(57)【要約】【課題】有用タンパク質を雌鳥類の卵管特異的に発現させることにより効率的に卵中に蓄積でき、また毒性のあるタンパク質でも鳥類に悪影響を与えず卵中に蓄積できるＧ０トランスジェニックキメラ鳥類並びにトランスジェニック鳥類及びそれらの作製方法を提供する。【解決手段】有用タンパク質を卵管特異的発現プロモーターにて発現する複製能欠失型レトロウイルスベクターによって遺伝子導入されたＧ０トランスジェニックキメラ鳥類及びトランスジェニック鳥類。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
卵管特異的に発現可能なプロモーターによってコントロールされたタンパク質をコードする複製能欠失型レトロウイルスベクターを
ａ）鳥類の受精卵に導入し、
ｂ）孵化によりＧ０トランスジェニックキメラ鳥類を得、
ｃ）該Ｇ０トランスジェニックキメラ鳥類を該Ｇ０トランスジェニックキメラ鳥類又は野生型鳥類と交配することにより得られる、
雌Ｇ１トランスジェニック鳥類若しくはその子孫の雌トランスジェニック鳥類、又は、雌Ｇ０トランスジェニックキメラ鳥類が生産する卵中へのタンパク質の生産方法。
【請求項２】
複製能欠失型レトロウイルスベクターの導入箇所が受精卵の胚、血管、又は心臓のいずれかであることを特徴とする請求項１記載の生産方法。
【請求項３】
複製能欠失型レトロウイルスベクターの導入箇所が受精卵の胚であることを特徴とする請求項１又は２記載の生産方法。
【請求項４】
複製能欠失型レトロウイルスベクターの導入法がマイクロインジェクション法、リポフェクション法、又はエレクトロポレーション法のいずれかであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項記載の生産方法。
【請求項５】
複製能欠失型レトロウイルスベクターの導入法がマイクロインジェクション法であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項記載の生産方法。
【請求項６】
雌Ｇ０トランスジェニックキメラ鳥類が生産する卵中へのタンパク質の生産が卵白中である請求項１〜５のいずれか１項記載の生産方法。
【請求項７】
雌Ｇ１トランスジェニック鳥類又はその子孫が生産する卵中へのタンパク質の生産が卵白中である請求項１〜５のいずれか１項記載の生産方法。
【請求項８】
卵管特異的に発現可能なプロモーターがニワトリ・オボアルブミンプロモーターである請求項１〜７のいずれか１項記載の生産方法。
【請求項９】
タンパク質がヒト成長ホルモンである請求項１〜８のいずれか１項記載の生産方法。
【請求項１０】
卵管特異的に発現可能なプロモーターによってコントロールされたタンパク質をコードする複製能欠失型レトロウイルスベクターを鳥類の受精卵に導入し、孵化させることにより得られたＧ０トランスジェニックキメラ鳥類であるトランスジェニック鳥類。
【請求項１１】
Ｇ０トランスジェニックキメラ鳥類である請求項１０記載のトランスジェニック鳥類を該トランスジェニック鳥類又は野生型鳥類と交配することにより得られるＧ１トランスジェニック鳥類又はその子孫であるトランスジェニック鳥類。
【請求項１２】
鳥類がニワトリ又はウズラである請求項１０又は１１記載のトランスジェニック鳥類。
【請求項１３】
タンパク質がヒト成長ホルモンである請求項１０又は１１記載のトランスジェニック鳥類。
【請求項１４】
ヒト成長ホルモンを卵中に生産し、雌トランスジェニックキメラ鳥類又は雌トランスジェニック鳥類である請求項１３記載のトランスジェニック鳥類。
【請求項１５】
卵白中にヒト成長ホルモンを０．１ｎｇ／ｍｌ以上含む請求項１４記載のトランスジェニック鳥類。
【請求項１６】
卵白中にヒト成長ホルモンを１ｎｇ／ｍｌ以上含む請求項１４記載のトランスジェニック鳥類。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、トランスジェニック雌鳥類で効率的に卵中に有用タンパク質を蓄積させるため卵管特異的に発現させることに関する。またこの形質が子孫に効率的に伝播して作製されるトランスジェニック鳥類のベクター及び方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年数多くの医薬品タンパク製剤が開発されているが、活性に糖鎖が必要であるエリスロポエチン（ＥＰＯ）などは、大腸菌などによる安価な生産システムでは生産できず、生産コストの高い動物細胞での生産に頼らざるを得ない現状である。糖鎖のついたタンパク質を安価に生産するために現在注目を集めているのがトランスジェニック動物である。
【０００３】
トランスジェニックマウスが世界で初めて作製されて以来多くのトランスジェニック動物が作製されるようになった。この技術を応用して近年ではウシ、ブタなどでトランスジェニック動物を作製してさまざまな有用タンパク質を生産させる試みが世界各地で行われている。これがいわゆる動物工場である。
【０００４】
実際に、イギリスではヒトα−アンチトリプシンをミルク中に分泌するヒツジがすでに作製されている。しかし大型哺乳類は成長速度が遅く、広い飼育スペースが必要であるなどの理由から工業的に有用タンパク質の生産に時間とコストがかかるという問題点がある。
【０００５】
ウズラやニワトリに代表される家禽類は、食肉用、採卵用家畜として長年の飼育実績があり、また大型哺乳類と比べて成長速度が速く飼育スペースも小さくてすむというメリットもあることから安価に有用タンパク質を生産することが可能である。
【０００６】
一般的にトランスジェニック動物作製においては、受精卵の前核へＤＮＡをマイクロインジェクションする方法がとられている。しかし、鳥類でこの方法は応用できない。鳥類では１細胞期の胚を取得するために雌鳥を殺す必要があり、また卵内の核を見分けることが困難であるため、鳥類のトランスジェニック作製技術は他の哺乳類に比べ遅れていた。
【０００７】
最近ではトランスジェニック鳥類の技術も進んできており、従来のトランスジェニック動物作製技術以外のウイルスを用いる方法でトランスジェニックキメラ鳥類を作製したという報告も数例でてきている。また、オボアルブミンプロモーターの一部を用いてβ−ガラクトシダーゼの発現を試ている例もある（特許文献１）。
【０００８】
【特許文献１】
特表２０００−５１２１４９号公報
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
これらの報告されているトランスジェニック鳥類の発現プロモーターは、鳥類の全身で発現するものが多く、有用タンパク質の回収は、少量の血から回収するか、鳥を殺して組織又は血液から回収することになるが、この方法では非常に手間と時間がかかり不向きである。効率よく有用タンパク質を回収する方法として卵に蓄積させ回収する方法が有用タンパク質生産にとって不可欠である。そのための１つの方法は、全身で発現されたタンパク質が血中を回り卵中に蓄積したものを回収するという方法である。この方法は抗体などのＦｃ領域を持つタンパク質では、Ｆｃが卵黄中に移行するという特性があるため効率よく卵中に蓄積回収できる。
【００１０】
しかしながらこの方法はＦｃ領域を持つ抗体などのタンパク質に限られており、その他の有用タンパク質ではタンパク質の発現が全身で高くても卵中の蓄積量が必ずしも高くないという問題がある。また鳥類にとって毒性が強いものではこの方法を用いることができないという欠点もある。
【００１１】
また、卵を作る器官である卵管特異的に発現するオボアルブミンプロモーターの一部を用いてβ−ガラクトシダーゼの発現を試みている例（特許文献１）では、具体性に欠けるところがあり、また、実際に卵管特異的にβ−ガラクトシダーゼが発現するかは疑問が残る。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
Ｆｃ領域のない有用タンパク質をいかに効率的に卵中に蓄積させるかという問題を克服するため、本発明者らは卵白のタンパク質に着目した。卵白は、３０種類以上のタンパク質から成るが、主なものはオボアルブミン（５４％）、オボトランスフェリン（コンアルブミン  １２％）、オボムコイド（１１％）、オボグロブリン（８％）、リゾチーム（３．５％）である。これらのタンパク質のプロモーターは卵管で特異的に発現し、その制御下に発現するタンパク質を卵白に蓄積させる。これらのタンパク質のプロモーターを有用タンパク質の発現プロモーターとして用いることにより、効率的に卵中に有用タンパク質を蓄積できるのではないかと考えた。
【００１３】
そこで本発明者らはトランスジェニック鳥類作製に用いられている複製能欠失型レトロウイルスベクターであるモロニー・ミューリン・ロイケミア・ウイルスをベクターに用いた。オボアルブミンプロモーターの中で卵管特異的に発現させる領域を用いて医薬品として有用なヒト成長ホルモンを発現するウイルスベクターをコードするプラスミドを構築した後、このウイルスベクターを生産するためのパッケージング細胞を作製した。このパッケージング細胞を用いてウイルスベクターを生産し、ウイルスベクターを産卵直後のウズラ及びニワトリの胚にマイクロインジェクションすることによりＧ０トランスジェニックキメラ鳥類を作製した。このＧ０トランスジェニックキメラ鳥類のゲノムにおいてＰＣＲ法にて導入遺伝子を確認した。作製したＧ０トランスジェニックキメラウズラを非トランスジェニックのウズラと交配して得られたＧ１トランスジェニックウズラ雌の性成熟後に解析を行った。ヒト成長ホルモンの発現をみるためにＲＴ−ＰＣＲを行ったところヒト成長ホルモンの発現は卵管特異的であることが分かった。また、卵白中にヒト成長ホルモンを数ｎｇ／ｍｌの濃度で蓄積していることを発見し本発明に至った。
【００１４】
本発明によりトランスジェニック鳥類において卵白中にあるオボアルブミンのプロモーターの卵管特異的に発現させる領域を用いてヒト成長ホルモンを生産することで卵管特異的に発現させることが可能であるということを証明した。これにより効率的に卵中に目的タンパク質を蓄積させることができるようになり、Ｆｃ領域を持たない有用タンパク質を卵中に蓄積する上で極めて優れた方法を提供するものである。
【００１５】
本発明は、有用タンパク質の生産において卵管特異的発現プロモーターを用いて発現するトランスジェニック鳥類で、有用タンパク質を卵中に蓄積するための方法であり、この方法により作製されたＧ０トランスジェニックキメラ鳥類及びＧ１トランスジェニック鳥類とその子孫である。
【００１６】
即ち、本発明は、卵管特異的に発現可能なプロモーターによってコントロールされたタンパク質をコードする複製能欠失型レトロウイルスベクターを
ａ）鳥類の受精卵に導入し、
ｂ）孵化によりＧ０トランスジェニックキメラ鳥類を得、
ｃ）該Ｇ０トランスジェニックキメラ鳥類を該Ｇ０トランスジェニックキメラ鳥類又は野生型鳥類と交配することにより得られる、
雌Ｇ１トランスジェニック鳥類若しくはその子孫の雌トランスジェニック鳥類、又は、雌Ｇ０トランスジェニックキメラ鳥類が生産する卵中へのタンパク質の生産方法である。
また、本発明は、卵管特異的に発現可能なプロモーターによってコントロールされたタンパク質をコードする複製能欠失型レトロウイルスベクターを鳥類の受精卵に導入し、孵化させることにより得られたＧ０トランスジェニックキメラ鳥類、及び、このＧ０トランスジェニックキメラ鳥類を該トランスジェニック鳥類又は野生型鳥類と交配することにより得られるＧ１トランスジェニック鳥類又はその子孫でもある。
【００１７】
【発明の実施の形態】
本発明のＧ０トランスジェニックキメラ鳥類及びＧ１トランスジェニック鳥類は、複製能欠失型レトロウイルスベクターによって外来性タンパク質の遺伝子が導入された鳥類であって導入遺伝子に由来するタンパク質を卵中に生産することを特徴とする。
【００１８】
本発明におけるＧ０トランスジェニックキメラ鳥類及びＧ１トランスジェニック鳥類の作製方法は本発明者らが以前開発した方法（特開２００２−１７６８８０）を用いることができるがその方法に限られたものではない。
【００１９】
本発明において鳥類に導入される遺伝子は特に限定されないが、レトロウイルスに由来しない遺伝子であることが望ましい。レトロウイルスに由来しない遺伝子としては特に限定されず、グリーン・フルオレッセント・プロテイン（ＧＦＰ）などのマーカーとして用いられるタンパク質をコードする遺伝子又はヒト成長ホルモン、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、抗体等の有用タンパク質をコードする遺伝子などが挙げられる。
【００２０】
上記の導入遺伝子は、ベクターコンストラクトでプロウイルスの５’末端及び３’末端の間に挿入される。これらの導入遺伝子産物を効率的に卵中に蓄積させるためには、卵管特異的に発現される遺伝子のプロモーター配列を用いる。本発明でいう卵管特異的に発現可能なプロモーターは、卵白に含まれるタンパク質の発現調節を担っている遺伝子配列の意味であり、例えばオボアルブミンプロモーターなどが挙げられ、なかでもニワトリ由来のオボアルブミンプロモーターが、その解析が進んでおり発現をコントロールする領域がより解明されているため好適に用いられるが、卵管特異的に発現する遺伝子のプロモーターであればこれに限定されるのものではない。
【００２１】
本発明で用いられる複製能欠失型レトロウイルスベクターとしては、複製能が欠失していれば特に限定されるものではないが、モロニー・ミューリン・ロイケミア・ウイルス（ＭｏＭＬＶ）、エビアンロイコシス・ウイルス（ＡＬＶ）に由来するものが好ましい。
【００２２】
安全性を考慮し、遺伝子導入ベクターとして用いられるレトロウイルスベクターは、複製に必要なｇａｇ，ｐｏｌ，ｅｎｖのうちのいずれかか又は全てを欠くことにより、自己複製能を欠失したウイルスが用いられる。
【００２３】
パッケージング細胞作製方法としては細胞にｇａｇ，ｐｏｌ，ｅｎｖ遺伝子とレトロウイルスベクターをコードするプラスミドを導入することにより作製できる。上記のレトロウイルスベクターをコードするプラスミドをｇａｇ、ｐｏｌを構成的に発現するＧＰ２９３細胞に導入する方法としては特に限定されないが、例えばリポフェクション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法などが挙げられる。鳥類の細胞にこの複製能欠失型レトロウイルスを効率的に感染させるための外被タンパク質（ｅｎｖ）は、水疱性口内炎ウイルス（Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ：ＶＳＶ）の外被タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）シュードタイプを用いることが望ましいがこれに限定されるものではない。上記のＶＳＶ−Ｇタンパク質を発現するＧＰ２９３細胞としては、ｇａｇ、ｐｏｌを構成的に発現するＧＰ２９３細胞に、ＶＳＶ−Ｇタンパク質の発現ベクターをトランスフェクションと同時にレトロウイルスベクターをコードするプラスミドをトランスフェクトしてもよいがこの方法に限られたものではない。
【００２４】
パッケージング細胞等により生産されたシュードタイプのウイルスは通常マイクロインジェクション法（Ｂｏｓｓｅｌａｍ、Ｒ．Ａら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４３，５３３）により導入される。ウイルス導入法としてはこの他にリポフェクション法、エレクトロポレーション法などが実施可能である。また、導入は胚が好ましいが限定されるものではなく分化後の血管内、心臓へも導入される。
【００２５】
本発明のＧ０トランスジェニックキメラ鳥類を作製する方法としては特に限定されないが、例えば、ＶＳＶ−Ｇタンパク質を含む膜を有する複製能欠失型レトロウイルスベクターに上記のプロモーターと導入遺伝子を挿入したものを鳥類の胚盤葉又は分化後の血管、心臓に導入し、その胚盤葉を孵化させることにより作製することができる。孵化の方法として本発明者らが開発した人工卵殻による方法（Ｋａｍｉｈｉｒａ，Ｍ．ら（１９９８）Ｄｅｖｅｌｏｐ，Ｇｒｏｗｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．，４０，４４９）等が用いられる。
【００２６】
本発明で使用する鳥類としては、特に限定されるものではなく、例えばニワトリ、ウズラ、七面鳥、カモなどがあげられる。なかでもニワトリやウズラは入手が容易で産卵種としても多産であり、長年の飼育経験により安全性が認められている点が好ましい。
【００２７】
本発明の作製法で遺伝子を導入された鳥類は、その体細胞にモザイクキメラ状に遺伝子が導入されたものでありこの一世代目をＧ０トランスジェニックキメラ鳥類と呼ぶ。またその子孫である導入遺伝子をもった鳥類をＧ１，Ｇ２，Ｇ３〜トランスジェニック鳥類と称する。
【００２８】
Ｇ０トランスジェニックキメラ鳥類を成体まで成長させ、非トランスジェニック鳥類（野生型鳥類）又はＧ０トランスジェニックキメラ鳥類と交配を行うことによりＧ０トランスジェニックキメラ鳥類に導入した遺伝子を子孫Ｇ１トランスジェニック鳥類へ伝播することができる。遺伝子伝播の成否は、得られたＧ１トランスジェニック鳥類の血液または細胞などからＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ法又はハイブリダイゼーション法などにより遺伝子導入を検定することができる。
【００２９】
作製したＧ０トランスジェニックキメラ鳥類及びＧ１トランスジェニック鳥類での卵管特異的発現は、卵管とその他の組織又は血液からｍＲＮＡをとり、ＲＴ−ＰＣＲ法又はノーザンブロット法などでの比較により調べることができる。
【００３０】
本発明において、卵中へのタンパク質の生産としては、卵黄中であっても卵白中であってもよいが、なかでも卵白中へのタンパク質への生産であることが好ましい。卵管特異的に発現するプロモーターを用いて発現させると卵白中にタンパク質を蓄積させることができると推測される。
例えば、ヒト成長ホルモン遺伝子をオボアルブミンプロモーターで発現させたＧ１トランスジェニック鳥類の場合、卵白中のヒト成長ホルモンの含有量は好ましくは０．１ｎｇ／ｍｌ以上、より好ましくは１ｎｇ／ｍｌ以上である。卵白中のヒト成長ホルモンの含有量の測定方法としては特に限定されないが、例えば、市販のヒト成長ホルモン測定用キットｈＧＨ  ＥＬＩＳＡ（ロッシュ社製）等を用いることができる。
【００３１】
【実施例】
以下、実施例により本発明を詳述するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【００３２】
（実施例１）ヒト成長ホルモンをオボアルブミンプロモーターを用いて発現させるレトロウイルスベクターを作製した。
１．ニワトリ繊維芽細胞からのゲノムＤＮＡの抽出
まず、ニワトリゲノムを抽出するにあたりニワトリの有精卵を１０日間孵卵した。その後ニワトリ胚を取り出し、ハサミで細かく切断した。切断した胚を０．５ｇ／ｌコラゲナーゼ（和光純薬社製）溶液で５−１０分処理した。ＰＢＳで２回洗浄した後ピペッティングして細かくし、ＤＭＥＭ（ダルベッコズ・モディファイド・イーグルス・メディウム  シグマ社製）培地３８．５℃で２日間培養した。細胞を回収後ＰＢＳで洗浄した後ペレットを１ｍｌのＴＮＥ（Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭＥＤＴＡ）に懸濁した。０．１ｍｌの１０％ＳＤＳ、０．０５ｍｌの２０ｍｇ／ｍｌＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫを加え５５℃１時間インキュベートしその後３７℃で一晩インキュベートした。この溶液をフェノールクロロホルム処理を数回行った後エタノール沈殿を行いゲノムを抽出した。
【００３３】
２．ニワトリゲノムＤＮＡのファージライブラリーの作製
調製したニワトリゲノムをＭｂｏＩで部分分解を行い、ショ糖密度勾配遠心を行い２３Ｋｂ付近を回収してファージベクターＥＭＢＬ３（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）につないだ。これをパッケージングキットＧｉｇａｐａｃｋＩＩＩ  Ｇｏｌｄ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）を用いてマニュアルに従いパッケージングし、ファージライブラリーとした。
【００３４】
３．プラークハイブリダイゼーション
希釈したライブラリーを宿主細胞である大腸菌ＬＥ３９２細胞に感染させトップアガーに懸濁後、ＬＢプレートに重層させ一晩３７℃で培養してプラークを形成させた。プラークを形成させたプレートにナイロンメンブレンフィルターＨｙｂｏｎｄ−Ｎ（アマシャムバイオサイエンス社製）をのせファージをトランスファーした。トランスファーしたメンブレンを変性溶液（１．５Ｍ  ＮａＣｌ、０．５Ｍ  ＮａＯＨ）に浸して変性した後中和溶液（１．５Ｍ  ＮａＣｌ、０．５ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５））に浸し中和した。その後２×ＳＳＣ（１．７５％ＮａＣｌ，０．８８％  Ｃ６Ｈ５Ｏ７Ｎａ３・２Ｈ２Ｏ（ｐＨ７．０））で洗浄した後８０℃で２時間ベーキングした。プラークハイブリダイゼーションを行うためのプローブは、オボアルブミンのＴＡＴＡｂｏｘ直前を約１Ｋｂ増幅する化学合成オリゴヌクレオチド（ＯＶＡｐｒｏ５）５’−ｃｔｇｔｇｇｔｇｔａｇａｃａｔｃｃａｇｃａ−３’（配列番号１）と（ＯＶＡｐｒｏ３）５’−ｔｔｔｇａｃｃｔｔｔｇａｃｇｃｃａｔａｇ−３’（配列番号２）をプライマーとしてＰＣＲを行い得た。得られたＰＣＲ産物をランダムプライマーラベリングキット（ＢｃａＢＥＳＴ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ  ＴａＫａＲａ社製）を用いてプローブをラベルした。ファージをトランスファーしたメンブレンをこのプローブを用いたプラークハイブリダイゼーションで約１０万個のプラークを解析した結果、ポジティブなプラーク（１５’−Ａ）をクローニングした。
【００３５】
４．クローニングしたファージＤＮＡの解析
このファージからＤＮＡを抽出し、解析したところ１７Ｋｂの断片が含まれていることが確認された。確認するためオボアルブミンエキソン１の卵管特異的発現に必要といわれるＴＡＴＡｂｏｘ上流３．５Ｋｂにプライマーを化学合成した（ＯＶＡ−３．５ｋｂ５；  ５’−ｃａｃａｔｃｃａａａｇｇａｇｃｔｔｇａｃｃ−３’（配列番号３）、ＯＶＡ−３．５ｋｂ３；５’−ｃａｇｔｔｇｇａａｇｇｔｔａｃｃｔｇｇｇａ−３’（配列番号４））。これらのプライマー及びＯＶＡｐｒｏ５、ＯＶＡｐｒｏ３を用いて１５’−ＡファージＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行ったところ、それぞれ約０．６Ｋｂ、１．１Ｋｂの増幅が見られた。次にＥＭＢＬ３ベクターの両端にそれぞれアニールするプライマーを化学合成した（５’−ａｃｔｃｇｔｇａａａｇｇｔａｇｇｃｇｇａｔｃｔｇ−３  ’（配列番号５）、５’−ｃｇｔｃｃｇａｇａａｔａａｃｇａｇｔｇｇａｔｃｔｇ−３’（配列番号６））。このプライマーを用いてインサートＤＮＡの両端の塩基配列を決定した。その結果ＥＭＢＬ３の右のアームにオボアルブミン遺伝子のエキソン１の上流３８４７ｂｐからクローニングされていることが確認できた。しかし、ＥＭＢＬ３の左のアームから塩基配列を決定した結果はその遺伝子を特定することができなかった。このことから１５’−Ａクローンは２個以上のインサートがクローニングされたものと考えられた。そこで、オボアルブミンプロモータを利用するに際し必要であるオボアルブミン開始コドンを含むかどうか、制限酵素及びＰＣＲ法を用いて確認を行うこととした。オボアルブミン開始コドンの下流に存在するＫｐｎＩがクローニングされているかを確認するためにＫｐｎＩで切断した結果７Ｋｂの断片を確認した。また、開始コドンの下流約６０ｂｐにプライマー（ＯＶＡ３０６０）５’−ｃａｔｔｇｇｃａｔｇｇｔｇｇａｃｔｔｔ−３  ’（配列番号７）を化学合成した。ＯＶＡｐｒｏ５とＯＶＡ３０６０で１５’−ＡファージＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。その結果約３ＫｂのＤＮＡが増幅された。制限酵素ＫｐｎＩとＰＣＲ法の結果より１５’−ＡファージＤＮＡにはオボアルブミン開始コドン及びその下流１．９Ｋｂが含まれていることが確認された。以上の結果を総合すると１５’−ＡファージＤＮＡにはオボアルブミン遺伝子のエキソン１上流３．８Ｋｂからオボアルブミン開始コドンを含み少なくとも開始コドンの下流約１．９Ｋｂの制限酵素ＫｐｎＩサイトを含む全長約７．４Ｋｂがクローニングされていることが確認された。
【００３６】
５．ヒト成長ホルモンｃＤＮＡの調製
ヒト成長ホルモンはＨＵＶＥＣｓ（Ｈｕｍａｎ  Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  ＶｅｉｎＥｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌｓ）から調製した。調製した方法は、まずＨＵＣＥＣｓを１０％ＦＣＳと３０μｇ／ｍｌのＥｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＥＣＧＳ；Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｌａｂｗａｒｅ社製）を含むＴＣＭ１９９培地で培養した。培養後回収した細胞からＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ  Ｇｅｎｏｍｅ（東洋紡社製）を用いてゲノムを調製した。この調製したゲノムを鋳型として化学合成したプライマー５’−ｃａｇｃｔｃａａｇｇａｔｃｃｃａａｇｇｃｃｃ−３’  （配列番号８）、５’−ｇｇａｃａｃｃｔａｇｔｃａｇａｃａａａａｔｇａｔｇｃａａｃ−３’（配列番号９）を用いてＰＣＲを行った。このＰＣＲ産物を鋳型として化学合成したプライマー５’−ａｔａｃｔｃｇａｇｇｔｔｃａｃｃａｔｇｇｃｔａｃａｇｇｔａａｇｃｇｃｃ−３’（配列番号１０；下線部はＸｈｏＩ制限酵素サイト）、５’−ａａｔｃｔｃｇａｇａｃｇｃｇｔｇｇａｃａｃｃｔａｇｔｃａｇａｃａａａ−３’（配列番号１１；下線部はＸｈｏＩ，ＭｌｕＩ制限酵素サイト）を用い再びＰＣＲを行った。ＰＣＲにより増幅した断片をＸｈｏＩで切断し、プラスミドｐＺｅｏＳＶ２（＋）（インビトロジェン社製）のＸｈｏＩサイトに挿入してヒト成長ホルモンゲノム遺伝子を持つプラスミドｐＺｅｏｇＧＨを作製した。染色体由来のこのヒト成長ホルモン遺伝子はイントロンを含んでいるためイントロンを含まないｃＤＮＡを取得することとした。作製したこのプラスミドｐＺｅｏｇＧＨをリポフェクション法にてＣＨＯ細胞（理化学研究所のＣＥＬＬ  ＢＡＮＫより入手）にトランスフェクトした。このトランスフェクトしたＣＨＯ細胞をＦ１２培地にて培養後、ｍＲＮＡ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ロッシュ社製）を用いてｍＲＮＡを取得し、得られたｍＲＮＡから化学合成したプライマー  ５’−ａｔｇｇｃｔａｃａｇｇｃｔｃｃｃｇｇａｃｇｔｃｃｃｔ−３’（配列番号１２）、５’−ｃａｇｃｔａｇａａｇｃｃａｃａｇｃｔｇｃｃｃｔｃｃａｃａｇ−３  ’（配列番号１３）にてＲＴ−ＰＣＲをＲＴ−ＰＣＲ  Ｂｅａｄｓ（アマシャムバイオサイエンス社製）を用いて行った。得られたＲＴ−ＰＣＲ産物を化学合成プライマー５‘−ａｔａｃｔｃｇａｇａｃｃａｔｇｇｃｔａｃａｇｇｃｔｃｃｃｇ−３’（配列番号１４；下線部はＸｈｏＩ制限酵素サイト）、５‘−ａａｔｃｔｃｇａｇａｃｇｃｇｔａｇｃｔａｇａａｇｃｃａｃａｇｃｔｇｃ−３’（配列番号１５；下線部はＸｈｏＩ，ＭｌｕＩ制限酵素サイト）を用いてＰＣＲを行い、ヒト成長ホルモンのｃＤＮＡを得た。このｃＤＮＡをＸｈｏＩで処理して、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ＋（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）のＸｈｏＩサイトに挿入してプラスミドｐＢｌｕｅｃＧＨを作製した。
【００３７】
６．オボアルブミンプロモーターによるヒト成長ホルモン発現レトロウイルスベクターの構築
オボアルブミンプロモーターによるヒト成長ホルモン発現レトロウイルスベクターをコードするプラスミドｐＬＧＯＧは以下のようにして作製した。
まず、オボアルブミンプロモーターをクローニングしたファージＤＮＡをＳａｌＩ−ＫｐｎＩで切断し、７Ｋｂを切り出し、ｐＵＣ１９のＳａｌＩ−ＫｐｎＩサイトに挿入しプラスミドｐ１９ＯＶＡ−３．５Ｋｂを作製した。オボアルブミン開始コドンの直前にＸｈｏＩ制限酵素サイトを付加するために、５’−ａｔｃａａｇｃｔｔｃｔｃｃｔａｇａｃｔａｃａｔｇａｃｃｃｃａｔａ−３’（配列番号１６；下線部はＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素サイト）、５’−ａｔｃｃｔｃｇａｇｔｔｇｔｃｔａｇａｇｃａａａｃａｇｃａｇａ−３’（配列番号１７下線部はＸｈｏＩ制限酵素サイト）を化学合成した。ｐ１９ＯＶＡ−３．５Ｋｂを鋳型としてＰＣＲを行い増幅した。この増幅した断片を、ＨｐａＩ、ＸｈｏＩで処理し、１２０ｂｐを回収した。また、グリーン・フルオロレッセント・プロテイン（ＧＦＰ）をつなぐためにプライマーを化学合成した（５’−ａｔｇｃｔｃｇａｇｇｔｔｃａｃｃａｔｇａｇｃａａｇｇｇｃｇａｇｇ−３’（配列番号１８；下線部はＸｈｏＩ制限酵素サイト）、５’−ａｔｃｇｇｔａｃｃｇｃａｔｇｃａｃｇｃｇｔｃｇａｔｃｃａｇａｃａｔｇａｔａａｇａｔａ−３’（配列番号１９；下線部はＫｐｎＩ，ＳｐｈＩ，ＭｌｕＩ制限酵素サイト））。このプライマーを用いてプラスミドｐＧＲＥＥＮ  ＬＡＮＴＥＲＮ−１（ＧＩＢＣＯ社製）を鋳型としてＰＣＲを行った。この断片をＸｈｏＩ、ＫｐｎＩで処理した。この二つの調製した断片をｐ１９ＯＶＡ−３．５ＫｂのＨｐａＩ、ＫｐｎＩサイトに同時に挿入してｐＯＶＡ−ＧＦＰを作製した。ヒト成長ホルモンゲノムＤＮＡを含むプラスミドｐＺｅｏｇＧＨをＸｈｏＩ及びＭｌｕＩで切り出した断片をｐＯＶＡ−ＧＦＰのＸｈｏＩ、ＭｌｕＩサイトに挿入してプラスミドｐＯＶＡ−ｇＧＨを作製した。レトロウイルスベクターｐＬＧＲＮ（特開２００２−１７６８８０）を鋳型としてプライマー５’−ｃａｔａｃｇｃｇｔｔｃｔｔｃｇｇａｃｃｃｔｇｃａｔｔｃ−３’（配列番号２０；下線部は，ＭｌｕＩ制限酵素サイト）、５’−ｔｇｃｇｇｔａｔｔｔｔｃｔｃｃｔｔａｃｇｃａｔｃ−３  ’（配列番号２１）を化学合成し、ＰＣＲ産物が平滑末端で得られるＰｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いてＰＣＲを行った。この増幅した断片をＸｂａＩで処理した後ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（＋）のＳｍａＩ，ＸｂａＩサイトに挿入してプラスミドｐＢｌｕｅ３’ＬＴＲＭｌｕＸｂａを作製した。このプラスミドｐＢｌｕｅ３’ＬＴＲＭｌｕＸｂａからＸｈｏＩ及びＸｂａＩ断片を切り出しｐＬＧＲＮのＸｈｏＩ、ＸｂａＩサイトに挿入してプラスミドｐＬＧを作製した。オボアルブミンプロモーター及びヒト成長ホルモンゲノムＤＮＡが含まれるプラスミドｐＯＶＡ−ｇＧＨをＳａｌＩ及びＭｌｕＩで切り出した断片をｐＬＧのＸｈｏＩ、ＭｌｕＩサイトに挿入してｐＬＧＯｇＧを作製した。ヒト成長ホルモンｃＤＮＡを含むプラスミドｐＢｌｕｅｃＧＨをＸｈｏＩ及びＭｌｕＩで切り出した断片をｐＬＧＯｇＧのＸｈｏＩ、ＭｌｕＩサイトに挿入してヒト成長ホルモンをオボアルブミンプロモーターで発現させる複製能欠失型レトロウイルスベクターをコードするプラスミドｐＬＧＯＧを作製した。このプラスミド地図を図１に示���た。
【００３８】
（実施例２）オボアルブミンプロモーターによるヒト成長ホルモン発現ウイルスベクターの調製
実施例１で作製したベクターコンストラクトｐＬＧＯＧよりレトロウイルスを調製するため、ＧＰ２９３細胞（クローンテック社製）を直径１００ｍｍの培養ディッシュにてＤＭＥＭ培地を用いて培養した。９０％コンフレントになるように前日にまき直しリポフェクション法によりプラスミドｐＬＧＯＧを１１μｇ及びプラスミドｐＶＳＶ−Ｇ（クローンテック社製）１１μｇをＧＰ２９３細胞にトランスフェクトした。４８時間後、上清を０．４５μｍ酢酸セルロースフィルター（アドバンテック社製）を通して夾雑物を除いた後、２５，０００ｒｐｍ、４℃で１．５時間超遠心分離した。上清を捨て沈殿をＴＮＥ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、１３０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に溶解しウイルス液とした。このウイルス液をＤＭＥＭにポリブレン（シグマ社製）１０μｇ／ｍｌになるように加えたもので希釈した。別に２４ｗｅｌｌマイクロプレートで培養したＧＰ２９３細胞の培地をこのウイルスを希釈したポリブレン入りＤＭＥＭと培地交換した。培養して増殖させた後この細胞を回収して、ＤＭＥＭを用いて１３．３ｃｅｌｌ／ｍｌになるよう希釈し９６ｗｅｌｌマイクロプレートに１５０μｌずつ分注した。２週間後コロニーを形成したところで２４ｗｅｌｌマイクロプレートに植え継いだ。この中からタイターの高いものを選択し、パッケージング細胞とした。このパッケージング細胞を培養し、ｐＶＳＶ−Ｇプラスミドをリポフェクション法でトランスフェクトした。４８時間後上清を０．４５μｍ酢酸セルロースフィルター（アドバンテック社製）を通して夾雑物を除いた後、２５，０００ｒｐｍ、４℃で１．５時間超遠心分離した。上清を捨て沈殿をＴＮＥ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、１３０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に溶解しウイルス液とした。このようにして得られた高タイターウイルス溶液は１×１０８〜８×１０８ｃｆｕ／ｍｌであった。
【００３９】
ウイルスタイターの測定は、以下のように行った。測定の前日にＮＩＨ３Ｔ３細胞（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションより入手）を２４ｗｅｌｌディッシュに１．５×１０４細胞植え培養した。１０２〜１０６倍に１０μｇ／ｍｌポリブレン入りＤＭＥＭで希釈したウイルス溶液１ｍｌを細胞の培地と交感し、４８時間後に蛍光顕微鏡によりＧＦＰ（グリーン・フルオレッセント・プロテイン）を発現している細胞の割合を測定し、以下の計算式によりタイターを決定した。
ウイルスタイター＝細胞数×希釈率×発現割合  （ｃｆｕ／ｍｌ）
【００４０】
（実施例３）ウズラ胚へのレトロウイルスのインジェクション及び胚培養
ＷＥ系統のウズラ受精卵（日本生物科学研究所）を使用した。産卵直後の受精卵の卵殻を７０％エタノールで消毒し、鋭端部を直径２ｃｍの円形にダイヤモンドカッター（ＭＩＮＩＭＯ７Ｃ７１０，ミニター社製）で切り取り、胚を露出させた。胚盤葉を実体顕微鏡で観察しながら、ガラス管（ＧＤ−１、ナリシゲ社製）をマイクロピペット製作機（ＰＣ−１０，ナリシゲ社製）で加工し、実施例２で調製したウイルス溶液をガラス管内に入れ、外形約２０μｍとなるように先端を折って作製した針を刺しマイクロインジェクター（Ｔｒａｎｓｊｅｃｔｏｒ５２４６、エッペンドルフ社製）を用いて胚盤下腔の中央に２μｌを注入した。この卵殻に切り口まで卵白を満たした後卵白を糊としてＰＴＦＥ膜（ミリラップ、ミリポア社製）とポリ塩化ビニリデンラップ（サランラップ、旭化成社製）とで蓋をした。このウイルスをインジェクションした、受精卵を自動転卵装置が内蔵された孵卵器（昭和フランキ社製Ｐ−００８型）で１５分ごとに９０度転卵しながら孵卵を行った。孵卵開始２日後、ニワトリのＳ卵を７０％エタノールで消毒し、鈍端部を直径３．５ｃｍの円形にダイヤモンドカッターで切り取り中身を取り除いた殻にウイルスをインジェクションしたウズラの卵白と卵黄を移し、濃度５０ｍｇ／ｍｌで卵白に懸濁した乳酸カルシウム溶液を０．５ｍｌ添加後、卵白を糊としてポリ塩化ビニリデンラップ（サランラップ、旭化成社製）とで蓋をした。ニワトリＳ卵に移した胚を自動転卵装置が内蔵された孵卵器で１５分ごとに３０度転卵しながら孵卵を行った。
【００４１】
（実施例４）ニワトリ胚へのレトロウイルスのインジェクション及び胚培養
ニワトリ受精卵（日本生物科学研究所）を使用した。産卵直後の卵殻を７０％エタノールで消毒し、鋭端部を直径３．５ｃｍの円形にダイヤモンドカッター（ＭＩＮＩＭＯ７Ｃ７１０，ミニター社製）で切り取り、胚を露出させた。胚盤葉を実体顕微鏡で観察しながら、ガラス管（ＧＤ−１、ナリシゲ社製）をマイクロピペット製作機（ＰＣ−１０，ナリシゲ社製）で加工し、実施例２で調製したウイルス溶液をガラス管内に入れ、外形約２０μｍとなるように先端を折って作製した針を刺しマイクロインジェクター（Ｔｒａｎｓｊｅｃｔｏｒ５２４６、エッペンドルフ社製）を用いて胚盤下腔の中央に２μｌを注入した。この卵殻に切り口まで卵白を満たした後卵白を糊としてＰＴＦＥ膜（ミリラップ、ミリポア社製）とポリ塩化ビニリデンラップ（サランラップ、旭化成社製）とで蓋をした。このウイルスをインジェクションした受精卵を自動転卵装置が内蔵された孵卵器（昭和フランキ社製Ｐ−００８型）で１５分ごとに９０度転卵しながら孵卵を行った。孵卵開始２日後、ニワトリのＬＬ卵を７０％エタノールで消毒し、鈍端部を直径４．５ｃｍの円形にダイヤモンドカッターで切り取り中身を取り除いた殻にニワトリの卵白と卵黄を移し、濃度５０ｍｇ／ｍｌで卵白に懸濁した乳酸カルシウム溶液を０．５ｍｌ添加後、卵白を糊としてポリ塩化ビニリデンラップ（サランラップ、旭化成社製）とで蓋をした。ニワトリＬＬ卵に移した胚を自動転卵装置が内蔵された孵卵器で１５分ごとに３０度転卵しながら孵卵を行った。
【００４２】
（実験例５）遺伝子導入鳥類胚の孵化率
ウズラにウイルス導入胚操作を２回、計９６胚行い、複製能欠失型レトロウイルスベクターにより導入した胚及びニワトリにウイルス導入胚操作を４回、計１４０胚行い、複製欠失型レトロウイルスベクターにより導入した胚を実施例４で示した方法により孵化させた。ウズラでは平均１９．８％、ニワトリでは平均１７．１％の孵化率で遺伝子導入鳥類胚を孵化させることができた。図２に遺伝子導入ウズラ胚の孵化率を示した。
【００４３】
（実験例６）孵化胚より採取したゲノムＤＮＡのＰＣＲ解析
孵化したニワトリ及びウズラの卵殻の漿尿膜を採取し、ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ  Ｇｅｎｏｍｅ（東洋紡社製）を用いてトランスジェニックキメラ鳥類ゲノムＤＮＡを調製した。調製したゲノムＤＮＡをＧＦＰ内でＰＣＲにて増幅可能な化学合成したプライマー５’−ｔｇｇｔｇａａｔａｇａａｔｃｇａｇｃｔｇａａｇｇｇｃａｔｔ−３’（配列番号２２）５’−ａａｃｔｃｃａｇｃａｇｇａｃｃａｔｇｔｇｇｔｃｔｃｔｃｔｔ−３  ’（配列番号２３）を用いてＰＣＲを行った。この結果を図３に示した。この結果より、ウズラでは検定した全ての個体から導入遺伝子を検出することができた。また、ニワトリでも７０％の導入効率であった。このことにより本発明者らは高い効率でＧ０トランスジェニック鳥類を作製したことが確認された。
【００４４】
（実施例７）Ｇ１トランスジェニックウズラ作製及び伝播効率
Ｇ０トランスジェニックキメラ鳥類は遺伝子導入を行った際すでに多くの細胞からなる胚であるため、遺伝子が導入されている細胞と導入されていない細胞のモザイクになっていると考えられ、ここでＧ１トランスジェニックウズラの作製を試みた。Ｇ０トランスジェニックキメラウズラを非トランスジェニックウズラと自然交配させ、生まれたＧ１ウズラの導入遺伝子伝播効率を実施例６記載のトランスジェニックキメラウズラに対して検定した方法を用いて求めた。その結果５羽のＧ０トランスジェニックキメラウズラから生まれたヒナ合計１７５羽を解析し、１８羽から導入遺伝子を検出し伝播効率は約１０％であった。このＧ０トランスジェニックキメラウズラからＧ１ウズラへの伝播効率を図４に示した。
【００４５】
（実施例８）Ｇ１トランスジェニックウズラでのヒト成長ホルモンの発現解析
作製したＧ１トランスジェニックウズラでのヒト成長ホルモンの発現が卵管特異的であるかの確認を行った。成熟した雌の各組織を採取し、ｍＲＮＡ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ロッシュ社製）を用いてｍＲＮＡを取得し、得られたｍＲＮＡから化学合成したプライマー  ５’−ａｇｔａｔｔｃａｔｔｃｃｔｇｃａｇａａｃｃｃｃｃａｇａｃｃ−３’（配列番号２４）、５’−ｃｔｇｔｔｇｇｃｇａａｇａｃａｃｔｃｃｔｇａｇｇａａｃｔｇ−３  ’（配列番号２５）にてＲＴ−ＰＣＲをＲＴ−ＰＣＲＢｅａｄｓ（アマシャムバイオサイエンス社製）を用いて行った。この結果を図５に示した。この結果より卵管で導入したヒト成長ホルモンが発現している一方、他の組織では発現が認められなかった。このことより導入したオボアルブミンプロモーターが卵管特異的に働いていることが確認された。
【００４６】
（実施例９）Ｇ１トランスジェニックウズラ及びＧ０トランスジェニックキメラニワトリの卵白中でのヒト成長ホルモン蓄積の解析
Ｇ１トランスジェニックウズラ雌が成熟後産卵した卵を採取後ヒト成長ホルモンの卵白中の濃度をＥＬＩＳＡ法で測定した。定量には市販のヒト成長ホルモン測定用キットｈＧＨ  ＥＬＩＳＡ（ロッシュ社製）を用いて測定した。このキットでは数十ｐｇ／ｍｌのヒト成長ホルモンを測定することが可能である。ＥＬＩＳＡでヒト成長ホルモンの卵白中の濃度を測定した結果を図６に示した。この結果いずれのＧ１トランスジェニックウズラにおいても卵白中に数ｎｇ／ｍｌの濃度でヒト成長ホルモンが生産されていることが明らかとなった。また、Ｇ０トランスジェニックキメラニワトリ雌の卵白を測定した結果でも、１．１ｎｇ／ｍｌの濃度であった。
【００４７】
【発明の効果】
本発明により卵管特異的に発現可能なプロモーターを用いて外来タンパク質の発現をコントロールすることにより卵管特異的に発現することが可能であり、効率的に外来タンパク質を卵中に蓄積できることが示された。更に、本発明のＧ０トランスジェニックキメラウズラは導入遺伝子をＧ１ウズラに伝播し、Ｇ１トランスジェニックウズラも作製可能であることも示している。このことから有用タンパク質の生産において効率的に卵中に蓄積させることができるようになり、これを回収することにより安価に有用タンパク質を生産することが可能となった。
【００４８】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】複製能欠失型レトロウイルスベクターのベクターコンストラクトｐＬＧＯＧの構造を示す。ψはパッケージングシグナル配列を示す。ＧＦＰはグリーン・フルオロレッセント・プロテイン遺伝子を示す。ＯＶＡｐｒｏはオボアルブミンプロモーター遺伝子を示す。ｈＧＨはヒト成長ホルモンｃＤＮＡを示す。５’ＬＴＲ及び３’ＬＴＲはそれぞれＭｏＭＬＶのロングターミナルリピートを示す。Ａｍｐｒはアンピシリン耐性遺伝子を示す。
【図２】遺伝子導入胚の孵化効率を示す。遺伝子導入胚数に対してどれだけ孵化したかを孵化効率で示した。
【図３】孵化胚より採取したゲノムＤＮＡのＰＣＲによる解析を示した。Ｍは分子量マーカーを示した。番号は孵化したＧ０の番号を示した。ＧＦＰはグリーン・フルオロレッセント・プロテイン遺伝子を示した。
【図４】導入遺伝子のＧ１への伝播効率を示した。Ｇ０  Ｎｏ．はＧ０の番号を示した。検定したＧ１のうち導入遺伝子をもっているＧ１の割合を伝播効率（％）で表した。
【図５】オボアルブミンプロモーターによりコントロールされたヒト成長ホルモン遺伝子の組織特異的発現を示した。Ｍはマーカー、Ｂは脳、Ｈは心臓、Ｌは肝臓、Ｓは脾臓、Ｏは卵管を示した。ＮＣはネガティブコントロールとしてＰＣＲの鋳型なし、ＰＣはポジティブコントロールとしてｐＬＧＯＧを鋳型としてＰＣＲを行った。
【図６】Ｇ１ウズラ及びＧ０ニワトリが産んだ卵の卵白中におけるヒト成長ホルモン濃度（ｎｇ／ｍｌ）の測定を行った。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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