【手続補正書】
【提出日】平成24年6月7日(2012.6.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のステップを含む方法：
ａ）ｉ）    第１の標的ドメインおよび第２の標的ドメインを含む標的配列；
ｉｉ）  １）前記第１の標的ドメインに実質的に相補的な第１のプローブドメイン；および
２）５’−ライゲーション部分；
を含む第１のライゲーションプローブ；ならびに
ｉｉｉ）１）前記第２の標的ドメインに実質的に相補的な第２のプローブドメイン；
２）３’ライゲーション部分；
を含む第２のライゲーションプローブ；
を含むライゲーション基質を提供するステップであって、
前記第１および前記第２のライゲーションプローブの少なくとも１つは、アンカー配列を含むステップ；
ｂ）リガーゼ酵素の非存在下で前記第１および前記第２のライゲーションプローブをライゲーションし、ライゲーション産物を形成するステップ；
ｃ）前記アンカー配列に実質的に相補的な捕捉プローブを含む基板上で前記ライゲーションされた産物を捕捉するステップ；ならびに
ｄ）前記ライゲーションされた産物の存在を検出するステップ。
【請求項２】
以下のステップを含む方法：
ａ）ｉ）    第１の標的ドメインおよび第２の標的ドメインを含む標的配列；
ｉｉ）  １）前記第１の標的ドメインに実質的に相補的な第１のプローブドメイン；および
２）チオエステルを含む５’−ライゲーション部分；
を含む第１のライゲーションプローブ；ならびに
ｉｉｉ）１）前記第２の標的ドメインに実質的に相補的な第２のプローブドメイン；および
２）求核部を含む３’ライゲーション部分；
を含む第２のライゲーションプローブ；
を含むライゲーション基質を提供するステップであって、
前記標的ドメインの少なくとも１つは、ＰＮＡを含まないステップ；ならびに
ｂ）リガーゼ酵素の非存在下で前記第１および前記第２のライゲーションプローブをライゲーションし、ライゲーション産物を形成するステップ。
【請求項３】
前記第１および第２のライゲーションプローブの少なくとも１つが、アンカープローブをさらに含む、請求項２に記載の方法であって、
ａ）前記アンカー配列に実質的に相補的な捕捉プローブを含む基板上で前記ライゲーションされた産物を捕捉するステップ；および
ｂ）前記ライゲーションされた産物の存在を検出するステップ；
をさらに含む方法。
【請求項４】
以下のステップを含む化学ライゲーションの方法：
ａ）ｉ）    第１の標的ドメインおよび第２の標的ドメインを含む標的配列；
ｉｉ）  １）前記第１の標的ドメインに実質的に相補的な第１のプローブドメイン；および
２）５’−ライゲーション部分；
を含む第１のライゲーションプローブ；ならびに
ｉｉｉ）１）前記第２の標的ドメインに実質的に相補的な第２のプローブドメイン；および
２）３’ライゲーション部分；
を含む第２のライゲーションプローブ；
を含むライゲーション基質を提供するステップであって、
前記第１および前記第２のライゲーションプローブの少なくとも１つは、プローブドメインと前記ライゲーション部分との間に少なくとも第１のリンカーを含むステップ；ならびに
ｂ）リガーゼ酵素の非存在下で前記第１および前記第２のライゲーションプローブをライゲーションするステップ。
【請求項５】
前記第１の標的ドメインおよび前記第２の標的ドメインが、少なくとも１つのヌクレオチドによって分離されるか、または互いに隣接する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記第１および前記第２のライゲーションプローブの少なくとも１つ又は両方がヌクレオチド類似体を含み、前記第１および前記第２のライゲーションプローブの両方がヌクレオチド類似体を含む場合、前記第１のライゲーションプローブは前記第２のライゲーションプローブと異なるヌクレオチド類似体を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記第１および前記第２のライゲーションプローブの少なくとも１つは酵素反応のためのプライマー部位をさらに含み、前記酵素反応が増幅反応であり、そして前記捕捉するステップｃ）より前に行われ、前記ライゲーション産物が増幅されてもよく、ここで前記増幅反応はＰＣＲであってもよい、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記プライマー部位および前記アンカー配列が、同一のライゲーションプローブ上にある、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
以下のステップを含む方法：
ａ）第１の標的ドメインおよび第２の標的ドメインを含む標的配列を提供するステップ；
ｂ）ｉ）    前記第１の標的ドメインに実質的に相補的な第１のプローブドメイン；
ｉｉ）  第１のライゲーション部分；および
ｉｉｉ）標識；
を含む第１のライゲーションプローブを提供するステップ；
ｃ）ｉ）    前記第２の標的ドメインに実質的に相補的な第２のプローブドメイン；
ｉｉ）  第２のライゲーション部分；および
ｉｉｉ）アンカー配列；
を含む第２のライゲーションプローブを提供するステップ；
ｄ）リガーゼ酵素の非存在下で前記第１および前記第２のライゲーションプローブをライゲーションし、ライゲーション産物を形成するステップであって、前記ライゲーションするステップが、前記アンカー配列が前記第１のライゲーションプローブに移動するか若しくは前記標識が前記第２のライゲーションプローブに移動する移動反応を含むステップ；ならびに
ｅ）前記ライゲーション産物を検出するステップ。
【請求項１０】
前記ライゲーション産物が２次ライゲーション反応の基質の役割を果たす、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
以下のステップを含む方法：
ａ）ｉ）    第１の標的ドメインおよび第２の標的ドメインを含む標的配列；
ｉｉ）  １）前記第１の標的ドメインに実質的に相補的な第１のプローブドメイン；および
２）５’−ライゲーション部分；
を含む第１のライゲーションプローブ；ならびに
ｉｉｉ）１）前記第２の標的ドメインに実質的に相補的な第２のプローブドメイン；および
２）３’ライゲーション部分；
を含む第２のライゲーションプローブ；
を含む細胞を提供するステップ；
ｂ）リガーゼ酵素の非存在下で前記第１および前記第２のライゲーションプローブをライゲーションし、ライゲーション産物を形成するステップ；ならびに
ｃ）前記ライゲーション産物を検出するステップ。
【請求項１２】
前記第１のライゲーションプローブがアンカー配列をさらに含み、前記第２のライゲーションプローブが標識をさらに含み、前記ライゲーションするステップが、前記標識が前記第１のライゲーションプローブに移動するか若しくは前記アンカー配列が前記第２のライゲーションプローブに移動する移動反応を含み、そして、前記第１および第２のライゲーションプローブの少なくとも１つは酵素反応のためのプライマー部位をさらに含んでもよく、前記酵素反応が増幅反応であってもよく、前記増幅反応がＰＣＲであってもよい、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記標的配列が、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはマイクロＲＮＡを含む、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記第１および前記第２のライゲーションプローブの少なくとも１つが安定化部分をさらに含み、前記ライゲーションするステップ（ｂ）に続いて若しくは同時に、前記安定化部分が放出され、前記安定化部分はマイナーグルーブ結合分子または核酸であってもよい、請求項１または１１に記載の方法。
【請求項１５】
以下のステップを含む方法：
ａ）第１の標的ドメインおよび第２の標的ドメインを含む標的配列を提供するステップ；
ｂ）１）前記第１の標的ドメインに実質的に相補的な第１のプローブドメイン；および
２）５’−ライゲーション部分；
を含む第１のライゲーションプローブを提供するステップ；
ｃ）１）前記第２の標的ドメインに実質的に相補的な第２のプローブドメイン；
２）３’ライゲーション部分；
を含む第２のライゲーションプローブを提供するステップ；
ｄ）リガーゼ酵素の非存在下で前記第１および前記第２のライゲーションプローブをライゲーションし、ライゲーション産物を形成するステップであって、前記ライゲーション産物が前記ライゲーション産物の結合活性を減少させる環化反応を受けるステップ；ならびに
ｅ）前記ライゲーション産物を検出するステップ。
【請求項１６】
前記基板がビーズである、請求項１に記載の方法。