【誤訳訂正書】
【提出日】平成24年3月6日(2012.3.6)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）支持体に固定されたＰＮＡプローブと標的核酸とのハイブリダイゼーション反応段階と、
（２）核酸加水分解酵素（nuclease）を用いて、前記標的核酸の断片化、又は、前記ＰＮＡプローブとミスマッチ（mismatch）される前記標的核酸の単一本の選別的分解を行う段階と、を含み、
前記（１）（２）の段階を同時に行うことを特徴とする、ＰＮＡプローブと標的核酸とのハイブリダイゼーション効率又は特異度を増加させる方法。
【請求項２】
前記標的核酸の大きさが２００ｂｐ乃至２０,０００ｂｐであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記標的核酸の大きさが２００ｂｐ乃至５,０００ｂｐであることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記標的核酸の前記ＰＮＡプローブと結合する部分が検出可能な標識で標識されたものであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記検出可能な標識が、ビオチン、ローダミン、シアニン３、シアニン５、ピレン、シアニン２、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）、カルセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、アレクサ４８８、６−カルボキシ−フルオレセイン（ＦＡＭ）、２′，４′，５′，７′−テトラクロロ−６−カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）、２′，７′−ジクロロ−６−カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）、フルオレセインクロロトリアジニル、フルオレセイン、オレゴングリーン、マグネシウムグリーン、カルシウムグリーン、６−カルボキシ−４′，５′−ジクロロ−２′，７′−ジメトキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、テトラメチルローダミン、テトラメチル−ローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、ローダミン ファロイジン、ピロニンＹ、リサミン、Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、カルシウムクリムソン、テキサスレッド、ナイルレッド、及びチアジカルボシアニンから構成された群から選ばれるものであることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記標的核酸が、分岐ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）増幅、ハイブリッドキャプチャー、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）、核酸配列基礎増幅（ＮＡＳＢＡ）、逆転写−重合酵素連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、転写−媒介増幅（ＴＭＡ）、及びローリングサークル増幅（ＲＣＡ）から構成された群から選ばれる方法によって増幅されたものであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記核酸加水分解酵素が、ＤＮａｓｅ１、エキソヌクレアーゼ及びエンドヌクレアーゼ、及びこれらの混合物から構成された群から選ばれるものであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記核酸加水分解酵素が、エキソヌクレアーゼ１、Ｓ１ヌクレアーゼ、マングビーンヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼＡ、リボヌクレアーゼＴ１、リボヌクレアーゼＰ１、制限酵素、及びこれらの混合物から構成された群から選ばれるものであることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
突然変異、一塩基変異多型（ＳＮＰ）、遺伝型、遺伝子発現、スプライス−変異体又は後生学的（epigenetic）分析、又はリシーケンシング（resequencing）分析に使われることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ハイブリダイゼーションを蛍光検出法、電気的方法、電気化学的方法、質量変化を用いた検出法、電荷量変化を用いた検出法、又は光学的性質の差異を用いた検出法によって検出することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
活性成分として核酸加水分解酵素を含む、支持体に固定されたＰＮＡプローブと標的核酸とのハイブリダイゼーション効率又は特異度を増加させるための組成物。
【請求項１２】
前記核酸加水分解酵素が、ＤＮａｓｅ１、エキソヌクレアーゼ及びエンドヌクレアーゼ、及びこれらの混合物から構成された群から選ばれるものであることを特徴とする、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記核酸加水分解酵素が、エキソヌクレアーゼ１、Ｓ１ヌクレアーゼ、マングビーンヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼＡ、リボヌクレアーゼＴ１、ヌクレアーゼＰ１、制限酵素、及びこれらの混合物から構成された群から選ばれるものであることを特徴とする、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
支持体に固定された複数のＰＮＡプローブ、及び、核酸加水分解酵素を含むことを特徴とする、核酸検出用キット。
【請求項１５】
前記核酸加水分解酵素が、ＤＮａｓｅ１、エキソヌクレアーゼ及びエンドヌクレアーゼ、及びこれらの混合物から構成された群から選ばれるものであることを特徴とする、請求項１４に記載のキット。
【請求項１６】
前記核酸加水分解酵素が、エキソヌクレアーゼ１、Ｓ１ヌクレアーゼ、マングビーンヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼＡ、リボヌクレアーゼＴ１、リボヌクレアーゼＰ１、制限酵素、及びこれらの混合物から構成された群から選ばれるものであることを特徴とする、請求項１５に記載のキット。 
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【発明の詳細な説明】
【発明の名称】支持体に固定されたＰＮＡプローブと標的核酸とのハイブリダイゼーション効率又は特異度を増加させるための方法、組成物、及びキット
【技術分野】
【０００１】
本発明は、支持体に固定された（immobilized）ペプチド核酸（peptide nucleic acid, ＰＮＡ）プローブと標的核酸とのハイブリダイゼーション効率又は特異度を増加させる技術に関するものであって、より詳しくは、支持体に固定されたＰＮＡプローブと標的核酸とのハイブリダイゼーション反応において核酸加水分解酵素（nuclease）を用いて標的核酸を断片化（fragmentation）して標的核酸の大きさを減少させたり、ＰＮＡプローブとミスマッチ（mismatch）される標的核酸を選別的に分解して、ＰＮＡプローブのハイブリダイゼーション効率又は特異度を増加させる方法、組成物、及びキットに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子発現の差異、一塩基変異多型（SNPs；single nucleotide polymorphisms）、突然変異、及び病原性バクテリアやウイルスなどの疾病に連関された遺伝情報が明らかになっている。このような遺伝情報の差異や変異によって個体間の差異が現われ、遺伝性疾患の発病如何及び疾病に対する感受性が決定される。よく使われる変異や遺伝子発現分析方法には、ＤＮＡ配列分析、ＲＦＬＰ（restriction fragment length polymorphism）、対立形質特異的ＰＣＲ（allele specific polymerase chain reaction）、サザンブロット（southern blot）又はノーザンブロット（northern blot）の方法がある（文献[Present and future of rapid and/or high throughput methods for nucleic acid testing, Gyorgy csako, 2005, Clinica Chimica Acta 1-25]）。しかし、これらの方法はたくさんの時間と努力、費用、及び熟練された技術などを必要とし、一度に一つの遺伝子や変異分析のみができ、煩わしいゲル電気泳動分析を必然的に伴うという限界がある。
【０００３】
従って、既存の遺伝子分析方法の短所を克服することができる新しい分析システムとしてＤＮＡチップ（chip）又はＤＮＡマイクロアレイ技術が頭をもたげた（文献[Single nucleotide polymorphism discrimination assisted by improved base stacking hybridization using oligonucleotide microarrays, Wang D et al., 2003, Biotechniques, 35(2), 300-306]）。ＤＮＡチップは固体表面上に既知の遺伝情報に基づいて設計されたＤＮＡプローブを高密で固定させたチップであって、チップ上において分析しようとする標的核酸とのハイブリダイゼーション反応を蛍光を用いて検出する方法である。ＤＮＡチップを用いれば１回の実験で多様な遺伝情報が分析できるため疾病診断に最も有用である（文献[Development and evaluation of a highly sensitive human papillomavirus genotyping DNA chip, Kim K et al., 2006, Gynecologic Oncology 100, 38-43]）。このようなＤＮＡチップは現在までの技術水準で最も効率的な分析及び診断方法として知られているが、相変わらず下記のような技術的問題点を抱えている。
【０００４】
先ず、ＤＮＡプローブが生物学的（核酸加水分解酵素など）及び化学的（酸、塩基など）安定性が低くてＤＮＡチップの製品の安定性が低い。
【０００５】
第２に、ＳＮＰや突然変異などの一つの塩基配列の差異を正確に区別し難い場合が多い。
【０００６】
第３に、オリゴヌクレオチドプローブ（oligonucleotide probe）から製作されたチップのハイブリダイゼーション反応において標的核酸の長さに制限がある。
【０００７】
ＤＮＡチップでのように支持体に固定されたプローブを使用する場合、標的核酸の大きさが大きいほどプローブへの接近が難しくなってハイブリダイゼーション反応効率が落ちるため、あまり長くない標的核酸をハイブリダイゼーション反応に適用しなければならない。標的核酸の長さが２００の塩基対（ｂｐ）以上になればハイブリダイゼーション効率が急速に減少し特異信号が減少して背景信号との区別が容易でなく、４００ｂｐ超過の標的核酸は特異信号が殆ど発生しなくて分析が不可能である（文献[Optimization of fragmentation conditions for microarray analysis of viral RNA, Martin et al., 2005, Analytical biochemistry, 347, 316-323]及び[Correlation between microarray DNA hybridization efficiency and the position of short capture probe on the target nucleic acid, Regis et al., 2005, Bio Techniques, 39, 89-96]）。前記した問題点を解決するために標的が散在している場合、それぞれの短い断片で増幅させる方法、長く増幅させた後に制限酵素で断片化する方法、及び遺伝体の増幅後に再びそれぞれの特異的プライマーで小さく増幅する方法などが使われてきた（文献[Toward genome-wide SNP genotyping, Ann-Christine Syvanen, 2005, Nature genetics, 37, S5-S10]及び[Assessing Genetic Variation: Genotyping Single Nucleotide Polymorphism, Ann-Christine Syvanen, Nature, 2001, 2, 930-942]）。しかし、このような方法は標的核酸をハイブリダイゼーション反応のできる小さい断片で製作することにおいて、たくさんの時間と高度の努力、及び費用が消耗される煩わしくて非効率的な方法である。なお、反応しない残余の標的核酸の反応によって非特異信号が増加する可能性も排除することはできない。
【０００８】
また、ＤＮＡ自体の不安定性を解決するためには、多様なＤＮＡ類似体（analogues）が開発されており、その中でＰＮＡ（peptide nucleic acids）は１９９１年ニエルソン（Nielson）によって開発された（文献[Peptide nucleic acid, PNA, sequence-selective recognition of DNA by strand displacement with a thymine-substituted polyamide, P.E. Neilson et al., 1991, Science, 254, 1497-1500]）。図１に示したように、ＰＮＡはＤＮＡのホスホジエステル（phosphodiester）結合がペプチド結合（peptide bond）に取り替えられており、ＤＮＡのようなアデニン、チミン、グアニンとシトシンを有していて塩基特異的にＤＮＡやＲＮＡとハイブリダイゼーション反応を起し得る。特に、負電荷を帯びるリン酸結合の骨格のために互いに電気的に反発する天然核酸とは違ってペプチド結合からなる骨格は電荷を帯びないからハイブリダイゼーション反応においてＰＮＡはＤＮＡより天然核酸に最も強く結合し、この結合は塩濃度（salt concentration）に影響を及ぼされない。なお、ＰＮＡは核酸加水分解酵素、蛋白質分解酵素のような生分解酵素に分解されないためにＤＮＡやＲＮＡより安定性が非常に高い。このように天然核酸を相補的に認識することができ、ハイブリダイゼーション結合力と安定性に優れるＰＮＡは遺伝子分析又は診断などに用いられる（文献[PNA for rapid microbiology, Stender H et al., 2002, Journal of Microbiological Methods, 48, 1-17]、[Peptide nucleic acids on microarrays and other biosensors, Brandt O et al., 2004, Trends in Biotechnology, 22, 617-622]、及び[Detection of target DNA using fluorescent cationic polymer and peptide nucleic acid probes on solid support, Frdric R Raymond et al., 2005, BMC technology, 5, 1-5]）。
【０００９】
ＰＮＡの生物学的安定性を用いた研究としては、例えば蛍光標識されたＰＮＡプローブを標的核酸と反応させ、ＰＮＡとＤＮＡのハイブリダイゼーション反応がなされるとＤＮＡのアニオンにカチオンのポリマーが結合され、ＰＮＡとＤＮＡとの間にミスマッチされた部分が存在すれば核酸加水分解酵素のS1ヌクレアーゼによってミスマッチされた部分が除去されてＦＲＥＴ（Fluorescence resonance energy transfer）でＳＮＰを区別する方法が報告されている（文献[SNP detection using peptide nucleic acid probes and conjugated polymers: Applications in neurodegenerative disease identification, Brent S et al., 2005, Proceedings of the National Academy of Sciences 102, 34-39]）。また、マイクロチューブ内において一つ又は二つのＰＮＡプローブと標的核酸とのハイブリダイゼーション反応の後、核酸加水分解酵素で処理してＰＮＡプローブと塩基配列がミスマッチされた標的核酸を除去する方法を通じてＰＮＡプローブと完全にハイブリダイズされたものに蛍光物質を取り付けて肉眼又は質量分析器で確認する方法が報告された（文献[Detection of single nucleotide polymorphisms by the combination of nuclease S1 and ＰＮＡ. Sheng Ye et al., 2002, Nucleic acid research No. 2, 235-236]、及び[ＰＮＡ of one base differentiating protection of DNA from nuclease and its use for SNP detection. Makoto K et al., 2002, Journal of American Chemical Society 2003 125, 3758-3762]）。しかし、前記方法では全てＰＮＡプローブを均質の（homogeneous）溶液状態においてハイブリダイズさせるため、標的核酸の大きさに関わらずハイブリダイゼーション反応が生じる。この方法はただハイブリダイゼーション反応の後に核酸加水分解酵素を添加することによって標的核酸とＰＮＡプローブのミスマッチの部分を除去して特異度を増加させたものである。なお、この方法では１回に一つ又は二つのＰＮＡプローブを使用して１回に一つの遺伝子変異を分析したため、長さが長い標的核酸を使用していなかった。
【００１０】
一方、韓国登録特許第４３６５５４号（2004. 6. 8.登録）は既存のＤＮＡチップに核酸加水分解酵素を適用してハイブリダイズされた核酸の検出感度を増加させる方法を開示したことがある。この方法は核酸加水分解酵素を用いて固定化されたＤＮＡプローブのうちハイブリダイズされていない単一本のＤＮＡプローブを除去することであって、具体的には、二重本のＤＮＡの末端は認識できず、単一本のＤＮＡの３′−末端のみを認識し、特に単一本の３′−末端がＯＨ基を有する状態で存在すべきであればＤＮＡを加水分解する特性を有するエキソヌクレアーゼI（Exonuclease I）を用いてＤＮＡの５′−末端が基板に固定され、３′−末端のＯＨ基が露出されたハイブリダイズされていないＤＮＡプローブを除去する方法である。従って、この方法は核酸加水分解酵素を加えて標的核酸を断片化したり選別的に分解することとは全く合い異なるものである。この方法は背景信号による非特異信号を減少させることはできるが、一つの塩基が不一致になって生じる非特異信号を減少させることはできないため、ＳＮＰや突然変異の検出には使い難い。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明者らは前記のような従来技術の問題点を解決するために、核酸加水分解酵素に安定なＰＮＡをプローブで用いて、支持体に固定されたＰＮＡプローブは分解されずにＰＮＡプローブとハイブリダイズされない標的核酸の部分を核酸加水分解酵素を用いて除去することにより、既存のＤＮＡチップより高い信頼度と特異度で一塩基変異多型（ＳＮＰ）が検出できることを確認した。また、多様な長さの標的核酸とＰＮＡプローブとのハイブリダイゼーション反応に核酸加水分解酵素を添加すれば、大きさが大きい標的核酸の場合にもハイブリダイゼーション効率が高くなって複雑な増幅方法及び前処理過程を経なくてもチップに適用できるのみならず、強い特異信号と優れる特異度で希望する部位の変異を選別することができることを確認し、本発明を完成することに至った。
【００１２】
従って、本発明の目的は支持体に固定されたＰＮＡプローブと標的核酸とのハイブリダイゼーション効率又は特異度を増加させるための方法を提供することである。本発明による方法は多様な大きさの標的核酸に対して突然変異、ＳＮＰ、遺伝型、遺伝子発現、スプライス−変異体又は後生学的（epigenetic）分析、又はリシーケンシング（resequencing）分析などに広く適用することができる。
【００１３】
本発明のもう一つの目的は支持体に固定されたＰＮＡプローブと標的核酸とのハイブリダイゼーション効率又は特異度を増加させるための組成物を提供するためである。
【００１４】
本発明のまたもう一つの目的は支持体に固定されたＰＮＡプローブと標的核酸とのハイブリダイゼーション効率又は特異度を増加させるためのキットを提供するためのものである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、（１）支持体に固定されたＰＮＡプローブと標的核酸とのハイブリダイゼーション反応段階と、（２）核酸加水分解酵素（nuclease）を用いて、前記標的核酸の断片化、又は、前記ＰＮＡプローブとミスマッチされる前記標的核酸の単一本の選別的分解の単一本の段階と、を含み、前記（１）（２）の段階を同時に行うことを特徴とする、ＰＮＡプローブと標的核酸とのハイブリダイゼーション効率又は特異度を増加させる方法に関するものである。
【００１６】
また、本発明は、活性成分として核酸加水分解酵素を含む、支持体に固定されたＰＮＡプローブと標的核酸とのハイブリダイゼーション効率又は特異度を増加させるための組成物に関するものである。
【００１７】
また、本発明は
ｉ）支持体に固定された複数のＰＮＡプローブ、及び
ii）核酸加水分解酵素；
とを含む、核酸検出用キットに関するものである。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】ＤＮＡとＰＮＡの基本構造の差異を示す図面である。
【図２】本発明の一例によるＰＮＡオリゴチップ上において核酸加水分解酵素を用いてハイブリダイゼーション特異度を増加させる原理を示す図面である。
【図３】本発明の一例によるＰＮＡオリゴチップ上において核酸加水分解酵素を用いて長さが長い標的核酸のハイブリダイゼーション効率を増加させる原理を示す図面である。
【図４】本発明から使われる各サイズ別標的核酸（E. coli 16S rDNA）の塩基配列、及びプローブ及びプライマーの位置を示す図面である。
【図５】各サイズ別標的核酸（E. coli 16S rDNA）を増幅した後、１.５％アガロースゲル上において電気泳動した結果を示す図面である。
【図６】ＰＮＡオリゴチップ上において蛍光イメージのスポット配置図である。
【図７】標的核酸（E. coli 16S rDNA）を末端標識（end label）、ビオチン−dCTP標識、及びビオチン−dCTP標識及び核酸加水分解酵素の処理時、ＰＮＡオリゴチップのハイブリダイゼーション結果を示す蛍光イメージ及び定量分析データを示す図面（130ｂｐ）である。
【図８】標的核酸（E. coli 16S rDNA）を末端標識（end label）、ビオチン−dCTP標識、及びビオチン−dCTP標識及び核酸加水分解酵素の処理時、ＰＮＡオリゴチップのハイブリダイゼーション結果を示す蛍光イメージ及び定量分析データを示す図面（:280ｂｐ）である。
【図９】標的核酸（E. coli 16S rDNA）を末端標識（end label）、ビオチン−dCTP標識、及びビオチン−dCTP標識及び核酸加水分解酵素の処理時、ＰＮＡオリゴチップのハイブリダイゼーション結果を示す蛍光イメージ及び定量分析データを示す図面（:450ｂｐ）である。
【図１０】標的核酸（E. coli 16S rDNA）を末端標識（end label）、ビオチン−dCTP標識、及びビオチン−dCTP標識及び核酸加水分解酵素の処理時、ＰＮＡオリゴチップのハイブリダイゼーション結果を示す蛍光イメージ及び定量分析データを示す図面（759ｂｐ）である。
【図１１】標的核酸（E. coli 16S rDNA）を末端標識（end label）、ビオチン−dCTP標識、及びビオチン−dCTP標識及び核酸加水分解酵素の処理時、ＰＮＡオリゴチップのハイブリダイゼーション結果を示す蛍光イメージ及び定量分析データを示す図面（1000ｂｐ）である。
【図１２】核酸加水分解酵素の非添加及び添加時、末端標識された標的核酸（E. coli 16S rDNA、130ｂｐ及び450ｂｐ）の検出信号を定量分析した結果を示す図面である。
【図１３】核酸加水分解酵素の非添加及び添加時、ビオチン−dCTP標識された標的核酸（HBVラミブジン耐性遺伝子）の検出信号を定量分析した結果を示す図面である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２０】
本発明は支持体に固定されたＰＮＡプローブの標的核酸とのハイブリダイゼーション反応効率又は特異度を向上させ、塩基配列が一致しない標的核酸の非特異的結合を減少させる技術に関するものである。本発明では、支持体に固定させたＰＮＡプローブを使用する場合、多様な長さの標的核酸に対してＰＮＡプローブとハイブリダイズされない標的核酸の単一本の領域とＰＮＡプローブと完璧に相補的でなくて標的核酸でＰＮＡプローブとミスマッチされた部分を核酸加水分解酵素で加水分解する方法を使用する。しかも本発明では、ハイブリダイゼーション反応と同時に核酸加水分解酵素を加えることにより、標的核酸の長さが短くなってハイブリダイゼーション効率が高くなる。また、標的核酸のうちＰＮＡプローブとハイブリダイズされた領域以外の部分は加水分解されて特異度が増加される。その結果、既存の方法では適用できなかった長さが長い標的核酸に含まれた多数の一塩基変異多型と突然変異を検出することができるようになる。なお、本発明の参考例として、ハイブリダイゼーション効率の増加なく特異度を増加させる効果のみを得るためであれば標的核酸のハイブリダイゼーション反応後に核酸加水分解酵素を加えることもできる。標的核酸のハイブリダイゼーション反応後に核酸加水分解酵素を加える場合には、標的核酸の長さがあまりにも長ければハイブリダイゼーション効率が減少するので、この場合、標的核酸の長さは４００ｂｐ以下、例えば２０乃至４００ｂｐであるのが望ましい。
【００２１】
本発明では、標的核酸と核酸加水分解酵素の反応をＰＮＡプローブが固定されているＰＮＡチップに適用しようと、配列番号１０乃至１５のＰＮＡオリゴマーをガラススライド表面に固定してＰＮＡチップを製作し、核酸加水分解酵素を添加してその特性を調べた。配列番号１０のＰＮＡオリゴマーはＥ．ｃｏｌｉの１６ＳｒＤＮＡの標的核酸と完全に結合できるプローブであり、配列番号１１乃至１３のＰＮＡオリゴマーは序列番号１０と一つの塩基が異なって設計されたプローブである。配列番号１４のＰＮＡオリゴマーはＢ型肝炎ウイルス（Hepatitis B virus、HBV）のラミブジン耐性（lamivudine resistant）遺伝子の標的核酸と完全に結合できるプローブ（１８０ｗ）であり、配列番号１５は配列番号１４と一つの塩基が異なって設計されたプローブ（１８０ｔ）である。配列番号１４と１５は既存のチップで非特異信号が非常に強くて標的核酸を特異的に検出することができなかった配列である。
【００２２】
【表１】
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【００２３】
エポキシ（epoxy）作用基が露出されたガラススライドに前記ＰＮＡオリゴマーを固定してＰＮＡチップを製作した。
【００２４】
本発明では、核酸加水分解酵素の作用を究明するために、下記のように標的核酸を使用した。
【００２５】
１）既存のＤＮＡチップで分析が難しい長さの標的核酸も分析ができるかを調査するために、Ｅ．ｃｏｌｉの１６Ｓ ｒＤＮＡを１３０、２８０、４５０、７５９、１０００ｂｐで五つの長さの標的核酸を増幅させて使用した。
【００２６】
２）点突然変異（mutation）の分別力を調査するために一つの塩基配列が相異なるラミブジン耐性HBV突然変異型と野生型の標的核酸を増幅して使用した。
【００２７】
本発明では、チップのハイブリダイゼーション反応に使用する標的核酸を
１）プライマー（下記表２参照）の５′末端を検出可能な標識物質として標識して増幅させた後、核酸加水分解酵素の添加又は非添加の下においてハイブリダイゼーション反応を行い検出する方法、
２）重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）時、検出可能な標識物質として標識されたｄＮＴＰを添加して増幅反応中に標識されるようにした後、核酸加水分解酵素の非添加の下においてハイブリダイゼーション反応を行い検出する方法、及び
３）ＰＣＲ時に検出可能な標識物質として標識されたｄＮＴＰを添加して増幅反応中に標識されるようにした後、核酸加水分解酵素の添加の下においてハイブリダイゼーション反応を行い検出する方法、
を用いて、支持体に固定されたＰＮＡプローブのハイブリダイゼーションの特異信号と信号分離能を比較した。
【００２８】
前記１）乃至３）の方法は大きく
ａ）標的ＤＮＡを製造する段階
ｂ）プローブＰＮＡと標的ＤＮＡとのハイブリダイゼーション反応を行う段階
ｃ）ハイブリダイゼーション反応後に残余反応物を除去するために洗滌する段階
ｄ）ＰＮＡ／ＤＮＡハイブリッド形成による信号を検出する段階
とを含む。
【００２９】
ハイブリダイゼーションを蛍光検出法によって検出しようとする場合には、段階ａ）からプライマーを末端標識すること（方法１）は核酸加水分解酵素の処理時に加水分解されて蛍光物質の発色如何を確認し難いから望ましくなく（図７乃至１２参照）、ＰＣＲに使用するｄＮＴＰ（即ち、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）、例えばｄＣＴＰに蛍光物質を直接に取り付けたりビオチンのように蛍光物質と反応できる物質を取り付けるのが望ましい（方法３）。使用可能な標識物質には特別な制限はない。例えばビオチン、ローダミン、シアニン（Cyanine）３、シアニン５、ピレン（pyrene）、シアニン２、緑色蛍光蛋白質（GFP; Green Fluorescent Protein）、カルセイン（Calcein）、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）アレクサ（Ａｌｅｘａ）４８８、６−カルボキシ−フルオレセイン（ＦＡＭ）、２′，４′，５′，７′−テトラクロロ−６−カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）、２′，７′−ジクロロ−６−カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）、フルオレセインクロロトリアジニル（Fluorescein Chlorotriazinyl）、フルオレセイン、オレゴングリーン（Oregon Green）、マグネシウムグリーン（Magnesium Green）、カルシウムグリーン（Calcium Green）、６−カルボキシ−４′,５′−ジクロロ−２′,７′−ジメトキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、テトラメチルローダミン（Tetramethylrhodamine）、テトラメチル−ローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、ローダミンファロイジン（Rhodamine Phalloidin）、ピロニンＹ（Pyronin Y）、リサミン（Lissamine）、ROX（X-rhodamine）、カルシウムクリムソン（Calcium Crimson）、テキサスレッド（Texas Red）、ナイルレッド（Nile Red）、及びチアジカルボシアニン（Thiadicarbocyanine）などを使用することができる。
【００３０】
蛍光検出法以外の他の方法（下記段階ｄ）に対する記載参照）によってハイブリダイゼーションを検出しようとする場合には、このような標識過程は省略することができる。本発明で使用できる標的核酸の増幅方法には特別な制限はない。例えば、分岐ＤＮＡ（bDNA; branched DNA）増幅、ハイブリッドキャプチャー（Hybrid capture）、リガーゼ連鎖反応（LCR; ligase chain reaction）、重合酵素連鎖反応（PCR）、核酸配列基礎増幅（NASBA; nucleic acid sequence based amplification）、逆転写−重合酵素連鎖反応（RT-PCR; reverse transcription-PCR）、鎖置換増幅（SDA; stand displacement amplification）、転写−媒介増幅（TMA; transcription mediated amplification）、及びローリングサークル増幅（RCA; rolling circle amplification）などの方法を使用することができる。
【００３１】
段階ｂ）は一般的なハイブリダイゼーション反応であって、ハイブリダイゼーション緩衝液に核酸加水分解酵素を添加すれば長さが長い（例えば、２００〜２０，０００ｂｐ、特に２００〜５，０００ｂｐの長さ）標的核酸の場合、核酸加水分解酵素によって標的核酸が切り離れてプローブに接近が容易になってハイブリダイゼーション効率を増加させる（図３参照）。
【００３２】
段階ｃ）は一般的な洗滌方法と同一な方法で行うところ、段階ｃ）で核酸加水分解酵素を添加する場合、ハイブリダイゼーション反応の特異度を増加させる作用を示す（図２参照）。具体的には、確かに相補的な配列を有する標的核酸はＰＮＡプローブと完全な二重本を形成することに比べて、塩基配列の一つが不一致である標的核酸は相補的な配列部分のみでハイブリダイズされて二重本を形成し、塩基が相補的でない部分では単一本で存在する部分的ハイブリダイゼーションの状態にある。ここで、単一本に特異的なＤＮＡ分解酵素を処理すれば完全にハイブリダイズされた二重本の部分は分解されず、不完全にハイブリダイズされた標的核酸は加水分解されて完全にハイブリダイズされた標的核酸のみを選別することができるようになる。ＤＮＡが固定されたＤＮＡチップはＤＮＡプローブ自体が核酸加水分解酵素によって分解できるからこの方法を使用するには難しい。従って、本発明では核酸加水分解酵素に安定したＰＮＡを用いて、図１から示されたようにＰＮＡの核酸加水分解酵素に最も安定した性質はＰＮＡとＤＮＡとが完全に結合した部位は核酸加水分解酵素が認知できなくて強い結合をそのまま保持する反面、一つの塩基配列がミスマッチされているＰＮＡとＤＮＡとの結合は不安定な結合であるため、核酸加水分解酵素によって標的ＤＮＡが分解するようになる。その結果、ＰＮＡチップにはＰＮＡとＤＮＡとが完全に相補的に結合されている部分のみが残っている。
【００３３】
本発明で使用可能な核酸加水分解酵素には特別な制限があるのではなく、DNase１、エキソヌクレアーゼ（exonuclease）及びエンドヌクレアーゼ（endo- nuclease）を単独又は混合して使用することができる。エキソヌクレアーゼやエンドヌクレアーゼの具体的な例としてはエキソヌクレアーゼ１（exonuclease 1）、S1ヌクレアーゼ（S1 nuclease）、マングビーンヌクレアーゼ（Mung bean nuclease）、リボヌクレアーゼA（ribonuclease A）、リボヌクレアーゼT1（ribonuclease T1）又はヌクレアーゼP1（nuclease P1）、などが挙げられる。核酸の特定塩基配列を切る制限酵素もこのような目的で使用することができる。特に、S1ヌクレアーゼは多様に用いられている核酸加水分解酵素であって、単一本の核酸と切れ目（nick）が形成された二重本の核酸を分解し、ループ（loop）やギャップ（gap）が形成されたヘテロ２本鎖核酸（heteroduplex DNA）も分解することができる（文献[Purifacation and Properties of S1 Nuclease from Aspergillus, Vogt VM, 1980, Methods in Enzymology, 65, 248-255]）。このような特性を用いて一つの塩基がミスマッチされて切れ目を形成している標的核酸を除去して、一つの塩基差異の変異も正確に区別することができるようになる。
【００３４】
段階ｄ）は一般的なハイブリダイゼーション検出方法を用いて行われるところ、蛍光検出法、電気的方法、電気化学的方法、質量変化を用いた検出法、電荷量変化を用いた検出法、又は光学的性質の差異を用いた検出法を用いることができる（文献[DNA biosensors based on Peptide Nucleic Acid (ＰＮＡ) recognition layers, Wang J, 1998,Biosensors and Bioelectronics, 13, 757-762]、[Labelfree fully electronic nucleic acid detection system based on a field-effect transistor device, Uslu F et al., 2004, Biosensors and Bioelectronics, 19, 17231731]、[Direct ultrasensitive electrical detection of DNA and DNA sequence variations using nanowire nanosensors, Hahm J and Lieber CM, 2004, Nano Letters, 4, 51-54]、[Impedance-based detection of DNA sequences using a silicon transducer with PNA as the probe layer, A. Macanovic et al. 2004, Nucleic Acids Research, 32, e20]、[S. Manalis and T. Burg,US Patent 7,282,329 "Suspended microchannel detectors"]、及び[P. Warthoe and S. Iben, US Patent Application Publication 2004/0072208 A1 "Surface acoustic wave sensors and method for detecting target analytes"]）。
【００３５】
本発明による方法（例：前記方法３）を用いると、区別が容易でなかった一つの塩基差異も正確に区別することができるようになって、診断用チップで偽陰性及び偽陽性の結果を減らすことができて信頼度が大きく高められる。また、既存のオリゴチップで使用に限られていたサイズが大きい標的核酸を用いることができるようになって、多様なサイズの標的核酸を限られずに使用することができる。なお、標的核酸を様々な検出標識で標識して使用することができて、核酸のハイブリダイゼーションによって単一本と二重本とを区別する全ての方法に適用できる。
【００３６】
活性成分として核酸加水分解酵素を含む本発明の組成物は支持体に固定されたＰＮＡプローブと標的核酸とのハイブリダイゼーション効率又は特異度を増加させるために使用することができる。
【００３７】
支持体に固定された複数のＰＮＡプローブと核酸加水分解酵素を含む本発明の核酸検出用キットは標的核酸に含まれた複数のＳＮＰと突然変異を検出することに使用することができる。本発明のキットは３つ以上のＰＮＡプローブが含まれる。全体ゲノムのＳＮＰと突然変異を検出するためのキットには数万又は数十万個のＰＮＡプローブが含まれる。
【００３８】
実施例
【００３９】
以下、本発明を実施例によってより具体的に説明するが、これは本発明がよくわかるようにするためであって、本発明の範囲はいずれにも限られるものではない。
【００４０】
製造例１：標的核酸製造のためのプライマーの合成
【００４１】
本発明による標的核酸の製造のために、先ずＰＣＲに使用するためのプライマーを合成した。プライマー配列は表２に示したように５つのサイズが異なるE. coliの16S rDNAの遺伝子部位から選んだ。また、表３から示されたように、Ｂ型肝炎ウイルスのラミブジン耐性遺伝子に反応できる部位から選んだ。ＰＣＲに使用するためのプライマーはビオチンが付着されないプライマーと５′末端にビオチンが付着されているプライマーの２種類をバイオニア（Bioneer、韓国）に依頼して合成した。
【００４２】
【表２】
2010520747.tif 000002
【００４３】
【表３】
2010520747.tif 000003
【００４４】
製造例２：ビオチン化プライマーを用いたPCRによる標的核酸の製造
【００４５】
鋳型DNAとしては韓国遺伝子銀行（Korean Collection for Type Culture）から分譲されたE. coli KCTC 1112から抽出したＤＮＡを使用した。次のような条件でＰＣＲを行ってＤＮＡを増幅させた。
【００４６】
鋳型ＤＮＡ溶液（５０ｎｇ／μｌ）２μｌ、表２に示された５つのビオチン化センスプライマー（２０ｐｍｏｌ／μｌ）１μｌ、及びビオチン化アンチセンスプライマー（２０ｐｍｏｌ／μｌ）１μｌ、ｄＮＴＰ（２５ｍＭ）３μｌ、１０×Ｔａｑ緩衝液（ＭｇＣｌ２含）５μｌ、０．２％ＢＳＡ（bovine serum albumin）５μｌ、Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ、Ｓｏｌｇｅｎｔ、韓国）０．２μｌ、蒸留水３６．８μｌの組成で９４℃で５分間処理した後、９４℃で１分、５５℃で１分、７２℃で１分を３０回繰り返してから７２℃で５分間さらに反応させた。
【００４７】
反応が終わったＰＣＲ産物（１３０ｂｐ、２８０ｂｐ、４５０ｂｐ、７５９ｂｐ、１０００ｂｐ）５μｌにゲルローディング緩衝液（サンバイオ、韓国）１μｌを入れ、１．５％のアガロースゲル上で電気泳動した後、１μｇ／ｍｌエチジウムブロマイド（ＥｔＢｒ）で染色してからＵＶトランスイルミネート（UV-transilluminator）で産物を確認した。各サイズ別の標的核酸の塩基配列及びプローブとプライマーの位置を図４に示し、電気泳動した結果を図５に示した。
【００４８】
製造例３：ビオチン−dCTPを用いたPCRによる標的核酸の製造
【００４９】
鋳型ＤＮＡとしては韓国遺伝子銀行から分譲されたＥ．ｃｏｌｉ ＫＣＴＣ １１１２から抽出したＤＮＡを使用した。次のような条件でＰＣＲを行ってＤＮＡを増幅させた。
【００５０】
鋳型ＤＮＡ溶液（５０ｎｇ／μｌ）２μｌ、表２に示された５つのセンスプライマー（２０ｐｍｏｌ／μｌ）１μｌ、及びアンチセンスプライマー（２０ｐｍｏｌ／μｌ）１μｌ、ｄＮＴＰ（２．５ｍＭ）２．４５μｌ、１１−ビオチン−ｄＣＴＰ（１ｍＭ）４μｌ、１０×Ｔａｑ緩衝液（ＭｇＣｌ２含）５μｌ、０．２％ＢＳＡ５μｌ、Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ、Ｓｏｌｇｅｎｔ）０．２μｌ、蒸留水３２．８μｌの組成で９４℃で５分間処理した後、９４℃で１分、５５℃で１分、７２℃で１分を３０回繰り返してから７２℃で５分間さらに反応させた。
【００５１】
反応が終わったＰＣＲ産物（１３０ｂｐ、２８０ｂｐ、４５０ｂｐ、７５９ｂｐ、１０００ｂｐ）５μｌにゲルローディング緩衝液（サンバイオ、韓国）１μｌを入れ、１．５％のアガロースゲル上で電気泳動した後、１μｇ／ｍｌエチジウムブロマイド（ＥｔＢｒ）で染色してからＵＶトランスイルミネート（UV-transilluminator）で産物を確認した。各サイズ別の標的核酸の塩基配列及びプローブとプライマーの位置を図４に示し、電気泳動した結果を図５に示した。
【００５２】
製造例４：ＰＮＡチップの製作
【００５３】
前記表１から示された配列番号１０乃至１３の精製されたＰＮＡオリゴマーをPANArrayTMスポット緩衝液（パナジン、韓国）に５０mMで希釈してエポキシ基がコーティングされたガラス板にピン方式でスポットし、７５％湿度が保持される常温で４時間定置した。以後、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に入れて１５分間超音波洗浄し、０．１Ｍの無水コハク酸を添加したＤＭＦに入れて４０℃で２時間反応させ、残余アミン基を除去した。ＤＭＦで１５分間洗滌し、３次蒸留水で１５分間超音波洗滌した。以後、０.１Mエタノールアミンが入っている１００mMトリス緩衝液（Tris-HCl）を入れて４０℃で２時間反応して固体表面の残余エポキシ基を不活性化した。３次蒸留水を用いて５分間洗浄した後に乾燥した。
【００５４】
比較例１：ビオチン標識プライマーを用いて増幅された標的核酸のハイブリダイゼーション反応
【００５５】
末端にビオチンが結合されたＰＣＲ産物をPANArrayTMハイブリダイゼーション緩衝液（パナジン、韓国）１００μｌに５μｌ添加して使用し、この際蛍光反応を起すためにストレプトアビジン−Ｃｙ５を添加した。ガラススライドに１００μｌのハイブリダイゼーション緩衝液を付与し、４０℃で２時間反応させた。反応後にＰＡＮＡｒｒａｙＴＭ洗滌緩衝液（パナジン、韓国）で常温で５分間２回洗滌し乾燥した（核酸加水分解酵素非添加群）。核酸加水分解酵素の添加群の場合、乾燥されたスライドに反応緩衝液１００μｌ中、S1ヌクレアーゼ０.５μｌ（１Ｕ／μｌ）（Amersham Biosciences、米国）を付与し、３７℃で１時間反応させた後、前記洗滌及び乾燥過程を繰り返した。蛍光スキャナー（Genepix 4000B、Exon、米国）を用いてスライドのイメージを分析した。その結果を図７乃至図１２に示した。
【００５６】
図７乃至図１１に示したように、１３０ｂｐの標的核酸では良好な特異信号サイズ及び特異信号と非特異信号の分離能（perfect match/mismatch ratio、 P／M比）を示したが、２８０ｂｐ、４５０ｂｐ、７５９ｂｐ、１０００ｂｐで標的核酸のサイズが大きくなることにつれて特異信号が減少することが見られた。特に、１０００ｂｐの標的核酸では非常に低い特異信号が発生されて特異信号と非特異信号の区別が難しかった（P／M比が２未満）。
【００５７】
また、図１２に示したように、核酸加水分解酵素を添加した場合、標的核酸の残余部分が除去されるため、信号が全く発生しなかった。前記結果からチップで核酸加水分解酵素が標的核酸を加水分解することを確認することができた。
【００５８】
比較例２：ビオチン−ｄＣＴＰを用いて増幅された標的核酸のハイブリダイゼーション反応
【００５９】
ビオチン−ｄＣＴＰが結合されたPCR産物をPANArrayTMハイブリダイゼーション緩衝液（パナジン、韓国）１００μｌに５μｌ添加して使用した。スライドに１００μｌのハイブリダイゼーション緩衝液を付与し、４０℃で２時間反応させた。反応後にPANArrayTM洗滌緩衝液（パナジン、韓国）で常温で５分間２回洗滌し乾燥した。乾燥されたスライドに蛍光反応を起すためにハイブリダイゼーション緩衝液１００μｌとストレプトアビジン−Ｃｙ５を混合して使用した。スライドに１００μｌのハイブリダイゼーション混合液を満たして、４０℃で３０分間反応させた。反応後にPANArrayTM洗滌緩衝液（パナジン、韓国）で常温で５分間２回洗滌し乾燥した。蛍光スキャナー（Genepix 4000B、Exon、米国）を用いてガラススライドのイメージを分析した。その結果を図７乃至図１１に示した。
【００６０】
図７乃至図１１に示したように、わりとサイズが小さい１３０ｂｐ乃至４５０ｂｐの標的核酸の場合は核酸加水分解を添加しない場合にも比較的高い特異信号を得ることができるが、特異信号と非特異信号の分離能は多少劣り、サイズが大きい７５９ｂｐ乃至１０００ｂｐの標的核酸の場合は特異信号が減少し、特異信号と非特異信号との分離能が著しく劣ることが確認できた（１０００ｂｐ標的核酸の場合、Ｐ／Ｍ比が２．３乃至３．５）。
【００６１】
実施例１：ビオチン−ｄＣＴＰを用いて増幅された標的核酸のハイブリダイゼーション反応及び核酸加水分解酵素の処理
【００６２】
ビオチン−ｄＣＴＰが結合されたＰＣＲ産物をPANArrayTMハイブリダイゼーション緩衝液（パナジン、韓国）１００μｌに５μｌ添加して使用した。スライドに１００μｌのハイブリダイゼーション緩衝液を付与し、４０℃で２時間反応させた。反応後にPANArrayTM洗滌緩衝液（パナジン、韓国）で常温で５分間２回洗滌し乾燥した。乾燥されたスライドに反応緩衝液１００μｌ中、Ｓ１ヌクレアーゼ（Amersham Biosciences、米国）０．５μｌ（１Ｕ／μｌ）を添加して付与し、３７℃で１時間反応させた。反応後、前記洗滌及び乾燥過程を繰り返した。乾燥されたスライドに蛍光反応を起すためにハイブリダイゼーション緩衝液１００μｌとストレプトアビジン−Ｃｙ５を混合して使用した。スライドに１００μｌのハイブリダイゼーション混合液を満たして、４０℃で３０分間反応させた。反応後にPANArrayTM洗滌緩衝液（パナジン、韓国）で常温で５分間２回洗滌し乾燥した。蛍光スキャナー（Genepix 4000B、Exon、米国）を用いてガラススライドのイメージを分析した。その結果を図７乃至図１１に示した。
【００６３】
図７乃至図１１に示したように、核酸加水分解酵素で処理した場合、標的核酸のサイズに大きく影響を及ぼさなく、７５９ｂｐまでは１３０ｂｐと比べて全く差異がないくらい信号強度５００００乃至６００００の高い特異信号を示し、特異信号と非特異信号の分離能を示すP／M比が８.３乃至１１で末端標識された標的核酸を用いた比較例１に比べて約１０倍高い結果を示した。また、サイズが大きい７５９ｂｐ乃至１０００ｂｐの標的核酸の場合は核酸加水分解酵素を添加した本発明の方法が核酸加水分解酵素を添加しない方法より特異信号がさらに大きく、特異信号と非特異信号との分離能も３倍以上大きいことを確認することができた。
【００６４】
比較例３及び実施例２：Ｂ型肝炎ウイルスＰＮＡチップにおけるハイブリダイゼーション反応
【００６５】
本実施例では、既存の方法では特異信号と非特異信号とを区分することが難しかった１８０ｔプローブに対する本発明の効果を調べようとした。
【００６６】
製造例１から製造された表３のプライマー（Ｈｂｖ−Ｆ及びＨｂｖ−Ｒ）と鋳型ＤＮＡとしてジンイン（Genine、韓国）から入手したＨＢＶ ＤＮＡを使用して、製造例３と実質的に同一な方法で標的ＤＮＡを増幅させ、表１に示したＨＢＶプローブ（配列番号１４及び１５）を用いて製造例４と実質的に同一な方法でＰＮＡチップを製作した後、比較例２及び実施例１と実質的に同一な反応でハイブリダイゼーション反応、又はハイブリダイゼーション反応及び核酸加水分解酵素の処理を行い、その結果を図１３に示した。
【００６７】
核酸加水分解酵素を添加しない場合には特異信号のサイズと非特異信号のサイズが殆ど同じでＰＮＡチップでＨＢＶ野生型と突然変異型を区分することができなかったが、核酸加水分解酵素を処理した場合は非特異信号が大きく減少してＨＢＶ野生型と突然変異型を区分することができた（Ｐ／Ｍ比＝２．５）。
【産業上の利用可能性】
【００６８】
本発明によると、支持体に固定したＰＮＡプローブを使用する場合、標的核酸のハイブリダイゼーション反応と同時に核酸加水分解酵素を処理してハイブリダイズされていない標的核酸を選別的に除去することにより、ハイブリダイゼーション反応の敏感度及び特異度を増加させて一つの塩基ミスマッチ（single mismatch）を容易に区別することができる。また、標的核酸のハイブリダイゼーション反応時に核酸加水分解酵素を処理することによって、サイズが大きい標的核酸のハイブリダイゼーション反応の効率を増加させて複雑な増幅方法及び前処理過程を経なくても長さが長い標的核酸の分析が可能であり、長い標的核酸に含まれた多数個のＳＮＰや多数の突然変異を一度の標的核酸増幅で検出することができる。従って、多疾病に関与する遺伝子や突然変異を短時間内に優秀な敏感度及び特異度で検出することができ、区別が難しかったＳＮＰを優秀な敏感度及び特異度で検出して多様な遺伝子を幅広く診断するに有用に使用することができる。
【配列表のプレテキスト】
【００６９】
配列番号１はE. coliの16S rDNAの標的核酸を増幅するためのEC1、EC2、及びEC3センスプライマーの塩基配列である。
配列番号２はE. coliの16S rDNAの標的核酸を増幅するためのEC1アンチセンスプライマーの塩基配列である。
配列番号３はE. coliの16S rDNAの標的核酸を増幅するためのEC2アンチセンスプライマーの塩基配列である。
配列番号４はE. coliの16S rDNAの標的核酸を増幅するためのEC3及びEC4アンチセンスプライマーの塩基配列である。
配列番号５はE. coliの16S rDNAの標的核酸を増幅するためのEC4センスプライマーの塩基配列である。
配列番号６はE. coliの16S rDNAの標的核酸を増幅するためのEC5センスプライマーの塩基配列である。
配列番号７はE. coliの16S rDNAの標的核酸を増幅するためのEC5アンチセンスプライマーの塩基配列である。
配列番号８はHBVのラミブジン耐性遺伝子の標的核酸を増幅するためのHbv-Fプライマーの塩基配列である。
配列番号９はHBVのラミブジン耐性遺伝子の標的核酸を増幅するためのHbv-Rプライマーの塩基配列である。
配列番号１０はE. coliの16S rDNAの標的核酸と完全に結合することができるＰＮＡプローブの塩基配列である。
配列番号１１乃至１３は配列番号１０と一つの塩基が異なって設計されたＰＮＡプローブの塩基配列である。
配列番号１４はHBVのラミブジン耐性遺伝子の標的核酸と完全に結合することができるＰＮＡプローブ（180w）の塩基配列である。
配列番号１５は配列番号１４と一つの塩基が異なって設計されたＰＮＡプローブ（180t）の塩基配列である。 
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】図面
【訂正対象項目名】図２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図２】
2010520747.tif 000004
【誤訳訂正４】
【訂正対象書類名】図面
【訂正対象項目名】図３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図３】
2010520747.tif 000005
【誤訳訂正５】
【訂正対象書類名】図面
【訂正対象項目名】図６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図６】
2010520747.tif 000006