(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に示されたH-Ras遺伝子の塩基配列の少なくとも一部から成り、以下の群から選ばれたいずれか一つの変異を有するポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドの存在を検出することによりH-Ras遺伝子変異を検出し、該H-Ras遺伝子変異はコステロ症候群では同定されNoonan症候群では同定されないという基準に基づき、該H-Ras遺伝子変異を有する患者がコステロ症候群である可能性が高いと判定する方法：
（ａ）第３４番目のｇがａに置換； 
（ｂ）第３５番目のｇがｃに置換;
（ｃ）第３５番目のｇがｔに、第３６番目のｃがｔに置換;及び
（ｄ）第３８番目のｇがａに置換。
【請求項２】
請求項１に記載のポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドの塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、請求項１に記載のH-Ras遺伝子変異を検出することができるＤＮＡから成るポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドを使用する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
請求項１に記載のH-Ras遺伝子変異を検出することができる請求項２に記載のＤＮＡから成るポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドを遺伝子増幅用プライマーとして使用する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
請求項１に記載のH-Ras遺伝子変異を検出することができる請求項２に記載のＤＮＡから成るポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドをハイブリダイゼーション用プローブとして使用する、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
配列番号２に示されたアミノ酸配列からなるH-Ras遺伝子の発現産物の少なくとも一部から成り、以下の群から選ばれたいずれか一つの変異を有するポリペプチド又はオリゴペプチドの存在を検出することによりH-Ras遺伝子変異を検出し、該H-Ras遺伝子変異はコステロ症候群では同定されNoonan症候群では同定されないという基準に基づき、該H-Ras遺伝子変異を有する患者がコステロ症候群である可能性が高いと判定する方法：
（ａ）第１２番目のＧ（グリシン）がＡ（アラニン）に置換； 
（ｂ）第１２番目のＧ（グリシン）がＳ（セリン）に置換;
（ｃ）第１２番目のＧ（グリシン）がＶ（バリン）に置換;及び
（ｄ）第１３番目のＧ（グリシン）がＤ（アスパラギン酸）に置換。
【請求項６】
請求項３に記載の遺伝子増幅用プライマーを含む、請求項３に記載の方法を実施するための測定用システム。
【請求項７】
請求項４に記載のハイブリダイゼーション用プローブを含む、請求項４に記載の方法を実施するための測定用システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コステロ症候群に関連するH-Ras遺伝子の塩基配列及びそれにコードされるアミノ酸配列における変異、該変異の検出方法、及び該検出方法を利用するコステロ症候群の診断方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
コステロ（Costello）症候群は1971年にニュージーランドのJM Costelloにより初めて報告された疾患である（非特許文献１）。特徴的な顔貌、精神遅滞、カールした毛髪、新生児期の哺乳障害、心合併症（肥大型心筋症・不整脈）、手足の緩い皮膚、足関節の位置異常、腫瘍好性を示す先天的な症候群である。2003年までに約115症例が報告されているが同胞例は少なく、突然変異を有する常染色体優性遺伝形式が予測されているが、その原因は不明である（非特許文献２）。
【０００３】
コステロ症候群の類縁疾患であるNoonan症候群の原因遺伝子が2001年に同定された（非特許文献３）。Noonan症候群の原因遺伝子であるPTPN11遺伝子は細胞質型チロシンホスファターゼSHP-2をコードし、Noonan症候群患者の約５0%に遺伝子変異が同定された。同定された変異はホスファターゼ活性が上昇する機能獲得性の変異であった（非特許文献４〜６）。PTPN11の変異はコステロ症候群に同定されなかったため、これらの類縁疾患の原因は異なることが予測されていた（非特許文献７及び８）。
【非特許文献１】Costello, J. A new syndrome. NZ Med J 74, 397 (1971)
【非特許文献２】Hennekam, R.C. Costello syndrome: an overview. Am J Med Genet C Semin Med Genet 117, 42-8 (2003)
【非特許文献３】Tartaglia, M. et al. Mutations in PTPN11, encoding the protein tyrosine phosphatase SHP-2, cause Noonan syndrome. Nat Genet 29, 465-8 (2001)
【非特許文献４】Araki, T. et al. Mouse model of Noonan syndrome reveals cell type- and gene dosage-dependent effects of Ptpn11 mutation. Nat Med 10, 849-57 (2004)
【非特許文献５】Niihori, T. et al. Functional analysis of PTPN11/SHP-2 mutants identified in Noonan syndrome and childhood leukemia. J Hum Genet 50, 192-202 (2005)
【非特許文献６】Tartaglia, M. et al. Somatic mutations in PTPN11 in juvenile myelomonocytic leukemia, myelodysplastic syndromes and acute myeloid leukemia. Nat Genet 34, 148-50 (2003)
【非特許文献７】Troger, B. et al. No mutation in the gene for Noonan syndrome, PTPN11, in 18 patients with Costello syndrome. Am J Med Genet A 121, 82-4 (2003)
【非特許文献８】Tartaglia, M., Cotter, P.D., Zampino, G., Gelb, B.D. & Rauen, K.A. Exclusion of PTPN11 mutations in Costello syndrome: further evidence for distinct genetic etiologies for Noonan, cardio-facio-cutaneous and Costello syndromes. Clin Genet 63, 423-6 (2003)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
従って、本発明の目的は、コステロ（Costello）症候群の原因となる遺伝子変異を見つけ、それに基づく検出方法及び診断方法等を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は上記課題を解決すべく、増殖因子等のシグナル伝達においてSHP-2はRAS/MAPキナーゼを活性化することに注目し、コステロ症候群の原因がシグナル伝達系でSHP-2の上流、あるいは下流にある分子であるという仮説をたてた。それに基づき、PTPN11遺伝子変異のないNoonan症候群２８人とコステロ症候群１３人のゲノムDNAに対して癌遺伝子であるRasのsuperfamily であるH-RAS, K-RAS, N-RAS及び E-RASのシークエンスを行った。その結果、コステロ症候群の原因となる遺伝子変異を見つけ、本発明を完成した。
【０００６】
即ち、本発明は、以下の各態様に係るものである。
［１］  配列番号１に示されたH-Ras遺伝子の塩基配列の少なくとも一部から成り、以下に示す変異の少なくとも一つを有するポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド：
（ａ）第３４番目のｇがａに置換； 
（ｂ）第３５番目のｇがｃに置換;
（ｃ）第３５番目のｇがｔに、第３６番目のｃがｔに置換;及び
（ｄ）第３８番目のｇがａに置換。
［２］  上記態様１に記載のポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドの塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ、上記態様１記載のポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドの存在を検出するために使用できるＤＮＡから成るポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド。
［３］  １０〜１００個の連続した塩基配列から成る、上記態様１又は２記載のポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド。
［４］  上記態様１〜３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドから成る遺伝子増幅用プライマー。
［５］  上記態様１〜３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドから成るハイブリダイゼーション用プローブ。
［６］  H-Ras遺伝子の発現産物の少なくとも一部から成り、以下に示す変異の少なくとも一つを有するポリペプチド又はオリゴペプチド：
（ａ）第１２番目のＧ（グリシン）がＡ（アラニン）に置換； 
（ｂ）第１２番目のＧ（グリシン）がＳ（セリン）に置換;
（ｃ）第１２番目のＧ（グリシン）がＶ（バリン）に置換;及び
（ｄ）第１３番目のＧ（グリシン）がＤ（アスパラギン酸）に置換。
［７］  上記態様６記載のポリペプチド又はオリゴペプチドにおいて、上記態様６記載に記載の４つの置換部位以外で、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、上記態様６記載のポリペプチド又はオリゴペプチドを認識する抗体の抗原として機能する、ポリペプチド又はオリゴペプチド。
［８］  上記態様６又は７記載のポリペプチド又はオリゴペプチドを認識する抗体。
［９］  上記態様１〜３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドの存在を検出することによる、H-Ras遺伝子変異の検出方法。
［１０］  上記態様６又は７記載のポリペプチド又はオリゴペプチドの存在を検出することによる、H-Ras遺伝子変異の検出方法。
［１１］  上記態様９又は１０に記載の検出方法を実施するための、測定用システム。
［１２］  上記態様４に記載の遺伝子増幅用プライマーを含む、上記態様１１記載の測定用システム。
［１３］  上記態様５記載のハイブリダイゼーション用プローブを含む、上記態様１１記載の測定用システム。
［１４］  上記態様８記載の抗体を含む、上記態様１１記載の測定用システム。
［１５］  上記態様９又は１０に記載の検出方法を利用する、コステロ症候群の診断方法。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によりH-RASの生殖細胞変異が先天奇形症候群のコステロ症候群を引き起こすことが明らかになり、H-RASのヒト発生に重要な役割を果たすとことが判明した。更に、本発明によりコステロ症候群の遺伝子診断法が確立し、コステロ症候群の確定診断が可能になった。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明者は、本明細書中の表２に示されるように、コステロ症候群の患者中に見られるH-RAS遺伝子変異を同定した。これら変異の塩基レベルにおける具体的な変異は本発明の第一の態様に係るポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドに含まれるもので、それらアミノ酸レベルにおける具体的な変異は本発明の第六の態様に係るポリペプチド又はオリゴペプチドに含まれるものである。これら変異の位置は、該遺伝子のコード領域における「atg」開始コドンの最初の塩基を塩基番号の１とし、それに対応するメチオニンをアミノ酸番号の１としている。
【０００９】
本発明において「ポリヌクレオチド」及び「オリゴヌクレオチド」は、プリンまたはピリミジンが糖にβ-N-グリコシド結合したヌクレオシドのリン酸エステル（ヌクレオチドATP、GTP、CTP、UTP；またはdATP、dGTP、dCTP、dTTP）が複数個結合した分子を意味する。通常、数個から数十個のヌクレオチドが結合したものをオリゴヌクレオチドといい、それ以上のヌクレオチドが結合したものをポリヌクレオチドというが、両者の間には、このようなヌクレオチドの重合度の高低による厳密な区別はない。尚、本発明におけるポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドは１本鎖または２本鎖であり、１本鎖の場合はセンス鎖およびアンチセンス鎖のいずれか一方である。
【００１０】
本発明のポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドは、コステロ症候群患者から取得した血球等の適当な試料から調製したゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡを鋳型として使用し、例えば、表１に示したH-RAS遺伝子のエクソン１用の適当なプライマーを用いるPCR（Polymerase Chain Reaction）法又はRT-PCR法、並びに、その他のNASBA（Nucleic acid sequence based amplification）法、TMA（Transcription-mediated amplification）法およびSDA（Strand Displacement Amplification）法等の当業者に公知の任意の遺伝子増幅法により増幅することができる。
【００１１】
更に、本発明のポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドは、当業者に周知の方法により、写本発明のオリゴヌクレオチドをプローブとして、コステロ症候群患者から取得した適当な試料の全mRNAから調製したcDNAライブラリーをスクリーニングすることによって単離することができる。又は、野生型のH-RAS遺伝子のcDNAに、当業者に公知の部位特異的突然変異誘発に基づき、市販のミューテーションシステム等を用いて塩基変異を導入して調製することも可能である。
【００１２】
又、本発明のオリゴヌクレオチドは、公知の方法（例えば、Carruthers（1982）Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 47:411-418; Adams（1983）J. Am. Chem. Soc. 105:661; Belousov（1997）Nucleic Acid Res. 25:3440-3444; Frenkel（1995）Free Radic. Biol. Med. 19:373-380; Blommers（1994）Biochemistry 33:7886-7896; Narang（1979）Meth. Enzymol. 68:90; Brown（1979）Meth. Enzymol. 68:109; Beaucage（1981）Tetra. Lett. 22:1859; 米国特許第4,458,066号）に記載されているような周知の化学合成技術により、in vitroにおいて合成することもできる。また、本発明のポリヌクレオチドを適当な制限酵素で切断する等の方法によって作製することもできる。
【００１３】
本発明のポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドには、上記のポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドの塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ、上記態様１記載のポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドの存在を検出するために使用できるＤＮＡから成るポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドも含まれる。本明細書において、ハイブリダイズにおける「ストリンジェント（stringent）な条件」とは、前記のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドと、ゲノムDNAとの選択的かつ検出可能な特異的結合を可能とする条件である。ストリンジェント条件は、塩濃度、有機溶媒（例えば、ホルムアミド）、温度、及びその他公知の条件の適当な組み合わせによって定義される。すなわち、塩濃度を減じるか、有機溶媒濃度を増加させるか、またはハイブリダイゼーション温度を上昇させるかによってストリンジェンシー（stringency）は増加する。更に、ハイブリダイゼーション後の洗浄の条件もストリンジェンシーに影響する。この洗浄条件もまた、塩濃度と温度によって定義され、塩濃度の減少と温度の上昇によって洗浄のストリンジェンシーは増加する。従って、ストリンジェントな条件の好適な一具体例としては、750 mM NaCl、75 mM クエン酸三ナトリウム、1% SDS、及び30℃の条件でハイブリダイゼーションを行い、30 mM NaCl、3 mM クエン酸三ナトリウム、0.1% SDS、及び25℃の条件で洗浄を行うものである。
【００１４】
又、このような「ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドの存在を検出するために使用できるＤＮＡから成るポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド」とは、以下に記載された各種の検出方法において、増幅用プライマー及びハイブリダイゼーション用プローブとして使用して、コステロ症候群の患者中に見られるH-RAS遺伝子変異を検出・同定することができることを意味する。
【００１５】
本発明のポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドは、H-Ras遺伝子変異の検出方法に用いる各種の測定用システムの構成要素として有用である。代表的な例として、遺伝子（DNA）増幅用プライマー及びハイブリダイゼーション用プローブを挙げることが出来る。従って、本発明のポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドは、その用途に応じて、適当な長さ、例えば、１０〜１００個の連続した塩基配列から成る。
【００１６】
本発明において「ポリペプチド」及び「オリゴペプチド」とは、アミド結合（ペプチド結合）によって複数のアミノ酸残基が互いに結合して構成された分子を意味する。通常、数個から数十個のアミノ酸残基が結合したものをオリゴペプチドといい、それ以上のアミノ酸残基が結合したものをポリペプチドというが、両者の間には、このようなアミノ酸残基の重合度の高低による厳密な区別はない。
【００１７】
これらのポリペプチド又はオリゴペプチドは、本発明のポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドの発現産物としてコステロ症候群患者から取得した適当な試料中に含まれている場合にそれから当業者に公知の任意の方法に従って単離する方法、それぞれの変異アミノ酸残基を含むアミノ酸配列の情報に基づき当業者に公知の任意の化学合成によってペプチドを調製する方法、又は、本発明のポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドを含む適当な組換えベクター等を用いた組換えDNA技術で適当な宿主細胞を形質転換し、該形質転換細胞により生産する方法などにより調製することができる。更に、本発明のポリペプチドを適当なプロテアーゼによって消化することによって、オリゴペプチドを作製することも可能である。
【００１８】
本発明のポリペプチド又はオリゴペプチドは、コステロ症候群患者に特有のH-Ras遺伝子変異に由来する４種類の変異の他に、上記のポリペプチド又はオリゴペプチドを認識する抗体の抗原として機能する限りは、更に、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたものであっても良い。即ち、該抗体が認識するエピトープ以外の部位にこのような変異が含まれていても良い。このようなポリペプチド又はオリゴペプチドは、化学合成によって直接ペプチドを調製する方法の他に、これらをコードするポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドを既に記載した部位特異的突然変異誘発法等により作製し、これを当業者に公知の適当な系で発現させることによって調製することも可能である。
【００１９】
本発明の抗体は、本発明のポリペプチド又はオリゴペプチドを特異的に認識するものである。本発明抗体はポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり、更に、このような結合活性を有している限り、元の完全な構造を有する抗体に限らず、例えば、Fab、F(ab')2、Fv断片等の完全な抗体由来の各種誘導体が全て含まれる。これらの各種抗体又はその誘導体は、H-Ras遺伝子変異の検出方法に用いる各種の測定用システムの構成要素として有用である。
【００２０】
本発明の抗体は上記のポリペプチド又はオリゴペプチド、又はそれらと適当なアジュバントとの複合体を免疫原として用いて、当業者に公知の任意の方法で作製することが出来る。例えばポリクローナル抗体の場合には、上記の免疫原で動物を免役した後、血清から得ることができる。あるいは、上記の免疫原をコードする発現ベクターを注射や遺伝子銃によって、動物の筋肉や皮膚に導入した後、血清を採取することによって作製することができる。動物としては、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ニワトリなどが用いられる。また、モノクローナル抗体は、公知のモノクローナル抗体作成法（「単クローン抗体」、長宗香明、寺田弘共著、廣川書店、1990年； "Monoclonal Antibody" James W. Goding, third edition, Academic Press, 1996）に従って作成することができる。
【００２１】
本発明のH-Ras遺伝子変異の検出方法は、被験者の血液等の各種試料中の、上記のポリヌクレオチド若しくはオリゴヌクレオチド、又は、ポリペプチド若しくはオリゴペプチドの存在を検出することを特徴とする。この検出は、測定対象に応じて、当業者に公知の任意の条件・方法で行うことが出来る。
【００２２】
例えば、既に記載したＰＣＲ法及びＲＴ−ＰＣＲ法等の各種ＰＣＲ法、並びに、ＩＣＡＮ法等の各種遺伝子増幅法を用いて得られた増幅産物中で本発明のポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドの存在を検出することができる。このような増幅産物中の検出は、直接塩基配列を決定する方法（シークエンス法）に加えて、例えばPCR-SSCP法、PCR-CFLP法、PCR-PHFA法等で行うことも出来る。或いは、ハイブリダーゼーション反応を利用した、例えば、タクマン法（Taqman PCR）、侵入法（Invader method）、ＲＣＡ法、及びマイクロアレイ（ＤＮＡチップ）法等のスニップタイピングで使用される各種方法を用いて、本発明のポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドの存在を検出することも出来る。
【００２３】
このような検出方法に使用する本発明のシステム（装置又はキット）は、上記塩基配列における変異を測定するための具体的な方法・手段に応じて、適当な構成をとることが出来る。該システムは、例えば、本発明のポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドから成る遺伝子増幅用プライマー及びハイブリダイゼーション用のプローブを含むことが出来る。或いは、本発明のオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを増幅するために使用される適当な長さの塩基配列からなるプライマーを含有する。これらは、その用途に応じて、適当な長さ、例えば、１０〜１００個の連続した塩基配列から成る。
【００２４】
又、本発明のポリペプチド又はオリゴペプチドの存在は、例えば、本発明の抗体を用いたＥＩＡ及びＥＬＩＳＡ等の免疫学的特異反応を利用する方法、エドマン法を用いた気相シークエンサー等ペプチドのアミノ酸配列分析法、更には、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ及びＥＳＩ  Ｑ−ＴＯＦ／ＭＳ法等に代表される質量分析によって検出することが出来る。  
【００２５】
以上のシステムに構成要素として含まれる、各種のプライマー、プローブ、又は、抗体は、当業者に公知の任意の放射性物質、蛍光物質、色素等の適当な標識物質によって標識されていても良い。更に、上記システムには、その構成・使用目的などに応じて、当業者に公知の他の要素又は成分、例えば、各種試薬、酵素、緩衝液、反応プレート（容器）等が含まれる。
【００２６】
本発明の検出方法によって、被験者由来の試料に、特定の変異を含むポリヌクレオチド若しくはオリゴヌクレオチド、又は、それに対応するポリペプチド若しくはオリゴペプチドの存在が検出された場合には、該被験者はコステロ症候群であると診断することが出来る。
【００２７】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例の記載によって何ら限定して解釈されるものではない。又、特に記載のない場合には、以下の実施例は、例えば、Sambrook and Maniatis, in Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989; Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New   York, N.Y, 1995等に記載されている、当業者に公知の標準的な遺伝子工学及び分子生物学的技術に従い、実施することが出来る。又、本明細書中に引用された文献の記載内容は本明細書の開示内容の一部を構成するものである。
【実施例１】
【００２８】
方法
１）ゲノムDNAの精製
患者血液中の白血球（Leukocytes）、培養細胞、組織より、常法に従い、ゲノムDNAを精製した (Promega DNA extraction kit)。
２）RAS遺伝子全エクソンのPCR
患者ゲノムDNA100ngを用いてH-RAS, K-RAS, N-RAS及びE-RASの蛋白翻訳領域のエクソンのPCRを行った。各遺伝子の寄託番号（GenBank:NCBI）エクソンの種類、使用した各プライマーの塩基配列、アリーリング温度を表１に示す。反応液（30μl）の組成は、10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 0.2 mM dNTP, 10% (v/v) DMSO, 0.4 pmol of each primer, 100 ng genomic DNA and 2.5 units of Taq DNA polymeraseである。PCR反応は、94 ℃、15 秒での変性；表１に示した温度、15秒でのアニーリング；及び72 ℃、30 分でのエクステンションからなる増幅反応サイクルを３５回繰り返した。
３）シークエンス反応
PCR産物はアガロースゲルに流し切り出し精製した。精製産物はABI PRISM 310 automated DNA sequencer (Applied Biosystems)でシークエンスを行い塩基配列を決定した。シークエンスの結果とジーンバンクでの登録された配列を比較し遺伝子変異を見つけた。
【００２９】
【表１】
0004830101.tif 000002
【００３０】
結果と考察
コステロ症候群１３人中１２人にH-RAS遺伝子変異が同定された(表２)。変異はコドン１２と１３に集中し、G12Sが７人、G12Aが２人、G12Vが１人、G13Dが２人の患者に見つかった。尚、これらの変異はH-RAS遺伝子のエクソン１に存在するものである。コステロ症候群は多くが孤発例で遺伝性は少ないことが今までに報告されていた。これらの変異が突然変異で起こったものであるかを調べるために、４家系で両親のゲノムDNAを検索したところ、両親には変異は同定されなかった(表２)。次に変異が生殖細胞変異であるか否かを検証するために患者において血液細胞以外の頬粘膜細胞（buccal cells）あるいは線維芽細胞（fibroblasts）で変異を調べた(COS38,62，37, 64)。その結果２つの組織で変異が同定されたため変異は突然変異で起こった生殖細胞変異であることが確かめられた（表２）。因みに、RAS遺伝子変異は1982年に初めて発見された癌遺伝子であり、これまですべての癌の約30%に体細胞変異が同定されてきた（Takai, Y., Sasaki, T. & Matozaki, T. Small GTP-binding proteins. Physiol Rev 81, 153-208 (2001)）
【００３１】
PTPN11遺伝子変異のないNoonan症候群２８人とコステロ症候群１人にはH-RAS, K-RAS, N-RAS, E-RASに遺伝子変異が同定されなかった。Noonan症候群とコステロ症候群はその表現型に重複を示す類縁疾患として知られていたが、本発明により、コステロ症候群のみにH-RAS遺伝子変異が同定されたことにより、２つの疾患が分子遺伝学的に異なる疾患であることが証明された。また２つの原因遺伝子がともにシグナル伝達系のRAS/MAPキナーゼ系を活性化ずる変異であることより、RAS/MAPキナーゼの活性化が多発奇形症候群をひきおこすことが明らかになった。
【００３２】
【表２】
0004830101.tif 000003
【産業上の利用可能性】
【００３３】
これまでコステロ症候群の診断は臨床的症状の組み合わせで行われていたため、正確な頻度・自然歴は不明であった。本発明によりコステロ症候群の遺伝子診断法が確立したことにより、コステロ症候群の確定診断が可能になった。コステロ症候群の約17%に腫瘍が発生することが示唆されてきたが、正確な診断法がないために腫瘍のスクリーニング方法の検討が難しかった（Gripp, K.W. et al. Five additional Costello syndrome patients with rhabdomyosarcoma: proposal for a tumor screening protocol. Am J Med Genet 108, 80-7 (2002)）。今後正確な診断を行うことにより、コステロ症候群の腫瘍合併率とその予防のためのスクリーニング法の検討、また治療へのアプローチが可能になると考えられる。
【配列表】
0004830101000001.app