(57)【要約】【課題】炭化水素資化能を持たないクロレラ目藻類から、炭化水素資化能を有するクロレラ変異体を作成する方法を提供する。【解決手段】野生型クロレラに変異処理を施した後、従属栄養培地で培養し、炭化水素資化能を有する変異体を選択する。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
野生型クロレラに変異処理を施した後、従属栄養培地で培養し、炭化水素資化能を有する変異体を選択することを特徴とするクロレラ変異体の作成方法。
【請求項２】
クロレラが、オキセノクロレラ属に属するクロレラである請求項１の作成方法。
【請求項３】
変異処理が、野生型クロレラの培養温度より5℃以上高い温度での培養である請求項１の作成方法。
【請求項４】
変異処理が、紫外線照射である請求項１の作成方法。
【請求項５】
請求項１の方法によって作成されたクロレラ変異体であって、
(1)  独立栄養培地では増殖しないこと；
(2)  炭化水素を資化すること；
(3)  藻体表面が疎水性であること；および
(4)  18SリボゾームDNA配列が、親株である野生型クロレラと相同であること、を特徴とするクロレラ変異体。
【請求項６】
親株である野生型クロレラが、オキセノクロレラ属に属するクロレラである請求項５のクロレラ変異体。
【請求項７】
請求項６または７のクロレラ変異体を炭化水素汚染環境に接触させることを含む環境浄化方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この出願の発明は、炭化水素資化能を有するクロレラ変異体とその作成方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
近年大きな社会問題となっている海洋汚染では、その発生源として、有害化学物質、油類、放射性物質、廃棄物の投棄、富栄養価物などが知られている。
【０００３】
中でも、油類による汚染は、原油生産地域のみならず、油脂を使用あるいは生産する工場、たとえば食品加工場等の周辺においても問題となっている。また、油田から原油を搬送する際にタンカーの事故が起これば、広い海域に渡り水質汚染が起こり、海鳥、哺乳動物、魚介類等の周辺環境に甚大な被害をもたらす。例えば、海鳥や海洋性の哺乳動物は、羽毛や皮膚表面に疎水性物質を有し、海水との直接接触を防止して体温を維持しているが、油が付着すると、この疎水性物質が失われるため体温が低下し、生存できなくなる。また、これらの動物は海水から余分な塩分を排出しながら水分を補給するが、油の付着によりこの機能も失われるため、脱水症状を起こす。さらに、海草や魚介類は、表面に油が付着することにより光合成や呼吸ができなくなり、死滅する。
【０００４】
従来、タンカーや油田の事故により一過的に水域に流出した原油や石油は、オイルフェンスによりその広がりを防止し、界面活性剤や有機溶剤からなる油処理剤を散布することにより、油が水と混合するようにして処理していた。しかし、油処理剤を使用する方法では、流出した油類は、小さな油滴となり、水と混合され、やがて海洋中に希釈されてその被害の規模を縮小できるものの、根本的な解決にはならない。また、工業排水等に少量含まれる油類の処理には適用できるものではなかった。
【０００５】
そこで、光や熱により油を分解する方法や、活性炭や薬剤を用いた物理化学的吸着等の方法も提案され、一部で使用されている。しかし、これらの方法は、光や熱、あるいは大量の試薬を用いる上、浄化のための機械設備等を必要とするため、コストが高い、タンカー事故等の遠洋における油の処理には適用しにくい、広範に渡る汚染には対応できないなどの問題があった。
【０００６】
そこで、近年、環境適応性の高い方法として、バイオレメディエーションが注目されている。バイオレメディエーションは、浄化機能を有する各種の微生物を用いて、環境汚染の著しい水域や土壌における油等の炭化水素や富栄養価物等を乳化、分解、資化する方法であり、常温・常圧で行うためにエネルギーをほとんど必要としない。したがって、コストが低い、汚染の現場で直接的に処理を行うことができる、油田や工場の操業中であっても浄化処理を行うことができる、広範囲に渡る汚染を浄化することができる、などの利点を有する。
【０００７】
このようなバイオレメディエーションで用いられる微生物としては、各種のものが知られている。たとえば、Agrobacterium属やRodococcas属の油分解性バクテリアが、高い炭化水素分解性を示すものとして報告されている（非特許文献１）。しかし、これらのバクテリアは、低いpHにおける分解能が低いという問題点を有している。これに対して、石油分解酵母（Candida maltosa）は低いpH領域においても高い活性を示すことが報告されている（非特許文献２）が、このような酵母は30℃以上の高温およびpH6.5以上では活性が著しく低下するため、高温地域では使用できないという問題があった。
【０００８】
さらに、酵母様の形態を示す真核微生物であるPrototheca属、中でもPrototheca zoptii var hydrocarbonea等の緑藻が石油分解性を有することが報告されているが、これらの育成及び分解の条件は、pH3〜9、塩化ナトリウム濃度0.8〜2.4重量％、25℃以下であり、限られた環境下においてのみ活性を示す。とくに30℃以上を超える温度では、生育及び油成分の分解は不可能とされていた（非特許文献３）。一般的に海水の塩濃度は約3.5重量％であるため、従来報告されているPrototheca属の藻類は、海水からの油成分の分解・浄化には使用できない。また土壌汚染に対しては、使用できる温度と塩濃度の範囲が限定されているため、沿岸地域や気温の高い地域では使用できなかったのが実情である。
【０００９】
これに対して、この出願の発明者らは、炭化水素を資化する微細藻類であって、30〜40℃の温度領域において炭化水素を資化できることを特徴とする微細藻類、具体的にはプロトテカ（Prototheca）属に属する微細藻Prototheca zopfii RND-16（FERM P-18543）と、その利用方法を発明し、既に特許出願している（特願平2001-305823号）。
【００１０】
なお、クロレラ（Chlorella）は光合成によって栄養素を合成することのできる独立栄養性の緑藻であり、自然界に広く分布している。健康食品や水産養殖の餌料としても広範に利用され、また宇宙ステーション等の閉鎖循環系における食物連鎖の一役を担う生物としても注目されている。しかしながら、このクロレラの環境浄化への利用については、従来全く知られていない。
【００１１】
【非特許文献１】
Biosci.Biotechnol.Biochem., 59, 11, 2159-2161 (1995)
【非特許文献２】
Wolf, K., ed, Non-conventional Yeast in Biotechnology, pp.426-430 (1996)
【非特許文献３】
Appl.Environ.Microb., p.333-336 (1983); System.Appl.Microbiol.5, 119-123 (1984)
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
前記のとおり、重油等の油類による環境汚染を浄化する手段として、炭化水素資化能を有する微生物を用いたバイオレメディエーション法が注目を集めており、そのための有用微生物が様々に報告されている。
【００１３】
しかしながら、汚染さらた環境の特性は千差万別であり、例えば土壌と水域による違い、海水と淡水による違い、あるいは単一汚染か複合汚染かによる違いなどによって、有効に作用する微生物の種類も異なっている。従って、それぞれの汚染環境の特性によって、さらに他種多様な環境浄化微生物の探索が求められている。ところが、従来の環境浄化微生物の探索は、自然界に存在する微生物を広範にスクリーニングし、目的の微生物を特定するという方法に依存していた。この方法では、多大の労力と時間を要するにも係わらず、必ずしも目的微生物が得られるとは限らなかった。
【００１４】
この出願の発明は、以上のとおりの問題点を解決し、容易に入手可能な材料生物（野生型クロレラ）から、炭化水素資化能に優れた新しい変異体藻類を作成する方法と、この方法によって作成されたクロレラ変異体、並びにこのクロレラ変異体の利用発明を提供することを課題としている。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
この出願の発明は、以上のとおりの課題を解決するものとして、野生型クロレラに変異処理を施した後、従属栄養培地で培養し、炭化水素資化能を有する変異体を選択することを特徴とするクロレラ変異体の作成方法を提供する。
【００１６】
この作成方法においては、野生型クロレラが、オキセノクロレラ属に属するクロレラであることを好ましい態様の一つとしている。
【００１７】
また、この作成方法においては、変異処理が、野生型クロレラの培養温度より5℃以上高い温度で野生型クロレラを培養すること、または野生型クロレラに紫外線照射を行うことをそれぞれ好ましい態様としている。
【００１８】
この出願の発明はまた、前記の方法によって作成されたクロレラ変異体であって、
(1)  独立栄養培地では増殖しないこと；
(2)  炭化水素を資化すること；
(3)  藻体表面が疎水性であること；および
(4)  18SリボゾームDNA配列が、親株である野生型クロレラと相同であること
を特徴とするクロレラ変異体を提供する。
【００１９】
このクロレラ変異体においては、親株である野生型クロレラが、オキセノクロレラ属に属するクロレラであることを好ましい態様としている。
【００２０】
さらにこの出願の発明は、前記のクロレラ変異体を炭化水素汚染環境に接触させることを含む環境浄化方法をも提供する。
【００２１】
以下、この出願の発明についてその実施形態を説明する。
【００２２】
【発明の実施の形態】
この発明のクロレラ変異体の作成方法に使用する野生型クロレラは、クロレラ目（Chlorococcales）に属する微細藻類であり、例えばクロレラ（Chlorella）、クンショウモ（Pediastrum）、アミミドロ（Hydrodictyon）等の公知のものを使用することができるが、オキセノクロレラ（Auxenochlorella）の使用が好ましい。なお、この出願において「野生型」とは自然界に棲息することを意味する訳ではなく、「変異型クロレラ」との対比において非変異型であることを意味する。すなわち、クロレラ本来の光合成による独立栄養性を備え、炭化水素資化能を持たないことを意味する。この野生型クロレラは、自然界に棲息するものを採取し、常法によって培養したものを使用することができる。あるいは微生物供給機関（例えばATCCやECACC等）から購入して使用することもできる。例えば、オキセノクロレラはATCC30407株として市販されている。
【００２３】
野生型クロレラに対する変異処理は、細胞や微生物に突然変異を導入するために使用されている公知の方法によって行うことができる。例えば、放射線や紫外線照射、アルキル化剤やアクリジン色素等の変異誘発物質による処理などである。また、特定の培養条件（例えば、高温や低温、高酸性または高アルカリ性、高酸素または低酸素など）も、この変異処理に含まれる。このような培養条件による変異処理は、特定環境での使用に特化したクロレラ変異体の作成にとって好ましい手段の一つである。高温培養による変異処理としては、例えば野生型クロレラを最も効率的に増殖する温度（約25℃）よりも5℃以上高い温度（すなわち、30〜70℃、好ましくは35〜65℃、最も好ましくは40〜60℃）で、1〜60分間、好ましくは3〜45分間、最も好ましくは5〜30分間、培養する。
【００２４】
次いで、変異処理を施したクロレラを従属栄養培地で培養し、この培地で良好に増殖し、かつ炭化水素を資化する藻体を選択することによって、目的のクロレラ変異体を作成することができる。
【００２５】
従属栄養培地としては、例えば、クロレラ等の微細藻類の培養に通常使用される液体培地（例えば、Sabouraud Dextrose培地など）に寒天を加えた培地等を使用することができる。例えば、オキセノクロレラを親株として、高温または紫外線照射により変異処理した場合には、Sabouraud Dextrose寒天培地において暗所で1〜10日間、好ましくは3〜7日間培養することによって、白色コロニーを形成する藻体が得られる。そして、この藻体から、炭化水素資化能を有するものを分離することによって、この発明のクロレラ変異体を得ることができる。
【００２６】
炭化水素の資化能は、標準石油等の炭化水素を含む液体培地に藻体を植藻して培養し、その間の炭化水素量をガスクロマトグラフ等によって測定することによって判定することができる。
【００２７】
以上のとおりの方法によって作成されたクロレラ変異体は、以下の特性を有している。
(1)  独立栄養培地では増殖しないこと。
(2)  炭化水素を資化すること。
(3)  藻体表面が疎水性であること。
(4)  18SリボゾームDNA配列が、親株である野生型クロレラと相同であること。
【００２８】
このうち、前記(4)における「相同」とは、DNA配列が90％以上、好ましくは95%以上、最も好ましくは98％以上、同一であることを意味する。
【００２９】
特に、オキセノクロレラを親株として、高温または紫外線照射により変異処理して得られたオキセノクロレラ変異体は、実施例にも示したように、藻体表面の性状が疎水性であり（親株は親水性）、先願発明（特願2001-305823号）のP. zopfii（FERM P-18543）と同等またはそれ以上の炭化水素分解活性を有している。
ただし、このオキセノクロレラ変異体の18SリボゾームDNA配列は、P. zopfiiのDNA配列との相同性が87.1％であるのに対し、親株であるオキセノクロレラDNAとの相同性は99.1％である。
【００３０】
以上のとおりに作成されたクロレラ変異体は、公知の手段によって炭化水素汚染環境に接触させることによって、環境浄化に使用することができる。すなわち、クロレラ変異体を原油等の炭化水素で汚染された水域や土壌に接触させることによって、迅速にかつ効率よく、炭化水素成分が分解され、浄化処理を行うことができる。クロレラ変異体と水土壌との接触方法はとくに限定されず、浄化対象の地域や水域にクロレラ変異体を散布する方法や、クロレラ変異体を含有する浄化槽に排水や汚泥を該導入する方法等のさまざまな方法が適用できる。もちろん、これらの浄化方法では、排水または土壌を微細藻類と接触させる工程以外に、洗浄、沈降、ろ過、攪拌、培養等の様々な工程を有していてもよい。また、クロレラ変異体は生藻の状態であってもよく、あるいは乾燥体であってもよい。
【００３１】
以下、実施例を示してこの出願の発明についてさらに詳細かつ具体的に説明するが、この出願の発明は以下の例に限定されるものではない。
【００３２】
【実施例】
オキセノクロレラ（A. protothecoides ATCC30407株）を、Sabouraud Dextrose培地１リットル（蒸留水に酵素消化カゼイン10g、デキストロース20g含有）に植藻し、25℃の暗所で3日間培養した後、この培養液に以下の変異処理を施した。
(a)  高温度処理：40〜60℃、5〜30分間
(b)  紫外線照射：250〜300nm、１〜10分間
次いで、変異処理後の藻体を、Sabouraud Dextrose寒天培地１リットル（前記Sabouraud Dextrose培地に寒天20gを添加）に植藻し、25℃の暗所下で、3〜7日間培養した後、白色コロニーを形成する藻体を分離した。
試験例１：表面性状
実施例で得た変異処理後のオキセノクロレラの表面性状を試験した。試験管内に水とヘキサンを入れて２層液を調製し、これに藻体を入れて混合した後、藻体が水層に移動したものを親水性、ヘキサン層に移動したものを疎水性として判定した。
【００３３】
また、親株であるA. protothecoides ATCC30407株を、独立栄養培地および従属栄養培地で培養した場合の表面性状、並びに従属栄養性で炭化水素資化能を有するP. zopfii（FERM P-18543）を従属栄養培地で培養した場合の表面性状も同様にして判定した。
【００３４】
その結果、親株であるA. protothecoides ATCC30407株はいずれの培養であっても親水性であるのに対し、実施例で得たオキセノクロレラ変異体は、P. zopfii（FERM P-18543）と同様に疎水性であった。
試験例２：炭化水素資化能
三角フラスコ（50ml容）に1%標準石油（４種の炭化水素：n-テトラデカン、n-ペンタデカン、n-ヘキサデカン、n-ヘプタデカンを等量づつ含む）、および0.67% yaest nitrogen base（Defco社）を含む溶液20mlを入れ、藻体を植藻して30℃で静置培養した。培養0〜20日間の標準石油の変化をガスクロマトグラフにより測定し、炭化水素分解活性（mg oil/L・d）を求めた。
【００３５】
親株であるA. protothecoides ATCC30407株の活性は0 mg oil/L・dであり、全く炭化水素資化能を示さなかった。またP. zopfii（FERM P-18543）の活性は400-450 0 mg oil/L・dであった。これに対し、実施例で得たオキセノクロレラ変異体の炭化水素分解活性は、400-500 0 mg oil/L・dであり、P. zopfii（FERM P-18543）と同様またはそれ以上の炭化水素資化能を有することが確認された。試験例３：18SリボゾームDNA配列の相同性
A. protothecoides ATCC30407株、P. zopfii（FERM P-18543）、および実施例で作成したオキセノクロレラ変異体のそれぞれのゲノムDNAを文献（Kim C.S. etal., Nucleic Acid Res. 25: 1085-1089, 1997）の記載に従って抽出、精製した。このゲノムDNAを鋳型とするPCR法により18S rDNAを増幅し、ABI-373 DNAシークエンサーにより配列を決定し、各藻体間の塩基配列を比較した。
【００３６】
その結果、A. protothecoides ATCC30407株とP. zopfii（FERM P-18543）の18S rDNA配列の相同性は87.1％であった。一方、A. protothecoides ATCC30407株とオキセノクロレラ変異体との相同性は99.9％であった。
【００３７】
【発明の効果】
以上詳しく説明したとおり、この出願の発明により、炭化水素資化能を持たないクロレラ目藻類から、炭化水素資化能を有するクロレラ変異体を作成することが可能となる。これにより、重油流出等の炭化水素汚染へのバイオレメディエーションの可能性が大きく広がる。