(57)【要約】【課題】  本発明は遺伝子銃、および遺伝子形質転換への遺伝子銃の応用に関する。【解決手段】  遺伝子形質転換のために、低圧ガスを遺伝子銃に使用して生物材料を含有する溶液を直接加速し、金属粒子担体を用いることなく、生物材料を細胞膜／壁または動物の皮膚を通って貫入させる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子銃を用いて生物材料を送達する方法であって：
加圧室、スプレヤー、制御器および材料送達システムを含んでなる遺伝子銃を提供するステップ；
少なくとも生物材料を含むサンプル溶液を材料送達システム中に置くステップ；
遺伝子銃をトリガーし、制御器の制御を通して加圧室へガスを送ってガスの圧力を確立するステップ；
サンプル溶液を材料送達システムから放出し、加圧室内のガスによりサンプル溶液を加速するステップ；および
スプレーノズルおよびスプレーチューブからなるスプレヤーであって、スプレーノズルは発散部および収束部を含んでなる内部形状を有し、スプレーチューブは発散する真直ぐなチューブであることを特徴とする前記スプレヤーから、サンプル溶液の噴出速度を超音速でありかつ生物材料が均一に標的中に注入されるようにサンプル溶液を噴出するステップ
を含んでなる上記方法。
【請求項２】
生物材料が核酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
生物材料がタンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
生物材料がビリオンである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
生物材料がワクチンである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
生物材料が癌免疫治療用の免疫原である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
サンプル溶液をガスにより200〜300m/sの速度まで加速する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
スプレヤー出口の圧力がほぼ１気圧である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
スプレーノズルはさらに発散部と収束部の間に位置するスプレーネックを含んでなり、かつ収束部の内部形状のある範囲はrt＜Rt＜2rt［式中、Rtは収束部の曲面半径を表し、rtはスプレーネックの半径である］を含み；そしてθ＜15度［ここで、θは発散部とスプレーチューブの間の角度である］である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ガスが窒素ガスおよびヘリウムガスを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
遺伝子銃を使用することにより遺伝子を形質転換する方法であって：
加圧室、スプレヤー、制御器および材料送達システムからなる遺伝子銃を提供するステップ；
少なくとも核酸を含むサンプル溶液を材料送達システム中に置くステップ；
遺伝子銃をトリガーし、制御器の制御を通して加圧室へガスを送ってガスの圧力を確立するステップ；
加圧室内のガスが圧力を確立した後にサンプル溶液を材料送達システムから放出して、加圧室内のガスによりサンプル溶液を加速するステップ；および
スプレーノズルおよびスプレーチューブからなるスプレヤーであって、スプレーノズルは発散部および収束部を含んでなる内部形状を有し、スプレーチューブは発散する真直ぐなチューブであることを特徴とする前記スプレヤーから、サンプル溶液の噴出速度を超音速でありかつ生物材料が均一に標的中に注入されるようにサンプル溶液を噴出するステップ
を含んでなる上記方法。
【請求項１２】
サンプル溶液をガスにより200〜300m/sまで加速する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
スプレヤー出口の圧力がほぼ１気圧である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
スプレーノズルはさらに発散部と収束部の間に位置するスプレーネックを含んでなり、かつ収束部の内部形状のある範囲はrt＜Rt＜2rt［式中、Rtは収束部の曲面半径を表し、rtはスプレーネックの半径である］を含み；そしてθ＜15度［ここで、θは発散部とスプレーチューブの間の角度である］である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
核酸を遺伝子治療用に使用する、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関係特許出願に対するクロスリファレンス
本特許出願は2003年２月３日に出願した米国特許出願第60/444,775号の優先権を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は遺伝子銃システムに関する。さらに特定すれば、本発明は遺伝子銃システム、および遺伝子を形質転換するための上記遺伝子銃システムの応用に関し、ここでガスを用いる上記遺伝子銃システムは、低圧下で生物材料を含有する溶液を高速に加速して、生物材料を、金属粒子担体を用いることなく、細胞膜／壁または動物の皮膚を貫通させ、遺伝子形質転換をほんの低い圧力で達成することができる。
【背景技術】
【０００３】
関係技術の説明
遺伝子材料の発見および遺伝学の急速な発展に従って、今や科学者は遺伝子工学技術を巧みに実施し、例えば、外来遺伝子を導入して細胞、またはさらに生物の性質を制御することができる。基礎科学研究においておよび農産物の改良において、生物学的特性および形態を変える目的でDNAなどの異種遺伝子材料を宿主細胞に導入することが広く応用されている。例えば、遺伝子工学は、農産物の耐虫性、耐霜性または栄養組成の改良を助ける。最近、遺伝子形質転換技術は遺伝子治療または遺伝子ワクチンの形態でヒト疾患の治療に応用されている。医学分野における遺伝子形質転換技術応用の成功によって、癌を含むまだ少数ではあるが遺伝性疾患の臨床治療に著しいブレークスルーが行われている。
【０００４】
遺伝子形質転換は複数の異なる手法で実施することができ、最初期の手法は細菌プラスミドまたはウイルスベクターを媒介担体に利用して遺伝子を動物または植物細胞の細胞質中に送達する。絶えざる開発と改良が行われているが、医療に応用するときに、細菌プラスミドまたウイルスベクターの非特異的免疫応答および遺伝子組換えを含む副作用ならびにそれに伴うリスクを見過ごすわけに行かない。それに対して、細菌またはウイルス担体を利用しない他の物理的または機械的遺伝子形質転換手法、例えば電気穿孔法およびマイクロインジェクションは、前記担体の副作用を回避して治療目的に応用することができる。しかし、その安定性と成功率は低くかつその操作は煩雑である。
【０００５】
最近、物理的手法を用いる遺伝子形質転換は実操作に応用されている。物理的手法である粒子銃は、生物材料（例えば、DNA）を運ぶ金粒子を細胞中に加速し、遺伝子形質転換または遺伝子導入を行う。粒子銃はまた、他の分野、例えば植物、哺乳類動物体細胞、遺伝子治療、および最近開発されたDNAワクチン接種の研究開発に応用することもできる。
【０００６】
粒子銃システムは、サンプルカートリッジ内のDNAコートした金粒子、および高圧衝撃波原理に基づいてチューブを加速するガスを使用する。加圧室内で予め設定した高圧に到達すると、DNAコートした粒子を含有するサンプルカートリッジは生じる衝撃波により停止スクリーン中に加速される。DNAコートした粒子は加速を続けて慣性効果により標的組織に進入する。上記方法の大きな欠点は衝撃波から生じる大きなノイズである。衝撃波が発生する高速かつ高圧のガスも細胞死をもたらす。さらに、従来の粒子銃技術で利用されるガスは、高価なヘリウムを使用しかつ担体として高価な金粒子が必要である。
【０００７】
遺伝子を運ぶ金粒子を使用する粒子銃の利用は可能であるが、金粒子は通常細胞に損傷を与えるかまたは金属粒子と運ばれる生物材料との間の相互作用により生物材料の構造変化を誘発して臨床効果を妨げる。さらに、粒子銃操作は、DNAコート金粒子の調製が複雑であり手間がかかるので、使用者にとっては不便である。治療目的で、表皮組織を通して発現させる特定の弱毒ワクチン、遺伝子治療用のビリオン、または臨床試験用試薬に用いるための効果的かつ便利な遺伝子送達ツールが必要とされている。特に、この必要とされる遺伝子送達ツールは遺伝子または生物材料を有意な変動を生じることなく確実に送達できるものである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、空気力学および二相流理論に基づいて、低いノイズ、衝撃波誘導細胞死、および高価なヘリウムガスまたは金粒子使用の諸問題を解決する低圧ガス加速遺伝子銃を提供する。本発明の遺伝子銃は、様々な種類の生物または遺伝子材料を細胞中に送達するために応用することができる。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記の問題を解決するために、本発明は低圧下で操作可能な遺伝子銃であって、ミクロ担体（金粒子またはタングステン粒子）を用いることなく、ガス（窒素ガス、ヘリウムガスまたはさらに空気）を用いて生物材料を含有する溶液を極く高い速度、例えば200m/secより高い速度まで直接加速する上記遺伝子銃を提供する。生物材料は動物の表皮組織または細胞膜／壁を貫通し、細胞質または細胞核中に進入して、特定のタンパク質を発現しかつ新しい生物機能を作製することができる。
【発明の効果】
【００１０】
本発明は、遺伝子形質転換に応用可能な遺伝子銃を提供する。本発明の好ましい実施形態によれば、遺伝子銃のスプレーノズルの形状設計と遺伝子銃操作の改変は、遺伝子銃を4atmより低い圧力で操作しかつサンプル溶液を極く高速度まで加速することを可能にする。生物材料は、金属粒子により運ばれることなく、表皮または細胞／膜／壁を貫通して細胞または生物中に進入することができる。
【００１１】
低圧を用いるので、生物材料は金属粒子を用いることなく細胞中に移動され、最小限のノイズで遺伝子形質転換を達成しかつ細胞を破損することはない。さらに、遺伝子銃操作用圧力が低いので、本発明においてはノイズの減少とともにガスの消費および操作コストが低減される。
【００１２】
本発明のサンプルは、金属粒子を用いることなく、溶液形態で調製するので、遺伝子銃の操作は容易かつ簡単であって、金粒子の調製で通常遭遇する困難はなくなる。本発明においては、生物材料、例えば、DNA、RNA、タンパク質、ビリオンまたは薬物を溶液形態で調製し、加速して細胞中に進入させて送達または遺伝子形質転換を行う。遺伝子銃の操作は生物材料を運ぶために金属粒子を用いないので、生物材料を改変するリスクは低下しかつ標的細胞の損傷は低減される。本発明の遺伝子銃は生物材料を細胞または生物中に送達することができて、免疫ワクチン、免疫治療、癌治療または遺伝子治療の分野に応用することができる。
【００１３】
以上の一般的説明および以下の詳細な説明は共に例示であって、請求項に記載した本発明のさらなる説明の提供を意図すると理解されなければならない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
図面の簡単な説明
本特許のファイルは少なくとも１枚のカラーによる図面を含む。カラー図面を伴う本特許のコピーは必要な費用を添えて申請すれば特許所管官庁から提供されるであろう。添付図面は本発明のさらなる理解を提供するために含まれるものであり、本明細書に組込まれてその一部分を構成するものである。図面は本発明の実施形態を図解し、本説明と一緒に本発明の原理を説明するのに役立つ。
【００１５】
好ましい実施形態の説明
図１を参照すると、図１は本発明の好ましい実施形態による遺伝子銃100の断面図である。本発明の遺伝子銃100は４つの部分に区分され、少なくとも加圧室102、スプレヤー104、後部コネクター106および材料送達システム108からなる。後部コネクターはバルブを経由して高圧ガス源（図２）と接続される。ガス（流れ方向を矢印で示す）を後部コネクター106から加圧室102へ送る。加圧室102内のガスが予め設定した圧力まで増加すると、その高圧ガスおよび高圧ガスにより運ばれるサンプル溶液はスプレヤー104を通ってスプレーされる。加圧室の材料は軽金属、例えばアルミニウム合金である。スプレヤー104の材料は生体適合性金属、例えばステンレス鋼またはその合金である。
【００１６】
一般的に、サンプル溶液（すなわち、生物材料を含有する溶液）はガスにより、約200〜300m/sの速度まで加速されるが、この速度は音速を超えない。スプレヤー104は、図１に示すように、少なくとも末端スプレーチューブ104aおよびノズル104bからなる。空気動力学の理論によれば、スプレーノズル内外の圧力差が1.8atmより大きいとき、超音速流が発生する。もしノズルの断面直径が最初は収束し、次いで少し発散すると、超音速流がノズル104bにおいて発生する。ガス速度は、スプレーチューブ104aに進入すると徐々に低下する。スプレーチューブ104aの長さが増加するほど、ガス速度は低下する。その際、ガス速度を、スプレーチューブ104aの長さによってある特定の限界内に制御することができる。
【００１７】
本発明の好ましい実施形態によれば、適当な設計は、本発明で開示したように、ミクロ担体なしのサンプル溶液および材料送達システムの応用を含む。サンプル溶液を、高圧を適用せずに所要の速度まで均一に加速して、標的細胞の損傷を和らげることができる。さらに、スプレーノズル104bおよびスプレーチューブ104aの形状設計により、スプレーノズル出口の圧力を大気圧に近づけることができる。それにより標的細胞の損傷を低減する。本発明の好ましい一実施形態によれば、遺伝子銃操作は、粒子担体を含有しないサンプル溶液を特別なスプレーノズルの遺伝子銃と組合わせて使用する。この特別なスプレーノズルによれば、末端スプレーチューブの長さとガス源のタイプを変えることによりサンプル溶液を異なる速度まで加速することができる。
【００１８】
材料送達システム108の設計は、操作要件に従って調節することができる。例示として、重力補給機構を用いて材料送達システムからサンプル溶液滴を放出する。次いでサンプル溶液滴を高速ガス流により運び去って標的組織中に高速で噴出させる。材料送達システム108の内部空洞が十分大きくサンプル溶液を保持できれば、サンプル溶液をその入口を通して内部空洞中に注入することができる。サンプル溶液流は内部空洞と接続したチャネルを通って出口へ流れ、スプレーネック周りに液滴として安定して放出され、あるいは、材料送達システムはさらに徐放ローディングステーションを備え、サンプル溶液滴をローディングステーション上に置いてガス流に運び去られるのを待ってもよい。粘度制御などの他の機構を利用して徐放機能を達成してもよい。さらに、制御バルブを材料送達システム中に組込み、遺伝子銃が単ショットまたは複数回のショットで噴出するかどうかに依って、サンプル溶液の放出、または放出量を制御してもよい。
【００１９】
あるいは、材料送達システム108を単ショットでの操作を容易にするように設計することができる。シュートする前に、スプレーネックを加圧室から分離し、サンプル溶液をスプレーネックに供給してもよい。スプレーネックを加圧室と接続すると、サンプル溶液を放出する準備ができる。操作の間、サンプル溶液を高速ガス流に曝す。高速ガス流はサンプル溶液をスプレーネックから運び去り、サンプル溶液をさらにスプレヤー104によって所要の速度まで加速する。
【００２０】
図２は全体の遺伝子銃システムを図解する。遺伝子銃システム200のガス源はガス貯槽220から与えられる。ガス貯槽220のガス源としてはヘリウムガス、窒素ガスもしくはその他のガスまたは空気が挙げられる。ヘリウムは1000m/sを超える速度で移動することができる。さらに、ヘリウムの質量は小さいため標的に対して与える損傷がより少ない。従って、ヘリウムは高価であることを除くと理想的なガスである。より厚いケラチンまたはワックス層をもつ動物または植物細胞についてはヘリウムガスの使用が必須である。しかし、容易に貫通しうる生物系に対する遺伝子銃には窒素ガス使用で十分である。ガス貯槽220内のガスを圧力調節器222によってある特定の圧力に設定する。遺伝子銃の加圧貯槽内の圧力は1.8atmより高くなければならない。チュービング内にガス圧力低下があるので、圧力調節器222はさらに高い圧力に設定しなければならない。
【００２１】
図２に示すように、ガスはガス貯槽220から圧力調整器222およびチュービング210を通過する。さらに制御バルブ224を用いてガスをコネクター206経由で加圧室202に進入させるかどうかを決定する。制御バルブ224は制御器（図に示してない）により制御される。遺伝子銃システム200が操作している間、圧力調整器222を適当な圧力に設定する。生物材料を含有する溶液（サンプル溶液）を遺伝子銃内に入れる。生物材料は、例えばRNA、DNA、タンパク質、ペプチド、糖類、ビリオンまたは薬物であってもよい。遺伝子銃システムのハンドル構造230に接続されたトリガーデバイス226を始動し、制御器をオフに設定して制御バルブ224を開放するシグナルを送る。ガス流が加圧室202中に流入してガス流の場を確立した後、次いでサンプル溶液を高速ガス流によって運び去り、スプレヤー204を通して標的組織中に噴出する。
【００２２】
本発明の遺伝子銃の構造はハンドル構造およびトリガーデバイスを含むが、ハンドル構造およびトリガーデバイスはいずれか１つの型式の技術またはアセンブリーに限定されるものでない。現存するハンドル構造およびトリガーデバイス用のいずれのアセンブリーまたは技術を使用してもよい。ハンドル構造およびトリガーデバイスは本発明の本質的な特徴ではないので、ハンドル構造およびトリガーデバイスの詳細を繰返して説明しない。その仕様および例は例示としてのみ考えられることを意図する。本明細書に開示した本発明の明細と実施を考察すれば、当業者にはさらなる利点および改変が容易にわかるであろう。
【００２３】
サンプル溶液滴を高速で移動させるために、本発明は図３に示す高速スプレヤー300を提供する。通常の真直ぐなスプレーチューブと異なって本発明のスプレーチューブ302は円錐形であり、ガス流速が超音速流速を達成するのを可能にしてサンプル溶液速度を音速に近付かせる。スプレーノズル304入口の形状は、噴出されるサンプル溶液がより均一に分布して出口で局在化しないように、すなわち細胞死を起こさないようにする。さらに、スプレーノズル出口のガス圧は大気圧に近づいて細胞に対する損傷を和らげる。
【００２４】
本発明のスプレーチューブとスプレーノズルは以下の理論に従って設計する：
流れ場が等エントロピー流れであると仮定すると、スプレーノズルの面積(Ae)とスプレーネックの面積A*の比は次式で与えられる；
2004236657.tif 000002
［式中、Meはマッハ（Mach）数、すなわちガス流速の音速に対する比であり、かつγは比熱比である］。もしMe、Aeおよびγが規定されると、A*が決定される。
【００２５】
同様に、もしスプレーノズルの出口における圧力であれば、加圧室Poの圧力も次式により決定することができる。
【００２６】
2004236657.tif 000003
もし加圧室の圧力がガス貯槽圧力であれば、ガス貯槽の所要圧力Pcは次式により決定される。
【００２７】
2004236657.tif 000004
［式中、Ldはダンプ損失である］。
【００２８】
サンプル溶液を運び去るにはある特定のガス流速が必要であるので、必要なガス貯槽圧力は加圧室入口のマッハ数（Min）を規定することにより得られる。
【００２９】
さらに、定常状態においては、minの質量流量(mass flow rate)はmoutの質量流量と等しい。
【００３０】
2004236657.tif 000005
［式中、ρはガス密度であり、T0は加圧室内の温度であり、Ainはガス貯槽からの加圧室入口の面積である］。この際、Ainは容易に決定される。
【００３１】
図３は、本発明のスプレーノズル304の形状設計を図解する。スプレーノズル304は収束部分32および発散部36を含んでなるように設計される。収束部32と発散部36の間の遷移領域はスプレーネック34である。スプレーノズル304の形状には急激な遷移が無く滑らかなガス流を得る。本発明のスプレーノズル304を設計するための一般的ルールは次の通りである：
(1)スプレーノズルに存在するガス流速が均一でない単純化設計。
【００３２】
2004236657.tif 000006
上図のように、Rtは収束部32の曲率半径を表し、rtはスプレーネック34の半径であって、単純化設計の収束部に対してrt＜Rt＜2rtである。θは、上図のように、発散部36とスプレーノズルおよびスプレーチューブ中心軸との間の角度（破線）であって、単純化設計の収束部に対してθは15度未満である。スプレーノズル収束部の形状は発散する真直ぐなチューブであり、円錐形構造を形成する。傾斜直線と中心軸の間の角度θは15度より小さく、好ましくは10〜15度である。
【００３３】
もし摩擦損失が無視されかつ収束部における圧力が十分高ければ、ガス流速はスプレーチューブ内で超音速を達成する。スプレーチューブの分散角θによって、超音速ガス流により斜めの衝撃波が生じるのを防止することができる。一般的に、スプレーチューブの形状を固定すれば、ガス流の膨張比とMe（出口におけるマッハ数）が決定される。同じスプレーチューブについて、もし異なるガスを用いれば、異なるマッハ数または異なるスプレーチューブ入口圧（P）が得られる。窒素を例にとって、膨張比Ae/At（分散端末の面積／ネックの面積）、相対直径比De/Dt、分散部Lの最小長さ（円錐形状で1.2度）およびスプレーチューブ入口圧力を以下に掲げる。
【００３４】
（A）もしMe＝1.2、De＝5mmであれば、P＝2.425(atm.)、Ae/At＝1.034、De/Dt＝1.0151、Dt＝4.925mm、L＝3.57mm；
（B）もしMe＝1.3、De＝5mmであれば、P＝2.771(atm.)、Ae/At＝1.0663、De/Dt＝1.0326、Dt＝4.842mm、L＝7.58mm；
（C）もしMe＝1.4、De＝5mmであれば、P＝3.182(atm.)、Ae/At＝1.1115、De/Dt＝1.0543、Dt＝4.7425mm、L＝12.356mm；
（D）もしMe＝1.5、De＝5mmであれば、P＝3.67(atm.)、Ae/At＝1.1762、De/Dt＝1.0845、Dt＝4.6104mm、L＝18.7mm；
（E）もしMe＝1.6、De＝5mmであれば、P＝4.25(atm.)、Ae/At＝1.2502、De/Dt＝1.118、Dt＝4.4723mm、L＝25.33mm；
（F）もしMe＝1.2、De＝4mmであれば、P＝2.425(atm.)、Ae/At＝1.034、De/Dt＝1.0151、Dt＝3.9405mm、L＝2.856mm；
（G）もしMe＝1.3、De＝4mmであれば、P＝2.771(atm.)、Ae/At＝1.0663、De/Dt＝1.0326、Dt＝3.8736mm、L＝6.06mm；
（H）もしMe＝1.4、De＝4mmであれば、P＝3.182(atm.)、Ae/At＝1.1115、De/Dt＝1.0543、Dt＝3.794mm、L＝9.8886mm；
（I）もしMe＝1.5、De＝4mmであれば、P＝3.67(atm.)、Ae/At＝1.1762、De/Dt＝1.0845、Dt＝3.688mm、L＝14.96mm；
（J）もしMe＝1.6、De＝4mmであれば、P＝4.25(atm.)、Ae/At＝1.2502、De/Dt＝1.118、Dt＝3.5778mm、L＝20.26mm；
（K）もしMe＝1.2、De＝3mmであれば、P＝2.425(atm.)、Ae/At＝1.034、De/Dt＝1.0151、Dt＝2.9554mm、L＝2.14mm；
（L）もしMe＝1.3、De＝3mmであれば、P＝2.771(atm.)、Ae/At＝1.0663、De/Dt＝1.0326、Dt＝2.905mm、L＝4.549mm；
（M）もしMe＝1.4、De＝3mmであれば、P＝3.182(atm.)、Ae/At＝1.1115、De/Dt＝1.0543、、Dt＝2.845mm、L＝7.416mm；
（N）もしMe＝1.5、De＝3mmであれば、P＝3.67(atm.)、Ae/At＝1.1762、De/Dt＝1.0845、Dt＝2.766mm、L＝11.22mm；
（O）もしMe＝1.6、De＝3mmであれば、P＝4.25(atm.)、Ae/At＝1.2502、De/Dt＝1.118、Dt＝2.6834mm、L＝15.198mm；
（P）もしMe＝1.2、De＝2.5mmであれば、P＝2.425(atm.)、Ae/At＝1.034、De/Dt＝1.0151、Dt＝2.463mm、L＝1.776mm；
（Q）もしMe＝1.3、De＝2.5mmであれば、P＝2.771(atm.)、Ae/At＝1.0663、De/Dt＝1.0326、Dt＝2.426mm、L＝3.565mm；
（R）もしMe＝1.4、De＝2.5mmであれば、P＝3.182(atm.)、Ae/At＝1.1115、De/Dt＝1.0543、Dt＝2.371mm、L＝6.180mm；
（S）もしMe＝1.5、De＝2.5mmであれば、P＝3.67(atm.)、Ae/At＝1.1762、De/Dt＝1.0845、Dt＝2.305mm、L＝9.350mm；
（T）もしMe＝1.6、De＝2.5mmであれば、P＝4.25(atm.)、Ae/At＝1.2502、De/Dt＝1.118、Dt＝2.236mm、L＝12.665mm。
【００３５】
以上の計算から、圧力P、スプレーネック直径Dtおよび分散部最小長Lが、スプレーチューブの出口マッハ数Meおよび出口直径Deを固定すると得られる。もしDtを4.74mmに固定すれば、Me＝1.4を得るために圧力Pは3.18atm（約46.75psi）を必要とする。全システムにおける圧力損失を考慮すると、制御バルブ後のガス圧力はほぼ90〜100psiでなければならないが、それでもガス貯槽の低い圧力範囲下にある。
【００３６】
(2)  均一なガス流速設計
スプレーノズルにおけるガス流の方向は中心軸に平行でない。中心軸に平行なガス流を得るためには、分散部の上記単純設計のスプレーネックで発生した膨張波をスプレーノズルの特別な曲面設計により補償しなければならない。
【００３７】
ガス流速はスプレーノズル出口で超音速を達成するので、円錐形状のスプレーチューブまたは真直ぐなスプレーチューブをスプレーノズルに接続してサンプルを加速し、細胞壁および／または細胞膜を通過して表皮細胞中に貫入する効果のあることが証明されている高い速度まで上昇させる。
【実施例】
【００３８】
サンプル溶液調製
サンプル溶液の調製は含有する生物材料に基づいて改定および改変することができるが、特定の技術または方法に限定されるものでない。一般的に生物材料を処理し、次いでサンプル溶液として適当な溶液に溶解することができ、金属粒子担体は使用しない。
【００３９】
DNA溶液の調製
完全なタンパク質発現システムを用いて構築したDNAプラスミドを、無菌蒸留水中に溶解する。調製した溶液は遺伝子銃のボンバードメント用として直接適用することができる。
【００４０】
キトサンオリゴマーの調製
キトサン（Sigma C-3646）を6%酢酸溶液中に5mg/mLの濃度で溶解し、次いで8% KNO2（キトサンに対してw/w）を加えて、室温下で1時間反応させた。1時間後、同じ容積の0.1N NaOHを加えて反応を終結させ、次いで無水アルコールを加え（溶液容積／無水アルコール容積＝1/3）、次いで4℃で一夜置換えた。混合物を4℃で遠心分離（1500rpm）して沈降物を採集し、その沈降物を0.5%酢酸溶液に2mg/mLの濃度で再溶解し、そして0.45μmフィルターによりろ過した。
【００４１】
キトサンオリゴマー-CMC複合体の調製
キトサンオリゴマーを2mg/mLカルボキシメチルセルロース（CMC）と3:1（容積で）の比で混合して攪拌し、キトサンオリゴマー-CMC複合体を得る。
【００４２】
DNA-キトサンオリゴマー-CMC複合体の調製
0.3μlの（濃度1μg/μl）pEGFP-N2ベクター（Clontech）に4μlのキトサンオリゴマー-CMC複合体を加え、その混合物を均一になるまで攪拌した。
【００４３】
DNA溶液によるマウス皮膚のボンバードメント
遺伝子銃実験に用いた検体はほぼ数週齢のBALB/cマウスである。マウス腹部の毛を剃ってマウスの皮膚を露出させる。3-4週齢Balb/cマウスを選択し、剃って腹部皮膚を露出させる。裸DNAまたはキトサン-CMC-DNA溶液を遺伝子銃に充填した後、露出したマウス皮膚にボンバードメントを実施する。各マウスの腹部皮膚のサイズは、容積4.3μlの各ショットのボンバードメントを平均４ショット受けることができる。１日後、マウスを犠牲にしてその皮膚を除去し、蛍光顕微鏡下でまたは顕微切片を作成して観察する。
【００４４】
EGFPタンパク質によるマウス皮膚のボンバードメント
DNA溶液によるボンバードメント方法と同様に、マウスを剃って腹部皮膚を露出させる。EGFPタンパク質（4μg）溶液を遺伝子銃に充填した後、露出したマウス皮膚にボンバードメントを実施する。ボンバードメント後、皮膚を洗浄溶液を用いて洗浄して皮膚外部に残ったタンパク質を洗い落とす。その後、マウスを犠牲にしてその皮膚を除去し、蛍光顕微鏡下でまたは顕微切片を作成して観察する。
【００４５】
マウス皮膚の凍結切片
マウス皮膚を除去して立方体の切片を作り、O.C.T.包埋剤（Tissue-Tek, Sakura Finetechnical Co. Ltd.）を用いて処理する。次いで組織を深冷凍結顕微切片作成法により10μm厚みのスライス切片とし、蛍光顕微鏡下で観察する。
【００４６】
裸DNAボンバードメントの遺伝子免疫感作
３週齢Balb/cマウスを選択し、マウスの腹部皮膚を遺伝子銃により、DNA溶液24μl（1.8μgの裸pEGFP DNAベクターを含有する）を用いて４週間にわたり毎週1回ボンバードメントを実施する。ボンバードメントは100psiのヘリウム圧力を用いて実施する。第１週から第５週まで、眼窩から毎週１回血液を採取することにより血清を採集する。血清をウェスタンブロットにより分析する。EGFPタンパク質（0.5μg）を電気泳動（SDS-PAGE）により分離してニトロセルロースペーパーに移し、マウスから得た血清を用いて100倍に希釈し、TBSバッファー（Tris塩基20mM、NaCl 150mM、Tween20 0.3%、pH 7.2）を用いて３回洗浄し、次いで抗マウスIgGとコンジュゲートしたペルオキシダーゼ（Sigma A-5906）を用いて処理する。次に、生成物をTBSバッファーにより４回洗浄し、そしてニトロセルロースペーパーをLumiGLO（商標）（KPL 50-60-00および50-59-60）を用いて現像し、表示しかつ記録する。
【００４７】
遺伝子銃のボンバードメントから得た結果
裸DNA溶液を用いるボンバードメント
シューティング（ボンバードメント）は60psiのヘリウム圧力により実施し、各ショットは0.2μg DNAを含む。マウスの腹部表皮細胞上に存在する緑色蛍光を、蛍光顕微鏡下で観察した。図4A（拡大率40倍、40X）に示すように、左側はショット領域であり、蛍光顕微鏡下で緑色蛍光を放射し；一方、右側は非シューティング領域（ショットしていない）であり、従って蛍光を示さない。腹部領域のショット領域については、図4B（400X）に示すように、ほとんど全ての表皮細胞は緑色蛍光を示し、遺伝子銃のボンバードメントの高い有効性を示す。
【００４８】
キトサン-DNAナノ粒子を用いるボンバードメント
シューティング（ボンバードメント）は50psiのヘリウム圧力により実施し、各ショットは0.3μg DNA（キトサン：CMC＝3：1）を含む。マウスの腹部表皮細胞上に存在する緑色蛍光を、蛍光顕微鏡下で観察する。図５（拡大率40倍、40X）はDNA-キトサンのナノ粒子によるボンバードメントの結果を示す。遺伝子銃のボンバードメントから得た緑色蛍光の分布は広範であり所望のボンバードメントの結果を得たことを示す。
【００４９】
EGFPタンパク質によるボンバードメント
シューティング（ボンバードメント）は100psiのヘリウム圧力により実施し、各ショットは4μg EGFPタンパク質を含む。マウスの腹部細胞上に存在する蛍光を、蛍光顕微鏡により観察する。マウス皮膚の凍結切片に対する図６（400X）の蛍光観察結果は、EGFPタンパク質が表皮中に導入されるが、さらに深い組織（例えば、筋組織）中には導入されないことを示す。
【００５０】
裸DNA溶液またはDNAコート粒子による遺伝子形質転換
４週齢Balb/cマウスを選択してマウスの腹部皮膚を遺伝子銃により、60psiのヘリウム圧力により、金属粒子担体を含まない裸DNAサンプル溶液（DNA溶液グループ）またはDNAコートした金粒子サンプル（粒子グループ）を用いてボンバードメントする。粒子を含まないDNA溶液は0.2μg pEGFP-N2ベクターを含有し、一方、DNAコートした粒子サンプルはスペルミジン／CaCl2によりコートした0.2μg pEGFP-N2ベクター/0.1mg金粒子を含む。ボンバードメント後の翌日に、マウス腹部皮膚を２グループから除去し、蛍光顕微鏡下で蛍光を観察した。
【００５１】
図７は、本発明の遺伝子銃を用いてDNA溶液ボンバードメントした後のマウスの腹部表皮細胞の拡大写真（40X）である。細胞に存在する蛍光は、pEGFP-N2ベクターによる細胞に対する形質転換の成功を表す。観察された蛍光は顕著かつ均一である。
【００５２】
図８は、DNAコートした粒子を用いたボンバードメント後のマウスの腹部表皮細胞の拡大写真（40X）である。他方では、観察された蛍光は弱くかつ分布はまばらである。
【００５３】
上記２グループの結果を比較するとこれは、裸DNA溶液を用いる遺伝子銃のボンバードメントによって優れた形質転換効果が達成されることを示す。
【００５４】
裸DNAによるマウス遺伝子免疫感作のウェスタンブロット
４週齢Balb/cマウスを選択し、剃って腹部皮膚を露出させる。裸DNA サンプル溶液（溶液グループ）またはDNAコートした金粒子（粒子グループ）を遺伝子銃中に充填した後、ボンバードメントをマウス皮膚に対して実施し、２グループから得られる免疫応答を比較する。
【００５５】
マウスの腹部皮膚を、遺伝子銃により４〜６週間にわたり、毎週１回ボンバードメントし、前記ボンバードメントは80psiのヘリウム圧力を用いて実施する。溶液グループに対するボンバードメントは、裸DNA溶液を用いて４週間にわたり毎週１回、1.8μgの裸pEGFP-N2ベクターを含有する１ショットを実施する。粒子グループに対するボンバードメントは、DNAコートした金粒子を用いて６週間にわたり毎週１回、0.6μgの裸pEGFP-N2ベクター／0.6mg金粒子を含有する１ショットを実施した。第１週から第５週まで、血清を毎週１回採集する。次いで血清は、ウェスタンブロットにより分析して抗EGFP抗体が存在するかどうかを見る。
【００５６】
溶液グループの結果を図９に示す。マウスm1-m5は裸DNA溶液（pEGFP-N2）を用いて免疫感作し、一方、マウスm6は免疫感作を有しない水を用いて免疫感作した対照である。マウスm1-m5は第２ブースト（第３週）後に中度の抗体反応が観察され、マウスm5は第２週に弱い抗体反応が観察された。
【００５７】
粒子グループの結果を図１０に示す。マウスA5およびA8は免疫感作を有しない水を用いて免疫感作した対照である。マウスA1-A4およびA6-A7に対しては、中度の抗体反応が全般的に第４または第５週に見られたが、マウスA7は第２週に弱い抗体反応が観察された。
【００５８】
裸DNA溶液による遺伝子銃とDNAコート粒子による遺伝子銃の免疫感作結果を比較すると、全般的に、裸DNA溶液により誘導された免疫感作が若干優れると思われる。両者ともにボンバードメント後の第３週〜第４週に抗体反応を誘導することができる。
【００５９】
従って、遺伝子銃スプレーノズルの形状設計および遺伝子銃操作の改変により、遺伝子銃をより低圧で操作してサンプル溶液を極めて高い速度まで加速することが可能になる。生物材料は、金属粒子により運ばれることなく、表皮または細胞／膜／壁を貫通して細胞または生物中に進入することができる。
【００６０】
低圧を用いるので、生物材料を、金属粒子を用いることなく、細胞中に移動し、最小限のノイズと細胞に対する損傷で遺伝子形質転換を達成する。さらに、本発明のサンプルは溶液形態で調製し、金属粒子を用いないので、遺伝子銃の操作は容易かつ簡単であって、従来遭遇した金粒子調製における困難がなくなる。本発明においては、生物材料、例えばDNA、RNA、タンパク質、ビリオンまたは薬物を溶液形態で調製しかつ加速して細胞中に進入させ、送達または遺伝子形質転換を果たす。
【００６１】
さらに、スプレーノズルの形状設計によって、遺伝子銃の操作を改変してサンプル溶液の均一な分布を可能にする。ノズル開口部における圧力が大気圧に近いので、標的細胞が損傷されるのを防止する。
【００６２】
本発明の範囲または精神から逸脱することなく、本発明の構造に様々な修飾および改変を行いうることは当業者であれば明らかであろう。以上を照合して、本発明は、本発明の請求項およびその同等物の範囲内にある限りにおいて、本発明の修飾および改変を包含することを意図する。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】図１は、本発明の好ましい実施形態による遺伝子銃の断面図である。
【図２】図２は、遺伝子銃とチューブアセンブリーの間の接続を図解する。
【図３】図３は、本発明の好ましい実施形態によるスプレヤーおよびスプレーノズルの断面図である。
【図４Ａ】図4Aは、本発明の遺伝子銃を用いるDNA溶液ボンバードメント後のマウスの腹部表皮細胞の拡大写真（40 X）である。
【図４Ｂ】図4Bは、本発明の遺伝子銃を用いるDNA溶液ボンバードメント後のマウスの腹部表皮細胞の拡大写真（400 X）である。
【図５】図５は、本発明の遺伝子銃を用いるキトサン-DNA溶液によるボンバードメント後のマウスの腹部表皮細胞の拡大写真（40 X）である。
【図６】図６は、本発明の遺伝子銃を用いるEGFPタンパク質溶液によるボンバードメント後のマウスの腹部表皮細胞の凍結スライスの拡大写真（400 X）である。
【図７】図７は、本発明の遺伝子銃を用いるDNA溶液ボンバードメント後のマウスの腹部表皮細胞の拡大写真（40 X）である。
【図８】図８は、本発明の遺伝子銃を用いるDNAコート粒子によるボンバードメント後のマウスの腹部表皮細胞の拡大写真（40 X）である。
【図９】図９は、本発明の遺伝子銃を用いるDNA溶液ボンバードメント後のマウスの免疫応答をモニターするウェスタンブロットの結果を示す。
【図１０】図１０は、本発明の遺伝子銃を用いるDNAコートした粒子によるボンバードメント後のマウスの免疫応答をモニターするウェスタンブロットの結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【外国語明細書】
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