【手続補正書】
【提出日】平成25年11月25日(2013.11.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）標的核酸を含有すると思われる試料を調製するステップと、
ｂ）前記試料、第１のオリゴヌクレオチドプローブ、第２のオリゴヌクレオチドプローブ、および任意付加的な第３のオリゴヌクレオチドプローブならびに配列特異的エンドヌクレアーゼを含む反応混合物を調製するステップであって、
第１のオリゴヌクレオチドプローブおよび第２のオリゴヌクレオチドプローブは第１の配列、第２の配列をそれぞれ含み、
第１のオリゴヌクレオチドプローブおよび第２のオリゴヌクレオチドプローブの第１の配列は、前記標的核酸の非重複配列に相補的であり、
第１のオリゴヌクレオチドプローブおよび第２のオリゴヌクレオチドプローブのそれぞれの第２の配列は互いに相補的であり、したがって、前記配列特異的エンドヌクレアーゼによって認識される二重鎖制限部位を形成し、
第１のオリゴヌクレオチドプローブ、第２のオリゴヌクレオチドプローブ、または第３のオリゴヌクレオチドプローブのうちの少なくとも１つは、前記制限部位の片側に配置された検出可能な標識および前記制限部位の反対側に配置された消光部分を含み、
前記第１または第２のプローブは検出可能な標識を有するとき、第１のオリゴヌクレオチドプローブおよび第２のオリゴヌクレオチドプローブの第１の配列は前記標的核酸の非重複核酸配列と選択的にハイブリダイズし、第１のオリゴヌクレオチドプローブおよび第２のオリゴヌクレオチドプローブの第２の配列は互いに選択的にハイブリダイズし、それによって前記二重鎖制限部位を形成し、その結果、前記標的核酸が前記試料中に存在していれば、前記配列特異的エンドヌクレアーゼが前記二重鎖を前記制限部位で切断し、前記標識の検出が可能となり、標的生物の核酸からおよび互いからオリゴヌクレオチドプローブの残りの部分を変性させるか、または、
前記第１のオリゴヌクレオチドプローブおよび第２のオリゴヌクレオチドプローブは標識されておらず、および、前記第２のオリゴヌクレオチドプローブはさらに第３の配列を含み、第３の配列の少なくとも一部分は、前記第２のオリゴヌクレオチドプローブの前記第２の配列とヘアピンを形成し、前記第１のオリゴヌクレオチドプローブおよび第２のオリゴヌクレオチドプローブが前記標的核酸と結合していない場合に、前記ヘアピンは前記第２のオリゴヌクレオチドプローブが前記第１のオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズすることを妨げ、
前記第３の配列の前記一部分は、前記第３のオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズして、二重鎖制限部位を形成し、
前記第３のオリゴヌクレオチドプローブは、前記二重鎖制限部位を形成する、前記第２のオリゴヌクレオチドプローブの前記第３の配列とハイブリダイズする第１の配列の片側に配置された検出可能な標識を含む非標的特異的オリゴヌクレオチドプローブ、および、前記第３のオリゴヌクレオチドプローブの前記第１の配列の反対側に配置された消光部分を含み、
前記標的核酸が前記試料中に存在する場合は、前記第１のオリゴヌクレオチドプローブおよび第２のオリゴヌクレオチドプローブの前記第１の配列を、前記標的核酸の前記非重複配列と選択的にハイブリダイズさせ、
それにより、前記ヘアピンループの変性させ、および、前記第１のオリゴヌクレオチドプローブおよび第２のオリゴヌクレオチドプローブの前記第２の配列間のハイブリダイゼーションさせ、前記配列特異的エンドヌクレアーゼによる前記制限部位での以前に形成された二重鎖を切断させ、前記第３の配列の前記第２のオリゴヌクレオチドプローブから分離させ、ならびに前記第１のオリゴヌクレオチドプローブおよび第２のオリゴヌクレオチドプローブの前記標的核酸から解離させ、および、複数のサイクルを施し、
前記複数のサイクルは：ｉ）化学修飾された二重鎖制限部位の形成する、前記第２のオリゴヌクレオチドプローブの前記第３の配列と前記第３のオリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーション、ｉｉ）化学修飾された二重鎖制限部位の形成配列特異的制限エンドヌクレアーゼによる、化学修飾された二重鎖制限部位の一本鎖のニッキング、ｉｉｉ）標識の消光物質からの遊離、ｉｖ）前記第３のオリゴヌクレオチドプローブの前記第２のオリゴヌクレオチドプローブの前記第３の配列からの解離、であり、および、
試料中の標的核酸の存在を示す標識からシグナルを検出する、ステップと、
を含むことを特徴とする、
試料中の標的核酸の存在または非存在を検出する方法。
【請求項２】
前記反応混合物は、熱サイクリングに供されて、前記標的核酸から切断されたオリゴヌクレオチドを変性させることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
熱サイクリング温度は、融解曲線を基準として選択されることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記反応混合物は、ｉ）前記標的核酸に対する第１のオリゴヌクレオチドプローブの融解温度、ｉｉ）前記標的核酸に対する第２のオリゴヌクレオチドプローブの融解温度、ならびにｉｉｉ）第１のオリゴヌクレオチドプローブおよび第２のオリゴヌクレオチドプローブで形成されたハイブリッドの融解温度よりも高いハイブリダイゼーション温度に維持されることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
ａ）標的核酸を含有すると思われる試料を調製するステップと、
ｂ）以下：
ｉ）前記試料、
ｉｉ）第１の配列および第２の配列を有する第１のオリゴヌクレオチドプローブ、第１の配列および第２の配列を有する第２のオリゴヌクレオチドプローブ、第１の配列および第２の配列を有する第３のオリゴヌクレオチドプローブ、ならびに
ｉｉｉ）配列特異的エンドヌクレアーゼ
を含む反応混合物を調製するステップであって、
第１のオリゴヌクレオチドプローブは、標的核酸配列に相補的な第１の配列および第２のオリゴヌクレオチドプローブの第１の配列に相補的な第２の配列を有し、第２の配列の第１の部分は、制限部位の化学修飾された一本鎖部分であり、第１のオリゴヌクレオチドプローブの第１の配列および第２の配列の一部分は二次構造を形成し、
第２のオリゴヌクレオチドプローブは、前記標的と直接ハイブリダイズしないプローブであり、第２のプローブの第１の配列の一部分は、第１のプローブの第２の配列の化学修飾された一本鎖部分に相補的であり、第２のオリゴヌクレオチドプローブの第２の配列は、第３のオリゴヌクレオチドプローブの第１の配列に相補的であり、第２のプローブの第２の配列の一部分は、制限部位の化学修飾された一本鎖部分であり、第２のオリゴヌクレオチドプローブの第１の配列および第２の配列は部分的に重複し、第２のオリゴヌクレオチドプローブの第１の配列および第２の配列の少なくとも一部分は二次構造を形成し、
第３のオリゴヌクレオチドプローブは、前記標的と直接ハイブリダイズしないプローブであり、第１の配列は、第２のオリゴヌクレオチドプローブの制限部位の化学修飾された一本鎖部分に相補的な一部分を含み、第１の配列上に配置された検出可能な標識または消光部分をさらに含み、第２の配列は、第１の配列の一部分とヘアピンループを形成し、第２の配列上に配置された検出可能な標識または消光部分を有し、その結果、前記消光部分が、第３のオリゴヌクレオチドプローブ上のその相対的位置のために、前記検出可能な標識のシグナルを遮断し、
前記標的核酸が前記試料中に存在していれば、前記標的核酸を第１のオリゴヌクレオチドプローブの第１の配列と選択的にハイブリダイズさせて、第１の複合体を形成させ、複数のサイクルで、ｉ）第１のオリゴヌクレオチドプローブの第２の配列の少なくとも一部分と第２のオリゴヌクレオチドプローブの第１の配列とを選択的にハイブリダイズさせて、第２の複合体を形成させ、ｉｉ）二重鎖制限部位の化学修飾された一本鎖を形成する第１のオリゴヌクレオチドプローブの第２の配列の一部分と第２のプローブ上の相補的配列とのハイブリダイゼーションによって形成された前記二重鎖制限部位の一本鎖部分を切断し、それによって、第２のオリゴヌクレオチドプローブの第２の配列を第２のオリゴヌクレオチドプローブの第１の配列の非重複部分から分離させ、ｉｉｉ）第２のオリゴヌクレオチドプローブを第１の複合体から解離させ、
複数のサイクルで、ｉ）第２のオリゴヌクレオチドプローブの第２の配列を第３のオリゴヌクレオチドプローブの第１の配列と選択的にハイブリダイズさせて、第３の複合体を形成させ、それによって、標識を消光物質から分離させ、シグナルを遊離させ、ｉｉ）第２のオリゴヌクレオチドプローブの第２の配列の前記一部分と第３のオリゴヌクレオチドプローブの第１の配列上の相補的配列とのハイブリダイゼーションによって形成された一本鎖二重鎖制限部位を切断し、ｉｉｉ）標識を消光物質から遊離させ、ｉｖ）第２のオリゴヌクレオチドプローブの第２の配列を第３のオリゴヌクレオチドプローブから解離させ、
前記試料中の前記標的核酸の存在を示す、前記標識から生成されるシグナルを検出するステップと
を含むことを特徴とする、試料中の標的核酸の存在または非存在を検出する方法。
【請求項６】
前記二次構造はヘアピンであることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記核酸標的配列は、ヒトパピローマウイルス１６型およびヒトパピローマウイルス５８型からなる群から選択されるヒトパピローマウイルス核酸であることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記標的核酸は配列番号２および配列番号３からなる群から選択されることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
第１のオリゴヌクレオチドプローブは配列番号１であり、第２のオリゴヌクレオチドプローブは配列番号２であり、第３のオリゴヌクレオチドプローブは配列番号３であることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
前記配列特異的エンドヌクレアーゼは、ＢｓｏＢＩ、Ｈｉｎｃ  ＩＩ、Ａｖａ  Ｉ、Ｎｃｉ  ＩおよびＦｎｕ  ４Ｈからなる群から選択される酵素であることを特徴とする、請求項１または５に記載の方法。
【請求項１１】
前記配列特異的エンドヌクレアーゼはＢｓｏＢＩであることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記検出可能な標識は蛍光物質であることを特徴とする、請求項１または５に記載の方法。
【請求項１３】
前記蛍光物質はキサンテン色素であることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記消光物質はローダミン色素であることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記反応混合物は遮断プローブをさらに含むことを特徴とする、請求項１または５に記載の方法。
【請求項１６】
前記化学修飾された制限部位は半修飾されていることを特徴とする、請求項１または５に記載の方法。