【手続補正書】
【提出日】平成24年3月7日(2012.3.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８６】
他の態様において、治療剤は核酸を含んでもよい。これらの態様において、治療剤はｓｉＲＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびアンチセンス核酸から選択され得る。ある態様において、治療剤はｓｉＲＮＡであってもよい。いくつかの態様において、ｓｉＲＮＡは５〜５０塩基対、好ましくは１０〜３５塩基対、より好ましくは１９〜２７塩基対を有するＲＮＡを含む。ｓｉＲＮＡはまた、ＲＮＡ／ＤＮＡ混合分子またはタンパク質／ＲＮＡ混合分子を含んでもよい。ある態様において、治療剤はコラーゲンの分泌を抑制してもよい。治療剤は、標的器官へ送達されてから、組織メタロプロテアーゼインヒビター（ＴＩＭＰ）または分子シャペロンの活性を実質的に抑制してもよい。いくつかの態様において、治療剤の標的組織への送達によって抑制される分子シャペロンは、コラーゲン特異的なもの、例えば熱ショックタンパク質４７（ＨＳＰ４７）などであってもよい。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９６】
他の態様において、治療剤は核酸を含んでもよい。これらの態様において、治療剤はｓｉＲＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびアンチセンス核酸から選択され得る。ある態様において、治療剤はｓｉＲＮＡであってもよい。いくつかの態様において、ｓｉＲＮＡは５〜５０塩基対、好ましくは１０〜３５塩基対、より好ましくは１９〜２７塩基対を有するＲＮＡを含む。ｓｉＲＮＡはまた、ＲＮＡ／ＤＮＡ混合分子またはタンパク質／ＲＮＡ混合分子を含んでもよい。ある態様において、治療剤はコラーゲンの分泌を抑制してもよい。治療剤は、標的器官へ送達されてから、組織メタロプロテアーゼインヒビター（ＴＩＭＰ）または分子シャペロンの活性を実質的に抑制してもよい。いくつかの態様において、治療剤の標的組織への送達によって抑制される分子シャペロンは、コラーゲン特異的なもの、例えば熱ショックタンパク質４７（ＨＳＰ４７）などであってもよい。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５７】
ポリマー２の合成
ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ（１：２、１．２ｍＬ）中の分解性脂質リンカー（Ａ、３５．８ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ）の溶液を、ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ（１：２、１ｍＬ）中のＰＥＩ６００（１５．０ｍｇ、０．０２５ｍｍｏｌ）の溶液に撹拌しながら添加した。これを、室温で１時間激しく撹拌した。次いで、ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ（１：２、１ｍＬ）中のアクリロイルレチノール（Ｂ、３．４ｍｇ、０．０１ｍｍｏｌ）の溶液、および、ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ（１：２、１ｍＬ）中のアクリロイルポリエチレングリコール（Ｃ、１８．２ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ）の溶液を添加した。室温でさらに２時間激しく撹拌後、これを氷水中で冷却し、撹拌しながら２Ｍ塩酸／エーテル（０．５ｍＬ）でクエンチし、冷ジエチルエーテル（−２０℃）で４５ｍＬにした。沈殿物が生じた。固体生成物を、遠心分離（５，０００ｒｐｍ）によって得た。ジエチルエーテル（３０ｍＬ）を固体に添加し、懸濁液をもう１回遠心分離した。最終生産物を室温にて一晩減圧下で乾燥して、所望の生成物を得た（６０ｍｇ、８０％）。生成物は、ＮＭＲスペクトロスコピーによって確認した。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５８】
ポリマー３の合成
ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ（１：２、１．２ｍＬ）中の分解性脂質リンカー（Ａ、４７．８ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）の溶液を、ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ（１：２、１ｍＬ）中のＰＥＩ６００（１５．０ｍｇ、０．０２５ｍｍｏｌ）の溶液に撹拌しながら添加した。これを、室温で１時間激しく撹拌した。次いで、ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ（１：２、１ｍＬ）中のアクリロイルレチノール（Ｂ、３．４ｍｇ、０．０１ｍｍｏｌ）の溶液、および、ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ（１：２、１ｍＬ）中のアクリロイルポリエチレングリコール（Ｃ、１８．２ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ）の溶液を添加した。室温でさらに２時間激しく撹拌後、これを氷水中で冷却し、撹拌しながら２Ｍ塩酸／エーテル（０．５ｍＬ）でクエンチし、冷ジエチルエーテル（−２０℃）で４５ｍＬにした。沈殿物が生じた。固体生成物を、遠心分離（５，０００ｒｐｍ）によって得た。ジエチルエーテル（３０ｍＬ）を固体に添加し、懸濁液をもう１回遠心分離した。最終生産物を室温にて一晩減圧下で乾燥して、所望の生成物を得た（６０ｍｇ、８０％）。生成物は、ＮＭＲスペクトロスコピーによって確認した。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５９】
ポリマー４の合成
ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ（１：２、１．２ｍＬ）中の分解性脂質リンカー（Ａ、５９．７ｍｇ、０．１２５ｍｍｏｌ）の溶液を、ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ（１：２、１ｍＬ）中のＰＥＩ６００（１５．０ｍｇ、０．０２５ｍｍｏｌ）の溶液に撹拌しながら添加した。これを、室温で１時間激しく撹拌した。次いで、ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ（１：２、１ｍＬ）中のアクリロイルレチノール（Ｂ、３．４ｍｇ、０．０１ｍｍｏｌ）の溶液、および、ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ（１：２、１ｍＬ）中のアクリロイルポリエチレングリコール（Ｃ、１８．２ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ）の溶液を添加した。室温でさらに２時間激しく撹拌後、これを氷水中で冷却し、撹拌しながら２Ｍ塩酸／エーテル（０．５ｍＬ）でクエンチし、冷ジエチルエーテル（−２０℃）で４５ｍＬにした。沈殿物が生じた。固体生成物を、遠心分離（５，０００ｒｐｍ）によって得た。ジエチルエーテル（３０ｍＬ）を固体に添加し、懸濁液をもう１回遠心分離した。最終生産物を室温にて一晩減圧下で乾燥して、所望の生成物を得た（６０ｍｇ、８０％）。生成物は、ＮＭＲスペクトロスコピーによって確認した。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６３】
例９
細胞取り込み
初代肝星細胞（ＨＳＣ）を、既報の手順（Houglum et al. "Two Different cis-acting Regulatory Regions Direct Cell-specific Transcription of the Collagen al (1) Gene in Hepatic Stellate Cells and in Skin and Tendon Fibroblasts." J. Clin. Invest. 1995, 96, 2269-2276）を用いて肝組織から単離した。単離した肝星細胞を、適切な培地中、３×１０５／２ｍＬ／ウェルの播種密度で、６ウェルプレートにて一晩培養した。ポリマー１〜４については、試験ポリマーの溶液を、Ｍｉｌｌｉ  Ｑ−Ｈ２Ｏ（５ｍｇ／ｍＬ）に溶解した。ポリマー５については、試験ポリマーの溶液をＭｉｌｌｉ  Ｑ−Ｈ２Ｏ（５ｍｇ／ｍＬ）に溶解し、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、２８．６５ｍｇ／ｍＬ、約１００ｍＭ）に溶解したオールトランスレチノールの溶液と、レチノール：試験ポリマーの重量／重量比２５：２．５で混合した。全ポリマーについて、混合物を、試験ポリマーの終濃度０．１７ｍｇ／ｍＬまで、５％グルコース中でさらに希釈した。混合物を２０秒間ボルテックスし、１５分間室温で安定させた。ＲＮａｓｅフリー水中に調製したＣｙ３標識ｓｉＲＮＡの溶液（０．２５ｍｇ／ｍＬ、約２０ｍＭ）を、混合物に添加した（試験ポリマー１：Ｃｙ３−ｓｉＲＮＡの重量／重量比２．５：１）。混合物をさらにボルテックスし、もう１５分間室温でインキュベートした。混合物（１００μＬ）を初代ＨＳＣ培養物に添加し、もう４時間３７℃でインキュベーションを続けた。次いで、蛍光顕微鏡下で画像を記録した（Ｅｘ／Ｅｍ：５３２／５５４ｎｍ）。２つのコントロールについては、（ａ）ＤＭＳＯ中のレチノールの溶液（２８．６５ｍｇ／ｍＬ）を、ＲＮａｓｅフリー水中に調製したＣｙ３標識ｓｉＲＮＡの溶液（０．２５ｍｇ／ｍＬ、約２０ｍＭ）に、２．５：１のレチノール：Ｃｙ３−ｓｉＲＮＡの重量／重量比で添加し、および（ｂ）試験ポリマーをＭｉｌｌｉ  Ｑ−Ｈ２Ｏに溶解した溶液（５ｍｇ／ｍＬ）を、ＲＮａｓｅフリー水中に調製したＣｙ３標識ｓｉＲＮＡの溶液（０．２５ｍｇ／ｍＬ、約２０ｍＭ）に、２．５：１の試験ポリマー：Ｃｙ３−ｓｉＲＮＡの重量／重量比で添加した。２つの混合物は、５％グルコースでさらに希釈し、１５分間室温でインキュベートした。各々の混合物を１００μＬ、別々に初代ＨＳＣ培養物に添加し、４時間３７℃でインキュベートした。画像を、蛍光顕微下で写真によって記録した（Ｅｘ／Ｅｍ：５３２／５５４ｎｍ）。結果を図４に示す。図４の写真が示すとおり、カチオンポリマー＋ｓｉＲＮＡ＋レチノールで処理した細胞は、水溶性分解性架橋カチオンポリマー＋ｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡのみで処理した細胞と比較して、より多くのＣｙ３クロモフォアを取り込んだ。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６５】
例１１
正常ラット腎線維芽細胞（ＮＲＫ−４９ｆ）はＡＴＣＣから購入し、一晩、１０％のＦＢＳおよび１％のペニシリンおよびストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ培地中、３×１０５／２ｍＬ／ウェルの播種密度で、６ウェルプレートにて一晩培養した。ポリマー１〜４については、試験ポリマーの溶液を、Ｍｉｌｌｉ  Ｑ−Ｈ２Ｏ（５ｍｇ／ｍＬ）に溶解した。ポリマー５については、試験ポリマーの溶液をＭｉｌｌｉ  Ｑ−Ｈ２Ｏ（５ｍｇ／ｍＬ）に溶解し、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、２８．６５ｍｇ／ｍＬ、約１００ｍＭ）に溶解したオールトランスレチノールの溶液と、種々の重量／重量比で混合した。全ポリマーについて、混合物を、試験ポリマーの終濃度０．１７ｍｇ／ｍＬまで、５％グルコース中でさらに希釈した。混合物を、試験ポリマーの終濃度０．１７ｍｇ／ｍＬまで、５％グルコース中でさらに希釈した。混合物を２０秒間ボルテックスし、１５分間室温で安定させた。ＲＮａｓｅフリー水中に調製したｓｉＨＳＰ−４７の溶液（０．２５ｍｇ／ｍＬ、約２０ｍＭ）を、種々の重量／重量比で混合物に添加した。混合物をさらにボルテックスし、もう１５分間室温でインキュベートした。混合物（２００μＬ）をＮＲＫ−４９ｆ培養物に添加し、さらに４８時間３７℃でインキュベーションを続けた。細胞を、トランスフェクションの４８時間後に採取し、全ＲＮＡをRNeasy Mini Kit（Qiagen, Cat. No. #74104）で抽出し、ｃＤＮＡを、逆転写キットである、ＲＴ−ＰＣＲ用Superscript III First-Strand Synthesis System（Invitrogen, Cat. No. #18080-051）で合成した。ＨＳＰ−４７に対する定量的ＰＣＲは、Brilliant SYBR Green QPCR Mix（Stratagene, Cat. No. #600548）により、Stratagene Mx3005Pシステムにて、プライマー：５’−ＣＡＡＴＧＴＧＡＣＣＴＧＧＡＡＡＣＴＧＧ−３’（フォワード）（配列番号４）および５’−ＡＴＧＡＡＧＣＣＡＣＧＧＴＴＧＴＣＴＡＣ−３’（配列番号５）を用いて行なった。結果を図６〜８に示す。図６〜８に示すとおり、産生されるｍＲＮＡの量は、カチオンポリマー＋ｓｉＲＮＡ＋レチノールを含む組成物で処理した細胞において、カチオンポリマー＋ｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡのみで処理した線維芽細胞細胞と比較して減少した。
【手続補正８】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項６８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項６８】
状態が、肝線維症、肝硬変症、膵炎、膵線維症、声帯瘢痕化、声帯粘膜線維症、喉頭線維症、肺線維症、特発性肺線維症、嚢胞性線維症、骨髄線維症、後腹膜線維化症および腎性全身性線維症からなる群から選択される、請求項６５に記載の医薬組成物。