(57)【要約】【課題】本発明は、PDEコア構築物を提供することを課題とする。【解決手段】改変された物理化学的特性を有する、修飾を受けたホスホジエステラーゼ(PDE)ポリペプチド、該修飾PDEポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、該ポリペプチドに対する抗体、および調製方法が提供された。このようなポリペプチドは、ホスホジエステラーゼ活性のアゴニストまたはアンタゴニストを同定するためのスクリーニングアッセイ法に有用である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ末端の欠失を伴うPDEポリペプチド配列を含むポリペプチドであって、凝集物の形成が減少しているポリペプチド。
【請求項２】
PDEポリペプチド配列が長い形態のPDEポリペプチド配列である、請求項1記載のポリペプチド。
【請求項３】
PDEポリペプチド配列がPDE4ポリペプチド配列である、請求項1または2記載のポリペプチド。
【請求項４】
PDEポリペプチド配列がPDE4Dポリペプチド配列である、請求項1〜3のいずれか一項記載のポリペプチド。
【請求項５】
全ポリペプチド調製品における非凝集ポリペプチドの比率が全ポリペプチドの55％〜100％である、請求項1〜4のいずれか一項記載のポリペプチド。
【請求項６】
ポリペプチド配列が、天然のPDEポリペプチドのLF1スプライス部位とUCR1起始点の最初のアミノ酸との間に位置する任意のアミノ酸から開始する、請求項1〜5のいずれか一項記載のポリペプチド。
【請求項７】
ポリペプチド配列が天然のPDEポリペプチドのLF1のスプライス部位から開始する、請求項1〜6のいずれか一項記載のポリペプチド。
【請求項８】
PDEポリペプチド配列の起始点が天然のPDEポリペプチドのUCR1起始点の13アミノ酸上流に位置する、請求項1〜7のいずれか一項記載のポリペプチド。
【請求項９】
PDE4Dポリペプチド配列が、D3、D4、D5、D6、D7、およびD8からなる群より選択される一つのアイソフォームの配列である、請求項4〜8のいずれか一項記載のポリペプチド。
【請求項１０】
ポリペプチドが一つまたは複数のセリン残基の突然変異を含有する、請求項1〜9のいずれか一項記載のポリペプチド。
【請求項１１】
セリン残基がアラニンまたはアスパラギン酸のいずれかに変異している、請求項10記載のポリペプチド。
【請求項１２】
セリン残基がSer54およびSer579からなる群より選択される、請求項10または11記載のポリペプチド。
【請求項１３】
ポリペプチドが減少したチューブリン会合を示す、請求項1〜9のいずれか一項記載のポリペプチド。
【請求項１４】
請求項1〜13のいずれか一項記載のポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド配列。
【請求項１５】
請求項14記載のポリヌクレオチド配列を含有する発現ベクターまたはウイルスであって、適合性を有する原核生物または真核生物の宿主細胞中で、該ポリヌクレオチド配列を直接発現することができる発現ベクターまたはウイルス。
【請求項１６】
ウイルスが組換えバキュロウイルスである、請求項15記載のウイルス。
【請求項１７】
請求項15または16記載の発現ベクターまたはウイルスによって形質転換されたまたはそれに感染した原核生物または真核生物の宿主細胞。
【請求項１８】
宿主細胞が昆虫細胞である、請求項17記載の宿主細胞。
【請求項１９】
請求項17または18記載の宿主細胞を、ポリペプチドが発現するような適切な培地中で培養する段階、および細胞から該ポリペプチドを精製する段階を含む、請求項1〜13のいずれか一項記載のポリペプチドを作製する方法。
【請求項２０】
宿主細胞が昆虫細胞である、請求項19記載のポリペプチドを作製する方法。
【請求項２１】
請求項19または20記載の方法によって作製される、請求項1〜13のいずれか一項記載のポリペプチド。
【請求項２２】
請求項1〜13のいずれか一項記載のポリペプチドに対する抗体。
【請求項２３】
請求項1〜13のいずれか一項記載のポリペプチドのN末端ドメインのエピトープに結合する、請求項22記載の抗体。
【請求項２４】
請求項1〜13のいずれか一項記載のポリペプチドの少なくとも一つを含む、ホスホジエステラーゼ活性のアゴニストまたはアンタゴニストを同定するためのスクリーニングアッセイ法。
【請求項２５】
炎症性疾患を治療するための薬剤候補を同定および取得するための方法であって、請求項1〜13のいずれか一項記載のポリペプチドのホスホジエステラーゼ活性の活性化または阻害を測定する段階を含む方法。
【請求項２６】
請求項24記載のアッセイ法または請求項25記載の方法によって同定される化合物。
【請求項２７】
請求項1〜13のいずれか一項記載のポリペプチドのホスホジエステラーゼ活性のアゴニストまたはアンタゴニストと、薬学的に許容される担体とを含有する薬学的組成物。
【請求項２８】
炎症性疾患を治療するための医薬品の調製を目的とする、請求項1〜13のいずれか一項記載のポリペプチドまたは薬学的に許容されるその塩のホスホジエステラーゼ活性のアゴニストまたはアンタゴニストの使用。
【請求項２９】
ホスホジエステラーゼ活性のアゴニストまたはアンタゴニストを同定するための、請求項1〜13のいずれか一項記載のポリペプチドの使用。
【請求項３０】
結晶化のための、請求項1〜13のいずれか一項記載のポリペプチドの使用。
【請求項３１】
請求項1〜13のいずれか一項記載のポリペプチドを、X線結晶解析に適切な状態に結晶化させる段階、および該ポリペプチドについてX線結晶解析を実施する段階を含む、アゴニストまたはアンタゴニストの候補をホスホジエステラーゼと相互作用する能力についてアッセイする方法。
【請求項３２】
請求項1〜13のいずれか一項記載のポリペプチドを少なくとも一つ含む、ホスホジエステラーゼ活性のアゴニストまたはアンタゴニストを同定するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、修飾を受けたホスホジエステラーゼ(PDE)ポリペプチドであって、PDEのアゴニストまたはアンタゴニストを同定するためのスクリーニングアッセイ法、該修飾PDEポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、該ポリペプチドに対する抗体、該ポリペプチドの調製方法および使用に特に有用な改変された物理化学的特性を有するポリペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
ホスホジエステラーゼ(PDE)は、(cAMPを含む)種々の環状ヌクレオシド一リン酸の加水分解を触媒する酵素ファミリーを代表する。種々のホルモンおよび神経伝達物質が結合した細胞表面レセプターからその細胞の内部へインパルスを伝えることによって、これらの環状ヌクレオチドが細胞内セカンドメッセンジャーとして機能することが分かっている。ホスホジエステラーゼの役割は、メッセンジャーの仕事が一旦完了した環状モノヌクレオチドを分解することであり、それによって、細胞内の環状ヌクレオチドのレベルが制御され、環状ヌクレオチドのホメオスタシスが維持される。
【０００３】
PDEには10種のファミリーが同定されており、PDE1からPDE10と称されている。それぞれのファミリー内において、関連性はあるが別個の二種以上の遺伝子産物(A、B、Cなど)が存在し、そしてこれらの代替的なmRNAのそれぞれについてのプロセシングによって、多様なスプライス変異体が生じ、最新の推奨命名法(非特許文献１)にしたがって、アラビア数字を追加して特定する。
【０００４】
現在までに同定されているすべてのPDE遺伝子産物は、一つの触媒ドメインと、少なくとも一つの調節ドメインとを有する。触媒ドメインはそれぞれのPDEタンパク質のカルボン酸末端に向かって位置し、そしてPDEファミリーの間で最も高い相同性-アミノ酸レベルで75％を超える相同性-を有する(非特許文献２)。それにもかかわらず、30を超える公知のPDEのそれぞれの基質特異性、動力学的特性、調節特性ならびに細胞別分布および細胞内分布は個々に区別可能である(非特許文献３)。
【０００５】
PDE4、PDE7、およびPDE8は、cAMPに対して高い特異性を示す。PDE5、PDE6、PDE9およびPDE10はcGMPについて選択的である。PDE3は同程度の親和性にてcAMPおよびcGMPと結合する。しかし、cAMPを最も効率的に加水分解し、cGMPをほとんど加水分解しない。それゆえに、PDE3のcAMP加水分解能は、cGMPによって負の調節を受けている。PDE1およびPDE2は、cAMPおよびcGMPの両方を加水分解する。しかし、PDE1についての相対的効率は、アイソザイムのサブタイプによって異なっている(非特許文献２)。
【０００６】
PDEのアミノ末端は調節ドメインから構成される。そしてこのドメインは、ファミリー間およびファミリー内の変種間の両者で大きく異なっている。この領域には様々なもの：PDE1ではCa2+-カルモジュリン(CaM)についての結合ドメイン；PDE2、PDE5、およびPDE6では非触媒性cGMP-35結合部位；PDE6ではシグナル伝達Gタンパク質トランスデューシンについての結合ドメイン、が含まれている。アミノ末端領域についても、いくつかのPDE3およびPDE4ではタンパク質ターゲティング配列と、膜ターゲティング配列が含まれ、同様にPDE1、PDE3、PDE4およびPDE5ではプロテインキナーゼリン酸化部位が含まれる。これらのリン酸化部位は、触媒活性の調節および/または細胞内での配置に関して重要である可能性が高い(非特許文献２)。
【０００７】
本発明の特に対象となるものには、PDE4酵素がある。PDE4酵素のアミノ酸配列から、PDE4酵素は一つの共通する構造を共有していることが推論される(非特許文献４〜６)。それぞれの遺伝子ファミリー(PDE4A、PDE4B、PDE4C、PDE4D)のメンバーは、それぞれのファミリーについて異なっている共通のC末端領域と、PDE4アイソフォームのすべてについて類似性が高い(すべてのPDE4にわたる約360アミノ酸の範囲で84％の相同性；非特許文献６)触媒ドメインとを共有している。
【０００８】
「長い形態」のPDE4におけるN末端から触媒領域までの配列を、五つの領域に分割することが可能であり、その内の三つ(N末端領域、リンカー領域1および2、すなわちLR1およびLR2)はアイソフォーム特異的であり、そして二つは、すべてのアイソフォームの間で広く類似しているより保存性の高い領域である上流保存領域1および2(UCR1およびUCR2)である。「短い形態」のPDE4(たとえば、PDE4A1、PDE4B2、PDE4D1、PDE4D2)はUCR1およびLR1を欠き、そしてUCR2のN末端領域の長さが異なる。すべての領域の全体にわたって、PKA(たとえばヒトPDE4D3でのSer54)、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ(たとえばヒトPDE4B2のSer487)、カゼインキナーゼII(たとえばPDE4B2のSer489)およびカルシウム-ジアシルグリセロール依存性プロテインキナーゼ(非特許文献６)を含めた種々のキナーゼに対する潜在的なリン酸化部位がある。これらの部位のうちのいくつかの部位でのリン酸化によるPDEの活性化(たとえばSer54)や、他のリン酸化による阻害への寄与が示されている。いくつかのリン酸化が、異なる(一つまたは複数の)部位におけるさらなるリン酸化によるその後の活性化が可能な状態に酵素を準備するのに貢献するといういくつかの証拠も存在する(非特許文献６)。他の自己調節的部位が、特定のPDE4のN末端配列において見られ得る(非特許文献５および７)。
【０００９】
特異的にPDE4を阻害することは、疾患分野の極めて広い範囲の全体において役立つかもしれない。これらには、喘息、アトピー性皮膚炎、うつ病、再灌流障害、敗血症性ショック、中毒性ショック、自己免疫性糖尿病、AIDS、クローン病、多発性硬化症、脳虚血、乾癬、同種移植拒絶、再狭窄、脳卒中、潰瘍性大腸炎、悪液質、大脳マラリア、アレルギー性鼻結膜炎、変形性関節症、慢性関節リウマチ、自己免疫性脳脊髄炎が含まれる(非特許文献６および特許文献１)。喘息の分野において、PDE4の阻害は、気管支の平滑筋におけるcAMPの増加に役立ち、それによって、気管支の動きを適度に遅くする効果を発揮させ、喘息の症状の緩和に役立つ。しかし、おそらく最も重要なことは、現在では、PDE4の阻害は免疫応答と炎症細胞反応とを抑制する方法として認識されていることである(非特許文献８〜１０)。
【００１０】
PDE4は、炎症プロセスに関与する事実上すべての細胞タイプの活性の調節において主要な役割を果たす。血液の区画から組織内への白血球の補充現象が、制御されない、不適当である、長引くまたは自己に向いているのいずれかの場合、免疫された状態および炎症状態が生じる。喘息、慢性関節リウマチおよび多発性硬化症において、炎症細胞による組織の浸潤が長引いて激しくなり、最終的に激しい(そして尽きることのない)痛みと機能低下に至る。圧倒的にかつ一般的な炎症反応がしばしば死を招く可能性がある急性呼吸促迫症候群(ARDS)のような状況においては、免疫系が急に制御できなくなる。少なくとも脳および肺における虚血の後に由来する再灌流障害の程度を規定する役割を、炎症が部分的に有するかもしれないことを示唆する実質的な根拠も存在する(非特許文献１１)。
【００１１】
PDE4Dホスホジエステラーゼ-本発明の最も好ましい焦点である-は、(同じ酵素ポリペプチドの異なる分子形態を表す)アイソザイムの形態で哺乳動物中に存在する。これらのホスホジエステラーゼは細胞のサイトゾルに集まっており、そして公知のあらゆる膜構造とも会合しない。PDE4DアイソザイムはcAMPを特異的に分解し、抗うつ薬(たとえばロリプラム)のような薬物についての共通するターゲットである。PDE4Dのいくつかのスプライス形が知られている。短い形態のPDE4D1およびPDE4D2はUCR1およびLR1部位を欠く。これらよりもむしろ本発明の興味は長いアイソフォームに集中し、PDE4D3、PDE4D4、PDE4D5、PDE4D6、PDE4D7およびPDE4D8と名付けられている6種が知られている。これらのすべては共通してLR1部位およびUCR1部位ならびにこれらの部位のC末端に位置するドメインを持つ。しかしこれらのN末端ドメインは異なっている。アイソフォームのPDE4D6、D7およびD8は、最近、特許文献１において開示された。
【００１２】
PDE4Dのアイソザイムを阻害する化合物を同定するために、細胞をインヒビターで処理し、そしてcAMPの加水分解を測定するという全細胞のアッセイ法、あるいは、天然源または組換えPDE4Dアイソザイムを過剰発現する細胞のいずれか一方から単離される精製PDE4Dアイソザイムを用いるインビトロアッセイ法、のいずれか一方のスクリーニングアッセイ法を利用する。このようなアッセイ法は、たとえば特許文献２〜５内に記述されている。特許文献３は、酵母で発現された組換えPDE4Dの精製を記述している。PDEアゴニストまたはアンタゴニストを同定するために、PDE4Dの組換え天然型を使用することには、PDE4Dポリペプチドは最適な物理化学的特性、特に凝集物の形成に関する最適な特性を持たないという不利な点がある。凝集物の形成はタンパク質の沈殿を導く可能性があり、そして正当なオリゴマー分子と比較して酵素活性が低下するかもしれないことが知られている。したがって、PDE4Dホスホジエステラーゼ活性のアゴニストまたはアンタゴニストを同定することを目標としたスクリーニングアッセイ法において、PDE4Dポリペプチドの天然型の凝集物は、これらのアッセイ法の質に悪影響を与える。さらに、個々の組換えPDE4Dアイソフォームに基づいたアッセイ法の使用には、すべての長い形態または短い形態のPDE4Dアイソフォームに同時に作用するアゴニストまたはアンタゴニストの代わりに、PDE4Dの単一のアイソフォームだけに特異的なアゴニストまたはアンタゴニストが結果として同定されてしまうかもしれないという不利な点がある。
【００１３】
【特許文献１】国際公開第02/074992号パンフレット
【特許文献２】国際公開第00/09504号パンフレット
【特許文献３】国際公開第01/35979号パンフレット
【特許文献４】国際公開第01/68600号パンフレット
【特許文献５】国際公開第98/45268号パンフレット
【非特許文献１】Beavo J.A.ら、Molecular Pharmacology、1994年、第46巻、p.399-405
【非特許文献２】PerryおよびHiggs、Curr.Opinion Chem.Biol.、1998年、第2巻、p.472-481
【非特許文献３】HouslayおよびMilligan、Trends in Biochem.Sci.、1997年、第22巻、p.217-224
【非特許文献４】BeavoおよびReifsnyder、Trends Pharmacol.Sci.、1990年、第11巻、p.150-155
【非特許文献５】Bolgerら、Mol.Cell Biol.、1993年、第13巻、6558-6571
【非特許文献６】Houslay、SullivanおよびBolger、Adv.Pharmacol.、1998年、第44巻、225-242
【非特許文献７】McPheeら、Biochem.J.、1995年、第310巻、p.965-974
【非特許文献８】Hughesら、Drug Discov.Today、1997年、第2巻、p.89-101
【非特許文献９】Torphy、Am. J. Respir. Crit. Care Med.、1998年、第157巻、p.351-370
【非特許文献１０】Teixeiraら、Trends Pharm.Sci.、1997年、第18巻、p.164-171
【非特許文献１１】EntmanおよびSmith、Cardiovasc.Res.、1994年、第28巻、p.1301-1311
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、修飾ホスホジエステラーゼ(PDE)ポリペプチドであって、PDEのアゴニストまたはアンタゴニストを同定するためのスクリーニングアッセイ法、該修飾PDEポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、該ポリペプチドに対する抗体、該ポリペプチドの調製方法および使用に特に有用な改変された物理化学的特性を有するポリペプチドを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明に係るポリペプチドにおいては、（１）アミノ末端の欠失を伴うPDEポリペプチド配列を含むポリペプチドであって、凝集物の形成が減少しているポリペプチドであることを特徴とする。
【００１６】
本発明に係るポリペプチドにおいては、（２）PDEポリペプチド配列が長い形態のPDEポリペプチド配列である、上記(1)記載のポリペプチドであることを特徴とする。
【００１７】
本発明に係るポリペプチドにおいては、（３）PDEポリペプチド配列がPDE4ポリペプチド配列である、上記(1)または(2)記載のポリペプチドであることを特徴とする。
【００１８】
本発明に係るポリペプチドにおいては、（４）PDEポリペプチド配列がPDE4Dポリペプチド配列である、上記(1)〜(3)のいずれか一項記載のポリペプチドであることを特徴とする。
【００１９】
本発明に係るポリペプチドにおいては、（５）全ポリペプチド調製品における非凝集ポリペプチドの比率が全ポリペプチドの55％〜100％である、上記(1)〜(4)のいずれか一項記載のポリペプチドであることを特徴とする。
【００２０】
本発明に係るポリペプチドにおいては、（６）ポリペプチド配列が、天然のPDEポリペプチドのLF1スプライス部位とUCR1起始点の最初のアミノ酸との間に位置する任意のアミノ酸から開始する、上記(1)〜(5)のいずれか一項記載のポリペプチドであることを特徴とする。
【００２１】
本発明に係るポリペプチドにおいては、（７）ポリペプチド配列が天然のPDEポリペプチドのLF1のスプライス部位から開始する、上記(1)〜(6)のいずれか一項記載のポリペプチドであることを特徴とする。
【００２２】
本発明に係るポリペプチドにおいては、（８）PDEポリペプチド配列の起始点が天然のPDEポリペプチドのUCR1起始点の13アミノ酸上流に位置する、上記(1)〜(7)のいずれか一項記載のポリペプチドであることを特徴とする。
【００２３】
本発明に係るポリペプチドにおいては、（９）PDE4Dポリペプチド配列が、D3、D4、D5、D6、D7、およびD8からなる群より選択される一つのアイソフォームの配列である、上記(4)〜(8)のいずれか一項記載のポリペプチドであることを特徴とする。
【００２４】
本発明に係るポリペプチドにおいては、（１０）ポリペプチドが一つまたは複数のセリン残基の突然変異を含有する、上記(1)〜(9)のいずれか一項記載のポリペプチドであることを特徴とする。
【００２５】
本発明に係るポリペプチドにおいては、（１１）セリン残基がアラニンまたはアスパラギン酸のいずれかに変異している、上記(10)記載のポリペプチドであることを特徴とする。
【００２６】
本発明に係るポリペプチドにおいては、（１２）セリン残基がSer54およびSer579からなる群より選択される、上記(10)または(11)記載のポリペプチドであることを特徴とする。
【００２７】
本発明に係るポリペプチドにおいては、（１３）ポリペプチドが減少したチューブリン会合を示す、上記(1)〜(9)のいずれか一項記載のポリペプチドであることを特徴とする。
【００２８】
本発明に係るポリヌクレオチド配列においては、（１４）上記(1)〜(13)のいずれか一項記載のポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド配列であることを特徴とする。
【００２９】
本発明に係る発現ベクターまたはウイルスにおいては、（１５）上記(14)記載のポリヌクレオチド配列を含有する発現ベクターまたはウイルスであって、適合性を有する原核生物または真核生物の宿主細胞中で、該ポリヌクレオチド配列を直接発現することができる発現ベクターまたはウイルスであることを特徴とする。
【００３０】
本発明に係るウイルスにおいては、（１６）ウイルスが組換えバキュロウイルスである、上記(15)記載のウイルスであることを特徴とする。
【００３１】
本発明に係る宿主細胞においては、（１７）上記(15)または(16)記載の発現ベクターまたはウイルスによって形質転換されたまたはそれに感染した原核生物または真核生物の宿主細胞であることを特徴とする。
【００３２】
本発明に係る宿主細胞においては、（１８）宿主細胞が昆虫細胞である、上記(17)記載の宿主細胞であることを特徴とする。
【００３３】
本発明に係る方法においては、（１９）上記(17)または(18)記載の宿主細胞を、ポリペプチドが発現するような適切な培地中で培養する段階、および細胞から該ポリペプチドを精製する段階を含む、上記(1)〜(13)のいずれか一項記載のポリペプチドを作製する方法であることを特徴とする。
【００３４】
本発明に係る方法においては、（２０）宿主細胞が昆虫細胞である、上記(19)記載のポリペプチドを作製する方法であることを特徴とする。
【００３５】
本発明に係るポリペプチドにおいては、（２１）上記(19)または(20)記載の方法によって作製される、上記(1)〜(13)のいずれか一項記載のポリペプチドであることを特徴とする。
【００３６】
本発明に係る抗体においては、（２２）上記(1)〜(13)のいずれか一項記載のポリペプチドに対する抗体であることを特徴とする。
【００３７】
本発明に係る抗体においては、（２３）上記(1)〜(13)のいずれか一項記載のポリペプチドのN末端ドメインのエピトープに結合する、上記(22)記載の抗体であることを特徴とする。
【００３８】
本発明に係る方法においては、（２４）上記(1)〜(13)のいずれか一項記載のポリペプチドの少なくとも一つを含む、ホスホジエステラーゼ活性のアゴニストまたはアンタゴニストを同定するためのスクリーニングアッセイ法であることを特徴とする。
【００３９】
本発明に係る方法においては、（２５）炎症性疾患を治療するための薬剤候補を同定および取得するための方法であって、上記(1)〜(13)のいずれか一項記載のポリペプチドのホスホジエステラーゼ活性の活性化または阻害を測定する段階を含む方法であることを特徴とする。
【００４０】
本発明に係る化合物においては、（２６）上記(24)記載のアッセイ法または上記(25)記載の方法によって同定される化合物であることを特徴とする。
【００４１】
本発明に係る組成物においては、（２７）上記(1)〜(13)のいずれか一項記載のポリペプチドのホスホジエステラーゼ活性のアゴニストまたはアンタゴニストと、薬学的に許容される担体とを含有する薬学的組成物であることを特徴とする。
【００４２】
本発明に係る使用においては、（２８）炎症性疾患を治療するための医薬品の調製を目的とする、上記(1)〜(13)のいずれか一項記載のポリペプチドまたは薬学的に許容されるその塩のホスホジエステラーゼ活性のアゴニストまたはアンタゴニストの使用であることを特徴とする。
【００４３】
本発明に係る使用においては、（２９）ホスホジエステラーゼ活性のアゴニストまたはアンタゴニストを同定するための、上記(1)〜(13)のいずれか一項記載のポリペプチドの使用であることを特徴とする。
【００４４】
本発明に係る使用においては、（３０）結晶化のための、上記(1)〜(13)のいずれか一項記載のポリペプチドの使用であることを特徴とする。
【００４５】
本発明に係る方法においては、（３１）上記(1)〜(13)のいずれか一項記載のポリペプチドを、X線結晶解析に適切な状態に結晶化させる段階、および該ポリペプチドについてX線結晶解析を実施する段階を含む、アゴニストまたはアンタゴニストの候補をホスホジエステラーゼと相互作用する能力についてアッセイする方法であることを特徴とする。
【００４６】
本発明に係るキットにおいては、（３２）上記(1)〜(13)のいずれか一項記載のポリペプチドを少なくとも一つ含む、ホスホジエステラーゼ活性のアゴニストまたはアンタゴニストを同定するためのキットであることを特徴とする。
【００４７】
本発明に係る産物、方法、および使用においては、（３３）本明細書に実質的に記載されているような特に実施例に関連する産物、方法および使用であることを特徴とする。
【発明の効果】
【００４８】
本発明により、修飾を受けたホスホジエステラーゼ(PDE)ポリペプチドであって、PDEのアゴニストまたはアンタゴニストを同定するためのスクリーニングアッセイ法、該修飾PDEポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、該ポリペプチドに対する抗体、該ポリペプチドの調製方法および使用に特に有用な改変された物理化学的特性を有するポリペプチドが提供された。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４９】
本明細書で用いられる「ポリペプチド」という用語はアミノ酸のポリマーを指し、特定の長さを指すものではない。したがって、ペプチド、オリゴペプチドおよびタンパク質は、ポリペプチドの定義の範囲内に含まれる。
【００５０】
本明細書で用いられる「物理化学的特性」という用語は、ポリペプチドの持つ、モノマーの形成、オリゴマーの形成または凝集物の形成への傾向を指す。
【００５１】
本明細書で用いられる「凝集」および「凝集物の形成」という用語は互換可能に用いられ、ポリペプチド鎖の会合のタイプを指す。オリゴマーの形成とは対照的に、この会合のタイプは不可逆的なプロセスであり、質量作用の法則にしたがわない。凝集は時間依存的に進行し、規定された数の鎖が会合しても停止しない。ポリペプチドの凝集によって、タンパク質の沈殿が導かれる可能性がある。というのは、凝集物の分子サイズは劇的に増加するので、分子の溶解性が低下するからである。さらに、真正のオリゴマー分子と比べると、凝集によって酵素活性が低下するかもしれないことが知られている。
【００５２】
本明細書で用いられる「オリゴマーの形成」という用語は、ポリペプチド鎖の可逆的な会合を指し、これによって、特定のタンパク質濃度におけるオリゴマータンパク質とモノマータンパク質との比率や、熱力学的平衡状態でのその比率を、会合定数によって記述できる。
【００５３】
本明細書で用いられる「非凝集」という用語は、オリゴマーもしくはモノマーとして、または質量作用の法則にしたがった平衡状態でのオリゴマーおよびモノマーの混合物としてのいずれかの状態で存在するポリペプチドを指す。
【００５４】
本明細書で用いられる「改善された物理化学的特性」という用語は、ポリペプチドの凝集物の形成が減少することを指す。定義を目的として、その中に凝集PDEが溶出されるゲル濾過実験のフラクションと、その中に非凝集PDEが溶出されるゲル濾過実験のフラクションとを定量することによって、本発明のポリペプチドの凝集物の形成を求める。凝集の程度は、全(凝集および非凝集)PDEに基づく非凝集PDEのパーセントで算出される。50mMのTrisHCl、pH7.7、100mMのNaCl、0.5mMのMgCl2で、4℃、流速0.1mL/分にて平衡化されたスーパーロース12サイズ排除カラム(タイプPC3.2/30；Amersham Pharmacia Biotech)に添加するという条件で、50μLのNi-NTAアガロースで精製されたアイソフォーム調製品をゲル濾過に用いる場合、凝集の定義を目的として、フラクション2から4の中に凝集PDEが溶出されると認められ、その中では、少なくとも200万ダルトンの凝集分子が溶出する。そしてフラクション5から11の中に非凝集PDEが溶出されると認められ、そこは約30万ダルトンの分子が溶出されるフラクションに相当する。278nmでのクロマトグラムを記録する。溶出容量から前方に開始するので、カラムの溶出液を50μLのフラクションとして集める。
【００５５】
本明細書で用いられる「長い形態のPDE」という用語は、アイソフォーム特異的N末端ドメイン、リンカー領域LR1および/またはLR2、ならびに上流保存領域UCR1およびUCR2を含むPDEアイソフォームを指す。
【００５６】
本明細書で用いられる「UCR1起始点」という用語は、配列番号：1〜7にて注釈が付けられているように、PDE4DのUCR1ドメインの最初のアミノ酸を指す。
【００５７】
本明細書で用いられる「LF1部位」という用語は、配列番号：1〜7に示されるように、PDE4Dのスプライス部位の最初のアミノ酸を指す。
【００５８】
本明細書で用いられる「LF1の上流のアミノ酸」という用語は、天然のタンパク質においてLF-1部位からアミノ末端方向へ数えた際のアミノ酸の位置を指す。
【００５９】
本明細書で用いられる「D3」という用語は、PDE4D3アイソフォームを指す。本明細書で用いられる「D4」という用語は、PDE4D4アイソフォームを指す。本明細書で用いられる「D5」という用語は、PDE4D5アイソフォームを指す。本明細書で用いられる「D6」という用語は、WO02/074992に規定されているように、PDE4D6アイソフォームを指す。本明細書で用いられる「D7」という用語は、WO02/074992に規定されているように、PDE4D7アイソフォームを指す。本明細書で用いられる「D8」という用語は、WO02/074992に規定されているように、PDE4D8アイソフォームを指す。ヒトPDE4Dアイソフォームのポリペプチド配列であるD3、D4、D5、D6、D7、およびD8は、配列番号：1および3〜7に示されている。
【００６０】
本明細書で用いられる「Ser54」という用語は、PDE4D3の54番目の位置のSer残基を指し、そして他の任意のPDEポリペプチドのそれぞれの位置におけるSer残基を指す。PDE4D3のSer54に対応する位置については、異なるアイソフォームおよびすべてのPDE4Dアイソフォームに共通するコア配列についての配列番号：1〜7中に注釈がある。
【００６１】
本明細書で用いられる「Ser579」という用語は、PDE4D3の579番目の位置のSer残基を指し、そして他の任意のPDEポリペプチドのそれぞれの位置におけるSer残基を指す。PDE4D3のSer579に対応する位置については、異なるアイソフォームおよびすべてのPDE4Dアイソフォームに共通するコア配列についての配列番号：1〜7中に注釈がある。
【００６２】
本明細書で用いられる「チューブリン会合」という用語は、精製PDE調製品のチューブリン含有量を指す。
【００６３】
本明細書で用いられる「アゴニスト」という用語はさらに、PDEホスホジエステラーゼ活性のアクチベータをも指し、そして「アンタゴニスト」という用語はさらに、PDEホスホジエステラーゼ活性のインヒビターをも指す。
【００６４】
天然の組換えPDEポリペプチドの不利な点は、ポリペプチドの凝集物が形成するというところにあり、これによって、スクリーニングアッセイ法によってPDEホスホジエステラーゼ活性のモジュレーターを同定するための条件が最適状態に及ばなくなってしまう。というのは、凝集物の形成によってポリペプチドの沈殿が導かれ、そしてポリペプチドの活性を損なうかもしれないことが知られているからである。本発明は、これらの酵素のアゴニストまたはアンタゴニストを同定するために特に役立つ、改善された物理化学的特性を伴うPDEポリペプチドの作製に向けられている。
【００６５】
組換えPDEポリペプチドによる凝集物の形成という問題は、本発明において、PDE4Aポリペプチド配列以外の、アミノ末端の欠失を伴うPDEポリペプチド配列を含有するポリペプチドを作製することによって解決された。ここで、図2および3に示されるように、当該ポリペプチドは凝集物の形成を減少させた。図1に示されるように、これらのポリペプチドは、天然の組換えタンパク質の比活性に匹敵する比活性を有する。好ましい態様においては、本発明によって、アミノ末端の欠失を伴うPDEポリペプチド配列を含むポリペプチドが提供される。ここで、全タンパク質調製品における非凝集PDEの比率は、全タンパク質の55％から、好ましくは60％から、より好ましくは65％から、最も好ましくは68％から、100％までであり、好ましくは90％までであり、より好ましくは80％までであり、最も好ましくは70％までであり、PDEフラクションのゲル濾過から溶出したフラクションを定量することによって測定される。定量は次のようにして実施する。上記のようにして実施したサイズ排除クロマトグラフィーからのフラクションの等しい体積のアリコートをSDS-PAGEによって分析する(走路およびアイソフォームあたり一つのゲル、図3)。クーマシー染色されたPDEの吸光度を、次のようにして積算する。電気泳動後に、クーマシー染色されたポリアクリルアミドゲルをビデオ・イメージング・システムによって画像化した(図1)。マッキントッシュコンピュータと、パブリックドメインソフトウェアの「NIH Image」、バージョン1.61(米国国立衛生研究所が開発し、インターネット上で、http://rsb.info.nih.gov/nih-image/にて利用可能である)とを用いて、PDEのバンドの吸光度を積算した。ソフトウェアによって送り返されたPDEのバンドあたりの積算任意単位は、もともとのプール内の相対的PDE濃度を表す。フラクション2〜4のPDEのバンドからの積算濃度を計算し、凝集PDEの相対量であるPDEaggを得る(図3)。これらのフラクションは、少なくとも200万ダルトンの分子を含む。同様に、フラクション5〜11のPDEのバンドからの積算濃度を計算し、非凝集PDEの相対量であるPDEnon-aggを得る。フラクション5〜11においては、30万ダルトンの範囲の分子が溶出する。PDEaggとPDEnon-aggとの合計によって、全PDEの相対量であるPDEtotalを得る。非凝集PDEのパーセンテージは、PDEnon-aggとPDEtotalとの比率に100をかけることによって与えられる。
【００６６】
本発明の好ましい態様において、アミノ末端の欠失を伴うPDEポリペプチド配列は長い形態のPDEポリペプチド配列である。より好ましい態様において、PDEポリペプチド配列は、PDE4ポリペプチド配列であり、長い形態のPDE4ポリペプチド配列が好ましい。さらに好ましい態様において、ポリペプチド配列はPDE4Dポリペプチド配列であり、長い形態のPDE4Dポリペプチド配列が好ましい。
【００６７】
ポリペプチドのアミノ末端欠失変異体の作製方法は広く知られている。たとえばPCR(Sambrookら、Molecular Cloning：A Laboratory Manual(1989)、Cold Spring Harbor Laboratory Press、ニューヨーク、米国)を用いての部位特異的変異誘発を利用することによって、このような欠失変異体を作製することが可能である。
【００６８】
本発明の一つの態様において、ポリペプチドは、LF1の25アミノ酸上流とLF1部位との間から、好ましくはLF1の20アミノ酸上流とLF1部位との間から、より好ましくはLF1の15アミノ酸上流とLF1部位との間から、さらに好ましくはLF1の10アミノ酸上流とLF1部位との間から、最も好ましくはLF1の5アミノ酸上流とLF1部位との間から始まるPDEポリペプチド配列を含有する。
【００６９】
別の態様において、PDEポリペプチド配列は、LF1のスプライス部位と天然のPDEポリペプチドのUCR1起始点の最初のアミノ酸との間に位置する任意のアミノ酸から開始する。PDEポリペプチドの最も好ましい態様であるPDE4Dの場合において、これらの部位は、長い形態のPDE4Dアイソフォームのすべてにおいて同一である。
【００７０】
別のさらに好ましい本発明の態様においては、アミノ末端の欠失は、PDEポリペプチド配列が天然のPDEポリペプチドのLF1のスプライス部位から始まるようになっている。このPDEポリペプチド配列を、「コア構築物」と呼ぶ。コア構築物は、すべてのアイソフォームが共有しているPDEの配列をまたいでいる。PDE4Dのコア構築物の配列を配列番号：2に示す。
【００７１】
別のさらに好ましい本発明の態様において、PDEポリペプチド配列の起始点は、天然のPDEポリペプチドのUCR1起始点の13アミノ酸上流に位置する。この位置が長い形態のPDE4Dアイソフォームのどこに位置するかということと、PDE4Dのコア構築物を配列番号：1〜7に示す。
【００７２】
上記のアミノ末端の欠失を伴うPDEポリペプチドを作製するための土台と、改善された物理化学的特性は、PDE4A以外のあらゆるPDEアイソフォームに存在し得る。最も好ましい態様に関して、PDEポリペプチド配列は、D3、D4、D5、D6、D7、およびD8からなる群より選択されるPDE4Dのアイソフォームの一つである。しかしながら、未だに同定されていないPDEのさらなるアイソフォームにまで、本発明は及ぶ。
【００７３】
PDEポリペプチドの上記の変異体も、本発明にとって有用である。特に対象となるものは、一つまたは複数のセリン残基の突然変異を含有するPDEポリペプチド配列である。該セリンがアラニンまたはアスパラギン酸のいずれかに変異していることが好ましい。最も好ましい態様においては、該セリン残基がSer54およびSer579からなる群より選択される。このようなセリンは、PDEポリペプチドのリン酸化のターゲットの代表である。これらの部位のいくつかのリン酸化によって、PDEのホスホジエステラーゼ活性が活性化したり、または阻害を受けることが示されている。
【００７４】
ポリペプチド中でアミノ酸の置換を生じさせる方法は、分子生物学の当業者に周知である。たとえば、[Sambrookら、Molecular Cloning：A Laboratory Manual(1989)、Cold Spring Harbor Laboratory Inc、ニューヨーク、米国]に記載されている部位特異的変異誘発などの方法がある。
【００７５】
別の好ましい本発明の態様においては、上記のPDEポリペプチドがチューブリン会合を減少させる。したがって、より純粋なPDEポリペプチド調製品を得ることが可能になる。チューブリン会合が減少していることを調べるために、PDEポリペプチド調製品中のチューブリン分子あたりのPDE分子の比率を、SDS-PAGEの定量によって算出する。チューブリン分子あたりのPDE分子の比率は好ましくは少なくとも5であり、より好ましくは少なくとも10であり、さらに好ましくは少なくとも15であり、よりさらに好ましくは少なくとも20であり、そして最も好ましくはチューブリン分子あたり少なくとも25分子のPDEである。PDE調製品中のチューブリン含有量を、次のようにして求める。SECからのフラクションの等しい体積のアリコートを、SDS-PAGE(走路およびアイソフォームあたり一つのゲル、図3)によって分析する。クーマシー染色されたPDEのバンドとチューブリンのバンドとの吸光度を、PDE凝集を定量するために上記のようにして積算する。フラクション2〜11のPDEのバンドからの積算濃度を計算し、全PDEの相対量であるPDEtotalを得る。同様に、フラクション2〜11のチューブリンのバンドからの積算濃度を計算してチューブリン2-11を得る。そしてそれによって、全チューブリンの相対量であるチューブリンtotalを得る。質量あたりの質量に基づく、PDEとチューブリンとの比率(図4C)は、全PDE4Dの相対量であるPDEtotと全チューブリンの相対量であるチューブリンtotalとの比率と同一である。
【００７６】
本発明のペプチドが上記のようにアミノ末端の欠失によってそこから作製されるPDEポリペプチドには、配列番号：1〜7に示されるポリペプチドと実質的に相同、すなわち同一であるポリペプチドが含まれ、そしてそれは、天然型の場合、ホスホジエステラーゼ活性とPDEの特異性とを有する。特に、これらのPDEポリペプチドは、U50159(D3)、L20969(D4)、S：1059276(D5)として、そしてWO02/074992に開示されているとおりのD6、D7およびD8についての配列として規定されている、すでに公表されているPDE4D3からD8のポリペプチド配列をも包含する。二つのポリペプチドのアミノ酸配列の相同性が少なくとも45〜55％、典型的には少なくとも70〜75％、より典型的には少なくとも80〜85％、そして最も典型的には90％以上である場合、本明細書で用いられるように、当該二つのポリペプチド(またはそのポリペプチドの領域)は実質的に相同、すなわち同一である。二つのアミノ酸配列の相同性のパーセントまたは同一性を求めるために、最適な比較を目的として、これらの配列を整列する(たとえば、他のポリペプチドまたは核酸分子とのアライメントが最適になるように、一方のポリペプチド配列中にギャップを導入することができる)。次いで、対応するアミノ酸の位置におけるアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。一方の配列中の位置が、他方の配列中の対応する位置のアミノ酸残基と同一のもので占められている場合、次いで、この分子はその位置において相同となる。本明細書で用いられるように、アミノ酸の「相同性」はアミノ酸の「同一性」と等価である。二つの配列間の相同性のパーセントは、配列によって共有される同一の位置の数の関数である(すなわち、相同性のパーセントは、(同一の位置の数)/(位置の総数)を100倍したものと等しい)。本発明のPDEポリペプチド配列は哺乳動物由来が好ましく、ヒト由来が特に好ましい。本発明はさらに、活性にほとんど影響を与えないことが当技術分野において知られている一般的な規則にしたがって選択された欠失、挿入、反復、および置換を伴う上記のポリペプチドの変異体も包含する。たとえば、表現型がサイレントなアミノ酸置換を起こす方法についてのガイダンスが、[Bowie、Science 247, 1306-1310 (1990)]によって提供されている。ここで、著者らは、変化に対するアミノ酸配列の耐性を研究するためには、主に二種の方針が存在することを示している。
【００７７】
本発明は、上記のPDEポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチドを提供する。このようなポリヌクレオチドに含まれる配列の一例として、PDE4Dの「コア構築物」をコードするポリヌクレオチド配列を配列番号：8に示す。しかしながら、本発明は、上記のあらゆるPDEポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチドに関する。
【００７８】
本発明は、上記のPDEポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチド配列を含有する発現ベクターまたはウイルスであって、適合性を有する原核生物または真核生物の宿主細胞中で、そのポリヌクレオチド配列を直接発現することができる発現ベクターまたはウイルスを提供する。本発明はさらに、そのような発現ベクターまたはウイルスによって形質転換されたまたはそれに感染した原核生物または真核生物の宿主細胞を提供する。本発明はさらに、上記のPDEポリペプチド配列を発現する宿主細胞を、該ポリペプチドが発現するような適切な培地中で培養する段階、および細胞から該ポリペプチドを精製する段階を含む、このようなポリペプチドを作製する方法を提供する。好ましい態様において、修飾PDEポリペプチドを発現させるために用いるウイルスは組換えバキュロウイルスである。組換えタンパク質を発現させるための組換えバキュロウイルスを作製する方法は、当業者に周知である。トランスファーベクターとしてのpFASTBacに基づく組換えバキュロウイルスが好ましい。本発明の好ましい態様の宿主細胞は、昆虫細胞である。組換えタンパク質を発現させる目的で組換えバキュロウイルスを感染させることが可能な昆虫細胞は、当技術分野において周知である。修飾を受けたPDEポリペプチドを作製するための好ましい方法は、上記のPDEポリペプチド配列を発現する昆虫細胞を、該ポリペプチドが発現するのに適した培地中で培養する段階、および当該ポリペプチドを昆虫細胞から精製する段階を含む方法である。精製を促進するために、PDEポリペプチドはタグを含んでいてもよい。このようなタグの種々のタイプおよびポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列にタグを結合させる方法は、当業者にとって周知であり、たとえば、myc-タグ、FLAG-タグ、六つのヒスチジンのタグ(以下、6×Hisタグと称する)がある。タンパク質のタギングに関する総説は、たとえば、[Fritze and Anderson、Methods in Enzymology 327,3-16(2000)]に見出すことができる。周知のように、このようなタグをポリペプチドのいずれか一方の側に結合させてもよい。いくつかのタグを、精製されたポリペプチドから酵素的に除去してもよいことも知られており、たとえば、タンパク質のアミノ末端に融合したFLAG-タグを、ウシのエンテロキナーゼを用いる消化によって除去してもよい(Hopp,T.P.、Biotechnology,6,1204-1210(1988))。好ましい態様において、上記のPDEポリペプチドはそのC末端にて6×Hisタグと連結している。組換えポリペプチドの精製を簡単にするためのこのような6×Hisタグの使用、そして6×Hisタグ付着ポリペプチドの精製方法は周知である(たとえば、Siskら、J.Virol. 68,766(1994)；および[Petty,K.J.(Ausubel,F.M.ら編) Current Protocols in Molecular Biology,Vol.2、NY John Wiley and Sons (1996))。
【００７９】
好ましい態様において、本発明のポリペプチドは精製されたものである。組換え細胞および非組換え細胞から単離する場合において、細胞性成分が実質的に無いとき、本明細書で用いられるような、「精製された」ポリペプチドと言われる。しかしながら、ポリペプチドは、細胞内では通常会合することがない別のポリペプチドと(たとえば「融合タンパク質」として)結合することも可能であり、そしてそれでもなお「精製された」ものである。本発明のポリペプチドは精製されたものが好ましい。本発明のポリペプチドを精製して均一なものとすることができる。しかしながら、その中のポリペプチドが均一なものまで精製されていない調製品が有用であることは理解される。無視できない量の他の成分が存在するときでさえ、調製品にはポリペプチドが所望の機能を示す効果があることが、決定的な特徴である。したがって、本発明は、様々な程度の純度を包含する。一つの態様において、「細胞性成分が実質的に無い」という言葉には、ポリペプチド調製品中の他のタンパク質(すなわち汚染タンパク質)が(乾燥重量で)約30％未満であること、他のタンパク質が約20％未満であること、他のタンパク質が約10％未満であること、または他のタンパク質が約5％未満であることが包含される。ポリペプチドが組換えによって作製される場合、培地が実質的に無いという可能性もある。すなわち、培地はポリペプチド調製品の体積の約20％未満、約10％未満または約5％未満に相当する。
【００８０】
本発明はさらに、上記のあらゆるポリペプチドに対する抗体を提供する。PDEポリペプチドのN末端ドメインのエピトープと結合する抗体が好ましい。別の好ましい態様において、D3、D4、D5、D6、D7、およびD8からなる群より選択されるPDE4DポリペプチドのN末端に抗体が結合する。このような抗体は種々の目的に役立つことだろう。これらの抗体を、本発明のポリペプチドの検出に用いてもよい。これらを本発明のポリペプチドのアフィニティー精製に用いてもよい。さらに、PDE4Dホスホジエステラーゼ活性のアゴニストまたはアンタゴニストを同定するためのスクリーニングアッセイ法に用いてもよい。
【００８１】
本発明はさらに、ホスホジエステラーゼ活性のアゴニストまたはアンタゴニストを同定するための、上記のポリペプチドの使用を提供する。
【００８２】
血管系疾患を治療するための薬剤候補を同定および取得する方法のために本発明のポリペプチドを用いることが可能である。ここで、本方法は、上記のあらゆるポリペプチドのホスホジエステラーゼ活性の活性化または阻害を測定する段階を含む。ホスホジエステラーゼ活性を測定するための種々の方法が知られており、たとえば、[Owensら、Biochem.J. 326,53-60 (1997)]がある。このような薬剤候補は、PDEのホスホジエステラーゼ活性のアゴニストまたはアンタゴニストのいずれか一方の化合物でもよい。
【００８３】
本発明はさらに、上記のポリペプチドの少なくとも一つを含む、ホスホジエステラーゼ活性のアゴニストまたはアンタゴニストを同定するためのスクリーニングアッセイ法を提供する。加えて、上記のポリペプチドを結晶化のために用いることが可能である。これらのポリペプチドの結晶は、化合物のホスホジエステラーゼとの相互作用をアッセイすることに役立つ。したがって、本発明はさらに、上記のポリペプチドをX線結晶解析に適切な状態に結晶化させる段階、および該ポリペプチドについてX線結晶解析を実施する段階を含む、アゴニストまたはアンタゴニストの候補をホスホジエステラーゼと相互作用する能力についてアッセイする方法を提供する。
【００８４】
本発明はさらに、上記のプロセスまたは方法のいずれか一方によって同定される化合物を提供する。
【００８５】
本発明は、本発明のPDEポリペプチドのホスホジエステラーゼ活性のアクチベータまたはインヒビターと、薬学的に許容される担体とを含有する薬学的組成物を提供する。通常用いられているあらゆる担体材料を利用することが可能である。担体材料としては、経腸投与、経皮投与または非経口投与に適する有機または無機材料を用いることが可能である。適切な担体には、水、ゼラチン、アラビアゴム、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、タルク、植物性油脂、ポリアルキレングリコール、ワセリンなどが含まれる。さらに、医薬品は他の薬学的に活性な物質を含んでいてもよい。調剤の慣例にしたがって、追加の添加物-たとえば、香料、安定剤、乳化剤、緩衝剤など-を添加してもよい。
【００８６】
本発明のPDEポリペプチドまたは薬学的に許容されるその塩のホスホジエステラーゼ活性のアゴニストまたはアンタゴニストを、ホスホジエステラーゼ活性が高まるかまたは低下することによって引き起こされる疾患の治療薬を調製するために使用してもよい。このような疾患には、喘息、アトピー性皮膚炎、うつ病、敗血症性ショック、中毒性ショック、自己免疫性糖尿病、AIDS、クローン病、多発性硬化症、乾癬、同種移植拒絶、潰瘍性大腸炎、悪液質、大脳マラリア、アレルギー性鼻結膜炎、変形性関節症、慢性関節リウマチ、自己免疫性脳脊髄炎、および再灌流障害、脳虚血、再狭窄、脳卒中または末梢動脈の閉塞障害などの血管系疾患が含まれる。しかしながら、本発明は上記に列挙された疾患に限定されるものではなく、ホスホジエステラーゼ活性の上昇または低下に依存するすべての疾患に及ぶ。本発明の特に対象となるものは、血管系疾患の治療薬を調製するために、このような、PDEまたは薬学的に許容されるその塩のホスホジエステラーゼ活性のアゴニストまたはアンタゴニストを使用することである。最も好ましい態様は、脳卒中の治療薬を調製するために、このような、PDEまたは薬学的に許容されるその塩のホスホジエステラーゼ活性のアゴニストまたはアンタゴニストを使用することである。
【００８７】
さらに、本発明は、上記のポリペプチドを少なくとも一つ含む、ホスホジエステラーゼ活性のアゴニストまたはアンタゴニストを同定するためのキットを提供する。
【００８８】
本発明において、本明細書に実質的に記載されているような、特に上記の例に関連する産物、方法、プロセス、アッセイ法および使用についての権利も主張する。
【００８９】
本発明を、次の非限定的な実施例によってさらに記述する。
【００９０】
以下、「アイソフォーム」という用語は、天然のPDE4Dスプライス変異体D3およびD5〜D8ならびに本発明によるコア変異体であるDCに関する。
【実施例１】
【００９１】
PDE4Dアイソフォーム3〜8およびコア構築物のクローニング
コア構築物
アミノ酸配列FDVカルボキシ末端からLF1のスプライス部位までの、PDE4Dアイソフォーム3〜8のすべてに共通するコアフラグメントをコードするcDNAをPCRによって作製した。PCRでは、二つの追加アミノ酸(KおよびL)をFDV配列の前に導入するHindIIIクローニング部位を有する5'オリゴヌクレオチド
2004194658.tif 000002
を用いた。3'末端では、プライマーのセット、天然の配列を生じさせるプライマー
2004194658.tif 000003
、または6×His残基をコードする配列が追加されたプライマー
2004194658.tif 000004
のいずれかを用い、組換えタンパク質を迅速に精製することが可能となった。コア構築物をコードするcDNAを、EcoRI-EcoRVフラグメントとして、発現ベクターpENTR(商標)1a(GIBCO/BRL)内にクローニングした。
【００９２】
(コア構築物以外の)アイソフォーム
指向性クローニングのために組み込まれるEcoRIおよびHindIIIに対する末端制限酵素部位を伴う合成オリゴヌクレオチドを用いることによって、N末端特異的アイソフォームをコードするDNAフラグメントを作製した。二つの追加アミノ酸残基(KおよびL)を導入するHindIII部位を介して、これらのアイソフォーム特異的DNAフラグメントをコア構築物配列と融合した。発現の前にDNA配列を決定することによって、このクローンの完全性を確認した。
【実施例２】
【００９３】
昆虫細胞におけるPDE4Dアイソフォームおよびコア構築物の発現
昆虫細胞中で発現させるために、pFASTBAC1ベクター(Life Technologies. Inc)内にcDNAをクローニングした。そして配列決定によって、産物を確認した。バキュロウイルスゲノム内に組換えた後、精製されたウイルスのDNAを昆虫細胞内に形質転換した。5％(v/v)のウシ胎仔血清を含むTC100培地(BioWhittaker)中で、Sf9細胞を27℃で培養した。1.5×109pfu/mLの力価のウイルスのストックを作製した。アイソフォームを1〜24Lの発酵という大きな規模で作製するために、Sf9細胞を感染効率を1で感染させた。
【００９４】
一つの例において、無血清SF1培地を用いて、1Lの撹拌フラスコ中にて、6×Hisタグ付着PDE4DポリペプチドのDC、D3、D5、D6、D7およびD8をSf9細胞内で作製した。組換えバキュロウイルスによる感染の3日後に、感染細胞を回収した。
【００９５】
他の例において、15Lの培地(SF1、0％血清)、0.15Lの脂質および9LのSf9細胞が入った24Lのエアリフト培養槽内でPDE4Dコア構築物のDCを作製した。発酵の進展の全体を通して、pH6.2、27.0±0.2℃、およびpO2が30.0±0.5％にて細胞を培養した。細胞を3日間増殖させた。感染した細胞数は2.3×106細胞/mLであった。450mLの組換えバキュロウイルスによって細胞を感染させた。感染から68時間後に細胞を回収した。そして濃縮した上清だけでなく、細胞ペレットも次の処理まで-80℃で保存した。
【実施例３】
【００９６】
6×Hisタグ付着PDE4Dアイソフォームの精製
1リットルの培養ブロスから得られた、それぞれのアイソフォームが過剰発現しているSf9細胞を、プロテアーゼインヒビター(プロテアーゼインヒビターの混合錠剤「complete,EDTA-free」；Roche)を追加した、50mMのHEPES、pH7.8、300mMのNaCl、lOmMのイミダゾール、1mMのDTTの50mL中に氷上で再懸濁した。50mLのドーンス(Dounce)型ホモジナイザーを用いて細胞を開き、そして均一混合物を4℃にて、70,000g(Kontron TFT 45.94ローターにて30,000rpm)で1時間遠心分離処理した。孔径が1.2μmのフィルター(Minisart；Sartorius、ドイツ)で上清を濾過し、次いで6mLのNi-NTAアガロースカラムにかけて流速を2mL/分とした。300mMのNaCl、10mMのイミダゾールを含む50mMのHEPES、pH7.8で平衡化した後、同じ緩衝液中、30mLのイミダゾールの10から230mMの直線勾配にて、タンパク質を溶出した。クーマシー染色されたSDS-PAGEによって分析したPDE4Dアイソフォームを含有するフラクションを集めて、-80℃で冷凍保存した。アイソフォームの相互汚染を防ぐために、異なるPDE4Dアイソフォーム調製品のそれぞれについて、新鮮なNi-NTAアガロース材料を用いた。
【実施例４】
【００９７】
6×Hisタグ付着PDE4Dアイソフォームの比活性
Ni-NTAアガロースで精製されたアイソフォーム調製品の相対濃度を、SDS-PAGEによって推定した。等しい体積のアイソフォーム調製品を、グラジエントゲル(4〜12％NuPage；Invitrogen)に添加した。電気泳動の後、クーマシー染色されたポリアクリルアミドゲルを、ビデオ・イメージング・システムによって画像化した(図1)。マッキントッシュコンピュータと、パブリックドメインソフトウェアの「NIH Image」、バージョン1.61(米国国立衛生研究所が開発し、インターネット上で、http://rsb.info.nih.gov/nih-image/にて利用可能である)とを用いてPDE4Dのバンドの吸光度を積算した。ソフトウェアによって送り返された、PDE4Dのバンドあたりの積算任意単位は、もともとのプール内の相対的PDE4D濃度を示す(図1、「量」)。独立したSDS-PAGE、対応するバンドの切り出し、トリプシン分解およびMALDI-MSによるトリプシンペプチドの同定によって、PDE4Dのバンドおよびチューブリンのバンドの同一性を検証しておいた。
【００９８】
市販の放射性ホスホジエステラーゼアッセイ法(cAMP依存性ホスホジエステラーゼ［3H］アッセイ法；Amersham Pharmacia Biotech)を利用して、製造メーカーの取扱説明書にしたがって、106倍に希釈した精製アイソフォームの等しい体積分の活性を測定した。得られた任意の活性単位は、もともとのプール内の相対的PDE4D活性を表す(図1、「活性」)。
【００９９】
相対活性値を相対濃度値で割って、PDE4Dアイソフォームの相対比活性を算出した(図1、「比活性」)。
【実施例５】
【０１００】
サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)による凝集の定性的検討
50μLのNi-NTAアガロースで精製されたアイソフォーム調製品を、50mMのTrisHCl、pH7.7、100mMのNaCl、0.5mMのMgCl2で、4℃、流速0.1mL/分にて平衡化されたスーパーロース12サイズ排除カラム(タイプPC3.2/30；Amersham Pharmacia Biotech)に添加した。278nmでのクロマトグラムを記録した。溶出容量から開始したので、カラムの溶出液を50μLのフラクションとして集めた(図2)。
【実施例６】
【０１０１】
凝集物およびチューブリン含有量の定量
SECからのフラクションの等しい体積のアリコートを、SDS-PAGE(走路およびアイソフォームあたり一つのゲル、図3)によって分析した。クーマシー染色されたPDE4Dのバンドおよびチューブリンのバンドの吸光度を、上記のようにして積算した。フラクション2〜4のPDE4Dのバンドからの積算濃度を計算し、凝集PDE4Dの相対量であるPDEaggを得た(図3)。同様に、フラクション5〜11のPDE4Dのバンドからの積算濃度を計算し、非凝集PDE4Dの相対量であるPDEnon-aggを得た。PDEaggとPDEnon-aggとの合計によって、全PDE4Dの相対量であるPDEtotalを得る。PDEnon-aggとPDEtotalとの比率に100をかけることによって、非凝集PDEのパーセンテージを得る(図4B)。
【０１０２】
同様に、フラクション2〜11のチューブリンのバンドからの積算濃度を計算してチューブリン2-11を得た。そしてそれによって、全チューブリンの相対量であるチューブリンtotalを得た。PDEとチューブリンとの比率(図4C)は、全PDE4Dの相対量であるPDEtotと、全チューブリンの相対量であるチューブリンtotalとの比率と一致する。
【実施例７】
【０１０３】
ホスホジエステラーゼ活性の活性評価および阻害
ホスホジエステラーゼ活性を測定するために、IMAP FP-アッセイ法を用いた。HEFPホスホジエステラーゼ・アッセイ・キット(Molecular Devices社)を用いて、コア構築物とPDE4D3のホスホジエステラーゼ活性を測定した。2μLのPDE4D3またはPDE4Dコア構築物、2μLのcAMP(最終濃度は40nM)および1μLの試験基質または担体を、撹拌器上で45分間インキュベートした。キットによる12μLの結合溶液(ビーズを含み、1：320に希釈されている)を添加し、そして反応混合物を撹拌器上で2時間インキュベートした。Packard BioScience社のFusion a-FP HTにて、発光フィルターとしてPolarizer 535を、そして励起フィルターとしてFluorescein 485/20を用いて、サンプルの蛍光偏光度を測定した。インヒビターとしてロリプラムを用い、そしてPDE4Dコア構築物を30ng/mLで用いて、PDE4Dコア構築物のホスホジエステラーゼ活性の阻害を測定した。
【図面の簡単な説明】
【０１０４】
【図１】種々のPDE4DアイソフォームD3およびD5からD8についての、ならびにPDE4Dコア構築物(DC)についての特異的ホスホジエステラーゼ活性を示す図である。
【図２】種々のPDE4Dアイソフォームおよびコア構築物による凝集物の形成を示す図である。この図において、PDE4Dの種々のアイソフォーム(D3、D5、D6、D7、D8)、およびコア構築物(DC)のゲル濾過のプロファイルが示されている。最初の溶出ピークはPDE4D凝集物を表す。DCの溶出プロファイルにおける目だった肩-ここでは約300,000ダルトンのポリペプチドが溶出される-は、PDE4Dの五種のアイソフォームと比較して、DCの凝集が減少していることを示す。
【図３】PDE4Dのコア構築物(DC)の凝集の定量、およびコア構築物調製品のチューブリン含有量の定量を示す図である。A)では、DCの溶出プロファイルが示されており、フラクションは底部に示されている。B)はゲル濾過からの異なるフラクションのSDS-PAGEを示す。C)は、B)においてクーマシー染色されたSDS-PAGEに対応する個々のフラクションの吸光度の分析を示す。
【図４】種々のアイソフォームおよびPDEコア構築物の、凝集とチューブリン含有量の相違を示す図である。A)上記のようにして分析されたDCおよびPDE4Dの五種のアイソフォームについてのSDS-PAGEゲルが示されている。B)コア構築物ならびにアイソフォームD3およびD5からD8についての、非凝集PDE4Dのパーセンテージが、全PDE4Dタンパク質に基づいて示されている。五種のアイソフォームと比較して、DCが最も高い非凝集PDE4Dのパーセンテージを示す。C)この図は、DCならびにアイソフォームD3およびD5からD8についての、PDE4Dとチューブリンとの比率を示す。全PDEの質量と全チューブリンの質量に基づくものである。以上のように、DCのチューブリン含有量は、示されている五種のPDE4Dアイソフォームのそれよりも顕著に少ない。
【図５】活性評価を示す図である。PDE4Dコア構築物(DC)およびPDE4D3(D3)の両者についてのホスホジエステラーゼ活性が示されている。
【図６】ロリプラム阻害を示す図である。PDE4Dコア構築物(DC)のホスホジエステラーゼ活性を、ロリプラムによって阻害することができる。ロリプラム阻害によるDCのホスホジエステラーゼ活性のIC50は0.34±0.06mMであった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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