(57)【要約】　　　（修正有）【課題】新規の細胞外マトリックスタンパク質、及びその遺伝子、さらにはその抗体等を提供する。【解決手段】本発明にかかるタンパク質及びその遺伝子は、マウス由来の新規な細胞外マトリックス因子であり、マウス由来の特定なアミノ酸配列からなるタンパク質、及び／又は、マウス由来の特定なアミノ酸配列において、１又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなる細胞外マトリックスタンパク質と、これをコードする遺伝子である。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子。
（ａ）配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列において、１又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなる細胞外マトリックスタンパク質。
【請求項２】
マウス由来である請求項１記載の遺伝子。
【請求項３】
配列番号１に示される塩基配列のうち、４３〜１０８３番目の塩基配列をオープンリーディングフレームとして有する請求項１又は２記載の遺伝子。
【請求項４】
配列番号３に示される塩基配列のうち、３９〜１１５１番目の塩基配列をオープンリーディングフレームとして有する請求項１又は２記載の遺伝子。
【請求項５】
配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
【請求項６】
配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列において、１又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなる細胞外マトリックスタンパク質。
【請求項７】
細胞外マトリックス因子に結合する性質を有する請求項５又は６記載のタンパク質。
【請求項８】
細胞外マトリックス因子のうち、タイプ６コラーゲン、ラミニン１０、及びタイプ１コラーゲンの少なくとも何れかに結合する性質を有する請求項７記載のタンパク質。
【請求項９】
分泌タンパク質である請求項５〜８のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項１０】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の遺伝子を含む組換え発現ベクター。
【請求項１１】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の遺伝子が導入された形質転換体。
【請求項１２】
請求項５〜９のいずれか１項に記載のタンパク質に対する抗体。
【請求項１３】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の遺伝子、又は、請求項５〜９のいずれか１項に記載のタンパク質を含んでなる細胞接着用薬剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規細胞外マトリックスタンパク質、及びその遺伝子に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
細胞外マトリックスは、組織の細胞を取り巻く細胞支持組織であり、コラーゲン、エラスチン、フィブリリンなどの繊維性タンパク質、フィブロネクチン、ラミニンなどの糖蛋白質、プロテオグリカンなどの複合糖質及びヒアルロン酸などの糖質からなる。細胞外マトリックスは、細胞表面レセプターと結合することにより細胞接着、移動、増殖、分化、形態、代謝など細胞の活動に重大な影響を与えることが知られている。したがって、生体の受精、発生、成熟、加齢、炎症、創傷治癒、免疫、腫瘍など多くの生体現象と関連することが知られている。
【０００３】
より詳細には、細胞外マトリックス因子についてこれまで以下の知見が得られており、その細胞接着活性など、生命活動において細胞外マトリックス因子が果たす役割の重要性が明らかになっている。
【０００４】
▲１▼　生体を構成する細胞は血球細胞などの浮遊系細胞を除き、常に細胞外環境に接着して存在する。その接着は、隣り合った細胞同士の接着である細胞間接着と細胞の基質との接着である細胞―基質接着の２つに分けられる。この基質の実態が細胞外マトリックスである。細胞と基質との接着は細胞の生命維持に必須であり、これら細胞は基質、すなわち細胞外マトリックスとの接着なしには生きられない。すなわち、アポトーシスを引き起こして死ぬことが知られている。この細胞外マトリックスの生存維持作用は細胞外マトリックス因子とインテグリンをはじめとする細胞表面レセプターとの結合によって細胞内のＡｋｔやＭＡＰキナーゼなどのキナーゼが活性化されることでアポトーシスが回避されている。
【０００５】
▲２▼　このように、細胞外マトリックス因子に対する細胞の接着によって誘導される現象はきわめて動的なものであり、細胞の重要な機能を制御している。たとえば、細胞の増殖も細胞外マトリックスによって制御されている。すなわち、細胞は増殖因子が存在しても、細胞外マトリックスへの接着なしには増殖できない、いわゆる基質依存性の細胞増殖が古くから知られている。その実態は、細胞増殖因子からのシグナルとともに、細胞外マトリックスへの接着による細胞内シグナル、たとえばＭＡＰキナーゼの活性化が必須である。
【０００６】
▲３▼　細胞外マトリックスへの細胞接着による細胞内シグナル伝達は異なる細胞外マトリックスによって異なっている。たとえば、間質系細胞外マトリックスの主要構成因子であるフィブロネクチンへの接着はＭＡＰキナーゼの活性化とｓｍａｌｌ　Ｇｐｒｏｔｅｉｎ　Ｒｈｏの活性化を誘導する。一方、基底膜細胞外マトリックスの主要構成因子であるラミニンへの接着はＭＡＰキナーゼの活性化とｓｍａｌｌ　Ｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｒｈｏに代わって、Ａｋｔやｓｍａｌｌ　Ｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｒａｃを活性化する。これら異なる細胞外マトリックス因子への接着によって細胞の性質は強く影響され、一般的にはフィブロネクチンは細胞を増殖型に、ラミニンは分化型に誘導する。すなわち、異なる細胞外マトリックス因子は異なる細胞内シグナルを伝達し、これにより細胞の生存、増殖、分化を制御する。
【０００７】
▲４▼　細胞接着因子である多くの細胞外マトリックス因子は、細胞の移動の主役である。細胞外マトリックス因子による細胞接着は単に細胞をその基質にとどめておくだけの作用ではない。細胞外マトリックスは細胞接着と同時に細胞の伸展を誘導する。この伸展は、細胞内のアクチンを含む細胞骨格系の再編成を必須とし、これらはｓｍａｌｌ　Ｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｒｈｏ，　Ｒａｃ　Ｃｄｃ４２の制御下にある。細胞外マトリックスはこれらｓｍａｌｌ　Ｇ　ｐｒｏｔｅｉｎの活性化レベルをドラマティックに制御することで、細胞骨格系の構築を誘導し、細胞を伸展させる。
【０００８】
▲５▼　細胞の移動は細胞外マトリックスへの接着を足がかりとして、細胞外マトリックスへの接着シグナルに応答した細胞骨格系の再構成の連続によって移動することから、細胞外マトリックスは細胞の移動に必須である。
【０００９】
▲６▼　細胞の移動は胚の初期発生から生体のボディープランの構築に必須であり、もちろんすべての組織は細胞の移動を伴って構築される。創傷や疾病の治癒もその周囲の細胞の移動、浸潤によって行われる。
【００１０】
▲７▼　浮遊系の細胞でも、白血球を含む血球、免疫系細胞の血管壁の通過や組織への浸潤、組織間の移動も細胞外マトリックス因子への接着を必要とする。がん細胞の転移もその実態は細胞の原発層からの移動である。
【００１１】
▲８▼　これらの正常、および疾患、疾病における細胞移動は細胞外マトリックスへの接着と接着シグナルに応答した細胞内シグナルによって制御されている。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
このように、細胞外マトリックス因子は細胞、組織の働きを細胞の外側から調節する重要な役割を果たしている。したがって、これら細胞外マトリックス因子の遺伝子、タンパク質やこれらタンパク質に対する抗体は、受精、胚発生、形態形成等を研究する上で、さらに、細胞外マトリックスの形成異常や代謝異常によって生じる疾患、疾病を研究する上で、非常に有用である。また、これらの遺伝子や抗体は、細胞外マトリックスの関与する病気の診断や、その治療効果の検査などにも有用である。そのため、より多くの新規細胞外マトリックス因子を見出し、これを生産し利用する方法の開発が強く望まれていた。
【００１３】
本発明は、上記の課題に鑑みなされたものであり、その目的は、新規の細胞外マトリックスタンパク質、及びその遺伝子、さらにはその抗体等を提供することにある。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記の課題に鑑み鋭意検討した結果、マウス由来のｃＤＮＡライブラリーの中から分泌シグナル配列と予想される配列を含むｃＤＮＡを選別し、これを用いてタンパク質を発現させ、その機能を解析したところ、このタンパク質が分泌タンパク質であり、新規の細胞外マトリックスタンパク質であること等を見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１５】
即ち、本発明に係るタンパク質は、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質であり、本発明に係る遺伝子は、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子である。
（ａ）配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列において、１又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなる細胞外マトリックスタンパク質。
【００１６】
上記（ａ）のタンパク質は、本発明者が今回新たに細胞外マトリックスタンパク質として単離・同定したものであり、Ｎ末端側に予想分泌シグナル配列を有する。また、後述の実施例に示すように、機能解析の結果、このタンパク質は細胞外分泌される分泌タンパク質であること、他の細胞外マトリックス因子との結合性を有すること（特に、タイプ６コラーゲン、ラミニン１０、及びタイプ１コラーゲンとの比較的高い結合性を有すること）等が実験的に確認されている。
【００１７】
本発明に係る組換え発現ベクターは、上記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子を含むものである。例えば、配列番号１又は３に示される遺伝子が挿入された組換え発現ベクターが挙げられる。組換え発現ベクターの作製には、プラスミド、ファージ、又はコスミドなどを用いることができるが特に限定されるものではない。
【００１８】
本発明に係る形質転換体は、上記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子が導入された形質転換体である。ここで、「遺伝子が導入された」とは、公知の遺伝子工学的手法（遺伝子操作技術）により、対象細胞（宿主細胞）内に発現可能に導入されることを意味する。また、上記「形質転換体」とは、細胞・組織・器官のみならず、動物個体（マウスやラット、ウサギ、ブタ、サルなどの形質転換動物）を含む意味である。特に、マウスやラットは、実験動物・病態モデル動物として広く用いられており、ノックアウトマウス等は、細胞外マトリックス因子の機能解析、同因子が関係する病気の病態解析やその病気の診断法、診断薬、治療法、治療薬の開発などに有用である。
【００１９】
本発明に係る抗体は、上記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質、又はその部分ペプチドを抗原として、公知の方法によりポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体として得られる抗体である。
【００２０】
【発明の実施の形態】
本発明の実施の一形態について図１ないし図３に基づいて説明すれば、以下の通りである。尚、本発明はこれに限定されるものではない。
【００２１】
本発明は、新規な細胞外マトリックス因子であるタンパク質とこれをコードする遺伝子とを見出すとともに、これら遺伝子及びタンパク質の機能を解析し、これらの利用方法を提案するものである。そこで以下では、本発明の遺伝子、タンパク質の配列、構造について説明し、次いでこれら遺伝子、タンパク質の機能、利用方法等について説明することとする。
【００２２】
（１）本発明に係る遺伝子及びタンパク質の配列、構造
本発明者は、マウス由来ｃＤＮＡライブラリーの中から分泌シグナル配列と予想される配列を含む２つのｃＤＮＡをスクリーニングし、これら２つの全長ｃＤＮＡ配列を決定し、さらにこれら２つのｃＤＮＡがコードするタンパク質のアミノ酸配列をそれぞれ決定した。以下の説明では、配列を決定した第１の新規ｃＤＮＡを「３７３７７遺伝子」と称し、当該遺伝子にコードされるタンパク質を「３７３７７タンパク質」と称して説明する。また、上記３７３７７遺伝子のアイソフォームである第２の新規ｃＤＮＡを「４８２５０遺伝子」と称し、当該遺伝子にコードされるタンパク質を「４８２５０タンパク質」と称して説明する。
【００２３】
本発明に係る遺伝子は、前述のように、（ａ）配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子か、（ｂ）配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列において、１又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなる細胞外マトリックスタンパク質をコードする遺伝子であればよいが、本実施の形態では、▲１▼配列番号１に示される塩基配列のうち、４３〜１０８３番目の塩基配列をオープンリーディングフレームとして有するｃＤＮＡ（３７３７７遺伝子）、▲２▼配列番号３に示される塩基配列のうち、３９〜１１５１番目の塩基配列をオープンリーディングフレームとして有するｃＤＮＡ（４８２５０遺伝子）、▲３▼これらｃＤＮＡの塩基配列に対応する塩基配列を有するｍＲＮＡが例示される。これら遺伝子はマウス（Ｍｕｓ　ｍｕｓｃｕｌｕｓ）由来である。
【００２４】
なお、本発明の「遺伝子」には、ＲＮＡ及びＤＮＡが含まれるものとする。ＲＮＡにはｍＲＮＡが含まれ、ＤＮＡには、例えばクローニングや化学合成技術又はそれらの組み合わせで得られるようなｃＤＮＡやゲノムＤＮＡなどが含まれる。また、ＤＮＡは二本鎖でも一本鎖でもよく、一本鎖ＤＮＡは、センス鎖となるコードＤＮＡでもよく、アンチセンス鎖となるアンチコード鎖でもよい（アンチセンス鎖は、プローブとして又はアンチセンス薬物として利用できる）。さらに、本発明の「遺伝子」は、上記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする配列以外に、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列やベクター配列（発現ベクター配列を含む）などの配列を含むものであってもよい。
【００２５】
一方、本発明に係るタンパク質は、上記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質であればよいが、本実施の形態では、▲１▼配列番号２に示されるアミノ酸配列を有しており、３４７のアミノ酸残基からなる３７３７７タンパク質、及び、▲２▼配列番号４に示されるアミノ酸配列を有しており、３７１のアミノ酸残基からなる４８２５０タンパク質が例示される。
【００２６】
上記３７３７７タンパク質及び４８２４０タンパク質は、図１及び図２に示すように、何れも、分泌シグナル配列のほか、１つのフィブロネクチンタイプ３モチーフ、４つの糖鎖結合部位（ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　Ｎ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ　ｓｉｔｅ）、１つの疎水性アミノ酸に富んだ領域を有している。また、図３に示すように、これらタンパク質の一次構造を比較すると、カルボキシル末端（Ｃ末端）を除く領域では、１００％の相同性が認められた。これに対して、Ｃ末端領域ではほとんど相同性が認められなかった。それゆえ、３７３７７タンパク質及び４８２５０タンパク質は、カルボキシル末端部位の異なるアイソフォームであると推定される（後述の実施例参照）。
【００２７】
さらに、図３に示すように、３７３７７タンパク質及び４８２５０タンパク質ともに、その一次構造は、ヒトの機能未知ｃＤＮＡであるＦＬＪ２１５５１遺伝子の塩基配列から予測されるアミノ酸配列と高い相同性を示す。特に、４８２５０タンパク質は、３７３７７タンパク質よりもその相同性は高い。しかしながら、Ｃ末端領域ではほとんど相同性が認められない。尚、ＦＬＪ２１５５１遺伝子以外に相同性の高いｃＤＮＡは報告されていない。
【００２８】
上記３７３７７タンパク質のアミノ酸組成は表１に示すようになっており、上記４８２５０タンパク質のアミノ酸組成は表２に示すようになっている。
【００２９】
【表１】
2004008019.tif 000002
【００３０】
【表２】
2004008019.tif 000003
【００３１】
前述のように、本発明に係るタンパク質には、前記（ｂ）のタンパク質、即ち、配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列において、１又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなる細胞外マトリックスタンパク質も含まれるが、ここで、「１又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異タンパク質作製法により置換、欠失、挿入、及び／又は付加できる程度の数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されることを意味する。このように、上記（ｂ）のタンパク質は、換言すれば、上記（ａ）のタンパク質の変異タンパク質であり、ここにいう「変異」は、主として公知の変異タンパク質作製法により人為的に導入された変異を意味するが、天然に存在する同様の変異タンパク質を単離精製したものであってもよい。
【００３２】
上記変異タンパク質には、野生型の活性（後述する細胞接着活性・細胞伸展活性・他の細胞外マトリックス因子との結合性等）に異常を持つ変異タンパク質（機能欠失型の変異タンパク質と称する）が含まれていても良い。このような機能欠失型の変異タンパク質は、例えば、野生型タンパク質と構造を比較することにより、その構造の中で活性に必須な領域が明らかになるという、タンパク質の機能解析において有用である。また、本発明に係る遺伝子には、上記機能欠失型の変異タンパク質をコードする遺伝子が含まれても良い。このような遺伝子は、例えば、新たな形質転換体の作出に有用である。
【００３３】
本発明に係るタンパク質は、タンパク質の精製や検出等を容易に行うために、公知のＨＡやＦｌａｇ等の付加配列を末端に含ませてもよいし、融合タンパク質であってもよい。また、Ｎ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎなどの各種修飾を受けていてもよいし、二量体以上の多量体を形成するものであってもよい。例えば、後述の実施例に示すように、３７３７７タンパク質及び４８２５０タンパク質は、何れも、ＥＧＦＰと融合したＥＧＦＰ融合タンパク質として、ヒト２９３Ｔ細胞に発現させると、電気泳動にて、アミノ酸配列から予想される以上のサイズを示すバンドが検出されている。それゆえ、３７３７７タンパク質及び４８２５０タンパク質は、各種修飾を受けているとともに、二量体を形成している可能性が高い。
【００３４】
（２）新規細胞外マトリックスタンパク質の機能
図１及び図２に示すように、上記３７３７７タンパク質及び４８２５０タンパク質は、何れも、分泌シグナル配列を有しており、後述の実施例にも示すように、細胞外分泌型のタンパク質（分泌タンパク質）である。また、これら３７３７７タンパク質及び４８２５０タンパク質は、何れも、細胞接着活性及び細胞伸展活性を有しており、特に、３７３７７タンパク質は、４８２５０タンパク質よりも高い細胞伸展活性を有している（後述の実施例参照）。
【００３５】
このように、３７３７７タンパク質及び４８２５０タンパク質は、何れも細胞外に分泌されること、細胞接着活性及び細胞伸展活性を有していることから、細胞外の環境に細胞を接着させる作用を有しており、また、細胞の移動は細胞外タンパク質への接着を必須とすることから、細胞の移動に関わっていると予測される。つまり、３７３７７タンパク質及び４８２５０タンパク質は、何れも、細胞接着因子として機能すると考えられる。
【００３６】
さらに、上記３７３７７タンパク質及び４８２５０タンパク質は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ（試験管反応系）において、他の細胞外マトリックス因子に結合する性質を有している。具体的には、細胞外マトリックス因子のうち、タイプ６コラーゲン、ラミニン１０、及びタイプ１コラーゲンと比較的高い結合性を持つことが示された（後述の実施例参照）。
【００３７】
また、フィブロネクチン、ラミニン、テネイシン、トロンボスポンディン、コラーゲン等、一般的に細胞外マトリックスを形成するタンパク質は二量体を含む多量体を形成する。このような多量体の形成は、これらの分子が細胞外マトリックスに取り込まれるために極めて重要であることが知られており、上述したように、３７３７７タンパク質及び４８２５０タンパク質は、何れも二量体を形成すると予測される。
【００３８】
さらに、３７３７７タンパク質及び４８２５０タンパク質が有するフィブロネクチンタイプ３モジュールは、フィブロネクチン、テネイシンを含む多くの細胞外マトリックス因子に認められる構造として知られている。また、後述の実施例に示すように、３７３７７タンパク質及び４８２５０タンパク質は、細胞外マトリックス因子であるタイプ１コラーゲン、タイプ６コラーゲン、ラミニン１０や、基底膜細胞外マトリックス粗抽出物であるＥＣＭゲル（ラミニン１、タイプ４コラーゲン、ニドゲン、プロテオグリカンを含む）に結合する活性がある。それゆえ、３７３７７タンパク質及び４８２５０タンパク質は、新規な細胞外マトリックスタンパク質であり、何れも細胞外マトリックス因子結合タンパク質と考えられる。
【００３９】
（３）本発明に係るタンパク質、及びその遺伝子の利用方法
上記のように、本発明に係るタンパク質は、本発明者によって初めて明らかにされた新規な細胞外マトリックスタンパク質であり、細胞接着因子及び細胞外マトリックス因子結合タンパク質として機能する。したがって、本発明に係る遺伝子、タンパク質等は以下の有用性を有する。
【００４０】
細胞外マトリックスは、組織を構成する細胞外環境であることから、細胞接着、移動、増殖、分化、形態、又は代謝等の細胞の各種活動に重大な影響を与えるため、生体の受精、発生、成熟、加齢、炎症、創傷治癒、免疫、腫瘍等多くの生体現象と関連することが知られている。また、同様な観点から様々な組織形成を規定する働きを有することも知られており、細胞外マトリックス因子は、細胞・組織の働きを細胞の外側から調節する重要な役割を果たしている。
【００４１】
それゆえ、本発明に係る遺伝子、タンパク質、及びその抗体等は、受精、胚発生、形態形成、さらには細胞外マトリックスの形成異常や代謝異常によって生じる疾患、疾病を研究する上で大変有用な道具となり得る。また、本発明に係る遺伝子、タンパク質等は、細胞外マトリックスの関与する病気の診断薬や、その治療効果を検査するための検査薬として有効に用いることができる。加えて、細胞外マトリックスは、組織形成を規定する細胞外環境であることから、本発明に係る遺伝子、タンパク質等は、再生医学における組織再生や、生体外における人工組織形成に応用可能である。
【００４２】
また、タイプ１コラーゲンの変異は、骨形成異常やＥｈｌｅｒｓ−Ｄａｎｌｏｓ症候群を引き起こすことが知られており、タイプ６コラーゲンの変異は、Ｂｅｈｔｌｅｍ　ｆｏｒｍ　ｏｆ　ａｕｔｏｓｏｍａｌ　ｄｏｍｉｎａｎｔ　ｍｙｏｐａｔｈｙ　ｗｉｔｈ　ｃｏｎｔｒａｃｔｕｒｅｓ　（ＯＭＩＭ　１５８８１０）にローカスしていることが知られている。さらに、タイプ１コラーゲン、タイプ６コラーゲンとも動脈硬化症で発現が強く亢進することが知られている。本発明に係るタンパク質は、上記各タイプのコラーゲンと結合する活性を有していることから、タイプ１・６コラーゲン結合タンパク質としての観点からは、これらタイプのコラーゲンを原因とする疾患の診断、治療へ応用することが可能である。
【００４３】
３７３７７，　４８２５０タンパク質は、上記両コラーゲンのうちタイプ６コラーゲンに特に強く結合する。タイプ６コラーゲンはマイクロフィブリル構成タンパク質として血管壁に多く存在し、動脈硬化症に関わっていることから、本発明の遺伝子、タンパク質等は、当該疾患において、たとえば過剰なタイプ６コラーゲンの蓄積を抑制し、タイプ６コラーゲンの繊維状構造形成を阻害することで、動脈硬化を抑制する治療薬として有用であり、または、その診断に有用であると考えられる。
【００４４】
また、前述したように、細胞外マトリックスの多くは細胞接着、伸展活性を持ち、組織での細胞の接着を支持することにより細胞の形態を規定する物理的作用のほかに、細胞表面レセプターを介して細胞に生存、増殖、分化等細胞の生命活動を支配する細胞内シグナルを伝達する。個々の細胞外マトリックス因子は異なる細胞内シグナルを伝達し、これによって細胞、およびその集合体である組織の形成、機能を緻密に制御している。新たな細胞接着性因子である３７３７７およびそのアイソフォームである４８２５０は、新たな細胞機能制御因子として、これら制御にかかわっていることが十分予測される。
【００４５】
したがって、本発明の遺伝子、タンパク質等は、たとえば生体内において罹患時や術後の組織修復の促進もしくはその制御に有用であると考えられる。
【００４６】
以下では、本発明に係る遺伝子、タンパク質等の具体的な利用方法について説明する。
【００４７】
本発明に係る遺伝子又はその変異遺伝子は、各種ホスト細胞中に導入して、本発明に係る細胞外マトリックスタンパク質又はその変異タンパク質を発現させることができる。導入された本発明に係る遺伝子又は変異遺伝子は、ホスト細胞中でベクターとして存在してもよいし、ホスト細胞のゲノムＤＮＡ中に「外部」ＤＮＡ、又は「付加」ＤＮＡとして含まれてもよい。ここで言う「外部」ＤＮＡとは、ホスト細胞のゲノム中には天然に存在しないが人為的操作の結果、ホスト細胞のゲノム中に挿入されたＤＮＡを意味する。また上記「付加」ＤＮＡとは、特定のホスト細胞のゲノム中に天然に存在するが、人為的操作の結果、さらに追加してホスト細胞のゲノム中に挿入されたＤＮＡを意味する。
【００４８】
上記ベクターの具体的な種類は特に限定されるものではなく、ホスト細胞中で発現可能なベクターを適宜選択すればよい。すなわち、ホスト細胞の種類に応じて、確実に遺伝子を発現させるために適宜プロモーター配列を選択し、これと本発明に係る遺伝子を各種プラスミド等に組み込んだものを発現ベクターとして用いればよい。さらに、上記発現ベクターには、プロモーター配列だけでなくターミネーター配列を含めてもよい。
【００４９】
また、上記遺伝子又は変異遺伝子がホスト細胞に導入されたか否か、さらにはホスト細胞中で確実に発現しているか否かを確認するために、各種マーカーを用いてもよい。例えば、ホスト細胞中で欠失している遺伝子をマーカーとして用い、このマーカーを含むプラスミド等を、本発明に係る遺伝子を含む発現ベクターとともにホスト細胞に導入する。これによってマーカー遺伝子の発現から本発明に係る遺伝子の導入を確認することができる。あるいは、オワンクラゲ由来の緑色蛍光タンパク質ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　Ｐｒｏｔｅｉｎ）をマーカーとして用い、本発明に係る細胞外マトリックスタンパク質のＧＦＰ融合タンパク質を発現させてもよい。
【００５０】
上記ホスト細胞は、特に限定されるものではなく、従来公知の各種細胞を好適に用いることができる。具体的には、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）等の細菌、酵母（出芽酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅや分裂酵母Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ）、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐａｓ　ｌａｅｖｉｓ）の卵母細胞、各種哺乳動物の培養細胞、あるいは昆虫の培養細胞等を挙げることができるが、特に限定されるものではない。
【００５１】
上記発現ベクターをホスト細胞に導入する方法、すなわち形質転換方法も特に限定されるものではなく、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。
【００５２】
前述したように、本発明に係るタンパク質及びその遺伝子は、研究用の各種試薬だけでなく、細胞外マトリックスの関与する病気の診断や治療、治療効果の検査等に用いられる各種薬剤に応用することが可能となる。
【００５３】
本発明に係る遺伝子やタンパク質等の薬剤化については、従来公知の方法を適用することができ、特に限定されるものではない。例えば研究用試薬の場合、本発明に係る遺伝子を形質転換キット化したり、本発明に係る細胞外マトリックスタンパク質を異種発現系で大量生産し精製したりすればよい。
【００５４】
同様に、本発明に係るタンパク質に対する抗体の生産方法も特に限定されるものではなく、例えば、上記３７３７７タンパク質又は４８２５０タンパク質それ自体、又はその部分ペプチドを抗原として、従来公知の方法によりポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体として得ることができる。
【００５５】
また、本発明に係る細胞外マトリックスタンパク質は、細胞接着活性及び細胞伸展活性を有することから、細胞接着用や細胞伸展用の薬剤として使用することができる。本発明に係る細胞接着用薬剤又は細胞伸展用薬剤の具体的な組成は、本発明に係る細胞外マトリックスタンパク質またはその遺伝子が含まれていれば特に限定されるものではない。具体的には、使用対象の細胞の種類に応じて、細胞接着活性及び細胞伸展活性の少なくとも一方が発揮できるような緩衝液等が含まれていればよい。
【００５６】
また、本発明に係る遺伝子の一部配列をプローブやプライマーとして用いることができる。上記一部配列とは、上記３７３７７遺伝子及び４８２５０遺伝子に含まれる特徴的・特異的な配列であればよい。このようにプローブに用いる場合としては、例えば、本発明の遺伝子の一部配列をチップ上に固定してＤＮＡチップ（マイクロアレイを含む）を構成し、当該ＤＮＡチップを各種検査・診断用に用いるような場合が挙げられる。
【００５７】
（４）本発明に係るタンパク質、遺伝子の取得方法
本発明に係る上記３７３７７遺伝子及び４８２５０遺伝子の取得方法は、特に限定されるものではなく、前述の開示された配列情報等に基づいて種々の方法により、上記遺伝子配列を含むＤＮＡ断片を単離し、クローニングすることができる。例えば、上記３７３７７タンパク質又は４８２５０タンパク質をコードするｃＤＮＡの一部配列と特異的にハイブリダイズするプローブを調製し、ヒトやマウスなどのゲノムＤＮＡライブラリーやｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすればよい。このようなプローブとしては、上記３７３７７タンパク質又は４８２５０タンパク質をコードするｃＤＮＡの塩基配列又はその相補配列の少なくとも一部に特異的にハイブリダイズするプローブであれば、いずれの配列・長さのものを用いてもよい。また、上記スクリーニングにおける各ステップについては、通常用いられる条件の下で行えばよい。
【００５８】
上記スクリーニングによって得られたクローンは、制限酵素地図の作成及びその塩基配列決定（シークエンシング）によって、さらに詳しく解析することができる。これらの解析によって、本発明に係る遺伝子配列を含むＤＮＡ断片を取得したか容易に確認することができる。
【００５９】
また、上記プローブの配列を、上記３７３７７タンパク質又は４８２５０タンパク質の機能上重要と考えられる領域（例えば、分泌シグナル配列又はＮ型糖結合領域）の中から選択し、ヒト・マウスやその他の生物のゲノムＤＮＡ（又はｃＤＮＡ）ライブラリーをスクリーニングすれば、上記３７３７７タンパク質又は４８２５０タンパク質と同様の機能を有する相同分子や類縁分子をコードする遺伝子を単離しクローニングできる可能性が高い。
【００６０】
本発明に係る遺伝子（ポリヌクレオチド）を取得する方法は、上記スクリーニング法以外にも、ＰＣＲ等の増幅手段を用いる方法がある。例えば、上記３７３７７タンパク質及び４８２５０タンパク質のｃＤＮＡ配列のうち、５’側及び３’側の非翻訳領域の配列（又はその相補配列）の中からそれぞれプライマーを調製し、これらプライマーを用いてヒト・マウスなどのゲノムＤＮＡ（又はｃＤＮＡ）等を鋳型にしてＰＣＲ等を行い、両プライマー間に挟まれるＤＮＡ領域を増幅することで、本発明のポリヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を大量に取得できる。
【００６１】
本発明に係るタンパク質を取得する方法についても、特に限定されるものではなく、例えば、上述のようにして取得された遺伝子（上記３７３７７タンパク質又は４８２５０タンパク質、あるいはその相同分子等をコードするｃＤＮＡ等）を導入した組換え発現ベクターを作製し、周知の方法により大腸菌や酵母等の微生物又は動物細胞などに組み入れて形質転換体として、そのｃＤＮＡがコードするタンパク質を発現させ精製することで、上記３７３７７タンパク質又は４８２５０タンパク質等の本発明に係るタンパク質を容易に取得することができる。
【００６２】
上記３７３７７タンパク質又は４８２５０タンパク質の変異タンパク質を作製する方法についても、特に限定されるものではなく、例えば、部位特異的突然変異誘発法（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ−Ｇｏｔｏｈ，　Ｇｅｎｅ　１５２，２７１−２７５（１９９５）他）、ＰＣＲ法等を利用して塩基配列に点変異を導入し変異タンパク質を作製する方法、あるいはトランスポゾンの挿入による突然変異株作製法などの周知の変異タンパク質作製法を用いて、上述のようにして取得された遺伝子の塩基配列において、１又はそれ以上の塩基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されるように改変を加えることによって作製することができる。また、変異タンパク質の作製には、市販のキットを利用してもよい。
【００６３】
【実施例】
以下の実施例では、本発明にかかる３７３７７遺伝子及び４８２５０遺伝子をマウスから取得した具体的な方法、及び本発明にかかる３７３７７タンパク質及び４８２５０タンパク質の物性を調べた結果について、図１〜図６に基づいて、順番に説明する。
【００６４】
〔実施例１：ｃＤＮＡライブラリーの作製〕
（１）ｍＲＮＡの調製
マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）各器官又は組織０．５ｇ〜１ｇを１０ｍｌの懸濁液でホモジェナイズし、２Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）１ｍｌと、同量のフェノール／クロロホルム（体積比５：１）混合液を加え抽出した。抽出後水層に同量のイソプロパノールを加えて、ＲＮＡを水相から分離沈澱させた。この試料を氷の上で１時間インキュベーションした後、４，０００ｒｐｍ、１５分間の条件で冷却遠心機にかけ、沈澱物を回収した。得られた沈殿物を７０％エタノールで洗い、水８ｍｌに溶解後、２ｍｌの５ＭＮａＣｌ、１％ＣＴＡＢ（ｃｅｔｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌ　ａｍｍｏｎｉｕｍ　ｂｒｏｍｉｄｅ）、４Ｍ尿素、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓを含むｐＨ７．０の水溶液１６ｍｌを加えてＲＮＡを沈澱させ、ポリサッカライドを除いた（ＣＴＡＢ沈澱）。
【００６５】
続いて、室温で４，０００ｒｐｍ、１５分間の条件で遠心機にかけ、ＲＮＡを４ｍｌの７Ｍグアニジン−Ｃ１に溶解した。そして２倍量のエタノールを加えた後、氷上で１時間インキュベーションし、４，０００ｒｐｍ、１５分間の条件で遠心機にかけ、生じた沈澱物を７０％エタノールで洗いＲＮＡを回収した、これを再度水に溶解し、ＲＮＡの純度をＯＤ比２６０／２８０（＞１．８）と２３０／２６０（＜０．４５）を読むことによって計測した。
【００６６】
（２）第１鎖ｃＤＮＡの調製
調製した上記ｍＲＮＡ１５μｇを用いて、逆転写酵素３，０００ｕｎｉｔにより、最終容量１６５μｌの反応液中で、５−メチル−ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰを各々０．５４ｍＭ、０．６Ｍトレハロース、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、７５ｍＭＫＣｌ、３ｍＭＭｇＣｌ２、１０ｍＭＤＴＴ、５２ｎｇ／μｌＢＳＡ、ＲＮａｓｅインヒビター５ｕｎｉｔの条件下で逆転写反応を行った。
【００６７】
尚、プライマーとしては、次に示す制限酵素ＸｈｏＩの認識配列を含むオリゴヌクレオチド１ｓｔ　ＢＳ（配列中、ＶはＡ，Ｇ又はＣを示し、ＮはＡ，Ｇ，Ｃ又はＴを示す）を１２．６μｌ用いた。
【００６８】
５’−ＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＡＧＧＡＴＣＣＡＡＧＡＧＣＴＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＶＮ−３’（配列番号５）
上記逆転写反応を始める際、反応液の１／４を採取し、それに１．５μｌの［α−３２Ｐ］−ｄＧＴＰ（３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ、１０μＣｉ／μｌ；Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を加えることにより、第１鎖ｃＤＮＡの合成効率を測定した。ＲＩ標識した反応液の０．５μｌをＤＥ−８１ペーパー上にスポットし、０．５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で３回洗った前後のＲＩ活性を測定し、計算した。その後、ＲＩ標識した反応液と非標識の反応液を混合し、０．５ＭＥＤＴＡ８μｌ、１０％ＳＤＳ２μｌ、プロテイナーゼ（Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）Ｋ２０μｇを加え、４５℃で１５分間加熱した。フェノール／クロロホルムによる抽出、エタノール沈澱後、沈澱をＲＮａｓｅフリーに処理してある水（以下ＲＮａｓｅフリー水とする）４７μｌに溶解した。
【００６９】
（３）５’キャップ構造及び３’末端へのビオチン付加
ＲＮＡジオールのビオチン化ＲＮＡのジオール部位（Ｃａｐ構造のある５’末端と、ポリＡ鎖のある３’末端のリボースの双方に存在）にビオチンを結合させるために、２段階の反応を行った。この２段階の反応は、それぞれ、ジオール基の酸化とそれに続くビオチンヒドラジトと酸化ＲＮＡ体のカップリング反応である。まず、逆転写反応で得られたＲＮＡ−第１鎖ｃＤＮＡ複合体１５μｇを、６．６ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）と、酸化剤として過ヨウ素酸ナトリウムを用いて５０μｌの反応液中で処理した。この酸化反応は遮光条件の下、氷上で４５分間行った。
【００７０】
続いて、５Ｍ塩化ナトリウム１１μｌ、１０％ＳＤＳ０．５μｌ、そして同量のイソプロパノールを加え、６０分間氷上に放置した後、４℃で１５分間１５，０００ｒｐｍ遠心し沈澱を取得した。沈澱物は７０％エタノールで洗い、ＲＮａｓｅフリー水５０μｌに再溶解させた。その試料に１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ６．１）５μｌ、１０％ＳＤＳ５μｌ、１０ｍＭビオチンヒドラジド（Ｓｉｇｍａ社製）１５０μｌを加え、室温（２２〜２６℃）で終夜反応させた。最後に、５μｌの５ＭＮａＣｌ、１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ６．１）７５μｌ、及び２．５倍量のエタノールを加え、１時間の氷上冷却後、４℃において１５分間遠心し、ビオチン化した。反応後、反応液を１５分間遠心し、再度ＲＮＡ−ＤＮＡ複合体を沈澱させた。沈澱物は７０％エタノールで１回、更に８０％エタノールで１回洗い、ＲＮａｓｅフリー水７０μｌに溶解した。
【００７１】
（４）ＲＮａｓｅＩによる完全長ｃＤＮＡの選択
上記のようにして得られたビオチン化ＲＮＡ−ＤＮＡ複合体について、１本鎖ＲＮＡを消化するＲＮａｓｅＩで処理することにより、逆転写反応時に完全なｃＤＮＡの伸長が得られなかったｍＲＮＡ、及びｍＲＮＡの３’末端に標識されたビオチン残基を取り除いた。具体的には、上記ビオチン化ＲＮＡ−ＤＮＡ複合体の試料７０μｌに、１０×ＲＮａｓｅＩバッファー（１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５０ｍＭＥＤＴＡ、２ＭＮａＯＡｃ）１０μｌ、ＲＮａｓｅＩ（ＲＮａｓｅ　ＯｎｅＴＭ；Ｐｒｏｍｅｇａ社製）２００ｕｎｉｔを加えて、３７℃で１５分間処理することで１本鎖ＲＮＡを消化した。
【００７２】
（５）完全長ｃＤＮＡの採取
ストレプトアビジンをコートしたマグネティックビーズにｃＤＮＡが非特異的吸着するのを防止するため、１００μｇの酵母ｔＲＮＡ（ＤＮａｓｅＩ処理したもの）を５ｍｇ（５００μｌ）のマグネティックビーズ（ｍａｇｎｅｔｉｃ　ｐｏｒｏｕｓ　ｇｌａｓｓ（ＭＰＧ）ｐａｒｔｉｃｌｅｓ　ｃｏａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（ＣＰＧ，ＮＪ））に加え、１時間氷上に放置した後、５０ｍＭＥＤＴＡ、２ＭＮａＣｌの溶液にて洗った。
【００７３】
上記ビーズを５０ｍＭＥＤＴＡ、２ＭＮａＣｌの溶液５００μｌ中に懸濁し、上記（４）で取得したＲＮａｓｅＩ処理されたｃＤＮＡを加えた。室温にて３０分間撹拌することで、マグネティックビーズと完全長ｃＤＮＡを結合させた。
【００７４】
完全長ｃＤＮＡを捕獲したビーズを５０ｍＭＥＤＴＡ、２ＭＮａＣｌの溶液で４回、０．４％ＳＤＳ、５０μｇ／μｌ酵母ｔＲＮＡで１回、１０ｍＭＮａＣｌ、０．２ｍＭＥＤＴＡ、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２０％グリセロールで１回、５０μｇ／μｌ酵母ｔＲＮＡ水溶液で１回、ＲＮａｓｅＨバッファー（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭＭｇＣｌ２、２０ｍＭＫＣｌ、０．１ｍＭＥＤＴＡ、０．１ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）で１回洗浄した後、ＲＮａｓｅＨ用バッファー１００μｌに懸濁し、ＲＮａｓｅＨ３ｕｎｉｔを加え、３７℃で３０分間加温した。その後、１０％ＳＤＳ１μｌ、０．５ＭＥＤＴＡ２μｌを加えて、１０分間、６５℃に曝し、その上清を回収した。
【００７５】
回収した上清（１本鎖完全長ｃＤＮＡを含む）はフェノール／クロロホルムで抽出し、スピードバッグにて液量を１００μｌ以下に減じてからＧ２５／Ｇ１００　Ｓｅｐｈａｄｅｘクロマトグラフィーに付した。ＲＩ活性を持った分画はシリコン処理したマイクロチューブに収集するとともに、グリコーゲン２μｇを加え、エタノール沈澱にて得られた沈澱物を３０μｌの超純水に溶解した。
【００７６】
（６）１本鎖ｃＤＮＡへのオリゴｄＧ付加
回収した１本鎖ｃＤＮＡ３０μｌを、最終容量５０μｌの反応液中で、２００ｍＭカコジル酸ナトリウム（ｐＨ６．９）、１ｍＭＭｇＣｌ２、１ｍＭＣｏＣｌ２、１ｍＭ２−メルカプトエタノール、１００μＭｄＧＴＰの条件のもと、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（宝酒造社製）３２ｕｎｉｔを用いて３７℃で３０分間のオリゴｄＧ付加反応に付した。反応終了時にＥＤＴＡを５０ｍＭとなるように加え、一連のフェノール／クロロホルムによる抽出、エタノール沈澱を経て、３１μｌの超純水に溶解した。
【００７７】
（７）第２鎖ｃＤＮＡ合成
第１鎖ｃＤＮＡを鋳型にした第２鎖ｃＤＮＡの合成は以下のように行った。最終容量６０μｌの反応系で、第２鎖低バッファー（２００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．７５）、１００ｍＭＫＣｌ、１００ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、２０ｍＭＭｇＳＯ４、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１ｍｇ／μｌＢＳＡ）３μｌ、第２鎖高バッファー（２００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．２）、６００ｍＭＫＣｌ、２０ｍＭＭｇＣｌ２）３μｌ、ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ各々０．２５ｍＭ、β−ＮＡＤＨ６μｌ、オリゴｄＧ付加された第１鎖ｃＤＮＡ３１μｌ、第２鎖プライマー−アダプター６００ｎｇを加え、Ｅｘ　ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ　Ｅｘ　Ｔａｑ；宝酒造社製）１５ｕｎｉｔ、耐熱性ＤＮＡリガーゼ（Ａｍｐｌｉｇａｓｅ；Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ社製）１５０ｕｎｉｔ、耐熱性ＲＮａｓｅＨ（Ｈｙｂｒｉｄａｓｅ；Ｅｐｉｃｅｎｔｅｒｅ社製）３ｕｎｉｔによって第２鎖ｃＤＮＡを合成した。
【００７８】
尚、第２鎖プライマー−アダプターとしては、次に示す２ｎｄ−Ｘプライマーを用いた。
【００７９】
ＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＴＴＣＴＣＧＡＧＴＴＡＡＴＴＡＡＡＴＴＡＡＴＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣ　（配列番号６）
０．５ＭＥＤＴＡを１μｌ加えることで反応を停止させ、さらにタンパク質成分を分解するために、１０％ＳＤＳ１μｌ、プロテイナーゼ（Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）Ｋ１０μｇの存在下に４５℃で１５分間加熱し、最終的にフェノール／クロロホルムによる抽出、エタノール沈澱にて精製した２本鎖完全長ｃＤＮＡを得た。
【００８０】
（８）ライブラリーの調製
ＭｏｂｉＴｅｃ社製のλＰＳベクターをｃＤＮＡ用に改変してλＰＳ（ＲＩＫＥＮ）ベクター：λ−ＦＬＣ−１ベクターを作製し、これにｃＤＮＡを挿入してｃＤＮＡライブラリーを調製した（特開２０００−３２５０８０号公報参照）。
【００８１】
〔実施例２：新規細胞外マトリックス遺伝子の選別〕
上記作製方法により得られた１０　ｄａｙｓ　ｎｅｏｎａｔｅ　ｃｏｒｔｅｘ由来ｃＤＮＡライブラリーに含まれるｃＤＮＡの塩基配列を決定した。この中から分泌シグナル配列と予想される配列を含むｃＤＮＡとして、３７３７７遺伝子を選択した。
【００８２】
また、マウス胎生１２日ｓｐｉｎａｌ　ｇａｎｇｌｉｏｎ由来ｃＤＮＡライブラリーに含まれるｃＤＮＡの塩基配列を決定した。この中から分泌シグナル配列と予想される配列を含むｃＤＮＡとして４８２５０遺伝子を選択した。
【００８３】
具体的には、ｃＤＮＡライブラリーの各クラスタからひとつの代表クローンを選択した。代表クローンはＱ−ｂｏｔ（ＧＥＮＥＴＩＸ　ＬＩＭＩＴＥＤ製）で選択し、３８４穴プレートにアレイ化した。このとき、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は３０℃で１８〜２４時間、５０μｌのＬＢ培地で培養した。このとき、ＬＢ培地には、１００ｍｇ／ｍｌのアンピシリン及び５０ｍｇ／ｍｌのカナマイシンを添加した。
【００８４】
培養した各クローンを、さらに１００ｍｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１．３ｍｌのＨＴ液中で培養し、遠心分離により大腸菌を回収した後、ＱＩＡｐｒｅｐ　９６　Ｔｕｒｐｏ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてプラスミドＤＮＡを回収、精製した。取得されたプラスミド中に挿入されているｃＤＮＡの鎖長を調べるために、上記で取得したプラスミドＤＮＡの１／３０を制限酵素ＰｖｕＩＩで消化し、１％のアガロースゲル電気泳動を行った。
【００８５】
得られたプラスミド中に挿入された完全長ｃＤＮＡの全長の塩基配列解析には、３種類のシークエンサを用いた。また、プラスミドは挿入配列の長さが２．５ｋｂより短いものと長いものの２つのカテゴリに分けた。このうち２．５ｋｂより短い挿入配列を有するクローンについては両端から塩基配列を解析した。
【００８６】
このとき、次に示すセンス鎖のプライマーと、アンチセンス鎖のプライマーを用いて、Ｔｈｅｒｍｏｓｅｑｕｅｎａｓｅ　Ｐｒｉｍｅｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）で反応させ、Ｌｉｃｏｒ　ＤＮＡ４２００（ｌｏｎｇ　ｒｅａｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ）を用いて解析した。
【００８７】
ＣＡＣＧＡＣＧＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣ（センス鎖・配列番号７）
ＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧ（アンチセンス鎖・配列番号８）
上記塩基配列解析により解析ができなかったギャップは、プライマウォーキング法により決定した。その際、ＡＢＩ　Ｐｒｉｓｍ　３７７及び／又はＡＢＩ　Ｐｒｉｓｍ　３７００（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｉｎｃ．製）、ＢｉｇＤｙｅ　ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　ｋｉｔ、及びＣｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ＦＳ　ｒｅａｄｅｙ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｉｎｃ．製）を用いた。
【００８８】
また、挿入されているｃＤＮＡが２．５ｋｂより長いクローンの配列決定は、ショットガン法によって実施した。このとき、Ｓｈｉｍａｄｚｕ　ＲＩＳＡ　３８４、及びＤＹＥｎａｍｉｃ　ＥＴ　ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　ｃｙｃｌｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用いた。ショットガンライブラリを作製するために、４８の独立な代表クローンからＰＣＲで増殖した４８のＤＮＡフラグメントを用いた。増幅されたＤＮＡ断片の末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼによって平滑化した。
【００８９】
上記ＤＮＡ断片をｐＵＣ１８ベクターへ挿入して組み換えベクターを作製し、この組み換えベクターを用いて、大腸菌ＤＨ１０Ｂを形質転換した。この大腸菌から、上記代表クローンのアレイ化と同様にしてプラスミドを調製した。
【００９０】
各代表クローンについては、両末端からの塩基配列解析によって塩基配列を決定し、該塩基配列をコンピューター上で連結した後、Ｄｏｕｂｌｅ　Ｓｔｒｏｋｅ　Ｓｈｅａｒｉｎｇ　Ｄｅｖｉｃｅ（Ｆｉｏｒｅ　Ｉｎｃ．製）によるｓｈｅａｒｉｎｇを行った。ショットガン法による塩基配列決定は、１２〜１５クローンの重複をもって行った。この塩基配列決定により配列が決定できなかったギャップは、上記と同様にプライマウォーキングによって決定した。
【００９１】
その結果、配列番号１、並びに配列番号３に示すように、上記３７３７７遺伝子のｃＤＮＡは３２９個、４８２５０遺伝子のｃＤＮＡは３５９個のアミノ酸をコードしていると考えられた。
【００９２】
また、上記３７３７７遺伝子及び４８２５０遺伝子配列からアミノ酸配列を予測すると、図１〜３に示すように、３７３７７遺伝子及び４８２５０遺伝子にコードされるタンパク質（すなわち、３７３７７タンパク質及び４８２５０タンパク質）は、何れも、分泌シグナルのほか、１つのフィブロネクチンタイプ３モチーフ、４つの糖鎖結合部位、１つの疎水性アミノ酸に富んだ領域を有していることが分かった。また、図３に示すように、これらタンパク質の一次構造を比較すると、カルボキシ末端（Ｃ末端）を除く領域では、１００％の相同性が認められた。これに対して、Ｃ末端側ではほとんど相同性が認められなかった。それゆえ、３７３７７タンパク質及び４８２５０タンパク質は、カルボキシ末端部位の異なるアイソフォームであると推定された。
【００９３】
さらに、図３に示すように、３７３７７タンパク質及び４８２５０タンパク質ともに、その一次構造は、ヒトの機能未知ｃＤＮＡであるＦＬＪ２１５５１遺伝子の塩基配列から予測されるアミノ酸配列と高い相同性を示した。特に、４８２５０タンパク質は、３７３７７タンパク質よりもその相同性は高かった。しかしながら、Ｃ末端領域では殆ど相同性が認められなかった。それゆえ、４８２５９タンパク質とＦＬＪ２１５５１遺伝子にコードされるタンパク質も互いにアイソフォームであると予測された。尚、ＦＬＪ２１５５１遺伝子以外に相同性の高いｃＤＮＡは報告されていない。
【００９４】
〔実施例３：新規細胞外マトリックスタンパク質の発現〕
上記実施例２で単離された上記３７３７７遺伝子又は４８２５０遺伝子において、３７３７７タンパク質又は４８２５０タンパク質をコードするｃＤＮＡ領域を以下の（１）〜（４）のプライマーを用いてＰＣＲにより増幅した。
【００９５】
（１）３７３７７フォワードプライマー
ｃＤＮＡの翻訳開始コドンＡＴＧを含む３８から５８番目の塩基配列（配列番号１参照）と、発現ベクターに組込むためにＥｃｏＲＩサイトをその５’側に配したプライマーを作製し、３７３７７フォワードプライマーとした。
【００９６】
５’−ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＧＧＣＡＡＣＡＴＧＣＴＣＴＣＣＡＧＣＣＴＧＧ−３’（配列番号９）
（２）３７３７７リバースプライマー
ｃＤＮＡの１０５４番目から１０８３番目の塩基配列（配列番号１参照）を含み、発現ベクターに組込むためにＮｏｔＩサイトをその３’側に配したプライマーを作製し、３７３７７リバースプライマーとした。
【００９７】
５’−ＴＴＴＴＣＣＴＴＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＡＧＣＴＣＡＣＴＣＡＣＴＡＴＴＴＧＡＡＡＡＡＡＴＧＴＴＴＣ−３’（配列番号１０）
（３）４８２５０フォワードプライマー：ｃＤＮＡの翻訳開始コドンＡＴＧを含む３４から５４番目の塩基配列（配列番号３参照）と、発現ベクターに組込むためにＥｃｏＲＩサイトをその５’側に配したプライマーを作製し、４８２５０フォワードプライマーとした。
【００９８】
５’−ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＧＧＣＡＡＣＡＴＧＣＴＣＴＣＣＡＧＣＣＴＧＧ−３’（配列番号１１）
（４）４８２５０リバースプライマー
ｃＤＮＡの１０２８番目から１１５１番目の塩基配列（配列番号３参照）を含み、発現ベクターに組込むためにＮｏｔＩサイトをその３’側に配したプライマーを作製し、４８２５０リバースプライマーとした。
【００９９】
５’−ＴＴＴＴＣＣＴＴＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＴＧＣＴＧＴＴＣＴＡＴＴＧＴＴＧＧＧＧＧＡＧＧ−３’（配列番号１２）
得られた増幅産物をＥｃｏＲＩとＮｏｔＩで消化した。その後、熱処理により制限酵素を失活させた後、増幅されたｃＤＮＡをプラスミドｐＥＧＦＰ−Ｎ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）のＥｃｏＲＩとＰｓｐＯＭＩの間に挿入して、３７３７７−ＥＧＦＰ融合タンパク質を発現するベクター（３７３７７発現ベクター）、及び４８２５０−ＥＧＦＰ融合タンパク質を発現するベクター（４８２５０発現ベクター）を作製した。
【０１００】
そして、上記各発現ベクターを用いて、大腸菌Ｏｎｅ　Ｓｈｏｔ　ＴＯＰ１０　Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ　ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を形質転換した。その後、形質転換した大腸菌を増殖し、上記発現ベクターを調製・精製した。得られた発現ベクターを遺伝子導入試薬ＦｕＧｅｎｅ６（ロッシュ社製）を用いて、ヒト２９３Ｔ細胞に導入した。
【０１０１】
発現ベクターを導入したヒト２９３Ｔ細胞の培養上清を得て、この培養上清に含まれる３７３７７−ＥＧＦＰ融合タンパク質及び４８２５０−ＥＧＦＰ融合タンパク質を、５％〜２０％濃度勾配ポリアクリルアミドゲルにて電気泳動した。その後、ナイロンメンブレンに転写して、抗ＧＦＰモノクローナル抗体Ｂ２（サンタクルーズ社製）によりウェスタンブロットを行い、３７３７７−ＥＧＦＰ融合タンパク質及び４８２５０−ＥＧＦＰ融合タンパク質を検出した。これによって、３７３７７タンパク質及び４８２５０タンパク質の発現を解析した。
【０１０２】
その結果、図４（ａ）・（ｂ）に示すように、両融合タンパク質とも培養上清中に検出されたことから、いずれも細胞外分泌タンパク質であることが分かった。また、図４（ａ）に示すように、３７３７７−ＥＧＦＰ融合タンパク質では、主に約７５ｋＤａ及び約１５０ｋＤａの二つの産物が検出された。予想サイズは約７０ｋＤａであることから、Ｎ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎなどの修飾を受けていること、また二量体を形成していると考えられた。
【０１０３】
同様に、図４（ｂ）に示すように、４８２５０−ＥＧＦＰ融合タンパク質では、約８０ｋＤａ及び約１６０ｋＤａの２つの産物が検出され、約１６０ｋＤａのものが主であった。予想サイズは約７５ｋＤａであることから、３７３７７タンパク質と同様に、Ｎ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎなどの修飾を受けていること、また二量体を形成していると考えられた。
【０１０４】
〔実施例４：新規タンパク質の細胞接着活性と細胞伸展活性〕
上記実施例３で作製した３７３７７発現ベクター又は４８２５０発現ベクターを導入したヒト２９３Ｔ細胞を培養し、その培養上清（３７３７７−ＥＧＦＰ融合タンパク質又は４８２５０−ＥＧＦＰ融合タンパク質を含む）を、ウサギ抗ＧＦＰポリクローナル抗体を結合させた９６穴プレートに加え、一晩、インキュベートした。その後、この９６穴プレートをＰＢＳで洗った後、１％ウシ血清アルブミンで１時間ブロッキングした。さらに、ヒト骨肉腫細胞ＭＧ６３を上記９６穴プレートに加え、３７℃で１時間インキュベートし、ＰＢＳで２回洗った。２％ホルマリンで固定後、ディフクイック（和光純薬工業社製）で染色した。
【０１０５】
その結果、図５（ａ）に示すように、３７３７７−ＥＧＦＰ融合タンパク質では、ＭＧ６３細胞は接着、伸展した。一方、図５（ｂ）に示すように、４８２５０−ＥＦＧＰ融合タンパク質における細胞接着活性及び細胞伸展活性は、３７３７７−ＥＧＦＰ融合タンパク質と比較して弱かった。図５（ｃ）に示すように、コントロールとして用いた分泌型ＥＧＦＰタンパク質では、細胞伸展活性は認められなかった。このことから特に３７３７７−ＥＧＦＰタンパク質は、細胞伸展活性を示す新規細胞外マトリックスタンパク質であることが分かった。
【０１０６】
〔実施例５：他の細胞外マトリックス因子との結合性〕
さらに、他の細胞外マトリックス因子との結合性を調べるため、以下の実験を行った。
【０１０７】
９６穴プレートにタイプ１コラーゲン、タイプ６コラーゲン、ラミニン１０を含む各種細胞外マトリックス因子溶液を加え室温で２時間インキュベートした。その後、これら溶液を除き、室温で一晩４℃静置し、乾燥させた。
【０１０８】
上記９６穴プレートをＰＢＳで洗った後、前記実施例３で作製した３７３７７発現ベクター又は４８２５０発現ベクターを導入したヒト２９３Ｔ細胞を培養し、その培養上清（３７３７７−ＥＧＦＰ融合タンパク質又は４８２５０−ＥＧＦＰ融合タンパク質を含む）を加え、さらに４℃一晩インキュベートした。
【０１０９】
その後、上記９６穴プレートをＰＢＳで４回洗った後、この９６穴プレートに残ったＥＧＦＰ融合タンパク質におけるＥＧＦＰタンパク質による蛍光を、蛍光イメージアナライザーにより測定した。このとき、コントロールとして用いた分泌型ＥＧＦＰタンパク質の蛍光強度を差し引いた値を比較した。
【０１１０】
その結果、図６（ａ）に示すように、３７３７７−ＥＧＦＰ融合タンパク質は、タイプ６コラーゲン、ＥＣＭゲル（シグマ社製）、ラミニン１０、タイプ１コラーゲンの順で高い蛍光値を示した。
【０１１１】
図６（ｂ）に示すように、４８２５０−ＥＧＦＰタンパク質も同様な傾向を示し、ラミニン１０，タイプ６コラーゲン、タイプ１コラーゲンの順で高い蛍光値を示した（ＥＣＭゲルに対する結合活性は測定していない）。これらの結果から、３７３７７タンパク質及び４８２５０タンパク質とも、他の細胞外マトリックスと比較してタイプ６コラーゲン、ラミニン１０、タイプ１コラーゲンに相互作用する細胞外マトリックス因子であることが分かった。
【０１１２】
【発明の効果】
以上のように、本発明は新規な細胞外マトリックス因子に関するものであり、細胞外マトリックスの機能解析等の研究に利用できるばかりでなく、細胞外マトリックスの形成異常や代謝異常によって生じる疾患、疾病の診断薬、治療薬、治療効果を検査するための検査薬、またはこれら薬剤の開発に有効利用できるものである。加えて、細胞外マトリックスは、組織形成を規定する細胞外環境であることから、本発明に係るタンパク質及びその遺伝子等は、再生医学における組織再生や、生体外における人工組織形成に利用できるものである。
【０１１３】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に係る３７３７７タンパク質のアミノ酸配列を示す配列図である。
【図２】本発明に係る３７３７７タンパク質及び４８２５０タンパク質の一次構造を示す模式図である。
【図３】本発明に係る３７３７７タンパク質及び４８２５０タンパク質と、ＦＬＪ２１５５１タンパク質とのアミノ酸配列とを比較した図である。
【図４】（ａ）・（ｂ）は、それぞれ、実施例において、３７３７７−ＥＧＦＰ融合タンパク質及び４８２５０−ＥＧＦＰ融合タンパク質の発現と細胞外分泌を調べたウェスタンブロットの結果を示す画像である。
【図５】（ａ）〜（ｃ）は、実施例において、３７３７７−ＥＧＦＰ融合タンパク質及び４８２５０−ＥＧＦＰ融合タンパク質の細胞接着活性及び細胞伸展活性を調べた結果を示す画像であり、（ａ）は３７３７７−ＥＧＦＰ融合タンパク質の結果を、（ｂ）は４８２５０−ＥＧＦＰ融合タンパク質の結果を、（ｃ）はコントロールの分泌型ＥＧＦＰタンパク質の結果を示す。
【図６】（ａ）・（ｂ）は、それぞれ、実施例において、３７３７７−ＥＧＦＰ融合タンパク質及び４８２５０−ＥＧＦＰ融合タンパク質の各種細胞外マトリックス分子への結合を示すヒストグラムである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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