【手続補正書】
【提出日】平成26年2月20日(2014.2.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１２】
実施例5: KPM由来ΔendA ΔrecA菌株の構築
ΔrecA::Km耐性菌株KPM348、KPM349、KPM350、KPM351およびKPM352はそれぞれ、KPM343、KPM344、KPM345、KPM346およびKPM347に対応するΔendA菌株に由来するものであった。本実施例において用いられる場合のΔは、欠失を意味する。ΔrecA::Km耐性標的化カセットは、本質的には他のノックアウト変異の構築について記述したようにP1vir形質導入によってKPM343、KPM344、KPM345、KPM346およびKPM347に移入した。
1. ΔrecA::Km耐性変異を保有する大腸菌株BW26547を、形質導入用のドナーとして用いた。菌株は大腸菌遺伝子貯蔵センター(E.coli Genetic Stock Center)から得た。
2. ファージP1virを、30 μg/mlカナマイシンを有するLB培地中37℃で増殖させたBW26547に対し繁殖させて、ΔrecA::Km耐性形質導入溶菌液を得た。
3. 形質導入のため、ΔendAレシピエント菌株KPM343、KPM344、KPM345、KPM346およびKPM347を、A5P/G6Pを補充したLB培地中37℃で増殖させた。
4. 形質導入は標準的なプロトコルにしたがい、30 μg/mlカナマイシンを含有するLB寒天プレート上37℃で潜在的な形質導入体を選択して行った。
5. recAとgutQの距離は約6 kb (理論上の同時形質導入率: 約82%)にすぎず、したがって潜在的なカナマイシン耐性形質導入体を
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およびKPM菌株において欠失されたgutQ遺伝子の両方の存在についてPCRにより試験した。
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6. 結果として、ΔrecA::Km耐性およびオリジナルのΔgutQ変異を含有する菌株KPM348、KPM349、KPM350、KPM351およびKPM352が得られた。
7. カナマイシン耐性遺伝子をpCP20による一過性の形質転換を用い除去して、菌株KPM353、KPM354、KPM355、KPM356、およびKPM357を得る。
8. 上記のrecAプライマーはΔrecA最終菌株におけるKanR挿入断片の除去を特定するのに役立つ。
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２ａ】
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【図１２ｂ】
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【図１２ｃ】
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【図１２ｄ】
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【図１２ｅ】
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【図１２ｆ】
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【図１２ｇ】
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【図１３】
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【図１４ａ】
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【図１４ｂ】
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【図１４ｃ】
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【図１４ｄ】
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【図１４ｅ】
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【図１４ｆ】
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【図１４ｇ】
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【図１４ｈ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２ａ】
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【図２２ｂ】
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【図２２ｃ】
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【図２２ｄ】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７１】
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【図７２】
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【図７３】
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【図７４】
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【図７５】
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【図７６】
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【図７７】
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【図７８】
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【図７９】
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【図８０】
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【図８１】
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【図８２】
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【図８３】
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【図８４】
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【図８５】
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【図８６】
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【図８７】
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【図８８−１】
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【図８８−２】
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【図８８−３】
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【図８９】
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【図９０】
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【図９１】
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【図９２Ａ】
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【図９２Ｂ】
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