【手続補正書】
【提出日】平成26年9月19日(2014.9.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プライマー伸長の方法であって、
ａ）第一のプライマー分子（「第一のフォワードプライマー」）を、核酸鎖（「リバース鎖」）上の相補性プライマー結合配列（「リバース鎖ＰＢＳ」）に対してハイブリダイズさせる工程であって、第一のフォワードプライマーのヌクレオチド塩基の少なくとも６０％が、アデニン、チミンもしくはウラシルであるか、またはアデニン、チミンもしくはウラシルに対して相補性である、工程と、
ｂ）前記リバース鎖をテンプレートとして用いて、前記第一のフォワードプライマー分子を伸長することによって、前記リバース鎖の全長相補体であり、それに対してハイブリダイズされた伸長された第一のフォワード鎖を生成する工程と、
ｃ）第二のプライマー分子（「第二のフォワードプライマー」）を前記リバース鎖ＰＢＳに対してハイブリダイズさせる工程であって、前記リバース鎖もまた、前記第一のフォワード鎖にハイブリダイズされている、工程と、
を含み、かつ
任意で、工程（ｂ）および（ｃ）を含む１以上の増幅サイクルによって、前記フォワード鎖を増幅する工程を含み、第一の増幅サイクルの工程（ｃ）の前記第二のフォワードプライマーが、引き続く増幅サイクルの工程（ｂ）の前記第一のフォワードプライマーであり、かつリバース鎖のかなりの割合が、前記１以上の繰り返しの間中またはその間の全ての時点でフォワード鎖にハイブリダイズされている、方法。
【請求項２】
ａ）第一のリバースプライマー分子を、伸長されたフォワード鎖上の相補性リバース−プライマー結合配列（「フォワード鎖ＰＢＳ」）に対してハイブリダイズさせる工程と；
ｂ）前記フォワード鎖をテンプレートとして用いてテンプレート依存性方式で前記第一のリバースプライマー分子を伸長することによって、前記フォワード鎖の全長相補体であり、それに対してハイブリダイズされた、伸長された第一のリバース鎖を、生成する工程と；
ｃ）第二のプライマー（「第二のリバースプライマー」）を、前記フォワード鎖ＰＢＳに対してハイブリダイズさせる工程であって、前記フォワード鎖はまた、前記第一のリバース鎖に対してハイブリダイズされている、工程と、
によって前記リバース鎖を増幅することを含み、かつ
任意で、工程（ｂ）〜（ｃ）の１以上の繰り返しによって前記リバース鎖を増幅することを含み、工程（ｃ）の前記第二のリバースプライマーが、繰り返された工程（ｂ）の前記第一のリバースプライマーであり、かつフォワード鎖のかなりの割合が、前記１以上の繰り返しの間中またはその間の全ての時点でリバース鎖に対してハイブリダイズされている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
全てのフォワードプライマーのＴｍが、５０℃、５５℃、６０℃または６５℃以下であり、かつ前記リバース鎖のＴｍが、９５℃、９０℃、８５℃、８０℃または７５℃以上である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
増幅が、等温条件下で行われ、かつ
任意で、前記等温条件が、全てのフォワードプライマーのＴｍより高いが、リバース鎖のＴｍより低い温度に調節され、前記リバース鎖のＴｍは、同一のリバース鎖のクローン集団における前記リバース鎖の半分が、その全長にわたって前記リバース鎖に完全にハイブリダイズされる完全に相補性の鎖から完全に変性される温度である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
一本鎖のテンプレート配列の固定されたクローンアンプリコンの局所的集団を生成する方法であって：
ａ）前記一本鎖のテンプレート配列（「テンプレート１」）を固定部位（「ＩＳ１」）に結合する工程であって、ＩＳ１が、テンプレート１に対して実質的にハイブリダイズすることができる固定されたプライマー（「ＩＳ１プライマー」）の多重コピーを含み、テンプレート１が、ＩＳ１プライマーに対するハイブリダイゼーションによってＩＳ１に対して結合される、工程と、
ｂ）溶液中で、ＩＳ１プライマーおよび非固定プライマー（「ＳＰ１プライマー」）を用いてテンプレート１を増幅する工程であって、前記一本鎖のテンプレート１に対して相補性である増幅された鎖が、一本鎖である場合、ＩＳ１上のプライマーに対して実質的にハイブリダイズできず、増幅によって、テンプレート１のＩＳ１に対する最初のハイブリダイゼーションのポイントのまわりに固定されたクローンアンプリコンの局在化集団を生成する、工程とを含む、方法。
【請求項６】
第一のテンプレート配列（「テンプレート１」）および第二のテンプレート配列（「テンプレート２」）の分離されかつ固定されたクローン集団を生成する方法であって、前記第一のおよび第二のテンプレート配列を増幅して、実質的に第一の固定部位（「ＩＳ１」）に対して結合され、第二の固定部位（「ＩＳ２」）には結合されないテンプレート１のクローンアンプリコンの集団、または実質的にＩＳ２に結合されＩＳ１には結合されないテンプレート２のクローンアンプリコンの集団を生成する工程を含み、
ａ）両方のテンプレートおよび全てのアンプリコンは、同じ連続液相中に含まれ、前記連続液相が第一のおよび第二の固定部位（それぞれ、「ＩＳ１」および「ＩＳ２」）と接触し、かつＩＳ１およびＩＳ２が空間的に隔てられており、
ｂ）テンプレート１は、一本鎖型である場合、第一のサブ配列（「Ｔ１−ＦＯＲ」）を一端に含み、かつ第二のサブ配列（「Ｔ１−ＲＥＶ」）をその反対の端に含み、
ｃ）テンプレート２は、一本鎖型である場合、第一のサブ配列（「Ｔ２−ＦＯＲ」）を一端に含み、かつ第二のサブ配列（「Ｔ２−ＲＥＶ」）をその反対端に含み、
ｄ）ＩＳ１は、Ｔ１およびＴ２が一本鎖である場合、Ｔ１−ＦＯＲおよびＴ２−ＦＯＲに対して実質的にハイブリダイズできる固定された核酸プライマー（「ＩＳ１プライマー」）の多重コピーを含み、
ｅ）ＩＳ２は、Ｔ１およびＴ２が一本鎖である場合、Ｔ１−ＦＯＲおよびＴ２−ＦＯＲの両方に対して実質的にハイブリダイズできる固定されたプライマー（「ＩＳ２プライマー」）の多重コピーを含み、
ｆ）Ｔ１−ＲＥＶのリバース相補体は、一本鎖である場合、ＩＳ１上のプライマーに対して実質的にハイブリダイズすることができず、ただし、前記連続液相中の非固定プライマー（「ＳＰ１」）に対して実質的にハイブリダイズでき、
ｇ）Ｔ２−ＲＥＶのリバース相補体は、一本鎖である場合、ＩＳ２上のプライマーに対して実質的にハイブリダイズできず、ただし、前記連続液相中の非固定プライマー（「ＳＰ２」）に対して実質的にハイブリダイズできる、方法。
【請求項７】
第一のテンプレート配列（「テンプレート１」）と第二のテンプレート配列（「テンプレート２」）の分離されかつ固定されたクローン集団を生成する方法であって、前記第一のおよび第二のテンプレート配列を増幅する工程を含み、
ａ）両方のテンプレートが、一本鎖型であり、かつ両方とも同じ連続液相中に含まれ、第一のおよび第二の固定部位（それぞれ、「ＩＳ１」および「ＩＳ２」）が前記連続液相と接触し、かつＩＳ１およびＩＳ２が空間的に隔てられており、
ｂ）テンプレート１は、第一のサブ配列（「Ｔ１−ＦＯＲ」）をその３'末端に、およびＴ１−ＦＯＲと非重複性である第二のサブ配列（「Ｔ１−ＲＥＶ」）をその５'末端に含み、
ｃ）テンプレート２は、第一のサブ配列（「Ｔ２−ＦＯＲ」）をその３'末端に、およびＴ２−ＦＯＲと非重複性である第二のサブ配列（「Ｔ２−ＲＥＶ」）をその５'末端に含み、
ｄ）ＩＳ１は、Ｔ１−ＦＯＲおよびＴ２−ＦＯＲの両方に対してハイブリダイズできる、固定されたプライマー（「ＩＳ１プライマー」）を含み、
ｅ）ＩＳ２は、Ｔ１−ＦＯＲおよびＴ２−ＦＯＲの両方に対してハイブリダイズできる、固定されたプライマー（「ＩＳ２プライマー」）を含み、
ｆ）Ｔ１−ＲＥＶのリバース相補体は、ＩＳ１上のプライマーに対して実質的にハイブリダイズできず、かつ／またはＴ２−ＲＥＶのリバース相補体は、ＩＳ２上のプライマーに対して実質的にハイブリダイズできないが、各々が、前記連続液相中の非固定プライマーに対して実質的にハイブリダイズでき、
それによって増幅が、実質的にＩＳ１に対して結合するがＩＳ２に対しては結合しないテンプレート１のクローンアンプリコンの集団、および／または実質的にＩＳ２に対して結合するがＩＳ１に対しては結合しないテンプレート２のクローンアンプリコンの集団をもたらす、方法。
【請求項８】
前記一本鎖のテンプレートが、増幅される複数のインプット核酸配列（この配列は既知であっても未知であってもよい）を採用すること、ならびに第一のユニバーサルアダプター配列および第二のユニバーサルアダプター配列を、少なくとも１つのインプット核酸の末端上に追加することによって生成され、前記第一のユニバーサルアダプター配列が、ＩＳ１プライマーおよび／またはＩＳ２プライマーに対してハイブリダイズし、かつ前記第二のユニバーサルアダプター配列のリバース相補体が少なくとも１つの非固定プライマーに対してハイブリダイズする、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
２つの異なる固定部位が、
ａ）単一支持体の空間的に隔てられているサブコンポーネントであり、
ｂ）異なる接続されていない支持体上であり、かつ
任意で、前記支持体が、三次元のマトリックスを形成し、かつ前記２つの異なる固定部位が完全には重複しない前記支持体の２つの異なる三次元の部分であるか、または前記２つの異なる固定部位が異なる支持体上である、
請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
各々の固定部位が分離されたビーズであり、各々のビーズが、増幅後のアンプリコンのクローン集団を含み、各々のビーズが、アレイの分離されたウェルに分配され、かつ合成による配列が行われ、かつ
任意で、前記アレイが大規模ＦＥＴアレイである、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記プライマー伸長が、１つ以上の検出可能標識（例えば、蛍光標識または放射性標識）の伸長された固定された核酸鎖への組み込みをもたらす、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
核酸分子またはその一部を遊離するように１つ以上の伸長された固定された核酸鎖を処理する工程をさらに含み、任意で、前記処理する工程が、制限エンドヌクレアーゼを用いるか、またはリボザイムを用いる切断からなる、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記プライマーのうちの１つ以上が、制限エンドヌクレアーゼ認識部位もしくはリボザイム認識部位を有するか、またはこのような部位の一部を有し、この一部は、プライマー伸長が起きると、完全になる、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
複数の異なる核酸配列を増幅するための方法であって、
前記異なる核酸配列が各々、第一のおよび第二の核酸アダプター配列を備え、前記第一のおよび第二の核酸アダプター配列が、前記各々の異なる核酸配列について同じであるか、または前記異なる核酸配列が各々、異なるタグを備え、その結果前記異なる配列がお互いから識別され得る、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
表面上の１つ以上の別個のエリアの形態における複数の固定された核酸であって、各々のエリアが、複数の同一の核酸鎖、および複数の同一のそれに対してハイブリダイズした相補鎖を含み、このようなエリア内の各々の核酸鎖は、その鎖の長さのある距離内の表面上に別の核酸鎖が配置されるように配置されており、任意で、前記核酸が固定される表面の１ｍｍ２あたりに少なくとも１つの別個のエリアが存在する、核酸。
【請求項１６】
少なくとも１つのリバース核酸鎖と、少なくとも１つの支持体上に必要に応じて固定された複数のフォワードプライマーと、必要に応じて溶液中の複数のリバースプライマーと、ポリメラーゼと、のうちのいずれか１つまたはいずれかのサブセットまたは全てを含み、かつ核酸鎖（「リバース鎖」）のクローン集団を含む、組成物であって、必要に応じて各々のクローン集団の個々のリバース鎖が、低融点（例えば、ブリーザブル（ｂｒｅａｔｈａｂｌｅ））プライマー結合配列を３'末端に、および／または低融点プライマー配列を５'末端に含む、組成物。