【手続補正書】
【提出日】平成24年4月4日(2012.4.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６３】
【図１】Ｂｉａｃｏｒｅ結合アッセイ結果を示す図。
【図２】オリゴマー、ポリマーおよび／または原線維に結合することが判明した化合物の代表的な骨格を示す図。
【図３】ＡＤ−ＣＢ−００１Ｐ−ＷＺ−０１０１９のＵＶおよびガンマＨＰＬＣ分析を示す図。
【図４】チオフラビンＴおよびトレーサを含むチオフラビンＴを用いた脳切片の免疫染色ならびにチオフラビンＴを用いない脳切片の免疫染色を示す図。
【図５】ＦＤＤＮＰおよびトレーサを含むＦＤＤＮＰを用いた脳切片の免疫染色ならびにＦＤＤＮＰを用いない脳切片の免疫染色を示す図。
【図６】１分のフレーミングを使用した白色ラットの脳の冠状断面を示す図。２分後、トレーサ濃度が脳内の最大レベルに達し、７分後に完全に洗い流される。
【図７】アミロイド（ＡＤ患者の脳薄片）を使用したｅｘ  ｖｉｖｏ競合アッセイを示す図。
【図８】ＡＤ脳薄片に対する［１８Ｆ］−ＣＢ００１競合試験は、可逆的斑結合およびＰｉＢとの競合が存在し、白質結合がほとんど／全くないことを実証する図。
【図９】トレーサ特異性を示す最適な染色および洗浄プロトコルを示す図。
【図１０】［１８Ｆ］−ＣＢ００３が、アルツハイマーの脳と正常な脳とを明確に差別化することを示す図。
【図１１Ａ】ＰｉＢおよびＣＢ００３による［１８Ｆ］−ＰｉＢ組織結合の濃度依存性ブロッキングを示す図。
【図１１Ｂ】オートジオグラフィー染色を使用したｅｘ  ｖｉｖｏ競合アッセイによる［１８Ｆ］−ＰｉＢのＩＣ５０濃度を示す図。
【図１２】Ａβ４２不溶性凝集体に対するＣＢ００３結合の動態解析を示す図。
【図１３】Ａβ４２可溶性凝集体に対するＣＢ００３結合の動態解析を示す図。
【図１４】Ａβ４２不溶性凝集体に対するＰｉＢ結合の動態解析を示す図。
【図１５】Ａβ４２可溶性凝集体に対するＰｉＢ結合の動態解析を示す図。
【図１６】Ａβ４２不溶性凝集体に対するＣＢ００４結合の動態解析を示す図。
【図１７】Ａβ４２可溶性凝集体に対するＣＢ００４結合の動態解析を示す図。
【図１８】非常に良好な脳吸収を示すＡｐｐおよびＷＴマウスにおける［１８Ｆ］−ＣＢ−００１によるマイクロＰＥＴ画像を示す図。
【図１９】ＷＴおよびＡｐｐマウスにおける［１８Ｆ］−ＣＢ−００３によるマイクロＰＥＴ画像を示す図。
【図２０】ＷＴおよびＡｐｐマウスにおける［１８Ｆ］−ＣＢ−００３によるマイクロＰＥＴ画像を示す図。
【図２１】ＷＴおよびＡｐｐマウスにおける、ＷＴに対するＡｐｐのＢ／Ｍ増加率％を示す図。
【図２２】ＷＴおよびＡｐｐマウス脳における［１８Ｆ］ＰｉＢの脳洗浄を示す図。
【図２３】ＷＴおよびＡｐｐマウス脳における［１８Ｆ］−ＣＢ００３の脳洗浄を示す図。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６５】
可溶性ＡＤオリゴマー、ポリマーおよび原線維に結合する様々な化合物をスクリーニングするために、金表面固定標的タンパク質に対してスクリーニングリガンドを導入し、得られた結合および分離速度を測定するＢｉａｃｏｒｅ計測器を使用して、アッセイを展開した。図１において、曲線の左側の部分は、特定の基質に対するリガンドの結合を表す。曲線の右側の部分は、基質からのリガンドの分離を表す。対照リガンドと比べて迅速に結合し、緩慢に分離したリガンドが対象であると見なされた。
図１：Ｂｉａｃｏｒｅ結合アッセイ結果。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６６】
数百種の化合物を同様にしてスクリーニングし、いくつかの共通の化合物類を、７つの共通のケモタイプ、すなわちフラボン、クマリン、カルバゾール、キノリノン、クロメノン、イミダゾールおよびトリアゾールに分けられる対象として識別した。
図２：オリゴマー、ポリマーおよび／または原線維に結合することが判明した化合物の代表的な骨格。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８０】
放射能検出器を備えた分析ＨＰＬＣによって純度を測定し、対応する非標識参照標準のＨＰＬＣデータとの比較によって個性を確認した。
図３．ＡＤ−ＣＢ−００１Ｐ−ＷＺ−０１０１９のＵＶおよびガンマＨＰＬＣ分析。
【化１７】
2011512354.tif 000001
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０１】
チフラビンＴによる脳切片の免疫染色。アルツハイマー病のドナーからの脳サンプルを、固定後パラフィンワックス浸透させた。脳サンプルが埋め込まれたパラフィンブロックをミクロトーム上に載せ、薄片に切断した。次いで、切片を脱パラフィンし、水和させた後、ＡＤ−ＣＢ−００１Ｓ−ＷＺ０１０１３を用いて、または用いずにインキュベートした。１ｕＭのチオフラビンＴを用いて染色を行った。蛍光顕微鏡で画像を得た。
図４：チオフラビンＴおよびトレーサを含むチオフラビンＴを用いた脳切片の免疫染色ならびにチオフラビンＴを用いない脳切片の免疫染色。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０２】
ＦＤＤＮＰを用いた脳切片の染色。アルツハイマー病のドナーからの脳サンプルを、固定後パラフィンワックス浸透させた。脳サンプルが埋め込まれたパラフィンブロックをミクロトーム上に載せ、薄片に切断した。次いで、切片を脱パラフィンし、水和させた後、ＡＤ−ＣＢ−００１Ｓ−ＷＺ０１０１３を用いて、または用いずにインキュベートした。１ｕＭのＦＤＤＮＰを用いて染色を行った。蛍光顕微鏡で画像を得た。
図５：ＦＤＤＮＰおよびトレーサを含むＦＤＤＮＰを用いた脳切片の免疫染色ならびにＦＤＤＮＰを用いない脳切片の免疫染色。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０３】
ＡＤ−ＣＢ−００１の造影結果
白色スプラーグドーリーラットに、１０％ＥｔＯＨ：水にて配合された約８５０ｕＣｉのＡＤ−ＣＢ−００１を尾の静脈から注射した。動的走査をＲ４マイクロＰＥＴスキャナで３０分間実施した。１分のフレーミングを使用してデータを再構築した。数分以内で、トレーサがラットの脳に入り、迅速に洗い流された。
図６：１分のフレーミングを使用した白色ラットの脳の冠状断面。２分後、トレーサ濃度が脳内の最大レベルに達し、７分後に完全に洗い流される。
【化２５】
2011512354.tif 000002
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３２】
図７：アミロイド（ＡＤ患者の脳薄片）を使用したｅｘ  ｖｉｖｏ競合アッセイ。
オートラジオグラフィー染色
［１８Ｆ］−ＣＢ−００１によるＡＤ患者の脳のアミロイドオートグラフィー染色（ｅｘ  ｖｉｖｏ）は、アミロイド結合が良好であり、白質結合がほとんど／全くないことを示している。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３３】
図８：ＡＤ脳薄片に対する［１８Ｆ］−ＣＢ００１競合試験は、可逆的斑結合およびＰｉＢとの競合が存在し、白質結合がほとんど／全くないことを実証している。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３７】
それらの結果は、１）濃度の増加に伴ってＰｉＢが［１８Ｆ］−ＣＢ００１染色を阻止し、それにより、２つの化合物が同一のアミロイド結合ポケットをめぐって競合することが示唆され；２）ＰｉＢが、低温ＣＢ００１と同じ強度でトレーサ結合を阻止し、それにより、双方が類似した結合親和性を有することが示唆され；３）ＦＤＤＮＰが、そのより低いアミロイド結合親和性のために、［１８Ｆ］−ＣＢ００１染色を阻止する能力がはるかに小さいことを実証するものである。
図９：トレーサ特異性を示す最適な染色および洗浄プロトコル。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３８】
このデータは、以下の順序の（非特異的）白質結合を示唆している：
ＦＤＤＮＰ＞ＣＢ００１＞［１８Ｆ］−ＰｉＢ＞ＣＢ００３
図１０：［１８Ｆ］−ＣＢ００３は、アルツハイマーの脳と正常な脳とを明確に差別化する。
図１１Ａ：ＰｉＢおよびＣＢ００３による［１８Ｆ］−ＰｉＢ組織結合の濃度依存性ブロッキング。
図１１Ｂ：オートジオグラフィー染色を使用したｅｘ  ｖｉｖｏ競合アッセイによる［１８Ｆ］−ＰｉＢのＩＣ５０濃度。
【表７】
2011512354.tif 000003
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２４１】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイ
可溶性ＡＤオリゴマー、ポリマーおよび原線維に結合する様々な化合物を試験するために、金表面固定票的タンパク質にリガンドを導入し、得られた結合速度および解離速度を測定するＢｉａｃｏｒｅ測定器を使用してアッセイを展開した。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２４２】
カルバゾール類は、また、可溶性凝集体（２６２ｎＭ）より不溶性凝集体（９ｎＭ）に対して有利かつ優先的に結合する独自の驚くべき能力を示した。ＰｉＢは、また、不溶性凝集体（１６ｎＭ）に対して十分に結合するばかりでなく、可溶性凝集体（４８ｎＭ）に対しても本質的に等しく結合する。トレーサの不溶性凝集体に対する結合と可溶性凝集体に対する結合とを差別化することが好適である造影用途では、ＣＢ−００３が与える結合比はより大きく２９：１であるのに対して、ＰｉＢが与える比はわずかに３：１である。したがって、ＣＢ−００３は、ＰｉＢと比べてより選択的な結合情報を与えることができる。それらの結果は、１）可溶性凝集体結合ではＰＩＢ＞ＣＢ３＞ＣＢ４＞であり；２）不溶性凝集体結合では、ＰＩＢ＝ＣＢ３＞ＣＢ４であることを示している。
図１８：ＡｐｐおよびＷＴマウスにおける［１８Ｆ］−ＣＢ−００１によるマイクロＰＥＴ画像は非常に良好な脳吸収を示す。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２４３】
図１９：ＷＴおよびＡｐｐマウスにおける［１８Ｆ］−ＣＢ−００３によるマイクロＰＥＴ画像。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２４４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２４４】
それらの結果は、１）ＷＴマウスとＡｐｐマウスが脳におけるトレーサ滞留時間に統計的に有意な差を示し；２）Ａｐｐマウスが、ＷＴマウスと比較して２５％大きい脳／筋肉比を示すことを実証している。カルバゾールは、（ＷＴおよびＡＰＰの両方について）マウス脳への驚くほど大きい吸収を示すとともに、ＡＰＰマウスからＷＴマウスを区別できるように十分に遅い洗浄を示す。本明細書に提示されている理論に束縛されることなく、これらの結果の背景にある理由は、ＣＢ−００３が、１８Ｆ−ＰｉＢより速い洗浄速度を有するためであると考えられ、それは染色データと一致する。１８Ｆ−ＰｉＢは、合理的な灰質対白質比を得るために、過酷な洗浄条件を必要とする。ＣＢ−００３の迅速な洗浄は、恐らくはその小さい非特異的結合の主な要因であるが、洗浄は、ＷＴをＡＰＰと差別化するのに十分に遅い。これは、カルバゾールが、先行技術のデータから明らかでないヒトＡＤ脳における優れた洗浄および滞留特性の独自の組合せを示すことを示唆するものである。中性化合物であるＣＢ−００３は、また、メチレンブルーなどの両性イオン系造影剤と比較してより大きい吸収値を潜在的に有することになる。
ＷＴおよびＡｐｐマウス脳における［１８Ｆ］ＰｉＢと［１８Ｆ］−ＣＢ−００３を比較すると、［１８Ｆ］−ＣＢ−００３の脳洗浄の方が［１８Ｆ］ＰｉＢの場合よりはるかに速いことがわかる：
図２２：［１８Ｆ］ＰｉＢ
図２３：［１８Ｆ］−ＣＢ００３
【手続補正１６】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
2011512354.tif 000004
【図２】
2011512354.tif 000005
【図３−１】
2011512354.tif 000006
【図３−２】
2011512354.tif 000007
【図４】
2011512354.tif 000008
【図５】
2011512354.tif 000009
【図６】
2011512354.tif 000010
【図７】
2011512354.tif 000011
【図８】
2011512354.tif 000012
【図９】
2011512354.tif 000013
【図１０】
2011512354.tif 000014
【図１１Ａ】
2011512354.tif 000015
【図１１Ｂ】
2011512354.tif 000016
【図１２】
2011512354.tif 000017
【図１３】
2011512354.tif 000018
【図１４】
2011512354.tif 000019
【図１５】
2011512354.tif 000020
【図１６】
2011512354.tif 000021
【図１７】
2011512354.tif 000022
【図１８】
2011512354.tif 000023
【図１９】
2011512354.tif 000024
【図２０】
2011512354.tif 000025
【図２１】
2011512354.tif 000026
【図２２】
2011512354.tif 000027
【図２３】
2011512354.tif 000028