【手続補正書】
【提出日】平成26年2月14日(2014.2.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４０３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４０３】
すでに公開されている方法の中から、抗ＫＡＡＧ１  ＩｇＧ１キメラ抗体のＡＤＣＣ活性を測定するためのインビトロ分析を採用した。この方法で、ＷＩＬ２−Ｓと呼ばれるリンパ腫細胞系の存在下で抗ＣＤ２０リツキサンのＡＤＣＣ活性を測定した（Ｉｄｕｓｏｇｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４，４１７８−４１８４）。ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＮＣ）を、濃度が増大する３Ｄ３キメラＩｇＧ１抗体の存在下で活性化されたＮＫ細胞源として使用した（図１３を参照）。標的細胞を１：２５の比で活性化されたＰＢＭＮＣとともにインキュベートした。図示するように、細胞死は、ＯＶＣＡＲ−３及びリンパ腫細胞系の両方の存在下で用量に依存して増加し、後者はＲＴ−ＰＣＲによってＫＡＡＧ１を発現することが証明された（不図示）。正の対照として、公開された方法から得られた結果を再現し、この場合、リツキサンに関してＷＩＬ２−Ｓ細胞の存在下で高レベルのＡＤＣＣが得られた。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４０７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４０７】
ＳＣＩＤマウスにおけるＴＯＶ−１１２Ｄ細胞系の腹腔内接種の結果、ヒトにおいて観察されるものと非常によく似た数ダースの微小転移性腫瘍が移植された。抗体の希釈剤であるＰＢＳで処置されたマウスは、検査によると、動物１匹あたり平均で２５〜３０の腫瘍を含んでいた（図１４Ａ及び図１４Ｂ）。数例では、これらのマウスの腹腔中の腫瘍数は多すぎて腫瘍の数を容易に測定できなかったので、これらのマウスは統計分析から除外した。マウスを３Ｃ４及び３Ｄ３抗体で処理した場合、微小転移性腫瘍の数は大幅に減少した。加えて、抗ＫＡＡＧ１で処理した群につき少なくとも１匹の動物では腫瘍が見られなかった。さらに多数のＴＯＶ−１１２Ｄ腫瘍（＞５０／動物）を含むマウスで第２の実験を実施し、非常によく似た結果を得た。さらに、３Ｄ３抗体と比較して、３Ｃ４で処置された群ではほとんど差はなかった。しかし、これらのインビボ実験における傾向並びに細胞ベースの分析で得られた結果は、３Ｄ３抗体の方が若干有効性が高いことを示した。これが、よりアクセス可能なエピトープによるのか、又は抗原に対して３Ｃ４と比較して３Ｄ３のより高い親和性によるのかは、まだわかっていない。これらの２つの実験から得られた結果は、卵巣癌細胞表面上のＫＡＡＧ１を標的とすることは、インビボの腫瘍の拡大を著しく軽減することにつながり得ることを証明した。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４０９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４０９】
実施例１０
ＫＡＡＧ１は皮膚腫瘍及び腎臓細胞癌で発現され、これらの適応症における治療上の標的である。
実施したｍＲＮＡプロファイリング研究から、ＫＡＡＧ１抗原をコード化する転写物は、黒色腫試料及び腎臓癌由来の細胞系で高度に発現されたことがわかった。これらの結果は、Ｓｏｏｋｎａｎａｎら（２００７年）で開示された。これらの癌型におけるＫＡＡＧ１遺伝子の転写調節を確認するために、免疫組織化学法を、扁平上皮細胞癌及び黒色腫から単離されたいくつかの切片を含むヒト皮膚腫瘍組織マイクロアレイ（Ｐａｎｔｏｍｉｃｓ  Ｉｎｃ．、カリフォルニア州リッチモンド）で抗ＫＡＡＧ１抗体を用いて実施した。このアレイの分析は、扁平上皮細胞癌及び黒色腫から単離された生検において非常に強い染色を示した（図１５、上のパネル）。これらの型はどちらも皮膚癌の最も一般的な形態に含まれ、また興味深いことに、扁平上皮細胞癌は最も転移性が強く、この事実もＫＡＡＧ１の発現と侵襲的表現型とを結びつける。すでに観察されたように、アレイ上に含まれる３つの正常な皮膚試料上のＫＡＡＧ１の存在は非常に微弱であるか又は存在しなかった。同様に、ＫＡＡＧ１は、腎臓癌のアレイに含まれる試料の多くで検出された。陽性試料のほとんどは、主に乳頭細胞癌型のものであり、若干の明細胞癌がＫＡＡＧ１タンパク質を発現した。乳頭癌は腎臓癌症例の約２０％に相当する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４１０】
ＫＡＡＧ１の機能が、卵巣癌におけるその役割と比較して、これらの種類の癌で同じかどうかを試験するために、黒色腫及び腎臓細胞癌由来の細胞系を得、スフェロイド培養試験で試験した（実施例１及び６を参照）。黒色腫モデルに関して、Ａ３７５及びＳＫ−ＭＥＬ５細胞の２つの悪性黒色腫細胞系を、これらが５％ＦＢＳの存在下でスフェロイドを形成することを可能にする条件下で培養した。培養物を５μｇ／ｍｌの濃度の抗ＫＡＡＧ１キメラ３Ｄ３抗体とともに又はこの抗体なしでインキュベートした。図１６に示すように、培養物中に３Ｄ３抗体を含めることで、黒色腫細胞系におけるスフェロイド構造の適切な構築が防止された。この結果は、ＫＡＡＧ１が卵巣癌において果たすのと同様の役割を黒色腫でも果たすことを示唆した。腎臓細胞癌由来の細胞系も試験した。Ａ−４９８細胞系は腎臓乳頭細胞癌細胞系であるのに対して、７８６−Ｏは腎臓明細胞癌である。図１６で示すように、Ａ−４９８スフェロイドのみが３Ｄ３抗ＫＡＡＧ１抗体の存在によって影響を受け、一方、７８６−Ｏ細胞系はこの分析で影響を受けなかった。これらの結果は、前述の免疫組織化学法の結果に匹敵し、スフェロイド形成の阻害が、主に乳頭腎臓癌由来の腎臓癌細胞表面上のＫＡＡＧ１の存在に依存することを示す。しかし、抗ＫＡＡＧ１抗体は腎臓明細胞癌の他の種類の分析において機能し得る可能性がある。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４１２】
実施例１１
ＫＡＡＧ１は卵巣癌細胞の表面上で発現される。ＫＡＡＧ１をコード化するｃＤＮＡの一次構造のバイオインフォーマティック分析、生化学研究、及び上皮細胞中のタンパク質の免疫組織化学的検出から得られた総合結果は、ＫＡＡＧ１抗原が細胞表面上に位置することを示唆した。しかし、ＫＡＡＧ１が実際に膜結合タンパク質であることを証明するためにはさらに直接的な証拠が必要であった。一方法において、ＫＡＡＧ１を発現することが知られている卵巣癌細胞系をマイクロタイタープレート中に播種し、細胞を透過しない条件下で固定し、抗ＫＡＡＧ１キメラ抗体の濃度を増加させつつインキュベートした。細胞をよく洗浄した後、修飾された細胞ベースのＥＬＩＳＡにおいて二次抗体としてＨＲＰ結合抗ヒトＩｇＧを用いて結合抗体を検出した（図１７Ａを参照）。これらの実験から得ることができる最初の観察結果は、抗体を細胞によって特異的に捕獲することができることであり、このことは、ＫＡＡＧ１が細胞表面で存在することを示唆した。第２に、結合の量は、ＳＫＯＶ−３細胞上で最強であり、ＴＯＶ−２１Ｇ細胞は最弱の結合を示した。これは、ＫＡＡＧ１  ｍＲＮＡがこれらの細胞系において同様の割合で発現されることを証明したＲＴ−ＰＣＲデータ（不図示）と完全に一致した。さらに、３Ｄ３抗体は最強のシグナルを生じ、このことは、この抗体によって標的とされるエピトープがこの分析では最もアクセス可能であったことを意味する。３Ｇ１０は、最高レベルのＡＢ−０４４７を発現した細胞系においてＫＡＡＧ１を検出できるだけであった（ＳＫＯＶ−３細胞、図１７Ａの右パネルを参照）。使用した第２の方法はフローサイトメトリーであった。この場合、マウス３Ｄ３抗ＫＡＡＧ１抗体をＳＫＯＶ−３卵巣癌細胞とともに飽和条件でインキュベートし、続いてよく洗浄し、結合した３Ｄ３抗ＫＡＡＧ１抗体を、フローサイトメーターでＦＩＴＣと結合した抗マウスＩｇＧを用いて検出した。図１７Ｂで示すように、ＳＫＯＶ−３細胞の表面でのシグナルは、バックグラウンドの読みと同じ蛍光レベルである、非哺乳動物非関連性タンパク質について特異的な負の対照である抗ＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシアニン）抗体で標識された同じ細胞と比較してはるかに高かった。まとめると、これらの結果は、ＫＡＡＧ１が細胞表面上に位置することを示す。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４１３】
実施例１２
ヒト化抗ＫＡＡＧ１抗体の使用法。
インビトロ及び予備インビボ結果の両方に基づいて、２つのマウス抗ＫＡＡＧ１抗体候補（３Ｄ３及び３Ｃ４と表示）を、当業者に周知の方法を使用するコンピュータ内でのモデリングを用いたヒト化について選択した。手短に言うと、ネズミ抗体の可変領域を、高い配列相同性と類似したＣＤＲループ長さを呈するマウス、ヒト化、及び完全ヒト可変領域の利用可能な結晶構造に基づいて３Ｄでモデル化した。ＣＤＲは、抗原結合に寄与するアミノ酸配列であり、抗体鎖上に３つのＣＤＲが存在する。さらに、ＣＤＲ間に介在するアミノ酸配列であるフレームワーク領域を、マウスとヒト抗体配列との標準的相同性比較によって修飾し、その結果、「最良適合」ヒト配列を得た。これらの修飾は、潜在的なＮ及びＯ結合グリコシル化部位の保存はもちろんのこと、ヒト化構造における最大抗原結合を保証するために、これらの修飾はＣＤＲの適切なポジショニングが確実に維持されるようにした。ヒト化（ｈ）３Ｄ３及び３Ｇ４における重鎖及び軽鎖可変領域の両方の配列の結果として、それぞれ９６％及び９４％がヒト化された。各抗体の３Ｄ３及び３Ｃ４モデルの構造をそれぞれ図１８Ａ及び１８Ｂに示す。これらの構造に示されるように、３Ｄ３は、３つの異常なアミノ酸（図１８Ａ、重鎖上のＭｅｔ９３及びＧｌｙ９４、並びに軽鎖上のＳｅｒ５７）がＣＤＲモデルに近いので、これらのアミノ酸の維持を必要とした。モデリングは、これらのマウスアミノ酸のヒト等価物での置換が抗体のＫＡＡＧ１抗原との結合を相殺し得ることを予想した。３Ｃ４の場合、６個のアミノ酸が異常と見なされた（図１８Ｂ、重鎖上のＧｌｕ１、Ｇｌｎ７２及びＳｅｒ９８、並びに軽鎖上のＴｈｒ４６、Ｐｈｅ４９及びＳｅｒ８７）。両図において、軽鎖ＣＤＲは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３についてそれぞれＬ１、Ｌ２、及びＬ３により示され、一方、重鎖ＣＤＲは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３についてそれぞれＨ１、Ｈ２、及びＨ３で示される。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４１５】
トランスフェクトされた哺乳動物細胞における発現ベクターのアセンブリ及びｈ３Ｄ３の産生後（実施例５を参照）、ヒト化プロセスの生物学的同等性を証明するためにいくつかの分析を実施した。エフェクター機能を有する抗体が必要とされたので、ｈ３Ｄ３をヒトＩｇＧ１として構築した。ｈ３Ｄ３の能力を組換えＫＡＡＧ１と直接比較するためにＥＬＩＳＡに基づく分析を実施した。これらの試験を実施するために用いられる方法は、組換えＦｃ−ＫＡＡＧＩを使用して実施例３に記載したとおりにした。図１９Ａに示すように、ｈ３Ｄ３の結合活性は、キメラ３Ｄ３の結合活性と同じであった。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４１６】
さらに正確な測定は、Ｂｉａｃｏｒｅ装置で表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いて実施した。動態解析を用いて、キメラ３Ｄ３のｈ３Ｄ３との親和性並びに軽及び重鎖の様々な置換を含むハイブリッド抗体との親和性を比較した（図１９Ｂを参照）。手短に言えば、抗ヒトＦｃをＢｉａｃｏｒｅセンサーチップ上に固定しキメラ又はｈ３Ｄ３をこのチップ上に捕獲した。様々な濃度のモノマー組換えＫＡＡＧ１を注入し、データを簡単な１：１モデルに全体的に適合させて、相互作用の動態パラメータを決定した。キメラ３Ｄ３の動態パラメータを図１９Ｂで図示した（ｍ３Ｄ３）。キメラ３Ｄ３の平均ＫＤは２．３５×１０−１０Ｍであった。比較して、キメラ（Ｃ）／ヒト化（Ｈ）の全置換は、非常に類似した動態パラメータを示した。キメラ重鎖とともに発現されたキメラ軽鎖（図１９Ｂでは「ＣＣ」として表示）の平均ＫＤは２．７１×１０−１０Ｍであり、キメラ重鎖とともに発現されたヒト化軽鎖（図１９Ｂでは「ＨＣ」として表示）の平均ＫＤは３．０９×１０−１０Ｍであり、ヒト化重鎖とともに発現されたキメラ軽鎖（図１９Ｂでは「ＣＨ」として表示）の平均ＫＤは５．０５×１０−１０Ｍであり、ヒト化重鎖とともに発現されたヒト化軽鎖（図１９Ｂでは「ＨＨ」として表示）の平均ＫＤは４．３９×１０−１０Ｍであった。分析から、３Ｄ３のヒト化がもとのマウス抗体の結合活性を保存することがわかった。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４１７】
ｈ３Ｄ３の生物学的機能をスフェロイド培養試験で評価した（実施例６を参照）。ＳＫＯＶ−３卵巣癌細胞を、５％ＦＢＳの存在下、ｈ３Ｄ３又は非ＫＡＡＧ１結合同位体対照抗体の存在下で培養した。結果（図１９Ｃに図示）は、緩衝液又は非関連ＩｇＧのいずれかを用いた治療は、コンパクトな３−Ｄ構造の形成を阻害しなかったことを示す。対照的に、キメラ３Ｄ３とヒト化３Ｄ３とはどちらも、スフェロイドが形成されるのを防止した。結果を二とおりで示す（左及び右のパネル）。これらの結果は、キメラ３Ｄ３の生物活性がヒト化３Ｄ３で保存されることを示し、ｈ３Ｄ３が同様に挙動することを示唆する。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図９Ａ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図９Ａ】
2012507266.tif 000001
【手続補正１１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図９Ｂ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図９Ｂ】
2012507266.tif 000002
【手続補正１２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図９Ｃ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図９Ｃ】
2012507266.tif 000003
【手続補正１３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１０Ａ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１０Ａ】
2012507266.tif 000004
【手続補正１４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１０Ｂ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１０Ｂ】
2012507266.tif 000005
【手続補正１５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１０Ｃ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１０Ｃ】
2012507266.tif 000006
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2012507266000001.app