(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）生物学的な液状調製物を、脂質コートされたウイルスを不活化するのに十分である濃度および条件下で、溶媒−洗剤組み合わせ物により処理し；
（ｂ） （ａ）において得られた液状調製物を、細孔容積が３次元架橋された疎水性アクリル酸ポリマーで充填されているシリカビーズからなるクロマトグラフィー充填 物を通過させることによって、その液状調製物から溶媒−洗剤試薬を除去し；そして
（ｃ） 段階（ｂ）の液状生産物を、孔径１５ｎｍ〜７０ｎｍをもつ フィルターを通過させる：段階を含んでなる生物学的な液状調製物中に存在するウイルスの不活化方法。
【請求項２】
クロマトグラフィー充填物が、ＳＤＲ ＨｙｐｅｒＤ（登録商標）（Ｂｉｏｓｅｐｒａ）である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
段階（ａ）の後に、（ａ１）溶媒−洗剤組み合わせ物を疎水性成分によって抽出することを含んでなる段階（ａ１）が存在する、請求項１記載の方法。
【請求項４】
疎水性成分が生物学的に適合しうる植物油である、請求項３記載の方法。
【請求項５】
溶媒−洗剤組み合わせ物が、ＴｎＢＰ；Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００；Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０およびコール酸ナトリウムからなる群から選ばれる薬剤の少なくとも１種を含有する、請求項１記載の方法。
【請求項６】
液状調製物がヒト血漿から得られる、請求項１記載の方法。
【請求項７】
液状調製物がヒト血漿の沈降物から生じる、請求項１記載の方法。
【請求項８】
沈降物が寒冷沈降物である、請求項７記載の方法。
【請求項９】
沈降物が免疫グロブリンを含有する、請求項７または８記載の方法。
【請求項１０】
液状調製物が、
（ａ）血漿から免疫グロブリン含有沈降物を得て；
（ｂ） 該沈降物を水中に再懸濁し；
（ｃ） 段階（ｂ）において得られた沈降物のｐＨを調整し；そして
（ｄ） 段階（ｃ）において得られる沈降物を、メンブランフィルターを用いて限外濾過／透析濾過して、所望のタンパク質濃度を得ること：を含んでなる方法によって得られる調製物である、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
段階（ｃ）のｐＨがｐＨ５以下に調整される、請求項１０記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、生物調製物からのウイルスの除去および不活化方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
血液および血漿調製物のような生物学的に誘導される液状調製物が、原料として使用され、これから多数の生物学的に有用な化合物が精製できる。そのような化合物の例は、免疫グロブリン、ＶＩＩＩ因子、アルブミン、α１抗トリプシン、ＩＸ因子、ＸＩ因子、ＰＰＳＢ、フィブリノーゲンおよびトロンビン（プロトロンビン）を含む。さらに、種々の生物学的産物、例えばホルモン、成長因子、酵素およびリガンドが、細胞培養から得られる生物調製物から単離されている。
【０００３】
これらの有用な物質の生産に使用される細胞は、種々の動物起源からの野生型細胞か、あるいはまた、遺伝的に工作された原核もしくは真核細胞のいずれかであってもよい。これらの液状調製物から得られる生物学的物質は、治療目的のために、特に静脈内投与によってヒトに投与される場合には、調製物の無菌性が主たる関心事である。かくして、多くの努力は、これらの調製物中に存在しているかもしれないウイルス、例えば肝炎ウイルスおよびＨＩＶウイルスの不活化に注ぎ込まれている。
【０００４】
脂質コートされたウイルスは、非イオン性の生物学的適合性溶媒および洗剤を用いる処理によって効果的に不活化される。溶媒−洗剤施用によるウイルスの不活化方法は、例えば、欧州特許第０１３１７４０号において記述されている。しかしながら、脂質コートされていないウイルスは、溶媒−洗剤処理によって不活化することができず、かくして、他の不活化方法が、それらの不活化のために使用されねばならない。これらは、加熱（パスツーリゼーション）、短波長紫外線（ＵＶＣ）のような照射またはγ線放射の施用、ならびに物理的手段による除去、例えばサイズ排除によりウイルスを除去するような非常に狭いフィルター孔を通しての調製物のナノ濾過（ナノフィルトレーション（ｎａｎｏｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ））を含む。
【０００５】
Ｎｏｒｅｅｎら（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，２６：３２１−３２９（１９９８））は、７％ＩＶＩｇ溶液における溶媒洗剤処理の前に、Ｍｅｍｂｅｒｇミクロ多孔膜中空糸（Ｐｌａｎｏｖａ）３５ｎｍフィルターを使用して、両非包膜および包膜ウイルスの潜在的な混入を低下させる試験を行った。上記研究では、ナノフィルトレーションは、シンドビスウイルス、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、ウシのウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）、ネコ・カリシウイルス、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣ）、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、ウシ・パルボウイルス（ＢＰＶ）およびブタ・パルボウイルス（ＰＰＶ）：を含むサイズが７０ｎｍ〜１８ｎｍにわたる種々のエンベロープおよび非エンベロープウイルスの除去のために有効であった。この研究は、３５ｎｍより大きいすべてのウイルスの完全な減少（検出アッセイ限界までの）を示した。興味あることに、ＥＭＣおよびＨＡＶのような比較的小さいウイルスさえもが、この濾過方法によって少なくとも部分的に除去された。
【０００６】
これらの研究は、生物学的調製物からのウイルスの除去のためのナノフィルトレーションの使用をもたらした。しかしながら、溶媒−洗剤法（脂質コートされたウイルスの不活化のための）、ならびにナノフィルトレーション除去（サイズ排除、したがって脂質コートされていないウイルスの除去のための）による両ウイルス不活化を組み合わせることが望ましい場合には、ナノフィルトレーション段階は、特に溶媒−洗剤が、油抽出およびＣ−１８逆相樹脂によって除去されるべきである溶媒−洗剤利用を進行させねばならないことが発見された。この理由は、溶媒−洗剤の抽出後には、小油滴の痕跡物、ならびに樹脂の親水性部分に結合している溶媒−洗剤の残渣が常に存在するからであった。さらにまた、生物学的調製物から精製される若干のタンパク質は、精製工程の間に改変されることがあり、そして改変されたタンパク質は、改変されたタンパク質の疎水性が変化するダイマーおよびポリマーを形成する可能性がある。これらの油滴の痕跡物、タンパク質ダイマーの凝集体および油とタンパク質残渣の混合物は、ナノフィルターの小さい孔をふさぎ、その結果、濾過の時間を増加し、高価なフィルターの高頻度の交換を必要とし、そして一般に、生産物の収率を減少させがちである。
【０００７】
ナノフィルターを詰まらせる傾向にある油滴の残渣（汚染物）は、分子排除のクロマトグラフィーメカニズムか、または疎水性クロマトグラフィーのいずれかを使用することによって除去された。しかしながら、溶媒洗剤の除去のための慣用法のどれも、溶媒洗剤によって惹起されるダイマー形成もしくは凝集の問題の処理に、未まだ、向けられておらず、そしてこの問題は、未まだ、残されたままである。生物学的な液状調製物、例えば免疫グロブリン調製物からの溶媒−洗剤の除去は、一般に、ゲルクロマトグラフィーを使用することによって実施される。米国特許第５，０９４，９６０号および同第５，６４８，４７２号は、ゲル逆相（疎水性）クロマトグラフィーを使用しない、免疫グロブリン調製物からの溶媒−洗剤の除去に関する。
【０００８】
２つの他の特許は、溶媒洗剤の除去が、液状ＩＶＩｇ生産物の安定性に影響することを指摘している方法に与えられた（米国特許第５，０９４，９６０号、同第４，７８９，５４５号および同第５，６４８，４７２号）。Ｇ．Ｗｅｒｎｅｒａｎｄ  Ｐ．Ｓｅｌｏｓｓｅ（米国特許第５，６４８，４７２号）は、ＴｎＢＰおよび／またはＴｒｉｔｏｎＸ１００による免疫グロブリンの処理と、それに続く生物学的に適合しうる植物油を用いる抽出を含み、この場合、ＴｎＢＰおよび／またはＴｒｉｔｏｎＸ１００および植物油が、続いて、疎水性材料における固相抽出によって除去される、静脈内適用に適するエンベロープ・ウイルスを不活化された免疫グロブリン液を調製する方法を記している。これは、ＩＶＩｇの植物油抽出と、それに続く疎水性カラムを通すクロマトグラフィーの組み合わせが、高い温度においてさえも、免疫グロブリンの非常に安定な液状溶液を生産することを示した。この特許は、ＩＶＩｇ調製物が、２つの先行特許にしたがって調製されることを特許請求している：
Ｂｏｎｏｍｏ，１９９２（米国特許第５，０９４，９６０号）は、固相抽出および好適な樹脂としてのＷａｔｅｒｓ  Ｉｎｃ．製Ｂｕｌｋ  Ｃ−１８充填物の使用を教示している。Ｗｏｏｄｓ，１９８６（米国特許第４，７８９，５４５号）は、天然に存在する油による溶媒洗剤の除去を特徴とするが、この方法によって得られる生産物は、静脈内免疫グロブリンの不安定な調製物をもたらした。
【０００９】
Ｇｕｅｒｒｉｅｒら（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｂ  ６６４：１１９−１２５（１９９５））は、ウイルスを不活化された生物液から溶媒−洗剤混合物を除去することを意図する特定の吸着剤（ｓｏｒｂｅｎｔ）を記述している。溶媒−洗剤除去性（ＳＤＲ）ＨｙｐｅｒＤ吸着剤は、Ｂｉｏｓｅｐｒａ（Ｃｅｒｏｙ−Ｓａｉｎｔ−Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅ，Ｆｒａｎｃｅ）によって供給されている。このクロマトグラフィー充填物は、細孔容積が、３次元架橋された疎水性アクリル酸ポリマーにより満たされたシリカビーズから作成された。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、最初に、溶媒−洗剤によって調製物を処理し、この後、溶媒−洗剤を、植物油の使用による抽出を、固相抽出（具体的には、米国特許第５，６４８，４７２号により推奨されているようなＢｕｌｋＣ１８を用いる）と組み合わせ、または組み合わすことなく行うことを含む、生物調製物中に存在するウイルスの不活化方法が、ＰｌａｎｏｖａTMＦｉｌｔｅｒ３５ｎｍを通過させることが非常に困難であった免疫グロブリン液状調製物をもたらすという発見に基づいている。かくして、そのような操作はウイルスの有効な不活化のために不適当であるということが、明確に理解された。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明によれば、驚くべきことに、溶媒−洗剤処理と、それに続くＢｉｏｓｅｐｒａ製ＳＤＲ  ＨｙｐｅｒＤを利用するクロマトグラフィーの組み合わせが、高い流速においてＩＶＩｇのＰｌａｎｏｖａ  Ｆｉｌｔｅｒ３５ｎｍの通過を可能にし、そして非常に高い収率を特徴としながら、活性ウイルスを欠く液状調製物をもたらすことが発見された。本発明によれば、さらに、免疫グロブリンのダイマー形成の問題は、ナノフィルトレーション段階前にｐＨを４．０に低下させることによって部分的に解決できることが見い出された。
【００１２】
かくして、本発明は、
（ｉ）生物学的な液状調製物を、脂質コートされたウイルスを不活化するのに十分である濃度および条件下で溶媒−洗剤組み合わせ物と接触させ；
（ｉｉ）（ａ）において得られた液状調製物を、細孔容積が３次元架橋された疎水性アクリル酸ポリマーで充填されているシリカビーズからなるクロマトグラフィー充填物上を通過させることによって、その液状調製物から溶媒−洗剤痕跡物を除去し；そして
（ｉｉｉ）段階（ｂ）の液状生産物を、孔径範囲約１５ｎｍ〜約７０ｎｍをもつフィルターを通過させる：
段階を含んでなる液状調製物中に存在するウイルスの不活化方法に関する。
【００１３】
段階（ａ）の後、油のような疎水性組成物、例えば生物学的に適合しうる植物油による溶媒−洗剤の抽出の段階が場合によって存在してもよい。かくして、また、段階（ｂ）にけるクロマトグラフィー充填物の除去は、油痕跡物および油関連不純物の除去において有用である。
【００１４】
用語「ウイルスを不活化する」は、ウイルスが、溶液中に維持されているが、生存不可能にされている（例えば、それらの脂質コートを溶解することによって）状況、ならびに液状調製物からのウイルスの物理的除去（例えば、サイズ排除によって）の両方を指す。かくして、本発明の文脈上、この用語は、ウイルス破壊およびウイルス除去の両方を指す。
【００１５】
用語「生物学的な液状調製物（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｌｉｑｕｉｄ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）」は、生物起源から得られたすべての種類の液状調製物を指す。これは、典型的には、体液、例えば血液、血漿および尿から得られた調製物、ならびに調製物中に細胞によって分泌された生物学的な物質を含有するか、または本来、細胞内に存在していて、種々の操作、例えば細胞の溶解により液状調製物に放出された物質を含有する、細胞培養物から得られる液体を含む。
【００１６】
ウイルス不活化の方法は、本発明によれば、多数の実用、例えば：免疫グロブリン、ＶＩＩＩ因子、アルブミン、α１抗トリプシン、ＩＸ因子、ＸＩ因子、ＰＰＳＢ、フィブリノーゲン、およびトロンビン（プロトロンビン）およびその他を含む、種々のタンパク質の単離；細胞培養物からの遺伝的に工作されたタンパク質の単離；ホルモン、成長因子、酵素、凝血因子、レセプターおよびその他の生物学的に活性なコポリマー等の単離、のために使用されてもよい。
【００１７】
本発明の好適な実施態様によれば、生物学的な液状調製物は、精製されるべきものとしての免疫グロブリンを単離することが意図されており、そして該調製物は血漿分画からのペーストＩＩ（Ｐａｓｔｅ  ＩＩ）を水中に再懸濁し、その調製物のｐＨを調整し、そして限外濾過し、そして得られる生産物を、所望のタンパク質濃度を得るためにメンブランフィルターを使用してダイアフィルトレーションすることによって得られる。
【００１８】
脂質コートされたウイルスを不活化させるべく使用される溶媒−洗剤組み合わせ物は、ＴｎＢＰとＴｒｉｔｏｎＸ−１００；Ｔｗｅｅｎ８０とコール酸ナトリウム、およびその他のような当該技術分野において既知のいかなる溶媒−洗剤組み合わせ物であってもよい。溶媒洗剤の濃度は、当該技術分野において通常使用される濃度、例えば、＞０．１％ＴｎＢＰと＞０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００であるべきである。典型的には、溶媒−洗剤がウイルスを不活化する条件は、ｐＨレベル範囲５〜８における溶媒洗剤１０〜１００ｍｇ／ｍｌ、および温度範囲２〜３７℃において３０分〜２４時間からなる。しかしながら、他の溶媒洗剤組み合わせ物および適当な条件が、当該技術分野において熟達したすべての人にとって明らかであろう。
【００１９】
溶媒−洗剤処理を遂行した後、溶媒−洗剤の大部分は、ＳＤＲ樹脂（溶媒−洗剤除去）の使用によって除去されるが、これは、細孔容積が、３次元架橋された疎水性アクリル酸ポリマーにより充填されているシリカビーズからなるクロマトグラフィー充填物である。そのようなＳＤＲの例は、Ｂｉｏｓｅｐｒａによって供給されるＨｙｐｅｒＤ樹脂である。
【００２０】
次いで、得られる調製物は、孔径７０ｎｍ未満、好ましくは１５〜５０ｎｍをもつナノフィルターを通過させられる。正確な孔径は、液状調製物中に維持されねばならないタンパク質、およびサイズ排除によって除去されねばならないウイルスのサイズにしたがって決定されるべきである。
【００２１】
本発明の方法は、ナノフィルトレーション段階が、溶媒洗剤による処理に先行する他のウイルス不活化方法を超える次の長所をもつ：
（１）フィルターの細孔に付着するウイルス量は、比較的小さく（若干のウイルスが溶媒−洗剤処理によって除去されるので）、その結果、操作の費用のかかる部分であるフィルターの交換が減少される。
【００２２】
（２）液状調製物は、溶媒−洗剤およびＳＤＲ抽出（ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ）により処理された後では、このナノフィルトレーション段階が方法の第１段階として実施されたよりもはるかに素早くナノフィルターを通過するので、操作の時間経過が減少される。
【００２３】
（３）生産の間のフィルターの目詰まりは、通常、収率における有意な減少をもたらした。本発明の収率は、約９７〜１００％である。
【００２４】
（４）ＳＤＲ樹脂の疎水性充填は、免疫グロブリン溶液におけるダイマーの濃度を減少させる。免疫グロブリンが、そのダイマーを一旦枯渇されると、低いｐＨレベルが分子にさらなる負電荷を付与し、これが、次に互いに反発することによって、新しいダイマー形成の割合を低下する。
【００２５】
調製物が免疫グロブリン調製物である場合のダイマー形成問題は、ｐＨレベルをｐＨ５以下に低下することによって部分的に解決される。
【００２６】
【実施例】
実施例１：免疫グロブリン調製物中のウイルスの不活化
Ｃｏｈｎ分画法によって血漿から調製されたペーストＩＩが、１８時間水中に再懸濁された；ｐＨは、ＨＣｌの添加によって４．６に調整された。得られる溶液は、３０，０００Ｋ  Ｆｉｌｔｒｏｎメンブランフィルターを用いて限外濾過／ダイアフィルトレーション処理されて、タンパク質濃度９０ｍｇ／ｍｌを得た。ｐＨが５．３に調整され、そして０．３％ＴｎＢＰおよび１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００がその溶液に添加された。得られた懸濁液は、６℃で４時間インキュベートされた。次いで、懸濁液は、２つのサブプロセスに分けてかけられた。１つの懸濁液は、最初に、トウゴマ油によって抽出され、続いてＷａｔｅｒｓ製Ｂｕｌｋ  Ｃ−１８樹脂においてクロマトグラフィーにかけられ、そして第２のサンプルは、ＢｉｏｓｅｐｒａＳＤＲ  ＨｙｐｅｒＤ樹脂によるクロマトグラフィーにかけられた（前以ての油抽出なしに）。
【００２７】
次いで、各溶液３００ｍｌが、０．２μ酢酸セルロースフィルターを通して濾過された。次いで、両溶液が、３５ＮＰｌａｎｏｖａフィルターを通過するその性能について試験された。試験は図１に示したように計画された。
【００２８】
タンパク質溶液３００〜３５０ｍｌが加圧容器に入れられた。圧力は、加圧窒素ガスの大貯蔵器によって供給された。この貯蔵器は、窒素シリンダーから必要に応じて充填された。加圧容器内の圧力を増加させることによって、タンパク質溶液は、０．２μプレフィルターのセットと、それに続く７５ＮのＰｌａｎｏｖａプレフィルターを通して流出した。
【００２９】
Ｐｌａｎｏｖａ３５Ｎは、フィルターセットの末端に接続され、これは、また圧力ゲージに接続された。圧力は、３５Ｎフィルターでは１０ＰＳＩに、そして７５Ｎフィルターでは１１〜１２ＰＳＩにおいて一定に保たれた。したがって、この一定圧力下で、フィルターの部分的目詰まりがあれば、フィルターを通してのタンパク質溶液の流速は急速に減少する。２種のＰｌａｎｏｖａフィルター（７５Ｎおよび３５Ｎ）前の圧力が、全濾過の間モニターされた。しかしながら、流速は、３５Ｎフィルターを通過する５０ｍｌ毎について平均化された。濾過は、平均流速が初発流速の５０％以下のレベルに達した時に停止された。この種の閾値は、フィルター細孔の５０％がふさがれた速度を表す。図１から分かるように、この閾値後の測定はいくらか誤差が多いけれども、この種類の溶液についての速度は、ほぼ直線である。
【００３０】
【表１】
0004808864.tif 000002
【００３１】
【表２】
0004808864.tif 000003
【００３２】
表１および２に示されるように、初発流速は、Ｃ−１８樹脂を用いる場合に、より低かった（０．９対１．１６ｍｌ／ｍｉｎ）。さらにまた、流速は、より速やかに減少し、その結果、濾過容量は、ＳＤＲと比べてＣ−１８樹脂を用いる場合は、より低かった。
【００３３】
図２および表３〜４において分かるように、Ｓ／Ｄが、油抽出と、それに続くＣ−１８クロマトグラフィー処理によって除去された場合の生産物よりも、ＳＤＲによってクロマトグラフィー処理された生産物において、５０％閾値に達するまでの濾過物の堆積量は、少なくとも２倍早く、そして容量は２倍高かった。
【００３４】
これは、ＳＤＲカラムクロマトグラフィーによってＩｇＧ溶液からダイマー、ポリマーおよび凝集体が除去されたためである。
【００３５】
実験室規模の実験では、ＳＤ段階についての種々の条件が検討された：ｐＨ、Ｓ／Ｄ濃度、温度およびインキュベーション時間の長さが検討され、そしてサンプルがＳＤＲカラムにおいてクロマトグラフィー処理された。次（表３）は、種々の条件におけるＳＤＲ前後において、ＩｇＧサンプル中のモノマー、ダイマーおよび凝集体のパーセンテージの４並列試行の平均値を示す。
【００３６】
結果は、ＳＤＲカラム後には、ダイマーの有意な減少および凝集体（ポリマー）の増加は極めてわずかであることを示している。凝集体（ポリマー）の増加は、使用されたＳＤ条件とは独立の、標準誤差もしくは分析アッセイによるものである。
【００３７】
【表３】
0004808864.tif 000004
【００３８】
実施例２：Ｓ／Ｄが除去された液状調製物
実施例１と同じサンプル調製操作が使用されたが、この実施例では、溶媒洗剤（Ｓ／Ｄ）が油抽出およびカラムクロマトグラフィーによって除去されたサンプルは、完全生産バッチから回収された。また、Ｓ／ＤがＳＤＲにおけるクロマトグラフィーによって除去されたサンプルも、同じバッチから回収されたが早期段階（Ｓ／Ｄ不活化後の）で回収され、そしてクロマトグラフィーは、より小スケールで実施された。濾過工程を促進するために、両溶液の温度は３０℃まで上昇され、そして両方とも、４５ｍｇ／ｍｌのタンパク質に調整された。
【００３９】
【表４】
0004808864.tif 000005
【００４０】
【表５】
0004808864.tif 000006
【００４１】
実施例３：ナノフィルトレーションの効果
材料は、実施例２と同様に調製された。１つは、３５ＮＰｌａｎｏｖａフィルターの使用によるウイルス除去に関して試験された。ｐＨ４．０におけるＩｇＧ溶液４５ｍｇ／ｍｌが、ＨＩＶ−１，ＰＲＶ，ＢＶＤＶ，ＨＡＶもしくはＭＶＭによりスパイク（ｓｐｉｋｅ）された。１０7〜１０9ＰＦＵ／ｍｌ以上の最終濃度を得るために、すべてのウイルスは超遠心によって沈降され、そして少量の水もしくは血清不含バッファー中に再懸濁された。
【００４２】
出発材料のｐＨ４．０±０．１および濾過条件（３７±１℃）のために、この溶液の潜在的殺ウイルス効果の検討が、Ｐｌａｎｏｖａフィルターによるナノフィルトレーションの研究前に、ＢＶＤＶに関して３５±１℃において評価された。実験中に得られた結果は、ｐＨ＝４．０における出発材料において、インキュベーション８時間後に非常に低い不活化レベル（１．０１  ｌｏｇ）を示した。同じ結果が、ＭＶＭおよびＨＡＶによっても得られた。他方、同じ条件において、インキュベーション６時間後のＨＩＶおよびＰＲＶは、それぞれ５．０３および５．２２  ｌｏｇ低下ファクターを示した。
【００４３】
スパイキング実験は、規模を縮小した条件にしたがって２並列で実施された。大きいウイルスの濾過中に生じた７５Ｎフィルターの早期目詰まりのために、３種の置換可能なＰｌａｎｏｖａ７５Ｎ、０．１および０．２μＭフィルターの特定のセットが設置された（図１）。３５Ｎフィルターにおける圧力は、一定に０．７ｂａｒに調整された。濾液が収集され、そして残留ウイルスが、最大のウイルス回収率のために超遠心された。
【００４４】
次の表は、３５Ｎを通し、そして上記条件、例えば３５±１℃およびｐＨ＝４．０におけるインキュベーションにおけるナノフィルトレーション、およびプレフィルターの使用の結果として、モデル・ウイルスのウイルスタイター低下ファクターに関するものである。
【００４５】
【表６】
0004808864.tif 000007
【００４６】
この特定の段階は、タンパク質濃度を低下させないだけでなく、また免疫グロブリンの特性、例えばＦｃ機能、抗補体活性（ＡＣＡ）を変化させず、そしてＨＰＬＣによって試験されるように分子の完全な形は維持されていた。
【００４７】
実施例４：フィブリノーゲン調製物におけるＳ／Ｄ除去後のナノフィルトレーション
ビタミンＫ依存性プロテアーゼを枯渇するためのＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ吸着後、ｐＨ７．５において再懸濁された凍結沈降物が、１％ＴｎＢＰおよび１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００の溶媒／洗剤（Ｓ／Ｄ）混合物を用いるウイルス不活化にかけられた。混合液は３０℃で４時間インキュベートされた。次いで、Ｓ／Ｄ混合物が、ひまし油と、それに続くＷａｔｅｒｓ製ＢｕｌｋＣ−１８樹脂におけるクロマトグラフィーによって除去されるか、または前以ての油抽出なしにＢｉｏｓｐｒａ製ＳＤＲ  ｈｙｐｅｒＤ樹脂におけるクロマトグラフィーによって除去された。次いで、両サンプルは、実施例１におけると同じ濾過工程を通して濾過され、そして１０ｍｌ毎に流速がモニターされた。結果が、表６および７に示される。
【００４８】
【表７】
0004808864.tif 000008
【００４９】
【表８】
0004808864.tif 000009
【００５０】
表６および７において示されるように、たとえ、初発流速が両樹脂において類似していても、流速は、油抽出（Ｃ−１８）の組み合わせを用いた場合は、より速やかに減少し、その結果、濾過容量は、ＳＤＲを用いた場合の濾過容量（６５ｍｌ）と比較するとＣ−１８樹脂を用いた場合には、より低かった（３５ｍｌ）。
【図面の簡単な説明】
【図１】ナノフィルターを通過する堆積濾過物の関数として、流速の低下を表すことによって、ナノフィルターブロッキングの比率を示すグラフである。２つの起源の免疫グロブリン溶液４５ｍｇ／ｍｌが、この実験では使用された（すなわち、溶媒洗剤が、油抽出と、それに続くＣ−１８でのクロマトグラフィーによって除去されたＩＶＩｇ溶液と、溶媒洗剤が、ＳＤＲのみによって除去されたＩＶＩｇ溶液である。）
【図２】３５Ｎナノフィルターを通過する堆積濾過物の濾過時間に及ぼす溶媒除去の効果を示すグラフである。昇温（３７℃）した場合、流速は、溶媒洗剤除去のための両方法において若干早くなる。
【図１】
0004808864.tif 000010
【図２】
0004808864.tif 000011