【誤訳訂正書】
【提出日】平成24年4月13日(2012.4.13)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
クラミジア種の細菌が原因である感染の予防または治療に用いる薬学的組成物を調製するための、
（ａ）配列番号１、または
（ｂ）配列番号１のＴ細胞エピトープおよび／またはＢ細胞エピトープを含む、配列番号１によりコードされるポリペプチドの免疫原性部分
から選択されるアミノ酸配列を含み、クラミジア種に由来する融合パートナーに融合しているポリペプチドの使用。
【請求項２】
配列番号１によりコードされるポリペプチドの免疫原性部分が、少なくとも２０個のアミノ酸残基の長さである、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
配列番号１によりコードされるポリペプチドの免疫原性部分が、少なくとも３０個のアミノ酸残基の長さである、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
ポリペプチドに脂質が付加されて、ポリペプチドの自己アジュバント作用を可能にする、請求項１から３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５】
（ａ）配列番号１、または
（ｂ）配列番号１のＴ細胞エピトープおよび／またはＢ細胞エピトープを含む、配列番号１によりコードされるポリペプチドの免疫原性部分
から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、クラミジア種に由来する融合パートナーに融合しているポリペプチドを含む、クラミジア種の細菌が原因である感染の予防または治療に用いる薬学的組成物。
【請求項６】
配列番号１によりコードされるポリペプチドの免疫原性部分が、少なくとも２０個のアミノ酸残基の長さである、請求項５に記載の薬学的組成物。
【請求項７】
配列番号１によりコードされるポリペプチドの免疫原性部分が、少なくとも３０個のアミノ酸残基の長さである、請求項５に記載の薬学的組成物。
【請求項８】
ポリペプチドに脂質が付加されて、ポリペプチドの自己アジュバント作用を可能にする、請求項５から７のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項９】
融合ポリペプチドがワクチンに製剤化される、請求項５から８のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項１０】
融合ポリペプチドが、クラミジア種の細菌に対する免疫化用に製剤化される、請求項９に記載の薬学的組成物。
【請求項１１】
クラミジア種がクラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）である、請求項１０に記載の薬学的組成物。
【請求項１２】
融合ポリペプチドが、クラミジア種の細菌に感染していない対象への送達用に製剤化される、請求項５から１１のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項１３】
融合ポリペプチドを、ワクチンあたり０．１〜１０００μｇの用量で含有する、請求項９から１１のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【発明の詳細な説明】
【発明の名称】クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）抗原のワクチンおよび診断への使用
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、クラミジア・トラコマチスに由来するポリペプチドおよび核酸に基づいた免疫原性ポリペプチドならびに免疫原性組成物のワクチンおよび診断薬としての使用を開示するものである。
【背景技術】
【０００２】
（一般的背景）
クラミジア種は、動物およびヒトの両方において、広範な疾患の原因となる。特に重要なのは、偏性細胞内細菌であるクラミジア・トラコマチスであり、これは、上皮細胞に感染し、そこで増殖する。クラミジア・トラコマチスは、先進諸国においては、性感染症（ＳＴＤ）の最も頻繁な原因であり、発展途上国においては、眼疾患の最も共通の原因である（Schachter、Moncadaら、１９８８）。世界全体で、９２００万人がクラミジア感染を保有していると推定されている（ＷＨＯ、１９９９）。
【０００３】
クラミジア性感染症は、治療をしないと長引き、完全な排除までには、治療開始後１２カ月以上を要することが多い。感染中に誘発された防御免疫は、血清変異株に特異的であって持続しないと考えられており、したがって、頻繁に再感染を起こし得る（Katz、Batteigerら、１９８７）。これらの状況、すなわち感染が長引くこと、および再感染の可能性があることのために、骨盤の炎症性疾患、不妊症および子宮外妊娠を含む重症の続発症を発症する恐れがある（Branham、１９９９）。
【０００４】
クラミジア感染は、抗生物質療法によって効果的に制御することができる。しかし、無症状の症例が多いことから、クラミジアの持続的な制御は、有効なクラミジアワクチンの開発によって、ようやく達成が可能となるであろう。過去数十年にわたり、クラミジア感染に対するワクチンに対して多くの努力がなされてきたが、これまでのところ、ワクチンの開発には至っていない。
【０００５】
このような状況下、クラミジアに対するワクチンの開発は、緊急課題である。クラミジアに対する防御物質を定義する多くの試みがなされている。しかし、特異的な長期にわたる防御免疫応答は、いまだに達成されていない。過去数十年にわたり、クラミジア感染に対するワクチンを開発する多くの努力がなされてきたが、これまでのところ、ワクチンの開発には至っていない。初期の努力の一部は、トラコーマの制御を重点的に取り扱い、生存している生物体の全体または不活性化した生物体の全体を抗原として使用して、ヒトおよびサルを免疫した（Wang、Graystonら、１９６７；GraystonおよびWang、１９７８）。不活性化した全細胞ワクチンを用いて、小児に予防接種をしたところ、はじめは防御が得られたが、この防御は、血清型に特異的で、持続しなかった（GraystonおよびWang、１９７８）。さらに、部分的に防御された個人が再感染すると、予防接種されていない対照で起きた疾患よりも症状の重い臨床疾患に至った（GraystonおよびWang、１９７８）。不活性化した生物体の全体を用いた初期の試みが、過敏症反応と思われるいくつかの症例に至った事実から、サブユニットワクチンの開発が試みられるようになった。
【０００６】
クラミジア・トラコマチスは、クラミジアワクチンの生産に適合する可能性があるいくつかのタンパク質を、保持および分泌する。長年の間、候補分子の探索では、感染体である基本小体（ＥＢ：Elementary Body）の表面に結合するタンパク質が主として重点的に取り扱われてきた。多くのそのようなタンパク質が特徴付けられたにも関わらず、これらの数個のみが、動物モデルにおいてサブユニットワクチンとして部分的な防御の誘発を示したにすぎない。はじめて記載された免疫原性分子は、主要外膜タンパク質（ＭＯＭＰ：major outer membrane protein）であり、したがって、この分子は、候補ワクチンとして、非常に詳細に研究されてきている。しかし、クラミジア・トラコマチスまたは組換え調製物から抽出したＭＯＭＰで種々の動物を免疫する多くの試みがなされたが、一貫した結果は得られなかった（Su、Parnellら、１９９５；Pal、Barnhartら、１９９９；Zhang、Yangら、１９９９；Pal、Theodorら、２００１；Shaw、Grundら、２００２）。ＭＯＭＰのワクチンとしての効果が比較的低い理由は、不明であるが、不適切なアジュバントもしくは送達系、またはタンパク質の未変性構造を模倣していないＭＯＭＰ免疫原の使用が原因である可能性がある（Pal、Theodorら、２００１）。
【０００７】
より最近になって、その他の免疫原性分子がいくつか、同定されている（Hassell、Reynoldsら、１９９３；KuboおよびStephens、２０００；LaVerda、Albaneseら、２０００；Fling、Sutherlandら、２００１；Goodall，Yeoら、２００１；Starnbach、Loomisら、２００３）。
【０００８】
クラミジア・トラコマチスに対する免疫は、いつくかの基本的な特徴によって特徴付けられる。すなわち、特異的に感作したＴリンパ球が防御を仲介し（SuおよびCaldwell、１９９５；Morrison、Suetら、２０００；MorrisonおよびCaldwell、２００２）、最も重要なメディエーター分子は、インターフェロンγ（ＩＦＮγ）であるようである（MorrisonおよびCaldwell、２００２）。さらに、ＩｇＧ、ＩｇＭおよびＩｇＡのアイソタイプの抗体も、ある役割を果たしている可能性がある（Cotter、Mengら、１９９５）。１９９５年には、Tripplesら（TipplesおよびMcClarty、１９９５）は、ＣＴＰシンテターゼの遺伝子を単離し、Guら（Gu、Wenmanら、１９９５）は、ＲＮＡポリメラーゼのαサブユニットの遺伝子の周辺の領域をクローン化した。この領域には、タンパク質であるＳｅｃＹ、Ｓ１３、Ｓ１１およびＬ１７の遺伝子もまた含有されており、これらは、大腸菌（Escherichia coli）および枯草菌（Bacillus subtilis）のタンパク質と等価である。１９９７年には、伸長因子Ｔｓの遺伝子が単離された（Zhang、Taoら、１９９７）。
【０００９】
１９９８年には、Stevensらが、クラミジア・トラコマチスの完全なゲノム配列を報告し、約８７５個のオープンリーディングフレームの存在を予想した。とりわけ、ＣＴ４４２、ＣＴ４６０、ＣＴ５０９、ＣＴ５７９、ＣＴ５８７、ＣＴ７１３、ＣＴ８１２またはＣＴ６８１（ＭＯＭＰ）を構成するヌクレオチド配列が記載されており、上記配列に対する仮想タンパク質の配列も提案されている。いかに重要であろうとも、この配列情報を使用して、ＤＮＡがｉｎ  ｖｉｖｏで転写されてタンパク質に翻訳されているか否かを予想することはできない。
【００１０】
さらに重要なのは、配列情報に基づいて、所与の配列が、免疫原性タンパク質をコードするものであるのか、それとも不活性なタンパク質をコードするものであるのかを予想することは不可能である。ＷＯ９９／２８４７５には、クラミジア・トラコマチスの完全なゲノム配列が記載されているが、何らかの免疫原性効果を裏付ける証拠はない。同様に、ＷＯ９９／２７１０５には、クラミジア・ニューモニエ（C. pneumoniae）の完全なゲノム配列が記載されている。
【００１１】
クラミジア・トラコマチスによる感染中または感染後に、タンパク質が免疫系によって認識されるか否かを決定するには、所与のタンパク質を調製し、本明細書に記載されている適切なアッセイで試験し、可能であれば、免疫原性効果を有する断片またはエピトープを決定する方法しかない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
（発明の概要）
本発明は、クラミジア種（クラミジア・トラコマチス亜種（C. trachomatis ssp）およびクラミジア・ニューモニエ（C. pneumonia））が原因である感染の、クラミジア・トラコマチス抗原またはその免疫原性部分もしくは他の変異体を含むポリペプチドの使用による、あるいはクラミジア・トラコマチス抗原またはその免疫原性部分もしくは他の変異体をコードするＤＮＡ配列の使用による予防、治療および検出に関する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
（発明の詳細な説明）
本発明は、クラミジア種の細菌が原因である感染の予防、治療または診断用の薬学的組成物の調製に用いる、クラミジア抗原（ポリペプチドまたは核酸）ｃｔ０４３、ｃｔ５１１、ｃｔ５２１、ｃｔ６１６、ｃｔ８０３、ｃｔ０６７、ｃｔ６７９、ｃｔ５８３、ｃｔ６０３、ｃｔ０２６、ｃｔ０９３、ｃｔ３５７、ｃｔ６５９、ｃｔ１１１、ｃｔ５０９、ｃｔ５８７、ｃｔ０２３、ｃｔ０２５、ｃｔ０７８、ｃｔ０８２、ｃｔ１１８、ｃｔ１７４、ｃｔ００３、ｃｔ００５、ｃｔ０２７、ｃｔ０３２、ｃｔ００８、ｃｔ０１６、ｃｔ０２８、ｃｔ０３５、ｃｔ１４１、ｃｔ６４３、ｃｔ４１４、ｃｔ８７４、ｃｔ４５６、ｃｔ６８１、ｃｔ１２３、ｃｔ１２５、ｃｔ１２６、ｃｔ１３３、ｃｔ１５０、ｃｔ１７５、ｃｔ３７６、ｃｔ０８３、ｃｔ０８９、ｃｔ１５５、ｃｔ１６８、ｃｔ１７５、ｃｔ１８４、ｃｔ１２４、ｃｔ０８２、ｃｔ３３６、ｃｔ３４２、ｃｔ８４２、ｃｔ３２３、ｃｔ０８０、ｃｔ０８４、ｃｔ１１０、ｃｔ１１９、ｃｔ５４１、ｃｔ４４３、ｃｔ７９５、ｃｔ３９６、ｃｔ２８３、ｃｔ０５１、ｃｔ００２、ｃｔ００９、ｃｔ０１５、ｃｔ０３０、ｃｔ０４８、ｃｔ０６１、ｃｔ０６３、ｃｔ０６８、ｃｔ０７１、ｃｔ０５１、ｃｔ０８０、ｃｔ１１５、ｃｔ１１９、ｃｔ６７８、ｃｔ５６１、ｃｔ５３８、ｃｔ５８２、ｃｔ８７５、ｃｔ３２２、ｃｔ１１２、ｃｔ３１５、ｃｔ６１０、、ｃｔ１４７、ｃｔ２２８、ｃｔ２３２、ｃｔ６１４、ｃｔ０９８、ｃｔ２６５、ｃｔ３７５、ｃｔ００４、ｃｔ０３８、ｃｔ０４０、ｃｔ０５２、ｃｔ０５３、ｃｔ２０１、ｃｔ２４５、ｃｔ２４６、ｃｔ４０５、ｃｔ４２０、ｃｔ４２６、ｃｔ５０７、ｃｔ５１２、ｃｔ５１３、ｃｔ５１４、ｃｔ５１６、ｃｔ３１６、ｃｔ４３９、ｃｔ４９２、ｃｔ５２０、ｃｔ５２３、ｃｔ５２６、ｃｔ６１１、ｃｔ６１３、ｃｔ６２６、ｃｔ６３０、ｃｔ６４７、ｃｔ６４９、ｃｔ７２５、ｃｔ７３４、ｃｔ７７９、ｃｔ８０１、ｃｔ８３３、ｃｔ８３５、ｃｔ８３６、ｃｔ８４５、またはそれらの断片（免疫原性部分、例えば、Ｔ細胞またはＢ細胞エピトープ）もしくは相同体の使用を開示する。
【００１４】
また、本発明は、クラミジア種の細菌が原因である感染の予防、治療または診断用の薬学的組成物の調製に用いる、特定のペプチド断片、例えば、ＣＴ５４１−ＰＦ１（アミノ酸位置１１１−２４３）、ＣＴ４４３−ＰＦ１（アミノ酸位置２１４−２９１）、ＣＴ７９５−ＰＦ１（アミノ酸位置１−１６３）、ＣＴ３９６−ＰＦ１（アミノ酸位置１７０−３１８）、ＣＴ８４２−ＰＦ１（アミノ酸位置４３３−５１５）、ＣＴ２８３−ＰＦ１（アミノ酸位置４７７−５７７）、ＣＴ８７４−ＰＦ１（アミノ酸位置３３０−４２６）、ＣＴ０５１−ＰＦ１（アミノ酸位置３８−１７７）、ＣＴ１４１−ＰＦ１（アミノ酸位置１７−１２６）、ＣＴ６４３−ＰＦ１（アミノ酸位置７６９−８４１）、ＣＴ６８１−ＰＦ１（アミノ酸位置１５６−３９１）、ＣＴ６８１−ＰＦ２（アミノ酸位置１９９−３２９）、ＣＴ６８１−ＰＦ３（アミノ酸位置２９４−３４９）、ＣＴ４１４−ＰＦ１（アミノ酸位置６０５−７２２）、ＣＴ４１４−ＰＦ２（アミノ酸位置４６３−５３０）、ＣＴ４５６−ＰＦ１（アミノ酸位置６９５−８４０）、ＣＴ４５６−ＰＦ２（アミノ酸位置１３７−２２９）、ＣＴ４５６−ＰＦ３（アミノ酸位置２４３−３２１）、ＣＴ４５６−ＰＦ４（アミノ酸位置２０９−２９１）、ＣＴ４５６−ＰＦ５（アミノ酸位置１７５−２７９）、ＣＴ４５６−ＰＦ６（アミノ酸位置５６７−７３０）、ＣＴ４５６−ＰＦ７（アミノ酸位置２１０−５４０）、ＣＴ４５６−ＰＦ８（アミノ酸位置１９０−２７９）、ＣＴ５２１−ＰＦ１（アミノ酸位置１４−３６）、ＣＴ５２１−ＰＦ２（アミノ酸位置４０−６２）、ＣＴ５２１−ＰＦ３（アミノ酸位置５２−７５）、ＣＴ５２１−ＰＦ４（アミノ酸位置６６−８８）、ＣＴ５２１−ＰＦ５（アミノ酸位置１１６−１３８）、ＣＴ５０４−ＰＦ１またはこれらペプチド断片をコードする核酸の使用も開示する。
【００１５】
また、本発明は、ワクチンまたは診断薬の形態をとる薬学的組成物も開示する。
【００１６】
薬学的組成物を調製するために使用するポリペプチドは、脂質が付加されて自己アジュバント作用を可能にするか、または融合パートナーに融合させることができる。ここでの融合パートナーは、クラミジア・トラコマチスに由来する別のポリペプチドであることができる。それらには、ＣＴ８１２、ＣＴ５７９、ＣＴ５８７、Ｃａｐ、ＣＴ７１３、ＣＴ４４２またはＭＯＭＰあるいは上記のいずれかのＴ細胞またはＢ細胞のエピトープの少なくとも１種に由来するポリペプチド断片の１つまたは複数が含まれるが、それらに限定されない。また、本発明は、本発明のポリペプチド（またはそれらの免疫原性部分）の２つ以上の相互融合体を含む融合ポリペプチドにも関する。
【００１７】
本発明によって開示されているワクチンを、クラミジア種、例えば、クラミジア・トラコマチスによる感染を予防または治療するために使用することできる。
【００１８】
本発明によって開示されている診断薬（上記の抗原またはそれに対する抗体）を、クラミジア種、例えば、クラミジア・トラコマチスによる感染を診断するために使用することできる。
【００１９】
開示されている診断方法は、細胞性免疫、血清学、または単純な皮膚試験に基づく。クラミジア種の細菌による過去または現在進行中の感染の細胞性免疫による診断は、検体、例えば、単核細胞（例えば、Ｔリンパ球）を含む血液検体を、陽性反応、例えば、細胞増殖またはＩＦＮγ等のサイトカインの放出を検出するために、診断試薬と接触させるステップを含む。クラミジア種の細菌による過去または現在進行中の感染の血清学による診断方法は、感染がある場合には陽性反応を検出するために、検体、例えば、血液検体をその抗原に対する抗体と接触させるステップ、または抗原を対象の体液と接触させるステップを含み、抗体の当該ポリペプチドへの結合を検出する場合には、当該結合は、対象がクラミジア種の細菌に感染していることを示す。皮膚試験は、診断薬を、皮内注射するか、または皮膚に（例えば、パッチによって）施用するステップを含み、注射または施用の部位の陽性皮膚応答が、クラミジア種の細菌による感染を示す。
【００２０】
また、本発明は、クラミジア種の細菌による感染に対して免疫する方法も開示する。この方法は、上記の本発明のワクチンを、哺乳類に投与するステップを含む。
【００２１】
（定義）
ポリペプチド
本発明における「ポリペプチド」という用語は、通常の意味を有するものとする。すなわち、アミノ酸残基がペプチド共有結合によって連結している、完全長タンパク質、オリゴペプチド、短いペプチドおよびそれらの断片を含む、アミノ酸の鎖であり、いかなる長さであってもよい。
【００２２】
ポリペプチドを、グリコシル化によって、脂質付加（例えば、Mowatら、１９９１によって記載されているようにパルミトイルオキシスクシンイミド、またはLustiｇら、１９７６によって記載されているように塩化ドデカノイルを用いた化学的な脂質付加）によって、補欠分子族を含むことによって、または例えば、ヒスチジンタグまたはシグナルペプチド等の追加のアミノ酸を含有させることによって、化学的に修飾することができる。
【００２３】
したがって、各ポリペプチドを、特定のアミノ酸によって特徴付け、特定の核酸配列によってコードされることができる。そのような配列には、組換え法または合成法によって生成される類似体および変異体が含まれ、そのようなポリペプチド配列は、組換えポリペプチドのアミノ酸残基の１個または複数が置換、挿入、付加または欠失によって改変されているにも関わらず、本明細書に記載されている生物学的アッセイのいずれかにおいて、免疫原性を示すことが理解されよう。置換は、「保存的」であることが好ましい。これらは、以下の表によって定義される。第２列の同じ四角内、好ましくは第３列の同じ行内にあるアミノ酸を相互に置換することができる。第３列では、アミノ酸を１文字コードで示している。
【表１】
2008520550.tif 000001
【００２４】
本発明内の好ましいポリペプチドは、クラミジア・トラコマチスの免疫原性抗原である。そのような抗原は、例えば、クラミジア・トラコマチスの細胞および／またはクラミジア・トラコマチスの培地の濾液から得ることができる。したがって、上記の抗原のうちの１つの免疫原性部分を含むポリペプチドは、そのような免疫原性部分のみから構成されていてもよいし、または追加の配列を含有していてもよい。追加の配列は、天然のクラミジア・トラコマチスの抗原から得てもよいし、または異種であってもよく、そのような配列は、免疫原性であってもよいが、そうである必要はない。
【００２５】
各ポリペプチドは、特定の核酸配列によってコードされる。そのような配列には、それらの類似体および変異体が含まれ、そのような核酸配列は、１個または複数の核酸が置換、挿入、付加または欠失によって改変されていることが理解されよう。置換は、アミノ酸配列に何らかの変化が起きることはないコドンの使用のサイレント置換が好ましいが、置換を導入してタンパク質の発現を促進してもよい。
【００２６】
本明細書の文脈では、「実質的に純粋なポリペプチド断片」という用語は、純粋なポリペプチド断片が未変性状態で結合しているその他のポリペプチド材料を最大で５重量％含有するポリペプチド調製物を意味する（その他のポリペプチド材料の比率は、より低い方が好ましく、例えば、最大で４％、最大で３％、最大で２％、および最大で１／２％である）。実質的に純粋なポリペプチド断片が、少なくとも９６％純粋であること、すなわち、調製物中、実質的に純粋なポリペプチド断片が、ポリペプチド材料の全量に対して、少なくとも９６重量％を占めることが好ましい。実質的に純粋なポリペプチド断片の占める比率は、より高い方が好ましく、例えば、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．２５％、少なくとも９９．５％、および少なくとも９９．７５％である。ポリペプチド断片が、「実質的に純粋な形態」であること、すなわち、純粋なポリペプチド断片が未変性状態で結合するその他の抗原のいずれもが基本的に存在しないこと、つまり、クラミジア種に属する細菌からのその他の抗原のいずれもが存在しないことが特に好ましい。これは、以下に詳細に説明するような非クラミジア系宿主細胞中での組換え法によって、あるいはよく知られている固相または液相ペプチド合成法、例えば、Merrifieldによって記載されている方法もしくはその変法によりポリペプチド断片を合成することによって、ポリペプチド断片を調製することにより、達成することができる。
【００２７】
「クラミジア種」という用語は、動物またはヒトにおいてクラミジア感染を起こすことができる細菌と理解されている。例として、クラミジア・トラコマチス（C. trachomatis）、クラミジア・ニューモニエ（C. pneumonia）、およびC. muridarumがあげられる。
【００２８】
クラミジア・トラコマチスの主要外膜タンパク質（ＭＯＭＰ）は、クラミジア・トラコマチスの発達の生涯過程のあらゆる段階で発現し、クラミジアの外膜の全タンパク質量の約６０％を占める。ＭＯＭＰは、保存ドメインと、それらの間に存在する４つの高度可変ドメイン（ＶＤ１〜４）とに分けることができる（Stephens、Wagarら、１９８８）。通常、Ｔ細胞エピトープは、保存領域に位置し（Ortiz、Demickら、１９９６）、ヒト抗体の応答は、主として可変ドメインに対して起きる。特異的モノクローナル抗体の反応性および可変領域の詳細な配列解析に基づいて、クラミジア・トラコマチスは、１５の異なる血清変異株に分類することができ、これらの変異株中、Ａ、Ｂ、ＢａおよびＣがトラコーマの原因となり、Ｄ〜Ｋが性感染症（ＳＴＤ）の原因となり、Ｌ１〜Ｌ３が鼠径リンパ肉芽腫症の原因となり、ＭｏＰｎ（C. muridarum）はマウスに感染する。
【００２９】
「クラミジア患者」という用語は、培養またはＰＣＲによってクラミジア亜種感染が証明された個体と理解されている。培養、顕微鏡およびＰＣＲによるクラミジアの診断は、当業者にはよく知られている。
【００３０】
「遅延型過敏症反応（ＤＴＨ：delayed type hypersensitivity reaction）」という用語は、ポリペプチドの皮内注射または皮膚への施用の後に誘発される、Ｔ細胞によって仲介される炎症応答であり、当該炎症応答は、ポリペプチドの注射または施用の７２〜９６時間後に現れると理解されている。
【００３１】
「ＩＦＮγ」という用語は、インターフェロンガンマと理解されている。ＩＦＮγの測定は、免疫学的応答の指標として用いられる。
【００３２】
「核酸断片」および「核酸配列」という用語は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡ（locked nucleic acid）、ＰＮＡ、ＲＮＡ、ｄｓＲＮＡおよびＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを含むいずれかの核酸分子と理解されている。また、自然に存在しないヌクレオシドを含む核酸分子も含まれる。この用語には、使用に応じて、いかなる長さ、例えば、１０〜１００００個のヌクレオチドを含む核酸分子も含む。核酸分子を医薬品として、例えば、ＤＮＡ療法に使用するか、または本発明に従ってポリペプチドを調製する方法に使用する場合、少なくとも１種のエピトープをコードする、約１８〜約１０００ヌクレオチド長の分子を使用するのが好ましく、場合によっては、この分子をベクター内に導入する。核酸分子をプローブとして、プライマーとして、またはアンチセンス療法に使用する場合、１０〜１００ヌクレオチド長の分子を使用するのが好ましい。本発明によれば、その他の分子の長さ、例えば、少なくとも１２、１５、２１、２４、２７、３０、３３、３６、３９、４２、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００または１０００個のヌクレオチド（またはヌクレオチド誘導体）を有する分子、あるいは最大で１００００、５０００、４０００、３０００、２０００、１０００、７００、５００、４００、３００、２００、１００、５０、４０、３０または２０個のヌクレオチド（またはヌクレオチド誘導体）を有する分子を使用することもできる。
【００３３】
ハイブリダイゼーションの条件と共に使用される場合の「緊縮性」という用語は、当技術分野で定義されているように、すなわち、ハイブリダイゼーションを、融解温度Ｔｍより１５〜２０℃低い温度で行うと定義されている。Sambrookら、１９８９、１１．４５−１１．４９頁を参照されたい。「高緊縮性の」条件、すなわち、融解温度Ｔｍより５〜１０℃低い温度が好ましい。
【００３４】
本明細書を通して、文脈上別の意味が要求されない限り、「含む（comprise）」または「含む（comprises）」もしくは「含む（comprising）」等のその変形は、述べられている構成要素または整数または構成要素もしくは整数の群を含むことを意味するが、その他の構成要素または整数または構成要素もしくは整数の群のいずれをも排除することを意味するものではないと理解されたい。
【００３５】
配列同一性
「配列同一性」という用語は、等しい長さの２つのアミノ酸配列間または等しい長さの２つのヌクレオチド配列間の相同性の程度の定量的な尺度を意味する。比較しようとする２つの配列は、ギャップの挿入またはタンパク質配列の末端の切断によって可能になる、最も一致した状態に整列化させる必要がある。配列同一性は、
【数１】
2008520550.tif 000002
【００３６】
として計算することができる。ただし、式中、Ｎｄｉｆは、整列化したときに２つの配列間で一致しない残基の全数であり、Ｎｒｅｆは、１つの配列中の残基の数である。したがって、ＤＮＡ配列ＡＧＴＣＡＧＴＣは、配列ＡＡＴＣＡＡＴＣと、７５％の配列同一性を有することになる（Ｎｄｉｆ＝２およびＮｒｅｆ＝８）。ギャップは、特定の残基に対して一致しないとして数えられ、すなわち、ＤＮＡ配列ＡＧＴＧＴＣは、ＤＮＡ配列ＡＧＴＣＡＧＴＣと、７５％の配列同一性を有することになる（Ｎｄｉｆ＝２およびＮｒｅｆ＝８）。別法として、配列同一性は、ブラスト（BLAST）プログラム、例えば、BLASTPプログラム（PearsonおよびLipman、１９８８）（www.ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST）によって計算することもできる。本発明のある態様では、Thompson J.ら、１９９４に記載されているように、http://www2.ebi.ac.uk/clustalw/ で入手できるデフォルトパラメーターを用い、配列比較法ClustalWで、配列化を実施している。
【００３７】
配列同一性の好ましい最低パーセントは、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、および９９．５％等の、少なくとも８０％である。
【００３８】
免疫原性部分
本発明のより好ましい実施形態では、ポリペプチドが、Ｂ細胞またはＴ細胞に対するエピトープ等の、ポリペプチドの免疫原性部分を含む。ポリペプチドの免疫原性部分は、当該ポリペプチドの一部であり、免疫原性部分は、動物もしくはヒトにおいて免疫応答を誘発する、かつ／または生物学的試料において、本明細書に記載されている生物学的アッセイのいずれかで測定される免疫応答を誘発する。ポリペプチドの免疫原性部分は、Ｔ細胞のエピトープであってもよいし、またはＢ細胞のエピトープであってもよい。免疫原性部分は、ポリペプチドの比較的小さな部分の１つもしくはいくつかに関係していてもよいし、ポリペプチド配列全体に散在していてもよいし、またはポリペプチドの特定の部分に存在していてもよい。いくつかのポリペプチドに関して、ポリペプチド全体に配列全長にわたり、エピトープが散在していることが示されている（Ravn、Demissieら、１９９９）。免疫応答において認識される適切なＴ細胞エピトープを同定するために、「強力な」方法を使用することができる。すなわち、Ｔ細胞エピトープは線形であることから、ポリペプチドの欠失変異体は、系統的に構築すれば、ポリペプチドのどの領域が、免疫認識において必須であるかを示すであろう。例えば、これらの欠失変異体に対して、具体的には、本明細書に記載されているＩＦＮγアッセイを実施する。別法では、重複しているオリゴペプチドを利用し、ＭＨＣクラスＩＩエピトープを検出する。好ましくは、このオリゴペプチドは、当該ポリペプチドに由来するアミノ酸の、例えば、２０個からなる長さを有する合成オリゴペプチドである。これらのペプチドを生物学的アッセイ（例えば、本明細書に記載されているＩＦＮγアッセイ）で試験することができ、これらのうちのいくつかは、ペプチド中にＴ細胞エピトープが存在する証拠として、陽性の応答（それによって免疫原性）を示すであろう。ＭＨＣクラスＩエピトープを検出するためには、結合するであろうペプチドを予想し（Stryhn、Pedersenら、１９９６）、それに次いで、これらのペプチドを合成し、適切な生物学的アッセイ、例えば、本明細書に記載されているＩＦＮγアッセイで試験することができる。好ましくは、このペプチドは、当該ポリペプチドに由来するアミノ酸残基の、例えば、８〜１１個からなる長さを有する。Ｂ細胞エピトープは、例えば、Harboeらによって記載されているように（Harboe、Oettingerら、１９９６）、目的のポリペプチド全体に重複しているペプチドに対するＢ細胞の認識を解析することによって決定することができる。
【００３９】
Ｔ細胞エピトープの最も短い長さは、少なくとも６個のアミノ酸であることが示されているが、Ｔ細胞エピトープは、より長いアミノ酸からなることが普通である。したがって、本発明のポリペプチド断片は、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１２個、少なくとも１４個、少なくとも１６個、少なくとも１８個、少なくとも２０個、少なくとも２２個、少なくとも２４個および少なくとも３０個のアミノ酸残基等、少なくとも７個のアミノ酸残基からなる長さを有する。したがって、本発明の方法の重要な実施形態では、ポリペプチド断片が、最大で４０個、３５個、３０個、２５個および２０個のアミノ酸残基等、最大で５０個のアミノ酸残基からなる長さを有することが好ましい。１０〜２０個のアミノ酸残基からなる長さを有するペプチドが、ＭＣＨクラスＩＩエピトープとして最も効率がよいと証明されるであろうと予想され、したがって、本発明の方法で使用するポリペプチド断片の特に好ましい長さは、１５個、１４個、１３個、１２個および特に１１個等、１８個のアミノ酸残基である。７〜１２個のアミノ酸残基からなる長さを有するペプチドが、ＭＣＨクラスＩエピトープとして最も効率がよいと証明されるであろうと予想され、したがって、本発明の方法で使用するポリペプチド断片の特に好ましい長さは、１０個、９個、８個および特に７個等、１１個のアミノ酸残基である。
【００４０】
ポリペプチドの免疫原性部分は、遺伝子的に異型なヒトの集団の広範な部分によって認識される場合（高頻度）、またはそのごく一部によって認識される場合（低頻度）がある。さらに、一部の免疫原性部分は、高い免疫学的応答（ドミナント）を誘発し、別の免疫原性部分は、顕著であるものの、低めの応答（サブドミナント）を誘発する。高頻度＞＜低頻度は、広範に分布しているＭＨＣ分子（ＨＬＡ型）に結合する免疫原性部分、または複数のＭＨＣ分子にさえ結合する免疫原性部分と関係付けることができる（Kilgus、Jardetzkyら、１９９１）（Sinigaglia、Guttingerら、１９８８）。
【００４１】
しかし、クラミジア感染に対する新しいワクチンに用いる候補分子を提供するという状況では、サブドミナントなエピトープも、ドミナントなエピトープと同様、適切である。というのは、サブドミナントであるにもかかわらず、そのようなエピトープは、防御を誘発することができることが示されているからである。
【００４２】
変異体
本発明のポリペプチドに共通する特徴は、実施例で説明するように、免疫学的応答を誘発する能力である。置換、挿入、付加または欠失によって作製される本発明のポリペプチドの変異体も、本明細書に記載されているいずれかのアッセイによって測定すると免疫原性であることを理解されたい。
【００４３】
免疫個体
免疫個体とは、クラミジア感染が排除または制御されているヒトまたは動物と定義される。
【００４４】
免疫原性
免疫原性のポリペプチドとは、現在クラミジアに感染しているか、または過去にクラミジアに感染した生物学的試料または個体において、免疫応答を誘発するポリペプチドと定義される。免疫応答は、以下の方法のいずれかでモニターすることができる。
【００４５】
・ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける細胞応答は、現在クラミジアに感染しているか、または過去にクラミジアに感染した動物またはヒトから採取したリンパ球からの、ＩＦＮγ等の関連性があるサイトカインの放出によって、またはこれらのＴ細胞の増殖の検出によって測定される。誘発は、ポリペプチドまたは免疫原性部分を、１×１０５〜３×１０５細胞／ウェルを含む懸濁液に加えることによって行われる。細胞は、血液、脾臓、肝臓または肺のいずれかから単離する。ポリペプチドまたは免疫原性部分を、２０μｇ／ｍｌ以下の濃度になるように、懸濁液に加える。２〜５日間、刺激する。細胞増殖をモニターするために、細胞に、放射標識したチミジンを加え、パルスを発生させ、１６〜２２時間インキュベーションした後、液体シンチレーションカウンターでカウントして増殖を検出する。陽性の応答は、｛バックグラウンド＋２×（標準偏差）｝超である応答とする。ＩＦＮγの放出は、当業者によく知られたＥＬＩＳＡ法によって測定することができる。陽性の応答は、｛バックグラウンド＋２×（標準偏差）｝超である応答とする。ペプチドに対する免疫学的応答をモニターする場合、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−α、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＬ−６、ＴＧＦ−β等のＩＦＮγ以外のサイトカインも関連性があるであろう。サイトカイン（例えば、ＩＦＮγ）の存在を測定する別のさらに感度の高い方法は、ＥＬＩＳＰＯＴ法であり、この方法では、血液、脾臓、肝臓または肺のいずれかから単離した細胞を、好ましくは１〜４×１０６細胞／ｍｌの濃度に希釈し、最終濃度が２０μｇ／ｍｌ以下であるポリペプチドまたは免疫原性部分の存在下で、１８〜２２時間インキュベーションする。その後、細胞の懸濁液を１〜２×１０６／ｍｌに希釈し、抗ＩＦＮγで被覆したMaxisorpプレートに移し、好ましくは、４〜１６時間インキュベーションする。ＩＦＮγ産生細胞を、標識された二次抗ＩＦＮγ抗体およびスポットの発生に関わる基質を使用して測定する。発生したスポットは、解剖顕微鏡を使用して数えることができる。ＰＣＲ法を使用して、関連性があるサイトカインをコードするｍＲＮＡの存在を測定することも可能である。通常、１種または複数のサイトカインを、例えば、ＰＣＲ法、ＥＬＩＳＰＯＴ法またはＥＬＩＳＡ法を利用して測定することになる。特定のペプチドによって誘発されるこれらのサイトカインのいずれかの量の顕著な増加または減少を使用して、ペプチドの免疫学的活性を評価することができることが、当業者であれば理解できよう。
【００４６】
・また、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける細胞応答は、免疫個体またはクラミジア・トラコマチスに感染したヒトに由来するＴ細胞株を使用することによっても測定できる。この場合、Ｔ細胞株は、生存しているクラミジアまたは細菌細胞の抽出液と共に、ＩＬ−２を添加して、１０〜２０日間処理されている。１×１０５〜３×１０５細胞／ウェルを含有するＴ培養細胞株の懸濁液に、２０μｇ／ｍｌ以下の濃度になるようにポリペプチドを加えてインキュベーションする。インキュベーションは、２〜６日間行う。ＩＦＮγの誘導または別のサイトカインの放出を、ＥＬＩＳＡ法で検出する。Ｔ細胞の刺激を、上記のように、放射標識したチミジンを使用して細胞増殖を検出することによってモニターすることもできる。どちらのアッセイも、陽性の応答は、｛バックグラウンド＋２×（標準偏差）｝超である応答とする。
【００４７】
・ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける細胞応答は、臨床的または準臨床的にクラミジアに感染している個人に、最大で１００μｇのポリペプチドまたは免疫原性部分を皮内注射またはパッチから局所施用した後に、陽性のＤＴＨ応答として測定することができ、陽性の応答は、注射または施用の７２〜９６時間後に少なくとも５ｍｍの直径を有する。
【００４８】
・ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける液性の応答は、免疫個体または感染している個体における特異的な抗体の応答によって測定することができる。抗体の存在は、ＥＬＩＳＡ法またはウェスタンブロット法によって測定することができる。ウェスタンブロット法の場合、ポリペプチドまたは免疫原性部分をニトロセルロース膜またはポリスチレン表面のいずれかに吸収させる。血清を、好ましくは、ＰＢＳ中で、１：１０〜１：１００に希釈し、吸収させたポリペプチドに加え、１〜１２時間インキュベーションする。標識した二次抗体を使用することにより、特異抗体の存在を、光学濃度（ＯＤ）を、例えば、ＥＬＩＳＡ法によって測定することができる。この場合、陽性の応答は、｛バックグラウンド＋２×（標準偏差）｝超である応答とし、または別法として、ウェスタンブロット法においては、目視で確認できる応答とする。
【００４９】
・別の関連性があるパラメーターは、アジュバント中のポリペプチドによる予防接種後またはＤＮＡによる予防接種後に誘発された、動物モデルにおける防御の測定である。適切な動物モデルとして、霊長類、モルモットまたはマウスがあげられ、これらは、クラミジア感染に曝されている。誘発された防御の読み取りは、予防接種されていない動物と比較した標的臓器中のクラミジア細菌の量の減少、予防接種されていない動物と比較した生存期間の延長、および予防接種されていない動物と比較した体重減少の抑制であることができるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５０】
調製方法
一般に、クラミジア・トラコマチス抗原およびそのような抗原をコードするＤＮＡ配列を、種々の方法のいずれかを使用して調製することができる。それらは、クラミジア・トラコマチスの細胞から、上記の方法等の方法で、未変性タンパク質として精製することができる。免疫原性のある抗原を、抗原をコードするＤＮＡ配列を使用して組換えによって調製することもできる。このＤＮＡ配列は、発現ベクターに挿入され、適切な宿主中で発現させられている。宿主細胞の例として、大腸菌があげられる。本発明のポリペプチドまたは免疫原性部分を、約１００個未満のアミノ酸、一般的には、５０個未満のアミノ酸を有するように、合成によって調製することもでき、成長しているアミノ酸の鎖にアミノ酸を順次加える市販の固相技術等の当業者によく知られた技術を使用して調製することができる。
【００５１】
ＤＮＡワクチンと定義される、ポリペプチドをコードするプラスミドＤＮＡの構築および調製においては、大腸菌等の宿主株を使用することができる。次いで、プラスミドＤＮＡを、目的のプラスミドを保有している宿主株を一晩培養することによって調製し、菌体内毒素を除去するステップを含む、例えば、Qiagen Giga-Plasmidカラムキット（Qiagen社製、Santa Clarita、カリフォルニア州、米国）を使用して精製することができる。ＤＮＡワクチンに使用するプラスミドは、菌体内毒素を含まないことが必須である。
【００５２】
融合タンパク質
免疫原性ポリペプチドを、融合タンパク質として調製することもでき、この方法によって、本発明のポリペプチドの優れた特徴を達成することができる。例えば、組換えにより調製する場合には、ポリペプチドの搬出を促進する融合パートナー、ポリペプチドの精製を促進する融合パートナー、および本発明のポリペプチド断片の免疫原性を促進する融合パートナーは、いずれも興味深い、可能性のあるものである。したがって、本発明は、上記で定義したポリペプチドまたは免疫原性部分の少なくとも１つと、融合パートナーの少なくとも１つとを含む融合ポリペプチドにも関する。融合パートナーは、免疫原性を促進するために、クラミジア・トラコマチスに由来する別のポリペプチド、例えば、クラミジア種に由来するポリペプチド断片、具体的には、ＣＴ８１２、ＣＴ５７９、ＣＴ５８７（Goodall、Yeoら、２００１）、Ｃａｐ（Fling、Sutherlandら、２００１）、ＣＴ７１３（KuboおよびStephens、２０００）、ＣＴ４４２（Starnbach、Loomisら、２００３）、もしくはＭＯＭＰ（Stephens、Wagarら、１９８８）、または上記のいずれかのＴ細胞エピトープもしくはＢ細胞エピトープの少なくとも１種であることができる。また、本発明は、本発明の２つ以上のポリペプチド（またはそれらの免疫原性部分）の相互融合体を含む融合ポリペプチドにも関する。
【００５３】
生成物の免疫原性を促進することができるであろう、その他の融合パートナーは、ＩＦＮγ、ＩＬ−２およびＩＬ−１２等のリンホカインである。発現および／または精製を促進するためには、融合パートナーは、例えば、細菌の線毛タンパク質、具体的には、ピリ線毛の成分であるピリンおよびｐａｐＡ；プロテインＡ；ＺＺ−ペプチド（ＺＺ−融合体は、スウェーデンのPharrnacia社から販売されている）；マルトース結合タンパク質；グルタチオンＳトランスフェラーゼ；β−ガラクトシダーゼ；またはポリヒスチジンであることができる。融合タンパク質を、宿主細胞中で、組換えによって調製することができる。この宿主細胞は、大腸菌であることができるであろう。異なる融合パートナーの間に、リンカー領域を導入することも可能である。
【００５４】
その他の興味深い融合パートナーは、脂質を付加されているポリペプチドである。それによって、免疫系に適するように免疫原性ポリペプチドが提示される。この効果は、例えば、ＷＯ９６／４０７１８Ａに記載されているボレリア・ブルグドルフェリ（Borrelia burgdorferi）のＯｓｐＡポリペプチドに基づいたワクチン、または緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）のＯｐｒｌリポタンパク質に基づいたワクチン（Cote-SIerra、Jongertら、１９９８）から知られている。別の可能性として、免疫原性ポリペプチドへの、既知のシグナル配列のＮ末端の融合体、およびＮ末端のシステインがある。適切な調製の宿主内で調製すると、そのような融合体により、Ｎ末端のシステインで免疫原性ポリペプチドに脂質が付加される。
【００５５】
薬学的組成物
薬学的組成物は、以下に説明するいずれかのワクチン（治療用および予防用の両方）またはいずれかの診断用試薬と定義される。
【００５６】
ワクチン、タンパク質
本発明の別の部分は、本発明のポリペプチド（もしくはその免疫原性部分の少なくとも１つ）または融合ポリペプチドを含むワクチン組成物に関する。そのようなワクチン組成物の最適化された性能を保証するために、ワクチン組成物は、免疫学的および薬学的に許容される担体、賦形剤またはアジュバントを含むことが好ましい。
【００５７】
本発明のポリペプチドが動物によって認識される、有効なワクチンとは、動物モデルにおいて、病原性のあるクラミジアに曝露した後、予防接種されていない動物と比較して、標的臓器中のクラミジア細菌の量を減少させ、生存期間を延長し、かつ／または体重減少を抑制することができるものとする。
【００５８】
適切な担体は、ポリペプチドが疎水性の非共有結合によって結合するポリマー、例えば、プラスチック、具体的には、ポリスチレン；ポリペプチドが共有結合によって結合するポリマー、例えば、多糖類；またはポリペプチド、具体的には、ウシ血清アルブミン、卵白アルブミンもしくはスカシ貝ヘモシアニンからなる群から選択される。適切な賦形剤は、希釈剤および懸濁化剤からなる群から選択される。アジュバントは、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロマイド（ＤＤＡ）、クィルＡ、ポリＩ：Ｃ、水酸化アルミニウム、フロインドの不完全アジュバント、ＩＦＮγ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）、トレハロースジマイコレート（ＴＤＭ）、トレハロースジベヘネート（ＴＤＢ）およびムラミルジペプチド（ＭＤＰ）からなる群から選択されるのが好ましい。
【００５９】
有効成分としてペプチド配列を含有するワクチンの調製は、いずれも参照によって本明細書に組み入れられている米国特許第４，６０８，２５１号、第４，６０１，９０３号、第４，５９９，２３１号および第４，５９９，２３０号に例示されているように、通常、当業者にはよく知られている。
【００６０】
ワクチンのアジュバント効果を達成するためのその他の方法として、水酸化アルミニウムもしくはリン酸アルミニウム（ミョウバン）等の薬剤、糖の合成ポリマー（カルボポール；Carbopol）、熱処理によるワクチン中のタンパク質の凝集化、アルブミンに対するペプシン処理（Ｆａｂ）抗体を用いた再活性化による凝集化、クリプトスポリジウムパルブム（Cryptosporidium parvum）等の細菌細胞、菌体内毒素もしくはグラム陰性細菌のリポ多糖成分との混合物、mannide monooleate（アラセル（Aracel）Ａ）等の生理学的に許容される油性の賦形剤中の乳濁液、または代用血液として使用されるパーフルオロカーボン（Fluosol-DA）の２０％溶液を用いた乳濁液の使用があげられる。その他の可能性としては、上記のアジュバントと組み合わせてサイトカイン等の免疫調節物質、またはポリＩ：Ｃ等の合成ＩＦＮγ誘発剤を使用することが含まれる。
【００６１】
アジュバント効果を達成するための別の興味深い方法は、（参照によって本明細書に組み入れられている）（Gosselin、Wardwellら、１９９２）に記載されている技術を利用することである。要するに、本発明の抗原等の適切な抗原を、単核球／マクロファージ上のＦｃγ受容体に対する抗体（または抗原結合抗体断片）に結合させることができる。
【００６２】
ワクチンは、剤形に対応した方法で投与され、治療に有効かつ免疫原性を示す量で投与するものとする。投与量は、免疫応答を開始する個々の免疫系の能力および所望する防御の程度等を含め、治療対象によって異なる。適切な投与量の範囲として、ワクチンあたり、約数百μｇ、好ましくは約１〜３００μｇ等の約０．１〜１０００μｇ、特に約１０〜５０μｇの有効成分を含む。初期投与および追加免疫に関する適切な投与計画も多様であるが、通常、初期投与、それに続く接種またはその他の投与に代表される。
【００６３】
多種多様な投与形態をとることができる。ワクチンを投与する従来からの方法のいずれかを適用できる。これらには、固体の生理学的に許容される基剤上もしくは生理学的に許容される分散剤の形態での経口投与、または注射等による非経口投与が含まれると考えられる。ワクチンの投与量は、投与経路によって異なるものであり、ワクチンを投与される個人の年齢によって、またそれよりは程度は低いが、ワクチンを投与される個人の大きさによって、変動するものである。
【００６４】
ワクチンは、従来法に従って、注射により、例えば皮下注射または筋肉内注射により非経口的に投与される。その他の投与形態に適する別の剤形として、坐剤、および、場合によっては、経口製剤があげられる。坐剤には、従来からの結合剤および担体、例えば、ポリアルキレングリコールまたはトリグリセリドを含むことができる。そのような坐剤を、０．５〜１０％、好ましくは１〜２％の範囲の有効成分を含む混合物から形成することができる。経口製剤には、通常利用される賦形剤、例えば、製薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、および炭酸マグネシウム等を含む。これらの組成物は、液剤、懸濁剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、徐放性製剤または散剤の形態をとり、有効成分を１０〜９５％、好ましくは２５〜７０％含有するのが都合がよい。
【００６５】
多くの場合、ワクチンを複数回投与する必要があるであろう。特に、ワクチンは、クラミジア感染を防止し、かつ／または確立したクラミジア感染を治療するために投与することができる。感染防止のために投与する場合には、ワクチンは、感染の臨床的な徴候または症状が明確に現れる前に、予防的に投与される。
【００６６】
遺伝的変動のために、各個人は、同一のペプチドに対して異なる強度の免疫応答で反応することがある。したがって、本発明のワクチンは、免疫応答を高めるために、いくつかの異なるポリペプチドを含むことができる。ワクチンは、２つ以上のポリペプチドまたは免疫原性を含むことができ、その場合、ポリペプチドは全部、上記で定義されているペプチドであってもよいし、全部ではないが一部のペプチドが、その他のクラミジア血清変異株の１種または複数に由来していてもよい。後者の例では、ポリペプチドについて上記で記載されている基準を、ポリペプチドが必ずしも満たす必要はなく、それ自体の免疫原性に基づいて作用するか、または単にアジュバントとして作用するかのいずれかであってよい。
【００６７】
ワクチンは、２〜２０個もしくは特に３〜２０個の異なるポリペプチドもしくは融合ポリペプチド等、または３〜１０個のポリペプチドもしくは融合ポリペプチド等の、１〜２０個の異なるポリペプチドもしくは融合ポリペプチドを含むことができる。
【００６８】
また、本発明は、クラミジア種が原因であるクラミジア感染に対して、ヒトを含む動物を免疫する方法であって、本発明のポリペプチドまたは上記の本発明のワクチン組成物または上記の生ワクチンを、動物に投与するステップを含む方法にも関する。
【００６９】
また、本発明は、本発明の免疫原性組成物を調製する方法にも関する。この方法は、本発明のポリペプチドを調製、合成または単離するステップと、ワクチン用の媒体中にポリペプチドを溶解または分散させるステップと、場合により、その他のクラミジア・トラコマチス抗原および／または担体すなわち賦形剤および／またはアジュバント物質を加えるステップとを含む。
【００７０】
ワクチンＤＮＡ
本発明の核酸断片を、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて抗原を発現させるために使用することができる。すなわち、核酸断片を、参照によって組み入れられている総論（Ulmer、Donnellyら、１９９３）で述べられているように、いわゆるＤＮＡワクチンに使用することができる。
【００７１】
したがって、本発明は、本発明の核酸断片を含むワクチンにも関する。このワクチンは、ワクチンを投与されたヒトを含む動物によってｉｎ  ｖｉｖｏで抗原を発現させ、発現する抗原の量は、ヒトを含む動物において、病原性のクラミジアが原因である感染に対する抵抗を実質的に高めるのに有効である。
【００７２】
そのようなＤＮＡワクチンの効果は、免疫応答を調節することができるポリペプチドをコードするＤＮＡ断片と共に、発現生成物をコードする遺伝子を投与することによって、促進することができるであろう。
【００７３】
組換え生ワクチン
ワクチンに対する細胞性免疫応答を効果的に活性化させる１つの可能性として、非病原性の微生物またはウイルスにおいて、ワクチン中に適切な抗原を発現させることによって達成することができる。そのような微生物のよく知られた例が、ウシ型結核菌ＢＣＧ（Mycobacterium bovis BCG）、サルモネラ属（Salmonella）およびシュードモナス属（Pseudomona）であり、ウイルスの例がワクシニアウイルス（Vaccinia Virus）およびアデノウイルス（Adenovirus）である。
【００７４】
別の可能性は、ワクシニアウイルスまたはアデノウイルス等の弱毒化したウイルスに、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを統合することである（RolphおよびRamshaw、１９９７）。組換えワクシニアウイルスは、感染した宿主細胞の細胞質中で複製することができ、したがって、目的のポリペプチドが免疫応答を誘発することができる。この免疫応答によって、クラミジアに対する防御が誘発されるのをねらう。
【００７５】
治療用ワクチン
また、本発明は、D. Lowry（Lowryら、１９９９）の文献に記載されているように、治療用ワクチンとして使用するための本発明のポリペプチドまたは核酸の使用にも関する。ワクチンとして投与する場合、実験動物におけるクラミジア・トラコマチス感染の重症度を低下させる能力、または過去の感染の再活性化を防止する能力に基づいて、治療的特徴を有する抗原を同定することができる。治療用ワクチンに使用する組成物は、ワクチンについて上記で記載したように調製することができる。
【００７６】
診断用タンパク質
また、本発明は、ヒトを含む動物におけるクラミジアが原因であるクラミジア感染を診断する方法にも関する。この方法は、本発明のポリペプチドを動物に皮内注射するステップを含み、注射部位における陽性の皮膚応答は、当該動物がクラミジアに感染していることを示唆し、注射部位における陰性の皮膚応答は、当該動物がクラミジアに感染していないことを示唆する。
【００７７】
病原性のクラミジアによる過去または進行中の感染の診断を目指す場合には、単核細胞（すなわちＴリンパ球）を含む患者の血液検体を、１つまたは複数の本発明のポリペプチドの検体と接触させることができるであろう。このような接触は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで行うことができ、陽性の反応は、例えば、Ｔ細胞の増殖またはＩＦＮγ等のサイトカインの細胞外の相への放出であり得る。対象の血清検体を本発明のポリペプチドと接触させることもまた可能であり、血清検体中の抗体とポリペプチドとの結合が実証されることにより、過去または進行中の感染が示される。
【００７８】
したがって、本発明は、動物またはヒトにおけるクラミジア種による進行中または過去の感作をｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断する方法にも関する。この方法は、動物またはヒトから血液検体を供給するステップと、当該動物の検体を本発明のポリペプチドと接触させるステップとを含み、血液検体中の単核細胞による少なくとも１種のサイトカインの細胞外の相への顕著な放出は、当該動物に感作が生じていることを示唆する。陽性応答は、患者の血液検体からの放出が、｛クラミジアと診断されていない患者の血液検体からの放出＋２×（標準偏差）｝超である応答とする。また、本発明は、動物またはヒトにおけるクラミジアによる進行中または過去の感作をｉｎ  ｖｉｔｒｏで診断する方法にも関する。この方法は、動物またはヒトから血液検体を供給するステップを含み、当該動物の検体を本発明のポリペプチドと接触させることによって、血清検体中に本発明のポリペプチドを認識する抗体が存在することを示す。診断するために使用する免疫原性組成物は、２〜２０個もしくは特に３〜２０個の異なるポリペプチドもしくは融合ペプチド等、または３〜１０個のポリペプチドもしくは融合ペプチド等の、１〜２０個の異なるポリペプチドもしくは融合ペプチドを含むことができる。
【００７９】
診断用ＤＮＡ
本発明のポリペプチドをコードする核酸のプローブを、所与の検体中の病原体の存在を検出するための多様な診断アッセイに使用することができる。本発明の核酸断片を動物に投与するステップ、または検体を本発明の核酸断片もしくはそれに対して相補的な核酸断片と共にインキュベーションするステップと、インキュベーションによってハイブリダイゼーションした核酸の存在を（当技術分野でよく知られたハイブリダイゼーションアッセイを使用して）検出するステップとを含む、ヒトを含む動物中または検体中のクラミジアの核酸の存在を測定する方法もまた、本発明に含まれる。そのようなクラミジア感染を診断する方法では、上記で定義したヌクレオチド配列の少なくとも一部を含む組成物を使用し、試験しようとする動物またはヒトの検体中の、核酸断片（または相補的な断片）とハイブリダイゼーションするヌクレオチド配列の存在を、ＰＣＲ法を使用して検出することになるであろう。
【００８０】
抗体
また、イムノアッセイにおいて本発明のポリペプチドと特異的に反応するモノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体または当該抗体の特異的結合断片もまた、本発明の一部である。抗体は、当業者に既知の方法で調製することができる。ポリクローナル抗体は、哺乳類中で、例えば、本発明のポリペプチドおよび必要であればアジュバントを１回または複数回注射することによって育てることができる。本発明のモノクローナル抗体は、例えば、KohlerおよびMilstein（１９７５）によってはじめて記載されたハイブリドーマ法によって、または米国特許第４，８１６，５６７号に記載されているような組換えＤＮＡ法によって調製することができる。また、モノクローナル抗体は、例えば、（McCafferty、Griffithsら、１９９０）によって記載されている技術を使用して生成したファージライブラリーから単離することもできる。抗体を調製する方法は、文献、例えば、米国６１３６９５８に記載されている。
【００８１】
感染している恐れのある臓器の検体を、本発明のポリペプチドを認識するそのような抗体と接触させることができる。当技術分野でよく知られた方法により検体と抗体との間での反応が認められる場合、進行中の感染が示唆されることになる。もちろん、対象の血清検体を本発明のポリペプチド断片の少なくとも１つと接触させた後、抗体と抗原との間の反応を可視化するよく知られた方法を使用することによって、血清中の抗クラミジア抗体の存在を示すことも可能である。
【００８２】
診断に際しては、本発明の抗体、核酸断片および／またはポリペプチドを、組成物中で、単独または１つの成分としてのいずれかで使用することができる。そのような組成物は、当技術分野においては既知であり、本発明の抗体、核酸断片またはポリペプチドが、少なくとも１種のその他の分子、例えば、（放射性もしくは蛍光）標識または担体分子に、結合、好ましくは共有結合している組成物を含む。
【００８３】
本発明は、
１）クラミジア泌尿生殖器感染患者のＴ細胞を刺激し、ＩＮＦγを分泌させる能力、あるいは
２）クラミジア泌尿生殖器感染患者のＴ細胞を刺激し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるクラミジアの増殖を抑制するサイトカインを分泌させる能力、あるいは
３）クラミジア泌尿生殖器感染患者の血清ＩｇＧ抗体および／またはＩｇＭ抗体および／またはＩｇＡ抗体による認識、あるいは
４）Chlamydia muridarumおよび／またはクラミジア・トラコマチスに実験的に感染しているマウスのＴ細胞および／または抗体による認識、あるいは
５）マウスへの投与によって、クラミジア・トラコマチスの細菌抗原を認識する免疫応答を誘発する能力、あるいは
６）予防接種によって、Chlamydia muridarumおよび／またはクラミジア・トラコマチスによる実験的攻撃感染に対して少なくとも部分免疫をもたらす能力
を有するクラミジア・トラコマチスの抗原性成分を開示する。
【００８４】
第１に、クラミジア・トラコマチスのタンパク質から防御Ｔ細胞の分子標的を同定するために、クラミジア・トラコマチス血清型Ｄ（ＵＷ−３／Ｃｘ株、ＡＴＣＣ番号：ＶＲ−８８５）のタンパク質の可溶化液を、マルチ溶出法（AndersenおよびHeron、１９９３）によって分画した。この方法では、複合タンパク質の混合物中のタンパク質を、分子量によって狭い画分に分離し、次いで、分離したタンパク質を使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて末梢血単核球（PBMC:Peripheral Blood Mononuclear Cell）を刺激する。数日間インキュベーションした後、ＩＮＦγの放出をＥＬＩＳＡによってモニターする（図１）。クラミジア患者の応答を、過去にクラミジア感染と診断されたことのない正常な血液提供者の応答と比較した。こうして比較することによって、ヒトへの感染の第１段階において、エフェクターＴ細胞を刺激してＩＮＦγを放出させる能力のあるクラミジア・トラコマチスのタンパク質を同定することができる。この方法を使用して、これらの防御Ｔ細胞の標的が、５〜１２、１６〜２０、２５〜３５および５８〜７４ｋＤａの見かけ分子量を有するタンパク質またはタンパク質の断片であることが示された（図２および３）。各刺激領域内の細菌のタンパク質の正確なアイデンティティーを、質量分析によって決定した。
【００８５】
刺激抗原をさらに同定し、特徴付けると、特異的なクラミジア・トラコマチス抗原のそれぞれは、ａ）実施例１で例示するように、クラミジア・トラコマチスの抽出液の抗原から精製することができ、ｂ）実施例１で例示するような、大腸菌から生成および精製された抗原であることができ、ｃ）実施例１で例示するような、重複している合成ペプチドであることができ、またはｄ）実施例５で例示するような、組換えアデノウイルス構築物を直接用いた標的患者ＰＢＭＣの形質導入体であることができるものである。図４に例示するように、この方法によって、ＩＮＦγの放出によって測定された極めて強力な刺激能力を有する刺激領域のそれぞれの中にある、単一の抗原およびそれに由来するペプチドを同定することができた。
【００８６】
第２に、５’−プライマーにコザック配列および３’−プライマーに終止コドンを含有する遺伝子特異的オリゴヌクレオチドを使用したポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）により、完全長のクラミジア・トラコマチスの遺伝子を増幅することによって、定方向発現ライブラリーを構築した。クラミジア・トラコマチス血清型ＤのゲノムＤＮＡを、ＰＣＲ反応の鋳型として使用し、目的の遺伝子内のプライマーの位置およびＴｍを含む自動化プライマー設計のために、新たに開発されたＵＮＩＸ（登録商標）プログラムを使用した。まず、単位複製配列を、組換えにより、Gateway「entry vector」（Invitrogen製）内に挿入し、次いで、組換えにより、Ｈｉｓ６タグおよびentry vectorと同一の組換え配列を含有するｐＤＥＳＴ１７発現ベクター（Invitrogen製）内に移動させた。高いレベルのクラミジア・トラコマチスに特異的なＩｇＧ、ＩｇＭまたはＩｇＡ抗体を有するヒト血清検体のプールを使用し、コロニーブロット法（French maulおよびmaul、１９８６）により、クラミジア・トラコマチス抗原の発現について、個々のクローンをスクリーニングした。細胞溶解の前に、プラスミドによってコードされているプロモーターに向けてはじまる転写を誘発するために、コロニーリフトのために使用するニトロセルロース製フィルターを、１％アラビノース溶液にあらかじめ浸漬した。クラミジア患者の血清ＩｇＧ、ＩｇＭまたはＩｇＡ抗体に結合する陽性のクローンは、はじめのスクリーニングに使用したものと同一の血清検体のプールを使用して、ウェスタンブロット法によって、さらに分析するために選択した。この方法によって、ワクチンおよび診断に適切な、免疫反応性のクラミジア・トラコマチスのタンパク質をコードするクローンの同定に至った。
【００８７】
第３に、ゲノム発現ライブラリーを、大腸菌ファージラムダｇｔｌ１（λｇｔｌ１）中で構築した。クラミジア・トラコマチス血清型Ｄの高分子量の染色体ＤＮＡを、基本小体から、ＳＤＳ（１％）およびプロテイナーゼＫ（１００μｇ／ｍｌ）を含有する溶解緩衝液中に抽出後、フェノールで抽出し、エタノールで沈殿させた。ＤＮＡを超音波処理によって部分的に分解し、０．２〜０．８ｋｂのサイズのＤＮＡ断片を、λｇｔｌ１に連結した。連結混合物をｉｎ  ｖｉｔｒｏパッケージし、組換えファージを大腸菌Ｙ１０９０ｒ−上に蒔いて培養し、約３．４×１０５の一次ラムダファージを含有するゲノム発現ライブラリーを得た。この一次ライブラリーを増幅して、６．７×１０９ＰＦＵ／ｍｌのゲノムのランダム発現ライブラリーを得た。第１の実験では、このライブラリーを、完全長の発現ライブラリーのスクリーニングのために上記で使用したものと同一のヒト血清検体のプールを使用し、プラークリフト法によってスクリーニングした。クラミジア・トラコマチスに特異的なＩｇＧ、ＩｇＭまたはＩｇＡ抗体に結合する、免疫反応性のプラーク８８個を同定した。これらのプラークを、８個のプール（ＩｇＡ反応性プラークのプール２個、ＩｇＧ反応性プラークのプール５個、およびＩｇＭ反応性プラークのプール１個）として貯蔵した。はじめのスクリーニングに使用したものと同一の血清プール（一次抗体）を用いて、再スクリーニングした。個々の血清反応性のファージプラークを単離し、個別に血清反応性であるファージの挿入ＤＮＡ配列を決定した。この方法により、ワクチンおよび診断に適切な、特異的クラミジア・トラコマチス免疫反応性ペプチドをコードするいくつかのクローンを同定した。
【００８８】
最後に、実験的クラミジア感染においてマウスの免疫系によって認識される抗原を同定するか、または攻撃感染に対して少なくとも部分免疫をもたらすために、感染症の動物モデルを小型齧歯類において確立した。クラミジアは種によって、自然の宿主に対して、高い程度の特異性を示す。したがって、上記の種々のスクリーニング戦略に使用したクラミジア・トラコマチス血清型Ｄは、ヒトの病原体であり、これは、ヒトへの感染に通常伴う病理学的変化をマウスでは起こさない。一方、マウスを近縁のC.muridarum MoPn株に実験的に感染させることができ、何人かの研究者が、実験的ＭｏＰｎ感染に対する部分免疫の誘発を過去に実証している。したがって、性器感染モデルは確立されており、かつＣ５７マウスにおいて確認されている。このモデルにおいて、異なる抗原の防御効果が、１）子宮頚部の拭き取りによる細菌数、２）生殖器の病理学的変化、および３）免疫反応性細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける細胞アッセイを評価することによって研究された。
【００８９】
表１：クラミジア抗原
【表２】
2008520550.tif 000003
【００９０】
2008520550.tif 000004
【００９１】
2008520550.tif 000005
【００９２】
2008520550.tif 000006
【００９３】
2008520550.tif 000007
【表３】
2008520550.tif 000008
【実施例】
【００９４】
（実施例１：クラミジア・トラコマチス血清型ＤのヒトＴ細胞抗原の同定）
緒言
本発明者らは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、次いで電気溶出により分離した複合タンパク質の混合物から得た狭い分子量の画分を使用して、クラミジア・トラコマチスのタンパク質に対するＴ細胞の応答を分析した。この方法により、免疫応答を直接分析し、刺激性のタンパク質画分を比較することができる。これによって、いくつかの刺激性のタンパク質画分の同定およびＴ細胞の標的の同定に至った。これらのＴ細胞標的を、組換え法およびタンパク質配列の全体に広がって重複しているペプチドを使用して、さらに評価した。
【００９５】
材料および方法
微生物および培養
クラミジア・トラコマチス血清型Ｄ（ＵＷ−３／Ｃｘ株）を、Ｈｅｌａ２２９細胞（ＡＴＣＣ製、Rockville、メリーランド州、米国）内で増殖させた。５％ウシ胎児血清（Gibco BRL製、熱により不活性化）、１％ｖ／ｖ  Ｈｅｐｅｓ、１％ｖ／ｖ  Ｌ−グルタミン、１％ｖ／ｖ  ピルビン酸、および１０μｇ／ｍｌのゲンタマイシンを含有する継代培地ＲＰＭＩ１６４０（Gibco BRL製、Grand Island、ニューヨーク州、米国）中で、Ｔ細胞を培養した。
【００９６】
１７５ｃｍ２のフラスコ中のＨｅｌａ２２９細胞のセミコンフルエントな単層を、ＤＥＡＥ−デキストラン（ＨＢＳＳ中４５μｇ／ｍｌ）で、室温にて１５分間前処理した後、３ｍｌのＨＢＳＳ中の１封入体形成単位／細胞のクラミジア・トラコマチス血清型Ｄに感染させた。フラスコを、プレート振とう器上で、３７℃にて２時間インキュベーションした。２時間後に、５％グルコースおよび１μｇ／ｍｌのシクロヘキシミドを追加した５０ｍｌの継代培地ＲＰＭＩ１６４０を各フラスコに加え、細胞を加湿空気中で、５％のＣＯ２雰囲気下、７２時間、さらにインキュベーションした。
【００９７】
クラミジア・トラコマチスの収集
クラミジアを、感染後７２時間で収集した。細胞を、セルスクレーパーを用いてフラスコから取り出し、４℃にて３５，０００ｇで３０分間遠心分離した。ペレットを、フラスコあたり５ｍｌのＨＢＳＳ中に再懸濁させ、氷上で超音波処理し、５００ｇおよび４℃で１５分間遠心分離した。上澄みを採取し、氷上で保存し、ペレットを、前回と同量に再懸濁させ、超音波処理および遠心分離を繰り返した。２つの上澄みをプールし、３００００ｇおよび４℃で３０分間遠心分離し、ペレットを、針と注射器を用いてＳＰＧ緩衝液（３ｍｌ／Ｔ１７５）中に再懸濁させた。短時間の超音波処理の後、懸濁液を、３０％ジアトリゾ酸溶液（７６ｍｌの水中にジアトリゾ酸メグルミン５０ｇ、ジアトリゾ酸ナトリウム７．７ｇ）上に穏やかに層状に置き、４０，０００ｇで３０分間遠心分離した。遠心分離後、ペレットをＳＰＧ緩衝液中に再懸濁させ、−７０℃で保存した。
【００９８】
分画用クラミジア・トラコマチスの溶菌液の調製
６〜８ｍｇのクラミジア・トラコマチスを、３００００ｇで３０分間遠心分離し、ペレットを、１：１でＷＦＩおよび検体緩衝液／ＤＴＴ中に再懸濁させ、５分間沸騰させた。１２秒間の超音波処理を２回行った後、懸濁液を、３００００ｇで３０分間遠心分離した。上澄みを、使用するまで−７０℃で保存した。
【００９９】
クラミジア・トラコマチスの溶菌液の分画
クラミジア・トラコマチスの溶菌液を、AndersenおよびHeron（１９９３）の記載に準じて分画した。簡単に説明すると、クラミジア・トラコマチスの溶菌液を、タンパク質として約６〜８ｍｇの量で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０〜２０％ゲル）により一晩かけて分離した（１１ｃｍ中心幅のウェル、０．７５ｍｍゲル）。溶出緩衝液（アンモニアＣＡＰＳ緩衝液、ｐＨ１０．２）中で、あらかじめ平衡化したゲルをMulti-Eluterに移し、２０分間電気溶出した。タンパク質画分を吸引した後、ＳＤＳ１０〜２０％ポリアクリルアミドゲル上で分離、銀染色（BlumおよびGross、１９８７）することにより分析した。画分中のタンパク質濃度を、Micro BCA法（Pierce製、Oud-beijerland、オランダ）によって推定した。全画分のうちの０．５ｍｌを、０．５％ヒトＡＢ血清で安定化させ、使用するまで−７０℃で保存した。残りは、質量分析に使用するために、血清を添加せずに−７０℃で保存した。
【０１００】
質量分析
ペプチドの質量による対応付けのための試料を、銀染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルから切り出した。バンドを洗浄、乾燥、還元し、ヨードアセトアミドでアルキル化してから、Shevchenkoら、１９９８の記載に基本的に準じて、改変トリプシンで一晩消化した。
【０１０１】
提供者
デンマークのBispebjerg病院でクラミジアと診断された患者に、研究への参加および抗生物質療法の開始前に血液検体の提供を依頼した。クラミジア感染の記録のない対照である対象にも、研究への参加を依頼した。個々の患者の検体を、男女別にＭまたはＫとし、場合によっては、特定の患者から採取した第１、２、３、．．．番目の検体に、Ａ、Ｂ、Ｃ．．．として続き番号を割り当てることにより、独自の同定可能なコードを用いてアノテートした。いずれの場合も、検体Ａは、あらゆる治療をはじめる前に採取した。例えば、１２ＭＢは、患者番号が１２である男性から採取した、第２番目の検体を示す。対照検体は、ＫＫ−ｘｘとアノテートした。
【０１０２】
リンパ球の調製および細胞培養
末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、全血から、Lymphoprep（Nycomed Ａ／Ｓ製、オスロ、ノルウェー）の密度勾配遠心分離によって分離し、使用するまで、液体窒素内で凍結した。ＰＢＭＣを解凍後、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、１％非必須アミノ酸、１％グルタミン（Gibco製）、１％ピルビン酸、１％Ｈｅｐｅｓ、および１０％ヒトＡＢ血清（地元の血液銀行、Rigshospitalet製、コペンハーゲン）を追加したＲＰＭＩ１６４０中に、再懸濁した。細胞の生存率および数を、ニグロシン染色法によって測定した。細胞を、三連とし、丸底マイクロタイタープレート（Nunc製、Roskilde、デンマーク）中で、全量１００μｌ中に１．２５×１０５細胞／ウェルで培養した。はじめの用量−応答研究に基づいて、抗原を以下の濃度で添加した。ＳｖＤ溶菌液：２μｇ／ｍｌ、ＳｖＤ画分２μｇ／ｍｌ、ｒＣＴ５２１  ５μｇ／ｍｌ、ＣＴ５２１重複ペプチド  １０μｇ／ｍｌ。フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ、２μｇ／ｍｌ）を陽性対照として使用し、抗原を含まない細胞培養を陰性対照として含めた。３７℃にて加湿空気（５％のＣＯ２および９５％空気）中で５日間インキュベーションした後、上澄みを収集した。
【０１０３】
ＩＦＮγアッセイ
上澄み中のＩＦＮγの量を、市販の抗体（Endogen製）を用いて、ＥＬＩＳＡ法によって測定し、メーカーの指示に従って使用した。組換えＩFＮγを、標準（Endogen製）として使用した。
【０１０４】
重複ペプチド
ＣＴ５２１の完全な一次配列を網羅する、２２〜２３塩基のペプチド（９〜１２個のアミノ酸が重複）１０個を、固相法（Schafer-N製）によって合成した。
【０１０５】
大腸菌内でのクラミジア・トラコマチス抗原の生成
質量分析法によって同定した抗原をコードするＣＴ遺伝子を、Gateway Cloning Technology Manual（Invitrogen製）に従って、ｐＤＥＳＴ１７ベクターのＮＨ２−末端（Ｈｉｓ）６配列を有するフレーム中にクローン化した。組換えクラミジア・トラコマチス抗原の生成のために、プラスミドベクターを、アラビノースの存在下で高いレベルの組換えタンパク質生成を促進するＢＬ２１−ＡＩ大腸菌株（Invitrogen製）内にクローン化した。
【０１０６】
組換えクラミジア・トラコマチス抗原の小規模な精製
細菌細胞ペレットを、１０ｍＭイミダゾール、２０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、８Ｍ尿素中に懸濁させ、メーカー（BioSpec Products, Inc）の指示に従って、BeadBeaterによって細胞を破壊した後、室温にて穏やかに振とうしながら１時間インキュベーションした。清澄な上澄みを、HisTrapカラム（Pharmacia Biotech製）上に加え、洗浄後、０．５Ｍイミダゾール、２０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、８Ｍ尿素で溶出した。溶出試料を、調製用ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で電気泳動して分離した。目的の組換えポリペプチドを、クーマシーブルー染色法によって同定し、切り出し、４２２型Electro-Eluterをメーカー（BioRad）の取り扱い説明書に従って使用して、ゲル切片から電気溶出した。電気溶出した組換え抗原を、８０〜９０％アセトン（Aldrich製、ＨＰＬＣグレード）中で沈殿させ、９５％エタノール中で洗浄後、最小量の１０ｍＭイミダゾール、２０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、８Ｍ尿素中に再懸濁させた。最後に、試料を５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５；１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、４０％グリセロールへ透析し、−２０℃で保存した。
【０１０７】
結果：
クラミジア溶菌液に対するＴ細胞の応答
Ｈｅｌａ細胞感染７２時間後に収集したクラミジア・トラコマチス血清型Ｄ溶菌液のＴ細胞認識に関して、クラミジア患者をスクリーニングした。この溶菌液は、クラミジア・トラコマチスの全成分の混合物を意味し、クラミジア・トラコマチスの抗原のレパートリー全体を網羅するものである。この調製物を使用して、１５人のクラミジア患者および６人の対照提供者からのＰＢＭＣを刺激した（図１）。溶菌液に対する応答は、１５人の患者中８人において、顕著なレベル（＞１０００ｐｇ／ｍｌ）のＩＦＮγに関連があった。１人の対照提供者においてのみ、１０００ｐｇ／ｍｌ超のＩＦＮγで、溶菌液に対し応答した。
【０１０８】
クラミジア患者は、複数の抗原を認識する
Ｔ細胞の応答の特異性を、マルチ溶出法によって得たタンパク質画分を用いて、ＰＢＭＣを刺激することによって調べた。この方法を溶菌液に使用し、隣接する画分とは最低限しか重複しない狭い画分を得た（図２）。各画分のポリペプチドの数を、１０〜３０個と推定する。そのような画分のパネルを使用して、溶菌液全体に応答した８人の患者および６人の対照提供者の抗原認識パターンをスクリーニングした（図３）。これらの画分に対する細胞性応答は、応答が複数の抗原に対するものであることを示した。しかし、ＩＦＮγを生成するピークが、５〜１２、１６〜２０、２５〜３５および５８〜７４ＫＤａの分子量の領域で認められた。
【０１０９】
クラミジア患者による組換えタンパク質の認識
分子量領域１６〜２０（図２）を含む画分７ならびに隣接する画分６および８について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。ゲルを銀染色し、画分を含有する部分をゲルから切り出し、Milli Q水中に置き、タンパク質を同定するために質量分析に送った。ＣＴ５２１、ＣＴ０４３、ＣＴ５１１、ＣＴ６１６、ＣＴ３１５およびＣＴ８０３の６個のヒットが同定された。分子量領域２５〜３５を含む画分１０、１１、１２、１３、１４および１５も、さらに質量分析に送った。ＣＴ６０３、ＣＴ６７８、ＣＴ５６１、ＣＴ６１０、ＣＴ５３８、ＣＴ５８２、ＣＴ５８３、ＣＴ６７９、ＣＴ０６７、ＣＴ６８１の１０個のヒットが同定された。分子量領域５８〜７４を含む画分２２を、質量分析に送った。ＣＴ８７５、ＣＴ１１０、ＣＴ１１２の３個のヒットが同定された。最後に、画分１８を質量分析に送り、ＣＴ５８７およびＣＴ３２２の２個のヒットが同定された。
【０１１０】
組換えタンパク質、ｒＣＴ０４３、ｒＣＴ５１１、ｒＣＴ５２１、ｒＣＴ６１６、ｒＣＴ８０３を大腸菌から精製し、１ＫＡ、１５ＫＡ、７ＫＡおよび１２ＫＡの４人の患者において、５種のクラミジア・トラコマチスのタンパク質の免疫学的活性を調べた（図４）。ｒＣＴ５２１は、試験した４つの中で、最も有望な抗原であった。対照提供者に比べ、４人の患者のうち３人（１ＫＡ、７ＫＡおよび１５ＫＡ）が、ｒＣＴ５２１に対して強力（＞１０００ｐｇ／ｍ）に応答した。ｒＣＴ８０３、ｒＣＴ５１１およびｒＣＴ６１６は、４人の患者のうち２人（１ＫＡ、７ＫＡ）において、高いレベルのＩＦＮγを誘発し、ｒＣＴ０４３は、すべての患者において、低いレベルのＩＦＮγを誘発した。組換えタンパク質、ＣＴ０４３、ＣＴ５１１、ＣＴ６０３、ＣＴ５６１、ＣＴ６１０、ＣＴ５８３、ＣＴ６７９、ＣＴ０６７、ＣＴ６８１、ＣＴ８７５、ＣＴ１１０、ＣＴ１１２、ＣＴ５８７およびＣＴ３２２を大腸菌内で生成し、１０人の患者および５人の対照でＴ細胞認識を試験した（実施例８）。
【０１１１】
クラミジア患者によるＣＴ５２１の認識
クラミジア感染患者によるＣＴ５２１の認識を、提供者のより大きなパネルで試験した。いずれも１５００ｐｇ／ｍｌ超のＩＦＮγでクラミジアの溶菌液に応答した、全部で４１人のクラミジア患者を、ＣＴ５２１の認識について試験した。さらに、１５００ｐｇ／ｍｌ未満のＩＦＮγで溶菌液に応答した１１人の対照提供者も含めた（図５）。５００ｐｇ／ｍｌを超えるＩＦＮγの応答に基づいて、患者をＣＴ５２１陽性およびＣＴ５２１陰性に分類することができた。４１人の患者のうち３４人が、ＣＴ５２１陽性であり（８２．９％）、１１人の対照のうち２人のみが、ＣＴ５２１に応答した（１８．２％）。これらの結果から、ＣＴ５２１が、クラミジアの溶菌液全体に応答したクラミジア患者によって、高頻度で認識されることが示されている。
【０１１２】
合成ペプチドより対応付けした、ＣＴ５２１に対するＴ細胞応答の精密な特異性
ＣＴ５２１に対するＴ細胞応答の精密な特異性を、ＣＴ５２１の完全な配列を網羅する重複ペプチドのパネルをスクリーニングすることによって対応付けた。ペプチドを、９〜１２個のアミノ酸が重複する２２〜２３塩基として合成し、４１人のクラミジア患者および１１人の対照のＰＢＭＣを刺激するために使用した（図６）。応答は非常に不均一であるにもかかわらず、特定の領域が応答の強力な標的となっている特定の階層が存在した。タンパク質のＮ末端部分（アミノ酸１４〜アミノ酸３６）、中心部分（アミノ酸４０〜アミノ酸８８）、およびＣ末端部分（アミノ酸１１６〜アミノ酸１３８）に存在するエピトープが、その他よりも、強力にまたは頻繁に認識された。
【０１１３】
（実施例２：定方向性ライブラリー戦略（抗体標的のスクリーニング））
緒言
高スループットな手法をとり、クラミジア・トラコマチス血清型Ｄゲノム中の血清反応性抗原を試験した。最初の２００個のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）から、完全長ライブラリーを構築した。このライブラリーは、大腸菌内で、抗原を組換えによって発現するように設計されていた。このライブラリーをスクリーニングするために、本発明者らは、ウェスタンブロット分析法によってクラミジア・トラコマチスの基本小体（ＥＢ）の抽出液全体に対する反応性に基づいて選択した、５人の高い応答の患者の血清プールを使用した。
【０１１４】
材料および方法
完全長ライブラリーの構築
クラミジア・トラコマチス血清型Ｄのゲノムは、公的に入手可能であり、Stephensら（Stephens、Kalmanら、１９９８）によって定義されている一次アノーテーションを使用した。遺伝子Ｃｔ００１〜Ｃｔ２００を、クローニングのために選択した。特定の遺伝子の増幅用の５’および３’プライマーを、「社内製の」ソフトウェアによって設計した。２００個の特異的なクラミジア・トラコマチス遺伝子からなる完全長配列を、Entry Vector、ｐＤＯＮＲ  ２０１（Invitrogen製）内にクローン化した。このベクターによって、目的の遺伝子を、Gatewayクローニングシステム（Invitrogen製）の異なる目的ベクターにクローン化することができる。ｐＤＥＳＴ１７目的ベクターは、６×ヒスチジン親和性タグを有する、大腸菌内での組換えクラミジア・トラコマチスのタンパク質の発現のために使用した。細菌宿主は、アラビノースによる誘発によって組換えクラミジア・トラコマチスのタンパク質を生成するためのＢＬ２１−ＡＩ（登録商標）であった。
【０１１５】
発現
１ｍｌの培地を含有する２×９６ウェルプレートを、３７℃にて一晩、増殖させた。培地をＯＤ６００＝０．１になるまで希釈し、ＯＤ６００＝０．５になるまで、３７℃にて振とう（１８０ｒｐｍ）しながらインキュベーションした。その後、Ｌ−アラビノースを、最終濃度が０．２％になるように加えることによって、培養物を誘発した。４時間誘発した後、培養物を氷上に移し、細菌のペレットを遠心分離（３，０００ｇ／２０分）によって収集した。ペレットを、コロニーブロット法の結果が得られるまで、冷蔵庫に保管した。
【０１１６】
患者の血清
ライブラリーのスクリーニングに使用する患者の血清プールを調製するために、５人の陽性クラミジア・トラコマチス患者、３ＫＡ、１１ＫＡ、１２ＫＡ、１３ＫＡおよび１７ＫＡを選択した。アルカリホスファターゼ結合ウサギ抗ヒト−ＩｇＡ、−ＩｇＧおよび−ＩｇＭのそれぞれを二次検出マーカーとして使用するウェスタンブロット分析法（DakoCytomation製、デンマーク）において、クラミジア・トラコマチス血清型Ｄの基本小体の抽出液に対する特異的かつ高い反応性に基づいて、これらの患者の血清を選択した。
【０１１７】
患者の血清プール（１０倍希釈）は、全大腸菌タンパク質抽出液を２ｍｇ／ｍｌで用いて、室温にて３時間前処理した。作用患者血清プールは、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ＴＢＳＴ製）中に１：２００で希釈した。
【０１１８】
コロニーブロット
完全長大腸菌発現ライブラリーのスクリーニングは、基本的には、Frenchら（１９８６）に従って行った。Ｃｔ００１〜Ｃｔ２００およびゲノム全体から選択された遺伝子をコードする細菌培養物（１ｍｌ）を、２つの９６穴ディープウェルプレート中で、３７℃にて、一晩、増殖させた。（６×８）のグリッパー用具を使用して、細菌培養物を、（１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する）ＬＢ寒天を含有するペトリ皿に移した。コロニーを、３０℃にて一晩放置した。コロニーを１％Ｌ−アラビノース中にあらかじめ浸漬したニトロセルロース製の膜上で複製し、コロニーの面が下になるようにして、（１００μｇ／ｍｌアンピシリンおよび０．２％Ｌ−アラビノースを含有する）新しいＬＢ寒天プレートに移した。プレートを、３７℃にて４時間インキュベーションし、最後に、膜を空のペトリ皿に移し、クロロホルム中にあらかじめ浸漬した紙製のフィルター上で、コロニーの面が上になるようにして、１５分間保った。こうして、細菌は、クロロホルムの蒸気に曝された。膜を、リゾチームおよびＤＮＡ分解酵素を含有する溶菌緩衝液中で、一晩インキュベーションした。洗浄工程を繰り返した後、膜を一次抗体（作用患者血清プール）と共に、室温にて２時間インキュベーションした。膜を繰り返し（過剰の１×ＴＢＳＴで４回）洗浄した後、二次抗体中で、１時間インキュベーションした。二次抗体は、
Ａ．ウサギ抗ヒトＩｇＧ（ＤＯ３３６）DakoCytomation製、
Ｂ．ウサギ抗ヒトＩｇＡ（ＤＯ３３８）DakoCytomation製、
Ｃ．ウサギ抗ヒトＩｇＭ（ＤＯ３３７）DakoCytomation製、または
Ｄ．ウサギ抗ヒトＩｇＧ（ＤＯ３３６）およびウサギ抗ヒトＩｇＡ（ＤＯ３３８）のプール
のいずれかであった。すべて、アルカリホスファターゼと結合していた。
【０１１９】
１×ＴＢＳＴ中で２回洗浄後、膜を、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質（Sigma Fast製）で展開した。
【０１２０】
全カテゴリー（ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＭ）で陽性のクローンを選択した。
【０１２１】
コロニーブロット法で陽性のクローンを用いたウェスタンブロット法
１ｍｌの培養物からの細菌のペレットを、２００μｌのＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液中に再懸濁させ、９５℃にて５分間加熱、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより電気泳動後、標準的なウェスタンブロット法によってニトロセルロースに移動させた。上記と同一の患者血清プールおよび二次抗体（Ａ〜Ｃ）のプールと共に、膜をインキュベーションした。タンパク質の誘発の対照として、複製膜を、抗Ｐｅｎｔａ−Ｈｉｓ抗体と共にインキュベーションし、メーカー（Qiagen）の指示に従って処理した。コロニーブロット法で反応しなかった２つのコロニーを、対照として含めた。
【０１２２】
結果：
細菌コロニースクリーニング手法における患者血清により認識されたＣＴ抗原の同定結果を以下に示す。
【表４】
2008520550.tif 000009
【０１２３】
（実施例３：ランダムライブラリー戦略）
緒言
クラミジア・トラコマチス血清型Ｄゲノム中の血清反応性抗原をスクリーニングするために、ランダム発現ライブラリーを、発現ベクターλｇｔｌ１内で構築した。このライブラリーは、β−ガラクトシダーゼを有するフレーム内に融合させた１００〜４００個のアミノ酸残基からなるクラミジア・トラコマチスのペプチド断片を、ランダムに発現するように設計されていた。ライブラリーを、ウェスタンブロット分析法によってクラミジア・トラコマチスの基本小体（ＥＢ）の抽出液全体に対する反応性に基づいて選択した患者の血清を用いてスクリーニングした。
【０１２４】
材料および方法
高分子量クラミジア・トラコマチス血清型ＤゲノムＤＮＡの単離
約８．６×１０９ＩＦＵ（感染単位）を含有するクラミジア・トラコマチス血清型Ｄの基本小体の粗調製物を、４０，０００×ｇで６０分間、４４〜５４％ジアトリゾ酸溶液で段階密度勾配超遠心分離することによって、さらに精製した。５４％界面にバンドを形成した基本小体を採取し、１０倍量のＳＰＧ緩衝液（２５０ｍＭスクロース；１０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４；５ｍＭ  Ｌ−グルタミン酸）中に希釈し、３０，０００×ｇで３０分間遠心分離することによって沈殿させた。基本小体のペレットを、５ｍｌのＴＥＮＳ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ  ９；１００ｍＭ  ＥＤＴＡ；２００ｍＭ  ＮａＣｌ；１％ＳＤＳ）中に再懸濁させ、１００μｇ／ｍｌプロテイナーゼＫと共に、３７℃にて６０分間インキュベーションした。試料をＴＥＮＳ緩衝液中に１回希釈し、核酸をフェノール／クロロホルム抽出により精製後、エタノールで沈殿させた（Maniatisら、１９８７）。ＲＮＡを、ＲＮＡ分解酵素Ｔ１およびＲＮＡ分解酵素Ａの混合物（Stratagene製）２５Ｕ／ｍｌで、３７℃にて６０分間処理することによって除去し、フェノール／クロロホルムよる抽出およびエタノールによる沈殿を再度行った。クラミジア・トラコマチス血清型ＤゲノムＤＮＡの調製物を、ＴＥ中に０．４μｇ／μｌで再懸濁させ、一部をアガロースゲル電気泳動法により試験したところ、高分子量、≫５０ｋｂのＤＮＡを含有していることが示された。
【０１２５】
クラミジア・トラコマチスの全ゲノムランダム発現ライブラリーの構築
１７５μｌのＴＭ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８；１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２）中に５０ｕｇのＤＮＡを含有する微量遠心機用チューブを、Soniprep １５０超音波処理器（ＭＳＥ製）内に置かれた氷水浴内に入れて、超音波処理することによって、クラミジア・トラコマチスゲノムＤＮＡのランダムな断片を生成させた。マイクロチップ（１／８インチφ）を試料の表面下約２ｍｍに入れ、超音波処理を１５μの振幅で８０分間継続的に行った。このような条件下では、ゲノムＤＮＡは、ランダムに分割され、アガロースゲル電気泳動で分析すると、０．０５〜１ｋｂの範囲の大きさの断片となっていた。これに続く、超音波処理したＣＴゲノムＤＮＡのフェノール／クロロホルム抽出およびエタノールによる沈殿工程の調製の過程は、適宜場合によって加えた。約１０μｇの超音波処理ＤＮＡ断片の末端の修復およびリン酸化を、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、クレノウＤＮＡポリメラーゼおよびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを組み合わせてインキュベーションすることにより行った。さらに、ランダム断片化ＣＴゲノムＤＮＡを、ＥｃｏＲＩメチラーゼで処理した後、５０倍モル過剰のリン酸化ＥｃｏＲＩリンカー（１２塩基、BioLabs製）を用いて、リンカーの連結を行った。ＤＮＡをＥｃｏＲＩで処理し、最終ＤＮＡ標本は、６％アクリルアミドゲル上でサイズ分画を行い、０．２〜０．８ｋｂの大きさの断片を５００μｌのＧＥＳ緩衝液（０．５Ｍ酢酸アンモニウム；１０ｍＭ酢酸マグネシウム；０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ；０．１％ＳＤＳ）中で４２℃にて一晩インキュベーションすることによって、ゲル切片から溶出させた。清澄な上澄みをエタノールで２回沈殿させ、最終的なペレットを１０μｌのＴＥ中に再懸濁させた。ＤＮＡをＥｃｏＲＩにより消化し、脱リン酸化したλｇｔｌ１ファージのベクターアーム（Stratagene製）に連結した。ライゲーションミックスは、Gigapack III Gold抽出液を用いて、メーカー（Stratagene）の指示に従って、ｉｎ  ｖｉｔｒｏパッケージした。組換えファージを大腸菌Ｙ１０９０ｒ−上に蒔いて培養し、全部で約３４０，０００種の一次ラムダファージを生成した。ＩＰＴＧおよびＸ−ｇａｌの存在下でファージを蒔いて培養し、青／白選択アッセイから判断すると、これらのうち約６０％が、真の組換え
ファージであった。一次ファージ発現ライブラリーを約３×１０４ＰＦＵ／１３５ｍｍφプレートの密度で増殖させた後、採取し、７％ｖ／ｖ  ＤＭＳＯ中に小分け分注して、−８０℃にて保存した。増殖させたクラミジア・トラコマチスの全ゲノムランダム発現ライブラリーの力価は、６．７×１０９ＰＦＵ／ｍｌであった。
【０１２６】
患者の血清
ランダム発現ライブラリーのスクリーニングにおいて使用した患者の血清のプールは、実施例２において先に記載したものと同一であった。
【０１２７】
クラミジア・トラコマチスの全ゲノムランダム発現ライブラリーのスクリーニング
増殖させたλｇｔｌ１発現ライブラリーを、大腸菌Ｙ１０９０ｒ−細胞に吸収させ、５×１０４〜１×１０５ＰＦＵ／１３５ｍｍ寒天プレートで蒔き、４２℃にて３時間半インキュベーションした。プレートを、水中の１０ｍＭ  ＩＰＴＧであらかじめ飽和させてから乾燥させたニトロセルロース製のメンブランフィルター（BioTrace NT、Pall Corporation製）上に重ね、３７℃にてさらに３．５時間インキュベーションした。フィルターを、１．５％ＢＳＡを含有するＴＢＳＴに移し、室温にて３０分間インキュベーションした後、２００倍に希釈した患者の血清のプールと共に室温にて３０分間インキュベーションした。過剰な患者の血清を、ＴＢＳＴ中で各１０分間３回洗浄後、アルカリホスファターゼ結合ウサギ抗ヒト−ＩｇＡ、−ＩｇＧまたは−ＩｇＭのいずれかと共に室温にて３０分間インキュベーションした。最後に、ＴＢＳＴ中で各１０分間３回洗浄した後、フィルターをＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質（Sigma Fast製）で展開した。
【０１２８】
免疫反応性が陽性のプラークの部分を１０個の部分からなるプールに採取し、滴定後、個々の陽性プラークを同定するために、２．５〜５×１０３ＰＦＵ／１３５ｍｍ寒天プレートの密度で蒔き、再度スクリーニングした。
【０１２９】
ＤＮＡ配列決定および配列解析
個々の陽性として選択されたファージのプラークを、プラークの部分をかき取ることによって採取し、２０μｌの水中に懸濁させ、１０秒間ボルテックスした後、３７℃にて１５分間インキュベーションした。懸濁液を、微量遠心管中で、最大スピードで３０秒間遠心分離し、４．５μｌの清澄な上澄みを、それぞれ２．５ｐｍｏｌの順方向プライマー、５’−ｃｃａｇｃｃａｔｃｇｃｃａｔｃｔｇｃｔｇｃａｃｇ−３’、およびλｇｔｌ１  ＥｃｏＲＩ逆方向プライマー（BioLabs製）、ならびに１容量のHot StarTaq Master Mix（Qiagen製）を使用するＰＣＲ法による増幅に使用した。残りのファージ懸濁液を１００μｌのＳＭ緩衝液中に希釈し、２５μｌのＣＨＣｌ３と一緒にして、ファージストックとして４℃にて保存した。
【０１３０】
ＰＣＲ法による増幅を、Gene Amp PCR System ９７００サーモサイクラー（Applied Biosystem製）内で、９５℃で１５分間、次いで、９５℃で１分間、６０℃で１分間および７２℃で１分間の３０サイクル行った。４μｌをアガロースゲル電気泳動によって試験した。増幅したＤＮＡの配列決定のために、ＰＣＲ反応の残りの６μｌを５倍希釈し、MicroSpin S−３００  ＨＲカラムを用いて、メーカー（Amersham Biosciences）の指示に従って精製した。配列決定は、２８塩基下流でＬａｃＺ遺伝子のＥｃｏＲＩクローニング部位をプライムする、５’−ＣＡＣＣＡＧＡＣＣＡＡＣＴＧＧＴＡＡＴＧ−３’、または８５塩基上流でＬａｃＺ遺伝子のＥｃｏＲＩクローニング部位をプライムする、５’−ＧＣＣＡＴＣＧＣＣＡＴＣＴＧＣＴＧＣＡＣＧ−３’のいずれかの配列決定プライマーを使用するジデオキシ鎖停止法（MWG-BIOTECH（ドイツ）によって契約）によって行った。配列は、Vector NTI Suiteソフトウェアパッケージ（InforMax製）を用いて解析した。
【０１３１】
結果：
発現ライブラリースクリーニングによるクラミジア・トラコマチスの血清反応性抗原の同定
一次抗体としてプールした患者の血清を使用したクラミジア・トラコマチスλｇｔｌ１発現ライブラリーの第１スクリーニングによって、抗ヒト−ＩｇＡ、−ＩｇＧまたは−ＩｇＭのいずれかをそれぞれの第２検出抗体として使用した場合において、いくつかの免疫反応性プラークを同定した。要約すると、８８個の陽性プラークの部分を採取し、プールした。
【０１３２】
再スクリーニングのために採取したプラーク部分の数：
血清反応性のクラス  プラークヒット数  スクリーニングのためのプールの数          
ＩｇＡ              ２４              各１２個のプラーク部分からなる２個のプール
ＩｇＧ              ５０              各１０個のプラーク部分からなる５個のプール
ＩｇＭ              １４              各１４個のプラーク部分からなる１個のプール
合計                ８８                                            ８個のプール
【０１３３】
生成されたファージプールは、個々の陽性のファージのプラークの同定を可能にするために、培養の密度がはるかに低い以外は、はじめのスクリーニングと同一の条件を使用して再スクリーニングした。要約すると、全部で１２９個の陽性のプラークを個別に採取し、アノテートした後、直接配列解析およびファージストックの生成のそれぞれに使用した。
【０１３４】
個別に採取した陽性プラークの数：
血清反応性のクラス  個別のプラーク数
ＩｇＡ              ４１
ＩｇＧ              ７９
ＩｇＭ              ９              
合計                １２９
【０１３５】
個別に単離した陽性のファージ中で、β−ガラクトシダーゼ融合体として発現した挿入断片のアイデンティティーを、配列決定法およびBlast解析（ＥＭＢＬ−ＥＢＩ）によって同定した。
【０１３６】
ＣＴ抗原のアイデンティティーを、ランダム発現ライブラリーをスクリーニングすることによって同定した。
【０１３７】
全部で１０３個の個別のプラークの配列を決定し、２２個の特有な配列相同性に分類した（ＰＦ＝ペプチド断片）：
ＣＴ５４１−ＰＦ１（アミノ酸位置１１１−２４３）
ＣＴ４４３−ＰＦ１（アミノ酸位置２１４−２９１）
ＣＴ７９５−ＰＦ１（アミノ酸位置１−１６３）
ＣＴ３９６−ＰＦ１（アミノ酸位置１７０−３１８）
ＣＴ８４２−ＰＦ１（アミノ酸位置４３３−５１５）
ＣＴ２８３−ＰＦ１（アミノ酸位置４７７−５７７）
ＣＴ８７４−ＰＦ１（アミノ酸位置３３０−４２６）
ＣＴ０５１−ＰＦ１（アミノ酸位置３８−１７７）
ＣＴ１４１−ＰＦ１（アミノ酸位置１７−１２６）
ＣＴ６４３−ＰＦ１（アミノ酸位置７６９−８４１）
ＣＴ６８１−ＰＦ１（アミノ酸位置１５６−３９１）
ＣＴ６８１−ＰＦ２（アミノ酸位置１９９−３２９）
ＣＴ６８１−ＰＦ３（アミノ酸位置２９４−３４９）
ＣＴ４１４−ＰＦ１（アミノ酸位置６０５−７２２）
ＣＴ４１４−ＰＦ２（アミノ酸位置４６３−５３０）
ＣＴ４５６−ＰＦ１（アミノ酸位置６９５−８４０）
ＣＴ４５６−ＰＦ２（アミノ酸位置１３７−２２９）
ＣＴ４５６−ＰＦ３（アミノ酸位置２４３−３２１）
ＣＴ４５６−ＰＦ４（アミノ酸位置２０９−２９１）
ＣＴ４５６−ＰＦ５（アミノ酸位置１７５−２７９）
ＣＴ４５６−ＰＦ６（アミノ酸位置５６７−７３０）
ＣＴ４５６−ＰＦ７（アミノ酸位置７１−１８０）
ＣＴ４５６−ＰＦ８（アミノ酸位置１９０−２７９）
ＣＴ５０４−ＰＦ１
【０１３８】
（実施例５：クラミジア・トラコマチス抗原をコードする組換えアデノウイルスの生成）
緒言
Ｔ細胞反応性をスクリーニングのために、標的細胞に対するクラミジア・トラコマチス抗原の別の送達経路を探索するために、本発明者らは、患者のＰＢＭＣを直接形質導入することによって、抗原をコードする組換えアデノウイルスを構築し、試験した。
【０１３９】
材料および方法
組換えアデノウイルスのストックの構築
選択されたクラミジア・トラコマチス抗原をコードする組換えアデノウイルスは、基本的にViraPower Adenoviral Gateway Expression System（Invitrogen製）を使用することによって、コザック配列、ＡＣＣＡＴＧＧ、の状況におけるＡＴＧ開始コドンを有するフレーム内のＣＴ遺伝子をｐＡｄ／ＣＭＶ／Ｖ５−DEST vector（Invitrogen製）内に導入して、生成した。停止コドンを、ＣＴ遺伝子のＯＲＦのすぐ下流に導入した。生存組換えアデノウイルスを、形質移入した２９３Ａ細胞中で、メーカー（Invitrogen）の指示に従って生産した。一次組換えアデノウイルスのストックを凍結解凍法によって調製し、小分け分注して−８０℃にて保存した。組換えアデノウイルスのストックの２９３Ａ細胞中で、ＴＣＩＤ５０として計る力価を、エンドポイント法によって測定した。
【０１４０】
結果：
アデノウイルスのストックの調製
直接形質導入し、ＰＢＭＣ標的細胞アッセイにおいてＣＴ抗原を発現させるために、アデノウイルスにおいて完全長クラミジア・トラコマチス抗原をクローン化した。
【０１４１】
以下のＣＴ抗原が、アデノウイルスのストックとして利用可能：
ＣＴ４６０、ＣＴ５２９、ＣＴ５７９、ＣＴ５８７、ＣＴ６８１、ＣＴ５０９、ＣＴ７１３、ＣＴ０４３、ＣＴ５１１、ＣＴ５２１、ＣＴ６１６。
【０１４２】
アデノウイルスの形質転換クラミジア・トラコマチス抗原に対するＴ細胞の応答
４種のアデノウイルス構築物（ＡｄＶｐＣＴ０４３、ＡｄＶｐＣＴ５１１、ＡｄＶｐＣＴ５２１およびＡｄＶｐＣＴ６１６）の免疫学的活性を、９人の患者および４人の対照において調べた（図７）。ＡｄＶｐＣＴ５２１は、９人中６人の患者で、強力な（＞５００ｐｇ／ｍｌ）ＩＦＮγの応答を誘発した。ＡｄＶｐＣＴ５１１は、９人中４人の患者で、５００ｐｇ／ｍｌを上回るＩＦＮγのレベルで認識されたが、ＡｄＶｐＣＴ６１６およびＡｄＶｐＣＴ０４３のそれぞれは、３人および２人の患者で、応答が刺激されたのみであった。対照群では、１人の提供者が、ＡｄＶｐＣＴ５１１およびＡｄＶｐＣＴ５２１に応答した。
【０１４３】
（実施例６：齧歯類防御戦略）
緒言
齧歯類防御戦略を使用して、クラミジア抗原の効力を評価した。簡単に説明すると、抗原で免疫化した動物を、C. muridarumに、膣において攻撃感染させる。抗原で免疫化することによる防御能力は、膣のクラミジアの数を定量化し、慢性の病理学的変化をスコア化することによって評価する。ワクチン抗原に対する攻撃前の免疫応答には、脾臓細胞の再刺激後にＩＮＦgを定量化することによって、かつ、クラミジア・トラコマチスＥＢ溶菌液に対する血清抗体の反応性および免疫原に対するＥＬＩＳＡ反応性を評価することによってアクセスする。このモデルで調べた抗原は、Ｃｔ０１５、Ｃｔ０２５、Ｃｔ０２６、Ｃｔ０３０、Ｃｔ０４８、Ｃｔ０６３、Ｃｔ０７８、Ｃｔ０８０、Ｃｔ１８４、Ｃｔ５２１、Ｃｔ０５１、Ｃｔ０８９、Ｃｔ１７５、Ｃｔ４４３、Ｃｔ４５６、Ｃｔ５１１、Ｃｔ５４１、Ｃｔ５８３およびＣｔ６０３である。
【０１４４】
材料および方法
動物
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス、雌、８〜１２週齢をHarlan Laboratoriesから入手した。マウスを、標準的な環境条件で飼育し、標準的な飼料および水を自由に与えた。マウスの使用は、デンマーク法務省（Lov om dyreforsog、jvf lovbekendelser nr.726 of 9. １９９３年９月）および動物保護委員会が進める規制にしたがった。提案する実験の詳細な説明を、申請者による地域の倫理調査委員会（２００３／５６１−７８６）に提出し、許可を得た。
【０１４５】
Chlamydia muridarum
C. muridarumを、ＨｅＬａ２２９細胞（ＡＴＣＣ製、Rockville、メリーランド州、米国）中で増殖させた。ＨｅＬａ細胞を、完全培地（ＲＰＭＩ−１６４０（Gibco BRL製）；５％熱不活性化ウシ胎児血清（Cambrex bioscience製）；１％ｖ／ｖ  Ｈｅｐｅｓ；１％ｖ／ｖ  Ｌ−グルタミン、１％ｖ／ｖピルビン酸、および１０μｇ／ｍｌのゲンタマイシン中で増殖させた。１７５ｃｍ２のフラスコ内に蒔いたＨｅＬａ２２９細胞のサブコンフルエントな単層を、Ｈａｎｋｓ緩衝食塩溶液（ＨＢＳＳ）中の４５μｇ／ｍｌ  ＤＥＡＥ−デキストランで、室温にて１５分間前処理した後、３ｍｌのＨＢＳＳ中の１ＭＯＩ（すなわち、１封入体形成単位（ＩＦＵ）のC. muridarum／ＨｅＬａ細胞）に感染させた。３７℃にて２時間インキュベーション後に、５％グルコースおよび１μｇ／ｍｌのシクロヘキシミドを追加した５０ｍｌの完全培地を加え、感染させた細胞は、５％のＣＯ２を含有する加湿したインキュベーター内で４２〜４４時間さらにインキュベーションした。適切な量の標的細胞内の封入体の存在を顕微鏡的に確認した後、単層を、セルスクレーパーを用いてフラスコから取り出し、４℃にて３５，０００ｇで３０分間遠心分離した。ペレットを、フラスコあたり５ｍｌのＨＢＳＳ中に再懸濁させ、氷上で２×１０００ジュールで超音波処理後、４℃にて５００ｇで１５分間遠心分離した。上澄みを採取し、氷上で保存した。ペレットを、５ｍｌのＨＢＳＳ中に再懸濁させ、最終ステップとして、超音波処理および遠心分離を行った。上澄みをプールし、４℃にて３０，０００ｇで３０分間遠心分離し、ペレットをＳＰＧ緩衝液（２５０ｍＭスクロース；１０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４；５ｍＭ  Ｌ−グルタミン酸）中に再懸濁させた。短時間の超音波処理の後、懸濁液を、３０％ジアトリゾ酸溶液上に穏やかに層状に置き、４０，０００ｇで３０分間遠心分離した。遠心分離後、ペレットを、ＳＰＧ緩衝液中に再懸濁させ、−７０℃で保存した。
【０１４６】
C. muridarum調製物の感染力を、ＭｃＣｏｙ細胞上で滴定することによって定量化後、免疫蛍光アッセイで、封入体を数え上げた。簡単に説明すると、９０〜９５％サブコンフルエントなＨｅＬａ２２９の単層を、滴定した接種材料と共に室温にて７５０ｇで１時間遠心分離した後、３５℃にて２時間インキュベーションした。接種材料を、５％グルコースおよび１μｇ／ｍｌのシクロヘキシミドを追加した完全培地で置き換え、３７℃にて４２〜４４時間さらにインキュベーションした。染色するために、細胞を９９％の氷冷したエタノール中で、１５分間固定した。固定した細胞を、ウサギポリクローナル抗−クラミジアＭＯＭＰ抗体と共に１時間インキュベーションした後、ＦＩＴＣ標識化ブタ−抗ウサギＩｇ抗体で二次染色した。細胞を、ヨウ化プロピジウムで対比染色した。２０高出力（×４０）電界における封入陽性細胞を、蛍光顕微鏡を用いて数え上げて、C. muridarumストックの感染力を定量化した（ＩＦＵ／μｌで表示）。
【０１４７】
マウスの感染
マウスを、膣内において、１０５〜１０７ＩＦＵ（１００〜１０，０００ＩＤ５０）で感染させた。感染は、接種後第７日目および第１４日目に頚膣部の拭き取りを得て、蛍光染色し、検体中の感染単位を数え上げることによってモニターした。
【０１４８】
免疫
マウスを、尾の底部において、皮下（ｓｃ）で、２週間の間隔をおいて３回免疫化した。ワクチンは、２５０μｇのＤＤＡおよび１００μｇのＴＤＢ中に乳化させた１〜５μｇのペプチド（上記を参照）で構成されていた。陰性対照として、ペプチドを含有しないＤＤＡ／ＴＤＢを単独で注射した。陽性対照として、マウスを、１０５ＩＦＵのC. muridarumに、５５〜７５日間、鼻腔内感染させた。鼻腔内感染させた場合、マウスは、ほとんど完全に防御され、膣からの感染により誘発された防御に匹敵するものであった。
【０１４９】
リンパ球の培養、血清抗体および免疫誘発能力の評価
強力な免疫応答を誘発する能力を評価するために、脾臓を、最後の免疫化後第２１日目に取り出し、組織を金属製メッシュで擦り通すことによって脾臓のリンパ球を得て、単一の細胞懸濁液とし、ＲＰＭＩ−１６４０中で、室温にて８００ｇで１回洗浄後、再刺激培地（ＲＰＭＩ−１６４０、Gibo製；１０％熱不活性化ウシ胎児血清、Biochrom AG製、ベルリン；ペニシリンＧ、１００Ｕ／ｍｌ；ストレプトマイシン、１００μｇ／ｍｌ；１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ；２ｍＭ  Ｌ−グルタミン；１ｍＭピルビン酸）中に再懸濁した。
【０１５０】
単離した細胞を、三連で、丸底９６ウェルプレート内で、２００μｌの再刺激培地中、２×１０５細胞／ウェルで培養した。ペプチドを０．０８〜５μｇ／ｍｌの範囲の濃度で添加し、７２時間インキュベーションした。陰性および陽性対照（培地または５μｇ／ＣｏｎＡのいずれか）は、必要に応じて、すべての実験で含められた。再刺激後、上澄みを収集し、ＩＦＮγを酵素結合免疫吸着測定法（Brandt、Elhayら、２０００）によって定量化した。臨界である２０００ｐｇ／μｌ超の高いレベルのＩＦＮγをもたらすワクチンの候補は、Ｃｔ０１５、Ｃｔ０２５、Ｃｔ０２６、Ｃｔ０３０、Ｃｔ０４８、Ｃｔ０６３、Ｃｔ０７８、Ｃｔ０８０、Ｃｔ１８４、Ｃｔ５２１、天然C. muridarumのＭＯＭＰ、Ｃｔ０５１、Ｃｔ１７５、Ｃｙ４４３、Ｃｔ４５６およびＣｔ６０３であった（図１６）。
【０１５１】
同一の時点で、眼房から血液検体を採取し、血清を調製した。クラミジア・トラコマチス血清型ＤおよびC. muridarumの基本小体に対する反応性について、ウェスタンブロット解析法（Theisen、Soeら、２００４）によって、血清を試験した。簡単に説明すると、密度勾配によって精製した基本小体を、４〜１２％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、ニトロセルロース上にエレクトロブロット後、Ｍｅｓｈ緩衝液中のスキムミルク中でブロックした。血清のプール（それぞれのワクチン群から各４匹）を、１００倍に希釈し、ブロットを加え、１時間インキュベーションし、洗浄後、アルカリホスファターゼ結合二次抗体を加え、さらに１時間インキュベーションした。反応は、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ（Sigma製）基質を加えてインキュベーションすることによって可視化した。観察された大きさが理論的な大きさと一致する場合、バンドを陽性と評価した。陽性は、Ｃｔ０１５、Ｃｔ０３０、Ｃｔ０４８、Ｃｔ０７８、Ｃｔ１８４およびＣｔ５２１（図１５）であった。
【０１５２】
免疫化に使用した組換えタンパク質および熱不活性化したC. muridarumの基本小体に対する反応性について、ＥＬＩＳＡ法（Rosenkrands、Aggerら、２００５）によって、血清を試験した。簡単に説明すると、プレートを炭酸緩衝液ｏ／ｎ中の抗原（０．５μｇ／ｍｌ）でコーティングし、ＢＳＡでブロック後、洗浄した。プレートに、あらかじめ希釈した検体を加え、室温にて２時間インキュベーションし、洗浄後、ペルオキシダーゼ結合二次抗体を加え、１時間インキュベーションした。反応は、ＴＭＢ基質を加えてインキュベーションすることによって可視化し、この反応を、硫酸を加えて停止し、４５０ｎｍにおいて読み取った。データに４パラメーターフィットを適用した後、ＯＤ＝１．０における力価を計算した（図１４）。ＩｇＧ１が高い抗原は、Ｃｔ０１５およびＣｔ０３０であった。ＩｇＧ２ｂが高い抗原は、Ｃｔ０６３、Ｃｔ５２１Ｈｉｇｈであった。
【０１５３】
防御効力の評価
ワクチンの効力を評価するために、第１回目の免疫化の８〜１２週間後に、１０５〜１０７ＩＦＵ（１００〜１０，０００ＩＤ５０）で膣内感染させることによって、マウスを攻撃した。ワクチン候補の防御効力を、病理学的評価および頚膣部の拭き取りにより得た感染単位を数え上げることによってモニターした。
【０１５４】
細菌数は、攻撃の７、１４および／または２１日後に得た頚膣部の拭き取りによって測定した。拭き取り検体を、１ｍｌのＳＰＧ緩衝液に、４℃にて、準備ができるまで浸した。同じ日に、検体をｍｍガラスビーズの存在下全速で３０秒間ボルテックスすることによって、C. muridarumの基本小体を、拭き取り検体から機械的に振り落とした。緩衝液をエッペンドルフチューブに移し、分析するまで−８０℃にて保存した。上記に準じて、免疫蛍光アッセイで、サブコンフルエントなＭｃＣｏｙ細胞への封入体を数え上げることによって、感染性の基本小体を定量化した（図８）。ＰＩＤ７における拭き取り検体のＩＦＵの数え上げ後に防御を誘発する抗原は、Ｃｔ０１５、Ｃｔ０２５、Ｃｔ０４８、Ｃｔ１８４、Ｃｔ５２１、Ｃｔ４４３、Ｃｔ６０３および天然C. muridarumのＭＯＭＰである。
【０１５５】
病理学的には、ＰＩＤ４９において、急性および慢性の病態の徴候に関して、生殖器官全体を顕微鏡的に評価した。肉眼的な病理学的評価から、卵管水腫のスコアを計算した。スコアは、個々のワクチン群における卵管水腫の卵管の全数に対する比として計算した（図９）。ＰＩＤ４２において、かなりの防御を誘発した抗原は、Ｃｔ０２５、Ｃｔ０６３、Ｃｔ１８４、Ｃｔ５２１である。
【０１５６】
入手可能な材料に基づくと、Ｃｔ１８４およびＣｔ５２１が、攻撃モデルにおいて最も効果が高い抗原である。Lipovaccに処方すると、これらは、膣クラミジアに対して、最も少ない病態および最良の防御を誘発している。
【０１５７】
（実施例７：全ゲノムランダム発現ライブラリーを使用したクラミジア・トラコマチスの特異的Ｔ細胞エピトープのスクリーニング）
緒言
患者のＰＢＭＣ内のＴ細胞の増殖を刺激する、有望なクラミジア・トラコマチスの特異的な抗原標的を直接スクリーニングするために、全ゲノムランダム発現ライブラリーを使用した。（溶原菌ファージの増殖を促進する）溶原菌宿主細菌Ｙ１０８９ｒ−内でβ−ガラクトシダーゼと融合した組換えポリペプチドを発現する、ランダムに選択されるλｇｔｌ１ファージを発現する細菌のプールを、患者のＰＢＭＣ細胞に直接投与する。細菌が発現したクラミジア・トラコマチスの抗原に暴露されたことにより、おそらくは特異的なエフェクターＴ細胞を介して、インキュベーション中に患者のＰＢＭＣが活性化されるが、そのインキュベーション後、細菌をさらに増殖させるために、抗生物質を添加することによって、混合物を清澄化し、実施例１の記載に基本的に準じて、さらに２〜４日間インキュベーションする。読み取りは、ＩＮＦγおよび／または特異的なＴ細胞の増殖であり得る。
【０１５８】
理論的には、個々のランダムに発現される大きさが０．４〜０．８ｋｂのクラミジア・トラコマチスの遺伝子配列を含有する全ゲノムランダム発現ライブラリーは、約１：１０，０００の個々のラムダクローンにおいて、いずれの遺伝子配列をも（正しい配向で、かつ融合パートナー、β−ガラクトシダーゼを有するリーディングフレームにおいて）網羅する。したがって、それぞれ５００〜１０００個のランダムに選択される細菌のクローンを含有する１０〜２０個のプールをスクリーニングすれば、クラミジア・トラコマチスのゲノム全体を網羅することになる。Aldersonら（２０００）によるデータから、わずか１０４のＴ細胞を含有する１０６もの対照細菌／ウェルを添加したところ、低レベルの非特異的ＩＮＦγおよび増殖しか得られなかったことが示されている。顕著でかつ特異的なＩＮＦγの放出および特異的Ｔ細胞の増殖は、わずか１０４のＴ細胞を含有する、わずか１０３の抗原特異的な細菌／ウェルを添加することによって認められた。したがって、１０５のＰＢＭＣ細胞／ウェルに添加される５００個の異なる個々のクローンを含有する１０６の細菌を有するプールは、各ウェルにおいて、Ｔ細胞の集団を、特定の組換え融合体を特異的に発現する２０００個の細菌に暴露することができる。
【０１５９】
材料および方法
β−ガラクトシダーゼ／ＣＴ５２１融合体を発現するλｇｔｌ１ファージクローンの構築
陽性のＴ細胞エピトープ標的対照として使用するためにλｇｔｌ１−βｇａｌ／ＣＴ５２１を構築した。ＣＴ５２１をコードする完全長の配列を、鋳型としてクラミジア・トラコマチス血清型ＤゲノムＤＮＡ、ならびに特異的な順方向プライマー、５’−ＴＡＴＡＧＡＡＴＴＣＡＴＧＴＴＡＡＴＧＣＣＴＡＡＡＣＧＡＡＣＡＡＡＡ−３’、および逆方向プライマー、５’−ＴＡＴＡＧＡＡＴＴＣＴＴＡＴＡＣＣＣＴＴＴＣＣＡＣＡＣＧＣＴＴＡＡＣＡＡＡＴＣＧ−３’を使用してＰＣＲ法によって増幅した。この逆方向プライマーは、β−ガラクトシダーゼオープンリーディングフレームを有するフレーム内におけるλｇｔｌ１発現ベクターのＥｃｏＲＩクローニング部位へのクローニングのためにＥｃｏＲＩ部位を含有していた。クローン化した組換えファージ構築物を、正しい配向および配列に関して、個々のファージプラークの配列を直接決定する（実施例３を参照）ことによって確認した。
【０１６０】
λｇｔｌ１溶原菌ライブラリーとしてのクラミジア・トラコマチスの全ゲノムランダム発現ライブラリーの調製
Ｙ１０８９ｒ−中のクラミジア・トラコマチスの全ゲノムランダム発現ライブラリーの溶原菌の細菌ストックを、Singhら（１９８９）によって記載されている方法に基本的に準じて構築した。
【０１６１】
（実施例８）
１０人のクラミジア患者および５人の対照からＰＢＭＣを単離し、先の記載（実施例１）に準じて、培養した。細胞培養物を、１．２５×１０５のＰＢＭＣの三連の培養物として確立し、５μｇのタンパク質で刺激した。抗原を含有しない細胞培養物を陰性対照（Ｃ）として含め、ＰＨＡ（２μｇ／ｍｌ）を分裂促進性の陽性対照として使用した（結果は示されていない）。以下の抗原を試験した。ＣＴ０４３、ＣＴ００８  ＣＴ０１６  ＣＴ０２５  ＣＴ０２６、ＣＴ０４８、ＣＴ０９８、ＣＴ１１０、ＣＴ１２５、ＣＴ１５５、ＣＴ００３、ＣＴ００５、ＣＴ０２３、ＣＴ０２７、ＣＴ０２８、ＣＴ０３２、ＣＴ０３５、ＣＴ０７８、ＣＴ０８２、ＣＴ０９３、ＣＴ１１１、ＣＴ１２３、ＣＴ１２６、ＣＴ１３３、ＣＴ１７５、ＣＴ１８４、ＣＴ００２、ＣＴ００９、ＣＴ０１５、ＣＴ０６１、ＣＴ０６３、ＣＴ０６８、ＣＴ０７１、ＣＴ０８０；ＣＴ０８９、ＣＴ１４１、ＣＴ５０９、ＣＴ８０３、ＣＴ００４、ＣＴ０３０、ＣＴ０３８、ＣＴ０４０、ＣＴ０５２、ＣＴ０５３、ＣＴ０６７、ＣＴ５１１、ＣＴ５８３、ＣＴ６０３、ＣＴ６８１、ＣＴ２６５、ＣＴ３２３、ＣＴ３２２、ＣＴ３４２、ＣＴ３５７ｒ、ＣＴ３７５、ＣＴ３７６、ＣＴ４５６、ＣＴ２１３、ＣＴ１６８、ＣＴ３９６、ＣＴ４４３、ＣＴ５８７、ＣＴ６１０、ＣＴ６７９、ＣＴ８４２、ＣＴ８７５、ＣＴ５６１、ＣＴ６５９、ＣＴ１１２、ＣＴ１２４、ＣＴ１５０、ＣＴ２０１、ＣＴ２４５、ＣＴ２４６、ＣＴ４０５、ＣＴ４２０、ＣＴ４２６、ＣＴ５０７、ＣＴ５１２、ＣＴ５１３、ＣＴ５１４、ＣＴ５１６、ＣＴ３１６、ＣＴ４３９、ＣＴ４９２、ＣＴ５２０、ＣＴ５２３、ＣＴ５２６、ＣＴ６１１、ＣＴ６１３、ＣＴ６２６、ＣＴ６３０、ＣＴ６４７、ＣＴ６４９、ＣＴ７２５、ＣＴ７３４、ＣＴ７７９、ＣＴ８０１、ＣＴ８３３、ＣＴ８３５、ＣＴ８３６、ＣＴ８４５およびＣＴ５４１（図１０）。
【０１６２】
図１０に示すように、ヒトによる認識の程度は多様である。強力かつ高頻度で認識されるものがある−５人以上の患者が、全対照を超えるＩＦＮγのレベルで応答している。これらには、ＣＴ３７５、ＣＴ３７６、ＣＴ００４、ＣＴ０４８、ＣＴ０７８、ＣＴ１１０、ＣＴ５８３、ＣＴ６０３、ＣＴ６８１、ＣＴ１８４、ＣＴ１７５、ＣＴ０２５、ＣＴ００２、ＣＴ０１５、ＣＴ０６３、ＣＴ４５６、ＣＴ１６８、ＣＴ３９６、ＣＴ４４３、ＣＴ１２４、ＣＴ０２８、ＣＴ０３０、ＣＴ４３、ＣＴ０４８、ＣＴ０８０、ＣＴ１１１、ＣＴ３１６、ＣＴ３２２、ＣＴ３４２、ＣＴ３７５、ＣＴ４９２、ＣＴ５１２、ＣＴ５２０、ＣＴ５２１、ＣＴ５２３、ＣＴ５４１、ＣＴ６１１、ＣＴ６１３、ＣＴ６３０、ＣＴ６４９、ＣＴ７３４、ＣＴ８０１、ＣＴ８０３（図１１）が含まれ、その他は、まったく認識されていない（例えば、ＣＴ０７１、ＣＴ１３３、ＣＴ００５）。
【０１６３】
（実施例９）
抗体標的の複数抗原プリントイムノアッセイ（Mapia:Multiple Antigen Print Immunoassay）試験−Lyashchenkoら（２０００）の記載に基本的に順ずる。簡単に説明すると、実施例２および３の抗原を、実施例１の記載に準じて、精製した。抗原をニトロセルロース製の膜上にプリントし、患者の血清および対照血清（各２０個）に対する反応を試験した。対照は、目視によるカットオフを定義するために使用した。目視によるカットオフを上回る明確な反応を示した患者の血清を、陽性とみなし、１〜２０個の陽性として順位付けた。
【表５】
2008520550.tif 000010
【０１６４】
（実施例１０：Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマウスにおける防御戦略）
このモデルにおいて試験した抗原は、ＣＴ５２１、ＴＣ００５２（muridarumの主要外膜タンパク質）およびこれら２種のタンパク質の組合せである。
【０１６５】
材料および方法
動物
Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマウス、雌、８〜１２週齢をHarlan Laboratoryから入手した。マウスを、標準的な環境条件で飼育し、標準的な飼料および水を自由に与えた。
【０１６６】
Chlamydia muridarum
実施例６の記載に準じて、C. muridarumを、ＨｅＬａ２２９細胞中で増殖させ、収集した。
【０１６７】
マウスの感染
マウスを、子宮内において、１０５ＩＦＵで感染させた。感染を、接種後第７日目および第１４日目および第２１日目に、頚膣部の拭き取り後、実施例６の記載に準じて、蛍光染色し、検体中の感染単位を数え上げることによってモニターした。
【０１６８】
免疫
マウスを、尾の底部において、皮下（ｓｃ）で、２週間の間隔をおいて３回免疫化した。ワクチンは、２５０μｇのＤＤＡおよび１００μｇのＴＤＢ中に乳化させた５μｇのｒＣＴ５２１、５μｇのｒＴＣ００５２、またはそれらの組合せ（５μｇのｒＣＴ５２１＋５μｇのｒＴＣ００５２）で構成されていた。陰性対照として、タンパク質を含有しないＤＤＡ／ＴＤＢを単独で注射した。
【０１６９】
リンパ球の培養および免疫誘発能力の評価
強力な免疫応答を誘発する能力を評価するために、血液検体を、眼房から最後の免疫化後第７日目に取り出し、グループ（マウス１０匹）としてプールし、血液リンパ球を、密度勾配により精製後、再刺激培地（ＲＰＭＩ−１６４０、Gibo製；１０％熱不活性化ウシ胎児血清、Biochrom AG製、ベルリン；ペニシリンＧ、１００Ｕ／ｍｌ；ストレプトマイシン、１００μｇ／ｍｌ；１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ；２ｍＭ  Ｌ−グルタミン；１ｍＭピルビン酸）中に再懸濁した。
【０１７０】
単離した細胞を、三連で、丸底９６ウェルプレート内で、２００μｌの再刺激培地中、２×１０５細胞／ウェルで培養した。タンパク質を、０．３１〜１０μｇ／ｍｌの範囲の濃度で添加し、７２時間インキュベーションした。陰性および陽性対照（培地または５μｇ／ＣｏｎＡのいずれか）を含めた。再刺激後、上澄みを収集し、ＩＦＮγを、酵素結合免疫吸着測定法（Brandtら、２０００）によって定量化した（図１２）。ｒＣＴ５２１を用いた免疫化により、ｒＣＴ５２１による再刺激に応答して、強力なＩＦＮγの放出が誘発され、ｒＣＴ５２１のエピトープの対応付け（実施例１に記載されているペプチド）により、Ｐ４（アミノ酸４０〜６２）が、ドミナントなエピトープであることが明らかになった（図１２ａ）。同様に、ｒＴＣ００５２を用いた免疫化によっても、相同なタンパク質に応答して、強力なＩＦＮγの放出が誘発された（図１２ｂ）。興味深いことに、ｒＣＴ５２１とｒＴＣ００５２との混合物は、ｒＣＴ５２１単独による免疫化に比べ、ｒＣＴ５２１への応答を非常に効率よく促進した（図１２ｃ）。
【０１７１】
防御効力の評価
ワクチンの効力を評価するために、第１回目の免疫化の１０週間後に、１０５で膣内感染させることによって、マウスを攻撃した。ワクチン候補の防御効力を、実施例６の記載に準じて、頚膣部の拭き取りにより得た感染単位を数え上げることによってモニターした。ｒＣＴ５２１およびｒＴＣ００５２はいずれも、高いレベルの防御を誘発し、２種のタンパク質の組合せは、防御に対して正の付加効果を有した（図１３）。ｒＣＴ５２１を用いた防御実験を、Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマウスで繰り返したところ、同様な結果が得られ、ＢＡＬＢ／ｃ×Ｃ５７ＢＬ／６ｊ  Ｆ１マウスにおいても、ｒＣＴ５２１を用いた免疫化後に高いレベルの防御が認められている（結果は示されていない）。
【０１７２】
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Theisen, M., S. Soe, et al. (2004). "A Plasmodium falciparum GLURP-MSP3 chimeric protein; expression in Lactococcus lactis, immunogenicity and induction of biologically active antibodies.（熱帯熱マラリア原虫ＧＬＵＲＰ−ＭＳＰ３キメラタンパク質：ラクトコッカスラクティス中での発現、免疫原性および生物学的に活性な抗体の誘発）" Vaccine 22(9-10): 1188-98.
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【図面の簡単な説明】
【０１７３】
【図１】図１は、クラミジア・トラコマチス血清型Ｄ溶菌液の細胞反応性を示す図である。６人の対照提供者および１５人の患者から単離したＰＢＭＣのＩＦＮγの応答を示す。ＰＢＭＣを、５μｇ／ｍｌのクラミジア・トラコマチス溶菌液で刺激し、ＩＦＮγの放出を、上澄み中で、５日後に測定した。
【図２】図２は、クラミジア・トラコマチス血清型Ｄのタンパク質画分を示す図である。細菌の溶菌液を、マルチ溶出法によって狭い分子画分に分離した。画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色によって分析した。分子量マーカーの泳動を、右（レーン１）にキロダルトンで示す。溶菌液を、第１および残りのレーンに示す。
【図３】図３は、クラミジア・トラコマチス血清型Ｄのタンパク質画分のヒトＴ細胞認識を示す図である。８人のクラミジア患者（＞１０００ｐｇ／ｍｌで溶菌液全体に応答）および６人の対照提供者から単離したＰＢＭＣを、２μｇ／ｍｌの個々の画分で刺激した。ＩＦＮγの放出を、上澄み中で、５日後に測定した。短い線は、ＩＦＮγ放出量の平均値を示す。
【図４】図４は、４人の患者および３人の対照における組換えタンパク質に対するＴ細胞の応答を示す図である。ＰＢＭＣを、５μｇ／ｍｌのｒＣＴ５２１、ｒＣＴ５１１、ｒＣＴ６１６、ｒＣＴ０４３およびｒＣＴ８０３で刺激した。三連の培地のＩＦＮγの平均値を示す。
【図５】図５は、４１人のクラミジア患者（いずれも１５００ｐｇ／ｍｌ超のＩＦＮγでクラミジア・トラコマチス血清型Ｄの溶菌液に応答）および１５００ｐｇ／ｍｌ未満のＩＦＮγで溶菌液に応答した１１人の対照提供者におけるｒＣＴ５２１の認識を示す図である。ＰＢＭＣを、ｒＣＴ５２１（５μｇ／ｍｌ）および重複ＣＴ５２１ペプチド（各１０μｇ／ｍｌ）のプールで刺激し、ＩＦＮγのレベルを上澄み中で測定した。Ｃ：抗原を含有しない対照のウェル。短い線は、ＩＦＮγの平均値（ｐｇ／ｍｌ）を示す。
【図６】図６は、ＣＴ５２１ペプチド（１０μｇ／ｍｌ）の刺激によるＩＦＮγの放出を示す図である。短い線は、各ペプチドに対するＩＦＮγ放出量の平均値を示す。カットオフ値を、２００ｐｇ／ｍｌのＩＦＮγと設定する（線）。
【図７】図７は、クラミジア・トラコマチス抗原をコードする異なる組換えアデノウイルスで形質転換したＰＢＭＣによるＩＦＮγの放出を示す図である。患者のＰＢＭＣを、表示するアデノウイルスを用いて感染効率１で形質転換し、ＩＮＦγの放出を第２日目に測定した。ＡｄＶａＭｏｃｋは、挿入断片のない形質転換アデノウイルスの活性を示す。
【図８】図８は、ＰＩＤ７およびＰＩＤ１４における封入体形成単位を示す図である。
【図９】図９は、ＰＩＤ４９における卵管水腫のスコアを示す図である。
【図１０】図１０は、クラミジア・トラコマチスのタンパク質に対するＴ細胞の応答を示す図である（図１０ａ〜１０ｉ）。タンパク質を、１０人の患者（黒丸）および５人の対照（四角）において試験した。Ｃ、抗原を含有しない細胞培地。平均ならびに７５および２５パーセンタイルを示す。
【図１１】図１１は、５人以上の患者が全対照を超えるＩＦＮγのレベルで応答したクラミジア・トラコマチスのタンパク質に対するＴ細胞の応答を示す図である。タンパク質を、１０人の患者（黒丸）および５人の対照（四角）において試験した。Ｃ、抗原を含有しない細胞培地。平均ならびに７５および２５パーセンタイルを示す。
【図１２】図１２は、最後の免疫化の１週間後の血液リンパ球による抗原特異的応答を示す棒グラフである。ＩＦＮγ応答を、１０匹の動物からプールした細胞培地中で測定した。各棒は、三連の値の平均値±標準偏差を示す。
【図１３】図１３は、Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマウスにおける感染７、１４および２１日後の封入体形成単位を示す図である。値は、ｌｏｇ１０  ＩＦＵ／ｍｌで示す。値はすべて、１０匹の動物の平均値±平均値の標準誤差を示す。
【図１４】図１４は、ＥＬＩＳＡ法によって、ＯＤ＝１．０における希釈度として測定した免疫原に対する血清の反応性を示す図である。各点は、４匹の動物の平均値±平均値の標準誤差を示す。
【図１５】図１５は、C. muridarum（ＭｏＰｎのＥＢ）またはクラミジア・トラコマチス（血清型ＤのＥＢ）の基本小体の可溶化液全体に対する特異的な血清の反応性を示す図である。陽性を、赤の点で示す。理論的な大きさと一致する大きさのバンドを、陽性とする。
【図１６】図１６は、最後の免疫化の３週間後の脾細胞による抗原特異的応答を示す。ＩＦＮγの応答を、４匹の個別の動物の細胞培地中で測定した。各棒は、三連の値の平均値±標準偏差を示す。
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】図面
【訂正対象項目名】図８−１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図８−１】
2008520550.tif 000011
【誤訳訂正４】
【訂正対象書類名】図面
【訂正対象項目名】図８−２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図８−２】
2008520550.tif 000012
【誤訳訂正５】
【訂正対象書類名】図面
【訂正対象項目名】図９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図９】
2008520550.tif 000013
【誤訳訂正６】
【訂正対象書類名】図面
【訂正対象項目名】図１１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図１１】
2008520550.tif 000014
【誤訳訂正７】
【訂正対象書類名】図面
【訂正対象項目名】図１４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図１４】
2008520550.tif 000015
【誤訳訂正８】
【訂正対象書類名】図面
【訂正対象項目名】図１５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図１５】
2008520550.tif 000016
【誤訳訂正９】
【訂正対象書類名】図面
【訂正対象項目名】図１６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図１６】
2008520550.tif 000017