(57)【要約】【課題】血清或いは血清成分無しで動物由来の細胞を維持、増殖させうる培地を提供する。【解決手段】下記に示す糖タンパク質を含有し、且つ、動物の血清若しくは血清成分を含まないことを特徴とする、培地を提供する。１）ローヤルゼリー中に存在し、非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動において単一バンドを形成する。２）還元条件下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定される分子量が約５７キロダルトンである。３）配列式１のアミノ酸番号１〜８のアミノ酸配列を含む。（配列式１）　Ａｓｎ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　Ｈｉｓ　Ｇｌｕ　Ｍｅｔ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　Ｐｈｅ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ｘａａ　Ａｓｐ【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記に示す糖タンパク質を含有し、且つ、動物の血清若しくは血清成分を含まないことを特徴とする培地。
１）ローヤルゼリー中に存在し、非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動において単一バンドを形成する。
２）還元条件下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定される分子量が約５７キロダルトンである。
３）配列式１のアミノ酸番号１〜８のアミノ酸配列を含む。
【請求項２】
前記糖タンパクを、ローヤルゼリー乃至はローヤルゼリーの分画物として含有することを特徴とする、請求項１に記載の培地。
【請求項３】
前記ローヤルゼリーの分画物が、エタノール不溶性画分であることを特徴とする、請求項２に記載の培地。
【請求項４】
前記ローヤルゼリーの分画物が、限外濾過において、分子量１０万の限外濾過膜通過、分子量１万の限外濾過膜非通過の分画であることを特徴とする、請求項２又は３に記載の培地。
【請求項５】
前記ローヤルゼリーの分画物が、次に示すステップに従って製造されていたもの、或いは、これを凍結乾燥したものであることを特徴とする、請求項２〜４何れか１項に記載の培地。
ステップ１：ローヤルゼリーに１００〜１０００倍量のエタノールを加え、良く混和させ、不溶性画分を集める。
ステップ２：ステップ１のエタノール不溶性画分に１００〜１０００倍量の水を加え、不溶性画分を除去する。
ステップ３：ステップ２の水可溶性画分を分子量１０万の限外濾過膜を用いて限外濾過を行い通過画分を集める。
ステップ４：ステップ３の分子量１０万の限外濾過膜通過画分を、分子量１万の限外濾過膜を用いて限外濾過し、非通過画分を集め分画物とする。
【請求項６】
培地が動物由来の細胞の培養用であることを特徴とする、請求項１〜５何れか１項に記載の培地。
【請求項７】
動物由来の細胞が、ガン細胞、ハイブリドーマ又は幹細胞であることを特徴とする、請求項６に記載の培地。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、無血清培地に関し、更に詳細には、ガン細胞、ハイブリドーマ或いは幹細胞などの培養に好適な無血清培地に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年に於けるバイオ技術の発展は目を見張るものがあり、抗体産生脾細胞とミエローマを融合し、ハイブリドーマを作成し、モノクローナル抗体を作成する技術や、動物細胞や大腸菌などの菌類に遺伝子乃至はその断片を導入して形質転換したり、種々の幹細胞を分化、増殖させて臓器や器官を形成させたりすることを可能ならしめている。この様なバイオ技術は、先端医学研究、先端生物学研究では必須の技術であり、これからのこれらの分野のさらなる発展には無くてはならない技術となっている。この様な現状を見ると、全く動物の生体成分無しで、バイオ技術が成立しているかの如くに感じられるが、細胞培養の段階においては、ＦＢＳ（牛胎仔血清）等の血清成分を培地中に加えることが必須であり、この点で完全には、他の動物と無縁のところでバイオ技術が行えない欠点があった。この様な血清成分を必要とする理由としては、無血清培地には種々の成長因子が不足していることが挙げられ、動物細胞においてはこの様な成長因子抜きでは分裂、増殖が行えないためであると言われている。又、この様に、培地中に人為的に成分をコントロールできない、血清成分を加えることは、当該血清成分のロットのばらつきなどにより、培養が大きく影響を受けることを意味し、その意味でも、血清成分無しで、動物などの細胞が培養できる培地の開発が望まれていた。又、この様な傾向は、ウシ・スポンジ状脳炎（ＢＳＥ）の問題の発生により、より深刻なものとなっている。これは、ＢＳＥの病原プリオンがどの様な経路をたどって感染して行くかが不明なため、医療用に培養された細胞を介してＦＢＳ由来のプリオンが感染しないとは言い切れない事情もあるからである。言い換えれば、ＦＢＳ等の血清乃至は血清成分を培地の必須成分としていることが、バイオ技術の医療への進展、工業への進展を阻害していると言える。
【０００３】
一方、下記に示す特性の糖タンパク質について、肝細胞の初代培養において、肝細胞を血清無しで維持増殖させる作用を有することは知られているが、無血清培地に本タンパク質を含有させることにより、ガン細胞、ハイブリドーマ或いは幹細胞など動物由来細胞の培養用の無血清培地の成分として有用であることは全く知られていなかった。
１）ローヤルゼリー中に存在し、非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動において単一バンドを形成する。
２）還元条件下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定される分子量が約５７キロダルトンである。
３）配列式１のアミノ酸番号１〜８のアミノ酸配列を含む。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、この様な状況下に為されたものであり、血清或いは血清成分無しで動物由来の細胞を維持、増殖させうる培地を提供することを課題とする。
【０００５】
この様な状況に鑑みて、本発明者らは、血清或いは血清成分無しで動物由来の細胞を維持、増殖させうる培地を求めて、鋭意研究努力を重ねた結果、特定のローヤルゼリー中の糖タンパク質がガン細胞、ハイブリドーマ或いは幹細胞など動物由来細胞の培養用の無血清培地の成分として有用であることを見出し、発明を完成させるに至った。即ち、本発明は以下に示す技術に関するものである。
（１）下記に示す糖タンパク質を含有し、且つ、動物の血清若しくは血清成分を含まないことを特徴とする、培地。
１）ローヤルゼリー中に存在し、非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動において単一バンドを形成する。
２）還元条件下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定される分子量が約５７キロダルトンである。
３）配列式１のアミノ酸番号１〜８のアミノ酸配列を含む。
（２）前記糖タンパク質を、ローヤルゼリー乃至はローヤルゼリーの分画物として含有することを特徴とする、（１）に記載の培地。
（３）前記ローヤルゼリーの分画物が、エタノール不溶性画分であることを特徴とする、（２）に記載の培地。
（４）前記ローヤルゼリーの分画物が、限外濾過において、分子量１０万の限外濾過膜通過、分子量１万の限外濾過膜非通過の分画であることを特徴とする、（２）又は（３）に記載の培地。
（５）前記ローヤルゼリーの分画物が、次に示すステップに従って製造されていたもの、或いは、これを凍結乾燥したものであることを特徴とする、（２）〜（４）何れか１項に記載の培地。
ステップ１：ローヤルゼリーに１００〜１０００倍量のエタノールを加え、良く混和させ、不溶性画分を集める。
ステップ２：ステップ１のエタノール不溶性画分に１００〜１０００倍量の水を加え、不溶性画分を除去する。
ステップ３：ステップ２の水可溶性画分を分子量１０万の限外濾過膜を用いて限外濾過を行い通過画分を集める。
ステップ４：ステップ３の分子量１０万の限外濾過膜通過画分を、分子量１万の限外濾過膜を用いて限外濾過し、非通過画分を集め分画物とする。
（６）培地が動物由来の細胞の培養用であることを特徴とする、（１）〜（５）何れか１項に記載の培地。
（７）動物由来の細胞が、ガン細胞、ハイブリドーマ又は幹細胞であることを特徴とする、（６）に記載の培地。
以下、本発明について更に詳細に説明を加える。
【０００６】
【発明の実施の形態】
（１）本発明の培地の必須成分である糖タンパク質
本発明の培地は、次に示す特性を示す糖タンパク質を必須成分として含有することを特徴とする。１）ローヤルゼリー中に存在し、非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動において単一バンドを形成する。２）還元条件下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定される分子量が約５７キロダルトンである。３）配列式１のアミノ酸番号１〜８のアミノ酸配列を含む。本発明の明細書においてかかる糖タンパク質を単に「５７キロダルトンの糖タンパク質」と称することがある。この５７キロダルトンの糖タンパク質は、本発明の培地において、無血清の条件下でも、細胞の維持、増殖促進剤として作用する。
【０００７】
かかる糖タンパク質は、以下に示す手技に従って定性或いは定量することができる。即ち、凍結乾燥したローヤルゼリーを０．７重量％で１０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、ＵＦ１０万（Ｍｉｎｉｐｌａｔｅ１００；限外濾過）で６倍濃縮、７回脱塩を行い、その濾液をさらにＵＦ３万（Ｍｉｎｉｐｌａｔｅ３０；限外濾過）で８倍濃縮、１回脱塩を行い、分子量１０万〜３万の分画を得た。上記の分子量１０万〜３万のサンプルは、陰イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーによって分画することで、分子量５７キロダルトンタンパク質を分離できる。陰イオン交換クロマトグラフィーとしては、通常に知られている方法に従って行えば良く、例えば東ソー株式会社製ＤＥＡＥーＴｏｙｏｐｅａｒｌ６５０Ｍをカラムとして用いて、２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）を展開液Ａ、２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）と１ＭＮａＣｌを展開液Ｂとしてグラジェントにより、流速を５ｍｌ／ｍｉｎ、２８０ｎｍの吸光度で検出し、２．５ｍｌ／チューブで分画したフラクションＮｏ．１１９〜１２７に分子量５７キロダルトンのタンパク質画分を検出することができる。さらにこの画分をゲル濾過クロマトグラフィーにより、これは通常に知られている方法に従って行えば良く、この様な好ましい例としては、例えば、ファルマシア株式会社製ＨｉＬｏａｄ１６／６０Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００をカラムとして用いて、０．１５Ｍ塩化ナトリウム含有５０ｍＭリン酸カリウムバッファーｐＨ７．０を展開液とし、流速を１．０ｍｌ／ｍｉｎで２８０ｎｍの吸光度で検出し、２．０ｍｌ／チューブで分画したフラクションＮｏ．３５〜４３に分子量５７キロダルトンのタンパク質を検出することが出来る。また、既知分子量のゲル濾過分析の結果より、上記タンパク質は、分子量５７キロダルトンモノマータンパク質であると確定された。又、このタンパク質は、Ｎ−グルコシダーゼＦによって消化され、消化後の分子量が４８キロダルトンになるため糖タンパク質であることを本発明者は見出している。又、前記の分析用のカラムから分取用カラムに変えることにより、分取精製も行うことができる。
【０００８】
本発明の培地において、前記５７キロダルトンの糖タンパク質は、５７キロダルトンの糖タンパクに精製した形で含有させることもできるが、かかる５７キロダルトンの糖タンパク質を濃縮した画分を用いることもできるし、又、かかる５７キロダルトンのタンパクを豊潤に含有する、新鮮なローヤルゼリーにおいては、ローヤルゼリーそのものを含有させることもできる。経済的にも、効果としても最も好ましい形態は、５７キロダルトンの糖タンパク質を濃縮した分画である。かかる分画としては、５７キロダルトンの糖タンパク質のエタノール不溶性と分子量の差を利用して、水可溶性で且つエタノール不溶性の分画、或いは、５７キロダルトンの前後の大きさを限外濾過などによって切った分画を用いることである。より好ましいものとしてはこの２つの分画の共有集合である水可溶性で且つエタノール不溶性であって、５７キロダルトンの前後の分子量のタンパク質を限外濾過で切った画分である。５７キロダルトンの前後の分子量を切った画分は、１０万の限外濾過膜を通過し、１万の限外濾過膜を非通過の分画を集めることにより得られる。これらをステップごとに記述すれば次のようなステップが好ましく例示できる。
ステップ１：ローヤルゼリーに１００〜１０００倍量のエタノールを加え、良く混和させ、不溶性画分を集める。
ステップ２：ステップ１のエタノール不溶性画分に１００〜１０００倍量の水を加え、不溶性画分を除去する。
ステップ３：ステップ２の水可溶性画分を分子量１０万の限外濾過膜を用いて限外濾過を行い通過画分を集める。
ステップ４：ステップ３の分子量１０万の限外濾過膜通過画分を、分子量１万の限外濾過膜を用いて限外濾過し、非通過画分を集め分画物とする。
かくして得られた分画は、５７キロダルトンの糖タンパク質を豊潤に含有する分画であるので、そのまま他の成分とともに混合、滅菌し培地とすることもできるが、凍結乾燥などして濃縮し用いることもできる。滅菌は濾過滅菌により行うことが好ましい。
【０００９】
（２）本発明の培地
本発明の培地は、上記５７キロダルトンの糖タンパク質を含有し、且つ、血清乃至は血清成分を含有しないことを特徴とする。本発明の培地に於ける、５７キロダルトンの糖タンパク質の好ましい含有量は、１〜２０重量％が好ましく、更に好ましくは５〜１５重量％である。これは、少なすぎると細胞などが維持、増殖できない場合があり、多すぎると流動性を損なうなど培地の物理化学的な変化困難性が現れる場合があるからである。本発明の培地において、前記５７キロダルトンの糖タンパク質は、ＦＢＳの如くに使用することができる。即ち、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ等の混合培地やその変法培地に添加することで培地を作成する。従って、市販の前記混合培地を購入し、これに５７キロダルトンの糖タンパク質を混合することにより、本発明の培地とすることができる。本発明の培地には、通常培養で使用されている培地成分を任意の成分として含有することができる。かかる任意の成分としては例えば、アミノ酸類、糖類、ビタミン類などが好ましく例示できる。又、培養客体としては、動物由来の細胞が好ましく例示でき、例えば、ミエローマ、アデノカルシノーマ、メラノーマなどのガン細胞、ベーロ細胞などの正常培養細胞、脾細胞とミエローマの融合細胞に代表される、ガン細胞と正常細胞のハイブリドーマ、ＥＳ細胞に代表される種々の幹細胞、骨髄移植に於ける骨髄細胞、人工授精に於ける卵子等が好ましく例示できる。特に好ましいものは、ガン細胞、ハイブリドーマ又は幹細胞である。本発明の培地を用いることにより、ＦＢＳ等の動物血清或いは血清成分フリーの状態で、細胞を培養することができ、この為、感染性のあるウィルスやプリオンと言った感染源をコンタミすることなく、必要なバイオ技術産物を産生させることができる。従って、バイオ技術を遺憾なくした発揮した生体活性物質、臓器、器官などの製造に有意義である。
【００１０】
【実施例】
以下に、実施例を挙げて本発明について更に詳細に説明を加えるが、本発明がかかる実施例にのみ、限定されないことは言うまでもない。
【００１１】
＜実施例１＞
市販のＭＥＭを用いて、各種ガン細胞の培養を行った。ガン細胞は、１０％ＦＢＳ加ＭＥＭ培地で５％炭酸ガス条件で４８時間予備培養した後、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄し、ＰＢＳを加えて１０５個／ｍｌの濃さに調整し、２４穴のウェルに１００μｌ加え、下記に示す本発明の培地９００μｌを加えて同条件で７２時間培養した。培地は２４時間ごとに新しいものと交換した。７２時間後、細胞をヘキスト３３３４２を用いた蛍光染色を行い、生存細胞の割合をカウントした。陽性コントロールとして、５７キロダルトンの糖タンパク質の代わりにＦＢＳを添加したものを、陰性コントロールとして、ＭＥＭ培地のみで培養したものを用いた。結果を表１に生存率として示す。これより、本発明の培地はガン細胞の培養用の無血清培地として好適であることがわかる。
（培地１）
５７キロダルトンの糖タンパク質　　　　　　　　　　５．０ｍｇ／ｍｌ
ＭＥＭ培地
【００１２】
【表１】
2004008130.tif 000002
【００１３】
＜実施例２＞
細胞として、マウスより取り出した造血幹細胞を用い、実施例１と同様に５７キロダルトンの糖タンパク質の作用を確認した。生存率は、陽性コントロールが９８％で、陰性コントロールが０．９％であるのに対し、培地１は９６％であった。
【００１４】
＜実施例３＞
混合培地をＲＰＭＩ培地に変え、実施例１と同様に検討を行った。結果を表２に示す。ＲＰＭＩ培地でも同様の効果が認められた。
（培地２）
５７キロダルトンの糖タンパク質　　　　　　　　　　　５．０ｍｇ／ｍｌ
ＲＰＭＩ培地
【００１５】
【表２】
2004008130.tif 000003
【００１６】
＜実施例４＞
培地に於ける５７キロダルトンの糖タンパク質の含量を変えて検討した。細胞はメラノーマを用いた。結果は生存率が８３％であり、この濃度でもかろうじて使用可能であることを確認した。
（培地３）
５７キロダルトンの糖タンパク質　　　　　　　　　　２．５ｍｇ／ｍｌ
ＭＥＭ培地
【００１７】
＜実施例５＞
培地に於ける５７キロダルトンの糖タンパク質の含量を変えて検討した。細胞はメラノーマを用いた。結果は生存率が９８％であり、この濃度でも使用可能であることを確認した。
（培地４）
５７キロダルトンの糖タンパク質　　　　　　　　　　　２０ｍｇ／ｍｌ
ＭＥＭ培地
【００１８】
＜実施例６＞
次に示す、ステップに従ってローヤルゼリー（５７キロダルトンの糖タンパク質の含有量が、タンパク質の総量に対して１３．２％）を精製し、５７キロダルトンの糖タンパク質を４２重量％含有する分画１を得た。この分画を用いて、培地５を作成し、実施例１と同様にメラノーマＢ−１６を培養した。生存率は９７％であり、この様な分画の形でも使用可能であることが確かめられた。
（培地５）
分画１　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　５０ｍｇ／ｍｌ
ＭＥＭ培地
（５７キロダルトンの糖タンパク質の含有量２０ｍｇ／ｍｌ）
【００１９】
（分画の精製法）
ステップ１：ローヤルゼリーに５００倍量のエタノールを加え、良く混和させ、不溶性画分を集めた。
ステップ２：ステップ１のエタノール不溶性画分に２００倍量の水を加え、不溶性画分を除去した。
ステップ３：ステップ２の水可溶性画分を分子量１０万の限外濾過膜を用いて限外濾過を行い通過画分を集めた。
ステップ４：ステップ３の分子量１０万の限外濾過膜通過画分を、分子量１万の限外濾過膜を用いて限外濾過し、非通過画分を集め、７２時間凍結乾燥し、分画１とした。
【００２０】
【発明の効果】
本発明によれば、血清或いは血清成分無しで動物由来の細胞を維持、増殖させうる培地を提供することができる。
【００２１】
【配列表】
2004008130.tif 000004
【００２２】
2004008130.tif 000005