(57)【要約】【課題】反応過程での微生物触媒劣化を抑制し、触媒の再利用回数を増大させることにより菌体当たりの生産性（Ｓ，Ｓ−ＥＤＤＳ生産量／使用菌体乾燥重量）を向上させ、Ｓ，Ｓ−ＥＤＤＳの生産コストを大幅に低減することができ、大スケールもしくは高速反応時に必要となる除熱用外部熱交換器の水酸化マグネシウムによるスケーリングを回避でき、工業的に安価で容易なプロセスを提供する。【解決手段】原料としてフマル酸、エチレンジアミン、及び金属塩を用い、触媒としてリアーゼ活性を有する微生物または該処理物を用いてＳ，Ｓ−エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸（Ｓ，Ｓ−ＥＤＤＳ）を製造する系において、反応装置に外部循環ラインを設け、当該ラインにｐＨをコントロールするためのアルカリをライン混合する方法を採用し、ｐＨを６〜１０にコントロールする。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
原料としてフマル酸、エチレンジアミン、及びマグネシウム塩を用い、触媒としてリアーゼ活性を有する微生物または該処理物を用いてＳ，Ｓ−エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸を製造する際に、反応装置に外部循環ラインを設け、当該ラインにｐＨをコントロールするためのアルカリをライン混合することを特徴とするＳ，Ｓ−エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸の製造方法。
【請求項２】
外部循環ラインのｐＨを６〜１０の範囲にコントロールすることを特徴とする請求項１記載のＳ，Ｓ−エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸の製造方法。
【請求項３】
外部循環ラインで投入するアルカリ（２５質量％水酸化ナトリウム水溶液換算）に対し循環流量を２．７倍以上とし、かつアルカリライン混合点のレイノルズ数を１５０００以上にすることを特徴とする請求項１または２記載のＳ，Ｓ−エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸の製造方法。
【請求項４】
外部循環ラインに熱交換器を設置しすることを特徴とする請求項１〜３いずれか一項記載のＳ，Ｓ−エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸の製造方法。
【請求項５】
反応器内のｐＨ  を６〜１０、反応器内部温度を２０〜５０℃にコントロールすることを特徴とする請求項１〜４いずれか一項記載のＳ，Ｓ−エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸の製造方法。
【請求項６】
外部循環ラインの吸引を反応器内に設置されたフィルターを通して行い、反応器への戻りを底部に設けることを特徴とする請求項１〜５いずれか一項に記載のＳ，Ｓ−エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸の製造方法。
【請求項７】
反応器内に設置されるフィルターが攪拌翼に対して円周方向に設置されていることを特徴とする請求項１〜６いずれか一項に記載のＳ，Ｓ−エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸の製造方法。
【請求項８】
触媒がリアーゼ活性を有する微生物の固定化触媒であることを特徴とする請求項１〜７いずれか一項に記載のＳ，Ｓ−エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸の製造方法。
【請求項９】
フレッシュな触媒を触媒失活量分新たに添加し、回分反応器の反応速度を一定に保つことを特徴とする請求項１〜８いずれか一項に記載のＳ，Ｓ−エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、リアーゼ活性を有する微生物もしくはその該処理物によりＳ，Ｓ−エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸（以下、Ｓ，Ｓ−ＥＤＤＳと称す。）を製造する方法に関する。Ｓ，Ｓ−ＥＤＤＳは重金属を補足するという特異な性質を有し、光学活性であることから自然界に放出された後に生分解を受け易く、キレート剤や洗剤用ビルダーなどに用いられる。
【０００２】
【従来の技術】
下記式（１）
【化１】
2004236620.tif 000002
で示されるＳ，Ｓ−ＥＤＤＳは、Ｌ−アスパラギン酸とジブロムエタンから［Ｊｏｈｎ  Ａ．  Ｎｅａｌ  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｎｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍ．  ７，  ２４０５  （１９６８）  ］化学合成法により製造できる。これに対し、微生物による製造については放線菌ＭＧ４１７−ＣＦ１７株の培養液からホスホリパーゼＣの特異的阻害剤として単離同定されているが［Ｔ．  Ｎｉｓｈｉｋｉｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．  ，  Ｊ．  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ  ３７，  ４２６  （１９８４）］、この方法では生産性が極めて低く工業的製法とはなり難い。
【０００３】
安価な原料であるフマル酸及びエチレンジアミンから微生物触媒作用を利用して効率よく生産する方法としては特許文献１に記載の方法があり、さらに菌体あたりの活性及び生産性を向上させる手段として系内にマグネシウムイオンを存在させる特許文献２に記載の方法が知られている。
【特許文献１】特開平９−１４０３９０号
【特許文献２】特開平１０−５２２９２号
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、特許文献１、２の従来方法においては反応過程での触媒劣化が著しく再利用回数が制限され、菌体当たりの生産性（Ｓ，Ｓ−ＥＤＤＳ生産量／使用菌体乾燥重量）が悪く生産コストに対する触媒コストが高いことが課題となっていた。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、この課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、マグネシウム系での反応において低下するｐＨを補完するためにアルカリを添加する際に、アルカリが直接触媒と触れないように混合し、かつその際に生成する水酸化マグネシウムの沈殿を速やかに溶解させ、その混合液のｐＨを許容値以上にしないことにより触媒失活が著しく低減することを見出し、さらに該操作によりライン中の析出物がなくなり、巨大反応器や高速反応に必要な除熱用熱交換器の伝熱面の汚れを大幅に低減できることを見出して本発明に到達した。
【０００６】
すなわち、本発明は、原料としてフマル酸、エチレンジアミン、及びマグネシウム塩を用い、触媒としてリアーゼ活性を有する微生物または該処理物を用いてＳ，Ｓ−エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸を製造する際に、反応装置に外部循環ラインを設け、当該ラインにｐＨをコントロールするためのアルカリをライン混合することを特徴とするＳ，Ｓ−エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸の製造方法に関する。
【０００７】
この時、外部循環ラインのｐＨを６〜１０の範囲にコントロールすること、外部循環ラインで投入するアルカリ（２５質量％水酸化ナトリウム水溶液換算）に対し循環流量を２．７倍以上とし、かつアルカリライン混合点のレイノルズ数を１５０００以上にすること、外部循環ラインに熱交換器を設置しすること、反応器内のｐＨ  を６〜１０、反応器内部温度を２０〜５０℃にコントロールすること、外部循環ラインの吸引を反応器内に設置されたフィルターを通して行い、反応器への戻りを底部に設けること、反応器内に設置されるフィルターが攪拌翼に対して円周方向に設置されていること、触媒がリアーゼ活性を有する微生物固定化触媒であること、フレッシュな触媒を触媒失活量分新たに添加し、回分反応器の反応速度を一定に保つこと、等により更に効果は増大する。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本反応で用いられる微生物触媒種としては、ハフニア（Ｈａｆｎｉａ）属、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属、アシドボラックス（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、アースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属、パラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）属、スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）属、ブレブンジモナス（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ）属等の細菌を挙げることができる。具体的には、Ｈａｆｎｉａ  ａｌｖｅｉＡＴＣＣ９７６０株、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐ．ＫＫ−５株〔ＦＥＲＭＢＰ−５４１２〕、同ＫＫ−９株〔ＦＥＲＭＢＰ−５４１３〕、Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｓｐ．ＴＮ−５１株〔ＦＥＲＭＢＰ−５４１６〕、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  ＴＮ−１３１株〔ＦＥＲＭＢＰ−５４１８〕、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．ＫＫ−３株〔ＦＥＲＭＢＰ−５４１４〕、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＫＫ−６株〔ＦＥＲＭＢＰ−５４１５〕、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．ＴＮ−２８株〔ＦＥＲＭＢＰ−５４１９〕、Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ  ｓｐ．  ＴＮ−３０株〔ＦＥＲＭＢＰ−５４１７〕および同ＴＮ−３株〔ＦＥＲＭＢＰ−５８８６〕を挙げることができる。ただし、リアーゼ活性を有するのであればこれらの細菌種に限定されるものではない。これらの細菌を直接用いるか、もしくはアクリルアミドなどのモノマーと混合して重合させそのポリマーを裁断し、分離・再利用を容易にした固定化触媒として用いても良い。
【０００９】
マグネシウムイオン源として硫酸塩、塩酸塩、硝酸塩、水酸化物等の水溶性マグネシウム化合物また炭酸塩、リン酸塩等の難溶性マグネシウム化合物が挙げられる。
【００１０】
反応系のｐＨ調整のために用いられるアルカリとしては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどのアルカリ金属塩水溶液、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウムなどのアルカリ土類金属塩水溶液、アンモニア水や、メチルアミン、エチルアミンなどの有機アミン水溶液などの水溶性塩基化合物が挙げられる。
【００１１】
反応系（外部循環ライン及び反応器内）のｐＨは６〜１０、好ましくは８〜９、特に好ましくは８．５近辺に保つ。このｐＨ範囲の時に反応が促進され、かつ触媒の安定性が向上し、触媒あたりの生産性が大きく向上する。この範囲を外れた場合、触媒失活が急速に進行する。
【００１２】
反応液を外部循環する方法としては、触媒を通さない目開きを有するフィルターにより反応液上清を取り出す他に、沈降分離、遠心分離などの物理力分離や、荷電や磁力による凝集分離を行い上清のみを取り出し、ｐＨ調整や温度調整を行い再度反応器へ戻す方法が挙げられる。また、これらの組み合わせによる分離も可能である。
【００１３】
フィルターにより触媒分離を行う方法としては、中空糸や平膜等の他に、触媒を固定化して粒径を大きくした場合、ＳＵＳや樹脂のメッシュやパンチングプレートなどの安価なフィルターで分離する方法が挙げられる。また、これらのフィルターは縦型とし反応器内に円周上に設置する以外にも、反応器の攪拌を妨げない位置に任意に設置しても構わない。
【００１４】
循環ラインのｐＨ制御については、混合溶解点の後方に一般的なｐＨ測定器を設置し、ＯＮ／ＯＦＦ制御やＰＩＤ制御などの一般的制御方法を用いてｐＨ６〜１０の範囲に入るようにアルカリ投入を行う他に、ＨＰＬＣ分析や、あらかじめ検量線を用いて反応率と相関させた電気伝導度などを用いて測定される反応率及び反応速度から計算されるアルカリ要求量を投入したり、また、反応速度からポンプ流量やＯＮ／ＯＦＦ間隔をあらかじめ設定して無観測でアルカリ投入してもよい。
【００１５】
アルカリを添加する手法としては、循環ライン中にアルカリノズルを挿入する他に、循環ラインとアルカリ投入ラインを直接接合したり、ライン中に小型の攪拌機を設置したり、攪拌槽を設けてもよい。また、アルカリノズルを挿入する場合はノズル先端部分を砥ぎ、先端部面積をなくすことにより、水酸化マグネシウムの沈殿付着及びノズル閉塞を抑制できる。その他、超音波印加やノッカーなどの振動を与える方法や、空気等を導入して２流体ノズルとし２次流体の噴流などにより付着物（水酸化マグネシウム）を取り除いても構わない。
【００１６】
アルカリ混合点の下記式（２）で表されるレイノルズ数
【数１】
2004236620.tif 000003
（ρ：密度［ｋｇ／ｍ３］、ｕ：線流速［ｍ／Ｓ］、Ｄ：代表長さ［ｍ］、μ：粘度［Ｐａ・Ｓ］）
を１５０００以上にする方法としては、混合点における管径（Ｄ）を小さくすることにより線流速（ｕ）を上げる他に、スタティックミキサーやインラインミキサーなどの混合器や攪拌翼・ポンプ循環等の機械的攪拌方法を用いることができる。  循環ライン、アルカリラインの流量については、面積式流量計や容積式流量計などの一般的な流量計で測定でき、その流量比設定については手動もしくは自動で設定できる。
【００１７】
循環ラインに熱交換器を挿入し槽内液温の調節を行う場合、熱交換器種類は多管式、スパイラル式、プレート式などの一般的な熱交換器を用いることができ、またジャケットによる熱交換と組み合わせてもよい。これらの熱交換の手段を用い、槽内液温を２０〜５０℃、好ましくは３５〜４５℃に調節する。
【００１８】
外部循環ラインの還流液はｐＨが若干高いため速やかな分散が好ましい。そのため、反応器底部に導入し攪拌翼吐出流（上向流が好ましい）により迅速に混合する他に、スプレーノズルによる噴霧や、さらに外部循環による希釈混合を用いてもよい。
【００１９】
【実施例】
以下に実施例を用いて本発明を具体的に説明する。なお、本発明はこの実施例に制約されるものではない。
【００２０】
実施例１
５１２ｍＭフマル酸、２５６ｍＭ  エチレンジアミン、２５６ｍＭ水酸化マグネシウムを純水に溶解し、水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ８．５に調整したものを原料として作成、それを図１に示す外部循環型反応器に２Ｌ仕込み、リアーゼ活性を有する微生物をジメチルアクリルアミドで固定化した触媒（０．５ｍｍ×０．５ｍｍ×２ｍｍ）を４．９２質量％投入し、液温（１）４０℃、槽内ｐＨ（２）８．５、外部循環ラインｐＨ（８）上限値９．５でＳ，Ｓ−ＥＤＤＳ生成反応を行った。この時、外部循環中の循環ポンプ（１２）流量（９）＝８６ｍＬ／ｍｉｎ、補助循環ポンプ（１１）流量＝１１．９Ｌ／ｍｉｎ、アルカリポンプ（１３）流量＝１．４７ｍＬ／ｍｉｎ、アルカリ混合点（７）のレイノルズ数は２００００となるようにした。反応終了後、触媒を沈降させて内部フィルター（４）（ＳＵＳ３０４メッシュ、目開き１８０）より反応終了液を系外に排出し（１４）、新たに原料（１０）を仕込んで繰り返し反応を計１００バッチ実施した。各々のバッチの反応率経時変化は、反応液をサンプリングし１５０００ｒｐｍ×５ｍｉｎでＳＳ分を除去した後にＨＰＬＣ（ＷＡＫＯＳＩＬ  ５Ｃ８  溶出液；１０ｍＭ水酸化テトラ−ｎ−ブチルアンモニウムと０．４ｍＭＣｕＳＯ４を含む５０ｍＭ燐酸ｐＨ２）により分析した。
得られた各バッチの反応率経時変化から各バッチ反応初速度を求め、横軸に反応総時間、縦軸に反応初速度をプロットし、最小二乗法により触媒劣化乗数（ｋｄ）を求めた結果、ｋｄ＝−０．０００３［１／ｈｒ］となった（図２参照）。
【００２１】
比較例１
５１２ｍＭフマル酸、２５６ｍＭ  エチレンジアミン、２５６ｍＭ水酸化マグネシウムを純水に溶解し、水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ８．５に調整したものを原料として作成、それを２００ｍｌのビーカーに投入し、リアーゼ活性を有する微生物をジメチルアクリルアミドで固定化した触媒（０．５ｍｍ×０．５ｍｍ×２ｍｍ）を４．９２質量％投入し、槽内ｐＨが８．５を維持するように２５％水酸化ナトリウム水溶液をＯＮ／ＯＦＦ制御で滴下し４０℃で反応を行った。反応終了後、ビーカー内液をＳＵＳ３０４・目開き１８０メッシュで濾し、触媒とフレッシュな原料を再度ビーカーに仕込んで回分反応を繰り返した。各々のバッチの反応率経時変化は、反応液をサンプリングし１５０００ｒｐｍ×５ｍｉｎでＳＳ分を除去した後にＨＰＬＣにより分析した。その結果、繰り返し回数５回で反応速度は５０％まで低下し（図３参照）、ｋｄ＝−０．０２３１［１／ｈｒ］となった。また、この時反応器中に巨大な水酸化マグネシウムの凝集体が生成し反応器及び攪拌翼に付着した。
【００２２】
比較例２
５１２ｍＭフマル酸、２５６ｍＭ  エチレンジアミン、２５６ｍＭ水酸化マグネシウムを純水に溶解し、水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ８．５に調整したものを原料として作成した。その原料に２５質量％水酸化ナトリウム水溶液を原料に対し１倍、０．５倍、０．２倍、０．１倍、０．０２倍及び０．０１倍投入したモデル液を作成した。次に、３０ｍｌのＰＰ容器にリアーゼ活性を有する微生物をジメチルアクリルアミドで固定化した触媒（０．５ｍｍ×０．５ｍｍ×２ｍｍ）を２ｇ投入し、液温４０℃の条件の下、先ほどのモデル液を一晩通液した。
一晩通液後に各容器中の触媒を取り出してホウ酸緩衝液で洗浄し、３０℃の条件でフレッシュな原料中で攪拌して生成するＳ，Ｓ−ＥＤＤＳ量をＨＰＬＣを用いて測定し、触媒残存活性を以下の式に基づいて算出した。なお、活性測定時は触媒の膜透過性の影響を考慮するため０．１％トリトンを添加した系で実施した。その結果、以下の表１に示すようにｐＨが１０を越える条件では触媒は著しく失活した。
（残存）活性［Ｕ／ｍｇＧＥＬ］
＝総液量［Ｌ］＊生成Ｓ，Ｓ−ＥＤＤＳ濃度［ｍＭ］／反応時間［ｍｉｎ］／触媒質量［ｇ］
注）触媒質量は微生物を固定化したゲルを遠心脱水した質量
【００２３】
【表１】
2004236620.tif 000004
【００２４】
比較例３
５１２ｍＭフマル酸、２５６ｍＭ  エチレンジアミン、２５６ｍＭ水酸化マグネシウムを純水に溶解し、水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ８．５に調整したものを原料として作成、それを図４に示す外部循環型反応器に２Ｌ仕込み、リアーゼ活性を有する微生物をジメチルアクリルアミドで固定化した触媒（０．５ｍｍ×０．５ｍｍ×２ｍｍ）を４．９２質量％投入し、液温４０℃、槽内ｐＨ８．５、外部循環ラインｐＨ上限値９．５でＳ，Ｓ−ＥＤＤＳ生成反応を行った。この時、外部循環中の循環ポンプ流量＝８６ｍＬ／ｍｉｎ、アルカリ流量＝１．４７ｍＬ／ｍｉｎは実施例１と同じとし、補助循環ポンプの流量をアルカリ混合点レイノルズ数が５０００、１００００となるように流量調節を行った。その結果、レイノルズ数５０００及び１００００での条件ではアルカリノズル近傍で水酸化マグネシウムの強固な結晶が成長しアルカリノズル閉塞が発生し、反応中のｐＨ維持を行うことができなかった。
【００２５】
比較例４
５１２ｍＭフマル酸、２５６ｍＭ  エチレンジアミン、２５６ｍＭ水酸化マグネシウムを純水に溶解し、水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ８．５に調整したものを原料としてＳ，Ｓ−ＥＤＤＳ生成反応を行い、反応終了液上清を採取した。それを２００ｍｌビーカーに仕込み、リアーゼ活性を有する微生物をジメチルアクリルアミドで固定化した触媒（０．５ｍｍ×０．５ｍｍ×２ｍｍ）を４ｇ投入し、６０℃、３０℃、１０℃で浸漬を一晩行った。次に、浸漬した触媒を取り出し前述のフレッシュな原料２００ｍｌと混合してそれぞれ６０℃、３０℃、１０℃で反応を行った結果、１時間経過後の単位触媒重量あたりＳ，Ｓ−ＥＤＤＳ生成量は０ｇ（６０℃）、０．００１８ｇ（３０℃）、０．０００３５ｇ（１０℃）であった。
【００２６】
【発明の効果】
原料としてフマル酸、エチレンジアミン、及び金属塩を用い、触媒としてリアーゼ活性を有する微生物または該処理物を用いてＳ，Ｓ−エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸（Ｓ，Ｓ−ＥＤＤＳ）を製造する系において、反応装置に外部循環ラインを設け、当該ラインにｐＨをコントロールするためのアルカリをライン混合する本発明の方法を採用することにより触媒の劣化を抑制でき、Ｓ，Ｓ−ＥＤＤＳの生産コストを大幅に低減することができる。また、本発明により大スケールもしくは高速反応時に必要となる除熱用外部熱交換器の水酸化マグネシウムによるスケーリングを回避でき、工業的に安価で容易なプロセスが構築できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】外部循環型反応装置（補助循環設備付帯）
【図２】実施例１の槽内触媒の活性残存率推移示したグラフ
【図３】比較例１の１バッチ目と５バッチ目の反応速度比較
【符号の説明】
１    槽内温度指示計
２    槽内ｐＨ指示調節計
３    攪拌機
４    内部フィルター
５    恒温水循環ポンプ
６    恒温槽
７    外部循環ライン流量計
８    外部循環ラインｐＨ指示調節計
９    外部循環ポンプ流量計
１０  原料貯槽
１１  外部循環ライン補助循環ポンプ
１２  外部循環ポンプ
１３  アルカリ投入ポンプ
１４  反応液貯槽
１５  ２５％ＮａＯＨ貯槽
【図１】
2004236620.tif 000005
【図２】
2004236620.tif 000006
【図３】
2004236620.tif 000007