【手続補正書】
【提出日】平成26年2月17日(2014.2.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２２】
定性発現シグネチャーを感受性または耐性のバイナリ形式の結果に変換するために、同じ薬剤に曝した感受性菌株のそれからのサンプルの転写プロファイルの平均二乗距離（ＭＳＤ）を計算するためのアルゴリズムを開発した。薬剤感受性実験におけるＭＳＤ測定基準は以下のように計算した：
１．サンプル量の変動を、加工していない値（raw value）をサンプル中の全ての関連プローブについてのカウントの平均数に標準することによって補正する。
２．本発明者らがＰｊと示す一群のＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ（商標）プローブを選択する。下付き文字ｊは１から、選択したプローブの合計数Ｎｐｒｏｂｅｓの範囲である。この分析は薬剤感受性分離株と薬剤耐性分離株の間で差次的に変化したプローブに限られる。
３．薬剤感受性菌株の複製はＮｓａｍｐとして定義する。それぞれの複製に関して、薬剤処理前後のそれぞれのプローブＰｊに関する標準化カウントは
【数１】
2013520206.tif 000001
または
【数２】
2013520206.tif 000002
で示し、ｉはサンプルインデックスを表す。
４．「対数誘導比」を次に算定する：
【数３】
2013520206.tif 000003
このように比を対数変換することによって、いずれか１つのプローブが計算したＭＳＤを占めるのを妨げる。
５．薬剤感受性サンプルの平均誘導比、
【数４】
2013520206.tif 000004
は、異なる生物学的複製を合計してサンプルの数を標準化することによって計算する：
【数５】
2013520206.tif 000005
６．ＭＳＤを、（インデックスｉの）薬剤感受性菌株の複製それぞれに関して次いで計算する、これは全ての薬剤感受性サンプルの平均挙動からサンプルがどの程度異なるかを反映する数である：
【数６】
2013520206.tif 000006
７．耐性菌株に関する誘導比、
【数７−１】
2013520206.tif 000007
は感受性菌株のそれと同様に計算する：
【数７−２】
2013520206.tif 000008
８．薬剤耐性菌株に関するＭＳＤを、薬剤感受性集団の中心と比較して計算する：
【数８】
2013520206.tif 000009
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２３】
大部分の感受性菌株は平均的感受性菌株と同様に挙動するので、
【数９】
2013520206.tif 000010
の典型的な値は、耐性菌株に関する典型的な値
【数１０】
2013520206.tif 000011
と比較して小さい。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２４】
最後に、測定したＭＳＤ値の統計的有意性を割り当てた。
【数１１】
2013520206.tif 000012
の値は平均からの偶発偏差数（random deviation）の合計であるので、それらは正規分布、中心極限定理の結果と非常に似ている。したがって、薬剤感受性集団に対する所与のサンプルからの標準偏差数を反映するｚスコアをそれぞれのサンプルに関して算定した：
【数１２】
2013520206.tif 000013
ここで、標準偏差および平均は以下のように定義する：
【数１３】
2013520206.tif 000014
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２７】
Ｐｊと示される一群のＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ（商標）プローブを記載したように選択する。下付き文字ｊは１から、選択したプローブの合計数Ｎｐｒｏｂｅｓの範囲である。
【数１４−１】
2013520206.tif 000015
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２８】
生物同定は擬似または異なる生物と比較して転写産物を検出する能力に依存するので、対象の生物なしで調製したサンプル中のバックグラウンドレベルのＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ（商標）カウントをしたがって使用して対照中心を定義した。これらの対照サンプルの中心
【数１４−２】
2013520206.tif 000016
は、異なる生物学的複製を合計してサンプルの数を標準化することによって計算する：
【数１５】
2013520206.tif 000017
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２９】
ＭＳＤを、（インデックスｉの）実験サンプルの平均技術反復に関して次いで計算する、これは全ての対照サンプルの平均挙動からサンプルがどの程度異なるかを反映する数である：
【数１６】
2013520206.tif 000018
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３０】
最後に、測定したＭＳＤ値の統計的有意性を割り当てた。
【数１７】
2013520206.tif 000019
の値は平均からの偶発偏差数の合計であるので、それらは正規分布、中心極限定理の結果と非常に似ている。したがって本発明者らは、対照集団に対する所与のサンプルからの標準偏差数を反映するｚスコアをそれぞれのサンプルに関して算定した：
【数１８】
2013520206.tif 000020
ここで、標準偏差および平均は以下のように定義する：
【数１９】
2013520206.tif 000021
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３８】
他の実施形態
本発明は、その詳細な説明と共に記載されているが、前述の説明は、添付の特許請求の範囲の範囲によって定義される本発明の範囲を制限するわけでなく、それを例示することを目的とすることは理解されよう。他の態様、利点、および改変は、以下の特許請求の範囲内にある。
本発明は、以下の態様を包含する。
［１］
病原体の薬剤感受性を決定する方法であって、
病原体を含むサンプルを提供するステップ；
サンプルと１つまたは複数の試験化合物を接触させて試験サンプルを提供するステップ；
病原体から試験サンプル中にメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）が放出される条件下で試験サンプルを処理するステップ；
複数のプローブのサブセットを含む複数の核酸プローブに試験サンプルを曝すステップであって、それぞれのサブセットが、耐性がある生物と比較して試験化合物に感受性がある生物中で差次的に発現される標的ｍＲＮＡと特異的に結合する１つまたは複数のプローブを含み、プローブと標的ｍＲＮＡの間の結合が起こり得る時間および条件下で曝露が起こる、ステップ；
プローブと標的ｍＲＮＡの間の結合のレベルを決定し、それによって標的ｍＲＮＡのレベルを決定するステップ；および
試験化合物の存在下で標的ｍＲＮＡのレベルと参照レベルを比較するステップであって、標的ｍＲＮＡの参照レベルと比較した標的ｍＲＮＡのレベルの違いが、病原体が試験化合物に対して感受性であるか、または耐性であるかを示すステップ
を含む、方法。
［２］
試験化合物が病原体に対する既知の治療または潜在的な治療である、上記［１］に記載の方法。
［３］
方法が、サンプルを２つ以上の試験化合物と接触させるステップを含む、上記［１］に記載の方法。
［４］
サンプルを４時間未満１つまたは複数の試験化合物と接触させる、上記［１］に記載の方法。
［５］
感染性疾患の病原体を同定する方法であって、
病原体に感染している疑いがある被験体から試験サンプルを提供するステップ；
メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）が放出される条件下で試験サンプルを処理するステップ；
複数のプローブのサブセットを含む複数の核酸プローブに試験サンプルを曝すステップであって、それぞれのサブセットが病原体を独自に同定する標的ｍＲＮＡと特異的に結合する１つまたは複数のプローブを含み、プローブと標的ｍＲＮＡの間の結合が起こり得る時間および条件下で曝露が起こるステップ；および
プローブと標的ｍＲＮＡの間の結合のレベルを決定し、それによって標的ｍＲＮＡのレベルを決定するステップ
を含み、
参照サンプルと比較した試験サンプルの標的ｍＲＮＡの増大が試験サンプル中の病原体のアイデンティティーを示す、方法。
［６］
試験サンプルが、痰、血液、尿、大便、関節液、脳脊髄液、および子宮頸部／膣スワブからなる群から選択される、上記［１］または［５］に記載の方法。
［７］
試験サンプルが複数の異なる感染性疾患の病原体または非病原性生物を含む、上記［１］または［５］に記載の方法。
［８］
１つまたは複数の核酸プローブが表２から選択される、上記［１］または［５］に記載の方法。
［９］
病原体が細菌、真菌、ウイルス、または寄生虫である、上記［１］または［５］に記載の方法。
［１０］
病原体が結核菌（Mycobacterium tuberculosis）である、上記［１］または［５］に記載の方法。
［１１］
プローブとの接触前にｍＲＮＡが粗製状態である、上記［１］または［５］に記載の方法。
［１２］
方法が、ｍＲＮＡを増殖するステップを含まない、上記［１］または［５］に記載の方法。
［１３］
方法が、酵素的、化学的、または機械的に細胞を溶解するステップを含む、上記［１］または［５］に記載の方法。
［１４］
方法が、マイクロ流体デバイスの使用を含む、上記［１］または［５］に記載の方法。
［１５］
方法が、病原体感染をモニタリングするために使用される、上記［１］または［５］に記載の方法。
［１６］
病原体が被験体からのサンプル中に存在する、上記［１］に記載の方法。
［１７］
被験体がヒトである、上記［５］または［１６］に記載の方法。
［１８］
被験体用の治療を決定または選択するステップ、および、必要に応じて、被験体に治療を施すステップをさらに含む、上記［５］または［１６］に記載の方法。
［１９］
被験体用の治療を選択する方法であって、
病原体に感染している疑いがある被験体から試験サンプルを提供するステップ；
メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）が放出される条件下で試験サンプルを処理するステップ；
複数のプローブのサブセットを含む複数の核酸プローブに試験サンプルを曝すステップであって、それぞれのサブセットが病原体を独自に同定する標的ｍＲＮＡと特異的に結合する１つまたは複数のプローブを含み、プローブと標的ｍＲＮＡの間の結合が起こり得る時間および条件下で曝露が起こるステップ；および
プローブと標的ｍＲＮＡ間の結合のレベルを決定し、それによって標的ｍＲＮＡのレベルを決定するステップ
を含み、参照サンプルと比較した試験サンプルの標的ｍＲＮＡの増大が試験サンプル中の病原体のアイデンティティーを示す方法において、必要に応じて、被験体からのサンプル中の病原体を同定するステップと、
上記［１］に記載の方法を使用して病原体の薬剤感受性を決定するステップと、
病原体が感受性のある薬剤を、被験体を治療する際に使用するために選択するステップと
を含む、方法。
［２０］
被験体における病原体による感染をモニタリングするための方法であって、
第一の時点に、病原体を含む第一のサンプルを得るステップ；
上記［１］に記載の方法を使用して第一のサンプル中の病原体の薬剤感受性を決定するステップ；
必要に応じて、病原体が感受性のある治療を選択するステップ、および、選択した治療を被験体に施すステップ；
第二の時点に、病原体を含む第二のサンプルを得るステップ；
上記［１］に記載の方法を使用して第二のサンプル中の病原体の薬剤感受性を決定するステップ；および
第一のサンプル中の病原体の薬剤感受性と第二のサンプル中の病原体の薬剤感受性を比較し、それによって被験体における感染をモニタリングするステップ
を含む、方法。
［２１］
被験体が免疫無防備状態である、上記［２０］に記載の方法。
［２２］
方法が、病原体が感受性のある治療を選択するステップ、および、選択した治療を被験体に施すステップ、ならびに、上記［１］に記載の方法を使用して選択した治療に対する、第二のサンプル中の病原体の薬剤感受性を決定するステップを含み、病原体の薬剤感受性の変化が、病原体が治療に耐性があるか、または治療に耐性がある状態になりつつあるかを示す、上記［２０］に記載の方法。
［２３］
病原体の薬剤感受性の変化が、病原体が治療に耐性があるまたは治療に耐性がある状態になりつつあることを示し、前記方法が、被験体に異なる治療を施すステップをさらに含む、上記［２０］に記載の方法。
［２４］
被験体の集団内における病原体による感染をモニタリングする方法であって、
第一の時点に、集団内の被験体から第一の複数のサンプルを得るステップと、
病原体に感染している疑いがある被験体から試験サンプルを提供するステップ；
メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）が放出される条件下で試験サンプルを処理するステップ；
複数のプローブのサブセットを含む複数の核酸プローブに試験サンプルを曝すステップであって、それぞれのサブセットが病原体を独自に同定する標的ｍＲＮＡと特異的に結合する１つまたは複数のプローブを含み、プローブと標的ｍＲＮＡの間の結合が起こり得る時間および条件下で曝露が起こるステップ；および
プローブと標的ｍＲＮＡの間の結合のレベルを決定し、それによって標的ｍＲＮＡのレベルを決定するステップ
を含み、ここで、参照サンプルと比較した試験サンプルの標的ｍＲＮＡの増大が試験サンプル中の病原体のアイデンティティーを示す方法において、上記［１］に記載の方法を使用して第一の複数のサンプルにおける病原体の薬剤感受性を決定するステップ、および、必要に応じて、第一の複数のサンプルにおける感染性疾患の病原体を同定するステップと、
必要に応じて、被験体に治療を施すステップと、
第二の時点に、集団内の被験体から第二の複数のサンプルを得るステップと、
病原体に感染している疑いがある被験体からの試験サンプルを提供するステップ；
メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）が放出される条件下で試験サンプルを処理するステップ；
複数のプローブのサブセットを含む複数の核酸プローブに試験サンプルを曝すステップであって、それぞれのサブセットが病原体を独自に同定する標的ｍＲＮＡと特異的に結合する１つまたは複数のプローブを含み、プローブと標的ｍＲＮＡの間の結合が起こり得る時間および条件下で曝露が起こるステップ；および
プローブと標的ｍＲＮＡの間の結合のレベルを決定し、それによって標的ｍＲＮＡのレベルを決定するステップ
を含み、ここで、参照サンプルと比較した試験サンプルの標的ｍＲＮＡの増大が試験サンプル中の病原体のアイデンティティーを示す方法において、上記［１］に記載の方法を使用して第二の複数のサンプルにおける病原体の薬剤感受性を決定するステップ、および、必要に応じて、第一の複数のサンプル中の感染性疾患の病原体を同定するステップと、
第一の複数のサンプルおよび第二の複数のサンプルにおける、病原体の薬剤感受性および必要に応じて病原体のアイデンティティーを比較し、それによって被験体の集団内の感染をモニタリングするステップと
を含む方法。
［２５］
固形支持体と結合した複数のポリヌクレオチドであって、少なくとも１つのポリヌクレオチドを含み、それぞれのポリヌクレオチドが表２から選択される１つまたは複数の遺伝子と選択的にハイブリダイズする、複数のポリヌクレオチド。
［２６］
配列番号１〜２２７またはそれらの任意の組合せを含む、上記［２５］に記載の複数のポリヌクレオチド。