(57)【要約】      （修正有）【課題】リポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素の結晶構造およびその阻害剤を提供する。【解決手段】リポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素の結晶を作成しそのＸ線回折から該酵素の三次元立体構造を得ることにより該酵素の阻害剤を設計、選択することができる。また、同酵素の阻害剤及びそのスクリーニング方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
マウスに由来するリポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素の結晶。
【請求項２】
結晶が斜方晶系の空間群Ｐ２１２１２１を有し、単位格子がａ＝４６．２±０．５Å、ｂ＝６６．８±０．７Å、ｃ＝１０５．３±１．０Åの大きさを有する請求項１に記載の結晶。
【請求項３】
結晶が斜方晶系の空間群Ｃ２２２１を有し、単位格子がａ＝４５．７±０．５Å、ｂ＝６６．８±０．７Å、ｃ＝１０４．５±１．０Åの大きさを有する請求項１に記載の結晶。
【請求項４】
表２の構造座標で表わされる３次元立体構造を有するリポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素。
【請求項５】
表３の構造座標で表わされる３次元立体構造を有するリポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素。
【請求項６】
リポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素を阻害する化合物の選定における表２又は表３の構造座標の使用。
【請求項７】
リポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素の阻害剤の選定方法であって、
（ａ）リポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素の立体構造を表わす表２又は表３の３次元構造座標を提供し；
（ｂ）候補化合物の立体構造を提供し；
（ｃ）リポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素の基質結合部位に適合する候補化合物を阻害剤として選択する；
ことを含む方法。
【請求項８】
（ｄ）選択された阻害剤をプロスタグランジンＨ２の存在下にリポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素と接触させて、該酵素の活性を測定し該候補化合物の阻害効果を確認することを更に含む請求項７に記載の方法。
【請求項９】
請求項７又は８に記載の方法により選定されたリポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素の阻害剤。
【請求項１０】
4-ジベンゾ(a, d)シクロヘプテン-5-イリデン-1-(4-(２H-テトラゾール-5-イル) ブチル)ピペリジンよりなるリポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素の阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はリポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素（以下「Ｌ−ＰＧＤＳ」という場合がある）の３次元立体構造及び、該３次元立体構造を用いるＬ−ＰＧＤＳの阻害剤の選定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
プロスタグランジン（ＰＧ）Ｄ２は様々な組織で活発に産生され、多くの生理学的事象に関与する。中枢神経系においてＰＧＤ２はＤＰ受容体依存様式で非眼球急速運動性（ノンレム）睡眠を促進し、痛感性の反応を制御する。ＰＧＤ２は、マスト細胞、好塩基球、及びＴヘルパータイプ２細胞によっても活発に産生され、ＤＰ及びＣＲＴＨ２受容体を介してアレルギー媒介物として作用する。ＰＧＤ２は９α，１１β−ＰＧＦ２及びＰＧＪ２、Δ１２−ＰＧＪ２，及び１５−デオキシ−Δ１２，１４−ＰＧＪ２等のプロスタグランジンのＪシリーズに変換される。これらのプロスタグランジン類は生物学的システムにおいてＰＧＤ２とは全く異なる性質を有する。１５−デオキシ−Δ１２，１４−ＰＧＪ２は、ＰＰＡＲγ、即ち脂肪細胞、マクロファージ、及び単球の分化に関与する核内受容体のリガンドとして作用し、ＮＦ−κＢ及びＡＰ−１依存性の遺伝子発現を阻害する。
アラキドン酸カスケードは、ミクロソーム酵素、ＰＧＨ２シンターゼ（シクロオキシゲナーゼ、ＣＯＸ）から出発し、該酵素は細胞膜の脂質二重層から供給されるアラキドン酸からＰＧＨ２を産生する。９，１１−エンドパーオキサイド基を有するＰＧＨ２は不安定であり、水溶液中で自発的に分解して主に９−ケト及び１１−ヒドロキシ基を有するＰＧＥ２に異性化される。ＰＧＥ２のレジオイソマーである９−ヒドロキシ及び１１−ケト基を有するＰＧＤ２はＰＧＤシンターゼ（ＰＧＤＳ，プロスタグランジンＨ２Ｄイソメラーゼ[ＥＣ５．３．９９．２]）によりＰＧＨ２から産生される。
【０００３】
ＰＧＤＳは２つの遺伝的に異なるタイプからなり、１つは造血器型酵素(Ｈ−ＰＧＤＳ）であり、他はリポカリン型酵素（Ｌ−ＰＧＤＳ）である(Y. Urade and O. Hayaishi, Vitamins Hormones 58:89-120 (2000))。Ｈ−ＰＧＤＳは分子量２６ＫＤａを有するグルタチオン依存性酵素である。それは造血器の抗原提示細胞及びマスト細胞に局在している。進化論的及び結晶学的分析によりＨ−ＰＧＤＳはグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）のシグマクラスであることが明らかになった。一方、Ｌ−ＰＧＤＳは分子量２６ＫＤａで、Ｈ−ＰＧＤＳと同じ分子量を有するグルタチオン非依存性酵素であるが、そのアミノ酸配列、遺伝子構造、進化的起源、細胞局在性はＨ−ＰＧＤＳとは全く異なる。
【０００４】
Ｌ−ＰＧＤＳは様々な分泌性タンパク質からなるリポカリン遺伝子ファミリーのメンバーであり、脈絡叢、くも膜及び中枢神経系の希突起膠細胞に局在する (Y. Urade and O. Hayaishi, Biochim. Biophys. Acta, 1482:259-271 (2000))。Ｌ−ＰＧＤＳノックアウトマウスはＰＧＥ２及びγ−アミノ酪酸により誘導される異疼痛、接触で生ずる痛みを欠いており（Eguchi et al., Proc. Natl. Acad.Sci. USA, 96:726-730 (1998）)、睡眠を奪った後のリバウンドとしてのノンレム睡眠が少ない（Eguchi et al., The 3rd International Conference on Oxygen and Life, Kyoto Vol. 1233C:429-433 (2002))。また高脂肪食を負荷することにより誘発される心臓肥大が軽度である。またヒトＬ−ＰＧＤＳ過剰発現マウスは、脳におけるＰＧＤ２の増加と同時に起こる、痛覚刺激後の過剰量のノンレム睡眠を示す(Pinzar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97:4903-4907 (2000))。Ｌ−ＰＧＤＳは中枢神経系においてＰＧＤ２を製造することによって疼痛感及びノンレム睡眠の調節に寄与すると考えられる。さらに、ヒトＬ−ＰＧＤＳ過剰発現マウスは、アレルギー性気道炎症が亢進（Fujitani et al., J. Immunol,168:443-449 (2002))している。また、L-PGDSは多発性硬化症(Chabas et al., Science, 294:1731-1735 (2001))、タイ−サックス病やサンドホッフ病(Myerowitzet al., Hum. Mol. Genet, 11:1343-1350 (2002))等の神経変性疾患患者の脳内で遺伝子発現の亢進が認められる。さらに安定狭心症患者の冠状動脈の動脈硬化巣でＬ−ＰＧＤＳの発現が認められる(Eguchi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:14689-14694(1997))。
従ってＬ−ＰＧＤＳの阻害剤を見出すことができれば、該阻害剤は新しいタイプの鎮痛剤、睡眠調節剤、抗アレルギー剤、神経変性疾患治療薬、動脈硬化防止剤、心臓肥大防止剤等として用い得ることが期待できる。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、Ｌ−ＰＧＤＳの立体構造を明かにして、その立体構造を用いてＬ−ＰＧＤＳの阻害剤を設計、探索する方法を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明は、マウスに由来するリポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素の結晶を提供する。マウスのリポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素は配列番号１のアミノ酸配列を有する。配列番号１において１〜２４位のアミノ酸はシグナルペプチドであるのでこの部分を除いたタンパク質を用いるのが好ましい。またマウスＬ−ＰＧＤＳには、６５、８９、１８６に３つのシステインを含むので、組換え法でＬ−ＰＧＤＳを製造する場合、天然の８９及び１８６間ジサルファイド結合以外のジサルファイド結合の形成を避けるため６５位のシステインをアラニンで置換することが結晶構造の解明のため好ましい。このような置換を行い、シグナルペプチド部分を除いたＬ−ＰＧＤＳを以下で「天然型Ｃｙｓ６５Ａｌａ
Ｌ−ＰＧＤＳ」又は単に「天然型Ｌ−ＰＧＤＳ」と称することがある。
この天然型Ｌ−ＰＧＤＳから得られる結晶は、斜方晶系の空間群Ｐ２１２１２１を有し、単位格子がａ＝４６．２±０．５Å、ｂ＝６６．８±０．７Å、ｃ＝１０５．３±１．０Åの大きさを有する。結晶学的な非対称単位中に２分子のＬ−ＰＧＤＳが存在する。
【０００７】
他の１態様の結晶は、シグナルペプチド部分を除き、Ｃｙｓ６５Ａｌａの置換のほかに、６４、９４、及び１４５位のメチオニンをセレノメチオニンに置換したＬ−ＰＧＤＳ（このようなＬ−ＰＧＤＳを以下で「Ｓｅ−Ｍｅｔ型Ｌ−ＰＧＤＳ」と称することがある）より製造する。このＳｅ−Ｍｅｔ型Ｌ−ＰＧＤＳから得られる結晶は斜方晶系の空間群Ｃ２２２１を有し、単位格子がａ＝４５．７±０．５Å、ｂ＝６６．８±０．７Å、ｃ＝１０４．５±１．０Åの大きさを有する。結晶学的な非対称単位中に１分子のＬ−ＰＧＤＳが存在する。
【０００８】
本発明は、表２の構造座標で表わされる３次元立体構造を有するリポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素に関する。この構造座標は上記「天然型Ｌ−ＰＧＤＳ」の結晶のＸ線構造解析より得られたものである。
本発明は、表３の構造座標で表わされる３次元立体構造を有するリポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素にも関する。この構造座標は上記「Ｓｅ−Ｍｅｔ型Ｌ−ＰＧＤＳ」の結晶のＸ線構造解析より得られたものである。
天然型Cys65Ala  L-PGDSとSe-Met型L-PGDSの結晶構造は、野生型  L-PGDSの立体構造と以下の理由により相同であると無理なく推定できる。すなわち（i）天然型Cys65Ala  L-PGDSの結晶構造によって、PGDS反応の触媒機構を無理なく説明できる。(ii)PGH2という異なる分子と相互作用することから明らかなように、65番目のシステイン残基の側鎖は蛋白質内腔の表面に露出し、またPGDS活性を有する野生型L-PGDSにおいては、65番目のシステイン残基の側鎖は蛋白質骨格の要素であるジスルフィド結合の形成に関与していない。(iii)さらに蛋白質骨格の要素であるジスルフィド結合を欠くCys89,189Ala変異体であっても、構造の表現形である酵素活性を保持していることは、L-PGDSのバレル構造はそれ自体が強固で、天然型Cys65Ala  L-PGDSの構造もアミノ酸置換によって大きく変化しないことを示唆している。(iv) Se-Met型L-PGDSの立体構造は天然型Cys65Ala  L-PGDSの立体構造と相同である。
【０００９】
表２及び３はプロテインデータバンク（Protein Data Bank, http://www.rcsb.org/pdb/、アメリカ）所定の書式に従って原子の３次元構造座標を表示している。第１列のＡＴＯＭはタンパク質を構成する原子であることを示し、第２列は蛋白質を構成する１番のアミノ酸から順に、原子ごとに連続してつけた番号であり、第３列は蛋白質を構成する原子の種類を示す。例えば、Ｃα炭素原子はＣＡ，アミド窒素原子はＮ，カルボニル炭素原子はＣ，カルボニル酸素原子はＯと表記される。第４列はアミノ酸の種類を３文字表記法で示す。第５列は分子の種類を示す。第６列はアミノ酸配列における位置番号を示す。第７〜９列は順に３次元構造座標Ｘ，Ｙ，Ｚを示す。第１０列は占有率と呼ばれる項で通常は１である。第１１列は温度因子であり、第１２列は表２においては原子の種類を、表３においては分子の種類を示す。
【００１０】
これらの構造座標を使用するとＬ−ＰＧＤＳの阻害剤を選定することができる。即ち本発明は、リポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素の阻害剤の選定における表２又は３の構造座標の使用に関する。
本発明はリポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素の阻害剤の選定方法であって、
（ａ）リポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素の立体構造を表わす表２又は表３の３次元構造座標を提供し；
（ｂ）候補化合物の立体構造を提供し；
（ｃ）リポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素の基質結合部位に適合する候補化合物を阻害剤として選択する；
ことを含む方法に関する。
【００１１】
L-PGDSの「基質結合部位」とは、配列番号１のL-PGDSのアミノ酸配列で、３９位、４３−４８位、５４位、６５−６７位、７７−８３位、９０−９６位、１０３−１０７位、１１６−１２０位、１２９−１３３位、１４３−１４９位、１８０位のアミノ酸残基で規定される中空の構造の内側の空間を言う。これらの領域には、アミノ酸が１ないし５個程度前後したものも含まれる。
「適合する」とは、候補化合物の全体又は部分が、上記の基質結合部位の全体又は部分に形状的及びエネルギー的に安定に結合することを言う。その結果、Ｌ−ＰＧＤＳへの基質の結合が妨げられる。
【００１２】
好ましい態様では上記のようにして選択された阻害剤をプロスタグランジンＨ2の存在下にＬ−ＰＧＤＳと接触させてＬ−ＰＧＤＳの活性を測定し、選択された阻害剤の阻害効果を確認する。
【００１３】
本発明の方法によりＬ−ＰＧＤＳの新規阻害剤が発見された。即ち本発明は、4-ジベンゾ(a, d)シクロヘプテン-5-イリデン-1-(4-(2H-テトラゾール-5-イル) ブチル)ピペリジンよりなるリポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素の阻害剤にも関する。
【００１４】
【発明の実施の形態】
【００１５】
（Ｉ）Ｌ−ＰＧＤＳの立体構造、基質結合部位及び反応機構
（ｉ）Ｌ−ＰＧＤＳの全体の立体構造
Ｌ−ＰＧＤＳの結晶構造は典型的なリポカリンの折りたたみを示し、８つのストランドの逆平行βバレル、３つのαヘリックス領域、及びＣ末端ストランドよりなる（図１Ａ）。そのバレルは４０ｘ３０ｘ３５Åの大きさであり、杯状部分の外側でＣｙｓ８９／１８６の保存されたジスルフィド結合でストランド間を架橋している。そのタンパク質の外表面は荷電又は極性のアミノ酸残基よりなる。推定のリガンド入り口の分子表面は静電的に正で、負に荷電した酵素の基質ＰＧＨ２及びその生成物ＰＧＤ２を吸引する(図１Ｂ）。
【００１６】
L−PGDSのアミノ酸配列を三次元構造を考慮して公知の多様なリポカリンのアミノ酸配列とアライメントした（図２）。Ｌ−ＰＧＤＳはカーネルタイプのリポカリンであると分類され、３つの構造的に保存された領域（ＳＣＲ）１，２及び３を有する。これらのＳＣＲはＬ−ＰＧＤＳ分子のバレルの閉じた末端を構成し、Ｎ−末端ヘリックス１並びにストランドＡ，ストランドＦ及びＧ，及びストランドＨよりなる。ヘリックス１はバレルの閉じた末端近くに位置し、その疎水性相互作用によりバレル構造を安定化すると考えられる。Ｌ−ＰＧＤＳの分子表面でさえも、ＳＣＲは保存されている（図１Ｃ）。短いヘリックス２を含むループＡＢに対応するＥＦループ及びΩループはバレルの閉じた蓋を構築する。２つのグリコシル化部位はＬ−ＰＧＤＳのΩループの大きい蓋のＡｓｎ５１の位置及びストランドＣのＡｓｎ７８の位置にある（図３Ａの矢印）。
【００１７】
疎水性側鎖によって支配されるＬ−ＰＧＤＳの内部には、図５及び図３Ｂにおいて右から左へＣｙｓ６５Ａｌａ，Ｓｅｒ８１，Ｔｈｒ６７，Ｓｅｒ４５，Ｔｙｒ１４９，Ｔｈｒ１４７，Ｓｅｒ１３３，及びＨｉｓ１１６の８つの極性残基からなる注目すべき親水性ベルトがある。その極性ベルトにおける残基は基質ＰＧＨ２の結合ばかりではなく生成物ＰＧＤ２の遊離にも関与し、後で部位指定突然変異により示すように、ω鎖の極性のヒドロキシル基の水和及び脱水和のコストを減少させることにより、ＰＧＤＳ活性における生成物ＰＧＤ２の放出を促進する。
【００１８】
結晶構造でアラニンにより置換されている推定触媒残基Ｃｙｓ６５は、βストランドＢのＮ末端に位置し、タンパク質の開いた縁のバレルの内側に面している（図５及び３Ｂ）。そのＣｙｓ６５Ａｌａ残基は水素結合距離内でＳｅｒ４５，Ｔｈｒ６７，Ｓｅｒ８１のヒドロキシル側鎖のクラスターにより取り囲まれている（図３Ｂ）。これらの残基はＴｙｒ１４９，Ｔｈｒ１４７，Ｓｅｒ１３３と共にＬ−ＰＧＤＳの疎水性バレル中で水素結合ネットワークを形成する。
【００１９】
（ｉｉ）Ｌ−ＰＧＤＳのオープン−クローズ立体配座異性体
我々は、Ｌ−ＰＧＤＳの基質結合部位の入り口においてオープン及びクローズ型を有する２つのタイプの結晶構造を決定した。空間群Ｃ２２２１を有するＳｅ−Ｍｅｔ型Ｌ−ＰＧＤＳの結晶構造においては活性部位はΩループのＴｒｐ５４及びＥＦループのＨｉｓ１１１の間の閉じた芳香族ブリッジによりタンパク質外部から分離されている。異なった空間群Ｐ２１２１２１を有する天然型のＬ−ＰＧＤＳ結晶においては、Ｈｉｓ１１１を有するＥＦループの異なったコンフォメーションのため基質結合部位の入り口は開いている（図４Ａ）。Ｔｒｐ５４及び動きやすいＥＦループの１０９ＳＰＨＸＧＳの残基は、Ｘｅｎｏｐｕｓホモログを含む全ての同定されたＬ−ＰＧＤＳ配列のアミノ酸配列において保存されている。P２１２１２１結晶の非対称単位に含まれる２分子の天然型L-PGDS分子のうちの片方は、EFループを構成するＰｒｏ１１０、Ｈｉｓ１１１に対応する電子密度が低く、この２残基については原子モデルを電子密度にあてはめなかった。フレキシブルなループのオープン−クローズ立体配座異性体は基質及び基質でないリガンドのＬ−ＰＧＤＳの基質結合部位への結合に重要な役割を果たすと考えられる。
【００２０】
（ｉｉｉ）リポカリンとしてのＬ−ＰＧＤＳの親油性レチノイン酸結合
必須の結晶化添加物としてレチノイン酸の存在下にＬ−ＰＧＤＳを結晶化させた。Ｌ−ＰＧＤＳは多くの他のリポカリンと類似してレチノイン酸及びレチナールを結合する。ポケットの底のＰｈｅ３９は、異なった結晶形Ｐ２１２１２１及びＣ２２２１において異なった回転異性体を示した（図４Ｂ）。天然型のＰ２１２１２１結晶はＰｈｅ３９の近くで嵩だかく大きい残留電子密度を有する広い空洞を示し、一方Ｓｅ−ＭｅｔＣ２２２１結晶においては対応する残留電子密度はＰｈｅ３９側鎖の電子密度と連続であり、天然の形のそれより狭い空洞を生じた。天然型の結晶のＰｈｅ３９側鎖の近くのＴｒｐ４３のインドール環付近の残留電子密度は結合したレチノイン酸分子に起因すると結論付けられた。これらのレチノイド類は非拮抗的にＬ−ＰＧＤＳ活性を阻害する。このレチノイド類の結合はレチノイド類と相互作用するＴｒｐ４３を含むＬ−ＰＧＤＳの疎水性残基クラスターの再組織化を必要とする
【００２１】
（ｉｖ）基質ＰＧＨ２の結合様式
基質ＰＧＨ２は、エネルギー最小ＰＧＨ２モデルによりＬ−ＰＧＤＳの基質結合部位の親水性ベルトに沿って位置する（図５）。提案された結合モデルにおいてはＰＧＨ２の１５−ヒドロキシル基を有するω鎖は基質結合部位に挿入し、シクロペンタン環に結合したエンドパーオキサイドにおけるＣ１１に結合した酸素原子は触媒のＣｙｓ６５残基のチオール基に到達する。ＰＧＨ２のα鎖末端のカルボキシル基の負の電荷はコンプレックスモデルの杯状部分の静電的に正のふたを作るＬｙｓ９２及びＡｒｇ８５の側鎖の正の電荷により相殺される（図５）。基質結合部位の親水性ベルトは極性のヒドロキシル基を有するＰＧＨ２またはＰＧＤ２のω鎖の挿入または脱離を促進することができる。なぜなら溶媒中のω鎖の１５ヒドロキシルの水和水はエンタルピー的な脱水コストなしにこれらの極性側鎖と交換できるからである。ＰＧＨ２のエンドパーオキサイドの極性表面はＣｙｓ６５及びＳｅｒ４５、Ｔｈｒ６７、及びＳｅｒ８１を含むヒドロキシルクラスターに面する。シクロペンタンの頭の他の疎水性部分はＰｈｅ８３及びＭｅｔ９４を含む疎水性側鎖によりくるまれている。基質結合部位の入り口にあるフレキシブルなＥＦループの閉じたコンホメーションはＰＧＤＳ反応の触媒スペースを提供し、溶媒中の塩基から触媒部位を分離することにより特異的にＰＧＤ２を製造することを助け得る。更に、ドッキングスタディにおいて生じた９−ヒドロキシル−１１−ケト−シクロペンタンを有するより嵩高い生成物ＰＧＤ２を収容する十分なスペースがある。
【００２２】
（ｖ）Ｌ−ＰＧＤＳの反応機構
Ｌ−ＰＧＤＳにより触媒されるＰＧＤＳ活性の反応機構を推定し図６に示した。Ｌ−ＰＧＤＳの触媒残基はＣｙｓ６５であり、そのチオール基はＳｅｒ４５、Ｔｈｒ６７、及びＳｅｒ８１との相乗的な水素結合ネットワークにより反応種としてのチオレートイオンとして安定化する。提示した反応機構におけるＰＧＨ２のＬ−ＰＧＤＳに対する結合様式は、ＰＧＤＳ反応においてＣｙｓ６５の硫黄原子へＰＧＨ２のＣ１１のエンドパーオキサイド酸素を向ける適当な幾何学を提供する（図５及び図６の工程１）。モデルにおいて触媒のＣｙｓ６５のＳｅｒ４５、Ｔｈｒ６７、及びＳｅｒ８１との水素結合ネットワークは、Ｃｙｓ６５のチオール基のｐＫａを減少させ、生理学的ｐＨでのＰＧＤＳ触媒の反応種としてチオレートアニオンを安定化させる。提案された反応機構は以下のようである（図６）。
Ｃｙｓ６５のチオレートアニオンは塩基としてＰＧＨ２のＣ１１のエンドパーオキサイド酸素を攻撃し（図６の工程２）、反応中間体として推定されるＳ−Ｏ付加物を生じる（工程３）。Ｓｅｒ４５のヒドロキシル基は不安定なＳ−Ｏ結合を攻撃し、Ｃ１１の水素原子のプロトンを再配置し、協奏的な方式でカルボニル基に変換する（工程３及び４）。生成物ＰＧＤ２の脱離後、Ｃｙｓ６５のチオールプロトンは解離して、反応種としてのチオレートアニオンを再び形成する。
【００２３】
（ｖｉ）Ｌ−ＰＧＤＳ活性の変異体分析
提案した基質結合及び反応機構を確認するためＬ−ＰＧＤＳ分子の基質結合ポケット内部の９つのアミノ酸残基へ部位指定突然変異を行った。精製した野性型酵素と同じＰＧＤＳ活性を有する組換えタンパク質の製造が容易なのでＣｙｓ８９，１８６Ａｌａ構築物をこの目的に用いた。様々な変異体を発現させ、均一となるまで精製し、ｐＨ８、９及び１０でＬ−ＰＧＤＳ活性を比較した（図８）。
【００２４】
Ｃｙｓ６５はＬ−ＰＧＤＳ活性の触媒残基として確認された。何故ならＣｙｓ６５Ａｌａ変異体は酵素活性を完全に失うからである。触媒ポケット内部のＣｙｓ６５を囲むヒドロキシルクラスターのＳｅｒ４５、Ｔｈｒ６７、及びＳｅｒ８１をＡｌａにより置換した場合、そのＰＧＤＳ活性は、ＰＧＨ２についてのＫｍの顕著な減少なしに、３０〜１５％に減少した（図８及び表１）。従ってｋｃａｔ／Ｋｍは、Ｓｅｒ４５Ａｌａ及びＳｅｒ８１Ａｌａの場合それぞれ０．３６及び０．５０μＭ−１分−１で野性型酵素の５分の１にまで顕著に減少した。Ｌ−ＰＧＤＳ活性は、Ｓｅｒ４５，８１Ａｌａダブル変異体において野性型酵素の１０％以下に減少し、Ｓｅｒ４５、Ｔｈｒ６７及びＳｅｒ８１のトリプル変異体においてはほとんど消滅した。これらの結果はＣｙｓ６５のチオレートアニオンがＳｅｒ４５、Ｔｈｒ６７及びＳｅｒ８１のヒドロキシルクラスターで安定化され、上記触媒作用における反応種として作用するという考えと一致する。
【００２５】
注目すべきことに、３つの変異体Ｐｈｅ８３Ｉｌｅ、Ａｒｇ８５Ｇｌｕ及びＬｙｓ９２Ｇｌｕがそれぞれ４．４７、４．８６及び５．７１μＭ−１分−１というｋｃａｔ／Ｋｍで、２．３８μＭ−１分−１を有する野性型酵素のそれより、２倍大きい活性を示した（図８及び表１）。一方、ＰＧＨ２についてのこれらの変異体のＫｍ値（ｐＨ８で１１〜１５μＭ）はＡｒｇ８５Ｇｌｕ変異体（７μＭ）を除けば野性型酵素（１３μＭ）に匹敵する。これらの結果はＬ−ＰＧＤＳ反応の律速段階は異性化の触媒過程ではなく生成物脱離であることを示唆する。Ｌ−ＰＧＤＳのリガンド入り口表面の正の静電的特徴を起しているＡｒｇ８５及びＬｙｓ９２の正電荷はＰＧＨ２やＰＧＤ２のα鎖の負電荷との間に大きな親和力を発生させ（図１Ｂ）、生成物を基質結合部位に保つのを助け得る。図５に示すＰＧＨ２結合モデルと同様に、Ｐｈｅ８３もその芳香環により触媒Ｃｙｓ６５残基のまわりの広い穴に生成物を収容するのを助け得る。Ｔｈｒ１４７Ａｌａ及びＴｙｒ１４９Ｐｈｅ変異体は野性型酵素とくらべて活性が１／２に減少する。従ってＴｈｒ１４７及びＴｙｒ１４９のこれらの極性側鎖は触媒をターンオーバーさせるのに重要である。
【００２６】
【表１】
ＰＧＤＳ活性のＬ−ＰＧＤＳ変異体の動力学的パラメーター
2004194581.tif 000002
動力学パラメーターはｐＨ＝８．０で測定した
【００２７】
（ｖｉｉ）Ｌ−ＰＧＤＳによる生成物ＰＧＤ２の高親和性結合
Ｌ−ＰＧＤＳは、生成物ＰＧＤ２を高親和性（Ｋｄ＝８９．４±３．４ｎＭ，ｋｏｎ＝１．２４ｘ１０３±３７Ｍ−１秒−１,ｋｏｆｆ＝１．１１ｘ１０−４±７．０ｘ１０−６秒−１）に結合するが、表面プラスモン共鳴分析（Jonson, et al.,Biotechniques 1991 Nov;11(5):620-627；Beuckmann et al., Biochemistry, 38:8006-8013(1996)）によればＰＧＥ２もＰＧＦ２αも結合しない（図７）。Ｌ−ＰＧＤＳはＰＧＤ２輸送タンパク質として十分に作用する。結合解離実験も、結合したＰＧＤ２がＬ−ＰＧＤＳの疎水性ポケットからゆっくり脱離することを示唆する。一方Ｈ−ＰＧＤＳはＰＧＤ２に対して顕著な親和性を示さない。これらの結果はＬ−ＰＧＤＳは細胞内でＣＯＸと共役したＰＧＤ２合成酵素として機能した後にＰＧＤ２の細胞外輸送体として作用する２つの機能を有するタンパク質であることを示唆する。
【００２８】
（ＩＩ）構造座標を用いるＬ−ＰＧＤＳ阻害剤の選定
表２又は３に示す３次元構造座標を用いて、Ｌ−ＰＧＤＳを阻害する化合物を選定することができる。
本発明は、リポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素の阻害剤の選定方法であって、
（ａ）リポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素の立体構造を表わす表２又は表３の３次元構造座標を提供し；
（ｂ）候補化合物の立体構造を提供し；
（ｃ）リポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素の基質結合部位に適合する候補化合物を阻害剤として選択する；
ことを含む方法にも関する。
上記のようにＬ−ＰＧＤＳの基質結合部位を構成するアミノ酸残基は、配列番号１のL-PGDSのアミノ酸配列で、３９位、４３−４８位、５４位、６５−６７位、７７−８３位、９０−９６位、１０３−１０７位、１１６−１２０位、１２９−１３３位、１４３−１４９位、１８０位のアミノ酸残基である。
【００２９】
Ｌ−ＰＧＤＳの３次元立体構造情報を基に、試験化合物の各々について、Ｌ−ＰＧＤＳの基質結合部位への結合の適合性を評価する。この評価では、各々の試験化合物の構造を変化させた中から、Ｌ−ＰＧＤＳの活性部位に対して立体構造的かつエネルギー的に安定した結合様式を示す試験化合物とその構造を数値的もしくは視覚的に順位付けする。この評価は、各種バーチャルスクリーニングプログラムによって自動で実行することができる。順位付けされた試験化合物の中から、数値的もしくは視覚的にＬ−ＰＧＤＳの基質結合部位に結合しやすいリード化合物を選定する。これで得られた化合物を基本骨格とし、より安定にＬ−ＰＧＤＳの基質結合部位へ結合する誘導体をデザインし合成することで、Ｌ−ＰＧＤＳの新規な阻害剤を開発できる。
【００３０】
阻害剤の設計を行うにはコンピューターを用いて行なうことが好ましい。この際に用いられるコンピューターは、例えばシリコングラフィックス社によって供給されているワークステーションＯＣＴＡＮＥなどが好適であるが、これに限定されるものではなく、適当なプログラムが動作するように調整されているコンピューターであればよい。また、コンピューターの記憶媒体にも特に制限はない。設計に用いるプログラムは、例えばアクセルリス社から市販されているコンピューター・プログラムＩｎｓｉｇｈｔ  ＩＩを用いることで達成できる。特に、該目的のために特別に作成されたＩｎｓｉｇｈｔ  ＩＩのモジュールであるＬｕｄｉやＤＯＣＫといったプログラムを単独又は組み合わせて用いることで、より容易に同定、検索、評価又は設計することができる。
【００３１】
阻害剤の設計には、概念的に２つの段階がある。最初の段階は、当業者においてリード化合物と称される薬物設計の出発点となる化合物を見つけだす段階である。次の段階は、そのリード化合物から出発してより活性が優れる、体内動態が優れる、毒性や副作用の少ないなど、医薬品としてより優れた性質を持つ化合物を見いだすリード化合物の最適化の過程である。
【００３２】
本発明が提供するＬ−ＰＧＤＳの構造座標を用いてリード化合物を見つけだす段階は、例えば複数の化合物の構造が入力してあるコンピューター中のデータベースを利用して、データベース中の化合物とＬ−ＰＧＤＳの３次元構造上の相互作用を逐次、視覚的方法によって選別する方法、又はコンピューターにより結合のエネルギーの大きさを逐次計算し、安定にＬ−ＰＧＤＳと結合する化合物をデータベースの中から探し出す方法などによって達成される。化合物の構造のデータベースは３次元構造座標が決定され入力されていることが望ましいが、低分子化合物の場合には、そのコンフォーメーションは比較的自由に変化されうるし、各コンフォメーションの３次元構造座標を計算で導くことも比較的短時間で可能であるので、３次元構造座標のデータベースでなくてもよい。この場合は、低分子化合物の化学的な共有結合情報をデータベースに入力する。
具体的には、視覚的方法では、まずコンピューターの画面上にＬ−ＰＧＤＳを、本発明の構造座標に従って表示する。この際、コンピューターの画面上にクリスタル・アイを用いるなどの３次元表記をしてもよいが、必ずしも３次元表記を用いなくても視覚的な検討は可能である。
【００３３】
考慮すべき化学的相互作用は静電相互作用、疎水性相互作用、水素結合、ファンデルワールス相互作用などである。すなわち、該化合物の３次元空間での構造が、その官能基群においてカルボキシル基、ニトロ基、ハロゲン基などの陰性電荷を帯びやすい基が、Ｌ−ＰＧＤＳのリジン、アルギニン、ヒスチジンといった正電荷を持つアミノ酸残基に相互作用するように、アミノ基、イミノ基、グアニジル基などの陽性電荷を帯びやすい基が、Ｌ−ＰＧＤＳのグルタミン酸、アスパラギン酸といった負電荷を持つアミノ酸残基に相互作用するように、脂肪族基や芳香族基といった疎水性の官能基が、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン及びメチオニンといった疎水性のアミノ酸残基と相互作用するように、水酸基、アミド基などの水素結合に関与する基が、Ｌ−ＰＧＤＳの主鎖や側鎖部分と水素結合ができるように、更には、該化合物とＬ−ＰＧＤＳとの結合において立体的な障害が生じないように、また、更には、空隙部分がなるべくできないように空隙部分が充填され、ファンデルワールス相互作用が大きくなるようになど、相互作用に好ましい構造になっているかを総合的に考慮することである。このように、静電相互作用、疎水性相互作用、ファンデルワールス相互作用、水素結合などやその他の因子を、コンピューター画面上で視覚的に総合的に考慮して、最終的に該化合物がリード化合物として適当であるか否かの判断を行う。
【００３４】
コンピューターによるエネルギー評価による方法では、分子力場計算を用いて化合物と、Ｌ−ＰＧＤＳとの結合のエネルギーを求める。その計算をデータベースの中の各化合物に適用し、安定に結合できるリード化合物となりうる化合物を、このデータベースの中から求める。分子力場計算に用いる力場は、プログラムＩｎｓｉｇｈｔ  ＩＩのＤＩＳＣＯＶＥＲモジュールにある、蛋白質に最適化されたＡＭＢＥＲの力場、ＣＶＦＦなどを利用できる。また、Ｉｎｓｉｇｈｔ  ＩＩのＬｕｄｉなどコンピューター・プログラムによっては、蛋白質分子において相互作用するアミノ酸残基の３次元構造座標を与えると、自動的にリード化合物の候補を出力するものもあり、本発明の方法に用いることが可能である。また、視覚的検討と、エネルギーを考慮した検討は厳密に区別されるものではなく、それぞれの手法を適宜に組み合わせて用いることも有用である。
【００３５】
次の段階であるリード化合物の最適化を行う方法は、あらかじめリード化合物が上記の方法で見いだされている場合に、そのリード化合物を更に優れた分子、例えば阻害剤として更に生物活性の高い化合物や、医薬品として経口投与を考えた場合に有利な構造を有する分子などへ最適化する目的で用いられる。リード化合物とＬ−ＰＧＤＳの化学的結合の実態を明らかにすることによって、リード化合物とＬ−ＰＧＤＳ相互作用において最適ではない相互作用部位を直接見いだし、その部位に最適な官能基を有する化合物を新たに設計することが可能となり、より最適化された化合物が設計できる。
【００３６】
コンピューターによる視覚的検討の場合は、まず、リード化合物の３次元構造座標と本発明のＬ−ＰＧＤＳの３次元構造座標を、分子の３次元構造座標を表現するコンピューター・プログラムが動作するコンピューター又はそのコンピューターの記憶媒体に入力して、コンピューター画面上でリード化合物とＬ−ＰＧＤＳの複合体モデルを表示する。この際、コンピューターの画面上に前述のようなクリスタル・アイを用いるなどの３次元表記をしてもよいが、必ずしも３次元表記を用いなくても視覚的な検討は可能である。そして、リード化合物がＬ−ＰＧＤＳと更に好ましく相互作用できるように、若しくは相互作用を保持させたまま、より体内動態の優れた化合物へと改変することが、論理的な化合物の設計である。
考慮すべき化学的相互作用はリード化合物を見つけだす場合と同様であり、最終的にリード化合物から、阻害剤としてより好ましい性質を持つ化合物を新たに設計する。
【００３７】
コンピューターによるエネルギー評価による方法では、分子力場計算を用いて、リード化合物から設計された新たな化合物とＬ−ＰＧＤＳとの結合のエネルギーを求め、該設計の妥当性を判断する。更には、溶媒分子などもモデルに加え、分子動力学法を用いて自由エネルギーを求め、安定に結合できる化合物へ誘導する方法もある。分子力場計算に用いる力場は、プログラムＩｎｓｉｇｈｔ  ＩＩのＤＩＳＣＯＶＥＲモジュールにある、蛋白質に最適化されたＡＭＢＥＲの力場、ＣＶＦＦなどを利用できる。ここで名称が出たプログラム、力場はこれに限られるものではなく、同等の機能を有するプログラム、力場を使用することも可能である。
視覚的検討と、エネルギー評価による方法を適宜に組み合わせて用いてもよい。コンピューターによる視覚的検討やエネルギー評価に加え、リード化合物もしくはリード化合物からデザインされた化合物とＬ−ＰＧＤＳを複合体結晶とし、その結晶構造をＸ線結晶解析によって実験的に解析し、結合様式を構造座標として決定することは、Ｌ−ＰＧＤＳの基質結合部位と化合物の結合の適合性の評価の向上や化合物の設計の質の向上にとって重要な情報を与える。複合体結晶の作製は、Ｌ−ＰＧＤＳと化合物が共存している溶液中で、Ｌ−ＰＧＤＳを結晶化させることで得られる。また化合物を含まない溶液中で作製したＬ−ＰＧＤＳの結晶を、化合物を含みなおかつＬ−ＰＧＤＳ結晶が安定に存在する溶液に漬けることでも得られる。作製した複合体結晶のＸ線結晶構造解析は、天然型Cys65Ala  Ｌ−ＰＧＤＳの構造座標の決定で用いた方法で行うことができる。この場合、表２もしくは表３に記載のＬ−ＰＧＤＳの構造座標を使って解析を行うことができる。また必要があればSe-Met型L-PGDSの構造座標の決定で用いた方法を用いても良い。
【００３８】
以上のようにしてＬ−ＰＧＤＳの阻害剤の候補化合物を選択した後、好ましくは該選択した化合物を基質（プロスタグランジンＨ２）存在下に該酵素と接触させて、該化合物の該酵素活性を阻害する能力を確認する（例えば、Shimizu, T.,Yamamoto, S., and Hayaishi, O. (1979). Purification and properties of prostaglandin D synthetase from rat brain. J. Biol. Chem. 254, 5222-5228を参照）。該酵素活性測定は例えば以下のようにして行うことができる。
【００３９】
基質の〔1-14C〕プロスタグランジン(PG)H2は、〔1-14C〕アラキドン酸にシクロオキシゲナーゼを反応させて調製する。PGH2は水溶液中では容易に分解する（半減期約5分）ので、乾固させて低温（−80℃）で保存する。酵素反応は1mMジチオスレイトール)および酵素を含む0.1Mリン酸緩衝液（pH7.5）50μlに、PGH2  溶液（アセトンまたは不揮発性のジエチレングリコールジメチルエーテル溶液）1μlをマイクロシリンジで注入して行う。25℃、30〜60秒間の反応後、氷冷したエーテル/メタノール/0.1Mクエン酸混液（30：4：1 v/v/v）300μlを加えて反応を停止し、酸性条件下で基質および反応生成物をエーテル層に抽出する。続いて反応液に無水硫酸ナトリウムを加えて脱水を行い、有機溶媒相の一部（50μl程度）を低温室内（4℃）でシリカゲル薄層に塗布し、冷凍庫内（−20℃）でシリカゲル薄層クロマトグラフィー（展開溶媒：エーテル/メタノール/酢酸（90：2：1 v/v/v））を行う。展開後、PGD2画分とそれ以外の部分の放射活性を測定し、PGD2 への変換率をもとに酵素活性を算出する。
市販の非標識PGH2を用いて酵素反応を行い、反応後、FeCl2処理によりPGH2を12(S)-ヒドロキシ-8,10-トランス-5-シス-ヘプタデカトリエノール酸に分解した後、11-β- PGE2を内部標準とする逆相HPLCあるいは市販のELISAによりPGD2  を定量する方法も使用できる。
【００４０】
上述のようにＬ−ＰＧＤＳの阻害剤は、鎮痛剤、睡眠調節剤、動脈硬化防止剤、心臓肥大防止剤、抗アレルギー剤、神経変性疾患治療薬等として用い得る。
【００４１】
【実施例】
実施例１
Ｌ−ＰＧＤＳの製造
天然型Ｌ−ＰＧＤＳの製造
Gｌu２４からC末端までのL−PGDS遺伝子[ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ／ＤＤＢＪＴＭアクセッションナンバーＤ８３３２９]をマウス脳ｃDNAライブラリーからPCR増幅により得、発現ベクターｐGEX−２T（アマシャム・ファルマシア・バイオテック社）に挿入し、その発現ベクターでEscherichia coli DH5α（東洋紡）を形質転換した。pGEX−２Tは目的遺伝子をグルタチオン（GSH)トランスフェラーゼ(GST)遺伝子の下流に挿入し、目的蛋白質をGSＴ融合蛋白質として発現するための発現ベクターである。Ｃｙｓ６５Ａｌａを作成するため、得られた発現ベクターを鋳型としてＣｙｓ６５をＡｌａに置換されるようにミスマッチコドンを含む一対の合成オリゴマー
５’−ＧＣＴＧＴＡＴＴＧＴＡＴＡＴＧｇｃａＡＡＧＡＣＡＧＴＧＧＴＡ−３’
５’−ＴＡＣＣＡＣＴＧＴＣＴＴｔｇｃＣＡＴＡＴＡＣＡＡＴＡＣＡＧＣ−３’
を作成した。さらにこのQuick change site-directed mutagenesis キット（ストラタジーン社）を用いてＣｙｓ６５Ａｌａ発現ベクターをを作成した。これをグルタチオン（GSH)トランスフェラーゼ遺伝子（ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ／ＤＤＢＪＴＭアクセッションナンバーＵ５８０１２）と結合させ、その発現ベクターでEscherichia coli DH5α（東洋紡）を形質転換した。
この発現ベクターで形質転換したEscherichia coli DH5αで製造されるL−PGDSはGSＴ融合蛋白質である。形質転換体をLB培地、３７℃で培養し、OD６００ｎｍが０．５−０．６になったところで０．６−１ｍMになるようにIPTGを添加し、３７℃で６時間、L−PGDSの生産を行ったのち、培地から形質転換体を分離した。得られた形質転換体を超音波破砕機によって破砕し、遠心分離によって上静を集め、GSH−セファロース４Bカラムクロマトグラフィーにより精製した。これをトロンビンとインキュベートしL−PGDSとGSHを切り離した後、５mMトリス／HCｌ（pH8.0)中でのSuperdex７５カラムクロマトグラフィーを行い、引き続いて１０mMクエン酸ナトリウム(pH4.5)中でMono−Sクロマトグラフィーを行い、さらに精製を行った。
なお部位特定突然変異導入はQuickChange部位特定突然変異導入キット（Stratgene, Heiderberg, Germeny)を用いて行った。そのＤＮＡ配列は、SequiThermサイクル配列決定キット（Epicentre Technologies, Madison, WI）によるサイクル配列決定の後LI-CORモデル4000L自動DNAシークエンサー（LI-COR Inc., Lincoln, NE）で確認した。
【００４２】
Ｓｅ−Ｍｅｔ型Ｌ−ＰＧＤＳの製造
上と同様にして得たｐＧＥＸ−２ＴベクターでＥ.ｃｏｌｉ  Ｂ８３４（ＤＥ３）（Novagene, WI,米国）を形質転換し、次のセレノメチオニンを含有するアミノ酸に富んだ培地で培養した（１Ｌ当たりのｇ数）：アラニン１．５ｇ；アルギニンＨＣｌ１．７５ｇ；アスパラギン酸１．２ｇ；システイン０．１ｇ；グルタミン酸２ｇ；グルタミン１ｇ；グリシン１．６２６ｇ；ヒスチジン０．１７５ｇ、イソロイシン０．７ｇ；ロイシン０．７ｇ；リシンＨＣｌ１．２６ｇ；フェニルアラニン０．４ｇ；プロリン０．３ｇ、セリン６．２５ｇ；トレオニン０．７ｇ；チロシン０．５ｇ；バリン０．７ｇ；アデニン１ｇ；グアノシン１．３３ｇ；チミン０．３３ｇ；ウラシル１ｇ、酢酸ナトリウム１．５ｇ；コハク酸３ｇ；塩化アンモニウム１．５ｇ；水酸化ナトリウム０．８５ｇ；Ｋ２ＨＰＯ４１０．５ｇ；ＭｇＳＯ４０．２５ｇ；ＦｅＳＯ４（ＩＩ）０．００４２ｇ；グルコース２０ｇ；セレノメチオニン０．０７５ｇ、及びKao and Michayluk Basal ビタミン溶液（Sigma-Aldrich）。上記培地での培養に先立って、形質転換体を３７℃の1mLのLB培地で一晩培養した。この1mLの培養液を500mLの上記培地に混合し、３７℃でさらに一晩培養した。この500mLの培養液のうち50mLを350mLの新しい上記培地に加え３７℃で培養し、OD600ｎｍが０．５−０．６になったところで0.6−１mMになるようにIPTGを添加し、３７℃で12時間培養を続け、L−PGDSを生産した。
Ｓｅ−Ｍｅｔ型Ｌ−ＰＧＤＳの精製は上記天然型酵素と同じ方法でおこなった。
【００４３】
実施例２
Ｌ−ＰＧＤＳの結晶化
精製した酵素を、１０μＭのａｌｌ−ｔｒａｎｓレチノイン酸を含む５ｍＭトリス／ＨＣｌ（ｐＨ８、結晶化ストック緩衝液）に対し透析し、ＹＭ−３膜（ミリポア、Badford, MA）を用いる限外濾過により１０ｍｇ／ｍｌまで濃縮した。結晶化はハンギングドロップ蒸気拡散法により２２．５℃の一定温度で行った。
天然型のＣｙｓ６５Ａｌａ  Ｌ−ＰＧＤＳは、10mg/mlのタンパク質溶液２μｌを２Ｍマロン酸ナトリウム、０．１Ｍトリス／ＨＣｌ（ｐＨ８）及び１０％（ｖ／ｖ）１,４−ジオキサンを含む等容量のリザーバー溶液と混合することによって結晶化させた。３週間以内に最大の大きさ０．１ｘ０．１ｘ０．４ｍｍの棒状の結晶を得た。
Ｓｅ−Ｍｅｔ型Ｃｙｓ６５ＡｌａＬ−ＰＧＤＳもハンギングドロップ蒸気拡散法により得た。液滴は１０μＭのａｌｌ−ｔｒａｎｓレチノイン酸を含む２μｌの１０ｍｇ／ｍｌのタンパク質溶液、及び０．１Ｍのトリス／ＨＣｌ（ｐＨ９．５）中の１．２５Ｍクエン酸ナトリウム、１０％のジオキサン、２％トライトンＸ−４０５を含む等容量の母液からなった。
結晶学的パラメーターは回転対陰極型Ｘ線発生器及びＲｉｇａｋｕ  ＲＡＸＩＳ−ＩＶイメージングプレートシステムを用いて決定した（波長１．００００Å）。
天然型のＬ−ＰＧＤＳの結晶は単位胞の大きさａ＝４６．２、ｂ＝６６．８、ｃ＝１０５．３Åを有する斜方晶系の空間群Ｐ２１２１２１に属し、非対称単位中に２つの分子よりなる。
Ｓｅ−Ｍｅｔ型Ｌ−ＰＧＤＳの結晶は斜方晶系の空間群Ｃ２２２１に属し単位胞の大きさａ＝４５．７、ｂ＝６６．８、ｃ＝１０４．５Åを有し非対称単位中に１つの分子を有する。
【００４４】
実施例３
データ収集及び構造決定
Ｓｅ−Ｍｅｔ型及び天然型のＣｙｓ６５ＡｌａＬ−ＰＧＤＳの結晶の回折データはスプリング−８理研ビームラインＩ（ＢＬ４５ＸＵ）タンパク質クリスタログラフィーステーションで温度１００Ｋで収集した。回折データはＤＥＮＺＯ及びＳＣＡＬＥＰＡＣＫ（Otwinowski et al., Methods Enzymol.,276:307-326 (1997)）を用いて処理した。ＣＣＰ４スイート（Collaborative Computational Project, Number 4, 1994）を引き続く結晶学的計算に用いた。
空間群C2221に属するSe−Met型Cys65Ala  L−PGDSの結晶の解析は多波長異常分散法を用いた。セレニウムの３つの部位は差パターソンマップから見出した。位相精密化及び電子密度修飾はＳＨＡＲＰ（de La Fortelle et al., Methods Enzymol.,276:472-494 (1997)）及びＳＯＬＯＭＯＮ（Abrahams et al., Acta Crystallogr., D32:30-42 (1996)）を用いて行なった。プログラム、Ｏ（Jones etal., Acta Crystallogr., A47:110-119 (1991)）及びＸｔａｌＶｉｅｗ（McRee, Practical protein crystallography, Academic Press, 1993）をモデル構築のため用いた。結晶学的精密化はCNS（Brunger  et al., Acta Crystallogr.,D54:905-921 (1996)）による分子動力学を考慮した精密化計算と、手動によるモデルの修正を交互に行うサイクルによって行った。βバレル部分のフレキシブルなループ領域は弱い不明瞭な電子密度を示した。現在のモデルはＣ２２２１結晶構造においてＣＤループのＡｓｎ８８及び９つのＮ末端残基を含まない。結晶学的Ｒ及びＲfreeは、Ｓｅ−Ｍｅｔ酵素について２．５Å分解能でそれぞれ０．２３及び０．２８であった。
Ｐ２１２１２１を有する天然型の結晶は分子置換を用いて解き、上と同様な結晶学的精密化を行った後、ＣＣＰ４スイートのＲＥＦＭＡＣ５を用いてさらにフルマトリクス最小二乗精密化と手動による方法によって精密化した。非対称単位の２つの分子における１分子のＣＤループ領域は電子密度が低いので定めなかった。結晶学的Ｒ及びＲfree値は、その天然の酵素について２．１Å分解能でそれぞれ０．２４及び０．２８であった。Ｐ２１２１２１の天然の構造は、４Å以上の偏差を有するオープンＥＦループ及びＰｈｅ３９を除いて、Ｃ２２２１のＳｅＭｅｔタンパク質と全く類似の構造を示す（全体の原子ｒ.ｍ.ｓ.ｄ.＝０．２６Å）。両方の構造座標のRamachandranプロットの許されない領域内に残基はない。
得られた天然型Ｌ−ＰＧＤＳの構造座標を表２に、Ｓｅ−Ｍｅｔ型Ｌ−ＰＧＤＳの構造座標を表３に示す。
【００４５】
実施例４
Ｌ−ＰＧＤＳへのＰＧＤ２の結合
Ｌ−ＰＧＤＳへのＰＧＤ２、ＰＧＥ２、ＰＧＦ２αの結合を、BiaCore2000システム（BiaCore, Uppsala,Sweden）で表面プラスモン共鳴測定法を用いて分析した。カルボキシメチルデキストランで被覆したＣＭ５センサーチップ（BIAcore AB）にＬ−ＰＧＤＳ変異体Ｃｙｓ８９，１８６Ａｌａを固定化した。結合試験は結合及び解離相の両方で０．１〜１０μＭ濃度範囲で３０μｌ／分の一定の流速で２５℃で行った。各試験の後、そのセンサーチップ表面を１５μｌの１．５Ｍ尿素により再生させた。速度定数値は、４つの独立した実験によるLangmuir１：１結合モデルを用いて対照表面（ウシ血清アルブミン）を差し引いた後、解析ソフトウエアーBIAエバリュエーション３．０ソフトウエアを用いることにより計算した。結果を図７に示す。
【００４６】
実施例５
Ｌ−ＰＧＤＳの立体構造を用いたＬ−ＰＧＤＳ阻害剤の探索
天然型Ｃｙｓ６５Ａｌａ  Ｌ−ＰＧＤＳの立体構造をコンピューターの画面上に表示しその構造へ種々の化合物の立体構造を適合させることを試みた。その結果、式：
【化１】
2004194581.tif 000003
で示される、4-ジベンゾ(a, d)シクロヘプテン-5-イリデン-1-(4-(２H-テトラゾール-5-イル) ブチル)ピペリジン（以下ＡＴ−５６という）が図９に示すように、Ｌ−ＰＧＤＳの立体構造に適合することが解った。ＡＴ−５６はＬ−ＰＧＤＳの３９、４０、４３、４５、４８、５４、６７、６９、７７、７９、９２、９４、９６、１０５、１０７、１０９、１１６、１１８、１２０、１２９、１３１、１３３、１４５、１４７、１４９位のアミノ酸残基により形成されるポケットに入っている。このうち４５、９２、１４７、１４９位のアミノ酸残基は基質結合部位であり、ＡＴ−５６はＬ−ＰＧＤＳの阻害剤である可能性がある。
【００４７】
ＡＴ−５６のL-PGDS 酵素活性阻害作用
ヒト組換え型酵素を用いて、上で見出したAT-56の L-PGDS 酵素に対する阻害作用、及び比較のためAT-56の Ｈ-PGDS 酵素に対する阻害作用を調べた。
L-PGDS 阻害活性測定には、[1-14C]PGH2 (5 μM) を基質として、ヒト組換え型 L-PGDS、0.1 M Tris-HCl (pH 8.0)、1 mM DTT (ジチオスレイトール) 存在下に 25 ℃ で 1 分間反応させた。
造血器型 PGD 合成酵素 (H-PGDS) 阻害活性測定には、[1-14C]PGH2 (40 μM) を基質として、0.1 M Tris-HCl (pH 8.0)、0.1 mM GSH (還元型グルタチオン)、存在下に 25 ℃ で 30 秒間反応させた。
AT-56 は基質添加の5 分間前処置し、続いて基質を添加した。反応終了後、反応液は薄層クロマトグラフィーにより、PGD2 を分離・定量し、酵素活性を算出した。なおＡＴ−５６は特開平７−７０１１２号公報３〜４頁に記載の方法に従って製造した。
結果を図１０に示す。AT-56 は、用量依存的に L-PGDS による PGH2 から PGD2 への異性化反応を阻害し、その 50 % 阻害濃度(IC50 値)は、95 μM であった。一方、AT-56 (3-300μM) は、H-PGDS を阻害しなかった。このようにAT-56 はL-PGDS を特異的に阻害する化合物であることが確認された。
【００４８】
L-PGDSを発現する細胞(TE-671)からのPGD2産生に対するAT-56の抑制作用
L-PGDSを発現するヒト小脳髄芽細胞 (TE671) からのカルシウムイオノフォア(A23187；5-(メチルアミノ)-2-[[(2R,3R,6S,8S,9R,11R)-3,9,11-トリメチル-8-[(1S)-1-メチル-2-オキソ-2-(1H-ピロール-2-イル)エチル]-1,7-ジオキサスピロ[5.5]ウンデカ-2-イル]メチル]-4-ベンゾキサゾールカルボン酸)刺激によるPGD2産生に対するAT-56の抑制作用を調べた。
TE-671を1x105個の密度でマイクロプレートに播種し、続いて細胞をA23187(5μM)で刺激してPGD2産生を惹起した。AT-56 あるいは溶媒 (Vehicle) は、A23187 刺激の15分前に細胞培養液に添加した。 A23187 刺激の 15 分後に培養液を回収し、培養液中のPGD2  濃度をエンザイムイムノアッセイ(EIA)法によって定量した。
結果を図１１に示す。TE-671 細胞は無刺激に比べ、A23187で刺激することによってPGD2産生が増加した。このA23187刺激によるPGD2産生をAT-56は用量依存的に抑制した。この結果もＡＴ−５６がＬ−ＰＧＤＳの阻害剤であることを確認するものである。
【００４９】
2004194581.tif 000004
2004194581.tif 000005
2004194581.tif 000006
2004194581.tif 000007
2004194581.tif 000008
【００５０】
2004194581.tif 000009
2004194581.tif 000010
2004194581.tif 000011
2004194581.tif 000012
【００５１】
2004194581.tif 000013
2004194581.tif 000014
2004194581.tif 000015
2004194581.tif 000016
【００５２】
2004194581.tif 000017
2004194581.tif 000018
2004194581.tif 000019
2004194581.tif 000020
【００５３】
2004194581.tif 000021
2004194581.tif 000022
2004194581.tif 000023
2004194581.tif 000024
【００５４】
2004194581.tif 000025
2004194581.tif 000026
2004194581.tif 000027
2004194581.tif 000028
【００５５】
2004194581.tif 000029
2004194581.tif 000030
2004194581.tif 000031
2004194581.tif 000032
【００５６】
2004194581.tif 000033
2004194581.tif 000034
2004194581.tif 000035
2004194581.tif 000036
【００５７】
2004194581.tif 000037
2004194581.tif 000038
2004194581.tif 000039
2004194581.tif 000040
【００５８】
2004194581.tif 000041
2004194581.tif 000042
2004194581.tif 000043
2004194581.tif 000044
【００５９】
2004194581.tif 000045
2004194581.tif 000046
2004194581.tif 000047
2004194581.tif 000048
【００６０】
2004194581.tif 000049
2004194581.tif 000050
2004194581.tif 000051
2004194581.tif 000052
ATOM   1200  OE1 GLU A 189     20.472  19.433  20.610  1.00 76.28      O
【００６１】
2004194581.tif 000053
2004194581.tif 000054
2004194581.tif 000055
2004194581.tif 000056
【００６２】
2004194581.tif 000057
2004194581.tif 000058
2004194581.tif 000059
2004194581.tif 000060
【００６３】
2004194581.tif 000061
2004194581.tif 000062
2004194581.tif 000063
2004194581.tif 000064
【００６４】
2004194581.tif 000065
2004194581.tif 000066
2004194581.tif 000067
2004194581.tif 000068
【００６５】
2004194581.tif 000069
2004194581.tif 000070
2004194581.tif 000071
2004194581.tif 000072
【００６６】
2004194581.tif 000073
2004194581.tif 000074
2004194581.tif 000075
2004194581.tif 000076
【００６７】
2004194581.tif 000077
2004194581.tif 000078
2004194581.tif 000079
2004194581.tif 000080
【００６８】
2004194581.tif 000081
2004194581.tif 000082
2004194581.tif 000083
2004194581.tif 000084
【００６９】
2004194581.tif 000085
2004194581.tif 000086
2004194581.tif 000087
2004194581.tif 000088
【００７０】
2004194581.tif 000089
2004194581.tif 000090
2004194581.tif 000091
2004194581.tif 000092
【００７１】
2004194581.tif 000093
2004194581.tif 000094
2004194581.tif 000095
2004194581.tif 000096
【００７２】
2004194581.tif 000097
2004194581.tif 000098
2004194581.tif 000099
2004194581.tif 000100
【００７３】
2004194581.tif 000101
2004194581.tif 000102
2004194581.tif 000103
2004194581.tif 000104
【００７４】
2004194581.tif 000105
2004194581.tif 000106
【００７５】
【表２】
2004194581.tif 000107
【表３】
2004194581.tif 000108
【表４】
2004194581.tif 000109
【表５】
2004194581.tif 000110
【表６】
2004194581.tif 000111
【表７】
2004194581.tif 000112
【表８】
2004194581.tif 000113
【表９】
2004194581.tif 000114
【００７６】
【表１０】
2004194581.tif 000115
【表１１】
2004194581.tif 000116
【表１２】
2004194581.tif 000117
【表１３】
2004194581.tif 000118
【表１４】
2004194581.tif 000119
【表１５】
2004194581.tif 000120
【表１６】
2004194581.tif 000121
【表１７】
2004194581.tif 000122
【表１８】
2004194581.tif 000123
【表１９】
2004194581.tif 000124
【００７７】
【表２０】
2004194581.tif 000125
【表２１】
2004194581.tif 000126
【表２２】
2004194581.tif 000127
【表２３】
2004194581.tif 000128
【表２４】
2004194581.tif 000129
【表２５】
2004194581.tif 000130
【表２６】
2004194581.tif 000131
【表２７】
2004194581.tif 000132
【表２８】
2004194581.tif 000133
【表２９】
2004194581.tif 000134
【００７８】
【表３０】
2004194581.tif 000135
【表３１】
2004194581.tif 000136
【表３２】
2004194581.tif 000137
【表３３】
2004194581.tif 000138
【表３４】
2004194581.tif 000139
【表３５】
2004194581.tif 000140
【表３６】
2004194581.tif 000141
【表３７】
2004194581.tif 000142
【表３８】
2004194581.tif 000143
【表３９】
2004194581.tif 000144
【表４０】
2004194581.tif 000145
【表４１】
2004194581.tif 000146
【表４２】
2004194581.tif 000147
【表４３】
2004194581.tif 000148
【表４４】
2004194581.tif 000149
【表４５】
2004194581.tif 000150
【表４６】
2004194581.tif 000151
【００７９】
【配列表】
2004194581.tif 000152
2004194581.tif 000153
【図面の簡単な説明】
【図１】Ｌ−ＰＧＤＳの全体の構造を示す。
（Ａ）天然型Ｌ−ＰＧＤＳのＰ２１２１２１結晶の立体構造のリボン図表示である。バレルに対して直角に見たもの。上側はバレルの開いた末端であり、下側は閉じた末端である。ストランド及びヘリックスはＡ−Ｈ及び１−３と表示した。
（Ｂ）開いた（ｏと示す）末端及び閉じた（ｃと示す）末端から見たＬ−ＰＧＤＳの静電気的特徴を示す。黒色は静電的に陽性、白色は陰性を示す。
（Ｃ）Ｌ−ＰＧＤＳの保存表面。公知のＬ−ＰＧＤＳ類のアミノ酸配列保存の程度をＬ−ＰＧＤＳ分子表面に描いている。濃色はより多く保存されていることを示す。
【図２】マウスＬ−ＰＧＤＳ及び他のリポカリンの構造を考慮した配列アライメント。ＳＣＲはバレル構造の閉じた末端を構成し、全ての配列において高度なアミノ酸保存が保たれており、Ｌ−ＰＧＤＳの活性上重要であると推定される。Ｌ−ＰＧＤＳはＮ末端領域に約２０の残基よりなるシグナル配列を有する。ＰＧＤＳ：マウスＬ−ＰＧＤＳ、ＨＮＧＡＬ：ヒト好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン、ＢＬＧ：ヒトβ−ラクトグロビリン、ＲＢＰ：ヒトレチナール結合タンパク質、ＥＲＡＢＰ：ラット精巣上体レチノイン酸結合タンパク質、ＭＵＰ：マウス主尿タンパク質、ＯＰＢ：ウシにおい物質結合タンパク質，ＢＢＰ：チョウビリン結合タンパク質。
【図３】Ｌ−ＰＧＤＳ構造の注目すべき特徴を示す。
（Ａ）注目すべき特徴を有するＳｅ−Ｍｅｔ型Ｃ２２２１結晶のＬ−ＰＧＤＳの全体の骨組み構造のステレオ図。エンベロープの内側の親水性ベルト内の８つの残基を示す；Ｃｙｓ８９／１８６の１つのＳ−Ｓブリッジ及び２つの芳香族残基Ｔｒｐ５４及びＨｉｓ１１１が接触した構造がバレル構造の上端に見出される；左上のＧｌｎ５１及び右下Ｇｌｎ７８が２つの推定Ｎ−グリコシル化部位である。
（Ｂ）親水性ベルトのクローズアップである。８つの極性残基、Ｃｙｓ６５Ａｌａ、Ｓｅｒ４５、Ｔｈｒ６７、Ｓｅｒ８１、Ｔｙｒ１４９、Ｔｈｒ１４７、Ｓｅｒ１３３、及びＨｉｓ１１６があり、これらは基質ＰＧＨ２の推定の結合部位を形成する。
【図４】（Ａ）エンベロープの入り口の閉じた、及び開いた様式を示すステレオ図。ＥＦループのＨｉｓ１１１は、ΩループのＴｒｐ５４の芳香族相互作用により基質結合部位の入り口を閉じ（Ｈ１１１ｃ）、又は開く（Ｈ１１１ｏ）ことができる。
（Ｂ）Ｐｈｅ３９及びＴｒｐ４３の周囲の基質結合部位の底部のステレオ図。Ｐ２１２１２１（Ｆ３９ｏ）及びＣ２２２１（Ｆ３９ｏ）結晶構造における２つの回転異性体を示す。
【図５】Ｌ−ＰＧＤＳの提案されたＰＧＨ２結合様式を示すステレオ図。ＰＧＤＳ結合及び触媒に関与するその推定残基を、結合したＰＧＨ２と共に示す。
【図６】（Ｂ）反応機構の模式図。Ｃｙｓ６５を含む水素結合ネットワークはチオール及びチオレートの平衡をシフトさせることにより生理学的ｐＨでのチオレートアニオン形成を促進する。ＰＧＨ２の結合後（１）、Ｃｙｓ６５のチオレートはＣ１１原子に結合したエンドエポキシ酸素に塩基攻撃を及ぼし（２）、推定中間体としてＳ−Ｏ付加物を形成する（３）。不安定なＳ−Ｏ結合は水素結合の協奏的再配置で容易に切断され（３）、生成物ＰＧＤ２（４）のＣ１１カルボニルを生ずる。
【図７】Ｌ−ＰＧＤＳに対するＰＧＤ２，ＰＧＥ２、及びＰＧＦ２αの結合の結合及び解離速度。Ｌ−ＰＧＤＳに対するＰＧＤ２，ＰＧＥ２、及びＰＧＦ２αの結合をＢＩＡｃｏｒｅを用いた表面プラスモン共鳴測定により分析した。ＰＧＤ２濃度は０．０〜７．５μＭで変え、ＰＧＥ２、及びＰＧＦ２αの濃度は１０μＭである。
【図８】様々な変異体タンパク質のＰＧＤＳ活性をｐＨ、８．０、９．０及び１０．０で測定した。活性はＰＧＤＳの比活性を示す
【図９】ＡＴ−５６が結合したＬ−ＰＧＤＳを示す。
【図１０】ＡＴ−５６によるＬ−ＰＧＤＳ酵素活性阻害作用を示す
【図１１】ヒト脳髄芽細胞によるＰＧＤ２産生の、ＡＴ−５６による抑制を示す。
【図１】
2004194581.tif 000154
【図２】
2004194581.tif 000155
【図３】
2004194581.tif 000156
【図４】
2004194581.tif 000157
【図５】
2004194581.tif 000158
【図６】
2004194581.tif 000159
【図７】
2004194581.tif 000160
【図８】
2004194581.tif 000161
【図９】
2004194581.tif 000162
【図１０】
2004194581.tif 000163
【図１１】
2004194581.tif 000164