【誤訳訂正書】
【提出日】平成26年4月28日(2014.4.28)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
デオキシリボ核酸の環状鎖を含む組成物であって、
該デオキシリボ核酸の環状鎖の少なくとも一部は、転写によって、CCT-eta、α-SMA又はそれらの組み合わせを阻害する低分子ヘアピンリボ核酸配列の鎖に対応し、
該デオキシリボ核酸の環状鎖が、該デオキシリボ核酸のin vivoでの取込みを促進するナノ粒子多糖導入試薬のマトリックスに埋め込まれている、
組成物。
【請求項２】
薬学的に受容できる賦形剤を更に含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記リボ核酸が、CCT-eta mRNA、CCT-eta蛋白、α-SMA mRNA、α-SMA蛋白又はそれらの組み合わせの発現を阻害する、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
CCT-eta mRNAが、SEQ ID No. 7、11、12、13、14、それらのバリアントまたはそれらの組み合わせを含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
α-SMA mRNAが、SEQ ID No. 8、21、22、それらのバリアントまたはそれらの組み合わせを含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項６】
CCT-eta蛋白が、SEQ ID No. 9、15、16、17、18、それらのバリアントまたはそれらの組み合わせを含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項７】
α-SMA蛋白が、SEQ ID No. 10、19、20、それらのバリアントまたはそれらの組み合わせを含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項８】
前記リボ核酸が、SEQ ID No. 1またはそのバリアントを含有するセンス鎖、及び、SEQ ID No. 2またはそのバリアントを含有するアンチセンス鎖を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記リボ核酸が、SEQ ID No. 5またはそのバリアントを含有するセンス鎖、及び、SEQ ID No. 6またはそのバリアントを含有するアンチセンス鎖を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記ナノ粒子多糖導入試薬がアガロースマトリックス材料である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記導入試薬がlipofectamineを更に含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
前記環状デオキシリボ核酸が、プラスミドベクターまたはウイルスベクターから選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記導入試薬が、Mirus Transit TKOの親油性試薬、アテロコラーゲン、lipofectin, cellfectin、ポリカチオン、リポゾーム、あるいはそれらの組み合わせを更に含む、請求項１に記載の組成物。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２９】
【図１】図1は、胎児と成体の創傷治癒における、CCT-eta mRNA量のqRT-PCR測定を示した図である。
【図２】図2は、成体の創傷における、CCT-etaのin situハイブリダイゼーションを示した図である。
【図３】図3は、全層外皮性創傷の治癒過程におけるCCT-eta発現を免疫組織化学的に示した図である。
【図４】図4は、CCT-eta siRNAとリポゾーム試薬jetPEIとの複合体を皮内投与後のウサギの創傷の治癒を示した図である。
【図５】図5は、CCT-eta siRNAとアテロコラーゲンの複合体を皮内投与後のウサギ創傷の治癒を示した図である。
【図６】図6は、アガロースゲルマトリックス中のCCT-eta siRNAを投与した後のCCT-eta mRNAの定量結果を示した図である。
【図７】図7は、pRNA-mEta 1203siRNAの概略図である。
【図８】図8は、トランスフェクトされたNIH3T3線維芽細胞のウェスタンブロットの結果を示した図である。対照のpRNA-CMV3.1プラスミドが左側で、pRNA-mEta 1203siRNAが右側である。
【図９】図9は、細胞内アクチンのアイソフォームであるCCT-etaとCCT-betaに対する各siRNAの効果を示した図である。（A） CCT-eta siRNA投与後の蛋白発現を調べた代表的なウェスタンブロットの結果。  1 =  無処理、 2 = EGF単独、 3 = CCT-eta siRNA単独、4 = CCT-eta siRNA + EGF、5 = 対照用スクランブルsiRNA単独、6 = スクランブルsiRNA + EGF。CCT-eta siRNA投与により、蓄積していたα-SMAの量が劇的に減少するということに留意して下さい。（B） CCT-beta siRNA投与後の蛋白発現を調べた代表的なウェスタンブロットの結果。1列から6列目までは図9Aと同様であり、CCT-beta siRNAではなくCCT-betaが使われたことが違いである。
【図１０】図10は、CCT-etaとα-SMAの各mRNA蓄積に対するsiRNAの効果を示した図である。
【図１１】図11は、損傷の総コラーゲン量へのCCT-eta siRNAの効果を示した図である。
【図１２】図12は、熱傷創感染において瘢痕の形成の指標となる分子を調べた図である。（A）a-平滑筋アクチンmRNAのqRT-PCR。（B）タイプIコラーゲンmRNAのqRT-PCR。（C）組織のヒドロキシプロリン含量の定量（従って、コラーゲン蛋白の蓄積を定量化）
【図１３】図13は、顔面または手足に火傷および鈍傷による瘢痕で大きな損傷を受けた状態になった３人の患者の写真である。
【図１４】図14は、成体線維芽細胞のベースライン運動性とEGFに誘導された運動性におけるCCT-etaに対するsiRNAの影響を示した図である。（A）CCT-etaに対するsiRNAは、成体線維芽細胞のベースライン運動性とEGFに誘導された運動性を減少させる。対照のスクランブルsiRNAはどちらにも影響がなかった。（B） CCT-etaに対するsiRNAは成体線維芽細胞におけるPDGFに誘導された収縮性を消失させるが、対照のスクランブルsiRNAは全くそのような影響がなかった。
【図１５】図15は、CCT-betaではなく、CCT-eta蛋白とmRNAが胎児と成体では線維芽細胞において異なる発現をすることを示している図である。
【図１６】図16は、成体では細胞遊走がEGFとPDGF誘導に応答するが、胎児では応答しないことを示した図である。
【図１７】図17は、CCT-etaとCCT-betaに対するsiRNAが、線維芽細胞において標的のベーサルおよびEGFに誘導される両方のmRNA量と蛋白量を減少させることを示した図である。
【図１８】図18は、CCT-eta に対するsiRNAが線維芽細胞のEGFに誘導される遊走を減少させるが、CCT-betaに対するsiRNAは線維芽細胞のEGFに誘導される遊走を減少させるようには見えないことを示す図である。
【図１９】図19は、CCT-eta に対するsiRNAが線維芽細胞のPDGFに誘導される遊走を減少させるが、CCT-betaに対するsiRNAは線維芽細胞のPDGFに誘導される遊走を減させるようには見えないことを示す図である。
【図２０】図20は、成体線維芽細胞は胎児線維芽細胞より収縮性があることを示す図である。
【図２１】図21は、CCT-betaではなくCCT-eta に対するsiRNAが、成体線維芽細胞でPDGFに誘導される細胞牽引力を減少させることを示す図である。
【図２２】図22は、成体線維芽細胞は胎児線維芽細胞と比較すると、α-SMAのmRNA量と蛋白量は有意的に増加していることを示す図である。NS =有意差がない。
【図２３】図23は、α-SMAに対するsiRNAが、成体線維芽細胞においてα-SMAのベーサルおよびEGFに誘導される両方のmRNA量と蛋白量を特異的に減少させることを示す図である。
【図２４】図24は、α-SMAに対するsiRNAが、成体線維芽細胞においてベーサルおよびEGFに誘導される両方の細胞の遊走を阻害することを示す図である。
【図２５】図25は、CCT-eta siRNAで処置した創傷におけるCCT-etaのmRNA量を示す図である。
【図２６】図26は、CCT-eta siRNAで処置した創傷におけるα-SMAのmRNA量を示す図である。
【図２７】図27は、CCT-eta siRNAで処置した創傷におけるMetaMorph分析によるコラーゲン量を示す図である。
【図２８】図28は、CCT-eta siRNAで処置した成体創傷におけるヒドロキシプロリン量を示す図である。
【図２９】図29は、CCT-eta siRNAで処置した創傷における引張強度を正規化したパーセントで示した図である。
【図３０】図30は、CCT-eta siRNAで処置した全層切開創傷の、0日目から28日目の間で断続的に撮ったタイムポイントでの患部の写真である。
【図３１】図31は、創傷のコラーゲン量と組織化に対するCCT-eta siRNAの効果を、MetaMorphで分析した結果を示す図である。
【図３２】図32は、創傷の引張強度に対するCCT-eta siRNAの効果を示した図である。
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００９８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００９８】
幾つかの実施態様では、導入試薬は、アガロースマトリックスに埋め込まれたsiRNA-lipofectamine ナノ粒子複合体を含む、ゲルベースの調製剤でありうる。
【誤訳訂正４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１７６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１７６】
成体ウサギの背面に作った全層切開創傷を、アガロースマトリックス中のCCT-etaに対するsiRNA（SEQ ID No. 1 and 2）または対照（スクランブルsiRNA）（SEQ ID Nos. 3、4）で局所的に処置した。そして創傷が完全に閉鎖されるまで治癒を待った（瘢痕堆積を伴う）。典型的には約4週間以上であった。そして治癒した創傷部位を切除し生じた瘢痕形成を調べるために分析した。CCT-etaに対する活性のあるsiRNAを週に1度投与することで、CCT-etaとα-SMAのmRNA量と蛋白量を持続的に減少さることができるとスクランブルsiRNAとの比較で明らかになった。ヒドロキシプロリンアッセイによって、CCT-eta siRNAで処置した創傷は、無処置とスクランブルsiRNA処置した創傷と比較した時、総コラーゲン含量が少ないということが明らかになった。マッソン・トリクローム染色した創傷切片のMetamorph分析でも、処置した創傷の総コラーゲン含量が同様に減少していると示された。治癒した創傷の機械的強度を調べるためにテンシオメーターを使用した。驚くことに、CCT-eta siRNAで処置した創傷は、無処置とスクランブルsiRNA処置した創傷と比較すると、引張強度が増加していると現実に示された。これらのデータはCCT-etaに対するsiRNAが瘢痕形成を鎮静し創傷治癒を促進する効果的な薬剤であることを示唆している。
【誤訳訂正５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１７８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１７８】
低融点アガロースでのCCT-eta siRNAの複合体形成：siRNAは、アガロースマトリックスに埋め込んだ調製済siRNA-lipofectamineナノ粒子複合体を使用してゲルベースの製剤によって治癒中の創傷に導入された。2.5 μlのlipofectamineと5.0 μlのCCT-eta siRNA（100 pmol）を100 μlのOptiMEM と混合した。20分間室温でインキュベーションした後（ナノ粒子が構築されるように）、最終生成物siRNA/lipofectamine混合物を、0.8%のアガローストランスフェクション溶液100 μlと混合した。ゲルベースの混合物100 μl（最終濃度: 0.4% アガロースに50 pM siRNA）を注意深く混ぜた後、成体ニュージーランド白ウサギの2 cmの全層背面切開創傷に投与した。動物を0日目、7日目、14日目にゲルベース混合物で治療した。創傷は28日間に渡って治癒させ、29日目に切除された。創傷組織の多種の生物化学的、分子生物学的分析を行った。
【誤訳訂正６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１８９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１８９】
結論：創傷治癒においてCCT-eta mRNA量が増加すると確認した。RT-PCRによって対照に比べCCT-eta siRNAで処置された創傷ではCCT-eta mRNAが減少すると示された。アガロースゲルマトリックスと結合したsiRNA複合体を複数回、投与すると、全層切開創傷でのsiRNAによるCCT-eta発現の減少を促進した。α-SMAのmRNA量はCCT-eta siRNAで処置された創傷では相当減少していた。生化学的分析によって、CCT-eta siRNAで処置された創傷でヒドロキシプロリン含量の減少を示したが、それは総コラーゲン量が減少したことを意味している。
全創傷の全体と組織学的検査によって、異常な組織炎症や毒性を示す証拠は何もないことが示された。MetaMorph分析によって、CCT-eta siRNAは創傷コラーゲンの好ましい再組織化に影響すると示された。CCT-etaをダウンレギュレートすることは、実際に引張強度として測定された、創傷治癒の機械的な性質を改善することである。
【誤訳訂正７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１９３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１９３】
本明細書の開示は、好適な実施態様を参照してかなり詳細に記述されているが、別の解釈も可能である。従って、添付の請求の趣旨と範囲は「説明」と本明細書内に含まれる好ましい解釈に限定されるべきではない。
本発明は以下に関するものである。
１．T-複合体ポリペプチド含有シャペロニンのサブユニットであるetaを阻害する薬剤、α-平滑筋アクチンを阻害する薬剤、またはそれらの組み合わせ等から選択された分子治療剤を投与することを含む瘢痕化を減少させる方法。
２．瘢痕化は線維症を含む、前記1に記載の方法。
３．CCT-etaを阻害する薬剤はCCT-eta mRNAの発現を阻害する薬剤、CCT-eta蛋白を阻害する薬剤、またはその組み合わせから選択される、前記1に記載の方法。
４．CCT-eta mRNAを阻害する薬剤は、SEQ ID No. 1またはそのバリアントを含有するセンス鎖、そしてSEQ ID No. 2またはそのバリアントを含有するアンチセンス鎖を含むsiRNAを含む、前記3に記載の方法。
５．CCT-eta mRNAを阻害する薬剤は、SEQ ID No. 7, 11, 12, 13, 14またはそのバリアントからまたはそれらの組み合わせから選択された標的mRNAを阻害するsiRNAを含む、前記3に記載の方法。
６．CCT-eta 蛋白を阻害する薬剤は抗体である、前記3に記載の方法。
７．抗体はSEQ ID No. 9, 15, 16, 17, 18またはそれらの組み合わせを含むCCT-eta蛋白を阻害する、前記6に記載の方法。
８．α-SMAを阻害する薬剤は、α-SMA mRNAの発現を阻害する薬剤、α-SMA蛋白を阻害する薬剤、またはその両者から選択される、前記1に記載の方法。
９．α-SMA mRNAを阻害する薬剤は、SEQ ID No. 5またはそのバリアントを含有するセンス鎖、そしてSEQ ID No. 6またはそのバリアントを含有するアンチセンス鎖を含むsiRNAを含む、前記8に記載の方法。
１０．α-SMA mRNAを阻害する薬剤は、SEQ ID No. 8, 21, 22またはそのバリアントからまたはそれらの組み合わせから選択された標的mRNAを阻害するsiRNAを含む、前記8に記載の方法。
１１．α-SMA蛋白を阻害する薬剤は抗体である、前記8に記載の方法。
１２．抗体はSEQ ID No. 10, 19, 20 またはそれらの組み合わせを含むα-SMA蛋白を阻害する、前記11に記載の方法。
１３．分子薬剤はsiRNA、リボザイム、アンチセンスオリゴヌクレオチド、抗体、またはそれらの組み合わせから選択される、前記1に記載の方法。
１４．分子薬剤はベクターにコードされている、前記1に記載の方法。
１５．ベクターはプラスミドベクターまたはウイルスベクターから選択する、前記14に記載の方法。
１６．分子薬剤は導入試薬と併せて投与される、前記1に記載の方法。
１７．導入試薬はMirus Transit TKOの親油性試薬、アテロコラーゲン、lipofectin, lipofectamine, cellfectin、ポリカチオン、リポゾーム、あるいはそれらの組み合わせから選択される、前記16に記載の方法。
１８．線維症は、デュピュイトラン拘縮、ペイロニー病、肺線維症、肝硬変、間質性肺疾患、瘢痕性脱毛症から選択される、前記2に記載の方法。
１９．CCT-eta を阻害する薬剤、α-SMAを阻害する薬剤、またはそれらの組み合わせから選択される効果量の治療分子薬剤を含む組成物。
２０．前記19に記載の組成物にはさらに薬学的に受容できる医薬品添加物も含まれる。
２１．分子薬剤は、CCT-eta mRNAの発現を阻害する薬剤、CCT-eta蛋白を阻害する薬剤、α-SMA mRNAの発現を阻害する薬剤、α-SMA蛋白を阻害する薬剤、またはそれらの組み合わせから選択されうる、前記19に記載の組成物。
２２．CCT-eta mRNAはSEQ ID No. 7, 11, 12, 13, 14、そのバリアントまたはそれらの組み合わせを含む、前記21に記載の組成物。
２３．α-SMA mRNAはSEQ ID No. 8, 21, 22、そのバリアントまたはそれらの組み合わせを含む、前記21に記載の組成物。
２４．CCT-eta蛋白はSEQ ID No. 9, 15, 16, 17, 18、そのバリアントまたはそれらの組み合わせを含む、前記21に記載の組成物。
２５．α-SMA蛋白はSEQ ID No. 10, 19, 20, それらのバリアントまたはそれらの組み合わせを含む、前記21に記載の組成物。
２６．CCT-eta mRNAを阻害する薬剤は、SEQ ID No. 1またはそのバリアントを含有するセンス鎖、そしてSEQ ID No. 2またはそのバリアントを含有するアンチセンス鎖から成るsiRNAから構成されている、前記21に記載の組成物。
２７．α-SMA mRNAを阻害する薬剤は、SEQ ID No. 5またはそのバリアントから成るセンス鎖、そしてSEQ ID No. 6またはそのバリアントから成るアンチセンス鎖を含むsiRNAを含む、前記21に記載の組成物。