【手続補正書】
【提出日】平成26年3月19日(2014.3.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試験化合物の患者への投与の後に、試験化合物の潜在的な毒性または副作用を決定するためのイン・ビトロの方法であって、
ｂ）哺乳類細胞と試験化合物とを接触させる工程（ここで、哺乳類細胞は患者から取得された生体サンプルに含まれ、編集酵素ＡＤＡＲ１ａ、ＡＤＡＲ１ｂおよびＡＤＡＲ２並びにセロトニン２Ｃ受容体（５ＨＴＲ２Ｃ）を発現している）、
ｃ）同一の細胞抽出物において：
−細胞ＲＮＡ抽出物において測定される５−ＨＴ２ＣＲ  ｍＲＮＡの同定された各アイソフォームの平均比率を与える編集プロフィール、および／または、
−前記編集酵素ＡＤＡＲ１ａ、ＡＤＡＲ１ｂおよびＡＤＡＲ２の定量的な発現
を決定する工程、
ｄ）試験化合物で処理した前記細胞と非処理の対照細胞との間で、工程ｃ）で得られた結果を比較する工程
を含んでなる、方法。
【請求項２】
ｓ５ＨＴＲ２ＣのＡＤＡＲ依存性Ａ−ｔｏ−Ｉ  ｍＲＮＡ編集のｍＲＮＡ編集メカニズムの変化に関連する病状の処置に有用な治療化合物を選択するためのイン・ビトロの方法であって、
ｂ）哺乳類細胞と試験化合物とを接触させる工程（ここで、哺乳類細胞は哺乳類細胞は患者から取得された生体サンプルに含まれ、編集酵素ＡＤＡＲ１ａ、ＡＤＡＲ１ｂおよびＡＤＡＲ２並びに５−ＨＴ２Ｃ受容体を発現している）、
ｃ）同一の細胞抽出物において：
−細胞ＲＮＡ抽出物において測定される５−ＨＴ２ＣＲのｍＲＮＡの同定された各アイソフォームの平均比率を与える編集プロフィール、および／または、
−前記編集酵素ＡＤＡＲ１ａ、ＡＤＡＲ１ｂおよびＡＤＡＲ２の定量的な発現
を決定する工程、
ｄ）試験化合物で処理した前記細胞と未処理の対照細胞との間で、工程ｃ）で得られた結果を比較する工程
を含んでなる、方法。
【請求項３】
工程ｃ）において、５−ＨＴ２ＣＲ  ｍＲＮＡの同定された各アイソフォームの編集プロフィールと、前記編集酵素ＡＤＡＲ１ａ、ＡＤＡＲ１ｂおよびＡＤＡＲ２の定量的な発現とが、同一の細胞抽出物において決定される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
工程ｃ）において、５−ＨＴ２ＣＲ  ｍＲＮＡの同定された各アイソフォームの編集プロフィールと、前記編集酵素ＡＤＡＲ１ａ、ＡＤＡＲ１ｂおよびＡＤＡＲ２の定量的な発現とが、同一の細胞抽出物において決定される場合に、それらが同一の全ＲＮＡ細胞抽出物において決定される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
工程ｃ）において、編集プロフィールの決定結果の分析により、これらの編集酵素ＡＤＡＲ１ａ、ＡＤＡＲ１ｂおよびＡＤＡＲ２の活性指数の取得が可能になる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
工程ｃ）において、前記編集酵素ＡＤＡＲ１ａ、ＡＤＡＲ１ｂおよびＡＤＡＲ２の定量的な発現が、前記編集酵素のｍＲＮＡ発現の測定または細胞抽出物において発現する前記編集酵素タンパク質の測定により決定される、請求項１〜３または５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記哺乳類細胞が、細胞株、特に、ヒト、マウスまたはラット由来であって、５ＨＴ２ＣＲ、ＡＤＡＲ１およびＡＤＡＲ２酵素、好ましくは、ＡＤＡＲ１ａ、ＡＤＡＲ１ｂおよびＡＤＡＲ２酵素、の一定かつ構成的な発現を示す細胞株である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記哺乳類細胞が、５ＨＴ２ＣＲの編集を変化させる能力を有する薬剤で処理されたときに、少なくとも編集部位Ａが編集された少なくとも１種の５ＨＴ２ＣＲアイソフォーム、少なくとも編集部位Ｂが編集された少なくとも１種の５ＨＴ２ＣＲアイソフォーム、少なくとも編集部位Ｃが編集された少なくとも１種の５ＨＴ２ＣＲアイソフォーム、少なくとも編集部位Ｄが編集された少なくとも１種の５ＨＴ２ＣＲアイソフォームおよび少なくとも編集部位Ｅが編集された少なくとも１種の５ＨＴ２ＣＲアイソフォーム、好ましくは、編集された５ＴＨ２ＣＲのすべてのアイソフォームを発現する能力を更に有する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記哺乳類細胞が、神経芽細胞腫細胞株、好ましくは、ヒト神経芽細胞腫細胞株由来である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記哺乳類細胞が、ヒト神経芽細胞腫ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞株である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記試験化合物の投与後の患者における潜在的な毒性若しくは副作用、またはｓ５ＨＴＲ２ＣのｍＲＮＡ編集の変化に関連する処置された病状が、精神疾患、統合失調症、うつ病、うつ病による自殺または異常摂食行動からなる群から選択される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
工程ｂ）において、前記哺乳類細胞が、前記哺乳類細胞の培養に適した培地において試験化合物の存在下で培養される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
工程ｂ）において、５−ＨＴ２ＣＲ  ｍＲＮＡの同定された各アイソフォームの編集プロフィールおよび／または前記編集酵素ＡＤＡＲ１ａ、ＡＤＡＲ１ｂおよびＡＤＡＲ２の定量的な発現を同一の細胞抽出物において決定する工程ｃ）の前に、前記哺乳類細胞を試験化合物の存在下で、少なくとも１時間、好ましくは、少なくとも５、１０、１６、２４時間培養する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
工程ｃ）において、細胞ＲＮＡ抽出物において測定される５−ＴＨ２ＣＲ  ｍＲＮＡの同定された各アイソフォームの平均比率を与える編集プロフィールが、２段階ＰＣＲを含んでなるネステッドＰＣＲを伴うＣＥ−ＳＳＣＰ法により測定され、かつ、１段階目のＰＣＲが、
マウスまたはラット哺乳類細胞株の場合：
順方向：５’−ＴＧＴＣＣＣＴＡＧＣＣＡＴＴＧＣＴＧＡＴＡＴＧＣ−３’、および
逆方向：５’−ＧＣＡＡＴＣＴＴＣＡＴＧＡＴＧＧＣＣＴＴＡＧＴＣ−３’
ヒト細胞株の場合：
順方向：５’−ＴＧＴＣＣＣＴＡＧＣＣＡＴＴＧＣＴＧＡＴＡＴＧＣ−３’、および
逆方向：５’−ＧＣＡＡＴＣＴＴＣＡＴＧＡＴＧＧＣＣＴＴＡＧＴＣ−３’
のプライマーセットにより行われ、かつ、
２段階目のＰＣＲが、
マウスまたはラット細胞株の場合：
順方向：５’−ＴＴＴＧＴＧＣＣＣＣＧＴＣＴＧＧＡＴ−３’、および
逆方向：５’−ＧＣＣＴＴＡＧＴＣＣＧＣＧＡＡＴＴＧ−３’；並びに
ヒト細胞株の場合：
順方向：５’−ＡＴＧＴＧＣＴＡＴＴＴＴＣＡＡＣＡＧＣＧＴＣＣＡＴＣ−３’、
逆方向：５’−ＧＣＡＡＴＣＴＴＣＡＴＧＡＴＧＧＣＣＴＴＡ−３’
のプライマーセットで行われる、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
工程ｃ）において、ＡＤＡＲ  ｍＲＮＡのＰＣＲ増幅に特異的な１対のプライマーが、−ヒトＡＤＡＲ１−１５０アイソフォームｍＲＮＡの増幅の場合：
順方向：５’−ＧＣＣＴＣＧＣＧＧＧＣＧＣＡＡＴＧＡＡＴＣＣ−３’および
逆方向：５’−ＣＴＴＧＣＣＣＴＴＣＴＴＴＧＣＣＡＧＧＧＡＧ−３’
−ヒトＡＤＡＲ１−１１０アイソフォームｍＲＮＡの増幅の場合：
順方向：５’−ＣＧＡＧＣＣＡＴＣＡＴＧＧＡＧＡＴＧＣＣＣＴＣＣ−３’および
逆方向：５’−ＣＡＴＡＧＣＴＧＣＡＴＣＣＴＧＣＴＴＧＧＣＣＡＣ−３’
−ヒトＡＤＡＲ２  ｍＲＮＡの増幅の場合：
順方向：５’−ＧＣＴＧＣＧＣＡＧＴＣＴＧＣＣＣＴＧＧＣＣＧＣ−３’ および
逆方向：５’−ＧＴＣＡＴＧＡＣＧＡＣＴＣＣＡＧＣＣＡＧＣＡＣ−３’
−マウスＡＤＡＲ１−１５０アイソフォームｍＲＮＡの増幅の場合：
順方向：５’−ＧＴＣＴＣＡＡＧＧＧＴＴＣＡＧＧＧＧＡＣＣＣ−３’ および
逆方向：５’−ＣＴＣＣＴＣＴＡＧＧＧＡＡＴＴＣＣＴＧＧＡＴＡＣ−３’
−マウスＡＤＡＲ１−１１０アイソフォームｍＲＮＡの増幅の場合：
順方向：５’−ＴＣＡＣＧＡＧＴＧＧＧＣＡＧＣＧＴＣＣＧＡＧＧ−３’ および
逆方向：５’−ＣＴＣＣＴＣＴＡＧＧＧＡＡＴＴＣＣＴＧＧＡＴＡＣ−３’並びに
−マウスＡＤＡＲ２  ｍＲＮＡの増幅の場合：
順方向：５’−ＧＣＴＧＣＡＣＡＧＴＣＴＧＣＣＴＴＧＧＣＴＡＣ−３’
逆方向：５’−ＧＣＡＴＡＡＡＧＡＡＡＣＣＴＧＡＧＣＡＧＧＧＡＣ−３’
から選択される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
試験化合物の潜在的な毒性を予測する、または、セロトニン２Ｃ受容体（５ＨＴＲ２Ｃ）のＡＤＡＲ依存性Ａ−ｔｏ−Ｉ  ｍＲＮＡ編集のｍＲＮＡ編集メカニズムの変化に関連する病状の処置に有用な治療化合物を選択するためのイン・ビトロの方法であって、
（ａ）哺乳類細胞株（好ましくは、本発明の方法のために描写された特徴を有するこれらの細胞株）、好ましくは、神経芽細胞腫細胞株、より好ましくは、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞株上で、５ＨＴ２ＣＲの編集を変化させる能力に基づいて、化合物をスクリーニングする工程であって、これらの化合物が毒性若しくは副作用を有する、または有しないと知られている、工程；
（ｂ）前記スクリーニングに基づいて、基準パネルのメンバーを選択する工程であって、前記パネルが、５ＨＴ２ＣＲの編集を変化させるそれらの能力に関して異なるメンバーを含んでなり、メンバーはそれらの毒性または副作用に関して異なっていてもよい、工程；
（ｃ）前記５ＨＴ２ＣＲの編集に関して未知の活性の試験化合物をスクリーニングして、５ＨＴ２ＣＲの編集の変化についてその影響を決定し、それにより前記試験化合物に対する５ＨＴ２ＣＲの編集プロフィールと、場合によって、ＡＤＡＲの発現とを得る工程；
（ｄ）前記試験化合物と前記基準パネルとに対する５ＨＴ２ＣＲの編集プロフィールおよび、場合によって、ＡＤＡＲの発現を比較する工程；
（ｅ）試験化合物により引き起こされる５ＨＴＲ２Ｃの編集の変化が基準化合物のそれと同じであるとの推定に基づいて、試験化合物の潜在的な毒性を予測し、または５ＨＴＲ２ＣのｍＲＮＡ編集メカニズムの変化に関連する病状の処置に有用な潜在的治療化合物として試験化合物を選択する工程
を含んでなり、
５ＨＴ２ＣＲの編集プロフィールおよび場合によってＡＤＡＲの発現を変化させるそれらの能力に対して前記哺乳類細胞上でスクリーニングする工程が、請求項１〜１５の工程ｃ）に対応し、かつ、５−ＨＴ２ＣＲ  ｍＲＮＡの同定された各アイソフォームの編集プロフィールおよび前記編集酵素ＡＤＡＲ１ａ、ＡＤＡＲ１ｂおよびＡＤＡＲ２の定量的な発現が決定される、方法。
【請求項１７】
化合物を試験するに適した動物モデル、好ましくはマウスまたはラットにイン・ビボでその試験化合物を更に投与し、かつ、全血液および／または皮膚サンプル、または脳における５ＨＴＲ２ＣのｍＲＮＡ編集、および／または、発現したＡＤＡＲアイソフォームの変化を決定することにより、この動物モデルにおけるその投与の後のこの試験化合物の潜在的な毒性または副作用を評価する、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
患者への試験化合物の投与後に試験化合物の潜在的な毒性若しくは副作用を決定するための、または、５ＨＴＲ２ＣのＡＤＡＲ依存性Ａ−ｔｏ−Ｉ  ｍＲＮＡ編集のｍＲＮＡ編集メカニズムの変化に関連する病状の処置に有用な治療化合物を選択するためのキットであって、
（ａ）編集酵素ＡＤＡＲ１ａ、ＡＤＡＲ１ｂおよびＡＤＡＲ２、ならびにセロトニン２Ｃ受容体（５ＨＴＲ２Ｃ）を発現する、細胞株に由来する哺乳類細胞；および
（ｂ）２段階ＰＣＲを含んでなるネステッドＰＣＲを伴う定量的（Ｑ）ＰＣＲにより、前記哺乳類細胞のＲＮＡ抽出物に存在する５−ＨＴ２ＣＲ  ｍＲＮＡの各アイソフォームを測定するための２セットのプライマー；ならびに、場合により、
（ｃ）定量的Ｑ−ＰＣＲにより、編集酵素ＡＤＡＲ１ａ、ＡＤＡＲ１ｂおよびＡＤＡＲ２の定量的発現を測定するための１セットのプライマー
を含んでなる、キット。
【請求項１９】
前記哺乳類細胞が、神経芽細胞腫細胞株由来、好ましくは、ヒト神経芽細胞腫細胞株由来であり、より好ましくは、ヒト神経芽細胞腫ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞株である、請求項１８に記載のキット。
【請求項２０】
前記哺乳類細胞が、神経芽細胞腫細胞株由来、好ましくは、ヒト神経芽細胞腫細胞株由来であり、より好ましくは、ヒト神経芽細胞腫ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞株である、請求項１８に記載のキット。
【請求項２１】
請求項１６のｂ）において選択された基準パネルおよび／または前記基準パネルに対する５ＨＴ２ＣＲの編集プロフィールならびに場合によりＡＤＡＲの発現を更に含んでなる、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載のキット。