(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
同じか異なっていてもよい少なくとも２つの抗体
−第一抗体つまり
−ヘキサマー形態のフラビウイルスのNS1タンパク質での免疫捕捉によって予備選択されたポリクローナル抗体、及び
−ヘキサマー形態のフラビウイルスのNS1タンパク質に対する高い親和性について予備選択され、次いで精製された抗-NS1モノクローナル抗体の混合物
からなる群から選択される抗体からなるNS1糖タンパク質を捕捉するための抗体、
−第二抗体つまり
−ヘキサマー形態のNS1タンパク質に対するポリクローナル抗体、及び
−ヘキサマー形態のNS1タンパク質に対するモノクローナル抗体の混合物
からなる群から選択される明示抗体
を用いる免疫学的方法により、感染の臨床段階期間にわたって生物試料におけるフラビウイルスのNS1非構造糖タンパク質を検出することからなることを特徴とする、フラビウイルス感染の早期検出方法。
【請求項２】
フラビウイルス感染が、デング熱ウイルス感染であることを特徴とする請求項１に記載の検出方法。
【請求項３】
第一抗体が適当な固体支持体に付着し、第二抗体が適当な標識に任意に複合していることを特徴とする請求項１及び２のいずれかに記載の検出方法。
【請求項４】
第二抗体が標識に複合していない際に、固体支持体に付着したNS1タンパク質に対するその結合が、次いで、適当な標識に複合された第三抗体で検出されることを特徴とする請求項３に記載の検出方法。
【請求項５】
第三抗体が酵素に複合していることを特徴とする請求項４に記載の検出方法。
【請求項６】
−第一抗体、つまり捕捉抗体は、ヘキサマー形態であるデング熱ウイルスのNS1タンパク質での免疫捕捉によって選択されるマウスのポリクローナル抗体からなり、かつ
−第二抗体、つまり分析される生物試料でNS1の存在を検出するための抗体は、ヘキサマー形態であるデング熱ウイルス血清型1のNS1タンパク質で免疫化したウサギ由来のポリクローナル抗体からなり、第二抗体の付着は、ペルオキシダーゼに複合し、第二抗体に対する抗体からなる第三抗体で明示されることを特徴とする請求項５に記載の検出方法。
【請求項７】
−下記の抗体：
−ヘキサマー形態のフラビウイルスのNS1タンパク質での免疫捕捉によって予備選択されたポリクローナル抗体、及び
−ヘキサマー形態のフラビウイルスのNS1タンパク質に対する高い親和性について予備選択され、次いで精製された抗-NS1モノクローナル抗体の混合物
からなる群から選択される少なくとも１つの捕捉抗体、
−下記の抗体：
−ヘキサマー形態のNS1タンパク質に対するポリクローナル抗体、及び
−ヘキサマー形態のNS1タンパク質に対するモノクローナル抗体の混合物
からなる群から選択される少なくとも１つの明示抗体、
−フラビウイルス及び/又はフラビウイルスに応じた種々の血清型のヘキサマー形態であるNS1タンパク質からなる少なくとも１つの陽性対照、及び
−正常なヒト血清からなる少なくとも１つの陰性対照
からなることを特徴とする、フラビウイルス感染の早期診断のための箱入りのセット。
【請求項８】
前記少なくとも１つの捕捉抗体及び／又は前記少なくとも１つの明示抗体が、ヘキサマー形態のNS1タンパク質に対するモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項７に記載の箱入りセット。
【請求項９】
NS1タンパク質が、感染した哺乳動物細胞、或いはフラビウイルスのNS1タンパク質遺伝子又はNS1タンパク質の全体又は一部分を発現できる該遺伝子のフラグメントもしくはフラビウイルスゲノムのフラグメントを含む組換えプラスミドでトランスフェクトされた哺乳動物細胞いずれかからの培養上清から得られることを特徴とする請求項８に記載の診断のための箱入りセット。
【請求項１０】
NS1タンパク質がデング熱ウイルスのタンパク質であることを特徴とする、請求項７〜９のいずれか１項に記載のフラビウイルス感染の早期診断のための箱入りセット。
【請求項１１】
プラスミドが、1999年6月7日付けで番号I-2220でInstitut Pasteurによって開設されているCollection Nationale de Cultures et de Microorganismes [National collection of cultures and microorganisms]に寄託されたことを特徴とする請求項９及び１０のいずれかに記載のフラビウイルス感染の早期診断のための箱入りセット。
【請求項１２】
フラビウイルス感染のインビトロでの早期検出のための、分解されていないヘキサマー形態でのNS1タンパク質に対する高い親和性を有する、精製され修飾された少なくとも１つのモノクローナル抗NS1抗体の使用。
【請求項１３】
フラビウイルス感染の診断キットを製造するための、分解されていないヘキサマー形態でのNS1タンパク質に対する高い親和性を有する、精製され修飾された少なくとも１つのモノクローナル抗NS1抗体の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
この発明は、フラビウイルス、特にデング熱ウイルスの早期検出方法及びその応用に関する。
【０００２】
デング熱は、急性熱病性の熱帯性疾患であり、これを引き起こすウイルスは、蚊によって媒介されるアルボウイルスである。疾患の媒介物はヤブカ属の蚊、特にネッタイシマカであり、多くは一般にその幼虫を家屋及び家屋周辺の領域に残す。1951年に単離された原因ウイルスは、4つの異なる抗原型に分類された(DEN1、DEN2、DEN3 及びDEN4)。それはフラビウイルス科、フラビウイルス属に属している。
20億人以上の住民が風土病域で生活しており、ウイルスによって感染した個体数は1年当たり1億人以上であると考えられる。デング熱は、特に50万件の入院及び一年当たり数万件の死亡件数(大部分は子供である)の原因である。
【０００３】
臨床的な徴候は、5〜8日の潜伏期間後、一般に突然始まり、重い頭痛、腰痛、筋肉と関節の痛み、また悪寒を伴う画一的な発熱(DFデング熱)の現象からなる。熱病段階の3日目〜5日目には、うっ血性の斑丘発疹が3〜4日間現れる可能性がある(従来のデング熱)。
深刻な場合には、感染は、血管透過性の増大及びうっ血の規制解除によって特徴付けられる出血症候群(DHFつまりデング出血熱)を生じる可能性がある。大多数の場合には、疾患は一般に好都合には1週間以内で進展するが、循環血液量減少に関連したショック事象(DSSつまりデング熱ショック症候群)において致命的であることが分かっている。これらの合併症は、特に異種デング熱ウイルス(異なる血清型)での一次感染中に獲得される、予め存在する免疫の存在に起因している可能性がある。詳細には、血清学的応答について異なる2つのタイプが、デング熱に感染した個体で同定される:フラビウイルス感染に罹患したことがなく、別のフラビウイルス(例えば黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイルス)に対して予防接種を受けたことのない個体は、感染の原因となるウイルスに特異的な抗体がゆっくりと現れることによって特徴付けられる一次応答を示すであろう;既にフラビウイルス感染(例えば他のデング熱血清型)に罹患しているか、又は別のフラビウイルスに対して予防接種を受けている個体は、抗体の迅速な出現によって特徴付けられる二次応答を示すであろう。
【０００４】
感染因子はフラビウイルス科に属するデング熱ウイルスであり、この科には、黄熱病ウイルス及び日本脳炎ウイルスも属している(T.P. Monathら、(1996) Flaviviruses in B.N. Fields, D.M. Knipe, P.M. Howlyら(編集) "Fields Virology" Philadelphia: Lippincott Raven Press Publishers)。これらのウイルスは、11 000ヌクレオチドからなり、約 3400アミノ酸のポリタンパク質をエンコードする正極性の一本鎖RNAを有する。それは、ウイルスや細胞のプロテアーゼによる翻訳と同時の切断ならびに翻訳後の切断中に、3つの構造タンパク質と7つの非構造タンパク質NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B及びNS5に分離される。NS1非構造タンパク質は、初めて1970年にP.K. Russelら(J. Immunol., (1970), 105, 838-845)によって同定され、1985年にG.W. Smithら(J. Gen Virol., (1985), 66, 559-571)によって特徴付けられた。この糖タンパク質は、フラビウイルス属(上記のT.P. Monath)、特に4つのデング熱ウイルス血清型で高度に保存されており、細胞内形態及び細胞外形態で存在する。細胞内形態は、ウイルス複製の初期段階に関わっていると考えられる(Hall R.A.ら、J. Virol. (1999), 73, 10272-10280; Rice C.M.ら、J. Virol., (1997), 71, 291-298; Rice C.M.ら、J. Virol., (1996), 222, 159-168; Rice C.M.ら、 J. Virol., (1997), 71, 9608-9617)。原形質膜に輸送される前に、NS1タンパク質はダイマー化を受ける。昆虫細胞ではなく、哺乳動物細胞では、NS1タンパク質の一部は、主として可溶性タンパク質の形態で、又は二次的には微粒子形態のいずれかで、細胞外媒体に放出される。タンパク質が可溶性形態である場合、タンパク質はオリゴマー、特にペンタマー又はヘキサマーの形態で存在する(Crooks A.J.ら、J. Chrom. (1990), 502, 59-68 及び J. Gen. Virol. (1994), 75, 3453-3460)。現時点で、NS1タンパク質の生物学的機能は未知である。
【０００５】
幾つかの研究は、NS1タンパク質がフラビウイルス感染に対して現存する保護免疫応答において免疫優勢であることを示唆している。幾つかのフラビウイルス、例えば黄熱病、デング熱、日本脳炎及びダニ媒介脳炎ウイルスを用いて行われた実験は、NS1タンパク質サブユニット又はワクシニアもしくはアデノウイルス型のウイルスベクターによって産生されるNS1タンパク質を用いて予防接種した動物での同種ウイルスの致死用量に対し部分的又は全体的な保護を示している(Schlesingerら、J. Virol (1986), 60, 1153-1155; J. Gen. Virol., (1987), 68, 853-857; Falgoutら、J. Virol., (1990), 64, 4356-4363; Jacobsら、J. Virol., (1992), 66, 2086-2095; Hallら、J. Gen. Virol., (1996), 77, 1287-1294; Konishiら、Virology, (1991), 185, 401-410)。
モノクローナル抗-NS1抗体でのマウスの受動免疫によっても、ある程度の保護を得ることができる(Schlesingerら、J. Immunol. (1985), 135, 2805-2809; Gouldら、J. Gen. Virol., (1986), 67, 591-595; Henchalら、J. Gen. Virol., (1988), 69, 2101-2107)。保護における抗-NS1抗体の役割は、完全には知られていない。感染細胞表面の NS1タンパク質は、補体-固定抗体によって認識され、感染細胞の溶解をもたらしている可能性がある(Schlesingerら、 Virology, (1993), 192, 132-141)。
【０００６】
特別な治療法は存在せず、患者に払われる介護は独特の対症的なものである。従来のデング熱の場合、治療は鎮痛薬と解熱薬の投与に基づいている。DHFの場合、治療は、水力電気問題(hydroelectric problem)の矯正及び利尿の再開と組合わさった、血漿漏出を補償するための注入からなる。
デング熱ウイルスに対して市場で入手可能なワクチンは、ない。他方、4つのデング熱ウイルス血清型の弱毒化株での保護アッセイがN. Bhamarapravatiら (Dengue and Dengue haemorrhagic fever (1997), 367-377)によって行われているが、不満足な結果となっている。したがって、予防は媒介物と争うことにのみ基づいている。この争いは、幼虫の駆除と"成体殺性剤(adulticide)"の噴霧を組合わせている。
【０００７】
ワクチン不在下では、流行病をモニターし、上記の合併症を予防する必要がある;このため、積極的なモニタープログラムが、特に世界保健機構によって開設された。これは、本質的に発熱と媒介昆虫の症例をモニターすること、及び発熱し、デング熱ウイルスに感染している疑いのある個体について血清学的かつウイルス学的なスクリーニングを行うことからなる。
デング熱の病因は、患者が、原因が別のアルボウイルス、インフルエンザのような発疹性の発熱を引き起こすウイルス、又は疾患、例えばレプトスピラ症及びマラリアすらもの因子である非ウイルス性病原体あり得るデング熱-様の画一的な熱病症候群を示す際には時として確認しづらい。研究室試験は、診断を提供することができるにすぎない。
【０００８】
現時点で、デング熱の診断には幾つかの試験が存在する。しかし、解釈し得る結果を得るためには、幾つかの方法を組合わせる必要がある:
-  従来のウイルス学的な技術、特に細胞培養物の感染又は若いマウスの脳での増殖又は蚊への接種による増幅、及び例えば免疫蛍光での調査によるウイルスの単離。これらの方法には、実行しにくく、試料が早期に採取されることと保存状態が良好であることに依存しているという欠点がある;さらに、最初の結果は、1週間以内では得られない;これらの欠点を克服するために、RT/PCR試験(V. Deubel, L'eurobiologiste (1997), volume XXXI, 37-155)を利用することができる;しかし、この手法は必ずしも信頼できるものではなく、費用と装置の点でデング熱ウイルスが関わる国々で常套的に使用することができない;
-  血清学的試験; 最も早期の血清学的診断は、MAC-ELISA (免疫グロブリンM 抗体捕捉酵素-結合イムノソルベントアッセイ)技術を用いて、ウイルス抗原に特異的なIgMを検索することにある。症状が現れてから数日後にこれらのIgMを検出することにより、フラビウイルス感染の可能性についての診断を確立することができる。IgG型抗体は、IgM型抗体より遅く現れる。全ての場合に、抗体の研究には2つの試料が必要である: 1つは臨床的な徴候の開始時、他方は、赤血球凝集反応阻止(IHA)を介した血清学的な変換又はELISAを決定するため10〜28日後である。
【０００９】
単純で安価な免疫学的試験も提案されている。これは危険な状態の国々で使用でき、特異的な免疫試薬として、フラビウイルスに特有のNS1非構造タンパク質から誘導されるペプチドを使用している。つまり、米国特許第5 824 506号は、NS1非構造タンパク質から誘導されるペプチドを用いる方法を記載しており、これにより、デング熱ウイルスの存在によって誘発される抗体を検出することができる;しかし、選択されるペプチドは、本質的に回復期の個体から得られる試料を認識し、初めて感染した患者よりも二度感染した患者をより良く認識する;これらの取るに足らない結果は、使用されるペプチドが天然のタンパク質の抗原特性を表さず、それ故に探索される抗体をあまり認識しないという事実によって説明できるかもしれない。
全ての場合に、フラビウイルス感染について末期の確認がなされるにすぎない。
【００１０】
Sir Albert Sakzewski Virus Research Center, Royal Children's Hospitalのレポート(A. Falconar, 1991)は、DEN2ウイルス感染患者の血清におけるNS1非構造糖タンパク質についての研究を記載している。このレポートの著者らは、捕捉抗体として用いられるポリクローナル抗-NS1抗体を含むウサギの血清をマイクロタイタープレートに固定化するダブル-サンドウィッチELISAアッセイを開発している。捕捉された抗原は、DEN2型のデング熱ウイルスのマウスモノクローナル抗体、又はデング熱の血清学的な複合体に特異的なNS1タンパク質に対するマウスモノクローナル抗体を用いて検出される;抗原/抗体複合体の形成は、ペルオキシダーゼ-複合ヤギ抗-マウスIgGを用いて認められる。この方法で、著者らは、分解又は精製したダイマーNS1タンパク質をスタンダードとして用いることにより、アッセイの検出感度は関連プローブとしてのDEN2モノクローナル抗体で約4 ng/ml、モノクローナル抗体群で約60 ng/mlであることを示した。
【００１１】
しかし、このアッセイでは、急性もしくは回復段階での一次感染の場合、又は抗-NS1抗体の力価が高い回復段階での二次感染のどちらでも、NS1タンパク質を検出することができない;このことから、著者らは、二次感染は一過性であるので、二次感染の場合のみ、NS1タンパク質が感染中に大量に存在しなければならないと結論付けた。
ここで、発明者らは、ヘキサマー形態のフラビウイルスのNS1タンパク質を精製する方法を開発した。これにより、ヘキサマー形態のこのタンパク質に特異的な抗体を選択することができ、驚くべきことに、フラビウイルスに感染した状況、特に特異的な抗体反応が認められない早期段階、特にデング熱ウイルスでの一次感染中に、これらの抗体が、循環しているNS1タンパク質に関する種々の問題を決定するための選択手段であることが示された。
【００１２】
この結果、発明者らは、当該分野の従来法より良好な実際的な必要性に対応する、フラビウイルス感染の早期検出方法、つまり信頼性があり、迅速かつ安価で、そのうちに医療保護に適用できる方法を提供することを目的とした。
したがって、この発明の対象は、同じか異なっていてもよい少なくとも2つの抗体
- 第一抗体つまり
- ヘキサマー形態のフラビウイルスのNS1タンパク質の免疫捕捉によって予備選択されたポリクローナル抗体、及び
- ヘキサマー形態のフラビウイルスのNS1タンパク質に対する高い親和性について予備選択された抗-NS1モノクローナル抗体混合物(モノクローナル抗体は次いで精製される)
からなる群から選択される抗体からなるNS1糖タンパク質を捕捉するための抗体、
- 第二抗体つまり
- ヘキサマー形態のNS1タンパク質に対するポリクローナル抗体、及び
- ヘキサマー形態のNS1タンパク質に対するモノクローナル抗体混合物
からなる群から選択される明示抗体
を用いる免疫学的方法により、感染の臨床段階期間にわたって生物試料におけるフラビウイルスのNS1非構造糖タンパク質を検出することからなることを特徴とする、フラビウイルス感染の早期検出方法である。
【００１３】
この発明の目的のため、表現"フラビウイルスのヘキサマー形態のNS1タンパク質"は、フラビウイルスに感染するか、又はフラビウイルスのNS1タンパク質遺伝子からなる発現系を用いて形質転換され、後述のこの発明の方法にしたがって精製される哺乳動物細胞の培養上清から得られる天然タンパク質を意味することを意図する。このヘキサマー形態のNS1タンパク質は、当該タンパク質のモノマー形態又はダイマー形態のような他の形態とは異なり、図1に記載するような電気泳動法又はクロマトグラフィー技術を用いて決定される。
この発明の目的のため、表現"フラビウイルスのNS1タンパク質に対するポリクローナル及びモノクローナル抗体"は、
-  ヘキサマー形態のNS1タンパク質で、
-  又は、生のもしくは不活化したフラビウイルスで
非哺乳動物を免疫化して得られる抗体を意味することを意図する。ポリクローナル抗体は、ヘキサマー形態のNS1タンパク質に対する親和性について選択され、1回の工程で精製される。モノクローナル抗体は、ヘキサマー形態のNS1タンパク質に対する高い親和性について予備選択され、次いで従来技術、特にイオン交換もしくはアフィニティクロマトグラフィーによって精製される。
【００１４】
この発明の目的のため、表現"ヘキサマー形態のNS1タンパク質に対するモノクローナル抗体の親和性"は、抗体部位の50%飽和に必要なタンパク質濃度を意味することを意図する;これは、実施例5に記載するプロトコルにしたがって、抗体の親和定数(affinity constant)によって測定される。
この発明の目的のため、用語"高い親和性"は、定数が10-8 M未満の親和性を意味することを意図する。
【００１５】
驚くべきことに、生物試料中のNS1タンパク質を検出するために、完全に過度に免疫化したウサギの血清の代わりに、ヘキサマー形態のNS1タンパク質での免疫捕捉により選択され精製されるポリクローナル抗体、又はヘキサマー形態のNS1タンパク質に対する親和性が高く、精製されるモノクローナル抗体を使用することによって、方法の感度を著しく改善し、一次感染及び二次感染双方の患者の血液に循環するNS1タンパク質を早期の感染段階から検出することができる。
この発明による方法には、幾つかの利点がある:
-  方法は早期に行うことができる:NS1糖タンパク質の存在は、抗体反応が検出される以前の臨床段階中に認められる、
-  方法は感受性である:1 ng タンパク質/ml未満のごくわずかな血清を検出することができ、一次感染の早期段階で循環しているNS1タンパク質を検出することができる、
-  方法は迅速である:結果が一日以内に得られる、
-  方法は比較的安価であり、それ故に危険な状態にある国々で使用することができる、
-  方法は、フラビウイルスに最近感染した個体から予防接種した個体を区別することができる。なぜなら、NS1タンパク質は予防接種した個体には存在せず、その個体では抗体が依然として検出可能であろうからである。
【００１６】
この方法の有利な具体例によれば、フラビウイルス感染は、デング熱ウイルスでの感染である。
この方法の別の有利な具体例によれば、第一抗体は、適当な固体支持体に付着していることが好ましく、第二抗体は適当な標識に任意に複合している。
この方法の別の有利な具体例によれば、第二抗体が標識に複合していない場合、固体支持体に付着したNS1タンパク質に対するその結合は、次いで第三抗体で検出され、適当な標識に複合する。第三抗体は、従来使用される抗体、例えば第二抗体に相対し、特にヤギ、ブタ又はロバで産生されるIgGである。
【００１７】
用いられる標識には、例として、蛍光標識、ビオチン/ストレプトアビジン系、非同位体標識又は酵素、例えばセイヨウワサビペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼが挙げられる。
この方法の別の有利な具体例によれば、第三抗体は酵素に複合している。
この方法の別の有利な具体例によれば、
-  第一抗体、つまり捕捉抗体は、デング熱ウイルスのNS1タンパク質(タンパク質はヘキサマー形態である)での免疫捕捉によって選択されるマウスのポリクローナル抗体からなり、かつ
-  第二抗体、つまり分析される生物試料でNS1の存在を検出するための抗体は、デング熱ウイルスのNS1タンパク質(タンパク質はヘキサマー形態である)で免疫化したウサギ由来のポリクローナル抗体からなる。第二抗体の付着は、ペルオキシダーゼに複合した、第二抗体に対する抗体からなる第三抗体を用いて認められる。
【００１８】
この方法の別のより有利な具体例によれば、マウスのポリクローナル抗体は、デング熱血清型1のヘキサマーNS1タンパク質での免疫捕捉によって精製される。
また、この発明の対象は、
- 上記のような少なくとも1つの捕捉抗体及び少なくとも1つの明示抗体、
- フラビウイルス及び/又はフラビウイルスに応じた種々の血清型のNS1タンパク質(タンパク質はヘキサマー形態である)からなる少なくとも1つの陽性対照、及び
- 正常なヒト血清からなる少なくとも1つの陰性対照
からなることを特徴とする、フラビウイルス感染を診断するためのキット又は箱入りのセットである。
【００１９】
この発明による診断のための箱入りセットの有利な具体例によれば、ヘキサマー形態のNS1タンパク質は、感染した哺乳動物細胞、又はNS1タンパク質遺伝子からなる組換えプラスミドもしくは該遺伝子のフラグメントもしくはフラビウイルスゲノムのフラグメント(フラグメントはNS1タンパク質を全て又は一部発現できる)でトランスフェクトされた哺乳動物細胞のいずれかからの培養上清から得られる。
この発明による診断のための箱入りセットの別の有利な具体例によれば、
NS1タンパク質はデング熱ウイルスのタンパク質である。
【００２０】
診断のための箱入りセットのさらに有利な具体例によれば、プラスミドはpCIneo-NS1.FGAプラスミドであり、これは1999年6月7日付けで番号I-2220でInstitut Pasteurによって開設されているCollection Nationale de Cultures et de Microorganismes [National collection of cultures and microorganisms]に寄託された。
また、この発明の対象は、アフィニティクロマトグラフィーのような従来技術を用いるNS1タンパク質の精製前に、沈降剤での処理、続く遠心分離によって、NS1タンパク質の可溶型が該タンパク質の微粒子形態から分離されることを特徴とする、感染した哺乳動物細胞、又はフラビウイルスのNS1タンパク質遺伝子からなる組換えプラスミドもしくは該遺伝子のフラグメントもしくはフラビウイルスゲノムのフラグメント(フラグメントはヘキサマー形態でNS1タンパク質を発現し得る)でトランスフェクトした哺乳動物細胞のいずれかからの培養上清から、ヘキサマー形態のフラビウイルスのNS1タンパク質を精製する方法である。
【００２１】
例えば、遠心分離は、10 000 gより大きいか、それに等しい速度で行われる。
この発明の目的のため、用語"沈降剤"は、具体的には例えばポリエチレングリコールのような微粒子タンパク質又は細胞残がいを沈澱させる剤を意味することを意図する。剤は、可溶性タンパク質と微粒子タンパク質又は細胞残がいを分離できる従来条件下で用いられる。
この精製方法の好ましい具体例では、ヘキサマーNS1タンパク質は、デング熱ウイルス、特にデング熱ウイルス血清型1のタンパク質である。
【００２２】
また、この発明の対象は、任意に他のタンパク質と会合し、少なくとも1つの医薬的に許容される賦形剤と組合わさった、ヘキサマー形態のフラビウイルスのNS1タンパク質を有効成分として含むことを特徴とする、免疫原性組成物である。
この発明による免疫原性組成物の好ましい具体例で、免疫原性組成物は、種々のデング熱ウイルス血清型に相当するヘキサマー形態のNS1タンパク質の少なくとも1つの混合物からなる。
【００２３】
また、この発明の対象は、少なくとも1つの医薬的に許容される賦形剤と組みあわさった、
-  あらゆる血清型のデング熱ウイルスのNS1タンパク質の全て又は一部を発現し得るポリヌクレオチド、
-  宿主に注入されており、あらゆる血清型のデング熱ウイルスのNS1タンパク質をエンコードするDNA(このDNAは該タンパク質を発現する)を発現できるプロモーターを少なくとも1つ含む発現系
からなる群から選択される有効成分を含むことを特徴とする免疫原性組成物である。
核酸を用いる予防接種のプロトコルは、特に国際出願WO 90/11092に記載されている。
【００２４】
この発明の対象は、インビボで抗体の産生を誘発し得る免疫原性組成物を製造するための、ヘキサマー形態のフラビウイルスのNS1タンパク質、又はその発現系の使用である。
この使用の好ましい方法では、NS1タンパク質は、デング熱ウイルス、特にデング熱ウイルス血清型1のタンパク質である。
また、この発明の対象は、ヘキサマー形態のNS1タンパク質に高い親和性を有する少なくとも1つのモノクローナル抗-NS1抗体の使用である。このモノクローナル抗体は、受動免疫を誘発し得る医薬品の製造のため、次いで精製され、修飾される。
有利には、抗体に対する修飾は、特にFabフラグメントの選択又は抗体のヒト化である。
【００２５】
また、この発明の対象は、早期段階でのフラビウイルスの感染を診断できる、NS1タンパク質に特異的な抗体をインビトロで選択するためのヘキサマーのNS1タンパク質の使用である。
この使用の有利な具体例で、抗体はポリクローナル抗体である。
この使用の別の有利な具体例で、抗体はモノクローナル抗体である。
この使用の別の有利な具体例で、タンパク質は、デング熱ウイルス、特にデング熱ウイルス血清型1のNS1タンパク質である。
抗-NS1モノクローナル抗体は、ヘキサマー形態のNS1タンパク質で免疫化したマウス由来の脾臓細胞を適当な骨髄腫細胞と融合して有利に得られる。
また、この発明の対象は、プロモーターと結合した配列SEQ ID No. 1で定義されるポリヌクレオチドを適当な真核細胞で発現させることからなることを特徴とする、デング熱ウイルスのNS1タンパク質をエンコードするポリヌクレオチドの発現方法である。
【００２６】
この発明の他の特徴及び利点は、残りの記載及び図面によって例示される実施例において明らかである:
-  図1は、排除クロマトグラフィー後に得られる、精製されたヘキサマー細胞外NS1タンパク質を示す。(a) 排除クロマトグラフィー後、タンパク質を限外ろ過で0.5 mg/mlに濃縮し、ジメチルスベリミデート(DMS)を用いて0、0.5、5 及び50 mMで処理する。得られた生成物を非還元Laemmli緩衝液に入れ、4〜20%勾配のアクリルアミドゲルで分離し、クマシーブルーで染色する。50 mM DMSで処理した試料を電気泳動前に3分95℃で加熱し、非共有オリゴマーを分離する。(b) 精製NS1タンパク質を37℃で0.5% 又は1% のn-オクチルグルコシド(nOG)を用いて一晩処理し、任意に25 mMのDMSを用いて1時間処理する。タンパク質を、4〜20%勾配のアクリルアミドゲルで熱変性せずに分離し、文献からの又は上記のようなモノクローナル抗-NS1抗体を用いるイムノブロッティングにより検出する。
【００２７】
-  図2は、後述の実施例2のクローン4Cを用いて得られるデング熱ウイルス血清型1のNS1タンパク質の配列、及びその相当するコード化配列を示す。
-  図3は、デング熱ウイルスに予め感染した患者(その血清を急性段階と回復期段階中に採取した)における捕捉-ELISAによる検出方法を用いて循環しているNS1タンパク質をアッセイして得られる結果、また従来技術IHA (デング熱ウイルス血清型1、2、3又は4の赤血球凝集阻止) 及び MAC ELISA (免疫グロブリンM抗体捕捉酵素-結合イムノソルベントアッセイ)を用いて得られる結果との比較を示している; D1はデング熱血清型1に相当し; D2はデング熱血清型2に相当し;D3はデング熱血清型3に相当し、かつD4はデング熱血清型4に相当する; ID = 患者の身元; 1は疾患の急性段階での第一試料に相当し、2は回復期段階(第一の2〜4週間後に採取)での第二試料に相当する;捕捉-ELISAアッセイで、値は、10、30又は90倍に希釈した同一の血清について得られる光学密度として示す。
【００２８】
-  図4は、フランス領ギアナのデングウイルス血清型1に感染した患者由来の血清について捕捉-ELISAアッセイを用いるNS1タンパク質の検出を示す。 示した数は、カテゴリー当たりに分けられた患者数を示す(捕捉-ELISAによる正又は負ならびにIgMに対する正又は負)。
-  図5は、デング熱ウイルス1に感染したフランス領ギアナ出身の4人の患者について得られた結果を示す。試料は、患者からD1〜D5の疾患の臨床段階中に毎日採取した。グラフはそれぞれ患者に対応しており、そのそれぞれの日に試料を採取した。グラフは、開発した捕捉-ELISAアッセイでのNS1タンパク質の検出結果、RT-PCRの結果及びMAC-ELISA技術を用いて得られた結果と併せている。報告されたO.D.値は、バックグランドのノイズ値に対して1回較正した。正の閾値を破線で示す。
-  図6は、抗-NS1モノクローナル抗体F22及びG18の特徴を示す。
【００２９】
-  図7は、実施例3に記載されるポリクローナル手法を用いる捕捉-ELISAアッセイと比較した、モノクローナル手法を用いる捕捉-ELISAアッセイでのNS1タンパク質の検出を示す。得られた結果は、分析した血清の各希釈(10回、30回又は90回)について測定される光学密度値の形態で示しており、負の対照の平均値より小さい。
-  図8は、黄熱病に特異的な捕捉-ELISAアッセイを用いて黄熱病ウイルスに感染した患者由来の血清におけるNS1タンパク質の証明を示している。試験した各血清について、負の対照の平均値より小さい、開発されたアッセイを用いて測定される光学密度値、黄熱病IgMに特異的なMAC-ELISAアッセイを用いて測定される光学密度値及びウイルスの単離結果を、入手できた際に示している。
【００３０】
実施例1: デング熱ウイルス血清型1のNS1タンパク質の精製
1. 材料と方法
タンパク質を、A.K.I. Falconarら(J. Virol. Meth, (1990), 30, 323-332)によって記載される方法に適用される条件下、デング熱ウイルス血清型1、FGA/89株(P. Despresら、Virol, (1993), 196, 209-219)に感染したVero細胞で産生させる。
細胞培養物を感染から5日後に回収し、1500 gで遠心分離し、細胞残がいを除く。遠心分離分離の上清を20 mM Tris-HCl、1 mMアジ化ナトリウムに入れ、冷限外ろ過で6倍に濃縮し、7.5％のポリエチレングリコール(PEG)濃縮物を用いて2時間4℃で沈澱させ、次いで30分10 000 gで遠心分離し、ウイルス粒子を除く。7.5% PEG含有の浄化した上清を0.05% Tween 20と1 mg/ml のアプロチニンで処置し、次いで抗-NS1モノクローナル抗体を付着させた免疫親和性カラムに通す。Falconarら(上記)に記載されるように、ジエチルアミンの技術にしたがってタンパク質を溶出し、限外ろ過で濃縮し、溶出液を、1 mMアジ化ナトリウム含有10 mM Tris-HCl 緩衝液pH 7.5で交換する。
【００３１】
2. 結果
結果を図1に示す。
図1aは、NS1タンパク質が実際にヘキサマー形態であることを示している。ヘキサマー形態の比率は、DMS濃度の増加に伴って増加する(図1a)。
ヘキサマー形態の細胞外NS1タンパク質は、ノニオン性洗浄剤n-オクチルグルコシド(nOG)の存在下、ダイマーサブユニットに変換されてもよい(図1b)。n-オクチルグルコシド(nOG)の存在下又は不在下37℃で一晩インキュベートし、25 mM DMSで処理した後、nOG不在下でダイマー、テトラマー及びヘキサマーに相当するバンドが存在すること、及びnOG存在下で、nOG濃度に応じたヘキサマーの部分的又は完全な分離があることが認められる(図1b)。
【００３２】
実施例2: デング熱ウイルス血清型1のNS1タンパク質のVero細胞による発現
1. 材料と方法
そのシグナルペプチドをエンコードする遺伝子、次いで翻訳開始コドン、さらに翻訳終結コドンからなるNS1タンパク質遺伝子を含むpCIneo-NS1.FGAプラスミド(1999年6月7日付けでNo. I-2220でInstitut Pasteur のCollection Nationale de Cultures et de Microorganismes [National collection of cultures and microorganisms] (CNCM)に寄託)を、受容性細菌の大腸菌(Stratagene のepicurian SURE)に導入する。このプラスミドを細菌培養物中で増幅し、プラスミドDNAの調製についての従来技術にしたがって精製する。精製DNAを用いて種々のクローンをシークエンスし(クローン4Cの配列を図2に示す)、DOTAP (Boehringer Mannheim)のようなカチオン性リポソーム、又はFuGENE (Boehringer Mannheim)のような非リポソーム剤とのいずれかの適当な混合物を用いてVero細胞をトランスフェクトする。FuGENEと DNAは、無血清培地で15分プレインキュベートし、次いで混合物をVero細胞層と24時間接触させる。次に、細胞をPBS (リン酸緩衝食塩水)で洗浄し、3%パラホルムアルデヒド含有PBS溶液を用いて室温で20分固定し、0.5% Triton X-100含有PBSを用いて5分浸透させる。NS1抗原の存在は、次いでフルオロセイン(fluoroscein)-標識した複合抗体によって認識される特異的な抗体を用いて認められる。
【００３３】
2. 結果
このようにして、トランスフェクト細胞の約20%に、NS1ウイルス抗原に特異的な強力な蛍光シグナルを測定することができる。
つまり、NS1の発現が立証され、安定な系は、トランスフェクト細胞に選択的なマーカーであるネオマイシンの存在下で確立され得る。
図2は、こうして得られるデング熱ウイルス血清型1のNS1タンパク質の配列、また相当するコード化配列を示す。
【００３４】
実施例3: デング熱ウイルス血清型1での感染に関連したこの発明による捕捉-ELISA技術の実施及び従来技術法との比較
1. 捕捉-ELISA技術の原則
NS1ウイルス抗原は、デング熱血清型1の精製されたヘキサマーNS1タンパク質についての免疫捕捉で予め精製された単一特異的なマウスポリクローナル抗体を用いて捕捉される。
NS1の存在は、セイヨウワサビペルオキシダーゼに複合した抗体で認識される、精製したヘキサマーNS1タンパク質で免疫化したウサギ由来抗体を用いて認められる。
【００３５】
2. 材料と方法
a-  NS1タンパク質に対するマウスのポリクローナル抗体の精製
a1- NS1タンパク質の膜への付着
精製NS1タンパク質は、両性ナイロン膜(Nytran, Schleicher & Schuell)への吸着によって付着する。膜表面を、次いでリン酸緩衝食塩溶液(PBS; 10 mM リン酸エステル; pH 7.2; 150 mM NaCl)に3%濃度で存在するウシアルブミンで浸す。 PBSで2回洗浄後、0.25%のグルタルアルデヒドを含有するPBSを用いて15分室温で膜を処理する。PBSで3回洗浄後、3%ウシアルブミン含有100 mMグリシン緩衝液で膜を中和し、PBSで2回洗浄し、次いで1 mM アジ化ナトリウムを有する PBSに4℃で保存する。
【００３６】
a2- マウスの単一特異的なポリクローナル抗体(捕捉抗体)の精製
-  ポリクローナル腹水の生産: デング熱ウイルスに感染し、死にかかっている若いスイスマウスの脳を9 mlのPBS緩衝液中ですりつぶす。生成物を10分 10 000 gで4℃で遠心分離する。
ウイルス懸濁液を、以下の項目日程にしたがってスイスマウスに注射する:
-  D0: 腿に皮下で0.5 mlの抗原
-  D3: 腹膜内に0.4 mlの抗原及び0.1 mlの完全フロイントアジュバント、
-  D25: 腹膜内に0.5 mlの抗原、
-  D26: 0.5 mlのTG180マウスの腹水、及び
-  D28: 腹膜内に0.5 mlの抗原。
腹水をD42で回収する。
腹水を回収後、クロットを室温で1時間形成させ、次いで少なくとも30分1500 gで遠心分離する。上清を4℃で一晩放置する。上清のpHを2M酢酸を用いて4.8に調整し、上清を同条件下で再度遠心分離する。2N水酸化ナトリウム溶液を加えて、上清のpHを次いで7.0-7.2に調整する。上清は、-20℃に保存してもよい。
【００３７】
- デング熱ウイルス血清型1に特異的なマウス抗体の精製:
上記のようにして調製した4つのデング熱ウイルス血清型に対するポリクローナル腹水の混合物中で、膜を室温で1時間インキュベートする。
膜を3回PBSで洗浄後、NS1タンパク質に付着した抗体を、 ジエチルアミン溶液pH 11.4 (100 mMジエチルアミンを含有するIscove (Gibco)で改質したダルベッコ培地)で溶出する。抗体を限外ろ過で濃縮し、1 mMアジ化ナトリウムを含むPBS緩衝液に戻す。
b- NS1タンパク質に対するウサギポリクローナル抗体(明示抗体)の調製:
ウサギは、D0、D7、D21及び任意にD49で、実施例1の方法にしたがって精製したヘキサマーNS1タンパク質30μgを3回又は4回連続的に注射して免疫化し、次いでD83で出血させた。文献に記載されるか、又は上記のように製造されるモノクローナル抗体を有するSepharoseビーズでのインキュベーションによって、血清から非特異的なシグナルを奪う。
【００３８】
c- 捕捉-ELISA法
c1- 標準的な曲線
ヒト血清の試験用の各捕捉-ELISAプレートについて、標準的な範囲を、ポイント1に記載される方法にしたがって精製したNS1タンパク質の溶液から調製する。その初期濃度は0.5 μg/mlであり、それを3-倍連続希釈で希釈する。
C2- 急性段階中の循環しているNS1タンパク質の検出:
上記方法にしたがって得られる精製したマウスポリクローナル抗体(捕捉抗体)をプレートに付着させ、PBS溶液に希釈し、4℃で一晩インキュベートさせる。 PBS/0.05% Tween 溶液で5分3回洗浄した後、プレートを室温で30分PBS、0.05% Tween 及び3% ミルクの混合物で浸す。PBS/0.05% Tween溶液で3回洗浄後、試験され、希釈されるか又は希釈されない血清を置き、さらに室温で1時間反応させる。1/10、1/30及び1/90の希釈物を、PBS/0.05% Tween溶液中で調製する。3回洗浄した後、NS1に特異的な第二抗体(上記のポイント3で得られる明示抗体)を加え、PBS/0.05% Tweenと3%ミルクの混合物に希釈した後、45分37℃でインキュベートする。3回洗浄後、抗-IgG抗体を第二抗体に相対させ、ペルオキシダーゼで標識する。当業者に公知の従来条件下で調製したこの抗体を加え、45分37℃でインキュベーションを行う。3回洗浄後、TMB溶液(3,3', 5,5'-テトラメチルベンジジン、Kierkegaard & Perry Lab)を用いて10分暴露を行う。比色反応は、硫酸を用いて止める。
【００３９】
3. 結果
結果を図3に示す。
この発明による捕捉-ELISA技術により、疾患の急性段階におけるNS1タンパク質の存在を検出することができる。この検出は、患者が一次感染であるか二次感染であるかどうかとは無関係である。
結果から、NS1タンパク質が回復期段階に採取された試料では検出されないため、該タンパク質の存在は一過性のものであることが分かる(図3)。
疾患の急性段階に採取された試料の93%はMAC ELISAアッセイを用いて陰性であることが明らかになったが、回復期段階に採取した試料の100%が、この同じアッセイで陽性であることが分かった(図3).
【００４０】
同様に、赤血球凝集阻止アッセイ(IHA)では、疾患の急性段階にある80%の症例でデング熱ウイルス血清型1の感染を検出することができないが、この試験は回復段階に採取された試料については100%陽性であることが分かった(図3)。 WHOの基準によれば、回復期段階に採取された血清において1280未満のIHAレベルは、デング熱の一次感染を診断でき、1280以上のレベルはデング熱の二次感染を診断できる。したがって、この研究における陽性血清の半分は、一次デング熱の症例に相当し、他の半分は二次デング熱の症例に相当する。つまり、この発明による捕捉-ELISA技術は、一次及び二次感染の症例でNS1タンパク質を検出することができる。
【００４１】
実施例4: 検出領域の決定
1. 材料と方法
a- デング熱ウイルス1に感染したフランス領ギニア出身患者群について行った研究
試料は、臨床的な徴候(当初の画一的な発熱)の現象を示すD0から回復期段階の最後に相当するD66のあいだ、デング熱ウイルス血清型1に感染した患者から採取する。
循環しているNS1の存在を、実施例3に記載される捕捉-ELISA法にしたがってこれらの患者の血清で研究する。得られた結果を、データが利用可能である際に、MAC-ELISAによって測定される特異的なIgMに対する陽性と比較する。
b- デング熱ウイルス1に感染した4人の患者の毎日のモニター
試料は、D1〜D5の臨床段階中の4人の患者から毎日採取した。各血液試料について、ウイルスRNAを明らかにするためのRT-PCR反応、デング熱ウイルスに特異的なIgMを検出するためのMAC-ELISAアッセイ及び上記の捕捉-ELISA法に従ったデング熱NS1抗原についての研究を行った。
【００４２】
2. 結果
a- 検出領域の決定
結果を図4に示す。
D1〜D6のあいだ、循環しているNS1タンパク質の検出の可能性は、感染患者の64% (D2で)〜100% (D5で)のあいだで変動する。D10以降、循環しているNS1タンパク質はもはや検出されないが、抗体反応が優勢になる。
循環しているNS1タンパク質の検出は、ある症例ではD3に現れてD5から最高潮に達する全IgM(ウイルス抗原に特異的)の存在や、ある症例ではD2に現れる可能性がある全IgGの存在にすら依存しているものとは考えられない。他方、臨床段階でNS1抗原が検出されないことは、具体的にはNS1に相対しているIgGの存在によって説明できるかもしれない。
つまり、この発明による捕捉-ELISA技術を用いる血清中のNS1抗原についての検出領域は、臨床的な徴候が現れた後のD1〜D6であることが好ましい。
【００４３】
b- デング熱ウイルスに感染した4人の患者の毎日のモニター
結果を図5に示す。
研究した4人の患者で、NS1タンパク質は、症状の始まりに対して試料を採取した日に関わらず、D5まで連続的に検出される。ある患者の場合、タンパク質の検出領域は、RT-PCRによって検出されるウイルス血症期間より幅広い。
【００４４】
実施例5: デング熱ウイルス血清型1での感染に関連したモノクローナル手段での捕捉-ELISA技術の実施、及び上記捕捉-ELISA技術との比較
1. 材料と方法
a- デング熱ウイルス血清型1のNS1タンパク質に対するマウスのモノクローナル抗体の産生及び特徴づけ
a1- NS1タンパク質に対するマウスのモノクローナル抗体の産生
実施例1の方法にしたがって精製した、デング熱ウイルス血清型1のヘキサマーNS1タンパク質10μgを7回注射して、メスのBalb/Cマウスを免疫化した。完全フロイントアジュバントでの最初の注射及び不完全フロイントアジュバントでのその後の5回の注射は、15日あけて皮下で行う。動物を殺す3日前に行う不完全フロイントアジュバントでの最終注射は、腹膜内に行う。
標準的なプロトコルにしたがって、免疫化マウスの脾臓細胞をマウスの骨髄腫と融合し、クローンが現れるまで培養する。
【００４５】
a2- 抗-NS1抗体を分泌するハイブリドーマの同定
NS1タンパク質に特異的な抗体を、従来のELISA技術を用いるか、又は捕捉-ELISA技術を用いて検出した。
-  従来のELISA技術
実施例1の方法にしたがって精製したヘキサマーNS1タンパク質を、4℃で一晩PBS溶液中1 μg/ml濃度で吸着によりプレートに付着させる。PBS/0.1% Tween (PT)溶液で3回洗浄後、0.5% ゼラチン含有PT溶液(PTG)を用いて2倍希釈した種々のハイブリドーマの上清とタンパク質を1時間37℃でインキュベートする。PTで3回洗浄後、PTGに希釈したペルオキシダーゼ-標識した抗-マウスIgG 抗体を加え、1時間37℃でインキュベートする。3回洗浄後、オルソフェニレンジアミンの存在下で過酸化水素溶液を用いて暴露を行う。
【００４６】
-  捕捉-ELISA技術
使用した技術は、試験される血清の希釈を、非感染のVero細胞、又はデング熱ウイルス血清型1で5日間感染し、ポリエチレングリコール7%で沈澱させたVero細胞に対する培養上清(実施例1:デング熱ウイルス血清型1のNS1タンパク質の精製参照)について、PTG溶液で1/10希釈に置換した以外は、実施例3に記載されている(急性段階で循環しているNS1タンパク質の検出参照)。非感染のVero 細胞の培養上清に対する種々のハイブリドーマ由来上清の反応性は、非特異的シグナルに対する対照として用いる。
【００４７】
a3- 4つのデング熱ウイルス血清型の1つに感染したVero細胞に対する間接的な免疫蛍光による抗-NS1モノクローナル抗体の反応性
Vero細胞は、4つのデング熱ウイルス血清型の1つで40時間感染させる:
血清型1: FGA/89株
血清型 2: NG株
血清型 3: H87株
血清型 4: H241株
PBS溶液で1回洗浄後、細胞を研究室温度で30分PBS中3%のパラホルムアルデヒド溶液で固定する。次に、PBSで洗浄した細胞を10分PBS中0.5%のTriton X-100溶液で浸透させる。PBSで洗浄後、ELISAで陽性に反応する種々のハイブリドーマからの上清とともに細胞を1時間インキュベートする。PBSで3回洗浄後、蛍光標識した抗-マウスIgG抗体を加え、1時間インキュベートする。PBSで3回洗浄後、スライドをカバーガラスで覆い、蛍光顕微鏡下で観察する。
【００４８】
a4- マウスモノクローナル腹水の調製
モノクローナル腹水を、Balb/Cマウスで産生させる。モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマクローンを腹膜内注射する1週間前に、マウスに 0.5 mlのプリスタン(2,6,10,14-テトラメチルペンタデカン, Sigma)を腹膜内注射する。腹水を形状のまま除き、1500 rpmで20分遠心分離し、-20℃で保存する。
a5- 抗-NS1 モノクローナル抗体のイソタイプの決定
抗-NS1抗体のイソタイプを、種々のマウス免疫グロブリンのサブクラス: IgG1、IgG2a、IgG2b 及びIgG3に対する抗体を用いるELISAで決定する。免疫グロブリンの軽鎖を、同じ方法論にしたがって決定する。
【００４９】
a6- 抗-NS1モノクローナル抗体の親和定数の測定(B Friguetら、J. Immunol, (1985), 77, 305-319)
抗体の親和性は、抗体の部位の50%を飽和するのに必要な抗原濃度に相当する。インキュベーションは、反応の平衡に達するために、抗体を一定濃度にし、抗原の濃度は低下するようにした液体培地で4℃で一晩行う。平衡後の遊離抗体の濃度は、ELISAアッセイを用いて測定する: 混合物を、抗原とプレインキュベートしたプレートに沈積させる。(平衡のシフトを避けるため)4℃で20分インキュベート後、β-ガラクトシダーゼ-結合抗-マウスIgG、次いで酵素反応で、ELISAを暴露する。解離定数KDを次いで測定する。
【００５０】
a7- 種々の抗-NS1 モノクローナル抗体についての競合反応
この反応により、同じエピトープ又は異なるエピトープに対するモノクローナル抗体の特異性を決定することができる。エピトープの決定は、非標識モノクローナル抗体及びビオチンに結合した第二モノクローナル抗体の抗原に対する反応性を利用する。
非標識の第一モノクローナル抗体を、抗原を予め付着したプレートに飽和濃度(ELISAで予め測定)で入れ、2時間37℃でインキュベートする。4℃でPT溶液で4回洗浄後、ビオチンに結合した第二モノクローナル抗体を加え、20分4℃でインキュベートする。4℃でPT溶液で4回洗浄後、ペルオキシダーゼ-標識したストレプトアビジン複合体溶液を加え、37℃で1時間インキュベートする。PT溶液で4回洗浄後、オルソフェニレンジアミンの存在下で過酸化水素溶液を用いて複合体が認められる。シグナルが分光光度計での読み取り後に得られる場合、 これは、2つの抗体によって認識されるエピトープが異なることを意味する。逆の場合には、2つのモノクローナル抗体は抗原の同じエピトープに相対している。
【００５１】
b- モノクローナル抗体G18及びF22の精製
抗体G18及びF22は、実施例3に記載されるように免疫親和性によって精製する。
c-   モノクローナル抗体を用いる捕捉-ELISAアッセイでの循環しているNS1タンパク質の検出
精製モノクローナル抗体G18及びF22は、一定の希釈でPBS溶液中に混合し、4℃で一晩インキュベートする。このELISAの後の工程は、先の実施例の工程と同様である。
d- ポリクローナル手法を用いるアッセイとモノクローナル手法を用いる捕捉-ELISAアッセイの比較
フランス領ギアナの血清パネルを、モノクローナル手法を用いる捕捉-ELISAアッセイ、次いでポリクローナル手法を用いるアッセイで同じ日に試験した。血清は、種々の希釈: 10、30及び90回で試験した。
【００５２】
2. 結果
a- モノクローナル抗体の特徴づけ
結果を図6に示す。
抗体G18とF22を、NS1タンパク質の種々のエピトープに高い親和性で結合する能力について選択した。抗体F22はデング熱ウイルス血清型1に特異的で、G18はデング熱ウイルス血清型1と3に特異的である。
b- NS1抗原捕捉のためのモノクローナル抗体の使用
結果を図7に示す。
選択されたモノクローナル抗体は、ポリクローナル手法を用いて得られる結果を再現するのみならず、ポリクローナル抗体より著しい反応性を示す。したがって、開発されたモノクローナルの手段は、診断の用途に特に適していると思われる。
【００５３】
実施例6: 別のデング熱ウイルス血清型又は別のフラビウイルスでの感染に関連したこの発明による捕捉-ELISA技術の実施
1. 材料と方法
a- 培養上清の調製
Vero細胞をデング熱ウイルス2又は日本脳炎ウイルス又は黄熱病ウイルスのいずれかで感染する。次いで、培養上清を実施例1に記載する方法にしたがって調製する。
b- 黄熱病ウイルス及び日本脳炎ウイルスのNS1タンパク質に対するモノクローナル抗体の精製
黄熱病ウイルスのNS1タンパク質に対する抗体8G4、1A5及び2D10 (J.J. Schlesingerら、Virology, (1983), 125, 8-17)ならびに日本脳炎ウイルスのNS1タンパク質に対する抗体171-2-2及び70-14-20のモノクローナル腹水を、タンパク質A Sepharose CL-4Bビーズ(Pharmacia Biotech)で精製する。これらのモノクローナル腹水を、タンパク質Aビーズで4℃で一晩インキュベートする。ビーズを3回PBS/0.05% Tweenで洗浄した後、タンパク質Aビーズに付着した抗体をグリシン緩衝溶液pH=3で溶出する。それらを次に限外ろ過で濃縮し、1 mMアジ化ナトリウム含有PBS緩衝液に戻す。
【００５４】
c- デング熱ウイルス2培養上清中のNS1タンパク質の検出
c1- 使用した抗体
捕捉工程は、モノクローナル抗体3D1.4及び1A12の腹水混合物を用いて行う(A.K.I. Falconarら、Arch. Virology, (1994), 137, 315-326)。次に、タンパク質を2つのウサギ抗体混合物: 実施例3に記載される精製タンパク質で免疫化後に得られる血清及び4つのデング熱血清型ウイルスでの免疫化後に得られるウサギ血清を用いて認識する。
c2- 捕捉-ELISA法
用いた技術は、実施例3に記載されるものと同じである。
d- 日本脳炎ウイルス培養上清中のNS1タンパク質の検出
d1- 使用した抗体
精製モノクローナル抗体171-2-2 及び70-14-20 を、捕捉工程に用いる。次に、日本脳炎のNS1タンパク質の組換えタンパク質で予め免疫化したウサギからの2つの血清混合物で、タンパク質を認識する。
【００５５】
d2- 捕捉-ELISA法
用いた技術は、実施例3に記載されるものと同じである。
e- 黄熱病ウイルス培養上清及びこのウイルスの感染患者由来血清におけるNS1タンパク質の検出
e1- 使用した抗体
精製したモノクローナル抗体8G4、1A5及び2D10を所定の希釈で、PBS溶液に混合し、捕捉抗体として用いる。黄熱病NS1に特異的な第二抗体は、黄熱病17DウイルスのNS1タンパク質に対して予め免疫化したウサギ血清からの開始物を用いた(J.J. Schlesingerら、J. immunol. (1985), 135, 2805-2809)。
e2- 捕捉-ELISA法
用いた技術は、実施例3に記載のものと同じである。
【００５６】
2. 結果
NS1タンパク質の分泌は、種々のフラビウイルス、DEN2ウイルス(Winklerら、Virology (1988), 162, 187-196、Pryorら、Virology (1993) 194, 769-780)、ダニ媒介脳炎ウイルス(Leeら、J. Gen. Virol. (1989), 70, 335-343、Crooksら、J. Chrom. (1990), 502, 59-68、Crooksら、J. Gen. Virol. (1994), 75, 3453-3460)、日本脳炎ウイルス(Mason, Virology (1989), 169, 354-364、Fanら、Virology (1990), 177, 470-476)、マリーバレー脳炎ウイルス(Hallら、J. Virol. Meth. (1991), 32, 11-20)及び黄熱病ウイルス(Postら、Vir. Res. (1990), 18, 291-302)に感染したインビトロの細胞培養物で以前に報告されている。これらの結果は、異なるELISA技術を用いて得られたので、感染した哺乳動物細胞上清にこの発明の捕捉-ELISA技術を用いてタンパク質を決定するよう努めた。
NS1タンパク質は、DEN2ウイルス、日本脳炎ウイルス又は黄熱病ウイルスのいずれかに感染したVero細胞の培養上清で検出できる。
【００５７】
図8に示した結果で立証されるように、黄熱病ウイルスに感染した患者由来の血清では、この技術を用いてタンパク質を決定することもできた。Ch. Mathiot (Institut Pasteur of Dakar)によって寛大にも提供された18個の血清のうち、7個はNS1抗原血症に陽性である。DEN1ウイルスに関して、循環しているNS1タンパク質の検出は、黄熱病に特異的なIgMの存在と無関係であると考えられる。
この発明による捕捉-ELISA技術により、種々のフラビウイルスに感染した細胞の培養上清及び黄熱病ウイルスに感染した患者由来血清中でNS1タンパク質を検出することができる。このため、それは、DEN1ウイルス以外のフラビウイルスの感染を検出するための診断上の応用性を有している。
【００５８】
【図面の簡単な説明】
【図１】  排除クロマトグラフィー後に得られる、精製されたヘキサマー細胞外NS1タンパク質を示す。(a) 排除クロマトグラフィー後、タンパク質を限外ろ過で0.5 mg/mlに濃縮し、ジメチルスベリミデート(DMS)を用いて0、0.5、5 及び50 mMで処理する。得られた生成物を非還元Laemmli緩衝液に入れ、4〜20%勾配のアクリルアミドゲルで分離し、クマシーブルーで染色する。50 mM DMSで処理した試料を電気泳動前に3分95℃で加熱し、非共有オリゴマーを分離する。(b) 精製NS1タンパク質を37℃で0.5% 又は1% のn-オクチルグルコシド(nOG)を用いて一晩処理し、任意に25 mMのDMSを用いて1時間処理する。タンパク質を、4〜20%勾配のアクリルアミドゲルで熱変性せずに分離し、文献からの又は上記のようなモノクローナル抗-NS1抗体を用いるイムノブロッティングにより検出する。
【図２】    後述の実施例2のクローン4Cを用いて得られるデング熱ウイルス血清型1のNS1タンパク質の配列、及びその相当するコード化配列を示す。
【図３】    図3は、デング熱ウイルスに予め感染した患者(その血清を急性段階と回復期段階中に採取した)における捕捉-ELISAによる検出方法を用いて循環しているNS1タンパク質をアッセイして得られる結果、また従来技術IHA (デング熱ウイルス血清型1、2、3又は4の赤血球凝集阻止) 及び MAC ELISA (免疫グロブリンM抗体捕捉酵素-結合イムノソルベントアッセイ)を用いて得られる結果との比較を示している; D1はデング熱血清型1に相当し; D2はデング熱血清型2に相当し;D3はデング熱血清型3に相当し、かつD4はデング熱血清型4に相当する; ID = 患者の身元; 1は疾患の急性段階での第一試料に相当し、2は回復期段階(第一の2〜4週間後に採取)での第二試料に相当する;捕捉-ELISAアッセイで、値は、10、30又は90倍に希釈した同一の血清について得られる光学密度として示す。
【図４】  フランス領ギアナのデング熱ウイルス血清型1に感染した患者由来の血清について捕捉-ELISAアッセイを用いるNS1タンパク質の検出を示す。 示した数は、カテゴリー当たりに分けられた患者数を示す(捕捉-ELISAによる正又は負ならびにIgMに対する正又は負)。
【図５】  デング熱ウイルス1に感染したフランス領ギアナ出身の4人の患者について得られた結果を示す。試料は、患者からD1〜D5の疾患の臨床段階中に毎日採取した。グラフはそれぞれ患者に対応しており、そのそれぞれの日に試料を採取した。グラフは、開発した捕捉-ELISAアッセイでのNS1タンパク質の検出結果、RT-PCRの結果及びMAC-ELISA技術を用いて得られた結果と併せている。報告されたO.D.値は、バックグランドのノイズ値に対して1回較正した。正の閾値を破線で示す。
【図６】  抗-NS1モノクローナル抗体F22及びG18の特徴を示す。
【図７】    実施例3に記載されるポリクローナル手法を用いる捕捉-ELISAアッセイと比較した、モノクローナル手法を用いる捕捉-ELISAアッセイでのNS1タンパク質の検出を示す。得られた結果は、分析した血清の各希釈(10回、30回又は90回)について測定される光学密度値の形態で示しており、負の対照の平均値より小さい。
【図８】    黄熱病に特異的な捕捉-ELISAアッセイを用いて黄熱病ウイルスに感染した患者由来の血清におけるNS1タンパク質の証明を示している。試験した各血清について、負の対照の平均値より小さい、開発されたアッセイを用いて測定される光学密度値、黄熱病IgMに特異的なMAC-ELISAアッセイを用いて測定される光学密度値及びウイルスの単離結果を、入手できた際に示している。
【配列表】
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【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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