【手続補正書】
【提出日】平成23年12月6日(2011.12.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むトランスジェニック植物細胞であって、該タンパク質が、SEQ ID NO:2のアミノ酸配列と少なくとも90％の配列同一性を有する、トランスジェニック植物細胞。
【請求項２】
前記タンパク質が、SEQ ID NO:2のアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有する、請求項1記載の細胞。
【請求項３】
植物細胞において機能的なプロモーターおよび該プロモーターに機能的に連結されたポリヌクレオチドを含むベクターであって、該ポリヌクレオチドが、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードし、かつ該タンパク質が、SEQ ID NO:2のアミノ酸配列と少なくとも90％の同一性を有する、ベクター。
【請求項４】
複数の請求項1記載の細胞を含む植物。
【請求項５】
請求項1記載のポリヌクレオチドを含む、請求項4記載の植物の種子。
【請求項６】
第2の除草剤抵抗性遺伝子をさらに含む、請求項1記載の植物細胞。
【請求項７】
AAD-1、AAD-12、グリホセート抵抗性遺伝子、およびイミダゾリノン抵抗性遺伝子からなる群より選択される除草剤抵抗性遺伝子をさらに含む、請求項1記載のトランスジェニック植物細胞。
【請求項８】
請求項1記載のポリヌクレオチドを用いる形質転換に複数の植物細胞を供する工程、培地中で該細胞を培養する工程、該細胞をホスフィノトリシンに曝す工程、および該細胞がホスフィノトリシンに対して抵抗性であるか否かを判定する工程を含む、植物細胞における抵抗性マーカーとしてホスフィノトリシン抵抗性遺伝子を使用する方法。
【請求項９】
少なくとも1種類の請求項4記載の植物を圃場において生長させる工程、および該圃場の少なくとも一部にグルタミンシンセターゼ阻害除草剤を適用する工程を含む、圃場において少なくとも1種類の雑草を制御する方法。
【請求項１０】
前記グルタミンシンセターゼ阻害除草剤が、グルホシネート、ビアロホス、およびホスフィノトリシンからなる群より選択される、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
前記植物が、グリホセート、グルホシネート、2,4-D、キザロホップ、イマゼタピル、クロルスルフロン、ジカンバ、メソトリオン、イソキサフルトール、およびブタフェナシルからなる群より選択される除草剤に対して抵抗性である、請求項9記載の方法。
【請求項１２】
少なくとも1種類の請求項4記載のトランスジェニック植物の種子を圃場に植える工程を含み、
該圃場の少なくとも一部に、グルホシネート、ホスフィノトリシン、およびビアロホスからなる群より選択される第1の除草剤を適用する工程；ならびに
該圃場の少なくとも一部に少なくとも1種類の他の除草剤を適用する工程
をさらに含む、
圃場において少なくとも1種類の雑草を制御する方法であって、
該植物が、
グルタミンシンセターゼ阻害除草剤に対する抵抗性を付与する酵素をコードする異種ポリヌクレオチド、および
少なくとも1種類の他の除草剤に対する抵抗性を付与する酵素をコードする第2の異種ポリヌクレオチド
を含む、方法。
【請求項１３】
少なくとも1種類の他の除草剤が、2,4-D、アセトクロル、アシフルオルフェン、アロキシジム、アミドスルフロン、アミノピラリド、アトラジン、ベフルブタミド、ビスピリバック、ブタフェナシル、カフェンストロール、カルフェントラゾン、クロリムロン、クロロトルロン、シニドン-エチル、クレトジム、クロジナホップ、クロマゾン、クロプロキシジム（cloproxydim）、クロピラリド、クロランスラム、シアナジン、シクロスルファムロン、シクロキシジム、シハロホップ、ダイムロン、ジカンバ、ジクロホップ、ジクロルプロップ、ジクロスラム、ジフルフェニカン、ジメテナミド、ジクワット、ジチオピル、ジウロン、エタルフルラリン、フェノキサプロップ、フラザスルフロン、フロラスラム、フルアジホップ、フルカルバゾン、フルフェナセット、フルフェニカン、フルフェンピル（flufenpyr）、フルメツラム、フルミクロラック、フルミオキサジン、フルロキシピル、フルチアセト、ホメサフェン、ホラムスルフロン、グルホシネート、グリホセート、ハロサフェン（halosafen）、ハロスルフロン、ハロキシホップ、イマザメタベンズ、イマザモクス、イマザピク、イマザピル、イマザキン、イマゼタピル、イマゾスルフロン、ヨードスルフロン、イオキシニル、イソキサベン、イソキサフルトール、ラクトフェン、リヌロン、MCPA、メコプロップ、メフェナセット、メフルイジド、メソスルフロン、メソトリオン、メタミホップ、メタザクロル、メトスラム、メトリブジン、MSMA、ナプロパミド、ニコスルフロン、ノルフルラゾン、オリザリン、オキサジアゾン、オキシフルオルフェン、パラコート、ペブラート、ペンジメタリン、ペノクススラム、ピクロラム、ピコリナフェン（picolinafen）、ピノキサデン（pinoxaden）、プリミスルフロン、プロホキシジム、プロパニル、ピラフルフェン、ピラゾスルフロン、ピリベンゾキシム、ピリミノバック、ピリチオバック、ピロキサスルホン、ピロクススラム（pyroxsulam）、キンクロラック、キンメラック、キザロホップ、リムスルフロン、サフルフェナシル、セトキシジム、シマジン、スルコトリオン、スルフェントラゾン、スルホメツロン、テフリルトリオン（tefuryltrione）、テムボトリオン（tembotrione）、テプラロキシジム、テルバシル、チアゾピル、チジアズロン、チエンカルバゾン（thiencarbazone）、チフェンスルフロン、チオベンカルブ、トプラメゾン、トラルコキシジム、トリアスルフロン、トリベヌロン、トリクロピル、トリフロキシスルフロン、トリフルラリン、トリフルスルフロン、およびトリトスルフロン（tritosulfuron）からなる群より選択される、請求項12記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
除草剤耐性作物（HTC）形質に加えて、本発明の遺伝子によってトランスジェニック作物において除草剤耐性が作出される、除草剤を使用して雑草を制御する方法も、本発明の範囲内である。本発明のHTC形質の組み合わせも、他のHTC形質（グリホセート耐性および2,4-D耐性を含むが、これらに限定はされない）と組み合わせられた場合、特に、（グリホセートのような）除草剤に対する新たに獲得された抵抗性または本質的な耐性を有する種を制御するために、有益である。さらに、（世界的にますます普及してきている）グリホセート耐性作物を他のグリホセート耐性作物と輪作する場合、グリホセート抵抗性の自生植物の制御が困難である場合がある。従って、作物へ重ね合わせられた（stacked）、または個々に形質転換されたこれらのトランスジェニック形質の使用は、他のHTC自生植物の制御のための手段を提供することができる。
[本発明1001]
ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むトランスジェニック植物細胞であって、該ポリヌクレオチドが、65℃で6×SSCという条件の下で、SEQ ID NO:2をコードする核酸プローブの完全な相補体とハイブリダイズする、トランスジェニック植物細胞。
[本発明1002]
プローブがSEQ ID NO:1およびSEQ ID NO:3からなる群より選択される配列を含む、本発明1001の細胞。
[本発明1003]
タンパク質がSEQ ID NO:2のアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有する、本発明1001の細胞。
[本発明1004]
植物細胞において機能的なプロモーターおよび該プロモーターに機能的に連結されたポリヌクレオチドを含むベクターであって、該ポリヌクレオチドが、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードし、かつ該ポリヌクレオチドが、65℃で6×SSCという条件の下で、SEQ ID NO:2のアミノ酸配列をコードする核酸プローブの完全な相補体とハイブリダイズする、ベクター。
[本発明1005]
複数の植物細胞に本発明1004のベクターを提供する工程、および該ベクターを含まない細胞を殺傷しながらまたはそれらの増殖を阻害しながら、前記ポリヌクレオチドを発現する細胞が増殖することを可能にする除草剤の濃度において該複数の細胞を増殖させる工程を含む、本発明1001の植物細胞を選択する方法であって、該除草剤がホスフィノトリシンを含む、方法。
[本発明1006]
除草剤がビアロホスおよびグルホシネートからなる群より選択される、本発明1005の方法。
[本発明1007]
形質転換植物細胞を同定しかつ再生させる工程をさらに含む、本発明1005の方法。
[本発明1008]
複数の本発明1001の細胞を含む植物。
[本発明1009]
本発明1008の植物の種子。
[本発明1010]
バチルス・チューリンゲンシス(Bacillus thuringiensis)、フォトラブダス(Photorhabdus)、およびゼノラブダス(Xenorhabdus)からなる群より選択される生物に由来する昆虫抵抗性遺伝子をさらに含む、本発明1001の植物細胞。
[本発明1011]
第2の除草剤抵抗性遺伝子をさらに含む、本発明1001の植物細胞。
[本発明1012]
前記タンパク質を産生する、本発明1008の植物。
[本発明1013]
タンパク質がSEQ ID NO:2を含む、本発明1012の植物。
[本発明1014]
本発明1004のベクターを用いる形質転換に複数の植物細胞を供する工程、培地中で該細胞を培養する工程、該細胞をホスフィノトリシンに曝す工程、および該細胞がホスフィノトリシンに対して抵抗性であるか否かを判定する工程を含む、植物細胞における抵抗性マーカーとしてホスフィノトリシン抵抗性遺伝子を使用する方法。
[本発明1015]
本発明1004のベクターを用いて植物細胞を形質転換する工程、および形質転換植物細胞を繁殖物を産生する植物体へと再生させる工程を含む、ホスフィノトリシン抵抗性の植物細胞、植物体、およびそれらの繁殖物を作成する方法。
[本発明1016]
植物のゲノムに本発明1004のベクターを組み入れる工程、およびホスフィノトリシン抵抗性について選択する工程を含む、ホスフィノトリシン抵抗性植物の作製の方法。
[本発明1017]
(a)出発植物細胞のポリメラーゼによって認識されるプロモーター、および
(b)グルタミンシンセターゼ阻害剤を産生するストレプトマイセス・セリカラー(Streptomyces coelicolor)A3微生物に由来するDNAフラグメントを含むコード領域
を含む組換えDNAを出発植物細胞の核ゲノムに組み入れる工程を含む、ホスフィノトリシンまたはホスフィノトリシン部分を有する化合物を含むグルタミンシンセターゼ阻害剤の除草活性に対して耐性である植物細胞を作製する方法であって、該DNAフラグメントが、該グルタミンシンセターゼ阻害剤に対するアセチルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードする、方法。
[本発明1018]
ホスフィノトリシンまたはホスフィノトリシン部分を有する化合物を含むグルタミンシンセターゼ阻害剤の除草活性に対して耐性である植物を作製する方法であって、
(a)本発明1001の植物細胞を作製する工程、および
(b)該細胞から、核ゲノムに前記ポリヌクレオチドを含む植物体を再生させる工程
を含む、方法。
[本発明1019]
雑草を駆除することにより、圃場における栽培植物の群を保護する方法であって、該植物が、その細胞のゲノムに本発明1004のベクターが組み入れられており、該雑草が、活性成分としてグルタミンシンセターゼ阻害剤を含む除草剤の適用によって駆除される、方法。
[本発明1020]
(i)
(a)該出発植物細胞のポリメラーゼによって認識されるプロモーター、および
(b)ホスフィノトリシンまたはホスフィノトリシン部分を有する化合物を含むグルタミンシンセターゼ阻害剤を産生するストレプトマイセス・セリカラーA3微生物に由来するDNAフラグメントを含むコード領域
を含む外来DNAを用いて、植物細胞培養物中の出発植物細胞を形質転換する工程;ならびに
(ii)非形質転換植物細胞を殺傷するために十分な濃度のグルタミンシンセターゼ阻害剤を植物細胞培養物に適用することにより形質転換植物細胞を選択する工程
を含む、核ゲノムに組み入れられた外来DNAを有する形質転換植物細胞の純粋培養物を作製する方法。
[本発明1021]
変異タンパク質を作製するためにSEQ ID NO:2を含むタンパク質を修飾する工程、およびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ活性について該変異タンパク質を分析する工程を含む、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ活性を有する合成タンパク質を作製する方法。
[本発明1022]
複数の修飾ポリヌクレオチドを作出するためにSEQ ID NO:1およびSEQ ID NO:3からなる群より選択されるポリヌクレオチドを修飾する工程、ならびに該修飾ポリヌクレオチドを遺伝子シャッフリング手法において使用する工程を含む、本発明1021の方法。
[本発明1023]
SEQ ID NO:1およびSEQ ID NO:3からなる群より選択されるポリヌクレオチドをエラープローンPCRにより修飾する工程を含む、本発明1021の方法。
[本発明1024]
前記アミノ酸配列のうちの少なくとも一つをコードする少なくとも一つのポリヌクレオチドを修飾する工程を含む、本発明1021の方法。
[本発明1025]
本発明1004のベクターを含む、ストレプトマイセス以外の細菌細胞。
[本発明1026]
(a)複数の植物細胞に本発明1004のベクターを提供する工程;および
(b)該ベクターを欠く細胞を殺傷しながらまたはそれらの増殖を阻害しながら該ポリヌクレオチドを発現する細胞が増殖することを可能にする除草剤の濃度において該複数の細胞を増殖させる工程
を含む、本発明1004のベクターを含む植物細胞を選択する方法であって、
該除草剤がホスフィノトリシンを含む、方法。
[本発明1027]
発現カセットが低コピー数バイナリーベクターの中に存在する、本発明1026の方法。
[本発明1028]
除草剤がビアロホスおよびグルホシネートからなる群より選択される、本発明1026の方法。
[本発明1029]
細菌発現系、植物細胞培養物発現系、藻類発現系、動物細胞発現系、ウイルス発現系、真菌発現系、および酵母発現系からなる群より選択される発現系において使用される、本発明1026の方法。
[本発明1030]
発現系がシュードモナス・フルオレセンス(Pseudomonas fluorescens)発現系である、本発明1029の方法。
[本発明1031]
AAD-1およびAAD-12からなる群より選択される除草剤抵抗性遺伝子をさらに含む、本発明1001のトランスジェニック植物細胞。
[本発明1032]
圃場にグリホセートを適用する工程をさらに含む方法であって、植物がグリホセート抵抗性遺伝子をさらに含む、本発明1019の方法。
[本発明1033]
圃場にイミダゾリノン除草剤を適用する工程をさらに含む方法であって、植物がイミダゾリノン抵抗性遺伝子をさらに含む、本発明1019の方法。
[本発明1034]
圃場に2,4-Dを適用する工程をさらに含む方法であって、植物がAAD-1およびAAD-12からなる群より選択される除草剤抵抗性遺伝子をさらに含む、本発明1019の方法。
[本発明1035]
圃場にアリールオキシフェノキシプロピオネート除草剤を適用する工程をさらに含む方法であって、植物がAAD-1除草剤抵抗性遺伝子をさらに含む、本発明1019の方法。
[本発明1036]
圃場にピリジルオキシアセテート除草剤を適用する工程をさらに含む方法であって、植物がAAD-12除草剤抵抗性遺伝子をさらに含む、本発明1019の方法。
[本発明1037]
DSM-2遺伝子を含有している個々の植物または作物植物の群を、該遺伝子を含有していない同一種の植物の集団から選択または区別する方法。
[本発明1038]
植物の集合にグルホシネートまたはビアロホスを適用する工程を含む、本発明1037の方法。
[本発明1039]
温室、グロースチャンバー、または圃場において実施される、本発明1037の方法。
[本発明1040]
少なくとも1種類の本発明1012のトランスジェニック植物の種子を圃場に植える工程を含み、
該圃場の少なくとも一部に、グルホシネート、ホスフィノトリシン、およびビアロホスからなる群より選択される第1の除草剤を適用する工程;ならびに
該圃場の少なくとも一部に少なくとも1種類の他の除草剤を適用する工程
をさらに含む、
圃場において少なくとも1種類の雑草を制御する方法であって、
該植物が、
グルタミンシンセターゼ阻害除草剤に対する抵抗性を付与する酵素をコードする異種ポリヌクレオチド、および
少なくとも1種類の他の除草剤に対する抵抗性を付与する酵素をコードする第2の異種ポリヌクレオチド
を含む、方法。
[本発明1041]
除草剤が連続的にまたは同時に適用される、本発明1040の方法。
[本発明1042]
第1の除草剤がグルタミンシンセターゼ阻害除草剤である、本発明1040の方法。
[本発明1043]
少なくとも1種類の他の除草剤が、2,4-D、アセトクロル、アシフルオルフェン、アロキシジム、アミドスルフロン、アミノピラリド、アトラジン、ベフルブタミド、ビスピリバック、ブタフェナシル、カフェンストロール、カルフェントラゾン、クロリムロン、クロロトルロン、シニドン-エチル、クレトジム、クロジナホップ、クロマゾン、クロプロキシジム(cloproxydim)、クロピラリド、クロランスラム、シアナジン、シクロスルファムロン、シクロキシジム、シハロホップ、ダイムロン、ジカンバ、ジクロホップ、ジクロルプロップ、ジクロスラム、ジフルフェニカン、ジメテナミド、ジクワット、ジチオピル、ジウロン、エタルフルラリン、フェノキサプロップ、フラザスルフロン、フロラスラム、フルアジホップ、フルカルバゾン、フルフェナセット、フルフェニカン、フルフェンピル(flufenpyr)、フルメツラム、フルミクロラック、フルミオキサジン、フルロキシピル、フルチアセト、ホメサフェン、ホラムスルフロン、グルホシネート、グリホセート、ハロサフェン(halosafen)、ハロスルフロン、ハロキシホップ、イマザメタベンズ、イマザモクス、イマザピク、イマザピル、イマザキン、イマゼタピル、イマゾスルフロン、ヨードスルフロン、イオキシニル、イソキサベン、イソキサフルトール、ラクトフェン、リヌロン、MCPA、メコプロップ、メフェナセット、メフルイジド、メソスルフロン、メソトリオン、メタミホップ、メタザクロル、メトスラム、メトリブジン、MSMA、ナプロパミド、ニコスルフロン、ノルフルラゾン、オリザリン、オキサジアゾン、オキシフルオルフェン、パラコート、ペブラート、ペンジメタリン、ペノクススラム、ピクロラム、ピコリナフェン(picolinafen)、ピノキサデン(pinoxaden)、プリミスルフロン、プロホキシジム、プロパニル、ピラフルフェン、ピラゾスルフロン、ピリベンゾキシム、ピリミノバック、ピリチオバック、ピロキサスルホン、ピロクススラム(pyroxsulam)、キンクロラック、キンメラック、キザロホップ、リムスルフロン、サフルフェナシル、セトキシジム、シマジン、スルコトリオン、スルフェントラゾン、スルホメツロン、テフリルトリオン(tefuryltrione)、テムボトリオン(tembotrione)、テプラロキシジム、テルバシル、チアゾピル、チジアズロン、チエンカルバゾン(thiencarbazone)、チフェンスルフロン、チオベンカルブ、トプラメゾン、トラルコキシジム、トリアスルフロン、トリベヌロン、トリクロピル、トリフロキシスルフロン、トリフルラリン、トリフルスルフロン、およびトリトスルフロン(tritosulfuron)からなる群より選択される、本発明1040の方法。
[本発明1044]
植物から試料を収集する工程、および前記ポリヌクレオチドの存在について該試料を分析する工程を含む、植物が本発明1008のポリヌクレオチドを含むか否かを検出する方法。
[本発明1045]
前記ポリヌクレオチドによってコードされたタンパク質の存在について試料を分析する工程を含む、本発明1044の方法。
[本発明1046]
前記ポリヌクレオチドの存在について検出するためにPCRプライマーまたはプローブを使用する工程を含む、本発明1044の方法。
[本発明1047]
前記タンパク質の存在について検出するために抗体を使用する工程を含む、本発明1044の方法。
[本発明1048]
バチルス・チューリンゲンシス、フォトラブダス、およびゼノラブダスからなる群より選択される生物に由来する昆虫抵抗性遺伝子をさらに含む、本発明1008の植物。
[本発明1049]
真菌抵抗性、ストレス耐性、収量の増加、油の性質の改善、繊維品質の改善、ウイルス抵抗性、熟成の遅延、低温耐性、および塩耐性からなる群より選択される農業形質のための遺伝子をさらに含む、本発明1008の植物。
[本発明1050]
少なくとも1種類の本発明1008の植物を圃場において生長させる工程、および該圃場の少なくとも一部にグルタミンシンセターゼ阻害除草剤を適用する工程を含む、圃場において少なくとも1種類の雑草を制御する方法。
[本発明1051]
除草剤グルホシネート、ビアロホス、およびホスフィノトリシンをさらに含む、本発明1050の方法。
[本発明1052]
植物が、グリホセート、グルホシネート、2,4-D、キザロホップ、イマゼタピル、クロルスルフロン、ジカンバ、メソトリオン、イソキサフルトール、およびブタフェナシルからなる群より選択される除草剤に対して抵抗性である、本発明1050の方法。
[本発明1053]
植物が単子葉植物である、本発明1024の方法。
[本発明1054]
単子葉植物が、トウモロコシ、イネ、コムギ、オオムギ、ライムギ、サトウキビ、暖地型および寒地型の芝草、オートムギ、ソルガム、および牧草からなる群より選択される、本発明1053の方法。
[本発明1055]
植物が双子葉植物である、本発明1024の方法。
[本発明1056]
温室、グロースチャンバー、または圃場において実施される方法であって、DSM-2遺伝子が選択マーカーとして機能する、本発明1037の方法。
[本発明1057]
ポリヌクレオチドが、植物における発現を増加させるためのコドン使用頻度を有する、本発明1012の植物。
[本発明1058]
ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むトランスジェニックダイズ植物であって、該ポリヌクレオチドが、65℃で6×SSCという条件の下で、SEQ ID NO:2をコードする核酸プローブの完全な相補体とハイブリダイズする、トランスジェニックダイズ植物。
[本発明1059]
ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むトランスジェニックトウモロコシ植物であって、該ポリヌクレオチドが、65℃で6×SSCという条件の下で、SEQ ID NO:2をコードする核酸プローブの完全な相補体とハイブリダイズする、トランスジェニックトウモロコシ植物。
[本発明1060]
本発明1058または1059のトランスジェニック植物を作製するために、植物における発現を増加させるためのコドン使用頻度を有するポリヌクレオチドを使用する方法。
[本発明1061]
作物植物にポリヌクレオチドを組み込む工程を含む、植物に除草剤耐性を伝達するためにタンパク質を使用する方法であって、該ポリヌクレオチドが該タンパク質をコードし、かつ該タンパク質がホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ活性を有し、該ポリヌクレオチドが、65℃で6×SSCという条件の下で、SEQ ID NO:2をコードする核酸プローブの完全な相補体とハイブリダイズし、かつ該ポリヌクレオチドの発現および該タンパク質の産生が該植物をホスフィノトリシン除草剤耐性にする、方法。