【手続補正書】
【提出日】平成24年11月5日(2012.11.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）組換えヒトＦＶＩＩを発現する哺乳動物細胞株を得る工程；および
ｂ）前記哺乳動物細胞をインスリンを欠いている血清不含培地中で培養する工程
を含む、組換えヒト第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）の産生方法。
【請求項２】
前記哺乳動物細胞株がチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、ＢＨＫ細胞株またはＨＥＫ２９３細胞株である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記哺乳動物細胞株がＣＨＯ細胞株である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞における前記ＦＶＩＩの産生が、インスリン存在下におけるＦＶＩＩの産生に匹敵する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞が、血清不含培養で増殖するように改変された組換えヒトＦＶＩＩを発現する細胞株を、インスリン非存在下で増殖するＦＶＩＩ産生細胞株を得るため、前記細胞株をインスリン量を減少させながら連続的に培養する工程により、インスリン非存在下における細胞培養で増殖するように順応させる工程によって調製される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
血清不含培養における増殖用に改変された組換えヒトＦＶＩＩを発現する前記細胞株が、欧州細胞カルチャーコレクション、イギリス、ポートダウンに２００８年１０月８日にアクセッション番号０８１００８０１において寄託されたＣＨＯ  １Ｅ９細胞株である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
インスリン非存在下で増殖する前記ＦＶＩＩ産生細胞株が、欧州細胞カルチャーコレクション、イギリス、ポートダウンに２００８年１０月８日にアクセッション番号０８１００８０２において寄託されたＣＨＯ  １Ｅ９細胞株である、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞培養培地がビタミンＫ１を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記連続的な培養が、インスリンを濃度を減少させながら細胞の連続継代にパルスする工程を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
細胞株を１４日目までインスリンを含有する標準的な血清不含培地中で増殖させる工程、そして１４日目に血清不含、インスリン不含培地へ前記細胞株を移す工程を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞を血清不含、インスリン不含培地中で１〜３日間増殖させる工程、その後、０．２ｍｇ／ｍｌのインスリンを含むインスリン含有培地へ前記細胞を移す工程、そして前記細胞株を前記インスリン含有培地中で１〜３日間増殖させる工程を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
インスリン含有培地中での１〜３日間の増殖の後、前記細胞株を血清不含、インスリン不含培地中へ移す工程を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞を血清不含、インスリン不含培地中で１〜３日間増殖させる工程、その後、前記細胞を０．０７０ｍｇ／ｍｌのインスリンを含むインスリン含有培地中へ移す工程、そして前記細胞株を前記インスリン含有培地中で３〜８日間増殖させる工程を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
インスリン含有培地中で３〜８日間増殖させた後、前記細胞株を血清不含、インスリン不含培地中へ移す工程を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞を血清不含、インスリン不含培地中で１〜２日間増殖させる工程、その後、前記細胞を０．０３０ｍｇ／ｍｌのインスリンを含むインスリン含有培地中へ移す工程、そして前記細胞株を前記インスリン含有培地中で３〜９日間増殖させる工程を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
インスリン含有培地中で３〜９日間増殖させた後、前記細胞株を血清不含、インスリン不含培地中へ移す工程を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記細胞を血清不含、インスリン不含培地中で１〜２日間増殖させる工程、その後、前記細胞を０．０１６ｍｇ／ｍｌのインスリンを含むインスリン含有培地中へ移す工程、そして前記細胞株を前記インスリン含有培地中で３〜９日間増殖させる工程を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
血清不含培地中で増殖するＦＶＩＩ産生細胞株を血清不含、インスリン不含培地中で増殖する細胞株へと順応させる方法であって、インスリンを濃度を減少させながら哺乳動物細胞の連続継代にパルスする工程を含み、ここで、前記パルスする工程は、ａ）前記細胞株をインスリン含有培地中で１〜９日間増殖させ、続いて、ｂ）インスリン不含、血清不含培地中で１〜３日間増殖させる工程、ならびに工程ａ）および工程ｂ）を繰り返す工程であって、ここで、各連続工程ａ）における培地は、検出可能なインスリンを含有しなくなるまで、前の工程ａ）のおよそ半分の濃度のインスリンを含有する、工程を含む、方法。
【請求項１９】
前記哺乳動物細胞がＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞またはＨＥＫ２９３細胞である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記哺乳動物細胞がＣＨＯ細胞株である、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
ａ）哺乳動物細胞株を、インスリンを含有する標準血清不含培地中で１４日目まで増殖させる工程、そして１４日目に前記細胞株を血清不含、インスリン不含培地へ移す工程、
ｂ）工程ｂ）の前記細胞を血清不含、インスリン不含培地中で１〜２日間増殖させる工程、その後、前記細胞を０．２ｍｇ／ｍｌのインスリンを含むインスリン含有培地中へ移す工程、そして前記細胞株を前記インスリン含有培地中で１〜３日間増殖させる工程、
ｃ）工程ｂ）のインスリン含有培地中での１〜３日間の増殖の後、前記細胞株を血清不含、インスリン不含培地中へ移す工程、
ｄ）工程ｃ）の前記細胞を血清不含、インスリン不含培地中で１〜３日間増殖させる工程、その後、前記細胞を０．０７０ｍｇ／ｍｌのインスリンを含むインスリン含有培地中へ移す工程、そして前記細胞株を前記インスリン含有培地中で３〜８日間増殖させる工程、
ｅ）工程ｄ）のインスリン含有培地中での３〜８日間の増殖の後、前記細胞株を血清不含、インスリン不含培地中へ移す工程、
ｆ）工程ｅ）の前記細胞を血清不含、インスリン不含培地中で１〜２日間増殖させる工程、その後、前記細胞を０．０３０ｍｇ／ｍｌのインスリンを含むインスリン含有培地中へ移す工程、そして前記細胞株を前記インスリン含有培地中で３〜９日間増殖させる工程、
ｇ）工程ｆ）のインスリン含有培地中での３〜９日間の増殖の後、前記細胞株を血清不含、インスリン不含培地中へ移す工程、
ｈ）工程ｇ）の前記細胞を血清不含、インスリン不含培地中で１〜２日間増殖させる工程、その後、前記細胞を０．０１６ｍｇ／ｍｌのインスリンを含むインスリン含有培地中へ移す工程、そして前記細胞株を前記インスリン含有培地中で３〜９日間増殖させる工程、および
ｉ）工程ｈのインスリン含有培地中での３〜９日間の増殖の後、前記細胞株を血清不含、インスリン不含培地中へ移す工程であって、ここで、工程ｉ）の細胞は、血清不含、インスリン不含培地中での長期増殖に順応させられている、工程
を含む、請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１８〜２１のいずれか１項に記載の方法に従って産生される細胞。
【請求項２３】
ヒトＦＶＩＩを発現し、かつ、動物由来成分を欠いているインスリン不含培地中での増殖に順応させられている哺乳動物組換え細胞。
【請求項２４】
前記細胞がＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞またはＨＥＫ２９３細胞である、請求項２３に記載の組換え細胞。
【請求項２５】
前記細胞がＣＨＯ細胞である、請求項２３または２４に記載の組換え細胞。
【請求項２６】
前記細胞は、血清不含培地中で増殖するＦＶＩＩ産生細胞株を血清不含、インスリン不含培地中で増殖する細胞株へと順応させる工程によって産生され、前記工程は、インスリンを濃度を減少させながら哺乳動物細胞の連続継代にパルスする工程を含み、ここで、前記パルスする工程は、ａ）前記細胞株をインスリン含有培地中で１〜９日間増殖させる工程に続き、ｂ）インスリン不含、血清不含培地中で１〜３日間増殖させる工程、ならびに工程ａ）および工程ｂ）を繰り返す工程であって、ここで、各連続工程ａ）における培地は、検出可能なインスリンを含有しなくなるまで、前の工程ａ）のおよそ半分の濃度のインスリンを含有する、工程を含む、請求項２３〜２５のいずれか１項に記載の組換え細胞。
【請求項２７】
欧州細胞カルチャーコレクション、イギリス、ポートダウンに２００８年１０月８日にアクセッション番号０８１００８０１において寄託された、ヒトＦＶＩＩを発現する組換えＣＨＯ細胞。
【請求項２８】
欧州細胞カルチャーコレクション、イギリス、ポートダウンに２００８年１０月８日にアクセッション番号０８１００８０２において寄託された、ヒトＦＶＩＩを発現する組換えＣＨＯ細胞。
【請求項２９】
哺乳動物細胞におけるＦＶＩＩまたはＦＶＩＩ関連ポリペプチドのラージスケール産生方法であって、
（ａ）請求項２２に記載の細胞を血清不含、インスリン不含培地を含有する培養容器中に播種する工程、さらに前記哺乳動物細胞の培養物を少なくとも前記細胞が所定の密度に到達するまで増殖させる工程、
（ｂ）前記増殖させた種培養物を血清不含、インスリン不含培地を含有するラージスケール培養容器へ移す工程、
（ｃ）血清不含、インスリン不含培地中の前記ラージスケール培養物を、少なくとも前記細胞が所定の密度に到達するまで増殖させる工程、
（ｄ）血清不含、インスリン不含培地中の工程（ｃ）で得られた培養物を、ＦＶＩＩ発現またはＦＶＩＩ関連ポリペプチド発現に適当な条件下で維持する工程、および
（ｅ）前記ＦＶＩＩまたはＦＶＩＩ関連ポリペプチドを前記維持された培養物から取り出す工程
を含む、方法。
【請求項３０】
工程（ｂ）の前に、漸進的にサイズが大きくなる種培養容器を用いて工程ａ）を繰り返す工程をさらに含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
血清不含、インスリン不含培地中の工程（ｃ）で得られた培養物を、定期的な、前記培養培地の採取および新鮮培地による置換によって、保持する工程をさらに含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記方法がマイクロキャリア法である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
前記方法がマクロ多孔質キャリア法、標準マイクロキャリア法またはマイクロキャリア灌流法である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記方法が懸濁法である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３５】
前記方法が灌流法である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記方法がバッチ／ドローフィル法である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記方法が単純バッチ法、フェドバッチ法またはドローフィル法である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記方法がケモスタット培養法である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３９】
前記細胞が、前記播種工程の前に、インスリンを欠いている血清不含培地中での増殖に順応させられている、請求項２９に記載の方法。
【請求項４０】
前記細胞は、前記播種工程の前に、懸濁培養における増殖が可能である、請求項２９に記載の方法。
【請求項４１】
前記所望のＦＶＩＩまたはＦＶＩＩ関連ポリペプチドがヒトＦＶＩＩまたはヒトＦＶＩＩ関連ポリペプチドである、請求項２９に記載の方法。
【請求項４２】
ＦＶＩＩまたはＦＶＩＩ関連ポリペプチドが、少なくとも約１ｍｇ／ｌ／日の培養物のレベルで産生され、好ましくはＦＶＩＩまたはＦＶＩＩ関連ポリペプチドが、少なくとも約２．５ｍｇ／ｌ／日の培養物のレベルで産生される、請求項２９に記載の方法。
【請求項４３】
ＦＶＩＩまたはＦＶＩＩ関連ポリペプチドが、少なくとも約５ｍｇ／ｌ／日の培養物のレベルで産生される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
ＦＶＩＩまたはＦＶＩＩ関連ポリペプチドが、少なくとも約８ｍｇ／ｌ／日の培養物のレベルで産生される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
ＦＶＩＩまたはＦＶＩＩ関連ポリペプチドが、約３〜４ｍｇ／ｌ／日のレベルで産生される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
産生されるＦＶＩＩまたはＦＶＩＩ関連ポリペプチド単位が、少なくとも５０００Ｕ／ｌ／日であり、好ましくは産生されるＦＶＩＩまたはＦＶＩＩ関連ポリペプチド単位が、少なくとも７０００Ｕ／ｌ／日であり、より好ましくは産生されるＦＶＩＩまたはＦＶＩＩ関連ポリペプチドの活性単位が、約７０００〜１０，０００Ｕ／ｌ／日である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４７】
工程（ｃ）で得られた培養物を、細胞含有キャリアの沈降の後、培養物上清の一部を定期
的に採取し、新鮮な培地で置換する工程によって動物産生物不含、インスリン不含培地中で維持する工程をさらに含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項４８】
キャリアの前記沈降前に、前記培養の設定値より低い所定の温度まで前記培養物を冷却する工程をさらに含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記培養物を、キャリアの前記沈降前に、前記培養の温度設定値より５℃〜３０℃低い温度まで冷却する、好ましくは前記培養物を、前記培養の温度設定値より５℃〜２０℃低い温度まで冷却する、より好ましくは前記培養物を、前記培養の温度設定値より５℃〜１５℃低い温度まで冷却する、最も好ましくは前記培養物を、前記培養の温度設定値より約１０℃低い温度まで冷却する、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記培地が、次の添加物、ｉ）グルタミン；最終濃度０．９ｇ／ｌ、ｉｉ）硫酸第二鉄×７Ｈ２Ｏ  ０．０００６ｇ／ｌ、ｉｖ）プトレシン、×２ＨＣｌ  ０．００３６ｇ／ｌ、ｖｉ）ビタミンＫ１  ０．００２５ｇ／ｌ、ｖｉｉ）シンペロニック；最終濃度１ｇ／ｌ、フェノールレッド  ０．００８ｇ／ｌ、エタノールアミン  ０．００１５３ｇ／ｌ、および炭酸水素Ｎａ  ２ｇ／ｌのうちの１以上が補充された血清不含ＤＭＥＭ／ＨＡＭ  Ｆ１２に基づく処方物である、請求項１、請求項２、請求項３、請求項１８、請求項１９、請求項２０または請求項２９に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２７】
具体的な実施形態において、好ましい方法における条件は、ラージスケール培養における細胞の細胞密度が１〜３×１０６／ｍｌであり、当該培養物が希釈率０．２５〜１．５で、ｐＨ７．１＋−０．３、ｐＯ２  １０〜５０％に維持されるようなものである。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
ａ）組換えヒトＦＶＩＩを発現するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株を得る工程；および
ｂ）前記ＣＨＯ細胞をインスリンを欠いている血清不含培地中で培養する工程
を含む、組換えヒト第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）の産生方法。
（項目２）
前記ＣＨＯ細胞における前記ＦＶＩＩの産生が、インスリン存在下におけるＦＶＩＩの産生に匹敵する、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記ＣＨＯ細胞が、血清不含培養で増殖するように改変された組換えヒトＦＶＩＩを発現するＣＨＯ細胞株を、インスリン非存在下で増殖するＦＶＩＩ産生ＣＨＯ細胞株を得るため、前記ＣＨＯ細胞株をインスリン量を減少させながら連続的に培養する工程により、インスリン非存在下における細胞培養で増殖するように順応させる工程によって調製される、項目１に記載の方法。
（項目４）
血清不含培養における増殖用に改変された組換えヒトＦＶＩＩを発現する前記ＣＨＯ細胞株が、欧州細胞カルチャーコレクション、イギリス、ポートダウンに２００８年１０月８日にアクセッション番号０８１００８０１において寄託された細胞株１Ｅ９細胞株である、項目３に記載の方法。
（項目５）
インスリン非存在下で増殖する前記ＦＶＩＩ産生ＣＨＯ細胞株が、欧州細胞カルチャーコレクション、イギリス、ポートダウンに２００８年１０月８日にアクセッション番号０８１００８０２において寄託された１Ｅ９細胞株である、項目３に記載の方法。
（項目６）
前記細胞培養培地がビタミンＫ１を含む、項目１に記載の方法。
（項目７）
前記連続的な培養が、インスリン濃度を減少させながらＣＨＯ細胞の連続継代をパルスする工程を含む、項目３に記載の方法。
（項目８）
ＣＨＯ細胞株を１４日目までインスリンを含有する標準的な血清不含培地中で増殖させる工程、そして１４日目に血清不含、インスリン不含培地へ前記細胞株を移す工程を含む、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記細胞を血清不含、インスリン不含培地中で１〜３日間増殖させる工程、その後、０．２ｍｇ／ｍｌのインスリンを含むインスリン含有培地へ前記細胞を移す工程、そして前記ＣＨＯ細胞株を前記インスリン含有培地中で１〜３日間増殖させる工程を含む、項目８に記載の方法。
（項目１０）
インスリン含有培地中での１〜３日間の増殖の後、前記ＣＨＯ細胞株を血清不含、インスリン不含培地中へ移す工程を含む、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記細胞を血清不含、インスリン不含培地中で１〜３日間増殖させる工程、その後、前記細胞を０．０７０ｍｇ／ｍｌのインスリンを含むインスリン含有培地中へ移す工程、そして前記ＣＨＯ細胞株を前記インスリン含有培地中で３〜８日間増殖させる工程を含む、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
インスリン含有培地中で３〜８日間増殖させた後、前記ＣＨＯ細胞株を血清不含、インスリン不含培地中へ移す工程を含む、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記細胞を血清不含、インスリン不含培地中で１〜２日間増殖させる工程、その後、前記細胞を０．０３０ｍｇ／ｍｌのインスリンを含むインスリン含有培地中へ移す工程、そして前記ＣＨＯ細胞株を前記インスリン含有培地中で３〜９日間増殖させる工程を含む、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
インスリン含有培地中で３〜９日間増殖させた後、前記ＣＨＯ細胞株を血清不含、インスリン不含培地中へ移す工程を含む、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記細胞を血清不含、インスリン不含培地中で１〜２日間増殖させる工程、その後、前記細胞を０．０１６ｍｇ／ｍｌのインスリンを含むインスリン含有培地中へ移す工程、そして前記ＣＨＯ細胞株を前記インスリン含有培地中で３〜９日間増殖させる工程を含む、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
血清不含培地中で増殖するＦＶＩＩ産生細胞株を血清不含、インスリン不含培地中で増殖する細胞株へと順応させる方法であって、インスリン濃度を減少させながらＣＨＯ細胞の連続継代をパルスする工程を含み、ここで、前記パルスする工程は、ａ）前記細胞株をインスリン含有培地中で１〜９日間増殖させ、続いて、ｂ）インスリン不含、血清不含培地中で１〜３日間増殖させる工程、ならびに工程ａ）および工程ｂ）を繰り返す工程であって、ここで、各連続工程ａ）における培地は、検出可能なインスリンを含有しなくなるまで、前の工程ａ）のおよそ半分の濃度のインスリンを含有する、工程を含む、方法。
（項目１７）
ａ）ＣＨＯ細胞株を、インスリンを含有する標準血清不含培地中で１４日目まで増殖させる工程、そして１４日目に前記細胞株を血清不含、インスリン不含培地へ移す工程、
ｂ）工程ｂ）の前記細胞を血清不含、インスリン不含培地中で１〜２日間増殖させる工程、その後、前記細胞を０．２ｍｇ／ｍｌのインスリンを含むインスリン含有培地中へ移す工程、そして前記ＣＨＯ細胞株を前記インスリン含有培地中で１〜３日間増殖させる工程、
ｃ）工程ｂ）のインスリン含有培地中での１〜３日間の増殖の後、前記ＣＨＯ細胞株を血清不含、インスリン不含培地中へ移す工程、
ｄ）工程ｃ）の前記細胞を血清不含、インスリン不含培地中で１〜３日間増殖させる工程、その後、前記細胞を０．０７０ｍｇ／ｍｌのインスリンを含むインスリン含有培地中へ移す工程、そして前記ＣＨＯ細胞株を前記インスリン含有培地中で３〜８日間増殖させる工程、
ｅ）工程ｄ）のインスリン含有培地中での３〜８日間の増殖の後、前記ＣＨＯ細胞株を血清不含、インスリン不含培地中へ移す工程、
ｆ）工程ｅ）の前記細胞を血清不含、インスリン不含培地中で１〜２日間増殖させる工程、その後、前記細胞を０．０３０ｍｇ／ｍｌのインスリンを含むインスリン含有培地中へ移す工程、そして前記ＣＨＯ細胞株を前記インスリン含有培地中で３〜９日間増殖させる工程、
ｇ）工程ｆ）のインスリン含有培地中での３〜９日間の増殖の後、前記ＣＨＯ細胞株を血清不含、インスリン不含培地中へ移す工程、
ｈ）工程ｇ）の前記細胞を血清不含、インスリン不含培地中で１〜２日間増殖させる工程、その後、前記細胞を０．０１６ｍｇ／ｍｌのインスリンを含むインスリン含有培地中へ移す工程、そして前記ＣＨＯ細胞株を前記インスリン含有培地中で３〜９日間増殖させる工程、および
ｉ）工程ｈのインスリン含有培地中での３〜９日間の増殖の後、前記ＣＨＯ細胞株を血清不含、インスリン不含培地中へ移す工程であって、ここで、工程ｉ）の細胞は、血清不含、インスリン不含培地中での長期増殖に順応させられている、工程
を含む、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
項目１６または１７に記載の方法に従って産生される細胞。
（項目１９）
ヒトＦＶＩＩを発現し、かつ、動物由来成分を欠いているインスリン不含培地中での増殖に順応させられている組換えＣＨＯ細胞。
（項目２０）
前記細胞は、血清不含培地中で増殖するＦＶＩＩ産生細胞株を血清不含、インスリン不含培地中で増殖する細胞株へと順応させる工程によって産生され、前記工程は、インスリン濃度を減少させながらＣＨＯ細胞の連続継代をパルスする工程を含み、ここで、前記パルスする工程は、ａ）前記細胞株をインスリン含有培地中で１〜９日間増殖させる工程に続き、ｂ）インスリン不含、血清不含培地中で１〜３日間増殖させる工程、ならびに工程ａ）および工程ｂ）を繰り返す工程であって、ここで、各連続工程ａ）における培地は、検出可能なインスリンを含有しなくなるまで、前の工程ａ）のおよそ半分の濃度のインスリンを含有する、工程を含む、項目１９に記載の組換え細胞。
（項目２１）
欧州細胞カルチャーコレクション、イギリス、ポートダウンに２００８年１０月８日にアクセッション番号０８１００８０１において寄託された、ヒトＦＶＩＩを発現する組換えＣＨＯ細胞。
（項目２２）
欧州細胞カルチャーコレクション、イギリス、ポートダウンに２００８年１０月８日にアクセッション番号０８１００８０２において寄託された、ヒトＦＶＩＩを発現する組換えＣＨＯ細胞。
（項目２３）
哺乳動物細胞におけるＦＶＩＩまたはＦＶＩＩ関連ポリペプチドのラージスケール産生方法であって、
ａ）項目１８に記載の細胞を血清不含、インスリン不含培地を含有する培養容器中に播種する工程、さらに前記哺乳動物細胞培養物を少なくとも前記細胞が所定の密度に到達するまで増殖させる工程、
ｂ）前記増殖させた種培養物を血清不含、インスリン不含培地を含有するラージスケール培養容器へ移す工程、
ｃ）血清不含、インスリン不含培地中の前記ラージスケール培養物を、少なくとも前記細胞が所定の密度に到達するまで増殖させる工程、
ｄ）血清不含、インスリン不含培地中の工程（ｃ）で得られた培養物を、ＦＶＩＩ発現またはＦＶＩＩ関連ポリペプチド発現に適当な条件下で維持する工程、および
ｅ）前記ＦＶＩＩまたはＦＶＩＩ関連ポリペプチドを前記維持された培養物から取り出す工程
を含む、方法。
（項目２４）
工程（ｂ）の前に、漸進的にサイズが大きくなる種培養容器を用いて工程ａ）を繰り返す工程をさらに含む、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
血清不含、インスリン不含培地中の工程（ｃ）で得られた培養物を、定期的な、前記培養培地の採取および新鮮培地による置換によって、保持する工程をさらに含む、項目２３に記載の方法。
（項目２６）
前記方法がマイクロキャリア法である、項目２３に記載の方法。
（項目２７）
前記方法がマクロ多孔質キャリア法である、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
前記方法が標準マイクロキャリア法である、項目２６に記載の方法。
（項目２９）
前記方法がマイクロキャリア灌流法である、項目２６に記載の方法。
（項目３０）
前記方法が懸濁法である、項目２３に記載の方法。
（項目３１）
前記方法が灌流法である、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
前記方法がバッチ／ドローフィル法である、項目３０に記載の方法。
（項目３３）
前記方法が単純バッチ法である、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
前記方法がフェドバッチ法である、項目３２に記載の方法。
（項目３５）
前記方法がドローフィル法である、項目３２に記載の方法。
（項目３６）
前記方法がケモスタット培養法である、項目２３に記載の方法。
（項目３７）
前記細胞が、前記播種工程の前に、インスリンを欠いている血清不含培地中での増殖に順応させられている、項目２３に記載の方法。
（項目３８）
前記細胞は、前記播種工程の前に、懸濁培養における増殖が可能である、項目２３に記載の方法。
（項目３９）
前記所望のＦＶＩＩまたはＦＶＩＩ関連ポリペプチドがヒトＦＶＩＩまたはヒトＦＶＩＩ関連ポリペプチドである、項目２３に記載の方法。
（項目４０）
ＦＶＩＩまたはＦＶＩＩ関連ポリペプチドが、少なくとも約１ｍｇ／ｌ／日の培養物のレベルで産生される、項目２３に記載の方法。
（項目４１）
ＦＶＩＩまたはＦＶＩＩ関連ポリペプチドが、少なくとも約２．５ｍｇ／ｌ／日の培養物のレベルで産生される、項目４０に記載の方法。
（項目４２）
ＦＶＩＩまたはＦＶＩＩ関連ポリペプチドが、少なくとも約５ｍｇ／ｌ／日の培養物のレベルで産生される、項目４１に記載の方法。
（項目４３）
ＦＶＩＩまたはＦＶＩＩ関連ポリペプチドが、少なくとも約８ｍｇ／ｌ／日の培養物のレベルで産生される、項目４２に記載の方法。
（項目４４）
ＦＶＩＩまたはＦＶＩＩ関連ポリペプチドが、約３〜４ｍｇ／ｌ／日のレベルで産生される、項目４２に記載の方法。
（項目４５）
産生されるＦＶＩＩまたはＦＶＩＩ関連ポリペプチド単位が、少なくとも５０００Ｕ／ｌ／日である、項目４２に記載の方法。
（項目４６）
産生されるＦＶＩＩまたはＦＶＩＩ関連ポリペプチド単位が、少なくとも７０００Ｕ／ｌ／日である、項目４２に記載の方法。
（項目４７）
産生されるＦＶＩＩまたはＦＶＩＩ関連ポリペプチドの活性単位が、約７０００〜１０，０００Ｕ／ｌ／日である、項目４２に記載の方法。
（項目４８）
工程（ｃ）で得られた培養物を、細胞含有キャリアの沈降の後、培養物上清の一部を定期
的に採取し、新鮮な培地で置換する工程によって動物産出物不含、インスリン不含培地中で維持する工程をさらに含む、項目２３に記載の方法。
（項目４９）
キャリアの前記沈降前に、前記培養の設定値より低い所定の温度まで前記培養物を冷却する工程をさらに含む、項目４８に記載の方法。
（項目５０）
前記培養物を、キャリアの前記沈降前に、前記培養の設定値より５℃〜３０℃低い温度まで冷却する、項目４９に記載の方法。
（項目５１）
前記培養物を、前記培養の温度設定値より５℃〜２０℃低い温度まで冷却する、項目５０に記載の方法。
（項目５２）
前記培養物を、前記培養の温度設定値より５℃〜１５℃低い温度まで冷却する、項目５１に記載の方法。
（項目５３）
前記培養物を、前記培養の温度設定値より約１０℃低い温度まで冷却する、項目５２に記載の方法。
（項目５４）
前記培地が、１以上の次の添加物、ｉ）グルタミン；最終濃度０．９ｇ／ｌ、ｉｉ）硫酸第二鉄×７Ｈ２Ｏ  ０．０００６ｇ／ｌ、ｉｖ）プトレシン、×２ＨＣｌ  ０．００３６ｇ／ｌ、ｖｉ）ビタミンＫ１  ０．００２５ｇ／ｌ、ｖｉｉ）シンペロニック；最終濃度１ｇ／ｌ、フェノールレッド  ０．００８ｇ／ｌ、エタノールアミン  ０．００１５３ｇ／ｌ、および炭酸水素Ｎａ  ２ｇ／ｌが補充された血清不含ＤＭＥＭ／ＨＡＭ  Ｆ１２に基づく処方物である、項目１、項目１６または項目２３に記載の方法。