【事件の表示】
　平成　４年特許願第５０５６５９号「リポソームへの成長ホルモン類の結合」拒絶査定に対する審判事件［平成　４年　９月　３日国際公開、ＷＯ９２／１４４４８、平成　５年　９月１６日国内公表、特表平　５−５０６２５１］について、次のとおり審決する。
【結　論】
　本件審判の請求は、成り立たない。
【理　由】
 　
１，手続の経緯、本願発明
　　　　　　　　　　　　　　　　　
　本願は平成３年１０月３０日（パリ条約による優先権主張１９９１年２月１４日　米国）を国際出願日とする出願であって、その請求項１〜３０に係る発明は、平成１３年４月２５日付けの手続補正書により補正された明細書の記載から見てその請求項１〜３０のとおりのものと認められる。
　そのうち請求項１、２１に記載された発明は次のものである。
　　
【請求項１】
　修飾されたリポソームを製造するための方法であって、
（ａ）リポソームとフォスファチジルエタノールアミンを有するリポソーム成分を含んでいる反応容器を準備するステップ、　
（ｂ）該反応容器へ、増殖因子である認識物質成分を加えるステップ、　　（ｃ）該リポソーム成分および認識物質成分の反応混合物を緩衝化するステップ、　
（ｄ）緩衝化した反応混合物へ、リポソーム成分および認識物質成分のアミン残基を連結する架橋試薬を加えるステップ、　
（ｅ）該試薬を含む緩衝化した反応混合物を修飾されたリポソームを形成するに十分な時間インキュベートするステップを含んでいる前記方法。
　（以下、本願発明１という。）
　　　　　　　　　　
【請求項２１】
　増殖因子である認識物質成分へ架橋試薬によって共有結合したリポソーム成分よりなり、該架橋試薬はリポソーム成分及び認識物質成分のアミン残基を連結している修飾リポソーム。
（以下、本願発明２という。）
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
２，引用刊行物の記載の概要
　　　　　　　　　　　
  これに対し、原査定の拒絶の理由に引用された本願の優先権主張日前に頒布された刊行物は以下のとおりである。
　　　　　　　　　　　　
（１）Biochemical and Biophysical Research Communications, (1989),
　　　Vol.160, No.2, p.732-736（以下引用例１という。）
　　　　　　　　　　　　　
「ＥＧＦでラベルされたリポソームの調製及びヘパトサイトによる取り込み」と題した論文であって以下の事項が記載されている。
　　　　　　　　　　　　
ａ．表皮増殖因子（ＥＧＦ）を架橋剤のＮ−ヒドロキシスクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ)プロピオネート（ＳＰＤＰ）によってジスルフィド結合によりリポソーム表面に結合させたこと、ＥＧＦ-リポソームはＥＧＦレセプターによって媒介されるラットヘパトサイトにかなりの量で取り込まれ、その取り込みはリポソーム表面に結合したＥＧＦの量に依存したこと。（第７３２頁　要約参照）
　　　　　　　　　　　　　　　
ｂ．ジスルフィド結合でリポソーム表面にＥＧＦを結合させるために，ＥＧＦとＤＰＰＥ（ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン）のアミノ基をＳＰＤＰで修飾し、ＥＧＦ-ＤＴＰ、ＤＤＰＥ-ＤＴＰすなわちＥＧＦとＤＰＰＥの３−（２−ピリジルジチオ)プロピオネート（ＤＴＰ）誘導体を得る。ＥＧＦ−ＤＴＰはジチオスレイトールでＥＧＦ-ＳＨに還元され、セファデックスＧ-２５でゲル濾過により精製する。
　ＤＰＰＣ、コレステロール、ＤＰＰＥ−ＤＴＰからなる３Ｈ-イヌリンを内包したリポソーム（ＲＥＶ）が調製され、ＥＧＦ-ＳＨの調製後すぐにＲＥＶに加え、混合物は２５℃１時間インキュベートされ、それから１８時間４℃で置く。ＥＧＦ-リポソームはセファロース４Ｂカラムでのゲル濾過で未反応ＥＧＦ-ＳＨから分離される。（第７３３頁）
　　　　　　　　　　　　　
ｃ．リポソームの外表面に結合するＥＧＦの量はＥＧＦ-ＳＨの濃度に依存する。（第７３４頁　表１参照）
　　　　　　　　　　　　　　　
ｄ．ＥＧＦを結合したリポソームは、ガン細胞のようなＥＧＦレセプターを有する細胞への薬物キャリヤーとして有用な手段となるだろう。（第７３６頁）
　　　　　　　　　　　　　　
（２）'Liposome technology',(1984),CRC Press,Inc., Vol.III, Chapter 6, 　p.75-94
  （以下引用例２という。）
　　　　　　　　　　　　　
  「リポソーム表面上への特殊蛋白の固定化：薬物ターゲッテイングシステム」と題される項目において、薬物を標的器官に輸送するため、薬物を内包するリポソームに標的器官に対する親和性を付与する手段として、リポソーム表面への蛋白の固定化が論じられている。その固定化手法の一例として以下の架橋試薬による固定化方法が記載されている。
　　　　　　　　　　　
ａ． 反応性のものを含む種々のホスホリピッドがリポソーム膜に取り込まれるため、蛋白の適切な反応性の基との結合にそれらを使用することが合理的である。この方向での最初の実験は、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）含有リポソームにカルボジイミドで活性化されたカルボキシ基を含む蛋白を結合させることに基づくものであった。・・・
　同様に、アルデヒド基は容易にＰＥアミノ基（活性化された蛋白の場合）と、あるいは蛋白のアミノ基（活性化されたリポソームの場合）と反応する。上記の技術でリポソームへ多くの活性蛋白を効率的に結合させることができた。・・・・この方法に従って、ＰＥや他の反応性ホスホリピッドがリポソームに取り込まれる。そして、それはジアルデヒドまたはジイミデートのような二官能性試薬で活性化される。リポソームからある程度離れて位置する残った二官能性試薬のフリーの基は、蛋白を固定化するのに使用される。（第７９頁３〜２２行）
　　　　　　　　　　　　　　　　　
ｂ．卵黄レシチンと、コレステロールと、Ｌ−α−ＰＥ（ホスファチジルエタノールアミン）から調製したリポソームの懸濁液へグルタルアルデヒドを加え、１０−２Ｍ硼酸緩衝液及び0.145Ｍ　ＮａＣｌ、ｐＨ８．５、総脂質濃度１０ｍｇ/ｍｌにおいて、５分２０℃でインキュベーションする。過剰のグルタルアルデヒドを硼酸緩衝液に透析して除去する。・・透析後α−キモトリプシン水溶液を活性化リポソーム懸濁液に１．５×１０−４Ｍの濃度で加えて４℃一晩インキュベートする。その後セファロース４Ｂカラムクロマトグラフィーによって遊離および固定化蛋白（キモトリプシン）を分離し、α−キモトリプリシンを表面へ固定化したリポソームを得る。（第７９頁下から１０行〜第８０頁４行）
　　　　　　　　　　　　　　　　
ｃ．二官能性試薬としてジメチルズベリミデートを使用する場合、α−キモトリプシンをリポソーム懸濁液に１．５×１０−４Ｍの濃度で加えた。それからジイミデートを少量ずつ、混合物に４℃一定のｐＨで最終濃度１．５ｍｇ/ｍｌとなるまで加えた。混合物は同じ条件で３０分インキュベートされ、硼酸緩衝液に４℃で透析された。遊離酵素の分離と固定化酵素の活性測定はグルタルアルデヒドの場合と同様にして行われた。（第８０頁５〜１１行）
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
ｄ．最近、活性の保存と結合の質の点から高収量の固定化蛋白をもたらす他の二官能性試薬の使用が提案されている。最も有望で広く使用されているこの種の試薬の一つはＮ−オキシスクシンイミジル-３（２-ピリジルチオ）-プロピオネートである。（第８０頁　３４〜３７行）　
　　　　　　　　　　　　　　　　　
３．対比判断
　　　　　　　　　
３−１　本願発明１について
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　引用例２（摘記事項ｂ）の、グルタルアルデヒドによりα−キモトリプシンをホスファチジルエタノールアミンを有するリポソームに固定化する方法において、「卵黄レシチンと、コレステロールと、Ｌ−α−ＰＥ（ホスファチジルエタノールアミン）から調製したリポソームの懸濁液」は「リポソームとフォスファチジルエタノールアミンを有するリポソーム成分」に、グルタルアルデヒドは「アミン残基を連結する架橋試薬」に相当し、また、上記のリポソームの懸濁液は液体であるから当然に容器内に収容されて準備されるものである。
　そうすると、本願発明１と、引用例２の方法とは、（ａ）のリポソーム及びフォスファチジルエタノールアミンを有するリポソーム成分を収容した反応容器を備えるステップを経て、リポソーム成分と蛋白のアミン残基（アミノ基と同義）を、アミン残基を連結する架橋試薬を介して結合させる方法である点で一致し、以下の点で相違する。
　　　　　　　　　　　　
Ａ．前者はリポソームに固定化する蛋白が「増殖因子である認識物質成分」であるのに対し、後者はα-キモトリプシンである点。 
　　　　　　　　　　　
Ｂ．前者は（ａ）ステップの後（ｂ）〜（ｅ）のステップを順次経る方法であるのに対し、後者はリポソームの懸濁液へグルタルアルデヒドを加えリポソームのアミノ基を活性化した後、過剰のグルタルアルデヒドを除去し、ついでα−キモトリプシン水溶液を活性化リポソーム懸濁液に加えてインキュベートする方法である点。
　　　　　　　　　　　　　　　　　
　そこで、各相違点につき検討する。
　　　　　　　　　　　　
Ａ，固定化される蛋白について
　引用例２は、薬物を内包するリポソームを標的器官に輸送するため、リポソームに標的器官に対する親和性を有する蛋白を固定化する方法の一つとしてグルタルアルデヒドによる手法が述べられ、α-キモトリプシンは固定される蛋白のモデルとして利用されているにすぎないから、標的器官への親和性を有し、リポソームへの結合に利用可能な官能基を有する蛋白であれば、固定化の対象となりうることは当業者が容易に理解するところ、引用例１には、ＥＧＦにリポソームとの結合に利用できるアミノ基が存在すること、ＥＧＦを固定化したリポソームは、ガン細胞のようなＥＧＦレセプターを有する細胞への薬物キャリヤとして有用な手段となることが示されているから、リポソームへ固定化すべき蛋白として、ＥＧＦ（「増殖因子である認識物質成分」に相当する）を選択することは、当業者が容易に想到しうることである。
　　　　　　　　　　　　　　
Ｂ，反応工程について
   刊行物２の摘記事項ｂの方法は、二官能性試薬を使用する架橋反応を行うにあたりリポソーム側のアミン残基にあらかじめ二官能性試薬を反応させ、これに蛋白のアミン残基を連結するものであるが、摘記事項ｃには、グルタルアルデヒドと同様の二官能性試薬であるジメチルズベリミデートを使用する場合の手法として、α−キモトリプシンをリポソーム懸濁液に１．５×１０−４Ｍの濃度で加え、それからジイミデートを少量に分割して、混合物に４℃一定のｐＨで最終濃度１．５ｍｇ/ｍｌとなるまで加え、同じ条件で３０分インキュベートすることが記載されている。
  このように、二官能性試薬を用いる架橋反応は、緩衝液存在下（一定のｐＨ条件下）で、リポソーム側にあらかじめ過剰の二官能性試薬を反応させ、これに蛋白を加えるという方法のほか、リポソームと蛋白の結合が多く得られる条件（リポソームと蛋白の混合比、二官能性架橋試薬の添加方法や最終濃度等。引用例１においても、ＥＦＧ-ＳＨとリポソームとの結合に最適なＥＧＦ-ＳＨ濃度が検討されている。）を設定し、両者の混合物中で連結反応を行う方法も可能であることが示されている。
　　　　　　　　　　　　　
　そうすると、アミン残基を連結する架橋試薬によりリポソームと蛋白を結合させるにあたり、あらかじめリポソームと蛋白の結合が多く得られる条件を設定し、両者の混合物に二官能性試薬を加えて反応させることは、当業者が普通に採用する範囲内のものということができ、また、その場合は、通常（ａ）〜（ｅ）のステップで行うのが自然であって、かかる工程を特定をした点に格別の創意は見あたらない。
　そして、Ａ、Ｂの相違点を組み合わせる点にも格別の困難性を認めることはできず、明細書の記載から見て、その効果も当業者が予測する範囲を越えるものではない。
　　　　　　　　　　　　　　　　　
３−２　本願発明２について
　　　　　　　　　　　　　
   本願発明２と、引用例２のグルタルアルデヒドによりα-キモトリプシンを結合したリポソームとを対比すると、グルタルアルデヒドはアミン残基を連結させる架橋試薬であるから、両者は、「蛋白へ架橋試薬によって共有結合したリポソーム成分よりなり、該架橋試薬はリポソーム成分及び蛋白のアミン残基を連結している修飾リポソーム。」である点で一致し、前者は蛋白が増殖因子である認識物質成分であるのに対し、後者はα−キモトリプシンである点で相違している。
　しかしながら、引用例１には、ＥＧＦがリポソームを標的器官に輸送するための蛋白として利用可能であり、リポソームとの結合に利用しうるアミン残基を有することも公知であるから、これをグルタルアルデヒドを架橋試薬としてリポソームのアミン残基と連結させ修飾リポソームとすることは当業者が容易に想到しうることである。
　　　　　　　　　　　
　なお、請求人は平成１４年４月８日付上申書で「アミン残基を連結する架橋試薬」を「アミン残基を連結するグルタルアルデヒド及び二官能オキシランからなる群から選ばれた架橋試薬」と特定する補正案を示しているが、引用例２にグルタルアルデヒドを架橋試薬とする点がすでに開示されている以上、これに限定しても本願発明の進歩性を認めることはできない。
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
 ４． むすび
　　　　　　　　　　　　　　　
　以上のとおりであるから、本願発明１、２は、引用例１、２に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明することができたものであるから、特許法第２９条第２項の規定により特許を受けることができない。
　したがって、その他の請求項に係る発明について判断するまでもなく本件審判請求は理由がない。
　　　　　　　　　　　　　
　よって結論のとおり審決する。