【手続補正書】
【提出日】平成26年8月28日(2014.8.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
イソブタノール生合成経路を含む組換え宿主細胞であって、該経路が、染色体に組み込まれた異種ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドによって触媒されるピルベートからアセトラクテートへの基質から生成物への変換を含み、該経路が、プラスミド上のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドによって触媒されるアセトラクテートから２，３−ジヒドロキシイソバレレートへの基質から生成物への変換を含み、そしてピルベートからアセトラクテートへの変換を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが染色体に組み込まれていない組換え宿主細胞と比較して、イソブタノール生成の力価が増加している、上記組換え宿主細胞。
【請求項２】
２，３−ブタンジオール、２−ブタノール、又は２−ブタノン生合成経路を含む組換え宿主細胞であって、該経路が、染色体に組み込まれた異種ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドによって触媒されるピルベートからアセトラクテートへの基質から生成物への変換を含み、そして該経路が、プラスミド上のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドによって触媒される少なくとも１つの基質から生成物への変換を含む、上記組換え宿主細胞。
【請求項３】
細菌、シアノバクテリア、糸状菌、及び酵母からなる群から選択される、請求項１又は２に記載の組換え宿主細胞。
【請求項４】
クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、ロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、パエニバチルス属（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、アルスロバクター属（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄ
ａ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、イサチェンキア属（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、及びサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）からなる群から選択される属のメンバーである、請求項１又は２に記載の組換え宿主細胞。
【請求項５】
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）又はサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である、請求項１又は２に記載の組換え宿主細胞。
【請求項６】
ポリペプチドが宿主細胞サイトゾルで発現する、請求項１又は２に記載の組換え宿主細胞。
【請求項７】
基質から生成物への変換：２，３−ジヒドロキシイソバレレートからα−ケトイソバレレート；α−ケトイソバレレートからイソブチルアルデヒド；及びイソブチルアルデヒドからイソブタノールへの変換を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを
さらに含む、請求項１又は３〜６のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
【請求項８】
基質から生成物への変換：２，３−ジヒドロキシイソバレレートからα−ケトイソバレレート；α−ケトイソバレレートからイソブチリル−ＣｏＡ；イソブチリル−ＣｏＡからイソブチルアルデヒド；及びイソブチルアルデヒドからイソブタノールへの変換を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１又は３〜６のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
【請求項９】
基質から生成物への変換：２，３−ジヒドロキシイソバレレートからα−ケトイソバレレート；α−ケトイソバレレートからバリン；バリンからイソブチルアミン；イソブチルアミンからイソブチルアルデヒド；及びイソブチルアルデヒドからイソブタノールへの変換を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１又は３〜６のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
【請求項１０】
基質から生成物への変換：アセトラクテートからアセトイン；アセトインから２，３−ブタンジオール；２，３−ブタンジオールから２−ブタノン；及び２−ブタノンから２−ブタノールへの変換を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項２〜６のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
【請求項１１】
ピルベートからアセトラクテートへの基質から生成物への変換を触媒するポリペプチドが、アセト乳酸シンターゼである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
【請求項１２】
アセト乳酸シンターゼが、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、又は１８から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％の同一性を有する、請求項１１に記載の組換え宿主。
【請求項１３】
宿主細胞におけるピルビン酸デカルボキシラーゼ、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、又はＦｒａ２の一つ又はそれ以上の発現が低下するか、又は実質的に排除される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
【請求項１４】
ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする内在性ポリヌクレオチドに欠失、突然変異、及び／又は置換を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
【請求項１５】
ピルベートからアセトラクテートへの変換を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする内在性ポリヌクレオチドに組み込まれる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
【請求項１６】
ポリヌクレオチドが、ＰＤＣ１−ＴＲＸ１遺伝子間領域で染色体に組み込まれる、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
【請求項１７】
（ａ）ピルベートからアセトラクテートへの基質から生成物への変換を触媒するポリペプチドをコードし、染色体に組み込まれるポリヌクレオチドと；
（ｂ）アセトラクテートから２，３−ジヒドロキシイソバレレートへの基質から生成物への変換を触媒するポリペプチドをコードし、プラスミド上にあるポリヌクレオチドと；
（ｃ）２，３−ジヒドロキシイソバレレートからα−ケトイソバレレートへの基質から生成物への変換を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと；
（ｄ）α−ケトイソバレレートからイソブチルアルデヒドへの基質から生成物への変換を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと；
を含む組換え宿主細胞であって、
ここで宿主細胞がピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を実質的に含まず；そして
宿主細胞がイソブタノールを生産する、上記組換え宿主細胞。
【請求項１８】
（ａ）請求項１〜１７のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞、又はそれらの任意の組み合わせを備えるステップと；
（ｂ）生合成経路生成物が生成される条件下で、宿主細胞を発酵性炭素基質と接触させて発酵ブロスを形成するステップと；
を含む方法。
【請求項１９】
発酵ブロスを抽出剤と接触させて二相発酵混合物を生産するステップをさらに含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
抽出剤が、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪アルコール、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪酸、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪酸のエステル、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪アルデヒド、及びＣ１２〜Ｃ２２脂肪アミドからなる群から選択される水不混和性有機抽出剤を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
生合成経路生成物がアルコールであり、そして方法が、発酵ブロスを有機酸、及びその有機酸によりアルコールをエステル化する能力を有する酵素と接触させるステップをさらに含む、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
生合成経路生成物がアルコールであり、そして方法が、発酵ブロスの少なくとも一部分を気化させて、水とアルコールとを含む蒸気流を形成するステップをさらに含む、請求項１８〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
生合成経路生成物がイソブタノールである、請求項１８〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
ブタノール生成速度又は力価が、ピルベートからアセトラクテートへの変換を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが染色体に組み込まれていない組換え宿主細胞と比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約２倍、少なくと
も約３倍、又は少なくとも約４倍大きな差で増加する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
生合成経路のステップを触媒する非組込み型の組換えポリヌクレオチドのコピー数又は発現を増加させる方法であって、
生合成経路の生成物が生産される条件下で、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞を発酵性炭素基質と接触させて発酵ブロスを形成するステップ
を含む、上記方法。
【請求項２６】
ピルベート利用生合成経路におけるフラックスを増加させる方法であって、
（ａ）請求項１〜１７のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞、又はそれらの任意の組み合わせを備えるステップと；
（ｂ）宿主細胞におけるピルベート利用生合成経路のフラックスが増加する条件下で、宿主細胞を発酵性炭素基質と接触させて発酵ブロスを形成するステップと；
を含む、上記方法。
【請求項２７】
２，３−ブタンジオール、イソブタノール、２−ブタノール、又は２−ブタノン生合成経路の生成物の形成を増加させる方法であって、
（ｉ）請求項１〜１７のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞、又はそれらの任意の組み合わせを備えるステップと；
（ii）ピルベート利用経路の生成物が形成される条件下で宿主細胞を増殖させるステップと；
を含み、
該組換え宿主細胞により形成される生成物の量が、ピルベートからアセトラクテートへの変換を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが染色体に組み込まれていない宿主細胞により形成される生成物の量より多い、上記方法。
【請求項２８】
（ｉ）請求項１〜１７のいずれか一項に記載の宿主細胞、又はそれらの任意の組み合わせ；
（ii）ブタノール；
（iii）抽出剤；及び
（iv）任意にエステル化酵素
を含む組成物。
【請求項２９】
抽出剤が、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪アルコール、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪酸、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪酸のエステル、Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪アルデヒド及びＣ１２〜Ｃ２２脂肪アルデヒドからなる群から選択される水不混和性有機抽出剤である、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
アセトラクテートからアセトイン；アセトインから３−アミノ−２−ブタノール；３−アミノ−２−ブタノールから３−アミノ−２−ブタノールホスフェート；及び３−アミノ−２−ブタノールホスフェートから２−ブタノンへの基質から生成物への変換を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項２〜６のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。