【手続補正書】
【提出日】平成24年5月21日(2012.5.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
脊椎動物被験体における循環内皮細胞を検出し、必要に応じて定量するための方法であって、該方法は、
（ａ）該被験体から得られた、循環細胞を含む体液と、抗血管新生薬剤とを、生きた内皮細胞を非生細胞である内皮細胞にするように接触させる工程；
（ｂ）該細胞を、生細胞によって排除されるが、死細胞によって取り込まれる色素で処理する工程；および
（ｃ）生じた細胞を顕微鏡下で観察する工程、ならびに
（ｄ）該体液中の該非生細胞である内皮細胞を、リンパ球のサイズの約３分の１というそのサイズ、角のある外見、および強くかつ屈折性の色によって同定する工程、
を包含し、ここで該体液が血液、リンパまたは血漿である、方法。
【請求項２】
前記色素は、ファストグリーンである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞は、生細胞を染色する色素でさらに処理される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記生細胞を染色する色素は、ヘマトキシリン／エオシン（Ｈ＆Ｅ）もしくはライト−ギムザである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記内皮細胞を定量する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記体液は、血液もしくは血漿である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
治療剤の有効性を決定する方法であって、該方法は、該治療剤で処置した試験被験体から得られた血液、リンパまたは血漿中の循環内皮細胞のレベルと、以下のいずれか：
（ｉ）該治療剤で処置する前の該試験被験体から得られた血液、リンパまたは血漿中の循環内皮細胞のレベル；もしくは
（ｉｉ）該治療剤で処置していないコントロール被験体から得られた血液、リンパまたは血漿中の循環内皮細胞のレベル；とを比較する工程を包含し、
それによって、節（ｉ）もしくは（ｉｉ）の被験体から得られた血液、リンパまたは血漿中の循環内皮細胞のレベルと比較して、該試験被験体から得られた血液、リンパまたは血漿中の循環内皮細胞の低下したレベルは、該治療剤の有効性を示し、そしてここで該決定は、請求項１に記載の方法によって行われる、
方法。
【請求項８】
試験被験体から得られた組織中の内皮細胞を検出し、必要に応じて定量するための方法であって、該方法は、
（ａ）該組織を脱凝集して、該組織中に含まれる任意の内皮細胞を含むサンプルを得る工程、
（ｂ）該サンプルを、抗血管新生薬剤で処理して、生きた内皮細胞を非生細胞である内皮細胞にする工程；
（ｃ）該サンプルを、生細胞によって排除されるが、死細胞によって取り込まれる色素で処理する工程；および
（ｄ）該サンプル中の細胞を、顕微鏡下で観察する工程、ならびに
（ｅ）該サンプル中の該非生細胞である内皮細胞を、リンパ球のサイズの約３分の１というそのサイズ、角のある外見、および強くかつ屈折性の色によって同定する工程、
を包含する、方法。
【請求項９】
前記抗血管新生薬剤は、ベバシズマブである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記色素は、ファストグリーンである、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞は、生細胞を染色する色素でさらに処理される、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記生細胞を染色する色素は、ヘマトキシリン／エオシン（Ｈ＆Ｅ）もしくはライト−ギムザである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記内皮細胞を定量する工程をさらに包含する、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
試験被験体から得られた組織中の内皮細胞の生存性に対する処理の効果を決定する方法であって、該方法は、
（ａ）少なくとも生細胞である内皮細胞および本来取り囲んでいる生細胞である非内皮細胞から構成される組織と、内皮細胞の生存性に対するその効果が試験される該処理とを接触させる工程、
（ｂ）必要であれば、いかなるさらなる内皮細胞死ももたらすことなく、該組織を脱凝集して任意の内皮細胞を含むサンプルを得る工程、
（ｃ）該サンプルを、生細胞によって排除されるが、死細胞によって取り込まれる色素で処理する工程；
（ｄ）得られた細胞を、顕微鏡下で観察する工程、および
（ｅ）該サンプル中の非生細胞である内皮細胞を、リンパ球のサイズの約３分の１というそのサイズ、角のある外見、および強くかつ屈折性の色によって同定する工程、
を包含する、方法。
【請求項１５】
前記色素は、ファストグリーンである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記細胞は、生細胞を染色する色素でさらに処理される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記生細胞を染色する色素は、ヘマトキシリン／エオシン（Ｈ＆Ｅ）もしくはライト−ギムザである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
所望でない新生血管構造によって特徴付けられる状態を処置するための組合せ物であって、該組合せ物は、
（ａ）抗脈管形成剤、および
（ｂ）エタノールおよび／もしくはＤＭＳＯ
を含み、該エタノールおよび／もしくはＤＭＳＯは、血中で毒性水準未満（ｓｕｂ−ｔｏｘｉｃ）のレベルを維持するように投与されることを特徴とする、組合せ物。
【請求項１９】
前記抗脈管形成剤は、内皮細胞死をもたらす、請求項１８に記載の組合せ物。
【請求項２０】
前記脈管形成剤は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）のインヒビターである、請求項１９に記載の組合せ物。
【請求項２１】
前記抗脈管形成剤は、ベバシズマブである、請求項２０に記載の組合せ物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
さらに、本発明のアッセイ方法は、驚くべきことに、上記非毒性物質ＤＭＳＯおよびエ
タノールが、抗脈管形成薬物の効果を強化し得ることを明らかにした。なぜなら、それら自体がこの効果を示し得るからである。従って、別の局面において、本発明は、所望でない新生血管構造によって特徴付けられる状態を処置するための改善された方法に関し、上記方法は、このような処置を必要とする被験体に、抗血管新生薬剤を、非毒性であるが、上記主要薬物の抗血管新生効果を高めるに十分である、エタノールおよび／もしくはＤＭＳＯの血中レベルを維持しながら投与する工程を包含する。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
脊椎動物被験体における循環内皮細胞を検出し、必要に応じて定量するための方法であって、該方法は、
（ａ）試験されるべき被験体から得られた体液と、抗血管新生薬剤とを接触させる工程；
（ｂ）該細胞を、生細胞によって排除されるが、死細胞によって取り込まれる色素で処理する工程；および
（ｃ）生じた細胞を顕微鏡下で観察する工程、ならびに
（ｄ）その培養物中の該内皮細胞を、該内皮細胞の小さなサイズ、しばしば角のある外見、およびしばしば強くかつ屈折性の色によって同定する工程、
を包含する、方法。
（項目２）
前記色素は、ファストグリーンである、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記細胞は、生細胞を染色する色素でさらに処理される、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記生細胞を染色する色素は、ヘマトキシリン／エオシン（Ｈ＆Ｅ）もしくはライト−ギムザである、項目３に記載の方法。
（項目５）
前記内皮細胞を定量する工程をさらに包含する、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記体液は、血液もしくは血漿である、項目１に記載の方法。
（項目７）
治療剤の有効性を評価するための方法であって、該方法は、前記薬剤で処置した試験被験体における循環内皮細胞のレベルと、以下のいずれか：
（ｉ）該薬剤で処置する前の該被験体における循環内皮細胞のレベル；もしくは
（ｉｉ）該薬剤で処置していないコントロール被験体における循環内皮細胞のレベル；とを比較する工程を包含し、
それによって、節（ｉ）もしくは（ｉｉ）の被験体と比較して、該試験被験体における循環内皮細胞の低下したレベルは、該薬剤の有効性を示し、そしてここで該評価は、項目１に記載の方法によって行われる、
方法。
（項目８）
組織サンプル中の内皮細胞を検出し、必要に応じて定量するための方法であって、該方法は、
（ａ）該サンプルを脱凝集して、該サンプル中に含まれる任意の内皮細胞を遊離させる工程、
（ｂ）必要な場合、該遊離させた細胞を、抗血管新生薬剤で処理する工程；
（ｃ）該細胞を、生細胞によって排除されるが、死細胞によって取り込まれる色素で処理する工程；および
（ｄ）得られた細胞を、顕微鏡下で観察する工程、ならびに
（ｅ）その培養物中の該内皮細胞を、該内皮細胞の小さなサイズ、しばしば角のある外見、およびしばしば強くかつ屈折性の色によって同定する工程、
を包含する、方法。
（項目９）
前記抗血管新生薬剤は、ベバシズマブである、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記色素は、ファストグリーンである、項目８に記載の方法。
（項目１１）
前記細胞は、生細胞を染色する色素でさらに処理される、項目８に記載の方法。
（項目１２）
前記生細胞を染色する色素は、ヘマトキシリン／エオシン（Ｈ＆Ｅ）もしくはライト−ギムザである、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記内皮細胞を定量する工程をさらに包含する、項目８に記載の方法。
（項目１４）
微小凝集物中の細胞の生存性に対する処理の効果を決定するための方法であって、該方法は、
（ａ）少なくとも生きた内皮細胞および本来取り囲んでいる生きた非内皮細胞から構成される組織サンプルと、該処理とを接触させる工程、
（ｂ）必要であれば、いかなるさらなる内皮細胞死ももたらすことなく、該微小凝集物を遊離の任意の内皮細胞へと脱凝集する工程、
（ｃ）該細胞を、生細胞によって排除されるが、死細胞によって取り込まれる色素で処理する工程；
（ｄ）得られた細胞を、顕微鏡下で観察する工程、および
（ｅ）該培養物中の該内皮細胞を、該内皮細胞の小さなサイズ、しばしば角のある外見、およびしばしば強くかつ屈折性の色によって同定する工程、
を包含する、方法。
（項目１５）
前記色素は、ファストグリーンである、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記細胞は、生細胞を染色する色素でさらに処理される、項目１４に記載の方法。
（項目１７）
前記生細胞を染色する色素は、ヘマトキシリン／エオシン（Ｈ＆Ｅ）もしくはライト−ギムザである、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
被験体における所望でない新生血管構造によって特徴付けられる状態を処置するための方法であって、該方法は、該処置の必要な被験体に、抗脈管形成剤を、毒性水準未満（ｓｕｂ−ｔｏｘｉｃ）を維持する血中レベルのエタノールおよび／もしくはＤＭＳＯと組み合わせて投与する工程を包含する、方法。
（項目１９）
前記抗脈管形成剤は、内皮細胞死をもたらす、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記脈管形成剤は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）のインヒビターである、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記抗脈管形成剤は、ベバシズマブである、項目２０に記載の方法。