【手続補正書】
【提出日】平成26年8月29日(2014.8.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド中のＲＮＡ鎖を切断するリボヌクレアーゼであって、
リボヌクレアーゼは、リボヌクレアーゼ  ＨＩ（ＲＮａｓｅ  ＨＩ）またはその誘導体の触媒ドメインを含む融合タンパク質であり、リボヌクレアーゼ  ＨＩまたはその誘導体の触媒ドメインは、基質に結合しないが、触媒活性を保持し、
好ましくは、ＲＮａｓｅ  ＨＩまたはその誘導体の触媒ドメインは、ＲＮａｓｅ  ＨＩハイブリッド結合ドメインを含まず、
およびＲＮａｓｅ  ＨＩまたはその誘導体の触媒ドメインは、好ましくは、少なくとも１つのアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入から選択される基質結合ドメインの変化を含み、該変化は、そのようなＲＮａｓｅ  ＨＩまたはその誘導体の触媒ドメインによる結合する基の不安定化をもたらし、
ジンクフィンガーＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド結合ドメインは、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド中の特異的な配列に結合する能力を有している、ことを特徴とするリボヌクレアーゼ。
【請求項２】
ジンクフィンガードメインは、ジンクフィンガーＺｆＱＱＲの誘導体であり、好ましくは、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２で示される配列ＺｆＱＱＲの１９−３０３までのヌクレオチドによってコードされたポリペプチドである、ことを特徴とする請求項１に記載のリボヌクレアーゼ。
【請求項３】
ＲＮａｓｅ  ＨＩの触媒ドメインは、バチルス・ハロデュランスからのものであり、好ましくは、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１で示されるｒｎｈＡ遺伝子のヌクレオチド１７５−５８８によってコードされたポリペプチドを含み、より好ましくは、ＲＮａｓｅ  ＨＩの触媒ドメインは、Ｋ８１Ａ、Ｋ８９Ｅ、および、Ｋ１２３Ａから選ばれた基質結合ドメイン中の１つのアミノ酸の少なくとも１つの置換を含み、好ましくは、すべての置換Ｋ８１Ａ、Ｋ８９Ｅ、およびＫ１２３Ａを含む、ことを特徴とする請求項１または２に記載のリボヌクレアーゼ。
【請求項４】
リボヌクレアーゼは、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４で示されるような融合タンパク質ｃａｔＡＥＡ−ＺｆＱＱＲ、またはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６で示されるような融合タンパク質ＧＱを含むか、またはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８で示されるような融合タンパク質ＧＧＫＫＱを含む、ことを特徴とする請求項１乃至３に記載のリボヌクレアーゼ。
【請求項５】
請求項１乃至４のリボヌクレアーゼを含む組成物。
【請求項６】
ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド中のＲＮＡ鎖の切断のための請求項１乃至４のリボヌクレアーゼ、または、請求項５の組成物の使用であって、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド中のＲＮＡ鎖の切断は、ジンクフィンガーの結合部位から離れた、２−１６のヌクレオチド、好ましくは５−７のヌクレオチドにある、ことを特徴とする使用。
【請求項７】
ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド中のＲＮＡ鎖を切断する、ＲＮａｓｅ  ＨＩの操作した変異体を得る方法であって、
前記方法は、
ａ）好ましくは結合ドメインの除去によって、および／または、基質の結合に関与するアミノ酸の置換によって、基質と結合しないが触媒活性を保持する、ＲＮａｓｅ  ＨＩ触媒ドメインを得る工程と、
好ましくは、少なくとも１つのアミノ酸の置換、欠失、または挿入から選択される、ＲＮａｓｅ  ＨＩの触媒ドメインの基質結合ドメインの変化を導入し、該変化が、そのようなＲＮａｓｅ  ＨＩの触媒ドメインによる結合する基の不安定化をもたらす工程、
ｂ）ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド中の特異的な配列に結合する能力を有する結合ドメインを含む、好ましくは、ジンクフィンガーＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド結合ドメインを含む、工程ａ）で得られたＲＮａｓｅ  ＨＩ触媒ドメインを含む融合タンパク質を作ることによって操作したＲＮａｓｅ  ＨＩを得る工程を含み、
好ましくは、ジンクフィンガードメインは、ジンクフィンガーＺｆＱＱＲの誘導体、好ましくは、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２で示された配列ＺｆＱＱＲのヌクレオチド１９−３０３によってコードされたポリペプチドであり、
および好ましくは、ＲＮａｓｅ  ＨＩの触媒ドメインは、バチルス・ハロデュランスからのものであり、好ましくは、ＳＥＱ  ＩＤ：１で示されるｒｎｈＡ遺伝子のヌクレオチド１７５−５８８によってコードされたポリペプチドを含む、ことを特徴とする方法。
【請求項８】
ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド結合タンパク質またはそのドメインの配列優先性を決定する方法であって、
前記方法は、
ａ）ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド基質のライブラリーの混合物に、精製したタンパク質またはそのドメインを接触させる工程であって、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド基質は、中心部分、好ましくは９または１０のヌクレオチド位置に、無作為な配列を含み、フランキング配列は固定され、試験されるタンパク質またはそのドメインが、それに対する親和性を有している配列と結合することを可能にする、工程、
ｂ）結合したＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを含むタンパク質またはそのドメインの、レジン、好ましくはグルタチオンアガロースへの固定化によって、結合していないＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを分離する工程、
ｃ）結合していないハイブリッドを取り除く工程、
ｄ）好ましくはグルタチオンを含有する緩衝液を加えることによって、関連するＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドと一緒に、組換え型タンパク質を分離する工程、
ｅ）ＰＣＲ、好ましくはＲＴ−ＰＣＲを用いて、分離したハイブリッドを増幅する工程であって、増幅反応において、無作為化領域に隣接する不変の配列上の既知の配列に相補的なプライマーが用いられ、プライマーの１つでのＰＣＲ反応中に、ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターの配列は、ＲＮＡポリメラーゼによるインビトロの転写のための二本鎖ＤＮＡを得るために加えられる、工程、
ｆ）ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを得るために、ＲＮａｓｅＨ活性と、ＲＮＡ鋳型の３’末端に相補的なＤＮＡプライマーとを持っていない逆転写酵素を用いて、逆転写を行う工程を含み、および、
工程ａ）乃至ｆ）は好ましくは繰り返される、ことを特徴とする方法。
【請求項９】
プロモータ配列は、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼのプロモータ配列を含み、ＲＮＡポリメラーゼはＴ７  ＲＮＡポリメラーゼである、ことを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
タンパク質またはそのドメインは、好ましくはジンクフィンガーを含む、組換え型タンパク質または組み換え型ドメインであり、好ましくは、タンパク質またはそのドメインは、ＲＮａｓｅ  ＨＩまたはその誘導体の融合であり、好ましくは、ＲＮａｓｅ  ＨＩは、バチルス・ハロデュランスからのものであり、好ましくは、ＳＥＱ  ＩＤ：１で示されるｒｎｈＡ遺伝子のヌクレオチド１７５−５８８によってコードされたポリペプチドとジンクフィンガーを含む、ことを特徴とする請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
タンパク質またはそのドメインは、ジンクフィンガードメインおよびグルタチオン Ｓ−トランスフェラーゼドメイン（ＧＳＴ）の融合であり、好ましくは、ジンクフィンガードメインおよびＳＥＱ  ＩＤ：３７によってコードされたＧＳＴの融合である、ことを特徴とする請求項８乃至１０に記載の方法。
【請求項１２】
ジンクフィンガーは、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド中の特異的な配列に結合する能力を有する、ことを特徴とする請求項８乃至１０に記載の方法。
【請求項１３】
ジンクフィンガーは、好ましくはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２で示される配列ＺｆＱＱＲの１９−３０３までのヌクレオチドによってコードされた配列のＺｆＱＱＲである、ことを特徴とする請求項８乃至１２に記載の方法。
【請求項１４】
ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドのライブラリーを得る方法であって、
前記方法は、
ａ）ＲＮＡポリメラーゼのためのプロモータ配列を含む、不変の配列に隣接する、中央の位置に縮重配列を包含しているＤＮＡオリゴヌクレオチドのライブラリーをＰＣＲ増幅する工程、
ｂ）鋳型として工程ａ）で得られた二本鎖ＤＮＡ上のＲＮＡポリメラーゼを使用してＲＮＡ鎖を合成する工程、
ｃ）リボヌクレアーゼＨ活性を持っていない逆転写酵素を用いて、工程ｂ）で得られたＲＮＡの３’末端にある不変な配列に相補的なプライマーの逆転写を行う工程であって、逆転写の間、ＲＮＡ鎖は分解されず、相補的なＲＮＡ鎖とＤＮＡ鎖からなるハイブリッド核酸分子が得られる、工程を含み、
好ましくは、オリゴヌクレオチドは、無作為の９または１０のヌクレオチド位置を含む中央の位置に、縮重配列を含有し、
および好ましくは、プロモータ配列は、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼのためのプロモータ配列を含み、ＲＮＡポリメラーゼはＴ７  ＲＮＡポリメラーゼである、ことを特徴とする方法。