【手続補正書】
【提出日】平成25年12月17日(2013.12.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
接着細胞の生産方法であって、
ａ．培養培地中にマイクロキャリアを含有する培養容器に接着細胞を導入すること；
ｂ．この同培養容器中にて数回の連続細胞継代を行うことによって該細胞を増幅すること（ここで、１回目の細胞継代の後の各細胞継代は、
ｉ．先行細胞継代の間に得られた細胞集団の全部または一部を、マイクロキャリアから細胞を脱離させるために該細胞集団を酵素処理した後に使用し、
ｉｉ．培養培地および増加量のマイクロキャリアを導入する
ことによって行われる）；
ｃ．最終細胞継代の間に生産された細胞集団を、所望によりマイクロキャリアから細胞を脱離させるために細胞集団を酵素処理した後に、回収すること
による、方法。
【請求項２】
接着細胞によって生産された生物学的作用物質の生産方法であって、
ａ．培養培地中にマイクロキャリアを含有する培養容器に接着細胞を導入すること；
ｂ．この同培養容器中にて数回の連続細胞継代を行うことによって該細胞を増幅すること（ここで、１回目の細胞継代の後の各細胞継代は、
ｉ．先行細胞継代の間に得られた細胞集団の全部または一部を、マイクロキャリアから細胞を脱離させるために該細胞集団を酵素処理した後に使用し、
ｉｉ．培養培地および増加量のマイクロキャリアを導入する
ことによって行われる）；
ｃ．最終細胞継代の間に生産された細胞集団を、生物学的作用物質を生産するように処理すること（ここで、この処理は、細胞を増幅するために使用したものと同じ培養容器中にて行われる）；および
ｄ．生物学的作用物質を回収すること
による、方法。
【請求項３】
生物学的作用物質が感染病原体であり、工程ｃにおける細胞集団の処理が、感染培地中にて細胞集団を該感染病原体に感染させることによって行われる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
感染病原体が狂犬病ウイルスである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
感染培地が動物由来の生成物を含まない、請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
同じ培養容器中で行われる細胞継代の回数が２回、３回または４回である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
１回目の細胞継代の間の培養培地中のマイクロキャリアの濃度が１ｇ／ｌ未満である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
１回目の細胞継代の間の培養培地中のマイクロキャリアの濃度が０.５ｇ／ｌ以下である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
酵素処理がタンパク質分解酵素を含有する溶液を使用する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
タンパク質分解酵素がトリプシンである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
各次細胞継代が培養培地の量を増加させることによって行われる、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
１回目の細胞継代が培養容器の作業容積の１／５〜半分である量の培養培地中にて行われる、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
培養培地が動物由来の血清を含まない、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
培養培地が動物由来の生成物を含まない、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
培養培地中のタンパク質濃度が１５ｍｇ／ｌ以下である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
培養培地がさらに細胞保護剤を含有する、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
細胞保護剤がポリビニルピロリドンまたはポロキサマーである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
培養容器が、３〜３０００リットルの作業容積を有するバイオリアクターである、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
培養容器が、２０〜１０００リットルの作業容積を有するバイオリアクターである、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
培養容器が、２０〜５００リットルの作業容積を有するバイオリアクターである、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
培養容器が使い捨てバイオリアクターである、請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
接着細胞がベロ細胞である、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
工程ｃにおいて回収される細胞集団が、工程ａにおいて最初に導入された細胞の数の少なくとも６０倍の細胞を含有する、請求項１および６〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
接着細胞の生産方法であって、
ａ．接着細胞のストックを解凍すること、次いで
ｂ．この解凍した接着細胞に請求項１および６〜２３のいずれか１項に記載の方法を施すこと
による、方法。
【請求項２５】
さらに、
ａ．マイクロキャリアから細胞を脱離させるために細胞集団を酵素処理した後に回収した細胞集団を第２の培養容器に移すこと（ここで、この第２の培養容器は、より大きい作業容積を有し、第１の培養容器中で行われた最終細胞継代の間じゅう存在していたマイクロキャリアの量よりも多量のマイクロキャリアを含有する培養培地を含有する）；および
ｂ．この第２の容器中にて、請求項１および６〜２４のいずれか１項に記載の方法の工程ｂおよびｃを行うこと
による、請求項１および６〜２４のいずれか１項に記載のマイクロキャリアに対する接着細胞の生産方法。
【請求項２６】
請求項２５の工程ａおよびｂを第３の培養容器中にて再度繰り返す（ここで、この第３の培養容器は、第２の培養容器の作業容積よりも大きい作業容積を有する）、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
生物学的作用物質の生産のための、請求項１および６〜２６のいずれか１項に記載の方法に従って生産された細胞の使用。
【請求項２８】
培養培地中にマイクロキャリアを含有する培養容器中にて接着細胞を生産する方法であって、単一の培養容器中にて連続細胞継代を行うことにより、生産された細胞の量が６０倍以上増加する、方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００１】
本発明の課題は、培養培地中にマイクロキャリアを含有する培養容器に接着細胞を導入し、同容器中にて数回の連続細胞継代を行うことを含む接着細胞の製造方法であって、毎回、先行細胞継代の細胞集団の全てまたは一部を使用して次の細胞継代を行う方法である。本発明はまた、生物学的作用物質の製造、特にワクチンまたは薬物の製造のためのこの方法の使用に関する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００２】
１９８０年代に、マイクロキャリアによる細胞培養技術の発達によって、接着細胞の大規模生産が促進され、その結果、生物学的作用物質の製造が促進された。それにもかかわらず、医薬用の生物学的作用物質の製造を目的とする接着細胞の生産は、細胞の形態学的および／または生物学的変換のリスクがあるので、一定数の規制上の要求、特に、一定数の「細胞継代」を超える接着細胞の使用の禁止という規制上の要求に気を付けなければならない。ベロ株の細胞の場合には特にそうである。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００３】
特許文献１には、工業的スケールで用いられる、ワーキング・セル・バンク由来の種細胞から接着細胞のバッチを製造する方法が記載されている。それは、連続細胞継代の過程で作業容積を大きくしていく異なるバイオリアクター中にて毎回生じる一連の細胞継代に基づく。これにより、毎回マイクロキャリアの量を増加させることができるが、同時に、一般的に１〜５ｇ／ｌである培養培地中のマイクロキャリアの最適濃度を維持することができる。このようにして、細胞バイオマスは、所望の工業的な細胞バッチが得られるまで連続細胞継代の間に増加する。あるバイオリアクターから別のバイオリアクターへの細胞の移動は、トリプシン処理によって接着細胞をマイクロキャリアから脱離させ、次いで、血清タンパク質または血清を該培地に導入することによって酵素の作用を遮断して細胞の完全性をできる限り保存した後に行われる。次いで、得られた細胞懸濁液を（使用したマイクロキャリアの存在下または不在下で）、より多量の新しいマイクロキャリアを含有するより大きなバイオリアクターに移す。しかしながら、この工業的な接着細胞生産方法は、多量の材料の使用および扱いを必要とし、生物学的作用物質の生産コストに影響を及ぼす。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００４】
生物学的作用物質の生産を目的とする接着細胞の生産コストを低減するために、特許文献２は、工業的な細胞バッチを生産しようとするたびにワーキング・バンク由来の種細胞から再度出発することを要しないより速い生産方法を提案している。この方法は、各細胞継代後に、ほとんどの細胞（細胞バイオマスの８０〜９０％）を１個以上の別のバイオリアクターに移して細胞バイオマスの増幅を継続させ、細胞の工業的生産バッチを継続させることができ、一方、該細胞の残り１０〜２０％を保持してさらなる細胞バッチを生産する「フィーダー細胞の」ストックを保持することができる。それにもかかわらず、この方法は、以下の欠点を有する：
・  生産された細胞バッチは、それらがすべて同数の細胞継代を有するとは限らない場合、ある種の不均一性を示す；
・  各移動操作時に培養液中に「フィーダー」細胞のストックを保持することにより、必ず、細胞継代の回数と直接関係する細胞の「老化」が生じ、その結果、既に記載された規制上の理由のために限られた期間のみ使用することができる。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００５】
細胞の完全性に害を及ぼすトリプシンのようなタンパク質分解酵素の使用を省略するために、非特許文献１は、いかなる酵素処理も行われなかった場合の接着細胞のマイクロキャリア間移動（ビース間移動）技法を記載している。接着細胞で被覆されたマイクロキャリアと未被覆マイクロキャリアとの密接な接触は、細胞を増幅することができる未被覆マイクロキャリア上への細胞の移動を促進する。したがって、細胞増殖を増大させるために、接着細胞で被覆されたマイクロキャリアを含有する培養培地に未被覆マイクロキャリアを添加し、マイクロキャリア間の接触を促進するために、培養培地の断続的な撹拌が行われる。それにもかかわらず、生産される細胞集団は、該細胞が細胞周期の様々な段階のものであるので、「脱同期化」され、これは、生物学的作用物質の生産の主たる欠点となり得る。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
生産コストを低減するために、接着細胞の大規模生産方法およびそれに由来する生物学的作用物質の生産を最適化することが依然として必要とされている。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００９】
この趣旨で、本発明の対象は、以下のものである：
ａ．培養培地中にマイクロキャリアを含有する培養容器に接着細胞を導入すること、
ｂ．同培養容器中にて連続細胞継代を行うことによって該細胞を増幅すること（ここで、１回目の細胞継代の後の各細胞継代は、
ｉ．先行細胞継代の間に得られた細胞集団の全部または一部を、細胞をマイクロキャリアから脱離させるために該細胞集団を酵素処理した後に使用すること、および
ｉｉ．培養培地および漸増量のマイクロキャリアを導入すること
によって行われる）、および
ｃ．最終細胞継代の間に生産された細胞集団を回収すること（細胞をマイクロキャリアから脱離させるために該細胞集団を酵素処理した後であってもよい）
による、接着細胞の生産方法。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
本発明の対象は、また、以下のものである：
ａ．培養培地中にマイクロキャリアを含有する培養容器に接着細胞を導入すること、
ｂ．同培養容器中にて数回の連続細胞継代を行うことによって該細胞を増殖させること（ここで、１回目の細胞継代の後の各細胞継代は、
ｉ．先行細胞継代の間に得られた細胞集団の全部または一部を、細胞をマイクロキャリアから脱離させるために該細胞集団を酵素処理した後に使用すること、および
ｉｉ．培養培地および漸増量のマイクロキャリアを導入すること
によって行われる）、
ｃ．最終細胞継代の間に生産された細胞集団を、生物学的作用物質を生産するように処理すること（ここで、この処理は、細胞を増殖させるために使用した培養培地と同じ培養培地にて行われる）、および
ｄ．生物学的作用物質を回収すること
による、接着細胞によって生産された生物学的作用物質の生産方法。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
生物学的作用物質の生産方法の一の態様によると、生物学的作用物質は、感染病原体であり、細胞集団の処理は、最終細胞継代の間に生産された細胞集団を感染培地中にて該感染病原体に感染させることによって行われる。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３１】
本発明は、また、生物学的作用物質の生産のための、本発明の方法に従って生産された細胞の使用に関する。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３２】
最後に、同一の培養容器中にて連続細胞継代を行うことによって、生産された細胞の量が６０倍以上増加する、培養培地中にマイクロキャリアを含有する培養容器中にて接着細胞を生産する方法に関する。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４２】
細胞の集団が生物学的作用物質の生産に使用される場合、最終細胞継代は、しばしば、細胞脱離工程を含まずに行われる。次いで、マイクロキャリアに接着している細胞の懸濁液の形態の生産された細胞の集団は、目的の生物学的作用物質を生産するように同一の培養容器中で直接処理される。「生物学的作用物質」という用語は、接着細胞によって生産され得る物質または生物を意味することを意図される。これらは、特に、ウイルスまたはタンパク質（抗体、抗原、酵素など）である。接着細胞によって生産される生物学的作用物質の生産方法が同一の培養容器中で行われる２連続細胞継代を含む場合、したがって、本発明の方法は、以下の工程を行うことに相当する：
ａ．培養培地、マイクロキャリアおよび接着細胞を培養容器に導入する工程、
ｂ．細胞をマイクロキャリアに接着させて増殖させることを可能にする培養条件下に細胞をおく工程、
ｃ．酵素処理によって細胞をマイクロキャリアから脱離させる（細胞の一部を培養容器から取り出してもよい）工程、
ｄ．新しく導入されるマイクロキャリアの量が前に導入されたマイクロキャリアの量よりも多くなるように培養培地およびマイクロキャリアを再度導入する工程、
ｅ．再度、細胞をマイクロキャリアに接着させて増殖させることを可能にする培養条件下に細胞をおく工程、
ｆ．得られた細胞集団を生物学的作用物質を生産するように処理する工程、および
ｇ．得られた細胞集団を回収する工程、
ここで、工程ａ）〜ｆ）は同一の培養容器中にて行われる。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４３】
同一の容器中で３以上の連続細胞継代が行われる場合、これは、生物学的作用物質を生産する工程ｆ）の行う前に、同一の培養容器中で工程ｅ）の後に工程ｃ）、ｄ）およびｅ）を再度繰り返すことに相当する。通常、工程ｃ）、ｄ）およびｅ）は、工程ｅ）の後に１回繰り返される（３連続細胞継代を行うことに相当する）か、または、工程ｅ）の後に２回繰り返される（４連続細胞継代を行うことに相当する）。好ましくは、工程ｃ（細胞のマイクロキャリアからの脱離に相当する）は、細胞が実質的にコンフルエントである場合に行われる。通常、培養培地の容量は、マイクロキャリアが添加されるたびに増加する（工程ｄ）。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４４】
例えばサイトカイン、抗体またはワクチンタンパク質のような組換えタンパク質の問題である場合、細胞懸濁液は、適切な生産培地を使用してこのタンパク質の生産を促進する培養条件下におく。例えば、ＥＰ０３５４１２９に記載のＣＨＯおよびベロ細胞による組換えタンパク質の生産のための培地が挙げられる。生物学的作用物質が感染病原体である場合、マイクロキャリアに接着している細胞の懸濁液は、一般に培養培地を感染培地と置き換えた後、培養容器に感染病原体（細菌、ウイルス、寄生虫など）を導入することによって、感染させられる。感染性生物学的作用物質は、特に、組換えウイルス（組換えポックスウイルス、組換えアデノウイルス）であり得るか、または狂犬病ウイルス、インフルエンザウイルス、ポリオウイルスなどのようなウイルスであり得る。生物学的作用物質は、通常、１つ以上の工程で培養上清を除去することによって回収される（実施例７を参照）。生物学的作用物質が非溶解性ウイルスの場合のように細胞内にある場合、上清および後に溶解剤で処理される細胞を回収することはしばしば有利である。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４５】
生物学的作用物質の生産に使用される培地、特に狂犬病のようなウイルスの生産に使用される感染培地は、有利には、動物由来の血清、動物由来のタンパク質または動物由来の生成物を含まないものであり得る。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６１】
本発明に従って接着細胞を生産する方法は、培養培地中０.５ｇ／ｌ以下の濃度でのｃｙｔｏｄｅｘTMマイクロビーズの存在下における培養および／または血清を含有しないかまたは非常に僅かなタンパク質（１５ｍｇ／ｌ以下）を含有する培地における培養のような、より困難な培養条件に細胞を適応させるために１回以上の「適応」細胞継代が行われる慣用的に推奨されている適応期間に頼らずに、解凍したばかりの細胞を培養容器に直接導入することによって有利に行われ得る。典型的な例としては、当業者に周知の手順に従って接着細胞のストックを解凍し、次いで、この解凍した細胞の懸濁液を、培養培地中にマイクロキャリアを含有する培養容器に直接導入して、本発明の方法を行う。前記のように、特に、マイクロキャリアとしてｃｙｔｏｄｅｘTMマイクロビーズを使用する場合、１回目の細胞継代の間の培養培地中のマイクロキャリアの濃度は、一般的に０.５ｇ／ｌ以下の濃度に減縮される；それは、一般的には０.１〜０.４ｇ／ｌであり、より具体的には０.１〜０.３ｇ／ｌである。培養培地は、また、タンパク質を全く含まないか、または非常に低い総タンパク質含量（１５ｍｇ／ｌ以下）を有することができる。凍結細胞のストックは、バイアルからのもの（この場合、細胞の量は、一般に、比較的低く、１０7〜５×１０8細胞である）であり得るか、または有利には、最大で１００倍の細胞を含有するバッグからのものであり得る。大規模な細胞生産法は、解凍したバッグの内容物を大容量の培養容器に直接播くことができるので、特に速くできるようになる。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６５】
接着細胞の生産方法であって、
ａ．接着細胞を、培養培地中にマイクロキャリアを含有する第１の培養容器に導入する工程；
ｂ．この第１の培養容器中にて数回の連続細胞継代を行うことによって細胞を増幅する工程（ここで、１回目の細胞継代の後の各細胞継代は、毎回、先行細胞継代の間に得られた細胞集団の全部または一部であって酵素処理によって細胞がマイクロキャリアから脱離したものを使用して行われ、また、毎回、培養培地および増加量のマイクロキャリアを添加して行われる）；
ｃ．この第１の培養容器中で行われた最終細胞継代の間に得られた細胞集団を、酵素処理によって細胞をマイクロキャリアから脱離させた後に回収する工程；
ｄ．回収した細胞集団を、より大きな作業容積を有し、かつ、第１の培養容器中で行われた最終細胞継代の間に存在していたマイクロキャリアの量よりも多量のマイクロキャリアを含有する培養培地を含有している第２の培養容器に移す工程；
ｅ．この第２の培養容器中にて数回の連続細胞継代を行うことによって、細胞を増幅する工程（ここで、１回目の細胞継代の後の各細胞継代は、毎回、先行細胞継代の間に得られた細胞集団の全部または一部であって酵素処理によって細胞がマイクロキャリアから脱離したものを使用して行われ、また、毎回、培養培地および増加量のマイクロキャリアを添加して行われる）；
ｆ．この第２の培養容器中にて行われる最終細胞継代の間に得られた細胞集団を、所望により酵素処理によって細胞をマイクロキャリアから脱離させた後、回収する工程；
ｇ．さらに大きな作業容積を有する第３の培養容器中にて、工程ｄからｆを再度繰り返す工程
による方法。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６８】
本発明の方法の反復は、生物学的作用物質の生産のために行われ得る。この趣旨で、本発明の対象は、以下のものである：
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６９】
マイクロキャリアに接着している細胞によって生産される生物学的作用物質の生産方法であって、
ａ．接着細胞を、培養培地中にマイクロキャリアを含有する第１の培養容器に導入する工程；
ｂ．この第１の培養容器中にて数回の連続細胞継代を行うことによって細胞を増幅する工程（ここで、１回目の細胞継代の後の各細胞継代は、毎回、先行細胞継代の間に生産された細胞集団の全部または一部であって酵素処理によって細胞がマイクロキャリアから脱離したものを使用して行われ、また、毎回、培養培地および増加量のマイクロキャリアを添加して行われる）；
ｃ．この第１の培養容器中で行われた最終細胞継代の間に得られた細胞集団を、酵素処理によって細胞をマイクロキャリアから脱離させた後に回収する工程；
ｄ．回収した細胞集団を、より大きな作業容積を有し、かつ、第１の培養容器中で行われた最終細胞継代の間に存在していたマイクロキャリアの量よりも多量のマイクロキャリアを含有する培養培地を含有している第２の培養容器に移す工程；
ｅ．この第２の培養容器中にて数回の連続細胞継代を行うことによって、細胞を増幅する工程（ここで、各新細胞継代は、毎回、先行細胞継代の間に生産された細胞集団の全部または一部であって酵素処理によって細胞がマイクロキャリアから脱離したものを使用して行われ、また、毎回、培養培地および増加量のマイクロキャリアを添加して行われる）；
ｆ．この第２の培養容器中にて行われる最終細胞継代の間に得られた細胞集団を、生物学的作用物質を生産するように処理する工程（ここで、この工程ｆは、工程ｄおよびｅを行うために使用して培養容器と同じ培養容器中にて行われる）；および
ｇ．生物学的作用物質を回収する工程
による方法。
【手続補正２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７０】
所望により、工程ｄおよびｅは、生物学的作用物質を生産するように細胞集団を処理する前に第３の培養容器中で繰り返すことができる。
【手続補正２２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７１】
前記のように、生産される生物学的作用物質は、例えば、組換えタンパク質または狂犬病ウイルスのようなウイルスであり得る。
【手続補正２３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７２】
本発明の対象は、また、本発明の方法のうちの１つによって生産された細胞の、生物学的作用物質の生産のための使用である。
【手続補正２４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９７】
２．２）「ビーズ間移動」法を実施するために使用した操作プロトコール
４日目に細胞をトリプシンで処理しなかったことを除いて、セクション２．１に記載の操作プロトコールを適用した。４日目に、同じ割合の細胞およびマイクロビーズを取り出すようにマイクロビーズ懸濁液の量の２／３を取り出して、「一体型」法において使用した培養条件下においた。次いで、総量４リットルの細胞培養培地中にｃｙｔｏｄｅｘ  １４.８ｇ（すなわち、１.２ｇ／ｌの濃度）を含有するマイクロビーズ懸濁液を導入した。次いで、操作プロトコールは、セクション２．１に記載と同じであった。