【手続補正書】
【提出日】平成23年11月10日(2011.11.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
a）6〜20アミノ酸長である;
b）β1インテグリン（SEQ ID NO:13）に対する対応ベストフィット配列アラインメントに少なくとも25％の類似度を有する
と定義されるCRKL結合モチーフを含み、および
100アミノ酸長またはそれ未満のアミノ酸長であり、CRKLを発現する細胞に生理的条件下で結合する、単離された腫瘍標的化ペプチド。
【請求項２】
CRKL結合モチーフが、β1インテグリン（SEQ ID NO:13）に対するベストフィット配列アラインメントに少なくとも40％の類似度を有する、請求項1記載のペプチド。
【請求項３】
CRKL結合モチーフが、β1インテグリン（SEQ ID NO:13）に対するベストフィット配列アラインメントに少なくとも50％の類似度を有する、請求項1記載のペプチド。
【請求項４】
CRKL結合モチーフが、β1インテグリン（SEQ ID NO:13）に対するベストフィット配列アラインメントに少なくとも60％の類似度を有する、請求項1記載のペプチド。
【請求項５】
β1インテグリン（SEQ ID NO:13）に対するベストフィット配列アラインメントに同一ではない配列を有する、請求項1記載のペプチド。
【請求項６】
CRKL結合モチーフが、β1インテグリン（SEQ ID NO:13）のPSIドメイン領域に対するベストフィット配列アラインメントを有する、請求項1記載のペプチド。
【請求項７】
CRKL結合モチーフが、アミノ酸10〜29;15〜34;18〜37;36〜55;39〜58;45〜64;94〜113;196〜215;198〜213;203〜222;244〜263;330〜349;377〜396;379〜398;380〜399;398〜417;400〜419;413〜432;447〜466;460〜479;460〜479;464〜483;469〜488;474〜493;475〜494;512〜533;519〜538;551〜570;574〜593;577〜596;579〜598;590〜609;596〜615;613〜632;615〜634;616〜635;644〜663;648〜667;663〜682;674〜693;682〜701;721〜740;727〜746;および779〜798からなる群より選択されるβ1インテグリン（SEQ ID NO:13）のPSIドメイン領域に対するベストフィット配列アラインメントを有する、請求項1記載のペプチド。
【請求項８】
CRKL結合モチーフが、SEQ ID NO:78〜SEQ ID NO:123からなる群より選択される配列を有する、請求項1記載のペプチド。
【請求項９】
環状ペプチドとしてさらに定義される、請求項1記載の単離ペプチド。
【請求項１０】
分子に結合している、請求項1記載の単離ペプチド。
【請求項１１】
分子がタンパク質であり、ペプチドが該タンパク質に結合または融合して、天然に存在するタンパク質ではないタンパク質複合体を形成する、請求項10記載の単離ペプチド。
【請求項１２】
タンパク質の末端に位置する、請求項11記載の単離ペプチド。
【請求項１３】
分子が、プロアポトーシス物質、抗血管新生物質、サイトカイン、細胞傷害性物質、薬剤、化学療法剤、ホルモン、増殖因子、抗生物質、抗体またはそのフラグメントもしくは一本鎖、生存因子、抗アポトーシス物質、ホルモンアンタゴニスト、抗原、ペプチド、タンパク質、診断薬、放射性同位体、または造影剤である、請求項10記載の単離ペプチド。
【請求項１４】
分子が、グラミシジン;マガイニン;メリチン;デフェンシン;セクロピン;（KLAKLAK）2（SEQ ID NO:70）;（KLAKKLA）2（SEQ ID NO:71）;（KAAKKAA）2（SEQ ID NO:72）;（KLGKKLG）3（SEQ ID NO:73）;Bcl-2;Bad;Bak;Bax;およびBikからなる群より選択されるプロアポトーシス物質である、請求項13記載の単離ペプチド。
【請求項１５】
プロアポトーシス物質が（KLAKLAK）2（SEQ ID NO:70）である、請求項14記載の単離ペプチド。
【請求項１６】
SEQ ID NO:70がDアミノ酸からなる、請求項15記載の単離ペプチド。
【請求項１７】
分子が、トロンボスポンジン、アンギオスタチン、色素上皮由来因子、アンギオテンシン、ラミニンペプチド、フィブロネクチンペプチド、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤、組織メタロプロテイナーゼ阻害剤、インターフェロン、インターロイキン12、血小板因子4、IP-10、Gro-β、トロンボスポンジン、2-メトキシエストラジオール、プロリフェリン関連タンパク質、カルボキシアミドトリアゾール、CM101、マリマスタット、ポリ硫酸ペントサン、アンギオポエチン2、ハービマイシンA、PNU145156E、16Kプロラクチンフラグメント、リノミド、サリドマイド、ペントキシフィリン、ゲニステイン、TNP-470、エンドスタチン、パクリタキセル、ドセタキセル、ポリアミン類、プロテアソーム阻害剤、キナーゼ阻害剤、シグナル伝達ペプチド、アキュチン、シドフォビル、ビンクリスチン、ブレオマイシン、AGM-1470、血小板因子4、ミノサイクリン、エンドスタチンXVIII、エンドスタチンXV、マトリックスメタロプロテイナーゼ-2のC末端ヘモペキシンドメイン、ヒトプラスミノーゲンのクリングル5ドメイン、エンドスタチンとアンギオスタチンの融合タンパク質、エンドスタチンとヒトプラスミノーゲンのクリングル5ドメインの融合タンパク質、インターフェロン-γによって誘導されるモノカイン（Mig）、MigとIP10の融合タンパク質、可溶性FLT-1（fins様チロシンキナーゼ1受容体）、またはキナーゼ挿入ドメイン受容体（KDR）からなる群より選択される抗血管新生物質である、請求項13記載の単離ペプチド。
【請求項１８】
分子が、インターロイキン1（IL-1）、IL-2、IL-5、IL-10、IL-11、IL-12、IL-18、インターフェロン-γ（IF-γ）、IF-α、IF-β、腫瘍壊死因子、またはGM-CSF（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子）からなる群より選択されるサイトカインである、請求項13記載の単離ペプチド。
【請求項１９】
巨大分子複合体に結合している、請求項10記載の単離ペプチド。
【請求項２０】
複合体が、ウイルス、バクテリオファージ、細菌、リポソーム、ミクロ粒子、磁気ビーズ、酵母細胞、または哺乳動物細胞である、請求項19記載の単離ペプチド。
【請求項２１】
ウイルスに結合している、請求項13記載の単離ペプチド。
【請求項２２】
レンチウイルス、パポバウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、AAV、ワクシニアウイルスまたはヘルペスウイルスである、請求項14記載の単離ペプチド。
【請求項２３】
ペプチドが固体支持体に結合している、請求項19記載の単離ペプチド。
【請求項２４】
固体支持体がマイクロタイターディッシュまたはマイクロチップである、請求項23記載の単離ペプチド。
【請求項２５】
請求項1記載のペプチドを得る工程および構築物を調製するために該ペプチドを分子に結合する工程を含む、構築物を調製する方法。
【請求項２６】
CRKLを発現する細胞へのペプチド、分子またはタンパク質の送達を標的化するための、薬学的組成物であって、該組成物が
CRKLを発現する細胞を含む細胞集団に該ペプチドを投与することにより分子またはタンパク質を該細胞に送達するための、得られた請求項1記載のペプチドを含む、
前記組成物。
【請求項２７】
CRKLを発現する細胞が被験者中に存在し、ペプチドまたはタンパク質融合構築物が薬学的に許容される組成物中で製剤される、請求項26記載の組成物。
【請求項２８】
被験者がヒト被験者である、請求項27記載の組成物。
【請求項２９】
細胞に送達されたペプチド、分子またはタンパク質を検出する、請求項26記載の組成物。
【請求項３０】
被験者が疾患または障害を有している、請求項26記載の組成物。
【請求項３１】
被験者が癌を有する、請求項30記載の組成物。
【請求項３２】
癌が、前立腺癌、乳癌、肉腫、歯肉癌、舌癌、肺癌、皮膚癌、肝癌、腎癌、眼癌、脳癌、白血病、中皮腫、神経芽細胞腫、頭部癌、頸部癌、膵癌、腎癌、骨癌、精巣癌、卵巣癌、中皮腫、子宮頸癌、胃腸癌、リンパ腫、脳癌、結腸癌および膀胱癌からなる群より選択される、請求項31記載の組成物。
【請求項３３】
癌が前立腺癌である、請求項32記載の組成物。
【請求項３４】
癌が乳癌である、請求項32記載の組成物。
【請求項３５】
癌が肉腫である、請求項32記載の組成物。
【請求項３６】
モチーフが、6〜10アミノ酸長であるとさらに定義される、請求項1記載の方法。
【請求項３７】
モチーフが、14〜20アミノ酸長であるとさらに定義される、請求項1記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
本発明の一つの局面は、6〜20アミノ酸長であり、β1インテグリン（SEQ ID NO:13）に対する対応ベストフィット配列アラインメントに少なくとも25％の類似度を有すると定義されるCRKL結合モチーフを含み、および100アミノ酸長またはそれ未満のアミノ酸長であり、CRKLを発現する細胞に生理的条件下で結合する、単離された腫瘍標的化ペプチドに関連した。CRKL結合モチーフは、β1インテグリン（SEQ ID NO:13）に対するベストフィット配列アラインメントに少なくとも40％、少なくとも50％、または少なくとも60％の類似度を有し得る。特定の態様では、ペプチドは、β1インテグリン（SEQ ID NO:13）に対するベストフィット配列アラインメントに同一ではない配列を有する。特定の態様では、CRKL結合モチーフは、β1インテグリン（SEQ ID NO:13）のPSIドメイン領域に対するベストフィット配列アラインメントを有し得る。CRKL結合モチーフは、アミノ酸6〜10;10〜29;15〜34;18〜37;36〜55;39〜58;45〜64;94〜113;196〜215;198〜213;203〜222;244〜263;330〜349;377〜396;379〜398;380〜399;398〜417;400〜419;413〜432;447〜466;460〜479;460〜479;464〜483;469〜488;474〜493;475〜494;512〜533;519〜538;551〜570;574〜593;577〜596;579〜598;590〜609;596〜615;613〜632;615〜634;616〜635;644〜663;648〜667;663〜682;674〜693;682〜701;721〜740;727〜746;および779〜798からなる群より選択されるβ1インテグリン（SEQ ID NO:13）のPSIドメイン領域に対するベストフィット配列アラインメントを有し得る。特定の態様では、CRKL結合モチーフは、SEQ ID NO:78〜SEQ ID NO:123からなる群より選択される配列を有する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
前記ペプチドは分子に結合され得る;たとえば、分子はタンパク質であり得、ペプチドは該タンパク質に結合または融合して、天然に存在するタンパク質ではないタンパク質複合体を形成し得る。ペプチドは、該タンパク質の末端に位置し得る。前記分子は、プロアポトーシス物質、抗血管新生物質、サイトカイン、細胞傷害性物質、薬剤、化学療法剤、ホルモン、増殖因子、抗生物質、抗体またはそのフラグメントもしくは一本鎖、生存因子、抗アポトーシス物質、ホルモンアンタゴニスト、抗原、ペプチド、タンパク質、診断薬、放射性同位体、または造影剤であり得る。前記分子は、グラミシジン;マガイニン;メリチン;デフェンシン;セクロピン;（KLAKLAK）2（SEQ ID NO:70）;（KLAKKLA）2（SEQ ID NO:71）;（KAAKKAA）2（SEQ ID NO:72）;（KLGKKLG）3（SEQ ID NO:73）;Bcl-2;Bad;Bak;Bax;およびBikからなる群より選択されるプロアポトーシス物質であり得る。特定の態様では、プロアポトーシス物質は（KLAKLAK）2（SEQ ID NO:70）である。SEQ ID NO:70はDアミノ酸からなり得る。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
以下の図面は本明細書の一部であり、本発明の特定の局面をさらに明らかにするために含まれる。本発明は、本明細書において提示する特定の態様の詳細な説明と組み合わせて図面を参照することにより、さらによく理解され得る。
（図１Ａ）図1A〜C:癌細胞におけるペプチドの標的化およびインターナリゼーション。図1A、ファージペプチド
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は、DU145細胞の細胞表面に結合する。配列RGD-4Cを提示するファージクローン（Arap et al., 1998）は陽性対照として、およびfd-tet（挿入物なし）は陰性対照としての役割を果たした。バーは、三重の平板培養からの平均±標準偏差を表す。
（図１Ｂ）図1A〜C:癌細胞におけるペプチドの標的化およびインターナリゼーション。図1B、非透過処理KS 1767 細胞の細胞表面上の腫瘍ホーミングファージの免疫局在。
（図１Ｃ）図1A〜C:癌細胞におけるペプチドの標的化およびインターナリゼーション。図1C、合成ペプチドYRCTLNSPFFWEDMTHECHAGG-D(KLAKLAK)2 SEQ ID NO:67)は、WST-1試薬および抗アネキシンV FITC抗体を使用することにより細胞生存率によって測定されるように、DU 145細胞内のインターナリゼーションを可能にする。
（図１Ｄ）図1D、合成ペプチドYRCTLNSPFFWEDMTHECHAGG-D(KLAKLAK)2 SEQ ID NO:67)は、WST-1試薬および抗アネキシンV FITC抗体を使用することにより細胞生存率によって測定されるように、DU 145細胞内のインターナリゼーションを可能にする。
（図２Ａ）図2A〜C:腫瘍ホーミングペプチドとβ1インテグリン（SEQ ID NO:13）の配列アラインメント。図2A、腫瘍ホーミングペプチド
2011525491.tif 000002
は、プレキシン-セマフォリン-インテグリン（PSI）ドメイン（配列領域26〜78の残基）（SEQ ID NO:12）にマッチする。
（図２Ｂ）図2A〜C:腫瘍ホーミングペプチドとβ1インテグリン（SEQ ID NO:13）の配列アラインメント。図2B、8個すべてのβインテグリンサブユニット（SEQ ID NO:14〜21）と
2011525491.tif 000003
ペプチド配列の配列アラインメント。
（図２Ｃ）図2A〜C:腫瘍ホーミングペプチドとβ1インテグリン（SEQ ID NO:13）の配列アラインメント。図2C、すべての腫瘍ホーミングペプチド（表1）とβ1インテグリン（SEQ ID NO:13）の配列アラインメント。
（図３Ａ）図3A〜D:ペプチドによる受容体結合。図3A、組換えHisタグCRKL（rCRKL）、rCRKL-SH3（N）ドメイン、およびrCRKL-SH3（C）ドメインは、腫瘍ホーミングペプチド
2011525491.tif 000004
に結合する。
（図３Ｂ）図3A〜D:ペプチドによる受容体結合。図3B、組換えHisタグrCRKL、rCRKL-SH3（N）ドメイン、およびrCRKL-SH3（C）ドメインは、PSIドメイン内の領域に対応する合成ペプチドNSTFLQEGMPTSA（SEQ ID NO:23）に結合する。
（図３Ｃ）図3A〜D:ペプチドによる受容体結合。図3C、PSIドメイン全体の組換えgst融合タンパク質（残基22〜82 SEQ ID NO: 74-CLKANAKSCGECIQAGPNCGWCTNSTFLQEGMPTSARCDDLEALKKKGC)、直鎖状gst-PSI (残基48-62, SEQ ID NO: 75 - TNSTFLQEGMPTSAR)、環状gst-PSI (残基26-74, SEQ ID NO: 76 - CTNSTFLQEGMPTSARC)を結合アッセイのために作製した。直鎖状PSIおよび環状PSI由来の領域はどちらもCRKLに結合する。
（図３Ｄ）図3A〜D:ペプチドによる受容体結合。図3D、rCRKL-SH3（C）ドメインへの腫瘍ホーミングペプチドの結合活性は、腫瘍ホーミング
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ペプチドによって、PSI由来（NSTFLQEGMPTSA;SEQ ID NO:23）ペプチドまたはSEQ ID NO:1を提示する腫瘍ホーミングファージによって阻害される。バーは、三重のウエルからの平均±標準偏差を表す。
（図４Ａ）図4A〜D:CRKLと結合ペプチドとの間の相互作用。図4A、腫瘍ホーミングペプチドへのrCRKL-SH3（C）の結合特性。SEQ ID NO:1におけるPro→Alaは、SEQ ID NO:25として提供される。CRKL SH3（C）ドメインの突然変異分析。
（図４Ｂ）図4A〜D:CRKLと結合ペプチドとの間の相互作用。図4B、腫瘍ホーミングファージ（CNSTFLQEGMPTSAC; SEQ ID NO:77を提示する）およびPSI由来ファージ（CNSTFLQEGMPTSAC;SEQ ID NO:23を提示する）は、組換えCRKLに結合する。バーは、三重のウエルからの平均±標準偏差を表す。
（図４Ｃ）図4A〜D:CRKLと結合ペプチドとの間の相互作用。図4C、CRKL SH3（C）ドメイン（SEQ ID NO:24）およびHisタグ組換えタンパク質として作製した対照欠失突然変異型の概略図。4つの突然変異型を作製し、試験した:Δ1（欠失残基236〜256）、Δ2（欠失残基257〜277）、Δ3（欠失残基278〜293）、およびΔSH3（C）（欠失残基236〜293）。
（図４Ｄ）図4A〜D:CRKLと結合ペプチドとの間の相互作用。図4D、結合領域は、SH3（C）ドメインの残基236〜277の間に位置する。
（図５）CRKLとβ1インテグリンとの間のタンパク質-タンパク質相互作用。組換えgst-PSIタンパク質によるβ1インテグリンへのCRKL結合の濃度依存的阻害（800nMまで）。インテグリンαvβ3およびαvβ5を対照として使用した。三重のウエルからの平均の標準偏差を示す。
（図６Ａ）図6A〜B:CRKLの細胞表面局在。図6A、DU145細胞上のCRKLのフローサイトメトリー分析。モノクローナル抗CRKL（＊＊）、抗β1インテグリン（＊）、および抗AHSG抗体（c、対照）を使用することによって免疫標識を実施した。
（図６Ｂ）図6A〜B:CRKLの細胞表面局在。図6B、細胞表面上の個々のCRKL-金粒子（矢印）を示すCRKLの透過型電子顕微鏡検査（TEM）。試験に使用したDU145細胞は、透過処理を行わずに固定した。抗CRKLポリクローナル抗体を試験において使用した。スケールバーを示す。
（図７Ａ）図7A〜C:CRKL分泌。図7A、無血清培地（SFM）で培養した様々な癌細胞型は、非リン酸化形態のCRKLを分泌する。
（図７Ｂ）図7A〜C:CRKL分泌。図B、CRKL抗体は、培地中の細胞外形態のCRKLを中和し、細胞の増殖および移動に影響を及ぼす。使用した対照抗体は以下のとおりであった:抗IL-11受容体、抗AHSG、抗grb2、抗α6インテグリン、および免疫前抗体。バーは、二重のウエルからの平均±標準偏差を表す。
（図７Ｃ）図7A〜C:CRKL分泌。図C、CRKL抗体は、培地中の細胞外形態のCRKLを中和し、細胞の増殖および移動に影響を及ぼす。使用した対照抗体は以下のとおりであった:抗IL-11受容体、抗AHSG、抗grb2、抗α6インテグリン、および免疫前抗体。バーは、二重のウエルからの平均±標準偏差を表す。
（図８Ａ）図8A〜D:CRKLのsiRNAノックダウンの影響。細胞の増殖（図8A）を示す。三重のウエルからの平均の標準偏差を表す。
（図８Ｂ）図8A〜D:CRKLのsiRNAノックダウンの影響。細胞の接着（図8B）を示す。三重のウエルからの平均の標準偏差を表す。
（図８Ｃ）図8A〜D:CRKLのsiRNAノックダウンの影響。細胞の移動（図8C）を示す。三重のウエルからの平均の標準偏差を表す。
（図８Ｄ）図8A〜D:CRKLのsiRNAノックダウンの影響。図8D、組換えCRKLは、細胞増殖アッセイにおいてCRKL siRNAノックダウン細胞を救済する。DU145細胞をCRKL siRNAで48時間トランスフェクトした後、組換えCRKLを外因的にウエルに添加した。WST-1試薬を用いて細胞増殖を測定した。
（図９Ａ）図9A〜D:腫瘍標的化および機構モデル。図9A、rCRKLへの腫瘍ホーミングまたは対照（挿入物なし、突然変異型
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、またはスクランブル
2011525491.tif 000007
）ファージのインビトロでのファージ結合。
（図９Ｂ）図9A〜D:腫瘍標的化および機構モデル。図9B〜D、種々の腫瘍型を担持するマウスにおける標的化または対照ファージ構築物のインビボでのホーミング。腫瘍ホーミングファージは、対照と比較した場合、腫瘍に選択的に局在した。2つの独立した実験からの代表的データを示す。
（図９Ｃ）図9A〜D:腫瘍標的化および機構モデル。図9B〜D、種々の腫瘍型を担持するマウスにおける標的化または対照ファージ構築物のインビボでのホーミング。腫瘍ホーミングファージは、対照と比較した場合、腫瘍に選択的に局在した。2つの独立した実験からの代表的データを示す。
（図９Ｄ）図9A〜D:腫瘍標的化および機構モデル。図9B〜D、種々の腫瘍型を担持するマウスにおける標的化または対照ファージ構築物のインビボでのホーミング。腫瘍ホーミングファージは、対照と比較した場合、腫瘍に選択的に局在した。2つの独立した実験からの代表的データを示す。
（図１０）腫瘍担持マウスにおける標的化阻害。腫瘍ホーミングファージを対照gstまたは組換えgst-CRKLと共にプレインキュベートした後、大きさの適合するヒト腫瘍（DU145由来）を担持するヌードマウスに投与した。組換えCRKLによって前処理した腫瘍ホーミングファージにおいて阻害が認められた。2つの独立した実験からの結果を示す。
（図１１）合成腫瘍ホーミングプロアポトーシスペプチドによる腫瘍異種移植片の処理。ヒト前立腺癌異種移植片（DU145由来）を担持する、大きさの適合するヌードマウスのコホートを使用した。合成腫瘍ホーミングプロアポトーシスペプチドYRCTLNSPFFWEDMTHECHAGG-D(KLAKLAK)2 (SEQ ID NO:67)で処置した腫瘍担持マウスにおいて腫瘍増殖の著明な低下が認められた。等モル量の
2011525491.tif 000008
(SEQ ID NO:70)は、未処置動物と比較して腫瘍体積に差を示さなかった（スチューデント t-検定、p＜0.001）。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２８】
本発明は、たとえば、6〜20アミノ酸長であり、β1インテグリン（SEQ ID NO:13）に対する対応ベストフィット配列アラインメントに、たとえば少なくとも25％の類似度を有すると定義されるCRKL結合モチーフを含み、および100アミノ酸長またはそれ未満のアミノ酸長であり得、CRKLを発現する細胞に生理的条件下で結合する、単離された腫瘍標的化ペプチドを提供する。CRKL結合モチーフは、β1インテグリン（SEQ ID NO:13）に対するベストフィット配列アラインメントに少なくとも40％、少なくとも50％、または少なくとも60％の類似度を有し得る。特定の態様では、ペプチドは、β1インテグリン（SEQ ID NO:13）に対するベストフィット配列アラインメントに同一ではない配列を有する。特定の態様では、CRKL結合モチーフは、β1インテグリン（SEQ ID NO:13）のPSIドメイン領域に対するベストフィット配列アラインメントを有し得る。CRKL結合モチーフは、アミノ酸10〜29;15〜34;18〜37;36〜55;39〜58;45〜64;94〜113;196〜215;198〜213;203〜222;244〜263;330〜349;377〜396;379〜398;380〜399;398〜417;400〜419;413〜432;447〜466;460〜479;460〜479;464〜483;469〜488;474〜493;475〜494;512〜533;519〜538;551〜570;574〜593;577〜596;579〜598;590〜609;596〜615;613〜632;615〜634;616〜635;644〜663;648〜667;663〜682;674〜693;682〜701;721〜740;727〜746;および779〜798からなる群より選択されるβ1インテグリン（SEQ ID NO:13）のPSIドメイン領域に対するベストフィット配列アラインメントを有し得る。特定の態様では、CRKL結合モチーフは、SEQ ID NO:78〜SEQ ID NO:123からなる群より選択される配列を有する。特定の態様では、単離ペプチドは環状ペプチドとしてさらに定義され得る。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２９】
様々なCRKL結合ペプチドが本発明に関して使用され得る。CRKL結合ペプチドの非限定的なリストを以下に提供する（SEQ ID NO:78〜123）。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３０】
（表1）腫瘍ホーミングペプチドはβ1インテグリンと類似度を共有する
2011525491.tif 000009
2011525491.tif 000010
2011525491.tif 000011
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３２】
「腫瘍標的化ペプチド」は、6〜20アミノ酸長であり、β1インテグリン（SEQ ID NO:13）に対する対応ベストフィット配列アラインメントに少なくとも25％の類似度を有すると定義されるCRKL結合モチーフを含み、および100アミノ酸長またはそれ未満のアミノ酸長であり、細胞外CRKLとの特異的結合を含む、生理的条件下での器官、組織または細胞型への選択的局在化によって特徴づけられるペプチドである。選択的局在化は、たとえば以下で開示する方法によって測定でき、その方法では、推定上の標的化ペプチド配列がファージの外表面で提示されるタンパク質に結合する。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５８】
プロアポトーシス物質の例は、グラミシジン;マガイニン;メリチン;デフェンシン;セクロピン;（KLAKLAK）2（SEQ ID NO:70）;（KLAKKLA）2（SEQ ID NO:71）;（KAAKKAA）2（SEQ ID NO:72）;（KLGKKLG）3（SEQ ID NO:73）;Bcl-2;Bad;Bak;Bax;およびBikである。特定の態様では、前記プロアポトーシス物質は（KLAKLAK）2（SEQ ID NO:70）である。SEQ ID NO:70はDアミノ酸からなり得る。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１４】
実施例1:インビボでの腫瘍ホーミングペプチドの選択
ファージディスプレイランダムペプチドライブラリー（Arap et al., 1998; Pasqualini and Ruoslahti, 1996; Pasqualini et al., 2001）を、ヒトDU145由来の前立腺癌異種移植片を担持するnu/nu（ヌード）マウスに静脈内投与し、24時間の循環時間枠後に腫瘍を回収した。3回の選択後、腫瘍標的ファージ富化集団を回収し、個々のファージクローンによって提示されたペプチド挿入物に対応するDNAを配列決定した（表２）。主要ペプチドを選択し、機能的特徴づけのためにアミノ酸配列
2011525491.tif 000012
を選択した。最初に、
2011525491.tif 000013
ペプチドの腫瘍標的化特異性を、DU145由来腫瘍を担持するマウスにおいてインビボで評価した。個々の
2011525491.tif 000014
の全身静脈内投与後、いくつかの対照器官で認められたファージ局在を伴わないまたはかろうじて検出可能なファージ局在を伴う、腫瘍異種移植片への著明なホーミングが観察された（挿入物不含ファージを陰性対照として使用した）。これに一致して、DU145前立腺癌細胞はまた、水相-有機相分離アッセイ（Giordano et al., 2001）およびファージに基づく免疫蛍光アッセイ（KS1767細胞）を使用することによってインビトロでも標的され、ペプチド
2011525491.tif 000015
を提示するファージは、ペプチド挿入物を提示しない陰性対照ファージよりもはるかに多く腫瘍細胞表面に結合することが認められた（図1A、B）。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１５】
（表２）
2011525491.tif 000016
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１８】
ファージディスプレイランダムペプチドライブラリーの選択
インビボでのファージスクリーニングを記述されているように（Arap et al.,1998; Arap et al., 2004; Pasqualini and Ruoslahti, 1996; Pasqualini et al., 2001）実施した。一般的な配置X2CX12CX2（SEQ ID NO:124）（C、システイン;X、任意の残基）で挿入物を提示するランダムファージライブラリーを、ヒトDU145前立腺癌細胞由来の腫瘍異種移植片を担持する無胸腺ヌードマウスに全身投与し（尾静脈）、24時間循環させた。マウスを深麻酔下に置き、腫瘍異種移植片を切除して、計量し、結合ファージ集団を回収して、処理した（Arap et al., 1998; Arap et al., 2004; Pasqualini and Ruoslahti, 1996; Pasqualini et al., 2001）。連続3回のインビボ選択を実施した。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２４】
ファージ結合およびタンパク質-タンパク質アッセイ
精製タンパク質に関するファージ結合アッセイを記述されているように（Giordano et al. 2001）実施した。組換えタンパク質を先に記述されているように（Cardo-Vila et al., 2003; Smith and Scott, 1993）マイクロタイターウエルに被覆した。簡単に述べると、タンパク質をPBS 50μl中1μg/mlで4℃にて一晩マイクロタイターウエルに固定化した。ウエルをPBSで2回洗浄し、3％  BSAを含有するPBSにより室温で2時間ブロックして、109 T.U.の野生型腫瘍ホーミングファージ
2011525491.tif 000017
、スクランブルファージ
2011525491.tif 000018
、突然変異型ファージ
2011525491.tif 000019
、PSI由来環状ファージ（CNSTFLQEGMPTSAC;SEQ ID NO:77）またはfd-tetファージと共に、1.5％  BSAを含有するPBS 50μl中でインキュベートした。室温で1時間後、ウエルをPBSで10回洗浄し、細菌感染によってファージを回収した。ポリクローナル抗CKRLを用いたELISAは、ウエル上のCKRL組換えタンパク質の存在と濃度を確認した。タンパク質を含有するSH3への腫瘍ホーミングファージの結合を試験するため、マイクロタイターウエルを250ng/mlの組換えgst-SH3ドメイン（CKRL-D1、CKRL-D2、grb2-D1、grb2-D2、Lyn、src;Pronomics）、rCKRLタンパク質、および陰性対照gstまたはBSAで4℃にて一晩被覆した。SH3（C）突然変異型結合試験のために、2μg/mlのHisタグ組換え野生型SH3-Cおよび突然変異型SH3（C）ドメインを被覆した。腫瘍ホーミングファージ（1010 T.U.）またはfd-tetファージ（挿入物なし）を各ウエルに添加し、前述したように結合アッセイを実施した。CRKLとインテグリンβ1の間のタンパク質-タンパク質相互作用実験を、1μg/ウエルのα5β1、αvβ3またはαvβ5インテグリン（Chemicon）で被覆したウエルに関して実施した。gst-PSIによるβ1インテグリンへのCKRLの結合阻害を評価するため、CKRLと漸増濃度のgst-PSIまたはgstを室温で15分間プレインキュベートした後、被覆ウエルに添加した。3時間後、抗CKRL抗体、続いてHRP結合抗ウサギIgGを使用してインテグリンへのCKRLの結合を検出した。等しい量のインテグリンがプレートに結合したことを確認するため、抗インテグリン抗体（Amersham Pharmacia）の1:1500希釈を使用して並行実験を実施した。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２５】
スクランブルおよび突然変異型腫瘍ホーミングファージの設計と構築
CRKLタンパク質への結合特性を検討するファージクローンを作製するため、スクランブルペプチド配列を提示するファージおよび突然変異型（Pro→AlaおよびPhe-Phe-Trp→Ala-Ala-Ala）を、選択したCRKL結合腫瘍ホーミングファージペプチド
2011525491.tif 000020
から設計し、構築した。スクランブルペプチド配列
2011525491.tif 000021
、突然変異型
2011525491.tif 000022
または天然PSI由来ファージ（CNSTFLQEGMPTSAC;SEQ ID NO:77）をSfiI消化したfUSE5ベクター（Smith and Scott,1993）にクローニングした。簡単に述べると、提示されるペプチドに対応する合成オリゴヌクレオチド鋳型の各々500ng（Sigma-Genosys）を、プライマーセット
2011525491.tif 000023
（Sigma-Genosys）ならびに20μl中のTaq-DNAポリメラーゼ（Promega）2.5Uを用いて以下のようにPCR増幅によって二本鎖DNAに変換した:94℃、2分、続いて94℃、30秒、60℃、30秒および72℃、30秒を35サイクル、続いて72℃、5分間。挿入物隣接領域内にBglI制限部位を含有する二本鎖DNA配列を、QIAquickヌクレオチド除去キット（Qiagen）を使用して精製し、溶出した。オリゴヌクレオチドをBglIにより37℃で2時間消化し、再精製して、SfiI消化fUSE5ベクターに連結した。生じたファージクローンを、正しい挿入とヌクレオチド配列を確認するためにPCR増幅した。個々のファージクローンをファージ結合アッセイにおいて試験した。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２７】
グリシニルグリシン架橋を介してプロアポトーシス配列に融合した腫瘍ホーミングペプチドのインターナリゼーション能力を記述されているように（Arap et al., 2004; Ellerby et al., 1999; Kolonin et al., 2004; Zurita et al., 2004）試験した。複合腫瘍ホーミングペプチド、YRCTLNSPFFWEDMTHECHAGG-D(KLAKLAK)2 (SEQ ID NO:67)または非標的化対照ペプチドD（KLAKLAK）2(SEQ ID NO:70)を合成し、漸増等モルペプチド濃度をDU145細胞に添加した。細胞生存率を、WST-1試薬（Roche）およびアポトーシスに関するアネキシンV染色によって検定した（Zurita et al., 2004; Cardo-Vila et al., 2003）。腫瘍ホーミングファージ局在化試験のために、細胞を109 T.U.の腫瘍ホーミングファージ
2011525491.tif 000024
または陰性対照（fd-tet）ファージと共に6時間および24時間インキュベートした。ウエルを20mMグリシンで洗浄して非特異的細胞表面結合ファージを除去し、次に4％パラホルムアルデヒドで固定した。非透過処理細胞をウサギ抗fdバクテリオファージ抗体（Sigma）と共に室温で2時間、続いてCys3標識抗ウサギIgG抗体（Jackson ImmunoResearch）と共に1時間インキュベートした。細胞を再び4％パラホルムアルデヒドで固定し、DAPI（Vector Laboratories）の存在下で標本にして、Olympus蛍光顕微鏡で画像を取得した。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２８】
実施例4:CRKLとの相互作用の特徴づけ
他の試験は、SH3ドメインが、1個のPro残基を含有するモチーフに加えてPXXPおよび非PXXPモチーフに結合することを示した（Mayer, 2001; Sicheri et al., 1997; Kang et al., 2000; Kato et al., 2000; Xu et al., 1997）。SEQ ID NO:1に示す配列はいかなるそのような公知のモチーフも含有しないので、部位指定突然変異誘発を使用して腫瘍ホーミングペプチドの結合特性を評価した。これらの試験の結果は、CRKL-SH3（C）ドメインへの結合が腫瘍ホーミングペプチド内に存在するPro残基および環状Cys-Cysジスルフィド架橋に依存することを示した（図4A）;fd-tet挿入物不含ファージおよび無関係な合成環状ペプチドを陰性対照として使用した。CRKL-SH3（C）ドメインの突然変異分析も実施し、結果は、結合領域が残基Gly236とTrp277の間であることを示した（図  4C、D）。加えて、腫瘍ホーミングファージ（SEQ ID NO:1）とPSI由来ファージ（SEQ ID NO:77）の両方が組換えCRKLに結合することが示された（図4B）。さらに、アフィニティークロマトグラフィーを使用することにより、CRKLがDU145無血清馴化培地から精製され得ること、および突然変異形態の腫瘍ホーミングペプチドで調製した対照カラムは、同じ実験条件下でもはやCRKLに検出可能レベルで結合しないことが確認された。膜画分との相互共免疫沈降アッセイを使用することにより、CRKLとβ1インテグリンは細胞表面複合体を形成することが確認された;これに対し、抗IL11受容体、抗EGF受容体、または他のインテグリン（抗β3および抗β5）を含む無関係な膜貫通受容体に対して惹起した対照抗体は、CRKLまたはβ1インテグリンとの関連を示さなかった。最後に、CRKLとβ1インテグリンの間のタンパク質-タンパク質相互作用は、組換えタンパク質として発現されるPSIドメインによって用量依存的に阻害され得ることが明らかにされた（IC50＝20nm）;共免疫沈降試験と一致して、対照インテグリンは結合を示さなかった（図5）。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２９】
突然変異型構築物
すべてのプライマーセットを（表３）に要約する。完全長CRKL cDNA（Invitrogen）のオープンリーディングフレームをPCR増幅しpET28a（Novagen）発現ベクターにクローニングした。SHドメインの各々に対応するcDNAをPCR増幅し、ベクターのSac IおよびXho I制限部位にクローニングした。すべての構築物を制限消化およびDNA配列決定によって確認し、BL21（Stragene）細菌株に形質転換して、組換えタンパク質をHisタグカラム（Qiagen）で精製した。精製組換えタンパク質を、クマシー染色ならびに抗CRKLおよび抗His抗体を使用することによるウエスタンブロット分析を通して確認した。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３０】
SH3ドメイン（カルボキシル末端）のCRKL突然変異型をPCR突然変異誘発によって作製した。60bp（Δ1およびΔ2）と54bp（Δ3）を除去し、読み枠を維持するようにプライマーセットを設計した。PSIドメイン構築物のために、環状および線状ペプチド形態のPSIドメインを生成した。PSIオリゴヌクレオチドをアニーリングした後（表３）、二本鎖オリゴヌクレオチドを、EcoRIでの消化後にヌクレオチド除去キット（QIAGEN）を用いて精製し、pGEX4T-1ベクターにクローニングした。CRKLタンパク質がオリゴマー化することを示すため、漸増濃度の組換えgst-CRKLを固定化CRKLタンパク質（Hisタグ組換え形態）または固定化BSAと共に4℃で一晩インキュベートし、その後3回洗浄した。gstに対する抗体を使用することによってタンパク質-タンパク質相互作用を検出した。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３１】
（表３）PCRプライマー（SEQ ID NO:32〜53）
2011525491.tif 000025
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３３】
細胞表面および膜局在化
ビオチンによる細胞表面標識化を記述されているように（Monferran et al., 2004）実施した。簡単に述べると、DU145細胞を膜不透過性Biotin-LC-LC-NHS EZ link（Pierce）で標識した。ビオチニル化膜タンパク質を洗浄し、可溶化して、清澄化し、続いてストレプトアビジンビーズ（Pharmacia）で免疫沈降させた。指示される適切な抗体でウエスタンブロット法を実施した。ファージ細胞表面結合アッセイを、選択的相互作用性リガンドのバイオパニング迅速分析（Biopanning and Rapid Analysis of Selective Interactive Ligands）（BRASIL）法（Giordano et al., 2001）を介して、記述されているようにDU145細胞に関して実施した。膜分画を記述されているように（Mintz et al., 2003）実施した。免疫ブロットを指示される適切な抗体でプローブした。共焦点画像をLSM 510（Carl Zeiss）共焦点顕微鏡で取得した。DU145細胞をフィブロネクチン被覆スライドガラス上で増殖させ、4％パラホルムアルデヒド（PFA）で固定して、適切な抗体（ポリクローナルCRKL抗体およびモノクローナルAHSG抗体）で標識した。電子顕微鏡画像をHigh Resolution Electron Microscopy Core Facility（JSM 5900走査型およびJEM 1010透過型電子顕微鏡）で取得した。金ナノ粒子抗体複合体を、20〜25nmまたは40〜45nmの金をホウ酸ナトリウム中で混合することによって調製した。金結合ナノ粒子をTEM分析によって確認した。DU145細胞を氷上にて適切な抗体（モノクローナル抗CRKL、抗β1インテグリン、および抗AHSG抗体）で標識し、続いて二次結合蛍光抗体で標識して、FACSによって分析した。
【手続補正２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３６】
siRNA試験
CRKL（mRNAアクセッション番号NM＿005207）、β1インテグリン（mRNAアクセッション番号NM＿002211）、および対照siRNAを購入した（Santa Cruz, AmbionおよびDharmacon）。siRNAオリゴヌクレオチド配列および対応する製造業者を（表４）に要約する。Oligofectamine（Invitrogen）またはDharmaFect（Dharmacon）を使用してsiRNAをDU 145細胞にトランスフェクトした（1〜2x105細胞/ウエル）。トランスフェクトした細胞を処理の前に48〜72時間インキュベートした。アネキシンV染色（Roche）によって測定した場合、トランスフェクト細胞において細胞死またはアポトーシスは認められなかった。トランスフェクト細胞を採集し、プロテアーゼ阻害剤の存在下で溶解した。腫瘍ホーミングファージ結合活性も、CRKLノックダウン細胞において検討した。救済実験のために、1.5μgまでの組換えCRKLをCRKL siRNAトランスフェクト細胞に外因的に添加した。外因性Hisタグ組換えCRKLタンパク質（400ng/ml）または対照タンパク質（EGF、200ng/ml;MIF、300ng/ml;PMA、300ng/ml）をβ1インテグリンノックダウン実験で使用した。等しい量のタンパク質を負荷し、SDS-PAGEによって、続いて適切な抗体を用いたウエスタンブロット分析によって分割した。WST-1（Roche）を用いて細胞増殖アッセイを実施した。細胞移動アッセイをボイデンチャンバーアッセイ（Corning）において実施した。
【手続補正２２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３７】
（表４）siRNA
2011525491.tif 000026
【手続補正２３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４２】
腫瘍担持マウスにおける治療
DU145腫瘍担持マウスの大きさを適合させ、個別のコホートに分けた（n＝各群当たり4匹のマウス）。腫瘍ホーミングペプチド
2011525491.tif 000027
をプロアポトーシスモチーフD（KLAKLAK）2(SEQ ID NO:70)と融合して合成した。非結合ペプチド
2011525491.tif 000028
またはD（KLAKLAK）2(SEQ ID NO:70)を対照として使用した。合成ペプチドを全身投与し、腫瘍体積を記述されているように（Arap et al., 1998; Arap et al., 2004）測定した。
【手続補正２４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2011525491000001.app
【手続補正２５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
本発明の他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかになる。しかし、詳細な説明および特定の実施例は、本発明の好ましい態様を指示するが、本発明の精神および範囲内で様々な変更および修正がこの詳細な説明から当業者に明らかになるので、説明のためにのみ与えられるものであることを理解されたい。
[請求項1001]
a）6〜20アミノ酸長である;
b）β1インテグリン（SEQ ID NO:47）に対する対応ベストフィット配列アラインメントに少なくとも25％の類似度を有する
と定義されるCRKL結合モチーフを含み、および
100アミノ酸長またはそれ未満のアミノ酸長であり、CRKLを発現する細胞に生理的条件下で結合する、単離された腫瘍標的化ペプチド。
[請求項1002]
CRKL結合モチーフが、β1インテグリン（SEQ ID NO:47）に対するベストフィット配列アラインメントに少なくとも40％の類似度を有する、請求項1001記載のペプチド。
[請求項1003]
CRKL結合モチーフが、β1インテグリン（SEQ ID NO:47）に対するベストフィット配列アラインメントに少なくとも50％の類似度を有する、請求項1001記載のペプチド。
[請求項1004]
CRKL結合モチーフが、β1インテグリン（SEQ ID NO:47）に対するベストフィット配列アラインメントに少なくとも60％の類似度を有する、請求項1001記載のペプチド。
[請求項1005]
β1インテグリン（SEQ ID NO:47）に対するベストフィット配列アラインメントに同一ではない配列を有する、請求項1001記載のペプチド。
[請求項1006]
CRKL結合モチーフが、β1インテグリン（SEQ ID NO:47）のPSIドメイン領域に対するベストフィット配列アラインメントを有する、請求項1001記載のペプチド。
[請求項1007]
CRKL結合モチーフが、アミノ酸10〜29;15〜34;18〜37;36〜55;39〜58;45〜64;94〜113;196〜215;198〜213;203〜222;244〜263;330〜349;377〜396;379〜398;380〜399;398〜417;400〜419;413〜432;447〜466;460〜479;460〜479;464〜483;469〜488;474〜493;475〜494;512〜533;519〜538;551〜570;574〜593;577〜596;579〜598;590〜609;596〜615;613〜632;615〜634;616〜635;644〜663;648〜667;663〜682;674〜693;682〜701;721〜740;727〜746;および779〜798からなる群より選択されるβ1インテグリン（SEQ ID NO:47）のPSIドメイン領域に対するベストフィット配列アラインメントを有する、請求項1001記載のペプチド。
[請求項1008]
CRKL結合モチーフが、SEQ ID NO:1〜SEQ ID NO:46からなる群より選択される配列を有する、請求項1001記載のペプチド。
[請求項1009]
環状ペプチドとしてさらに定義される、請求項1001記載の単離ペプチド。
[請求項1010]
分子に結合している、請求項1001記載の単離ペプチド。
[請求項1011]
分子がタンパク質であり、ペプチドが該タンパク質に結合または融合して、天然に存在するタンパク質ではないタンパク質複合体を形成する、請求項1010記載の単離ペプチド。
[請求項1012]
タンパク質の末端に位置する、請求項1011記載の単離ペプチド。
[請求項1013]
分子が、プロアポトーシス物質、抗血管新生物質、サイトカイン、細胞傷害性物質、薬剤、化学療法剤、ホルモン、増殖因子、抗生物質、抗体またはそのフラグメントもしくは一本鎖、生存因子、抗アポトーシス物質、ホルモンアンタゴニスト、抗原、ペプチド、タンパク質、診断薬、放射性同位体、または造影剤である、請求項1010記載の単離ペプチド。
[請求項1014]
分子が、グラミシジン;マガイニン;メリチン;デフェンシン;セクロピン;（KLAKLAK）2（SEQ ID NO:48）;（KLAKKLA）2（SEQ ID NO:49）;（KAAKKAA）2（SEQ ID NO:50）;（KLGKKLG）3（SEQ ID NO:51）;Bcl-2;Bad;Bak;Bax;およびBikからなる群より選択されるプロアポトーシス物質である、請求項1013記載の単離ペプチド。
[請求項1015]
プロアポトーシス物質が（KLAKLAK）2（SEQ ID NO:48）である、請求項1014記載の単離ペプチド。
[請求項1016]
SEQ ID NO:48がDアミノ酸からなる、請求項1015記載の単離ペプチド。
[請求項1017]
分子が、トロンボスポンジン、アンギオスタチン、色素上皮由来因子、アンギオテンシン、ラミニンペプチド、フィブロネクチンペプチド、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤、組織メタロプロテイナーゼ阻害剤、インターフェロン、インターロイキン12、血小板因子4、IP-10、Gro-β、トロンボスポンジン、2-メトキシエストラジオール、プロリフェリン関連タンパク質、カルボキシアミドトリアゾール、CM101、マリマスタット、ポリ硫酸ペントサン、アンギオポエチン2、ハービマイシンA、PNU145156E、16Kプロラクチンフラグメント、リノミド、サリドマイド、ペントキシフィリン、ゲニステイン、TNP-470、エンドスタチン、パクリタキセル、ドセタキセル、ポリアミン類、プロテアソーム阻害剤、キナーゼ阻害剤、シグナル伝達ペプチド、アキュチン、シドフォビル、ビンクリスチン、ブレオマイシン、AGM-1470、血小板因子4、ミノサイクリン、エンドスタチンXVIII、エンドスタチンXV、マトリックスメタロプロテイナーゼ-2のC末端ヘモペキシンドメイン、ヒトプラスミノーゲンのクリングル5ドメイン、エンドスタチンとアンギオスタチンの融合タンパク質、エンドスタチンとヒトプラスミノーゲンのクリングル5ドメインの融合タンパク質、インターフェロン-γによって誘導されるモノカイン（Mig）、MigとIP10の融合タンパク質、可溶性FLT-1（fins様チロシンキナーゼ1受容体）、またはキナーゼ挿入ドメイン受容体（KDR）からなる群より選択される抗血管新生物質である、請求項1013記載の単離ペプチド。
[請求項1018]
分子が、インターロイキン1（IL-1）、IL-2、IL-5、IL-10、IL-11、IL-12、IL-18、インターフェロン-γ（IF-γ）、IF-α、IF-β、腫瘍壊死因子、またはGM-CSF（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子）からなる群より選択されるサイトカインである、請求項1013記載の単離ペプチド。
[請求項1019]
巨大分子複合体に結合している、請求項1010記載の単離ペプチド。
[請求項1020]
複合体が、ウイルス、バクテリオファージ、細菌、リポソーム、ミクロ粒子、磁気ビーズ、酵母細胞、または哺乳動物細胞である、請求項1019記載の単離ペプチド。
[請求項1021]
ウイルスに結合している、請求項1013記載の単離ペプチド。
[請求項1022]
レンチウイルス、パポバウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、AAV、ワクシニアウイルスまたはヘルペスウイルスである、請求項1014記載の単離ペプチド。
[請求項1023]
ペプチドが固体支持体に結合している、請求項1019記載の単離ペプチド。
[請求項1024]
固体支持体がマイクロタイターディッシュまたはマイクロチップである、請求項1023記載の単離ペプチド。
[請求項1025]
請求項1001記載のペプチドを得る工程および構築物を調製するために該ペプチドを分子に結合する工程を含む、構築物を調製する方法。
[請求項1026]
（a）請求項1001〜1024のいずれか一項記載のペプチドを得る、または請求項1023記載の方法によって調製する工程;および
（b）該ペプチドを、CRKLを発現する細胞を含む細胞集団に投与し、それによって分子またはタンパク質を該細胞に送達する工程
を含む、CRKLを発現する細胞へのペプチド、分子またはタンパク質の送達を標的化する方法。
[請求項1027]
CRKLを発現する細胞が被験者中に存在し、ペプチドまたはタンパク質融合構築物が薬学的に許容される組成物中で製剤され、該組成物が前記被験者に投与される、請求項1026記載の方法。
[請求項1028]
被験者がヒト被験者である、請求項1027記載の方法。
[請求項1029]
検出方法としてさらに定義され、細胞に送達されたペプチド、分子またはタンパク質を検出する工程をさらに含む、請求項1026記載の方法。
[請求項1030]
被験者が疾患または障害を有しており、治療方法としてさらに定義される、請求項1026記載の方法。
[請求項1031]
被験者が癌を有する、請求項1029または1030記載の方法。
[請求項1032]
癌が、前立腺癌、乳癌、肉腫、歯肉癌、舌癌、肺癌、皮膚癌、肝癌、腎癌、眼癌、脳癌、白血病、中皮腫、神経芽細胞腫、頭部癌、頸部癌、膵癌、腎癌、骨癌、精巣癌、卵巣癌、中皮腫、子宮頸癌、胃腸癌、リンパ腫、脳癌、結腸癌および膀胱癌からなる群より選択される、請求項1031記載の方法。
[請求項1033]
癌が前立腺癌である、請求項1032記載の方法。
[請求項1034]
癌が乳癌である、請求項1032記載の方法。
[請求項1035]
癌が肉腫である、請求項1032記載の方法。
[請求項1036]
モチーフが、6〜10アミノ酸長であるとさらに定義される、請求項1001記載の方法。
[請求項1037]
モチーフが、14〜20アミノ酸長であるとさらに定義される、請求項1001記載の方法。