【手続補正書】
【提出日】平成26年5月22日(2014.5.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２２７】
ネズミモノクローナル抗体Ｍｏｖ１９及びＦＲ１−２１のヒト化Ｍｏｖ１９抗体は以前に報告されているフレームワークリサーフィシング法（Roguska  M.等、Proc.Natl.Acad.  Sci.USA  1994  Feb;91:969-973)及び(Roguska等、Protein  Eng.9(10):895-904  (1996)）に従ってヒト化した。要すれば、各可変領域フレームワーク残基に関する平均溶媒アクセス性をＰＤＢデータベースの緊密関連解明抗体構造(closely  related  solved  antibody  structure)を用いて計算し、そして３０％平均アクセス性より高値の位置を表面残基としてマークした（Pedersen  J.T.等、J.  Mol.  Biol.  1994;  235:  959-973）。ヒト表面置き換え配列は、Ｋａｂａｔデータベースにおけるヒト抗体生殖細胞系統配列の相当する位置にネズミ抗体配列の表面位置をアラインすることにより選択した（Johnson,G.  and  Wu,  T.  T.  (2001)  Nucleic  Acids  Research,29:205-206）。最も相同なヒト軽鎖可変領域表面（クローンDPK19、Ｍｏｖ１９に関してはIMGT遺伝子座IGKV2D-30*01、そしてＦＲ１−２１に関してはIMGT遺伝子座IGKV1/OR2-0*01）及び最も相同なヒト重鎖可変領域表面（クローン8M27、Ｍｏｖ１８に関してはIMGT遺伝子座IGHV1-69*08、そしてＦＲ１−２１に関してはIMGT遺伝子座IGHV5-51*02  for  FR1-21）を選択することによりネズミＭｏｖ１９フレームワーク表面位置を置き換え、６ＣＤＲ（表１）は未改変のままとした。ネズミ及びヒトＭｏｖ１９及びＦＲ１−２１の表面位置及び残基を図１Ａ〜Ｄに示す。
【表１−１】
2013524773.tif 000001
【表１−２】
2013524773.tif 000002
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３３】
ねずみ抗ＦＯＬＲ１抗体の開発
２種の異なる免疫化／スクリーニングのシリーズを用いた。第１のシリーズはＦＲ１−２１クローンの形成をもたらし、そして第２のシリーズはＦＲ１−４８、ＦＲ１−４９、ＦＲ１−５７及びＦＲ１−６５クローンの形成をもたらしている。第１のシリーズにおいては、マウスを約５ｘ１０６ＦＯＬＲ１発現ＫＢ細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１７）で皮下免疫化した。第２のシリーズにおいては、自身の表面にヒトＦＯＬＲ１を発現する３００−１９細胞を用いてマウスを免疫化した。これらの細胞を作成するためにヒトＦＯＬＲ１アミノ酸配列をＮＣＢＩウエブサイト（アクセッションＮＰ＿０５７９３７）から入手し、次にそれをコドン最適化し、Ｂｌｕｅ  Ｈｅｒｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙにより合成し、ＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩ制限部位によりフランキングさせることによりｐＳＲａ哺乳類発現ベクター内へのクローニングを容易にした。３００−１９細胞、即ちＢａｌｂ／ｃマウスから誘導した前Ｂ細胞系統（Reth等、Nature,  317:  353-355  (1985)）をｐＳＲａ−ＦｏｌＲ１発現プラスミドでトランスフェクトすることにより細胞表面上にｈｕＦＯＬＲ１を高レベルで安定に発現させた。ＩｍｍｕｎｏＧｅｎ，Ｉｎｃにおいて使用されているもののような当該分野で知られている標準的な免疫化プロトコルを両方のシリーズに適用した。免疫化したマウスは、ハイブリドーマ形成のために屠殺する３日前に抗原でブーストした。マウスの脾臓を標準的動物プロトコルに従って、例えば２枚の滅菌フロスト処理顕微鏡用スライドの間で組織を磨砕することによりＲＰＭＩ−１６４０培地中の単細胞懸濁液を得た。脾細胞を遠心分離し、ペレット化し、洗浄し、ポリエチレングリコール−１５００（Ｒｏｃｈｅ７８３６４１）を用いることによりネズミミエローマ、例えばＰ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３細胞（Kearney等、J  Immunol,123:  1548-1550（1979））と融合させた。ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン（ＨＡＴ）（ＳｉｇｍａＨ−０２６２）を含有するＲＰＭＩ−１６４０選択培地に融合細胞を再懸濁し、そして３７℃５％ＣＯ２下に９６穴平底培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ−Ｃｏｓｔａｒ３５９６、ウェル当たり細胞懸濁液０．２ｍＬ）中における生育に関して選択した。５日間インキュベートした後、培養上澄み０．１ｍＬを各ウェルから取り出し、ヒポキサンチン−チミジン（ＨＴ）補給物（ＳｉｇｍａＨ−０１３７）を含有するＲＰＭＩ−１６４０培地０．１ｍＬと置き換えた。ハイブリドーマクローンが抗体スクリーニングに使用できるようになるまで、３７℃５％ＣＯ２下にインキュベーションを継続した。免疫化及びハイブリドーマ作成の他の手法、例えばLangone等、(編集“Immunochemical  Techniques,Part  I”,Methods  in  Enzymology,Academic  Press,  volume  121,Florida)及びHarlow等、(“Antibodies:  A  Laboratory  Manual”;  Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press,New  York  (1988))に記載されているものも使用できる。
【表１−３】
2013524773.tif 000003
（実施例６）
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２５８】
本明細書において引用した全ての出版物、特許、特許出願、インターネットサイト、及び受託番号／データベースの配列（ポリヌクレオチド及びポリペプチドの配列の両方を包含する）は、各々の出版物、特許、特許出願、インターネットサイト、及び受託番号／データベースの配列が特定的及び個別に参照により本明細書に組み込まれる場合と同等程度まで、全ての目的のために、参照により全体が本明細書に組み込まれる。
【数１】
2013524773.tif 000004
【数２】
2013524773.tif 000005
【数３】
2013524773.tif 000006
【数４】
2013524773.tif 000007
【数５】
2013524773.tif 000008
【数６】
2013524773.tif 000009
【数７】
2013524773.tif 000010
【数８】
2013524773.tif 000011
【数９】
2013524773.tif 000012
【数１０】
2013524773.tif 000013
【数１１】
2013524773.tif 000014
【数１２】
2013524773.tif 000015
【数１３】
2013524773.tif 000016
【数１４】
2013524773.tif 000017
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2013524773000001.app