(57)【要約】　　　（修正有）【課題】新規の細胞外マトリックスタンパク質、及びその遺伝子、さらにはその抗体等を提供する。【解決手段】本発明にかかるタンパク質及びその遺伝子は、マウス由来の新規な細胞外マトリックス因子であり、ＡＤＡＭ−ＴＳＬファミリータンパク質であって、マウス由来の特定なアミノ酸配列からなるタンパク質、及び／又は、マウス由来の特定なアミノ酸配列において、１又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなる細胞外マトリックスタンパク質と、これをコードする遺伝子である。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなる細胞外マトリックスタンパク質。
【請求項２】
マウス由来である請求項１記載の遺伝子。
【請求項３】
配列番号１に示される塩基配列のうち、７９〜２０５２番目の塩基配列をオープンリーディングフレームとして有する請求項１又は２記載の遺伝子。
【請求項４】
配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
【請求項５】
配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなる細胞外マトリックスタンパク質。
【請求項６】
細胞接着活性を有する請求項４又は５記載のタンパク質。
【請求項７】
分泌タンパク質である請求項４〜６のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項８】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の遺伝子を含む組換え発現ベクター。
【請求項９】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の遺伝子が導入された形質転換体。
【請求項１０】
請求項４〜７のいずれか１項に記載のタンパク質に対する抗体。
【請求項１１】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の遺伝子、又は、請求項４〜７のいずれか１項に記載のタンパク質を含んでなる細胞接着用薬剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規細胞外マトリックスタンパク質、及びその遺伝子に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
細胞外マトリックスは、組織の細胞を取り巻く細胞支持組織であり、コラーゲン、エラスチン、フィブリリンなどの繊維性タンパク質、フィブロネクチン、ラミニンなどの糖蛋白質、プロテオグリカンなどの複合糖質及びヒアルロン酸などの糖質からなる。細胞外マトリックスは、細胞表面レセプターと結合することにより細胞接着、移動、増殖、分化、形態、代謝など細胞の活動に重大な影響を与えることが知られている。したがって、生体の受精、発生、成熟、加齢、炎症、創傷治癒、免疫、腫瘍など多くの生体現象と関連することが知られている。
【０００３】
より詳細には、細胞外マトリックス因子についてこれまで以下の知見が得られており、その細胞接着活性など、生命活動において細胞外マトリックス因子が果たす役割の重要性が明らかになっている。
【０００４】
▲１▼　生体を構成する細胞は血球細胞などの浮遊系細胞を除き、常に細胞外環境に接着して存在する。その接着は、隣り合った細胞同士の接着である細胞間接着と細胞の基質との接着である細胞―基質接着の２つに分けられる。この基質の実態が細胞外マトリックスである。細胞と基質との接着は細胞の生命維持に必須であり、これら細胞は基質、すなわち細胞外マトリックスとの接着なしには生きられない。すなわち、アポトーシスを引き起こして死ぬことが知られている。この細胞外マトリックスの生存維持作用は細胞外マトリックス因子とインテグリンをはじめとする細胞表面レセプターとの結合によって細胞内のＡｋｔやＭＡＰキナーゼなどのキナーゼが活性化されることでアポトーシスが回避されている。
【０００５】
▲２▼　このように、細胞外マトリックス因子に対する細胞の接着によって誘導される現象はきわめて動的なものであり、細胞の重要な機能を制御している。たとえば、細胞の増殖も細胞外マトリックスによって制御されている。すなわち、細胞は増殖因子が存在しても、細胞外マトリックスへの接着なしには増殖できない、いわゆる基質依存性の細胞増殖が古くから知られている。その実態は、細胞増殖因子からのシグナルとともに、細胞外マトリックスへの接着による細胞内シグナル、たとえばＭＡＰキナーゼの活性化が必須である。
【０００６】
▲３▼　細胞外マトリックスへの細胞接着による細胞内シグナル伝達は異なる細胞外マトリックスによって異なっている。たとえば、間質系細胞外マトリックスの主要構成因子であるフィブロネクチンへの接着はＭＡＰキナーゼの活性化とｓｍａｌｌ　Ｇｐｒｏｔｅｉｎ　Ｒｈｏの活性化を誘導する。一方、基底膜細胞外マトリックスの主要構成因子であるラミニンへの接着はＭＡＰキナーゼの活性化とｓｍａｌｌ　Ｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｒｈｏに代わって、Ａｋｔやｓｍａｌｌ　Ｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｒａｃを活性化する。これら異なる細胞外マトリックス因子への接着によって細胞の性質は強く影響され、一般的にはフィブロネクチンは細胞を増殖型に、ラミニンは分化型に誘導する。すなわち、異なる細胞外マトリックス因子は異なる細胞内シグナルを伝達し、これにより細胞の生存、増殖、分化を制御する。
【０００７】
▲４▼　細胞接着因子である多くの細胞外マトリックス因子は、細胞の移動の主役である。細胞外マトリックス因子による細胞接着は単に細胞をその基質にとどめておくだけの作用ではない。細胞外マトリックスは細胞接着と同時に細胞の伸展を誘導する。この伸展は、細胞内のアクチンを含む細胞骨格系の再編成を必須とし、これらはｓｍａｌｌ　Ｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｒｈｏ，　Ｒａｃ　Ｃｄｃ４２の制御下にある。細胞外マトリックスはこれらｓｍａｌｌ　Ｇ　ｐｒｏｔｅｉｎの活性化レベルをドラマティックに制御することで、細胞骨格系の構築を誘導し、細胞を伸展させる。
【０００８】
▲５▼　細胞の移動は細胞外マトリックスへの接着を足がかりとして、細胞外マトリックスへの接着シグナルに応答した細胞骨格系の再構成の連続によって移動することから、細胞外マトリックスは細胞の移動に必須である。
【０００９】
▲６▼　細胞の移動は胚の初期発生から生体のボディープランの構築に必須であり、もちろんすべての組織は細胞の移動を伴って構築される。創傷や疾病の治癒もその周囲の細胞の移動、浸潤によって行われる。
【００１０】
▲７▼　浮遊系の細胞でも、白血球を含む血球、免疫系細胞の血管壁の通過や組織への浸潤、組織間の移動も細胞外マトリックス因子への接着を必要とする。がん細胞の転移もその実態は細胞の原発層からの移動である。
【００１１】
▲８▼　これらの正常、および疾患、疾病における細胞移動は細胞外マトリックスへの接着と接着シグナルに応答した細胞内シグナルによって制御されている。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
このように、細胞外マトリックス因子は細胞、組織の働きを細胞の外側から調節する重要な役割を果たしている。したがって、これら細胞外マトリックス因子の遺伝子、タンパク質やこれらタンパク質に対する抗体は、受精、胚発生、形態形成等を研究する上で、さらに、細胞外マトリックスの形成異常や代謝異常によって生じる疾患、疾病を研究する上で、非常に有用である。また、これらの遺伝子や抗体は、細胞外マトリックスの関与する病気の診断や、その治療効果の検査などにも有用である。そのため、より多くの新規細胞外マトリックス因子を見出し、これを生産し利用する方法の開発が強く望まれていた。
【００１３】
本発明は、上記の課題に鑑みなされたものであり、その目的は、新規の細胞外マトリックスタンパク質、及びその遺伝子、さらにはその抗体等を提供することにある。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記の課題に鑑み鋭意検討した結果、マウス由来のｃＤＮＡライブラリーの中から分泌シグナル配列と予想される配列を含むｃＤＮＡを選別し、これを用いてタンパク質を発現させ、その機能を解析したところ、このタンパク質が分泌タンパク質であり、新規の細胞外マトリックスタンパク質であること等を見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１５】
即ち、本発明に係るタンパク質は、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質であり、本発明に係る遺伝子は、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子である。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなる細胞外マトリックスタンパク質。
【００１６】
上記（ａ）のタンパク質は、本発明者が今回新たに細胞外マトリックスタンパク質として単離・同定したものであり、Ｎ末端側に予想分泌シグナル配列を有する。また、後述の実施例に示すように、機能解析の結果、このタンパク質は細胞外分泌される分泌タンパク質であること、細胞外マトリックスタンパク質であること等が実験的に確認されている。
【００１７】
本発明に係る組換え発現ベクターは、上記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子を含むものである。例えば、配列番号１に示される遺伝子が挿入された組換え発現ベクターが挙げられる。組換え発現ベクターの作製には、プラスミド、ファージ、又はコスミドなどを用いることができるが特に限定されるものではない。
【００１８】
本発明に係る形質転換体は、上記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子が導入された形質転換体である。ここで、「遺伝子が導入された」とは、公知の遺伝子工学的手法（遺伝子操作技術）により、対象細胞（宿主細胞）内に発現可能に導入されることを意味する。また、上記「形質転換体」とは、細胞・組織・器官のみならず、動物個体（マウスやラット、ウサギ、ブタ、サルなどの形質転換動物）を含む意味である。特に、マウスやラットは、実験動物・病態モデル動物として広く用いられており、ノックアウトマウス等は、細胞外マトリックス因子の機能解析、同因子が関係する病気の病態解析やその病気の診断法、診断薬、治療法、治療薬の開発などに有用である。
【００１９】
本発明に係る抗体は、上記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質、又はその部分ペプチドを抗原として、公知の方法によりポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体として得られる抗体である。
【００２０】
【発明の実施の形態】
本発明の実施の一形態について図１および図２に基づいて説明すれば、以下の通りである。尚、本発明はこれに限定されるものではない。
【００２１】
本発明は、新規な細胞外マトリックス因子であるタンパク質とこれをコードする遺伝子とを見出すとともに、これら遺伝子及びタンパク質の機能を解析し、これらの利用方法を提案するものである。そこで以下では、本発明の遺伝子、タンパク質の配列、構造について説明し、次いでこれら遺伝子、タンパク質の機能、利用方法等について説明することとする。
【００２２】
（１）本発明に係る遺伝子及びタンパク質の配列、構造
本発明者は、マウスａｄｕｌｔ　ｃｏｒｐｏｒａ　ｑｕａｄｒａｇｅｍｉｎａ由来ｃＤＮＡライブラリーの中から分泌シグナル配列と予想される配列を含むｃＤＮＡをスクリーニングし、この全長ｃＤＮＡ配列を決定し、さらにこのｃＤＮＡがコードするタンパク質のアミノ酸配列を決定した。
【００２３】
本発明において見出された新規な細胞外マトリックス因子は、細胞外マトリックス因子のひとつとして知られるＡＤＡＭ−ＴＳＬファミリータンパク質（後記（３）参照）と相同性を有している。それゆえ、以下の説明では、配列を決定した新規ｃＤＮＡを「ＡＤＡＭ−ＴＳＬＲ１（ＡＤＡＭ−ＴＳＬ−ｒｅｌａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子」と称し、当該遺伝子にコードされるタンパク質を「ＡＤＡＭ−ＴＳＬＲ１（ＡＤＡＭ−ＴＳＬ−ｒｅｌａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ）タンパク質」と称して説明する。
【００２４】
本発明に係る遺伝子は、前述のように、（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子か、（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなる細胞外マトリックスタンパク質をコードする遺伝子であればよいが、本実施の形態では、▲１▼配列番号１に示される塩基配列のうち、７９〜２０５２番目の塩基配列をオープンリーディングフレームとして有するｃＤＮＡ（ＡＤＡＭ−ＴＳＬＲ１遺伝子）、▲２▼このｃＤＮＡの塩基配列に対応する塩基配列を有するｍＲＮＡが例示される。これら遺伝子はマウス（Ｍｕｓ　ｍｕｓｃｕｌｕｓ）由来である。
【００２５】
なお、本発明の「遺伝子」には、ＲＮＡ及びＤＮＡが含まれるものとする。ＲＮＡにはｍＲＮＡが含まれ、ＤＮＡには、例えばクローニングや化学合成技術又はそれらの組み合わせで得られるようなｃＤＮＡやゲノムＤＮＡなどが含まれる。また、ＤＮＡは二本鎖でも一本鎖でもよく、一本鎖ＤＮＡは、センス鎖となるコードＤＮＡでもよく、アンチセンス鎖となるアンチコード鎖でもよい（アンチセンス鎖は、プローブとして又はアンチセンス薬物として利用できる）。さらに、本発明の「遺伝子」は、上記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする配列以外に、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列やベクター配列（発現ベクター配列を含む）などの配列を含むものであってもよい。
【００２６】
一方、本発明に係るタンパク質は、上記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質であればよいが、本実施の形態では、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有しており、６５８のアミノ酸残基からなるＡＤＡＭ−ＴＳＬＲ１タンパク質が例示される。
【００２７】
上記ＡＤＡＭ−ＴＳＬＲ１タンパク質は、図１（ａ）・（ｂ）に示すように、アミノ末端（Ｎ末端）側から順に分泌シグナル配列、ＥＩＬＤＶ配列、６個のトロンボスポンディンタイプ１リピート（ＴＳＰ−１）ドメインを有しており、カルボキシル末端（Ｃ末端）側にはシステインリッチ領域を有している。上記ＥＩＬＤＶ配列は、インテグリンα４β１認識配列である（後述の実施例参照）。また、一次構造中には、糖鎖結合部位（ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　Ｎ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ　ｓｉｔｅ）が２カ所認められる。
【００２８】
さらに、上記ＡＤＡＭ−ＴＳＬＲ１タンパク質のアミノ酸組成は表１に示すようになっている。
【００２９】
【表１】
2004008016.tif 000002
【００３０】
また、相同性検索の結果、上記ＡＤＡＭ−ＴＳＬＲ１遺伝子（ｃＤＮＡ）の３’側部分と、ヒトＥＳＴクローンであるＦＬＪ１３７１０遺伝子とは約９３％の相同性を示している。そのため、ＦＬＪ１３７１０遺伝子にコードされるタンパク質は、Ｎ末端を欠いたＡＤＡＭ−ＴＳＬＲ１タンパク質のヒトホモログである可能性が高い。
【００３１】
さらに、ＡＤＡＭ−ＴＳＬＲ１タンパク質のドメイン構造を、以前に単離されたＡＤＡＭ−ＴＳＬファミリータンパク質と比較した結果、図２に示すように、他のＡＤＡＭ−ＴＳＬファミリータンパク質と構造的な類似が認められるものの、上記ＡＤＡＭ−ＴＳＬＲ１タンパク質は、すべてのＡＤＡＭ−ＴＳＬファミリータンパク質に共通して存在するアミノ末端側のトロンボスポンディンタイプ１リピートを有していなかった。
【００３２】
前述のように、本発明に係るタンパク質には、前記（ｂ）のタンパク質、即ち、配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなる細胞外マトリックスタンパク質も含まれるが、ここで、「１又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異タンパク質作製法により置換、欠失、挿入、及び／又は付加できる程度の数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されることを意味する。このように、上記（ｂ）のタンパク質は、換言すれば、上記（ａ）のタンパク質の変異タンパク質であり、ここにいう「変異」は、主として公知の変異タンパク質作製法により人為的に導入された変異を意味するが、天然に存在する同様の変異タンパク質を単離精製したものであってもよい。
【００３３】
上記変異タンパク質には、野生型の活性（後述する細胞接着活性等）に異常を持つ変異タンパク質（機能欠失型の変異タンパク質と称する）が含まれていても良い。このような機能欠失型の変異タンパク質は、例えば、野生型タンパク質と構造を比較することにより、その構造の中で活性に必須な領域が明らかになるという、タンパク質の機能解析において有用である。また、本発明に係る遺伝子には、上記機能欠失型の変異タンパク質をコードする遺伝子が含まれても良い。このような遺伝子は、例えば、新たな形質転換体の作出に有用である。
【００３４】
本発明に係るタンパク質は、タンパク質の精製や検出等を容易に行うために、公知のＨＡやＦｌａｇ等の付加配列を末端に含ませてもよいし、融合タンパク質であってもよい。また、Ｎ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎなどの各種修飾を受けていてもよいし、二量体以上の多量体を形成するものであってもよい。例えば、後述の実施例に示すように、ＡＤＡＭ−ＴＳＬＲ１タンパク質は、ＥＧＦＰと融合したＥＧＦＰ融合タンパク質として、ヒト２９３Ｔ細胞に発現させると、電気泳動にて、アミノ酸配列から予想される以上のサイズを示すバンドが検出されている。それゆえ、ＡＤＡＭ−ＴＳＬＲ１タンパク質は、各種修飾を受けている可能性が高い。
【００３５】
（２）新規細胞外マトリックスタンパク質の機能
図１（ａ）・（ｂ）に示すように、上記ＡＤＡＭ−ＴＳＬＲ１タンパク質は、分泌シグナル配列を有しており、後述の実施例にも示すように、細胞外分泌型のタンパク質（分泌タンパク質）であることが実験により確認されている。また、ＡＤＡＭ−ＴＳＬＲ１タンパク質は、細胞接着活性および細胞伸展活性を有している（後述の実施例参照）。
【００３６】
このように、ＡＤＡＭ−ＴＳＬＲ１タンパク質は、細胞外に分泌されること、細胞接着活性及び細胞伸展活性を有していることから、細胞外の環境に細胞を接着させる作用を有しており、また、細胞の移動は細胞外タンパク質への接着を必須とすることから、細胞の移動に関わっていると予測される。つまり、ＡＤＡＭ−ＴＳＬＲ１タンパク質は、細胞接着因子として機能すると考えられる。
【００３７】
さらに、上記ＡＤＡＭ−ＴＳＬＲ１タンパク質は、ｉｎ　ｖｉｖｏで他の細胞外マトリックス因子である繊維性タンパク質フィブリリンと共局在すること、および、マウス胎児やマウス成体の種々の組織で発現することが示された（後述の実施例参照）。
【００３８】
（３）本発明に係るタンパク質、及びその遺伝子の利用方法
上記のように、本発明に係るタンパク質は、本発明者によって初めて明らかにされた新規な細胞外マトリックスタンパク質であり、細胞接着因子及びフィブリリンと共局在するＡＤＡＭ−ＴＳＬファミリータンパク質として機能する。したがって、本発明に係る遺伝子、タンパク質等は以下の有用性を有する。
【００３９】
細胞外マトリックスは、組織を構成する細胞外環境であることから、細胞の各種活動に重大な影響を与えるため、多くの生体現象と関連することが知られている。また、同様な観点から様々な組織形成を規定する働きを有することも知られており、細胞外マトリックス因子は、細胞・組織の働きを細胞の外側から調節する重要な役割を果たしている。
【００４０】
他方、ＡＤＡＭ−ＴＳＬファミリータンパク質は、細胞外マトリックス因子のひとつとして知られており、これまでにショウジョウバエから単離されたｐａｐｉｌｉｎ等５個のｃＤＮＡが同定されている（Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ　２００２　Ａｐｒ　５；２７７（１４）：１２１８２−９）。ｐａｐｉｌｉｎは基底膜細胞外マトリックスに存在し、筋肉組織形成に関わること（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　１２７，　５４７５−５４８５，　２０００）、プロコラーゲンＮ−ペプチダーゼ活性を阻害することが報告されている。
【００４１】
また、ＡＤＡＭ−ＴＳＬファミリータンパク質は、メタロプロテアーゼ活性を持つ細胞外マトリックス分解酵素ＡＤＡＭ−ＴＳファミリータンパク質のカルボキシル側領域と構造的な相同性がある。ＡＤＡＭ−ＴＳファミリータンパク質は、細胞外マトリックス因子を分解し、具体的には、ＡＤＡＭ−ＴＳ１はアグリカン、バーシカンを、ＡＤＡＭ−ＴＳ４はアグリカン、バーシカン、ブレビカンを、ＡＤＡＭ−ＴＳ１３はフォンビルブランド因子を分解する酵素活性を持ち、またＡＤＡＭ−ＴＳ２，　ＡＤＡＭ−ＴＳ３はプロコラーゲンＮ−ペプチダーゼ活性を持つ。
【００４２】
さらに、ＡＤＡＭ−ＴＳファミリー遺伝子は、ウシやヒトの疾患の原因遺伝子である可能性が報告されており、具体的にはＡＤＡＭ−ＴＳ２がウシのｄｅｒｍａｔｏｓｐａｒａｘｉｓや、ヒトのＥｈｌｅｒｓ−Ｄａｎｌｏｓ症候群（ＶＩＩＣ型）の、ＡＤＡＭ−ＴＳ１３がヒトのｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ　ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉｃ　ｐｕｒｐｕｒａの疾患原因遺伝子であることが報告されている。
【００４３】
このような知見から、今回得られた上記ＡＤＡＭ−ＴＳＬＲ１タンパク質、その遺伝子、及びその抗体等は、受精、胚発生、形態形成、さらには細胞外マトリックスの形成異常や代謝異常によって生じる疾患、疾病（特に、ＡＤＡＭ−ＴＳＬファミリータンパク質に関わる各種疾患や疾病）を研究する上で大変有用な道具となり得るものである。また、本発明に係る遺伝子、タンパク質等は、細胞外マトリックスの関与する病気の診断薬や、その治療効果を検査するための検査薬として有効に用いることができる。加えて、細胞外マトリックスは、組織形成を規定する細胞外環境であることから、本発明に係る遺伝子、タンパク質等は、再生医学における組織再生や、生体外における人工組織形成に応用可能である。
【００４４】
また、上記ＡＤＡＭ−ＴＳＬＲ１タンパク質の発現パターン解析から、胎児期から成体までの期間で様々な臓器に広く発現していることがわかった（後述の実施例参照）。このことから臓器特有の機能にかかわらず、組織・生体の維持に必須であり、かつ普遍的な機能を有していると推察される。アミノ酸配列から推定される構造は、ＡＤＡＭ−ＴＳファミリータンパク質と部分的に相同性があり、機能面での関連性を示唆している。一方、ＡＤＡＭ−ＴＳファミリーが有しているプロテアーゼ（タンパク分解酵素）活性ドメインを欠いていることから、ＡＤＡＭ−ＴＳＬＲ１タンパク質はタンパク質分解酵素活性を持たず、むしろＡＤＡＭ−ＴＳファミリータンパク質の標的分子にＡＤＡＭ−ＴＳタンパク質と同様な機作で認識、結合し、ＡＤＡＭ−ＴＳによる標的分子の分解を制御、すなわち抑制する重要な役割をもっていることを推測させる。
【００４５】
生体における形態形成や疾病、疾患に伴う組織修復において、組織の分解と再構築は非常に重要なプロセスである。ＡＤＡＭ−ＴＳファミリータンパク質はこのプロセスにおいて、組織の形態および機能を規定する細胞外マトリックスの分解にかかわっていると考えられている。ＡＤＡＭ−ＴＳＬＲ１タンパク質は、その構造上の特徴、発現パターン、培養細胞での局在パターンなどから考え合わせると、全身性に広く普遍的に存在する構造、例えば血管のようなもの、あるいはもっとひろく生体内に多く含まれるすべての細胞外マトリックスに存在し、細胞外マトリックスに対するＡＤＡＭ−ＴＳファミリーによる分解を負に制御していると考えられる。
【００４６】
したがって、ＡＤＡＭ−ＴＳＬＲ１タンパク質の機能に何らかの障害が起きた場合には、全身的な出血傾向の増大や、臓器を独立に機能、維持させることが難しくなり一種の臓器不全に陥る可能性も考えられ、また癌患者においては術後の転移、再発の可能性の増大も考えられる。すなわち、ＡＤＡＭ−ＴＳＬＲ１の発現量や機能活性を個人レベルで把握できれば、処置後の症状予測等、医療面での貢献度は大きいと考えられる。
【００４７】
また、上記ＡＤＡＭ−ＴＳＬＲ１タンパク質は、ＡＤＡＭ−ＴＳをはじめとする細胞外マトリックス分解酵素のナチュラルインヒビターとしての応用が期待できる。さらに、ＡＤＡＭ−ＴＳＬＲ１タンパク質の予測される機能から、ＡＤＡＭ−ＴＳを原因遺伝子とする疾患、たとえばＥｈｌｅｒｓ−Ｄａｎｌｏｓ症候群（ＶＩＩＣ型）や、ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ　ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉｃ　ｐｕｒｐｕｒａの診断、治療に応用できると考えられる。
【００４８】
さらに、上記ＡＤＡＭ−ＴＳＬＲ１タンパク質は、以下の知見から、慢性関節リュウマチへの応用が期待できる。
【００４９】
▲１▼　ＡＤＡＭ−ＴＳファミリータンパク質は、アグリカンをはじめとするプロテオグリカンを分解する活性を持つ。
【００５０】
▲２▼　上記アグリカンは軟骨に含まれる細胞外マトリックス因子で、アグリカンの分解は軟骨の機能、形態の安定性消失を促すことから、アグリカン分解酵素に対する阻害剤が発見されれば、慢性関節リュウマチを含む関節炎の治療に大変有効であると期待されている。
【００５１】
▲３▼　ＡＤＡＭ−ＴＳＬＲ１はＡＤＡＭ−ＴＳの基質である細胞外マトリックスへの結合部位と同様な構造を持ちながら、酵素活性部位はないことから、これらＡＤＡＭ−ＴＳの基質、たとえば、アグリカンなどの細胞外マトリックス因子との結合を競合的に阻害することで、アグリカン分解活性を抑制する阻害剤として応用することが可能である。したがって、アグリカンなどのプロテオグリカンの分解が関与する慢性関節リュウマチを含む関節炎の治療に有効である。
【００５２】
さらに、上記ＡＤＡＭ−ＴＳＬＲ１タンパク質のＴＳＰ−１ドメインのアミノ末端側にはＥＩＬＤＶの５つのアミノ酸からなる配列が存在する。この配列はフィブロネクチンのＩＩＩＣＳ領域に存在するインテグリン（４（１結合配列と一致する。したがって、本発明のタンパク質は、インテグリン（４（１のリガンドであることが予測される。実際、ＡＤＡＭ−ＴＳＬＲ１はインテグリン（４（１を発現するヒト骨肉腫細胞ＭＧ６３の細胞接着、伸展を促進する。
【００５３】
上記インテグリン（４（１はリンパ球など血球由来の細胞が用いるインテグリンであり、特に、これら血球系細胞の血管内皮細胞への接着と血管外への浸潤をつかさどる細胞表面レセプターとして知られている。
【００５４】
上記ＡＤＡＭ−ＴＳＬＲ１は血管を取り巻く細胞外マトリックス、マイクロフィブリルの主要構成成分であるＦｉｂｒｉｌｌｉｎ−１と共局在することから、血管内皮細胞層を浸潤した細胞がさらにマイクロフィブリルを通過して血管外に移動するための重要な足場として働いていることが推測される。
【００５５】
一方、これら白血球、リンパ球、マクロファージなどの血球系細胞が血管を浸潤するためには、やはり、その周囲の細胞外マトリックスの分解が必要と考えられ、ＡＤＡＭ−ＴＳＬＲ１タンパクは血管壁周辺の細胞外マトリックスに存在し、細胞外マトリックスの分解を緻密に調節することによってこれら細胞の血管浸潤を制御していると考えられる。
【００５６】
もし上記ＡＤＡＭ−ＴＳＬＲ１遺伝子に異常が起きれば、血管を取り巻く細胞外マトリックス構造の制御機構が乱れ、たとえばリンパ球が無秩序に周辺組織実質内に浸潤し、それによって例えば免疫系から隔離されている中枢神経系などの組織で多発性硬化症のような自己免疫疾患が引き起こされる可能性が考えられる。また、全身性に出血傾向が増大するなどの危険性も考えられる。さらには、癌患者において、癌原発巣が簡単に他臓器へ浸潤、転移しやすくなることも考えられる。
【００５７】
動脈硬化症においても、血管壁への白血球、リンパ球、マクロファージなどの血球系細胞の浸潤がその病変の進行に大きくかかわっていることが知られており、上記ＡＤＡＭ−ＴＳＬＲ１は本疾患にもかかわっていることが予測される。
【００５８】
したがって、本発明のタンパク質は、白血球、リンパ球、マクロファージなどの血球系細胞や、がん細胞の血管壁への、もしくは血管内への浸潤を含む各種組織内、および組織間での移動を制御する因子として有用である。たとえば、これら細胞の移動を抑制することで上記の自己免疫疾患、がん転移、動脈硬化症や白血球などの血球系細胞やがん細胞がかかわる疾患の診断、治療への応用が期待できる。
【００５９】
さらに、上記ＡＤＡＭ−ＴＳＬＲ１タンパク質は、血管を取り巻く細胞外マトリックス、マイクロフィブリルの主要構成成分であるフィブリリン１（Ｆｉｂｒｉｌｌｉｎ−１）と細胞外マトリックス中で共局在する。
【００６０】
フィブリリンはコラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、エラスチンなど他の細胞外マトリックス因子が構築する細胞外マトリックスとは異なる独自の細胞外マトリックスを形成する。また、上記Ｆｉｂｒｉｌｌｉｎ−１は大動脈解離を主とする心血管系の異常などを生ずる先天性疾患であるＭａｒｆａｎ症候群の原因タンパク質である。心血管系の異常は生命予後を大きく左右する。その原因はフィブリリンタンパク質中の変異によるフィブリリン細胞外マトリックスの形成の抑制による。
【００６１】
上記のように、ＡＤＡＭ−ＴＳＬＲ１は細胞外マトリックス中においてフィブリリン１とともに存在し、他の細胞外マトリックス因子である各種コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニンなどには結合しないことから、フィブリリンの形成する細胞外マトリックスに、もしくはフィブリリンそのものに特異的に結合するタンパク質であると考えられ、フィブリリンマトリックス形成にかかわっていることが予測される。
【００６２】
したがって、本発明のＡＤＡＭ−ＴＳＬＲ１は、たとえばその親和性を利用して、Ｍａｒｆａｎ症候群における変異フィブリリンを除去することで、もしくは正常フィブリリンの線維形成を促進することで、、正常フィブリリンによるフィブリリンマトリックス形成を促進する、ことに応用可能と考えられる。
【００６３】
また、フィブリリンをその分解酵素から守ることで、フィブリリンマトリックス形成を促進できる可能性がある。
【００６４】
さらに、ＡＤＡＭ−ＴＳＬＲ１タンパク質は、他にも細胞に分化を引き起こす機能を有している可能性があり、このような観点から、細胞分化誘導剤として利用できる可能性がある。
【００６５】
以下では、本発明に係る遺伝子、タンパク質等の具体的な利用方法について説明する。
【００６６】
本発明に係る遺伝子又はその変異遺伝子は、各種ホスト細胞中に導入して、本発明に係る細胞外マトリックスタンパク質又はその変異タンパク質を発現させることができる。導入された本発明に係る遺伝子又は変異遺伝子は、ホスト細胞中でベクターとして存在してもよいし、ホスト細胞のゲノムＤＮＡ中に「外部」ＤＮＡ、又は「付加」ＤＮＡとして含まれてもよい。ここで言う「外部」ＤＮＡとは、ホスト細胞のゲノム中には天然に存在しないが人為的操作の結果、ホスト細胞のゲノム中に挿入されたＤＮＡを意味する。また上記「付加」ＤＮＡとは、特定のホスト細胞のゲノム中に天然に存在するが、人為的操作の結果、さらに追加してホスト細胞のゲノム中に挿入されたＤＮＡを意味する。
【００６７】
上記ベクターの具体的な種類は特に限定されるものではなく、ホスト細胞中で発現可能なベクターを適宜選択すればよい。すなわち、ホスト細胞の種類に応じて、確実に遺伝子を発現させるために適宜プロモーター配列を選択し、これと本発明に係る遺伝子を各種プラスミド等に組み込んだものを発現ベクターとして用いればよい。さらに、上記発現ベクターには、プロモーター配列だけでなくターミネーター配列を含めてもよい。
【００６８】
本発明に係る遺伝子を含む発現ベクターも特に限定されるものではなく、従来公知のプラスミド等を好適に用いることができる。
【００６９】
また、上記遺伝子又は変異遺伝子がホスト細胞に導入されたか否か、さらにはホスト細胞中で確実に発現しているか否かを確認するために、各種マーカーを用いてもよい。例えば、ホスト細胞中で欠失している遺伝子をマーカーとして用い、このマーカーを含むプラスミド等を、本発明に係る遺伝子を含む発現ベクターとともにホスト細胞に導入する。これによってマーカー遺伝子の発現から本発明に係る遺伝子の導入を確認することができる。あるいは、オワンクラゲ由来の緑色蛍光タンパク質ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　Ｐｒｏｔｅｉｎ）をマーカーとして用い、本発明に係る細胞外マトリックスタンパク質のＧＦＰ融合タンパク質を発現させてもよい。
【００７０】
上記ホスト細胞は、特に限定されるものではなく、従来公知の各種細胞を好適に用いることができる。具体的には、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）等の細菌、酵母（出芽酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅや分裂酵母Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ）、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐａｓ　ｌａｅｖｉｓ）の卵母細胞、各種哺乳動物の培養細胞、あるいは昆虫の培養細胞等を挙げることができるが、特に限定されるものではない。
【００７１】
上記発現ベクターをホスト細胞に導入する方法、すなわち形質転換方法も特に限定されるものではなく、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。
【００７２】
前述したように、本発明に係るタンパク質及びその遺伝子は、研究用の各種試薬だけでなく、細胞外マトリックスの関与する病気の診断や治療、治療効果の検査等に用いられる各種薬剤に応用することが可能となる。
【００７３】
本発明に係る遺伝子やタンパク質等の薬剤化については、従来公知の方法を適用することができ、特に限定されるものではない。例えば研究用試薬の場合、本発明に係る遺伝子を形質転換キット化したり、本発明に係る細胞外マトリックスタンパク質を異種発現系で大量生産し精製したりすればよい。
【００７４】
また、本発明に係るタンパク質に対して、前述したように変異を導入すれば、細胞接着等の機能が高い活性を持つ変異型のタンパク質や、精製の容易な組換えタンパク質等を人為的に得られる可能性がある。それゆえ、薬剤化に際しては、このような変異型のタンパク質や組換えタンパク質を用いてもよい。
【００７５】
同様に、本発明に係るタンパク質に対する抗体の生産方法も特に限定されるものではなく、例えば、上記ＡＤＡＭ−ＴＳＬＲ１タンパク質それ自体、又はその部分ペプチドを抗原として、従来公知の方法によりポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体として得ることができる。
【００７６】
また、本発明に係る細胞外マトリックスタンパク質は、細胞接着活性及び細胞伸展活性を有することから、細胞接着用や細胞伸展用の薬剤として使用することができる。すなわち、本発明には、上記のタンパク質または遺伝子を含んでなる細胞接着用薬剤（細胞接着誘導剤）や細胞伸展用薬剤が含まれる。
【００７７】
本発明に係る細胞接着用薬剤又は細胞伸展用薬剤の具体的な組成は、本発明に係る細胞外マトリックスタンパク質またはその遺伝子が含まれていれば特に限定されるものではない。具体的には、使用対象の細胞の種類に応じて、細胞接着活性及び細胞伸展活性の少なくとも一方が発揮できるような緩衝液等が含まれていればよい。
【００７８】
例えば、細胞接着用薬剤は、細胞外マトリックス因子タンパク質を目的の組織内に投与または発現させることにより、細胞同士または細胞の足場への接着を誘導する。そこで、上記細胞接着用薬剤には、上記ＡＤＡＭ−ＴＳＬＲ１タンパク質やその遺伝子以外に、これらを効率よく細胞内に導入するための運搬体（外被タンパク質等）などを含むものであってもよく、また、接着誘導剤は、各種の試薬や反応液、酵素などと組み合わせて使用することができる。
【００７９】
また、本発明に係る遺伝子の一部配列をプローブやプライマーとして用いることができる。このようにプローブに用いる場合としては、例えば、本発明の遺伝子の一部配列をチップ上に固定してＤＮＡチップ（マイクロアレイを含む）を構成し、当該ＤＮＡチップを各種検査・診断用に用いるような場合が挙げられる。
【００８０】
上記プローブ等として用いられる一部配列とは、上記ＡＤＡＭ−ＴＳＬＲ１遺伝子に含まれる特徴的・特異的な配列であればよく、具体的には、上記ＡＤＡＭ−ＴＳＬＲ１タンパク質をコードするｃＤＮＡの塩基配列又はその相補配列の少なくとも一部に特異的にハイブリダイズするプローブであれば、いずれの配列・長さのものを設計して用いてもよい。
【００８１】
（４）本発明に係るタンパク質、遺伝子の取得方法
本発明に係る上記ＡＤＡＭ−ＴＳＬＲ１遺伝子の取得方法は、特に限定されるものではなく、前述の開示された配列情報等に基づいて種々の方法により、上記遺伝子配列を含むＤＮＡ断片を単離し、クローニングすることができる。例えば、上記ＡＤＡＭ−ＴＳＬＲ１タンパク質をコードするｃＤＮＡの一部配列と特異的にハイブリダイズするプローブを調製し、ヒトやマウスなどのゲノムＤＮＡライブラリーやｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすればよい。このようなプローブとしては、上記ＡＤＡＭ−ＴＳＬＲ１タンパク質をコードするｃＤＮＡの塩基配列又はその相補配列の少なくとも一部に特異的にハイブリダイズするプローブであれば、いずれの配列・長さのものを用いてもよい。また、上記スクリーニングにおける各ステップについては、通常用いられる条件の下で行えばよい。
【００８２】
上記スクリーニングによって得られたクローンは、制限酵素地図の作成及びその塩基配列決定（シークエンシング）によって、さらに詳しく解析することができる。これらの解析によって、本発明に係る遺伝子配列を含むＤＮＡ断片を取得したか容易に確認することができる。
【００８３】
また、上記プローブの配列を、上記ＡＤＡＭ−ＴＳＬＲ１タンパク質の機能上重要と考えられる領域（例えば、分泌シグナル配列、Ｎ型糖結合領域、ＴＳＰ−１領域、ＥＩＬＤＶ領域等）の中から選択し、ヒト・マウスやその他の生物のゲノムＤＮＡ（又はｃＤＮＡ）ライブラリーをスクリーニングすれば、上記ＡＤＡＭ−ＴＳＬＲ１タンパク質と同様の機能を有する相同分子や類縁分子をコードする遺伝子を単離しクローニングできる可能性が高い。
【００８４】
本発明に係る遺伝子（ポリヌクレオチド）を取得する方法は、上記スクリーニング法以外にも、ＰＣＲ等の増幅手段を用いる方法がある。例えば、上記ＡＤＡＭ−ＴＳＬＲ１タンパク質のｃＤＮＡ配列のうち、５’側及び３’側の非翻訳領域の配列（又はその相補配列）の中からそれぞれプライマーを調製し、これらプライマーを用いてヒト・マウスなどのゲノムＤＮＡ（又はｃＤＮＡ）等を鋳型にしてＰＣＲ等を行い、両プライマー間に挟まれるＤＮＡ領域を増幅することで、本発明のポリヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を大量に取得できる。
【００８５】
本発明に係るタンパク質を取得する方法についても、特に限定されるものではなく、例えば、上述のようにして取得された遺伝子（上記ＡＤＡＭ−ＴＳＬＲ１タンパク質、あるいはその相同分子等をコードするｃＤＮＡ等）を導入した組換え発現ベクターを作製し、周知の方法により大腸菌や酵母等の微生物又は動物細胞などに組み入れて形質転換体として、そのｃＤＮＡがコードするタンパク質を発現させ精製することで、上記ＡＤＡＭ−ＴＳＬＲ１タンパク質等の本発明に係るタンパク質を容易に取得することができる。
【００８６】
上記ＡＤＡＭ−ＴＳＬＲ１タンパク質の変異タンパク質を作製する方法についても、特に限定されるものではなく、例えば、部位特異的突然変異誘発法（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ−Ｇｏｔｏｈ，　Ｇｅｎｅ　１５２，２７１−２７５（１９９５）他）、ＰＣＲ法等を利用して塩基配列に点変異を導入し変異タンパク質を作製する方法、あるいはトランスポゾンの挿入による突然変異株作製法などの周知の変異タンパク質作製法を用いて、上述のようにして取得された遺伝子の塩基配列において、１又はそれ以上の塩基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されるように改変を加えることによって作製することができる。また、変異タンパク質の作製には、市販のキットを利用してもよい。
【００８７】
本発明に含まれる変異タンパク質は、野性型と比べてより優れた細胞接着活性等を有するものであってもよいし、野性型と同様の細胞接着活性等を有するものであってもよい。また、サイレント変異（アミノ酸配列は変わらず、塩基配列のみが変化する変異）であってもよい。つまり、本発明に含まれる変異タンパク質は、前述した細胞接着活性等の各種性質が野生型タンパク質と略同等であってもよいし、より優れていてもよい。
【００８８】
【実施例】
以下の実施例では、本発明にかかるＡＤＡＭ−ＴＳＬＲ１遺伝子をマウスから取得した具体的な方法、及び本発明にかかるＡＤＡＭ−ＴＳＬＲ１タンパク質の物性を調べた結果について、図１〜図８に基づいて、順番に説明する。
【００８９】
〔実施例１：ｃＤＮＡライブラリーの作製〕
（１）ｍＲＮＡの調製
マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）各器官又は組織０．５ｇ〜１ｇを１０ｍｌの懸濁液でホモジェナイズし、２Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）１ｍｌと、同量のフェノール／クロロホルム（体積比５：１）混合液を加え抽出した。抽出後水層に同量のイソプロパノールを加えて、ＲＮＡを水相から分離沈澱させた。この試料を氷の上で１時間インキュベーションした後、４，０００ｒｐｍ、１５分間の条件で冷却遠心機にかけ、沈澱物を回収した。得られた沈殿物を７０％エタノールで洗い、水８ｍｌに溶解後、２ｍｌの５ＭＮａＣｌ、１％ＣＴＡＢ（ｃｅｔｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌ　ａｍｍｏｎｉｕｍ　ｂｒｏｍｉｄｅ）、４Ｍ尿素、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓを含むｐＨ７．０の水溶液１６ｍｌを加えてＲＮＡを沈澱させ、ポリサッカライドを除いた（ＣＴＡＢ沈澱）。
【００９０】
続いて、室温で４，０００ｒｐｍ、１５分間の条件で遠心機にかけ、ＲＮＡを４ｍｌの７Ｍグアニジン−Ｃ１に溶解した。そして２倍量のエタノールを加えた後、氷上で１時間インキュベーションし、４，０００ｒｐｍ、１５分間の条件で遠心機にかけ、生じた沈澱物を７０％エタノールで洗いＲＮＡを回収した、これを再度水に溶解し、ＲＮＡの純度をＯＤ比２６０／２８０（＞１．８）と２３０／２６０（＜０．４５）を読むことによって計測した。
【００９１】
（２）第１鎖ｃＤＮＡの調製
調製した上記ｍＲＮＡ１５μｇを用いて、逆転写酵素３，０００ｕｎｉｔにより、最終容量１６５μｌの反応液中で、５−メチル−ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰを各々０．５４ｍＭ、０．６Ｍトレハロース、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、７５ｍＭＫＣｌ、３ｍＭＭｇＣｌ２、１０ｍＭＤＴＴ、５２ｎｇ／μｌＢＳＡ、ＲＮａｓｅインヒビター５ｕｎｉｔの条件下で逆転写反応を行った。
【００９２】
尚、プライマーとしては、次に示す制限酵素ＸｈｏＩの認識配列を含むオリゴヌクレオチド１ｓｔ　ＢＳ（配列中、ＶはＡ，Ｇ又はＣを示し、ＮはＡ，Ｇ，Ｃ又はＴを示す）を１２．６μｌ用いた。
【００９３】
５’−ＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＡＧＧＡＴＣＣＡＡＧＡＧＣＴＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＶＮ−３’（配列番号３）
上記逆転写反応を始める際、反応液の１／４を採取し、それに１．５μｌの［α−３２Ｐ］−ｄＧＴＰ（３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ、１０μＣｉ／μｌ；Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を加えることにより、第１鎖ｃＤＮＡの合成効率を測定した。ＲＩ標識した反応液の０．５μｌをＤＥ−８１ペーパー上にスポットし、０．５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で３回洗った前後のＲＩ活性を測定し、計算した。その後、ＲＩ標識した反応液と非標識の反応液を混合し、０．５ＭＥＤＴＡ８μｌ、１０％ＳＤＳ２μｌ、プロテイナーゼ（Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）Ｋ２０μｇを加え、４５℃で１５分間加熱した。フェノール／クロロホルムによる抽出、エタノール沈澱後、沈澱をＲＮａｓｅフリーに処理してある水（以下ＲＮａｓｅフリー水とする）４７μｌに溶解した。
【００９４】
（３）５’キャップ構造及び３’末端へのビオチン付加
ＲＮＡジオールのビオチン化ＲＮＡのジオール部位（Ｃａｐ構造のある５’末端と、ポリＡ鎖のある３’末端のリボースの双方に存在）にビオチンを結合させるために、２段階の反応を行った。この２段階の反応は、それぞれ、ジオール基の酸化とそれに続くビオチンヒドラジトと酸化ＲＮＡ体のカップリング反応である。まず、逆転写反応で得られたＲＮＡ−第１鎖ｃＤＮＡ複合体１５μｇを、６．６ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）と、酸化剤として過ヨウ素酸ナトリウムを用いて５０μｌの反応液中で処理した。この酸化反応は遮光条件の下、氷上で４５分間行った。
【００９５】
続いて、５Ｍ塩化ナトリウム１１μｌ、１０％ＳＤＳ０．５μｌ、そして同量のイソプロパノールを加え、６０分間氷上に放置した後、４℃で１５分間１５，０００ｒｐｍ遠心し沈澱を取得した。沈澱物は７０％エタノールで洗い、ＲＮａｓｅフリー水５０μｌに再溶解させた。その試料に１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ６．１）５μｌ、１０％ＳＤＳ５μｌ、１０ｍＭビオチンヒドラジド（Ｓｉｇｍａ社製）１５０μｌを加え、室温（２２〜２６℃）で終夜反応させた。最後に、５μｌの５ＭＮａＣｌ、１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ６．１）７５μｌ、及び２．５倍量のエタノールを加え、１時間の氷上冷却後、４℃において１５分間遠心し、ビオチン化した。反応後、反応液を１５分間遠心し、再度ＲＮＡ−ＤＮＡ複合体を沈澱させた。沈澱物は７０％エタノールで１回、更に８０％エタノールで１回洗い、ＲＮａｓｅフリー水７０μｌに溶解した。
【００９６】
（４）ＲＮａｓｅＩによる完全長ｃＤＮＡの選択
上記のようにして得られたビオチン化ＲＮＡ−ＤＮＡ複合体について、１本鎖ＲＮＡを消化するＲＮａｓｅＩで処理することにより、逆転写反応時に完全なｃＤＮＡの伸長が得られなかったｍＲＮＡ、及びｍＲＮＡの３’末端に標識されたビオチン残基を取り除いた。具体的には、上記ビオチン化ＲＮＡ−ＤＮＡ複合体の試料７０μｌに、１０×ＲＮａｓｅＩバッファー（１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５０ｍＭＥＤＴＡ、２ＭＮａＯＡｃ）１０μｌ、ＲＮａｓｅＩ（ＲＮａｓｅ　ＯｎｅＴＭ；Ｐｒｏｍｅｇａ社製）２００ｕｎｉｔを加えて、３７℃で１５分間処理することで１本鎖ＲＮＡを消化した。
【００９７】
（５）完全長ｃＤＮＡの採取
ストレプトアビジンをコートしたマグネティックビーズにｃＤＮＡが非特異的吸着するのを防止するため、１００μｇの酵母ｔＲＮＡ（ＤＮａｓｅＩ処理したもの）を５ｍｇ（５００μｌ）のマグネティックビーズ（ｍａｇｎｅｔｉｃ　ｐｏｒｏｕｓ　ｇｌａｓｓ（ＭＰＧ）ｐａｒｔｉｃｌｅｓ　ｃｏａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（ＣＰＧ，ＮＪ））に加え、１時間氷上に放置した後、５０ｍＭＥＤＴＡ、２ＭＮａＣｌの溶液にて洗った。
【００９８】
上記ビーズを５０ｍＭＥＤＴＡ、２ＭＮａＣｌの溶液５００μｌ中に懸濁し、上記（４）で取得したＲＮａｓｅＩ処理されたｃＤＮＡを加えた。室温にて３０分間撹拌することで、マグネティックビーズと完全長ｃＤＮＡを結合させた。
【００９９】
完全長ｃＤＮＡを捕獲したビーズを５０ｍＭＥＤＴＡ、２ＭＮａＣｌの溶液で４回、０．４％ＳＤＳ、５０μｇ／μｌ酵母ｔＲＮＡで１回、１０ｍＭＮａＣｌ、０．２ｍＭＥＤＴＡ、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２０％グリセロールで１回、５０μｇ／μｌ酵母ｔＲＮＡ水溶液で１回、ＲＮａｓｅＨバッファー（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭＭｇＣｌ２、２０ｍＭＫＣｌ、０．１ｍＭＥＤＴＡ、０．１ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）で１回洗浄した後、ＲＮａｓｅＨ用バッファー１００μｌに懸濁し、ＲＮａｓｅＨ３ｕｎｉｔを加え、３７℃で３０分間加温した。その後、１０％ＳＤＳ１μｌ、０．５ＭＥＤＴＡ２μｌを加えて、１０分間、６５℃に曝し、その上清を回収した。
【０１００】
回収した上清（１本鎖完全長ｃＤＮＡを含む）はフェノール／クロロホルムで抽出し、スピードバッグにて液量を１００μｌ以下に減じてからＧ２５／Ｇ１００　Ｓｅｐｈａｄｅｘクロマトグラフィーに付した。ＲＩ活性を持った分画はシリコン処理したマイクロチューブに収集するとともに、グリコーゲン２μｇを加え、エタノール沈澱にて得られた沈澱物を３０μｌの超純水に溶解した。
【０１０１】
（６）１本鎖ｃＤＮＡへのオリゴｄＧ付加
回収した１本鎖ｃＤＮＡ３０μｌを、最終容量５０μｌの反応液中で、２００ｍＭカコジル酸ナトリウム（ｐＨ６．９）、１ｍＭＭｇＣｌ２、１ｍＭＣｏＣｌ２、１ｍＭ２−メルカプトエタノール、１００μＭｄＧＴＰの条件のもと、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（宝酒造社製）３２ｕｎｉｔを用いて３７℃で３０分間のオリゴｄＧ付加反応に付した。反応終了時にＥＤＴＡを５０ｍＭとなるように加え、一連のフェノール／クロロホルムによる抽出、エタノール沈澱を経て、３１μｌの超純水に溶解した。
【０１０２】
（７）第２鎖ｃＤＮＡ合成
第１鎖ｃＤＮＡを鋳型にした第２鎖ｃＤＮＡの合成は以下のように行った。最終容量６０μｌの反応系で、第２鎖低バッファー（２００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．７５）、１００ｍＭＫＣｌ、１００ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、２０ｍＭＭｇＳＯ４、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１ｍｇ／μｌＢＳＡ）３μｌ、第２鎖高バッファー（２００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．２）、６００ｍＭＫＣｌ、２０ｍＭＭｇＣｌ２）３μｌ、ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ各々０．２５ｍＭ、β−ＮＡＤＨ６μｌ、オリゴｄＧ付加された第１鎖ｃＤＮＡ３１μｌ、第２鎖プライマー−アダプター６００ｎｇを加え、Ｅｘ　ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ　Ｅｘ　Ｔａｑ；宝酒造社製）１５ｕｎｉｔ、耐熱性ＤＮＡリガーゼ（Ａｍｐｌｉｇａｓｅ；Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ社製）１５０ｕｎｉｔ、耐熱性ＲＮａｓｅＨ（Ｈｙｂｒｉｄａｓｅ；Ｅｐｉｃｅｎｔｅｒｅ社製）３ｕｎｉｔによって第２鎖ｃＤＮＡを合成した。
【０１０３】
尚、第２鎖プライマー−アダプターとしては、次に示す２ｎｄ−Ｘプライマーを用いた。
【０１０４】
ＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＴＴＣＴＣＧＡＧＴＴＡＡＴＴＡＡＡＴＴＡＡＴＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣ　（配列番号４）
０．５ＭＥＤＴＡを１μｌ加えることで反応を停止させ、さらにタンパク質成分を分解するために、１０％ＳＤＳ１μｌ、プロテイナーゼ（Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）Ｋ１０μｇの存在下に４５℃で１５分間加熱し、最終的にフェノール／クロロホルムによる抽出、エタノール沈澱にて精製した２本鎖完全長ｃＤＮＡを得た。
【０１０５】
（８）ライブラリーの調製
ＭｏｂｉＴｅｃ社製のλＰＳベクターをｃＤＮＡ用に改変してλＰＳ（ＲＩＫＥＮ）ベクター：λ−ＦＬＣ−１ベクターを作製し、これにｃＤＮＡを挿入してｃＤＮＡライブラリーを調製した（特開２０００−３２５０８０号公報参照）。
【０１０６】
〔実施例２：新規細胞外マトリックス遺伝子の選別〕
上記作製方法により得られたａｄｕｌｔ　ｃｏｒｐｏｒａ　ｑｕａｄｒａｇｅｍｉｎａ由来ｃＤＮＡライブラリーに含まれるｃＤＮＡの塩基配列を決定した。この中から分泌シグナル配列と予想される配列を含むｃＤＮＡとして、ＡＤＡＭ−ＴＳＬＲ１遺伝子を選択した。
【０１０７】
具体的には、ｃＤＮＡライブラリーの各クラスタからひとつの代表クローンを選択した。代表クローンはＱ−ｂｏｔ（ＧＥＮＥＴＩＸ　ＬＩＭＩＴＥＤ製）で選択し、３８４穴プレートにアレイ化した。このとき、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は３０℃で１８〜２４時間、５０μｌのＬＢ培地で培養した。このとき、ＬＢ培地には、１００ｍｇ／ｍｌのアンピシリン及び５０ｍｇ／ｍｌのカナマイシンを添加した。
【０１０８】
培養した各クローンを、さらに１００ｍｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１．３ｍｌのＨＴ液中で培養し、遠心分離により大腸菌を回収した後、ＱＩＡｐｒｅｐ　９６　Ｔｕｒｐｏ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてプラスミドＤＮＡを回収、精製した。取得されたプラスミド中に挿入されているｃＤＮＡの鎖長を調べるために、上記で取得したプラスミドＤＮＡの１／３０を制限酵素ＰｖｕＩＩで消化し、１％のアガロースゲル電気泳動を行った。
【０１０９】
得られたプラスミド中に挿入された完全長ｃＤＮＡの全長の塩基配列解析には、３種類のシークエンサを用いた。また、プラスミドは挿入配列の長さが２．５ｋｂより短いものと長いものの２つのカテゴリに分けた。このうち２．５ｋｂより短い挿入配列を有するクローンについては両端から塩基配列を解析した。
【０１１０】
このとき、次に示すセンス鎖のプライマーと、アンチセンス鎖のプライマーを用いて、Ｔｈｅｒｍｏｓｅｑｕｅｎａｓｅ　Ｐｒｉｍｅｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）で反応させ、Ｌｉｃｏｒ　ＤＮＡ４２００（ｌｏｎｇ　ｒｅａｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ）を用いて解析した。
【０１１１】
ＣＡＣＧＡＣＧＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣ（センス鎖・配列番号５）
ＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧ（アンチセンス鎖・配列番号６）
上記塩基配列解析により解析ができなかったギャップは、プライマウォーキング法により決定した。その際、ＡＢＩ　Ｐｒｉｓｍ　３７７及び／又はＡＢＩ　Ｐｒｉｓｍ　３７００（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｉｎｃ．製）、ＢｉｇＤｙｅ　ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　ｋｉｔ、及びＣｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ＦＳ　ｒｅａｄｅｙ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｉｎｃ．製）を用いた。
【０１１２】
また、挿入されているｃＤＮＡが２．５ｋｂより長いクローンの配列決定は、ショットガン法によって実施した。このとき、Ｓｈｉｍａｄｚｕ　ＲＩＳＡ　３８４、及びＤＹＥｎａｍｉｃ　ＥＴ　ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　ｃｙｃｌｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用いた。ショットガンライブラリを作製するために、４８の独立な代表クローンからＰＣＲで増殖した４８のＤＮＡフラグメントを用いた。増幅されたＤＮＡ断片の末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼによって平滑化した。
【０１１３】
上記ＤＮＡ断片をｐＵＣ１８ベクターへ挿入して組み換えベクターを作製し、この組み換えベクターを用いて、大腸菌ＤＨ１０Ｂを形質転換した。この大腸菌から、上記代表クローンのアレイ化と同様にしてプラスミドを調製した。
【０１１４】
各代表クローンについては、両末端からの塩基配列解析によって塩基配列を決定し、該塩基配列をコンピューター上で連結した後、Ｄｏｕｂｌｅ　Ｓｔｒｏｋｅ　Ｓｈｅａｒｉｎｇ　Ｄｅｖｉｃｅ（Ｆｉｏｒｅ　Ｉｎｃ．製）によるｓｈｅａｒｉｎｇを行った。ショットガン法による塩基配列決定は、１２〜１５クローンの重複をもって行った。この塩基配列決定により配列が決定できなかったギャップは、上記と同様にプライマウォーキングによって決定した。
【０１１５】
その結果、配列番号１に示すように、上記ＡＤＡＭ−ＴＳＬＲ１遺伝子のｃＤＮＡは６５８個のアミノ酸をコードしていると考えられた。
【０１１６】
また、上記ＡＤＡＭ−ＴＳＬＲ１遺伝子からアミノ酸配列を予測すると、図１（ａ）・（ｂ）に示すように、ＡＤＡＭ−ＴＳＬＲ１遺伝子にコードされるタンパク質（すなわち、ＡＤＡＭ−ＴＳＬＲ１タンパク質）は、分泌シグナルのほか、６個のトロンボスポンディンタイプ１リピートと、Ｃ末端側のシステインリッチ領域と、２個所の糖鎖結合部位と、Ｎ末端側のＥＩＬＤＶ領域とが認められた。
【０１１７】
また、その相同性を比較すると、上記ＡＤＡＭ−ＴＳＬＲ１遺伝子（ｃＤＮＡ）の３’側部分と、ヒトＥＳＴクローンであるＦＬＪ１３７１０遺伝子とは約９３％の相同性を有しており、Ｎ末端を欠いたＡＤＡＭ−ＴＳＬＲ１タンパク質のヒトホモログである可能性が示された。さらに、ＡＤＡＭ−ＴＳＬＲ１タンパク質のドメイン構造をＡＤＡＭ−ＴＳＬファミリータンパク質と比較した結果、図２（ａ）〜（ｄ）に示すように、上記ＡＤＡＭ−ＴＳＬＲ１タンパク質は、他のＡＤＡＭ−ＴＳＬファミリータンパク質と構造的な類似しているが、Ｎ末端側のトロンボスポンディンタイプ１リピートを有していなかった。
【０１１８】
〔実施例３：新規細胞外マトリックスタンパク質の発現〕
（１）ＡＤＡＭ−ＴＳＬＲ１−ＥＧＦＰ融合タンパク質の発現
ＡＤＡＭ−ＴＳＬＲ１遺伝子（ｃＤＮＡ）を、以下に示す配列番号７（フォワードプライマー）および配列番号８のプライマー（リバースプライマー）を用いてＰＣＲにより増幅した。フォワードプライマーは、ｃＤＮＡの翻訳開始コドンＡＴＧを含む７９から１０４番目の塩基配列と、タンパク質発現効率を亢進するためのＫｏｚａｋ配列と、発現ベクターに組込むためのＥｃｏＲＩサイトとをその５’側に配したプライマーである。また、リバースプライマーはｃＤＮＡの２０３２から２０５２番目の塩基配列を含み、発現ベクターに組込むためにＮｏｔＩサイトをその３’側に配したプライマーである。
【０１１９】
５’−ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＧＣＣＧＣＣＡＴＧＴＴＴＧＴＣＡＧＣＴＡＣＣＴＧＴＴＡＴＴＡＡＣ−３’　（配列番号７）
５’−ＴＴＴＴＣＣＴＴＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＣＧＧＣＴＣＣＣＣＡＧＡＡＡＧＣＣＣＡＣ−３’　（配列番号８）
増幅されたＡＤＡＭ−ＴＳＬＲ１遺伝子を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩで処理し、ＧＦＰ発現遺伝子を有するプラスミドｐＥＧＦＰ−Ｎ１　（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）のＥｃｏＲＩとＰｓｐＯＭＩの間に挿入し、ＥＧＦＰと融合したＡＤＡＭ−ＴＳＬＲ１タンパク質をコードする遺伝子を有するプラスミド（ＡＤＡＭ−ＴＳＬＲ１−ＥＧＦＰプラスミド）を作製した。
【０１２０】
上記ＡＤＡＭ−ＴＳＬＲ１−ＥＧＦＰプラスミドで形質転換した大腸菌ＯｎｅＳｈｏｔ　Ｔｐｏ１０　（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を増殖させ、当該プラスミドを精製した。得られたＡＤＡＭ−ＴＳＬＲ１−ＥＧＦＰプラスミドを遺伝子導入試薬ＦｕＧｅｎｅ６（ロッシュ社）を用いてヒト２９３Ｔ細胞に導入して、培養した。
【０１２１】
ＡＤＡＭ−ＴＳＬＲ１−ＥＧＦＰプラスミドを導入したヒト２９３Ｔ細胞の培養液上清と細胞破砕物とを、５〜２０％濃度勾配ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動し、ナイロンメンブレンに転写後、抗ＧＦＰモノクローナル抗体Ｂ−２（サンタクルーズ社）によりウェスタンブロットを行い、ＡＤＡＭ−ＴＳＬＲ１−ＥＧＦＰ融合タンパク質を検出した。その結果、図３（ａ）・（ｂ）に示すように、約１２５ｋＤａの産物が細胞破砕物のみならず培養上清からも検出され、ＡＤＡＭ−ＴＳＬＲ１タンパク質が細胞外分泌タンパク質であることが明らかとなった。
【０１２２】
また、アミノ酸数から予想されるサイズは約１０５ｋＤａであるので、検出されたＡＤＡＭ−ＴＳＬＲ１−ＥＦＧＰ融合タンパク質は糖鎖の付加などの修飾を受けていると考えられる。
【０１２３】
（２）ＡＤＡＭ−ＴＳＬＲ１−Ｈｉｓ−ｍｙｃ融合タンパク質の発現
ＡＤＡＭ−ＴＳＬＲ１遺伝子（ｃＤＮＡ）を配列番号９（フォワードプライマー）および配列番号１０のプライマー（リバースプライマー）を用いてＰＣＲにより増幅した。フォワードプライマーは、ｃＤＮＡの翻訳開始コドンＡＴＧを含む７９から１０４番目の塩基配列と、タンパク質発現効率を亢進するためのＫｏｚａｋ配列、発現ベクターに組込むためのＮｈｅＩサイトをその５’側に配したプライマーである。また、リバースプライマーはｃＤＮＡの２０３２から２０５２番目の塩基配列を含み、発現ベクターを組込むためにＮｏｔＩサイトをその３’側に配したプライマーである。
【０１２４】
５’−ＡＡＣＴＡＧＣＴＡＧＣＧＡＡＴＴＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＴＴＴＧＴＣＡＧＣＴＡＣＣＴＧＴＴＡＴＴＡＡＣ−３’　（配列番号９）
５’−ＡＡＡＡＧＧＡＡＡＡ　ＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧ　ＧＴＣＧＡＣＣＴＣＧ　ＧＣＴＣＣＣＣＡＧＡ　ＡＡＧＣＣＣＡＣ−３’　（配列番号１０）
増幅したＡＤＡＭ−ＴＳＬＲ１遺伝子をＮｈｅＩとＮｏｔＩで処理し、ヒスチジンヘキサマー（以下Ｈｉｓと略す）とｍｙｃの融合タンパク質（Ｈｉｓ−Ｍｙｃ）を発現するｐＳｅｃ−Ｔａｇ２Ａベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＮｈｅＩとＮｏｔＩサイトの間に挿入し、Ｈｉｓ−ＭｙｃにさらにＡＤＡＭ−ＴＳＬＲ１タンパク質が融合したタンパク質をコードするプラスミド（ＡＤＡＭ−ＴＳＬＲ１−Ｈｉｓ−Ｍｙｃプラスミド）を作製した。
【０１２５】
上記ＡＤＡＭ−ＴＳＬＲ１−Ｈｉｓ−Ｍｙｃプラスミドで形質転換した大腸菌ＯｎｅＳｈｏｔ　Ｔｐｏ１０　（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を増殖させ、当該プラスミドを精製した。得られたＡＤＡＭ−ＴＳＬＲ１−Ｈｉｓ−Ｍｙｃプラスミドを遺伝子導入試薬ＦｕＧｅｎｅ６（ロッシュ社）を用いてヒト２９３Ｔ細胞に導入して培養した。
【０１２６】
ＡＤＡＭ−ＴＳＬＲ１−Ｈｉｓ−Ｍｙｃプラスミドを導入したヒト２９３Ｔ細胞の培養液上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて電気泳動し、ナイロンメンブレンに転写後、抗ｍｙｃモノクローナル抗体（Ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ社）によりウェスタンブロットを行い、ＡＤＡＭ−ＴＳＬＲ１−Ｈｉｓ−Ｍｙｃ融合タンパク質を検出した。その結果、約９０ｋＤａの産物が検出された。
【０１２７】
〔実施例４：ＡＤＡＭ−ＴＳＬＲ１タンパク質の細胞外マトリックスでの局在〕
実施例３で作成したＡＤＡＭ−ＴＳＬＲ１−ＥＧＦＰプラスミドを導入したヒト２９３Ｔ細胞を２％中性ホルマリンで固定し、抗ＧＦＰモノクローナル抗体と抗ｍｙｃモノクローナル抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）との混合物、およびローダミン標識抗マウスイムノグロブリン抗体により免疫染色を行った。
【０１２８】
ＡＤＡＭ−ＴＳＬＲ１−ＥＧＦＰプラスミドを導入したヒト２９３Ｔ細胞の顕微鏡写真を図４（ａ）に、微分干渉顕微鏡写真を図４（ｂ）に示す。図４（ａ）・（ｂ）から明らかなように、ＡＤＡＭ−ＴＳＬＲ１−ＥＧＦＰ融合タンパク質が細胞外に点状に固相化されていることが分かる。
【０１２９】
また、培養途中のマウス初代胎児線維芽細胞の培養皿に、ＡＤＡＭ−ＴＳＬＲ１−ＥＧＦＰプラスミドを導入したヒト２９３Ｔ細胞の培養液上清を加えた後、３日間培養を続けた。３日後培養液を除き、２％中性ホルマリンで固定し、ウサギ抗フィブリリンポリクローナル抗体またはウサギ抗フィブロネクチン抗体とローダミン標識抗ウサギイムノグロブリン抗体とにより免疫染色を行った。
【０１３０】
その結果、図５（ａ）に示すように、ＡＤＡＭ−ＴＳＬＲ１−ＥＧＦＰ融合タンパク質は細胞外マトリックスに線維状に固相化した。ここで、フィブリリンの免疫染色領域の顕微鏡写真を図５（ｂ）に示すが、図５（ａ）と図５（ｂ）を合成すると、図５（ｃ）に示すように、ＡＤＡＭ−ＴＳＬＲ１−ＥＧＦＰ融合タンパク質の免疫染色領域とフィブリリンの免疫染色領域とは、部分的に一致していた。つまり、ＡＤＡＭ−ＴＳＬＲ１タンパク質とフィブリリンとは共局在を示していた。一方、ＡＤＡＭ−ＴＳＬＲ１タンパク質は、フィブロネクチンとはあまり共局在しなかった。
【０１３１】
次に、培養途中のマウス初代胎児線維芽細胞の培養皿に、ＡＤＡＭ−ＴＳＬＲ１−Ｈｉｓ−Ｍｙｃプラスミドを導入したヒト２９３Ｔ細胞の培養液上清を加えた後、３日間培養を続けた。３日後培養液を除き、２％中性ホルマリンで固定し、マウス抗Ｈｉｓモノクローナル抗体とマウス抗ｍｙｃモノクローナル抗体との混合物、およびローダミン標識抗マウスイムノグロブリン抗体により免疫染色を行った。その結果、図６に示すように、ＡＤＡＭ−ＴＳＬＲ１−Ｈｉｓ−Ｍｙｃ融合タンパク質も線維状の構造として細胞外マトリックスに固相化されていることが示された。
【０１３２】
〔実施例５：ＡＤＡＭ−ＴＳＬＲ１タンパク質の細胞接着活性〕
ＡＤＡＭ−ＴＳＬＲ１−ＥＧＦＰプラスミドを導入したヒト２９３Ｔ細胞のＡＤＡＭ−ＴＳＬＲ１−ＥＧＦＰタンパク質を含む培養液上清を、ウサギ抗ＧＦＰポリクローナル抗体を結合させた９６穴プレート中で一晩インキュベートした。９６穴プレートをＰＢＳで洗った後、１％ウシ血清アルブミンで１時間ブロッキングした。ヒト骨肉腫細胞ＭＧ６３を９６穴プレートに加え、３７℃で１時間インキュベート後、ＰＢＳで２回洗った。２％ホルマリンで固定後、ディフクイック（和光純薬工業製）で染色した。
【０１３３】
染色されたＭＧ６３細胞を観察したところ、図７（ａ）に示すように細胞が伸展していた。一方、図７（ｂ）に示すように、ＡＤＡＭ−ＴＳＬＲ１−ＥＧＦＰ融合タンパク質を含む培養液上清を加えていない対照実験区では、ＭＧ６３細胞の伸展は認められなかった。このことから、ＡＤＡＭ−ＴＳＬＲ１タンパク質は、細胞接着、伸展活性を持つことが見出された。
【０１３４】
〔実施例６：マウスの各種組織におけるＡＤＡＭ−ＴＳＬＲ１遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ発現〕
ＲＴ−ＰＣＲを用いて、マウス胚および成体マウスの組織におけるＡＤＡＭ−ＴＳＬＲ１遺伝子のメッセンジャーＲＮＡの発現量を調べた。まず、マウス全ＲＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社，Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ，　ＣＡ，　ＵＳＡ）から、当該メーカーのプロトコールに従って、オリゴｄＴプライマーおよびｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ（ＲｎａｓｅＨ−）　（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてｃＤＮＡを合成した。マウスＲＮＡとしては、１；脳、２；骨髄、３；７日目胎児、４；１１日目胎児、５；１５日目胎児、６；１７日目胎児、７；眼、８；心臓、９；腎臓、１０；肝臓、１１；肺、１２；リンパ節、１３；前立腺、１４；唾液腺、１５；平滑筋、１６；脊髄、１７；脾臓、１８；胃、１９；精巣、２０；胸腺、２１；子宮に由来するもの、の計２１種類について調べた。得られたｃＤＮＡを鋳型とし、ＰＣＲを行った。
【０１３５】
使用したプライマーは、５’側のプライマーの塩基配列を配列番号１１に、３’側のプライマーの塩基配列を配列番号１２に示した。５’側のプライマーは、ＡＤＡＭ−ＴＳＬＲ１遺伝子（ｃＤＮＡ）の翻訳開始コドンの１７１５番から１７３６番の塩基配列であり、また、３’側のプライマーはｃＤＮＡの２０４４から２０６５番目の塩基配列の相補鎖である。
【０１３６】
ｃｃｔｇｃｃａｃｃｔｃａａｇｃｃｔｔｇｔｇｇ　（配列番号１１）
ｔｇｃａｇｇｔｇｔｇｔｔａｔｃｇｇｃｔｃｃｃ　（配列番号１２）
ＰＣＲは、ＳＩＧＭＡ社（Ｓａｉｎｔ　Ｌｏｕｉｓ，　Ｍｏ，　ＵＳＡ）製ＲｅａｄｙＭｉｘＴＭ　ＲＥＤＴａｑＴＭ　ＰＣＲ　ＲＥＡＣＴＩＯＮ　ＭＩＸに上記ｃＤＮＡおよび上記ＲＴ−ＰＣＲプライマーを混ぜ、９４℃５分後、９４℃３０秒、６５℃４０秒、７２℃４０秒のサイクルを３０回行って反応させた。
【０１３７】
ＲＴ−ＰＣＲによって得られたｃＤＮＡサンプルを１．５％アガロースゲルにて電気泳動した。その結果、図８に示すように、ＲＴ−ＰＣＲでＡＤＡＭ−ＴＳＬＲ１タンパク質のメッセンジャーＲＮＡが検出されたマウス臓器は、脳、骨髄、７日目胎児、１１日目胎児、１５日目胎児、１７日目胎児、眼、肺、リンパ節、脊髄、脾臓、胃、胸腺、子宮である。腎臓、肝臓、肺、前立腺、唾液腺、平滑筋、精巣については検出感度以下であった。
【０１３８】
【発明の効果】
以上のように、本発明は新規な細胞外マトリックス因子に関するものであり、細胞外マトリックスの機能解析等の研究に有用であるばかりでなく、細胞外マトリックスの形成異常や代謝異常によって生じる疾患、疾病（特に、ＡＤＡＭ−ＴＳＬファミリータンパク質に関わる各種疾患や疾病）の診断薬、治療薬、治療効果を検査するための検査薬、またはこれら薬剤の開発に有効利用できるものである。加えて、細胞外マトリックスは、組織形成を規定する細胞外環境であることから、本発明に係るタンパク質及びその遺伝子等は、再生医学における組織再生や、生体外における人工組織形成に利用できるものである。
【０１３９】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】（ａ）は、本発明に係るＡＤＡＭ−ＴＳＬＲ１タンパク質のアミノ酸配列を、（ｂ）は、ＡＤＡＭ−ＴＳＬＲ１タンパク質のドメイン構造を示す図である。
【図２】（ａ）〜（ｄ）はＡＤＡＭ−ＴＳＬファミリータンパク質のドメイン構造を示す図である。
【図３】実施例において、ＡＤＡＭ−ＴＳＬＲ１−ＥＧＦＰ融合タンパク質を発現するベクターを導入したヒト２９３Ｔの細胞破砕物、および培養液上清のウェスタンブロッティングを示す図である。
【図４】（ａ）・（ｂ）は、実施例において、ＡＤＡＭ−ＴＳＬＲ１−ＥＧＦＰ融合タンパク質を発現するベクターを導入したヒト２９３Ｔの細胞の顕微鏡画像である。
【図５】（ａ）〜（ｃ）は、実施例において、ＡＤＡＭ−ＴＳＬＲ１−ＥＧＦＰ融合タンパク質を含む培養液で培養したマウス初代胎児線維芽細胞を示す顕微鏡画像である。（ａ）はＡＤＡＭ−ＴＳＬＲ１−ＥＧＦＰ融合タンパク質を、（ｂ）はフィブリリンを組織染色しており、（ｃ）は（ａ）と（ｂ）とを合成した画像である。
【図６】実施例において、ＡＤＡＭ−ＴＳＬＲ１−Ｈｉｓ−Ｍｙｃ融合タンパク質を含む培養液で培養したマウス初代胎児線維芽細胞において、ＡＤＡＭ−ＴＳＬＲ１−Ｈｉｓ−Ｍｙｃ融合タンパク質を組織染色した顕微鏡画像である。
【図７】（ａ）は、実施例において、ＡＤＡＭ−ＴＳＬＲ１−ＥＧＦＰ融合タンパク質を固定した培養皿で培養したマウス初代胎児線維芽細胞を、（ｂ）は培養液のみで培養したマウス初代胎児線維芽細胞を示す顕微鏡画像である。
【図８】実施例において、ＡＤＡＭ−ＴＳＬＲ１タンパク質のマウス胚および種々のマウス組織における発現を、ＲＴ−ＰＣＲによって調べた結果を示す電気泳動の画像である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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