【手続補正書】
【提出日】平成24年1月5日(2012.1.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
転写の5’から3’の方向に作動可能に連結された構成要素として:
光合成微生物細胞において機能するプロモーター;
(i)二糖リン酸シンターゼ、(ii)二糖リン酸ホスファターゼ並びに(iii)二糖リン酸シンターゼ及び二糖リン酸ホスファターゼからなる群から選択される、二糖生合成活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド;ならびに
転写終結配列;
を含む人工DNA構築物を含むトランスジェニック光合成微生物細胞であって、
前記DNA構築物を含まない光合成微生物細胞と比較して増加したレベルの二糖を蓄積する前記トランスジェニック光合成微生物細胞。
【請求項２】
二糖生合成活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドが:
(a)スクロースリン酸シンターゼおよびスクロースリン酸ホスファターゼ(ASF)活性を有する配列番号2またはそれに95%同一の配列;
スクロースリン酸シンターゼ(SPS)活性を有する配列番号4またはそれに95%同一の配列;
スクロースリン酸ホスファターゼ(SPP)活性を有する配列番号6またはそれに95%同一の配列;
トレハロースリン酸シンターゼ(TPS)活性を有する配列番号77またはそれに95%同一の配列;
トレハロースリン酸ホスファターゼ(TPP)活性を有する配列番号79またはそれに95%同一の配列;
グルコシルグリセロールリン酸シンターゼ(GPS)活性を有する配列番号81またはそれに95%同一の配列;
グルコシルグリセロールリン酸ホスファターゼ(GPP)活性を有する配列番号83またはそれに95%同一の配列;
マンノシルフルクトースリン酸シンターゼ(MPS)活性を有する配列番号85またはそれに95%同一の配列;又は
マンノシルフルクトースリン酸ホスファターゼ(MPP)活性を有する配列番号87またはそれに95%同一の配列;
から選択されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、
(b)スクロースリン酸シンターゼ/スクロースリン酸ホスファターゼ(ASF)活性をコードする配列番号1またはそれに95%同一の配列;
スクロースリン酸シンターゼ(SPS)活性をコードする配列番号3またはそれに95%同一の配列;
スクロースリン酸ホスファターゼ(SPP)活性をコードする配列番号5またはそれに95%同一の配列;
トレハロースリン酸シンターゼ(TPS)活性をコードする配列番号76またはそれに95%同一の配列;
トレハロースリン酸ホスファターゼ(TPP)活性をコードする配列番号78またはそれに95%同一の配列;
グルコシルグリセロールリン酸シンターゼ(GPS)活性をコードする配列番号80またはそれに95%同一の配列;
グルコシルグリセロールリン酸ホスファターゼ(GPP)活性をコードする配列番号82またはそれに95%同一の配列;
マンノシルフルクトースリン酸シンターゼ(MPS)活性をコードする配列番号84またはそれに95%同一の配列;又は
マンノシルフルクトースリン酸ホスファターゼ(MPP)活性をコードする配列番号86またはそれに95%同一の配列;
から選択される配列を含む単離されたポリヌクレオチド;
(c)単離されたポリヌクレオチドがASF活性を有するポリペプチドをコードする配列番号1;
単離されたポリヌクレオチドがSPS活性を有するポリペプチドをコードする配列番号3;
単離されたポリヌクレオチドがSPP活性を有するポリペプチドをコードする配列番号5;
単離されたポリヌクレオチドがTPS活性を有するポリペプチドをコードする配列番号76;
単離されたポリヌクレオチドがTPP活性を有するポリペプチドをコードする配列番号78;
単離されたポリヌクレオチドがGPS活性を有するポリペプチドをコードする配列番号80;
単離されたポリヌクレオチドがGPP活性を有するポリペプチドをコードする配列番号82;
単離されたポリヌクレオチドがMPS活性を有するポリペプチドをコードする配列番号84;又は
単離されたポリヌクレオチドがMPP活性を有するポリペプチドをコードする配列番号86;
から選択される核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする単離されたポリヌクレオチドであって、前記ストリンジェントな条件が6X SSC(0.9M塩化ナトリウムおよび0.09Mクエン酸ナトリウム)を含む溶液中65℃でのインキュベーションを含む前記単離されたポリヌクレオチド;又は
(d)(a)、(b)または(c)のポリヌクレオチド配列に相補的な単離されたポリヌクレオチド
から選択される、請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
蓄積された二糖モノマーが細胞にとって内因性である、請求項１〜２のいずれか1つに記載の細胞。
【請求項４】
細胞が、光合成細菌であるシアノバクテリア細胞;または緑藻である、請求項１〜３のいずれか1つに記載の細胞。
【請求項５】
細胞がシネココッカスおよびシネコシスチスからなる群から選択されるシアノバクテリアである、請求項１〜４のいずれか1つに記載の細胞。
【請求項６】
プロモーターが
誘導性プロモーター、又は、
carB、nirA、psbAII、dnaK、kaiAおよびλPRから選択されるプロモーター
である、請求項１〜５のいずれか1つに記載の細胞。
【請求項７】
DNA構築物が、
配列番号19(asfをコードするpLybAL11);
配列番号20(asfをコードするpLybAL12);
配列番号44(asfをコードするpLybAL15);
配列番号45(asfをコードするpLybAL16);
配列番号46(asfをコードするpLybAL17);
配列番号47(asfをコードするpLybAL18);
配列番号48(asfをコードするpLybAL19);
配列番号49(asfをコードするpLybAL21);
配列番号50(asfをコードするpLybAL22);
配列番号51(asfをコードするpLybAL13f);
配列番号52(asfをコードするpLyAL13r);
配列番号53(asfをコードするpLybAL14f);
配列番号54(asfをコードするpLybAL14r);
配列番号65(asfをコードするpLybAL7f);
配列番号69(asfをコードするpLybAL8f);
配列番号118(tpsおよびtppをコードするpLybAL23);
配列番号121(tpsおよびtppをコードするpLybAL28);
配列番号122(tpsおよびtppをコードするpLybAL29);
配列番号123(tpsおよびtppをコードするpLybAL30);
配列番号124(tpsおよびtppをコードするpLybAL31);
配列番号125(tpsおよびtppをコードするpLybAL36);
配列番号126(tpsおよびtppをコードするpLybAL37);
配列番号130(tpsおよびtppをコードするpLybAL24);または
配列番号133(tpsおよびtppをコードするpLybAL33)
から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１〜６のいずれか1つに記載の細胞。
【請求項８】
細胞が、
1分当たり乾燥バイオマス1グラム当たり二糖を少なくとも約0.1マイクログラム蓄積する、又は、
1分当たり乾燥バイオマス1グラム当たり二糖を少なくとも約0.1マイクログラムから最大1分当たり乾燥バイオマス1グラム当たり二糖を約10マイクログラムまで蓄積する、
請求項１〜７のいずれかに記載の細胞。
【請求項９】
以下:
(a)配列番号70、配列番号72および配列番号74またはそれらに対する少なくとも95%の同一性およびインベルターゼ活性もしくはスクラーゼフェリドキシン活性を有するそれらのヌクレオチドバリアントからなる群から選択されるヌクレオチド配列を細胞が含まない;
(b)配列番号71、配列番号73および配列番号75またはそれらに対する少なくとも95%の同一性およびインベルターゼ活性もしくはスクラーゼフェリドキシン活性を有するそれらのポリペプチドバリアントからなる群から選択されるポリペプチド配列を細胞が発現しない;
(c)配列番号70、配列番号72および配列番号74またはそれらに対する少なくとも95%の同一性およびインベルターゼ活性もしくはスクラーゼフェリドキシン活性を有するそれらのヌクレオチドバリアントからなる群から選択されるヌクレオチド配列に特異的な低分子干渉RNAを細胞が発現する;
(d)活性ポリンポリペプチドをコードする配列番号94またはそれに95%同一の配列を含む単離されたポリヌクレオチドを細胞が含み、蓄積された二糖がスクロースであり、細胞がポリンを発現し、発現されたポリンが、蓄積されたスクロースを細胞から分泌させる;
(e)配列番号95またはそれに95%同一の配列を含みポリン活性を有するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを細胞が含み、蓄積された二糖がスクロースであり、細胞がポリンを発現し、発現されたポリンが、蓄積されたスクロースを細胞から分泌させる;または
(f)配列番号91(ポリンをコードするpLybAL32)を含む単離されたポリヌクレオチドを細胞が含み、蓄積された二糖がスクロースであり、細胞がポリンを発現し、発現されたポリンが、蓄積されたスクロースを細胞から分泌させる;
の少なくとも1つを満足させる、請求項１〜８のいずれかに記載の細胞。
【請求項１０】
配列番号19(asfをコードするpLybAL11);
配列番号20(asfをコードするpLybAL12);
配列番号44(asfをコードするpLybAL15);
配列番号45(asfをコードするpLybAL16);
配列番号46(asfをコードするpLybAL17);
配列番号47(asfをコードするpLybAL18);
配列番号48(asfをコードするpLybAL19);
配列番号49(asfをコードするpLybAL21);
配列番号50(asfをコードするpLybAL22);
配列番号51(asfをコードするpLybAL13f);
配列番号52(asfをコードするpLyAL13r);
配列番号53(asfをコードするpLybAL14f);
配列番号54(asfをコードするpLybAL14r);
配列番号65(asfをコードするpLybAL7f);
配列番号69(asfをコードするpLybAL8f);
配列番号118(tpsおよびtppをコードするpLybAL23);
配列番号121(tpsおよびtppをコードするpLybAL28);
配列番号122(tpsおよびtppをコードするpLybAL29);
配列番号123(tpsおよびtppをコードするpLybAL30);
配列番号124(tpsおよびtppをコードするpLybAL31);
配列番号125(tpsおよびtppをコードするpLybAL36);
配列番号126(tpsおよびtppをコードするpLybAL37);
配列番号130(tpsおよびtppをコードするpLybAL24);
配列番号133(tpsおよびtppをコードするpLybAL33);
配列番号91(ポリンをコードするpLybAL32);
配列番号102(SS-UPPをコードするpLybAL3f);
配列番号103(SE-UPPをコードするpLybAL5f);
配列番号106(SE-UPPをコードするpLybAL4f);
配列番号107(SE-UPPをコードするpLybAL9f);
配列番号109(SE-UPPをコードするpLybAL6fb);
配列番号110(SE-UPPをコードするpLybAL10fb);または
配列番号91(ポリンをコードするpLybAL32)
から選択される少なくとも1つの配列を含む人工DNA構築物。
【請求項１１】
トランスジェニック光合成微生物細胞を用いる発酵性糖の生産方法であって、
請求項１〜９のいずれかに記載のトランスジェニック光合成微生物細胞を培養担体に接種し;
接種された培養担体で光合成微生物を培養し;
蓄積された発酵性糖を単離すること
を含み、
任意に、以下の特徴:
(a)発酵性糖が光合成微生物内に蓄積する;
(b)蓄積された発酵性糖の単離が、(1)培養担体からの、培養した光合成微生物の少なくとも一部を収穫すること、及び、(2)収穫物からの発酵性糖を回収することを含む;
(c)蓄積された発酵性糖が、光合成微生物から分泌され、培養培地から単離される;
(d)蓄積された発酵性糖の単離が、培養培地からの蓄積された発酵性糖の単離を含む;
(e)物理的バリアがシールされている間、光合成微生物の培養の全部または実質的な部分が行われるように、接種後に培養担体のまわりの物理的バリアを取り外し可能にシールすることを含む;
(f)(1)培養担体に流体を供給すること;(2)培養担体に栄養素を供給すること;または(3)培養担体にガスを供給することの少なくとも1つ含む;
(g)培養担体を接種ステーション、培養ステーションおよび収穫ステーションの少なくとも1つに運搬することを含む;
(h)光合成微生物による発酵性糖の合成の誘導を含む;
(i)光合成微生物による発酵性糖の合成の誘導を含み、発酵性糖の合成の誘導が、温度、pH、代謝物、光、浸透圧剤、重金属および抗生物質からなる群から選択される誘導剤に光合成微生物を暴露することを含む;
(j)発酵性糖の合成の誘導が、光合成微生物を塩化合物で処理することを含む;
(k)発酵性糖の合成の誘導が、光合成微生物を塩化ナトリウムで処理することを含む;
(l)発酵性糖の合成の誘導が、光合成微生物を塩化合物で処理することを含み、塩化合物が約0.01mM〜1.5Mまたは約0.2〜0.9Mの濃度で添加される;
(m)発酵性糖の合成の誘導が、光合成微生物を、エアゾールスプレーによって増殖表面に塗布された誘導剤に暴露することを含む;
(n)光合成微生物が、1リットル相当量当たり乾燥バイオマス少なくとも約50グラムの密度まで培養される;
(o)発酵性糖が、グルコース、フルクトース、スクロース、トレハロース、グルコシルグリセロールおよびマンノシルフルクトースからなる群から選択される少なくとも1つの糖を含む;
(p)発酵性糖が、スクロースおよびトレハロースからなる群から選択される少なくとも1つの糖を含む;
(q)光合成微生物が天然に存在する光合成微生物を含む;又は
(r)請求項１２〜１５のいずれか１項に記載のフォトバイオリアクター又は装置の中又はフォトバイオリアクター又は装置の上で光合成微生物を培養する
の１つ以上を有する、前記方法。
【請求項１２】
光合成微生物を培養するためのフォトバイオリアクターにおいて、
その表面の少なくとも一部の上にある光合成微生物に栄養素および水分を提供するのに適した非ゼラチン質の固体培養担体であって、前記表面の一部が非水平に向けられるとき、光合成微生物がそれに付着するのを可能にする形状を有する前記固体培養担体;ならびに
少なくとも前記培養担体の表面の一部をおおう物理的バリアであって、前記培養担体の表面の一部への接種、このような光合成微生物の培養に適した環境の形成および維持ならびにこのような培養した光合成微生物の収穫を可能にするように構成された前記物理的バリア
を含む、前記フォトバイオリアクター。
【請求項１３】
培養担体が、以下の特徴:
(a)培養担体が柔軟性である;
(b)培養担体が1以上の硬質材料を含む;
(c)培養担体が少なくとも2つの層、すなわち第2層に隣接した第1層を含み、ここで少なくとも2つの層の材料が同一材料または異なる材料である;
(d)培養担体が少なくとも2つの層、すなわち第2層に隣接した第1層を含み、ここで第1層が高表面積の増殖材料を含み、第2層が透過型材料を含む;
(e)培養担体が、可撓的に連結された硬質部分であって、1以上の硬質材料で構成される前記硬質部分を含む;
(f)培養担体が布を含む;
(g)培養担体が、天然繊維、改質天然繊維、合成繊維またはそれらの組み合わせで構成される布を含む;
(h)培養担体が、織物、編物、フェルト、架橋繊維ポリマーのメッシュまたはそれらの組み合わせからなる群より選ばれる布を含む;
(i)培養担体が、綿、羊毛、アサ、木繊維、他のセルロース系繊維又はそれらの組み合わせからなる群から選択される天然繊維を含む;
(j)培養担体が、ニトロセルロース、セルロースアセタート、セルローススルホナート、架橋デンプン及びそれらの組み合わせからなる群から選択される改質天然繊維を含む;
(k)培養担体が、ポリエステル、ポリアクリラート、ポリアミン、ポリアミド、ポリスルホン又はそれらの組み合わせからなる群から選択される合成繊維を含む;
(l)培養担体が吸水性ポリマーでコーティングされる;
(m)培養担体が布を含み；前記布が繊維を含み；布、布の繊維または両方が吸水性ポリマーでコーティングされる;
(n)培養担体が布を含み；前記布が繊維を含み；布、布の繊維または両方が吸水性ポリマーでコーティングされ；前記吸水性ポリマーが寒天、ポリアクリラート、ポリアミド、ポリアミン、ポリエチレングリコール、修飾デンプンおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される;
(o)フォトバイオリアクターが1つの培養担体を含む;又は
(p)フォトバイオリアクターが複数の培養担体を含む
の１つ以上を有する、請求項１２に記載のフォトバイオリアクター。
【請求項１４】
物理的バリアが、以下の特徴:
(a)物理的バリアが、固体微粒子および液体に対して少なくとも実質的に不透過性であるが、前記培養担体の表面の一部に隣接する空間を往復するガスまたは蒸気の移動を妨げないばかりでなく、前記培養担体の表面の一部の化学線照射も妨げない;
(b)フォトバイオリアクターが、培養担体と物理的バリアとの間に位置する化学線源をさらに含む;
(c)物理的バリアが、培養担体と化学線源との間にあり、このような化学線に対し十分に透明であり、培養中に光合成微生物による光合成を可能にするために十分にガス透過性である;
(d)湿らせた培養担体が十分な水分を保持するように、物理的バリアが水蒸気に対して十分に不透過性であり、それにより培養中に光合成微生物が適切に水和されたままである;
(e)物理的バリアが、光合成微生物の培養の少なくとも一部分において、培養担体およびその培養担体上の任意の光合成微生物を密閉し、かつ、取り外し可能にシールされるように構成される;
(f)物理的バリアが柔軟性である;
(g)物理的バリアが、固体微粒子、液体、ガスおよび蒸気に対して少なくとも実質的に不透過性である第1の部分ならびに、ガスおよび蒸気に対して透過性であるが、固体微粒子および液体に対して少なくとも実質的に不透過性である第2の部分をさらに含む;
(h)物理的バリアが、固体微粒子、液体、ガスおよび蒸気に対して少なくとも実質的に不透過性である第1の部分ならびに、ガスおよび蒸気に対して透過性であるが、固体微粒子および液体に対して少なくとも実質的に不透過性である第2の部分をさらに含み、
バリアの第2の部分が、
(1)少なくとも約5ガーレー秒から約10,000ガーレー秒以下までのガスまたは蒸気交換速度を有する、又は
(2)オレフィン繊維もしくはポリエチレン繊維材料、ポリテトラフルオロエチレン濾過媒体、セルロース系フィルター材料、ファイバーグラスフィルター材料、ポリエステルフィルター材料、ポリアクリラートフィルター材料、ポリスルホン膜またはナイロン膜を含む選択膜を含む;
(i)物理的バリアが、固体微粒子、液体、ガスおよび蒸気に対して少なくとも実質的に不透過性である第1の部分ならびに、ガスおよび蒸気に対して透過性であるが、固体微粒子および液体に対して少なくとも実質的に不透過性である第2の部分をさらに含み、
第1の部分が化学線に対して少なくとも実質的に透過性であり、第2の部分が化学線に対して少なくとも実質的に透過性ではなく、第1および第2の部分の、互いに対する配置および少なくとも前記培養担体の表面の一部に対する配置が光合成微生物による光合成を維持するために十分な量の化学線およびガスが交換されるようなものである
の１つ以上を有する、請求項１２〜１３のいずれかに記載のフォトバイオリアクター。
【請求項１５】
請求項１２〜１４のいずれかに記載の少なくとも1つのフォトバイオリアクター;および
少なくとも1つのフォトバイオリアクターの少なくとも1つの培養担体が非水平に向いた少なくとも1つのフォトバイオリアクターが取り付けられる構造物
を含む、光合成微生物を培養するための装置であって、
任意に、以下の特徴:
(a)少なくとも1つのフォトバイオリアクターが構造物から吊り下げられる;
(b)構造物が物理的バリアによって実質的におおわれる;
(c)構造物が、コンベヤシステムの経路に沿って少なくとも1つの培養担体を運搬することができるようにコンベヤシステムまたはその構成要素を含む;
(d)前記装置が、(1)各培養担体をコンベヤシステムの経路に沿って運搬しながら光合成微生物を接種できる接種ステーション;(2)各培養担体をコンベヤシステムの経路に沿って運搬しながら、接種された各培養担体上の光合成微生物を培養するための培養ステーション;および(3)培養した光合成微生物の少なくとも一部を各培養担体から収穫するために培養担体が運ばれる収穫ステーションをさらに含む;
(e)前記装置が、(1)各培養担体をコンベヤシステムの経路に沿って運搬しながら光合成微生物を接種できる接種ステーション;(2)各培養担体をコンベヤシステムの経路に沿って運搬しながら、接種された各培養担体上の光合成微生物を培養するための培養ステーション;および(3)培養した光合成微生物の少なくとも一部を各培養担体から収穫するために培養担体が運ばれる収穫ステーションをさらに含み;接種ステーションおよび収穫ステーションが、実質的に互いに隣接しているかまたは実質的に同延である;
(f)前記装置が、各培養担体上の光合成微生物による発酵性糖の合成を誘導するための誘導ステーションをさらに含む;
(g)前記装置が、流体供給システム、栄養供給システム、ガス供給システムまたは微生物供給システムの少なくとも1つをさらに含む;
(h)前記装置が、請求項１〜９のいずれか1つに記載の細胞であって、固体培養担体に付着した前記細胞をさらに含む
の１つ以上を有する、前記光合成微生物を培養するための装置。
【請求項１６】
請求項１２〜１５のいずれかに記載のフォトバイオリアクターまたは装置を用いる光合成微生物の培養方法であって、
培養担体に光合成微生物を接種し;
接種された培養担体で光合成微生物を培養し;
培養担体から培養した光合成微生物の少なくとも一部を収穫すること
を含み、
任意に、以下の特徴：
(a)物理的バリアがシールされている間、光合成微生物の培養の全部または実質的な部分が行われるように、培養担体の接種後にフォトバイオリアクターの物理的バリアをシールすることを含む;
(b)物理的バリアがシールされている間、光合成微生物の培養の全部または実質的な部分が行われるように、培養担体の接種後にフォトバイオリアクターの物理的バリアを取り外し可能にシールすることを含む;
(c)接種ステーション、培養ステーションおよび収穫ステーションに各培養担体を運搬することを含む;
(d)(1)培養担体に流体を供給すること;(2)培養担体に栄養素を供給すること;または(3)培養担体にガスを供給することの少なくとも1つを含む;
(e)光合成微生物が、1リットル相当量当たり乾燥バイオマス少なくとも約50グラムの密度まで培養される;又は
(f)光合成微生物が、請求項１〜９のいずれか1つに記載の細胞を含む
の１つ以上を有する、前記方法。