【誤訳訂正書】
【提出日】平成24年10月26日(2012.10.26)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者における２−アラキドノイルグリセロール（２−ＡＧ）媒介内在性カンナビノイドシグナル伝達を刺激するための医薬組成物であって、モノアシルグリセロールリパーゼ（ＭＡＧＬ）を選択的に阻害する治療的有効量の化合物を含む、当該医薬組成物。
【請求項２】
前記化合物が脂肪酸アミドヒドロラーゼ（ＦＡＡＨ）に比してＭＡＧＬの阻害に対して選択的である請求項１記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記化合物がＦＡＡＨに比してＭＡＧＬの阻害に対して少なくとも１００倍の選択性を有する請求項２記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記患者がヒトである請求項１記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記化合物が下記に示す式Ｉの構造を有する請求項１記載の医薬組成物：
【化１】
2012508737.tif 000001
[式中、ＸはＮ又はＣＨ、Ｒ１はＨ又はＯＨであり、そしてＲ２及びＲ３の各々は、下記の構造の一つを有する]。
【化２】
2012508737.tif 000002
【請求項６】
前記化合物が脂肪酸アミドヒドロラーゼ（ＦＡＡＨ）及びα／βヒドロラーゼ６（ＡＢＨＤ６）の両方に比してＭＡＧＬの阻害に対して選択的である請求項１記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記化合物が下記に示す式Ｉの構造を有する請求項６記載の医薬組成物：
【化３】
2012508737.tif 000003
[式中、ＸはＣＨ、Ｒ１はＯＨであり、そしてＲ２及びＲ３の各々は、下記の構造の一つを有する]。
【化４】
2012508737.tif 000004
【請求項８】
前記患者がヒトである請求項１記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記患者が疼痛、炎症、抑鬱又は不安神経症を患っている請求項１記載の医薬組成物。
【請求項１０】
内在性カンナビノイドシグナル伝達に付随又は関連する患者の症状を治療又は回復するための医薬組成物であって、モノアシルグリセロールリパーゼ（ＭＡＧＬ）を選択的に阻害する治療的有効量の化合物を含む、当該医薬組成物。
【請求項１１】
前記症状が、疼痛、抑鬱、不安神経症、炎症性症候群、心血管障害、代謝障害、卒中、アルツハイマー病、多発性硬化症又は緑内障である、請求項１０記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記症状が２−ＡＧシグナル伝達により媒介される又は関連する請求項１０記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記化合物が下記に示す式Ｉの構造を有する請求項１０記載の医薬組成物：
【化５】
2012508737.tif 000005
[式中、ＸはＮ又はＣＨ、Ｒ１はＨ又はＯＨであり、そしてＲ２及びＲ３の各々は、下記の構造の一つを有する]。
【化６】
2012508737.tif 000006
【請求項１４】
式中、ＸがＣＨ、Ｒ１がＯＨであり、そしてＲ２及びＲ３の各々が、下記に示す構造を有する請求項１３記載の医薬組成物。
【化７】
2012508737.tif 000007
【請求項１５】
前記化合物がＦＡＡＨに比してＭＡＧＬの阻害に対して選択的である請求項１０記載の医薬組成物。
【請求項１６】
前記化合物がＦＡＡＨ及びＡＢＨＤ６の両方に比してＭＡＧＬの阻害に対して選択的である請求項１０記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記患者がヒトである、請求項１０記載の医薬組成物。
【請求項１８】
下記に示す式Ｉの化合物：
【化８】
2012508737.tif 000008
[式中、ＸはＮ又はＣＨ、Ｒ１はＨ又はＯＨであり、そしてＲ２及びＲ３の各々は、下記の構造の一つを有する]。
【化９】
2012508737.tif 000009
【請求項１９】
式中、ＸがＣＨ、Ｒ１がＯＨであり、そしてＲ２及びＲ３の各々が、下記に示す構造を有する、請求項１８記載の化合物。
【化１０】
2012508737.tif 000010
【請求項２０】
侵襲性の腫瘍細胞の増殖を阻害するための医薬組成物であって、モノアシルグリセロールリパーゼ（ＭＡＧＬ）を特異的に阻害する治療的有効量の化合物を含む、当該医薬組成物。
【請求項２１】
前記腫瘍細胞が癌を有する又は癌になる危険のある患者内に存在する請求項２０記載の医薬組成物。
【請求項２２】
前記腫瘍細胞が、乳腺腫瘍細胞、卵巣腫瘍細胞、黒色腫細胞、肺腫瘍細胞又は脳腫瘍細胞である請求項２１記載の医薬組成物。
【請求項２３】
前記化合物が脂肪酸アミドヒドロラーゼ（ＦＡＡＨ）に比してＭＡＧＬの阻害に対して選択的である請求項２０記載の医薬組成物。
【請求項２４】
前記化合物が下記に示す式Ｉの構造を有する請求項２３記載の医薬組成物：
【化１４】
2012508737.tif 000011
[式中、ＸはＮ又はＣＨ、Ｒ１はＨ又はＯＨであり、そしてＲ２及びＲ３の各々は、下記の構造の一つを有する]。
【化１５】
2012508737.tif 000012
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０００４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０００４】
本発明は、全体として他の脳セリンヒドロラーゼに比してモノアシルグリセロールリパーゼ（ＭＡＧＬ）を選択的に阻害するための、並びに被験者における２−アラキドノイルグリセロール（２−ＡＧ）媒介内在性カンナビノイドシグナル伝達を刺激するための方法及び組成物に関する。また本発明は、腫瘍細胞の増殖を阻害するための及び癌を治療するための方法にも関連する。
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０００５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０００５】
カンナビノイド受容体ＣＢ１及びＣＢ２は、マリファナの向精神成分、Δ９−テトラヒドロカンナビノールの分子標的である。ＣＢ１は主に脳で発現するが、また肺、肝臓及び腎臓でも発現する。ＣＢ２は、主に免疫系及び造血細胞で発現する。また、二つの内在性リガンド、言い換えれば「内在性カンナビノイド」、即ちアラキドン酸含有脂質アナンダミド（Ｎ−アラキドノイルエタノールアミン、ＡＥＡ）及び２−アラキドノイルグリセロール（２−ＡＧ）も同定されている。内在性カンナビノイド系は、食欲、痛覚、炎症、及び記憶を含むさまざまな生理的プロセスを制御しており、並びにそれは、肥満、慢性疼痛、不安神経症、及び抑鬱等の障害を治療するために、重要な最新の薬学的興味の中心となっている。
【誤訳訂正４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０００６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０００６】
内在性カンナビノイドシグナル伝達は、酵素的加水分解によって堅固に制御されている。２−ＡＧ又はＡＥＡの加水分解により、アラキドン酸（ＡＡ）が産生される。主要なＡＥＡ−加水分解酵素は、脂肪酸アミドヒドロラーゼ（ＦＡＡＨ）である。遺伝子的な又は薬理学的なＦＡＡＨの破壊により、神経系及び抹消の至る所でＡＥＡレベルが著しく上昇し、結果的に、痛覚、炎症、不安神経症、及び抑鬱の減少を含む、多発性のＣＢ１−及び／又はＣＢ−２依存性の行動的影響に帰着する。興味深いことに、低体温症及び運動障害等の、直接作用性ＣＢ１アゴニストの周知の他の行動的影響の幾つかは、ＦＡＡＨ破壊動物では観察されない（ゴパーラジュら（Ｇｏｐａｒａｊｕ  ｅｔ  ａｌ．）、「フェブス・レターズ（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．）」、１９９８年、第４２２巻：ｐ．６９−７３；及びカスリアら（Ｋａｔｈｕｒｉａ  ｅｔ．  ａｌ．）、「ネイチャー・メディスン（Ｎａｔ  Ｍｅｄ）」、２００３年、第９巻：ｐ．７６−８１）。これらの動物は、また野生型の２−ＡＧ１７レベルを有しており、このことは生体内でさらなるＣＢ１制御の挙動プロセスが２−ＡＧによって媒介されているかもしれないことを示唆している。幾つかのエビデンスは、モノアシルグリセロールリパーゼ（ＭＡＧＬ）が神経系における２−ＡＧの加水分解のための主要な酵素であることを示唆している。例えば、ディンら（Ｄｉｎｈ  ｅｔ  ａｌ．）、「プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）」、２００２年、第９９巻：ｐ．１０８１９−２４；ディンら（Ｄｉｎｈ  ｅｔ  ａｌ．）、「モレキュラー・ファルマコロジー（Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．）」、２００４年、第６６巻：ｐ．１２６０−４；ブランクマンら（Ｂｌａｎｋｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．）、「ケミストリー＆バイオロジー（Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．）」、２００７年、第１４巻：ｐ．１３４７−５６；及び野村ら（Ｎｏｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．）、「ネイチャー・ケミカル・バイオロジー（Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．）」、２００８年、第４巻：ｐ３７３−８、を参照。しかしながら、これら以前の研究のどれも、ＭＡＧＬが生体内における２−ＡＧの加水分解で果たす役割を明確には検討していない。一方、幾つかのＭＡＧＬ阻害剤が当該技術分野において開示されているが（ホーマンら（Ｈｏｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．）、「ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）」、２００５年、第４３５巻：ｐ．１１０８−１２；ヴァーヴェルら（Ｖａｒｖｅｌ  ｅｔ  ａｌ．）、「ジャーナル・オブ・ファルマコロジー・アンド・エクスペリメンタル・セラピューティックス（Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｓｐ．Ｔｈｅｒ．）」、２００２年、第３０１巻：ｐ．９１５−２４；及びサーリオら（Ｓａａｒｉｏ  ｅｔ  ａｌ．）、「ケミストリー＆バイオロジー（Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．）」、２００５年、第１２巻：ｐ．６４９−５６）、そのどれも生体内で薬理学的なツールとして一般的に使用するために要求されるレベルの有効性も明確性も示していない。
【誤訳訂正５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０００８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０００８】
当該技術分野において、生体内で強力かつ選択的にＭＡＧＬを阻害する化合物を求める、並びに内在性カンナビノイドシグナル伝達活性に付随又は関連する症状又は障害を治療するための新規な方法を求めるニーズが存在する。また発明者らには、腫瘍増殖の阻害及び癌治療のための代替可能で効果的な方法を求めるニーズが存在する。本発明は、これら及び当該技術分野において実現されていない他のニーズに取り組むものである。
【誤訳訂正６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０００９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０００９】
一態様において、本発明は、被験者における２−アラキドノイルグリセロール媒介内在性カンナビノイドシグナル伝達を刺激するための方法を提供する。当該方法は、モノアシルグリセロールリパーゼ（ＭＡＧＬ）を選択的に阻害する化合物の治療的に有効な量を、被験者に対し投与すること（例えば、腹腔内注射又は経口投与）を含む。これらの方法の幾つかにおいて、本化合物は、脂肪酸アミドヒドロラーゼ（ＦＡＡＨ）に比してＭＡＧＬを選択的に阻害する。例えば、本化合物は、ＦＡＡＨと比較し、ＭＡＧＬの阻害に対し少なくとも１００倍の選択性を有することができる。これらの方法の幾つかで用いるＭＡＧＬ選択的阻害剤は、本明細書に開示する式Ｉに示す構造を有する。幾つかの他の方法において、ＭＡＧＬ特異的阻害剤は、ＦＡＡＨ及びα／βヒドロラーゼ６（ＡＢＨＤ６）の両方に対して、ＭＡＧＬ選択的である。幾つかの好ましい実施態様においては、ＭＡＧＬ選択的阻害剤は化合物ＪＺＬ１８４である。好ましくは、本発明の方法で治療されるべき被験者はヒトである。これらの方法の幾つかにおいて治療されるべき被験者は、例えば疼痛、炎症、抑鬱又は不安神経症等の、内在性カンナビノイドシグナル伝達によって媒介される又は関連する、症状又は障害を患っている。
【誤訳訂正７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１０】
関連する態様において、本発明は、被験者における、内在性カンナビノイドシグナル伝達に付随又は関連する症状、又はその治療効果が増加したカンナビノイド（例えば、２−ＡＧ）レベルに由来することができる疾患、を治療又は回復するための方法を提供する。これらの方法は、モノアシルグリセロールリパーゼ（ＭＡＧＬ）を選択的に阻害する化合物の治療的に有効な量を含む医薬組成物を被験者に投与することを含んでいる。これらの方法の幾つかは、２−ＡＧシグナル伝達が役割を果たす、例えば疼痛等の症状又は障害を治療することに向けられる。これらの方法の幾つかは、式Ｉに示す構造を有するＭＡＧＬ選択的阻害剤を用いる。当該方法の幾つかにおいて、ＭＡＧＬ選択的阻害剤は、ＦＡＡＨに比してモノアシルグリセロールリパーゼ（ＭＡＧＬ）を選択的に阻害する。幾つかの他の方法において、用いた化合物はＦＡＡＨ及びＡＢＨＤ６の両方に比して、ＭＡＧＬの阻害に選択的である。幾つかの好ましい実施態様において、用いるＭＡＧＬ選択的阻害剤は化合物ＪＺＬ１８４である。
【誤訳訂正８】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１２】
式中、ＸはＮ又はＣＨ、Ｒ１はＨ又はＯＨであり、そしてＲ２及びＲ３の各々は、下記の構造のうちの１つを有する。
【化２】
2012508737.tif 000013
【誤訳訂正９】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１４】
さらに他の態様において、本発明は、改良された性質を有するＭＡＧＬ阻害剤の化合物を同定するための方法を提供する。当該方法は、（ａ）本明細書で開示されるＭＡＧＬ選択的阻害剤（例えば、ＪＺＬ１８４）の一以上の構造アナログを合成すること、（ｂ）当該アナログに関する機能アッセイを実施し、ＭＡＧＬ選択的阻害剤のものと比較して改良された生物学的又は薬学的性質を有するアナログを同定すること、を含む。式Ｉに包含される任意の化合物も、構造アナログの合成ためのリード化合物として役立つことができる。幾つかの好ましい実施態様において、化合物ＪＺＬ１８４が使用される。これらのスクリーニング法において、アナログにおいて同定されるべき、改良された生物学的又は薬学的性質は、例えば、ＭＡＧＬに対する増強された阻害活性、又は脳セリンヒドロラーゼと比較してＭＡＧＬに対する増加された選択性等であることができる。
【誤訳訂正１０】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１５】
他の態様において、本発明は、腫瘍細胞、特に侵襲性の腫瘍細胞の増殖を阻害するための方法を提供する。当該方法は、モノアシルグリセロールリパーゼ（ＭＡＧＬ）を特異的に阻害する治療的有効量の化合物と腫瘍細胞を接触させることを含む。幾つかの実施態様において、当該方法は被験者に存在する腫瘍の増殖を阻害することに向けられる。被験者は、癌を有すると診断された者であることができる。また被験者は、癌にかかりやすい又は癌になる危険のある者であることができる。当該方法は、充実性腫瘍及び白血病の細胞を含む、任意の腫瘍細胞の増殖を阻害するために用いることができる。幾つかの実施態様において、当該方法は、乳房腫瘍細胞、卵巣腫瘍細胞、黒色腫細胞、肺腫瘍細胞又は脳腫瘍細胞の増殖を阻害するために使用される。
【誤訳訂正１１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１６】
本発明の幾つかの方法において、用いられるＭＡＧＬ阻害化合物（又は「ＭＡＧＬ拮抗化合物」又は「ＭＡＧＬアンタゴニスト化合物」）は、脂肪酸アミドヒドロラーゼ（ＦＡＡＨ）に対してＭＡＧＬの阻害に選択的である。例えば、化合物は、本明細書で開示される任意のＭＡＧＬ選択的阻害剤であることができる。幾つかの他の実施態様において、用いられるＭＡＧＬ阻害化合物は、ＭＡＧＬに特異的な阻害ポリヌクレオチドである。このような阻害性ポリヌクレオチドの例には、低分子緩衝ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、アンチセンス核酸及び相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）が含まれる。
【誤訳訂正１２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１７】
関連する態様において、本発明は、被験者の腫瘍の症候を治療又は回復する方法を提供する。これらの方法は、モノアシルグリセロールリパーゼ（ＭＡＧＬ）を特異的に阻害する化合物の治療的に有効な量を含む医薬組成物を被験者に投与することを含んでいる。任意の腫瘍又は癌により苦しめられる被験者も、これらの方法による治療のために回復可能である。例えば、当該方法は、乳腺腫瘍、卵巣腫瘍、黒色腫、肺腫瘍又は脳腫瘍を患う被験者を治療するために使用することができる。幾つかの方法において、用いられるＭＡＧＬ阻害剤は、脂肪酸アミドヒドロラーゼ（ＦＡＡＨ）に対してＭＡＧＬの阻害に選択的である化合物である。幾つかの他の方法において、ＭＡＧＬの発現又は細胞内レベルを特異的に減少させる阻害ポリヌクレオチドが使用される。
【誤訳訂正１３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１９】
【図１】図１Ａ−１Ｂは、ＭＡＧＬ阻害剤の構造及び拮抗ＡＢＰＰプロファイルを示している。Ａ：ＭＡＧＬ阻害剤の構造；Ｂ：マウス脳膜プロテオーム中のセリンヒドロラーゼ活性へのＭＡＧＬ阻害剤の影響を示す拮抗ＡＢＰＰ。比較のために示したものは、それぞれ選択的ＦＡＡＨ及びＡＢＨＤ６阻害剤である、ＵＲＢ５９７（カスリアら（Ｋａｔｈｕｒｉａ  ｅｔ  ａｌ．）、「ネイチャー・メディスン（Ｎａｔ  Ｍｅｄ）」、２００３年、第９巻：ｐ．７６−８１）及びＷＷＬ７０（リーら（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．）、「ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・ケミカル・ソサイアティ（Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．）」、２００７年、第１２９巻：ｐ．９５９４−５）である。阻害剤を脳膜と共に３０分間インキュベートし、次にセリンヒドロラーゼ指向ＡＢＰＰプローブＦＰローダミン（２マイクロＭ、３０分間）で処理し、それからプロテオームをＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びインゲル蛍光スキャニングによって分析し、阻害された酵素を検出した。対照プロテオームは、ＤＭＳＯのみで処理した。蛍光ゲルをグレイスケールで示す。文献（例えば、ブランクマンら（Ｂｌａｎｋｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．）、「ケミストリー＆バイオロジー（Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．）」、２００７年、第１４巻：ｐ．１３４７−５６）に報告された通り、脳ＭＡＧＬがＳＤＳ−ＰＡＧＥによって３５ｋＤａの二重線として移動することに特に言及しておく。
【図２】図２Ａ−２Ｃは、ＪＺＬ１８４の二の生体外キャラクタリゼーションを示している。Ａ：拮抗的ＡＢＰＰによって定量した、マウス脳膜セリンヒドロラーゼへのＪＺＬ１８４の濃度依存的影響；Ｂ：基質アッセイ法（それぞれ２−ＡＧ及びオレイン酸アミド）によって定量した、ＪＺＬ１８４による脳膜ＭＡＧＬ及びＦＡＡＨ活性の遮断；Ｃ：基質アッセイ法（それぞれ２−ＡＧ及びアナンダミド）によって定量した、ＪＺＬ１８４による組換え型ＭＡＧＬ及びＦＡＡＨ活性の遮断。酵素はＣＯＳ７細胞中で組換えにより発現させた。ＪＺＬ１８４は、組換え型ＭＡＧＬ活性のほぼ完全な遮断を引き起こしたが（＞９５％）、おそらく他の酵素の活性を反映して、脳膜においては２−ＡＧ加水分解活性の〜１５％の残存が観察されたことに特に言及しておく。Ａ−Ｃについては、分析に先立って試料をＪＺＬ１８４で３０分間処理した。Ｂ及びＣについては、データは、三つの独立した実験に対する平均±標準誤差として表した。
【図３】図３Ａ−３Ｆは、ＪＺＬ１８４の生体内でのキャラクタリゼーションを示している。Ａ及びＢ：明示の投与量（４−４０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内投与）でＪＺＬ１８４により４時間処理したマウスから調製した脳膜の、セリンヒドロラーゼ活性プロファイル（Ａ）並びにＭＡＧＬ及びＦＡＡＨ活性（Ｂ）；Ｃ：ＪＺＬ１８４により処理（１６ｍｇ／ｋｇ、腹腔内投与、４時間）したマウスから調製された脳膜中のセリンヒドロラーゼ活性のＡＢＰＰ−ＭｕｄＰＩＴ分析。ＭＡＧＬ及びＦＡＡＨの対照シグナルは、それぞれ赤色及び青色のバーで示す；Ｄ−Ｆ：明示の投与量（４−４０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内投与）でＪＺＬ１８４により４時間処理したマウス由来の、脳の２−ＡＧ（Ｄ）、アラキドン酸（Ｅ）、及びＮＡＥ（Ｆ）レベル（Ｆ）。Ｆについては、このＦＡＡＨ阻害剤によって誘導されるＮＡＥの増加を確認するために、ＵＲＢ５９７で処理（１０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内投与）したマウスからのデータも示す。Ｂ−Ｆについては、溶媒処理対照動物と対比した阻害剤処理動物について、＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１である。データは、平均±標準誤差として表した。群当たりｎ＝３−５マウスである。
【図４】図４Ａ−４Ｅは、生体内でのＪＺＬ１８４の阻害活性の時間経過解析を示している。Ａ及びＢ：明示の時間、ＪＺＬ１８４（１６ｍｇ／ｋｇ、腹腔内投与）により処理したマウスから調製した脳膜のセリンヒドロラーゼ活性プロファイル（Ａ）並びにＭＡＧＬ及びＦＡＡＨ活性（Ｂ）；Ｃ−Ｅ：明示の時間ＪＺＬ１８４により処理（１６ｍｇ／ｋｇ、腹腔内投与）したマウス由来の、脳の２−ＡＧ（Ｄ）、アラキドン酸（Ｅ）、及びＮＡＥレベル。Ｂ−Ｅについては、溶媒処理対照動物と対比した阻害剤処理動物について、＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１である。データは、平均±標準誤差として表した。群当たりｎ＝３−５マウスである。
【図５】図５Ａ−５Ｅは、ＪＺＬ１８４の行動的影響を示している。Ａ及びＢ：ＪＺＬ１８４（１６ｍｇ／ｋｇ）は、熱痛覚の尾浸漬アッセイ法において（Ａ）並びに有害な化学痛覚の酢酸腹腔緊張アッセイ法において（Ｂ）鎮痛作用を引き起こした。これらの効果は、ＣＢ１アンタゴニスト、リモナバン（３ｍｇ／ｋｇ）による前処理によって遮断された；Ｃ−Ｅ：ＪＺＬ１８４は、著しい低体温症（Ｃ）、運動性低下症（Ｄ）、及び反射亢進（Ｅ）を引き起こしたが、それらはまたリモナバンによって著しく減弱された。ベースラインの尾浸漬潜伏時間及び直腸温度は、それぞれ０．８２±０．０２秒及び３７．４±０．１℃であった。溶媒−ＪＺＬ１８４処理マウスと対比した溶媒−溶媒処理マウスについて、＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１である。溶媒処理マウス、リモナバン-ＪＺＬ１８４処理マウス対比した溶媒−ＪＺＬ１８４処理マウスについて、＃はｐ＜０．０５、＃＃はｐ＜０．０１である。データは、平均±標準誤差として表した。群当たりｎ＝１０−１４マウスである。
【図６】図６Ａ−６Ｂは、化合物ＷＷＬ９８の構造（Ａ）及び化合物ＪＺＬ１８４の合成経路（Ｂ）を示している。他のカルバミン酸系阻害剤も同様の経路で合成した。
【図７】図７Ａ−７Ｃは、ＭＡＧＬ及びＦＡＡＨのＩＺＬ１８４による経時的な阻害を示している。Ａ：マウス脳膜プロテオーム中のＭＡＧＬ活性のＦＰローダミン標識化のＪＺＬ１８４による阻害；Ｂ：マウス脳膜プロテオーム中のＦＡＡＨ活性のＦＰローダミン標識化のＪＺＬ１８４による阻害；Ｃ：ＪＺＬ１８４によるＭＡＧＬ及びＦＡＡＨ阻害についての計算値ｋｏｂｓ／［Ｉ］。
【図８】図８Ａ−８Ｂは、化合物ＪＺＬ１８４は、ＣＢ１受容体に結合しないこと又は２−ＡＧ生合成酵素ＤＡＧＬβを阻害しないことを示している。Ａ：ＪＺＬ１８４は、ＣＢ１受容体から３Ｈ−リモナバンの結合を置換しなかった；Ｂ：ＪＺＬ１８４（２５μＭ）は、組換えでＣＯＳ−７細胞中に発現されたＤＡＧＬβを阻害しなかった。既知のＤＡＧＬβ阻害剤テトラヒドロリプスタチン（ＴＨＬ、２５μＭ）を正の対照として使用した。
【図９】図９Ａ−９ＢはＪＺＬ１８４の用量反応検討のための脳脂質測定値を示している。ＪＺＬ１８４（４−４０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内投与）の投与４時間後に脳のＣ１８：１又はＣ１６：０ＭＡＧ（Ａ）又は遊離脂肪酸（Ｂ）レベルにおける著しい変化は測定されないことが認められた。
【図１０】図１０Ａ−１０Ｅは、ＪＺＬ１８４の経口投与の効果を示している。Ａ及びＢ：明示の投与量（４−４０ｍｇ／ｋｇ、経口投与）でＪＺＬ１８４により４時間処理したマウスから調製した脳膜の、セリンヒドロラーゼ活性プロファイル（Ａ）並びにＭＡＧＬ及びＦＡＡＨ活性（Ｂ）；Ｃ及びＤ：ＪＺＬ１８４（１−４０ｍｇ／ｋｇ、経口投与）により４時間処理したマウス由来の、脳の２−ＡＧ（Ｃ）及びＡＥＡ（Ｄ）レベル；Ｅ：腹腔内又は経口投与によって処理したマウス由来の脳のＪＺＬ１８４の相対レベル。Ｂ−Ｄについては、溶媒処理動物と対比した阻害剤処理動物について、＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１である。データは、平均±標準誤差として表した。群当たりｎ＝３−５マウスである。
【図１１】図１１Ａ−１１Ｃは、ＪＺＬ１８４処理に続くマウスにおける脳脂質測定値の時間経過を示している。ＪＺＬ１８４投与（１６ｍｇ／ｋｇ、腹腔内投与）に続く２４時間を通して、脳のＣ１８：１又はＣ１６：０のＮＡＥ（Ａ）、ＭＡＧ（Ｂ）、又は遊離脂肪酸（Ｃ）レベルにおいて著しい変化は認められなかった。
【図１２】図１２は、マウス脳中のＪＺＬ１８４レベルの時間経過解析を示している。ＪＺＬ１８４を１６ｍｇ／ｋｇで経口投与した。
【図１３】図１３Ａ−１３Ｄは、侵襲性の癌細胞内でＭＡＧＬが増加することを示しているが、ここで当該酵素はモノアシルグリセロール（ＭＡＧ）及び遊離脂肪酸（ＦＦＡ）レベルを制御する。（Ａ）非侵襲性（青色）及び侵襲性（赤色）のヒト癌細胞株内のセリンヒドロラーゼ活性のＡＢＰＰ。セリンヒドロラーゼ活性は、細胞全体のプロテオームにおいて活性に基づくプローブ、ＦＰローダミンで標識化し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びインゲル蛍光スキャニング（蛍光ゲルをグレイスケールで示す）によって検出した。赤色枠で強調したのは二の酵素、ＭＡＧＬ及びＫＩＡＡ１３６３は、非侵襲性癌細胞と対比して侵襲性癌細胞において一貫して増加している。３３及び３５ｋＤａのＦＰローダミン標識バンドがＭＡＧＬを表すことを確認するために、プロテオームを、ＤＭＳＯ又は選択的ＭＡＧＬ阻害剤ＪＺＬ１８４（１μＭ、４時間）により前処理した癌細胞からも調製した。（Ｂ）ＪＺＬ１８４（１μＭ、４時間）の存在下（赤色バー）又は非存在下（黒色バー）における癌細胞のＣ２０：４ＭＡＧ加水分解活性。（Ｃ、Ｄ）ＭＡＧＬの阻害（ＪＺＬ１８４  １μＭ、４時間）は、侵襲性細胞のＭＡＧレベルを増加し（Ｃ）ＦＦＡレベルを減少するが（Ｄ）、しかし非侵襲性細胞ではそうではない。侵襲性の癌細胞は、それぞれのＭＡＧＬ活性を反映して、非侵襲性の癌細胞と比較して基本的により高レベルのＦＦＡ（及びより低レベルのＭＡＧ）を有することに特に言及しておく。ＤＭＳＯ処理対照群と対比したＪＺＬ１８４処理群について、＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１である。非侵襲性癌細胞と対比した侵襲性癌細胞について、＃はｐ＜０．０５、＃＃はｐ＜０．０１である。データは、平均±標準誤差として表した。群当たりｎ＝４−５である。
【図１４】図１４Ａ−１４Ｆは、ＭＡＧＬの安定なｓｈＲＮＡ媒介ノックダウンが侵襲性癌細胞においてＦＦＡレベルを低下することを示している。（Ａ、Ｄ）ＭＡＧＬを、二の独立した短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）オリゴヌクレオチド（ｓｈＭＡＧＬ１、ｓｈＭＡＧＬ２）を使用して安定にノックダウンした結果、異なるセリンヒドロラーゼ（ＤＰＰＩＶ）を標的とするｓｈＲＮＡを発現するｓｈ対照細胞と比較してＣ８１６１及びＳＫＯＶ３細胞のＭＡＧＬ活性において＞７０％が減少した。（Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｆ）ｓｈＭＡＧＬ細胞は、ＭＡＧレベルの増加（Ｂ、Ｅ）及びＦＦＡレベルの減少（Ｃ、Ｆ）を示している。ｓｈ対照群と対比したｓｈＭＡＧＬ群について、＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１である。非侵襲性癌細胞と対比した侵襲性癌細胞について、＃はｐ＜０．０５、＃＃はｐ＜０．０１である。ｓｈ対照細胞のＭＡＧＬ活性並びにＭＡＧ及びＦＦＡレベルは、親癌細胞株のそれらからそれほど異なっていなかった。データは、平均±標準誤差として表した。群当たりｎ＝４−５である。
【図１５】図１５Ａ−１５Ｃは、高悪性度の原発性ヒト卵巣腫瘍が良性腫瘍と比較して増加したＭＡＧＬ活性及びＦＦＡを有することを示している。（Ａ）個体の腫瘍検体についてのＣ２０：４ＭＡＧ加水分解活性測定値。ＪＺＬ１８４（１μＭ、３０分間）による前処理が、測定された加水分解活性の大部分はＭＡＧＬによることを確認した。（Ｂ）高悪性度腫瘍と対比した良性腫瘍におけるＭＡＧＬ活性の概要図であり、ここで各値は、（Ａ）に示した総Ｃ２０：４ＭＡＧ加水分解活性のＪＺＬ１８４感受性の部分として表した。（Ｃ）高悪性度腫瘍と対比した良性腫瘍におけるＦＦＡレベル。良性腫瘍群と対比した高悪性度群について、＊＊はｐ＜０．０１である。データは、平均±標準誤差として表した。群当たりｎ＝１０−１３である。
【図１６】図１６Ａ−１６Ｊは、ｓｈＲＮＡ媒介ノックダウン及びＭＡＧＬの薬理学的阻害が癌の侵襲性を減じることを示している。（Ａ−Ｃ、Ｆ−Ｇ）ｓｈＭＡＧＬ細胞は、ｓｈ対照及び非感染の親細胞と比較して、減少した移動（Ａ、Ｆ）、浸潤（Ｂ、Ｇ）、及び細胞生存（Ｃ、Ｈ）を示す。移動及び浸潤アッセイは、細胞５０，０００個をコラーゲン（１０μｇ／ｍｌ）で被覆した膜又はバイオコートＴＭマトリゲル（ＢｉｏＣｏａｔＴＭ  Ｍａｔｒｉｇｅｌ）（登録商標）を含有する８μｍ孔径を備えたインサートに播種する前に、癌細胞を４時間無血清培地に移植することによってそれぞれ実施した。Ｃ８１６１及びＳＫＯＶ３の移動時間は、それぞれ５時間及び２０時間だった。移動又は浸潤した細胞は、倍率４００Ｘで４視野当たり計数した平均数±標準誤差で言及する。細胞生存アッセイは、細胞２０、０００個を無血清培地中で９６ウェルプレートに播種することによって実施した。生存は、ＷＳＴ−１増殖アッセイを使用して評価した。代表的な移動プレート（倍率４００Ｘ）をｓｈＭＡＧＬ細胞と対比したｓｈ対照細胞について示す（Ａ、Ｆ）。（Ｄ、Ｉ）ｓｈＭＡＧＬ細胞は、ｓｈ対照細胞及び非感染の親細胞と比較して、ＳＣＩＤマウスにおいて損傷した腫瘍増殖を示している。Ｃ８１６１又はＳＫＯＶ３細胞２ｘ１０６個／１００μｌを側腹部の皮下に注入し、ノギスを使用して腫瘍増殖を測定した。（Ｅ、Ｊ）ＪＺＬ１８４処理（４μｌ／ｇポリエチレングリセロール３００溶媒として毎日４０ｍｇ／ｋｇを経口投与）は、溶媒処理と比較してＳＣＩＤマウスにおける異種移植した腫瘍増殖速度を著しく減少する。ｓｈ対照群と対比したｓｈＭＡＧＬ群又は溶媒処理群と対比したＪＺＬ１８４群について、＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１である。ｓｈ対照細胞及び親癌細胞は、その移動、細胞生存、浸潤、又は生体内での腫瘍増殖においてそれほど異なっていなかった。データは、平均±標準誤差として表した。群当たりｎ＝５−８である。
【図１７】図１７Ａ−１７Ｆは、ＭＡＧＬの異所性発現がＦＦＡレベルを増加し、そしてＭＵＭ２Ｃ黒色腫細胞の生体外及び生体内の病原性を亢進することを示している。（Ａ）ＡＢＰＰ（上段パネル）、ウェスタンブロット（中断パネル）及びＣ２０：４ＭＡＧ加水分解活性（下段パネル）によって確認したＭＵＭ２Ｃ細胞中のＭＡＧＬの過剰発現（ＭＡＧＬ−ＯＥ、赤色バー）。対照細胞及びＳ１２２Ａ細胞（黒色バー）は、それぞれ空のベクター（ＥＶ）に感染した癌細胞又は触媒的に不活性なＭＡＧＬ変異株（Ｓ１２２Ａ）に相当する。ウェスタン分析によりＳ１２２Ａ−ＭＡＧＬ変異株の過剰発現を確認したが、当該変異株は、ＡＢＰＰ及びＣ２０：４ＭＡＧ加水分解アッセイによって評価されたように、いかなる活性も示さなかった。（Ｂ、Ｃ）ＭＡＧＬ−ＯＥ細胞は、ＥＶ対照細胞及びＳ１２２Ａ細胞と比較してより低いＭＡＧレベル（Ｂ）及びより高いＦＦＡレベル（Ｃ）を含んでいる。これらの代謝的効果は、生体内原位置でのＪＺＬ１８４による処理（１μＭ、４時間、栗色のバー）によって逆転された。（Ｄ、Ｅ）ＭＡＧＬ−ＯＥ  ＭＵＭ２Ｃ細胞は、ＥＶ及びＳ１２２Ａ対照細胞と比較して、増加した移動（Ｄ）及び浸潤（Ｅ）を示している。この亢進した移動及び浸潤は、ＪＺＬ１８４（１μＭ、４時間）によって逆転された。代表的な移動パネルを示す（Ｄ）。（Ｆ）ＭＡＧＬ−ＯＥ  ＭＵＭ２Ｃ細胞は、ＥＶ又はＳ１２２Ａ対照細胞と比較してＳＣＩＤマウスにおいて著しく亢進した腫瘍増殖速度を示す（細胞２ｘ１０６個を正所性に移植）。対照群と対比したＭＡＧＬ−ＯＥ群について、＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１である。データは平均±標準誤差で表す。群当たりｎ＝４−６である。
【図１８】図１８Ａ−１８Ｄは、外来性脂肪酸での処理によるｓｈＭＡＧＬ癌細胞の病原性の特性の回復を示している。（Ａ）減少したｓｈＭＡＧＬ細胞の移動は、パルミチン酸又はステアリン酸による処理（２０μＭ、４時間、斜線赤色バー）によって逆転される。（Ｂ）パルミチン酸又はステアリン酸の添加（２０μＭ、４時間）は、ＭＵＭ２Ｃ及びＯＶＣＡＲ３細胞の移動を増加し、そしてＪＺＬ１８４処理ＭＡＧＬ−ＯＥ細胞における減少した移動を救出する。（Ｃ）ｓｈＭＡＧＬ−Ｃ８１６１細胞の減少した腫瘍増殖は、高脂肪食（ＨＦＤ）（６０ｋｃａｌ％脂肪）による処理によって逆転される。癌細胞を側腹部へ注入する前の２週間、マウスを通常固形飼料（ＮＣ）又はＨＦＤで飼い、腫瘍増殖の時間経過を通じてこれらの飼料で養った。挿入図は、時間経過を通じての動物の体重である。ＨＦＤ群由来の外植されたｓｈＭＡＧＬ腫瘍（斜線赤色バー）は、ＮＣ群由来のｓｈＭＡＧＬ腫瘍（赤色バー）と比較して増加したＦＦＡレベルを含んでいる。ｓｈ対照群と対比したｓｈＭＡＧＬ群について、＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１である。ｓｈＭＡＧＬ対照群（それそれＤＭＳＯ処理群及びＮＣ処理群）と対比したパルミチン酸又はステアリン酸又はＨＦＤ処理したｓｈＭＡＧＬ群について、＃＃はｐ＜０．０１である。データは、平均±標準誤差として表した。（Ａ）については、群当たりｎ＝４−５；（Ｂ、Ｃ）については、群当たりｎ＝７−８である。
【図１９】図１９Ａ−１９Ｉは、ＭＡＧＬがプロ腫瘍原性シグナル伝達分子に富む脂質代謝ネットワークを制御することを示している。（Ａ、Ｂ）ＥＶ対照細胞と対比したＭＡＧＬ−ＯＥ（ＭＵＭ２Ｃ及びＯＶＣＡＲ３の両方）（Ａ）及びｓｈ対照細胞と対比したｓｈＭＡＧＬ（Ｂ）の異常ＭＡＧＬ活性に関する癌細胞モデルのリピドーム解析。示した代謝産物は、ＥＶ対照細胞と対比したＭＡＧＬ−ＯＥ細胞（ＭＵＭ２Ｃ及びＯＶＣＡＲ３の両方）において増加した（赤色）又は減少した（青色）代謝産物であり（Ａ）、そしてｓｈ対照細胞と対比したｓｈＭＡＧＬ細胞（Ｃ８１６１及びＳＫＯＶ３の両方）においては逆の特性を示した（Ｂ）。代謝産物の親質量を提供しており、円の大きさは相対的な変化の大きさを示している。（Ｃ、Ｄ）癌細胞モデルにおけるＣ１６：０ＬＰＡ及びＰＧＥ２レベルの定量。（Ｅ）Ｃ１６：０ＬＰＡ（１００ｎＭ、４時間）又はＰＧＥ２（１００ｎＭ、４時間）によるｓｈＭＡＧＬ癌細胞の処理は、ｓｈ対照細胞と比較してそれらの移動障害を救出する。百日咳毒素（ＰＴＸ）（１００ｎｇ／ｍｌ、４時間）は、ＭＡＧＬ−ＯＥ癌細胞の増加した移動を逆転する。（Ｇ）ＭＡＧＬ−ＯＥ細胞と対比したＥＶ対照細胞におけるＬＰＡによる移動の濃度依存的刺激。ＬＰＡによって誘導されるＥＶ対照細胞における移動の最大刺激は、ＭＡＧＬ−ＯＥ細胞において見出される亢進した移動と基本的に一致し、そしてＬＰＡはＭＡＧＬ−ＯＥ細胞の移動をそれ以上増加しないことに特に言及しておく。（Ｈ）移動損傷パーセンテージで表した、ｓｈＭＡＧＬ癌細胞と対比したｓｈ対照癌細胞のＥＧＦＲ（上皮成長因子受容体）阻害剤チロホスチンＡＧ−１４７８に対する感受性。チロホスチンの抗移動効果に関するＩＣ５０値をパネル中に提供する。（Ｉ）ＭＡＧＬ−ＦＦＡ経路を他のプロ腫瘍原性脂質へと結びつけることが可能な代謝ネットワークを示す図。（Ａ）及び（Ｂ）について、データは比較群間の平均相対変化として表した；群当たりｎ＝４−５。（Ｃ−Ｇ）について、それぞれの対照細胞群と比較したＭＡＧＬ−ＯＥ細胞群又はｓｈＭＡＧＬ細胞群（Ｃ−Ｇ）、ＤＭＳＯ処理対照細胞と対比したＪＺＬ１８４処理細胞（Ｃ、Ｄ）については、＊はＰ＜０．０５、＊＊はＰ＜０．０１である。侵襲性細胞（Ｃ８１６１、ＳＫＯＶ３）と対比した非侵襲性親細胞（ＭＵＭ２Ｃ、ＯＶＣＡＲ３）（Ｃ、Ｄ）、又はｓｈ対照細胞と対比したＬＰＡ／ＰＧＥ２処理ｓｈＭＡＧＬ細胞（Ｅ）については、＃＃はＰ＜０．０１である。データは、平均±標準誤差で表した；群当たりｎ＝３−５。
【図２０】図２０Ａ−２０Ｇは、パネルを通して、非侵襲性と対比した侵襲性の黒色腫細胞株及び卵巣癌細胞株のＭＡＧＬ、ＫＩＡＡ１３６３及び脂肪分解プロファイルを示している。ＭＡＧＬ阻害剤ＪＺＬ１８４による癌細胞処理によって引き起こされる増加したＭＡＧと減少したＦＦＡとの間に質量バランスの矛盾が存在する。（Ａ−Ｃ）侵襲性黒色腫細胞（Ｃ８１６１）及び卵巣細胞（ＳＫＯＶ３）は、それらの非侵襲性カウンターパート（それぞれＭＵＭ２Ｃ及びＯＶＣＡＲ３細胞）と比較してより大きな移動（Ａ）及び浸潤（Ｂ）及びより速い腫瘍増殖速度（Ｃ）を示す。（Ｄ）癌細胞株の脂肪分解特性は、他の脂肪分解活性と比較して、侵襲性癌細胞において強いＭＡＧ加水分解活性を示す。生体外での、種々の脂質基質からの遊離脂肪酸（ＦＦＡ）の遊離を測定した。細胞を無血清培地中、生体内原位置でＤＭＳＯ又はＪＺＬ１８４により４時間処理した。細胞溶解物（２０μｇ）を１００μＭ脂質基質と共に室温で１時間インキュベートした。上段及び下段のパネルは、比較及び可視化を容易にするために同じデータを異なったｙ軸の尺度（ＭＡＧ加水分解活性の有無）で示している。脂質基質についての略称は下記のとおりである。ＴＡＧ、トリアシルグリセロール；ＤＡＧ、ジアシルグリセロール；ＭＡＧ、モノアシルグリセロール；ＰＣ、ホスファチジルコリン；ＬＰＣ、リゾホスファチジルコリン；ＰＥ、ホスファチジルエタノールアミン；ＬＰＥ、リゾホスファチジルエタノールアミン。非侵襲性癌株群と対比した侵襲性癌株群については、＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１であり、ＪＺＬ１８４と対比したＤＭＳＯについては、＃＃はｐ＜０．０１である。データは、平均±標準誤差として表した；群当たり、ｎ＝３−１５。（Ｇ−Ｉ）リゾリン脂質の増加は、ＭＡＧＬ阻害剤ＪＺＬ１８４による癌細胞処理によって引き起こされる増加したＭＡＧと減少したＦＦＡの間の質量バランスの矛盾を説明する。（Ｅ）ＪＺＬ１８４（１μＭ、４時間）は、Ｃ８１６１及びＳＫＯＶ３細胞において５５００−６１００ｐｍｏｌ／１０６のＦＦＡレベルの減少を引き起こす。このＦＦＡレベルの減少は、ＪＺＬ１８４処理癌細胞において見出されるリゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）及びリゾホスファチジルエタノールアミン（ＬＰＥ）レベルの正味の増加（４１００−６５００ｐｍｏｌ／１０６細胞）と同様の大きさである。（Ｆ）Ｃ１７：０ＭＡＧ（２０μＭ、１時間）は、癌細胞によってＣ１７：０ＬＰＣ及びＣ１７：０ＬＰＥに変換されるが、しかもこの変換は癌細胞をＪＺＬ１８４（１μＭ、４時間）と共にプレインキュベーションすることによってより亢進される。Ｃ１７：０ＭＡＧは、またＣ１７：０ＬＰＡにも変換されるが、しかしこの場合には、当該変換はＪＺＬ１８４によって遮断される。これらのデータは、Ｃ１７：０ＭＡＧは、癌細胞中でＣ１７：０ＬＰＣ及びＣ１７：０ＬＰＥに直接転換されるが、一方、Ｃ１７：０ＭＡＧのＣ１７：０ＬＰＡへの変換には、Ｃ１７：０ＭＡＧのＣ１７：０ＦＦＡへのＭＡＧＬ依存加水分解が要求されることを示している。Ｃ２０：４ＭＡＧ（２０μＭ、１時間）は、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）に変換されるが、この変換はＪＺＬ１８���によって遮断される。（Ｇ）Ｃ１６：０及びＣ２０：４ＦＦＡは、侵襲性癌細胞によってそれぞれＬＰＡ及びＰＧＥ２に変換される。Ｃ８１６１及びＳＫＯＶ３細胞を、無血清培地中、ｄ２−Ｃ１６：０ＦＦＡ又はｄ８−Ｃ２０：４ＦＦＡ（１０μＭ、４時間）で処理した。ｄ２−Ｃ１６：０ＦＦＡは、ｄ２−Ｃ１６：０  ＬＰＡに変換され、ｄ８−Ｃ２０：４ＦＦＡは、ｄ８−Ｃ２０：４ＰＧＥ２に変換された。処理細胞と対比した対照細胞の比較については、＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１であり、ＭＡＧ単独処理細胞と対比したＪＺＬ１８４／ＭＡＧ処理細胞の比較については、＃はｐ＜０．０５、＃＃はｐ＜０．０１である。データは、平均±標準誤差で表した；群当たり、ｎ＝３−４。
【図２１】図２１Ａ−２１Ｉは、ＭＡＧＬが侵襲性癌細胞株においてＭＡＧ、ＦＦＡ及び癌細胞の病原性を制御することを示している。（Ａ、Ｂ）ＪＺＬ１８４処理（１μＭ、４時間）は、２３１ＭＦＰ細胞においてＭＡＧレベルを増加し（Ａ）及びＦＦＡレベルを減少する。（Ｃ）ｓｈＭＡＧＬプローブは、活性に基づいたタンパク質プロファイリング（ＡＢＰＰ）によって判断すると、侵襲性癌細胞Ｃ８１６１、ＳＫＯＶ３、及び２３１ＭＦＰにおいて他のセリンヒドロラーゼと比較してＭＡＧＬの活性を選択的に減少する。活性に基づいたプローブＦＰローダミンにより細胞全体のプロテオームにおいてセリンヒドロラーゼ活性を標識化し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びインゲル蛍光スキャニング（蛍光ゲルをグレイスケールで示す）によって検出した。、ＡＢＰＰ（対Ｃ８１６１、ＳＫＯＶ３、及び２３１ＭＦＰ）及びＣ２０：４ＭＡＧ基質アッセイ（対２３１ＭＦＰ）によって評価しところ、ＭＡＧＬ活性は両方のｓｈＭＡＧＬプローブ（ｓｈＭＡＧＬ１、ｓｈＭＡＧＬ２）により＞７５％減少した。（Ｄ、Ｅ）ｓｈＭＡＧＬ細胞は、ｓｈ対照又は２３１ＭＦＰ親細胞と比較して増加したＭＡＧレベル（Ｄ）及び減少したＦＦＡレベル（Ｅ）を示す。（Ｆ−Ｈ）ｓｈＭＡＧＬ細胞は、ｓｈ対照又は２３１ＭＦＰ親細胞と比較して減少した移動（Ｆ）、浸潤（Ｇ）、及び細胞生存（Ｈ）を示す。移動障害は、Ｃ１６：０ＦＦＡ又はＣ１８：０ＦＦＡによる処理（２０μＭ、４時間）によって救出された。（Ｉ）ＪＺＬ１８４によるＭＡＧＬの急性遮断により、癌細胞の移動が損傷される。それぞれの対照群と対比したＪＺＬ１８４処理細胞又はｓｈＭＡＧＬ細胞については、＊＊はｐ＜０．０１である。ＤＭＳＯ処理ｓｈＭＡＧＬ群と対比したＣ１６：０又はＣ１８：０ＦＦＡ処理群については、＃＃はｐ＜０．０１である。データは、平均±標準誤差として表した；群当たり、ｎ＝４−６。
【図２２】図２２Ａ−２２Ｂは、生体内でのＪＺＬ１８４処理（経口強制飼養４０ｍｇ／ｋｇ、３０日間、４μＬ／ｇポリエチレングリコールを毎日１回投与）が腫瘍異種移植片ＭＡＧＬ活性を阻害すること（Ａ）及びｓｈＭＡＧＬ腫瘍がｓｈ対照細胞と比較してより低いＦＦＡレベルを含んでいたこと（Ｂ）を示している。溶媒又はＪＺＬ１８４処理したマウス腫瘍ホモジネートを、１００μＭＣ２０：４ＭＡＧの添加前に、ＤＭＳＯ又はＪＺＬ１８４（１μＭ、３０分間）と共に生体外で３０分間インキュベートした。それぞれ溶媒腫瘍又はｓｈ対照腫瘍と対比したＪＺＬ１８４処理腫瘍又はｓｈＭＡＧＬ腫瘍については、＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１である。データは、平均±標準誤差として表した；グループ当たり、ｎ＝４。
【図２３】図２３Ａ−２３Ｇは、ＭＡＧＬの異所性発現がＦＦＡレベルを増加し、卵巣癌細胞ＯＶＣＡＲ３及びＭＵＭ２Ｃ並びに黒色腫細胞の生体外及び生体内での病原性を亢進することを示している。（Ａ）ＡＢＰＰ（上段パネル）、ウェスタンブロット（中段パネル）及びＣ２０：４ＭＡＧ加水分解活性（下段パネル）によって確認した、ＯＶＣＡＲ３細胞におけるＭＡＧＬの過剰発現（ＭＡＧＬ−ＯＥ、赤色バー）。対照及びＳ１２２Ａ細胞（黒色バー）は、空ベクター（ＥＶ）により感染した癌細胞又は触媒的に不活性なＭＡＧＬ変異株（Ｓ１２２Ａ）に相当する。ウェスタン分析は、Ｓ１２２Ａ−ＭＡＧＬ変異株の過剰発現を確認したが、当該変異株はＡＢＰＰ及びＣ２０：４ＭＡＧ加水分解アッセイによる評価においてはいかなる活性をも示さなかった。（Ｂ、Ｃ）ＭＡＧＬ−ＯＥ細胞は、ＥＶ対照細胞及びＳ１２２Ａ細胞と比較してより低いＭＡＧレベル（Ｂ）及びより高いＦＦＡレベル（Ｃ）を含んでいる。これらの代謝的効果は、生体内原位置でのＪＺＬ１８４による処理（１μＭ、４時間、栗色のバー）によって逆転された。（Ｄ、Ｅ）ＭＡＧＬ−ＯＥ  ＯＶＣＡＲ３細胞は、ＥＶ及びＳ１２２Ａ対照細胞と比較して増加した移動（Ｄ）及び浸潤（Ｅ）を示す。この亢進した移動及び浸潤は、ＪＺＬ１８４（１μＭ、４時間）によって逆転された。代表的な移動のパネルを示す（Ｄ）。（Ｆ）ＭＡＧＬ−ＯＥ  ＭＵＭ２Ｃ及びＯＶＣＡＲ３細胞は、ＥＶ対照細胞と比較して著しく亢進した細胞生存（血清飢餓培養後２４時間）を示す。（Ｇ）ＭＡＧＬ−ＯＥ  ＭＵＭ２Ｃ細胞の亢進した腫瘍増殖速度は、侵襲性のＣ８１６１黒色腫細胞の腫瘍増殖速度と同様である。Ｃ８１６１及びＭＵＭ２Ｃのデータは、それぞれ図１６Ｅ及び図１７Ｆに由来する（これらの実験は、腫瘍増殖速度の直接比較を可能にするために同時に実施したことを特に言及しておく）。対照群と対比したＭＡＧＬ−ＯＥ群については、＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１である。データは、平均±標準誤差として表した；群当たり、ｎ＝４−６。
【図２４】図２４Ａ−２４Ｊは、癌の攻撃性における、カンナビノイドのシグナル伝達、エネルギー力学、脂肪酸ベータ酸化又は脂肪酸合成の評価を示している。ｓｈ対照及びｓｈＭＡＧＬ癌細胞におけるＦＦＡレベルは、ＣＢ１アンタゴニスト（リモナバン、１μＭ、４時間）又はＣＢ２アンタゴニスト処理（ＡＭ６３０、１μＭ、４時間）によって変化しなかった。Ｃ１６：０及びＣ２０：４ＦＦＡについてのデータを示す。他のＦＦＡ（Ｃ１８：０、Ｃ１８：１）についても同様の結果が見出された。（Ｂ）ｓｈＭＡＧＬ癌細胞における移動障害は、ＣＢ１アンタゴニストであるリモナバン又はＣＢ２アンタゴニストであるＡＭ６３０のどちらの処理（１μＭ、４時間）によっても、又は両方のアンタゴニストによる共同処理によっても救出されなかった。ｓｈ対照細胞と対比した各ｓｈＭＡＧＬ群について、＊＊はｐ＜０．０１である。データは、平均±標準誤差として表した；群当たり、ｎ＝６。（Ｃ、Ｄ）ＤＮＡマイクロアレイ分析によって測定したＣＢ１受容体（Ｃ）及びＣＢ２受容体（Ｄ）ｍＲＮＡレベル。左の棒グラフは、ＨＵ１３３ＡＰｌｕｓ２．０アフィメトリクスアレイにより実施されたヒト癌細胞株のＮＣＩ６０パネルの分析から抽出したデータに相当する（ロスら（Ｒｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．）、２０００年）。右の棒グラフは、ＨＵ１３３ＡＰｌｕｓ２．０アフィメトリクスアレイにより実施された本研究に使用した侵襲性及び非侵襲性癌細胞株の分析から抽出したデータに相当する。比較のために、高いＣＢ１受容体レベルを含むＳＮＢ−１９癌細胞株を示す。（Ｅ−Ｈ）ＭＡＧＬの増加した発現（ＭＡＧＬ−ＯＥ）又は減少した発現（ｓｈＭＡＧＬ）は、癌細胞におけるＮＡＤ＋（Ｅ）、ＮＡＤＨ（Ｆ）、ピルビン酸（Ｇ）、又は乳酸（Ｈ）レベルを変化させない。データは、平均±標準誤差として表した；群当たり、ｎ＝６。（Ｉ）脂肪酸β酸化阻害剤トリメタジジン（３−ケトアシルコエンザイムＡチオラーゼ阻害剤、１００μＭ、４時間のプレインキュベーション及び移動に関してはコインキュベーション）又はエトモキシル（ＣＰＴＩ阻害剤、１００μＭ、４時間のプレインキュベーション及び移動に関してはコインキュベーション）は、癌細胞の移動に影響を与えなかった。対照群と対比したＭＡＧＬ−ＯＥ群について、＊＊はｐ＜０．０１である。データは、平均±標準誤差として表した、群当たり、ｎ＝３。（Ｊ）エトモキシル処理（１００μＭ、４時間）は、Ｃ２０：４ＦＦＡを除いては癌細胞中のＦＦＡレベルを変化させなかったが、当該ＦＦＡはＣ８１６１及びＳＫＯＶ３細胞において増加した。それぞれの対照群と対比したｓｈＭＡＧＬ又はＭＡＧＬ−ＯＥ細胞について、＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１である。ＤＭＳＯ処理対照群と対比したエトモキシル処理群については、＃はｐ＜０．０５である。データは、平均±標準誤差で表した；群当たり、ｎ＝３−４。
【図２５】図２５Ａ−２５Ｄは、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤チロホスチンの癌細胞への影響を示している。チロホスチンは、ｓｈＭＡＧＬ癌細胞において見出される移動及び細胞生存の障害と同様のレベルで、Ｃ８１６１（Ａ、Ｂ）及びＳＫＯＶ３（Ｃ、Ｄ）細胞において、移動及び細胞生存（４８時間、無血清）を減少した。Ｃ８１６１及びＳＫＯＶ３ｓｈＭＡＧＬ細胞は、細胞移動及び細胞生存（Ａ、Ｂ）においてチロホスチン誘発障害に対する亢進した感受性を示す。溶媒処理ｓｈ対照細胞又はｓｈＭＡＧＬ癌細胞と対比したチロホスチン処理細胞の間では、＊はｐ＜０．０５、＊＊はＰ＜０．０１である；同処理群のｓｈ対照とｓｈＭＡＧＬ癌細胞との間では、＃＃はｐ＜０．０１である。データは、平均±標準誤差として表した、群当たり、ｎ＝４。
【誤訳訂正１４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２０】
発明の詳細な説明
Ｉ．概要
２−アラキドノイルグリセロール（２−ＡＧ）及びアナンダミドは、カンナビノイド受容体ＣＢ１及びＣＢ２を活性化する脂質伝達物質である。内在性カンナビノイドシグナル伝達は、アナンダミドについては、脂肪酸アミドヒドロラーゼ（ＦＡＡＨ）によって媒介される過程、２−ＡＧについては、モノアシルグリセロールリパーゼ（ＭＡＧＬ）によって基本的に制御されていると考えられている過程である、酵素的加水分解によって終結する。本発明は、ＭＡＧＬの選択的阻害剤の本発明者らによる合成及びキャラクタリゼーションに一部基づいている。ＭＡＧＬ選択的阻害剤はＭＡＧＬのヒドロラーゼ活性を強力に阻害する一方で、ＦＡＡＨ等の他の脳セリンヒドロラーゼにほとんど又は全く阻害活性を有しないことが見出された。加えて、マウスへの腹腔内注射又は経口投与において、選択的ＭＡＧＬ阻害剤は、脳の２−ＡＧレベルを著しく増加させることができたが、アナンダミド又は他のＮ−アシルエタノールアミン等の他の既知の脂質シグナル伝達分子のレベルを変化させない。また、阻害剤により処理されたマウスも、痛覚消失症を含む一連のＣＢ１依存的行動的影響を示す。
【誤訳訂正１５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２２】
これらの発見に従って、本発明は、ＭＡＧＬ選択的アンタゴニスト化合物又はその薬学的に許容可能な塩を含む治療的な組成物を提供する。これらの組成物は、異所性の又は不十分なカンナビノイドシグナル伝達、特に２−ＡＧ媒介内在性カンナビノイドシグナル伝達に連結又は媒介される、被験者の障害又は症状の症候を治療又は回復するために、又は増加したカンナビノイドレベルから有利な効果を引き出すことのできる疾患を治療するために使用することができる。このような障害又は症状には、例えば、疼痛、炎症、抑鬱、不安神経症、多発性硬化症、緑内障、及びアルツハイマー病が含まれる。これらの特殊な症状又は障害のいずれかを患う被験者における治療応用に加えて、本発明の組成物は、一般的にカンナビノイド依存性行動的影響（例えば、痛覚消失症）を誘導するために、又は２−ＡＧ媒介内在性カンナビノイドシグナル伝達活性を刺激又は増大するために、他の被験者においても用いることができる。本明細書で例示するＭＡＧＬ選択的阻害化合物をリード化合物として使用することにより、本発明は、改良された生物学的活性及び薬学的特性を備えた新規なＭＡＧＬ阻害剤のためのスクリーニング方法をさらに提供する。当該新規ＭＡＧＬ阻害剤は、異常な又は減少したカンナビノイドシグナル伝達活性によって引き起こされる又は関連する、障害又は症状の治療における増強された特性を備えた治療薬を提供することができる。次節に、本発明の組成物の生成及び使用、並びに本発明の実施方法についてのガイダンスを提供する。
【誤訳訂正１６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２６】
「抗悪性腫瘍剤（ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  ａｇｅｎｔ）」は、ヒトの新生物、特に細胞腫、肉腫、リンパ腫、又は白血病等の悪性（癌性）の病変の発達又は進行を阻害する機能特性を有する薬剤に言及するために本明細書で使用する。転移阻害はしばしば抗悪性腫瘍剤の一特性である。
【誤訳訂正１７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２９】
カンナビノイドシグナル伝達と関連する症状又は障害とは、異所性の又は抑制された内在性カンナビノイドシグナル伝達に連結、媒介又は関連する障害をいう。このように、当該障害には、減少した内在性カンナビノイドレベル（例えば、２−ＡＧ）又は内在性カンナビノイドを分解する過剰な酵素活性によって引き起こされる症状が包含される。カンナビノイドシグナル伝達と関連する症状又は障害には、内在性カンナビノイドシグナル伝達の増大によって有益な効果（例えば、疼痛）を誘導することのできる症状が含まれる。当該用語には広く、治療効果が増加したカンナビノイドレベル又は減少したアラキドン酸レベルから獲得することのできる疾病も含まれる（例えば、アルツハイマー病又は多発性硬化症）。本発明の幾つかの好ましい実施態様において、当該症状又は障害は、２−ＡＧシグナル伝達と関連又は付随する（例えば、異所性の又は抑制された２−ＡＧシグナル伝達）症状・障害であり、又は２−ＡＧシグナル伝達活性を刺激することによって有益な効果を誘導することのできる症状・障害である。このような症状又は障害の例には、疼痛、抑鬱、不安神経症、心血管障害、代謝障害、炎症性症候群及び卒中が含まれる。
【誤訳訂正１８】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３０】
本発明において使用する場合、心血管障害という用語は、心臓又は血管（動脈及び静脈）に関わる疾患のクラスをいう。それは、心臓血管系に悪影響を及ぼす任意の疾患を含むが、しかし特にアテローム性動脈硬化症（動脈疾患）と関連するこれらの症状をいう。これらの症状は同様の原因、機序、及び治療法を有する。通常の心血管障害の例には、動脈硬化症（動脈の硬化）、アテローム性動脈硬化症（血管壁上のコレステロール蓄積等の粥腫）、リウマチ性心疾患、全身性高血圧症及び卒中が含まれる。本明細書で使用する場合、炎症性疾患とは、異常な、過剰な又は調節解除された炎症に付随する疾患又は症状である。それらには、ヒトの種々の疾患の根底にある、大きな、無関連な疾患群、例えばアレルギー反応及びある筋障害等が含まれる。代謝障害とは、正常な成長発育に必須のある代謝反応が起きないときに発生する健康状態をいう。これらには、アミノ酸代謝障害（例えば、メープルシロップ尿症及びホモシスチン尿症）、有機酸代謝障害（例えば、メチルマロン酸尿症）、脂肪酸ベータ酸化障害（例えば、ＭＣＡＤ欠損症）、テイ・サックス病及びゴーシェ病等の脂質代謝障害（脂質蓄積症）、ミトコンドリア障害（例えば、ミトコンドリア心筋症）、及びペルオキソーム病（例えば、ツェルベルガー症候群）含まれる。
【誤訳訂正１９】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３１】
カンナビノイドの行動的影響（又はＣＢ１依存性及び／又はＣＢ２依存性行動的影響）とは、カンナビノイドシグナル伝達活性の結果として被験者によって示される生理学的及び行動上の応答をいう。カンナビノイドの行動的影響の幾つかは、２−ＡＧシグナル伝達に関与するが、本明細書では２−ＡＧ媒介行動的影響（又は２−ＡＧ依存行動的影響）と呼ぶ。下記の実施例において詳述する通り、２−ＡＧ媒介行動的影響には無痛覚症（減少した痛覚）が含まれる。特に指定のない限り、カンナビノイドの行動影響には、また被験者に存する又は被験者によって経験される、炎症、不安神経症又は抑鬱に付随する症候の軽減又は回復も包含される。
【誤訳訂正２０】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３２】
内在性カンナビノイド系とは、食欲、痛覚、気分、及び記憶を含む、種々の生理学的過程に関与する、神経調節物質及びその受容体の一群をいう。カンナビノイド受容体（カンナビスの向精神効果を媒介する受容体と同一）に結合する内在性の脂質が内在性カンナビノイドと命名される。概して、内在性カンナビノイド系には（１）それぞれ主に中枢神経系及び抹消神経に位置する２のＧタンパク質共役型受容体である、カンナビノイド受容体ＣＢ１及びＣＢ２；（２）内在性アラキドン酸に基づく脂質である、アナンダミド（N-アラキドニルエタノールアミン又はＡＥＡ）及び２−アラキドノイルグリセロール（２−ＡＧ）、これらは、カンナビノイド受容体のリガンドであって、集合的に「内在性カンナビノイド」と呼ばれる；及び（３）内在性カンナビノイドであるアナンダミド及び２−ＡＧを合成及び分解する酵素、が含まれる。内在性カンナビノイド系は、遺伝的及び薬理学的方法を使用して研究されてきた。これらの研究は、神経調節物質放出、運動学習、シナプス可塑性、食欲、及び痛覚を含む、様々な生理学的過程における内在性カンナビノイドシグナル伝達についての広範な役割を明らかにした。
【誤訳訂正２１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３３】
痛覚過敏は、被験者（例えば、温血動物）が疼痛に対し増加した感受性を示す症状である。それは、身体への物理的損傷、例えば、手術によって不可避的に生じた受傷に付随することが知られている。疼痛は、関節炎及びリウマチ性疾患等のヒトの炎症症状に付随することも知られている。痛覚過敏には、限定されるものではないが、炎症（例えば、リウマチ性関節炎及び変形性関節症）と関連する疼痛、術後痛、後分娩痛、歯科症状（齲蝕及び歯肉炎）と関連する疼痛、限定されるものではないが、日焼け、擦過傷、挫傷その他を含む熱症と関連する疼痛、スポーツ損傷及び捻挫、限定されるものではないが、ツタウルシ、アレルギー性皮疹及び皮膚炎を含む皮膚症状と関連する疼痛、及び軽い刺激に対する感受性を増加する有害冷感等の他の疼痛等の軽中度の疼痛から激痛までが含まれる。
【誤訳訂正２２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３５】
「ポリヌクレオチド」又は「核酸配列」とは、ヌクレオチドの多量体型（ポリリボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチド）をいう。幾つかの例において、ポリヌクレオチドとは、それが由来するところの生物体の天然ゲノム中において、それがすぐ近くに隣接しているどちらのコード配列（一は５’末端上、及び一は３’末端上）ともすぐ近くに隣接していない配列をいう。それ故に、当該用語には、例えば、ベクター：自己複製プラスミド若しくはウイルス；又は原核生物若しくは真核生物のゲノムＤＮＡに取り込まれた、又は他の配列とは別個の独立した分子（例えば、ｃＤＮＡ）として存在する組換えＤＮＡが含まれる。ポリヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、又は各々のヌクレオチドの修飾型であることができる。
【誤訳訂正２３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３７】
用語「被験者」には、哺乳動物、とくにヒト、さらに、他の非ヒト動物、例えば、ウマ、イヌ、ネコ、マウス及びラットが含まれる。
【誤訳訂正２４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００４０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００４０】
ＩＩＩ．ＭＡＧＬ選択的阻害剤
本発明は、新規なＭＡＧＬ阻害剤を提供する。ＭＡＧＬ阻害剤には、ＭＡＧＬの発現、修飾、制御若しくは活性を妨害する化合物、又はＭＡＧＬの正常な生物学的活性（例えば、そのセリンヒドロラーゼ活性）の一以上を下方制御する化合物が含まれる。特に本発明のＭＡＧＬ阻害剤は、ＭＡＧＬ酵素活性を遮断又は阻害する。上記で言及したように、ＭＡＧＬは、神経系における、カンナビノイド受容体リガンド、２−ＡＧの加水分解の原因となる主要な酵素である。ＭＡＧＬ阻害剤又はアンタゴニスト化合物は、痛覚消失症等のカンナビノイド依存行動的影響を誘発するのに有用である。ＭＡＧＬ酵素活性を特異的に阻害又は抑制する化合物は、異常な（例えば、抑制又は減少した）カンナビノイドシグナル伝達活性によって引き起こされる又は関連する障害又は症状（例えば、疼痛）を治療するうえで種々の治療的又は予防的応用を有することができる。ＭＡＧＬ酵素活性を阻害するいかなる分子も、カンナビノイド依存行動的影響を誘発する、又は抑制されたカンナビノイドシグナル伝達活性に連結した症状を治療することができるかもしれない。しかしならが、他の脳セリンヒドロラーゼ（例えば、ＦＡＡＨ）をも阻害するＭＡＧＬアンタゴニスト化合物は、これらの他の酵素によって媒介される様々な生物学的機能により妨害されるかもしれない。このような非選択的ＭＡＧＬ阻害剤は、抑制されたカンナビノイドシグナル伝達活性に連結した障害（例えば、疼痛消失）を治療することができるが、多くの望まれない副作用を有しがちである。従って、このような治療的な応用においてはＭＡＧＬ酵素活性を選択的に阻害する分子が好ましい。ＭＡＧＬ酵素活性を特異的に阻害することによって、一方では他の脳セリンヒドロラーゼ（ＦＡＡＨ）に著しい影響を生じずに、不十分な又は抑制された２−ＡＧシグナル伝達活性と関連した又は連結した症候を治療又は回復することができる。
【誤訳訂正２５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００４１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００４１】
従って本発明は、他の脳セリンヒドロラーゼ（例えば、ＦＡＡＨ又はＡＢＨＤ６）の一以上の酵素活性が著しくは悪影響を受けない濃度で、ＭＡＧＬの酵素活性を実質的に遮断又は阻害する、新規なＭＡＧＬ−選択的阻害剤（又は「ＭＡＧＬ−特異的阻害剤」）を提供する。幾つかの好ましい実施態様において、ＭＡＧＬ阻害剤は、ＭＡＧＬによる２−ＡＧの加水分解を遮断する。特に、本発明のＭＡＧＬ選択的阻害剤又はＭＡＧＬ選択的アンタゴニストは、ＦＡＡＨ阻害に比較してＭＡＧＬの阻害に対し選択性を示す化合物である。他の脳セリンヒドロラーゼ（例えば、ＦＡＡＨ）にまさったＭＡＧＬに対する化合物の選択性は、当該化合物の存在下に同種基質に関する各酵素の酵素活性を分析することによって測定することができる。明細書の実施例で詳述する通り、選択性は、脳膜プロテオームにおける化合物による基質（例えば、ＭＡＧＬに対しては２−ＡＧ及びＦＡＡＨには対してはオレイン酸アミド）の加水分解阻害のＩＣ５０値を測定することによって決定することができる。ＩＣ５０値を測定するのに加えて、ＦＡＡＨに比したＭＡＧＬに対する阻害剤の選択性は、化合物存在下での酵素的触媒加水分解反応の擬一次速度定数（ｋｏｂｓ／［Ｉ］）を測定することによっても決定することができる。これは、下記の実施例に記載した通り、脳膜プロテオーム中に存在する酵素により生体外で実施することもできる。脳膜プロテオームに存在する加水分解酵素を使用する以外に、酵素活性アッセイは、組換え酵素によっても実施することができる。例えば、他の脳セリンヒドロラーゼと同様にＭＡＧＬ、ＦＡＡＨは、本明細書に記載した方法又は当該技術分野で報告された方法に従って組換えで容易に得ることができる（例えば、ブランクら（Ｂｌａｎｋ  ｅｔ  ａｌ．）、「ケミストリー＆バイオロジー（Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．）」、２００７年、第１４巻：ｐ．１３４７−５６）。典型的には、ＭＡＧＬ選択的阻害剤は、ＦＡＡＨに対するそのＩＣ５０値よりも少なくとも２０倍、好ましくは少なくとも５０、１００、２５０又は５００倍低いＭＡＧＬに対するＩＣ５０値を有すべきである。ｋｏｂｓ／［Ｉ］により測定するならば、ＭＡＧＬ選択的阻害剤は、通常、ＦＡＡＨに対するそれよりも少なくとも１０倍、好ましくは少なくとも２５、５０、７５、１００又は３００倍高いＭＡＧＬに対する速度定数を有するだろう。
【誤訳訂正２６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００４２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００４２】
本発明のＭＡＧＬ選択的阻害剤の幾つかは、ＦＡＡＨに加えて、また一以上の他の脳セリンヒドロラーゼに比してＭＡＧＬに対して選択的でもある。例えば、化合物は、ＡＢＨＤ６及び／又はＡＢＨＤ１２に比してＭＡＧＬに対して選択的であることができる。ＡＢＨＤ６及びＡＢＨＤ１２は、マウス脳において２−ＡＧヒドロラーゼ活性を示すことが明らかにされた他の二つの脳酵素であり、明確な細胞内分布を示している（例えば、ブランクら（Ｂｌａｎｋ  ｅｔ  ａｌ．）、「ケミストリー＆バイオロジー（Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．）」、２００７年、第１４巻：ｐ．１３４７−５６を参照）。これらの酵素を阻害しないＭＡＧＬ選択的アンタゴニストは、内在性カンナビノイドシグナル伝達と関連した現在は未知の機能を研究及び証明するために有用である。
【誤訳訂正２７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００４５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００４５】
例示したＭＡＧＬ−特異的阻害剤の幾つかは、ＦＡＡＨに比してＭＡＧＬを選択的に阻害する。実施例において詳述する通り、図１Ａに示す化合物ＷＷＬ１５２、ＷＷＬ１６２、ＪＺＬ１７５及びＪＺＬ１８４の全ては、ＦＡＡＨに比してＭＡＧＬに対して選択性を示す。化合物の幾つかは、ＦＡＡＨに加えて他の脳セリンヒドロラーゼにもまさってＭＡＧＬに対して選択的である。これらには、式Ｉによって包含される化合物ＪＺＬ１８４及びＪＺＬ１７５が含まれる。これらの二つの化合物は、特異的にＭＡＧＬを阻害し、ＡＢＨＤ６と同様にＦＡＡＨに関して全く又は非常に減少した阻害活性しか有しない。
【誤訳訂正２８】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００４７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００４７】
ＩＶ．内在性カンナビノイドシグナル伝達の亢進及びそれに付随する症状の治療
本発明は、このような治療を必要とする被験者において、内在性カンナビノイドシグナル伝達（特に２−ＡＧシグナル伝達活性）を刺激若しくは増大する、又はカンナビノイドの加水分解（例えば、２−ＡＧの加水分解）を阻害する方法を提供する。下記の実施例に明らかにする通り、本発明のＭＡＧＬ特異的阻害剤によるＭＡＧＬの阻害は、生体内での２−ＡＧ媒介内在性カンナビノイドシグナル伝達を増大するために十分であるが、一方、脳セリンヒドロラーゼの非選択的阻害により別に生じるかもしれない、いかなる意図しない結果も制限している。本発明者らは、幾つかのカンナビノイド依存性の行動的影響がＭＡＧＬの選択的阻害に由来し得ることも確認した。これらの行動的影響（２−ＡＧ媒介行動的影響）には、例えば、痛覚消失症、運動性低下症、低温低下、及び反射亢進が含まれる。種々の状況下で、ある被験者においては一定の２−ＡＧ媒介行動的影響（例えば、痛覚消失症）を誘発することが望ましいかもしれない。例えば、疼痛を患う被験者は、ＭＡＧＬ選択的阻害によって誘発される痛覚消失から治療的利益を得ることができる。被験者における２−ＡＧシグナル伝達活性を刺激又は増大するために、当該方法は、本明細書で開示するＭＡＧＬ選択的阻害剤の治療的に有効な量を被験者に投与することを含んでいる。いくつかの関連する方法は、本発明のＭＡＧＬ選択的阻害剤を被験者に投与することによって、ＣＢ１及び／又はＣＢ２依存性の行動的影響を被験者に誘発することに向けられている。いくつかの方法において、被験者は、例えば、２−ＡＧによって媒介される行動的影響、例えば痛覚消失を誘発することができるように、化合物を投与される。
【誤訳訂正２９】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００４８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００４８】
本明細書で開示するＭＡＧＬ選択的阻害剤は、また一般的に異常なカンナビノイドシグナル伝達（特に２−ＡＧシグナル伝達活性）により引き起こされる又は関連する障害、又は２−ＡＧシグナル伝達活性を増大又は刺激することによって有益な効果を得ることができる症状を治療するためにも適している。従って、ＭＡＧＬ選択的阻害剤を用いる場合、本発明は、カンナビノイドシグナル伝達に連結する又は関連する障害又は症状を患う被験者を治療するための方法をさらに提供する。当該方法は、本明細書で開示するＭＡＧＬ選択的阻害剤の治療的に有効な量を、治療を必要とする被験者に投与することを必要とする。治療されるべき被験者には、異常な（不十分又は抑制された）カンナビノイドシグナル伝達により媒介される又は関連する障害又は症状を患う被験者が含まれる。治療されるべき被験者には、また増大したカンナビノイドシグナル伝達活性から有益な効果を得ることができる症状を有する被験者でもあることができる。いくつかの好ましい実施態様において、当該方法は、２−ＡＧシグナル伝達と関連する症状を患う被験者において、２−ＡＧ媒介シグナル伝達活性を刺激することに向けられる。これらの障害及び症状の例には、疼痛、炎症、不安神経症、抑鬱、心血管障害、代謝障害、及び卒中が含まれる。本発明の方法に適した多くの炎症性障害が存在する。これらの障害は、例えば、喘息、自己免疫疾患、慢性炎症、慢性前立腺炎、糸球体腎炎、過敏症、炎症性腸疾患、骨盤内炎症性疾患、再灌流障害、リウマチ性関節炎、移植拒絶及び脈管炎等、当該技術分野において周知である。卒中に加えて、本発明の治療方法に適した心血管障害には、また動脈瘤、狭心症、アテローム性動脈硬化症、脳血管疾患、うっ血性心不全、冠動脈疾患、及び心筋梗塞（心臓発作）も含まれる。同様に、増大する内在性カンナビノイドシグナル伝達（例えば、２−ＡＧ媒介シグナル伝達活性）から利益を売ることのできる代謝障害は当該技術分野で周知である。このような障害の例には、フェニルケトン尿症、アルカプトン尿症、地中海貧血症、ポルフィリン症、テイ・サックス病、ハーラー症候群、ゴーシェ病、ガラクトース血症、クッシング症候群、真性糖尿病、甲状腺機能亢進症、及び甲状腺機能低下症が含まれる。
【誤訳訂正３０】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００５０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００５０】
典型的には、本発明の治療方法には、本発明のＭＡＧＬ特異的阻害剤を含有する医薬組成物を治療の必要な被験者に投与することが含まれる。ＭＡＧＬ特異的阻害剤は、単独で又は障害に適した他の既知の治療薬と併用して使用することができる。例えば、疼痛を有する被験者には、疼痛を緩和する他の鎮痛剤を追加的に投与することができる。このような既知の鎮痛剤には、モルヒネ及びモクソニジンが含まれる（米国特許第６，１１７，８７９号を参照）。幾つかの他の方法において、本発明のＭＡＧＬ特異的阻害剤は、被験者の内在性カンナビノイドシグナル伝達活性を亢進するためにＦＡＡＨ選択的阻害剤と併用して使用することもできる。ＭＡＧＬ阻害剤単独又はＦＡＡＨ阻害単独と比較して、ＭＡＧＬ選択的阻害剤及びＦＡＡＨ選択阻害剤両方の投与は、望むカンナビノイド依存性の行動的影響、例えば疼痛の減少又は炎症、不安神経症、及び抑鬱に付随する症候の回復を被験者に強力により良く誘発することができた。ＦＡＡＨ選択的阻害剤は当該技術分野で既知である（例えば、フェグリーら（Ｆｅｇｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．））、「ジャーナル・オブ・ファルマコロジー・アンド・エクスペリメンタル・セラピューティクス（Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．）」、２００５年、第３１３巻：ｐ．３５２−８）。例えば、ＦＡＡＨ選択的阻害剤ＵＲＢ５９７は、ケイマンケミカル社（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）（アナーバー、ミシガン州）等から容易に市販品を入手することができる。
【誤訳訂正３１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００５２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００５２】
一般的に、治療は、被験者が所望の薬理学的及び／又は生理学的な効果を獲得することを可能にする。当該効果は、カンナビノイドシグナル伝達と関連する症状若しくは障害又はその前兆又はその症候から被験者を完全に又は部分的に防止するかとの点からは、予防的であってもよい。それはまた、カンナビノイドシグナル伝達及び／又は障害に起因する有害作用（例えば、疼痛）と関連する症状又は疾患に対する部分的か又は完全な治癒の点からは治療的であることができる。被験者がヒトである場合、人が知覚する疼痛のレベルは、被験者当人に疼痛を述べること又は疼痛を他の痛みの経験と比較することを頼むことによって評価することができる。あるいは、疼痛のレベルは、ストレス関連因子の放出又は抹消神経系若しくはＣＮＳ（中枢神経系）中の疼痛伝達神経の活動等の、被験者の疼痛に対する身体反応を測定することによって較正することができる。又、疼痛レベルは、人が疼痛がないと報告するのに要求される、又は被験者が疼痛の症候を示すことを停止するのに要求される、十分に特性化された鎮痛剤の量を測定することによっても較正することができる。
【誤訳訂正３２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００５３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００５３】
本発明の治療法に適した被験者は、ヒトの被験者、ヒト以外の哺乳動物及びＭＡＧＬを発現する他の動物であることができる。被験者は、現在疼痛を引き起こしておりそして疼痛を引き起こし続けそうな進行中の症状を有していてもよい。また被験者は、通常痛みの結果を伴う術式又は事象を耐えてきてもよいし又は耐えることになってもよい。例えば、被験者は、糖尿病性神経因性疼痛又は膠原病性脈管疾患等の慢性の疼痛症状を有していてもよい。被験者は、また炎症、神経損傷、又は毒暴露（化学療法薬への暴露を含む）を有していてもよい。治療又は治療介入は、被験者の疼痛を減少又は和らげ、その結果、被験者が知覚する疼痛レベルが、治療しなかったとしたならば被験者が知覚したであろう疼痛レベルと比較して減少することを意図している。
【誤訳訂正３３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００５６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００５６】
Ｖ．新規ＭＡＧＬ阻害剤のスクリーニング
本明細書に記載する特異的ＭＡＧＬ阻害剤に加えて、本発明は、また改良された特性を有する新規ＭＡＧＬ阻害剤のスクリーニング方法をも提供する。薬剤発見過程における重要な段階は、化学アナログプログラムに基づく適切なリード化学鋳型の選択である。一定の分子標的のためのリード化学鋳型を同定する過程には、典型的には、機能アッセイにおける多数の化合物（しばしば１００、０００以上）のスクリーニング、活性を確認するための二次アッセイの試験用のある任意の活性閾値に基づく亜集合の選抜、並びに次に残った活性化合物の化学的合成の適合性の評価、が含まれる。本明細書に記載する新規ＭＡＧＬ阻害剤、例えば、式Ｉの化合物は、改良された生物学的又は薬学的特性を有する関連化合物を探索するためのリード化合物を提供する。例えば、これらＭＡＧＬ阻害剤のアナログ又は誘導体は、ＭＡＧＬに対するより高い親和性を有する又は皮膚により浸透性である化合物を同定することによって選別することができる。このような改良された特性を有する化合物は、種々の薬学的応用のために適している。
【誤訳訂正３４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００５７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００５７】
本発明のスクリーニング方法には、典型的には最初に本明細書で例示するＭＡＧＬ選択的阻害剤（例えば、ＪＺＬ184又はＪＺＬ１７５）のアナログ、誘導体又は変形型の合成が含まれる。スクリーニングのために一定のＭＡＧＬ阻害剤の構造的アナログのライブラリーを作成すると、次に、当該アナログ又は変異型が由来するＭＡＧＬ阻害剤の当該特性と比較して改良された生物学的特性を有するアナログ又は誘導体を同定するために機能アッセイを実施する。例えば、現有するＭＡＧＬ選択的阻害剤のアナログ化合物は、その選択性を維持しつつ、ＭＡＧＬに対する高められた阻害活性（例えば、減少したＩＣ５０）を求めて選別することができる。あるいは、アナログは、ＦＡＡＨ及び／又はＡＢＨＤ６に比してＭＡＧＬに対する亢進した選択性を求めて選別することができる。それらは、また追加の脳セリンヒドロラーゼ（例えば、ＡＢＨＤ１２）に比してＭＡＧＬに対する選択性を求めて選別することもできる。幾つかの他の実施態様において、アナログは、ＭＡＧＬポリペプチドに対する亢進した結合親和性を求めて選別することができる。さらに、アナログ化合物のライブラリーは、例えば、より良い皮膚浸透性等の薬学的な性質又は薬物動態学的な性質を有する化合物を同定することにより評価することができる。
【誤訳訂正３５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００５９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００５９】
本明細書で例示するＭＡＧＬ選択的阻害剤の化学的骨格に基づくアナログ又は誘導体を合成するためには、当該技術分野で周知の有機化学において通常用いられる方法が必要となるだけである。例えば、既知化合物の化学アナログのコンビナトリアルライブラリーは、段階的な方法で合成することができる。化合物の大きなコンビナトリアルライブラリーは、ＷＯ第９５／１２６０８号、ＷＯ第９３／０６１２１号、ＷＯ第９４／０８０５１号、ＷＯ第９５／３５５０３号及びＷＯ第９５／３０６４２号に記載された、エンコードされた合成ライブラリー（ＥＳＬ）法によって構築することができる。種々のアナログの他の合成方法は、例えば、オーバーマン（Ｏｖｅｒｍａｎ）著、「有機反応（Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ）」、第１−６２巻、ウィリー・インターサイエンス（Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）、２００３年；ブルームら（Ｂｒｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．）、「フェデラル・プロキュアメント（ＦｅｄＰｒｏｃ．）」、１９８６年、第４５巻：ｐ．２７７９−８３；ベン−メナームら（Ｂｅｎ−Ｍｅｎａｈｅｍ  ｅｔ  ａｌ．）、「リーセント・プログレス・イン・ホルモン・リサーチ（ＲｅｃｅｎｔＰｒｏｇ．Ｈｏｒｍ．Ｒｅｓ．）」、１９９９年、第５４巻：ｐ．２７１−８８；シュラムら（Ｓｃｈｒａｍｍ  ｅｔ  ａｌ．）、「アニュアル・レビュー・オブ・バイオケミストリー（Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ）」、１９９８年、第６７巻：ｐ．６９３−７２０；ボーリンら（Ｂｏｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．）、「バイオポリマーズ（Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ）」、１９９５年、第３７巻：ｐ．５７−６６；カールテンら（Ｋａｒｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．）、「エンドクライン・レビューズ（ＥｎｄｏｃｒＲｅｖ．）」、１９８６年、第７巻：ｐ．４４−６６；ホら（Ｈｏ  ｅｔ  ａｌ．）著、「有機合成戦略（Ｔａｃｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｓｉｓ）」、ウィリー・インターサイエンス（Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）、１９９４年；及びシャイトら（Ｓｃｈｅｉｔ  ｅｔ  ａｌ）著、「ヌクレオチド・アナログ：合成及び生物学的機能（Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ａｎａｌｏｇｓ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ）」、ジョンウィリー＆サンズ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ）、１９８０年、に記載されている。
【誤訳訂正３６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００６０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００６０】
所定のＭＡＧＬ選択的阻害剤のアナログ化合物のライブラリーにおける亢進した生物学的活性又は薬学的特性は、当該技術分野で周知の任意の機能アッセイによっても容易に選別することができる。例えば、ＭＡＧＬ及び他の脳セリンヒドロラーゼの化合物による阻害は、例えば、脳膜プロテオーム中に存在する酵素によって同族基質の加水分解を定量すること等、本明細書で開示する又は当該技術分野で周知の酵素活性アッセイにより試験することができる。ヒト又は他の種由来の他の脳セリンヒドロラーゼと同様にＭＡＧＬ、ＦＡＡＨも当該技術分野で周知である。その塩基配列のクローニング並びにその酵素的及び他の生物学的活性のキャラクタリゼーションは、当該技術分野で全て報告されている。例えば、ブランクマンら（Ｂｌａｎｋｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．）、「ケミストリー＆バイオロジー（Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ）」、２００７年、第１４巻：ｐ．１３４７−５６；ソンマ・デルペロら（Ｓｏｍｍａ−Ｄｅｌｐｅｒｏ  ｅｔ  ａｌ．）、「ザ・バイオケミカル・ジャーナル（Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．）」、１９９５年、第３１２巻：ｐ．５１９−２５；ディンら（Ｄｉｎｈ  ｅｔ  ａｌ．）、「プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、２００２年、第９９巻、ｐ．１０８１９−９；ディンら（Ｄｉｎｈ  ｅｔ  ａｌ．）、「モレキュラー・ファルマコロジー（Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．）」、２００４年、第６６巻：ｐ．１２６０−４；ムッソリーら（Ｍｕｃｃｉｏｌｉ  ｅｔ  ａｌ．）、「ザ・ジャーナル・オブ・ニューロサイエンス（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．）」、２００７年、第２７巻：ｐ．２８８３−９；ザンら（Ｇｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．）、「プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、１９９７年、第９４巻、ｐ．２２３８−２２４２；ワンら（Ｗａｎ  ｅｔ  ａｌ．）、「ゲノミクス（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）」、１９９８年、第５４巻：ｐ．４０８−４１４；パトリセリら（Ｐａｔｒｉｃｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．）、「バイオオーガニック＆メディシナル・ケミストリー・レターズ（Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．）」、１９９８年、第８巻：ｐ．６１３−６１８；及びゴーパルディ（Ｇｏｐａｒａｊｕ  ｅｔ  ａｌ．）、「バイオヒミカ・エト・バイオフィジカ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ）」、１９９９年、第１４４１巻：ｐ．７７−８４、を参照。
【誤訳訂正３７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００６１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００６１】
本化合物の他の生物学的又は生化学的活性の改良（例えば、ＭＡＧＬに対する亢進した結合親和性）は、当該技術分野で通常用いられる方法により試験することができる。一般的な概要については、例えば、サンブルックら（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．）著、「モレキュラー・クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」、コールドスプリング・ハーバー・プレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク（Ｎ．Ｙ．）、第３版（２０００年）；アウスベルら（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．）、「分子生物学カレントプロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、ジョンウィリー＆サンズ、インク（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．）、ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）（１９９９年）；及びバーガー及びキンメル（Ｂｅｒｇｒ  ａｎｄ  Ｋｉｍｍｅｌ）著、「酵素学における方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）」、サンディエゴ（Ｓａｎ  Ｄｅｇｏ）、アカデミックプレス、インク（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｓｓ，Ｉｎｃ）を参照。また本発明のスクリーニング法において用いることのできる追加の生化学的又は薬学的アッセイ法も当該技術分野で周知であり日常的に実施されている。例えば、ＭＡＧＬ選択的阻害剤のアナログ化合物の皮膚浸透特性は、例えば、レミントン著「薬学の科学と実践（Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ）」、ジェンナロ（Ｇｅｎｎａｒｏ）編、リッピンコット・ウィリアムズ＆ウィルキンス（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍａｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ）、（第２０版、２００３年）、等に記載された方法を使用して分析することができる。
【誤訳訂正３８】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００６４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００６４】
本発明で用いるＭＡＧＬ拮抗化合物には、ＭＡＧＬの細胞レベルを下方制御する又は生物学的活性（例えば、リパーゼ活性）を阻害するいかなる薬剤も含まれる。適したＭＡＧＬ拮抗化合物には、以下に記載するスクリーニングに従って同定することができる新規薬剤、例えば追加の小分子化合物又は抗体（例えば、アンタゴニスト抗体）等も含まれる。幾つかの実施態様において、腫瘍増殖を阻害する又は癌を治療するために用いられるＭＡＧＬ拮抗化合物は、特異的にＭＡＧＬ発現を阻害する又はその細胞レベルを下方制御する薬剤（例えば、阻害ポリヌクレオチド）である。例えば、ＭＡＧＬを標的にする阻害ポリヌクレオチドには、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、アンチセンス核酸、又は相補ＤＮＡが含まれる。これらの核酸薬剤を標的遺伝子の発現を特異的に停止させるために使用することは、周知であり当該技術分野において通常用いられている。ＭＡＧＬを特異的に標的とするこのような核酸薬剤は、当該技術分野で周知の方法を使用して調製することができる。例として、ＭＡＧＬ遺伝子を標的とするｓｈＲＮＡ及びｓｉＲＮＡは、下記の実施例で明らかなとおり、ＭＡＧＬ発現レベルを下方制御するために使用することができる。
【誤訳訂正３９】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００６９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００６９】
本発明の方法による治療に適した被験者は、種々の型の癌を患っている被験者、又は癌発症の危険にある又は素因を有する被験者である。本発明の方法は、多数の腫瘍細胞の増殖を阻害するために用いることができる。治療を施すことのできる腫瘍又は癌の例には、肺、皮膚、乳房、脳、胃腸、尿生殖路（例えば、腎臓、膀胱及び尿道、前立腺、睾丸）、血管、神経系、骨及び肝臓由来の腫瘍が含まれる。それらは、充実性腫瘍、白血病及び転移性腫瘍を包含する。本発明に適した充実性腫瘍には、例えば、肉腫、黒色腫、癌腫、又は他の充実性腫瘍癌が含まれる。
【誤訳訂正４０】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００７９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００７９】
所定のＭＡＧＬアンタゴニスト化合物について、当業者であれば通常用いる薬学的な方法を使用して、容易に腫瘍増殖を阻害し及び癌を治療する当該化合物の有効量、又はカンナビノイドシグナル伝達と関連する症状を治療する化合物の有効量を同定することができる。典型的には、生体外で使用される投与量は、医薬組成物の生体内原位置での投与のための有用な量に関する役立つガイダンスを提供することができ、並びに動物モデルはヒトの被験者における特定の障害の治療のための有効な投与量を決定するために使用することができる。よりしばしば、適した薬用量は、通常のヒトに関する、最大許容用量及び安全投与量を決めるために、哺乳動物種に関する臨床研究によって決定することができる。より高い投与量が要求される特定の状況を除いて、ＭＡＧＬアンタゴニスト化合物の好ましい投与量は普通には、一日当たり約０．００１から約１０００ｍｇ、より普通には約０．０１から約５００ｍｇの範囲にある。一般に、投与されるＭＡＧＬアンタゴニスト化合物の分量は、被験者の症状を有効に及び確実に防止又は最小化する最少の投与量である。それ故に、上記の投与量の範囲は、本明細書での教示のための一般的なガイダンス及び補助を提供することを意図するものであり、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。本発明の医薬組成物の調製及び投与に関する追加のガイダンスもまた当該技術分野で記載されている。例えば、「グッドマン及びギルマンズの薬物療法学の薬理学的基礎（Ｇｏｏｄｍａｎ  ＆  Ｇｉｌｍａｎ‘ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｅｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）」、ハルドマン（Ｈａｒｄｍａｎ）ら編、マッグローヒル・プロフェッショナル（ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ（第１０版、２００１年）；レミントン（Ｒｍｉｎｇｔｏｎ）著「薬学の科学と実践（Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ）」、ジェンナロ（Ｇｅｎｎａｒｏ）編、リッピンコット・ウィリアムズ＆ウィルキンス（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ）（第２０版、２００３年）；及び「製剤投与形態及び薬剤デリバリーシステム（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）」、アンセルら（Ａｎｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．）編、リッピンコット・ウィリアムズ＆ウィルキンス（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ）（第７版、１９９９年）を参照。
【誤訳訂正４１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００８２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００８２】
構造的に多様なカルバメートのライブラリーについて拮抗的ＡＢＰＰ選別を実施している間に、発明者らは、ＦＡＡＨ、ＭＡＧＬ及び、ＡＢＨＤ６（図１Ｂ）を含む脳セリンヒドロラーゼの特定の亜集合を阻害する化合物ＷＷＬ９８（図６）を同定した。発明者らは、次にＭＡＧＬの潜在能力及び選択性を改良するためにＷＷＬ９８を修飾することに注力した。ＷＷＬ１５２及びＷＷＬ１６２（図１Ａ）で代表される通り、ピペラジンのスペーサ及び末端ビスアリールモチーフの取り込は、ＭＡＧＬ及びＡＢＨＤ６に関する潜在能力を維持しつつ、一方ＦＡＡＨに関する活性を顕著に減少すること（図１Ｂ）が発見された。ピペラジンをピペリジニルメタノール骨格構造で置換すると、ＦＡＡＨ及びＡＢＨＤ６の両方に比したＭＡＧＬに対する選択性を示す化合物である、ＪＺＬ１７５（図１Ｂ）を産出した。最後に、追加の選択性の増強は、ピペリジニルメタノール骨格構造上へのビス（メチレン−３，４−ジオキシフェニル）の包接によって行いＪＺＬ１８４（図１Ａ及びＢ）を与えた。
【誤訳訂正４２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００９８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００９８】
［３Ｈ］リモナバン結合によるＪＺＬ１８４置換：上記の通り膜を調製した。膜タンパク質（８μｇ）を、非標識リモナバン５μＭの存在下又は非存在下に（非特異的結合を定量するため）、０．２-３ｎＭ［３Ｈ］リモナバン含有５０ｍＭトリス塩酸、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭ  ＥＧＴＡ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、  １．２５ｇ／ｌ  ＢＳＡ、と３０℃で９０分間インキュベートした。２番目のセットの試料も、ＪＺＬ１８４濃度を変化させる（０．００１−１０μＭ）以外は、同様のプロトコルを使用して調製した。反応は、リットル当たりトリス緩衝液５ｇを含有するＢＳＡ（トリスＢＳＡ）に予浸したワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）ＧＦ／Ｂガラス繊維フィルタ減圧ろ過によって停止し、続いて４℃のトリスＢＳＡで３回洗浄した。結合した放射活性は、シンチレーション液であるサイニット・セイフ、エコノ１（ＳｃｉｎｉｔＳａｆｅ  Ｅｃｏｎｏ  １）で抽出後に４５％の効率で液体シンチレーション分光光度法によって測定した。
【誤訳訂正４３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１２８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１２８】
ヒト癌細胞株におけるＲＮＡ干渉研究：ＲＮＡ干渉の研究は、既述の通り行った（チャングら（Ｃｈｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．）、２００６年）。手短に言えば、低分子ヘアピン型ＲＮＡ構築物をｐＬＰ−レトロＱ（ｐＬＰ−ＲｅｔｒｏＱ）アクセプターシステムにサブクローンし、アンフォパック（ＡｍｐｈｏＰａｃｋ）−２９３細胞株（クロンテック社製（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））を使用してレトロウイルスを作成した。ＲＮＡ干渉の研究に利用したヘアピン型オリゴヌクレオチドは；ＭＡＧＬ用には（ｓｈＭＡＧＬ１）、５‘−ＣＡＡＣＴＴＴＣＡＡＧＧＴＣＣＴＴＧＣ−３’（配列番号１）及び（ｓｈＭＡＧＬ２）、５‘−ＡＧＡＣＴＡＣＣＣＴＧＧＧＣＴＴＣＣ−３’（配列番号２）；ｓｈ対照用には（ｓｈＤＰＰＩＶ）５‘−ＧＡＴＴＣＴＴＣＴＧＧＧＡＣＴＧＣＴＧ−３’（配列番号３）であった。ｓｈ対照構築物は、侵襲性と非侵襲性癌細胞（ＤＰＰＩＶ）の間で一貫して変化しない他と別なセリンヒドロラーゼを標的とするよう設計した。内在性タンパク質を標的とするｓｈ対照構築物（非機能的なスクランブルド構築物よりは）を使用することが、ＲＮＡ干渉機構の一般的な活性による非特異的な効果を制御する。培養１−６日の上清を含むウイルスを収集し、超遠心分離で濃縮し、１０μｇ／ｍｌのポリブレンの存在下に４８時間安定して細胞を感染するために使用した。感染に続いて、ピューロマイシン（Ｃ８１６１、ＭＵＭ２Ｃ、ＳＫＯＶ３、及び２３１ＭＦＰに対しては１μｇ／ｍｌ、ＯＶＣＡＲ３に対しては０．３μｇ／ｍｌ）を含む培地で３日間選抜を行ったが、それは、レトロウイルスベクターがこの選択マーカーを含んでいたからである。感染した細胞を増殖し、ＡＢＰＰによって酵素活性の損失及びＣ２０：４ＭＡＧ加水分解活性に関し試験を行った。
【誤訳訂正４４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１２９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１２９】
ヒト癌細胞株における過剰発現の研究：安定したＭＡＧＬ過剰発現は、ＲＮＡ干渉研究に関し上述した通りＡｍｐｈｏＰａｃｋ−２９３細胞株を使用してレトロウイルスを作成し、ＭＡＧＬ遺伝子をｐＭＳＣＶｐｕｒｏベクター（ｐＭＳＣＶｐｕｒｏ  ｖｅｃｔｏｒ）（クロンテック社製）にサブクローニングすることによって達成した。ヒトＭＡＧＬ構築物は、プライマー、５‘−ＧＣＴＣＴＣＧＡＧＧＣＣＧＣＣＡＴＧＣＣＡＧＡＧＧＡＡＡＧＴＴＣＣ−３’（配列番号４）及び５‘−ＡＧＣＴＧＡＡＴＴＣＴＣＡＧＧＧＴＧＧＧＧＡＣＧＣＡＧＴＴＣＣＴＧ−３’（配列番号５）によるＰＣＲによって作成した。ＰＣＲ産物は、ＸｈｏＩ及びＥｃｏＲＩの制限サイトを使用してｐＭＳＣＶＣｐｕｒｏ（クロンテック社製）にサブクローニングした。
【誤訳訂正４５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１３５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１３５】
リピドーム解析は、標的及び非標的モードの両方でＬＣ−ＭＳ分析によって行った。標準的な脂質クラスは、選択イオン検出（ＳＩＭ）を使用して標的化によって定量し（非標的化分析によって定量した高存在量の代謝産物を除く）、代謝産物の同一性は、代謝産物のそれぞれの標準品との共溶出、及びアジレント６５２０精密質量ＱＴＯＦ−ＭＳ−ＭＳ（Ａｇｉｌｅｎｔ  ６５２０  Ａｃｃｕｒａｔｅ  Ｍａｓｓ  ＱＴＯＦ−ＭＡＳ−ＭＳ）による精密質量分析により測定される１０ｐｐｍ以内の質量精度によって確認した。リピドーム解析は、標的及び非標的モードの両方でＬＣ−ＭＳ分析によって行った。標準的な脂質クラスは、選択イオン検出（ＳＩＭ）を使用して標的化によって定量し（非標的化分析によって定量した高存在量の代謝産物を除く）、代謝産物の同一性は、代謝産物のそれぞれの標準品との共溶出、及びアジレント６５２０精密質量ＱＴＯＦ−ＭＳ−ＭＳ（Ａｇｉｌｅｎｔ  ６５２０  Ａｃｃｕｒａｔｅ  Ｍａｓｓ  ＱＴＯＦ−ＭＡＳ−ＭＳ）による精密質量分析により測定される１０ｐｐｍ以内の質量精度によって確認した。これらの脂質は、ピーク下の面積を測定することによって定量し、内部標準に対し規準化した（ポジティブモードにおけるＣ１２：０ＭＡＧＥ又はネガティブモードにおけるＣ１５：０ＦＦＡ）。各々の脂質種のｐｍｏｌｅｓ／１ｘ１０６細胞における絶対定量は、１０ｎｍｏｌのＣ１２：０ＭＡＧＥ及び／又はＣ１５：０ＦＦＡと対照して分析した各クラスのそれぞれの脂質の標準曲線の作成に基づいたが、そこでは脂質及び標準品の相対抽出効率も考慮に入れた。ＭＡＧは、内部標準Ｃ１５：０ＭＡＧ（Ｃ１２：０ＭＡＧＥの代わりに）に基づいても定量したが、同一の結果が得られた。ＭＳインターフェースにおいてＭＡＧの脂肪酸アシルアニオン種への５％未満の分解が存在した。発明者らは、非天然のＣ１５：０ＭＡＧ種（これもまた、内在性ＭＡＧ種と同様の分解パターンを有する）と対照してＭＡＧレベルを定量したので、インターフェースにおける極小のＭＡＧ分解レベルは、ＭＡＧの絶対定量を妨げなかった。ＭＡＧ及びＦＦＡ定量のための動的線形範囲は、それぞれ０．６−１０，０００ｐｍｏｌｅｓ及び１−１０，０００ｐｍｏｌｅｓであった。非標的化データを質量範囲２００−１２００Ｄａを使用してアジレント１１００ＬＣ−ＭＳＤ  ＳＬ装置に収集し、計算的な分析のためにコモン・データ・フォーマット（ＣＤＦ）として転送した。試料対の間の違った発現代謝産物は、多数のＬＣ−ＭＳトレースからの質量ピークの相対シグナル強度を一列に並べ定量する、ＸＣＭＳ分析物プロファイリングソフトウェアを使用することによって同定した。重要な阻害剤、ｓｈＭＡＧＬ又はＭＡＧＬ−ＯＥ感受性のピーク変化は、内部標準（ポジティブモードにおけるＣ１２ＭＡＧＥ及びネガティブモードにおけるＣ１５：０ＦＦＡ）に対し規準化したピーク下面積を使用することにより手作業の定量によって確認した。