【手続補正書】
【提出日】平成26年8月13日(2014.8.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０５１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０５１５】
【表５０】
2013535987.tif 000001
結果は、変異ＨＰＧＧモチーフ（すなわちＨａＧＧ［配列番号４２８］）のみを有する
変異ＥａＤ５Ｓ−３５ａと比べて、なおも妥当なΔ５デサチュラーゼ活性を保ちながら、コドン最適化ＥａＤ５ＳΔ５デサチュラーゼが、変異ＨＰＧＧ（配列番号１８１）および変異ＨＤＡＳＨ（配列番号１８３）モチーフの双方を含んでなるように、修飾され得ることを実証した。好ましい二重変異体は、ＥａＤ５Ｓ−３５ａ１５８ｇ（配列番号１１１および１１２；ｐＺｕＦｍＥａＤ５Ｓ−Ａ（Ｓ）−１５８ｇ形質転換体中において２８．４％の変換効率でＤＧＬＡをＡＲＡに変換できる）、ＥａＤ５Ｓ−３５ａ１５８ｓ（配列番号３６２および３６３；ｐＺｕＦｍＥａＤ５Ｓ−Ａ（Ｓ）−１５８ｓ形質転換体中において２７．４％の変換効率でＤＧＬＡをＡＲＡに変換できる）、およびＥａＤ５Ｓ−３５ａ１５９ｇ（配列番号３６４および３６５；ｐＺｕＦｍＥａＤ５Ｓ−Ａ（Ｓ）−１５９ｇ形質転換体中において２６．５％の変換効率でＤＧＬＡをＡＲＡに変換できる）であった。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０５１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０５１６】
以上、本発明を要約すると下記のとおりである。
１．乾燥細胞重量の質量％として測定して、少なくとも２５質量％のエイコサペンタエン酸を含んでなる油を産生する、組換え微生物宿主細胞。
２．油が、総脂肪酸の質量％として測定して、少なくとも４５質量％のエイコサペンタエン酸を含んでなる、上記１に記載の組換え微生物宿主細胞。
３．油の総脂肪酸の質量％として測定されたリノール酸と、総脂肪酸の質量％として測定されたエイコサペンタエン酸との比率が少なくとも２．４である、上記１または２に記載の組換え微生物宿主細胞。
４．（ａ）少なくとも１つのΔ８デサチュラーゼに連結された少なくとも１つのΔ９エロンガーゼを有するポリペプチドを含んでなる、少なくとも１つのマルチザイム；
（ｂ）その発現が下方制御されている、少なくとも１つのペルオキシソーム形成因子タンパク質；および
（ｃ）少なくともリゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ［「ＬＰＡＡＴ」］活性を有する、少なくとも２つのポリペプチド；
（ｄ）少なくともリン脂質：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ［「ＰＤＡＴ」］活性を有する、少なくとも１つのポリペプチド
を含んでなる、組換え宿主細胞。
５．ｉ）Ｌ３５Ｆ変異；
ｉｉ）Ｌ３５Ｍ変異；
ｉｉｉ）Ｌ３５Ｇ変異；
ｉｖ）Ｌ３５Ｇ変異と、Ｓ９Ａ、Ｓ９Ｄ、Ｓ９Ｇ、Ｓ９Ｉ、Ｓ９Ｋ、Ｓ９Ｑ、Ｑ１２Ｋ、Ａ２１Ｄ、Ａ２１Ｔ、Ａ２１Ｖ、Ｖ３２Ｆ、Ｙ８４Ｃ、Ｑ１０７Ｅ、Ｌ１０８Ｇ、Ｇ１２７Ｌ、Ｗ１３２Ｔ、Ｍ１４３Ｎ、Ｍ１４３Ｗ、Ｌ１６１Ｔ、Ｌ１６１Ｙ、Ｗ１６８Ｇ、Ｉ１７９Ｍ、Ｉ１７９Ｒ、Ｃ２３６Ｎ、Ｑ２４４Ｎ、Ａ２５４Ｗ、およびＡ２５４Ｙからなる群から選択される少なくとも１つのその他の変異；
ｖ）Ｌ３５Ｇ、Ａ２１Ｖ、Ｌ１０８Ｇ、およびＩ１７９Ｒ変異；
ｖｉ）Ｌ３５Ｇ、Ｗ１３２Ｔ、およびＩ１７９変異；
ｖｉｉ）Ｌ３５Ｇ、Ｓ９Ｄ、Ｙ８４Ｃ、およびＩ１７９Ｒ変異；
ｖｉｉｉ）Ｌ３５Ｇ、Ｙ８４Ｃ、Ｉ１７９Ｒ、およびＱ２４４Ｎ変異；
ｉｘ）Ｌ３５Ｇ、Ａ２１Ｖ、Ｗ１３２Ｔ、Ｉ１７９Ｒ、およびＱ２４４Ｎ変異；
ｘ）Ｋ５８ＲおよびＩ２５７Ｔ変異；
ｘｉ）Ｄ９８Ｇ変異；
ｘｉｉ）Ｌ１３０ＭおよびＶ２４３Ａ変異；および
ｘｉｉｉ）Ｋ５８Ｒ、Ｌ３５Ｆ、Ｌ３５Ｇ、Ｌ３５Ｍ、Ｓ９Ａ、Ｓ９Ｄ、Ｓ９Ｇ、Ｓ９
Ｉ、Ｓ９Ｋ、Ｓ９Ｑ、Ｑ１２Ｋ、Ａ２１Ｄ、Ａ２１Ｔ、Ａ２１Ｖ、Ｖ３２Ｆ、Ｙ８４Ｃ、Ｄ９８Ｇ、Ｑ１０７Ｅ、Ｌ１０８Ｇ、Ｇ１２７Ｌ、Ｌ１３０Ｍ、Ｗ１３２Ｔ、Ｍ１４３Ｎ、Ｍ１４３Ｗ、Ｌ１６１Ｔ、Ｌ１６１Ｙ、Ｗ１６８Ｇ、Ｉ１７９Ｍ、Ｉ１７９Ｒ、Ｃ２３６Ｎ、Ｖ２４３Ａ、Ｑ２４４Ｎ、Ａ２５４Ｗ、Ａ２５４Ｙ、およびＩ２５７Ｔからなる群から選択される、少なくとも２つの変異を含んでなる任意の組み合わせ
からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸変異によって、配列番号３と異なる、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含んでなる、少なくとも１つの変異Δ９エロンガーゼポリペプチドをさらに含んでなる、上記４に記載の組換え微生物宿主細胞。
６．少なくとも１つの変異Δ９エロンガーゼポリペプチドがＬ３５Ｇ置換を含んでなり、変異Δ９エロンガーゼポリペプチドが配列番号３のΔ９エロンガーゼ活性と比べて改善されたΔ９エロンガーゼ活性を有する、上記５に記載の組換え微生物宿主細胞。
７．マルチザイムが、
（ａ）リンカーが、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、および配列番号１０からなる群から選択される；および
（ｂ）配列が、配列番号１２、配列番号１４、および配列番号１６からなる群から選択される配列から本質的になる
からなる群から選択される特性を有する、上記４に記載の組換え微生物宿主細胞。
８．少なくとも２つのリゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼが、
（ａ）配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２３、および配列番号２５からなる群から選択される配列から本質的になる配列；および
（ｂ）配列番号１８、配列番号２２、および配列番号２３からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較して、アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ  Ｗ法に基づいて少なくとも４３．９％のアミノ酸同一性を有し、配列番号２６および配列番号２７からなる群から選択される少なくとも１つの１−アシル−ｓｎ−グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼファミリーモチーフをさらに含んでなるポリペプチド
からなる群から選択される、上記４に記載の組換え微生物宿主細胞。
９．少なくとも１つのリン脂質：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼが、
（ａ）配列番号２９および配列番号３０からなる群から選択される配列から本質的になる配列；および
（ｂ）配列番号２９および配列番号３０からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較して、アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ  Ｗ法に基づいて少なくとも９０％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド
からなる群から選択される、上記４に記載の組換え微生物宿主細胞。
１０．宿主細胞がヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）のものである、上記４に記載の組換え微生物宿主細胞。
１１．宿主細胞が、少なくとも１つの変異Δ５デサチュラーゼポリペプチドをさらに含んでなり、ここで該変異Δ５デサチュラーゼポリペプチドが、
ａ）配列番号１８０［ＨｘＧｘ］に記載のアミノ酸モチーフと、配列番号１８２［ＨｘｘｘＨ］に記載のアミノ酸モチーフとを含んでなり、配列番号１８０［ＨｘＧｘ］が配列番号１８１［ＨＰＧＧ］と同一でなく、配列番号１８２［ＨｘｘｘＨ］が配列番号１８３［ＨＤＡＳＨ］と同一でない、変異ポリペプチド；
ｂ）配列番号１０６［ＥｇＤ５Ｍまたはコドン最適化ＥｇＤ５Ｒ＊−３４ｇ１５８ｇ）］、配列番号１０８［ＥｇＤ５Ｒ＊−３４ｇ１５８ｇ３４７ｓ］、配列番号１１０［ＥｇＤ５Ｓ−３６ｓ１５７ｇ］、配列番号１１２［ＥａＤ５Ｓ−３５ａ１５８ｇ］、配列番号２９９［ＥｇＤ５Ｒ＊−３４ｇ１５７ｇ］、配列番号３０１［ＥｇＤ５Ｒ＊−３４ｇ１５８ａ］、配列番号３０３［ＥｇＤ５Ｒ＊−３４ｇ１５８ｇ］、配列番号３２９［ＥｇＤ５Ｓ−３６ｓ１５６ｅ］、配列番号３３１［ＥｇＤ５Ｓ−３６ｓ１５８ａ］、配列番号３３３［ＥｇＤ５Ｓ−３６ｓ１５８ｇ］、配列番号３６３［ＥａＤ５Ｓ−３５ａ１５８ｓ］、および配列番号３６５［ＥａＤ５Ｓ−３５ａ１５９ｇ］からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、変異ポリペプチド
からなる群から選択される、上記４〜１０のいずれかに記載の組換え微生物宿主細胞。
１２．ａ）エイコサペンタエン酸を含んでなる微生物油が生産される、上記１〜１０のいずれかに記載の宿主細胞を培養するステップと；
ｂ）任意選択的に、ステップ（ａ）の微生物油を回収するステップと
を含んでなる、エイコサペンタエン酸を含んでなる微生物油を製造する方法。
１３．ステップ（ｂ）の回収された油をさらに処理する、上記１２に記載の方法。
【手続補正３】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
乾燥細胞重量の質量％として測定して、少なくとも２５質量％のエイコサペンタエン酸を含んでなる油を産生する、組換え微生物宿主細胞。
【請求項２】
（ａ）少なくとも１つのΔ８デサチュラーゼに連結された少なくとも１つのΔ９エロンガーゼを有するポリペプチドを含んでなる、少なくとも１つのマルチザイム；
（ｂ）その発現が下方制御されている、少なくとも１つのペルオキシソーム形成因子タンパク質；および
（ｃ）少なくともリゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ［「ＬＰＡＡＴ」］活性を有する、少なくとも２つのポリペプチド；
（ｄ）少なくともリン脂質：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ［「ＰＤＡＴ」］活性を有する、少なくとも１つのポリペプチド
を含んでなる、組換え宿主細胞。
【請求項３】
ａ）エイコサペンタエン酸を含んでなる微生物油が生産される、請求項１または２に記載の宿主細胞を培養するステップと；
ｂ）任意選択的に、ステップ（ａ）の微生物油を回収するステップと
を含んでなる、エイコサペンタエン酸を含んでなる微生物油を製造する方法。