(57)【要約】【課題】止血補助因子としてＲＮＡを含む医薬製剤の提供。【解決手段】本医薬製剤は、ＲＮＡまたは１つもしくは２つ以上の凝固促進ＲＮＡフラグメントを、凝固を促進しさらにフィブリン溶解を促進するために十分な量で含むものからなる。この製剤は、止血プロセスのアクチベーター、例えば第ＶＩＩ因子活性化プロテアーゼ（ＦＳＡＰ）と一緒に用いるのが特に有利である。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
凝固を促進するために十分な量の天然もしくは合成ＲＮＡまたは１つもしくは２つ以上の天然もしくは合成ＲＮＡの凝固促進フラグメント、ＲＮＡ類似体、例えばペプチド核酸、リボザイムまたはＲＮＡアプタマーを含む医薬製剤。
【請求項２】
凝固促進量の天然もしくは合成ＲＮＡまたは１つもしくは２つ以上の天然もしくは合成ＲＮＡの凝固促進フラグメント、ペプチド核酸、リボザイムまたはＲＮＡアプタマーの他に、血液凝固因子のアクチベーターを含む請求項１に記載の医薬製剤。
【請求項３】
第ＶＩＩ因子活性化プロテアーゼ（ＦＳＡＰ）またはそのプロエンザイムをアクチベーターとして含む請求項２に記載の医薬製剤。
【請求項４】
凝固を促進させるために用いられる請求項１〜３のいずれかに記載の医薬製剤の使用。
【請求項５】
フィブリン溶解促進または凝固抑制のために十分な量の、リボ核酸分解活性またはＲＮＡ複合体形成能力を有する１つまたは２つ以上のＲＮＡ分解またはＲＮＡ抑制化合物を含む医薬製剤。
【請求項６】
フィブリン溶解促進または凝固抑制のために十分な量の１つまたは２つ以上のＲＮＡ分解、ＲＮＡ抑制またはＲＮＡ隠蔽化合物の他に、血漿フィブリン溶解性因子のアクチベーターを含む請求項５に記載の医薬製剤。
【請求項７】
血漿フィブリン溶解性因子のアクチベーターとしてプラスミノゲンアクチベーター活性化プロテアーゼＦＳＡＰまたはそのプロエンザイムを含む請求項６に記載の医薬製剤。
【請求項８】
健常者と比較して血漿ＲＮＡ含有量の増加を検出することを含む、とりわけ術後の高血液凝固性状態、妊娠の合併症、担癌状態、急性心筋梗塞または敗血症の検出用診断補助薬。
【請求項９】
凝固第ＶＩＩ因子活性化プロテアーゼＦＳＡＰまたはそのプロエンザイムの定量的または定性的検出用診断補助薬であって、
ａ）凝固第ＶＩＩＩ／ＶＩＩＩａ因子またはＶ／Ｖａ因子を不活化する作用、または
ｂ）全体的な凝固テストで凝固時間を短縮させる作用、または
ｃ）プラスミノーゲンアクチベーターを活性化させる作用、または
ｄ）第ＶＩＩ因子を活性化させる作用
を検出するために十分量の天然もしくは合成ＲＮＡ、天然もしくは合成ＲＮＡの活性なフラグメント、またはＲＮＡ類似体、例えばペプチド核酸、リボザイムまたはＲＮＡアプタマーを含む、上記の診断補助薬。
【請求項１０】
ａ）非活性化不完全トロンボプラスチン時間（ＮＡＰＴＴ）、または
ｂ）プロトロンビン時間（ＰＴ）、または
ｃ）血漿カルシウム再添加時間、または
ｄ）活性化不完全トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）
を用いて凝固時間を短縮する作用を測定するために、十分量の天然もしくは合成ＲＮＡ、天然もしくは合成ＲＮＡの活性なフラグメント、ペプチド核酸、リボザイムまたはＲＮＡアプタマーを含む請求項８に記載の診断補助薬。
【請求項１１】
ａ）単鎖ウロキナーゼ（ｓｃｕＰＡ、単鎖ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター）、または
ｂ）単鎖ｔＰＡ（ｓｃｔＰＡ、単鎖組織プラスミノゲンアクチベーター）
の活性化を介してプラスミノゲンアクチベーターを活性化または強化する作用を測定することを目的とする、十分量の天然もしくは合成ＲＮＡ、天然もしくは合成ＲＮＡの活性なフラグメント、ペプチド核酸、リボザイムまたはＲＮＡアプタマーを含む請求項８または９に記載の診断補助薬。
【請求項１２】
敗血症の治療に十分な量の１つまたは２つ以上のＲＮＡ分解、ＲＮＡ抑制またはＲＮＡ複合体形成化合物を含む請求項５に記載の医薬製剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、凝固因子の他にさらに天然もしくは合成リボ核酸（ＲＮＡ）またはＲＮＡの生体活性を有するフラグメントまたはＲＮＡ分解物質（例えばリボヌクレアーゼ）を含む医薬製剤に関する。
【０００２】
【従来技術】
止血（凝固およびフィブリン溶解）プロセス（前記プロセスは血管損傷が開始した後、局所的におよび限られた時間で進行する）は、活性化された血管壁の細胞、血小板およびタンパク因子間の特異的な相互作用によって制御される。止血で活性を有するタンパク質が損傷部位の特に陰性に荷電した生体膜上に集中するのは、多くの場合、カルシウム結合性およびビタミンＫ依存性凝固因子のイオン的な相互作用を介して達成される。これらの相互作用、したがって凝固系の活性化およびフィブリンクロットの生成の程度は、錯化剤（例えばエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）またはクエン酸塩）によってｉｎ　ｖｉｔｒｏで防止することができる。前記の抗凝固剤の使用はｉｎ　ｖｉｖｏでは容認されない。生体では、経口用ビタミンＫ拮抗物質による治療によって凝固因子のカルシウム結合を阻止し、それによって止血の程度を低下させることができる。
【０００３】
細胞壁の損傷はまた、血小板および他の血管細胞の細胞膜の暴露による陰性荷電リン脂質の生成の他に、細胞内成分（特に細胞質ゾルタンパク質）の暴露を伴なう。凝固系は血中に存在する２つの異なるカスケード様凝固因子活性化経路を含むことは十分に研究された事実である。誘発メカニズムに応じて、内因性経路または外因性経路が凝固始動に提供される。組織の損傷が存在するときは、トロンボプラスチン（組織因子、ＴＦ）が、影響を受けた細胞のリン脂質とともに外因性凝固経路のイニシエーターとして暴露される。これらのプロセスにおける第ＶＩＩ凝固因子の具体的な機能は、ドイツ特許公開公報１９９０３６９３号に開示されている。膜結合トロンボプラスチンは、第ＶＩＩ凝固因子（ＦＶＩＩ）および血液循環中の活性化された第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩａ）の両方に結合することができる。このＴＦ−ＦＶＩＩａ複合体は、カルシウムおよび脂質の存在下でＦＸの結合をもたらし、このＦＸは限定的タンパク分解によってその活性型（ＦＸａ）に変換される。続いてＦＸａはプロトロンビンからトロンビンへの活性化、フィブリン形成、したがって最終的には創傷の閉鎖をもたらす。
【０００４】
現在までに知られたところによれば、トロンボプラスチンに結合したＦＶＩＩの更なる活性化は特に自己触媒的に発生するが、前記は、凝固カスケード（特にＦＸａおよびトロンビンによる）の開始後に促進され、前記反応カスケードの顕著な強化をもたらす。
上記の発見から、ある種の臨床場面でＦＶＩＩａまたはＦＶＩＩａ含有濃縮物の投与が望ましいと推論することができる。例えば、ＦＶＩＩＩの投与の結果としてＦＶＩＩＩに対する抗体を産生している血友病Ａの患者では、いわゆるＦＶＩＩａのＦＶＩＩＩインヒビター迂回活性（ＦＥＩＢＡ）が利用される。これに関して、ＦＶＩＩａに対する許容性は良好であり、血栓形成性を生じることがないが、凝固を限定的であるが十分な程度に確保するのに適切であることが明らかになった。組換えＦＶＩＩａは既に治療および予防に使用されている。血漿から得られるＦＶＩＩも同様に活性化され使用することができる。これまでに知られたところでは、この活性化のためにプロテアーゼ（例えばトロンビン）を使用することが可能であるが、しかしながらこれらのプロテアーゼはそのような酵素として強力に凝固を活性化し、血栓の危険性をもたらすおそれがある。したがって、トロンビンは続いて除去するか不活化する必要があり、収量の低下につながる。ＦＸａまたはＦＩＩａは、付随する血栓の危険性のためにしばしば禁忌であり、非常の場合にのみ（例えば極度の失血および制御不能の出血）使用が指示される。
【０００５】
ＦＶＩＩａは健常人の血漿中に非常に低濃度でのみ見出される。血中で循環しているＦＶＩＩａの生成および起源については今日までほとんど分かっていない。したがって、発現されたトロンボプラスチンまたは細胞崩壊時に放出されたトロンボプラスチンの痕跡量がこの原因であると推定されている。凝固に付随する全プロセスについての集中的研究にもかかわらず、損傷細胞の構成成分が止血プロセスの誘発に決定的な役割を果たす可能性があるという証拠は今日までまったく発見されていない。
【０００６】
今や驚くべきことに、損傷組織および細胞から放出された構成成分の中で、細胞外ＲＮＡが、（ａ）外因性および（ｂ）内因性凝固カスケード誘発の重要な初期補助因子であることが見出された。この発見によって、前記ＲＮＡまたは生体内活性を有する前記ＲＮＡフラグメントの機能、および止血プロセスにおけるリボヌクレアーゼの機能のさらに詳細な研究、並びに天然または合成ＲＮＡまたは生体内活性をもつそのフラグメントが添加されて止血を促進する医薬製剤、または対応するリボヌクレアーゼが添加されＲＮＡの細胞外機能を抑制する医薬製剤の開発に関する研究が促進された。これに関しては、細胞外ＲＮＡは血漿接触相系を活性化させるための天然の“外来”性表面として存在する（これまでにカオリンまたは他の多価陰イオン性物質による前記血漿接触相系のｉｎ　ｖｉｔｒｏ始動が報告された）。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題及び課題を解決する手段】
本発明はしたがって、凝固を促進するために十分な量の天然もしくは合成ＲＮＡ、または１つもしくは２つ以上の凝固促進ＲＮＡフラグメント、ペプチド核酸、リボザイムまたはＲＮＡアプタマーを含む医薬製剤に関する。前記医薬製剤は、好ましくはさらに血漿凝固因子のアクチベーターを含む。特に適当なアクチベーターは（ａ）第ＶＩＩ因子活性化プロテアーゼ（ＦＳＡＰ）またはそのプロエンザイムおよび（ｂ）接触相の成分、例えば第ＸＩＩ因子、キニノゲンおよびプレカリクレインである。本発明はさらに、ＲＮＡの前凝固因子作用を停止または防止するリボヌクレアーゼの医薬製剤に関する。
【０００８】
本発明の医薬製剤は、ＲＮＡがＦＳＡＰのプロエンザイムのためのもっとも有効な補助因子であり、ＦＡＳＰの活性化をもたらすという認識を基にしている。この相互作用は、活性化血小板の細胞ホモジネートまたは上清に由来する天然のＲＮＡおよび細胞質ゾルＲＮＡ（特にリボソームＲＮＡ）から得られた分画または合成ＲＮＡの両方で達成される。これに関しては、細菌性ＲＮＡおよびウイルス性ＲＮＡもまた有効であり、種々の細胞タイプのＲＮＡ分子が非常に類似していることから、細胞特異的補助因子効果が存在しないことは明らかである。したがって、強い陰性過剰電荷が明らかにＦＳＡＰの補助因子としてのＲＮＡの機能を決定している。
【０００９】
この認識は、ＦＳＡＰは特異的にＲＮＡに結合することができ、高張食塩水溶液によって再び解離されるという観察によって支持される。したがって、生理的条件下では、ＤＮＡではなくＲＮＡのみによるＦＳＡＰとの特異的結合が検出できるということは注目に値する。
本発明はしたがって凝固の外因性活性化はＲＮＡとＦＳＡＰ（ＦＳＡＰは凝固プロエンザイムである第ＶＩＩ因子のもっとも有効なアクチベーターである）との相互作用によって誘発されるという認識を基にしている。前記凝固経路（組織の損傷によって特異的に活性化される）は、したがって新規な補助因子、（天然または合成）ＲＮＡによって順調に進行させることができる。
【００１０】
同時に、ＲＮＡは、全血、血漿および精製系で示されたように、接触相系の活性化のための天然の補助因子としても存在する。このことは、適切な医薬製剤による止血プロセスに対する正の作用または負の作用を表出させる新規で非常に多様な方法に門戸を開くものである。
これについての新規な出発点は、止血プロセスで機能させることを目的とするＲＮＡ分解およびＲＮＡ抑制化合物の使用である。凝固に影響を与える補助因子ＲＮＡがＲＮＡ切断またはＲＮＡ抑制物質を供給することによって不活化される場合、前記ＲＮＡはもはやＦＳＡＰまたは接触系の活性化に利用できなくなる。このことから、リボヌクレアーゼは有効なＦＳＡＰの機能を停止させ、したがってまた凝固第ＶＩＩ因子および内因性凝固を無効にすることができることが明らかである。これは治療に利用可能な新規な抗凝固原理をもたらす。ＲＮＡ分解またはＲＮＡ隠蔽成分（例えば結合タンパク質のようなもの）は、したがって重要な治療効果を表すことができる。この効果は、高度に特異的（副作用を示さない）および選択的に凝固系の始動を阻止し、したがって強い抗凝固作用または抗血栓作用を有する。
【００１１】
ドイツ特許公開公報１９９０３６９３号は、さらに第ＶＩＩ因子活性化プロテアーゼ（ＦＳＡＰ）はまた、単鎖ウロキナーゼ（ｓｃｕＰＡ、単鎖ウロキナーゼプラスミノゲンアクチベーター）および単鎖ｔＰＡ（ｓｃｔＰＡ、単鎖組織プラスミノゲンアクチベーター）の効率的活性化を惹起する特性を有し、したがってプラスミノゲンアクチベーター活性化因子（ＰＡＡ）として機能することができることを開示している。プラスミノゲンアクチベーターの活性化は、共役反応におけるプラスミノゲンの存在下、プラスミンそのものの生成、またはプラスミンによって生じるフィブリンクロットの溶解によっても決定することができる。
このことからＲＮＡまたは生体活性を有するそのフラグメントもまた強力なフィブリン溶解促進作用をもつことが明らかである。
【００１２】
したがって、本発明は、フィブリン溶解を促進するために十分な量のＲＮＡ、１つもしくは２つ以上のフィブリン溶解促進ＲＮＡフラグメントまたはＲＮＡ類似体、例えばペプチド核酸、リボザイムまたはＲＮＡアプタマーの他に、さらに血中フィブリン溶解性因子のためのアクチベーターを含む医薬製剤に関する。血中フィブリン溶解性因子のアクチベーターとしてプラスミノーゲンアクチベーター活性化プロテアーゼ（ＦＳＡＰ）またはそのプロエンザイムを利用することが可能であり、好ましい。ＦＳＡＰがプロウロキナーゼのフィブリン溶解性特性を非常に効率的に活性化することができることは特に知られている。したがって、例えばフィブリン沈着または血栓の症例で、ＦＳＡＰプロエンザイムの活性化を促進することによってフィブリン溶解の始動および／または強化のためにＲＮＡを用いることもまた可能である。これに関して、ＲＮＡそのもの、その生体活性フラグメントまたは合成により製造された分子の形態を有する前記に由来する構造物を用いることもできる。したがって、ＲＮＡ分解またはＲＮＡ抑制物質はまた、ＦＳＡＰの活性化を防止する作用したがってフィブリン溶解を抑制する作用を有する。
【００１３】
ＦＳＡＰの固有の特性によって、ＤＥ１９９０３６９３に記載されたさらに別の測定方法が既に開発されている。そこに記載されたテスト方法は今や、診断補助薬が十分量のＲＮＡまたはその活性なフラグメントを含むとき、さらに特異的に、また正確に実施することができる。
したがって本発明はさらに、凝固第ＶＩＩ因子活性化プロテアーゼＦＳＡＰまたはそのプロエンザイムの定量的および定性的検出用診断補助薬に関する。前記補助薬では、以下の測定をするために十分量のＲＮＡまたは生体活性を有するそのフラグメントが用いられる：
ａ）凝固第ＶＩＩＩ／ＶＩＩＩａ因子またはＶ／Ｖａ因子を不活化する作用、または
ｂ）全体的な凝固試験で凝固時間を短縮させる作用、または
ｃ）プラスミノーゲンアクチベーターを活性化させる作用、または
ｄ）第ＶＩＩ因子を活性化させる作用。
【００１４】
ＦＳＡＰによって惹起される凝固第ＶＩＩＩ／ＶＩＩＩａ因子またはＶ／Ｖａ因子の不活化の測定は、ＦＳＡＰ含有溶液を第ＶＩＩＩ／ＶＩＩＩａ因子またはＶ／Ｖａ因子とインキュベートし、続いて通常の活性測定アッセイの手段によって残留する前記因子の量を測定し、さらに標準曲線との比較によってＦＳＡＰの量を定量的に決定することを基にしている。この事例では、プロテアーゼ活性は、予め設定した時間の後で、アプロチニンの限定的添加（これらの濃度ではアプロチニンはその後のアッセイ系の測定に影響を与えないという利点を有する）によって抑制される。続いて凝固因子の残留活性を当業者に周知の手段によって測定する。前記の測定に特に適していることが証明されたアッセイ系は、いわゆるＣｏａｍａｔｉｃ（登録商標）第ＶＩＩＩ因子アッセイ（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ　ＡＢ）（本質的に第ＩＸａおよび第Ｘ因子を含む）を用い、トロンビンインヒビターの存在下で生成されたＦＸａの量が色素原基質の変換を用いて定量化される。これはその順番どおりにＦＶＩＩＩまたはＦＶＩＩＩａの量に比例する。
【００１５】
ＦＶおよびＦＶＩＩＩの不活化にもかかわらず、ＦＳＡＰの血液、血小板に富む血漿、または血漿への添加は凝固時間を短縮した。すなわち、前凝固因子作用は種々のいわゆる“全体的凝固テスト”において顕著であった。前記のテスト系には、例えば非活性化不完全トロンボプラスチン時間（ＮＡＰＴＴ）、プロトロンビン時間（ＰＴ）およびカルシウム再添加時間が含まれる。これら凝固時間の短縮（例えばいわゆる凝固計（ｃｏａｇｕｌｏｍｅｔｅｒ）で、トロンボエラストグラフィーでまたは他の色素原アッセイで測定される）は、前凝固因子物質の濃度に相関するので、逆に凝固時間からサンプル中の前記物質の濃度について検量線を基準にして結論を引き出すことができる。したがって、ＦＳＡＰの濃度は選択した全体的凝固テストを利用して決定することができる。
【００１６】
したがって、本発明はまた、以下の手段を用いて凝固時間短縮の影響を測定することによってＦＳＡＰの定量的および定性的検出を目的とする、十分量のＲＮＡまたは生体活性を有するそのフラグメントを含む診断補助薬に関する：
ａ）非活性化不完全トロンボプラスチン時間（ＮＡＰＴＴ）
ｂ）プロトロンビン時間（ＰＴ）
ｃ）血漿カルシウム再添加時間、または
ｄ）活性化不完全トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）。
ＲＮＡまたはそのフラグメントの添加はまた、前記テストの特異性および感度をさらに高める。
【００１７】
ＲＮＡの前凝固活性をさらに用いて、全血または血漿で凝固時間を測定するために前記診断補助薬にこの補助因子を供給することができる。天然のＲＮＡ（転移ＲＮＡまたはリボソームＲＮＡ）の他に、天然のＲＮＡよりもリボヌクレアーゼに対して安定であることを理由に合成ＲＮＡ、例えばポリＩＣ、ポリＣまたはポリＡＵを前凝固補助因子として用いることができる。前記製剤は、（ＦＳＡＰとは別個に）特に内因性接触相の活性化に関与し、したがって対応する凝固時間を測定する診断に用いることができる。
【００１８】
最後に、ＦＳＡＰによって惹起される、単鎖ウロキナーゼまたは単鎖ｔＰＡにおける活性化はまたＦＳＡＰを検出するテスト系で用いることができる。前記テスト系もまたＲＮＡまたはその活性フラグメントの添加によってさらに改善される。この事例では、活性化されたプラスミノゲンアクチベーターの活性は、例えば色素原基質を利用して測定される。プラスミノゲンアクチベーターの活性化は、共役反応でプラスミノゲンの存在下で、プラスミンそのものの生成により、またはプラスミンによってもたらされるフィブリンクロットの溶解により測定することができる。
【００１９】
本発明の医薬製剤は、凝固薬としてそれら単独でまたは他の物質（プロテアーゼ活性を高める物質、例えばヘパリンまたはヘパリン関連物質（例えばヘパラン硫酸）および／またはカルシウムイオン）と併用して用いることができる。前記のような組成物の使用は、例えば抗体の存在のためにＦＶＩＩＩおよび／またはＦＩＸおよび／または接触相のタンパク質（例えばＦＸＩＩ）が許容できないとき、または他のタイプの欠損症状が存在するとき、そのＦＶＩＩＩインヒビター迂回活性（ＦＥＩＢＡ）の利用と併せて指示することができる。一般的な出血予防または出血の制御を目的として本発明の凝固促進用医薬製剤をｅｘ　ｖｉｖｏで使用することもまた可能である。
他方、本発明の医薬製剤によるプラスミノゲンアクチベーターの活性化はまた単鎖ＰＡの限定的なタンパク分解をもたらすことができ、これはその活性化に適切である。これにより、例えばプロウロキナーゼの活性化を介してフィブリン溶解をもたらす。このことは、血栓塞栓性疾患（例えば下肢静脈血栓症、心筋梗塞または卒中）において本発明の医薬製剤の使用を指示することができることを示している。
【００２０】
本発明の製剤は、したがってプラスミノゲンアクチベーター（例えばウロキナーゼまたはｔＰＡ）の内因性または外因性活性化のために用いることができる。この可能な使用は、ＦＳＡＰはまた前凝固作用も有しているという事実と矛盾しない。２つの反応のどちらが優勢であるかという問題は、おそらく生理学的基質の利用可能性によって制御される。これまでに知られているところでは、第ＶＩＩ因子は血漿中で中程度に活性化され、永久的に一定の濃度のＦＶＩＩａを維持し、突然の血管の損傷に直ちに対抗することができる。対照的に、わずかにｎｇ量のｔＰＡおよびウロキナーゼプラスミノゲンアクチベーターが１ｍＬの血漿に存在する。フィブリン沈着または血栓が生じた場合にのみ、プラスミノーゲン活性化を介して局所的に（特に血栓結合的に）その血栓溶解活性を活性化後に示すプラスミノーゲンアクチベーター濃度の増加が、分泌または合成によりもたらされる。特に局所的に限定された単鎖ＰＡの存在下では、その活性化はＦＶＩＩの活性化よりも重要で、その生理的状況への順応を可能にする。したがって、ＦＳＡＰはまた止血を調節することができ、先天的または後天的欠損症状に適切なＦＳＡＰまたはそのプロエンザイムの代用になるであろう。
【００２１】
ＦＳＡＰの作用を強化するプラスミノゲンアクチベーター（特にウロキナーゼ）は、特にカルシウムおよび／またはヘパリンもしくはヘパリン様物質（例えばデキストラン硫酸）によって促進されることが判明しているので、本発明にしたがってフィブリン含有血栓の溶解のために、ＲＮＡまたは生体活性を有するそのフラグメントとは別に、可溶性カルシウム塩および／またはヘパリンもしくはヘパリン様物質をさらに別に含む医薬製剤を用いるのが特に有利である。本発明のさらに詳細な内容は以下の実施例で明らかになるであろう。ただしこれら実施例は本発明を制限しようとするものではない。
【００２２】
【実施例】
実施例１：種々の供給源に由来するＲＮＡは前凝固補助因子として機能する
下記（ａ）〜（ｅ）から得られるＲＮＡをリボヌクレアーゼＡで処理した後、または処理せずに同じ濃度で濁度測定凝固テスト用い、カルシウム再添加時間を測定した：
（ａ）培養ヒト線維芽細胞（ｒＲＮＡ）
（ｂ）酵母（ｔＲＮＡ）
（ｃ）大腸菌（Ｅ．　ｃｏｌｉ）
（ｄ）Ｑβファージ（一本鎖ＲＮＡ）
（ｅ）合成起源（ポリＩＣ、ポリＣ、ポリＡＵ）。
全てのタイプのＲＮＡが凝固時間を顕著に減少させることができたが（カオリン当量単位（ＫＥＵ／ｍＬ）で定量）、ＤＮＡは全く作用を示さなかった。ＲＮＡサンプルをリボヌクレアーゼＡで予備処理することによって、前凝固因子活性は不活化されたが、大腸菌ＲＮＡのみはリボヌクレアーゼＡ処理に部分的に耐性を示した。このことは、あいまいではあるが、種々のタイプの多価陰イオンＲＮＡは前凝固因子活性を有し、これらのタイプのＲＮＡを低分子量フラグメントに断片化することによって前記凝固因子活性が失われることを示している。純正のｒＲＮＡまたはｔＲＮＡと比較して、合成の一本鎖および二本鎖ＲＮＡは、以下の順序で前凝固因子活性を凝固テストで示した：
ポリＩＣ＞ポリＣ＞ポリＡＵ＞ポリｄＩｄＣ。
【００２３】
実施例２：血漿環境中のＲＮＡの態様：ＲＮＡの記憶
血中（および他の体液中）のリボヌクレアーゼは循環ＲＮＡ量を制御しているが、血漿中のＲＮＡの前凝固因子機能を測定することができた。この関係を確立するために、血漿中の限定量のＲＮＡの運命を一定時間追跡した。高分子量ＲＮＡは血漿中で約５分の半減期で分解され、３０分後にはもはや検出することはできなかったが、このＲＮＡの前凝固因子活性は、９０分以後はそれ以上変化せずに検出することができた。この“ＲＮＡの記憶”現象はおそらく、血漿中のＲＮＡ依存成分の活性化によるものであろう（前記成分はカルシウム再添加後の凝固の開始に寄与する）。血漿中のＲＮＡはしたがって“潜在”凝固現象および“高凝固性”状態の現象に必須であることは極めてあり得ることで、前記現象を予知し、これを予防することは血栓性合併症の診断および治療に極めて重要である。
【００２４】
実施例３：ＲＮＡ依存凝固開始のメカニズム
血漿に添加されたＲＮＡは、組織因子によって誘発される凝固を前記補助因子の全ての濃度で高めることができたが、前記ＲＮＡの同等な作用はカオリン誘発凝固で明白であった。このことは、ＲＮＡは陰イオン性補助因子（外来表面）として接触相系凝固の開始に必要であることを示している。この事実を確認するために、プレカリクレインおよびキニノゲンを精製系で反応させ、生成されたカリクレインの量を測定した。緩衝液コントロールに対して、ＲＮＡの添加はカリクレインの顕著な増加をもたらし、一方、ＲＮＡをリボヌクレアーゼＡで予備処理することによって前記作用は阻止された。第ＸＩＩ因子および第ＶＩＩＩ因子欠損血漿での実験は、接触相補助因子としてのＲＮＡの機能を明瞭に示した。さらにプレカリクレイン欠損血漿では（正常血漿と比較して）ＲＮＡは全く作用を示さなかった。総合すれば、これらの結果は、天然物質のＲＮＡは、カオリン（人工物質）と同様に接触相系に暴露された後、凝固の内因性開始を進行させることを証明した。
【００２５】
実施例４：患者血漿におけるＲＮＡの検出
血液を約２００単位／ｍＬのリボヌクレアーゼインヒビターの存在下で採取し続いて血漿を調製するか、また別には血液を採取し血漿を得た後、安定剤ＰＡＱ−ｇｅｎｅ（Ｑｉａｇｅｎ）を前記に添加し、ＲＮＡの加水分解を防いだ。ＲＮＡを調製した後（Ｔｒｉｚｏｌ法による）、前記ＲＮＡをナイロンフィルターに固定し、放射能標識ｒＲＮＡ特異的オリゴを用いてハイブリダイゼーションした後、検量線により血漿ＲＮＡ量を定量した。前記分析方法を用いて、急性心筋梗塞または敗血症患者の血漿中の陽性サンプルを特定した。前記のＲＮＡ含有量は健常ドナーのそれより高かった。
【００２６】
実施例５：ＲＮＡ拮抗物質
ＲＮＡの前凝固因子活性（特に血漿接触相系の始動に関する活性）は、ＲＮＡをリボヌクレアーゼで予備処理することによって防止することができる。したがって血漿中のリボヌクレアーゼ濃度の増加は核酸の加水分解切断をもたらし、したがってリボヌクレアーゼは抗凝固作用を示すということはもっともなように聞こえる。細胞培養で示されたように（Ｌａｎｄｒｅ　ｅｔ　ａｌ．，　２０００）、内皮細胞は大量のリボヌクレアーゼを産生しこれを血中に分泌するので、リボヌクレアーゼによる抗凝固治療は、血管系における天然の調節原理に非常に近い。また別に、リボヌクレアーゼはまた、リボザイムまたはＲＮＡアプタマーに対して抗凝固作用を示すかもしれない。なぜならば、これらの物質は、天然のＲＮＡと同様に接触相の活性化を惹起させることができるからである。
【００２７】
実施例６：ＲＮＡの細胞機能
ＲＮＡは血漿環境でも一定の生存時間を有するので、血管壁細胞（すなわち内皮細胞単層培養）に対する多価陰イオン物質の作用を調べた。細胞外ＲＮＡの細胞に対する作用を調べる非常に鋭敏な機能テストは内皮細胞の透過性の変化である。この変化はブタの脳の微小血管内皮細胞の高密度単層で調べられた。ＲＮＡは前記細胞の透過性を濃度依存態様で増加させ、リボヌクレアーゼとの予備インキュベーションは細胞外ＲＮＡの前記作用を防止することができた。血管損傷部位領域にある内皮細胞の透過性に対する作用は創傷治癒反応の開始に必要で、したがって細胞外ＲＮＡの細胞に対するこの機能は極めて重要である。