(57)【要約】【課題】アミロイドβタンパク質の産生を亢進する遺伝子、タンパク質、それらの用途の提供。【解決手段】アミロイドβタンパク質の産生を亢進する遺伝子、その遺伝子にコードされるタンパク質またはその塩、そのタンパク質に対する抗体、その抗体を含有してなる診断剤または医薬、前記タンパク質等を用いることを特徴とするアルツハイマー病治療に有効な化合物をスクリーニングする方法、前記タンパク質等を含むアルツハイマー病治療に有効な化合物のスクリーニングのためのキット等の提供。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミロイドβタンパク質（Ａβ）の産生を亢進する、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：１９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とするタンパク質またはその塩。
【請求項２】
アミロイドβタンパク質（Ａβ）の産生を亢進する、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７または配列番号：１９で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその塩。
【請求項３】
請求項１または請求項２記載のタンパク質の部分ペプチドまたはその塩。
【請求項４】
請求項１もしくは請求項２記載のタンパク質もしくは請求項３記載の部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
【請求項５】
ＤＮＡである請求項４記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８または配列番号：１８で表される塩基配列を含有するＤＮＡ。
【請求項７】
請求項６記載のＤＮＡを含有する組換えベクター。
【請求項８】
請求項７記載の組換えベクターで形質転換させた形質転換体。
【請求項９】
請求項１もしくは請求項２記載のタンパク質もしくは請求項３記載の部分ペプチドに対する抗体。
【請求項１０】
請求項９記載の抗体を含有してなる診断薬。
【請求項１１】
アルツハイマー病の診断薬である請求項１０記載の診断薬。
【請求項１２】
請求項９記載の抗体を含有してなる医薬。
【請求項１３】
アルツハイマー病の治療・予防剤である請求項１２記載の医薬。
【請求項１４】
請求項４記載のポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
【請求項１５】
配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８または配列番号：１８で表される塩基配列を含有するＤＮＡとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
【請求項１６】
請求項４記載のポリヌクレオチドまたはその一部と相補的な塩基配列を含有してなるアンチセンスポリヌクレオチド。
【請求項１７】
配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８または配列番号：１８で表される塩基配列を含有するＤＮＡまたはその一部と相補的な塩基配列を含有してなるアンチセンスＤＮＡ。
【請求項１８】
請求項１もしくは請求項２記載のタンパク質もしくは請求項３記載の部分ペプチドまたはその塩を用いることを特徴とする、アミロイドβタンパク質（Ａβ）の産生を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法。
【請求項１９】
請求項１もしくは請求項２記載のタンパク質もしくは請求項３記載の部分ペプチドまたはその塩を含有してなる、アミロイドβタンパク質（Ａβ）の産生を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング用キット。
【請求項２０】
請求項１８記載のスクリーニング方法または請求項１９記載のスクリーニング用キットを用いて得られる、アミロイドβタンパク質（Ａβ）の産生を阻害する化合物またはその塩。
【請求項２１】
請求項４もしくは請求項１４記載のポリヌクレオチド；請求項１５記載のＤＮＡ；または配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８または配列番号：１８で表される塩基配列を含有するＤＮＡを含有してなる診断薬。
【請求項２２】
アルツハイマー病の診断薬である請求項２１記載の診断薬。
【請求項２３】
請求項１４記載のポリヌクレオチド；または請求項１５記載のＤＮＡを含有してなる医薬。
【請求項２４】
アルツハイマー病の治療・予防剤である請求項２３記載の医薬。
【請求項２５】
請求項１もしくは請求項２記載のタンパク質もしくは請求項３記載の部分ペプチドの活性を阻害する化合物またはその塩を含有してなるアルツハイマー病の治療・予防剤。
【請求項２６】
アルツハイマー病患者に請求項１もしくは請求項２記載のタンパク質もしくは請求項３記載の部分ペプチドの活性を阻害する化合物またはその塩を投与することを特徴とするアルツハイマー病の予防・治療方法。
【請求項２７】
アルツハイマー病の治療・予防剤を製造するための請求項１もしくは請求項２記載のタンパク質もしくは請求項３記載の部分ペプチドまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩の使用。
【請求項２８】
配列番号：７で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその塩。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、アルツハイマー病の発症・進展に深くかわっているアミロイドβタンパク（Ａβ）の産生を制御する遺伝子、タンパク質、その用途等に関する。具体的には本発明は、Ａβの産生を制御する遺伝子、その遺伝子にコードされるタンパク質、該タンパク質に対する抗体、該タンパク質またはその抗体等を含有してなる医薬、さらにはアルツハイマー病の診断方法、予防・治療方法等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
アルツハイマー病患者脳の病理学的特徴として、神経細胞の脱落に加えて、老人斑、神経原線維変化の蓄積が知られている。これらのうち、アルツハイマー病における最初期の病理変化は老人斑の形成であり、その主要構成成分がＡβであることから、Ａβの産生あるいは分解の異常がアルツハイマー病の発症・進展に深くかわっていると考えられている。Ａβは前駆体タンパク質（βＡＰＰ）からβ−セクレターゼとγ−セクレターゼにより切断され産生される。β−セクレターゼについては、既に新規アスパラギン酸プロテアーゼであることが同定された（Ｎｅｕｒｏｎ  ２７，  ４１９−４２２，  ２０００）。一方、γ−セクレターゼについては、家族性アルツハイマー病（ＦＡＤ）原因遺伝子、プレセニリンあるいはプレセニリンを含む複合体がその活性発現に関与していることが明らかにされている（Ｎｅｕｒｏｎ  ２７，４１９−４２２，  ２０００）。また、最近、プレセニリンと複合体を形成し、βＡＰＰのプロセシングに関与する新規膜貫通型糖タンパク質としてニカストリン（Ｎｉｃａｓｔｒｉｎ）が報告された（Ｎａｔｕｒｅ  ４０７，  ４８−５４，  ２０００）。
【非特許文献１】
Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ８，  ４４７−４５３，  １９９８
【非特許文献２】
Ｔｏｕｃｈｏｔ，  Ｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，  ２５６，  ７９−８４，  １９８９
【非特許文献３】
Ｓｅｋｉ  Ｎ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅｔ．，  ４５，  ３８−４２，  ２０００
【非特許文献４】
Ｌｅｌｉａｓ  Ｊ．Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．，  ９０，  １４７９−１４８３，  １９９３
【非特許文献５】
Ａｄｒａ  Ｃ．Ｎ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，  ２４，  １８８−１９０，  １９９４
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、γ−セクレターゼについては、その実体の詳細は不明である（Ｎｅｕｒｏｎ  ２７，  ４１９−４２２，  ２０００）。γ−セクレターゼ活性は抗プレセニリン抗体によって巨大な分子量のフラクションに回収され、その活性の制御には、プレセニリンＮ端およびＣ端フラグメント複合体の安定化因子など、多くの未同定の因子が関与し得ると考えられる。さらに、βＡＰＰのプロセシングは、粗面小胞体、ゴルジ体などから細胞膜上へ輸送される分泌経路、細胞膜上、さらに、細胞内に再取り込みされた後のエンドソーム内で引き起こされることから（Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  ＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙ  ８，  ４４７−４５３，  １９９８）、βＡＰＰの細胞内輸送系に関与する様々な因子もＡβの産生に影響し得ると考えられる。そこで、これらの因子を遺伝子として同定することは、Ａβの産生を抑制する薬剤の開発やアルツハイマー病の診断薬など、新しい医薬への応用を図ることができることから、極めて重要なことと考えられる。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、Ａβの産生を制御する遺伝子を探索するため、βＡＰＰフラグメントからＡβの産生が促進されることにより薬剤耐性遺伝子の発現が亢進するよう設計された細胞株を考案し、これを用いたアルツハイマー病関連遺伝子のスクリーニング方法について、既に特許出願をした（ＰＣＴ／ＪＰ０２／００８３６、２００２年２月１日出願）。本発明者は、このスクリーニング法を用いてさらに研究した結果、新たに５種のアルツハイマー病関連遺伝子を特定することに成功し、本発明を完成するに至った。
【０００５】
即ち、本発明は、
（１）Ａβの産生を亢進する、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：１９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特徴とするタンパク質またはその塩、
（２）Ａβの産生を亢進する、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７または配列番号：１９で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその塩、
（３）上記（１）または（２）記載のタンパク質の部分ペプチドまたはその塩、
（４）上記（１）もしくは（２）記載のタンパク質もしくは上記（３）記載の部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（５）ＤＮＡである上記（４）記載のポリヌクレオチド、
（６）配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８または配列番号：１８で表される塩基配列を含有するＤＮＡ、
（７）上記（６）記載のＤＮＡを含有する組換えベクター、
（８）上記（７）記載の組換えベクターで形質転換させた形質転換体、
（９）上記（１）もしくは（２）記載のタンパク質もしくは上記（３）記載の部分ペプチドに対する抗体、
（１０）上記（９）記載の抗体を含有してなる診断薬、
（１１）アルツハイマー病の診断薬である上記（１０）記載の診断薬、
（１２）上記（９）記載の抗体を含有してなる医薬、
（１３）アルツハイマー病の治療・予防剤である上記（１２）記載の医薬、
（１４）上記（４）記載のポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、
（１５）配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８または配列番号：１８で表される塩基配列を含有するＤＮＡとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ、
（１６）上記（４）記載のポリヌクレオチドまたはその一部と相補的な塩基配列を含有してなるアンチセンスポリヌクレオチド、
（１７）配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８または配列番号：１８で表される塩基配列を含有するＤＮＡまたはその一部と相補的な塩基配列を含有してなるアンチセンスＤＮＡ、
（１８）上記（１）もしくは（２）記載のタンパク質もしくは上記（３）記載の部分ペプチドまたはその塩を用いることを特徴とする、Ａβの産生を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（１９）上記（１）もしくは（２）記載のタンパク質もしくは上記（３）記載の部分ペプチドまたはその塩を含有してなる、Ａβの産生を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング用キット、
（２０）上記（１８）記載のスクリーニング方法または上記（１９）記載のスクリーニング用キットを用いて得られる、Ａβの産生を阻害する化合物またはその塩、
（２１）上記（４）もしくは（１４）記載のポリヌクレオチド；上記（１５）記載のＤＮＡ；または配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８または配列番号：１８で表される塩基配列を含有するＤＮＡを含有してなる診断薬、
（２２）アルツハイマー病の診断薬である上記（２１）記載の診断薬、
（２３）上記（１４）記載のポリヌクレオチド；または上記（１５）記載のＤＮＡを含有してなる医薬、
（２４）アルツハイマー病の治療・予防剤である上記（２３）記載の医薬、
（２５）上記（１）もしくは（２）記載のタンパク質もしくは上記（３）記載の部分ペプチドの活性を阻害する化合物またはその塩を含有してなるアルツハイマー病の治療・予防剤、
（２６）アルツハイマー病患者に上記（１）もしくは（２）記載のタンパク質もしくは上記（３）記載の部分ペプチドの活性を阻害する化合物またはその塩を投与することを特徴とするアルツハイマー病の予防・治療方法、
（２７）アルツハイマー病の治療・予防剤を製造するための上記（１）もしくは（２）記載のタンパク質もしくは上記（３）記載の部分ペプチドの活性を阻害する化合物またはその塩の使用、
（２８）配列番号：７で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその塩等を提供する。
【０００６】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について詳細に説明する。
（ペプチド、タンパク質、その部分ペプチドまたはそれらの塩）
本発明のペプチド、タンパク質またはその塩は、ヒトまたは温血動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サルなど）由来のあらゆる細胞（例えば、網膜細胞、肝細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくは癌細胞など）もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、例えば、脳、脳の各部位（例、網膜、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋など、または血球系の細胞もしくはその培養細胞（例えば、ＭＥＬ，Ｍ１，ＣＴＬＬ−２，ＨＴ−２，ＷＥＨＩ−３，ＨＬ−６０，ＪＯＳＫ−１，Ｋ５６２，ＭＬ−１，ＭＯＬＴ−３，ＭＯＬＴ−４，ＭＯＬＴ−１０，ＣＣＲＦ−ＣＥＭ，ＴＡＬＬ−１，Ｊｕｒｋａｔ，ＣＣＲＴ−ＨＳＢ−２，ＫＥ−３７，ＳＫＷ−３，ＨＵＴ−７８，ＨＵＴ−１０２，Ｈ９，Ｕ９３７，ＴＨＰ−１，ＨＥＬ，ＪＫ−１，ＣＭＫ，ＫＯ−８１２，ＭＥＧ−０１など）やあらゆる組織由来するタンパク質であってもよく、組換えタンパク質であってもよく、また合成タンパク質であってもよい。
本発明のタンパク質は、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：１９で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質である。
実質的に同一のアミノ酸配列としては、例えば、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：１９で表わされるアミノ酸配列と約５０％以上、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。さらに、本発明のタンパク質は配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：１９で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：１９で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。実質的に同質の活性としては、Ａβの産生において配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：１９で表わされるタンパク質と同質の影響を与えるものであれば、他の活性は異なっていてもかまわない。
【０００７】
また、本発明のタンパク質としては、▲１▼配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：１９で表わされるアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、▲２▼配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：１９で表わされるアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、▲３▼配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：１９で表わされるアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または▲４▼それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有するタンパク質なども用いられる。
具体的には、本発明のタンパク質としては、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質、配列番号：３で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質、配列番号：５で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質、配列番号：７で表わされるアミノ酸配列、配列番号：１９で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質などが好ましく用いられる。
【０００８】
本明細書におけるタンパク質は、ペプチド標記の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）である。配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５または配列番号：１９で表わされるアミノ酸配列を有するタンパク質をはじめとする本発明のタンパク質は、Ｃ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ−）、アミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）の何れであってもよい。
ここでエステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピルもしくはｎ−ブチルなどのＣ１−６アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ３−８シクロアルキル基、例えば、フェニル、α−ナフチルなどのＣ６−１２アリール基、例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ１−２アルキル基もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ１−２アルキル基などのＣ７−１４アラルキル基のほか、経口用エステルとして汎用されるピバロイルオキシメチル基などが用いられる。
本発明のタンパク質がＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明のタンパク質に含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。
さらに、本発明のタンパク質には、上記したタンパク質において、Ｎ末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチルなどのＣ２−６アルカノイル基などのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、Ｎ端側が生体内で切断され生成したグルタミル基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば、−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチルなどのＣ２−６アルカノイル基などのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖タンパク質などの複合タンパク質なども含まれる。
【０００９】
本発明のタンパク質の部分ペプチド（以下、部分ペプチドと略記する場合がある）としては、前記した本発明のタンパク質の部分ペプチドと実質的に同一のアミノ酸配列であれば何れのものであってもよい。本発明の部分ペプチドのアミノ酸の数は、例えば、前記した配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７または配列番号：１９で表わされる構成アミノ酸配列のうち少なくとも５個以上、好ましくは２０個以上、より好ましくは１００個以上のアミノ酸配列を有するペプチドなどが好ましい。
実質的に同一のアミノ酸配列とは、これらアミノ酸配列と約５０％以上、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を示す。
【００１０】
また、本発明の部分ペプチドは、上記アミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が欠失し、または、そのアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が付加し、または、そのアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜１０個程度、より好ましくは数個、さらに好ましくは１〜５個程度）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されていてもよい。
また、本発明の部分ペプチドは、Ｃ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ−）、アミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）のいずれであってもよい。ここで、エステルにおけるＲは上記と同意義を示す。
さらに、本発明の部分ペプチドには、前記した本発明のタンパク質と同様に、Ｎ末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基で保護されているもの、Ｎ端側が生体内で切断され生成したＧｌｎがピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなども含まれる。
本発明のタンパク質またはその部分ペプチドの塩としては、酸または塩基との生理学的に許容される塩が挙げられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。
【００１１】
前記した本発明の配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７または配列番号：１９で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質をはじめとする、本発明のスクリーニング方法で得られたＤＮＡにコードされるペプチド、タンパク質（以下、ペプチドも含めてタンパク質と略記する）またはその塩は、前述したヒトやその他の哺乳動物の細胞または組織から公知のペプチドまたはタンパク質の精製方法によって製造することもできるし、後述する本発明のタンパク質をコードするＤＮＡで形質転換された形質転換体を培養することによっても製造することができる。また、後述のタンパク質合成法またはこれに準じて製造することもできる。
ヒトやその他の哺乳動物の組織または細胞から製造する場合、ヒトやその他の哺乳動物の組織または細胞をホモジナイズした後、酸などで抽出を行ない、得られた抽出液を逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わせることにより、本発明のタンパク質を精製単離することができる。
【００１２】
本発明のタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩またはそのアミド体の合成には、通常市販のタンパク質合成用樹脂を用いることができる。そのような樹脂としては、例えば、クロロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、アミノメチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、ＰＡＭ樹脂、４−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセトアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル）フェノキシ樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃアミノエチル）フェノキシ樹脂などを挙げることができる。このような樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的とするタンパク質の配列通りに、公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合させる。反応の最後に樹脂からタンパク質を切り出すと同時に各種保護基を除去し、さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフィド結合形成反応を実施し、目的のタンパク質またはそのアミド体を取得する。
上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、タンパク質合成に使用できる各種活性化試薬を用いることができるが、特に、カルボジイミド類がよい。カルボジイミド類としては、ＤＣＣ、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロリル）カルボジイミドなどが用いられる。これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤（例えば、ＨＯＢｔ、ＨＯＯＢｔ）とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するかまたは、対称酸無水物またはＨＯＢｔエステルあるいはＨＯＯＢｔエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活性化を行なった後に樹脂に添加することができる。
【００１３】
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、タンパク質縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド，Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド，Ｎ−メチルピロリドンなどの酸アミド類、塩化メチレン、クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素類、トリフルオロエタノールなどのアルコール類、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、ピリジン、ジオキサン、テトラヒドロフランなどのエーテル類、アセトニトリル、プロピオニトリルなどのニトリル類、酢酸メチル、酢酸エチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。反応温度はタンパク質結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜選択され、通常約−２０℃〜５０℃の範囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は通常１．５〜４倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行うことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行なうことができる。反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはアセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化することができる。
【００１４】
原料のアミノ基の保護基としては、例えば、Ｚ、Ｂｏｃ、ターシャリーペンチルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、Ｃｌ−Ｚ、Ｂｒ−Ｚ、アダマンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロイル、ホルミル、２−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフィノチオイル、Ｆｍｏｃなどが用いられる。
カルボキシル基は、例えば、アルキルエステル化（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ターシャリーブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、２−アダマンチルなどの直鎖状、分枝状もしくは環状アルキルエステル化）、アラルキルエステル化（例えば、ベンジルエステル、４−ニトロベンジルエステル、４−メトキシベンジルエステル、４−クロロベンジルエステル、ベンズヒドリルエステル化）、フェナシルエステル化、ベンジルオキシカルボニルヒドラジド化、ターシャリーブトキシカルボニルヒドラジド化、トリチルヒドラジド化などによって保護することができる。
セリンの水酸基は、例えば、エステル化またはエーテル化によって保護することができる。このエステル化に適する基としては、例えば、アセチル基などの低級アルカノイル基、ベンゾイル基などのアロイル基、ベンジルオキシカルボニル基、エトキシカルボニル基などの炭酸から誘導される基などが用いられる。また、エーテル化に適する基としては、例えば、ベンジル基、テトラヒドロピラニル基、ｔ−ブチル基などである。
チロシンのフェノール性水酸基の保護基としては、例えば、Ｂｚｌ、Ｃｌ２−Ｂｚｌ、２−ニトロベンジル、Ｂｒ−Ｚ、ターシャリーブチルなどが用いられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、例えば、Ｔｏｓ、４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル、ＤＮＰ、ベンジルオキシメチル、Ｂｕｍ、Ｂｏｃ、Ｔｒｔ、Ｆｍｏｃなどが用いられる。
【００１５】
原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、例えば、対応する酸無水物、アジド、活性エステル〔アルコール（例えば、ペンタクロロフェノール、２，４，５−トリクロロフェノール、２，４−ジニトロフェノール、シアノメチルアルコール、パラニトロフェノール、ＨＯＮＢ、Ｎ−ヒドロキシスクシミド、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、ＨＯＢｔ）とのエステル〕などが用いられる。原料のアミノ基の活性化されたものとしては、例えば、対応するリン酸アミドが用いられる。
保護基の除去（脱離）方法としては、例えば、Ｐｄ−黒あるいはＰｄ−炭素などの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、また、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理や、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピペリジン、ピペラジンなどによる塩基処理、また液体アンモニア中ナトリウムによる還元なども用いられる。上記酸処理による脱離反応は、一般に約−２０℃〜４０℃の温度で行なわれるが、酸処理においては、例えば、アニソール、フェノール、チオアニソール、メタクレゾール、パラクレゾール、ジメチルスルフィド、１，４−ブタンジチオール、１，２−エタンジチオールなどのようなカチオン捕捉剤の添加が有効である。また、ヒスチジンのイミダゾール保護基として用いられる２，４−ジニトロフェニル基はチオフェノール処理により除去され、トリプトファンのインドール保護基として用いられるホルミル基は上記の１，２−エタンジチオール、１，４−ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、希水酸化ナトリウム溶液、希アンモニアなどによるアルカリ処理によっても除去される。
【００１６】
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、およびその保護基の脱離、反応に関与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段から適宜選択しうる。
タンパク質のアミド体を得る別の方法としては、例えば、まず、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基をアミド化して保護した後、アミノ基側にペプチド（タンパク質）鎖を所望の鎖長まで延ばした後、該ペプチド鎖のＮ末端のα−アミノ基の保護基のみを除いたタンパク質とＣ末端のカルボキシル基の保護基のみを除去したタンパク質とを製造し、この両タンパク質を上記したような混合溶媒中で縮合させる。縮合反応の詳細については上記と同様である。縮合により得られた保護タンパク質を精製した後、上記方法によりすべての保護基を除去し、所望の粗タンパク質を得ることができる。この粗タンパク質は既知の各種精製手段を駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥することで所望のタンパク質のアミド体を得ることができる。
タンパク質のエステル体を得るには、例えば、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、タンパク質のアミド体と同様にして、所望のタンパク質のエステル体を得ることができる。
【００１７】
本発明のタンパク質の部分ペプチドまたはその塩は、公知のペプチドの合成法に従って、あるいは本発明のタンパク質を適当なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。ペプチドの合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによっても良い。すなわち、本発明のタンパク質を構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱離としては、例えば、以下の▲１▼〜▲５▼に記載された方法が挙げられる。
▲１▼Ｍ．  Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ  および  Ｍ．Ａ．  Ｏｎｄｅｔｔｉ、ペプチド  シンセシス  （Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ），  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９６６年）
▲２▼ＳｃｈｒｏｅｄｅｒおよびＬｕｅｂｋｅ、ザ  ペプチド（Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ），  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９６５年）
▲３▼泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、  丸善（株）  （１９７５年）
▲４▼矢島治明  および榊原俊平、生化学実験講座  １、  タンパク質の化学ＩＶ、  ２０５、（１９７７年）
▲５▼矢島治明監修、続医薬品の開発  第１４巻  ペプチド合成  広川書店
また、反応後は通常の精製法、たとえば、溶媒抽出・蒸留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー・再結晶などを組み合わせて本発明の部分ペプチドを精製単離することができる。上記方法で得られる部分ペプチドが遊離体である場合は、公知の方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法によって遊離体に変換することができる。
【００１８】
（ポリヌクレオチドまたはＤＮＡ）
本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、以下に説明する本発明の配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７または配列番号：１９で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドと同様に調製することができる。
本発明の配列番号：１、配列番号：３、配列番号：、配列番号：７または配列番号：１９で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７または配列番号：１９で表わされるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする塩基配列（ＤＮＡまたはＲＮＡ、好ましくはＤＮＡ）を含有するものであればいかなるものであってもよい。該ポリヌクレオチドとしては、本発明の配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７または配列番号：１９で表わされるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、ｍＲＮＡ等のＲＮＡであり、二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ：ＲＮＡのハイブリッドでもよい。一本鎖の場合は、センス鎖（即ち、コード鎖）であっても、アンチセンス鎖（即ち、非コード鎖）であってもよい。
本発明の配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７または配列番号：１９で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするＤＮＡとしては、染色体ＤＮＡ、染色体ＤＮＡライブラリー、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、前記した細胞・組織より全ＲＮＡまたはｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（以下、ＲＴ−ＰＣＲ法と略称する）によって増幅することもできる。
具体的には、本発明の配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７または配列番号：１９で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするＤＮＡとしては、例えば、それぞれ配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８または配列番号：１８で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８または配列番号：１８で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、本発明の配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７または配列番号：１９で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質のＡβ産生亢進活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであれば何れのものでもよい。
配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８または配列番号：１８で表わされる塩基配列とハイブリダイズできる塩基配列としては、例えば、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８または配列番号：１８で表わされる塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列などが用いられる。
【００１９】
ハイブリダイゼーションは、公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ（Ｊ．  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．  Ｐｒｅｓｓ，  １９８９）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。より好ましくは、ハイストリンジェントな条件に従って行なうことができる。
該ハイストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が約１９〜４０ｍＭ、好ましくは約１９〜２０ｍＭで、温度が約５０〜７０℃、好ましくは約６０〜６５℃の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が約１９ｍＭで温度が約６５℃の場合が最も好ましい。
本発明の配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７または配列番号：１９で表わされるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列の一部、または該ＤＮＡと相補的な塩基配列の一部を含有してなるポリヌクレオチドとは、下記の本発明の部分ペプチドをコードするＤＮＡを包含するだけではなく、ＲＮＡをも包含する意味で用いられる。
本発明の配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７または配列番号：１９で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、例えば、公知の実験医学増刊「新ＰＣＲとその応用」１５（７）、１９９７記載の方法またはそれに準じた方法により、本発明の配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７または配列番号：１９で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質のｍＲＮＡを定量することができる。
なお、本発明のＤＮＡは、ＰＣＴ／ＪＰ０２／００８３６に開示されているスクリーニング方法および後述の参考例１〜５に記載の方法によって取得されたものである。
【００２０】
（アンチセンス）
本発明に従えば、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７または配列番号：１９で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質遺伝子の複製又は発現を阻害することのできるアンチセンス・ポリヌクレオチド（核酸）を、クローン化したあるいは配列が決定された配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７または配列番号：１９で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列情報に基づき設計し、合成しうる。そうしたポリヌクレオチド（核酸）は、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７または配列番号：１９で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質の遺伝子のＲＮＡとハイブリダイズすることができ、該ＲＮＡの合成又は機能を阻害することができるか、あるいは配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７または配列番号：１９で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質関連ＲＮＡとの相互作用を介して配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７または配列番号：１９で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質遺伝子の発現を調節・制御することができる。配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７または配列番号：１９で表わされるアミノ酸配列を有するタンパク質関連ＲＮＡの選択された配列に相補的なポリヌクレオチド、及び配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７または配列番号：１９で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質関連ＲＮＡと特異的にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドは、生体内及び生体外で配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７または配列番号：１９で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質遺伝子の発現を調節・制御するのに有用であり、また病気などの治療又は診断に有用である。そうしたポリヌクレオチドは、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７または配列番号：１９で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質遺伝子の５’端ヘアピンループ、５’端６−ベースペア・リピート、５’端非翻訳領域、ポリペプチド翻訳開始コドン、タンパク質コード領域、ＯＲＦ翻訳終止コドン、３’端非翻訳領域、３’端パリンドローム領域、及び３’端ヘアピンループを好ましい対象領域として選択し調製しうるが、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７または配列番号：１９で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質遺伝子内の如何なる領域も対象として選択しうる。
【００２１】
目的核酸と対象領域の少なくとも一部に相補的なポリヌクレオチドとの関係、あるいは、対象物とハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドとの関係は、「アンチセンス」であるということができる。アンチセンス・ポリヌクレオチドは、２−デオキシ−Ｄ−リボースを含有しているポリデオキシヌクレオチド、Ｄ−リボースを含有しているポリヌクレオチド、プリン又はピリミジン塩基のＮ−グリコシドであるその他のタイプのポリヌクレオチド、あるいは非ヌクレオチド骨格を有するその他のポリマー（例えば、市販のタンパク質、核酸及び合成配列特異的な核酸ポリマー）又は特殊な結合を含有するその他のポリマー（但し、該ポリマーはＤＮＡやＲＮＡ中に見出されるような塩基のペアリングや塩基の付着を許容する配置をもつヌクレオチドを含有する）などが挙げられる。それらは、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、さらにＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドであることができ、さらに非修飾ポリヌクレオチド（または非修飾オリゴヌクレオチド）、さらには公知の修飾の付加されたもの、例えば当該分野で知られた標識のあるもの、キャップの付いたもの、メチル化されたもの、１個以上の天然のヌクレオチドを類縁物で置換したもの、分子内ヌクレオチド修飾のされたもの、例えば非荷電結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、カルバメートなど）を持つもの、電荷を有する結合又は硫黄含有結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）を持つもの、例えばタンパク質（ヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ・インヒビター、トキシン、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジンなど）や糖（例えば、モノサッカライドなど）などの側鎖基を有しているもの、インターカレート化合物（例えば、アクリジン、ソラレンなど）を持つもの、キレート化合物（例えば、金属、放射活性をもつ金属、ホウ素、酸化性の金属など）を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、修飾された結合を持つもの（例えば、αアノマー型の核酸など）であってもよい。ここで「ヌクレオシド」、「ヌクレオチド」及び「核酸」とは、プリン及びピリミジン塩基を含有するのみでなく、修飾されたその他の複素環型塩基をもつようなものを含んでいて良い。こうした修飾物は、メチル化されたプリン及びピリミジン、アシル化されたプリン及びピリミジン、あるいはその他の複素環を含むものであってよい。修飾されたヌクレオチド及び修飾されたヌクレオチドはまた糖部分が修飾されていてよく、例えば１個以上の水酸基がハロゲンとか、脂肪族基などで置換されていたり、あるいはエーテル、アミンなどの官能基に変換されていてよい。
【００２２】
本発明のアンチセンス・ポリヌクレオチド（核酸）は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、あるいは修飾された核酸（ＲＮＡ、ＤＮＡ）である。修飾された核酸の具体例としては核酸の硫黄誘導体やチオホスフェート誘導体、そしてポリヌクレオシドアミドやオリゴヌクレオシドアミドの分解に抵抗性のものが挙げられるが、それに限定されるものではない。本発明のアンチセンス核酸は次のような方針で好ましく設計されうる。すなわち、細胞内でのアンチセンス核酸をより安定なものにする、アンチセンス核酸の細胞透過性をより高める、目標とするセンス鎖に対する親和性をより大きなものにする、そしてもし毒性があるならアンチセンス核酸の毒性をより小さなものにする。
こうした修飾は当該分野で数多く知られており。例えば  Ｊ．  Ｋａｗａｋａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍ  Ｔｅｃｈ  Ｊａｐａｎ，  Ｖｏｌ．  ８，  ｐｐ．２４７，  １９９２；  Ｖｏｌ．  ８，  ｐｐ．３９５，  １９９２；  Ｓ．  Ｔ．  Ｃｒｏｏｋｅ  ｅｔ  ａｌ．  ｅｄ．，  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  １９９３  などに開示がある。
本発明のアンチセンス核酸は、変化せしめられたり、修飾された糖、塩基、結合を含有していて良く、リポゾーム、ミクロスフェアのような特殊な形態で供与されたり、遺伝子治療により適用されたり、付加された形態で与えられることができうる。こうして付加形態で用いられるものとしては、リン酸基骨格の電荷を中和するように働くポリリジンのようなポリカチオン体、細胞膜との相互作用を高めたり、核酸の取込みを増大せしめるような脂質（例えば、ホスホリピド、コレステロールなど）といった疎水性のものが挙げられる。付加するに好ましい脂質としては、コレステロールやその誘導体（例えば、コレステリルクロロホルメート、コール酸など）が挙げられる。こうしたものは、核酸の３’端あるいは５’端に付着させることができ、塩基、糖、分子内ヌクレオシド結合を介して付着させることができうる。その他の基としては、核酸の３’端あるいは５’端に特異的に配置されたキャップ用の基で、エキソヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅなどのヌクレアーゼによる分解を阻止するためのものが挙げられる。こうしたキャップ用の基としては、ポリエチレングリコール、テトラエチレングリコールなどのグリコールをはじめとした当該分野で知られた水酸基の保護基が挙げられるが、それに限定されるものではない。
アンチセンス核酸の阻害活性は、本発明の形質転換体、本発明の生体内や生体外の遺伝子発現系、あるいは配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７または配列番号：１９で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質の生体内や生体外の翻訳系を用いて調べることができる。該核酸は公知の各種の方法で細胞に適用できる。
【００２３】
本発明の部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、前述した本発明の部分ペプチドをコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。また、染色体ＤＮＡ、染色体ＤＮＡライブラリー、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、前記した細胞・組織よりｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接ＲＴ−ＰＣＲ法によって増幅することもできる。
具体的には、本発明の部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、（１）配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８または配列番号：１８で表わされる塩基配列を有するＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡ、または（２）配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８または配列番号：１８で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、本発明の配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７または配列番号：１９で表わされるアミノ酸配列を有するタンパク質と実質的に同質のＡβ産生亢進活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡなどが用いられる。
配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８または配列番号：１８で表わされる塩基配列の部分塩基配列とハイブリダイズできる塩基配列としては、例えば、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８または配列番号：１８で表わされる塩基配列の部分塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列などが用いられる。
【００２４】
本発明の配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７または配列番号：１９で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチド（以下、本発明のタンパク質と略記する場合がある）を完全にコードするＤＮＡのクローニングの手段としては、本発明のタンパク質の部分塩基配列を有する合成ＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ法によって増幅するか、または適当なベクターに組み込んだＤＮＡを本発明のタンパク質の一部あるいは全領域をコードするＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを用いて標識したものとのハイブリダイゼーションによって選別することができる。ハイブリダイゼーションの方法は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ（Ｊ．  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，  １９８９）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。
【００２５】
ＤＮＡの塩基配列の置換は、公知のキット、例えば、ＭｕｔａｎＴＭ−Ｇ（宝酒造）、ＭｕｔａｎＴＭ−Ｋ（宝酒造）などを用いて、Ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ法やＫｕｎｋｅｌ法などの公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って行なうことができる。
クローン化された本発明のタンパク質をコードするＤＮＡは目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして使用することができる。該ＤＮＡはその５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもできる。
【００２６】
（発現ベクター）
本発明のタンパク質の発現ベクターは、例えば、（イ）本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを含むＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ）から目的とするＤＮＡ断片を切り出し、（ロ）該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。
ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，ｐＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス，ワクシニアウイルス，バキュロウイルスなどの動物ウイルスなどの他、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏなどが用いられる。
本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、動物細胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ−ＴＫプロモーターなどが挙げられる。
これらのうち、ＣＭＶプロモーター、ＳＲαプロモーターなどを用いるのが好ましい。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーターなどが、宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなど、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが好ましい。
【００２７】
発現ベクターには、以上の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）などを含有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ｄｈｆｒと略称する場合がある）遺伝子〔メソトレキセート（ＭＴＸ）耐性〕、アンピシリン耐性遺伝子（以下、Ａｍｐｒと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子（以下、Ｎｅｏｒと略称する場合がある、Ｇ４１８耐性）等が挙げられる。特に、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ−）細胞を用いてｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、目的遺伝子をチミジンを含まない培地によっても選択できる。
また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列を、本発明のタンパク質のＮ端末側に付加する。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ＰｈｏＡ・シグナル配列、ＯｍｐＡ・シグナル配列などが、宿主がバチルス属菌である場合は、α−アミラーゼ・シグナル配列、サブチリシン・シグナル配列などが、宿主が酵母である場合は、ＭＦα・シグナル配列、ＳＵＣ２・シグナル配列など、宿主が動物細胞である場合には、インシュリン・シグナル配列、α−インターフェロン・シグナル配列、抗体分子・シグナル配列などがそれぞれ利用できる。
【００２８】
（形質転換体）
このようにして構築された本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを含有するベクターを用いて、形質転換体を製造することができる。
宿主としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌の具体例としては、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｋ１２・ＤＨ１〔Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，６０巻，１６０（１９６８）〕，ＪＭ１０３〔Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，９巻，３０９（１９８１）〕，ＪＡ２２１〔Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１２０巻，５１７（１９７８）〕，ＨＢ１０１〔Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，４１巻，４５９（１９６９）〕，Ｃ６００〔Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，３９巻，４４０（１９５４）〕などが用いられる。
バチルス属菌としては、例えば、バチルス・ズブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＭＩ１１４〔Ｇｅｎｅ，２４巻，２５５（１９８３）〕，２０７−２１〔Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，９５巻，８７（１９８４）〕などが用いられる。酵母としては、例えば、サッカロマイセス・セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＨ２２，ＡＨ２２Ｒ−，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ−１２、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）ＮＣＹＣ１９１３，ＮＣＹＣ２０３６、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）などが用いられる。
【００２９】
昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがＡｃＮＰＶの場合は、ヨトウガの幼虫由来株化細胞（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ  ｃｅｌｌ；Ｓｆ細胞）、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉの中腸由来のＭＧ１細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉの卵由来のＨｉｇｈ  ＦｉｖｅＴＭ細胞、Ｍａｍｅｓｔｒａｂｒａｓｓｉｃａｅ由来の細胞またはＥｓｔｉｇｍｅｎａ  ａｃｒｅａ由来の細胞などが用いられる。ウイルスがＢｍＮＰＶの場合は、カイコ由来株化細胞（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ  Ｎ；ＢｍＮ細胞）などが用いられる。該Ｓｆ細胞としては、例えば、Ｓｆ９細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１７１１）、Ｓｆ２１細胞（以上、Ｖａｕｇｈｎ，  Ｊ．Ｌ．ら、Ｉｎ  Ｖｉｖｏ，  １３，  ２１３−２１７，（１９７７））などが用いられる。
昆虫としては、例えば、カイコの幼虫などが用いられる〔前田ら、Ｎａｔｕｒｅ，３１５巻，５９２（１９８５）〕。
動物細胞としては、例えば、サル細胞ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ、チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ細胞と略記）、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ−）細胞と略記）、マウスＬ細胞、マウスＡｔＴ−２０、マウスミエローマ細胞、ラットＧＨ３、ヒトＦＬ細胞などが用いられる。
【００３０】
エシェリヒア属菌を形質転換するには、例えば、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，６９巻，２１１０（１９７２）やＧｅｎｅ，１７巻，１０７（１９８２）などに記載の方法に従って行なうことができる。
バチルス属菌を形質転換するには、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＆  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６８巻，１１１（１９７９）などに記載の方法に従って行なうことができる。
酵母を形質転換するには、例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９４巻，１８２−１８７（１９９１）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，７５巻，１９２９（１９７８）などに記載の方法に従って行なうことができる。
昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、例えば、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ６，  ４７−５５（１９８８）などに記載の方法に従って行なうことができる。
動物細胞を形質転換するには、例えば、細胞工学別冊８新細胞工学実験プロトコール．２６３−２６７（１９９５）（秀潤社発行）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２巻，４５６（１９７３）に記載の方法に従って行なうことができる。
このようにして、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体が得られる。
宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する際、培養に使用される培地としては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無機物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどが挙げられる。また、酵母エキス、ビタミン類、生長促進因子などを添加してもよい。培地のｐＨは約５〜８が望ましい。
【００３１】
エシェリヒア属菌を培養する際の培地としては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地〔ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ），Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，４３１−４３３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９７２〕が好ましい。ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせるために、例えば、３β−インドリルアクリル酸のような薬剤を加えることができる。宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行ない、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。
宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない、必要により通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、バークホールダー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ）最小培地（Ｂｏｓｔｉａｎ，  Ｋ．  Ｌ．  ら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，７７巻，４５０５（１９８０））や０．５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地（Ｂｉｔｔｅｒ，  Ｇ．  Ａ．  ら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，８１巻，５３３０（１９８４））が挙げられる。培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０℃〜３５℃で約２４〜７２時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
【００３２】
宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、培地としては、Ｇｒａｃｅ’ｓ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｒａｃｅ，  Ｔ．Ｃ．Ｃ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  １９５，  ７８８  （１９６２））に非働化した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のｐＨは約６．２〜６．４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３〜５日間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２巻，５０１（１９５２）〕，ＤＭＥＭ培地〔Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８巻，３９６（１９５９）〕，ＲＰＭＩ  １６４０培地〔Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，１９９巻，５１９（１９６７）〕，１９９培地〔Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，７３巻，１（１９５０）〕などが用いられる。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０℃〜４０℃で約１５〜６０時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
以上のようにして、形質転換体の細胞膜に本発明のタンパク質を生成せしめることができる。
【００３３】
（タンパク質の分離精製）
上記培養物から本発明のタンパク質を分離精製するには、例えば、下記の方法により行なうことができる。
本発明のタンパク質を培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過により本発明のタンパク質の粗抽出液を得る方法などが適宜用いられる。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどのタンパク質変性剤や、トリトンＸ−１００ＴＭなどの界面活性剤が含まれていてもよい。培養液中に本発明のタンパク質が分泌される場合には、培養終了後、公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。
このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれる本発明のタンパク質の精製は、公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
【００３４】
このようにして得られる本発明のタンパク質が遊離体で得られた場合には、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には公知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊離体または他の塩に変換することができる。
なお、組換え体が産生する本発明のタンパク質を、精製前または精製後に適当なタンパク質修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去することもできる。タンパク質修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダーゼなどが用いられる。
このようにして生成する本発明のタンパク質またはその塩の活性は、標識したリガンドとの結合実験、特異抗体を用いたエンザイムイムノアッセイ、酵素活性、シグナル情報伝達活性、物質輸送活性、物質透過活性、Ａβ産生亢進活性などにより測定することができる。
【００３５】
（抗体）
本発明のタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩（以下、本発明のタンパク質と略記する場合がある）に対する抗体は、本発明のタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を認識し得る抗体であれば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよい。
本発明のタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩（以下、本発明のタンパク質と略記する場合もある）に対する抗体は、本発明のタンパク質を抗原として用い、公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。
【００３６】
〔モノクローナル抗体の作製〕
（ａ）モノクロナール抗体産生細胞の作製
本発明のタンパク質は、哺乳動物に対して投与により抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は通常２〜６週毎に１回ずつ、計２〜１０回程度行なわれる。用いられる哺乳動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギが挙げられるが、マウスおよびラットが好ましく用いられる。
モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原を免疫された温血動物、例えば、マウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。抗血清中の抗体価の測定は、例えば、後記の標識化タンパク質と抗血清とを反応させたのち、抗体に結合した標識剤の活性を測定することにより行なうことができる。融合操作は既知の方法、例えば、ケーラーとミルスタインの方法〔Ｎａｔｕｒｅ、２５６巻、４９５頁（１９７５年）〕に従い実施することができる。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウィルスなどが挙げられるが、好ましくはＰＥＧが用いられる。
骨髄腫細胞としては、例えば、ＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０などが挙げられるが、Ｐ３Ｕ１が好ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は１：１〜２０：１程度であり、ＰＥＧ（好ましくは、ＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６０００）が１０〜８０％程度の濃度で添加され、約２０〜４０℃、好ましくは約３０〜３７℃で約１〜１０分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。
【００３７】
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには種々の方法が使用できるが、例えば、タンパク質の抗原を直接あるいは担体とともに吸着させた固相（例、マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる）またはプロテインＡを加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、抗免疫グロブリン抗体またはプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素などで標識したタンパク質を加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法などが挙げられる。
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの選別は、公知あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができるが、通常はＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞用培地などで行なうことができる。選別および育種用培地としては、ハイブリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても良い。例えば、１〜２０％、好ましくは１０〜２０％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ  １６４０培地、１〜１０％の牛胎児血清を含むＧＩＴ培地（和光純薬工業（株））またはハイブリドーマ培養用無血清培地（ＳＦＭ−１０１、日水製薬（株））などを用いることができる。培養温度は、通常２０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。培養時間は、通常５日〜３週間、好ましくは１週間〜２週間である。培養は、通常５％炭酸ガス下で行なうことができる。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。
【００３８】
（ｂ）モノクロナール抗体の精製
モノクローナル抗体の分離精製は、通常のポリクローナル抗体の分離精製と同様に免疫グロブリンの分離精製法〔例、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例、ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相またはプロテインＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕に従って行なうことができる。
【００３９】
〔ポリクローナル抗体の作製〕
本発明のポリクローナル抗体は、公知あるいはそれに準じる方法にしたがって製造することができる。例えば、免疫抗原（本発明のタンパク質抗原）とキャリアータンパク質との複合体をつくり、上記のモノクローナル抗体の製造法と同様に哺乳動物に免疫を行ない、該免疫動物から本発明のタンパク質に対する抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行なうことにより製造できる。
哺乳動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアータンパク質との複合体に関し、キャリアータンパク質の種類およびキャリアーとハプテンとの混合比は、キャリアーに架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれば、どの様なものをどの様な比率で架橋させてもよいが、例えば、ウシ血清アルブミン、ウシサイログロブリン、キーホール・リンペット・ヘモシアニン等を重量比でハプテン１に対し、約０．１〜２０、好ましくは約１〜５の割合でカプルさせる方法が用いられる。
また、ハプテンとキャリアーのカプリングには、種々の縮合剤を用いることができるが、グルタルアルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステル、チオール基、ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。
縮合生成物は、温血動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約２〜６週毎に１回ずつ、計約３〜１０回程度行なうことができる。ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された哺乳動物の血液、腹水など、好ましくは血液から採取することができる。
抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、上記の血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製法に従って行なうことができる。
【００４０】
以下に、本発明のＡβの産生を亢進するＤＮＡ（本発明のＤＮＡ）、そのＤＮＡと相補的な塩基配列を有するアンチセンスＤＮＡ、そのＤＮＡを含有する組換えベクターによる形質変換体、そのＤＮＡがコードするタンパク質、その部分ペプチドまたはその塩（本発明のタンパク質）および本発明の抗体の用途等を説明する。
（１）アルツハイマー病の組織マーカー
本発明のタンパク質は、アルツハイマー病患者の脳にも発現しているため、アルツハイマー病の組織マーカーとして使用することができる。また、本発明のタンパク質に選択的に結合するペプチド、タンパク質もしくはＤＮＡの検出または分取にも利用できる。
（２）本発明のタンパク質が関与する各種疾病の治療・予防剤
本発明のＡβ産生を亢進する作用を有するタンパク質について、そのドミナントネガテイブ体はアルツハイマー病の治療・予防剤等の医薬として使用することができる。
上記ドミナントネガテイブ体は、そのアミノ酸配列の一部が置換もしくは欠失したもの、そのアミノ酸配列にアミノ酸が付加したもの、または置換、欠失、付加が組み合わさったもののいずれであってもよく、Ａβ産生を亢進する作用が損失または減弱しているものである。
このドミナントネガテイブ体は、通常の遺伝子工学的手法により作製することができる。例えば、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列を公知のキット、例えば、ＭｕｔａｎＴＭ−Ｇ（宝酒造）、ＭｕｔａｎＴＭ−Ｋ（宝酒造）などを用いて、Ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ法やＫｕｎｋｅｌ法などの公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って変換した後、上記の本発明のタンパク質の製造法に準じて製造することができる。
また、Ａβ産生を亢進する作用が損失または減弱していることは、ドミナントネガテイブ体またはそれをコードするＤＮＡのＡβ産生を亢進する作用を本発明のスクリーニング方法で確認することによって行うことができる。
【００４１】
（３）アルツハイマー病に対する医薬候補化合物のスクリーニング法
本発明のＡβ産生を亢進する作用を有するタンパク質の機能（活性）を阻害する化合物またはその塩は、アルツハイマー病の治療・予防剤等の医薬として使用できる。したがって、本発明のタンパク質およびそのＤＮＡは、本発明のタンパク質の機能（活性）を阻害する化合物またはその塩のスクリーニングのための試薬として有用である。
すなわち、本発明は、本発明のタンパク質、そのＤＮＡ、そのＤＮＡと相補的に結合するアンチセンスＤＮＡ、そのＤＮＡを含有する組換えベクターで形質転換された形質変換体、または本発明の抗体を用いることを特徴とする本発明のタンパク質の機能（活性）を阻害する化合物（以下、阻害剤と略記する場合がある）のスクリーニング方法を提供する。
また、本発明のスクリーニング用キットは、本発明のタンパク質、そのＤＮＡ、そのＤＮＡと相補的に結合するアンチセンスＤＮＡ、そのＤＮＡを含有する組換えベクターで形質転換された形質変換体、または本発明の抗体等を含有するものである。
上記スクリーニング方法として、具体的には、次のようなものが挙げられる。
【００４２】
（３−１）本発明のタンパク質と組織、細胞、またはそれらの膜画分との反応を阻害する化合物のスクリーニング方法
（ｉ）本発明のタンパク質が作用する組織、細胞またはそれらの膜画分に、本発明のタンパク質を接触させた場合と（ｉｉ）本発明のタンパク質が作用する組織、細胞またはそれらの膜画分に、本発明のタンパク質および試験化合物を接触させた場合との比較を行うことを特徴とする本発明のタンパク質と組織、細胞またはそれらの膜画分との反応性を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法があげられる。
上記の細胞には株化細胞を用いても良いし、初代培養系を用いても良い。
細胞または組織としては、ヒトやその他の温血動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サル等）の細胞（例えば、神経細胞、内分泌細胞、神経内分泌細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、肝細胞、脾細胞、メサンギウム細胞、表皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球、樹状細胞）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくはガン細胞等、もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、例えば、脳、脳の各部位（例、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、唾液腺、末梢血、前立腺、睾丸（精巣）、卵巣、胎盤、子宮、骨、軟骨、関節、骨格筋等を用いても良い。
【００４３】
本発明のスクリーニング方法においては、上記した反応性としては、結合量、細胞刺激活性、組織刺激活性などを測定して比較する。結合量を測定する場合、ビアコアなどの測定機器や標識リガンドが用いられる場合もある。後者の場合、例えば、〔３Ｈ〕、〔１２５Ｉ〕、〔１４Ｃ〕、〔３５Ｓ〕、蛍光色素、蛍光タンパク質、ビオチン、β−ガラクトシダーゼやパーオキシダーゼなどの酵素、フラッグなどのタグと呼ばれるペプチドなどで標識された本発明のタンパク質を利用することができる。
本発明の配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７または配列番号：１９で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質の結合量を調べる場合、それぞれ、タンパクＸ、ＧＡＢＡＲＡＰＬ１、ＧＡＴＥ−１６、それらの類似タンパク質、あるいはＰＥＮ−２を含有する組織、細胞、その膜画分あるいは粗精製画分などを用いても良い。また、細胞刺激活性としては、細胞の生化学的な変化を伴うものであればどのようなものでも良いが、例えば、アラキドン酸代謝物、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ２＋の遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞外液のｐＨの低下、細胞膜電位変動、Ｋ＋チャンネル機能、細胞内タンパク質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、オートファゴソーム形成、神経突起の伸長または崩壊などが挙げられる。組織刺激活性としては、組織の生化学あるいは生理学的な変化を伴うものであればどのようなものでも良いが、例えば、収縮や弛緩活性を挙げることができる。
【００４４】
（３−２）本発明のタンパク質の酵素活性に対する阻害剤のスクリーニング法
本発明のタンパク質が酵素活性を有する場合または酵素活性に何らかの関係を有する場合、その活性を指標として、本発明のタンパク質の酵素活性を阻害する化合物（以下、阻害剤と略記する）をスクリーニングできる。
【００４５】
（３−３）形質転換体を用いた、本発明のタンパク質の活性に対する阻害剤のスクリーニング法
本発明のタンパク質またはその部分ペプチドをコードするＤＮＡを含有する組換えベクターによる形質転換体を用いて、導入された該ＤＮＡに起因する形質転換体の生化学的な変化を指標として、本発明のタンパク質の活性の阻害剤をスクリーニングできる。
形質転換体としては、酵母や細胞が好ましく用いられるが、細胞を用いる場合、親株として、株化細胞を用いても、初代培養系を用いても、さらに、上記（３−１）記載の種々の細胞を用いても良い。上記の導入された該ＤＮＡに起因する形質転換体の生化学的な変化の指標としては、検出可能であればどのようなものも指標として用いることが可能である。例えば、該形質転換体が特有に産生している物質（例えば、Ａβ）の産生を指標とすることができる。
Ａβの測定法には種々の方法が用いられるが、Ａβ特異的抗体を用いる免疫化学的方法を用いることが好ましい。これらの方法には、免疫沈降法、ウエスタンブロッテイング、酵素免疫測定法、サンドイッチ型酵素免疫測定法あるいはそれらの組み合わせ方法が用いられる。形質転換体を作製する親株としては、内在性にβＡＰＰを発現しているものでも、あるいは外来性にβＡＰＰあるいはそのフラグメントを導入したものでも、内在性にγ−セクレターゼ活性を有するものでも、プレセニリンなどの導入でγ−セクレターゼ活性を導入したものでも、検出に十分なＡβ産生量を示すものであれば、いずれも用いることができる。導入するβＡＰＰやプレセニリンはＦＡＤ由来の変異を有していてもかまわない。また、本発明者が作製した、βＡＰＰフラグメントからのＡβの産生が促進されることによりピューロマイシンなどの薬剤耐性遺伝子の発現が亢進するよう設計された細胞株を親株として用いた場合、Ａβの測定以外にも、ピューロマイシンなどの薬剤耐性を指標として、化合物のスクリーニングを実施することができる。
【００４６】
導入された該ＤＮＡに起因する形質転換体が特有に産生している物質として、Ａβ以外にも例えば、分泌型ＡＰＰを用いても良い。また、Ａβの中でも特にＡβ４２に注目することもできる。
さらに、上記の導入された該ＤＮＡに起因する形質転換体の生化学的な変化の指標として、例えば、アラキドン酸代謝物、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ２＋の遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞外液のｐＨの低下、細胞膜電位変動、Ｋ＋チャンネル機能、細胞内タンパク質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、オートファゴソーム形成、神経突起の伸長または崩壊などを測定しても良い。
【００４７】
（３−４）本発明のタンパク質の発現を阻害する化合物のスクリーニング法
本発明のタンパク質、そのＤＮＡ、そのＤＮＡと相補的に結合するアンチセンスＤＮＡ、そのＤＮＡを含有する組換えベクターによる形質変換体、または本発明の抗体は、本発明のタンパク質の発現を阻害する化合物のスクリーニング法に用いることができる。
用いる材料としては、本発明のタンパク質を発現している細胞が用いられるが、組織、動物などを用いても良い。その際、株化細胞を用いても、初代培養系を用いても、さらに、上記（３−１）記載の種々の細胞や組織を用いても良い。上記動物には、後述するレポータージーンを導入したノックアウト動物も含まれる。本発明のタンパク質の発現量は抗体などを用いて免疫化学的方法などの公知の方法により測定することもできるし、本発明のタンパク質のｍＲＮＡをノザンハイブリダイゼーション法、ＲＴ−ＰＣＲやＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ法を用いて、公知の方法により測定することもできる。
さらに、本発明のタンパク質をコードする遺伝子のプロモーター領域（促進プロモーター、抑制プロモーターなど）とレポーター遺伝子を組み合わせ、プロモーター活性を促進または阻害する化合物をレポータージーンアッセイによりスクリーニングすることができる。その際、親株としては、株化細胞を用いても、初代培養系を用いても、さらに、上記（３−１）記載の種々の細胞を用いても良い。レポーター遺伝子としては、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、成長因子、β−グルクロニダーゼ、アルカリホスファターゼ、Ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＦＰ）およびβ−ラクタマーゼなどが好んで用いられる。これらレポーター遺伝子のベクター構築やアッセイ法は公知の技術に従うことができる（例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３，  ２９−４３，  １９９９）。
【００４８】
（４）本発明の抗体を用いる診断剤
本発明の抗体を作製し、各種疾病、とりわけアルツハイマー病の診断に用いることができる。また、それらの抗体を用いて、本発明のタンパク質を定量できるほか、組織染色等による検出を行うこともできる。これらの目的には、抗体分子そのものを用いてもよく、また、抗体分子のＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、あるいはＦａｂ画分を用いてもよい。抗体はモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト−マウスキメラ抗体、ヒト抗体、遺伝子工学的に作製されたヒト抗体でも構わない。ヒト抗体は、ヒトミエローマ細胞を用いた細胞融合法やヒトイムノグロブリン遺伝子を導入されたマウスに免疫し、そのマウスの免疫担当細胞をミエローマ細胞と細胞融合することにより作製できる（Ｋ．  Ｔｏｍｉｚｕｋａ  ｅｔ．  Ａｌ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ９７，  ７２２−７２７，  ２０００）。遺伝子工学的に作製されたヒト抗体には、ＶＨ領域とＶＬ領域を架橋した単鎖抗体も含まれる。
本発明の抗体を用いる本発明のタンパク質の定量法は、特に制限されるべきものではなく、被測定液中の抗原量（例えば、本発明のタンパク質量）に対応した抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、ネフロメトリー、競合法、イムノメトリック法およびサンドイッチ法が好適に用いられる。これら個々の免疫学的測定法を本発明の定量方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発明のポリペプチドの測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書等を参照することができる。
【００４９】
例えば、入江  寛編「ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和４９年発行）、入江  寛編「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和５４年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭和５３年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）（医学書院、昭和５７年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年発行）、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ」  Ｖｏｌ．  ７０（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ａ））、  同書  Ｖｏｌ．  ７３（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ｂ））、  同書  Ｖｏｌ．  ７４（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ｃ））、  同書  Ｖｏｌ．  ８４（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ｄ：Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ））、  同書  Ｖｏｌ．  ９２（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ｅ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ））、  同書  Ｖｏｌ．  １２１（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ｉ：Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ））（以上、アカデミックプレス社発行）等を参照することができる。
【００５０】
（５）本発明の抗体を含有する医薬
本発明のＡβ産生を亢進する作用を有するタンパク質の活性を中和する作用を有する本発明の抗体は、例えば、当該タンパク質の発現過多に起因する疾患、とりわけアルツハイマー病の治療・予防剤等の医薬として使用することができる。抗体はモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト−マウスキメラ抗体、ヒト抗体、遺伝子工学的に作製されたヒト抗体でも構わない。ヒト抗体は、ヒトミエローマ細胞を用いた細胞融合法やヒトイムノグロブリン遺伝子を導入されたマウスに免疫し、そのマウスの免疫担当細胞をミエローマ細胞と細胞融合することにより作製できる。遺伝子工学的に作製されたヒト抗体には、ＶＨ領域とＶＬ領域を架橋した単鎖抗体も含まれる。
【００５１】
（６）本発明のタンパク質のワクチン
本発明のタンパク質、それ自身、あるいはキャリアータンパク質とともにワクチンとして免疫し、アルツハイマー病の進展抑制剤あるいは治療剤として用いることができる。キャリアータンパク質としては、生体に対して安全性が高ければどのようなキャリアータンパク質も用いることが可能であるが、例えば、破傷風毒素などが用いられる。
【００５２】
（７）本発明のタンパク質に関連した遺伝子診断法
本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ（プロモーター領域、エクソン、イントロンを含む）またはｍＲＮＡの性状に関する情報は、それらの異常（遺伝子異常）が見出された場合、例えばアルツハイマー病に関連した該ＤＮＡまたは該ｍＲＮＡの損傷、突然変異、発現低下、コピー数の増加、発現過多等の異常を検出することを具現化することになるので、遺伝子診断を行う際に有用である。ｍＲＮＡに関してはスプライシングバリアントの発現増加や低下、或いはｍＲＮＡエディティング（Ｃ．  Ｍ．  Ｎｉｓｗｅｎｄｅｒ  ｅｔ．  Ａｌ．  Ａｎｎ．  Ｎ．  Ｙ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ８６１，  ３８−４８，  １９９８）による変異導入も考慮される。また染色体上の座位に関する情報は本発明のＤＮＡが関与する遺伝病の研究にも利用できる。本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを用いる上記の遺伝子診断は、例えば、公知のノーザンハイブリダイゼーションやＰＣＲ−ＳＳＣＰ法（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，第５巻，８７４〜８７９頁（１９８９年）、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ，第８６巻，２７６６〜２７７０頁（１９８９年）、ＤＮＡマイクロアレイ（Ｓｃｉｅｎｃｅ，第２７０巻，４６７〜４７０頁（１９９５年）、或いはその他の方法（実験医学１８巻１４号、１８９４−１９０６頁、２０００年）等により実施することができる。上記のいずれかの手法により該遺伝子の発現増加或いは低下、ＤＮＡの突然変異が検出された場合は、各種疾病、とりわけアルツハイマー病に関して罹り易いとか、アルツハイマー病である可能性が高い、等の診断を行うことができる。
特に近年、疾患関連遺伝子を探索する上で非常に重要なツールとしてＳＮＰｓ（ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ、一塩基多型）と呼ばれる多型マーカーが登場し、疾患へのなり易さ（なり難さ）を規定していたり、薬剤に対する応答性の違い・副作用の違いにも影響するものとしてにわかに注目を集めている。
ＳＮＰｓのタイピング法としては、その具体的な目的に応じて、直接塩基配列決定法、Ｉｎｖａｄｅｒ法、Ｓｎｉｐｅｒ法、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法、オリゴＳＮＰチップ法などが挙げられる（実験医学１８巻１２号、２０００年）。
こうした手法により見出された本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ（プロモーター領域、エクソン、イントロンを含む）に存在するＳＮＰｓは、それ自体単独で、或いは他の遺伝子上のＳＮＰｓや本発明のＤＮＡと併せて解析することにより、アルツハイマー病に対する罹りやすさの判定や発症時期の予測、或いはアルツハイマー病の診断に有用である。
【００５３】
（８）本発明のタンパク質に関連したアンチセンスＤＮＡを含有する医薬
Ａβ産生を亢進する本発明のタンパク質をコードするＤＮＡまたはその一部と相補的な塩基配列を含み、当該ＤＮＡに相補的に結合し、当該ＤＮＡの発現を抑制することができるアンチセンスＤＮＡは、生体内における当該ＤＮＡまたはそれにコードされるタンパク質の機能を抑制することができるので、例えば、Ａβ産生を亢進するタンパク質の発現過多に起因する疾患、例えば、アルツハイマー病の治療・予防剤として使用することができる。
例えば、該アンチセンスＤＮＡを単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクター等の適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って投与することができる。該アンチセンスＤＮＡは、そのままで、あるいは摂取促進のために補助剤等の生理学的に認められる担体とともに製剤化し、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。あるいは、エアロゾル化して吸入剤として気管内に投与することもできる。
さらに、該アンチセンスＤＮＡは、組織や細胞における本発明のＤＮＡの存在やその発現状況を調べるための診断用オリゴヌクレオチドプローブとして使用することもできる。
【００５４】
（９）ＤＮＡ導入動物を用いたアルツハイマー病の予防・治療薬の評価法
本発明は、外来性の本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ（以下、本発明の外来性ＤＮＡと略記する）またはその変異ＤＮＡ（本発明の外来性変異ＤＮＡと略記する場合がある）を有する非ヒト哺乳動物を用いたアルツハイマー病の予防・治療薬の評価法を提供する。
すなわち、本発明は、
（１）本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物、
（２）非ヒト哺乳動物がげっ歯動物である第（１）記載の動物、
（３）げっ歯動物がマウスまたはラットである第（２）記載の動物、および
（４）本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを含有し、哺乳動物において発現しうる組換えベクターを提供するものである。
本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物（以下、本発明のＤＮＡ導入動物と略記する）は、未受精卵、受精卵、精子およびその始原細胞を含む胚芽細胞等に対して、好ましくは、非ヒト哺乳動物の発生における胚発生の段階（さらに好ましくは、単細胞または受精卵細胞の段階でかつ一般に８細胞期以前）に、リン酸カルシウム法、電気パルス法、リポフェクション法、凝集法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、ＤＥＡＥ−デキストラン法等により目的とするＤＮＡを導入することによって作出することができる。また、該ＤＮＡ導入方法により、体細胞、生体の臓器、組織細胞等に目的とする本発明の外来性ＤＮＡを導入し、細胞培養、組織培養等に利用することもでき、さらに、これら細胞を上述の胚芽細胞と公知の細胞融合法により融合させることにより本発明のＤＮＡ導入動物を作出することもできる。
【００５５】
非ヒト哺乳動物としては、例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウス、ラット等が用いられる。なかでも、病体動物モデル系の作成の面から個体発生および生物サイクルが比較的短く、また、繁殖が容易なゲッ歯動物、とりわけマウス（例えば、純系として、Ｃ５７ＢＬ／６系統，ＤＢＡ２系統等、交雑系として、Ｂ６Ｃ３Ｆ１系統，ＢＤＦ１系統，Ｂ６Ｄ２Ｆ１系統，ＢＡＬＢ／ｃ系統，ＩＣＲ系統等）またはラット（例えば、Ｗｉｓｔａｒ，ＳＤ等）等が好ましい。
哺乳動物において発現しうる組換えベクターにおける「哺乳動物」としては、上記の非ヒト哺乳動物の他にヒト等が挙げられる。
本発明の外来性ＤＮＡとは、非ヒト哺乳動物が本来有している本発明のＤＮＡではなく、いったん哺乳動物から単離・抽出された本発明のＤＮＡをいう。
本発明の変異ＤＮＡとしては、元の本発明のＤＮＡの塩基配列に変異（例えば、突然変異等）が生じたもの、具体的には、塩基の付加、欠損、他の塩基への置換等が生じたＤＮＡ等が用いられ、また、異常ＤＮＡも含まれる。
該異常ＤＮＡとしては、異常な本発明のタンパク質を発現させるＤＮＡを意味し、例えば、正常な本発明のタンパク質の機能を抑制するタンパク質を発現させるＤＮＡ等が用いられる。
本発明の外来性ＤＮＡは、対象とする動物と同種あるいは異種のどちらの哺乳動物由来のものであってもよい。本発明のＤＮＡを対象動物に導入するにあたっては、該ＤＮＡを動物細胞で発現させうるプロモーターの下流に結合したＤＮＡコンストラクトとして用いるのが一般に有利である。例えば、本発明のヒトＤＮＡを導入する場合、これと相同性が高い本発明のＤＮＡを有する各種哺乳動物（例えば、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウス等）由来のＤＮＡを発現させうる各種プロモーターの下流に、本発明のヒトＤＮＡを結合したＤＮＡコンストラクト（例、ベクター等）を対象哺乳動物の受精卵、例えば、マウス受精卵へマイクロインジェクションすることによって本発明のＤＮＡを高発現するＤＮＡ導入哺乳動物を作出することができる。
【００５６】
本発明のタンパク質の発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミド、λファージ等のバクテリオファージ、モロニー白血病ウィルス等のレトロウィルス、ワクシニアウィルスまたはバキュロウィルス等の動物ウイルス等が用いられる。なかでも、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミドまたは酵母由来のプラスミド等が好ましく用いられる。
上記のＤＮＡ発現調節を行うプロモーターとしては、例えば、▲１▼ウイルス（例、シミアンウイルス、サイトメガロウイルス、モロニー白血病ウイルス、ＪＣウイルス、乳癌ウイルス、ポリオウイルス等）に由来するＤＮＡのプロモーター、▲２▼各種哺乳動物（ヒト、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウス等）由来のプロモーター、例えば、アルブミン、インスリンＩＩ、ウロプラキンＩＩ、エラスターゼ、エリスロポエチン、エンドセリン、筋クレアチンキナーゼ、グリア線維性酸性タンパク質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、血小板由来成長因子β、ケラチンＫ１，Ｋ１０およびＫ１４、コラーゲンＩ型およびＩＩ型、サイクリックＡＭＰ依存タンパク質キナーゼβＩサブユニット、ジストロフィン、酒石酸抵抗性アルカリフォスファターゼ、心房ナトリウム利尿性因子、内皮レセプターチロシンキナーゼ（一般にＴｉｅ２と略される）、ナトリウムカリウムアデノシン３リン酸化酵素（Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅ）、ニューロフィラメント軽鎖、メタロチオネインＩおよびＩＩＡ、メタロプロティナーゼ１組織インヒビター、ＭＨＣクラスＩ抗原（Ｈ−２Ｌ）、Ｈ−ｒａｓ、レニン、ドーパミンβ−水酸化酵素、甲状腺ペルオキシダーゼ（ＴＰＯ）、タンパク質鎖延長因子１α（ＥＦ−１α）、βアクチン、αおよびβミオシン重鎖、ミオシン軽鎖１および２、ミエリン基礎タンパク質、チログロブリン、Ｔｈｙ−１、免疫グロブリン、Ｈ鎖可変部（ＶＮＰ）、血清アミロイドＰコンポーネント、ミオグロビン、トロポニンＣ、平滑筋αアクチン、プレプロエンケファリンＡ、バソプレシン等のプロモーター等が用いられる。なかでも、全身で高発現することが可能なサイトメガロウイルスプロモーター、ヒトタンパク質鎖延長因子１α（ＥＦ−１α）のプロモーター、ヒトおよびニワトリβアクチンプロモーター等が好適である。
【００５７】
上記ベクターは、ＤＮＡ導入哺乳動物において目的とするｍＲＮＡの転写を終結する配列（一般にターミネターと呼ばれる）を有していることが好ましく、例えば、ウィルス由来および各種哺乳動物由来の各ＤＮＡの配列を用いることができ、好ましくは、シミアンウィルスのＳＶ４０ターミネーター等が用いられる。その他、目的とする外来性ＤＮＡをさらに高発現させる目的で各ＤＮＡのスプライシングシグナル、エンハンサー領域、真核ＤＮＡのイントロンの一部等をプロモーター領域の５’上流、プロモーター領域と翻訳領域間あるいは翻訳領域の３’下流に連結することも目的により可能である。
該翻訳領域は導入動物において発現しうるＤＮＡコンストラクトとして、前記のプロモーターの下流および所望により転写終結部位の上流に連結させる通常のＤＮＡ工学的手法により作製することができる。
受精卵細胞段階における本発明の外来性ＤＮＡの導入は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞のすべてに存在するように確保される。ＤＮＡ導入後の作出動物の胚芽細胞において、本発明の外来性ＤＮＡが存在することは、作出動物の後代がすべて、その胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性ＤＮＡを保持することを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性ＤＮＡを有する。
【００５８】
本発明の外来性正常ＤＮＡを導入させた非ヒト哺乳動物は、交配により外来性ＤＮＡを安定に保持することを確認して、該ＤＮＡ保有動物として通常の飼育環境で継代飼育することが出来る。
受精卵細胞段階における本発明の外来性ＤＮＡの導入は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞の全てに過剰に存在するように確保される。ＤＮＡ導入後の作出動物の胚芽細胞において本発明の外来性ＤＮＡが過剰に存在することは、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性ＤＮＡを過剰に有することを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性ＤＮＡを過剰に有する。
導入ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該ＤＮＡを過剰に有するように繁殖継代することができる。
本発明の正常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、本発明の正常ＤＮＡが高発現させられており、内在性の正常ＤＮＡの機能を促進することにより最終的に本発明のタンパク質の機能亢進症、や、本発明のタンパク質が関連する疾患、例えばアルツハイマー病あるいはアルツハイマー病様病態（例えば、Ａβの脳内沈着、ＰＨＦ−タウ、神経細胞死など）を発症することがあり、その病態モデル動物として利用することができる。例えば、本発明の正常ＤＮＡ導入動物、その組織およびその細胞を用いて、本発明のタンパク質の機能亢進症や、本発明のタンパク質が関連する疾患、例えばアルツハイマー病あるいはアルツハイマー病様病態（例えば、Ａβの脳内沈着、ＰＨＦ−タウ、神経細胞死など）の病態機序の解明およびこれらの疾患の治療方法の検討を行うことが可能であり、さらに、アルツハイマー病の治療・予防薬のスクリーニング試験にも利用可能である。
【００５９】
一方、本発明の外来性異常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、交配により外来性ＤＮＡを安定に保持することを確認して該ＤＮＡ保有動物として通常の飼育環境で継代飼育することが出来る。さらに、目的とする外来ＤＮＡを前述のプラスミドに組み込んで原科として用いることができる。プロモーターとのＤＮＡコンストラク卜は、通常のＤＮＡ工学的手法によって作製することができる。受精卵細胞段階における本発明の異常ＤＮＡの導入は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞の全てに存在するように確保される。ＤＮＡ導入後の作出動物の胚芽細胞において本発明の異常ＤＮＡが存在することは、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常ＤＮＡを有することを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫は、その胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常ＤＮＡを有する。導入ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該ＤＮＡを有するように繁殖継代することができる。
本発明の異常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、本発明の異常ＤＮＡが高発現させられており、内在性の正常ＤＮＡの機能を阻害することにより最終的に本発明のタンパク質の機能不活性型不応症となることがあり、その病態モデル動物として利用することができる。例えば、本発明の異常ＤＮＡ導入動物、その組織およびその細胞を用いて、本発明のタンパク質の機能不活性型不応症の病態機序の解明およびこの疾患を治療方法の検討や治療薬スクリーニング試験にも利用可能である。
また、具体的な利用可能性としては、本発明の異常ＤＮＡ高発現動物は、本発明のタンパク質の機能不活性型不応症における本発明の異常タンパク質による正常タンパク質の機能阻害（ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｎｅｇａｔｉｖｅ作用）を解明するモデルとなる。本発明のタンパク質はＡβ産生に密接に関係しており、その発現亢進はＡβの産生亢進に繋がっている。一方、この事実は、正常範囲の発現量のタンパク質が、βＡＰＰを含有するγ−セクレターゼ複合体の生理的な役割にも関与している可能性を示唆するものであり、本発明のタンパク質の異常ＤＮＡ導入動物、およびその組織あるいは細胞は、アルツハイマー病の治療・予防薬の検討に有用である。
【００６０】
また、上記２種類の本発明のＤＮＡ導入動物のその他の利用可能性として、例えば、
▲１▼組織培養のための細胞源としての使用、
▲２▼本発明のＤＮＡ導入動物の組織中のＤＮＡもしくはＲＮＡを直接分析するか、またはＤＮＡにより発現された本発明のタンパク質組織を分析することによる、本発明のタンパク質により特異的に発現あるいは活性化する本発明のタンパク質との関連性についての解析、
▲３▼ＤＮＡを有する組織の細胞を標準組織培養技術により培養し、これらを使用して、一般に培養困難な組織からの細胞の機能の研究、
▲４▼上記▲３▼記載の細胞を用いることによる細胞の機能を高めるような薬剤のスクリーニング、および
▲５▼本発明の変異タンパク質の単離精製およびその抗体作製等が考えられる。
さらに、本発明のＤＮＡ導入動物を用いて、本発明のタンパク質の機能不活性型不応症等を含む、本発明のタンパク質に関連する疾患の臨床症状を調べることができ、また、本発明のタンパク質に関連する疾患モデルの各臓器におけるより詳細な病理学的所見が得られ、新しい治療方法の開発、さらには、該疾患による二次的疾患の研究および治療に貢献することができる。
【００６１】
また、本発明のＤＮＡ導入動物から各臓器を取り出し、細切後、トリプシン等のタンパク質（タンパク質）分解酵素により、遊離したＤＮＡ導入細胞の取得、その培養またはその培養細胞の系統化を行うことが可能である。さらに、本発明のタンパク質産生細胞の特定化、Ａβ産生、アポトーシス、分化あるいは増殖との関連性、またはそれらにおけるシグナル伝達機構を調べ、それらの異常を調べること等ができ、本発明のタンパク質およびその作用解明のための有効な研究材料となる。
さらに、本発明のＤＮＡ導入動物を用いて、本発明のタンパク質の機能不活性型不応症を含む、本発明のタンパク質に関連する疾患の治療薬の開発を行うために、上述の検査法および定量法等を用いて、有効で迅速な該疾患治療薬のスクリーニング法を提供することが可能となる。また、本発明のＤＮＡ導入動物または本発明の外来性ＤＮＡ発現ベクターを用いて、本発明のタンパク質が関連する疾患のＤＮＡ治療法を検討、開発することが可能である。
【００６２】
（１０）ノックアウト動物を用いたアルツハイマー病の予防・治療薬の評価法
本発明は、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞および本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を用いたアルツハイマー病の予防・治療薬の評価法を提供する。以下、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを略して本発明のＤＮＡと記載することがある。
すなわち、本発明は、
（１）本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞、
（２）該ＤＮＡがレポーター遺伝子（例、大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子）を導入することにより不活性化された第（１）項記載の胚幹細胞、
（３）ネオマイシン耐性である第（１）項記載の胚幹細胞、
（４）非ヒト哺乳動物がげっ歯動物である第（１）項記載の胚幹細胞、
（５）げっ歯動物がマウスである第（４）項記載の胚幹細胞、
（６）本発明のＤＮＡが不活性化された該ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物、
（７）該ＤＮＡがレポーター遺伝子（例、大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子）を導入することにより不活性化され、該レポーター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの制御下で発現しうる第（６）項記載の非ヒト哺乳動物、
（８）非ヒト哺乳動物がげっ歯動物である第（６）項記載の非ヒト哺乳動物、
（９）げっ歯動物がマウスである第（８）項記載の非ヒト哺乳動物、および
（１０）第（７）項記載の動物に、試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞とは、該非ヒト哺乳動物が有する本発明のＤＮＡに人為的に変異を加えることにより、該ＤＮＡの発現能を抑制するか、もしくは該ＤＮＡがコードしている本発明のタンパク質の活性を実質的に喪失させることにより、ＤＮＡが実質的に本発明のタンパク質の発現能を有さない（以下、本発明のノックアウトＤＮＡと称することがある）非ヒト哺乳動物の胚幹細胞（以下、ＥＳ細胞と略記する）をいう。
非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものが用いられる。
【００６３】
本発明のＤＮＡに人為的に変異を加える方法としては、例えば、遺伝子工学的手法により該ＤＮＡ配列の一部または全部の削除、他ＤＮＡを挿入または置換させることによって行うことができる。これらの変異により、例えば、コドンの読み取り枠をずらしたり、プロモーターあるいはエクソンの機能を破壊することにより本発明のノックアウトＤＮＡを作製すればよい。
本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞（以下、本発明のＤＮＡ不活性化ＥＳ細胞または本発明のノックアウトＥＳ細胞と略記する）の具体例としては、例えば、目的とする非ヒト哺乳動物が有する本発明のＤＮＡを単離し、そのエクソン部分にネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子を代表とする薬剤耐性遺伝子、あるいはｌａｃＺ（β−ガラクトシダーゼ遺伝子）、ｃａｔ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子）を代表とするレポーター遺伝子等を挿入することによりエクソンの機能を破壊するか、あるいはエクソン間のイントロン部分に遺伝子の転写を終結させるＤＮＡ配列（例えば、ポリＡ付加シグナル等）を挿入し、完全なｍＲＮＡを合成できなくすることによって、結果的に遺伝子を破壊するように構築したＤＮＡ配列を有するＤＮＡ鎖（以下、ターゲッティングベクターと略記する）を、例えば相同組換え法により該動物細胞の染色体に導入し、得られたＥＳ細胞について本発明のＤＮＡ上あるいはその近傍のＤＮＡ配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析あるいはターゲッティングベクター上のＤＮＡ配列とターゲッティングベクター作製に使用した本発明のＤＮＡ以外の近傍領域のＤＮＡ配列をプライマーとしたＰＣＲ法により解析し、本発明のノックアウトＥＳ細胞を選別することにより得ることができる。
【００６４】
また、相同組換え法等により本発明のＤＮＡを不活化させる元のＥＳ細胞としては、例えば、前述のような既に樹立されたものを用いてもよく、また公知のＥｖａｎｓとＫａｕｆｍａｎの方法に準じて新しく樹立したものでもよい。例えば、マウスのＥＳ細胞の場合、現在、一般的には１２９系のＥＳ細胞が使用されているが、免疫学的背景がはっきりしていないので、これに代わる純系で免疫学的に遺伝的背景が明らかなＥＳ細胞を取得する等の目的で例えば、Ｃ５７ＢＬ／６マウスやＣ５７ＢＬ／６の採卵数の少なさをＤＢＡ／２との交雑により改善したＢＤＦ１マウス（Ｃ５７ＢＬ／６とＤＢＡ／２とのＦ１）を用いて樹立したもの等も良好に用いうる。ＢＤＦ１マウスは、採卵数が多く、かつ、卵が丈夫であるという利点に加えて、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを背景に持つので、これを用いて得られたＥＳ細胞は病態モデルマウスを作出したとき、Ｃ５７ＢＬ／６マウスと戻し交配することでその遺伝的背景をＣ５７ＢＬ／６マウスに代えることが可能である点で有利に用い得る。
また、ＥＳ細胞を樹立する場合、一般には受精後３．５日目の胚盤胞を使用するが、これ以外に８細胞期胚を採卵し胚盤胞まで培養して用いることにより効率よく多数の初期胚を取得することができる。
また、雌雄いずれのＥＳ細胞を用いてもよいが、通常雄のＥＳ細胞の方が生殖系列キメラを作出するのに都合が良い。また、煩雑な培養の手間を削減するためにもできるだけ早く雌雄の判別を行うことが望ましい。
ＥＳ細胞の雌雄の判定方法としては、例えば、ＰＣＲ法によりＹ染色体上の性決定領域の遺伝子を増幅、検出する方法が、その１例として挙げることができる。この方法を使用すれば、従来、核型分析をするのに約１０６個の細胞数を要していたのに対して、１コロニー程度のＥＳ細胞数（約５０個）で済むので、培養初期におけるＥＳ細胞の第一次セレクションを雌雄の判別で行うことが可能であり、早期に雄細胞の選定を可能にしたことにより培養初期の手間は大幅に削減できる。
【００６５】
また、第二次セレクションとしては、例えば、Ｇ−バンディング法による染色体数の確認等により行うことができる。得られるＥＳ細胞の染色体数は正常数の１００％が望ましいが、樹立の際の物理的操作等の関係上困難な場合は、ＥＳ細胞の遺伝子をノックアウトした後、正常細胞（例えば、マウスでは染色体数が２ｎ＝４０である細胞）に再びクローニングすることが望ましい。
このようにして得られた胚幹細胞株は、通常その増殖性は大変良いが、個体発生できる能力を失いやすいので、注意深く継代培養することが必要である。例えば、ＳＴＯ繊維芽細胞のような適当なフィーダー細胞上でＬＩＦ（１−１００００Ｕ／ｍｌ）存在下に炭酸ガス培養器内（好ましくは、約５％炭酸ガス、約９５％空気または約５％酸素、約５％炭酸ガス、約９０％空気）で約３７℃で培養する等の方法で培養し、継代時には、例えば、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液（通常約０．００１−０．５％トリプシン／約０．１−５ｍＭ  ＥＤＴＡ、好ましくは約０．１％トリプシン／約１ｍＭ  ＥＤＴＡ）処理により単細胞化し、新たに用意したフィーダー細胞上に播種する方法等がとられる。このような継代は、通常１−３日毎に行うが、この際に細胞の観察を行い、形態的に異常な細胞が見受けられた場合はその培養細胞は放棄することが望まれる。
ＥＳ細胞は、適当な条件により、高密度に至るまで単層培養するか、または細胞集塊を形成するまで浮遊培養することにより、頭頂筋、内臓筋、心筋等の種々のタイプの細胞に分化させることが可能であり〔Ｍ．  Ｊ．  ＥｖａｎｓおよびＭ．  Ｈ．  Ｋａｕｆｍａｎ，  Ｎａｔｕｒｅ，  第２９２巻、１５４頁、１９８１年；Ｇ．  Ｒ．  Ｍａｒｔｉｎ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，  第７８巻、７６３４頁、１９８１年；Ｔ．  Ｃ．  Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎ  ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｅｍｂｒｙｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ，  第８７巻、２７頁、１９８５年〕、本発明のＥＳ細胞を分化させて得られる本発明のＤＮＡ発現不全細胞は、インビトロにおける本発明のタンパク質の細胞生物学的検討において有用である。
本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、該動物のｍＲＮＡ量を公知の方法を用いて測定して間接的にその発現量を比較することにより、正常動物と区別することが可能である。
該非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものが用いられる。
【００６６】
本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、例えば、前述のようにして作製したターゲッティングベクターをマウス胚幹細胞またはマウス卵細胞に導入し、導入によりターゲッティングベクターの本発明のＤＮＡが不活性化されたＤＮＡ配列が遺伝子相同組換えにより、マウス胚幹細胞またはマウス卵細胞の染色体上の本発明のＤＮＡと入れ換わる相同組換えをさせることにより、本発明のＤＮＡをノックアウトさせることができる。
本発明のＤＮＡがノックアウトされた細胞は、本発明のＤＮＡ上またはその近傍のＤＮＡ配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析またはターゲッティングベクター上のＤＮＡ配列と、ターゲッティングベクターに使用したマウス由来の本発明のＤＮＡ以外の近傍領域のＤＮＡ配列とをプライマーとしたＰＣＲ法による解析で判定することができる。非ヒト哺乳動物胚幹細胞を用いた場合は、遺伝子相同組換えにより、本発明のＤＮＡが不活性化された細胞株をクローニングし、その細胞を適当な時期、例えば、８細胞期の非ヒト哺乳動物胚または胚盤胞に注入し、作製したキメラ胚を偽妊娠させた該非ヒト哺乳動物の子宮に移植する。作出された動物は正常な本発明のＤＮＡ座をもつ細胞と人為的に変異した本発明のＤＮＡ座をもつ細胞との両者から構成されるキメラ動物である。該キメラ動物の生殖細胞の一部が変異した本発明のＤＮＡ座をもつ場合、このようなキメラ個体と正常個体を交配することにより得られた個体群より、全ての組織が人為的に変異を加えた本発明のＤＮＡ座をもつ細胞で構成された個体を、例えば、コートカラーの判定等により選別することにより得られる。このようにして得られた個体は、通常、本発明のタンパク質のヘテロ発現不全個体であり、本発明のタンパク質のヘテロ発現不全個体同志を交配し、それらの産仔から本発明のタンパク質のホモ発現不全個体を得ることができる。
卵細胞を使用する場合は、例えば、卵細胞核内にマイクロインジェクション法でＤＮＡ溶液を注入することによりターゲッティングベクターを染色体内に導入したトランスジェニック非ヒト哺乳動物を得ることができ、これらのトランスジェニック非ヒト哺乳動物に比べて、遺伝子相同組換えにより本発明のＤＮＡ座に変異のあるものを選択することにより得られる。
【００６７】
このようにして本発明のＤＮＡがノックアウトされている個体は、交配により得られた動物個体も該ＤＮＡがノックアウトされていることを確認して通常の飼育環境で飼育継代を行うことができる。
さらに、生殖系列の取得および保持についても常法に従えばよい。すなわち、該不活化ＤＮＡの保有する雌雄の動物を交配することにより、該不活化ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得しうる。得られたホモザイゴート動物は、母親動物に対して、正常個体１，ホモザイゴート複数になるような状態で飼育することにより効率的に得ることができる。ヘテロザイゴート動物の雌雄を交配することにより、該不活化ＤＮＡを有するホモザイゴートおよびヘテロザイゴート動物を繁殖継代する。
本発明のタンパク質のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞は、本発明のタンパク質のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を作出する上で、非常に有用である。
また、本発明のタンパク質のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のタンパク質により誘導され得る種々の生物活性を欠失するため、本発明のタンパク質の生物活性の不活性化を原因とする疾病のモデルとなり得るので、これらの疾病の原因究明および治療法の検討に有用である。
本発明のタンパク質はＡβ産生に密接に関係しており、その発現亢進あるいは抑制はＡβの産生亢進に繋がっている。一方、この事実は、正常範囲の発現量の本発明のタンパク質が、βＡＰＰやプレセニリンを含有するγ−セクレターゼ複合体の生理的な役割にも関与している可能性を示唆するものであり、本発明のタンパク質のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物、およびその組織あるいは細胞は、アルツハイマー病の治療・予防薬の検討に有用である。
【００６８】
（１１）本発明のＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療・予防効果を有する化合物のスクリーニング方法
本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療・予防効果を有する化合物のスクリーニングに用いることができる。
すなわち、本発明は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に試験化合物を投与し、該動物の変化を観察・測定することを特徴とする、本発明のＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療・予防効果を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
該スクリーニング方法において用いられる本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものがあげられる。
試験化合物としては、例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などがあげられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
具体的には、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を、試験化合物で処理し、無処理の対照動物と比較し、該動物の各器官、組織、疾病の症状などの変化を指標として試験化合物の治療・予防効果を試験することができる。
試験動物を試験化合物で処理する方法としては、例えば、経口投与、静脈注射などが用いられ、試験動物の症状、試験化合物の性質などにあわせて適宜選択することができる。また、試験化合物の投与量は、投与方法、試験化合物の性質などにあわせて適宜選択することができる。
該スクリーニング方法において、試験動物に試験化合物を投与した場合、アルツハイマー病の改善が見られた場合、該試験化合物をアルツハイマー病に対して治療・予防効果を有する化合物として選択することができる。
【００６９】
本発明のスクリーニング方法で得られた化合物またはそれから誘導される化合物（以下、本発明のスクリーニング方法で得られた化合物と略記する場合がある）は、塩を形成していてもよく、該化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸）や塩基（例アルカリ金属）等との塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩等が用いられる。
（ｉ）本発明のタンパク質、その部分ペプチドまたはその塩、もしくは（ｉｉ）本発明のスクリーニング方法で得られる本発明のタンパク質の機能を阻害する化合物もしくはそれから誘導される化合物またはその塩を含有する医薬は、それ自体または適当な医薬組成物として投与することができる。上記投与に用いられる医薬組成物は、上記またはその塩と薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤とを含むものである。このような組成物は、経口または非経口投与に適する剤形として提供される。
すなわち、例えば、経口投与のための組成物としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤等があげられる。このような組成物は公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有するものである。例えば、錠剤用の担体、賦形剤としては、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウム等が用いられる。
また、例えば非経口投与に適する剤形としては、注射剤（例、皮下注射剤、静脈内注射剤、筋肉注射剤、腹腔内注射剤など）、外用剤（例、経鼻投与剤、経皮投与剤、軟膏剤など）、座剤（例、直腸剤、膣座剤など）、徐放剤（例、徐放性マイクロカプセルなど）、ペレット、点滴剤などが用いられる。
【００７０】
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、哺乳動物（例えば、ヒト、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル等）に対して投与することができる。
上記タンパク質または化合物の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルート等により差異はあるが、例えば、アルツハイマー病の治療目的で該化合物を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき該化合物を約０．０１〜１０００ｍｇ、好ましくは約０．１〜１０００ｍｇ、さらに好ましくは約１．０〜２００ｍｇ、より好ましくは約１．０〜５０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患等によっても異なるが、例えば、アルツハイマー病の治療目的で該化合物を注射剤の形で通常成人（６０ｋｇとして）に投与する場合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００７１】
本発明のタンパク質に対するドミナントネガテイブ体または本発明のタンパク質に対する抗体を含有する上記疾患の治療・予防剤は、そのまま液剤として、または適当な剤型の医薬組成物として、哺乳動物（例、ヒト、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サル等）に対して経口的または非経口的に投与することができる。投与量は、投与対象、対象疾患、症状、投与ルート等によっても異なるが、例えば、本発明のドミナントネガテイブ体や抗体を１回量として、通常０．００１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重程度、好ましくは０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重程度、さらに好ましくは０．１〜５ｍｇ／ｋｇ体重程度を、１日１〜５回程度、好ましくは１日１〜３回程度、静脈注射により投与するのが好都合である。他の非経口投与および経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。症状が特に重い場合には、その症状に応じて増量してもよい。
本発明のタンパク質ＡまたはＢに対するドミナントネガテイブ体または本発明のタンパク質ＡまたはＢに対する抗体を含有する医薬は、前記のスクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬と同様にして製造することができる。
本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ、本発明のタンパク質に対するドミナントネガテイブ体をコードするＤＮＡまたは本発明のタンパク質に対するアンチセンスＤＮＡを単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクター等の適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って投与することができる。該ポリヌクレオチドまたはアンチセンスＤＮＡは、そのままで、あるいは摂取促進のために補助剤等の生理学的に認められる担体とともに製剤化し、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。あるいは、エアロゾル化して吸入剤として気管内に投与することもできる。
これらＤＮＡまたはアンチセンスＤＮＡの投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、本発明のＤＮＡまたはアンチセンスＤＮＡを吸入剤として気管内に局所投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇ）においては、一日につき該ＤＮＡまたはアンチセンスＤＮＡを約０．１〜１００ｍｇ投与する。
【００７２】
本明細書において、塩基やアミノ酸等を略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  による略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
ＤＮＡ          ：デオキシリボ核酸
ｃＤＮＡ        ：相補的デオキシリボ核酸
Ａ            ：アデニン
Ｔ            ：チミン
Ｇ            ：グアニン
Ｃ            ：シトシン
ＲＮＡ          ：リボ核酸
ｍＲＮＡ        ：メッセンジャーリボ核酸
ｄＡＴＰ        ：デオキシアデノシン三リン酸
ｄＴＴＰ        ：デオキシチミジン三リン酸
ｄＧＴＰ        ：デオキシグアノシン三リン酸
ｄＣＴＰ        ：デオキシシチジン三リン酸
ＡＴＰ          ：アデノシン三リン酸
ＥＤＴＡ        ：エチレンジアミン四酢酸
ＳＤＳ          ：ドデシル硫酸ナトリウム
【００７３】
Ｇｌｙ  ：グリシン
Ａｌａ      ：アラニン
Ｖａｌ        ：バリン
Ｌｅｕ      ：ロイシン
Ｉｌｅ  ：イソロイシン
Ｓｅｒ  ：セリン
Ｔｈｒ    ：スレオニン
Ｃｙｓ  ：システイン
Ｍｅｔ  ：メチオニン
Ｇｌｕ  ：グルタミン酸
Ａｓｐ  ：アスパラギン酸
Ｌｙｓ  ：リジン
Ａｒｇ  ：アルギニン
Ｈｉｓ  ：ヒスチジン
Ｐｈｅ  ：フェニルアラニン
Ｔｙｒ  ：チロシン
Ｔｒｐ  ：トリプトファン
Ｐｒｏ  ：プロリン
Ａｓｎ  ：アスパラギン
Ｇｌｎ  ：グルタミン
ｐＧｌｕ        ：ピログルタミン酸
Ｈｓｅ            ：ホモセリン
【００７４】
また、本明細書中で繁用される置換基、保護基および試薬を下記の記号で表記する。
Ｍｅ            ：メチル基
Ｅｔ            ：エチル基
Ｂｕ            ：ブチル基
Ｐｈ            ：フェニル基
ＴＣ            ：チアゾリジン−４（Ｒ）−カルボキサミド基
Ｔｏｓ          ：ｐ−トルエンスルフォニル
ＣＨＯ          ：ホルミル
Ｂｚｌ          ：ベンジル
Ｃｌ２−Ｂｚｌ    ：２，６−ジクロロベンジル
Ｂｏｍ          ：ベンジルオキシメチル
Ｚ              ：ベンジルオキシカルボニル
Ｃｌ−Ｚ        ：２−クロロベンジルオキシカルボニル
Ｂｒ−Ｚ        ：２−ブロモベンジルオキシカルボニル
Ｂｏｃ          ：ｔ−ブトキシカルボニル
ＤＮＰ          ：ジニトロフェニル
Ｔｒｔ          ：トリチル
Ｂｕｍ          ：ｔ−ブトキシメチル
Ｆｍｏｃ        ：Ｎ−９−フルオレニルメトキシカルボニル
ＨＯＢｔ        ：１−ヒドロキシベンズトリアゾール
ＨＯＯＢｔ      ：３，４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ−
１，２，３−ベンゾトリアジン
ＨＯＮＢ        ：１−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミド
ＤＣＣ          ：Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド
【００７５】
本願明細書の配列表の配列番号は以下の配列を示す。
［配列番号：１］
タンパクＸのアミノ酸配列を示す。
［配列番号：２］
タンパクＸをコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
［配列番号：３］
ＧＡＢＡＲＡＰＬ１のアミノ酸配列を示す。
［配列番号：４］
ＧＡＢＡＲＡＰＬ１をコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
［配列番号：５］
ＧＡＴＥ−１６のアミノ酸配列を示す。
［配列番号：６］
ＧＡＴＥ−１６をコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
［配列番号：７］
ＧＡＴＥ−１６  ｖａｒｉａｎｔのアミノ酸配列を示す。
［配列番号：８］
ＧＡＴＥ−１６  ｖａｒｉａｎｔ  ＤＮＡの塩基配列を示す。
［配列番号：９］
実施例１で用いたセンスプライマーの塩基配列を示す。
［配列番号：１０］
実施例１で用いたアンチセンスプライマーの塩基配列を示す。
［配列番号：１１］
参考例１で用いたセンスプライマーの塩基配列を示す。
［配列番号：１２］
参考例１で用いたアンチセンスプライマーの塩基配列を示す。
［配列番号：１３］
マウスＮｏｔｃｈ  １の細胞内ドメイン（ＮＩＣＤ）のアミノ酸配列を示す。
［配列番号：１４］
参考例１で用いたセンスプライマーの塩基配列を示す。
［配列番号：１５］
参考例１で用いたアンチセンスプライマーの塩基配列を示す。
［配列番号：１６］
参考例１で用いられたＤＮＡオリゴマーの塩基配列を示す。
［配列番号：１７］
参考例１で用いられたＤＮＡオリゴマーの塩基配列を示す。
［配列番号：１８］
ヒトＰＥＮ−２をコードするｃＤＮＡの塩基配列を示す。
［配列番号：１９］
ヒトＰＥＮ−２のアミノ酸配列を示す。
【００７６】
後述の参考例１で得られたプラスミドをｐＣｘＮＣ５３ＮＩＣＤを保持する形質転換体エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＤＨ５α／ｐＣｘＮＣ５３ＮＩＣＤは、２００１年７月２６日から茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６（郵便番号３０５−８５６６）の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７６７６として寄託され、さらに、２００１年６月１９日から大阪府大阪市十三本町２丁目１７番８５号（郵便番号５３２−８６８６）の財団法人・発酵研究所（ＩＦＯ）に寄託番号ＩＦＯ  １６６５１として寄託されている。
後述の参考例２で得られたプラスミドｐＨＥＳｐａｃを保持する形質転換体エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＤＨ５α／ｐＨＥＳｐａｃは、２００１年７月２６日から茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６（郵便番号３０５−８５６６）の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７６７７として寄託され、さらに、２００１年６月１９日から大阪府大阪市十三本町２丁目１７番８５号（郵便番号５３２−８６８６）の財団法人・発酵研究所（ＩＦＯ）に寄託番号ＩＦＯ  １６６５２として寄託されている。
【００７７】
【実施例】
以下に、参考例および実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はそれらに限定されるものではない。
【００７８】
参考例１  キメラタンパク質Ｃ５３ＮＩＣＤをコードするＤＮＡの作製
ＡβのＮ末端からγ−セクレターゼ切断部位を含むＡＰＰ細胞膜領域までのＡＰＰフラグメントのＮ末端にメチオニンを付加したＣ５３（配列番号：１０）をコードするＤＮＡをヒトＡＰＰ  ｃＤＮＡ（Ｋａｎｇ  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３２，  ７３３−７３６，  １９８７）を鋳型にＰＣＲ法により作製した。配列番号：１１で示したオリゴＤＮＡをセンス鎖プライマーとして、配列番号：１２で表されるオリゴＤＮＡをアンチセンス鎖プライマーとして用いた。その際、マウスＮｏｔｃｈ  １の細胞内ドメイン（ＮＩＣＤ）（配列番号：１３）をコードするＤＮＡ断片とのキメラＤＮＡを調製するため、５’側に、ＫｐｎＩ部位、３’側にＸｂａＩ部位を導入した。
ＮＩＣＤをコードするＤＮＡ断片は、マウスＮｏｔｃｈ  １  ｃＤＮＡ（Ａｍｏ  ＦＦｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １５，  ２５９−２６４，  １９９３）を鋳型にＰＣＲ法により以下の方法で調製した。まず、配列番号：１４で示したオリゴＤＮＡをセンス鎖プライマー、配列番号：１５で表されるオリゴＤＮＡをアンチセンス鎖プライマーとしてＰＣＲ法を行うことにより、ＮＩＣＤのＮ末端からＣ端側の途中までをコードする短いＤＮＡ断片（９２８ｂｐ）を調製した。この断片は、５’側に人工的にＸｂａＩ部位を付加しており、また、３’側にはマウスＮｏｔｃｈ  １  ｃＤＮＡ配列由来のＮｏｔＩ部位を含んでいる。
次に、これにＣ５３をコードするＤＮＡ断片をＸｂａＩでつなげ、このキメラＤＮＡ断片を、あらかじめＫｐｎＩとＮｏｔＩ部位を導入したｐＣｘＮ（Ｎｉｗａ  Ｈｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ  １０８：１９３，  １９９１）に、この部位で挿入した。これにより、Ｃ５３およびＮＩＣＤのＣ端側の途中までをコードしたキメラＤＮＡを含むプラスミドｐＣｘＮＣ５３ＮＩＣＤΔＣを調製した。
次に、完全長のＮＩＣＤをコードするＤＮＡ断片を調製するため、あらかじめクローニングしたＮＩＣＤコード領域を含むマウスＮｏｔｃｈ  １  ｃＤＮＡのＳｓｐＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片より、ＮｏｔＩ−ＮｏｔＩ  ＤＮＡ断片を調製し、これをｐＣｘＮＣ５３ＮＩＣＤΔＣのＮｏｔＩ部位に挿入した。これにより、Ｃ５３ＮＩＣＤをコードするキメラＤＮＡが調製され、このキメラＤＮＡを含むプラスミドをｐＣｘＮＣ５３ＮＩＣＤと命名した。なお、ベクターとして用いたｐＣｘＮ（Ｎｉｗａ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ  １０８：１９３，  １９９１）は、β−アクチンのプロモーター、ネオマイシン耐性遺伝子をもつプラスミドであるが、ｐＣｘＮＣ５３ＮＩＣＤを調製するため、ｐＣｘＮのＥｃｏＲＩ部位に配列番号：１６および配列番号：１７のＤＮＡオリゴマーを挿入することにより、新たにＫｐｎＩとＮｏｔＩ部位を導入して使用した。
【００７９】
参考例２  ＨＥＳ−１をプロモーターとするピューロマイシン耐性遺伝子（ｐａｃ：  ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｇｅｎｅ）の作製
ＨＥＳ−１プロモーター（配列番号：１８）（Ｔａｋｅｂａｙａｓｈｉ  Ｋ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ．２６９（７）：５１５０−６，  １９９４）は、マウス染色体を鋳型とし、ＰＣＲ法でＫｐｎＩとＨｉｎｄＩＩＩ部位を付加し増幅し調製した。次に、これを、ベクターＰＧＶ−Ｂ（東洋ビーネット株式会社より購入。ＴＯＹＯ  Ｂ−Ｎｅｔ  Ｃｏ．，  ＬＴＤ）のＫｐｎＩとＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入した。このプラスミドをｐＧＶ−Ｂ−ＨＥＳ−１と命名した。一方、ピューロマイシン耐性遺伝子は、ｐＰＵＲ（クローンテック社）より、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩでピューロマイシン耐性遺伝子をコードするＤＮＡ断片を切り出し調製した。このＤＮＡ断片をｐＧＶ−Ｂ−ＨＥＳ−１のＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩ部位に挿入し、完成したプラスミドをｐＨＥＳｐａｃと命名した。
【００８０】
参考例３  ピューロマイシン耐性遺伝子およびＣ５３ＮＩＣＤ  ｃＤＮＡ（およびヒトプレセニリン１  ｃＤＮＡ）を恒常的に発現する細胞株：Ａ５−９細胞（およびＡ５−９−ＰＳ１）の樹立
マウスｐｒｏ−Ｂ細胞由来の細胞株、ＢａＦ／３細胞（Ｐａｌａｃｉｏｓ，  Ｒ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  ４１：７２７，  １９８５）に上記の構築したプラスミドをエレクトロポレーション法により遺伝子導入した。細胞はネオマイシンおよびピューロマイシン耐性を指標に選択した。得られた形質変換体をＡ５−９細胞と命名した。さらに、Ａ５−９細胞にヒトプレセニリン１  ｃＤＮＡを導入した。ヒトプレセニリン１  ｃＤＮＡは、ヒト脳より調製したｃＤＮＡよりＰＣＲ法で調製し（Ｓｕｄｏｈ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．  ７１：１５３５，  １９９８）、ＳＲαプロモーター（Ｔａｋｅｂｅ，Ｙ．，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．  ８：４６６，  １９８８）とハイグロマイシン耐性遺伝子をもつベクターに挿入したのち、エレクトロポレーション法によりＡ５−９細胞に遺伝子導入した。細胞はハイグロマイシン耐性を指標に選択した。得られた形質変換体をＡ５−９−ＰＳ１細胞と命名した。
【００８１】
参考例４  ヒトｃＤＮＡライブラリーの作製とＡ５−９あるいはＡ５−９−ＰＳ１細胞へのトランスフェクション
ヒトｃＤＮＡライブラリーは、ヒト海馬由来のｍＲＮＡ（クローンテック社）より、ギブコ社から市販されているｃＤＮＡ合成キット（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭ  Ｃｈｏｉｃｅｓｙｓｔｅｍ）を用いてｃＤＮＡを合成し調製した。得られたｃＤＮＡは、ＢｓｔＸＩアダプター（インビトロゲン社）を付け、レトロウイルスベクター、ｐＭＸ（Ｏｎｉｓｈｉ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｘｐ．  Ｈｅｍａｔｏｌ．  ２４：３２４，  １９９６）のＢｓｔＸＩ部位に導入した。このライブラリーをパッケージング細胞であるＰｈｎｅｎｉｘ−Ｅｃｏ細胞にトランスフェクトし、ヒトｃＤＮＡライブラリーを含むウイルスを産生させた（Ｘｕ  Ｘ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．  ２７：２３−２９，  ２００１；  Ｈｉｔｏｓｈｉ  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．  ８：４６１−４７１，  １９９８  ）。このウイルスを既に報告されている方法にしたがい（Ｋｉｔａｍｕｒａ，  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ９２：９１４６，  １９９５）、Ａ５−９細胞あるいはＡ５−９−ＰＳ１細胞（それぞれ４×１０６細胞数）に感染させた。感染効率は、ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｓｅｎｃｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）をコードするｃＤＮＡを同時に感染させて、ＧＦＰを発現している細胞の蛍光で解析した。その結果、感染効率はほぼ２５％であった。
【００８２】
参考例５  Ａβ産生を上げる細胞の選択
上記参考例４記載の、レトロウイルスによる感染によりヒト海馬ｃＤＮＡライブラリーを遺伝子導入されたＡ５−９細胞あるいはＡ５−９−ＰＳ１細胞を、高濃度のピューロマイシン（Ａ５−９細胞は２５μｇ／ｍｌ；Ａ５−９−ＰＳ１細胞は９μｇ／ｍｌ）存在下で培養することにより、ピューロマイシン耐性能を獲得した細胞を選択した。用いたピューロマイシン濃度は、親株であるＡ５−９細胞およびＡ５−９−ＰＳ１細胞が死滅するピューロマイシン最低濃度が、それぞれ２０μｇ／ｍｌおよび５μｇ／ｍｌであることから決定した。次に、それらの細胞が産生するＡβを、高感度ウエスタンブロッティング法（Ｉｄａ  Ｎ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７１：２２９０８，  １９９６）を用いて測定した。即ち、Ａβの検出は、３日間の培養（初期細胞濃度２×１０５細胞／ｍｌ、３ｍｌ培地）で培地に分泌されるＡβを抗Ａβモノクローナル抗体６Ｅ１０で免疫沈降し、その沈降物を抗Ａβ抗体を用いる高感度ウエスタンブロッティング法で検出した。Ａβ産生量の比較は、ウエスタンブロッティング法で検出されるＡβのバンドの強度を親株の産生するＡβ量と比較して判定した。ＰＳ１を過剰発現していないＡ５−９細胞では、１６クローンのピューロマイシン耐性細胞が、また、ＰＳ１を過剰発現しているＡ５−９−ＰＳ１細胞では、２回のトランスフェクションの結果、合計約６０クローンのピューロマイシン耐性細胞が得られた。それらのうち、Ａ５−９細胞では５クローンが、Ａ５−９−ＰＳ１では、２５クローンがＡβ４０の産生を上げていることがわかった。
【００８３】
実施例１
Ａ５−９を親株とした「アルツハイマー関連遺伝子のスクリーニング方法」（ＰＣＴ／ＪＰ０２／００８３６および上記参考例１〜５参照）により、Ａβの産生を上昇するｃＤＮＡとして、ＧＡＴＥ−１６（オリジナル名、ＧＥＦ２：ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．  ＡＪ０１０５６９）に相当するｃＤＮＡ、ＧＡＢＡＲＡＰＬ１をコードするｃＤＮＡ、および、機能不明なタンパクＸをコードするｃＤＮＡ（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．  ＮＰ＿０７１３６０）を同定した。ここで同定したＧＡＴＥ−１６は、公知のＧＡＴＥ−１６のアミノ酸配列４４番目のイソロイシンがアスパラギン酸に置換されていた。以降、これをＧＡＴＥ−１６  ｖａｒｉａｎｔ  Ｉ４４Ｄと表記する。また、ＧＡＢＡＲＡＰＬ１は、ヒト海馬由来のｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、配列番号：９で表されるセンスプライマーおよび配列番号：１０で表されるアンチセンスプライマーを用いたＰＣＲ法により、そのｃＤＮＡを単離した。
上記のＧＡＴＥ−１６、ＧＡＢＡＲＡＰＬ１およびタンパクＸについてＡβの産生の影響を調べた。その結果を表１および表２に示す。
【００８４】
【表１】
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【００８５】
【表２】
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【００８６】
その結果、表１に示したように、ＧＡＴＥ−１６は対照の約２倍のＡβ産生増加を示し、ＧＡＢＡＲＡＰＬ１も比較的弱いがＡβ産生増加を示した。ＧＡＴＥ−１６およびＧＡＢＡＲＡＰＬ１は酵母のオートファージに必要な因子のホモローグであることから、これらの結果は、酵母のオートファジーあるいはそれと類似した細胞内輸送経路が、Ａβ産生に関与していることを示唆するものである。また、タンパクＸは、８５個のアミノ酸よりなる機能不明なタンパクである。この遺伝子を細胞に導入すると、Ａβ４２の増加率のほうが、Ａβ４０に比べ高かった（表２）。Ａβ４２の毒性がＡβ４０より高いことが知られているが、タンパクＸの作用を抑制することにより、Ａβ４２の産生を抑制できる可能性がある。
以上の結果より、ＧＡＴＥ−１６、ＧＡＢＡＲＡＰＬ１およびタンパクＸはＡβの産生を上昇させるため、アルツハイマー病の診断薬として有用である。
【００８７】
実施例２
プレセニリンと相互作用し、Ｎｏｔｃｈシグナルに関与するいくつかの因子が、線虫を用いた遺伝学的手法により同定されている（Ｆｒａｎｃｉｓ，Ｒ．  ｅｔ  ｅｌ．，  Ｄｅｖ．  Ｃｅｌｌ  ３：  ８５−９７，  ２００２）。また、ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ（ＲＮＡｉ）法を用いて、（１）これらの因子がＡβ産生に必要なプレセニリン複合体の構成タンパク質であること、（２）これらの因子を欠損すると機能的なプレセニリン複合体が構成されず、Ａβ産生が減少することも報告された。本発明では、これらの因子のうちヒトＰＥＮ−２遺伝子（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．  ＡＦ２２００５３）（配列番号：１８）について検討したところ、表３に示したように、その遺伝子産物（配列番号：１９）がＡβ産生促進因子であることを見出した。さらに、ヒトＰＥＮ−２遺伝子を過剰発現させるとＡβ産生を著しく上昇させ、特にＡβ４２の上昇率がＡβ４０に比べ著しく高くなることを見出した。この結果は、ＰＥＮ−２の作用を阻害することにより、Ａβ産生ばかりでなくＡβ４２産生を選択的に抑制できる可能性を示すものである。
以上の結果から、ヒトＰＥＮ−２もまた、アルツハイマー病の診断薬として有用である。
【００８８】
【表３】
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【００８９】
【発明の効果】
本発明によって、Ａβの産生を制御する遺伝子、すなわちアルツハイマー病関連遺伝子あるいはアルツハイマー病関連候補遺伝子が提供される。それらの遺伝子、それらの遺伝子と特異的にハイブリダイズするヌクレオチド、それらの遺伝子を含有する組換えベクターによる形質変換体、それらのｃＤＮＡがコードするタンパク質、あるいは該タンパク質に対する抗体を用いたアルツハイマー病の診断方法、治療方法および予防方法等が提供される。さらに、該遺伝子、該遺伝子と特異的にハイブリダイズするヌクレオチド、該遺伝子を含有する組換えベクターによる形質変換体、それらのｃＤＮＡがコードするタンパク質、あるいは該タンパク質に対する抗体等を用いたアルツハイマー病の診断剤、治療・予防剤等が提供される。
【００９０】
【配列表】
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