(57)【要約】【課題】選択性・親和性が低い化合物（ペプチド、糖類、合成有機分子）についても、簡便かつ迅速にその認識ＤＮＡ配列を決定するための技術を提供すること。【解決手段】下記のステップ：（１）以下の式（Ｉ）：式（Ｉ）：　５‘−塩基配列（ａ）−（Ｎ）ｎ−３’（上記式中、塩基配列（ａ）は核酸結合分子（Ａ）が認識する塩基配列、「Ｎ」はそれぞれ独自に任意のヌクレオチド、及び「ｎ」は自然数を示す。）で表されるランダムな塩基配列から成る核酸分子のプールを調製し、（２）核酸結合分子（Ａ）及び認識塩基配列が未知である核酸結合分子（Ｂ）を含む異種分子二量体と、上記核酸分子のプールとの間で結合反応を行ない、（３）異種分子二量体との親和性が高い核酸分子を選択し、及び（４）選択された核酸分子の塩基配列を同定することにより核酸結合分子（Ｂ）が認識する塩基配列（５‘−（Ｎ）ｎ−３’）を決定する、ことから成る核酸結合分子（Ｂ）が認識する塩基配列の決定方法。【選択図】　　　図１ID=005008 HE=044 WI=070 LX=0000 LY=0000>
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記のステップ：
（１）以下の式（Ｉ）：
式（Ｉ）：　５‘−塩基配列（ａ）−（Ｎ）ｎ−３’
（上記式中、塩基配列（ａ）は核酸結合分子（Ａ）が認識する塩基配列、「Ｎ」はそれぞれ独自に任意のヌクレオチド、及び「ｎ」は自然数を示す。）
で表されるランダムな塩基配列から成る核酸分子のプールを調製し、
（２）核酸結合分子（Ａ）及び認識塩基配列が未知である核酸結合分子（Ｂ）を含む異種分子二量体と、上記核酸分子のプールとの間で結合反応を行ない、
（３）異種分子二量体との親和性が高い核酸分子を選択し、及び
（４）選択された核酸分子の塩基配列を同定することにより核酸結合分子（Ｂ）が認識する塩基配列（５‘−（Ｎ）ｎ−３’）を決定する、ことから成る核酸結合分子（Ｂ）が認識する塩基配列の決定方法。
【請求項２】
ゲルシフトアッセイを用いて異種分子二量体と複合体を形成した核酸分子をその他の核酸分子から分離することにより、異種分子二量体との親和性が高い核酸分子を選択することを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ステップ（３）の後に、選択された核酸分子を増幅するステップ（３−１）を含む、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
ステップ（２）において、ステップ（３−１）で増幅された核酸分子を核酸分のプールとして使用し異種分子二量体との間で結合反応を行うことを特徴とする、請求項３記載の方法。
【請求項５】
ステップ（２）、（３）及び（３−１）を複数回繰り返すことにより異種分子二量体との親和性が高い核酸分子を濃縮することを特徴とする、請求項４記載の方法。
【請求項６】
選択された核酸分子をＰＣＲ法により増幅することを特徴とする、請求項３ないし５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ステップ（２）において、異種分子二量体と上記核酸のプールとの間の非特異的な結合を抑制するために、ポリｄＩ−ｄＣ存在下で結合反応を行なうことを特徴とする、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
核酸結合分子がオリゴペプチドである、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
各オリゴペプチドが１０個〜３０個のアミノ酸残基から成る、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
核酸結合分子（Ａ）のオリゴポリペプチドが転写活性化因子に由来する、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
核酸結合分子（Ａ）のオリゴペプチドが酵母の転写活性化因子である、ＧＣＮ４の塩基性領域に由来する２３個のアミノ酸残基から成るＧ２３である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
核酸結合分子（Ａ）のオリゴポリペプチドがベーシックロイシンジッパータンパク質の塩基性領域に由来する、請求項１ないし９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
核酸結合分子（Ｂ）がＤ−体アミノ酸からなるオリゴペプチドである、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
異種分子二量体がホスト−ゲスト包接化合物による錯体形成能を利用して得られるものである、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
異種分子二量体が各核酸結合分子のＣ末端にホスト又はゲスト包接化合物のいずれか一方を導入することにより調製されることを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ホスト−ゲスト包接化合物がアダマンタン及びβ−シクロデキストリンの組み合わせである、請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項１７】
核酸分子が二本鎖ＤＮＡである、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
塩基配列（ａ）が３個〜５個のヌクレオチドからなることを特徴とする、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
塩基配列（ａ）が５‘−ＡＴＧＡＣ−３’である、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
上記請求項のいずれか一項に記載の決定方法で決定された塩基配列（５‘−（Ｎ）ｎ−３’）を有する核酸分子。
【請求項２１】
請求項２０記載の核酸分子を含む核酸構築物。
【請求項２２】
認識塩基配列が既知である核酸結合分子（Ａ）及び認識塩基配列が未知である核酸結合分子（Ｂ）を含む異種分子二量体。
【請求項２３】
核酸結合分子がオリゴペプチドである、請求項２２記載の異種分子二量体。
【請求項２４】
各オリゴペプチドが１０個〜３０個のアミノ酸残基から成る、請求項２３記載の異種分子二量体。
【請求項２５】
核酸結合分子（Ａ）のオリゴポリペプチドが転写活性化因子に由来する、請求項２２ないし２４のいずれか一項に記載の異種分子二量体。
【請求項２６】
核酸結合分子（Ａ）のオリゴペプチドが酵母の転写活性化因子である、ＧＣＮ４の塩基性領域に由来する２３個のアミノ酸残基から成るＧ２３である、請求項２２ないし２５のいずれか一項に記載の異種分子二量体。
【請求項２７】
核酸結合分子（Ａ）のオリゴポリペプチドがベーシックロイシンジッパータンパク質の塩基性領域に由来する、請求項２２ないし２４のいずれか一項に記載の異種分子二量体。
【請求項２８】
ホスト−ゲスト包接化合物による錯体形成能を利用して得られるものである、請求項２２ないし２７のいずれか一項に記載の異種分子二量体。
【請求項２９】
以下の式（Ｉ）で表されるランダムな塩基配列：
式（Ｉ）：　５‘−塩基配列（ａ）−（Ｎ）ｎ−３’
（上記式中、塩基配列（ａ）は核酸結合分子（Ａ）が認識する塩基配列、「Ｎ」はそれぞれ独自に任意のヌクレオチド、及び「ｎ」は自然数を示す。）から成る核酸分子のプール、及び、核酸結合分子（Ａ）及び認識塩基配列が未知である核酸結合分子（Ｂ）を含む異種分子二量体を含む、核酸結合分子（Ｂ）が認識する塩基配列を決定するためにキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、タンパク質等の各種ＤＮＡ結合分子、特に、短鎖ペプチドが認識する核酸分子の塩基配列の決定方法、並びに、それに用いる異種分子二量体及びキット等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
天然のＤＮＡ結合タンパク質においてＤＮＡと直接接触する部分は単純なαヘリックス構造（ＤＮＡ認識ヘリックス）をとることが多い。現在までの研究で、認識されるＤＮＡの塩基配列（以下、「認識ＤＮＡ配列」ともいう）とＤＮＡ認識ヘリックスのアミノ酸配列との間には一般的な相関関係は見いだされておらず、テーラーメイドに塩基配列認識能を持つタンパク質の設計において重大な問題の一つとなっている。特に、短鎖ペプチドのＤＮＡ結合能は一般に低いため、その認識ＤＮＡ配列を決定することは困難である。
【０００３】
これまでＤＮＡに結合するタンパク質や抗生物質の認識ＤＮＡ配列を決定する方法として、デオキシリボヌクレアーゼＩ又は硫酸ジメチルのようなメチル化剤を用いる修飾アッセイに於けるフットプリンティング法が用いられてきたが、現在の処、選択性・親和性が低いペプチドなどの化合物の認識ＤＮＡ配列を検定できる方法はない。
【０００４】
今後、ＤＮＡに直接作用する薬剤の開発が進むと予想されることからも、ＤＮＡ等の核酸結合分子が認識する塩基配列を簡便に決定する技術の開発が必須である。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者は上記課題を解決するために、選択性・親和性が低い化合物（ペプチド、糖類、合成有機分子）についても、簡便かつ迅速にその認識ＤＮＡ配列を決定するための技術の開発を試み、その結果、本発明を完成させた。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
即ち、本発明者は、天然のＤＮＡ結合タンパク質は直接ＤＮＡ塩基と接触する部分にαヘリックス構造を多用している。このことから、約２５個のアミノ酸からなるオリゴペプチドはヘリックス構造をとることにより４〜５塩基対の塩基配列を認識することが期待される。しかしながら、約２５アミノ酸からなるオリゴペプチド単体では安定なＤＮＡとの複合体を形成する例はまれであるため、その認識ＤＮＡ配列を決定することは不可能である。そこで、新しく作製したオリゴペプチドと認識塩基配列が明らかになっているオリゴペプチドと異種二量体を作製し、ペプチド二量体とＤＮＡとの親和性を高めた上で異種二量体の認識ＤＮＡ配列を決定する、という方法を考えた。
この方法によれば、異種二量体のうち、片方のペプチドが認識するＤＮＡ配列はわかっているので、新たに作製したオリゴペプチドがどのようなＤＮＡ塩基配列を認識するかは簡単に知ることができる。
【０００７】
本発明は上記方法に基づき完成したものである。即ち、第一に、下記のステップ：
（１）以下の式（Ｉ）で表されるランダムな塩基配列：
式（Ｉ）：　５‘−塩基配列（ａ）−（Ｎ）ｎ−３’
（上記式中、塩基配列（ａ）は核酸結合分子（Ａ）が認識する塩基配列、「Ｎ」はそれぞれ独自に任意のヌクレオチド、及び「ｎ」は自然数を示す。）
から成る核酸分子のプールを調製し、
（２）核酸結合分子（Ａ）及び認識塩基配列が未知である核酸結合分子（Ｂ）を含む異種分子二量体と、上記核酸分子のプールとの間で結合反応を行ない、
（３）異種分子二量体との親和性が高い核酸分子を選択し、及び
（４）選択された核酸分子の塩基配列を同定することにより核酸結合分子（Ｂ）が認識する塩基配列（５‘−（Ｎ）ｎ−３’）を決定することから成る、核酸結合分子（Ｂ）が認識する塩基配列の決定方法に係る。
【０００８】
本発明方法のステップ（３）における異種（分子）二量体との親和性が高い核酸分子の選択は、当業者に公知の任意の手段により行なうことが出来る。好適例として、ゲルシフトアッセイを用いて異種分子二量体と複合体を形成した核酸分子を、その他の核酸分子から分離する方法を挙げることが出来る。
【０００９】
本発明方法において、ステップ（３）の後に、選択された核酸分子を増幅するステップ（３−１）、及び、必要に応じて、ステップ（２）において、ステップ（３−１）で増幅された核酸分子を核酸分子のプールとして使用して異種分子二量体との間で結合反応を行うことも可能である。更に、このようなステップ（２）、（３）及び（３−１）を複数回繰り返すことにより異種分子二量体との親和性が高い核酸分子を濃縮することができる。このような方法はＳＡＡＢ法（Ｓｅｌｅｃｔｅｄ　Ａｎｄ　Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　Ｂｉｎｄｉｎｇ）と呼ばれる。選択された核酸分子を増幅するには、当業者に公知の任意の方法で行なうことが出来るが、簡便性及び迅速性等の点からＰＣＲ法が好適である。
【００１０】
本発明方法のステップ（２）における、異種分子二量体と核酸分子のプールとの間の結合反応における、溶媒の種類、共存させる塩濃度、及び反応各成分の濃度等の諸条件は、異種分子二量体との親和性が高い核酸分子がより迅速に且つ特異的に選択されるように、当業者がその適宜最適化することができる。例えば、非特異的な結合を抑制するために、ポリｄＩ−ｄＣ存在下で結合反応を行なうことが好ましい。このように選択条件を最適化することで、ステップ（２）、（３）及び（３−１）の反復回数をより少なくすることが出来る。
【００１１】
本発明方法で使用する核酸結合分子には、任意の化合物、例えば、各種ゴペプチド、オリゴ糖類、有機分子等が含まれる。特に、本発明の特徴として、例えば、１０個〜３０個のアミノ酸残基から成る短鎖オリゴペプチドのようなＤＮＡ結合能の低い化合物を核酸結合分子として使用し、該分子が認識する塩基配列を決定することが出来ることである。
このような短鎖オリゴペプチドから成る核酸結合分子（Ａ）の例として、当業者に公知の各種転写活性化因子に由来するもの、例えば、酵母の転写活性化因子であるＧＣＮ４の塩基性領域に由来する２３個のアミノ酸残基から成るオリゴペプチド（以下、「Ｇ２３」と称す）、及び、ベーシックロイシンジッパータンパク質の塩基性領域に由来するもの、例えば、ロイシンジッパータンパク質であるＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質（Ｃ／ＥＢＰ）のＤＮＡ結合に由来する２３個のアミノ酸残基から成るオリゴペプチド（以下、「Ｃ２３」と称す）「Ｃ２３」を挙げることができる。
又、認識する塩基配列が未知の核酸結合分子（Ｂ）の一例として、Ｄ−体アミノ酸からなる合成オリゴペプチドを挙げることが出来る。
ここで、核酸結合分子（Ａ）及び核酸結合分子（Ｂ）をそれぞれ構成する分子の種類は互いに異なるものであっても構わない。例えば、核酸結合分子（Ａ）としてオリゴペプチドを用い、核酸結合分子（Ｂ）としてはオリゴ糖類を使用することも可能である。
このような核酸結合分子は市販されているものを使用するか、又は、目的に応じて、当業者に公知の方法により適宜合成することが可能である。
【００１２】
異種（分子）二量体の作成方法に特に制限はないが、好適例として、ホスト−ゲスト包接化合物による錯体形成能を利用して得られるものを挙げることが出来る。これは、異種分子二量体を構成する各核酸結合分子のＣ末端に当業者に公知の任意の方法によりホスト又はゲスト包接化合物のいずれか一方を導入することにより調製することが出来る。このような目的に好適なホスト−ゲスト包接化合物は当業者に公知であり容易に調製することが出来る。一例として、アダマンタン及びβ−シクロデキストリンの組み合わせを挙げることが出来る。
【００１３】
核酸分子の例としては、二本鎖ＤＮＡ及びＲＮＡを挙げることが出来る。これらの核酸分子において構成塩基が適宜修飾されていても良い。これらの核酸分子は公知技術に基づいて当業者が任意に調製することが出来る。更に、核酸分子のプールを構成するランダムな塩基配列において、式（Ｉ）における塩基配列（ａ）は、核酸結合分子（Ａ）が認識できる範囲として３個〜５個のヌクレオチド（塩基対）からなるものであることが好ましい。例えば、核酸結合分子（Ａ）としてＧ２３を使用する場合には、塩基配列（ａ）は５‘−ＡＴＧＡＣ−３’であることが好ましい。又、式（Ｉ）中の「Ｎ」はそれぞれ独自にＡ、Ｔ，Ｇ，Ｃ等の任意のヌクレオチドをランダムに表している。好ましくは、各「Ｎ」がＡ、Ｔ，Ｇ，及びＣの全てをとり、塩基配列「（Ｎ）ｎ」全体としてＡ、Ｔ，Ｇ，及びＣからなる全ての組み合わせがプールに存在するように核酸分子を調製する。
例えば、ゲルシフトアッセイを用いて異種分子二量体と複合体を形成した核酸分子を、その他の核酸分子から分離し、異種分子二量体との親和性が高い核酸分子を選択するためには、核酸分子のプールを構成するランダムな塩基配列は、当業者に公知の任意の方法により、例えば、３２Ｐのような放射性標識でラベル化されていることが好ましい。
【００１４】
本発明は、更に、上記の決定方法で決定された塩基配列（５‘−（Ｎ）ｎ−３’）を有する核酸分子自体、及び、このような核酸分子を含む核酸構築物に係る。ここで「核酸構築物」とは、その他の核酸と結合又は組み合わされ、各種の目的で使用することのできる物質をいい、例えば、該核酸分子を各種プラスミド等内にクローニングして得られるクローニングベクターを挙げることができる。このようなクローニングベクターは大腸菌等の適当な宿主体内で増殖させた後に回収し、上記核酸分子の塩基配列を決定する為に使用することが出来る。
【００１５】
本発明は、又、上記方法で使用する、認識塩基配列が既知である核酸結合分子（Ａ）及び認識塩基配列が未知である核酸結合分子（Ｂ）を含む異種分子二量体自体に係る。
【００１６】
本発明は、又、以下の式（Ｉ）で表されるランダムな塩基配列：
式（Ｉ）：　５‘−塩基配列（ａ）−（Ｎ）ｎ−３’
（上記式中、塩基配列（ａ）は核酸結合分子（Ａ）が認識する塩基配列、「Ｎ」はそれぞれ独自に任意のヌクレオチド、及び「ｎ」は自然数を示す。）から成る核酸分子のプール、及び、核酸結合分子（Ａ）及び認識塩基配列が未知である核酸結合分子（Ｂ）を含む異種分子二量体を含む、核酸結合分子（Ｂ）が認識する塩基配列を決定するためにキットにも係る。このようなキットには、異種分子二量体と核酸のプールとの間の結合反応、及び、選択された核酸分子の増幅反応等に使用する、価各種の溶媒、塩類、濃度、その他の任意の試薬並びに実験プロトコールなどを更に含むことが出来る。
【００１７】
【発明の実施の形態】
以下、核酸結合分子としてオリゴペプチドを用いて、本発明の具体的態様を詳細に説明する。
まず、ＧＣＮ４のベーシックリージョンＧ２３のＣ末端にアダマンタン（Ａｄ）を導入したＧ２３Ａｄと、非天然アミノ酸を含む新しいＤＮＡ認識ペプチドとして、Ｇ２３を構成するアミノ酸が光学異性体であるＤ体のアミノ酸であるＤＧ２３のＣ末端にβ−シクロデキストリン（Ｃｄ）を導入したＤＧ２３Ｃｄ（図１）を当業者に周知の固相ペプチド合成法を用いて合成した。アダマンタンとシクロデキストリンによる異種二量体形成能を利用して形成されるＧ２３Ａｄ／ＤＧ２３Ｃｄペプチド二量体は約１０塩基対のＤＮＡ塩基配列を認識することが期待される。天然のＧＣＮ４由来のＧ２３Ａｄは５’−ＡＴＧＡＣ−３’という配列を認識することがわかっているが、もう半分の新しく設計した非天然アミノ酸からなるＤＧ２３Ｃｄの認識配列は未知である。本発明では、新しく設計したペプチドが結合するＤＮＡ塩基配列をＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃのすべての組み合わせが存在するようにした４５通りのＤＮＡ配列プール中から選びだすという手法の確立を試みた。
【００１８】
その方法として既に述べたＳＡＡＢ法という方法を導入した。まず、１０塩基対からなる人工二量体タンパク質のＤＮＡ結合配列を設計し、その半分をＧ２３が認識する５’−ＡＴＧＡＣ−３’配列とし、残りの半分をＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃのすべての組み合わせが存在するようにランダム化した４５通りの配列（５’−ＡＴＧＡＣＮ１Ｎ２Ｎ３Ｎ４Ｎ５−３’）として用いた。４５通りの配列（５’−ＡＴＧＡＣＮ１Ｎ２Ｎ３Ｎ４Ｎ５−３’）を含む一本鎖ＤＮＡを合成し、これに３２Ｐで放射標識したプライマーをアニールさせた後、Ｋｌｅｎｏｗ　Ｆｒａｇｍｅｎｔにより伸長反応を起こして二本鎖ＤＮＡのランダムプールを作製した。この結果、この二本鎖ＤＮＡランダムプール中のＤＮＡはすべてＧ２３ペプチドが結合する配列をもち、その隣にＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃのすべての組み合わせをもった配列が存在することになる。
【００１９】
こうして調製されたＤＮＡプールに異種二量体ペプチドをそれぞれ５０　ｎＭ、１００　ｎＭ、２００　ｎＭの濃度になるように加え、４℃で３０分間結合実験を行ったのち、結合混合液を氷上でのゲルシフトアッセイによりＤＮＡとＤＮＡ−異種二量体ペプチド複合体に分離し、ホスト−ゲスト錯体形成能により二量化した異種二量体ペプチドが結合したＤＮＡだけを抽出したのち、ＰＣＲ法によって抽出したＤＮＡ配列を増幅させた。その後、この増幅させたＤＮＡを再び結合実験に用い、同様の手順でペプチド二量体に結合したＤＮＡだけを抽出した。以上のような一連の結合、選択、増幅の操作を繰り返すことにより、ペプチド二量体と特異的に結合する配列が４５通りの配列をもつＤＮＡプールの中から濃縮された。
【００２０】
この手法では、二量体ペプチドをＤＮＡと結合させる条件によってＤＮＡプールの中から二量体ペプチドが認識するＤＮＡ塩基配列が効率よく選択できるかどうかが決まる。仮に選択の初期の段階で結合条件を厳しくしすぎると、二量体ペプチドとＤＮＡとの結合がほとんど起こらないため、特異的な塩基配列が選ばれてこない可能性がある。また、二量体ペプチドとＤＮＡの間に非特異的な結合が起こりやすい結合条件で結合、選択、増幅の操作を繰り返しても、効率よく二量体ペプチドの特異的な認識塩基配列が選ばれてこないと考えられる。
【００２１】
したがって、すでにどのような配列に結合するかがわかっているＧＣＮ４由来のタンパク質に由来するペプチド二量体であるＧ２３Ｃｄ／Ｇ２３ＡｄおよびＣ／ＥＢＰ由来のペプチドとＧＣＮ４由来のペプチドの異種二量体であるＣ２３Ｃｄ／Ｇ２３Ａｄを用いて一連の結合、選択、増幅実験を行い、期待されるＤＮＡ塩基配列が選ばれてくるＤＮＡ結合条件を探索した。
【００２２】
各結合・選択・増幅の操作ごとに特異的に結合する配列の濃縮をゲルシフト法による結合バンドの割合によって確認後、結合が強くなった時点で選択されたＤＮＡを３２Ｐでラベル化していないプライマーを用いてＰＣＲ法により増幅させ、制限酵素Ｂａｍ　ＨＩおよびＥｃｏ　ＲＩにより二本鎖ＤＮＡを切断して、ｐＵＣ１９にクローニングした。生成したコロニーをＧＣＮ４由来のタンパク質の同種二量体であるＧ２３Ｃｄ／Ｇ２３ＡｄおよびＣ／ＥＢＰ由来のタンパク質とＧＣＮ４由来のタンパク質の異種二量体であるＣ２３Ｃｄ／Ｇ２３Ａｄ双方から選択された系に対してそれぞれ数十個ずつ選び、ＳＡＡＢ法により選択された二量体結合部位の塩基配列決定を行った。
【００２３】
ＳＡＡＢ法を用いて二量体形成部位として、β−シクロデキストリン　（Ｃｄ）とアダマンタン　（Ａｄ）のホスト−ゲスト錯体形成能を利用した３種類の二量体ペプチドの認識ＤＮＡ塩基配列の効率的な決定条件について調べた。
【００２４】
【実施例】
以下、実施例に則して、本発明を更に説明する。尚、本発明の技術的範囲は以下の実施例に何等拘束されるものではない。
【００２５】
認識ＤＮＡ塩基配列がわかっているペプチド二量体を用いたＳＡＡＢ法によるオリゴペプチド認識ＤＮＡ配列の決定
ＧＣＮ４由来のペプチドであるＧ２３Ａｄ／Ｇ２３Ｃｄからなる同種二量体は、回文配列であるＣＲＥ（５’−ＡＴＧＡＣＧＴＣＡＴ−３’）を特異的に認識して結合し、高い安定性を持つ複合体を形成することが知られている。ＳＡＡＢ法における選択条件を最適化するために、まずこの同種二量体ペプチドに着目し、ランダムＤＮＡプールを用いてＳＡＡＢ法を行ったときにＧ２３Ａｄ／Ｇ２３Ｃｄの本来の認識配列であるＣＲＥ配列が選択されてくるような結合条件を探索した。この際、選択の初期の段階で結合条件を厳しくしすぎるとＧ２３Ａｄ／Ｇ２３ＣｄとランダムＤＮＡプールとの結合が起こらず、効率的な特異的な配列の濃縮が起こらない可能性がある。そのため初期の結合条件はＧ２３Ａｄ／Ｇ２３Ｃｄが高い結合能を有する条件である低塩濃度（４　ｍＭ　ＫＣｌ）の条件下で、二量体タンパク質濃度が５０　ｎＭ、１００　ｎＭ、２００　ｎＭの３種類になるように加えて行った。結合実験後、氷上でのゲルシフトアッセイにより目的の二量体タンパク質とＤＮＡとの結合バンドを分離した後、複合体部分のアクリルアミドゲルを切り出し、ＤＮＡを抽出した。この抽出したＤＮＡをＰＣＲ法を用いて増幅させ、次の結合実験に用いた。この時、切り出して増幅させた結合バンドは、今回の最初に構築した結合実験系では、目視で結合を確認することができ、かつ加えたペプチド濃度が最も小さいサンプルのものである。
低塩濃度（４　ｍＭ　ＫＣｌ）の条件下でＳＡＡＢ法の結合・選択・濃縮実験を３回繰り返して行った後、選択されてきたＤＮＡの塩基配列を決定した。その結果から、Ｎ１の位置にＧが選択される可能性が高いことは確認できたが、選ばれてきた塩基配列の種類が多く、この結合条件では特定の塩基配列（５’−ＧＴＣＡＴ−３’）に収束していないことがわかった。
【００２６】
そこで、５回目の結合・選択・濃縮実験以降、Ｇ２３Ａｄ／Ｇ２３Ｃｄの非特異的なＤＮＡ結合を抑制するため、ＤＮＡプールとＧ２３Ａｄ／Ｇ２３Ｃｄの結合反応にポリｄＩ−ｄＣを添加した。ポリｄＩ−ｄＣは負電荷のリン酸骨格を持ち、ＤＮＡ結合タンパク質と静電的な結合を起こし、Ｇ２３Ａｄ／Ｇ２３ＣｄのＤＮＡプールに対する非特異的な結合を抑えることが期待される。この条件下で結合・選択・濃縮実験を７回目まで繰り返したのち選択されたＤＮＡの塩基配列を決定した。その結果を解析したところ、Ｎ１の位置にＧが選択される可能性は以前よりも高くなっており、またＮ１の位置にＧが選択された場合、Ｎ２の位置にはＴが高確率で選択されるということがわかり、ポリｄＩ−ｄＣの添加によってＧ２３Ａｄ／Ｇ２３Ｃｄ二量体と非特異的な塩基配列との結合を抑制することにより、ＳＡＡＢ法による目的配列の選択が効率的に進むことが確認できた。
【００２７】
８回目のサイクル以降は、更にＧ２３Ａｄ／Ｇ２３Ｃｄの非特異的なＤＮＡ結合を抑制するため、高塩濃度（１００　ｍＭ　ＫＣｌ）または高塩濃度（１００　ｍＭ　ＫＣｌ）かつポリｄＩ−ｄＣ添加の条件下で結合・選択・濃縮実験を行い、９回目の結合・濃縮実験終了後に再び選択されたＤＮＡの塩基配列を決定した（表１）。その結果、天然のＧＣＮ４においても塩基配列選択性が低いＮ５の位置のみ複数の塩基が選択さたものを含めて、塩基配列を決定したなかで約８割の高確率で５’−ＡＴＧＡＣＧＴＣＡＮ−３’という配列が存在していることがわかった。このことより、以上１１回のＳＡＡＢサイクルを繰り返すことでＧ２３Ａｄ／Ｇ２３Ｃｄペプチド二量体の認識ＤＮＡ配列が決定できる系を確立することができた。
【００２８】
【表１】
2004008108.tif 000003
【００２９】
二量体形成部位として、β−シクロデキストリン　（Ｃｄ）とアダマンタン　（Ａｄ）のホスト−ゲスト錯体形成能を利用した二量体ペプチドを用いて、ＳＡＡＢ法を適用することにより、２３アミノ酸から成る短鎖オリゴペプチドの認識ＤＮＡ塩基配列を決定することができることがわかった。ここではＧ２３Ｃｄ／Ｇ２３Ａｄ二量体タンパク質の認識ＤＮＡ配列が、更に短期間で収束する系を確立すること目的として、まず、初期の段階から結合条件（表２）を厳しくすることを試みた。また、ランダムプールＤＮＡとペプチド二量体が結合したバンドをアクリルアミドゲルから切り出す際、デンシトメーターで測定した結合割合　（表３）が１０％未満のバンドの切り出しは行わず、その値を超える最も小さい数値に対応した結合バンドを切り出し増幅させるという方針を採用し、これにより非特異的に結合したＤＮＡ塩基配列がサイクルを重ねても増幅しないように試みた。
【００３０】
【表２】
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【００３１】
【表３】
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【００３２】
ＳＡＡＢ法によるオリゴペプチド認識ＤＮＡ塩基配列決定の条件最適化
新しく考案した結合条件で結合・選択・増幅実験を行った（図２）。その結果、Ｇ２３Ｃｄ／Ｇ２３Ａｄの二量体ペプチドでは、３回目および５回目の結合・選択・増幅実験後に行った二量体ペプチドの結合塩基配列の決定結果では選択された塩基配列にばらつきが多いのに対し、９回目の結合・選択・増幅実験後に行った結合塩基配列の決定結果からは、選択性が低いＮ５の位置のみ他の塩基が選択されて来ているのも含めて約８割の高確率で再び５’−ＡＴＧＡＣＧＴＣＡＮ−３’という配列が得られていることが確認できた。このことより、Ｇ２３Ａｄ／Ｇ２３Ｃｄ二量体ペプチドの認識ＤＮＡ配列を決定するのに要するＳＡＡＢサイクルを前節で示した条件に比べて２サイクル短縮することが可能であった。
【００３３】
ロイシンジッパータンパク質Ｃ／ＥＢＰの塩基性領域にあるＤＮＡ結合部位に由来する２３アミノ酸ペプチド（Ｃ２３）からなるＣ２３Ｃｄ／Ｇ２３Ａｄ異種二量体ペプチドについても同様の結合条件でＳＡＡＢサイクルを重ね、認識ＤＮＡ配列の決定を行った。その結果、１１回目の結合・選択・濃縮実験後に行った結合部位の塩基配列の決定から、こちらも選択性が低いＮ５の位置のみ他の塩基が選択されているのを含めて８割以上の確率で５’−ＡＴＧＡＣＧＣＡＡＮ−３’という配列に収束していることが確認できた。ＧＣＮ４の同種二量体だけでなく、Ｃ／ＥＢＰとＧＣＮ４の異種二量体についても収束したことで、本節で用いた条件は、今後、ホスト−ゲスト相互作用による人工二量体形成部位を用いて形成した他のＤＮＡ結合ペプチドに対しても利用可能であると考えられる。
【００３４】
ＳＡＡＢ法によるＤ−アミノ酸オリゴペプチドが認識するＤＮＡ塩基配列の決定
認識配列が未知であるＤＧ２３Ｃｄ／Ｇ２３Ａｄペプチド二量体についても本節で用いたＧ２３Ｃｄ／Ｇ２３ＡｄおよびＣ２３Ｃｄ／Ｇ２３Ａｄペプチド二量体の認識ＤＮＡ配列が収束したのと同様の条件で結合・選択・増幅の操作を繰り返した。ＤＧ２３Ｃｄ／Ｇ２３Ａｄペプチド二量体で９回目の結合・選択・濃縮実験後に行った結合塩基配列の決定結果より、５’−ＡＴＧＡＣＧＴＮＮＮ−３’と５’−ＡＴＧＡＣＡＣＮＮＮ−３’という配列に対して再び収束していることが確認できた。また、１２回目の結合・選択・増幅の操作の後の認識塩基配列決定の結果では、５’−ＡＴＧＡＣＡＣＮＮＮ−３’、その中でも５’−ＡＴＧＡＣＡＣＡＣＮ−３’という配列が選択される確率が上がった。これらの結果から、ＤＧ２３Ｃｄ／Ｇ２３Ａｄペプチド二量体は５’−ＡＴＧＡＣＡＣＡＣＮ−３’という塩基配列に最も高い親和性を示すと考えられる（図３）。
【００３５】
以下に本発明の実施例で使用した各実験方法の実際の手順について記載する。
【実験方法】
ペプチド（ＤＧ２３）の合成
ＤＧ２３ペプチド（Ａｃ−ＤＰＡＡＬＫＲＡＲＮＴＥＡＡＲＲＳＲＡＲＫＬＱＣ−ＮＨ２）はＦｍｏｃ固相合成法によって化学合成した。樹脂はＦｍｏｃ−ＰＡＬ−ＰＥＧ　ｒｅｓｉｎ（０．１６　ｍｍｏｌ／ｇ）を用いた。縮合は、樹脂に対して２．５当量のＤ−体Ｆｍｏｃアミノ酸、２．５当量のＨＯＢｔ、２．５当量のＰｙＢＯＰ、そして３．７５当量のＮ−メチルモルフォリンを加え、３０から６０分撹拝することでおこなった。但し、カルボキシル基がＰｆｐ基で活性化されているＦｍｏｃアミノ酸を用いる場合はＨＯＢｔだけを加え、Ｄｈｂｔ基で活性化されているＦｍｏｃアミノ酸を用いる場合は他には他に何も加えずに縮合反応をおこなった。Ｎ末端のアミノ酸のＦｍｏｃ基を脱保護した後、Ｎ−アセチルイミダゾールをもちいてペプチドのＮ末端をアセチル化した。反応の進行は、各縮合反応終了後、カイザーテストで確かめた。樹脂からの切り出しおよび脱保護は、氷上、窒素雰囲気下にて、ＴＭＳＢｒ（１．３５　ｍｌ）、チオアニソール（１．２　ｍｌ）、エタンジチオール（０．６　ｍｌ）、ｍ−クレゾール（０．２　ｍｌ）を縮合後の樹脂に加え、氷上にて３時間撹拝した。ろ過後、樹脂をトリフルオロ酢酸で洗浄し、ろ液を減圧濃縮した。氷上にて水を加え３０分間撹拝し、エーテル抽出で精製した後、ゲルろ過（Ｇ−１０　Ｓｅｐｈａｄｅｘ，５％　酢酸−水）を行ない、最後に逆相クロマトグラフィー（移動相Ａ、０．１％トリフルオロ酢酸−水；移動相Ｂ、０．１％トリフルオロ酢酸−水　／　５０％アセトニトリル；グラジエント、５０−７５％移動相Ｂ（４０分）；流速、６　ｍｌ　／　ｍｉｎ）で精製した。
【００３６】
ホスト分子を導入したペプチド（ＤＧ２３Ｃｄ）の合成
リン酸ニナトリウム溶液（０．５　Ｍ，ＰＨ９．０，４００μｌ）、ジメチルホルムアミド（４００μＬ）、水酸化ナトリウム（１　Ｍ，６０μｌ）に溶かした６−ヨードβシクロデキストリン（１２４　ｍｇ，１００　ｍｍｏｌ）に、氷上および窒素雰囲気下にて、水（２００μｌ）に溶かしたＤＧ２３ペプチド（１０　ｍｇ）を加え、撹拝した。反応の進行を逆相クロマトグラフィー（０．０５％　トリフルオロ酢酸、１０−４０％　アセトニトリル）で確認した後、２−メルカプトエタノール（１００μｌ）を加えて撹拝した。１５分後、酢酸（１００μｌ）を加えてｐＨ試験紙で酸性を確認後、ゲルろ過（Ｇ−１０　Ｓｅｐｈａｄｅｘ；５％　酢酸−水）を行なった。ニンヒドリン発色したフラクションを回収し、逆相クロマトグラフィー（移動相Ａ、０．０５％トリフルオロ酢酸−水；移動相Ｂ、０．０５％トリフルオロ酢酸−水／５０％アセトニトリル；流速、５　ｍｌ　／　ｍｉｎ；グラジエント、２０−８０％　Ｂ（３５分））を行ない、回収したフラクション（溶出時間、１８分）をトリエチルアミンで中和した後、生じた塩をＳｅｐ−Ｐａｋ　Ｃ−１８カラムで除いた。凍結乾燥しＤＧ２３Ｃｄ（５．５　ｍｇ，３８％）を得た。この固体をｐＨ８の１／１０×ＴＥ緩衝液　（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　（１０　ｍＭ），ＥＤＴＡ　（１　ｍＭ））に溶かし、アミノ酸定量分析によって濃度を決定した。最終生成物の同定は１Ｈ−ＮＭＲ、アミノ酸分析およびイオンスプレー式質量分析によって行なった。
【００３７】
ゲスト分子を導入したＤＧ２３Ａｄの合成
リン酸緩衝液（ｐＨ９．０，０．５　Ｍ，６００μｌ）と水酸化ナトリウム（１　Ｎ，５０μｌ）を混ぜた溶液に、氷上、窒素雰囲気下にて、ジメチルホルムアミド（２００μｌ）に溶かしたＮ−（ｂｒｏｍｏａｃｅｔｙｌ）−１−ａｄａｍａｎｔａｎｅｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ（１７　ｍｇ，６０　ｍｍｏｌ）を加えた後、さらに、水（２００μｌ）に溶かしたＤＧ２３ペプチド（１０　ｍｇ，３．６　ｍｍｏｌ）を加え、１時間撹拝した。反応液に２−メルカプトエタノール（１００μｌ）を加えた後、酢酸（１０μｌ）を加え、ゲルろ過（Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−１０，５　％酢酸−水）によって精製した。ニンヒドリン反応のあるフラクションを回収し、逆相クロマトグラフィーで精製し、ＤＧ２３Ａｄ（８　ｍｇ，７４％）を得た。最終生成物の同定は１Ｈ−ＮＭＲ、アミノ酸分析およびイオンスプレー式質量分析によって行なった。
【００３８】
３２Ｐでラベル化したプライマー　Ｅの作製
反応条件下（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　（５０　ｍＭ，ｐＨ８．０），ＭｇＣｌ２　（１０　ｍＭ），ＤＴＴ　（５　ｍＭ））にプライマー　Ｅ　（１００　ｐｍｏｌ，５’−ＧＡＴＣＧＡＡＴＴＣＣＧＧＡＧ−３’）と［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ　（１５μｌ）とＴ４　Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｋｉｎａｓｅ　（５μｌ）を加えて、３７℃で３０分インキュベートしプライマー　Ｅ　（１００　ｐｍｏｌ）の５’−末端の放射標識反応を行った。その反応液にＥＤＴＡ　（０．５Ｍ，２μｌ）を加えて反応を終結させた後、Ｓｅｐ−ｐａｋ　（平衡化：メタノール　（３　ｍｌ），滅菌水　（３　ｍｌ），ＴＥＡＡ　（０．１　Ｍ，３　ｍｌ）にＴＥＡＡ　（０．１　Ｍ，３　ｍｌ）とともに通し、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水　（５　ｍｌ）で塩を除去した後、３０　％アセトニトリルで目的物を回収して、スピードバックで減圧濃縮を行った。
【００３９】
３２Ｐでラベル化したランダムＤＮＡプールの作製
３２Ｐでラベル化したプライマー　Ｅに相補的な結合サイトの半分がランダム化されたＮ５−３テンプレート（５０　ｐｍｏｌ）を加え、反応条件下　（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　（２５　ｍＭ），ＮａＣｌ　（１００　ｍＭ），ＥＤＴＡ　（１　ｍＭ，ｐＨ８．０），ｄＮＴＰ　Ｍｉｘｔｕｒｅ　（０．１　ｍＭ））で９５℃、２分間のアニーリング反応を行い、室温に３時間かけて徐冷した。その後Ｋｌｅｎｏｗ　Ｆｒａｇｍｅｎｔ（０．５μｌ）を加えて４℃で２時間反応させた後、反応液と同量のフェノールを加えてＶｏｒｔｅｘし、１５，０００　ｒｐｍで５分間遠心して水層のみを予め分注しておいた同体積のクロロホルムに加えてＶｏｒｔｅｘし、１５，０００　ｒｐｍで２分間遠心して再度水層のみを予め分注しておいた１／１０量の酢酸ナトリウム　（３Ｍ，ｐＨ　５．２）に加えた。そこに両者の体積の３倍量のエタノールを加えてＶｏｒｔｅｘし、−２０℃で一晩または−８０℃で２０分間放置した。放置後、１５，０００　ｒｐｍで１０分間遠心してＤＮＡを沈澱させ、エタノールのみを廃棄した。更に、そこに冷７０％エタノール　（５００μｌ）を加え１５，０００　ｒｐｍで２分間遠心して、塩を除去し、再びＤＮＡを沈澱させ７０％エタノールのみを廃棄し、スピードバックで減圧乾燥を行った。乾燥後、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水　（１０μｌ），ｄｙｅ　（ＸＣとＢＰＢの混合液，３μｌ），ｓｕｃｒｏｓｅ　（６０％，２μｌ）を加えてＶｏｒｔｅｘし、サンプルを予め１５０Ｖ，３０分間Ｐｒｅ−ｒｕｎしておいた１０％非変性アクリルアミドゲルに全量直接ロードし、ＴＢＥ緩衝溶液中　（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　（２０　ｍＭ），ｂｏｒｉｃ　ａｃｉｄ　（２０　ｍＭ），　ＥＤＴＡ，（０．１　ｍＭ））で１３０〜１５０Ｖの範囲で約７０分間ゲルシフトアッセイを行い、目的の二本鎖ＤＮＡと未反応のプライマーなどの不純物を分離し、二本鎖ＤＮＡのランダムプールのバンドのみを切り出して回収した。
【００４０】
１０％アクリルアミドゲルの作製
ゲル一枚当たり、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水　（４．８５　ｍｌ）、１０×ＴＢＥ　（０．１５　ｍｌ）、３０％アクリルアミドストック（アクリルアミド：ビスアクリルアミド＝２９：１，２．５　ｍｌ）、ＴＥＭＥＤ（Ｎ，Ｎ，Ｎ，Ｎ−Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ−ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ，５μｌ）を２００　ｍｌのナスフラスコに入れ攪拌し、脱気を行った。その後３０％　ＡＰＳ（Ａｍｍｏｎｉｕｍ　Ｐｅｒｏｘｏｄｉｓｕｌｆａｔｅ，１７．５μｌ）を加えてよく攪拌し、ゲル板（スぺーサー：ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ　０．７５　ｍｍ、ＰＣＲ精製　１　ｍｍ）に流し込み、コウム（ウェル数：　ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ　１０、ＰＣＲ精製　６）をセットし、約２時間硬化させた。
【００４１】
ＳＡＡＢ法によるセレクション
氷中で、結合反応条件下にて、二本鎖ＤＮＡに二量体タンパク質濃度がそれぞれ５０　ｎＭ、１００　ｎＭ、２００　ｎＭ、になるように加え、全量を１０μｌとした。４℃で３０分間、結合実験を行った後、各反応溶液を予め氷中で６０　Ｖ，３０分間Ｐｒｅ−ｒｕｎしておいた１０％非変性アクリルアミドゲルに全量直接ロードし、氷中でＴＢＥ緩衝溶液中　（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　（２０　ｍＭ），ｂｏｒｉｃ　ａｃｉｄ　（２０　ｍＭ），ＥＤＴＡ　（０．１　ｍＭ））にて９０〜１１０Ｖの範囲で約２００分間ゲルシフトアッセイを行った。泳動後のゲルをラップで包んだ後、Ｘフィルムに感光させ、二量体タンパク質と二本鎖ＤＮＡが結合しているバンドを切り出して回収した。
【００４２】
ゲルシフト電気泳動後のＤＮＡ結合解析
現像したフィルムを、ＤｅｓｋｓｃａｎＩＩとＮＩＨ−Ｉｍａｇｅ（ｖｅｒｓｉｏｎ　１．６２）で解析し、各バンドの濃さからＤＮＡとタンパク質二量体の結合割合を算出した。
【００４３】
切り出したゲルからの二本鎖ＤＮＡの回収
切り出したゲルにｅｌｕｔｉｏｎ　ｂｕｆｆｅｒ（ＮＨ４ＯＡｃ　（０．５　Ｍ），ＥＤＴＡ　（１　ｍＭ），（ｐＨ８．０），ＰＣＲ精製後　（１５０μｌ），Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ後　（１００μｌ））を加え、３７℃で一晩放置した。１５，０００　ｒｐｍで２分間遠心後、上清のみをＳＵＰＲＥＣに回収してこれを１５，０００　ｒｐｍで２分間遠心した。残ったゲルに再びｅｌｕｔｉｏｎ　ｂｕｆｆｅｒ　（ＰＣＲ精製後　（４０μｌ），Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ後　（２０μｌ）を加えて３７℃で１時間放置し、上清をゲルごと再度先程のＳＵＰＲＥＣに回収し、１５，０００　ｒｐｍで２分間遠心した。残ったゲルカスにｅｌｕｔｉｏｎ　ｂｕｆｆｅｒ　（１０μｌ）を再度加え、これを再び先程のＳＵＰＲＥＣに回収し、１５，０００　ｒｐｍで２分間遠心した。回収した上清にＱＩＡＧＥＮのＤＮＡ抽出キット　（ＱＩＡＥＸＩＩ）のＢｕｆｆｅｒ　ＱＸ１をＤＮＡ溶液の６倍量とＱＩＡＥＸＩＩ（１０μｌ）を加え、２分毎に５回攪拌してＤＮＡを樹脂に吸着させた。これを１５，０００ｒｐｍで２分間遠心し、上清を廃棄して樹脂のみを回収した。回収した樹脂にＷａｓｈ　Ｂｕｆｆｅｒ　（Ｂｕｆｆｅｒ　ＰＥ，５００μｌ）を加えてＶｏｒｔｅｘを行って洗浄し、１５，０００ｒｐｍで１分間遠心してＷａｓｈ　Ｂｕｆｆｅｒのみを廃棄した。この洗浄は２回繰り返した。樹脂を自然乾燥後、１／１０×ＴＥを２０μｌ加えてＶｏｒｔｅｘを行い３０分間静置して１／１０×ＴＥ緩衝液　（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　（１０　ｍＭ），ＥＤＴＡ　（１　ｍＭ））にＤＮＡを溶出させた後に１５，０００　ｒｐｍで２分間遠心し、上清をＳＵＰＲＥＣに回収してこれを１５，０００　ｒｐｍで２分間遠心して目的の二本鎖ＤＮＡを回収した。この溶出は２回繰り返した。
【００４４】
ＰＣＲによる選択されたＤＮＡの増幅
回収したＤＮＡにＰＣＲ反応条件下（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液　（５　ｍＭ，（ｐＨ８．２）），　ＥＤＴＡ　（０．０１ｍＭ），ＤＴＴ　（０．１　ｍＭ），Ｔｗｅｅｎ　（０．０１　％），Ｎｏｎｉｄｅｔ　Ｐ−４０　（０．０１　％），　Ｇｌｙｃｅｒｏｌ　（５　％），ｄＮＴＰ　Ｍｉｘｔｕｒｅ　（０．２　ｍＭ），ｓｕｃｒｏｓｅ　（６　％））にテンプレートである二本鎖ＤＮＡ　（４μｌ），ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　（０．５μｌ），プライマーＤ　（２０　ｐｍｏｌ，５’−ＡＧＡＣＧＧＡＴＣＣＡＴＴＡＧ−３’）を加え、更にラベル化したプライマーＥとラベル化していないプライマーＥの総量が２０　ｐｍｏｌになるように加えた。反応液の体積は１００μｌになるように調整した。調整後Ｍｉｎｅｒａｌ　ｏｉｌ　（７５μｌ）を加え、ＰＣＲサイクル（９４℃　３０　ｓ，５２℃３０　ｓ，７３℃　１　ｍ）を１５回繰り返し、ランダムＤＮＡプールの作製時と同様にフェノール処理、クロロホルム処理、エタノール沈澱、エタノールリンスを行い、ゲルシフトアッセイにより精製した。
【００４５】
ＳＡＡＢ法により選択されたＤＮＡのプラスミドへのクローニング
ＳＡＡＢ法によるセレクション後の二本鎖ＤＮＡをｃｏｌｄ　ｐｒｉｍｅｒを用いてＰＣＲ法で増幅させ、ゲルシフトで精製した二本鎖ＤＮＡに反応条件下（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液　（１０　ｍＭ，ｐＨ　７．５），　ＭｇＣｌ２　（０．７　ｍＭ），２−ＭＥ　（０．７　ｍＭ），ＮａＣｌ　（５　ｍＭ），ＢＳＡ　（０．００１　％）で制限酵素Ｂａｍ　ＨＩ　（５μｌ）およびＥｃｏ　ＲＩ　（５μｌ）をそれぞれ加え、３７℃で２時間インキュベートし、二本鎖ＤＮＡを切断した。この際の反応液の総体積は１００μｌとした。その後ランダムＤＮＡプールの作製時と同様にフェノール処理、クロロホルム処理、エタノール沈澱、エタノールリンスを行い、スピードバックで減圧乾燥を行った。制限酵素処理を行ったインサートＤＮＡを５　ｎｇ／μｌに調整し、これを予めＢａｍ　ＨＩおよびＥｃｏ　ＲＩで同様に制限酵素処理しておいたｐＵＣ１９に濃度がそれぞれ１倍、４倍、１０倍になるように加え、ＤＮＡ溶液と同体積のＴａＫａＲａのＬＩＧＡＴＩＯＮ　ＫＩＴ　Ｖｅｒ．２のＩ液を加え、１６℃で３０分間反応させた。反応液の内の１μｌを予め分注しておいたコンピテントセル　ＤＨ５αＴＭ　（２０μｌ）に加え、氷中で３０分間放置した後、４２℃で９０秒、氷中に２分間置き、ＳＯＣ　（１８０μｌ）を加えて、３７℃で１時間攪拌した。その内の１００μｌをＬＢ−Ａｍｐプレートにまき、３７℃で一晩コロニーを培養した。
【００４６】
予めＬＢ　（５　ｍｌ），Ａｍｐ　（５μｌ）分注しておいた栄研の丸底スピッツに、プレート内で培養したコロニーを殖菌し、３７℃で一晩、攪拌しながら培養した。培養後、栄研スピッツを２０００ｒｐｍで２０分間遠心した後、上清を廃棄した。そこにＱＩＡＧＥＮのＱＩＡｐｒｅｐ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　ＫＩＴのＢｕｆｆｅｒ　Ｐ１　（２５０μｌ）を加えて攪拌し、大腸菌を溶解させた。１．５ｍｌのエッペンチューブに移した後、Ｂｕｆｆｅｒ　Ｐ２　（２５０μｌ）、Ｂｕｆｆｅｒ　Ｎ３（３５０μｌ）を加えて攪拌し、１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心した。予めＱＩＡｐｒｅｐ　ｓｐｉｎ　ｃｏｌｕｍｕを挿した２ｍｌ　ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　ｔｕｂｅに遠心後の上清のみを加え、１５，０００ｒｐｍで１分間遠心した。ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　ｔｕｂｅの透過液を廃棄後、Ｂｕｆｆｅｒ　ＰＥ　（７５０μｌ）を加え１５，０００ｒｐｍで１分間遠心し、ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　ｔｕｂｅの透過液を再度廃棄した。更に残留物を除去するために１５，０００ｒｐｍで１分間遠心し、ＱＩＡｐｒｅｐ　ｓｐｉｎ　ｃｏｌｕｍｕを１．５ｍｌのエッペンチューブに挿した。ＱＩＡｐｒｅｐ　ｓｐｉｎ　ｃｏｌｕｍｕにＴｒｉｓ（１０ｍＭ，（ｐＨ８．０），５０μｌ）を加えて１分間静置後、１５，０００ｒｐｍで１分間遠心して目的の二本鎖ＤＮＡを回収した。この回収は２回繰り返した。
【００４７】
ＳＡＡＢ法により選択されたＤＮＡの塩基配列決定
回収したプラスミド　（５００　ｎｇ），シークエンス用のプライマー（Ｍ１３−ＲＶ，３．２ｐｍｏｌ，０．５μｌ），プレミックス　（５×Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｂｕｆｆｅｒ，ｄＮＴＰ　ｍｉｘ，ＤｙｅＤｅｏｘｙ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｓ，ＡｍｐｌｉＴａｑ，ＦＳ，４μｌ）の総量を１０μｌとし、ＰＣＲサイクル（９６℃　３０　ｓ，５０℃　１５　ｓ，６０℃　４　ｍ）を２５回繰り返した。ＰＣＲ後の反応液に５％　ＣＴＡＢ　／　０．５Ｍ　ＮａＣｌ　（１．２５μｌ）を加えて１５，０００　ｒｐｍで３分間遠心し上清を捨てた。沈澱物にＮａＣｌ　（１．２　Ｍ，２５μｌ）を加えてＶｏｒｔｅｘし、エタノール　（６２．５μｌ）を加えて再び１５，０００　ｒｐｍで３分間遠心して上清を廃棄した。更に、沈澱物に７０％エタノール　（２５０μｌ）を加えてＶｏｒｔｅｘし、１５，０００　ｒｐｍで３分間遠心して上清を捨てて得た沈澱物をスピードバックで減圧乾燥した（ＣＴＡＢ沈澱法）。乾燥後、ローディングバッファー（脱イオンホルムアミド：ローディング・ダイ＝５：１，３μｌ）に溶解させ、９５℃で２分間ヒートショックを行い、加熱後すぐにサンプルを氷上に置き急冷した。このサンプルの全量の内１．５μｌを予め１２００　ＶでＰｒｅ−ｒｕｎしておいたシークエンス用ゲルに直接ロードし、ＴＢＥ緩衝溶液中（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　（１００　ｍＭ），ｂｏｒｉｃ　ａｃｉｄ　（１００　ｍＭ），ＥＤＴＡ　（０．５　ｍＭ））で１２００　Ｖで７時間泳動し、選択された塩基配列の決定を行った。
【００４８】
シークエンス用ゲル（４　％アクリルアミド、６　Ｍ尿素、１×ＴＢＥゲル）の作製
ＵＲＥＡ　（１８．０　ｇ），Ｓｔｏｃｋ溶液（５０％　Ｓｕｐｅｒ　Ｒｅａｄｉｎｇ　ＤＮＡ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ，５．０　ｍｌ），１０×ＴＢＥ　（５．０　ｍｌ），Ｍｉｌｌ−Ｑ水　（２２　ｍｌ）を攪拌し、５０　ｍｌにメスアップした。この溶液をろ過、脱気後、１０％　ＡＰＳ　（２５０μｌ）およびＴＥＭＥＤ　（２５μｌ）を加えて攪拌してゲル板に流し込み、約３時間硬化させて使用した。
【００４９】
【発明の効果】
本発明方法によって、新しく合成したペプチド、オリゴ糖類、有機分子の認識ＤＮＡ配列を簡便に決定することが出来る。本研究の成果によって、ＤＮＡを標的とする薬剤の開発や新しいＤＮＡチップ素子の開発が効率的に遂行できることが期待される。またＤ−体アミノ酸からなるＤＮＡ結合ペプチドは、新しい遺伝子をターゲットとした医薬のリード化合物となることが期待される。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＧＣＮ４のベーシックリージョンＧ２３のＣ末端にアダマンタン（Ａｄ）を導入したＧ２３Ａｄと、非天然アミノ酸を含む新しいＤＮＡ認識ペプチドとして、Ｇ２３を構成するアミノ酸が光学異性体であるＤ体のアミノ酸であるＤＧ２３のＣ末端にβ−シクロデキストリン（Ｃｄ）を導入したＤＧ２３Ｃｄを示す。
【図２】本発明方法の結合・選択・増幅実験を示す。
【図３】認識配列が未知であるＤＧ２３Ｃｄ／Ｇ２３Ａｄペプチド二量体についてＳＡＡＢサイクルを重ね、認識ＤＮＡ配列の決定を行った様子を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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