(57)【要約】【課題】温度安定性に優れ、強力なメラニン生成抑制能を有する新規微生物、この微生物由来のメラニン生成抑制剤、および化粧料を提供する。【解決手段】Ｒｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ属に属する微生物［例えばＲｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ  ＮＢ３２０４（ＦＥＲＭＰ−１９１６７）］またはＲｕｅｇｅｒｉａに属する微生物［例えばＲｕｅｇｅｒｉａ  ＮＢ６４５０（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１６８）］、もしくはそれらの近縁微生物であって、メラニン生成抑制能を有することを特徴とする微生物と、この微生物菌体、または菌体抽出物を有効成分とするメラニン生成抑制剤、およびこのメラニン生成抑制剤を含有する化粧料。【選択図】  図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｒｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ属またはＲｕｅｇｅｒｉａに属する微生物またはそれらの近縁微生物であって、メラニン生成抑制能を有することを特徴とする微生物。
【請求項２】
配列番号１または配列番号２の塩基配列と９０％以上相同の１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列を有する請求項１の微生物。
【請求項３】
Ｒｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ  ＮＢ３２０４（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１６７）である請求項１の微生物。
【請求項４】
Ｒｕｅｇｅｔｒｉａ  ＮＢ６４５０（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１６８）である請求項１の微生物。
【請求項５】
請求項１から４のいずれか１以上の微生物菌体、または１以上の菌体抽出物を有効成分とするメラニン生成抑制剤。
【請求項６】
請求項５のメラニン生成抑制剤を含有する化粧料。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この出願の発明は、メラニン生成抑制能を有する新規の微生物と、この微生物菌体またはその菌体抽出物を有効成分とするメラニン生成抑制剤、および化粧料に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
メラニン産生細胞（メラノサイト）におけるメラニン生成は、美容の観点ばかりか皮膚の老化や疾病発現と密接に関連した現象である。生体内におけるメラニン生成は、チロシンを前駆物質としてチロシナーゼによりドーパを経由してインドールキノンが合成され、さらに自動酸化によってメラニンに至る経路で行われる。
【０００３】
従来、チロシナーゼ活性を阻害することによりメラニンの生成を抑制する物質としては、ビタミンＣ、コウジ酸、システイン、アルブミン、グルタチオン、ハイドロキノン等が知られている。また、天然物由来のメラニン生成抑制物質としては、セリ科植物抽出物、胎盤抽出物等も知られている。
【０００４】
さらに、メラニン生成抑制能を有する微生物やその抽出物を利用したメラニン生成の抑制技術としては、トリコデルマ属に属する微生物の産生物（特許文献１）、ビフィドバクテリウム属微生物の菌体抽出物（特許文献２）、未同定の微生物菌株ＭＥＬ−１（ＦＥＲＭ  Ｐ−１２９９１）（特許文献３）、糸状菌ＨＡＭ−１株の抽出物（特許文献４）、糸状菌の２次代謝産物ＡＦＴ−６０６（特許文献５）等が知られている。
【０００５】
【特許文献１】
特開平２−１４５１８９号公報
【特許文献２】
特開平５−３３１０３６号公報
【特許文献３】
特開平６−２６９２７８号公報
【特許文献４】
特開平７−２１３２９４号公報
【特許文献５】
特開平８−１０４６９５号公報
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、ビタミンＣやコウジ酸等の物質は、一般に安定性が低く、またその効果が十分でなかったり、安全性に問題があった。例えば、ビタミンＣを高濃度で使用した場合には酸化作用を促進することが知られている。またコウジ酸はその不快臭によって化粧料等への使用が敬遠されている。また、最近、コウジ酸には癌原性が疑われている。
【０００７】
一方、天然物由来や微生物または微生物由来のメラニン抑制物質は、安全性や強いメラニン生成抑制作用が主張されてはいるが、広範な用途という観点からは安定性に問題を有している。特に、従来の天然物由来物質や微生物、微生物抽出物は温度安定性が低く、例えば全身美白等に有効な温水入浴時での使用は不可能であった。
【０００８】
この出願の発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであって、温度安定性に優れ、強いメラニン生成抑制能を有する新規微生物を提供することを課題としている。
【０００９】
さらにこの出願の発明は、この微生物を利用したメラニン生成抑制剤、および化粧料を提供することを課題としている。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
この出願は、前記の課題を解決するための発明として、Ｒｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ属またはＲｕｅｇｅｒｉａ属に属する微生物またはそれらの近縁微生物であって、メラニン生成抑制能を有することを特徴とする微生物を提供する。
【００１１】
この出願は、配列番号１または配列番号２の塩基配列と９０％以上相同の１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列を有する微生物を提供する。
【００１２】
この出願は、Ｒｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ  ＮＢ３２０４（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１６７）およびＲｕｅｇｅｒｉａ  ＮＢ６４５０（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１６８）である微生物を提供する。
【００１３】
またこの出願は、前記のいずれか１以上の微生物菌体、または１以上の菌体抽出物を有効成分とするメラニン生成抑制剤を提供する。
【００１４】
さらにこの出願は、前記のメラニン生成抑制剤を含有する化粧料を提供する。
【００１５】
以下、前記の各発明について、実施形態を説明する。
【００１６】
【発明の実施の形態】
この発明のＲｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ属に属する微生物は、具体的には、Ｒｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎ、Ｒｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ  ｇａｌｌａｅｃｉｅｎｓｉｓ、Ｒｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ等である。
【００１７】
またＲｕｅｇｅｒｉａ属の微生物は、具体的には、Ｒｕｅｇｅｒｉａ  ａｌｇｉｃｏｌａ、Ｒｕｅｇｅｒｉａ  ａｔｌａｎｔｉｃａ、Ｒｕｅｇｅｒｉａ  ｇｅｌａｔｉｎｏｖｏｒａｎｓ等である。
【００１８】
またＲｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ属微生物の近縁微生物としては、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｓｐ．、Ｒｉｃｋｅｔｔｉｓｉａ  ｓｐ．、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ．，Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．等を挙げることができる。Ｒｕｅｇｅｒｉａ属微生物の近縁微生物としては、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．、Ｓｔａｐｐｉａ  ｓｐ．、Ａｈｒｅｎｓｉａ  ｓｐ．等を挙げることができる。
【００１９】
この発明の微生物は、これらの微生物から、例えば後記実施例に示した方法によってメラニン生成抑制能を検定し、強いメラニン生成抑制を示す菌株を選択することによって得ることができる。すなわち、チロシナーゼによる基質（ドーパ）の変性を、対照比４０％以上、好ましくは５０％以上抑制する微生物を選択する。
【００２０】
この出願の発明は、微生物の具体例として、Ｒｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ  ＮＢ３２０４株およびＲｕｅｇｅｒｉａ  ＮＢ６４５０株を提供する。
【００２１】
Ｒｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ  ＮＢ３２０４株は、この出願の発明者らが長崎県南高来郡国見町倉地川河口で採取した泥砂サンプルから分離したＲｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ属微生物であり、２００２年１２月２０日付で独立行政法人産業技術研究所特許微生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１６７として特許寄託されている。
【００２２】
このＲｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ  ＮＢ３２０４株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１６７）は、好気性のグラム陰性桿菌である。また、Ｄ−ｆｒｕｃｔｏｓｅ、ｍｅｔｈｙｌ  ｐｙｒｕｖａｔｅ、ｍｏｎｏ−ｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｃｃｉｎａｔｅ、ｂｅｔａ−ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒｉｃ  ａｃｉｄ、Ｄ，Ｌ−ｌａｃｔｉｃ  ａｃｉｄ、ａｌａｎｉｎａｍｉｄｅ、Ｄ−ａｌａｎｉｎｅ、Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄ、Ｌ−ｐｒｏｌｉｎｅ、ｉｎｏｓｉｎｅ、ｕｒｉｄｉｎｅ、ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ、およびｇｌｙｃｅｒｏｌの資化性を有している。
【００２３】
一方、Ｒｕｅｇｅｒｉａ  ＮＢ６４５０株は、発明者らが長崎県南高来郡南有馬町有馬川河口で採取した砂と泥のサンプルから分離したＲｕｅｇｅｒｉａ属微生物であり、同じく２００２年１２月２０日付で特許微生物として寄託されている（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１６８）。
【００２４】
このＲｕｅｇｅｒｉａ  ＮＢ６４５０株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１６８）もまた、好気性のグラム陰性桿菌であり、ｂｅｔａ−ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒｉｃ  ａｃｉｄ、Ｄ，Ｌ−ｌａｃｔｉｃ  ａｃｉｄ、ａｌａｎｉｎａｍｉｄｅ、およびｇｌｙｃｅｒｏｌの資化性を有している。
【００２５】
これらの微生物Ｒｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ  ＮＢ３２０４株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１６７）およびＲｕｅｇｅｒｉａ  ＮＢ６４５０株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１６８）は塩類要求性を有し、海水培地で生育する。例えば、煮沸殺菌した人口海水Ｍａｒｉｎｅ  Ａｇａｒ  ２２１６培地（ｐＨ７．６；Ｄｉｆｃｏ社）等で良好に生育させることができる。また、−８０℃程度の温度で凍結保存することもできる。
【００２６】
また、Ｒｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ  ＮＢ３２０４株はその１６ｓ  ｒＤＮＡが配列番号１の塩基配列を有すること、Ｒｕｅｇｅｒｉａ  ＮＢ６４５０株はその１６ｓ  ｒＤＮＡが配列番号２の塩基配列を有することによって特徴付けることもできる。さらに、Ｒｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ属微生物およびＲｕｅｇｅｒｉａ微生物、並びにこれらの近縁微生物は、それぞれ配列番号１または配列番号２の塩基配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上相同の１６ｓｒＤＮＡを有する微生物と定義することもできる。
【００２７】
この発明のメラニン生成抑制剤は、前記のとおりのメラニン生成抑制能を有する１以上の微生物の菌体、または１以上の菌体抽出物を有効成分とする。
【００２８】
菌体としては、菌体破壊物や乾燥菌体を含む。また菌体抽出物としては、微生物の培養上清、その濃縮液、あるいは水またはアルコール（メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール等）による公知の抽出法によって抽出された菌体成分等である。
【００２９】
この発明のメラニン生成抑制剤は、前記のとおりの微生物菌体または菌体抽出物を実質的に単独で含むものであってもよく、あるいは培地や蒸留水等に懸濁したものであってもよい。
【００３０】
さらにこの発明の化粧料は、前記のメラニン生成抑制剤を単独で、または２種以上を組み合わせて配合することができ、その配合量は、化粧料中のメラニン生成抑制剤を０．００１〜１０重量％、好ましくは０．１〜５重量％程度とする。
【００３１】
この発明の化粧料には、前記の成分のほか、通常の化粧料に用いられる成分、例えば油剤、界面活性剤、緩衝剤、水、低級アルコール、多価アルコール、粉体、保湿剤等の美容成分、増粘剤、防腐剤、色素、酸化防止剤、紫外線吸収剤、香料、キレート剤等を、メラニン生成抑制剤の効果を損なわない範囲で配合することができる。
【００３２】
この発明の化粧料は、その形態には限定されず、例えば乳液、クリーム、パック、化粧水、ファンデーション等として好適に使用することができる。また、この発明の微生物およびその菌体抽出物は温度安定性が高く、特に菌体抽出物は１００℃の温度でもメラニン生成抑制作用を示すため、特に高温で使用する入浴剤、温熱パック等としての使用に適している。
【００３３】
以下、この発明の微生物について行った試験結果を示す。
（１）    １６ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列の決定
Ｒｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ  ＮＢ３２０４株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１６７）およびＲｕｅｇｅｒｉａ  ＮＢ６４５０株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１６８）から公知の方法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８９；  Ａｕｓｕｂｅｌ，  Ｆ．  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．Ｙ，  １９９５等）に基づいてＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ法によって１６ｓ  ｒＤＮＡを増幅した。ＰＣＲプライマーとしては、２７ｆ（５’−ａｇａｇｔｔｔｇａｔｃｃｔｇｇｃｔｃａｇ−３’：配列番号３）および１４９２ｒ（５’−ｇｇｃｔａｃｃｔｔｇｔｔａｃｇａｃｔｔ−３’：配列番号４）を用いた。またＰＣＲ条件は表１のとおりとした。
【００３４】
【表１】
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【００３５】
増幅したＤＮＡについてＡＢＩ  ＰＲＩＳＭＴＭ  ３１０ＮＴ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて塩基配列を解析し、得られた配列をＧｅｎＢａｎｋに登録されている配列（ＧｅｎＢａｎｋ／国立遺伝学研究所）およびＭｉｃｒｏＳｅｑＴＭ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）のデーターベースと比較した。その結果、Ｒｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ  ＮＢ３２０４株の１６ｓ  ｒＤＮＡは配列番号１、Ｒｕｅｇｅｔｒｉａ  ＮＢ６４５０株の１６ｓ  ｒＤＮＡは配列番号２の塩基配列を有していることが確認された。
【００３６】
さらに、近縁種との系統樹をＭｉｃｒｏＳｅｑＴＭ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて近隣結合法（ＮＪ法）により作成した（図１、２）。
（２）    微生物培養上清のメラニン生成抑制能
Ｒｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ  ＮＢ３２０４株およびＲｕｅｇｅｒｉａ  ＮＢ６４５０株をそれぞれマリンブロース５ｍｌに１白金耳植え付け、２０ｏＣで５日間静置培養後、培養液を３．６００ｒｐｍ５分間遠心し上清を分離した。その培養上清１００μｌを取り、１ｍＭドーパ（基質）および１０μｇ／ｍｌチロシナーゼ（酵素）と３７ｏＣで１０および２０分間反応させた。メラニン生成量は、波長４７５ｎｍの吸光度をもとに定量した。また、コントロールしてビタミンＣおよびコウジ酸の効果も測定した。
【００３７】
結果は、図３〜５に示した通りであり、Ｒｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ  ＮＢ３２０４株およびＲｕｅｇｅｒｉａＮＢ６４５０株の培養上清は、ビタミンＣおよびコウジ酸と同等またはそれ以上の強いメラニン生成抑制作用を有することが確認された。
（３）    微生物培養上清の温度安定性
前記（２）と同様にして得たＲｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ  ＮＢ３２０４株およびＲｕｅｇｅｒｉａ  ＮＢ６４５０株の培養上清を１００ｏＣで３分間の加熱処理し、前記（２）と同様にしてメラニン生成に対する効果を測定した。
【００３８】
結果は図６に示したとおりであり、１００℃での加熱によっても、培養上清のメラミン生成抑制能は失活しないことが確認された。
（４）    メラニン産生細胞のメラニン生成に対する効果
ヒトメラニン産生細胞を培養し、前記（２）と同様にして得たＲｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ  ＮＢ３２０４株およびＲｕｅｇｅｒｉａ  ＮＢ６４５０株の培養上清を細胞培養液中に添加した。その後、細胞をトリプシン処理によって回収、ＰＢＳ−で洗浄後、再び３，０００ｒｐｍ×３０秒間で遠沈し、上澄みを吸引した。さらにＰＢＳ−で洗浄後、再び３，０００ｒｐｍ×３０秒間で遠心、上澄みを吸引し、超純水２００μｌを加え軽く攪拌した。さらにエタノール：エーテル＝１：１溶液１ｍｌを加え、軽く攪拌して１５分間放置し、その後３０００ｒｐｍ×３０秒で遠心分離し、上澄みを吸引した。さらに、１０％ＤＭＳＯ／ＮａＯＨ溶液１ｍｌを加え攪拌し、８０℃で５分間インキュベートして攪拌し、８０℃で１０分間インキュベートした後、吸光度（４７５ｎｍ）を測定した。
【００３９】
その結果、Ｒｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ  ＮＢ３２０４株およびＲｕｅｇｅｒｉａ  ＮＢ６４５０株の培養上清はいずれも、メラニン産生細胞のメラニン生成を顕著に抑制することが確認された。
（５）    還元能力
ビタミンＣのメラニン生成抑制能は、ビタミンＣの還元能に依存することが知られている。そこで、Ｒｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ  ＮＢ３２０４株およびＲｕｅｇｅｒｉａ  ＮＢ６４５０株の培養上清について還元能を測定した。すなわち、前記（２）のメラニン生成測定系に、鉄塩化第二鉄（三価の鉄）とフェナントロリンを加え、フェナントロリンが還元された二価の鉄と特異的に結合することによる赤色反応によって還元能を測定した。コントロールとしてビタミンＣおよびコウジ酸の還元能を同様にして測定した。
【００４０】
その結果、ビタミンＣには明らかな還元能があり、コウジ酸も僅かに還元能を有するが、Ｒｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ  ＮＢ３２０４株およびＲｕｅｇｅｒｉａ  ＮＢ６４５０株の培養上清には還元作用は認められなかった。
【００４１】
【発明の効果】
以上詳しく説明したとおり、この出願によって、温度安定性に優れ、強力なメラニン生成抑制能を有する新規微生物が提供される。さらにこの出願によって、高温でもメラニン生成抑制作用を発揮するメラニン生成抑制剤と、この抑制剤を含有する新しい化粧料が提供される。
【００４２】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】Ｒｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ  ＮＢ３２０４株の近縁種を示す系統樹である。
【図２】Ｒｕｅｇｅｒｉａ  ＮＢ６４５０株の近縁種を示す系統樹である。
【図３】Ｒｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ  ＮＢ３２０４株およびＲｕｅｇｅｒｉａ  ＮＢ６４５０株のそれぞれの培養上清とビタミンＣのメラニン生成抑制能を試験した結果を示す写真像である。
【図４】Ｒｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ  ＮＢ３２０４株およびＲｕｅｇｅｒｉａ  ＮＢ６４５０株のそれぞれの培養上清とコウジ酸のメラニン生成抑制能を試験した結果を示す写真像である。
【図５】Ｒｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ  ＮＢ３２０４株およびＲｕｅｇｅｒｉａ  ＮＢ６４５０株のそれぞれの培養上清、ビタミンＣおよびコウジ酸のメラニン生成抑制能を試験した結果を示すグラフである。
【図６】Ｒｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ  ＮＢ３２０４株およびＲｕｅｇｅｒｉａ  ＮＢ６４５０株のそれぞれの培養上清、ビタミンＣおよびコウジ酸の還元能を試験した結果である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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