(57)【要約】【課題】呈味性物質に応答するセンサー、並びに呈味性物質の同定方法及び検出方法を提供すること。【解決手段】Ｇタンパク質共役型受容体１４タンパク質、該タンパク質を発現する細胞、及び該細胞の膜画分からなる群より選択されるものを含むことを特徴とする呈味性物質反応性組成物。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｇタンパク質共役型受容体１４タンパク質、該タンパク質を発現する細胞、及び該細胞の膜画分からなる群より選択されるものを含むことを特徴とする呈味性物質反応性組成物。
【請求項２】
Ｇタンパク質共役型受容体１４タンパク質を発現する細胞を含むことを特徴とする呈味性物質反応性組成物。
【請求項３】
細胞がチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）である、請求項１又は２記載の組成物。
【請求項４】
呈味性物質が甘味成分である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
呈味性物質が、グルコース、フラクトース、スクロース、ラクトース、マルトース、ソルビトール及び食塩からなる群より選択されるものである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物と試験化合物とを接触させたときの結合量又は細胞刺激活性を測定することを特徴とする、呈味性物質の同定方法。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物と被検サンプルとを接触させ、該組成物と被検サンプル中の呈味性物質との結合量又は細胞刺激活性を測定することを特徴とする、被検サンプル中の呈味性物質の検出方法。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物を含むことを特徴とする呈味性物質の同定又は検出用キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、呈味性物質反応性組成物に関する。また本発明は、呈味性物質の同定方法、及び呈味性物質の検出方法に関する。さらに本発明は、上記組成物を含む、呈味性物質の同定又は検出用キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
Ｇタンパク質共役型受容体１４（ＳＥＮＲ／ＧＰＲＥ／ウロテンシン−ＩＩ受容体としても知られている。以下「ＧＰＲ１４」という）は、Ｔａｌら（Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ｒｅｓ．　Ｃｏｍｍｕｎ．　２０９，　７５２−７５９，　１９９５）により最初に報告され、その後、そのリガンド（アゴニスト）がウロテンシン−ＩＩであることが報告されている（Ａｍｅｓ，　ＲＳ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎａｔｕｒｅ，　４０１：　２８２−２８６，　１９９９）。ウロテンシン−ＩＩは血圧上昇に関与するポリペプチドであり、ＧＰＲ１４は主に心臓血管組織に存在することが知られている。そのため、ＧＰＲ１４の研究は、大部分が血管収縮作用に焦点が当てられていた。しかし、ＧＰＲ１４に関して、ウロテンシン−ＩＩ以外のリガンド（アゴニスト）は知られていない。
【０００３】
一方、呈味性物質の受容体についての研究が近年進んでおり、現在Ｔ１Ｒ、Ｔ２Ｒ、ＴＨＴＲのシリーズが味覚受容体として知られている。しかし、これらの受容体がどのような物質をリガンド（アゴニスト）としているかはほとんど不明である。従って、味覚受容体を解明し、呈味性物質としてのリガンドを探索することが望まれていた。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、呈味性物質に応答するセンサー、並びに呈味性物質の同定及び検出方法を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、ＧＰＲ１４遺伝子をクローニングし、それを細胞膜上に発現させた形質転換細胞を用いて、ＧＰＲ１４の各種呈味性物質への応答性を測定したところ、ＧＰＲ１４が呈味性物質への応答性を有し、生体内でこれらの物質のセンサーとして働いていることを見出した。さらに本発明者は、ＧＰＲ１４タンパク質及びＧＰＲ１４タンパク質を発現する細胞を利用して、呈味性物質の同定及び検出を行うことができるという知見を得て、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は、Ｇタンパク質共役型受容体１４タンパク質、該タンパク質を発現する細胞、及び該細胞の膜画分からなる群より選択されるものを含むことを特徴とする呈味性物質反応性組成物である。ここで該組成物としては、Ｇタンパク質共役型受容体１４タンパク質を発現する細胞を含むものであることが好ましい。また該細胞は、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）であることが好ましい。
【０００７】
また呈味性物質としては、甘味成分が挙げられる。呈味性物質は、グルコース、フラクトース、スクロース、ラクトース、マルトース、ソルビトール及び食塩からなる群より選択されるものが好ましい。
【０００８】
本発明はまた、上記組成物と試験化合物とを接触させたときの結合量又は細胞刺激活性を測定することを特徴とする、呈味性物質の同定方法である。
【０００９】
さらに本発明は、上記組成物と被検サンプルとを接触させ、該組成物と被検サンプル中の呈味性物質との結合量又は細胞刺激活性を測定することを特徴とする、被検サンプル中の呈味性物質の検出方法である。
また本発明は、上記組成物を含むことを特徴とする呈味性物質の同定又は検出用キットである。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に係る呈味性物質反応性組成物（以下、「本組成物」という）は、Ｇタンパク質共役型受容体１４（以下、「ＧＰＲ１４」という）を含むことを特徴とするものであり、このＧＰＲ１４が呈味性物質に対して応答する味覚受容体であるという知見に基づくものである。従って、本組成物は、味覚センサー又は呈味性物質反応性センサーとして機能する。また本発明者は、ＧＰＲ１４が、グルコース、フラクトース、スクロース、ラクトース、マルトース、ソルビトール、食塩などの呈味性物質に対し応答することを見出し、さらにはこの応答が濃度依存的であったことから、ＧＰＲ１４を、呈味性物質の検出及び定量に利用可能であると考えた。
【００１１】
１．ＧＰＲ１４を含む呈味性物質反応性組成物
本組成物はＧＰＲ１４を含むことを特徴とし、具体的には、本組成物はＧＰＲ１４タンパク質又はＧＰＲ１４タンパク質を発現する細胞若しくは細胞膜画分を含む。以下に、ＧＰＲ１４タンパク質及びＧＰＲ１４タンパク質を発現する細胞に関して説明する。
【００１２】
（１）ＧＰＲ１４タンパク質
ＧＰＲ１４タンパク質は、既にＧＰＲ１４遺伝子及びタンパク質の塩基配列及びアミノ酸配列が公開されているため、それらの情報を利用して、当技術分野で公知の方法により製造することができる。例えば、ＧＰＲ１４に関する配列情報は、ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ　Ｄａｔａ　Ｌｉｂｒａｒｉｅｓにアクセッション番号Ｕ２３４８３として登録されている。本発明において利用可能なＧＰＲ１４の配列情報を、配列番号１（塩基配列）及び配列番号２（アミノ酸配列）として例示した。
【００１３】
ＧＰＲ１４タンパク質は、配列番号２に示すアミノ酸配列を含むタンパク質がＧＰＲ１４として機能する限り、当該アミノ酸配列において複数個、好ましくは１個若しくは数個のアミノ酸に欠失、置換、付加等の変異が生じているものであってもよい。
【００１４】
「ＧＰＲ１４としての機能」としては、例えば、呈味性物質との結合活性、呈味性物質を介したシグナル情報伝達作用などが挙げられる。「ＧＰＲ１４として機能する」とは、例えば配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質とほぼ同等の機能を有することを指す。従って、配列番号２に示すアミノ酸配列において変異が生じたアミノ酸を含むタンパク質の活性が、配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質と同等（０．５〜１．５倍程度）であることが好ましいが、これらの活性の程度やタンパク質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。リガンド結合活性やシグナル情報伝達作用などの活性の測定は、当技術分野で公知の方法に従って行なうことができ、例えば、後述する「２．呈味性物質の同定方法」の項に記載のようにして測定することができる。
【００１５】
また、本発明において使用するＧＰＲ１４タンパク質としては、ＧＰＲ１４タンパク質の部分ペプチドも包含される。そのような部分ペプチドとしては、ＧＰＲ１４タンパク質としての機能を有する部分ペプチドであればいずれのものであってもよいが、例えば、ＧＰＲ１４タンパク質分子のうち、細胞膜の外に露出している部位であって、受容体結合活性を有するものなどが用いられる。具体的には、ＧＰＲ１４タンパク質の部分ペプチドとしては、ヒドロパシープロット解析において細胞外領域（親水性部位）であると分析された部分を含むペプチドである。また、疎水性部位を一部に含むペプチドも同様に用いることができる。個々のドメインを個別に含むペプチドも用い得るが、複数のドメインを同時に含む部分のペプチドでもよい。
ＧＰＲ１４タンパク質の部分ペプチドのアミノ酸の数は、上記ＧＰＲ１４タンパク質の構成アミノ酸配列のうち少なくとも２０個以上、好ましくは５０個以上、より好ましくは１００個以上のアミノ酸配列を有するペプチドなどが好ましい。
【００１６】
本組成物に含まれるＧＰＲ１４タンパク質又はその部分ペプチドは、ヒトやラットなどの細胞又は組織から当技術分野で公知のタンパク質の精製方法によって製造することができる。また、ＧＰＲ１４タンパク質をコードするＤＮＡで形質転換された形質転換体を培養することによっても製造することができる（下記参照）。また、当技術分野で公知の化学的ペプチド合成方法、例えば固相合成法などによって製造することもできる。
【００１７】
（２）ＧＰＲ１４タンパク質の製造
ＧＰＲ１４タンパク質を遺伝子組換え手法により製造する場合には、ＧＰＲ１４タンパク質をコードするＤＮＡ（ＧＰＲ１４遺伝子）を導入した形質転換体を培養し、この培養物から該タンパク質を回収することができる。
【００１８】
（ａ）　　ＧＰＲ１４遺伝子のクローニング
ＧＰＲ１４遺伝子は、上述した通り、その塩基配列情報が公開されているため、その情報を利用して作製することができる。本発明において利用可能なＧＰＲ１４遺伝子の塩基配列として、配列番号１に示す塩基配列を例示する。また、配列番号１に示す塩基配列からなるＤＮＡの全部又は一部の配列に相補的な配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるＤＮＡであって、ＧＰＲ１４として機能するタンパク質をコードする遺伝子もＧＰＲ１４遺伝子に含まれる。ストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、相同性が高い核酸、すなわち６０％以上、好ましくは８０％以上の相同性を有するＤＮＡの相補鎖がハイブリダイズし、それより相同性が低い核酸の相補鎖がハイブリダイズしない条件が挙げられる。ストリンジェントな条件とは、例えばナトリウム濃度が、１０〜３００ｍＭ、好ましくは２０〜１００ｍＭであり、温度が２５〜７０℃、好ましくは４２〜５５℃における条件をいう。
【００１９】
ＧＰＲ１４遺伝子は、上述した塩基配列情報により、化学合成によって、又は塩基配列情報に基づいて設計したプライマーを用いた増幅反応によって、あるいは該塩基配列を有するＤＮＡ断片をプローブとしてハイブリダイズさせることによって得ることができる。以下に、プライマーを用いた増幅反応によりＧＰＲ１４をクローニングする手法を説明する。
【００２０】
ＧＰＲ１４遺伝子の塩基配列を基にプライマーを設計する場合には、該配列の５’末端から約２０〜３０塩基及び３’の終止コドンを含む上流側の約２０〜３０塩基を選択し、プライマーを設計することが好ましい。例えば、本発明において利用可能なプライマーの例を以下に示す：
フォーワードプライマー：ＧＡＴ　ＧＧＣ　ＴＣＴ　ＧＡＧ　ＣＣＴ　ＧＧＡ　ＧＴＣ　ＴＡＣ　ＡＡＣ　ＡＡＧ　ＣＴＴ　ＴＣ（配列番号３）
リバースプライマー：ＴＣＡ　ＧＡＧ　ＡＡＧ　ＧＧＣ　ＣＣＣ　ＧＴＴ　ＡＣＧ　ＧＧＡ（配列番号４）
【００２１】
上述のように設計したプライマーの合成法は、当技術分野で周知である。例えば、ホスホアミダイト法などの一般的なオリゴヌクレオチド合成法を用いることができる。
【００２２】
続いて、上記設計したプライマーを用いて、ｃＤＮＡライブラリー又はｍＲＮＡを鋳型として増幅反応を行う。増幅反応としては、限定するものではないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ＬＡＭＰ法（Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ　Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）などが挙げられる。本発明において増幅反応は、ＰＣＲが好ましい。ｍＲＮＡの抽出及びｃＤＮＡライブラリーの作製は常法に従って行うことができる。
【００２３】
このようにして得られたｍＲＮＡを鋳型として、ランダムプライマーと共に逆転写酵素を用いて一本鎖ｃＤＮＡを合成した後、該一本鎖ｃＤＮＡから二本鎖ｃＤＮＡを合成する。次に、得られた二本鎖ｃＤＮＡを適当なクローニングベクターに組み込んで組換えベクターを作製する。そしてこの組換えベクターを用いて大腸菌等を形質転換し、テトラサイクリン耐性、アンピシリン耐性等を指標として形質転換体を選択することにより、ｃＤＮＡのライブラリーを得ることができる。
【００２４】
あるいは、上記組織から得られたｍＲＮＡを鋳型として、ランダムプライマーと共に逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを作製することもできる。Ｐｏｌｙ　Ａ＋　ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）は市販されており、例えばヒト脳組織としては、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製Ｈｕｍａｎ　Ｂｒａｉｎ　Ｐｏｌｙ　Ａ＋　ＲＮＡ（カタログ番号６５１６−１）などが挙げられる。
逆転写酵素としては、例えばＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ社製のＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ逆転写酵素を利用可能である。
【００２５】
上記のようにして得られる形質転換体又はｃＤＮＡライブラリーから目的のＤＮＡを有する株を選択するには、上記プライマー、例えば、配列番号３及び４に示すプライマーを合成し、これを用いて増幅反応を行い、得られた断片をプローブとして、ｃＤＮＡライブラリーからスクリーニングする方法、あるいはλファージ（λｇｔ１１等）を用いた場合は、λｇｔ１１インサート増幅用のプライマーを用いて増幅反応を行う方法を採用することができる。但し、本発明においてはこれらのプライマーに限定されるものではない。
【００２６】
このようにして得られたＤＮＡ増幅断片を、３２Ｐ、３５Ｓ又はビオチン等で標識してプローブとし、これを形質転換体のＤＮＡを変性固定したニトロセルロースフィルターとハイブリダイズさせ、得られたポジティブ株を検索することによりスクリーニングすることができる。
【００２７】
次に、得られたクローンから全長のｃＤＮＡをクローニングする。ｃＤＮＡのクローニングには、例えばＴＡクローニング法が用いられる。ＴＡクローニング法は、市販のキット、例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製のＴＡクローニングキットを用いて行うことができる。
上記スクリーニングにおいて得られたｃＤＮＡの単離クローンについて、増幅産物をテンプレートにしてｃＤＮＡの塩基配列を決定する。
【００２８】
塩基配列の決定はマキサム−ギルバートの化学修飾法、又はＭ１３ファージを用いるジデオキシヌクレオチド鎖終結法等の公知手法により行うことができるが、通常は自動塩基配列決定装置（例えばＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製ＡＢＩ３７３シークエンサー等）を用いて配列決定が行われる。
【００２９】
（ｂ）　　組換えベクター及び形質転換体の作製
宿主を形質転換するための組換えベクターは、上記ＧＰＲ１４遺伝子を適当なベクターに連結することにより得ることができ、形質転換体は、上記組換えベクターを、目的の遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することにより得ることができる。
【００３０】
ベクターとしては、形質転換用のベクターとして当技術分野で公知のベクターが使用され、例えば、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ、レトロウイルス又はワクシニアウイルスなどの動物ウイルスベクター、バキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクター、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）などが挙げられる。
【００３１】
ベクターにＧＰＲ１４遺伝子を挿入するには、まず、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。
【００３２】
ＧＰＲ１４遺伝子は、その遺伝子の機能が発揮されるようにベクターに組み込まれることが必要である。そこで、組換えベクターには、プロモーター、ＧＰＲ１４遺伝子のほか、所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）などを連結することができる。なお、選択マーカーとしては、例えばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。さらに、大腸菌及び酵母などの２種以上の宿主微生物で自律的増殖が可能なベクターのほか、各種のシャトルベクターを使用することもできる。このようなベクターについても、前記制限酵素で切断し、その断片を得ることができる。
【００３３】
ＤＮＡ断片とベクター断片とを連結させるには、公知のＤＮＡリガーゼを用いる。そして、ＤＮＡ断片とベクター断片とをアニーリングさせた後に連結させ、組換えベクターを作製する。
【００３４】
形質転換に使用する宿主としては、ＧＰＲ１４遺伝子を発現できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、細菌（大腸菌、枯草菌等）、酵母、動物細胞（ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等）、昆虫細胞が挙げられる。
【００３５】
細菌を宿主とする場合は、本発明の組換えベクターが該細菌中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボゾーム結合配列、ＧＰＲ１４遺伝子、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。大腸菌としては、例えばエッシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＤＨ５αなどが挙げられ、枯草菌としては、例えばバチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などが挙げられる。プロモーターは、大腸菌等の宿主中で発現できるものであればいずれを用いてもよい。細菌への組換えベクターの導入方法は、細菌にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されるものではない。例えばカルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
【００３６】
酵母を宿主とする場合は、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ）などが用いられる。この場合、プロモーターは酵母中で発現できるものであれば特に限定されない。酵母への組換えベクターの導入方法は、酵母にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されず、例えばエレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等が挙げられる。
【００３７】
動物細胞を宿主とする場合は、サル細胞ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、マウスＬ細胞、ラットＧＨ３、ヒトＦＬ細胞等が用いられる。プロモーターとしてＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター等が用いられ、また、ヒトサイトメガロウイルスの初期遺伝子プロモーター等を用いてもよい。動物細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。
【００３８】
昆虫細胞を宿主とする場合は、Ｓｆ９細胞などが用いられる。昆虫細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法などが挙げられる。
【００３９】
形質転換体は、導入する遺伝子内に構成されるマーカー遺伝子の性質を利用して選択される。例えば、ネオマイシン耐性遺伝子を用いた場合には、Ｇ４１８薬剤に抵抗性を示す細胞を選択する。
【００４０】
（ｃ）　　ＧＰＲ１４タンパク質の生産
本発明において、ＧＰＲ１４タンパク質は、ＧＰＲ１４遺伝子を保有する前記形質転換体を培養し、その培養物から採取することにより得ることができる。「培養物」とは、培養細胞、培養菌体、又は細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。
【００４１】
大腸菌や酵母菌等の微生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。ここで、培地に添加される炭素源、窒素源、無機物などについては当技術分野で公知である。
【００４２】
培養は、通常、振盪培養又は通気攪拌培養などの好気的条件下、約３７℃で約５時間〜３０日間行う。培養期間中、ｐＨは中性付近に保持する。ｐＨの調整は、無機又は有機酸、アルカリ溶液等を用いて行う。培養中は必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００４３】
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する場合は、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、Ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドール酢酸（ＩＡＡ）等を培地に添加してもよい。
【００４４】
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地、ＤＭＥＭ培地又はこれらの培地に牛胎児血清等を添加した培地等が用いられる。培養は、通常、５％ＣＯ２存在下、３７℃で約５時間〜３０日間行う。培養中は必要に応じてカナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００４５】
培養後、目的のＧＰＲ１４タンパク質は細胞表面上に生産されるため、菌体又は細胞を破砕することによりタンパク質を抽出する。その後、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、前記培養物中から目的のタンパク質を単離精製することができる。
目的のタンパク質が得られたか否かは、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動等により確認することができる。
【００４６】
（３）ＧＰＲ１４タンパク質を発現する細胞
ＧＰＲ１４タンパク質を発現する細胞は、上記「１．ＧＰＲ１４を含む呈味性物質反応性組成物」の項の「（ｂ）　　組換えベクター及び形質転換体の作製」に記載の方法と同様にして作製することができる。すなわち、ＧＰＲ１４遺伝子を組み込んだ組換えベクターを作製し、それを用いて宿主細胞を形質転換する。
【００４７】
組換えベクターは、宿主細胞を形質転換するためのベクターであれば特に限定されるものではない。特に、哺乳動物において高発現するものが好ましく、例えばｐＥＦ−ＢＯＳベクター（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ，　Ｓ．　ａｎｄ　Ｎａｇａｔａ，　Ｓ．　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　１９９０，
１８，　１７：　５３２２）が挙げられる。
【００４８】
宿主細胞は、ＧＰＲ１４遺伝子を発現できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、細菌（大腸菌、枯草菌等）、酵母、動物細胞（チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、ＣＯＳ細胞等）、昆虫細胞が挙げられる。本組成物においては、ＣＨＯ細胞などの哺乳動物細胞を宿主として用いることが好ましい。
【００４９】
上記組換えベクターを、宿主細胞に導入し、組換えベクターが導入された細胞を培養する。宿主として動物細胞を使用した場合には、培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地、ＤＭＥＭ培地又はこれらの培地に牛胎児血清等を添加した培地等が用いられる。培養は、通常、５％ＣＯ２存在下、３７℃で７〜１４日行う。ＣＨＯ細胞を培養する場合には、ＨａｍＦ−１２培地を用いて、５％ＣＯ２存在下、３７℃で１０〜１４日間培養する。
上記のようにして、ＧＰＲ１４タンパク質を発現する細胞を作製することができる。
【００５０】
本組成物において、ＧＰＲ１４タンパク質を発現する細胞を用いる場合には、該細胞をグルタルアルデヒド、ホルマリンなどで固定化してもよい。固定化方法は、当技術分野で公知の方法に従って行なうことができる。また本組成物として使用するＧＰＲ１４タンパク質は、細胞膜上に発現するＧタンパク質共役型受容体であるため、ＧＰＲ１４タンパク質を発現する細胞として、細胞膜画分を用いることも可能である。細胞膜画分としては、細胞を破砕した後、当技術分野で公知の方法で得られる細胞膜が多く含まれる画分のことをいう。細胞の破砕方法としては、Ｐｏｔｔｅｒ−Ｅｌｖｅｈｊｅｍ型ホモジナイザーで細胞を押し潰す方法、ワーリングブレンダーやポリトロン（Ｋｉｎｅｍａｔｉｃａ社製）による破砕、超音波による破砕、フレンチプレスなどで加圧しながら細胞を細いノズルから噴出させることによる破砕などが挙げられる。細胞膜の分画には、分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの遠心力による分画法が主として用いられる。例えば、細胞破砕液を低速（５００ｒｐｍ〜３０００ｒｐｍ）で短時間（通常、約１分〜１０分）遠心し、上清をさらに高速（１５０００ｒｐｍ〜３００００ｒｐｍ）で通常３０分〜２時間遠心し、得られる沈澱を膜画分とする。該膜画分中には、発現したＧＰＲ１４タンパク質と細胞由来のリン脂質や膜タンパク質などの膜成分が多く含まれる。ＧＰＲ１４タンパク質を発現する細胞又はその膜画分中のＧＰＲ１４タンパク質の量は、１細胞当たり１０３〜１０７分子であるのが好ましく、１０５〜１０７分子であるのがさらに好適である。
【００５１】
（４）呈味性物質反応性組成物（センサー）としての機能
ＧＰＲ１４タンパク質は、以下の実施例２及び３において、呈味性物質に対し濃度依存的に応答することが示された。また、以下の実施例４において、ＧＰＲ１４遺伝子が舌組織で発現することを確認したため、ＧＰＲ１４は味覚受容体として機能していると考えられる。従って、本組成物、すなわちＧＰＲ１４タンパク質又はＧＰＲ１４タンパク質を発現する細胞は、呈味性物質のセンサーとして利用可能である。
【００５２】
本発明において「呈味性物質」とは、甘味、苦み、うま味、塩味、酸味、辛味、えぐ味などの味覚のシグナルを生ずる成分又は化合物を指す。具体的には、呈味性物質としては、限定するものではないが、グルコース、フラクトース、スクロース、ラクトース、マルトース、ソルビトール及び食塩が挙げられる。本組成物は特に、グルコース、フラクトース、スクロース、ラクトース、マルトース、ソルビトールなどの甘味成分に対し応答する。
【００５３】
２．呈味性物質の同定方法
本組成物は、呈味性物質を単離し、同定するための試薬として有用である。すなわち、本発明に係る呈味性物質の同定方法（以下、「本同定方法」という）は、本組成物と試験化合物とを接触させ、それらの結合量又はそれらによる細胞刺激活性を測定することを特徴とするものである。
【００５４】
試験化合物としては、呈味性物質であるかどうかを判定することが望まれる候補化合物や、コンビナトリアルケミストリーなどのライブラリーなどが用いられる。例えば、試験化合物としては、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物などが挙げられる。
【００５５】
具体的に説明すると、本同定方法は、本組成物を用いることによって、ＧＰＲ１４タンパク質に結合する試験化合物、又はＧＰＲ１４と結合して細胞刺激活性を有する試験化合物を同定する方法である。細胞刺激活性としては、例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内カルシウム遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内タンパク質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓ活性化、ｐＨの低下などを促進する活性又は抑制する活性などが挙げられる。本同定方法においては、例えば、本組成物と試験化合物とを接触させた場合のＧＰＲ１４タンパク質に対する試験化合物の結合量や、試験化合物による細胞刺激活性などを測定することを特徴とする。
【００５６】
本同定方法において、ＧＰＲ１４タンパク質に対する試験化合物の結合量、又は試験化合物による細胞刺激活性は、限定するものではないが、以下の（１）〜（５）に記載するいずれかの手法により測定することができる。すなわち、
（１）　標識した試験化合物を、本組成物に接触させて、標識した試験化合物とＧＰＲ１４タンパク質との結合量を測定する。
（２）　標識した試験化合物を、本組成物に含まれるＧＰＲ１４タンパク質を発現する細胞又は細胞膜画分に接触させて、標識した試験化合物とこの細胞又は膜画分との結合量を測定する。
（３）　標識した試験化合物を、本組成物に含まれるＧＰＲ１４タンパク質を発現する細胞を培養することによって細胞膜上に発現したＧＰＲ１４タンパク質に接触させて、標識した試験化合物とＧＰＲ１４タンパク質との結合量を測定する。
（４）　試験化合物を、本組成物に含まれるＧＰＲ１４タンパク質を発現する細胞又は細胞膜画分に接触させて、ＧＰＲ１４タンパク質を介した細胞刺激活性を測定する。
（５）　試験化合物を、本組成物に含まれるＧＰＲ１４タンパク質を発現する細胞を培養することによって細胞膜上に発現したＧＰＲ１４タンパク質に接触させて、ＧＰＲ１４タンパク質を介する細胞刺激活性を測定する。
【００５７】
そして、上記（１）〜（３）の試験のいずれかにより測定した本組成物と試験化合物とを接触させた場合の結合量を、本組成物と呈味性物質ではない物質とを接触させた場合の結合量（ネガティブコントロール）、又は本組成物とウロテンシンＩＩとを接触させた場合の結合量（ポジティブコントロール）と比較する。それにより、試験化合物と接触させた場合の結合量が、呈味性物質ではない物質と接触させた場合の結合量と比較して有意に上昇した場合に、試験化合物を呈味性物質と決定する。ここで、「呈味性物質ではない物質」としては、純水などが挙げられる。
【００５８】
あるいは、上記（４）又は（５）の試験により測定した本組成物と試験化合物とを接触させた場合の細胞刺激活性を、呈味性物質ではない物質と接触させた場合若しくは試験化合物と接触させていない場合の細胞刺激活性（ネガティブコントロールコントロール）、又は、ウロテンシンＩＩと接触させた場合の細胞刺激活性（ポジティブコントロール）と比較する。それにより、試験化合物と接触させた場合の結合量が、呈味性物質ではない物質と接触させた場合若しくは試験化合物と接触させていない場合の細胞刺激活性と比較して有意に上昇した場合に、試験化合物を呈味性物質と決定する。ここで、試験化合物と接触させない場合の細胞刺激活性は、上記（４）又は（５）の試験において、試験化合物を接触させずに、ＧＰＲ１４タンパク質を発現する細胞又は細胞膜画分の細胞刺激活性を測定することにより、決定することができる。
【００５９】
本同定方法に関して上記の（１）〜（５）の手法を実施するためには、本組成物と、標識した試験化合物が必要である。本組成物は、上記「１．ＧＰＲ１４を含む呈味性物質反応性組成物」の項に記載のようにして作製することができる。また標識した試験化合物としては、〔３Ｈ〕、〔１２５Ｉ〕、〔１４Ｃ〕、〔３５Ｓ〕などの放射性同位体、フルオレセイン、スルホローダミン、テトラメチルローダミンなどの蛍光標識、ルシフェリンなどの化学発光標識、標識用抗体で標識した化合物（例えばペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物）などが好適である。あるいは、本組成物を、上記標識により標識してもよい。
【００６０】
呈味性物質を同定するには、本組成物に、一定量の標識で標識した試験化合物を共存させる。非特異的結合量（ＮＳＢ）を知るために、過剰量の未標識の試験化合物を加えた反応チューブも用意する。反応の温度及び時間は、組成物に含まれるＧＰＲ１４タンパク質量、試験化合物量などを考慮して適宜決定する。反応後、ガラス繊維濾紙等で濾過し、適量のバッファーなどで洗浄した後、ガラス繊維濾紙に残存する標識量を計測する。放射性同位体で標識した場合には、放射活性を、例えば液体シンチレーションカウンター、γ−カウンターなどにより計測することができる。蛍光標識した場合には、蛍光強度を、例えば蛍光プレートリーダー、蛍光レーザースキャナーなどにより計測することができる。抗体で標識した場合には、抗体結合量を一般的なプレートリーダーを用いて計測することができる。全結合量（Ｂ）から非特異的結合量（ＮＳＢ）を引いたカウント（Ｂ−ＮＳＢ）が０ｃｐｍを越える試験化合物を呈味性物質として選択することができる。
【００６１】
本同定方法に関して上記の（１）〜（５）の手法を実施するためには、ＧＰＲ１４タンパク質を介する細胞刺激活性を公知の方法又は市販の測定用キットを用いて測定することができる。ここで細胞刺激活性としては、例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内カルシウム遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内タンパク質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下などを促進する活性又は抑制する活性などが挙げられる。
具体的には、まず、本組成物のＧＰＲ１４タンパク質を発現する細胞をマルチウェルプレート等に培養する。本同定方法を行なうにあたっては前もって新鮮な培地又は細胞に毒性を示さない適当なバッファーで交換し、試験化合物などを添加して一定時間インキュベートした後、細胞を抽出又は上清液を回収して、生成した産物をそれぞれの方法に従って定量する。細胞刺激活性の指標とする物質（例えば、アラキドン酸など）の生成が、細胞が含有する分解酵素によって検定困難な場合は、該分解酵素に対する阻害剤を添加してアッセイを行なってもよい。また、ｃＡＭＰ産生抑制などの活性については、フォルスコリンなどで細胞の基礎的産生量を増大させておいた細胞に対する産生抑制作用として検出することができる。
【００６２】
以下に、細胞内カルシウム濃度を測定して、細胞刺激活性を測定する方法を記載する。細胞内カルシウム濃度の測定は、当技術分野で公知であり、例えばＦｕｒａ−２を用いた蛍光法などが挙げられる。その他、細胞内カルシウムの上昇に伴って細胞内の産生・放出が変化するプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）を測定することによって間接的に細胞内カルシウム濃度を測定することができる。この産生が変化したＰＧＥ２は、細胞外に放出されるため、リガンド刺激の４時間後の培養上清を回収し、該上清中のＰＧＥ２濃度を測定する。ＰＧＥ２の測定には、例えばＣａｙｍａｎ社製のＰｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ　Ｅ２　ＥＩＡ測定キットを用いることができる。
【００６３】
試験化合物と接触させた、ＧＰＲ１４タンパク質を発現する細胞の細胞内カルシウム濃度が、呈味性物質以外の物質と接触させた場合又は試験化合物を接触させない場合の細胞内カルシウム濃度と比較して増大している場合には、この試験化合物が呈味性物質であるといえる。
【００６４】
上述のようにして同定された呈味性物質は、ＧＰＲ１４に結合して味覚として感知されるため、本同定方法は、食品の分野で、調味料、加工食品などにおいて利用するための新規な呈味性物質を同定するのに有用である。
【００６５】
３．呈味性物質の検出方法
ＧＰＲ１４は呈味性物質に対し濃度依存的に応答するため、本組成物は、呈味性物質を検出するために使用することができる。本発明において「検出」とは、被検サンプル中に含まれる呈味性物質の有無を判定することを指し、また、被検サンプル中に含まれる呈味性物質量を測定する定量的な検出をも指す。
【００６６】
本発明に係る、被検サンプル中の呈味性物質の検出方法（以下、「本検出方法」という）は、本組成物と被検サンプルとを接触させ、本組成物と被検サンプル中の呈味性物質との結合量又は呈味性物質による細胞刺激活性を測定することを特徴とするものである。
【００６７】
被検サンプルとしては、含まれる呈味性物質を検出又は定量することが望まれるサンプル、呈味性物質の有無を判定することが望まれるサンプルなどが用いられる。例えば、被検サンプルとしては、液体状、固形状及び気体状の化合物、例えば食品などが挙げられる。
【００６８】
具体的に説明すると、本検出方法は、本組成物と被検サンプルとを接触させた場合の、被検サンプル中に含まれる呈味性物質のＧＰＲ１４タンパク質との結合量、又は呈味性物質による細胞刺激活性を測定し、被検サンプル中の呈味性物質を検出するものである。
【００６９】
ＧＰＲ１４タンパク質と呈味性物質との結合量、及び呈味性物質による細胞刺激活性は、上記「２．呈味性物質の同定方法」に記載のようにして測定することができる。従って、上記（１）〜（５）に記載したいずれかの手法において、「試験化合物」を「呈味性物質」に置き換えて行う。本検出方法は、本組成物を標識して実施することが好ましい。
【００７０】
本検出方法においては、特に、上記（１）〜（５）の試験を行ない、被検サンプル中に呈味性物質が存在すること、すなわち被検サンプル中の呈味性物質がＧＰＲ１４タンパク質に結合することを確認（定性的確認）した後に、改めて、（１）〜（５）の試験方法によりその結合活性又は細胞刺激活性の定量的確認を行なうことが好ましい。この定量的確認を行うことによって、被検サンプル中に含まれる呈味性物質量を測定することが可能となる。定量的な検出を行う場合には、既知濃度の呈味性物質を用いて、予め検量線を作成しておくことが好ましい。
【００７１】
本検出方法により、被検サンプル中の呈味性物質の存在の検出及び呈味性物質量の測定が可能になる。従って、従来では数値化が困難であった味覚の数値化・定量化に有用である。
【００７２】
４．呈味性物質の同定又は検出用キット
本組成物は、呈味性物質を同定又は検出するためのキットとして提供することができる。本発明に係る呈味性物質の同定又は検出用キット（以下、「本キット」という）は、本組成物の他、本同定方法又は検出方法を行うために有用な成分を含むものである。そのような成分としては、例えば、本組成物を懸濁するためのバッファー、標識、非特異的結合を低減させるための界面活性剤又は各種タンパク質、プロテアーゼによるＧＰＲ１４タンパク質又は呈味性物質の分解を抑制するためのプロテアーゼ阻害剤、細胞刺激活性を測定するための成分などが挙げられる。バッファーは、ＧＰＲ１４タンパク質と呈味性物質との結合を阻害しないものであればいずれでもよい。例えば、ｐＨ４〜１０（望ましくはｐＨ６〜８）のリン酸バッファー、トリス−塩酸バッファーなどが挙げられる。
【００７３】
また、界面活性剤としては、例えばＣＨＡＰＳ、Ｔｗｅｅｎ−８０ＴＭ、ジギトニン、デオキシコレートなどが挙げられ、各種タンパク質としては、例えばウシ血清アルブミン、ゼラチンなどが挙げられる。さらに、プロテアーゼ阻害剤としては、例えばＰＭＳＦ、ロイペプチン、Ｅ−６４、ペプスタチンなどが挙げられる。
本キットを利用することにより、本同定方法又は検出方法を簡便に行うことができる。
【００７４】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明は下記実施例にその技術的範囲が限定されるものではない。
【００７５】
〔実施例１〕ＧＰＲ１４のクローニングとＣＨＯ細胞への導入
ラットＧＰＲ１４は、膀胱より得た。すなわち、埼玉実験動物供給所より得たＷｉｓｔａｒ系雄性ラット（体重２００ｇ前後）６匹を断頭、脱血したのち膀胱を採取し、滅菌した生理食塩水で洗った。その後、採取した膀胱を氷冷したＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ社のＴＲＩｚｏｌ　１０ｍｌ中に加え、ポリトロン社のポリトロンホモジナイザーを最高速度で１〜２分間使用して、膀胱組織をホモジナイズした。これからＴＲＩｚｏｌに添付されたマニュアルに従って、Ｔｏｔａｌ　ＲＮＡを２３０μｇ得た。この２３０μｇのＴｏｔａｌ　ＲＮＡ全量に対して、タカラのＯｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０を用いてＰｏｌｙ　（Ａ）＋　ＲＮＡを精製した。その結果１１μｇのラット膀胱Ｐｏｌｙ　（Ａ）＋　ＲＮＡを得た。このうち１μｇをＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ社の逆転写酵素Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ　ＩＩを用いてｃＤＮＡ溶液２０μｌを得た。ここから１μｌを使用して、プライマー（配列番号３及び４）を用いてタカラのＥＸ　Ｔａｑを使用して、次のＰＣＲ条件でシングルバンドのＰＣＲ産物を得た。すなわち、ＰＣＲ条件は、９４℃にて３分の後、９４℃１分、５５℃１分及び７２℃１．５分からなるサイクルを３５サイクル行い、その後７２℃にて７分とした。
【００７６】
このようにして得られたＰＣＲ産物は、ＦＭＣ　ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ社の低融点アガロースＳｅａＰｌａｑｕｅ　ＧＴＧアガロース（１％）を用いて電気泳動を行い、１１６１ｂｐのＧＰＲ１４のバンドの部分のみを剃刀で切り出した。切り出したアガロース小片は、ＴＡＥが入ったＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ社の透析バックを用いて電気透析を行い、アガロースとＰＣＲ産物を分離した。ＴＡＥに溶けたＰＣＲ産物はエタノール沈殿法によって回収し、１５μｌのＴＥに溶かした。このうち１μｌをエチジウムブロマイドを含んだアガロースゲルで泳動し、ＰＣＲ産物のバンドがＵＶ照射のもとで肉眼で観察できるかを確認した。バンドが泳動ゲル上で確認できたため、１５μｌ中の２μｌをインビトロゲン社のＴＡ　　Ｃｌｏｎｉｎｇ　ｋｉｔに使用してクローニングを行った。Ｘ−ｇａｌを使用したブルー／ホワイトセレクションによってインサートが存在すると思われるクローンを、アンピシリン含有Ｌ／Ｂプレートより採取した。ＧＰＲ１４クローンは次のプライマーを用いてＰＣＲを施行した（５’−ＣＧＣ　ＧＧＡ　ＴＴＣ　ＡＴＧ　ＧＣＴ　ＣＴＧ　ＡＧＣ　ＣＴＧ　ＧＡＧ−３’（配列番号５）、下線部はＢａｍ　ＨＩサイトを表す；５’−ＡＣＧ　ＣＧＴ　ＣＧＡ　ＣＴＣ　ＡＧＡ　ＧＡＡ　ＧＧＧ　ＣＣＣ　ＧＴＴ　ＡＣ−３’（配列番号６）下線部はＳａｌ　Ｉサイトを表す）。これをｐＥＦ−ＢＯＳのＢａｍ　ＨＩ　／　Ｓａｌ　Ｉサイトに導入した。ｐＥＦ−ＢＯＳは、Ｎａｇａｔａ，　Ｓ．　ａｎｄ　Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ，　Ｓ．，　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　１８：５３２２　（１９９０）に記載のものである。
【００７７】
このＧＰＲ１４−ｐＥＦ−ＢＯＳベクター５μｌと２μｌのｐＥＦ−ｎｅｏ（Ｎａｇａｔａら）を、プロメガ社のＴｒａｎｓＦａｓｔ　ｋｉｔを用いてＣＨＯ細胞に導入した。これらの遺伝子を導入されたＣＨＯ細胞は、シグマ社のＨａｍ’ｓ　Ｆ−１２培養液（ＪＨＲ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社の熱不活化ウシ胎児血清を１０％含む）にＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ社の抗生物質（ペニシリン５０Ｕ／ｍｌ／ストレプトマイシン５０μｇ／ｍｌ）と４００μｇ／ｍｌのナカライテスク社のＧ４１８を加えて５％の炭酸ガスのもと３７℃で２週間培養し、ネオマシン耐性の細胞を得た。この細胞はＣＨＯ−Ｓ株と名付け、セルバンカー（ダイアヤトロン社製）に懸濁後、−８０℃で保存した。
【００７８】
〔実施例２〕ＧＰＲ１４の呈味性物質に対する応答
実施例１で取得した細胞（以降ＣＨＯ−Ｓ株と呼ぶ）を、Ｎｕｔｒｉｅｎｔ　Ｍｉｘｔｕｒｅ　Ｆ−１２　ＨＡＭ（ＳＩＧＭＡ社製）に１０％ウシ血清、並びに５０μｇ／ｍｌペニシリン及びストレプトマイシンを添加した培地（以降Ｆ−１２培地と呼ぶ）中で２４穴培養フラスコを用いて３７℃、炭酸ガス濃度５．０％で４日間培養した。培養後、×１０リン酸緩衝液（以降ＰＢＳと呼ぶ）で３回洗浄した。これをＣＨＯ−Ｓ株試験細胞とした。
【００７９】
このＣＨＯ−Ｓ株試験細胞に、Ｆ−１２培地に以下の２５種の呈味性物質を溶解した溶液及びＦ−１２培地を０．２ｍｌずつ添加し、３７℃、炭酸ガス濃度５．０％で４時間恒温処理した。呈味性物質としては、１５０ｍＭグルコース、７０ｍＭフラクトース、４５ｍＭスクロース、６０ｍＭラクトース、４５ｍＭマルトース、１７０ｍＭソルビトール、７５ｍＭグリシン、３５ｍＭアラニン、０．２５ｍＭアスパルテーム、０．０１ｍＭリゾチーム、０．０５ｍＭステビオサイド、０．３７ｍＭアセスルファム　Ｋ、０．０１ｍＭ塩酸キニーネ、８．０ｍＭカフェイン、４５ｍＭフェニルアラニン、２２ｍＭトリプトファン、２．９ｍＭアルギニン、８．０ｍＭグルタミン酸ナトリウム、０．４５ｍＭグアノシン　５’−モノフォスフェート２ナトリウム塩、１．５ｍＭイノシン　５’−モノフォスフェート２ナトリウム塩、０．６５ｍＭクエン酸、４５ｍＭ食塩、ウロテンシン−ＩＩ　１０−９Ｍを使用した。
【００８０】
処理後培地を回収し、遠心分離によってＣＨＯ−Ｓ株試験細胞を除去した（ＰＧＥ試験液）。ＰＧＥ試験液は、Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ　Ｅ２　ＥＩＡ　Ｋｉｔ（Ｃａｙｍａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ製）を用いてＰＧＥ２量を測定した。　ＣＨＯ−Ｓ株は、ウロテンシン　ＩＩの他に、グルコース、フラクトース、スクロース、ラクトース、マルトース、ソルビトール及び食塩の添加により、培養液中のＰＧＥ２濃度が上昇した（図１）。図１において、１〜２４は、１：グルコース、２：フラクトース、３：スクロース、４：ラクトース、５：マルトース、６：ソルビトール、７：アラニン、８：グリシン、９：アスパルテーム、１０：リゾチーム、１１：ステビオサイド、１２：アセスルファム　Ｋ、１３：塩酸キニーネ、１４：カフェイン、１５：フェニルアラニン、１６：トリプトファン、１７：アルギニン、１８：グルタミン酸ナトリウム、１９：グアノシン　５’−モノフォスフェート２ナトリウム塩、２０：イノシン　５’−モノフォスフェート２ナトリウム塩、２１：クエン酸、２２：食塩、２３：ウロテンシン−ＩＩ　１０−９Ｍ、２４：ｍｉｌｉ−Ｑ、を表す。以上の実験から、ＧＰＲ１４はこれらの呈味性物質に応答することが明らかである。これに対し、その他の呈味性物質を添加した場合には、培養液中のＰＧＥ量は上昇せず、応答は起こらなかった。
また同時に実施例１と同様の方法で得られたフラクタルカイン受容体を発現するＣＸ３ＲＣＲ発現株を用いて、同じ測定を行った。
【００８１】
ラットフラクタルカイン受容体（ＣＸ３ＣＲ；アクセッション番号ＮＭ＃１３３５３４）を発現するＣＨＯ細胞は以下のように調製した。ラット脳ｃＤＮＡライブラリーをＥｃｏＲＩ　Ｌｉｎｋｅｒを用いてＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社のλＺＡＰ　ＩＩのＥｃｏＲＩサイトに組み込み、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社のＧｉｇａｐａｃｋ　ＩＩＩ　Ｇｏｌｄでｉｎ　ｖｉｔｒｏパッケージングを行った。ラットフラクタルカイン受容体の５’側の３４個の塩基配列をもとにしてプローブを作製し、プラークハイブリダイゼーションを施行した。得られたポジティブプラークに対して、ヘルパーファージを用いたｉｎ　ｖｉｖｏ　Ｅｘｃｉｓｉｏｎによって、フラクタルカイン受容体を含んだベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＣＸ３ＣＲ１を得た。このｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＣＸ３ＣＲ１に対して、２つの制限酵素Ｓａｌ　Ｉ及びＳｐｅ　Ｉ処理を行い、ＣＸ３ＣＲ１フラグメントを得た。このフラグメントは同様の制限酵素で処理したｐＥＦ−ＢＯＳベクターに組み込んだ。
【００８２】
シーケンスによって確認されたフラクタルカイン受容体を含むｐＥＦ−ＢＯＳベクター３μｇ、ヒトＧα１６（ヒトＧα１６：塩基配列を配列番号７に示す）を組み込んだｐＥＦ−ＢＯＳを３μｇ、及び１μｇのｐＥＦ−ＢＯＳにネオマイシン耐性遺伝子を組み込んだｐＥＦ−ｎｅｏ（Ｎａｇａｔａらより得た）を、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（ＡＴＣＣより入手）にプロメガ社のＴｒａｎｓＦａｓｔ　ｋｉｔを用いて導入した。これらの遺伝子を導入したＣＨＯ細胞は、シグマ社のＨａｍ’ｓ　Ｆ−１２培養液（ＪＨＲ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社の熱不活化ウシ胎児血清を１０％含む）にＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ社の抗生物質（ペニシリン５０Ｕ／ｍｌ／ストレプトマイシン５０μｇ／ｍｌ）と４００μｇ／ｍｌのナカライテスク社のＧ４１８を加えて５％の炭酸ガスのもと３７℃で２週間培養し、ネオマシン耐性の細胞を得た。
【００８３】
Ｇ４１８存在下で増殖した細胞をクローニングシリンダーを用いて細胞を単離した。単離した細胞よりＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ　社のＴＲＩｚｏｌを用いてＴｏｔａｌ　ＲＮＡ　を抽出し、ＲＴ−ＰＣＲを施行した。その結果、図２に示すようにＣＸ３ＣＲとＧα１６とを共発現（ＣＸ３ＣＲ＋Ｇ１６）させた場合には、ＣＸ３ＣＲとＧα１６についてＰＣＲの明瞭なバンドが確認された（図２の右端のレーン）。
【００８４】
さらにＣＸ３ＣＲ、フラクタルカイン受容体及びＧα１６を共発現させた細胞に対して同仁社のＦｕｒａ−２をロードし、アゴニストであるフラクタルカインを作用させた時の細胞内カルシウム濃度変化について検討した。結果を図３に示す。細胞内で上昇したｃＡＭＰ濃度を低下する働きのあるＧタンパク質Ｇｉに共役するフラクタルカイン受容体ＣＸ３ＣＲは、細胞内で一緒に発現したＧα１６と共役して、図３の１番上のＣＸ３ＣＲ−Ｇ１６及び上から２番目のＣＸ３ＣＲ＋Ｇ１６のように、矢印で示した１０−７Ｍのフラクタルカインを作用させた場合に細胞内カルシウム濃度の上昇が認められた。従って、フラクタルカイン受容体は、ＣＨＯ細胞内でＧタンパク質と共役して機能することが明らかになった。
【００８５】
しかしながらこの受容体はＧＰＲ１４のアゴニストであるウロテンシンＩＩには刺激されないため、今回の実験においてはネガティブコントロールとして使用した。
ＣＨＯ−Ｓ株と同様に、呈味性物質を添加した場合のＰＧＥ量を測定した（図１）。ＣＸ３ＲＣＲ発現株においては、全ての呈味性物質の場合にＰＧＥ２量の上昇が起こらず、これらの物質に対し応答していないことが明らかであった（図１）。
【００８６】
〔実施例３〕ＧＰＲ１４の呈味性物質に対する濃度依存的応答
実施例１で調製したＣＨＯ−Ｓ株を、Ｆ−１２培地で２４穴培養フラスコを用いて３７℃、炭酸ガス濃度５．０％で４日間培養した。培養後、×１０　ＰＢＳで３回洗浄した。これをＣＨＯ−Ｓ株試験細胞とした。ＣＨＯ−Ｓ株試験細胞に、Ｆ−１２培地に以下に記載する種々の濃度の呈味性物質を溶解した溶液及びＦ−１２培地を０．２ｍｌずつ添加し、３７℃、炭酸ガス濃度５．０％で４時間恒温処理した。試験に使用した呈味性物質は、３００、１５０、７５、３７．５、１８．８ｍＭグルコース；１４０、７０、３５、１７．５ｍＭフラクトース；９０、４５、２２．５、１１．３ｍＭスクロース；並びに９０、４５、２２．５、１１．３ｍＭ食塩である。処理後培地を回収し、遠心分離によってＣＨＯ−Ｓ株試験細胞を除去した（ＰＧＥ試験液）。ＰＧＥ試験液を、Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ　Ｅ２　ＥＩＡ　Ｋｉｔ（Ｃａｙｍａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ製）を用いて、ＰＧＥ２量を測定した。
【００８７】
グルコース、フラクトース、スクロース及び食塩を添加したＣＨＯ−Ｓ株においては、ＰＧＥ２濃度が呈味性物質の濃度に依存して増加した（図４）。すなわち、ＧＰＲ１４はこれらの呈味性物質に濃度依存的に応答することは明らかであった。
【００８８】
〔実施例４〕ＧＰＲ１４の舌組織における発現確認
ＧＰＲ１４の舌組織での発現をｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより検討した。
プローブは、ラットＧＰＲ１４の塩基配列８８−１４７ｂｐの一部の配列を相補的にした配列（ｒＧＰＲ１４／ＡＳ：５’−　ＣＣＡ　ＣＡＡ　ＧＧＴ　ＣＴＴ　ＴＣＡ　ＧＧＧ　ＡＧＣ　ＴＧＧ　ＧＡＴ　ＣＴＧ　ＴＴＧ　ＧＧＣ　ＣＧＧ　ＡＣＣ　ＡＧＧ　ＡＡＣ　ＴＧＴ　ＴＧＡ　ＧＧＧ　ＡＣＡ　Ｃ　−３’；配列番号８）を使用した。一方、ネガティブコントロールとして、８８−１４７ｂｐの一部の塩基配列（ｒＧＰＲ１４／Ｓ：５’−　ＧＴＧ　ＴＣＣ　ＣＴＣ　ＡＡＣ　ＡＧＴ　ＴＣＣ　ＴＧＧ　ＴＣＣ　ＧＧＣ　ＣＣＡ　ＡＣＡ　ＧＡＴ　ＣＣＣ　ＡＧＣ　ＴＣＣ　ＣＴＧ　ＡＡＡ　ＧＡＣ　ＣＴＴ　ＧＴＧ　Ｇ　−３’；配列番号９）をプローブとして使用した。なお、この配列は、ヒト、マウス及びラットに共通な塩基配列である。この２つのプローブの３’側にビオチンをラベルし、ＨＰＬＣによって精製した。
【００８９】
マウス舌組織は採取後すぐに冷ＰＢＳで洗った後、ＯＴＣコンパウンドに包埋し、−２０℃で保存した。この組織はクライオスタットで５μｍに薄切し、Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｋ及び過酸化水素水を作用させた後、ＤＡＫＯ社超高感度核酸プローブ検出キットを用いて、ＧＰＲ１４を薄い褐色から濃い褐色として組織中で検出した。組織の対比染色にはメチルグリーンを用いた。
【００９０】
図５Ａに示すように、マウスの舌組織ではＧＰＲ１４が薄い褐色として、舌の表層部分に染まることが観察された（図中、矢印）。ネガティブコントロールを示す図５Ｂでは、褐色に染まる部分はない。従って、褐色に染まる染色部位は非特異的な反応ではなく、特異的な反応であることがわかる。この試験より、ＧＰＲ１４は舌組織において発現していることがわかった。
【００９１】
【発明の効果】
本発明によれば、呈味性物質反応性組成物が提供される。本組成物は、呈味性物質の同定及び検出に有用である。従って、本組成物を利用することにより、新規な呈味性物質を同定することが可能となる。
【００９２】
【配列表】
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【００９３】
【配列表フリーテキスト】
配列番号３〜９：合成ＤＮＡ
【図面の簡単な説明】
【図１】ＧＰＲ１４の呈味性物質に対する応答を示す図である。
【図２】ＣＨＯ細胞におけるＣＸ３ＣＲとＧ１６αの発現を示す図である。
【図３】ＣＸ３ＣＲ３アゴニストであるフルクタルカインを作用させた場合の、ＣＸ３ＣＲ発現ＣＨＯ細胞、ＣＸ３ＣＲ及びＧ１６α発現ＣＨＯ細胞、並びにＣＸ２ＣＲ−Ｇ１６α発現ＣＨＯ細胞におけるカルシウム濃度の変化を示すグラフである。
【図４】ＧＰＲ１４の呈味性物質に対する濃度依存的な応答を示す図である。
【図５】マウスの舌組織において発現するＧＰＲ１４を示す図である。ＡはプローブとしてｒＧＰＲ１４／ＡＳを使用した場合を示し、ＢはプローブとしてｒＧＰＲ１４／Ｓを使用したネガティブコントロールを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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