【手続補正書】
【提出日】平成26年5月23日(2014.5.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養細胞における乳酸生産を低下させる方法であって、乳酸脱水素酵素(ＬＤＨ)に特異的な低分子干渉ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ)をコードする第一異種性核酸配列、及びピルビン酸脱水素酵素キナーゼ(ＰＤＨＫ)に特異的なｓｉＲＮＡをコードする第二異種性核酸配列を含んでなる細胞を培養することを含んでなり、第一異種性核酸配列は第一プロモーターに作動的に連結され、第二異種性核酸配列は第二プロモーターに作動的に連結されている方法。
【請求項２】
ＬＤＨがＬＤＨａである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
培養細胞が、第二ＰＤＨＫに特異的なｓｉＲＮＡをコードする第三異種性核酸配列を更に含み、第三異種性核酸配列は第三プロモーターに作動的に連結されている請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
培養細胞が、第三ＰＤＨＫに特異的なｓｉＲＮＡをコードする第四異種性核酸配列を更に含み、第四異種性核酸配列は第四プロモーターに作動的に連結されている請求項３に記載の方法。
【請求項５】
培養細胞が、第五ＰＤＨＫに特異的なｓｉＲＮＡをコードする第五異種性核酸配列を更に含み、第五異種性核酸配列は第五プロモーターに作動的に連結されている請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ＰＤＨＫが、ＰＤＨＫ１、ＰＤＨＫ２、ＰＤＨＫ３、及びＰＤＨＫ４から成る群から選択される請求項１、２、３、４、及び５の何れか一項に記載の方法。
【請求項７】
ＰＤＨＫが、ＰＤＨＫ１、ＰＤＨＫ２、及びＰＤＨＫ３から成る群から選択される請求項１、２、３、及び４の何れか一項に記載の方法。
【請求項８】
ＰＤＨＫが、ＰＤＨＫ１及びＰＤＨＫ２から成る群から選択される請求項１〜３の何れか一項に記載の方法。
【請求項９】
ＰＤＨＫが、ＰＤＨＫ１及びＰＤＨＫ３から成る群から選択される請求項１〜３の何れか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ＰＤＨＫが、ＰＤＨＫ２及びＰＤＨＫ３から成る群から選択される請求項１〜３の何れか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ＬＤＨがＬＤＨａであり、第一ＰＤＨＫがＰＤＨＫ１であり、第二ＰＤＨＫがＰＤＨＫ２であり、第三ＰＤＨＫがＰＤＨＫ３である請求項４に記載の方法。
【請求項１２】
培養細胞が異種性ポリペプチドを生産する請求項１〜１１の何れか一項に記載の方法。
【請求項１３】
異種性ポリペプチドが抗体である請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
培養細胞の平均乳酸生産速度が、約ネガティブ０．０２ｍｇ／１０６細胞／日未満である請求項１〜１３の何れか一項に記載の方法。
【請求項１５】
培養細胞が、ＰＤＨＫ及びＬＤＨを含んでなる異種性核酸配列を持たない培養細胞より、少なくとも約７５％高い比生産性を有する請求項１〜１４の何れか一項に記載の方法。
【請求項１６】
培養細胞が、約３００ｍＯｓｍ未満のオスモル濃度を有する請求項１〜１５の何れか一項に記載の方法。
【請求項１７】
培養細胞が、ＰＤＨＫ及びＬＤＨを含んでなる異種性核酸配列を持たない培養細胞より、少なくとも約６８％高いポリペプチド生産性を有する請求項１〜１６の何れか一項に記載の方法。
【請求項１８】
培養細胞が哺乳類細胞である請求項１〜１７の何れか一項に記載の方法。
【請求項１９】
培養細胞における乳酸脱水素酵素(ＬＤＨ)及びピルビン酸脱水素酵素キナーゼ(ＰＤＨＫ)転写をサイレンシング又は下方制御する方法であって、
ＬＤＨに特異的な低分子干渉ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ)をコードする第一異種性核酸配列、及びＰＤＨＫに特異的なｓｉＲＮＡをコードする第二異種性核酸配列を含んでなるベクターを細胞に導入する工程を含んでなり、第一異種性核酸配列は第一プロモーターに作動的に連結され、第二異種性核酸配列は第二プロモーターに作動的に連結されており、ｓｉＲＮＡが発現され、それによってＬＤＨ及びＰＤＨＫの遺伝子転写がサイレンシング又は下方制御される方法。
【請求項２０】
培養において低下された乳酸生産を呈する細胞を作成する方法であって、ＬＤＨに特異的な低分子干渉ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ)をコードする第一異種性核酸配列、及びＰＤＨＫに特異的なｓｉＲＮＡをコードする第二異種性核酸配列を含んでなるベクターを細胞に導入する工程を含んでなり、第一異種性核酸配列は第一プロモーターに作動的に連結され、第二異種性核酸配列は第二プロモーターに作動的に連結されている方法。
【請求項２１】
約ネガティブ０．０２ｍｇ／１０６細胞／日未満の平均乳酸生産率を有する培養物中における細胞。
【請求項２２】
一又は複数のＰＤＨＫ及びＬＤＨを含んでなる一又は複数の異種性核酸配列を持たない培養細胞より、少なくとも約７５％高い比生産性を有する培養物中における細胞。
【請求項２３】
約３００ｍＯｓｍ未満のオスモル濃度を有する培養物中における細胞。
【請求項２４】
乳酸脱水素酵素(ＬＤＨ)に特異的な第一低分子干渉ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ)をコードする第一異種性核酸配列、及びピルビン酸脱水素酵素キナーゼ(ＰＤＨＫ)に特異的な第二ｓｉＲＮＡをコードする第二異種性核酸配列を含んでなり、第一異種性核酸配列は第一プロモーターに作動的に連結され、第二異種性核酸配列は第二プロモーターに作動的に連結されている、培養物中における細胞。
【請求項２５】
細胞が、第二ＰＤＨＫに特異的なｓｉＲＮＡをコードする第三異種性核酸配列を更に含み、第三異種性核酸配列が第三プロモーターに作動的に連結されている請求項２４に記載の細胞。
【請求項２６】
細胞が、第三ＰＤＨＫに特異的なｓｉＲＮＡをコードする第四異種性核酸配列を更に含み、第四異種性核酸配列は第四プロモーターに作動的に連結されている請求項２５に記載の細胞。
【請求項２７】
細胞が、第五ＰＤＨＫに特異的なｓｉＲＮＡをコードする第五異種性核酸配列を更に含み、第五異種性核酸配列は第五プロモーターに作動的に連結されている請求項２６に記載の細胞。
【請求項２８】
ＰＤＨＫが、ＰＤＨＫ１、ＰＤＨＫ２、ＰＤＨＫ３、及びＰＤＨＫ４から成る群から選択される請求項２４、２５、２６、及び２７の何れか一項に記載の細胞。
【請求項２９】
ＰＤＨＫが、ＰＤＨＫ１、ＰＤＨＫ２、及びＰＤＨＫ３から成る群から選択される請求項２４、２５、及び２６の何れか一項に記載の細胞。
【請求項３０】
ＰＤＨＫが、ＰＤＨＫ１及びＰＤＨＫ２から成る群から選択される請求項２４又は２５に記載の細胞。
【請求項３１】
ＰＤＨＫが、ＰＤＨＫ１及びＰＤＨＫ３から成る群から選択される請求項２４又は２５に記載の細胞。
【請求項３２】
ＰＤＨＫが、ＰＤＨＫ２及びＰＤＨＫ３から成る群から選択される請求項２４又は２５に記載の細胞。
【請求項３３】
ＬＤＨがＬＤＨａであり、第一ＰＤＨＫがＰＤＨＫ１であり、第二ＰＤＨＫがＰＤＨＫ２であり、第三ＰＤＨＫがＰＤＨＫ３である請求項２６に記載の細胞。
【請求項３４】
細胞が異種性ポリペプチドを生産する請求項２１〜３３の何れか一項に記載の細胞。
【請求項３５】
異種性ポリペプチドが抗体である請求項３４に記載の細胞。
【請求項３６】
細胞が約ネガティブ０．０２ｍｇ／１０６細胞／日未満の平均乳酸生産率を有する請求項２２〜３５の何れか一項に記載の細胞。
【請求項３７】
細胞が、ＬＤＨ及びＰＤＨＫを含んでなる異種性核酸配列を持たない細胞より、少なくとも約７５％高い比生産性を有する請求項２３〜３６の何れか一項に記載の細胞。
【請求項３８】
細胞が、約３００ｍＯｓｍ未満のオスモル濃度を有する請求項２４〜３７の何れか一項に記載の細胞。
【請求項３９】
細胞が、ＬＤＨ及びＰＤＨＫを含んでなる異種性核酸配列を持たない細胞より、少なくとも約６８％高いポリペプチド生産性を有する請求項２３〜３６及び３８の何れか一項に記載の細胞。
【請求項４０】
細胞が哺乳類細胞である請求項２１〜３９の何れか一項に記載の細胞。
【請求項４１】
乳酸脱水素酵素(ＬＤＨ)に特異的な低分子干渉ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ)をコードする第一異種性核酸配列、及びピルビン酸脱水素酵素キナーゼ(ＰＤＨＫ)に特異的なｓｉＲＮＡをコードする第二異種性核酸配列を含んでなり、第一異種性核酸配列は第一プロモーターに作動的に連結され、第二異種性核酸配列は第二プロモーターに作動的に連結されているベクター。
【請求項４２】
培養細胞における乳酸生産を低減させる方法であって、ａ)乳酸脱水素酵素(ＬＤＨ)に特異的な低分子干渉ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ)、及びｂ)ピルビン酸脱水素酵素キナーゼ(ＰＤＨＫ)に特異的なｓｉＲＮＡを発現する細胞を培養することを含んでなる方法。
【請求項４３】
培養細胞が、第二ＰＤＨＫに特異的なｓｉＲＮＡを更に発現する請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
培養細胞が、第三ＰＤＨＫに特異的なｓｉＲＮＡを更に発現する請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
培養細胞が、第四ＰＤＨＫに特異的なｓｉＲＮＡを更に発現する請求項４３又は４４に記載の方法。
【請求項４６】
培養細胞が、ＬＤＨ及びＰＤＨＫに特異的なｓｉＲＮＡを持たない培養細胞より、少なくとも約６８％高いポリペプチド生産性を有する請求項４２〜４５の何れか一項に記載の方法。
【請求項４７】
培養細胞において異種性ポリペプチドを生産する方法であって、
前記培養細胞における乳酸の生産を減少させる工程を含んでなり、前記細胞は、乳酸脱水素酵素(ＬＤＨ)に特異的な低分子干渉ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ)をコードする第一異種性核酸配列、及びピルビン酸脱水素酵素キナーゼ(ＰＤＨＫ)に特異的なｓｉＲＮＡをコードする第二異種性核酸配列を含み、第一異種性核酸配列は第一プロモーターに作動的に連結され、第二異種性核酸配列は第二プロモーターに作動的に連結されている方法。
【請求項４８】
培養細胞において乳酸を生産する方法であって、
前記培養細胞における、乳酸脱水素酵素(ＬＤＨ)発現、及びピルビン酸脱水素酵素キナーゼ(ＰＤＨＫ)発現を促進する工程を含む方法。