(57)【要約】      （修正有）【課題】ＨＩＶ−１をコードする全長ゲノムをクローニングし、その構造と機能を解明すること。【解決手段】下記の何れかの塩基配列を有するＤＮＡ。（１）ウイルス由来の特定な塩基配列；又は（２）ウイルス由来の特定な塩基配列において、１〜複数個の塩基が欠失、置換及び／又は付加している塩基配列であって、感染性ウイルスゲノムをコードする塩基配列：【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の何れかの塩基配列を有するＤＮＡ。
（１）配列番号１に記載の塩基配列；又は
（２）配列番号１に記載の塩基配列において、１〜複数個の塩基が欠失、置換及び／又は付加している塩基配列であって、感染性ウイルスゲノムをコードする塩基配列：
【請求項２】
請求項１に記載のＤＮＡを有する組み換えベクター。
【請求項３】
請求項１に記載のＤＮＡ又は請求項２に記載の組み換えベクターを有する形質転換体。
【請求項４】
請求項１に記載のＤＮＡを宿主に形質転換して得られる形質転換体を培養することにより調製される、ウイルス粒子。
【請求項５】
請求項１に記載のＤＮＡを用いて、抗ＨＩＶ剤の感受性を試験する方法。
【請求項６】
請求項１に記載のＤＮＡを用いて、抗ＨＩＶ剤耐性に関与する変異を検出する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、感染性ＨＩＶゲノムをコードする新規なＤＮＡに関する。
【０００２】
【従来の技術】
現在中国では注射薬物乱用者（ＩＤＵ）を中心としてＨＩＶ流行が急速に進行しつつある。中国衛生当局によって発表された最新の推計値（２００２年６月現在）によれば、中国におけるＨＩＶ感染者数は１００万人と推定されている。感染者報告数は毎年３０％を超える割合で増加していることから、このまま有効な対策がとられない場合、２０１０年には、中国におけるＨＩＶ累積感染者数は、１，０００万人に達するものと推測されている。このような場合、問題は中国に留まらず、日本を含む東アジア地域に重大な影響をもたらす危険性が憂慮される。
【０００３】
中国におけるＨＩＶ流行は、１９８９年の雲南省における薬物乱用者（ＩＤＵ）における感染のアウトブレークに始まった。１９９４年にまでの間流行は主に雲南省に限局していたが、１９９５年以降、中国北西部・南東部・華中など様々な地域に急速に波及している。
【０００４】
中国における流行の形成に関与するウイルスどのような起源のどのような構造をもったウイルスであるかは、最近まで明らかでなかったが、２０００年に新興の流行地の中国北西部の新彊ウイグル自治区のＩＤＵ間の流行にはＣＲＦ０７＿ＢＣ、中国南東部の広西チワン族自治区のＩＤＵ間の流行はＣＲＦ０８＿ＢＣとよばれる２種の組換え型流行株（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ    ｆｏｒｍｓ，    ＣＲＦｓ）が関与していることが明らかにされた。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
感染性分子クローンの分離は、ＨＩＶ遺伝子の構造・機能相関やウイルスの複製機構、エイズ発症のメカニズムの解析に重要な役割を果たすだけでなく、ＨＩＶ研究に必須な分子生物学的（ＨＩＶ遺伝子発現システムなど）・免疫学的試薬（単クローン抗体、ＣＴＬアッセイ系など）の開発、さらにワクチンおよびその評価系（エイズ発症の動物モデル等）の開発に極めて重要な意義をもっている。また薬剤耐性機構の解析などエイズ研究の様々な分野における有用な道具となることが期待される。本発明は、感染性ＨＩＶ遺伝子をクローニングし、その構造と機能を解明することを解決すべき課題とした。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、東アジア地域において予測される今度の流行の激化に重要な役割を果たす可能性のある上記の２種の組換え型流行株のうち、ＣＲＦ０８＿ＢＣの感染性分子クローンを分離することに初めて成功し、さらに当該ＤＮＡをヒト培養細胞に導入することにより感染能を有するウイルス粒子を産生することを確認した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
【０００７】
即ち、本発明によれば、下記の何れかの塩基配列を有するＤＮＡが提供される。
（１）配列番号１に記載の塩基配列；又は
（２）配列番号１に記載の塩基配列において、１〜複数個の塩基が欠失、置換及び／又は付加している塩基配列であって、感染性ウイルスゲノムをコードする塩基配列：
【０００８】
本発明の別の側面によれば、上記した本発明のＤＮＡを有する組み換えベクターが提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明のＤＮＡ又は組み換えベクターを有する形質転換体が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明のＤＮＡを宿主に形質転換して得られる形質転換体を培養することにより調製される、ウイルス粒子が提供される。
【０００９】
本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明のＤＮＡを用いて、抗ＨＩＶ剤の感受性を試験する方法が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明のＤＮＡを用いて、抗ＨＩＶ剤耐性に関与する変異を検出する方法が提供される。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施方法及び実施態様について詳細に説明する。
（Ａ）本発明のＤＮＡ
本発明のＤＮＡは、下記の何れかの塩基配列を有する。
（１）配列番号１に記載の塩基配列；又は
（２）配列番号１に記載の塩基配列において、１〜複数個の塩基が欠失、置換及び／又は付加している塩基配列であって、感染性ウイルスゲノムをコードする塩基配列：
【００１１】
本明細書において「１〜複数個の塩基が欠失、置換及び／又は付加している塩基配列」における「１〜複数個」の範囲は特には限定されないが、例えば、１から６０個、好ましくは１から３０個、より好ましくは１から２０個、さらに好ましくは１から１０個、特に好ましくは１から５個程度を意味する。
本発明のＤＮＡは、以下の実施例に記載する方法で取得することができるし、あるいは本明細書の配列表の配列番号１に記載した塩基配列の情報に基づいて適当なプローブ又はプライマーを設計し、ＨＩＶ粒子からスクリーニングすることにより取得することができる。
【００１２】
本発明のＤＮＡは、配列番号１に記載の塩基配列において、１〜複数個の塩基が欠失、置換及び／又は付加している塩基配列であって、感染性ウイルスゲノムをコードする塩基配列を有していてもよい。
所定のＤＮＡ配列に所望の変異を導入する方法は当業者に公知である。例えば、部位特異的変異誘発法、縮重オリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲ、核酸を含む細胞の変異誘発剤又は放射線への露出等の公知の技術を適宜使用することによって、変異を有するＤＮＡを構築することができる。このような公知の技術は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｎｕａｌ，  ２ｎｄ  Ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ．，１９８９、並びにＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １〜３８，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  （１９８７−１９９７）に記載されている。
【００１３】
（Ｂ）本発明の組み換えベクター
本発明のＤＮＡは適当なベクター中に挿入して使用することができる。本発明で用いるベクターの種類は特に限定されず、例えば、自立的に複製するベクター（例えばプラスミド等）でもよいし、あるいは、宿主細胞に導入された際に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、組み込まれた染色体と共に複製されるものであってもよい。
好ましくは、本発明で用いるベクターは発現ベクターである。発現ベクターにおいて本発明のＤＮＡは、転写に必要な要素（例えば、プロモーター等）が機能的に連結されている。プロモータは宿主細胞において転写活性を示すＤＮＡ配列であり、宿主の種類に応じて適宜することができる。
【００１４】
細菌細胞で作動可能なプロモータとしては、ファージ・ラムダのＰＲ若しくはＰＬプロモータ、大腸菌の  ｌａｃ、ｔｒｐ若しくはｔａｃプロモータ、バチルス・ステアロテルモフィルス・マルトジェニック・アミラーゼ遺伝子もしくはバチルス・リケニホルミスαアミラーゼ遺伝子のプロモータなどが挙げられる。哺乳動物細胞で作動可能なプロモータの例としては、ＳＶ４０プロモータ、ＭＴ−１（メタロチオネイン遺伝子）プロモータ、またはアデノウイルス２主後期プロモータなどがある。昆虫細胞で作動可能なプロモータの例としては、ポリヘドリンプロモータ、Ｐ１０プロモータ、オートグラファ・カリホルニカ・ポリヘドロシス塩基性タンパクプロモータ、バキュウロウイルス即時型初期遺伝子１プロモータ、またはバキュウロウイルス３９Ｋ遅延型初期遺伝子プロモータ等がある。酵母宿主細胞で作動可能なプロモータとしては、酵母解糖系遺伝子由来のプロモータ、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモータ、ＴＰＩ１プロモータ、ＡＤＨ２−４ｃプロモータなどがある。
【００１５】
本発明の組み換えベクターはさらに選択マーカーを含有してもよい。選択マーカーとしては、例えば、その補体が宿主細胞に欠けている遺伝子（例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）など）、または薬剤耐性遺伝子（例えば、アンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリンなど）を挙げることができる。
本発明のＤＮＡ、プロモータ、および所望によりターミネータおよび／または分泌シグナル配列をそれぞれ連結し、これらを適切なベクターに挿入する方法は当業者に周知である。
【００１６】
（Ｃ）本発明の形質転換体
本発明のＤＮＡ又は組み換えベクターを適当な宿主に導入することによって形質転換体を作製することができる。
本発明のＤＮＡまたは組み換えベクターを導入される宿主細胞は、本発明のＤＮＡを発現できれば任意の細胞でよく、細菌、酵母、真菌および高等真核細胞等が挙げられる。
【００１７】
細菌はグラム陽性細菌（例えば、バチルス、ストレプトマイセス等）でもグラム陰性細菌（例えば、大腸菌等）の何れでもよい。細菌の形質転換は、プロトプラスト法、または公知の方法でコンピテント細胞を用いることにより行うことができる。
哺乳類細胞の例としては、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、ＣＨＬ細胞またはＣＨＯ細胞等が挙げられる。哺乳類細胞の形質転換は、例えば、エレクトロポーレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等を用いることができる。
【００１８】
酵母細胞の例としては、サッカロマイセスまたはシゾサッカロマイセスに属する細胞が挙げられ、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓ１ａｅ）またはサッカロマイセス・クルイベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）等が挙げられる。酵母宿主の形質転換は、例えば、エレクトロポレーション法、スフェロブラスト法、酢酸リチウム法等を用いて行うことができる。
その他、昆虫細胞を宿主として用いることも可能であり、その場合には、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、タンパク質を発現させることができる。
【００１９】
（Ｄ）本発明のウイルス粒子
上記の形質転換体を、導入されたＤＮＡの発現を可能にする条件下で適切な栄養培地中で培養することにより、培地中に本発明のＨＩＶのウイルス粒子を生成することができる。
形質転換体の培養物から、本発明のウイルス粒子を単離精製する方法は、当業者に公知の常法に従って行うことができる。具体的には、例えば、本発明のＤＮＡを宿主（例えば、ＨｅＬａ細胞などの哺乳動物細胞）に導入し、４８〜７２時間培養した後の培養上清を回収し、フィルター（例えば、孔径０．４５μｍ）を通すことによって無細胞ウイルス調製液を得ることができる。
【００２０】
（Ｅ）本発明のＤＮＡの利用
本発明のＤＮＡを用いて、抗ＨＩＶ剤の抗ウイルス活性を評価する方法を提供することができる。
具体的には、本発明のＤＮＡを実施例に記す方法に従いＨｅＬａ細胞などの動物細胞に導入することで、感染性ＨＩＶ−１粒子が得られる。これを、ウイルス感受性細胞などに感染させ、抗ＨＩＶ剤の候補物質（候補薬剤）の存在下で培養することにより、候補薬剤の５０％有効阻害濃度（ＩＣ５０）を決定することができる。ＩＣ５０値の比較により、候補薬剤の中から抗ＨＩＶ効果の優れた薬剤を選別することが可能となる。本発明のＤＮＡは、未治療者に有効な抗ＨＩＶ活性を有する物質のスクリ−ニングに有用と考えられる。
【００２１】
また、本発明のＤＮＡを用いて、ＨＩＶ−１の薬剤耐性変異を検出する方法を提供することができる。
具体的には、薬剤治療を受けたが効果が認められず耐性ウイルスの出現が疑われるＨＩＶ感染者のウイルスについて、ＰＣＲ法により阻害剤の標的遺伝子を増幅し、ＤＮＡ組み換え技術を用いて本発明ＤＮＡとの組み換えＤＮＡを作製する。これをＨｅＬａ細胞などの動物細胞に導入して組み換えウイルスを得る。このウイルスの薬剤感受性をＭＡＧＩＣ−５Ａ  （Ｈａｃｈｉｙａ，  Ａ．，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．  ４５：４９５−５０１，  ２００１）を用いて解析することにより、感染者のウイルスが薬剤耐性を獲得しているか否かを判定することが可能となる。
【００２２】
また、感染者のウイルスに認められた変異を、部位特異的変異導入法により本発明のＤＮＡに導入し、これを用いて得られるウイルスの薬剤感受性をＭＡＧＩＣ−５Ａを用いて決定する。これにより、感染者ウイルス遺伝子に検出された変異が、実際にウイルスの薬剤耐性発現に関与するか否かを決定することが可能となる。
【００２３】
さらに、本発明のＤＮＡを用いて、臨床応用化されていない抗ＨＩＶ剤候補について、あらかじめどのような耐性変異が出現しうるかをを解析する方法を提供することができる。具体的には、本発明のＤＮＡ由来ウイルスをウイルス感受性細胞に感染させ、候補薬剤存在下で継代培養し、段階的に薬剤濃度を増加していくことにより、薬剤低感受性ウイルスを選別する。得られた耐性ウイルスの変異点解析により、薬剤耐性の獲得に関与する変異の検出ができる。また、同定された個々の変異の薬剤耐性獲得に果たす役割を、本発明のＤＮＡを用いた部位特異的変異導入法により明確にすることが可能となる。
以下の実施例により、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されることはない。
【００２４】
【実施例】
（Ａ）実験と結果
以下の実験を行なった。なお、実験方法の詳細については、（Ｂ）実験方法に記載する。
中国雲南省の各地域のＩＤＵからＥＤＴＡ血を採取し、フィコール遠心によって末梢血リンパ球を分離し、ＰＨＡ処理で活性化した健常者からのＣＤ８陽性細胞を除去したＰＢＭＣとの共培養によってＨＩＶ−１を分離した。それら分離株の遺伝子型をｇａｇ（ｐ１７），ＲＴ，ｅｎｖ（Ｃ２／Ｖ３）領域の塩基配列を決定することによって判定し、ＣＲＦ０７＿ＢＣあるいはＣＲＦ０８＿ＢＣと考えられるウイルス株を選択した。その中でＰＢＭＣ中での増殖能の高いＨＩＶ−１ＣＲＦ０８＿ＢＣ株（００Ｎ−ＨＨ０４０）を選び、感染性分子クローン分離のための出発材料とした。
【００２５】
ＨＩＶ−１ＣＲＦ０８＿ＢＣ株（００ＣＮ−ＨＨ０４０）をＣＤ８陽性細胞を除去した末梢血リンパ球（ＰＢＭＣ）への感染７日後に、感染細胞からＤＮＡを抽出し、それを鋳型としてＬｏｎｇ  ＰＣＲを行い、完全長のＨＩＶ−１ゲノムをｐＢＲ３２２由来のベクター（ｐＢＲ−ＴＡ）に図１に示すようなスキームで再構築した。２２個の候補クローンをＨｅＬａ細胞にＦｕＧｅｎｅ６によりトランスフェクトし、ウイルス粒子産生を４８時間後の培養上清中の逆転写酵素活性で測定した。
【００２６】
ウイルス産生のあった４クローンの関してＰＢＭＣを用いた感染実験によって感染性をスクリーニングした。その結果、１クローン（ｐ００ＣＮ−ＨＨ０４０．ＮＸ２２）が対照となるもとの分離ウイルス株と同様なレベルのウイルス産生良好な感染性を示した（図２）。本クローンはヒトＣＤ４およびＨＩＶ−１コレセプター発現系を導入したヒトグリオブラストーマに由来するＮＰ２細胞を用いたアッセイ系よってコレセプターとしてＣＣＲ５を用いることを確認した。
【００２７】
本分子クローンが新規のＣＲＦ０８＿ＢＣであることは、決定された全塩基配列の系統樹解析（近隣結合法）（図３）および組換え点検索プログラム（ｂｏｏｔｓｃａｎｎｉｎｇ  ｐｌｏｔｓ／ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ  ｐｌｏｔ）（図４）によって確認した。
【００２８】
（Ｂ）実験方法（ＨＩＶ−１  ＣＲＦ０８＿ＢＣ感染性分子クローンの構築とそのウイルス学的性質の解析方法）
（１）ゲノム全長クローンの構築
ＨＩＶ−１株  ＨＨ０４０    感染後７日目の末梢血単核細胞からＤＮＡｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＤＮＡを抽出、精製後、下記のプライマーを用いて、５’ＬＴＲを含む領域およびｐｂｓから３’ＬＴＲを含む領域を増幅後、Ｘｃｍｌ消化したｐＢＲ３２２由来ＴＡ  ｃｌｏｎｉｎｇベクターｐＢＲＴＡ２にクローニングした。つづいて、それぞれのプラスミドのｐｂｓ内のＮａｒＩサイトとｐＢＲＴＡ２内のＰｖｕＩサイトで切断した後に、５’ＬＴＲとｐｂｓから３’ＬＴＲを含む領域を結合させることによって、完全長のＨＨ０４０ゲノムを含むクローンを樹立した、さらに新たなｐｂｓから３’ＬＴＲを含む領域のＰＣＲ産物をＮａｒＩとＸｈｏＩで切断後、構築したプラスミドのＮａｒＩ−ＸｈｏＩサイトに挿入することによって、新たな完全長のクローンを樹立した。
【００２９】
ＰＣＲ    ｐｒｉｍｅｒｓ
ＣＵ３Ａ          ５’−ＴＧＧ  ＡＡＧ  ＧＧＴ  ＴＡＡ  ＴＴＴ  ＡＣＴ  ＣＴＡ  ＡＧＡ  ＡＡＡ  ＧＧＣ−３’（配列番号２）
ｐｂｓ−０６５Ｂ        ５’−ＴＴＧ  ＧＣＧ  ＴＡＣ  ＴＣＡ  ＣＣＡ  ＧＴＣ  ＧＣＣ−３’（配列番号３）
ｐｂｓ−４９６Ａ        ５’−ＡＧＴ  ＧＧＣ  ＧＣＣ  ＣＧＡ  ＡＣＡ  ＧＧ−３’（配列番号４）
Ｕ５−４９７Ｂ          ５’−ＧＧＴ  ＣＴＧ  ＡＧＧ  ＧＡＴ  ＣＴＣ  ＴＡＧ  ＴＴＡ  ＣＣＡ  Ｇ−３’（配列番号５）
ｎｅｆ  ＸｈｏＩ−５１５Ｂ  ５’−ＴＴＣ  ＣＡＧ  ＧＴＣ  ＴＣＧ  ＡＧＡ  ＴＡＣ  ＴＧＣ−３’（配列番号  ６）
【００３０】
（２）ウイルス液の調製
ＨｅＬａ細胞を４．８×１０４細胞／ｍｌに調整し、２４ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに１ｍｌ／ｗｅｌｌ入れ、１晩培養した。翌日精製したプラスミドＤＮＡ  ５００ｎｇをＦｕＧＥＮＥ６（Ｒｏｃｈｅ）を用いてＨｅＬａ細胞にｔｒａｎｓｆｅｃｔし、４８時間後に培養上清を回収し、上清に含まれるウイルス量をＲＴ  ａｓｓａｙ法によって定量した。
【００３１】
（３）感染性
ヒト全血からＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて末梢血リンパ球を分離し、１０％ウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯ）および１μｇ／ｍｌフィトヘマグルチニン（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、２μｇ／ｍｌポリブレン（Ｓｉｇｍａ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯ）を用いて培養した。３日後遠心分離によって培養上清を除いた後に、１０％ウシ胎児血清、２０ｕｎｉｔ／ｍｌのＩＬ２（Ｒｏｃｈｅ）、２μｇ／ｍｌポリブレンを含むＲＰＭＩ１６４０培地（ＩＬ２    加培養液）を用いて４×１０６／ｍｌに調整後、９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに５０μｌ／ｗｅｌｌ準備した。ここにＨｅＬａ細胞を用いて調整したウイルス液１００μｌを加えて懸濁し、３７℃で１晩吸着させた。吸着後、上清１００μｌを除き２００μｌのＩＬ２加培養液を加えて静置後、上清２００μｌを吸引、新たに２００μｌのＩＬ２加培養液を加え、上清に含まれるウイルス濃度を１／２５まで希釈した後に、培養を開始した。３日毎に培養上清１５０μｌを回収、新たなＩＬ２加培養液を１５０μｌを加えて１６日間培養した。回収した培養上清に含まれるウイルス量はＲＴ  ａｓｓａｙ法にて定量した。
【００３２】
（４）コレセプター使用域の同定
ＣＸＣＲ４またはＣＣＲ５を発現するＮＰ２／ＣＤ４細胞（Ｓｏｄａ，  Ｙ．，  Ｓｈｉｍｉｚｕ，  Ｎ．，  Ｊｉｎｎｏ，  Ａ．，  Ｌｉｕ，  ＨＹ．，  Ｋａｎｂｅ，  Ｋ．，  ＫＩｔａｍｕｒａ，  Ｔ．，Ｈｏｓｈｉｎｏ，  Ｈ．，  Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｎｅｗ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｕｓａｇｅｓ  ｏｆ  ＨＩＶ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｇｌｉｏｍａ  ＮＰ２  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃ．  Ｒｅｓ．ｃｏｍ．  ２５８：  ３１３−３２１  （１９９９））を、１０％ウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯ）を含むＤＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ）で５×１０４／ｍｌに調整し、９６  ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに１００μｌ／ｗｅｌｌ入れ、一晩培養した。翌日、培養上清を除き、ＨｅＬａ細胞を用いて調整したウイルス１００μｌを入れ、一晩吸着させた。吸着後上清を除き、新しい培地２００μｌを加えて培養した。新しい培地を加えた直後（ｄａｙ１）および感染後３、５、７日目の培養上清に含まれるウイルス量をＲＴ  ａｓｓａｙ法で定量した。
【００３３】
（５）塩基配列の系統解析
（００ＣＮ−ＨＨ０４０．ＮＸ２２）の塩基配列は、ＢｉｇＤｙｅ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｃｙｃｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ    Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いたｄｙｅ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ法によって決定した。得られた塩基配列をロスアラモス研究所のＨＩＶ    ｓｅｑｕｅｎｃｅ    ｄａｔａｂａｓｅ（  ＨＹＰＥＲＬＩＮＫ  ”ｈｔｔｐ：／／ｈｉｖ−ｗｅｂ．ｌａｎｌ．ｇｏｖ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｈｉｖ−ｄｂ／ｍａｉｎｐａｇｅ．ｈｔｍｌ”  ｈｔｔｐ：／／ｈｉｖ−ｗｅｂ．ｌａｎｌ．ｇｏｖ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｈｉｖ−ｄｂ／ｍａｉｎｐａｇｅ．ｈｔｍｌ）にて公開されている各サブタイプのｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅと、アミノ酸コーディング領域を考慮して整列させた。ｏｕｔｇｒｏｕｐとして、ＳＩＶｃｐｚｇａｂを用いた。さらにギャップを含む領域および整列の曖昧な領域を除去してアライメントを作成した。このアライメントをもとに、Ｆｅｌｓｅｎｓｔｅｉｎ  ８４  ｍｏｄｅｌを用いてｍａｘｉｍｕｍ  ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ  ｄｉｓｔａｎｃｅ  ｍａｔｒｉｘ  を作成し、これをもとに近隣結合法によって系統樹を作成した。系統樹の作成には、Ｐｈｙｌｉｐ  ｖｅｒ３．６ａ３プログラム（Ｆｅｌｓｅｎｓｔｅｉｎ  Ｊ．（２００２）  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，  Ｓｅａｔｔｌｅ，  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）を用いた。
【００３４】
サブタイプ間組換え体の解析は、ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ  ｐｌｏｔ法およびｂｏｏｔｓｃａｎｎｉｎｇ  ｐｌｏｔ法によって行った。これらの解析は、ｏｕｔｇｒｏｕｐを除いて整列し直し、同様に処理して作成したアライメントをもとにして行った。Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ  ｐｌｏｔ法は  ５００ｂａｓｅ  ｐａｉｒのウインドウサイズで、１０  ｂａｓｅ  ｐａｉｒ毎の遺伝的距離をＦｅｌｓｅｎｓｔｅｉｎ８４  ｍｏｄｅｌを用いて算出し、プロットした。Ｂｏｏｔｓｃａｎｎｉｎｇ  ｐｌｏｔ法は、５００  ｂａｓｅ  ｐａｉｒのウインドウサイズで、１００  ｂａｓｅ  ｐａｉｒ毎に１つのｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅとクラスターを形成する信頼度（ｂｏｏｔｓｔｒａｐ    ｖａｌｕｅ）をプロットした。これらの解析には、ｓｉｍｐｌｏｔ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．２プログラム（Ｌｏｌｅ  Ｋ．Ｓ．（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３（１）：１５２−１６０）を用いた。
【００３５】
【発明の効果】
本発明のＤＮＡはその全塩基配列が決定されており、さらにヒト培養細胞に導入することにより感染能を有するウイルス粒子を産生する。これらの特徴は、アジア地域流行株の生物活性を分子遺伝学的に解析する際に出発材料として有用であり、以下に示す広範囲の応用が考えられる。
【００３６】
第一に、ＨＩＶ−１の薬剤耐性に関する各種検査系の開発（抗ＨＩＶ剤感受性試験系、薬剤耐性変異検出系など）に有用と考えられる。
第二に、ＨＩＶ−１の免疫学的あるいは遺伝学的検査系の開発（各種抗原を用いたＥＬＩＳＡの開発、各種オリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ検査系など）に有用と考えられる。
第三に、抗ＨＩＶ阻害剤およびワクチンの開発、あるいはそれらの評価系の開発に有用と考えられる。
第四に、ＨＩＶ−１の生物学的、免疫学的諸性質を解析する培養細胞系または動物モデル系の開発に有用と考えられる。
第五に、ＨＩＶ−１の各遺伝子産物の構造と機能の開発およびゲノムの転写・複製調節を解析する系の開発に有用と考えられる。
【００３７】
【配列表】
2004236525.tif 000002
【００３８】
2004236525.tif 000003
2004236525.tif 000004
2004236525.tif 000005
2004236525.tif 000006
2004236525.tif 000007
2004236525.tif 000008
【００３９】
2004236525.tif 000009
【００４０】
2004236525.tif 000010
【００４１】
2004236525.tif 000011
【００４２】
2004236525.tif 000012
【００４３】
2004236525.tif 000013
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ＨＩＶ−１ＣＲＦ０８＿ＢＣの感染性分子クローンの構築方法の概要を示す。
【図２】図２は、ＰＢＭＣを用いた感染実験によって感染性をスクリーニングした結果を示す。
【図３】図３は、決定された全塩基配列の系統樹解析（近隣結合法）を示す。
【図４】図４は、決定された全塩基配列の組換え点検索プログラム（ｂｏｏｔｓｃａｎｎｉｎｇ  ｐｌｏｔｓ／ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ  ｐｌｏｔ）解析を示す。
【図１】
2004236525.tif 000014
【図２】
2004236525.tif 000015
【図３】
2004236525.tif 000016
【図４】
2004236525.tif 000017