【誤訳訂正書】
【提出日】平成23年6月10日(2011.6.10)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【発明の詳細な説明】
【発明の名称】添加剤の少ないインフルエンザワクチン
【技術分野】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、インフルエンザウイルス感染に対する防御のためのワクチンの分野、特に、低レベルの薬学的添加剤を含むワクチンの分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
（背景技術）
種々の形態のインフルエンザウイルスワクチンが利用可能である（例えば、参考文献１（非特許文献１）の第１７章および第１８章を参照のこと）。ワクチンは、一般に、生のウイルスもしくは不活性化ウイルスのいずれかに基づく。不活性化ワクチンは、全ビリオン、「分解」ビリオン、もしくは精製表面抗原に基づき得る。
【０００３】
抗原性内容物に加えて、現在のインフルエンザワクチンは、種々の薬学的添加物および他の夾雑物（例えば、抗細菌性保存剤（例えば、チメロサール）；界面活性剤（例えば、ＣＴＡＢ、ポリソルベート８０、オクトキシノール  １０など）；抗生物質（例えば、ネオマイシン、カナマイシン）；ホルムアルデヒド；および卵由来物質（卵タンパク質（例えば、オボムコイド）およびニワトリＤＮＡを含む）を含む。
【０００４】
２００６／０７季の間に、例えば、米国において使用される４種の不活性化ワクチンの製造業者のデータシートは、以下の情報を明らかにしている：
【０００５】
【表１】
2010531348.tif 000001
ＦｌｕｖｉｒｉｎＴＭ  ２００６−０７製品と同様に、参考文献２（特許文献１）は、ホルムアルデヒドを含んでいないが、チメロサールおよび卵物質を含むワクチンを調製した。
【０００６】
本発明の目的は、さらに改善されたインフルエンザワクチン、およびそれらの製造のためのプロセスを提供することであり、これらワクチンおよびプロセスは、これら薬学的添加剤の量および／もしくは数を減少もしくは排除し、それによって、より純粋なワクチン生成物を与える。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第９７／１４４３４号パンフレット
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】ＰｌｏｔｋｉｎおよびＯｒｅｎｓｔｅｉｎ編、Ｖａｃｃｉｎｅｓ．２００４年、第４版
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の開示）
本発明によれば、インフルエンザワクチンは、水銀保存剤；抗生物質；ホルムアルデヒド；および卵由来物質のうちの少なくとも３種を欠いている。いくつかの実施形態において、ワクチンは、これら４種の成分のいずれをも含まない。
【００１０】
従って、本発明の一実施形態において、インフルエンザウイルス抗原を含むワクチンが提供され、ここで上記ワクチンは、水銀保存剤も、抗生物質も、卵由来物質も含まない。
【００１１】
ホルムアルデヒドを含まないワクチンが好ましい。従って、本発明は、インフルエンザウイルス抗原を含むワクチンを提供し、ここで上記ワクチンは、水銀保存剤も、抗生物質も、ホルムアルデヒドも含まない。本発明はまた、インフルエンザウイルス抗原を含むワクチンを提供し、ここで上記ワクチンは、抗生物質も、ホルムアルデヒドも、卵由来物質も含まない。
【００１２】
本発明はまた、インフルエンザウイルス抗原を含むワクチンを提供し、ここで上記ワクチンは、水銀保存剤も、抗生物質も、ホルムアルデヒドも、卵由来物質も含まない。
【００１３】
好ましいワクチンはまた、非常に少量のエンドトキシン含有量（例えば、０．１ＩＵ／ｍｌ未満）、好ましくは、０．０５ＩＵ／ｍｌ未満を有する。エンドトキシン測定の国際単位は周知であり、例えば、国際標準［３，４］（例えば、ＮＩＢＳＣから利用可能である２ｎｄ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  （Ｃｏｄｅ  ９４／５８０−ＩＳ））との比較によって、サンプルに対して計算され得る。卵中で増殖させたウイルスから調製される現在のワクチンは、０．５−５ＩＵ／ｍｌの範囲のエンドトキシンレベルを有する。
【００１４】
本発明はまた、インフルエンザウイルス抗原を調製するためのプロセスを提供し、上記プロセスは、以下の工程を包含する：（ｉ）インフルエンザウイルスを、卵由来物質および抗生物質の非存在下で細胞培養系において増殖させる工程；（ｉｉ）上記工程（ｉ）において増殖したインフルエンザウイルスを、ホルムアルデヒドの非存在下で不活性化する工程；ならびに（ｉｉｉ）上記不活性化インフルエンザウイルス由来のワクチン抗原処方物を、チメロサールの非存在下で調製する工程。上記得られた抗原処方物は、一価ワクチンもしくは多価ワクチンを調製するために使用され得るバルクワクチン抗原であり得る。
したがって、本発明は、以下の項目を提供する：
（項目１）
インフルエンザウイルス抗原を含むワクチンであって、ここで該ワクチンは、抗生物質も、ホルムアルデヒドも、卵由来物質も含まない、ワクチン。
（項目２）
インフルエンザウイルス抗原を含むワクチンであって、ここで該ワクチンは、水銀保存剤も、抗生物質も、ホルムアルデヒドも含まない、ワクチン。
（項目３）
インフルエンザウイルス抗原を含むワクチンであって、ここで該ワクチンは、水銀保存剤も、抗生物質も、卵由来物質も含まない、ワクチン。
（項目４）
インフルエンザウイルス抗原を含むワクチンであって、ここで該ワクチンは、水銀保存剤も、抗生物質も、ホルムアルデヒドも、卵由来物質も含まない、ワクチン。
（項目５）
０．１ＩＵ／ｍｌ未満のエンドトキシンを有する、項目１〜４のいずれか１項に記載のワクチン。
（項目６）
１５μｇのヘマグルチニンあたり１０ｎｇ未満の宿主細胞ＤＮＡを有する、項目１〜５のいずれか１項に記載のワクチン。
（項目７）
上記抗原は、全ウイルス抗原である、項目１〜６のいずれか１項に記載のワクチン。
（項目８）
上記抗原は、分解ウイルス抗原（ｓｐｌｉｔ  ｖｉｒｕｓ  ａｎｔｉｇｅｎ）である、項目１〜７のいずれか１項に記載のワクチン。
（項目９）
上記抗原は、精製表面糖タンパク質抗原である、項目１〜８のいずれか１項に記載のワクチン。
（項目１０）
上記抗原は、ビロソームである、項目１〜９のいずれか１項に記載のワクチン。
（項目１１）
１つより多いインフルエンザウイルス株に由来する抗原を含む、項目１〜１０のいずれか１項に記載のワクチン。
（項目１２）
インフルエンザウイルス抗原を調製するためのプロセスであって、該プロセスは、以下の工程：（ｉ）インフルエンザウイルスを、卵由来物質および抗生物質の非存在下で細胞培養系において増殖させる工程；（ｉｉ）工程（ｉ）において増殖させた該インフルエンザウイルスを、ホルムアルデヒドの非存在下で不活性化する工程；ならびに（ｉｉｉ）ワクチン抗原処方物を、チメロサールの非存在下で、該不活性化インフルエンザウイルスから調製する工程、
を包含する、プロセス。
【００１５】
（抗原成分）
本発明は、インフルエンザビリオンから調製されたインフルエンザウイルス抗原を使用する。
【００１６】
上記ビリオンは、ホルムアルデヒドを使用せずに不活性化される。ウイルスを不活性化させるための化学的手段は、以下の薬剤のうちの１種以上の有効量での処置を含む：界面活性剤、β−プロピオラクトン、もしくはＵＶ光。不活性化するためのさらなる化学的手段は、メチレンブルー、ソラレン、カルボキシフラーレン（Ｃ６０）もしくは任意のこれらの組み合わせでの処理を含む。ウイルス不活性化の他の方法は、当該分野で公知であり、例えば、２成分のエチルアミン（ｂｉｎａｒｙ  ｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）、アセチルエチレンイミン、もしくはガンマ線照射である。
【００１７】
ビリオンは、種々の方法によってウイルス含有流体から採取され得る。例えば、精製プロセスは、上記ビリオンを破壊するための界面活性剤を含む直線状のスクロース勾配溶液を使用する、ゾーン遠心分離を包含し得る。次いで、抗原は、必要に応じて希釈した後に、ダイアフィルトレーションによって精製され得る。
【００１８】
分解ビリオン（ｓｐｌｉｔ  ｖｉｒｉｏｎ）は、界面活性剤（例えば、エチルエーテル、ポリソルベート８０、デオキシコレート、トリ−Ｎ−ブチルホスフェート、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｎ１０１、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ  ＮＰ９など）で精製ビリオンを処理して、サブビリオン（ｓｕｂｖｉｒｉｏｎ）調製物を生成すること（「Ｔｗｅｅｎ−エーテル」分割プロセスが挙げられる）によって、得られる。インフルエンザウイルスを分割する方法は、当該分野で周知である（例えば、参考文献５〜１０などを参照のこと）。上記ウイルスの分割は、代表的には、感染性であろうと、非感染性であろうと、破壊濃度の分割薬剤（ｓｐｌｉｔｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）で、全ウイルスを破壊もしくはフラグメント化することによって、行われる。上記破壊は、上記ウイルスタンパク質の完全なもしくは部分的な可溶化を生じ、上記ウイルスの完全性を変化させる。好ましい分割薬剤は、非イオン性界面活性剤およびイオン性（例えば、カチオン性）界面活性剤（例えば、アルキルグリコシド、アルキルチオグリコシド、アシル糖、スルホベタイン、ベタイン、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−グルカミド、Ｈｅｃａｍｅｇ、アルキルフェノキシ−ポリエトキシエタノール、四級アンモニウム化合物、サルコシル、ＣＴＡＢ（セチルトリメチルアンモニウムブロミド）、トリ−Ｎ−ブチルホスフェート、Ｃｅｔａｖｌｏｎ、ミリスチルトリメチルアンモニウム塩、リポフェクチン、リポフェクタミン、およびＤＯＴＭＡ、オクチルフェノキシポリオキシエタノールもしくはノニルフェノキシポリオキシエタノール（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ界面活性剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００もしくはＴｒｉｔｏｎ  Ｎ１０１））、ポリオキシエチレンソルビタンエステル（Ｔｗｅｅｎ界面活性剤）、ポリオキシエチレンエーテル、ポリオキシエチレンエステルなどである。１つの有用な分割手順は、デオキシコール酸ナトリウムおよびホルムアルデヒドの連続した効果（ｃｏｎｓｅｃｕｔｉｖｅ  ｅｆｆｅｃｔ）を使用し、そして分割は、最初のビリオン精製（例えば、スクロース密度勾配溶液における）の間に起こり得る。分解ビリオンは、有用なことには、等張性リン酸ナトリウム緩衝化塩化ナトリウム溶液中に再懸濁され得る。
【００１９】
精製表面抗原ワクチンは、上記インフルエンザ表面抗原ヘマグルチニン、および代表的には、ノイラミニダーゼも含む。これらタンパク質を精製形態で調製するためのプロセスは、周知である。
【００２０】
インフルエンザ抗原はまた、ＩＮＦＬＥＸＡＬ  ＶＴＭ製品およびＩＮＶＡＶＡＣＴＭ製品のように、ビロソーム（核酸非含有ウイルス様リポソーム粒子）の形態で示され得る［１１］。
【００２１】
上記インフルエンザウイルスは、弱毒化され得る。上記インフルエンザウイルスは、温度感受性であり得る。上記インフルエンザウイルスは、低温適合され得る。しかし、これら３つの特徴は、生のウイルスワクチンとより大きく関連する。
【００２２】
ワクチンにおいて使用するためのヒトインフルエンザウイルス株は、流行期によって変化する。現在の大流行の狭間の期間において、ワクチンは、代表的には、２種のインフルエンザＡ型株（Ｈ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２）および１種のインフルエンザＢ型株を含み、三価ワクチンが代表的である。本発明はまた、流行株（すなわち、上記ワクチンレシピエントおよび一般のヒト集団が免疫学的に未経験である株）に由来するＨＡ（例えば、Ｈ２、Ｈ５、Ｈ７もしくはＨ９サブタイプ株（特に、インフルエンザＡ型ウイルスの）を使用し得、流行株についてのインフルエンザワクチンは、一価であり得るか、または流行株を追加した通常の三価ワクチンに基づき得る。しかし、流行期および上記ワクチン中に含まれる抗原の性質に依存して、本発明は、ＨＡサブタイプであるＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５もしくはＨ１６（インフルエンザＡウイルス）のうちの１種以上から防御し得る。本発明は、インフルエンザＡウイルスＮＡサブタイプであるＮ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８もしくはＮ９のうちの１種以上から防御し得る。
【００２３】
大流行の狭間の株（ｉｎｔｅｒ−ｐａｎｄｅｍｉｃ  ｓｔｒａｉｎ）に対して免疫するのに適しているのと同様に、本発明の組成物は、流行株に対して免疫するのに特に有用である。流行の発生を引き起こす可能性を与えるインフルエンザ株の特徴は、以下である：（ａ）上記インフルエンザ株は、現在流行っているヒト株におけるヘマグルチニンと比較して、新たなヘマグルチニンを含む（すなわち、１０年を超えてヒト集団において顕性でなかった（例えば、Ｈ２）か、またはヒト集団において以前に全く見られなかった（例えば、Ｈ５、Ｈ６もしくはＨ９、一般に、トリ集団においてのみ見られたもの）もの）、および／もしくは上記インフルエンザ株は、現在流行っているヒト株におけるノイラミニダーゼと比較して、新たなノイラミニダーゼを含み、その結果、上記ヒト集団は、上記株のヘマグルチニンおよび／もしくはノイラミニダーゼに対して免疫学的に未経験である；（ｂ）上記インフルエンザ株は、上記ヒト集団において水平感染することができる；ならびに（ｃ）上記インフルエンザ株は、ヒトに対して病原性である。Ｈ５ヘマグルチニンタイプを有するウイルスは、流行のインフルエンザ（例えば、Ｈ５Ｎ１株）に対して免疫するのに好ましい。他の考えられる株としては、Ｈ５Ｎ３、Ｈ９Ｎ２、Ｈ２Ｎ２、Ｈ７Ｎ１およびＨ７Ｎ７、ならびに任意の他の新生の潜在的に流行する株が挙げられる。Ｈ５サブタイプ内では、ウイルスは、ＨＡクレード１、ＨＡクレード１’、ＨＡクレード２もしくはＨＡクレード３［１２］に入り、クレード１および３は、特に適切である。
【００２４】
抗原が有用なことに上記組成物に含まれ得る他の株は、抗ウイルス療法に耐性（例えば、オセルタミビル［１３］および／もしくはザナミビルに耐性）である株（耐性流行株を含む［１４］）である。
【００２５】
本発明の組成物は、１種以上の（例えば、１種、２種、３種、４種もしくはそれ以上）のインフルエンザウイルス株（インフルエンザＡウイルスおよび／もしくはインフルエンザＢウイルスを含む）に由来する抗原を含み得る。一価ワクチンは、二価、三価、四価などであり得るように調製され得る。ワクチンが、１種より多いインフルエンザ株を含む場合、その異なる株は、代表的には、別個に増殖させられ、上記ウイルスが回収され、抗原が調製された後に混合される。従って、本発明のプロセスは、１種より多いインフルエンザ株由来の抗原を混合する工程を包含し得、このプロセスは、非冷蔵条件下で行われ得る。三価ワクチンが好ましく、２つのインフルエンザＡウイルス株および１つのインフルエンザＢウイルス株に由来する抗原を含む。
【００２６】
本発明のいくつかの実施形態において、上記組成物は、単一のインフルエンザＡ株に由来する抗原を含み得る。いくつかの実施形態において、上記組成物は、２つのインフルエンザＡ株に由来する抗原を含み得るが、ただし、これら２つの株は、Ｈ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２ではない。いくつかの実施形態において、上記組成物は、２つより多いインフルエンザＡ株に由来する抗原を含み得る。
【００２７】
上記インフルエンザウイルスは、リアソータント株（ｒｅａｓｓｏｒｔａｎｔ  ｓｔｒａｉｎ）であり得、逆遺伝学技術によって得られてきた可能性がある。逆遺伝学技術［例えば、１５〜１９］は、望ましいゲノムセグメントを有するインフルエンザウイルスが、プラスミドを使用してインビトロで調製されることを可能にする。代表的には、これは、（ａ）望ましいウイルスＲＮＡ分子（例えば、ｐｏｌＩプロモーターから）をコードするＤＮＡ分子、および（ｂ）ウイルスタンパク質（例えば、ｐｏｌＩＩプロモーターから）をコードするＤＮＡ分子を発現する工程を包含し、その結果、細胞における両方のタイプのＤＮＡの発現は、完全なインタクトな感染性ビリオンのアセンブリをもたらす。上記ＤＮＡは、好ましくは、上記ウイルスＲＮＡおよびタンパク質の全てを提供するが、上記ＲＮＡおよびタンパク質のうちのいくつかを提供するために、ヘルパーウイルスを使用することも可能である。各ウイルスＲＮＡを生成するために別個のプラスミドを使用するプラスミドベースの方法が好ましく［２０〜２２］、これら方法はまた、上記ウイルスタンパク質の全てもしくはいくつか（例えば、ＰＢ１タンパク質、ＰＢ２タンパク質、ＰＡタンパク質およびＮＰタンパク質のみ）を発現するためにプラスミドを使用することを包含し、最大１２個までのプラスミドがいくつかの方法において使用される。必要とされるプラスミドの数を減らすために、近年のアプローチ［２３］は、（ウイルスＲＮＡ合成のために）同じプラスミド上の複数のＲＮＡポリメラーゼＩ転写カセット（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個もしくは８個全てのインフルエンザＡ  ｖＲＮＡセグメントをコードする配列）、および別のプラスミド上のＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターを有する複数のタンパク質コード領域（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個もしくは８個全てのインフルエンザＡ  ｍＲＮＡ転写物をコードする配列）を合わせる。上記参考文献２３の方法の好ましい局面は、（ａ）単一のプラスミド上のＰＢ１、ＰＢ２およびＰＡ  ｍＲＮＡコード領域；ならびに（ｂ）単一のプラスミド上の全部で８個のｖＲＮＡコードセグメントを含む。１つのプラスミド上に上記ＮＡおよびＨＡセグメントを、ならびに別のプラスミド上に６つの他のセグメントを含めることはまた、事態を促進し得る。
【００２８】
ｐｏｌＩプロモーターを使用して、上記ウイルスＲＮＡセグメントをコードするための代替として、バクテリオファージポリメラーゼプロモーターを使用することが可能である［２４］。例えば、ＳＰ６、Ｔ３もしくはＴ７ポリメラーゼのためのプロモーターが、便利には、使用され得る。ｐｏｌＩプロモーターの種特異性が原因で、バクテリオファージポリメラーゼプロモーターは、多くの細胞型（例えば、ＭＤＣＫ）のためのより便利であり得るが、細胞はまた、外因性ポリメラーゼ酵素をコードするプラスミドでトランスフェクトされなければならない。
【００２９】
他の技術において、二重のｐｏｌＩプロモーターおよびｐｏｌＩＩプロモーターを使用して、上記ウイルスＲＮＡおよび単一のテンプレートに由来する発現可能なｍＲＮＡを同時にコードすることが可能である［２５，２６］。
【００３０】
従って、上記ウイルスは、特に、インフルエンザＡウイルスは、Ａ／ＰＲ／８／３４ウイルスに由来する１つ以上のＲＮＡセグメント（代表的には、Ａ／ＰＲ／８／３４に由来する６つのセグメント）を含み得、上記ＨＡおよびＮセグメントは、ワクチン株（すなわち、６：２リアソータント）に由来する。これはまた、Ａ／ＷＳＮ／３３ウイルスに由来するか、もしくはワクチン調製のためのリアソータントウイルスを生成するために有用な任意の他のウイルス株に由来する１つ以上のＲＮＡセグメントを含み得る。代表的には、本発明は、ヒトからヒトへ伝染し得る株から防御し、よってこの株のゲノムは、通常、哺乳動物（例えば、ヒト）インフルエンザウイルスから生じる少なくとも１つのＲＮＡセグメントを含む。これはまた、トリインフルエンザウイルスから生じるＮＳセグメントを含み得る。
【００３１】
上記のように、上記抗原の供給源として使用されるウイルスは、一般に、細胞培養で増殖させられ、それによって、有精卵（ｅｍｂｒｙｏｎａｔｅｄ  ｈｅｎ  ｅｇｇ）に由来する成分による汚染を避ける。従って、本発明のワクチンは、ニワトリＤＮＡを含まない可能性があり、同様に、卵タンパク質を含まない（例えば、オボアルブミンおよびオボムコイド）。
【００３２】
上記細胞基質は、代表的には、哺乳動物起源の細胞株である。適切な起源哺乳動物細胞としては、ハムスター、ウシ、霊長類（ヒトおよびサルが挙げられる）およびイヌの細胞が挙げられるが、これらに限定されない。種々の細胞タイプが使用され得る（例えば、腎臓細胞、線維芽細胞、網膜細胞、肺細胞など）。適切なハムスター細胞の例は、名称ＢＨＫ２１もしくはＨＫＣＣを有する細胞株である。適切なサル細胞は、例えば、アフリカミドリザル細胞（例えば、Ｖｅｒｏ細胞株におけるような腎臓細胞）である。適切なイヌ細胞は、例えば、ＭＤＣＫ細胞株におけるような腎臓細胞である。従って、適切な細胞株としては、ＭＤＣＫ；ＣＨＯ；２９３Ｔ；ＢＨＫ；Ｖｅｒｏ；ＭＲＣ−５；ＰＥＲ．Ｃ６；ＷＩ−３８；などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３３】
インフルエンザウイルスを増殖させるための好ましい哺乳動物細胞株としては、Ｍａｄｉｎ  Ｄａｒｂｙイヌ腎臓に由来するＭＤＣＫ細胞［２７〜３０］；アフリカミドリザル（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ  ａｅｔｈｉｏｐｓ）腎臓に由来するＶｅｒｏ細胞［３１〜３３］；もしくはヒト胚性網膜芽（ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔ）に由来するＰＥＲ．Ｃ６細胞［３４］が挙げられる。これら細胞株は、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）［３５］、Ｃｏｒｉｅｌｌ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｉｅｓ［３６］、もしくはＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）から広く利用可能である。例えば、上記ＡＴＣＣは、種々の異なるＶｅｒｏ細胞を、カタログ番号ＣＣＬ−８１、ＣＣＬ−８１．２、ＣＲＬ−１５８６およびＣＲＬ−１５８７の下で供給しており、ＭＤＣＫ細胞を、カタログ番号ＣＣＬ−３４の下で供給している。ＰＥＲ．Ｃ６は、受託番号９６０２２９４０の下でＥＣＡＣＣから入手可能である。哺乳動物細胞株の代替として、ウイルスは、トリ細胞株［例えば、参考文献３７−３８、３９］上で増殖させられ得る（トリ胚性幹細胞［３７、４０］およびアヒル（例えば、アヒル網膜）もしくはニワトリに由来する細胞株が挙げられる）。適切なトリ胚性幹細胞としては、ニワトリ胚性幹細胞、ＥＢ４５、ＥＢ１４、およびＥＢ１４−０７４に由来するＥＢｘ細胞株が挙げられる［４１］。ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）がまた、使用され得るなど。
【００３４】
インフルエンザウイルスを増殖させるための最も好ましい細胞株は、ＭＤＣＫ細胞株である。上記のもとのＤＣＫ細胞株は、ＡＴＣＣから、ＣＣＬ−３４として入手可能であるが、この細胞株の派生物がまた、使用され得る。例えば、参考文献２７は、懸濁培養での増殖に適したＭＤＣＫ細胞株を開示する（ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２２１９として寄託された「ＭＤＣＫ  ３３０１６」）。同様に、参考文献４２は、無血清培養の懸濁物中で増殖させるＭＤＣＫ由来細胞株を開示する（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７４４９として寄託される「Ｂ−７０２」）。参考文献４３は、非腫瘍形成性ＭＤＣＫ細胞（「ＭＤＣＫ−Ｓ」（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６５００）、「ＭＤＣＫ−ＳＦ１０１」（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６５０１）、「ＭＤＣＫ−ＳＦ１０２」（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６５０２）および「ＭＤＣＫ−ＳＦ１０３」（ＰＴＡ−６５０３）が挙げられる）を開示する。参考文献４４は、非常に感染しやすいＭＤＣＫ細胞株（「ＭＤＣＫ．５Ｆ１」細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ-１２０４２）が挙げられる）を開示する。これらＭＤＣＫ細胞株のうちのいずれかが、使用され得る。
【００３５】
細胞増殖のための培養、および同様に、上記培養を開始するために使用されるウイルス接種物は、好ましくは、単純ヘルペスウイルス、ＲＳウイルス、パラインフルエンザウイルス３、ＳＡＲＳコロナウイルス、アデノウイルス、ライノウイルス、レオウイルス、ポリオーマウイルス、ビルナウイルス、サーコウイルス、および／もしくはパルボウイルスを実質的に含まない（すなわち、夾雑について試験され、陰性結果を与える）［４５］。単純ヘルペスウイルスの非存在は、特に好ましい。
【００３６】
ウイルスは、懸濁培養［２７、４６、４７］もしくは接着培養において、細胞上で増殖させられ得る。一実施形態において、上記細胞は、懸濁物中での増殖のために適合され得る。懸濁培養における増殖のために適合されている１つの適切なＭＤＣＫ細胞株は、ＭＤＣＫ  ３３０１６（ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２２１９として寄託された）である。代替として、マイクロキャリア培養（ｍｉｃｒｏｃａｒｒｉｅｒ  ｃｕｌｔｕｒｅ）が使用され得る。
【００３７】
インフルエンザウイルス複製を支援する細胞株は、好ましくは、無血清培養培地および／もしくはタンパク質非含有培地中で増殖される。培地は、本発明の状況において無血清培地として言及され、無血清培地中では、ヒトもしくは動物起源の血清に由来する添加物は存在しない。タンパク質非含有は、上記細胞の増殖が、タンパク質、増殖因子、他のタンパク質添加物および非血清タンパク質を排除しても生じるが、必要に応じて、ウイルス増殖のために必要であり得る、トリプシンもしくは他のプロテアーゼのようなタンパク質を含み得る培地を意味することが理解される。このような培養において増殖している細胞は、天然には、タンパク質自体を含む。
【００３８】
インフルエンザウイルス複製を支援している細胞株は、好ましくは、ウイルス複製の間に、３７℃未満［４８］（例えば、３０〜３６℃）で増殖させられる。
【００３９】
培養細胞においてウイルスを増殖させるための方法は、一般に、上記培養細胞に、培養されるべき株を接種する工程、上記感染細胞を、ウイルス増殖のために、例えば、ウイルス力価もしくは抗原発現によって決定される場合、所望の期間にわたって（例えば、接種後２４〜１６８時間の間）培養する工程、および上記増殖したウイルスを回収する工程を包含する。上記培養細胞に、１：５００〜１：１、好ましくは、１：１００〜１：５、より好ましくは、１：５０〜１：１０のウイルス対  細胞比で接種する（ＰＦＵもしくはＴＣＩＤ５０によって測定される）。上記ウイルスは、上記細胞の懸濁物に添加されるか、または上記細胞の単層に適用され、そして上記ウイルスは、少なくとも６０分間にわたって、しかし通常は、３００分間未満、好ましくは、９０〜２４０分間の間、２５℃〜４０℃、好ましくは、２８℃〜３７℃で、上記細胞上で吸収される。上記感染細胞培養物（例えば、単層）は、凍結−融解によって、もしくは酵素作用によって、取り出されて、採取される培養上清のウイルス含有量を増大させる。次いで、上記採取した流体は、不活性化されるかもしくは凍結して貯蔵される。培養細胞は、約０．０００１〜１０、好ましくは、０．００２〜５、より好ましくは、０．００１〜２の感染多重度（「ｍ．ｏ．ｉ．」）で感染させられ得る。さらにより好ましくは、上記細胞は、約０．０１のｍ．ｏ．ｉで感染させられる。感染細胞は、感染後３０〜６０時間で回収され得る。好ましくは、上記細胞は、感染後３４〜４８時間で回収される。さらにより好ましくは、上記細胞は、感染後３８〜４０時間で回収される。プロテアーゼ（代表的には、トリプシン）は、一般に、細胞培養の間にウイルス放出を可能にするために添加され、上記プロテアーゼは、上記培養の間の任意の適切な段階で添加され得る。本発明によれば、抗生物質は、上記培養の間に回避され得る。
【００４０】
インフルエンザワクチンは、現在では、ＨＡレベル（代表的には、ＳＲＩＤによって測定される）を参照することによって標準化されている。既存のワクチンは、代表的には、１株あたり約１５μｇのＨＡを含むが、より低用量が使用され得る（例えば、アジュバントを使用する場合）。分割量（例えば、１／２（すなわち、７．５μｇ  ＨＡ／株））、１／４および１／８が、より高い用量（例えば、３×もしくは９×用量［４９、５０］）が使用されてきたのと同様に、使用されている［６２、６３］。従って、ワクチンは、インフルエンザ株１つあたり０．１〜１５０μｇの間のＨＡ、好ましくは、０．１〜５０μｇ、例えば、０．１〜２０μｇ、０．１〜１５μｇ、０．１〜１０μｇ、０．１〜７．５μｇ、０．５〜５μｇなどを含み得る。特定の用量は、例えば、１株あたり約９０、約４５、約３０、約１５、約１０、約７．５、約５、約３．８、約１．９、約１．５を含む。本発明のワクチン、キットおよびプロセスの成分（例えば、それらの容積および濃度）は、最終製品中にこれら抗原用量を提供するために選択され得る。
【００４１】
本発明で使用されるＨＡは、ウイルス中で見いだされるような天然のＨＡであり得るか、または改変され得る。例えば、ＨＡを改変して、抗原決定基（例えば、ＨＡ１とＨＡ２との間の切断部位の周りのような過塩基性領域）を除去することは、公知である。
【００４２】
ヘマグルチニンを含むのと同様に、本発明の組成物は、さらなるインフルエンザウイルスタンパク質を含み得る。例えば、それらは、代表的には、ノイラミニダーゼ糖タンパク質を含む。それらはまた、マトリクスタンパク質（例えば、Ｍ１および／もしくはＭ２）（もしくはそのフラグメント）、および／もしくは核タンパク質を含み得る。
【００４３】
（宿主細胞ＤＮＡ）
ウイルスが、細胞株で増殖させられた場合、次いで、残りの細胞株ＤＮＡのいかなる腫瘍形成活性を最少にするために、その最終ワクチン中の上記残りの細胞株ＤＮＡの量を最少にすることは、標準的実務である。従って、上記組成物は、好ましくは、１用量あたり１０ｎｇ未満（好ましくは、１ｎｇ未満、およびより好ましくは、１００ｐｇ未満）の残りの宿主細胞ＤＮＡを含むが、微量の宿主細胞ＤＮＡが存在し得る。一般には、本発明の組成物から排除されることが望ましい上記宿主細胞ＤＮＡは、１００ｂｐより長いＤＮＡである。
【００４４】
残りの宿主細胞ＤＮＡの測定は、生物製剤の慣用的な規制要件であり、当業者の通常の能力の範囲内である。ＤＮＡを測定するために使用されるアッセイは、代表的には、確証されたアッセイである［５１、５２］。確証されたアッセイの性能的特徴は、数学的かつ定量的な用語で記載され得、その誤差の考えられる原因が同定されている。上記アッセイは、一般に、正確性、精度、特異性のような特徴について試験されている。一旦アッセイが較正され（例えば、宿主細胞ＤＮＡの既知の標準的な量に対して）、試験されたら、定量的ＤＮＡ測定が、慣用的に行われ得る。ＤＮＡ定量の３つの基本技術が、使用され得る：ハイブリダイゼーション法（例えば、サザンブロットもしくはスロットブロット［５３］）；イムノアッセイ法（例えば、ＴｈｒｅｓｈｏｌｄＴＭ  Ｓｙｓｔｅｍ［５４］）；および定量的ＰＣＲ［５５］。これら方法は、当業者が全て精通しているが、各方法の精度特徴は、問題の宿主細胞、例えば、ハイブリダイゼーションのためのプローブの選択、増幅のためのプライマーおよび／もしくはプローブの選択などに依存する。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓの上記ＴｈｒｅｓｈｏｌｄＴＭ  Ｓｙｓｔｅｍは、総ＤＮＡのピコグラムレベルについての定量的アッセイであり、生物薬剤中の夾雑ＤＮＡのレベルをモニターするために使用されてきた［５４］。代表的なアッセイは、ビオチン化ｓｓＤＮＡ結合タンパク質と、ウレアーゼ結合体化抗ｓｓＤＮＡ抗体、ＤＮＡとの間の反応複合体の非配列特異的形成を伴う。全てのアッセイ成分は、上記製造業者から入手可能なｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｔｏｔａｌ  ＤＮＡ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ中に含まれる。種々の商業的製造業者が、残りの宿主細胞ＤＮＡを検出するための定量的ＰＣＲアッセイを提供している（例えば、ＡｐｐＴｅｃＴＭ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＢｉｏＲｅｌｉａｎｃｅＴＭ、Ａｌｔｈｅａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓなど）。ヒトウイルスワクチンの宿主細胞ＤＮＡ夾雑を測定するためのケミルミネッセントハイブリダイゼーションアッセイおよび総ＤＮＡ  ＴｈｒｅｓｈｏｌｄＴＭ  ｓｙｓｔｅｍの比較は、参考文献５６中に見いだされ得る。
【００４５】
夾雑ＤＮＡは、標準的精製手順（例えば、クロマトグラフィーなど）を使用するワクチン調製の間に除去され得る。残りの宿主細胞ＤＮＡの除去は、ヌクレアーゼ処理によって（例えば、ＤＮａｓｅを使用することによって）、増強され得る。宿主細胞ＤＮＡ夾雑を低下させるための便利な方法は、参考文献５７および５８に開示され、これらの方法は、２工程処理を要し、第１は、ウイルス増殖の間に使用され得るＤＮａｓｅ（例えば、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ）を使用し、次いで、ウイルス破壊の間に使用され得るカチオン性界面活性剤（例えば、ＣＴＡＢ）を使用する。アルキル化剤（例えば、β−プロピオラクトン）での処理はまた、宿主細胞ＤＮＡを除去するために使用され得、有利なことには、同様に、ビリオンを不活性化するために使用される［５９］と同時に、ホルムアルデヒドの使用を回避する。
【００４６】
１５μｇのヘマグルチニンあたり＜１０ｎｇ（例えば、＜１ｎｇ、＜１００ｐｇ）の宿主細胞ＤＮＡを含むワクチンが好ましく、０．２５ｍｌ容積あたり＜１０ｎｇ（例えば、＜１ｎｇ、＜１００ｐｇ）の宿主細胞ＤＮＡを含むワクチンも同様である。５０μｇのヘマグルチニンあたり＜１０ｎｇ（例えば、＜１ｎｇ、＜１００ｐｇ）の宿主細胞ＤＮＡを含むワクチンがより好ましく、０．５ｍｌ容積あたり＜１０ｎｇ（例えば、＜１ｎｇ、＜１００ｐｇ）の宿主細胞ＤＮＡを含むワクチンも同様である。
【００４７】
（アジュバント）
本発明の組成物は、有利なことには、アジュバントを含み得る。上記アジュバントは、上記組成物を受ける患者において誘発される免疫応答（体液性および／もしくは細胞性）を増強するように機能し得る。アジュバントとインフルエンザワクチンの使用は、以前から記載されてきた。参考文献６０および６１において、水酸化アルミニウムが使用され、そして参考文献６２においては、水酸化アルミニウムとリン酸アルミニウムとの混合物が使用された。参考文献６３はまた、アルミニウム塩のアジュバントの使用を記載した。Ｃｈｉｒｏｎ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ製のＦＬＵＡＤＴＭ製品は、水中油型エマルジョンを含む。
【００４８】
本発明で使用され得るアジュバントとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：
・カルシウム塩およびアルミニウム塩（もしくはその混合物）を含む、ミネラル含有組成物。カルシウム塩としては、リン酸カルシウム（例えば、参考文献６４に開示される「ＣＡＰ」粒子）が挙げられる。アルミニウム塩としては、水酸化物、リン酸塩、硫酸塩などが挙げられ、上記塩は、任意の適切な形態をとる（例えば、ゲル、結晶、無定形など）。これら塩への吸着が、好ましい。上記ミネラル含有組成物はまた、金属塩の粒子として処方され得る［６５］。アルミニウム塩のアジュバントは、以下でより詳細に記載される。
【００４９】
・サイトカイン誘導因子（以下をより詳細に参照のこと）。
【００５０】
・広い範囲の植物種の樹皮、葉、茎、根およびさらには花において見いだされるステロールグリコシドおよびトリテルペノイドグリコシドの異種由来のグループであるサポニン［参考文献１０１の第２２章］。Ｑｕｉｌｌａｉａ  ｓａｐｏｎａｒｉａ  Ｍｏｌｉｎａ樹木の樹皮に由来するサポニンは、アジュバントとして広範に研究されてきた。サポニンはまた、Ｓｍｉｌａｘ  ｏｒｎａｔａ（サルサパリラ（ｓａｒｓａｐｒｉｌｌａ））、Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌｌａ  ｐａｎｉｃｕｌａｔａ（ｂｒｉｄｅｓ  ｖｅｉｌ）、およびＳａｐｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉａｎａｌｉｓ（カスミソウ）から商業的に得られ得る。サポニンアジュバンド処方物としては、精製処方物（例えば、ＱＳ２１）、ならびに脂質処方物（例えば、ＩＳＣＯＭ）が挙げられる。ＱＳ２１は、ＳｔｉｍｕｌｏｎＴＭとして販売されている。サポニン組成物は、ＨＰＬＣおよびＲＰ−ＨＰＬＣを使用して精製された。これらの技術を使用する特定の精製画分が、同定され、ＱＳ７、ＱＳ１７、ＱＳ１８、ＱＳ２１、ＱＨ−Ａ、ＱＨ−ＢおよびＱＨ−Ｃを含む。好ましくは、上記サポニンは、ＱＳ２１である。ＱＳ２１を生成するための方法は、参考文献６６に開示されている。Ｑｕｉｌ  Ａの画分Ａと一緒に、少なくとも１種の他のアジュバントを使用することが可能である［６７］。サポニン処方物はまた、ステロール（例えば、コレステロール）を含み得る［６８］。サポニンとコレステロールの組み合わせは、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）とよばれる特有の粒子を形成するために使用され得る［参考文献１０１の第２３章］。ＩＳＣＯＭはまた、代表的には、リン脂質（例えば、ホスファチジルエタノールアミンもしくはホスファチジルコリン）を含む。任意の公知のサポニンは、ＩＳＣＯＭにおいて使用され得る。好ましくは、上記ＩＳＣＯＭは、ＱｕｉｌＡ、ＱＨＡおよびＱＨＣのうちの１種以上を含む。ＩＳＣＯＭは、参考文献６８〜７０にさらに開示されている。必要に応じて、上記ＩＳＣＯＭは、さらなる界面活性剤も欠き得る［７１］。少なくとも２種のＩＳＣＯＭ複合体（各複合体は、１つのサポニン画分を本質的に含み、ここで上記複合体は、ＩＳＣＯＭ複合体もしくはＩＳＣＯＭマトリクス複合体である）の混合物を使用することが可能である［７２］。サポニンベースのアジュバントの開発の総説は、参考文献７３および７４に見いだされ得る。
【００５１】
・脂肪性アジュバント（以下をより詳細に参照のこと）。
【００５２】
・細菌性ＡＤＰリボシル化毒素（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ熱不安定性エンテロトキシン「ＬＴ」、コレラ毒素「ＣＴ」、もしくは百日咳毒素「ＰＴ」）およびその解毒化誘導体（例えば、ＬＴ−Ｋ６３およびＬＴ−Ｒ７２として公知の変異毒素）［７５］。粘膜アジュバントとしての解毒化ＡＤＰリボシル化毒素の使用は、参考文献７６に記載され、非経口アジュバントとしての使用は、参考文献７７に記載される。
【００５３】
・生体接着剤および粘膜接着剤（例えば、エステル化ヒアルロン酸ミクロスフェア［７８］もしくはキトサンおよびその誘導体［７９］）。
【００５４】
・微粒子（すなわち、約１００ｎｍ〜約１５０μｍ直径、より好ましくは、約２００ｎｍ〜約３０μｍ直径、もしくは約５００ｎｍ〜約１０μｍ直径の粒子）。上記微粒子は、生体分解性かつ非毒性である物質（例えば、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリカプロラクトンなど）から形成され、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）が好ましく、必要に応じて、負に荷電した表面（例えば、ＳＤＳで）もしくは正に荷電した表面（例えば、カチオン性界面活性剤（例えば、ＣＴＡＢ）で）を有するように処理されている。
【００５５】
・リポソーム（参考文献１０１の第１３章および１４章）。アジュバントとしての使用に適切なリポソーム処方物の例は、参考文献８０〜８２に記載されている。
【００５６】
・水中油型エマルジョン（以下をより詳細に参照のこと）。
【００５７】
・ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステル［８３］。このような処方物は、オクトキシノールと組み合わせたポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤［８４］および少なくとも１種のさらなる非イオン性界面活性剤（例えば、オクトキシノール）と組み合わせたポリオキシエチレンアルキルエーテルもしくはポリオキシエチレンアルキルエステル界面活性剤［８５］をさらに含む。好ましいポリオキシエチレンエーテルは、以下の群から選択される：ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル（ラウレス  ９）、ポリオキシエチレン−９−ステオリルエーテル、ポリオキシエチレン（ｐｏｌｙｏｘｙｔｈｅｙｌｅｎｅ）−８−ステオリルエーテル、ポリオキシエチレン−４−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−３５−ラウリルエーテル、およびポリオキシエチレン−２３−ラウリルエーテル。
【００５８】
・ムラミルペプチド（例えば、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（「ｔｈｒ−ＭＤＰ」）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルグルコサミニル（ｇｌｕｃｓａｍｉｎｙｌ）−Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−Ａｌ−Ｄ−イソｇｌｕ−Ｌ−Ａｌａ−ジパルミトオキシプロピルアミド（「ＤＴＰ−ＤＰＰ」、もしくは「ＴｈｅｒａｍｉｄｅＴＭ」）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（「ＭＴＰ−ＰＥ」）。
【００５９】
・第１のグラム陰性細菌から調製された外膜タンパク質プロテオソーム調製物と組み合わせた、第２のグラム陰性細菌から得たリポサッカリド調製物（ここで上記外膜タンパク質プロテオソームおよびリポサッカリド調製物は、安定な非共有結合アジュバント複合体を形成する）。このような複合体は、「ＩＶＸ−９０８」（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ外膜およびリポポリサッカリドから構成される複合体）を含む。それらは、インフルエンザワクチンのためのアジュバントとして使用されてきた［８６］。
【００６０】
・メチルイノシン  ５’−モノホスフェート（「ＭＩＭＰ」）［８７］。
【００６１】
・ポリヒドロキシル化ピロリジジン（ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｘｌａｔｅｄ  ｐｙｒｒｏｌｉｚｉｄｉｎｅ）化合物［８８］（例えば、以下の式を有するもの）もしくはその薬学的に受容可能な塩もしくは誘導体：
【００６２】
【化１】
2010531348.tif 000002
ここでＲは、水素、直鎖もしくは分枝鎖の、非置換もしくは置換された、飽和もしくは不飽和のアシル、アルキル（例えば、シクロアルキル）、アルケニル、アルキニル、およびアリール基を含む群より選択される。例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：カスアリン（ｃａｓｕａｒｉｎｅ）、カスアリン−６−α−Ｄ−グルコピラノース、３−エピ−カスアリン、７−エピ−カスアリン、３，７−エピ−カスアリンなど。
【００６３】
・γイヌリン［８９］もしくはその誘導体（例えば、アルガムリン（ａｌｇａｍｍｕｌｉｎ））。
【００６４】
・ＣＤ１ｄリガンド（例えば、α−グリコシルセラミド（例えば、α−ガラクトシルセラミド））。
【００６５】
これらおよび他のアジュバント活性物質は、参考文献１０１および１０２においてより詳細に議論されている。
【００６６】
組成物は、上記アジュバントのうちの２種以上を含み得る。例えば、それらは、有利なことには、水中油型エマルジョンおよびサイトカイン誘導因子の両方を含み得る。なぜならこの組み合わせは、インフルエンザワクチンによって誘発される上記サイトカイン応答（例えば、インターフェロン−γ応答）を改善するからである。上記改善は、上記エマルジョンもしくは上記薬剤のいずれかが、それだけで使用される場合に認められるものよりはるかに大きい。
【００６７】
組成物中の抗原およびアジュバントは、代表的には、混合された状態である。
【００６８】
ワクチンがアジュバントを含む場合、ワクチンは、送達時に即座に調製され得る。従って、本発明は、すぐ混合できる状態の上記抗原成分およびアジュバント成分を含むキットを提供する。上記キットは、上記アジュバントおよび上記抗原が、使用時まで別個に保持されることを可能にする。上記成分は、上記キット内で互いに物理的に分離しており、この分離は、種々の方法で達成され得る。例えば、上記２つの成分は、２つの別個の容器（例えば、バイアル）中に存在し得る。次いで、上記２つのバイアルの内容物は、例えば、１つのバイアルの内容物を取り出し、それらを別のバイアルの内容物に添加するか、または両方のバイアルの内容物を別個に取り出し、それらを第３の容器中で混合することによって、混合され得る。好ましい配置において、上記キットの成分のうちの一方は、シリンジ中に存在し、他方は、容器（例えば、バイアル）中に存在する。上記シリンジは、その成分を第２の容器の中に挿入して、混合するために（例えば、ニードルと一緒に）使用され得、次いで、その混合物は、上記シリンジの中へと引き上げられる。次いで、上記シリンジの混合された内容物は、代表的には、新しい滅菌ニードルを通じて患者に投与され得る。シリンジ中に１つの成分をパッキングすることは、患者への投与のために別個のシリンジを使用する必要性を排除する。別の好ましい配置において、上記２つのキット成分は、一緒に保持されるが、同じシリンジ中に別個に存在する（例えば、デュアルチャンバーシリンジ）（例えば、参考文献９０〜９７などに開示されるもの）。上記シリンジが（例えば、患者への投与の間に）作動される場合、上記２つのチャンバの内容物は、混合される。この配置は、使用時の別個の混合工程の必要性を回避する。
【００６９】
（水中油型エマルジョンアジュバント）
水中油型エマルジョンは、インフルエンザウイルスワクチンを補助するにあたって使用するために特に適していることが見いだされた。種々のこのようなエマルジョンが公知であり、それらは、代表的には、少なくとも１種の油および少なくとも１種の界面活性剤を含み、上記油および界面活性剤は、生体分解性（代謝可能）かつ生体適合性である。上記エマルジョン中の油滴は、一般に、５μｍ未満の直径であり、そしてミクロン未満の直径ですらある可能性があり、これらの小さなサイズは、安定なエマルジョンを提供するために、マイクロフルイダイザーで達成される。２２０ｎｍ未満のサイズを有する液滴が好ましい。なぜなら、それらは、濾過滅菌に供しやすいからであり得る。
【００７０】
本発明は、油（例えば、動物（例えば、魚）供給源もしくは植物供給源に由来する油）とともに使用され得る。植物油の供給源としては、堅果、種子および穀類が挙げられる。ラッカセイ油、大豆油、ココナッツ油およびオリーブ油は、最も一般に入手可能であり、上記堅果油の例である。ホホバ油が使用され得、例えば、ホホバ豆から得られ得る。種子の油としては、サフラワー油、綿実油、ひまわり油、ごま油などが挙げられる。穀類のグループにおいては、コーン油は、最も一般に入手可能であるが、他の穀類（例えば、小麦、オーツ麦、ライ麦、コメ、テフ、ライコムギなど）の油もまた、使用され得る。種子の油には天然に存在しないが、グリセロールおよび１，２−プロパンジオールの６〜１０個の炭素の脂肪酸エステルは、堅果および種子の油から出発する適切な物質の、加水分解、分離およびエステル化によって調製され得る。哺乳動物の乳汁に由来する脂肪および油は代謝可能であり、従って、本発明の実施において使用され得る。動物供給源から純粋な油を得るために必要な分離、精製、鹸化および他の手段のためのプロセスは、当該分野で周知である。大部分の魚は、代謝可能な油を含み、この油は、容易に回収され得る。例えば、鱈肝油、鮫肝油、および鯨油（例えば、鯨ろう）は、本明細書において使用され得る魚油のいくつかの例である。多くの分枝鎖油は、５−炭素イソプレン単位において生化学的に合成され、一般に、テルペノイドといわれる。鮫肝油は、スクアレン、２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチル−２，６，１０，１４，１８，２２−テトラコサヘキサンとして公知の分枝状不飽和テルペノイド（これは、本明細書において特に好ましい）を含む。スクアラン（スクアレンの飽和アナログ）はまた、好ましい油である。魚油（スクアレンおよびスクアランを含む）は、市販の供給源から容易に入手可能であるか、または当該分野で公知の方法によって得られ得る。他の好ましい油は、トコフェロールである（以下を参照のこと）。油の混合物が、使用され得る。
【００７１】
界面活性剤は、それらの「ＨＬＢ」（親水性／親油性バランス）によって分類され得る。本発明の好ましい界面活性剤は、少なくとも１０、好ましくは、少なくとも１５、およびより好ましくは、少なくとも１６のＨＬＢを有する。本発明は、界面活性剤とともに使用され得、界面活性剤としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：上記ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（一般に、Ｔｗｅｅｎといわれ、特に、ポリソルベート  ２０およびポリソルベート  ８０）；エチレンオキシド（ＥＯ）、プロピレンオキシド（ＰＯ）、および／もしくはブチレンオキシド（ＢＯ）のコポリマー（ＤＯＷＦＡＸＴＭ  商標名の下で販売される）（例えば、直線状ＥＯ／ＰＯブロックコポリマー）；オクトキシノール（これは、エトキシ（オキシ−１，２−エタンジイル）基を反復する数が変動し得る）（オクトキシノール−９（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、もしくはｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）が、特に重要である）；（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール（ＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ−６３０／ＮＰ−４０）；リン脂質（例えば、ホスファチジルコリン（レシチン）；ラウリル、セチル、ステアリルおよびオレイルアルコールから得られるポリオキシエチレン脂肪エステル（Ｂｒｉｊ界面活性剤として公知）（例えば、トリエチレングリコールモノラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ  ３０）；ならびにソルビタンエステル（一般に、ＳＰＡＮとして公知）（例えば、ソルビタントリオレエート（Ｓｐａｎ  ８５）およびソルビタンモノラウレート）。上記エマルジョンに含めるための好ましい界面活性剤は、Ｔｗｅｅｎ  ８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）、Ｓｐａｎ  ８５（ソルビタントリオレエート）、レシチンおよびＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００である。上記のように、界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ  ８０）は、以下の実施例に認められる熱安定性に寄与し得る。
【００７２】
界面活性剤の混合物が、使用され得、これは、例えば、Ｔｗｅｅｎ  ８０／Ｓｐａｎ  ８５混合物である。ポリオキシエチレンソルビタンエステル（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ  ８０））およびオクトキシノール（例えば、ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００））の組み合わせはまた、適切である。別の有用な組み合わせは、ラウレス  ９＋ポリオキシエチレンソルビタンエステルおよび／もしくはオクトキシノールを含む。
【００７３】
界面活性剤の好ましい量（重量％）は、以下のとおりである：ポリオキシエチレンソルビタンエステル（例えば、Ｔｗｅｅｎ  ８０）  ０．０１〜１％（特に、約０．１％）；オクチルフェノキシポリオキシエタノールもしくはノニルフェノキシポリオキシエタノール（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００もしくはＴｒｉｔｏｎシリーズの他の界面活性剤）  ０．００１〜０．１％（特に、０．００５〜０．０２％）；ポリオキシエチレンエーテル（例えば、ラウレス  ９）  ０．１〜２０％（好ましくは、０．１〜１０％および特に、０．１〜１％もしくは約０．５％）。
【００７４】
本発明で有用な特定の水中油型エマルジョンアジュバントとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：
・スクアレン、Ｔｗｅｅｎ  ８０、およびＳｐａｎ  ８５のサブミクロンエマルジョン。容積によるエマルジョンの組成は、約５％  スクアレン、約０．５％  ポリソルベート  ８０および約０．５％  Ｓｐａｎ  ８５であり得る。重量の観点で、これら比は、４．３％  スクアレン、０．５％  ポリソルベート  ８０および０．４８％  Ｓｐａｎ  ８５になっている。このアジュバントは、参考文献１０１の第１０章および参考文献１０２の第１２章により詳細に記載されるように、「ＭＦ５９」［９８−９９  １００］として公知である。上記ＭＦ５９エマルジョンは、有利なことには、クエン酸イオン（例えば、１０ｍＭ  クエン酸ナトリウム緩衝剤）を含む。
【００７５】
・スクアレン、トコフェロール、およびＴｗｅｅｎ  ８０のエマルジョン。上記エマルジョンは、リン酸緩衝化生理食塩水を含み得る。上記エマルジョンはまた、Ｓｐａｎ  ８５（例えば、１％で）および／もしくはレシチンを含み得る。これらエマルジョンは、２〜１０％  スクアレン、２〜１０％  トコフェロールおよび０．３〜３％  Ｔｗｅｅｎ  ８０を有し得、スクアレン：トコフェロールの重量比は、好ましくは≦１である。なぜなら、これは、より安定なエマルジョンを提供するからである。スクアレンおよびＴｗｅｅｎ  ８０は、約５：２の容積比で存在し得る。１つのこのようなエマルジョンは、Ｔｗｅｅｎ  ８０をＰＢＳ中に溶解して、２％  溶液を提供し、次いで、この溶液の９０ｍｌと、（５ｇのＤＬ−α−トコフェロールおよび５ｍｌのスクアレン）の混合物とを混合し、次いで、上記混合物をマイクロフルイダイザーにかけることによって、作製され得る。上記得られたエマルジョンは、サブミクロン油液滴（例えば、１００〜２５０ｎｍの間、好ましくは、約１８０ｎｍの平均直径を有する）を有し得る。
【００７６】
・スクアレン、トコフェロール、およびＴｒｉｔｏｎ  界面活性剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）のエマルジョン。上記エマルジョンはまた、３ｄ−ＭＰＬ（以下を参照のこと）を含み得る。上記エマルジョンは、リン酸塩緩衝剤を含み得る。
【００７７】
・ポリソルベート（例えば、ポリソルベート  ８０）、Ｔｒｉｔｏｎ界面活性剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）およびトコフェロール（例えば、α−トコフェロールスクシネート）を含むエマルジョン。上記エマルジョンは、これら３つの成分を、約７５：１１：１０の質量比（例えば、７５０μｇ／ｍｌ  ポリソルベート  ８０、１１０μｇ／ｍｌ  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００および１００μｇ／ｍｌ  α−トコフェロールスクシネート）で含み得、そしてこれらの濃度は、抗原からのこれら成分の任意の寄与を含むべきである。上記エマルジョンはまた、スクアレンを含み得る。上記エマルジョンはまた、３ｄ−ＭＰＬ（以下を参照のこと）を含み得る。上記水相は、リン酸塩緩衝剤を含み得る。
【００７８】
・スクアラン、ポリソルベート  ８０およびポロキサマー  ４０１（「ＰｌｕｒｏｎｉｃＴＭ  Ｌ１２１」）のエマルジョン。上記エマルジョンは、リン酸緩衝化生理食塩水（ｐＨ７．４）中に処方され得る。このエマルジョンは、ムラミルジペプチドのための有用な送達ビヒクルであり、そして「ＳＡＦ−１」アジュバント中でスレオニル−ＭＤＰとともに使用されてきた［１０３］（０．０５〜１％  Ｔｈｒ−ＭＤＰ、５％  スクアラン、２．５％  Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｌ１２１および０．２％  ポリソルベート  ８０）。このエマルジョンはまた、「ＡＦ」アジュバント［１０４］（５％  スクアラン、１．２５％  Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｌ１２１および０．２％  ポリソルベート  ８０）のように、Ｔｈｒ−ＭＤＰなしでも使用され得る。マイクロフルイダイゼーションが好ましい。
【００７９】
・スクアレン、水性溶媒、ポリオキシエチレンアルキルエーテル親水性非イオン性界面活性剤（例えば、ポリオキシエチレン（１２）セトステアリルエーテル）および疎水性非イオン性界面活性剤（例えば、ソルビタンエステルもしくはマンニドエステル（例えば、ソルビタンモノオレエート（ｍｏｎｏｌｅａｔｅ）もしくは「Ｓｐａｎ  ８０」））を含むエマルジョン。上記エマルジョンは、好ましくは、熱可逆性であり、そして／または上記油滴の少なくとも９０％（容積で）が、２００ｎｍ未満のサイズを有する［１０５］。上記エマルジョンはまた、以下のうちの１種以上を含み得る：アルジトール；低温保護剤（例えば、糖（例えば、ドデシルマルトシドおよび／もしくはスクロース））；および／もしくはアルキルポリグリコシド。このようなエマルジョンは、凍結乾燥され得る。
【００８０】
・０．５〜５０％の油、０．１〜１０％のリン脂質、および０．０５〜５％の非イオン性界面活性剤を有するエマルジョン。参考文献１０６に記載されるように、好ましいリン脂質成分は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、スフィンゴミエリンおよびカルジオリピンである。サブミクロン液滴サイズが有利である。
【００８１】
・非代謝性油（例えば、軽いミネラルオイル）および少なくとも１種の界面活性剤（例えば、レシチン、Ｔｗｅｅｎ  ８０もしくはＳｐａｎ  ８０）のサブミクロン水中油型エマルジョン。添加剤が含まれ得る（例えば、ＱｕｉｌＡサポニン、コレステロール、サポニン−親油性結合体（例えば、参考文献１０７に記載され、グルクロン酸のカルボキシル基を介して脂肪族アミンをデスアシルサポニンに添加することによって形成されるＧＰＩ−０１００）、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ｄｉｍｅｔｈｙｉｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ）および／もしくはＮ，Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）プロパンジアミン）。
【００８２】
・ミネラルオイル、非イオン性親油性エトキシ化脂肪アルコール、および非イオン性親水性界面活性剤（例えば、エトキシ化脂肪アルコールおよび／もしくはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー）を含むエマルジョン［１０８］。
【００８３】
・ミネラルオイル、非イオン性親水性エトキシ化脂肪アルコール、および非イオン性親油性界面活性剤（例えば、エトキシ化脂肪アルコールおよび／もしくはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー）を含むエマルジョン［１０８］。
【００８４】
・サポニン（例えば、ＱｕｉｌＡもしくはＱＳ２１）およびステロール（例えば、コレステロール）が螺旋状ミセル（ｈｅｌｉｃａｌ  ｍｉｃｅｌｌｅ）として会合されるエマルジョン［１０９］。
【００８５】
上記エマルジョンは、送達時に即座に抗原と混合され得る。従って、上記アジュバントおよび抗原は、使用時に最終処方物の準備のできた状態で、パッケージされたもしくは配布したワクチンにおいて別個に保持され得る。上記抗原は、一般には、水性形態において存在し、その結果、上記ワクチンは、２つの液体を混合することによって、最終的に調製される。上記２つの流体の混合のための容積比は、変動し得る（例えば、５：１〜１：５の間で）が、一般には、約１：１である。
【００８６】
上記抗原およびアジュバントを混合した後、ヘマグルチニン抗原は、一般には、水溶液中に残っているが、それ自体は、上記油／水界面の周りに分布し得る。一般に、任意のヘマグルチニンが上記エマルジョンの油層に入り込むとしても、ごくわずかである。
【００８７】
組成物が、トコフェロールを含む場合、上記αトコフェロール、βトコフェロール、γトコフェロール、δトコフェロール、εトコフェロールもしくはξトコフェロールのうちのいずれかが使用され得るが、α−トコフェロールが好ましい。上記トコフェロールは、いくつかの形態（例えば、異なる塩および／もしくは異性体）をとり得る。塩としては、有機塩（例えば、コハク酸塩、酢酸塩、ニコチン酸塩など）が挙げられる。Ｄ−α−トコフェロールおよびＤＬ−α−トコフェロールは、ともに使用され得る。トコフェロールは、有利なことには、年配の患者（例えば、６０歳以上の年齢の）において使用するためのワクチン中に含まれる。なぜなら、ビタミンＥは、この患者群における免疫応答に対して陽性の影響を有することが報告されたからである［１１０］。それらはまた、上記エマルジョンを安定化するための一助となり得る抗酸化特性を有する［１１１］。好ましいα−トコフェロールは、ＤＬ−α−トコフェロールであり、そしてこのトコフェロールの好ましい塩は、コハク酸塩である。上記コハク酸塩は、ＴＮＦ関連リガンドとインビボで協力することが見いだされた。さらに、α−トコフェロールスクシネートは、インフルエンザワクチンと適合し、水銀化合物の代替として有用な保存剤であることが公知である［８］。
【００８８】
（サイトカイン誘導因子）
本発明の組成物に含めるためのサイトカイン誘導因子は、患者に投与された場合に、サイトカイン（インターフェロンおよびインターロイキンが挙げられる）を放出するように免疫系を誘発することができる。サイトカイン応答は、インフルエンザ感染に対する宿主防御の初期段階および決定的段階に関与することが公知である［１１２］。好ましい因子は、以下のうちの１種以上の放出を誘発し得る：インターフェロン−γ；インターロイキン−１；インターロイキン−２；インターロイキン−１２；ＴＮＦ−α；ＴＮＦ−β；およびＧＭ−ＣＳＦ。好ましい因子は、Ｔｈ１型免疫応答と関連するサイトカイン（例えば、インターフェロン−γ、ＴＮＦ−α、インターロイキン−２）の放出を誘発する。インターフェロン−γおよびインターロイキン−２の両方の刺激が好ましい。
【００８９】
従って、本発明の組成物を受容する結果として、患者は、インフルエンザ抗原で刺激された場合に、抗原特異的様式において所望のサイトカインを放出するＴ細胞を有する。例えば、彼らの血液から精製されたＴ細胞は、インフルエンザウイルスヘマグルチニンにインビトロで曝された場合、γ−インターフェロンを放出する。末梢血単球細胞（ＰＢＭＣ）におけるこのような応答を測定するための方法は、当該分野で公知であり、これらの方法としては、ＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＳＰＯＴ、フローサイトメトリーおよびリアルタイムＰＣＲが挙げられる。例えば、参考文献１１３は、破傷風毒素に対する抗原特異的Ｔ細胞媒介性免疫応答、具体的には、γ−インターフェロン応答がモニターされた研究を報告し、ＥＬＩＳＰＯＴが抗原特異的ＴＴ誘導性応答を自発的応答から識別するための最も感度の高い方法であるが、フローサイトメトリーによる細胞質内サイトカイン検出は、再刺激効果を検出するための最も有効な方法であることを見いだした。
【００９０】
適切なサイトカイン誘導因子としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：
・免疫刺激性オリゴヌクレオチド（例えば、ＣｐＧモチーフ（グアノシンにホスフェート結合によって連結された非メチル化シトシンを含むジヌクレオチド配列を含むもの）、もしくは二本鎖ＲＮＡ、もしくはパリンドローム配列を含むオリゴヌクレオチドもしくはポリ（ｄＧ）配列を含むオリゴヌクレオチド。
【００９１】
・３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡ（「３ｄＭＰＬ」（「ＭＰＬＴＭ」としても公知））［１１４、１１５、１１６、１１７］。
【００９２】
・イミダゾキノリン化合物（例えば、Ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ（「Ｒ-８３７」）［１１８、１１９］、Ｒｅｓｉｑｕｉｍｏｄ（「Ｒ−８４８」）［１２０］、およびそれらのアナログ；ならびにそれらの塩（例えば、塩酸塩））。免疫刺激性イミダゾキノリンについてのさらなる詳細は、参考文献１２１〜１２２  １２３  １２４  １２５に見いだされ得る。
【００９３】
・チオセミカルバゾン化合物（例えば、参考文献１２６に開示されるもの）。活性化合物を処方、製造およびスクリーニングするための方法はまた、参考文献１２６に記載される。上記チオセミカルバゾンは、サイトカイン（例えば、ＴＮＦ−α）の生成のためのヒト末梢血単球細胞の刺激において特に有効である。
【００９４】
・トリプタンスリン（ｔｒｙｐｔａｎｔｈｒｉｎ）化合物（例えば、参考文献１２７に開示されているもの）。活性化合物を処方、製造およびスクリーニングするための方法はまた、参考文献１２７に記載されている。上記チオセミカルバゾン（ｔｈｉｏｓｅｍｉｃａｒｂａｚｏｎｅ）は、サイトカイン（例えば、ＴＮＦ−α）の生成のためのヒト末梢血単球細胞の刺激において特に有用である。
【００９５】
・ヌクレオシドアナログ（例えば、（ａ）Ｉｓａｔｏｒａｂｉｎｅ（ＡＮＡ−２４５；７−チア−８−オキソグアノシン）およびそのプロドラッグ：
【００９６】
【化２】
2010531348.tif 000003
；（ｂ）ＡＮＡ９７５；（ｃ）ＡＮＡ−０２５−１；（ｄ）ＡＮＡ３８０；（ｅ）参考文献１２８〜１２９  １３０に開示される化合物；  （ｆ）以下の式を有する化合物：
【００９７】
【化３】
2010531348.tif 000004
ここで：
Ｒ１およびＲ２は、各々独立して、Ｈ、ハロ、−ＮＲａＲｂ、−ＯＨ、Ｃ１−６アルコキシ、置換されたＣ１−６アルコキシ、ヘテロシクリル、置換されたヘテロシクリル、Ｃ６−１０アリール、置換されたＣ６−１０アリール、Ｃ１−６アルキル、もしくは置換されたＣ１−６アルキルであり；
Ｒ３は、存在しないか、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、置換されたＣ１−６アルキル、Ｃ６−１０アリール、置換されたＣ６−１０アリール、ヘテロシクリル、もしくは置換されたヘテロシクリルであり；
Ｒ４およびＲ５は、各々独立して、Ｈ、ハロ、ヘテロシクリル、置換されたヘテロシクリル、−Ｃ（Ｏ）−Ｒｄ、Ｃ１−６アルキル、置換されたＣ１−６アルキル、もしくは一緒に結合されて、Ｒ４−５におけるような５員環を形成し：
【００９８】
【化４】
2010531348.tif 000005
上記結合は、
【００９９】
【化５】
2010531348.tif 000006
によって示される結合において達成され、
Ｘ１およびＸ２は、各々独立して、Ｎ、Ｃ、Ｏ、もしくはＳであり；
Ｒ８は、Ｈ、ハロ、−ＯＨ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、−ＯＨ、−ＮＲａＲｂ、−（ＣＨ２）ｎ−Ｏ−Ｒｃ、−Ｏ−（Ｃ１−６アルキル）、−Ｓ（Ｏ）ｐＲｅ、もしくは−Ｃ（Ｏ）−Ｒｄであり；
Ｒ９は、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、置換されたＣ１−６アルキル、ヘテロシクリル、置換されたヘテロシクリルもしくはＲ９ａであり、ここでＲ９ａは、
【０１００】
【化６】
2010531348.tif 000007
であり、上記結合は、
【０１０１】
【化７】
2010531348.tif 000008
によって示される結合において達成され、
Ｒ１０およびＲ１１は、各々独立して、Ｈ、ハロ、Ｃ１−６アルコキシ、置換されたＣ１−６アルコキシ、−ＮＲａＲｂ、もしくは−ＯＨであり；
各ＲａおよびＲｂは、独立して、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、置換されたＣ１−６アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｒｄ、Ｃ６−１０アリールであり；
各Ｒｃは、独立して、Ｈ、ホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェート、Ｃ１−６アルキル、もしくは置換されたＣ１−６アルキルであり；
各Ｒｄは、独立して、Ｈ、ハロ、Ｃ１−６アルキル、置換されたＣ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、置換されたＣ１−６アルコキシ、−ＮＨ２、−ＮＨ（Ｃ１−６アルキル）、−ＮＨ（置換されたＣ１−６アルキル）、−Ｎ（Ｃ１−６アルキル）２、−Ｎ（置換されたＣ１−６アルキル）２、Ｃ６−１０アリール、もしくはヘテロシクリルであり；
各Ｒｅは、独立して、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、置換されたＣ１−６アルキル、Ｃ６−１０アリール、置換されたＣ６−１０アリール、ヘテロシクリル、もしくは置換されたヘテロシクリルであり；
各Ｒｆは、独立して、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、置換されたＣ１−６アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｒｄ、ホスフェート、ジホスフェート、もしくはトリホスフェートであり；
各ｎは、独立して、０、１、２、もしくは３であり；
各ｐは、独立して、０、１、もしくは２である；あるいは
（ｇ）（ａ）〜（ｆ）のうちのいずれかの薬学的に受容可能な塩、（ａ）〜（ｆ）のうちのいずれかの互変異性体、もしくは上記互変異性体の薬学的に受容可能な塩。
【０１０２】
・ロキソリビン（７−アリル−８−オキソグアノシン）［１３１］。
【０１０３】
・参考文献１３２に開示される化合物（アシルピペラジン化合物、インドールジオン化合物、テトラヒドライソキノリン（ＴＨＩＱ）化合物、ベンゾシクロジオン化合物、アミノアザビニル化合物、アミノベンゾイミダゾールキノリノン（ＡＢＩＱ）化合物［１３３、１３４］、ヒドラフタルアミド（Ｈｙｄｒａｐｔｈａｌａｍｉｄｅ）化合物、ベンゾフェノン化合物、イソオキサゾール化合物、ステロール化合物、キナジリノン化合物、ピロール化合物、［１３５］、アントラキノン化合物、キノキサリン化合物、トリアジン化合物、ピラザロピリミジン（Ｐｙｒａｚａｌｏｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ）化合物、およびベンザゾール（Ｂｅｎｚａｚｏｌｅ）化合物［１３６］が挙げられる）。
【０１０４】
・ポリオキシドニウム（ｐｏｌｙｏｘｉｄｏｎｉｕｍ）ポリマー［１３７、１３８］もしくは他のＮ−酸化ポリエチレン−ピペラジン誘導体。
【０１０５】
・参考文献１３９に開示される化合物。
【０１０６】
・アミノアルキルグルコサミニドホスフェート誘導体（例えば、ＲＣ−５２９［１４０、１４１］。
【０１０７】
・ＣＤ１ｄリガンド（例えば、α−グリコシルセラミド［１４２−１４３  １４４  １４５  １４６  １４７  １４８  １４９］（例えば、α−ガラクトシルセラミド）、フィトスフィンゴシン含有α−グリコシルセラミド、ＯＣＨ、ＫＲＮ７０００［（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−１−Ｏ−（α−Ｄ−ガラクトピラノシル）−２−（Ｎ−ヘキサコサノイルアミノ）−１，３，４−オクタデカントリオール］、ＣＲＯＮＹ−１０１、３”−Ｏ−スルホ−ガラクトシルセラミドなど）。
【０１０８】
・ホスファゼン（例えば、例えば、参考文献１５０および１５１に記載されるようなポリ［ジ（カルボキシラートフェノキシ）ホスファゼン］（「ＰＣＰＰ」））。
【０１０９】
・以下のような低分子免疫強化剤（ＳＭＩＰ）：
Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
Ｎ２，Ｎ２−ジメチル−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
Ｎ２−エチル−Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−Ｎ２−プロピル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
１−（２−メチルプロピル）−Ｎ２−プロピル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
Ｎ２−ブチル−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
Ｎ２−ブチル−Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−Ｎ２−ペンチル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−Ｎ２−プロプ−２−エニル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
１−（２−メチルプロピル）−２−［（フェニルメチル）チオ］−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン
１−（２−メチルプロピル）−２−（プロピルチオ）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン
２−［［４−アミノ−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２−イル］（メチル）アミノ］エタノール
２−［［４−アミノ−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２−イル］（メチル）アミノ］エチルアセテート
４−アミノ−１−（２−メチルプロピル）−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２−オン
Ｎ２−ブチル−１−（２−メチルプロピル）−Ｎ４，Ｎ４−ビス（フェニルメチル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
Ｎ２−ブチル−Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−Ｎ４，Ｎ４−ビス（フェニルメチル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−Ｎ４，Ｎ４−ビス（フェニルメチル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
Ｎ２，Ｎ２−ジメチル−１−（２−メチルプロピル）−Ｎ４，Ｎ４−ビス（フェニルメチル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン
１−｛４−アミノ−２−［メチル（プロピル）アミノ］−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル｝−２−メチルプロパン−２−オール
１−［４−アミノ−２−（プロピルアミノ）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル］−２−メチルプロパン−２−オール
Ｎ４，Ｎ４−ジベンジル−１−（２−メトキシ−２−メチルプロピル）−Ｎ２−プロピル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン。
【０１１０】
本発明において使用するための上記サイトカイン誘導因子は、Ｔｏｌｌ様レセプター（ＴＬＲ）のモジュレーターおよび／もしくはアゴニストであり得る。例えば、それらは、上記ヒトＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、および／もしくはＴＬＲ９タンパク質のうちの１種以上のアゴニストであり得る。好ましい因子は、ＴＬＲ７のアゴニスト（例えば、イミダゾキノリン）および／もしくはＴＬＲ９のアゴニスト（例えば、ＣｐＧオリゴヌクレオチド）である。これら因子は、先天性免疫経路を活性化するために有用である。
【０１１１】
上記サイトカイン誘導因子は、上記組成物の生成の間に種々の段階で上記組成物に添加され得る。例えば、上記サイトカイン誘導因子は、抗原組成物内に存在し得、次いで、この混合物は、水中油型エマルジョンへ添加され得る。代替として、上記サイトカイン誘導因子は、水中油型エマルジョン内に存在し得、上記エマルジョン中にある場合、上記因子は、乳化前に上記エマルジョン成分に添加され得るか、または乳化後に上記エマルジョンに添加され得るかのいずれかである。同様に、上記因子は、上記エマルジョン液滴内でコアセルベートにされ得る。最終組成物内の上記サイトカイン-誘導因子の位置および分布
は、その親水性／親油性特性に依存し、例えば、上記因子は、水相中、油相中、および／もしくは油−水界面に位置し得る。
【０１１２】
上記サイトカイン誘導因子は、別個の薬剤（例えば、抗原（例えば、ＣＲＭ１９７））に結合体化され得る。低分子のための結合体化技術の概説は、参考文献１５２に提供されている。代替として、上記アジュバントは、さらなる薬剤と非共有的に（例えば、疎水性相互作用もしくはイオン性相互作用によって）会合されていてもよい。
【０１１３】
２つの好ましいサイトカイン誘導因子は、（ａ）免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよび（ｂ）３ｄＭＰＬである。
【０１１４】
免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド改変／アナログ（例えば、ホスホロチオエート改変）を含み得、そして二本鎖もしくは（ＲＮＡを除く）一本鎖であり得る。参考文献１５３、１５４および１５５は、考えられるアナログ置換（例えば、グアノシンの、２’−デオキシ−７−デアザグアノシンでの置換）を開示する。ＣｐＧオリゴヌクレオチドの上記アジュバント効果は、参考文献１５６−１５７  １５８  １５９  １６０  １６１においてさらに議論されている。ＣｐＧ配列は、ＴＬＲ９（例えば、モチーフＧＴＣＧＴＴもしくはＴＴＣＧＴＴ）に指向され得る［１６２］。上記ＣｐＧ配列は、Ｔｈ１免疫応答を誘導するのに特異的であり得る（例えば、ＣｐＧ−Ａ  ＯＤＮ（オリゴデオキシヌクレオチド）か、または上記ＣｐＧ配列は、Ｂ細胞応答を誘導するのにより特異的であり得る（例えば、ＣｐＧ−Ｂ  ＯＤＮ）。ＣｐＧ−Ａ  ＯＤＮおよびＣｐＧ−Ｂ  ＯＤＮは、参考文献１６３−１６４  １６５において議論されている。好ましくは、上記ＣｐＧは、ＣｐＧ−Ａ  ＯＤＮである。好ましくは、上記ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、その５’末端がレセプター認識のために接近可能であるように構築される。必要に応じて、２つのＣｐＧオリゴヌクレオチド配列がそれらの３’末端に結合されて、「イムノマー（ｉｍｍｕｎｏｍｅｒ）」を形成し得る。例えば、参考文献１６２および１６６−１６７  １６８を参照のこと。有用なＣｐＧアジュバントは、ＣｐＧ７９０９（ＰｒｏＭｕｎｅＴＭ（Ｃｏｌｅｙ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．）としても公知）である。
【０１１５】
ＣｐＧ配列を使用する代替として、またはＣｐＧ配列を使用するのに加えて、ＴｐＧ配列が使用され得る［１６９］。これらオリゴヌクレオチドは、非メチル化ＣｐＧモチーフを含まない可能性がある。
【０１１６】
上記免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、ピリミジンリッチであり得る。例えば、上記免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、１つより多い連続チミジンヌクレオチド（例えば、参考文献１６９に開示されるように、ＴＴＴＴ）を含み得るか、そして／または上記免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、＞２５％  チミジン（例えば、＞３５％、＞４０％、＞５０％、＞６０％、＞８０％など）を有するヌクレオチド組成を有し得る。例えば、上記免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、１つより多い連続シトシンヌクレオチド（例えば、参考文献１６９に開示されるように、ＣＣＣＣ）を含み得るか、そして／または上記免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、＞２５％  シトシン（例えば、＞３５％、＞４０％、＞５０％、＞６０％、＞８０％など）を有するヌクレオチド組成を有し得る。これらオリゴヌクレオチドは、非メチル化ＣｐＧモチーフを含まない可能性がある。
【０１１７】
免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、代表的には、少なくとも２０ヌクレオチドを含む。上記免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、１００より少ないヌクレオチドを含み得る。
【０１１８】
３ｄＭＰＬ（３  ｄｅ−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡもしくは３−Ｏ−デスアシル−４’−モノホスホリルリピドＡとしても公知）は、モノホスホリルリピドＡにおける還元末端グルコサミンの３位が、脱アシル化されたアジュバントである。３ｄＭＰＬは、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｍｉｎｎｅｓｏｔａのヘプトース欠損変異体から調製されたものであり、リピドＡに化学的に類似であるが、酸不安定性ホスホリル基および塩基不安定性アシル基を欠いている。３ｄＭＰＬは、単球／マクロファージ系統の細胞を活性化し、いくつかのサイトカイン（ＩＬ−１、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−αおよびＧＭ−ＣＳＦが挙げられる）の放出を刺激する（参考文献１７０も参照のこと）。３ｄＭＰＬの調製は、もともと、参考文献１７１に記載されている。
【０１１９】
３ｄＭＰＬは、それらのアシル化（例えば、異なる長さであり得る３個、４個、５個もしくは６個のアシル鎖を有する）によって変動する関連分子の混合物の形態をとり得る。その２つのグルコサミン（２−デオキシ−２−アミノグルコースとしても公知）モノサッカリドは、それらの２位の炭素で（すなわち、２位および２’位で）Ｎ−アシル化されており、その３’位にはＯ−アシル化も存在する。炭素２に結合された基は、式−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＲ１Ｒ１’を有する。炭素２’に結合された基は、式−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＲ２Ｒ２’を有する。炭素３’に結合された基は、式−Ｏ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＲ３Ｒ３’を有する。代表的な構造は、以下である：
【０１２０】
【化８】
2010531348.tif 000009
基Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、各々独立して、−（ＣＨ２）ｎ−ＣＨ３である。ｎの値は、好ましくは、８〜１６の間であり、より好ましくは、９〜１２の間であり、そして最も好ましくは、１０である。
【０１２１】
基Ｒ１’、Ｒ２’およびＲ３’は、各々独立して、（ａ）−Ｈ；（ｂ）−ＯＨ；もしくは（ｃ）−Ｏ−ＣＯ−Ｒ４であり得、ここでＲ４は、−Ｈもしくは−（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ３のいずかであり、ここでｍの値は、好ましくは、８〜１６の間であり、より好ましくは、１０、１２もしくは１４である。２位において、ｍは、好ましくは、１４である。２’位において、ｍは、好ましくは、１０である。３’位において、ｍは、好ましくは、１２である。基Ｒ１’、Ｒ２’およびＲ３’は、従って、好ましくは、ドデカン酸、テトラデカン酸、もしくはヘキサデカン酸に由来する−Ｏ−アシル基である。
【０１２２】
Ｒ１’、Ｒ２’およびＲ３’のうちの全てが−Ｈである場合、上記３ｄＭＰＬは、３個のアシル鎖（２位、２’位および３’位の各々に１個）を有するのみである。Ｒ１’、Ｒ２’およびＲ３’のうちの２つのみが−Ｈである場合、上記３ｄＭＰＬは、４個のアシル鎖を有し得る。Ｒ１’、Ｒ２’およびＲ３’のうちの１つのみが−Ｈである場合、上記３ｄＭＰＬは、５個のアシル鎖を有し得る。Ｒ１’、Ｒ２’およびＲ３’のうちのいずれも−Ｈでない場合、上記３ｄＭＰＬは、６個のアシル鎖を有し得る。本発明に従って使用される上記３ｄＭＰＬアジュバントは、これら形態の、３〜６個のアシル鎖を有する混合物であり得るが、上記混合物において６個のアシル鎖を伴う３ｄＭＰＬを含めることが好ましく、特に、ヘキサアシル鎖形態が、総３ｄＭＰＬの重量の少なくとも１０％（例えば、≧２０％、≧３０％、≧４０％、≧５０％もしくはそれ以上）を構成することを確実にすることが好ましい。６個のアシル鎖を有する３ｄＭＰＬは、最もアジュバント活性形態であることが見いだされた。
【０１２３】
従って、本発明の組成物に含めるための３ｄＭＰＬの最も好ましい形態は、以下である：
【０１２４】
【化９】
2010531348.tif 000010
３ｄＭＰＬが混合物の形態で使用される場合、本発明の組成物における３ｄＭＰＬの量もしくは濃度への言及は、上記混合物中の合わせた３ｄＭＰＬ種に言及する。
【０１２５】
水性条件において、３ｄＭＰＬは、ミセル状凝集物もしくは種々のサイズを有する（例えば、直径＜１５０ｎｍまたは＞５００ｎｍを有する）粒子を形成し得る。これらのうちのいずれかもしくは両方は、本発明で使用され得、よりよい粒子は、慣用的なアッセイによって選択され得る。より小さい粒子（例えば、３ｄＭＰＬの透明な水性懸濁物を与えるに十分小さい）は、それらの優れた活性が原因で、本発明に従う使用に好ましい［１７２］。好ましい粒子は、２２０ｎｍ未満の平均直径を有し、より好ましくは、２００ｎｍ未満もしくは１５０ｎｍ未満もしくは１２０ｎｍ未満の平均直径を有し、１００ｎｍ未満の平均直径をさらに有し得る。しかし、大部分の場合において、上記平均直径は、５０ｎｍより小さくはない。これら粒子は、濾過滅菌に適しているに十分小さい。粒子直径は、平均粒子直径が明らかにする動的光散乱の慣用的技術によって評価され得る。粒子がｘ  ｎｍの直径を有するといわれる場合、一般に、この平均あたりに粒子の分布があるが、粒子数の少なくとも５０％（例えば、≧６０％、≧７０％、≧８０％、≧９０％、もしくはそれ以上）が、ｘ±２５％の範囲内に直径を有する。
【０１２６】
３ｄＭＰＬは、有利なことには、水中油型エマルジョンと組み合わせて使用され得る。上記３ｄＭＰＬの実質的に全てが、上記エマルジョンの水相に位置し得る。
【０１２７】
上記３ｄＭＰＬは、それ自体で使用され得るか、または１種以上のさらなる成分と組み合わせて使用され得る。例えば、上記ＱＳ２１サポニンと組み合わせて［１７３］（水中油型エマルジョン中に含める［１７４］）、免疫刺激性オリゴヌクレオチドと組み合わせて、ＱＳ２１および免疫刺激性オリゴヌクレオチドの両方と組み合わせて、リン酸アルミニウムと組み合わせて［１７５］、水酸化アルミニウムと組み合わせて［１７６］、もしくはリン酸アルミニウムおよび水酸化アルミニウムの両方と組み合わせて、３ｄＭＰＬを使用することは公知である。
【０１２８】
（脂肪性アジュバント）
本発明で使用され得る脂肪性アジュバントは、上記に記載の水中油型エマルジョンを含み、そして同様に、例えば、以下を含む：
・式Ｉ、式ＩＩもしくは式ＩＩＩの化合物、またはそれらの塩：
【０１２９】
【化１０】
2010531348.tif 000011
参考文献１７７、例えば、「ＥＲ  ８０３０５８」、「ＥＲ  ８０３７３２」、「ＥＲ  ８０４０５３」、「ＥＲ  ８０４０５８」、「ＥＲ  ８０４０５９」、「ＥＲ  ８０４４４２」、「ＥＲ  ８０４６８０」、「ＥＲ  ８０４７６４」、「ＥＲ  ８０３０２２」もしくは「ＥＲ  ８０４０５７」において定義されるように、例えば、
【０１３０】
【化１１】
2010531348.tif 000012
【０１３１】
【化１２】
2010531348.tif 000013
・Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（例えば、ＯＭ−１７４）由来のリピドＡの誘導体（参考文献１７８および１７９に記載される）。
【０１３２】
・カチオン性脂質および（通常は中性の）コ−リピド（ｃｏ−ｌｉｐｉｄ）（例えば、アミノプロピル−ジメチル−ミルストレイルオキシ−プロパナミニウム（ｐｒｏｐａｎａｍｉｎｉｕｍ）  ブロミド−ジフィタノイルホスファチジル−エタノールアミン（「ＶａｘｆｅｃｔｉｎＴＭ」）もしくはアミノプロピル−ジメチル−ビス−ドデシルオキシ−プロパナミニウム  ブロミド−ジオレオイルホスファチジル−エタノールアミン（「ＧＡＰ−ＤＬＲＩＥ：ＤＯＰＥ」））の処方物。（±）−Ｎ−（３−アミノプロピル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ビス（ｓｙｎ−９−テトラデセンイルオキシ）−１−プロパナミニウム塩を含む処方物が好ましい［１８０］。
【０１３３】
・３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡ（上記を参照のこと）。
【０１３４】
・ホスフェート含有非環式骨格に結合された脂質を含む化合物（例えば、ＴＬＲ４アンタゴニストＥ５５６４［１８１，１８２］：
【０１３５】
【化１３】
2010531348.tif 000014
（アルミニウム塩アジュバント）
水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムとして公知のアジュバントが使用され得る。これら名称は、従来からのものであるが、いずれも存在する実際の化合物の正確な記載ではないので、便宜的にのみ使用される。（例えば、参考文献１０１の第９章を参照のこと）。本発明は、アジュバントとして一般に使用される上記「水酸化物」もしくは「リン酸塩」アジュバントのうちのいずれかを使用し得る。
【０１３６】
「水酸化アルミニウム」として公知の上記アジュバントは、代表的には、オキシ水酸化アルミニウム（ａｌｕｍｉｎｉｕｍ  ｏｘｙｈｙｄｒｏｘｉｄｅ）塩であり、この塩は、通常、少なくとも部分的に結晶質である。オキシ水酸化アルミニウムは、式ＡｌＯ（ＯＨ）によって表され得、赤外線（ＩＲ）分光法によって、特に、１０７０ｃｍ-１の吸着バンド（ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｂａｎｄ）および３０９０〜３１００ｃｍ-１の強い肩の存在によって、他のアルミニウム化合物（例えば、水酸化アルミニウムＡｌ（ＯＨ）３）とは区別され得る［参考文献１０１の第９章を参照のこと］。水酸化アルミニウムアジュバントの結晶性の程度は、半価高（ｈａｌｆ  ｈｅｉｇｈｔ）（ＷＨＨ）での回折バンド幅によって示され、結晶性が乏しい粒子は、より小さな結晶サイズに起因して、より大きな線の拡がりを示す。その表面積は、ＷＨＨが増加するにつれて増加し、より高いＷＨＨ値を有するアジュバントは、より高い抗原吸着能力を有することが認められた。繊維状形態（例えば、透過型電子顕微鏡でみられるように）は、水酸化アルミニウムアジュバントに代表的である。水酸化アルミニウムアジュバントのｐＩは、代表的には、約１１である（すなわち、上記アジュバント自体は、生理学的ｐＨにおいて正の表面電荷を有する）。ｐＨ７．４において１．８〜２．６ｍｇ  タンパク質／ｍｇ  Ａｌ＋＋＋の間の吸着能が、水酸化アルミニウムアジュバントについて報告された。
【０１３７】
「リン酸アルミニウム」として公知のアジュバントは、代表的には、ヒドロキシリン酸アルミニウムであり、しばしば、少量の硫酸塩（すなわち、ヒドロキシリン酸硫酸アルミニウム）も含む。上記アジュバントは、沈澱によって得られ得、そして沈澱の間のその反応条件および濃度は、その塩においてヒドロキシルの代わりにホスフェートを使用する程度に影響を及ぼす。ヒドロキシリン酸塩は、一般に、０．３〜１．２の間のＰＯ４／Ａｌモル比を有する。ヒドロキシリン酸塩は、ヒドロキシル基の存在によって、厳密なＡｌＰＯ４とは区別され得る。例えば、３１６４ｃｍ−１のＩＲスペクトルバンド（例えば、２００℃に加熱した場合）は、構造的ヒドロキシルの存在を示す［参考文献１０１の第９章］。
【０１３８】
上記リン酸アルミニウムアジュバントのＰＯ４／Ａｌ３＋モル比は、一般に、０．３〜１．２の間、好ましくは、０．８〜１．２の間、およびより好ましくは、０．９５±０．１である。上記リン酸アルミニウムは、一般には、無定形であり、特に、ヒドロキシルリン酸塩に関しては、無定形である。代表的なアジュバントは、ＰＯ４／Ａｌモル比が０．８４〜０．９２の間である無定形ヒドロキシリン酸アルミニウムであり、これは、０．６ｍｇ  Ａｌ３＋／ｍｌで含まれる。上記リン酸アルミニウムは、一般に、粒状である（例えば、透過型電子顕微鏡でみられるように、板状形態）。上記粒子の代表的直径は、任意の抗原吸着の後、０．５〜２０μｍの範囲（例えば、約５〜１０μｍ）内にある。ｐＨ７．４での０．７〜１．５ｍｇ  タンパク質／ｍｇ  Ａｌ＋＋＋の間の吸着能が、リン酸アルミニウムアジュバントについて報告された。
【０１３９】
リン酸アルミニウムのゼロ荷電（ＰＺＣ）の点は、ヒドロキシルの代わりにホスフェートを使用する置換の程度に逆に関連しており、この置換の程度は、沈澱によって上記塩を調製するために使用される反応物の反応条件および濃度に依存して変動し得る。ＰＺＣはまた、溶液中の遊離リン酸イオンの濃度を変化させる（より多くのリン酸＝より酸性のＰＺＣ）ことによって、または緩衝剤（例えば、ヒスチジン緩衝剤（ＰＺＣをより塩基性にする））を添加することによって、変化させられる。本発明に従って使用されるリン酸アルミニウムは、一般に、４．０〜７．０の間、より好ましくは、５．０〜６．５の間、例えば、約５．７のＰＺＣを有する。
【０１４０】
本発明の組成物を調製するために使用されるアルミニウム塩の懸濁物は、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝剤、ヒスチジン緩衝剤もしくはＴｒｉｓ緩衝剤）を含み得るが、これは、常に必要であるわけではない。上記懸濁物は、好ましくは、無菌かつ発熱物質を含まない。懸濁物は、遊離水性リン酸イオンを含み得、例えば、１．０〜２０ｍＭの間、好ましくは、５〜１５ｍＭの間、およびより好ましくは、約１０ｍＭの濃度で存在し得る。上記懸濁物はまた、塩化ナトリウムを含み得る。
【０１４１】
本発明は、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムの両方の混合物を使用し得る［６２］。この場合において、水酸化物よりより多くのリン酸アルミニウム（例えば、少なくとも２：１（例えば、≧５：１、≧６：１、≧７：１、≧８：１、≧９：１など）の重量比）が存在し得る。
【０１４２】
患者に投与するための組成物中のＡｌ＋＋＋の濃度は、好ましくは、１０ｍｇ／ｍｌ未満、例えば、≦５ｍｇ／ｍｌ、≦４ｍｇ／ｍｌ、≦３ｍｇ／ｍｌ、≦２ｍｇ／ｍｌ、≦１ｍｇ／ｍｌなどである。好ましい範囲は、０．３〜１ｍｇ／ｍｌの間である。最大０．８５ｍｇ／用量が好ましい。
【０１４３】
１種以上のアルミニウム塩アジュバントを含めるのと同様に、上記アジュバント成分は、１種以上のさらなるアジュバントもしくは免疫刺激剤を含み得る。このようなさらなる成分としては、３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡアジュバント（「３ｄ−ＭＰＬ」）；および／もしくは水中油型エマルジョンが挙げられるが、これらに限定されない。３ｄ−ＭＰＬはまた、３  ｄｅ−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡもしくは３−Ｏ−デスアシル−４’−モノホスホリルリピドＡとして言及されてきた。上記名称は、モノホスホリルリピドＡの還元末端グルコサミンの３位が脱アシル化されていることを示す。上記３ｄ−ＭＰＬは、Ｓ．ｍｉｎｎｅｓｏｔａのヘプトース欠損変異体から調製されたものであり、リピドＡと化学的に類似であるが、酸不安定性ホスホリル基および塩基不安定性アシル基を欠いている。上記３ｄ−ＭＰＬは、上記単球／マクロファージ系列の細胞を活性化し、いくつかのサイトカイン（ＩＬ−１、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−αおよびＧＭ−ＣＳＦが挙げられる）の放出を刺激する。３ｄ−ＭＰＬの調製は、もともと、参考文献１７１に記載されたものであり、上記生成物は、Ｃｏｒｉｘａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによって製造され、名称ＭＰＬＴＭの下で販売されている。さらなる詳細は、参考文献１１４〜１１７に見いだされ得る。
【０１４４】
（薬学的組成物）
本発明の組成物は、薬学的に受容可能である。それらは、通常、上記抗原に加えて成分を含み、例えば、それらは、代表的には、１種以上の薬学的キャリアおよび／もしくは賦形剤を含む。このような成分の完全な開示は、参考文献１８３において入手可能である。
【０１４５】
組成物は、一般に、水性形態において存在する。
【０１４６】
上記組成物は、水銀物質を含まない。上記組成物は、保存剤（例えば、２−フェノキシエタノール）を含み得るが、保存剤なしのワクチンは、より好ましい。
【０１４７】
張度を制御するために、生理学的塩（例えば、ナトリウム塩）を含めることが好ましい。塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）が好ましく、この塩は、１〜２０ｍｇ／ｍｌの間で存在し得る。存在し得る他の塩は、塩化カリウム、二水素リン酸カリウム、リン酸二ナトリウム二水和物、塩化マグネシウム、塩化カルシウムなどを含む。
【０１４８】
組成物は、一般に、２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜４００ｍＯｓｍ／ｋｇの間、好ましくは、２４０〜３６０ｍＯｓｍ／ｋｇの間の重量オスモル濃度を有し、およびより好ましくは、２９０〜３１０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲内に入る。重量オスモル濃度は、ワクチン接種によって引き起こされる疼痛に対して影響を有しないと以前は報告されている［１８４］が、にもかかわらず、この範囲にある重量オスモル濃度を維持することは、好ましい。
【０１４９】
組成物は、１種以上の緩衝剤を含み得る。代表的緩衝剤としては、以下が挙げられる：リン酸塩緩衝剤；Ｔｒｉｓ緩衝剤；ホウ酸塩緩衝剤；コハク酸塩緩衝剤；ヒスチジン緩衝剤；もしくはクエン酸塩緩衝剤。緩衝剤は、代表的には、５〜２０ｍＭ範囲に含まれる。上記緩衝剤は、上記エマルジョンの水相中に存在し得る。
【０１５０】
組成物のｐＨは、一般に、５．０〜８．１の間、より代表的には、６．０〜８．０の間、例えば、６．５〜７．５の間、または７．０〜７．８の間である。本発明のプロセスは、従って、パッケージングする前にバルクワクチンのｐＨを調節する工程を包含し得る。
【０１５１】
上記組成物は、好ましくは、無菌である。上記組成物は、好ましくはグルテンを含まない。
【０１５２】
上記ワクチンは、抗生物質（例えば、ネオマイシン、カナマイシン、ポリミキシンＢ）を含まない。
【０１５３】
上記組成物は、１回の免疫のための物質を含み得るか、または複数回の免疫（すなわち、複数用量の組成物）のための物質を含み得る。複数用量の配置は、通常は、上記ワクチン中に保存剤を含む。この必要性を回避するために、ワクチンは、物質の除去のための無菌アダプターを有する容器中に含まれ得る。
【０１５４】
インフルエンザワクチンは、代表的には、約０．５ｍｌの投与容積において投与されるが、半用量（すなわち、約０．２５ｍｌ）が、小児に投与され得、したがって、単位用量は、選択される（例えば、患者への投与のために、０．５ｍｌ用量を与える単位用量）。
【０１５５】
（組成物もしくはキット成分のパッケージング）
本発明のプロセスは、ワクチンが容器に入れられる、特に、医師が使用するための分配のための容器へ入れられる工程を包含し得る。このような容器へとパッケージングされた後、上記容器は、冷蔵されない。
【０１５６】
上記ワクチンのための適切な容器としては、バイアル、鼻用スプレーおよび使い捨てシリンジ（これらは、無菌であるべきである）が挙げられる。
【０１５７】
組成物／成分がバイアル中に位置する場合、上記バイアルは、好ましくは、硝子もしくはプラスチック物質から作製される。上記バイアルは、好ましくは、上記組成物が添加される前に滅菌される。ラテックス感受性の患者に伴う問題を回避するために、バイアルは、好ましくは、ラテックスを含まないストッパーで密封され、全てのパッケージング材料にラテックスがないことが好ましい。上記バイアルは、単一用量のワクチンを含み得るか、または上記バイアルは、１用量より多く（「複数用量のバイアル）、例えば、１０用量を含み得る。好ましいバイアルは、無色の硝子から作製される。
【０１５８】
バイアルは、予め充填されたシリンジがキャップに挿入され得るように適合したキャップ（例えば、ルアーロック）を有し得、上記シリンジの内容物は、上記バイアルに放出され得、上記バイアルの内容物は、シリンジへと戻され得る。上記バイアルから上記シリンジの取り出しの後に、ニードルが取り付けられ得、上記組成物は、患者に投与され得る。上記キャップは、好ましくは、シールもしくはカバーの内部に位置し、その結果、上記シールもしくはカバーは、上記キャップに接近する前に外されなければならない。バイアルは、その内容物の無菌的取り出しを可能にする、特に、複数用量バイアルのためのキャップを有し得る。
【０１５９】
組成物／成分がシリンジにパッケージングされる場合、上記シリンジは、上記シリンジに取り付けられたニードルを有し得る。ニードルが取り付けられていない場合、別個のニードルが、組み立ておよび使用のために、上記シリンジとともに供給され得る。このようなニードルは、シースに入れられ得る。安全ニードルが好ましい。１インチ２３ゲージ、１インチ２５ゲージおよび５／８インチ２５ゲージのニードルが代表的である。シリンジは、上記内容物のロット番号、インフルエンザ流行期および使用期限日が印刷されて、記録の保持を容易にし得る剥離ラベルとともに提供され得る。上記シリンジにおけるプランジャーは、好ましくは、プランジャーが吸引の間に偶然外れてしまわないようにストッパーを有する。上記シリンジは、ラテックスゴムキャップおよび／もしくはプランジャーを有し得る。使い捨てシリンジは、ワクチンの単一用量を含む。上記シリンジは、一般に、ニードルを取り付ける前に、先端をシールするために先端キャップを有し、上記先端キャップは、好ましくは、ブチルゴムから作製される。上記シリンジおよびニードルが別個にパッケージされる場合、上記ニードルには、好ましくは、ブチルゴムシールドが取り付けられる。好ましいシリンジは、商品名「Ｔｉｐ−Ｌｏｋ」ＴＭの下で販売されるものである。
【０１６０】
容器は、半用量の容積を示すために、例えば、小児への送達を容易にするために、印が付けられ得る。例えば、０．５ｍｌ用量を含むシリンジは、０．２５ｍｌ容積を示す印を有し得る。
【０１６１】
硝子容器（例えば、シリンジもしくはバイアル）が使用される場合、ソーダ石灰硝子からよりも、ホウケイ酸硝子から作製される容器を使用することが好ましい。
【０１６２】
組成物は、上記ワクチンの詳細を含むリーフレット（例えば、投与のための説明書、上記ワクチン内の抗原の詳細など）と一緒に（例えば、同じボックス中に）組み合わせられ得る。上記説明書はまた、警告（例えば、ワクチン接種後のアナフィラキシー反応の場合にすぐに使用できるように、アドレナリンの溶液を保持すること）を含み得る。
【０１６３】
（処置およびワクチンの投与の方法）
本発明の組成物は、ヒト患者への投与のために適切であり、本発明は、患者における免疫応答を惹起するための方法を提供し、上記方法は、本発明の組成物を上記患者に投与する工程を包含する。
【０１６４】
本発明はまた、医薬としての使用のための本発明のキットもしくは組成物を提供する。
【０１６５】
上記方法および本発明の使用によって惹起された免疫応答は、一般に、抗体応答、好ましくは、防御的抗体応答を含む。抗体応答、中和能力およびインフルエンザウイルスワクチン接種後の防御を評価するための方法は、当該分野で周知である。ヒト研究は、ヒトインフルエンザウイルスのヘマグルチニンに対する抗体力価が、防御と相関することを示した（約３０〜４０の血清サンプル赤血球凝集阻害力価は、同種のウイルスによる感染に対して約５０％の防御を与える）［１８５］。抗体応答は、代表的には、赤血球凝集阻害によって、マイクロ中和（ｍｉｃｒｏｎｅｕｔｒａｌｉｓａｔｉｏｎ）によって、単一放射状免疫拡散法（ＳＲＩＤ）によって、および／もしくは単一放射状溶血（ＳＲＨ）によって測定される。これらアッセイ技術は、当該分野で周知である。
【０１６６】
本発明の組成物は、種々の方法で投与され得る。最も好ましい免疫経路は、筋肉内注射（例えば、腕もしくは足へ）によるものであるが、他の利用可能な経路としては、皮下注射、鼻内［１８６  １８７  １８８］、経口［１８９］、皮内［１９０、１９１］、経皮的（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、経皮的（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）［１９２］などが挙げられる。
【０１６７】
本発明に従って調製されるワクチンは、小児および成人の両方を処置するために使用され得る。インフルエンザワクチンは現在、６ヶ月の年齢から、小児および成人の免疫における使用に推奨されている。従って、上記患者は、１歳未満、１〜５歳、５〜１５歳、１５〜５５歳、もしくは少なくとも５５歳であり得る。上記ワクチンを受けるための好ましい患者は、老齢（例えば、≧５０歳、≧６０歳、および好ましくは、≧６５歳）、若年（例えば、≦５歳）、入院患者、ヘルスケア労働者、軍職員（ａｒｍｅｄ  ｓｅｒｖｉｃｅ  ａｎｄ  ｍｉｌｉｔａｒｙ  ｐｅｒｓｏｎｎｅｌ）、妊婦、慢性疾患患者、免疫不全患者、上記ワクチンを受ける前の７日間に抗ウイルス化合物（例えば、オセルタミビルもしくはザナミビル化合物；以下を参照のこと）を摂取している患者、卵アレルギーを有するヒトおよび外国旅行に行くヒトである。上記ワクチンは、これら群の対してのみ適切であるわけではないが、集団においてより一般的に使用され得る。流行株に関して、全ての年齢群への投与が好ましい。
【０１６８】
本発明の好ましい組成物は、有効性についての上記ＣＰＭＰ基準の１、２もしくは３を満たす。成人（１８〜６０歳）において、これら基準は、以下のとおりである：（１）≧７０％  血清防御（ｓｅｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）；（２）≧４０％  血清変換；および／もしくは（３）≧２．５倍のＧＭＴ増大。老齢（＞６０歳）において、これら基準は、以下のとおりである：（１）≧６０％  血清防御；（２）≧３０％  血清変換；および／もしくは（３）≧２倍のＧＭＴ増大。これら基準は、少なくとも５０名の患者でのオープンラベル研究に基づく。
【０１６９】
処置は、単一用量スケジュールもしくは複数用量スケジュールによってであり得る。複数用量は、初期免疫スケジュールおよび／もしくはブースター免疫スケジュールにおいて使用され得る。複数用量スケジュールにおいて、種々の用量は、同じもしくは異なる経路（例えば、非経口的初回刺激および粘膜ブースト、粘膜の初回刺激および非経口的ブーストなど）によって与えられ得る。１回より多い用量（代表的には、２用量）の投与は、免疫的に経験のない患者において（例えば、インフルエンザワクチンを以前に一度も受けたことがない人のため、または新たなＨＡサブタイプ（流行の勃発におけるような）に対するワクチン接種のため）特に有用である。複数用量は、代表的には、少なくとも１週間間隔を空けて（例えば、約２週間、約３週間、約４週間、約６週間、約８週間、約１２週間、約１６週間など）投与される。
【０１７０】
本発明によって生成されるワクチンは、他のワクチン（例えば、麻疹ワクチン、流行性耳下腺炎ワクチン、風疹ワクチン、ＭＭＲワクチン、水痘ワクチン、ＭＭＲＶワクチン、ジフテリアワクチン、破傷風ワクチン、百日咳ワクチン、ＤＴＰワクチン、結合体化Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  ｂ型ワクチン、不活化ポリオウイルスワクチン、Ｂ型肝炎ウイルスワクチン、髄膜炎菌結合体ワクチン（例えば、四価Ａ  Ｃ  Ｗ１３５  Ｙ  ワクチン）、ＲＳウイルスワクチン、肺炎球菌結合体ワクチンなど）と実質的に同時に（例えば、同じ診断の間に、またはヘルスケア専門施設もしくはワクチン接種施設への訪問の間に）、患者に投与される。肺炎球菌ワクチンおよび／もしくは髄膜炎菌ワクチンと実質的に同時に投与することは、老齢患者において特に有用である。
【０１７１】
同様に、本発明のワクチンは、抗ウイルス化合物、および特に、インフルエンザウイルスに対して活性な抗ウイルス化合物（例えば、オセルタミビルおよび／もしくはザナミビル）と実質的に同時に（例えば、同じ診断の間に、またはヘルスケア専門家への訪問の間に）、患者に投与され得る。これら抗ウイルス剤としては、ノイラミニダーゼインヒビター（例えば、（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−４−アセチルアミノ−５−アミノ−３（１−エチルプロポキシ）−１−シクロヘキセン−１−カルボン酸もしくは５−（アセチルアミノ）−４−［（アミノイミノメチル）−アミノ］−２，６−アンヒドロ−３，４，５−トリデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクトノン−２−エン酸（それらのエステル（例えば、そのエチルエステル）およびその塩（例えば、リン酸塩）を含む））が挙げられる。好ましい抗ウイルス剤は、（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−４−アセチルアミノ−５−アミノ−３（１−エチルプロポキシ）−１−シクロヘキセン−１−カルボン酸、エチルエステル、リン酸（１：１）（オセルタミビルリン酸（ＴＡＭＩＦＬＵＴＭ）としても公知）である。
【０１７２】
（総括）
用語「含む」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を包含し、例えば、Ｘを「含む」組成物は、もっぱらＸからなっていてもよいし、さらなる何か（例えば、Ｘ＋Ｙ）を含んでいてもよい。
【０１７３】
語句「実質的に」とは、「完全に」を排除せず、例えば、Ｙを「実質的に含まない」組成物は、Ｙを完全に含まなくてもよい。必要な場合、語句「実質的に」とは、本発明の定義から省略され得る。
【０１７４】
数値ｘに関して用語「約」とは、例えば、ｘ±１０％を意味する。
【０１７５】
具体的に示されなければ、２種以上の成分を混合する工程を含むプロセスは、いかなる特定の混合の順序を要しない。従って、成分は、いずれの順序でも混合され得る。３種の成分が存在する場合、２種の成分が互いに合わされ、次いで、その組み合わせが、第３の成分と合わされ得るなど。
【０１７６】
動物（および特にウシ）物質を、細胞培養において使用する場合、それらは、伝染性海綿状脳症（ＴＳＥ）がない、特に、ウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）がない供給源から得られるべきである。全体として、動物由来物質の完全な非存在下で細胞を培養することが好ましい。
【０１７７】
化合物が組成物の一部として身体に投与される場合、その化合物は、代わりに適切なプロドラッグによって置換され得る。
【０１７８】
細胞基質が、リアソータント手順もしくは逆遺伝学手順のために使用される場合、それは、好ましくは、例えば、Ｐｈ  Ｅｕｒ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｃｈａｐｔｅｒ  ５．２．３．のような、ヒトワクチン生成において使用することについて承認されたものである。
【０１７９】
ポリペプチド配列間の同一性は、好ましくは、ＭＰＳＲＣＨプログラム（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）において行われるように、ｕｓｉｎｇ  ａｎ  パラメーター  ギャップオープンペナルティー＝１２およびギャップエクステンションペナルティー＝１を伴うアフィンギャップ検索を使用して、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎホモロジー検索アルゴリズムによって決定される。
【０１８０】
（本発明を実施するための態様）
卵を使用するのではなく、インフルエンザＡウイルスおよびインフルエンザＢウイルスを、参考文献２７および４７の教示に従って、懸濁培養においてＭＤＣＫ細胞中で増殖させた。上記培養物は、いかなる抗生物質をも含んでいなかった。
【０１８１】
最終培養培地を、透明にして、ビリオンを提供し、それを、クロマトグラフィーおよび限外濾過／ダイアフィルトレーションに供した。
【０１８２】
不活性化のためにホルムアルデヒドを使用するのではなく、得られた物質中のビリオンを、参考文献５９の教示に従って、β−プロピオラクトン（最終濃度  ０．０５％  ｖ／ｖ；２〜８℃で１６〜２０時間インキュベートされ、次いで、３７℃で、２〜２．５時間インキュベートすることによって加水分解される）を使用して不活性化した。次いで、ＣＴＡＢを使用して、上記ビリオンを分割し、種々のさらなる処理工程を行って、精製表面タンパク質を含む最終の一価バルクワクチンを得た。
【０１８３】
上記最終のバルク物質は、水銀保存剤も、抗生物質も、ホルムアルデヒドも、卵由来物質も含まなかった。
【０１８４】
ワクチンの個々の用量を、上記バルクから調製し、各々は、Ａ／Ｈ１Ｎ１、Ａ／Ｈ３Ｎ２およびＢ株に由来する１５μｇのＨＡを含んでいた。このワクチンを、治験において患者に投与した。コントロール患者は、卵由来のＡｇｒｉｐｐａｌＴＭ（これは、ホルムアルデヒドおよび微量の抗生物質を含み得る）を受けた。上記ＭＤＣＫ由来のワクチンは、十分に寛容され、高度に免疫原性（Ａｇｒｉｐｐａｌに免疫学的に劣っていない）であり、インフルエンザワクチンの評価のためのＣＨＭＰ基準およびＣＢＥＲ基準を満たしていた。類似の免疫原性および安全性のプロフィールが、上記ＭＤＣＫ由来のワクチンの３つの異なるロットによって誘導され、このことによって、上記細胞培養製造技術が、一貫した臨床結果を生じることができることを確認した。
【０１８５】
本発明は、例示によってのみ記載されており、改変は、本発明の範囲および趣旨の範囲内にとどまりながら行われ得ることが理解される。
【０１８６】
参考文献
【０１８７】
【数１】
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【０１８８】
【数２】
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【０１８９】
【数３】
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【０１９０】
【数４】
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【０１９１】
【数５】
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