(57)【要約】【課題】線維芽細胞によるコラーゲンの産生を活発化する作用を有するコラーゲン産生促進剤、細胞中でのエイコサノイド産生反応における酵素であるホスホリパーゼＡ２の活性を抑制するホスホリパーゼＡ２活性阻害剤、及び血小板の活性化を抑制する血小板凝集抑制剤並びに皮膚外用剤及び美容飲食品の提供。【解決手段】ミカン科ワンピ属の黄皮の葉の抽出物を有効成分として含有するコラーゲン産生促進剤、ホスホリパーゼＡ２活性阻害剤、及び血小板凝集抑制剤、並びに皮膚外用剤及び美容飲食品である。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミカン科ワンピ属の黄皮の葉を、水若しくは親水性有機溶媒又はこれらの混合溶媒で抽出して得られるコラーゲン産生促進物質を有効成分として含むことを特徴とするコラーゲン産生促進剤。
【請求項２】
ミカン科ワンピ属の黄皮の葉を、水若しくは親水性有機溶媒又はこれらの混合溶媒で抽出して得られるホスホリパーゼＡ２活性阻害物質を有効成分として含むことを特徴とするホスホリパーゼＡ２活性阻害剤。
【請求項３】
ミカン科ワンピ属の黄皮の葉を、水若しくは親水性有機溶媒又はこれらの混合溶媒で抽出して得られる血小板凝集抑制物質を有効成分として含むことを特徴とする血小板凝集抑制剤。
【請求項４】
請求項１から３のいずれかに記載の黄皮の葉から抽出される有効成分を配合したことを特徴とするコラーゲン産生促進作用及び抗炎症作用を有する皮膚外用剤。
【請求項５】
請求項１から３のいずれかに記載の黄皮の葉から抽出される有効成分を配合したことを特徴とするコラーゲン産生促進作用及び抗炎症作用を有する美容飲食品。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、線維芽細胞によるコラーゲンの産生を活発化する作用を有するコラーゲン産生促進剤、細胞中でのエイコサノイド産生反応における酵素であるホスホリパーゼＡ２の活性を抑制するホスホリパーゼＡ２活性阻害剤、及び血小板の活性化を抑制する血小板凝集抑制剤、並びにコラーゲン産生促進作用及び抗炎症作用を有する皮膚外用剤及び美容飲食品に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
皮膚の表皮及び真皮は、表皮細胞、線維芽細胞及びこれらの細胞の外にあって皮膚構造を支持するコラーゲン等の細胞外マトリックスにより構成されている。若い皮膚においては、これら皮膚組織の相互作用が恒常性を保つことにより水分保持、柔軟性、弾力性等が確保され、肌は外見的にも張りや艶があってみずみずしい状態に維持される。
【０００３】
ところが、紫外線の照射、空気の著しい乾燥、過度の皮膚洗浄等、ある種の外的因子の影響があったり、加齢が進んだりすると、細胞外マトリックスの主要構成成分であるコラーゲンの産生量が減少すると共に架橋による弾力低下を起こす。その結果、皮膚は保湿機能や弾力性が低下し、角質は異常剥離を始めるため、肌は張りや艶を失い、荒れ、シワ等の老化症状を呈するようになる。
このように、皮膚の老化に伴う変化、即ち、シワ、くすみ、きめの消失、弾力性の低下等には、コラーゲン等の真皮マトリックス成分の減少、変性が関与している。
【０００４】
また、ホスホリパーゼＡ２は、アラキドン酸の代謝経路であるアラキドン酸カスケードの重要酵素であって、ホスホリパーゼＡ２が過剰に活性化するとアラキドン酸の代謝に異常が起こり、炎症、アレルギー、喘息、虚血、心筋梗塞等を引き起こす。このため、ホスホリパーゼＡ２の作用を阻害する物質により上記疾患に対処する試みがなされている。ホスホリパーゼＡ２活性阻害物質としては、例えば、メパクリン、パラブロモフェナシルブロミド、デキサメタゾン等が使用されてきたが、これらの物質はいずれも合成品であり、副作用が問題となっていた。
【０００５】
また、血小板に存在するシクロオキシゲナーゼは、外傷による出血があると血小板を凝集させる作用を有するトロンボキサンＡ２をアラキドン酸から合成して血小板凝集物からなる血栓を生じさせ、自動的な止血を可能にしている。しかし、本来生命維持に必須の上記機構に異常が生じて不必要な血小板凝集が進行し、多量の血栓が形成されると、脳梗塞や心筋梗塞の原因となる。そのような異常事態を防止する手段として、血小板凝集抑制作用を有する物質を投与することにより好ましくない血栓形成を防止することが考えられる。
【０００６】
前記トロンボキサンＡ２は気管支の平滑筋を収縮させる作用があるためこれが過剰になると喘息症状を招くことがあるが、血小板凝集抑制作用を有する物質はトロンボキサンＡ２の合成を阻害していると考えられるので、血小板凝集抑制物質は喘息の予防にも有効である。
【０００７】
そこで、血小板凝集抑制作用を有する物質によって脳梗塞、心筋梗塞、喘息等を予防することが検討され、多くの植物抽出物について血小板凝集抑制作用が試験された。その結果、ニンニク、タマネギ、ショウガ、ウコン、オールスパイス、クローブ等の抽出物が有効であると報告されている。また、トウガラシの主要辛味成分であるカプサイシン、ジヒドロカプサイシン、ノルジヒドロカプサイシンについて、それらの血小板凝集抑制作用は弱いという報告がある（荒井綜一監修「機能性食品の研究」学会出版センター１９９５年発行；ｐ．１３９）。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、かかる現状に鑑みてなされたものであり、従来における前記諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。
即ち、本発明の第一の目的は、真皮線維芽細胞におけるコラーゲンの産生を促進して皮膚の老化を防止及び／又は改善し得るコラーゲン産生促進剤を提供するところにある。
本発明の第二の目的は、ホスホリパーゼＡ２活性阻害作用を通じて、エイコサノイドの生成を抑制して炎症反応及び／又は免疫反応を抑えることができるホスホリパーゼＡ２活性阻害剤を提供するところにある。
本発明の第三の目的は、血小板の凝集抑制作用を通じて、ホスホリパーゼＡ２の活性化を抑制し、また、細胞外マトリックスの崩壊を防ぐことにより、炎症反応及び／又は免疫反応を抑制することができる血小板凝集抑制剤を提供するところにある。
本発明の第四の目的は、コラーゲン産生促進作用及び抗炎症作用を有し、特に、皮膚の老化の防止及び／又は改善に有用な皮膚外用剤及び美容作用を付与した飲食品を提供するところにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、前記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、ミカン科ワンピ属の黄皮の葉の抽出物が、コラーゲン産生促進作用、ホスホリパーゼＡ２活性阻害作用、及び血小板凝集抑制作用を兼ね備えていることを知見し、黄皮の葉の抽出物を有効成分として配合することで、コラーゲン産生促進作用及び抗炎症作用を有し、皮膚の老化の防止及び／又は改善に有用な皮膚外用剤及び美容飲食品が得られることを見出し、本発明をなすに至った。
【００１０】
即ち、前記課題を解決するための手段としては、下記の通りである。
＜１＞　ミカン科ワンピ属の黄皮の葉を、水若しくは親水性有機溶媒又はこれらの混合溶媒で抽出して得られるコラーゲン産生促進物質を有効成分として含むことを特徴とするコラーゲン産生促進剤である。
＜２＞　ミカン科ワンピ属の黄皮の葉を、水若しくは親水性有機溶媒又はこれらの混合溶媒で抽出して得られるホスホリパーゼＡ２活性阻害物質を有効成分として含むことを特徴とするホスホリパーゼＡ２活性阻害剤である。
＜３＞　ミカン科ワンピ属の黄皮の葉を、水若しくは親水性有機溶媒又はこれらの混合溶媒で抽出して得られる血小板凝集抑制物質を有効成分として含むことを特徴とする血小板凝集抑制剤である。
＜４＞　前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載の黄皮の葉から抽出される有効成分を配合したことを特徴とするコラーゲン産生促進作用及び抗炎症作用を有する皮膚外用剤である。
＜５＞　前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載の黄皮の葉から抽出される有効成分を配合したことを特徴とするコラーゲン産生促進作用及び抗炎症作用を有する美容飲食品である。
【００１１】
本願出願人は、黄皮の葉の抽出物が、テストステロン５α−レダクターゼ阻害作用及びアンドロゲン受容体結合阻害作用を有し、抗男性ホルモン剤として用いられることを既に提案している（特開２００１−２２６２７８号公報）。
しかしながら、黄皮の葉の抽出物が、コラーゲン産生促進作用、ホスホリパーゼＡ２活性阻害作用、又は血小板凝集抑制作用を有し、皮膚の老化を防止及び／又は改善に極めて有用であることは、全く知られておらず、その後、本願出願人が更に鋭意研究を重ねた結果導き出した新知見である。
【００１２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について更に詳しく説明する。
＜コラーゲン産生促進剤、ホスホリパーゼＡ２活性阻害剤、又は血小板凝集抑制剤＞
本発明のコラーゲン産生促進剤、ホスホリパーゼＡ２活性阻害剤、又は血小板凝集抑制剤は、黄皮の葉の抽出物を有効成分として含有する。
前記黄皮（学名：Ｃｌａｕｓｅｎａ　ｌａｎｓｉｕｍ（Ｌｏｕｒ．）Ｓｋｅｅｌｓ）は、ミカン科ワンピ属に属する常緑小高木であって、果実が食用又は生薬として利用されるため、インドから中国南部にかけて広く栽培されているものである。
【００１３】
本発明においては、抽出原料として、黄皮の葉を使用する。黄皮の葉の全体を使用してもよいし、葉の一部（例えば、葉身）を使用してもよい。また、予め細切り、粉砕又は粗砕しておいたものを使用することが好ましい。
前記黄皮の葉は、採取後直ちに乾燥したものを使用するのが適当である。乾燥は天日で行ってもよいし、通常使用される乾燥機を用いて行ってもよい。また、ヘキサン、ベンゼン等の非極性溶媒によって脱脂等の前処理を施してから抽出原料として使用してもよい。脱脂等の前処理を行うことにより、抽出処理を効率よく行うことができる。
【００１４】
前記抽出溶媒としては、水若しくは親水性有機溶媒又はこれらの混合溶媒を使用するのが好ましい。好適な抽出溶媒の具体例としては、水、低級脂肪族アルコール、含水の低級脂肪族アルコール等が例示できる。前記低級脂肪族アルコールとしては、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、１，３−ブチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、などが挙げられる。
【００１５】
前記抽出溶媒として使用し得る水には、純水、水道水、井戸水、鉱泉水、鉱水、温泉水、湧水、淡水等の他、これらに各種処理を施したものが含まれる。水に施す処理としては、例えば、精製、加熱、殺菌、滅菌、ろ過、イオン交換、浸透圧の調整、緩衝化等が含まれる。従って、本発明において抽出溶媒として使用し得る水には、精製水、熱水、イオン交換水、生理食塩水、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水等も含まれる。
【００１６】
２種以上の親水性有機溶媒の混合溶媒を抽出溶媒として使用する場合、その混合比は適宜調整することができる。例えば、水と低級脂肪族アルコールとの混合液を使用する場合には、水と低級脂肪族アルコールとの混合比を７：３〜２：８（質量比）とすることができる。
【００１７】
前記抽出処理は、黄皮の葉に含まれる可溶性成分を抽出溶媒に溶出させ得る限り特に限定はなく、常法に従って行うことができる。抽出処理の際には、特殊な抽出方法を採用する必要はなく、室温乃至還流加熱下において任意の装置を使用することができる。
例えば、抽出溶媒を満たした処理槽に黄皮の葉を投入し、ときどき攪拌しながら可溶性成分を溶出させる。この際、抽出条件は抽出原料等に応じて適宜調整し得るが、抽出溶媒量は、通常、抽出原料の５〜１５倍量（質量比）であり、抽出時間は通常１〜３時間であり、抽出温度は、通常常温〜９５℃程度である。
【００１８】
前記抽出処理により黄皮の葉から可溶性成分を溶出させた後、ろ過して抽出残渣を除くことによって、抽出液を得ることができる。得られた抽出液は、該抽出液の希釈液若しくは濃縮液、該抽出液の乾燥物、又はこれらの粗精製物若しくは精製物を得るために、常法に従って希釈、濃縮、乾燥、精製等の処理を施してもよい。前記精製等の処理は、具体的には、活性炭処理、吸着樹脂処理、イオン交換樹脂処理等によって行うことができ、これらの処理は、黄皮の葉の抽出液のコラーゲン産生促進活性、ホスホリパーゼＡ２活性阻害活性、血小板凝集抑制活性の低下を招かない範囲で行われる。
【００１９】
得られる黄皮の葉の抽出液はそのままでもコラーゲン産生促進剤、ホスホリパーゼＡ２活性阻害剤、又は血小板凝集抑制剤として使用することができるが、濃縮液又はその乾燥物としたものの方が利用しやすい。抽出液の乾燥物を得るにあたっては、吸湿性を改善するためにデキストリン、シクロデキストリン等のキャリアーを添加してもよい。
【００２０】
以上のようにして得られるコラーゲン産生促進剤、ホスホリパーゼＡ２活性阻害剤、又は血小板凝集抑制剤は、特に制限はなく、常法に従って製剤化して粉末状、顆粒状、錠剤状等、任意の剤形として提供することもできる。製剤化する場合、保存や取扱いを容易にするために、デキストリン、シクロデキストリン等の薬学的に許容され得るキャリアー、その他任意の助剤を添加することができる。
【００２１】
本発明のコラーゲン産生促進剤は、真皮線維芽細胞におけるコラーゲンの産生を促進する。その結果、皮膚の老化を防止及び／又は改善し得る。
【００２２】
本発明のホスホリパーゼＡ２活性阻害剤は、生体内においてホスホリパーゼＡ２が過剰に活性化するとアラキドン酸代謝に異常が起こり、炎症、アレルギー、喘息、虚血、心筋梗塞等が引き起こされる。従って、本発明のホスホリパーゼＡ２活性阻害剤によれば、ホスホリパーゼＡ２の過剰な活性化を抑制することにより、ホスホリパーゼＡ２が関与する炎症等の疾患を改善することができる。
【００２３】
本発明の血小板凝集抑制剤は、血小板の凝集を阻害することができる。生体内において血小板が凝集して活性化すると血栓形成、動脈硬化症の進展、ガン転移、炎症等が引き起こされる。従って、本発明の血小板凝集抑制剤によれば、血小板凝集を抑制することにより、血小板凝集が関与する炎症等の疾患を改善することができる。
【００２４】
＜コラーゲン産生促進作用及び抗炎症作用を有する皮膚外用剤＞
本発明の皮膚外用剤は、前記本発明の黄皮の葉の抽出物を含有し、コラーゲン産生促進作用及び抗炎症作用（ホスホリパーゼＡ２活性阻害作用及び血小板凝集抑制作用）を有するものである。
ここで、皮膚外用剤とは、皮膚に適用される各種薬剤を意味し、例えば、化粧料、医薬部外品、医薬品等が含まれる。前記皮膚外用剤としては、肌に対するものとして、軟膏、パップ、クリーム、乳液、ローション、パック、ゼリー等を例示でき、頭皮に対するものとして、トニック、リンス、シャンプー、アストリンゼント等が挙げられる。
【００２５】
本発明の皮膚外用剤は、黄皮の葉の抽出物を、その生理活性を妨げないような任意の主剤、助剤に配合したものであってもよいし、黄皮の葉の抽出物を主成分とするものであってもよい。
【００２６】
黄皮の葉の抽出物を配合して皮膚外用剤を製造する際には、任意の助剤を添加して、黄皮の葉の抽出物を任意の剤形に製剤化することができる。
【００２７】
前記黄皮の葉の抽出物の配合量は、黄皮の葉の抽出物の活性の強さや、黄皮の葉の抽出物を配合する皮膚外用剤の種類によって異なり一概には規定できないが、皮膚外用剤全量に対し通常、０．００１〜１０．０質量％が好ましく、０．０１〜１．０質量％がより好ましい。
【００２８】
本発明の皮膚外用剤において、前記黄皮の葉の抽出物以外にも、更に必要に応じて、収斂剤、殺菌・抗菌剤、美白剤、紫外線吸収剤、保湿剤、細胞賦活剤、消炎・抗アレルギー剤、抗酸化・活性酸素消去剤、などの任意成分を常用量配合することができる。なお、黄皮の葉の抽出物、前記任意成分を併用した場合、黄皮の葉の抽出物と併用された構成成分との間の相乗作用が、通常期待される以上の優れた使用効果をもたらすことがある。
【００２９】
前記収斂剤としては、例えば、クエン酸又はその塩類、酒石酸又はその塩類、乳酸又はその塩類、塩化アルミニウム、硫酸アルミニウム・カリウム、アラントインクロルヒドロキシアルミニウム、アラントインジヒドロキシアルミニウム、パラフェノールスルホン酸亜鉛、硫酸亜鉛、ジユエキス、エイジツエキス、ハマメリスエキス、ゲンノショウコエキス、チャカテキン類、ガイヨウエキス、オドリコソウエキス、オトギリソウエキス、ダイオウエキス、ヤグルマソウエキス、スギナエキス、キズタエキス、キューカンバーエキス、マロニエエキス、サルビアエキス、メリッサエキス、などが挙げられ、これらの１種を単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００３０】
前記殺菌・抗菌剤としては、例えば、安息香酸、安息香酸ナトリウム、パラオキシ安息香酸エステル、塩化ジステアリルメチルアンモニウム、塩化ベンゼトニウム、塩化アルキルジアミノエチルグリシン液、塩酸クロルヘキシジン、オルトフェニルフェノール、感光素１０１号、感光素２０１号、サリチル酸、サリチル酸ナトリウム、ソルビン酸、ハロカルバン、レゾルシン、パラクロロフェノール、フェノキシエタノール、ビサボロール、ヒノキチオール、メントール、キトサン、キトサン分解物、ジユエキス、クジンエキス、エンメイソウエキス、ビワエキス、ウワウルシエキス、ホップエキス、ユッカエキス、アロエエキス、ケイヒエキス、ガジュツエキス、などが挙げられ、これらの１種を単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００３１】
前記美白剤としては、例えば、アスコルビン酸及びその誘導体、イオウ、胎盤抽出物、コウジ酸及びその誘導体、グルコサミン及びその誘導体、アゼライン及びその誘導体、アルブチン及びその誘導体、ヒドロキシケイヒ酸及びその誘導体、グルタチオン、アルニカエキス、オウゴンエキス、センキュウエキス、ソウハクヒエキス、サイコエキス、ボウフウエキス、ハマボウフウエキス、マンネンタケ菌糸体培養物又はその抽出物、ギムネマエキス、シナノキエキス、モモ葉エキス、エイジツエキス、クジンエキス、ジユエキス、トウキエキス、ヨクイニンエキス、カキ葉エキス、ダイオウエキス、ボタンピエキス、ハマメリスエキス、マロニエエキス、オトギリソウエキス、オドリコソウエキス、油溶性カンゾウエキス（カンゾウ疎水性フラボン、グラブリジン、グラブレン、リコカルコンＡ）、などが挙げられ、これらの１種を単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００３２】
前記紫外線吸収剤としては、例えば、β−イソプロピルフラノン誘導体、ウロカニン酸、ウロカニン酸エチル、オキシベンゾン、オキシベンゾンスルホン酸、テトラヒドロキシベンゾフェノン、ジヒドロキシジメトキシベンゾフェノン、ジヒドロキシベンゾフェノン、シノキサート、ジイソプロピルケイヒ酸メチル、メトキシケイヒ酸オクチル、パラアミノ安息香酸グリセリル、パラジメチルアミノ安息香酸アミル、パラジメチル安息香酸オクチル、パラアミノ安息香酸、パラアミノ安息香酸エチル、ブチルメトキシジベンゾイルメタン、酸化チタン、β−カロチン、γ−オリザノール、コメヌカエキス、アロエエキス、カバノキエキス、シラカンバエキス、カミツレエキス、コゴメグサエキス、セイヨウサンザシエキス、ヘンナエキス、チョウチグルミエキス、マロニエエキス、イチョウ葉エキス、カミツレエキス、セイヨウサンザシエキス、油溶性カンゾウエキス、などが挙げられ、これらの１種を単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００３３】
前記保湿剤としては、例えば、セリン、グリシン、スレオニン、アラニン、コラーゲン、加水分解コラーゲン、ヒドロネクチン、フィブロネクチン、ケラチン、エラスチン、ローヤルゼリー、コンドロイチンヘパリン、グリセロリン脂質、グリセロ糖脂質、スフィンゴリン脂質、スフィンゴ糖脂質、リノール酸又はそのエステル類、エイコサペンタエン酸又はそのエステル類、ペクチン、アルゲコロイド、ビフィズス菌発酵物、乳酸発酵物、酵母抽出物、レイシ菌糸体培養物又はその抽出物、小麦胚芽油、アボガド油、米胚芽油、ホホバ油、ダイズリン脂質、γ−オリザノール、ビロウドアオイエキス、ヨクイニンエキス、ジオウエキス、タイソウエキス、カイソウエキス、キダチアロエエキス、ゴボウエキス、マロニエエキス、マンネンロウエキス、アルニカエキス、小麦フスマ、コメヌカエキス、などが挙げられ、これらの１種を単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００３４】
前記細胞賦活剤としては、例えば、リボフラビン又はその誘導体、ピリドキシン又はその誘導体、ニコチン酸又はその誘導体、パントテン酸又はその誘導体、α−トコフェロール又はその誘導体、アルニカエキス、ニンジンエキス、オタネニンジンエキス、エゾウコギエキス、ヘチマエキス（サポニン）、シコンエキス、シラカンバエキス、オオバクエキス、ボタンピエキス、シャクヤクエキス、ムクロジエキス、ベニバナエキス、アシタバエキス、ビワ葉エキス、ヒキオコシエキス、ユキノシタエキス、黄杞エキス、サルビアエキス、ニンニクエキス、マンネンロウエキス、などが挙げられ、これらの１種を単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００３５】
前記消炎・抗アレルギー剤としては、例えば、アズレン、アラントイン、アミノカプロン酸、インドメタシン、塩化リゾチーム、イプシロンアミノカプロン酸、オキシベンゾン、グリチルリチン酸又はその誘導体、グリチルレチン酸又はその誘導体、感光素３０１号、感光素４０１号、塩酸ジフェンヒドラミン、トラネキサム酸又はその誘導体、アデノシンリン酸、エストラジオール、エスロン、エチニルエストラジオール、コルチゾン、ヒドロコルチゾン、プレドニゾン、プロゲステロン、コルチコステロン、アルニカエキス、インチンコウエキス、サンシシエキス、ジュウヤクエキス、セイヨウトチノキエキス、カンゾウエキス、トウキエキス、ヨモギエキス、ワレモコウエキス、リンドウエキス、サイコエキス、センキュウエキス、ボウフウエキス、セイヨウノコギリソウエキス、オウレンエキス、シソエキス、などが挙げられ、これらの１種を単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００３６】
前記抗酸化・活性酸素消去剤としては、例えば、ジブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソール、没食子酸プロピル、バイカリン、バイカレイン、スーパーオキサイドディスムターゼ、カタラーゼ、ローズマリーエキス、メリッサエキス、オウゴンエキス、エイジツエキス、ビワ葉エキス、ホップエキス、ハマメリスエキス、シャクヤクエキス、セージエキス、キナエキス、カミツレエキス、ユーカリエキス、シソエキス、イチョウ葉エキス、タイムエキス、カルダモンエキス、キャラウェイエキス、ナツメグエキス、メースエキス、ローレルエキス、クローブエキス、ターメリックエキス、ヤナギタデエキス、などが挙げられ、これらの１種を単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００３７】
また、黄皮の葉の抽出物を配合した皮膚外用剤を製造する場合、他の化粧料製造原料の選択が制限されることはほとんどなく、一般的な化粧料基材や助剤である、油脂類、ロウ類、炭化水素類、脂肪酸類、アルコール類、エステル類、界面活性剤、香料、などをいずれも使用可能である。
【００３８】
＜コラーゲン産生促進作用及び抗炎症作用を有する美容飲食品＞
本発明の美容用飲食品は、前記本発明の黄皮の葉の抽出物を含有し、コラーゲン産生促進作用及び抗炎症作用（ホスホリパーゼＡ２活性阻害作用、血小板凝集抑制作用）を有し、それぞれの作用を通じて皮膚の老化を防止及び／又は改善することができるので、美容飲食品に配合するのに好適である。ここで、「美容飲食品」とは、美肌又は皮膚の老化防止・改善を図ることを目的とした飲食物を意味する。
【００３９】
前記美容飲食品は、前記本発明のコラーゲン産生促進剤、ホスホリパーゼＡ２活性阻害剤、及び血小板凝集抑制剤をその活性を妨げないような任意の飲食品に配合したものであってもよいし、本発明のコラーゲン産生促進剤、ホスホリパーゼＡ２活性阻害剤、及び血小板凝集抑制剤を主成分とする栄養補助食品であってもよい。
【００４０】
本発明のコラーゲン産生促進剤、ホスホリパーゼＡ２活性阻害剤、及び血小板凝集抑制剤を配合して美容飲食品を製造する際には、例えば、デキストリン、デンプン等の糖類；ゼラチン、大豆タンパク、トウモロコシタンパク等のタンパク質；アラニン、グルタミン、イソロイシン等のアミノ酸類；セルロース、アラビアゴム等の多糖類；大豆油、中鎖脂肪酸トリグリセリド等の油脂類等の任意の助剤を添加して任意の剤形に製剤化することができる。
【００４１】
本発明の美容飲食品におけるコラーゲン産生促進剤、ホスホリパーゼＡ２活性阻害剤、及び血小板凝集抑制剤の配合量は、添加対象飲食品の一般的な摂取量を考慮して成人一日当たり黄皮の葉の抽出物の摂取量が１日当たり約１〜１０００ｍｇ程度となるように調整することが好ましい。
【００４２】
前記美容飲食品の具体例としては、例えば、清涼飲料、炭酸飲料、栄養飲料、果実飲料、乳酸飲料等の飲料（これら飲料の濃縮液及び調整用粉末を含む）；アイスクリーム、アイスシャーベット、かき氷等の氷菓；そば、うどん、はるさめ、ぎょうざの皮、シュウマイの皮、中華麺、即席麺等の麺類；飴、キャンディー、ガム、チョコレート、スナック菓子、ビスケット、ゼリー、ジャム、クリーム、焼き菓子等の菓子類；かまぼこ、ハム、ソーセージ等の水産・畜産加工食品；加工乳、発酵乳等の乳製品；サラダ油、天ぷら油、マーガリン、マヨネーズ、ショートニング、ホイップクリーム、ドレッシング等の油脂及び油脂加工食品；ソース、たれ等の調味料；錠剤状、顆粒状等の種々の形態の健康・栄養補助食品類；その他スープ、シチュー、サラダ、惣菜、漬物などを例示することができる。
【００４３】
以上に説明した本発明のコラーゲン産生促進剤、ホスホリパーゼＡ２活性阻害剤、及び血小板凝集抑制剤、並びにコラーゲン産生促進作用及び抗炎症作用を有する皮膚外用剤及び美容飲食品は、ヒトに対して好適に適用されるものであるが、本発明の作用効果が奏される限り、ヒト以外の動物に対して適用できるものである。
【００４４】
【実施例】
以下、実施例を示して本発明を更に詳細に説明する。なお、本発明の範囲はこれらの実施例等に何ら限定されるものではない。
【００４５】
〔製造例１〕
ミカン科ワンピ属の黄皮の葉の乾燥物を細切りしたもの１００ｇを抽出溶媒１０００ｍＬに投入し、穏やかに攪拌しながら３時間、７０℃に保った後、ろ過し、得られたろ液を４０℃で減圧下にて濃縮し、更に、減圧乾燥機で乾燥して黄皮の葉の抽出物を得た。
抽出溶媒として、下記表１に示す４種類を用いて上記抽出処理を行い試料Ｎｏ．１〜４の黄皮の葉の抽出物を得た。各黄皮の葉抽出物の収率を表１に示した。
【００４６】
【表１】
2004075627.tif 000002
【００４７】
〔実施例１〕　＜コラーゲン産生促進作用の試験＞
製造例１で得られた試料Ｎｏ．１〜４の黄皮の葉の抽出物について、コラーゲン産生促進作用の試験を行った。Ｗｅｂｓｔｅｒらの方法（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．９６，２２０，１９７９）に準拠して、以下のようにして試験を行った。
【００４８】
ヒトの線維芽細胞を２４ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅに播種し、３７℃、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒの下にて、各試料添加培地（試料濃度：２００ｐｐｍ及び５０ｐｐｍ）で２４時間培養した後、β−アミノプロピオニトリルと［３Ｈ］−プロリンとを添加し、更に２４時間培養した。当該培養液全体にペプシン／酢酸溶液を加えて４℃下で１６時間消化した。
次いで、この消化液にキャリアーを加えて２５％食塩／酢酸溶液で沈殿させた。更に、中性条件下で再溶解させて、４．５ｍｏｌ／Ｌ食塩水溶液で再沈殿させた。得られた沈殿物を２０％エタノールで洗浄した後、その沈殿物の放射活性を測定した。
コラーゲン産生促進活性比は、対照群についても同様な操作を行い、放射活性比により算出した。各試料のコラーゲン産生促進活性比（％）を表２に示す。
【００４９】
【表２】
2004075627.tif 000003
【００５０】
〔実施例２〕　＜ホスホリパーゼＡ２活性阻害作用の試験＞
ラット白血病細胞のＲＢＬ−２Ｈ３細胞を７５ｃｍ２のフラスコで１５ｖ／ｖ％ＦＢＳ含有ＭＥＭ培地にて３７℃、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒの下で培養し、常法により細胞を集めた。得られた細胞を１５ｖ／ｖ％ＦＢＳ含有ＭＥＭ培地にて５×１０５個／ｍＬになるよう調製した。更に、〔３Ｈ〕アラキドン酸（５０μＣｉ／５００μＬ）を、３μＬ／１０ｍＬの割合で加えた。得られた調製液を２４穴プレートに１ｍＬ播種し、３７℃、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒの下で一晩培養した。各ｗｅｌｌ中の培地を捨て、ＰＢＳ（−）で洗浄後、無血清ＭＥＭ培地を加え、３７℃で３０分間、インキュベーションした。
【００５１】
次いで、製造例１で得られた試料Ｎｏ．１〜４の黄皮の葉の抽出物を溶解した溶液（試料溶液）を各穴に加え、同様に１０分間インキュベーションした。更に、１ｍｍｏｌ／Ｌ　Ａ２３１８７　１０μＬを加え、３７℃で５分間インキュベーションした。反応後、水冷下に上清４００μＬを取り、シンチレーションカクテル６ｍＬを加えて液体シンチレーションカウンターで放射活性を測定した。同様にして、空試験（Ａ２３１８７刺激なし）及びコントロール（試料溶液の溶媒）について測定し、下記式によりホスホリパーゼＡ２活性阻害率を求めた。
【００５２】
＜数式１＞
ホスホリパーゼＡ２活性阻害率（％）＝〔（Ｂ−Ａ）／（Ｂ−Ｃ）〕×１００
但し、式中、Ａは、試料添加時の放射活性を意味する。Ｂは、コントロールの放射活性を意味する。Ｃは、空試験の放射活性を意味する。
【００５３】
次に、試料濃度を段階的に減少させて上記測定を行い、ホスホリパーゼＡ２活性阻害率が５０％になる試料濃度ＩＣ５０（ｐｐｍ）を内挿法により求めた（ＩＣ５０値が小さいほどホスホリパーゼＡ２活性阻害作用が強いことを表す）。結果を表３に示す。
【００５４】
【表３】
2004075627.tif 000004
【００５５】
〔実施例３〕　＜血小板凝集抑制作用の試験＞
日本種白色家兎の血液に７７ｍｍｏｌ／Ｌ　ＥＤＴＡを血液量の１／１０容量添加し、１０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して沈殿物を除いた。上清を２１００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、沈殿した血小板を採取した。得られた血小板を血小板洗浄液に浮遊させ、２１００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。沈殿した血小板を採取し、血小板数が３０万個／μＬになるように血小板浮遊液に浮遊させた。
【００５６】
上述のようにして調製した洗浄血小板浮遊液２２３μＬに塩化カルシウム溶液１μＬを加え、３７℃に１分間インキュベーションした。そこに、製造例１で得られた試料Ｎｏ．１〜４の抽出物を溶解した溶液（試料溶液）２〜４０μＬを加えて、更に２分間インキュベーションした後、１分間攪拌した。次いで、凝集惹起剤として１０ｐｐｍコラーゲン溶液２５μＬを添加し、３７℃で１０分間インキュベーションした後、血小板凝集測定装置　ＰＡＭ１２ＣＬ（メバニクス株式会社製）を用いて、凝集率Ａを測定した。別に、試料溶液の代わりに試料溶液の溶媒を添加し、上記と同様に操作し、凝集率Ｂを測定し、下記式により血小板擬集抑制率を求めた。
【００５７】
＜数式２＞
血小板凝集抑制率（％）＝｛（Ｂ−Ａ）／Ｂ｝×１００
但し、式中、Ａは、凝集惹起剤添加、試料溶液添加時の凝集率を意味する。Ｂは、凝集惹起剤添加、試料溶液無添加時の凝集率を意味する。
【００５８】
次に、各試料溶液の濃度を段階的に減少させて上記血小板凝集率を測定し、抑制率が５０％になる試料濃度ＩＣ５０（ｐｐｍ）を内挿法により求めた（ＩＣ５０値が小さいほど血小板凝集抑制作用が強いことを表す）。結果を表４に示す。
【００５９】
【表４】
2004075627.tif 000005
【００６０】
〔実施例４〕　乳液
下記の組成のコラーゲン産生促進作用及び抗炎症作用を有する乳液を常法により製造した。
ホホバオイル　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　４ｇ
オリーブオイル　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２ｇ
スクワラン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２ｇ
セタノール　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２ｇ
モノステアリン酸グリセリル　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２ｇ
ポリオキシエチレンセチルエーテル（２０Ｅ．Ｏ）　　　　　　　　２．５ｇ
オレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（２０Ｅ．Ｏ）　　　　　　　　　２ｇ
１，３−ブチレングリコール　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　３ｇ
パラオキシ安息香酸メチル　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．１５ｇ
アスコルビン酸リン酸マグネシウム　　　　　　　　　　　　　　　０．１ｇ
黄杞エキス　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．１ｇ
イチョウ葉エキス　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．１ｇ
コンキオリン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．１ｇ
オウバクエキス　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．１ｇ
カミツレエキス　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．１ｇ
グリチルリチン酸ジカリウム　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．１ｇ
香料　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．０５ｇ
黄皮の葉の抽出物（試料Ｎｏ．１）　　　　　　　　　　　　　　　　　１ｇ
精製水　　　　　　　　　　　　　　　　　　残部（全量を１００ｇとする）
【００６１】
〔実施例５〕　化粧水
下記の組成のコラーゲン産生促進作用及び抗炎症作用を有する化粧水を常法により製造した。
グリセリン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　３ｇ
１，３−ブチレングリコール　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　３ｇ
オレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（２０Ｅ．Ｏ）　　　　　　０．５ｇ
パラオキシ安息香酸メチル　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．１５ｇ
クエン酸　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．１ｇ
クエン酸ソーダ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．１ｇ
油溶性甘草エキス　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．１ｇ
海藻エキス　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．１ｇ
キシロビオースミクスチャー　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．５ｇ
クジンエキス　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．１ｇ
香料　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．０５ｇ
黄皮の葉の抽出物（試料Ｎｏ．２）　　　　　　　　　　　　　　　　　２ｇ
精製水　　　　　　　　　　　　　　　　　　残部（全量を１００ｇとする）
【００６２】
〔実施例６〕　クリーム
下記の組成のコラーゲン産生促進作用及び抗炎症作用を有するクリームを常法により製造した。
流動パラフィン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　５ｇ
サラシミツロウ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　４ｇ
セタノール　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　３ｇ
スクワラン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０ｇ
ラノリン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２ｇ
ステアリン酸　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１ｇ
オレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（２０Ｅ．Ｏ）　　　　　　０．１５ｇ
モノステアリン酸グリセリル　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　３ｇ
１，３−ブチレングリコール　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　６ｇ
パラオキシ安息香酸メチル　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．１５ｇ
レチノイン酸　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．１ｇ
酵母エキス　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．１ｇ
シソエキス　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．１ｇ
シナノキエキス　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．１ｇ
ジユエキス　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．１ｇ
香料　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．１ｇ
黄皮の葉の抽出物（試料Ｎｏ．３）　　　　　　　　　　　　　　　　　１ｇ
精製水　　　　　　　　　　　　　　　　　　残部（全量を１００ｇとする）
【００６３】
〔実施例７〕　パック
下記の組成のコラーゲン産生促進作用及び抗炎症作用を有するパックを常法により製造した。
ポリビニルアルコール　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１５ｇ
ポリエチレングリコール　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　３ｇ
プロピレングリコール　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　７ｇ
エタノール　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０ｇ
パラオキシ安息香酸エチル　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．０５ｇ
酢酸トコフェロール　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．１ｇ
セージエキス　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．１ｇ
トウキエキス　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．１ｇ
ニンジンエキス　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．１ｇ
香料　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．０５ｇ
黄皮の葉の抽出物（試料Ｎｏ．１）　　　　　　　　　　　　　　　　　５ｇ
精製水　　　　　　　　　　　　　　　　　　残部（全量を１００ｇとする）
【００６４】
〔実施例８〕　飴
下記の原料から常法によりコラーゲン産生促進作用及び抗炎症作用を有する飴を製造した。
ショ糖　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　７０質量部
水飴　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　３０質量部
クエン酸　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１質量部
香料　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．１質量部
黄皮の葉の抽出物（試料Ｎｏ．１）　　　　　　　　　　　　　０．１質量部
【００６５】
〔実施例９〕　チューインガム
下記の原料から常法によりコラーゲン産生促進作用及び抗炎症作用を有するチューインガムを製造した。
チューインガムベース　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　７０質量部
ショ糖　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　５４質量部
水飴　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０質量部
軟化剤　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　４質量部
香料（ハッカ油）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１質量部
黄皮の葉の抽出物（試料Ｎｏ．４）　　　　　　　　　　　　　　　１質量部
【００６６】
〔実施例１０〕　錠剤状栄養補助食品
下記の混合物を打錠して、コラーゲン産生促進作用及び抗炎症作用を有する錠剤状の栄養補助食品を製造した。
黄皮の葉の抽出物（試料Ｎｏ．３）　　　　　　　　　　　　　　５０質量部
粉糖（ショ糖）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１８８質量部
グリセリン脂肪酸エステル　　　　　　　　　　　　　　　　　　１２質量部
【００６７】
〔実施例１１〕　顆粒状栄養補助食品
下記の混合物を顆粒状に形成して、コラーゲン産生促進作用及び抗炎症作用を有する顆粒状栄養補助食品を製造した。
黄皮の葉の抽出物（試料Ｎｏ．１）　　　　　　　　　　　　　　３０質量部
ビートオリゴ糖　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０００質量部
ビタミンＣ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１６７質量部
ステビア抽出物　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０質量部
【００６８】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明によれば、ミカン科ワンピ属の黄皮の葉の抽出物を有効成分として含有する、コラーゲン産生促進剤、ホスホリパーゼＡ２活性阻害剤、血小板凝集抑制剤、及びコラーゲン産生促進作用及び抗炎症作用を有する皮膚外用剤が提供される。
従って、本発明のコラーゲン産生促進剤によれば、真皮線維芽細胞におけるコラーゲンの産生を促進して皮膚の老化を防止及び／又は改善できる。また、本発明のホスホリパーゼＡ２活性阻害剤によれば、ホスホリパーゼＡ２が関与する種々の皮膚疾患、肌荒れ、炎症等を予防又は改善することができる。また、本発明の血小板凝集抑制剤によれば、血小板凝集が関与する種々の皮膚疾患、肌荒れ、炎症等を予防又は改善することができる。また、本発明のコラーゲン産生促進作用及び抗炎症作用を有する皮膚外用剤及び美容飲食品によれば、特に、皮膚の老化を防止及び／又は改善できる。