【誤訳訂正書】
【提出日】平成26年10月16日(2014.10.16)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ｈＮＧＡＬ）から選択されるタンパク質に由来するムテインであって、配列番号１に示されるｈＮＧＡＬの直鎖状ポリペプチド配列の配列位置３３、３６、４１、５２、５４、６８、７０、７９、８１、１３４、１３６、および１３８に対応する配列位置のうちのいずれかにおいて、少なくとも１１の突然変異させたアミノ酸残基を含み、但しｈＮＧＡＬの直鎖状ポリペプチド配列の配列位置１３８に対応する配列位置のアミノ酸残基は変異されており、検出可能なアフィニティーで所与の小分子である標的に結合するムテイン。
【請求項２】
ｈＮＧＡＬの直鎖状ポリペプチド配列の配列位置４２、４８、４９、５５、７５、７７、８０、および１２７に対応する配列位置のうちのいずれかにおいて、少なくとも１つの突然変異させたアミノ酸残基をさらに含む、請求項１に記載のムテイン。
【請求項３】
ｈＮＧＡＬの直鎖状ポリペプチド配列の配列位置４３、４４、４６、４７、５０、５１、５９、６５、７８、８６、８７、９８、９９、１０３、１０７、１１０、および１１１に対応する配列位置のうちのいずれかにおいて、少なくとも１つの突然変異させたアミノ酸残基をさらに含む、請求項１または２に記載のムテイン。
【請求項４】
ｈＮＧＡＬの野生型配列の配列位置１４、２１、６０、８４、８８、１１６、１４１、１４５、１４３、１４６、または１５８に対応する配列位置のうちの少なくとも１カ所においてＣｙｓ残基が導入される、請求項１から３のいずれか一項に記載のムテイン。
【請求項５】
ｈＮＧＡＬの野生型配列の配列位置６５、７１、７３、７４、１１６、１２５、および１３５に対応する配列位置のうちの少なくとも１カ所において、成熟ｈＮＧＡＬの野生型アミノ酸配列に対してさらなるアミノ酸置換を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載のムテイン。
【請求項６】
有機低分子またはペプチドに結合する、請求項１から５のいずれか一項に記載のムテイン。
【請求項７】
有機低分子が、金属キレート化剤または薬剤である、請求項６に記載のムテイン。
【請求項８】
突然変異させたアミノ酸が、Ｖａｌ３３→Ｇｌｎ；Ｌｅｕ３６→Ａｒｇ；Ｉｌｅ４１→Ａｌａ；Ｔｙｒ５２→Ｔｈｒ；Ｔｈｒ５４→Ｇｌｎ；Ｓｅｒ６８→Ａｌａ；Ｌｅｕ７０→Ａｒｇ；Ｔｒｐ７９→Ａｌａ、Ｌｅｕ；Ａｒｇ８１→Ｍｅｔ；Ｌｙｓ１３４→Ｓｅｒ；Ｔｈｒ１３６→Ｓｅｒ；およびＴｙｒ１３８→Ｌｅｕからなる群から選択される、成熟ｈＮＧＡＬの野生型アミノ酸配列に対して含む、請求項１から７のいずれか一項に記載のムテイン。
【請求項９】
Ｌｅｕ４２→Ｐｒｏ、Ｐｒｏ４８→Ｌｅｕ、Ｇｌｎ４９→Ｌｅｕ、Ｉｌｅ５５→Ｔｈｒ、Ｌｙｓ７５→Ｍｅｔ、Ａｓｐ７７→Ｇｌｕ、Ｉｌｅ８０→Ｔｈｒ、およびＳｅｒ１２７→Ｇｌｎからなる群から選択されるアミノ酸置換を、成熟ｈＮＧＡＬの野生型アミノ酸配列に対してさらに含む、請求項８に記載のムテイン。
【請求項１０】
Ａｒｇ４３→Ｐｒｏ、Ｇｌｕ４４→Ｖａｌ、Ｇｌｕ４４→Ｍｅｔ、Ｌｙｓ４６→Ｐｒｏ、Ａｓｐ４７→Ｇｌｕ、Ｌｙｓ５０→Ｌｅｕ、Ｍｅｔ５１→Ｌｅｕ、Ｌｙｓ５９→Ａｒｇ、Ａｓｎ６５→Ａｓｐ、Ｔｙｒ７８→Ｈｉｓ、Ｇｌｙ８６→Ｓｅｒ、Ｓｅｒ８７→Ｐｒｏ、Ｓｅｒ８７→Ｐｈｅ、Ｌｙｓ９８→Ｇｌｕ、Ｓｅｒ９９→Ａｓｎ、Ｌｅｕ１０３→Ｉｌｅ、Ｌｅｕ１０７→Ｐｈｅ、Ｖａｌ１１０→Ｍｅｔ、およびＶａｌ１１１→Ａｌａからなる群から選択されるアミノ酸置換を、成熟ｈＮＧＡＬの野生型アミノ酸配列に対してさらに含む、請求項８または９に記載のムテイン。
【請求項１１】
アミノ酸置換：
（ａ）Ｖａｌ３３→Ｇｌｎ；Ｌｅｕ３６→Ａｒｇ；Ｉｌｅ４１→Ａｌａ；Ｔｙｒ５２→Ｔｈｒ；Ｔｈｒ５４→Ｇｌｎ；Ｓｅｒ６８→Ａｌａ；Ｌｅｕ７０→Ａｒｇ；Ｔｒｐ７９→Ａｌａ；Ｉｌｅ ８０→Ｔｈｒ；Ａｒｇ８１→Ｍｅｔ；Ｌｙｓ１３４→Ｓｅｒ；およびＴｙｒ１３８→Ｌｅｕ；
（ｂ）Ｖａｌ３３→Ｇｌｎ；Ｌｅｕ３６→Ａｒｇ；Ｉｌｅ４１→Ａｌａ；Ｔｙｒ５２→Ｔｈｒ；Ｔｈｒ５４→Ｇｌｎ；Ｓｅｒ６８→Ａｌａ；Ｌｅｕ７０→Ａｒｇ；Ｔｒｐ７９→Ｌｅｕ；Ｉｌｅ ８０→Ｔｈｒ；Ａｒｇ８１→Ｍｅｔ；Ｌｙｓ１３４→Ｓｅｒ；およびＴｙｒ１３８→Ｌｅｕ；
（ｃ）Ｖａｌ３３→Ｇｌｎ；Ｌｅｕ３６→Ａｒｇ；Ｉｌｅ４１→Ａｌａ；Ｔｙｒ５２→Ｔｈｒ；Ｔｈｒ５４→Ｇｌｎ；Ｓｅｒ６８→Ａｌａ；Ｌｅｕ７０→Ａｒｇ；Ｔｒｐ７９→Ｌｅｕ；Ｉｌｅ ８０→Ｔｈｒ；Ａｒｇ８１→Ｍｅｔ；Ｓｅｒ１２７→Ｇｌｎ；Ｌｙｓ１３４→Ｓｅｒ；およびＴｙｒ１３８→Ｌｅｕ；
（ｄ）Ｖａｌ３３→Ｇｌｎ；Ｌｅｕ３６→Ａｒｇ；Ｉｌｅ４１→Ａｌａ；Ｔｙｒ５２→Ｔｈｒ；Ｔｈｒ５４→Ｇｌｎ；Ｓｅｒ６８→Ａｌａ；Ｌｅｕ７０→Ａｒｇ；Ｔｒｐ７９→Ｌｅｕ；Ｉｌｅ ８０→Ｔｈｒ；Ａｒｇ８１→Ｍｅｔ；Ｌｙｓ１３４→Ｓｅｒ；Ｔｈｒ１３６→Ｓｅｒ；およびＴｙｒ１３８→Ｌｅｕ；
（ｅ）Ｖａｌ３３→Ｇｌｎ；Ｌｅｕ３６→Ａｒｇ；Ｉｌｅ４１→Ａｌａ；Ｔｙｒ５２→Ｔｈｒ；Ｔｈｒ５４→Ｇｌｎ；Ｓｅｒ６８→Ａｌａ；Ｌｅｕ７０→Ａｒｇ；Ｔｒｐ７９→Ｌｅｕ；Ｉｌｅ ８０→Ｔｈｒ；Ａｒｇ８１→Ｍｅｔ；Ｓｅｒ１２７→Ｇｌｎ；Ｌｙｓ１３４→Ｓｅｒ；Ｔｈｒ１３６→Ｓｅｒ；およびＴｙｒ１３８→Ｌｅｕ；
（ｆ）Ｖａｌ３３→Ｇｌｎ；Ｌｅｕ３６→Ａｒｇ；Ｉｌｅ４１→Ａｌａ；Ｔｙｒ５２→Ｔｈｒ；Ｔｈｒ５４→Ｇｌｎ；Ｓｅｒ６８→Ａｌａ；Ｌｅｕ７０→Ａｒｇ；Ａｓｐ７７→Ｇｌｕ；Ｔｒｐ７９→Ｌｅｕ；Ｉｌｅ ８０→Ｔｈｒ；Ａｒｇ８１→Ｍｅｔ；Ｓｅｒ１２７→Ｇｌｎ；Ｌｙｓ１３４→Ｓｅｒ；Ｔｈｒ１３６→Ｓｅｒ；およびＴｙｒ１３８→Ｌｅｕ；
（ｇ）Ｖａｌ３３→Ｇｌｎ；Ｌｅｕ３６→Ａｒｇ；Ｉｌｅ４１→Ａｌａ；Ｌｅｕ４２→Ｐｒｏ；Ｐｒｏ４８→Ｌｅｕ；Ｇｌｎ４９→Ｌｅｕ；Ｔｙｒ５２→Ｔｈｒ；Ｔｈｒ５４→Ｇｌｎ；Ｉｌｅ５５→Ｔｈｒ；Ｓｅｒ６８→Ａｌａ；Ｌｅｕ７０→Ａｒｇ；Ｌｙｓ７５→Ｍｅｔ；Ａｓｐ７７→Ｇｌｕ；Ｔｒｐ７９→Ｌｅｕ；Ｉｌｅ ８０→Ｔｈｒ；Ａｒｇ８１→Ｍｅｔ；Ｓｅｒ１２７→Ｇｌｎ；Ｌｙｓ１３４→Ｓｅｒ；Ｔｈｒ１３６→Ｓｅｒ；およびＴｙｒ１３８→Ｌｅｕ；
（ｈ）Ｖａｌ３３→Ｇｌｎ；Ｌｅｕ３６→Ａｒｇ；Ｉｌｅ４１→Ａｌａ；Ｌｅｕ４２→Ｐｒｏ；Ａｒｇ４３→Ｐｒｏ；Ｇｌｕ４４→Ｖａｌ；Ｌｙｓ４６→Ｐｒｏ；Ａｓｐ４７→Ｇｌｕ；Ｐｒｏ４８→Ｌｅｕ；Ｇｌｎ４９→Ｌｅｕ；Ｌｙｓ５０→Ｌｅｕ；Ｍｅｔ５１→Ｌｅｕ；Ｔｙｒ５２→Ｔｈｒ；Ｔｈｒ５４→Ｇｌｎ；Ｉｌｅ５５→Ｔｈｒ；Ｓｅｒ６８→Ａｌａ；Ｌｅｕ７０→Ａｒｇ；Ｌｙｓ７５→Ｍｅｔ；Ａｓｐ７７→Ｇｌｕ；Ｔｒｐ７９→Ｌｅｕ；Ｉｌｅ ８０→Ｔｈｒ；Ａｒｇ８１→Ｍｅｔ；Ｓｅｒ１２７→Ｇｌｎ；Ｌｙｓ１３４→Ｓｅｒ；Ｔｈｒ１３６→Ｓｅｒ；およびＴｙｒ１３８→Ｌｅｕ；
（ｉ）Ｖａｌ３３→Ｇｌｎ；Ｌｅｕ３６→Ａｒｇ；Ｉｌｅ４１→Ａｌａ；Ｌｅｕ４２→Ｐｒｏ；Ａｒｇ４３→Ｐｒｏ；Ｇｌｕ４４→Ｖａｌ；Ｌｙｓ４６→Ｐｒｏ；Ａｓｐ４７→Ｇｌｕ；Ｐｒｏ４８→Ｌｅｕ；Ｇｌｎ４９→Ｌｅｕ；Ｌｙｓ５０→Ｌｅｕ；Ｍｅｔ５１→Ｌｅｕ；Ｔｙｒ５２→Ｔｈｒ；Ｔｈｒ５４→Ｇｌｎ；Ｉｌｅ５５→Ｔｈｒ；Ａｓｎ６５→Ａｓｐ；Ｓｅｒ６８→Ａｌａ；Ｌｅｕ７０→Ａｒｇ；Ｌｙｓ７５→Ｍｅｔ；Ａｓｐ７７→Ｇｌｕ；Ｔｒｐ７９→Ｌｅｕ；Ｉｌｅ ８０→Ｔｈｒ；Ａｒｇ８１→Ｍｅｔ；Ｌｙｓ９８→Ｇｌｕ；Ｖａｌ１１０→Ｍｅｔ；Ｓｅｒ１２７→Ｇｌｎ；Ｌｙｓ１３４→Ｓｅｒ；Ｔｈｒ１３６→Ｓｅｒ；およびＴｙｒ１３８→Ｌｅｕ；
（ｊ）Ｖａｌ３３→Ｇｌｎ；Ｌｅｕ３６→Ａｒｇ；Ｉｌｅ４１→Ａｌａ；Ｌｅｕ４２→Ｐｒｏ；Ａｒｇ４３→Ｐｒｏ；Ｇｌｕ４４→Ｖａｌ；Ｌｙｓ４６→Ｐｒｏ；Ａｓｐ４７→Ｇｌｕ；Ｐｒｏ４８→Ｌｅｕ；Ｇｌｎ４９→Ｌｅｕ；Ｌｙｓ５０→Ｌｅｕ；Ｍｅｔ５１→Ｌｅｕ；Ｔｙｒ５２→Ｔｈｒ；Ｔｈｒ５４→Ｇｌｎ；Ｉｌｅ５５→Ｔｈｒ；Ａｓｎ６５→Ａｓｐ；Ｓｅｒ６８→Ａｌａ；Ｌｅｕ７０→Ａｒｇ；Ｌｙｓ７５→Ｍｅｔ；Ａｓｐ７７→Ｇｌｕ；Ｔｒｐ７９→Ｌｅｕ；Ｉｌｅ ８０→Ｔｈｒ；Ａｒｇ８１→Ｍｅｔ；Ｇｌｙ８６→Ｓｅｒ；Ｓｅｒ１２７→Ｇｌｎ；Ｌｙｓ１３４→Ｓｅｒ；Ｔｈｒ１３６→Ｓｅｒ；およびＴｙｒ１３８→Ｌｅｕ；
（ｋ）Ｖａｌ３３→Ｇｌｎ；Ｌｅｕ３６→Ａｒｇ；Ｉｌｅ４１→Ａｌａ；Ｌｅｕ４２→Ｐｒｏ；Ａｒｇ４３→Ｐｒｏ；Ｇｌｕ４４→Ｍｅｔ；Ｌｙｓ４６→Ｐｒｏ；Ａｓｐ４７→Ｇｌｕ；Ｐｒｏ４８→Ｌｅｕ；Ｇｌｎ４９→Ｌｅｕ；Ｌｙｓ５０→Ｌｅｕ；Ｍｅｔ５１→Ｌｅｕ；Ｔｙｒ５２→Ｔｈｒ；Ｔｈｒ５４→Ｇｌｎ；Ｉｌｅ５５→Ｔｈｒ；Ａｓｎ６５→Ａｓｐ；Ｓｅｒ６８→Ａｌａ；Ｌｅｕ７０→Ａｒｇ；Ｌｙｓ７５→Ｍｅｔ；Ａｓｐ７７→Ｇｌｕ；Ｔｒｐ７９→Ｌｅｕ；Ｉｌｅ ８０→Ｔｈｒ；Ａｒｇ８１→Ｍｅｔ；Ｇｌｙ８６→Ｓｅｒ；Ｓｅｒ８７→Ｐｒｏ；Ｓｅｒ９９→Ａｓｎ；Ｌｅｕ１０７→Ｐｈｅ；Ｓｅｒ１２７→Ｇｌｎ；Ｌｙｓ１３４→Ｓｅｒ；Ｔｈｒ１３６→Ｓｅｒ；およびＴｙｒ１３８→Ｌｅｕ；
（ｌ）Ｖａｌ３３→Ｇｌｎ；Ｌｅｕ３６→Ａｒｇ；Ｉｌｅ４１→Ａｌａ；Ｌｅｕ４２→Ｐｒｏ；Ａｒｇ４３→Ｐｒｏ；Ｇｌｕ４４→Ｖａｌ；Ｌｙｓ４６→Ｐｒｏ；Ａｓｐ４７→Ｇｌｕ；Ｐｒｏ４８→Ｌｅｕ；Ｇｌｎ４９→Ｌｅｕ；Ｌｙｓ５０→Ｌｅｕ；Ｍｅｔ５１→Ｌｅｕ；Ｔｙｒ５２→Ｔｈｒ；Ｔｈｒ５４→Ｇｌｎ；Ｉｌｅ５５→Ｔｈｒ；Ｌｙｓ５９→Ａｒｇ；Ａｓｎ６５→Ａｓｐ；Ｓｅｒ６８→Ａｌａ；Ｌｅｕ７０→Ａｒｇ；Ｌｙｓ７５→Ｍｅｔ；Ａｓｐ７７→Ｇｌｕ；Ｔｒｐ７９→Ｌｅｕ；Ｉｌｅ ８０→Ｔｈｒ；Ａｒｇ８１→Ｍｅｔ；Ｓｅｒ１２７→Ｇｌｎ；Ｌｙｓ１３４→Ｓｅｒ；Ｔｈｒ１３６→Ｓｅｒ；およびＴｙｒ１３８→Ｌｅｕ；
（ｍ）Ｖａｌ３３→Ｇｌｎ；Ｌｅｕ３６→Ａｒｇ；Ｉｌｅ４１→Ａｌａ；Ｌｅｕ４２→Ｐｒｏ；Ａｒｇ４３→Ｐｒｏ；Ｇｌｕ４４→Ｖａｌ；Ｌｙｓ４６→Ｐｒｏ；Ａｓｐ４７→Ｇｌｕ；Ｐｒｏ４８→Ｌｅｕ；Ｇｌｎ４９→Ｌｅｕ；Ｌｙｓ５０→Ｌｅｕ；Ｍｅｔ５１→Ｌｅｕ；Ｔｙｒ５２→Ｔｈｒ；Ｔｈｒ５４→Ｇｌｎ；Ｉｌｅ５５→Ｔｈｒ；Ａｓｎ６５→Ａｓｐ；Ｓｅｒ６８→Ａｌａ；Ｌｅｕ７０→Ａｒｇ；Ｌｙｓ７５→Ｍｅｔ；Ａｓｐ７７→Ｇｌｕ；Ｔｒｐ７９→Ｌｅｕ；Ｉｌｅ ８０→Ｔｈｒ；Ａｒｇ８１→Ｍｅｔ；Ｓｅｒ８７→Ｐｈｅ；Ｓｅｒ１２７→Ｇｌｎ；Ｌｙｓ１３４→Ｓｅｒ；Ｔｈｒ１３６→Ｓｅｒ；およびＴｙｒ１３８→Ｌｅｕ；または
（ｎ）Ｖａｌ３３→Ｇｌｎ；Ｌｅｕ３６→Ａｒｇ；Ｉｌｅ４１→Ａｌａ；Ｌｅｕ４２→Ｐｒｏ；Ａｒｇ４３→Ｐｒｏ；Ｇｌｕ４４→Ｖａｌ；Ｌｙｓ４６→Ｐｒｏ；Ａｓｐ４７→Ｇｌｕ；Ｐｒｏ４８→Ｌｅｕ；Ｇｌｎ４９→Ｌｅｕ；Ｌｙｓ５０→Ｌｅｕ；Ｍｅｔ５１→Ｌｅｕ；Ｔｙｒ５２→Ｔｈｒ；Ｔｈｒ５４→Ｇｌｎ；Ｉｌｅ５５→Ｔｈｒ；Ｓｅｒ６８→Ａｌａ；Ｌｅｕ７０→Ａｒｇ；Ｌｙｓ７５→Ｍｅｔ；Ａｓｐ７７→Ｇｌｕ；Ｔｙｒ７８→Ｈｉｓ；Ｔｒｐ７９→Ｌｅｕ；Ｉｌｅ ８０→Ｔｈｒ；Ａｒｇ８１→Ｍｅｔ；Ｌｅｕ１０３→Ｉｌｅ；Ｌｅｕ１０７→Ｐｈｅ；Ｖａｌ１１１→Ａｌａ；Ｓｅｒ１２７→Ｇｌｎ；Ｌｙｓ１３４→Ｓｅｒ；Ｔｈｒ１３６→Ｓｅｒ；およびＴｙｒ１３８→Ｌｅｕ
を、成熟ｈＮＧＡＬの野生型アミノ酸配列に対して含む、請求項９または１０に記載のムテイン。
【請求項１２】
Ｇｌｕ２８→Ｈｉｓ、Ｃｙｓ８７→Ｓｅｒ、およびＴｈｒ１４５→Ａｌａからなる群から選択されるアミノ酸置換を、成熟ｈＮＧＡＬの野生型アミノ酸配列に対してさらに含む、請求項９から１１のいずれか一項に記載のムテイン。
【請求項１３】
選択される標的分子に対する結合アフィニティーでターゲティング部分とコンジュゲートされているか、あるいは、有機分子、酵素標識、放射性標識、着色標識、蛍光標識、発色標識、発光標識、ハプテン、ジゴキシゲニン、ビオチン、金属錯体、金属、金コロイドからなる群から選択される標識にコンジュゲートされている、請求項１から１２のいずれか一項に記載のムテイン。
【請求項１４】
そのＮ末端および／またはそのＣ末端において、タンパク質、タンパク質ドメイン、またはペプチドと融合されているか、あるいは、その血清半減期を延長する部分とコンジュゲートされている、請求項１から１３のいずれか一項に記載のムテイン。
【請求項１５】
ムテインが、所与の小分子である標的に、１μＭ以下、１００μＭ以下、１μＭ以下、５００ｎＭ以下、２００ｎＭ以下、１００ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、または１ｎＭ以下のＫDにより結合する、請求項１から１４のいずれか一項に記載のムテイン。
【請求項１６】
化合物を事前に選択された部位にターゲティングするための、請求項１から１５のいずれか一項に記載のムテインの使用であって、
（ａ）前記ムテインを、前記化合物と接触させるステップと、
（ｂ）前記ムテイン／標的複合体を、前記事前に選択された部位に送達するステップと
を含む使用。
【請求項１７】
請求項１から１５のいずれか一項に記載のムテインを含む診断用キットまたは解析用キット。
【請求項１８】
請求項１から１２、１４、および１５のいずれか一項に記載のムテインをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子。
【請求項１９】
請求項１８に記載の核酸分子を含有する宿主細胞。
【請求項２０】
請求項１から１５のいずれか一項に記載のムテインを生成させる方法であって、
（ａ）ｈＮＧＡＬタンパク質をコードする核酸分子を、ｈＮＧＡＬの直鎖状ポリペプチド配列の配列位置３３、３６、４１、５２、５４、６８、７０、７９、８１、１３４、１３６、および１３８に対応する配列位置のうちの任意の少なくとも１１カ所をコードするヌクレオチドトリプレットにおいて突然変異誘発にかける結果、１または複数のムテイン核酸分子を得るステップ、但しｈＮＧＡＬの直鎖状ポリペプチド配列の配列位置１３８に対応する配列位置のアミノ酸残基は変異されるステップと、
（ｂ）適切な発現系において、（ａ）で得られた１または複数のムテイン核酸分子を発現させるステップと、
（ｃ）選択および／または単離により、所与の小分子である標的に対する検出可能な結合アフィニティーを有する１または複数のムテインを濃縮するステップと
を含む方法。
【請求項２１】
核酸分子を、ｈＮＧＡＬの直鎖状ポリペプチド配列の配列位置４２、４８、４９、５５、７５、７７、８０、および１２７に対応する配列位置のうちのいずれかをコードする、少なくとも１つのヌクレオチドトリプレットにおいて突然変異誘発にかけるステップをさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
核酸分子を、ｈＮＧＡＬの直鎖状ポリペプチド配列の配列位置４３、４４、４６、４７、５０、５１、５９、６５、７８、８６、８７、９８、９９、１０３、１０７、１１０、および１１１に対応する配列位置のうちのいずれかをコードする、少なくとも１つのヌクレオチドトリプレットにおいて突然変異誘発にかけるステップをさらに含む、請求項２０または２１に記載の方法。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１２】
上記の参考文献で開示されるリポカリンムテインは、タンパク質様の標的高分子に優先的に結合するように選択され、小分子に結合するようには選択されていない。したがって、この分野でなされた進歩にもかかわらず、高度の結合アフィニティー、例えば、ナノモル範囲のアフィニティーで小分子に結合するように特異的に適合させたｈＮＧＡＬムテインが得られれば望ましいであろう。このようなムテインによれば、診断的適用および治療的適用におけるｈＮＧＡＬムテインの適性がさらに改善されるであろう。
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１７】
核医学用ヒト化抗体の主要な障害は、循環時間が長いことであり、これにより、ＲＩＴにおける造影コントラストが低下し、腫瘍特異性が制約される。この問題を回避するため、キレート化された放射性核種から、腫瘍ターゲティング抗体を結合解除する、いわゆるプレターゲティング戦略が開発されている（Ｃｈａｎｇら（２００２年）、Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．、１巻、５５３〜５６３頁）。これにより、第１段階における、抗体による位置特定および循環からのクリアランスという緩徐な過程の後、第２段階において、小分子の放射性積載物の迅速かつ特異的な送達が可能となる。まず、ビオチニル化された放射性核種のキレートと共に、抗体−ストレプトアビジンコンジュゲートを適用し、その後、エピトープペプチドとコンジュゲートしたキレート錯体と共に、二特異性抗体を適用した。さらに、金属キレートに直接的に結合しうるモノクローナル抗体が開発された（Ｌｅ  Ｄｏｕｓｓａｌら（１９９０年）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、５０巻、３４４５〜３４５２頁；Ｃｏｒｎｅｉｌｌｉｅら（２００３年）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１２５巻、３４３６〜３４３７頁；Ｃｏｒｎｅｉｌｌｉｅら（２００３年）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１２５巻、１５０３９〜１５０４８頁）。
【誤訳訂正４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１８】
しかし、理想的な系となると、遺伝子融合戦略を用いて、ターゲティングペプチド／タンパク質のモジュール（例えば、天然の受容体リガンド、抗体フラグメント（ＫｅｎａｎｏｖａおよびＷｕ、前出）、または代替的な結合タンパク質（Ｓｋｅｒｒａ（２００７年）、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１８巻、２９５〜３０４頁；Ｓｋｅｒｒａ（２００７年）、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．、９巻、３３６〜３４４頁）に容易に結合させうる、頑健な折り畳み特性を有する単一のポリペプチド鎖を含む、小分子金属キレート（small metal chelate）に特異的な結合タンパク質であろう。ｈＮＧＡＬ、ラットα2ミクログロブリン類縁タンパク質（Ａ２ｍ）、およびマウス２４ｐ３／ウテロカリン（２４ｐ３）のムテインは、このような標的小分子に対する高度の結合アフィニティーを有する、このようなタンパク質を提供する。
【誤訳訂正５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２０】
所与の標的は、任意の所望の非天然標的／リガンドでありうる。「非天然リガンド」という用語は、生理学的条件下においては天然の成熟ｈＮＧＡＬに結合しない、任意の化合物を指す。標的（リガンド）は、免疫学的ハプテン、例えば、金属キレート化剤などの有機小分子、または、例えば、２〜約２５、もしくは約３０、もしくは約３５アミノ酸の長さのペプチド（下記を参照されたい）の特徴を示す、遊離形態またはコンジュゲート形態にある任意の化合物でありうる。
【誤訳訂正６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２１】
本明細書で用いられる「有機分子」または「有機小分子」という用語は、少なくとも２つの炭素原子を含むが、７または１２以下の回転可能な炭素結合を含むことが好ましく、分子量が１００〜２０００ドルトン、好ましくは１００〜１０００ドルトンの範囲にあり、また場合によって、１つまたは２つの金属原子を包含する有機分子を指す。
【誤訳訂正７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３３】
本発明の一実施形態によれば、ムテインは、有機小分子に結合する。有機小分子は、金属キレート化剤の場合もあり、金属キレート化剤を含有するカルボキシ基またはアミノ基などの薬剤の場合もある。このようなキレート化剤の非限定的な例は、少数の例示的な例だけを挙げれば、エチレン−ジアミン−四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、１，４，７，１０−テトラ−アザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−四酢酸（ＤＯＴＡ）、または２−メチル−６−（ｐ−イソチオシアナトベンジル）−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸（１Ｂ４Ｍ−ＤＯＴＡ）、２−（ｐ−イソチオシアナトベンジル）−５，６−シクロヘキサノ−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸（ＣＨＸ−ＤＯＴＡ）、２−（ｐ−イソチオシアナトベンジル）−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸（Ｃ−ＤＯＴＡ）、および１，４，７，１０−テトラアザ−Ｎ−（１−カルボキシ−３−（４−ニトロフェニル）プロピル）−Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−トリス（酢酸）シクロドデカン（ＰＡ−ＤＯＴＡ）など、これらの誘導体（例えば、Ｃｈａｐｐｅｌｌ，Ｌ、「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  １，４，７，１０−ｔｅｔｒａａｚａｃｙｃｌｏｄｏｄｅｃａｎｅ−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ  ｆｏｒ  ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、３０巻、６号、５８１〜５９５頁を参照されたい）である。ＤＴＰＡ、ＤＯＴＡ、またはこれらの誘導体は、例えば、イットリウム（Ｙ）、テルビウム（Ｔｂ）、インジウム（Ｉｎ）、ルテチウム（Ｌｕ）、およびビスマス（Ｂｉ）からなる群から選択される金属イオンと錯化しうる。ＤＴＰＡ誘導体は、例えば、米国特許第５，１２４，４７１号、同第５，２８６，８５０号、同第５，４３４，２８７号で説明される、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）系列のアミノ酸を含めたシクロヘキシル−ＤＴＰＡでありうる。本発明のムテインにより結合されうるキレート化剤の別の例は、米国特許第５，７５６，８２５号で説明されるヒドロキサム酸ベースの二官能性キレート化剤である。別の例は、ｐ−ＳＣＮ−Ｂｚ−ＨＥＨＡ（１，４，７，１０，１３，１６−ヘキサアザシクロ−オクタデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’，Ｎ’’’’，Ｎ’’’’’−六酢酸）（Ｄｅａｌら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、４２巻、２９８８頁、１９９９年）と称するキレート化剤であり、２２５Ａｃなど、放射性核種の有効なキレート化剤である。
【誤訳訂正８】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３５】
所与の標的として用いうる小分子の純粋に例示的な別の例は、［４＋２］ディールス−アルダー反応の遷移状態類似体として関心が見出されている、ノルボルネンハプテンなどのハプテンである（例えば、Ｘｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９９年、２８６巻、２３４５〜２３４８；またはＨｉｌｖｅｒｔら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９８９年、１１１巻、９２６１〜９２６２頁を参照されたい）。それに対しては、免疫反応（これは、抗体の生成を意味する）もまた発生しうる、すべての可能な小分子に対してアフィニティーを有するムテインの生成に対する本発明の適性を示すため、実施例１６では、このようなハプテンを用いた。したがって、ここでもまた、所与の標的が任意のハプテンでありうることが注目される。
【誤訳訂正９】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００５６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００５６】
一般に、本明細書に記載のｈＮＧＡＬムテインを、化学反応、物理反応、光学反応、または酵素反応において検出可能な化合物またはシグナルを直接的または間接的に発生させる、任意の適切な化学物質または酵素により標識することが可能である。物理反応であり、また、同時に光学反応／マーカーでもある例は、照射時における蛍光の発光である。アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、またはβ−ガラクトシダーゼが、発色反応生成物の形成を触媒する酵素標識（また、同時に、光学標識）の例である。一般に、抗体に対して広く用いられるすべての標識（もっぱら、免疫グロブリンのＦｃ部分における糖部分と共に用いられる標識を除く）もまた、本発明のムテインに対するコンジュゲーションに用いることができる。本発明のムテインはまた、例えば、所与の細胞、組織、もしくは内臓に対する治療的に活性な薬剤の標的送達に適するか、または、細胞の選択的ターゲティング、例えば、周囲の正常細胞に影響を与えることのない、腫瘍細胞の選択的ターゲティングに適する、任意のこのような薬剤ともコンジュゲートさせることができる。このような治療的に活性な薬剤の例には、放射性核種、毒素、有機小分子、および治療用ペプチド（細胞表面受容体のアゴニスト／アンタゴニストとして作用するペプチド、または所与の細胞標的上におけるタンパク質結合部位について競合するペプチドなど）が含まれる。適切な毒素の例には、百日咳毒素、ジフテリア毒素、リシン、サポリン、シュードモナス属外毒素、カリチアマイシンもしくはその誘導体、タキソイド、メイタンシノイド、ツブリシン、またはドラスタチン類似体が含まれるがこれらに限定されない。ドラスタチン類似体は、アウリスタチンＥ、モノメチルアウリスタチンＥ、アウリスタチンＰＹＥ、およびアウリスタチンＰＨＥでありうる。細胞増殖抑制剤の例には、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、５−フルオロウラシル、タキソテール（ドセタキセル）、パクリタキセル、アントラサイクリン（ドキソルビシン）、メトトレキサート、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、ダカルバジン、シクロホスファミド、エトポシド、アドリアマイシン、カンプトテシン、コンブレタスタチンＡ−４類縁化合物、スルホンアミド、オキサジアゾリン、ベンゾ［ｂ］チオフェン、合成スピロケタールピラン、モノテトラヒドロフラン化合物、キュラシンおよびキュラシン誘導体、メトキシエストラジオール誘導体、およびレウコボリンが含まれるが、これらに限定されない。本発明のリポカリンムテインはまた、アンチセンスの核酸分子、小分子干渉ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、またはリボザイムなど、治療的に活性な核酸ともコンジュゲートさせることができる。このようなコンジュゲートは、当技術分野でよく知られる方法により産生することができる。
【誤訳訂正１０】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１０３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１０３】
本発明の具体的な実施形態において、リガンドは、金属キレート化剤など、有機小分子でありうる。
【誤訳訂正１１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１４９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１４９】
【図１】ｈＮＧＡＬについてデザインされるランダムライブラリーの概略表示と併せて、エンテロバクチンと複合体化されたｈＮＧＡＬの３次元構造を示す図である。
【図２】Ｍｅ・ＤＴＰＡ結合活性を有するｈＮＧＡＬ変異体の特性を示す図である。
【図３】Ｍｅ・ＤＴＰＡ結合活性を有するｈＮＧＡＬ変異体の結晶構造を示す図である。
【図４】放射免疫療法またはｉｎ  ｖｉｖｏイメージングのプレターゲティングに、Ｍｅ・ＤＴＰＡ結合活性を有するｈＮＧＡＬ変異体を適用する可能性を示す図である。
【図１Ａ】エンテロバクチンと複合体化されたヒトｈＮＧＡＬ（ＰＤＢエントリー：１Ｌ６Ｍ、鎖Ａ、完全リガンドを含有する；Ｒｏｌａｎｄ  Ｓｔｒｏｎｇ博士のご厚意による）の３次元構造を示す図である。ポリペプチド骨格をライトグレーのリボンとして示す一方、天然リガンドを黒色で示す。初期「天然」ライブラリーにおいてランダム化された側鎖は、グレーで示す。
【図１Ｂ】１２のアミノ酸位置３３、３６、４１、５２、５４、６８、７０、７９、８１、１３４、１３６、および１３８に対し、同時的なランダム突然変異誘発を行うためのアセンブリーＰＣＲ戦略の概略表示を示す図である。フラグメント（ａ）をもたらす縮重オリゴデオキシヌクレオチドＰ１およびＰ２、また、フラグメント（ｂ）をもたらす縮重プライマーＰ３およびＰ４と共に、ＮＧＡＬの構造遺伝子を、ＰＣＲにおける鋳型として用いた。ランダム化された位置を、明色のバーで示す。両方のフラグメントを単離し、組み合わせて、ＰＣＲプライマーＰ５およびＰ６により実施される次回の増幅において適用した。２つの異なるＢｓｔＸＩ制限部位を、ファージディスプレイのためのプラスミドベクターであるｐＮＧＡＬ３５上において遺伝子カセットをサブクローニングするのに用いた。
【図２】Ｍｅ・ＤＴＰＡ結合活性を有するｈＮＧＡＬ変異体の特性を示す図である。
【図２Ａ】ＳｔｒｅｐタグＩＩによるアフィニティー精製およびゲル濾過後における、組換えによる野生型ｈＮＧＡＬ（レーン１、４）、および変異体Ｔｂ７．Ｎ９（レーン２、５）のほか、Ｃ２６（レーン３、６）に対するＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を示す図である。レーン１〜３は、２−メルカプトエタノールにより還元された試料を示す。非還元性条件下において、電気泳動の運動性がわずかながら増強されたことは、各場合において一重のジスルフィド結合が適正に形成されていることを示す。
【図２Ｂ】ＥＬＩＳＡにおける結合活性を示す図である。ＳｔｒｅｐタグＩＩに対して特異的な抗体により捕捉された精製ｈＮＧＡＬ変異体によりマイクロ滴定プレートをコーティングし、Ｙ・ＤＴＰＡ−ＤＩＧ（小分子）コンジュゲートの希釈系列と共にインキュベートした後で、抗ＤＩＧ  Ｆａｂ／ＡＰおよびｐＮＰＰ基質により検出した（シグナル強度は、ｍＯＤ／分単位で与えられる）。このアッセイにおいて、組換えによる野生型ｈＮＧＡＬが示したシグナルは、無視できるものであった（図示しない）。最後の成熟ステップに由来するｈＮＧＡＬ変異体であるＣ２６（挿入図を参照されたい）は、著明な低密度（２．５対１０μｇ／ｍｌの捕捉抗体濃度による、１００対２５０ｎＭ）で固定化したことに留意されたい。
【図２Ｃ】競合ＥＬＩＳＡにおけるｈＮＧＡＬ変異体Ｃ２６の金属キレート結合活性を示す図である。このＥＬＩＳＡのセットアップは、パネル（Ｂ）で示したセットアップと同様であったが、可変濃度の遊離Ｍｅ・Ｂｎ−ＣＨＸ−Ａ’’−ＤＴＰＡ−トリスキレート錯体、または（比較としての）Ｆｅ3+・エンテロバクチンの存在下におけるトレーサーとして、固定濃度のＹ・ＤＴＰＡ−ＲＮアーゼ−ＤＩＧ（タンパク質）コンジュゲートを用いた。
【図２Ｄ】Ｂｉａｃｏｒｅ測定器上で測定された、ｈＮＧＡＬ変異体Ｃ２６についての、リアルタイムにおける反応速度解析を示す図である。アミン化学反応により、Ｙ・ＤＴＰＡ−ＲＮアーゼコンジュゲートを、ＣＭ５センサーチップに結合させ（ΔＲＵ＝２４０）、様々な濃度で、精製されたｈＮＧＡＬ変異体Ｃ２６を適用した。各場合において、測定されたシグナルをグレーの線で示す一方、曲線近似は黒色の線で示す。この曲線セットから決定される反応速度定数を、表３に列挙する（実施例１３）。
【図２Ｅ】流速２５μｌ／分のＢｉａｃｏｒｅ測定器上で測定された、ｈＮＧＡＬ変異体ＣＬ３１についての、リアルタイムにおける反応速度解析を示す図である。アミン化学反応により、Ｙ・ＤＴＰＡ−ＲＮアーゼコンジュゲートを、ＣＭ５センサーチップに結合させ（ΔＲＵ＝３００）、表示される様々な濃度で、精製されたｈＮＧＡＬ変異体ＣＬ３１を適用した。各場合において、測定されたシグナルをグレーの線で示す一方、曲線近似は黒色の線で示す。
【図３】ポリペプチド骨格を有する、Ｙ・ＤＴＰＡ−トリスキレートと複合体化させたｈＮＧＡＬ変異体Ｔｂ７．Ｎ９の結晶構造を、ライトグレーのリボンとして示す一方、結合したＹ3+・ＤＴＰＡリガンドは、２Ｆo−Ｆc電子密度（配位子であるＤＴＰＡ、およびＹ3+に配位する１つの水分子の周囲の１σ軌道、ならびにＹ3+イオンの周囲の４σ軌道を輪郭とする）を含めた黒色のスティックによるモデルとして示す。結合した金属キレート錯体との接触距離である半径４Å以内に、８本のβストランド各々において少なくとも１つずつの、全体で１５の残基：Ｇｌｎ３３、Ａｒｇ３６、Ｔｈｒ５２、Ｇｌｎ５４、Ｖａｌ６６、Ａｌａ６８、Ａｒｇ７０、Ａｓｐ７７、Ｔｙｒ７８（骨格を介してだけ）、Ｌｅｕ７９、Ｍｅｔ８１、Ｐｈｅ８３、Ｔｙｒ１０６、Ｐｈｅ１２３、およびＴｈｒ１３６が見出されている。これらの残基の側鎖は、残基Ｓｅｒ１３４、および金属に結合する水への架橋を形成する、水素結合した水分子と共に、グレーのスティックとして示す。
【図４】放射免疫療法またはｉｎ  ｖｉｖｏイメージングのプレターゲティングに、Ｍｅ・ＤＴＰＡ結合活性を有するｈＮＧＡＬ変異体を適用する可能性を示す図である。図４（Ａ）は、（ｉ）本発明による、Ｍｅ・ＤＴＰＡ結合活性を有するＮＧＡＬムテイン（黒色）、および（ｉｉ）腫瘍標的に対する特異性を有する、抗体／フラグメント、または代替的な結合タンパク質（例えば、別のリポカリンムテイン）を含む、二特異性融合タンパク質またはコンジュゲートが、血流に適用されることを示す。図４（Ｂ）は、融合タンパク質が腫瘍において蓄積される一方で、結合しなかった融合タンパク質は腎臓を経て消失することを示す。図４（Ｃ）：放射性核種−ＤＴＰＡ複合体を血流に適用することを示す図である。図４（Ｄ）：放射性核種−ＤＴＰＡ複合体に、腫瘍に結合した融合タンパク質が結合する一方で、過剰な複合体は腎臓により迅速に排出されることを示す図である。図４（Ｅ）：結合した放射性核種の局所的な崩壊により、腫瘍内における効果的な細胞死がもたらされ、また、バイスタンダー効果も活用されることを示す図である。図４（Ｄ*）：Ｍｅ・ＤＴＰＡ複合体の２価形を適用することにより、アビディティー効果を介して腫瘍部位においてより堅固な結合がもたらされ、これにより、放射性核種の半減期の延長が可能となることを示す図である。
【誤訳訂正１２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１６０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１６０】
ある程度のアフィニティー成熟ステップを行うため、突然変異誘発させたｈＮＧＡＬライブラリーをコロニースクリーンに直接適用したが、Ｔｂ／Ｙ・ＤＴＰＡ−ＲＮアーゼ−ＤＩＧコンジュゲートの濃度を、５０ｎＭから５ｎＭに低下させることにより、厳密性を上昇させる条件下において行った。厳密性をさらに上昇させるため、２０ｎＭ〜１ｎＭの濃度において、厳密に１価のＴｂ／Ｙ・ＤＴＰＡ−ＤＩＧ小分子コンジュゲートを適用した。最後に、第２の膜を、まず、１０ｎＭ  Ｙ・ＤＴＰＡ−ＤＩＧと共に１時間にわたり、また、次いで、ＰＢＳ／Ｔによる３回にわたる洗浄後において、１０μＭの遊離錯体であるＹ・ｐ−ＮＨ2−Ｂｎ−ＣＨＸ−Ａ’’−ＤＴＰＡと共にインキュベートした後、上記の通り、洗浄、検出、および染色することにより、競合コロニースクリーンを実施した。
【誤訳訂正１３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１７８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１７８】
この戦略であれば、リガンドとしての昆虫リポカリンおよび有機分子について既に示された（Ｂｅｓｔｅら、前出；Ｓｃｈｌｅｈｕｂｅｒら、前出）のと同様に、リガンドポケットを効果的に再整形して、より小分子のＤＴＰＡ金属キレート錯体(smaller DTPA metal chelate complex)に対する新たな特異性を達成すると予測できるだろう。
【誤訳訂正１４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１９１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１９１】
Ｔｂ3+およびＹ3+のほか、他の３価金属イオンも用いて、遊離リガンド競合物質としてのＴｂ・ＤＴＰＡ−ＲＮアーゼおよびＭｅ・ｐ−ＮＨ2−Ｂｎ−ＣＨＸ−Ａ’’−ＤＴＰＡによりコーティングしたマイクロ滴定プレートを用いる競合ＥＬＩＳＡにおいて、小分子の可溶性キレートリガンド(small soluble chelate ligand)に対するｈＮＧＡＬ変異体の結合活性をさらに調べた。これらの測定は、Ｔｂ3+／Ｙ3+により帯電させたキレート複合体、とりわけ、アフィニティー成熟から得られる変異体Ｔｂ７．Ｎ９、Ｙｄ５、およびＣ２６の場合に、良好な阻害曲線を示した。これに対し、固定化されたリガンドに対するＴｂ７の結合活性は、適正な競合効果をもたらすにはおそらく低度に過ぎた。最後の変異体であるＣ２６は、異なる金属イオンを用いてより完全に解析された（図２Ｃ）。遊離金属キレートの５０％最大濃度から推定されるそのＫD値は、２．７±０．０３ｎＭ（Ｙ3+）、３．６±０．２４ｎＭ（Ｇｄ3+）、２．９±０．１７ｎＭ（Ｔｂ3+）、９．４±０．３３ｎＭ（Ｌｕ3+）、４４．７±２．５ｎＭ（Ｉｎ3+）、および９５±７ｎＭ（Ｂｉ3+）であった。したがって、操作されたｈＮＧＡＬ変異体、とりわけＣ２６が、小分子の金属キレートリガンドに対して強力な結合活性を示すのに対し、選択時におけるキャリアータンパク質として用いられたＲＮアーゼの関連は、さほどの役割を果たさない。
【誤訳訂正１５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１９６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１９６】
予測されるキラリティーを示す電子密度により良好に定義される（ＢｒｅｃｈｂｉｅｌおよびＧａｎｓｏｗ（１９９２年）、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ、１巻、１１７３〜１１７８頁）、配位子のＤＴＰＡ部分は、Ｉｎ3+・ＤＴＰＡ錯体の小分子結晶構造において既に見られている（Ｍａｅｃｋｅら（１９８９年）、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．、３０巻、１２３５〜１２３９頁）のと同様に、金属イオンが、捕捉された野球ボールを表す、野球グラブとして説明することができる。Ｙ3+イオンには、９つの原子が配位している。それらのうちの８つが、８座のキレート化配位子に由来し、５つがそのカルボン酸酸素（距離２．３〜２．５Å）に由来し、３つがそのアミン窒素（距離２．５〜２．７Å）に由来するのに対し、１つは、結合水の酸素（距離約２．７Å）である。天然のｈＮＧＡＬエンテロバクチン複合体の場合と同様、金属イオンとタンパク質側鎖との間には、直接の配位的接触が存在するわけではない。該ＤＴＰＡ誘導体のベンジル側鎖から突出するチオ尿素基と、コンジュゲートしたトリス部分とは、リポカリンの裂け目の外側に配向する。チオ尿素基の原子Ｎ４と、Ａｓｐ７７の２つのカルボン酸酸素との間には、２つの水素結合が存在する（ＯＤ１：距離３．４Å；ＯＤ２：距離２．９Å）。末端のトリスヒドロキシメチル基は、電子密度において部分的に定義されるに過ぎない（図３）。