【手続補正書】
【提出日】平成15年10月28日(2003.10.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の性質を有するコア蛋白質と糖鎖とからなるコンドロイチン硫酸プロテオグリカン。
（Ａ）コア蛋白質の一次構造：
配列表配列番号１の１番目のバリン（Ｖａｌ）から５１４番目のトレオニン（Ｔｈｒ）までのアミノ酸配列もしくはそれと相同性を有するアミノ酸配列を有する。
（Ｂ）糖鎖：
分子量約３０キロダルトンのコンドロイチン硫酸を含有する。
（Ｃ）本プロテオグリカンにノイラミニダーゼ、Ｏ−グリコシダーゼまたはＮ−グリコシダーゼを作用させると糖鎖が遊離する。
【請求項２】
分子量が、還元条件下におけるドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動において約１５０キロダルトンである請求項１記載のコンドロイチン硫酸プロテオグリカン。
【請求項３】
次の性質を有する糖蛋白質。
（Ａ）分子量：
（ａ）ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で還元条件下において約１２０キロダルトンのバンドを形成する、
（ｂ）ノイラミニダーゼ、Ｏ−グリコシダーゼおよびＮ−グリコシダーゼの酵素反応後、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で還元条件下において約１００キロダルトンのバンドを形成する、
（Ｂ）蛋白質の一次構造：
配列表配列番号１の１番目のバリン（Ｖａｌ）から５１４番目のトレオニン（Ｔｈｒ）までのアミノ酸配列あるいはそれと相同性を有するアミノ酸配列を有する。
【請求項４】
配列表配列番号１の１番目のバリン（Ｖａｌ）から５１４番目のトレオニン（Ｔｈｒ）までのアミノ酸配列あるいはそれと相同性を有するアミノ酸配列を含み、糖鎖を有していてもよい蛋白質。
【請求項５】
配列表配列番号１の２５２番目のリジン（Ｌｙｓ）から３９８番目のシステイン（Ｃｙｓ）までのアミノ酸配列あるいはそれと相同性を有するアミノ酸配列を含み、糖鎖を有していてもよい蛋白質。
【請求項６】
配列表配列番号２の３１番目のバリン（Ｖａｌ）から５４５番目のトレオニン（Ｔｈｒ）までのアミノ酸配列あるいはそれと相同性を有するアミノ酸配列を含み、糖鎖を有していてもよい蛋白質。
【請求項７】
配列表配列番号２の２８３番目のリジン（Ｌｙｓ）から４２９番目のシステイン（Ｃｙｓ）までのアミノ酸配列あるいはそれと相同性を有するアミノ酸配列を含み、糖鎖を有していてもよい蛋白質。
【請求項８】
配列表配列番号１に示されるアミノ酸配列と配列番号２に示されるアミノ酸配列との間で共通するアミノ酸をその順序で含むアミノ酸配列を有し、糖鎖を有していてもよい蛋白質。
【請求項９】
以下の方法で製造され、かつ、以下の性質を有することを特徴とするコンドロイチン硫酸プロテオグリカン。
（方法）
工程ａ：ラットの脳をタンパク質分解酵素阻害剤、金属キレート剤及び還元剤を含む緩衝液中でホモジナイズし、そのホモジネートを高速遠心して不溶性物質を回収する。
工程ｂ：工程ａで回収された不溶性物質をタンパク質分解酵素阻害剤と界面活性剤を含む緩衝液中でホモジナイズし、そのホモジネートを遠心して上清を回収する。
工程ｃ：工程ｂで回収された上清を界面活性剤、金属キレート剤、還元剤及びタンパク質分解酵素阻害剤を含む尿素緩衝液に分散し、次いで同尿素緩衝液に対して透析する。
工程ｄ：工程ｃによる透析後の溶液を、尿素緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−樹脂と混合する。
工程ｅ：工程ｄを経たＤＥＡＥ−樹脂を回収してカラムにつめ、次いで尿素緩衝液中でＮａＣｌの直線濃度勾配（0.1Mから0.7M）をかけ、0.45から0.68ＭのＮａＣｌ濃度で溶出される画分を回収する。
工程ｆ：工程ｅで回収された画分についてゲル濾過クロマトグラフを行い、Ｋａｖが0.11から0.65の範囲にある画分を回収する。
工程ｇ：工程ｆで回収された画分に、酢酸カリウムを含む９５％エタノール水溶液を添加して、沈殿物を形成させる。
工程ｈ：工程ｇで形成された沈澱物を、酢酸カリウムを含む７５％エタノール水溶液で洗浄し、減圧乾燥する。
工程ｉ：工程ｈで得られた乾燥物を、グアニジン塩酸を含む緩衝液に溶解する。
工程ｊ：工程ｉで得られた溶液についてオクチルセファロースを用いた疎水クロマトグラフィーを行い、トリトン系界面活性剤の濃度勾配によって溶出し、0.3％から 0.6％の界面活性剤濃度で溶出される画分を回収する。
工程ｋ：工程ｊで回収された画分について工程ｇと同様にエタノールで沈澱物を形成させる。
工程ｌ：工程ｋで形成された沈殿物を、グアニジン塩酸を含む緩衝液中で塩化セシウム密度勾配遠心法（初期密度1.38ｇ／ｍｌ；150,000xgで３０時間）に付し、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン画分を取得する。
（性質）
（Ａ）糖鎖：分子量約３０キロダルトンのコンドロイチン硫酸を含有する。
（Ｂ）本プロテオグリカンにノイラミニダーゼ、Ｏ−グリコシダーゼまたはＮ−グリコシダーゼを作用させると糖鎖が遊離する。
（Ｃ）分子量が、還元条件下におけるドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動において約１５０キロダルトンである。
【請求項１０】
以下の方法で製造され、かつ、以下の性質を有することを特徴とする請求項９に記載のコンドロイチン硫酸プロテオグリカン。
（方法）
工程１：ラットの脳を２ｍＭ フェニルメチルスルフォニルフルオライド、２０ｍＭ ＥＤＴＡ及び１０ｍＭ Ｎ−エチルマレイミドを含むリン酸塩緩衝食塩水中でホモジナイズし、そのホモジネートを27,000xgで４０分間遠心して沈澱物を回収する。（本工程および以下の工程は特に示していない限り全て４℃で行う。）
工程２：工程１で回収した沈殿物について、再度、工程１と同様にホモジネーションし、遠心して、不溶性物質を回収する。
工程３：工程２で回収した不溶性物質を、２ｍＭ フェニルメチルスルフォニルフルオライドと１％ノニデット Ｐ−４０を含むリン酸塩緩衝食塩水中で０℃においてホモジナイズし、ホモジネートを回収する。
工程４：工程３で回収したホモジネートを６０分間撹拌し、次いでこれを27,000xgで４０分間遠心して上清を回収し、これを凍結乾燥する。
工程５：工程４で得られた凍結乾燥物を、0.2 ％ノニデットＰ−４０、0.1 Ｍ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ Ｎ−エチルマレイミド及び0.2 ｍＭフェニルメチルスルフォニルフルオライドを含む４Ｍ尿素、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（pH7.5）中に分散し、次いで同緩衝液に対して透析する。
工程６：工程５における透析後の溶液を27,000xgで３０分間遠心し、上清を回収する。
工程７：工程６で回収した上清を、尿素緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−樹脂と混合し、この混合物を２時間撹拌する。
工程８：工程７における撹拌後のＤＥＡＥ−樹脂を回収し、これを尿素緩衝液で洗浄する。
工程９：工程８における洗浄後のＤＥＡＥ−樹脂をカラムにつめ、次いで尿素緩衝液中でＮａＣｌの直線濃度勾配（0.1 Ｍから0.7 Ｍ）をかけ、0.45から0.68ＭのＮａＣｌ濃度で溶出される画分を回収する。
工程１０：工程９で回収された画分を濃縮し、この濃縮液を、0.2 ％ノニデットＰ−４０と２ｍＭ フェニルメチルスルフォニルフルオライドとを含む４Ｍグアニジン塩酸、５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ7.5）を用いたセファロースＣＬ−４Ｂのカラム（直径1.6 ｃｍ×１００ｃｍ）のクロマトグラフィーに付し、Ｋａｖが0.11から0.65の範囲にある画分を回収する。
工程１１：工程１０で回収された画分を濃縮する。
工程１２：工程１１で得られた濃縮液に、1.3 ％（Ｗ／Ｖ）酢酸カリウムを含む３倍容の９５％エタノールを添加して、沈殿物を形成させる。
工程１３：工程１２で形成された沈澱物を、０℃で、１％（Ｗ／Ｖ）酢酸カリウムを含む７５％エタノールで洗浄し、減圧乾燥する。
工程１４：工程１３で得られた乾燥物を、室温で、グアニジン塩酸緩衝液（４Ｍグアニジン塩酸、５０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ7.5）に溶解する。
工程１５：工程１４で得られた溶液をオクチルセファロースのカラム（直径1.6 ｃｍ×5.0 ｃｍ）に負荷し、グアニジン塩酸緩衝液中でノニデットＰ−４０の直線濃度勾配（０％から0.8 ％（Ｖ／Ｖ））をかけ、0.3 ％から0.6 ％(v/v)のノニデットＰ−４０濃度で溶出される画分を回収する。
工程１６：工程１５で回収した画分にエタノールを添加して沈殿物を形成させ、この沈殿物を減圧乾燥する。
工程１７：工程１６で得られた乾燥物を、グアニジン塩酸緩衝液（４Ｍグアニジン塩酸、５０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ7.5）中で塩化セシウム密度勾配遠心法（初期密度1.38ｇ／ｍｌ；１０℃；150,000xgで３０時間）に付する。
工程１８：工程１７の処理が終了した試料を７つに分画し、その第２番目から第６番目の画分を回収する。
工程１９：工程１８で回収した画分をリン酸塩緩衝食塩水に対して透析して、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン画分を取得する。
（性質）
（Ａ）糖鎖：分子量約３０キロダルトンのコンドロイチン硫酸を含有する。
（Ｂ）本プロテオグリカンにノイラミニダーゼ、Ｏ−グリコシダーゼまたはＮ−グリコシダーゼを作用させると糖鎖が遊離する。
（Ｃ）分子量が、還元条件下におけるドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動において約１５０キロダルトンである。
【請求項１１】
以下の方法で製造され、かつ、以下の性質を有することを特徴とする糖蛋白質。
（方法）
工程ａ：ラットの全脳から調製した核除去分画を、3-[(3-コールアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-1-プロパンスルホン酸で可溶化する。
工程ｂ：工程ａで得られた可溶化物をＤＥＡＥ−樹脂のカラムに負荷し、0.6Ｍ NaCl溶液で溶出される画分を回収する。
工程ｃ：工程ｂで回収された画分を塩化セシウム密度勾配遠心法で分画する。
工程ｄ：工程ｃで得られた分画をコンドロイチナーゼＡＢＣで消化した後、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付して糖蛋白質を取得する。
（性質）
分子量：
（ａ）ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で還元条件下において約１２０キロダルトンのバンドを形成する、
（ｂ）ノイラミニダーゼ、Ｏ−グリコシダーゼおよびＮ−グリコシダーゼの酵素反応後、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で還元条件下において約１００キロダルトンのバンドを形成する。
【請求項１２】
以下の方法で製造され、かつ、以下の性質を有することを特徴とする、請求項１１に記載の糖蛋白質。
（方法）
工程１：ラットの全脳から調製した核除去分画を、１％ 3-[(3-コールアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-1-プロパンスルホン酸で可溶化する。
工程２：工程１で得られた可溶化物をＤＥＡＥ−樹脂のカラムに負荷し、0.25M NaClで洗浄する。
工程３：工程２における洗浄後の樹脂から、0.6Ｍ NaCl溶液で溶出される画分を回収する。
工程４：工程３で回収された画分を塩化セシウム密度勾配遠心に付した後、遠心後の試料を１０分画し、その中で最も密度が低い３つの画分を回収する。
工程５：工程４で回収された分画をコンドロイチナーゼＡＢＣで消化する。
工程６：工程５における消化後の分画を、還元条件下でドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（６％ポリアクリルアミド）に付し、約１２０キロダルトンのバンドを分離することにより糖蛋白質を取得する。
（性質）
分子量：
（ａ）ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で還元条件下において約１２０キロダルトンのバンドを形成する。
（ｂ）ノイラミニダーゼ、Ｏ−グリコシダーゼおよびＮ−グリコシダーゼの酵素反応後、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で還元条件下において約１００キロダルトンのバンドを形成する。
【請求項１３】
以下の方法で製造されることを特徴とする、ニューログリカンＣのコア蛋白質をコードするＤＮＡ。
工程ａ：３２Ｐ標識したｃＤＮＡプローブを、ラットのニューログリカンＣのＤＮＡ断片（制限酵素XbaI-Hind III 消化ＤＮＡ断片；配列表１の塩基番号６２４〜１７３５）をもとにして作製する。
工程ｂ：工程ａで得られたプローブを用い、以下の条件のプラークハイブリダイゼーションによってヒトのｃＤＮＡライブラリーから相同性の高い塩基配列を有するクローンを単離することにより、ニューログリカンＣのコア蛋白質をコードするＤＮＡを取得する。
（プラークハイブリダイゼーションの条件）
宿主：大腸菌(Escherichia coli) XL-1 blue MRF'
条件：60℃、３ｘＳＳＣ(SSC：0.15MNaCl、0.015M酢酸ナトリウム)中でハイブリダイゼーション行い、60℃、0.1ｘＳＳＣで洗浄を行う。
【請求項１４】
請求項１３に記載のＤＮＡによってコードされることを特徴とする、ニューログリカンＣのコア蛋白質。
【請求項１５】
ラットのニューログリカンＣのＤＮＡ断片（制限酵素XbaI-Hind III 消化ＤＮＡ断片；配列表１の塩基番号６２４〜１７３５）をもとにして作製されるｃＤＮＡプローブ。
【請求項１６】
以下の工程を経て得られるクローン。  
工程ａ：３２Ｐ標識したｃＤＮＡプローブを、ラットのニューログリカンＣのＤＮＡ断片（制限酵素XbaI-Hind III 消化ＤＮＡ断片；配列表１の塩基番号６２４〜１７３５）をもとにして作製する。
工程ｂ：工程ａで得られたプローブを用い、以下の条件のプラークハイブリダイゼーションによってヒトのｃＤＮＡライブラリーから相同性の高い塩基配列を有するクローンを単離する。
（プラークハイブリダイゼーションの条件）
宿主：大腸菌(Escherichia coli) XL-1 blue MRF'
条件：60℃、３ｘＳＳＣ(SSC：0.15MNaCl、0.015M酢酸ナトリウム)中でハイブリダイゼーション行い、60℃、0.1ｘＳＳＣで洗浄を行う。
【請求項１７】
配列表配列番号１の１番目のバリン（Ｖａｌ）から５１４番目のトレオニン（Ｔｈｒ）までのアミノ酸配列あるいはそれと相同性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むＤＮＡ。
【請求項１８】
配列表配列番号１の２５２番目のリジン（Ｌｙｓ）から３９８番目のシステイン（Ｃｙｓ）までのアミノ酸配列あるいはそれと相同性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むＤＮＡ。
【請求項１９】
配列表配列番号２の３１番目のバリン（Ｖａｌ）から５４５番目のトレオニン（Ｔｈｒ）までのアミノ酸配列あるいはそれと相同性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むＤＮＡ。
【請求項２０】
配列表配列番号２の２８３番目のリジン（Ｌｙｓ）から４２９番目のシステイン（Ｃｙｓ）までのアミノ酸配列あるいはそれと相同性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むＤＮＡ。
【請求項２１】
請求項１〜１２及び１４のいずれか１項に記載のプロテオグリカン、蛋白質またはそれらのペプチドフラグメントをヒト以外の哺乳動物に免疫し、該動物の体液から採取することができるか、または該動物の抗体産生細胞によって産生される、該プロテオグリカンおよび該蛋白質の両者あるいはどちらか一方と反応する抗体。