【手続補正書】
【提出日】平成24年10月31日(2012.10.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
【図１】ＬＡＰＣ９ＡＤからＡＩへの変化：１×ＰＢＳ  対  １Ｈ７  対  ＥＣ４。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
【図２】Ｎ−カドヘリンに対する分類されたＬＡＰＣＡＩの腫瘍増殖曲線。去勢ＳＣＩＤに分類されたＬＡＰＣＡＩ。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
【図３】処理されＮ−カドヘリンに分類された腫瘍のＦＡＣＳ結果。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
【図４】処理されＮ−カドヘリンに分類された腫瘍のさらなるＦＡＣＳ結果。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
【図５】前立腺癌におけるＮ−カドヘリンシグナル伝達のモデル。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２７】
［図１７］連続パニングラウンドを介する抗−Ｎ−カドヘリンファージ抗体の濃縮。
［図１８］ＰＣ３細胞のＡ１４、Ｃ７、Ｅ４およびＤ４ダイアボディ染色。
［図１９］Ｎ−カドヘリン陰性細胞へのＣ７ダイアボディの結合。
［図２０］Ｎ−カドヘリン発現細胞へのＥ４およびＤ４ダイアボディの特異的結合。
［図２１］ＬＡＰＣ９  ＡＩ  腫瘍における１２４Ｉ標識Ｄ４  Ｄｂの腫瘍局在。
発明の詳細な説明
本発明者らは、本明細書において、癌患者を処置する方法および癌幹細胞を同定する方法であって、癌細胞においてＮ−カドヘリンタンパク質が正常または低レベルで発現されるか、または一部の癌細胞により発現され、過剰発現されない方法を報告する。加えて、本発明者らは、本明細書において、Ｎ−カドヘリンの細胞外ドメインに特異的である抗体、およびそのフラグメントを報告する。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３９】
定義
「Ｎ−カドヘリンおよびＥ−カドヘリン」は、（１）それぞれの参照核酸によってコードされるポリペプチドまたはアミノ酸配列に対し、好ましくは少なくとも約２５、５０、１００、２００、５００、１０００またはそれ以上のアミノ酸の領域にわたって、約６０％以上のアミノ酸配列同一性、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、好ましくは９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％またはそれ以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、（２）参照アミノ酸配列を含む免疫原、それらのそれぞれの免疫原性フラグメント、およびそれらのそれぞれの保存的に修飾された変異体に対する抗体、例えば、ポリクローナル抗体に特異的に結合する、（３）ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で、参照アミノ酸配列をコードする核酸、およびそれらのそれぞれの保存的に修飾された変異体に特異的にハイブリダイズする、（４）参照核酸配列に対し、好ましくは少なくとも約２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、５００、１０００またはそれ以上のヌクレオチドの領域にわたって、約９５％以上の、好ましくは約９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の核酸配列同一性を有する核酸配列を有する、核酸、例えば、遺伝子、ｐｒｅ−ｍＲＮＡ、ｍＲＮＡおよびポリペプチド、多型変異体、対立遺伝子、変異体ならびに種間相同体を示す。ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列は、一般的に、霊長類、例えば、ヒト、齧歯動物、例えば、ラット、マウス、ハムスター、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジを含むが、これらに限定されない、哺乳動物または他の哺乳動物由来である。本発明の核酸およびタンパク質は、天然または組換え分子の両方を含む。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１１】
いくつかの態様において、本発明は、以下の群から選択されるアミノ酸配列を含む、Ｎ−カドヘリンの細胞外ドメイン１−３に結合することができるモノクローナル抗体またはそのフラグメントを含む。
配列番号２：ＭＡＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＱＡＳＧＹＴＦＴＳＹＹＩＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＦＥＷＭＧＩＩＮＰＳＧＧＳＡＳＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＴＳＴＶＹＭＥＬＲＳＬＲ
配列番号３：ＭＡＱＶＱＬＱＥＳＧＷＹＦＤＬＷＧＲＧＴＰＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＩＶＬＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＲＮＤＬＧＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＤＹＮＧＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲ
配列番号４：ＭＡＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＳＦＳＮＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＶＩＳＹＤＧＲＶＫＳＹＡＤＡＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＥＮＩＬＹＶＱＩＤＳＬＲＶＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＧＧＤＨＡＡＧＭＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＳＡＬＴＱＰＡＳＶＳＧＳＰＧＱＳＩＴＩＳＣＴＧＧＲＳＤＩＧＧＹＮＹＶＳＷＹＱＱＨＰＧＫＡＰＫＬＭＩＹＤＶＧＮＲＰＳＧＶＳＮＲＦＳＧＳＫＳＧＮＴ
配列番号５：ＭＡＰＧＡＡＧＧＶＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＸＶＹＹＣＡＲＬＥＹＳＳＳＳＲＡＦＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＳＥＬＴＱＤＰＡＶＳＶＡＬＧＱＴＶＲＩＴＣＱＧＤＳＬＲＳＹＹＡＳＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＶＬＶＩＹＧＫＮＮＲＰＳＧＩＰＤＲＦＳＧＳＳＳＧＮＴＡＳＬＴＩＴＧＡＱＡＥＤＥＡＤＹＹＣＮＳＲＤＳＳＧＮＨＶＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬＧ
配列番号６：ＭＡＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦ
配列番号７：ＭＡＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＲＰＧＡＳＶＲＩＳＣＫＡＳＧＹＰＦＴＴＹＰＩＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＧＩＮＰＮＳＧＡＴＫＮＶＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴＡＤＴＳＩＲＴＡＹＭＥＬＳＲＬＴＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＥＧＤＴＧＳＹＬＧＧＹＷＧＬＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＳＥＬＴＱＤＰＡＶＳＶＡＬＧＱＴＶＲＩＴＣＱＧＤＳＬＲＳＹＹＡＳＷＹＱＱＫＰＧＲＡＰＬＬＶＩＹＧＫＮＩＲＰＳＧＩＰＤＲＦＳＧＳＳＳＧＮＳＡＳＬＴＩＴＧＡＱＡＥＤＥＡＤＹＹＣＮＳＲＤＲＳＧＮＹＬＦＧＶＧＴＫＶＴＶＬＧ
配列番号８：ＭＡＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＥＳＬＥＩＳＣＫＧＳＧＹＳＦＡＮＮＷＩＧＷＶＲＱＭＰＧＫＧＬＥＷＭＧＳＩＹＰＧＤＳＤＶＲＹＳＲＳＦＱＧＨＶＴＩＳＡＤＫＳＩＳＴＡＹＬＱＷＳＳＬＫＡＳＤＴＡＭＹＹＣＡＲＨＲＶＡＹＳＧＹＤＡＦＤＩＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＳＶＬＴＱＤＰＡＶＳＶＡＬＧＱＴＶＲＩＴＣＱＧＤＳＬＲＳＹＹＰＳＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＶＬＶＩＹＧＫＮＮＲＰＳＧＩＰＤＲＦＳＧＳＳＳＧＮＴＡＳＬＴＩＴＧＡＱＡＥＤＥＡＤＹＹＣＨＳＲＤＲＳＧＮＱＶＬＦＧＧＧＴＫＶＴＶＬＧ
配列番号９：ＭＡＱＶＱＬＶＱＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＶＩＷＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＶＧＧＥＧＧＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＶＭＴＱＳＰＳＴＬＳＡＳ
いくつかの態様において、本発明は、ｓｃＦｖである、Ｎ−カドヘリンの細胞外ドメイン１−３またはＮ−カドヘリンの細胞外ドメイン４に結合することができる抗体フラグメントを提供する。いくつかの態様において、本発明は、ダイアボディである、Ｎ−カドヘリンの細胞外ドメイン１−３またはＮ−カドヘリンの細胞外ドメイン４に結合することができる抗体フラグメントを提供する。ダイアボディを生産するために、リンカーＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１０）をＳＧＧＧＧＳ（配列番号１１）と置き換えた。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３３】
実施例１：ヒトＮ−カドヘリンに特異的なヒトＳｃＦｖの単離および特性化
原料および方法
Ｎ−カドヘリン組換えタンパク質発現および細胞系
２つの非依存性Ｎ−カドヘリン組換えタンパク質、Ｎ−カドヘリン細胞外ドメイン１から３（ＥＣＤ１−３）およびＮ−カドヘリンの第４のドメイン（ＥＣＤ４）を生産した（Ｚ  Ｗａｉｎｂｅｒｇ）。ｃＤＮＡ配列を、ｍＲＮＡ製造物からＲＴ−ＰＣＲを使用してクローニングした。ＥＣＤ１−３に対する核酸１６０から４９７および核酸４８９から６０３を細菌発現系中、６ヒスチジン（配列番号１２）タグを有するフレーム内に、およびベクター中、ＧＳＴタグを有するフレーム中にクローニングした。発現を数時間で誘導し、誘導後、ペリプラズム画分を単離し、Ｎｉ−ＮＴＡクロマトグラフィーを使用して組換えタンパク質を精製した。タンパク質を、サイズおよび純度に関してＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。ＬＮＣａｐ  Ｎ−カドヘリントランスフェクト細胞を生産した。完全Ｎ−カドヘリンｃＤＮＡをベクターにクローニングし、感染によりＬＮＣａｐにトランスフェクトした。ＰＣ３細胞およびＤＵ１４５の２つの前立腺細胞系を使用して、単離された抗−Ｎ−カドヘリン抗体フラグメントを特徴付けた。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３７】
ｓｃＦｖおよびダイアボディの発現および精製
ｐＳｙｎ１にクローニングされたＳｃＦｖおよびダイアボディを、タンパク質発現のために、ＴＧ１細菌にトランスフェクトした。細菌を０．５  Ｏ．Ｄ６００ｎｍの密度まで増殖させ、１ｍＭのＩＰＴＧで発現を誘導した。誘導の４時間後、細菌を遠沈させ、ペリプラズム画分を生成した。６ＨＩＳ（配列番号１２）タグタンパク質をＮｉ−ＮＴＡカラム上で精製した。溶離したタンパク質をＰＢＳ濃縮液に対して透析し、フィルターで濾過した。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４２】
図１７において示されるとおり、パニングラウンド１、２および３由来のポリクローナルファージ抗体をＥＬＩＳＡにより分析した。パニングラウンドのために使用される標的を、ＥＬＩＳＡプレートを被覆するために使用した。ファージ抗体の結合をＨＲＰ接合抗Ｍ１３抗体で検出した。
表１
【表１】
2012508027.tif 000001
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４８】
Ｄ４ダイアボディ（Ｄ４Ｄｂ）を生産し、ＰＣ３およびＤＵ１４５染色について、Ｅ４Ｄｂと比較した（図１８）。Ｅ４ＤｂおよびＤ４Ｄｂの両方は、ＰＣ３を染色し、ＤＵ１４５に対して陰性であった。ＰＣ３のＤ４Ｄｂ染色は、Ｅ４Ｄｂより強かった（図２０）。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４９】
図１８に示されるとおり、Ｎ−カドヘリン陽性細胞（ＰＣ３）をダイアボディと共にインキュベートし、染色し、フローサイトメトリーにより分析した。二次抗体のみ：抗−Ｃ−Ｍｙｃ−ＦＩＴＣ（灰色で塗られる）、Ａ１４Ｄｂ（破線）、Ｅ４Ｄｂ（細線）、Ｃ７Ｄｂ（太線）。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５０】
図１９に示されるとおり、Ｎ−カドヘリン陰性細胞（ＤＵ１４５）およびＮ−カドヘリン陽性細胞（ＰＣ３）をＣ７Ｄｂと共にインキュベートし、染色し、フローサイトメトリーにより分析した。二次抗体のみ：抗−Ｃ−Ｍｙｃ−ＦＩＴＣ（灰色で塗られる）、Ｃ７Ｄｂ（実線）。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５１】
図２０に示されるとおり、Ｎ−カドヘリン陰性細胞（ＤＵ１４５）およびＮ−カドヘリン陽性細胞（ＰＣ３）をダイアボディと共にインキュベートし、染色し、フローサイトメトリーにより分析した。二次抗体のみ：抗−Ｃ−Ｍｙｃ−ビオチン、ストレプトアビジンＲ−ＰＥ（灰色で塗られる）、Ｅ４Ｄｂ（破線）、Ｄ４Ｄｂ（実線）。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５２】
図２１は、ＬＡＰＣ９  ＡＩ腫瘍における１２４Ｉ標識Ｄ４Ｄｂの腫瘍局在を示す。冠状断面を注射４時間後に記録した。