(57)【要約】【課題】ＤＮＡやＲＮＡ等の塩基配列において、ＳＮＰ（一塩基変異）等における微小な配列変異を迅速且つ高感度に検出方法を提供することを目的とする。【解決手段】一本鎖ＤＮＡ分解酵素を利用した塩基配列における変異の検出法であって、（１）電極に固着させたプローブと、サンプル核酸との間でハイブリダイゼーションを行う工程と、（２）前記ハイブリダイゼーションにより形成した二本鎖ＤＮＡのみが残存するように、一本鎖ＤＮＡ分解酵素による分解工程と、（３）前記二本鎖ＤＮＡに対してインターカレータで処理する第一の処理工程と、（４）電流を測定する第一の測定工程と、（５）前記二本鎖ＤＮＡを一本鎖へ変性させるように、変性及び洗浄する工程と、（６）前記工程（３）と同じインターカレータ溶液で処理する第二の処理工程と、（７）電流を測定する第二の測定工程と、を備える検出法を開示する。【選択図】　　　図９
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
一本鎖ＤＮＡ分解酵素を利用した塩基配列における変異の検出法であって、
（１）　電極に固着させたプローブと、サンプル核酸と、の間でハイブリダイゼーションを行う工程と、
（２）　前記ハイブリダイゼーションにより形成した二本鎖ＤＮＡのみが残存するように、一本鎖ＤＮＡ分解酵素による分解工程と、
（３）　前記二本鎖ＤＮＡに対してインターカレータで処理する第一の処理工程と、
（４）　電流を測定する第一の測定工程と、
（５）　前記二本鎖ＤＮＡを一本鎖へ変性させるように、変性及び洗浄する工程と、
（６）　前記工程（３）と同じインターカレータ溶液で処理する第二の処理工程と、
（７）　電流を測定する第二の測定工程と、
を備える検出法。
【請求項２】
前記第一の測定工程で得られる電流値をＩ１とし、前記第二の測定工程で得られる電流値をＩ２とすると、前記Ｉ１及びＩ２の電流値の比較からインターカレータの取込み率を算出して、一塩基変異の有無を検出する検出工程をさらに備える請求項１に記載の検出法。
【請求項３】
前記検出工程は、
ΔＩ　＝　［（Ｉ１　−　Ｉ２）／Ｉ２］＊１００
により実行される請求項２に記載の検出法。
【請求項４】
前記プローブは電極固着部を有する請求項１に記載の検出法。
【請求項５】
前記電極固着部は前記電極の表面との反応により結合し得る請求項４に記載の検出法。
【請求項６】
前記電極は少なくとも表面が金から構成され、前記電極固着部はメルカプト基を含む請求項４又は５に記載の検出法。
【請求項７】
前記電極は少なくともその表面がアビジン又はストレプトアビジンからなり、前記電極固着部はビオチン残基を含む、請求項５又は６に記載の検出法。
【請求項８】
前記電極は少なくともその表面がカルボキシル基を有し、前記電極固着部はアミノ基を含む、請求項４又は５に記載の検出法。
【請求項９】
前記プローブはオリゴヌクレオチド部と前記電極固着部との間にリンカー部を有する請求項４に記載の検出法。
【請求項１０】
前記リンカー部は炭素数６〜６０を有する炭化水素鎖である請求項９に記載の検出法。
【請求項１１】
前記工程（１）の後に、溶媒による洗浄工程を、さらに備える請求項１に記載の検出法。
【請求項１２】
請求項１ないし１１の何れか一項に記載の検出法を実行する検出装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、核酸の塩基配列検出法に係り、より詳細には、ＤＮＡやＲＮＡ等の塩基配列の特定位置にある塩基種の変異を見つけ出し、ＳＮＰ（一塩基変異）における微小な配列変異を迅速に検出する技術に関する。
【０００２】
【従来の技術】
現在までに利用されているＤＮＡの塩基配列の変異を定量する方法の代表的な方法としては、ＳＳＣＰ法やＤＮＡシーケンシング等が知られている。
【０００３】
ＳＳＣＰ法は、１９８９年にＯｒｉｔａ　Ｍ．等が開発した方法であり、一本鎖ＤＮＡが塩基配列に依存した高次構造（Ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄ　ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）を利用した多型解析手法の一つであって、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により移動度の差として検出する方法である。ＰＣＲで増幅させたＤＮＡ断片を多用するため、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法とも称呼される。
【０００４】
しかし、この手法は、電気泳動法を用いるため、定量分析に不向きであり、また、一度に多量のサンプル核酸を迅速に解析することは困難である。
【０００５】
また、ＤＮＡシーケンシングは、その種類が数種あることが知られているが、基礎となる一つの方法は、１９７５年に開発されたサンガー法である。このサンガー法は、以下のようにして実行される方法である。
【０００６】
すなわち、検査対象のＤＮＡ断片を一本鎖とし、調査したい部位の５’側上流の塩基配列を認識し、蛍光標識したプライマーと、４種類（塩基としてのアデニン・チミン・グアニン・シトシンを有する）のデオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰ）と、１種類のダイデオキシヌクレオチド（ｄｄＮＴＰ）との存在下で、ＤＮＡポリメラーゼによって相補鎖を伸長させる。このとき、ＤＮＡの構成要素であるｄＮＴＰを取り込んだ場合には、次々にＤＮＡの伸長が進行する。
【０００７】
一方、ｄｄＮＴＰを取り込んだ場合には、予めヌクレオチドとの結合部位に水酸基が付加されていて重合反応が阻害されるため、ＤＮＡはそれ以上伸長することができない。これにより、特定の塩基を末端に有する複数のＤＮＡ断片が生成する。この方法においては、４種類のｄｄＮＴＰを用いて４つのサンプルを作製し、電気泳動を行い得られるＤＮＡバンドを順に読んでいくことで、塩基配列を解析することが可能となる。
【０００８】
しかしながら、本方法では、ＤＮＡ断片の広範囲の塩基配列を分析したい場合には適するが、特定の部位の変異のみを検査したい場合には、簡便さに欠ける。
【０００９】
さらに、近年、特開平１１−１０３８９４号公報や特開平７−４７０００号公報等において、ｄｄＮＴＰを利用した、ＤＮＡの変異を検出する方法が提案されている。
【００１０】
しかし、上記公報に記載された方法では、塩基配列の微小変異まで検出することが困難であるという問題がある。また、同一サンプル内における複数の塩基配列における変異について、一度の操作では検出できなく、検出効率は低いという問題も指摘されている。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、本発明は上記事情に鑑み、ＤＮＡやＲＮＡ等の塩基配列において、ＳＮＰ（一塩基変異）等における微小な配列変異を迅速且つ高感度に検出方法及び検出装置を提供することを目的とする。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
上記目的は、一本鎖ＤＮＡ分解酵素を利用した塩基配列における変異の検出法であって、（１）電極に固着させたプローブと、サンプル核酸と、の間でハイブリダイゼーションを行う工程と、（２）前記ハイブリダイゼーションにより形成した二本鎖ＤＮＡのみが残存するように、一本鎖ＤＮＡ分解酵素による分解工程と、（３）前記二本鎖ＤＮＡに対してインターカレータで処理する第一の処理工程と、（４）電流を測定する第一の測定工程と、（５）前記二本鎖ＤＮＡを一本鎖へ変性させるように、変性及び洗浄する工程と、（６）前記工程（３）と同じインターカレータ溶液で処理する第二の処理工程と、（７）電流を測定する第二の測定工程と、を備える検出法により達成される。
【００１３】
本発明の好ましい態様によれば、前記検出法において、前記第一の測定工程で得られる電流値をＩ１とし、前記第二の測定工程で得られる電流値をＩ２とすると、前記Ｉ１及びＩ２の電流値の比較からインターカレータの取込み率を算出して一塩基変異の有無を検出する検出工程をさらに備えることを特徴とする。
【００１４】
本発明の好ましい態様によれば、前記検出法において、前記検出工程は、
ΔＩ　＝　［（Ｉ１　−　Ｉ２）／Ｉ２］＊１００
により実行されることを特徴とする。
【００１５】
本発明の好ましい態様によれば、前記検出法において、前記電極はその表面が少なくとも金であり、該金は電極固着部を介して前記プローブを備えることを特徴とする。
【００１６】
本発明の好ましい態様によれば、前記検出法において、前記プローブは電極固着部を有することを特徴とする。
【００１７】
本発明の好ましい態様によれば、前記検出法において、前記電極固着部は前記電極の表面との反応により結合し得ることを特徴とする。
【００１８】
本発明の好ましい態様によれば、前記検出法において、前記電極は少なくとも表面が金から構成され、前記電極固着部はメルカプト基を含むことを特徴とする。
【００１９】
本発明の好ましい態様によれば、前記検出法において、前記電極は少なくともその表面がアビジン又はストレプトアビジンからなり、前記電極固着部はビオチン残基を含むことを特徴とする。
【００２０】
本発明の好ましい態様によれば、前記電極は少なくともその表面がカルボキシル基を有し、前記電極固着部はアミノ基を含むことを特徴とする。
【００２１】
本発明の好ましい態様によれば、前記検出法において、前記プローブはオリゴヌクレオチド部と前記電極固着部との間にリンカー部を有することを特徴とする。
【００２２】
本発明の好ましい態様によれば、前記検出法において、前記リンカー部は炭素数６〜６０を有する炭化水素鎖であることを特徴とする。
【００２３】
本発明の好ましい態様によれば、前記検出法において、前記工程（１）の後に、溶媒による洗浄工程を、さらに備えることを特徴とする。
【００２４】
また、上記目的は、前述の検出法を実行する検出装置により達成される。
【００２５】
【発明の実施の形態】
以下、本発明による微小な塩基配列変異の検出法を、その好ましい実施形態に基づいて説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２６】
なお、本発明で用いる用語「微小な塩基配列変異」とは、一塩基置換変異体のみならず、二塩基置換体以上の変異体や、塩基の脱離や挿入した配列変異を含むものである。
【００２７】
［塩基変異の検出法］
本発明による塩基配列における変異の検出法は、一本鎖ＤＮＡ分解酵素を利用した塩基配列における変異の検出法であって、
（１）　電極に固着させたプローブと、サンプル核酸と、の間でハイブリダイゼーションを行う工程と、
（２）　前記ハイブリダイゼーションにより形成した二本鎖ＤＮＡが残存するように、一本鎖ＤＮＡ分解酵素により前記プローブとハイブリダイズしない未反応サンプル核酸を分解する工程と、
（３）　前記二本鎖ＤＮＡに対してインターカレータで処理する第一の処理工程と、
（４）　電流を測定する第一の測定工程と、
（５）　前記二本鎖ＤＮＡを一本鎖へ変性させるように、変性及び洗浄する工程と、
（６）　前記工程（３）と同じインターカレータ溶液で処理する第二の処理工程と、
（７）　電流を測定する第二の測定工程と、
（８）　前記第一の測定工程で得られる電流値をＩ１とし、前記第二の測定工程で得られる電流値をＩ２とすると、前記Ｉ１及びＩ２の電流値の比較から前記インターカレータの取込み率を算出して、一塩基変異の有無を検出する検出工程と、を備える検出法である。
【００２８】
図１は、本発明による塩基配列における変異の検出法を説明する工程図である。以下の説明では、前記（１）の工程を第一工程と、前記（２）の工程を第二工程と、前記（３）の工程を第三工程と、前記（４）の工程を第四工程と、前記（５）の工程を第五工程と、前記（６）の工程を第六工程と、前記（７）の工程を第七工程と、前記（８）の工程を第八工程という。
【００２９】
以下、各工程毎に詳細に説明する。
【００３０】
（第一工程）
本発明による第一工程は、電極固着部を通じて電極に固着させたプローブと、サンプル核酸との間でハイブリダイゼーションを行う工程である。
【００３１】
電極に固着させるプローブは、塩基配列に変異を有するの核酸の当該変異部分の３’末端側（上流側）に隣接する塩基配列（変異部分より一塩基上流部の塩基配列）に対し、該塩基配列それぞれと相補的なオリゴヌクレオチドである。
【００３２】
ここで、塩基配列に変異を有する核酸（以下、「サンプル核酸」という。）の当該変異部分とは、本発明による検出法により被検出対象、つまり標的となる部分である。この変異部分は、ＳＮＰ（一塩基変異）等の塩基配列の変異として、核酸中の特定位置に存する。
【００３３】
サンプル核酸の例としては、塩基配列に変異を有するＤＮＡやＲＮＡ等が挙げられる。
【００３４】
本発明に利用されるプローブのオリゴヌクレオチド部は、その目的の認識部位を特異的に認識できるだけの配列長の範囲内で適宜選択可能であるが、その配列長は、以下の配列長の限定されるわけではないが、特異的に認識できる観点から、１０〜１００の塩基であることが望ましい。
【００３５】
本発明では、１３〜２５塩基が特定に塩基配列部位を認識するのに適した塩基配列にプローブを利用する。そして、変異が予想される箇所を中心に、±１塩基になるように設定するが、これに限定されるわけではなく、目的部位を特異的認識可能であればよい。
【００３６】
図２は、本発明に適用されるプローブの概略図である。図２（Ａ）に示すように、本発明のプローブは、電極固着部であるメルカプト基により修飾されたオリゴヌクレオチドであって、前記メルカプト基を介して電極に固着可能なプローブを利用することができる。そして、後述する理由から、リンカーとして、炭素数が６〜６０の炭化水素鎖を介して前記メルカプト基と前記オリゴヌクレオチド部とが結合していることが好ましい。
【００３７】
リンカーの炭素数が６以下では、前記オリゴヌクレオチド部と電極との距離が近くなり、サンプル核酸との間のハイブリダイゼーションを妨げ、さらに電極が後述する一本鎖核酸分解酵素反応の阻害要因となる。一方、リンカーの炭素数が６０以上では、ハイブリダイゼーションにより形成した二本鎖核酸に作用するインターカレータと電極との距離が長くなり、検出感度が低下するおそれがある。
【００３８】
本発明に利用されるプローブを固着させるための電極は、プローブにおける電極固着部が反応により結合し得るものを用いることが好ましい。具体的には、電極と電極固着部との好ましい組合せを、以下の▲１▼〜▲３▼に例示する。
【００３９】
▲１▼　少なくとも表面が金から構成される電極と、メルカプト基（−ＳＨ）である電極固着部との組合せ
▲２▼　少なくとも表面がアビジン又はストレプトアビジンから構成される電極と、ビオジン残基を含む電極固着部との組合せ
▲３▼　少なくとも表面がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）を有する電極と、アミノ基（−ＮＨ２）を含む電極固着部との組合せ
を挙げることができる。
【００４０】
少なくとも表面が金から構成される電極の具体例としては、電極全体が金からなる金電極や、金以外の材質からなる基材の表面周囲を金でめっきしたものや、金の蒸着法等により製造された基材が挙げられる。
【００４１】
また、少なくとも表面がアビジン又はストレプトアビジンからなるものや、カルボキシル基を有する電極の具体例としては、電極の表面周囲を、アビジン又はストレプトアビジンや、カルボキシル基を有する樹脂等によって被覆した電極等が挙げられる。
【００４２】
なお、かかる電極は、必要に応じて、予めアルカリや酸等により洗浄してから用いられることが好ましい。
【００４３】
プローブの固着化処理は、例えば、電極を、一定条件下にて、濃度が好ましくは１０ｐｍｏｌ／μＬ以下の前記プローブを含む溶液に浸漬する等により行われる。その後、必要に応じて、プローブを固着化させた電極をホルムアミド等の変性剤溶液や、３０℃以上のＨ２ＯやＳＳＣ（塩化ナトリウムとクエン酸ナトリウムを混合した緩衝溶液）等に浸漬させて、非特異的結合オリゴヌクレオチドを除去、洗浄することが好ましい。
【００４４】
図２（Ｂ）に示すように、本発明に利用されるプローブを、一の電極に対して一のプローブが対応するように配設させ、このようにして得られた電極を複数個用いることにより、多くの塩基種を同時に検出することが可能となる。
【００４５】
前述のように調整した電極に固着させたプローブを用いて、該プローブとサンプル核酸との間でハイブリダイゼーションを行う。本ハイブリダイゼーション反応は、該反応に適したバッファーで行うことが好ましい。例えば、ＳＳＣ（塩化ナトリウムとクエン酸ナトリウムを混合した緩衝溶液）を挙げることができる。
【００４６】
図３は、かかるハイブリダイゼーションにより得られる二本鎖ＤＮＡの模式図である。図３に示すように、サンプルＤＮＡと、該サンプルＤＮＡの塩基配列と相補配列を有するプローブ部位と、の間で二本鎖ＤＮＡが形成される。
【００４７】
しかるの後に、サンプルＤＮＡとプローブとハイブリダイズしなかった分子群を除去するために、前述の２ＸＳＳＣ等により洗浄することが望ましい。
【００４８】
（第二工程）
第二工程では、第一工程で形成された二本鎖ＤＮＡのみを残存させる工程である。前述の第一工程において、全てのサンプルＤＮＡが二本鎖ＤＮＡを形成しているとは、必ずしも言えない。プローブＤＮＡとハイブリダイズできなかったサンプルＤＮＡは、後述するインターカレータの電気化学特性を不安定化し、特に、微小な塩基配列の変異の検出を妨げるものと考えられる。
【００４９】
通例、サンプル核酸の長さの方がプローブＤＮＡよりも長く、必然的にプローブＤＮＡと二本鎖を形成し得ない一本鎖ＤＮＡ部位が、サンプル核酸には相当量存在する。第一工程後に、２ｘＳＳＣにより洗浄を行っているとはいえ、電極表面に未反応サンプルに残存する可能性はある。この一本鎖ＤＮＡ部位や未反応ＤＮＡは、後程のインターカレータと静電気的に作用する傾向があるため、第二工程において一本鎖ＤＮＡの影響を排除する必要がある。
【００５０】
そのため、本発明では、一本鎖ＤＮＡ分解酵素（以下、「Ｓ１ヌクレアーゼ」という。）により、電極表面の近傍に残存した一本鎖ＤＮＡや、プローブと二本鎖ＤＮＡを形成することができなかったサンプル核酸の一本鎖部を選択的に分解させる（図４参照）。
【００５１】
かかるＳ１ヌクレアーゼの作用により、検出感度の向上が図られ、本発明が目的とする微小な塩基配列の変異の検出を可能とする。
【００５２】
具体的な一本鎖ＤＮＡ分解酵素の具体例としては、先のＳ１ヌクレアーゼ以外に、マングビーン（Ｍｕｎｇ　Ｂｅａｎ）やＢＡＬ　３ｌヌクレアーゼを挙げることができる。
【００５３】
第二工程におけるＳ１ヌクレアーゼの濃度は、０．１〜１０ユニット／μＬであることが好ましく、分解温度は３６．５〜３７．５℃であることが好ましい。
【００５４】
また、Ｓ１ヌクレアーゼ以外の一本鎖ＤＮＡ分解酵素を利用する場合には、各酵素の性質の応じた濃度及び温度を、適宜選択することが可能であることは、当業者には理解できる。
【００５５】
（第三工程）
本発明の第三工程は、先述の第一工程により形成された二本鎖ＤＮＡに対してインターカレータによる処理を行う工程である。当該工程により二本鎖の層間にインターカレータが侵入し、一種の電荷移動錯体が形成されるため、後行の電気化学的検出に利用される。
【００５６】
本発明で用いられる用語「インターカレータ」とは、二本鎖の二重螺旋の塩基対間に入り込むリガンド（配位子）のことをいう。
【００５７】
本発明に用いられるインタカレータ１０としては、フェロセン、カテコールアミン、金属ビピリジン錯体、金属フェナンスリン錯体、ビオローゲン、またはこれら化合物を導入した、いわゆる縫い込み型インターカレータを有効成分とするものが挙げられる。特に好ましくは、フェロセン縫い込み型インターカレータである。
【００５８】
くわえて、エチジュウム、エチジュウムブロマイド、アクリジン、アミノアクリジン、アクリジンオレンジ、プロフラビン、エリブチジン、アクチノマイシンＤ，ドーノマイシン、マイトマイシンＣ，トリス（フェナントロリン）亜鉛錯体、トリス（フェナントロリン）ルテニウム錯体、トリス（フェナントロリン）コバルト錯体、ジ（フェナントロリン）亜鉛錯体、ジ（フェナントロリン）ルテニウム錯体、ジ（フェナントロリン）コバルト錯体、ビピリジンプラチナ錯体、ターピリジンプラチナ錯体、フェナントロリンプラチナ錯体、トリス（ビピリジン）亜鉛錯体、トリス（ビピリジル）ルテニウム錯体、トリス（ビピリジル）亜鉛錯体、トリス（ビピリジル）ルテニウム錯体、トリス（ビピリジル）コバルト錯体、ジ（ビピリジル）亜鉛錯体、ジ（ビピリジル）ルテニウム錯体、ジ（ビピリジル）コバルト錯体を有効成分としてもよい。
【００５９】
インターカレータによる処理は、一定ｐＨ下で、前記インターカレータを含むバッファー溶液に浸漬する等により行われる。
【００６０】
本発明の第三工程におけるインターカレータの処理濃度は、数ｎＭ〜数ｍＭオーダの濃度範囲で用いられる。好ましくは、１０μＭ〜１ｍＭであり、より好ましくは０．０５ｍＭである。
【００６１】
図５は、本発明による検出法の第三工程により二本鎖の層間に侵入したインターカレータと二本鎖ＤＮＡの模式図を示す。図５（Ａ）は、いわゆるフルマッチ状態の二本鎖の模式図であり、プローブの塩基配列がサンプルＤＮＡのそれと完全に相補的な関係にあり、二本鎖の層間にインターカレータが侵入した状態を模式的に示す。
【００６２】
一方、図５（Ｂ）は、いわゆるミスマッチ状態の二本鎖の模式図である。プローブの塩基配列がサンプルＤＮＡのそれと一部の領域（図５（Ｂ）に示すミスマッチ領域）にて完全な相補的関係を有しないために、インターカレータが侵入することが出来なったものを示す。そのため、一箇所にて塩基配列に変異が発生した場合でも、本発明によるインターカレータと、後述する電気化学的検出法との組合せにより、微小な塩基配列変異を検出することが可能となる。
【００６３】
本発明で利用する用語「フルマッチ」とは、二本鎖を形成したＤＮＡの塩基対が完全に相補的である状態をいい、本発明で利用する用語「ミスマッチ」とは、二本鎖を形成したＤＮＡの塩基対に、相補的な関係にない塩基対は一つ以上存在する状態をいう。
【００６４】
（第四工程）
第四工程においては、インターカレータによる二本鎖へのインターカレーションをを電気化学的に検出する工程である。
【００６５】
電気化学的検出法の具体例は、インターカレータにより電極に流れる電流値が変化し、この電流値は二本鎖に侵入したインターカレータの酸化還元反応を利用するものである。つまり、二本鎖の形成の程度がインターカレーションの程度として定量検出され得る。したがって、この電流値を検出することにより二本鎖量が測定され得る。
【００６６】
本発明に利用される電気化学的測定法には、サイクリックボルタンメトリーやディファレンシャルパルスボルタンメトリー（以下、「ＤＰＶ」という。）等のよって行うことができる。
【００６７】
また、後述するように、本発明では電気化学的測定法に基づいて、インターカレータの導入率を算出しているが、「Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ　ＤＮＡ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　ａｓｓａｙ　ｂｙｕｓｉｎｇ　ｅｕｒｏｐｉｕｍ　ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ　ｅｎｅｒｇｙ　ｔｒａｎｓｆｅｒ」　Ｓｕｅｄ，　Ｓ，　Ｙｕａｎ，　Ｊ　ａｎｄ　Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，　Ｋ（２０００）　Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１１；　８２７−８３１に記載されているように、蛍光部分を有するインターカレータを利用しても、塩基配列の変異を検出することは可能である。
【００６８】
図６は、前述した第二工程〜第四工程までの一連の操作を模式的に表した図である。Ｓ１ヌクレアーゼの作用により、二本鎖ＤＮＡのみを残存させるように一本鎖ＤＮＡを分解させ、しかる後にインターカレータ処理により、相補的な関係を有する塩基対の領域のみに前記インターカレータを取込ませる。
【００６９】
次いで、本発明による第四工程にて、ＤＰＶ測定を行うことにより、二本鎖量の評価が可能となる。
【００７０】
（第五工程）
本発明の第五工程にて、前記第一工程で形成された二本鎖ＤＮＡを、化学的、物理化学的、又は電気化学的に解離・変性させて、ターゲット分子内の非ハイブリダイゼーション部分を分解するとともに、ハイブリダイゼーションが行われていない一本鎖状態で残存するプローブ分子群も同時に分解する。
【００７１】
化学的に解離・変性させる処理としては、変性剤としてホルムアミド等により二本鎖を形成したＤＮＡのうち、当初から電極に固着された一本鎖プローブのみを生成させる。
【００７２】
また、物理化学的に解離・変性させる処理としては、核酸の解離温度による熱を利用する処理等がある。
【００７３】
さらに、電気化学的に解離・変性させる処理としては、定電流定電圧、パルス電流パルス電位を利用する処理等がある。
【００７４】
本工程では、特に、化学的に解離・変性させる処理が好ましい。
【００７５】
上記変性剤による処理には洗浄効果も有するため、第五工程では、変性及び洗浄が同時に進行することになる。
【００７６】
（第六工程）
前記第三工程と同様に、第六工程では、インターカレータ溶液を用いて、第五工程で生成した一本鎖ＤＮＡと前記インターカレータとの間での非特異的な静電的作用により、一本鎖ＤＮＡとインターカレータとが結合させる。
【００７７】
インターカレータ溶液を用いる処理条件等は、前述の第三工程と同様である。
【００７８】
（第七工程）
本工程では、前記第四工程と同様に、２回目のＤＰＶ測定を行う。これは、二本鎖形成に関与した一本鎖プローブ量のみに比例した電流値が得られ、後述する算出工程により、プローブ量当たりの結合したターゲットＤＮＡを正確に把握するための基準となる。
【００７９】
（第八工程）
第八工程においては、前記第四工程で得られた電流値をＩ１とし、前記第七工程で得られた電流値をＩ２とすると、前記Ｉ１及びＩ２の電流値の比較から前記インターカレータの取込み率を算出し、一塩基変異の有無を検出する検出工程である。
【００８０】
前記取込み率を算出するために使用した算出式は、前記Ｉ１及びＩ２を用いて、
ΔＩ　＝　［（Ｉ１　−　Ｉ２）／Ｉ２］＊１００
より求める。
【００８１】
上記の算出式は、ハイブリダイゼーションにより形成された二本鎖に関与した一本鎖プローブのインターカレータへの影響を排除し、二本鎖へ取込まれたインターカレータの割合を見積もるための式である。
【００８２】
本発明の検出法によれば、塩基配列の変異を有するサンプル核酸をターゲットとし、塩基配列の変異を高感度に検出することが可能になる。具体的には、ＳＮＰ等の一塩基変異を、迅速かつ高感度の検出が実現される。そして、本発明の検出法による検出結果に基づいて、生物学、医学分野での遺伝子、表現形質との相関の解析が可能となる。
【００８３】
また、本発明の検出法によって、薬剤代謝酵素、癌抑制遺伝子などの特定の遺伝子を検出・解析することにより、遺伝子診断の分野にも利用できる。さらに、癌、高血圧等の成人病の予防等に役立てることもできる。
【００８４】
［実施例］
以下、実施例を挙げて、本発明による塩基配列変異の検出法について、詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。
【００８５】
（プローブの電極への固着化）
Ａ〜Ｅの５つのグループに対して各４本のピン電極（ＴＵＭ研究所製ＥＣＡチップ）に、以下の２種類のプローブ（ｋ−ｒａｓ遺伝子のコドン１２中の塩基配列の一部に相当する）を、各々２ｐｍｏｌ／μＬの濃度にて固着させるため、一晩放置した（図７参照）。
【００８６】
プローブ１：グループＡ〜Ｃに使用
Ｋ−ｒａｓ−Ｗ２０Ｍ（２０塩基、野生型）
ＨＳ−（ＣＨ２）６−ＣＴＡＣＧＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣＡＡＣＴ
プローブ２：グループＤ及びＥに使用
Ｋ−ｒａｓ−Ｓ２０Ｍ（２０塩基、突然変異型）
ＨＳ−（ＣＨ２）６−ＣＴＡＣＧＣＧＡＣＣＡＧＣＴＣＣＡＡＣＴ
（非特異的結合部の除去）
前述のように固着化させた各グループの電極を、変性剤として７０％ホルムアミドにより、４２℃で１０分間洗浄し、非特異的結合オリゴヌクレオチドを除去した。
【００８７】
（ハイブリダイゼーション）
各グループに対して、サンプル核酸としてのターゲットＤＮＡを図８に掲載した核酸を用いて、２ｘＳＳＣ、２８℃で３時間ハイブリダイゼーションを行った。
【００８８】
しかる後に、２ｘＳＣＣにて、室温で１０分間洗浄した。
【００８９】
（Ｓ１ヌクレアーゼによる分解処理）
次いで、各グループに対して、Ｓ１ヌクレアーゼ１／２００（約０．８ユニット／μＬ）にて、３７℃で１時間、分解処理を行った。分解処理により、２０塩基プローブに対して、１２０塩基のターゲットＤＮＡをハイブリダイズさせた後に残存する１００塩基分に相当する一本鎖ＤＮＡは、非結合的に結合したターゲットＤＮＡやハイブリダイゼーションが行われず、一本鎖として残存するプローブＤＮＡ等をＳ１ヌクレアーゼ酵素により分解した。
【００９０】
（インターカレータ処理：その１）
ハイブリダイゼーション後の二本鎖ＤＮＡを有する各グループの電極を、インターカレータとしてフェロセン化ナフタレンジイミド（以下、「ＦＮＤ」という。）を含むインターカレータ溶液（１Ｍ酢酸バッファー、ｐＨ５．６、０．１ＭＫＣｌ、５０μＭ　ＦＮＤ）に浸漬させた。
【００９１】
（１回目のＤＰＶ測定）
その後、電気化学測定器であるＥＣＡチップリーダ　ＴＧＶ１０００（ＴＵＭ研究所製）により、Ａｇ／ＡｇＣｌ参照電極を用いて、測定用電解室溶液（０．１Ｍ、ＡｃＯＨ−ＡｃＯＫ（ｐＨ５．６）、０．１Ｍ　ＫＣｌ、　０．０５ｍＭ）中で各グループの１回目のＤＰＶを測定した（以下、この値をＩ１と総称する）。
【００９２】
（変性及び洗浄）
前記ＤＰＶ測定後、変性剤としての７０％ホルムアミドを用いて、４２℃で１０分間変性及び洗浄を各グループごとに行い、二本鎖を形成したＤＮＡのうち、当初の電極に固着されえた１本鎖プローブのみを生成させた。
【００９３】
（インターカレータによる処理：その２）
前述と同様に、ＦＮＤを含むインターカレータ溶液（１Ｍ酢酸バッファー、ｐＨ５．６、０．１ＭＫＣｌ、５０μＭ　ＦＮＤ）に浸漬させた。
【００９４】
（２回目のＤＰＶ測定）
その後、１回目と同じ電気化学測定器を用いて、１本鎖プローブに対して静電気的に作用したインターカレータに基づく２回目のＤＰＶ測定を行った（以下、この値をＩ２と総称する）。
【００９５】
以上の電流値Ｉ１及びＩ２の結果から、
ΔＩ　＝　［（Ｉ１　−　Ｉ２）／Ｉ２］＊１００
により、電流値の差から、前記インターカレータの取込み率を算出し、結果を図９に示す。
【００９６】
図１０は、図９に示すΔＩの結果を棒グラフで示した図である。図１０に示す結果から、Ａグループの４本にピン電極からの平均値の結果はフルマッチ状態に対応するΔＩであると考えられ、ミスマッチ領域が存在するＣグループと有意な差異が確認された。
【００９７】
また、フルマッチとミスマッチが同量で存在するヘテロ接合体に相当するＢグループは、ＡグループとＣグループとの中間的な結果を示すことから、フルマッチとミスマッチサンプルは同効率でプローブとハイブリダイズし、ミスマッチが存在するため、ハイブリダイゼーション効率が減少し、ＡグループとＣグループの差が現れたことではないこと分かる。
【００９８】
さらに、クロスチェックを行うために変異型プローブを利用した。これに対して、ミスマッチ［野生型ターゲットＤＮＡ］とフルマッチ［変異型ターゲットＤＮＡ］のインターカレータ取込率の結果は有意に異なり、本発明が高精度であることが明らかになった。
【００９９】
【発明の効果】
本発明の検出法によれば、ＤＮＡやＲＮＡ等の塩基配列で、特定位置にある塩基配列の変異を迅速、かつ、高感度に検出することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明による塩基配列における変異の検出法を説明する工程図である。
【図２】本発明に適用されるプローブの概略図である。図２（Ａ）は、本発明に利用されるプローブは、電極固着部と、リンカーと、オリゴヌクレオチドと、から構成されるプローブであることを概略的に示し、図２（Ｂ）は、本発明に利用されるプローブが電極に配設される状態の模式図である。
【図３】ハイブリダイゼーションにより形成される二本鎖ＤＮＡの模式図である。
【図４】本発明による一本鎖ＤＮＡ分解酵素により、一本鎖ＤＮＡが選択的に分解される状態を説明する図である。
【図５】本発明による検出法の工程の一部でインターカレータが二本鎖ＤＮＡの層間に挿入された状態の模式図である。図５（Ａ）は、いわゆるフルマッチ状態においてインターカレータが挿入された二本鎖の模式図であり、一方、図５（Ｂ）は、いわゆるミスマッチ領域が存在した場合に、インターカレータが挿入された二本鎖の模式図である。
【図６】本発明による第二工程から第四工程までの一連の操作を説明する模式図である。
【図７】本発明の各グループ（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥ）に利用されるプローブの表を示す図である。
【図８】本発明の各グループに対して利用されるターゲットＤＮＡの表を示す図である。図８中に示す１２０塩基のターゲットは、ｋ−ｒａｓ遺伝子のコドン１２中の塩基配列の一部に相当し、５’から数えて３６〜５５番目塩基がプローブと相補的範囲であり、突然変異型の場合は、４６番目に変異（Ｇ→Ｃ）が存在するターゲットである。
【図９】本発明の検出法により得られた結果を表に示す図である。なお、本図中のｍｅｒは、塩基の数を示し、例えば、１２０ｍｅｒとは１２０塩基のことを指す。
【図１０】図９に示すΔＩの結果を棒グラフで示した図である。図中のＷＴは野生型を意味し、ＭＴは突然変異型を意味する。
【符号の説明】
１０　インターカレータ
【配列表】
ＳＥＱＵＥＮＣＥ　ＬＩＳＴＩＮＧ
＜１１０＞　ティー・ユー・エム研究所
＜１２０＞　一本鎖ＤＮＡ分解酵素を利用した塩基配列検出法及び該検出法を実行する検出装置
＜１６０＞　１
＜２１０＞　１
＜２１１＞　２０
＜２１２＞ＤＮＡ
＜２１３＞ヒト
＜４００＞　１
ＣＴＡＣＧＣＣＡＣＣ　ＡＧＣＴＣＣＡＡＣＴ
＜２１０＞　２
＜２１１＞　２０
＜２１２＞ＤＮＡ
＜２１２＞ヒト
＜４００＞　２
ＣＴＡＣＧＣＧＡＣＣ　ＡＧＣＴＣＣＡＡＣＴ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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