(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ピロリドンカルボン酸および／またはその塩に加えてアルギニンをも有効成分としてなることを特徴とする皮膚の血行改善または促進のための外用剤。
【請求項２】
ピロリドンカルボン酸および／またはその塩とアルギニンとのモル比率が２：１〜１：２であることを特徴とする請求項１記載の外用剤。
【請求項３】
ピロリドンカルボン酸アルギニン塩を有効成分として含有してなることを特徴とする皮膚の血行改善または促進のための外用剤。
【請求項４】
該外用剤が目の隈の改善のためのものであることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の外用剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、有効成分として、ピドリロンカルボン酸、ピロリドンカルボン酸塩およびピロリドンカルボン酸誘導体のうちから選ばれる少なくとも１種類、またはこれに加えてアルギニンをも含有することを特徴とする生体内一酸化窒素合成酵素産生促進剤および生体内一酸化窒素産生促進化粧料組成物または医薬組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
一酸化窒素（Ｎｉｔｒｉｃ  Ｏｘｉｄｅ，  ＮＯ）については、その生理学的、薬理学的な役割が注目され研究が行われてきている。ＮＯは、生体内で、ＮＯ合成酵素（Ｎｉｔｒｉｃ  Ｏｘｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈａｓｅ，  ＮＯＳ）によって、アルギニンを基質として生成される。このＮＯＳは、生体の状態が正常であるときにも存在する構成酵素のｃＮＯＳと、ある刺激によって多量に産生される誘導酵素のｉＮＯＳの２つに分類される。ｃＮＯＳが生成するＮＯの濃度と比較すると、ｉＮＯＳが生成するＮＯ濃度は２から３オーダー程度高く、ｉＮＯＳの方が極端に多量のＮＯを生成することが知られている。
【０００３】
ｉＮＯＳが生成する場合のようにＮＯが多量に発生した場合には、活性酸素と反応して生体外来の微生物やガン細胞などを攻撃する一方で、炎症や組織障害を起こすことが知られている。一方、ｃＮＯＳが生成する場合のようにＮＯ量が少ない場合はサイクリックＧＭＰ（ｃＧＭＰ）を介し、生体に対する種々の保護的作用、すなわち血管拡張作用、血行改善、抗血小板凝集作用、抗菌作用、抗がん作用、消化管吸収促進、腎機能調節、神経伝達作用、勃起（生殖）、学習、食欲などを担うと考えられる。
【０００４】
従来は、生体内で多量に発生するＮＯに由来すると考えられる炎症や組織障害を防止する目的で、ＮＯＳの酵素活性の阻害剤の検討がなされてきている。しかしながら、ＮＯＳの酵素活性を促進し、適度にＮＯを産生させることで、生体に対する種々の保護的作用を発現させる目的でＮＯＳ（特にｃＮＯＳ）の酵素活性（または発現量）を促進することについては検討されてこなかった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
前項記載の従来技術の背景下に、本発明はＮＯの産生量を適切なレベルにたもつために、ｃＮＯＳの酵素活性（または発現量）を促進し、かつ、ｉＮＯＳの酵素活性（または発現量）は促進しない物質を見出し、これを利用して優れた一酸化窒素合成酵素産生促進剤、延いては一酸化窒素産生促進化粧料組成物または医薬組成物を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
発明者らは、前項記載の課題を解決するために鋭意検討した結果、ピロリドンカルボン酸およびピロリドンカルボン酸塩、さらにはピロリドンカルボン酸誘導体が、またはこれらと併用された場合のアルギニンが、そのような物質として優れた効果を持つことを見出し、このような知見に基いて本発明を完成するにいたった。
【０００７】
すなわち、本発明は、有効成分として、ピドリロンカルボン酸、ピロリドンカルボン酸塩およびピロリドンカルボン酸誘導体のうちから選ばれる少なくとも１種類、またはこれに加えてアルギニンをも含有することを特徴とする生体内一酸化窒素合成酵素産生促進剤および生体内一酸化窒素産生促進化粧料組成物または医薬組成物に関する。
【０００８】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
【０００９】
本発明に用いるピロリドンカルボン酸としては、Ｄ−ピロリドンカルボン酸（Ｄ−２−ピロリドン−５−カルボン酸）およびＬ−ピロリドンカルボン酸（Ｌ−２−ピロリドン−５−カルボン酸）を挙げることができる。また、両方の光学異性体が任意の比率で混合したもの（これにはＤＬ−ピロリドンカルボン酸（ＤＬ−２−ピロリドン−５−カルボン酸）も包含される）を用いることもできる。さらには、本発明に用いるピロリドンカルボン酸は、遊離体でもよいし、アルギニン、リジン、金属イオン、トリエタノールアミンなどと塩を形成していてもよい。また、酸無水物、エステル、アミド、ペプチド、蛋白質などの誘導体の形態のものでもよい。
【００１０】
本発明の一酸化窒素合成酵素産生促進剤は、生体内においてｃＮＯＳの発現量を増大させ、延いては一酸化窒素の産生を促進する効果をもつ一方で、ｉＮＯＳの発現量を増大させる効果は実質的に持たない。
【００１１】
本発明の生体内一酸化窒素合成酵素産生促進剤は、ＮＯの基質として知られるアルギニンなどの他の物質と組み合わせることで、必要に応じて効果を増大させることも可能である。ここに、アルギニンはＬ−アルギニンでもＤ-アルギニンでもよく、また両方の光学異性体が任意の比率で混合したもの（これにはＤＬ−アルギニンも包含される）でもよい。
【００１２】
本発明の一酸化窒素合成酵素産生促進剤、またはその有効成分であるピロリドンカルボン酸、ピロリドンカルボン酸塩およびピロリドンカルボン酸誘導体のうちから選ばれる少なくとも1種類若しくはこれに加えてアルギニン（以下、一酸化窒素合成酵素促進剤（広義）と総称する）は、これを医薬品や化粧料等に配合してこれらを血管拡張作用、血行改善、抗血小板凝集作用、抗菌作用、抗がん作用、消化管吸収促進、腎機能調節、神経伝達作用、勃起（生殖）促進、学習促進、食欲増進などの機能をもつ医薬品や化粧料等に調製することができる。
【００１３】
本発明の一酸化窒素合成酵素産生促進剤を化粧料に配合して使用する場合（生体内一酸化窒素産生促進化粧料組成物）、このような化粧料組成物の用途については、特に制限はないが、化粧料の例えば皮膚の血行改善または血行促進用成分として用いることができる。より具体的には、頭髪用、頭皮用、顔面用、ボディー用などの化粧料や入浴剤、霜やけ防止剤、等の成分として用いるのに適している。
【００１４】
本発明の一酸化窒素合成酵素産生促進剤を化粧料として提供する場合、その化粧料組成物中の含有濃度としては特に制限はないが、好ましくは０．０１重量％から２０重量％、より好ましくは０．０５重量％から１０重量％、さらに好ましくは０．１重量％から５重量％である。
【００１５】
このような化粧組成物の剤型としては、ローション、乳剤、ゲル剤、クリーム、軟膏等を挙げることができる。
【００１６】
本発明の一酸化窒素合成酵素産生促進剤を医薬品に配合して使用する場合（生体内一酸化窒素産生促進医薬組成物）、例えば、血行の不良や悪化の防止、さらにはこれらの予防用の医薬組成物あるいは皮膚の血行改善または促進などのための医薬組成物に用いることができる。さらにこの組成物から医療用の組成物や化粧料などを得ることも可能である。
【００１７】
医薬組成物における本発明の一酸化窒素合成酵素産生促進剤の含有濃度には特に制限はないが、好ましくは０．０１重量％から２０重量％、より好ましくは０．０５重量％から１０重量％、さらに好ましくは０．１重量％から５重量％である。
【００１８】
このような医薬組成物の剤型としては、適宜、液剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤、錠剤等の経口投与薬、あるいは静脈内投与、動脈内投与の注射剤などにすることもできる。
【００１９】
また、経皮吸収効果のあるものと併用することなどにより、外用剤としても使用可能である。外用剤として使用する場合、そのような医薬組成物には、外用剤基剤に通常用いられる油脂類、ロウ類、炭化水素類、脂肪酸類、低級アルコール類、高級アルコール類、多価アルコール類、エステル類、界面活性剤、水溶性高分子等を含有させることができる。さらに、他の皮膚細胞賦活剤、抗炎症剤、活性酸素消去剤、保湿剤、紫外線吸収剤、防腐防黴剤、香料等を含有させることができる。
【００２０】
外用剤の剤型としては、適宜、ローション剤、乳剤、ゲル剤、クリーム、軟膏等の剤型とすることができる。
【００２１】
【実施例】
以下、本発明の内容を実施例により更に説明する。
【００２２】
比較例１〜３および実施例１〜４
血管内皮細胞を１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）含有ＤＭＥＭ培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ変法ＭＥＭ）を用いて培養した。但し、フェノールレッドおよびＬ−アルギニン無添加の培地とした。この培地で２４時間培養した。２４時間培養後に、Ｌ−２−ピロリドン−５−カルボン酸とＬ−アルギニンを下記第１表に示すように添加量を変えて添加した。さらに、２４時間培養した。
【００２３】
その後の培養上清中の二酸化窒素を測定することにより、一酸化窒素の産生量を求めた。二酸化窒素は、Ｇｒｉｅｓｓ法を用いて測定した。培養液中の細胞数を測定して細胞１０３個当たりの一酸化窒素生成量をｎｍｏｌで表した。なお、陰性対照としては、アルギニンもピロリドンカルボン酸も含まないもの（比較例１）、およびアルギニンを単独に含むもの（比較例２）を用いた。また、陽性対照としては、アルギニンとグリコール酸を含むもの（比較例３）を用いた。
【００２４】
結果を下記第１表に示す。表中、Ｌ−Ａｒｇ、Ｌ−ＰＣＡおよびＧＡは、それぞれ、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ピロリドンカルボン酸およびグリコール酸を意味する。
【００２５】
【表１】
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【００２６】
第１表に示した結果から、ピロリドンカルボン酸とアルギニンの両者を培地に添加して場合には、従来の一酸化窒素の生成に対して促進効果があるとして知られているグリコール酸とアルギニンの組み合わせよりも同じ添加濃度（１０ｍＭ）で比較したときに、一酸化窒素の生成量がより増大することが明らかになった。さらに、ピロリドンカルボン酸単独でも一酸化窒素産生促進効果を呈し、その添加量が増大するにつれて一酸化窒素の生成量が増大することが明らかになった。
【００２７】
実施例５
血管内皮細胞を１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）含有ＤＭＥＭを用いて培養した。この培地で２４時間培養した。２４時間培養後にＬ−ピロリドンカルボン酸を所定濃度（後掲第３表参照）となるように添加した培地でさらに２４時間培養してから、ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡの逆転写には、逆転写キット（ＧＩＢＣＯ製）を用いてｃＤＮＡを作成してＰＣＲに供した（ＲＴ−ＰＣＲ）。プライマーとしては、下記第２表に示すものを用いた。ＰＣＲの条件としては、ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇを９５℃で３０秒、ａｎｎｅａｌｉｎｇを５９℃で６０秒、ｅｘｔｅｎｓｉｏｎを７３℃で９０秒にして、４０サイクル実施した。
【００２８】
【表２】
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【００２９】
上記のように、ＲＴ−ＰＣＲを用いて、ｃＮＯＳとｉＮＯＳのメッセンジャーＲＮＡの発現量を調べた。ｉＮＯＳは本実験においては検出されなかったのに対して、ｃＮＯＳが検出され、さらにその量は、下記第３表に示すように、ピロリドンカルボン酸の添加量に依存して増加する傾向が認められた。表中のＬ−ＰＣＡはＬ−ピロリドンカルボン酸を意味する。
【００３０】
【表３】
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【００３１】
因みに、ピロリドンカルボン酸とアルギニン塩についてＬ体の替わりにＤ体を用いた場合、両者を組み合わせた場合などについて実験を行ったが同様の結果が得られた。
【００３２】
実施例６：Ｏ／Ｗ型乳剤
下記の原材料組成及び製法によりＯ／Ｗ型乳剤を調製した。
【００３３】
原材料組成：（１）スクワラン  ５．０（重量％、以下同じ。）、（２）白色ワセリン  ２．０、（３）ミツロウ  ０．５、（４）ソルビタンセスキオレエート  ０．８、（５）ポリオキシエチレンオレイルエーテル（２０ＥＯ）  １．２、（６）パラオキシ安息香酸メチル  ０．１、（７）プロピレングリコール  ５．０、（８）精製水  ５７．１、（９）カルボキシビニルポリマー（１．０重量％水溶液）  ２０．０、（１０）水酸化カリウム  ０．１、（１１）エタノール５．０、（１２）Ｌ−ピロリドンカルボン酸−Ｌ−アルギニン塩（１０重量％水溶液）  ３．０、および（１３）香料  ０．２。
【００３４】
製法：（１）〜（５）の油相成分を混合し７５℃に加熱して融解し、均一化した。一方、（６）〜（８）の水相成分を混合し、溶解して７５℃に加熱し、これに前記融解均一化した油相成分を添加して予備乳化した。この予備乳化物に（９）を添加した後ホモミキサーにて均一に乳化し、さらに（１０）を加えてｐＨを調整した。これを冷却後４０℃にて（１１）〜（１３）を添加し、混合し、均一化した。
【００３５】
目の隈を気にする２０代から４０代の女性１０名（内５名は貧血の自覚症状を有していた）を一群とし、上記の組成の組成物を用いて使用試験を行った。また、同様の成員からなる他の一群に対して原材料（１２）のＬ−ピロリドンカルボン酸−Ｌ−アルギニン塩を水に置換した組成物を使用して比較試験を行った（比較例４）。２種類の組成物をそれぞれブラインドで１日２回、２か月の間目の隈部に塗布使用させ、２週間後及び２か月後の目の隈の改善状況を調査した。
【００３６】
本発明の組成物を使用した被験者は、２か月後には全て目の隈が改善されており、特に貧血症状を有する被験者においては、２週間後には目の隈が改善されていた。それに対して、Ｌ−ピロリドンカルボン酸−Ｌ−アルギニン塩を水に置換した比較例４の組成物においては、有意な目の隈改善効果は認められなかった。
【００３７】
なお、本実施例６における２種の組成物については、上記使用試験期間中に含有成分の析出、分離、凝集、変臭、変色といった製剤の状態変化は全く見られなかった。また、本発明による組成物使用群および比較例の組成物使用群において、皮膚刺激性反応や皮膚感作性反応を示したパネラーは存在しなかった。
【００３８】
実施例７：ローション
（１）エタノール  １０．０（重量％、以下同じ。）（２）ヒドロキシエチルセルロース  １．０、（３）Ｌ−ピロリドンカルボン酸−Ｌ−アルギニン塩（１０重量％水溶液）  ３．０、（４）パラオキシ安息香酸メチル  ０．１、および（５）精製水  ８５．９を混合し均一とすることでローションを調製した。
【００３９】
実施例８：Ｏ／Ｗ型乳剤
下記の原材料組成及び製法によりＯ／Ｗ型乳剤を調製した。
【００４０】
原材料組成：（１）ステアリン酸  ０．２（重量％、以下同じ。）、（２）セタノール  １．５、（３）ワセリン  ３．０、（４）流動パラフィン  ７．０、（５）ポリオキシエチレン（１０ＥＯ）モノオレイン酸エステル  １．５、（６）酢酸トコフェロール  ０．５、（７）グリセリン  ５．０、（８）パラオキシ安息香酸メチル  ０．１、（９）トリエタノールアミン  １．０、（１０）精製水  ７６．２、および（１１）Ｌ−ピロリドンカルボン酸−Ｌ−アルギニン塩（１０重量％水溶液）  ４．０。
【００４１】
製法：（１）〜（６）の油相成分を混合し、７０℃に加熱して均一に融解し、そのまま７０℃に保った。一方、（７）〜（１０）の水相成分を混合し、加熱して均一とし、７０℃とした。この水相成分に前記油相成分を攪拌しながら徐々に添加して乳化し、冷却した後４０℃にて（１１）を添加し、混合した。
【００４２】
実施例９：水性ゲル剤
下記の原材料組成及び製法により水性ゲル剤を調製した。
【００４３】
原材料組成：（１）精製水  ８４．３（重量％、以下同じ。）、（２）カルボキシビニルポリマー  ０．５、（３）ジプロピレングリコール  １０．０、（４）パラオキシ安息香酸メチル  ０．１、（５）水酸化カリウム  ０．１、および（６）Ｌ−ピロリドンカルボン酸−ＤＬ−アルギニン塩（１０重量％水溶液）  ５．０。
【００４４】
製法：（１）に（２）を均一に溶解した後、これに（３）に（４）を溶解して添加し、次いで（５）を加えて増粘させ、最後に（６）を添加した。
【００４５】
実施例１０：Ｗ／Ｏ乳化型軟膏
下記の原材料組成及び製法によりＷ／Ｏ乳化型軟膏を調製した。
【００４６】
原材料組成：（１）流動パラフィン  ３０．０（重量％、以下同じ。）、（２）マイクロクリスタリンワックス  ２．０、（３）ワセリン  ５．０、（４）ジグリセリルオレイン酸エステル  ５．０、（５）プロピレングリコール  ３．０、（６）パラオキシ安息香酸メチル  ０．１、（７）Ｌーピロリドンカルボン酸−Ｌ−アルギニン塩  ０．５、および（８）精製水  ５４．４。
【００４７】
製法：予め混合し７０℃に加熱溶解した（１）〜（４）に、同様に加熱溶解均一化した（５）〜（８）を徐々に添加して均一に乳化し、混合しながら冷却した。
【００４８】
【発明の効果】
本発明によれば、優れた生体内一酸化窒素合成酵素産生促進剤、延いてはこれを利用した生体内一酸化窒素産生促進化粧料若しくは医薬組成物が容易に提供されることができる。