【手続補正書】
【提出日】平成26年11月5日(2014.11.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
非ケラチノサイト上皮細胞を連続的に培養する方法であって、
ａ）前記非ケラチノサイト上皮細胞をフィーダー細胞およびカルシウム含有培地の存在下で培養すること、及び
ｂ）培養中に、前記フィーダー細胞、前記非ケラチノサイト上皮細胞、またはこれら両方におけるＲｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）の活性を阻害すること、
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記非ケラチノサイト上皮細胞は、初代細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記非ケラチノサイト上皮細胞は、初代細胞ではない、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記非ケラチノサイト上皮細胞は、腫瘍細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記非ケラチノサイト上皮細胞は、扁平上皮細胞、円柱細胞、腺腫細胞、および移行上皮細胞からなる群から選択される、請求項２、３、または４に記載の方法。
【請求項６】
前記非ケラチノサイト上皮細胞は、前立腺細胞、乳房細胞、肝細胞、膵島細胞、肺上皮細胞、腎細胞、膀胱細胞、胃上皮細胞、大腸上皮細胞、小腸上皮細胞、尿道上皮細胞、精巣上皮細胞、卵巣上皮細胞、甲状腺細胞、副甲状腺細胞、副腎細胞、胸腺細胞、胆嚢細胞、および下垂体細胞からなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記カルシウム含有培地は、血清または血清代替物を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記フィーダー細胞は、増殖性線維芽細胞または非増殖性線維芽細胞である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記非増殖性線維芽細胞は、マウス線維芽細胞またはヒト線維芽細胞である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＲＯＣＫは、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤１（ＲＯＣＫ１）、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤２（ＲＯＣＫ２）、またはこれら両方である、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
ＲＯＣＫの活性の阻害は、前記非ケラチノサイト上皮細胞を小分子ＲＯＣＫ阻害剤の存在下で培養することを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記小分子ＲＯＣＫ阻害剤は、Ｙ−２７６３２、ＨＡ１１００塩酸塩、ＨＡ１０７７、およびＧＳＫ４２９２８６からなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ＲＯＣＫの活性の阻害は、前記非ケラチノサイト上皮細胞をＲＯＣＫ１、ＲＯＣＫ２、またはこれら両方に特異的なＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）分子の存在下で培養することを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
ｃ）ＲＯＣＫを阻害した後に、前記非ケラチノサイト上皮細胞を継代すること、及び
ｄ）前記継代細胞をＲＯＣＫが阻害されていない細胞培養環境下に設置すること、
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＲＯＣＫが阻害されていない環境は、三次元細胞培養環境である、請求項１４に記載
の方法。
【請求項１６】
前記ＲＯＣＫが阻害されていない環境は、前記非ケラチノサイトの分化を通常誘導しない環境である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＲＯＣＫが阻害されていない環境は、前記非ケラチノサイトの分化を誘導する環境である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
条件的に不死化された非ケラチノサイト上皮細胞集団。
【請求項１９】
前記条件的に不死化された非ケラチノサイト上皮細胞は、正常な細胞に由来する、請求項１８に記載の細胞集団。
【請求項２０】
前記条件的に不死化された非ケラチノサイト上皮細胞は、腫瘍に由来する、請求項１８に記載の細胞集団。
【請求項２１】
前記条件的に不死化された非ケラチノサイト上皮細胞は、扁平上皮細胞、円柱細胞、腺腫細胞、および移行上皮細胞からなる群から選択される細胞に由来する、請求項１９または２０に記載の細胞集団。
【請求項２２】
前記条件的に不死化された非ケラチノサイト上皮細胞は、前立腺細胞、乳房細胞、肝細胞、膵島細胞、肺上皮細胞、腎細胞、膀胱細胞、胃上皮細胞、大腸上皮細胞、小腸上皮細胞、尿道上皮細胞、精巣上皮細胞、卵巣上皮細胞、甲状腺細胞、副甲状腺細胞、副腎細胞、胸腺細胞、胆嚢細胞、および下垂体細胞からなる群から選択される細胞への分化を促進するその後の環境下に設置された後にそれらに分化することができる、請求項２１に記載の細胞集団。
【請求項２３】
非ケラチノサイト上皮細胞の増殖を刺激する方法であって、
ａ）前記非ケラチノサイト上皮細胞をフィーダー細胞およびカルシウム含有培地の存在下で培養すること、及び
ｂ）培養中に、前記フィーダー細胞、前記非ケラチノサイト上皮細胞、またはこれら両方におけるＲｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）の活性を阻害すること、を含み、
それによって、前記Ｒｈｏキナーゼの活性を阻害しながら前記非ケラチノサイト上皮細胞を培養することが、非ケラチノサイト上皮細胞の増殖を刺激する、
前記方法。
【請求項２４】
前記非ケラチノサイト上皮細胞は、初代細胞である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記非ケラチノサイト上皮細胞は、初代細胞ではない、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記非ケラチノサイト上皮細胞は、腫瘍細胞である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記非ケラチノサイト上皮細胞は、扁平上皮細胞、円柱細胞、腺腫細胞、および移行上皮細胞からなる群から選択される請求項２４、２５、または２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記非ケラチノサイト上皮細胞は、前立腺細胞、乳房細胞、肝細胞、膵島細胞、肺上皮細胞、腎細胞、膀胱細胞、胃上皮細胞、大腸上皮細胞、小腸上皮細胞、尿道上皮細胞、精巣上皮細胞、卵巣上皮細胞、甲状腺細胞、副甲状腺細胞、副腎細胞、胸腺細胞、胆嚢細胞、および下垂体細胞からなる群から選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記カルシウム含有培地は、血清または血清代替物を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記フィーダー細胞は、非増殖性線維芽細胞である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記非増殖性線維芽細胞は、マウス線維芽細胞またはヒト線維芽細胞である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＲＯＣＫは、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤１（ＲＯＣＫ１）、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤２（ＲＯＣＫ２）、またはこれら両方である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
ＲＯＣＫの活性の阻害は、前記非ケラチノサイト上皮細胞を小分子ＲＯＣＫ阻害剤の存在下で培養することを含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記小分子ＲＯＣＫ阻害剤は、Ｙ−２７６３２、ＨＡ１１００塩酸塩、ＨＡ１０７７、およびＧＳＫ４２９２８６からなる群から選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
ＲＯＣＫの活性の阻害は、前記非ケラチノサイト上皮細胞をＲＯＣＫ１、ＲＯＣＫ２、またはこれら両方に特異的なＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）分子の存在下で培養することを含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
前記腫瘍細胞は、対象の血液循環から単離された、請求項２６に記載の方法。
【請求項３７】
前記腫瘍細胞は、対象由来の異常な組織から単離された、請求項２６に記載の方法。
【請求項３８】
異常な非ケラチノサイト上皮（ＮＫＥ）細胞の存在を特徴とする状態の治療を必要とする対象の候補治療を同定する方法であって、
ａ）前記対象から得られた前記異常なＮＫＥ細胞をフィーダー細胞、カルシウム含有培地、および少なくとも１つのＲｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤の存在下で培養して、生体外で異常なＮＫＥ細胞集団を産生すること、
ｂ）生体外で、前記異常なＮＫＥ細胞の少なくとも一部の応答プロファイルを決定すること、及び
ｃ）前記決定された応答プロファイルに基づいて、前記対象の候補治療を同定すること、
を含む、前記方法。
【請求項３９】
前記応答プロファイルは、生体外で、前記異常なＮＫＥ細胞から抽出されるＤＮＡの少なくとも一部の配列を同定することによって少なくとも部分的に決定される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記応答プロファイルは、生体外で、前記異常なＮＫＥ細胞中に産生される少なくとも１つのｍＲＮＡを同定することによって少なくとも部分的に決定される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記応答プロファイルは、生体外で、前記異常なＮＫＥ細胞中に産生されない少なくとも１つのｍＲＮＡを同定することによって少なくとも部分的に決定される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
前記応答プロファイルは、生体外で、前記異常なＮＫＥ細胞が発現する１つ以上のタンパク質を同定することによって少なくとも部分的に決定される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４３】
前記応答プロファイルは、生体外で、前記異常なＮＫＥ細胞が発現しない１つ以上のタンパク質を同定することによって少なくとも部分的に決定される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４４】
前記応答プロファイルは、生体外で、前記異常なＮＫＥ細胞を化学療法剤に供し、かつ、生体外で、前記異常なＮＫＥ細胞に対する前記化学療法剤の治療指数を決定することによって少なくとも部分的に決定される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４５】
前記対象由来の前記異常なＮＫＥ細胞は、前記対象の血液循環から得られる、請求項３８に記載の方法。
【請求項４６】
対象における異常な非ケラチノサイト上皮（ＮＫＥ）細胞を同定する方法であって、
ａ）前記対象から単離された少なくとも１つの異常な候補ＮＫＥ細胞をフィーダー細胞、カルシウム含有培地、および少なくとも１つのＲｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤の存在
下で培養して、生体外で異常な候補ＮＫＥ細胞集団を産生すること、
ｂ）生体外で、前記異常な候補ＮＫＥ細胞集団の少なくとも一部の組織起源プロファイルを決定すること、及び
ｃ）前記異常な候補ＮＫＥ細胞の少なくとも１つの特性を、前記異常な候補ＮＫＥ細胞の前記決定された組織起源プロファイルの組織と同一の組織から得られる正常なＮＫＥ細胞の同一の特性と比較して、前記異常な候補ＮＫＥ細胞と前記正常なＮＫＥ細胞との間に差異があるかを決定すること、を含み、
差異は、前記異常な候補ＮＫＥ細胞が正常なＮＫＥ細胞と比較して異常であることを示す、
前記方法。
【請求項４７】
前記異常な候補ＮＫＥ細胞は、前記対象の血液循環から得られる、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記組織起源プロファイルは、生体外で、前記異常な候補ＮＫＥ細胞中に産生される少なくとも１つのｍＲＮＡを同定することによって少なくとも部分的に決定される、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
前記組織起源プロファイルは、生体外で、前記異常な候補ＮＫＥ細胞中に産生されない少なくとも１つのｍＲＮＡを同定することによって少なくとも部分的に決定される、請求項４６に記載の方法。
【請求項５０】
前記組織起源プロファイルは、生体外で、前記異常な候補ＮＫＥ細胞が発現する１つ以上のタンパク質を同定することによって少なくとも部分的に決定される、請求項４６に記載の方法。
【請求項５１】
前記組織起源プロファイルは、生体外で、前記異常な候補ＮＫＥ細胞が発現しない１つ以上のタンパク質を同定することによって少なくとも部分的に決定される、請求項４６に記載の方法。
【請求項５２】
前記組織起源プロファイルは、組織学的に少なくとも部分的に決定される、請求項４６に記載の方法。
【請求項５３】
自家性標的非ケラチノサイト上皮（ＮＫＥ）細胞を製造する方法であって、
ａ）対象から得られた前記標的ＮＫＥ細胞をフィーダー細胞、カルシウム含有培地、および少なくとも１つのＲｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤の存在下で培養して、生体外の自家性標的ＮＫＥ細胞集団を産生すること、及び
ｂ）前記生体外の自家性標的ＮＫＥ細胞集団を回収すること、
を含む、前記方法。
【請求項５４】
前記自家性標的ＮＫＥ細胞は、前立腺細胞、乳房細胞、肝細胞、膵島細胞、肺上皮細胞、腎細胞、膀胱細胞、胃上皮細胞、大腸および小腸上皮細胞、尿道上皮細胞、精巣上皮細胞、卵巣上皮細胞、子宮頸部上皮細胞、甲状腺細胞、副甲状腺細胞、副腎細胞、胸腺細胞、胆嚢細胞、ならびに下垂体細胞からなる群から選択される、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
遺伝子改変された自家性標的非ケラチノサイト上皮（ＮＫＥ）細胞を製造する方法であって、
ａ）対象から得られた前記標的ＮＫＥ細胞をフィーダー細胞、カルシウム含有培地、および少なくとも１つのＲｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤の存在下で培養して、生体外の標的ＮＫＥ細胞集団を産生すること、
ｂ）生体外で前記標的ＮＫＥ細胞集団の少なくとも一部を遺伝子改変すること、
ｃ）遺伝子改変された前記標的ＮＫＥ細胞を選択すること、
ｄ）前記選択された遺伝子改変された標的ＮＫＥ細胞をフィーダー細胞、カルシウム含有培地、および少なくとも１つのＲｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤の存在下で培養して、生体外の遺伝子改変された自家性標的ＮＫＥ細胞集団を産生すること、及び
ｅ）生体外で遺伝子改変された前記自家性標的ＮＫＥ細胞集団を回収すること、
を含む、前記方法。
【請求項５６】
前記対象から得られる前記標的ＮＫＥ細胞は、肝細胞、肺上皮細胞、および膵島細胞からなる群から選択される、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記対象から得られる前記標的肝細胞は、第ＶＩＩＩ因子のコーディング領域を含む導入遺伝子を挿入することによって遺伝子改変される、請求項５５に記載の方法。
【請求項５８】
前記対象から得られる前記標的肺上皮細胞は、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）のコーディング領域を含む導入遺伝子を挿入することによって遺伝子改変される、請求項５５に記載の方法。