(57)【要約】【課題】新規な変異点を有するニトリルヒドラターゼのアミノ酸配列及び該遺伝子の塩基配列を提供する。【解決手段】シュードノカルディア・サーモフィラＰｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ JCM3095由来であり、ヘテロな２種のサブユニットから構成されるニトリルヒドラターゼに新規な変異を導入し、得られる変異体のアミノ酸配列及び該遺伝子の塩基配列を提供する。また、該遺伝子が挿入されたプラスミドを作製し、該プラスミドを導入した形質転換体を、ニトリル化合物を対応するアミド化合物に変換する触媒として用いる。【効果】ニトリル化合物を対応するアミド化合物に効率良く変換することが可能となる。【選択図】    図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
αサブユニットとβサブユニットとを有するニトリルヒドラターゼにおいて、
前記αサブユニットが、配列表の配列番号：１のアミノ酸配列の３６番目、７１番目、１４８番目及び２０４番目のアミノ酸の何れか一つ以上のアミノ酸を他のアミノ酸に置換したアミノ酸配列を有することを特徴とするニトリルヒドラターゼ。
【請求項２】
前記αサブユニットのアミノ酸配列の６番目、１９番目、３８番目、７７番目、９０番目、１０２番目、１０６番目、１２６番目、１３０番目、１４２番目、１４６番目、１８７番目、１９４番目及び２０３番目のアミノ酸の何れか一つ以上のアミノ酸が他のアミノ酸に更に置換されている請求項１に記載のニトリルヒドラターゼ。
【請求項３】
前記βサブユニットが配列表の配列番号：２のアミノ酸配列を有する請求項１または２に記載のニトリルヒドラターゼ。
【請求項４】
前記βサブユニットのアミノ酸配列の１０番目、３２番目、３７番目、４１番目、４６番目、４８番目、５１番目、７２番目、１１８番目、１２７番目、１４６番目、１６０番目、１８６番目及び２１７番目のアミノ酸の何れか一つ以上のアミノ酸が他のアミノ酸にさらに置換されている請求項３に記載のニトリルヒドラターゼ。
【請求項５】
前記βサブユニットのアミノ酸配列の２０番目、２１番目、１０８番目、２００番目及び２１２番目のアミノ酸の何れか一つ以上のアミノ酸が他のアミノ酸に更に置換されている請求項４に記載のニトリルヒドラターゼ。
【請求項６】
前記βサブユニット及び前記αサブユニットの少なくとも一方の有する前記アミノ酸配列の前記アミノ酸置換位置以外の位置において１個または数個のアミノ酸が、ニトリルヒドラターゼ活性が損なわれない範囲で置換、挿入または削除されている請求項１〜５に記載のニトリルヒドラターゼ。
【請求項７】
αサブユニットとβサブユニットとを有するニトリルヒドラターゼにおいて、
βサブユニットが、配列表の配列番号：２のアミノ酸配列の１０番目、３２番目、３７番目、４１番目、４６番目、４８番目、５１番目、７２番目、１１８番目、１２７番目、１４６番目、１６０番目、１８６番目及び２１７番目のアミノ酸の何れか一つ以上のアミノ酸を他のアミノ酸に置換したアミノ酸配列を有することを特徴とするニトリルヒドラターゼ。
【請求項８】
前記βサブユニットのアミノ酸配列の２０番目、２１番目、１０８番目、２００番目及び２１２番目のアミノ酸の何れか一つ以上のアミノ酸が他のアミノ酸に更に置換されている請求項７に記載のニトリルヒドラターゼ。
【請求項９】
前記αサブユニットが、配列表の配列番号：１のアミノ酸配列を有する請求項７または８に記載のニトリルヒドラターゼ。
【請求項１０】
前記αサブユニットの３６番目、７１番目、１４８番目及び２０４番目のアミノ酸の何れか一つ以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されている請求項９に記載のニトリルヒドラターゼ。
【請求項１１】
前記αサブユニットのアミノ酸配列の６番目、１９番目、３８番目、７７番目、９０番目、１０２番目、１０６番目、１２６番目、１３０番目、１４２番目、１４６番目、１８７番目、１９４番目及び２０３番目のアミノ酸の何れか一つ以上のアミノ酸が他のアミノ酸に更に置換されている請求項１０に記載のニトリルヒドラターゼ。
【請求項１２】
前記αサブユニット及び前記βサブユニットの少なくとも一方有する前記アミノ酸配列の前記アミノ酸置換位置以外の位置において、１個または数個のアミノ酸が、ニトリルヒドラターゼ活性が損なわれない範囲で置換、挿入または削除されている請求項７〜１１に記載のニトリルヒドラターゼ。
【請求項１３】
ニトリルヒドラターゼのαサブユニットのアミノ酸配列をコードする遺伝子において、
前記アミノ酸配列が、配列表の配列番号：１のアミノ酸配列の３６番目、７１番目、１４８番目及び２０４番目のアミノ酸の何れか一つ以上のアミノ酸を他のアミノ酸に置換したアミノ酸配列であることを特徴とする遺伝子。
【請求項１４】
前記アミノ酸配列の６番目、１９番目、３８番目、７７番目、９０番目、１０２番目、１０６番目、１２６番目、１３０番目、１４２番目、１４６番目、１８７番目、１９４番目及び２０３番目のアミノ酸の何れか一つ以上のアミノ酸が他のアミノ酸に更に置換されている請求項１３に記載の遺伝子。
【請求項１５】
前記αサブユニットのアミノ酸配列の有する前記アミノ酸置換位置以外の位置において、１個または数個のアミノ酸が、ニトリルヒドラターゼ活性が損なわれない範囲で置換、挿入または削除されている請求項１３または１４に記載の遺伝子。
【請求項１６】
配列表の配列番号：３の塩基配列の１０６番目から１０８番目、２１１番目から２１３番目、４４２番目から４４４番目及び６１０番目から６１２番目の何れか一つ以上の塩基配列を他の塩基配列に置換して得られる塩基配列を有する請求項１３に記載の遺伝子。
【請求項１７】
前記塩基配列の１６番目から１８番目、５５番目から５７番目、１１２番目から１１４番目、２２９番目から２３１番目、２６８番目から２７０番目、３０４番目から３０６番目、３１６番目から３１８番目、３７６番目から３７８番目、３８８番目から３９０番目、４２４番目から４２６番目、４３６番目から４３８番目、５５９番目から５６１番目、５８０番目から５８２番目及び６０７番目から６０９番目の何れか一つ以上の塩基配列が他の塩基配列にさらに置換されている請求項１６に記載の遺伝子。
【請求項１８】
ニトリルヒドラターゼのβサブユニットのアミノ酸配列をコードする遺伝子において、
前記アミノ酸配列が、配列表の配列番号：２のアミノ酸配列の１０番目、３２番目、３７番目、４１番目、４６番目、４８番目、５１番目、７２番目、１１８番目、１２７番目、１４６番目、１６０番目、１８６番目及び２１７番目のアミノ酸の何れか一つ以上のアミノ酸を他のアミノ酸に置換したアミノ酸配列である遺伝子。
【請求項１９】
前記アミノ酸配列の２０番目、２１番目、１０８番目、２００番目及び２１２番目のアミノ酸の何れか一つ以上のアミノ酸が他のアミノ酸に更に置換されている請求項１８に記載の遺伝子。
【請求項２０】
前記βサブユニットのアミノ酸配列の有する前記アミノ酸置換位置以外の位置において、１個または数個のアミノ酸が、ニトリルヒドラターゼ活性が損なわれない範囲で置換、挿入または削除されている請求項１８または１９に記載の遺伝子。
【請求項２１】
配列表の配列番号：４記載の塩基配列の２８番目から３０番目、９４番目から９６番目、１０９番目から１１１番目、１２１番目から１２３番目、１３６番目から１３８番目、１４２番目から１４４番目、１５１番目から１５３番目、２１４番目から２１６番目、３５２番目から３５４番目、３７９番目から３８１番目、４３６番目から４３８番目、４７８番目から４８０番目、５５６番目から５５８番目及び６４９番目から６５１番目の何れか一つ以上の塩基配列を他の塩基配列に置換して得られる塩基配列を有する請求項１８に記載の遺伝子。
【請求項２２】
前記塩基配列の５８番目から６０番目、６１番目から６３番目、３２２番目から３２４番目、５９８番目から６００番目及び６３４番目から６３６番目の何れか一つ以上の塩基配列が他の塩基配列に更に置換されている請求項２１に記載の遺伝子。
【請求項２３】
ニトリルヒドラターゼのαサブユニットのアミノ酸配列をコードする遺伝子とβサブユニットのアミノ酸配列をコードする遺伝子とを有するニトリルヒドラターゼをコードする遺伝子において、
前記αサブユニットのアミノ酸配列が、配列表の配列番号：１のアミノ酸配列の３６番目、７１番目、１４８番目及び２０４番目のアミノ酸の何れか一つ以上のアミノ酸を他のアミノ酸に置換したアミノ酸配列であることを特徴とする遺伝子。
【請求項２４】
前記αサブユニットのアミノ酸配列の６番目、１９番目、３８番目、７７番目、９０番目、１０２番目、１０６番目、１２６番目、１３０番目、１４２番目、１４６番目、１８７番目、１９４番目及び２０３番目のアミノ酸の何れか一つ以上のアミノ酸が他のアミノ酸に更に置換されている請求項２３に記載の遺伝子。
【請求項２５】
前記αサブユニットのアミノ酸配列の有する前記アミノ酸置換位置以外の位置において、１個または数個のアミノ酸が、ニトリルヒドラターゼ活性が損なわれない範囲で置換、挿入または削除されている請求項２３または２４に記載の遺伝子。
【請求項２６】
前記αサブユニットのアミノ酸配列をコードする遺伝子が、配列表の配列番号：３の塩基配列の１０６番目から１０８番目、２１１番目から２１３番目、４４２番目から４４４番目及び６１０番目から６１２番目の何れか一つ以上の塩基配列を他の塩基配列に置換して得られる塩基配列を有する請求項２３に記載の遺伝子。
【請求項２７】
前記塩基配列の１６番目から１８番目、５５番目から５７番目、１１２番目から１１４番目、２２９番目から２３１番目、２６８番目から２７０番目、３０４番目から３０６番目、３１６番目から３１８番目、３７６番目から３７８番目、３８８番目から３９０番目、４２４番目から４２６番目、４３６番目から４３８番目、５５９番目から５６１番目、５８０番目から５８２番目及び６０７番目から６０９番目の何れか一つ以上の塩基配列が他の塩基配列にさらに置換されている請求項２６に記載の遺伝子。
【請求項２８】
前記βサブユニットのアミノ酸配列が配列表の配列番号：２のアミノ酸配列である請求項２３〜２７のいずれかに記載の遺伝子。
【請求項２９】
前記βサブユニットのアミノ酸配列が、前記配列番号：２のアミノ酸配列の１０番目、３２番目、３７番目、４１番目、４６番目、４８番目、５１番目、７２番目、１１８番目、１２７番目、１４６番目、１６０番目、１８６番目及び２１７番目のアミノ酸の何れか一つ以上のアミノ酸を他のアミノ酸に置換したアミノ酸配列である請求項２３〜２７のいずれかに記載の遺伝子。
【請求項３０】
前記βサブユニットのアミノ酸配列の２０番目、２１番目、１０８番目、２００番目及び２１２番目のアミノ酸の何れか一つ以上のアミノ酸が他のアミノ酸に更に置換されている請求項２９に記載の遺伝子。
【請求項３１】
前記βサブユニットのアミノ酸配列の有する前記アミノ酸置換位置以外の位置において、１個または数個のアミノ酸が、ニトリルヒドラターゼ活性が損なわれない範囲で置換、挿入または削除されている請求項２９または３０に記載の遺伝子。
【請求項３２】
前記βサブユニットのアミノ酸配列をコードする遺伝子が、配列表の配列番号：４の塩基配列を有する請求項２８に記載の遺伝子。
【請求項３３】
前記βサブユニットのアミノ酸配列をコードする遺伝子が、配列表の配列番号：４記載の塩基配列の２８番目から３０番目、９４番目から９６番目、１０９番目から１１１番目、１２１番目から１２３番目、１３６番目から１３８番目、１４２番目から１４４番目、１５１番目から１５３番目、２１４番目から２１６番目、３５２番目から３５４番目、３７９番目から３８１番目、４３６番目から４３８番目、４７８番目から４８０番目、５５６番目から５５８番目及び６４９番目から６５１番目の何れか一つ以上の塩基配列を他の塩基配列に置換して得られる塩基配列を有する請求項２９に記載の遺伝子。
【請求項３４】
前記塩基配列の５８番目から６０番目、６１番目から６３番目、３２２番目から３２４番目、５９８番目から６００番目及び６３４番目から６３６番目の何れか一つ以上の塩基配列が他の塩基配列に更に置換されている請求項３３に記載の遺伝子。
【請求項３５】
ニトリルヒドラターゼのαサブユニットのアミノ酸配列をコードする遺伝子とβサブユニットのアミノ酸配列をコードする遺伝子とを有するニトリルヒドラターゼをコードする遺伝子において、
前記βサブユニットのアミノ酸配列が、配列表の配列番号：２のアミノ酸配列の１０番目、３２番目、３７番目、４１番目、４６番目、４８番目、５１番目、７２番目、１１８番目、１２７番目、１４６番目、１６０番目、１８６番目及び２１７番目のアミノ酸の何れか一つ以上のアミノ酸を他のアミノ酸に置換したアミノ酸配列であることを特徴とする遺伝子。
【請求項３６】
前記アミノ酸配列の２０番目、２１番目、１０８番目、２００番目及び２１２番目のアミノ酸の何れか一つ以上のアミノ酸が他のアミノ酸に更に置換されている請求項３５に記載の遺伝子。
【請求項３７】
前記βサブユニットのアミノ酸配列の有する前記アミノ酸置換位置以外の位置において、１個または数個のアミノ酸が、ニトリルヒドラターゼ活性が損なわれない範囲で置換、挿入または削除されている請求項３５または３６に記載の遺伝子。
【請求項３８】
前記βサブユニットのアミノ酸配列をコードする塩基配列が、配列表の配列番号：４記載の塩基配列の２８番目から３０番目、９４番目から９６番目、１０９番目から１１１番目、１２１番目から１２３番目、１３６番目から１３８番目、１４２番目から１４４番目、１５１番目から１５３番目、２１４番目から２１６番目、３５２番目から３５４番目、３７９番目から３８１番目、４３６番目から４３８番目、４７８番目から４８０番目、５５６番目から５５８番目及び６４９番目から６５１番目の何れか一つ以上の塩基配列を他の塩基配列に置換して得られる塩基配列を有する請求項３５に記載の遺伝子。
【請求項３９】
前記塩基配列の５８番目から６０番目、６１番目から６３番目、３２２番目から３２４番目、５９８番目から６００番目及び６３４番目から６３６番目の何れか一つ以上の塩基配列が他の塩基配列に更に置換されている請求項３８に記載の遺伝子。
【請求項４０】
前記αサブユニットのアミノ酸配列が、配列表の配列番号：１のアミノ酸配列を有する請求項３５〜３９のいずれかに記載の遺伝子。
【請求項４１】
前記αサブユニットのアミノ酸配列が、配列表の配列番号：１のアミノ酸配列の３６番目、７１番目、１４８番目及び２０４番目のアミノ酸の何れか一つ以上のアミノ酸を他のアミノ酸に置換したアミノ酸配列である請求項３５〜３９のいずれかに記載の遺伝子。
【請求項４２】
前記αサブユニットのアミノ酸配列の６番目、１９番目、３８番目、７７番目、９０番目、１０２番目、１０６番目、１２６番目、１３０番目、１４２番目、１４６番目、１８７番目、１９４番目及び２０３番目のアミノ酸の何れか一つ以上のアミノ酸が他のアミノ酸に更に置換されている請求項４１に記載の遺伝子。
【請求項４３】
前記αサブユニットのアミノ酸配列の有する前記アミノ酸置換位置以外の位置において、１個または数個のアミノ酸が、ニトリルヒドラターゼ活性が損なわれない範囲で置換、挿入または削除されている請求項４１または４２に記載の遺伝子。
【請求項４４】
前記αサブユニットのアミノ酸配列をコードする遺伝子が、配列表の配列番号：３の塩基配列を有する請求項４０に記載の遺伝子。
【請求項４５】
前記αサブユニットのアミノ酸配列をコードする遺伝子が、配列表の配列番号：３の塩基配列の１０６番目から１０８番目、２１１番目から２１３番目、４４２番目から４４４番目及び６１０番目から６１２番目の何れか一つ以上の塩基配列を他の塩基配列に置換して得られる塩基配列を有する請求項４１に記載の遺伝子。
【請求項４６】
前記塩基配列の１６番目から１８番目、５５番目から５７番目、１１２番目から１１４番目、２２９番目から２３１番目、２６８番目から２７０番目、３０４番目から３０６番目、３１６番目から３１８番目、３７６番目から３７８番目、３８８番目から３９０番目、４２４番目から４２６番目、４３６番目から４３８番目、５５９番目から５６１番目、５８０番目から５８２番目及び６０７番目から６０９番目の何れか一つ以上の塩基配列が他の塩基配列にさらに置換されている請求項４５に記載の遺伝子。
【請求項４７】
請求項１〜１２のいずれかに記載のニトリルヒドラターゼをコードする遺伝子を有することを特徴とするプラスミド。
【請求項４８】
前記ニトリルヒドラターゼのαサブユニットをコードする遺伝子が、配列番号：３の塩基配列または請求項１３〜１６のいずれかに記載の遺伝子である請求項２１に記載のプラスミド。
【請求項４９】
前記ニトリルヒドラターゼのβサブユニットをコードする遺伝子が、配列番号：４の塩基配列または請求項１７〜１９のいずれかに記載の遺伝子である請求項２１または２２に記載のプラスミド。
【請求項５０】
請求項２３〜４６のいずれかに記載のニトリルヒドラターゼをコードする遺伝子を有することを特徴とするプラスミド。
【請求項５１】
前記ニトリルヒドラターゼの宿主細胞での発現のための構成を有する請求項４７〜５０のいずれかに記載のプラスミド。
【請求項５２】
請求項５１に記載のプラスミドによって宿主細胞を形質転換して得られた形質転換体。
【請求項５３】
ニトリルヒドラターゼの生産方法において、
請求項５２に記載の形質転換体を培地で培養して、該形質転換体に前記プラスミドの有するニトリルヒドラターゼ遺伝子に基づくニトリルヒドラターゼを生産させる工程を有することを特徴とする生産方法。
【請求項５４】
前記培養後の形質転換体、培養液及びそれらの処理物からニトリルヒドラターゼを回収する工程を更に有する請求項５３に記載の生産方法。
【請求項５５】
ニトリル化合物を水性媒体中でニトリルヒドラターゼを接触させて対応するニトリル化合物を得るニトリル化合物の製造方法において、
前記ニトリルヒドラターゼが請求項１〜１２のいずれかに記載のものである
ことを特徴とする製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規なニトリルヒドラターゼ及びそれをコードする遺伝子、該遺伝子を含有するプラスミド、該プラスミドにより形質転換された細胞株、該細胞株を用いてニトリルヒドラターゼを産生する方法、及び該細胞株を培養して得られる培養液・細胞・細胞処理物を用いてニトリル化合物から対応するアミド化合物を製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、種々の化合物のニトリル基を水和によりアミド基に変換するニトリル水和活性を有する酵素であるニトリルヒドラターゼが発見され、該酵素を産生する微生物株が多数開示されている。ニトリルヒドラターゼを用いてニトリル化合物よりアミド化合物を工業的に製造するためには、アミド化合物の製造コストに占める該酵素の製造コストを下げることが重要である。より具体的には、酵素調製物の単位重量あたりの該酵素含有量を高くする必要がある。そこで、該酵素の遺伝子を用いて遺伝子工学の手法により該酵素を大量に発現させることを目的として、該酵素の遺伝子をクローニングする試みが為されている。
【０００３】
ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物としては、シュードノカルディア・サーモフィラ（本菌株は、理化学研究所微生物系統保存施設（埼玉県和光市広沢２−１）に番号ＪＣＭ３０９５として保管され、何人にも請求により自由に分譲される。）が見い出されている（特許文献１参照）。
【０００４】
また、同株よりニトリルヒドラターゼが単離され、同酵素がαサブユニット及びβサブユニットより構成されることが確認されている。そして、同株よりニトリルヒドラターゼ遺伝子が単離され、そのアミノ酸配列及び塩基配列を明らかにされるとともに、同酵素の機能を実質的に変化させない置換変異部位を有するニトリルヒドラターゼが見い出された。さらに、このニトリルヒドラターゼを形質転換体内で大量に発現できるプラスミド及び同プラスミドにより形質転換された細胞株（一例としてＭＴ−１０８２２：ブタペスト条約に則って、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５７８５として独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されている。）が作出された。加えて、該細胞株による該ニトリルヒドラターゼの生産及び該細胞株若しくはそれより得られる該ニトリルヒドラターゼをニトリル化合物と接触させる事による対応するアミド化合物の製造が可能となっている（特許文献２参照）。
【０００５】
しかし、ニトリルヒドラターゼの機能を実質的に変化させない置換変異部位が該公報に記載されているもの以外に存在するのか、存在するならばその置換変異部位は遺伝子配列上の何処に相当する部位であるかに関しては未だ明らかとなっていなかった。
【０００６】
【特許文献１】
特開平８−５６６８４号公報
【特許文献２】
特開平９−２７５９７８号公報
【特許文献３】
特開平１１−２５３１６８号公報
なお、ニトリルヒドラターゼをコードする遺伝子を宿主細胞で発現させて酵素活性のあるニトリルヒドラターゼを生産する場合にこの酵素の活性化に関与するタンパク質が存在する点が特許文献３に開示されている。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、機能を実質的に変化させない新規な置換変異部位を有するニトリルヒドラターゼのアミノ酸配列及び該遺伝子の塩基配列を提供する事である。さらに、該遺伝子を含むプラスミド、該プラスミドにより形質転換された細胞株、該細胞株を用いた該酵素の産生方法、及び該細胞株を培養して得られる培養液・細胞・細胞処理物を用いてニトリル化合物から対応するアミド化合物を製造する方法をも提供する事である。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らはかかる状況の下、特開平９−２７５９７８号公報に開示されているニトリルヒドラターゼ遺伝子に、該公報には開示されていない新規な置換変異部位を導入し、該変異導入後の該遺伝子の塩基配列を決定した。さらに、該遺伝子を含むプラスミド、該プラスミドにより形質転換された細胞株を作製した。また、該細胞株を用いた該酵素の産生や該細胞株を培養して得られる培養液・細胞・細胞処理物を用いたニトリル化合物からの対応アミド化合物の製造に関しても鋭意検討を重ねた結果、本願発明を完成させるに至った。
【０００９】
本発明にかかるニトリルヒドラターゼのαサブユニットは、配列番号：１に示されるαサブユニットのアミノ酸配列の３６番目、７１番目、１４８番目、及び２０４番目のアミノ酸の何れか一つ以上のアミノ酸を他のアミノ酸に置換した変異を有するアミノ酸配列を有することを特徴とする。
【００１０】
本発明にかかるニトリルヒドラターゼのβサブユニットは、配列表の配列番号：２に示すβサブユニットのアミノ酸配列の１０番目、３２番目、３７番目、４１番目、４６番目、４８番目、５１番目、７２番目、１１８番目、１２７番目、１４６番目、１６０番目、１８６番目及び２１７番目のアミノ酸の何れか一つ以上のアミノ酸を他のアミノ酸に置換した変異を有するアミノ酸配列を有することを特徴とする。
【００１１】
本発明にかかるニトリルヒドラターゼは、αサブユニットとβサブユニットを有し、これらのサブユニットの少なくとも一方が上記の変異を有することを特徴とする。
【００１２】
本発明にかかるニトリルヒドラターゼのαサブユニットをコードする遺伝子は、上記のαサブユニットにおける変異を有するアミノ酸配列をコードすることを特徴とする。
【００１３】
本発明にかかるニトリルヒドラターゼのβサブユニットをコードする遺伝子は、上記のβサブユニットにおける変異を有するアミノ酸配列をコードすることを特徴とする。
【００１４】
本発明にかかるニトリルヒドラターゼをコードする遺伝子は、αサブユニットをコードする遺伝子とβサブユニットをコードする遺伝子とを有し、これらのサブユニットの少なくとも一方が上記の変異を有することを特徴とする。
【００１５】
本発明のプラスミドは、上記の遺伝子のいずれかを有することを特徴とする。
【００１６】
本発明の形質転換体は、上記のプラスミドを用いて宿主細胞を形質転換することに得られたものであることを特徴とする。
【００１７】
本発明のニトリルヒドラターゼの製造は、上記の形質転換体、該形質転換体の培養液、または該形質転換体や該培養液の処理物からニトリルヒドラターゼを回収する工程を有することを特徴とする。
【００１８】
本発明のアミド化合物の製造方法は、水性媒体中でニトリル化合物を上記のニトリルヒドラターゼとを接触させて該ニトリル化合物を対応するアミド化合に変換する工程を有することを特徴とする。
【００１９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について更に詳細に説明する。
【００２０】
本発明のニトリルヒドラターゼは、シュードノカルディア・サーモフィラ由来のニトリルヒドラターゼに変異を導入して得られたものである。具体的には、配列表の配列番号：１及び２に示すアミノ酸配列の所定の部位の少なくとも１つ以上におけるアミノ酸を他のアミノ酸で置換したものにより基本的に構成される。
すなわち、本発明は、配列表の配列番号：１に示される２０５個のアミノ酸の配列により表されるαサブユニットの内の少なくとも１個以上を他のアミノ酸で置換したものを構成要素とするニトリルヒドラターゼ、配列表の配列番号：２に示される２３３個のアミノ酸の配列により表されるβサブユニットの構成アミノ酸計４３８個の内の少なくとも１個以上を他のアミノ酸で置換したものを構成要素とするニトリルヒドラターゼ及びその両方を構成要素とするニトリルヒドラターゼを含んでいる。
【００２１】
本発明のニトリルヒドラターゼに用いられる具体的なアミノ酸配列には、以下のものが含まれる。
（ａ−０）  配列番号：１のαサブユニットのアミノ酸配列
（ａ−１）  配列番号：１に示されるαサブユニットのアミノ酸配列の３６番目、７１番目、１４８番目、及び２０４番目のアミノ酸の何れか一つ以上のアミノ酸を他のアミノ酸に置換した変異を有するアミノ酸配列
（ａ−２）  配列表の配列番号：１に示されるαサブユニットのアミノ酸配列の６番目、１９番目、３８番目、７７番目、９０番目、１０２番目、１０６番目、１２６番目、１３０番目、１４２番目、１４６番目、１８７番目、１９４番目、及び２０３番目のアミノ酸の何れか一つ以上のアミノ酸を他のアミノ酸に置換した変異を有するアミノ酸配列
（ｂ−０）  配列表の配列番号：２に示されるβサブユニットのアミノ酸配列
（ｂ−１）  配列表の配列番号：２に示すβサブユニットのアミノ酸配列の１０番目、３２番目、３７番目、４１番目、４６番目、４８番目、５１番目、７２番目、１１８番目、１２７番目、１４６番目、１６０番目、１８６番目及び２１７番目のアミノ酸の何れか一つ以上のアミノ酸を他のアミノ酸に置換した変異を有するアミノ酸配列
（ｂ−２）  配列表の配列番号：２に示すβサブユニットのアミノ酸配列の２０番目、２１番目、１０８番目、２００番目、及び２１２番目のアミノ酸の何れか一つ以上のアミノ酸を他のアミノ酸に置換した変異を有するアミノ酸配列
上記の各変異は、変異前のニトリルヒドラターゼ活性を少なくとも維持し得るものである。
【００２２】
本発明のニトリルヒドラターゼは、上記の（ａ−０）〜（ｂ−２）から選択されたアミノ酸配列を有する以下の構成要素からなる。
（Ａ−１）  αサブユニットが上記の（ａ−１）の変異を含むアミノ酸配列を有するニトリルヒドラターゼ
（Ａ−２）  αサブユニットが上記の（ａ−１）及び（ａ−２）の変異を含むアミノ酸配列を有するニトリルヒドラターゼ
（Ｂ−１）  βサブユニットが上記の（ｂ−１）の変異を含むアミノ酸配列を有するニトリルヒドラターゼ
（Ｂ−２）  βサブユニットが上記の（ｂ−１）及び（ｂ−２）の変異を含むアミノ酸配列を有するニトリルヒドラターゼ
（Ａ−３）  αサブユニットが上記の（ａ−１）の変異を含むアミノ酸配列を有し、βサブユニットが上記の（ｂ−０）のアミノ酸配列を有するニトリルヒドラターゼ
（Ａ−４）  αサブユニットが上記の（ａ−１）の変異を含むアミノ酸配列を有し、βサブユニットが上記の（ｂ−１）の変異を含むアミノ酸配列を有するニトリルヒドラターゼ
（Ａ−５）  αサブユニットが上記の（ａ−１）の変異を含むアミノ酸配列を有し、βサブユニットが上記の（ｂ−２）の変異を含むアミノ酸配列を有するニトリルヒドラターゼ
（Ａ−６）  αサブユニットが上記の（ａ−１）の変異を含むアミノ酸配列を有し、βサブユニットが上記の（ｂ−１）及び（ｂ−２）の変異を含むアミノ酸配列を有するニトリルヒドラターゼ
（Ａ−７）  αサブユニットが上記の（ａ−１）及び（ａ−２）の変異を含むアミノ酸配列を有し、βサブユニットが上記の（ｂ−０）のアミノ酸配列を有するニトリルヒドラターゼ
（Ａ−８）  αサブユニットが上記の（ａ−１）及び（ａ−２）の変異を含むアミノ酸配列を有し、βサブユニットが上記の（ｂ−１）の変異を含むアミノ酸配列を有するニトリルヒドラターゼ
（Ａ−９）  αサブユニットが上記の（ａ−１）及び（ａ−２）の変異を含むアミノ酸配列を有し、βサブユニットが上記の（ｂ−２）の変異を含むアミノ酸配列を有するニトリルヒドラターゼ
（Ａ−１０）  αサブユニットが上記の（ａ−１）及び（ａ−２）の変異を含むアミノ酸配列を有し、βサブユニットが上記の（ｂ−１）及び（ｂ−２）の変異を含むアミノ酸配列を有するニトリルヒドラターゼ
（Ｂ−３）  αサブユニットが上記の（ａ−０）のアミノ酸配列を有し、βサブユニットが上記の（ｂ−１）のアミノ酸配列を有するニトリルヒドラターゼ
（Ｂ−４）  αサブユニットが上記の（ａ−０）のアミノ酸配列を有し、βサブユニットが上記の（ｂ−１）及び（ｂ−２）の変異を含むアミノ酸配列を有するニトリルヒドラターゼ
（Ｂ−５）  αサブユニットが上記の（ａ−２）の変異を含むアミノ酸配列を有し、βサブユニットが上記の（ｂ−１）及び（ｂ−２）の変異を含むアミノ酸配列を有するニトリルヒドラターゼ
なお、上記の特定された変異部位以外のアミノ酸については、上記の特定部位の変異による目的とするニトリルヒドラターゼ活性を損なわない範囲内で、アミノ酸の置換、挿入、欠失が生じてもよい。
【００２３】
本発明においてニトリルヒドラターゼ遺伝子には、ニトリルヒドラターゼのαサブユニットをコードする遺伝子及びニトリルヒドラターゼのβサブユニットをコードする遺伝子が含まれる。
【００２４】
本発明にかかる遺伝子は、シュードノカルディア・サーモフィラ由来のニトリルヒドラターゼ遺伝子に変異導入を施したものであり、これには、αサブユニットのアミノ酸配列をコードする遺伝子；βサブユニットをコードする遺伝子；及びαサブユニットをコードする遺伝子とβサブユニットをコードする遺伝子の両方を有するニトリルヒドラターゼ遺伝子が含まれる。
【００２５】
具体的には、以下のものを挙げることができる。
（Ｇ−１）  先に挙げた（ａ−１）の変異を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子；
（Ｇ−２）  先に挙げた（ａ−１）及び（ａ−２）の変異を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子；
（Ｇ−３）  先に挙げた（ｂ−１）の変異を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子；
（Ｇ−４）  先に挙げた（ｂ−１）及び（ｂ−２）の変異を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子；及び
（Ｇ−３）  先に挙げた（Ａ−１）〜（Ｂ−４）のいずれかのニトリルヒドラターゼをコードする塩基配列を有する遺伝子。
【００２６】
上記の変異の基礎となる配列番号：１のαサブユニットのアミノ酸配列をコードする塩基配列としては、配列番号：３の塩基配列が好ましい。また、上記変異の基礎となる配列番号：２のβサブユニットのアミノ酸配列をコードする塩基配列としては、配列番号：４の塩基配列が好ましい。
【００２７】
例えば、配列番号：３を基礎とした場合の上記（ａ−１）の変異は、配列番号：３の塩基配列の１０６番目から１０８番目、２１１番目から２１３番目、４４２番目から４４４番目、及び６１０番目から６１２番目の何れか一つ以上の塩基配列を他の塩基配列に置換して得ることができる。
【００２８】
また、配列番号：３を基礎とした場合の上記（ａ−２）の変異は、配列番号：３の塩基配列の１６番目から１８番目、５５番目から５７番目、１１２番目から１１４番目、２２９番目から２３１番目、２６８番目から２７０番目、３０４番目から３０６番目、３１６番目から３１８番目、３７６番目から３７８番目、３８８番目から３９０番目、４２４番目から４２６番目、４３６番目から４３８番目、５５９番目から５６１番目、５８０番目から５８２番目、及び６０７番目から６０９番目の何れか一つ以上の塩基配列を他の塩基配列に置換した塩基配列の一部を置換して得ることができる。
【００２９】
一方、配列番号：４を基礎とした場合の上記（ｂ−１）の変異は、配列番号：４の塩基配列の２８番目から３０番目、９４番目から９６番目、１０９番目から１１１番目、１２１番目から１２３番目、１３６番目から１３８番目、１４２番目から１４４番目、１５１番目から１５３番目、２１４番目から２１６番目、３５２番目から３５４番目、３７９番目から３８１番目、４３６番目から４３８番目、４７８番目から４８０番目、５５６番目から５５８番目、及び６４９番目から６５１番目の何れか一つ以上の塩基配列を他の塩基配列に置換して得ることができる。
【００３０】
また、配列番号：４を基礎とした場合の上記（ｂ−２）の変異は、配列番号：４の塩基配列の５８番目から６０番目、６１番目から６３番目、３２２番目から３２４番目、５９８番目から６００番目、及び６３４番目から６３６番目の何れか一つ以上の塩基配列を他の塩基配列に置換した塩基配列の一部を置換して得ることができる。
【００３１】
これらの置換は、各遺伝子がコードするα及びβサブユニットの少なくとも一方が組み込まれたニトリルヒドラターゼの活性が置換前の状態を維持、またはそれよりも向上するような範囲内で行われる。なお、変異導入手段に関しては特に限定されない。
【００３２】
本発明のニトリルヒドラターゼ遺伝子における上記の（ａ−１）、（ａ−２）、（ｂ−１）及び（ｂ−２）の変異部位以外の部位については、それがニトリルヒドラターゼ活性を有するタンパク質の鋳型として機能できる範囲内で、塩基の置換、挿入または削除による更なる変異を有するものでもよい。
【００３３】
このような更なる変異については以下のような例をあげることができる。ある一定の塩基配列を有する遺伝子を鋳型として転写・翻訳された場合であっても、それを導入する宿主細胞の種類や培養に使用する栄養培地の成分や組成若しくは培養時の温度やｐＨ等によっては、遺伝子発現後の宿主細胞内酵素による修飾などにより、所期の酵素作用は保持しているものの配列表におけるＮ末端付近のアミノ酸の１個又は２個以上が欠失したり、Ｎ末端に１個又は２個以上のアミノ酸が新たに付加した異型体を産生する事があり得る。その為、そのような異型なニトリルヒドラターゼも本発明に含まれるものとする。
【００３４】
一方、本発明のニトリルヒドラターゼ生産用のプラスミドは上記のニトリルヒドラターゼ遺伝子を用いて調製することができる。具体例としては以下のものを挙げるこのができる。
（Ｐ−１）  先に挙げた（ａ−１）の変異を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するプラスミド；
（Ｐ−２）  先に挙げた（ａ−１）及び（ａ−２）の変異を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するプラスミド；
（Ｐ−３）  先に挙げた（ｂ−１）の変異を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するプラスミド；
（Ｐ−４）  先に挙げた（ｂ−１）及び（ｂ−２）の変異を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するプラスミド；及び
（Ｐ−３）  先に挙げた（Ａ−１）〜（Ｂ−４）のいずれかのニトリルヒドラターゼをコードする塩基配列を有するプラスミド。
【００３５】
また、本発明にかかる形質転換体または細胞株は、このプラスミドを用いて任意の宿主細胞を形質転換して得られたものである。本発明のニトリルヒドラターゼの生産方法は、上記の形質転換体や細胞株を培養してニトリルヒドラターゼを産生させる工程を有する。また、本発明のアミド化合物の製造方法は、このようなニトリルヒドラターゼを産生する形質転換体や細胞株を培養して得られる培養液、細胞または細胞処理物を媒体中にてニトリル化合物と接触させて対応するアミド化合物を製造させる工程を有する。
【００３６】
本発明におけるプラスミドは、ニトリルヒドラターゼのαサブユニットをコードする遺伝子、βサブユニットをコードする遺伝子またはニトリルヒドラターゼ遺伝子に加え、各遺伝子の発現に必要な制御領域及び自律複製に必要な領域などの、任意の宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体や細胞株によるニトリルヒドラターゼの産生を可能せしめる構成を有することができる。ここでいう任意の宿主細胞とは、後述の実施例の様にその一例として大腸菌が挙げられるが、これに限定されるのものではなく、枯草菌等のバチルス属菌、酵母や放線菌等の他の微生物も用いる事ができる。
【００３７】
発現に必要な制御領域としては、プロモーター配列（転写を制御するオペレーター配列を含む。）、リボゾーム結合配列（ＳＤ配列）、転写終結配列等を挙げることができる。具体的なプロモーター配列の例としては、大腸菌由来のトリプトファンオペロンのｔｒｐプロモーター、ラクトースオペロンのｌａｃプロモーター、ラムダファージ由来のＰＬプロモーター及びＰＲプロモーターや、枯草菌由来のグルコン酸合成酵素プロモーター（ｇｎｔ）、アルカリプロテアーゼプロモーター（ａｐｒ）、中性プロテアーゼプロモーター（ｎｐｒ）、α−アミラーゼプロモーター（ａｍｙ）等が挙げられる。また、ｔａｃプロモーターやｔｒｃプロモーターのように人為的に設計・改変された配列も利用できる。
【００３８】
リボゾーム結合配列としては、大腸菌由来や枯草菌由来又はシュードノカルディア本来の配列が挙げられるが、大腸菌や枯草菌等の所望の宿主細胞内で機能する配列であれば特に限定されるものではない。たとえば、１６ＳリボゾームＲＮＡの３’末端領域に相補的な配列が４塩基以上連続したコンセンサス配列をＤＮＡ合成により作成してこれを利用してもよい。転写終結配列は必ずしも必要ではないが、ρ因子非依存性のもの、例えばリポプロテインターミネーター・ｔｒｐオペロンターミネーター等が利用できる。これら制御領域のプラスミド上での配列順序は、プロモーター配列とリボゾーム結合配列はニトリルヒドラターゼをコードする遺伝子より５’末端側上流に位置する事が望ましく、転写終結配列はニトリルヒドラターゼをコードする遺伝子より３'末端側下流に位置する事が望ましい。また、その様な制御領域によりαサブユニット遺伝子及びβサブユニット遺伝子が各々独立のシストロンとして発現されてもよいし、共通の制御領域によりポリシストロンとして発現されてもよい。
【００３９】
以上の要件を満たしているプラスミドベクターの例としては、大腸菌中での自律複製可能な領域を有しているｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＳＣ１０１や、枯草菌中での自律複製可能な領域を有しているｐＵＢ１１０、ｐＴＺ４、ｐＣ１９４、ρ１１、φ１、φ１０５等を挙げる事ができる。また、２種類以上の宿主細胞内での自律複製が可能なプラスミドベクターの例として、ｐＨＶ１４、ＴＲｐ７、ＹＥｐ７及びｐＢＳ７を挙げる事ができる。
【００４０】
このようなプラスミドベクターに本発明のニトリルヒドラターゼをコードする遺伝子を該ニトリルヒドラターゼの活性発現に必要な領域と共に挿入して本発明のプラスミドを構築する方法、該プラスミドを所望の宿主細胞に形質転換する方法及び該形質転換体内でニトリルヒドラターゼを産生させる方法には、例えば「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ」（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２００１）等に記載されている分子生物学・生物工学・遺伝子工学の分野において公知の一般的な方法と宿主細胞が利用できる。
【００４１】
なお、宿主細胞が微生物の場合、該形質転換体を培養する培地としてＬＢ培地やＭ９培地などが一般的に用いられるが、より好ましくはそのような培地成分にＦｅイオン及びＣｏイオンを０．１μｇ／ｍＬ以上存在させるとよく、該形質転換体を植菌した後、適当な培養温度（一般的には、２０℃〜５０℃）で生育させればよい。
【００４２】
本発明のニトリルヒドラターゼをコードする遺伝子を発現させて所望の酵素活性を有するニトリルヒドラターゼを生産する場合、該ニトリルヒドラターゼの活性化に関与するタンパク質をコードする遺伝子が必要となる。
【００４３】
このニトリルヒドラターゼの活性化に関与するタンパク質とは、該タンパク質の発現の有無が、ニトリルヒドラターゼの活性化を直接左右する性質を有しているタンパク質の事であり、特開平１１−２５３１６８号公報に記載されるシュードノカルディア・サーモフィラ由来のニトリルヒドラターゼ活性化に関与するタンパク質（ニトリルヒドラターゼ活性化タンパク質）をその代表例として挙げる事が出来る。具体的には、ニトリルヒドラターゼ活性化タンパク質としては、配列番号：５のアミノ酸配列に示される１４４個のアミノ酸の配列により構成されるものをその代表例として挙げる事が出来る。また、配列番号：５のアミノ酸配列の一部でのアミノ酸の置換、欠失、削除または挿入により得られた異型タンパク質も、ニトリルヒドラターゼの活性化に関与するものであれば、ニトリルヒドラターゼ活性化タンパク質に含まれるものとする。この異型タンパク質としては、配列番号５のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換または付加による変異を有し、ニトリルヒドラターゼの活性化に関与する性質を維持しているものを挙げることができる。
【００４４】
ニトリルヒドラターゼ活性化タンパク質をコードする遺伝子としては、ニトリルヒドラターゼ活性化タンパク質をコードする遺伝子であれば特に限定されるものではない。この遺伝子としては、上記の配列番号：５のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子及び上記の異型タンパク質をコードする遺伝子を挙げることができる。更に、このニトリルヒドラターゼ活性化タンパク質をコードする遺伝子の好ましい例としては、配列番号：６の塩基配列を有する遺伝子を挙げる事が出来る。更に、ニトリルヒドラターゼ活性化タンパク質をコードする遺伝子には、配列番号：６に記載の塩基配列配列の１個または２個以上について塩基の置換、欠失、削除又は挿入が行われた配列であっても、それがニトリルヒドラターゼの活性化に関与するタンパク質の鋳型として機能する場合には、ニトリルヒドラターゼ活性化タンパク質をコードする遺伝子の範囲に含まれるものとする。
【００４５】
ニトリルヒドラターゼ活性化タンパク質をコードする遺伝子は、遺伝子組換え技術を用いたニトリルヒドラターゼの生産に利用するプラスミド中に、αサブユニットをコードする遺伝子及びβサブユニットをコードする遺伝子とともに組み込まれることが好ましい。その場合におけるこれらのプラスミド上における順序は特に限定されず、また、３つの遺伝子が同一の制御領域により制御されてもよく、２つの遺伝子が同一の制御領域により制御され、残る１つの遺伝子が他の２つとは異なる制御領域により制御されてもよく、３つの遺伝子が各々異なる制御領域により制御されてもよい。
【００４６】
本発明のニトリルヒドラターゼ又はニトリルヒドラターゼ活性を有する形質転換体を利用して、ニトリル化合物から対応するアミド化合物を製造するには、所望のニトリル化合物を、ニトリルヒドラターゼ酵素精製物や粗酵素調製物、該形質転換体の培養液、培養液から得られる形質転換体又は形質転換体の処理物と水性媒体中で接触させればよい。ここでいう処理物とは、該形質転換体からの抽出物や磨砕物、これらの抽出物や磨砕物のニトリルヒドラターゼ活性画分を分離して得られる粗酵素調製物や更に精製して得られる酵素精製物などの後分離物、該形質転換体や該形質転換体の抽出物、磨砕物または後分離物を適当な手段を用いて固定化した固定化物の事を示している。接触させる温度は特に限定されないが、好ましくは該ニトリルヒドラターゼが失活しない温度範囲内であり、より好ましくは０℃〜６０℃である。ニトリル化合物としては、本発明のニトリルヒドラターゼが基質として作用できる化合物であれば特に限定されないが、好ましくはアセトニトリル、プロピオニトリル、アクリロニトリル、メタクリロニトリル、ｎ−ブチロニトリル、イソブチロニトリル、クロトノニトリル、α−ヒドロキシイソブチロニトリル等といった炭素数２〜４のニトリル化合物がその代表例として挙げられる。該ニトリル化合物の水性媒体中での濃度は、特に限定されるものではなく、また、反応温度も特に限定されないが、好ましくは該ニトリルヒドラターゼが失活しない温度範囲内であり、より好ましくは０℃〜５０℃である。
【００４７】
【実施例】
以下の実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例によって何等限定されるものではない。
【００４８】
［参考例１］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（１）
αサブユニットの６番目のＬｅｕをＭｅｔに置換するために、宝酒造社製の「ＬＡ ＰＣＲ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ」を用いた部位特異的な変異導入を行った。以後、「ＬＡ ＰＣＲ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ」を単にキットと呼ぶ。以下の参考例では、基本的にキットの原理及び操作方法を踏襲した。
【００４９】
３０ｍＬの試験管に１０ｍＬのＬＢ液体培地を調製し、１２１℃・２０分間のオートクレーブにより滅菌した。この培地に終濃度が１００μｇ／ｍＬとなるようにアンピシリンを添加した後、ＭＴ−１０８２２を一白金耳植菌し、３７℃・３００ｒｐｍにて約２０時間培養した。該培養液１ｍＬを適当な遠心チューブに分取した後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ×５分）により該菌体を分離した。続いてアルカリＳＤＳ抽出法により該菌体よりプラスミドｐＰＴ−ＤＢ１を調製した。
【００５０】
各々１０ｎｇのｐＰＴ−ＤＢ１を鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号：７記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号：８に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返す事により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号：９に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号：１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１及びＮｏ．２の反応終了液各５μＬを用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。Ｍｉｃｒｏｃｏｎ１００（宝酒造社製）を用いてそれぞれのＰＣＲ反応終了液より過剰なプライマー及びｄＮＴＰを除去した後、ＴＥを加えて各々５０μＬの溶液を調製した。該ＴＥ溶液を各０．５μＬずつ含む全量４７．５μＬのアニーリング溶液（組成はキットに記載の条件による）を調製し、熱変性処理（９８℃）を１０分間行った後、３７℃まで６０分間かけて一定の速度で冷却を行い、続いて３７℃で１５分間保持することによってアニーリング処理を行った。アニーリング処理液にＴａＫａＲａ ＬＡ Ｔａｑを０．５μＬ加えて７２℃で３分間加熱処理を行い、ヘテロ２本鎖を完成させた。これにＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号：８に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号：１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ加えて全量を５０μＬとした後、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことによるＰＣＲ反応Ｎｏ．３を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．３の反応終了液５μＬを用いたアガロース電気泳動（シグマ社製タイプＶＩＩ低融点アガロース使用；アガロース濃度０．８重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、約２ｋｂの増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。続いて、アガロースゲルから約２ＫｂのＤＮＡ断片のみを切り出し、該アガロース片（約０．１ｇ）を細かく粉砕し１ｍＬのＴＥ溶液に懸濁後、５５℃で１時間保温してアガロースを完全に融解させた。この融解液に対してフェノール／クロロホルム抽出とエタノール沈澱を行って該ＤＮＡ断片を精製し、最終的に１０μＬのＴＥに溶解した。精製した約２ｋｂの増幅ＤＮＡ断片を制限酵素ＥｃｏＲI及びＨｉｎｄIIIにより切断した後、この制限酵素処理液に対してフェノール／クロロホルム抽出とエタノール沈澱を行って該ＤＮＡ断片を精製し、最終的に１０μＬのＴＥに溶解した。同様に、ＥｃｏＲI及びＨｉｎｄIIIによりｐＰＴ−ＤＢ１を切断し、アガロースゲル電気泳動（シグマ社製タイプＶＩＩ低融点アガロース使用；アガロース濃度０．７％）を行い、アガロースゲルから約２．７ＫｂのＤＮＡ断片のみを切り出した。切りだしたアガロース片（約０．１ｇ）を細かく粉砕し１ｍＬのＴＥ溶液に懸濁後、５５℃で���時間保温してアガロースを完全に融解させた。この融解液に対してフェノール／クロロホルム抽出とエタノール沈澱を行って該ＤＮＡ断片を精製し、最終的に１０μＬのＴＥに溶解した。この様にして得られた約２ｋｂと約２．７ＫｂのＤＮＡ断片をＤＮＡライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて連結させた後、大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体Ｎｏ．１を得た。
【００５１】
得られた形質転換体を用いたアミド化合物の製造における転化率及び選択率を以下の方法により求めた。
【００５２】
５００ｍＬのバッフル付三角フラスコに４０μｇ／ｍＬの硫酸第二鉄・七水和物及び１０μｇ／ｍＬの塩化コバルト・二水和物を含む１００ｍＬのＬＢ液体培地を調製し、１２１℃・２０分間のオートクレーブにより滅菌した。この培地に終濃度が１００μｇ／ｍＬとなるようにアンピシリンを添加した後、形質転換体Ｎｏ．１を一白金耳植菌し、３７℃・1３０ｒｐｍにて約２０時間培養した。該培養終了液から遠心分離（５０００Ｇ×１５分）により菌体を分離した。続いて、分離した該菌体を５０ｍＬの生理食塩水に再懸濁した後に、再度遠心分離（５０００Ｇ×１５分）により菌体を分離した。該菌体０．１ｇを２０ｍＬの５０ｍＭリン酸カリウム水溶液（ｐＨ７．０）に懸濁し、これに１ｍＬのアクリロニトリル又はメタアクリロニトリルを添加して１０℃で緩やかに攪拌しながら１時間反応させた。反応終了後、ＨＰＬＣを用いて反応液の分析を行った結果、反応液中には添加したニトリル化合物（アクリロニトリル又はメタアクリロニトリル）に相当するモル量のアミド化合物（アクリルアミド又はメタアクリルアミド）のみが存在しており、ニトリル化合物（アクリロニトリル又はメタアクリロニトリル）及び対応する有機酸（アクリル酸又はメタアクリル酸）の存在は認められなかった。すなわち、転化率及び選択率は１００％であった。
【００５３】
また、上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製した。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によってニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定した。その結果、表１に示したクローンにおいてニトリルヒドラターゼのαサブユニットの６番目のＬｅｕがＭｅｔに置換されていた。
【００５４】
【表１】
2004194588.tif 000003
［参考例２］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（２）
αサブユニットの６番目のＬｅｕをＴｈｒに置換するために、ｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型として、参考例１と同様の操作により部位特異的な変異導入を行った。
参考例１で調製したｐＰＴ−ＤＢ１のプラスミドＤＮＡ１０ｎｇを各々鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号：１１記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号：８に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号：９に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号：１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１及びＮｏ．２の反応終了液各５μＬを用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。
以後、ＰＣＲ反応Ｎｏ．２を含む参考例１における操作と全く同じ操作により、形質転換体Ｎｏ．２を得た。
【００５５】
次に、参考例１と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、１００％であった。
【００５６】
また、上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製した。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によってニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定した。その結果、表２に示したクローンにおいてニトリルヒドラターゼのαサブユニットの６番目のＬｅｕがＴｈｒに置換されていた。
【００５７】
【表２】
2004194588.tif 000004
［参考例３］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（３）αサブユニットの６番目のＬｅｕをＡｌａに置換するために、ｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型として、参考例１と同様の操作により部位特異的な変異導入を行った。
【００５８】
参考例１で調製したｐＰＴ−ＤＢ１のプラスミドＤＮＡ１０ｎｇを各々鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号：１２記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号：８に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号：９に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号：１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１及びＮｏ．２の反応終了液各５μＬを用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。以後、参考例１と全く同じ操作により、形質転換体Ｎｏ．３を得た。
【００５９】
次に、参考例１と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、転化率及び選択率は１００％であった。
【００６０】
また、上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製した。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によってニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定した。その結果、表３に示したクローンにおいてニトリルヒドラターゼのαサブユニットの６番目のＬｅｕがＡｌａに置換されていた。
【００６１】
【表３】
2004194588.tif 000005
［参考例４］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（４）αサブユニットの６番目のＬｅｕをＶａｌに置換するために、ｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型として、参考例１と同様の操作により部位特異的な変異導入を行った。
【００６２】
参考例１で調製したｐＰＴ−ＤＢ１のプラスミドＤＮＡ１０ｎｇを各々鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号：１３記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号：８に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号：９に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号：１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１及びＮｏ．２の反応終了液各５μＬを用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。以後、参考例１と全く同じ操作により、形質転換体Ｎｏ．４を得た。
【００６３】
次に、参考例１と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、転化率及び選択率は１００％であった。
【００６４】
また、上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製した。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によってニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定した。その結果、表４に示したクローンにおいてニトリルヒドラターゼのαサブユニットの６番目のＬｅｕがＶａｌに置換されていた。
【００６５】
【表４】
2004194588.tif 000006
［参考例５］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（５）αサブユニットの１９番目のＡｌａをＶａｌに置換するために、ｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型として、参考例１と同様の操作により部位特異的な変異導入を行った。
【００６６】
参考例１で調製したｐＰＴ−ＤＢ１のプラスミドＤＮＡ１０ｎｇを各々鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号：１４記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号：８に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号：９に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号：１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１及びＮｏ．２の反応終了液各５μＬを用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。以後、参考例１と全く同じ操作により、形質転換体Ｎｏ．５を得た。
【００６７】
次に、参考例１と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、転化率及び選択率は１００％であった。
【００６８】
また、上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製した。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によってニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定した。その結果、表５に示したクローンにおいてニトリルヒドラターゼのαサブユニットの１９番目のＡｌａがＶａｌに置換されていた。
【００６９】
【表５】
2004194588.tif 000007
［参考例６］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（６）αサブユニットの３８番目のＭｅｔをＬｅｕに置換するために、ｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型として、参考例１と同様の操作により部位特異的な変異導入を行った。
【００７０】
参考例１で調製したｐＰＴ−ＤＢ１のプラスミドＤＮＡ１０ｎｇを各々鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号：１５記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号：８に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号：９に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号：１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１及びＮｏ．２の反応終了液各５μＬを用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。以後、参考例１と全く同じ操作により、形質転換体Ｎｏ．６を得た。
【００７１】
次に、参考例１と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、転化率及び選択率は１００％であった。
【００７２】
また、上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製した。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によってニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定した。その結果、表６に示したクローンにおいてニトリルヒドラターゼのαサブユニットの３８番目のＭｅｔがＬｅｕに置換されていた。
【００７３】
【表６】
2004194588.tif 000008
［参考例７］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（７）αサブユニットの７７番目のＴｈｒをＳｅｒに置換するために、ｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型として、参考例１と同様の操作により部位特異的な変異導入を行った。
【００７４】
参考例１で調製したｐＰＴ−ＤＢ１のプラスミドＤＮＡ１０ｎｇを各々鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号：１６記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号：８に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号：９に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号：１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１及びＮｏ．２の反応終了液各５μＬを用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。以後、参考例１と全く同じ操作により、形質転換体Ｎｏ．７を得た。
【００７５】
次に、参考例１と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、転化率及び選択率は１００％であった。
【００７６】
また、上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製した。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によってニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定した。その結果、表７に示したクローンにおいてニトリルヒドラターゼのαサブユニットの７７番目のＴｈｒがＳｅｒに置換されていた。
【００７７】
【表７】
2004194588.tif 000009
［参考例８］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（８）αサブユニットの９０番目のＧｌｙをＡｌａに置換するために、ｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型として、参考例１と同様の操作により部位特異的な変異導入を行った。
【００７８】
参考例１で調製したｐＰＴ−ＤＢ１のプラスミドＤＮＡ１０ｎｇを各々鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号：１７記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号：８に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号：９に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号：１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１及びＮｏ．２の反応終了液各５μＬを用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。以後、参考例１と全く同じ操作により、形質転換体Ｎｏ．８を得た。
【００７９】
次に、参考例１と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、転化率及び選択率は１００％であった。
【００８０】
また、上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製した。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によってニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定した。その結果、表８に示したクローンにおいてニトリルヒドラターゼのαサブユニットの９０番目のＧｌｙがＡｌａに置換されていた。
【００８１】
【表８】
2004194588.tif 000010
［参考例９］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（９）αサブユニットの１０２番目のＶａｌをＡｌａに置換するために、ｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型として、参考例１と同様の操作により部位特異的な変異導入を行った。
【００８２】
参考例１で調製したｐＰＴ−ＤＢ１のプラスミドＤＮＡ１０ｎｇを各々鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号：１８記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号：８に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号：９に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号：１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１及びＮｏ．２の反応終了液各５μＬを用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。以後、参考例１と全く同じ操作により、形質転換体Ｎｏ．９を得た。
【００８３】
次に、参考例１と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、転化率及び選択率は１００％であった。
【００８４】
また、上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製した。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によってニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定した。その結果、表９に示したクローンにおいてニトリルヒドラターゼのαサブユニットの１０２番目のＶａｌがＡｌａに置換されていた。
【００８５】
【表９】
2004194588.tif 000011
［参考例１０］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（１０）
αサブユニットの１０６番目のＶａｌをＩｌｅに置換するために、ｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型として、参考例１と同様の操作により部位特異的な変異導入を行った。
【００８６】
参考例１で調製したｐＰＴ−ＤＢ１のプラスミドＤＮＡ１０ｎｇを各々鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号：１９記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号：８に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号：９に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号：１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１及びＮｏ．２の反応終了液各５μＬを用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。以後、参考例１と全く同じ操作により、形質転換体Ｎｏ．１０を得た。
【００８７】
次に、参考例１と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、転化率及び選択率は１００％であった。
【００８８】
また、上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製した。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によってニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定した。その結果、表１０に示したクローンにおいてニトリルヒドラターゼのαサブユニットの１０６番目のＶａｌがＩｌｅに置換されていた。
【００８９】
【表１０】
2004194588.tif 000012
［参考例１１］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（１１）
αサブユニットの１２６番目のＰｈｅをＴｙｒに置換するために、ｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型として、参考例１と同様の操作により部位特異的な変異導入を行った。
【００９０】
参考例１で調製したｐＰＴ−ＤＢ１のプラスミドＤＮＡ１０ｎｇを各々鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号：２０記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号：８に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号：９に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号：１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１及びＮｏ．２の反応終了液各５μＬを用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。以後、参考例１と全く同じ操作により、形質転換体Ｎｏ．１１を得た。
【００９１】
次に、参考例１と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、転化率及び選択率は１００％であった。
【００９２】
また、上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製した。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によってニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定した。その結果、表１１に示したクローンにおいてニトリルヒドラターゼのαサブユニットの１２６番目のＰｈｅがＴｙｒに置換されていた。
【００９３】
【表１１】
2004194588.tif 000013
［参考例１２］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（１２）
αサブユニットの１３０番目のＧｌｎをＧｌｕに置換するために、ｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型として、参考例１と同様の操作により部位特異的な変異導入を行った。
【００９４】
参考例１で調製したｐＰＴ−ＤＢ１のプラスミドＤＮＡ１０ｎｇを各々鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号：２１記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号：８に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号：９に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号：１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１及びＮｏ．２の反応終了液各５μＬを用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。以後、参考例１と全く同じ操作により、形質転換体Ｎｏ．１２を得た。
【００９５】
次に、参考例１と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、転化率及び選択率は１００％であった。
【００９６】
また、上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製した。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によってニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定した。その結果、表１２に示したクローンにおいてニトリルヒドラターゼのαサブユニットの１３０番目のＧｌｎがＧｌｕに置換されていた。
【００９７】
【表１２】
2004194588.tif 000014
［参考例１３］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（１３）
αサブユニットの１４２番目のＬｅｕをＶａｌに置換するために、ｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型として、参考例１と同様の操作により部位特異的な変異導入を行った。
【００９８】
参考例１で調製したｐＰＴ−ＤＢ１のプラスミドＤＮＡ１０ｎｇを各々鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号：２２記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号：８に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号：９に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号：１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１及びＮｏ．２の反応終了液各５μＬを用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。以後、参考例１と全く同じ操作により、形質転換体Ｎｏ．１３を得た。
【００９９】
次に、参考例１と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、転化率及び選択率は１００％であった。
【０１００】
また、上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製した。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によってニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定した。その結果、表１３に示したクローンにおいてニトリルヒドラターゼのαサブユニットの１４２番目のＬｅｕがＶａｌに置換されていた。
【０１０１】
【表１３】
2004194588.tif 000015
［参考例１４］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（１４）
αサブユニットの１４６番目のＧｌｕをＡｓｐに置換するために、ｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型として、参考例１と同様の操作により部位特異的な変異導入を行った。
【０１０２】
参考例１で調製したｐＰＴ−ＤＢ１のプラスミドＤＮＡ１０ｎｇを各々鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号：２３記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号：８に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号：９に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号：１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１及びＮｏ．２の反応終了液各５μＬを用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。以後、参考例１と全く同じ操作により、形質転換体Ｎｏ．１４を得た。
【０１０３】
次に、参考例１と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、転化率及び選択率は１００％であった。
【０１０４】
また、上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製した。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によってニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定した。その結果、表１４に示したクローンにおいてニトリルヒドラターゼのαサブユニットの１４６番目のＧｌｕがＡｓｐに置換されていた。
【０１０５】
【表１４】
2004194588.tif 000016
［参考例１５］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（１５）
αサブユニットの１８７番目のＡｌａをＴｈｒに置換するために、ｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型として、参考例１と同様の操作により部位特異的な変異導入を行った。
【０１０６】
参考例１で調製したｐＰＴ−ＤＢ１のプラスミドＤＮＡ１０ｎｇを各々鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号：２４記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号：８に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号：９に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号：１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１及びＮｏ．２の反応終了液各５μＬを用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。以後、参考例１と全く同じ操作により、形質転換体Ｎｏ．１５を得た。
【０１０７】
次に、参考例１と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、転化率及び選択率は１００％であった。
【０１０８】
また、上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製した。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によってニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定した。その結果、表１５に示したクローンにおいてニトリルヒドラターゼのαサブユニットの１８７番目のＡｌａがＴｈｒに置換されていた。
【０１０９】
【表１５】
2004194588.tif 000017
［参考例１６］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（１６）
αサブユニットの１９４番目のＳｅｒをＬｅｕに置換するために、ｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型として、参考例１と同様の操作により部位特異的な変異導入を行った。
【０１１０】
参考例１で調製したｐＰＴ−ＤＢ１のプラスミドＤＮＡ１０ｎｇを各々鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号：２５記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号：８に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号：９に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号：１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１及びＮｏ．２の反応終了液各５μＬを用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。以後、参考例１と全く同じ操作により、形質転換体Ｎｏ．１６を得た。
【０１１１】
次に、参考例１と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、転化率及び選択率は１００％であった。
【０１１２】
また、上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製した。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によってニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定した。その結果、表１６に示したクローンにおいてニトリルヒドラターゼのαサブユニットの１９４番目のＳｅｒがＬｅｕに置換されていた。
【０１１３】
【表１６】
2004194588.tif 000018
［参考例１７］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（１７）
αサブユニットの２０３番目のＡｌａをＧｌｕに置換するために、ｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型として、参考例１と同様の操作により部位特異的な変異導入を行った。
【０１１４】
参考例１で調製したｐＰＴ−ＤＢ１のプラスミドＤＮＡ１０ｎｇを各々鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号：２６記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号：８に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号：９に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号：１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１及びＮｏ．２の反応終了液各５μＬを用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。以後、参考例１と全く同じ操作により、形質転換体Ｎｏ．１７を得た。
【０１１５】
次に、参考例１と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、転化率及び選択率は１００％であった。
【０１１６】
また、上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製した。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によってニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定した。その結果、表１７に示したクローンにおいてニトリルヒドラターゼのαサブユニットの２０３番目のＡｌａがＧｌｕに置換されていた。
【０１１７】
【表１７】
2004194588.tif 000019
［参考例１８］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（１８）
βサブユニットの２０番目のＡｌａをＶａｌに置換するために、ｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型として、参考例１と同様の操作により部位特異的な変異導入を行った。
参考例１で調製したｐＰＴ−ＤＢ１のプラスミドＤＮＡ１０ｎｇを各々鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号：２７記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号：８に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号：９に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号：１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１及びＮｏ．２の反応終了液各５μＬを用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。
以後、参考例１と全く同じ操作により、形質転換体Ｎｏ．１８を得た。
【０１１８】
次に、参考例１と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、転化率及び選択率は１００％であった。
【０１１９】
また、上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製した。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によってニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定した。その結果、表１８に示したクローンにおいてニトリルヒドラターゼのβサブユニットの２０番目のＡｌａがＶａｌに変換されていた。
【０１２０】
【表１８】
2004194588.tif 000020
［参考例１９］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（１９）
βサブユニットの２１番目のＡｓｐをＡｓｎに置換するために、ｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型として、参考例１と同様の操作により部位特異的な変異導入を行った。
【０１２１】
参考例１で調製したｐＰＴ−ＤＢ１のプラスミドＤＮＡ１０ｎｇを各々鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号：２８記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号：８に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号：９に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号：１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１及びＮｏ．２の反応終了液各５μＬを用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。以後、参考例１と全く同じ操作により、形質転換体Ｎｏ．１９を得た。
【０１２２】
次に、参考例１と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、転化率及び選択率は１００％であった。
【０１２３】
また、上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製した。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によってニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定した。その結果、表１９に示したクローンにおいてニトリルヒドラターゼのβサブユニットの２１番目のＡｓｐがＡｓｎに置換されていた。
【０１２４】
【表１９】
2004194588.tif 000021
［参考例２０］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（２０）
βサブユニットの１０８番目のＧｌｕをＡｓｐに置換するために、ｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型として、参考例１と同様の操作により部位特異的な変異導入を行った。
【０１２５】
参考例１で調製したｐＰＴ−ＤＢ１のプラスミドＤＮＡ１０ｎｇを各々鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号：２９記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号：８に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号：９に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号：１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１及びＮｏ．２の反応終了液各５μＬを用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。以後、参考例１と全く同じ操作により、形質転換体Ｎｏ．２０を得た。
【０１２６】
次に、参考例１と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、転化率及び選択率は１００％であった。
【０１２７】
また、上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製した。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によってニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定した。その結果、表２０に示したクローンにおいてニトリルヒドラターゼのβサブユニットの１０８番目のＧｌｕがＡｓｐに置換されていた。
【０１２８】
【表２０】
2004194588.tif 000022
［参考例２１］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（２１）
βサブユニットの１０８番目のＧｌｕをＰｒｏに置換するために、ｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型として、参考例１と同様の操作により部位特異的な変異導入を行った。
【０１２９】
参考例１で調製したｐＰＴ−ＤＢ１のプラスミドＤＮＡ１０ｎｇを各々鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号：３０記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号：８に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号：９に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号：１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１及びＮｏ．２の反応終了液各５μＬを用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。以後、参考例１と全く同じ操作により、形質転換体Ｎｏ．２１を得た。
【０１３０】
次に、参考例１と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、転化率及び選択率は１００％であった。
【０１３１】
また、上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製した。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によってニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定した。その結果、表２１に示したクローンにおいてニトリルヒドラターゼのβサブユニットの１０８番目のＧｌｕがＰｒｏに置換されていた。
【０１３２】
【表２１】
2004194588.tif 000023
［参考例２２］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（２２）
βサブユニットの１０８番目のＧｌｕをＳｅｒに置換するために、ｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型として、参考例１と同様の操作により部位特異的な変異導入を行った。
【０１３３】
参考例１で調製したｐＰＴ−ＤＢ１のプラスミドＤＮＡ１０ｎｇを各々鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号：３１記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号：８に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号：９に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号：１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１及びＮｏ．２の反応終了液各５μＬを用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。以後、参考例１と全く同じ操作により、形質転換体Ｎｏ．２２を得た。
【０１３４】
次に、参考例１と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、転化率及び選択率は１００％であった。
【０１３５】
また、上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製した。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によってニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定した。その結果、表２２に示したクローンにおいてニトリルヒドラターゼのβサブユニットの１０８番目のＧｌｕがＳｅｒに置換されていた。
【０１３６】
【表２２】
2004194588.tif 000024
［参考例２３］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（２３）
βサブユニットの１０８番目のＧｌｕをＡｒｇに置換するために、ｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型として、参考例１と同様の操作により部位特異的な変異導入を行った。
【０１３７】
参考例１で調製したｐＰＴ−ＤＢ１のプラスミドＤＮＡ１０ｎｇを各々鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号：３２記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号：８に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号：９に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号：１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１及びＮｏ．２の反応終了液各５μＬを用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。以後、参考例１と全く同じ操作により、形質転換体Ｎｏ．２３を得た。
【０１３８】
次に、参考例１と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、転化率及び選択率は１００％であった。
【０１３９】
また、上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製した。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によってニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定した。その結果、表２３に示したクローンにおいてニトリルヒドラターゼのβサブユニットの１０８番目のＧｌｕがＡｒｇに置換されていた。
【０１４０】
【表２３】
2004194588.tif 000025
［参考例２４］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（２４）
βサブユニットの１０８番目のＧｌｕをＣｙｓに置換するために、ｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型として、参考例１と同様の操作により部位特異的な変異導入を行った。
【０１４１】
参考例１で調製したｐＰＴ−ＤＢ１のプラスミドＤＮＡ１０ｎｇを各々鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号：３３記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号：８に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号：９に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号：１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１及びＮｏ．２の反応終了液各５μＬを用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。以後、参考例１と全く同じ操作により、形質転換体Ｎｏ．２４を得た。
【０１４２】
次に、参考例１と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、転化率及び選択率は１００％であった。
【０１４３】
また、上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製した。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によってニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定した。その結果、表２４に示したクローンにおいてニトリルヒドラターゼのβサブユニットの１０８番目のＧｌｕがＣｙｓに置換されていた。
【０１４４】
【表２４】
2004194588.tif 000026
［参考例２５］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（２５）
βサブユニットの１０８番目のＧｌｕをＬｅｕに置換するために、ｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型として、参考例１と同様の操作により部位特異的な変異導入を行った。
【０１４５】
参考例１で調製したｐＰＴ−ＤＢ１のプラスミドＤＮＡ１０ｎｇを各々鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号：３４記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号：８に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号：９に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号：１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１及びＮｏ．２の反応終了液各５μＬを用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。以後、参考例１と全く同じ操作により、形質転換体Ｎｏ．２５を得た。
【０１４６】
次に、参考例１と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、転化率及び選択率は１００％であった。
【０１４７】
また、上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製した。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によってニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定した。その結果、表２５に示したクローンにおいてニトリルヒドラターゼのβサブユニットの１０８番目のＧｌｕがＬｅｕに置換されていた。
【０１４８】
【表２５】
2004194588.tif 000027
［参考例２６］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（２６）
βサブユニットの１０８番目のＧｌｕをＴｈｒに置換するために、ｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型として、参考例１と同様の操作により部位特異的な変異導入を行った。
【０１４９】
参考例１で調製したｐＰＴ−ＤＢ１のプラスミドＤＮＡ１０ｎｇを各々鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号：３５記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号：８に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号：９に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号：１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１及びＮｏ．２の反応終了液各５μＬを用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。以後、参考例１と全く同じ操作により、形質転換体Ｎｏ．２６を得た。
【０１５０】
次に、参考例１と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、転化率及び選択率は１００％であった。
【０１５１】
また、上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製した。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によってニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定した。その結果、表２６に示したクローンにおいてニトリルヒドラターゼのβサブユニットの１０８番目のＧｌｕがＴｈｒに置換されていた。
【０１５２】
【表２６】
2004194588.tif 000028
［参考例２７］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（２７）
βサブユニットの２００番目のＡｌａをＡｓｐに置換するために、ｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型として、参考例１と同様の操作により部位特異的な変異導入を行った。
【０１５３】
参考例１で調製したｐＰＴ−ＤＢ１のプラスミドＤＮＡ１０ｎｇを各々鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号：３６記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号：８に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号：９に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号：１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１及びＮｏ．２の反応終了液各５μＬを用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。以後、参考例１と全く同じ操作により、形質転換体Ｎｏ．２７を得た。
【０１５４】
次に、参考例１と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、転化率及び選択率は１００％であった。
【０１５５】
また、上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製した。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によってニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定した。その結果、表２７に示したクローンにおいてニトリルヒドラターゼのβサブユニットの２００番目のＡｌａがＡｓｐに置換されていた。
【０１５６】
【表２７】
2004194588.tif 000029
［参考例２８］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（２８）
βサブユニットの２００番目のＡｌａをＩｌｅに置換するために、ｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型として、参考例１と同様の操作により部位特異的な変異導入を行った。
【０１５７】
参考例１で調製したｐＰＴ−ＤＢ１のプラスミドＤＮＡ１０ｎｇを各々鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号：３７記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号：８に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号：９に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号：１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１及びＮｏ．２の反応終了液各５μＬを用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。以後、参考例１と全く同じ操作により、形質転換体Ｎｏ．２８を得た。
【０１５８】
次に、参考例１と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、転化率及び選択率は１００％であった。
【０１５９】
また、上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製した。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によってニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定した。その結果、表２８に示したクローンにおいてニトリルヒドラターゼのβサブユニットの２００番目のＡｌａがＩｌｅに置換されていた。
【０１６０】
【表２８】
2004194588.tif 000030
［参考例２９］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（２９）
βサブユニットの２００番目のＡｌａをＶａｌに置換するために、ｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型として、参考例１と同様の操作により部位特異的な変異導入を行った。
【０１６１】
参考例１で調製したｐＰＴ−ＤＢ１のプラスミドＤＮＡ１０ｎｇを各々鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号：３８記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号：８に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号：９に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号：１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１及びＮｏ．２の反応終了液各５μＬを用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。以後、参考例１と全く同じ操作により、形質転換体Ｎｏ．２９を得た。
【０１６２】
次に、参考例１と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、転化率及び選択率は１００％であった。
【０１６３】
また、上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製した。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によってニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定した。その結果、表２９に示したクローンにおいてニトリルヒドラターゼのβサブユニットの２００番目のＡｌａがＶａｌに置換されていた。
【０１６４】
【表２９】
2004194588.tif 000031
［参考例３０］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（３０）
βサブユニットの２００番目のＡｌａをＧｌｕに置換するために、ｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型として、参考例１と同様の操作により部位特異的な変異導入を行った。
【０１６５】
参考例１で調製したｐＰＴ−ＤＢ１のプラスミドＤＮＡ１０ｎｇを各々鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号：３９記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号：８に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号：９に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号：１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１及びＮｏ．２の反応終了液各５μＬを用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。以後、参考例１と全く同じ操作により、形質転換体Ｎｏ．３０を得た。
【０１６６】
次に、参考例１と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、転化率及び選択率は１００％であった。
【０１６７】
また、上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製した。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によってニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定した。その結果、表３０に示したクローンにおいてニトリルヒドラターゼのβサブユニットの２００番目のＡｌａがＧｌｕに置換されていた。
【０１６８】
【表３０】
2004194588.tif 000032
［参考例３１］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（３１）
βサブユニットの２１２番目のＳｅｒをＴｙｒに置換するために、ｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型として、参考例１と同様の操作により部位特異的な変異導入を行った。
【０１６９】
参考例１で調製したｐＰＴ−ＤＢ１のプラスミドＤＮＡ１０ｎｇを各々鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号：４０記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号：８に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号：９に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号：１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１及びＮｏ．２の反応終了液各５μＬを用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。以後、参考例１と全く同じ操作により、形質転換体Ｎｏ．３１を得た。
【０１７０】
次に、参考例１と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、転化率及び選択率は１００％であった。
【０１７１】
また、上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製した。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によってニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定した。その結果、表３１に示したクローンにおいてニトリルヒドラターゼのβサブユニットの２１２番目のＳｅｒがＴｙｒに置換されていた。
【０１７２】
【表３１】
2004194588.tif 000033
［参考例３２］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（３２）
クローンＮｏ．５のアミノ酸変異（αサブユニットの１９番目：ＡｌａがＶａｌ）とクローンＮｏ．１１のアミノ酸変異（αサブユニットの１２６番目：ＰｈｅがＴｙｒ）を共に有しているアミノ酸置換体においてもニトリルヒドラターゼ活性が保持されていることを確認した。
【０１７３】
３０ｍｌの試験管に１０ｍｌのＬＢ液体培地を調製し、１２１℃・２０分間のオートクレーブにより滅菌した。この培地に終濃度が１００μｇ／ｍｌとなるようにアンピシリンを添加した後、参考例１１で得られたクローンＮｏ．１１を一白金耳植菌し、３７℃・３００ｒｐｍにて約２０時間培養した。該培養液１ｍｌを適当な遠心チューブに分取した後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ×５分）により菌体を分離した。続いてアルカリＳＤＳ抽出法により該菌体よりクローンＮｏ．１１のプラスミドＤＮＡを調製した。
【０１７４】
クローンＮｏ．１１のプラスミドＤＮＡ１μｇを鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号：１４記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号：８に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μｌの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号：９に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号：１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μｌの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１およびＮｏ．２の反応終了液各５μｌを用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。以後、参考例１と全く同じ操作により、形質転換体Ｎｏ．３２を得た。
【０１７５】
次に、参考例１と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、転化率及び選択率は１００％であった。
【０１７６】
また、上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製した。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によってニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定した。その結果、表３２に示したように野生型のニトリルヒドラターゼのαサブユニットの１９番目のＡｌａがＶａｌに、αサブユニットの１２６番目のＰｈｅがＴｙｒにそれぞれ置換されていた。
【０１７７】
【表３２】
2004194588.tif 000034
［参考例３３］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（３３）
クローンＮｏ．１のアミノ酸変異（αサブユニットの６番目：ＬｅｕがＭｅｔ）とクローンＮｏ．３２のアミノ酸変異（αサブユニットの１９番目のＡｌａがＶａｌ；αサブユニットの１２６番目のＰｈｅがＴｙｒ）を共に有しているアミノ酸置換体においてもニトリルヒドラターゼ活性が保持されていることを確認した。
【０１７８】
３０ｍｌの試験管に１０ｍｌのＬＢ液体培地を調製し、１２１℃・２０分間のオートクレーブにより滅菌した。この培地に終濃度が１００μｇ／ｍｌとなるようにアンピシリンを添加した後、参考例３２で得られたクローンＮｏ．３２を一白金耳植菌し、３７℃・３００ｒｐｍにて約２０時間培養した。該培養液１ｍｌを適当な遠心チューブに分取した後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ×５分）により菌体を分離した。続いてアルカリＳＤＳ抽出法により該菌体よりクローンＮｏ．３２のプラスミドＤＮＡを調製した。
【０１７９】
クローンＮｏ．３２のプラスミドＤＮＡ１μｇを鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号：７記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号：８に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μｌの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号：９に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号：１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μｌの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１およびＮｏ．２の反応終了液各５μｌを用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。以後、参考例１と全く同じ操作により、形質転換体Ｎｏ．３３を得た。
【０１８０】
次に、参考例１と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、転化率及び選択率は１００％であった。
【０１８１】
また、上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製した。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によってニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定した。その結果、表３３に示したように野生型のニトリルヒドラターゼのαサブユニットの６番目のＬｅｕがＭｅｔに、αサブユニットの１９番目のＡｌａがＶａｌに、αサブユニットの１２６番目のＰｈｅがＴｙｒにそれぞれ置換されていた。
【０１８２】
【表３３】
2004194588.tif 000035
［参考例３４］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（３４）
クローンＮｏ．２のアミノ酸変異（αサブユニットの６番目：ＬｅｕがＴｈｒ）とクローンＮｏ．３２のアミノ酸変異（αサブユニットの１９番目のＡｌａがＶａｌ；αサブユニットの１２６番目のＰｈｅがＴｙｒ）を共に有しているアミノ酸置換体においてもニトリルヒドラターゼ活性が保持されていることを確認した。
【０１８３】
参考例３３で調製したクローンＮｏ．３２のプラスミドＤＮＡ１μｇを鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号：１１記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号：８に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μｌの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号：９に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号：１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μｌの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１およびＮｏ．２の反応終了液各５μｌを用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。以後、参考例１と全く同じ操作により、形質転換体Ｎｏ．３４を得た。
【０１８４】
次に、参考例１と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、転化率及び選択率は１００％であった。
【０１８５】
また、上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製した。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によってニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定した。その結果、表３４に示したように野生型のニトリルヒドラターゼのαサブユニットの６番目のＬｅｕがＴｈｒに、αサブユニットの１９番目のＡｌａがＶａｌに、αサブユニットの１２６番目のＰｈｅがＴｙｒにそれぞれ置換されていた。
【０１８６】
【表３４】
2004194588.tif 000036
［参考例３５］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（３５）
クローンＮｏ．３のアミノ酸変異（αサブユニットの６番目：ＬｅｕがＡｌａ）とクローンＮｏ．３２のアミノ酸変異（αサブユニットの１９番目のＡｌａがＶａｌ；αサブユニットの１２６番目のＰｈｅがＴｙｒ）を共に有しているアミノ酸置換体においてもニトリルヒドラターゼ活性が保持されていることを確認した。
【０１８７】
参考例３３で調製したクローンＮｏ．３２のプラスミドＤＮＡ１μｇを鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号：１２記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号：８に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μｌの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号：９に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号：１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μｌの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１およびＮｏ．２の反応終了液各５μｌを用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。以後、参考例１と全く同じ操作により、形質転換体Ｎｏ．３５を得た。
【０１８８】
次に、参考例１と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、転化率及び選択率は１００％であった。
【０１８９】
また、上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製した。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によってニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定した。その結果、表３５に示したように野生型のニトリルヒドラターゼのαサブユニットの６番目のＬｅｕがＡｌａに、αサブユニットの１９番目のＡｌａがＶａｌに、αサブユニットの１２６番目のＰｈｅがＴｙｒにそれぞれ置換されていた。
【０１９０】
【表３５】
2004194588.tif 000037
［参考例３６］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（３６）
クローンＮｏ．２０のアミノ酸変異（βサブユニットの１０８番目：ＧｌｕがＡｓｐ）とクローンＮｏ．３１のアミノ酸変異（βサブユニットの２１２番目：ＳｅｒがＴｙｒ）を共に有しているアミノ酸置換体においてもニトリルヒドラターゼ活性が保持されていることを確認した。
【０１９１】
３０ｍｌの試験管に１０ｍｌのＬＢ液体培地を調製し、１２１℃・２０分間のオートクレーブにより滅菌した。この培地に終濃度が１００μｇ／ｍｌとなるようにアンピシリンを添加した後、参考例３１で得られたクローンＮｏ．３１を一白金耳植菌し、３７℃・３００ｒｐｍにて約２０時間培養した。該培養液１ｍｌを適当な遠心チューブに分取した後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ×５分）により菌体を分離した。続いてアルカリＳＤＳ抽出法により該菌体よりクローンＮｏ．３１のプラスミドＤＮＡを調製した。
【０１９２】
クローンＮｏ．３１のプラスミドＤＮＡ１μｇを鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号：２９記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号：８に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μｌの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号：９に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号：１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μｌの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１およびＮｏ．２の反応終了液各５μｌを用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。以後、参考例１と全く同じ操作により、形質転換体Ｎｏ．３６を得た。
【０１９３】
次に、参考例１と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、転化率及び選択率は１００％であった。
【０１９４】
また、上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製した。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によってニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定した。その結果、表３６に示したように野生型のニトリルヒドラターゼのβサブユニットの１０８番目のＧｌｕがＡｓｐに、βサブユニットの２１２番目のＳｅｒがＴｙｒにそれぞれ置換されていた。
【０１９５】
【表３６】
2004194588.tif 000038
［参考例３７］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（３７）
クローンＮｏ．２３のアミノ酸変異（βサブユニットの１０８番目：ＧｌｕがＡｒｇ）とクローンＮｏ．３１のアミノ酸変異（βサブユニットの２１２番目：ＳｅｒがＴｙｒ）を共に有しているアミノ酸置換体においてもニトリルヒドラターゼ活性が保持されていることを確認した。
【０１９６】
参考例３６で調製したクローンＮｏ．３１のプラスミドＤＮＡ１μｇを鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号：３２記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号：８に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μｌの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号：９に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号：１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μｌの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１およびＮｏ．２の反応終了液各５μｌを用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。以後、参考例１と全く同じ操作により、形質転換体Ｎｏ．３７を得た。
【０１９７】
次に、参考例１と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、転化率及び選択率は１００％であった。
【０１９８】
また、上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製した。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によってニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定した。その結果、表３７に示したように野生型のニトリルヒドラターゼのβサブユニットの１０８番目のＧｌｕがＡｒｇに、βサブユニットの２１２番目のＳｅｒがＴｙｒにそれぞれ置換されていた。
【０１９９】
【表３７】
2004194588.tif 000039
［参考例３８］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（３８）
クローンＮｏ．２７のアミノ酸変異（βサブユニットの２００番目：ＡｌａがＡｓｐ）とクローンＮｏ．３１のアミノ酸変異（βサブユニットの２１２番目：ＳｅｒがＴｙｒ）を共に有しているアミノ酸置換体においてもニトリルヒドラターゼ活性が保持されていることを確認した。
【０２００】
参考例３６で調製したクローンＮｏ．３１のプラスミドＤＮＡ１μｇを鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号：３６記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号：８に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μｌの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号：９に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号：１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μｌの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１およびＮｏ．２の反応終了液各５μｌを用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。以後、参考例１と全く同じ操作により、形質転換体Ｎｏ．３８を得た。
【０２０１】
次に、参考例１と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、転化率及び選択率は１００％であった。
【０２０２】
また、上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製した。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によってニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定した。その結果、表３８に示したように野生型のニトリルヒドラターゼのβサブユニットの２００番目のＡｌａがＡｓｐに、βサブユニットの２１２番目のＳｅｒがＴｙｒにそれぞれ置換されていた。
【０２０３】
【表３８】
2004194588.tif 000040
［参考例３９］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（３９）
クローンＮｏ．３０のアミノ酸変異（βサブユニットの２００番目：ＡｌａがＧｌｕ）とクローンＮｏ．３１のアミノ酸変異（βサブユニットの２１２番目：ＳｅｒがＴｙｒ）を共に有しているアミノ酸置換体においてもニトリルヒドラターゼ活性が保持されていることを確認した。
【０２０４】
参考例３６で調製したクローンＮｏ．３１のプラスミドＤＮＡ１μｇを鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番３９記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号：８に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μｌの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号：９に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号：１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μｌの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１およびＮｏ．２の反応終了液各５μｌを用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。
以後、参考例１と全く同じ操作により、形質転換体Ｎｏ．３９を得た。
【０２０５】
次に、参考例１と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、転化率及び選択率は１００％であった。
【０２０６】
また、上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製した。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によってニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定した。その結果、表３９に示したように野生型のニトリルヒドラターゼのβサブユニットの２００番目のＡｌａがＧｌｕに、βサブユニットの２１２番目のＳｅｒがＴｙｒにそれぞれ置換されていた。
【０２０７】
【表３９】
2004194588.tif 000041
［実施例1］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（４０）
αサブユニットの３６番目のＴｈｒをＭｅｔに置換するために、宝酒造社製の「ＬＡ ＰＣＲ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ」を用いた部位特異的な変異導入を行った。以後、「ＬＡ ＰＣＲ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ」を単にキットと呼ぶ。以下の実施例では、基本的にキットの原理及び操作方法を踏襲した。
３０ｍＬの試験管に１０ｍＬのＬＢ液体培地を調製し、１２１℃・２０分間のオートクレーブにより滅菌した。この培地に終濃度が１００μｇ／ｍＬとなるようにアンピシリンを添加した後、ＭＴ−１０８２２を一白金耳植菌し、３７℃・３００ｒｐｍにて約２０時間培養した。該培養液１ｍＬを適当な遠心チューブに分取した後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ×５分）により該菌体を分離した。続いてアルカリＳＤＳ抽出法により該菌体よりプラスミドｐＰＴ−ＤＢ１を調製した。
【０２０８】
各々１０ｎｇのｐＰＴ−ＤＢ１を鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号：４１記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号：８に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返す事により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号：９に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号：１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。
ＰＣＲ反応Ｎｏ．１及びＮｏ．２の反応終了液各５μＬを用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。Ｍｉｃｒｏｃｏｎ１００（宝酒造社製）を用いてそれぞれのＰＣＲ反応終了液より過剰なプライマー及びｄＮＴＰを除去した後、ＴＥを加えて各々５０μＬの溶液を調製した。該ＴＥ溶液を各０．５μＬずつ含む全量４７．５μＬのアニーリング溶液（組成はキットに記載の条件による）を調製し、熱変性処理（９８℃）を１０分間行った後、３７℃まで６０分間かけて一定の速度で冷却を行い、続いて３７℃で１５分間保持することによってアニーリング処理を行った。アニーリング処理液にＴａＫａＲａ ＬＡ Ｔａｑを０．５μＬ加えて７２℃で３分間加熱処理を行い、ヘテロ２本鎖を完成させた。これにＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号：８に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号：１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ加えて全量を５０μＬとした後、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことによるＰＣＲ反応Ｎｏ．３を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．３の反応終了液５μＬを用いたアガロース電気泳動（シグマ社製タイプＶＩＩ低融点アガロース使用；アガロース濃度０．８重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、約２ｋｂの増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。続いて、アガロースゲルから約２ＫｂのＤＮＡ断片のみを切り出し、該アガロース片（約０．１ｇ）を細かく粉砕し１ｍＬのＴＥ溶液に懸濁後、５５℃で１時間保温してアガロースを完全に融解させた。この融解液に対してフェノール／クロロホルム抽出とエタノール沈澱を行って該ＤＮＡ断片を精製し、最終的に１０μＬのＴＥに溶解した。精製した約２ｋｂの増幅ＤＮＡ断片を制限酵素ＥｃｏＲI及びＨｉｎｄIIIにより切断した後、この制限酵素処理液に対してフェノール／クロロホルム抽出とエタノール沈澱を行って該ＤＮＡ断片を精製し、最終的に１０μＬのＴＥに溶解した。同様に、ＥｃｏＲI及びＨｉｎｄIIIによりｐＰＴ−ＤＢ１を切断し、アガロースゲル電気泳動（シグマ社製タイプＶＩＩ低融点アガロース使用；アガロース濃度０．７％）を行い、アガロースゲルから約２．７ＫｂのＤＮＡ断片のみを切り出した。切りだしたアガロース片（約０．１ｇ）を細かく粉砕し１ｍＬのＴＥ溶液に懸濁後、５５℃で１時間保温してアガロースを完全に融解させた。この融解液に対してフェノール／クロロホルム抽出とエタノール沈澱を行って該ＤＮＡ断片を精製し、最終的に１０μＬのＴＥに溶解した。この様にして得られた約２ｋｂと約２．７ＫｂのＤＮＡ断片をＤＮＡライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて連結させた後、大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体Ｎｏ．４０を得た。
【０２０９】
次に、参考例１と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、転化率及び選択率は１００％であった。
【０２１０】
また、上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製した。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によってニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定した。その結果、表４０に示したクローンにおいてニトリルヒドラターゼのαサブユニットの３６番目のＴｈｒがＭｅｔに置換されている事を確認した。
【０２１１】
【表４０】
2004194588.tif 000042
［実施例２］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（４１）
αサブユニットの７１番目のＡｒｇをＨｉｓに置換するために、ｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型として、実施例１と同様の操作により部位特異的な変異導入を行った。
【０２１２】
実施例１で調製したｐＰＴ−ＤＢ１のプラスミドＤＮＡ１０ｎｇを各々鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号：４２記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号：８に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号：９に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号：１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１及びＮｏ．２の反応終了液各５μＬを用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。以後、実施例１と全く同じ操作により、形質転換体Ｎｏ．４１を得た。
【０２１３】
次に、参考例１と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、転化率及び選択率は１００％であった。
【０２１４】
また、上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製した。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によってニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定した。その結果、表４１に示したクローンにおいてニトリルヒドラターゼのαサブユニットの７１番目のＡｒｇがＨｉｓに置換されている事を確認した。
【０２１５】
【表４１】
2004194588.tif 000043
［実施例３］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（４２）
αサブユニットの１４８番目のＧｌｙをＡｓｐに置換するために、ｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型として、実施例１と同様の操作により部位特異的な変異導入を行った。
実施例１で調製したｐＰＴ−ＤＢ１のプラスミドＤＮＡ１０ｎｇを各々鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号：４３記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号：８に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号：９に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号：１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１及びＮｏ．２の反応終了液各５μＬを用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。
以後、実施例１と全く同じ操作により、形質転換体Ｎｏ．４２を得た。
【０２１６】
次に、参考例１と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、転化率及び選択率は１００％であった。
【０２１７】
また、上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製した。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によってニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定した。その結果、表４２に示したクローンにおいてニトリルヒドラターゼのαサブユニットの１４８番目のＧｌｙがＡｓｐに置換されている事を確認した。
【０２１８】
【表４２】
2004194588.tif 000044
［実施例４］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（４３）
αサブユニットの２０４番目のＶａｌをＡｒｇに置換するために、ｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型として、実施例１と同様の操作により部位特異的な変異導入を行った。
【０２１９】
実施例１で調製したｐＰＴ−ＤＢ１のプラスミドＤＮＡ１０ｎｇを各々鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号：４４記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号：８に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号：９に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号：１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１及びＮｏ．２の反応終了液各５μＬを用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。以後、実施例１と全く同じ操作により、形質転換体Ｎｏ．４３を得た。
【０２２０】
次に、参考例１と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、転化率及び選択率は１００％であった。
【０２２１】
また、上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製した。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によってニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定した。その結果、表４３に示したクローンにおいてニトリルヒドラターゼのαサブユニットの２０４番目のＶａｌがＡｒｇに置換されている事を確認した。
【０２２２】
【表４３】
2004194588.tif 000045
［実施例５］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（４４）
αサブユニットの２０４番目のＶａｌをＬｙｓに置換するために、ｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型として、実施例１と同様の操作により部位特異的な変異導入を行った。
実施例１で調製したｐＰＴ−ＤＢ１のプラスミドＤＮＡ１０ｎｇを各々鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号：４５記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号：８に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号：９に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号：１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１及びＮｏ．２の反応終了液各５μＬを用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。以後、実施例１と全く同じ操作により、形質転換体Ｎｏ．４４を得た。
【０２２３】
次に、参考例１と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、転化率及び選択率は１００％であった。
【０２２４】
また、上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製した。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によってニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定した。その結果、表４４に示したクローンにおいてニトリルヒドラターゼのαサブユニットの２０４番目のＶａｌがＬｙｓに置換されている事を確認した。
【０２２５】
【表４４】
2004194588.tif 000046
［実施例６］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（４５）
αサブユニットの２０４番目のＶａｌをＴｒｐに置換するために、ｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型として、実施例１と同様の操作により部位特異的な変異導入を行った。
実施例１で調製したｐＰＴ−ＤＢ１のプラスミドＤＮＡ１０ｎｇを各々鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号：４６記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号：８に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号：９に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号：１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１及びＮｏ．２の反応終了液各５μＬを用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。
以後、実施例１と全く同じ操作により、形質転換体Ｎｏ．４５を得た。
【０２２６】
次に、参考例１と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、転化率及び選択率は１００％であった。
【０２２７】
また、上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製した。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によってニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定した。その結果、表４５に示したクローンにおいてニトリルヒドラターゼのαサブユニットの２０４番目のＶａｌがＴｒｐに置換されている事を確認した。
【０２２８】
【表４５】
2004194588.tif 000047
［実施例７］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（４６）
αサブユニットの２０４番目のＶａｌをＴｈｒに置換するために、ｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型として、実施例１と同様の操作により部位特異的な変異導入を行った。
【０２２９】
実施例１で調製したｐＰＴ−ＤＢ１のプラスミドＤＮＡ１０ｎｇを各々鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号：４７記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号：８に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号：９に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号：１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１及びＮｏ．２の反応終了液各５μＬを用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。以後、実施例１と全く同じ操作により、形質転換体Ｎｏ．４６を得た。
【０２３０】
次に、参考例１と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、転化率及び選択率は１００％であった。
【０２３１】
また、上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製した。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によってニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定した。その結果、表４６に示したクローンにおいてニトリルヒドラターゼのαサブユニットの２０４番目のＶａｌがＴｈｒに置換されている事を確認した。
【０２３２】
【表４６】
2004194588.tif 000048
［実施例８］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（４７）
βサブユニットの１０番目のＴｈｒをＡｓｐに置換するために、ｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型として、実施例１と同様の操作により部位特異的な変異導入を行った。
【０２３３】
実施例１で調製したｐＰＴ−ＤＢ１のプラスミドＤＮＡ１０ｎｇを各々鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号：４８記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号：８に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号：９に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号：１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１及びＮｏ．２の反応終了液各５μＬを用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。以後、実施例１と全く同じ操作により、形質転換体Ｎｏ．４７を得た。
【０２３４】
次に、参考例１と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、転化率及び選択率は１００％であった。
【０２３５】
また、上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製した。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によってニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定した。その結果、表４７に示したクローンにおいてニトリルヒドラターゼのβサブユニットの１０番目のＴｈｒがＡｓｐに置換されている事を確認した。
【０２３６】
【表４７】
2004194588.tif 000049
［実施例９］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（４８）
βサブユニットの１０番目のＴｈｒをＧｌｕに置換するために、ｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型として、実施例１と同様の操作により部位特異的な変異導入を行った。
【０２３７】
実施例１で調製したｐＰＴ−ＤＢ１のプラスミドＤＮＡ１０ｎｇを各々鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号：４９記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号：８に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号：９に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号：１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１及びＮｏ．２の反応終了液各５μＬを用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。以後、実施例１と全く同じ操作により、形質転換体Ｎｏ．４８を得た。
【０２３８】
次に、参考例１と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、転化率及び選択率は１００％であった。
【０２３９】
また、上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製した。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によってニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定した。その結果、表４８に示したクローンにおいてニトリルヒドラターゼのβサブユニットの１０番目のＴｈｒがＧｌｕに置換されている事を確認した。
【０２４０】
【表４８】
2004194588.tif 000050
［実施例１０］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（４９）
βサブユニットの１０番目のＴｈｒをＴｒｐに置換するために、ｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型として、実施例１と同様の操作により部位特異的な変異導入を行った。
【０２４１】
実施例１で調製したｐＰＴ−ＤＢ１のプラスミドＤＮＡ１０ｎｇを各々鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号：５０記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号：８に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号：９に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号：１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１及びＮｏ．２の反応終了液各５μＬを用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。以後、実施例１と全く同じ操作により、形質転換体Ｎｏ．４９を得た。
【０２４２】
次に、参考例１と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、転化率及び選択率は１００％であった。
【０２４３】
また、上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製した。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によってニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定した。その結果、表４９に示したクローンにおいてニトリルヒドラターゼのβサブユニットの１０番目のＴｈｒがＴｒｐに置換されている事を確認した。
【０２４４】
【表４９】
2004194588.tif 000051
［実施例１１］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（５０）
βサブユニットの１０番目のＴｈｒをＧｌｙに置換するために、ｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型として、実施例１と同様の操作により部位特異的な変異導入を行った。
【０２４５】
実施例１で調製したｐＰＴ−ＤＢ１のプラスミドＤＮＡ１０ｎｇを各々鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号：５１記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号：８に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号：９に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号：１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１及びＮｏ．２の反応終了液各５μＬを用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。以後、実施例１と全く同じ操作により、形質転換体Ｎｏ．５０を得た。
【０２４６】
次に、参考例１と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、転化率及び選択率は１００％であった。
【０２４７】
また、上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製した。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によってニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定した。その結果、表５０に示したクローンにおいてニトリルヒドラターゼのβサブユニットの１０番目のＴｈｒがＧｌｙに置換されている事を確認した。
【０２４８】
【表５０】
2004194588.tif 000052
［実施例１２］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（５１）
βサブユニットの１０番目のＴｈｒをＴｙｒに置換するために、ｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型として、実施例１と同様の操作により部位特異的な変異導入を行った。
【０２４９】
実施例１で調製したｐＰＴ−ＤＢ１のプラスミドＤＮＡ１０ｎｇを各々鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号：５２記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号：８に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号：９に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号：１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１及びＮｏ．２の反応終了液各５μＬを用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。以後、実施例１と全く同じ操作により、形質転換体Ｎｏ．５１を得た。
【０２５０】
次に、参考例１と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、転化率及び選択率は１００％であった。
【０２５１】
また、上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製した。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によってニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定した。その結果、表５１に示したクローンにおいてニトリルヒドラターゼのβサブユニットの１０番目のＴｈｒがＴｙｒに置換されている事を確認した。
【０２５２】
【表５１】
2004194588.tif 000053
［実施例１３］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（５２）
βサブユニットの１０番目のＴｈｒをＣｙｓに置換するために、ｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型として、実施例１と同様の操作により部位特異的な変異導入を行った。
【０２５３】
実施例１で調製したｐＰＴ−ＤＢ１のプラスミドＤＮＡ１０ｎｇを各々鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号：５３記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号：８に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号：９に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号：１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１及びＮｏ．２の反応終了液各５μＬを用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。以後、実施例１と全く同じ操作により、形質転換体Ｎｏ．５２を得た。
【０２５４】
次に、参考例１と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、転化率及び選択率は１００％であった。
【０２５５】
また、上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製した。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によってニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定した。その結果、表５２に示したクローンにおいてニトリルヒドラターゼのβサブユニットの１０番目のＴｈｒがＣｙｓに置換されている事を確認した。
【０２５６】
【表５２】
2004194588.tif 000054
［実施例１４］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（５３）
βサブユニットの３２番目のＶａｌをＧｌｙに置換するために、ｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型として、実施例１と同様の操作により部位特異的な変異導入を行った。
【０２５７】
実施例１で調製したｐＰＴ−ＤＢ１のプラスミドＤＮＡ１０ｎｇを各々鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号：５４記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号：８に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号：９に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号：１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１及びＮｏ．２の反応終了液各５μＬを用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。以後、実施例１と全く同じ操作により、形質転換体Ｎｏ．５３を得た。
【０２５８】
次に、参考例１と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、転化率及び選択率は１００％であった。
【０２５９】
また、上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製した。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によってニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定した。その結果、表５３に示したクローンにおいてニトリルヒドラターゼのβサブユニットの３２番目のＶａｌがＧｌｙに置換されている事を確認した。
【０２６０】
【表５３】
2004194588.tif 000055
［実施例１５］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（５４）
βサブユニットの３７番目のＰｈｅをＴｈｒに置換するために、ｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型として、実施例１と同様の操作により部位特異的な変異導入を行った。
【０２６１】
実施例１で調製したｐＰＴ−ＤＢ１のプラスミドＤＮＡ１０ｎｇを各々鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号：５５記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号：８に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号：９に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号：１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１及びＮｏ．２の反応終了液各５μＬを用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。以後、実施例１と全く同じ操作により、形質転換体Ｎｏ．５４を得た。
【０２６２】
次に、参考例１と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、転化率及び選択率は１００％であった。
【０２６３】
また、上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製した。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によってニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定した。その結果、表５４に示したクローンにおいてニトリルヒドラターゼのβサブユニットの３７番目のＰｈｅがＴｈｒに置換されている事を確認した。
【０２６４】
【表５４】
2004194588.tif 000056
［実施例１６］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（５５）
βサブユニットの３７番目のＰｈｅをＡｌａに置換するために、ｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型として、実施例１と同様の操作により部位特異的な変異導入を行った。
【０２６５】
実施例１で調製したｐＰＴ−ＤＢ１のプラスミドＤＮＡ１０ｎｇを各々鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号：５６記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号：８に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号：９に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号：１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１及びＮｏ．２の反応終了液各５μＬを用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。以後、実施例１と全く同じ操作により、形質転換体Ｎｏ．５５を得た。
【０２６６】
次に、参考例１と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、転化率及び選択率は１００％であった。
【０２６７】
また、上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製した。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によってニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定した。その結果、表５５に示したクローンにおいてニトリルヒドラターゼのβサブユニットの３７番目のＰｈｅがＡｌａに置換されている事を確認した。
【０２６８】
【表５５】
2004194588.tif 000057
［実施例１７］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（５６）
βサブユニットの３７番目のＰｈｅをＬｅｕに置換するために、ｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型として、実施例１と同様の操作により部位特異的な変異導入を行った。
【０２６９】
実施例１で調製したｐＰＴ−ＤＢ１のプラスミドＤＮＡ１０ｎｇを各々鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号：５７記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号：８に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号：９に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号：１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１及びＮｏ．２の反応終了液各５μＬを用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。以後、実施例１と全く同じ操作により、形質転換体Ｎｏ．５６を得た。
【０２７０】
次に、参考例１と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、転化率及び選択率は１００％であった。
【０２７１】
また、上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製した。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によってニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定した。その結果、表５６に示したクローンにおいてニトリルヒドラターゼのβサブユニットの３７番目のＰｈｅがＬｅｕに置換されている事を確認した。
【０２７２】
【表５６】
2004194588.tif 000058
［実施例１８］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（５７）
βサブユニットの３７番目のＰｈｅをＩｌｅに置換するために、ｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型として、実施例１と同様の操作により部位特異的な変異導入を行った。
【０２７３】
実施例１で調製したｐＰＴ−ＤＢ１のプラスミドＤＮＡ１０ｎｇを各々鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号：５８記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号：８に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号：９に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号：１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１及びＮｏ．２の反応終了液各５μＬを用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。以後、実施例１と全く同じ操作により、形質転換体Ｎｏ．５７を得た。
【０２７４】
次に、参考例１と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、転化率及び選択率は１００％であった。
【０２７５】
また、上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製した。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によってニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定した。その結果、表５７に示したクローンにおいてニトリルヒドラターゼのβサブユニットの３７番目のＰｈｅがＩｌｅに置換されている事を確認した。
【０２７６】
【表５７】
2004194588.tif 000059
［実施例１９］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（５８）
βサブユニットの３７番目のＰｈｅをＶａｌに置換するために、ｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型として、実施例１と同様の操作により部位特異的な変異導入を行った。
【０２７７】
実施例１で調製したｐＰＴ−ＤＢ１のプラスミドＤＮＡ１０ｎｇを各々鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号：５９記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号：８に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号：９に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号：１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１及びＮｏ．２の反応終了液各５μＬを用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。以後、実施例１と全く同じ操作により、形質転換体Ｎｏ．５８を得た。
【０２７８】
次に、参考例１と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、転化率及び選択率は１００％であった。
【０２７９】
また、上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製した。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によってニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定した。その結果、表５８に示したクローンにおいてニトリルヒドラターゼのβサブユニットの３７番目のＰｈｅがＶａｌに置換されている事を確認した。
【０２８０】
【表５８】
2004194588.tif 000060
［実施例２０］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（５９）
βサブユニットの４１番目のＰｈｅをＧｌｕに置換するために、ｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型として、実施例１と同様の操作により部位特異的な変異導入を行った。
【０２８１】
実施例１で調製したｐＰＴ−ＤＢ１のプラスミドＤＮＡ１０ｎｇを各々鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号：６０記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号：８に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号：９に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号：１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１及びＮｏ．２の反応終了液各５μＬを用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。以後、実施例１と全く同じ操作により、形質転換体Ｎｏ．５９を得た。
【０２８２】
次に、参考例１と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、転化率及び選択率は１００％であった。
【０２８３】
また、上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製した。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によってニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定した。その結果、表５９に示したクローンにおいてニトリルヒドラターゼのβサブユニットの４１番目のＰｈｅがＧｌｕに置換されている事を確認した。
【０２８４】
【表５９】
2004194588.tif 000061
［実施例２１］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（６０）
βサブユニットの４１番目のＰｈｅをＴｈｒに置換するために、ｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型として、実施例１と同様の操作により部位特異的な変異導入を行った。
【０２８５】
実施例１で調製したｐＰＴ−ＤＢ１のプラスミドＤＮＡ１０ｎｇを各々鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号：６１記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号：８に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号：９に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号：１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１及びＮｏ．２の反応終了液各５μＬを用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。以後、実施例１と全く同じ操作により、形質転換体Ｎｏ．６０を得た。
【０２８６】
次に、参考例１と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、転化率及び選択率は１００％であった。
【０２８７】
また、上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製した。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によってニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定した。その結果、表６０に示したクローンにおいてニトリルヒドラターゼのβサブユニットの４１番目のＰｈｅがＴｈｒに置換されている事を確認した。
【０２８８】
【表６０】
2004194588.tif 000062
［実施例２２］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（６１）
βサブユニットの４１番目のＰｈｅをＡｌａに置換するために、ｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型として、実施例１と同様の操作により部位特異的な変異導入を行った。
【０２８９】
実施例１で調製したｐＰＴ−ＤＢ１のプラスミドＤＮＡ１０ｎｇを各々鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号：６２記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号：８に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号：９に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号：１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１及びＮｏ．２の反応終了液各５μＬを用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。以後、実施例１と全く同じ操作により、形質転換体Ｎｏ．６１を得た。
【０２９０】
次に、参考例１と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、転化率及び選択率は１００％であった。
【０２９１】
また、上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製した。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によってニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定した。その結果、表６１に示したクローンにおいてニトリルヒドラターゼのβサブユニットの４１番目のＰｈｅがＡｌａに置換されている事を確認した。
【０２９２】
【表６１】
2004194588.tif 000063
［実施例２３］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（６２）
βサブユニットの４１番目のＰｈｅをＬｅｕに置換するために、ｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型として、実施例１と同様の操作により部位特異的な変異導入を行った。
【０２９３】
実施例１で調製したｐＰＴ−ＤＢ１のプラスミドＤＮＡ１０ｎｇを各々鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号：６３記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号：８に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号：９に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号：１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１及びＮｏ．２の反応終了液各５μＬを用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。以後、実施例１と全く同じ操作により、形質転換体Ｎｏ．６２を得た。
【０２９４】
次に、参考例１と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、転化率及び選択率は１００％であった。
【０２９５】
また、上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製した。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によってニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定した。その結果、表６２に示したクローンにおいてニトリルヒドラターゼのβサブユニットの４１番目のＰｈｅがＬｅｕに置換されている事を確認した。
【０２９６】
【表６２】
2004194588.tif 000064
［実施例２４］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（６３）
βサブユニットの４１番目のＰｈｅをＩｌｅに置換するために、ｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型として、実施例１と同様の操作により部位特異的な変異導入を行った。
【０２９７】
実施例１で調製したｐＰＴ−ＤＢ１のプラスミドＤＮＡ１０ｎｇを各々鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号：６４記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号：８に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号：９に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号：１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１及びＮｏ．２の反応終了液各５μＬを用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。以後、実施例１と全く同じ操作により、形質転換体Ｎｏ．６３を得た。
【０２９８】
次に、参考例１と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、転化率及び選択率は１００％であった。
【０２９９】
また、上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製した。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によってニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定した。その結果、表６３に示したクローンにおいてニトリルヒドラターゼのβサブユニットの４１番目のＰｈｅがＩｌｅに置換されている事を確認した。
【０３００】
【表６３】
2004194588.tif 000065
［実施例２５］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（６４）
βサブユニットの４１番目のＰｈｅをＶａｌに置換するために、ｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型として、実施例１と同様の操作により部位特異的な変異導入を行った。
【０３０１】
実施例１で調製したｐＰＴ−ＤＢ１のプラスミドＤＮＡ１０ｎｇを各々鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号：６５記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号：８に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号：９に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号：１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１及びＮｏ．２の反応終了液各５μＬを用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。以後、実施例１と全く同じ操作により、形質転換体Ｎｏ．６４を得た。
【０３０２】
次に、参考例１と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、転化率及び選択率は１００％であった。
【０３０３】
また、上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製した。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によってニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定した。その結果、表６４に示したクローンにおいてニトリルヒドラターゼのβサブユニットの４１番目のＰｈｅがＶａｌに置換されている事を確認した。
【０３０４】
【表６４】
2004194588.tif 000066
［実施例２６］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（６５）
βサブユニットの４６番目のＭｅｔをＧｌｙに置換するために、ｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型として、実施例１と同様の操作により部位特異的な変異導入を行った。
【０３０５】
実施例１で調製したｐＰＴ−ＤＢ１のプラスミドＤＮＡ１０ｎｇを各々鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号：６６記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号：８に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号：９に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号：１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１及びＮｏ．２の反応終了液各５μＬを用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。以後、実施例１と全く同じ操作により、形質転換体Ｎｏ．６５を得た。
【０３０６】
次に、参考例１と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、転化率及び選択率は１００％であった。
【０３０７】
また、上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製した。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によってニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定した。その結果、表６５に示したクローンにおいてニトリルヒドラターゼのβサブユニットの４６番目のＭｅｔがＧｌｙに置換されている事を確認した。
【０３０８】
【表６５】
2004194588.tif 000067
［実施例２７］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（６６）
βサブユニットの４６番目のＭｅｔをＴｙｒに置換するために、ｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型として、実施例１と同様の操作により部位特異的な変異導入を行った。
【０３０９】
実施例１で調製したｐＰＴ−ＤＢ１のプラスミドＤＮＡ１０ｎｇを各々鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号：６７記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号：８に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号：９に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号：１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１及びＮｏ．２の反応終了液各５μＬを用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。以後、実施例１と全く同じ操作により、形質転換体Ｎｏ．６６を得た。
【０３１０】
次に、参考例１と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、転化率及び選択率は１００％であった。
【０３１１】
また、上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製した。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によってニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定した。その結果、表６６に示したクローンにおいてニトリルヒドラターゼのβサブユニットの４６番目のＭｅｔがＴｙｒに置換されている事を確認した。
【０３１２】
【表６６】
2004194588.tif 000068
［実施例２８］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（６７）
βサブユニットの４６番目のＭｅｔをＬｅｕに置換するために、ｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型として、実施例１と同様の操作により部位特異的な変異導入を行った。
【０３１３】
実施例１で調製したｐＰＴ−ＤＢ１のプラスミドＤＮＡ１０ｎｇを各々鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号：６８記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号：８に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号：９に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号：１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１及びＮｏ．２の反応終了液各５μＬを用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。以後、実施例１と全く同じ操作により、形質転換体Ｎｏ．６７を得た。
【０３１４】
次に、参考例１と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、転化率及び選択率は１００％であった。
【０３１５】
また、上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製した。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によってニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定した。その結果、表６７に示したクローンにおいてニトリルヒドラターゼのβサブユニットの４６番目のＭｅｔがＬｅｕに置換されている事を確認した。
【０３１６】
【表６７】
2004194588.tif 000069
［実施例２９］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（６８）
βサブユニットの４６番目のＭｅｔをＬｙｓに置換するために、ｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型として、実施例１と同様の操作により部位特異的な変異導入を行った。
【０３１７】
実施例１で調製したｐＰＴ−ＤＢ１のプラスミドＤＮＡ１０ｎｇを各々鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号：６９記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号：８に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号：９に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号：１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１及びＮｏ．２の反応終了液各５μＬを用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。以後、実施例１と全く同じ操作により、形質転換体Ｎｏ．６８を得た。
【０３１８】
次に、参考例１と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、転化率及び選択率は１００％であった。
【０３１９】
また、上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製した。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によってニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定した。その結果、表６８に示したクローンにおいてニトリルヒドラターゼのβサブユニットの４６番目のＭｅｔがＬｙｓに置換されている事を確認した。
【０３２０】
【表６８】
2004194588.tif 000070
［実施例３０］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（６９）
βサブユニットの４６番目のＭｅｔをＡｓｐに置換するために、ｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型として、実施例１と同様の操作により部位特異的な変異導入を行った。
【０３２１】
実施例１で調製したｐＰＴ−ＤＢ１のプラスミドＤＮＡ１０ｎｇを各々鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号：７０記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号：８に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号：９に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号：１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１及びＮｏ．２の反応終了液各５μＬを用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。以後、実施例１と全く同じ操作により、形質転換体Ｎｏ．６９を得た。
【０３２２】
次に、参考例１と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、転化率及び選択率は１００％であった。
【０３２３】
また、上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製した。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によってニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定した。その結果、表６９に示したクローンにおいてニトリルヒドラターゼのβサブユニットの４６番目のＭｅｔがＡｓｐに置換されている事を確認した。
【０３２４】
【表６９】
2004194588.tif 000071
［実施例３１］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（７０）
βサブユニットの４８番目のＬｅｕをＧｌｙに置換するために、ｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型として、実施例１と同様の操作により部位特異的な変異導入を行った。
【０３２５】
実施例１で調製したｐＰＴ−ＤＢ１のプラスミドＤＮＡ１０ｎｇを各々鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号：７１記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号：８に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号：９に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号：１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１及びＮｏ．２の反応終了液各５μＬを用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。以後、実施例１と全く同じ操作により、形質転換体Ｎｏ．７０を得た。
【０３２６】
次に、参考例１と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、転化率及び選択率は１００％であった。
【０３２７】
また、上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製した。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によってニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定した。その結果、表７０に示したクローンにおいてニトリルヒドラターゼのβサブユニットの４８番目のＬｅｕがＧｌｙに置換されている事を確認した。
【０３２８】
【表７０】
2004194588.tif 000072
［実施例３２］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（７１）
βサブユニットの４８番目のＬｅｕをＡｌａに置換するために、ｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型として、実施例１と同様の操作により部位特異的な変異導入を行った。
【０３２９】
実施例１で調製したｐＰＴ−ＤＢ１のプラスミドＤＮＡ１０ｎｇを各々鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号：７２記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号：８に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号：９に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号：１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１及びＮｏ．２の反応終了液各５μＬを用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。以後、実施例１と全く同じ操作により、形質転換体Ｎｏ．７１を得た。
【０３３０】
次に、参考例１と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、転化率及び選択率は１００％であった。
【０３３１】
また、上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製した。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によってニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定した。その結果、表７１に示したクローンにおいてニトリルヒドラターゼのβサブユニットの４８番目のＬｅｕがＡｌａに置換されている事を確認した。
【０３３２】
【表７１】
2004194588.tif 000073
［実施例３３］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（７２）
βサブユニットの４８番目のＬｅｕをＶａｌに置換するために、ｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型として、実施例１と同様の操作により部位特異的な変異導入を行った。
【０３３３】
実施例１で調製したｐＰＴ−ＤＢ１のプラスミドＤＮＡ１０ｎｇを各々鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号：７３記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号：８に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号：９に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号：１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１及びＮｏ．２の反応終了液各５μＬを用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。以後、実施例１と全く同じ操作により、形質転換体Ｎｏ．７２を得た。
【０３３４】
次に、参考例１と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、転化率及び選択率は１００％であった。
【０３３５】
また、上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製した。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によってニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定した。その結果、表７２に示したクローンにおいてニトリルヒドラターゼのβサブユニットの４８番目のＬｅｕがＶａｌに置換されている事を確認した。
【０３３６】
【表７２】
2004194588.tif 000074
［実施例３４］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（７３）
βサブユニットの４８番目のＬｅｕをＳｅｒに置換するために、ｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型として、実施例１と同様の操作により部位特異的な変異導入を行った。
【０３３７】
実施例１で調製したｐＰＴ−ＤＢ１のプラスミドＤＮＡ１０ｎｇを各々鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号：７４記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号：８に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号：９に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号：１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１及びＮｏ．２の反応終了液各５μＬを用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。以後、実施例１と全く同じ操作により、形質転換体Ｎｏ．７３を得た。
【０３３８】
次に、参考例１と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、転化率及び選択率は１００％であった。
【０３３９】
また、上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製した。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によってニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定した。その結果、表７３に示したクローンにおいてニトリルヒドラターゼのβサブユニットの４８番目のＬｅｕがＳｅｒに置換されている事を確認した。
【０３４０】
【表７３】
2004194588.tif 000075
［実施例３５］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（７４）
βサブユニットの４８番目のＬｅｕをＴｈｒに置換するために、ｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型として、実施例１と同様の操作により部位特異的な変異導入を行った。
【０３４１】
実施例１で調製したｐＰＴ−ＤＢ１のプラスミドＤＮＡ１０ｎｇを各々鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号：７５記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号：８に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号：９に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号：１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１及びＮｏ．２の反応終了液各５μＬを用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。以後、実施例１と全く同じ操作により、形質転換体Ｎｏ．７４を得た。
【０３４２】
次に、参考例１と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、転化率及び選択率は１００％であった。
【０３４３】
また、上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製した。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によってニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定した。その結果、表７４に示したクローンにおいてニトリルヒドラターゼのβサブユニットの４８番目のＬｅｕがＴｈｒに置換されている事を確認した。
【０３４４】
【表７４】
2004194588.tif 000076
［実施例３６］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（７５）
βサブユニットの４８番目のＬｅｕをＡｒｇに置換するために、ｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型として、実施例１と同様の操作により部位特異的な変異導入を行った。
【０３４５】
実施例１で調製したｐＰＴ−ＤＢ１のプラスミドＤＮＡ１０ｎｇを各々鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号：７６記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号：８に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号：９に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号：１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１及びＮｏ．２の反応終了液各５μＬを用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。以後、実施例１と全く同じ操作により、形質転換体Ｎｏ．７５を得た。
【０３４６】
次に、参考例１と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、転化率及び選択率は１００％であった。
【０３４７】
また、上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製した。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によってニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定した。その結果、表７５に示したクローンにおいてニトリルヒドラターゼのβサブユニットの４８番目のＬｅｕがＡｒｇに置換されている事を確認した。
【０３４８】
【表７５】
2004194588.tif 000077
［実施例３７］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（７６）
βサブユニットの５１番目のＰｈｅをＡｌａに置換するために、ｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型として、実施例１と同様の操作により部位特異的な変異導入を行った。
【０３４９】
実施例１で調製したｐＰＴ−ＤＢ１のプラスミドＤＮＡ１０ｎｇを各々鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号：７７記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号：８に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号：９に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号：１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１及びＮｏ．２の反応終了液各５μＬを用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。以後、実施例１と全く同じ操作により、形質転換体Ｎｏ．７６を得た。
【０３５０】
次に、参考例１と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、転化率及び選択率は１００％であった。
【０３５１】
また、上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製した。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によってニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定した。その結果、表７６に示したクローンにおいてニトリルヒドラターゼのβサブユニットの５１番目のＰｈｅがＡｌａに置換されている事を確認した。
【０３５２】
【表７６】
2004194588.tif 000078
［実施例３８］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（７７）
βサブユニットの５１番目のＰｈｅをＶａｌに置換するために、ｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型として、実施例１と同様の操作により部位特異的な変異導入を行った。
【０３５３】
実施例１で調製したｐＰＴ−ＤＢ１のプラスミドＤＮＡ１０ｎｇを各々鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号：７８記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号：８に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号：９に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号：１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１及びＮｏ．２の反応終了液各５μＬを用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。以後、実施例１と全く同じ操作により、形質転換体Ｎｏ．７７を得た。
【０３５４】
次に、参考例１と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、転化率及び選択率は１００％であった。
【０３５５】
また、上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製した。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によってニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定した。その結果、表７７に示したクローンにおいてニトリルヒドラターゼのβサブユニットの５１番目のＰｈｅがＶａｌに置換されている事を確認した。
【０３５６】
【表７７】
2004194588.tif 000079
［実施例３９］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（７８）
βサブユニットの７２番目のＴｒｐをＰｈｅに置換するために、ｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型として、実施例１と同様の操作により部位特異的な変異導入を行った。
【０３５７】
実施例１で調製したｐＰＴ−ＤＢ１のプラスミドＤＮＡ１０ｎｇを各々鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号：７９記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号：８に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号：９に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号：１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１及びＮｏ．２の反応終了液各５μＬを用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。以後、実施例１と全く同じ操作により、形質転換体Ｎｏ．７８を得た。
【０３５８】
次に、参考例１と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、転化率及び選択率は１００％であった。
【０３５９】
また、上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製した。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によってニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定した。その結果、表７８に示したクローンにおいてニトリルヒドラターゼのβサブユニットの７２番目のＴｒｐがＰｈｅに置換されている事を確認した。
【０３６０】
【表７８】
2004194588.tif 000080
［実施例４０］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（７９）
βサブユニットの１１８番目のＰｈｅをＡｌａに置換するために、ｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型として、実施例１と同様の操作により部位特異的な変異導入を行った。
【０３６１】
実施例１で調製したｐＰＴ−ＤＢ１のプラスミドＤＮＡ１０ｎｇを各々鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号：８０記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号：８に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号：９に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号：１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１及びＮｏ．２の反応終了液各５μＬを用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。以後、実施例１と全く同じ操作により、形質転換体Ｎｏ．７９を得た。
【０３６２】
次に、参考例１と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、転化率及び選択率は１００％であった。
【０３６３】
また、上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製した。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によってニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定した。その結果、表７９に示したクローンにおいてニトリルヒドラターゼのβサブユニットの１１８番目のＰｈｅがＡｌａに置換されている事を確認した。
【０３６４】
【表７９】
2004194588.tif 000081
［実施例４１］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（８０）
βサブユニットの１１８番目のＰｈｅをＬｅｕに置換するために、ｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型として、実施例１と同様の操作により部位特異的な変異導入を行った。
【０３６５】
実施例１で調製したｐＰＴ−ＤＢ１のプラスミドＤＮＡ１０ｎｇを各々鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号：８１記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号：８に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号：９に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号：１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１及びＮｏ．２の反応終了液各５μＬを用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。以後、実施例１と全く同じ操作により、形質転換体Ｎｏ．８０を得た。
【０３６６】
次に、参考例１と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、転化率及び選択率は１００％であった。
【０３６７】
また、上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製した。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によってニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定した。その結果、表８０に示したクローンにおいてニトリルヒドラターゼのβサブユニットの１１８番目のＰｈｅがＬｅｕに置換されている事を確認した。
【０３６８】
【表８０】
2004194588.tif 000082
［実施例４２］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（８１）
βサブユニットの１１８番目のＰｈｅをＩｌｅに置換するために、ｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型として、実施例１と同様の操作により部位特異的な変異導入を行った。
【０３６９】
実施例１で調製したｐＰＴ−ＤＢ１のプラスミドＤＮＡ１０ｎｇを各々鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号：８２記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号：８に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号：９に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号：１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１及びＮｏ．２の反応終了液各５μＬを用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。以後、実施例１と全く同じ操作により、形質転換体Ｎｏ．８１を得た。
【０３７０】
次に、参考例１と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、転化率及び選択率は１００％であった。
【０３７１】
また、上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製した。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によってニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定した。その結果、表８１に示したクローンにおいてニトリルヒドラターゼのβサブユニットの１１８番目のＰｈｅがＩｌｅに置換されている事を確認した。
【０３７２】
【表８１】
2004194588.tif 000083
［実施例４３］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（８２）
βサブユニットの１１８番目のＰｈｅをＶａｌに置換するために、ｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型として、実施例１と同様の操作により部位特異的な変異導入を行った。
【０３７３】
実施例１で調製したｐＰＴ−ＤＢ１のプラスミドＤＮＡ１０ｎｇを各々鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号：８３記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号：８に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号：９に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号：１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１及びＮｏ．２の反応終了液各５μＬを用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。以後、実施例１と全く同じ操作により、形質転換体Ｎｏ．８２を得た。
【０３７４】
次に、参考例１と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、転化率及び選択率は１００％であった。
【０３７５】
また、上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製した。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によってニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定した。その結果、表８２に示したクローンにおいてニトリルヒドラターゼのβサブユニットの１１８番目のＰｈｅがＶａｌに置換されている事を確認した。
【０３７６】
【表８２】
2004194588.tif 000084
［実施例４４］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（８３）
βサブユニットの１２７番目のＬｅｕをＡｌａに置換するために、ｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型として、実施例１と同様の操作により部位特異的な変異導入を行った。
【０３７７】
実施例１で調製したｐＰＴ−ＤＢ１のプラスミドＤＮＡ１０ｎｇを各々鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号：８４記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号：８に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号：９に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号：１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１及びＮｏ．２の反応終了液各５μＬを用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。以後、実施例１と全く同じ操作により、形質転換体Ｎｏ．８３を得た。
【０３７８】
次に、参考例１と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、転化率及び選択率は１００％であった。
【０３７９】
また、上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製した。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によってニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定した。その結果、表８３に示したクローンにおいてニトリルヒドラターゼのβサブユニットの１２７番目のＬｅｕがＡｌａに置換されている事を確認した。
【０３８０】
【表８３】
2004194588.tif 000085
［実施例４５］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（８４）
βサブユニットの１２７番目のＬｅｕをＶａｌに置換するために、ｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型として、実施例１と同様の操作により部位特異的な変異導入を行った。
【０３８１】
実施例１で調製したｐＰＴ−ＤＢ１のプラスミドＤＮＡ１０ｎｇを各々鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号：８５記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号：８に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号：９に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号：１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１及びＮｏ．２の反応終了液各５μＬを用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。以後、実施例１と全く同じ操作により、形質転換体Ｎｏ．８４を得た。
【０３８２】
次に、参考例１と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、転化率及び選択率は１００％であった。
【０３８３】
また、上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製した。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によってニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定した。その結果、表８４に示したクローンにおいてニトリルヒドラターゼのβサブユニットの１２７番目のＬｅｕがＶａｌに置換されている事を確認した。
【０３８４】
【表８４】
2004194588.tif 000086
［実施例４６］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（８５）
βサブユニットの１２７番目のＬｅｕをＳｅｒに置換するために、ｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型として、実施例１と同様の操作により部位特異的な変異導入を行った。
【０３８５】
実施例１で調製したｐＰＴ−ＤＢ１のプラスミドＤＮＡ１０ｎｇを各々鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号：８６記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号：８に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号：９に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号：１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１及びＮｏ．２の反応終了液各５μＬを用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。以後、実施例１と全く同じ操作により、形質転換体Ｎｏ．８５を得た。
【０３８６】
次に、参考例１と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、転化率及び選択率は１００％であった。
【０３８７】
また、上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製した。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によってニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定した。その結果、表８５に示したクローンにおいてニトリルヒドラターゼのβサブユニットの１２７番目のＬｅｕがＳｅｒに置換されている事を確認した。
【０３８８】
【表８５】
2004194588.tif 000087
［実施例４７］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（８６）
βサブユニットの１４６番目のＡｒｇをＧｌｙに置換するために、ｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型として、実施例１と同様の操作により部位特異的な変異導入を行った。
【０３８９】
実施例１で調製したｐＰＴ−ＤＢ１のプラスミドＤＮＡ１０ｎｇを各々鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号：８７記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号：８に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号：９に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号：１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１及びＮｏ．２の反応終了液各５μＬを用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。以後、実施例１と全く同じ操作により、形質転換体Ｎｏ．８６を得た。
【０３９０】
次に、参考例１と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、転化率及び選択率は１００％であった。
【０３９１】
また、上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製した。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によってニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定した。その結果、表８６に示したクローンにおいてニトリルヒドラターゼのβサブユニットの１４６番目のＡｒｇがＧｌｙに置換されている事を確認した。
【０３９２】
【表８６】
2004194588.tif 000088
［実施例４８］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（８７）
βサブユニットの１６０番目のＡｒｇをＬｅｕに置換するために、ｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型として、実施例１と同様の操作により部位特異的な変異導入を行った。
【０３９３】
実施例１で調製したｐＰＴ−ＤＢ１のプラスミドＤＮＡ１０ｎｇを各々鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号：８８記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号：８に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号：９に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号：１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１及びＮｏ．２の反応終了液各５μＬを用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。以後、実施例１と全く同じ操作により、形質転換体Ｎｏ．８７を得た。
【０３９４】
次に、参考例１と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、転化率及び選択率は１００％であった。
【０３９５】
また、上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製した。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によってニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定した。その結果、表８７に示したクローンにおいてニトリルヒドラターゼのβサブユニットの１６０番目のＡｒｇがＬｅｕに置換されている事を確認した。
【０３９６】
【表８７】
2004194588.tif 000089
［実施例４９］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（８８）
βサブユニットの１６０番目のＡｒｇをＴｒｐに置換するために、ｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型として、実施例１と同様の操作により部位特異的な変異導入を行った。
【０３９７】
実施例１で調製したｐＰＴ−ＤＢ１のプラスミドＤＮＡ１０ｎｇを各々鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号：８９記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号：８に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号：９に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号：１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１及びＮｏ．２の反応終了液各５μＬを用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。以後、実施例１と全く同じ操作により、形質転換体Ｎｏ．８８を得た。
【０３９８】
次に、参考例１と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、転化率及び選択率は１００％であった。
【０３９９】
また、上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製した。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によってニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定した。その結果、表８８に示したクローンにおいてニトリルヒドラターゼのβサブユニットの１６０番目のＡｒｇがＴｒｐに置換されている事を確認した。
【０４００】
【表８８】
2004194588.tif 000090
［実施例５０］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（８９）
βサブユニットの１８６番目のＬｅｕをＧｌｕに置換するために、ｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型として、実施例１と同様の操作により部位特異的な変異導入を行った。
【０４０１】
実施例１で調製したｐＰＴ−ＤＢ１のプラスミドＤＮＡ１０ｎｇを各々鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号：９０記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号：８に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号：９に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号：１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１及びＮｏ．２の反応終了液各５μＬを用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。以後、実施例１と全く同じ操作により、形質転換体Ｎｏ．８９を得た。
【０４０２】
次に、参考例１と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、転化率及び選択率は１００％であった。
【０４０３】
また、上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製した。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によってニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定した。その結果、表８９に示したクローンにおいてニトリルヒドラターゼのβサブユニットの１８６番目のＬｅｕがＧｌｕに置換されている事を確認した。
【０４０４】
【表８９】
2004194588.tif 000091
［実施例５１］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（９０）
βサブユニットの１８６番目のＬｅｕをＡｓｐに置換するために、ｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型として、実施例１と同様の操作により部位特異的な変異導入を行った。
【０４０５】
実施例１で調製したｐＰＴ−ＤＢ１のプラスミドＤＮＡ１０ｎｇを各々鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号：９１記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号：８に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号：９に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号：１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１及びＮｏ．２の反応終了液各５μＬを用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。以後、実施例１と全く同じ操作により、形質転換体Ｎｏ．９０を得た。
【０４０６】
次に、参考例１と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、転化率及び選択率は１００％であった。
【０４０７】
また、上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製した。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によってニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定した。その結果、表９０に示したクローンにおいてニトリルヒドラターゼのβサブユニットの１８６番目のＬｅｕがＡｓｐに置換されている事を確認した。
【０４０８】
【表９０】
2004194588.tif 000092
［実施例５２］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（９１）
βサブユニットの１８６番目のＬｅｕをＬｙｓに置換するために、ｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型として、実施例１と同様の操作により部位特異的な変異導入を行った。
【０４０９】
実施例１で調製したｐＰＴ−ＤＢ１のプラスミドＤＮＡ１０ｎｇを各々鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号：９２記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号：８に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号：９に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号：１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１及びＮｏ．２の反応終了液各５μＬを用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。以後、実施例１と全く同じ操作により、形質転換体Ｎｏ．９１を得た。
【０４１０】
次に、参考例１と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、転化率及び選択率は１００％であった。
【０４１１】
また、上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製した。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によってニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定した。その結果、表９１に示したクローンにおいてニトリルヒドラターゼのβサブユニットの１８６番目のＬｅｕがＬｙｓに置換されている事を確認した。
【０４１２】
【表９１】
2004194588.tif 000093
［実施例５３］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（９２）
βサブユニットの１８６番目のＬｅｕをＡｒｇに置換するために、ｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型として、実施例１と同様の操作により部位特異的な変異導入を行った。
【０４１３】
実施例１で調製したｐＰＴ−ＤＢ１のプラスミドＤＮＡ１０ｎｇを各々鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号：９３記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号：８に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号：９に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号：１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１及びＮｏ．２の反応終了液各５μＬを用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。以後、実施例１と全く同じ操作により、形質転換体Ｎｏ．９２を得た。
【０４１４】
次に、参考例１と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、転化率及び選択率は１００％であった。
【０４１５】
また、上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製した。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によってニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定した。その結果、表９２に示したクローンにおいてニトリルヒドラターゼのβサブユニットの１８６番目のＬｅｕがＡｒｇに置換されている事を確認した。
【０４１６】
【表９２】
2004194588.tif 000094
［実施例５４］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（９３）
βサブユニットの１８６番目のＬｅｕをＡｓｎに置換するために、ｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型として、実施例１と同様の操作により部位特異的な変異導入を行った。
【０４１７】
実施例１で調製したｐＰＴ−ＤＢ１のプラスミドＤＮＡ１０ｎｇを各々鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号：９４記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号：８に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号：９に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号：１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１及びＮｏ．２の反応終了液各５μＬを用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。以後、実施例１と全く同じ操作により、形質転換体Ｎｏ．９３を得た。
【０４１８】
次に、参考例１と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、転化率及び選択率は１００％であった。
【０４１９】
また、上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製した。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によってニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定した。その結果、表９３に示したクローンにおいてニトリルヒドラターゼのβサブユニットの１８６番目のＬｅｕがＡｓｎに置換されている事を確認した。
【０４２０】
【表９３】
2004194588.tif 000095
［実施例５５］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（９４）
βサブユニットの１８６番目のＬｅｕをＳｅｒに置換するために、ｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型として、実施例１と同様の操作により部位特異的な変異導入を行った。
【０４２１】
実施例１で調製したｐＰＴ−ＤＢ１のプラスミドＤＮＡ１０ｎｇを各々鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号：９５記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号：８に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号：９に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号：１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１及びＮｏ．２の反応終了液各５μＬを用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。以後、実施例１と全く同じ操作により、形質転換体Ｎｏ．９４を得た。
【０４２２】
次に、参考例１と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、転化率及び選択率は１００％であった。
【０４２３】
また、上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製した。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によってニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定した。その結果、表９４に示したクローンにおいてニトリルヒドラターゼのβサブユニットの１８６番目のＬｅｕがＳｅｒに置換されている事を確認した。
【０４２４】
【表９４】
2004194588.tif 000096
［実施例５６］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（９５）
βサブユニットの１８６番目のＬｅｕをＧｌｙに置換するために、ｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型として、実施例１と同様の操作により部位特異的な変異導入を行った。
【０４２５】
実施例１で調製したｐＰＴ−ＤＢ１のプラスミドＤＮＡ１０ｎｇを各々鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号：９６記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号：８に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号：９に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号：１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１及びＮｏ．２の反応終了液各５μＬを用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。以後、実施例１と全く同じ操作により、形質転換体Ｎｏ．９５を得た。
【０４２６】
次に、参考例１と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、転化率及び選択率は１００％であった。
【０４２７】
また、上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製した。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によってニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定した。その結果、表９５に示したクローンにおいてニトリルヒドラターゼのβサブユニットの１８６番目のＬｅｕがＧｌｙに置換されている事を確認した。
【０４２８】
【表９５】
2004194588.tif 000097
［実施例５７］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（９６）
βサブユニットの２１７番目のＡｓｐをＧｌｙに置換するために、ｐＰＴ−ＤＢ１プラスミドＤＮＡを鋳型として、実施例１と同様の操作により部位特異的な変異導入を行った。
【０４２９】
実施例１で調製したｐＰＴ−ＤＢ１のプラスミドＤＮＡ１０ｎｇを各々鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号：９７記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号：８に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号：９に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号：１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μＬの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１及びＮｏ．２の反応終了液各５μＬを用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。以後、実施例１と全く同じ操作により、形質転換体Ｎｏ．９６を得た。
【０４３０】
次に、参考例１と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、転化率及び選択率は１００％であった。
【０４３１】
また、上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製した。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によってニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定した。その結果、表９６に示したクローンにおいてニトリルヒドラターゼのβサブユニットの２１７番目のＡｓｐがＧｌｙに置換されている事を確認した。
【０４３２】
【表９６】
2004194588.tif 000098
［実施例５８］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（９７）
クローンＮｏ．４０のアミノ酸変異（αサブユニットの３６番目：ＴｈｒがＭｅｔ）とクローンＮｏ．１１のアミノ酸変異（αサブユニットの１２６番目：ＰｈｅがＴｙｒ）を共に有しているアミノ酸置換体においてもニトリルヒドラターゼ活性が保持されていることを確認した。
【０４３３】
３０ｍｌの試験管に１０ｍｌのＬＢ液体培地を調製し、１２１℃・２０分間のオートクレーブにより滅菌した。この培地に終濃度が１００μｇ／ｍｌとなるようにアンピシリンを添加した後、参考例１１で得られたクローンＮｏ．１１を一白金耳植菌し、３７℃・３００ｒｐｍにて約２０時間培養した。該培養液１ｍｌを適当な遠心チューブに分取した後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ×５分）により菌体を分離した。続いてアルカリＳＤＳ抽出法により該菌体よりプラスミドＤＮＡを調製した。
【０４３４】
調製したプラスミドＤＮＡ１０ｎｇを各々鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号：４１記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号：８に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μｌの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号：９に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号：１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μｌの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１およびＮｏ．２の反応終了液各５μｌを用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。以後、実施例１と全く同じ操作により、形質転換体Ｎｏ．９７を得た。
【０４３５】
次に、参考例１と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、転化率及び選択率は１００％であった。
【０４３６】
また、上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製した。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によってニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定した。その結果、表９７に示したように野生型のニトリルヒドラターゼのαサブユニットの３６番目のＴｈｒがＭｅｔに、αサブユニットの１２６番目のＰｈｅがＴｙｒにそれぞれ置換されていた。
【０４３７】
【表９７】
2004194588.tif 000099
［実施例５９］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（９８）
クローンＮｏ．４２のアミノ酸変異（αサブユニットの１４８番目：ＧｌｙがＡｓｐ）とクローンＮｏ．４３のアミノ酸変異（αサブユニットの２０４番目：ＶａｌがＡｒｇ）を共に有しているアミノ酸置換体においてもニトリルヒドラターゼ活性が保持されていることを確認した。
【０４３８】
３０ｍｌの試験管に１０ｍｌのＬＢ液体培地を調製し、１２１℃・２０分間のオートクレーブにより滅菌した。この培地に終濃度が１００μｇ／ｍｌとなるようにアンピシリンを添加した後、実施例４で得られたクローンＮｏ．４３を一白金耳植菌し、３７℃・３００ｒｐｍにて約２０時間培養した。該培養液１ｍｌを適当な遠心チューブに分取した後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ×５分）により菌体を分離した。続いてアルカリＳＤＳ抽出法により該菌体よりプラスミドＤＮＡを調製した。
【０４３９】
調製したプラスミドＤＮＡ１０ｎｇを各々鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号：４３記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号：８に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μｌの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号：９に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号：１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μｌの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１およびＮｏ．２の反応終了液各５μｌを用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。以後、実施例１と全く同じ操作により、形質転換体Ｎｏ．９８を得た。
【０４４０】
次に、参考例１と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、転化率及び選択率は１００％であった。
【０４４１】
また、上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製した。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によってニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定した。その結果、表９８に示したように野生型のニトリルヒドラターゼのαサブユニットの１４番目のＧｌｙがＡｓｐに、αサブユニットの２０４番目のＶａｌがＡｒｇにそれぞれ置換されていた。
【０４４２】
【表９８】
2004194588.tif 000100
［実施例６０］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（９９）
クローンＮｏ．７７のアミノ酸変異（βサブユニットの５１番目：ＰｈｅがＶａｌ）とクローンＮｏ．２０のアミノ酸変異（βサブユニットの１０８番目：ＧｌｕがＡｓｐ）を共に有しているアミノ酸置換体においてもニトリルヒドラターゼ活性が保持されていることを確認した。
【０４４３】
３０ｍｌの試験管に１０ｍｌのＬＢ液体培地を調製し、１２１℃・２０分間のオートクレーブにより滅菌した。この培地に終濃度が１００μｇ／ｍｌとなるようにアンピシリンを添加した後、参考例２０で得られたクローンＮｏ．２０を一白金耳植菌し、３７℃・３００ｒｐｍにて約２０時間培養した。該培養液１ｍｌを適当な遠心チューブに分取した後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ×５分）により菌体を分離した。続いてアルカリＳＤＳ抽出法により該菌体よりプラスミドＤＮＡを調製した。
【０４４４】
調製したプラスミドＤＮＡ１０ｎｇを各々鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号：７８記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号：８に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μｌの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号：９に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号：１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μｌの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１およびＮｏ．２の反応終了液各５μｌを用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。以後、実施例１と全く同じ操作により、形質転換体Ｎｏ．９９を得た。
【０４４５】
次に、参考例１と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、転化率及び選択率は１００％であった。
【０４４６】
また、上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製した。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によってニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定した。その結果、表９９に示したように野生型のニトリルヒドラターゼのβサブユニットの５１番目のＰｈｅがＶａｌに、βサブユニットの１０８番目のＧｌｕがＡｓｐにそれぞれ置換されていた。
【０４４７】
【表９９】
2004194588.tif 000101
［参考例４０］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（１００）
クローンＮｏ．２０のアミノ酸変異（βサブユニットの１０８番目：ＧｌｕがＡｓｐ）とクローンＮｏ．３０のアミノ酸変異（βサブユニットの２００番目：ＡｌａがＧｌｕ）を共に有しているアミノ酸置換体においてもニトリルヒドラターゼ活性が保持されていることを確認した。
【０４４８】
３０ｍｌの試験管に１０ｍｌのＬＢ液体培地を調製し、１２１℃・２０分間のオートクレーブにより滅菌した。この培地に終濃度が１００μｇ／ｍｌとなるようにアンピシリンを添加した後、参考例３０で得られたクローンＮｏ．３０を一白金耳植菌し、３７℃・３００ｒｐｍにて約２０時間培養した。該培養液１ｍｌを適当な遠心チューブに分取した後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ×５分）により菌体を分離した。続いてアルカリＳＤＳ抽出法により該菌体よりプラスミドＤＮＡを調製した。
【０４４９】
調製したプラスミドＤＮＡ１０ｎｇを各々鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号：２９記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号：８に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μｌの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号：９に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号：１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μｌの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１およびＮｏ．２の反応終了液各５μｌを用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。以後、実施例１と全く同じ操作により、形質転換体Ｎｏ．１００を得た。
【０４５０】
次に、参考例１と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、転化率及び選択率は１００％であった。
【０４５１】
また、上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製した。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によってニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定した。その結果、表１００に示したように野生型のニトリルヒドラターゼのβサブユニットの１０８番目のＧｌｕがＡｓｐに、βサブユニットの２００番目のＡｌａがＧｌｕにそれぞれ置換されていた。
【０４５２】
【表１００】
2004194588.tif 000102
［実施例６１］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（１０１）
クローンＮｏ．８２のアミノ酸変異（βサブユニットの１１８番目：ＰｈｅがＶａｌ）とクローンＮｏ．３０のアミノ酸変異（βサブユニットの２００番目：ＡｌａがＧｌｕ）を共に有しているアミノ酸置換体においてもニトリルヒドラターゼ活性が保持されていることを確認した。
【０４５３】
３０ｍｌの試験管に１０ｍｌのＬＢ液体培地を調製し、１２１℃・２０分間のオートクレーブにより滅菌した。この培地に終濃度が１００μｇ／ｍｌとなるようにアンピシリンを添加した後、参考例３０で得られたクローンＮｏ．３０を一白金耳植菌し、３７℃・３００ｒｐｍにて約２０時間培養した。該培養液１ｍｌを適当な遠心チューブに分取した後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ×５分）により菌体を分離した。続いてアルカリＳＤＳ抽出法により該菌体よりプラスミドＤＮＡを調製した。
【０４５４】
調製したプラスミドＤＮＡ１０ｎｇを各々鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号：８３記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号：８に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μｌの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号：９に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号：１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μｌの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１およびＮｏ．２の反応終了液各５μｌを用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。以後、実施例１と全く同じ操作により、形質転換体Ｎｏ．１０１を得た。
【０４５５】
次に、参考例１と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、転化率及び選択率は１００％であった。
【０４５６】
また、上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製した。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によってニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定した。その結果、表１０１に示したように野生型のニトリルヒドラターゼのβサブユニットの１１８番目のＰｈｅがＶａｌに、βサブユニットの２００番目のＡｌａがＧｌｕにそれぞれ置換されていた。
【０４５７】
【表１０１】
2004194588.tif 000103
［実施例６２］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（１０２）
クローンＮｏ．８８のアミノ酸変異（βサブユニットの１６０番目：ＡｒｇがＴｒｐ）とクローンＮｏ．９２のアミノ酸変異（βサブユニットの１８６番目：ＬｅｕがＡｒｇ）を共に有しているアミノ酸置換体においてもニトリルヒドラターゼ活性が保持されていることを確認した。
【０４５８】
３０ｍｌの試験管に１０ｍｌのＬＢ液体培地を調製し、１２１℃・２０分間のオートクレーブにより滅菌した。この培地に終濃度が１００μｇ／ｍｌとなるようにアンピシリンを添加した後、実施例５３で得られたクローンＮｏ．９２を一白金耳植菌し、３７℃・３００ｒｐｍにて約２０時間培養した。該培養液１ｍｌを適当な遠心チューブに分取した後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ×５分）により菌体を分離した。続いてアルカリＳＤＳ抽出法により該菌体よりプラスミドＤＮＡを調製した。
【０４５９】
調製したプラスミドＤＮＡ１０ｎｇを各々鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号：８９記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号：８に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μｌの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号：９に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号：１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μｌの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１およびＮｏ．２の反応終了液各５μｌを用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。以後、実施例１と全く同じ操作により、形質転換体Ｎｏ．１０２を得た。
【０４６０】
次に、参考例１と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、転化率及び選択率は１００％であった。
【０４６１】
また、上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製した。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によってニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定した。その結果、表１０２に示したように野生型のニトリルヒドラターゼのβサブユニットの１６０番目のＡｒｇがＴｒｐに、βサブユニットの１８６番目のＬｅｕがＡｒｇにそれぞれ置換されていた。
【０４６２】
【表１０２】
2004194588.tif 000104
［実施例６３］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（１０３）
クローンＮｏ．２のアミノ酸変異（αサブユニットの６番目：ＬｅｕがＴｈｒ）とクローンＮｏ．９７のアミノ酸変異（αサブユニットの３６番目：ＴｈｒがＭｅｔ；αサブユニットの１２６番目：ＰｈｅがＴｙｒ）を共に有しているアミノ酸置換体においてもニトリルヒドラターゼ活性が保持されていることを確認した。
【０４６３】
３０ｍｌの試験管に１０ｍｌのＬＢ液体培地を調製し、１２１℃・２０分間のオートクレーブにより滅菌した。この培地に終濃度が１００μｇ／ｍｌとなるようにアンピシリンを添加した後、実施例５８で得られたクローンＮｏ．９７を一白金耳植菌し、３７℃・３００ｒｐｍにて約２０時間培養した。該培養液１ｍｌを適当な遠心チューブに分取した後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ×５分）により菌体を分離した。続いてアルカリＳＤＳ抽出法により該菌体よりプラスミドＤＮＡを調製した。
【０４６４】
調製したプラスミドＤＮＡ１０ｎｇを各々鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号：１１記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号：８に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μｌの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号：９に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号：１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μｌの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１およびＮｏ．２の反応終了液各５μｌを用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。以後、実施例１と全く同じ操作により、形質転換体Ｎｏ．１０３を得た。
【０４６５】
次に、参考例１と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、転化率及び選択率は１００％であった。
【０４６６】
また、上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製した。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によってニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定した。その結果、表１０３に示したように野生型のニトリルヒドラターゼのαサブユニットの６番目のＬｅｕがＴｈｒに、αサブユニットの３６番目のＴｈｒがＭｅｔに、αサブユニットの１２６番目のＰｈｅがＴｙｒにそれぞれ置換されていた。
【０４６７】
【表１０３】
2004194588.tif 000105
［実施例６４］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（１０４）
クローンＮｏ．４１のアミノ酸変異（αサブユニットの７１番目：ＡｒｇがＨｉｓ）とクローンＮｏ．３２のアミノ酸変異（αサブユニットの１９番目：ＡｌａがＶａｌ；αサブユニットの１２６番目：ＰｈｅがＴｙｒ）を共に有しているアミノ酸置換体においてもニトリルヒドラターゼ活性が保持されていることを確認した。
【０４６８】
３０ｍｌの試験管に１０ｍｌのＬＢ液体培地を調製し、１２１℃・２０分間のオートクレーブにより滅菌した。この培地に終濃度が１００μｇ／ｍｌとなるようにアンピシリンを添加した後、参考例３２で得られたクローンＮｏ．３２を一白金耳植菌し、３７℃・３００ｒｐｍにて約２０時間培養した。該培養液１ｍｌを適当な遠心チューブに分取した後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ×５分）により菌体を分離した。続いてアルカリＳＤＳ抽出法により該菌体よりプラスミドＤＮＡを調製した。
【０４６９】
調製したプラスミドＤＮＡ１０ｎｇを各々鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号：４２記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号：８に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μｌの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号：９に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号：１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μｌの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１およびＮｏ．２の反応終了液各５μｌを用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。以後、実施例１と全く同じ操作により、形質転換体Ｎｏ．１０４を得た。
【０４７０】
次に、参考例１と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、転化率及び選択率は１００％であった。
【０４７１】
また、上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製した。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によってニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定した。その結果、表１０４に示したように野生型のニトリルヒドラターゼのαサブユニットの１９番目のＡｌａがＶａｌに、αサブユニットの７１番目のＡｒｇがＨｉｓに、αサブユニットの１２６番目のＰｈｅがＴｙｒにそれぞれ置換されていた。
【０４７２】
【表１０４】
2004194588.tif 000106
［実施例６５］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（１０５）
クローンＮｏ．４０のアミノ酸変異（αサブユニットの３６番目：ＴｈｒがＭｅｔ）とクローンＮｏ．９８のアミノ酸変異（αサブユニットの１４８番目：ＧｌｙがＡｓｐ；αサブユニットの２０４番目：ＶａｌがＡｒｇ）を共に有しているアミノ酸置換体においてもニトリルヒドラターゼ活性が保持されていることを確認した。
【０４７３】
３０ｍｌの試験管に１０ｍｌのＬＢ液体培地を調製し、１２１℃・２０分間のオートクレーブにより滅菌した。この培地に終濃度が１００μｇ／ｍｌとなるようにアンピシリンを添加した後、実施例５９で得られたクローンＮｏ．９８を一白金耳植菌し、３７℃・３００ｒｐｍにて約２０時間培養した。該培養液１ｍｌを適当な遠心チューブに分取した後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ×５分）により菌体を分離した。続いてアルカリＳＤＳ抽出法により該菌体よりプラスミドＤＮＡを調製した。
【０４７４】
調製したプラスミドＤＮＡ１０ｎｇを各々鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号：４１記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号：８に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μｌの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号：９に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号：１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μｌの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１およびＮｏ．２の反応終了液各５μｌを用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。以後、実施例１と全く同じ操作により、形質転換体Ｎｏ．１０５を得た。
【０４７５】
次に、参考例１と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、転化率及び選択率は１００％であった。
【０４７６】
また、上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製した。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によってニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定した。その結果、表１０５に示したように野生型のニトリルヒドラターゼのαサブユニットの３６番目のＴｈｒがＭｅｔに、αサブユニットの１４８番目のＧｌｙがＡｓｐに、αサブユニットの２０４番目のＶａｌがＡｒｇにそれぞれ置換されていた。
【０４７７】
【表１０５】
2004194588.tif 000107
［実施例６６］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（１０６）
クローンＮｏ．４７のアミノ酸変異（βサブユニットの１０番目：ＴｈｒがＡｓｐ）とクローンＮｏ．１０１のアミノ酸変異（βサブユニットの１１８番目：ＰｈｅがＶａｌ；βサブユニットの２００番目：ＡｌａがＧｌｕ）を共に有しているアミノ酸置換体においてもニトリルヒドラターゼ活性が保持されていることを確認した。
【０４７８】
３０ｍｌの試験管に１０ｍｌのＬＢ液体培地を調製し、１２１℃・２０分間のオートクレーブにより滅菌した。この培地に終濃度が１００μｇ／ｍｌとなるようにアンピシリンを添加した後、実施例６１で得られたクローンＮｏ．１０１を一白金耳植菌し、３７℃・３００ｒｐｍにて約２０時間培養した。該培養液１ｍｌを適当な遠心チューブに分取した後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ×５分）により菌体を分離した。続いてアルカリＳＤＳ抽出法により該菌体よりプラスミドＤＮＡを調製した。
【０４７９】
調製したプラスミドＤＮＡ１０ｎｇを各々鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号：４８記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号：８に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μｌの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号：９に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号：１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μｌの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１およびＮｏ．２の反応終了液各５μｌを用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。以後、実施例１と全く同じ操作により、形質転換体Ｎｏ．１０６を得た。
【０４８０】
次に、参考例１と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、転化率及び選択率は１００％であった。
【０４８１】
また、上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製した。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によってニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定した。その結果、表１０６に示したように野生型のニトリルヒドラターゼのβサブユニットの１０番目のＴｈｒがＡｓｐに、βサブユニットの１１８番目のＰｈｅがＶａｌに、βサブユニットの２００番目のＡｌａがＧｌｕにそれぞれ置換されていた。
【０４８２】
【表１０６】
2004194588.tif 000108
［実施例６７］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（１０７）
クローンＮｏ．５６のアミノ酸変異（βサブユニットの３７番目：ＰｈｅがＬｅｕ）とクローンＮｏ．１００のアミノ酸変異（βサブユニットの１０８番目：ＧｌｕがＡｓｐ；βサブユニットの２００番目：ＡｌａがＧｌｕ）を共に有しているアミノ酸置換体においてもニトリルヒドラターゼ活性が保持されていることを確認した。
【０４８３】
３０ｍｌの試験管に１０ｍｌのＬＢ液体培地を調製し、１２１℃・２０分間のオートクレーブにより滅菌した。この培地に終濃度が１００μｇ／ｍｌとなるようにアンピシリンを添加した後、参考例４０で得られたクローンＮｏ．１００を一白金耳植菌し、３７℃・３００ｒｐｍにて約２０時間培養した。該培養液１ｍｌを適当な遠心チューブに分取した後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ×５分）により菌体を分離した。続いてアルカリＳＤＳ抽出法により該菌体よりプラスミドＤＮＡを調製した。
【０４８４】
調製したプラスミドＤＮＡ１０ｎｇを各々鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号：５７記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号：８に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μｌの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号：９に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号：１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μｌの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１およびＮｏ．２の反応終了液各５μｌを用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。以後、実施例１と全く同じ操作により、形質転換体Ｎｏ．１０７を得た。
【０４８５】
次に、参考例１と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、転化率及び選択率は１００％であった。
【０４８６】
また、上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製した。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によってニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定した。その結果、表１０７に示したように野生型のニトリルヒドラターゼのβサブユニットの３７番目のＰｈｅがＬｅｕに、βサブユニットの１０８番目のＧｌｕがＡｓｐに、βサブユニットの２００番目のＡｌａがＧｌｕにそれぞれ置換されていた。
【０４８７】
【表１０７】
2004194588.tif 000109
［実施例６８］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（１０８）
クローンＮｏ．５８のアミノ酸変異（βサブユニットの３７番目：ＰｈｅがＶａｌ）とクローンＮｏ．１００のアミノ酸変異（βサブユニットの１０８番目：ＧｌｕがＡｓｐ；βサブユニットの２００番目：ＡｌａがＧｌｕ）を共に有しているアミノ酸置換体においてもニトリルヒドラターゼ活性が保持されていることを確認した。
【０４８８】
３０ｍｌの試験管に１０ｍｌのＬＢ液体培地を調製し、１２１℃・２０分間のオートクレーブにより滅菌した。この培地に終濃度が１００μｇ／ｍｌとなるようにアンピシリンを添加した後、参考例４０で得られたクローンＮｏ．１００を一白金耳植菌し、３７℃・３００ｒｐｍにて約２０時間培養した。該培養液１ｍｌを適当な遠心チューブに分取した後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ×５分）により菌体を分離した。続いてアルカリＳＤＳ抽出法により該菌体よりプラスミドＤＮＡを調製した。
【０４８９】
調製したプラスミドＤＮＡ１０ｎｇを各々鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号：５９記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号：８に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μｌの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号：９に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号：１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μｌの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１およびＮｏ．２の反応終了液各５μｌを用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。以後、実施例１と全く同じ操作により、形質転換体Ｎｏ．１０８を得た。
【０４９０】
次に、参考例１と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、転化率及び選択率は１００％であった。
【０４９１】
また、上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製した。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によってニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定した。その結果、表１０８に示したように野生型のニトリルヒドラターゼのβサブユニットの３７番目のＰｈｅがＶａｌに、βサブユニットの１０８番目のＧｌｕがＡｓｐに、βサブユニットの２００番目のＡｌａがＧｌｕにそれぞれ置換されていた。
【０４９２】
【表１０８】
2004194588.tif 000110
［実施例６９］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（１０９）
クローンＮｏ．６３のアミノ酸変異（βサブユニットの４１番目：ＰｈｅがＩｌｅ）とクローンＮｏ．９９のアミノ酸変異（βサブユニットの５１番目：ＰｈｅがＶａｌ；βサブユニットの１０８番目：ＧｌｕがＡｓｐ）を共に有しているアミノ酸置換体においてもニトリルヒドラターゼ活性が保持されていることを確認した。
【０４９３】
３０ｍｌの試験管に１０ｍｌのＬＢ液体培地を調製し、１２１℃・２０分間のオートクレーブにより滅菌した。この培地に終濃度が１００μｇ／ｍｌとなるようにアンピシリンを添加した後、実施例６０で得られたクローンＮｏ．９９を一白金耳植菌し、３７℃・３００ｒｐｍにて約２０時間培養した。該培養液１ｍｌを適当な遠心チューブに分取した後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ×５分）により菌体を分離した。続いてアルカリＳＤＳ抽出法により該菌体よりプラスミドＤＮＡを調製した。
【０４９４】
調製したプラスミドＤＮＡ１０ｎｇを各々鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号：６４記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号：８に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μｌの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号：９に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号：１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μｌの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１およびＮｏ．２の反応終了液各５μｌを用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。以後、実施例１と全く同じ操作により、形質転換体Ｎｏ．１０９を得た。
【０４９５】
次に、参考例１と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、転化率及び選択率は１００％であった。
【０４９６】
また、上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製した。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によってニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定した。その結果、表１０９に示したように野生型のニトリルヒドラターゼのβサブユニットの４１番目のＰｈｅがＩｌｅに、βサブユニットの５１番目のＰｈｅがＶａｌに、βサブユニットの１０８番目のＧｌｕがＡｓｐにそれぞれ置換されていた。
【０４９７】
【表１０９】
2004194588.tif 000111
［実施例７０］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（１１０）
クローンＮｏ．６８のアミノ酸変異（βサブユニットの４６番目：ＭｅｔがＬｙｓ）とクローンＮｏ．３７のアミノ酸変異（βサブユニットの１０８番目：ＧｌｕがＡｒｇ；βサブユニットの２１２番目：ＳｅｒがＴｙｒ）を共に有しているアミノ酸置換体においてもニトリルヒドラターゼ活性が保持されていることを確認した。
【０４９８】
３０ｍｌの試験管に１０ｍｌのＬＢ液体培地を調製し、１２１℃・２０分間のオートクレーブにより滅菌した。この培地に終濃度が１００μｇ／ｍｌとなるようにアンピシリンを添加した後、参考例３７で得られたクローンＮｏ．３７を一白金耳植菌し、３７℃・３００ｒｐｍにて約２０時間培養した。該培養液１ｍｌを適当な遠心チューブに分取した後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ×５分）により菌体を分離した。続いてアルカリＳＤＳ抽出法により該菌体よりプラスミドＤＮＡを調製した。
【０４９９】
調製したプラスミドＤＮＡ１０ｎｇを各々鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号：６９記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号：８に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μｌの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号：９に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号：１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μｌの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１およびＮｏ．２の反応終了液各５μｌを用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。以後、実施例１と全く同じ操作により、形質転換体Ｎｏ．１１０を得た。
【０５００】
次に、参考例１と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、転化率及び選択率は１００％であった。
【０５０１】
また、上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製した。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によってニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定した。その結果、表１１０に示したように野生型のニトリルヒドラターゼのβサブユニットの４６番目のＭｅｔがＬｙｓに、βサブユニットの１０８番目のＧｌｕがＡｒｇに、βサブユニットの２１２番目のＳｅｒがＴｙｒにそれぞれ置換されていた。
【０５０２】
【表１１０】
2004194588.tif 000112
［実施例７１］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（１１１）
クローンＮｏ．７２のアミノ酸変異（βサブユニットの４８番目：ＬｅｕがＶａｌ）とクローンＮｏ．３７のアミノ酸変異（βサブユニットの１０８番目：ＧｌｕがＡｒｇ；βサブユニットの２１２番目：ＳｅｒがＴｙｒ）を共に有しているアミノ酸置換体においてもニトリルヒドラターゼ活性が保持されていることを確認した。
【０５０３】
３０ｍｌの試験管に１０ｍｌのＬＢ液体培地を調製し、１２１℃・２０分間のオートクレーブにより滅菌した。この培地に終濃度が１００μｇ／ｍｌとなるようにアンピシリンを添加した後、参考例３７で得られたクローンＮｏ．３７を一白金耳植菌し、３７℃・３００ｒｐｍにて約２０時間培養した。該培養液１ｍｌを適当な遠心チューブに分取した後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ×５分）により菌体を分離した。続いてアルカリＳＤＳ抽出法により該菌体よりプラスミドＤＮＡを調製した。
【０５０４】
調製したプラスミドＤＮＡ１０ｎｇを各々鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号：７３記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号：８に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μｌの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号：９に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号：１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μｌの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１およびＮｏ．２の反応終了液各５μｌを用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。以後、実施例１と全く同じ操作により、形質転換体Ｎｏ．１１１を得た。
【０５０５】
次に、参考例１と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、転化率及び選択率は１００％であった。
【０５０６】
また、上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製した。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によってニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定した。その結果、表１１１に示したように野生型のニトリルヒドラターゼのβサブユニットの４８番目のＬｅｕがＶａｌに、βサブユニットの１０８番目のＧｌｕがＡｒｇに、βサブユニットの２１２番目のＳｅｒがＴｙｒにそれぞれ置換されていた。
【０５０７】
【表１１１】
2004194588.tif 000113
［実施例７２］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（１１２）
クローンＮｏ．８５のアミノ酸変異（βサブユニットの１２７番目：ＬｅｕがＳｅｒ）と  クローンＮｏ．１０２のアミノ酸変異（βサブユニットの１６０番目：ＡｒｇがＴｒｐ；βサブユニットの１８６番目：ＬｅｕがＡｒｇ）を共に有しているアミノ酸置換体においてもニトリルヒドラターゼ活性が保持されていることを確認した。
【０５０８】
３０ｍｌの試験管に１０ｍｌのＬＢ液体培地を調製し、１２１℃・２０分間のオートクレーブにより滅菌した。この培地に終濃度が１００μｇ／ｍｌとなるようにアンピシリンを添加した後、実施例６２で得られたクローンＮｏ．１０２を一白金耳植菌し、３７℃・３００ｒｐｍにて約２０時間培養した。該培養液１ｍｌを適当な遠心チューブに分取した後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ×５分）により菌体を分離した。続いてアルカリＳＤＳ抽出法により該菌体よりプラスミドＤＮＡを調製した。
【０５０９】
調製したプラスミドＤＮＡ１０ｎｇを各々鋳型として２種類のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１は、配列表の配列番号：８６記載のプライマー及びＭ１３プライマーＭ４（配列表の配列番号：８に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μｌの系（組成はキットに記載の条件による）で、熱変性（９８℃）１５秒、アニーリング（５５℃）３０秒、伸長反応（７２℃）１２０秒の条件を２５サイクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．２は、ＭＵＴ４プライマー（配列表の配列番号：９に配列を記載）及びＭ１３プライマーＲＶ（配列表の配列番号：１０に配列を記載）を各々５０ｐｍｏｌ含む全量５０μｌの系（組成はキットに記載の条件による）で、ＰＣＲ反応Ｎｏ．１と同様の操作により行った。ＰＣＲ反応Ｎｏ．１およびＮｏ．２の反応終了液各５μｌを用いたアガロース電気泳動（アガロース濃度１．０重量％）によりＤＮＡ増幅産物の分析を行ったところ、増幅ＤＮＡ産物の存在が確認できた。以後、実施例１と全く同じ操作により、形質転換体Ｎｏ．１１２を得た。
【０５１０】
次に、参考例１と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、転化率及び選択率は１００％であった。
【０５１１】
また、上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製した。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によってニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定した。その結果、表１１２に示したように野生型のニトリルヒドラターゼのβサブユニットの１２７番目のＬｅｕがＳｅｒに、βサブユニットの１６０番目のＡｒｇがＴｒｐに、βサブユニットの１８６番目のＬｅｕがＡｒｇにそれぞれ置換されていた。
【０５１２】
【表１１２】
2004194588.tif 000114
［実施例７３］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（１１３）
クローンＮｏ．３４のアミノ酸変異とクローンＮｏ．１１０のアミノ酸変異を共に有しているアミノ酸置換体においてもニトリルヒドラターゼ活性が保持されていることを確認した。
【０５１３】
３０ｍｌの試験管に１０ｍｌのＬＢ液体培地を調製し、１２１℃・２０分間のオートクレーブにより滅菌した。この培地に終濃度が１００μｇ／ｍｌとなるようにアンピシリンを添加した後、参考例３４で得られたクローンＮｏ．３４および実施例７０で得られたクローンＮｏ．１１０を一白金耳植菌し、３７℃・３００ｒｐｍにて約２０時間培養した。該培養液１ｍｌを適当な遠心チューブに分取した後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ×５分）によりそれぞれの菌体を分離した。続いてアルカリＳＤＳ抽出法により該菌体よりクローンＮｏ．３４及びクローンＮｏ．１１０のプラスミドＤＮＡをそれぞれ調製した。
【０５１４】
クローンＮｏ．１１０のプラスミドＤＮＡをＥｃｏＲIおよびＮｏｔIによって切断した後、アガロースゲル電気泳動（シグマ社製タイプＶＩＩ低融点アガロース使用；アガロース濃度１．０％）を行い、アガロースゲルから約７７０ｂｐのＤＮＡ断片を切り出した。同様に、クローンＮｏ．３４のプラスミドＤＮＡをＥｃｏＲIおよびＮｏｔIによって切断した後、アガロースゲル電気泳動（シグマ社製タイプＶＩＩ低融点アガロース使用；アガロース濃度０．７％）を行い、アガロースゲルから約３．８ｋｂｐのＤＮＡ断片を切り出した。切りだした両アガロース片（約０．１ｇ）を細かく粉砕し１ｍｌのＴＥ溶液にそれぞれ懸濁後、５５℃で１時間保温してアガロースを完全に融解させた。この融解液に対してフェノール／クロロホルム抽出とエタノール沈澱を行って各ＤＮＡ断片を精製し、最終的に１０μｌのＴＥに溶解した。
【０５１５】
この様にして得られたクローンＮｏ．１１０由来の約７７０ｂｐのＤＮＡ断片とクローンＮｏ．３４由来の約３．８ＫｂｐのＤＮＡ断片をＤＮＡライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて連結させてプラスミドを構築した。このプラスミドにより大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体Ｎｏ．１１３を得た。
【０５１６】
次に、参考例１と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、転化率及び選択率は１００％であった。
【０５１７】
また、上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製した。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によってニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定した。その結果、表１１３に示したように野生型のニトリルヒドラターゼのαサブユニットの６番目のＬｅｕがＴｈｒに、αサブユニットの１９番目のＡｌａがＶａｌに、αサブユニットの１２６番目のＰｈｅがＴｙｒに、βサブユニットの４６番目のＭｅｔがＬｙｓに、βサブユニットの１０８番目のＧｌｕがＡｒｇに、βサブユニットの２１２番目のＳｅｒがＴｙｒにそれぞれ置換されていた。
【０５１８】
【表１１３】
2004194588.tif 000115
［実施例７４］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（１１４）
クローンＮｏ．３４のアミノ酸変異とクローンＮｏ．１１１のアミノ酸変異を共に有しているアミノ酸置換体においてもニトリルヒドラターゼ活性が保持されていることを確認した。
【０５１９】
３０ｍｌの試験管に１０ｍｌのＬＢ液体培地を調製し、１２１℃・２０分間のオートクレーブにより滅菌した。この培地に終濃度が１００μｇ／ｍｌとなるようにアンピシリンを添加した後、参考例３４で得られたクローンＮｏ．３４および実施例７１で得られたクローンＮｏ．１１１を一白金耳植菌し、３７℃・３００ｒｐｍにて約２０時間培養した。該培養液１ｍｌを適当な遠心チューブに分取した後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ×５分）によりそれぞれの菌体を分離した。続いてアルカリＳＤＳ抽出法により該菌体よりクローンＮｏ．３４及びクローンＮｏ．１１１のプラスミドＤＮＡをそれぞれ調製した。
【０５２０】
クローンＮｏ．１１１のプラスミドＤＮＡをＥｃｏＲIおよびＮｏｔIによって切断した後、アガロースゲル電気泳動（シグマ社製タイプＶＩＩ低融点アガロース使用；アガロース濃度１．０％）を行い、アガロースゲルから約７７０ｂｐのＤＮＡ断片を切り出した。同様に、クローンＮｏ．３４のプラスミドＤＮＡをＥｃｏＲIおよびＮｏｔIによって切断した後、アガロースゲル電気泳動（シグマ社製タイプＶＩＩ低融点アガロース使用；アガロース濃度０．７％）を行い、アガロースゲルから約３．８ｋｂｐのＤＮＡ断片を切り出した。切りだした両アガロース片（約０．１ｇ）を細かく粉砕し１ｍｌのＴＥ溶液にそれぞれ懸濁後、５５℃で１時間保温してアガロースを完全に融解させた。この融解液に対してフェノール／クロロホルム抽出とエタノール沈澱を行って各ＤＮＡ断片を精製し、最終的に１０μｌのＴＥに溶解した。
【０５２１】
この様にして得られたクローンＮｏ．１１１由来の約７７０ｂｐのＤＮＡ断片とクローンＮｏ．３４由来の約３．８ＫｂｐのＤＮＡ断片をＤＮＡライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて連結させてプラスミドを構築した。このプラスミドにより大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体Ｎｏ．１１４を得た。
【０５２２】
次に、参考例１と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、転化率及び選択率は１００％であった。
【０５２３】
また、上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製した。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によってニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定した。その結果、表１１４に示したように野生型のニトリルヒドラターゼのαサブユニットの６番目のＬｅｕがＴｈｒに、αサブユニットの１９番目のＡｌａがＶａｌに、αサブユニットの１２６番目のＰｈｅがＴｙｒに、βサブユニットの４８番目のＬｅｕがＶａｌに、βサブユニットの１０８番目のＧｌｕがＡｒｇに、βサブユニットの２１２番目のＳｅｒがＴｙｒにそれぞれ置換されていた。
【０５２４】
【表１１４】
2004194588.tif 000116
［実施例７５］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得
クローンＮｏ．３５のアミノ酸変異とクローンＮｏ．１１２のアミノ酸変異を共に有しているアミノ酸置換体においてもニトリルヒドラターゼ活性が保持されていることを確認した。
【０５２５】
３０ｍｌの試験管に１０ｍｌのＬＢ液体培地を調製し、１２１℃・２０分間のオートクレーブにより滅菌した。この培地に終濃度が１００μｇ／ｍｌとなるようにアンピシリンを添加した後、参考例３５で得られたクローンＮｏ．３５および実施例７２で得られたクローンＮｏ．１１２を一白金耳植菌し、３７℃・３００ｒｐｍにて約２０時間培養した。該培養液１ｍｌを適当な遠心チューブに分取した後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ×５分）によりそれぞれの菌体を分離した。続いてアルカリＳＤＳ抽出法により該菌体よりクローンＮｏ．３５及びクローンＮｏ．１１２のプラスミドＤＮＡをそれぞれ調製した。
【０５２６】
クローンＮｏ．１１２のプラスミドＤＮＡをＥｃｏＲIおよびＮｏｔIによって切断した後、アガロースゲル電気泳動（シグマ社製タイプＶＩＩ低融点アガロース使用；アガロース濃度１．０％）を行い、アガロースゲルから約７７０ｂｐのＤＮＡ断片を切り出した。同様に、クローンＮｏ．３５のプラスミドＤＮＡをＥｃｏＲIおよびＮｏｔIによって切断した後、アガロースゲル電気泳動（シグマ社製タイプＶＩＩ低融点アガロース使用；アガロース濃度０．７％）を行い、アガロースゲルから約３．８ｋｂｐのＤＮＡ断片を切り出した。切りだした両アガロース片（約０．１ｇ）を細かく粉砕し１ｍｌのＴＥ溶液にそれぞれ懸濁後、５５℃で１時間保温してアガロースを完全に融解させた。この融解液に対してフェノール／クロロホルム抽出とエタノール沈澱を行って各ＤＮＡ断片を精製し、最終的に１０μｌのＴＥに溶解した。
【０５２７】
この様にして得られたクローンＮｏ．１１２由来の約７７０ｂｐのＤＮＡ断片とクローンＮｏ．３５由来の約３．８ＫｂｐのＤＮＡ断片をＤＮＡライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて連結させてプラスミドを構築した。このプラスミドにより大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体Ｎｏ．１１５を得た。
【０５２８】
次に、参考例１と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、転化率及び選択率は１００％であった。
【０５２９】
また、上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製した。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によってニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定した。その結果、表１１５に示したように野生型のニトリルヒドラターゼのαサブユニットの６番目のＬｅｕがＡｌａに、αサブユニットの１９番目のＡｌａがＶａｌに、αサブユニットの１２６番目のＰｈｅがＴｙｒに、βサブユニットの１２７番目のＬｅｕがＳｅｒに、βサブユニットの１６０番目のＡｒｇがＴｒｐに、βサブユニットの１８６番目のＬｅｕがＡｒｇにそれぞれ置換されていた。
【０５３０】
【表１１５】
2004194588.tif 000117
［実施例７６］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（１１８）
クローンＮｏ．１０３のアミノ酸変異とクローンＮｏ．１０６のアミノ酸変異を共に有しているアミノ酸置換体においてもニトリルヒドラターゼ活性が保持されていることを確認した。
【０５３１】
３０ｍｌの試験管に１０ｍｌのＬＢ液体培地を調製し、１２１℃・２０分間のオートクレーブにより滅菌した。この培地に終濃度が１００μｇ／ｍｌとなるようにアンピシリンを添加した後、実施例６３で得られたクローンＮｏ．１０３および実施例６６で得られたクローンＮｏ．１０６を一白金耳植菌し、３７℃・３００ｒｐｍにて約２０時間培養した。該培養液１ｍｌを適当な遠心チューブに分取した後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ×５分）によりそれぞれの菌体を分離した。続いてアルカリＳＤＳ抽出法により該菌体よりクローンＮｏ．１０３及びクローンＮｏ．１０６のプラスミドＤＮＡをそれぞれ調製した。
【０５３２】
クローンＮｏ．１０６のプラスミドＤＮＡをＥｃｏＲIおよびＮｏｔIによって切断した後、アガロースゲル電気泳動（シグマ社製タイプＶＩＩ低融点アガロース使用；アガロース濃度１．０％）を行い、アガロースゲルから約７７０ｂｐのＤＮＡ断片を切り出した。同様に、クローンＮｏ．１０３のプラスミドＤＮＡをＥｃｏＲIおよびＮｏｔIによって切断した後、アガロースゲル電気泳動（シグマ社製タイプＶＩＩ低融点アガロース使用；アガロース濃度０．７％）を行い、アガロースゲルから約３．８ｋｂｐのＤＮＡ断片を切り出した。切りだした両アガロース片（約０．１ｇ）を細かく粉砕し１ｍｌのＴＥ溶液にそれぞれ懸濁後、５５℃で１時間保温してアガロースを完全に融解させた。この融解液に対してフェノール／クロロホルム抽出とエタノール沈澱を行って各ＤＮＡ断片を精製し、最終的に１０μｌのＴＥに溶解した。
【０５３３】
この様にして得られたクローンＮｏ．１０６由来の約７７０ｂｐのＤＮＡ断片とクローンＮｏ．１０３由来の約３．８ＫｂｐのＤＮＡ断片をＤＮＡライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて連結させてプラスミドを構築した。このプラスミドにより大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体Ｎｏ．１１６を得た。
【０５３４】
次に、参考例１と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、転化率及び選択率は１００％であった。
【０５３５】
また、上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製した。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によってニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定した。その結果、表１１６に示したように野生型のニトリルヒドラターゼのαサブユニットの６番目のＬｅｕがＴｈｒに、αサブユニットの３６番目のＴｈｒがＭｅｔに、αサブユニットの１２６番目のＰｈｅがＴｙｒに、βサブユニットの１０番目のＴｈｒがＡｓｐに、βサブユニットの１１８番目のＰｈｅがＶａｌに、βサブユニットの２００番目のＡｌａがＧｌｕにそれぞれ置換されていた。
【０５３６】
【表１１６】
2004194588.tif 000118
［実施例７７］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（１１９）
クローンＮｏ．１０４のアミノ酸変異とクローンＮｏ．１０７のアミノ酸変異を共に有しているアミノ酸置換体においてもニトリルヒドラターゼ活性が保持されていることを確認した。
【０５３７】
３０ｍｌの試験管に１０ｍｌのＬＢ液体培地を調製し、１２１℃・２０分間のオートクレーブにより滅菌した。この培地に終濃度が１００μｇ／ｍｌとなるようにアンピシリンを添加した後、実施例６４で得られたクローンＮｏ．１０４および実施例６７で得られたクローンＮｏ．１０７を一白金耳植菌し、３７℃・３００ｒｐｍにて約２０時間培養した。該培養液１ｍｌを適当な遠心チューブに分取した後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ×５分）によりそれぞれの菌体を分離した。続いてアルカリＳＤＳ抽出法により該菌体よりクローンＮｏ．１０４及びクローンＮｏ．１０７のプラスミドＤＮＡをそれぞれ調製した。
【０５３８】
クローンＮｏ．１０７のプラスミドＤＮＡをＥｃｏＲIおよびＮｏｔIによって切断した後、アガロースゲル電気泳動（シグマ社製タイプＶＩＩ低融点アガロース使用；アガロース濃度１．０％）を行い、アガロースゲルから約７７０ｂｐのＤＮＡ断片を切り出した。同様に、クローンＮｏ．１０４のプラスミドＤＮＡをＥｃｏＲIおよびＮｏｔIによって切断した後、アガロースゲル電気泳動（シグマ社製タイプＶＩＩ低融点アガロース使用；アガロース濃度０．７％）を行い、アガロースゲルから約３．８ｋｂｐのＤＮＡ断片を切り出した。切りだした両アガロース片（約０．１ｇ）を細かく粉砕し１ｍｌのＴＥ溶液にそれぞれ懸濁後、５５℃で１時間保温してアガロースを完全に融解させた。この融解液に対してフェノール／クロロホルム抽出とエタノール沈澱を行って各ＤＮＡ断片を精製し、最終的に１０μｌのＴＥに溶解した。
【０５３９】
この様にして得られたクローンＮｏ．１０７由来の約７７０ｂｐのＤＮＡ断片とクローンＮｏ．１０４由来の約３．８ＫｂｐのＤＮＡ断片をＤＮＡライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて連結させてプラスミドを構築した。このプラスミドにより大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体Ｎｏ．１１７を得た。
【０５４０】
次に、参考例１と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、転化率及び選択率は１００％であった。
【０５４１】
また、上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製した。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によってニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定した。その結果、表１１７に示したように野生型のニトリルヒドラターゼのαサブユニットの１９番目のＡｌａがＶａｌに、αサブユニットの７１番目のＡｒｇがＨｉｓに、αサブユニットの１２６番目のＰｈｅがＴｙｒに、βサブユニットの３７番目のＰｈｅがＬｅｕに、βサブユニットの１０８番目のＧｌｕがＡｓｐに、βサブユニットの２００番目のＡｌａがＧｌｕにそれぞれ置換されていた。
【０５４２】
【表１１７】
2004194588.tif 000119
［実施例７８］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（１２０）
クローンＮｏ．１０４のアミノ酸変異とクローンＮｏ．１０８のアミノ酸変異を共に有しているアミノ酸置換体においてもニトリルヒドラターゼ活性が保持されていることを確認した。
【０５４３】
３０ｍｌの試験管に１０ｍｌのＬＢ液体培地を調製し、１２１℃・２０分間のオートクレーブにより滅菌した。この培地に終濃度が１００μｇ／ｍｌとなるようにアンピシリンを添加した後、実施例６４で得られたクローンＮｏ．１０４および実施例６８で得られたクローンＮｏ．１０８を一白金耳植菌し、３７℃・３００ｒｐｍにて約２０時間培養した。該培養液１ｍｌを適当な遠心チューブに分取した後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ×５分）によりそれぞれの菌体を分離した。続いてアルカリＳＤＳ抽出法により該菌体よりクローンＮｏ．１０４及びクローンＮｏ．１０８のプラスミドＤＮＡをそれぞれ調製した。
【０５４４】
クローンＮｏ．１０８のプラスミドＤＮＡをＥｃｏＲIおよびＮｏｔIによって切断した後、アガロースゲル電気泳動（シグマ社製タイプＶＩＩ低融点アガロース使用；アガロース濃度１．０％）を行い、アガロースゲルから約７７０ｂｐのＤＮＡ断片を切り出した。同様に、クローンＮｏ．１０４のプラスミドＤＮＡをＥｃｏＲIおよびＮｏｔIによって切断した後、アガロースゲル電気泳動（シグマ社製タイプＶＩＩ低融点アガロース使用；アガロース濃度０．７％）を行い、アガロースゲルから約３．８ｋｂｐのＤＮＡ断片を切り出した。切りだした両アガロース片（約０．１ｇ）を細かく粉砕し１ｍｌのＴＥ溶液にそれぞれ懸濁後、５５℃で１時間保温してアガロースを完全に融解させた。この融解液に対してフェノール／クロロホルム抽出とエタノール沈澱を行って各ＤＮＡ断片を精製し、最終的に１０μｌのＴＥに溶解した。
【０５４５】
この様にして得られたクローンＮｏ．１０８由来の約７７０ｂｐのＤＮＡ断片とクローンＮｏ．１０４由来の約３．８ＫｂｐのＤＮＡ断片をＤＮＡライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて連結させてプラスミドを構築した。このプラスミドにより大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体Ｎｏ．１１８を得た。
【０５４６】
次に、参考例１と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、転化率及び選択率は１００％であった。
【０５４７】
また、上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製した。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によってニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定した。その結果、表１１８に示したように野生型のニトリルヒドラターゼのαサブユニットの１９番目のＡｌａがＶａｌに、αサブユニットの７１番目のＡｒｇがＨｉｓに、αサブユニットの１２６番目のＰｈｅがＴｙｒに、βサブユニットの３７番目のＰｈｅがＶａｌに、βサブユニットの１０８番目のＧｌｕがＡｓｐに、βサブユニットの２００番目のＡｌａがＧｌｕにそれぞれ置換されていた。
【０５４８】
【表１１８】
2004194588.tif 000120
［実施例７９］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（１１９）
クローンＮｏ．１０５のアミノ酸変異とクローンＮｏ．１０９のアミノ酸変異を共に有しているアミノ酸置換体においてもニトリルヒドラターゼ活性が保持されていることを確認した。
【０５４９】
３０ｍｌの試験管に１０ｍｌのＬＢ液体培地を調製し、１２１℃・２０分間のオートクレーブにより滅菌した。この培地に終濃度が１００μｇ／ｍｌとなるようにアンピシリンを添加した後、実施例６５で得られたクローンＮｏ．１０５および実施例６９で得られたクローンＮｏ．１０９を一白金耳植菌し、３７℃・３００ｒｐｍにて約２０時間培養した。該培養液１ｍｌを適当な遠心チューブに分取した後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ×５分）によりそれぞれの菌体を分離した。続いてアルカリＳＤＳ抽出法により該菌体よりクローンＮｏ．１０５及びクローンＮｏ．１０９のプラスミドＤＮＡをそれぞれ調製した。
【０５５０】
クローンＮｏ．１０９のプラスミドＤＮＡをＥｃｏＲIおよびＮｏｔIによって切断した後、アガロースゲル電気泳動（シグマ社製タイプＶＩＩ低融点アガロース使用；アガロース濃度１．０％）を行い、アガロースゲルから約７７０ｂｐのＤＮＡ断片を切り出した。同様に、クローンＮｏ．１０５のプラスミドＤＮＡをＥｃｏＲIおよびＮｏｔIによって切断した後、アガロースゲル電気泳動（シグマ社製タイプＶＩＩ低融点アガロース使用；アガロース濃度０．７％）を行い、アガロースゲルから約３．８ｋｂｐのＤＮＡ断片を切り出した。切りだした両アガロース片（約０．１ｇ）を細かく粉砕し１ｍｌのＴＥ溶液にそれぞれ懸濁後、５５℃で１時間保温してアガロースを完全に融解させた。この融解液に対してフェノール／クロロホルム抽出とエタノール沈澱を行って各ＤＮＡ断片を精製し、最終的に１０μｌのＴＥに溶解した。
【０５５１】
この様にして得られたクローンＮｏ．１０９由来の約７７０ｂｐのＤＮＡ断片とクローンＮｏ．１０５由来の約３．８ＫｂｐのＤＮＡ断片をＤＮＡライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて連結させてプラスミドを構築した。このプラスミドにより大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体Ｎｏ．１１９を得た。
【０５５２】
次に、参考例１と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、転化率及び選択率は１００％であった。
【０５５３】
また、上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製した。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によってニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定した。その結果、表１１９に示したように野生型のニトリルヒドラターゼのαサブユニットの３６番目のＴｈｒがＭｅｔに、αサブユニットの１４８番目のＧｌｙがＡｓｐに、αサブユニットの２０４番目のＶａｌがＡｒｇに、βサブユニットの４１番目のＰｈｅがＩｌｅに、βサブユニットの５１番目のＰｈｅがＶａｌに、βサブユニットの１０８番目のＧｌｕがＡｓｐにそれぞれ置換されていた。
【０５５４】
【表１１９】
2004194588.tif 000121
［実施例８０］ニトリルヒドラターゼ活性を保持したアミノ酸置換体の取得（１２０）
クローンＮｏ．９８のアミノ酸変異とクローンＮｏ．１００のアミノ酸変異を共に有しているアミノ酸置換体においてもニトリルヒドラターゼ活性が保持されていることを確認した。
【０５５５】
３０ｍｌの試験管に１０ｍｌのＬＢ液体培地を調製し、１２１℃・２０分間のオートクレーブにより滅菌した。この培地に終濃度が１００μｇ／ｍｌとなるようにアンピシリンを添加した後、実施例５９で得られたクローンＮｏ．９８および参考例４０で得られたクローンＮｏ．１００を一白金耳植菌し、３７℃・３００ｒｐｍにて約２０時間培養した。該培養液１ｍｌを適当な遠心チューブに分取した後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ×５分）によりそれぞれの菌体を分離した。続いてアルカリＳＤＳ抽出法により該菌体よりクローンＮｏ．９８及びクローンＮｏ．１００のプラスミドＤＮＡをそれぞれ調製した。
【０５５６】
クローンＮｏ．１００のプラスミドＤＮＡをＥｃｏＲIおよびＮｏｔIによって切断した後、アガロースゲル電気泳動（シグマ社製タイプＶＩＩ低融点アガロース使用；アガロース濃度１．０％）を行い、アガロースゲルから約７７０ｂｐのＤＮＡ断片を切り出した。同様に、クローンＮｏ．９８のプラスミドＤＮＡをＥｃｏＲIおよびＮｏｔIによって切断した後、アガロースゲル電気泳動（シグマ社製タイプＶＩＩ低融点アガロース使用；アガロース濃度０．７％）を行い、アガロースゲルから約３．８ｋｂｐのＤＮＡ断片を切り出した。切りだした両アガロース片（約０．１ｇ）を細かく粉砕し１ｍｌのＴＥ溶液にそれぞれ懸濁後、５５℃で１時間保温してアガロースを完全に融解させた。この融解液に対してフェノール／クロロホルム抽出とエタノール沈澱を行って各ＤＮＡ断片を精製し、最終的に１０μｌのＴＥに溶解した。
【０５５７】
この様にして得られたクローンＮｏ．１００由来の約７７０ｂｐのＤＮＡ断片とクローンＮｏ．９８由来の約３．８ＫｂｐのＤＮＡ断片をＤＮＡライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて連結させてプラスミドを構築した。このプラスミドにより大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換体Ｎｏ．１２０を得た。
【０５５８】
次に、参考例１と同じ方法により添加率及び選択率を求めたところ、転化率及び選択率は１００％であった。
【０５５９】
また、上記菌体からアルカリＳＤＳ抽出法によりプラスミドを調製した。続いて、ＡＢＩ社製のシークエンシングキットとオートシークエンサー３７３Ａを用いたダイデオキシ法によってニトリルヒドラターゼ遺伝子部分の塩基配列を決定した。その結果、表１２０に示したように野生型のニトリルヒドラターゼのαサブユニットの１４８番目のＧｌｙがＡｓｐに、αサブユニットの２０４番目のＶａｌがＡｒｇに、βサブユニットの１０８番目のＧｌｕがＡｓｐに、βサブユニットの２００番目のＡｌａがＧｌｕにそれぞれ置換されていた。
【０５６０】
【表１２０】
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【０５６１】
【発明の効果】
本発明により、シュードノカルディア・サーモフィラ由来のニトリルヒドラターゼの本質的な機能を変化させる事の無い新規な変異点を有するニトリルヒドラターゼのアミノ酸配列及び該遺伝子の塩基配列が提供される。さらに、該遺伝子を含むプラスミド、該プラスミドを含む形質転換体、該形質転換体を用いた該酵素の産生方法、及び該形質転換体を用いたニトリル化合物からの対応するアミド化合物の製造方法が提供される。
【０５６２】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】プラスミドｐＰＴ−ＤＢ１の制限酵素切断点地図を示す。
【符号の説明】
ｂｌａ：β−ラクタマーゼをコードする遺伝子を示す。
ＣｏｌＥ１-ｏｒｉ：ＣｏｌＥ１系の複製開始部位を示す。
ｌａｃＺ：ｐＵＣ１８由来のラクトースオペロンのプロモーターおよびオペレーター領域を示す。
ＮＨα：シュードノカルディア・サーモフィラ由来のニトリルヒドラターゼのαサブユニットをコードする遺伝子を示す。
ＮＨβ：シュードノカルディア・サーモフィラ由来のニトリルヒドラターゼのβサブユニットをコードする遺伝子を示す。
Ｐ１６：シュードノカルディア・サーモフィラ由来のニトリルヒドラターゼの活性化に関与するタンパク質をコードする遺伝子を示す。
【図１】
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