【手続補正書】
【提出日】平成26年7月16日(2014.7.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者の中の少なくとも１つの標的生物を検出するための複数のプローブおよび／またはオリゴヌクレオチドのプライマーペアを含む混合物において、各プローブまたはオリゴヌクレオチドのプライマーペアが：
ａ．前記少なくとも１つの標的生物のゲノム中に存在する第１の標的配列と特異的にハイブリッド形成する第１の相同プローブ配列と；および
ｂ．前記少なくとも１つの標的生物のゲノム中に存在する第２の標的配列と特異的にハイブリッド形成する第２の相同プローブ配列と；
を含み、および
ｃ．各プローブがさらに、前記第１および前記第２の相同プローブ配列との間の、検出可能な部分およびプライマーを含む骨格配列を含み、
前記第１の標的配列および前記第２の標的配列が、少なくとも２つのヌクレオチドを含む対象領域によって分離されおり、各プローブ中の前記第１および第２の相同プローブ配列のそれぞれが：
ｉ．前記標的生物と特異的にハイブリッド形成し；
ｉｉ．５０−７２℃の範囲のＴｍを有し；
ｉｉｉ．（ａ）前記混合物中の他のいかなる相同プローブ配列、（ｂ）いかなる骨格配列、（ｃ）前記被験者のゲノム中に存在するいかなるヌクレオチド配列、または（ｄ）前記標的生物以外の所定の配列決定された生物セットのゲノム中に存在するいかなるヌクレオチド配列とも特異的にハイブリッド形成せず；
ｉｖ．前記少なくとも１つの標的ゲノムにおいて反復閾値未満で発生し、前記反復閾値が２０であり；および
ｖ．４つを超える連続した同一ヌクレオチドを含有せず、実質的に二次構造を有しない
こと；
を特徴とする混合物。
【請求項２】
請求項１に記載の混合物において、前記第１および第２の相同プローブ配列のそれぞれが、前記対象領域に隣接する前記対象生物の配列決定された変異体のゲノムと特異的にハイブリッド形成すること、および対象領域が前記対象生物の配列決定した変異体のうちで多型であり、および選択的に、当該対象領域が毒素生産または抗生物質耐性と関連していることを特徴とする混合物。
【請求項３】
請求項１に記載の混合物において、前記混合物が、少なくとも４、１０、１５、２０、３０、４０、６０、８０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、１０００、２０００、４０００、８０００、１００００、１５０００、または２００００の異なる標的生物に対して少なくとも１つのプローブおよび／またはオリゴヌクレオチドのプライマーペアを含むことを特徴とする混合物。
【請求項４】
請求項１に記載の混合物において、前記混合物が、少なくとも１０、２０、３０、４０、６０、８０、１００、２００、２５０、５００、１０００、２０００、４０００、８０００、１００００、２００００、３００００、４００００、５００００、６００００、７００００、８００００、９００００、または１０００００のプローブおよび／またはオリゴヌクレオチドのプライマーペアを含むことを特徴とする混合物。
【請求項５】
請求項１に記載の混合物において、前記混合物が、少なくとも１つの被験者特異的プローブおよび／またはオリゴヌクレオチドのプライマーペアをさらに含み、当該被験者がヒトであることを特徴とする混合物。
【請求項６】
請求項１に記載の混合物において、前記混合物がさらに生物サンプルからの抽出核酸をさらに含み、当該生物サンプルがヒト患者に由来することを特徴とする混合物。
【請求項７】
請求項１に記載の混合物が、少なくとも１つのサンプル内部較正標準核酸、少なくとも１つのプローブおよび／または当該内部較正標準核酸と特異的にハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドのプライマーペアを、さらに含むことを特徴とする混合物。
【請求項８】
請求項１に記載の混合物において、前記混合物が、表４、５、６、８、または９のいずれか１つからの少なくとも１つの相同プローブ配列、またはそれからの逆相補的配列を含むことを特徴とする混合物。
【請求項９】
請求項１に記載の混合物において、前記対象領域が、少なくとも２、４、８、１０、２０、４０、６０、８０、１００、１２５、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１２００、１４００、１６００、１８００、または２０００のヌクレオチドであることを特徴とする混合物。
【請求項１０】
１つまたは複数の標的生物の存在を検出する方法が：
ａ）標的生物を含有する疑いがある試験サンプルを、請求項１に記載の混合物と接触させるステップと；
ｂ）第１および第２の標的配列とハイブリッド形成する少なくとも１つのプローブおよび／またはオリゴヌクレオチドのプライマーペアによって、対象領域を捕獲するステップと；
ｃ）前記捕獲された対象領域を検出し、それにより、１つまたは複数の標的生物の存在を検出するステップと；
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法において、既知のゲノムの配列および配列決定エラーのモデルに関して、前記対象領域を配列決定し、および前記捕獲された対象領域の配列を分析して、前記サンプル中に存在する種々の生物の割合または存在量を推定するステップをさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項１０に記載の方法において、前記試験サンプルが、ヒト被験者から得られることを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項１０に記載の方法において、サンプル内部較正標準核酸を前記試験サンプルに添加し、および当該内部較正標準核酸を検出するステップをさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項１０に記載の方法において、検出された前記少なくとも１つの標的生物に基づいて治療的助言を与えるステップをさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項１５】
請求項１０に記載の方法を含む、病原体に感染した被験者の治療方法において、少なくとも１つの病原体の存在を検出するステップと、前記検出された少なくとも１つの病原体に基づいて前記被験者に適切な予防を施すステップとをさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項１６】
請求項１に記載の混合物の製造方法が：
ａ）対象生物のための少なくとも１つの基準ゲノム、少なくとも１つの非ハイブリッド形成ゲノム、および場合により、前記基準ゲノムと同一でない少なくとも１つのハイブリッド形成ゲノムを提供するステップと；
ｂ）前記基準ゲノムをｎ−ｍｅｒへスライスするステップであって、ｎが１８−５０の範囲であるステップと；
ｃ）前記スライスされた基準ゲノムからスクリーニングされたｎ−ｍｅｒのセットを同定するステップであって、前記スクリーニングされたｎ−ｍｅｒのセットが、
ｉ）非反復性であり、
ｉｉ）実質的に二次構造を有しないｎ−ｍｅｒからなり、
ｉｉｉ）４つを超える連続した同一ヌクレオチドを含有するｎ−ｍｅｒを有さず、
ｉｖ）５０−７２℃の範囲のＴｍを有するｎ−ｍｅｒからなるステップと；
ｄ）相同プローブ配列のセットを同定するステップであって、前記相同プローブ配列が、スクリーニングされたｎ−ｍｅｒからなり；
ｉ）前記ｎ−ｍｅｒが、いかなる非ハイブリッド形成ゲノムとも特異的にハイブリッド形成せず、
ｉｉ）前記ｎ−ｍｅｒが、前記基準ゲノムおよび場合により少なくとも１つのハイブリッド形成ゲノムにおいて１−２０回発生するステップと；
ｅ）複数のプローブおよび／またはオリゴヌクレオチドのプライマーペアを構築するステップであって、各プローブまたはオリゴヌクレオチドのプライマーペアが第１の相同プローブ配列および第２の相同プローブ配列を含み、
ｉ）前記第１および第２の相同プローブ配列がそれぞれ、前記対象生物のゲノム中の第１および第２の標的配列と特異的にハイブリッド形成し、前記第１および第２の標的配列が少なくとも２つのヌクレオチドを含む対象領域によって分離されており、
ｉｉ）前記複数のプローブが、互いに特異的にハイブリッド形成せず、そして
ｉｉｉ）前記複数のプローブが、実質的に二次構造を有しないステップと；
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載の方法において、２つ以上の基準ゲノムが提供され、少なくとも１つのプローブおよび／またはオリゴヌクレオチドのプライマーペアが、前記基準ゲノムの少なくとも１つとハイブリッド形成することを特徴とする方法。
【請求項１８】
請求項１６に記載の方法において、前記混合物中の前記プローブおよび／またはオリゴヌクレオチドのプライマーペアが、対象領域のゲノム配列のセット内の既知の配列間に存在する多型の閾値数に基づいてスコア化および選択されることを特徴とする方法。
【請求項１９】
請求項１６に記載の方法において、相同プローブ配列が、排除ゲノムのセットに対して指定の長さよりも長い完全な一致を含有しないように各プローブまたはオリゴヌクレオチドのプライマーペアが変更され、前記変更された配列が、１つまたは複数の標的ゲノムとまだハイブリッド形成し得ることを特徴とする方法。
【請求項２０】
請求項１６に記載の方法において、追加の対象生物のそれぞれの数ｎに対して、ステップ（ａ）−（ｅ）を繰り返すことをさらに含み、当該ｎが４，１０，１５，２０，３０，４０，６０，８０，１００，１５０，２００，２５０，３００，４００，５００，１０００，２０００，４０００，８０００，１００００，１５０００，または２００００よりも大きいことを特徴とする方法。
【請求項２１】
請求項１６に記載の方法において、前記少なくとも１つの非ハイブリッド形成ゲノムが、前記標的生物以外の所定の配列決定された生物セットを含み、選択的に前記少なくとも１つの非ハイブリッド形成ゲノムがヒトゲノムを含むことを特徴とする方法。
【請求項２２】
請求項１６に記載の方法において、前記ゲノムのｎ−ｍｅｒへのスライシングが、１とｎの間のオフセットを有することを特徴とする方法。
【請求項２３】
請求項１６に記載の方法において、前記方法が、少なくとも１０、９、８、７、６、５、４、３、または２メガベースの標的ゲノムにおいて、シングルコアＰｅｎｔｉｕｍ（登録商標）Ｘｅｏｎ  ２．５ｇｈｚプロセッサを用いて１６、１４、１２、１０、８、６、もしくは４日間、または７２、４８、３６、２４、１２、１０、８、６、もしくは４時間かからないことを特徴とする方法。