(57)【要約】  【課題】  ＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼを安定化させる。  【解決手段】  カルシウムイオンまたはカルシウム塩を含有するＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ組成物、ならびに、ＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ、カルシウムイオンまたはカルシウム塩、さらに電子受容体および緩衝液を含有するグルコース測定用試薬組成物。  【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
カルシウムイオンまたはカルシウム塩を含有するＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ組成物。
【請求項２】
カルシウム塩が、塩化カルシウムまたは酢酸カルシウムもしくはクエン酸カルシウムである請求項１記載のＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ組成物。
【請求項３】
ＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼが、アセトバクター・カルコアセティカス由来のＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼである請求項１記載のＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ組成物。
【請求項４】
さらに血清アルブミンを含有する請求項１記載のＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ組成物。
【請求項５】
ＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ、カルシウムイオンまたはカルシウム塩、さらに電子受容体および緩衝液を含有するグルコース測定用試薬組成物。
【請求項６】
カルシウム塩が、塩化カルシウムまたは酢酸カルシウムもしくはクエン酸カルシウムである請求項５記載のグルコース測定用試薬組成物。
【請求項７】
ＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼが、アセトバクター・カルコアセティカス由来のＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼである請求項５記載のグルコース測定用試薬組成物。
【請求項８】
さらに血清アルブミンを含有する請求項５記載のグルコース測定用試薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は安定化されたＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ組成物および該組成物を使用するグルコース測定用試薬組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
血清、尿などの検体中のグルコース測定法としては、従来から化学法と酵素法が存在するが、一般的に特異性、安全性の面で酵素法が優れているとされている。酵素法としては、グルコースオキシダーゼ・ペルオキシダーゼ系、ヘキソキナーゼ・グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ系が主に使用されているが、両測定系とも、複数の酵素を用いるため簡便な反応系ではない。更に前者（グルコースオキシダーゼ・ペルオキシダーゼ系）は、過酸化水素が共存物質の影響を受けやすく、溶存酸素が律速のときには使用するのが困難になる。後者（ヘキソキナーゼ・グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ系）では補酵素としてＮＡＤ＋  が必要であり、更に平衡反応が含まれているため、微量のグルコースを測定しにくい欠点が存在する。
【０００３】
補酵素として、ＰＱＱを必要とするＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼをグルコース測定系に使用することは、上記他の酵素を使用する問題点を解決する一つの方法である。特にグルコースを電気センサーを使用して測定することを考えた場合、グルコースオキシダーゼを用いる系では、酸素濃度の影響を受けるが、ＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼでは影響を受けない利点を有する。何故なら、該酵素は下記の反応を触媒し、グルコースより得た電子を電子受容体に受け渡す反応を触媒する酵素であるから。
【０００４】
グルコース  ＋  電子受容体  →  グルコノラクトン  ＋  還元型電子受容体              
【０００５】
ここで、電子受容体としては、フェリシアニド、電子キャリアと２，６−ジクロロフェノールインドフェノールの組み合わせ、電子キャリアとテトラゾリウム塩の組み合わせなどが挙げられる。
【０００６】
本発明に使用するＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼとは、補酵素として、ＰＱＱを必要とする酵素であり、例えばアシネトバクター・カルコアセティカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）ＮＣＩＢ１１５１７、アシネトバクター・カルコアセティカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）  ＩＦＯ１２５５２、ＩＦＯ１３００６などから生産される。
【０００７】
該酵素を利用するグルコースの定量は、検体中のグルコースに電子受容体の存在下にＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼを作用させ、生成する還元型電子受容体を測定する方法などにより行われる（たとえば、非特許文献１を参照。）。
【非特許文献１】Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．８９  （１９８２）  ｐ２０（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
このようなＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼの有する問題点は、グルコースオキシダーゼやヘキソキナーゼと比較すると、その安定性にあり、精製した酵素標品を臨床検査薬に添加しても、酵素の失活が著しく、試薬の劣化が激しいため保存が困難であると同時に測定値への影響も大きく実用上問題となっていた。また該酵素の安定化剤としては、ＰＱＱを添加することが効果があるとされているが、ＰＱＱは非常に高価であり、産業上、その添加は難しい（たとえば、非特許文献２を参照。）。
【非特許文献２】Ａｒｃｈ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．，  ２１８，  ６２３−６２５  （１９８２）
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者等はＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼの安定化剤について、種々鋭意検討したところ、カルシウムイオンを使用すると安定化効果が高いことを見いだし、本発明に達した。
【００１０】
すなわち、本発明はカルシウムイオンまたはカルシウム塩を含有するＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ組成物である。
【００１１】
また本発明は、ＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ、カルシウムイオンまたはカルシウム塩、さらに電子受容体および緩衝液を含有するグルコース測定用試薬組成物である。
【発明の効果】
【００１２】
本発明ではより安価で、安定性に優れたＰＱＱグルコースデヒドロゲナーゼ組成物を得ることができる。また、この組成物を使用して、グルコース測定を溶存酸素の制約を受けずに、正確に測定することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明において、ＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼとは、補酵素として、ＰＱＱを必要とする酵素であり、例えばアシネトバクター・カルコアセティカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）ＮＣＩＢ１１５１７、アシネトバクター・カルコアセティカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）  ＩＦＯ１２５５２、ＩＦＯ１３００６などから生産される。
【００１４】
この酵素の１つとして、理化学的性質が、例えば分子量：約５５，０００（ゲル濾過法）、Ｋｍ値：７．９×１０−２Ｍ（Ｄ−グルコース）、至適ｐＨ：ｐＨ６〜７、至適温度：３７℃、ｐＨ安定性：ｐＨ６〜７、熱安定性：３０℃以下であるものが例示される。
【００１５】
本発明では、上記酵素に、カルシウムイオンまたはカルシウム塩を含有させる。本発明の酵素組成物は、これらの安定化剤を含有するものであれば、水性組成物、凍結乾燥物を問わない。
【００１６】
カルシウムイオンの供給形態としては、塩化カルシウム、酢酸カルシウム、クエン酸カルシウム等の無機酸または有機酸のカルシウム塩を挙げることができる。また、水性組成物において、カルシウムイオンの含有量は、１×１０-4〜１×１０-2Ｍであることが好ましい。
【００１７】
本発明では好ましくは、カルシウムイオンまたはカルシウム塩のほかに、グルタミン酸、グルタミンおよびリジンからなる群から選択されるアミノ酸を添加することができる。これらのアミノ酸は、１種または２種以上であってもよい。前記の水性組成物において、グルタミン酸、グルタミンおよびリジンからなる群から選択されたアミノ酸の含有量は、０．０１〜０．２重量％であることが好ましい。また前記の水性組成物に血清アルブミンを添加する場合、その含有量は０．０５〜０．５重量％であることが好ましい。
【００１８】
本発明ではカルシウムイオンまたはカルシウム塩を含有させた場合、安定性を向上させる効果が見られるが、上記アミノ酸を含有させることにより、グルコースデヒドロゲナーゼの安定性がさらに上昇する。
【００１９】
緩衝剤としては、通常のものが使用され、通常、組成物のｐＨを５〜１０とするものが好ましい。具体的にはトリス塩酸、ホウ酸、グッド緩衝液が用いられるが、カルシウムと不溶性の塩を形成しない緩衝液はすべて使用できる。
【００２０】
前記の水性組成物には、必要により他の成分、例えば界面活性剤、安定化剤、賦形剤などを添加しても良い。
【００２１】
水性組成物を調製する場合、緩衝液への各安定剤の添加順序は、特に制限されない。本発明の凍結乾燥物は、通常の方法に従い、前記水性組成物を凍結乾燥して得る。
【００２２】
なお、ＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ活性の測定は、次の方法に従った。
【００２３】
５０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ緩衝液、ｐＨ６．５  ２５．５ｍｌ、３．０ｍＭ  ＰＭＳ  ２．０ｍｌ、６．６ｍＭ  ＮＴＢ  １．０ｍｌおよび１Ｍ  グルコースを含む６．３％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００  ０．９ｍｌを混合する。この混合液を３７℃で５分間インキュベートした後、酵素液を０．１ｍｌ添加し、混和後、水を対照に３７℃に制御された分光光度計で５７０ｎｍの吸光度変化を４〜５分間記録し、その初期直線部分から１分間当たりの吸光度変化を求める。１分間に１マイクロモルのグルコースを酸化する酵素量を１単位（Ｕ）とする。
【００２４】
本発明のグルコース測定用試薬組成物とは、ＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼとカルシウムまたはカルシウム塩、さらに電子受容体および緩衝液を含有するものである。電子受容体としては、フェリシアニド、電子キャリアと２，６−ジクロロフェノールインドフェノールの組み合わせ、電子キャリアとテトラゾリウム塩の組み合わせなどが挙げられる。また、緩衝液としては、通常のものが使用され、通常、組成物のｐＨを５〜１０とするものが好ましい。具体的にはトリス塩酸、ホウ酸、グッド緩衝液が用いられるが、カルシウムと不溶性の塩を形成しない緩衝液はすべて使用できる。
【００２５】
本発明のグルコース測定用試薬を用いて、検体中のグルコースを測定する方法としては、検体を本発明のグルコース測定用試薬と接触させ、生成した還元型電子受容体を比色法、電気センサー等で検出する方法などがある。
【００２６】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に示す。
【実施例１】
【００２７】
下記成分を水道水６Ｌに溶解し、ｐＨを７．０に調整した後、オートクレーブで１２１℃、２０分間滅菌して、培地を得た。
【００２８】
グルコース      ６０ｇ
ポリペプトン  １８０ｇ
酵母エキス      ３０ｇ
ＮａＣｌ        ６０ｇ
上記培地の入った１０Ｌジャーファーメンターに、アシネトバクター・カルコアセティカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）ＮＣＩＢ１１５１７（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉａ，  Ａｂａｄｅｅｎ  Ｓｃｏｔｌａｎｄ）  を接種し、３０℃で２０時間通気攪拌培養後、遠心分離して菌体を取得した。
【００２９】
得られた菌体をダイノミルにより破砕し、ＰＥＩ処理、硫安分画、フェニルセファロースクロマトグラフィーおよびＤＥＡＥ−セファロースクロマトグラフィーにより精製し、６００ＵのＰＱＱ−グルコースデヒドロゲナーゼを得た。
【００３０】
得られた酵素を下記化合物を含む５０ｍＭ  トリス塩酸緩衝液、ｐＨ７．５中に保存して、３０℃、４日間保存し、その残存活性を調べた。得られた結果を表１に示す。
【００３１】
【表１】
2004236665.tif 000002
【００３２】
１ｍＭ  ＣａＣｌ2  の添加により、本発明の安定性が著しく向上したが、ＭｇＳＯ4  の添加による安定化効果はなかった。なお、１ｍＭ  ＣａＣｌ2  の存在下、リジン、グルタミンまたはグルタミン酸の添加により、本発明の安定性がさらに向上した。
【実施例２】
【００３３】
実施例１で得た酵素組成物を下記添加物を含む５０ｍＭ  トリス塩酸緩衝液、ｐＨ７．５中で３０℃、４日間保存し、残存活性を測定した。１ｍＭ  ＣａＣｌ2  に加えて、実施例１で本発明の効果をさらに向上させる効果があったアミノ酸どうしを、さらに組み合わせて添加すると、それぞれ単独で使用するより、更に安定化効果があった。特に１ｍＭ  ＣａＣｌ2  共存下、グルタミン酸、グルタミンまたはさらにリジンとの組み合わせが良好であった。一方、１ｍＭ  ＣａＣｌ2  に加えて、ＰＱＱを添加した場合においても、良好な安定化効果が得られることが判明した。その結果を表２に示す。
【００３４】
【表２】
2004236665.tif 000003
【実施例３】
【００３５】
ＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼを（１）５０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．５、（２）１０ｍＭ  ＣａＣｌ2  および０．２％  ＢＳＡを含む５０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．５、（３）１０ｍＭ  ＣａＣｌ2  、０．０５％  グルタミン、０．０５％  グルタミン酸、０．０５％  リジン、０．２％およびＢＳＡを含む５０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ緩衝液中、ｐＨ７．５で保存して、その熱安定性を比較した。その結果は図１に示す通りであり、（２）の条件、すなわちＣａＣｌ2  とＢＳＡを添加した緩衝液中で、ＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼの安定性は大幅に向上した。さらに（３）の条件、すなわちＣａＣｌ2  共存下、グルタミン、グルタミン酸、リジンにＢＳＡを組み合わせた緩衝液中で、ＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼの安定性はさらに向上した。
【実施例４】
【００３６】
実施例１のＰＱＱグルコースデヒドロゲナーゼ５Ｕ／ｍｌ、１−メトキシ−５−フェナゾリウムメチルサルフェート２９．５ｍＭ、ＭＴＴ０．６ｍＭ、ＮａＮ3  ０．２ｍＭ、１０ｍＭ  ＣａＣｌ2、０．０５％グルタミン、０．０５％グルタミン酸、０．０５％リジン、０．２％ＢＳＡ、５０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．５を混合して、グルコース測定用試薬組成物とした。該試薬組成物を使用して、血清中のグルコースを測定した。その結果は、図２に示す通りである。グルコース濃度に従って、吸光度が直線的に上昇した。
【産業上の利用可能性】
【００３７】
本発明のＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ組成物、ならびに、グルコース測定用試薬組成物は、血清、尿などの検体中のグルコース測定に用いられうる。本発明の組成物は安定性に優れるため、この組成物を使用して、グルコース測定を正確に行なうことができ、産業界に寄与するところが大である。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】ＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼの熱安定性を示すグラフである。
【図２】グルコースの検量線を示すグラフである。
【図１】
2004236665.tif 000004
【図２】
2004236665.tif 000005