(57)【要約】      （修正有）【課題】新規プロテアーゼ活性を有する酵素の提供。【解決手段】プロテアーゼ活性を示す酵素をコードするDNA 配列を含んで成るDNA 構築体であって、このDNA 配列がＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｃｕｌｅａｔｕｓ由来のプロテアーゼＩまたはプロテアーゼＩＩをコードするDNA 配列、又は上記２種類のDNA 配列と80％以上相同であるその類似配列を含んで成る、DNA 構築体。このDNA 配列によりコードされるプロテアーゼは酸性の至摘pHを有する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロテアーゼ活性を示す酵素をコードするDNA 配列を含んで成るDNA 構築体であって、ここでこのDNA 配列はSEQ ID No.2 に示すDNA 配列又はSEQ ID No.2 に示すDNA 配列と80％相同であるその類似配列を含んで成る、DNA 構築体。
【請求項２】
タンパク質分解活性を示す酵素をコードする前記DNA 配列が微生物から獲得できる、請求項１記載のDNA 構築体。
【請求項３】
前記DNA 配列が糸状菌又は酵母から獲得できる、請求項２記載のDNA 構築体。
【請求項４】
前記DNA 配列が、アスペルギルス、リゾプス、トリコデルマ、ペニシリウス、フサリウム、シタリジウム又はヒュミコラの株から獲得できる、請求項３記載のDNA 構築体。
【請求項５】
前記DNA 配列がアスペルギルスの株、特にアスペルギルス・アキュレアトゥス、アスペルギルス・ニガー又はアスペルギルス・オリザの株から獲得できる、請求項４記載のDNA 構築体。
【請求項６】
前記DNA 配列がアスペルギルス・アキュレアトゥス CBS 101.43 のDNA ライブラリーを基礎に単離又は製造されたものである、請求項５記載のDNA 構築体。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項記載のDNA 構築体を含んで成る組換発現ベクター。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか１項記載のDNA 構築体又は請求項７記載の組換発現ベクターを含んで成る細胞。
【請求項９】
真核細胞、特に菌類細胞、例えば酵母細胞又は糸状菌細胞である、請求項８記載の細胞。
【請求項１０】
前記細胞がアスペルギルスの株、特にアスペルギルス・ニガー又はアスペルギルス・オリザの株に属する、請求項９記載の細胞。
【請求項１１】
タンパク質分解活性を示す酵素を製造する方法であって、請求項８〜10のいずれか１項記載の細胞をその酵素の生産が可能な条件下で培養し、そしてその培養物からこの酵素を回収することを含んで成る方法。
【請求項１２】
請求項１〜６のいずれか１項記載のDNA 構築によりコードされる、又は請求項11記載の方法により製造される、タンパク質分解活性を示す酵素。
【請求項１３】
ウシのグルカゴン中のPhe-Val 又はLys-Tyr 結合を好適に加水分解する、プロテアーゼ活性を有する酵素。
【請求項１４】
アスペルギルス・アキュレアトゥスCBS 101.43由来の精製プロテアーゼに対して生起された抗体と免疫学的に反応性であり、且つSEQ ID No.１又は２に示すDNA 配列によりコードされる、請求項12〜13のいずれか１項記載の酵素。
【請求項１５】
微生物から獲得できる、請求項12〜14のいずれか１項記載の酵素。
【請求項１６】
細菌又は菌類から獲得できる、請求項15記載の酵素。
【請求項１７】
アスペルギルス、リゾプス、トリコデルマ、ペニシリウム、フサリウム、シタリジウム又はヒュミコラの株から獲得できる、請求項16記載の酵素。
【請求項１８】
アスペルギルス・アキュアトゥスの株から獲得できる、請求項17記載の酵素。
【請求項１９】
請求項12〜18のいずれか１項記載のプロテアーゼ活性を示す酵素に富む、植物細胞壁の成分の分解のために有用な酵素調製品。
【請求項２０】
１又は複数種のその他の植物細胞壁分解酵素、例えばペクチンリアーゼ、ペクテートリアーゼ、エンドグルカナーゼ、アラビナナーゼ、キシラナーゼ、グルカナーゼ、ガラクタナーゼ、マンナナーゼ、α−ガラクトシダーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、エキソペプチダーゼ又はペクチンメチルエステラーゼを更に含んで成る、請求項19記載の調製品。
【請求項２１】
タンパク質含有物質の分解又は改変のため、請求項12〜18のいずれか１項記載の酵素又は請求項19もしくは20記載の酵素調製品を利用する方法。
【請求項２２】
コンタクトレンズの洗浄のため、請求項12〜18のいずれか１項記載の酵素又は請求項19もしくは20記載の酵素調製品を利用する方法。
【請求項２３】
Ｈ2Ｏ2の存在下、好ましくは３％のＨ2Ｏ2の存在下で実施する、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
Ｈ2Ｏ2の中和のためにカタラーゼを併せて使用する、請求項23記載の方法。
【請求項２５】
ベークド製品の調製のための、請求項12〜18のいずれか１項記載の酵素又は請求項19もしくは20記載の酵素調製品の利用。
【請求項２６】
動物飼料の調製のための、請求項12〜18のいずれか１項記載の酵素又は請求項19もしくは20記載の酵素調製品の利用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明はプロテアーゼ活性を有する酵素をコードするDNA 構築体、この酵素を製造する方法、プロテアーゼ活性を有する酵素及びこの酵素を含む酵素調製品に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
プロテアーゼはペプチド結合で切断できる酵素である。酸性プロテアーゼ（即ち、酸性の至摘pHを有するプロテアーゼ）は哺乳動物及び微生物を含む多種多様な生物により生産されることが見い出されている。例えば、微生物の酸性プロテアーゼは、細菌株、例えばバチルス（Bacillus）種の株(JP O1240184）、菌類株、例えばリゾプス（Rhizopus）種の株（EP 72978）、シタリジウム（Schytalidium）種の株(JP 48091273）、スルホロブス(Sulpholobus）種及びサーモプラズマ（Thermoplasma）種の株（WO/9010072）、並びにアスペルギルス(Aspergillus）種の株（JP 50121486, EP 82395)により生産されることが見い出されている。
【０００３】
JP 3058794はＲ．ニベウス(R. niveus）由来の酸性プロテアーゼをコードする遺伝子のクローニング及びその組換発現を開示している。クリホネクチラ・パラシチカ(Cryhonectira parasitica）に由来するアスパラギン酸プロテアーゼをコードする遺伝子のクローニング及び発現がChoiら（1993）に記載されている。Takahashi ら（1991）、Inoue ら（1991）及びJP 40755586 は酸性プロテアーゼ（プロテアーゼＡ）をコードするアスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger）からの遺伝子のクローニングを開示している。
【０００４】
Berka ら（1990）のアスペルギルス・アワモリ(Aspergillus awamori）からのアスパラギン酸プロテアーゼ、アスペルギロペプシンＡをコードする遺伝子を開示している。アスペルギルス・オリザ(A. oryzae）からのアスパラギン酸プロテアーゼ、アスペルギロペプシンＯをコードする遺伝子のクローニングがBerka ら（1993）により述べられている。アスペルギルス・オリザからの酸性プロテアーゼ（PEPA）をコードする遺伝子のクローニングはGomiら（1993）により開示されている。
【０００５】
酸性プロテアーゼは工業的に、例えば食品及び飼料の製造において、革産業（例えば獣皮の脱毛）において、タンパク質加水分解物の製造において、並びにワインの製造及び醸造産業において幅広く利用されている。
【０００６】
様々な用途、特に食品及び飼料産業において、単一成分の酸性プロテアーゼの要望がある。
【発明の開示】
【０００７】
発明の概要
本発明の目的は単一成分プロテアーゼを製造することにある。
【０００８】
従って、第一の観点において、本発明はプロテアーゼ活性を示す酵素をコードするDNA 配列を含んで成るDNA 構築体に関連し、このDNA 配列はSEQ ID No.１に示すDNA 配列又はSEQ ID No.１に示すDNA 配列と80％以上相同であるその類似配列を含んで成る。
【０００９】
第二の観点において、本発明はプロテアーゼ活性を示す酵素をコードするDNA 配列を含んで成るDNA 構築体に関連し、このDNA 配列はSEQ ID No.２に示すDNA 配列又はSEQ ID No.２に示すDNA 配列と80％以上相同であるその類似配列を含んで成る。
【００１０】
SEQ ID No.１に示すDNA 配列は、以降の開示においてプロテアーゼＩと呼んでいる酵素をコードする。SEQ ID No.２に示すDNA 配列によりコードされる酵素はプロテアーゼIIと呼ぶ。
【００１１】
データーベース相同性サーチにより、SEQ ID No.１及び２に示すDNA 配列は一般的に新規であることが見い出された。SEQ ID No.１に示すDNA 配列の、公知のプロテアーゼ遺伝子との最大の相同性は、アスペルギルス・ニガー（A. niger）酸性プロテイナーゼＡに対する74.7％であることが見い出させ、 538個のヌクレオチドの重複が認められた。プロテイナーゼIIに対する最大の相同性はアスペルギルス・オリザ  アスペルギロペプシンＯに対する75.5％であることが見い出され、 343個のヌクレオチドの重複が認められた。
【００１２】
更なる観点において、本発明は本発明のDNA 構築体を有する発現ベクター、このDNA 構築体又は発現ベクターを含んで成る細胞、及びプロテアーゼ活性を示す酵素を製造する方法に関する。この方法は、前記細胞を、この酵素の生産を可能とする条件下で培養し、そしてその培養物からこの酵素を回収することを含んで成る。
【００１３】
更なる別の観点において、本発明はプロテアーゼ活性を示す酵素に関連し、この酵素は上記の本発明のDNA 構築体によりコードされるものであるか、又は本発明の方法により製造されたものである。
【００１４】
更なる重要な観点において、本発明はプロテアーゼ活性を有する酵素であって、 7.0以下のpH及び３％以下の過酸化水素の存在下で活性である酵素に関する。本明細書において、酵素について用いている「活性」なる語は、その酵素が上述の条件、例えば本明細書の実施例５に記載の条件下で基質を加水分解できる酵素を意味することを意図している。
【００１５】
7.0 以下のpH及び３％以下の過酸化水素の存在下で活性であり、且つ実施例５に特定する条件下でレンズから80％以上のリゾチームを除去する本発明の酵素を以下の開示において「H2O2・安定性プロテアーゼ」と呼ぶ。この酵素は一般に新規であると信じられている。
【００１６】
また、本発明はプロテアーゼ活性を有する酵素であって、 7.0以下のpHで活性であり、且つPhe-Val 又はLys-Tyr 結合に対して特異的である酵素を提供する。「特異的」なる語は、その酵素が、基質がウシのグルカゴンであるときに、これらの結合を主として切断することを意味することを意図している。
【００１７】
本明細書に記載のプロテアーゼＩ及びプロテアーゼIIは本発明の酵素の好適な例である。これらの酵素は酸性プロテアーゼ、即ち、酸性の至摘pHを有するプロテアーゼであることが見い出されている。
【００１８】
本発明により、高純度、即ち、本明細書の材料と方法の章に記載のSDS ゲル電気泳動による決定に従い純度75％以上、そしてより好ましくは純度90％以上であるプロテアーゼを提供することが可能である。
【００１９】
最後の観点において、本発明は本発明の酵素を含んで成る酵素調製品、及びタンパク質含有物質の改変又は分解を所望する様々な目的のための酵素又は酵素調製品の利用に関する。
発明の詳細な説明
本発明のDNA 構築体、ベクター及び方法
本明細書において、本発明のDNA 構築体を定義するために用いている「類似体」なる語は、プロテアーゼ活性を有する酵素をコードし、且つSEQ ID No.１又は２のそれぞれに示しているDNA 配列と80％以上相同である任意のDNA 配列を含むものと理解される。類似なDNA 配列は、以下に記載の条件下でプロテアーゼ酵素をコードするDNA と同一のプローブにハイブリダイズするDNA 配列でありうる：５ＸのSSC の中での予備浸漬及び５ＸのSSC 、５ＸのDenhardt、50mMのリン酸ナトリウム、pH6.8 及び50μｇの変性音波処理牛胸腺DNA 溶液中での１ｈで約55℃でのプレハイブリダイジング、それに続く50μCiの32-P-dCTP ラベル化プローブの添加された同一の溶液の中での18ｈで約55℃でのハイブリダイゼーション、それに続く２ＸのSSC 、 0.2％のSDS での55℃で30分の３回の洗浄。類似のDNA 配列はSEQ ID No.１又は２に示す配列と90％以上相同であることが好ましく、その配列と95％以上相同であることが好ましい。
【００２０】
類似のDNA 配列は、例えば、別の生物から単離されたものであるか、又はSEQ ID No.１もしくは２に示すDNA 配列をもとに、例えば別のプロテアーゼアミノ酸配列をもたらすことはないが、このDNA構築体を導入する宿主生物のコドン用法に対応するヌクレオチド置換、又は異なるアミノ酸配列をもたらし、それ故、可能としては、天然酵素とは異なる特性を有するプロテアーゼ突然変異体をもたらしうる別のタンパク質構造をもたらすヌクレオチド置換により調製されたものであってよい。可能な改変のその他の例は、その配列への１もしくは複数個のヌクレオチドの挿入、その配列のいづれかの末端への１もしくは複数個のヌクレオチドの付加、又はその配列のいづれかの末端もしくは配列内での１もしくは複数個のヌクレオチドの欠失である。
【００２１】
更に、類似のDNA 配列によりコードされるプロテアーゼはSEQ ID No.１もしくは２に示すDNA 配列によりコードされる精製プロテアーゼに対して生起した抗体と免疫学的に交差反応性である。
【００２２】
SEQ ID No.１に示すDNA 配列の類似体がハイブリダイズすることのできうるヌクレオチドプローブは、例えば以下の任意のDNA 配列又は任意のそれらの組合せをもとに調製できうる：
(a) AATTAAGCAT CCTCCATCTT
(b) CAAAGCTCAA TCTCGCTAAC
(c) TCCCGCTCTT CTCTCGATCT
(d) CATCATCCCA ATAACTCGGA
(e) CAAAATGAAG ACCTCTGCTC
(f) TCTTGACCGC TGGCCTGTTG
(g) GCACCGCTGC TATTGCTGCT
(h) CCTCTCACCG CGAAGCGCGC
(i) ACGTGCTCGC GCTGCCAAGC
(j) TGGCACCAGC CGCAAGAGCA
(k) AGGGGGGTCT CAAGCCCGGC
(l) ACCCAGCGAG GCCATAACCT
(m) GACCGGCTCC AAGAACACCG
(n) GAGGTACTCG TCCAACTGGG
(o) CCGGCGCCGT GCCAT
(p)  AATTAAGCAT  CCTCCATCTT  CAAAGCTCAA  TCTCGCTAAC  TCCCGCTCTT
CTCTCGATCT   CATCATCCCA   ATAACTCGGA    CAAAATGAAG   ACCTCTGCTC
TCTTGACCGC   TGGCCTGTTG   GCACCGCTGC    TATTGCTGCT   CCTCTCACCG
CGAAGCGCGC   ACGTGCTCGC   GCTGCCAAGC    TGGCACCAGC   CGCAAGAGCA
AGGGGGGTCT   CAAGCCCGGC   ACCCAGCGAG    GCCATAACCT   GACCGGCTCC
AAGAACACCG GAGGTACTCG TCCAACTGGG CCGGCGCCGT  GCCAT
これらの配列はSEQ ID No.１に示すDNA 配列又はかかる配列の類似体の部分配列を構成する。
【００２３】
SEQ ID No.２に示すDNA 配列の類似体とハイブリダイズすることのできるヌクレオチドプローブは、例えば任意の以下のDNA 配列又は任意のそれらの組合せをもとに調製できうる：
(p1) CTGCTTCTCC TTCTCTTCCT
(q) CCTCGTGATA TCTGCTTGAA
(r) CATCTCCTCA TCATGGTCGT
(s) CCTCAACAAG GTGCAGCCTT
(t) CTTCTGGGTC TGACCACCGC
(u) CGCCACTGGT CCCCTGGCCG
(v) AGCCGCAGGC TTCTGTCCGG
(w) TCAAGAACTT CTCCGTCAAG
(x) CAGGTCGAGA AGGCGGGCAG
(y) CAAGGGACGT ACCGTTAACC
(z) TGCCGGGTCT GTATGCGAAT
(aa) GCGCTGGCCA AGTATGGCGC
(bb) CCAGGTGCGG CCAGCGTCAA
(cc) GGCCGCCGCC GTCAGTGGCA
(dd) GCGTCGTGAC CACCCGCAGG CCAACGACG
(ee)  CTGCTTCTCC  TTCTCTTCCT  CCTCGTGATA TCTGCTTGAA  CATCTCCTCA
TCATGGTCTG   CCTCAACAAG    GTGCAGCCTT   CTTCTGGGTC   TGACCACCGC
CGCCACTGGT   CCCCTGGCCG    AGCCGCAGGC   TTCTGTCCGG   TCAAGAACTT
CTCCGTCAAG   CAGGTCGAGA    AGGCGGGCAG   CAAGGGACGT   ACCGTTAACC
TGCCGGGTCT   GTATGCGAAT    GCGCTGGCCA   AGTATGGCGC   CCAGGTGCGG
CCAGCGTCAA GGCCGCCGCC GTCAGTGGCA GCGTCGTGAC CACCCGCAGG CCAACGACG
これらの配列はSEQ ID No.２に示すDNA 配列又はかかる配列の類似体の部分配列を構成する。
【００２４】
本発明のDNA 配列は以下を包括する一般方法により単離されうる：
−適当なベクターの中で、アスペルギルス・アキュレアトゥス（A. aculeatus）由来のDNA ライブラリーをクローニングする、
−このベクターで適当な酵母宿主細胞を形質転換させる、
−この宿主細胞を、このDNA ライブラリー中のクローンによりコードされる任意の課題の酵素を発現させる適当な条件下で培養する、
そして
−かかるクローンにより生産される酵素の任意のプロテアーゼ活性を決定することにより、陽性クローンをスクリーニングする。
【００２５】
このスクリーニング法のより詳細な説明は以下の実施例１及びその内容を引用することで本明細書に組入れるWO93/11249に示す。
【００２６】
酵素をコードするDNA 配列は例えば、アスペルギルス・アキュレアトゥス、例えばCentraalbureau voor Schimmelcutures, Delft,NLより公共的に入手できる株CBS 101.43のcDNAライブラリーをスクリーニングし、そして適度な酵素活性（即ち、タンパク質及びペプチドにおけるペプチド結合を加水分解する酵素の能力により規定されるプロテアーゼ活性）を示すクローンを選別することにより単離されうる。適切なDNA 配列は標準の手順、例えば実施例１に記載の通りにして、クローンから単離されうる。
【００２７】
同族酵素をコードするDNA 配列、即ち、類似のDNA 配列は、別の微生物、詳しくは菌類、例えば別のアスペルギルス種の株、特にＡ．アキュレアトゥスもしくはＡ．ニガーの株、トリコデルマ(Trichoderma）種の株、特にＴ．ハージアヌム（T. harzianum）もしくはＴ．リージー(T. reesie）の株、フサリウム（Fusarium）種の株、特にＦ．オキシスポルム（F. oxysporum）の株、リゾプス（Rhizopus）種の株、例えばＲ．ニベウス(R. niveus）の株、シリタリジウム種の株、又はヒュミコラ（Humicola）種の株のcDNAライブラリーを同様にスクリーニングすることにより誘導できうるものと予測される。
【００２８】
他方、本発明のDNA 配列は、公知の手順に従って、本明細書に開示するDNA 配列をもとに調製した合成オリゴヌクレオチドプローブの利用により、適当な生物由来のDNA から簡単に単離できうる。例えば、適切なオリゴヌクレオチドプローブは任意の上記の部分ヌクレオチド配列をもとに調製できうる。
【００２９】
このDNA 配列を次に組換発現ベクターの中に挿入できる。これは組換えDNA 手順に簡単にかけることのできうる任意のベクターであってよく、そしてベクターの選択は往々にしてそれを導入する宿主細胞に依存するであろう。即ち、このベクターは自己複製式ベクター、即ち、染色体外質として存在し、その複製は染色体の複製とは独立しているベクター、例えばプラスミドであってよい。他方、このベクターは、宿主細胞の中に導入したときに、その宿主細胞ゲノムの中に組込まれ、そしてそれが組込まれた染色体と一緒に複製されるものであってよい。
【００３０】
ベクターにおいて、このプロテアーゼをコードするDNA 配列は適当なプロモーター及びターミネーター配列に作動連結されているべきである。このプロモーターは選択した宿主細胞の中で転写活性を示す任意のDNA 配列であってよく、そしてその宿主細胞にとって内性又は外性のいづれかであるタンパク質をコードする遺伝子に由来しうる。このプロテアーゼをコードするDNA 配列、プロモーター及びターミネーターをそれぞれライゲーションするのに用いる手順並びにそれらを適当なベクターの中に挿入するのに用いる手順は当業者に公知である（例えば、Sambrookら、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY, 1989を参照のこと）。
【００３１】
本発明の酵素をコードするDNA 配列により形質転換させる宿主細胞は真核細胞、特に菌類細胞、例えば酵母又は糸状菌細胞であることが好ましい。特に、この細胞のアスペルギルスの種に属し、最も好ましくはアスペルギルス・オリザ又はアスペルギルス・ニガーである。菌類細胞は、公知の方法での、プロトプラストの形式、及びそのプロトプラストの形質転換、それに続くその細胞壁の再生を包括する方法により形質転換されうる。宿主微生物としてのアスペルギルス・オリザの利用はEP 238,023 (Novo Noridisk A/S)に記載され、その内容は引用することで本明細書に組入れる。この宿主細胞は酵母細胞、例えばサッカロマイセス(Saccharomyces）の株、特にサッカロマイセス・セレビジエ(S. cerevisiae）、サッカロマイセス・クルイベリ(S. kluyveri）もしくはサッカロマイセス・ウバルム(S. uvarum）、シゾサッカロマイセス(Schizosaccharomyces）種の株、例えばシゾサッカロマイセス・ポンベ（S.ポンベ）、ハンセヌラ(Hansenula）種、ピチア（Pichia）種、ヤロイア（Yarrowia）種の株、例えばヤロイア・リポリチカ(Y. lipolytica）、又はクルイベロマイセス(Kluyveromyces）種、例えばクルイベロマイセス・ラクチス(K. lactis）であってもよい。
【００３２】
更なる観点において、本発明はプロテアーゼ活性を有する酵素を製造する方法に関連し、その方法においてはこの酵素をコードする本発明のDNA 構築体により形質転換された適当な宿主細胞を、この酵素の生産を可能とする条件下で培養し、そして得られる酵素をその培養物から回収する。
【００３３】
この形質転換宿主細胞を培養するのに用いる培地は注目の宿主細胞を増殖するのに適当な適当な任意の慣用の培地であってよい。発現したプロテアーゼは好都合には培養培地に分泌され、そしてそれから、遠心又は濾過によりその培地から細胞を分離させ、硫酸アンモニウムの如くの塩によりその培地のタンパク質性成分を沈殿させ、次いでイオンクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の如くのクロマトグラフィー手順を行うことを含む公知の手順により、回収できうる。
本発明の酵素
好ましくは、本発明のプロテアーゼ（例えばH2O2安定性又はLys-Tyr もしくはPhe-Val 特異的プロテアーゼ）は２〜７の範囲のpH、例えば 6.0以下のpH、例えば２〜６の範囲のpH、そして最も好ましくは４〜６のpH範囲において活性である。
【００３４】
この両酸性プロテアーゼは0.01〜５％の過酸化水素、例えば 0.1〜５％， 0.5〜４％，１〜４％、又は２〜３％の過酸化水素の存在下で活性であり、そしてコンタクトレンズの洗浄に適用できることが理解されるであろう。
【００３５】
本発明のH2O2−安定プロテアーゼの好適な例は、SEQ ID No.１に示すDNA 配列又はこのDNA 配列と80％以上相同である上記したその類似体によりコードされる酵素である。
【００３６】
本発明のLys-Tyr 又はPhe-Val 特異的プロテアーゼの好適な例はSEQ ID No.２に示すDNA 配列又はこのDNA 配列と80％以上相同である上記したその類似体によりコードされる酵素である。
【００３７】
本発明の酵素のアスペルギルス・アキュレアトゥスCBS 101.43に由来する精製酵素に対して生起させた抗体と免疫学的に反応性であることが好ましく、そしてSEQ ID No.１又は２に示すDNA 配列によりコードされる。本明細書において、「由来する」なる語は株CBS101.43により生産されるプロテアーゼを意味するだけでなく、株CBS 101.43から単離され、且つ前記DNA 配列により形質転換された宿主生物において生産されたDNA 配列によりコードされるプロテアーゼも意味する。
【００３８】
本発明のH2O2安定プロテアーゼ及びLys-Tyr 又はPhe-Val 特異的プロテアーゼは共に菌類種アスペルギルス・アキュレアトゥスの株から獲得できるが、かかる酵素は同様にその他の生物、特に微生物からも獲得できると考えられる。
【００３９】
即ち、本発明の酵素は好ましくは細菌又は菌類、例えばアスペルギルス、リゾプス、トリコデルマ、例えばＴ．リージー又はＴ．ハージアヌム、ペニシリウム(Penicillium）、フサリウム、シタリシウム又はヒュミコラ、例えばＨ．インソレンスもしくはＨ．ラヌギノーザ(H. lanuginosa）の株、あるいはバチルスの株から獲得できる。
【００４０】
アスペルギルス種の例には、Ａ．ニガー、Ａ・オリザ又はＡ．アキュレアトゥス、例えばＡ．アキュレアトゥスCBS 101.43が含まれる。
【００４１】
更なる別の観点において、本発明はプロテアーゼ含有材料の分解又は改変にとって有用な酵素調製品に関連し、この調製品は上記のプロテアーゼ活性を示す酵素に富んでいる。
【００４２】
本発明の酵素に富む酵素調製品は例えば複数種の酵素活性体を含んで成る酵素調製品、特に複数種の植物細胞壁分解酵素を含んで成る酵素調製品、例えばPectinase(商標）、Pectinex Ultra SP(商標）、ガマナーゼ、セルクラストもしくはセルザイム、又はプロテアーゼ及び／もしくはエキソペプチダーゼ含有酵素調製品、例えばNeutrase（商標）、Alcalase（商標）もしくはFlavourzyme(商標)(全てNovo Nordisk A/Sより入手可能）でありうる。本明細書において、「富む」なる語は、この酵素調製品のプロテアーゼ活性が上記の方法により調製される本発明の酵素の添加により、例えば少なくとも 1.1倍の富化係数により高められていることを意味することを意図している。
【００４３】
他方、プロテアーゼ活性を示す酵素に富むこの酵素調製品は、主要酵素成分として本発明の酵素を含んで成るもの、例えば単一成分酵素調製品であってよい。
【００４４】
この酵素調製品は当業界に公知の方法に従って調製でき、そして液体又はドライ調製品の形態であってもよい。例えば、この酵素調製品は顆粒又は微顆粒の形態であってよい。この調製品に含ませるべき酵素は当業界に公知の方法に従って安定化されうる。
【００４５】
本発明に係る酵素調製品は植物の細胞壁の分解又は改変のための試薬として使用されうる。エクステンシンの如くの一部のタンパク質は植物細胞壁の成分である。従って、プロテアーゼは植物細胞壁の分解又は改変を促進するであろう。かかるプロテアーゼを含む植物細胞壁分解用酵素調製品は、オリーブ及びナタネの如くの植物源からの油の抽出又はリンゴ、ナシ及びかんきつ類の如くの様々な果実からの果汁の生産の如くの多種多様な用途のために利用されうる。
【００４６】
この酵素調製品は更に１又は複数種のその他の植物細胞壁分解酵素、例えばペクチンリアーゼ、ペクテートリアーゼ、エンドグルカナーゼ、アラビナナーゼ、キシラナーゼ、グルカナーゼ、ガラクタナーゼ、マンナナーゼ、α−ガラクトシダーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、ペクチンアセチルエストラーゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、エキソペプチダーゼ又はペクチンメチルエステラーゼを含みうる。この調製品は更に上記のエンド酵素と同じ基質に対してエクソ活性を示す１又は複数種の酵素を含みうる。本発明に係るプロテアーゼは数多くのその他の細胞壁分解酵素と同じpH及び温度条件で働き、そしてそれ故かかる用途に極めてよく適合する。
【００４７】
更なる酵素はアスペルギルス属に属する微生物、好ましくはアスペルギルス・アキュレアトゥス、アスペルギルス・アワモリもしくはアスペルギルス・オリザ、又はトリコデルマにより生産されうる。
【００４８】
本発明に係る酵素調製品はワイン産業においても、濁りを防止するため又は濁りを溶かすために利用でき、なぜなら往々にしてタンパク質が望ましくない濁りの形成に関与しているからである。本発明に係るプロテアーゼはワインの発酵及び熟成下の条件下で活性であり、それ故この用途にとって極めて有用である。
【００４９】
本発明の酵素又は酵素調製品は、いわゆるハード・フラワーの軟化を獲得するためにフラワーのグルテン成分を虚弱化させる等のため、ベーキングにおいて利用されうる。ウイーク（虚弱）フラワーの利用は、非常に伸長であり、且つ弾性でないものでなければならない練り製品の製造、例えば押出ベークド製品、ビスケット及びその他の製品であって輸送及びベーキングの際にそのもとの形態が保たれていなければならない製品の製造にとって重要である。本発明のプロテアーゼはフラワーの虚弱化のために慣用的に使用されている剤、例えばメタ亜硫酸ナトリウム(SMS）に対する所望の代替品を成す。 SMSの利用は潜在的な健康に対する危険性を理由に望ましくないと考えられている。
【００５０】
このプロテアーゼ調製品はタンパク質の消化性を高めるために食品及び飼料産業においても利用できうる。例えば、この酵素又は酵素調製品は動物飼料に加えるか、又は動物飼料を加工するのに用いられうる（特に、家豚又は家禽）。これにより、飼料の成分の消化性は高まり、動物の成長率及び飼料利用率の向上がもたらされる。Brenesら（1993）を参照のこと。
【００５１】
更に、本発明の酵素又は酵素調製品は例えば植物タンパク質、例えばダイズ(soy）、エンドウマメ(pea）、ハウチワマメ(lupin）及びナタネ（rape）の種子タンパク質、乳製品、例えばカゼイン、食肉タンパク質又は魚類タンパク質由来のタンパク質加水分解物を作るのに有用でありうる。このプロテアーゼは、食品、飼料又はデジカル製品を作るために、溶解度、粘稠度、味又は発酵性を高めるため、抗原性を下げるため、又はその他の目的のために、タンパク質加水分解物に利用されうる。このプロテアーゼは単独で、又はその他のプロテアーゼと共に、もしくはエキソペプチダーゼの如くのその他の酵素と共に利用できうる。本発明のプロテアーゼの、エキソペプチダーゼに富む酵素調製品との一緒での利用はタンパク質加水分解物の味をよくするであろう。
【００５２】
このプロテアーゼ調製品はタンパク質を改変するため、例えばタンパク質に原因する又はある程度原因する粘性の低下のためにも利用できうる。かかる粘性の問題はダイズ及びエンドウマメの如くの様々なタンパク質含有植物材料の加工において公知である。
【００５３】
更に、この酵素又は酵素調製品は魚類又は肉類の加工において、例えば歯ごたえ及び／又は粘性を変えるために用いられうる。
【００５４】
このプロテアーゼ調製品は発酵プロセス、例えば大麦、麦芽及びその他のビールの如くの製品のための原材料の酵母発酵を促進するのにも利用できうる。
【００５５】
更に、本発明の酵素又は酵素調製品は革産業において、例えば獣皮からの脱毛において有用でありうる。このプロテアーゼの低い至摘pHは有利であり、なぜならその後の獣皮のなめし作業は酸性の条件で行われるからである。このプロテアーゼ調製品はタンパク質からのペプチドの製造にとって有用であり、この場合、その他のタンパク質分解活性物を本質的に含まないクローニングされた酵素を利用することが好都合である。
【００５６】
更に、このプロテアーゼ調製品は様々な製品の精製を助長するもしくは品質を向上するために、例えばガム、例えばグアーガム、キサンタンガムの精製を助長するもしくは品質を向上するため、絹の脱ガムのため、又は羊毛の品質向上のために、タンパク質を分解するのに使用されうる。
【００５７】
過酸化水素に対する安定性のため、本発明の両プロテアーゼはコンタクトレンズの洗浄、及びタンパク質含有材料を除去するため過酸化水素の利用を包括するその他の用途のために極めて有用である。
【００５８】
以上の用途のため、本発明の酵素調製品の用量及びこの調製品を使用するためのその他の条件は当業界に公知の方法に基づいて決定されうる。
【００５９】
本発明を以下の実施例において更に詳しく説明し、ここでこれらは本発明の範囲を限定するものではない。
材料と方法
ドナー生物：mRNAは、ダイズ含有発酵培地の中で、十分な通気を保証するための撹拌を伴って増殖させたアスペルギルス・アキュレアトゥスCBS 101.43から単離した。菌糸を３〜５日間の増殖後に回収し、液体窒素の中で急速凍結し、そして−80℃で保存した。
酵母株：使用したサッカロマイセス・セビジエ株はyNG231 (MAT アルファ、 leu2, ura3-52, his4-539, pep4−デルタ１、cir+）又はJG169 (MATα；ura 3-52；leu 2-3, 112；his 3-D200；pep 4-113; prcl::HIS3；prb1::LEU2；cir+）とした。
プラスミド：酵母TPI プロモーターを含む発現プラスミドpYHD17は市販のプラスミドpYESII（Invitrogen）から調製した。プラスミド及びその構築は、その内容を引用することで本明細書に組入れるWO93/11249に更に説明してある。
アスペルギルス発現ベクターpHD414はプラスミドｐ775 (EP 238023に記載）の誘導体である。pHD414の構築はWO93/11249に更に説明してある。pHD414はＡ．ニガーグルコアミラーゼターミネーター及びＡ．オリザTAKAアミラーゼプロモーターを含む。
全RNA の抽出：全RNA は、Chirgwinら1979及びWO93/11249に本質的に記載の通りの、グアニジニウムチオシアネートによる抽出、それに続く 5.7Ｍのクッションによる超遠心により調製した。
ポリ（Ａ）+ RNA の単離：ポリ（Ａ）+ RNA はオリゴ（dT）セルロースアフィニティークロマトグラフィー（Aviv & Leder, 1972）により単離した。一般には、 0.2ｇのオリゴ（dT）セルロース(Boehringer Mannheim）を10mlの１Ｘのカラム装填バッファー（20mMのトリス−Cl、pH7.6 、 0.5ＭのNaCl、１mMのEDTA、 0.1％のSDS)の中で予備膨潤させ、DEPC処理した栓付きプラスチックカラム（Poly Prep Chromatography Calumn, Bio Rad）に載せ、次いで20mlの１Ｘの装填バッファーで平衡化させた。全RNA を65℃で８min 加熱し、氷の上で５min 急冷し、そして１vol の２Ｘのカラム装填バッファーをRNA サンプルに加えた後、カラムの上に載せた。その溶出液を回収し、そして各装填の前にそのサンプルを上記の通りに加熱し、次いで氷の上で急冷して、２〜３回再装填した。このオリゴ（dT）カラムを10vol の１Ｘの装填バッファー、次いで３vol のメディウム塩バッファー（20mMのトリス−Cl、pH7.6 、 0.1ＭのNaCl、１mMのEDTA、 0.1％のSDS)で洗い、次いで65℃に予備加熱しておいた３vol の溶出バッファー（10mMのトリス−Cl、pH7.6 、１mMのEDTA、0.05％のSDS)によりポリ（Ａ）+ RNA を 500μｌづつの画分を回収しながら溶出させた。そのOD260 を各回収画分について測定し、そしてmRNA含有画分をプールし、そして−20℃で12ｈかけてエタノール沈殿させた。ポリ（Ａ）+ RNA を遠心により回収し、DEPC-DIWに再懸濁し、そして５〜10μｇのアリコートとして−80℃で保存した。
ノーザンブロット分析：様々な菌糸由来のポリ（Ａ）+ RNA(５μｇ／サンプル）を 1.2アガロース− 2.2Ｍホルムアルデヒドゲル（Sambrookら、1989）で電気泳動させ、次いで10ＸのSSC(Sambrookら、1989）をトランスファーバッファーとして用いてナイロン膜（Hybond-N, Amersham）にブロットした。３種のランダムプライムした（Feinberg & Vogelstein, 1983)32Ｐ−ラベル化cDNAプローブを個々のハイブリダイゼーションに用いた：１）Ａ．アキュレアトゥス由来のポリガラクツロナーゼのための 1.3kbのNot Ｉ−Spe Ｉフラグメント、２）Ａ．アキュレアトゥス由来のエンドグルカナーゼＩをコードする 1.3kbのNot Ｉ−Spe Ｉフラグメント、及び３）Ａ．アキュレアトゥス由来のガラクタナーゼをコードする 1.2kbのEag Ｉフラグメント。ノーザンハイブリダイゼーションは５ＸのSSC(Sambrookら、1989）、５ＸのDenhardt溶液（Sambrookら、1989）、 0.5％のSDS(ｗ／ｖ）及び 100μｇ／mlの変性サク精子DNA の中で、約２ng／mlのプローブ濃度で65℃で16ｈ行い、次いで65℃で５ＸのSSC(２×15min)、２ＸのSSC 、 0.5％のSDS(１×30min)、 0.2ＸのSSC 、 0.5％のSDS(１×30min)及び５ＸのSSC(２×15min)で洗った。−80℃で12ｈオートラジオグラフィーにかけた後、プローブ＃１をフィルターからその製造者の仕様書に従って除去し、そしてプローブ＃２と再ハイブリダイズさせ、そして最後にプローブ＃３と再ハイブリダイズさせた。Bethesda Research Laboratories由来のRNAラダーをサイズマーカーとして用いた。
cDNA合成：
第一鎖の合成：二本鎖cDNAを５μｇのＡ．アキュレアトゥスポリ（Ａ）+ RNA から、RNase H 法(Gubler & Hoffman 1983, Sambrookら1989）により、ヘアーピン改良を利用して合成した。ポリ（Ａ）+ RNA(５μｌのDEPC処理中で５μｇ）を70℃で８min 加熱し、氷の上で急冷し、そして１mMづつのdNTP（Pharmacia)、40ユニットのヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビター（RNasin, Promega)、10μｇのオリゴ（dT)12-18プライマー(Pharmacia）及び1000ユニットのSuper ScriptII RNase H−逆転写酵素（Bethesda Research Laboratories）を含む逆転写酵素バッファー（50mMのトリス−Cl、pH8.3 、75mMのKCl 、３mMのMgCl2 、10mMのDTT ; Bethesda, Research Laboratories)により50μｌの最終容量となるように混合した。第一鎖cDNAは反応混合物を45℃で１ｈインキュベートすることにより合成した。
第二鎖の合成：合成後、30μｌの10mMのトリス−Cl、pH7.5 、１mMのEDTAを加え、そしてmRNA：cDNAハイブリドを、40μｇのグリコーゲン担体(Buehringer Mannheim）、0.2volの10ＭのNH4Ac 及び2.5volの96％のEtOHの添加により、−20℃で12ｈエタノール沈殿させた。そのハイブリドを遠心に回収し、70％のEtOHで洗い、風乾し、そして 100μＭづつのdNTP、44ユニットのＥ．コリ (E. coli) DNAポリメラーゼＩ（Amersham）、6.25ユニットのRNase H (Bethesda Research Laboratories)及び10.5ユニットのＥ．コリ DNAリガーゼ(New England Biolabs）を含む 256μｌの第二鎖バッファー（20mMのトリス−Cl、pH7.4 、90mMのKCl 、 4.6mMのMgCl2 、10mMの（NH4)2SO4、16μＭのβ NAD+ ) に再懸濁させた。第二鎖cDNA合成はこの反応チューブを16℃で３ｈインキュベートし、そしてその反応を20mMの最終濃度となるEDTAの添加により停止させ、次いでフェノール抽出した。
マング・ビーンヌクレアーゼ処理：二本鎖（ds）cDNAを２vol の96％のEtOH、0.1volの３ＭのNaAc、pH5.2 の添加により−20℃で12ｈエタノール沈殿させ、遠心により回収し、70％のEtOHで洗い、乾かし(Speed Vac）、そして36ユニットのマング・ビーンヌクレアーゼ（Bethesda Research Laboratories）を含む30μｌのマング・ビーンヌクレアーゼバッファー（30mMのNaAc、pH4.6 、 300mMのNaCl、１mMのZnSO4 、0.35mMのDTT 、２％のグリセロール）に再懸濁した。一本鎖ヘアーピンDNA を、その反応物の30℃で30min のインキュベーション、それに続く70μｌの10mMのトリス−Cl、pH7.5 、１mMのEDTAの添加、フェノール抽出、並びに２vol の96％のEtOH及び0.1volの３ＮのNaAc、pH5.2 による−20℃で12ｈのエタノール沈殿によりクリップした。
T4 DNAポリメラーゼによる平滑末端化：ds cDNA を 0.5mMづつのdNTP及び 7.5ユニットのT4 DNAポリメラーゼ（Invitrogen）を含む50μｌのT4 DNAポリメラーゼバッファー（20mMのトリス−アセテート、pH7.9 、10mMのMgAc、50mMのKAc 、１mMのDTT)の中で、その反応混合物を37℃で15min インキュベートすることにより平滑末端化した。その反応を20mMの最終濃度となるEDTAの添加により停止させ、次いでフェノール抽出及びエタノール沈殿を行った。
アダプターライゲーション及びサイズ選別：フィル・イン反応の後、cDNAを非パリンドロームBstXＩアダプターに、 600pmolのBstXＩアダプター及び５ユニットのＴ４リガーゼ（Invitrogen）を含む30μｌのライゲーションバッファー（50mMのトリス−Cl、pH7.8 、10mMのMgCl2 、10mMのDTT 、１mMのATP 、25μｇ／mlの牛血清アルブミン）の中で、その反応混合物を16℃で12ｈインキュベートすることによりライゲーションした。その反応は70℃で５min 加熱することにより停止させ、そしてアダプター付きcDNAをアガロースゲル電気泳動(0.8％の HSB−アガロース、FMC)によりサイズ分画して、ライゲーションしていないアダプター及び小cDNAで分離させた。このcDNAを 0.7kbのカットオフ値でサイズ選別し、そしてそのcDNAをアガロースゲルから、10mMのトリス−Cl、pH7.5 、１mMのEDTAの中で 100ボルトで１ｈかけて電気溶離させ、フェノール抽出し、そして上記のようにして−20℃で12ｈエタノール沈殿させた。
cDNAライブラリーの構築：アダプター付きのds DNAを遠心により回収し、70％のEtOHで洗い、そし25mlのDIW に再懸濁させた。大スケールライブラリーライゲーションの前に、それぞれ１μｌのds cDNA(反応チューブ＃１−＃３）、２ユニットのＴ４リガーゼ（Invitrogen）及び50ng（チューブ＃１），100ng(チューブ＃２）及び200ng(チューブ＃３及び＃４）のBstXＩ切断酵母発現ベクターのpYES 2.0ベクター（Invitrogen）又は yHD17のいづれか、を含む10μｌのライゲーションバッファー（先と同じ）の中で４通りの試験ライゲーションを行った。ライゲーション反応は16℃で12ｈのインキュベーション、70℃で５min の加熱により行い、そして１μｌづつのライゲーションを40μｌのコンピテントＥ．コリ1061細胞（OD 600＝ 0.9／１リットルのLB培地；冷DIW で２回、20mlの10％のグリセロールで１回洗い、２mlの10％のグリセロールに再懸濁) にエレクトロポレーションさせた(200Ω，2.5kV,  25μＦ）。各形質転換混合物に１mlのSOC を添加した後、細胞を37℃で１ｈ増殖させ、50μｌをLB＋アンピシリンプレート(100μｇ／ml）でプレート培養し、そして37℃で12ｈ増殖させた。
【００６０】
最適な条件を利用し、大スケールライゲーションを、９ユニットのＴ４リガーゼを含む40μｌのライゲーションバッファーの中で設定し、そしてその反応物を16℃で12ｈインキュベートした。そのライゲーション反応を70℃で５min 加熱することにより停止させ、−20℃で12ｈかけてエタノール沈殿させ、遠心により回収し、そして10μｌのDIW に再懸濁した。１μｌのアリコートをエレクロトコンピテントＥ．コリ1061細胞の中に、上記と同じエレクトロポレーション条件を利用して形質転換させ、そしてその形質転換細胞を力価検定し、そしてライブタリーを5000〜7000c.f.u.／プレートでLB＋アンピシリンプレート上でプレート培養した。各プレートに３mlの培地を加えた。細菌をかき取り、１mlのグリセロールを加え、そしてプールとして−80℃で保存した。残りの２mlをDNA 単離のために用いた。DNA の量が必須の数の酵母形質転換体をもたらすのに足りないときは、大スケールDNA を50μｌの−80℃の細菌ストックで接種して一夜増殖させた 500mlの培地（TB）から調製した。
酵母ライブラリーの構築：酵母中の全ての細菌クローンが試験されることを保証するため、オリジナルのプール中の細菌クローン数より５倍多い数の酵母形質転換体をリミットとして用意した。
【００６１】
個々のプール由来の１μｌのアリコートの精製プラスミドDNA (100ng／μｌ）を40μｌのコンピテントＳ．セレビジエJG169 細胞 (OD 600＝ 1.5／500ml のYPD ; 冷DIW で２回、冷１Ｍのソルビトールで１回洗い、 0.5mlの１Ｍのソルビトールに再懸濁；Becker & Guarante, 1991)にエレクトロポレーションした(200Ω，1.5kV,  25μＦ）。１mlの１Ｍの冷ソルビトールの添加後、 250〜400c.f.u／プレートとなるように80μｌのアリコートをSC＋グルコース−ウラシル上でプレート培養し、そして30℃で３〜５回インキュベートした。
アスペルギルスにおける発現のためのcDNA遺伝子の単離：
１又は複数種のプロテアーゼ生産性コロニーを50mlのガラス試験管中の20mlのYNB-1 培地に接種せしめた。このチューブを30℃で２日振盪した。その細胞を10min, 3000rpmでの遠心により回収した。
【００６２】
細胞を１mlの 0.9Ｍのソルビトール、 0.1ＭのEDTA、pH7.5 に再懸濁させた。そのペレットをエッペンドルフチューブに入れ、そして全速で30秒遠心した。細胞を 0.4mlの 0.9Ｍのソルビトール、 0.1ＭのEDTA、14mMのβ−メルカプトエタノールに再懸濁した。 100μｌの２mg／mlのZymolaseを加え、そしてその懸濁物を37℃で30分インキュベートし、そして30秒遠心した。そのペレット（スフェロプラスト）を 0.4mlのTEに再懸濁した。 1.5mlの0.05ＭのEDTA、pH8.0 、 0.6mlの２Ｍのトリス−Cl、pH8.0 、 0.6mlの10％のSDS のうちの90μｌを加え、そしてその懸濁物を65℃で30分インキュベートした。80μｌの５ＭのKOAcを加え、そしてその懸濁物を氷の上で60分以上インキュベートし、そして15分全速で遠心した。その上清液を、EtOHで満たした新鮮なチューブ（室温）に移し、完全ではあるが緩やかに混合し、そして30秒遠心した。そのペレットを冷70％EtOHで洗い、30秒遠心し、そして室温で風乾した。そのペレットを50μｌのTEに再懸濁し、そして15分遠心した。その上清液を新鮮なチューブに移した。 2.5μｌの10mg／mlのRNase を加え、37℃で30分インキュベートし、そして 500μｌのイソプロパノールを緩やかに混合しながら加えた。その混合物を30秒遠心し、そしてその上清液を除去した。そのペレットを冷96％EtOHですすぎ、そして室温で風乾した。そのDNA を50μｌの水に約 100μｌ／mlの最終濃度となるように溶かした。
アスペルギルス・オリザ又はアスペルギルス・ニガーの形質転換（一般手順）
100ml のYPD (Shermanら、Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, 1981）にＡ．オリザ又はＡ．ニガーの胞子を接種し、そして37℃で約２日間振盪させながらインキュベートした。菌糸をミラクロスによる濾過により回収し、そして 200mlの 0.6ＭのMgSO4 で洗った。その菌糸を15mlの 1.2ＭのMgSO4 、10mMのNaH2PO4 、pH＝5.8 に懸濁した。その懸濁物を氷で冷やし、そして 120mgのNovozym(商標)234バッチ1687を含む１mlのバッファーを加えた。５分後、１mlの12mg／mlのBSA (Sigma type H25)を加え、そして大量のプロトプラストがそのサンプルを顕微鏡で観察したときに見えるようになるまで37℃で 1.5〜2.5 時間緩やかに撹拌しながらインキュベートした。
【００６３】
その懸濁物をミラクロスで濾過し、濾液を滅菌チューブに移し、そして５mlの 0.6Ｍのソルビトール、 100mMのトリス−HCl 、pH＝7.0 をかぶせる。遠心を 100ｇで15分行い、そしてプロトプラストをMgSO4 クッションの頂部から集めた。２容量のSTC (1.2Ｍのソルビトール、10mMのトリス−HCl 、pH7.5 、10mMのCaCl2)をプロトプラスト懸濁物に加え、そしてその混合物を1000ｇで５分遠心した。そのプロトプラストペレットを３mlのSTC に再懸濁し、そして再びペレット化した。これを繰り返した。最後に、プロトプラストを 0.2〜１mlのSTC に再懸濁した。
【００６４】
100 μｌのプロトプラスト懸濁物を10μｌのSTC 中の５〜25μｇの適当なDNA と混合した。プロトプラストをp3SR2(プラスミドを有するＡ．ニドゥランスamdS遺伝子）と混合した。この混合物を室温で25分放置した。 0.2mlの60％のPEG 4000 (BDH 29576)、10mMのCaCl2 及び10mMのトリス−HCl 、pH＝7.5 を加え、そして慎重に混合し（２回）、そして最後0.85mlの同じ溶液を加え、そして慎重に混合した。この混合物を室温で25分放置し、2500ｇで15分遠心し、そしてそのペレットと２mlの 1.2Ｍのソルビトールに再懸濁した。もう１回の沈降化の後、プロトプラストを適当なプレート上にまいた。プロトプラストを 1.0Ｍのスクロース、pH7.0 、10mMのアセトアミド（窒素源）及び20mMのCsCl（バックグランド増殖のため）を含む最少プレート（Cove Biochem. Biophys. Acta 113  (1966) 51-56)上にまいた。37℃で４〜７日間インキュベート後、胞子をひろい、そして単一コロニーのためにまいた。この手順を繰り返し、そして第二回目の再単離を経た単一コロニーの胞子を特定の形質転換体として保存した。
免疫学的交差反応性：免疫学的交差反応性を決定するのに用いる抗体は精製プロテアーゼの利用により調製できうる。より詳しくは、本発明のプロテアーゼに対する抗血清は、N. Axelsenらの：A Manual of quantitative Immunoelectrophoresis, Blackwell Scientific Publications, 1973, Chapter 23 又はA. Johnstone and R. Thorpeの Immunochemistry in Practice, Blackwell Scientific Publications, 1982(より詳しくはpp. 27-31)に記載の手順に従い、ウサギ（又はその他のゲッ歯類）を免疫することにより生起させることができうる。精製したイムノグロブリンは抗血清から、例えば塩沈殿((NH4)2SO4）、それに続く透析及びイオン交換クロマトグラフィー（例えばDEAE−Sephadexでの）により得られうる。タンパク質免疫化学的特性決定はOutcher lony二重拡散分析（O. Ouchterlonyの：Handbook of Experimental Immunology  (D.M. Weir, Ed.), Blackwell Scientific Publications, 1967, pp. 655-706)、交差免疫電気泳動により（N. Axelsenら、前掲、Chapters３及び４）又はロケット免疫電気泳動（N. Axelsenら、Chapter ２）により行うことができる。
培地：
YPD ：10ｇの酵母抽出物、20ｇのペプトン、 810mlに至るまでのH2O 。オートクレーブにかけ、90mlの20％のグルコース（滅菌濾過）を添加。
10ＸのBasal 塩：66.8ｇの酵母窒素ベース、 100ｇのコハク酸、60ｇのNaOH、1000mlに至るまでのH2O 。滅菌濾過
SC-URA：90mlの10ＸのBasal 塩、22.5mlの20％のカスアミノ酸、９mlの１％のトリプトファン、 806mlに至るまでのH2O 。オートクレーブにかけ、 3.6mlの５％のスレオニン及び90mlの20％のグルコース又は20％のガラクトースを添加。
SC-Hブロス：アミノ酸抜きの 7.5ｇ／ｌの酵母窒素ベース、11.3ｇ／ｌのコハク酸、 6.8ｇ／ｌのNaOH、ビタミン抜きの 5.6ｇ／ｌのカスアミノ酸、 0.1ｇ／ｌのトリプトファン。 121℃で20min のオートクレーブにかける。オートクレーブにかけた後、10mlの30％のガラクトース溶液、5 mlの30％のグルコース溶液及び 0.4mlの５％のスレオニン溶液を1000mlの培地当りに加える。
SC-Hアガー：アミノ酸抜きの 7.5ｇ／ｌの酵母窒素ベース、11.3ｇ／ｌのコハク酸、 6.8ｇ／ｌのNaOH、ビタミン抜きの 5.6ｇ／ｌのカスアミノ酸、 0.1ｇ／ｌのトリプトファン及び20ｇ／ｌのアガー(Bacto）。 121℃で20min オートクレーブにかける。オートクレーブにかけた後、55mlの22％のガラクトース溶液及び 1.8mlの５％のスレオニン溶液を 450mlのアガー当りに加える。
YNB-1 アガー： 3.3ｇ／ｌのKH2PO4、16.7ｇ／ｌのアガー、pHを７に調整。 121℃で20min オートクレーブにかける。オートクレーブにかけた後、アミノ酸抜きの25mlの13.6％の酵母窒素ベース、25mlの40％のグルコース溶液、 1.5mlの１％Ｌ−ロイシン溶液及び 1.5mlの１％のヒスチジン溶液を 450mlのアガー当りに加える。
YNB-1 ブロス：組成はYNB-1 アガーと同じであるが、ただしアガー抜きとする。
FG-4アガー：35ｇ／ｌのアガー、30ｇ／ｌのダイズマメミール、15ｇ／ｌのマルトデキストリン（Glucidex６）、５ｇ／ｌのBacto ペプトン、pH7 。 121℃で40min オートクレーブにかける。
FG-4培地：30ｇ／ｌのダイズマメミール、15ｇ／ｌのマルトデキストリン（Glucidex６）、５ｇ／ｌのBacto ペプトン。 121℃で40min オートクレーブにかける。
MDU-2 培地：45ｇ／ｌのマルトース、１ｇ／ｌのMgSO4 ・７H2O 、１ｇ／ｌのNaCl、２ｇ／ｌのK2SO4 、12ｇ／ｌのKH2PO4、 0.1ml／ｌの Pluronic 61Ｌ、 0.5ml／ｌの微量金属溶液。pH5.0 。 121℃で20min オートクレーブにかける。15ml／ｌの50％の滅菌濾過尿素をオートクレーブの後に加えた。
カゼイン上層ゲル：１％のアガロース、pH5.5 のバッファー中の 0.5％のカゼイン。ゲルを煮沸し、次いでその上層をアガプレート上に注ぐ前に55％にまで冷却しておく。
供給バッチ式発酵
Ａ．オリザによるプロテアーゼＩ又はIIの供給バッチ式発酵のために用いる培地は、炭素源としてのマルトデキストリン、窒素源としての尿素及び酵母抽出物を含んで成る。
【００６５】
供給バッチ式発酵は、課題のＡ．オリザ宿主細胞の振盪フラスコ培養物を、 3.5％の炭素源及び 0.5％の窒素源を含んで成る培地に接種せしめることにより行った。pH5.0 及び34℃で24時間の培養後、炭素源及び窒素源の連続供給を開始した。炭素源を規定因子として保ち、そして酸素が過剰に存在していることを確実とした。供給バッチ式培養を４日間続け、その後酵素が回収できた。
酵素の特性決定
タンパク質分解活性
１ヘモグロビンプロテアーゼユニット(hpu）は以下の標準条件下で１分当り１mmole の第一アミノ基を遊離せしめる酵素量と規定する（セリン標準品との比較により決定）：
２％（ｗ／ｖ）のヘモグロビン溶液（牛； Sigmaより供給）を、 5.5のpHに調整したBritton and Robinsonの J. Chem. Soc., 1931, p.1451に記載の万能バッファーにより調製した。２mlの基質溶液を水浴の中で25℃で10min プレインキュベートした。 0.2〜0.3hpu／mlの万能バッファー(pH5.5）に相当するｂｇ／mlの酵素調製品を含む１mlの酵素溶液を加えた。25℃で30min のインキュベーション後、反応をクエンチング剤 (17.9ｇのトリクロロ酢酸、29.9ｇの酢酸ナトリウム及び19.8ｇの酢酸を含み、脱イオン水で 500mlとした溶液５ml）の添加により停止させた。ブランクを試験溶液と同じようにして調製したが、ただし酵素溶液の添加前にクエンチング剤を加えておいた。その反応混合物を水浴の中に20min 保ち、その後Whatman 42濾紙で濾過した。
【００６６】
第一アミノ基は以下の通りＯ−フタルジアルデヒド(OPA）の発色により決定した：7.62ｇの四硼酸二ナトリウム・10水和物及び 2.0ｇのドデシル硫酸ナトリウムを 150mlの水に溶かした。４mlのメタノールに溶かした 160mgのOPA を 400μｌのβ−メルカプトエタノールと共に加え、その後その溶液を水で 200mlにした。３mlのOPA試薬に上記で得た 400μｌの濾液を混合しながら加えた。 340nmでの光学密度（OD）を約５min 後に測定した。OPA 試薬は、 100mlの万能バッファー(pH5.5）中の10mgのセリンを含むセリン標準品についても行った。バッファー単独をブランクとして用いた。プロテアーゼ活性を以下の式により、OD測定値から計算した。
【００６７】
【数１】
2004236663.tif 000002
【００６８】
式中、ODt ，ODb ，ODser 及びODB は、試験溶液、ブランク、セリン標準品及びバッファーのそれぞれの光学密度であり、Ｃser は標準品中のセリンの濃度（mg／ml）であり（この場合、 0.1mg／ml）、そしてMWser はセリンの分子量である（105.09）。Ｑは酵素溶液の希釈系数（この場合８）であり、そしてｔi は分でのインキュベーション時間である（この場合30分）。
阻  害
以下のインヒビターを試験した：
ペプスタチン（アスパラギン酸インヒビター)(１mM）
PMSF（セリンプロテアーゼインヒビター）(0.1％）
PEFABLOC（セリンプロテアーゼインヒビター）(0.1％）
EDTA（金属プロテアーゼインヒビター）(0.1Ｍ）
PEFABLOCは Pentapharm, Basel、スイス国より入手、それ以外はSigma より入手した。
【００６９】
残留活性はpH5.5 で HPU／ｌとして決定した。
【００７０】
pH活性プロフィールは様々なpH値（４〜８）で HPU／ｌとして決定した。
【００７１】
pH安定性は酵素溶液（0.3HPU／ｌ）を50℃及び様々なpH値（４−５−６−７−８）で30, 60及び 120分放置し、そして放置前後のタンパク質分解活性を測定することにより決定した。
【００７２】
温度活性プロフィールは様々な温度（15〜70℃) で HPU／ｌとして決定した。
【００７３】
温度安定性は酵素溶液（0.3HPU／ｌ）をpH５及び様々な温度（20−40−50−60℃）で30, 60及び 120分放置し、そして放置前後のタンパク質分解活性を測定することにより決定した。
【００７４】
SDS ゲル電気泳動及び等密点電気泳動はPharmacia のPhast-Systemで、その製造者の仕様書に従い、勾酸８〜25及びIEF ３〜９を利用して行った。
特異性
本発明のプロテアーゼの特異性は下記のようにして決定した：
万能バッファーpH5.5(前述）中の 0.5mlの１mg／mlのヒトインスリン又はウシグルカゴン並びに同じバッファー中の75μｌのプロテアーゼＩ及びIIそれぞれ（0.6hpu／ｌ）を37℃で120minインキュベートした。反応は50μｌの１Ｎの塩酸の添加により停止させた。
【００７５】
インスリン又はグルカゴン分子はいくつかのペプチドフラグメントに切断された。これらを、適切なＣ−18カラム（Hibar LiChrosorb RP-18；５μｍ粒子；Merck AG, Darmstadt, FRGより供給）を用いる逆相HPLCにより単離した。そのフラグメントを以下の溶媒：
Ａ． 0.2Ｍの硫酸ナトリウム及び 0.1Ｍのリン酸、pH2.5 ；
Ｂ．アセトニトリル／水、50％；
を用い、90％のＡ／10％のＢから80％のＡ／20％のＢに至る０〜５分間の線形勾配、それに続く80％のＡ／20％のＢにより50分かけて溶出させた。単離したフラグメントを、L. Thim ら、「Secretionof human insulin by a transformed yeast cell」TEBS Letters212  (2), 1987, p307に記載の通りにして、Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) モデル 470Ａガス相シーケンサーを用いる自動エドマン分解、並びにフェニルチオヒンダントイン（PTH-）アミノ酸の高性能液体クロマトグラフィーによる分析によってアミノ酸配列決定にかけ、これによりインスリン又はグルカゴン分子中の切断部位を同定した。
実施例１
150 のプールにおいて約 1.5×106 の個別クローンより成るＡ．アキュレアトゥス由来のクローンを構築した。
【００７６】
DNA をこのライブラリー由来の20の個別のクローンから単離し、そしてcDNA挿入についての分析にかけた。挿入頻度は＞90％として認められ、そして平均インサートサイズは約1400bpであった。
【００７７】
いくつかのプール由来のDNA を酵母に形質転換し、そして 200〜500 の酵母コロニーを含む50〜100 枚のプレートが各プールから得られた。３〜５日の増殖後、アガープレートを数セットのアガープレートにレプリカプレートした。１セットのプレートを30℃で２〜４日間インキュベートし、そしてプロテアーゼ活性の検出のためにカゼイン上層ゲルをかぶせた。30℃で一夜のインキュベーション後、プロテアーゼ陽性コロニーは、白色の輪光（ハロ）により囲まれたコロニーとして同定した。
【００７８】
酵素陽性コロニー由来の細胞を単一コロニー単離のためにアガー上にまき、そして同定したプロテアーゼ生産性コロニーそれぞれについて酵素生産性単一コロニーを選別した。
【００７９】
単一コロニーとして陽性コロニーを獲得し、cDNAインサートをビオチニル化ポリリンカープライマーを用いて酵母コロニーから直接増幅し、磁性ビーズ(Dynabead M-280, Dynal）システムにより精製し、そして個別に連鎖停止法（Sangerら1977）及びSequenase システム(United States Biochemical）を用い、各cDNAクローンの５′末端の配列決定により特性決定した。２つの酵素遺伝子のDNA 配列はそれぞれSEQ ID No.１及び２に示す。
【００８０】
次いで、このプロテアーゼをコードするcDNAを上記の通りにして、アスペルギルスの中での発現のために単離し、そして標準の手順を利用してＥ．コリに形質転換させた。２つのＥ．コリのコロニーを各形質転換体から単離し、そしてDNA インサートを切り出す制限酵素HindIII 及びXba Ｉにより分析した。これらのクローンのうちの１つ由来のDNA を酵母株JG169 に再形質転換した。
【００８１】
いくつかの陽性クローンのDNA 配列を決定した。プロテアーゼをコードする２つのDNA 配列をそれぞれSEQ ID No.１及び２に示す。
実施例２
アスペルギルスにおいて遺伝子を発現させるため、cDNAを各ファミリーの１又は複数の代表体から、上記の手順を利用し、HindIII ／Xba Ｉ又はその他の適当な制限酵素による消化、ゲル上でのサイズ分画及び精製により単離し、その後のpHD 414 へのライゲーションによりプラスミドpA1P1 及びpA1P2 を得た。Ｅ．コリでの増幅後、プラスミドをＡ．オリザ又はＡ．ニガーに、上記の一般手順に従って、形質転換させた。
Ａ．オリザ形質転換体の試験
各形質転換体をTG-4アガーを有するペトリ皿の中央に接種した。30℃で５日間のインキュベーション後、直径４mmのプラグをコークスクリューによりそのコロニーの中央から取り出した。そのプラグを、pH5.5 のバッファーに 0.5％のカゼイン及び１％のアガロースを含むカゼイン上層ゲルに埋め込み、そして40℃で一夜インキュベートした。プロテアーゼ活性は上記のようにして決定した。形質転換体の一部は輪光を有し、それはアスペルギルス・オリザバックグランドよりも有意に大きかった。このことは、アスペルギルス・オリザにおけるプロテアーゼの有効な発現を実証する。最大のプロテアーゼ活性を有する８つの形質転換体を選別し、そして YPG−アガー上で保持した。
【００８２】
選択した８つの形質転換体それぞれを YPG−アガースラントからFG-4及びMDU-2 培地を有する 500mlの振盪フラスコ上に接種した。良好な通気を確実なものとするための十分な撹拌を伴う３〜５日間の発酵の後、培養液を2000ｇで10分遠心し、そして上清液を分析した。
【００８３】
各上清液15μｌを、カゼイン上層ゲル（直径13cmのペトリ皿中25ml）の中にあけられた直径４mmの穴の中に加えた。プロテアーゼ活性はインキュベーションによる白色輪光の形成により同定した。
供給バッチ式発酵
次に、プロテアーゼＩ及びIIのそれぞれを、上記の手順を用い、酵素を発現するＡ．オリザの供給バッチ式発酵により製造した。
実施例３
プロテアーゼＩ及びIIの特性決定
上記の供給バッチ式発酵により得られる上清液を、上記の材料と方法に記載の通りに実施する特性決定のために用いた。タンパク質分解活性は上記の手順を利用してpH5.5 で HPU／ｌとして測定した。
【００８４】
阻害試験は以下の結果を示す：
【００８５】
【表１】
2004236663.tif 000003
【００８６】
ペプスタチンによるプロテアーゼIIの阻害は、それがペプシン型のアスパラギン酸プロテアーゼであることを示す。プロテアーゼＩはペプスタチンにより阻害されず、それ故アスパラギン酸プロテアーゼとしては積極的に同定されなかった。一方、pH５での至摘活性は、それが酸性プロテアーゼであることを示す。
【００８７】
pH活性プロフィールを図１に示す。両酵素はpH５で至摘活性を有し、そしてプロテアーゼＩはプロテアーゼIIよりも狭い範囲で活性であることが示された。即ち、プロテアーゼＩはpH４〜６の範囲で60％以上の活性を示し、一方、プロテアーゼIIはpH４〜７の範囲で60％以上の活性を示す。
【００８８】
SDS ゲル分析により、プロテアーゼＩ及びIIのそれぞれの分子量は23,000及び37,000kDa であると推定された。IEF 分析から、両酵素のpIは約４と推定された。
【００８９】
図２は温度活性プロフィールを示す。それは両酵素についてやや似ていたが、ただし至摘温度はやや異なり、プロテアーゼＩは50℃、そしてプロテアーゼIIは45℃であった。
【００９０】
図３及び４はpH安定性を示す。各pHに関して、ゼロ時間活性を 100％に設定し、従ってそれらの得られる絶対値は異なっている。両プロテアーゼはpH４及び５で安定であった。pH６ではプロテアーゼＩは不安定であり、一方プロテアーゼIIは一定の安定性を有していた（30分、40％の残留活性）、両酵素ともpH７で不安定であった。
【００９１】
図５及び６は温度安定性を示す。各温度に関し、ゼロ時間活性を 100％に設定し、そして得られる絶対値は異なっていた。両プロテアーゼとも50℃までは安定であり、そして60℃で不安定であった。
【００９２】
プロテアーゼＩ及びプロテアーゼIIによるインスリン又はグルカゴンの加水分解により得られる結果に基づいて、プロテアーゼIIはインスリンとは反応せず、一方両プロテアーゼともグルカゴンは加水分解することがわかった。プロテアーゼはやや非特異的なプロテアーゼであり、一方プロテアーゼIIはより特異的であるものと考えられうる。プロテアーゼIIはウシのグルカゴン（その配列はBromer, Sinn, and Behrens, J. Amer. Chem. Soc., Vol. 79, p2807, 1958に示されている）において見い出せるLys-Tyr 及びPhe-Val 結合を切断できることがわかった。
実施例４
粘性低下のための本発明のプロテアーゼの利用
ダイズフラワー（脱脂して皮をむいたダイズマメより調製）を95℃でペレット化し、そして粉砕した。ダイズフラワーを15％のドライ物質となるように脱イオン水に懸濁した。ドライ物質のｇ当り５mgのプロテアーゼＩ酵素タンパク質及びドライ物質のｇ当り５mgのプロテアーゼII酵素タンパク質のそれぞれをダイズスラリーに加えた。このスラリーを40℃及びpH５〜６でインキュベートした。そのスラリー中の粘度を、１，２及び24時間のインキュベーション後に、brookfield LV DVIII 粘度計で、スピンドル＃31を有する小サンプルアダプターを用い、250rpmで測定した。残留粘度は下記の通りであった。
【００９３】
プロテアーゼＩ        プロテアーゼII
１時間                  73％                  47％
２時間                  59％                  38％
実施例５
コンタクトレンズの洗浄のための本発明のプロテアーゼの利用
コンタクトレンズ洗浄の分野において、コンタクトレンズの効果的な消毒及び洗浄の両方を得ることが通常必須である。コンタクトレンズを消毒する最も有効な方法の一つはそれらを３％のH2O2を含むpH3.5 の溶液に20分以上浸すことにある。レンズを目に装着する前にH2O2は例えばカタラーゼ又はプラチナディスクで中和する。残念ながら、このような苛酷な条件下で良好な効果を有することが示されている商業的に関心のもたれているプロテアーゼは今日までなく、従ってH2O2中和の後にプロテアーゼを添加してそのコンタクトレンズ上のタンパク質付着物を取り除くめんどうな第２工程が必要とされている。ブタのペプシンは現状用いられているプロテアーゼ（スブチリシン・カールスバーグ（Subtilisin carlsberg）よりは優れているが、しかし往々にして哺乳動物の生成物にはウイルスが結合しているため、問題がある。
【００９４】
本発明のプロテアーゼＩ及びIIをそれぞれ、コンタクトレンズから変性タンパク質を除去する能力について試験した。これらを現状用いられているセリンプロテアーゼ、更にはブタのペプシンと比較した。ただし、後者は商業的観点よりはむしろ技術的観点から関心がもたれる。
【００９５】
実験プロトコールは下記の通りにした：
材料：メンドリリゾチーム、Ｌ−6878（Sigma)
「Rythmic 」コンタクトレンズ（Essilor)（II型レンズ、ハイ・ウォーター、非イ      オン性）
プロテアーゼＩは上記の通りに製造
プロテアーゼIIは上記の通りに製造
ブタのペプシンＰ−6887（Sigma)
スブチリシン・カールスバーグ（Clear-lens Pro（商標)(Novo Nordisk A/S）。
標準バッファー：0.05M Na2HPO4, 0.9%  NaCl pH7.5
試薬バッファー：0.05M Na2HPO4, 0.9%  NaCl, 3% H2O2, pH3.5
シンチレーション液、オプチフェース「 HiSafe III 」
Sigma 由来のメンドリリゾチームを還元性メチル化により14Ｃでラベルし、そして精製した。
【００９６】
溶液は0.05ＭのNa2HPO4 ，0.9 ％のNaCl及び 0.2mg／mlのリゾチームpH7.5 を含むように調製した。14Ｃ−ラベル化リゾチームの量は、CPM （カウント／分）が約 200,000となるようにした。 1.0mlの溶液をシンチレーションガラスに移した。コンタクトレンズを加え、そしてそのガラスを85℃の湯浴の中に30分入れておいた。
【００９７】
次いでコンタクトレンズを３×３mlの試薬バッファーですすいだ。それを外科用メスで４等分にした。４等分したものそれぞれを、３mlの試薬バッファーを含む新鮮なシンチレーションガラスに移し入れた。
【００９８】
様々な量の試験すべきプロテアーゼを、 0.1, 0.5, 2.5, ５，12.5, 50及び 200μｇの酵素タンパク質／ml試薬バッファーの最終濃度となるように加えた。
【００９９】
反応は25℃で４時間行った。４等分にしたレンズを２×３mlの標準バッファーですすいだ。12mlのシンチレーション液を加え、そしてCPM をPackard 2500 TR 液体シンチレーションカウンターで測定した。
【０１００】
各プロテアーゼの評価のためには４枚のレンズを必要とした：二重測定を２日間にわたり行い、そしてブラインド対照を各レンズについて必要とした。
【０１０１】
消毒／洗浄の際にレンズから除去されたリゾチームの相対量を各４等分にしたレンズの質量バランスから計算した。図７は様々なプロテアーゼの性能のグラフ図を示す。
【０１０２】
両プロテアーゼともコンタクトレンズの洗浄の目的に非常に適していた。プロテアーゼＩは他のプロテアーゼよりも非常に優れていることがわかった。プロテアーゼIIは性能においてブタのペプシンに非常に近く、一方、現状利用されているセリンプロテアーゼは劣った性能を示した。本発明の酸性プロテアーゼの更なる利点は、涙液において見い出せる中性pHにおける低い活性である。このことはもしレンズが消毒／洗浄の後に適切にすすがれていないときの刺激の危険性を低くする。
実施例６
ベーキングのための本発明のプロテアーゼの利用
手順：
10ｇのケーキフラワーに 5.9ｇの水を加えた。この水は様々な濃度のプロテアーゼＩ、プロテアーゼII及びNeutrase（商標)(Novo Nordisk A/Sより入手可能）を含む。その練り製品をGlutamic 2200ミキサーで１分混合した。次いでそれをプラスチックバッグに入れ、そして32℃で25min インキュベートした。
【０１０３】
その後、その練り製品をGlutamicミキサーを用いて２％のNaCl（水溶液）で洗い、デンプンを取り除き、且つ練り製品にグルテンが残るようにした。
【０１０４】
次いでグルテン塊を均質となるまで手でころがし、そして高さ約 0.5cm、直径 2.5cm、そして中央に穴を有するシリンダーの形にプレスした。そのグルテン塊をその形に25℃で 30minプレスしておいた。次に、そのグリテンシリンダーをフックにひっかけ、そして２ｇのおもりを穴の中に入れた。全てを25℃の水に浸した。
【０１０５】
その後グルテンシリンダーの伸長を、それが破断するまで15分毎に測定した。
【０１０６】
酵素はAnson ユニットベース（AU）に基づいて投与した。最初は、Neutrase（商標）にとって最適な用量である7.5mAU／kgフラワーで試みた。（タンパク質分解活性の決定のための Anson−ヘモグロビン法では、変性ヘモグロビンを25℃の温度でpH7.5 で、10min の反応時間で消化した。未消化のヘモグロビンをトリクロロ酢酸(TCA）で沈殿させ、そしてTCA 可溶性生成物の量をフェノール試薬で決定した。これはチロシン及びトリプトファンにより青色を発する。１AUは、１ミリ当量のチロシンと同じ色調をフェノール試薬で発色させるTCA 可溶性生成物の量を１分当り遊離させるような一次速度でヘモグロビンを消化する酵素の量である。）
図８は酵素抜きでの並びにNeutrase（商標）、プロテアーゼＩ及びプロテアーゼIIによるグルテンの伸長曲線を示す。これらの曲線は同じ酵素投与量での６〜７回の測定の平均である。見ての通り、３種のプロテアーゼの全ての添加が、より速いグルテンの伸長を招いた。
【０１０７】
7.5mAU／kgフラワーの投与量のプロテアーゼＩは同じ投与量のNeutrase（商標）ほどグルテンを虚弱化させなかった。グルテンシリンダーは破断するまでより長く伸び、そして伸長速度は小さかった。
【０１０８】
この系においては可能な最大量である2.3mAU／kgフラワーのプロテアーゼIIの添加はグルテンを7.5mAU／kgのNeutrase（商標）とほぼ同じぐらいに虚弱化させた。グルテンはやや遅く破断し、そして曲線の形は同一ではなかった。このことは、プロテアーゼIIがAUベースに基づいて、グルテンの虚弱化についてNeutrase（商標）よりも約３倍の効率を有することを示す。
【０１０９】
まとめると、本発明のプロテアーゼはグルテンの虚弱化のための慣用的に利用されている化学品（幅広く利用されているその代表例はSMS(メタ亜硫酸ナトリウム）である）にとって代わる所望の代替品を成す。
実施例７
動物飼料のための本発明のプロテアーゼの利用
粉砕した脱脂済みの飼料級ダイズを以下の条件で脱イオン水を混合した。胃及び小腸のpH条件をシュミレートするために加水分解を２段階で行った。本発明のプロテアーゼIIの性能をBio-Feed Proのそれと比較した。Bio-Feed ProはBrenesら、1993により、ブロイラーの飼料として用いたときに向上した体重増及び飼料効率をもたらすことが実証されている。
加水分解条件：
加水分解混合物：70ｇの粉砕脱脂ダイズ
330 ｇの脱イオン水
温度          ：40℃
pH            ：第一段階  4.0
第二段階  6.5
時間          ：第一段階  180 分
第二段階  180 分
酵素          ：第一段階  Ｉ）ペプシン  1.92ｇ
（Merck art. 7190)
II）Ｉ＋Bio-Feed Pro 3.0L
5.5AU/kgダイズ
III ）Ｉ＋プロテアーゼII
0.19AU/kgダイズ
第二段階  Ｉ）パンクレアチン  ６ｇ
（Sigma P 1750)
II）Ｉ＋Bio-Feed Pro 3.0L
5.5AU/kgダイズ
III ）Ｉ＋プロテアーゼII
0.19AU/kgダイズ
Bio-Feed Pro（商標）はNovo Nordisk A/Sより入手した。プロテアーゼIIは上記の通りに獲得した。
【０１１０】
これらの酵素を開始時の０分目において加えた。加水分解中、 o Brix 及び重量オスモル濃度を反応経過を追跡するために測定した。Adler-Nissen (1986）に従うと、重量オスモル濃度の値は以下の式により加水分解度（DH）の計算のために用いることができる：
【０１１１】
【数２】
2004236663.tif 000004
【０１１２】
ここで、Δは重量オスモル濃度mOSMの上昇、Ｓ％はタンパク質濃度、ωは浸透圧計についての較正係数、ｈtot はタンパク質基質中のペプチド結合の総数（meqv／ｇタンパク質）、そしてｆosm は％をｇ／kg  H2O に変換する係数である。
【０１１３】
【数３】
2004236663.tif 000005
【０１１４】
更に、加水分解混合物のＮ−成分のスルホサルチル酸可溶性相の平均分子量を90分（第１段階）、並びに0.15及び 180（第２段階）の後に分析した。分子量分析は以下の方法により行った。
１．原  理
サンプルを希釈し、濾過し、そしてグル浸透クロマトグラフィー(GPC）モードで作動させた液体クロマトグラフィー系に注入した。この分離技術は十分に規定された孔直径を有する孔をもつ多孔質粒子で充填されたカラムを介する液体フローを利用する。様々な分子サイズを有するペプチド溶液をカラムに流したとき、小ペプチドは孔の中に流入でき、一方大きなペプチドは孔から排除されるであろう。即ち、溶液中のペプチドはその分子サイズ（及び分子量）に従って分離され、大きなペプチドは小さなペプチドよりも速くカラムから溶出する。カラム出口にある検出器は溶出液を連続的に測定する。このクロマトグラフィー系は、既知の分子量を有するペプチドで較正する。
２．クロマトグラフィー装置
2.1  HPLC系は
高圧ポンプ  WATERS M 510、流速 0.7ml／min.
インジェクター  WATERS WISP M 710
検出器  WATERS M 440 214nmまでの波長エクステンション
より成る。
2.2  GPC カラム、一式に接続された３本のTSK G 2000 SW ×Ｌ、7.8mm×300mm 、周囲温度で運転。
2.3  積分／データー処理  Waters 820 MAXIMA SIM クロマトグラフィーデーターシステム(810／820 GPC オプション付き）。
３．試  薬
3.1  リン酸バッファー  NaH2PO4 ・2H2O
3.2  塩化アンモニウム  NH4Cl
3.3  トリフルオロ酢酸（TFA), CF3COOH
3.4  アセトニトリル  CH3CN
3.5  移動相：
0.1 ％のTFA 及び25％のアセトニトリルを含む0.05Ｍのリン酸バッファー／ 0.5Ｍの塩化アンモニウム溶液
４．詳  細
4.1  較  正
クロマトグラフィー系は既知分子量を有するいく種かのペプチド標準品の注入により較正した。各標準品の分子量を、そのカラムからペプチドを溶出するのに必要な移動相の観察容積に対して半対数的にプロットした。最少二乗法計算により、最も良くフィットする三次式を導いた。この曲線は較正曲線を示す。
4.2  分  析
サンプルを移動相に約５mg／mlとなるように希釈／溶解した。この溶液を22μｍのフィルターで濾過し、そしてその20μｌをクロマトグラフィーに注入した。検出応答、対、溶出容積を記録した。記録した曲線−クロマトグラフィー図−は、サンプルの実際の分子量分布を示す。集積した重量分布及び平均分子量計算のため、クロマトグラフィー図を小タイム（及び溶出・容積）セグメントに分割した。各セグメントを溶出容積及びインターバル間のクロマトグラフィー図の面積により特性決定した。
５．計  算
結果は重量及び数平均分子量で表わす
【０１１５】
【数４】
2004236663.tif 000006
【０１１６】
ここで
Ｍw   ：重量平均分子量
Ｍn   ：数平均分子量
Ａi   ：各時間インターバルの間の集積した検出応答として測定した、各セグメントのク        ロマトグラフィー図面積。
Ｍw,i ：各セグメントについての対応の分子量。この値は時間インターバルの間の平均溶        出容積を用い、較正曲線により計算した。
結  果
o Brix，mOSM及び％DH値を以下の表に示す。
【０１１７】
【表２】
2004236663.tif 000007
【０１１８】
【表３】
2004236663.tif 000008
【０１１９】
【表４】
2004236663.tif 000009
【０１２０】
【表５】
2004236663.tif 000010
【０１２１】
分子量分析の結果を以下に示す：
【０１２２】
【表６】
2004236663.tif 000011
【０１２３】
見かけ上の分子量はpHを 6.5にすると大きくなり、なぜなら未消化のダイズタンパク質はpH4.0 よりもpH6.5 でのほうがより可溶性であるからである。
【０１２４】
プロテアーゼIIはBio-Feed Proよりも多くのタンパク質及びペプチドを遊離させ、且つ多くのタンパク質を分解することがわかり、従ってプロテアーゼIIはBio-Feed Proより優れているものと考えられる。
【０１２５】
本発明のプロテアーゼIIは酸性pH域において至摘活性を有するため、この酵素は動物の胃において直ちに働き、それ故若い動物のための飼料に用いたときにBio-Feed Proに比べて飼料効率の総合的な向上が達せられる。上記の結果はこの所見を裏付けする。
【０１２６】
参照文献
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【図面の簡単な説明】
【０１２７】
【図１】プロテアーゼＩ及びIIそれぞれのpH活性プロフィールを示す。
【図２】プロテアーゼＩ及びIIそれぞれの温度活性プロフィールを示す。
【図３】プロテアーゼＩ及びIIそれぞれのpH安定性を示す。
【図４】プロテアーゼＩ及びIIそれぞれのpH安定性を示す。
【図５】プロテアーゼＩ及びIIそれぞれの温度安定性を示す。
【図６】プロテアーゼＩ及びIIそれぞれの温度安定性を示す。
【図７】コンタクトレンズの洗浄における様々なプロテアーゼの性能。
【図８】本発明の酵素のグルテン伸長作用。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年3月17日(2004.3.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロテアーゼ活性を示す酵素をコードするDNA 配列を含んで成るDNA 構築体であって、ここでこのDNA 配列はSEQ ID No.2 に示すDNA 配列と、５ＸのSSC 、５ＸのDenhardt溶液、50mMのリン酸ナトリウム、pH6.8 及び50μｇの変性音波処理牛胸腺DNAを含む溶液中での55℃で１ｈのハイブリダイゼーション、それに続く50μCiの32-P-dCTP ラベル化プローブの添加された同溶液の中での55℃で18ｈのハイブリダイゼーション、それに続く２ＸのSSC、0.2％による55℃で30分の３回の洗浄の条件下でハイブリダイスする、DNA 構築体。
【請求項２】
タンパク質分解活性を示す酵素をコードする前記DNA 配列が微生物から獲得できる、請求項１記載のDNA 構築体。
【請求項３】
前記DNA 配列が糸状菌又は酵母から獲得できる、請求項２記載のDNA 構築体。
【請求項４】
前記DNA 配列が、アスペルギルス、リゾプス、トリコデルマ、ペニシリウス、フサリウム、シタリジウム又はヒュミコラの株から獲得できる、請求項３記載のDNA 構築体。
【請求項５】
前記DNA 配列がアスペルギルスの株、特にアスペルギルス・アキュレアトゥス、アスペルギルス・ニガー又はアスペルギルス・オリザの株から獲得できる、請求項４記載のDNA 構築体。
【請求項６】
前記DNA 配列がアスペルギルス・アキュレアトゥス CBS 101.43 のDNA ライブラリーを基礎に単離又は製造されたものである、請求項５記載のDNA 構築体。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項記載のDNA 構築体を含んで成る組換発現ベクター。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか１項記載のDNA 構築体又は請求項７記載の組換発現ベクターを含んで成る細胞。
【請求項９】
真核細胞、特に菌類細胞、例えば酵母細胞又は糸状菌細胞である、請求項８記載の細胞。
【請求項１０】
前記細胞がアスペルギルスの株、特にアスペルギルス・ニガー又はアスペルギルス・オリザの株に属する、請求項９記載の細胞。
【請求項１１】
タンパク質分解活性を示す酵素を製造する方法であって、請求項８〜10のいずれか１項記載の細胞をその酵素の生産が可能な条件下で培養し、そしてその培養物からこの酵素を回収することを含んで成る方法。
【請求項１２】
請求項１〜６のいずれか１項記載のDNA 構築によりコードされる、又は請求項11記載の方法により製造される、タンパク質分解活性を示す酵素。
【請求項１３】
ウシのグルカゴン中のPhe-Val 又はLys-Tyr 結合を好適に加水分解する、プロテアーゼ活性を有する酵素。
【請求項１４】
アスペルギルス・アキュレアトゥスCBS 101.43由来の精製プロテアーゼに対して生起された抗体と免疫学的に反応性であり、且つSEQ ID No.２に示すDNA 配列によりコードされる、請求項12〜13のいずれか１項記載の酵素。
【請求項１５】
微生物から獲得できる、請求項12〜14のいずれか１項記載の酵素。
【請求項１６】
細菌又は菌類から獲得できる、請求項15記載の酵素。
【請求項１７】
アスペルギルス、リゾプス、トリコデルマ、ペニシリウム、フサリウム、シタリジウム又はヒュミコラの株から獲得できる、請求項16記載の酵素。
【請求項１８】
アスペルギルス・アキュアトゥスの株から獲得できる、請求項17記載の酵素。
【請求項１９】
請求項12〜18のいずれか１項記載のプロテアーゼ活性を示す酵素に富む、植物細胞壁の成分の分解のために有用な酵素調製品。
【請求項２０】
１又は複数種のその他の植物細胞壁分解酵素、例えばペクチンリアーゼ、ペクテートリアーゼ、エンドグルカナーゼ、アラビナナーゼ、キシラナーゼ、グルカナーゼ、ガラクタナーゼ、マンナナーゼ、α−ガラクトシダーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、エキソペプチダーゼ又はペクチンメチルエステラーゼを更に含んで成る、請求項19記載の調製品。
【請求項２１】
タンパク質含有物質の分解又は改変のため、請求項12〜18のいずれか１項記載の酵素又は請求項19もしくは20記載の酵素調製品を利用する方法。
【請求項２２】
コンタクトレンズの洗浄のため、請求項12〜18のいずれか１項記載の酵素又は請求項19もしくは20記載の酵素調製品を利用する方法。
【請求項２３】
Ｈ2Ｏ2の存在下、好ましくは３％のＨ2Ｏ2の存在下で実施する、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
Ｈ2Ｏ2の中和のためにカタラーゼを併せて使用する、請求項23記載の方法。
【請求項２５】
ベークド製品の調製のための、請求項12〜18のいずれか１項記載の酵素又は請求項19もしくは20記載の酵素調製品の利用。
【請求項２６】
動物飼料の調製のための、請求項12〜18のいずれか１項記載の酵素又は請求項19もしくは20記載の酵素調製品の利用。