(57)【要約】【課題】本発明の目的は、細胞の剥離、足場の加工、形成等の複雑な操作を不要とし、細胞移植治療を簡便に実施できる細胞含有組成物を提供することにある。また、移植操作の際に細胞への悪影響を極力排除する細胞含有組成物を提供することにある。【解決手段】上記課題を解決するため、本発明の組織再生用組成物は、流動性媒体と、流動性媒体中に浮遊し生体吸収性材料から形成されてなるマイクロ粒子と、該マイクロ粒子の表面に接着した細胞とを含んでなり、全体が流動性を有することを特徴とする組織再生用組成物である。細胞をマイクロ粒子の表面で増殖、または標的細胞へ分化誘導させるので、細胞はマイクロ粒子とともに流動性を維持しており、そのまま生体に注入して細胞移植することができる。これにより、細胞剥離、中和、足場の加工等の煩雑な細胞操作がなくなるとともに細胞に対する悪影響も回避できる。【選択図】　　　　　図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
流動性媒体と、流動性媒体中に浮遊し生体吸収性材料から形成されてなるマイクロ粒子と、該マイクロ粒子の表面に接着した細胞とを含んでなり、全体が流動性を有することを特徴とする組織再生用組成物。
【請求項２】
マイクロ粒子の直径が、１０〜２０００μｍの範囲にある請求項１記載の組織再生用組成物。
【請求項３】
マイクロ粒子が、多孔体である請求項１または２記載の組織再生用組成物。
【請求項４】
生体吸収性材料が、脂肪族ポリエステルである請求項１〜３の何れかの項に記載の組織再生用組成物。
【請求項５】
脂肪族ポリエステルからなるマイクロ粒子の表面にコラーゲンまたはゼラチンが被覆されてなる請求項４記載の組織再生用組成物。
【請求項６】
生体吸収性材料が、コラーゲンである請求項１〜３の何れかの項に記載の組織再生用組成物。
【請求項７】
生体吸収性材料が、キトサンである請求項１〜３の何れかの項に記載の組織再生用組成物。
【請求項８】
細胞が胚性幹細胞、胚性生殖細胞または体性幹細胞である請求項１〜７の何れかの項に記載の組織再生用組成物。
【請求項９】
細胞が骨細胞またはその前駆細胞である請求項１〜７の何れかの項に記載の組織再生用組成物。
【請求項１０】
細胞が軟骨細胞またはその前駆細胞である請求項１〜７の何れかの項に記載の組織再生用組成物。
【請求項１１】
細胞が筋細胞またはその前駆細胞である請求項１〜７の何れかの項に記載の組織再生用組成物。
【請求項１２】
細胞が心筋細胞またはその前駆細胞である請求項１〜７の何れかの項に記載の組織再生用組成物。
【請求項１３】
細胞が神経細胞またはその前駆細胞である請求項１〜７の何れかの項に記載の組織再生用組成物。
【請求項１４】
細胞が腱細胞またはその前駆細胞である請求項１〜７の何れかの項に記載の組織再生用組成物。
【請求項１５】
細胞が脂肪細胞またはその前駆細胞である請求項１〜７の何れかの項に記載の組織再生用組成物。
【請求項１６】
細胞が膵細胞またはその前駆細胞である請求項１〜７の何れかの項に記載の組織再生用組成物。
【請求項１７】
細胞が肝細胞またはその前駆細胞である請求項１〜７の何れかの項に記載の組織再生用組成物。
【請求項１８】
細胞が腎細胞またはその前駆細胞である請求項１〜７の何れかの項に記載の組織再生用組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、組織再生の目的部位に、安全かつ簡易に注入することができる流動性のある細胞含有組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、細胞生物学や細胞工学の進歩により、生体から取り出した多分化能と自己複製能を持つ細胞（幹細胞）を患者に移植して治療を行う再生医療の研究が急速に進められている。これは標的細胞へ分化誘導をかけた幹細胞を生体組織の欠損部や疾患の責任病巣部位へ移植して目的組織（臓器）を修復・回復させる治療法である。現在はまだ基礎的研究の段階であるが、臨床試験も国内外の一部の医療機関で試みられ始めている。既存の細胞移植手法は、培養した未分化の細胞または分化させた細胞集団を組織損傷部位へ移植するために、その損傷部位の形状に合わせた足場を形成した上で、主に外科手術によって移植するものである。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
上述した従来の細胞移植方法では、移植部位への足場の加工、形成が必要なために外科手術を必要とし、将来、一般臨床への応用を考えると、患者（特に高齢者、長期罹患患者、障害者）への身体的、精神的負担は軽減できない。そこで、将来的には移植細胞を直接生体内に注入する手法が検討されている。また、既知の方法では、培養容器内で増殖させ容器の壁に接着している細胞を、トリプシン等の蛋白分解酵素やエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などの薬剤で処理して剥離し、次いで中和・洗浄などの工程を経て、さらに標的臓器（組織）の形状に加工した足場を作成して生体移植することになる。
【０００４】
しかし、上述した方法では、細胞操作の工程が煩雑であるだけでなく、周囲からの汚染（コンタミネーション）を防止するために、清潔な環境下で高度な技術を使って施行される必要がある。このため、設備の整った施設以外では細胞移植治療を実施するのが難しい。また、細胞をトリプシンやＥＤＴＡなどで処理する操作は、薬物の細胞に対する悪影響もあり、これら細胞の継代操作は細胞の老化（テロメアの短縮）を惹起し、細胞移植後に移植細胞の生存率が低下する危険性も考えられる。
【０００５】
本発明の目的は、細胞の剥離、足場の加工、形成等の複雑な操作を不要とし、細胞移植治療を簡便に実施できる細胞含有組成物を提供することにある。また、本発明の他の目的は、移植操作の際に細胞への悪影響を極力排除する細胞含有組成物を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明においては、細胞の足場として生体吸収性材料からなるマイクロ粒子を使用することにより、前述した目的を達成した。すなわち本発明は、流動性媒体と、流動性媒体中に浮遊し生体吸収性材料から形成されてなるマイクロ粒子と、該マイクロ粒子の表面に接着した細胞とを含んでなり、全体が流動性を有することを特徴とする組織再生用組成物である。
【０００７】
本発明においては、細胞をマイクロ粒子の表面で増殖、または標的細胞へ分化誘導させるので、細胞はマイクロ粒子とともに流動性を維持しており、そのまま生体に注入して細胞移植することができる。また、マイクロ粒子は生体吸収性材料から形成されているので、生体注入後所定期間が経過すると生体に吸収されて消失する。したがって、細胞剥離、中和、足場の加工等の煩雑な細胞操作がなくなるとともに細胞に対する悪影響も回避できる。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明において使用する生体吸収性材料からなるマイクロ粒子は、直径が１０〜２０００μｍの範囲にあることが好ましく、５０〜５００μｍの範囲が特に好ましい。また、マイクロ粒子は、細胞が侵入するのに十分な孔径の細孔を有する多孔体であることが好ましい。多孔体であることによって表面積が増大し、多数の細胞をマイクロ粒子の表面に接着させることができる。
【０００９】
本発明においては、以下に述べる理由から、流動性媒体として細胞の培養液を使用するのが好ましい。すなわち、細胞をマイクロ粒子表面に接着させ、増殖培地、分化誘導培地内で培養し、その各培養液をそのまま本発明の組織再生用組成物として使用することができる。また、流動性媒体としては、培養液以外の液（生理食塩水、リン酸緩衝液など）を使用することもできるが、その場合は、細胞培養後に培養液と置換する必要がある。
【００１０】
【実施例】
本発明において使用するマイクロ粒子は生体吸収性材料から形成されてなるが、好ましい生体吸収性材料としては、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸−グリコール酸共重合体、乳酸−カプロラクトン共重合体、グリコール酸−カーボネート共重合体、ポリジオキサノン、キトサン、架橋ヒアルロン酸、アルギン酸、コラーゲン及びゼラチンをあげることができる。これらの材料は、単独で使用してもよいし複数の材料を組合せて使用することもできる。また、細胞の接着性を向上させるために、粒子の表面を細胞接着性の良好な材料で被覆することもできる。そのようなコーティング材料としてはゼラチン及びコラーゲンが好ましい。最も好ましい組み合わせは、マイクロ粒子本体を、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸−グリコール酸共重合体、乳酸−カプロラクトン共重合体、グリコール酸−カーボネート共重合体、ポリジオキサノンなどの合成吸収性材料でつくり、その表面をゼラチンまたはコラーゲンで被覆したものである。この構成だと粒子自体の機械的強度が良好で細胞の接着性も良好になる。
【００１１】
上述した材料からマイクロ粒子を作るには、材料を溶媒に溶解した液を噴霧し溶媒を蒸発させることにより製造することができる。また、材料溶液を乳化させ次いで溶媒を蒸発させてマイクロ粒子を製造する方法、および原料を乳化させ、それを重合させてマイクロ粒子を製造する乳化重合によっても製造することができる。
【００１２】
マイクロ粒子を多孔性にする方法としては、材料溶液を乳化させて凍結し、次いで溶媒を蒸発させる凍結乾燥法による方法をあげることができる。また、材料と食塩や糖などの微粒子からなる造孔剤を混合してマイクロ粒子を作製し、次いで造孔剤を溶解除去して多孔性にする方法もある。
【００１３】
本発明において使用する細胞種にとくに制限はないが、胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ：ＥＳ細胞）、胚性生殖細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｇｅｒｍ　ｃｅｌｌ：ＥＧ細胞）、体性幹細胞（ａｄｕｌｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ：成人幹細胞；ＡＳ細胞）などの幹細胞および骨細胞、軟骨細胞、筋細胞、心筋細胞、神経細胞、腱細胞、脂肪細胞、膵細胞、肝細胞、腎細胞などの分化した細胞またはその前駆細胞をあげることができる。また、これらの細胞を遺伝子工学的手法により改変した遺伝子改変細胞も好ましく用いられる。
【００１４】
本発明の組織再生用組成物を製造するには、細胞をマイクロ粒子上に播種し、培養液中で培養すればよい。細胞の培養は既知の方法により実施することができる。すなわち、生体から細胞を分離・精製し、目的とする細胞を選別した後、必要に応じて細胞増殖因子を添加して増殖または標的細胞への分化誘導をかけて、培養液中で培養する。また、細胞増殖因子など細胞の増殖に必要な成分をマイクロ粒子に含有させ、これら成分を徐放するようにしてもよい。培養はインキュベータ内で実施するのが好ましい。得られた組織再生用組成物は、所定の容器に収納して、保存に適した条件で治療に必要となるまで保存する。保存は低温で行うのが好ましいが、短期間であれば常温または加温下で実施することもできる。
【００１５】
本発明の組織再生用組成物を保存する容器は、内面が細胞の接着しにくい材料で形成されたものが好ましい。細胞の接着しにくい材料としては、表面の対水接触角が４０度以下の親水性材料または対水接触角が１００度以上の疎水性材料が好ましい。また、容器の構造を、注射器を兼ねた構造にすれば、本発明の組織再生用組成物を、容器からそのまま生体に注入できるので便利である。
【００１６】
本発明の組織再生用組成物は、生体患部に注入することにより、変形性関節症、慢性関節リュウマチ、偽関節、歯周病、進行性筋ジストロフィー症、心筋梗塞、脳血管障害、パーキンソン病、脊髄損傷、腱損傷、糖尿病、肝機能障害、消化器機能不全、皮膚損傷、白血病、血液系疾患などに対する治療に利用できる。さらに具体的に言えば、変形性関節症の患者への軟骨細胞またはその前駆細胞の注入、歯周病患者への骨細胞またはその前駆細胞の注入、パーキンソン病患者の脳への神経細胞またはその前駆細胞の注入及び心臓病患者への心筋細胞またはその前駆細胞の注入などである。
【００１７】
図１には、本発明の組織再生用組成物の実施例を部分的に拡大して示す。図において、１は流動性媒体中に分散したマイクロ粒子であり、生体吸収性材料から形成されている。また、２はマイクロ粒子の表面に接着した細胞であり、治療の目的に応じて、前述したさまざまの細胞種を使用する。
【００１８】
【発明の効果】
本発明の組織再生用組成物は流動性を有しており、細胞が生体吸収性材料から形成されたマイクロ粒子に接着しているので、細胞を足場から剥離することなく、そのまま生体に注入して細胞移植を実施することができる。したがって、培養容器からの細胞の剥離操作や中和・洗浄操作が不要になり、治療に用いる場合に操作が簡単で安全性も高い。
【００１９】
また、培養容器から細胞を剥離する細胞操作過程が不要となり、剥離のための薬剤による細胞へ悪影響を回避し安全性を高めることができ、移植後の高い細胞生存率を達成することも可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の組織再生用組成物の実施例を示す模式図。
【符号の説明】
１．マイクロ粒子
２．細胞
【図１】
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