(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体適合性基体と該基体上に配置するミネラル相とを含み、
前記ミネラル相は、リン酸カルシウム成分、ペプチド両親媒性物質のナノ繊維及びポリ（Ｌ−リシン）を含有し、
前記ナノ繊維は、前記ポリ（Ｌ−リシン）に基体上で結合し、
前記基体は、ポリマー、金属、金属合金及びセラミックスからなる群から選択され、
前記ペプチド両親媒性物質が、Ｎ末端において、アミド結合を介してペプチドの前記Ｎ末端に、以下の(i)〜(xxiii)の炭素数を有する飽和直鎖状炭化水素が結合された、以下の(i)〜(xxiii) からなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とするナノ組織化生体適合性複合体。
0004837553.tif 000009
【請求項２】
ミネラル相のカルシウム含量が、化学量論比未満であり、ポリ（L−リシン）がリン酸カルシウムに組み込まれてなる請求項１の複合体。
【請求項３】
さらに、哺乳類の前骨芽細胞培養物を含む請求項１又は２の複合体。
【請求項４】
基体がチタン又はチタン合金を含む請求項１〜３のいずれか１つの複合体。
【請求項５】
生体適合性基体にペプチド両親媒性物質を結合させる方法であって、
生体適合性基体を準備し、
該基体上に実質的に単相のリン酸カルシウム成分を堆積し、
該リン酸カルシウム相にミネラル相を堆積し、該ミネラル相はリン酸カルシウムとそこに組み込まれたポリ（Ｌ−リシン）とを含み、及び
ポリ（Ｌ−リシン）をペプチド両親媒性物質のナノ繊維に接触させ、
該ペプチド両親媒性物質は、Ｎ末端において、アミド結合を介してペプチドの前記Ｎ末端に、以下の(i)〜(xxiii)の炭素数を有する飽和直鎖状炭化水素が結合された、以下の(i)〜(xxiii) からなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とする方法。
0004837553.tif 000010
【請求項６】
基体を反応性カルシウム試薬と反応性リン酸試薬とを含むメディウムに接触させ、
接触は基体にリン酸カルシウム成分が堆積するのに十分な時間行う請求項５の方法。
【請求項７】
ミネラル相はカルシウム試薬とリン酸試薬との反応生成物であり、ポリ（Ｌ−リシン）をミネラル相形成の反応中に導入する請求項５又は６の方法。
【請求項８】
さらに、ペプチド両親媒性物質上に哺乳類の細胞を培養させることを含む請求項５〜７のいずれか１つの方法。
【請求項９】
哺乳類の細胞が、前骨芽細胞を含む請求項８の方法。
【請求項１０】
基体がチタン又はチタン合金を含む請求項５〜９のいずれか１つの方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、米国仮出願第60/446,421号及び第60/495,965号（２００３年２月１１日及び２００３年８月１８日にそれぞれ出願）（全趣旨を参照することによりここに取り込む）からの優先権の利益を請求する。
米国政府は、登録番号DEFG02-00ER45810及びDMR0108342（それぞれエネルギー省及び国立科学財団からノースウエスタン大学に）に準じて、この発明の一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００２】
生体適合性スカフォールドを採用する再生医療の技術が、人口装具及び再建外科（例え
ば、頭部顎顔面及び脊髄手術）に近年使用されている人口装具材料の実行可能な代案を提
供する。また、これらの材料は、病気の、障害のある又は損傷した組織の置き換えるため
の組織又は器官等価物の形成に期待できる。生体適合性の、生物分解性材料は、組織又は
骨の成長を開始又は維持するスカフォールドに使用することができるが、生体内で時間が
たてば自然に分解される。また、そのような材料は、所定の領域に治療用材料（例えば、
遺伝に関する材料、細胞、ホルモン、薬物又はフロドラッグ）の制御放出に使用すること
ができるかもしれない。これらスカフォールドを形成するために使用されるポリ乳酸、ポ
リオルトエステル及びポリ無水物のようなポリマーは、成型が困難であり、その結果、特
に、細胞付着に不十分で、組織人工材料を利用する部位への一体化が不十分となる。一部
の例外を除いて、それらは、生物学的に関連する信号を欠く。
【０００３】
自己組織化ペプチド−両親媒性ナノ繊維が、ヒドロキシアパタイトのようなバイオミネ
ラルの成長を誘導するために使用されている。これらのナノ繊維は、比較的親水性のペプ
チド頭部基に結合した疎水性脂肪族化合物の尾部からなるペプチド−両親媒性物質を含む
。ペプチド頭部基は、少なくとも２つのセグメントを含むかもしれない。構造セグメント
と機能セグメントである。構造セグメントは、２から４のシステイン残基を含むかも知れ
ず、それは、繊維内で、個々のペプチド両親媒性分子間のジスルフィド結合形成によって
自己組織化ペプチド両親媒性構造を共有的に安定化するために使用されるかもしれない。
あるいは、構造セグメントは、例えば、セリン、ロイシン、アラニン又はグリシンのよう
な他の残基を含むかもしれない。これらの残基によって、ナノ繊維の共有的な安定を促進
することができるが、それらは、組織化されたナノ繊維中でβシート形成のような構造編
成に関与するかもしれない。機能頭部基は、異なるアミノ酸の組み合わせから構成される
かもしれず、分子の脂肪族化合物の尾部から最も遠い分子の端部近傍に配置するカルボキ
シル、チオール、アミン、ホスファート及びヒドロキシ官能基のような分子を含むかもし
れない。カルボキシ基含有残基として、アスパラギン酸又はグルタミン酸が例示される。
アミン又はグアニジウム含有残基として、それぞれ、リシン又はアルギニンが例示される
。ペプチド両親媒性物質が、水性条件下で自己組織化されると、これらの機能残基は、そ
れらがペプチド両親媒性物質に結合するために他の分子との反応に有効であるかもしれな
い、自己組織化ミセル（一般にナノ繊維）表面近傍に現われるであろうことが予想される
。
【０００４】
これら自己組織化ナノ繊維材料の多面的な能力及び機能性は、組織修復、細胞成長又は
臓器再構築において有用であることが分かるかもしれない。用語「組織」は、筋肉、神経
、血管及び骨組織ならびに組織についての他の共通の理解を含む。また、本発明は、神経
における軸索伸長の調節、阻害又は促進ならびに神経細胞内での細胞−基質接着性の調節
、阻害又は促進における適用を見出すことができる。これらのペプチド両親媒性組成物の
スカフォールド及び移植片（例えば、ステンレス鋼ステント、神経の電気的な刺激用の電
極又は金属系整形外科移植片）の表面への被覆は、さらに既存の再生医療戦略を増強する
ことができる。重要なことに、多重ペプチド信号を、種々の及び潜在的な相乗作用を達成
するために、同じ超分子自己組織化ペプチド両親媒性物質において用いることができる。
【０００５】
そのようなシステムのペプチド両親媒性組成物は、分子間架橋能がある残基を有するペ
プチド成分を含んでいてもよい。システイン残基のチオール分子は、適当な酸化剤の導入
によって、又は生理学的条件下で、分子間ジスルフィド結合形成のために用いることがで
きる。逆に、そのような結合は、システムに取り込まれる還元剤によって、又は還元条件
下で、開裂することができる。また、利用される場合のシステイン残基の濃度は、ナノ繊
維システムの化学的及び／又は生物学的安定性を制御するために変化させることができ、
よって、担体としてナノ繊維を用いることによって、細胞又は他の有用な剤の治療的伝達
又は放出を制御することができる。例えば、酵素を、ジスルフィド結合の加水分解によっ
て、それらの生物分解速度を制御するために、そのようなナノ繊維に組み込むことができ
る。そのような分解及び／又はシステイン残基の濃度は、多様な再生医療適用に利用する
ことができる。また、そのようなペプチド両親媒性物質のチオール機能性は、超分子構造
を表面に結合させるために利用することができる。ペプチド両親媒性物質の生物学的部分
の相互特性は、自然発生ペプチドにおいて見出されるアミノ酸配列を擬似するかもしれな
い。ペプチド−両親媒性ナノ繊維とＲＧＤペプチド配列からなる自己組織化ゲルは、コラ
ーゲン繊維の機能を擬似し、ヒドロキシアパタイト結晶の成長を組織化し、誘導する。そ
のようなペプチドにおける他の潜在的に有用なアミノ酸配列は、ＹＩＧＳＲ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）及びＩＫＶＡＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）アミノ酸配列を含むかもしれない。自己組織化ペプチド両親媒性物質中のそのようなアミノ酸配列は、細胞成長及び神経再生に相乗効果を有するかもしれない。生体に移植又は伝達された基体上への細胞の成長は、人工心臓、神経機能の回復、移植血管の回復；繊維格子上で上皮細胞を培養することによる皮膚移植の形成及び「人工皮膚」の製造に有用であろう。
【０００６】
血管の内皮又は内側層へのダメージは、バルーン血管形成術及びステント手順の過程で
しばしば起こり、新生内膜増殖を刺激することが見出されており、アテローム硬化性欠陥
の再狭窄を導く。正常な内皮細胞は、血管を裏打ちし、独自にかつ完全に血液に適合する
。内皮細胞は、血管壁への血小板の堆積及び血栓形成を活発に阻止する代謝プロセスを開
始する。血管系内のダメージを受けた動脈表面は、血栓形成に対して非常に影響されやす
い。凝血を防止し、血小板凝集を阻害するために全身性の薬剤を用いながら、直接血栓形
成及びその後の脈管内膜平滑筋細胞の増殖を直接的に防止するために、ダメージを受けた
動脈表面を治療することが必要である。
チタン及びその合金のような金属で形成されるステントは、組織化された内皮細胞の成
長を促進させるために設計されている。そのようなステントは、ステント本体の少なくと
も一部の表面に、好ましくは、ステント本体の少なくとも内表面に、格子縞波形のような
規則的なパターンが配置された複数の凹部を含む。他のステントは、ステント本体に、複
数のひだ、リッジ、チャネル又は孔を有する表面特性を有し、少なくとも孔のいくつかは
、ステント本体の内部から外側面の間に及んでおり（つまり、ステント本体を貫通してい
る）、組織化された細胞成長を促進するように所定の大きさを有している。
【０００７】
埋め込み可能な表面及びスカフォールド上の、例えば、神経細胞及び内皮細胞の統制さ
れた成長は、生体内の細胞、器官及び組織の再生及び成長のために望ましいであろう。外
科的移植片を取り囲む組織上又は中での組織、血管組織、神経及び細胞の成長を促進する
ことができる外科的移植片を提供することは望ましいであろう。脈管形成及び／又は新血
管新生中に行われるような、組織化された細胞構造への浸潤細胞の成長を促進することに
適する生体への配置に対して、新たな、かつより良好なスカフォールド、移植片、ステン
ト及び電極が、ダメージを受けた生体器官及び血管の修復を助けるために望ましいであろ
う。
【０００８】
関連する考慮すべき事項の一部として、重量比、剛性及び自然に形成する酸化物層の生
体不活性特性に対する金属の高い強度が広範囲に及ぶ臨床的な成功をもたらす場合、チタ
ン及びその合金は骨格移植片材料として広範囲に用いられている。しかし、再生医療が発
達するにつれて、研究者は、別の不活性酸化金属表面に対して生物活性を有する要素を導
入するために、チタン系移植片表面へのリン酸カルシウム被膜の使用を研究している。イ
ンビトロの研究は、リン酸カルシウムが、細胞の付着及び増殖を高める骨伝導性被膜を形
成するかもしれないことを示している。インビボモデルは、チタン表面が種々のリン酸カ
ルシウム被膜、多くの場合、ヒドロキシアパタイト（Ca10(PO4)2(OH)2）で被覆された場
合、移植片における界面強度が改善されることを示している。また、研究は、これらのリ
ン酸カルシウム被膜の分解は、移植片−組織界面で、促進された新たな骨形成を助長する
ことを示している。
【０００９】
チタンをこれらリン酸カルシウム被膜で被覆するために通常使用されている方法は、プ
ラズマスプレー、電気泳動、ゾルゲル法及び溶液相析出である。プラズマスプレー又はゾ
ルゲル法のような方法は、緻密で、多くの場合にはほとんど又は全く相選択性がない高い
結晶性のアパタイト型相をもたらす傾向があり、また、これらの方法のいくつかは、多孔
質のチタン構造の内表面を被覆することができない。これらの成長方法の多くは、非常に
長い成長時間（数週間から数ヶ月）を要し、結晶の大きさ又は形状をほとんど制御するこ
とができず、有機巨大分子によってもたらされるようないずれかの付加された化学機能性
を欠いている。有機巨大分子は、バイオミネラル結晶改質における役割を果たすことが知
られている。さらに、クラスターが多孔質表面に形成される場合、表面被覆は一般に１０
０％未満となる。しかし、溶液−相成長は、表面が多孔質であっても、移植片表面に直接
リン酸カルシウム被膜の核形成が可能である。さらに、この浸潤化学のアプローチは、ヒ
ドロキシアパタイトのみならず、ヒドロキシアパタイトの前駆体であるリン酸オクタカル
シウム(Ca8H2(PO4)6・5H2O)、のような、他の生物学的に関連するリン酸カルシウム相の
形成を可能にする。これら被膜の溶液−相成長は、被膜に有機巨大分子を導入させ、プラ
ズマスプレーのような、高温被膜プロセスのいずれをも伴わない特徴を有する。
【００１０】
種々の生物学的超分子とリン酸カルシウム被膜との相互作用の調査が行われた。アルブ
ミン、フィブロネクチン及びポリアミノ酸のような生体分子の存在下では、リン酸カルシ
ウム被膜の成長は実質的に阻害される。例えば、ポリ（Ｌ−リシン）は、優れた化学機能
性を有する細胞接着プロモーターとして定着しているが、チタン合金表面でのアパタイト
成長を阻害することが示されている。ポリアミノ酸は、ポリアミノ酸−被覆チタン系表面
へのポリ（Ｌ−リシン）被覆有機アパタイトの成長によってこの問題と取り組むための核
形成剤及び超分子つなぎ鎖として用いられている。この方法は、ポリアミノ酸をいくつか
の被覆工程及び層で用いており、また、有機アパタイトの比較的バルキーなクラスターを
もたらし、それは、微細な多孔質組織への被膜構造において不利かもしれない。研究され
た代替のアプローチでは、既存のリン酸カルシウム層上にアルブミンを含むリン酸カルシ
ウム被膜を成長させている。
【００１１】
移植可能な金属表面へのポリアミン−改質ナノ組織化されたリン酸カルシウム被膜を形
成することは望ましいであろう。リン酸カルシウム上へ成長させたシードによって、新た
な材料は、ポリアミンの化学的及び生物学的機能性を有する移植可能な表面への溶液−相
リン酸カルシウム成長の多機能性及び簡便さを兼ね備える。
実質的に全ての表面を被覆するように、バイオミネラルで材料表面を被覆することは望
ましいかもしれず、その被膜は、化学的改質、ペプチド両親媒性ナノ繊維の付着、細胞及
び組織成長及び接着に対して有利な表面を提供する。さらに、被膜は、患者に対して移植
片に適した材料を適用することができ、被膜が生理学的条件下で分解し得るのであれば、
望ましいであろう。
【発明の開示】
【００１２】
要旨
一つには、本発明の実施形態は、自己組織化ペプチド両親媒性物質が金属のような他の
材料へ結合することに指向する。新たに形成された結合は、他の材料へ元の自己組織化ペ
プチド両親媒性ナノ繊維又は球状ミセル集合体を結合させるであろう。適当な自己組織化
ナノ繊維又はミセルと第２表面との結合は、さらに、第２表面への細胞又は組織成長を正
しい位置に配置するために用いることができる。あるいは、ペプチド両親媒性物質は、表
面に結合するかもしれず、成長したペプチド両親媒性ナノ繊維を正しい位置に配置するた
めに用いることができるかも知れず、又はナノ繊維構造の材料表面への自己組織化を開始
するために用いることができる。そのような表面は、興味深い材料がステントである場合
、組織修復、細胞の移植片への接着及び再狭窄のような症状の最小化に有用であろう。
【００１３】
ペプチド両親媒性物質の第２表面への結合は、ペプチド両親媒性又はそれらを含む自己
組織化ナノ繊維もしくはミセルの表面への物理吸着、化学吸着又は共有結合によってなさ
れるかもしれない。そのような結合の例は、限定されないが、自己−組織化ナノ構造と表
面との間のイオン性、配位、キレート化、アミド又はエステル結合を含む。そのような結
合機構は、金属表面、ポリマー、ペプチド−改質生体材料被膜又は組織を含有する他のペ
プチドを含む他の材料へのペプチドナノ構造の付着に対して安定なメカニズムを提供する
ことが予想される。この付着は、ミセルを含むペプチドを材料表面に強く安定化させるこ
とを可能にするであろう。そのような伝達機構は、それ自体、細胞−特異動向の改質から
薬物伝達への適用範囲を与えるかもしれない。一実施形態では、ペプチド両親媒性ナノ繊
維は、カルボキシ基−リッチなペプチド配列を含む。そのようなペプチド両親媒性物質は
、遊離アミンを表す表面に結合する。あるいは、そのペプチド両親媒性ナノ繊維は、遊離
アミンを示す残基を含むかもしれず、一方、第２表面又は構造はカルボキシ官能基を表す
かもしれない。
【００１４】
そのような機能性改質表面に関して、このパラグラフからパラグラフ００２５（含む）
の実施形態を考慮せよ。本発明の実施形態は、その表面がミネラルでプレシード化された
移植可能基体上への有機的に改質されたバイオミネラル被覆である。好ましい実施形態で
は、有機的−改質被膜は、リン酸カルシウムでプレシード化された金属基体上に被覆され
たリン酸カルシウムからなる。本発明の一実施形態は、バイオミネラル被膜で基体を被覆
する方法である。
【００１５】
本発明の実施形態は、金属表面にリン酸カルシウムのシードが成長したチタン表面上の
ポリ（Ｌ−リシン）−改質ナノ組織化リン酸カルシウム被膜を含む。
本発明の実施形態では、プレシード化された基体上の被膜は、カルシウム−金属欠乏（
リン酸オクタカルシウム）ミネラル（結晶成長が、ポリアミン、好ましくはミネラル化中
に存在するポリ（Ｌ−リシン）のようなアミノ酸を含むポリアミンによって阻まれ又は改
質されている）からなる。さらに、ポリ（Ｌ−リシン）ポリアミノ酸は、密接にミネラル
相に組み込まれると考えられている。
【００１６】
本発明の一実施形態は、細胞付着、組織成長又は治療用組成物の伝達における使用を促
進するための改変結晶材料表面を有する基体を被膜するための組成物である。被覆溶液は
、溶解した結晶材料ならびにポリアミン及び好ましくはポリペプチド又はそれらの酸性塩
の溶液からなる。その組成物は、溶解した興味深い結晶材料及びアミノ酸モノマーを含ん
でいてもよいポリアミンを含む。好ましくは、ポリマーは、材料に組み込まれた際、ペプ
チド、ペプチド両親媒性物質、たんぱく質及び細胞との結合を形成するための遊離官能基
を有するアミノ酸を含む。好ましくは、ポリマーは、リシンモノマー、より好ましくはポ
リリシン又はそれらの酸性塩を含む。
一実施形態では、被膜は細胞成長及び細胞接着に有用であり、被膜は、生理学的条件下
で分解しやすい。
【００１７】
本発明の他の実施形態は、細胞、組織の成長用又は治療用組成物の放出用基体である。
そのような基体は、インビトロで細胞又は組織を培養するために用いることができ、ある
いは、インビボで細胞又は骨のような組織を成長又は培養するために用いることができる
。基体は、その表面がミネラルでプレシード化された生体適合性材料からなり、その後ミ
ネラル又はその正常な結晶構造が、ポリアミン、好ましくはポリペプチドを材料内に取り
込むことによって改質された材料で被覆される。基体上の被膜は、さらに、被膜材料中の
ポリアミンに結合したジスルフィド又はアミドのような他の結合によって、又は結晶材料
自体に対する他の結合によって、ペプチドに結合されていてもよい。あるいは、基体上の
被膜は、自己組織化ペプチド両親媒性物質に結合されていてもよいし、自己組織化ペプチ
ド両親媒性物質に、好ましくはアミド結合によって、架橋されてもよい。また、基体を被
覆する材料は、酸化物、水酸化物、リン酸エステル（塩）、炭酸エステル（塩）、シュウ
酸エステル（塩）及びそれら自体ペプチド又は自己組織化ペプチド両親媒性物質と結合す
ることができるこれらイオンの組み合わせを含んでいてもよい。
【００１８】
本発明の他の実施形態は、基体上の材料被膜を形態学的に改質する方法である。その方
法は、生物学的に適合可能な基体をプレシード化し、次いでプレシード化された基体を、
溶解結晶材料あるいはポリアミンもしくはポリアミノ酸又はそれらの酸付加塩（それは、
結晶材料又はバイオミネラルに組み込まれ、ナノ結晶ミネラルを形成するであろう）を有
するバイオミネラルの溶液である組成物で処理することを含む。得られた被膜の形態は、
組成物及び基体を被覆する方法によって制御することができる。さらに、その方法は、被
膜のナノ結晶材料に組み込まれたポリアミンに分子が結合する作用を含んでいてもよい。
【００１９】
例示された本発明で得られた被膜の形態は、純粋な無機ミネラル被膜よりも１〜２けた
小さい不規則な外観を有する。この増大した組織及び減少した外観サイズは、一体となっ
ている基板上又はそのような有機改質材料で被覆された表面での細胞付着、増殖及び広が
りを促進するために有利となるであろう。さらに、被膜の破壊された、不十分な結晶特性
、ミネラル組成物の酵素−易損性有機成分との組み合わせは、特に自然再吸収及び再建プ
ロセスを利用しやすい被膜を遊離に形成するであろう。最後に、ポリアミノ酸の被膜への
組み込みは、リシンポリマーの側鎖における遊離アミン又はジスルフィド基によって、さ
らなる化学官能性を与える。そのような化学機能性は、成長因子、生物関連ペプチド配列
のような生物学的分子又は治療薬の取り込み又は共有結合に使用することができる。
新たな材料は、チタン上の溶液−相リン酸カルシウム成長の多機能性及び簡便性に、ポ
リ（Ｌ−リシン）の化学的及び生物学的機能性を兼備させる。
従って、本発明の実施形態は、また、移植可能なスカフォールド、外科用デバイス、電
極、ステント及び他の基体表面へ被覆された自己組織化ペプチド両親媒性物質を含むこと
ができる。これら表面への被膜を含むペプチド両親媒性物質は、細胞の成長を高めること
によって、生体での組織の成長を高めることができる。
【００２０】
本発明の一実施形態は、基体に堆積された１以上の生物学的信号を含む、自己組織化ペ
プチド−両親媒性ミセル、球体又は円筒形のシステムを提供する。そのペプチド両親媒性
物質における種々の構造ペプチド配列は、組織化されたナノ繊維を、構造安定性を増減す
るために、可逆的に基体上に架橋することができるかもしれず、あるいはナノ繊維の疎水
性コア中に封入された又はそれら親水性表面に吸着された分子の伝達速度の制御を可能に
するかもしれない。
他の実施形態では、ペプチド両親媒性物質のペプチド成分は、一旦繊維に組織化される
と、これらの繊維は、金属表面又は他のいずれかのタイプの表面を機能化するために、さ
らなる又はカルバミド結合に関わることができるように、カルボキシで終結されているこ
とが好ましい。
【００２１】
本発明の他の実施形態は、細胞成長及び移植のための一時的なスカフォールディングと
して、自己組織化ペプチド両親媒性ナノ繊維被覆表面を形成及び利用する方法である。
本発明の他の実施形態は、内皮細胞、器官組織及び神経細胞のための移植直後のインビト
ロ及びインビボ双方での支持構造として、細胞成長に利用することができる、生体分解可
能、非毒性自己組織化ペプチド両親媒性ナノ繊維被覆表面及びスカフォールドである。
本発明の他の実施形態は、細胞成長用の支持体を与えるが、その表面又はスカフォールド
の移植後の成長細胞塊の血管新生を可能にし、かつ高める、生体分解可能な自己組織化ペ
プチド両親媒性ナノ繊維被覆表面及びスカフォールドを形成及び構成する方法である。
本発明の他の実施形態は、細胞の１以上のタイプが成長することができ、又は細胞の基体
への成長速度を制御することができるように、化学的に異なる自己組織化ペプチド両親媒
性被膜のドメインで表面が被覆された自己組織化ペプチド両親媒性ナノ繊維である。
本発明の他の実施形態は、ステントが移植される血管又は他の管腔内での血管形成を促進
するために適応される移植可能な自己組織化ペプチド両親媒性ナノ繊維被覆ステントであ
る。
【００２２】
本発明の他の実施形態は、新脈管内膜浸潤を促進又は刺激するために適応されるが、新
血管新生をもたらすための浸潤細胞の組織化を伴う、移植可能な自己組織化ペプチド両親
媒性ナノ繊維被覆ステントである。
本発明の他の実施形態は、細胞−リッチなインビトロ環境において培養された際又は体
管腔（血管のような）内に移植された際、生存細胞の内殖を促進するために適応される移
植可能な自己組織化ペプチド両親媒性ナノ繊維被覆ステントである。
本発明の他の実施形態は、細胞が体管腔又は器官に移植された際、組織化された細胞構造
への細胞の成長を促進するために設計された生存細胞成長貫通孔及び／又は他の表面外観
で占められる、移植可能な自己組織化ペプチド両親媒性ナノ繊維被覆ステントである。
本発明の他の実施形態は、例えば、移植されたステント内で脈管内膜の血管形成又は増殖
を阻害又は促進するために選択されたものなど、生存細胞が、被膜ナノ繊維から放出され
るように治療用生物活性剤を生成するために遺伝子工学で作られた自己組織化ペプチド両
親媒性ナノ繊維被覆ステントである。
【００２３】
本発明の他の実施形態は、ある技術を提供し、それによって、必要な器官からの機能的
細胞を、自己組織化ペプチド両親媒性物質からなるナノ繊維で被覆されたスカフォールド
上に成長させる。被覆されたスカフォールドは、インビボまたはインビトロ−使用細胞培
養技術、続いて、付着及び平衡の後、スカフォールド細胞複合体を、付着、成長及び機能
に適する患者の部位に移転させることに使用することができる。栄養物及び成長因子は、
細胞培養の間供給され、必要に応じて、付着、生存又は成長を可能にする。あるいは、栄
養物及び成長因子を自己組織化ペプチド両親媒性ミセルによって封入する。
【００２４】
細胞及び組織の成長のために、自己組織化ペプチド両親媒性ナノ繊維被覆スカフォール
ド又は外科用デバイスを使用することは、その高い表面領域が、細胞接着及び成長のため
の非常に多くの部位をもたらすため、有利である。被膜の繊維特性は、新たな血管形成ま
で、拡散によって、栄養物を、成長細胞培養物に浸透させることを可能にする。組織培養
物中で構成され、その後成功裏に移植される器官に対して、移植後の血管成長の前に、細
胞成長及び分別を起こすことができるように、マトリクスは、十分な表面領域を有し、栄
養物にさらすべきである。移植後、細胞増殖が起こるにつれて、その構造は、栄養物の拡
散及び生成物の廃棄のために、ならびに血管の内植を連続させることを可能にするに違い
ない。自己組織化ペプチド両親媒性物質から製造されたナノ繊維ゲル及びミセルは、高い
表面領域を有し、良好な成長環境を提供するために最適である。
一部には、本発明の実施形態の他の観点、特性、利益及び利点は、以下の記載、添付の
請求項及びここに伴う図面に関して明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１Ａ】チタン箔上にリン酸カルシウムを成長させるための実験装備（概略図）である。
【図１Ｂ】箔底面を溶液による沈殿固まりから保護している、概略図で用いられる箔のサンプルである。
【図２】サンプルのプレシード化及びリン酸カルシウム被膜成長中の反応溶液の時間依存ｐＨ変化。
【図３Ａ】チタン箔への純粋な無機ＯＣＰ（Ａ）被膜の走査電子顕微鏡写真デジタル画像。
【図３Ｂ】チタン箔へのｐＬｙ−ＣＰ（Ｂ）被膜の走査電子顕微鏡写真デジタル画像。（ｂ）の挿入図は、ｐＬｙ−ＣＰ被膜のナノスケール特徴に関する高倍率画像である。
【図４】ＯＣＰ及びｐＬｙ−ＣＰの粉末Ｘ線回折パターンである。ＯＣＰの主な回折レベルの数値を表示している。
【図５】チタン上のＯＣＰ及びｐＬｙ−ＣＰの被膜の反射フーリエ変換赤外分光スペクトルである。無機被膜パターンはＯＣＰの特徴的なバンドを示し、一方、ｐＬｙ−ＣＰ被膜は、不十分な結晶ＯＣＰ及びポリ（Ｌ−リシン）の混入物の存在を示す。１３５０から２０００及び３４００以上の高周波バンドは、反射実験装備からの周囲水によるものであると考えられる。
【図６Ａ】CaCl2及びNa2HPO4で１０分間プレシード化したチタン表面の走査電子顕微鏡写真デジタル画像である。リン酸カルシウムのシードは認められない。
【図６Ｂ】CaCl2及びNa2HPO4で２時間プレシード化したチタン表面の走査電子顕微鏡写真デジタル画像である。シード結晶が、２時間成長後のＴｉ表面に認められる。
【図７】ＯＣＰ被膜対ｐＬｙ−ＣＰ被膜の異なる分解動向を示す走査電子顕微鏡写真デジタル画像及び対応ＥＤＳパターンである。スケールバーは１μｍである。ＥＤＳプロットのｘ軸はエネルギー（ｅＶ）を示し、ＥＤＳパターンは３０００から３５００ｅＶのバックグラウンド強度によって標準化されている。
【図８】ＸＰＳによって測定されたＳ：Ｎ比は、ＯＣＰ及びｐＬｙ被膜に対するシステインの結合親和性を示す。Ｓ及びＮのいずれも実質的にＯＣＰサンプルでは検出されなかった。エラーバーは、二重測定の±１標準変化を示す。
【図９】本発明の被膜への接着に有用なペプチドＣ16Ｈ31Ｏ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）の概略構造を示し、(ＰＯ4)はリン酸化セリンを示す。
【図１０Ａ】本発明のポリ（Ｌ−リシン）改質リン酸カルシウム組織化被膜に付着した自己組織化ペプチド両親媒性ナノ繊維束の走査電子顕微鏡写真デジタル画像である。
【図１０Ｂ】（ａ）の自己組織化ナノ繊維の高倍率走査電子顕微鏡写真デジタル画像であり、個々の繊維層を示す。
【図１１Ａ】培養１日後のチタン上のｐＬｙ−ＣＰ被膜上に広がった前骨芽細胞マウス頭蓋細胞の走査電子顕微鏡写真デジタル画像である。
【図１１Ｂ】培養４日後のチタン上のｐＬｙ−ＣＰ被膜上に広がった前骨芽細胞マウス頭蓋細胞の走査電子顕微鏡写真デジタル画像である。
【図１１Ｃ】培養７日後のチタン上のｐＬｙ−ＣＰ被膜上に広がった前骨芽細胞マウス頭蓋細胞の走査電子顕微鏡写真デジタル画像である。
【図１２Ａ】アミノ−シラン化チタン表面に共有結合したペプチド両親媒性ナノ繊維の走査電子顕微鏡写真デジタル画像であり、Ｔｉ表面に共有結合したこれら繊維の低倍率画像を示す。
【図１２Ｂ】アミノ−シラン化チタン表面に共有結合したペプチド両親媒性ナノ繊維の走査電子顕微鏡写真デジタル画像であり、Ｔｉ表面に共有結合したこれら繊維の高倍率画像を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
本発明の実施形態は、一般に、哺乳動物の生体内に配置される第２基体上に結合する自
己組織化ペプチド両親媒性ナノ繊維又はミセル被膜に関する。そのような基体は、多孔質
のスカフォールド、電極及びステントのような外科的移植片を含む。自己組織化ペプチド
両親媒性ナノ繊維被膜は、基体への細胞及び組織の成長及び接着を促進するアミノ酸を有
するペプチド両親媒性物質を含む。好ましくは、ペプチド−両親媒性物質設計及び機能は
、蛋白質、細胞及びコラーゲンのような構造を自然に発生した後、パターン化される。基
体は、基体上に細胞を成長させるために生体の外で使用され、次いで、生体内に配置する
ことができる。あるいは、被覆基体を直接生体内に配置し、細胞又は組織の成長を促進し
てもよい。また、ナノ繊維又はミセルは、そのような細胞及び組織の成長を促進するため
に活性化化合物を封入してもよい。本発明の組成物及び方法を説明する前に、この発明は
、説明された特定の分子、組成物、方法又はプロトコールに限定されるものではなく、こ
れらは変更してもよいことを理解すべきである。また、説明で用いた専門用語は、特定の
種類又は実施形態のみを説明する目的のためであり、添付の請求項によってのみ限定され
るであろう本発明の範囲を限定する意図はないことが理解されるであろう。
また、ここ及び添付の請求項で用いられる単数形「a」「an」及び「the」は、特に明確
に断りのない限り、複数を含む。よって、例えば、「細胞」とは、１以上の細胞及び当業
者等に公知の等価を示す。
【００２７】
特に言及しない限り、ここで用いられているすべての技術及び科学用語は当業者によっ
て一般に理解されているのと同様の意味を有する。ここに記載したものと同様又は等価な
いずれの方法及び材料も、本発明の実施形態の実施又は試験で使用することができるが、
好ましい方法、装置及び材料を次に説明する。ここで言及した全ての刊行物について、全
趣旨を参照することによりここに取り込む。ここでは、発明が、先の発明の長所によるそ
のような開示より以前に起こる権利がないということを認めることとして解釈されるもの
ではない。
【００２８】
本発明の組成物及び方法を説明する前に、この発明は、説明された特定の分子、組成物
、手順又は生成物に限定されないことを理解すべきである。また、説明で用いた用語も特
定の説明又は実施形態を説明する目的のみに対してであることを理解すべきであり、添付
のクレームによってのみ限定されるであろう本発明の範囲を限定する意図はない。
【００２９】
ペプチド両親媒性物質と第２表面とを結合するために使用されるカップリング剤は、ペ
プチド両親媒性物質及び／又はそれらの自己組織化球形ミセルもしくはナノ繊維と、第２
表面とを物理吸着、化学吸着又は共有グラフト化によるものとすることができる。カップ
リング剤結合の例は、自己組織化ナノ繊維又はミセルと表面との間のイオン結合には限定
されず、配位結合、キレート結合、金属スルフィド結合、アミド又はエステル結合が含ま
れる。そのような結合機構は、限定されないが、他の自己組織化ペプチド両親媒性物質、
細胞、タンパク、軟骨、金属、合金、セラミックス、ガラス、ミネラル、ポリマーならび
にステント、スカフォールド、電極及び歯科矯正具のような生体適合性移植片を含む第２
表面材料へのペプチドナノ構造の付着に安定なメカニズムを与えることが予想される。こ
の付着は、ミセルを含むペプチドの材料表面への強固な安定化を可能にするであろう。一
実施形態では、カルボキシ基−リッチなペプチド配列を含むペプチド両親媒性ナノ繊維が
用いられる。そのようなペプチド両親媒性物質は、遊離アミンを表す表面に結合する。
【００３０】
結合の一実施形態では、ペプチド両親媒性ナノ繊維は、チタン又は金属合金のようなア
ミノ−シラン化金属表面に結合する。ペプチド両親媒性物質とアミノ−シランような表面
基を有する表面との間のアミド結合を形成するために用いられる化学物質及び方法は、ペ
プチド合成（Knorrら、Fieldsら、Wellingsら、それらの方法を、全趣旨を参照すること
によりここに取り込む）に使用されるものと同様である。その反応は、極性有機溶媒、例
えば、限定されないが、N,N-ジメチルホルムアミド (DMF)又はN-メチルポロリドン (NMP)
中で行われ、それらの双方はアミノ酸を溶解することができる。また、その方法は、ペプ
チド両親媒性物質におけるカルボン酸官能基の反応性を増大させるための触媒として、O-
ベンゾトリアゾール-N,N,N',N'-テトラメチル−ウロニウム−ヘキサフルオロホスファー
ト (HBTU)のような化合物の利用を含む。他のペプチドカップリング剤又は活性化剤は、
限定されないが、ジシクロヘキシルカルボジイミド (DCC)、O-(7-アザベンゾトリアゾー
ル-l-イル)-1,1,3-,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート(HATU)及びベ
ンゾトリアゾール-l-イル-オキシトリピノリジノホスホニウムヘキサフルオロホスファー
ト(PyBOP)を含む。次いで、これらの反応性酸基を、塩基性プロトンシンク、ジイソプロ
ピルエチルアミン (DIEA)の存在下、遊離アミンと反応させ、最終的に、安定なアミノ結
合を残してHBTU及び水を除去するための最終脱離反応に導く。
【００３１】
金属及び金属合金酸化物表面は、生物学的適用のために、種々のアミノ−シランで改質
することができる。これらの改質は、種々のペプチド両親媒性物質又は自己組織化ミセル
の酸化物表面への付着のために用いることができる。例えば、TiO2-不動体化チタン表面
と所望のアミノ−シランとのインキュベーションによって、酸化物−溶媒界面でTi-O-Si
結合を生成し、酸化金属表面へアミノシランが共有結合する。この処理は、適当なペプチ
ド両親媒性物質との標準的なアミド結合反応にさらされた遊離アミンをそのままの状態に
残し、金属表面に繋留されたその遊離アミンと、ナノ繊維において露出したカルボン酸と
がアミド結合を形成し、繊維がシラン化Ti表面へ共有結合する。
【００３２】
本発明の一実施形態では、標準的なアミド結合反応は、プレ組織化、架橋ペプチドナノ
繊維に適用される。例えば、ペプチド両親媒性分子の希釈溶液は、上述したように組成的
に必要なものと合致し、緩和な還元剤（ジチオールスレイトール（DTT）のような）の溶
液中で維持され、ペプチドナノ繊維を形成する酸性条件下で自己組織化される。これらの
ナノ繊維は、非破壊的な酸化剤（イオジンのような）の添加によって架橋され、安定な分
子間、繊維内ジスルフィド結合を形成する。これら繊維の得られた懸濁液は、全ての還元
剤又は酸化剤（DTT及びイオジンのような）を除去するために水で透析される。次いで、
この架橋繊維の透析懸濁液を、凍結乾燥し、乾燥繊維を、ペプチド−溶解性極性有機溶媒
（DMIF又はNMPのような）中で激しい振動及び超音波によって再懸濁する。繊維の共有結
合による架橋は、それらを非水性環境中で安定化する。
【００３３】
基体は、生体適合性材料であることが好ましく、限定されないが、市販の純粋なチタン
、チタン合金あるいはクロム及びその合金、ハストアロイ316L及び304等のステンレス鋼
のような他の金属を含み、主な（presenting）酸化物表面は、有機非極性溶媒、有機極性
溶媒、最後に蒸留水中で超音波によって洗浄してもよい。次いで、洗浄金属又は合金は、
緩和なフッ化水素酸、硝酸溶液等でエッチングし、硝酸中での再不動体化する。不動体化
された基体サンプルを、蒸留水で完全に洗浄し、乾燥する。洗浄され、不動体化されたサ
ンプルを、次いで、真空乾燥によって脱水し、室温以上の温度で保存し、アミノシラン化
する。乾燥され、不動体化された基体を、窒素下、無水の疎水性有機溶媒（トルエンのよ
うな）中のアミノプロピルトリエトキシシラン（APTES）のようなアミノシランの希釈溶
液に導入する。アミノシラン化された金属基体を、次いで、有機非極性溶媒、有機極性溶
媒、最後に水で完全にすすぎ、不活性ガス下、高温（例えば、１００℃）でアニールする
。また、基体は、限定されないが、生体適合性ポリマー又は種々のカーバイド、ホウ化物
及び窒化物とすることができる。
【００３４】
カップリング剤の他の実施形態では、酸化表面を有する金属を、CaCl2及びNa2HPO4又は
他の同様の塩を含む溶液中に含浸し、表面にリン酸カルシウムをプレシート化する。次い
で、このプレシード化基体を、ポリ（Ｌ−リシン）、CaC12及びNa2HPO4を含む溶液中に含
浸する。サンプルを水で洗浄し、室温で乾燥する。ポリ（Ｌ−リシン）は、新たに形成さ
れたリン酸カルシウムの被膜の得られたミネラル相に取り込まれ、ポリ（Ｌ−リシン）の
側鎖の遊離アミンが組織化被膜表面に表れる。他のミネラル、例えば、限定されないが、
炭酸カルシウムをリン酸カルシウムの代わりに用いてもよい。多くの種々のアミン又はポ
リアミン、有機酸又はポリ有機酸をミネラルに取り込んでもよい。そのようなアミン又は
ポリアミド（ポリ（Ｌ−リシン）を含む）のいずれかを、不動体化した金属表面に物理吸
着、化学吸着又は共有グラフト化することができる。後に議論がなされる、後述の図１か
ら１１及び実施例２から５を参照のこと。また、アミノ酸及びポリアミノ酸を、米国特許
第6,051,272号（全趣旨を参照することによりここに取り込む）に記載されているように
、表面処理するために用いてもよい。さらに、空気の存在下に結合反応に付すことができ
、それにより表面被膜化合物（システイン等）を金属表面の酸化のために用いることがで
き（それらの酸化物は除去されている）、そこに直接的な結合を形成することができる。
これは、アミノ酸、ペプチド又はポリアミノ酸を金属に直接的に結合させる方法となるで
あろう。
【００３５】
第２表面は、カップリング剤としてカルボン酸基で終末させてもよい。例えば、３−メ
ルカプトプロピオン酸を、いずれかの金属表面にカルボン酸基を誘導するために使用する
ことができる。あるいは、ポリメリック材料（ポリエチレン等）を酸化して、カルボン酸
終末表面を与えてもよい。これらのカルボン酸終末表面は、アミン又はヒドロキシル基含
有ペプチド両親媒性物質と反応することができ、それらを第２表面に結合させることがで
きる。
【００３６】
他の実施形態では、例えば、２組のペプチド両親媒性繊維を、独立的に自己組織化、架
橋、透析、凍結乾燥及び溶液中で懸濁することができる。ナノ繊維の１組は、カルボキシ
ル官能基に富むもの、もうひとつを、遊離アミンに富むものにすることができる。ＨＢＴ
Ｕ及びＤＩＥＡの存在を組み合わせた場合、これらの分離したナノ繊維は、互いに結合す
るかもしれない。そのような適用は、互いに連携して良好に機能するかもしれない種々の
アミノ酸配列を組み合わせることにおいて有用であるかもしれない。この種の適用は、一
つのペプチド両親媒性繊維のタイプが上述したように表面に付着することができ、相補的
な繊維のタイプがこれら付着した繊維に結合することができる場合、さらに金属表面改質
と組み合わせることができるかも知れず、種々の共有結合ナノ繊維の二重層の品質を形成
する。上述した方法の他の実施形態は、チタン以外の金属表面の利用を含む。アミノ−シ
ラン化は、限定されないが、チタン合金、シリコン、タンタル、クロム及びクロム含有合
金（ステンレス鋼を含む）を含む適当な酸化物を表すいずれかの表面に付すことができる
ことは合理的に予想される。種々のセラミック第２基体も、また、アルミナ及びシリコン
酸化物の種々の形態を含む、この点において有用であろう。
【００３７】
ペプチド両親媒性物質及びそれらの自己組織化ナノ繊維は、それらの表面上への細胞の
付着及び成長を促進することができる。例えば、その細胞付着リガンドＲＧＤは、他の文
脈において、インテグリン−媒介細胞付着において重要な役割を果たすことが見出されて
いる。酸性アミノ酸及びアミノ酸とＲＧＤリガンドとを伴うペププチド−両親媒性種は、
ペプチド−両親媒性物質、それらの自己組織化ナノ繊維又はセルあるいはナノ繊維ゲルへ
の細胞付着を媒介するために用いることができる。アミノ酸配列ＩＫＶＡＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）は、他の文脈において、ニューロンの成長及び発達のために重要であることが確認されている。従って、酸性アミノ酸及びＩＫＶＡＶ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）を有するペプチド−両親媒性種は、本発明の実施形態の実施において、ペプチド−両親媒性物質、それらの自己組織化ナノ繊維又はセルあるいはナノ繊維ゲルへのニューロンの成長を媒介するために用いることができる。アミノ酸配列ＹＩＧＳＲ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）は、他の文脈において、神経細胞内で細胞−基体接着を促進するために重要であり、また、軸索ガイダンスにおいても役割を果たすことが確認されている。従って、酸性アミノ酸及びＹＩＧＳＲ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）を有するペプチド−両親媒性種は、本発明の実施形態の実施において、ペプチド−両親媒性物質、それらの自己組織化ナノ繊維又はセルあるいはナノ繊維ゲルへの神経細胞内で細胞−基体付着を促進するために用いることができる。歯質における例えとして、ホスホホリンタンパク質族は、アミノ酸配列Asp-Ser(P)-Ser(P) 及び Ser(P)-Asp-Ser(P)の多数の繰り返しを含む。これらの大量のリン酸化タンパク質は、ヒドロキシアパタイトのミネラル化において重要な役割を果たすことが推測される。従って、ホスホセリン残基を、自己組織化の後、その繊維が、長いペプチドセグメントによって表されるのと同様の高いリン酸化表面を表すことを可能にするペプチド配列に組み込むことができる。そのようなペプチドは、部分的に、ホスホホリンタンパク質中に見出されるホスファート基の繰り返し構成を捕捉する。
【００３８】
本発明の実施形態の実施において有用な種々のＣ又はＮ終端ペプチド−両親媒性物質は
、自動ペプチドシンセサイザーでの標準的なフルオレニルメトキシカルボニル化学を用い
て製造することができる。ペプチド両親媒性溶液は、ｐＨの変更、塩の添加によってある
いは荷電又はキレート化ペプチド両親媒性物質の添加によってナノ繊維に形成することが
できる。本発明の実施形態で使用することができる典型的なペプチド両親媒性物質を以下
の表１から３に示す。表１から３に挙げたようなペプチド両親媒性物質のナノ繊維への形
成は、Hartgerinkら、Science、 294、1683-1688、(2001)及びHartgerinkら、PNAS、99、
5133-5138、(2002)（全趣旨を参照することによりここに取り込む）によって示されてい
る。他のペプチド両親媒性物質は、公知の方法、合成技術あるいは所望の両親媒性組成物
又はペプチド配列によってそれらの容易な改変を用いて、当業者によって知られているよ
うに製造することができる。例えば、ここで提供されたペプチド両親媒性物質は、係属中
の出願ＳＮ10/294,114号、2002年11月14日出願及び第10/368,517号、2003年2月18日出願
（全趣旨を参照することによりここに取り込む）に開示されているように製造、特徴づけ
及び／又は組織化することができる。 限定されることなく、そのような組み込まれた出
願のペプチド両親媒性物質は、それらの表、図及実施例に記載されているように、本発明
の組成物及び方法と併せて用いることができる。
【００３９】
【表１】
0004837553.tif 000002
所望の細胞又は組織成長に依存して、リン酸化部分は必要でないかもしれない。上述し
たように、細胞付着又は相互作用は、ペプチド成分の特定の配列によって促進される。PA
10から12及び15に関して、非−RGD配列は、細胞標的に依存して利用することができる。
特に、ＩＫＶＡＶ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）は、他の文脈において、ニューロンの成長及び発達に重要であることが確認されている。従って、本発明の両親媒性組成物は、対応する用途に対するそのような配列を有するペプチド成分を含むことができる。最後に、表１に関して、いくつかのＰＡ組成物はシステイン残基を含まないことに注意を要する。システインアミノ酸は、分子内ナノ繊維安定性を高めるために用いることができるが、ミセル又はナノ繊維の自己組織化には必要でなく、ペプチド両親媒性物質又はそれらのミセルの第２表面への結合のために必要でもない。好ましい実施形態では、システインアミノ酸は、ペプチドの結合反応中に、自己組織化ミセル又はナノ繊維を安定化するために存在する。  また、繊維及びミセルに自己組織化するトリブロックボラ両親媒性物質が、本発明の実施において有用であるかもしれない。
【００４０】
一実施形態では、ここで説明した１以上の両親媒性組成物の水性溶液及び物理的条件下
でゲル化を誘導するのに十分な因子又は試薬が添加される。そのような種々のＰＡ組成物
のナノ繊維へのゲル化及び／又は自己組織化は、乾燥、多価、二価又はより高い原子価の
金属イオン、キレート化及び／又は種々の荷電両親媒性物質の組み合わせによって、実質
的に中性のｐＨ条件下で達成することができる。
【００４１】
【表２】
0004837553.tif 000003
電極、ステント、スカフォールド又は外科用デバイスあるいは他の第２表面は、種々の
方法で、ナノ繊維又はミセルを含むペプチド両親媒性物質で被覆することができる。第２
表面は、その表面にアミン又はカルボン酸基を有し、透析された、予め自己組織化された
ペプチド両親媒性ナノ繊維又はミセルの懸濁液中に配置させることができる。あるいは、
ナノ繊維ゲルの小さなサンプルを、しばらくの間、電極、ステント、スカフォールド又は
外科的デバイスに塗布し、次いで溶媒で洗浄して過剰のゲルを除去してもよい。また、ペ
プチド両親媒性物質の溶液を、基体に噴霧、エアロゾル化してそれに被覆し、次いで、酸
性蒸気にさらしてナノ繊維又はミセルを形成してもよい。あるいは、電極、ステント、フ
カフォールド、外科的デバイスを、ペプチド両親媒性物質の容量中に配置し、取り出し、
酸性蒸気にさらし、塩溶液又は溶液を含むペプチド両親媒性物質に浸漬し、ナノ繊維を形
成してもよい。第２表面への被覆は、これらの方法を組み合わせて行ってもよく、意図す
る用途のために十分な被膜を確保するために必要に応じて繰り返してもよい。次いで、被
覆された表面は、例えば、ＮＭＰ中のＨＢＴＵ及びＤＩＥＡで処理し、第２表面にペプチ
ド両親媒性物質を結合させる。
【００４２】
ナノ繊維中にシステインアミノ酸を有するそのような被覆基体を酸素、イオジン、過酸
化水素又はオゾンのような酸化物質へさらすことは、ジスルフィド結合の共有捕獲及び形
成に有用かもしれない。そのような被膜は、細胞成長速度を高めるために続いて加熱され
るかもしれないスカフォールド及びデバイスに被覆されたナノ繊維に、熱安定性を与える
ことができる。
【００４３】
他の化合物を、被膜を形成する自己組織化ペプチド両親媒性コアに取り込むか、封止し
てもよい。これらの化合物は、移植後の血管の内植又は第２基体を被覆するナノ繊維の生
体への伝達を高めるかもしれない。また、栄養物、成長因子、分化又は脱分化の誘導物質
、免疫調整剤、炎症阻害剤、リンパネットワーク又は神経線維の内植を高める又は可能に
する生物活性剤ならびに薬物を、自己組織化ペプチド両親媒性ナノ繊維被膜に取り込んで
もよい。細胞増殖に影響を与える多くの剤が平滑筋細胞の増殖を遅らせる又は阻害する試
みにおいて狭窄及び再狭窄の医薬治療剤として試験されている。これらの組成物は、ヘパ
リン、クロマチン、アスピリン、魚油、カルシウムアンタゴニスト、ステロイド及びプロ
スタサイクリンを含むかもしれない。そのような剤を、繊維中に全体的に封入してもよい
し、薬物伝達カテーテルを用いてより局所的に付加的に与えてもよい。  特に、１以上の
医薬品を含む生体分解可能なペプチド両親媒性ナノ繊維を治療部位に移植してもよい。ナ
ノ繊維が分解されるに従って、医薬品が治療部位で直接放出される。
【００４４】
多くの細胞は、自己組織化ペプチド両親媒性ナノ繊維の被膜を有する電極、ステント、
スカフォールド、外科的デバイス上で成長することができる。スカフォールド又は外科的
移植片の被膜は、特定の細胞型の最適な成長のために選択されたペプチドを有するペプチ
ド自己組織化ペプチド両親媒性ナノ繊維を含む。例えば、RGD、IKVAV（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）、KGE、RGDS（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）ペプチド配列を有するペプチド両親媒性物質及びそれらからなる自己組織化ナノ繊維又はそれらの組み合わせは、細胞成長に最適かもしれない。
【００４５】
移植に適する細胞の例は、限定されないが、肝細胞及び胆管細胞、膵臓の島細胞、上皮
小体細胞、甲状腺細胞、ホルモン−生成生殖巣細胞を含む副腎−視床下部−脳下垂体軸の
細胞、上皮細胞、神経細胞、心筋細胞、血管細胞、リンパ管細胞、腎臓細胞、腸管細胞、
骨形成細胞、軟骨形成細胞、平滑筋形成細胞及び骨格筋形成細胞を含む。
第２表面は、自己組織化ペプチド両親媒性物質に付着した細胞への栄養物及び成長因子
の適当な拡散を可能にするために表面積を最大限にする形状にすべきである。密に圧縮さ
れた細胞による適当な拡散は、栄養物及び酸素が血管から周辺組織に拡散する生体内で起
こるのと同様の条件下で、約２００から３００μｍの範囲で起こすことができる。
【００４６】
本発明では、細胞は、組織培養の分野の当業者に公知の技術を用いて、初期に培養する
ことができる。しかし、一旦細胞が成長し始め、自己組織化ペプチド両親媒性物質被覆電
極、ステント、スカフォールド又は外科的デバイスを被覆すると、それらは付着、成長及
び機能に適する患者の部位に移植される。フカフォールドを被服する生体分解可能な自己
組織化ペプチド両親媒性物質の利点の一つは、インビボでナノ繊維被膜が分解するに従っ
てそれらがゆっくり放出されるように、脈管形成化合物を、自己組織化ペプチド両親媒性
ナノ繊維に直接取り込むことができることである。細胞−自己組織化ペプチド両親媒性ナ
ノ繊維構造は血管化され、その構造が分解するに従って細胞はそれらの本来の性質に従っ
て分化するであろう。
【００４７】
第２表面、例えば、多孔質スカフォールドは、自己組織化ペプチド両親媒性ナノ繊維組
成物で被覆することができ、それは、インビボで機能的器官組織を生成するために移植用
にインビトロで製造することができる。そのスカフォールドは、生体適合可能、生体分解
可能又は非生体分解可能とすることができる自己組織化ペプチド両親媒性ナノ繊維で被覆
された三次元構造である。そのようなフカフォールドの例は、Porex Corporation, Fairb
urn, GA、Mykrolis Corporation Billerica, MA及びRobocasting, Albuquerque, NMから
入手可能な多孔質セラミック材料を含む。ナノ繊維又はミセルは、細胞成長及び付着を誘
発及び支持することができるアミノ酸を伴うペプチド両親媒性物質を有する。種々の組織
由来の細胞を、好ましくはインビボで機能組織を生成するために十分量で、ナノ繊維被覆
スカフォールドの全てを均一に、インビトロにおいて繊維表面に付着させる。あるいは、
細胞−スカフォールド組成物に血管の成長を可能にするための適当な血管新生を有する患
者の部位に移植される細胞−スカフォールド組成物を、栄養物溶液中、インビトロで、形
成するために、組織又は細胞を、自己組織化ペプチド両親媒性ナノ繊維被覆スカフォール
ド上に成長させる。血管形成を刺激する成長因子、化合物及び免疫調整剤は、細胞−スカ
フォールド組成物を被覆するナノ繊維に結合させることができる。種々の細胞集団を含む
ペプチド両親媒性ナノ繊維細胞−スカフォールド組成物の組み合わせを移植することがで
きる。
適切な場合、免疫抑制剤を第２表面又はスカフォールド、移植片又は電極の部位に注入
することができる。あるいは、免疫抑制剤を、自己組織化ナノ繊維又はミセル被覆スカフ
ォールド又は外科移植片に組み込むことができる。
【００４８】
ある条件下において、生体は、その多くの作用のうちの細胞アポトーシスへの影響を有
する他の薬物を自然に生成する。Aminらの米国特許第5,759,836号（全趣旨を参照するこ
とによりここに取り込む）において説明されているように、窒素酸化物(NO)は、誘導酵素
、窒素酸化物シンセターゼ（動脈ホメオスタシスに有益なタンパク質の族に属する）によ
って生成される。しかし、窒素酸化物のアポトーシスの調整における作用は複雑である。
プロアポトーシス作用は、多量のNOが酸化窒素シンターゼの誘導性によって誘導される異
常生理学条件に関連するようである。それに反して、抗アポトーシス作用は連続的な低い
レベルの内皮のNO放出に起因し、それは、アポトーシスを阻害し、NOの抗アテローム性動
脈硬化機能の一因となると考えられる。"Nitric Oxide and Apoptosis:  Another Paradi
gm For The Double-Edged Role of Nitric Oxide" (Nitric Oxide 14:275-281,1997) に
おいて、Dimmelerが、窒素酸化物のプロ及び抗アポトーシス作用を議論している。窒素酸
化物シンターゼを封入する自己組織化ペプチド両親媒性ナノ繊維は、ステント等の移植さ
れた外科用デバイスを被覆するために用いることができる。
【００４９】
一実施形態では、スカフォールド又は外科用移植片が、表１及び表２のペプチド両親媒
性物質からなるナノ繊維で被覆される。ステント、スカフォールド、電極又は外科用デバ
イスは、当該分野で公知で、必要とされる表面特性を含むように適合させることができる
（例えば、成型、打ち抜き、組み立て等）いずれかの適当な基体から形成することができ
る。好ましいスカフォールド及びステントは、金属、セラミック又は三次元不織マトリク
スを形成するために均一に横たわるポリマー繊維を含む材料から形成され、高い多孔質、
一般に約５０％から約８５％の範囲、好ましくは少なくとも約７５％を示す複雑に配置さ
れた構造を形成するために焼成される。スカフォールド繊維は、一般に約１μｍから２５
μｍの範囲の直径を有する。第２構造における平均的な有効孔のサイズは、孔及び間隙へ
の細胞の内植が高められるように（例えば、約１μｍから約１００μｍの平均直径を有す
る）することができる。
【００５０】
自己組織化ペプチド両親媒性ナノ繊維で被覆された基体表面（つまり、電極、外科用デ
バイス又は移植片、ステントあるいはスカフォールド）は、ステンレス鋼、タンタル、ニ
チノール、エルギロイ（elgiloy）のような金属及び合金、サファイア又は窒化シリコン
のようなセラミック、ポリテトラフルオロエチレン、PFA又はポリエチレンのようなポリ
マーあるいはこれら材料の組み合わせを含む生体適合性材料から形成することができる。
スカフォールドおよび／又はナノ繊維は、生体分解性又は非生体分解性であってもよい。
スカフォールド又はステントは、適当な適用のために、全体に自己支持型及び成型ナノ繊
維ゲルから形成することができる。ナノ繊維ゲルは分解性であるかもしれない。被覆スカ
フォールド又は移植片はコラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン及びこれらの複合混合
物のような細胞外成分で被覆されていてもよい。好ましいマトリクス構造が、栄養物が拡
散によってのみ供給されるところで通常達成することができるよりも、より高い固定化細
胞密度を可能にするために、細胞が移植以外の目的のための培養において成長する場合、
非分解性材料は特に有用である。ステント、スカフォールド又は外科用移植片は、生体適
合性の非多孔質ポリマー、あるいは溶解可能塩の粒子をそれらの硬化前に組み込み、次い
で、塩粒子を溶解除去してそこに空洞又は空隙を残すことによって多孔が形成されたポリ
マーから形成することができる。ポリマーは、多くの医療グレードのプラスチック、限定
されないが、高密度ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリウレタン、ポリスルホン、ナイ
ロン及びポリテトラフルオロエチレンを含む生物安定性又は生物吸着可能なものとするこ
とができる。多孔質ポリマーステント本体は、約３０μｍから約６５μｍの範囲の平均粒
径の孔を有するように、当該分野で公知の方法によって形成することができる。
【００５１】
自己組織化ペプチド両親媒性ナノ繊維によってもたらされる生物学的信号は、移植すべ
き細胞又は組織の種類に適するものとしなければならず、周囲環境に細胞をさらすことを
最大限にしなければならない。また、血管形成及びスカフォールド又は組織浸潤を促進す
る細胞の能力を高めるように設計されなければならない。
【００５２】
本発明の一実施形態では、ステントは、自己組織化ペプチド両親媒性ナノ繊維で被覆さ
れる。被覆ステント本体は、表面に打ち抜き又は成型された表面特性を有するに生物適合
性ポリマー又は生物適合性金属から形成することができる。適当な可撓性が、当業者に公
知の本体における操作のためにステントに与えられるべきである。例えば、本発明のステ
ント本体は、焼成金属繊維の多孔質マトリクス又はポリマーのような、多孔質の生体適合
性材料から形成することができる（孔はそこへの内植細胞の組織化を促進するサイズであ
る）。自己組織化ペプチド両親媒性ナノ繊維は、ポリマー又は金属の表面及び／又は孔全
体に適用される。
【００５３】
自己組織化ペプチド両親媒性ナノ繊維被覆ステント本体は、被覆ステントが細胞−リッ
チな媒体中で培養された場合又は被覆ステントが、哺乳動物のような被験者中の血管又は
他の管状生体内腔に移植された場合に、生存細胞によるステントの浸潤及び個体数を促進
するように設計される。さらに、被覆ステント本体の表面特性は、被覆ステント本体の表
面特性の配置及び直径によって決定される特定のパターンで細胞成長が行われるように、
自己組織化ペプチド両親媒性ナノ繊維被覆ステントへ浸潤及び棲息する生存細胞をもたら
すように選択される。そのような予め決定された細胞成長のパターンの一例は、血管形成
及び／又は新血管新生である。
【００５４】
孔が貫通した自己組織化ペプチド両親媒性ナノ繊維被覆表面（つまり、ステント、電極
又はスカフォールド）は、当該分野で知られているように、細胞培養条件下、被覆表面が
、細胞−リッチな媒体（例えば、0.8 mlの培地中、内皮細胞6から10×104 ）中に培養さ
れる場合、生存細胞が容易に生息するであろう。そのような細胞培養方法は、例えば、上
のD.A. Dichekら（全趣旨を参照することによりここに取り込む）で述べられている。そ
のような孔を有する自己組織化ペプチド両親媒性ナノ繊維被覆表面又は基体には、生体環
境を取り巻くものと同様の組織化された細胞構造を作り出すように、細胞が、周囲細胞環
境から容易に浸潤することができる。
【００５５】
基体（例えば、電極、スカフォールド、ステント又は外科用デバイス）の表面は、三次
元形態を前提とする水性環境が広がり又は密集する生体適合性物質の層を含むことができ
、その層は、少なくとも基体表面の一部を被覆する。例えば、生体適合性物質は、ヒドロ
ゲル層が、多孔質三次元層を作り出す水性環境と接触することによって水を吸収するにつ
れて広がるように、１以上のヒドロゲルであるか、ヒドロゲルを含むことができる。ある
いは、ヒドロゲルは、さらに、ペプチド両親媒性物質又は自己組織化ペプチド両親媒性物
質を含むことができる。ステントの場合、ヒドロゲル及びペプチドナノ繊維の広がりは、
取り巻く組織を支持し、内皮細胞成長の部位に与えられる。
【００５６】
自己細胞は、宿主対象の生体内におけるそれらの必要とする部位への配置の後、自然に
自己組織化ペプチド両親媒性ナノ繊維被覆基体（スカフォールド、ステント、電極又は外
科用デバイス）に侵入し、基体が移植された生体部位を作り上げる細胞に応じて変化する
組織化された細胞構造を自発的に発生させる。例えば、内皮又は他の適当な細胞は、当該
分野で公知の方法を用いて、移植前の生存ナノ繊維被覆ステントを作り上げる細胞培地実
験において、自己組織化ペプチド両親媒性物質被覆ステントに侵入させることができる。
例えば、生存ペプチド両親媒性ナノ繊維被覆基体は、本発明に従って得ることができ、そ
のペプチド両親媒性ナノ繊維被覆基体は、内皮細胞、平滑筋細胞、白血球、単核細胞、上
皮細胞、多核白血球、リンパ球、好塩基球、繊維芽細胞、幹細胞、上皮細胞、好酸球等及
びそれらのいずれか２種以上の組み合わせから選択される生存細胞が棲息する。
【００５７】
一般的な血管内ステントは、約2.0mmから約6.0mmの範囲の外径及び約0.1mmから約12mm
、例えば、約0.1mmから約1.0mmの範囲の壁厚を有することができる。粒径は、ステントが
移植される箇所の解剖学的構造に依存する。ステントは拡張可能であり、例えば、そのよ
うな設計は、米国特許第5,059,211号（参照することによりここに取り込む）に開示され
ており、それは、多孔質ポリマー材料からなる拡張可能なステントを開示している。ステ
ントは、カテーテルによって伝達することができる。
【００５８】
本発明の方法の利点は、パッセンジャー白血球及び抗原−提示細胞の移植なしに、必要
な生物学的機能を有する実質細胞の選択的な移植手段を提供することである。その結果、
薬物の使用なしに、組織の拒絶のリスクを大幅に減少する。本発明は、培地に、欠損したタンパク質生成物を形成する新たな遺伝子を導入する間、細胞を操作することができ又はそれらを細胞表面に抗原発現を抑制するために修飾することができるため、器官機能の損失を処置する他の手段に他の利点を有し、そのため、同じHLA組織型の細胞が有効でない場合に、免疫抑制が必要でない。
【００５９】
本発明の自己組織化ペプチド両親媒性ナノ繊維被覆基体（ステント、電極、スカフォー
ルド）は、治療される特定の生体器官によって指向されるように、当該分野で公知のいず
れかの外科的技術を用いて移植することができる。
【００６０】
本発明の処理方法の実施形態における自己組織化ペプチド両親媒性ナノ繊維被覆第２表
面に内植する生存細胞は、有益な生物活性剤を封入することができる。例えば、被膜のナ
ノ繊維は、基体が移植される被験者の自己細胞、所望の生物活性剤を自然に生成する、移
植前に基体にシード化された細胞又は所望の生物活性剤を生成するために遺伝的に修飾さ
れた細胞を封入することができる。本発明の方法の実施に有用である１以上の生物活性剤
を自然に生成する生存細胞は、内皮細胞、平滑筋細胞、白血球、単核細胞.、多形核白血
球、リンパ球、好塩基球、繊維芽細胞、幹細胞、上皮細胞、エオシン好性白血球等及びそ
れらの適当な組み合わせを含む。そのような細胞は、供与又は自己細胞のいずれでもよい
。
【００６１】
あるいは、本発明の治療方法の実施形態で使用される被膜におけるナノ繊維カプセル化
細胞又は化合物は、組換え遺伝子生成物が、被覆された第２表面を有する移植片部位に伝
達されるように、患者に適当な化合物の伝達に応えて生物活性剤を急送又は放出するよう
に設計することができる。
また、神経成長は、例えば、適当な神経細胞成長ペプチド配列を含む自己組織化ペプチ
ド両親媒性ナノ繊維で被覆された電極又は他の表面によって促進される。繊維長に沿う神
経の成長を受けて、構造物は、適当な位置に移植され、神経源から神経機能が望まれる領
域に拡張する。
【００６２】
１以上の細胞系の付着のためのナノ繊維の単一被膜を有するスカフォールド又は外科用
移植片を用いる方法の変形において、被覆スカフォールドは、最初の細胞付着及び成長が
各集団で別々に起こるように、異なる自己組織化ナノ繊維の被膜で構成される。また、単
一のスカフォールドは、種々の細胞タイプの付着を最適化するために異なる材料で形成す
ることができる。付着は、細胞及び構造物組成双方の機能である。例えば、リン酸化アミ
ノ酸及びRGDペプチド配列を有するペプチド両親媒性物質のようなコラーゲンからなるナ
ノ繊維で外科的移植片を被覆すると、細胞の付着を増大させることができる。他の実施例
では、自己組織化ペプチド両親媒性ナノ繊維（リン酸化アミノ酸及びRGDペプチド配列を
有する）は、生体分解可能なスカフォールド上に被覆することができる。スカフォールド
の移植及び分解の後、血管細胞は、所望の箇所に血液を配送するために適当な接合を形成
する。器官による排出口は、類似の方法で構築されるかもしれず、常に、細胞の本来の作
用を活用する。リンパネットワーク及び神経線維の内植も促進するかもしれない。
【００６３】
任意に、ナノ繊維被覆表面又はスカフォールドへの成長のため、細胞を、供与者から、
もしくはナノ繊維被覆スカフォールド上にインビトロで処理し、培養し、次いで、被験者
に再導入された宿主被験者から得ることができる。現在の好ましい実施形態では、移植さ
れた細胞を、被験者に対して「自己」とし、細胞の供与者および受容者が一人で、同じこ
とを意味する。
【００６４】
本発明の方法の実施形態による自己組織化ペプチド両親媒性ナノ繊維被覆スカフォール
ド、電極、ステント又は外科用デバイス中にカプセル化されることによる伝達に適する生
物活性剤は、傷中で毛細管の形成を調整し、かつ毛細管を被覆し、かつ支持するために平
滑筋を誘引するものを含む、哺乳動物の生体が血管形成を刺激するために利用するこれら
の生物活性剤を含む。被膜のナノ繊維中にカプセル化することができるそのような生物活
性剤の例は、血管内皮成長因子(VEGF)、繊維芽細胞成長因子(FGF)、特にFGF-1、アンジオ
ポイエチン１、トロンビン等を含む。本発明の方法による伝達に適する生物活性剤のさら
なる例は、血小板伝達成長因子-A (PDGF-A)、変換成長因子β(TGF-β)、核因子Kβ(NF-Kp
)、誘導性酸化還元制御転写因子等のような、抗増殖性、抗再狭窄又はアポトーシス剤を
含む。
【００６５】
この開示で説明した方法は、種々の生物学的応答を活性化又は改質することができる生
物材料又は他の表面に特定の生物機能ペプチド配列を伝達するために使用することができ
る。そのような応答は、基体又は生物材料に結合したペプチドに対する選択的な結合、細
胞増殖の改善又は増大、あるいは生物スカフォールドの選択的な分解をも含むことができ
る。この機構は、薬物伝達にも適用することができる。薬物又は他の治療用分子は、安定
なミセル組織中に取り込むこともできるし、それらはナノ繊維表面に化学的に結合するこ
ともできる。骨再生、歯科再生及び心血管ステント改質を含む分野におけるこの方法の適
用の広範囲な可能性があるであろうことが予想される。
【００６６】
上述したように、本発明の方法及び組成物はまた、一体構造の形態において通常結晶材
料のナノ結晶又は結晶性が不十分な相の成長を、好ましくは基体上の被膜として提供する
ことができる。ナノ結晶相は、溶解した結晶材料と、被膜の結晶材料に取り込まれ及び材
料の結晶領域の大きさを減少させる添加剤とを含む溶液で、その表面にミネラルをプレシ
ード化された基体を接触させることによって形成される。添加剤は、ナノ結晶形体を与え
、また、他の分子での被膜に化学的に反応するためのさらなる反応機能性を与える。その
組成物は、被膜を有する基体、特に多孔質やチャネルのような微細な特性を有するこれら
基体の表面有効範囲を増大させる。被覆基体は、インビトロ及びインビボにおいて、ナノ
結晶被覆基体材料上への細胞成長のために使用することができる。
【００６７】
本発明の組成物は、限定されないが、ポリマー又はそれらの酸付加塩のような有機添加
剤及び溶解した材料成分を含む溶液であることが好ましい。結晶材料の成分は、分子又は
イオンであってもよい。溶液は、結晶成分ならびに添加剤を溶解することができるもので
あるべきである。溶液は、水性溶液、有機溶液又はそれらの組み合わせであってもよく、
エタノール、アミン及びそれらの酸付加塩、アミノ酸、界面活性剤のような有機液体なら
びに結晶材料の溶解性成分を含んでいてもよい。
【００６８】
結晶成長を阻止し、通常の結晶材料のナノ結晶相をもたらす組成物中の有機添加剤は、
ポリアミン、酸又はそれらの塩を含む。その添加剤は、被膜の分解に対するその反応性を
制御するために選択することができる。他の添加剤は、ポリアミノ酸又はカルボン酸、ス
ルホン酸、リン酸、アミン基、チオール、ヒドロキシル基またはこれら基の組み合わせの
ような側鎖を有する他のポリマーであってもよい。ポリマー中のこれらの基は、ジスルフ
ィド、アミド又はペプチド結合を介して、ペプチドのような他の生物関連分子に結合させ
るために用いることができる。溶液中のポリマー又はその塩の濃度は、約100 mM未満、好
ましくは10から20mMとすることができ、その濃度は、被膜の形態を制御するために使用す
ることができる。添加剤の濃度が低ければ、有機添加剤の濃度が高いものよりも結晶形態
の破壊がより少なくなることが予想される。本発明に有用なポリマーは、天然源から誘導
することができ、当業者に公知の固相合成技術によって形成することができ、あるいは、
それらをアルドリッチケミカル（Milwaukee WI）のような供給源から購入してもよい。
【００６９】
それに組み込まれた有機添加剤を有する基体上の好ましい被膜は、図３Ａ及び図３Ｂに
示されたように、有機添加剤なしに基体上に堆積された材料の溶液によって形成されたも
のよりも、より小さい形態学的特徴を有する材料をもたらす。被膜の好ましい特性は、約
2000ｎｍ未満のサイズのものである。基体上の被膜の厚みは、約50μｍ未満、好ましくは
約10μｍ未満であり、より好ましくは１μｍ未満である。薄い被膜は細胞付着を与え、チ
タン又はタンタルの生物学的発泡体のような多孔質の基体における小孔の閉塞を減少させ
る。
【００７０】
好ましくは、有機添加剤の添加は、ナノ結晶又は不十分な結晶ミネラル相を形成するよ
うに、結晶形成に影響を与えるであろう。そのような特徴は、細胞再構築中に、被膜材料
を、特に酸分解させやすくする。あるいは、被膜材料は、生理学的条件下で、限定されな
いが、プロナーゼ及びトリプシンのような生物酵素による酵素の攻撃に敏感になるかもし
れない。ミネラル複合体の有機成分が酵素によって消化される場合、そのような酵素によ
って被膜も破壊される。被膜に取り込まれた添加剤は、それがインビボでの自然発生再構
築に対して敏感になるために、これら２種の主な分解手段（酸及び酵素）に敏感であるこ
とが好ましい。材料被膜中の種々の酸又は酵素消化に対する有機添加剤の感受性は、製造
された被覆基体を生物学的活性酵素又は生理学的溶液で処置する間に、被膜形態（たとえ
ば、走査型電子顕微鏡による）及び化学物質（例えば、Ｘ 線光電子分光法による）にお
ける経時変化によって、監視することができる。これらの分解された被膜からのミネラル
副生成物は、新たなミネラル化組織の形成に用いることができる原料として利用するたこ
とが期待される。
【００７１】
被膜材料は、溶液中に溶解している。そのような被膜に有用な無機材料は、限定されな
いが、ヒドロキシアパタイト、フルオロアパタイト、カーボネートフルオロアパタイト、
カーボネートヒドロキシアパタイト及びそれらの組み合わせを含むことができる。また、
リン酸カルシウム、シュウ酸カルシウム、炭酸カルシウム及びこれら無機材料の組み合わ
せも有用である。リン酸カルシウムは、限定されないが、リン酸二カルシウム二水和物、
リン酸オクタカルシウム、マグネシウム置換リン酸カルシウムを含んでもよい。限定され
ないが、Zn+2 又はMg+2のような無機イオンもプレシードにCa+2 塩に組み合わせてもよい
し、被膜に組み込んでもよい。これら無機材料及びこれらの材料の塩は、天然源から又は
アルドリッチケミカル（Milwaukee WI）のような化学物質の供給者から得ることができる
。溶液中の被膜材料の各成分の好ましい濃度は、約100ミリモル未満とすることが好まし
い。
【００７２】
被膜溶液の温度は、被膜プロセスの速度及び形態を制御するために用いることができる
。溶液のその温度では有機ポリアミンを分解しない。温度は、約７５℃未満とすることが
でき、好ましくは約５℃から４０℃の範囲である。
【００７３】
被覆される基体は、生体適合性材料であることが好ましく、ポリマー、金属、金属合金
、セラミック又はこれらの組み合わせとすることができる。基体は、被覆前にその意図す
る用途に適した形状を有することが好ましい。移植片の例は、股関節及び膝関節、破壊し
た骨用のプレート及びピン、歯科インプラント及び他の再構成物を含む。本発明の実施に
おいて有用な基体は、酸化物表面、水酸化物表面又は基体表面の少なくとも一部を被覆す
るこれら基の組み合わせを有していてもよい。被膜は、その上に堆積される材料又は他の
材料のシード層の核形成を可能にする官能基を含む表面を有していることが好ましい。表
面における官能基の例は、限定されないが、酸化物、水酸化物、リン酸化物、及びカーボ
ネートを含む。本発明の実施に有用な金属及び合金は、限定されないが、チタン及びその
合金、外科用スチール、アマルガム、Ｃｏ−Ｃｒ合金、タンタル又はシリコン及びシリカ
系材料を含む。基体は、チタン合金であることが好ましく、その例は、整形外科用及び歯
科用インプラントに有用なTi6A14Vと呼ばれているチタン合金である。金属又は合金は、
バルク材料、多孔質発泡体であってもよく、セラミックのような他の基体上の接着性フィ
ルムのような被覆又は堆積されたものであってもよい。適切なセラミック材料は、酸化物
及び水酸化物の機能性が存在しており、例えば、アルミナ、サファイア及び焼成アパタイ
トのようなリン酸カルシウムである。
【００７４】
基体のプレ−シード化を、被膜組成物又はそれにして構造的に同様のものの成分を利用
して行うことができる。基体は、有機添加剤を用いずに被膜溶液で基体を被覆することに
よって、被膜材料を用いてプレ−シード化してもよい。例えば、CaC12及びNa2HPO4のシー
ド組成物溶液を、CaC12、Na2HPO4及びポリ（Ｌ−リシン） を含む溶液でそれに被覆する
前に基体に接触させるために用いることができる。基体は、CaC12と接触させ、次いで、N
a2HPO4と接触させることが好ましい。プレ−シード化は、基体上に被覆材料のシード層を
定着させることが望ましい。また、シード被膜は限定されないが、化学気相堆積法、原子
層化学気相堆積法又はスプレーコーティングを含む他の方法によって形成してもよい。
有機添加物を含む被膜材料で被覆された基体を、細胞、組織の成長又は付着のために、
あるいは治療用組成物を放出させるために用いてもよい。組織の例は、限定されないが、
骨及び象牙質を含んでもよい。被覆基体は、適当な細胞、栄養物及び細胞組織成長用の他
の試薬が入ったベッセル中にそれを配置することによって、インビトロで、細胞又は組織
を培養するために用いることができる。被覆基体又はその上に細胞の培養物を有するもの
は、患者の細胞、組織、象牙質又は骨の成長又は培養のための移植後にインビボで用いる
ことができる。基体は、材料中へのポリ（アミノ酸）のような有機添加物の組み込みによ
って改質された材料で被覆される生体適合材料から形成されるであろう。
【００７５】
材料及び有機添加剤で被覆された基体を、限定されないが、被膜に結合したアミノ酸、
ペプチド又は自己組織化ペプチド両親媒性物質のような他の分子を含むために、さらに改
質してもよい。例えば、CaP層への pLyの組み込みは、被膜への官能化生体分子の結合の
ための有効な化学的つなぎ鎖を誘導する。ポリ（Ｌ−リシン）の正荷電遊離アミノ側鎖は
、負荷電分子との静電気的相互作用によって、あるいはリシンの遊離アミンと標的分子の
カルボン酸との間でアミド結合を形成することのいずれかによって結合リンカーとしての
役割を果たすことができる。被膜に組み込まれた有機添加剤の化学的機能性は、成長因子
、ぺプチド配列のような生体分子又は治療薬の取り込みのために使用することができる。
また、ペプチド又は自己組織化ペプチド両親媒性物質は、ポリ（アミノ酸）のような被膜
材料へ取り込まれた有機添加剤の反応基に結合することができ、あるいは、分子又は自己
組織化両親媒性物質の結晶材料自体への結合によって結合することができる。そのような
結合は、限定されないが、アミド、エステル及びジスルフィド結合を含む。被膜中の有機
添加剤へ結合した好ましいペプチドは、種々のタイプの細胞付着のために有用であるアミ
ノ酸配列を含むことが好ましい。種々のタイプの細胞のそれへの付着に有用なアミノ酸配
列を有する非対称のペプチドは、限定されないが、表３に示したものを含む。また、米国
特許第5,670,483及び米国特許第5,955,343号（全趣旨を参照することによりここに取り込
む）のような非対称ペプチド両親媒性物質が、本発明の実施において有用かもしれない。
また、ボラ（Bola）両親媒性及び自己組織化ボラ両親媒性物質は、本発明の被膜への結合
のために有用かもしれない。種々のタイプの細胞のそれらへの付着に関連するアミノ酸配
列を有する自己組織化ペプチド両親媒性物質は、表３のペプチドから製造することができ
る。
【００７６】
【表３】
0004837553.tif 000004
あるいは、基体上の被膜は、また、被膜との結合によって、ペプチド又は自己組織化ペ
プチド両親媒性物質へ結合することができる。基体上の被膜に結合した自己組織化ペプチ
ド両親媒性は、細胞への接着、成長因子を促進するためのカプセル化された薬物、治療剤
、薬物又は生物関連ペプチド配列をさらに含んでいてもよい。ペプチド両親媒性物質は、
基体被膜へ結合した自己組織化ペプチド両親媒性の安定性を高めるために、チオール部分
のような又は他の架橋のためのアミノ酸を有することができる。
【００７７】
基体上の被膜材料に組み込まれたポリマー構造は、限定されないが、成長因子、治療薬
、ペプチド及び自己組織化ペプチド両親媒性物質のような分子とさらに結合していてもよ
い。分子との結合は、ファンデアワールス相互作用、イオン結合、水素結合又はキレート
化によるものでもよい。あるいは、基体上の被膜材料は、限定されないが、ジスルフィド
結合及び好ましくはポリアミン及びペプチドとの間のエステル又はアミド結合を含む種々
の結合によって、ペプチド又は自己組織化ペプチド両親媒性と結合していてもよい。被膜
中のポリマーとペプチドとの間のアミド結合の形成は、例えば、限定されないが、N,Nジ
メチルホルムアミド (DMF) 又はNメチルピロリドン (NMP)（双方ともアミノ酸の安定化が
可能である）のような極性有機溶媒中で行うことができる。また、その方法は、ペプチド
両親媒性物質のカルボン酸官能基の反応性を増加させる触媒として、O-ベンゾロチアゾー
ル-N,N,N',N'テトラメチル-ウロニウム-ヘキサフルオロ-フォスファート(HBTU) のような
化合物の利用を含む。他のペプチドカップリング剤又は活性化剤は、限定されないが、ジ
シクロヘキシルカルボジイミド (DCC)、O(7アザベンゾロチアゾール lイル)1,1,3-,3-テ
トラメチルウロニウムヘキサフルオロフォスファート (HATU)及びベンゾトリアゾール1イ
ル-オキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスファート (PyBOP)を含む。こ
れらの反応性酸基は、次いで、遊離アミンと反応に付し、その後、プロトンシンクジイソ
プロピルエチルアミン(DIEA)の存在が最終脱離反応への助けとなって、HBTU及び水を除去
して、安定なアミド結合を残す。自己組織化ペプチド両親媒性物質を、基体の被膜への結
合又は付着の前に、ジスルフィド結合を介して架橋することができる。
【００７８】
基体を被覆する材料は、添加剤を組み込む金属欠如ミネラルから構成されていてもよい
。被膜に組み込まれた添加剤は、約２５重量％以下で存在させることができ、添加剤を用
いない被膜中の結晶に比較して、被膜中に存在する結晶の大きさを減少させる。添加剤は
、限定されないが、ポリ（アミノ酸）を含んでいてもよい。例えば、基体は、カルシウム
欠如リン酸オクタカルシウムミネラルからなっていてもよく、それは、ミネラル化の間に
存在するポリアミン、ポリ（L−リシン）によって結晶成長を阻止又は改質する。理論に
拘束されることを望まないならば、結晶化プロセス中に、ポリ（L−リシン）は、カルシ
ウム欠如リン酸オクタカルシウム材料に密接に組み込まれるかもしれない。この有機改質
から得られた被膜の形態は、図３ａ及び図３ｂの比較によって示されるように、純粋な無
機リン酸オクタカルシウムミネラル被膜よりも１から２桁小さい大きさの不均一な外観を
有する。この増加したテクスチャ及び減少した外観サイズは、細胞の付着、増殖及び拡散
に好ましい影響を与えることが期待される。さらに、破砕され、結晶特性に乏しく、ミネ
ラル複合体の酵素易損性の有機成分と結合した被膜は、本来の再吸収及び再成型プロセス
を特に利用しやすくするはずである。最終的に、被膜材料へのポリアミノ酸の組み込みは
、側鎖における遊離アミン又は酸を介してさらなる化学的な機能性を与える。そのような
化学的機能性は、成長因子、生物関連ペプチドのような生物学的分子又は治療薬の組み込
みに使用することができる。
【００７９】
本発明の一実施形態は、移植基体へ材料を被覆する方法である。その方法は、溶解した
被膜材料及び有機添加剤の溶液である組成物で、被膜と適合性のシード層を有する生物学
的に適合性の基体を被覆することを含む。その方法は、さらに、基体上にシード層を形成
し、基体上の被膜材料に分子又は自己組織化超分子構造を結合させる工程又は反応を含ん
でいてもよい。その被膜組成物は、組成物と基体を接触させるか、組成物で被覆するため
の当該分野で公知の方法によって、プレ−シード基体に適用してもよい。基体は、材料及
びポリマー（例えば、CaCl2、Na2HPO4及びポリ（L−リシン））を含む組成物中にそれを
浸すことによって被覆することができる。例えば、プレシード化された基体を、ポリ（ア
ミノ酸）酸を添加したCaCl2溶液に配置する。次いで、Na2HPO4のような塩をこの混合物に
添加し、サンプルをインキュベートする。被膜工程は、１回以上繰り返してもよい。多孔
質又はチャネルを有する基体に対して、基体（好ましくは小さな孔）を通して、または基
体を横切って、組成物を流すことによって基体を被覆することが好ましい。ポンプ及び組
成物用タンクを採用する閉ループ流システムを使用することができ、流速はポンプ、バル
ブ又は流量コントローラーによって制御される。あるいは、基体を、アトマイザー又は他
の噴霧器を用いて、被覆するためにスプレーしてもよい。新鮮な被膜組成物を用いた基体
の多層被膜は、被膜厚さ及び基体の均質性を高める。被膜材料は、有機添加剤の１から１
５重量％を含んでいることが好ましい。
【００８０】
図３A及び図３Bは、ポリ（L−リシン）のようなポリアミンが有する、プレ−シード化
された生体適合性チタン基体上でのリン酸オクタカルシウムの成長への著しい影響を示す
。図３Aの走査型電子顕微鏡写真では、純粋な無機被膜は、リン酸オクタカルシウムの大
きく（＞１μｍ）、良好に形成された板様結晶からなることを示す。これに対して、図３
ｂに示されたポリ（L−リシン）改質被膜は、破砕され、不均質な形状で、結晶特性に乏
しく、純粋な無機のミネラルよりも１から２桁小さい大きさからなる。これらの材料を構
成する外観の多くは１００ｎｍの大きさよりも小さく、材料に本来のナノスケールテクス
チャを与える。そのようなナノスケールテクスチャ又は形態は、細胞付着及び被膜の被覆
基体への拡散又は一体化したサンプルを促進することができる。このpLyOCP被膜の X線回
折は、さらにその不十分な結晶化特性を示し、それは、材料に、細胞の改造中の酸分解の
経路に対して敏感にさせるに違いない。pLyOCPのプロナーゼのような生物酵素（それは、
ミネラル複合体の有機成分が酵素によって消化された際、材料の被膜テクスチャ及び形態
を破壊する）での処理は、SEM及びエネルギー分散性X線スペクトル（EDS）によって示さ
れる。不十分な結晶有機−材料複合体被膜は特に酸分解に適するのみならず、酵素消化に
も適し、これらはインビボにおける本来の骨の再吸収のための２つの主な手段である。
【００８１】
ポリ（L−リシン）のようなポリアミンの存在は、被膜形態、結晶サイズ及び潜在的な
改造に影響を与えるのみならず、システムに化学的機能性の要素を与える。材料皮膜に取
り込まれたポリ（L−リシン）からの側鎖は、化学反応に有効な遊離アミドを含む。例え
ば、これらのアミンは、生物関連ペプチド配列の遊離酸とアミド結合を形成することがで
きる。図９は、ナノ繊維を形成するために自己組織化することができるペプチド両親媒性
物質を示し、それは、分子の脂肪族末端が繊維の中ほどに配列され、官能化ペプチド配列
が組織化されたナノ繊維の外側に露出される。分子中のシステイン残基を酸化条件にさら
すことができ、よって、分子間ジスルフィド結合の形成によってナノ繊維を共有的に安定
化する。分子の外側に露出したカルボン酸は、アミド結合を形成するためにポリ（L−リ
シン）からの遊離アミンと反応することができ、ペプチド両親媒性ナノ繊維が組織化され
たplyOCP表面に共有結合する。図１０Aは、チタン表面上のポリ（L−シリン）改変リン酸
カルシウム被膜へのナノ繊維束の付着を示す。図１０Bのより高倍率では、（L−リシン）
改質リン酸カルシウム被膜の下層の個々のナノ繊維（矢印参照）被覆組織化外観を解像す
ることを可能にする。この実施例で用いたペプチド両親媒性物質は、ホスホホリン、歯の
無機質化の制御に関連する象牙質−特異プロテインを狙って作られている。もちろん、ア
ミド結合のために必要なカルボン酸を露出する限り、ほとんどいずれものペプチド両親媒
性ナノ繊維をこの適用に用いることができる。逆に、遊離酸を表すリン酸カルシウム被膜
への有機添加剤への組み込みを、同様に遊離アミンを示すPAナノ繊維に結合させるために
使用することができる。ペプチド両親媒性物質は、pLyOCP表面へ付着することができる超
分子の集合体の例であるが、この化学的機能性は、同様に、個々の分子又はペプチド配列
の付着のために利用することができる。例えば、ペプチド配列argglyasp (RGD)は、通常
、細胞付着に関与するが、ply-OCP表面への細胞の付着を高めるために表面に結合させる
ことができる。
【００８２】
種々の物理的及び化学的分析を、本発明の方法及び組成物によって製造される被膜を特
徴付けるために使用することができる。XRD、RFTIR、XPS、TGA及び元素分析のような方法
を、添加剤での改質被膜が、添加剤を用いない結晶被膜に比較して外観サイズを減少して
いることを測定するために当業者によって使用することができる。また、種々の量の添加
剤を用いる形態における作用も、これらの方法によって測定することができる。例えば、
ミネラル相への添加剤の取り込みは、XRD及びFTIRによって見られる被膜の結晶性の破壊
ならびに被膜の化学的反応性又は細胞付着を促進する能力を表す。
【００８３】
実施例１
市販の純粋なチタン又は二酸化チタンを含むいずれかのチタン合金の表面を超音波で、
有機非極性溶媒、有機極性溶媒及び最後に蒸留水中で洗浄する。次いで、洗浄されたチタ
ンを、弱フッ化水素酸、硝酸溶液中でエッチングし、硝酸で再不動化する。不動化された
サンプルを蒸留水で完全にすすぎ、乾燥する。次いで、洗浄され、不動化したサンプルを
真空脱水によって脱水し、１２０℃で保存し、アミノ−シラン化する。乾燥し、不動化し
た表面を、窒素下、トルエンのような無水疎水性有機溶媒中のアミノプロピルトリエトキ
シシラン（APTES）のようなアミノシランの希釈溶液に導入した。アミノ−シラン化され
たチタン表面を、次いで、有機非極性溶媒、有機極性溶媒、最後に水で完全にすすぎ、６
０℃で１時間、窒素下でのアニールする。
【００８４】
PAナノ繊維のアミノ−シラン化TiO2表面への共有結合。N,N-ジメチルホルムアミド (DM
F)中の架橋ナノ繊維の懸濁液に、O-ベンゾトリアゾール-N,N,N',N'-トリメチル-ウロニウ
ム-ヘキサフルオロ-ホスファート(HBTU)及びジイソプロピルエチルアミン(DIEA)の溶液を
添加して、ナノ繊維の遊離カルボン酸ごとに、わずかに１当量よりも少ない（０．９５）
HBTU及びアミノ−シラン化チタン表面の見積もり遊離アミンごとに約６当量を供給する。
この溶液を、数分間インキュベートし、アミノ−シラン化チタン表面にさらす。一旦導入
したアミノ−シラン化チタンをナノ繊維反応溶液中で最小１時間振盪し、水で完全にすす
ぎ、室温で乾燥する。図１２A及び１２Bは、低及び高倍率のチタン表面へ共有結合したこ
れら繊維の画像を示す。
【００８５】
実施例２
プレ組織化ペプチドナノ繊維のチタン表面上のポリ（L−シリン）改質リン酸カルシウ
ム被膜への共有結合。PAナノ繊維の製造。ペプチドナノ繊維を、上記のように組織化、架
橋、透析、凍結乾燥及びDMF中で再懸濁した。
リン酸カルシウム被膜の製造。上記のように、チタン箔を洗浄、エッチング、不動体化
及び洗浄した。それらを乾燥し、それらをAPTESで処理するよりもむしろ、箔を、CaCl2及
びNa2HPO4の溶液中に、少なくとも３０分間浸し、リン酸カルシウムで表面をプレシード
化する。このプレシード化溶液を、次いで、ポリ（L−リシン、CaCl2及びNa2HPO4）を含
む溶液中に、少なくも３時間放置し、サンプルを水ですすぎ、室温で乾燥する。ポリ（L
−リシン）が、新たに形成されたリン酸カルシウム被膜の得られたミネラル相に取り込ま
れ、ポリ（L−リシン）の側鎖からの遊離アミンが組織化された被膜表面に表れたと考え
られる。
【００８６】
PAナノ繊維のアミノ−シラン化ポリ（L−リシン）−改質リン酸カルシウム被覆TiO2表
面への共有結合。N,N-ジメチルホルムアミド (DMF)中の架橋ナノ繊維の懸濁液に、O-ベン
ゾトリアゾール-N,N,N',N'-トリメチル-ウロニウム-ヘキサフルオロ-ホスファート(HBTU)
及びジイソプロピルエチルアミン(DIEA)の溶液を添加して、ナノ繊維の遊離カルボン酸ご
とに、わずかに１当量よりも少ない（０．９５）HBTU及びチタン表面を被覆するリシン改
質リン酸カルシウム上に露出した見積もり遊離アミンごとに約６当量のDIEAを供給する。
この溶液を、数分間インキュベートし、アミノ−シラン化チタン表面にさらす。一旦導入
したリン酸カルシウム被覆チタンをナノ繊維反応溶液中で最小１時間振盪し、水で完全に
すすぎ、室温で乾燥する。図１０Aは、組織化された被覆表面への繊維束の付着を示す走
査型電子顕微鏡写真である。図１０Bは、リン酸カルシウム被膜の組織化構造を被覆する
個々の繊維層を示す高倍率画像である。
【００８７】
実施例３
pLy-OCPの成長手順。チタン表面を、連続的に、有機非極性溶媒、有機極性溶媒及び水
で洗浄する。洗浄されたチタン箔を簡単に弱フッ化水素酸、硝酸溶液でエッチングして、
表面に存在する酸化物を除去してもよく、表面を不動体化するためにより濃度の高い硝酸
溶液で不動体化する。酸処理サンプルを、次いで、蒸留水で完全にすすぎ、2mMのCaC12及
び1.2mMのNa2HPO4を含むプレシード溶液中に、少なくとも３０分間室温で放置する。さら
し時間を長くすること（２４時間まで）によって、より良好な適用範囲を得てもよい。プ
レシーディングの後、サンプルを次いで、1mMのポリ（Lリシン）を添加した2mMのCaCl及
び1.2mMのNa2HPO4を含有する新鮮なミネラル化溶液中に放置し、少なくとも３時間室温で
インキュベートする。このミネラル化工程を、被膜厚さをかせぐために繰り返してもよい
。ミネラル化されたサンプルを蒸留水で完全にすすぎ、室温で乾燥する。
【００８８】
実施例４
化学試薬を、シグマ−アルドリッチ（セントルイス、MO）から入手した。溶液をFisher
Scientific(Hanover Park, IL)から得た。チタン箔をGoodfellow Inc.(Berwyn, PA)から
得た。
市販の純粋なチタン（Ti）箔(0.032 mm)を、５×８ｍｍの径の長方形に切断した。各サ
ンプルの一つの角を箔の面に垂直に折り曲げた。次いで、箔を試薬級のジクロロメタン、
アセトン及び脱イオン水中でそれぞれ１５分間超音波洗浄した。洗浄された箔を、次いで
、０．２５％のフッ化水素酸（HF）、２．５％の（HNO3）中で１分間エッチングし、表面
不動体化のために１０分間、４０％の硝酸（HNO3）中に放置した。酸処理サンプルを、次
いで、脱イオン水で完全にすすいた。洗浄、不動体化されたサンプルを２４ウェルの組織
培養ポリスチレン（TCPS）ウェルプレートのウェル中に、折り曲げた角を下に向けて載せ
、図1に示したように、箔の下側をTCPS表面の上方に有効に浮遊させた。この形状は、チ
タン基体の下側に見られるいずれの被膜も箔表面に直接成長し、溶液から析出した沈殿物
を付着させないようにした。
【００８９】
次いで、１０分から２４時間の時間範囲で、室温にて、Na2HPO4 を添加した(最終濃度1
.2mM)2mM CaCl2の溶液中にそれらを放置することによって、サンプルをプレシード化した
。対照プレシード化溶液は、2mMのCaCl2単独、1.2mMのNa2HPO4単独、1.2mMのNaCl単独、1
.2mMの Na2HPO4及び1mM ポリ(Lリシン) (MW=37,000) を含む2mM CaC12とした。プレシー
ド化の後、サンプルを、2mLの新鮮な2mMのCaCl2溶液（1mM のポリ(Lリシン)添加）中に放
置した。次いで、Na2HPO4（最終濃度1.2mM）を添加し、サンプルをこのミネラル化溶液中
で、少なくとも２４時間室温にてインキュベートした。このミネラル化プロセスをもう一
回繰り返した。これらのミネラル化溶液のｐHを、フィッシャブランドの電子装置のｐHメ
ータで追跡した。ミネラル化したサンプルを脱イオン水で完全にすすぎ、真空乾燥によっ
て乾燥した。乾燥サンプルを、次いで、X線光電子顕微鏡（XPS）、反射フーリエ変換赤外
分光法（RFTIR）及びエネルギー散乱X線分析（EDS）を含む走査型電子顕微鏡によって検
査した。15kV及び20mAで、Omicron XPSを用いてXPSを行い、スペクトルをＥＩＳソフトウ
ェア(v2.1.0)を用いて実行した。RFTIRを、BioRad FTS40 FTIRスペクトロフォトメータ(4
000700 cm-1、64スキャン、2cm-1解像度)を用いて、バックグラウンドとしてブランクTi
箔を使用し、被覆箔基体に行った。SEMサンプルを３ｎｍの金−パラジウムで被覆して、
日立S4500 フィールド・エミッション走査型電子顕微鏡（Princeton Gamma Tech X線検出
器で20kVにて）で検査した。
【００９０】
非付着沈殿物を、次いで、水洗、続いて遠心及び凍結乾燥の一連によって採取した。乾
燥沈殿物を、Rigaku DMax X線回折計を用いて、40kV及び20mAにて、粉末X線回折（XRD）
によって検査した。乾燥沈殿物中の水及び有機含有物を高解像度熱重量分析（TGA）によ
って、TA機器Hi Res TGA 2950を用いて測定した。サンプルを３℃／分で４５０℃まで加
熱し、１２０分間保持した。
【００９１】
分解実験を、OCP及びpLyCPで被覆され、上述したように成長させた箔サンプルで行った
。サンプルを２４時間それぞれの分解溶液１ｍｌ中に放置し、ミリポア水中で完全にすす
ぎ、真空乾燥によって乾燥した。酵素−ベース溶液は、ハンクス液（HBSS）中の０．２５
％トリプシン及びHBSS中の０．２％プロナーゼを含む。ｐH変更によって被膜の分解をHBS
S（ｐH７．４）及びｐH７、６、５、４、３及び２のクエン酸緩衝液を用いて行った。処
理サンプルを、次いで、SEM（20kV）でのSEM(１００秒間)中のEDSによって検査し、20kV
での解像のために３ｎｍのAu−Pdでのスパッタ被覆を行った。
【００９２】
化学的機能性を、Boc-S-tert-ブチルメルカプト-Lシステイン (Boc-Cys(StBu)OH)をpLy
CP被膜上に露出した遊離アミンに結合させることによって測定した。OCP及びpLyCPの双方
の被膜を上述したように製造した。遊離アミンの表面濃度を、定量ニンヒドリン試験を用
いて測定した。簡単に、乾燥サンプルを、エタノール中のフェノール及びピリジン中のカ
リウムシアニドの混合物で、１００℃にて５分間処理し、６０％エタノールを添加し、ジ
クロロメタン中の塩化テトラエチルアンモニウムですすいだ。得られた紫の溶液の吸収を
、５７０ｎｍで測定し、勾配pLy溶液から測定した標準曲線と比較した。ニンヒドリン反
応で使用しないサンプルを、0.1% BocCys(StBu)OH、0.95モル当量の1Hベンゾチアゾリウ
ム、1[ビス(ジメチルアミノ)メチレン]-ヘキサフルオロフォスファート (l),3オキサイド
(HBTU)及び0.5mMジイソプロピルエチルアミン (DIEA)を含む０．４ｍｌのジメチルホルム
アミド（DMF）中で一晩振盪した。対照サンプルをHBTU又はDIEAの不存在下、システイン
化合物にさらした。反応条件の各組からのサンプルの半分を脱イオン水で完全にすすぎ、
一方、他の半分を飽和NaCl溶液で１０分間洗浄し、脱イオン水で完全にすすいだ。すすが
れたサンプルを、次いで、乾燥し、XPS（225Wで(15kV及び15mW)によって試験した。
【００９３】
リン酸カルシウム成長反応を目視並びに反応ｐHのモニタリングによって追跡した。塩
化カルシウム溶液が透明になり始め、約ｐH5.8から5.9で無色になった。燐酸溶液を添加
して数秒以内に、ｐHが約７．８まで急激に上昇し、細かい白色沈殿物が生成した。純粋
な無機反応において、この懸濁沈殿物は、それが反応ウェル中に沈殿するように、続く３
から４時間にわたって粗く成長した。しかし、PLy−被覆溶液中の沈殿は、非常に細かく
残り、より少ない沈殿傾向を示した。図２は、燐酸添加後（約１分）の平衡点から２４時
間にわたって追跡した、種々の反応ｐHを示す。ｐHの追跡は、相対的な逐次のｐH減少に
よって特徴付けられ、１時間あたりにおける約ｐH７．６からｐH７．２での単一の急峻な
降下によって中断された。Plyを含む反応溶液において、顕著なｐHの降下が、目だってす
ぐに始まり、最終的なｐHはわずかに無機対照のそれよりも高いままであったことは注目
すべきである。
【００９４】
これらの反応によって形成された被膜のSEM顕微鏡写真を図３に示す。図３Aの被膜は、
純粋な無機物であり、一方、図３Bの被膜は、pLyの組み込みによって改質されている。純
粋な無機被膜は、大きく、薄く、板様の、通常１μｍを超える長さ及び幅のリン酸カルシ
ウム結晶で、リン酸オクタカルシウム（OCP）のそれと一致する組織からなる。被膜は、
約４から７μｍの厚さ（２から３結晶径）であり、被膜結晶の全体にわたる厚さは、サン
プル表面に対して平行及び垂直の双方に配向している。一方、pLs改質リン酸カルシウム(
pLy-CP)は、歪んで、阻止され、それら無機対照物よりも小さい大きさのオーダーの結晶
からなる。図３Bに挿入された高倍率では、これらの組織がさらに直径１００ｎｍより小
さい基礎構造からなることを示し、改質された被膜においてナノスケールの特徴を表して
いる。また、この被膜は、２から３の特徴厚みを有し、通常、１μｍ以下であるが、全箔
表面にわたって均一を維持している。
【００９５】
OCP沈殿物のTGAは、約９．５±０．２％の質量変化を生じさせ、値は、水和されたOCP
結晶（９．２％）からの予測される水の損失と適度に一致する。Ply改質沈殿物の分析は
、同様の水損失量を示すが、２３±１％の総質量損失を生じさせ、ミネラルが１４％程度
のポリ（L−リシン）からなることを示す。元素分析は、炭素、水素及び窒素の総含量（
質量）が１４．２±０．２％を示し、TGAから誘導されるリシン含量を確証する。さらに
、元素分析における炭素対窒素の質量比は２．６であり、それは、ポリ（L−リシン）に
おける炭素対窒素の２．５７の予測比と一致する。この傾向は、pLy-CPがいずれかの炭化
リン酸カルシウム種の有意な量を含む可能性を否定する。
【００９６】
pLy-CP 沈殿物のX線回折パターンは、図４に示すが、不十分な結晶リン酸カルシウムと
矛盾しない、比較的弱く、ブロードな回折ピークを示す。これらのブロードなピークは、
無機対照から得られる、OCP結晶回折パターンを暗示する。OCP (100)、(010)及び(002)の
顕著な回折間隔を図４に示す。
【００９７】
図５における反射FTIRスペクトルを試験し、無機被膜が963、1025、1037、1078及び111
5 cm-1に延びるPO43- に対応するバンドを生じさせる。さらに、873及び917cm-1でのHPO4
2- に延びるP-OHからのような、リン酸オクタカルシウムの明確なバンド特性がある。比
較として、pLyCPスペクトルは、963、1025及び1115cm-1 においてブロードなPO43- バン
ドを有する不十分な結晶又はアモルファスのリン酸カルシウムを良好に示す。良好に示さ
れたHPO42- バンドは、無機サンプルで見られる単一のブロードな約880 cm-1付近でのHPO
42-バンドによって入れ替わっている。さらに、pLysCPは、ミネラル中にポリ（L−リシン
）の存在を明確に表し、2990と2850cm-1との間のCH2 及びCH3 バンド、1650cm-1での強い
NH2変形バンド、3073cm-1でのNH3+バンドによって示されている。これらの観察は集合的
に、ポリ（L−リシン）がリン酸カルシウムミネラル系に取り込まれており、リン酸オク
タカルシウム相を本来形成する結晶化が妨害されていることを示す。
被膜及び前処理のXPSによる分析を以下の表４に要約する。
【００９８】
【表４】
0004837553.tif 000005
OCP及びpLyCP被膜双方のカルシウム、リン及び酸素結合エネルギーは、適度に先に公開
されたOCPのようなリン酸カルシウムの値と一致している。pLyCPスキャンにおける400.2e
Vでの窒素ピークは、この改質被膜におけるポリ（L−リシン）の存在を確認する。リン酸
カルシウム比を、式１に従って決定した。
【００９９】
【数１】
0004837553.tif 000006
（式中、Ix は元素"x" のXPSピークに対応する強度であり、Sx は元素"x" の感度因子で
ある。）
無機被膜中の1.31の比は、OCP (1.33)の予測値に適当に一致している。pLyCP被膜の1.14
は、カルシウム不足のOCPに一致している。XPSデータも、プレシード・プロセスに関する
いくらかの情報を与える。第１に、そのデータは、少量のカルシウム単独では、リン酸が
存在しない被膜のないTi表面に吸収されるかもしれないが、一方、リン酸単独では、２４
時間の値の被膜のないTi表面に顕著に結合しないことを示す。あるいは、CaC12 及びNa2H
PO4での表面の予備処理は、わずか１０分間で比較的Caリッチのリン酸カルシウム複合体
の形成をもたらすが、約１．５から２時間までに、SEMで認識できる結晶形成の指標はな
い。しかし、２時間までに、図６において認識できる小さい結晶が、金属表面を飾り、リ
ン酸カルシウム比が１．３に降下する。
チタン表面上のこのシード層の形成は、Ti表面にpLy-CPの成功裏の成長をもたらす。以下
の表５は、種々のプレシード処理の適用範囲を要約する。
【０１００】
【表５】
0004837553.tif 000007
カルシウム及びリン酸双方を含むプレシード処理は、pLy-OCP被膜の成長のための適切
な表面をもたらすことが表から明らかである。興味深いことには、CaC12前処理は、金属
表面にカルシウムの吸着をもたらすが、その後のpLyCP成長を促進するには不十分であっ
た。同様に、Na2HPO4処理単独では、金属表面におけるその後のpLyCP形成を促進しなかっ
た。リン酸カルシウムミネラル複合体のプレシード層は、pLysCPの均一な成長を促進する
ことを成功させた。
また、pLysCP被膜は、生物学的に関連する分解条件を特に可能にすることが分かった。
表６はこれらの観察を要約し、一方、図７は、被膜における分解作用を示すEDSパターン
に対応するSEM顕微鏡写真を示す。
【０１０１】
【表６】
0004837553.tif 000008
２４時間にわたる試験において、OCP及びpLyCP被膜の双方は、pH7.4の緩衝液中で比較
的安定であることが分かった。しかし、pH7.0に低下した場合、OCP被膜は非常に安定であ
ったが、非常に限定された溶解性を示すCa及びPのEDS強度においてわずかに降下した。組
織化されたpLyCP被膜は溶解が認められ、無機プレシード層の残存が明らかであるものを
残し、これは、図７に示された組織によって証明される。
EDS分析はCa及びPのピーク強度の実質的な降下を示す。無機シードの残渣、このｐHで
の安定性のため、ピークは全体的に消失しないからである。ｐH６．０のわずかに酸性の
条件下で、双方の被膜は十分に溶解した。これら基体の顕微鏡写真は、不毛であることを
示し、EDSスキャンはカルシウム又はリン酸の証拠を示さない。ｐH７．４で緩衝されたト
リプシン及びプロナーゼの酵素溶液での被膜の処理は、純粋な無機被膜は安定であるが、
一方、pLy-CP被膜はこの場合もやはり不安定で、無機プレシード層のみを残し、CaとPと
の小さいEDSピークを示した。
【０１０２】
また、Ca-P層に取り込まれたpLyは、被膜に官能化生物分子を結合するための有用な化
学的つなぎ鎖をもたらした。ポリ（L−リシン）の正荷電遊離アミノ酸側鎖は、負荷電分
子との静電相互作用又はリシンの遊離アミンと標的分子のカルボン酸との間のアミド結合
の形成のいずれかによって結合リンカーとして機能することができる。これらの結合機構
は、システイン分子をpLy-CP被膜に付着させることによって証明された。表面へのシステ
イン結合は、図８のXPSスペクトルにおいて164eVでの硫黄(1s)結合エネルギーピークの出
現によって明らかになる。図８に示されたこれらのスペクトルのS:Nモル比の比較は、種
々のサンプルにおける硫黄含量の半定量的な比較を与える。これらのデータは、第１に、
システインがpLy-CPにのみ結合し、HBTU及びDIEAが反応に添加された場合、おそらく形成
されたアミド結合の結合安定性が増加するために、より著しいシステインの存在が認めら
れることを示す。これらのサンプルを飽和生理食塩水ですすいだ場合、HBTU及びDIEA中で
処理されたサンプルのS:N比は、統計学的に区別が付かないままである。HBTU及びDIEA不
存在下でのPLy-CPへ結合するシステインは、S：N比の実質的な減少によって証明されるよ
うに、飽和生理食塩水で洗浄された場合、明らかに置き換わった。
【０１０３】
上記の観察は、チタン表面を被覆する新たなリン酸カルシウム−有機複合体を示す。全
体的に、XRD、RFTIR、XPS、TGA及び元素分析は、この新たな被膜へのpLyの取り込みが、
不十分な結晶、リン酸オクタカルシウムのカルシウムが不足した複合体をもたらすことを
示す。SEMによる試験は、OCP結晶の形成におけるpLyの強く歪んだ影響を明らかにする。
得られた被膜は、純粋な無機のOCP被膜において形成された透明でシャープな結晶上の、
不均一で、ナノスケール特性の暗示を構成する。ミネラル相へのpLyの取り込みは、XRD及
びFTIRによって、ならびに被膜の酵素分解によってみられる被膜結晶形の破壊を示す。小
さい、改質された結晶の外表面に単に被覆されたポリマーは、改質された結晶であり、こ
れらの結晶は、無機対照におけるように、残存することを十分に期待するであろう。しか
し、Ply-CP被膜における有機成分の酵素分解によって、pLy改質被膜は、分解して、無機
シード結晶のみを残す。この結果は、pLyがリン酸カルシウム構造全体に取り込まれるこ
とを強く示す。PLy-CP中の遊離アミンつなぎ鎖への生物分子の共有アミド結合は、システ
インを利用した非常に基本的な証明において示された。本来、pLy-CP被膜のシリンポリマ
ー全体にわたるアミド結合の存在は、システインとpLyとの間のアミド結合の直接的な同
定を混乱させる。しかし、この結合は、経験的な推論によって明らかにすることができる
。XPSよって検査した場合、システインの硫黄含量は、それを、サンプル表面に結合する
システインの化学的に独特なマーカーにする。PLy-CPサンプルにおけるXPS硫黄ピークの
選択的な出現は、システインが被膜のpLy成分と相互作用することを示す。この相互作用
は、２つの形態（静電気的及び共有的）を取るかもしれない。材料の静電気的結合は、シ
ステインの負荷電遊離酸とpLy側鎖における正荷電遊離アミンとの間の付着を含む。この
静電気的な付着は、HBTU及びDIEAの非存在下におけるpLy-CPへのシステインの結合を有す
るかもしれない。この相互作用を経験するサンプルを生理食塩水ですすぐことによって、
システインを塩化物イオンと置き換え、サンプルにおける硫黄の存在量を著しく減少させ
る。この置き換えは、結合の静電気特性を支持する。一方、システインをアミド結合試薬
HBTU及びDIEAの存在下で遊離アミンに導入する場合、形成されたアミド結合は、システイ
ンをpLy-CP表面に存続させる。アミド架橋剤の存在におけるこの残存と、静電気的な置換
に対する結合の非感受性との依存性は、システインが共有的にpLY被膜にアミド結合する
ことを強力に示す。
【０１０４】
理論に拘束されないことを望むならば、酸化されたチタン表面におけるpLY-CP被膜の成
長メカニズムは、いくつかの連続的な工程を含む。チタン表面へのリン酸カルシウムの核
形成は、生理的ｐHでの本来的な酸化チタン(TiO2)表面の形成を修飾する水酸化物イオン
に関連すると考えられている。上記に示したXPSデータは、プレシード段階において、Ca2
+ 単独は、PO43- 単独ではなく、酸化されたチタン表面に適度に結合することを示す。し
かし、同時に起こるCa2+ 及びPO43-双方の導入は、アモルファスリン酸カルシウムに対応
するCa:Pが1.55のリン酸カルシウム複合体を迅速に形成する。これらの複合体は、適当な
、カルシウムイオンと金属表面を修飾する水酸基との間の初期の相互作用を介して、金属
表面に核形成される。時間の経過により、これらの凝集は成熟し、それらの表面に添加さ
れたリン酸を取り込むために再編される。数時間後、これらの凝集物が成長し、図６に見
られるミネラル外観（OCP）となり、このCa:P比は１．５５から１．３３に降下した。し
かし、ポリ（L−リシン）がこれらの核形成段階の間に存在する場合、リン酸カルシウム
は金属表面上に直接核形成を成功させることができず、おそらく、pLyの正荷電側鎖によ
るカルシウム−水酸基相互作用の影響によるものと思われる。正に荷電したpLyは容易に
チタンのヒドロキシ化酸化物表面に結合することが示されている。よって、pLyが酸化物
表面上の必要な核形成する水酸基をブロックするかもしれないと結論することが適切であ
る。この現象は、なぜpLy-CPが被覆されていないTi表面に直接成長することができないか
を説明する。しかし、表面がリン酸カルシウムシードで修飾される場合、多くのより有用
な核形成部位が存在し、pLyがミネラル相の連続した成長を完全に阻害することができな
い。これらリン酸カルシウムシードはpLy-CP被膜の均一な成長を促進することは明らかで
ある。この成長のメカニズムは明らかではないが、破壊されたエキタキシーの一部として
新たなミネラルが成長すると考えられる。新たなミネラルは、表面にカルシウム及びリン
酸が存在せずに核形成し、成長し、それが被膜に組み込まれるように、pLyが新たに形成
するOCP結晶を破壊する。
【０１０５】
このpLy-CP被膜のXPSのCa/P比において示されるカルシウム欠乏は、二価のカルシウム
イオンが、電荷反発又は結晶部位妨害のいずれかによって、正荷電ポリマー側鎖によって
新たに形成する結晶から排除されることを示す。さらに、正荷電pLy側鎖と負荷電リン酸
イオンとの間のいくつかの選択的な相互作用があるかもしれない。このシナリオは、pLy-
CPのｐH追跡におけるミネラル形成の初期の発現を説明することを助けるかもしれない。
初期の段階のミネラル化において、リン酸親和性が部分的にリン酸リッチのCa-P凝集物を
作り出し、それは、順次結晶化の初期発現のトリガーとなるであろう。この種のリン酸結
合親和性は、適当な結晶形成を確かに破壊し、リン酸リッチ又はカルシウム欠乏のOCP結
晶を生成するであろう。PlyとCa-Pミネラルの構成物との間の２種の相互作用のいずれか
は、pLy-CP被膜で見られる破壊された構造の形成の原因となるであろう。
【０１０６】
本発明のpLy-CP被膜は、他のリン酸カルシウム被膜よりも、特に、臨床治療の観点から
、多くの利点を与える。被膜を成長させる溶液相は、プラズマスプレーのようなリン酸カ
ルシウム成長の方法が実行できないかもしれないことを最近認めた、多孔質表面を含む全
ての表面タイプに、その適用を利用しやすくする。pLy-CP被膜は、本来の骨に見出される
アパタイト結晶と適切に一致する非常に高い表面積及び外観サイズを有する。このナノス
ケールの組織及び高い表面積は、安定な組織移植界面を形成するために重要な、初期の細
胞付着、拡がり、増殖を促進することが期待されるであろうさらなる特徴である。この作
用のアクセントとして、ポリ（L−リシン）は、細胞接着促進剤として良好に確立されて
おり、pLy-CPにおけるその特筆すべき存在によって、移植被膜への細胞付着をさらに高め
ることが期待される。このpLy成分は細胞接着剤として生物活性を加えるのみならず、他
の生物活性剤の付着のための化学的な官能化つなぎ鎖を提供する。そのようなアプローチ
は、argglyasp (RGD)のような生物関連ペプチド、骨の形態形成タンパク又は抗炎症剤の
ような治療的分子が移植被膜を攻撃するために容易に適合させることができる。また、有
利にも、被膜は、ｐH及び酵素媒介メカニズムの双方、天然の骨における破骨細胞の再吸
収の２つの主なメカニズムによって、生物学的分解を可能にする。被膜分解は、新たに、
骨形成を促進するかも知れず、移植界面の強度を高めるかもしれない。この被膜は、骨伝
導性表面として機能するように巧みに計画実行されており、それは、容易にリサイクルす
ることができ、新たな生物起源のミネラル化のための結合ブロックのプールとして作用す
る。
【０１０７】
プレシード層の使用は、表面上に他の有機的改質材料の成長を促進するために使用する
ことができる。本発明においては、ミネラル被膜に導入された有機分子は、被膜形態及び
分解のような特性に対して影響を及ぼす。分解における有機物の影響は、ミネラルへ組み
込まれた又はpLyに化学的に付着した治療的分子の時間依存の放出を巧みに計画実行する
ために利用することができる。代替の有機成分も、材料分解の形態の影響又は速度を変え
るために利用することができる。表面被膜へのこのアプローチは、整形外科及び歯科移植
被膜に実質的に影響を及ぼす能力を備えた多くの広範に変動する潜在的な適用を与えるこ
とは明らかである。
【０１０８】
実施例５
この実施例は、ペプチド両親媒性ナノ繊維のチタン表面上のpLy-OCP被膜への化学的な
付着を示す。PLy-OCPに対してペプチド両親媒性ナノ繊維は、標準的なアミド結合反応を
基礎にしており、予備組織化、架橋ペプチドナノ繊維に適用される。特にペプチドセグメ
ントのＣ末端近傍でカルボン酸および構造ペプチドセグメントにおいて少なくとも２つの
システインを含む、ペプチド両親媒性分子の希釈溶液（図９及びHartgerinkら、PNAS、vo
l99、pp51335138、2002及びそのようなペプチドを形成する方法及び材料を参照、全趣旨
を参照することによりここに取り込む）は、弱い還元剤（ジリオールスレイトール（ＤＴ
Ｔ）のような）の溶液中に維持され、酸性条件下で自己組織化し、ペプチドナノ繊維を形
成する。これらのナノ繊維は、非破壊的な酸化剤（イオジンのような）の添加によって架
橋することができ、安定な分子間、繊維内ジスルフィド結合を形成する。これらの繊維の
得られた懸濁液を水に対して透析し、全ての還元又は酸化剤（ＤＴＴ及びイオジンのよう
な）を取り除く。この架橋繊維の透析された懸濁液を、次いで、凍結乾燥し、乾燥繊維を
、ペプチド溶解性極性有機溶媒（N,Nジメチルホルムアミド (DMF) 又はNMPのような）中
で、強力な攪拌及び超音波によって再懸濁する。繊維の共有架橋は、非水性環境において
それらを安定にする。
【０１０９】
N,Nジメチルホルムアミド(DMF)中の架橋ナノ繊維の懸濁液に、O-ベンゾトリアゾール-N
,N,N',N'-テトラメチル-ウロニウム-ヘキサフルオロ-ホスファート(HBTU)及びジイソプロ
ピルエチルアミン(DIEA)の溶液を添加し、ナノ繊維の遊離カルボン酸ごとに、わずかに１
当量よりも少ない（０．９５）HBTU及びチタン表面を被覆するリシン改質リン酸カルシウ
ム上に露出した見積もり遊離アミンごとに約６当量のDIEAを提供する。この溶液を、数分
間インキュベートし、被覆チタン表面にさらす。一旦導入したリン酸カルシウム被覆チタ
ンをナノ繊維反応溶液中で最小１時間振盪し、水で完全にすすぎ、室温で乾燥する。図１
０Aは、組織化被膜表面に付着した繊維の界面を示す走査型電子顕微鏡写真である。図１
０Bは、リン酸カルシウム被膜の組織化構造を被覆する個々の繊維の層を示す高倍率の画
像を示す。
【０１１０】
前骨芽（preosteoblastic）マウス頭蓋細胞での予備的なインビトロ実験は、pLy-CP被
膜の生体適合性を証明している。チタン箔サンプルは、上述したように、無機OCP及びポ
リ（L−リシン）改質リン酸カルシウムで被覆した。基体を、１１５℃で３０分間、オー
ドクレーブ処理し、それらを、滅菌組織−培養ポリスチレン２４ウェルプレートに載せた
。
【０１１１】
不死化したマウス頭蓋前骨芽細胞(MC3T3E1)を、10%ウシ胎仔血清 (Hyclone、Logan UT)
及び1%ペニシリン/ストレプトマイシンを含有するMEMα中のT75フラスコで培養した。培
地に30mM β-グリセロールホスファート及び50μg/mLアスコルビン酸を補充した。約９０
％の交会で、細胞を、０．２５％トリプリン、1mM エチレンジアミンテトラ酢酸 (EDTA)
で処理することによってT−フラスコから取り出した。 トリプシン処理を、培養培地を添
加することにより中止させ、細胞を遠心でペレット化した。細胞をメディウム中で再懸濁
し、5×103細胞/cm2の密度で被覆箔基体を覆った。新鮮なメディウムを、総容積1mL/サン
プルで添加した。細胞を７日間、３７℃及び5% CO2のインキュベーターで、３日ごとにメ
ディウムを交換して、培養した。
【０１１２】
サンプルをそれらの培養ウェルから、１日、４日及び７日間隔で取り出し、０．１Mの
カコジル酸ナトリウム緩衝液中の２．５％グルタールアルデヒド中で固定した。カジコル
酸ナトリウム緩衝液で完全にすすいだ後、サンプルを、１時間、０．１Mのカジコル酸ナ
トリウム緩衝液中の１％四酸化オスミウム中で１時間、後固定した。固定されたサンプル
を、次いで、勾配エタノール溶液(50%、70%、80%、90%、95%、100%)中で脱水し、臨界点
をエタノール−CO2交換によって乾燥した。乾燥サンプルを、３ｎｍの金−パラジウムで
スパッタ被覆し、走査型電子顕微鏡で観察した。
【０１１３】
インビトロ研究の結果、これらの基体上で培養された細胞は、生存可能であり、拡がり
及び増殖し、７日間の間にpLy-CP被膜上に融合性細胞層を形成したことを示す。図１１A
は、１日後の被膜上に広がった個々の細胞を示し、一方、図１１Bは、４日後の表面に広
がった多数の細胞を示す。図１１Cにおいて、７日後の増殖細胞によって形成された融合
性細胞層が認識できる。この実験は、材料が非毒性で通常の骨芽機能に不可欠な細胞付着
及び広がり挙動を促進することを証明する。
【０１１４】
本発明の実施形態の方法及び材料は、骨形成のリン酸カルシウム被膜でチタン系整形外
科移植材料を覆うことに最も容易に適合するであろう。上述した詳細な例は、この被膜材
料構成が高度に組織化され、反応溶液にさらされた表面を完全に覆うかもしれないことを
示す。そのような被膜は、細胞の付着、広がり、増殖及びおそらく骨芽細胞の分化に好ま
しい影響を与えるかもしれない。そのような影響は、移植表面との組織一体化における著
しい改良を与えることができる。被膜内の有機巨大分子の取り込みは、ペプチドミセル、
個々のペプチド配列あるいは薬物または成長因子のような他の治療分子を含む被膜表面へ
の生物学的機能材料の結合に使用することができる化学的機能性を加える。材料の低い結
晶性および酵素易損性の巨大分子の一体化は、これらの巨大分子の遅い放出のために材料
を有用なシステムにすることができる。同様に、この被膜を潜在的に分解性にすることは
、後に続く新たな骨マトリクスの生物学的ミネラル化のためのカルシウムおよびリン酸の
得やすい源となる。
【０１１５】
本発明は、それらのある好ましい実施形態を参照して詳細に記載しているが、他のバー
ジョンも可能である。例えば、ポリアミンに代えて、ミネラル相に治療用巨大分子を直接
組み入れることができるかもしれない。ポリ(L−リジン)のようなポリアミンの代用は、
治療の分子に限定する必要はないが、遊離酸（グルタミン酸又はアスパラギン酸のような
）を含むことができる、他のアミノ酸を、ミネラル相に組み込むことができる。これらの
分子は、材料表面に種々の化学的機能性を存在させるであろう。また、これらの分子は、
無機材料を改質するようにさらに変更してもよい。さらに、種々の化学物質、組織化、材
料特性で被膜を形成するために、ここに記述された方法を使用して、カルシウム−リン酸
比および濃度を変動させ、ヒドロキシアパタイト、リン酸三カルシウム、ブラッシュ石又
はモネタイトのようなリン酸カルシウムの種々の相を用いて、基体表面を被覆することが
できる。したがって、添付したクレームの意図および範囲は記載に限定されるべきではな
く、好ましいバージョンがこの明細書内に含まれる。
【図１Ａ】
0004837553.tif 000011
【図１Ｂ】
0004837553.tif 000012
【図２】
0004837553.tif 000013
【図３Ａ】
0004837553.tif 000014
【図３Ｂ】
0004837553.tif 000015
【図４】
0004837553.tif 000016
【図５】
0004837553.tif 000017
【図６Ａ】
0004837553.tif 000018
【図６Ｂ】
0004837553.tif 000019
【図７】
0004837553.tif 000020
【図８】
0004837553.tif 000021
【図９】
0004837553.tif 000022
【図１０Ａ】
0004837553.tif 000023
【図１０Ｂ】
0004837553.tif 000024
【図１１Ａ−Ｃ】
0004837553.tif 000025
【図１２Ａ】
0004837553.tif 000026
【図１２Ｂ】
0004837553.tif 000027
【配列表】
0004837553000001.app