【手続補正書】
【提出日】平成23年12月12日(2011.12.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞培養物中で弱毒化した水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）を産生する方法であって、
ＲＮＡあるいはコドンを最適化したＶＳＶ  Ｇタンパク質をコードする核酸配列を含む細胞を提供すること、ここで、当該最適化核酸配列からＶＳＶ  Ｇタンパク質の発現が誘導可能である、
前記最適化核酸配列からＶＳＶ  Ｇタンパク質が発現されるように、細胞を誘導することと、
誘導した細胞を弱毒化したＶＳＶで感染させることと、
感染した細胞を培養で成長させることと、
弱毒化したＶＳＶを培養物から回収することと
を含む方法。
【請求項２】
弱毒化したＶＳＶが繁殖欠損ＶＳＶである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
細胞が、ＶＳＶ  Ｇタンパク質の発現を制御するための熱ショック誘導可能な転写制御配列を有する核酸、または、ＶＳＶ  Ｇタンパク質の発現を制御するための熱ショック誘導可能な転写制御配列を有する核酸であって、当該熱ショック誘導可能な転写制御配列が、最小限のｈＣＭＶプロモーターの５’側に位置する複数コピーの熱ショックエレメントを含むハイブリッドプロモーターを含有する、を含む、請求項１または２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
熱ショック誘導可能な転写制御配列が、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによって認識され、熱誘導の際に機能的なｍＲＮＡを生じる転写単位を調節する、または、熱ショックエレメントが、５’−ＧＡＡｎｎＴＴＣ−３’（配列番号７）、５’−ＧＡＡＣＧＴＴＣ−３’（配列番号８）、５’−ＧＡＡＧＣＴＴＣ−３’（配列番号９）、５’−ＧＡＡＡＴＴＴＣ−３’（配列番号１０）、５’−ＧＡＡＴＡＴＴＣ−３’（配列番号１１）もしくはその組合せからなる請求項３に記載の方法。
【請求項５】
最小限のｈＣＭＶプロモーターが配列番号１２によって表される、請求項３または４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
熱ショック誘導可能な転写制御配列が配列番号６によって表される、請求項３から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
弱毒化したＶＳＶが、異種抗原、病原体由来の異種抗原、または、病原体由来の異種抗原であって、病原体が、麻疹ウイルス、サブグループＡおよびサブグループＢの呼吸器合胞体ウイルス、ヒトパラインフルエンザウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、１型または２型のヒトパピローマウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、狂犬病ウイルス、ヒトメタニューモウイルス、エプスタインバーウイルス、フィロウイルス、ブンヤウイルス、フラビウイルス、アルファウイルスまたはインフルエンザウイルスから選択される、をコードしている、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
弱毒化したＶＳＶが、サイトカイン、Ｔ−ヘルパーエピトープ、制限部位マーカー、または哺乳動物宿主において免疫応答を誘発することができる微生物病原体もしくは寄生生物のタンパク質から選択される、非ウイルス分子をさらにコードしている、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
細胞が適格な産生細胞、または、Ｖｅｒｏ細胞である、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
最適化したＶＳＶ  Ｇ遺伝子が、インディアナ血清型またはニュージャージー血清型に由来する、または、配列番号３、配列番号４および配列番号５からなる群から選択される、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
弱毒化したＶＳＶが、ＶＳＶ  Ｇタンパク質を欠く（ＶＳＶ−ΔＧ）、
切断された細胞外ドメインを有するＧタンパク質を発現する（ＶＳＶ−Ｇｓｔｅｍ）、
切断された細胞質尾部（ＣＴ）領域を有するＧタンパク質を発現する、
１個のアミノ酸に切断された細胞質尾部領域を有するＧタンパク質（Ｇ−ＣＴ１）を発現する、または、
９個のアミノ酸に切断された細胞質尾部領域を有するＧタンパク質（Ｇ−ＣＴ９）を発現する、
請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
弱毒化したＶＳＶが、ウイルスゲノム中のその野生型の位置から下流に転座しているＮ遺伝子を含み、それによってＮタンパク質発現が低下させる、または、非細胞変性性Ｍ遺伝子突然変異（Ｍｎｃｐ）を含み、前記突然変異が、内部ＡＵＧでタンパク質合成を開始すること、ＩＦＮ誘導に影響を与えること、核輸送に影響を与えること、もしくはその組合せによって、Ｍタンパク質のｍＲＮＡから発現される２つの重複するインフレームのポリペプチドの発現を低下させる、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
細胞培養物中で弱毒化した水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）を産生する方法であって、
ＲＮＡあるいはコドンを最適化したＶＳＶ  Ｇタンパク質をコードする核酸配列を含む細胞を提供すること、ここで、当該最適化核酸配列からＶＳＶ  Ｇタンパク質の発現が誘導可能である、
前記最適化した核酸配列を含む細胞を、弱毒化したＶＳＶのゲノムまたはアンチゲノムをコードしているポリヌクレオチドを含むウイルスｃＤＮＡ発現ベクター、ＶＳＶのＮ、Ｐ、ＬおよびＧタンパク質をコードしている１つまたは複数の支持プラスミド、およびＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードしているプラスミドで形質転換することと、
前記最適化した核酸配列からＶＳＶ  Ｇタンパク質が発現されるように、形質転換した細胞を誘導することと、
誘導した細胞を培養で成長させることと、
弱毒化したＶＳＶを培養物から回収することと
を含む方法。
【請求項１４】
細胞を、ＶＳＶのＭタンパク質をコードしている支持プラスミドでさらに形質移入する、または、弱毒化したＶＳＶが繁殖欠損ＶＳＶであり、および、細胞をＶＳＶのＭタンパク質をコードしている支持プラスミドで形質移入する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１３または１４のいずれか一項に記載の方法であって、
ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼがＴ７  ＲＮＡポリメラーゼであり、ウイルスｃＤＮＡ発現ベクターおよび支持プラスミドがＴ７プロモーターの制御下にある、およびまたは、
ＲＮＡが、弱毒化したＶＳＶのゲノムまたはアンチゲノムをコードしているポリヌクレオチドから転写される、およびまたは、
支持プラスミドによってコードされているＧタンパク質が、ＲＮＡあるいはコドンを最適化していないＶＳＶ  Ｇ遺伝子をコードする核酸配列によってコードされている、およびまたは、
前記最適化した核酸配列からのＶＳＶ  Ｇタンパク質の発現が、サイトメガロウイルスに由来するＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターの制御下にある、およびまたは、
前記最適化した核酸配列がインディアナ血清型またはニュージャージー血清型に由来する、およびまたは、
細胞が電気穿孔によって形質転換される、およびまたは、
弱毒化したＶＳＶが異種抗原をコードしている、およびまたは、
最適化したＶＳＶ  Ｇ遺伝子が、配列番号３、配列番号４および配列番号５からなる群から選択される、およびまたは、
弱毒化したＶＳＶがＶＳＶ  Ｇタンパク質を欠く（ＶＳＶ−ΔＧ）、もしくは、切断された細胞外ドメインを有するＧタンパク質を発現する（ＶＳＶ−Ｇｓｔｅｍ）、およびまたは、
細胞が、ＶＳＶ  Ｇタンパク質の発現を制御するための熱ショック誘導可能な転写制御配列を有する核酸、もしくは、ＶＳＶ  Ｇタンパク質の発現を制御するための熱ショック誘導可能な転写制御配列を有する核酸であって、当該熱ショック誘導可能な転写制御配列が、最小限のｈＣＭＶプロモーターの５’側に位置する複数コピーの熱ショックエレメントを含むハイブリッドプロモーターを含有する、もしくは、ＶＳＶ  Ｇタンパク質の発現を制御するための熱ショック誘導可能な転写制御配列を有する核酸であって、当該熱ショック誘導可能な転写制御配列が、最小限のｈＣＭＶプロモーターの５’側に位置する複数コピーの熱ショックエレメントを含むハイブリッドプロモーターを含有し、熱ショックエレメントが、５’−ＧＡＡｎｎＴＴＣ−３’（配列番号７）、５’−ＧＡＡＣＧＴＴＣ−３’（配列番号８）、５’−ＧＡＡＧＣＴＴＣ−３’（配列番号９）、５’−ＧＡＡＡＴＴＴＣ−３’（配列番号１０）、５’−ＧＡＡＴＡＴＴＣ−３’（配列番号１１）もしくはその組合せからなる、を含む、およびまたは、
最小限のｈＣＭＶプロモーターが配列番号１２によって表される、およびまたは、
熱ショック誘導可能な転写制御配列が配列番号６によって表される、
方法。
【請求項１６】
繁殖欠損水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）のパッケージングを改善する方法であって、
ａ）ＲＮＡあるいはコドンを最適化したＶＳＶ  Ｇタンパク質をコードする核酸配列を含む細胞を提供すること、ここで、当該最適化核酸配列からＶＳＶ  Ｇタンパク質の発現が誘導可能である、、
ｂ）前記最適化核酸配列からＶＳＶ  Ｇタンパク質が発現されるように、細胞を誘導することと、
ｃ）繁殖欠損ＶＳＶを細胞内に導入することと、
ｄ）細胞を培養で成長させることと、
ｅ）パッケージングされたＶＳＶを培養物から回収することと
を含む方法。
【請求項１７】
薬学的に許容できる担体中に、請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法に従って産生した、免疫原性的に有効な量の弱毒化したＶＳＶを含む免疫原性組成物。
【請求項１８】
単離した細胞であって、ＲＮＡあるいはコドンを最適化したＶＳＶ  Ｇタンパク質をコードする核酸配列を含む、または、
熱ショック誘導可能な転写制御配列に作動可能に連結し、ＲＮＡあるいはコドンを最適化したＶＳＶ  Ｇタンパク質をコードする核酸配列を含む、または、
温度の上昇に曝された場合にＶＳＶ  Ｇタンパク質を発現する、または、
約３９℃〜約４５℃の温度に曝された場合にＶＳＶ  Ｇタンパク質を発現する、または、
約３０分間〜約６時間の間、約３９℃〜約４５℃の温度に曝された場合に、ＶＳＶ  Ｇタンパク質を発現する、
前記細胞。
【請求項１９】
転写制御配列がハイブリッド熱ショックエレメント（ＨＳＥ）／ＣＭＶプロモーターを含む、または、
転写制御配列がハイブリッド熱ショックエレメント（ＨＳＥ）／ＣＭＶプロモーターを含み、ここで当該ハイブリッドプロモーターが、最小限のｈＣＭＶプロモーターの５’側に位置する複数コピーの熱ショックエレメントを含む、または、
転写制御配列がハイブリッド熱ショックエレメント（ＨＳＥ）／ＣＭＶプロモーターを含み、ここで当該ハイブリッドプロモーターが、最小限のｈＣＭＶプロモーターの５’側に位置する複数コピーの熱ショックエレメントを含み、ここで、当該熱ショックエレメントが５’−ＧＡＡｎｎＴＴＣ−３’（配列番号７）である、または、
転写制御配列がハイブリッド熱ショックエレメント（ＨＳＥ）／ＣＭＶプロモーターを含み、ここで当該ハイブリッドプロモーターが、最小限のｈＣＭＶプロモーターの５’側に位置する複数コピーの熱ショックエレメントを含み、ここで、当該熱ショックエレメントが、５’−ＧＡＡＣＧＴＴＣ−３’（配列番号８）、５’−ＧＡＡＧＣＴＴＣ−３’（配列番号９）、５’−ＧＡＡＡＴＴＴＣ−３’（配列番号１０）、５’−ＧＡＡＴＡＴＴＣ−３’（配列番号１１）およびその組合せからなる群から選択される、または、
転写制御配列がハイブリッド熱ショックエレメント（ＨＳＥ）／ＣＭＶプロモーターを含み、ここで当該ＣＭＶプロモーターが配列番号１２によって表される、または、
転写制御配列が配列番号６によって表される、または、
ＲＮＡあるいはコドンを最適化したＶＳＶ  Ｇタンパク質をコードする核酸配列が、配列番号３、配列番号４および配列番号５からなる群から選択される、
請求項１８に記載の細胞。
【請求項２０】
配列番号６によって表される転写制御配列。
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
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