(57)【要約】【課題】軟骨傷害の治療のうち、運動制限などの保存療法に効果が無く手術による治療を行う際、必要となる十分な量の軟骨細胞を短期間に得る方法及びその装置を提供する。【解決手段】未分化間葉系細胞を軟骨分化誘導培地で培養し、且つ超音波を照射することを特徴とする人工軟骨製造方法および未分化間葉系細胞を培養した培養容器、該容器に対して超音波を照射する超音波トランスデューサー、該超音波の制御をする制御手段、該超音波トランスデューサー及び該培養容器を水槽内で接触設置するための保持水槽を備えた人工軟骨製造装置。【選択図】  図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
未分化間葉系細胞を軟骨分化誘導培地で培養し、且つ超音波を照射することを特徴とする人工軟骨製造方法。
【請求項２】
該超音波の周波数が２０ｋＨｚ〜１０ＭＨｚ、バースト幅が１０μｓｅｃ〜１ｍｓｅｃ、繰返し周期が５Ｈｚ〜１０ｋＨｚ、超音波出力が５〜１２０ｍＷ／ｃｍ２であることを特徴とする請求項１記載の人工軟骨製造方法。
【請求項３】
該超音波の周波数が１．５ＭＨｚ、バースト幅が２００μｓｅｃ、繰返し周期が１．０ｋＨｚ、超音波出力が５〜１２０ｍＷ／ｃｍ２であることを特徴とする請求項２記載の人工軟骨製造方法。
【請求項４】
未分化間葉系細胞を培養した培養容器、該容器に対して超音波を照射する超音波トランスデューサー、該超音波の制御をする制御手段、該超音波トランスデューサー及び該培養容器を水槽内で接触設置するための保持水槽を備えた人工軟骨製造装置。
【請求項５】
該制御手段が、該制御手段から超音波パルスを出力制御する手段であることを特徴とする請求項４記載の人工軟骨製造装置。
【請求項６】
該超音波の周波数が２０ｋＨｚ〜１０ＭＨｚ、バースト幅が１０μｓｅｃ〜１ｍｓｅｃ、繰返し周期が５Ｈｚ〜１０ｋＨｚ、超音波出力が５〜１２０ｍＷ／ｃｍ２であることを特徴とする請求項５記載の人工軟骨製造装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、未分化細胞への物理的・機械的刺激負荷による分化誘導作用に関する。さらに詳しくは、未分化細胞への超音波照射により、未分化細胞から軟骨細胞への分化を促進することで、軟骨細胞移植、軟骨組織移植、骨軟骨細胞移植、骨軟骨組織移植等の治療に使用するため作製した、人工軟骨を製造する方法及びその装置に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
軟骨傷害の治療には主として運動制限などの保存療法が行われているが、しばしば保存療法では効果が見られない場合もあり、その場合には手術による治療も行われている。
【０００３】
軟骨障害部位の手術には、非障害部位から軟骨組織あるいは骨軟骨組織を採取しその組織を移植する方法（非特許文献１：Ｈａｎｇｏｄｙ  ｅｔ  ａｌ．：Ｆｏｏｔ  Ａｎｋｌｅ  Ｉｎｔ  Ｏｃｔ；１８（１０）：６２８−３４，  １９９７）や、非障害部位より採取した軟骨細胞を体外培養して増殖させ、障害部位へ移植する方法（非特許文献２：Ｂｒｉｔｔｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．：Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３３１，  ８８９−８９５，  １９９４）などが行われていた。しかし、非障害部位から軟骨組織を採取する方法では、その採取量に限りがあり、また採取した軟骨細胞を体外培養で増殖させる場合にも、十分な量の軟骨細胞を得るまで長期間を要していた。
【０００４】
一方、培養軟骨細胞に超音波を照射すると、軟骨基質の生合成が高まることが報告されている（非特許文献３：Ｐａｒｖｉｚｉ  ｅｔ  ａｌ．：  Ｊ  Ｏｒｔｈｏｐ．  Ｒｅｓ．，  １７（４）：４８８−９４，  １９９９、  非特許文献４：Ｎｉｓｈｉｋｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．：  Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｍａｓｔｅｒ  Ｒｅｓ．，  ５９（２）  ２０１−２０６，  ２００２、  非特許文献５：Ｚｉ−Ｊｕｎ  Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．：  ４ｔｈ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｒｔｉｌａｇｅ  Ｒｅｐａｉｒ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，  Ｔｒｏｎｔ，  １５−１８／Ｊｕｎ，  ２００２）。
【０００５】
このような作用をもたらす超音波は、Ｄｕａｒｔｅらにより骨折治療への研究が行われ（特許文献１：米国特許第４，５３０，３６０号）、その後米国Ｅｘｏｇｅｎ社により超音波骨折治療機セーフスＴＭ（ＳＡＦＨＳＴＭ）が開発されている。超音波骨折治療機セーフスＴＭ（ＳＡＦＨＳＴＭ）は、臨床試験において、脛骨骨幹部骨折（非特許文献６：Ｈｅｃｋｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．：  Ｊ  Ｂｏｎｅ  ａｎｄ  Ｊｉｏｎｔ  Ｓｕｒｇ，  ７６Ａ：  ２５−３４，  １９９４）ならび橈骨遠位端骨折（非特許文献７：Ｋｒｉｓｔｉａｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．：  Ｊ  Ｂｏｎｅ  ａｎｄ  Ｊｏｉｎｔ  Ｓｕｒｇ，  ７９Ａ：  ９６１−９７３，  １９９７）などの治癒促進効果が証明されている。
【０００６】
また、Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒらにより、未分化間葉系細胞をＩｎ  ｖｉｔｒｏで脂肪細胞、軟骨細胞および骨細胞へ分化させ得ることができ、これら３種類の細胞への分化をもたらす培地組成も知られている（非特許文献８：ＳＣＩＥＮＣＥ  ２８４（２）：  １４３−１４７，  １９９９、特許文献２：ＷＯ  ９８／３２３３３）。さらに、未分化間葉系細胞を骨分化誘導倍地中で培養する際に、超音波骨折治療機セーフスＴＭ（ＳＡＦＨＳＴＭ）による超音波を照射することで骨分化が促進されることも報告されている（非特許文献９：岡田他：第４回  日本組織工学会、川崎、７月６−７日、２００１）。
【０００７】
【特許文献１】
米国特許第４，５３０，３６０号
【特許文献２】
ＷＯ  ９８／３２３３３号パンフレット
【非特許文献１】
Ｆｏｏｔ  Ａｎｋｌｅ  Ｉｎｔ  Ｏｃｔ；１８（１０）：６２８−３４，  １９９７
【非特許文献２】
Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３３１，  ８８９−８９５，  １９９４
【非特許文献３】
Ｊ  Ｏｒｔｈｏｐ．  Ｒｅｓ．，  １７（４）：４８８−９４，  １９９９
【非特許文献４】
Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｍａｓｔｅｒ  Ｒｅｓ．，  ５９（２）  ２０１−２０６，  ２００２
【非特許文献５】
４ｔｈ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｒｔｉｌａｇｅ  Ｒｅｐａｉｒ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，  Ｔｒｏｎｔ，  １５−１８／Ｊｕｎ，  ２００２
【非特許文献６】
Ｊ  Ｂｏｎｅ  ａｎｄ  Ｊｉｏｎｔ  Ｓｕｒｇ，  ７６Ａ：  ２５−３４，  １９９４
【非特許文献７】
Ｊ  Ｂｏｎｅ  ａｎｄ  Ｊｏｉｎｔ  Ｓｕｒｇ，  ７９Ａ：  ９６１−９７３，  １９９７
【非特許文献８】
ＳＣＩＥＮＣＥ  ２８４（２）：  １４３−１４７，  １９９９
【非特許文献９】
岡田  他：第４回  日本組織工学会、川崎、７月６−７日、２００１
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、軟骨傷害の治療のうち、運動制限などの保存療法に効果が無く手術による治療を行う際、必要となる十分な量の軟骨細胞を短期間に得る方法及びその装置を提供するものである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らはかかる課題に対して鋭意検討した結果、培養未分化間葉系細胞へ超音波照射という機械的・力学的刺激を与えることにより軟骨分化を促進することを見出し、本発明に到達したものである。
【００１０】
すなわち、本発明は、未分化細胞に対して超音波を照射することを特徴とする細胞分化誘導方法に基づき、未分化間葉系細胞を軟骨分化誘導培地で培養し、且つ超音波を照射することを特徴とする人工軟骨製造方法を提供するものである。特に照射する超音波が超音波パルスであり、該超音波の周波数が２０ｋＨｚ〜１０ＭＨｚ、バースト幅が１０μｓｅｃ〜１ｍｓｅｃ、繰返し周期が５Ｈｚ〜１０ｋＨｚ、超音波出力が５〜１２０ｍＷ／ｃｍ２であること、更に該超音波の周波数が１．５ＭＨｚ、バースト幅が２００μｓｅｃ、繰返し周期が１．０ｋＨｚ、超音波出力が５〜１２０ｍＷ／ｃｍ２であることを特徴とする人工軟骨製造方法を提供するものである。
【００１１】
また本発明は、未分化間葉系細胞を培養した培養容器、該容器に対して超音波を照射する超音波トランスデューサー、該超音波の制御をする制御手段、該超音波トランスデューサー及び該培養容器を水槽内で接触設置するための保持水槽を備えた人工軟骨製造装置を提供するものである。
【００１２】
また本発明は、該制御手段が、該制御手段から超音波パルスを出力制御する手段であることを特徴とし、該超音波の周波数が２０ｋＨｚ〜１０ＭＨｚ、バースト幅が１０μｓｅｃ〜１ｍｓｅｃ、繰返し周期が５Ｈｚ〜１０ｋＨｚ、超音波出力が５〜１２０ｍＷ／ｃｍ２であることを特徴とする人工軟骨製造装置を提供するものである。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明は、未分化細胞の分化誘導、特に骨髄に由来する未分化間葉系細胞を軟骨細胞に分化誘導し、人工軟骨を製造する方法、およびそれに使用する超音波照射装置、すなわち人工軟骨製造装置に関するものである。
【００１４】
超音波を照射する超音波トランスデューサーは圧電セラミック製であり、電圧をかけると微小な歪みが生じる性質を利用して、超音波波形合成装置で作られた電気信号をトランスデューサーの圧電セラミックに与え、トランスデューサー表面に縦方向の振動（超音波）を作り出している。
【００１５】
使用する超音波は低出力超音波パルスであり、超音波周波数が２０ｋＨｚ〜１０ＭＨｚ、バースト幅が１０μｓｅｃ〜１ｍｓｅｃ、繰り返し周期が５Ｈｚ〜１０ｋＨｚ、超音波出力が５〜１２０ｍＷ／ｃｍ２の範囲のものが分化誘導効果が期待できるものであり、その中でも特に、超音波周波数が１．５ＭＨｚ、バースト幅が２００μｓｅｃ、繰り返し周期が１．０ｋＨｚ、超音波出力が５〜１２０ｍＷ／ｃｍ２のもの、特に出力が３０ｍＷ／ｃｍ２が好ましい。
【００１６】
超音波の制御手段は、かかる超音波トランスデューサーから照射する超音波を合成する超音波波形合成機能、出力制御、記憶演算手段、電源のＯＮ／ＯＦＦ制御機能を備える。各機能は本体部に一体内蔵させても、超音波トランスデューサー側と本体部に分割しても良い。
【００１７】
未分化培養細胞の容器は、本発明では実験の都合上ポリプロピレンチューブを使用したが、材質、形状については細胞培養に使用可能であれば適用可能である。超音波トランスデューサー培養容器は超音波を確実に照射させる為に水槽中に接触固定させる。
【００１８】
図１に本発明の人工軟骨製造装置の超音波照射に係るブロックダイアグラムを示す。電源、記憶演算装置、入出力装置、発信装置及び超音波波形合成装置で構成される本体部分、および超音波トランスデューサーを内蔵した超音波生成装置から構成される。実施例では、６つの超音波生成装置を水槽内にフレームで固定し、上記培養ヒト未分化間葉系細胞を入れたポリプロピレンチューブに超音波を照射する装置を使用した。
【００１９】
１）電源：
電池は充電不可能な高容量タイプのリチウム電池を用いる。電源スイッチはなく、前面パネルの操作により電源が入り、所定時間の超音波照射が完了すると自動的に電源が切れる。なお、超音波生成装置も同じ電池から電力を供給される。
【００２０】
操作スイッチ、液晶表示盤、ブザーの他に、接続ケーブルを通して超音波生成装置の制御信号の送信と電力供給が行われる。
【００２１】
２）記憶演算装置：
プリント基板にはＣＰＵ（中央制御装置）が搭載されており、超音波照射時間の管理ばかりでなく、超音波発生装置の動作や装着状態の監視および自己診断を行う。また、バックアップメモリに使用記録が記憶され、必要に応じて取り出せるよう設計する。
【００２２】
３）超音波波形合成装置：
超音波発生装置の制御信号としては、超音波パルスバースト巾２００μｓｅｃ、繰返し周期１ＫＨｚの信号を送る。発振装置で１．５ＭＨｚの超音波信号を生成する。制御信号と１．５ＭＨｚ超音波信号を合成して、超音波周波数：１．５ＭＨｚ、超音波出力：０〜１５０ｍＷ／ｃｍ２の範囲で可変、バースト幅：２００μｓｅｃ、繰返し周波数：１ｋＨｚの信号特性を有する波形の電気信号を生成する。
【００２３】
４）超音波生成装置
超音波生成装置は、圧電セラミック製のトランスデューサーからなり、本体と接続ケーブルで結合されている。圧電セラミックには電圧をかけると微小な歪みが生じる性質がある。これを利用して超音波波形合成装置で作られた電気信号をトランスデューサー内部の圧電セラミックに与え、トランスデューサー表面に縦方向の振動（超音波）を作り出して軟骨細胞に照射する。圧電セラミックの背面には、超音波吸収体を貼り付け、超音波もれを防止する。
【００２４】
【実施例】
１．超音波照射による軟骨分化誘導能の検証
［細胞培養］
ヒト未分化間葉系細胞を、１５ｍＬのポリプロピレンチューブ内で懸濁し、常温下１，５００ＲＰＭ、５分間遠心沈降後、３７℃、５％ＣＯ２環境下で２４時間静置し、その後、培地交換を行い、引き続き培養を行った。培地には軟骨形成分化用基礎培地（ＤＭＥＭ−ｈｉｇｈ  ｇｌｕｃｏｓｅ，  ０．１７ｍＭ  Ａｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ−２−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，  ０．３５ｍＭ  Ｐｒｏｌｉｎｅ，  １ｍＭ  Ｓｏｄｉｕｍ  ｐｙｒｕｖａｔｅ，  ０．１μＭ  Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ，  ６．２５μｇ／ｍＬ  Ｂｏｖｉｎｅ  ｉｎｓｕｌｉｎ，  ６．２５μｇ／ｍＬ  Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ，  ６．２５μｇ／ｍＬ  Ｓｅｌｅｎｏｕｓ  ａｃｉｄ，  ５．３３μｇ／ｍＬ  Ｌｉｎｏｌｅｉｃ  ａｃｉｄ，  １．２５ｍｇ／ｍＬ  Ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ）を使用した。
【００２５】
［試験群］
かかる培養ヒト未分化間葉系細胞を、以下の３グループに分けて、超音波照射による軟骨分化誘導能を検証した。
Ｇｒｏｕｐ  １  （ｎ＝６）  ：ＴＧＦ−β３無添加群
Ｇｒｏｕｐ  ２  （ｎ＝６）  ：ＴＧＦ−β３添加による軟骨分化誘導群
Ｇｒｏｕｐ  ３  （ｎ＝６）  ：ＴＧＦ−β３添加＋超音波刺激群
グループ１として無処置群（ＴＧＦ−β３無添加群）、ＴＧＦ−β３を１０  ｎｇ／ｍＬ存在下で培養を行った軟骨分化誘導群（グループ２）、及びグループ２と同じ条件で培養しかつ超音波を照射したグループ３の３群とした。各群ｎ＝６とし、培養は３７℃、５％ＣＯ２下で行い、軟骨形成分化用基礎培地は３日ごとに交換した。
【００２６】
［超音波照射条件］
超音波周波数：１．５ＭＨｚ、バースト幅：２００μｓｅｃ、繰り返し周期：１．０ｋＨｚ、超音波出力：１２０ｍＷ／ｃｍ２の超音波パルスを、グループ３の超音波照射群の培養ヒト未分化間葉系細胞を入れたポリプロピレンチューブに対して、直接、水中に設置した超音波生成装置（図２）の上におき、１日２０分間、１０日間毎日照射した。
【００２７】
［測定方法］
１）ペレットサイズの測定
１０日間の培養後、実体顕微鏡下にてペレットの写真撮影を行った（ｎ＝６）。ペレットサイズはその最大断面積とした。
【００２８】
２）組織学的検討
ペレットを１０％ホルマリンにて４８時間固定後、脱水、パラフィン包埋し、アルシアンブルー染色、抗アグリカン抗体染色を行った。
【００２９】
３）ＤＮＡ、総タンパク質、及びアグリカンの定量
ペレットはＰＢＳにて２回洗浄後、４℃、２４時間、４Ｍグアニジン塩酸にて抽出し、可溶性抽出画分は、タンパク質及びアグリカンの定量に使用した。また抽出残渣はＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ  処理後、ＤＮＡ定量に使用した。尚、可溶性抽出画分には、ＤＮＡは殆ど検出されない。
【００３０】
［結果］
アルシアンブルー染色（軟骨基質である酸性ムコ多糖染色法）では、Ｇｒｏｕｐ    １のペレットは、微かに染色されたが、分化誘導群であるＧｒｏｕｐ  ２、３では強く染色された。超音波刺激群（Ｇｒｏｕｐ  ３）では極性の強い染色が見られた（図３）。
【００３１】
抗アグリカン抗体による免疫染色では、Ｇｒｏｕｐ  １  のペレットは微かに染色されたが、Ｇｒｏｕｐ  ２、３では強く染色された（図４）。超音波刺激群（Ｇｒｏｕｐ  ３）では極性の強い染色が見られた。免疫染色パターンはアルシアンブルー染色と同様であった。
【００３２】
ペレットサイズは、Ｇｒｏｕｐ  １  （１．１９±０．１０ｍｍ２）、Ｇｒｏｕｐ  ２  （１．１９±０．０５ｍｍ２）、Ｇｒｏｕｐ  ３  （１．０８±０．０４ｍｍ２）、であった。分化誘導による差は認めなかったが、超音波刺激群（Ｇｒｏｕｐ  ３）では７％の縮小が認められた（図５）。
【００３３】
ＤＮＡ量は、Ｇｒｏｕｐ  １  （１０．４±０．８５μｇ）、Ｇｒｏｕｐ  ２  （９．３６±０．２８μｇ）、Ｇｒｏｕｐ  ３  （９．３８±０．４２μｇ）であった。軟骨分化誘導群（Ｇｒｏｕｐ  ２，  ３）では、ともに約１０％のＤＮＡ量低下が見られた。超音波刺激によるＤＮＡ産生への影響は認められなかった（図６）。
【００３４】
総タンパク質量は、Ｇｒｏｕｐ  １  （４．５２±０．０６μｇ）、Ｇｒｏｕｐ  ２  （４．７６±０．４７μｇ）、Ｇｒｏｕｐ  ３  （５．２２±０．１９μｇ）であった。ＴＧＦ−β３無添加群（Ｇｒｏｕｐ  １）と比較して、Ｇｒｏｕｐ  ２，  ３  ではそれぞれ約５％、１５％の増加が見られた（図７）。
【００３５】
アグリカン量は、Ｇｒｏｕｐ  １  （０．３４±０．３８ｎｇ）、Ｇｒｏｕｐ  ２  （１．３８±０．７６ｎｇ）、Ｇｒｏｕｐ  ３  （２．５５±１．１５ｎｇ）であった。アグリカン量は分化誘導により約４倍に増加した。さらに超音波刺激により８４％の増加を見た（図８）。
【００３６】
２．超音波出力と軟骨分化誘導能の検証
上記超音波照射装置を用いて、超音波出力と分化誘導能の指標としてアグリカン量との関係を調べた。
【００３７】
超音波周波数：１．５ＭＨｚ、バースト幅：２００μｓｅｃ、繰り返し周期：１．０ｋＨｚ、超音波出力：０、３０、６０、１２０ｍＷ／ｃｍ２の４段階の出力で超音波パルスを、グループ３の超音波照射群の培養ヒト未分化間葉系細胞を入れたポリプロピレンチューブに対して、直接、水中に設置した超音波生成装置の上におき、１日２０分間、１０日間毎日照射した。コントロール群（−）として上記グループ１の結果についても図９に示した。
【００３８】
超音波出力とアグリカン量について検討したところ、コントロール群  （図中で（−）表示）、０ｍＷ／ｃｍ２に比べ、超音波刺激群で有意なアグリカン量増加が見られた（１２０ｍＷ／ｃｍ２でＰ＜０．０５）。また、もっともアグリカン量増加のみられた超音波出力は３０ｍＷであった。（図９）
【００３９】
【発明の効果】
本発明は、患者本人より採取した未分化間葉系細胞を、軟骨分化誘導培地をもちいた体外培養系にて培養する際に、超音波を照射することにより、従来の培養法よりも迅速に人工軟骨を作製することが出来る。
【００４０】
従来から行われている、供給源の限られた軟骨細胞を軟骨障害部位へ移植する方法に替わり、患者自身の体から豊富に得ることのできる未分化間葉系細胞を利用し、これを速やかに軟骨細胞へ分化させることで人工軟骨を作成し、軟骨修復に使用し得ることができる。この方法を用いれば、同種移植を行う際、常に問題となる拒絶反応を回避することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の人工軟骨製造装置のブロックダイヤグラム。
【図２】本発明の人工軟骨製造装置の超音波生成装置部分の外観図。
【図３】ペレットのアルシアンブルー染色の結果。
【図４】アグリカンの免疫染色の結果。
【図５】各培養群のペレットサイズの結果。
【図６】各培養群のＤＮＡ量の結果。
【図７】各培養群の総タンパク質量の結果。
【図８】各培養群のアグリカン量の結果。
【図９】超音波出力とアグリカン量の関係。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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