【手続補正書】
【提出日】平成24年9月7日(2012.9.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸の連続的進化方法であって、
進化させる少なくとも１つの機能的核酸鎖を第一の宿主細胞へ導入する工程；
該第一の宿主細胞内で該機能的核酸鎖を複製する工程；
該機能的核酸鎖を変異させる工程；および
少なくとも１つの該変異させた機能的核酸鎖を第二の宿主細胞へ導入する工程
を含む、方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
別の局面において、本発明は、核酸鎖を最初の細胞から２番目の細胞へ、機能依存的な方式で伝達し得る、連続的指向性進化システムのキットおよびシステムを開示する。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
核酸の連続的進化方法であって、
進化させる少なくとも１つの機能的核酸鎖を第一の宿主細胞へ導入する工程；
該第一の宿主細胞内で該機能的核酸鎖を複製する工程；
該機能的核酸鎖を変異させる工程；および
少なくとも１つの該変異機能的核酸鎖を第二の宿主細胞へ導入する工程
を含む、方法。
（項目２）
前記宿主細胞が、原核細胞、真核細胞、および細菌細胞からなる群から選択される、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記機能的核酸鎖は、進化させる遺伝子および増殖コンポーネントをコードする第二の遺伝子を含む、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記増殖コンポーネントは、前記第一の宿主細胞における前記機能的核酸鎖の複製のために必要である、項目３に記載の方法。
（項目５）
前記増殖コンポーネントは、前記第二の宿主細胞への前記機能的核酸鎖の導入のために必要である、項目３に記載の方法。
（項目６）
前記変異工程は、前記変異核酸鎖の選択された機能についてのスクリーニングをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目７）
前記スクリーニング工程は、バクテリオファージディスプレイシステム、抗生物質耐性、およびレポーター遺伝子の発現のうちの少なくとも一つを含む、項目６に記載の方法。
（項目８）
前記宿主細胞は、
少なくとも一つの増殖シグナルが機能的に無力にされたファージゲノムを含むヘルパープラスミド；および
前記機能的な発現した核酸鎖に反応して１つまたは複数の該無力にされた増殖シグナルを提供することができるアクセサリープラスミド
をさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目９）
前記ファージ増殖シグナルは、遺伝子ＩＩタンパク質（ｇ２ｐ）、遺伝子ＩＩＩタンパク質（ｇ３ｐ）、または遺伝子ＶＩタンパク質（ｇ６ｐ）のうちの少なくとも１つの不活化によって、機能的に無力にされる、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記ファージゲノムは、Ｍ１３ファージゲノム、ｆｄファージゲノム、ｆ１ファージゲノム、ＺＪ／２ファージゲノム、Ｅｃ９ファージゲノム、ＡＥ２ファージゲノム、ＨＲファージゲノム、δＡファージゲノム、およびＩｋｅファージゲノムから成る群から選択される、項目８に記載の方法。
（項目１１）
前記変異機能的核酸鎖を第二の宿主細胞へ導入する工程は、前記第一の宿主細胞を培養する工程をさらに含み、ここで該第一の宿主細胞は、該機能的核酸鎖によってコードされるファージミド核酸分子を糸状ファージ粒子へパッケージングすることができる、項目８に記載の方法。
（項目１２）
前記変異機能的核酸鎖を第二の宿主細胞へ導入する工程は、前記パッケージングされたファージミド核酸分子を含む前記糸状ファージ粒子を該第二の宿主細胞へと導入し、その結果進化させる該核酸鎖を該第二の宿主細胞へ導入する工程をさらに含み、ここで該第二の宿主細胞は、ヘルパープラスミドおよびアクセサリープラスミドを含む、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記機能的核酸の変異工程が、前記変異機能的核酸鎖によってコードされる進化タンパク質または核酸を発現する工程をさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目１４）
前記機能的核酸の変異工程が、変異誘発剤を導入する工程を含む、項目１に記載の方法。
（項目１５）
前記変異誘発剤が、ヌクレオチドアナログ、ヌクレオシド前駆体、アルキル化剤、架橋剤、遺伝毒性物質、および放射線からなる群から選択される、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記変異誘発剤が、化学的変異原である、項目１４に記載の方法。
（項目１７）
前記化学的変異原は、３−クロロ−４−（ジクロロメチル）−５−ヒドロキシ−２（５Ｈ）−フラノン（ＭＸ）（ＣＡＳ  ｎｏ．７７４３９−７６−０）、Ｏ，Ｏ−ジメチル−Ｓ−（フタルイミドメチル）ホスホロジチオエート（ｐｈｏｓ−ｍｅｔ）（ＣＡＳ  ｎｏ．７３２−１１−６）、ホルムアルデヒド（ＣＡＳ  ｎｏ．５０−００−０）、２−（２−フリル）−３−（５−ニトロ−２−フリル）アクリルアミド（ＡＦ−２）（ＣＡＳ  ｎｏ．３６８８−５３−７）、グリオキサール（ＣＡＳ  ｎｏ．１０７−２２−２）、６−メルカプトプリン（ＣＡＳ  ｎｏ．５０−４４−２）、Ｎ−（トリクロロメチルチオ）−４−シクロヘキサン−１，２−ジカルボキシミド（カプタン）（ＣＡＳ  ｎｏ．１３３−０６−２）、２−アミノプリン（ＣＡＳ  ｎｏ．４５２−０６−２）、メチルメタンスルホネート（ＭＭＳ）（ＣＡＳ  ｎｏ．６６−２７−３）、４−ニトロキノリン１−オキシド（４−ＮＱＯ）（ＣＡＳ  ｎｏ．５６−５７−５）、Ｎ４−アミノシチジン（ＣＡＳ  ｎｏ．５７２９４−７４−３）、アジ化ナトリウム（ＣＡＳ  ｎｏ．２６６２８−２２−８）、Ｎ−エチル−Ｎ−ニトロソウレア（ＥＮＵ）（ＣＡＳ  ｎｏ．７５９−７３−９）、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソウレア（ＭＮＵ）（ＣＡＳ  ｎｏ．８２０−６０−０）、５−アザシチジン（ＣＡＳ  ｎｏ．３２０−６７−２）、クメンヒドロペルオキシド（ＣＨＰ）（ＣＡＳ  ｎｏ．８０−１５−９）、エチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）（ＣＡＳ  ｎｏ．６２−５０−０）、Ｎ−エチル−Ｎ−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＥＮＮＧ）（ＣＡＳ  ｎｏ．４２４５−７７−６）、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）（ＣＡＳ  ｎｏ．７０−２５−７）、５−ジアゾウラシル（ＣＡＳ  ｎｏ．２４３５−７６−９）、およびｔ−ブチルヒドロペルオキシド（ＢＨＰ）（ＣＡＳ  ｎｏ．７５−９１−２）からなる群から選択される、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記宿主細胞が、ＳＯＳ変異誘発損傷バイパスタンパク質を誘導的に発現するように改変される、項目１に記載の方法。
（項目１９）
前記ＳＯＳ変異誘発損傷バイパスタンパク質は、ポリメラーゼＶおよび活性化ｒｅｃＡからなる群から選択される、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記宿主細胞が、誤りがちのＤＮＡポリメラーゼサブユニットを誘導的に発現することができる変異促進性プラスミドを含む、項目１８に記載の方法。
（項目２１）
前記アクセサリープラスミドは、前記ヘルパープラスミドから１つまたは複数の無力になったシグナルを誘導的に発現することができる、項目８に記載の方法。
（項目２２）
前記方法は、前記変異核酸鎖を単離する工程をさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目２３）
前記方法は、前記工程を反復する工程をさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目２４）
前記宿主細胞は、ある細胞から別の細胞へと核酸を運搬するシステムをさらに含み、該システムは、前記第一の宿主細胞および前記第二の宿主細胞の間の接合伝達（接合）；該第一の宿主細胞が前記機能的核酸を封入し、該第二の宿主細胞への侵入を提供することができる、ウイルス感染；および該裸の核酸鎖が該第二の宿主細胞によって取り込まれる、該第一の細胞からの該機能的核酸の排除、からなる群から選択される、項目１に記載の方法。
（項目２５）
前記機能的核酸の排除の工程は、分泌または溶解のうちの少なくとも一つを含む、項目２４に記載の方法。