【誤訳訂正書】
【提出日】平成24年6月6日(2012.6.6)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に示すアミノ酸配列に対し少なくとも９８％の同一性があるアミノ酸配列を含み、かつ式（Ｉ）
【化１】
2009521239.tif 000001
（式中、ＲはＣ１〜Ｃ６のアルキル基であり、Ｒ１はＣ１〜Ｃ４のアルキルであり、Ｘは塩素、臭素またはヨウ素である）で示される２−アルキル−５−ハロペンタ−４−エンカルボン酸エステルのラセミ分割活性を有するポリペプチド。
【請求項２】
ポリペプチドは組換えタンパク質である、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のポリペプチドをコードする核酸。
【請求項４】
配列番号２に示す配列を含む、請求項３に記載の核酸。
【請求項５】
生物からｍＲＮＡを分離し、次いで、ＧＧＧＣＡＧＣＣＡＧＣＣＴＣＧＣのヌクレオチド配列を含む第１のプライマーとＴＣＡＣＡＧＣＴＣＡＧのヌクレオチド配列を含む第２のプライマーとを用いて核酸フラグメントを増幅させることによって得られる、請求項３又は４に記載の核酸。
【請求項６】
式（Ｉ）
【化２】
2009521239.tif 000002
（式中、ＲはＣ１〜Ｃ６のアルキル基であり、Ｒ１はＣ１〜Ｃ４のアルキルであり、Ｘは塩素、臭素またはヨウ素である）で示される２−アルキル−５−ハロペンタ−４−エンカルボン酸エステルのラセミ分割のための、請求項１又は２に記載のポリペプチドの使用。
【請求項７】
エナンチオマー的に富化された式（ＩＩ）
【化３】
2009521239.tif 000003
（式中、ＲはＣ１〜Ｃ６のアルキル基であり、ＡはＨ、Ｒ１（ここで、Ｒ１はＣ１〜Ｃ４のアルキルであってよい）またはＲ２（ここで、Ｒ２はＲ１とは異なるアルキル基である）であり、Ｘは塩素、臭素またはヨウ素である）で示される２−アルキル−５−ハロペンタ−４−エンカルボン酸またはそのエステルを製造する方法であって、式（Ｉ）
【化４】
2009521239.tif 000004
（式中、Ｒ、Ｒ１およびＸは上で定義されたとおりである）
で示される２−アルキル−５−ハロペンタ−４−エンカルボン酸エステルのエナンチオマー混合物を、水、または式Ｒ２ＯＨ（ここで、Ｒ２はＲ１とは異なるアルキル基である）で示されるアルコールの求核試薬としての存在下、請求項１又は２に記載のポリペプチドによって変換し、
ａ）残存する、エナンチオマー的に富化された、式（ＩＩ）においてＡがＲ１である２−アルキル−５−ハロペンタ−４−エンカルボキシルエステルを分離するか、または
ｂ）アルコールが求核試薬として使用されている場合、得られた、エナンチオマー的に富化された、式（ＩＩ）においてＡがＲ２である２−アルキル−５−ハロペンタ−４−エンカルボキシルエステルを分離するか、または
ｃ）水が求核試薬として使用されている場合、得られた、式（ＩＩ）においてＡがＨである２−アルキル−５−ハロペンタ−４−エンカルボン酸を分離する
ことを含む方法。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【発明の詳細な説明】
【発明の名称】エステラーゼ活性を有する新規なポリペプチドおよび組換えエステラーゼ、並びに、それらの使用
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、エステラーゼ活性、特に２−アルキル−５−ハロペンタ−４−エンカルボキシルエステラーゼ活性を有するポリペプチド、およびエステラーゼ活性を有する酵素的に活性な組換えタンパク質、並びに、ラセミ化合物２−アルキル−５−ハロペンタ−４−エンカルボン酸エステルエナンチオマー混合物を分割するための、それらの使用に関する。
【０００２】
エナンチオマー的に富化された２−アルキル−５−ハロペンタ−４−エンカルボン酸およびそのエステルは、例えば、レニン抑制特性を有し、製剤上、降圧剤として使用され得るデルタ−アミノ−ガンマ−ヒドロキシ−オメガ−アリールアルカンカルボキサミドなどの医薬品を製造する際の重要な中間体である。
【０００３】
エステラーゼは、一般に、ラセミ化合物の分割および非対称化に使用される。
【０００４】
しかしながら、キラル化合物の製造に適したエステラーゼとして商業的に入手可能なものは、非常に少ない。
【０００５】
実験室規模では、ブタの肝臓由来のエステラーゼ抽出物の使用が知られている。ブタ肝臓エステラーゼ（ＰＬＥ）は、古くに、天然ソースから分離され、その活性も以前から知られている（シモンズ，Ｊ．Ｐ．（Ｓｉｍｏｎｄｓ，Ｊ．Ｐ．）（１９１９年）アメリカン・ジャーナル・オブ・フィジオロジー（Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．）４８、１４１頁；バーマン，Ｅ．（Ｂａｍａｎｎ，Ｅ．）ら（１９３４年）ホッペ−ザイラーズ，Ｚ．（Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ  Ｚ．）２２９、１５頁；ファルコナー，Ｊ．Ｓ．（Ｆａｌｃｏｎｅｒ，Ｊ．Ｓ．）およびテーラー，Ｄ．Ｂ．（Ｔａｙｌｏｒ，Ｄ．Ｂ．）（１９４６年）バイオケミカル・ジャーナル（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．）４０、８３１−８３４頁）。
【０００６】
ＰＬＥの特性を明らかにするために、種々の研究も既に行われている（ヘイマン，Ｅ．（Ｈｅｙｍａｎｎ，Ｅ．）およびユンゲ，Ｗ．（Ｊｕｎｇｅ，Ｗ．）（１９７９年）ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）９５、５０９−５１８頁；レーナー，Ｒ．（Ｌｅｈｎｅｒ，Ｒ．）およびベルガー，Ｔ．（Ｖｅｒｇｅｒ，Ｔ．）（１９９７年）バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）３６、１８６１−１８６８頁）。さらに、例えば国際公開第０１／０９０７９号パンフレットにおいて、ブタ肝臓由来のエステラーゼ抽出物が、メチル−５−クロロ−２−（１−メチルエチル）−４−ペンテノアートの（Ｒ）エナンチオマーを選択的に加水分解できることを示すことも可能となっている。
【０００７】
しかしながら、そのようなブタの肝臓などの天然ソースからのエステラーゼ抽出物には欠点がある。
【０００８】
第１に、バッチ毎に品質が異なり、したがって、工業的プロセスの最適化が困難である。第２に、医薬品の製造に動物資源を使用することは、ウイルスやプリオンを常に排除できるとは限らないことから、望ましくない。
【０００９】
こうした理由から、標準化された品質を有する組換えブタ肝臓エステラーゼを、微生物中で生産することが求められている。
【００１０】
例えばフェブス・レター（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．）（１９９１年）、２９３、３７−４１頁に、推定エステラーゼ遺伝子のクローニングが記載されている。活性なブタ肝臓エステラーゼ酵素の最初の機能発現は、国際公開第０２／４８３２２号パンフレットで初めて報告された。国際公開第２００４／０５５１７７号パンフレットには、国際公開第０２／４８３２２号パンフレットに記載の配列番号１（ｒＰＬＥ）の組換えブタ肝臓エステラーゼを部位特異的突然変異誘発法により再度組換えたエステラーゼの製造が記載されている。国際公開第２００４／０５５１７７号パンフレット、および同じ発明者によって書かれたプロテイン・エンジニアリング（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）、１６、１１３９−１１４５頁、２００３年の論文から明らかなように、国際公開第０２／４８３２２号パンフレットのｒＰＬＥ配列に対する修飾は、デイビッド（Ｄａｖｉｄ）ら、（１９９８年）、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）２５７、１４２−１４８頁に記載されている組換えブタ腸内エステラーゼ（ＰＩＣＥ）が得られるように選択された。
【００１１】
ラセミ化合物２−アルキル−５−ハロペンタ−４−エンカルボン酸エステルの分割については、これらの論文のいずれにも記載されていない。
【００１２】
しかしながら、２−アルキル−５−ハロペンタ−４−エンカルボン酸エステルに対し所望の立体選択的活性を有し、かつ、バイオ技術により容易に製造することができるエステラーゼに対する要求が満たされていないため、これに対応する新規な組換えエステラーゼを提供することが本発明の目的であった。
【００１３】
フェブス・レター（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．）（１９９１年）、２９３、３７−４１頁および国際公開第０２／４８３２２号パンフレットに記載された公知のブタ肝臓エステラーゼ（ＰＬＥ）の遺伝子を、ブタ肝臓由来のｍＲＮＡから出発するｃＤＮＡとして分離し、クローニングする試みの中で、公知のＰＬＥ配列に加えて、第２の新規なエステラーゼ配列を見出した。対応するタンパク質乃至エステラーゼ、すなわち公知のｒＰＬＥと新規の「代替」エステラーゼ（ｒＡＰＬＥ）が製造される２つの配列の発現に続いて、意外にも、ｒＡＰＬＥのみがラセミ化合物２−アルキル−５−ハロペンタ−４−エンカルボン酸エステルを選択的に分割できることが明らかとなった。
【００１４】
したがって、本発明の目的は、アミノ酸配列が、公知のＰＬＥ配列と比べて、全５４８個のアミノ酸のうち、２１個が異なる、新規なエステラーゼ活性を有するポリペプチド、および、新規な組換えエステラーゼ（ｒＡＰＬＥ）によって、達成することができた。新規なｒＡＰＬＥは、また、ブタ腸内カルボキシルエステラーゼ（ＰＩＣＥ）とも、アミノ酸配列において、全５４８個のアミノ酸のうち、１２個が異なる。しかしながら、ＰＩＣＥはブタの腸管に見出されるものである。
【００１５】
本発明は、したがって、配列番号１のアミノ酸配列を含む、エステラーゼ活性を有するポリペプチドに関する。
【００１６】
本発明は、さらに、配列番号１のアミノ酸配列を含む、エステラーゼ活性を有する新規な組換えタンパク質に関する。
【００１７】
本発明のポリペプチドおよび組換えｒＡＰＬＥは、式（Ｉ）
【化１】
2009521239.tif 000005
（式中、ＲはＣ１〜Ｃ６のアルキル基であり、Ｒ１はＣ１〜Ｃ４のアルキルであり、Ｘは塩素、臭素またはヨウ素である）で示されるラセミ化合物２−アルキル−５−ハロペンタ−４−エンカルボン酸エステルを立体選択的に分割することができる。
【００１８】
エステラーゼ活性を有する本発明のポリペプチド、および、新規な組換えエステラーゼｒＡＰＬＥは、上述したように、フェブス・レター（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．）（１９９１年）、２９３、３７−４１頁に開示されている公知の配列とは、全５４８個のアミノ酸のうち２１個が異なり、デイビッド（Ｄａｖｉｄ）ら、（１９９８年）ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）２５７、１４２−１４８頁に開示されている公知のＰＩＣＥタンパク質とは、全５４８個のアミノ酸のうち、１２個が異なる。
【００１９】
本発明の新規なｒＡＰＬＥのタンパク質配列は、以下のアミノ酸の位置が、ＰＬＥタンパク質の公知の配列と異なる。
【００２０】
【表１】
2009521239.tif 000006
【００２１】
本発明のタンパク質および新規な組換えｒＡＰＬＥは、さらに、配列番号１に示す配列を修飾した配列の形態であってもよい。それは、例えば、α因子シグナル配列に由来するＧｌｕＡｌａＧｌｕＡｌａなどのように、配列のＮまたはＣ末端でアミノ酸の置換、欠失または付加などの通常の修飾を行うことによって、あるいは、他のタンパク質と融合させることによって得ることができる。
【００２２】
本発明は、また、さらに、適切な活性、特に２−アルキル−５−ハロペンタ−４−エンカルボン酸エステルに対して適切な活性を有する本発明の酵素のタンパク質配列を修飾した突然変異タンパク質を含むものである。突然変異タンパク質は、例えば、本発明の酵素をコードするＤＮＡを、公知の突然変異誘発技術（ランダム変異導入法、部位特異的突然変異誘発法、進化分子工学的手法、遺伝子シャッフル法など）により、そのＤＮＡが本発明の酵素とアミノ酸が少なくとも１個異なる酵素をコードするように修飾し、その後、その修飾ＤＮＡを適当な宿主細胞中で発現させることによって、得ることができる。したがって、本発明は、また、前述の変異、欠失、伸張、融合によって得られ、所望のエステラーゼ活性を有する酵素をコードする、配列番号１で示されるＤＮＡ配列を修飾した配列を含むものである。
【００２３】
エステラーゼ活性、特に２−アルキル−５−ハロペンタ−４−エンカルボキシルエステラーゼ活性は、ここでは、式（Ｉ）で示されるラセミ化合物２−アルキル−５−ハロペンタ−４−エンカルボン酸エステルを分割する能力と定義される。
【００２４】
本発明のポリペプチドおよび組換えｒＡＰＬＥは、以下に記載するように製造することができる。
【００２５】
まず、適当なキットを使用して、ブタの肝臓からｍＲＮＡを分離し、その後、ｍＲＮＡ抽出物をベースに逆転写によってｃＤＮＡを生産する。
【００２６】
その後、公知のブタ肝臓エステラーゼ遺伝子配列、ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号Ｘ６３３２３（マツシマ（Ｍａｔｓｕｓｈｉｍａ）ら、１９９１年）をベースとして特定のＰＣＲプライマーを調製し、その後、増幅およびクローニングを行う。
これらの特定のプライマーは、
【化２】
2009521239.tif 000007
である。
【００２７】
ＰＬＥタンパク質をコードする適切なヌクレオチド配列を含み、そしてプライマー中に必須のものとして存在するプライマー部分は、太字で示してある。
【００２８】
このプライマーの残りの配列部分には、例えば、制限エンドヌクレアーゼの開裂部位情報（イタリック体）、あるいは、発現に重要な配列要素が含まれる。この部分は、本発明のｒＡＰＬＥを製造する際に変更してもよい。
【００２９】
その後、プライマー１および２を用い、既存技術のＰＣＲ法により増幅を行う。
【００３０】
このＰＣＲ生成物は、その後、適当な宿主生物の中で、コードされたｒＡＰＬＥタンパク質の異種発現を行う発現構築体を、既存の方法により調製するために使用される。これには、ＰＣＲ生成物を、最初に、プラスミドベクター中にクローニングしておくことが好ましい。
【００３１】
こうして得られた組換えプラスミドを、その後、適当な宿主、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）に形質転換する。その後、得られたいくつかのクローンの挿入部分の配列を決定する。
【００３２】
意外にも、その中に、異なる配列を有する２つの組換えクローン群が同定された。マツシマ（Ｍａｔｓｕｓｈｉｍａ）ら、（１９９１年）フェブス・レター（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．）２９３、３７−４１頁に記載のＰＬＥの推定配列と１００％同一のものと、配列番号２（ＡＰＬＥ配列）に示すような、発現すると本発明の配列番号１のアミノ酸配列となる新規なヌクレオチド配列である。
【００３３】
本発明は、さらに、本発明のポリペプチドおよび組換えエステラーゼｒＡＰＬＥをコードする核酸またはヌクレオチド配列に関する。
【００３４】
例えば、そのような核酸は、配列番号２で示されるヌクレオチド配列を有する。
【００３５】
本発明は、また、さらに、本発明のポリペプチドおよび組換えエステラーゼｒＡＰＬＥをコードするヌクレオチド配列を含むか、または、配列番号２で示されるヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列に関する。
【００３６】
さらに、標準化された合成技術、例えば、自動ＤＮＡ合成装置を使用して、本発明のエステラーゼをコードする、本発明の核酸配列に対応する、適当なオリゴヌクレオチドを調製することも可能である。
【００３７】
本発明のエステラーゼをコードする核酸配列が純粋に合成により調製されることは、それ故、そのような酵素は動物ソースから得ないので、薬剤またはその中間体の製造に使用するうえで、特に有利である。
【００３８】
その後、見出された２つの配列（ＰＬＥおよびＡＰＬＥ配列）を発現させる。
【００３９】
公知のブタ肝臓エステラーゼ（ＰＬＥ、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  ＩＤ  Ｑ２９５５０）は、Ｎ末端シグナル配列およびＣ末端ＥＲリテンションシグナルである最後の４個のアミノ酸ＨＡＥＬを含む。
【００４０】
公知のＰＬＥおよび新規なＡＰＬＥを発現させるために、配列を適当な発現系に導入するベクターを構築する。その後、これらの発現構築体を適切な宿主細胞に形質転換する。
【００４１】
適切な宿主細胞は、ここでは、例えば、微生物、動物細胞糸および植物である。
【００４２】
原核微生物および真核微生物のいずれも使用することができる。好ましい原核宿主（細菌）は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）およびバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕ）属（例えば、Ｂ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｂ．リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、Ｂ．アミロリクエファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属（例えば、Ｐ．フルオレッセンス（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、Ｐ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ））、またはストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属（例えば、Ｓ．リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）、Ｓ．テンダエ（Ｓ．ｔｅｎｄａｅ））の菌株である。真核微生物が好ましく、菌類が特に好ましい。その例としては、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピヒア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、クルイベロマイセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）またはアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種が挙げられる。
【００４３】
発現は、分泌性発現または細胞内発現であり、そして誘導的および構成的である。
【００４４】
細菌の発現では、種に特異的なシグナルを、標的タンパク質を誘導的または構成的に発現させ、細胞内および分泌系に局在化させる商業的に入手可能なタンパク質発現菌株およびベクター（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓなどの企業から提供される）として選択することができ、さらに、溶解性の活性なタンパク質を得るために、タンパク質の正しい折りたたみを可能にするかまたは促進する技術を使用することもできる。
【００４５】
タンパク質は、分泌で発現されることが好ましく、この場合、ＰＬＥおよびＡＰＬＥの配列が、Ｎ−末端を介してＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のα因子シグナル配列と連結するベクターを構築することが好ましい。
【００４６】
さらに、例えば、ハードウィック（Ｈａｒｄｗｉｃｋ）ら、（１９９０年）エムボ・ジャーナル（ＥＭＢＯ  Ｊ．）９、６２３−６３０頁に記載されているように、ＥＲリテンションシグナルとして機能するＣ−末端テトラペプチドＨＡＥＬをさらに欠失させた構築体を調製することも可能である。
【００４７】
さらに好ましい発現は、ＥＲリテンションシグナルを有するかまたは有さない構築体の誘導的発現である。
【００４８】
意外にも、ＥＲリテンションシグナルを有する構築体もまた発現し、ラセミ化合物２−アルキル−５−ハロペンタ−４−エンカルボン酸エステルを選択的に分割することができるｒＡＰＬＥを得ることができる。
【００４９】
ＡＰＬＥ遺伝子のヌクレオチド配列から誘導される新規なエステラーゼｒＡＰＬＥのアミノ酸配列を、配列番号１に示す。
【００５０】
意外にも、新規なポリペプチド、またはｒＡＰＬＥタンパク質は、公知のｒＰＬＥとは対照的に、ラセミ化合物２−アルキル−５−ハロペンタ−４−エンカルボン酸エステルを立体選択的に分割し得ることを見出すことができた。それらは、例えば、Ｐ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）細胞中で、それぞれＡＰＬＥおよびＰＬＥをコードするＤＮＡセグメントの発現により得られたものである。
【００５１】
したがって、本発明は、さらに、式（Ｉ）
【化３】
2009521239.tif 000008
（式中、ＲはＣ１〜Ｃ６のアルキル基であり、Ｒ１はＣ１〜Ｃ４のアルキルであり、Ｘは塩素、臭素またはヨウ素である）で示されるラセミ化合物２−アルキル−５−ハロペンタ−４−エンカルボン酸エステルを分割するための、配列番号１に示す配列に対し少なくとも８０％の同一性を有する、本発明のエステラーゼ活性を有するポリペプチドおよび組換えエステラーゼ（ｒＡＰＬＥ）の使用に関する。
【００５２】
本発明のエステラーゼ活性を有するポリペプチドおよび組換えエステラーゼ（ｒＡＰＬＥ）は、配列番号１に示すタンパク質の配列に対する同一性が、少なくとも９０％であることが好ましく、少なくとも９８％であることが特に好ましい。本発明のエステラーゼ活性を有するポリペプチドまたは組換えエステラーゼ（ｒＡＰＬＥ）を、例えば、突然変異、欠失、伸長、融合などの通常の修飾により、配列番号１に示すＤＮＡ配列に修飾を行って得られた、所望のエステラーゼ活性を有する酵素をコードする配列とともに、使用することも可能である。
【００５３】
これに関連して、エナンチオマー的に富化された式（ＩＩ）
【化４】
2009521239.tif 000009
（式中、ＲはＣ１〜Ｃ６のアルキル基であり、ＡはＨ、Ｒ１（ここで、Ｒ１はＣ１〜Ｃ４のアルキルであってよい）またはＲ２（ここで、Ｒ２はＲ１とは異なるアルキル基である）であり、Ｘは塩素、臭素またはヨウ素である）で示される２−アルキル−５−ハロペンタ−４−エンカルボン酸またはそのエステルは、式（Ｉ）
【化５】
2009521239.tif 000010
（式中、Ｒ、Ｒ１およびＸは上で定義されたとおりである）
で示される２−アルキル−５−ハロペンタ−４−エンカルボン酸エステルのエナンチオマー混合物を、水、または式Ｒ２ＯＨ（ここで、Ｒ２はＲ１とは異なるアルキル基である）で示されるアルコールの求核試薬としての存在下、本発明のポリペプチドまたは本発明のｒＡＰＬＥによって変換し、
ａ）残存する、エナンチオマー的に富化された、式（ＩＩ）においてＡがＲ１である２−アルキル−５−ハロペンタ−４−エンカルボン酸エステルを分離するか、または
ｂ）アルコールが求核試薬として使用されている場合、得られた、エナンチオマー的に富化された、式（ＩＩ）においてＡがＲ２である２−アルキル−５−ハロペンタ−４−エンカルボン酸エステルを分離するか、または
ｃ）水が求核試薬として使用されている場合、得られた、式（ＩＩ）においてＡがＨである２−アルキル−５−ハロペンタ−４−エンカルボン酸を分離する
ことによって得ることができる。
【００５４】
式（ＩＩ）において、Ｒは、例えばメチル、エチル、ｎ−およびｉ−プロピル、ｎ−、ｉ−およびｔ−ブチル、ペンチル、並びにヘキシルなどのＣ１〜Ｃ６のアルキル基である。
【００５５】
Ｃ１〜Ｃ４のアルキル基が好ましく、ｉ−プロピル基が特に好ましい。
【００５６】
Ａは、Ｈ、Ｒ１（ここで、Ｒ１はＣ１〜Ｃ４のアルキル基、好ましくはＣ１〜Ｃ２のアルキル基、特に好ましくはメチル基である）、またはＲ２（ここで、Ｒ２はＲ１とは異なるアルキル基である）である。Ｒ２はＣ１〜Ｃ６のアルキル基であることが特に好ましい。
【００５７】
Ｘは、塩素、臭素またはヨウ素であり、好ましくは塩素である。
【００５８】
エナンチオマー的に富化された化合物とは、ここでは、エナンチオマー過剰率（ｅｅ）が、＞８０％、好ましくは＞９０％、特に好ましくは＞９７％を示すものを意味する。
【００５９】
本発明の酵素は、さらに、任意の形態で使用することができる。例えば、分散体として、溶液として、固定化して、粗酵素として、ソースから公知の精製方法を組み合わせて得られた酵素として、要求される酵素活性を有する全細胞（必要に応じて、固定化および／または透過化される）（天然のものまたは遺伝子修飾によるもの）として、または、そのような細胞の溶解物中で。
【００６０】
本発明の転換反応温度は、通常０〜９０℃、好ましくは１０〜６０℃である。反応溶液のｐＨは、４〜１１、好ましくは６〜９である。
【００６１】
溶媒の選択は、使用する求核試薬に依る。
【００６２】
もし、例えば、水を求核試薬とする場合、使用することができる溶媒は、水、水と水溶性溶媒、例えば、例えばメタノール、エタノール、イソプロパノール、ｔ−ブタノールなどのアルコール、ジオキサン、テトラヒドロフラン、アセトンまたはジメチルスルホキシドなどとの混合物、あるいは、水と非水溶性溶媒、例えば、例えばトルエン、キシレンなどの芳香族化合物、例えばヘキサン、ヘプタン、シクロヘキサンなどのアルカン、例えばジイソプロピルエーテル、メチルｔ−ブチルエーテルなどのエーテルなどとの２相系である。もし求核試薬がアルコールである場合、溶媒として、アルコールＲ２ＯＨ（ここで、Ｒ２はアルキル基であるが、Ｒ１とは異なるものである）を使用することが好ましい。しかしながら、アルコールと、例えばテトラヒドロフラン、ヘプタン、トルエン、ヘキサン、ＣＨ３ＣＮ、メチルｔ−ブチルエーテルなどの有機溶媒との混合物を使用することも可能である。
【００６３】
酵素を触媒としてラセミ化合物を分割した後、所望の最終生成物を分離する。これは、残存する、エナンチオマー的に富化された、式（ＩＩ）においてＡがＲ１である２−アルキル−５−ハロペンタ−４−エンカルボン酸エステルであるか、あるいは、水が求核試薬である場合、得られた、式（ＩＩ）においてＡがＨである２−アルキル−５−ハロペンタ−４−エンカルボン酸であり、アルコールが求核試薬である場合、エナンチオマー的に富化された、式（ＩＩ）においてＡがＲ２である２−アルキル−５−ハロペンタ−４−エンカルボン酸エステルである。
【００６４】
分離は、例えば、例えば抽出、結晶化、カラムクロマトグラフィ、蒸留などの従来法によって行うことができる。
【００６５】
本発明の方法により、式（Ｉ）に対応する酸またはエステルが、９８％までの理論収率で、かつ、＞９９％までのｅ．ｅ．で、得られる。
【００６６】
［実施例１：ｍＲＮＡの分離およびｃＤＮＡの生成］
新しく食肉処理されたブタの肝臓０．７ｇ（地域の食肉処理場から入手）を液体窒素中で凍結し、乳鉢でホモジナイズし、放出されたｍＲＮＡを、Ｆａｓｔ  Ｔｒａｃｋ  ｍＲＮＡ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ２．０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールスバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ）、カリフォルニア州（Ｃａｌｉｆ．）、米国（ＵＳＡ））を使用し、製造者によって作成された説明書（Ｆａｓｔ  Ｔｒａｃｋ  ２．０  ｋｉｔ  ｍａｎｕａｌ；バージョンＪ；０８２３０１；２５−００９９）にしたがって、分離または抽出した。抽出により、全量１２．９μｇのｍＲＮＡが得られた。
【００６７】
その後、このｍＲＮＡの０．２６μｇを、製造者の説明書にしたがい、ＲＴ−ＰＣＲ用のＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｓｙｓｔｅｍを使用して、ｃＤＮＡを生成するためのテンプレートとして使用した。
【００６８】
［実施例２：ブタの肝臓からのｃＤＮＡフラグメントの増幅とクローニング］
ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号Ｘ６３３２３（マツシマ（Ｍａｔｓｕｓｈｉｍａ）ら、１９９１年）のブタ肝臓エステラーゼ遺伝子配列をベースに、特定のプライマーを調整した。
【化６】
2009521239.tif 000011
【００６９】
公知のＰＬＥ配列に相同の塩基は、太字で示してある。制限エンドヌクレアーゼの認識配列は強調のためにイタリック体で示してある。
【００７０】
増幅は、マニュアル「フュージョン・ハイ−フィデリティ・ＤＮＡ・ポリメラーゼ（Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）」（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）に従い、１ＵのＰｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ、Ｅｓｐｏｏ、フィンランド（Ｆｉｎｌａｎｄ））、テンプレートとして５００ｎｇのｃＤＮＡ、それぞれ２０μｍｏｌのプライマー１および２、５μｌのｄＮＴＰ混合物（各２ｍＭ）の全てを、１×Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＨＦ  ｂｕｆｆｅｒ中に含む、５０μｌの混合物中で行い、まず９８℃、３０秒間の変性工程から開始し、続いて、３０サイクル（９８℃で１０秒間、６８℃で２０秒間、７２℃で１分間）の増幅、そして、完全な生成物を得るために７０℃で８分間の最終インキュベーションを行った。
【００７１】
このＰＣＲによって、１．８ｋｂのサイズのＤＮＡフラグメントが得られた（アガロースゲル電気泳動により測定）。
【００７２】
このＰＣＲ生成物を、その後、Ｑｉａｑｕｉｃｋ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、ドイツ（Ｇｅｒｍａｎｙ））を使用し、付属のマニュアルに従って精製した。
【００７３】
約０．１μｇの精製ＰＣＲ生成物を制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩで切断し、ＥｃｏＲＩ開裂点を介して、プラスミドベクターｐＨＩＬＺおよびｐＨＩＬ−Ｄ２にクローニングした。
【００７４】
その後、ベクターを、「カレント・プロトコルズ・イン・モリキュラー・バイオロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」に従って調製した、ＴＯＰ１０エレクトロコンピテントセルへ形質転換した。
【００７５】
「Ｄｙｅ  Ｄｅｏｘｙ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ」キット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．、Ｆｏｒｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、カリフォルニア州、米国）を使用して、得られたいくつかのクローンの挿入部分の配列を決定した。
【００７６】
これにより、２つの配列が同定され、一方は、予測された、マツシマ（Ｍａｔｓｕｓｈｉｍａ）ら、（１９９１年）フェブス・レター（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．）２９３、３７−４１に記載の配列に１００％対応するものであり、他方の配列は、配列番号２に対応するものであった。
【００７７】
［実施例３：α因子シグナル配列の導入およびＣ−末端の改変］
公知のタンパク質ＰＬＥおよび本発明のタンパク質ｒＡＰＬＥを分泌発現させるために、ＰＬＥおよびＡＰＬＥの配列がクローニングベクターｐＰＩＣＺ  α（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のα因子開始配列に、Ｎ−末端で結合しているベクターを構築した。さらに、Ｃ−末端テトラペプチドＨＡＥＬを欠失させた構築体を作製した。
【００７８】
ＰＣＲ  Ｉ：ＥｃｏＲＩａｌｐｈａ１／ａｌｐｈａＰＬＥ２のプライマー対を使用して、クローニングベクターｐＰＩＣＺ  α（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のα因子シグナル配列を増幅させた。５０μｌの混合物（テンプレート２ｎｇ、各プライマー０．５μＭ、ｄＮＴＰ０．２ｍＭ、Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）１Ｕ、全て１×Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＨＦ  ｂｕｆｆｅｒ中、マニュアル「フュージョン・ハイ・フィデリティ・ＤＮＡ・ポリメラーゼ（Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）に従う）中でＰＣＲを行った。
【００７９】
９５℃で３分間の変性の後、３０サイクル（９５℃で３０秒間、５７℃で３０秒間、７２℃で１５秒間）の増幅、そして最終工程は７２℃で７分間行った。
【００８０】
ＰＣＲ  ＩＩ：ＰＬＥａｌｐｈａ１／ＥｃｏＲＩＰＬＥ＋ＥＲ２のプライマー対か、またはＰＬＥａｌｐｈａ１／ＥｃｏＲＩＰＬＥ２（Ｃ−末端ＨＡＥＬテトラペプチドの欠失）のプライマー対を使用して、ＰＬＥおよびＡＰＬＥ配列をｐＨＩＬＺプラスミドから増幅した。
【００８１】
これらのＰＣＲもまた、５０μｌの混合物（テンプレート２ｎｇ、各プライマー０．５μＭ、ｄＮＴＰ０．２ｍＭ、Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）１Ｕ、全て１×Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＨＦ  ｂｕｆｆｅｒ中、マニュアル「フュージョン・ハイ・フィデリティ・ＤＮＡ・ポリメラーゼ（Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）に従う）中で実施した。
【００８２】
９５℃で３分間の変性の後、３０サイクル（９５℃で３０秒間、５７℃で３０秒間、７２℃で１５秒間）の増幅、そして最終工程は７２℃で７分間行った。
【００８３】
ＰＣＲ  ＩＩＩ：ＰＣＲＩおよびＰＣＲＩＩの生成物３μｌを使用して、プライマーレスＰＣＲにより、これら２つの生成物を結合した。
【００８４】
伸長は、ｄＮＴＰ０．２ｍＭ、Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）１Ｕの全てを、１×Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＨＦ  ｂｕｆｆｅｒ中に含む、４５μｌの混合物中で実施した。
【００８５】
反応混合物を９５℃で３分間加熱した後、９５℃で３０秒間、７２℃で４５秒間のサイクルを１０サイクル実施した。これらのオーバーラップする伸長生成物を増幅するために、５μｌのプライマー混合物（水３μｌ、５μＭのＥｃｏＲＩａｌｐｈａ１プライマー１μｌおよび５μＭのＥｃｏＲＩＰＬＥ＋ＥＲ２またはＥｃｏＲＩＰＬＥ２プライマー１μｌ）を加えた。生成物を、２０ＰＣＲサイクル（９５℃で３０秒間、５７℃で３０秒間、７２℃で１分間）および７２℃で７分間の単一の停止温度で増幅させた。
【００８６】
［プライマー配列：］
【化７】
2009521239.tif 000012
テンプレートに相同の領域は太字、制限エンドヌクレアーゼの認識配列はイタリック体。
【００８７】
［実施例４：ピヒア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）中において、ブタ肝臓エステラーゼを異種発現するための発現構築体の構築］
実施例３で得られたオーバーラップ伸長ＰＣＲ生成物を、Ｑｉａｑｕｉｃｋ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、ドイツ）を使用し、付属のマニュアルに従って精製した。約０．１μｇの精製ＰＣＲ生成物を、ＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼを使用して切断し、ＥｃｏＲＩ開裂点を介して、プラスミドベクターｐＧＡＰＺ  Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。
【００８８】
例えば、ＮｃｏＩによるコントロール開裂を参照して、挿入配列がプロモータに関して正しい方向であるかどうかをチェックした。
【００８９】
いずれの場合にも、正しい方向に挿入された配列を有するクローンを選別し、配列を決定し、保存した。
【００９０】
対応するプラスミドを次のように命名した。
【００９１】
マツシマ（Ｍａｔｓｕｓｈｉｍａ）ら、（１９９１年）フェブス・レター（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．）２９３、３７−４１頁に記載の公知のＰＬＥ配列を含有するプラスミドは、ｐＧＡＰＺ  Ａ  ＰＬＥ−ＥＲ（ＨＡＥＬテトラペプチドが欠失）およびｐＧＡＰＺ  Ａ  ＰＬＥ＋ＥＲ（ＨＡＥＬテトラペプチドが依然存在）と命名した。
【００９２】
新規なＡＰＬＥ配列から誘導されたプラスミドは、ｐＧＡＰＺ  Ａ  ＡＰＬＥ−ＥＲ（ＨＡＥＬテトラペプチドが欠失）およびｐＧＡＰＺ  Ａ  ＡＰＬＥ−ＥＲ（ＨＡＥＬテトラペプチドが依然存在）と命名した。
【００９３】
［実施例５：ピヒア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）中における、ブタ肝臓エステラーゼの構成的発現］
ｐＧＡＰＺ  Ａ  ＰＬＥ−ＥＲ、ｐＧＡＰＺ  Ａ  ＰＬＥ＋ＥＲ、ｐＧＡＰＺ  Ａ  ＡＰＬＥ−ＥＲ、ｐＧＡＰＺ  Ａ  ＡＰＬＥ＋ＥＲのプラスミドを、Ｐ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）Ｘ−３３に形質転換した。形質転換は、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＰｉｃｈｉａ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ  ｋｉｔ取扱説明書に従って行った。形質転換体を、１００ｍｇ／ｌのゼオシン（ｚｅｏｃｉｎ）を含有するＹＰＤプレート（１％酵母抽出物、２％ペプトン、２％Ｄ−グルコース、２％寒天）上で選別した。１００ｍｇ／ｌのゼオシンを含有するＹＰＤプレート上へ、５２個のゼオシン耐性クローンをストリークし、１５％グリセロール中で保存した。
【００９４】
［実施例６：エステラーゼ活性体の定性分析］
１００ｍｇ／ｌのゼオシンを含有するＹＰＤプレート上で、Ｐ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）形質転換体を、３０℃で４８時間培養した。細胞をＷｈａｔｍａｎ  ５４１  ｈａｒｄｅｎｅｄ  ａｓｈｌｅｓｓ  ７０ｍｍφ  ｆｉｌｔｅｒ上に採り、空気乾燥させた。呈色反応によりエステラーゼ活性体を可視化するために、６ｍｇのα−ナフチルアセテート（Ｓｉｇｍａ、５００ｍμｌのアセトンに溶解）、２．５ｍｇのテトラアゾ化ｏ−ジアニシジン（Ｆａｓｔ  Ｂｌｕｅ  Ｓａｌｔ  ＢＮ、Ｓｉｇｍａ、１２５μｌの水に溶解）および５ｍｌの、０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７）からなる溶液とともに、フィルターをインキュベートした。
【００９５】
活性体は、４種のプラスミド、ｐＧＡＰＺ  Ａ  ＰＬＥ−ＥＲ、ｐＧＡＰＺ  Ａ  ＰＬＥ＋ＥＲ、ｐＧＡＰＺ  Ａ  ＡＰＬＥ−ＥＲ、ｐＧＡＰＺ  Ａ  ＡＰＬＥ＋ＥＲの１つを組み込んだ形質転換体の全てで検出された。これにより、エステラーゼ活性を有する機能性タンパク質が発現したことがわかる。チェックのために、空ベクターを組込んだクローンについても同様にテストした。この場合、同等の反応期間において、有意のエステラーゼ活性体を観察することはできなかった。
【００９６】
［実施例７：メチル５−クロロ−２−（１−メチルエチル）−４−ペンテノエートに対する立体選択的エステラーゼ活性］
実施例６に記載したように、１００ｍｇ／ｌのゼオシンを含有するＹＰＤプレート上で、Ｐ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）形質転換体を、３０℃で４８時間培養した。細胞をＷｈａｔｍａｎ  ５４１  ｈａｒｄｅｎｅｄ  ａｓｈｌｅｓｓ  ７０ｍｍφ  ｆｉｌｔｅｒ上に採り、空気乾燥させた。フィルターを、基質溶液Ａ（ラセミ化合物メチル５−クロロ−２−（１−メチルエチル）−４−ペンテノエート１００μｌ、０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８）２００μｌ、１０ｍｇ／ｍｌフェノールレッド１５０μｌ、ＤＭＳＯ４５０μｌ、Ｈ２Ｏ６５０μｌ）または基質溶液Ｂ（ラセミ化合物に代えてメチル（２Ｓ、４Ｅ）−５−クロロ−２−（１−メチルエチル）−４−ペンテノエートを使用する以外は溶液Ａと同じ）とともにインキュベートした。基質に特異的なエステラーゼ活性により、エステル基質の加水分解で酸が放出される結果、ｐＨが低下し、それによりフェノールレッド指示薬の色が黄色に変化する。
【００９７】
このことから、ｐＧＡＰＺ  Ａ  ＡＰＬＥ−ＥＲプラスミドを含有する形質転換体は、基質溶液Ａの上でテストすると、３〜４時間のインキュベーション後にシグナル（コロニー周辺が黄色に変色）を発したが、基質溶液Ｂでは有意の変換が見られないことが明らかとなった（図１）。
【００９８】
ｐＧＡＰＺ  Ａ  ＰＬＥ−ＥＲおよびｐＧＡＰＺ  Ａ  ＰＬＥ＋ＥＲにより得られた形質転換体は、同一条件下で、基質溶液ＡおよびＢのいずれとも反応しなかった。
【００９９】
これにより、組換えｒＡＰＬＥは組替えｒＰＬＥとは異なる基質特異性を有しており、ｒＡＰＬＥを使用するメチル５−クロロ−２−（１−メチルエチル）−４−ペンテノエートの加水分解は（Ｒ）エナンチオマーに対し立体選択的に起きることがわかった。
【０１００】
［実施例８：ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動］
１０μｌの２×ＳＤＳサンプル緩衝液（１２５ｍＭトリス塩酸、ｐＨ６．８；４％ＳＤＳ、２０％グリセロール、５％β−メルカプトエタノール、０．０５％ブロモフェノールブルー）を、１０μｌの商業的に入手可能なブタ肝臓エステラーゼ、または、ｐＧＡＰＺ  Ａ  ＡＰＬＥ−ＥＲもしくは空のｐＧＡＰＺ  Ａプラスミド（コントロール菌株）を含有するＰ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）培養物（２リットルのバッフル付アーレンマイヤー（Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒ）フラスコ内、２５０ｍｌのＹＰＤ培地中、１００ｒｐｍ、２８℃で７２時間）の６０倍濃縮（ＳａｒｔｏｒｉｕｓのＣｅｎｔｒｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎｓ−Ｓｐｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎｓ）上澄み１０μｌに加えた。
【０１０１】
サンプルを９５℃で５分間加熱した後、１２．５％ポリアクリルアミドゲル（４％スタッキングゲル）上でタンパク質を分離し、検出のために、クマシー・ブリリアントブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｂｌｕｅ）Ｒ２５０により着色した。ｐＧＡＰＺ  Ａ  ＡＰＬＥプラスミドを有する酵母菌株では、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで、ｒＡＰＬＥに対して予期されたサイズ（約６０ｋＤａ）のタンパク質バンドが現れるが、コントロール菌株では現れない（図２）。商業的に入手可能なブタ肝臓エステラーゼを比較のために併せ分析したが、同じサイズ領域に、２つのタンパク質バンドが現れた（図２の矢印）。
【０１０２】
［実施例９：ＡＯＸ１プロモータによるブタ肝臓エステラーゼの誘導発現］
制限エンドヌクレアーゼＸｈｏＩにより、プラスミドｐＧＡＰＺ  Ａ  ＰＬＥ−ＥＲ、ｐＧＡＰＺ  Ａ  ＰＬＥ＋ＥＲ、ｐＧＡＰＺ  Ａ  ＡＰＬＥ−ＥＲ、ｐＧＡＰＺ  Ａ  ＡＰＬＥ＋ＥＲを切断し、ＡＰＬＥおよびＰＬＥをコードするそれぞれのフラグメントを、ＥＲリテンションシグナルを有しているものも有していないものも、ＸｈｏＩ開裂点を介して、ｐＰＩＣ９ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。制限エンドヌクレアーゼＮｃｏＩによるコントロール開裂を用いて、ＡＯＸ１プロモータに対して、正しい方向のフラグメントをチェックした。ＡＯＸ１プロモータを有するベクターを、実施例４でプラスミドに命名したように、ｐＰＩＣ９  ＰＬＥ−ＥＲ、ｐＰＩＣ９  ＰＬＥ＋ＥＲ、ｐＰＩＣ９  ＡＰＬＥ−ＥＲおよびｐＰＩＣ９  ＡＰＬＥ＋ＥＲと命名し、ＳａｌＩで直線化し、Ｐ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＫＭ７１に形質転換した。形質転換およびＨｉｓ原栄養体の選別は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎのピヒア（Ｐｉｃｈｉａ）発現キットの取扱説明書に従って行った。選別した形質転換体およびＫＭ７１菌株を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎのピヒア（Ｐｉｃｈｉａ）発現キットに従って、完全培地上で終夜培養し、１％メタノールで４８時間、誘導した。得られた培養物を、実施例７で記載した定性的ｐＨシフト法を用い、それぞれの場合、混合物中の培養物２μｌを試験することによって分析した。ＡＯＸ１誘導プロモータのコントロール下での発現は、実施例７の構成的発現を記載した状況と比較すると、ラセミ化合物メチル５−クロロ−２−（１−メチルエチル）−４−ペンテノエートに対して非常に高いｒＡＰＬＥ酵素活性を示した。フェニルレッドの色の変化（赤から黄色）は、わずか数分後に検出することができた（図３）。意外にも、ｒＡＰＬＥ活性は、Ｃ末端におけるＥＲリテンションシグナルＨＡＥＬの存在の有無に無関係であった。すなわち、ＥＲリテンションシグナルを有するｒＡＰＬＥを発現する細胞でさえ、活性を示した。対照的に、ｒＰＬＥを産生する酵母菌株は、ラセミ化合物メチル５−クロロ−２−（１−メチルエチル）−４−ペンテノエートに対して全く活性を示さなかった。
【図面の簡単な説明】
【０１０３】
【図１】メチル５−クロロ−２−（１−メチルエチル）−４−ペンテノエートに対する立体選択的エステラーゼ活性を示す。
【図２】組換えＡＰＬＥのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。
【図３】ＡＯＸ１プロモータによるブタ肝臓エステラーゼの誘導発現を示す。