(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表配列番号５に記載の塩基配列からなるＤＮＡを含むことを特徴とするＥＳ細胞選択用プローブ。
【請求項２】
配列表配列番号１７に記載の塩基配列からなるＤＮＡを含むことを特徴とする、ＥＳ細胞選択用プローブ。
【請求項３】
以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのＤＮＡからなる遺伝子。
（ａ）配列表配列番号１７に記載の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列表配列番号１８に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
（ｃ）（ｂ）のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つＥＳ細胞特異的に発現する蛋白質をコードするＤＮＡ
【請求項４】
以下の（ａ）又は（ｂ）の蛋白質。
（ａ）配列表配列番号１８に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つＥＳ細胞特異的に発現する蛋白質
【請求項５】
請求項３記載の遺伝子を含む発現ベクター。
【請求項６】
請求項５記載の発現ベクターで形質転換された細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＥＳ細胞（embryonic stem cells）に特異的に発現しているＥＣＡＴ遺伝子（ES cell associated transcript gene）およびその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
胚性幹（ＥＳ）細胞は哺乳動物の早期胚より分離された細胞で、体内のすべての細胞に分化する能力、すなわち分化全能性を維持したまま、半永久的に増殖する。ＥＳ細胞は１９８１年にまずマウスで樹立され、ノックアウトマウスによる遺伝子機能解析という画期的な技術をもたらした。さらに、１９９８年にヒトＥＳ細胞の樹立が報告されてからは、再生医学への応用が大きく期待されるようになった。ＥＳ細胞から分化させた心筋や神経細胞を心筋梗塞や神経変性疾患の患者へ移植して機能回復を計ろうというものである。
【０００３】
白血病に対する骨髄移植に代表されるように細胞移植療法は既に実施されているが、十分な移植細胞の確保と拒絶反応の抑制という２つの課題を抱えている。半永久的に分裂するＥＳ細胞を用いると、十分な細胞の確保という問題を一気に解決できる。さらに体細胞クローン技術と組み合わせると、拒絶反応も克服することが可能である。患者の体細胞から作製したクローン胚からＥＳ細胞を樹立し移植に用いれば、患者と同じ遺伝子を持つため拒絶は起こり得ない。したがって、ＥＳ細胞は細胞移植療法における２つの課題をともに克服する可能性を持つ。
【０００４】
このように大きな可能性を秘めたＥＳ細胞であるが、ヒトＥＳ細胞はマウスのＥＳ細胞に比べて樹立と維持が困難であり、確実な樹立技術および培養技術の開発が必要である。さらにヒトＥＳ細胞を樹立するためには胚を犠牲にする必要がある。さらに体細胞クローン技術と組み合わせた場合は、クローン人間の作製に容易につながる。このような倫理的問題点を解決するために、分化全能性を持ったＥＳ様細胞を体細胞から胚を経ずに直接作り出す技術の開発が望まれている。
【０００５】
これらの技術開発において重要な役割を果たすのがＥＳ細胞等分化全能性細胞で特異的に発現する遺伝子（ES cell associated transcript gene、以下ＥＣＡＴ遺伝子）である。ＥＣＡＴ遺伝子は、細胞がＥＳ細胞であるかどうかのマーカーとなる。またＥＣＡＴ遺伝子のＥＳ細胞特異的発現を引き起こす調節領域と薬剤耐性遺伝子を組み合わせることにより、多種類の細胞の混合培養からＥＳ細胞を効率よく選択することができる（特表平９−５００００４号公報：特許文献１、対応米国特許第６１４６８８８号公報：特許文献２）。さらに体細胞においてＥＣＡＴ遺伝子を発現誘導することにより、ＥＳ様細胞への変換を促進させうる可能性もある。
【０００６】
これまでにＥＣＡＴ遺伝子として唯一報告されているのは転写因子Ｏｃｔ３（Ｏｃｔ４、ＰＯＵ５ｆ１とも呼ばれる。以下Ｏｃｔ−３／４という）遺伝子である。また、同様な遺伝子がヒトでも報告されているが（以下ｈＯｃｔ−３／４遺伝子という：Takeda et al., Nucleic Acids Res. 20: 4613-4620, 1992：非特許文献１、配列表配列番号３９）、ｈＯｃｔ−３／４遺伝子についてはＥＳ細胞特異的な発現を証明したという報告はない。Ｏｃｔ−３／４はＥＳ細胞やＥＧ細胞（embryonic germ cells）で特異的に発現する転写因子であり、細胞の分化に伴いその発現が消失する。そこでＥＳ細胞のマーカーとして利用されているし、またその遺伝子座にネオマイシン耐性遺伝子をノックインすることにより、ＥＳ細胞樹立の効率化が図られている（特表平９−５００００４号公報；対応米国特許第６１４６８８８号公報）。しかし、Ｏｃｔ−３／４は分化全能性細胞以外に栄養外胚葉細胞でも発現しているという報告（Biol Reprod 63: 1698-1705, 2000：非特許文献２）もあり、Ｏｃｔ−３／４遺伝子のみを指標とするとＥＳ細胞以外の細胞も選択してしまうことになる。この危険性を防ぐためには、ＥＣＡＴ遺伝子を複数同定し、それらを組み合わせて使用することが望ましい。
【０００７】
またＯｃｔ−３／４のみを体細胞で発現誘導してもＥＳ様細胞への変換は認められない。また、Ｏｃｔ−３／４を恒常的に発現させてもＬＩＦ（leukemia inhibitor factor、白血病阻止因子）除去に伴うＥＳ細胞の分化（原始内胚葉、原始外胚葉への分化）は抑制できない。それどころか、Ｏｃｔ−３／４の発現量を通常のレベルのわずか１．５倍程度増加させることによっても、逆にＬＩＦ除去の際と同様の分化が誘導されるという興味深い結果が報告されている（実験医学、１９、３３０−３３８、２００１年：非特許文献３）。このようにＯｃｔ−３／４の作用は単純ではなく、Ｏｃｔ−３／４のみを体細胞で発現させて、ＥＳ細胞へ誘導することは困難である。かかる点からも、複数のＥＣＡＴ遺伝子を組み合わせて、ＥＳ細胞を解析する必要があると考えられる。
【０００８】
しかしながら、Ｏｃｔ−３／４遺伝子以外にＥＣＡＴ遺伝子は見出されておらず、再生医学、ＥＳ細胞の細胞移植への応用という観点から、新たなＥＣＡＴ遺伝子の提供が強く求められていた。
【特許文献１】特表平９−５００００４号公報
【特許文献２】米国特許第６１４６８８８号公報
【非特許文献１】Takeda et al., Nucleic Acids Res. 20: 4613-4620, 1992
【非特許文献２】Biol Reprod 63: 1698-1705, 2000
【非特許文献３】実験医学、１９、３３０−３３８、２００１年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、新規なＥＣＡＴ遺伝子を提供することを目的とする。さらに詳しくは、本発明は、新たなＥＣＡＴ遺伝子およびそれがコードする遺伝子産物ペプチドを用いたＥＳ細胞のスクリーニング方法、ならびにＥＳ細胞選択用プローブを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、ＥＣＡＴの候補遺伝子を同定するためにＥＳＴ（Expressed Sequence tag）データベース（詳細は後述）を利用し、コンピューター解析による候補遺伝子の同定を行って１０遺伝子を同定した。この１０遺伝子のうち、８遺伝子に関してノザンブロットを行い、ＥＳ細胞ならびに１２種類の臓器（マウス）における発現を解析した。結果、８遺伝子全ての発現がＥＳ細胞に特異的であることがわかった。また、これらの遺伝子の発現はＥＳ細胞をレチノイン酸で刺激誘導する、すなわち分化誘導することにより速やかに消失することがわかった。以上の結果から本発明者らは、これらの８つの遺伝子がＥＣＡＴ遺伝子であることを見出して本発明を完成した。さらに残る２つのうち、１つの遺伝子についてもノザンブロット等を行い解析し、ＥＣＡＴ遺伝子であることがわかった。
【００１１】
さらに、ＥＣＡＴ遺伝子のヒト相同遺伝子（以下ｈＥＣＡＴ）を同定し、ＥＳ細胞ならびに１３種類の臓器（ヒト）における発現を解析した。
即ち本発明は下記の通りである。
（１）配列表配列番号１、３、４、５、６、７または８に記載の塩基配列からなるＤＮＡのいずれか一つを含むことを特徴とするＥＳ細胞選択用プローブ。
（２）配列表配列番号１、３、４、５、６、７または８に記載の塩基配列からなるＤＮＡのいずれか一つとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つＥＳ細胞に特異的に発現する蛋白質をコードするＤＮＡを含むことを特徴とするＥＳ細胞選択用プローブ。
（３）配列表配列番号１、３、４、５、６、７または８に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、且つＥＳ細胞に特異的に発現する蛋白質をコードするＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るＤＮＡを含むことを特徴とするＥＳ細胞選択用プローブ。
（４）配列表配列番号９、１３、１５、１７、１９、２１、２３または４１に記載の塩基配列からなるＤＮＡのいずれか一つを含むことを特徴とするＥＳ細胞選択用プローブ。
（５）配列表配列番号９、１３、１５、１７、１９、２１または２３に記載の塩基配列からなるＤＮＡのいずれか一つを含むことを特徴とする上記（４）記載のＥＳ細胞選択用プローブ。
（６）配列表配列番号９、１３、１５、１７、１９、２１、２３または４１に記載の塩基配列からなるＤＮＡのいずれか一つとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つＥＳ細胞に特異的に発現する蛋白質をコードするＤＮＡを含むことを特徴とするＥＳ細胞選択用プローブ。
（７）配列表配列番号９、１３、１５、１７、１９、２１または２３に記載の塩基配列からなるＤＮＡのいずれか一つとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つＥＳ細胞に特異的に発現する蛋白質をコードするＤＮＡを含むことを特徴とする上記（６）記載のＥＳ細胞選択用プローブ。
（８）配列表配列番号９、１３、１５、１７、１９、２１、２３または４１に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、且つＥＳ細胞に特異的に発現する蛋白質をコードするＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るＤＮＡを含むことを特徴とするＥＳ細胞選択用プローブ。
（９）配列表配列番号９、１３、１５、１７、１９、２１または２３に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、且つＥＳ細胞に特異的に発現する蛋白質をコードするＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るＤＮＡを含むことを特徴とする上記（８）記載のＥＳ細胞選択用プローブ。
（１０）マウスＥＳ細胞の選択用である、上記（１）〜（９）のいずれか一つに記載のＥＳ細胞選択用プローブ。
【００１２】
（１１）配列表配列番号２７、２９、３１、３３、３５、３７または４３に記載の塩基配列からなるＤＮＡのいずれか一つを含むことを特徴とするＥＳ細胞選択用プローブ。
（１２）配列表配列番号２７、２９、３１、３３、３５または３７に記載の塩基配列からなるＤＮＡのいずれか一つを含むことを特徴とする上記（１１）記載のＥＳ細胞選択用プローブ。
（１３）配列表配列番号２７、２９、３１、３３、３５、３７または４３に記載の塩基配列からなるＤＮＡのいずれか一つとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つＥＳ細胞に特異的に発現する蛋白質をコードするＤＮＡを含むことを特徴とするＥＳ細胞選択用プローブ。
（１４）配列表配列番号２７、２９、３１、３３、３５または３７に記載の塩基配列からなるＤＮＡのいずれか一つとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つＥＳ細胞に特異的に発現する蛋白質をコードするＤＮＡを含むことを特徴とする上記（１３）記載のＥＳ細胞選択用プローブ。
（１５）配列表配列番号２７、２９、３１、３３、３５、３７または４３に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、且つＥＳ細胞に特異的に発現する蛋白質をコードするＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るＤＮＡを含むことを特徴とするＥＳ細胞選択用プローブ。
（１６）配列表配列番号２７、２９、３１、３３、３５または３７に記載の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、且つＥＳ細胞に特異的に発現する蛋白質をコードするＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るＤＮＡを含むことを特徴とする上記（１５）記載のＥＳ細胞選択用プローブ。
（１７）ヒトＥＳ細胞の選択用である、上記（１１）〜（１６）のいずれか一つに記載のＥＳ細胞選択用プローブ。
（１８）以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのＤＮＡからなる遺伝子。
（ａ）配列表配列番号１７に記載の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）（ａ）の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つＥＳ細胞に特異的に発現する蛋白質をコードするＤＮＡ
（ｃ）（ａ）の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、且つＥＳ細胞に特異的に発現する蛋白質をコードするＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るＤＮＡ
（１９）以下の（ａ）または（ｂ）の蛋白質。
（ａ）配列表配列番号１８に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つＥＳ細胞特異的に発現する蛋白質
（２０）以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのＤＮＡからなる遺伝子。
（ａ）配列表配列番号２９に記載の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）（ａ）の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つＥＳ細胞に特異的に発現する蛋白質をコードするＤＮＡ
（ｃ）（ａ）の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、且つＥＳ細胞に特異的に発現する蛋白質をコードするＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るＤＮＡ
【００１３】
（２１）以下の（ａ）または（ｂ）の蛋白質。
（ａ）配列表配列番号３０に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つＥＳ細胞特異的に発現する蛋白質
（２２）以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのＤＮＡからなる遺伝子。
（ａ）配列表配列番号３３に記載の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）（ａ）の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つＥＳ細胞に特異的に発現する蛋白質をコードするＤＮＡ
（ｃ）（ａ）の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、且つＥＳ細胞に特異的に発現する蛋白質をコードするＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るＤＮＡ
（２３）以下の（ａ）または（ｂ）の蛋白質。
（ａ）配列表配列番号３４に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つＥＳ細胞特異的に発現する蛋白質
（２４）以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのＤＮＡからなる遺伝子。
（ａ）配列表配列番号３７に記載の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）（ａ）の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つＥＳ細胞に特異的に発現する蛋白質をコードするＤＮＡ
（ｃ）（ａ）の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、且つＥＳ細胞に特異的に発現する蛋白質をコードするＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るＤＮＡ
（２５）以下の（ａ）または（ｂ）の蛋白質。
（ａ）配列表配列番号３８に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つＥＳ細胞特異的に発現する蛋白質
（２６）配列表配列番号９、１３、１５、１７、１９、２１、２３または４１に記載される塩基配列からなるＤＮＡ、あるいは配列表配列番号１０、１４、１６、１８、２０、２２、２４または４２に記載されるアミノ酸配列からなる蛋白質の細胞内での発現状況を解析することを特徴とする、ＥＳ細胞のスクリーニング方法。
（２７）配列表配列番号９、１３、１５、１７、１９、２１または２３に記載される塩基配列からなるＤＮＡ、あるいは配列表配列番号１０、１４、１６、１８、２０、２２または２４に記載されるアミノ酸配列からなる蛋白質の細胞内での発現状況を解析することを特徴とする、上記（２６）記載のＥＳ細胞のスクリーニング方法。
（２８）さらに配列表配列番号１１に記載される塩基配列からなるＤＮＡ、あるいは配列表配列番号１２に記載されるアミノ酸配列からなる蛋白質の細胞内での発現状況を解析することを含む、上記（２６）または（２７）記載のＥＳ細胞のスクリーニング方法。
（２９）さらに配列表配列番号２５に記載される塩基配列からなるＤＮＡ、あるいは配列表配列番号２６に記載されるアミノ酸配列からなる蛋白質の細胞内での発現状況を解析することを含む、上記（２６）〜（２８）のいずれか一つに記載のＥＳ細胞のスクリーニング方法。
（３０）配列表配列番号２７、２９、３１、３３、３５、３７または４３に記載される塩基配列からなるＤＮＡ、あるいは配列表配列番号２８、３０、３２、３４、３６、３８または４４に記載されるアミノ酸配列からなる蛋白質の細胞内での発現状況を解析することを特徴とする、ＥＳ細胞のスクリーニング方法。
【００１４】
（３１）配列表配列番号２７、２９、３１、３３、３５または３７に記載される塩基配列からなるＤＮＡ、あるいは配列表配列番号２８、３０、３２、３４、３６または３８に記載されるアミノ酸配列からなる蛋白質の細胞内での発現状況を解析することを特徴とする、上記（３０）記載のＥＳ細胞のスクリーニング方法。
（３２）さらに配列表配列番号３９に記載される塩基配列からなるＤＮＡ、あるいは配列表配列番号４０に記載されるアミノ酸配列からなる蛋白質の細胞内での発現状況を解析することを含む、上記（３０）または（３１）記載のＥＳ細胞のスクリーニング方法。
（３３）配列表配列番号９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３または４１、若しくは配列表配列番号２７、２９、３１、３３、３５、３７または４３に記載の塩基配列において繰り返し配列を含まない連続する２０塩基以上の部分配列からなり、且つＥＳ細胞に特異的に発現する遺伝子に特異的な配列を有するＤＮＡを含むことを特徴とするＥＳ細胞選択用プローブ。
（３４）上記（１）〜（１７）および（３３）のいずれか一つに記載のＥＳ細胞選択用プローブを用いて、ＥＳ細胞に特異的に発現する遺伝子の発現状況を解析することを含む、ＥＳ細胞のスクリーニング方法。
（３５）さらに配列表配列番号２または１１に記載の塩基配列からなるＤＮＡを含むＥＳ細胞選択用プローブを用いることを特徴とする、上記（３４）記載のＥＳ細胞のスクリーニング方法。
（３６）さらに配列表配列番号２５に記載の塩基配列からなるＤＮＡを含むＥＳ細胞選択用プローブを用いることを特徴とする、上記（３４）または（３５）記載のＥＳ細胞のスクリーニング方法。
（３７）さらに配列表配列番号２７に記載の塩基配列からなるＤＮＡを含むＥＳ細胞選択用プローブを用いることを特徴とする、上記（３４）記載のＥＳ細胞のスクリーニング方法。
（３８）さらに配列表配列番号３９に記載の塩基配列からなるＤＮＡを含むＥＳ細胞選択用プローブを用いることを特徴とする、上記（３４）または（３５）記載のＥＳ細胞のスクリーニング方法。
【００１５】
さらに本発明は、ＥＳ細胞に特異的に発現する遺伝子あるいはＥＳ細胞に特異的に発現する蛋白質をコードするＤＮＡを有する組換えベクター、特に分化抑制遺伝子強制発現用のベクター、ならびに当該ベクターで形質転換された形質転換細胞に関する。
【００１６】
さらに本発明は、ＥＳ細胞に特異的に発現する遺伝子あるいはＥＳ細胞に特異的に発現する蛋白質をコードするＤＮＡを含むゲノムＤＮＡ断片に薬剤耐性遺伝子等の選択用遺伝子を組み込んだ組換えベクター、特にＥＳ細胞選択用ベクター、ならびに当該ベクターで形質転換された形質転換細胞に関する。
【発明の効果】
【００１７】
本発明により、マウスＥＳ細胞において特異的に発現しているＥＣＡＴ遺伝子を９種新たに提供し得る。さらにこれらのうち７種の対応するヒトＥＣＡＴ遺伝子が提供される。更に、これらのＥＣＡＴ遺伝子あるいはその断片を組み合わせることにより、ＥＳ細胞の選択的細胞マーカーの取得が可能となる。さらには、薬剤耐性遺伝子との組み合わせによるＥＳ細胞の選択方法、体細胞からのＥＳ細胞様細胞への誘導の試み等において、Ｏｃｔ−３／４遺伝子あるいはその断片を単独で用いる場合よりも効果的であり、再生医療等の現場で有用であると考えられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明は、ＥＳ細胞に特異的に発現する遺伝子（以下、ＥＳ細胞特異的発現遺伝子ともいう）、即ちＥＣＡＴ遺伝子に関する。ＥＣＡＴ遺伝子の発現の有無を指標にしてＥＳ細胞であるかどうかを判断することが可能である。本発明は、このようなＥＳ細胞の当否を判断するのに好適なＥＳ細胞選択用プローブを提供する。このプローブとして、具体的には配列表配列番号１乃至８のいずれかに記載される塩基配列からなるＤＮＡ、配列表配列番号９に記載される塩基配列からなるＤＮＡ（以下ＥＣＡＴ１遺伝子）、配列表配列番号１１に記載される塩基配列からなるＤＮＡ（以下ＥＣＡＴ２遺伝子）、配列表配列番号１３に記載される塩基配列からなるＤＮＡ（以下ＥＣＡＴ３遺伝子）、配列表配列番号１５に記載される塩基配列からなるＤＮＡ（以下ＥＣＡＴ４遺伝子）、配列表配列番号１７に記載される塩基配列からなるＤＮＡ（以下ＥＣＡＴ５遺伝子）、配列表配列番号１９に記載される塩基配列からなるＤＮＡ（以下ＥＣＡＴ６遺伝子）、配列表配列番号２１に記載される塩基配列からなるＤＮＡ（以下ＥＣＡＴ７遺伝子）、配列表配列番号２３に記載される塩基配列からなるＤＮＡ（以下ＥＣＡＴ８遺伝子）または配列表配列番号４１に記載される塩基配列からなるＤＮＡ（以下ＥＣＡＴ９遺伝子）を含むポリヌクレオチドが例示される。さらに、本発明においては、ＥＳ細胞選択用プローブはＥＣＡＴ遺伝子の発現の有無を確認するという目的を達成し得るものであればいかなるものでもよく、上記の塩基配列に置換、欠失または付加等の修飾を受けていてもよい。具体的にはＥＣＡＴ遺伝子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし且つＥＳ細胞に特異的に発現する蛋白質をコードするＤＮＡを含むポリヌクレオチド、あるいはＥＣＡＴ遺伝子の塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり且つＥＳ細胞に特異的に発現する蛋白質をコードするＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るＤＮＡを含むポリヌクレオチドも、本発明においてＥＳ細胞選択用プローブとして好適に使用できる。具体的には、配列表配列番号２７に記載される塩基配列からなるＤＮＡ（以下ｈＥＣＡＴ２遺伝子）、配列表配列番号２９に記載される塩基配列からなるＤＮＡ（以下ｈＥＣＡＴ３遺伝子）、配列表配列番号３１に記載される塩基配列からなるＤＮＡ（以下ｈＥＣＡＴ４遺伝子）、配列表配列番号３３に記載される塩基配列からなるＤＮＡ（以下ｈＥＣＡＴ５遺伝子）、配列表配列番号３５に記載される塩基配列からなるＤＮＡ（以下ｈＥＣＡＴ７遺伝子）、配列表配列番号３７に記載される塩基配列からなるＤＮＡ（以下ｈＥＣＡＴ８遺伝子）または配列表配列番号４３に記載される塩基配列からなるＤＮＡ（以下ｈＥＣＡＴ９遺伝子）を含むポリヌクレオチドが例示される。
【００１９】
また、配列表配列番号２５に記載される塩基配列からなるＤＮＡ、すなわちＯｃｔ−３／４をコードするＤＮＡ、あるいは配列表配列番号３９に記載される塩基配列からなるＤＮＡ、すなわちｈＯｃｔ−３／４をコードするＤＮＡを含むポリヌクレオチドも、ＥＳ細胞選択用プローブとして使用することができる。上述のようにＯｃｔ−３／４遺伝子は栄養外胚葉細胞でも発現しているという報告があるので、好ましくはＯｃｔ−３／４遺伝子あるいはｈＯｃｔ−３／４遺伝子以外のＥＣＡＴ遺伝子を含むポリヌクレオチド等の、本発明の新規ＥＳ細胞選択用プローブを併用することが好ましい。また、上記ＥＣＡＴ遺伝子を含む新規ＥＳ細胞選択用プローブであっても、より正確にＥＳ細胞であるかどうかを判断するためには数種類のプローブを併用することが好ましい。
【００２０】
本明細書中、「ストリンジェントな条件」とは、塩基配列において約７０％以上、好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上の相同性を有するＤＮＡがハイブリダイズし得る条件をいい、ストリンジェンシーはハイブリダイズ反応や洗浄の際の温度、塩濃度等を適宜変化させることにより調節することができる。より好適な条件は９５％以上の相同性を有するＤＮＡがハイブリダイズし得る条件である。
ＥＣＡＴ２遺伝子は、ＥＣ細胞をレチノイン酸で刺激した時に発現が減少する遺伝子ｐＨ３４として報告され（Differentiation 46:61-67, 1991）、また理化学研究所のデータベースによればＥＳＧ（ES cell specific gene）１として記載されている。また、ＥＣＡＴ３遺伝子はＦボックスを有するマウス蛋白質をコードする遺伝子であり、その発現が精巣と卵巣で認められているものとして報告されている（Current Biology 9:1180-1182, 1999）。また、ＥＣＡＴ７遺伝子はＤＮＡメチル化を行うＤＮＭＴ３に似た蛋白質ＤＮＭＴ３Ｌとして報告されている（Genomics 65:293-298, 2000）。ＥＣＡＴ９遺伝子は、ＧＤＦ３とよばれる増殖因子として、マウスではJones CM et al., Mol Endocrinol. 6: 1961-1968, 1992に、ヒトではCaricasole et al., Oncogene 16: 95-103, 1998に報告されている。ＥＳ細胞特異的発現の報告はない。ＥＣＡＴ４遺伝子、ＥＣＡＴ５遺伝子およびＥＣＡＴ６遺伝子に関しては、文献上報告はないが蛋白質データベースの検索により、ＥＣＡＴ４遺伝子がホメオボックスを有していること、ＥＣＡＴ５遺伝子が癌遺伝子Ｈ−Ｒａｓに相同性を有していること、ＥＣＡＴ６遺伝子がケラチンに類似していることが明らかとなった。また、ＥＣＡＴ５遺伝子はその部分配列が知られてはいるもののｃＤＮＡ配列そのものならびに当該ＤＮＡ配列がコードする蛋白質のアミノ酸配列は未だ決定されていなかった。従って、本発明はＥＣＡＴ５遺伝子ならびにＥＣＡＴ５蛋白質、およびそれらと極めて相同性の高い遺伝子ならびに同様の挙動を示す蛋白質を提供する。
【００２１】
ここで「極めて相同性の高い遺伝子」とは、具体的にはＥＣＡＴ５遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子を意味し、この要件を満たせばＥＣＡＴ５遺伝子の塩基配列（配列表配列番号１７）において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されていてもよい。具体的にはＥＣＡＴ５遺伝子と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、特に好ましくは９５％以上の相同性を有する遺伝子である。また、「同様の挙動を示す蛋白質」とは、ＥＳ細胞に特異的に発現するというＥＣＡＴ５蛋白質の特徴を有する蛋白質を意味し、その要件を満たせばＥＣＡＴ５蛋白質のアミノ酸配列（配列表配列番号１８）において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されていてもよい。
【００２２】
さらに、本発明のＥＳ細胞選択用プローブには、各種ＥＣＡＴ遺伝子、ｈＥＣＡＴ遺伝子の配列を基に構築される、配列表配列番号９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３または４１、配列表配列番号２７、２９、３１、３３、３５、３７または４３に記載の塩基配列において繰り返し配列を含まない連続する２０塩基以上の部分配列からなるＤＮＡ断片が包含される。該ＤＮＡ断片は、ＥＣＡＴ遺伝子あるいはｈＥＣＡＴ遺伝子とハイブリダイズし得るものであれば特に限定されないが、具体的には、各配列表配列番号の塩基配列中、少なくとも検出を目的とする各種のＥＣＡＴ遺伝子あるいはｈＥＣＡＴ遺伝子に特異的な配列を含み、繰り返し配列のみで構成されることのない、通常約２０塩基以上、好ましくは約１００塩基以上、より好ましくは約２００塩基以上の連続した部分配列を有するＤＮＡ断片である。これらの好適な例としては、配列表配列番号１乃至８に記載のＤＮＡ断片が挙げられる。
【００２３】
上述した９種のマウスＥＣＡＴ遺伝子のうちＥＣＡＴ２遺伝子、ＥＣＡＴ３遺伝子、ＥＣＡＴ４遺伝子、ＥＣＡＴ５遺伝子、ＥＣＡＴ７遺伝子、ＥＣＡＴ８遺伝子およびＥＣＡＴ９遺伝子の７種について対応するヒトＥＣＡＴ遺伝子が存在することがわかった（後述：それぞれｈＥＣＡＴ２遺伝子、ｈＥＣＡＴ３遺伝子、ｈＥＣＡＴ４遺伝子、ｈＥＣＡＴ５遺伝子、ｈＥＣＡＴ７遺伝子、ｈＥＣＡＴ８遺伝子、およびｈＥＣＡＴ９遺伝子）。そのうち、ｈＥＣＡＴ３、ｈＥＣＡＴ５およびｈＥＣＡＴ８の遺伝子についてはその塩基配列ならびに当該塩基配列がコードする蛋白質のアミノ酸配列については未だ決定されていなかった。従って、本発明はｈＥＣＡＴ３、ｈＥＣＡＴ５およびｈＥＣＡＴ８の遺伝子ならびに蛋白質、およびそれらと極めて相同性の高い遺伝子ならびに同様の挙動を示す蛋白質を提供する。
【００２４】
ここで「極めて相同性の高い遺伝子」および「同様の挙動を示す蛋白質」とは、具体的にはｈＥＣＡＴ３、ｈＥＣＡＴ５またはｈＥＣＡＴ８の遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子を意味し、この要件を満たせばｈＥＣＡＴ３、ｈＥＣＡＴ５またはｈＥＣＡＴ８の遺伝子の塩基配列（それぞれ配列表配列番号２９、配列表配列番号３３、配列表配列番号３７）において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されていてもよい。具体的にはそれらの遺伝子と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、特に好ましくは９５％以上の相同性を有する遺伝子である。また、「同様の挙動を示す蛋白質」とは、ｈＥＣＡＴ３蛋白質、ｈＥＣＡＴ５蛋白質またはｈＥＣＡＴ８蛋白質の特徴を有する蛋白質を意味し、その要件を満たせばｈＥＣＡＴ３蛋白質、ｈＥＣＡＴ５蛋白質またはｈＥＣＡＴ８蛋白質のアミノ酸配列（それぞれ配列表配列番号３０、配列表配列番号３４、配列表配列番号３８）において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されていてもよい。
【００２５】
本発明のプローブは、当分野で公知の手法により調製することができる。例えば、本プローブは、対応するＥＣＡＴ遺伝子のＥＳＴを制限酵素で切断し単離したＤＮＡ、ゲノムＤＮＡやＥＳ細胞由来のｍＲＮＡから調製される相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を鋳型としてＰＣＲ法により増幅させて得られるＤＮＡ、さらに化学的に合成されるＤＮＡ、およびこれらの方法を適当に組み合わせて構築されるＤＮＡとして調製することができる。
【００２６】
本発明は、ＥＳ細胞に特異的に発現する遺伝子の発現状況を解析することを特徴とするＥＳ細胞のスクリーニング方法を提供する。ここで、「ＥＳ細胞に特異的に発現する遺伝子」は、上述のＥＣＡＴ遺伝子あるいはｈＥＣＡＴ遺伝子と同義であり、具体的にはＥＣＡＴ１遺伝子、ＥＣＡＴ２遺伝子、ＥＣＡＴ３遺伝子、ＥＣＡＴ４遺伝子、ＥＣＡＴ５遺伝子、ＥＣＡＴ６遺伝子、ＥＣＡＴ７遺伝子、ＥＣＡＴ８遺伝子、ＥＣＡＴ９遺伝子、ｈＥＣＡＴ２遺伝子、ｈＥＣＡＴ３遺伝子、ｈＥＣＡＴ４遺伝子、ｈＥＣＡＴ５遺伝子、ｈＥＣＡＴ７遺伝子、ｈＥＣＡＴ８遺伝子およびｈＥＣＡＴ９遺伝子、ならびにＯｃｔ−３／４遺伝子およびｈＯｃｔ−３／４遺伝子等が挙げられる。
【００２７】
本発明においてＥＳ細胞のスクリーニングは、ＥＳ細胞特異的発現遺伝子あるいはそれらがコードするＥＳ細胞特異的発現蛋白質の発現状況を解析することにより実施される。遺伝子レベルで発現状況を解析するには、上述のＥＳ細胞選択用プローブを用いることができる。また、上述のようにＯｃｔ−３／４をコードするＤＮＡを含むポリヌクレオチドからなるプローブも併用することが好ましい。このようなプローブは蛍光物質、酵素やラジオアイソトープ等で標識されていてもよい。また、蛋白質レベルで発現状況を解析するには、上記ＥＳ細胞特異的発現蛋白質に特異的な親和性を有する物質、例えば抗体を用いて、細胞内での当該蛋白質の発現を知ることができる。より具体的には、イムノブロットや免疫沈降法等、当分野で通常実施される抗原抗体反応を利用した方法が用いられる。ここで該抗体は、当該蛋白質と特異的に結合可能なものであれば特に限定されず、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体およびそれらの機能的断片のいずれであってもよい。これらの抗体またはその断片は、蛍光物質、酵素やラジオアイソトープ等で標識されていてもよい。
【００２８】
さらに、これらは市販されているものを用いても良く、また常法に従って適宜調製することができる。
【００２９】
本発明はまた、上記いずれかのＥＳ細胞特異的発現遺伝子あるいはＥＳ細胞特異的発現蛋白質をコードする遺伝子を含む発現ベクターに関する。ここで、ＥＳ細胞特異的発現遺伝子とは上述のとおりであり、またＥＳ細胞特異的発現蛋白質をコードする遺伝子とは具体的にはＥＣＡＴ１（配列表配列番号１０）をコードする遺伝子、ＥＣＡＴ２（配列表配列番号１２）またはｈＥＣＡＴ２（配列表配列番号２８）をコードする遺伝子、ＥＣＡＴ３（配列表配列番号１４）またはｈＥＣＡＴ３（配列表配列番号３０）をコードする遺伝子、ＥＣＡＴ４（配列表配列番号１６）またはｈＥＣＡＴ４（配列表配列番号３２）をコードする遺伝子、ＥＣＡＴ５（配列表配列番号１８）またはｈＥＣＡＴ５（配列表配列番号３４）をコードする遺伝子、ＥＣＡＴ６（配列表配列番号２０）をコードする遺伝子、ＥＣＡＴ７（配列表配列番号２２）またはｈＥＣＡＴ７（配列表配列番号３６）をコードする遺伝子、ＥＣＡＴ８（配列表配列番号２４）またはｈＥＣＡＴ８（配列表配列番号３８）をコードする遺伝子およびＥＣＡＴ９（配列表配列番号４２）またはｈＥＣＡＴ９（配列表配列番号４４）をコードする遺伝子が挙げられる。かかる発現ベクターは、中に含められる遺伝子の性質上、当該ベクターが細胞内、特にＥＳ細胞内で発現することにより分化を抑制する機能を有することが好ましい。即ち分化抑制遺伝子を強制発現するベクターである（以下、分化抑制遺伝子強制発現用ベクターともいう）。本発明の発現ベクターは、各種動物細胞内で複製保持または自律増殖でき、且つＥＳ細胞特異的発現遺伝子を発現しうるものであれば特に限定されず、ウイルスベクターやプラスミドベクター等が包含される。当該発現ベクターは、通常の遺伝子工学的手法に基づき、例えばMolecular cloning 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)等の基本書に従い作製することができる。好ましくはウイルスベクターであり、例えばレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シルビスウイルス等のＤＮＡウイルス又はＲＮＡウイルスにＥＳ細胞特異的発現遺伝子等を組み込んで作製する。また、必要に応じて、所望のプロモーター領域や薬剤耐性遺伝子領域、発現調節領域を導入することも可能である。
【００３０】
本発明の発現ベクターの細胞内への導入は、トランスフェクション、リポフェクション、マイクロインジェクション、衝撃ミサイル、エレクトロポレーション法等従来公知の方法によって行われる。
【００３１】
作製された本発明の発現ベクターが宿主細胞に組み込まれて発現しているか否かは、例えば導入されたＥＣＡＴ遺伝子が発現して産生する蛋白質（ポリペプチド）の量を、例えばＥＬＩＳＡ法等で測定することによって確認することができる。
【００３２】
さらにＥＣＡＴ遺伝子はＥＳ細胞であるかどうかを決定するためのプローブとしての利用に加え、ＥＳ細胞と他種類の細胞の混合物からＥＳ細胞を選択的に分離することにも利用できる。本発明者らは、各ＥＣＡＴ遺伝子の蛋白質翻訳領域に薬剤選択遺伝子をノックインするためのターゲッティングベクターを作成し、当該ベクターを用いて相同組換えをおこしたＥＳ細胞を樹立した。具体的には、特表平９−５００００４号公報（対応米国特許第６１４６８８８号公報）に記載の手法に準じて行った。例えばＥＣＡＴ３遺伝子、ＥＣＡＴ４遺伝子またはＥＣＡＴ５遺伝子にネオマイシン耐性遺伝子をノックインした細胞をＧ４１８存在下に培養すると、選択された細胞に分化細胞は全く認められなかった。かかる結果はＥＣＡＴ遺伝子がＥＳ細胞の選択的分離に利用できることを示唆するものである。より確実にＥＳ細胞のみを選択するためには、異なるＥＣＡＴ遺伝子を組み込んだ複数種のベクターを用いて相同組換えを行うことが好ましい。
【実施例】
【００３３】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。
実施例１  マウスＥＣＡＴ遺伝子の同定
（１）コンピューター解析による候補遺伝子の同定
（手順）
ＥＣＡＴの候補遺伝子を同定するためにＥＳＴデータベースを利用した。ＥＳＴは各種細胞や臓器由来のｃＤＮＡライブラリーから多数のｃＤＮＡクローンを無作為に抽出し、その５’または３’断端部の配列を１反応だけ解析し、公共データベースに登録したものである。ＥＳＴは各細胞、臓器で発現している遺伝子のカタログであるといえる。マウス由来のもので１００万クローン以上、マウスＥＳ細胞由来のものだけでも３万クローン以上が登録されている。
ＥＳＴデータベースとしてはＵｎｉｇｅｎｅを使用した。ＵｎｉｇｅｎｅはＥＳＴの中で同じ遺伝子に由来すると考えられるものをクラスタリングしたものであり、２００１年３月５日現在、マウスＥＳＴデータベースにおいては７９９１７セットが報告されている。各セットは少なくとも１つのＥＳＴもしくは既知遺伝子からなる。
解析の手法としては、Digital differential display法を使用した。この方法は、指定した細胞や臓器のライブラリーにおける各セットの存在頻度、すなわち各セットに含まれるＥＳＴクローン数をそのライブラリー由来の全ＥＳＴ登録数で割ったものを算出し、異なる細胞や臓器間での発現頻度を調べる方法である。
Digital differential display法により次に示す５つの細胞や臓器由来のライブラリー群における遺伝子発現頻度解析を行った。各群の括弧内の数字は解析したクローン数を示している。１群から５群までは該当するライブラリーをすべて解析した。６群はデーター数が膨大であるため、全身の臓器、細胞を可及的に含むように抽出した２３ライブラリーを解析した。
１群  １細胞期よりブラストシストまでの受精卵（４９０５０クローン）
２群  ＥＳ細胞またはEmbryonic carcinoma細胞（３２２７７クローン）
３群  受精後８．５日までの胎児（４６７２８クローン）
４群  受精後９日以降の胎児（１２８８８２クローン）
５群  精巣（６５６８５クローン）
６群  その他の細胞、組織（２７２４６０クローン）
Digital differential display法により受精卵とＥＳ細胞等の全能性細胞で特異的に発現することが予想されたセットについては、マウス由来のＥＳＴデータベースをＢｌａｓｔＮにて検索し、全能性細胞由来のライブラリーでのみＥＳＴが存在するかどうかを検討した。
使用したデータベースおよび解析プログラムのＵＲＬは以下の通りである。
Unigene Mouse Sequence Collection
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/Mm.Home.html
Digital differential display
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/ddd.cgi?ORG=Mm
Blast search
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/
（結果）
Digital differential display法による解析とＢｌａｓｔＮによるＥＳＴデータベース検索の結果の候補として１０個の遺伝子を同定した。これらの遺伝子のＥＳＴは受精卵とＥＳ細胞において高頻度に存在するが、第６群のその他の細胞や組織では認められない。胎児や精巣由来のライブラリーにＥＳＴが含まれる遺伝子も存在したが、これは分化全能性細胞である始原生殖細胞や精母細胞に由来する可能性が高いので、ＥＣＡＴ遺伝子の候補に含めた。一方Ｏｃｔ−３／４遺伝子は受精卵とＥＳ細胞で高頻度に存在するが、その他の細胞や臓器でも少数であるが含まれていた。候補のうち８遺伝子について、マウス由来のＥＳＴデータベースをＢｌａｓｔＮにて検索した結果を表１に示す（ＥＣＡＴ１〜８）。
同様にして残る２つの遺伝子のうち、１つの遺伝子（ＥＣＡＴ９）についても解析をすすめた。結果を表１に示す。
【００３４】
【表１】
0004829272.tif 000002
【００３５】
（２）ノザンブロット解析
（手順）
コンピューター解析により同定された候補遺伝子について、実際にＥＳ細胞特異的に発現しているかどうかをノザンブロットにより解析した。未分化ＥＳ細胞およびレチノイン酸で５日間分化誘導したＥＳ細胞よりライフテックオリエンタル社のＴｒｉｚｏｌを用いて全ＲＮＡを抽出した。成体マウスの各種臓器由来のＲＮＡはサワデーテクノロジーより購入した。全ＲＮＡ（５μｇ）をホルマリンアガロースゲルにより分離後、ナイロンメンブランにトランスファーし、ＵＶクロスリンクにより固定した。目的遺伝子のＥＳＴが購入可能な場合は同ＤＮＡをプローブとして用いた。ＥＳＴが入手不可能な場合は、ＰＣＲにて各ＥＣＡＴに特異的なＤＮＡ断片を増幅し、プローブとして用いた。具体的には以下のプローブを用いてＯｃｔ−３／４、ＥＣＡＴ１、ＥＣＡＴ２、ＥＣＡＴ３、ＥＣＡＴ４、ＥＣＡＴ５、ＥＣＡＴ６、ＥＣＡＴ７およびＥＣＡＴ８の発現を調べた。さらにＥＣＡＴ９の発現についても調べた。
Ｏｃｔ−３／４：プラスミドＣ１ in ＢＳ ＫＳ（Cell 60:461-472, 1990）をＥｃｏＲＩで切り出して調製した配列表配列番号２５に記載の配列を含むＤＮＡ断片。
ＥＣＡＴ１：Ｍｍ．３１０５４ＥＳＴ（＃ＡＩ４６７１２８）をＳａｌＩ／ＮｏｔＩで切り出して調製した配列表配列番号１に記載の配列を含むＤＮＡ断片。
ＥＣＡＴ２：ｐＨ３４ＥＳＴ（＃ＡＡ４７３３６６）をＳａｌＩ／ＮｏｔＩで切り出して調製した配列表配列番号２に記載の配列を含むＤＮＡ断片。
ＥＣＡＴ３：ＦＢＸ１５ＥＳＴ（＃ＡＡ５７１６８０）をＳａｌＩ／ＮｏｔＩで切り出して調製した配列表配列番号３に記載の配列を含むＤＮＡ断片。
ＥＣＡＴ４：ホメオボックスコーディング領域をゲートウェイ用にＰＣＲで増幅しＴＡクローニングしたプラスミドからＥｃｏＲＩで切り出して調製した配列表配列番号４に記載の配列を含むＤＮＡ断片。
ＥＣＡＴ５：Ｅ−ＲａｓＳ１１８／ＲＡＣＥ１１でＲＴ−ＰＣＲしたものをＴＡクローニングしたプラスミドからＥｃｏＲＩで切り出して調製した配列表配列番号５に記載の配列を含むＤＮＡ断片。
ＥＣＡＴ６：ケラチン−ＥＰＣＲ産物（４８９２７Ｓ／４８９２７ＡＳ）である配列表配列番号６に記載の配列を含むＤＮＡ断片。
ＥＣＡＴ７：ＤＮＭＴ３ＬＥＳＴクローン（ＡＡ８９５７７０，ｐＢＳＳＫ−ｄｎｍｔ３１）からＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩで切り出して調製した配列表配列番号７に記載の配列を含むＤＮＡ断片。
ＥＣＡＴ８：Ｍｍ．７７０１０ＲＡＣＥ産物をＴＡクローニングしたプラスミドからＥｃｏＲＩで切り出して調製した配列表配列番号８に記載の配列を含むＤＮＡ断片。
ＥＣＡＴ９：ＧＤＦ３(Jones CM. et al., 上述)を参考にして調製された配列表配列番号４１に記載の配列を含むＤＮＡ断片。
プローブの32Ｐ−ｄＣＴＰによる標識は、アマシャムファルマシア社のメガラベリングキットを用いて行った。ハイブリダイゼーションはフナコシ社のＱｕｉｃｋｈｙｂを用いて行った。洗浄後のシグナル解析は富士フィルム社のＢＡＳ５０００を用いて行った。
（結果）
コンピューター検索にて同定された１０遺伝子のうち、これまでに９遺伝子に関してノザンブロットを行い、ＥＳ細胞および１２種類の臓器における発現を解析した。即ちＥＳ細胞と成体マウスの１２種類の臓器における各ＥＣＡＴ遺伝子の発現をノザンブロットにより解析した結果を図１に示す。
９遺伝子に関する全ての発現がＥＳ細胞に特異的であることがわかった。精巣でも若干の発現が認められるものもあるが、精母細胞に由来すると考えられた。またこれらの遺伝子の発現はＥＳ細胞をレチノイン酸で刺激誘導するとすみやかに消失することがわかった。これらの結果から９遺伝子はＥＣＡＴ遺伝子であると考えられた。
【００３６】
（３）ＥＣＡＴ遺伝子の解析
ＥＣＡＴ遺伝子が未知遺伝子である場合全長ｃＤＮＡの同定はライフテックオリエンタル社の５’ＲＡＣＥシステム、バージョン２を使ったＲＡＣＥ（Rapid Amplification of cDNA Ends）法を用いて行った。理研マウス完全長ｃＤＮＡデータベースの検索はＵＲＬ（http://genome.gsc.riken.go.jp/）において行った。
【００３７】
実施例２  取得ＥＣＡＴ遺伝子の公知状況解析
（１）Ｂｌａｓｔ検索
ノザンブロットの結果ＥＣＡＴ遺伝子であることが確認された８遺伝子のＥＳＴ配列をＢｌａｓｔで検索した結果、３遺伝子に関しては既に配列が論文として報告されていた。ＥＣＡＴ２遺伝子はＥＣ細胞をレチノイン酸で刺激した時に発現が減少する遺伝子ｐＨ３４として報告されていた。ＥＣＡＴ４遺伝子はＦボックスを有するマウス蛋白質で、発現が精巣と卵巣でのみ認められるものとして報告されていた。ＥＣＡＴ７遺伝子はＤＮＡメチル化を行うＤＮＭＴ３に似た蛋白質ＤＮＭＴ３Ｌとして報告されていた。ＲＡＣＥ法によりｃＤＮＡ全長の同定を試みた結果、ＥＣＡＴ４遺伝子、ＥＣＡＴ５遺伝子、ＥＣＡＴ６遺伝子について翻訳領域を同定した。予想されるアミノ酸配列をＢｌａｓｔＰで検索した結果、ＥＣＡＴ４遺伝子はホメオボックスを有していること、ＥＣＡＴ５遺伝子は癌遺伝子Ｈ−Ｒａｓに相同性を有していること、ＥＣＡＴ６遺伝子はケラチンに類似していることがわかった。また、あらたにＥＣＡＴ遺伝子であることが確認されたＥＣＡＴ９遺伝子はＧＤＦ３とよばれる増殖因子であることがわかった。
（２）理研マウスｃＤＮＡデータベースの検索
２００１年２月に理研より公開されたマウス全長ｃＤＮＡデータベースを検索した結果、ＥＣＡＴ５遺伝子を除く８遺伝子はｃＤＮＡの全長が公開されていた。ＥＣＡＴ５遺伝子はデータベースに含まれていなかった。またＥＣＡＴ２遺伝子は理研のデータベースにおいてES cell specific gene (ＥＳＧ)１として記載されているが、他の８遺伝子に関してはＥＳ細胞での発現に関する情報は無かった。
【００３８】
実施例３  ヒトＥＣＡＴ遺伝子の同定
（１）ヒトゲノムＤＮＡおよびヒト蛋白質データベースのＢｌａｓｔ検索
Ｂｌａｓｔ検索した結果、ＥＣＡＴ２〜５、７、８遺伝子においてはアミノ酸配列が５０％以上一致するオルソログが存在することがわかった。また、ＥＣＡＴ９遺伝子についてもｈＧＤＦ３（Caricasole et al., 上述）としてｈＥＣＡＴ９遺伝子が存在する。ＥＣＡＴ１遺伝子とＥＣＡＴ６遺伝子に関してはヒトのオルソログは同定できなかった。
ＢｌａｓｔＰ検索の結果、ｈＥＣＡＴ３遺伝子、ｈＥＣＡＴ５遺伝子、ｈＥＣＡＴ８遺伝子の３遺伝子についてはhypothetical proteinを含め塩基配列およびアミノ酸配列ともに公開されていなかった。
【００３９】
実施例４  ヒト相同遺伝子の発現確認
霊長類におけるＥＣＡＴ遺伝子のＥＳ細胞特異的な発現を確認した。
ヒト成人の１３種類の臓器に由来する各全ＲＮＡ（サワデーテクノロジーあるいはフナコシより購入）、ヒト間葉系幹細胞（タカラより購入）由来の全ＲＮＡ、およびサルＥＳ細胞（未分化ならびにレチノイン酸により分化誘導されたもの、京都大学再生医学研究所の中辻教授提供）由来の全ＲＮＡをノザンブロット法により解析した。ｈＥＣＡＴ２，４，７，８，９およびｈＯｃｔ３／４に相当するＥＳＴクローンの全長ｃＤＮＡをプローブとして用いた。ハイブリダイゼーションは上記実施例１のマウスＥＣＡＴの解析と同様の手法で行ったが、ヒトプローブでサルＲＮＡを検出できるよう、反応や洗浄温度は低く（５０℃）設定した。その結果、すべての遺伝子について未分化ＥＳ細胞において強いシグナルを認めた（図２）。ＥＳ細胞の分化にともない、シグナルは著しく減弱した。その他の臓器（細胞）においてスメア状の薄いシグナルが認められたが、これは反応および洗浄温度を下げたことにより生じた非特異的なものであると考えられる。以上の結果から、ＥＣＡＴ遺伝子はマウスだけではなく霊長類のＥＳ細胞においても選択的に発現しており、そのマーカー遺伝子として利用できることが確認された。
本出願は、日本で出願された特願２００１−１６５９２７を基礎としておりそれらの内容は本明細書に全て包含されるものである。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】図１は、ＥＳ細胞と成体マウスの１２種類の臓器における各ＥＣＡＴ遺伝子の発現をノザンブロットにより解析した図である。
【図２】図２は、ＥＳ細胞、間葉系幹細胞とヒト成人の１３種類の臓器における各ＥＣＡＴ遺伝子の発現をノザンブロットにより解析した図である。
【図１】
0004829272.tif 000003
【図２】
0004829272.tif 000004
【配列表】
0004829272000001.app