【誤訳訂正書】
【提出日】平成24年2月1日(2012.2.1)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０００５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０００５】
本発明は、商業的量の感染性バキュロウイルスＯＢを生産する必要性によって、想到され、かつ実施に至った。本発明は、毛虫幼虫での感染性バキュロウイルスによる封入体の生産および細胞培養での連続的継代による大量のウイルス粒子の生産という利点を確認することで、想到された。次に、二段階方法は、最初に、毛虫幼虫内で感染性ウイルスを生産し、次に、大量の感染性バキュロウイルスを生産するために細胞培養で継代を限られた回数おこなうための接種材料として用いることによって、開発された。
一態様では、本発明は大量のバキュロウイルスを生産する方法に関するもので、該方法は、
バキュロウイルス接種材料を毛虫幼虫に接種すること、
接種された毛虫幼虫をインキュベートすること、
感染した毛虫幼虫からバキュロウイルス封入体を収集すること、
封入体から封入体由来ウイルスを抽出すること、
封入体由来ウイルスからなる接種材料によって宿主昆虫細胞の培養に接種すること、
ウイルス／細胞培養をインキュベートすること、ならびに
インキュベートされたウイルス／細胞培養からバキュロウイルスを収集すること、を含む。
ウイルス／細胞培養のインキュベーションは、好ましくはバキュロウイルスの継代を４ないし５回おこなえる期間にわたる。
バキュロウイルスは、異なるバキュロウイルス種（例えば、オオタバコガ（Helicoverpa armigera）ＳＮＰＶ、タバコガ（Helicoverpa
zea）ＳＮＰＶ、ヨトウガ（Spodoptera frugiperda）ＭＮＰＶ、大豆夜蛾（Anticarsia gemmatalis）ＭＮＰＶ、オウトグラファ・カリフォルニア（Autographa californica）ＭＮＰＶ、アナグラファ・ファルフェラ （Anagrapha falcifera）ＭＮＰＶ、マイマイガ（Lymantria
dispar ）ＭＮＰＶ、カイコ（Bombyx
mori）ＭＮＰＶ、シロイチモジヨトウ（Spodoptera exigua ）ＭＮＰＶ、イクラサギンウワバ（Trichoplusia ni）ＭＮＰＶ、オルギア・シュードツガータ（Orgyia pseudotsugata）ＭＮＰＶ、およびブズラ・スプレッサリア（Buzura suppressaria）ＳＮＰＶが挙げられる）を包含する総括的な用語として、本明細書中に使用される。好ましいバキュロウイルスは、オオタバコガ（Helicoverpa armigera）分離株である。好ましいオオタバコガ（Helicoverpa armigera）分離株は、Ｈ２５ＥＡ１株である。
元になるバキュロウイルス接種材料は、幼虫または細胞培養から得た封入体を含む任意の適当な供給源に由来するものであってもよい。
適当な量の封入体通常株（working stock）を生成するために、幼虫からバキュロウイルスを生産するステップが２つ以上あってもよい。
好ましい一形態では、封入体親株（master stock）を形成するために最初のステップで幼虫からバキュロウイルスを生産してもよい。
次に、封入体親株を用いて、封入体通常株を生成するための接種材料を提供することが可能である。好ましい形態では、封入体通常株が約２×１０１２個の封入体を有する一方で、封入体親株は約１０９個の封入体を有する。親株および通常株の両方を４℃または凍結して保存してもよい。
好ましくは、封入体由来ウイルス（ＯＤＶ）を、相対的に高いＭＯＩで細胞培養中にイノキュレートする。好ましい実施形態では、封入体由来の接種材料は、２．５×１０１０個という少ない封入体から得られ、１ｍｌあたり５×１０５個の細胞を含む１０リットル・バイオリアクターに導入される。この培養は、１０リットル容量（Ｐ１）から、１００リットル容量（Ｐ２）、続いて１，０００リットル（Ｐ３）、最終的には１０，０００リットル容量（Ｐ４）まで規模が拡大される。１０リットル培養で、１ｍｌあたり約１０７ＰＦＵ（バキュロウイルス）が得られる。１０，０００リットル培養では、好ましくは概算の細胞密度が１リットルあたり１．５〜２．０×１０９細胞及び１リットルあたり２．５ｘ１０１１ＯＢである（約１５０ＯＢ／細胞）。ＯＢは、タバコガ幼虫に対するＬＣ５０が０．２〜１．０ＯＢ／ｍｍ２である。
通常株から誘導された封入体の抽出は、任意の適当な方法によっておこなうことが可能である。好ましくは、封入体を溶解させるためにアルカリを用いることで、封入体由来ウイルスの抽出をおこない、結果として生ずるウイルス粒子を適当な緩衝培地で安定化させる。好ましい抽出方法は、アルカリ溶液とＯＢ懸濁液とを混合し、この混合液をウイルス粒子が分離される温度で一定時間にわたってインキュベートすることを含む。次に、好ましくは、ＯＶＤを安定化培地、好ましくはＶＰＭ３（図２に開示）に懸濁する。好ましくは、酸による中和ステップは含まれない。好ましいＯＤＶ抽出方法は、以下に概説されるＶＰＭ３抽出方法である。このＶＰＭ３抽出方法は、トリプシン処理が用いられないことおよびＶＰＭ３培地が血清を含まないという利点を有することから、この方法は従来の方法に比べて経済的であり、したがって大規模の商業的生産によりいっそう適している。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
バキュロウイルスを量産する方法であって、
バキュロウイルス接種材料を毛虫幼虫に接種し、前記接種された毛虫幼虫をインキュベートするステップと、
前記感染した毛虫幼虫からバキュロウイルスの封入体を収集し、前記封入体から封入体由来ウイルスを抽出して封入体親株を形成するステップと、
前記封入体親株からのバキュロウイルス接種材料を毛虫幼虫に接種し、前記封入体親株からのバキュロウイルス接種材料を接種された前記毛虫幼虫をインキュベートするステップと、
前記封入体親株からのバキュロウイルスに感染した前記毛虫幼虫からバキュロウイルスの封入体を収集し、前記封入体から封入体由来ウイルスを抽出して封入体通常株を形成するステップと、
前記封入体通常株の接種材料を宿主昆虫細胞の培養に接種するステップと、
ウイルス／細胞培養をインキュベートするステップと、ならびに
インキュベートされたウイルス／細胞培養からバキュロウイルスを収集するステップと、
を含み、
前記ウイルス／細胞培養がバキュロウイルスの継代を４ないし５回おこなえる期間インキュベートされる、
ことを特徴とする方法。  
【請求項２】
前記バキュロウイルスが、
オオタバコガ（Helicoverpa armigera）ＳＮＰＶ、
タバコガ（Helicoverpa zea）ＳＮＰＶ、
ヨトウガ（Spodoptera frugiperda）ＭＮＰＶ、
大豆夜蛾（Anticarsia gemmatalis）ＭＮＰＶ、
オウトグラファ・カリフォルニア（Autographa californica）ＭＮＰＶ、
アナグラファ・ファルフェラ （Anagrapha falcifera）ＭＮＰＶ、
マイマイガ（Lymantria dispar ）ＭＮＰＶ、
カイコ（Bombyx mori）ＭＮＰＶ、
シロイチモジヨトウ（Spodoptera exigua ）ＭＮＰＶ、
イクラサギンウワバ（Trichoplusia ni）ＭＮＰＶ、
オルギア・シュードツガータ（Orgyia pseudotsugata）ＭＮＰＶ、
およびブズラ・スプレッサリア（Buzura suppressaria）ＳＮＰＶ、
からなる群から選択されるいずれか一種から選ばれる、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記バキュロウイルスが、オオタバコガ（Helicoverpa armigera）分離株である、ことを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
適当な量の封入体通常株を生成するために、幼虫からバキュロウイルスを生成するステップが２つ以上存在する、ことを特徴とする請求項１ないし３のいずれか一項に記載の方法。  
【請求項５】
前記封入体通常株が２×１０１２個の封入体を有する一方で、前記封入体親株が１０９個の封入体を有する、ことを特徴とする請求項１ないし４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記封入体由来ウイルス（ＯＤＶ）を、１ｍｌあたり５×１０５個の細胞に対し２．５×１０１０個までの少ない封入体からなるＭＯＩで細胞培養中に植え付ける、ことを特徴とする請求項１ないし５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記封入体由来ウイルス（ＯＤＶ）の接種材料が、２．５×１０１０個の少ない封入体から得られ、前記接種材料を１ｍｌあたり５×１０５個の細胞を含む１０リットル・バイオリアクターに導入し、前記培養の規模を１０リットル容量（Ｐ１）から、１００リットル容量（Ｐ２）、続いて１，０００リットル（Ｐ３）、最終的には１０，０００リットル容量（Ｐ４）まで拡大することで、前記１０リットル培養で、１ｍｌあたり１０７ＰＦＵ（バキュロウイルス）が得られ、前記１０，０００リットル培養では細胞密度が１リットルあたり１．５〜２．０×１０９細胞、および１リットルあたり２．５×１０１１封入体（ＯＢ）であり、さらに前記封入体（ＯＢ）は、タバコガ幼虫に対するＬＣ５０が０．２〜１．０ＯＢ／ｍｍ２である、ことを特徴とする請求項１ないし６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記封入体由来ウイルス（ＯＤＶ）を、封入体を溶解させるためにアルカリを用いて抽出し、結果として生ずるウイルス粒子を適当な緩衝培地で安定化させる、ことを特徴とする請求項１ないし７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記抽出の方法が、アルカリ溶液と封入体（ＯＢ）懸濁液とを混合するステップと、該混合液をウイルス粒子が分離される温度で一定時間にわたってインキュベートし、さらに封入体由来ウイルス（ＯＤＶ）を安定化培地に懸濁するステップを含む、ことを特徴とする請求項１ないし８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記抽出の方法が、アルカリ溶液とＯＢ懸濁液とを混合するステップと、該混合液をウイルス粒子が分離される温度で一定時間にわたってインキュベートし、さらに封入体由来ウイルス（ＯＤＶ）を安定化培地に懸濁するステップを含み、前記ＯＤＶがトリプシン処理を用いることなく、また血清を用いることなく抽出される、ことを特徴とする請求項１ないし９のいずれか一項に記載の方法。