はさらに、本発明の核酸分子および／または本発明の制御領域および／または精子形成／精子完成の間の発現を可能にする制御領域を含む組換えDNA分子に関連する。
【００４２】
したがって、制御領域はレスポンダー機能に寄与する核酸分子の発現を制御し得る。あるいは、前記組換えDNA分子は、異種の核酸の発現を制御するか、あるいはいかなる核酸にも機能可能なように連結されておらずそれゆえにクローニング目的のために用い得るような、前記制御領域を含み得る。第一の選択肢においては、前記制御領域は異種のDNA配列に機能可能なように連結されている。例えば、前記制御領域は、例えば精子の運動性および／または受精に関わる別のシグナルカスケードのディストーターあるいはメンバーなどの、レスポンダー／ディストーターカスケードのメンバーをコードする、天然に存在するかあるいはin vitroで作り出されたDNAに機能可能なように連結され得る。また、本発明のこの態様においては、本発明の核酸分子は異なる領域に機能可能なように連結されているか、あるいはいかなる制御領域にも機能可能なように連結されていない可能性がある。制御領域は、本発明の核酸分子に対応する遺伝子の元々の制御領域であるか、あるいは前記遺伝子の異なるコピーあるいは異なる遺伝子から誘導され得る。さらに、制御領域は、（１つ以上のコピーが存在する場合）異なる種に由来する相同遺伝子のコピーから誘導され得るか、あるいは前記異なる種に由来する異なる遺伝子から誘導され得る。上に述べた制御領域は、発現を増強あるいは減弱し得るような最適な発現を得るために修飾することもできる。したがって、本発明にしたがい、例えば、T66k-20-cDNA（図7d参照）あるいは図10に示すcDNAを含む遺伝子の発現を調節する制御領域を、本発明にしたがって修飾されていないあるいは修飾された形で用いることなどが考えられる。本発明の教示、すなわちそのcDNAの配列のクローニングおよび開示のため、前記制御領域をクローニングし用いることは、当業者にとっては型にはまった実験である。
【００４３】
好都合であるのは、本発明の組換えDNA分子は、目的の遺伝的特性をコードし発現する発現単位をさらに含み得る。そのようなDNA分子は、組換えDNA分子が少なくとも１つのディストーターあるいは、ディストーター活性、好ましくはD2を有するタンパク質をコードし発現する発現単位をさらに含む場合、あるいは宿主の遺伝的背景が前記宿主に天然に存在し得るかあるいは導入されたものであり得るようなディストーター活性を提供する場合に、前記目的の遺伝的特性の遺伝を減弱あるいは増強するのに用い得る。
【００４４】
本発明の特に好ましい態様は、前記異種のDNA配列がペプチド、タンパク質、アンチセンスRNA、センスRNAおよび／またはリボザイムをコードする、組換えDNA分子に関連する。
【００４５】
アンチセンスRNAに関しては、アンチセンス治療あるいはアンチセンスノックアウト戦略の方法に応用し得る。アンチセンス治療は、動物あるいはヒトの患者に、DNA配列に機能可能なように連結された本発明の制御領域を含む組換えDNA、すなわちアンチセンスRNAに転写されるアンチセンス鋳型を投与することによって行い得る。アンチセンスRNAは、特異的なmRNA配列の一部分に対して相補的であるように作られた短い（一般的には少なくとも10、好ましくは、少なくとも14個のヌクレオチドであり、任意に100あるいはそれ以上までのヌクレオチドである）ヌクレオチド配列であり得る。アンチセンス技術に関連する標準的な方法が記載されている（Melani, Cancer Res. 51 (1991), 2897-2901）。DNA配列のアンチセンスRNAへの転写に続き、アンチセンスRNAが細胞内の標的mRNA分子に結合し、それによってそのmRNAの翻訳を阻害してそのmRNAにコードされると期待されるタンパク質の発現を抑制する。例えば、アンチセンス配列はそのmRNAの一部分あるいは全部に対して相補的であろう。加えて、細胞から野生型のレスポンダー転写産物を除去するのにリボザイムが都合良く用いられ得る。
【００４６】
本発明はさらに、前記ペプチド、タンパク質、アンチセンスRNA、センスRNA、毒素および／またはリボザイムが細胞死の原因となることができる、組換えDNA分子に関連する。
【００４７】
本発明のこの態様においては、R関連導入遺伝子を持たない精子を遺伝的に選別することができる。
【００４８】
例えば、R遺伝子のプロモーターは、前記構築物を有する前記精母細胞の破壊あるいはアポトーシスを誘導する遺伝子産物を発現させるのに用い得る。そのような構築物をXあるいはY染色体に挿入させると、それぞれ他の性染色体のトランスミッションがもたらされるだろう。この構築物のX染色体への挿入により、メスの動物において構築物の中立的なトランスミッションが誘導されるだろう。Y染色体への挿入は、好ましくは、本明細書中で以下に主張する規則に沿って活性化され得るような不活性状態にあるはずである。
【００４９】
エフェクター表現型をコードするDNAをさらに含む組換えDNA分子は、本発明のさらに好ましい態様である。
【００５０】
前記エフェクターポリペプチドが、固体支持体に選択的に結合する、あるいはあらかじめ選択された抗原決定基に結合する、イオンを可溶状態にとどめておくことができるものであるか、あるいは毒素、リボザイム、酵素、標識あるいは間接的に検出できる部分であるのが、特に好ましい。
【００５１】
本発明にしたがい、前記エフェクターポリペプチドがカルモジュリン、メタロチオネイン、その断片、緑色蛍光タンパク質（GFP）、β-ラクタマーゼ（Zlokarnik et al., 1998）、hCD24、myc、FLAG、ヘムアグルチニンあるいは、グルタミン酸、アスパラギン酸、リジン、ヒスチジンまたはアルギニンのうちの少なくとも1つに富んだアミノ酸配列であるのが最も好ましい。
【００５２】
それゆえ、言い換えれば、本発明の上記の態様は、タグであるかあるいはタグを有する（ポリ）ペプチドを発現させるためにRプロモーターを使用することに関連する。前記タグは、精子の細胞質に発現され得る。そのようなタグの一例は、GFPあるいはβ-ラクタマーゼである。前記タグは、精子の表面に選択的に局在子、それゆえに特異的な抗体によって認識され得る。これにより、Rプロモーターの調節下に発現された導入遺伝子を有する精子を、前記導入遺伝子を持たない精子から分離することが可能になる。当業者であれば、その表面に前記タグを有する精子を分離するための様々な方法を熟知している。好ましくは、前記タグはアフィニティークロマトグラフィーによって、あるいはセルソーターを用いることによって選別する。分離後、導入遺伝子を有する精子あるいは導入遺伝子を持たない精子を卵の受精に用い得る。個の態様には、常染色体あるいは性染色体のいずれかに導入遺伝子を挿入することが含まれる。
【００５３】
好都合であるのは、上に述べた固体支持体が膜あるいはELISAプレートの表面である。
【００５４】
さらに、本発明は本発明の核酸分子、本発明の制御領域あるいは本発明の組換えDNA分子を含むベクターに関連する。
【００５５】
本発明のベクターは、単にそれに含まれる遺伝エレメントの伝達のために用い得る。好都合であるのは、それが発現ベクターおよび／またはターゲッティングベクターである。Pichia pastoris由来のベクターあるいはCMV、SV-40、バキュロウイルスまたはレトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、あるいはウシパピローマウイルスといったウイルス由来のベクターなどの発現ベクターを、組換えDNA分子あるいは本発明のベクターを標的の細胞集団に輸送するのに用い得る。当業者に十分に知られている方法は、組換えウィルスベクターを構築するのに用い得る。例えば、上記引用のSambrookおよび上記引用のAusubelに記載の手法などを参照のこと。あるいは、組換えDNA分子および本発明のベクターは、標的細胞への輸送のためにリポソーム中に再構築し得る。
【００５６】
さらなる一態様にしたがい、前記ベクターが異種のプロモーターを有するのが好ましい。
【００５７】
レスポンダー機能に寄与する核酸には天然では機能可能なように連結されていない前記異種のプロモーターは、レスポンダー発現が開始される特定の時点を決定するのに用い得る。この時点は、天然のレスポンダー転写単位が用いられる場合に決められるものと同一あるいは異なるものであり得る。例えば、前記異種のプロモーターは、精子形成の初期あるいは後期二倍体段階にも活性であり得る。
【００５８】
前記異種のプロモーターが精子形成および／または精子完成において遺伝子発現を調節するのが特に好ましい。
【００５９】
最も好ましくは、前記異種のプロモーターはc-kitあるいはアンジオテンシン変換酵素（ACE）の精巣プロモーターであり、両者ともこの技術分野で十分に知られている。
【００６０】
本発明はさらに、本発明の核酸分子、組換えDNA分子あるいはベクターで形質転換あるいは形質導入された宿主細胞に関連する。
【００６１】
宿主細胞は、細菌、昆虫、真菌、植物、動物あるいはヒトの細胞といった、あらゆる原核あるいは真核細胞であり得る。原核宿主細胞は、通常は本発明の核酸分子の伝達のためにのみ用いられ、時々は発現産物の産生のために用いられるだろう。適切なほ乳類、魚類あるいは鳥類細胞株は十分に知られているか、あるいは当業者によって容易に決定することができ、COS細胞、Hela細胞、初代培養胚細胞株などが含まれる。
【００６２】
用語“形質転換あるいは形質導入された”は、本明細書中では可能な限り広い意味で用いられており、エレクトロポレーション、感染あるいは粒子線照射といった手法のことも言う。
【００６３】
さらに本発明は、そのタンパク質の発現を引き起こすための条件下で本発明の宿主細胞を培養する段階および前記タンパク質を培養物から回収する段階を含む、本明細書中で上に定義する通りの発現産物を組み換えによって作出する方法に関連する。
【００６４】
本発明の方法は、最も都合良くは、例えば上記引用のSambrookに記載された慣習的なプロトコールに沿って行われる。
【００６５】
本発明はさらに、本発明の核酸分子あるいは本発明の作出方法によって得ることができる核酸分子によってコードされる発現産物に関連する。
【００６６】
本発明にしたがい、前記発現産物はmRNAあるいはポリペプチドのいずれかであり得る。前記発現産物は、本発明にしたがい、レスポンダー表現型に関わり、トランスミッション比の歪みという現象に寄与する。
【００６７】
本発明のさらなる態様は、本発明の発現産物を特異的に認識する抗体に関与する。
【００６８】
本発明の抗体は、モノクローン性抗体であるかあるいはポリクローン性血清中に含まれる抗体であり得る。したがって、本明細書中で用いられる場合に、用語“抗体”は、ポリクローン性抗血清にも関連する。加えて前記用語は、Fab、Fv、scFv断片などの、抗体結合部位を含む抗体断片あるいは融合タンパク質に関連する。本発明の抗体は、精製あるいは診断過程を含む多数の応用性を有する。
【００６９】
本発明はさらに、前記MARK関連キナーゼに翻訳され得る本発明の核酸分子と、あるいは前記核酸分子のイントロンに対して、あるいは本発明の制御領域と、あるいはその相補鎖と、特異的にハイブリダイズする核酸分子に関連する。
【００７０】
前記核酸分子は、長さで少なくとも15ヌクレオチドを含み、上に記載した核酸または制御配列と、あるいはその相補鎖と特異的にハイブリダイズする。特異的なハイブリダイゼーションは、好ましくは厳しい条件下で起こり、全くあるいは十分に異なる制御特性を有するヌクレオチド配列とは全くあるいは極めてわずかしか交差ハイブリダイゼーションしないということを意味している。そのような核酸分子は、プローブとしておよび／または遺伝子発現を調節するために用い得る。核酸プローブ技術は、当業者には十分に知られており、そのようなプローブは長さが様々であり得るということを容易に認めるだろう。好ましいのは、長さが17から35ヌクレオチドの核酸プローブである。当然ながら、長さが100あるいはそれ以上までのヌクレオチドの核酸のプローブを用いることも適切であり得る。本発明の核酸プローブは、様々な応用に有用である。一方では、それらは本発明にしたがった制御配列を増幅するためのPCRプライマーとして用い得る。この態様においては、プライマーのうちの一方は、rsk3遺伝子と高い相同性を有するレスポンダーの3'部分とハイブリダイズし得る。別の応用は、本発明の制御配列とハイブリダイズする制御配列をゲノムDNAライブラリーの相同性スクリーニングによって同定するためのハイブリダイゼーションプローブとしての使用である。上に記載したとおりの制御配列に対して相補的である、本発明のこの好ましい態様にしたがった核酸分子も、例えばアンチセンスまたは三重らせん効果などによって、そのような制御配列を含む遺伝子の発現を抑制するためにあるいは、本発明の制御配列を含む遺伝子の（プレ）mRNAを特異的に切断する適切なリボザイムを構築するために用い得る（例えば、EP-B1 0 291 533、EP-A1 0 321 201、EP-A2 0 360 257などを参照）。適切な標的部位および対応するリボザイムの選別は、例えばSteinecke, Ribozymes, Methods in Cell Biology 50, Galbraith et al. eds Academic Press, Inc. (1995), 449-460などに記載されているように行い得る。さらに、当業者であれば、ある生物に由来する試料中に本発明の核酸分子の存在を検出するためといった特異的な応用のための適切なマーカーを持った核酸プローブを標識することも可能であるということを十分承知している。
【００７１】
上に記載した核酸分子は、DNAまたはRNA、あるいはそのハイブリッドのいずれかであり得る。さらに、前記核酸分子は、オリゴヌクレオチドアンチセンスのアプローチにおいて一般的に用いられている、例えばチオエステル結合および／またはヌクレオチド類似体などを含み得る。前記修飾は、細胞内のエンドおよび／またはエクソヌクレアーゼに対する核酸分子の安定化に有用であり得る。前記核酸分子は、細胞内で前記核酸分子の転写を可能にするようなキメラ遺伝子を含む適切なベクターによって転写され得る。そのような核酸分子は、本発明の制御配列を含む（プレ）mRNAを特異的に切断するようなリボザイム配列をさらに含み得る。さらに、本発明の制御配列に対して相補的であり（三重らせん；Lee, Nucl. Acids Res. 6 (1979), 3073；Cooney, Science 241 (1988), 456およびDervan, Science 251 (1991), 1360を参照）、それにより、コードされるmRNAおよび／またはタンパク質の転写および産生を妨げるようなオリゴヌクレオチドを設計することができる。
【００７２】
さらに、本発明は、本発明のDNA分子、制御領域、組換えDNA、ベクター、宿主細胞、発現産物あるいは抗体を含む薬剤組成物に関連する。
【００７３】
前記薬剤組成物は、本発明の前述の化合物のうちの少なくとも1つを単独あるいは組み合わせで、さらに任意に薬学的に許容可能なキャリアーあるいは賦形剤を含む。適切な薬剤キャリアーの例は、この技術分野では十分に知られており、リン酸緩衝生理食塩溶液、水、油／水乳濁液といった乳濁液、様々な種類の湿潤剤、滅菌した溶液などを含む。そのようなキャリアーを含む組成物は、慣習的な方法によって製剤し得る。これらの薬剤組成物は、それを必要としている対象に適切な用量で投与し得る。適切な組成物の投与は、例えば、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、局所、皮内、鼻腔内あるいは気管支内投与によるものなど、異なる方法によって果たし得る。投薬プログラムは、かかっている医者および他の臨床要因により決定されるだろう。医療技術の分野ではよく知られているように、ある患者のための投薬量は、患者の大きさ、体表面積、年齢、投与すべき特定の化合物、性別、投与の時間および経路、全身の健康状態、および同時に投与する他の薬物を含む、多くの要因に依存している。典型的な用量は、例えば、0.001から1000 μgまでの範囲内（あるいはこの範囲にある、発現用のまたは発現の阻害用の核酸）であり得るが、特に上述の要因を考慮すると、この典型的な範囲を下回るあるいは上回る用量が想定される。概して、薬剤組成物の規則的な投与としての治療プログラムは、一日あたり1 μgから10 mgユニットまでの範囲内にあるはずである。治療プログラムが連続注入である場合は、それぞれ1分あたりキログラム体重につき1 μgから10 mgユニットまでの範囲内にもあるはずである。経過は周期的な評価によりモニターし得る。投薬量は変化するであろうが、DNAの静脈内投与に好ましい投薬量は、およそ106から1022コピーまでの核酸分子である。本発明の組成物は、局所的にあるいは全身的に投与し得る。投与は一般的には静脈内などの非経口によるであろうが、DNAは、内部あるいは外部の標的部位へのbiolistic輸送あるいは動脈内の部位へのカテーテルなどによって、標的部位に直接投与することもできる。非経口投与のための調製物には、滅菌した水溶性あるいは非水溶性の溶液、懸濁液、および乳濁液が含まれる。非水溶性の溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの野菜油、およびオレイン酸エチルなどの注入可能な有機エステルである。水溶性キャリアーには、生理食塩水および緩衝された媒体を含め、水、アルコール／水の溶液、乳濁液または懸濁液が含まれる。非経口用賦形剤には、塩化ナトリウム溶液、リンガーブドウ糖液、ブドウ糖および塩化ナトリウム、乳酸加リンガー液、あるいは固定油が含まれる。静脈内用賦形剤には、体液および栄養補充液、電解質補充液（リンガーブドウ糖液に基づいたものなど）および類似のものが含まれる。例えば、抗生剤、抗酸化剤、キレート剤、および不活性気体および類似のものといった、保存剤および他の添加剤も存在し得る。さらに、本発明の薬剤組成物は、薬剤組成物の目的とする使用に応じて、インターロイキンまたはインターフェロンといったさらなる試薬を含み得る。
【００７４】
本発明により、とりわけ、様々な組換え核酸／DNA分子および本発明のベクターは、単独あるいはあらゆる組み合わせのいずれかで標準的なベクターおよび／または遺伝子輸送システムを用いて、そして任意に適切な化合物と共におよび／または薬学的に許容可能なキャリアーまたは賦形剤と共に投与し得るということが考えられる。投与後、前記分子はほ乳類、魚類または鳥類のゲノム中に安定に挿入され得る。一方で、ある細胞または組織、好ましくは膵細胞に特異的であり、前記細胞内で存続するようなウイルスベクターを用い得る。適切な薬剤キャリアーおよび賦形剤は、この技術分野では十分に知られている。
【００７５】
本発明はさらに、本発明の、核酸分子、制御領域、組換えDNA分子、ベクター、宿主細胞、発現産物、あるいは、本発明の核酸分子または制御領域に対してあるいはその相補鎖に対して、および好ましくは本明細書中で上に同定した領域に対してハイブリダイズするプライマーまたはオリゴヌクレオチド、あるいは抗体を含む診断組成物に関連する。PCRに用い得るフォワードおよびリバースといったプライマー対も、用語“プライマー”の上の定義に含まれる。前記プライマー対の前記プライマーのうちの一つは、rsk関連核酸配列の領域にハイブリダイズし得る。
【００７６】
一態様においては、前記診断組成物はキットの形で製造される。前記組成物は、プラスミド、添付の実施例中で同定されるあるいは本明細書中で上に記載したものに対応する核酸配列または制御エレメントの存在に関して、動物あるいは細胞をスクリーニングするための抗体および類似のものといった、追加の化合物をさらに含み得る。
【００７７】
本発明の診断組成物および／またはキットの成分は、任意に緩衝液および／または溶液中で、バイアルなどの容器に包装され得る。適切ならば、１つあるいはそれ以上の前記成分を１つの同じ容器中に包装し得る。さらにまたはあるいは、１つあるいはそれ以上の前記成分を、ニトロセルロースフィルターまたはナイロン膜、あるいはマイクロタイタープレートのウェルなどの固体支持体に吸着させ得る。
【００７８】
本発明はさらに、本発明の核酸分子、制御領域、組換えDNA分子あるいはベクターを細胞、好ましくは生殖細胞、胚細胞あるいは卵細胞またはそれらに由来する細胞に導入することを含む、トランスジェニック非ヒトほ乳類、魚類あるいは鳥類の作出方法に関連する。そのようなトランスジェニック動物を作り出す方法はこの技術分野では十分に知られており、例えば、“Guide to techniques in mouse development”（ed. Wassarman & DePamphilis）Methods in Enzymology Vol. 225 (Academic Press, 1993)などに記載されている。本発明の方法は、そのような動物のクローン化に関連した態様をも含む。これらの態様には、本発明の前記核酸分子、組換えDNA分子あるいはベクターを細胞、好ましくは胚細胞の核に導入する段階、その卵母細胞、接合子または初期胚の核を本発明の前記核酸分子、組換えDNA分子あるいはベクターを含む核と置き換える段階、前記卵母細胞、接合子または初期胚のいずれかを里母に移植するか、あるいは前記卵母細胞、接合子または初期胚を最初はin vitroまたはin vivoで培養し、その後で得られた胚を里母に移植して出産まで発生させる段階が含まれる。例えば、Wilmut I.ら（1997）“Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells”, Nature 385, 810-813などを参照。
【００７９】
本発明の方法の好ましい態様においては、前記染色体はX染色体あるいは鳥類または魚類における対応する性染色体か、常染色体である。
【００８０】
本発明の方法の代替的な好ましい態様においては、前記染色体はY染色体あるいは鳥類または魚類における対応する性染色体である。
【００８１】
本発明の核酸分子、制御領域、組換えDNA分子あるいはベクター、精子形成の際に発現を調節する異種のプロモーターおよび／または本明細書中で上に定義するとおりのエフェクター（ポリ）ペプチドをコードするDNA配列が単独あるいは組み合わせで、発現可能性に関して可逆的な不活性状態で前記Y染色体に挿入されるのが特に好ましい。
【００８２】
本発明の方法に従い、本発明の前記核酸分子制御領域、組換えDNA分子あるいはベクター、精子形成の際に発現を制御する異種のプロモーターおよび／または本明細書中で上に定義するとおりのエフェクター（ポリ）ペプチドをコードするDNA配列が単独あるいは組み合わせで、loxP部位またはFRT部位に隣接されているのが最も好ましい。
【００８３】
上の態様の全てにおいて、少なくとも１つのディストーターが同一のあるいは異なる染色体上に存在し得る。
【００８４】
本発明のさらなる特に好ましい態様はさらに、少なくとも１つのディストーターをコードする核酸分子を同一のあるいは異なる染色体に導入することあるいは、少なくとも１つのディストーターを含む染色体断片を前記細胞に導入することを含む。
【００８５】
前記ディストーターがD2および／またはD1であるのが最も好ましい。
【００８６】
本発明の前記方法およびその様々な好まし態様は、とりわけ動物の繁殖において広範な応用を提供する。したがって、上に概説したように、レスポンダーに寄与する分子および／または本明細書中で上に定義した通りのエフェクター（ポリ）ペプチドをコードする核酸配列を、前記核酸配列に天然で結合しているプロモーターの調節下におき得る。そのような構築物を染色体に挿入することは、ディストーター機能のない状態では、前記染色体のトランスミッションに関するならば染色体に不利益をもたらすだろう。この不利益は、49から0％の範囲のトランスミッション比であり得る。レスポンダー効果が対応する染色体に極めて低いトランスミッションをもたらすかあるいは全くトランスミッションをもたらさない場合で、かつ、もしも、加えて、本発明の核酸分子あるいはエフェクター（ポリ）ペプチドを含む上に列挙した構築物がY染色体に挿入されるならば、そのY染色体およびレスポンダー機能はオスの動物によってはほとんどあるいは全く伝達されないだろう。オスの動物を影響するためには、都合良くはY染色体は、不活性ではあるが活性化され得る構築物を含んでいなければならない。前記不活性な構築物は、トランスミッション比には影響を持たないべきである。前記構築物の一態様は、前記プロモーターあるいは精子形成の際に発現を調節する異種のプロモーターと、エフェクター（ポリ）ペプチドをコードする配列および／またはレスポンダー活性を付与する配列との間に位置する介在配列に隣接したloxPあるいはFRT部位を含む。介在配列は、エフェクターおよび／またはレスポンダー活性の発現を阻止するようなやり方で設計されるだろう。エフェクターおよび／またはレスポンダー活性の活性化は、同じ細胞に含まれるCreあるいはflpの活性のために介在配列が切り出されることにより遂げられ得る。前記構築物の別の態様には、前記プロモーターあるいは精子形成の際に発現を調節する異種のプロモーターに隣接したloxPあるいはFRT部位が含まれ、そのプロモーターは本発明の核酸あるいは上に述べた（ポリ）ペプチドをコードするエフェクター配列を含む構築物から離れる方向をとっている。Creあるいはflpの活性は、エフェクター配列あるいは精子形成の間にレスポンダー活性に寄与する配列の転写をもたらすようにそのプロモーターを反転させるだろう。前記構築物の別の態様には、精子形成の間にアンチセンス鎖が転写されるようにプロモーターに対して反対向きをとっている前記核酸配列に隣接したloxPあるいはFRT部位が含まれる。活性化は、同じ細胞に含まれるCreあるいはflpの活性のために、エフェクター配列あるいはレスポンダー活性に寄与する配列をひっくり返すことにより遂げられ得る。Creあるいはflpタンパク質の発現は、好都合には精子形成に先立って果たされるだろう。レスポンダーあるいはエフェクター機能の活性化は、そのような場合には、Rプロモーターあるいは精子形成／精子完成の間に発現を調節する別のプロモーターの調節下で精子形成の間に果たされる。好ましくは、Cre遺伝子は常染色体に挿入されており、以下のプロモーター：部位特異的な組み換えが接合子に生じる、サイトメガロウイルス極初期エンハンサー-ニワトリベータアクチンハイブリッド（CAG）プロモーター；発���が初期胚形成の間に開始される、アデノウイルスEIIaプロモーター；発現が胚形成の間に開始される、CMV；発現がやはり胚形成の間および生殖系列細胞において開始される、OCT4；発現がユビキタスである、HSV-TKあるいはPgk；構築物が精子形成の間に発現される、Pgk2；のうちの１つの調節下で発現され得る。上の態様においては、レスポンダーおよび／またはエフェクターをコードする構築物は、不活性な状態でオスの動物によって伝達される。Cre構築物のメスのキャリアーとの交配により、精子形成の間に活性化されるレスポンダーおよび／またはエフェクターを有するオスの子孫が得られるだろう。これらのオスの動物の子孫は、父親のX染色体を優勢にあるいは限定的に受け継ぎ、したがってメスの子孫である。X染色体が限定的に伝達される場合は、レスポンダーおよび／またはエフェクター機能は子孫に受け継がれない。しかし、レスポンダーおよび／またはエフェクター（ポリ）ペプチドが、例えば10から20％のトランスミッションを誘導するようなそれほど強くない影響を持つ場合には、オスのキャリアーを生じさせるためには低トランスミッションで十分なため、構築物の不活性化は必要ではない。マウスのR遺伝子の遺伝の頻度は、t-ディストーターとの相互作用がない状態で、天然では約20％の範囲内にある。
【００８７】
上で同定した本発明の方法の別の好ましい態様においては、レスポンダーおよび／またはエフェクターはX染色体あるいは常染色体に挿入される。この場合には、レスポンダー機能は精子形成の間にのみ作用することから、レスポンダーおよび／またはエフェクターをコードする構築物は天然の状態でメスの動物に伝達されるため、いかなる不活性構築物も必要ではない。野生型のオスの動物との交配により、活性なRおよび／またはエフェクターをコードする遺伝子をX染色体あるいは常染色体に有するメスの動物を生じさせることとなる。Rおよび／またはエフェクターをコードする遺伝子を有する染色体は、トランスミッションにおいて不利益を有する。Rおよび／またはエフェクターをコードする構築物がX染色体に挿入される場合には、メスの子孫は全くかあるいはわずかに低い割合でしか生じないだろう。
【００８８】
さらに、本発明は、そのY染色体または対応する性染色体に挿入された本発明の核酸分子、制御領域、組換えDNA分子あるいはベクター、精子形成の際に発現を調節する異種のプロモーターおよび／または本明細書中で上で定義したとおりのエフェクター（ポリ）ペプチドをコードするDNA配列を、単独あるいは組み合わせで発現可能性に関して活性な状態で有する、オスのトランスジェニック非ヒトほ乳類、魚類あるいは鳥類を作出するための方法に関連し、前記方法は前記オスのトランスジェニック非ヒトほ乳類、魚類あるいは鳥類に由来する精子を用いて卵子に精子をin vitroで受精させるあるいは注入することを含む。本発明の好ましい態様においては、前記方法はin vitro受精あるいは注入の前にさらに、前記エフェクター（ポリ）ペプチドを発現させること、および前記エフェクター（ポリ）ペプチドを発現し、したがって前記Y染色体あるいは対応する性染色体を含む精子を選別することを含む。上の方法は、天然の交配あるいは人工的な授精によるオスのキャリアーからの構築物のトランスミッションが0％に近い場合に有用である。マウスにおいてはt/+精子のトランスミッション比の歪みはin vitro受精の間には起こらないことが示されているため、トランスジェニックオスのキャリアーの作出は、in vitro受精を用いた本発明の方法によって達成され得る。本発明の方法の効率は、上に記載するとおりのin vitro受精の前に、Y染色体あるいは対応する性染色体を有する精子を選別することによりさらに上昇させることができる。選別は、例えばセルソーティングなどによって果たし得る。
【００８９】
あるいは、優勢にメスである子孫を生じさせるのに有用であるため、Rおよび／またはエフェクター機能のオスのキャリアーは、不活性なRおよび／またはエフェクターをコードする構築物を有するヘミ接合のオスの動物を、部位特異的な組換え酵素をコードする遺伝子座および好ましくはCre遺伝子座を有するヘミ接合のメスの動物と交配することによって得られる。そのような交配の子孫は、その系統の維持にも、目的とするメスの子孫を生じさせるのにも用いられ得る。Rおよび／またはエフェクターをコードする構築物の単一のオスのキャリアーから多くのメスの子孫を得ることができるのは、何の意味もない。
【００９０】
上で言及した本発明のさらなる態様は、ディストーター2（D2）と組み合わせた、好ましくはディストーター1（D1）と組み合わせたR遺伝子の使用に関連する。この態様においては、R構築物を有する染色体は優勢にあるいは限局的に伝達される。
【００９１】
ディストーターD1およびD2（および恐らくD3も、さらに仮定されているディストーターも）は、R構築物を有する染色体の優位に対してトランスに作用する。出願人はいかなる特異的な理論によっても縛られることを望んでいないが、現在のところ、D1およびD2が精子形成の二倍体の段階に発現していると想定されている。ディストーター遺伝子はいまだに同定されていないが、その遺伝子産物はR機能を有する染色体の優勢あるいは限局的なトランスミッションを誘導することがよく知られている。ディストーター機能は、例えばディストーターD1あるいはD2あるいは両方を含む部分的t-ハプロタイプを有する染色体によって提供され得る。ディストーター遺伝子の発現産物はさらに、R機能を持たない精子に負の影響を発揮することが想定されている。これとは対照的に、R機能を有する精子はR機能から保護される。そのような精子は運動性の観点で選択的に優位であり、したがって受精されるべき卵細胞により速く到達し得ることも示唆されている。
【００９２】
本発明にしたがい、D2、D1およびさらなるディストーターは、R構築物を有する同一のあるいは異なる染色体上に位置していると考えられる。RがY染色体に挿入されている場合は、交配は優勢にオスの子孫をもたらすだろう。X染色体への挿入は、対照的に、優勢あるいは限局的にメスの子孫をもたらすだろう。常染色体への挿入は、前記染色体および、それゆえ前記R構築物に関連するあらゆる特性の高いトランスミッションをもたらすだろう。R構築物の高いトランスミッションにより、R機能の維持が保証される。この態様の実用上の利点は、Rをコードする構築物がX染色体に挿入される場合には、Y染色体、すなわち雄性を維持するためにわずかに少しのオスの野生型動物個体しか必要ではないということである。前記オスの野生型動物個体は、ディストーターおよびR機能の両方を有するトランスジェニックヘミ接合メスの動物個体を野生型のオスと交配することによって生じさせ得る。
【００９３】
本発明の目的事は、本発明の核酸分子、制御領域、組換えDNA分子、あるいはベクターがそのゲノム中に安定に挿入されているか、あるいは本発明の宿主細胞から再生される、あるいは上に述べた本発明の方法によって得ることができる、トランスジェニック非ヒト哺乳類、魚類あるいは鳥類にも関連する。
【００９４】
前記トランスジェニック動物は、都合良くはマウス、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ラット、ウサギ、ウマ、イヌ、ネコ、ラクダ、ニワトリ、アヒル、サケまたはマスである。
【００９５】
前記トランスジェニック動物は、交配、in vitro受精あるいは人工授精を含め、非メンデル比で子孫を作出するために用い得る。
【００９６】
本発明はさらに、オスは本発明の核酸分子、制御領域、組換えDNA分子、あるいはベクターが、発現可能性に関して可逆的な不活性状態で前記Y染色体に、そして任意に少なくとも１つのディストーターがそのゲノム中に挿入されたトランスジェニック動物であり、メスはそのゲノムDNA中に部位特異的なDNA組換え酵素をコードする核酸分子が安定に挿入されているトランスジェニック動物である、一対のトランスジェニック非ヒトほ乳類、魚類または鳥類に関連する。
【００９７】
一対のトランスジェニック動物は、交配を成功させるために当然ながら好ましくは同じ種でなければならない。
【００９８】
好ましくは、前記一対の動物のうちの前記メスにおいては、前記DNA組換え酵素はCreまたはflpである。
【００９９】
最も都合良くは、、前記DNA組換え酵素は、精子形成の前に活性である制御エレメントによって調節される。
【０１００】
さらに、本発明は本明細書中で以前に定義したとおりのトランスジェニック非ヒトほ乳類、魚類あるいは鳥類のオスから得ることができる精子に関連する。
【０１０１】
前記精子は、例えば急速冷凍などに適した組成物に含まれ得る。
【０１０２】
本発明は、エフェクター（ポリ）ペプチドを発現させることおよび前記（ポリ）ペプチドの存在あるいは非存在に関して選別することを含む、本発明の精子を選別するための方法にも関連する。
【０１０３】
本発明のこの方法にしたがい、エフェクター（ポリ）ペプチドは好ましくは、セルソーティングあるいはアフィニティーークロマトグラフィーによって選別される。次に、エフェクター（ポリ）ペプチドおよびそれゆえに本発明の核酸分子を持つあるいは持たないいずれかの精子は、さらなる意図する目的のために用い得る。
【０１０４】
加えて、本発明は、以下の、
（a）本明細書中で上に定義する、細胞死の原因となり得るような組換えDNA分子の発現を可能にすること；および
（b）生存可能な精子を選別すること；
を含む、本発明の精子に対する選別の方法に関連する。
【０１０５】
細胞死は、都合良くは、タグを含むエフェクター分子のin vivoでの発現、および、構築物を有する精子の不活性かあるいは溶解をもたらすような、そのタグに結合する特異抗体および精子に対する補体のin vitroでの添加によっても引き起こし得る。
【０１０６】
前記方法は、Rプロモーター機能を有する精子が選別される場合に応用可能性がある。
【０１０７】
本発明のさらなる目的は、子孫を作出するためにその精子を使用することである。そのような作出には、交配、in vitro受精あるいは人工授精が含まれ得る。
【０１０８】
本発明のさらなる目的は、本発明の核酸分子、本発明の制御領域、本発明の組換えDNA、本発明のベクター、本発明の宿主細胞、本発明の発現産物あるいは本発明の抗体を、避妊薬の開発および／または製造用に卵の誘引物質を認識する精子表面受容体を単離するために使用することに関連する。
【０１０９】
さらに、本発明は、本発明の核酸分子、本発明の制御領域、本発明の組換えDNA、本発明のベクター、本発明の宿主細胞、本発明の発現産物あるいは本発明の抗体を、レスポンダー機能が関わると考えられているシグナルカスケードの（未成熟）活性化あるいは阻害（抑制）の引き金を引くことができる化学物質あるいは生物化合物を同定するために使用することに関連する。前記シグナルカスケードの活性化あるいは阻害（抑制）は、エネルギー予備の急速な消耗のためにおよび／または精子の運動を阻害することによって、精子の運動性に影響を及ぼす、および／または精子の排卵された卵を受精させる能力に影響し得ると考えられているため、そのような化合物は強力な避妊薬として応用し得る。
【０１１０】
前記化学物質あるいは生物化合物の同定は、細胞培養細胞中に発現した野生型のレスポンダータンパク質の活性化をアッセイとして用いる標準的なスクリーニング技術によって達成し得る。前記タンパク質の活性化は、MARKキナーゼの過剰発現によって得られた効果と同様に、細胞培養細胞中で微小管分裂の引き金を引き得ると考えられている。そのような効果を誘引するあるいは阻害する化合物を次に、精子の運動性および／または受精能力に対する効果を分析し得る。あるいは、前記化合物に対する同様のスクリーニング系は、細胞培養細胞におけるスクリーニングアッセイを前もって用いない精子に関しても考慮し得る。
【０１１１】
さらに、本発明の核酸分子、本発明の制御領域、本発明の組換えDNA、本発明のベクター、本発明の宿主細胞、本発明の発現産物あるいは本発明の抗体は、（ポリ）ペプチドであると期待される前記発現産物が結合し得る、レスポンダー／ディストーターシグナルカスケードの受容体分子あるいは他のメンバーを単離するために使用し得る。前記シグナル伝達分子は、レスポンダー（ポリ）ペプチドに関わるタンパク質複合体の免疫沈降およびそれらをコードする対応する遺伝子のクローニング、あるいは標準的な手法を用いた酵母におけるツーハイブリッドスクリーニング技術によって同定し得る。特に、最も好ましくは、レスポンダー遺伝子あるいは（ポリ）ペプチドは、前記レスポンダー／ディストーターシグナルカスケードを活性化すると考えられるシグナル分子の膜受容体を単離するのに用い得る。前記膜受容体は、新規避妊薬の開発の標的として最も好ましいと考えられる。
【０１１２】
加えて、本発明は、本発明のトランスジェニック非ヒトほ乳類、魚類または鳥類において本発明の核酸分子、制御領域、組換えDNA分子、ベクター、または発現産物、または前記DNA分子あるいはベクターまたはその一部分にコードされる異なる異種の発現産物を検出するための方法に関連し、前記本発明の核酸分子、制御領域、組換えDNA分子、ベクター、またはその一部分を前記トランスジェニック動物において、あるいはその前記一部を同定することを含む。本発明の方法により、本発明の動物を、本発明にしたがってそれらが有する遺伝構築物に基づいて同定することができる。さらに、この方法により、その一部分を解析することによって例えば屠殺した後にもそのような動物を同定すること可能になる。精子、卵細胞および胚も前記動物の一部と考えられるということに注意すべきである。検出は、本明細書中で上に明記したプライマーを用いてPCRによって果たし得る。検出可能なように標識されたプローブによる核酸ハイブリダイゼーションは、異なる検出方法を構成する。核酸、組換えDNA分子あるいはベクターのあらゆる部分または構成部分は、その指標である限りは、本発明の方法によって同定し得る。したがって、例えば、ベクターには前記ベクターの、したがって本発明の指標とはならないような、いかなる生物機能も持たない核酸配列が含まれ得る。別の態様においては、エフェクター（ポリ）ペプチドを検出に用い得る。当然ながら、本発明の核酸分子あるいはその一部分は、それ自体で検出され得る。上の過程を含む、当業者によって考えられるあらゆる態様は、上に述べた遺伝物質の検出を可能にする限りは、本発明の方法に帰着する。
【０１１３】
また、本発明は、t-レスポンダーとはことなるレスポンダー／ディストーターシグナルカスケードのメンバーの配列あるいは発現レベルを操作すること、および操作された形の前記異なるメンバーの発現をそれを有する精子に選択的にあるいは完全に限局させることを含む、遺伝的特性のトランスミッション比を歪める方法に関連する。
【０１１４】
前記配列および発現レベルの操作方法と同様に、本発明の好ましい態様および様々な応用は、本明細書中で以前に述べた。
【０１１５】
本発明は、組み換えによって操作され改変された配列あるいは発現レベルのレスポンダー／ディストーターシグナルカスケードのメンバーを有し、前記メンバーの発現がそれを有する精子に選択的あるいは完全に限定されている、トランスジェニック動物にも関連する。
【０１１６】
好ましくは、前記シグナルカスケードの前記メンバーは、レスポンダーではない。
【０１１７】
本発明のこれらの態様においては、このカスケードの好ましくはレスポンダーとは異なるメンバーの配列および発現レベルは、改変されるかあるいは破壊される。同様に、レスポンダーおよび／または１つあるいはそれ以上のディストーターの活性が影響されると期待される。レスポンダー／ディストーター機能の改変／破壊の種類に依存して、これらのトランスジェニック動物は上に述べたものに対応する交配計画に用い得る。
【０１１８】
最後に、本発明は、精子形成／精子完成の間に精子の運動性および／または受精に関わる遺伝子を発現させることを含む、オスのほ乳類からその子孫への遺伝的特性のトランスミッションを、非メンデル比に歪めるための方法に関連する。
【０１１９】
本発明の好ましい態様においては、前記遺伝的特性は性別を決定する。
【０１２０】
本発明の方法の別の好ましい態様においては、前記遺伝子は精子形成／精子完成の間に発現させるようなプロモーターの調節下にある。
【０１２１】
プロモーターは、前記遺伝子の元来のプロモーターであり得るか、あるいは前記遺伝子の異なるコピーまたは異なる遺伝子から由来し得る。さらに、プロモーターは、異なる種由来の相同遺伝子の1コピー（１つ以上が存在する場合）から由来し得るか、あるいは前記異なる種の異なる遺伝子から由来し得る。プロモーターは、増強されたあるいは減弱された発現であり得る、最適な発現を得るために修飾されることもある。
【０１２２】
本発明の方法の特に好ましい態様においては、前記プロモーターは、前記遺伝子を有する精子において前記遺伝子の選択的あるいは限局的な発現を可能にする。
【０１２３】
本発明のさらに好ましい態様においては、前記遺伝非亜ｈ、その野生型の対立遺伝子の機能を、あるいは精子の運動性および／または受精に関わる他の遺伝子の機能を妨げるように作られ、前記遺伝子は精子の運動性および／または受精に関わる１つあるいはそれ以上の遺伝子の機能を阻害し、および／または前記遺伝子はそれを発現する精母細胞／精子細胞に細胞死をもたらし、および／または前記遺伝子はそのタグを有する精子のin vitroでの選別を可能にするタグをコードする。
【０１２４】
本発明のさらに好ましい態様においては、前記遺伝子はcAMP依存性タンパク質キナーゼAの阻害物質をコードする。
【０１２５】
特に好ましい態様においては、前記阻害物質はPKIあるいは機能的に活性なその誘導体または断片である。
【０１２６】
本発明にしたがって用いられる場合に、用語“機能的に活性な誘導体あるいは断片”とは、１つあるいはそれ以上のアミノ酸置換、欠失、および／または付加によってPKIから誘導されるが、PKIの生物活性を本質的に維持している、すなわち少なくともcAMP依存性タンパク質キナーゼの活性に対する阻害性を維持しているような分子のことを言う。PKIの機能的に活性な誘導体あるいは断片の例は、当業者には十分に知られており、例えば、生物工学会社のカタログなどに見つけることができる（例えば、1998年のPromegaカタログなどを参照）。
【０１２７】
別の態様においては、本発明は本明細書中で上に定義したとおりの遺伝子を含むトランスジェニック動物に関連する。
【０１２８】
最後に、本発明は、本発明のトランスジェニック動物から得ることができる精子に関連する。
【０１２９】
本明細書に引用した参考文献は、本明細書中に参考文献として援用されている。
【０１３０】
図面は以下のものを示す：
図1：
（a）上のパネルは、マウスの17番染色体上の完全および部分的t-ハプロタイプのt-染色体領域の広がり（太いバー）を概略的に描いたもの、さらにマウスにおいてトランスミッション比の歪み現象（TRD）に寄与するレスポンダー（Rt）および2つのディストーター（D1、D2）のマッピング位置をも示す（Lyon 1984; Fox et al. 1985; Herrmann et al. 1986; Bullard et al. 1992）。レスポンダー機能は、真ん中のパネルにさらに詳細に示したT66Bゲノム領域に位置する（Schimenti et al. 1987; Nadeau et al. 1989; Rosen et al. 1990; Bullard et al. 1992）。Rを有する領域は、Rtを含まない部分的t-ハプロタイプth44、th51、tJr1とRtを含むth49、th2との組換え切断点によって定義される。th2とth49の切断点は一致する（Bullard et al. 1992）。その間に切断点が生じたはずの間隔は、きっちりとは定義されておらず（破線で示してある）、t-ハプロタイプDNAのみを示してある。マーカーTu66の位置は、レスポンダーのマッピングと下のパネルに示す緻密な遺伝的地図とを対比するためのアンカー点として働く。T66Bkとマウスrsk3の融合体のゲノムクローン（コスミドcat.15、cat.184、cat.169、cat.195）、制限地図および遺伝子構造は、レスポンダー候補であるT66BkがRtを有すると定義された領域内に都合良く存在するということを証明している。T66Bkのエキソン-イントロン構造は決定されていなかったが、黒いバーはT66B領域内に位置するマウスrsk3のエキソンを含む制限酵素断片を示している（Kispert 1990）。T66BkおよびT66Bk-2配列をコードする断片は、α-32P標識された断片pCRth2-161/170の、標準的な手法にしたがって、図の説明文2に記載されている通りに制限酵素切断され、電気泳動されてナイロン膜上にブロットされたコスミドDNAへのハイブリダイゼーションによって、さらに図の説明文4に記載の通りに配列決定することによって決定された。
【０１３１】
（b）コスミドcat.15のBamHI断片B9.1の解析により、別のT66Bk遺伝子ファミリーのメンバーであるT66Bk-2がB9.1のセントロメアに近い側に位置している一方で、テロメアに近い側にはT66Bk-rsk3融合遺伝子の予想されるプロモーターおよび第一エキソンが含まれていることが明らかになった。B9.1は、T66Bk-2の1エキソンの完全な予想タンパク質コーディング領域と、非翻訳配列をコードする単一の3'エキソン（3'と表示してある）を含む。T66Bk-2の予想されるプロモーター領域および第一エキソンをコードする非翻訳配列は、恐らくcat.15の6.1 kb BamHI断片内の、B9.1のセントロメアに近い側に位置しているが、厳密な位置は決定されていない。
【０１３２】
方法：
コスミドcat.15、cat.169、cat.169、cat.184およびcat.195を、慣習的な手法に従ってtW12/tW12ゲノムDNAからベクターpcos2EMBLに構築したコスミドライブラリーから単離した（Ehrich et al. 1987）。ライブラリースクリーニングおよびコスミドマッピングを、記載されている通りに行った（Herrmann et al. 1987; Rackwitz et al. 1985; Kispert 1990）。マウスrsk3の制限酵素地図、さらに構造および配列は以前に決定されている（マウスrsk3は当初、Tckと名付けられた；Kispert, 1990）。コスミドに由来するサブ断片とあるいはcDNAプローブとハイブリダイズするゲノム制限酵素断片の染色体位置推定は、制限酵素断片長多型（RFLP）マッピングにより行った（Fox et al. 1985; Herrmann et al. 1986）。th2、th49、tlow、t6、t5あるいは他の完全t-ハプロタイプ由来のゲノムDNA中に存在するが、th44、th51、あるいは野生型同系交配系統由来のDNAには存在しない場合は、t-ハプロタイプに特異的な多型性の制限酵素断片をT66B領域に当てはめた（Lyon 1984; Fox et al. 1985; Herrmann et al. 1986; Bullard et al. 1992）。
【０１３３】
図2：
様々なt-ハプロタイプを有するマウス、あるいは野生型のマウス系統のゲノムDNAまたはコスミドDNAのサザンブロットハイブリダイゼーション。DNAをBamHIエンドヌクレアーゼにて切断し、ナイロン膜へブロットし、プローブpCRth2-161/170とハイブリダイズさせた。2つの断片B7.8およびB9.1（アステリスクで記した）がレスポンダーを有するt-ハプロタイプに可視化されるが、R機能を持たないt-ハプロタイプにも野生型系統にも存在しない。両断片はコスミドcat.15中に存在し、図1（下段左）に示すように、共に遺伝子T66Bkの転写単位を含む。B9.1はさらに、T66Bk-2のタンパク質コーディングおよび3'非翻訳領域を含む。約6.1 kbの、コスミドcat.15上の第三のハイブリダイズする断片は、T66Bk-2遺伝子の一部を含んでいるとみられる。6.1 kb BamHI断片は、コスミドcat.15の近位（セントロメアに近い）末端に位置し、クローニングによって短縮されており、それゆえ総ゲノムDNAのハイブリダイゼーションで同定されるどの断片ともサイズが一致せずそれらと相関し得ない。
【０１３４】
略語：tJr1 = tw71Jr1；tlow = tlowH；tOr = 欠失染色体T Oak Ridge 4。129/Sv、C57BL6およびDBA/2はマウス同系交配系統である。
【０１３５】
方法：
ゲノムDNAを記載されている通り（Herrmann and Frischauf, 1987）に調製し、BamHIにて切断し、記載されている通り（Herrmann et al. 1986; Sambrook et al. 1989）にHybond N+膜（Amersham）にアルカリキャピラリートランスファーし、ChurchおよびGilbert（1984）にしたがってUV Stratalinker 2400（Stratagene）にてUV処理し、2 x 106 cpm/mlのプローブで0.5 M NaPi pH 6.8／7％SDS中、68℃にて一晩ハイブリダイズさせ、40 mM NaPi pH6.8／1％SDS中、68℃にて洗い、Kodak X-AR5 X線フィルムに感光させ、-80℃にて増感させる遮蔽をした。プローブは、供給者の使用説明書にしたがってT7 QuickPrime kit（Pharmacia Biotech）、プローブDNAおよび5 μlのα-32P dCTP（Amersham）を3000 Ci/mmoleにて用い、ランダムプライマー伸長により調製した。
【０１３６】
cDNAプローブ断片pCRth2-161/170は、20 mM Tris pH8.4、50 mM KCl、1.5 mM MgCl2、各0.2mM dATP/dCTP/dGTP/dTTP中、1 unitのTaq DNAポリメラーゼ、鋳型としておよそ50 ngのcDNA pCRth2-161/170、各20pmoleのプライマー161および171を用い、標準的なPCR増幅によって調製した。94℃にて30秒間、50℃にて30秒間、72℃にて2分間というのを15サイクル、72℃にて5分間の最終伸長を行い、産物をTAEバッファー（Sambrook et al. 1989）の1％アガロースゲルにのせ、電気泳動し、増幅された断片を長波長UV光（366 nm）下で切り出してEZ Enzyme Removers column（Amicon）を通す遠心によって精製し、エタノール沈殿（Sambrook et al. 1989）した。DNAをTEに溶解させた。
【０１３７】
図3：
RT-PCR解析により、T66Bkがレスポンダー領域に位置決定され、精子形成の間に転写されることを確認する。a）T66Bk-rsk3融合遺伝子に対して特異的なプライマー対181／144による精巣RNAのRT-PCRでは、t-レスポンダーを有するt-ハプロタイプのRNAから821 bpのcDNA断片が増幅され（比較するためには、図1を参照）、個の遺伝子がt-レスポンダーを有する領域に存在し、精巣に発現していることが確認される（上のパネル）。アッセイに用いたRNAおよび第一鎖cDNAの質は、マウスrsk3遺伝子（Tck、Kispert 1990を参照）から769 bpのcDNA断片を増幅するプライマー対145／146を用いたRT-PCRにより確認した。後者のRT-PCRもまた、T66B領域を含むt-ハプロタイプではより小さな断片を生じるが、野生型あるいはT66B領域を含まないt-ハプロタイプでは生じない。このより小さな断片は、rsk3のT66Bコピーにおける1エキソンの欠失のためである。T66Bk-rsk3融合遺伝子の実質的なレベルの転写は、22 days p.p.の精巣に初めて検出可能である（下のパネル）。この段階では、二倍体の精子細胞が形成されて、精子形成と呼ばれる精子への変換過程を受けているところである（Ruth 1990）。プライマー対155／170は、T66Bkや関連遺伝子に由来する815 bpのcDNA断片を増幅する。プライマー対155／170を用いて分析した全ての精子形成段階にRNAが存在することは、１つあるいはいくつかのT66Bk遺伝子ファミリーの転写の早期の開始を示唆している。T66Bk-rsk3融合遺伝子由来の極めて低いレベルの転写産物も、精子形成の早い段階に検出可能である。b）アンジオテンシン変換酵素（ACE、Howard et al. 1990）、c-kit（Rossi et al. 1992）およびマウスプロタミン1（mP1、Peschon et al. 1987）の精巣特異的転写産物に特異的なプライマー対を用いた精巣RNAのcomparative RT-PCRにより、T66Bk-rsk3融合遺伝子の転写の、既知の遺伝子の転写との対比が可能になる。全3つの遺伝子のプロモーターはトランスジェニックマウスにおいて解析されている（Langford et al. 1991; Albanesi et al. 1996; Peschon et al. 1987）。mP1は球形の、ACEおよびc-kitは伸長中の精子細胞中で転写されると推測されている。我々のRT-PCR解析ではT66Bk-rsk3融合遺伝子はACEおよびc-kitよりもわずかに遅れて転写されるとみられるため、我々はT66Bk-rsk3融合遺伝子の発現は伸長中の精子細胞に開始されるのが最もあり得ると結論付ける。
【０１３８】
方法：
精巣組織の総RNAを、公表されている手順にしたがい（Auffray and Rougeon 1979）、LiCl／尿素中で組織をホモジナイズした後に調製した。エタノール沈殿後、およそ100 mgの出発材料につき50 μlの10 mM Tris-HCl／1mM EDTA pH7.6（TE）にRNAを溶解させた。2μlの総RNA（およそ6μgのRNA）を、Gibco/BRLのSuperScriptプラスミドcDNA合成キットの使用説明書にしたがってoligo(dT)プライマーを用いたcDNA合成に使用した。第一鎖合成後、反応物をTEで50μlにまで希釈した。PCR増幅のために、0.5μlの第一鎖cDNAストック溶液を、20pmoleの各プライマー、20 mM Tris pH8.4、50 mM KCl、1.5mM MgCl2、各0.2mM dATP/dCTP/dGTP/dTTPおよび1 unitのTaq DNAポリメラーゼを含む20μlの反応混合液に添加した。反応混合液にミネラルオイルを重層し、PTC-100 thermocycler（MJ Research, Inc.）を用いて94℃にて30秒間、50℃にて30秒間、72℃にて30秒間というのを35サイクル行った。TAEバッファー中に0.4μg/mlの臭化エチジウムを含む、適切に1％または2％アガロースゲル中（Sambrook et al. 1989）で反応産物を電気泳動し、UV光ボックス用で撮影した。各写真の左端に示すように、Gibco/BRLの1kbラダーをマーカーとして用いた。
【０１３９】
図4：
a）予想される484アミノ酸残基のタンパク質をコードするT66Bk-rsk3融合遺伝子の部分CNDAを表すpCRth2-161/170の核酸配列およびアミノ酸配列。最初のメチオニン（開始コドン）の5'にある読み枠に合ういくつかの終止コドンと単一の長いオープンリーディングフレームの終わりの終止コドンは、このcDNAのタンパク質コーディング領域が完全なものであることを示唆している。アステリスクは、T66Bk遺伝子と短縮されたマウスrsk3遺伝子の間の接合点を示す。T66Bk配列のRT-PCR検出およびクローニングに用いたプライマーの核酸配列を示してある。プライマー番号および3'末端を示す。
【０１４０】
b）マウスrsk3関連遺伝子の一部に融合したT66Bk関連遺伝子の5'末端に由来する断片からなるcDNA断片ptlib0.7の部分核酸配列。この部分cDNAは、tw5/tw12成体オスの精巣から抽出したRNAを用いて構築したcDNAプラスミドライブラリーの総計およそ200,000クローンのクローンプールから、プラスミドベクターアンカープライマー（seq5lib）およびプライマー144を用いたPCR増幅によって単離した。別の380,000 cDNAクローンを、cDNAフィルターハイブリダイゼーションによりスクリーニングした。これらのクローンから、ここの示すものとの配列相同性を含む、rsk3配列に融合した別の部分cDNAを得た。示したcDNA配列の5'末端に位置するプライマー（161）の配列は、図4aに示すT66BkのcDNA断片をtw5/tw12成体オスの精巣cDNAから増幅するためにプライマー144（rsk3）と組み合わせて設計して用いた。
【０１４１】
方法：
完全t-ハプロタイプtw5/tw12を有する成体オスの精巣RNAのcDNAライブラリーを、供給者の使用説明書にしたがってSuperScript Plasmid cDNA synthesis kit（Gibco/BRL）を用いてプラスミドベクターpSV-Sport1中に構築した。RNA単離は図3の説明文中に記載の通りに行い、供給者（Qiagen）の使用説明書にしたがってOligotez beadsを用いてmRNA精製を行った。総計およそ200,000クローンのライブラリープールのDNA調製物を、Qiagen plasmid midi kit（Qiagen）を用いて調製し、プライマー対seq5lib/144を用いて図3の説明文中に記載の通りにPCR増幅によって分析した。0.7kbの断片を得て、使用説明書にしたがってInvitrogenのTA cloning kitを用いてベクターpCR2.1にクローニングした。別の380,000 cDNAクローンをフィルター上に置き、記載の通り（Herrmann et al. 1987）にハイブリダイゼーションによってスクリーニングした。
【０１４２】
72℃におけるプライマー伸長時間がサイクルあたり2分間であること以外は、図の説明文3に記載の通りにt-ハプロタイプth2に関してホモ接合である成体オスの精巣RNAから、プライマー対161／144を用いて調製し、増幅したcDNAのPCR増幅により、部分cDNA pCRth2-161/170を得た。図の説明文3に記載の通りに1％アガロースゲルからcDNA断片を精製し、プラスミドベクターpCR2.1にクローニングした。
【０１４３】
プラスミドDNAをQiagen Plasmid Midi kitを用いて調製した。使用説明書にしたがってRR DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing kit（PE Applied Biosystems）および、OLIGO Primer Analysis Software（NBI）にて設計した遺伝子特異的プライマーを用いて配列決定反応を行い、使用説明書にしたがって反応物をCentri-Sep column（Princeton Separations）を通して遠心により精製し、自動ABI Prism 310 Genetic Analyzer（PE Applied Biosystems）にて泳動した。配列は、Power Macintoshコンピューター上でMacMoly Tetra programs set（Soft Gene, Berlin）にて評価した。
【０１４４】
図5：
T66Bk遺伝子ファミリーのメンバーの転写を明らかにするノーザンブロットハイブリダイゼーション。転写物は分析した全てのt-ハプロタイプまたは野生型の系統由来の成体精巣において検出可能であるが、他の臓器由来のRNAには検出できない。精子形成の間、検出可能なレベルの転写物は、22 days p.p.の時点で初めて現れる。対照のため、ブロット物をGAPDHに対するプローブにて再ハイブリダイズした（Kispert 1990）。
【０１４５】
方法：
記載の通り（Auffray and Rougeon 1979）にRNAを抽出し、レーンあたりホルムアルデヒドを含む1％アガロースゲルに10 μgをのせ、標準的な手法（Sambrook et al. 1989）に従ってMOPSバッファー中、電気泳動した。ゲルを、それぞれ2ゲル体積分の0.1M NH4-酢酸中で20分間二回、50mM NaPiバッファーpH6.8中で一回洗い、50 mM NaPiバッファーpH6.8の水槽を用い、キャピラリートランスファー（Sambrook et al. 1989）によりHybond N+膜（Amersham）にブロットした。Church およびGilbert（1984）にしたがってフィルターをUV Stratalinker 2400（Stratagene）にてUV処理し、0.5M NaPiバッファーpH 6.8／7％SDS／25％ホルムアミド中、2 x 106 cpm/mlのプローブpCRth2-161/170を用いて68℃で一晩ハイブリダイズさせ、50mM NaPiバッファーpH 6.8／1％SDS中、68℃で洗い、増感遮蔽を用いてKodak X-AR5フィルムに感光させた。プローブ断片は、cDNA pCRth2-161/170を鋳型として用い、プライマー対にてPCRにより増幅し、図の説明文2に記載の通りに標識した。各レーン中のRNAの相対量を決定するために、GAPDH遺伝子の部分cDNA（Kispert 1990）を含むcDNAクローンpme66にて上の通りにフィルターを再ハイブリダイズさせた。
【０１４６】
図6：
プローブpCRth2-161/170を用いた、いくつかのほ乳類種およびニワトリに由来するDNAのサザンブロットハイブリダイゼーションにより、ハムスター、ウサギ、ブタ、ヒトおよびニワトリにT66Bk関連遺伝子が存在することが明らかになり、進化の間にこの遺伝子のクラスが保存されていることを示唆している。DNAをBamHiで消化し、Nylonフィルターにブロットし、弱めた厳しさ（58℃）でハイブリダイズさせ、洗った。
【０１４７】
方法：
記載（Herrmann and Frischauf 1987）の通りに臓器あるいは血液細胞（ヒト）からゲノムDNAを単離し、BamHIエンドヌクレアーゼにて切断し、TBEバッファー中、1％アガロースゲルにて電気泳動し、記載（Sambrook et al. 1989; Herrmann et al. 1986）の通りにアルカリキャピラリートランスファーによりHybond N+膜（Amersham）にブロットした。Church およびGilbert（1984）にしたがってフィルターをUV Stratalinker 2400（Stratagene）にてUV処理し、0.5M NaPiバッファーpH 6.8／7％SDS中、2 x 106 cpm/mlのプローブpCRth2-161/170を用いて58℃で一晩ハイブリダイズさせ、100mM NaPiバッファーpH 6.8／1％SDS中、58℃で洗い、増感遮蔽を用いてKodak X-AR5フィルムに感光させた。プローブ断片pCRth2-161/170は、図の説明文2に記載の通りに標識した。
【０１４８】
図7：
マウスゲノムには、T66Bk遺伝子ファミリーのいくつかのメンバーが含まれる。
【０１４９】
a）1メンバーT66Bk-2のタンパク質コーディングエキソンは、T66B領域コスミドcat.15のBamHI断片B9.1に含まれる、T66Bkのセントロメアに近い側にあるタンデムな重複配列中に位置する。このエキソンのヌクレオチド配列および予想されるアミノ酸配列を示す（図7a）。cDNA検出、マッピングおよび発現研究（図8参照）に用いたプライマー232および237の配列を、破線で示してある。cDNA T66k-8中で欠失している一塩基（T1164）に下線を引いてある。
【０１５０】
b）遺伝子型tw5/tw12の精巣cDNAライブラリーから、cDNA T66k-8を単離した。そのヌクレオチド配列は、アミノ酸残基359以降（下線を引いた）のオープンリーディングフレームのシフトをもたらす一塩基欠失を除き、オーバーラップする領域でT66Bk-2のヌクレオチド配列と同一である。プライマー161および237の配列を示す（図8参照）。
【０１５１】
c）cDNA T66k-7asは、T66Bkファミリーメンバーのアンチセンス転写産物に由来する。T66k-7asの5'末端は、T66Bkプロモーターの上流の配列と密接に関連している。その3'末端はT66Bk/T66Bk-2のタンパク質コーディング領域に近い5'イントロンと極めて類似している（図7a参照）。ゲノム中でのT66k-7asの位置は決定されていない。ベクター配列には破線で、T66Bk/T66Bk-2の大きなORFをコードするエキソンと高い類似性を持つ配列には二重破線で、T66Bk/T66Bk-2のそれぞれタンパク質コーディングエキソンおよび3'非翻訳エキソンの上流または下流のイントロン配列と高い類似性を持つ配列を''''''で下線を引いてある。T66Bk/T66Bk-2相同清涼行きの転写の方向を示してある。
【０１５２】
d）tw5/tw12精巣cDNAライブラリーからcDNAクローンT66k-20を単離した。ヌクレオチド配列および予想されるアミノ酸配列は、T66Bk遺伝子ファミリーの上記のメンバーと強い類似性を示す。
【０１５３】
e）T66Bk遺伝子ファミリーのメンバーの予想されるアミノ酸配列の比較。T66Bkと同一であるアミノ酸残基を''で示す。 で示すギャップは、最適な対応付けをするために導入した。すべてのタンパク質、さらにT66Bkにおいて改変されているタンパク質尾部の配列の強い類似性に注意して欲しい。T66k-20はN末端でより長いという事実にもかかわらず、T66Bkと比較してT66Bk-2とT66k-20のより密接な関係にも注意して欲しい。
【０１５４】
方法：
標準的な手法にしたがい、制限酵素消化およびベクターpBluescript KSによりコスミドcat.15のBamHI断片B9.1を単離した。DNA調製および配列決定は、図の説明文4に記載の通りに行った。tw5/tw12オスの精巣から構築したcDNAライブラリーから、ライブラリーをプレーティングし、プライマー対155／170を用いたcDNA pCRth2-161/144のPCR増幅に由来するcDNA断片とのハイブリダイゼーションによってスクリーニングして、cDNAクローンT66k-7as、T66k-8およびT66k-20を単離した。ライブラリースクリーニング、プローブ調製、ハイブリダイゼーション、プラスミド調製、配列決定などは、図の説明文2、3および4に記載されている。
【０１５５】
図8：
T66Bk-2遺伝子はT66B領域内に位置しており、精巣において22日数p.p.から発現している。
【０１５６】
T66Bk-2/T66k-8特異的プライマー（232）を用いた精巣RNAのRT-PCR増幅およびハイブリダイゼーションに由来する951 bpのcDNA断片は、t-ハプロタイプth2、th49、t6およびtw5を有するマウス由来のRNAに検出されるが、th44、th51およびtJr1には検出されない。それゆえ、コスミドcat. 15のマッピングデータと一致して、それはT66B領域にマップされる。th2/th2およびth49/th49から得られるシグナルは、tOr/t6あるいはtOr/tw5から得られるものよりも高いが、全二者はT66Bk-2に関してホモ接合であるが、後者はヘテロ接合であるという事実と一致している。T66A領域のみを有するt-ハプロタイプあるいは野生型（Balb/c）において、弱いシグナルが得られる。これは、オリゴヌクレオチド232がT66Bk遺伝子ファミリーの他のメンバーに対して結合する能力の低下による。異なる段階のt6/+メスに由来する精巣RNA（下のパネル）では、T66Bk-2の転写は22 days p.p.の時点で初めて検出される。しかし、シグナルは極めて弱いが、24 days p.p.の時点では有意に増加している。これは、T66Bk-2がT66Bkよりも低いレベルであるいは遅くに発現し得るということを示唆している。全体的に、RT-PCRおよびハイブリダイゼーションによって検出される、各精巣試料中のT66Bk-2の転写レベルは、各試料中に存在するT66Bk-2対立遺伝子の数とよく相関している。これは配列保存性と共に、cDNAクローンT66k-8がT66B領域内にあるT66Bk-2遺伝子座に由来するということをさらに示唆している。
【０１５７】
方法：
精巣由来のRNAを逆転写し、プライマー対161／237（図7a、b参照）を用いてPCRにより第一鎖cDNAを増幅し、図の説明文3に記載の通りに1％アガロースにて電気泳動することにより、産物を分離した。図の説明文2に記載の通りにcDNAをHybond N+フィルターにトランスファーし、供給者の使用説明書にしたがってDIG Oligonucleotide Tailing Kit（Boheringer Mannheim）を用いて標識したオリゴヌクレオチド232を用いてハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションは、0.5M NaPi pH 6.8／7％ SDS中、37℃にて行った。フィルターを、あらかじめ温めた40mM NaPi pH 6.8／1％SDS（37℃）にて室温で5分間、4回洗った。プレハイブリダイゼーションおよびオリゴヌクレオチド検出は、Boehringer（Mannheim）のプロトコールにしたがって行った。
【０１５８】
図9：
T66Bk遺伝子をコードするcDNAの核酸配列およびアミノ酸配列。
【０１５９】
配列は、図4aに示す pCRth2-161/144の配列を、5'-および3'-側の両方に伸長させたものであるが、オーバーラップする領域においては同一である。cDNA pSV-T66Bkの3'末端は、マウスrsk3遺伝子のイントロン中で終結し、コンセンサスなポリアデニル化シグナルを欠いており、これは不完全にスプライシングされたRNAのoligo(dT)プライミングに由来するものであることを示唆している。アステリスクはイントロンの位置を示す。位置2023と2024の間のアステリスクは、T66BkのMARK-およびrsk3-相同性領域の間の融合点を示す。
【０１６０】
方法：
図7に示したcDNAを単離するのに用いたものに加えて、完全t-ハプロタイプt6/tw5を有するオスの精巣RNAから、図の説明文4に記載の方法にしたがって別のcDNAライブラリーを構築し、図の説明文7、2、3および4に記載の通りにスクリーニングした。10個のプールに含まれる総計500 000個のcDNAクローンを、遺伝子T66BkをコードするcDNAクローンの存在に関してプライマー対161／144を用いてPCRにより解析した。4個の陽性クローンを同定し、cDNApCRth2-161/144をプローブとして用いてコロニーハイブリダイゼーションスクリーニングすることにより、pSV-T66Bkと名付けた1つを精製し、配列決定した。
【０１６１】
図10：
T66Bkキナーゼ遺伝子ファミリーの野生型メンバーの核酸配列および予想されるアミノ酸配列。
【０１６２】
a）野生型の同系交配マウス系統Balb/cの精巣RNAから、RT-PCRによりcDNA pCR.Balb-66kを単離した。オープンリーディングフレームの予想される開始コドンは、T66Bk遺伝子の翻訳開始よりさらに上流20アミノ酸残基の位置にあり、T66k-20において観察された状況と極めて類似している。ORFはT66k-20のものと長さが等しい。両遺伝子pCR.Balb-66kおよびT66k-20では、予想される翻訳開始コドンはKozak則にきっちりとは当てはまらないため、この翻訳開始コドンは効率よく使われてはいない可能性がある。したがって、この翻訳開始コドンあるいは次の3'に位置する翻訳開始コドンのいずれか、あるいは両方が用いられている可能性がある。
【０１６３】
b）野生型の同系交配マウス系統C3H/Nの精巣RNAから、プライマー161／220を用いてRT-PCRによりcDNA pCR.C3H-66kを単離した。T66BkのORFとは対照的に、この遺伝子のORFはC末端でより短く、433アミノ酸残基の予想されるタンパク質をもたらす。
【０１６４】
c）これは、129Sv野生型同系交配マウスのゲノムに由来するゲノムクローン断片pλ. 129-66kにコードされるORFの場合にも当てはまる。遺伝子T66Bkと比較してORFがこのように変わっていることの意味は不明である。しかし、ORFの長さおよび、それゆえ得られるタンパク質配列がタンパク質の性質に影響し得ると仮定されている。
【０１６５】
図11：
遺伝子T66Bkの予想されるプロモーターの核酸配列。コスミドcat.15のBamHI断片B9.1には、T66Bk-2のタンパク質コーディング領域（図2および7参照）も、T66Bkの予想される転写開始部位および上流領域も含まれている。ここに示す3641 bpの配列は、図7に示すT66Bk-2配列の3'に位置する、T66Bk-2のイントロンおよび3'非翻訳エキソンを示しており、続いてT66Bkの上流領域および予想される第一エキソンがある。スプライスドナー／アクセプター部位は、アステリスク（*）で示してある。エキソン配列に下線を引いてある。示してある、下線を引いたT66Bkのエキソン配列は、cDNA pSV-T66Bkに含まれる配列を表しているが、T66Bkの転写開始部位はさらに上流に位置している可能性がある。2つのコンセンサスなTATAボックスを太字で示し、下線を引いてある。T66Bkの転写開始部位は決定されていないが、このTATAボックスのうちのいずれかの3'に位置しているとみられる。両方のTATAボックスがTATA結合タンパク質複合体の結合に選択的に用いられているということも排除できない。tg5の構築に用いた予想されるプロモーター断片を単離するために用いた、KpnIおよびPmaIIに対する制限部位を、太字で示す。この配列には、既知の転写因子に関する多数の可能性のある的結合部位が含まれる（Faisst and Meyer 1992）。しかし、それらのうちのいずれも機能することが示されていないため、図では省いた。その位置はMacMolly's Interpret program（Softgene, Berlin）などの配列解析ソフトウエアによって容易に同定することができる。組織および段階特異的な転写の制御を確実にする制御エレメントが、転写開始部位のすぐ上流にしばしば位置しているが、第一エキソン、イントロンあるいはずっと上流または下流にも位置している可能性がある。ここに示す配列がすべてのシス制御エレメントを含んでいるか、あるいは精子形成の間のT66Bkの特異的な発現に必要なサブセットのみを含んでいるかは分からない。エキソン1にほとんど含まれるT66Bkの長い5'非翻訳領域が翻訳の開始および／または効率の制御に機能し得るということも考えられる。
【０１６６】
方法：
BamHI断片B9.1のクローニングおよび配列決定は、図の説明文7に記載の通りに行った。
【０１６７】
図12：
導入遺伝子tg4およびtg5は精子形成の間に発現する。
【０１６８】
オスのキャリアーからその子孫へのトランスミッションの歪みを示す導入遺伝子tg4およびtg5が精巣で発現していることを確認するために、導入遺伝子特異的なプライマー対を用いてRT-PCR解析を行った。tg4に関しては、MARK-およびrsk3相同性領域の間の接合点断片を増幅するプライマー対309／310を用いた。tg5に関しては、プライマー対313／314はhCD24からポリアデニル化シグナル配列までの3'末端を増幅する。精子細胞成熟の過程にあると予想される、精巣の様々な出産後段階を解析した。mRNAを逆転写の前にDNAseI処理し、この溶液のうちの1 μlをPCRで増幅した（+ DNAseI/- RT）。残ったものの逆転写後、このうちの1 μlを平行して増幅した。プライマー対309／310を用いて分析した対照である39 days p.p.の段階のtg5-43を除き、313／314を用いてtg5-43を分析した。
【０１６９】
対照反応のうちのいずれもPCR産物を示さなかったのに対し、逆転写にかけたすべての試料ではPCR後に期待される断片が得られた。これは、オスのキャリアーの精巣におけるtg4およびtg5の発現をそれぞれ証明している。しかし、発現は、図3に示すc-kitおよびT66Bkの解析から期待されるよりも早くに起こっている。これは、導入遺伝子の基底状態の転写を検出し得るRT-PCRアッセイの感度のためか、あるいは構築物に用いたプロモーター断片によりもたらされるあるいは挿入部位の影響によりもたらされる、導入遺伝子発現の不適切な調節のためであり得る。一方、tg4-3およびtg5-43を有する39 day p.p.の成体のオスは、より強い断片を示したが、これは成熟の間あるいはメスとの交配後に導入遺伝子発現が上昇することを示唆している。略語：ad、成体オス（交配した）；M、マーカー（1 kbラダー（Gibco/BRL））。
【０１７０】
方法：
以下の例外を除き、本質的には図の説明文3に記載の通りにRT-PCRを行った。逆転写酵素を添加する前に、1μl のDNAseI（RNAseを含まない、10units／μl）を反応液に加え、反応液を37℃で20分間インキュベートした。1μlの反応液を取って氷上に置き、残りに1μlのSuperscriptII Reverse Transcriptase（200 units／μl、Gibco/BRL）を添加し、反応液をさらに20分間、それぞれ37℃および55℃でインキュベートした。すべてのPCR反応は、同じPCRストック溶液に1 μlの対照反応液（+DNAseI/- RT）あるいは試験反応液（+ DNAseI/+ RT）のいずれかを添加してセットアップした。プライマー対309／310を用いたPCRを、表1の説明文に記載の通りに行った。同じ条件を、プライマー対313：5'-ATGGGCAGAGCAATGGT-3'および314：5'-CAGGTTCAGGGGGAGGT-3'に対して用いた。
【０１７１】
図13：
T66Bkは、マウスrsk3のN末端ポリペプチドをコードする第二のORFを含む。
【０１７２】
図は、rsk3相同性領域によってコードされるORFを強調してpSV-T66BkのcDNA配列を示したものである。MARK相同性領域の予想される翻訳開始および終止コドンも、rsk3相同性領域の2つの可能性のある翻訳開始コドンも、下線を引いてある。示したアミノ酸配列は、MARK関連キナーゼの終止コドンの3'かつスプライス部位の5'に位置する、*で示すATGコドンから始まる。別の可能性のある翻訳開始コドンが、rsk3相同性領域内に位置している。ありそうもないが、このORFが翻訳される2つの可能性がある。第一は、リボソームがMARK関連キナーゼの翻訳を完結した後にmRNAから離れず、次のORGから翻訳を再開するかもしれないということである。第二は、選択的スプライシングがMARK関連キナーゼをコードするエキソンをスキップするかもしれないということである。これは、位置2107-2109のATGが最初の可能性のある翻訳開始部位であるような転写物をもたらすだろう。後者は、そのような転写物が存在することを明らかにしている図4ｂに示す部分cDNA配列ptlib0.7において観察された場合である。しかし、t-ハプロタイプth2あるいはth49を有するオスではそれらは観察されず、完全t-ハプロタイプにのみ観察され、これはそれらがt-レスポンダーを有する領域の外側に位置する遺伝子に由来するということを示唆している。
【０１７３】
実施例は、本発明を例証する。
【０１７４】
【実施例】
実施例1：t複合レスポンダーに関する新規候補遺伝子のクローニング
T66B領域に由来するコスミドクローンを単離し、T66B内におけるそのゲノム位置をRFLPマッピングにより確認した（図1）。特に、コスミドct.184とcat.15のオーバーラップ部分内に含まれる断片pAK34は、完全t-ハプロタイプにおける3つのゲノムBamHI断片にハイブリダイズし、そのうちの１つ、5.5kb断片は、T66B領域内に位置する（Kispert 1990）。コスミドct.184およびcat.15は、プローブpAK34にハイブリダイズする5.5kb BamHI断片を含んでおり、したがって、それらがT66B領域に由来することを確実にしている。同様に、本明細書中に記載するcDNAに由来するPCR断片161／170は、コスミドcat.15に含まれるBamHI断片B9.1およびB7.8にハイブリダイズするが、両者共にT66B領域にマップすることができる（図1および2）。
【０１７５】
T66B領域から単離されたこのコスミドクラスター内に含まれる、少なくとも60kbのゲノム領域に広がる遺伝子を同定した。この遺伝子は、t-ハプロタイプの3コピー、それぞれ領域T66A、T66BおよびT66Cに１つ、に相当する。その野生型は、pp90リボソームS6キナーゼファミリー（Kisper 1990ではTckと呼ばれる）のキナーゼである、ヒトrsk3（Zhao et al. 1995）のマウス相同体をコードする。T66B領域に位置する遺伝子コピーは、野生型と比較して変化している（Kispert 1990）。5'末端はコスミドcat.15中に含まれておらず、もう1つのエキソンが見つからない。もう１つのエキソンが見つからないという事実は、部分および完全t-ハプロタイプおよび野生型に由来する精巣RNAの、プライマー対145／146を用いたRT-PCRによって検出された。予想された769bpの断片に加えて、より小さな断片が、T66B領域を含むt-ハプロタイプでは得られたが、T66Aのみを含むものにおいても野生型においても得られなかった（図3a）。これは、rsk3のT66B遺伝子コピーが精巣に発現していることの証拠となった。この遺伝子の5'配列を同定するために、tw5/tw12オスのマウスの精巣のmRNAからcDNAライブラリーを構築した。驚いたことに、スクリーニングした総計およそ580000個のcDNAクローンから2つのクローンが単離されたが、それらは野生型rsk3（Kispert 1990）の塩基438の5'に異種の配列を含んでいる。これらのクローンのうちの1つの部分配列を、図4bに示す。ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）増幅のためのプライマーは、フォワードプライマー（161）が新規配列内にあるこのcDNAの5'末端に位置し、リバースプライマー（144）がrsk3配列内に位置するように設計した。部分t-ハプロタイプth2およびth49のRNAから調製した精巣cDNAのPCR増幅により、2.1kbの断片が得られたが、th44、th51、tJr1あるいはBALB/c（野生型）のcDNAにはどんなバンドも検出されなかった。断片（pCRth2-161/144）をth2から単離し、クローニングして配列決定した（図4a）。それは、T66B領域内に位置するさらに別の新規遺伝子を含んでいる（以下参照）。
【０１７６】
pCRth2-161/144の配列に基づいて設計したプライマー対（181／144）により、th2、th49、tw5およびt6の精巣には含まれるが、th44、th51、tJr1あるいはBALB/c（野生型）の精巣には含まれない、精巣に発現する遺伝子のcDNA断片の増幅が可能である（図3a）。それゆえ、対応する転写産物はt特異的で、T66B領域にマップされる遺伝子に由来する。マウスrsk3に関するプライマー対145／146を用いたRT-PCRにより、第一鎖cDNA合成の質も確認された。PCRによるcDNAマッピングは、サザンブロットハイブリダイゼーションによるゲノム位置決定（図1および2参照）を確認している。
【０１７７】
実施例2：t複合レスポンダー候補遺伝子は新規キナーゼをコードする
2.1 kb cDNA断片pCRth2-161/144の配列には、484アミノ酸残基のタンパク質をコードする単一のオープンリーディングフレーム（ORF）が含まれている（図4a）。最初の可能性のある翻訳開始コドン（塩基337-339）の上流にあるいくつかの”読み枠にあった”終止コドンにより、予想されるタンパク質のN末端は完全であると示唆される。翻訳終止（塩基1789-1791）もやはり”非rsk3”配列の中に位置しており、融合転写産物のrsk3配列は塩基1837から始まる。
【０１７８】
タンパク質配列データベースによる配列比較により、ORF中にいくつかの既知のモチーフが明らかになったが、最も重要なのはタンパク質キナーゼドメインおよびコンセンサスなタンパク質チロシンキナーゼ活性化部位である。しかし、保存された残基のパターンは、セリン／スレオニンキナーゼのコンセンサスとより強く関連しており、単離された遺伝子が新規のセリン／スレオニンキナーゼをコードしていることを示唆する。しかし、in vivoにおける特異性は実験によって決定されなければならないままである。本発明にしたがい、この遺伝子をT66Bkと呼ぶ。既知のキナーゼに対する最良のマッチは、細胞骨格の調節に関わる（Drewes et al. 1997）、最近公表されたセリン／スレオニンキナーゼであるMARKに対して見出された。MARK2との同一性はアミノ酸レベルで25％以上であり、予想されるキナーゼドメイン内ではおよそ38％である。予想されるタンパク質には、カゼインキナーゼIIに対する8つの可能性のあるリン酸化部位、タンパク質キナーゼCに対するもの5つ、および5つの可能性のあるミリスチル化部位が含まれている。
【０１７９】
上に説明したデータは、T66Bk-rsk3融合遺伝子が、両者ともキナーゼに由来する2つの遺伝子部分の融合をもたらす再構成によって生じたということを示唆している。恐らく転写制御エレメントを含む5'領域は、MARK関連キナーゼに由来する。その3'末端は、マウスrsk3遺伝子に由来し、その配列のほとんどを含んでいる可能性があり、また恐らくそのポリ（A）付加シグナルはおよそ5kbの長さであり得る。図2に示すサザンブロットハイブリダイゼーションのデータにより、このゲノムがMARK関連キナーゼのいくつかの遺伝子ファミリーメンバーを含み得るということが示唆される。
【０１８０】
実施例3：T66Bk遺伝子ファミリーメンバーに由来する転写産物は精子形成の間に蓄積する
ノーザンブロットハイブリダイゼーションアッセイでは、T66Bk関連遺伝子に由来する転写産物が、cDNA断片pCRth2-161/170をプローブとして用い、出産後（p.p.）22日あるいはそれ以降のオスのt6/+精巣に検出することができる。およそ2.8kbおよび3.2kbの2つの転写産物が、tOr/ t6およびtOr/ tw5精巣RNAに認めることができる。BALB/c（野生型）の精巣RNAでは低い方のバンドのみがはっきりと検出することができる。この違いは、例えば、t-ハプロタイプおよび野生型あるいは様々な野生型系統を区別するような遺伝子変異体の異なるスプライシングあるいは異なる配列に起因し得る。T66Bk-rsk3融合遺伝子の予想された転写産物サイズはおよそ7kbであるため、観察されたRNAバンドのうちの１つをT66Bk-rsk3融合遺伝子と対応付けるのは不可能である。ノーザン解析により、卵巣、肝臓、脾臓、腎臓、肺あるいは心臓から単離したRNAにはいかなる転写産物も検出されなかったため、T66Bk遺伝子ファミリーのメンバーは極めて特異的に発現しており、精巣に限局されている可能性さえあるということが示された。
【０１８１】
プライマー対155／170を用いた精巣RNAのRT-PCR解析では、転写産物は分析した精子形成の最も早い段階であるday7 p.p.に早くも検出可能である（図3a）。これは、１つあるいはいくつかのT66Bk関連キナーゼ遺伝子の低レベルの転写は精子形成の早期に起こるが、ノーザン解析により検出可能な高レベルの転写は精子完成の間に起こるということを示唆している。
【０１８２】
この解釈と一致して、T66Bk-rsk3融合遺伝子の極めて低い（基底状態の）レベルの転写が、段階7、14および20 days p.p.の時点でRT-PCRにより検出可能であるが、より高いれｂれうは段階22 d.p.p.以降にのみ認めることができる（図3a）。これは、T66Bk-rsk3融合遺伝子が、おおよそ伸長中の精子細胞が現れる段階において正に制御されているということを示唆している（以下参照）。
【０１８３】
精子形成の間のT66Bk-rsk3融合遺伝子の発現の開始のステージングを可能にするために、遺伝子マウスプロタミン1（mP1）、アンジオテンシン変換酵素（ACE）およびc-kitを解析した（図3b）。mP1は円形の精子細胞に初めて発現することが報告されており（Peschon et al. 1987）、ACE（Howard et al. 1990）およびc-kit（Rossi etal. 1992）の精巣特異的プロモーターは、それぞれ定義されていない段階および段階IX-XIの伸長中の精子細胞において初めて活性化される。全3つのプロモーターの解析を、トランスジェニック動物を用いて成し遂げた（Langford et al. 1991; Albanesi et al. 1996; Perxhon et al. 1987）。ここに示すRT-PCR解析では、mP1転写産物は早くもday 14p.p.に検出されたが、強いバンドはday 18p.p.に現れた。Rugh（1990）によれば、精子細胞はオスの子犬ではday p.p.に現れる。ACEおよびc-kitに精巣転写産物は20 days p.p.では弱く検出可能だったが、T66Bk-rsk3融合遺伝子のバンド181／144と比較できるほどのシグナルは、22 days p.p.に初めて現れた。ACEのより早い発現がday7および14 p.p.の精子において検出された。したがって、RT-PCRデータは、ACEおよびc-kitが伸長中の精子細胞に発現することを示している公表されているデータと一致している。これは、精巣におけるT66Bk-rsk3融合遺伝子の発現は、伸長中の精子細胞においてc-kitおよびACEとほぼ同じ時期かあるいはそれよりも若干遅くに上昇するということ、およびT66Bk-rsk3融合遺伝子のプロモーターは精子形成の間にT66Bk-rsk3融合遺伝子を含まない精母細胞にT66Bk-rsk3融合遺伝子産物が分布することを除外するために十分遅く活性になる可能性があり（Willison and Ashworth 1987）、したがって、R機能にとって重要な特徴を満たしているということを示唆している。低レベルの発現はday 7および14 p.p.において見出されたが、day 18 p.p.の精巣には見出されず、この転写産物が減数分裂の終結によって分解し得ることを示唆している。
【０１８４】
実施例4：T66B関連遺伝子は進化の間に保存されている
T66Bk関連キナーゼの予想される相同体が、他の種にも存在する（図6）。プローブとしてcDNA断片191／144を用いた厳しさを下げたサザンブロットハイブリダイゼーションアッセイにより、ハムスター、ウサギ、ブタ、ニワトリおよびヒトにおいて交差ハイブリダイズする断片が明らかになった。これは、T66Bk関連遺伝子が他のほ乳類においても鳥類においても保存されていることを示唆している。
【０１８５】
実施例5：マウスT/t複合体はT66Bk遺伝子ファミリーのいくつかのメンバーをコードする
プローブpCRth2-161/170を用いたコスミドcat.15のサザンブロットハイブリダイゼーションでは、3つのハイブリダイズするBamHI断片、B7.8、B9.1および6.1 kb BamHI断片が検出される（図2参照）。これらのゲノムDNA断片の一部分をコードするT66Bkあるいは関連遺伝子の配列決定により、BamHI断片B7.8およびB9.1のそれぞれは、それぞれT66BkおよびT66Bk遺伝子ファミリーの他のメンバーをコードする大きなオープンリーディングフレームを含むことが明らかになった。セントロメアから最も遠いBamHI断片（B7.8）は、T66Bk ORFを含む（図1および4a）。その転写される部分（エキソン）は、cDNA pCRth2-161/144に含まれる対応するエキソンとは、恐らくtハプロタイプth2と、コスミドcat.15が由来するtw12の間の対立遺伝子変異による、一アミノ酸置換（ProからLeu）をもたらす一塩基点突然変異（塩基1490 CからT）がある点で異なる。
【０１８６】
次にセントロメアに近いBamHI断片（B9.1）は、T66Bkの5'非翻訳配列および最もあり得るのはそのプロモーターを、およびそのさらに上流、本明細書中ではT66Bk-2と呼ぶT66Bk遺伝子ファミリーの別のメンバーのORFをコードするエキソンおよび3'非翻訳エキソンを含んでいる。しかし、この場合、3'非翻訳エキソンはrsk3とは関連していない。大きなORFをコードするT66Bk-2のエキソン配列を図7aに示す。それは、多数の位置でT66BkのORFとは異なっているが、それにも関わらず、T66Bkに極めて密接に関連している。t6/+精巣cDNAパネルでは、T66Bk-2の発現は22 days p.p.に初めて検出される。かなり高い発現は24 days p.p.以降に観察される（図8）。
【０１８７】
マウスゲノムには、いくつかのT66Bk遺伝子ファミリーのさらなる遺伝子座が含まれており、そのうちのいくつかは、T66Bから遠位のT/t複合体の領域、恐らくT66Cに位置している。これは、部分t-ハプロタイプを有するマウスあるいは野生型のマウスのゲノムに含まれる、pCRth2-161/170にハイブリダイズするいくつかのBamHI断片が上に記載したものの他に観察されることに基づいている。これらのBamHI断片のうちのいくつかは、多型でありt-ハプロタイプに特異的だが、部分的t-ハプロタイプth44、tJr1、tlowH、th2あるいはth49にも、野生型にも存在しない（図2参照）。それゆえ、それらはT66Bから遠位のT/t複合体領域に含まれているはずである。T66B領域に含まれないT66Bk遺伝子ファミリーのメンバーのコーディング配列を得るために、T66Bk遺伝子に由来するプローブpCRtw5-155/170を用いたハイブリダイゼーションにより、遺伝子型tw5/tw12のオスのマウスから構築した精巣cDNAライブラリーから、いくつかのcDNAクローンを単離した。いくつかのcDNAクローンを単離した。それら全てはT66BkあるいはT66Bk-2と高い配列類似性を有している。
【０１８８】
それらのうちの１つ、T66k-8（図7b）は、タンパク質キナーゼドメインのC末端のORFに変異をもたらす一塩基欠失を含むことを除き、両遺伝子に関して入手可能な配列に関してはT66Bk-2と配列においてほとんど一致している。T66k-8からT66Bk-2への高い配列保存から、T66k-8がT66Bk-2遺伝子座に由来するということはあり得ないことではないとみられる。しかし、一塩基置換が、RNA転写、プロセシング、逆転写の誤りによるのか、あるいは他のメカニズムによるのか、どのようにこのcDNAクローンに導入されたかは明らかではない。例えば、ORFを改変し得るようなヌクレオチド配列の変化をもたらす、RNA編集が下等および高等真核生物において生じ得ることが示されている。現時点では、観察された改変の原因としてそのようなメカニズムを排除することはできない。T66k-8が重複されたT66bk-2遺伝子座に由来するということも排除できない。あるいは、T66k-8はT66Bk-2のtw5対立遺伝子座に由来し得る。別のcDNAも、T66k-8と同様の位置に一塩基欠失を含むことが見出された。対応する遺伝子のゲノム位置は決定されていない。どちらの遺伝子産物のC末端尾部について予想される改変も、そのタンパク質キナーゼ活性の制御および/またはレベルおよび/またはそのタンパク質の細胞内での局在の変化をもたらすと予想されるだろう。
【０１８９】
やはりこのcDNAライブラリーから単離された別のcDNAクローンであるT66k-7as（図7c）は、極めて興味をそそる配列および構造を有している。それには、単一の長いORFを含むエキソンの両側に由来するイントロン配列およびさらに下流に由来する別の配列を含め、プラスミドcDNAベクターにアンチセンスの向きで挿入されている、T66Bk/T66Bk-2に強く関連する配列が含まれる。それゆえ、T66k-7asは、T66Bkファミリー遺伝子のアンチセンス転写産物に由来するはずである。予想されるT66k-7as転写産物には長いORFは含まれていない。T66Bk/T66Bk-2のORFをコードするエキソンの5'のイントロン配列は、アンチセンス方向で極めてA/Tに富んでおり、このアンチセンス転写産物の合成の間に転写終結およびポリアデニル化シグナルとして働くかのようである。T66k-7asの5'末端と配列が関連している、cat.15のBamHI断片B9.1に含まれる配列は、T66Bkのプロモーターの近位にマップされ、これはT66Bkのプロモーター領域がT66BkセンスRNAの転写を、T66Bk-2アンチセンスRNAの転写と同様にシスで制御するエレメントを含み得るということを示唆している。もしそれが事実であるならば、アンチセンス転写は同じシス制御エレメントによってなされ、それゆえセンスRNAと同じ段階で起こり得る。これまでに、T66B領域の遺伝子座に由来するいかなるアンチセンス転写産物も同定されいない。それにも関わらず、T66Bk-7asの構造および配列の、T66Bk-2/T66Bkの頭から先までの配置および配列との類似性は、T66B領域のT66Bk-2遺伝子がアンチセンス方向で転写され得るということを示唆している。加えて、アンチセンス方向に転写され、cDNA T66k-7asをもたらし、T66B領域内に位置し得るような別のT66Bk-2遺伝子座が存在するはずである。
【０１９０】
T66Bk遺伝子ファミリーのメンバーから転写されたmRNAに相補的なアンチセンス転写産物の発現が、その遺伝子ファミリーに由来する機能する遺伝子産物のレベルを減少させるのによく適合しているだろうということは明らかである。これは精子に2つの方法で影響し得る。アンチセンス転写産物が、t-レスポンダーを有するものおよびそれを持たない両方の種類の精子細胞に作用するなら、T66Bkファミリー遺伝子産物のより高い活性により、前者はアンチセンス転写産物の負の作用から保護され得るが、後者は保護されない。その代わりの、よりあり得そうな方法では、アンチセンスRNA転写産物が前者の精子細胞に限定され、より低い発現のT66Bk遺伝子産物がそれらに発現している。これは、前者を高次形態的なディストーター遺伝子産物の負の作用から保護するであろうが、後者はそれらによって”だめにされる”だろう。この”だめにすること”はレスポンダー/ディストーターシグナルカスケードの過活性化に起因するだろう。
【０１９１】
T66Bkファミリーメンバーに由来するアンチセンスRNAは、ディストーターの負の影響を和らげると期待され、そのようにしてトランスミッション比の歪み現象に寄与すると考えられる。
【０１９２】
tw5/tw12精巣cDNAライブラリーから単離された別のcDNAクローンであるT66k-20は、T66Bk遺伝子ファミリーのさらに別のメンバーである（図7d）。そのORFは、アミノ酸残基の数、とりわけT66BkおよびT66Bk-2のものよりも20残基長いN末端において、T66BkおよびT66Bk-2と異なる（図7e）。最もあり得るのは、T66k-20がT66A領域に位置する遺伝子に由来し、それゆえ野生型のレスポンダー活性を提供し得るということである。
【０１９３】
Lyon（1984）によるth51th18とヘテロ接合なtlowHあるいはtlow3Hのトランスミッション比の解析は、tlowHとtlow3Hのトランスミッション比の間の強い違いを示した。加えて、どちらのt-ハプロタイプも野生型の染色体とヘテロ接合な、完全t-ハプロタイプの高値には達しなかった。これらのデータは、t-レスポンダー機能にいくつかの遺伝子座が関わっていることを示唆している。現在の解析レベルでは、T66Bk、T66Bk-2、T66k-8、T66K-20およびT66k-7asは、t-レスポンダー機能に協同して寄与し得ると推測される。
【０１９４】
tw5/tw12ハプロタイプを有するオスのRNAから調製した精巣cDNAライブラリーは、T66Bk遺伝子に由来するcDNAクローンを含んでいなかった。それゆえ、ハプロタイプt6/tw5を有するオスのRNAから別の精巣cDNAライブラリーを構築した。プライマー対161/144を用いたPCR増幅から予想されるサイズの断片を含む4つのクローンを同定し、そのうちの１つを精製して配列決定した（図9）。配列は、オーバーラップする領域ではcDNA pCRth2-161/144のものと一致し、それを5'末端でも3'末端でも伸長させたものである。T66B領域内のrsk3遺伝子座のイントロン内で配列が終わっており、コンセンサスなポリアデニル化シグナルを全くもたないということは何の意味も持たず、そのcDNAが適切にプロセッシングされたmRNA分子に由来するのではなく、完全にスプライスされておらずdAに富んだイントロン配列を含み得る、おそらくまれな転写産物に由来するということを示唆している。この知見は、T66Bk遺伝子転写産物にはコーディング領域のbp 438から3'末端まで、T66B中に完全なrsk3遺伝子座が含まれている可能性を開いたままにしている。
【０１９５】
t-ハプロタイプにコードされるT66Bkファミリーメンバーに加えて、野生型同系交配系統であるBalb/c、C3H/Nおよび129/Svに由来するさらに3つのファミリーメンバーを、RT-PCRによってあるいはゲノムクローン上に単離した（図10）。やはり、t-ハプロタイプファミリーメンバーとの高い配列保存が観察された。遺伝子pCR.Balb-66kは遺伝子T66k-20と同じ特徴、すなわち、さらに20アミノ酸残基をコードするのにT66Bkに用いられているものの上流の、可能性のある翻訳開始コドンを有している。しかし、ATGコドンの-3上流の位置にAまたはGを必要とするKozak則を満たしていないため、この翻訳開始が効率的に用いられているかは明らかではない。
【０１９６】
対照的に、遺伝子pCR.C3H-66kおよびpλ. 129-66kは、そのC末端で他の全てのT66Bkファミリーメンバーとは有意に異なっている。両遺伝子とも、わずか433アミノ酸残基の短縮されたタンパク質をもたらすトリプレット位置434の翻訳終止コドンを含んでいるが、残りの核酸配列は他のメンバーのものと有意に異なっているということはない。短縮は、キナーゼドメインの外側で起こっており、そのタンパク質がキナーゼとしてなお機能し得ることを示唆している。しかし、C末端の変異は、キナーゼ活性の制御および/またはレベルに影響し得る。このような状況では、C3H背景ではt-ハプロタイプは極めて高い比でトランスミットされるが、例えばt0などはBalb/c由来のT/t-複合体を有するオスから、遺伝子型t0/C3Hのオスから得られる比と比較してより低い比でトランスミットされる（Bennett et al. 1983）ということに注意するのは興味深い。129Sv背景も、C3Hと同様にt-ハプロタイプのトランスミッション比を高める（我々の観察）。pCR.C3H-66kおよびpλ. 129-66kにおける短くなったORFは、この挙動に影響している可能性がある。一方、他のT66Bkファミリーメンバーがコードする、T66Bkと同じ長さのタンパク質が、ここに示すものの他にこれらの系統に存在し得る。
【０１９７】
それゆえ、そして概して、関与する動物系統の遺伝的背景はトランスミッション比の歪みのレベルの点で表現型の発現に有意に寄与し得るということに注意すべきである。
【０１９８】
実施例6：T66Bkキナーゼをコードする導入遺伝子が導入されたオスにおけるトランスミッション比の歪み
レスポンダー表現型へのT66Bkの関与を証明するために、c-kitの精巣プロモーター（tg4-3;tg4-13）あるいはT66Bkの予想される内在性のプロモーター（図11）のいずれかの調節下に、トランスジェニックマウス（tg5-43;tg5-25）においてキナーゼ遺伝子T66Bk（図4a）を発現する導入遺伝子構築物を作製した。導入遺伝子の挿入のあるマウスを、t-ディストーターD1およびD2を発現するt-ハプロタイプth51-th18あるいは野生型の染色体C57BL6またはTtf/+tf（Lyon 1984）のいずれかを有するマウスと交配した。適切な遺伝子型のオスをNMRI異系交配メスと交配し、その子孫を導入遺伝子のキャリアーに関して分析した。Lyon（1984）の実験に基づいた予想は、もしT66Bkがトランスミッション比の歪みに関わるタンパク質をコードするならならば、遺伝子型+tlowH+/th51+th18の場合と同様に、t-ディストーターは導入遺伝子のトランスミッション比を増強するはずだが、野生型の染色体を有するオスでは導入遺伝子のトランスミッション比は低められているはずであるというものであった。表1は、これまでに得られたデータを示す。興味深いことに、導入遺伝子挿入のうちの１つ（tg4-3）は、オスでのみ観察されるため、Y染色体に生じたはずである。この場合は子孫を出生後に外面的な性別の特徴について調べ、他の導入遺伝子の挿入は、PCR解析によって調べた。データは、導入遺伝子のトランスミッションの有意な歪みを示しており、T66Bkがt-レスポンダー活性をコードしていることが確認された。データは、特別な遺伝的特性、とりわけ性別に関して選別する交配戦略におけるT66Bk遺伝子の潜在能力をも示している。加えて、データは、レスポンダー表現型の達成における制御エレメントとしての両プロモーターの有用性を示している。
しかし、得られたトランスミッション歪み効果は、遺伝子型+tlowH+/th51+th18あるいは+tlowH+/++tf（Lyon 1984）において観察されたものよりも少なからず低い。これは、導入遺伝子構築物からのT66Bkキナーゼの発現レベルが適切でないということか、あるいは導入遺伝子を有する精子細胞における野生型のレスポンダー遺伝子座の発現がT66Bk遺伝子の効果を弱めているということのいずれかを示唆している。tlowH染色体が、トランスミッション比の歪みに対する最適な効果に関する性質によって選択された遺伝子座を持っているということを考慮に入れるべきである。Lyonの解析（1984）では、この染色体を有する精子は野生型の染色体あるいはt-ディストーターth51-th18のいずれかを有する精子と、恐らく野生型のレスポンダー遺伝子座と組合わさって、競合する。対照的に、導入遺伝子の挿入は染色体17の外側で起こる。それゆえ、導入遺伝子の発現は、他に野生型のレスポンダー遺伝子座を発現する精子において常に起こる。これらの精子は、野生型の染色体あるいはt-ディストーターth51-th18のいずれかを有する精子と、恐らく野生型のレスポンダー遺伝子座と組合わさって競合する。導入遺伝子から発現されたT66Bkと、野生型のレスポンダー遺伝子座由来の発現産物の組み合わせは、tlowHt-ハプロタイプにおいて、T66Bk遺伝子ファミリーのメンバー、特にT66BkおよびT66Bk-2により発現される産物の組み合わせほどには、トランスミッション比を歪めるのに効果的でない可能性がある。また、遺伝的背景は様々なt-ハプロタイプによって達成されるトランスミッションの比の歪みに対してかなりの効果を有するということが証明された（Bennett et al., 1983）。T66Bk遺伝子の発現レベルおよび/または活性は、より強いトランスミッション比歪み効果を得るために将来の実験において最適化されなければならないということは極めて明らかである。
【０１９９】
また、導入遺伝子の発現のために用いる、転写効率、転写プロセシングおよび安定性および翻訳効率を制御するエレメントといった、発現レベルに影響する制御エレメントは、最大の効果を達成するために最適化されなければならない。おそらくはその5'非翻訳領域、第一イントロンおよび3'非翻訳領域を含め、T66k-20の発現を制御するものなど、組織および段階特異的なプロモーターを選択する事は簡便であろう。あるいは、対応するmRNAの安定性を増すことが知られている3'非翻訳領域を用い得た。T66k-20に由来する転写産物は、tw5/tw12を有するマウスのRNAから構築した精巣cDNAライブラリーから単離されたcDNAにおいて、高い比率でrepresentされているが、対照的にT66Bkに由来するcDNAは見出されず、T66Bk-2に由来するcDNAは非常にunderrepresentされていたということに我々は気づいており、これはT66k-20の転写レベルは先の遺伝子座のものよりも少なからず高いということを示唆している。
【０２００】
しかし、T66Bk関連遺伝子の増幅はトランスミッション比の歪みが進化していない飼育動物においても起こったため、遺伝的性質、とりわけ性別のトランスミッションの歪みに関するこのシステムを飼育動物に移すことは、大きな苦労無しには達成できない可能性がある。それゆえ、T66Bkは飼育動物に導入した場合に、トランスミッション比に対してより強い影響を有し得る。ここに示したデータは、選択的にあるいは限定的にさえ、同じ性別、例えばメスのみあるいはほとんどメスの子孫の父親になる飼育動物を作出する見通しを開く。
【０２０１】
実施例7：T66Bkキナーゼ遺伝子ファミリーの野生型のメンバーのクローニング
プライマー対161/220を用いたRT-PCRにより、それぞれ同系交配系統Balb/cおよびC3H/Nの精巣RNAからcDNA pCR.Balb-66kおよびpCR.C3H-66kを単離し、プラスミドベクターpCR2.1（Invitrogen）にクローニングし、図の説明文3および4に記載の方法を用いて解析した。PCRにおける伸長過程は、72℃で2分間行った。pλ. 129-66kの配列は、T66BkのcDNA断片をプローブとして用いてラムダ-FixIIゲノムライブラリーから単離したラムダ-FixIIクローンから作製した、pBluescriptKS中のEcoRIサブクローンに由来する。ラムダライブラリーは、ラムダクローニングおよびパッケージングキット（Stratagene）の供給者の使用説明書にしたがい、ES細胞株R1（Nagy et al. 1993）のゲノムDNAから構築した。ライブラリー構築、プレーティングおよびハイブリダイゼーションによるスクリーニングは、標準的な手法（Sambrook et al. 1989）にしたがったもので、図の説明文2、3および4に記載の方法である。
【０２０２】
プライマー配列：
ACE
5' GC CAA CCA GGG GAT A 3'; 5' CT GTC CGG TCA TAC TCT T 3'
c-kit
5' CTT GTG TCC TTG GGA GAA 3'; 5' GGT GCC ATC CAC TTC AC 3'
mP1
5' CGC AGC AAA AGC AGG AGC AG 3'; 5' CAT CGG ACG GTG GCA TTT TT 3'
マウスrsk3
144: 5' TGC TCA AGC CAA AAT  CTG TG 3'
145: 5' ATG GCC TGG GGA TCA TCT AC 3'
146: 5' CAC CGC TTG CAC ACT GAG TA 3'
cDNA pCRth2-161/144
155: 5' ATC GAT GTG TGG GGT CTT 3'
161: 5' GTT TGG GAG GAG CTT GTG 3'
170: 5' CTA GTC CAG CCC TTG ATG 3'
181: 5' TGG CAT CTT ATT GTC TAC 3'
191: 5' CCA AGC CCC TTT TTC TGA 3'
pSV-Sport1
seq5lib: 5' ATTTAGGTGACACTATAGAAGGTA 3'
オリゴヌクレオチド配列：
232:  5' CCC CCT TTA TCT GAC 3'
237:  5' TAT GCT GGC AGC ATC AAA 3'
【０２０３】
【表１】
0004749541.tif 000002
【０２０４】
表1：
キナーゼ遺伝子T66Bkをコードする導入遺伝子を有するマウスにおけるトランスミッション比の歪み。
【０２０５】
T66Bkのタンパク質コーディング領域を含む、2つの導入遺伝子構築物tg4およびtg5をin vitroで構築し、遺伝子型（(c57BL/6 X C3H/N)F1 X C57BL/6）メス X NMRIオスの受精卵の前核へDNAのインジェクトすること、およびNMRI仮母親に接合体あるいは2細胞期の胚を再移入することにより生殖細胞系列に導入した。どちらかの導入遺伝子のオスあるいはメスのキャリアーを、単一のt-ハプロタイプ染色体（th51-th18）上にTtf、+tfあるいはC57BL6に関してt-ディストーターD1およびD2の両方、あるいは野生型の遺伝子型Ttf/+tfまたはC57BL/C57BLのいずれかをを有するマウスと交配した。適切な遺伝子型を有するオスをPCR解析により同定し、NMRI異系交配メスとの試験交配に進めた。ほとんどの場合において、後期胚段階を導入遺伝子の存在または非存在に関して個々の子孫を分析するためのDNAの供給源として用い、残りはDNA供給源として尾片を用いて分析した。17番染色体のマーカー遺伝子座を、DNA溶液の質を検査するために平行して分析した。系列4-3の導入遺伝子tg4は、Y染色体と共に分離し、tg4がY染色体に挿入されていることを示唆している。それゆえ、この場合には、子孫はその出生後に外面的な性別の性質を用いて性別を調べた。交配データにより、tg4-3の場合には性別について、導入遺伝子の非メンデル遺伝が示されている。予想される50%からのずれは、t-ディストーター遺伝子座が存在するか存在しないかに依存しており、t-ハプロタイプレスポンダー遺伝子座Tcrから期待されるように、t-ディストーター遺伝子座の存在下では50%よりも有意に高く、非存在下では50%よりも低い。これは、T66Bkがt-レスポンダー活性をコードしているどいう知見を確実にする。
【０２０６】
方法：
tg4は、塩基45から塩基683のStyI部位までのc-kitの精巣プロモーター（Rossi et al. 1992; Albanesi et al. 1996）、cDNA th2-161/144およびrsk3のbp 438からbp998までを含むさらなるマウスrsk3配列（Kispert, 1990）、および内部リボソームエントリー部位IRES（Ghattas et al. 1991）を含むIRES-βgal-neoおよびβgal-neo融合遺伝子およびSV40ポリアデニル化シグナル（Friedrich and Soriano 1991）を含んでいる。手短に述べると、c-kitの精巣プロモーターは、プライマー対5'-ATGTAAGTGGCATGGAGT-3'および5'GCACACCGAAAATAAAA-3'を用いて精巣RNAからRT-PCRにより単離し、プラスミドベクターpCR2.1(Invitrogen)にクローニングした。5'末端のベクターのNotI部位からrsk3相同性領域内のBstEII部位までのcDNA th2-161/144を含むNotI-BstEII断片を、IRES-βgeo遺伝子の5'にBstEII部位からbp 998までのrsk3相同性領域を含むプラスミドIRES-βgeoのNotIおよびBstEII部位に連結した。NotI部位のちょうど3'にあるベクターpCR2.1のEcoRV部位を含む、得られた構築物の5'末端を、c-kitプロモーターのbp45からbp683を含むNotI-StyI（平滑；大腸菌DNAポリメラーゼIのKlenow断片を用いてStyI部位を平滑末端化した）断片の、構築物中のNotIおよびEcoRV部位へのライゲーションにより、ベクターpCR2.1にクローニングされたc-kitの精巣プロモーターを含むNotI-StyI断片と置き換えた。最終的な導入遺伝子構築物は、NotIおよびSalIによる切断によってベクターから切り出した。
【０２０７】
tg5は、T66Bkの5'非翻訳領域のほとんどの部分および予想されるプロモーター（図11）を含むT66Bkの予想転写開始部位の上流の2637 bpのゲノム領域（KpnIからPmII断片）、完全なタンパク質コーディング領域および翻訳の開始部位に構築されたHAタグを含む、HincII部位（bp293）からベクターpCR2.1のEcoRI部位までのcDNA th2-161/144、IRES配列およびヒトCD24（Kay et al. 1991）のコーディング領域、修飾したイントロンおよびSV40-tのポリアデニル化シグナル（Huang and Gorman 1990）を含む。tg5はいくつかの段階を経て構築した。初めに、ペプチド配列YPYDVPDYAをコードするHAタグをcDNA th2-161/144の翻訳開始に導入した。2番目に、T66Bkの予想されるプロモーターを2.6 kb KpnI（平滑）-PmII断片としてコスミドcat.15の ゲノムBamHI断片B9.1から単離子、HAタグ付加されたcDNA th2-161/144を含むベクターのEcoRVおよびHincII部位に連結した。EcoRV部位はベクターpCR2.1に由来し、HincII部位はcDNA th2-161/144の5'非翻訳領域内に含まれる。三番目の段階で、IRES配列およびhCD24コーディング領域をEcoRI-EagI（平滑化した）断片としてプラスミドpSLV-1から切り出し、修飾したイントロンおよびSV40-tのポリアデニル化シグナルをSnaBI-BamHI断片としてベクターpSV-Sport1（Gibco/BRL）から切り出し、インサートの3'末端に位置するベクター部位EcoRIおよびBamHIにて開いた、先の構築物中に両断片を一緒に連結させた。T66Bkの翻訳開始部位へのHAタグの構築は、以下のように行った。初めに、cDNA cDNA th2-161/144の2つの断片を、T66Bkの翻訳開始部位と読み枠があったペプチドYPYDVPDYAをコードするHAタグ配列をコードするオーバーラップする領域を作るような、それぞれプライマー5'-GGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTACATGTCAGAAAAAGG-3'および5'-ATGTACCCATACGACGTCCCAGACTACGCCATGGAGAAATTTCAT-3'を、それぞれ上流プライマー161または下流プライマー188（5'-ACCCTGGTTGTGGCAGTA-3'）と組み合わせて用いてPCRにより増幅した。PCRは、15サイクルを行い、50 ngの鋳型を加えたことを除き、図の説明文3に記載の通りに行った。次に、両断片をアガロースゲルから単離し、ともに第二のPCRで鋳型として用いた。最初の94℃30秒間、72℃2分間の15サイクルは、プライマーなしで行い、隣接するプライマー161および188を添加してさらに94℃30秒間、50℃30秒間、72℃30秒間を25サイクル行った。HAタグ配列を含む得られた断片をアガロースゲルから単離し、HincII-EcoNIで消化し、もとのcDNAクローンth2-161/144のHincII-EcoNI断片の位置に連結した。
【０２０８】
導入遺伝子のキャリアーに関する子孫の分析は、初めに個々の胚またはマウスの組織試料を可溶化バッファー（100 mM Tris-HCl pH8.5/5mM EDTA/0.2% SDS/200mM NaCl/200 μg/ml Proteinase K）中で一晩、55℃にて消化し、水で分注物を20倍に希釈し、80℃で30分間インキュベートすることによりProteinase Kを不活性化し、プライマー対309：5'-CAGCCCATGAATCCATC-3'および310：5'-TGCCTTCGGTCTGAAAG-3'およびサイクル条件94℃2分間、35サイクル94℃30秒間、50℃30秒間、72℃1分間を用いて図の説明文3に記載の通りに20 μlのPCR反応物のうちの1 μlをアッセイすることにより行った。マウスT/t-複合体の遠位領域の遺伝子座Hba-4psにおける遺伝子型を評価するための対照のPCR反応を、プライマー対Hb.1/Hb.2および公表（Schimenti and Hammer 1990）されているとおりの条件を用いて適切に行った。このPCR反応は、t-ディストーターD2を含む遠位t-ハプロタイプ領域th18の存在を分析することによっても評価した。同様に、t-ハプロタイプ領域th51における近位t-ディストーターの存在を、Tcp1遺伝子座のt-特異的断片の存在を分析することによって評価した。これは、プライマー対5'-AGGAAAGCTTGCCCAAGAGAATAGTTAATGC-3'および5'-AGGCGAATTCCATATCATCAATGCCACCAG-3'を用いてPCRにより行った。サイクル条件は、94℃40秒間、50℃40秒間、72℃40秒間を35サイクルであった。このマーカーにより、系統C57BL/6、NMRIおよびTtf/tfの対立遺伝子変異体間で区別することが可能になる。
【０２０９】
すべてのクローニング手順は、標準的な手法（Sambrook et al. 1989）にしたがって行い、トランスジェニックマウスの作出は、Methods in Enzymology, Vol. 225, Guides to Techniques in MouseDevelopment, 1993（ed. P. M. Wassarman and M.L. DePamphilis）に記載の方法にしたがって行った。t-ハプロタイプth51-th18を有するマウスは、Dr. M.F. Lyon（Harwell, England）より入手し、遺伝子型Ttf/+tfを持ったマウスは、Dr. K. Artzt（Austin, Texas）から贈与されたものであった。
【０２１０】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  （a）上のパネルは、マウスの17番染色体上の完全および部分的t-ハプロタイプのt-染色体領域の広がり（太いバー）を概略的に描いたもの、さらにマウスにおいてトランスミッション比の歪み現象（TRD）に寄与するレスポンダー（Rt）および2つのディストーター（D1、D2）のマッピング位置をも示す。
（b）コスミドcat.15のBamHI断片B9.1の解析により、別のT66Bk遺伝子ファミリーのメンバーであるT66Bk-2がB9.1のセントロメアに近い側に位置している一方で、テロメアに近い側にはT66Bk-rsk3融合遺伝子の予想されるプロモーターおよび第一エキソンが含まれていることが明らかになった。
【図２】  様々なt-ハプロタイプを有するマウス、あるいは野生型のマウス系統のゲノムDNAまたはコスミドDNAのサザンブロットハイブリダイゼーション。
【図３】  RT-PCR解析により、T66Bkがレスポンダー領域に位置決定され、精子形成の間に転写されることを確認する。
【図４】  a）予想される484アミノ酸残基のタンパク質をコードするT66Bk-rsk3融合遺伝子の部分CNDAを表すpCRth2-161/170の核酸配列およびアミノ酸配列。
b）マウスrsk3関連遺伝子の一部に融合したT66Bk関連遺伝子の5'末端に由来する断片からなるcDNA断片ptlib0.7の部分核酸配列。
【図５】  T66Bk遺伝子ファミリーのメンバーの転写を明らかにするノーザンブロットハイブリダイゼーション。
【図６】  プローブpCRth2-161/170を用いた、いくつかのほ乳類種およびニワトリに由来するDNAのサザンブロットハイブリダイゼーションにより、ハムスター、ウサギ、ブタ、ヒトおよびニワトリにT66Bk関連遺伝子が存在することが明らかになり、進化の間にこの遺伝子のクラスが保存されていることを示唆している。
【図７】  マウスゲノムには、T66Bk遺伝子ファミリーのいくつかのメンバーが含まれる。
【図８】  T66Bk-2遺伝子はT66B領域内に位置しており、精巣において22 day p.p.から発現している。
【図９】  T66Bk遺伝子をコードするcDNAの核酸配列およびアミノ酸配列。
【図１０】  T66Bkキナーゼ遺伝子ファミリーの野生型メンバーの核酸配列および予想されるアミノ酸配列。
【図１１】  遺伝子T66Bkの予想されるプロモーターの核酸配列。
【図１２】  導入遺伝子tg4およびtg5は精子形成の間に発現する。
【図１３】  T66Bkは、マウスrsk3のN末端ポリペプチドをコードする第二のORFを含む。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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