(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ストロンチウムイオン及び血清を含む培地を使用して培養した骨芽細胞によって形成された骨基質を定量する方法であって、形成された骨基質中に含まれるストロンチウムを検出する工程を含み、培地中の前記ストロンチウムイオン濃度が0.1μM〜1mMであり、培地中の前記血清濃度が培地に対し容量で0.5〜25%であることを特徴とする、方法。
【請求項２】
ストロンチウムイオンが放射性ストロンチウムイオン（８９Ｓｒ２＋）を含む、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、細胞あるいは細胞が形成する骨基質を標識するための培地、標識された細胞と形成された骨基質の定量方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
骨はハイドロキシアパタイトを主成分とする無機物とコラーゲンを中心とする有機物からできており、骨芽細胞による骨基質の形成と破骨細胞による骨組織の吸収を常に繰り返している。骨芽細胞はコラーゲンやオステオカルシン、オステオポンチンなどを合成し、同時にハイドロキシアパタイト結晶を形成する。ハイドロキシアパタイト結晶はコラーゲン繊維上に沈着し石灰化する。
【０００３】
骨芽細胞による骨基質の形成は体外においても観察される。すなわち何らかの方法によって分離された骨芽細胞を至適条件で培養することによって、in vitroでも石灰化を起こす。形成された骨基質は生体内で形成されるものと物理化学的な同じ性質であることが確認されている。
【０００４】
一方、再生医療技術の発展に伴い自己骨髄から培養して得られる細胞を用いて体外で骨基質を作り、体内へと戻す医療行為が行われている。人工関節や人工骨などの基材上で骨髄由来細胞を培養し骨芽細胞へと分化させ骨基質を形成させる。これを移植することで、早期に自家骨と結合し治癒を早めることができる。
【０００５】
in vitroで形成された骨基質を定量するためには、沈着したカルシウムの量を測定することや、骨基質特異的なタンパク質であるオステオカルシンを定量する方法が一般的である。しかし、カルシウム量を定量する方法は、培養皿上で細胞を培養している場合には非常に有効であるが、人工骨などの基材上で培養している場合には基材自体がカルシウムを主成分としているものが多いため実施不可能である。また、リン酸カルシウム系の材料はタンパク質を吸着する性質を持つものもあり、オステオカルシンの定量にも困難を伴う。
【０００６】
さらに、細胞を生体内に移植する細胞治療、移植治療において、移植細胞や骨組織が体内でどのような位置に分布・存在しているのかを非侵襲的に可視化して捉える技術は、骨組織、移植細胞の動態や分化過程、機能などを知る上で、重要である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、細胞あるいは細胞によって形成された骨基質を標識することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、骨芽細胞によって形成される骨基質のハイドロキシアパタイトのCa2+の位置に他のアルカリ土類金属元素を取り込ませ標識し、その元素を定量することによって新たに形成された骨基質の量を知るものである。骨基質に取り込まれるアルカリ土類金属元素の量は骨基質中のカルシウム量と相関関係にあるため、ストロンチウム又はバリウムを定量することによってカルシウムの量を推定することが可能である。
【０００９】
また、通常の細胞内のストロンチウムないしバリウム濃度は非常に低いため、幹細胞などの移植細胞をストロンチウム、特に放射性ストロンチウムにより標識することで、移植後の細胞の挙動を非侵襲的に可視化できることを本発明者は見出した。
【００１０】
本発明は、以下の培地、細胞、骨基質の定量法を提供するものである。
１．  骨基質もしくは細胞を標識するための培地であって、ストロンチウムイオンおよびバリウムイオンからなる群から選ばれる少なくとも１種のアルカリ土類金属イオンを含むことを特徴とする培地。
２．  血清をさらに含むことを特徴とする項１に記載の培地
３．  血清が0.1%から25%含まれることを特徴とする項２に記載の培地。
４．  アルカリ土類金属イオンがストロンチウムイオンである、項１〜３のいずれかに記載の培地。
５．  ストロンチウムイオンが放射性ストロンチウムイオン（８９Ｓｒ２＋）を含み、該放射性ストロンチウム（８９Ｓｒ）またはそのイオンにより骨基質ないし細胞を標識することを特徴とする、項４に記載の培地。
６．  培地中の前記アルカリ土類金属イオン濃度が0.1μM〜10mMであることを特徴とする項1〜５のいずれかに記載の培地。
７．  ストロンチウムイオンおよびバリウムイオンからなる群から選ばれる少なくとも１種のアルカリ土類金属イオンで標識された細胞。
８．  アルカリ土類金属イオンが放射性ストロンチウムイオンである項７に記載の細胞。
９．  細胞が移植用の細胞であり、生体内での移植細胞の挙動を追跡可能であることを特徴とする項８に記載の細胞。
１０．  項1に記載の培地を使用して培養した骨芽細胞によって形成された骨基質を定量する方法であって、形成された骨基質中に含まれるストロンチウム及びバリウムからなる群から選ばれる少なくとも１種のアルカリ土類金属を検出することを特徴とする骨基質の定量方法。
１１．  アルカリ土類金属がストロンチウムであることを特徴とする項１０に記載の方法。
１２．  アルカリ土類金属を外部から添加し骨基質に取り込ませることを特徴とする項１０または１１に記載の方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明による培地を用いることによって細胞（特に移植細胞）あるいは、細胞が形成する骨基質／骨芽細胞と骨基質を含む骨組織を標識することができ、カルシウムを含む材料上に形成した骨基質を定量することができるだけでなく、移植した細胞ないし骨組織の存在、分布等を非侵襲的に知ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明において、培地に添加され、細胞あるいは細胞が形成する骨基質中に取り込まれて標識ないし検出対象となる元素としては、ストロンチウム(Sr)、バリウム(Ba)が挙げられ、ストロンチウムが好ましい。ストロンチウムとバリウムは、二価イオンの形態で、水に可溶性の塩として培地中に添加され得る。ストロンチウムの塩としては、塩化ストロンチウム、臭化ストロンチウム、フッ化ストロンチウム、硝酸ストロンチウム、水酸化ストロンチウムが挙げられる。バリウムの塩としては、塩化バリウム、臭化バリウム、フッ化バリウム、硝酸バリウム、水酸化バリウムが挙げられる。
【００１３】
また、体外において培養された細胞が作った骨基質を定量する場合には、一定量のストロンチウムまたはバリウムを添加する。血清を加えた培地を使用して細胞を分化培養すると、血清中に微量に含まれるストロンチウムがカルシウムの代わりに形成した骨基質中に取り込まれる。また細胞の増殖などにほとんどあるいは全く影響のない量のストロンチウムまたはバリウムを添加することで、より高精度な骨基質の定量ないし細胞の標識を行うことが可能となる。
【００１４】
添加する血清の濃度は、培地に対し容量で0.5％から25%程度が好ましく、5%から15%がより好ましい。またＳｒイオンおよび／またはＢａイオンの濃度は0.1μMから10mM程度、好ましくは1μMから1mM程度である。
【００１５】
骨基質の定量は、一定期間これらの培地で分化させた後、石灰化層とともに細胞を回収しストロンチウムないしバリウムを定量することで行う。定量の方法は問わないが、原子吸光法や誘導結合プラズマ発光分光分析法などによって測定できる。
【００１６】
ストロンチウムおよび／またはバリウムで標識される細胞としては移植細胞が挙げられ、例えば造血幹細胞、間葉系幹細胞、脂肪幹細胞などの各種幹細胞、あるいは幹細胞を分化して得られた細胞が好ましい細胞として例示される。標識のために必要な培養期間は、ストロンチウムイオンないしバリウムイオンの培地中の濃度に依存し、特に限定されないが、通常１日以上培養すればよく、２〜３日から、１週間以上である。本発明の培地中で、必要に応じて分化誘導して継代培養することにより、標識された細胞ないし骨基質が得られる。
【００１７】
細胞の標識は、本発明の培地で細胞を培養することにより、実施可能である。細胞の標識のためには、放射性ストロンチウムを使用するのが特に好ましい。放射性ストロンチウムは医療分野ですでに使用されており、標識細胞に対する悪影響はほとんどないと推測される。
【００１８】
本発明の培地を用い、骨芽細胞をリン酸カルシウム系セラミクスに播種して培養した場合、従来法であれば、培養前に対象に存在するリン酸カルシウム系セラミクスに対し、骨芽細胞由来の新たに沈着された骨基質を定量することは困難であったが、本発明によれば、新たに形成された骨基質量を、ストロンチウム及び／又はバリウム量に基づき正確に定量ないし評価可能である。
【００１９】
本発明の培地は、従来各種の細胞培養に使用されている培地に、ストロンチウムおよび／またはバリウムをイオンないし塩の形態で添加することにより、製造することが可能である。
［実施例］
【００２０】
以下、本発明を実施例を用いてより詳細に説明するが、本発明がこれら実施例に限定されないことはいうまでもない。
【実施例１】
【００２１】
ラット大腿骨より採取した骨髄を培養し細胞を増殖させる。増殖した細胞をトリプシンによって処理し、培養プレート上に播種する。MEMに15%ウシ胎児血清、抗生物質、デキサメサゾン、β-グリセロフォスフェイト、アスコルビンサンを加えたものを基礎培地とし、それに0.1mM、1mM、10mM、のストロンチウムを加えた培地で培養した。この培養により骨髄由来の間葉系幹細胞が骨芽細胞に分化した。
培養開始7，9，11，14日目に細胞を回収し10%硝酸を加え溶解した後、誘導結合プラズマ発光分光分析装置によってカルシウムとストロンチウムの定量を行った。その結果を図1に示す。
【００２２】
図1を見てわかるように、検出されたカルシウムとストロンチウムは相関関係にあり、ストロンチウムを定量することによってカルシウム量が推定できることが確認された。
【実施例２】
【００２３】
ハイドロキシアパタイト製セラミックス（気孔率50％）に実施例１に示した骨芽細胞を播種し、基礎培地にストロンチウムを0.1mM添加した培地にて2週間培養した。培養9，11，14日目に細胞を回収し10%硝酸を加え溶解した後、誘導結合プラズマ発光分光分析装置によってストロンチウムの定量を行った。その結果を図2に示す。
ストロンチウム量は時系列的に増加し、骨芽細胞によりハイドロキシアパタイト製セラミックス上に蓄積したリン酸カルシウム量を、ストロンチウム量に基づき定量できることが明らかになった。
【実施例３】
【００２４】
ラット大腿骨より採取した骨髄を培養し細胞を増殖させる。増殖した細胞をトリプシンによって処理し、培養プレート上に播種する。MEMに15%ウシ胎児血清、抗生物質、デキサメサゾン、β-グリセロフォスフェイト、アスコルビン酸を加えたものを基礎培地とし、それに1.0μM、10μM、0.1mM、1.0mM、10mM、のストロンチウムを加えた培地で培養した。この培養により骨髄由来の間葉系幹細胞が骨芽細胞に分化した。培養開始4日目にBrdU細胞増殖アッセイ*を行った。結果を図３に示す。
※  BrdU細胞増殖アッセイ（Amersham Cat.No.RPN250）：  活発に増殖している細胞が新たにDNAを合成するときに、BrdU（ブロモデオキシウリジン）を取り込ませ免疫学的手法によって定量する。
【００２５】
10mMのSrを添加した系において細胞の増殖がやや抑制される傾向が見られたが、１μｍ〜１０ｍＭ、好ましくは１μｍ〜１ｍＭの濃度範囲のストロンチウムイオンを含む培地は、細胞増殖をほとんどあるいは全く抑制せず、細胞標識のための培地として使用できることが明らかになった。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図1は基礎培地に各種濃度のストロンチウムを添加し分化培養した細胞が形成した骨基質中のカルシウムとストロンチウム量は相関関係を示している。
【図２】図2はハイドロキシアパタイトセラミックス上で、ストロンチウムを含む培地で培養した細胞が形成した骨基質中に含まれるストロンチウム量を示している。
【図３】図３は、実施例３の細胞増殖アッセイの結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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