【手続補正書】
【提出日】平成26年11月6日(2014.11.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）第一の標的に結合するための非天然配列を有する結合ループを中に有するノッチンポリペプチドと、
（ｂ）第二の標的に結合するための配列を中に有する第二ポリペプチドであって、（i
）該第二の標的に結合する細胞表面受容体か又は（ii）該第二の標的に結合する細胞表面受容体リガンドである第二ポリペプチドと、
を含む、融合タンパク質。
【請求項２】
前記ノッチンポリペプチドが、ＥＥＴＩ−ＩＩ、ＡｇＲＰ又はアガトキシンのいずれか１つである、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
前記ノッチンポリペプチドがω−コノトキシンである、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
前記非天然配列が、細胞とそれを取り囲む組織との間の接着を媒介する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
前記ノッチンポリペプチドが、（ａ）αｖβ３インテグリン、（ｂ）αｖβ５インテグリン、及び（ｃ）α５β１インテグリンのうちの１又は２以上との結合を媒介する配列を含有する、請求項４に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
前記第二ポリペプチドが、受容体型チロシンキナーゼの細胞外ドメインであるか、又は抗体のＦｃ部分である、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
前記第二ポリペプチドが、受容体型チロシンキナーゼのＩｇ１ドメインである、請求項６に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
前記Ｉｇ１ドメインが、Ａｘｌ受容体、ＭｕＳＫ受容体、又はＦＧＦ受容体に由来する、請求項６に記載の融合タンパク質。  
【請求項９】
前記ノッチンポリペプチドが、ＥＥＴＩ−ＩＩ、ＡｇＲＰ及びアガトキシンからなる群より選択される、請求項６又は８に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
前記結合ループが、（ａ）αｖβ３インテグリン、（ｂ）αｖβ５インテグリン、及び（ｃ）α５β１インテグリンのうちの１又は２以上と結合するように操作されている、請求項９に記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
（ａ）インテグリンに対して高い親和性を有する結合ループを含む、ＥＥＴＩ−ＩＩ又はＡｇＲＰノッチンポリペプチドと、
（ｂ）（i）Ａｘｌ細胞外ドメイン、（ii）肝細胞増殖因子のＮＫ１断片、及び（iii）タンパク質の受容体結合部分からなる群より選択されるポリペプチドと、
を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
（ａ）ＤＮＡ構築物内に前記融合タンパク質と多数のランダム化ＤＮＡ配列とをコードする多数のＤＮＡ構築物を有するライブラリーを調製する工程と、
（ｂ）該ライブラリーの該ＤＮＡ構築物を酵母で発現させ、発現したＤＮＡ構築物が該酵母表面上にランダム化配列を有するポリペプチドとして提示される工程と、
（ｃ）それらクローンを標的と接触させることによって、該発現したＤＮＡ構築物と前記第一の標的又は前記第二の標的との結合について該クローンをスクリーニングする工程と、
（ｄ）該標的と高い親和性で結合する翻訳されたＤＮＡ構築物を発現するクローンを選択する工程と、
（ｅ）該選択されたクローンのコード配列を得ることによって、前記融合タンパク質を調製することができる工程と、
を具える、請求項１に記載の融合タンパク質を調製する方法。
【請求項１３】
前記ノッチンが、ＥＥＴＩ−ＩＩ、ＡｇＲＰ、アガトキシン又はコノトキシンのうちの１つである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記第二ポリペプチドが、受容体断片及びリガンド断片からなる群より選択される、請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記第二ポリペプチドが、チロシンキナーゼ受容体断片である、請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記第二ポリペプチドが、増殖因子断片である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記第二ポリペプチドが、Ａｘｌ、ｃ−Ｍｅｔ、ＨＧＦ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ受容体、及びＧａｓ６からなる群より選択されるポリペプチドを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記ノッチンポリペプチドがＥＥＴＩ−ＩＩである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記ノッチンが、インテグリンに結合するように操作されている、請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
前記インテグリンが、（ａ）αｖβ３インテグリン、（ｂ）αｖβ５インテグリン、及び（ｃ）α５β１インテグリンのうちの少なくとも１つである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ノッチンが、ループ１及びループ３が操作されたＥＥＴＩ−ＩＩである、請求項１３に記載の方法。
【請求項２２】
(ａ)（i）阻害される受容体の細胞外ドメインをコードするポリペプチドと、（ii）該阻害される受容体でない細胞表面受容体に結合するように操作されたループドメインを有するノッチンポリペプチドと、を含む一定量の可溶性融合タンパク質を投与する工程を具える、受容体に対するリガンドの結合を阻害する方法。
【請求項２３】
前記細胞表面受容体がインテグリンである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記阻害される受容体が受容体型チロシンキナーゼである、請求項１９又は２０に記載の方法。
【請求項２５】
前記チロシンキナーゼがＴＡＭ受容体型チロシンキナーゼである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記第二ポリペプチドが、抗体のＦｃ部分である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２７】
前記ノッチンがＥＥＴＩ−ＩＩであり、前記結合ループが、（ａ）αｖβ３インテグリン、（ｂ）αｖβ５インテグリン、及び（ｃ）α５β１インテグリンのうちの１又は２以上と結合するように操作されている、請求項９に記載の融合タンパク質。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
本発明の特定の態様は、（ａ）ＤＮＡ構築物内に前記融合タンパク質及び多数のランダム化ＤＮＡ配列をコードする多数のＤＮＡ構築物を有するライブラリーを調製する工程と、（ｂ）該ライブラリーの該ＤＮＡ構築物を酵母で発現させ、発現したＤＮＡ構築物が該酵母表面上にランダム化配列を有するポリペプチドとして提示される工程と、（ｃ）それらクローンを標的と接触させることによって、該発現したＤＮＡ構築物と前記第一の標的又は前記第二の標的との結合について該クローンをスクリーニングする工程と、（ｄ）該標的と高い親和性で結合する翻訳されたＤＮＡ構築物を発現するクローンを選択する工程と、（ｅ）該選択されたクローンのコード配列を得ることによって、前記融合タンパク質を調製することができる工程と、を具える、前記融合タンパク質を調製する方法を含む。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
本発明の特定の態様は、(ａ)（i）阻害される受容体の細胞外ドメインをコードするポリペプチドと、（ii）該阻害される受容体でない細胞表面受容体に結合するように操作されたループドメインを有するノッチンポリペプチドと、を含む一定量の可溶性融合タンパク質を投与する工程を具える、受容体に対するリガンドの結合を阻害する方法を含む。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
特定の態様において、本発明は、融合タンパク質を調製する方法を含み、その方法は、（ａ）前記融合タンパク質及び多数のランダム化ループドメインをコードする多数のＤＮＡ構築物を有し、一定の結合多様性とライブラリーから選択される多数の強力な結合体とを提供するライブラリーを調製する工程と、（ｂ）ライブラリー中のＤＮＡ構築物をタンパク質変異型として発現させる工程と、（ｃ）第二結合パートナーに対するタンパク質変異型の結合についてライブラリーをスクリーニングする工程と、（ｄ）第二結合パートナーに高い親和性で結合するＤＮＡ構築物を発現するクローンを選択する工程と、（ｅ）選択したクローンのコード配列を得る工程とを具え、これによって融合タンパク質を調製することができる。前記融合タンパク質は、第二結合パートナーに対して高い親和性で結合するように操作されたループドメインを有する第二ポリペプチド（例えば、ノッチン）に融合した、第一結合パートナー（例えば、受容体又は受容体リガンド）に結合する第一ポリペプチドを含む。選択される第二結合パートナーは、完全に異なる分子（タンパク質、糖タンパク質、多糖、脂質、細胞構造体、ウイルスエピトープ等）であっても、又は第一結合パートナー（受容体若しくは受容体リガンド）に対する結合部位上の異なるエピトープであってもよい。特定の態様において、本発明は、受容体断片である第一ポリペプチドを利用する。例えば、様々なドメインを有する細胞表面受容体を、細胞外リガンド結合ドメインをコードする断片の形態で用いる。細胞表面受容体は、受容体型チロシンキナーゼでもよい。本発明の特定の態様では、第一ポリペプチドが、受容体リガンドであっても、又は受容体に結合する該リガンドの断片であってもよい。リガンドは、アゴニストであってもアンタゴニストであってもよい。第一ポリペプチドは、Ａｘｌ、ｃ−Ｍｅｔ、ＨＧＦ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ受容体及びＧａｓ６からなる群より選択される配列の少なくとも一部分である配列を有し得る。