(57)【要約】【課題】細菌分野、ウイルス分野、ヒトゲノム解析分野及び動植物分野などに属する創薬、遺伝子解析およびプロテオーム解析などのバイオ関連ビジネスや日常診療の中でのテーラメイド医療での核酸変異検出に有用な核酸増幅産物の核酸解離曲線の波形パターンを解析ソフトで解析して核酸の変異検出方法を提供する。【解決手段】核酸増幅方法に核酸上の任意の特定あるいは不特定領域に相補的なヌクレチオド鎖に、該領域に相補性を有する可能性のあるヌクレオチド鎖が結合し、該領域と相似性のある複数の領域でアニールする波形生成プライマーを用いて増幅した核酸増幅産物の核酸解離曲線の波形パターンを、核酸増幅・検出装置にインストールされた波形一致率から波形を解析する解析ソフトで核酸の波形を解析して核酸変異を同定する。この方法によって細菌、体質、ウイルス、動植物などを解析、診断することを目的とした核酸の同定作業を迅速化した。【選択図】  図６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸を同定する方法であって、検査対象の核酸を核酸上の任意の特定あるいは不特定領域に相補的な、各塩基鎖に１塩基を配置したヌクレオチド鎖を３’末端に有し、該領域に相補性を有す可能性のある、各塩基鎖に複数塩基を配置したヌクレオチド鎖を５’末端に有して、該ヌクレオチド鎖は５’末端側から３’末端側にかけて段階的に相補性が高まると共に、段階的に安定性が低くなるように配列された特定プライマーを添加してポリメラーゼ酵素の存在下で核酸増幅後、該核酸増幅産物の２本鎖核酸に所定波長の励起光を照射して発生した蛍光強度が１本鎖核酸に変性すると共に減少する現象を観測した核酸溶解曲線を微分して得られた核酸解離曲線の山形の波形を、核酸増幅・変異検出装置にインストールされた波形解析ソフトウエアで解析して検査対象の核酸を同定することを特徴とする核酸解離曲線の波形を解析ソフトウエアで解析して核酸を同定する方法。
【請求項２】
上記特定プライマーのヌクレオチド鎖は、５’末端側から順に、アデニン、シトシン、グアニン、チミンを含む塩基の何れが４つを示すコードで構成される第１の領域、上記塩基の何れか３つを示すコードで構成される第２の領域、及び上記塩基の何れか２つを示すコードで構成される第３の領域を有し、それぞれ第１、第２及び第３領域の塩基の長さは１０〜３０塩基からなり、該特定プライマー全鎖長に対する相補可能性を有するヌクレオチド鎖の割合が０．１２〜０．８８であることを特徴とする請求項１に記載の核酸解離曲線の波形を解析ソフトウエアで解析して核酸を同定する方法。
【請求項３】
検査対象の核酸と請求項２に記載の特定プライマーをポリメラーゼ酵素の存在下、液体反応系の集合体である液相ＤＮＡチップを使用して核酸増幅を行い、増幅産物の変性に伴う蛍光強度の減少を観測することによって求められる核酸溶解曲線を微分して得られた核酸解離曲線の山形の波形を解析することを特徴とする請求項１に記載の核酸解離曲線の波形を解析ソフトウエアで解析して核酸を同定する方法。
【請求項４】
上記波形解析ソフトウエアを用いて解析された検査対象の核酸波形解析データを、インターネットを介して細菌、体質、ウイルス、その他の微生物、植物、動物の遺伝子及びそれの変異遺伝子、人工的に作製された遺伝子などを解析、診断する目的のユーザーに提供するシステムであることを特徴とする核酸解離曲線の波形を解析ソフトウエアで解析して核酸を同定する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、検査対象の核酸変異を核酸解離曲線の波形を解析することから同定する方法であって、特に波形解析を核酸増幅・変異検出装置（以下、検出装置と略記する）にインストールされた波形解析ソフトウエア（以後、解析ソフトと略記する）を利用して行う核酸を同定する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
２本鎖核酸の未知あるいは既知の核酸変異を検出する方法としては、従来から様々な方法が考案され、実用化されている。この核酸の変異とは、主にその塩基配列の塩基の変異、または長さの変異に関するものであり、それらを検出することにより判別されてきた。
【０００３】
未知の核酸塩基配列変異の検出法としては、対象とする塩基配列の部分をポリメラーゼ連鎖反応（以後、ＰＣＲと略記する）で増幅し、この増幅産物を変性せず、直接、増幅産物をポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、その泳動度の差から変異を検出するＰＣＲ−ＳＳＣＰ（ＰＣＲ−Ｓｉｎｇｌｅ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）法やショットガン法、プライマーウォーキング法、クローニング法など、シークェンス技術を基本として未知の核酸変位を検出する方法が用いられている。
【０００４】
既知の核酸塩基配列変異の検出法としては、核酸を制限酵素で適当に切断し、変異のある部分に意図的にＰＣＲプライマーの３’末端を配置し、ＰＣＲが行われるか、否かで判別するＰＣＲ−ＡＳＰ（ＰＣＲ−Ａｌｌｅ  ＳｐｅｃｉｆｉｃＰｒｉｍｅｒ）法や変異部分をＰＣＲで増幅し、これを制限酵素で切断可能か否かで判断するＰＣＲ−ＲＦＬＰ（ＰＣＲ−Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｌｅｎｇｔｈ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）法、変異部分を蛍光標識プローブで検出するタックマンプローブ法や最新の技術としてＩｎｖａｄｅｒ法などがある。
【０００５】
最近では遺伝子の塩基配列が一箇所だけ異なる状態およびその部位を指す一塩基多型（Ｓｉｎｇｌｅ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ、以後ＳＮＰｓと略記する）により個人に最適な医療を提供するができるとの判断から、特に既知の塩基変異の検出法としてＤＮＡチップ法などの方法を用いて遺伝子の塩基配列の変異を検出する方法が盛んに行われている。
【０００６】
現在は様々な分野で遺伝子情報が必要とされ、特にＳＮＰｓの概念が確立されて以来、既知のＳＮＰｓを検出するのと同様、未知のＳＮＰｓを効率良く、つまり高度な技術を必要とせず短時間に安価に核酸変位を検出する方法として検体中の２本鎖核酸、又はその増幅産物を加熱し、１本鎖に解離する温度点の差異およびその特徴から２本鎖核酸の未知あるいは既知の変異を短時間に容易に、安価に推定する核酸変異の検出法が開示されている（例えば特許文献１参照。）。
【０００７】
【特許文献１】
特開２００２−３２５５８１明細書
【０００８】
特許文献１によると、検体中の２本鎖核酸に温度をかけていくと、それらは１本鎖核酸に解離する。この急激に解離する温度をＴｍ（Ｍｅｌｔｉｎｇ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）値と呼ぶが、解離温度およびスピードなどの特性は２本鎖核酸の塩基配列および塩基のアデニン（Ａ）とチミン（Ｔ）間、グアニン（Ｇ）とシトシン（Ｃ）間の結合強度に差があるために各塩基Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔの含有率に左右される。また、この解離する温度およびスピードは同じく２本鎖核酸の長さに左右されるので予め正常型・異常型のＴｍ値あるいはＴｍのパターンを作成しておけば検体核酸のＴｍ値あるいはＴｍパターンを比較照合することによって異常型の存在を既知の変異として検出するものである。
【０００９】
検体核酸のＴｍ値あるいはＴｍパターンを得る検出装置としては、蛍光エネルギ供与体分子が付加された塩基からなる１本鎖核酸とエネルギ受容体分子が付加された塩基からなる１本鎖核酸とが結合した２本鎖核酸に励起光を照射すると蛍光を発する状態とし、温度を上げ２本鎖核酸が１本鎖核酸に変性する時の温度上昇に伴う蛍光強度の減少から、温度と蛍光量の相対値との関係からなる核酸の核酸溶解曲線を求め、その核酸溶解曲線を微分することによって核酸解離曲線からＴｍ値あるいはＴｍパターンが迅速かつ精度良く検出できる核酸の変異検出装置が開示されている（例えば特許文献２参照。）
【００１０】
【特許文献２】
特開平７−３１５００明細書
【００１１】
又、遺伝性疾患、癌性疾患あるいは伝染性疾患等の遺伝子診断の目的で核酸中の特定塩基配列を検出するために標的核酸の塩基配列に相補的プライマーを用いて僅かしか含まれていない核酸配列を増幅して検出するＰＣＲ法（例えば、特許文献３参照。）は標的塩基配列に複数の相補的なプライマーを用いて増幅部分の両端を規定して増幅反応を行い、得られた増幅産物を同定するものであるが増幅産物の鎖長が長くなると制限酵素を用いて生成物を開裂させ、開裂した生成物を分離して同定する工程が必要であった。これに対して核酸上の任意の特定あるいは不特定領域に相補性を有するヌクレチオド鎖及び相補可能性を有するヌクレオチド鎖とからなる波形生成用プライマーを用いて塩基配列の異なる複数の核酸を増幅させ、各核酸産物の解離曲線（波形）を既知核酸の波形と比較する（波形解析と言う）ことから核酸を同定する方法（例えば、特許文献４参照）がある。
【００１２】
【特許文献３】
特公平４−６７９６０号明細書
【特許文献４】
特許願２００２−１４３７０８号明細書
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上述のＴｍ値あるいはＴｍパターン、更に言及すれば核酸の一部塩基配列を増幅して菌種や核酸変異などを同定する核酸同定法で得られた解離曲線の波形パターンからなる波形解析データを細菌分野、ウイルス分野、ヒトゲノム解析分野及び動植物分野などに属する研究開発者たるユーザーにインターネットを介して情報として提供され、必要とするユーザーが職種、用途、活性などユーザー属性に応じ、細菌、体質、ウイルス、動植物などを解析、診断することを目的とした波形解析データをデータベースから随時入手して当該研究開発に利用できる情報提供システムとするには核酸の変異検出装置から核酸溶解曲線や核酸解離曲線からＴｍ値あるいはＴｍパターンを図形データ（波形データと同意語）として入手するだけでなく、検出装置にインストールされて解析ソフトで核酸変異を検出し、更にデジタルデータに変換して保存する方法が適しているが、その様な核酸解離曲線を利用した核酸を同定する方法は未だ存在しない。本発明は、波形生成プライマーを使用して増幅した検査対象核酸の増幅産物から得られた波形パターンを解析ソフトで解析して核酸変異を検出する方法を提供することを目的とする。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
本発明は、検査対象の核酸を核酸上の任意の特定あるいは不特定領域に相補的な、各塩基鎖に１塩基を配置したヌクレオチド鎖を３’末端に有し、該領域に相補性を有す可能性のある、各塩基鎖に複数塩基を配置したヌクレオチド鎖を５’末端に有して、該ヌクレオチド鎖は５’末端側から３’末端側にかけて段階的に相補性が高まると共に、段階的に安定性が低くなるように配列された特定プライマーを添加してポリメラーゼ酵素の存在下で核酸増幅後、該核酸増幅産物の２本鎖核酸に所定波長の励起光を照射して発生した蛍光強度が１本鎖核酸に変性すると共に減少する現象を観測した核酸溶解曲線を微分して得られた核酸解離曲線の山形の波形を、検出装置にインストールされた解析ソフトで波形を解析することによって検査対象核酸の変異を同定することによって課題を解決した。
【００１５】
上記の特定プライマーとしては、ヌクレオチド鎖が５’末端側から順に、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔを含む塩基の何れが４つを示すコードで構成される第１の領域、上記塩基の何れか３つを示すコードで構成される第２の領域、及び上記塩基の何れか２つを示すコードで構成される第３の領域を有し、それぞれ第１、第２及び第３領域の塩基の長さは１０〜３０塩基からなり、該特定プライマー全鎖長に対する相補可能性を有するヌクレオチド鎖の割合が０．１２〜０．８８であるプライマーを使用する。
【００１６】
本発明は、検査対象の核酸との上記プライマーをポリメラーゼ酵素の存在下、液体反応系の集合体である独立した液体反応系である液相ＤＮＡチップを使用して核酸増幅を行った後、増幅産物を加熱し１本鎖核酸に変性・解離する際に得られる解離温度あるいは解離パターンを求め、それらのデータから対象核酸の性状を識別・同定するもので、このような独立した液体反応系を複数集合させた場合、ａ）各種の異なるプライマーを添加した複数の独立した液体反応系を多数配置することにより、同時に識別同定可能な核酸性状の種類が飛躍的に増加すること、ｂ）同定したい対象２本鎖核酸について、異なる解離パターンを示す複数のプライマーを複数の液体反応系に多数配置することにより、対象を異なるプライマーで多元的に同定することとなり、検出精度が向上すること、ｃ）チップ自体の価格が安価であり、単なる研究用ではなく日常の通常検査としても頻回に利用が可能なこと、ｄ）研究用としてもゲノム解析など大量のサンプル処理を安価に行うことができるため、ヒト遺伝子スクリーニングが可能となること、ｅ）通常のＤＮＡチップと異なり、核酸増幅も同一の処理工程に含まれること、ｆ）利用者が個々の特定の目的に応用する場合、プライマーの設計変更のみで容易に標的遺伝子の変更が可能なこと、ｇ）各液体反応系に抽出ＤＮＡをサンプルとして添加するのみで増幅・同定を行うことができるので現在市販されているリアルタイムＰＣＲ機器に解析ソフトウエアをインストールすることで本発明の核酸の変異検出装置として利用できる。
【００１７】
本発明では２本鎖核酸が１本鎖核酸に変性する時の温度と蛍光強度の相対値との関係で求められた山形の波形を、波形一致率で判定する波形解析ソフトウエアを用いて検査対象の核酸波形解析データがデジタル化されているためにインターネットを介して細菌、体質、ウイルス、動植物などを解析、診断する目的のユーザーに提供することが容易となる。また、データベースとして保存することができる。
【００１８】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態を添付図面で説明する。図１は本発明の源となる、特定塩基配列に対する特異性を低め、該特定塩基配列と相似性のある複数箇所に同時にアニールする波形生成プライマーを使用して標的核酸を増幅する方法を模式的に説明する図であり、同図（Ａ）は複数の配列が増幅される様子を示し、（Ｂ）は複数の増幅産物が種々の相互干渉構造を形成する様子を示すものである。この方法で増幅された副産物は複数種類の１本鎖からなり、この副産物が互いに干渉して図１（Ｂ）に模式的に示すような高次構造や夾雑物を形成する。この際に例えばサイバーグリーン等の２本鎖特異のインターカレーターを共存させておくと１本鎖核酸の各塩基が水素結合により引き合って２本鎖構造を形成する部分にインターカレーターが挿入され、励起光に応じて蛍光を発する。この相互干渉構造は、加熱により解離、変性し、再度１本鎖核酸に戻るが、この際にインターカレーターが放出され、蛍光を発しなくなる。この解離状況は鋳型核酸の種類によって多様な変化を示すので、解離状況を加熱に対する蛍光強度の減弱をプロットした解離曲線のパターンの観察から核酸の同定が可能となる。
【００１９】
図２は上記の核酸増幅に使用される波形生成プライマーの概念構成を説明するもので、骨格として３’末端側に１塩基配列の塩基配列を有し、５’末端側に複数塩基配列の塩基配列を有している。このように５’末端側に非特異的塩基配列を有することにより、特定塩基配列のみならず、これに類似するような相似性のある配列にアニールすることができる。
【００２０】
図３は解離曲の波形パターンを説明する図であり、同図（Ａ）は図２で説明した波形生成プライマーを使用して図１で説明した核酸増幅を行った場合の核酸増幅産物の波形パターンを示し、同図（Ｂ）はＰＣＲ法によって増幅した場合の波形パターンを示す。図３において、（１）はカンピロバクタ、（２）はインフルエンザ菌、（３）はネズミチフス菌の波形パターンであるが図３（Ａ）に示すように、図２で説明した波形生成プライマーを使用して図１で説明した核酸増幅を行った場合の核酸増幅産物の波形パターンは菌種毎に多様な波形パターンが観察され、この波形を検出装置にインストールされた解析ソフトで解析する。更にテータベースとして蓄積された波形解析データは菌種の核酸同定に有用なものとなる。
【００２１】
図４〜図６で検体核酸の波形パターンを解析ソフトウエアで解析する方法の概略を示す。波形一致率の判定は波形の状態値Ａと重みＢとの積で判定される。検体核酸増幅産物で求められた波形が既知の塩基配列の波形と完全一致の場合に状態値Ａ１＝１、不一致の場合にはＡ２＝０となり、状態値Ａに掛け合わされる重みＢは０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、の１１段階を設定する。
【００２２】
図４は波形一致率の重み設定を示す概略図である。波形一致率の重みについては１１段階の区分で設定し、該１１段階の区分で完全一致では１００％、１０点を固定とし、それ以外の設定は変更可能とする。これによって核酸の変性検出装置で求められた検体核酸増幅産物の波形パターンを解析することができる。又、デジタルデータとして保存され、あるいはインターネットを介して細菌、体質、ウイルス、植物などを解析、診断することを目的とするユーザーに送信されて利用される。
【００２３】
図５は検体核酸増幅産物で求められた核酸変性温度と蛍光強度の相対値の関係から求められた核酸溶解曲線を微分して得られた核酸解離曲線の山形の波形パターンを解析する手段として、例えば、核酸変性温度軸を５℃刻みで目盛り、ここに検体核酸増幅産物で求められた波形パターンを当てはめて解析する。
【００２４】
図６は波形解析プログラム機能である波形一致率の判定範囲の設定について示すもので、検体核酸増幅産物で求められた核酸変性温度と蛍光強度の相対値の関係から求められた核酸解離曲線の波形パターンを、予め既知の塩基配列で設定された範囲１と範囲２の範囲での波形との波形一致率を求めて検体核酸の核酸変異を決定する概要を示すものである。
【００２５】
【発明の効果】
本発明により、遺伝子解析、プロテオーム解析などのバイオ関連ビジネスや日常診療の中でのテーラメイド医療において核酸同定に標的核酸の解離曲線の波形をデジタル化された波形解析データとして利用できることになり、従来の種々の方法に比較して迅速、かつ低価格で核酸同定が可能となる。また、市販されている核酸増幅・検出装置に解析ソフトをインストールすることによっても本発明を利用することが可能となる。
【００２６】
本発明で求められた波形解析データはインターネットを介して各地に存在する細菌分野、ウイルス分野、ヒトゲノム解析分野及び動植物分野などに属する共同研究者に即座にデータベースから波形解析データを送付することが可能となり、研究の速度が速まる効果が見込まれる。
【図面の簡単な説明】
【図１】波形生成プライマーを使用した核酸増幅方法を模式的に説明する図であり、同図（Ａ）は複数の配列が増幅される様子を示し、同図（Ｂ）は複数の増幅産物が種々の干渉構造を形成する様子を示す。
【図２】波形生成プライマーの概念構造図である。
【図３】解離曲線の波形パターンの一例を示す。
【図４】波形一致率の区分の範囲設定の一例である。
【図５】波形パターンのＸ軸（変性温度）目盛りの設定の一例である。
【図６】波形一致率の判定範囲の設定の一例である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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