(57)【要約】【課題】有害物質の検出感度の高い有害物質検出方法および有害物質検出システムを提供することを課題とするものである。【解決手段】被試験液体に、４−メチルウンベリフェリルβ−Ｄ−ガラクトピラノシドなど発色酵素基質と上記発色酵素基質と反応して発色物質を生成するβ−ガラクトシダーゼなどの酵素を有する大腸菌を添加てそれらを反応させ、生成した蛍光物質を定量し、蛍光質の量が上記発色酵素基質を添加しない場合の量と有意差がある場合に有害物が存在すると判定する。有害物質検出システムは、被試験液体を採取する採取装置１１、採取された上記被試験液体に発色性酵素基質と発色性酵素基質と反応して蛍光物質を生成する酵素を有する菌体とを添加する添加装置１２、発色性酵素基質と菌体とが添加された被試験液体における蛍光物質の量を定量する定量装置１５備えている。【選択図】        図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
被試験液体に、発色酵素基質および上記発色酵素基質と反応して発色物質または蛍光物質を生成する酵素を有する菌体を添加する第一工程、上記第一工程において生成した上記発色物質または上記蛍光物質の量を定量する第二工程、および上記第二工程において定量された上記発色物質または上記蛍光物質の量に基づく上記酵素の酵素活性の変化から有害物質を検出する第三工程を含むことを特徴とする有害物質検出方法。
【請求項２】
上記酵素は、β−ガラクトシダーゼおよび／またはβ−グルクロニダーゼであり、上記菌体は大腸菌または大腸菌群であることを特徴とする請求項１記載の有害物質検出方法。
【請求項３】
上記発色酵素基質は、上記酵素がβ−ガラクトシダーゼである場合、４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、Ｘ−ＧＡＬ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）、サーモンＧＡＬ（６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）、ＯＮＰＧ（Ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）、および４−トリフルオロウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドからなる群に含まれる少なくとも一種であり、上記酵素がβ−グルクロニダーゼである場合、ＭＵＧ（４−メチルウンベリフェリルβ−Ｄ−グルクロニド）、Ｘ−グルクロニド（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド）、および４−トリフルオロウンベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニドからなる群に含まれる少なくとも一種であることを特徴とする請求項１または請求項２記載の有害物質検出方法。
【請求項４】
被試験液体を採取する採取装置、採取された上記被試験液体に発色酵素基質と上記発色酵素基質と反応して発色物質または蛍光物質を生成する酵素を有する菌体とを添加する添加装置、上記発色酵素基質と上記菌体と上記被試験液体とを反応させる反応装置、上記反応装置内における上記発色物質または上記蛍光物質の量を定量する定量装置を備えたことを特徴とする有害物質検出システム。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、有害物質検出方法および有害物質検出システムに関し、詳しくは液体中に存在する有害な金属あるいはその他の有害物質の有無を検出する方法およびシステムに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
河川水、湖水、各種の排水などに有害物質が含まれている場合、それを事前に検知して、公共用水域への当該有害物質の拡散を未然に防止することを課題として、排水などから採取した試料水に試供菌体を添加した後、この菌体内のＡＴＰ濃度の変化から当該排水中の砒素、銅、亜鉛、鉄、フッ素、鉛、シアンなどの有害物質を検知する際に、上記試供菌体としてサルモネラ菌を用いることは、後記特許文献１から従来公知である。また試供菌体内のＡＴＰ濃度の変化から当該排水中の有害物質を検知する際に、添加される大腸菌およびサルモネラ菌の濃度をそれぞれ約１×１０６個／ミリリットルおよび約５×１０６個／ミリリットルとすることも後記特許文献２から従来公知である。あるいは、試料中に含まれている有害物質が微生物の物質代謝に及ぼす作用を測定することによって有害物質を検出する方法において、試料中に有害物質が存在する証拠として、当該有害物質が細菌のホスホトランスフェラーゼ系に及ぼす抑制作用を利用する有害物質検出法も後記特許文献３から従来公知である。
【０００３】
【特許文献１】
特開２００１−３４６５９７号公報（段落番号１１、請求項１）
【特許文献２】
特開２００１−２３１５９８号公報（段落番号１１、請求項１〜請求項３）
【特許文献３】
特開平８−３３４９９号公報（請求項１）
【０００４】
しかしながら、菌体内のＡＴＰ濃度の変化やホスホトランスフェラーゼ系に対する抑制作用から液体中の有害物質を検出する方法では、ＡＴＰ抽出試薬を個々の菌体に対して均一に作用させることが困難であり、また検出感度はＡＴＰ抽出量に比例するので、再現性が悪い問題があり、また或る特定の有害物質以外は、検出感度上から検出できない問題もある。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、従来技術における如上の現況に鑑みて、液体中に含まれる有害物質に対する検出感度の高い有害物質検出方法および有害物質検出システムを提供することを課題とするものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明の請求項１に係る有害物質検出方法は、被試験液体に、発色酵素基質および上記発色酵素基質と反応して発色物質または蛍光物質を生成する酵素を有する菌体を添加する第一工程、上記第一工程において生成した上記発色物質または上記蛍光物質の量を定量する第二工程、および上記第二工程において定量された上記発色物質または上記蛍光物質の量に基づく上記酵素の酵素活性の変化から有害物質を検出する第三工程を含むことを特徴とするものである。
【０００７】
本発明の請求項４に係る有害物質検出装置は、被試験液体を採取する採取装置、採取された上記被試験液体に発色性酵素基質と上記発色性酵素基質と反応して発色物質を生成する酵素を有する菌体とを添加する添加装置、上記発色性酵素基質と上記菌体とが添加された上記被試験液体における上記発色物質の量を定量する定量装置を備えたことを特徴とするものである。
【０００８】
【発明の実施の形態】
実施の形態１．
図１は、本発明の有害物質検出システムにおける実施の形態１を説明する概略ブロック図であって、有害物質検出システム１は、採取装置１１、添加装置１２、反応装置１３、定量装置１４、および制御装置１５を備えている。なお図１において、１６は液処理装置である。
【０００９】
河川水、湖水、各種の排水、あるいはその他の検査対象液体は、その一部が採取装置１１により採取され、採取された被試験液体は反応装置１３内に投入され、さらに反応装置１３内に前記発色酵素基質、ｐＨ緩衝液、および前記菌体が添加され、かく投入、添加された反応装置１３内のそれら内容物は、一定温度下のもとで攪拌下に保持される。その状態において当該内容物は反応し、当該被試験液体に有害物質が含有されていると、その含有量に応じて発色物質または蛍光物質が生成し、その生成量は経時的に変化する。よって上記内容物の一部は、時々採取され、上記の生成量が定量装置１において定量される。定量装置１による定量の結果は、逐一制御装置１５に入力され、制御装置１５により上記被試験液体中に有害物質が法定排水基準値以上に含有されているか否かが判断される。また制御装置１５により法定排水基準値以上含有されていると判断されると、その情報が液処理装置１６に入力され、上記検査対象液体は有害物質の除去のために液処理装置１６において液処理される。
【００１０】
上記の発色酵素基質、菌体などに就いての具体例、各添加量、およびその他の事項に就いては、本発明の有害物質検出方法に関する後記の諸実施の形態において詳述する。
【００１１】
実施の形態２．
実施の形態２においては、前記の発色酵素基質として４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（以下、４−ＭＵＧ）が用いられ、また前記の菌体として大腸菌が用いられた。大腸菌は、前記の酵素としてβ−ガラクトシダーゼを有し、４−ＭＵＧは、β−ガラクトシダーゼの触媒作用により加水分解反応が促進されて４−メチルウンベリフェロンを生成する。この４−メチルウンベリフェロンは、蛍光物質であって、その生成量は蛍光光度計にて定量された。
【００１２】
以下、実施の形態２を詳細に説明する。先ず被試験液体の模擬的な一例として、クロム量換算濃度で０．０５ｍｇ／リットルの重クロム酸カリ［Ｋ２Ｃｒ２Ｏ７］水溶液（以下、被試験液体−１）が用いられた。それに４−ＭＵＧがその濃度が０．００５重量％となるように添加され、さらにｐＨ緩衝化のためにリン酸緩衝液がその濃度が０．１Ｍ（モル／リットル）となるように添加され、かくしてｐＨ７．０の被試験液体−１が得られた。つぎにそれを３７℃に保温し、被試験液体−１の当該保温温度が安定したときに大腸菌がその菌体濃度が約１．４×１０５個／ミリリットルとなるように添加、攪拌され、その後は引き続き攪拌が行われた状態で同温度に保持された。なお大腸菌が添加された時点をもって４−ＭＵＧとβ−ガラクトシダーゼとの反応開始時点とし、その後は時々被試験液体−１が少量採取され、当該採取液に水酸化ナトリウム水溶液が添加されてｐＨがアルカリ側となるようにされ、ついで蛍光光度計を用いて励起波長を３８５ｎｍとし、且つ蛍光測定波長を４５０ｎｍに設定して４−メチルウンベリフェロンの生成量が測定され、その経時変化が調べられた。
【００１３】
またクロム量換算濃度で０．５ｍｇ／リットルの重クロム酸カリ水溶液（被試験液体−２）、同５．０ｍｇ／リットルの重クロム酸カリ水溶液（被試験液体−３）、およびブランクとして重クロム酸カリあるいはその他の有害物質を含まないイオン交換水（被試験液体−４）が用意され、それらに就いて被試験液体−１の場合と同じ条件で４−メチルウンベリフェロンの生成量の経時変化が調べられた。なお重クロム酸カリなど、６価クロムおよびその化合物の法定排出規準は０．５ｍｇ／リットルであって、被試験液体−１の６価クロム量は上記規準未満、被試験液体−２は上記規準と同じ、被試験液体−３は上記規準を越える量とされている。
【００１４】
図２は、横軸を反応時間（ｍｉｎ）とし、縦軸を被試験液体−４におけるβ−ガラクトシダーゼ活性を１００％としたときの被試験液体−１〜被試験液体−３の各β−ガラクトシダーゼ活性の変化率を示す。４−メチルウンベリフェロンの生成量の経時変化から、β−ガラクトシダーゼ活性の経時変化の定量が可能となり、また大腸菌の活性の経時変化の見積が可能となって、上記の各被試験液体中の有害物質（ここでは、クロム）の有無の判定が可能となる。図２に示すように、重クロム酸カリの含有量が少ない被試験液体−１ではβ−ガラクトシダーゼ活性の変化率の低下は見られないが、被試験液体−３では当該変化率は大きく低下している。一方、被試験液体−２では、被試験液体−３ほどではないにしても、被試験液体−１に就いてのデータと対比したとき、その低下を明確に確認することができる。よって実施の形態２は、被試験液体−２におけるβ−ガラクトシダーゼ活性の減少から６価クロムの少なくとも法定排出規準以上の含有を検出することが可能なることが明らかである。
【００１５】
実施の形態３．
実施の形態３においては、被試験液体の模擬的な他の例として、カドミウムの法定排出規準が０．１ｍｇ／リットルであることを考慮して、カドミウム量換算濃度で０．０１ｍｇ／リットルの硝酸カドミウム［Ｃｄ（ＮＯ３）２］水溶液（被試験液体−５）、同０．１ｍｇ／リットルの硝酸カドミウム水溶液（被試験液体−６）、および同１．０ｍｇ／リットルの硝酸カドミウム水溶液（被試験液体−７）が用意され、それらに就いて被試験液体−４と共に実施の形態２の場合と同じ条件（大腸菌：約１．４×１０５個／ミリリットルなど）で４−メチルウンベリフェロンの生成量が測定され、その経時変化が調べられた。それらの結果を図３に示す。
【００１６】
図３は、図２と同じく、横軸を反応時間（ｍｉｎ）とし、縦軸を被試験液体−４におけるβ−ガラクトシダーゼ活性を１００％としたときの被試験液体−５〜被試験液体−７の各β−ガラクトシダーゼ活性の変化率を示す。図３に示すように、被試験液体−６および被試験液体−７は勿論のこと、カドミウムの含有量がその法定排出規準より１オーダー少ない被試験液体−５においてもβ−ガラクトシダーゼ活性の変化率の低下は明確であって、よって実施の形態３は、被試験液体−５におけるβ−ガラクトシダーゼ活性の減少からカドミウムの少なくとも法定排出規準以上の含有を検出することが可能なることが明らかである。
【００１７】
実施の形態４．
実施の形態４においては、発色酵素基質として前記４−ＭＵＧに代えて、Ｘ−ＧＡＬ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）（以下、Ｘ−ＧＡＬ）が用いられた以外は、前記実施の形態２における被試験液体−２および被試験液体−４についての試験と同じ試験が行われた。その結果、被試験液体−４に対して被試験液体−２における大腸菌内のβ−ガラクトシダーゼ活性に明らかな減少が見られ、６価クロムの前記法定排出規準以上の含有を検出することが可能なることが明らかであった。
【００１８】
実施の形態５．
実施の形態５においては、発色酵素基質として前記４−ＭＵＧに代えて、サーモンＧＡＬ（６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）（以下、サーモンＧＡＬ）が用いられた以外は、前記実施の形態２における被試験液体−２および被試験液体−４についての試験と同じ試験が行われた。その結果、被試験液体−４に対して被試験液体−２における大腸菌内のβ−ガラクトシダーゼ活性に明らかな減少が見られ、６価クロムの前記法定排出規準以上の含有を検出することが可能なることが明らかであった。
【００１９】
実施の形態６．
実施の形態６においては、発色酵素基質として前記４−ＭＵＧに代えて、ＯＮＰＧ（Ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）（以下、ＯＮＰＧ）が用いられた以外は、前記実施の形態２における被試験液体−２および被試験液体−４についての試験と同じ試験が行われた。その結果、被試験液体−４に対して被試験液体−２における大腸菌内のβ−ガラクトシダーゼ活性に明らかな減少が見られ、６価クロムの前記法定排出規準以上の含有を検出することが可能なることが明らかであった。
【００２０】
実施の形態７．
実施の形態７においては、発色酵素基質として前記４−ＭＵＧに代えて、Ｘ−ＧＡＬが用いられた以外は、前記実施の形態３における被試験液体−６および被試験液体−４についての試験と同じ試験が行われた。その結果、被試験液体−４に対して被試験液体−６における大腸菌内のβ−ガラクトシダーゼ活性に明らかな減少が見られ、カドミウムの前記法定排出規準以上の含有を検出することが可能なることが明らかであった。
【００２１】
実施の形態８．
実施の形態８においては、発色酵素基質として前記４−ＭＵＧに代えて、サーモンＧＡＬが用いられた以外は、前記実施の形態３における被試験液体−６および被試験液体−４についての試験と同じ試験が行われた。その結果、被試験液体−４に対して被試験液体−６における大腸菌内のβ−ガラクトシダーゼ活性に明らかな減少が見られ、カドミウムの前記法定排出規準以上の含有を検出することが可能なることが明らかであった。
【００２２】
実施の形態９．
実施の形態９においては、発色酵素基質として前記４−ＭＵＧに代えて、ＯＮＰＧが用いられた以外は、前記実施の形態３における被試験液体−６および被試験液体−４についての試験と同じ試験が行われた。その結果、被試験液体−４に対して被試験液体−６における大腸菌内のβ−ガラクトシダーゼ活性に明らかな減少が見られ、カドミウムの前記法定排出規準以上の含有を検出することが可能なることが明らかであった。
【００２３】
実施の形態１０．
実施の形態１０においては、発色酵素基質としてＭＵＧ（４−メチルウンベリフェリルβ−Ｄ−グルクロニド）（以下、ＭＵＧ）が用いられ、また菌体として大腸菌が用いられた。大腸菌は、酵素としてβ−ガラクトシダーゼ以外にβ−グルクロニダーゼを有し、ＭＵＧは、β−グルクロニダーゼの触媒作用により加水分解反応が促進されて４−メチルウンベリフェロンを生成する。この４−メチルウンベリフェロンは、蛍光物質であって、その生成量は蛍光光度計にて定量される。しかして実施の形態１０では、前記実施の形態２とは４−ＭＵＧに代えてＭＵＧが用いられた点において異なるが、実施の形態２と同じ方法にて前記被試験液体−２および被試験液体−４について試験が行われた。その結果、被試験液体−４に対して被試験液体−２における大腸菌内のβ−グルクロニダーゼ活性に明らかな減少が見られ、６価クロムの前記法定排出規準以上の含有を検出することが可能なることが明らかであった。
【００２４】
実施の形態１１．
実施の形態１１においては、発色酵素基質として前記ＭＵＧに代えてＸ−グルクロニド（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド）（以下、Ｘ−グルクロニド）が用いられた点において実施の形態１０と異なり、それ以外は実施の形態１０と同じ方法にて前記被試験液体−２および被試験液体−４について試験が行われた。その結果、被試験液体−４に対して被試験液体−２における大腸菌内のβ−グルクロニダーゼ活性に明らかな減少が見られ、６価クロムの前記法定排出規準以上の含有を検出することが可能なることが明らかであった。
【００２５】
実施の形態１２．
実施の形態１２においては、前記被試験液体−２に代えて前記被試験液体−６が用いられた点において実施の形態１０異なり、それ以外は実施の形態１０と同じ方法にて前記被試験液体−６および被試験液体−４について試験が行われた。その結果、被試験液体−４に対して被試験液体−６における大腸菌内のβ−グルクロニダーゼ活性に明らかな減少が見られ、カドミウムの前記法定排出規準以上の含有を検出することが可能なることが明らかであった。
【００２６】
実施の形態１３．
実施の形態１３においては、発色酵素基質として前記ＭＵＧに代えてＸ−グルクロニドが用いられた点において実施の形態１２と異なり、それ以外は実施の形態１２と同じ方法にて前記被試験液体−６および被試験液体−４について試験が行われた。その結果、被試験液体−４に対して被試験液体−６における大腸菌内のβ−グルクロニダーゼ活性に明らかな減少が見られ、カドミウムの前記法定排出規準以上の含有を検出することが可能なることが明らかであった。
【００２７】
酵素がβ−ガラクトシダーゼである場合における発色酵素基質として４−トリフルオロウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、および酵素がβ−グルクロニダーゼである場合における発色酵素基質として４−トリフルオロウンベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニドも好ましい例であって、前記実施の形態２〜実施の形態１３において用いられた発色酵素基質と同様の検出が可能である。
【００２８】
実施の形態２〜実施の形態１３においては、有害物質の例として例えば６価クロムとカドミウムを取り上げて、それらの水質検査対象水中における含有量が各法定排水基準に達している場合にはその含有を明確に把握し得ることが示されたが、本発明はそれらのみならず、法定排水基準を定める総理府令の第１条の別第１に示された各種の有害物質、即ち鉛およびその化合物類、砒素およびその化合物類、水銀およびアルキル水銀その他の水銀化合物類、セレンおよびその化合物類、シアン化合物類、パラチオン、メチルパラチオン、メチルジメトン、およびニトロフェニルホスホノチオエートなどの有機リン化合物類、ポリ塩化ビフェニール、トリクロロエチレン、テトラクロロエチレン、ジクロロメタン、四塩化炭素、１，２−ジクロロエチレン、シス１，２−ジクロロエチレン、１，１，１−トリクロロエタン、１，１，２−トリクロロエタン、１，３−ジクロロプロペンなどの含塩素有機化合物類、チウラム、シマジン、チオベンカルプ、ベンゼンなどのその他の有機化合物類などについても実施の形態２〜実施の形態１３などと同様の方法にて含有の把握が可能である。
【００２９】
【発明の効果】
本発明の有害物質検出方法は、以上説明した通り、被試験液体に、発色酵素基質および上記発色酵素基質と反応して発色物質または蛍光物質を生成する酵素を有する菌体を添加する第一工程、上記第一工程において生成した上記発色物質または上記蛍光物質の量を定量する第二工程、および上記第二工程において定量された上記発色物質または上記蛍光物質の量に基づく上記酵素の酵素活性の変化から有害物質を検出する第三工程を含むことを特徴とするものであって、上記菌体が有する酵素活性の変化から有害物質の検出ものであるために、有害物質を再現性が良く、且つ高検出感度で検出可能な効果がある。
【００３０】
また本発明の有害物質検出システムは、以上説明した通り、被試験液体を採取する採取装置、採取された上記被試験液体に発色酵素基質と上記発色酵素基質と反応して発色物質または蛍光物質を生成する酵素を有する菌体とを添加する添加装置、上記発色酵素基質と上記菌体と上記被試験液体とを反応させる反応装置、上記反応装置内における上記発色物質または上記蛍光物質の量を定量する定量装置を備えたことを特徴とするものであるので、上記有害物質検出方法と同様の効果がある。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の有害物質検出装置における実施の形態１を説明する概略ブロック図。
【図２】本発明の有害物質検出方法における、重クロム酸カリ水溶液を被試験液体例とした実施の形態２での反応時間とβ−ガラクトシダーゼ活性の変化率を示すグラフ。
【図３】本発明の有害物質検出方法における、硝酸カドミウム水溶液を被試験液体例とした実施の形態３での反応時間とβ−ガラクトシダーゼ活性の変化率を示すグラフ。
【符号の説明】
１  有害物質検出装置、１１  採取装置、１２  添加装置、１３  反応装置、１４  定量装置、１５  制御装置、１６液処理装置。
【図１】
2004236572.tif 000003
【図２】
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【図３】
2004236572.tif 000005