(57)【要約】【課題】ヒト薬物代謝酵素CYP2A6遺伝子多型を迅速に判定する方法を提供する。【解決手段】以下の（a）〜（d）；（a）目的の遺伝的多型の遺伝子変異が存在する領域を増幅する段階、（b）遺伝子変異箇所をカーバーする検出プローブをアニールさせ、検出プローブの3’側隣接領域にアンカープローブをアニールさせる段階、（c）検出プローブの蛍光色素に励起光を照射した後、アンカープローブから放出される蛍光を連続的に検出する段階、（d）反応液の温度を上昇させる段階、を含むことを特徴とするCYP2A6遺伝子の変異の有無を判定する方法が提供される。また、かかる方法をサーマルサイクラーと蛍光検出器を統合したPCR装置を用いて行う方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（a）〜（d）；
（a）目的の遺伝的多型の遺伝子変異が存在する領域を増幅する段階、
（b）遺伝子変異箇所をカバーする検出プローブをアニールさせ、検出プローブの3’側隣接領域にアンカープローブをアニールさせる段階、
（c）検出プローブに結合した蛍光色素に励起光を照射した後、アンカープローブに結合した蛍光色素から放出される蛍光を連続的に検出する段階、
（d）反応液の温度を上昇させる段階、
を含むことを特徴とするCYP2A6遺伝子の変異の有無を判定する方法。
【請求項２】
以下の（a）〜（d）；
（a）目的の遺伝的多型の遺伝子変異が存在する領域を増幅する段階、
（b）遺伝子変異箇所をカバーする検出プローブをアニールさせ、検出プローブの3’側隣接領域にアンカープローブをアニールさせる段階、
（c）検出プローブに結合した蛍光色素に励起光を照射した後、アンカープローブに結合した蛍光色素から放出される蛍光を連続的に検出する段階、
（d）反応液の温度を上昇させる段階、
のすべての段階をサーマルサイクラーと蛍光検出器を統合したPCR装置を用いて行うことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記遺伝子変異が存在する領域を増幅するために、配列番号：１及び配列番号：２で示されるDNA配列をプライマーとして用いることを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記検出プローブが、配列番号：５及び／又は配列番号：６で示される蛍光標識されたDNA配列であることを特徴とする請求項１ないし３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記アンカープローブが、配列番号：７及び／又は配列番号：８で示される蛍光標識されたDNA配列であることを特徴とする請求項１ないし４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記遺伝子変異が存在する領域を増幅するために、配列番号：３及び配列番号：４で示されるDNA配列をプライマーとして用いることを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項７】
前記検出プローブが、配列番号：９で示される蛍光標識されたDNA配列であることを特徴とする請求項１、２、又は６に記載の方法。
【請求項８】
前記アンカープローブが、配列番号：１０で示される蛍光標識されたDNA配列であることを特徴とする請求項１、２、６又は７に記載の方法。
【請求項９】
配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３及び配列番号：４で示されるプライマー。
【請求項１０】
配列番号：５、配列番号：６及び配列番号：９で示される検出プローブ。
【請求項１１】
配列番号：７、配列番号：８及び配列番号：１０で示されるアンカープローブ。
【請求項１２】
ヒトゲノムDNA中のCYP2A6遺伝子多型を診断するためのキットであって；
（a）CYP2A6遺伝子の変異部位を含む領域を増幅するためのプライマー、
（b）遺伝子変異箇所を検出するための蛍光検出プローブ、
（c）検出プローブの3’側隣接領域に結合するアンカープローブ、
を含んでなるキット。
【請求項１３】
前記CYP2A6遺伝子の変異部位を含む領域を増幅するためのプライマーが、配列番号：１及び配列番号：２で示されるDNA配列であり、前記検出プローブが、配列番号：５及び／又は６で示されるDNA配列であり、前記アンカープローブが配列番号：７及び／又は８で示されるDNA配列である請求項１２に記載のキット。
【請求項１４】
前記CYP2A6遺伝子の変異部位を含む領域を増幅するためのプライマーが、配列番号：３及び配列番号：４で示されるDNA配列であり、前記検出プローブが、配列番号：９で示されるDNA配列であり、前記アンカープローブが配列番号：１０で示されるDNA配列である請求項１２に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、CYP2A6をコードする遺伝子の解析法及び解析キットに関し、更に詳しくは、例えば、CYP2A6酵素をコードする遺伝子の変異を解析して創薬に必要な情報を得る遺伝子解析法及びその解析キットに関する。
【従来の技術】
【０００２】
CYPファミリー（チトクロームP450ファミリー）は、生体外異物の解毒作用、生体内物質の合成及び代謝など、生体おいて重要な種々の役割を果たしている。例えば、生体に薬物を投与すると、特定のCYPが発癌感受性と正の相関を示しながら誘導されることが知られており、このCYP分子種が発癌に関与していることが示唆される。また、薬物投与時のみならず、高血圧や糖尿病などの病態時にもCYPが誘導され、その変動に伴って代謝活性が変化し、生体に何らかの影響を与えているとも考えられている。さらに、ある特定の薬物を代謝するCYPの分子種の遺伝的欠損の結果、該薬物の効果が通常よりも強く出るという症例も報告されており、CYP分子種の薬物代謝に関する研究は、疾患等の薬物治療の分野において極めて重要な研究対象となっている。
【０００３】
CYPは、薬物、化学発癌物質、環境汚染物質、あるいはステロイド、脂肪酸、プロスタグランジンのような内因性基質など、構造的に無関係な多様な化合物の代謝に関与するユビキタスな1原子酸素添加酵素のスーパーファミリーを構成する（Guengerich, 1991）。また、多くのアイソザイムの存在が知られており、その幾つかは既に同定されている（Nelson等, 1993）。
硫黄を含有する薬物の多くは、S-酸化経路を経由して代謝されるが、硫黄化合物の酸化反応は、通常CYP、あるいはフラビン含有モノオキシゲナーゼ（以下、FMOと称す）により触媒されることが知られている。なかでも、(+)-シス-3, 5-ジメチル-2-（3-ピリジル）チアゾリジン-4-オン（以下、SM-12502と略記する）は、in vitro及びin vivoにおいて血小板活性化因子（以下、PAFと称する）に対して選択的な拮抗作用を有する物質であり、抗PAF剤として開発が進められていた。
【０００４】
本発明者等は、SM-12502のS-酸化反応を担う代謝酵素の同定を行うべく検討した結果、該反応にはCYPスーパーファミリーの一つであるヒトCYP2A6が主に関与していることを、これまでに明らかにしてきた（薬物動態、vol.9, S297, 11B10-3 1994）。ヒトCYP2A6の基質として、上記SM-12502以外に知られているのは、クマリンのみである。ヒトCYP2A6はクマリンの7位水酸化反応を触媒するが、クマリン7位水酸化活性には、大きな個体差が存在することが報告されている（Rautio等, 1992；Iscan等, 1994）。また、クマリンをin vivoでヒトに投与した実験結果から、ヒトCYP2A6には遺伝的多型が存在することが示唆されている（Cholerton等, 1992；Fernadez-Salguero及びGonzalez, 1995）。
遺伝的多型とは、同じ種類の生物集団内に、個体間で互いに異なる特定の遺伝子の配列が２種以上存在し、その頻度が１％以上のものをいう。同種の生物は原則として同じ配列の遺伝子を共有し、通常、同じ配列の遺伝子に制御された同様の生理作用を営んでいる。しかし、同種の生物であっても、共通するはずの遺伝子配列が実際には互いに異なる場合がある。
遺伝的多型が出現する原因は、遺伝子配列上に突然変異が導入されることである。具体的には、塩基置換(substitution)、塩基欠失(deletion)、塩基挿入(insertion)、反復塩基配列（サテライト）数の違いなどが起きていることによる。ある種の酵素に遺伝的多型が存在した場合、該酵素の活性に影響が表れ、その結果、該酵素が関与する薬物代謝反応が個人間で異なるものとなることがある。
【０００５】
遺伝子の多型を解析する方法としては、制限酵素断片長多型（RFLP;Restriction Fragment Length Polymorphism）法あるいはPCR-制限酵素断片長多型（PCR-RFLP）法が存在する。PCR-制限酵素断片長多型法は、ターゲットとなる目的遺伝子をPCR法により増幅し、増幅した目的遺伝子を、変異部位において制限酵素で切断し、その断片を電気泳動し、その泳動度の分布から変異の有無を判定する。ヒトCYP2A6遺伝子多型に関し、制限酵素断片長多型法により解析した結果、多型の存在が報告されているが（例えば、非特許文献１又は２。）、該制限酵素断片多型とクマリン7位水酸化酵素活性との間に有意な相関は見出されなかった（例えば、非特許文献１又は２。）。
PCR制限酵素断片長多型法は、目的遺伝子の増幅と目的遺伝子の切断に長い処理時間を要する上、操作が煩雑であり、時間的コスト及び操作性の点で多くの問題が存在する。さらには、途中の工程、例えば、目的遺伝子の切断処理などが不十分である場合には、判定結果に誤判定を導きやすいというリスクも内包されており、結果の信頼性という観点からも十分な手段ということはできない。従って、CYP2A6の遺伝的多型を手掛かりとしたCYP2A6酵素活性の個体差を判別する有力な手段は現在のところ存在せず、その開発が待たれているのが現状である。
【０００６】
【非特許文献１】
Wainwright, B.J.等, 1985；Rautio, H.等, Nucl. Acid. Res. 13:4610, 1985
【非特許文献２】
Rautio, H.等, In 10th International Symposium on Microsomes & Drug Oxidations, Toronto, Canada, 18-21 July, pp.487, 1994.
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者等は、上記事情に鑑みて、ヒトCYP2A6遺伝的多型を迅速かつ簡便に判定する方法がないかについて鋭意研究を行った結果、意外にも目的遺伝子部位の増幅と変異部位の検出を同時に行うことで、迅速性・信頼性・簡便性の高いCYP2A6遺伝子の多型をリアルタイムで判定できることを見い出した。
よって、本発明は、CYP2A6遺伝子の遺伝子多型をCYP2A6遺伝子のPCR増幅と変異部位特異的な蛍光プローブによる検出を同時に行うための方法を提供することを目的とする。
また、本発明は、上記方法において用いられるべき、PCR増幅増幅用のプライマー及び変異部位の検出用の蛍光プローブを提供することを目的とする。
さらに、本発明は、上記方法の実施を容易にするためのキットを提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
しかして、本発明においては、以下の（a）〜（d）；
（a）目的の遺伝的多型の遺伝子変異が存在する領域を増幅する段階、
（b）遺伝子変異箇所をカーバーする検出プローブをアニールさせ、検出プローブの3’側隣接領域にアンカープローブをアニールさせる段階、
（c）検出プローブに結合した蛍光色素に励起光を照射した後、アンカープローブに結合した蛍光色素から放出される蛍光を連続的に検出する段階、
（d）反応液の温度を上昇させる段階、
を含むことを特徴とするCYP2A6遺伝子の変異の有無を判定する方法が提供される。また、かかる方法をサーマルサイクラーと蛍光検出器を統合したPCR装置を用いて行う方法も提供される。
また、CYP2A6の多型が存在する領域を増幅するために好適なプライマー、変異を領域に結合させるのに好適な検出プローブ、及び検出プローブの蛍光エネルギーによってさらに蛍光を放出する（蛍光共鳴エネルギー転移）アンカープローブが提供される。
さらに、上記方法を実施するのに用いて好適なキットも提供される。
【０００９】
本発明に係る方法は、PCR増幅用のプライマー、検出プローブ及びアンカープローブを適切にデザインし、組合わせることで未知の多型を同定することも可能であると思われる。また、既知の多型に関しては、該多型に特異的なPCR増幅用プライマー、検出プローブ及びアンカープローブをデザインすることで、該多型を迅速、的確、簡便に判定することが可能となる。ここで「検出プローブ」とは、目的の遺伝子の多型部位に結合する核酸プローブのことであり、変異部分を含む領域の野生型DNA配列と同じ配列をもち、3’末端に蛍光色素が結合される。また、「アンカープローブ」とは、検出プローブに結合される蛍光色素と自らに結合される蛍光色素との間で蛍光共鳴エネルギー転移が誘起され、その結果放出される蛍光をリアルタイムで検出することで、多型の有無を判定するための核酸プローブのことである。アンカープローブは、検出プローブの3’末端部分に連続するように対象のゲノムDNA配列と結合するようにデザインされ、該アンカープローブの5’末端には蛍光色素が結合される。検出プローブ及びアンカープローブに結合される蛍光色素は、蛍光共鳴エネルギー転移を引き起こすものであれば使用可能であるが、検出プローブにフルオレセインを結合させ、アンカープローブにLC Red640又はLC Red705を結合させたものを用いるのが好ましい。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態を詳述する。
本発明の実施の形態では、多型を判断する対象である生体試料の取得、該生体試料からのゲノムDNAの抽出及び遺伝的多型の存在するゲノム領域の増幅、検出プローブ及びアンカープローブの調製、及び検出プローブの解離をリアルタイムでモニターする工程が含まれる。
よって、かかる工程について順を追って説明する。
【００１１】
１．生体試料の取得
CYP2A6の多型を判定する対象として使用可能な生体試料としては、全血（末梢血）が使用可能であるが、バッフィーコート（白血球層）を用いるのが好ましい。
【００１２】
２．ゲノムDNAの抽出及び遺伝子多型存在領域のPCR増幅
（１）ゲノムDNAの抽出
遺伝子の多型を確認するためのゲノムDNAの調製は、当業者にとって周知の方法を用いることができる。例えば、対象の生体試料をSDSとEDTAの存在下でProteinase Kで処理し溶解させる。その後、引き続きフェノール抽出によりタンパク質の除去を行う。詳細には、生体試料をProteinase K（〜200 mg/ml）を含んだlysis buffer（例えば、50 mM Tris-HCl, pH7.5, 20 mM EDTA, 100 mM NaCl, 1 %SDS）で処理し、約55℃で一晩インキュベートする。組織片が完全に消失したことを確認後、中和フェノールを組織サンプルに添加してタンパク質を変性させ、遠心後、ゲノムDNAを上清に回収する。上清に対して、さらにフェノール／クロロホルム、クロロホルム処理を行った後、エタノール沈殿法にてゲノムDNAを沈殿に回収する。DNAの沈殿は乾きすぎに注意をしながら適度に風乾し、適当なバッファー（例えば、TEバッファー、10 mM Tris-HCl, pH8.0, 1mM EDTA）に溶解する。
【００１３】
（２）遺伝的多型存在領域のPCRによる増幅
確認すべき多型の存在する領域を増幅するために、使用可能な特異的DNAプライマーを調製し、増幅を行う。増幅を行うべき領域は、多型の存在する位置に依存するが、例えば、CYP2A6*1B、*4Cの判定では、イントロン8から3’非翻訳領域内にまで及ぶ819塩基対を、CYP2A6*9の判定では、5’非翻訳領域からエクソン1の440bpを増幅するとよい。
ここで用いるDNAプライマーは、標準的な合成技術、例えば、自動DNA合成装置などによって調製することができるが、商業的サービスを利用してもよい（例えば、SIGMA GENOSYS社）。該領域の増幅に使用されるポリメラーゼは市販のものを用いることができるが、より正確性の高いものを使用することが望ましい。
また、該領域の増幅を行う条件は、使用するDNAプライマーのアニール温度、使用するDNAポリメラーゼ、増幅する長さ等に依存するが、例えば、CYP2A6*1B、*4Cの判定では、95℃10分間の初期変性後、95℃15秒、61℃5秒、72℃30秒を55サイクル、CYP2A6*9の判定では、95℃10分間の初期変性後、95℃0秒、59℃5秒、72℃15秒を55サイクル行う。
PCR増幅を行うための装置は、サーマルサイクラーと蛍光検出器を統合したもので、反応物の状態をリアルタイムで検出できるものが望ましい。市販のものを使用することができるが、例えば、LightCycler装置（Roche社）が好適に使用可能である。
【００１４】
３．検出プローブ及びアンカープローブの調製
遺伝子多型の変異部分を検出するための検出プローブは変異部分をカバーする約20〜30bp長のプローブであって、変異部分に相当する野生型配列により構成される。検出プローブは3’末端に蛍光色素（例えば、フルオレセイン）を結合させ、ポリメラーゼによる伸張を防ぐために、3’-OHをリン酸化しておくのが望ましい。一方、アンカープローブは、約20〜30bp長のプローブであって、検出プローブに対して1〜5bpのギャップで隣接するようにデザインし、検出プローブと同様に5’末端には蛍光色素（例えば、LCRed640またはLCRed705）を結合させる。検出プローブとアンカープローブは商業的サービスを利用して合成することができる（例えば、Roche社）。
【００１５】
４．検出プローブの解離特性解析
（１）検出プローブ及びアンカープローブの適用
検出プローブ及びアンカープローブを、PCR増幅用のプライマー及び診断対象のゲノムDNAとともに反応液中に加え、PCR反応を行わせた後、DNA上の塩基配列の差異に基づく検出プローブとアンカープローブの解離温度の差異を解析する。判定対象のゲノムに遺伝子多型が存在する場合、検出プローブの結合力は、多型のないゲノムとの結合力よりも弱くなっていることが予想される。従って、反応液の温度を上昇させながら、検出プローブ及とアンカープローブ間の蛍光共鳴エネルギー転移により放出される蛍光をモニターすると、多型の存在するサンプルは多型のない正常サンプルより低い温度で蛍光が消失することになる。この正常サンプルにおける蛍光消失温度とのピークのズレから、多型の存在の有無を判定することが可能となる。
（２）解離特性のモニタリング
使用可能な装置としては、前述したように、PCR装置と蛍光検出器を統合したものが使用可能である。蛍光検出器の部分は、検出プローブに結合されている蛍光色素を励起することができる波長を出力することができ、その結果誘起される蛍光共鳴エネルギー転移により、アンカープローブから放出される波長を検出することができるユニットを具備する必要がある。さらに、検出した波長を数値化して取り込むことができるソフトウエアーを備えたコンピュターを具備する必要がある。かかる条件を具備した装置としては、例えば、Roche社のLightCycler装置を好適に使用することができる。
【００１６】
５．ヒトゲノムDNA中のCYP2A6遺伝子多型の診断用キット
本発明のPCR用プライマー、検出プローブ及びアンカープローブはキットとして、即ち、診断アッセイを実施するための使用説明書と、予め定められた量の試薬を組合わせて包装したものを提供する。本キットが提供される場合、組成物の異なる構成成分が別々の容器中に包装され、使用直前に混合される。このように構成成分を別々に包装することにより、活性構成成分の機能を失うことなく、長期間の貯蔵を可能にすることができる。
（a）容器等
キット中に含まれる試薬は、個々の構成成分の長期保存が可能で、容器の材質によって吸着されず、構成成分の特性が変化しないような何れかの種類の容器中に供給される。例えば、ポリカーボネート、ポリスチレンなどの有機ポリマー、又は試薬を保持するために典型的に用いられる他の何れかの適切な材料などにより構成される。
（b）使用説明書
また、キットには使用説明書も供給されている。使用説明は、紙又は他の材質上に印刷され、及び／又はフロッピー（登録商標）ディスク、CD-ROM、DVD-ROM、Zipディスク、ビデオテープ、オーディオテープなどの電気的に読み取り可能な媒体として供給されてもよい。また、詳細な指示は、キットに物理的に付随しない場合もあり得るが、その場合には、使用者はキットの製造者又は提供者によって指定され又は電子メールで供給されるウェッブサイトを利用することで、適切な指示を得ることができる。
【００１７】
【実施例】
以下に実施例を示すが、本発明はこれに限定されるものではない。
本実施例に示されるCYP2A6*1Bの遺伝子多型は、CYP2A6と相同性の高い偽遺伝子CYP2A7の一部と置換を起こしたものであること、また、CYP2A6*4Cはその遺伝子産物の酵素活性が全欠損していることが、発明者等によって明らかにされているものである。CYP2A6*1B及びCYP2A6*4Cのアリル頻度は日本人において高く、それぞれ、41.2%及び18.4%となっているため、特に本多型の迅速な判定方法の開発が望まれていた。
【００１８】
実施例１：CYP2A6*1B, CYP2A6*4Cの判定方法
バッフィーコート（白血球層）から得た生体試料から定法に従いゲノムDNAを抽出する。得られたDNAに対して、CYP2A6遺伝子のイントロン8から3’非翻訳領域の819 bpを，LC2A6F（5’-GCT ACA CCT GGC ATG GAT CAC-3’）（配列番号：１）およびLC2A6R（5’-GCA ATT AGG TGA GCG TGC AAT G-3’）（配列番号：２）の2種のプライマーを用い、LightCycler装置（Roche社）内でPCR増幅を行った。各変異はその3’末端がフルオレセインラベルされた野生型検出プローブである2A6*1B-FITC（5’-GAT GGC GGA AAG GAA GGG G-3’-FLU）（配列番号：５）および2A6*4-2-FITC（5’-ATA GAA AGA AAT TGA GGC TC-3’-FLU）（配列番号：６）を用いて検出した。さらにこれらに隣接するアンカープローブには5’末端がそれぞれLCRed705およびLCRed640で、また3’末端がリン酸化処理された2A6*1B-Red705（5’-LCRed705-GTG GTG GCT AGA GGG AAG AGA AGA AA-3’-PHO）（配列番号：７）および2A6*4-Red640（5’-LCRed640-GGA GGA TCA GAG CCT CCT CTG-3’-PHO）（配列番号：８）を用いた。これらを一度に用いて，ガラスキャピラリー内でヒトゲノムのPCRを行い，その後にDNA上の塩基配列の差異に基づく、蛍光標識プローブの解離温度の差異を画面上で調べた（メルティングカーブ分析）。
【００１９】
結果
CYP2A6*1B及びCYP2A6*4Cの両多型が存在する場合、解離曲線のピークは野生型よりも低い多型に特異的な解離温度に確認され、CYP2A6*1B又はCYP2A6*4Cの何れか一方にのみ多型が存在する場合は、野生型の解離温度の位置及び多型に特異的な解離温度の位置にそのピークが確認された。本実施例に示されるように、本発明で開示される方法を用いると、一回の操作において、迅速（約１時間）かつ簡便にCYP2A6*1B及びCYP2A6*4Cの変異の同時解析を行うことが可能となった。
【００２０】
実施例２：CYP2A6*9の判定方法
実施例１で用いたゲノムDNAに対して、CYP2A6遺伝子の5’非翻訳領域からエクソン1の440bpを2A6 up-0.1kb（5’-GGG CAT GTA GTT GGG AGG TG-3’）（配列番号：３）および2A6 ex1R（5’-GAT CCT GTC TTT CTG ATG CTG-3’）（配列番号：４）の2種のプライマーを用いて増幅した．変異はその3’末端がフルオレセインラベルされた野生型検出プローブである2A6*9-2 FITC（5’-GCA GTA TAA AGG CAA ACC A-3’-FLU）（配列番号：９）により検出した。隣接するアンカープローブには5’末端LCRed640で、また3’末端がリン酸化処理された2A6*9-Red640（5’-LCRed640-CAG CCG TCA CCA TCT ATC ATC CCA C-3’-PHO）（配列番号：１０）を用いた。以下、実施例１と同様に解離温度の差異を検討した。
【００２１】
【発明の効果】
本遺伝子解析法では、遺伝子変異が蛍光標識プローブの解離温度の差となって検出される。薬物代謝酵素（CYP）の多型判定に関し、PCR増幅と遺伝子判定は別々の操作であった。本方法では、これらの操作を一回で行うことができるため、迅速かつ簡便に解析を行うことができる。
本法を適用することにより、制限酵素処理や電気泳動等、従来法における誤判定や作業時間が長いといった問題が解決され、臨床現場で遺伝子多型判定を短時間で行い、個人ごとの薬物処方設計を支援することが可能となる。
【００２２】
参考文献：
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Fernandez-Salguero, P.及びGonzalez, F.J. Pharmacogenetics 5:S123-S128, 1995.
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Nelson, DR.等, DNA Cell Biol. 12:1-51, 1993.
Rautio, A.等, Pharmacogenetics 2:227-233, 1992.
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【００２３】
【配列表】
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2004194598.tif 000003
2004194598.tif 000004
2004194598.tif 000005