(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号１の７６〜１４５５位のＤＮＡ配列によってコードされるポリペプチド；
（ｂ）当該ＤＮＡ配列が発現する条件下で、配列番号１の配列を含んで成る細胞を培養することによって産生されるポリペプチド；
（ｃ）配列番号２の２６〜６４６位に示したアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド；及び
（ｄ）同一性が、３．０のＧＡＰクリエイションペナルティ（ｃｒｅａｔｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ）及び０．１のＧＡＰエクステンションペナルティ（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ）を用いるＧＣＧプログラムパッケージにおいて提供されるＧＡＰによって決定される場合に、配列番号２の２６〜４８５位のアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を含んで成る配列番号２のポリペプチドの２６〜４８５位に対して、少なくとも９０％の同一性がある配列を有するエンド−β−１，４−グルカナーゼ酵素、の１つから選択される、エンド−β−１，４−グルカナーゼ活性（ＥＣ  ３．２．１．４）を示す酵素。
【請求項２】
至適温度がpH７．５で６５℃である、請求項１に記載の酵素。
【請求項３】
５．５〜１０．５の範囲のpHで活性である、請求項１又は２に記載の酵素。
【請求項４】
５０％以上の相対活性がpH６．０〜９．２で維持される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の酵素。
【請求項５】
（ａ）配列番号１に示した、ヌクレオチド７６からヌクレオチド１４５５のヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド分子；
（ｂ）配列番号１に示した、ヌクレオチド７６からヌクレオチド１９４１のヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド分子；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸残基２６〜アミノ酸残基４８５のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子；
（ｄ）配列番号２のアミノ酸残基２６〜アミノ酸残基６４６のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子；
（ｅ）（ａ），（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）に相補的な分子；及び
（ｆ）（ａ）又は（ｂ）の縮重ヌクレオチド配列、
から成る群から選択されるエンド−β−１，４−エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項６】
エンド−β−１，４−グルカナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離したポリヌクレオチド分子であって、高度にストリンジェントな条件下で、配列番号１の７６〜１４５５位に示される配列を含んで成るＤＮＡプローブである変性二本鎖ＤＮＡプローブとハイブリダイズするポリヌクレオチド分子。
【請求項７】
エスケリッチャ・コリ、ＤＳＭ  １２８０５から単離される、請求項５又は６に記載の単離したポリヌクレオチド分子。
【請求項８】
次の作用可能に連結した因子：転写プロモーター；（ａ）配列番号１に示した、ヌクレオチド７６〜ヌクレオチド１４５５のヌクレオチド配列を含んで成る、エンド−β−１，４−グルカナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子、
（ｂ）配列番号２のアミノ酸残基２６〜アミノ酸残基４８５のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一である、エンド−β−１，４−グルカナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子、及び
（ｃ）（ａ）又は（ｂ）の縮重ヌクレオチド配列、
から成る群から選択されるＤＮＡセグメント；
並びに転写ターミネーター、を含んで成る発現ベクター。
【請求項９】
前記ＤＮＡセグメントによってコードされるポリペプチドを発現する、請求項８に記載の発現ベクターが導入された培養細胞。
【請求項１０】
エンド−β−１，４−グルカナーゼ活性を有するポリペプチドを産生する方法であって、請求項８に記載の発現ベクターが導入された細胞を培養し、当該細胞に前記ＤＮＡによってコードされるポリペプチドを発現せしめ、そして当該ポリペプチドを回収することを含んで成る方法。
【請求項１１】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の酵素を含んで成る酵素組成物。
【請求項１２】
有効量の請求項１〜４のいずれか１項に記載の酵素、又は、請求項１１に記載の酵素組成物で処理される、セルロース含有バイオマスの分解方法。
【請求項１３】
有効量の請求項１〜４のいずれか１項に記載の酵素、又は、請求項１１に記載の酵素組成物を含む洗浄溶液を用いる機械洗浄の工程の洗浄周期の間に、繊維を処理することを含んで成る、繊維の機械的な処理のための方法。
【請求項１４】
バイオポリッシング工程における有効量の請求項１〜４のいずれか１項に記載の酵素、又は、請求項１１に記載の酵素組成物の使用。
【請求項１５】
染色された繊維がストーン−ウォッシングされて、色が局存化して摩耗した外観を提供するための、有効量の請求項１〜４のいずれか１項に記載の酵素、又は、請求項１１に記載の酵素組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、グリコシルヒドロラーゼのファミリー９に属し、そしてバチルス・リチェニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のファミリー９のエンド−β−１，４−グルカナーゼに対して少なくとも７５％相同である、エンド−β−１，４−グルカナーゼ活性を示す酵素、その様なエンド−β−１，４−グルカナーゼをコードする単離したポリヌクレオチド分子、及び洗剤、紙及びパルプ、石油の掘削、石油の抽出、ワイン及びジュース、食品成分、動物の飼料又は繊維産業における前記酵素の使用に関する。
【０００２】
本発明の背景
セルロースは、β−１，４−グリコシド結合によって結合するグルコースのポリマーである。セルロース鎖は多くの分子内及び分子間水素結合を形成し、これは不溶性のセルロース微小繊維の形成をもたらす。グルコースへのセルロースの微生物的加水分解は、以下の３つのセルラーゼの主要なクラス：（ｉ）セルロース分子の到るところで無作為にβ−１，４−グリコシド結合を開裂する、エンドグルカナーゼ（ＥＣ  ３．２．１．４）；（ii）非還元末端からセルロースを消化し、そしてセロビオースを放出する、セロビオヒドロラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．９１）；及び（iii)セロビオース及び低分子量のセロデキストリンを加水分解してグルコースを放出せしめる、β−グルコシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．２１）を含む。
【０００３】
セルラーゼは多くの微生物によって産生され、そして複数の形態でしばしば存在している。セルロースの酵素的分解の経済的有意性の認識は、産業上使用され得る微生物のセルラーゼについての広範な探索を促進させてきた。その結果、大量のセルラーゼの酵素的特性及び一次構造が研究されてきた。触媒ドメインのアミノ酸配列の疎水性群の解析結果に基づいて、これらのセルラーゼは異なるグリコシルヒドロラーゼファミリーに分けられ；菌及び細菌のグリコシルヒドロラーゼは３５のファミリーに分類されてきた（Ｈｅｎｒｉｓｓａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１），（１９９３））。多くのセルラーゼは、プロリン及びヒドロキシアミノ残基に富むことがあるリンカーによって分けられた、セルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）及び触媒ドメイン（ＣＡＤ）から成る。セルラーゼの別の分類は、グリコシルヒドロラーゼの５つのファミリーを与える、それらの類似性（Ｇｉｌｋｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１））に基づいて確立されてきた。
【０００４】
セルラーゼは、菌、放線菌、粘液細菌及び真性細菌を含む多数の微生物だけでなく植物によっても合成される。特に、広範な特異性のエンド−β−１，４−グルカナーゼが同定されてきた。多くの細菌のエンドグルカナーゼが記述されてきた（Ｈｅｎｒｉｓｓａｔ（１９９３）；Ｇｉｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３））。
【０００５】
セルロース分解酵素の重要な産業上の使用は、紙パルプの処理、例えば排水の改良又は再生紙の脱インキのための使用である。セルロース分解酵素の別の重要な産業上の使用は、セルロース繊維又は織物の処理のための、例えば洗剤組成物又は織物柔軟剤組成物における成分としての、新規織物の生物学的仕上げ（衣類の仕上げ）のための、そしてセルロース含有織物、特にデニムの「ストーンウォッシュ」の外観を得るための使用であり、そしてその様な処理のための複数の方法が、例えばＧＢ−Ａ−１  ３６８  ５９９，ＥＰ−Ａ−０  ３０７  ５６４及びＥＰ−Ａ−０  ４３５  ８７６，ＷＯ９１／１７２４３，ＷＯ９１／１０７３２，ＷＯ９１／１７２４４，ＰＣＴ／ＤＫ９５／０００１０８及びＰＣＴ／ＤＫ９５／００１３２において示唆されてきた。
【０００６】
セルラーゼ、好ましくはエンド−β−１，４−グルカナーゼの活性（ＥＣ  ３．２．１．４）が望まれる適用に使用され得る、新規なセルラーゼ酵素又は酵素調製物を提供することについての要求が絶えず存在している。
【０００７】
本発明の目的は、わずかに酸性からアルカリ性の条件下で実質的なセルロース分解活性及び紙パルプ処理、織物処理、洗濯工程、抽出工程における、又は動物の飼料において向上した性能を有する新規酵素及び酵素組成物を提供することであり；好ましくはその様な新規の良好に実行できるエンドグルカナーゼは、高収率の組換え技術を用いることによって産生可能であるか又は産生される。
【０００８】
本発明の要約
本発明者は、実質的なセルロース分解活性を有する新規酵素、すなわちエンド−β−１，４−グルカナーゼ（酵素命名法に従いＥＣ  ３．２．１．４として分類される）を発見し、これはバチルス・リチェニホルミスに内在し、そしてグリコシルヒドロラーゼのファミリー９に属しており、本発明者はその様な酵素をコードするＤＮＡ配列のクローニング及び発現に成功してきた。
【０００９】
従って、その最初の観点において、本発明は（ａ）配列番号１の７６〜１４５５位のＤＮＡ配列によってコードされるポリペプチド；（ｂ）当該ＤＮＡ配列が発現する条件下で、配列番号１の配列を含んで成る細胞を培養することによって産生されるポリペプチド；（ｃ）同一性が、３．０のＧＡＰクリエイションペナルティ（ｃｒｅａｔｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ）及び０．１のＧＡＰエクステンションペナルティ（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ）を用いるＧＣＧプログラムパッケージにおいて提供されるＧＡＰによって決定される場合に、配列番号２の２６〜４８５位のアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を含んで成る配列番号２のポリペプチドの２６〜４８５位に対して、少なくとも７５％の同一性がある配列を有するエンド−β−１，４−グルカナーゼ酵素；及び（ｄ）エスケリッチャ・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＤＳＭ  １２８０５のプラスミドから得られるＤＮＡ配列の一部をコードするエンドグルカナーゼによってコードされるポリペプチド、の１つから選択される、エンド−β−１，４−グルカナーゼ活性（ＥＣ  ３．２．１．４）を示す酵素に関する。本発明の酵素は、Ｈｅｎｒｉｓｓａｔ等によって定義される様に、グリコシルヒドロラーゼのファミリー９に属するとして同定される。
【００１０】
その第２の観点において、本発明は（ａ）配列番号１に示す様な、ヌクレオチド７６〜ヌクレオチド１４５５のヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド分子、（ｂ）（ａ）の種相同体；（ｃ）配列番号２のアミノ酸残基２６〜アミノ酸残基４８５のアミノ酸配列に対して、少なくとも７５％同一であるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子、及び（ｃ）（ａ）又は（ｂ）の縮重ヌクレオチド配列、から成る群から選択される、触媒的に活性なドメインをコードする単離したポリヌクレオチド分子、好ましくはＤＮＡ分子であって；中程度にストリンジェントな条件下で、配列番号１の７６〜１４５５位に示される配列を含んで成るＤＮＡプローブ及び少なくとも１００塩基対の長さを有する配列番号１の７６〜１４５５位の亜配列を含んで成るＤＮＡプローブから成る群から選択される、変性した二本鎖ＤＮＡプローブとハイブリダイズすることができるポリヌクレオチド分子に関する。
【００１１】
本発明のエンドグルカナーゼをコードするＤＮＡ配列を含んで成るプラスミドｐＳＪ１６７８は、寄託番号ＤＳＭ  １２８０５のもと、１９９９年５月１４日に、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen and Zellkulturen GmbH (Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Federal Republic of Germany）において、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に従い、本発明者によって寄託された。
【００１２】
その第３、第４及び第５の観点において、本発明は、例えば本発明のポリヌクレオチド分子であるＤＮＡセグメントを含んで成る発現ベクター；当該ＤＮＡセグメント又は発現ベクターを含んで成る細胞；及びセルロース分解活性を示す酵素を産生する方法であって、当該酵素の産生を可能にする条件下で細胞を培養し、そして培養物から酵素を回収することを含んで成る方法を提供する。
【００１３】
更に別の観点において、本発明は、（ｉ）相同な不純物を含まないこと、及び（ii）酵素が上述した方法によって産生すること、を特徴とする、セルロース分解活性を示す単離した酵素を提供する。
【００１４】
更に、本発明は産業上での利用、例えば木材パルプの処理又はバイオマスの分解のための、本発明のその様な酵素又は酵素調製物の使用に関する。
【００１５】
本発明はまた、細菌の種バチルス・リチェニホルミスの菌株に由来する、エスケリッチャ・コリ  ＤＳＭ  １２８０５に存在するプラスミドｐＳＪ１６７８内にクローン化された、エンドグルカナーゼをコードしているＤＮＡ配列を宿しているエスケリッチャ・コリの菌株ＤＳＭ  １２８０５、又は当該Ｅ．コリの菌株の任意の変異体の単離されて実質的に純粋な生物学的培養物に関する。
【００１６】
本発明のエンドグルカナーゼは、ＣＭＣに対する高い比活性を有することによって、多くの産業上での利用における利点があり（エンドグルカナーゼ）、そして多くの他のエンドグルカナーゼと対照的に、本発明の酵素は高度に結晶性のセルロースを分解することができる。更に、この酵素は６０℃でのその至適温度を有し、そしてpH５．５〜９．５の間で完全に活性である。従って、本発明の酵素は、通常セロビオヒドロラーゼ（ＣＭＣに対して非常に小さな活性を有する）及びエンドグルカナーゼを共に必要とするであろう、全体的なバイオマスの分解に有利に使用され得る。
【００１７】
本発明の詳細な説明
本明細書で使用する様な、用語「グリコシルヒドロラーゼファミリー」は、Henrissat, B. "A classification of glycosyl hydrolases based of amino-acid sequence similarities." Biochem. J. 280: 309-316 (1991); Henrissat, B.,Bairoch, A. "New families in the classification of glycosyl hydrolases based on amino-acid sequence similarities. Biochem. J. 293: 781-788 (1993); Henris-sat, B., Bairoch, A. "Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases." Biochem. J. 316: 695-696 (1996); 及びDavies, G., Henrissat, B. "Structures and mechanisms of glycosyl hydrolases." Structure 3: 853-859 (1995); に記載されており、これらの全てが引用によって本明細書に組み入れられる。
【００１８】
本明細書で使用する様な、用語「機能的酵素特性」は、１又は複数の触媒的活性を示すポリペプチドの物理的及び化学的特性を意味することが意図される。機能的酵素特性の例は、酵素活性、特異的酵素活性、最大の活性に対する相対的な酵素活性（pH又は温度のいずれかの機能として測定される）、安定性（経時的な酵素活性の減損）、ＤＳＣの融解温度、Ｎ末端のアミノ酸配列、分子量（通常ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定される）、等電点（ｐＩ）である。
【００１９】
本文において、用語「発現ベクター」は、その転写を提供する追加のセグメントに作用可能に連結した、注目のポリペプチドをコードするセグメントを含んで成る、直線状又は環状のＤＮＡ分子を表す。その様な追加のセグメントは、プロモーター及びターミネーター配列を含むことがあり、そして任意に１又は複数の複製起点、１又は複数の選択マーカー、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル等を含むことがある。発現ベクターは通常プラスミド又はウイルスＤＮＡに由来し、あるいはその両方の因子を含み得る。本発明の発現ベクターは都合よく組換えＤＮＡ法にかけられ、そしてベクターの選択はしばしば、当該ベクターが導入され得る宿主細胞に依存するだろう。この様に、当該ベクターは自律複製ベクター、すなわち複製が染色体の複製から独立している、染色体外の実在物として存在するベクター、例えばプラスミドであってもよい。あるいは、当該ベクターは宿主細胞に導入される場合、宿主細胞のゲノムに組み込まれ、そしてそれを組み込んだ染色体と一緒に複製されるものであってもよい。
【００２０】
ポリペプチド又はタンパク質の発現と関連して本明細書で使用される、用語「組換え発現」又は「組換え的に発現」は、当業界の標準的な定義に従い定義される。タンパク質の組換え発現は、直前に記載した様な発現ベクターを用いて通常行われる。
【００２１】
用語「単離」は、ポリヌクレオチド分子に適用される場合、当該ポリペプチドがその天然の遺伝的環境から摘出され、そしてその結果他の外来の又は不所望のコード配列を含まず、そして遺伝子操作されたタンパク質産生系における使用に適した型にあることを表す。その様な単離された分子は、それらの天然の環境から分離され、そしてｃＤＮＡ及びゲノムクローンを含むものである。本発明の単離されたＤＮＡ分子は、それらと通常関連している他の遺伝子を含まないが、天然の５′及び３′の非翻訳領域、例えばプロモーター及びターミネーターを含み得る。関連領域の同定は当業者にとって自明であるだろう（例えば、Ｄｙｎａｎ  ａｎｄ  Ｔｉｊａｒ，Ｎａｔｕｒｅ  ３１６：７７４−７８，１９８５を参照のこと）。用語「単離されたポリヌクレオチド」は、代わりに「クローン化されたポリヌクレオチド」と称され得る。
【００２２】
タンパク質／ポリペプチドに適用される場合、用語「単離」は、当該タンパク質がその天然の環境以外の条件において見出されることを示す。好ましい形態において、単離されたタンパク質は、他のタンパク質、特に他の相同タンパク質（すなわち「相同な不純物」（下文を参照のこと））を実質的に含まない。好ましいのは、４０％以上純粋な形態の、更に好ましくは６０％以上純粋な形態のタンパク質を提供することである。
【００２３】
より更に好ましくは、好ましいのはＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定される場合に高度に精製された形態の、すなわち８０％以上純粋、更に好ましくは９５％以上純粋、そしてより更に好ましくは９９％以上純粋なタンパク質を提供することである。
【００２４】
用語「単離されたタンパク質／ポリペプチド」は、代わりに「精製されたタンパク質／ポリペプチド」と称されることもある。
【００２５】
用語「相同な不純物」は、本発明のポリペプチドが本来得られる、相同な細胞から生じる何らかの不純物（例えば、本発明のポリペプチド以外のポリペプチド）を意味する。
【００２６】
特異的な微生物供給源と関連して本明細書で使用される場合の、用語「得られた」は、ポリヌクレオチド及び／又はポリペプチドが、特異的な供給源によって、又は当該供給源由来の遺伝子が挿入された細胞によって生成したことを意味する。
【００２７】
用語「作用可能に連結した」は、ＤＮＡセグメントに関する場合、当該セグメントが並べられ、その結果それらがそれらの意図される目的のために協力して機能し、例えば転写がプロモーターにおいて開始し、そしてコードセグメントからターミネーターに進むことを表す。
【００２８】
用語「ポリヌクレオチド」は、５′から３′末端へと読まれるデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド塩基の一本鎖又は二本鎖ポリマーを表す。
【００２９】
用語「ポリヌクレオチド分子の相補体」は、参照配列と比較して、相補的な塩基配列及び逆の配向を有するポリヌクレオチド分子を表す。例えば、配列５′ＡＴＧＣＡＣＧＧＧ３′は５′ＣＣＣＧＴＧＣＡＴ３′と相補的である。
【００３０】
用語「縮重ヌクレオチド配列」は、１又は複数の縮重コドンを含むヌクレオチドの配列を表す（ポリペプチドをコードする参照ポリヌクレオチド分子と比較した場合）。縮重コドンは異なるヌクレオチドのトリプレットを含むが、同一のアミノ酸残基をコードする（すなわち、ＧＡＵ及びＧＡＣは、それぞれＡｓｐをコードする）。
【００３１】
用語「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼの結合及び転写の開始を提供するＤＮＡ配列を含む遺伝子の一部を表す。プロモーター配列は、一般に、しかし常にではなく、遺伝子の５′側の非コード領域において見出される。
【００３２】
用語「分泌シグナル配列」は、より大きなポリペプチドの成分として、それが合成される細胞の分泌経路を介してより大きなポリペプチドを方向づけるポリペプチド（「分泌ペプチド」）をコードするＤＮＡ配列を表す。より大きなポリペプチドは、分泌経路を通過する輸送の間、一般に開裂して分泌ペプチドを除去せしめる。
【００３３】
ポリヌクレオチド：
本発明の好ましい態様においては、本発明の単離したポリヌクレオチドは、配列番号１の類似のサイズの領域、又はそれと相補的な配列と、少なくとも中程度にストリンジェントな条件のもとでハイブリダイズし得る。
【００３４】
特に、本発明のポリヌクレオチドは、配列が配列番号１の７６〜１４５５位に示されている、酵素の触媒ドメインをコードする完全な配列又は少なくとも約１００塩基対の長さを有する配列番号１の亜配列を含んで成る任意のプローブのいずれかを含んで成る、変性した二本鎖ＤＮＡプローブと、少なくとも中程度にストリンジェントな条件下で、しかし好ましくは下文に詳述する様に高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするだろう。ヌクレオチドプローブと相同なＤＮＡ又はＲＮＡ配列との間の、中程度、又は高度にストリンジェントの場合のハイブリダイゼーションを決定するための適当な実験条件は、ハイブリダイズさせるＤＮＡフラグメント又はＲＮＡを含むフィルターの、５×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）中での１０分間の予浸、及び５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．１９８９）、０．５％ＳＤＳ及び１００μｇ／mlの変性して超音波処理されたサケ精子ＤＮＡ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．１９８９）の溶液中での当該フィルターのプレハイブリダイゼーション、続く１０ng／mlの濃度のランダムに準備した（Ｆｅｉｎｂｅｒｇ，Ａ．Ｐ．ａｎｄ  Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ，Ｂ．（１９８３）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３２：６−１３）、３２Ｐ−ｄＣＴＰ標識した（１×１０９cpm ／μｇ以上の比活性）プローブを含む同一の溶液中での、約４５℃での１２時間のハイブリダイゼーションを含む。当該フィルターは、続いて２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ中で、少なくとも６０℃で（中程度にストリンジェント）、より更に好ましくは少なくとも６５℃で（中程度／高度にストリンジェント）、より更に好ましくは少なくとも７０℃で（高度にストリンジェント）、そしてより更に好ましくは７５℃で（非常に高度にストリンジェント）、３０分間、２回洗浄される。
【００３５】
前記オリゴヌクレオチドプローブがこれらの条件下でハイブリダイズする分子は、Ｘ線フィルムを用いて検出される。
【００３６】
既に言及した様に、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、ＤＮＡ及びＲＮＡを含む。ＤＮＡ及びＲＮＡを単離するための方法は、当業界で公知である。注目の遺伝子をコードするＤＮＡ及びＲＮＡは、当業界で既知の方法によってジーンバンク又はＤＮＡライブラリーにおいてクローン化され得る。
【００３７】
本発明のエンドグカナーゼ（ｅｎｄｏｇｕｃａｎａｓｅ）活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、続いて、例えばハイブリダイゼーション又はＰＣＲによって同定され、そして単離される。
【００３８】
本発明は更に、異なる菌株由来の対応ポリペプチド及びポリヌクレオチドを提供する（オーソログ又はパラログ）。特に注目のものはバチルスの種を含む、グラム陽性好アルカリ性菌株由来のエンドグルカナーゼポリペプチドである。
【００３９】
本発明のエンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドの種相同体は、本発明によって提供される情報及び組成物を、常用のクローニング技術と一緒に用いることによってクローン化され得る。例えば、本発明のＤＮＡ配列は、前記タンパク質を発現する細胞型から得られる染色体ＤＮＡを用いてクローン化され得る。ＤＮＡの適当な供給源は、本明細書に開示される配列から設計されるプローブを用いてノーザンブロットを試験することによって同定され得る。ライブラリーは、続いてポジティブな細胞系の染色体ＤＮＡから調製される。エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする本発明のＤＮＡ配列は、続いて様々な方法によって、例えば本明細書及び特許請求の範囲に開示されている配列から設計されるプローブを用いて、あるいは開示された配列に基づいている、１又は複数の縮重プローブを用いて試験することによって単離され得る。本発明のＤＮＡ配列はまた、ポリメラーゼ連鎖反応、又はＰＣＲ（Ｍｕｌｌｉｓ、米国特許第４，６８３，２０２号）を用いて、本明細書に開示されている配列から設計したプライマーを用いてクローン化され得る。追加の方法において、前記ＤＮＡライブラリーは、宿主細胞を形質転換させ、又はトランスフェクションするために使用されることがあり、そして注目のＤＮＡの発現は、材料と方法並びに例１及び３に記載されている様に発現され、そして精製される、Ｂ．リチェニホルミス、ＡＴＣＣ  １４５８０からクローン化されたエンドグルカナーゼに対する抗体（モノクローナル又はポリクローナル）を用いて、あるいはエンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドに関する活性試験によって検出され得る。
【００４０】
エスケリッチャ・コリ  ＤＳＭ  １２８０５に存在するプラスミドにクローン化されたＤＮＡ配列のエンドグルカナーゼをコードしている部分及び／又は本発明の類似ＤＮＡ配列は、エンドグルカナーゼ活性を有する酵素を産生している、細菌種バチルス・リチュニホルミスの菌株、好ましくは菌株ＡＴＣＣ  １４５８０、又は本明細書に記載の別の若しくは関連の生物からクローン化され得る。
【００４１】
あるいは、類似配列は、エスケリッチャ・コリ  ＤＳＭ  １２８０５に存在するプラスミドから得られ得るＤＮＡ配列（これは添付した配列番号１と同一であると信じられている）、例えばそれらの亜配列に基づいて、そして／あるいは前記ＤＮＡ配列によってコードされるエンドグルカナーゼの別のアミノ酸配列をもたらすか、前記酵素の産生が意図される宿主生物のコドン使用頻度に対応するヌクレオチド置換の導入によって、あるいは異なるアミノ酸配列（すなわち本発明の酵素変異体）をもたらし得るヌクレオチド置換の導入によって構築され得る。
【００４２】
あるいは、本発明のエンドグルカナーゼをコードするＤＮＡは、公知の方法に従い、エスケリッチャ・コリ  ＤＳＭ  １２８０５に存在するプラスミドから得られるＤＮＡ配列に基づいて調製される合成オリゴヌクレオチドプローブの使用によって、適当な供給源、例えば下文で言及する生物のいずれかから都合よくクローン化され得る。
【００４３】
他の関連配列を得るための本発明の配列の使用方法：本発明のエンド−β−１，４−グルカナーゼをコードするポリヌクレオチドに関する本明細書の開示された配列の情報は、他の相同なエンドグルカナーゼを同定するための道具として使用され得る。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、様々な微生物の供給源、特にバチルス種のものに由来する他のマンナナーゼをコードする配列を増幅するために使用され得る。
【００４４】
ポリペプチド：
配列番号２の２６位〜約４８５位のアミノ酸配列は、触媒活性ドメインの成熟エンドグルカナーゼ配列である。当該酵素は、触媒活性ドメインと作用可能に連結し、そして配列番号２の約４８５位〜６４６位に相当するアミノ酸配列によって表されるセルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）を更に含んで成る。当該エンドグルカナーゼのＣＢＤはファミリー３ｂ（下文を参照のこと）に属する。
【００４５】
本発明はまた、配列番号２のポリペプチドと実質的に相同であるエンドグルカナーゼプロペプチド及びその種相同体（パラログ又はオーソログ）を提供する。用語「実質的に相同」は、配列番号２のアミノ酸番号２６〜４８５又は番号２６〜６４６の配列又はそのオーソログ若しくはパラログに対して７５％、好ましくは少なくとも８０％、更に好ましくは少なくとも８５％、そしてより更に好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドを表すために本明細書で使用される。配列同一性のパーセンテージは、常用の方法によって、当業界で知られているコンピュータープログラム、例えばＧＣＧプログラムパッケージにおいて提供されるＧＡＰ（Program Manual for the Wisconsin Package, Version 8, August 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711）によって決定され、これはNeedleman, S.B. and Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48, 443-453に開示されており、その全体が引用によって本明細書に組み入れられる。ＧＡＰは、次のポリペプチド配列の比較の設定値で使用される：ＧＡＰクリエーションペナルティ３．０及びＧＡＰエクステンションペナルティ０．１。
【００４６】
ポリヌクレオチド分子の配列同一性は、次のＤＮＡ配列の比較の設定値でＧＡＰを用いる類似の方法によって決定される：ＧＡＰクリエーションペナルティ５．０及びＧＡＰエクステンションペナルティ０．３。
【００４７】
実質的に相同のタンパク質及びポリペプチドは、１又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は付加を有することを特徴としている。これらの変化は好ましくは重要でない性質のものであり、すなわち保存的アミノ酸置換（表２を参照のこと）及び当該タンパク質又はポリペプチドの折りたたみ又は活性に有意に影響を及ぼさない他の置換；小さな欠失、典型的に１〜約３０アミノ酸のもの；並びに小さなアミノ又はカルボキシル末端の伸長、例えばアミノ末端のメチオニン残基、最大約２０〜２５残基のスモールリンカーペプチド、あるいは精製を容易にする小さな伸長（アフィニティータグ）、例えばポリヒスチジントラクト、プロテインＡ(Nilsson et al., EMBO J. 4: 1075, 1985: Nilsson et al., Methods Enzymol.198: 3, 1991）である。一般論として、Ford et al., Protein Expression and Purification 2: 95-107, 1991を参照のこと。これは引用によって本明細書に組み入れられる。アフィニティータグをコードするＤＮＡは、商業上の供給業者から入手可能である（例えば、Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ; New England Biolabs, Beverly, MA)。
【００４８】
しかしながら、たとえ上述の変化が好ましくは重要でない性質のものであっても、その様な変化は、それ以上の性質のものであることもあり、例えば、エンドグルカナーゼ活性を有する本発明のポリペプチドに対する、アミノ又はカルボキシル末端の伸長としての最大３００アミノ酸又はそれ以上のより大きなポリペプチドの融合である。
【表１】
0004837855.tif 000002
【００４９】
２０個の標準的なアミノ酸に加えて、標準的でないアミノ酸（例えば４−ヒドロキシプロリン、６−Ｎ−メチルリジン、２−アミノイソ酪酸、イソバリン及びα−メチルセリン）も、本発明に従うポリペプチドのアミノ酸残基の代わりとなり得る。限定数の非保存的アミノ酸、遺伝暗号によってコードされないアミノ酸、及び非天然のアミノ酸もアミノ酸残基の代わりとなり得る。「非天然のアミノ酸」は、タンパク質合成の後に修飾され、そして／あるいは、それらの側鎖において標準的なアミノ酸のものと異なる化学構造を有する。非天然のアミノ酸は化学合成することができ、あるいは、好ましくは市販のものであり、そしてピペコリン酸、チアゾリジンカルボン酸、デヒドロプロリン、３−及び４−メチルプロリン、及び３，３−ジメチルプロリンを含む。
【００５０】
本発明のエンドグルカナーゼポリペプチドの必須アミノ酸は、当業界で知られている方法、例えば部位指定突然変異導入又はアラニンスキャニング突然変異導入（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０８１−１０８５，１９８９）に従い同定され得る。後者の技術の場合、単一のアラニンの突然変異が前記分子の残基毎に導入され、そして生じた変異体分子は生物学的活性（すなわちエンドグルカナーゼ活性）について試験され、前記分子の活性に必須のアミノ酸残基が同定される。Ｈｉｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２７１：４６９９−４７０８，１９９６も参照のこと。前記酵素の活性部位又は他の生物学的相互作用も、核磁気共鳴、結晶学、電子回折又は光親和性標識の様な技術によって、推定される接触部位のアミノ酸の突然変異を一緒に用いて決定される様な構造の物理的解析によって決定され得る。例えば、de Vos et al., Science 255: 306-312, 1992; Smith et al., J. Mol. Biol. 224: 899-904, 1992; Wlodaver et al., FEBS. Lett. 309: 59-64, 1992を参照のこと。必須アミノ酸の同一性も、本発明に従うポリペプチドと関連しているポリペプチドとの相同性の解析から推測され得る。
【００５１】
複数のアミノ酸の置換が行われ、そして突然変異導入、組換え及び／又は混合の既知の方法、その後の関連のスクリーニング方法、例えばReidhaar-Olson and Sauer (Science 241: 53-57, 1988), Bowie and Sauer (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152-2156, 1989）、ＷＯ９５／１７４１３、又はＷＯ９５／２２６２５に開示されているものを用いて試験され得る。要約すると、これらの筆者は、ポリペプチドの２又はそれ以上の位置を同時に無作為化するための方法、又は異なる突然変異の組換え／混合（ＷＯ９５／１７４１３，ＷＯ９５／２２６２５）、その後の機能的なポリペプチドの選択、及びそれに続くそれぞれの位置で許容される置換のスペクトルを決定するための、突然変異が導入されたポリペプチドの配列決定を開示している。使用され得る他の方法は、ファージディスプレイ（例えば、Ｌｏｗｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３０：１０８３２−１０８３７，１９９１；Ｌａｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，２２３，４０９号；Ｈｕｓｅ，ＷＩＰＯ公報ＷＯ９２／０６２０４）及び領域指定突然変異導入（Ｄｅｒｂｙｓｈｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ ４６：１４５，１９８６；Ｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＤＮＡ ７：１２７，１９８８）を含む。
【００５２】
上文で開示されている様な突然変異導入／シマッフリング方法は、宿主細胞中のクローン化した、突然変異導入されたポリペプチドの活性を検出するための、高処理量の自動化型スクリーニング方法と組み合わせることができる。活性ポリペプチドをコードする突然変異導入されたＤＮＡ分子は、宿主細胞から回収され、そして近代的な装置を用いて素速く配列決定され得る。これらの方法は、注目のポリペプチドにおける個々のアミノ酸残基の重要性の素速い決定を可能にし、そして未知の構造のポリペプチドに適用され得る。
【００５３】
上文で開示された方法を用いて、当業者は配列番号２の残基２６〜約４８５又は残基２６〜６４６と実質的に相同の、そして野生型タンパク質のエンドグルカナーゼ活性を保持している種々のポリペプチドを同定し、そして調製することができる。
【００５４】
本発明のエンドグルカナーゼ酵素は、触媒ドメインを含んで成る酵素のコアに加えて、セルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）を含んで成ることもあり、当該酵素のセルロース結合ドメインと酵素のコア（触媒活性ドメイン）は、作用可能に連結され得る。セルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）は、上文に開示されているコードされた酵素及び添付した配列番号２の不可欠な部分として存在することがあり、あるいは別の起源に由来するＣＢＤは、前記エンドグルカナーゼ内に挿入され、その結果酵素のハイブリッドを生成し得る。本文において、用語「セルロース結合ドメイン」は、Peter Tomme et al.“Cellulose-Binding Domains: Classification and Proteins”in“Enzymatic Degradation of Insoluble Carbohydrates”, John N. Saddler and Michael H. Penner (Eds.), ACS Symposium Series, No.618, 1996に記載の様に理解され得ることが意図される。この定義は、１２０以上のセルロース結合ドメインを１０個のファミリー（Ｉ〜Ｘ）に分類し、そしてＣＢＤが種々の酵素、例えばセルラーゼ（エンドグルカナーゼ）、キシラナーゼ、マンナナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、アセチルエステラーゼ及びキチナーゼにおいて見出されることを示す。ＣＢＤはまた、藻類、例えば紅藻ポルフィラ・パープレア（Ｐｏｒｐｈｙｒａ  ｐｕｒｐｕｒｅａ）において、非加水分解性多糖結合タンパク質として見出されており、これについては、Tomme et al., （前記）を参照のこと。しかし、ほとんどのＣＢＤは、セルラーゼ及びキシラナーゼ由来であり、そしてＣＢＤは、タンパク質のＮ末端、Ｃ末端、又は内部に見つかっている。ハイブリッド酵素は、当業界に周知であり（ＷＯ９０／００６０９及びＷＯ９５／１６７８２参照）、リンカーを介するか、又は介さないで、エンドグルカナーゼをコードするＤＮＡ配列に結合されたセルロース結合ドメインをコードするＤＮＡのフラグメントを少なくとも含んでいるＤＮＡコンストラクトを、宿主細胞に導入し、その宿主細胞を培養して、前記融合遺伝子を発現させることによって、このハイブリッド酵素を調製することができる。ハイブリッド酵素は、以下の式：
ＣＢＤ−ＭＲ−Ｘ
によって記載される（式中、ＣＢＤは、Ｎ末端又はＣ末端領域として、少なくともセルロース結合ドメインに相当するアミノ酸配列であり；ＭＲは、中間領域（リンカー）であり、単なる結合であってもよいし、又は、好ましくは約２〜約１００の炭素原子、より好ましくは２〜４０の炭素原子を含んでいる短い結合基、又は、好ましくは約２〜約１００のアミノ酸、より好ましくは２〜４０のアミノ酸であってもよく；そしてＸは、本発明の第１又は第２ＤＮＡ配列によってコードされるポリペプチドのＮ末端又はＣ末端領域である）。
【００５５】
好ましい態様において、本発明の単離したポリヌクレオチドは、セルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）をコードする部分的なＤＮＡ配列を含んで成る。その様な部分的なＤＮＡ配列の例は、配列番号１の約４８５〜１９４１位のヌクレオチドに相当する配列又はエスケリッチャ・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、ＤＳＭ  １２８０５に存在するプラスミドｐＳＪ１６７８内にクローン化されたＤＮＡ配列のＣＢＤをコードしている部分である。本発明の単離したポリヌクレオチド分子は、連結（Ｌｉｎｋｉｎｇ）領域をコードしている部分的なヌクレオチド配列を更に含んで成ることもあり、この連結領域は単離したポリヌクレオチド分子に包含されるヌクレオチド配列によってコードされる酵素のセルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）及び触媒活性ドメイン（ＣＡＤ）は作用可能に連結している。好ましくは、当該連結領域は、約２アミノ酸残基〜約１２０アミノ酸残基、特に１０〜８０アミノ酸残基から成る。
【００５６】
免疫交差性
免疫交差性を決定するために使用され得るポリクローナル抗体、特に１つのものに特異的なポリクローナル抗体は、精製したセルロース分解酵素を用いて調製される。更に具体的には、本発明のエンドグルカナーゼに対する抗血清が、N.Axelsen et al. in: A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis, Blackwell Scientific Publications, 1973, Chapter 23、又はA.Johnstone and R. Thorpe, Immunochemistry in Practice, Blackwell Scientific Publications, 1982 （更に具体的にはｐ．２７−３１）に記載された方法に従って、ウサギ（又は他の齧歯類）を免疫化することによって産生され得る。精製した免疫グロブリンは、その抗血清から、例えば塩析（硫酸アンモニウム）、続いて透析、そして例えばＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ上でのイオン交換クロマトグラフィーによって得ることができる。タンパク質の免疫化学的な特徴づけは、オクタロニー二重拡散法（O.Ouchterlony in: Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir, Ed.), Blackwell Scientific Publications, 1967, pp.655-706 ）、交差免疫電気泳動（N.Axelsen et al., 上記、Chapters 3 and 4）、又はロケット免疫電気泳動（N.Axelsen et al., Chapter 2 ）によって行われ得る。
【００５７】
微生物源
本発明のために、特定の起源と関連して本明細書で使用される場合、用語「から得られる」又は「から得ることができる」とは、本酵素が、その特定の起源、又はその起源由来の遺伝子が導入された細胞によって産生されること、又は産生され得ることを意味する。
【００５８】
現時点では、本発明のセルラーゼは、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属の菌株、特にバチルス・リチェニホルミス（ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）の菌株に属するグラム陽性細菌から得られ得ると考えられている。
【００５９】
好ましい態様において、本発明のセルラーゼは、バチルス・リチェニホルミスの菌株、ＡＴＣＣ  １４５８０から得られる。現時点では、本発明の酵素と相同な酵素をコードしているＤＮＡ配列は、バチルス属に属する他の菌株から得られ得ると考えられている。
【００６０】
本発明のエンド−β−１，４−グルカナーゼが由来し得るバチルス・リチェニホルミスの菌株の単離物は、寄託番号ＡＴＣＣ  １４５８０名のもとで、American Type Culture Collection（ＡＴＣＣ）から入手することができる。
【００６１】
更に、本発明のエンド−β−１，４−グルカナーゼをコードするＤＮＡ配列を含んで成るプラスミドｐＳＪ１６７８はエスケリッチャ・コリの菌株を形質転換せしめ、寄託番号ＤＳＭ  １２８０５の名のもとで寄託された。
【００６２】
組換え発現ベクター
本発明の酵素をコードするＤＮＡコンストラクトを含んでいる組換えベクターは、組換えＤＮＡ技術に都合よくかけられ得る、任意のベクターであってもよく、このベクターの選択は、それが導入され得る宿主細胞にしばしば依存するだろう。この様に、当該ベクターは、自律複製ベクター、すなわち染色体外に存在して、染色体複製から独立して複製するベクター、例えばプラスミドであってもよい。あるいは、当該ベクターは、宿主細胞に導入した場合、部分的に又はその全体が宿主細胞ゲノムに組み込まれ、そして組み込まれた染色体と共に複製されるベクターであってもよい。
【００６３】
当該ベクターは、好ましくは本発明の酵素をコードするＤＮＡ配列が、ＤＮＡの転写に必要な追加のセグメントと作用可能に連結している発現ベクターである。一般に、当該発現ベクターは、プラスミド又はウイルスＤＮＡに由来するか、あるいは、その両者の要素を含んでもよい。用語「作用可能に連結する」とは、セグメントが並べられた結果、それらが、それらの意図されている目的と協調して機能し、例えば、転写がプロモーターにおいて開始し、そして当該酵素をコードするＤＮＡ配列を通過して進むことを指す。
【００６４】
プロモーターは、選択した宿主細胞内で転写活性を有する任意のＤＮＡ配列でよく、宿主細胞に対して同種の、又は異種の、そのいずれかのタンパク質をコードする遺伝子から得られ得る。
【００６５】
細菌宿主細胞で用いる適当なプロモーターは、バチルス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のマルトース産生アミラーゼ遺伝子、バチルス・リチェニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）アルファ−アミラーゼ遺伝子、バチルス・アミロリクエファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）アルファ−アミラーゼ遺伝子、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）アルカリ性プロテアーゼ遺伝子、又はバチルス・プミラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ）キシロシダーゼ遺伝子のプロモーター、又はラムダ・ファージＰR 又はＰL プロモーター又はＥ．コリ  ｌａｃ，ｔｒｐ又はｔａｃプロモーターを含む。
【００６６】
本発明の酵素をコードするＤＮＡ配列は、必要ならば、適当なターミネーターに作用可能に連結されてもよい。
【００６７】
本発明の組換えベクターは、更に、問題の宿主細胞内でのベクター複製を可能にするＤＮＡ配列を含んでもよい。
【００６８】
ベクターはまた、選択マーカー、例えば、宿主細胞の欠損を補完する産物の遺伝子、あるいは、例えば抗生物質、例えばカナマイシン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、テトラサイクリン、スペクチノマイシンなど、又は重金属もしくは除草剤に対する耐性をコードしている遺伝子を含んで成ることもある。
【００６９】
本発明の酵素を宿主細胞の分泌経路に向かわせるために、分泌シグナル配列（リーダー配列、プレプロ配列又はプレ配列としても知られている）が組換えベクター内に提供され得る。分泌シグナル配列は、本酵素をコードするＤＮＡ配列に正確な読み枠で連結する。分泌シグナル配列は、一般に、本酵素をコードするＤＮＡ配列の５′側に位置する。分泌シグナル配列は、本酵素と通常関連しているものでもよいし、又は別の分泌タンパク質をコードする遺伝子に由来してもよい。
【００７０】
本酵素をコードするＤＮＡ配列、プロモーター、並びに任意にターミネーター及び／又は分泌シグナル配列を各々ライゲーションし、適当なＰＣＲ増幅法によってこれらの配列を増幅し、そして複製又は組込みに必要な情報を含む適当なベクターにそれらを挿入するために使用する方法は、当業者に公知である（Sambrook et al. 前出）。
【００７１】
宿主細胞
宿主細胞に導入される、クローン化されたＤＮＡ分子は、その宿主にとって同種又は異種、いずれのものでもよい。宿主細胞にとって同種である場合、すなわち宿主細胞によって天然に産生される場合には、それは典型的には、その天然の環境のものとは別のプロモーター配列に、更に、場合によっては、別の分泌シグナル配列及び／又はターミネーター一配列に作用可能に連結されるだろう。用語「同種」とは、問題の宿主生物にとって天然の酵素をコードするＤＮＡ配列を含むことを意味する。用語「異種」とは、宿主細胞によって天然に発現されないＤＮＡ配列を含むことを意味する。従って、当該ＤＮＡ配列は、別の生物に由来するものであるか、又は合成配列であってもよい。
【００７２】
本発明のクローン化されたＤＮＡ分子又は組換えベクターが導入される宿主細胞は、所望の酵素を産生することができる任意の細胞であってもよく、細菌、酵母、菌類及びより高等な真核生物細胞を含む。
【００７３】
培養時に、本発明の酵素を産生することができる細菌宿主細胞の例は、グラム陽性細菌、例えば、バチルスの菌株、特にバチルス・アルカロフイラス（Ｂ．ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アミロリクエファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・ブレビス（Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ）、バチルス・ラウタス（Ｂ．ｌａｕｔｕｓ）、バチルス・レンタス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・リクエファシエンス（Ｂ．ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・リチェニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・サーキュランス（Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルス・コアギュランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・メガセリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｈｅｒｉｕｍ）、バチルス・ステアロサーモフィラス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）及びバチルス・チューリンゲンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）の菌株、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）の菌株、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）の菌株、特にストレプトミセス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）又はストレプトミセス・ムリナス（Ｓ．ｍｕｒｉｎｕｓ）であってもよく、あるいは、宿主細胞はグラム陰性細菌、例えば、エスケリッチャ・コリの菌株である。
【００７４】
細菌の形質転換は、プロトプラスト形質転換法、エレクトロポレーション法、接合、あるいはコンピテント細胞を用いた方法によって、本質的に知られている方法で行われる（Sambrook et al. 前出）。
【００７５】
細菌、例えばエスケリッチャ・コリ中で酵素を発現させた場合、当該酵素は、細胞質内に、典型的には不溶性顆粒（又は封入体）として貯留するか、あるいは、細菌の分泌配列によって細胞膜周辺腔に向かうだろう。前者の場合、細胞が溶解され、顆粒が回収され、そして変性され、この後、変性剤を希釈して、当該酵素が再生される。後者の場合、例えば超音波処理又は浸透圧ショックによって細胞を破壊することによって、細胞膜周辺腔の内容物を放出させ、そして当該酵素を回収することによって、酵素が回収され得る。
【００７６】
グラム陽性細菌、例えばバチルスの菌株又はストレプトミセスの菌株などのグラム陽性細菌中で本酵素を発現させた場合、当該酵素は、細胞質内に貯留するか、あるいは細菌の分泌配列によって細胞外の培地に向かうだろう。
【００７７】
培養時に、本発明の酵素を産生することができる菌類宿主細胞の例は、例えば、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）又はフザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）の菌株、特にアスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、及びフザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｒｕｍ）、並びにトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）の菌株、好ましくはトリコデルマ・ハルジアナム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）及びトリコデルマ・ヴィリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ）である。
【００７８】
菌類細胞は、プロトプラストの形成及びプロトプラストの形質転換、続く本質的に知られている方法での細胞壁の再生に関与する方法によって形質転換されうる。アスペルギルスの菌株の、宿主細胞としての使用はＥＰ  ２３８  ０２３（Novo Nordisk A/S）に記載されており、この内容は引用によって本明細書に組み入れられる。
【００７９】
培養時に本発明の酵素を産生する事が出来る酵母起源の宿主細胞の例は、例えばハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｌａ）族の菌株、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）族の菌株、特にクルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）及びクルイベロミセス・マルキアナス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｃｉａｎｕｓ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属の菌株、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）の菌株、特にサッカロミセス・カースベルゲンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス・クルイベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）及びサッカロミセス・ウバラム（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｕｖａｒｕｍ）、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属の菌株、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、並びにヤローウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属の菌株、特にヤローウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）である。
【００８０】
培養時に、本発明の酵素を産生することが出来る植物起源の宿主細胞の例は、例えばソラナム・ツベロサム（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）又はニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）の植物細胞である。
【００８１】
セルロース分解酵素の産生方法
本発明は、本発明に従い単離される酵素を産生する方法を提供し、この中で、本酵素をコードするＤＮＡ配列によって形質転換された適当な宿主細胞は、本酵素の産生を可能にする条件下で培養され、そして生成した酵素がその培養液から回収される。
【００８２】
本明細書で定義される場合、単離したポリペプチド（例えば酵素）とは、他のポリペプチドが本質的に含まれていないポリペプチドのことであり、例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定される場合、少なくとも約２０％純粋、好ましくは少なくとも約４０％純粋、更に好ましくは約６０％純粋、より更に好ましくは約８０％純粋、最も好ましくは約９０％純粋、そしてより最も好ましくは約９５％純粋である。
【００８３】
用語「単離されたポリペプチド」は、代わりに「精製されたポリペプチド」と称されることもある。
【００８４】
本酵素をコードするＤＮＡ配列を含んでいる発現ベクターを、異種の宿主細胞に導入した場合には、本発明の酵素の異種性組換え産生が可能となる。
【００８５】
それによって、同種性の不純物が含まれていないことを特徴とする、高度に精製された、又は単一成分のセルロース分解性組成物を作ることができる。
【００８６】
本文において、同種性の不純物とは、本発明の酵素を本来的に産生する同種性細胞に由来する任意の不純物（例えば本発明の酵素以外のポリペプチド）を意味する。
【００８７】
本発明において、同種の宿主細胞は、バチルス・リチェニホルミスの菌株であってもよい。
【００８８】
本形質転換宿主細胞を培養するために用いられる培地は、問題の宿主細胞を増殖させるために適した任意の常用の培地でよい。発現したセルロース分解酵素は、都合良く培養培地中に分泌されてもよく、そして、周知の方法によって、例えば、遠心又は濾過によって細胞を培地から分離し、硫酸アンモニウムなどで培地中のタンパク質成分を塩析させ、イオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー工程にかけることによって、その培地から回収され得る。
【００８９】
酵素組成物
より更なる観点において、本発明は、上述したようなエンドグルカナーゼ活性を示す酵素を含んで成る酵素組成物に関する。
【００９０】
本発明の酵素組成物は、本発明のエンドグルカナーゼに加えて、１又は複数の他の種類の酵素、例えば、ヘミセルラーゼ、例えばキシラナーゼ及びマンナナーゼ、他のセルラーゼ又はエンド−β−１，４−グルカナーゼ成分、キチナーゼ、リパーゼ、エステラーゼ、ペクチナーゼ、クチナーゼ、フィターゼ、オキシドレダクターゼ（ペルオキシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、オキシダーゼ、ラッカーゼ）、プロテアーゼ、アミラーゼ、レダクターゼ、フェノールオキシダーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、ペクチン酸リアーゼ、キシログルカナーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、ペクチンリアーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、トランスグルタミナーゼ；あるいはそれらの混合物を含んで成ることもある。
【００９１】
当該酵素組成物は、当業界で既知の方法に従い調製することができ、そして液体品又は乾燥組成物の形態であってよい。例えば、当該酵素組成物は、顆粒又は微少顆粒の形態であってよい。当該組成物中に含まれ得る本酵素は、当業界で既知の方法に従い安定化され得る。
【００９２】
エンドグルカナーゼは、多様な産業及び応用分野において利用される可能性がある。本発明の酵素組成物の好ましい使用例を以下に記す。本酵素組成物の適用量及び当該組成物が使用されるその他の条件は、当業界で既知の方法に基づいて決定されるだろう。
【００９３】
本発明に従う酵素組成物は、少なくとも１つの下記の目的のために有用であるだろう。
【００９４】
酵素
本発明の好ましい態様において、エンドグルカナーゼは、４〜１１、好ましくは５．５〜１０．５の範囲のpHで活性を示す。
【００９５】
使用
バイオマス分解
本発明に従う酵素又は酵素組成物は、例えば、下記のように有利に適用することができる：
−デバーキング（ｄｅｂａｒｋｉｎｇ）、すなわち、有利なエネルギーの節約をもたらす、機械的ドラムにおけるデバーキングの前の、ペクチンに富む形成層を部分的に分解し得る加水分解酵素による前処理のため。
−デフィブレイション（ｄｅｆｉｂｒａｔｉｏｎ）（精製又は叩解）、すなわち、繊維の表面に対する当該酵素の加水分解作用による、エネルギー消費の減少をもたらす、精製又は叩解の前の加水分解酵素によるセルロース繊維を含有する材料の処理のため。
−繊維の修飾、すなわち、より深く浸透する酵素を必要とする、繊維壁を通過する部分的な加水分解が求められる場合における、繊維の特性の修飾のため（例えば、粗い繊維をいっそう柔軟性とするため）。
−排水を改良するため：製紙用パルプの排水性は、加水分解性酵素によるパルプの処理によって改良され得る。本発明の酵素又は酵素組成物の使用は更に有効であることもあり、例えば繊維間の、及び製紙機のワイヤーメッシュにおける窪みの空間を塞ぐことによって排水の速度を制限する、細かい画分における、強力に水和した微小繊維の束の、より大量の流出をもたらし得る。
【００９６】
リグノセルロースパルプの処理は、例えば、ＷＯ９３／０８２７５号、ＷＯ９１／０２８３９号及びＷＯ９２／０３６０８号に記載されているように実施可能である。
【００９７】
洗剤産業における使用
本発明の酵素又は酵素組成物は、織物及び衣類の家庭用又は産業用の洗浄のための洗剤組成物において、並びに本発明の酵素又は酵素調製物を含む洗浄溶液を用いる機械洗浄の工程の洗浄周期の間に、繊維を処理することを含んで成る、繊維の機械的な処理のための方法に対して有用なことがある。
【００９８】
典型的に、本発明の洗剤組成物は、常用の成分、例えば界面活性剤（陰イオン性、非イオン性、双性イオン性、両性）、ビルダー、及び他の成分、例えば引用によって本明細書に組み入れられる、ＷＯ９７／０１６２９に記載のものを含んで成る。
【００９９】
織物の適用
別の態様において、本発明はバイオポリッシング工程における本発明のエンドグルカナーゼの使用に関する。バイオポリッシングは、繊維の湿潤性を損失しないで風合い及び外観に関する繊維の品質を改良する特定の処理である。バイオポリッシングの最も重要な効果は、少ない毛羽及びピリング、増加した光沢／輝き、改良された繊維の風合い、増加した耐久柔軟性及び変更された水吸収性により特徴づけることができる。バイオポリッシングは、通常編成及び織製繊維の製作の湿式処理において行われる。湿式処理は、例えば、糊抜き、精練、漂白、洗濯、染色／印刷及び仕上げのような工程を含んでなる。これらの工程の各々の間において、繊維は多少機械的作用にさらされる。一般に、繊維材料が編成又は織製された後、繊維は糊抜き段階、次いで精練段階などに進行する。糊抜きは繊維材料から糊剤を除去する作用である。機械的織機による織製前に、たて糸は、それらの引張強さを増加するために、糊剤の澱粉又は澱粉誘導体でしばしばコーティングされる。織製後、糊剤のコーティングを除去した後、繊維をさらに処理して均質かつ洗濯防水の結果を保証しなくてはならない。バイオポリッシングの効果を達成するためには、セルロース分解及び機械的作用の組み合わせが要求されることは知られている。また、セルラーゼによる処理を柔軟剤による常用の処理と組み合わせたとき、「超柔軟性」を達成できることが知られている。セルロースの繊維のバイオポリッシングのために本発明のエンドグルカナーゼを使用することは有利であり、例えば、いっそう完全なポリッシングを達成できることが考えられる。バイオポリッシングは、例えば、ＷＯ９３／２０２７８に記載されている方法を適用することによって得ることができる。
【０１００】
ストーン−ウォッシング
染色された繊維、特にデニム繊維又はジーンズにおいて、このような繊維から作られたデニム又はジーンズを軽石の存在下で洗濯して所望の繊維の局存化された浅色化を達成するか、又は繊維を酵素的に、特にセルロース分解酵素で処理することによって、「ストーン−ウォッシングされた」外観（色の局存化された摩耗）を提供することは知られている。本発明のエンドグルカナーゼによる処理は、ＵＳ  ４，８３２，８６４に開示されているように単独で、伝統的方法において要求されるより少量の軽石とともに、又はＷＯ９５／０９２２５に開示されているように、パーライトとともに、実施することができる。
【０１０１】
ＣＭＣユニットの決定
ＣＭＣユニットは、０．１Ｍ  Ｍｏｐｓ緩衝液（pH７．５）を用いる、６０℃、２０分のインキュベーション及びＰＨＡＢを用いる、還元糖の形成の決定によって決定される。１ＣＭＣユニットは、１分当たり１マイクロモルのグルコース当量の形成に相当する。ＣＭＣ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓのカルボキシメチルセルロース７Ｌ）の終濃度は、０．７５％。ＤＳ０．７である。
【０１０２】
材料と方法
菌株
バチルス・リチェニホルミスＡＴＣＣ  １４５８０
Ｂ．サブチリスＰＬ２３０６。この菌株は、既知のバチルス・サブチリスのセルラーゼ遺伝子の転写単位が分断され、その結果セルラーゼネガティブな細胞となった、分断されたａｐｒ及びｎｐｒ遺伝子を有するＢ．サブチリスＤＮ１８８５（Diderichsen et al.(1990)）である。当該分断は、本質的にA.L. Sonenshein et al. (1993) に記載の様に行われた。
【０１０３】
コンピテント細胞は、Yasbin et al. (1975)に記載の様に調製され、そして形質転換された。
【０１０４】
プラスミド
ｐＳＪ１６７８  国際特許公報ＷＯ９４／１９４５４に開示されている。
【０１０５】
ｐＭＯＬ９４４：
このプラスミドは、当該プラスミドをバチルス・サブチリス中で増殖可能にする因子、カナマイシン耐性遺伝子を本質的に含み、そしてＢ．リチェニホルミスＡＴＣＣ  １４５８０のａｍｙＬ遺伝子からクローン化した強力なプロモーター及びシグナルペプチドを有するｐＵＢ１１０誘導体である。当該シグナルペプチドは、シグナルペプチドを有するタンパク質融合体の成熟部分をコードしているＤＮＡをクローン化するのを便利にするＳａｃII部位を含む。これは、細胞の外側に向かうプレタンパク質の発現をもたらす。
【０１０６】
当該プラスミドは、常用の遺伝子操作技術によって構築されており、このことを下文で簡略して記述する。
【０１０７】
ｐＭＯＬ９４４の構築：
ｐＵＢ１１０プラスミド（McKenzie, T. et al., 1986 ）は、独特な制限酵素ＮｃｉＩを用いて消化された。プラスミドｐＤＮ１９８１（Jorgensen P.L. et al. (1990)）上にコードされているａｍｙＬプロモーターから増幅されたＰＣＲフラグメントがＮｃｉＩで消化され、そしてＮｃｉＩで消化したｐＵＢ１１０に挿入され、プラスミドｐＳＪ２６２４を与えた。使用した２つのＰＣＲプライマーは次の配列を有する：
#LWN5494  5′-GTCGCCGGGGCGGCCGCTATCAATTGGTAACTGTATCTCAGC-3′
#LWN5495  5′-GTCGCCCGGGAGCTCTGATCAGGTACCAAGCTTGTCGACCTGCAGAATGAGGCAGCAAGAAGAT-3′
プライマー＃ＬＷＮ５４９４は、当該プラスミドにＮｏｔＩ部位を挿入する。
【０１０８】
プラスミドｐＳＪ２６２４は、続いてＳａｃＩ及びＮｏｔＩで消化され、そしてｐＤＮ１９８１上にコードされているａｍｙＬプロモーターに対して増幅された新規なＰＣＲフラグメントは、ＳａｃＩ及びＮｏｔＩで消化され、そしてこのＤＮＡフラグメントは、ＳａｃＩ−ＮｏｔＩで消化されたｐＳＪ２６２４に挿入され、プラスミドｐＳＪ２６７０を与えた。
【０１０９】
このクローニングは、最初のａｍｙＬプロモーターのクローニングを、同一であるが、反対方向のプロモーターで置き換えている。ＰＣＲ増幅に使用した２つのプライマーは次の配列を有する：
#LWN5938  5′-GTCGGCGGCCGCTGATCACGTACCAAGCTTGTCGACCTGCAGAATGAGGCAGCAAGAAGAT-3′
#LWN5939  5′-GTCGGAGCTCTATCAATTGGTAACTGTATCTCAGC-3′
【０１１０】
プラスミドｐＳＪ２６７０は、制限酵素ＰｓｔＩ及びＢｃｌＩで消化され、そしてアルカリ性アミラーゼＳＰ７２２（ＷＯ９５／２６３９７として公開されている国際特許出願に開示されており、これは引用によってその全体が本明細書に組み入れられる）をコードしている、クローン化されたＤＮＡ配列から増幅されたＰＣＲフラグメントは、ＰｓｔＩ及びＢｃｌＩで消化され、そしてプラスミドｐＭＯＬ９４４を与えるべく挿入された。ＰＣＲ増幅に使用した２つのプライマーは、次の配列を有する：
#LWN7864  5′-AACAGCTGATCACGACTGATCTTTTAGCTTGGCAC-3′
#LWN7901       5′-AACTGCAGCCGCGGCACATCATAATGGGACAAATGGG-3′
プライマー＃ＬＷＮ７９０１は、当該プラスミドにＳａｃII部位を挿入する。
【０１１１】
一般的な分子生物学的方法
特に言及しない限り、ＤＮＡの操作及び形質転換は、分子生物学の標準的方法（Sambrook et al. (1989); Ausubel, F.M. et al. (eds)(1995); Harwood, C.R., and Cutting, S.M. (eds.)(1990) ）を用いて行われた。
【０１１２】
ＤＮＡの操作のための酵素は、提供者の指示に従い使用された（例えば、制限エンドヌクレアーゼ、リガーゼ等は、New England Biolabs, Inc. から入手可能である）。
【０１１３】
培地
ＴＹ（Ausubel et al. (1995) に開示されているもの）。
ＬＢアガー（Ausubel et al. (1995) に開示されているもの）。
ＬＢＰＧは、０．５％グルコース及び０．０５Ｍリン酸カリウム（pH７．０）を添加したＬＢアガーである。
ＢＰＸ培地は、ＥＰ  ０  ５０６  ７８０（ＷＯ９１／０９１２９）に記載されている。
【０１１４】
以下の例は、本発明を例示している。
例１
バチルス・リチェニホルミス由来のエンド−ベータ−１，４−グルカナーゼのクローニング及び発現
ゲノムＤＮＡの調製
菌株バチルス・リチェニホルミスＡＴＣＣ  １４５８０は、ＡＴＣＣ（American Type Culture Collection, USA ）に明記されている液体培地３の中で増幅した。３７℃及び３００rpm での１８時間のインキュベーション後、細胞が採取され、そしてゲノムＤＮＡがPitcher et al. (1989) に記載の方法によって単離された。
【０１１５】
ゲノムライブラリーの構築
バチルス・リチェニホルミスＡＴＣＣ  １４５８０のゲノムＤＮＡは、制限酵素Ｓａｕ３Ａで部分的に消化され、０．７％アガロースゲル電気泳動上でサイズ分画された。ＤＥＡＥセルロース紙電気泳動で、２〜７kbの断片を単離した（Dretzen, G., et al., 1981 ）。単離したＤＮＡ断片を、ＢａｍＨＩで消化したプラスミドｐＳＪ１６７８のＤＮＡにライゲーションした。
【０１１６】
ライゲーションしたＤＮＡはＥ．コリ  ＳＪ２のエレクトロポレーションに使用し、そして形質転換した細胞は、１０mg／mlクロラムフェニコール及び０．１％  ＣＭＣ（カルボキシメチルセルロースナトリウム、Aqualon, France ）を加えたＬＢアガープレート上にまき、当該プレートを３７℃で１８時間インキュベートした。
【０１１７】
コロニーハイブリダイゼーションによるポジティブなクローンの同定
上述の様に構築した、Ｅ．コリのＤＮＡライブラリーは、０．１％  ＣＭＣ（ナトリウム−カルボキシ−メチル−セルロース、Aqualon, France ）及び１０μｇ／mlのクロラムフェニコールを含むＬＢアガープレート上でスクリーニングして、そして３７℃で一晩インキュベートした。形質転換体は、同じ型のプレート上で引き続いてレプリカプレーティングされ、そしてこれらの新規なプレートは８時間又は一晩、３７℃でインキュベートされた。
【０１１８】
本来のプレートは、１mg／mlのＣｏｎｇｏ  Ｒｅｄ（Sigma, USA）を含む２５mlの水溶液で着色された。プレートを、１Ｍ  ＮａＣｌを用いて１５分間、２回洗浄した後、着色は穏やかな回転の撹拌で３０分間続いた。
【０１１９】
セルラーゼポジティブなコロニーが存在する位置に黄色の輪が現れ、当該レプリカプレートから、これらのセルラーゼポジティブなクローンが救出され、０．１％  ＣＭＣ及び９μｇ／mlのクロラムフェニコールを含むＬＢアガープレート上に再びストリーキングされ、そして３７℃で一晩インキュベートされた。
【０１２０】
ポジティブなクローンの特徴付け
再びストリーキングしたプレートから、エンドグルカナーゼポジティブなクローンが単一なコロニーとして得られ、そしてプラスミドが抽出された。表現型は、Ｅ．コリ  ＳＪ２の再形質転換によって確認され、そして、プラスミドが制限消化によって特徴づけられた。１つのポジティブなクローンがＭＢ６２９−３と命名された。
【０１２１】
エンドグルカナーゼ遺伝子は、蛍光末端標識した適当なオリゴヌクレオチドをプライマーとして、Ｔａｑ  ｄｅｏｘｙｔｅｒｍｉｎａｌ  ｃｙｃｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｋｉｔ（PerkinElmer, USA）を用いてＤＮＡの配列決定を行い、ｐＳＪ１６７８プラスミド及びクローン化されたエンドグルカナーゼをコードしているＤＮＡフラグメントの両側に対して独特なプライマーで開始する、プライマー歩行によって特徴づけた。
【０１２２】
配列データの分析は、Devereux et al. (1984)に従い行われた。当該配列は、配列番号１に示したＤＮＡ配列に相当する。
【０１２３】
配列番号２のアミノ酸配列によって表されるファミリー９のエンド−β−１，４−グルカナーゼ（Ｃｅｌ９とも表される）をコードしている本発明のＤＮＡ配列は、これらの２つのオリゴヌクレオチドから成るＰＣＲプライマー対を用いてＰＣＲ増幅された。
Ｃｅｌ９．Ｂ．リチェニホルミス．上流ＰｓｔＩ
5′-CAT CAT TCT GCA GCC GCG GCA GCT TCT GCT GAA GAA TAT CCT C-3′
Ｃｅｌ９．Ｂ．リチェニホルミス．下流ＮｏｔＩ
5′-GCG AGA ATA GCG GCC GCT AGT AAC CGG GCT CAT GTC CG-3′
制限部位ＰｓｔＩ及びＮｏｔＩは下線が引かれている。
【０１２４】
上述のＢ．リチェニホルミスＡＴＣＣ  １４５８０から単離した染色体ＤＮＡは、取扱い説明書に従い、Ａｍｐｌｉｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Perkin Elmer）を用いるＰＣＲ反応における鋳型として使用された。ＰＣＲ反応は、２００μＭの各ｄＮＴＰ、２．５ユニットのＡｍｐｌｉＴａｑポリメラーゼ（Perkin-Elmer, Cetus, USA）及び１００pmolの各プライマーを含むＰＣＲ緩衝液（１０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、pH８．３、５０mM  ＫＣｌ、１．５mM  ＭｇＣｌ2 、０．０１％（ｗ／ｖ）ゼラチン）中で行われた。
【０１２５】
ＰＣＲ反応は、ＤＮＡサーマルサイクラー（Landgraf, Germany ）を用いて行った。９４℃で１分間のインキュベーションを１回、続けて、９４℃で３０秒間の変性、６０℃で１分間のアニーリング及び７２℃で２分間の伸長のサイクルプロファイルを用いた３０サイクルのＰＣＲを行った。５μｌの増幅生成物のアリコートは、０．７％のアガロースゲル（ＮｕＳｉｅｖｅ，ＦＭＣ）中での電気泳動によって分析した。２．０kbのサイズのＤＮＡフラグメントの出現は、遺伝子セグメントの適当な増幅を示唆した。
【０１２６】
ＰＣＲフラグメントのサブクローニング
上述の様に生成したＰＣＲ生成物の４５μｌのアリコートは、取扱い説明書に従い、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キットを用いて精製された。精製されたＤＮＡは、５０μｌの１０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８．５）で溶出された。５μｇのｐＭＯＬ９４４及び２５μｌの精製されたＰＣＲフラグメントは、ＰｓｔＩ及びＮｏｔＩで消化され、０．８％の低温でゲル化するアガロース（ＳｅａＰｌａｇｕｅ  ＧＴＧ，ＦＭＣ）ゲル中で電気泳動され、関連するフラグメントがゲルから切り出され、そしてＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Qiagen, USA ）を用いて、取扱い説明書に従い精製された。単離されたＰＣＲ  ＤＮＡフラグメントは、続いてＰｓｔＩ−ＮｏｔＩ消化され、そして精製されたｐＭＯＬ９４４とライゲーションされた。ライゲーションは、０．５μｇの各ＤＮＡフラグメント、１ＵのＴ４  ＤＮＡリガーゼ及びＴ４リガーゼ緩衝液（Boehringer Mannheim, Germany）を用いて、１６℃で一晩行われた。
【０１２７】
ライゲーション混合物は、コンピテントＢ．サブチリスＰＬ２３０６を形質転換せしめるために使用された。形質転換した細胞は、ＬＢＰＧ  １０μｇ／mlのカナマイシンプレート上に蒔かれた。３７℃での１８時間のインキュベーション後、複数のクローンが新鮮なアガープレート上に再ストリークされ、そして更に１０μｇ／mlのカナマイシンを有する液体ＴＹ培地中で増殖され、そして３７℃で一晩インキュベートされた。次の日、１mlの細胞が、Ｑｉａｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎプラスミドミニプレップキット＃２７１０６を用いて、Ｂ．サブチリスのプラスミド調製物のための推奨に従い、当該細胞を単離するために使用された。このプラスミドＤＮＡは、ＤＮＡの配列決定のための鋳型として使用された。
【０１２８】
本発明のエンド−β−１，４−グルカナーゼ遺伝子を含む１つのクローンが保持され、このクローンはＭＢ９０５と表した。
【０１２９】
ＭＢ９０５由来のプラスミドは、発現試験のために、Ｂ．リチェニホルミスＡＴＣＣ  １４５８０の誘導体に導入された。この菌株は、ＭＢ９２４と命名された。クローン化したＤＮＡ配列は、ＢＰ−Ｘ培地中で、３７℃で５日間、３００rpm で発酵させることによって、Ｂ．リチェニホルミスにおいて発現した。配列番号２の成熟タンパク質に相当する、上清中に現れたエンドグルカナーゼタンパク質は、配列番号２の２６〜６４６位のアミノ酸に相当するタンパク質配列を含んで成る。
【０１３０】
例２
バチルス・リチェニホルミス由来のエンド−β−１，４−グルカナーゼの精製及び特徴づけ
精製
例１に記載した様に得られたＭＢ９２４は、５００mlの２つのバッフル付きの振盪フラスコ中の、１０μｇ／mlのカナマイシンを有する１５×２００mlのＢＰＸ培地において、３７℃、３００rpm で５日間増殖され、それによって２５００mlの培養液が得られた。培養液は等量のイオン化水で希釈され、そしてpHが酢酸を用いて７．５に調節された。続いて、１１２．５mlの陽イオン性薬剤（Ｃ５２１  １０％）及び２２５mlの陰イオン性薬剤（Ａ１３０  ０．１％）が、凝集のために撹拌の間加えられた。凝集した材料は、Ｓｏｒｖａｌ  ＲＣ  ３Ｂ遠心機を用いる、１００００rpm 、６℃での３０分間の遠心によって分離した。生じた上清は、合計量５０００ml中で、１ml当たり１２０ＣＭＣユニットを含んだ。
【０１３１】
上清は、ＷｈａｔｍａｎのガラスフィルターＧＦ／Ｄ及びＣを用いて清澄にされ、そして最終的に１０kDa のカットオフ値を有するｆｉｌｔｒｏｎのＵＦ膜上で濃縮された。合計で１７５０mlの量がpH８．０に調節された。
【０１３２】
高度に精製されたエンドグルカナーゼを得るために、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ陰イオン交換クロマトグラフィーを用いる最終段階が行われた。１７５０mlの溶液は、５０mmolのＴｒｉｓ  pH８．０の緩衝液で平衡化されたＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を含む８００mlのカラムにかけられた。エンドグルカナーゼは結合し、そして０．５ＭのＮａＣｌ勾配を用いて溶出された。９５％以上のエンドグルカナーゼが濃縮された。
【０１３３】
特徴づけ
純粋な酵素は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて６７kDa の一本のバンド及び約５．６の等電点を与えた。
【０１３４】
タンパク質濃度は、１７１６４０のモル吸光係数を用いて決定された（前記配列から推定されるアミノ酸配列に基づく）。pHの活性プロファイルは、pH６．０〜９．２、６０℃で、５０％以上の相対活性を示した。至適温度は、pH７．５で６５℃であった。ＤＳＣは、pH６．２で、７７℃での融解を示した。
【０１３５】
純粋なエンドグルカナーゼのＮ末端の決定：ＥＹＰＨＮＹＡＥＬＬＱＫ
【０１３６】
純粋なエンドグルカナーゼは、ファミリー９のグリコシルヒドロラーゼに属し、配列番号２の約２６〜約４８５位のアミノ酸配列に相当する触媒ドメイン、及び触媒ドメインと連結し、そして配列番号２の約４８６〜６４４位のアミノ酸配列によって表されるセルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）を含んで成る。ＣＢＤは、ファミリー３ｂに属する。
【０１３７】
免疫学的特性：デンマークの企業ＤＡＫＯにて、１つのものに特異的なウサギポリクローナル血清が、高度に精製されたエンド−β−１，４−グルカナーゼに対して、常用の技術を用いて産生された。当該血清は、本発明のエンドグルカナーゼによって、アガロースゲル中で良好な単一の沈澱を形成した。
【表２】
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【表３】
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【表４】
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【配列表】
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