(57)【要約】【課題】糖尿病治療又は予防に有用な新規化合物を提供すること。【解決手段】下記式（Ｉ）【化１】2004307426.tif 000005で表される化合物又はその塩。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（Ｉ）
【化１】
2004307426.tif 000004
で表される化合物又はその塩。
【請求項２】
下記の物理化学的性状を有する化合物又はその塩。
１）性質：黄色粉末；
２）溶解性：クロロホルム、メタノール、アセトン、酢酸エチルに可溶；
３）分子式：Ｃ１１Ｈ１２Ｏ５（ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳスペクトルにより測定）；
４）分子量：  ２２４．１（ＥＳＩ−ＭＳスペクトルにより測定）；
５）紫外線吸収スペクトル：λｍａｘ  ｎｍ（ε）
０．０１Ｎ塩酸−メタノール溶液中で測定した紫外線吸収スペクトルは、２０４（１２３００）、２７６（１４６００）、４２０（７５０）ｎｍに吸収極大を示す；
６）赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ）：νｍａｘ  ｃｍ−１
ＫＢｒディスクで測定した赤外線吸収スペクトルは、次の通りである：
３４６８、１６６１、１６２４、１３１９、１２７０、１２２９、１１８１、１１０３、１０４１、８７０、７８５、７２１；
７）１Ｈ−核磁気共鳴スペクトル；  δ（ｐｐｍ）
重クロロホルム溶液中（ＴＭＳ内部標準  ）で測定した核磁気共鳴スペクトル（５００ＭＨｚ）は、次の通りである：
１．６０（３Ｈ，ｓ），１．９３（３Ｈ，ｓ），２．４５（１Ｈ，ｄｔ，１８．５  Ｈｚ），２．７１（１Ｈ，ｄｑ，１８．５  Ｈｚ），４．６１（２Ｈ，ｍ）；
８）１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトル；  δ（ｐｐｍ）
重クロロホルム溶液中（ＴＭＳ内部標準  ）で測定した核磁気共鳴スペクトル（１２５ＭＨｚ）は、次の通りである：
７．７，２９．４，３０．８，５８．２，９４．４，１１６．８，１３２．９，１４１．１，１５１．０，１８２．０，１８６．１
１０）高速液体クロマトグラフィー：
カラム  ：  Ｗａｔｅｒｓ  ＳＹＭＭＥＴＲＹ  Ｃ１８（直径４．６×長さ１５０ｍｍ：ウォーターズ社製）
移動相  ：  ２２％アセトニトリル水−０．０２％ＨＣＯＯＨ
流  速  ：  １．０ｍｌ／分
検出波長：  ２１０ｎｍ
保持時間：  ４．５分。
【請求項３】
コニオケチジウム（Ｃｏｎｉｏｃｈａｅｔｉｄｉｕｍ）属に属する、請求項１又は２に記載の化合物の生産菌を培養し、得られた培養物より請求項１又は２に記載の化合物を回収することを特徴とする、請求項１又は２に記載の化合物の製造方法。
【請求項４】
コニオケチジウム（Ｃｏｎｉｏｃｈａｅｔｉｄｉｕｍ）属に属する、請求項１又は２記載の化合物の生産菌が、コニオケチジウム・セイヴェリ（Ｃｏｎｉｏｃｈａｅｔｉｄｉｕｍ  ｓａｖｏｒｙｉ）ＳＡＮＫ  ２７２８１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１４３）であることを特徴とする、請求項３に記載の製造方法。
【請求項５】
コニオケチジウム・セイヴェリ（Ｃｏｎｉｏｃｈａｅｔｉｄｉｕｍ  ｓａｖｏｒｙｉ．）ＳＡＮＫ  ２７２８１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１４３）。
【請求項６】
請求項１又は２に記載の化合物もしくはその塩を含有することからなる医薬。
【請求項７】
請求項１又は２に記載の化合物もしくはその塩を有効成分として含有することからなる糖尿病治療又は予防剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規化合物又はその塩、該化合物の製造方法、該化合物の生産菌、該化合物又はその塩を有効成分として含有することからなる医薬、該化合物又はその塩を含有することからなる糖尿病治療又は予防剤等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生体内に存在する唯一の血糖降下ホルモンと考えられているインスリンは、筋肉、肝臓、脂肪細胞又はその他のインスリン標的組織細胞の膜表面上に存在する、チロシンキナーゼ型受容体に結合して該受容体を活性化することにより、血糖降下作用を発揮する（非特許文献１：非特許文献２）。
【０００３】
血糖の関与する主要な疾患である糖尿病のうち、インスリン産生細胞であるすい臓のベータ細胞の機能不全によって起こるインスリン依存性糖尿病（以下、「Ｉ型糖尿病」という）は、インスリン注射剤によって治療され得る（非特許文献３）。インスリンに対する感受性が低下して起こるインスリン非依存性糖尿病（以下、「ＩＩ型糖尿病」という）は、糖尿病患者の大部分が罹患している疾患であるが、その治療にもインスリン注射剤が使用されている。
【０００４】
注射剤は、一般に、投与の煩雑さと患者の負担が問題となるが、インスリンを注射剤として投与する場合、それらに加え、体重増加や急激な血糖低下による昏睡状態の出来等の副作用が懸念される（非特許文献４）。インスリン注射剤にかかる諸問題を回避する目的でインスリン分泌を促進し得るスルホニルウレア剤、インスリン抵抗性を改善し得るチアゾリジンジオン系薬剤、糖の消化吸収を抑制し得るグリコシダーゼ阻害剤、肝臓での糖新生を抑制し得るビグアナイド系薬剤等が、経口投与可能なＩＩ型糖尿病治療薬として臨床において使用されている（非特許文献５）。しかしながら、それらの経口投与可能な医薬は、いずれもインスリンの受容体には直接作用せず、他の生体内蛋白質に作用して薬理作用を発揮するため、血糖降下作用以外の副作用が問題となり易く、長期間投与による薬理作用の減弱も報告されている（非特許文献６）。
【０００５】
一方、インスリンによるインスリン受容体の活性化を増強する物質及び単独でインスリン・シグナル伝達の活性化を増強する物質は、前述のインスリン受容体に直接作用しない経口投与可能な医薬と比較して、よりインスリンに近い作用を示し、それ故副作用の少ない医薬であることが期待されている（非特許文献７）。そのような物質のうち、外から生体に投与されたインスリンの作用も増強する物質は、Ｉ型糖尿病およびＩＩ型糖尿病のいずれの治療又は予防にも有用であることが期待される。
【０００６】
インスリンによるインスリン受容体の活性化を増強するかあるいは単独でインスリン・シグナル伝達の活性化を増強する低分子の化合物としては、ベンゾキノン誘導体（非特許文献８）、クマリン誘導体（特許文献１：特許文献２）等が知られているが、いずれも薬理作用が十分とは言えず、人体における薬理作用については未だ不明であり、実用化には至っていない。
【０００７】
【特許文献１】
国際公開第９７／１８８０８号パンフレット
【特許文献２】
特表２０００−５００４９０号公報
【非特許文献１】
ホワイト（Ｗｈｉｔｅ，  Ｍ．Ｆ．）および  カーン（Ｋａｈｎ，  Ｃ．Ｒ．）、「ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、２６９巻、ｐｐ１−４、１９９４年
【非特許文献２】
サルティエル（Ｓａｌｔｉｅｌ，  Ａ．Ｒ．）およびカーン（Ｋａｈｎ，  Ｃ．Ｒ．）、「ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）」、４１４巻、ｐｐ７９９−８０６、２００１年
【非特許文献３】
アトキンソン（Ａｔｋｉｎｓｏｎ，  Ｍ．Ａ．）およびアイゼンバース（Ｅｉｓｅｎｂａｒｔｈ，  Ｇ．Ｓ．）、「ザ・ランセット（Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ）」、３５８巻、ｐｐ２２１−２２９、２００１年
【非特許文献４】
ザ・ユーケー・プロスペクティブ・ダイアビーティーズ・スタディ・グループ（Ｔｈｅ  ＵＫ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｓｔｕｄｙ  Ｇｒｏｕｐ）、「ザ・ランセット（Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ）」、３５２巻、ｐｐ８３７−８５３、１９９８年
【非特許文献５】
ブーズ（Ｂｕｓｅ，  Ｊ．）、「ザ・アメリカン・ジャーナル・オブ・メディシン（Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）」、１０８巻、６Ａ号、サプルメント１、ｐｐ２３Ｓ−３２Ｓ、２０００年
【非特許文献６】
ザ・ユーケー・プロスペクティブ・ダイアビーティーズ・スタディ・グループ（Ｔｈｅ  ＵＫ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｓｔｕｄｙ  Ｇｒｏｕｐ）、「ダイアビーティーズ（Ｄｉａｂｅｔｅｓ）」、４４巻、ｐｐ１２４９−１２５８、１９９５年
【非特許文献７】
モラー（Ｍｏｌｌｅｒ，  Ｄ．Ｅ．）、「ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）」、４１４巻、ｐｐ８２１−８２７、２００１年
【非特許文献８】
ツァン（Ｚｈａｎｇ，  Ｂ．）ら、「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、２８４巻、ｐｐ９７４−９７７、１９９９年
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らは、生体内でインスリンと同様の作用を示す新規なＩ型及び／又ＩＩ型は糖尿病治療薬を開発するべく、新規な化合物の探索を鋭意実施した。その結果、土壌より分離されたたコニオケチジウム・セイヴェリ（Ｃｏｎｉｏｃｈａｅｔｉｄｉｕｍ  ｓａｖｏｒｙｉ．）  ＳＡＮＫ  ２７２８１株の培養液中に、インスリン依存性の細胞蛋白質チロシンリン酸化を増強する新規化合物を見出した。次いで、該化合物が、インスリンと同様に、脂肪細胞による糖の取り込みを促進することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明は、
（１）
下記式（Ｉ）
【００１０】
【化２】
2004307426.tif 000002
【００１１】
で表される化合物又はその塩、
（２）
下記の物理化学的性状を有する化合物又はその塩。
１）性質：黄色粉末；
２）溶解性：クロロホルム、メタノール、アセトン、酢酸エチルに可溶；
３）分子式：Ｃ１１Ｈ１２Ｏ５（ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳスペクトルにより測定）；
４）分子量：  ２２４．１（ＥＳＩ−ＭＳスペクトルにより測定）；
５）紫外線吸収スペクトル：λｍａｘ  ｎｍ（ε）
０．０１Ｎ塩酸−メタノール溶液中で測定した紫外線吸収スペクトルは、２０４（１２３００）、２７６（１４６００）、４２０（７５０）ｎｍに吸収極大を示す；
６）赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ）：νｍａｘ  ｃｍ−１
ＫＢｒディスクで測定した赤外線吸収スペクトルは、次の通りである：
３４６８、１６６１、１６２４、１３１９、１２７０、１２２９、１１８１、１１０３、１０４１、８７０、７８５、７２１；
７）１Ｈ−核磁気共鳴スペクトル；  δ（ｐｐｍ）
重クロロホルム溶液中（ＴＭＳ内部標準  ）で測定した核磁気共鳴スペクトル（５００ＭＨｚ）は、次の通りである：
１．６０（３Ｈ，ｓ），１．９３（３Ｈ，ｓ），２．４５（１Ｈ，ｄｔ，１８．５  Ｈｚ），２．７１（１Ｈ，ｄｑ，１８．５  Ｈｚ），４．６１（２Ｈ，ｍ）；
８）１３Ｃ−核磁気共鳴スペクトル；  δ（ｐｐｍ）
重クロロホルム溶液中（ＴＭＳ内部標準  ）で測定した核磁気共鳴スペクトル（１２５ＭＨｚ）は、次の通りである：
７．７，２９．４，３０．８，５８．２，９４．４，１１６．８，１３２．９，１４１．１，１５１．０，１８２．０，１８６．１
１０）高速液体クロマトグラフィー：
カラム  ：  Ｗａｔｅｒｓ  ＳＹＭＭＥＴＲＹ  Ｃ１８（直径４．６×長さ１５０ｍｍ：ウォーターズ社製）
移動相  ：  ２２％アセトニトリル水−０．０２％ＨＣＯＯＨ
流  速  ：  １．０ｍｌ／分
検出波長：  ２１０ｎｍ
保持時間：  ４．５分、
（３）
コニオケチジウム（Ｃｏｎｉｏｃｈａｅｔｉｄｉｕｍ）属に属する、（１）又は（２）に記載の化合物の生産菌を培養し、得られた培養物より（１）又は（２）に記載の化合物を回収することを特徴とする、（１）又は（２）に記載の化合物の製造方法、（４）
コニオケチジウム（Ｃｏｎｉｏｃｈａｅｔｉｄｉｕｍ）属に属する、（１）又は（２）記載の化合物の生産菌が、コニオケチジウム・セイヴェリ（Ｃｏｎｉｏｃｈａｅｔｉｄｉｕｍ  ｓａｖｏｒｙｉ）  ＳＡＮＫ  ２７２８１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１４３）であることを特徴とする、（３）に記載の製造方法、
（５）
コニオケチジウム・セイヴェリ（Ｃｏｎｉｏｃｈａｅｔｉｄｉｕｍ  ｓａｖｏｒｙｉ．）ＳＡＮＫ  ２７２８１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１４３）、
（６）
（１）又は（２）に記載の化合物もしくはその塩を含有することからなる医薬、及び、
（７）
（１）又は（２）に記載の化合物もしくはその塩を有効成分として含有することからなる糖尿病治療又は予防剤、
に関する。
【００１２】
本発明において、上記（１）又は（２）に記載の化合物を、Ｓ２７２８１化合物と呼ぶ。
【００１３】
本発明のＳ２７２８１化合物は、種々の異性体を有する。本発明においては、これらの異性体がすべて単一の式で示されているが、本発明はラセミ化合物を含むこれらの異性体およびこれらの異性体の混合物も全て含むものである。立体特異的合成法が使用されるかあるいは光学活性化合物が合成原料として使用される場合、個々の異性体を直接的に製造してもよく、また、先ず異性体の混合物を製造し、次いで該混合物より所望の異性体を単離精製してもよい。
【００１４】
本発明のＳ２７２８１化合物は、当業者に周知の方法を用いて塩にすることができる。本発明のＳ２７２８１化合物には、そのようなＳ２７２８１化合物の塩も包含される。Ｓ２７２８１化合物の塩としては、医学的に使用され、薬理学的に許容されるものであれば特に限定はない。なお、Ｓ２７２８１化合物の塩が医薬以外の用途に用いられる場合、例えば中間体として使用される場合には、何ら限定はない。そのような塩としては、好適にはナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩のようなアルカリ金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩のようなアルカリ土類金属塩；アルミニウム塩、鉄塩、亜鉛塩、銅塩、ニッケル塩、コバルト塩等の金属塩；アンモニウム塩のような無機塩；ｔ−オクチルアミン塩、ジベンジルアミン塩、モルホリン塩、グルコサミン塩、フェニルグリシンアルキルエステル塩、エチレンジアミン塩、Ｎ−メチルグルカミン塩、グアニジン塩、ジエチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン塩、クロロプロカイン塩、プロカイン塩、ジエタノールアミン塩、Ｎ−ベンジル−フェネチルアミン塩、ピペラジン塩、テトラメチルアンモニア塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩のような有機塩等のアミン塩；および、グリシン塩、リジン塩、アルギニン塩、オルニチン塩、アスパラギン塩のようなアミノ酸塩を挙げることができる。より好適には、薬理学的に許容される塩として好ましく使用されるもの、すなわち、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、カルシウム塩およびマグネシウム塩等を挙げることができる。
【００１５】
また、本発明のＳ２７２８１化合物又はその塩は、溶剤和物となることがある。例えば、該化合物を大気中に放置するかあるいは再結晶を行うことにより、水分を吸収して吸着水が付加したり水和物となることがある。本発明のＳ２７２８１化合物には、水和物のごとき溶剤和物も包含される。
【００１６】
さらに本発明のＳ２７２８１化合物には、生体内において代謝されてＳ２７２８１化合物に変換される化合物、いわゆるプロドラッグも全て含まれる。
【００１７】
【発明の実施の形態】
本発明のＳ２７２８１化合物の製造に供される該化合物生産菌は、Ｓ２７２８１化合物を生産する菌株であれば特に限定されないが、例えば、コニオケチジウム（Ｃｏｎｉｏｃｈａｅｔｉｄｉｕｍ）属に属する、Ｓ２７２８１化合物の生産菌等を挙げることができ、好適にはコニオケチジウム・セイヴェリ（Ｃｏｎｉｏｃｈａｅｔｉｄｉｕｍ  ｓａｖｏｒｙｉ）、より好適にはコニオケチジウム・セイヴェリ（Ｃｏｎｉｏｃｈａｅｔｉｄｉｕｍ  ｓａｖｏｒｙｉ）  ＳＡＮＫ  ２７２８１株（以下、単に「ＳＡＮＫ  ２７２８１株」という。）を挙げることができる。
【００１８】
土壌より分離されたＳＡＮＫ  ２７２８１株の菌学的性状を観察するため、次に記載の組成を有する各培地上で培養を行った。
［ＰＤＡ（ホ゜テト・テ゛キストロース寒天（Ｐｏｔａｔｏ  Ｄｅｘｔｒｏｓｅ  Ａｇａｒ））培地］
ニッスイ  ホ゜テトテ゛キストロース寒天培地
（日水製薬（株）製）                                ３９ｇ
蒸留水                                          １０００ｍｌ
［ＣＭＡ培地（コーンミール寒天（Ｃｏｒｎ  Ｍｅａｌ  Ａｇａｒ））培地］
コーンミールアカ゛ール（日水製薬（株）製）          １７ｇ
蒸留水                                          １０００ｍｌ
［ＷＳＨ培地］
オートミール                                        １０ｇ
硫酸マグネシウム七水和物                              １ｇ
リン酸二水素カリウム                                  １ｇ
硝酸ナトリウム                                        １ｇ
寒天                                                ２０ｇ
蒸留水                                          １０００ｍｌ
色調の表示は「メチューン・ハンドブック・オブ・カラー（Ｋｏｒｎｅｒｕｐ  Ａ，  Ｗａｎｓｃｈｅｒ  ＪＨ．  １９７８．  Ｍｅｔｈｕｅｎ  ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  ｃｏｌｏｕｒ（３ｒｄ．  ｅｄｉｔｉｏｎ）．  ＥｒｙｅＭｅｔｈｕｅｎ，  Ｌｏｎｄｏｎ）」に従った。
【００１９】
ＳＡＮＫ  ２７２８１株の培養下での菌学的性状は次の通りである。
【００２０】
ＰＤＡ培地上での成長は、２３℃、１週間の培養で直径７５乃至７８ｍｍである。コロニーは中央部で放射状の溝を有し薄い。コロニー表面は、オレンジ（５Ａ７）である。裏面はオレンジ（５Ａ７）乃至ライトイエロー（４Ａ５）である。
【００２１】
ＣＭＡ培地上での成長は、２３℃、１週間の培養で直径６０乃至６２ｍｍである。コロニーは平坦で薄い。コロニー表面はイエロイッシュオレンジ（４Ａ２）である。裏面はイエロイッシュオレンジ（４Ａ２）である。
【００２２】
ＷＳＨ培地上での成長は、２３℃、１週間の培養で直径７０乃至７４ｍｍである。コロニーは平坦で薄い。コロニー表面はライトイエロー（４Ａ４）である。裏面はライトイエロー（４Ａ４）である。
【００２３】
ＳＡＮＫ  ２７２８１株は、培養を継続することによりＷＳＨ培地上に子のう果を形成した。その菌学的性状は次の通りである。
【００２４】
子のう果は直径７０乃至１４０μｍ、寒天培地上に表在乃至潜在し、球形乃至亜球形で孔口はなく、褐色乃至黒色である。殻壁は厚さ６乃至１５μｍ、多角形の細胞で構成され膜質、淡褐色乃至褐色である。子のうは４胞子を含み、１重壁で壁は成熟時に消失する。子のう胞子は１８乃至２２×８乃至１２μｍ、両端がやや細まった楕円形乃至やや紡錘形、表面は小孔で覆われ、側面の全長にわたって１本の発芽スリットを生じ、淡褐色乃至暗褐色である。分生子は形成しない。
【００２５】
子のう果に孔口がなく子のうは１重壁、子のう胞子は単細胞、暗褐色で発芽スリットを有することから、フォンアークスの文献（Ａｒｘ  ＪＡ  ｖｏｎ．  １９７５．  Ｏｎ  Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ａｎｄ  ｓｏｍｅ  ｓｉｍｉｌａｒ  ｇｅｎｅｒａ  ｏｆ  Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ．  Ｓｔｕｄ．  Ｍｙｃｏｌ．  ８：１−２９）にしたがい、コニオケチジウム属に属すると考えられた。さらに、子のうは４胞子を含み、子のう胞子は１８乃至２２×８乃至１２μｍで楕円形乃至やや紡錘形、また分生子を形成しないことから、フォンアークスや宇田川と古谷の文献（Ｕｄａｇａｗａ  Ｓ，  Ｆｕｒｕｙａ  Ｋ．  １９７５．  Ｔｒａｎｓ．  Ｍｙｃｏｌ．  Ｓｏｃ．  Ｊａｐａｎ．  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｆｕｎｇｕｓ  ｆｌｏｒａ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ  １６：２１５−２２１）に従い、ＳＡＮＫ  ２７２８１株をコニオケチジウム・セイヴェリ（Ｃｏｎｉｏｃｈａｅｔｉｄｉｕｍ  ｓａｖｏｒｙｉ）と同定した。
【００２６】
該株は、コニオケチジウム・セイヴェリ（Ｃｏｎｉｏｃｈａｅｔｉｄｉｕｍ  ｓａｖｏｒｙｉ）  ＳＡＮＫ  ２７２８１として、平成１４年８月６日付けで、日本国茨城県つくば市東１−１−１中央第６に所在する独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに国際寄託され、受託番号  ＦＥＲＭ  ＢＰ−８１４３を付与された。
【００２７】
周知の通り、真菌類は自然界において、または人工的な操作（例えば、紫外線照射、放射線照射、化学薬品処理等）により、変異を起こしやすく、本発明の提供するＳＡＮＫ  ２７２８１株も同様である。本発明において、ＳＡＮＫ  ２７２８１株は、その全ての変異株を包含する。また、これらの変異株の中には、遺伝的方法、たとえば組み換え、形質導入、形質転換等によりえられたものも包含される。即ち、Ｓ２７２８１化合物を生産する、ＳＡＮＫ  ２７２８１株、それらの変異株およびそれらと明確に区別されない菌株は、全てＳＡＮＫ  ２７２８１株に包含される。
【００２８】
Ｓ２７２８１化合物の製造を目的とした該化合物生産菌の培養は、通常発酵生成物を生産するために使用される培地を用いて行うことができる。このような培地には、微生物が同化し得る炭素源、窒素源および無機塩が含まれる。
【００２９】
炭素源としては、グルコース、フルクトース、マルトース、シュークロース、マンニルトース、グリセリン、デキストリン、オート麦、ライ麦、トウモロコシデンプン、ジャガイモ、トウモロコシ粉、綿実油、糖蜜、クエン酸、酒石酸等を単一に、あるいは併用して用いることができる。培地の炭素源含量は、通常、培地量の１乃至１０重量％で変量する。
【００３０】
窒素源としては、蛋白質若しくはその加水分解物を含有する物質又は無機塩を用い、大豆粉、フスマ、落花生粉、綿実油、カゼイン加水分解物、ファーマミン、魚粉、コーンスチープリカー、ペプトン、肉エキス、イースト、イーストエキス、マルトエキス、硝酸ナトリウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム等を例示することができる。これらの窒素を単一であるいは併用して培地に含有せしめる場合の量は、通常培地量の０．２乃至１０重量％の範囲で変量する。
【００３１】
栄養無機塩としては、ナトリウム、アンモニウム、カルシウム、フォスフェート、サルフェート、クロライド、カーボネート等のイオンを得ることのできる通常の塩類を広く用いることができる。カリウム、カルシウム、コバルト、マンガン、鉄、マグネシウム等の金属も培地に微量含まれ得る。
【００３２】
液体培養に際しては、シリコン油、植物油、界面活性剤等が、消泡剤として使用される。
【００３３】
Ｓ２７２８１化合物の製造を目的として該化合物生産菌を液体培養する際の液体培地のｐＨは、特に限定されるものではないが、通常５．０乃至８．０である。
【００３４】
Ｓ２７２８１化合物生産菌の生育温度は、特に限定されるものではないが、通常１５乃至３０℃であり、好適には２０乃至２６℃である。また、Ｓ２７２８１化合物の製造を目的として該化合物生産菌を培養する際の温度は、特に限定されないが、通常１５乃至３０℃であり、好適には２０℃乃至２６℃である。Ｓ２７２８１化合物の製造を目的としてＳＡＮＫ  ２７２８１株を培養する際のより好適な温度は、２３℃である。
【００３５】
Ｓ２７２８１化合物は、該化合物生産菌を好気的な条件下で培養することにより製造することができる、好気的条件下の培養方法としては、、通常当該分野において使用される好気的培養方法であれば特に限定されないが、例えば、固体培養法、振とう培養法、通気攪拌培養法等を挙げることができる。
Ｓ２７２８１化合物を比較的大量に製造するための該化合物生産菌の培養は、通常、小規模な培養から開始し、段階的に培養規模を拡大することが好ましい。まず、少量の種培地を用いた前培養から初め、段階的に培養の規模を拡大し、多量の栄養培地に必要量の前培養液を接種することにより本培養を行うことができる。例えば、ＳＡＮＫ  ２７２８１株のスラントから、少量の種培地を入れた三角フラスコへ該株を接種し、２３℃にて数日間振盪培養を行い、該株を十分成長させる。必要に応じ、該前培養の規模を段階的に拡大した後、得られた培養物の全量又は必要量を栄養培地へ接種し、本培養を行う。
【００３６】
Ｓ２７２８１化合物生産菌を大量に培養するに際し、攪拌機又は通気装置を有するタンクを使用すれば、本培養用の栄養培地をタンクの中で調製し、滅菌することが可能であり好ましい。通常、栄養培地の滅菌温度は１２１℃であり、滅菌後培地が十分冷却してから前培養物を接種し、前述の温度にて通気攪拌培養を行う。
【００３７】
そのようなＳ２７２８１化合物生産菌の培養における該化合物量の経時変化は、生物学的試験あるいは分析化学的試験を用いて追跡することができる。生物学的試験にはインスリン依存性の細胞蛋白質チロシンリン酸化試験、脂肪細胞による糖取り込み試験等が、分析化学的試験には高速液体クロマトグラフィーや薄層クロマトグラフィー等がそれぞれ含まれる。そのような試験を実施するに際しては、予め、被検試料に抽出、分画、脱塩等の前処理を施しておくことが好ましい。
【００３８】
なお、ＳＡＮＫ  ２７２８１株によるＳ２７２８１化合物の生産は、通常培養開始から１５０乃至２００時間が経過した時点で最高値に達する。
【００３９】
培養物の可溶性画分と不溶性画分は、培養終了後、珪藻土等のろ過助剤を添加し、ろ過するか、又は、遠心分離を行うことにより分別することができる。得られたろ液、培養上清、菌体等に含まれるＳ２７２８１化合物は、その物理化学的性状を利用することにより、抽出、単離および精製することができる。
【００４０】
Ｓ２７２８１化合物をろ液、培養上清、菌体等から抽出するには、水と混和しないｎ−ブタノール、酢酸エチル、メチレンクロライド等の有機溶剤を単独で用いるか、あるいはそれら複数を組み合せて用いることができる。
【００４１】
得られた抽出物からＳ２７２８１化合物を精製するには、活性炭、アンバーライトＸＡＤ−２、ＸＡＤ−４（以上、ローム・アンド・ハース社製）、ダイヤイオンＨＰ−１０、ＨＰ−２０、ＨＰ−５０、ＣＨＰ２０Ｐ（以上、三菱化学（株）社製）のごとき吸着剤、ダウエックス５０Ｗｘ４、ダウエックス１ｘ２、ダウエックスＳＢＲ−Ｐ（ダウ・ケミカル社製）のごときイオン交換樹脂等を使用することができる。すなわち、Ｓ２７２８１を含有する上記の抽出物を吸着剤やイオン交換樹脂に付し、不純物を吸着させて除去するか、あるいは、Ｓ２７２８１化合物を吸着させた後、該化合物を適宜溶出させる。吸着剤に吸着したＳ２７２８１化合物は、メタノール水、アセトン水等の含水有機溶媒を用いて、イオン交換樹脂に吸着した該化合物は、塩酸やアンモニア水を用いて、それぞれ溶出させることができる。
【００４２】
このようにして精製又は部分精製されたＳ２７２８１化合物を、シリカゲル、フロリジルの如き担体を用いた吸着カラムクロマトグラフィー、アビセル（旭化成工業（株）社製）、セファデックスＬＨ−２０（ファルマシア社製）等を用いた分配カラムクロマトグラフィー、順相カラム、逆相カラムを用いた高速液体クロマトグラフィー等に供することにより、該化合物を均一な標品として単離することができる。
【００４３】
単離精製されたＳ２７２８１化合物は、例えば、次の条件による高速液体クロマトグラフィーにおいて単一のピークとして検出される。
［高速液体クロマトグラフィー実施の条件］
カラム  ：  Ｗａｔｅｒｓ  ＳＹＭＭＥＴＲＹ  Ｃ１８（直径４．６×長さ１５０ｍｍ：ウォーターズ社製）
移動相  ：  ２２％アセトニトリル−０．０２％ＨＣＯＯＨ
流  速  ：  １．０ｍｌ／分
検出波長：  ２１０ｎｍ
保持時間：  ４．５分
本発明のＳ２７２８１化合物又はその塩は、インスリン依存性の細胞蛋白質チロシンリン酸化を増強し、脂肪細胞による糖の取り込みを促進するので、該化合物を含有する医薬は、Ｉ型及び／又はＩＩ型糖尿病の治療又は予防に有用である。本発明は、Ｓ２７２８１化合物又はその塩を含有することからなる医薬を提供する。また、本発明は、Ｓ２７２８１化合物又はその塩を有効成分として含有することからなる糖尿病の治療又は予防剤を提供する。
【００４４】
本発明のＳ２７２８１化合物又はその塩は、医薬としてヒト又はヒト以外の動物に投与されるに際し、種々の形態をとり得る。その投与形態は、製剤、年齢、性別、疾患等に依存する。例えば、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、カプセル剤等は経口投与される。注射剤等は静脈内投与、筋肉内投与、皮内投与、皮下投与又は腹腔内投与される。坐剤は直腸内投与される。
【００４５】
Ｓ２７２８１化合物又はその塩を有効成分として含有する医薬製剤は、常法に従い、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、溶解剤、矯味矯臭剤、コーティング剤等、医薬製剤分野において通常使用し得る公知の補助剤を用いて製造することができる。
【００４６】
錠剤の形態に成形するに際しては、担体として当該分野で公知のものを広く使用でき、例えば、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、尿素、澱粉、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、珪酸等の賦形剤、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、澱粉液、ゼラチン溶液、カルボキシメチルセルロース、セラック、メチルセルロース、リン酸カリウム、ポリビニルピロリドン等の結合剤、乾燥澱粉、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、澱粉、乳糖等の崩壊剤、白糖、ステアリン、カカオバター、水素添加油等の崩壊抑制剤、第四級アンモニウム塩基、ラウリル硫酸ナトリウム等の吸収促進剤、グリセリン、澱粉等の保湿剤、澱粉、乳糖、カオリン、ベントナイト、コロイド状珪酸等の吸着剤、精製タルク、ステアリン酸塩、硼酸末、ポリエチレングリコール等の滑沢剤等を挙げることができる。錠剤は、必要に応じ、通常の剤皮を施した錠剤、例えば、糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶被錠、フィルムコーティング錠あるいは二重錠、多重錠とすることができる。
【００４７】
丸剤の形態に成形するに際しては、担体として当該分野で公知のものを広く使用でき、例えば、ブドウ糖、乳糖、澱粉、カカオ脂、硬化植物油、カオリン、タルク等の賦形剤、アラビアゴム末、トラガント末、ゼラチン、エタノール等の結合剤、ラミナラン、カンテン等の崩壊剤を挙げることができる。
【００４８】
注射剤として調製される場合、液剤及び懸濁剤は殺菌され、且つ血液と等張であるのが好ましく、これら液剤、乳剤および懸濁剤の形態に形成するに際しては、希釈剤として当該分野において公知のものを広く使用でき、例えば、水、エチルアルコール、プロピレングリコール、エポキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類等を挙げることができる。等張を維持するために充分な量の食塩、ブドウ糖又はグリセリンを含有せしめてもよい。溶解補助剤、緩衝剤、無痛化剤糖、着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤、他の薬剤等を含有せしめてもよい。
【００４９】
なお、注射剤を静脈内投与する場合、単独で、ブドウ糖、アミノ酸等の通常の補液と混合して、又は、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類等とのエマルジョンとして投与される。
【００５０】
坐剤の形態に成形するに際しては、担体として当該分野で公知のものを広く使用でき、例えばポリエチレングリコール、カカオ脂、高級アルコール、高級アルコールのエステル類、ゼラチン、半合成グリセライド等を挙げることができる。
【００５１】
上述の医薬製剤に含有せしめるＳ２７２８１化合物又はその塩の量は、特に限定されないが、上限は３０乃至７０重量％、下限は１重量％であり、好適な範囲は１乃至３０重量％である。
【００５２】
Ｓ２７２８１化合物又はその塩の投与量は、症状、年齢、体重、投与方法、剤形等に依存するが、通常成人に対して１日当たり投与するＳ２７２８１化合物又はその塩の量は、上限が１００乃至１０００ｍｇ、下限が１乃至１０ｍｇであり、好適な範囲は１０乃至１００ｍｇである。
【００５３】
Ｓ２７２８１化合物又はその塩の投与回数は、数日に１回、１日１回、又は１日複数回である。
【００５４】
本発明は、薬理上有効な量のＳ２７２８１化合物又はその塩を投与することからなる糖尿病の治療又は予防方法、糖尿病の治療又は予防のためのＳ２７２８１化合物又はその塩の使用をも提供する。
【００５５】
【実施例】
以下に、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれに限定されない。
実施例１．  Ｓ２７２８１化合物の製造
１）Ｓ２７２８１化合物生産菌の培養
コニオケチジウム  セイヴェリ（Ｃｏｎｉｏｃｈａｅｔｉｄｉｕｍ  ｓａｖｏｒｙｉ．）ＳＡＮＫ  ２７２８１株を培地組成−１で示される種培地８０ｍｌを含む５００ｍｌ容三角フラスコ５本に、スラントより接種し、回転振盪培養機を用いて、２１０ｒｐｍ、２３℃で１６８時間培養したものを前培養液とした。次いで、培地組成−２で示される栄養培地８０ｍｌを５００ｍｌ容三角フラスコ７５本に入れ、１２１℃で２０分間加熱滅菌した。これを２３℃に冷却した後、各三角フラスコに前培養液５ｍｌを接種し、回転数２１０ｒｐｍ、２３℃で１６８時間振盪することにより本培養を行った。
［培地組成−１］
可溶性でんぷん            ２．０  ％（重量／容積）
グリセリン                ３．０  ％（重量／容積）
グルコース                ３．０  ％（重量／容積）
大豆粉                    １．０  ％（重量／容積）
ゼラチン                  ０．２５％（重量／容積）
イーストエキス            ０．２５％（重量／容積）
硝酸アンモニウム          ０．２５％（重量／容積）
寒天                      ０．３  ％（重量／容積）
消泡剤ＣＢ−４４２        ０．０１％（容積／容積）
（滅菌前のｐＨ６．５）
［培地組成−２］
培地組成−１の組成から寒天を除いたもの
２）培養物からのＳ２７２８１化合物の単離
上記１）において得られた培養液６Ｌへろ過助剤であるセライト５４５（ジョンズ  マンビル  プロダクト  コーポレーション製）を添加し、ろ過を行ことにより、菌体と培養上清５．５Ｌをろ別した。得られた菌体画分に２Ｌの８０％アセトンを添加し、次いで３０分間攪拌抽出した後ろ過することにより、アセトン抽出液を得た。このアセトン抽出液を減圧下濃縮してアセトンを留去した後、回転数３０００ｒｐｍ、１５分間遠心分離することにより、Ｓ２７２８１化合物を含む菌体抽出液１．５Ｌを得た。該菌体抽出液１．５Ｌと前記培養上清５．５Ｌを合併し、塩酸でｐＨを３．０に調整した。
【００５６】
得られた溶液を、５５０ｍｌのＨＰ−２０カラム（ダイヤイオンＨＰ−２０：三菱化学（株）製）に付した。２Ｌの水で該カラムを洗浄した後、２Ｌの５０％アセトン水で溶出し、溶出液５００ｍｌからなる画分４つを回収し、そのうちＳ２７２８１化合物を含有する２つの画分を合併し、減圧下濃縮してアセトンを留去した後、ｐＨ３．０に調整し、酢酸エチル１．５Ｌで抽出した。該抽出液を飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで脱水し、次いでろ紙を用いてろ過した後、減圧下濃縮乾固してＳ２７２８１化合物を含有する抽出物２．１ｇを得た。
【００５７】
該抽出物２．１ｇを２０ｍｌのメタノールに溶解し、コスモシル（Ｃｏｓｍｏｓｉｌ  １４０Ｃ１８−ＯＰＮ：ナカライテスク（株）製）２５ｇにコーティングした。それを０．３％トリエチルアミンリン酸バッファー（ｐＨ３．０）１００ｍｌに懸濁し、予め、メタノール：０．３％トリエチルアミン−リン酸緩衝液（ｐＨ３）＝１：９で平衡化したコスモシルカラム（Ｃｏｓｍｏｓｉｌ  １４０Ｃ１８−ＯＰＮ（ナカライテスク（株）製）  １００ｇが充填されたオープン・カラム）に重層した。次いで、３９０ｍｌのメタノール：０．３％トリエチルアミン−リン酸緩衝液（ｐＨ３）＝１：９、１５０ｍｌのメタノール：０．３％トリエチルアミン−リン酸緩衝液（ｐＨ３）＝３：１７、１５０ｍｌのメタノール：０．３％トリエチルアミン−リン酸緩衝液（ｐＨ３）＝１：４、１５０ｍｌメタノール：０．３％トリエチルアミン−リン酸緩衝液（ｐＨ３）＝１：３、および、１０００ｍｌのメタノール：０．３％トリエチルアミン−リン酸緩衝液（ｐＨ３）＝３：７を該カラムへ順に添加し、溶出液を１５ｍｌずつ回収した。
【００５８】
得られた溶出画分のうち、Ｓ２７２８１化合物を含有する画分番号６２乃至７３を合併することにより、合計１８０ｍｌからなる画分を得、減圧下濃縮してメタノールを留去した後、２００ｍｌの酢酸エチルで２回抽出した。得られた抽出液を、飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで脱水し、次いでろ紙を用いてろ過した後、減圧下で濃縮乾固することにより、Ｓ２７２８１化合物を含む粗精製物１５０ｍｇを得た。
【００５９】
該粗精製物１５０ｍｇ全量を１．０ｍｌの５０％メタノール水に溶解せしめることにより試料溶液を調製し、そのうち２００μＬを、予め２２％アセトニトリル−０．０２％ＴＦＡで平衡化した高速液体クロマトグラフィー用カラム（Ｗａｔｅｒｓ  ＳＹＭＭＥＴＲＹ  Ｃ１８  直径１９×長さ１００ｍｍ：ウォーターズ社製）へ付し、２２％アセトニトリル−０．０２％ＴＦＡを移動相として流速６ｍｌ／分で溶出した。溶出液を検出波長２１０ｎｍでモニタ−し、保持時間７．５乃至９．０分に該当する画分を回収した。残りの試料溶液８００μｌについても同様の操作を行い、Ｓ２７２８１化合物を含有する画分合計４５ｍｌを得た。減圧下で濃縮してアセトニトリルを留去した後、１００ｍｌの水を添加し、２００ｍｌの酢酸エチルで抽出した。該抽出液を飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで脱水し、次いでろ紙を用いてろ過した後、減圧下で濃縮乾固することにより、Ｓ２７２８１化合物を含む部分精製物を５０ｍｇを得た。
【００６０】
該部分精製物５０ｍｇ全量を１．０ｍｌの５０％メタノール水に溶解せしめることにより試料溶液を調製し、そのうち２００μＬを、予め１６％アセトニトリル−０．０２％ＨＣＯＯＨで平衡化した高速液体クロマトグラフィー用カラム（Ｗａｔｅｒｓ  ＳＹＭＭＥＴＲＹ  Ｃ１８  直径１９×長さ１００ｍｍ：ウォーターズ社製）へ付し、１６％アセトニトリル−０．０２％ＨＣＯＯＨを移動相として流速６ｍｌ／分で溶出した。溶出液を検出波長２１０ｎｍでモニタ−し、保持時間１２．６乃至１３．８分に該当する画分を回収した。残りの試料溶液８００μｌについても同様の操作を行い、Ｓ２７２８１化合物を含有する画分合計３６ｍｌを得た。減圧下で濃縮してアセトニトリルを留去した後、５０ｍｌの水を添加し、１００ｍｌの酢酸エチルで抽出した。該抽出液を飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで脱水し、次いでろ紙を用いてろ過した後、減圧下で濃縮乾固することにより、Ｓ２７２８１化合物の黄色粉末１０．０ｍｇを得た。
【００６１】
この黄色粉末の一部を採取し、下記の条件の高速液体クロマトグラフィ−で分析した結果、保持時間４．５分に極大を示す単一のピークが検出された：
カラム  ：  Ｗａｔｅｒｓ  ＳＹＭＭＥＴＲＹ  Ｃ１８（直径４．６×長さ１５０ｍｍ：ウォーターズ社製）
移動相  ：  ２２％アセトニトリル−０．０２％ＨＣＯＯＨ
流  速  ：  １．０ｍｌ／分
検出波長：  ２１０ｎｍ
保持時間：  ４．５分。
試験例１．インスリン依存性細胞蛋白質チロシンリン酸化に対する作用
ラット肝癌由来細胞株Ｈ−４−ＩＩ−Ｅ−３Ｃ（ＣＲＬ−１６００、アメリカン  タイプ  カルチャー  コレクション、大日本製薬より入手）は、インスリン受容体を発現している細胞である（Ｓａｔｏ，Ｔ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，  ２６０，  ｐｐ３７７−８７（１９８８）：Ｓｍｉｔｈ，Ｒ．Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，  １３０，  ｐｐ４２８−３５（１９８７）：Ｓｍｉｔｈ，Ｒ．Ｍ．，  Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ．，  ５５，  ｐｐ５９３−７（１９８６）：Ａｎｄｒｅｏｎｅ，Ｔ．Ｌ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，  ２５７，  ｐｐ３５−８（１９８２））。該細胞を、１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地（インビトロジェン社製）を用い、２４穴細胞培養用プレートで増殖させた。ジメチルスルフォキシドに溶解した被検化合物を含む溶液を、０．１％量添加して、３７℃、３０分間、５％炭酸ガス存在下のインキュベーターで培養した。さらにヒト組み換え型インスリン（和光純薬）を０、１ｎＭおよび１００ｎＭの濃度になるようにそれぞれ添加し、さらに同条件下で１５分間培養した。培地を除去し、氷冷したトリス緩衝生理食塩水（以下、「ＴＢＳ」という）で２回細胞を洗浄した後、１％のトリトンＸ‐１００、１０％のグリセロール、１ｍＭのフェニルメチルスルフォニルフロリドおよび１ｍＭのオルソバナジン酸を含むＴＢＳを添加して、細胞を溶解させた。１２０００ｇにて１５分間遠心して不溶物を取り除き、細胞抽出物の可溶化画分を得た。該画分に、濃度２％のドデシル硫酸ナトリウム（以下、「ＳＤＳ」という）、終濃度５％の２−メルカプトエタノールおよび終濃度１０％のグルセロールをそれぞれ添加し、沸騰水浴上にて５分間保温した。得られた反応物を、４乃至１２％ポリアクリルアミドゲル（インビトロジェン社製）に添加し、トリス塩酸−グリシン緩衝液を用いて電気泳動（以下、「ＳＤＳ−ＰＡＧＥ」という）を行い、蛋白質を分離した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施した後、ゲル中の蛋白質をニトロセルロース膜（アドバンテック社製）に転移させ、該膜を２％のウシ血清アルブミン（シグマ社製）を含むＴＢＳ中に置き、室温で１時間、穏やかに振とうした。次いで、該膜を、１μｇ／ｍｌの抗リン酸化チロシン抗体４Ｇ１０（アップステート・バイオロジー社製）および０．２％のトゥイーン２０（シグマ社製）を含むＴＢＳ中に浸し、４℃にて１８時間、穏やかに振とうした。次いで、該膜を、０．２％のトゥイーン２０を含むＴＢＳで３回洗浄した後、０．２％のトゥイーン２０を含むＴＢＳを用いて１：１００００に希釈した、ペルオキシダーゼ標識抗マウスイムノグロブリンＧ抗体（セル・シグナリング社製）と室温にて２時間反応させた。反応後、０．２％のトゥイーン２０を含むＴＢＳで３回洗浄した後、ＥＣＬ化学発光キット（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）を加え、Ｘ線用フィルム（イーストマン・コダック社製）と接触させた後、これを現像した。
【００６２】
その結果、図１に示すとおり、インスリンは、複数の細胞蛋白質のチロシンリン化を濃度依存性に促進した。それに対し、Ｓ２７２８１化合物は、単独では細胞内蛋白質のチロシンリン酸化状態を変化させなかったが、インスリン依存性の細胞蛋白質チロシンリン酸化を増強した。Ｓ２７２８１化合物により、インスリン依存性チロシンリン酸化がさらに増強されたＳＤＳ−ＰＡＧＥ上の主要バンドには、インスリン受容体蛋白質、並びに、インスリン受容体によりチロシンリン酸化を受ける主要な基質の一つであり且つインスリンの作用発現に重要な役割を担うと考えられているＩＲＳ１蛋白質及びＩＲＳ２蛋白質（Ｃｈｏｕ，  Ｃ．Ｋ．，  ｅｔ．  ａｌ．，  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，  ２６２，  ｐｐ１８４２−１８４７（１９８７）、Ｋａｓｕｇａ，  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ，  １３，  ｐｐ３１７−２６（１９９０）、Ｐａｔｔｉ，Ｍ．Ｅ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０，ｐｐ２４６７０−２４６７３（１９９５）、および、Ｗｈｉｔｅ，  Ｍ．Ｆ．  Ａｍ．  Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．  Ｍｅｔａｂｏｌ．，  ２８３，  Ｅ４１３−Ｅ４２２（２００２））にそれぞれ対応するバンドが含まれ、Ｓ２７２８１化合物は両蛋白質のインスリン依存性チロシンリン酸化をさらに増強し得ることが示唆された。
試験例２．ラット遊離脂肪細胞による糖の取り込み
インスリンの細胞に対する作用は数多く報告されているが、その一つとして、ラット遊離脂肪細胞に対し、グルコース（２−デオキシグルコース）の取り込みを促進する作用が知られている（Ｒｏｄｂｅｌｌ，Ｍ．，  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４１，ｐｐ１３０−１３９（１９６６）、Ｏｌｅｆｓｋｙ，Ｊ．Ｍ．  ＆  Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｍ．，  Ｍｅｔａｂｏｌ，  １９７８  Ｄｅｃ；２７（１２  Ｓｕｐｐｌ  ２），ｐｐ１９１７−１９２９、および、Ｈｙｓｌｏｐ，Ｐ．Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２１８，ｐｐ２９−３６（１９８４））
ラット遊離脂肪細胞におけるグルコース取り込み試験の操作手順は、オレフスキーらの方法  （Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ、１７２巻、１３７頁、１９７８年）  に従った。すなわち、７齢のオスＳＤラットの精巣周囲脂肪組織（約２グラム）を切り出し、コラゲナーゼ等の処理により遊離細胞とし、１０ｍｌの培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ（グルコース不含、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に１ｍＭピルビン酸ナトリウム、２０ｍＨＥＰＥＳ、１％（容積／容積）ウシ胎児血清、および１０ｍｌ／Ｌの１００×Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｓｉｇｍａ社製、Ａ−５９５５）を添加したもの）に懸濁させた。この脂肪細胞懸濁液をチューブに１００μＬずつ分注し、薬物またはインスリンを含む培地を１００μＬ添加し、３７℃にて３０分間温浴上に放置した。次いで、［３Ｈ］２−デオキシ−Ｄ−グルコース（アマシャム  ファルマシア  バイオテク、２５−５０Ｃｉ／ｍｍｏｌ）の１０μＣｉ／ｍｌ溶液１０μＬを添加し（最終の比放射能は約０．５μＣｉ／ｍｌ）、５分間室温にて放置した後、得られた反応液１７５μｌを、予めシリコンオイルを１００μｌ入れたマイクロチューブに分注し、マイクロチューブ用卓上遠心分離装置を用いて１４０００回転、１５秒間遠心分離し、細胞を沈殿させた。該チューブを、シリコンオイル層の中央部分を目印に上下にはさみで切り分け、細胞の沈殿を含む方をバイアル瓶に移した後、ピコフロー２０（パッカード）を１０ｍｌ添加して、液体シンチレーションカウンターにて放射活性を測定した。各実験群において、同時に１ｍＭフロレチン（ｐｈｌｏｒｅｔｉｎ、Ｓｉｇｍａ社製）を添加した群を設けバックグランドとした。バックグランド群の平均カウント値を、対応する被験物質添加群のカウント値より差し引いて、細胞に取り込まれた［３Ｈ］２−デオキシグルコースのカウント値を算出した。被験物質を添加しなかった群を対照とした。
【００６３】
また、溶媒群と各添加群におけるグルコース取り込みの平均値の間の差につき、スチューデンツ・ｔ−試験（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ）法により有意差を検定し、Ｐ値を算出した。
【００６４】
結果を表１にまとめた。
【００６５】
【表１】
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表１に示すように、Ｓ２７２８１化合物は、インスリンと同様、２−デオキシグルコースの取り込みを有意に促進した。
【００６６】
試験例１および２の結果より、Ｓ２７２８１化合物は、インスリン受容体のインスリン依存性のチロシンリン酸化を増強することにより該受容体を活性化せしめ、それによりインスリン・シグナル伝達が活性化され、その結果脂肪細胞によるインスリンの取り込みを促進するものと考えられる。
【００６７】
【発明の効果】
本発明の提供する新規化合物は、インスリン依存性の細胞蛋白質チロシンリン酸化を増強するとともに、優れた脂肪細胞によるグルコース取り込み促進活性を示し、糖尿病治療又は予防剤として有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、Ｓ２７２８１化合物存在下又は非存在下における、各種濃度のインスリン刺激により生じるインスリン受容体発現細胞における蛋白質のリン酸化を示す。レーン１はインスリン及びＳ２７２８１化合物無添加、レーン２はインスリン無添加且つＳ２７２８１化合物１０μＭ添加、レーン３はインスリン１０−９Ｍ添加且つＳ２７２８１化合物無添加、レーン４はインスリン１０−９Ｍ添加且つＳ２７２８１化合物１０μＭ添加、レーン５はインスリン１０−７Ｍ添加且つＳ２７２８１化合物無添加、レーン６はインスリン１０−７Ｍ、Ｓ２７２８１化合物１０μＭ添加の、それぞれの反応物を試験例１に記載の方法に従ってＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った後、リン酸化を検出した。ＩＲＳ１蛋白質およびＩＲＳ２蛋白質ならびにインスリン受容体蛋白質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ上の位置を矢印で示す。
【図１】
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