(57)【要約】【課題】Ｎ−アセチルグルコサミンにガラクトースを転移する酵素が単離され、その遺伝子の構造が明らかにされた。したがって、該酵素等の遺伝子工学的な生産や該酵素による糖鎖の生産、該遺伝子らに基づく疾患の診断を可能にすること。【解決手段】配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列又は該アミノ配列において１若しくは複数個のアミノ酸が置換し若しくは欠失し、若しくは該アミノ配列に１若しくは複数個のアミノ酸が挿入され若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、基質となるＮ−アセチルグルコサミンにガラクトースを転移する活性を有するタンパク質および該タンパク質をコードする核酸を用いる。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が置換し若しくは欠失し、若しくは該アミノ酸配列に１若しくは複数個のアミノ酸が挿入され若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、Ｎ−アセチルグルコサミンにガラクトースを転移する活性を有するタンパク質。
【請求項２】
前記タンパク質は、配列番号１に示されるアミノ酸配列と２０％以上の相同性を有する請求項１記載のタンパク質。
【請求項３】
前記タンパク質は、配列番号１に示されるアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有する請求項１記載のタンパク質。
【請求項４】
前記タンパク質は、配列番号１に示されるアミノ酸配列又は該配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換し若しくは欠失し、若しくは該アミノ酸配列に１若しくは数個のアミノ酸が挿入され若しくは付加されたアミノ酸配列を有する請求項１記載のタンパク質。
【請求項５】
前記タンパク質は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する請求項４記載のタンパク質。
【請求項６】
請求項１ないし５のいずれか１項に記載のタンパク質をコードする核酸。
【請求項７】
配列番号２に示される塩基配列を有する核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、請求項１記載のタンパク質をコードする核酸。
【請求項８】
配列表の配列番号２に示される塩基配列の１ｎｔ〜１４９７ｎｔまでの塩基配列を有する請求項６記載の核酸。
【請求項９】
請求項６ないし８のいずれか１項に記載の核酸を含み、宿主細胞中で該核酸を発現することができる組換えベクター。
【請求項１０】
請求項６ないし８のいずれか１項に記載の核酸が導入され、該核酸を発現する細胞。
【請求項１１】
請求項６ないし８のいずれか１項に記載の核酸、又は当該核酸の塩基配列と相補的な塩基配列からなる核酸にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることを特徴とする測定用核酸。
【請求項１２】
請求項８記載の核酸中の部分領域と相補的な配列を有する請求項１１記載の測定用核酸。
【請求項１３】
プローブ又はプライマーである請求項１１又は１２記載の測定用核酸。
【請求項１４】
塩基数が１５塩基以上である請求項１３記載の測定用核酸。
【請求項１５】
請求項１１ないし１４のいずれか１項に記載の測定用核酸のうち少なくとも一つ含むマイクロアレイ。
【請求項１６】
請求項１１ないし１４のいずれか１項に記載の測定用核酸及び測定説明書を含む測定用キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、Ｎ−アセチルグルコサミンにガラクトースを転移する活性を有する新規な酵素及びそれをコードする核酸、並びに該核酸を測定するための核酸に関する。
【０００２】
【従来の技術】
これまでに、７種類のβ１，３−ガラクトース転移酵素（β３Ｇａｌ−ＴおよびＣｏｒｅ１Ｇａｌ−Ｔ）が知られている。このうち、β３Ｇａｌ−Ｔ１（特開平６−１８１７５９号公報）、−Ｔ２（Ｋｏｌｂｉｎｇｅｒ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３，４３３−４４０（１９９８））、−Ｔ５（Ｉｓｓｈｉｋｉ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４，１２４９９−１２５０７（１９９９））はＮ−アセチルグルコサミンにガラクトースを転移する。さらに、β３Ｇａｌ−Ｔ１及び−Ｔ２については、Ｎ−アセチルグルコサミン以外にＧａｌに対しても活性を示すことが報告されている（Ａｍａｄｏ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３，１２７７０−１２７７８（１９９８））。β３Ｇａｌ−Ｔ５に関しては、Ｎ−アセチルガラクトサミンに対しての転移活性も報告されている（Ｚｈｏｕ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７５，２２６３１−２２６３４（２０００））。また、β３Ｇａｌ−Ｔ４（Ｍｉｙａｚａｋｉ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２，２４７９４−２４７９９（１９９７））はＮ−アセチルガラクトサミンにガラクトースを転移する。β３Ｇａｌ−Ｔ６（Ｂａｉ，Ｘ．ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６，４８１８９−４８１９５（２００１））はガラクトースにガラクトースを転移するグリコサミノグリカン合成に関与する酵素である。Ｃｏｒｅ１−Ｇａｌ−Ｔ１及び−Ｔ２もＮ−アセチルガラクトサミンにガラクトースを転移するが、Ｏ−結合型糖鎖合成に関与している（Ｊｕ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７７，１７８−１８６（２００２）；  Ｋｕｄｏ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７７，４７７２４−４７７３１（２００２））。さらに、これらのβ３Ｇａｌ−Ｔは受容体基質の詳細な構造が異なることが予想されるが、必ずしも、考えられ得る全ての受容体基質にガラクトースを転移できるわけではない。
【０００３】
【特許文献１】特開平６−１８１７５６号公報
【０００４】
【非特許文献１】Ｋｏｌｂｉｎｇｅｒ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３，４３３−４４０（１９９８）
【０００５】
【非特許文献２】Ｉｓｓｈｉｋｉ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４，１２４９９−１２５０７（１９９９）
【０００６】
【非特許文献３】Ａｍａｄｏ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３，１２７７０−１２７７８（１９９８）
【０００７】
【非特許文献４】Ｚｈｏｕ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７５，２２６３１−２２６３４（２０００）
【０００８】
【非特許文献５】Ｍｉｙａｚａｋｉ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２，２４７９４−２４７９９（１９９７）
【０００９】
【非特許文献６】Ｂａｉ，Ｘ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６，４８１８９−４８１９５（２００１）
【００１０】
【非特許文献７】Ｊｕ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７７，１７８−１８６（２００２）
【００１１】
【非特許文献８】Ｋｕｄｏ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７７，４７７２４−４７７３１（２００２）
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
Ｎ−アセチルグルコサミンにガラクトースを転移する活性を有する多種の酵素を単離し、その遺伝子の構造を明らかにすることにより、様々な受容体基質にガラクトースを転移することが可能になるとともに該酵素の遺伝子工学的な生産や、該遺伝子に基づく疾患の診断が可能になる。
【００１３】
従って、本発明の目的は、Ｎ−アセチルグルコサミンにガラクトースを転移する活性を有する新規タンパク質及びそれをコードする核酸を提供することである。また、本発明の目的は、該核酸を宿主細胞内で発現する組換えベクター、及び該核酸が導入され、前記核酸およびタンパク質を発現する細胞を提供することである。また、該発現タンパク質は、抗体作製用に利用でき、該タンパク質の産生方法を提供するものである。さらに、該発現タンパク質および該発現タンパク質に対する抗体を用いた免疫組織染色およびＲＩＡやＥＩＡなどの免疫測定法に利用できる。さらに、本発明の目的は、上記の本発明の核酸を測定するための測定用核酸を提供することである。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
目的とするタンパク質は、未だ単離されていないので、その部分アミノ酸配列を知ることもできない。一般に、細胞に微量しか含まれていないタンパク質を単離精製することは容易ではなく、現在に至るまで単離されていないタンパク質を細胞から単離することは容易でないことが予想される。本発明者らは、目的とするタンパク質と比較的類似した作用を有する種々のタンパク質の遺伝子塩基配列間に、同一性が高いと考えられる領域を標的として、その相同配列を有すると思われるタンパク質を単離及び同定することを試みた。そして、公知のβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素（ｂ１，３−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ４）（β３Ｇｎ−Ｔ４）の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＰ＿１１０３９２）をクエリーとして塩基配列の検索を行い、相同な配列として、ＥＳＴ配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＸＭ＿０８５０４２）を得ることができた。次に、この相同領域をもとにしてプライマーを設定し、ｃＤＮＡライブラリーから５’ＲＡＣＥ（ｒａｐｉｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  ｅｎｄｓ）法で全長のオープンリーディングフレームを同定した。さらに、ＰＣＲで該タンパク質の遺伝子のクローニングに成功し、その塩基配列及び推定アミノ酸配列を決定することができ、本発明を完成するに至った。
【００１５】
すなわち、本発明は、配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が置換し若しくは欠失し、若しくは該アミノ酸配列に１若しくは複数個のアミノ酸が挿入され若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、Ｎ−アセチルグルコサミンにガラクトースを転移する活性を有するタンパク質を提供する。また、本発明は、該タンパク質をコードする核酸を提供する。さらに、本発明は、該核酸を含み、宿主細胞中で該核酸を発現することができる組換えベクターを提供する。さらに、本発明は、該組換えベクターにより形質転換され、前記核酸を発現する細胞を提供する。さらに、本発明は、核酸とハイブリダイズする、該核酸の測定用核酸ならびに測定用キットを提供する。
【００１６】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の説明のために、好ましい実施形態に関して詳述する。
（１）タンパク質
下記実施例１において詳述する方法によりクローニングされた、本発明のタンパク質をコードする核酸は、配列表の配列番号２に示される塩基配列を有し、それがコードする推定アミノ酸配列が、該塩基配列の下に記載されている。配列番号１には、該アミノ酸配列のみを取り出して示す。
【００１７】
実施例１で得られた本発明のタンパク質（本明細書では「Ｇａｌ−Ｔ７」と命名）は、次の性質を有する酵素である。なお、各性質及びその測定方法は下記実施例において詳述されている。
触媒反応
Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）受容体基質、ガラクトース（Ｇａｌ）供与体基質からガラクトースを転移する。触媒する反応を反応式で記載すると、
Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン−Ｒ  ＋  ＵＤＰ−ガラクトース          →  ガラクトシル−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン−Ｒ  ＋  ＵＤＰ（ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ  ＋  ＵＤＰ−Ｇａｌ  →  Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ    ＋  ＵＤＰ）
受容体基質特異性
受容体基質は、本発明タンパク質がガラクトース供与体基質からガラクトース残基を転移し得る基質である限り特に限定されないが、好ましくは、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、例えばＮ−アセチルグルコサミンαまたはβ１−Ｒ（Ｒは、ガラクトース、ｐ−ニトロフェノール（ｐＮｐ）やベンジル（Ｂｚ）基等の水酸基とエーテル結合した残基）、より好ましくは、Ｎ−アセチルグルコサミンβ１−Ｒである。
【００１８】
好ましくは、グルコース（Ｇｌｃ）にも若干特異性があり、Ｎ−アセチルグルコサミンβ１−Ｒに対する特異性の約１％ないし２０％である。
より好ましくは、Ｎ−アセチルガラクトサミンに対する活性はない。
【００１９】
より好ましくは、ガラクトースに対する活性はない。
供与体基質特異性
供与体基質は、本発明タンパク質が前記受容体基質に転移し得る基質として、好ましくはガラクトースである。ガラクトースを有する糖ヌクレオチドであるこがより好ましいが、そのような物質としては、例えば、より好ましくはＵＤＰ−ガラクトースである。アデノシン二リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミン（ＡＤＰ−Ｇａｌ）、ウリジン二リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミン（ＵＤＰ−Ｇａｌ）、グアノシン二リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧＤＰ−Ｇａｌ）、シチジン二リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミン（ＣＤＰ−Ｇａｌ）等が例示され、ＵＤＰ−Ｇａｌが最も好ましい。
【００２０】
二価イオン要求性
本発明タンパク質は、触媒反応に二価金属陽イオンを必要とする（この性質を「金属イオン要求性」とも記載する）。即ち、二価金属陽イオンをキレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸（以下、「ＥＤＴＡ」とも略記する）等）でキレートすると、糖転移活性を実質的に失う性質を有する。
【００２１】
二価金属陽イオンとしては、例えば、マンガンイオン（Ｍｎ２＋）、マグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）、亜鉛イオン（Ｚｎ２＋）、カルシウムイオン（Ｃａ２＋）、銅イオン（Ｃｕ２＋）、コバルトイオン（Ｃｏ２＋）等が挙げられる。
【００２２】
好ましくは、Ｍｎ２＋、Ｍｇ２＋の存在下で高い糖転移活性を示す。
好ましくは、Ｃｕ２＋、Ｃｏ２＋の存在下で若干の糖転移活性を示す。
発現
本発明タンパク質は、哺乳動物の組織、好ましくはヒトの組織で発現される。
【００２３】
好ましくは、精巣、子宮で高い発現を示す。
好ましくは、脳、脊髄、胎児脳、副腎、甲状腺、脾臓、骨格筋、肺、胃、大腸、膵臓で中程度の発現を示す。
【００２４】
好ましくは、小脳、骨髄、胸腺、心臓、気管、乳腺、肝臓、胎児肝臓、唾液腺、小腸、腎臓、前立腺、胎盤で低い発現を示す。
反応ｐＨ
本発明タンパク質の反応ｐＨは中世付近、好ましくは、ｐＨ５．５からｐＨ８．０であり、より好ましくは、約ｐＨ６．５である。
本発明によれば、Ｎ−アセチルグルコサミンにガラクトースを転移する活性を有するタンパク質が提供される。本発明のタンパク質は、本願明細書に記載した特徴を有する限り、その起源、製法等は限定されない。即ち、本発明のタンパク質は、天然産のタンパク質、遺伝子工学的手法により組換えＤＮＡから発現されたタンパク質、あるいは化学合成タンパク質の何れでもよい。
【００２５】
本発明のタンパク質は、典型的には、配列番号１に記載したアミノ酸残基４９８個からなるアミノ酸配列を有する。
なお、一般に、酵素のような生理活性を有するタンパク質において、そのアミノ酸配列のうち、１若しくは複数個のアミノ酸が置換し若しくは欠失し、若しくは該アミノ酸配列に１若しくは複数個のアミノ酸が挿入され若しくは付加された場合であっても、該生理活性が維持されることがあることは周知である。また、天然産のタンパク質の中には、それを生産する生物種の品種の違いや、生態型（ｅｃｏｔｙｐｅ）の違いによる遺伝子の変異、あるいはよく似たアイソザイムの存在等に起因して、１から複数個のアミノ酸変異を有する変異タンパク質が存在することは知られている。従って、配列番号１に示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が置換し若しくは欠失し、若しくは該アミノ酸配列に１若しくは複数個のアミノ酸が挿入され若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、Ｎ−アセチルグルコサミンにガラクトースを転移する活性を有するタンパク質（以下、便宜的に「修飾タンパク質」）も本発明の範囲に含まれる。
【００２６】
ここで、「複数個」とは、好ましくは１−２００個、より好ましくは１−１００個、さらにより好ましくは１−５０個、最も好ましくは１−２０個である。一般的には、部位特異的な変異によってアミノ酸が置換された場合に、元々のタンパク質が有する活性は保持される程度に置換が可能なアミノ酸の個数は、好ましくは１−１０個である。
【００２７】
さらに、該修飾タンパク質としては、配列番号１に示されるアミノ酸配列又は該配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換し若しくは欠失し、若しくは該アミノ酸配列に１若しくは数個のアミノ酸が挿入され若しくは付加されたアミノ酸配列を有するものが特に好ましい。
【００２８】
本発明のタンパク質は、クローニングされた核酸の塩基配列からの推定に基づいて、配列番号１のアミノ酸配列を有するが、その配列を有するタンパク質のみに限定されるわけではなく、本願明細書に記載した特性を有する限り全ての相同タンパク質を含むことが意図される。
【００２９】
このような修飾タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１に示されるアミノ酸配列と少なくとも２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは５０％、さらにより好ましくは７０％以上、最も好ましくは９０％以上の同一性を有することが好ましい。
【００３０】
本発明のタンパク質について、ＧＥＮＥＴＹＸ（ゼネティックス社）による同一性検索を行うと、最も似ているコンドロイチン合成酵素遺伝子（Ｋｉｔａｇａｗａ，Ｊ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６，３８７２１−３８７２６（２００１））とは１７．１９％の同一性である。したがって、本発明のタンパク質は新規なタンパク質であると考えられる。また、特に、本発明のタンパク質において相同性の高い領域は、配列番号１に示されるアミノ酸配列のうち３４０−３７５及び３９１−４３０である。
【００３１】
なお、ＧＥＮＥＴＹＸは、核酸解析、タンパク質解析用の遺伝情報処理ソフトウェアで、通常のホモロジー解析やマルチアラインメント解析の他、シグナルペプチド予測やプロモーター部位予測、二次構造予測が可能である。また、本明細書で用いたホモロジー解析プログラムは、高速・高感度な方法として多用されているＬｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法（Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．＆Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｗ．Ｒ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７７，１４３５−１４４１（１９８５））を採用している。
【００３２】
本願明細書において、同一性のパーセントは、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，２５．３３８９−３４０２（１９９７））に記載されているＢＬＡＳＴプログラム、あるいはＰｅａｒｓｏｎら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２４４４−２４４８（１９８８））に記載されているＦＡＳＴＡを用いて配列情報と比較し決定することが可能である。当該プログラムは、インターネット上でＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）、あるいはＤＮＡ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ（ＤＤＢＪ）のウェブサイトから利用することが可能である。各プログラムによる同一性検索の各種条件（パラメーター）は同サイトに詳しく記載されており、一部の設定を適宜変更することが可能であるが、検索は通常デフォルト値を用いて行う。なお、当業者に用いられる、配列比較の他のプログラムもまた使用可能である。
【００３３】
一般的に、同様の性質を有するアミノ酸同士の置換（例えば、ある疎水性アミノ酸から別の疎水性アミノ酸への置換、ある親水性アミノ酸から別の親水性アミノ酸への置換、ある酸性アミノ酸から別の酸性アミノ酸への置換、あるいはある塩基性アミノ酸から別の塩基性アミノ酸への置換）を導入した場合、得られる修飾タンパク質はもとのタンパク質と同様の性質を有することが多い。遺伝子組換え技術を使用して、このような所望の変異を有する組換えタンパク質を作製する手法は当業者に周知であり、このような修飾タンパク質も本発明の範囲に含まれる。
【００３４】
本発明のタンパク質は、例えば、後述の実施例１に従って、本発明の核酸による配列番号２に記載のＤＮＡ配列を大腸菌、酵母、昆虫、または動物細胞に、それぞれの宿主で増幅可能な発現ベクターを用いて導入および発現させることにより、当該タンパク質を大量に得ることができる。
【００３５】
本発明によって、このタンパク質のアミノ酸配列およびそれをコードするＤＮＡ配列が開示されれば、当該配列またはその一部を利用して、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲ等の核酸増幅反応等の遺伝子工学的手法を用いて、他の生物種から同様の生理活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を容易に単離することができる。このような場合、それらの遺伝子がコードする新規タンパク質も本発明の範囲に含まれる。
【００３６】
なお、本発明のタンパク質は、そのアミノ酸配列が上述した通りのものであり、前記酵素活性を有するものであれば、タンパク質に糖鎖が結合していてもよい。
【００３７】
より具体的には、後述する実施例２に記載したように、本発明のタンパク質における受容体基質の探索から、該タンパク質は、Ｎ−アセチルグルコサミンにガラクトースを転移する活性を有するものである。
【００３８】
（２）核酸
本発明は、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする核酸及び上記修飾タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸も提供する。本発明の核酸は、一本鎖および二本鎖型両方のＤＮＡ、およびそのＲＮＡ相補体も含む。ＤＮＡには、例えば、天然由来のＤＮＡ、組換えＤＮＡ、化学合成したＤＮＡ、ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡ、およびそれらの組み合わせが含まれる。本発明の核酸としてはＤＮＡが好ましい。なお、周知の通り、コドンには縮重があり、１つのアミノ酸をコードする塩基配列が複数存在するアミノ酸もあるが、上記アミノ酸配列をコードする塩基配列であれば、いずれの塩基配列を有するものも本願発明の範囲に含まれる。なお、下記の実施例１において実際にクローニングされたｃＤＮＡの塩基配列が配列番号２に示されている。よって、本発明の核酸は、好ましくは配列番号２の塩基１−１４９７を有する。
【００３９】
本明細書において、「ストリンジェントな条件下」とは、中程度又は高程度なストリンジェントな条件においてハイブリダイズすることを意味する。具体的には、中程度のストリンジェントな条件は、例えば、ＤＮＡの長さに基づき、一般の技術を有する当業者によって、容易に決定することが可能である。基本的な条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，７．４２−７．４５（２００１）に示され、そしてニトロセルロースフィルターに関し、５×ＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳ、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の前洗浄溶液、約４０−５０℃での、約５０％ホルムアミド、２×ＳＳＣ−６×ＳＳＣ（又は約４２℃での約５０％ホルムアミド中の、スターク溶液（Ｓｔａｒｋ’ｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）などの他の同様のハイブリダイゼーション溶液）のハイブリダイゼーション条件、および約６０℃、０．５×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳの洗浄条件の使用が含まれる。高ストリンジェントな条件もまた、例えばＤＮＡの長さに基づき、当業者によって、容易に決定することが可能である。一般的に、こうした条件は、中程度にストリンジェントな条件よりも高い温度及び／又は低い塩濃度でのハイブリダイゼーション及び／又は洗浄を含み、例えば上記のようなハイブリダイゼーション条件、及びおよそ６８℃、０．２×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳの洗浄を伴うと定義される。当業者は、温度および洗浄溶液塩濃度は、プローブの長さ等の要因に従って、必要に応じて調整可能であることを認識するであろう。
【００４０】
本発明の核酸は、例えば以下の方法により調製することが可能である。
公知のコンドロイチン合成酵素（β３Ｇｎ−Ｔ４）の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＰ＿１１０３９２）をクエリーとして塩基配列の検索を行い、ＥＳＴ配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＸＭ＿０８５０４２）を得ることができた。さらに、この配列から見出したゲノム配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＬ１３８９６５）又はその一部を利用して、ハイブリダイゼーションや核酸増幅反応等の遺伝子工学の基本的手法を用いてｃＤＮＡライブラリーなどから本発明核酸（例えば本発明ＤＮＡ）を調製することができる。
【００４１】
ここで、核酸増幅反応は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）［Ｓａｉｋｉ  Ｒ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０，１３５０−１３５４（１９８５）］，ライゲース連鎖反応（ＬＣＲ）［Ｗｕ  Ｄ．Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，４，５６０−５６９（１９８９）；  Ｂａｒｒｉｎｇｅｒ  Ｋ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，８９，１１７−１２２（１９９０）；  Ｂａｒａｎｙ  Ｆ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，１８９−１９３（１９９１）］、及び転写に基づく増幅［Ｋｗｏｈ  Ｄ．Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，１１７３−１１７７（１９８９）］等の温度循環を必要とする反応、並びに鎖置換反応（ＳＤＡ）［Ｗａｌｋｅｒ  Ｇ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，３９２−３９６（１９９２）；  Ｗａｌｋｅｒ  Ｇ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２０，１６９１−１６９６（１９９２）］、自己保持配列複製（３ＳＲ）［Ｇｕａｔｅｌｌｉ  Ｊ．Ｃ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，１８７４−１８７８（１９９０）］、及びＱβレプリカーゼシステム［リザイルディら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，１１９７−１２０２（１９８８）］等の恒温反応を含む。また、欧州特許第０５２５８８２号に記載されている標的核酸と変異配列の競合増幅による核酸配列に基づく増幅（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ
Ｂａｓｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：  ＮＡＳＡＢＡ）反応等も利用可能である。好ましくはＰＣＲ法である。
【００４２】
実施例１に示すように、配列番号３及び４のプライマーを使用した場合、ＰＣＲ産物として約１．５ｋｂｐのＤＮＡ断片が得られるので、これを例えばアガロースゲル電気泳動等の分子量によりＤＮＡ断片を篩い分ける方法で分離し、特定のバンドを切り出す方法等の常法に従って単離して本発明の核酸を得ることができる。
【００４３】
上記のようなハイブリダイゼーション、核酸増幅反応等を使用してクローニングされる相同な核酸は、配列表の配列番号１に記載の塩基配列に対して少なくとも２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは５０％以上、さらにより好ましくは７０％以上、最も好ましくは９０％以上の同一性を有する。
【００４４】
同一性パーセントは、視覚的検査および数学的計算によって決定することが可能である。あるいは、２つの核酸配列の同一性パーセントは、Ｄｅｖｅｒｅｕｘら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１２，３８７（１９８４）に記載され、そしてウィスコンシン大学遺伝学コンピューターグループ（ＵＷＧＣＧ）より入手可能なＧＡＰコンピュータープログラム、バージョン６．０を用いて、配列情報を比較することによって、決定可能である。ＧＡＰプログラムの好ましいデフォルトパラメーターには：（１）ヌクレオチドに関する単一（ｕｎａｒｙ）比較マトリックス（同一に対し１および非同一に対し０の値を含む）、並びにＳｃｈｗａｒｔｚ及びＤａｙｈｏｆｆ監修，Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｐｐ．３５３−３５８，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ（１９７９）に記載されるような、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ及びＢｕｒｇｅｓｓ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１４，６７４５（１９８６）の加重比較マトリックス；（２）各ギャップに対する３．０のペナルティおよび各ギャップ中の各記号に対しさらに０．１０のペナルティ；及び（３）末端ギャップに対するペナルティなし、が含まれる。当業者に用いられる、配列比較の他のプログラムもまた、使用可能である。
【００４５】
（３）組換えベクターと形質転換体
本発明によれば、単離した本発明の核酸を含む組換えベクターが提供される。
プラスミド等のベクターに本発明核酸のＤＮＡ断片を組込む方法としては、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１．１（２００１）に記載の方法などが挙げられる。簡便には、市販のライゲーションキット（例えば、宝酒造製等）を用いることもできる。このようにして得られる組換えベクター（例えば、組換えプラスミド）は、宿主細胞（例えば、大腸菌ＤＨ５α、ＴＢ１、ＬＥ３９２、ＸＬ−３９２、又はＸＬ−１Ｂｌｕｅ等）に導入される。
【００４６】
プラスミドを宿主細胞に導入する方法としては、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１６．１（２００１）に記載の塩化カルシウム法または塩化カルシウム／塩化ルビジウム法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、エレクトロインジェクション法、ＰＥＧなどの化学的な処理による方法、遺伝子銃などを用いる方法などが挙げられる。
【００４７】
ベクターは、簡単には当業界において入手可能な組換え用ベクター（例えば、プラスミドＤＮＡ等）に所望の遺伝子を常法により連結することによって調製することができる。用いられるベクターの具体例としては、大腸菌由来のプラスミドとして、例えば、ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ１、ｐＤＯＮＲ２０１、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２等が例示されるが、これらに限定されない。
【００４８】
当業者であれば制限末端は発現ベクターに適合するように適宜選択することが可能である。発現ベクターは、「本発明タンパク質を発現させたい宿主細胞」に適したものを当業者であれば適宜選択することができる。このように本発明発現ベクターは上記の本発明核酸が目的の宿主細胞中で発現し得るように遺伝子発現に関与する領域（プロモーター領域、エンハンサー領域、オペレーター領域等）が適切に配列されており、さらに本発明核酸が適切に発現するように構築されていることが好ましい。
【００４９】
また、発現ベクターの構築は、制限処理及び連結作業を必要としないＧａｔｅｗａｙシステム（インビトロジェン社）を用いることもできる。Ｇａｔｅｗａｙシステムとは、ＰＣＲ産物の方向性を維持したままクローニングができ、また、ＤＮＡ断片を適切に改変した発現ベクターにサブクローニングを可能にした部位特異的な組換えを利用したシステムである。具体的には、ＰＣＲ産物とドナーベクターとから部位特異的な組換え酵素であるＢＰクロナーゼによってエントリークローンを作成し、その後、このクローンと別の組換え酵素であるＬＢクロナーゼによって組換え可能なデスティネーションベクターにＰＣＲ産物を移入することにより、発現系に対応した発現クローンを調製するものである。最初にエントリークローンを作成すれば、制限酵素やリガーゼで作業する手間の係るサブクローニングステップが不要となる点を特徴の一つとする。
【００５０】
発現ベクターの種類は、原核細胞および／または真核細胞の各種の宿主細胞中で所望の遺伝子を発現し、所望のタンパク質を生産する機能を有するものであれば特に限定されないが、例えば、哺乳類用発現ベクターとしてｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ１、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＧｒｅｅｎＬａｎｔｅｒｎなどが好ましく、大腸菌用発現ベクターとしてｐＱＥ−３０、ｐＱＥ−６０、ｐＭＡＬ−Ｃ２、ｐＭＡＬ−ｐ２、ｐＳＥ４２０、ｐＥＴ又はｐＣＡＬ若しくはそれらの人工的修飾物（ｐＱＥ３０、ｐＥＴ又はｐＣＡＬを適当な制限酵素で処理して得られるＤＮＡフラグメント）などが好ましく、酵母用発現べクターとしてｐＹＥＳ２（サッカロマイセス属）、ｐＰＩＣ３．５Ｋ、ｐＰＩＣ９Ｋ、ｐＡ０８１５（以上ピキア属）、昆虫用発現ベクターとしてｐＦａｓｔＢａｃｐ、ｐＢａｃＰＡＫ８／９、ｐＢＫ２８３、ｐＶＬ１３９２、ｐＢｌｕｅＢａｃ４．５などが好ましい。
【００５１】
上記「本発明発現ベクター」を宿主細胞に組み込み、形質転換体を得ることができる。上記「宿主細胞」として真核細胞（哺乳類細胞、酵母、昆虫細胞等）であっても原核細胞（大腸菌、枯草菌等）であっても使用することができる。本発明の形質転換体を得るための宿主細胞は、特に限定されず、さらに、または、ヒト（例えば、ＨｅＬａ、２９３Ｔ、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ）、マウス（例えば、Ｎｅｕｒｏ２ａ、ＮＩＨ３Ｔ３）、サル（例えば、ＣＯＳ−１）由来の培養細胞でもよい。これらはいずれも公知であり、市販されているか（例えば、大日本製薬社）、あるいは公共の研究機関（例えば、理研セルバンク）より入手可能である。あるいは、胚、器官、組織若しくは非ヒト個体も使用可能である。
【００５２】
ところで、「本発明の核酸」は、ヒトゲノムライブラリーから発見された核酸であるため、本発明においては真核細胞を本発明の形質転換体の宿主細胞として用いるとより天然物に近い性質を有した「本発明酵素」が得られる（例えば糖鎖が付加された態様など）と考えられる。従って、「宿主細胞」としては真核細胞、特に哺乳類細胞を選択することが好ましい。動物細胞としてはマウス由来、アフリカツメガエル由来、ラット由来、ハムスタ−由来、サル由来またはヒト由来の細胞若しくはそれらの細胞から樹立した培養細胞株などが例示される。
【００５３】
宿主細胞として細菌、特に大腸菌を用いる場合、一般に発現べクターは少なくとも、プロモーター／オペレーター領域、開始コドン、所望のタンパク質をコードする遺伝子、終止コドン、ターミネーターおよび複製可能単位から構成される。
【００５４】
宿主細胞として酵母、植物細胞、動物細胞または昆虫細胞を用いる場合には、一般に発現べクターは少なくとも、プロモーター、関始コドン、所望のタンパク質をコードする遺伝子、終止コドン、ターミネーターを含んでいることが好ましい。またシグナルペブチドをコードするＤＮＡ、エンハンサー配列、所望の遺伝子の５’側および３’側の非翻訳領域、選択マーカー領域または複製可能単位などを適宜含んでいてもよい。
【００５５】
本発明のべクタ−において、好適な開始コドンとしては、メチオニンコドン（ＡＴＧ）が例示される。また、終止コドンとしては、常用の終止コドン（例えば、ＴＡＧ、ＴＧＡ、ＴＡＡなど）が例示される。
【００５６】
複製可能単位とは、宿主細胞中でその全ＤＮＡ配列を複製することができる能力をもつＤＮＡを意味し、天然のプラスミド、人工的に修飾されたプラスミド（天然のプラスミドから調製されたプラスミド）および合成プラスミド等が含まれる。
【００５７】
エンハンサー配列、ターミネーター配列については、例えば、それぞれＳＶ４０に由来するもの等、当業者において通常使用されるものを用いることができる。
【００５８】
選択マーカーとしては、通常使用されるものを常法により用いることができる。例えばテトラサイクリン、アンピシリン、またはカナマイシンもしくはネオマイシン、ハイグロマイシンまたはスペクチノマイシン等の抗生物質耐性遺伝子などが例示される。
【００５９】
発現べクターは、少なくとも、上述のプロモータ−、開始コドン、所望のタンパク質をコードする遺伝子、終止コドン、およびターミネーター領域を連続的かつ環状に適当な複製可能単位に連結することによって調製することができる。またこの際、所望により制限酵素での消化やＴ４  ＤＮＡリガーゼを用いるライゲーション等の常法により適当なＤＮＡフラグメント（例えば、リンカー、他の制限酵素部位など）を用いることができる。
【００６０】
本発明の発現べクターの宿主細胞への導入［形質転換（形質移入）］は従来公知の方法を用いて行うことができる。
例えば、細菌（Ｅ．ｃｏｌｉ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｓ  等）の場合は、例えばＣｏｈｅｎらの方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）］、プロトプラスト法［Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１６８，１１１（１９７９）］やコンピテント法［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５６，２０９（１９７１）］によって、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｖｉｓｉａｅの場合は、例えばＨｉｎｎｅｎらの方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５，１９２７（１９７８）］やリチウム法［Ｊ．Ｂ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５３，１６３（１９８３）］によって、植物細胞の場合は、例えばリーフディスク法［Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，１２９（１９８５）］、エレクトロポレ−ション法［Ｎａｔｕｒｅ，３１９，７９１（１９８６）］によって、動物細胞の場合は、例えばＧｒａｈａｍの方法［Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４５６（１９７３）］、昆虫細胞の場合は、例えばＳｕｍｍｅｒらの方法［Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，３，２１５６−２１６５（１９８３）］によってそれぞれ形質転換することができる。
【００６１】
なお、組換えベクターの構築及びそれを用いて本発明の核酸を宿主細胞に導入する方法の具体例が下記実施例１に詳述されている。
（４）タンパク質の単離・精製
近年、遺伝子工学的手法として、形質転換体を培養、生育させて、その培養物、生育物から目的物質を単離・精製する手法が確立されている。
【００６２】
本発明のタンパク質は、上記の如く調製された発現ベクターを含む形質転換細胞を栄養培地で培養することによって発現（生産）することができる。栄養培地は、宿主細胞（形質転換体）の生育に必要な炭素源、無機窒素源もしくは有機窒素源を含んでいることが好ましい。炭素源としては、たとえばグルコース、デキストラン、可溶性デンプン、ショ糖、メタノールなどが、例示される。無機窒素源もしくは有機窒素源としては、例えばアンモニウム塩類、硝酸塩類、アミノ酸、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などが例示される。また、所望により他の栄養素（例えば無機塩（例えば、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウム）、ビタミン類、抗生物質（例えばテトラサイクリン、ネオマイシン、アンピシリン、カナマイシン等）など）を含んでいてもよい。培養は、当業界において知られている方法により行われる。培養条件、例えば温度、培地のｐＨ及び培養時間は、本発明のタンパク質が大量に生産されるように適宜選択される。
【００６３】
本発明のタンパク質は、上記培養により得られる培養物より以下のようにして取得することができる。すなわち、本発明のタンパク質が宿主細胞内に蓄積する場合には、遠心分離やろ過などの操作により宿主細胞を集め、これを適当な緩衝液（例えば濃度が１０〜１００ｍＭ程度のトリス緩衝液、リン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＭＥＳ緩衝液など。ｐＨは用いる緩衝液によって異なるが、ｐＨ５．０〜９．０の範囲が望ましい。）に懸濁した後、用いる宿主細胞に適した方法で細胞を破壊し、遠心分離により宿主細胞の内容物を得る。一方、本発明のタンパク質が宿主細胞外に分泌される場合には、遠心分離やろ過などの操作により宿主細胞と培地を分離し、培養ろ液を得る。宿主細胞破壊液、あるいは培養ろ液はそのまま、または硫安沈殿と透析を行なった後に、本発明タンパク質の単離・精製に供することができる。単離・精製の方法としては、以下の方法が挙げることができる。即ち、当該タンパクに６×ヒスチジンやＧＳＴ、マルトース結合タンパクといったタグを付けている場合には、一般に用いられるそれぞれのタグに適したアフィニティークロマトグラフィーによる方法を挙げることができる。一方、そのようなタグを付けずに本発明タンパク質を生産した場合には、イオン交換クロマトグラフィーによる方法を挙げることができる。また、これに加えてゲルろ過や疎水性クロマトグラフィー、等電点クロマトグラフィーなどを組み合わせる方法も挙げることができる。
【００６４】
本発明のタンパク質を、Ｎ−アセチルグルコサミンを有する糖タンパク質、糖脂質、オリゴ糖又は多糖等に作用させることにより、ガラクトースが転移される。従って、本発明タンパク質は、糖タンパク質や糖脂質の糖鎖の修飾や、糖類の合成に用いることができる。さらに、本発明タンパク質を免疫原として動物に投与することにより、該タンパク質に対する抗体を作製することができ、該抗体を用いて免疫測定法により該タンパク質を測定することが可能になる。従って、本発明タンパク質及びこれをコードする核酸は、このような免疫原の作製に有用である。
【００６５】
本発明タンパク質はまた、精製および同定を容易にするために添加されるペプチドを含んでもよい。こうしたペプチドには、例えば、ポリ−Ｈｉｓまたは米国特許第５，０１１，９１２号およびＨｏｐｐら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６：１２０４，１９８８に記載される抗原性同定ペプチドが含まれる。こうしたペプチドの１つはＦＬＡＧ（登録商標）ペプチド（Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ（配列番号９））であり、該ペプチドは非常に抗原性であり、そして特異的なモノクローナル抗体が可逆的に結合するエピトープを提供し、発現された組換えタンパク質の迅速なアッセイおよび容易な精製を可能にする。４Ｅ１１と称されるネズミハイブリドーマは、本願明細書に援用される米国特許第５，０１１，９１２号に記載されるように、特定の二価金属陽イオンの存在下で、ＦＬＡＧ（登録商標）ペプチドに結合するモノクローナル抗体を産生する。４Ｅ１１ハイブリドーマ細胞株は、寄託番号ＨＢ  ９２５９下に、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に寄託されている。ＦＬＡＧ（登録商標）ペプチドに結合するモノクローナル抗体は、Ｅａｓｔｍａｎ  Ｋｏｄａｋ  Ｃｏ．，  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ
Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、コネチカット州ニューヘブンより入手可能である。
【００６６】
具体的には、後述される実施例１に記載されるように、本発明のタンパク質を発現する発現ベクターにＦＬＡＧのｃＤＮＡを挿入し、ＦＬＡＧ標識したタンパク質を発現させ、抗ＦＬＡＧ抗体によって、該タンパク質の発現を確認することができる。
【００６７】
（５）測定用核酸
本発明によれば、本発明の核酸と特異的にハイブリダイズする核酸（以下、「測定用核酸」と称する）が提供される。本発明の測定用核酸は、典型的には、本発明のタンパク質をコードする核酸の天然由来の又は合成されたフラグメントであり、プライマーまたはプローブを含むが、これらに限定されるものではない。ここで、「特異的」とは、検査対象となる生物試料、例えば細胞中に存在する他の核酸とハイブリダイズせず、上記本発明の核酸とのみハイブリダイズするという意味である。測定用核酸は、本発明の核酸、とりわけ配列番号２に示される塩基配列を有する核酸中の部分領域と相同的な配列を有することが一般的に好ましいが、一部不一致があっても差し支えないことが多い。尚、「測定」には、検出、増幅、定量、および半定量のいずれもが包含される。
【００６８】
（ａ）プライマー
本発明測定用核酸を核酸増幅反応用のプライマーとして使用する場合、本発明測定用核酸は、オリゴヌクレオチドであって、
配列番号１に示すタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列から以下の条件を満たすように２つの領域を選択し：
１）各領域の長さが１５−５０塩基であること；
２）各領域中のＧ＋Ｃの割合が３０−７０％であること；
上記領域と同じ塩基配列若しくは上記領域に相補的な塩基配列を有する一本鎖ＤＮＡを製造し、または、上記一本鎖ＤＮＡによってコードされるアミノ酸残基を変化させないように遺伝子暗号の縮重を考慮した一本鎖ＤＮＡの混合物を製造し、さらに必要であれば上記タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列に対する結合特異性を失わないように修飾した上記一本鎖ＤＮＡを製造する
ことを含む方法により製造された当該オリゴヌクレオチドが提供される。
【００６９】
本発明のプライマーは、本発明核酸の部分領域と相同的な配列を有することが好ましいが、１または２塩基の不一致があっても差し支えない。
なお、本発明のプライマーの塩基数は１５塩基以上、好ましくは２１塩基以上、より好ましくは２５塩基以上であり、５０塩基以下である。
【００７０】
本発明のプライマーは、典型的には、配列番号３（配列番号３の塩基番号１１−２９は、配列番号２の塩基番号１−１９に対応する）、配列番号４（配列番号４の塩基番号１４−３２は、配列番号２の塩基番号１４９７−１４７９に対応する）、配列番号５（配列番号５の塩基番号５−２８は、配列番号２の塩基番号８４−１０７に対応する）、配列番号６（配列番号２の塩基番号１３０５−１３２５に対応する）、及び配列番号７（配列番号２の塩基番号１３７８−１３５４に対応する）の塩基配列を有し、単独、又はプライマー対として用いることができる。
【００７１】
（ｂ）プローブ
本発明測定用核酸をプローブとして使用する場合、本発明測定用核酸は、配列番号２に記載の塩基配列の全体又は部分領域と相同的な配列を有することが好ましい。本発明の測定用核酸が、ｃＤＮＡプローブの場合、塩基数は、１５塩基以上、好ましくは２０塩基以上で、最長で、コード領域の全長、即ち、１４９４塩基である。配列番号２に記載した塩基配列又はその相補的な塩基配列と２０％以下、好ましくは１０％以下の不一致があっても、プローブとしての機能を果たし得る。また、本発明の測定用核酸が、合成オリゴヌクレオチドの場合、塩基数は１５塩基以上、好ましくは２０塩基以上、より好ましくは２４塩基以上である。合成オリゴヌクレオチドの場合、長さによるが、配列番号２に記載した塩基配列又はその相補的な塩基配列と１または２塩基程度の不一致があってもプローブとしての機能を果たし得る。
【００７２】
本発明のプローブは、例えば、配列番号８に記載された塩基配列を有する。これは、配列番号２の塩基番号１３２８−１３５１に相当し、配列番号６および７をプライマーとして核酸増幅反応を行った場合、その増幅産物にハイブリダイズして検出し得る。また、前述のプライマーも本発明のプローブとして使用し得る。
【００７３】
本発明のプローブには、該プローブが標的配列とハイブリダイズしたことを検出または確認するために、蛍光標識、放射標識、ビオチン標識等の標識を付した標識プローブが含まれる。被検核酸またはその増幅物を固相化し、標識プローブとハイブリダイズさせ、洗浄後、固相に結合された標識を測定することにより、検体中に被検核酸が存在するかを決定することができる。
【００７４】
（ｃ）マイクロアレイ
本発明測定用核酸は、マイクロアレイとして使用することができる。マイクロアレイは、ゲノム機能の大量で迅速な解析を可能にする手段である。具体的には、固相基盤、例えばガラス上に高密度に固定した多数の異なった核酸プローブに、標識した核酸をハイブリダイズさせ、各々のプローブからのシグナルを検出し、得られたデータを解析するものである。本願明細書において「マイクロアレイ」というときは、固相基盤、例えば、メンブラン、フィルター、チップ、ガラス上に、本発明測定用核酸を配列したものをいう。
【００７５】
（ｄ）被検核酸の測定
被検核酸の部分領域と相補的な配列を有する核酸をＰＣＲのような遺伝子増幅法のプライマー、又はプローブとして用いて被検核酸を測定する方法自体は周知であり、下記実施例３には、ヒト細胞中の本発明のタンパク質のｍＲＮＡをノーザンブロット及びインサイチューハイブリダイゼーションにより測定した方法が具体的に詳述されている。また、被検核酸の測定には、前記マイクロアレイを使用することもできる。
【００７６】
ＰＣＲのような核酸増幅法自体は、この分野において周知であり、そのための試薬キット及び装置も市販されているので容易に行うことができる。上記した本発明の測定用核酸の一対をプライマーとして用い、被検核酸を鋳型として用いて核酸増幅法を行うと、被検核酸が増幅されるのに対し、検体中に被検核酸が含まれない場合には増幅が起きないので、増幅産物を検出することにより検体中に被検核酸が存在するか否かを知ることができる。増幅産物の検出は、増幅後の反応溶液を電気泳動し、バンドをエチジウムブロミド等で染色する方法や、電気泳動後の増幅産物をナイロン膜等の固相に不動化し、被検核酸と特異的にハイブリダイズする標識プローブとハイブリダイズさせ、洗浄後、該標識を検出することにより行うことができる。また、クエンチャー蛍光色素とレポーター蛍光色素を用いたいわゆるリアルタイム検出ＰＣＲを行うことにより、検体中の被検核酸の量を定量することも可能である。なお、リアルタイム検出ＰＣＲ用のキットも市販されているので、容易に行うことができる。さらに、電気泳動バンドの強度に基づいて被検核酸を半定量することも可能である。なお、被検核酸は、ｍＲＮＡでも、ｍＲＮＡから逆転写したｃＤＮＡであってもよい。被検核酸としてｍＲＮＡを増幅する場合には、上記一対のプライマーを用いたＮＡＳＢＡ法（３ＳＲ法、ＴＭＡ法）を採用することもできる。ＮＡＳＢＡ法自体は周知であり、そのためのキットも市販されているので、上記一対のプライマーを用いて容易に実施することができる。
【００７７】
プローブとしては、上記測定用核酸に蛍光標識、放射標識、ビオチン標識等の標識を付した標識プローブを用いることができる。被検核酸又はその増幅物を固相化し、標識プローブとハイブリダイズさせ、洗浄後、固相に結合された標識を測定することにより、検体中に被検核酸が存在するか否かを調べることができる。あるいは、測定用核酸を固相化し、被検核酸をハイブリダイズさせ、固相に結合した被検核酸を標識プローブ等で検出することも可能である。このような場合、固相に結合した測定用核酸もプローブと呼ばれる。
【００７８】
【実施例】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００７９】
実施例１
１．遺伝子データベースの検索と新規グルコース転移酵素遺伝子（Ｇａｌ−Ｔ７）の塩基配列決定
既存のβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素遺伝子を用いて、遺伝子データベースから類似遺伝子の検索を行った。用いた配列はβ３Ｇｎ−Ｔ４のアミノ酸配列ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＰ＿１１０３９２である。また検索は、Ｂｌａｓｔ［Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ＳＦ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３−４１０（１９９０）］等のプログラムを利用した。
【００８０】
その結果、ＥＳＴ配列ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＸＭ＿０８５０４２が見出された。さらにこの配列からゲノム配列ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＬ１３８９６５が見い出された。ＡＬ１３８９６５からＧｅｎｅＳｃａｎ（ワシントン大学）ソフトウェアを用いて、ＯＲＦを予想した。その後、予想したＯＲＦが正しいことを、２種類のプライマー（ＧＰ１０５３；５’−ｇｇａａｔｔｃａｇｇａｔｇｃｇｇｃｃｇｃｃｃｇｃｃｔｇｃｔ−３’（配列番号３）、及びＧＰ１０４９；５’−ｇｃｔｃｔａｇａｇｔｇａｔｔｔａｔａａｃｔｃｃｔｃｔｃｇａａａａ−３’（配列番号４））を用いたＰＣＲ反応（９４℃、２０秒；６０℃、３０秒；７２℃、２分を３０サイクル）後、得られた断片の塩基配列解析をすることにより確認し、配列番号２に示した塩基配列情報を得た。
【００８１】
２．Ｇａｌ−Ｔ７遺伝子の発現ベクターへの組込み
Ｇａｌ−Ｔ７の発現系を作成するため、まずＧａｌ−Ｔ７遺伝子をシグマ社のｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ１ベクターに組込み、ｐＦＡＬＧ−Ｇａｌ−Ｔ７を作製した。
【００８２】
得られた塩基配列情報（配列番号２）に従い設計した２種類のプライマーＧＰ−１０５２（５’−ｇｇａａｔｔｃｔｇａａｇａｔａｃａａａｇａａａｇａｇｇｔ−３’）（配列番号５）とＧＰ−１０４９（前述）を用い、酵素活性に必要なＤＮＡ断片を、Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡ（Ｈｕｍａｎ  Ｂｒａｉｎ）を鋳型として増幅した。これらのプライマー中には制限酵素Ｅｃｏ  ＲＩあるいはＸｂａ  Ｉ切断部位を含むためｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ１ベクターのＥｃｏＲＩ−Ｘｂａ  Ｉ部位にＰＣＲ増幅断片を挿入することが可能である。しかし、ＰＣＲ増幅断片中にＥｃｏ  ＲＩが１ヵ所存在するため、最初に３’側のＥｃｏ  ＲＩ−Ｘｂａ  Ｉ断片を、続いて５’側のＥｃｏ  ＲＩ−Ｅｃｏ  ＲＩ断片を常法により挿入し、Ｇａｌ−Ｔ７発現ベクターを構築した。作製したベクターをｐＦＬＡＧ−Ｇａｌ−Ｔ７と命名した。なお、この操作により、Ｇａｌ−Ｔ７はＦＬＡＧタグに引きつづき、２９番目のセリンからタンパク質が産生されることになる。
【００８３】
３．  トランスフェクションとリコンビナント酵素の発現
２×１０６のＣＯＳ−１細胞を予め１０％  ＦＣＳ（ウシ胎児血清）を含むＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ）で１晩培養後、リポフェクタミン２０００（インビトロジェン社）を用いて、同社のプロトコールに従って、該細胞に１５μｇのｐＦＬＡＧ−Ｇａｌ−Ｔ７を導入した。培養４８時間から７２時間後の培養上清を回収し、上清１０ｍｌにＮａＮ３（０．０５％）、ＮａＣｌ（１５０ｍＭ）、ＣａＣｌ２（２ｍＭ）、抗Ｍ１レジン（シグマ社）（５０μｌ）を混合し、４℃で一夜攪拌した。反応混合液を遠心分離して（３０００ｒｐｍ、５分、４℃）ペレットを回収し、２ｍＭのＣａＣｌ２・ＴＢＳを９００μｌ加えて再度遠心分離（２０００ｒｐｍ、５分、４℃）し、ペレットを２００μｌの１  ｍＭ  ＣａＣｌ２  ・ＴＢＳ  に浮遊させ活性測定のサンプル（Ｇａｌ−Ｔ７酵素液）とした。
【００８４】
酵素液は常法により、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとウエスタンブロッテイングを行い、目的とするタンパク質が発現していることを確認した。抗体は抗ＦＬＡＧ  Ｍ２−ペルオキシダーゼ（Ａ−８５９２、ＳＩＧＭＡ社）を用いた。
【００８５】
実施例２
本発明タンパク質の酵素活性測定
１．供与体基質の探索
各種単糖受容体基質の混合液に対し、酵素液５μｌと様々な供与体基質を用いて、本発明酵素の供与体基質の探索を行った（表１）。
【００８６】
受容体基質は、Ｇａｌ−α−ｐＮｐ、Ｇａｌ−β−ｏＮｐ、ＧａｌＮＡｃ−α−Ｂｚ、ＧａｌＮＡｃ−β−ｐＮｐ、ＧｌｃＮＡｃ−α−ｐＮｐ、ＧｌｃＮＡｃ−β−Ｂｚ、Ｇｌｃ−α−ｐＮｐ、Ｇｌｃ−β−ｐＮｐ、ＧｌｃＡ−β−ｐＮｐ、Ｆｕｃ−α−ｐＮｐ、Ｍａｎ−α−ｐＮｐ（以上ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社）、Ｘｙｌ−α−ｐＮｐ、Ｘｙｌ−β−ｐＮｐ（以上シグマ社）が各２．５ｎｍｏｌ／２０μｌ含まれるように調製した。ここで、「Ｇａｌ」とはＤ−ガラクトース残基を示し、「Ｇｌｃ」とはＤ−グルコース残基を示し、「Ｆｕｃ」とはＤ−フコース残基を示し、「Ｍａｎ」とはＤ−マンノース残基を示し、「ｐＮｐ」はｐ−ニトロフェニル基を示し、「Ｂｚ」はベンジル基を示し、「−」はグリコシド結合を示す。また、「α」及び「β」は、糖環１位の前記グリコシド結合のアノマーを示し、５位ＣＨ２ＯＨまたはＣＨ３との位置関係がトランスのものを「α」、シスのものを「β」で示す。また、各種供与体基質（ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ、ＵＤＰ−Ｇａｌ、ＧＤＰ−Ｍａｎ、ＵＤＰ−ＧｌｃＡ、ＵＤＰ−Ｘｙｌ及びＧＤＰ−Ｆｕｃ、何れもシグマ社）に対する反応液は表２にまとめたとおりである。反応液中には適量の１４Ｃ標識供与体基質も混在させた。また、反応時間はすべて１６時間とした。反応後、ＳｅｐＰａｃｋ  Ｃ１８カラム（ウォーターズ社）で未反応の放射活性を有する供与体基質を除去し、受容体に取り込まれた供与体由来の放射活性を液体シンチレーションカウンターで測定した。その結果、Ｇａｌ−Ｔ７はＵＤＰ−Ｇａｌを供与体基質に用いたときのみ有意な活性が検出できた（表１）。
【００８７】
【表１】
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【００８８】
【表２】
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【００８９】
２．受容体基質の探索
さらに、受容体基質を探索する目的で、それぞれの受容体基質を単独で使用し（１０ｎｍｏｌ／２０μｌ）、反応を行った。その結果、Ｇａｌ−Ｔ７はＧｌｃＮＡｃ−β−Ｂｚを用いたときのみ、有意な放射活性が検出された。以上の結果から、Ｇａｌ−Ｔ７はＧｌｃＮＡｃにＧａｌを転移する糖転移酵素であることが明らかになった（表３）。また、若干ではあるが、Ｇａｌ−Ｔ７はＧｌｃにＧａｌを転移する活性を有していた。
【００９０】
【表３】
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【００９１】
３．至適ｐＨの検討
以上のように、Ｇａｌ−Ｔ７はＧｌｃＮＡｃにＧａｌを転移する糖転移酵素であることが明らかになった。そこで、該酵素の至適ｐＨを検討した。ここで用いた緩衝液はＭＥＳ（ｐＨ  ５．５、５．７５、６．０、６．２６、６．５、６．７５）、ＨＥＰＥＳ（ｐＨ  ６．７５、７．０、７．３、７．４、７．５）、カコジル酸（ｐＨ  ６．８、７．０、７．２、７．４）である。その結果、表４にまとめたように、ＭＥＳ（ｐＨ  ６．５）で活性が高くなる傾向がみられた。なお、本実施例では、酵素を添加しない場合のブランク値に、ＭＥＳ（ｐＨ  ７．０）のときの値（１９９．２５  ｄｐｍ）を採用した。以下の実験では、ＭＥＳ（ｐＨ  ６．５）を使用することにした。
【００９２】
【表４】
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【００９３】
４．２価陽イオン要求性の検討
一般に、糖転移酵素には２価の陽イオンを要求するものが多い。そこで、各種２価陽イオンを添加して、酵素活性を測定した。その結果、Ｇａｌ−Ｔ７はＭｇ２＋、Ｍｎ２＋を添加したときに高い活性を示し、Ｃｕ２＋、Ｃｏ２＋を添加したときに若干の活性を示した（表５）。これに対し、キレート剤であるＥＤＴＡを添加するといずれの酵素も活性を示さなかった。
【００９４】
【表５】
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【００９５】
実施例３
ヒト組織での発現解析
ヒト正常組織のｃＤＮＡを用いて、定量的ＰＣＲにより該遺伝子の発現量を定量した。正常組織のｃＤＮＡは、クロンテック社の総ＲＮＡから逆転写を行ったものを使用し、株化細胞に関しては総ＲＮＡを抽出し、常法によりｃＤＮＡを作製し使用した。Ｇａｌ−Ｔ７遺伝子の定量的発現解析に使用したプライマーはＫ１４−Ｆ２（５’−ｇａｃａｃａｃａｇｃｃｃｔｃｔｃｔｔｃｃａ−３’）（配列番号６）、Ｋ１４−Ｒ２（５’−ｔｇｇｇａａｃｔｔｇａｔｇａｇａａａｇｇｔａｇｔｃ−３’）（配列番号７）、プローブはＫ１４−Ｐ２（５’−ａｇｇｃｔｃｇｇｃｃｇｇｔｇｇａｔｔａｃｃｃｔａ−３’）（配列番号８）である。酵素及び反応液にはＵｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘを使用し、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ともにアプライドバイオシステムズ社）により反応液量２５μｌで定量を行った。定量の標準遺伝子としてはグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）遺伝子を使用し、既知濃度の鋳型ＤＮＡにより定量の検量線を作成し該遺伝子の発現量の標準化を行った。また、Ｇａｌ−Ｔ７の標準ＤＮＡとして、ｐＦＬＡＧ−Ｇａｌ−Ｔ７を用いた。反応温度は５０℃２分、９５℃１０分の後、９５℃１５秒・６０℃１分を５０サイクル行った。結果を図１に示した。Ｇａｌ−Ｔ７は精巣や子宮での発現が高かったが、調べた全ての組織で発現は確認できた。
【００９６】
【配列表】
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【００９７】
【発明の効果】
本発明により、Ｎ−アセチルグルコサミンにガラクトースを転移する酵素が単離され、その遺伝子の構造が明らかにされた。したがって、該酵素等の遺伝子工学的な生産や該酵素による糖鎖の生産、該遺伝子らに基づく疾患の診断が可能になった。
【図面の簡単な説明】
【図１】各種組織、株化細胞におけるＧａｌ−Ｔ７遺伝子の発現量をリアルタイムＰＣＲ法により定量した結果を示すグラフである。縦軸はコントロールのグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）遺伝子の発現量に対するＧａｌ−Ｔ７遺伝子の相対比をあらわす。
【図１】
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