(57)【要約】      （修正有）【課題】内皮細胞増殖のインヒビター、および、血管新生関連疾患の治療方法及びそれを検出するための診断方法を提供する。【解決手段】血管内皮細胞腫よりエンドスタチンタンパク質を精製・単離し、癌を含む血管新生の介在する疾患及びプロセスを治療する組成物、またエンドスタチンタンパク質に特異的な抗体を使用する体液または組織中におけるエンドスタチンタンパク質の存在を検出するための診断方法及びそのキットを提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
コラーゲンタンパク質のＣ末端非コラーゲン性領域のフラグメントであり、血管新生を阻害する能力によってさらに特徴づけられる、単離されたエンドスタチンタンパク質。
【請求項２】
コラーゲンタンパク質が非細線維性コラーゲンタンパク質である、請求の範囲第１項に記載のエンドスタチンタンパク質。
【請求項３】
コラーゲンタンパク質がXVIII型コラーゲンタンパク質である、請求の範囲第１項に記載のエンドスタチンタンパク質。
【請求項４】
コラーゲンタンパク質がXV型コラーゲンタンパク質である、請求の範囲第１項に記載のエンドスタチンタンパク質。
【請求項５】
Ｃ末端非コラーゲン性領域がＮＣ１ドメインである、請求の範囲第１項に記載のエンドスタチンタンパク質。
【請求項６】
組換え的に製造された、請求の範囲第１項〜第５項のいずれか１項に記載のエンドスタチンタンパク質。
【請求項７】
天然に存在するアミノ酸配列を有する、請求の範囲第１項〜第６項のいずれか１項に記載のエンドスタチンタンパク質。
【請求項８】
ヒト由来である、請求の範囲第１項〜第７項のいずれか１項に記載のエンドスタチンタンパク質。
【請求項９】
血管新生をインビボで阻害する、請求の範囲第１項〜第８項のいずれか１項に記載のエンドスタチンタンパク質。
【請求項１０】
血管新生をインビトロで阻害する、請求の範囲第１項〜第８項のいずれか１項に記載のエンドスタチンタンパク質。
【請求項１１】
配列番号１に示すＮ末端アミノ酸配列を有する、請求の範囲第１項に記載のエンドスタチンタンパク質。
【請求項１２】
非還元ゲル電気泳動によって測定して１８キロダルトンの分子量、または、還元ゲル電気泳動によって測定して２０キロダルトンの分子量を有する、請求の範囲第１項〜第１１項のいずれか１項に記載のエンドスタチンタンパク質。
【請求項１３】
ヘパリンアフィニティーカラムに結合し、リジンアフィニティーカラムに結合しない、請求の範囲第１２項に記載のエンドスタチンタンパク質。
【請求項１４】
請求の範囲第１項に記載のエンドスタチンタンパク質をコードする単離された核酸分子を含む組成物。
【請求項１５】
コラーゲンタンパク質が非細線維性コラーゲンタンパク質である、請求の範囲第１４項に記載の組成物。
【請求項１６】
コラーゲンタンパク質がXVIII型コラーゲンタンパク質である、請求の範囲第１４項に記載の組成物。
【請求項１７】
コラーゲンタンパク質がXV型コラーゲンタンパク質である、請求の範囲第１４項に記載の組成物。
【請求項１８】
Ｃ末端非コラーゲン性領域がＮＣ１ドメインである、請求の範囲第１４項に記載の組成物。
【請求項１９】
エンドスタチンタンパク質が、天然に存在するアミノ酸配列を有する、請求の範囲第１４項〜第１８項のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２０】
核酸配列がヒト由来である、請求の範囲第１４項〜第１９項のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２１】
エンドスタチンタンパク質が血管新生をインビボで阻害する、請求の範囲第１４項〜第２０項のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２２】
エンドスタチンタンパク質が血管新生をインビトロで阻害する、請求の範囲第１４項〜第２０項のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２３】
エンドスタチンタンパク質が、配列番号１に示すＮ末端アミノ酸配列を有する、請求の範囲第１４項に記載の組成物。
【請求項２４】
エンドスタチンタンパク質が、非還元ゲル電気泳動によって測定して
１８キロダルトンの分子量、または、還元ゲル電気泳動によって測定して２０キロダルトンの分子量を有する、請求の範囲第１４項〜第２３項のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２５】
エンドスタチンタンパク質が、ヘパリンアフィニティーカラムに結合し、リジンアフィニティーカラムに結合しない、請求の範囲第２４項に記載の組成物。
【請求項２６】
エンドスタチンタンパク質をコードする核酸分子を含み、細胞内に存在するときにエンドスタチンタンパク質を発現することのできるベクターを含む、請求の範囲第１４項〜第２５項のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２７】
ベクターが、細菌細胞、酵母細胞および昆虫細胞から成る群から選択される細胞内に存在するものである、請求の範囲第２６項に記載の組成物。
【請求項２８】
細胞が、大腸菌、ピチア・パストリスまたはショウジョウバエのものである、請求の範囲第２６項に記載の組成物。
【請求項２９】
コラーゲンタンパク質よりも請求の範囲第１項に記載のエンドスタチンタンパク質に選択的に結合する、単離された抗体。
【請求項３０】
エンドスタチンタンパク質が非細線維性コラーゲンタンパク質のフラグメントである、請求の範囲第２９項に記載の単離された抗体。
【請求項３１】
エンドスタチンタンパク質がXVIII型コラーゲンタンパク質のフラグメントである、請求の範囲第２９項に記載の単離された抗体。
【請求項３２】
エンドスタチンタンパク質がXV型コラーゲンタンパク質のフラグメントである、請求の範囲第２９項に記載の単離された抗体。
【請求項３３】
XVIII型コラーゲンタンパク質よりもエンドスタチンタンパク質に選択的に結合する、請求の範囲第２９項に記載の単離された抗体。
【請求項３４】
XV型コラーゲンタンパク質よりもエンドスタチンタンパク質に選択的に結合する、請求の範囲第２９項に記載の単離された抗体。
【請求項３５】
Ｃ末端非コラーゲン性領域がＮＣ１ドメインである、請求の範囲第２９項に記載の単離された抗体。
【請求項３６】
エンドスタチンタンパク質が、配列番号１に示すＮ末端アミノ酸配列を有する、請求の範囲第２９項に記載の単離された抗体。
【請求項３７】
モノクローナル抗体である、請求の範囲第２９項〜第３６項のいずれか１項に記載の単離された抗体。
【請求項３８】
請求の範囲第３７項に記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
【請求項３９】
請求の範囲第２９項〜第３７項のいずれか１項に記載の抗体の結合を阻害する、単離された抗体。
【請求項４０】
請求の範囲第１項に記載のエンドスタチンタンパク質をコードする核酸分子を含むベクターを細胞に導入することを含む、エンドスタチンタンパク質を発現させる方法。
【請求項４１】
コラーゲンタンパク質が非細線維性コラーゲンタンパク質である、請求の範囲第４０項に記載の方法。
【請求項４２】
コラーゲンタンパク質がXVIII型コラーゲンタンパク質である、請求の範囲第４０項に記載の方法。
【請求項４３】
コラーゲンタンパク質がXV型コラーゲンタンパク質である、請求の範囲第４０項に記載の方法。
【請求項４４】
Ｃ末端非コラーゲン性領域がＮＣ１ドメインである、請求の範囲第４０項に記載の方法。
【請求項４５】
エンドスタチンタンパク質が、配列番号１に示すＮ末端アミノ酸配列を有する、請求の範囲第４０項に記載の方法。
【請求項４６】
エンドスタチンタンパク質が、非還元ゲル電気泳動によって測定して１８キロダルトンの分子量、または、還元ゲル電気泳動によって測定して２０キロダルトンの分子量を有する、請求の範囲第４０項〜第４５項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
試料中の、請求の範囲第１項に記載のエンドスタチンタンパク質を検
出する方法であって、
ａ．エンドスタチンタンパク質を含む疑いのある試料と、エンドスタチンタンパク質に特異的な抗体とを合わせ、
ｂ．エンドスタチンタンパク質と抗体との結合の存在を検出することにより、試料中のエンドスタチンタンパク質を検出する
ことを含む方法。
【請求項４８】
コラーゲンタンパク質が非細線維性コラーゲンタンパク質である、請求の範囲第４７項に記載の方法。
【請求項４９】
コラーゲンタンパク質がXVIII型コラーゲンタンパク質である、請求の範囲第４７項に記載の方法。
【請求項５０】
コラーゲンタンパク質がXV型コラーゲンタンパク質である、請求の範囲第４７項に記載の方法。
【請求項５１】
Ｃ末端非コラーゲン性領域がＮＣ１ドメインである、請求の範囲第４７項に記載の方法。
【請求項５２】
エンドスタチンタンパク質が、配列番号１に示すＮ末端アミノ酸配列を有する、請求の範囲第４７項に記載の方法。
【請求項５３】
エンドスタチンタンパク質が、非還元ゲル電気泳動によって測定して１８キロダルトンの分子量、または、還元ゲル電気泳動によって測定して２０キロダルトンの分子量を有する、請求の範囲第４７項〜第５２項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
試料が、個体の体液または組織から取得された、血液、血漿、脊髄液、唾液、精液、膣分泌物および尿から成る群から選択されるものである、請求の範囲第４７項〜第５３項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
個体が血管新生に関連した疾患または状態を有する、請求の範囲第５４項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【先行関連出願の相互参照】
【０００１】
本出願は、1995年10月23日に出願された仮出願第60/005,835号、1996年8月2日に出願された仮出願第60/023,070号、1996年9月17日に出願された仮出願第60/026,263号の優先権を主張するものである。上記に参照された各出願については、その全文を本明細書に含める。
【技術分野】
【０００２】
本出願は、血管新生依存性癌などの血管新生に関連する疾患の治療において有用な新規の血管新生インヒビターに関する。本発明は、さらに血管新生依存性癌を治療する新規な組成物および方法に関する。さらに、本発明は、エンドスタチン(endostatin)を測定する診断用のアッセイおよびキット、エンドスタチンの分布を調べるための組織化学キット、エンドスタチン生合成をモニターする分子プローブ、エンドスタチンに特異的な抗体、エンドスタチンレセプターに対するペプチド作動剤および拮抗剤の開発、およびエンドスタチンペプチドに結合した細胞毒性物質に関する。
【背景技術】
【０００３】
いくつかの直接的な証拠により、今日、固形腫瘍の成長および存続ならびにその転移に、血管新生が必須であることが示されている（非特許文献１〜４）。血管新生を刺激するために、腫瘍は、その線維芽細胞成長因子（ＦＧＦおよびＢＦＧＦ）（非特許文献５）および血管内皮細胞成長因子／血管透過性因子（ＶＥＧＥ／ＶＰＦ）を含む、さまざまな血管新生因子の産生を増大する。しかし、多くの悪性腫瘍は、アンジオスタチンやトロンボスポンジンなどの血管新生インヒビターも産生する（非特許文献６〜８）。血管新生の表現型は、血管新生についてのこれらの正および負のレギュレーターの全体的なバランスの結果であると考えられている（非特許文献７〜１０）。すべてが腫瘍の存在に伴うわけではないが、幾つかの他の内因性の血管新生インヒビターが確認されている。これらには、血小板第４因子（非特許文献１１，１２）、インターフェロンアルファ、インターロイキン−１２および／またはインターフェロンガンマ（非特許文献１３）により誘導されるインターフェロン誘導タンパク質１０（非特許文献１４，１５）、gro-ベータ（非特許文献１６）および１６ｋＤａのプロラクチンＮ末端フラグメント（非特許文献１７）が含まれる。内皮細胞の増殖を特異的に阻害する唯一の既知の血管新生インヒビターは、アンジオスタチンである（非特許文献８）。
【０００４】
アンジオスタチンは、約３８キロダルトン（ｋＤａ）の内皮細胞増殖に対する特異的インヒビターである。アンジオスタチンは、プラスミノーゲンの内部フラグメントで、プラスミノーゲンの５つのクリングルのうち少なくとも３つを有する。アンジオスタチンは、腫瘍重量(weight)を低下させ、かつある種の腫瘍モデルにおいて転移を阻害することが分かっている（非特許文献８）。本明細書において以後使用される「アンジオスタチン」という用語は、上記のアンジオスタチン、内皮細胞増殖を阻害する活性を有する、アンジオスタチンのペプチドフラグメント、および内皮細胞増殖阻害活性を有する、アンジオスタチンのアミノ酸配列と（本明細書に定義されるように）実質的に相同の配列を有するアンジオスタチンのアナログを指す。
【０００５】
【非特許文献１】Folkman, J. (1989). What is the evidence that tumors are angiogenesis dependent?. J. Natl. Cancer Inst. 82, 4-6.
【非特許文献２】Hori, A., Sasada, R., Matsutani, E., Naito, K., Sakura, Y., Fujita, T., and Kozai, Y. (1991). Suppression of solid tumor growth by immunoneutralizing monoclonal antibody against human basic fibroblast growth factor. Cancer Res. 51, 6180-6184.
【非特許文献３】Kim, K. J., Li, B., Winer, J., Armanini, M., Gillett, N., Phillips, H. S., and Ferrara, N. (1993). Inhibition of vascular endothelial growth factor-induced angiogenesis suppresses tumor growth in vivo. Nature 362, 841-844.
【非特許文献４】Millauer, B., Shawver, L. K., Plate, K. H., Risau, W., and Ullrich, A. (1994). Glioblastoma growth inhibited in vivo by a dominant-negative Flk-1 mutant. Nature 367, 576-579.
【非特許文献５】Kandel, J., Bossy-Wetzel, E., Radvany, F., Klagsburn, M., Folkman, J., and Hanahan, D. (1991). Neovascularization is associated with a switch to the export of bFGF in the multistep development of fibrosarcoma. Cell 66, 1095-1104.
【非特許文献６】Chen, C., Parangi, S., Tolentino, M. J., and Folkman, J. (1995). A strategy to discover circulating angiogenesis inhibitors generated by human tumors. Cancer Res. 55, 4230-4233.
【非特許文献７】Good, D. J., Polverini, P. J., Rastinejad, F., Le Beau, M. M., Lemons, R. S., Frazier, W. A., and Bouck, N. P. (1990). A tumor suppressor-dependent inhibitor of angiogenesis is immunologically and functionally indistinguishable from a fragment of thrombospondin. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 87, 6624-6628.
【非特許文献８】O'Reilly, M. S., Holmgren, L., Shing, Y., Chen, C., Rosenthal, R. A., Moses, M., Lane, W. S., Cao, Y., Sage, E. H., and Folkman, J. (1994). Angiostatin: A novel angiogenesis inhibitor that mediates the suppression of metastases by a Lewis lung carcinoma. Cell 79, 315-328.
【非特許文献９】Parangi, S., O'Reilly, M., Christofori, G., Holmgren, L., Grosfeld, J., Folkman, J., and Hanahan, D. (1996). Antiangiogenic therapy of transgenic mice impairs de novo tumor growth. Proc Natl. Acad. Sci. USA 93, 2002-2007.
【非特許文献１０】Rastinejad, F., Polverini, P. J., and Bouck, N. P. (1989). Regulation of the activity of a new inhibitor of angiogenesis by a cancer suppressor gene. Cell 56, 345-355.
【非特許文献１１】Gupta, S. K., Hassel, T., and Singh, J. P. (1995). A potent inhibitor of endothelial cell proliferation is generated by proteolytic cleavage of the chemokine platelet factor 4. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 7799-7803.
【非特許文献１２】Maione, T. E., Gray, G. S., Petro, J., Hunt, A. J., Donner, A. L., Bauer, S. I., Carson, H. F., and Sharpe, R. J. (1990). Inhibition of angiogenesis by recombinant human platelet factor-4 and related peptides. Science 247, 77-79.
【非特許文献１３】Voest, E. E., Kenyon, B., M., O'Reilly, M. S., Truitt, G., D'Amato, R. J., and Folkman, J. (1995), Inhibition of angiogenesis in vivo by interleukin 12. J. Natl. Cancer Inst. 87, 581-586.
【非特許文献１４】Angiolillo, A. L., Sgadari, C., Taub, D. D., Liao, F., Farber, J. M., Miaheshwari, S., Kleinman, H. K., Reaman, G. H., and Tosato, G. (1995). Human interferon-inducible protein 10 is a potent inhibitor of angiogenesis in vivo. J. Exp. Med. 182, 155-162.
【非特許文献１５】Strieter, R. M., Kunkel, S. L., Arenberg, D. A., Burdick, M. D., and Polverini, P. J. (1995). Human interferon-inducible protein 10(IP-10), a member of the C-X-C chemokine family, is an inhibitor of angiogenesis. Biochem. Biophys. Res. Comm. 210, 51-57.
【非特許文献１６】Cao, Y., Chen, C., Weatherbee, J. A., Tsang, M., and Folkman, J. (1995). Gro-beta, a C-X-C chemokine, is an angiogenesis inhibitor that suppresses the growth of Lewis lung carcinoma in mice. J. Exp. Med. 182, 2069-2077.
【非特許文献１７】Clapp, C., Martial, J. A., Guzman, R. C., Rentier-Delrue, F., and Weiner, R. I. (1993). The 16-kilodalton N-terminal fragment of human prolactin is a potent inhibitor of angiogenesis. Endocrinology 133, 1292-1299.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
このように、本発明の目的は、エンドスタチンタンパク質を含む組成物を提供することである。
【０００７】
本発明の別の目的は、血管新生の介在する疾患およびプロセスを治療する方法を提供することである。
【０００８】
本発明のさらに別の目的は、体液または組織中におけるエンドスタチンの存在および量を検出するための診断または予後判断の方法およびキットを提供することである。
【０００９】
本発明のさらに別の目的は、血管腫、固形腫瘍、白血病、転移、毛細血管拡張乾癬硬皮症、化膿性肉芽腫、心筋血管新生、プラーク血管新生(plaque neovascularization)、冠動脈側枝(coronary collaterals)、脳脈側枝(cerebral collaterals)、動静脈奇形、虚血性四肢脈管形成(ischemic limb angiogenesis)、角膜疾患、ルベオーシス、血管新生性緑内障、糖尿病性網膜症、水晶体後線維増殖症、関節炎、糖尿病性血管新生症、黄斑変性、創傷治癒、消化性潰瘍、骨折、ケロイド、脈管新生、造血、排卵、月経、および胎盤形成を含むが、これらに限定されない、血管新生の介在する疾患およびプロセスの治療のための方法および組成物を提供することである。
【００１０】
本発明のさらに別の目的は、癌を治療するまたは癌の成長を抑制する組成物を提供することにある。
【００１１】
本発明のさらに別の目的は、体液中のエンドスタチンに特異的な抗体の存在を検出および定量する方法を提供することにある。
【００１２】
本発明のさらに別の目的は、エンドスタチン分子の特定の領域に対して選択的なエンドスタチン抗体からなる組成物を提供することにある。
【００１３】
本発明のさらに別の目的は、癌の検出または予後判断のための方法を提供することにある。
【００１４】
本発明のさらに別の目的は、インビボおよびインビトロにおいてエンドスタチン結合部位を可視化および定量する際に使用される組成物を提供することにある。
【００１５】
本発明のさらに別の目的は、エンドスタチン生合成を検出および定量する際に使用される組成物を提供することにある。
【００１６】
本発明のさらに別の目的は、副作用が少ない、癌の治療法を提供することにある。
【００１７】
本発明のさらに別の目的は、癌を治療するまたは癌の成長を抑制するための細胞毒性物質と結合したエンドスタチンまたはエンドスタチンペプチドを含む組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明は、新規のタンパク質インヒビターとその使用のための方法に関する。
【００１９】
本阻害タンパク質は、約１８，０００〜約２０，０００ダルトン（１８〜２０ｋＤａ）の分子量を有し、培養内皮細胞における内皮細胞増殖を阻害する能力を有する。本タンパク質は、さらに、その好ましいＮ末端アミノ酸配列により特徴づけることができ、その始めの２０個は、以下の通りである。
【００２０】
His Thr His Gln Asp Phe Gln Pro Val Leu 
1   2   3   4   5   6   7   8   9   10
His Leu Val Ala Leu Asn Thr Pro Leu Ser
11  12  13  14  15  16  17  18  19  20
（配列番号１）
【００２１】
本発明の好ましい内皮細胞増殖インヒビターは、上記の特徴を有し、マウスの血管内皮腫細胞系ＥＯＭＡから単離、精製することができるものである。この阻害タンパク質は、エンドスタチンと命名した。
【００２２】
本発明は、血管新生の阻害に十分な用量の実質的に精製されたエンドスタチンまたはエンドスタチン誘導体を含む組成物を望ましくない血管新生を有するヒトまたは動物に投与することによる、望ましくなく制御されていない血管新生の介在する疾患およびプロセスを治療する方法および組成物を提供するものである。本発明は、腫瘍の治療または腫瘍の成長の抑制において特に有用である。血管新生前の転移腫瘍を有する人間または動物へのエンドスタチンの投与は、これらの腫瘍の成長または拡大を予防する。
【００２３】
本発明はまた、生物学的液体および組織中のエンドスタチンを検出および測定するための、および組織中のエンドスタチンの分布を調べるための診断方法およびキットを包含する。診断方法およびキットは、当業者においてよく知られている全ての形態を取り得るものである。本発明はまた、エンドスタチンに特異的な抗体およびエンドスタチンに特異的な抗体の結合を阻害する抗体を包含する。これらの抗体は、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよい。エンドスタチンに特異的な抗体は、血管新生の介在する癌または他の疾患の発病または再発の診断または予後判断のためにエンドスタチンの存在および量を検出する診断用キットに使用することができる。また、エンドスタチンに特異的な抗体は、ヒトまたは動物に、エンドスタチンに対する受動免疫を与え、これにより血管新生阻害を低下させるために、ヒトまたは動物に投与することもできる。
【００２４】
本発明は、また、体液中のエンドスタチンと結合した抗体の存在および量を検出するための診断方法およびキットを包含する。診断法およびキットは、当業者に既知のいかなる
形態でもよい。
【００２５】
本発明は、また、ポジトロンエミッショントモグラフィー、オートラジオグラフィー、フローサイトメトリー、ラジオレセプターバインディングアッセイ、および免疫組織化学法を含むがこれに限定されない最新の技術により、エンドスタチン結合部位の検出および可視化に使用するために、放射性同位元素または他の分子またはタンパク質でラベルすることのできるエンドスタチンペプチドフラグメントを包含する。
【００２６】
これらのエンドスタチンペプチドはまた、エンドスタチンレセプターにおいて作動剤および拮抗剤として作用し、これによりエンドスタチンの生物活性を増強または遮断する。このようなペプチドは、エンドスタチンレセプターの単離にも使用される。
【００２７】
本発明はまた、治療および研究用途のために細胞毒性剤と結合したエンドスタチン、エンドスタチンフラグメント、エンドスタチン抗血清、またはエンドスタチンレセプター作動剤および拮抗剤を包含する。
【００２８】
本発明は、エンドスタチンの転写および翻訳に関与するリボ核酸およびデオキシリボ核酸に対する分子プローブを包含する。これらの分子プローブは、組織および細胞中におけるエンドスタチンの生合成を検出および測定する手段を提供する。
【００２９】
様々な形態の組換えエンドスタチンタンパク質が、腫瘍を有する動物に投与されると徐放性(sustained release)抗血管新生化合物として働くことは驚くべき発見である。好ましい徐放性化合物の形態は、非再生(un-refolded)組換え産生エンドスタチンである。
【００３０】
さらに、本発明は、上記に開示されるアミノ酸配列ならびにエンドスタチンおよびその内皮細胞増殖阻害ペプチドフラグメントをコードする、相当する核酸コドンを含む核酸配列を包含する。
【００３１】
本発明は、また、エンドスタチンタンパク質およびペプチドフラグメント、相当する核酸配列、ならびにインヒビターおよびそのペプチドに特異的に結合する抗体を使用する、内皮細胞関連性の疾患および障害を診断する方法に関する。
【００３２】
本発明は、また、エンドスタチンに特異的なレセプターを同定する方法およびこれにより同定、単離されるレセプター分子を包含する。
【００３３】
本発明は、また、XVIII型コラーゲンおよびエンドスタチンアミノ酸配列を含有する他の分子ならびにそれらのペプチドからエンドスタチンを放出することができる新規の酵素を同定する方法に関する。このようなエンドスタチン産生酵素もまた、本発明の一面である。
【００３４】
ある重要な医療における方法は、新しい形態の受胎調節で、この方法では子宮内膜での血管新生が阻害され胚の着床がおこらない、または維持できないように、有効量のエンドスタチンを女性に投与する。
【００３５】
本発明の特に重要な一面は、患者における血管新生関連性疾患、特に血管新生依存性癌を治療する、および患者における血管新生依存性癌を治癒する新規かつ有効な方法の発見である。本方法は、予期せずして、腫瘍の成長の阻害および腫瘍塊の縮小という医学的に重要な結果を与える。本方法は、本発明のエンドスタチンと別の抗血管新生化合物、好ましくは、アンジオスタチンとの併用投与に関する。このように、本発明はまた、血管新生依存性癌の治療または治癒に有効である、エンドスタチンおよび任意にアンジオスタチン
を含有する製剤を包含する。
【００３６】
本発明のこれらおよび他の目的、特徴および利点は、以下の開示された実施態様の詳細な説明および添付の請求の範囲を検討することにより、明らかなものとなるであろう。
【発明の効果】
【００３７】
本タンパク質は、内皮増殖および血管新生に対する強力かつ特異的なインヒビターである。本インヒビターを使用する全身治療は、腫瘍の誘発する血管新生をほぼ完全に阻害し、強力な抗腫瘍活性を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３８】
本出願人は、インビトロにおいて増殖する内皮細胞に添加すると、内皮細胞の増殖を阻害する能力を有する新しいクラスのタンパク質分子を発見した。従って、これらのタンパク質分子は、機能からエンドスタチンと定義されているが、この機能上の定義はインビトロまたはインビボにおける内皮細胞の成長を阻害するエンドスタチンの生物活性をまったく制限するものではないことが理解されるべきものである。エンドスタチンの他の多くの機能についても同様である。
【００３９】
「エンドスタチン」という用語は、好ましくは、非還元および還元の条件のゲル電気泳動による測定においてそれぞれ18ｋＤａから20ｋＤａの大きさを示すタンパク質を指す。エンドスタチンという用語には、また、この18ｋＤａから20ｋＤａのタンパク質の前駆体も含まれる。エンドスタチンという用語には、また、内皮細胞の増殖を阻害する能力を有する、この18ｋＤａから20ｋＤａのタンパク質のフラグメントおよび実質的に同様のアミノ酸配列を有する修飾されたタンパク質およびペプチドが含まれる。例えば、構造的または化学的に類似のアミノ酸とのアミノ酸の置換が、そのタンパク質の構造、コンホメーション、または活性を有意に変えない、アミノ酸のサイレント置換は、本技術分野ではよく知られている。このようなサイレント置換体も、添付の特許請求の範囲内に含まれるものとする。
【００４０】
「エンドスタチン」という用語は、エンドスタチンの一端または両端から、またはタンパク質の内部領域から、１つ以上のアミノ酸が欠落しても、得られる分子が内皮増殖阻害活性を保持している場合において、短くなったタンパク質またはペプチドを含むことが理解されよう。「エンドスタチン」という用語は、また、エンドスタチンの一端、または両端に、またはタンパク質の内部に、１つ以上のアミノ酸を付加しても、得られる分子が内皮増殖阻害活性を保持している場合において、長くなったタンパク質またはペプチドを含む。このような分子、例えば、チロシンを最初のポジションに追加した分子は、アッセイで使用するための125ヨウ素による放射活性ヨウ素化などのラベリングに有用である。他の放射性同位元素によるラベリングも、エンドスタチンレセプターを含む標的細胞を破壊する分子ツールを提供するのに有用である。リシンなどの分子による他のラベリングも、エンドスタチンレセプターによる細胞破壊の機構を提供する場合もある。
【００４１】
「実質的に相同な配列」とは、エンドスタチンアナログ配列中のアミノ酸残基配列とエンドスタチンの配列との間で、少なくともおよそ７０％の相同性、好ましくは少なくとも８０％の相同性、さらに好ましくは少なくともおよそ９０％の相同性があることを意味する。
【００４２】
また、エンドスタチンという言葉の定義には、エンドスタチンタンパク質の修飾物、そのサブユニットおよびペプチドフラグメントが含まれる。このような修飾には、特定の部位における天然に存在するアミノ酸と、天然に存在するおよび天然には存在しないアミノ酸を含むがこれに限定されない他の分子との置換が含まれる。このような置換は、エンド
スタチンの生物活性を変更し、生物学的および薬理学的作動剤または拮抗剤を与える。エンドスタチンという用語はまた、配列番号１および表１中に示される始めの20個のＮ末端アミノ酸の配列からなるエンドスタチンのＮ末端フラグメントを含む。この始めの20個のＮ末端アミノ酸の配列は、新たに同定されたXVIII型コラーゲンのＣ末端フラグメントに相当する。
表１は、３文字および１文字のアミノ酸表示の関係を示す。
【００４３】
【表１】
2004236662.tif 000002
【００４４】
エンドスタチンのＮ末端アミノ酸配列は、マウスのコラーゲンアルファ１XVIII型中に見られる、アミノ酸１１０５から開始しアミノ酸１１２４で終わる内部の20アミノ酸ペプチドフラグメントに相当する。インヒビターＮ末端アミノ酸配列もまた、ヒトのコラーゲンアルファ１XVIII型中に見られる、アミノ酸１１３２から開始しアミノ酸１１５１で終わる内部の20アミノ酸ペプチドフラグメントに相当する。
【００４５】
エンドスタチンは、マウスの血管内皮腫ＥＯＭＡから単離することができる。エンドスタチンは、組換えソース（source）、動物に移植された遺伝的に改変された細胞、腫瘍、および培養細胞および他のソースより生産することができる。エンドスタチンは、神経系の細胞内で産生されることが予期される。エンドスタチンは、血清、尿および腹水を含むがこれに限定されない体液から単離すること、または化学または生物学的方法（例えば、細胞培養、組換え遺伝子発現、ペプチド合成、前駆分子から活性エンドスタチンへのインビトロにおける酵素的触媒反応）により合成することができる。組換え技術には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用するＤＮＡソースからの遺伝子の増幅、および逆転写酵素／ＰＣＲを使用したＲＮＡソースからの遺伝子の増幅が含まれる。
【００４６】
エンドスタチンは、特異的かつ可逆的に内皮細胞の増殖を阻害する。本発明のインヒビタータンパク質分子は、受胎調節薬として、ならびに血管新生関連性疾患、特に血管新生
依存性癌および腫瘍の治療に有用である。本タンパク質分子はまた、血管新生依存性癌および腫瘍の治癒（curing）にも有用である。血管新生依存性癌および腫瘍を治療および治癒するというこれらの新規な化合物の予期せざる驚くべき能力は、医療分野において長らく満たされていなかった必要性に応えるものであり、人類に対して重要な恩恵をもたらすものである。
【００４７】
本明細書で使用される重要な用語は、以下のように定義される。「癌」とは、血管新生依存性癌および腫瘍、すなわちその成長（体積および／または質量における増大）のために、血液を供給する血管の数および密度の増大を必要とする腫瘍を意味する。「退縮」とは、腫瘍の質量および大きさの減少を意味する。
【００４８】
本発明の内皮増殖阻害タンパク質は、当業者によく知られている自動化タンパク質合成方法によって製造することができる。または、本発明の内皮増殖阻害タンパク質すなわちエンドスタチンは、共通または類似のＮ末端アミノ酸配列を有するタンパク質である、ヒトのアルファ１XVIII型コラーゲンおよびマウスのアルファ１XVIII型コラーゲンなどのより大きな既知のタンパク質より単離することができる。類似のＮ末端アミノ酸配列を有する他の可能性のあるエンドスタチン出発材料の例には、Bos taurus プレガストリック(pregastric)エステラーゼ、ヒトアルファ１タイプ１５コラーゲン、シュードモナスｓｐ．に由来するＮＡＤ依存性ホルメートデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．２．１．２）、ウシのアデノウイルスタイプ３のｓ１１４５９ヘキソンタンパク質、CELF21D12 2F21d12.3 Ｃ．エレガンス（Caenorhabditis elegans）遺伝子産物、トマトゴールデンモザイクウイルス由来のＶＡＬ１  ＴＧＭＶ  ＡＬ１タンパク質、ヒトのアデノウイルス１２由来のｓ０１７３０ヘキソンタンパク質、酵母菌が含まれる。例えば、エンドスタチンに密接に関係するペプチドは、アミノ酸５０２から５２１に相当するＢＯＶＭＰＥ１プレガストリックエステラーゼ（BOS TAUTUS）遺伝子配列に由来してもよいし、アミノ酸３１６で始まり３３５で終わるヒトのコラーゲンアルファ１タイプ１５に由来してもよい。
【００４９】
手動または自動タンパク質合成を含む、これらまたは他のソースに由来するタンパク質およびペプチドは、ウシ毛細血管内皮細胞増殖アッセイなどの生物学的活性アッセイを使用することにより、迅速かつ簡単にその内皮増殖阻害作用について調べることができる。他の阻害活性についてのバイオアッセイには、ニワトリＣＡＭアッセイ、マウス角膜アッセイ、および移植腫瘍に対する単離または合成タンパク質の投与作用がある。ニワトリＣＡＭアッセイは、O'Reilly，他により”Angiogenic Regulation of Metastatic Growth”Cell．vol．79(2), October 21, 1994 pp．315−328中に記載されており、その全文を参照により、本書に包含する。簡単に説明すると、そのままの卵黄を有する３日齢のニワトリ胚を、卵から分離し、ペトリ皿上に置く。３日間インキュベーションした後、テストするタンパク質を含むメチルセルロースディスクを各胚のＣＡＭに添加する。４８時間インキュベーションした後、胚およびＣＡＭを観察して、内皮成長が阻害されているかどうかを調べる。マウス角膜アッセイでは、成長因子を含有するペレット、および内皮成長インヒビターであることが疑われる物質を含有する別のペレットを、マウスの角膜に移植し、角膜中に作られた毛細血管のパターンを観察することを含む。
【００５０】
本出願人の発明はまた、本発明の内皮増殖阻害タンパク質分子、およびこのようなタンパク質分子に特異的に結合するモノクローナルおよびポリクローナル抗体に相当し、これをコードする核酸配列を包含する。生物活性タンパク質分子、そのタンパク質に相当する核酸配列および本発明のタンパク質に特異的に結合する抗体は、インビボにおける内皮プロセスの制御において、および例えば遺伝子療法による、内皮細胞関連性疾患の診断および治療において有用である。
【００５１】
エンドスタチンおよびエンドスタチンアナログに相当し、およびこれをコードする核酸
配列は、アミノ酸配列の知識に基づいて作成することができ、この技術分野ではコドン（３つの核酸塩基の配列）とアミノ酸間の対応が認識されている。あるコドン中の３つの塩基が代わってもそれでもまだ同じアミノ酸をコードするという、遺伝子コードの縮重のため、全ての特定のタンパク質またはペプチドフラグメントについて、多くの異なる可能なコーディング核酸配列が派生する。
【００５２】
核酸配列は、当技術分野でよく知られている自動化システムを使用して合成される。配列全体を合成することも、一連のより小さいオリゴヌクレオチドを作成して後に結合して完全な長さの配列を作成することもできる。または、核酸配列が、Ｎ末端アミノ酸配列に基づいて設計されたオリゴヌクレオチドプローブと遺伝子材料をクローニングするための既知の技術を使用することにより、遺伝子バンクより由来することもある。
【００５３】
本発明は、また、癌などの血管新生の介在する疾患の診断または予後判断の目的での体液および組織中のエンドスタチンの検出を含む。本発明はまた、細胞および組織内におけるエンドスタチン結合部位およびレセプターの検出を含む。本発明はまた、エンドスタチンの産生を刺激することによる、ならびに／または実質的に精製されたエンドスタチン、エンドスタチン作動剤または拮抗剤、および／もしくはエンドスタチン抗血清またはエンドスタチン抗血清に対する抗血清の患者への投与による、関節炎や腫瘍などを含むがこれらに限定されない血管新生疾患およびプロセスの治療または予防の方法を含む。さらなる治療方法には、エンドスタチン、エンドスタチンフラグメント、エンドスタチン抗血清または細胞毒性剤を結合したエンドスタチンレセプター作動剤および拮抗剤の投与が含まれる。エンドスタチンの由来は、動物でもヒトでもよいことが理解されるであろう。エンドスタチンは、化学反応により、または発現系と組み合わせた組換え技術により合成することもできる。エンドスタチンはまた、エンドスタチン前駆体などの、エンドスタチンのセグメントと配列相同性または同一性を有する異なる分子を酵素分解して、抗血管新生活性を有するペプチドを作成することによっても製造される。
【００５４】
エンドスタチンと特異的に結合する抗体を使用した受動抗体療法を、生殖、発生、および創傷治癒および組織修復などの内皮依存性プロセスを調節するために使用することが可能である。さらに、内因性のエンドスタチン抗血清のエンドスタチンと結合する作用をブロックするために、エンドスタチン抗体のＦａｂ領域に対する抗血清を投与することもできる。
【００５５】
エンドスタチンおよびエンドスタチンアナログに対して特異的な抗体は、当業でよく知られている技術および方法によって製造される。抗体は、ポリクローナルでもモノクローナルでもよい。体液中の本発明の内皮増殖インヒビターの存在の有無を測定するために、抗体は、ＥＬＩＳＡ、サンドイッチイムノアッセイ、およびラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）を含む競合的および非競合的イムノアッセイなどのよく知られた方式の免疫アッセイにおいて使用される。体液の例には、血液、血清、腹水、胸膜液、脳脊髄液、子宮液、唾液および粘液が含まれるが、これに限定されるものではない。
【００５６】
本発明のタンパク質、核酸配列および抗体は、内皮細胞関連性疾患および障害の診断および治療に有用である。特に重要な内皮細胞プロセスは、血管新生、血管の形成である。血管新生関連性疾患は、本発明の内皮細胞増殖阻害タンパク質を使用して、診断および治療することができる。血管新生関連性疾患には、例えば固形腫瘍、白血病などの血液腫瘍（blood born tumors）、および癌転移などの血管新生依存性癌；例えば血管腫、聴神経腫、神経線維腫、トラコーマおよび化膿性肉芽腫などの良性腫瘍；慢性関節リウマチ；乾蘚；例えば糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、黄斑変性、角膜移植拒絶、血管新生緑内障、水晶体後線維増殖、ルベオーシスなどの眼血管新生性疾患；オスラー−ウェバー症候群；心筋血管新生；プラーク血管新生；末梢血管拡張；血友病関節；血管線維腫；および創傷
肉芽などが含まれるがこれに限定されるものではない。本発明の内皮細胞増殖阻害タンパク質は、内皮細胞の過剰または異常な刺激の疾患の治療に有用である。これらの疾患には、腸癒着、アテローム硬化、強皮症、および肥厚性瘢痕、すなわちケロイドが含まれるがこれに限定されるものではない。これらは、また、ネコ引っ掻き病（Rochele minalia quintosa）および潰瘍（Helobacter pylori）などの病理学的帰結として血管新生を有する疾患の治療に有用である。
【００５７】
内皮細胞増殖阻害タンパク質は、胚の着床に必要な子宮の血管新生を減少または抑制することによって、受胎調節薬として使用することができる。このように本発明は、胚の着床を防止するのに十分量の阻害タンパク質を女性に投与する、有効な受胎調節方法を提供するものである。受胎調節方法のある側面において、性交または受精が起こる前または後に胚の着床をブロックするに十分量の阻害タンパク質が投与され、これによりおそらく「事後的（morning after）」方法である有効な受胎調節法を提供するものである。この記載に制限されるものではないが、子宮内膜表面の血管新生の阻害が胚盤胞(blastocyst)の着床を妨げると考えられる。卵管粘膜における同様の血管新生阻害が胚盤胞の着床を妨害し、これにより卵管妊娠の発生を防止する。投与方法には、錠剤、注射（静脈、皮下、筋肉）、座薬、膣スポンジ、膣タンポン、および子宮内装置が含まれるが、これらに限定されるものではない。エンドスタチン投与はまた、正常の促進された胎盤の血管新生、および順調に着床した胚盤胞および分化中の胚および胎児内の血管の発達を妨害すると考えられる。
【００５８】
逆に、レセプター拮抗剤として作用するエンドスタチンアナログによるエンドスタチンレセプターの遮断は、内皮形成および血管新生を促進する。このような作用は、子宮内膜の血管新生が不適切な場合、これに伴う不妊や、創傷の修復、切り傷や切開部の治癒、糖尿病における血管の問題、特に網脈および末梢血管の治療、筋肉および皮膚などの移植組織における血管新生の促進、特に心臓または心臓組織の移植後およびバイパス手術後における心筋の血管新生の促進、増強された細胞毒性物質のデリバリーのための固形および比較的無血管性の腫瘍の血管新生の促進、および大脳皮質および脊髄を含むがこれに限定されない神経組織への血流の増大などの場合において、好ましいものである。
【００５９】
驚くべきことに、非再生および不溶性の組換えエンドスタチンも、患者へ投与した場合に徐放性デポー剤(depot)として使用される強力な抗血管新生化合物であることが発見されている。
【００６０】
本発明は、また、エンドスタチンおよびエンドスタチンの内皮細胞増殖阻害ペプチドフラグメント、エンドスタチンおよびこの活性ペプチドフラグメントに相当する核酸配列、エンドスタチンおよびそのペプチドに特異的に結合する抗体を使用する、内皮細胞関連性疾患および障害の診断方法に関する。
【００６１】
本発明はさらに、エンドスタチンに特異的なレセプターを同定する方法、およびこれにより同定および単離されたレセプター分子も包含する。
【００６２】
本発明はまた、エンドスタチンレセプターを定量する方法も提供するものである。
【００６３】
本発明の特に重要な態様は、患者内の血管新生依存性癌を治療および治癒する新規で有効な方法の発見である。腫瘍の成長を阻害し、腫瘍塊の顕微鏡的なサイズへの持続的な退縮を引き起こすのに十分な量のエンドスタチンとアンジオタチンの併用投与により、血管新生依存性癌が治癒することが、予期せずして判明した。これにより、本発明はまた、血管新生依存性癌および腫瘍の処置および治療に有効な製剤を含む。
【００６４】
さらに詳細には、昆虫細胞または大腸菌より産生される組換えマウスエンドスタチンは、転移および原発腫瘍の血管新生および成長を強力に阻害する。新規な徐放性の方法において、大腸菌産生組換えエンドスタチンは、非再生物の懸濁液として、血管新生を阻害するに十分な量で投与され、これにより腫瘍の成長が阻害された。組換えエンドスタチンが腫瘍の退縮を引き起こすのに十分な量で投与されると、腫瘍塊は退縮した。体重の１〜２％の原発腫瘍は、エンドスタチンによる処置で、１５０倍を超えて退縮し、顕微鏡的な休眠病変になった。休眠腫瘍の免疫組織化学的分析の結果、血管新生の抑制は、高率の腫瘍細胞のアポプトーシスによって平衡した高い腫瘍細胞の増殖を伴うことが判明した。エンドスタチンで処理されたいずれのマウスにおいても毒性の所見はなかった。
【００６５】
本発明の一部として、エンドスタチンは患者の血液または尿などの体液から単離され、またはエンドスタチンは、当業者によく知られている組換えＤＮＡ法または合成ペプチド化学方法により製造され得ることが考えられる。タンパク質精製方法は、当技術分野はよく知られており、エンドスタチンの精製方法、および阻害作用のアッセイ方法の具体的な例は、以下の実施例に記載される。ヒト内因性エンドスタチンの単離は、同様の手法を用いて行われる。
【００６６】
組換えＤＮＡ技術を使用したエンドスタチンの製造方法の一例では、（１）以下にさらに詳しく記載されるように、上記のエンドスタチンを同定および精製し、（２）精製されたインヒビターのＮ末端アミノ酸配列を決定し、（３）Ｎ末端アミノ酸配列に相当するＤＮＡオリゴヌクレオチドプローブを合成作成し、（４）ヒトまたは他の哺乳類ＤＮＡのＤＮＡ遺伝子バンクを形成し、（５）ＤＮＡオリゴヌクレオチドプローブで遺伝子バンクを探索し、（６）オリゴヌクレオチドにハイブリダイズするクローンを選択し、（７）クローンからインヒビター遺伝子を単離し、（８）その遺伝子を発現ベクターなどの適当なベクターに挿入し、（９）遺伝子を含有するベクターを、インヒビター遺伝子を発現することのできる微生物または他の発現系に挿入し、（１０）組換え技術で生成されたインヒビターを単離するステップを要する。上記の技術は、"Molecular Cloning: A Laboratoary Manual" Second Edition By Sambrook et al., Cold Spring Harbor Press, 1989などの実験マニュアルにさらに詳細に記載されている。
【００６７】
エンドスタチンの遺伝子は、（１）組織からメッセンジャーＲＮＡを単離し、（２）逆転写酵素を使用して、相当するＤＮＡ配列を作成し、ついで（３）適当なプライマーを使用するＰＣＲによって、活性のあるエンドスタチンアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を増幅することにより、高濃度のエンドスタチンを発現する細胞または組織（腫瘍細胞のような）からも単離される。
【００６８】
エンドスタチンまたは生物活性を有するそのフラグメントを作成する別の方法は、ペプチド合成である。いったん、エンドスタチンの生物活性のあるフラグメントを、以下に詳細に記載するアッセイシステムを使用して見つければ、例えば、自動ペプチド配列決定方法により配列を決定することができる。または、エンドスタチンをコードする遺伝子またはＤＮＡ配列が単離されれば、例えば、上記の方法などにより、ＤＮＡ配列を決定することができ、ついでこれによりアミノ酸配列に関する情報が提供される。これにより、トリプシン消化などの特定の方法により、生物学的に活性なフラグメントが形成されたら、またはそのフラグメントのＮ末端の配列決定がされれば、残りのアミノ酸配列は、相同するＤＮＡ配列から決定することができる。
【００６９】
例えばＮ末端の20アミノ酸など、ペプチドのアミノ酸配列が判明すれば、"Solid Phase
Peptide Synthesis: A Practical Approach"  E．Atherton and R．C．Sheppard,  IRL Press,  Oxford Englandに例示されるように、当技術分野においてよく知られている技術によりフラグメントを合成することができる。同様に、多くのフラグメントを合成して、
これを結合してより大きなフラグメントを作成することもできる。インビトロおよびインビボにおける作動性および拮抗性作用を調べるために、これらの合成ペプチドフラグメントは、また、特定の位置にアミノ酸置換をもつように作成することもできる。組織に対する高い親和性を有するペプチドフラグメントは、アフィニティーカラムでエンドスタチンレセプターを単離するために使用することができる。エンドスタチンレセプターの単離および精製は、エンドスタチンの作用メカニズムの解明に向けての基本的なステップである。このことは、生物活性への最終的な経路であるエンドスタチンレセプターの活性を調節する薬剤の開発につながるものである。レセプターの単離により、インシチュおよび溶液ハイブリダイゼーション技術を使用した、レセプターの分布および合成をモニターをするヌクレオチドプローブの構築が可能となる。
【００７０】
エンドスタチンは、血管新生の介在する、またはこれを包含する疾患またはプロセスの治療に有効である。本発明は、血管新生介在性の疾患を、有効量のエンドスタチンまたはエンドスタチン作動剤および拮抗剤により治療する方法を含む。血管新生介在性の疾患には、固形腫瘍；白血病などの血液腫瘍（blood born tumors）、腫瘍転移；例えば血管腫、聴神経腫、神経線維腫、トラコーマおよび化膿性肉芽腫などの良性腫瘍；リューマチ様関節炎；乾蘚；例えば糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、黄斑変性、角膜移植拒絶、血管新生緑内障、水晶体後線維増殖、ルベオーシスなどの眼血管新生性疾患；オスラー・ウェバー症候群；心筋血管新生；プラーク血管新生；末梢血管拡張；血友病関節；血管線維腫；および創傷肉芽などが含まれるがこれに限定されるものではない。エンドスタチンは、内皮細胞の過剰または異常な刺激の疾患の治療に有用である。これらの疾患には、腸癒着、アテローム硬化、強皮症、および肥厚性瘢痕すなわちケロイドが含まれるがこれらに限定されるものではない。エンドスタチンは、未分化胚芽細胞の着床および胎盤、胚盤胞、および胚および胎児の発達に必要な血管新生を抑制することにより、受胎調節薬として使用することができる。
【００７１】
エンドスタチンの合成ペプチドフラグメントには、様々な用途がある。エンドスタチンレセプターに高い特異性および親和性で結合するペプチドを放射活性標識してオートラジオグラフィーおよびメンブラン結合技術を使用した結合部位の可視化および定量に使用することができる。この応用は、重要な診断および研究のための手段を提供するものである。エンドスタチンレセプターの結合特性を知ることは、レセプターにリンクした変換メカニズムの研究を助けるものである。
【００７２】
さらに、これらのペプチドに寿命の短い放射性同位元素で標識することで、エンドスタチン結合部位を有する腫瘍の位置を確認するために、ポジトロンエミッショントモグラフィーまたは他の最新のラジオグラフィック技術を使用して、インビボにおけるレセプター結合部位を可視化することができる。
【００７３】
これらの合成ペプチド内で系統的にアミノ酸置換をすることにより、レセプターに対するエンドスタチン結合を増大または低下させるエンドスタチンレセプターに対する親和力の高いペプチド作動剤および拮抗剤を得ることができる。このような作動剤は、微小転移の成長を抑制するのに使用され、これにより、癌の伝播を制限する。エンドスタチンの拮抗剤は、不適切な血管新生の場合に、アンジオスタチンの阻害作用を遮断し、おそらく血管新生を促進させるために使用される。この治療は、糖尿病における創傷治癒を促進する治療効果を有する。
【００７４】
エンドスタチンペプチドは、培養腫瘍細胞からエンドスタチンレセプターを単離する目的のアフィニティーカラムの作成に使用される。エンドスタチンレセプターの単離および精製についで、アミノ酸配列決定が行われる。次いで、レセプターの発現のためのベクター中へ挿入するために、核酸プローブが作成される。これらの技術は、当業者のよく知っ
ているものである。エンドスタチンレセプターを腫瘍細胞内に導入することにより、これらの細胞の内因性および外因性エンドスタチンに対する反応性が増大され、これにより転移成長の速度が減少される。
【００７５】
リシンなどの細胞毒性剤をエンドスタチンおよび高親和性エンドスタチンペプチドフラグメントに結合させて、これによりエンドスタチンに結合した細胞を破壊する手段を提供することができる。これらの細胞は、微小転移および原発腫瘍を含むがこれらに限定されない、多くの部位に見いだすことができる。細胞毒性剤と結合したペプチドは、所望の位置への送達を最大にするように設計された方法により、注入される。例えば、リシンを結合した高親和性エンドスタチンフラグメントは、標的部位に血液供給する血管中にカニューレを経て、または標的中に直接に送達される。このような薬剤はまた、注入カニューレと連結した浸透圧ポンプを経由してコントロールされた方法で送達される。組織の血管新生を増大させるために、エンドスタチン拮抗剤の組合せを、血管新生の促進剤と併用投与することもある。この治療方法は、転移癌を破壊する有効な手段を提供するものである。
【００７６】
本発明によれば、エンドスタチンは、疾患を治療するために、他の組成物および方法と組み合わせて使用することができる。例えば、腫瘍を、エンドスタチンと組み合わせて、従来のように、手術、放射線照射または化学療法により治療し、その後、微小転移の休眠を継続させ、残存する原発腫瘍を安定化するために、引き続いてエンドスタチンを患者に投与することができる。
【００７７】
本発明のエンドスタチンはまた、このインヒビターに特異的な抗体を産生するために使用することもできる。抗体は、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよい。エンドスタチンと特異的に結合するこれらの抗体は、体液または組織中のエンドスタチンを検出または定量するための、当業者のよく知る診断方法およびキットにおいて使用することもできる。これらのテストの結果は、癌および他の血管新生の介在する疾患の発生または再発を診断または予測するために使用することができる。
【００７８】
エンドスタチンは、エンドスタチンと結合する能力を有する抗体を検出および定量する診断的方法およびキットに使用することもできる。これらのキットは、インシチュにおいて原発腫瘍により分泌されたエンドスタチン存在下における微小転移の伝播を示す、循環中のエンドスタチン抗体の検出を可能とするものである。このような循環抗エンドスタチン抗体を持つ患者は、腫瘍および癌が発生しやすく、治療後または寛解期間後、癌の再発をする確率がより高い。これらの抗エンドスタチン抗体のＦａｂフラグメントは、抗エンドスタチン抗体による循環エンドスタチンの除去を中和するために使用することのできる抗エンドスタチンＦａｂフラグメント抗血清を作成する抗原として使用することができる。
【００７９】
本発明の別の態様は、過剰に存在する内因性エンドスタチンの作用を遮断する方法である。これは、ヒトまたは動物に、その系中に存在する好ましくないエンドスタチンに特異的な抗体で受動的な免疫を与えることによりおこなわれる。この治療は、異常な排卵、月経、および胎盤形成、ならびに血管新生を治療する際に重要である。これは、転移プロセスに対するエンドスタチン除去の作用を調べる有用な手段を提供するものである。エンドスタチン抗体のＦａｂフラグメントは、エンドスタチンの結合部位を含む。このフラグメントは、当業者に知られる技術を使用してエンドスタチン抗体から単離される。エンドスタチン抗血清のＦａｂフラグメントは、抗Ｆａｂフラグメント血清を作成する抗原として使用される。このエンドスタチンのＦａｂフラグメントに対する抗血清の注入により、エンドスタチンがエンドスタチン抗体と結合することが抑制される。エンドスタチンの抗エンドスタチンのＦａｂフラグメントへの結合を遮断することにより内因性抗エンドスタチン抗体を中和することによって治療効果が得られる。この治療の全体的な効果は、内因性
の循環するエンドスタチンが標的細胞に到達する能力を促進し、これにより転移の拡大を減少することである。
【００８０】
本発明は、内皮阻害活性を有するあらゆるエンドスタチン誘導体を含有することを意図していることが理解されよう。本発明は、完全なエンドスタチンタンパク質、エンドスタチンタンパク質の誘導体およびエンドスタチンタンパク質の生物学的に活性なフラグメントを含む。これらには、アミノ酸置換、またはアミノ酸官能基に糖や他の分子が付加されたエンドスタチン活性を有するタンパク質を含む。本発明はまた、エンドスタチンおよびエンドスタチンレセプターをコードする遺伝子、ならびにこれらの遺伝子によって発現されるタンパク質までを包含する。
【００８１】
上記のエンドスタチン活性を有するタンパク質およびタンパク質フラグメントは、当業者に既知の製剤方法を使用することにより、薬学的に許容される製剤中における単離および実質的に精製されたタンパク質およびタンパク質フラグメントとして提供することができる。これらの製剤は、標準的な経路で投与することができる。一般に、配合剤は、局所、経皮、腹腔内、頭蓋内、脳室内、大脳内、膣内、子宮内、経口、直腸内、または非経口（例えば、静脈内、脊髄内、皮下、または筋肉内）経路で、投与することができる。さらに、化合物が徐放されるように、エンドスタチンを生物分解性ポリマー中に含有させ、ポリマーを薬剤デリバリーが必要とされる場所の付近、例えば、腫瘍部位に埋め込む、またはエンドスタチンが全身的にゆっくりと徐放されるように埋め込むことができる。また、浸透圧マイクロポンプを使用して、転移成長部に直接またはその腫瘍に血液を供給する血管内に送達するなど、高濃度のエンドスタチンを問題の部位にカニューレを経してコントロールしながら送達することもできる。生物分解性ポリマーとその使用は、例えば、本明細書に参考文献としてその全文を含めるBrem et al．，J．Neurosurg．74：441−446（1991）などに詳細に記載される。
【００８２】
本発明のエンドスタチンの用量は、治療する疾患の段階または状態および、そのヒトまたは動物の体重および状態、ならびに化合物の投与経路などの他の臨床要因によって異なる。ヒトまたは動物を治療する場合は、約０．５ｍｇ／キログラムから５００ｍｇ／キログラムのエンドスタチンが投与できる。さらに好ましい範囲は、１ｍｇ／キログラムから１００ｍｇ／キログラムで、最も好ましい範囲は、２ｍｇ／キログラムから５０ｍｇ／キログラムである。特定の動物またはヒト内におけるエンドスタチンの半減期により、エンドスタチンは１日あたり数回から１週間に１回の割合で投与され得る。本発明は、ヒトおよび動物の双方における用途があることが理解されよう。本発明の方法は、同時または一定時間経過後に与えられる、単回および多回投与を含む。
【００８３】
エンドスタチン製剤は、経口、直腸、眼（硝子体内または眼房内を含む）、鼻、局所（頬側(buccal)および舌下(sublingal)を含む）、子宮内、膣、非経口（皮下、腹腔内、筋肉内、静脈内、皮内、頭蓋内、気管内、および硬膜外を含む）投与に適切な製剤を含む。エンドスタチン製剤は、単位用量形態で便利に提供することもでき、および従来の薬学技術で調剤できる。このような技術には、活性成分と薬学的キャリアまたは賦形剤とを混合する段階が含まれる。一般に、製剤は活性成分と液体キャリアまたは微細に砕かれた固形キャリアまたはその双方と均一かつ十分混ざるように混合し、その後必要に応じて製剤に成形して製造される。
【００８４】
非経口投与に適切な剤形には、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤および製剤と投与対象の血液を等張とするための溶質を含む場合もある水溶性および非水溶性滅菌注射溶液、ならびに懸濁剤および濃縮剤を含有する場合もある水溶性および非水溶性滅菌懸濁液が含まれる。製剤は、例えば密封アンプルおよびバイアルなどの単位用量または複数用量容器中にて提供することができる、または例えば注射用液などの滅菌液体キャリアを使用直前に添加す
るだけでよい凍結乾燥状態で保存することができる。即時注射溶液および懸濁液は、以前に記載した種類の滅菌粉末、顆粒、および錠剤から作成される。
【００８５】
好ましい単位用量製剤は、上記のように、投与成分の１日分の用量または単位、１日分のサブドース、またはその適当な一部を含有する製剤である。特に上記した成分に加えて、本発明の製剤は、その種類の製剤に関する他の当技術分野における従来の薬剤を含有し得ることが理解されよう。
【００８６】
完全なエンドスタチン分子の異なるペプチドフラグメントは、これらに限定されるものではないが以下のものを含むいくつかの用途における使用のために合成することができる。すなわち、特異的な抗血清を作成するための抗原として、エンドスタチン結合部位に対して活性な作動剤および拮抗剤として、エンドスタチンと結合する細胞をねらって殺すための細胞毒性剤と結合するペプチドとしての用途である。これらのペプチドを構成するアミノ酸配列は、分子の外側領域のこれらの位置に基づいて選択され、抗血清と結合しやすい。エンドスタチンのアミノおよびカルボキシ末端、および分子の中央領域は、合成されるフラグメント内で別々に表される。エンドスタチンの20アミノ酸より遠位のアミノ酸末端およびカルボキシ末端は、チロシンおよびリジン残基を含むか、含むように修飾され、多くの技法により標識される。チロシンまたはリジン残基を持たないフラグメントに、ペプチド上の反応性アミノおよび水酸基のラベリングができるように、チロシンまたはリジンが付け加えられる。これらのペプチド配列は、配列データバンクを使用して既知の配列と比較し、配列ホモロジーの可能性について調べる。この情報により、他の分子と高い配列ホモロジーを示す配列の排除が容易になり、これによりエンドスタチンに対する抗血清、作動剤および拮抗剤の開発において高い特異性を得る可能性を高めることができる。
【００８７】
ペプチドは標準的なミクロケミカル設備で合成することができ、純度はＨＰＬＣおよび質量分析法でチェックすることができる。ペプチド合成、ＨＰＬＣ生成、および質量分析法の方法は、当業者の知るところである。
【００８８】
ペプチドおよびエンドスタチンは、また、以下に記載されるように、組換え大腸菌、または昆虫または酵母の発現系において生産し、カラムクロマトグラフィーにて精製することができる。
【００８９】
エンドスタチンおよびエンドスタチン由来ペプチドは、標準的な方法を使用して他の分子と連結することができる。エンドスタチンの20アミノ酸より遠位のアミノ酸末端およびカルボキシ末端は、双方ともチロシンおよびリジン残基を含有する場合があり、多くの技法、例えば従来技法（チロシン残基−クロマチンＴ、ヨードゲン（iodogen）、ラクトパーオキシダーゼ；リジン残基−ボルトンハンター試薬）を使用した放射活性標識などにより、放射同位元素を使用して、または放射同位元素を使用しないで標識される。これらの連結技法は、当業者のよく知るところである。連結技法は、アミノ、スルフヒドリル、カルボキシル、アミド、フェノール、およびイミダゾールを含むがこれに限定されないアミノ酸上の可能な機能基に基づいて選択される。これらの連結を行うのに使用される様々な試薬には、グルタルアルデヒド、ジアゾ化ベンジジン、カルボジイミドおよびパラ−ベンゾキノンなどが含まれる。
【００９０】
エンドスタチンペプチドは、放射性同位元素、酵素、キャリアタンパク質、細胞毒性剤、蛍光分子および様々な用途のための他の化合物と化学的に連結される。連結反応の有効性は、それぞれの反応に適当なそれぞれの技術にて判定される。例えば、タンパク質エンドスタチンペプチドまたはタンパク質の125Ｉによる放射活性標識は、クロマチンＴおよび比活性の高いＮａ125Ｉを使用して行われる。反応は、メタ重亜硫酸ナトリウムにより終了され、混合物は使い捨てカラムで脱塩される。標識されたペプチドは、カラムより溶
出され、画分を回収する。各画分の一部を採取して放射活性をガンマカウンターで測定する。この方法では、反応しなかったＮａ125Ｉで標識されたエンドスタチンペプチドから分離される。最も比放射活性の高いペプチド分画をエンドスタチン抗血清との結合能力の分析などの後の使用のために保存する。
【００９１】
ペプチド抱合物の他の用途は、ポリクローナル抗血清の作成である。例えば、グルタルアルデヒドを使用して、リジン残基を含有するエンドスタチンペプチドを精製ウシ血清アルブミンと結合する。反応の有効性は、放射活性標識されたペプチドの取り込みを測定することで判断される。反応しなかったグルタルアルデヒドおよびペプチドは、透析で除去される。抱合物は、後の使用のために保存される。
【００９２】
エンドスタチンに対する抗血清を作成することができる。ペプチド合成および精製後、モノクローナルおよびポリクローナル抗血清の双方が、当業者の知る確立された方法で作成される。例えば、ポリクローナル抗血清は、ウサギ、ヒツジ、ヤギおよび他の動物内で作成される。ウシ血清アルブミンなどのキャリア分子と抱合されたエンドスタチン分子、またはエンドスタチンそのものは、アジュバンド混合液と混合され、乳化して背中、頸、体幹および時には肉趾の複数の部位に皮下注射される。追加注射を２週間から４週間毎など定期的におこなう。各注射からおよそ７から１０日後に、血液サンプルを拡張後の末端耳静脈などの静脈穿刺により採取する。血液サンプルは、４℃で一晩凝固させ、４℃で約２４００×ｇ約３０分間遠心分離する。血清を採取し、すぐに使用する場合は、４℃で、後の分析用に−２０から−９０℃で保存する。
【００９３】
ポリクローナル抗血清作成で得たすべての血清サンプル、またはモノクローナル抗血清作成で得た培地（media）サンプルは、分析をして力価を測定する。力価は、例えばドットブロットおよび密度分析、およびプロテインＡ、二次抗血清、冷エタノールまたは活性炭−デキストランを使用した放射活性標識ペプチド−抗体複合体の沈降および引き続くガンマカウンターによる放射活性測定などの分析などの数種類の方法で確立される。最も力価の高い抗血清は、また、市販のアフィニティーカラムで精製される。エンドスタチンペプチドは、アフィニティーカラム中のゲルに結合される。このカラムに抗血清サンプルを通過させると、抗エンドスタチン抗体はカラムに結合して残存する。これらの抗体は、引き続いて溶出され、回収して力価と比活性を測定する。
【００９４】
最も力価の高い抗血清は、以下を確立するためにテストされる。すなわち、ａ）抗原の最大の特異的結合と最低の非特異的結合のための最適な抗血清の希釈、ｂ）標準の置換曲線中における増大する量のエンドスタチンペプチドとの結合能力、ｃ）エンドスタチンに関連する種類を含めて、関連ペプチドおよびタンパク質との交差反応の可能性、ｄ）血漿、尿、組織および培養細胞培地中の抽出物中のエンドスタチンペプチドを検出する能力である。
【００９５】
エンドスタチンの測定のためのキットも、本発明の一部である。最も高い力価および特異性を有し、血漿、尿、組織および培養細胞培地中の抽出物中のエンドスタチンペプチドを検出できる抗血清は、アンジオタチンの迅速、高信頼性、高感度、高特異性の測定および分布検出のための使用の簡単なキットを確立するためにさらに調べられる。これらのアッセイキットは、これらに限定されないが、以下の技法を含む。すなわち、競合および非競合的アッセイ、ラジオイムノアッセイ、生物発光および化学発光アッセイ、蛍光光度アッセイ、サンドイッチアッセイ、イムノラジオメトリックアッセイ、ドットブロット、ＥＬＩＳＡなどの酵素結合アッセイ、マイクロタイタープレート、尿または血液の迅速なモニタリングのための抗体でコートしたストリップまたはディップスティック、および免疫細胞化学法などである。各キットについて、アッセイの範囲、感度、精度、信頼性、特異性、および再現性が確立される。アッセイ内およびアッセイ間の変動は、置換または活性
の標準曲線の２０％、５０％および８０％点において確立される。
【００９６】
研究において、および診療所において一般的に使用されるアッセイキットの一例は、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）キットである。あるエンドスタチンＲＩＡを以下に説明する。エンドスタチンまたはエンドスタチンペプチドの放射活性ヨウ素化および精製が成功した後、最も高い力価の抗血清を数段階に希釈して、適当な緩衝剤系中に、ほぼ一定量の放射活性を含有する試験管、例えば１０，０００ｃｐｍ、に添加する。他の試験管には、非特異的結合を測定するために、緩衝剤または前免疫血清を入れる。４℃で２４時間インキュベーション後、プロテインＡを添加し、試験管を振とうし、室温で９０分間インキュベートし、４℃においておよそ２０００〜２５００×ｇで遠心して標識した抗原と結合した抗体複合体を沈殿させる。上清は、吸引除去し、ペレット中の放射活性をガンマカウンターで計測する。非特異的結合を減じた後の約１０から４０％の標識ペプチドと結合した抗血清希釈度をさらに調べる。
【００９７】
次に、ある希釈範囲（およそ０．１ｐｇから１０ｎｇ）の、抗血清の作成に使用されるエンドスタチンペプチドを、放射活性標識ペプチドおよび抗血清を含有する試験管に既知の量のペプチドを添加することにより調べる。例えば２４から４８時間のさらなるインキュベーション時間後、プロテインＡを添加して、試験管を遠心分離にかけ、上清を除去し、ペレットの放射活性を測定する。放射活性標識されたエンドスタチンペプチドの結合の非標識エンドスタチンペプチド（標準）による置換は、標準曲線を与える。数種類の濃度の他のエンドスタチンペプチドフラグメント、プラスミノーゲン、異なる種のエンドスタチンおよび相同ペプチドを、アッセイ用試験管に添加して、エンドスタチン抗血清の特異性を調べる。
【００９８】
これらに限定されないが、原発および二次腫瘍、ルイス肺癌、エンドスタチン産生細胞の培養物、胎盤、子宮ならびに脳、肝臓および小腸などの他の組織を含む様々な組織の抽出物を、エンドスタチンの抽出に成功裏に使用された抽出方法にて調製する。組織抽出物の凍結乾燥またはＳｐｅｅｄ  Ｖａｃによる処理後、アッセイバッファを添加し、ＲＩＡ試験管内に各量を入れる。既知のエンドスタチン産生細胞の抽出物は、標準曲線と平行な置換曲線を示すが、エンドスタチンを産生しない組織の抽出物はエンドスタチン抗血清から放射活性標識されたエンドスタチンを置換しない。さらに、ルイス肺癌を有する動物の尿、血漿、脳脊髄液の抽出物を、量を増やしながらアッセイ用試験管に添加する。平行な置換曲線は、組織および体液中のエンドスタチンを測定するエンドスタチンアッセイの有用性を示す。
【００９９】
エンドスタチンを含有する組織抽出物は、一部を逆相ＨＰＬＣで分析して、さらに調べる。溶出画分を回収し、Ｓｐｅｅｄ  Ｖａｃで乾燥させ、ＲＩＡ緩衝剤で還元し、エンドスタチンＲＩＡで分析した。エンドスタチン免疫活性の最大量は、エンドスタチンの溶出位置に相当する画分に存在する。
【０１００】
アッセイキットは、指示書、抗血清、エンドスタチンまたはエンドスタチンペプチドおよび任意に放射活性標識エンドスタチンおよび／または結合したエンドスタチン−エンドスタチン抗体複合体を沈殿させる試薬を提供する。このキットは、腫瘍を有するおよび有さない動物およびヒトの生体液および組織抽出物中のエンドスタチンの測定に有用である。
【０１０１】
別のキットは、組織および細胞内のアンジオスタチンの分布測定に使用される。このエンドスタチン免疫組織化学キットは、指示書、エンドスタチン抗血清、および任意に遮断血清およびフルオロセインイソチオシアネートなどの蛍光分子と結合した二次血清、または一次抗血清を可視化するなんらかの他の試薬を提供する。免疫組織化学的技法は、当業
者のよく知るものである。このエンドスタチン免疫組織化学キットは、光学および電子顕微鏡の双方を使用して組織切片および培養細胞中のエンドスタチンの分布を与えるものである。これらは、研究および臨床の双方の目的で使用される。例えば、腫瘍を生検または採取し、組織切片をマイクロトームで切断し、エンドスタチン産生部位について調べる。このような情報は、癌の検出および治療において、診断およびおそらくは治療の目的に有用である。
【０１０２】
本発明は、以下の実施例によりさらに詳細に説明されるが、実施例はその範囲についていかなる制限をもあたえるものではない。反対に、本明細書の記載を読んだ後に、本発明の精神および／または添付の請求の範囲から逸脱することなく、当業者にそれ自体示唆される、多くの他の態様、変更およびこれらの均等物による手段が取られることが、明白に理解されるものである。
【実施例１】
【０１０３】
血管内皮腫細胞由来の毛細血管内皮細胞増殖のインヒビターの同定
ネズミの血管内皮腫の細胞系であるＥＯＭＡ（Obesoら、１９９０年）について、内皮細胞増殖のインヒビターの産生を実証するために評価を行った。知られている血管形成の内因性インヒビターの多くは、インビトロでの内皮細胞の増殖を阻害する。
【０１０４】
ならし(conditioned)培地の回収：ネズミの血管内皮細胞腫の細胞系であるＥＯＭＡの細胞を、１０％子ウシ血清（ＢＣＳ）および１％グルタミン−ペニシリン−ストレプトマイシン（ＧＰＳ）を補足したＤＭＥＭ中、二酸化炭素１０％のインキュベーター中、３７℃で維持した。ＥＯＭＡ細胞から得られたならし培地（すなわち、ＥＯＭＡ細胞の培養に使用された培地）をウシの毛細血管内皮細胞に加えて、７２時間の増殖アッセイにおいて、ｂＦＧＦで刺激した。このならし培地は、対照と比較して、毛細血管内皮細胞の増殖を可逆的に阻害した。阻害のパターンは内皮細胞増殖の阻害および刺激活性の存在と一致した（図１）。
【実施例２】
【０１０５】
内皮細胞増殖の阻害活性はアンジオスタチンによるものではない
ＥＯＭＡ細胞によって産生される毛細血管内皮細胞増殖のインヒビターがアンジオテンシンであるかどうかを決定するために、プールしたならし培地をリジンカラム（リジンをセファロース（商標）クロマトグラフィービーズに結合）に負荷した。リジン−セファロースはアンジオスタチンと結合し、アンジオスタチンの精製に使用されてきた（O'Reillyら、１９９６年）。内皮細胞の阻害活性は素通り画分においてのみ検出され、結合画分では検出されなかった（データは示さず）。リジン−セファロースに阻害活性が結合しないことから、新規な内皮細胞増殖のインヒビターはアンジオスタチンではないことが示された。
【実施例３】
【０１０６】
内皮細胞の増殖を特異的に阻害するＥＯＭＡ細胞のならし培地からの２０キロダルトンのタンパク質の精製
いくつかの血管形成インヒビターはヘパリンに対して親和性があるので、我々は、リジン−セファロースカラムからの素通り画分をヘパリン−セファロースカラムに負荷した。図２に示すように、阻害活性は相対的に高い親和性でヘパリンに結合し、塩化ナトリウムを０．６〜０．８Ｍ含むｐＨ７．４の１０ｍＭトリスで溶出した。阻害活性をさらに精製するために、試料を濃縮してゲル濾過（Bio-Rad Bio-Gel P-100 fine gelまたはPharmacia Sephacryl S-200HR gel）カラムに負荷し（図３参照）、Ｃ４カラムで逆相ＨＰＬＣを数サイクル行った。図４に例示するように、阻害活性はアセトニトリルを４０〜４５％含む０．１％トリフルオロ酢酸でＣ４カラムから溶出した。最後のＣ４カラムの後、阻害活
性は分子量が約２０キロダルトン（還元）または１８キロダルトン（非還元）のタンパク質と関連性があり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって見かけ上均一に精製された。
【０１０７】
実施例２および３については、製造元の指示に従って、リジン−セファロース、ヘパリン−セファロース、セファクリル(Sephacryl)Ｓ−２００ＨＲゲル（Pharmacia, Uppsala,
スウェーデン）、バイオ−ゲル(Bio-Gel)Ｐ−１００ファインポリアクリルアミドゲル（Bio-Rad Laboratories, Richmond,米国カリフォルニア州）、およびシンクロパック(SynChropak)ＲＰ−４（１００×４．６ｍｍ）Ｃ４逆相カラム（Synchrom, Inc., Lafayette,米国インディアナ州）を調製した。ヘパリン−セファロースカラム（５０×２．５ｃｍ）は、塩化ナトリウム５０ｍＭを含むｐＨ７．４の１０ｍＭトリス塩酸で平衡化した。プールしたならし培地を負荷し、カラムを平衡化緩衝液で洗浄した。カラムは、５０ｍＭ〜２Ｍの塩化ナトリウムを含むｐＨ７．４の１０ｍＭトリス塩酸で連続的に勾配溶出し（総容量２００ｍｌ）、続いて２Ｍの塩化ナトリウムを含むｐＨ７．４の１０ｍＭトリス塩酸１００ｍｌで溶出した。フラクションを回収し、それぞれの一部を毛細血管内皮細胞に適用した。内皮細胞の増殖を阻害したフラクションは、ＰＢＳで透析し（ＭＷＣＯ＝６，０００〜８，０００）、４０００ＭＷＣＯナノスピン(Nanospin)濃縮機（Gelman Scieneces, Ann Arbor,米国ミシガン州）を用いて濃縮した。
【０１０８】
バイオ−ゲルＰ−１００カラムまたはセファクリルＳ−２００ＨＲカラム（７５×１．５ｃｍ）はＰＢＳで平衡化した。ヘパリン−セファロースクロマトグラフィーで得られた試料を負荷し、カラムを平衡化緩衝液で溶出した。フラクションを回収し、それぞれの一部を内皮細胞に適用した。内皮細胞の増殖を阻害したフラクションは濃縮して上記の通り透析した。
【０１０９】
シンクロパックＲＰＧ（１００×４．６ｍｍ）カラムは、０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）水溶液で平衡化した。ＨＰＬＣ−グレード(grade)試薬（Pierce, Rockford,米国イリノイ州）を使用した。ゲル濾過クロマトグラフィーで得られた試料をカラムに負荷し、カラムを０．５ｍｌ／分の速度でアセトニトリルを含む０．１％ＴＦＡで勾配溶出し、フラクションを回収した。それぞれの一部を真空遠心分離で蒸発させ、ＰＢＳ中に再懸濁し、毛細血管内皮細胞に適用した。続いてシンクロパックＣ４カラムで少なくとも２サイクル処理することによって、阻害活性はさらに精製されて、見かけ上均一になった。
【０１１０】
２０キロダルトンのインヒビターをさらに特徴付けするために、我々は内皮起源および非内皮起源のいくつかの細胞系でこの物質を試験した。ＢＣＥアッセイ用に、ウシの毛細血管内皮細胞を前述した通り培養した（Folkmanら、１９７９年）。増殖アッセイのため、細胞をＰＢＳで洗浄し、０．０５％トリプシン溶液中に分散した。ＤＭＥＭ＋１０％ＢＣＳ＋１％ＧＰＳで細胞懸濁液（細胞２５，０００個／ｍｌ）を調製し、ゼラチン膜で覆った２４穴培養板上に流し（０．５ｍｌ／ウェル）、２４時間インキュベート（３７℃、二酸化炭素１０％）した。培地を０．２５ｍｌのＤＭＥＭ＋５％ＢＣＳ＋１％ＧＰＳで置換し、被検試料を適用した。２０分間インキュベートした後、培地およびｂＦＧＦを加えて、ＤＭＥＭ＋５％ＢＣＳ＋１％ＧＰＳ＋１ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦの最終的な容量を０．５ｍｌとした。７２時間後、細胞をトリプシンで分散し、ヘマトール(Hematall)（Fisher
Scientific, Pittsburgh,米国ペンシルバニア州）中に再懸濁し、コルター(Coulter)カウンターで数を計測した。
【０１１１】
非内皮細胞増殖アッセイ
ウシの大動脈平滑筋細胞（ＳＭＣ）、ウシの網膜色素上皮細胞（ＲＰＥ）、ミンクの肺上皮細胞（ＭＬＥ）、ルイス肺癌細胞（ＬＬＣ）およびＥＯＭＡ細胞、および３Ｔ３線維芽細胞を、二酸化炭素１０％のインキュベーター中、３７℃で維持した。増殖アッセイのため、細胞をＰＢＳで洗浄し、トリプシン０．０５％溶液中に分散した。細胞増殖アッセ
イのための至適条件は、異なる細胞型それぞれについて決定した。ＲＰＥ、ＭＬＥおよびＬＬＣについてはウシ胎児の血清（ＦＣＳ）を使用し、その他の細胞型にはＢＣＳを使用した。ＤＭＥＭ＋１０％ウシ血清＋１％ＧＰＳで細胞懸濁液（ＳＭＣ、ＲＰＥ、ＭＬＥは、細胞２０，０００個／ｍｌ；ＬＬＣ、ＥＯＭＡは１０，０００個／ｍｌ）を調製し、２４穴培養板（０．５ｍｌ／ウェル）上にプレートし、２４時間インキュベート（３７℃、二酸化炭素１０％）した。培地を０．５ｍｌのＤＭＥＭ＋５％ウシ血清＋１％ＧＰＳで置換し、被検試料を適用した。７２時間後、細胞をトリプシンで分散し、ヘマトール（Fisher Scientific, Pittsburgh,米国ペンシルバニア州）中に再懸濁し、コルターカウンターで数を計測した。
表２に示す通り、内皮細胞のみが有意に阻害された。
【０１１２】
【表２】
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【０１１３】
阻害効果は投与量１００ｎｇ／ｍｌで初めて観察され、６００ｎｇ／ｍｌ以上の投与量で阻害が最大になった。非内皮起源の細胞については、毛細血管内皮細胞の増殖を阻害するのに使用した投与量よりも１ログユニット(log unit)多い量を使用しても、有意な阻害効果が見られなかった（データは示さず）。
【実施例４】
【０１１４】
２０キロダルトンのタンパク質の微小配列(microsequence)分析によってXVIII型コラーゲンのフラグメントとの同一性を示す
上記実施例で記載した通り、ならし培地から得られた毛細血管内皮細胞の増殖に対する２０キロダルトンのインヒビターを均一に精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ＰＶＤＦ（Bio-Rad, Richmond,米国カリフォルニア州）上にエレクトロブロットし、ポンソーＳ染色によって検出し、膜から切り出した。Ｎ−末端の配列は、トリフルオロ酢酸を気相で供給して動作するＰＥ／ＡＢＤモデル４７０Ａプロテイン・シークエンサー（Foster City,米国カリフォルニア州）を使用して自動エドマン(Edman)分解によって決定した。
【０１１５】
配列ライブラリーの検索およびアラインメントは、ジェンバンク(GenBank)、ブルックハーベンプロテイン(Brookhaven Protein)、スイス−プロット(SWISS- PROT)およびＰＩＲのデータベースを組み合わせて実施した。検索は、国立バイオテクノロジーインフォメーションセンター（the National Center for Biotechnology Information）にて、ＢＬＡＳＴネットワークサービスを使用して実施した。
【０１１６】
インヒビターの微小配列分析によって、XVIII型コラーゲンのＣ−末端フラグメントとの同一性が示された。分子のクローニングおよびXVIII型コラーゲンの配列は、Ｏｌｓｅｎおよびその共同研究者ならびにＲｅｈｎおよびＰｉｈｌａｊａｎｉｅｍｉが初めて報告した（Ohら、１９９４年；Rehn and Pihlajaniemi、１９９４年）。XVIII型コラーゲンは、３種のスプライス変異型を有するＮ−末端領域、インターラプションを有する一連のコラーゲン様ドメイン、および３５キロダルトンのＣ−末端非コラーゲン（ＮＣｌ）ドメインからなる新規なコラーゲンである（Muragakiら、１９９５年；Rehn and Pihlajaniemi、１９９５年）。内皮細胞増殖の精製インヒビターについての、１８個のアミノ酸のＮ−末端微小配列の分析によって、これがＮＣ１ドメインのＣ−末端フラグメントと同一であることが確認される（図５）。我々は、XVIII型コラーゲンのこの阻害性フラグメントを「エンドスタチン」と名付け、またこれは、エンドスタチン活性を有する分子群に含まれる。
【実施例５】
【０１１７】
組換えマウスエンドスタチン（バキュロウイルスまたは大腸菌）はインビトロで内皮細胞の増殖を、インビボで血管形成を阻害する
本発明の内皮細胞増殖のインヒビターは、タンパク質を発現するために使用されるあらゆる系において組み換え的に発現され得る。そのような発現系の非制限的例としては、細菌発現系、イースト発現系および昆虫ウイルス発現系が含まれる。
【０１１８】
組換えマウスエンドスタチンは、ＢａｃＰＡＫバキュロウイルス発現系（CLONTECH Laboratories）を使用し、製造元のプロトコルに従って発現された。簡単に説明すると、マウスのXVIII型コラーゲンのシグナル配列およびＣ−末端部分（エンドスタチン領域）をコードするｃＤＮＡフラグメントを、ｐＢａｃＰＡＫ８伝達ベクターに挿入し、次にＢａｃＰＡＫ６ウイルスＤＮＡ（発現ベクター）およびｐＢａｃＰＡＫ８−エンドスタチンクローン（修飾伝達ベクター）のプラスミドＤＮＡを昆虫Ｓｆ２１細胞に同時移入(cotransfect)し、発現したマウスのエンドスタチンを含む培地を回収した。ＢａｃＰＡＫ６は初めにＢＳＵ酵素で消化し、独立した複製の能力を無くした。発現したマウスのエンドスタチンを含む培地を、塩化ナトリウム５０ｍＭを含有するｐＨ７．４の１０ｍＭトリスで平衡化しておいた１．５×４０ｃｍのヘパリン−セファロースカラムに負荷した。カラムは平衡化緩衝液で洗浄した後、０．２Ｍ塩化ナトリウム、０．４Ｍ塩化ナトリウム、０．６Ｍ塩化ナトリウム、および１Ｍ塩化ナトリウムを含むｐＨ７．４の１０ｍＭトリスで順次溶出した。クロマトグラフィーは全て４℃で実施した。０．６Ｍ塩化ナトリウムの溶出液（７２時間増殖アッセイにおいて、ウシの毛細血管内皮細胞を阻害した）は、ＰＢＳで透析し（６〜８０００ＭＷＣＯ）、次にヘパリン−セファロースカラムに再度負荷した。カラムは、５０ｍＭ〜１．２Ｍの塩化ナトリウムを含むｐＨ７．４の１０ｍＭトリスで勾配溶出した。各フラクションの一部を上記の通りウシの毛細血管内皮細胞に適用し、増殖を阻害したフラクションをプールし、ＰＢＳで透析し、ナノスピン・プラス(Nanospin Plus)（Gelman Sciences）遠心濃縮機（ＭＷＣＯ＝１０，０００）を用いて濃縮した。濃縮した試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、見かけのＭｒが２０キロダルトンの独立したバンドが示された。
【０１１９】
大腸菌からの組換えマウスエンドスタチンの発現および精製
XVIII型コラーゲンのｃＤＮＡのＣ−末端部分を使用して、ｐＥＴＫＨ１ベクター（ｐＥＴ１１ｄ誘導体）（Studierら、１９９０年）中にクローニングしたマウスのエンドスタチンのｃＤＮＡを増幅した。誘導によって、アミノ酸配列ＭＡＲＲＡＳＶＧＴＤ［配列番号２］（ＲＲＡＳ＝プロテインキナーゼＡ認識配列）およびマウスのエンドスタチンの配列が続くＮ−末端の６個のヒスチジン残基（ｐＴＢ０１＃８）を有する融合タンパク質を産生した。ｐＴＢ０１＃８プラスミドはＢＬ２１：ＤＥ３にトランスフォームし、融合タンパク質は上述したようにＮｉ+2−ＮＴＡビーズで精製した（QiaExpressionist Handb
ook, Qiagen）。簡単に説明すると、大腸菌をＯ．Ｄ．600が０．８〜０．９になるまで培養した後、１ｍＭのＩＰＴＧを用いて３時間、融合タンパク質の発現を誘導した。細菌をペレットにし、８Ｍ尿素、１０ｍＭのイミダゾールを含有するｐＨ８．０の１０ｍＭトリス塩酸中で再懸濁し、室温で１時間インキュベートした。懸濁液は、２０，０００ｇで１５分間遠心分離し、上清を室温で１時間、Ｎｉ+2−ＮＴＡビーズと共にインキュベートした。懸濁液をカラムに移し、８Ｍ尿素、０．１Ｍリン酸ナトリウム、１０ｍＭのイミダゾールを含有するｐＨ６．２５の１０ｍＭトリス塩酸で洗浄した。タンパク質は、２５０ｍＭのイミダゾールを含有する同じ緩衝液で溶出した。エンドスタチンを含有するフラクションは十分にＰＢＳで透析した。透析の間、エンドスタチンは沈澱した。沈澱したエンドスタチンはＰＢＳ中に再懸濁し、タンパク質濃度を２〜４ｍｇ／ｍｌに調製し、エンドスタチンは使用するまで−２０℃で保存した。マウスによる研究では、エンドスタチンをＰＢＳ中の懸濁液として送達した。ニワトリの漿尿膜アッセイでは、エンドスタチンをさらに水で透析し、凍結乾燥した。
【０１２０】
組換えマウスエンドスタチンは、バキュロウイルスまたは大腸菌発現系の両方で産生された。連続したヘパリン−セファロースクロマトグラフィーを用いて、昆虫細胞培地から組換えマウスエンドスタチンを見かけ上均一に精製した。大腸菌由来のマウスのエンドスタチンの精製にはＮｉ+2−ＮＴＡ−アガロースを使用した。
【０１２１】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、バキュロウイルスおよび大腸菌由来の組換えエンドスタチンについてそれぞれ、見かけ上均一に精製された約２０キロダルトンまたは約２２キロダルトン（還元）の独立したバンドが示された（データは示さず）。両者は使用に先立ちＰＢＳで透析した。透析後、大腸菌系由来の物質が沈澱し、続くインビボの研究のため、懸濁液として送達した。バキュロウイルス由来の組換えエンドスタチンは、ウシの毛細血管内皮細胞の増殖を投与量に依存して特異的に阻害した。阻害効果は投与量１００ｎｇ／ｍｌで観察され、６００ｎｇ／ｍｌ以上の投与量で阻害が最大になった。非内皮起源の細胞、またはＥＯＭＡ細胞の増殖については、内皮細胞の増殖を阻害するのに使用した投与量よりも１ログユニット(log unit)多い量を試験した場合でも、有意な阻害効果が見られなかった。
【０１２２】
沈澱した（非再生）物質は不溶性であるため、インビトロでは試験できなかった。しかし、透析の間はＰＢＳ中に多少溶解したので、このフラクションを内皮細胞アッセイに使用した。さらに、再生(refolding)後、このフラクションは溶解し、内皮細胞の増殖を阻害した（データは示さず）。この溶解性物質を内皮細胞に適用したところ、天然およびバキュロウイルス由来のエンドスタチンと同等の濃度で阻害することがわかった。
【０１２３】
組換えマウスエンドスタチンについて、インビボでの血管形成の阻害能力を試験するため、我々は、ニワトリの漿尿膜（ＣＡＭ）アッセイを用いた（Folkman,１９８５年；Nguyenら、１９９４年：これらは参照によりここに含める）。簡単に説明すると、受精後３日目の白色レグホン種の卵（Spafas, Norwich,米国コネチカット州）を割り、胚をその卵黄と共に１００×２０ｍｍのペトリ皿に採った（Folkman,１９８５年）。３日間インキュベート（３７℃、二酸化炭素３％）した後、エンドスタチンを含有するメチルセルロース（Fisher Scientific, Fair Lawn,米国ニュージャージー州）のディスクをそれぞれの胚のＣＡＭに適用した。このディスクは、テフロン（登録商標）の棒上で、０．４５％のメチルセルロース（水中）１０μｌ中のエンドスタチンを乾燥させて製造した。４８時間インキュベートした後、胚およびＣＡＭを立体顕微鏡で観察した。
【０１２４】
１０〜２０μｇ／１０μｌディスクの用量で投与した場合、試験したＣＡＭ（ｎ＝５／群）全てで、大腸菌およびバキュロウイルス由来のエンドスタチンに関し、インビボの血管形成の強力な阻害があった。大腸菌由来のエンドスタチンの沈澱は５日間かけて徐々に
溶解し、着床したＣＡＭに対して持続した血管形成効果をもたらした。対照的に、溶解性のバキュロウイルス由来のエンドスタチンは２４時間で溶解し、最大の血管形成効果は４８時間以内で与えた。試験した全てのニワトリの胚で毒性は認められなかった。
同様の方法で、ヒトのエンドスタチンを組換え的に製造した。
【実施例６】
【０１２５】
組換えマウスエンドスタチンは転移の成長を阻害する
腫瘍の成長は血管形成に依存することから、バキュロウイルス系で発現した組換えマウスエンドスタチンを用いて、ルイス肺癌転移を体系的に試験した。腫瘍が６００〜１２００ｍｍ3のルイス肺癌を罹患する動物を屠殺し、腫瘍を覆っている皮膚をベタジン(betadine)およびエタノールで清浄した。層流のフード中、無菌条件下で腫瘍組織を切除した。成長可能な腫瘍組織をふるい(sieve)および直径が２２〜３０ゲージの一連の連続したより小さな皮下針を通過させることによって、０．９％の通常の生理食塩水中の腫瘍細胞の懸濁液を調製した。最終濃度を１×１０7細胞／ｍｌに調整し、懸濁液を氷上に置いた。適用部位をエタノールで清浄した後、マウスの背部、正中線に近い部位に、０．１ｍｌの食塩水に懸濁した１×１０6個の細胞を皮下注射した。
【０１２６】
移植から約１４日後、腫瘍の大きさが１５００ｍｍ3になったとき、マウスを手術し腫瘍を除いた。切開部位は単純な断続縫合で閉じた。手術日から、マウスには毎日、組換え（バキュロウイルス）マウスエンドスタチン、または食塩水を腹腔内投与した。マウスには、一日一回、皮下注射によって０．３ｍｇ／ｋｇ／日のエンドスタチンを投与した。対照のマウスに転移性の疾患が発症したとき（すなわち、処置の１３日後）、全てのマウスを屠殺し解剖した。肺表面の転移を４倍の立体顕微鏡を用いてカウントした。
【０１２７】
ルイス肺癌転移の成長は、投与量０．３ｍｇ／ｋｇ／日のエンドスタチンを皮下から全身投与することによってほぼ完全に抑制された（７±３転移／マウス、ｎ＝４、ｐ＜０．００１）。対照的に、ルイス肺癌の一次性の腫瘍を切除した後、食塩水で処置したマウスでは、肺の転移は急速に成長した（７７±７転移／マウス）。腫瘍の負荷を示す肺の重量は、対照のマウスで７６０±３０ｍｇであったのに対し、エンドスタチン処理したマウスでは２４０±２５ｍｇであった（ｐ＜０．００１）。さらには、エンドスタチン処理した全てのマウスで体重減少、または毒性の発現は実証されなかった。
【実施例７】
【０１２８】
組換えマウスエンドスタチンは一次性腫瘍の成長を阻害する
バキュロウイルス系からのエンドスタチンの収率は大腸菌系からの収率より低く、すなわち、大腸菌系で３０〜４０ｍｇ／ｌであるのに対して、バキュロウイルス系では１〜２ｍｇ／ｌである。従って、一次性腫瘍の成長に対するエンドスタチン療法の効果を研究するにあたり、大腸菌由来のエンドスタチンを使用した。ルイス肺癌の一次性腫瘍を治療するのに十分量の、大腸菌由来の組換えマウスエンドスタチンを製造した。少なくとも１００〜２００ｍｍ3のルイス肺癌を罹患するマウスに、沈澱した精製タンパク質の懸濁液としてエンドスタチンを投与した。タンパク質は慣用的な方法で精製したが、マウスへの投与に先立って、再生は行わなかった。注射された沈澱は、２４〜４８時間かけてゆっくり吸収された。
【０１２９】
我々は、動物における徐放方法として、非再生組換えタンパク質の注射された貯蔵物(depot)を使用することについて、前例を知らない。しかし、エンドスタチンは、インビボで徐々に吸収され、強力な抗血管形成活性があって、抗腫瘍活性および抗血管形成活性が延長することがわかった。従って、これらのデータによって、組換えタンパク質の放出を制御する新規で一般的な方法が提案される。この原理に基づいて、我々は、非再生の大腸菌由来の組換えアンジオスタチンを送達し、同様に成功した。
【０１３０】
従って、本発明の態様の一つは、放出時間が少なくとも８時間、好ましくは少なくとも１２時間、さらに好ましくは、治療する患者および疾患によって少なくとも２４時間または少なくとも４８時間にわたる、内皮細胞増殖阻害タンパク質の徐放貯蔵物を提供するための、非再生状態の組換えエンドスタチン、またはエンドスタチンアナログを投与することである。任意に組換えおよび非再生のアンジオスタチンを投与し、少なくとも８時間、好ましくは少なくとも１２時間、さらに好ましくは、治療する患者および疾患によって少なくとも２４時間または少なくとも４８時間にわたって、アンジオスタチンタンパク質を放出する能力のあるタンパク質の徐放貯蔵物が同様に提供される。
【０１３１】
マウスに、上述した通り、ルイス肺癌を移植した。腫瘍をダイヤルカリパスで測定し、腫瘍の容積を次式：幅2×長さ×０．５２を用いて計算し、最終回について、対照に対する治療群の腫瘍容積（Ｔ／Ｃ）を決定した。３〜７日以内に腫瘍の容積が１００〜２００ｍｍ3（体重の０．５〜１％）になった後、マウスをランダムに２グループに分けた。一方のグループには、一日一回、腫瘍から遠い部位に、組換えマウスエンドスタチン（大腸菌由来）をＰＢＳ中の懸濁液として皮下注射した。他方のグループにはビヒクルのみを同様に注射した。試験終了後、対照のマウスが死亡し始めたときに、マウスを屠殺し解剖した。
【０１３２】
ルイスの一次性肺腫瘍の成長は、エンドスタチンによる全身的療法によって強力に抑制された。エンドスタチンの投与量の増量は有効性の向上と関連した（データは示さず）。投与量１０ｍｇ／ｋｇでは、腫瘍の成長は、ビヒクルのみで処置した対照マウスと比較して９７％阻害された。二つの別の実験において、２０ｍｇ／ｋｇを一日一回投与した場合、定着した一次性腫瘍はほぼ完全に退縮した（＞９９％阻害、ｐ＜０．００１）。これらの驚くべきおよび予測できなかった結果を図６および７に示す。
【０１３３】
図８、９、１０および１１は、種々の異なる腫瘍モデルにおいて、組換えマウスエンドスタチンが腫瘍の成長を阻害する有効性を示す。また、ヒト由来のエンドスタチンが腫瘍の成長を阻害する有効性も示される。
【０１３４】
残存する小さな腫瘍の免疫組織化学分析（図１２）によって、エンドスタチン処置した腫瘍では血管形成が強力に阻害されることが示された。さらに、エンドスタチン処置マウスおよび食塩水処置マウスにおける腫瘍の増殖指数は、両群において同じ高レベルであり、一方エンドスタチン処置後、アポトーシス指数は８倍に上昇した。このように、エンドスタチン療法によって、我々が以前に報告した、アンジオスタチンによる腫瘍の休眠状態と類似したパターンの状態となる（Holmgrenら、１９９５年；O'Reillyら、１９９６年）。さらに、処置したマウス全てで薬剤に関連した毒性は認められなかった。
【０１３５】
エンドスタチン療法を中断したところ、５〜１４日以内に一次性部位で腫瘍が再発し、血管新生が生じ、結局マウスは死亡した（データは示さず）。特に我々は、Ｃ−末端にポリヒスチジンタグを有する大腸菌由来の組換えマウスエンドスタチンを、上述したＮ−末端に標識した産物と同様の方法で発現、精製および投与したところ、ＣＡＭアッセイでは血管形成は阻害されず、ルイス肺癌の成長に対して効果がなかったことを発見した（データは示さず）。これらのデータは、組換えエンドスタチンの抗腫瘍活性および抗血管形成活性が、エンドスタチンの特異的な構造によるものであって、試料中の混入物によるものではないことを強く論証するものである。
【０１３６】
図１３は、大腸菌由来の組換えマウスエンドスタチンを用いて、ルイス肺癌を反復的に治療した結果を示す。これらの結果から、腫瘍の大きさの、エンドスタチン依存性の退縮は再現可能であり、エンドスタチン治療を中断すると腫瘍は成長することが明確に示され
る。
【０１３７】
これらの結果によって、マウスの血管内皮腫は、インビトロで内皮細胞の増殖に特異的な２０キロダルトンの新規なインヒビターであって、インビボでも血管形成および腫瘍成長を強力に阻害する物質を産生することが示される。このインヒビターであるエンドスタチンのＮ−末端の配列は、XVIII型コラーゲンのＣ−末端フラグメントと同一である。組換えエンドスタチンの全身投与によって、血管形成が強力に阻害され、転移は顕微鏡的な大きさで維持され、一次性腫瘍は１５０倍以上縮小して１ｍｍ3未満に退縮する。マウスをできるだけ長期間治療することで腫瘍の再成長は起こらず、薬物耐性は認められず、かつ毒性もない。エンドスタチンより長いXVIII型コラーゲンのＣ−末端部位のいくつかのフラグメントが内皮細胞の増殖を阻害しないことは興味深いことである（データは示さず）。
【０１３８】
エンドスタチンは、アンジオスタチン（O'Reillyら、１９９４年）を発見するために使用されたときと同一の方策すなわち腫瘍からの単離で発見された。腫瘍が血管形成のインヒビターの材料であるということは直感に反するものであるが、ここに報告する結果は、このアプローチの正当性を立証すると思われる。
【０１３９】
このことから、血管を形成する腫瘍中になぜ血管形成のインヒビターが存在するのかという疑問が生じる。一つの可能性としては、インヒビターは、血管形成の表現形に転換されつつある腫瘍細胞による産生のダウンレギュレーションの「痕跡」であるかもしれない。このことは、ｐ５３の第二の対立遺伝子が突然変異または欠失したリー−フラウメニ細胞によって産生されるトロンボスポンジン（Dameronら、１９９４年）にあてはまると考えられる。
【０１４０】
第二の可能性としては、腫瘍の成長に付随し、毛細血管の成長にとって重要な要素であるタンパク分解活性が、自身は阻害活性のない前駆体タンパクから循環血管形成インヒビターを遊離させるのかもしれない。例えば、アンジオスタチンは血管形成および内皮細胞の増殖を阻害するが、プラスミノーゲンは阻害しない（O'Reillyら、１９９６年；O'Reillyら、１９９４年）。エンドスタチンについて、同様のパターンが示される。
【０１４１】
エンドスタチン療法によって退縮する腫瘍の組織構造として、血管形成が遮断される一本以上の微小血管を取り囲む腫瘍細胞の、脈管周囲のカフィング(cuffing)が示された。腫瘍細胞は、全体の腫瘍の大きさは増加せず、強力なアポトーシスで相殺される強い増殖性を示した。これらのデータは、最近提案された新しいタイプの腫瘍の休眠状態のモデル（Holmgrenら、１９９５年）と一致する。さらに、エンドスタチンはインビトロで内皮細胞の増殖を阻害したが、ルイス肺癌細胞、または平滑筋細胞、上皮細胞、線維芽細胞、およびエンドスタチンが精製されたＥＯＭＡ細胞系を含む、他のタイプの細胞に対しては効果がなかった。
【０１４２】
内皮細胞の増殖を特異的に阻害することによって腫瘍を顕微鏡的な大きさに退縮させ、休眠状態で維持することが可能であるという事実は、腫瘍細胞は元々インヒビターに対して抵抗性であるという事実にかかわらず、内皮集団は腫瘍細胞を上回る強力な成長調節制御が可能であることを示す。
【０１４３】
エンドスタチンに関する結果によって、治療目的のため、二つの異なる細胞集団すなわち腫瘍細胞集団および内皮細胞集団に関して腫瘍を考えることは有益であって、それぞれが他方の細胞集団の成長を促進し得るという説（Forkman、１９９６年）が支持される。それぞれの細胞集団の成長は、例えば細胞毒化学療法および抗血管形成療法など、その細胞のタイプを選択的または特異的に標的とする薬剤によって、最高に阻害され得る。さら
には、両細胞集団の同時治療は、それぞれの細胞のタイプ単独の治療よりも有効である。
【０１４４】
この説を試験するために、ルイス肺癌を移植し、約３００ｍｍ3の大きさの腫瘍を有するマウスを、アンジオスタチンおよびエンドスタチンをそれぞれ２０ｍｇ／ｋｇ／日、２５日間投与する併用療法で治療した。治療の約１０日目までに腫瘍は顕微鏡的なレベルまで退縮した。図１４に示すように、全ての治療が終了した後であっても、腫瘍は退縮したまま、約３ヶ月間休眠状態にあったことは、完全に予測できなかった事実であった。より長期間の実験によって、アンジオスタチンとエンドスタチンを併用して腫瘍を初期に治療することで、正確な期間は現時点では不明であるが、非常に長期間休眠状態となることが示される。
【０１４５】
このような長期間の休眠状態は、当業者は治療法とみなす。例えば、ある治療が癌の治療法として有効である場合を定めるＮＩＨ（米国・国立衛生研究所）のガイドラインは、腫瘍が通常２倍になる時間の１０倍の期間、休眠状態にある（例えば大きさが増加しない）ことである。エンドスタチンとアンジオスタチンを併用して達成される休眠時間の長さは、この基準をはるかに超えている。
【０１４６】
従って、本発明の重要な態様は、血管形成依存性癌患者に投与したときに、血管形成依存性癌を長期間休眠状態とするか、または治療するのに十分量の、アンジオスタチンとエンドスタチンまたはエンドスタチン類似物との混合物を含有する組成物である。投与は例えば注射によって全身的であってもよく、その場合、投与量は患者および個々の癌によって決められるが、一般的には少なくとも０．２ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは少なくとも２．０ｍｇ／ｋｇ／日、さらに好ましくは少なくとも２０ｍｇ／ｋｇ／日である。一般的には、この組成物は毎日、少なくとも１０日間、好ましくは少なくとも２０日間、さらに好ましくは少なくとも２５日間投与される。その他の全身的投与経路としては、タンパク質を不活性化する消化環境から保護するために、例えばコーティングされたマイクロビーズに組成物が製剤化される場合には経口投与；経皮投与；およびポンプによる投与が含まれる。
【０１４７】
あるいは、この組成物が腫瘍などの血管形成依存性部位に局所的に投与される場合には、異なる投与量および治療期間を採用してもよい。そのような投与としては、例えば、その部位中またはその近辺への、外科的な移植や局所への注射を用いてもよい。
【実施例８】
【０１４８】
エンドスタチンに対する推定上のレセプターの単離
エンドスタチンおよびアンジオスタチンは両者とも、内皮細胞の増殖の特異的なインヒビターであるらしい。従って、エンドスタチンは、内皮細胞の表面上にもっぱら発現される特異的な構造に結合すると思われる。我々は、内皮細胞増殖の特異的なインヒビターの存在を他には知らない。
【０１４９】
エンドスタチンに特異的に結合するタンパク質を同定および単離することは、当業者によく知られた方法、例えばアフィニティークロマトグラフィーおよび発現クローニングを含む。
【０１５０】
アフィニティークロマトグラフィー：ウシの毛細血管内皮細胞（ＢＣＥ）を［35Ｓ］−メチオニンで放射性標識し、全細胞および膜抽出物を調製し、エンドスタチンで調製したアフィニティーカラムに適用する。陰性対照として、線維芽細胞タンパク質抽出物を同様の方法で単離する。結合したタンパク質は、塩化ナトリウム勾配を用いてカラムから溶出され、種々のフラクションは標準ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーを用いて分析する。この操作によって、エンドスタチンカラムに強く結合し、内皮細胞由来のフ
ラクションにのみ存在するタンパク質が得られる。二つの細胞のタイプをゲル電気泳動パターンで比較することによって、ＢＣＥ細胞に固有の発現したタンパク質が明らかになる。次にタンパク質の配列を決定し、対応する遺伝子のクローンを作る。ウシの毛細血管内皮細胞のｃＤＮＡライブラリーを作成し、縮重オリゴベースドＰＣＲ法でスクリーニングして、エンドスタチン特異性結合タンパクのｃＤＮＡの位置を決定する。対応するｃＤＮＡに対する縮重オリゴヌクレオチドを用いるハイブリッド形成もまた、エンドスタチン結合タンパク質の遺伝子を同定するために用いられる。もう一つのアプローチは、先の詳細な説明で述べた方法でペプチド配列に対する抗体を産生させ、同ライブラリーを免疫スクリーニングすることである。
【０１５１】
発現クローニング：ＢＣＥ細胞のｃＤＮＡライブラリーを作成する。エンドスタチンで予め増殖を阻害しておいたＢＣＥ細胞からポリ−Ａ ｍＲＮＡを単離する。この細胞はエンドスタチン結合タンパクを発現する。対応するｃＤＮＡライブラリーを、様々なｃＤＮＡを強く発現する細胞中に移入させる。表面にレセプタータンパク質を発現する細胞に対するエンドスタチンの結合活性は、この細胞の正の選択として使用される。この細胞を選択するために、精製したエンドスタチンはビオチンで標識し、その結果、ストレプタビジン(streptavidin)結合磁気ビーズまたはＦＡＣＳ選別を用いて検出される。あるいは、エンドスタチンに対する抗体はスクリーニングに用いられる。陽性細胞を選択した後、対応するプラスミドを単離、増幅し、強く発現する細胞中に再度移入する。正の選択を数回行った後、同じ挿入物についてエンドヌクレアーゼ消化およびＰＣＲを用いてプラスミドを分析する。これらのデータを用いて、相補群を形成し、配列を決定し、ＢＬＡＳＴネットワークプログラムで分析する。コンピュータによる分析に加えて、個々のｃＤＮＡを高発現細胞中に再度移入し、異なる条件下で（例えば、非標識エンドスタチンとの比較、結合の時間的経過、スキャッチャード分析などで、換言すれば、当業者に知られている「古典的な」レセプターの確認方法）エンドスタチン結合活性について試験する。
【実施例９】
【０１５２】
マウスのエンドスタチンタンパク質における抗血管形成活性に関与する最少領域の決定
種々のＰＣＲプライマーを設計し、対応するｃＤＮＡのクローンを大腸菌発現系中で作り、種々のエンドスタチンフラグメントを均一に精製する。完全な長さのｃＤＮＡを、Ｎ−末端およびＣ−末端から切断する。最初のスクリーニングで、毛細血管内皮の増殖アッセイおよびニワトリの胚のアッセイを用いて、完全な長さのフラグメントと比較した残存活性を定量する。
【実施例１０】
【０１５３】
XVIII型コラーゲンよりエンドスタチンを放出させる推定酵素の決定
XVIII型コラーゲンは、非細線維性コラーゲン群(non-fibrillar collagen type family)に属し、１３１５個、１５２７個、および１７７４個のアミノ酸残基を有するタンパク質をコードする、３種の異なるスプライシング変異型が発見され得る（Rehn, PNAS 91:4234, １９９４年）。差は、遺伝子のＮ−末端部分の変化によって生じ、従って３種のスプライシングの変異型は全て、自身が非コラーゲン性のドメイン１１（ＮＣ１１）のフラグメントであるエンドスタチンの材料になる可能性がある。XVIII型コラーゲンの機能は知られていないが、そのメッセージは血管が高度に新生された組織において実質的に発現されることから、脈管周囲のマトリックスの構築および／または構造の役割が提案されている（Ohら、Genomics 19:494,１９９４年）。XVIII型コラーゲンの機能についての最初の糸口は、内皮細胞増殖の強力なインヒビターとしてエンドスタチンを精製したことであった。
【０１５４】
この予備的なデータ、およびエンドスタチンが血管内皮腫（ＥＯＭＡ）のならし培地から精製されたという我々の初期の観察から、我々は、XVIII型コラーゲンからエンドスタ
チンを放出させる酵素を同定できないかどうか求めた。
【０１５５】
ＮＣ１１ドメインをコードする最後の３２５個のアミノ酸残基は大腸菌系および昆虫細胞バキュロウイルス系で発現され、精製されたタンパク質は、XVIII型コラーゲンのこの領域をクローン化する酵素を同定する基質として使用される。ＰＣＲによって、ＮＣ１１ドメインをコードするｃＤＮＡフラグメントは、ＩＰＴＧで誘導した後、標的タンパク質を強く発現する大腸菌発現ベクター（ｐＥＴ系列）中にクローン化する。あるいは、昆虫細胞の発現に好適なベクターを用いる。タンパク質は、Ｎｉ+2−ＮＴＡビーズを使用して精製するために、Ｃ−末端に位置するＨＩＳ6−タグで標識する。Ｎｉ+2−ＮＴＡ−アルカリ性ホスファターゼ結合体は、ウエスタンブロット法によってＣ−末端を検出することができる。Ｃ−末端にＨＩＳ6−タグを有するだけではなく、赤血球凝集素（Ｎ−末端にＨＡ−タグ）のコードもする、もう一つの構成体が作られる。これは、ＨＡ−特異性モノクローナル抗体を用いたウエスタンブロット法によって検出される。タンパク質のＮ−末端およびＣ−末端は、ＥＯＭＡ上清および異なるメタロプロテイナーゼ抽出物を用いたインキュベーションによって得られる。
【０１５６】
切断産物はＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析、またはウエスタンブロット法によって検出され、タンパク質はＮｉ+2−ＮＴＡビーズを使用して再精製され、イミダゾールで溶出し、ＰＢＳで透析し、様々なインビトロおよびインビボのアッセイで阻害活性を試験する（例えば、内皮細胞増殖、ニワトリの胚、およびマウスの角膜アッセイ）。精製した切断産物が阻害活性を示す場合、Ｎ−末端のアミノ酸の配列を決定し、ＥＯＭＡ上清から得られたエンドスタチンの元来の配列と比較する。従って、腫瘍を有するマウスの試験に十分なタンパク質を精製し、この活性と完全な長さのＮＣ１１ドメインの活性とを比較するために、切断操作をスケールアップすることが可能である。
【参考文献】
【０１５７】
次の参考文献は、ここに言及することによって全文を本明細書に含める。
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【図面の簡単な説明】
【０１５８】
【図１】図１：ＥＯＭＡ細胞のならし培地による毛細血管内皮細胞増殖の阻害。  ７２時間増殖アッセイにおいて、コンフルエントなＥＯＭＡ細胞から回収されたならし培地またはベース培地を、１ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦと共にウシ毛細血管内皮細胞に添加した。内皮細胞増殖は、ＥＯＭＡならし培地により阻害された。各バーは、平均±ＳＥＭを示す。
【図２】図２：内皮増殖インヒビターのＥＯＭＡならし培地からの精製。  コンフルエントなＥＯＭＡ細胞から回収されたならし培地をヘパリンセファロースカラムを使用して分画した。内皮増殖阻害活性は、約０．８Ｍ  ＮａＣｌにて溶出された。
【図３】図３：内皮細胞増殖のインヒビターのゲル濾過による精製。  ヘパリンセファロースクロマトグラフィーで精製されたインヒビターは、ゲル濾過カラムにかけられて、単一ピークとして溶出された。
【図４】図４：内皮細胞増殖のインヒビターの逆相カラムクロマトグラフィーによる精製。  ヘパリンセファロースカラムおよびゲル濾過クロマトグラフィーで精製されたインヒビターは、逆相カラムにかけられた。インヒビターは、約４５％アセトニトリルで、カラムから単一バンドとして溶出された。
【図５】図５：内皮細胞増殖のインヒビターのＮ末端アミノ酸配列。  精製された内皮細胞増殖のインヒビターのＮ末端アミノ酸配列は、１８型コラーゲンの模式図と共に示される。インヒビターのＮ末端配列から、インヒビターの実体がXVIII型コラーゲンの約２０ｋＤａのＣ末端フラグメント（黒塗りつぶしで示される）と同一であることが判明した。白抜き四角は、XVIII型コラーゲンのコラゲナーゼドメインを表す。
【図６】図６：ルイス肺癌の組換えマウスエンドスタチンインヒビターによる処置。  大腸菌で産生された組換えインヒビターを、約１５０ｍｍ3の腫瘍容積に達したルイス肺癌をもつマウスに投与した。インヒビターは、２０ｍｇ／ｋｇ／日で投与された。腫瘍塊は、処置から約１２日後に検出できないレベルにまで退縮した。
【図７】図７：組換えエンドスタチンの全身治療はルイス肺癌原発性腫瘍を退縮させる。  （Ａ）マウスの背部の皮下にルイス肺癌細胞を移植した。腫瘍が約２００ｍｍ3（体重の１％）の時に、組換えマウスエンドスタチンの全身治療（２０ｍｇ／ｋｇ／日）を開始した。エンドスタチンインヒビターで処置されたマウス内の腫瘍は、急速に退縮し、生理食塩水で処置した対照と比較して９９％以上阻害された。各ポイントは、５匹のマウスの平均±ＳＥＭを示す。実験は、繰り返され同等な結果を得た。  （Ｂ）エンドスタチン全身治療の１１日後における、代表的な処置および非処置の腫瘍を有するマウス。生理食塩水で処置されたマウス（右）は、表面が潰瘍化した急速に成長する赤い腫瘍を有した。エンドスタチンで処置されたマウス（左）は、小さい青白い残存腫瘍があった（矢印）。  （Ｃ）エンドスタチンで処置されたマウス中の疾患。５匹のエンドスタチンで処置されたマウスのうち３匹は、治療から１６日後に屠殺した。解剖の結果、当初の一次移植の部位に小さな白色の残存腫瘍があった（矢印）。
【図８】図８：大腸菌産生組み換えマウスエンドスタチンによるマウスＴ２４１線維肉腫細胞の治療。  Ｔ２４１線維肉腫細胞をマウスに移植した。対照マウスは、生理食塩水で処置した。実験マウスは、２０ｍｇ／ｋｇ／日の大腸菌産生組換えマウスエンドスタチンで処置した。
【図９】図９：大腸菌産生組換えマウスエンドスタチンによるマウスＢ１６Ｆ１０メラノーマの治療。  マウスＢ１６Ｆ１０メラノーマ細胞をマウスに移植した。対照マウスは、生理食塩水で処置した。実験マウスは、２０ｍｇ／ｋｇ／日の大腸菌産生組換えマウスエンドスタチンで処置した。
【図１０】図１０：大腸菌産生組換えマウスエンドスタチンによるＥＯＭＡ血管内皮腫の治療。  ＥＯＭＡ血管内皮腫細胞をマウスに移植した。対照マウスは、生理食塩水で処置した。実験マウスは、20ｍｇ／ｋｇ／日の大腸菌産生組換えマウスエンドスタチンで処置した。
【図１１】図１１：大腸菌産生組換えマウスまたはヒトエンドスタチンによるルイス肺癌の治療。  ルイス肺癌細胞をマウスに移植した。対照マウスは、生理食塩水で処置した。実験マウスは、マウスの配列に由来する組換えエンドスタチンまたはヒトの配列による組換えエンドスタチンで処置した。なお、どちらのエンドスタチンも大腸菌中で組換えにより産生された。マウスのエンドスタチンは、20ｍｇ／ｋｇ／日または2.5 ｍｇ／ｋｇ／日、ヒトのエンドスタチンは20ｍｇ／ｋｇ／日で投与された。
【図１２】図１２：エンドスタチンは、血管新生の阻害を引き起こし、ルイス肺癌原発性腫瘍のアポトーシスを増大した。  ルイス肺癌を移植され、生理食塩水対エンドスタチンで処置されたマウスの組織学的切片を、増殖（ＰＣＮＡ）、アポトーシス（ＴＵＮＥＬ）および血管新生（ｖＷＦ）について調べた。処置対非処置腫瘍における腫瘍細胞（Ａ）の増殖指数に、有意な差はなかった。対照的に、腫瘍細胞（Ｂ）のアポトーシス指数は、エンドスタチン処置マウスにおいて８倍も増大していた（ｐ＜０．００１）。血管密度（Ｃ）は、ｖＷＦに対する抗体で染色した切片における高倍率視野(high-power field, ＨＰＦ)当たりの毛細血管数を計数することにより測定した。血管新生は、エンドスタチン処置マウスにおける残存する顕微鏡的腫瘍中では、ほぼ完全に抑制されていた（ｐ＜０．００１）。
【図１３】図１３：ルイス肺癌の大腸菌産生組換えマウスエンドスタチンによるサイクルドーマンシー（Cycle Dormancy）治療  マウスの背部の皮下に、ルイス肺癌細胞を移植した。腫瘍が約200ｍｍ3（体重の１％）に達した時、20ｍｇ／ｋｇ／日の組換えマウスインヒビター（エンドスタチン）による全身投与を開始した。治療のおよそ１５日目において、エンドスタチンインヒビターで治療したマウス中の腫瘍は、基本的に検出不能のレベルにまで急速に退縮した。治療を中止すると、腫瘍の体積は急速に増大し、引き続いての治療の再開により同様の検出不能のレベルにまで治療された。図中のピークと谷は、エンドスタチンによる阻害のサイクリング作用である。
【図１４】図１４：大腸菌産生組換えマウスアンジオスタチンおよびエンドスタチンの併用療法  マウスの背部の皮下に、ルイス肺癌細胞を移植した。腫瘍が約300 ｍｍ3（体重の１％）に達した時、組換えマウスエンドスタチン（20ｍｇ／ｋｇ／日）および組換えマウスアンジオスタチン（20ｍｇ／ｋｇ／日）の併用による全身治療を開始した。併用療法で治療されたマウス中の腫瘍は、約15日で基本的に検出不能なレベルにまで急速に退縮した。重要なことであるが、治療中止後も、退縮した腫瘍は休止状態のままで大きさ、重量ともに増大しなかった。このことは医学的に大きな意味のある予期せざる結果である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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