【手続補正書】
【提出日】平成24年3月26日(2012.3.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞培養物の組成  を評価する方法であって、該方法が、
ａ）軟骨細胞の拡大のための細胞培養物を得；
ｂ）該細胞培養物から複数の細胞を選択し；
ｃ）この複数の細胞におけるミクロフィブリル結合タンパク質５（ＭＦＡＰ５）の平均発現レベルを決定し；次いで
ｄ）ＭＦＡＰ５の平均発現レベルに基づいて該培養物の組成を決定すること
を含むものであって、ここに、所定の閾値より低いＭＦＡＰ５の平均発現レベルが、該細胞培養物が軟骨細胞を含むことを示す、方法。
【請求項２】
さらに、複数の細胞における軟骨細胞マーカーの平均発現レベルを決定し、工程（ｄ）において、軟骨細胞マーカーの平均発現レベルおよびＭＦＡＰ５の平均発現レベルに基づいて該培養物の組成を決定することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ＭＦＡＰ５マーカーおよび軟骨細胞マーカーが、軟骨細胞におけるそれらの（ＭＦＡＰ５マーカーに対する軟骨細胞マーカーの）発現レベルの比率が皮膚の線維芽細胞または滑膜細胞と同等のまたは５倍高い比率であるものである、請求項２記載の方法。
【請求項４】
軟骨細胞マーカーが、ヒアルロン酸とプロテオグリカン連結タンパク質１（ＨＡＰＬＮ１）、マトリックスＧｌａタンパク質（ＭＧＰ）、ＧＦ様繰り返しとジスコイジンＩ様ドメイン３（ＥＤＩＬ３）、ＷＮＴ１誘導性シグナル経路タンパク質３（ＷＩＳＰ３）、アグレカン１（ＡＧＣ１）、軟骨オリゴマー基質タンパク質（ＣＯＭＰ）、ＩＩ型コラーゲン アルファ１（ＣＯＬ２Ａ１）、ＩＸ型コラーゲン アルファ１（ＣＯＬ９Ａ１）、ＸＩ型コラーゲン アルファ１（ＣＯＬ１１Ａ１）、白血球細胞由来ケモタキシン１タンパク質（ＬＥＣＴ１）、Ｓ１００カルシウム結合タンパク質ベータ（Ｓ１００Ｂ）、軟骨酸性タンパク質１（ＣＲＴＡＣ１）、ＳＲＹ−ボックス９タンパク質（ＳＯＸ９）、およびネブレット（ＮＥＢＬ）からなる群から選択される、請求項２記載の方法。
【請求項５】
軟骨細胞マーカーがＨＡＰＬＮ１である、請求項２記載の方法。
【請求項６】
ＭＦＡＰ５および軟骨細胞マーカーの発現レベルが、ＲＮＡレベルで決定される、請求項２記載の方法。
【請求項７】
発現レベルが、ＰＣＲを用いて決定される、請求項６記載の方法。
【請求項８】
発現レベルが、比較ＣＴＰＣＲ法を用いて決定される、請求項７記載の方法。
【請求項９】
比較ＣＴＰＣＲ法を用いて決定される場合、０．２５より高いＭＦＡＰ５に対する軟骨細胞マーカーの発現レベルの比率が、細胞培養物が軟骨細胞  を含むことを示す、請求項２記載の方法。
【請求項１０】
０．５５より高いＭＦＡＰ５に対する軟骨細胞マーカーのモル比が、細胞培養物が軟骨細胞を含むことを示す、請求項２記載の方法。
【請求項１１】
細胞培養物が、軟骨の生検から得られた細胞を含む、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
軟骨の生検が、膝関節から取得されるものである、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
細胞培養物の評価後の細胞培養物由来の細胞が、それを必要とする患者に投与されるためのものである、請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
培養物由来の細胞が、自家培養軟骨細胞の移植に用いられるためのものである、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
細胞培養物の組成を評価する方法であって、該方法が、
ａ）軟骨細胞の拡大のための細胞培養物を得；
ｂ）該細胞培養物中のＭＦＡＰ５の発現レベルを決定し；次いで
ｃ）ＭＦＡＰ５の発現レベルに基づいて細胞培養物の組成を決定すること
を含むものである方法。
【請求項１６】
さらに、細胞培養物中の軟骨細胞マーカーの発現レベルを決定し、工程ｃ）において、軟骨細胞マーカーおよびＭＦＡＰ５の発現レベルに基づいて細胞培養物の組成を決定することを含む、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
軟骨細胞マーカーが、ヒアルロン酸とプロテオグリカン連結タンパク質１（ＨＡＰＬＮ１）、マトリックスＧｌａタンパク質（ＭＧＰ）、ＧＦ様繰り返しとジスコイジンＩ様ドメイン３（ＥＤＩＬ３）、ＷＮＴ１誘導性シグナル経路タンパク質３（ＷＩＳＰ３）、アグレカン１（ＡＧＣ１）、軟骨オリゴマー基質タンパク質（ＣＯＭＰ）、ＩＩ型コラーゲン アルファ１（ＣＯＬ２Ａ１）、ＩＸ型コラーゲン アルファ１（ＣＯＬ９Ａ１）、ＸＩ型コラーゲン アルファ１（ＣＯＬ１１Ａ１）、白血球細胞由来ケモタキシン１タンパク質（ＬＥＣＴ１）、Ｓ１００カルシウム結合タンパク質ベータ（Ｓ１００Ｂ）、軟骨酸性タンパク質１（ＣＲＴＡＣ１）、ＳＲＹ−ボックス９タンパク質（ＳＯＸ９）、およびネブレット（ＮＥＢＬ）からなる群から選択されるものである、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
軟骨細胞マーカーがＨＡＰＬＮ１である、請求項１６記載の方法。
【請求項１９】
軟骨細胞マーカーおよびＭＦＡＰ５の発現レベルが、ＲＮＡレベルで決定される、請求項１６記載の方法。
【請求項２０】
細胞培養物の組成  を評価する方法であって、該方法が、
ａ）哺乳動物由来の軟骨の生検を得；
ｂ）前記生検から細胞を単離し；
ｃ）該単離された細胞を細胞培養物中で培養して軟骨細胞を生産し；
ｄ）前記細胞培養物から得られた複数の細胞におけるＭＦＡＰ５およびＨＡＰＬＮ１の発現レベルを決定し；次いで
ｅ）ＭＦＡＰ５およびＨＡＰＬＮ１の発現レベルに基づいて該培養物の組成を決定すること
を含むものである方法。
【請求項２１】
ＭＦＡＰ５およびＨＡＰＬＮ１の発現レベルが、ＲＮＡレベルで決定される、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
発現レベルがＰＣＲを用いて決定される、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
発現レベルが比較ＣＴＰＣＲ法を用いて決定される、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
比較ＣＴＰＣＲ法を用いて決定される場合、０．２５より高いＭＦＡＰ５に対するＨＡＰＬＮ１の発現レベルの比率が、細胞培養物が軟骨細胞を含むことを示す、請求項２０記載の方法。
【請求項２５】
０．５５より高いＭＦＡＰ５に対するＨＡＰＬＮ１のモル比が、細胞培養物が軟骨細胞を含むことを示す、請求項２０記載の方法。
【請求項２６】
細胞培養物の組成を評価する方法であって、該方法が、
ａ）哺乳動物由来の軟骨の生検を得；
ｂ）前記生検から細胞を単離し；
ｃ）該単離された細胞を細胞培養物中で培養して軟骨細胞を生産し；
ｄ）前記細胞培養物から得られた複数の細胞におけるＭＦＡＰ５および軟骨細胞マーカーの発現レベルを決定し；次いで
ｅ）ＭＦＡＰ５および軟骨細胞マーカーの発現レベルに基づいて該細胞培養物の軟骨細胞の存在を決定すること
を含むものである方法。
【請求項２７】
軟骨細胞マーカーが、ヒアルロン酸とプロテオグリカン連結タンパク質１（ＨＡＰＬＮ１）、マトリックスＧｌａタンパク質（ＭＧＰ）、ＧＦ様繰り返しとジスコイジンＩ様ドメイン３（ＥＤＩＬ３）、ＷＮＴ１誘導性シグナル経路タンパク質３（ＷＩＳＰ３）、アグレカン１（ＡＧＣ１）、軟骨オリゴマー基質タンパク質（ＣＯＭＰ）、ＩＩ型コラーゲン アルファ１（ＣＯＬ２Ａ１）、ＩＸ型コラーゲン アルファ１（ＣＯＬ９Ａ１）、ＸＩ型コラーゲン アルファ１（ＣＯＬ１１Ａ１）、白血球細胞由来ケモタキシン１タンパク質（ＬＥＣＴ１）、Ｓ１００カルシウム結合タンパク質ベータ（Ｓ１００Ｂ）、軟骨酸性タンパク質１（ＣＲＴＡＣ１）、ＳＲＹ−ボックス９タンパク質（ＳＯＸ９）、およびネブレット（ＮＥＢＬ）からなる群から選択されるものである、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
軟骨細胞マーカーがＨＡＰＬＮ１である、請求項２６記載の方法。
【請求項２９】
細胞培養物の組成を評価する方法であって、該方法が、
ａ）軟骨または滑膜由来の細胞を含む細胞培養物から複数の細胞を得；次いで
ｂ）この複数の細胞におけるミクロフィブリル結合タンパク質５（ＭＦＡＰ５）の平均発現レベルを決定すること
を含むものであって、ここに、所定の閾値より低いＭＦＡＰ５の平均発現レベルが、該細胞培養物が軟骨細胞を含むことを示す、方法。
【請求項３０】
軟骨細胞培養物の組成を評価して、線維芽細胞および／または滑膜細胞の存在を同定する方法であって、該方法が、
ａ）軟骨細胞培養物から複数の細胞を得；次いで
ｂ）この複数の細胞におけるミクロフィブリル結合タンパク質５（ＭＦＡＰ５）の平均発現レベルを決定すること
を含むものであって、ここに、所定の閾値より高いＭＦＡＰ５の平均発現レベルが、該細胞培養物が線維芽細胞および／または滑膜細胞を含むことを示す、方法。
【請求項３１】
細胞培養物の組成を評価して、線維芽細胞および／または滑膜細胞に対する軟骨細胞の比率を決定する方法であって、該方法が、
ａ）軟骨細胞培養物の細胞カウントを行い；
ｂ）該細胞培養物から複数の細胞を得；次いで
ｃ）この複数の細胞におけるミクロフィブリル結合タンパク質５（ＭＦＡＰ５）の平均発現レベルを決定すること
を含むものであって、ここに、所定の閾値より高いＭＦＡＰ５の平均発現レベルが、該細胞培養物が軟骨細胞より、線維芽細胞および／または滑膜細胞を多く含むことを示し、所定の閾値より低いＭＦＡＰ５の平均発現レベルが、該細胞培養物が線維芽細胞および／または滑膜細胞より、軟骨細胞を多く含むことを示す、方法。
【請求項３２】
さらに、複数の細胞における軟骨細胞マーカーの平均発現レベルを決定し、軟骨細胞マーカーおよびＭＦＡＰ５の発現レベルに基づいて線維芽細胞および／または滑膜細胞に対する軟骨細胞の比率を決定することを含む、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
軟骨細胞マーカーが、ヒアルロン酸とプロテオグリカン連結タンパク質１（ＨＡＰＬＮ１）、マトリックスＧｌａタンパク質（ＭＧＰ）、ＧＦ様繰り返しとジスコイジンＩ様ドメイン３（ＥＤＩＬ３）、ＷＮＴ１誘導性シグナル経路タンパク質３（ＷＩＳＰ３）、アグレカン１（ＡＧＣ１）、軟骨オリゴマー基質タンパク質（ＣＯＭＰ）、ＩＩ型コラーゲン アルファ１（ＣＯＬ２Ａ１）、ＩＸ型コラーゲン アルファ１（ＣＯＬ９Ａ１）、ＸＩ型コラーゲン アルファ１（ＣＯＬ１１Ａ１）、白血球細胞由来ケモタキシン１タンパク質（ＬＥＣＴ１）、Ｓ１００カルシウム結合タンパク質ベータ（Ｓ１００Ｂ）、軟骨酸性タンパク質１（ＣＲＴＡＣ１）、ＳＲＹ−ボックス９タンパク質（ＳＯＸ９）、およびネブレット（ＮＥＢＬ）からなる群から選択されるものである、請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
軟骨細胞マーカーがＨＡＰＬＮ１である、請求項３２記載の方法。