(57)【要約】【課題】骨格筋におけるグルコース毒性誘発インスリン抵抗性の特徴を有する、培養操作性にすぐれた培養細胞株、および該細胞株を用いた、インスリン抵抗性を改善する作用を有する化合物をスクリーニングする方法を提供する。【解決手段】インスリン受容体をコードするＤＮＡおよび４型糖輸送担体をコードするＤＮＡを導入したＣＨＯ細胞であって、インスリン抵抗性を示す細胞、ならびにグルコースおよび試験物質の存在下で前培養した該細胞のインスリン応答性を測定することにより、インスリン抵抗性を改善する作用を有する物質をスクリーニングする方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
インスリン受容体をコードするＤＮＡおよび４型糖輸送担体をコードするＤＮＡを導入したＣＨＯ細胞であって、インスリン抵抗性を示す細胞。
【請求項２】
インスリン受容体をコードするＤＮＡが、以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれか１項に記載のＤＮＡである請求項１に記載の細胞。
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列を有するＤＮＡ
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１つ以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有し、かつインスリン受容体活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
（ｄ）配列番号１で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつインスリン受容体活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
【請求項３】
４型糖輸送担体をコードするＤＮＡが、以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれか１項に記載のＤＮＡである請求項１または２に記載の細胞。
（ａ）配列番号４で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
（ｂ）配列番号３で表される塩基配列を有するＤＮＡ
（ｃ）配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１つ以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有し、かつ４型糖輸送担体活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
（ｄ）配列番号３で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ４型糖輸送担体活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
【請求項４】
配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１つ以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有し、かつ４型糖輸送担体活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡが、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれか１項に記載のＤＮＡである請求項３に記載の細胞。
（ａ）配列番号４で表されるアミノ酸配列の４６〜８２番目の領域に１つ以上のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列を有し、かつ４型糖輸送担体活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
（ｂ）配列番号６で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
（ｃ）配列番号５で表される塩基配列を有するＤＮＡ
【請求項５】
インスリン受容体をコードするＤＮＡおよび４型糖輸送担体をコードするＤＮＡをＣＨＯ細胞に導入し、該細胞をグルコース存在下およびグルコース非存在下でそれぞれ前培養を行った後に、細胞のインスリン応答性を測定し、グルコース非存在下で前培養したときのインスリン応答性と比較して、グルコース存在下で前培養したときのインスリン応答性が低下した細胞を選択することを特徴とする、請求項１に記載の細胞を取得する方法。
【請求項６】
インスリン存在下および非存在下で以下の（ａ）〜（ｅ）の少なくとも１つを測定し、（ａ）〜（ｄ）の場合はインスリン非存在下と比較してインスリン存在下での増加量を指標として、（ｅ）の場合はインスリン非存在下と比較してインスリン存在下での減少量を指標として、細胞のインスリン応答性を測定する請求項５に記載の方法。
（ａ）４型糖輸送担体の細胞表面への移行量
（ｂ）細胞の糖取り込み量
（ｃ）細胞のグリコーゲン合成酵素活性
（ｄ）細胞内グリコーゲン含量
（ｅ）細胞のグリコーゲン分解酵素活性
【請求項７】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞を、グルコースおよび試験物質存在下で、およびグルコース存在下かつ試験物質非存在下でそれぞれ前培養した後、それぞれの細胞のインスリン応答性を測定し、試験物質非存在下で前培養した場合のインスリン応答性と比較して、試験物質存在下で前培養した場合のインスリン応答性が増加する試験物質を選択することを特徴とする、インスリン抵抗性を改善する作用を有する物質のスクリーニング方法。
【請求項８】
細胞のインスリン応答性を、インスリン存在下および非存在下で以下の（ａ）〜（ｅ）の少なくとも１つを測定し、（ａ）〜（ｄ）の場合はインスリン非存在下と比較してインスリン存在下での増加量を指標として、（ｅ）の場合はインスリン非存在下と比較してインスリン存在下での減少量を指標として測定することを特徴とする請求項７に記載の方法。
（ａ）４型糖輸送担体の細胞表面への移行量
（ｂ）細胞の糖取り込み量
（ｃ）細胞のグリコーゲン合成酵素活性
（ｄ）細胞内グリコーゲン含量
（ｅ）細胞のグリコーゲン分解酵素活性
【請求項９】
以下の式に示す構造を有する化合物を有効成分とする糖尿病治療薬。
【化１】
2004215616.tif 000053
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、インスリン抵抗性を示す細胞、該細胞の取得方法および該細胞を用いたインスリン抵抗性を改善する作用を有する物質のスクリーニング方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
インスリンの血糖降下作用は、標的組織においてインスリン受容体へと結合したインスリンが、４型糖輸送担体（以下、ＧＬＵＴ４と称する）を細胞内プールから細胞表面へと移行させ、細胞表面上のＧＬＵＴ４を介して糖を細胞内へと取り込ませることにより発現される。インスリン標的組織におけるインスリンの作用が不全となった状態は、インスリン抵抗性と呼ばれ、２型糖尿病のもっとも重要な原因の１つであると考えられている。インスリン抵抗性の主な発症機序として、高血糖によりインスリン作用不全が生じる現象が知られており、この現象はグルコース毒性に基づくインスリン抵抗性と呼ばれる。糖尿病の発症前段階である耐糖能異常者では、毎食後にくり返し高血糖状態になる。また、糖尿病を発症した患者では高血糖状態が慢性化している。したがって、グルコース毒性に基づくインスリン抵抗性の発症は、糖尿病の発症や、糖尿病病態の悪循環形成の一因となり、さらなる病態の悪化に寄与すると考えられている。（例えば、非特許文献１参照）。以上より、グルコース毒性に基づくインスリン抵抗性を改善することは、糖尿病の発症予防、病態の改善、ならびに病態の悪化を防止する上で極めて重要と考えられる。
【０００３】
インスリン刺激による血中グルコースのクリアランスは、主に骨格筋と脂肪において行われるが、なかでも骨格筋においては、インスリンによるグルコースクリアランスの７０−８０％が行われることが知られている（例えば、非特許文献２参照）。したがって、骨格筋でのインスリン抵抗性の発症メカニズムを理解することは非常に重要である。骨格筋では、高濃度グルコースに曝露させるだけでインスリン抵抗性が生じることが培養筋細胞（例えば、非特許文献３参照）、単離骨格筋（例えば、非特許文献４参照）、１型糖尿病患者やインスリン欠乏動物モデル（例えば、非特許文献５参照）において示されている。また、このとき細胞表面上に移行したＧＬＵＴ４量の低下が認められている（例えば、非特許文献６参照）。さらに、インスリン抵抗性を示す骨格筋では、ＧＬＵＴ４の発現量には変化がないことが知られている。（例えば、非特許文献７参照）。すなわち、骨格筋においては、グルコース曝露により、ＧＬＵＴ４量の低下ではなく、ＧＬＵＴ４の移行に障害が生じることによって、インスリン抵抗性が発現する。
【０００４】
一方、脂肪では、高濃度グルコース曝露だけではインスリン抵抗性が惹起されず、高濃度グルコース曝露に加えて高濃度のインスリン曝露によって初めてインスリン抵抗性が惹起される（例えば、非特許文献８参照）。また、インスリン抵抗性を示す脂肪細胞ではＧＬＵＴ４発現量が低下しており、発現量の低下とインスリン抵抗性に相関があることが示されている（例えば、非特許文献７参照）。このように、骨格筋におけるグルコース毒性に基づくインスリン抵抗性発症のメカニズムは骨格筋と脂肪とでは異なる。したがって、骨格筋におけるグルコース毒性に基づくインスリン抵抗性を改善するような物質を見出すためには、脂肪ではなく、骨格筋、あるいは、骨格筋細胞でのインスリン抵抗性の特徴を示す細胞を用いることが肝要である。また、そのような物質を選択するための指標としては、グルコース毒性に基づいて低下した細胞表面上へのＧＬＵＴ４の移行量を回復させることを指標とするのが有用である。
【０００５】
骨格筋、あるいは、骨格筋より単離した細胞を材料として用いて物質の探索を行うことは、骨格筋の単離、および、骨格筋細胞の単離のための操作が煩雑なこと、また一度に探索できる物質数が少ないこと、さらにコストが高いことなどから、多くの物質を検索するには不向きである。これに加えて、骨格筋は膜構造が複雑であるので、細胞表面へ移行したＧＬＵＴ４量を、簡便かつ定量的に検出する方法は知られていない。一方、培養細胞株を用いる場合には、細胞株が骨格筋におけるインスリン抵抗性の特徴を保持していることが必要である。例えば、ラットの骨格筋由来の培養細胞株、Ｌ６細胞は高濃度グルコースに加えてインスリン存在下に前培養することで、グルコース毒性に基づくインスリン抵抗性を発現する（例えば、非特許文献９および非特許文献１０参照）が、グルコース曝露のみによってインスリン抵抗性を発現するか否かについては明らかではない。さらに、Ｌ６細胞を筋細胞へ分化させるため５〜６日間の培養を行う必要があることから、この細胞を実験に供するまでには時間と煩雑な操作を要する。したがって、Ｌ６筋細胞は多くの物質を検索するための十分な実験材料とは言えない。ここで、チャイニーズハムスター卵巣由来の細胞株であるＣＨＯ細胞はインスリン標的組織由来の細胞ではないものの、インスリン受容体とＧＬＵＴ４を共発現させると、インスリンに応答して細胞表面へのＧＬＵＴ４の移行が生じ、糖取り込みが上昇することが報告されている（例えば、非特許文献１１参照）。また、ｃ−ｍｙｃエピトープをタグとしてその分子内に挿入したＧＬＵＴ４（ＧＬＵＴ４ｍｙｃ）を発現させたＣＨＯ細胞株では、抗ｃ−ｍｙｃエピトープ抗体を用いることによって、インスリン刺激に応じたＧＬＵＴ４ｍｙｃの細胞表面への移行を簡便にかつ定量的に検出できることが報告されている（例えば、非特許文献１１参照）。さらに、本細胞株は、親株のＣＨＯ細胞と同様に培養操作性に優れており、多くの物質の検索をするための実験材料として適している。しかしながら、本細胞株が骨格筋と同様にグルコース毒性に基づくインスリン抵抗性を発現するか否か、すなわち、グルコース曝露のみによってインスリン刺激によるＧＬＵＴ４の移行量の低下や糖取り込みの低下が認められるか否かについては知られていない。また、インスリン受容体とＧＬＵＴ４を共発現させたすべてのＣＨＯ細胞株が、グルコース毒性に基づくインスリン抵抗性を示すか否かについても知られていない。
【０００６】
【非特許文献１】
Ｒ．Ｃ．カーン（Ｒ．  Ｃ．  Ｋａｈｎ）およびＧ．Ｃ．ワイア（Ｇ．  Ｃ．  Ｗｅｉｒ）編，「ジョスリンズ・ダイアビーティス・メリトゥス（Ｊｏｓｌｉｎ’ｓ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｍｅｌｌｉｔｕｓ）」，（米国），第１３版，リー・アンド・フェブリガー（Ｌｅａ  ａｎｄ  Ｆｅｂｌｉｇｅｒ），１９９４年，ｐ．２４７−２４８，２６０−２６１
【０００７】
【非特許文献２】
「ダイアビーティーズ（Ｄｉａｂｅｔｅｓ）」，（米国），１９８１年，第３０巻，第１２号，ｐ．１０００−１００７
【０００８】
【非特許文献３】
「ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」，（米国），１９８９年，第２６４巻，第１１号，ｐ．６５８７−６５９５
【０００９】
【非特許文献４】
「ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」，（米国），１９８６年，第２６１巻，第３６号，ｐ．１６８２７−１６８３３
【００１０】
【非特許文献５】
Ｒ．Ｃ．カーン（Ｒ．  Ｃ．  Ｋａｈｎ）およびＧ．Ｃ．ワイア（Ｇ．  Ｃ．  Ｗｅｉｒ）編，「ジョスリンズ・ダイアビーティーズ・メリトゥス（Ｊｏｓｌｉｎ’ｓ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｍｅｌｌｉｔｕｓ）」，（米国），第１３版，リー・アンド・フェブリガー（Ｌｅａ  ａｎｄ  Ｆｅｂｌｉｇｅｒ），１９９４年，ｐ．２６０
【００１１】
【非特許文献６】
「ザ・ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ）」，（米国），１９９８年，第１０１巻，第１１号，ｐ．２３７７−２３８６
【００１２】
【非特許文献７】
Ｒ．Ｃ．カーン（Ｒ．  Ｃ．  Ｋａｈｎ）およびＧ．Ｃ．ワイア（Ｇ．  Ｃ．  Ｗｅｉｒ）編，「ジョスリンズ・ダイアビーティーズ・メリトゥス（Ｊｏｓｌｉｎ’ｓ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｍｅｌｌｉｔｕｓ）」，（米国），第１３版，リー・アンド・フェブリガー（Ｌｅａ  ａｎｄ  Ｆｅｂｌｉｇｅｒ），１９９４年，ｐ．２５６−２５９
【００１３】
【非特許文献８】
「ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」，（米国），１９８９年，第２６４巻，第１４号，ｐ．８１５６−８１６３
【００１４】
【非特許文献９】
「ザ・ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ）」，（米国），２００１年，第１０８巻，第３号，ｐ．３７１−３８１
【００１５】
【非特許文献１０】
「ダイアビーティーズ（Ｄｉａｂｅｔｅｓ）」，（米国），２００２年，第５１巻，第７号，ｐ．２０９０−２０９８
【００１６】
【非特許文献１１】
「ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」，（米国），１９９３年，第２６８巻，第１９号，ｐ．１４５２３−１４５２６
【００１７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明が解決しようとする課題は、骨格筋におけるグルコース毒性誘発インスリン抵抗性の特徴を有する、培養操作性にすぐれた培養細胞株、および該細胞株を用いた、インスリン抵抗性改善作用を有する化合物を探索する方法を提供することにある。
【００１８】
【課題を解決するための手段】
本発明は、以下の（１）〜（９）に関する。
（１）インスリン受容体をコードするＤＮＡおよび４型糖輸送担体をコードするＤＮＡを導入したＣＨＯ細胞であって、インスリン抵抗性を示す細胞。
（２）インスリン受容体をコードするＤＮＡが、以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれか１項に記載のＤＮＡである（１）に記載の細胞。
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列を有するＤＮＡ
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１つ以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有し、かつインスリン受容体活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
（ｄ）配列番号１で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつインスリン受容体活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
【００１９】
（３）４型糖輸送担体をコードするＤＮＡが、以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれか１項に記載のＤＮＡである（１）または（２）に記載の細胞。
（ａ）配列番号４で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
（ｂ）配列番号３で表される塩基配列を有するＤＮＡ
（ｃ）配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１つ以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有し、かつ４型糖輸送担体活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
（ｄ）配列番号３で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ４型糖輸送担体活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
（４）配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１つ以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有し、かつ４型糖輸送担体活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡが、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれか１項に記載のＤＮＡである（３）に記載の細胞。
（ａ）配列番号４で表されるアミノ酸配列の４６〜８２番目の領域に１つ以上のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列を有し、かつ４型糖輸送担体活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
（ｂ）配列番号６で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
（ｃ）配列番号５で表される塩基配列を有するＤＮＡ
【００２０】
（５）インスリン受容体をコードするＤＮＡおよび４型糖輸送担体をコードするＤＮＡをＣＨＯ細胞に導入し、該細胞をグルコース存在下およびグルコース非存在下でそれぞれ前培養を行った後に、細胞のインスリン応答性を測定し、グルコース非存在下で前培養したときのインスリン応答性と比較して、グルコース存在下で前培養したときのインスリン応答性が低下した細胞を選択することを特徴とする、（１）に記載の細胞を取得する方法。
（６）インスリン存在下および非存在下で以下の（ａ）〜（ｅ）の少なくとも１つを測定し、（ａ）〜（ｄ）の場合はインスリン非存在下と比較してインスリン存在下での増加量を指標として、（ｅ）の場合はインスリン非存在下と比較してインスリン存在下での減少量を指標として、細胞のインスリン応答性を測定する（５）に記載の方法。
（ａ）４型糖輸送担体の細胞表面への移行量
（ｂ）細胞の糖取り込み量
（ｃ）細胞のグリコーゲン合成酵素活性
（ｄ）細胞内グリコーゲン含量
（ｅ）細胞のグリコーゲン分解酵素活性
【００２１】
（７）（１）〜（３）のいずれか１項に記載の細胞を、グルコースおよび試験物質存在下で、およびグルコース存在下かつ試験物質非存在下でそれぞれ前培養した後、それぞれの細胞のインスリン応答性を測定し、試験物質非存在下で前培養した場合のインスリン応答性と比較して、試験物質存在下で前培養した場合のインスリン応答性が増加する試験物質を選択することを特徴とする、インスリン抵抗性を改善する作用を有する物質のスクリーニング方法。
（８）細胞のインスリン応答性を、インスリン存在下および非存在下で以下の（ａ）〜（ｅ）の少なくとも１つを測定し、（ａ）〜（ｄ）の場合はインスリン非存在下と比較してインスリン存在下での増加量を指標として、（ｅ）の場合はインスリン非存在下と比較してインスリン存在下での減少量を指標として測定することを特徴とする（７）に記載の方法。
（ａ）４型糖輸送担体の細胞表面への移行量
（ｂ）細胞の糖取り込み量
（ｃ）細胞のグリコーゲン合成酵素活性
（ｄ）細胞内グリコーゲン含量
（ｅ）細胞のグリコーゲン分解酵素活性
（９）以下の式に示す構造を有する化合物を有効成分とする糖尿病治療薬。
【００２２】
【化２】
2004215616.tif 000002
【００２３】
【発明の実施の形態】
１．インスリン抵抗性を示す細胞
本発明の細胞は、以下のようにして取得できる。まず、ＣＨＯ細胞にインスリン受容体をコードするＤＮＡをおよびＧＬＵＴ４をコードするＤＮＡを導入することにより、インスリン受容体およびＧＬＵＴ４を発現する形質転換細胞を作製する。得られた細胞を、グルコース存在下およびグルコース非存在下でそれぞれ前培養を行った後に、細胞のインスリン応答性を測定する。グルコース非存在下でのインスリン応答性と比較してグルコース存在下のインスリン応答性が低下した細胞を、本発明のインスリン抵抗性を示す細胞として選択する。
【００２４】
（１）ＣＨＯ細胞
ＣＨＯ細胞には、チャイニーズハムスターの卵巣に由来する細胞株であるＣＨＯ〔Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．，  １０８，  ９４５  （１９５８）〕、およびＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＣＬ−６１）、ＣＨＯ（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｒｅｅ）（ＥＣＡＣＣ  Ｎｏ．００１０２３０７）、ＣＨＯ／ｄｈｆｒ−（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ−９０９６）、ＣＨＯ／ＤＧ４４〔Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ７７，  ４２１６  （１９８０）〕、ｐｒｏ−５（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ−１７８１）、ＣＨＯ  ｄＤＸＢ１１〔Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ７７，  ４２１６  （１９８０）〕等のＣＨＯに由来する細胞株が含まれる。ＣＨＯに由来する細胞には、ＣＨＯを親株または宿主として作製したサブクローン、変異株または形質転換株、さらにこれらのサブクローン、変異株または形質転換株を親株または宿主として作製したサブクローン、変異株または形質転換株等が含まれる。
【００２５】
（２）インスリン受容体をコードするＤＮＡおよびＧＬＵＴ４をコードするＤＮＡの調製
本発明において、インスリン受容体には、インスリン受容体活性を有するポリペプチドが全て含まれる。インスリン受容体をコードするＤＮＡとしては、（ａ）配列番号２で表されるヒトインスリン受容体のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、（ｂ）配列番号１で表される塩基配列を有するヒトインスリン受容体ｃＤＮＡ、（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１つ以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有し、かつインスリン受容体活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、（ｄ）配列番号１で表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、インスリン受容体活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡをあげることができる。
【００２６】
本発明において、ＧＬＵＴ４には、ＧＬＵＴ４活性を有するポリペプチドが全て含まれる。ＧＬＵＴ４をコードするＤＮＡとしては、例えば（ａ）配列番号４で表されるヒトＧＬＵＴ４のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、（ｂ）配列番号３で表される塩基配列を有するヒトＧＬＵＴ４ｃＤＮＡ、（ｃ）配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１つ以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有し、かつＧＬＵＴ４活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、（ｄ）配列番号３で表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、ＧＬＵＴ４活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡをあげることができる。また、配列番号４で表されるアミノ酸配列において、１つ以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有し、かつＧＬＵＴ４活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡとして、特に（ｅ）ヒトＧＬＵＴ４の細胞外ループにあたる、配列番号４で表されるアミノ酸配列の４６〜８２番目の領域に１つ以上のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列を有し、かつ４型糖輸送担体活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡをあげることができる。欠失、置換または付加されるアミノ酸の数としては、１〜数十個が好ましく、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１０個である。また、置換または付加するアミノ酸配列を適当なエピトープ（タグ）の配列を含む配列にすることにより、そのタグの配列を認識する抗体により細胞表面上に移行したＧＬＵＴ４を容易に検出することができる。このような目的に適するタグとしては、ヒトｃ−ｍｙｃエピトープ（配列番号７）、ＦＬＡＧペプチド（配列番号８）、Ｓタグ（配列番号９）、Ｖ５エピトープ（配列番号１０）、インフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）タグ（配列番号１１）等をあげることができる。
【００２７】
配列番号４で表されるアミノ酸配列の４６〜８２番目の領域に１個以上のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列を有し、かつ４型糖輸送担体活性を有するポリペプチドの例として、配列番号６で表されるアミノ酸からなるポリペプチドをあげることができる。配列番号６で表されるアミノ酸配列は、配列番号４の６６番目プロリンと６７番目グルタミン酸の間に、ヒトｃ−ｍｙｃのエピトープ配列を含む１６アミノ酸からなる配列を付加した配列である。配列番号６で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡとして、配列番号５で表される塩基配列を有するＤＮＡをあげることができる。
【００２８】
配列番号１に示す塩基配列を有するＤＮＡは、例えば、ヒトｃＤＮＡを鋳型とし、配列番号１の５’末端の１５塩基以上の連続する配列をその３’末端に含む塩基配列からなるＤＮＡと配列番号１の３’末端の１５塩基以上の連続する配列と相補的な配列をその３’末端に含む塩基配列からなるＤＮＡとをプライマーとするＰＣＲを行うことにより増幅した断片を、適当なクローニングベクターに挿入することにより、単離することができる。
【００２９】
配列番号３に示す塩基配列を有するＤＮＡは、例えば、ヒトｃＤＮＡを鋳型とし、配列番号３の５’末端の１５〜３０塩基の連続する配列をその３’末端に含む塩基配列からなるＤＮＡと配列番号３の３’末端の１５〜３０塩基の連続する配列と相補的な配列をその３’末端に含む塩基配列からなるＤＮＡとをプライマーとするＰＣＲを行うことにより増幅した断片を、適当なクローニングベクターに挿入することにより、単離することができる。
【００３０】
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとしては、配列番号３で表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡを固定化したフィルターと、０．７〜１．０ｍｏｌ／ｌのＮａＣｌ存在下、４２〜６５℃でハイブリダイゼーションを行い、続いて０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（ｓａｌｉｎｅ−ｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ）溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍｍｏｌ／ｌＬ  ＮａＣｌ、１５ｍｍｏｌ／ｌクエン酸ナトリウムよりなる）を用いて、４２〜６５℃条件下でフィルターを洗浄した後、なおハイブリダイズしているＤＮＡをあげることができる。配列番号３で表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡは、上記で得られる配列番号３に示す塩基配列を有するＤＮＡ（２本鎖）を、変性（センス鎖とアンチセンス鎖に分離）して得ることができる。ＤＮＡの変性と固定、ハイブリダイゼーション、洗浄は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  （２００１）に記載されている方法に準じて行うことができる。
【００３１】
（３）インスリン受容体およびＧＬＵＴ４を発現するＣＨＯ細胞の作製
インスリン受容体をコードするＤＮＡおよびＧＬＵＴ４をコードするＤＮＡを、それぞれのＤＮＡを含む発現ベクター、または両方のＤＮＡを含む発現ベクターとしてＣＨＯ細胞に導入することにより、該細胞でインスリン受容体およびＧＬＵＴ４を発現させることができる。
【００３２】
インスリン受容体をコードするＤＮＡまたはＧＬＵＴ４をコードするＤＮＡを挿入する発現用ベクターとしては、ほ乳類細胞で機能するプロモーターおよびポリアデニル化シグナルを有するものが用いられる。さらに、継代を重ねても導入したＤＮＡが安定して保持される形質転換細胞を選択するためには、薬剤耐性遺伝子の発現ユニット（プロモーターの下流に薬剤耐性遺伝子とポリアデニル化シグナルを順に連結した構造）を有するものが好ましい。
【００３３】
ほ乳類細胞で機能するプロモーターとしては、例えば、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のＩＥ（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、モロニーネズミ白血病ウイルスのロング・ターミナル・リピート（ＬＴＲ）、ラウス肉腫ウイルスのＬＴＲ、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子のプロモーター、延長因子−１のプロモーター、ユビキチンＣ遺伝子のプロモーター、ヒートショック蛋白質プロモーター、メタロチオネインのプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーターとヒト免疫不全ウイルスのＬＴＲを組み合わせたＳＲαプロモーター等をあげることができる。上記プロモーターと共に、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサー等も用いることができる。ポリアデニル化シグナルとしては、いかなるポリアデニル化シグナルも利用できるが、例えば、ＳＶ４０初期遺伝子のポリアデニル化シグナル、ウサギβグロビン遺伝子のポリアデニル化シグナル、ウシ成長ホルモンのポリアデニル化シグナル等を用いることができる。薬剤耐性遺伝子としては、Ｇ４１８耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ブラストサイジン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子等があげられる。薬剤耐性遺伝子の発現ユニットのプロモーターとポリアデニル化シグナルは上記のプロモーターとポリアデニル化シグナルを用いることができる。
【００３４】
上記の発現用ベクターとしては、例えば、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）〔インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社製〕、ｐＡＧＥ１０７〔特開平３−２２９７９、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ３，  １３３  （１９９０）〕、ｐＡＳ３−３（特開平２−２２７０７５）、ｐＣＤＭ８〔Ｎａｔｕｒｅ，  ３２９，  ８４０  （１９８７）〕、ｐＣＭＶ−Ｓｃｒｉｐｔ〔ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ（ストラタジーン）社製〕、ｐＲＥＰ４（インビトロジェン社製）、ｐＡＧＥ１０３〔Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  １０１，  １３０７  （１９８７）〕、ｐＡＧＥ２１０（ＷＯ９７／１０３５４）等をあげることができる。このような発現用ベクターのプロモーターとポリアデニル化シグナルの間に、インスリン受容体をコードするＤＮＡを挿入することで、インスリン受容体発現ベクターを調製できる。また、同様に、ＧＬＵＴ４をコードするＤＮＡを発現ベクターに挿入することで、ＧＬＵＴ４発現ベクターを調製できる。また、このようにして構築したインスリン受容体発現ベクターにさらに、プロモーター、ＧＬＵＴ４をコードするＤＮＡおよびポリアデニル化シグナルを順に連結したＧＬＵＴ４発現ユニットを挿入して作製したインスリン受容体・ＧＬＵＴ４発現ベクターも以下の発現に用いることができる。
【００３５】
ＣＨＯ細胞にインスリン受容体発現ベクターおよびＧＬＵＴ４発現ベクターを導入するか、あるいはインスリン受容体・ＧＬＵＴ４発現ベクターを導入する。ＣＨＯ細胞への組換えベクターの導入方法としては、動物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ３，  １３３  （１９９０）〕、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法〔Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８４，  ７４１３  （１９８７）〕、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  ５２，  ４５６  （１９７３）等をあげることができる。形質転換する操作を行った後に、発現ベクター中の薬剤耐性遺伝子に応じて、Ｇ４１８やハイグロマイシン等の薬剤への耐性を指標に、インスリン受容体とＧＬＵＴ４を安定して発現している形質転換細胞を選択できる。
【００３６】
（４）インスリン抵抗性を示す細胞株の選択
（３）で選択した形質転換細胞株をグルコース存在下およびグルコース非存在下で前培養を行った後、それぞれの細胞をインスリン刺激したときの細胞応答を指標に細胞のインスリン応答性を測定する。グルコース存在下で前培養した場合のインスリン応答性が、グルコース非存在下に前培養を行った細胞に比べて低下することを指標として、インスリン抵抗性を示す形質転換細胞株を選択することができる。
【００３７】
インスリン応答性の指標となる細胞応答としては、糖取り込み量の増加、ＧＬＵＴ４の細胞表面への移行量の増加、細胞のグリコーゲン合成酵素活性の増加、細胞内グリコーゲン含量の増加、および細胞のグリコーゲン分解酵素活性の減少があげられるが、これらに限定されるものではない。ＧＬＵＴ４の細胞表面への移行量を定量する方法としては、抗ＧＬＵＴ４抗体を用いたウェスタンブロットまたはＥＬＩＳＡがあげられる。ｃ−ｍｙｃエピトープなどのタグを細胞外ループに挿入したＧＬＵＴ４を発現させた場合は、タグを特異的に認識する抗体を用いたウェスタンブロットまたはＥＬＩＳＡによってもＧＬＵＴ４の細胞表面への移行量を定量することができる。例えば、タグとしてｃ−ｍｙｃエピトープを挿入したＧＬＵＴ４は、ｃ−ｍｙｃエピトープに対する抗体、好ましくは９Ｅ１０を用いて検出することができる。
【００３８】
ＥＬＩＳＡは、以下のようにして行うことができる。インスリン刺激時に同時に抗ＧＬＵＴ４抗体またはタグを特異的に認識する抗体を添加し、細胞表面に移行したＧＬＵＴ４と抗体を反応させた後、細胞をグルタルアルデヒドでマルチウェルプレートに固定化する。添加した抗ＧＬＵＴ４抗体またはタグを特異的に認識する抗体と結合する、ペルオキシダーゼ等の酵素またはビオチンで標識した抗体（例えば、添加した抗体の免疫に用いた動物のＩｇＧに対する抗体をペルオキシダーゼで標識した抗体等）を添加して、抗ＧＬＵＴ４抗体またはタグを特異的に認識する抗体と反応させる。ビオチン標識抗体を添加した場合は、さらにアビジンで標識したペルオキシダーゼ等の酵素を添加してビオチン標識抗体と反応させる。酵素反応により発色する基質を添加して反応させた後、発色量を分光高度計で測定する。
【００３９】
ウェスタンブロットは、以下のようにして行うことができる。インスリン刺激後の細胞を超音波等で破砕し、遠心分離により、上清（細胞質画分）と沈殿（細胞膜画分）を分離する。細胞膜画分を試料としてＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）をした後、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜に転写する。ＰＶＤＦ膜と抗ＧＬＵＴ４抗体またはタグを特異的に認識する抗体を反応させた後、添加した抗ＧＬＵＴ４抗体またはタグを特異的に認識する抗体と結合する、ペルオキシダーゼ等の酵素、ビオチン、１２５Ｉ等の放射性同位体等で標識した抗体（例えば、添加した抗体の免疫に用いた動物のＩｇＧに対する抗体をペルオキシダーゼで標識した抗体等）を添加して、抗ＧＬＵＴ４抗体またはタグを特異的に認識する抗体と反応させる。ビオチン標識抗体を添加した場合は、さらにアビジンで標識したペルオキシダーゼ等の酵素を添加してビオチン標識抗体と反応させる。酵素標識の場合は酵素反応により発色または発光する基質を添加して反応させ、発光基質の場合はＰＶＤＦ膜のオートラジオグラフィーをさらに行い、バンドを検出する。放射性同位体標識の場合はＰＶＤＦ膜のオートラジオグラフィーを行い、バンドを検出する。
【００４０】
糖取り込み量は、以下のようにして測定できる。インスリン刺激時に、インスリンと同時に３Ｈ等の放射性同位元素で標識した２−デオキシグルコースを添加した培地で３０分間培養し、糖を取り込みを開始させた後、糖取り込みの阻害剤であるフロレチンおよびグルコースを含む培地を添加することによって反応を停止させる。培地を除き、細胞に取り込まれた２−デオキシグルコースの量の指標として、細胞の放射能量を液体シンチレーションカウンター等の放射能測定器で測定する。
【００４１】
細胞のグリコーゲン合成酵素活性は、文献〔Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ２５，  ４８６  （１９６８）〕の記載に基づき、放射標識されたＵＤＰ−グルコースおよびグリコーゲンをインキュベートし、グリコーゲンへ取り込まれた放射標識グルコースの放射活性を定量することによって測定できる。
細胞内グリコーゲン含量は、文献〔Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  １１，  ２５６  （１９６５）〕の記載に基づき、細胞より抽出されたグリコーゲンをα−アミログルコシダーゼによってグルコースに分解した後、生じたグルコースを定量することによって測定できる。
【００４２】
細胞のグリコーゲン分解酵素活性は、ホスホグルコムターゼとグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼを共役させた実験系にて生成されるＮＡＤＰＨの吸光度を指標として間接的に測定する方法や、文献〔Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ４７，  ２０  （１９７２）〕の記載に基づき、放射標識されたグルコース−１−リン酸を用いた実験系にて直接的に測定することができる。
【００４３】
また、用いるグルコースの培地中での終濃度は、好ましくは１〜１００ｍｍｏｌ／ｌ、最も好ましくは１〜５０ｍｍｏｌ／ｌであるが、これらに限定されず、グルコース存在下に培養することによってインスリン抵抗性が誘発される濃度であればよい。また、前培養時の培地、培養温度、培養時間などのその他の培養条件は、細胞が生存して、グルコース処理によってインスリン抵抗性が誘発される条件であればよいが、好ましくは、使用される細胞株に適合した培地（ウシ胎児血清等の血清成分を添加してもよい）、あるいは、生理的な塩類を含む緩衝液を使用し、４〜６％（最も好適には５％）の炭酸ガスを含む空気存在下、３６〜３８℃（最も好適には３７℃）、２〜１８時間（最も好ましくは１６時間）である。
【００４４】
２．インスリン抵抗性を示す細胞を用いたインスリン抵抗性改善作用を有する物質のスクリーニング法
１．で選択されたインスリン抵抗性を示す細胞を用いて、以下のようにしてインスリン抵抗性改善作用を有する物質のスクリーニングを行うことができる。まず、インスリン抵抗性を示す細胞を、グルコースおよび試験物質存在下で、またはグルコース存在下かつ試験物質非存在下で前培養した後、それぞれの細胞をインスリン刺激した時の細胞応答を指標に細胞のインスリン応答性を測定する。グルコース存在下での細胞の前培養は、１．（４）に記載の培養条件と同様にして行うことができる。細胞のインスリン応答性は１．（４）に記載の方法で測定することができる。試験物質存在下で前培養した場合のインスリン応答性と比較して、試験物質非存在下で前培養した場合にインスリン応答性が増加する試験物質を選択することにより、インスリン抵抗性を改善する作用を有する物質のスクリーニングすることができる。
【００４５】
上記のスクリーニング法で選択されたインスリン抵抗性を改善する作用を有する物質は、糖尿病治療薬の有効成分として有用である。
上記のスクリーニング法で選択されたインスリン抵抗性を改善する作用を有する物質として、以下の構造式に示す構造を有する物質〔４，４’−オキシビス［Ｎ−（２−メチルフェニル）］ベンゼンスルホンアミド、以下化合物Ａとよぶ〕をあげることができる。化合物Ａは、ケムブリッジ（ＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅ）社から購入することができる（ＩＤ  Ｎｏ．５２３００６６）。
【００４６】
【化３】
2004215616.tif 000003
【００４７】
３．化合物Ａを有効成分として含有する糖尿病治療薬
化合物Ａは、そのまま単独で投与することも可能であるが、通常各種の医薬製剤として提供するのが望ましい。また、それら医薬製剤は、動物および人に使用されるものである。
本発明に係わる医薬製剤は、活性成分として化合物Ａを単独で、あるいは任意の他の治療のための有効成分との混合物として含有することができる。また、それら医薬製剤は、活性成分を薬理学的に許容される一種もしくはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られている任意の方法により製造される。
【００４８】
投与経路は、治療に際し最も効果的なものを使用するのが望ましく、経口または、例えば静脈内などの非経口をあげることができる。
投与形態としては、錠剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤、注射剤などがある。
経口投与に適当な、例えばシロップ剤のような液体調製物は、水、蔗糖、ソルビット、果糖などの糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコールなどのグリコール類、ゴマ油、オリーブ油、大豆油などの油類、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類などの防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミントなどのフレーバー類などを使用して製造できる。また、錠剤、散剤および顆粒剤などは、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニットなどの賦形剤、澱粉、アルギン酸ソーダなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルクなどの滑沢剤、ポリビニールアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチンなどの結合剤、脂肪酸エステルなどの界面活性剤、グリセリンなどの可塑剤などを用いて製造できる。
【００４９】
非経口投与に適当な製剤は、好ましくは受容者の血液と等張である活性化合物を含む滅菌水性剤からなる。例えば、注射剤の場合は、塩溶液、ブドウ糖溶液または塩水とブドウ糖溶液の混合物からなる担体などを用いて注射用の溶液を調製する。
また、これら非経口剤においても、経口剤で例示した希釈剤、防腐剤、フレーバー類、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、界面活性剤、可塑剤などから選択される１種もしくはそれ以上の補助成分を添加することもできる。
【００５０】
化合物Ａの投与量および投与回数は、投与形態、患者の年齢、体重、治療すべき症状の性質もしくは重篤度により異なるが、通常経口の場合、成人一人当り０．０１ｍｇ〜１ｇ、好ましくは０．０５〜５０ｍｇを一日一回ないし数回投与する。静脈内投与などの非経口投与の場合、成人一人当り０．００１〜１００ｍｇ、好ましくは０．０１〜１０ｍｇを一日一回ないし数回投与する。しかしながら、これら投与量および投与回数に関しては、前述の種々の条件により変動する。
【００５１】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００５２】
【実施例】
実施例１    インスリン抵抗性を示す細胞株の造成
（１）ヒトインスリン受容体とｃ−ｍｙｃエピトープを挿入したヒトＧＬＵＴ４を発現するＣＨＯ細胞の造成
ヒトインスリン受容体（以下、ｈＩＲと略す）ｃＤＮＡを含むプラスミド〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２６７，  １２７８８  （１９９２）、神戸大学  春日先生より供与〕から、長さ約４．２ｋｂのｈＩＲをコードする領域を含むｃＤＮＡ部分を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩによって切り出し、発現用ベクターｐＡＧＥ１１０（特開平５−３３６９６５）のＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入して、ｈＩＲ発現プラスミド、ｐＳＥｈＩＲを構築した。
【００５３】
ヒトＧＬＵＴ４ｃＤＮＡを含むプラスミド〔Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．，  ３１５，  １５３  （１９９６）、神戸大学  春日先生より供与〕のＧＬＵＴ４ｃＤＮＡ内に１箇所存在するＥｃｏ８１Ｉ切断部位に、配列番号１２および１３に示す塩基配列をそれぞれ有する合成ＤＮＡを挿入し、細胞外領域にｃ−ｍｙｃエピトープを挿入したヒトＧＬＵＴ４（以下、ｈＧＬＵＴ４ｍｙｃと称する）をコードするＤＮＡ（配列番号５）を含むプラスミドを構築した。ｈＧＬＵＴ４ｍｙｃは、ヒトＧＬＵＴ４の６６番目プロリンと６７番目グルタミン酸の間に、ヒトｃ−ｍｙｃのエピトープ配列を含む１６アミノ酸からなる配列（配列番号１４）を付加したアミノ酸配列（配列番号６）からなる。
【００５４】
このｈＧＬＵＴ４ｍｙｃをコードするＤＮＡをプラスミドから制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩで切り出し、発現用ベクターｐＡＧＥ２１０（ＷＯ９７／１０３５４）のＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩ間に挿入し、ｈＧＬＵＴ４ｍｙｃ発現プラスミド、ｐＳＥｈＧＬ４−ｍｙｃを構築した。まず、プラスミドｐＳＥｈＧＬ４−ｍｙｃをＣＨＯ細胞〔ＣＨＯ  ｄＤＸＢ１１、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ７７，  ４２１６  （１９８０）〕にエレクトロポレーション法により遺伝子導入し、ハイグロマイシン耐性によって形質転換細胞を選択した。次いで、プラスミドｐＳＥｈＩＲを同じくエレクトロポレーション法によって、この形質転換細胞に遺伝子導入し、Ｇ４１８耐性を獲得した細胞株についてモノクローン化を行い、ｈＩＲとｈＧＬＵＴ４ｍｙｃを発現するＣＨＯ細胞１２株を得た。
【００５５】
（２）インスリン応答性を示す細胞株の選択
（ａ）前培養
（１）で得られた細胞株を細胞培養用９６ウェルプレート（旭テクノグラス株式会社製）にて培養した。３７℃、５％炭酸ガス下で、５％ウシ胎児血清を含むα−ＭＥＭ（α−Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ；インビトロジェン社製）を用いてセミコンフルエントになるまで培養した後、培地を２０ｍｍｏｌ／ｌキシロースを添加した培地Ａ〔ＤＭＥＭ（インビトロジェン社製）を基礎培地として、１１０ｍｇ／ｌピルビン酸、０．１％ウシ血清アルブミン、６ｇ／ｌ  Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（４−ブタンスルホン酸）（ｐＨ７．２）を添加した培地〕に置換して、１晩培養を行った。
【００５６】
（ｂ）細胞表面に移行したＧＬＵＴ４の定量
抗ｃ−ｍｙｃエピトープを特異的に認識するマウスモノクローナル抗体９Ｅ１０を生産するハイブリドーマＭＹＣ１−９Ｅ１０．２（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−１７２９）を培養し、その培養上清を抗マウスＩｇＧアフィニティカラムにて精製し、９Ｅ１０を調製した。以下に示す９Ｅ１０を用いたＥＬＩＳＡにより、細胞表面に移行したＧＬＵＴ４の定量を行った。
【００５７】
（ａ）の培養を行った後、培養上清に６０ｎｍｏｌ／ｌインスリン（ウシインスリン、シグマ−アルドリッチ社製）と１．２μｇ／ｍｌ９Ｅ１０を添加し、３７℃にて３０分間インキュベーションを行った。対照としては、インスリンを添加せず１．２μｇ／ｍｌ９Ｅ１０のみを添加し、３７℃にて３０分間インキュベーションを行った。それぞれの上清を廃棄し、０．２５％グルタルアルデヒド溶液を添加し、１０分間、室温にて放置し固定化反応を行った。この上清を廃棄し、０．１ｍｏｌ／ｌグリシンを含むリン酸緩衝液を添加し、１０分間、室温にて放置することによって、固定化反応を停止した。この上清を廃棄し、５％スキムミルク、０．０５％トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０を含むリン酸緩衝液に置換し、ブロッキングを行った。この上清を廃棄し、ウェルを０．０５％トゥイーン２０を含むリン酸緩衝液にて洗浄した後、ビオチン化抗マウス抗体Ｆ（ａｂ）２フラグメント〔ベクター・ラボラトリーズ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）社製〕を含むリン酸緩衝液を添加し、室温にて１時間放置した。この上清を廃棄し、ウェルを０．０５％トゥイーン２０を含むリン酸緩衝液にて洗浄した後、アビジン化西洋ワサビペルオキシダーゼ（ベクター・ラボラトリーズ社製）を含むリン酸緩衝液を添加し、室温にて１時間放置した。この上清を廃棄し、ウェルを０．０５％トゥイーン２０を含むリン酸緩衝液にて洗浄した。それぞれのウェルについて、スミロン・ペルオキシダーゼ発色キット０（住友ベークライト社製）を用いて反応を行い、ペルオキシダーゼによる反応産物を波長４９０ｎｍの吸光度を測定することによって、細胞表面に移行したＧＬＵＴ４量を定量した。
【００５８】
インスリン添加時と非添加時の細胞表面に移行したＧＬＵＴ４量を比較し、インスリン添加時の細胞表面に移行したＧＬＵＴ４の増加量が多かった１株を、インスリン応答性を示す細胞株として選択した。選択した細胞株に対して、さらにモノクローン化の操作を行って得た２０株の中から、同様にしてインスリン応答性を測定し、比較的よくインスリン応答性を示す細胞３株を選択した。
【００５９】
（３）インスリン抵抗性を示す細胞株の選択
（２）で選択した３株について、（２）（ａ）と同様に前培養を行った。ただし、キシロースを添加した培地Ａ（以下、キシロース添加培地という）での培養の他に、キシロースの代わりに２０ｍｍｏｌ／ｌグルコースを添加した培地Ａ（以下、グルコース添加培地という）を用いた培養も行い、それぞれについて、（２）（ｂ）に記載した方法と同様にしてインスリン添加時とインスリン非添加時の細胞表面に移行したＧＬＵＴ４量を測定した。それぞれのインスリン添加時の細胞表面に移行したＧＬＵＴ４量を比較したところ、２株は、グルコースを含まないキシロース添加培地で前培養したときと比較して、グルコース添加培地で前培養したときのインスリン添加時の細胞表面に移行したＧＬＵＴ４量がかなり低下する性質を示した。このことは、この細胞株が、参考例１に示した骨格筋細胞と同様に、高濃度のインスリンを添加しなくとも２０ｍｍｏｌ／ｌという高濃度のグルコース存在下で前培養するだけで、グルコース毒性に基づくインスリン抵抗性が誘発されたことを示す。そのうち、測定値のばらつきの少ない１株を選択した。図１に選択した株のＧＬＵＴ４の細胞表面への移行量の測定結果を示した。最終的に選択された細胞株は、週２回の割合で継代操作を５ヶ月間行っても、そのインスリン応答性を示す性質、およびグルコース毒性に基づくインスリン抵抗性を示す性質は維持していたことから、薬剤の探索を安定して行う上で十分な性質を有することが確認された。
【００６０】
実施例２  細胞株のインスリン抵抗性の解析
（１）ウェスタンブロットによるＧＬＵＴ４発現量の定量
実施例１（２）（ａ）に記載の方法に準じて、実施例１で選択した細胞株を前培養した。ただし、培養は６ウェルプレート（旭テクノグラス株式会社製）で、実施例１（３）と同様にキシロース添加培地とグルコース添加培地それぞれを用いて行った。それぞれについて、６０ｎｍｏｌ／ｌになるようにインスリンを添加し、３７℃にて３０分間インキュベートし、インスリンによる刺激を行った。対照として、インスリンを添加せずに同様にインキュベートした。刺激の後、プレートを氷上に移し反応を停止させ、培養上清を捨てた。次に、予め氷冷しておいたリン酸緩衝液を用いて細胞を洗浄した。洗浄した細胞をＳＤＳ−ＰＡＧＥ用のサンプル調製用緩衝液（１０ｍｍｏｌ／ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、１％ＳＤＳ、１％メルカプトエタノール、２０％グリセロール）を用いて溶解した。細胞溶解液をマイクロチューブ中にて遠心分離操作を行い、得られた上清を細胞抽出液とした。細胞抽出液を５％から２０％の濃度勾配を有するポリアクリルアミドゲル（アトー社製）を用いて分離した。分離後、０．１ｍｏｌ／ｌ  Ｔｒｉｓ、０．１９２ｍｏｌ／ｌグリシンを含む２０％メタノール水溶液を用いて、タンパク質をＰＶＤＦ膜に転写した。転写後、膜を５％ウシ血清アルブミン、０．０５％トゥイーン２０を含むリン酸緩衝液を用いてブロッキングを行った。次に、一次抗体として１０μｇ／ｍｌの抗ｃ−ｍｙｃエピトープ抗体（９Ｅ１０）を、二次抗体として西洋ワサビペルオキシダーゼにて標識された抗マウス抗体Ｆ（ａｂ）２フラグメント（ベクター・ラボラトリーズ社製）を１０００倍に希釈して膜を処理した。抗体の検出は、エンハンスド・ケミカル・ルミネッセンス法（アマシャム・バイオサイエンシズ社製）によって行った。
【００６１】
その結果、図２に示すように、グルコース添加培地で前培養した、インスリン抵抗性を示す細胞は、キシロース添加培地で前培養したインスリン抵抗性を示さない細胞と同様に、インスリン添加時と非添加時でＧＬＵＴ４の発現量に変化は見られず、骨格筋におけるインスリン抵抗性と同様の性質を示した。
【００６２】
（２）細胞内への糖の取り込み量の測定
実施例１（２）（ａ）に記載の方法に準じて、実施例１で選択した細胞株を前培養した。ただし、培養は２４ウェルプレート（パッカード社製）で、実施例１（３）と同様にキシロース添加培地とグルコース添加培地それぞれを用いて行った。細胞を培地Ａにて３回洗浄することで、細胞外のグルコースを除去した後、６０ｎｍｏｌ／ｌインスリン、６０μｍｏｌ／ｌ  ２−デオキシグルコース（以下、２ＤＧと略す）、４４．４ｍＢｑ／ｍｌ  ２−（１，２−３Ｈ（Ｎ）−デオキシグルコース）（ＮＥＮ、パーキンエルマー社製）を含む培地Ａを添加し、糖取り込み反応を開始した。３７℃にて３０分間インキュベーションを行った後に、５ｍｍｏｌ／ｌフロレチン、５０ｍｍｏｌ／ｌグルコースを含む培地Ａを添加することによって反応を停止させた。反応停止後、直ちに上清を除去し、２０ｍｍｏｌ／ｌグルコースを含む培地Ａにて細胞を３回洗浄した。プレートを乾燥させた後、液体シンチレーター（マイクロシンチ０、パッカード社製）を添加した。細胞内に取り込まれた２ＤＧの放射活性は、ウェルプレート対応型シンチレーションカウンター（トップカウント、パッカード社製）を用いて測定した。
【００６３】
その結果、図３に示すように、実施例１で選択された細胞株は、グルコース添加培地で前培養することにより、インスリン添加時の細胞内への糖の取り込み量も低下し、グルコース毒性に基づくインスリン抵抗性が誘発されたことが示された。
【００６４】
実施例３  インスリン抵抗性を改善する薬剤のスクリーニング
（１）トログリタゾンによるインスリン抵抗性の改善
実施例１（２）（ａ）に記載の方法に準じて、実施例１で選択した細胞株を前培養した。ただし、培養は、実施例１（３）と同様にキシロース添加培地とグルコース添加培地それぞれを用いて行い、さらにグルコース添加培地の培養では、最後の１時間に、インスリン抵抗性を改善する作用を有する糖尿病治療薬であるトログリタゾン（三共株式会社製）〔Ｈｏｒｍ．  Ｍｅｔａｂ．  Ｒｅｓ．  ２９，  ２０３，  （１９９７）〕を１０μｍｏｌ／ｌの濃度になるように添加したものと添加しなかったものそれぞれの条件で培養した。それぞれについて、実施例１（３）に記載の方法に準じてインスリン添加時の細胞表面に移行したＧＬＵＴ４量を測定した。
【００６５】
その結果、図４に示すように、グルコース添加培地を用いた前培養により低下した、インスリン添加時の細胞表面に移行したＧＬＵＴ４量が、トログリタゾンを添加した前培養では回復し、インスリン抵抗性が改善されることが示された。したがって、キシロース添加培地、グルコース添加培地、グルコースおよび薬剤を添加した培地で細胞株を培養して、それぞれのインスリン応答性（インスリン添加時の細胞表面に移行したＧＬＵＴ４量）を測定して、比較することにより、薬剤の有するインスリン抵抗性を改善する作用を検出できることが確認できた。
【００６６】
（２）インスリン抵抗性を改善する薬剤のスクリーニング
（ａ）細胞表面に移行したＧＬＵＴ４量の測定によるスクリーニング
実施例１（２）（ａ）に記載の方法に準じて、実施例１で選択した細胞株を前培養した。ただし、培養は、実施例１（３）と同様にキシロース添加培地とグルコース添加培地それぞれを用いて行い、さらにグルコース添加培地では、種々の試験物質をさらに０．１μｍｏｌ／ｌの濃度で添加した培地と添加しない培地それぞれを用いて行った。それぞれについて、実施例１（３）に記載の方法に準じてインスリン添加時の細胞表面に移行したＧＬＵＴ４量を測定した。その結果、図５に示すように化合物Ａでは、グルコース添加培地を用いた前培養により低下した、インスリン添加時の細胞表面に移行したＧＬＵＴ４量が、化合物Ａを添加したグルコース添加培地を用いた前培養では回復し、化合物Ａがトログリタゾンと同様にインスリン抵抗性を改善することが見いだされた。
【００６７】
（ｂ）細胞内への糖取り込み量の測定によるスクリーニング
（ａ）と同様にして、実施例１で選択した細胞株を前培養した。キシロース添加培地、グルコース添加培地、化合物Ａおよびグルコース添加培地それぞれを用いた培養について、実施例２（２）に記載の方法に準じて細胞内の糖取り込み量を測定した。その結果、図６に示すように、化合物Ａは細胞表面に移行したＧＬＵＴ４量の低下を回復させるだけでなく、細胞内への糖取り込み量の低下も回復させることがわかった。したがって、細胞内への糖取り込み量の低下を指標にしても、インスリン抵抗性を改善する薬剤をスクリーニングできる。
【００６８】
実施例４  化合物Ａのラット摘出骨格筋のインスリン抵抗性に対する改善作用
Ｗｉｓｔａｒ系雄性ラット（体重８０〜１３０ｇ、日本クレア）を一晩絶食し、５０ｍｇ／体重ｋｇのペントバルビタールナトリウムを腹腔内投与することにより麻酔した。次に、前肢より滑車上顆筋を摘出した。摘出した筋肉を、０．１％ウシ血清アルブミン、３５ｎｍｏｌ／ｌインスリン、５あるいは２５ｍｍｏｌ／ｌグルコースを含むＫＲＢ−ＨＥＰＥＳ栄養液〔１１９ｍｍｏｌ／ｌ  ＮａＣｌ、２０ｍｍｏｌ／ｌ  ＮａＨＣＯ３、４．７ｍｍｏｌ／ｌ  ＫＣｌ、１．２ｍｍｏｌ／ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、１．２ｍｍｏｌ／ｌ  ＭｇＳＯ４、２．５ｍｍｏｌ／ｌ  ＣａＣｌ２、１５ｍｍｏｌ／ｌＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）〕中にて、３５℃にて３時間のインキュベーションを、気層に酸素９５％／二酸化炭素５％の組成のガスを通気して行い、グルコース毒性に基づくインスリン抵抗性を発現させた。また、上記のウシ血清アルブミン、インスリン、２５ｍｍｏｌ／ｌグルコースを含むＫＲＢ−ＨＥＰＥＳ栄養液に、０．１または１μｍｏｌ／ｌの化合物Ａを添加した栄養液、インスリンを添加しない、ウシ血清アルブミンおよび５ｍｍｏｌ／ｌグルコースを含むＫＲＢ−ＨＥＰＥＳ栄養液でも同様にインキュベーションを行った。なお、栄養液の浸透圧を合わせるため、それぞれの栄養液は、糖濃度が４０ｍｍｏｌ／ｌになるようにマニトールを添加した。
【００６９】
インキュベーション終了後に、インスリンに応答した糖取り込み量を測定した。まず、筋肉表面のグルコースを洗浄するために、グルコースを含まない栄養液（０．１％ウシ血清アルブミン、３５ｎｍｏｌ／ｌインスリン、４０ｍｍｏｌ／ｌマニトールを含むＫＲＢ−ＨＥＰＥＳ栄養液）中で、２９℃、１０分間のインキュベーションを行った。次いで、２ＤＧ取り込み反応は、１ｍｍｏｌ／ｌ  ２ＤＧ（６１．７９ｋＢｑ／ｍｌ  １，２−３Ｈ（Ｎ）−ＤＧ））、３９ｍｍｏｌ／ｌマニトール（３．７ｋＢｑ／ｍｌ［１４Ｃ］−マニトール、パーキンエルマー社製）、３５ｎｍｏｌ／ｌインスリン、０．１％ウシ血清アルブミンを含むＫＲＢ−ＨＥＰＥＳ栄養液（ｐＨ７．４）を用い、２９℃にて２０分間のインキュベーションを行った。反応後、筋肉を凍結させることで糖取り込み反応を停止させた。次に、凍結させた筋肉の湿重量を測定した後に、筋肉を５００μｌの１ｍｏｌ／ｌ水酸化ナトリウム水溶液を分注しておいたチューブに移し、９０℃、１０分間加熱して完全に溶解させ、抽出液を得た。この抽出液に５０μｌの濃塩酸を加えて中和した後、上清と沈殿とを遠心分離した。この上清１００μｌと２ｍｌの液体シンチレーターとを良く混和して、液体シンチレーションカウンターにて３Ｈ、１４Ｃの放射活性を測定した。測定された値から、既報〔Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２６１，  １６０４９  （１９８６）〕に記載の方法にしたがって筋肉内に取り込まれた２ＤＧ量を算出した。
【００７０】
その結果、図７に示すように、骨格筋はインスリンの添加により、細胞内の糖取り込み量が増加し、インスリン応答性を示すこと、また５ｍｍｏｌ／ｌから２５ｍｍｏｌ／ｌにグルコース濃度を上げることにより、細胞内の糖取り込み量が低下し、グルコース毒性によるインスリン抵抗性を示すことが確認された。実施例３で見いだされた化合物Ａは、この高グルコース濃度での糖取り込み量の低下を、濃度依存的に回復し、実施例１で選択された細胞株だけでなく、骨格筋におけるインスリン抵抗性も同様に改善することが示された。したがって、実施例３に記載したスクリーニング方法で選択された物質は、骨格筋におけるグルコース毒性に基づくインスリン抵抗性を改善する作用を有する。
【００７１】
【発明の効果】
本発明により、骨格筋と同様に、インスリンが存在しなくともグルコース存在下で培養するだけでインスリン抵抗性が誘発され、しかも培養が容易な細胞株、および該細胞株を用いた、グルコース毒性に基づくインスリン抵抗性を改善する作用を有する物質をスクリーニングする方法が提供される。インスリン抵抗性を改善する作用を有する物質は糖尿病治療薬の有効成分として有用である。
【００７２】
【配列表フリーテキスト】
配列番号１−発明者：矢野  浩史；近藤  英正；森  聖寿
発明者：高島  明；武田  勝哉；中西  聡
発明者：松田  譲
配列番号５−細胞外ループにｃ−ｍｙｃエピトープを挿入したヒトＧＬＵＴ４（ｈＧＬＵＴ４ｍｙｃ）をコードする配列
配列番号６−細胞外ループにｃ−ｍｙｃエピトープを挿入したヒトＧＬＵＴ４（ｈＧＬＵＴ４ｍｙｃ）
配列番号７−ヒトｃ−ｍｙｃエピトープ
配列番号８−ＦＬＡＧペプチド
配列番号９−Ｓタグ
配列番号１０−Ｖ５エピトープ
配列番号１１−インフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）タグ
配列番号１２−ｈＧＬＵＴ４ｍｙｃをコードするＤＮＡを構築するための合成ＤＮＡ
配列番号１３−ｈＧＬＵＴ４ｍｙｃをコードするＤＮＡを構築するための合成ＤＮＡ
配列番号１４−ｃ−ｍｙｃエピトープを含むアミノ酸配列
【００７３】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】インスリン受容体およびＧＬＵＴ４発現ＣＨＯ細胞株におけるインスリン応答性およびグルコース毒性に基づくインスリン抵抗性の誘発を示す。左の２つのバーは、前培養時にキシロースを添加した条件、右の２つのバーは前培養時にグルコースを添加した条件、＋と−はそれぞれインスリンの添加と非添加の条件を示す。縦軸は、各培養条件におけるＧＬＵＴ４の細胞表面への移行量（４９０ｎｍの吸光度）を示す。
【図２】インスリン受容体およびＧＬＵＴ４発現ＣＨＯ細胞株の各培養条件におけるＧＬＵＴ４の発現量を示す。左の２つのレーンは、前培養時にキシロースを添加した条件、右の２つのレーンは前培養時にグルコースを添加した条件、＋と−はそれぞれインスリンの添加と非添加の条件を示す。矢印がＧＬＵＴ４ｍｙｃのバンドの位置を示す。
【図３】インスリン受容体およびＧＬＵＴ４発現ＣＨＯ細胞株における、インスリン応答性およびグルコース毒性に基づくインスリン抵抗性の誘発を示す。左の２つのバーは、前培養時にキシロースを添加した条件、右の２つのバーは前培養時にグルコースを添加した条件、＋と−はそれぞれインスリンの添加と非添加の条件を示す。縦軸は各培養条件における細胞の糖（２−デオキシグルコース）取り込み量（放射能量）を示す。
【図４】トログリタゾンが、インスリン受容体およびＧＬＵＴ４発現ＣＨＯ細胞株のインスリン抵抗性を改善することを示す。左のバーは前培養時にキシロースを添加した条件、中央と右のバーは前培養時にグルコースを添加した条件、左と中央のバーは化合物非添加、右のバーはトログリタゾン添加の条件を示す。縦軸は、各培養条件におけるＧＬＵＴ４の細胞表面への移行量（４９０ｎｍの吸光度）を示す。
【図５】化合物Ａが、インスリン受容体およびＧＬＵＴ４発現ＣＨＯ細胞株のインスリン抵抗性を改善することを示す。左のバーは前培養時にキシロースを添加した条件、中央と右のバーは前培養時にグルコースを添加した条件、左と中央のバーは化合物非添加、右のバーは化合物Ａ添加の条件を示す。縦軸は、各培養条件におけるＧＬＵＴ４の細胞表面への移行量（４９０ｎｍの吸光度）を示す。
【図６】化合物Ａがインスリン受容体およびＧＬＵＴ４発現ＣＨＯ細胞株のインスリン抵抗性を改善することを示す。左のバーは前培養時にキシロースを添加した条件、中央と右のバーは前培養時にグルコースを添加した条件、左と中央のバーは化合物非添加、右のバーは化合物Ａ添加の条件を示す。縦軸は、各培養条件における細胞の糖（２−デオキシグルコース）取り込み量（放射能量）を示す。
【図７】化合物Ａが、ラット摘出骨格筋のインスリン抵抗性を改善することを示す。左の２つのバーは前培養時に５ｍｍｏｌ／ｌグルコースを添加した条件、右の３つのバーは前培養時に２５ｍｍｏｌ／ｌグルコースを添加した条件、＋と−はそれぞれインスリンの添加と非添加の条件、右の２つのバーは化合物Ａ０．１μｍｏｌ／ｌ、１μｍｏｌ／ｌ添加の条件を示す。縦軸は、各培養条件における細胞の糖（２−デオキシグルコース）取り込み量（μｍｏｌ／ｍｌ／２０分）を示す。値は各条件５検体の平均値で示し、＃はスチューデントの検定で、前培養時に５ｍｍｏｌ／ｌグルコースを添加したインスリン添加の条件と比較して有意な差（Ｐ＜０．０５）、＊はスチューデントの検定で、前培養時に２５ｍｍｏｌ／ｌグルコースを添加したインスリン添加、化合物非添加の条件と比較して有意な差（Ｐ＜０．０５）があることを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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