【手続補正書】
【提出日】平成26年9月9日(2014.9.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０６】
本明細書に引用される全ての特許、刊行物、および参考文献は、参照により本明細書に完全に組み込まれる。本開示と組み込まれた特許、刊行物、および参照文献との間に矛盾がある場合、本開示が優先するものとする。
本発明の態様として、例えば以下のものがある。
〔１〕式（Ｉ）
2013542184.tif 000001
の化合物であって、式中、
Ａは、リポーター部分であり、
Ｒ1は、Ｈ、アミノ保護基、およびアミノ封鎖基から選択され、
ｎは、１〜２０の整数であり、
各Ｒ2は、独立して、アミノ酸側鎖であり、少なくとも１つのＲ2は、−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＮＲ4aＲ4b、−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｎ+Ｒ4aＲ4bＲ4c、および−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＮＨ−Ｃ（＝ＮＲ5a）ＮＲ5bＲ5cから選択され、
Ｒ3は、アシルおよびスルホニルから選択され、
各Ｒ4aは、独立して、水素、アルキル、およびアリールから選択され、
各Ｒ4bは、独立して、アルキルおよびアリールから選択され、
各Ｒ4cは、独立して、水素、アルキル、およびアリールから選択され、
各Ｒ5aは、独立して、水素、アルキル、およびアリールから選択され、
各Ｒ5bは、独立して、アルキルおよびアリールから選択され、かつ
各Ｒ5cは、独立して、水素、アルキル、およびアリールから選択され、
Ｒ2が、−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｎ+Ｒ4aＲ4bＲ4cであるとき、前記化合物は、対アニオンをさらに含む、化合物。
〔２〕Ａは、アミノルシフェリン、クマリン、ローダミン、セレンテラジン、レゾルフィン、およびクレシルバイオレットから選択される、前記〔１〕に記載の化合物。
〔３〕Ａは、封鎖基またはペプチド鎖でさらに官能化されるローダミンまたはクレシルバイオレットである、前記〔１〕〜〔２〕のいずれかに記載の化合物。
〔４〕Ｒ1は、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、カルボベンジルオキシ（Ｃｂｚ）、ｔｅｒｔブチルオキシ（Ｂｏｃ）、アセチル、およびスクシニルからなる群から選択されるアミノ保護基またはアミノ封鎖基である、前記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の化合物。
〔５〕ｎは、２、３、４、または５である、前記〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の化合物。
〔６〕少なくとも１つのＲ2は、−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＮＲ4aＲ4bである、前記〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の化合物。
〔７〕Ｒ4aは水素であり、Ｒ4bはメチルである、前記〔６〕に記載の化合物。
〔８〕Ｒ4aおよびＲ4bは、それぞれメチルである、前記〔６〕に記載の化合物。
〔９〕少なくとも１つのＲ2は、−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｎ+Ｒ4aＲ4bＲ4cである、前記〔１〕〜〔８〕のいずれかに記載の化合物。
〔１０〕Ｒ4a、Ｒ4b、およびＲ4cは、それぞれメチルである、前記〔９〕に記載の化合物。
〔１１〕少なくとも１つのＲ2は、−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＮＨ−Ｃ（＝ＮＲ5a）ＮＲ5bＲ5cである、前記〔１〕〜〔１０〕のいずれかに記載の化合物。
〔１２〕Ｒ5aおよびＲ5bは水素であり、Ｒ5cはメチルである、前記〔１２〕に記載の化合物。
〔１３〕Ｒ3は、アシルである、前記〔１〕〜〔１２〕のいずれかに記載の化合物。
〔１４〕Ｒ3は、アセチルおよびトリフルオロアセチルから選択される、前記〔１〕〜〔１３〕のいずれかに記載の化合物。
〔１５〕前記化合物は、
2013542184.tif 000002
2013542184.tif 000003
から選択される、前記〔１〕に記載の化合物。
〔１６〕ヒストンデアセチラーゼ酵素の活性を検出する方法であって、
ａ）前記〔１〕〜〔１５〕のいずれか１項に記載の化合物を、ヒストンデアセチラーゼ酵素、および塩基性アミノ酸を認識するエンドペプチダーゼと、前記ヒストンデアセチラーゼ酵素を前記式（Ｉ）の化合物と反応させて生成物を形成し、前記エンドペプチダーゼを前記生成物と反応させて化合物Ａ−ＮＨ2を放出させるのに十分な条件下で、反応させることと、
ｂ）前記化合物Ａ−ＮＨ2を検出することと、を含む、方法。
〔１７〕前記化合物Ａ−ＮＨ2の前記検出を前記ヒストンデアセチラーゼ酵素の活性と相関させることをさらに含む、前記〔１６〕に記載の方法。
〔１８〕前記ヒストンデアセチラーゼ酵素の活性は、定量化される、前記〔１７〕に記載の方法。
〔１９〕前記エンドペプチダーゼは、前記式（Ｉ）の化合物と反応しない、前記〔１６〕〜〔１８〕のいずれかに記載の方法。
〔２０〕前記生成物は、以下の式（ＩＩ）
2013542184.tif 000004
を有する、前記〔１６〕〜〔１９〕のいずれかに記載の方法。
〔２１〕ｎの値および各Ｒ2部分の特定は、前記ヒストンデアセチラーゼ酵素に対する特異性を付与するように選択される、前記〔１６〕〜〔１９〕のいずれかに記載の方法。
〔２２〕塩基性アミノ酸を認識する前記エンドペプチダーゼは、トリプシンである、前記〔１６〕〜〔２１〕のいずれかに記載の方法。
〔２３〕式（ＩＩ）
2013542184.tif 000005
の化合物であって、式中、
Ａは、リポーター部分であり、
Ｒ1は、Ｈ、アミノ保護基、およびアミノ封鎖基から選択され、
ｎは、１〜２０の整数であり、
各Ｒ2は、独立して、アミノ酸側鎖であり、少なくとも１つのＲ2は、−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＮＲ4aＲ4b、−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｎ+Ｒ4aＲ4bＲ4c、および−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＮＨ−Ｃ（＝ＮＲ5a）ＮＲ5bＲ5cから選択され、
各Ｒ4aは、独立して、水素、アルキル、およびアリールから選択され、
各Ｒ4bは、独立して、アルキルおよびアリールから選択され、
各Ｒ4cは、独立して、水素、アルキル、およびアリールから選択され、
各Ｒ5aは、独立して、水素、アルキル、およびアリールから選択され、
各Ｒ5bは、独立して、アルキルおよびアリールから選択され、かつ
各Ｒ5cは、独立して、水素、アルキル、およびアリールから選択され、
Ｒ2が、−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｎ+Ｒ4aＲ4bＲ4cであるとき、前記化合物は、対アニオンをさらに含む、化合物。
〔２４〕Ａは、アミノルシフェリン、クマリン、ローダミン、セレンテラジン、レゾルフィン、およびクレシルバイオレットから選択される、前記〔２３〕に記載の化合物。
〔２５〕Ａは、封鎖基またはペプチド鎖でさらに官能化されるローダミンまたはクレシルバイオレットである、前記〔２３〕〜〔２４〕のいずれかに記載の化合物。
〔２６〕Ｒ1は、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、カルボベンジルオキシ（Ｃｂｚ）、ｔｅｒｔブチルオキシ（Ｂｏｃ）、アセチル、およびスクシニルからなる群から選択されるアミノ保護基またはアミノ封鎖基である、前記〔２３〕〜〔２５〕のいずれかに記載の化合物。
〔２７〕ｎは、２、３、４、または５である、前記〔２３〕〜〔２６〕のいずれかに記載の化合物。
〔２８〕少なくとも１つのＲ2は、−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＮＲ4aＲ4bである、前記〔２３〕〜〔２７〕のいずれかに記載の化合物。
〔２９〕Ｒ4aは水素であり、Ｒ4bはメチルである、前記〔２８〕に記載の化合物。
〔３０〕Ｒ4aおよびＲ4bは、それぞれメチルである、前記〔２８〕に記載の化合物。
〔３１〕少なくとも１つのＲ2は、−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｎ+Ｒ4aＲ4bＲ4cである、前記〔２３〕〜〔３０〕のいずれかに記載の化合物。
〔３２〕Ｒ4a、Ｒ4b、およびＲ4cは、それぞれメチルである、前記〔３１〕に記載の化合物。
〔３３〕少なくとも１つのＲ2は、−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＮＨ−Ｃ（＝ＮＲ5a）ＮＲ5bＲ5cである、前記〔２３〕〜〔３２〕のいずれかに記載の化合物。
〔３４〕Ｒ5aおよびＲ5bは水素であり、Ｒ5cはメチルである、前記〔３３〕に記載の化合物。
〔３５〕前記化合物は、
2013542184.tif 000006
2013542184.tif 000007
から選択される、前記〔２３〕に記載の化合物。
〔３６〕ヒストンアセチルトランスフェラーゼ酵素の活性を検出する方法であって、
ａ）前記〔２３〕〜〔３５〕のいずれか１項に記載の化合物を、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ酵素と、前記ヒストンアセチルトランスフェラーゼ酵素を前記式（ＩＩ）の化合物と反応させて生成物を形成するのに十分な条件下で、反応させることと、
ｂ）塩基性アミノ酸を認識するエンドペプチダーゼを添加して、前記エンドペプチダーゼが前記式（ＩＩ）の化合物と反応し、化合物Ａ−ＮＨ2を放出するようにすることと、  ｃ）前記化合物Ａ−ＮＨ2を検出することと、を含む、方法。
〔３７〕前記化合物Ａ−ＮＨ2の前記検出を前記ヒストンアセチルトランスフェラーゼ酵素の活性と相関させることをさらに含む、前記〔３６〕に記載の方法。
〔３８〕前記ヒストンアセチルトランスフェラーゼ酵素の活性は、定量化される、前記〔３７〕に記載の方法。
〔３９〕前記エンドペプチダーゼは、前記生成物と反応しない、前記〔３６〕〜〔３８〕のいずれかに記載の方法。
〔４０〕前記生成物は以下の式（ＩＩＩ）
2013542184.tif 000008
を有する、前記〔３６〕〜〔３９〕のいずれかに記載の方法。
〔４１〕ｎの値および各Ｒ2部分の特定は、前記ヒストンアセチルトランスフェラーゼ酵素に対する特異性を付与するように選択される、前記〔３６〕〜〔３９〕のいずれかに記載の方法。
〔４２〕塩基性アミノ酸を認識する前記エンドペプチダーゼは、トリプシンである、前記〔３６〕〜〔４１〕のいずれかに記載の方法。
〔４３〕ａ．式（Ｉ）または式（ＩＩ）の化合物と、
ｂ．塩基性アミノ酸を認識するエンドペプチダーゼと、
ｃ．任意に検出試薬と、を含む、組成物。
〔４４〕緩衝液、酵素補因子、および標的酵素からなる群から選択される１つ以上をさらに含む、前記〔４３〕に記載の組成物。
〔４５〕前記標的酵素は、ヒストンデアセチラーゼまたはヒストンアセチルトランスフェラーゼである、前記〔４４〕に記載の組成物。
〔４６〕前記検出試薬は、ルシフェリン検出試薬を含む、前記〔４３〕に記載の組成物。
〔４７〕ａ．式（Ｉ）または式（ＩＩ）の化合物と、
ｂ．塩基性アミノ酸を認識するエンドペプチダーゼと、
ｃ．任意に検出試薬と、を含む、キット。
〔４８〕緩衝液、酵素補因子、標的酵素、対照基質、および酵素阻害剤または活性化剤からなる群から選択される１つ以上をさらに含む、前記〔４７〕に記載のキット。
〔４９〕前記標的酵素は、ヒストンデアセチラーゼまたはヒストンアセチルトランスフェラーゼである、前記〔４８〕に記載のキット。
〔５０〕前記検出試薬は、ルシフェリン検出試薬を含む、前記〔４７〕に記載のキット。
〔５１〕標的酵素の活性を検出する方法であって、
ａ）少なくとも１つの封鎖アルギニンまたはリジン残基を含む化合物を、標的酵素、および塩基性アミノ酸を認識するエンドペプチダーゼと反応させて、前記反応が化合物Ａ−ＮＨ2の形成をもたらすことと、
ｂ）前記化合物Ａ−ＮＨ2を検出することと、を含む、方法。
〔５２〕少なくとも１つの封鎖アルギニンまたはリジン残基を含む前記化合物は、前記〔１〕〜〔１５〕のいずれか１項に記載の化合物である、前記〔５１〕に記載の方法。
〔５３〕少なくとも１つの封鎖アルギニンまたはリジン残基を含む前記化合物は、前記〔２３〕〜〔３５〕のいずれか１項に記載の化合物である、前記〔５１〕に記載の方法。
〔５４〕前記標的酵素は、ヒストンデアセチラーゼまたはヒストンアセチルトランスフェラーゼ酵素である、前記〔５１〕〜〔５３〕のいずれかに記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）
【化１】
2013542184.tif 000009
又は
2013542184.tif 000010
の化合物であって、式中、
Ａは、リポーター部分であり、Ａはアミノルシフェリンであり、
Ｒ1は、Ｈ、アミノ保護基、およびアミノ封鎖基から選択され、
ｎは、１〜２０の整数であり、
各Ｒ2は、独立して、アミノ酸側鎖であり、少なくとも１つのＲ2は、−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＮＲ4aＲ4b、−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｎ+Ｒ4aＲ4bＲ4c、および−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＮＨ−Ｃ（＝ＮＲ5a）ＮＲ5bＲ5cから選択され、
Ｒ3は、アシルおよびスルホニルから選択され、
各Ｒ4aは、独立して、水素、アルキル、およびアリールから選択され、
各Ｒ4bは、独立して、アルキルおよびアリールから選択され、
各Ｒ4cは、独立して、水素、アルキル、およびアリールから選択され、
各Ｒ5aは、独立して、水素、アルキル、およびアリールから選択され、
各Ｒ5bは、独立して、アルキルおよびアリールから選択され、かつ
各Ｒ5cは、独立して、水素、アルキル、およびアリールから選択され、
Ｒ2が、−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｎ+Ｒ4aＲ4bＲ4cであるとき、前記化合物は、対アニオンをさらに含む、化合物。
【請求項２】
Ｒ1は、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、カルボベンジルオキシ（Ｃｂｚ）、ｔｅｒｔブチルオキシ（Ｂｏｃ）、アセチル、およびスクシニルからなる群から選択されるアミノ保護基またはアミノ封鎖基である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
ｎは、２、３、４、または５である、請求項１又は２に記載の化合物。
【請求項４】
少なくとも１つのＲ2は、−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＮＲ4aＲ4bである、請求項１〜３のいずれかに記載の化合物。
【請求項５】
Ｒ4aおよびＲ4bは、それぞれメチルである、請求項１〜４のいずれかに記載の化合物。
【請求項６】
少なくとも１つのＲ2は、−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｎ+Ｒ4aＲ4bＲ4cである、請求項１〜５のいずれかに記載の化合物。
【請求項７】
少なくとも１つのＲ2は、−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＮＨ−Ｃ（＝ＮＲ5a）ＮＲ5bＲ5cである、請求項１〜６のいずれかに記載の化合物。
【請求項８】
Ｒ3は、アシルである、請求項１〜７のいずれかに記載の化合物。
【請求項９】
Ｒ3は、アセチル又はトリフルオロアセチルである、請求項１〜８のいずれかに記載の化合物。
【請求項１０】
前記化合物は、
【化２】
2013542184.tif 000011
2013542184.tif 000012
【化３】
2013542184.tif 000013
【化４】
2013542184.tif 000014
から選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項１１】
ヒストンデアセチラーゼ酵素の活性を検出する方法であって、
ａ）請求項１〜１０のいずれか１項に記載の式（Ｉ）の化合物を、ヒストンデアセチラーゼ酵素、および塩基性アミノ酸を認識するエンドペプチダーゼと、前記ヒストンデアセチラーゼ酵素を前記式（Ｉ）の化合物と反応させて生成物を形成し、前記エンドペプチダーゼを前記生成物と反応させて化合物Ａ−ＮＨ2を放出させるのに十分な条件下で、反応させることと、
ｂ）前記化合物Ａ−ＮＨ2を検出することと、を含む、方法。
【請求項１２】
前記エンドペプチダーゼは、前記式（Ｉ）の化合物と反応しない、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記生成物は、以下の式（ＩＩ）
【化５】
2013542184.tif 000015
を有する、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１４】
ヒストンアセチルトランスフェラーゼ酵素の活性を検出する方法であって、
ａ）請求項１〜１０のいずれか１項に記載の式（ＩＩ）の化合物を、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ酵素と、前記ヒストンアセチルトランスフェラーゼ酵素を前記式（ＩＩ）の化合物と反応させて生成物を形成するのに十分な条件下で、反応させることと、
ｂ）塩基性アミノ酸を認識するエンドペプチダーゼを添加して、前記エンドペプチダーゼが前記式（ＩＩ）の化合物と反応し、化合物Ａ−ＮＨ2を放出するようにすることと、  ｃ）前記化合物Ａ−ＮＨ2を検出することと、を含む、方法。
【請求項１５】
前記エンドペプチダーゼは、前記生成物と反応しない、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記生成物は以下の式（ＩＩＩ）
【化６】
2013542184.tif 000016
を有する、請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項１７】
ａ．式（Ｉ）または式（ＩＩ）の化合物と、
ｂ．塩基性アミノ酸を認識するエンドペプチダーゼと、
を含む、組成物。
【請求項１８】
ａ．式（Ｉ）または式（ＩＩ）の化合物と、
ｂ．塩基性アミノ酸を認識するエンドペプチダーゼと、
を含む、キット。
【請求項１９】
標的酵素の活性を検出する方法であって、
ａ）少なくとも１つの封鎖アルギニンまたはリジン残基を含む化合物を、標的酵素、および塩基性アミノ酸を認識するエンドペプチダーゼと反応させて、前記反応が化合物Ａ−ＮＨ2の形成をもたらすことと、
ｂ）前記化合物Ａ−ＮＨ2を検出することと、を含む、方法であって、
Ａはアミノルシフェリンである、前記方法。