【手続補正書】
【提出日】平成24年3月28日(2012.3.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトの全血において増強された細胞効力を有するαらせんポリペプチドを調製し、そして選択する方法であって：
（ａ）親αらせんポリペプチドの第一のアミノ酸および第二のアミノ酸を接続する架橋剤を含む該親αらせんポリペプチドを提供する工程と；
（ｂ）該親αらせんポリペプチド中の疎水性が高い側鎖に隣接した酸性の側鎖からなるジペプチドモチーフを特定する工程であって、該酸性の側鎖は、該親αらせんポリペプチドが標的に結合するのに必須ではない工程と；
（ｃ）該親αらせんポリペプチドの該ジペプチドモチーフ中の該酸性の側鎖を中性の側鎖で置き換えて改変されたαらせんポリペプチドを生成する工程と；
（ｄ）ヒト血清の存在および／または非存在において、細胞内標的へ該改変されたαらせんポリペプチドが結合することによって媒介される活性を測定することにより、該改変されたαらせんポリペプチドのインビトロの効力を決定する工程；
（ｅ）ヒト血清タンパク質に対する該改変されたαらせんポリペプチドの見かけの親和性（Ｋｄ＊）および該改変されたαらせんポリペプチドのＥＣ５０を決定する工程と；
（ｆ）該改変されたαらせんポリペプチドが、該親αらせんポリペプチドのＫｄ＊よりも高いＫｄ＊および該親αらせんポリペプチドのＥＣ５０以下のＥＣ５０を有する場合、該改変されたαらせんポリペプチドを増強されたαらせんポリペプチドとして選択する工程と、
を包含する、方法。
【請求項２】
ヒトの全血において増強された細胞効力を有するαらせんポリペプチドをスクリーニングする方法であって、該αらせんポリペプチドは、該ポリペプチドの第一のアミノ酸および第二のアミノ酸を接続する架橋剤を含み、該方法は、
（ａ）ヒト血清の存在および／または非存在において、細胞内標的に結合することにより媒介される該αらせんポリペプチドの活性を測定することにより、該αらせんポリペプチドのインビトロの効力を決定する工程と；
（ｂ）ヒト血清タンパク質に対する該αらせんポリペプチドの見かけの親和性（Ｋｄ＊）および該αらせんポリペプチドのＥＣ５０を決定する工程と；
（ｃ）該αらせんポリペプチドが１〜７００マイクロモル濃度のＫｄ＊を有する場合、該αらせんポリペプチドを増強されたαらせんポリペプチドとして選択する工程と、
を包含する、方法。
【請求項３】
前記増強されたαらせんポリペプチドが７０マイクロモル濃度未満のＫｄ＊を有する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記増強されたαらせんポリペプチドが約１〜１０マイクロモル濃度のＫｄ＊を有する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
前記増強されたαらせんポリペプチドが約０．１〜５０％というヒト血液中の推定遊離画分を保有し、ここで該推定遊離画分が式
【化４５】
2012503026.tif 000001
によって規定され、かつ［ＨＳＡ］総が７００マイクロモル濃度である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
前記増強されたαらせんポリペプチドが約０．５〜１０％というヒト血液中の推定遊離画分を保有する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記増強されたαらせんポリペプチドが、エネルギー依存性のプロセス、例えばエンドサイトーシスによって細胞膜を透過する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項８】
前記第一のアミノ酸および前記第二のアミノ酸のうちの少なくとも１つがα，α−二置換アミノ酸である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項９】
前記第一のアミノ酸および前記第二のアミノ酸の両方がα，α−二置換されている、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１０】
前記第一のアミノ酸および前記第二のアミノ酸が、３つまたは６つのアミノ酸で隔てられている、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１１】
前記架橋剤がα−らせんの１ターンまたは２ターンに架かる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１２】
前記架橋剤の長さがα−らせんの１ターンあたり約５Å〜約９Åである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１３】
前記増強されたαらせんポリペプチドがｐＨ７．４で正味の正の電荷を担持する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１４】
前記増強されたαらせんポリペプチドが治療効果を提供する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１５】
前記増強されたαらせんポリペプチドが、約１マイクロモル濃度以下というヒト血清タンパク質に対するみかけの親和性を有する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１６】
前記増強されたαらせんポリペプチドが、約３マイクロモル濃度以下というヒト血清タンパク質に対するみかけの親和性を有する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１７】
前記増強されたαらせんポリペプチドが、約１０マイクロモル濃度以下というヒト血清タンパク質に対するみかけの親和性を有する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１８】
前記増強されたαらせんポリペプチドが、対応する非架橋αらせんポリペプチドに比べて、エネルギー依存性のプロセスによって細胞膜を透過する能力が改善されている、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１９】
前記ジペプチドモチーフ中の前記酸性の側鎖および前記疎水性が高い側鎖の両方が前記標的に結合するのに必須ではなく、それぞれ中性の側鎖および疎水性がより低い側鎖で置換されている、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１または２に記載の方法であって、ここでＫｄ＊が式
【化４６】
2012503026.tif 000002
によって規定され、
ここでｎが１であり、かつＥＣ５０が任意のヒト血清の非存在下での全細胞アッセイで測定されるインビトロの効力であり、かつＥＣ’５０がＮ％のヒト血清における全細胞アッセイで測定されたインビトロの効力であり、Ｐが（Ｎ／１００）×（７００）マイクロモル濃度である、方法。
【請求項２１】
増強されたαらせんポリペプチドであって、該増強されたαらせんポリペプチドの第一のアミノ酸および第二のアミノ酸を接続する架橋剤を含み、該増強されたαらせんポリペプチドは、エネルギー依存性のプロセスによって細胞膜を透過し、かつ細胞内標的に結合し、請求項１または２に記載の方法によって選択される、ポリペプチド。
【請求項２２】
請求項２１に記載の増強されたαらせんポリペプチドであって、該増強されたαらせんポリペプチドは、エネルギー依存性のプロセスによって細胞膜を透過し、かつ細胞内標的に結合し、該増強されたαらせんポリペプチドが細胞膜を透過する能力は、細胞を、フルオレセイン化架橋ポリペプチドとともにインキュベートし、細胞の蛍光を測定することによって測定される、ポリペプチド。
【請求項２３】
障害の処置または制御の必要な被験体において該障害を処置または制御するための医薬の製造における、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法に従って選択された、増強されたαらせんポリペプチドの使用であって、該障害が、ＢＣＬ−２ファミリーメンバーの異常な発現または活性に関連する、使用。
【請求項２４】
障害の処置または制御の必要な被験体において該障害を処置または制御するための医薬の製造における、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法に従って選択された、増強されたαらせんポリペプチドの使用であって、該障害が、過剰増殖性細胞において、ＭＡＭＬタンパク質とＮｏｔｃｈタンパク質またはＣＳＬタンパク質との間の相互作用または結合によって媒介される過剰増殖性の疾患または状態である、使用。
【請求項２５】
障害の処置または制御の必要な被験体において該障害を処置または制御するための、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法に従って選択された、増強されたαらせんポリペプチドを含む組成物であって、該障害が、ＢＣＬ−２ファミリーメンバーの異常な発現または活性に関連する、組成物。
【請求項２６】
障害の処置または制御の必要な被験体において該障害を処置または制御するための、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法に従って選択された、増強されたαらせんポリペプチドを含む組成物であって、該障害が、過剰増殖性細胞において、ＭＡＭＬタンパク質とＮｏｔｃｈタンパク質またはＣＳＬタンパク質との間の相互作用または結合によって媒介される過剰増殖性の疾患または状態である、組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２４】
本発明のさらなる局面は、下の詳細な説明、実施例、図面および特許請求の範囲から明らかである。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
ヒトの全血において最適化された細胞効力を有するポリペプチドを調製する方法であって：
（ａ）該ポリペプチドの第一のアミノ酸および第二のアミノ酸を接続する架橋剤を含む親ポリペプチドを提供する工程であって、ここで該親ポリペプチドがエネルギー依存性プロセスによって細胞膜を透過して、かつ細胞内標的に結合する工程と；
（ｂ）疎水性が高い側鎖に隣接した酸性の側鎖からなる該親ポリペプチド中の１つ以上のジペプチドモチーフを特定する工程であって、該酸性の側鎖が該標的に結合するのに必須ではない工程と；
（ｃ）該モチーフ中の該酸性の側鎖を中性の側鎖で置き換えて改変された親ポリペプチドを調製する工程と；
（ｄ）全細胞アッセイ中の該改変された親ポリペプチドポリペプチドのインビトロの効力を測定する工程であって、ここで活性が、ヒト血清の存在および非存在において、該細胞内標的に結合することによって媒介される工程と；
（ｅ）ヒト血清タンパク質に対する該改変されたポリペプチドの見かけの親和性（Ｋｄ＊）およびそのＥＣ５０を算出する工程と；
（ｆ）該改変された親ポリペプチドが、該親ポリペプチドのＫｄ＊よりも高いＫｄ＊および該親ポリペプチドのＥＣ５０以下のＥＣ５０を有する場合、該改変された親ポリペプチドを最適化ポリペプチドとして選択する工程と、
を包含する、方法。
（項目２）
ポリペプチドの第一のアミノ酸および第二のアミノ酸を接続する架橋剤を含むポリペプチドをスクリーニングする方法であって、該ポリペプチドが、エネルギー依存性のプロセスによって細胞膜を透過して、かつ細胞内標的に結合する方法であって、
（ａ）全細胞アッセイ中の該ポリペプチドのインビトロの効力を測定する工程であって、ここで活性が、ヒト血清の存在および非存在において、該細胞内標的に結合することによって媒介される工程と；
（ｂ）ヒト血清タンパク質に対する該ポリペプチドの見かけの親和性（Ｋｄ＊）およびそのＥＣ５０を算出する工程と；
（ｃ）１〜７００マイクロモル濃度のＫｄ＊を有する化合物を選択する工程と、
を包含する、方法。
（項目３）
前記選択されたポリペプチドが７０マイクロモル濃度未満のＫｄ＊を有する、項目１または２に記載の方法。
（項目４）
前記選択されたポリペプチドが約１〜１０マイクロモル濃度のＫｄ＊を有する、項目１または２に記載の方法。
（項目５）
前記選択されたポリペプチドが約０．１〜５０％というヒト血液中の推定遊離画分を保有し、ここで該推定遊離画分が式
【化４５】
2012503026.tif 000003
によって規定され、かつ［ＨＳＡ］総が７００マイクロモル濃度である、項目１または２に記載の方法。
（項目６）
前記選択されたポリペプチドが約０．５〜１０％というヒト血液中の推定遊離画分を保有
する、項目１または２に記載の方法。
（項目７）
前記エネルギー依存性の細胞透過機構がエンドサイトーシスである、項目１または２に記載の方法。
（項目８）
前記第一のアミノ酸および前記第二のアミノ酸のうちの少なくとも１つがα，α−二置換アミノ酸である、項目１または２に記載の方法。
（項目９）
前記第一のアミノ酸および前記第二のアミノ酸の両方がα，α−二置換されている、項目１または２に記載の方法。
（項目１０）
前記選択されたポリペプチドがらせんを含む、項目１または２に記載の方法。
（項目１１）
前記選択されたポリペプチドがαらせんを含む、項目１または２に記載の方法。
（項目１２）
前記第一のアミノ酸および前記第二のアミノ酸が、３つのアミノ酸で隔てられている、項目１または２に記載の方法。
（項目１３）
前記架橋剤が、６と１４との間の連続した結合を含む、項目１または２に記載の方法。
（項目１４）
前記架橋剤が、８と１２との間の連続した結合を含む、項目１または２に記載の方法。
（項目１５）
前記選択されたポリペプチドが約１８原子〜２６原子の環を含む、項目１または２に記載の方法。
（項目１６）
前記第一のアミノ酸および前記第二のアミノ酸が、６つのアミノ酸で隔てられている、項目１または２に記載の方法。
（項目１７）
前記架橋剤が、８と１６との間の連続した結合を含む、項目１または２に記載の方法。
（項目１８）
前記架橋剤が、１０と１３との間の連続した結合を含む、項目１または２に記載の方法。
（項目１９）
前記選択されたポリペプチドが約２９原子〜３７原子の環を含む、項目１または２に記載の方法。
（項目２０）
前記架橋剤がα−らせんの１ターン〜５ターンまでの間に架かる、項目１または２に記載の方法。
（項目２１）
前記架橋剤がα−らせんの１ターンに架かる、項目１または２に記載の方法。
（項目２２）
前記架橋剤がα−らせんの２ターンに架かる、項目１または２に記載の方法。
（項目２３）
前記架橋剤の長さがα−らせんの１ターンあたり約５Å〜約９Åである、項目１または２に記載の方法。
（項目２４）
前記選択されたポリペプチドがｐＨ７．４で正味の正の電荷を担持する、項目１または２に記載の方法。
（項目２５）
前記選択されたポリペプチドが、１つ以上のハロゲン、アルキル基、蛍光性部分、親和性
標識、標的部分または放射性同位元素のうちの１つ以上を含む、項目１または２に記載の方法。
（項目２６）
前記選択されたポリペプチドが治療効果を提供する、項目１または２に記載の方法。
（項目２７）
前記選択されたポリペプチドが、約１マイクロモル濃度以下というヒト血清タンパク質に対するみかけの親和性を有する、項目１または２に記載の方法。
（項目２８）
前記選択されたポリペプチドが、約３マイクロモル濃度以下というヒト血清タンパク質に対するみかけの親和性を有する、項目１または２に記載の方法。
（項目２９）
前記選択されたポリペプチドが、約１０マイクロモル濃度以下というヒト血清タンパク質に対するみかけの親和性を有する、項目１または２に記載の方法。
（項目３０）
前記選択されたポリペプチドが、対応する非架橋ポリペプチドに比べて、エネルギー依存性のプロセスによって細胞膜を透過する能力が改善されている、項目１または２に記載の方法。
（項目３１）
前記ジペプチドモチーフ中の前記酸性側鎖および前記疎水性が高い側鎖が前記標的に結合するのに必須ではなく、それぞれ中性または疎水性がより低い側鎖で置換されている、項目１に記載の方法。
（項目３２）
前記ポリペプチドの第一のアミノ酸および第二のアミノ酸を接続する架橋剤を含むポリペプチドであって、エネルギー依存性のプロセスによって細胞膜を透過し、かつ細胞内標的に結合する、項目１または２に記載の方法によって選択される、ポリペプチド。
（項目３３）
異常なＢＣＬ−２ファミリーメンバーの発現または活性に関連する障害を処置または制御する方法であって、該処置または制御の必要な被験体に対して項目１〜３２のいずれかに記載のポリペプチドの有効量を投与する工程を包含する、方法。
（項目３４）
過剰増殖性細胞において、ＭＡＭＬタンパク質とＮｏｔｃｈタンパク質またはＣＳＬタンパク質との間の相互作用または結合によって媒介される過剰増殖性の疾患または状態を処置または制御する方法であって、該処置または制御の必要な被験体に対して、項目１〜３３のいずれかに記載のポリペプチドの有効量を投与する工程を包含する、方法。
（項目３５）
異常なＢＣＬ−２ファミリーメンバーの発現もしくは活性に関連する障害を処置または制御するため、または過剰増殖性細胞において、ＭＡＭＬタンパク質とＮｏｔｃｈタンパク質またはＣＳＬタンパク質との間の相互作用もしくは結合によって媒介される過剰増殖性の疾患または状態を処置または制御するための医薬の製造における項目１〜３４のいずれかに記載のポリペプチドの使用。
（項目３６）
項目１または２に記載の方法であって、ここでＫｄ＊が式
【化４６】
2012503026.tif 000004
によって規定され、
ここでｎが１であり、かつＥＣ５０が任意のヒト血清の非存在下での全細胞アッセイで測定されるインビトロの効力であり、かつＥＣ’５０がＮ％のヒト血清における全細胞アッセイで測定されたインビトロの効力であり、Ｐが（Ｎ／１００）×（７００）マイクロモル濃度である、方法。