【手続補正書】
【提出日】平成24年3月26日(2012.3.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト心血管前駆細胞の単離された集団であって、前記前駆細胞はＫＤＲを発現するがＣ−ＫＩＴを発現しないヒト心血管前駆細胞の集団。
【請求項２】
前記前駆細胞が、心筋細胞、内皮細胞、及び血管平滑筋細胞の前駆細胞である、請求項１に記載のヒト心血管前駆細胞の単離された集団。
【請求項３】
ヒト胚様体をアクチビン及びＢＭＰの存在下で無血清培地中において培養する工程と、その後に前記培養にＷｎｔの阻害剤を加える工程とによって得られる、請求項１に記載のヒト心血管前駆細胞の単離された集団。
【請求項４】
前記アクチビンが、アクチビンＡである請求項３に記載のヒト心血管前駆細胞の単離された集団。
【請求項５】
前記ＢＭＰが、ＢＭＰ４である請求項３に記載のヒト心血管前駆細胞の単離された集団。
【請求項６】
前記Ｗｎｔの阻害剤が、ＤＫＫ−１である請求項３に記載のヒト心血管前駆細胞の単離された集団。
【請求項７】
ヒト心血管前駆細胞を産生するための方法であって、
（ａ）ヒト胚様体をアクチビン及びＢＭＰの存在下で無血清培地中において培養する工程、及び
（ｂ）前記培地へＷｎｔの阻害剤を加え、ヒト心血管前駆細胞の集団を提供するために培養する工程を含む方法。
【請求項８】
（ｃ）収集した細胞集団を提供するために前記ヒト心血管前駆細胞を培養から収集する工程をさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
（ｄ）前記収集した細胞集団を心血管前駆細胞に濃縮する工程をさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記アクチビンが、アクチビンＡである請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＢＭＰが、ＢＭＰ４である請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
前記Ｗｎｔの阻害剤が、ＤＫＫ１である請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
前記工程（ａ）が、ｂＦＧＦの存在をさらに含む請求項７に記載の方法。
【請求項１４】
前記工程（ｂ）が、ＶＥＧＦを加える工程をさらに含む請求項７に記載の方法。
【請求項１５】
ヒト心血管前駆細胞を産生するための方法であって、
（ａ）ヒト胚様体を約１〜４日間にわたりアクチビンＡ及びＢＭＰ４の存在下で無血清培地中において培養する工程、
（ｂ）ＤＫＫ１を前記無血清培地へ加え、約１〜２日間にわたり培養する工程、及び、
（ｃ）ヒト心血管前駆細胞の集団を収集する工程を含む方法。
【請求項１６】
前記工程（ａ）が、ｂＦＧＦの存在をさらに含む請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記工程（ｂ）が、ＶＥＧＦを加える工程をさらに含む請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記アクチビンＡの濃度が、約０．５ｎｇ／ｍｌ〜約３０ｎｇ／ｍｌである請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＢＭＰ４の濃度が、約１．０ｎｇ／ｍｌ〜約２０ｎｇ／ｍｌである請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
ｂＦＧＦの濃度が、約１．０ｎｇ／ｍｌ〜約１０ｎｇ／ｍｌである請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＤＫＫ１の濃度が、約１００ｎｇ／ｍｌ〜約２００ｎｇ／ｍｌである請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＶＥＧＦの濃度が、約１．０ｎｇ／ｍｌ〜約５０．０ｎｇ／ｍｌである請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
ヒト心血管前駆細胞を産生するための方法であって、
（ａ）ヒト胚様体を約４日間にわたり約３．０ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ、約１０．０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４及び約５．０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦの存在下にて無血清培地中で培養する工程、及び
（ｂ）約１５０ｎｇ／ｍｌのＤＫＫ１及び約１０．０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦを無血清培地へ加え、心血管前駆細胞を生成するために約１〜２日間にわたり培養する工程を含む方法。
【請求項２４】
（ｃ）ＫＤＲを発現するがＣ−ＫＩＴを発現しない細胞を選別する工程をさらに含む請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記選別が、免疫選択による請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記選別が、フローサイトメトリーによる請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
ヒト心筋細胞の集団を発生する方法であって、ＫＤＲを発現するがＣ−ＫＩＴを発現しないヒト心血管前駆細胞の集団を約７〜約１０日間にわたりＷｎｔの阻害剤の存在下で培養する工程と、ヒト心筋細胞の集団を収集する工程とを含む方法。
【請求項２８】
前記ヒト心血管前駆細胞をＶＥＧＦ及びＷｎｔの阻害剤の存在下で培養する工程を含む請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記Ｗｎｔの阻害剤が、ＤＫＫ１である請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＶＥＧＦの濃度が、約１．０ｎｇ／ｍｌ〜約５０．０ｎｇ／ｍｌである請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
ＤＫＫ２の濃度が、約１００ｎｇ／ｍｌ〜約２００ｎｇ／ｍｌである請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
前記ヒト心血管前駆細胞が、単層として培養される請求項２７に記載の方法。
【請求項３３】
前記ヒト心血管前駆細胞が、凝集体として培養される請求項２７に記載の方法。
【請求項３４】
心筋細胞、内皮細胞及び血管平滑筋細胞を含有する心血管コロニーを発生する方法であって、ヒト心血管前駆細胞を約３〜約７日間にわたりＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、及びＷｎｔの阻害剤の存在下で培養する工程を含む方法。
【請求項３５】
前記Ｗｎｔの阻害剤が、ＤＫＫ１である請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記ＤＫＫ１の濃度が、約１００ｎｇ／ｍｌ〜約２００ｎｇ／ｍｌである請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記ＶＥＧＦの濃度が、約１．０ｎｇ／ｍｌ〜約５０．０ｎｇ／ｍｌである請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
前記ｂＦＧＦの濃度が、約１．０ｎｇ／ｍｌ〜約１０．０ｎｇ／ｍｌである請求項３４に記載の方法。
【請求項３９】
ヒト心血管前駆細胞の単離された集団を含む組成物。
【請求項４０】
請求項３４の方法によって産出されたヒト心血管コロニーの集団を含む組成物。
【請求項４１】
心筋細胞を置換する方法であって、当該置換を必要とする被験者に請求項２７に記載の方法によって産生されたヒト心筋細胞を含む組成物を投与する工程を含む方法。
【請求項４２】
心機能不全を特徴とする障害を治療する方法であって、前記治療を必要とする被験者にヒト心血管前駆細胞を含む組成物を投与する工程を含む方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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