(57)【要約】【課題】効率的で安価に天然型のＲ−メバロン酸を提供すること。【解決手段】メバロン酸を製造するに際して、メバロン酸経路を有しない放線菌に対して、アセトアセチルＣｏＡ合成酵素遺伝子、３−ハイドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡ合成酵素遺伝子及び３−ハイドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡ還元酵素遺伝子の３種類をコードするＤＮＡを形質転換し、該放線菌の細胞中にアセトアセチルＣｏＡ合成酵素、３−ハイドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡ合成酵素及び３−ハイドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡ還元酵素の３種類の酵素蛋白質を生成させ、これら３種類の酵素蛋白質の機能によりメバロン酸を生成、蓄積させることを特徴とする新規なメバロン酸の製造方法。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
メバロン酸を製造するに際して、メバロン酸経路を有しない放線菌に対して、アセトアセチルＣｏＡ合成酵素遺伝子、３−ハイドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡ合成酵素遺伝子及び３−ハイドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡ還元酵素遺伝子の３種類をコードするＤＮＡを形質転換し、該放線菌の細胞中にアセトアセチルＣｏＡ合成酵素、３−ハイドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡ合成酵素及び３−ハイドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡ還元酵素の３種類の酵素蛋白質を生成させ、これら３種類の酵素蛋白質の機能によりメバロン酸を生成、蓄積させることを特徴とする新規なメバロン酸の製造方法。
【請求項２】
上記アセトアセチルＣｏＡ合成酵素遺伝子が、放線菌由来のアセトアセチルＣｏＡ合成酵素遺伝子である請求項１記載の新規なメバロン酸の製造方法。
【請求項３】
放線菌由来の上記アセトアセチルＣｏＡ合成酵素遺伝子が、ストレプトマイセス  ｓｐ．  ＣＬ１９０株由来のアセトアセチルＣｏＡ合成酵素遺伝子である請求項２記載の新規なメバロン酸の製造方法。
【請求項４】
上記３−ハイドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡ合成酵素遺伝子が、放線菌由来の３−ハイドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡ合成酵素遺伝子である請求項１記載の新規なメバロン酸の製造方法。
【請求項５】
放線菌由来の上記３−ハイドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡ合成酵素遺伝子が、ストレプトマイセス  ｓｐ．  ＣＬ１９０株由来の３−ハイドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡ合成酵素遺伝子である請求項４記載の新規なメバロン酸の製造方法。
【請求項６】
上記３−ハイドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡ還元酵素遺伝子が、放線菌由来の３−ハイドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡ還元酵素遺伝子である請求項１記載の新規なメバロン酸の製造方法。
【請求項７】
放線菌由来の上記３−ハイドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡ還元酵素遺伝子が、ストレプトマイセス  ｓｐ．  ＣＬ１９０株由来の３−ハイドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡ還元酵素遺伝子である請求項６記載の新規なメバロン酸の製造方法。
【請求項８】
上記放線菌が、ストレプトマイセス  リビダンスである請求項１記載の新規なメバロン酸の製造方法。
【請求項９】
上記放線菌に対して、アセトアセチルＣｏＡ合成酵素遺伝子、３−ハイドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡ合成酵素遺伝子及び３−ハイドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡ還元酵素遺伝子の３種類をコードするＤＮＡを形質転換する際に、プラスミドベクターを用いる請求項１記載の新規なメバロン酸の製造方法。
【請求項１０】
上記プラスミドベクターが、大腸菌とのシャトルベクターである請求項９記載の新規なメバロン酸の製造方法。
【請求項１１】
配列番号１の塩基配列、
配列番号１の塩基配列において１〜数個の塩基配列が欠失、置換、付加及び／又は挿入されている塩基配列であって、アセトアセチルＣｏＡ合成酵素を機能させるために必要な配列をすべてコードする塩基配列、又は
配列番号１の塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズすることができる塩基配列であって、アセトアセチルＣｏＡ合成酵素を機能させるのに必要な配列をすべてコードする塩基配列、
からなるポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規な天然型のメバロン酸の製造方法に関する。本発明のメバロン酸の製造方法により得られるメバロン酸は、主に医薬・化粧品・食品分野等、メバロン酸の生理活性が活用される分野で有用であり、また、メバロン酸を利用した各種有用化合物の合成に用いられる中間体としても有用である。
【０００２】
【従来の技術】
メバロン酸は、重要な生理活性物質群であり多くの生命維持に必須のテルペノイドと呼ばれる物質群の生合成中間体である天然型のＲ−メバロン酸と、非天然型であるＳ−メバロン酸とが知られている。多くの場合、発酵法では天然型が得られ、化学合成方法では天然型及び非天然型の等量混合物であるラセミ体が得られる。また、メバロン酸は、無水状態では容易に脱水して分子内エステル化（ラクトン化）してメバロノラクトンとなるが、水溶液ないしアルカリ水溶液中で容易に水と反応してメバロン酸ないしメバロン酸塩となる。
【０００３】
メバロン酸の発酵生産方法としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ  ｆｉｂｕｌｉｇｅｒａを用いる方法（特許文献１参照）、培地成分としてカゼイン由来のペプトン及びコーン  スティープ  リカーを用いる方法（特許文献２参照）、ＭＬ−２３６Ｂに耐性を有するＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ  ｆｉｂｕｌｉｇｅｒａを用いる方法（特許文献３参照）等が知られている。しかし、これらの方法で用いられる菌株は、すべてメバロン酸経路を生命維持に利用している生物であることが既に知られており、これらの微生物自身がこの経路により下記の有用物質（テルペノイド）等を生合成する必要があることから、人為的にメバロン酸経路をメバロン酸合成のためだけに働かせることは事実上不可能である。
【０００４】
テルペノイドは、炭素数５のイソプレン単位を基本骨格に持つ一群の有機化合物の総称であり、イソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）の重合によって生合成される。（Ｃ５Ｈ８）ｎの不飽和炭化水素以外に、それらの酸化還元生成物（アルコール、ケトン、酸等）、炭素の脱離した化合物等が、多くの植物及び動物体内に見出されている。テルペノイドは、炭素数により、ヘミテルペン（Ｃ５）、モノテルペン（Ｃ１０）、セスキテルペン（Ｃ１５）、ジテルペン（Ｃ２０）、セスタテルペン（Ｃ２５）、トリテルペン（Ｃ３０）、テトラテルペン（Ｃ４０、カロチノイド）及びその他のポリテルペンに分類することができる。アブシジン酸、幼若ホルモン、ジベレリン、フォルスコリン、ホルボール等、生理活性を示す化合物も多い。また、構造の一部にイソプレン構造を有する複合テルペンとして、クロロフィル、ビタミンＫ、ユビキノン、ｔＲＮＡ等があり、これらも有用な生理活性を示す。
【０００５】
例えば、テルペノイド化合物の一種であるユビキノンは、電子伝達系の必須成分として、生体内で重要な機能を果たしており、心疾患に効果のある医薬品として使用されているほか、欧米では健康食品としての需要が増大している。また、ビタミンＫは、血液凝固系に関与する重要なビタミンであり、止血剤として利用されているほか、最近では骨代謝への関与が示唆され、骨粗鬆症治療への応用が期待されており、フィロキノンとメナキノンは医薬品として許可されている。また、ユビキノンやビタミンＫ類には、船体や橋脚等の建造物への貝類の付着阻害作用が在り、貝類付着防止塗料への応用が期待される。さらに、カロチノイドには抗酸化作用があり、β−カロチン、アスタキサンチン、クリプトキサンチン等、がん予防や免疫賦活活性を有するものとして期待されているものもある。このように、テルペノイドには生体等にとって有用な物質が含まれているが、これらの化合物は全て基本骨格単位であるイソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）を経由して生合成されることが知られている。
【０００６】
テルペノイド化合物の基本骨格であるＩＰＰは、動物や酵母等の真核生物ではアセチルＣｏＡからメバロン酸を経由して生合成されることが証明されている。
最近の研究から、生物には、テルペノイド生合成のために、全く異なる２種類の経路が存在することが明らかとなった。即ち、メバロン酸経路及び非メバロン酸経路である。
【０００７】
メバロン酸経路は、既に説明したように動物や酵母等の真核生物に存在し、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡ（以下、ＨＭＧ  ＣｏＡと略記することがある）還元酵素が律速酵素であると考えられている（非特許文献１参照）。この観点から、酵母において、ＨＭＧ  ＣｏＡ還元酵素を高発現させて細胞内のメバロン酸レベルを上げることにより、カロチノイドの生産性を向上させる試みがなされている（非特許文献２参照）。
【０００８】
大腸菌等の多くの原核生物では、別の経路、即ちピルビン酸とグリセルアルデヒド−３−リン酸とが縮合して生じる１−デオキシ−Ｄ−キシルロース  ５−リン酸を経由してＩＰＰが生合成される非メバロン酸経路が発見されており（非特許文献３参照）、１３Ｃラベル化基質を使った実験から、１−デオキシ−Ｄ−エリスリトール  ４−リン酸を経由してＩＰＰへと転換されることが証明されている（非特許文献４及び５参照）。特に大腸菌では、ＩＰＰは非メバロン酸経路でのみ合成されることが実証されている（非特許文献６）。
【０００９】
一方、放線菌Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．  ＣＬ１９０株（非特許文献７参照）は、メバロン酸経由でＩＰＰを合成していることが分っており（非特許文献８及び９参照）、本発明者等は、これまでに放線菌Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．  ＣＬ１９０株からメバロン酸経路上の一つの反応を触媒する酵素であるＨＭＧ  ＣｏＡ還元酵素をコードする遺伝子（ｈｍｇｒ）（非特許文献１０参照）、及びメバロン酸経路に関与する全ての酵素、即ちホスホメバロン酸キナーゼ、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ、メバロン酸キナーゼ、イソペンテニル  ２−リン酸イソメラーゼ、ＨＭＧ  ＣｏＡ還元酵素、ＨＭＧ  ＣｏＡ合成酵素、全てを含む遺伝子クラスターを、既にクローニングした（特許文献４、非特許文献１１及び非特許文献１２参照）。
【００１０】
原核生物の菌体内や培養液中に天然型のＲ−メバロン酸が蓄積するという知見は、これまで報告がない。この理由は、多くの原核生物がＲ−メバロン酸の生合成酵素系を持たないためと考えられる。
【００１１】
このように、メバロン酸の発酵生産に関して、真核生物を利用して天然型のＲ−メバロン酸を生産することは従来から可能である。しかし、Ｒ−メバロン酸の生産の際には、Ｒ−メバロン酸を真核生物の細胞内又は細胞外に蓄積させる必要があるが、一方で、真核生物においては、メバロン酸は生命維持に必要なテルペノイドの供給のために生合成され、テルペノイドへと変換されてしまう。即ち、蓄積と消費との綱引きとなるため、酵母等の真核生物を利用したＲ−メバロン酸の大量生産は、かなり困難な状況である。
【００１２】
さらに、メバロン酸合成酵素であるＨＭＧ  ＣｏＡ  還元酵素活性は、リン酸化、脱リン酸化等（活性化又は不活性化）による酵素活性調節やＨＭＧ  ＣｏＡ  還元酵素の生合成の雛型であるｍＲＮＡ量の調節、生合成下流に位置する各種テルペノイドからの多価フィードバック調節等が複雑に関与することが知られており、単に真核生物のＨＭＧ  ＣｏＡ  還元酵素活性を上げる手法によって天然型のＲ−メバロン酸の生産性を上げることは困難であった。
【００１３】
また、大腸菌を宿主として利用してＩＰＰを生産する可能性についての報告（非特許文献１３参照）もあり、ＩＰＰの生産が可能であれば、その下流のメバロン酸も生産可能であると類推できるが、実際には、大腸菌を宿主とした場合、その理由は不明であるが、メバロン酸は生産されない。
【００１４】
【特許文献１】
特開昭６３−２１６４８７号公報
【特許文献２】
特開平２−２１５３８９号公報
【特許文献３】
特開平３−２１０１７４号公報
【特許文献４】
特開２００１−１６１３７０号公報
【特許文献５】
特願２００２−３５７２１４号公報
【非特許文献１】
Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｅｌｌ，  ５，  ６５５  （１９９４）
【非特許文献２】
三沢ら、カロチノイド研究談話会講演要旨集  （１９９７）
【非特許文献３】
Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ，  ２９５，  ５１７  （１９９３）
【非特許文献４】
Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．  ３８，  ４７６９  （１９９７）
【非特許文献５】
Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．  ３９，  ４５０９  （１９９８）
【非特許文献６】
Ｒｏｈｍｅｒ，  Ｍ．  Ｉｎ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  Ｖｏｌ．  ２：  Ｉｓｏｐｒｅｎｏｉｄｓ  Ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  Ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｓ  ａｎｄ  Ｓｔｅｒｏｉｄｓ；  Ｂａｒｔｏｎ，  Ｄ．  Ｎａｋａｎｉｓｈｉ，  Ｋ．  Ｅｄｓ．  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ：  Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，  １９９９；  ｐｐ．  ４５−６７
【非特許文献７】
Ｊ．  Ａｎｔｉｂｉｏｔ．  ４３：  ４４４  （１９９０）
【非特許文献８】
Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．  ３１：  ６０２５  （１９９０）
【非特許文献９】
Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．  ３７：  ７９７９  （１９９６）
【非特許文献１０】
Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １８１：  １２５６  （１９９９）
【非特許文献１１】
Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １８２：  ４１５３  （２０００）
【非特許文献１２】
Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ＵＳＡ，  ９８：  ９３２  （２００１）
【非特許文献１３】
バイオサイエンスとインダストリー、５７（７）、４５５−４５８  （２００１）
【００１５】
【発明が解決しようとする課題】
既に、本出願人は、メバロン酸を製造するに際して、メバロン酸経路を有しない放線菌に対して、３−ハイドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡ合成酵素遺伝子及び３−ハイドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡ還元酵素遺伝子の２種類を形質転換し、該放線菌の細胞中に３−ハイドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡ合成酵素蛋白質及び３−ハイドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡ還元酵素蛋白質を生成させ、３−ハイドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡ合成酵素蛋白質及び３−ハイドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡ還元酵素蛋白質の機能によりメバロン酸を生成、蓄積させることを特徴とする新規なメバロン酸の製造方法を提供している（特願２００２−３５７２１４号）。この方法によるメバロン酸の生産性は、０．０２８〜０．０５５ｍｇ／ｍｌ程度であった。
【００１６】
従って、本発明の目的は、効率的で安価に天然型のＲ−メバロン酸を提供することにある。
【００１７】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、前述したように複雑に代謝調節を受けている真核生物であるカビや酵母のメバロン酸経路を利用して天然型のＲ−メバロン酸を生産させるよりも、むしろ生命維持に天然型のＲ−メバロン酸を必要としない原核生物に生産させることにより、天然型Ｒ−メバロン酸を効率的で安価に提供できる可能性があることに着眼した。また、前述した２種の酵素遺伝子（ＨＭＧ  ＣｏＡ合成酵素遺伝子及びＨＭＧ  ＣｏＡ還元酵素遺伝子）に加えて、アセトアセチルＣｏＡ合成酵素遺伝子を形質転換すること、即ちＨＭＧ  ＣｏＡ  合成酵素の基質であるアセトアセチルＣｏＡの供給能を上げることに着目し、検討を重ねた。その結果、宿主として、メバロン酸経路を有しない放線菌に対して、アセトアセチルＣｏＡ合成酵素遺伝子、ＨＭＧ  ＣｏＡ合成酵素遺伝子及びＨＭＧ  ＣｏＡ還元酵素遺伝子の３種類を形質転換することにより、効率的に天然型のＲ−メバロン酸を生産し得ることを見出し、本発明に至った。
【００１８】
つまり、本発明においては、メバロン酸経路を有しない放線菌に対して、アセトアセチルＣｏＡ合成酵素遺伝子、ＨＭＧ  ＣｏＡ合成酵素遺伝子及びＨＭＧ  ＣｏＡ還元酵素遺伝子の３種類を形質転換し、アセトアセチルＣｏＡ合成酵素蛋白質、ＨＭＧ  ＣｏＡ合成酵素蛋白質及びＨＭＧ  ＣｏＡ還元酵素蛋白質の３種類の酵素蛋白質の機能によりメバロン酸を生成、蓄積させることにより、天然型のＲ−メバロン酸を製造する。
【００１９】
即ち、本発明は、メバロン酸を製造するに際して、メバロン酸経路を有しない放線菌に対して、アセトアセチルＣｏＡ合成酵素遺伝子、３−ハイドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡ合成酵素遺伝子及び３−ハイドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡ還元酵素遺伝子の３種類をコードするＤＮＡを形質転換し、該放線菌の細胞中にアセトアセチルＣｏＡ合成酵素、３−ハイドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡ合成酵素及び３−ハイドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡ還元酵素の３種類の酵素蛋白質を生成させ、これら３種類の酵素蛋白質の機能によりメバロン酸を生成、蓄積させることを特徴とする新規なメバロン酸の製造方法（請求項１記載の発明）を提供するものである。
【００２０】
また、本発明は、上記アセトアセチルＣｏＡ合成酵素遺伝子が、放線菌由来のアセトアセチルＣｏＡ合成酵素遺伝子である請求項１記載の新規なメバロン酸の製造方法（請求項２記載の発明）を提供するものである。
また、本発明は、放線菌由来の上記アセトアセチルＣｏＡ合成酵素遺伝子が、ストレプトマイセス  ｓｐ．  ＣＬ１９０株由来のアセトアセチルＣｏＡ合成酵素遺伝子である請求項２記載の新規なメバロン酸の製造方法（請求項３記載の発明）を提供するものである。
【００２１】
また、本発明は、上記３−ハイドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡ合成酵素遺伝子が、放線菌由来の３−ハイドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡ合成酵素遺伝子である請求項１記載の新規なメバロン酸の製造方法（請求項４記載の発明）を提供するものである。
また、本発明は、放線菌由来の上記３−ハイドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡ合成酵素遺伝子が、ストレプトマイセス  ｓｐ．  ＣＬ１９０株由来の３−ハイドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡ合成酵素遺伝子である請求項４記載の新規なメバロン酸の製造方法（請求項５記載の発明）を提供するものである。
【００２２】
また、本発明は、上記３−ハイドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡ還元酵素遺伝子が、放線菌由来の３−ハイドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡ還元酵素遺伝子である請求項１記載の新規なメバロン酸の製造方法（請求項６記載の発明）を提供するものである。
また、本発明は、放線菌由来の上記３−ハイドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡ還元酵素遺伝子が、ストレプトマイセス  ｓｐ．  ＣＬ１９０株由来の３−ハイドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡ還元酵素遺伝子である請求項６記載の新規なメバロン酸の製造方法（請求項７記載の発明）を提供するものである。
【００２３】
また、本発明は、上記放線菌が、ストレプトマイセス  リビダンスである請求項１記載の新規なメバロン酸の製造方法（請求項８記載の発明）を提供するものである。
また、本発明は、上記放線菌に対して、アセトアセチルＣｏＡ合成酵素遺伝子、３−ハイドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡ合成酵素遺伝子及び３−ハイドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡ還元酵素遺伝子の３種類をコードするＤＮＡを形質転換する際に、プラスミドベクターを用いる請求項１記載の新規なメバロン酸の製造方法（請求項９記載の発明）を提供するものである。
また、本発明は、上記プラスミドベクターが、大腸菌とのシャトルベクターである請求項９記載の新規なメバロン酸の製造方法（請求項１０記載の発明）を提供するものである。
【００２４】
また、本発明は、配列番号１の塩基配列、配列番号１の塩基配列において１〜数個の塩基配列が欠失、置換、付加及び／又は挿入されている塩基配列であって、アセトアセチルＣｏＡ合成酵素を機能させるために必要な配列をすべてコードする塩基配列、又は配列番号１の塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズすることができる塩基配列であって、アセトアセチルＣｏＡ合成酵素を機能させるのに必要な配列をすべてコードする塩基配列、からなるポリヌクレオチド（請求項１１記載の発明）を提供するものである。
【００２５】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の好ましい実施形態を詳細に説明する。
まず、本明細書において、「１〜数個の塩基が欠失、置換、付加及び／又は挿入されている」とは、例えば１〜２０個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、最も好ましくは１〜５個の任意の数の塩基が欠失、置換、付加及び／又は挿入されていることを意味する。
【００２６】
また、本明細書において、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる」とは、ＤＮＡをプローブとして使用し、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡ又は該ＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍程度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ  塩化ナトリウム、１５ｍＭ  クエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡをあげることができる。
【００２７】
ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｎｕａｌ，  ２ｎｄＥｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ．，  １９８９．  （以後  ”モレキュラークローニング第二版”  と略す）等に記載されている方法に準じて行うことができる。ストリンジェントな条件でハイブリダイズすることができるＤＮＡとしては、プローブとして使用するＤＮＡの塩基配列と一定以上の相同性を有するＤＮＡが挙げられ、相同性は、例えば６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上である。
【００２８】
本発明のメバロン酸の製造方法は、Ａ）アセトアセチルＣｏＡ合成酵素蛋白質をコードするＤＮＡの取得、Ｂ）アセトアセチルＣｏＡ合成酵素蛋白質をコードするＤＮＡ、並びに天然型のＲ−メバロン酸の生合成に関与する酵素蛋白質ＨＭＧ  ＣｏＡ合成酵素蛋白質及びＨＭＧ  ＣｏＡ還元酵素蛋白質それぞれをコードするＤＮＡ、の計３種のＤＮＡを有する形質転換体の作製、Ｃ）該形質転換体でのこれらの酵素蛋白質の発現及びこれらの酵素蛋白質の作用による天然型のＲ−メバロン酸の発酵生産よりなる。
【００２９】
まず、Ａ）アセトアセチルＣｏＡ合成酵素蛋白質をコードするＤＮＡの取得について詳述する。
取得されるアセトアセチルＣｏＡ合成酵素蛋白質をコードするＤＮＡはアセトアセチルＣｏＡ合成酵素遺伝子を含むものであればよく、アセトアセチルＣｏＡ合成酵素遺伝子は、実質的にアセトアセチルＣｏＡ合成酵素、即ち２分子のアセチルＣｏＡからアセトアセチル  ＣｏＡを生成する反応を触媒する活性をもつ酵素蛋白質をコードするＤＮＡ配列であればよい。また、酵素反応にＮＡＤＰＨ等の補助因子を必要としてもしなくても構わない。
【００３０】
本発明におけるアセトアセチルＣｏＡ合成酵素蛋白質をコードするＤＮＡの取得方法としては、具体的には以下の方法等をあげることができる。
アセトアセチルＣｏＡ合成酵素遺伝子は既にいくつか報告されているため、本発明では、これらの遺伝子を使用しても構わないが、放線菌、特に放線菌ストレプトマイセス  ｓｐ．  ＣＬ１９０株からアセトアセチルＣｏＡ合成酵素遺伝子を取得するのが好ましい。本発明者等は、アセトアセチルＣｏＡ合成酵素遺伝子のクローニングを行い、放線菌ストレプトマイセス  ｓｐ．  ＣＬ１９０株から、新規なアセトアセチルＣｏＡ合成酵素遺伝子を取得し、配列番号１の塩基配列を有するＤＮＡを得た。以下に、放線菌ストレプトマイセス  ｓｐ．  ＣＬ１９０株を例示しながら、アセトアセチルＣｏＡ合成酵素蛋白質をコードするＤＮＡの取得方法を具体的に説明する。
【００３１】
放線菌ストレプトマイセス  ｓｐ．  ＣＬ１９０株を、適当な培地、例えば、グルコース２％、可溶性でんぷん２．５％、大豆粉１．５％、ドライイースト０．２％、及び炭酸カルシウム０．４％を含有するＫＧ培地（ｐＨ  ６．２）で、適当な温度（例えば３０℃）で数日間培養する。培養後、得られた培養液より遠心分離により菌体を取得し、菌体より常法（モレキュラークローニング  第二版）に従い染色体ＤＮＡを単離精製する。
【００３２】
ＰＣＲ法により配列番号１の塩基配列を有するＤＮＡを取得するためには、放線菌ストレプトマイセス  ｓｐ．  ＣＬ１９０株の染色体ＤＮＡを鋳型として使用し、既知のアセトアセチルＣｏＡ合成酵素の遺伝情報から設計した１対のプライマーＤＮＡを使用して、ＴａＫａＲａ  ＬＡ−ＰＣＲ（登録商標）  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２（宝酒造社製）又はＥｘｐａｎｄ（登録商標）  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（ベーリンガー・マンハイム社製）等を用い、ＤＮＡＴｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ（パーキンエルマージャパン社製）等でＰＣＲを行う。なお、後のクローニング操作を容易にするために、プライマーには適当な制限酵素部位を付加させておくことが好ましい。
【００３３】
ＰＣＲの条件としては、例えば、９４℃で３０秒間（変性）、５５℃で３０秒〜１分間（アニーリング）、７２℃で２分間（伸長）からなる反応工程を１サイクルとして、例えば３０サイクル行った後、７２℃で７分間反応させる条件をあげることができる。次いで、増幅されたＤＮＡ断片を、大腸菌で増幅可能な適切なベクター中にクローニングすることができる。クローニングは、常法、例えば、モレキュラークローニング  第二版、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １〜３８，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  （１９８７−１９９７）（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  １：  Ｃｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  （１９９５）等に記載された方法、あるいは市販のキット、例えばＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（ライフ・テクノロジーズ社製）やＺＡＰ−ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ〔ストラタジーン（Ｓｔａｒａｔａｇｅｎｅ）社製〕を用いて行うことが出来る。
【００３４】
クローニングベクターとしては、大腸菌Ｋ１２株中で自律複製できるものであれば、ファージベクター、プラスミドベクター等いずれでも使用できる、大腸菌の発現用ベクターをクローニングベクターとして用いてもよい。具体的には、ＺＡＰ  Ｅｘｐｒｅｓｓ〔ストラタジーン社製、Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，  ５，  ５８  （１９９２）〕、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）〔Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１７，  ９４９４  （１９８９）〕、Ｌａｍｂｄａ  ＺＡＰ  ＩＩ（ストラタジーン社製）、λｇｔ１０、λｇｔ１１〔ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，  １，  ４９  （１９８５）〕、λＴｒｉｐｌＥｘ（クローンテック社製）、λＥｘＣｅｌｌ（ファルマシア社製）、ｐＴ７Ｔ３１８Ｕ（ファルマシア社製）、ｐｃＤ２〔Ｈ．Ｏｋａｙａｍａ  ａｎｄ  Ｐ．Ｂｅｒｇ；Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ３，  ２８０  （１９８３）〕、ｐＭＷ２１８（和光純薬社製）、ｐＵＣ１１８（宝酒造社製）、ｐＥＧ４００〔Ｊ．  Ｂａｃ．，１７２，  ２３９２  （１９９０）〕、ｐＱＥ−３０（ＱＩＡＧＥＮ社製）等をあげることができる。
【００３５】
得られた形質転換株より、目的とするＤＮＡを含有したプラスミドを、常法、例えば、モレキュラークローニング  第二版、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １〜３８，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  （１９８７−１９９７）、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  １：Ｃｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  （１９９５）等に記載された方法により取得することができる。上記方法により、配列番号１の塩基配列を有するＤＮＡを取得することができる。
【００３６】
また、本発明のメバロン酸の製造方法においては、配列番号１の塩基配列において１〜数個の塩基配列が欠失、置換、付加及び／又は挿入されている塩基配列であって、アセトアセチルＣｏＡ合成酵素を機能させるために必要な配列をすべてコードする塩基配列、又は配列番号１の塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズすることができる塩基配列であって、アセトアセチルＣｏＡ合成酵素を機能させるのに必要な配列をすべてコードする塩基配列を有するＤＮＡであれば、後述するＢ）工程における形質転換体の作製に用いることができる。
【００３７】
例えば、配列番号１の塩基配列を有する放線菌由来のＤＮＡ断片の塩基配列を利用し、他の微生物等より、該ＤＮＡのホモログを適当な条件下でスクリーニングすることにより単離することができる。あるいは、変異ＤＮＡは、化学合成、遺伝子工学的手法、突然変異誘発等の当業者が既知の任意の方法で作製することもできる。具体的には、配列番号１の塩基配列を有するＤＮＡを利用し、これらＤＮＡに変異を導入することにより変異ＤＮＡを取得することができる。
【００３８】
ＤＮＡへの変異の導入は、例えば、配列番号１の塩基配列を有するＤＮＡに対し、変異源となる薬剤と接触作用させる方法、紫外線を照射する方法、遺伝子工学的手法を用いて行うことができる。遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発方法は、特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、モレキュラークローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  １０，  ６４８７  （１９８２）  、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  １２，  ９４４１  （１９８４）  、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  １３，  ４４３１  （１９８５）  、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  １３，  ８７４９  （１９８５）  、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．ＵＳＡ，  ７９，  ６４０９  （１９８２）  、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８２，  ４８８  （１９８５）  、Ｇｅｎｅ  ，１０２  ，６７  （１９９１）等に記載の方法に準じて行うことができる。
【００３９】
次に、Ｂ）アセトアセチルＣｏＡ合成酵素蛋白質をコードするＤＮＡ、並びに天然型のＲ−メバロン酸の生合成に関与するＨＭＧ  ＣｏＡ合成酵素蛋白質及びＨＭＧ  ＣｏＡ還元酵素蛋白質それぞれをコードするＤＮＡ、の計３種のＤＮＡを有する形質転換体の作製について詳述する。
【００４０】
本発明のメバロン酸の製造方法では、天然型のＲ−メバロン酸の生合成に関与する酵素蛋白質をコードするＤＮＡとして、アセトアセチルＣｏＡ合成酵素遺伝子、ＨＭＧ  ＣｏＡ合成酵素遺伝子及びＨＭＧ  ＣｏＡ還元酵素遺伝子の３種類の遺伝子を形質転換することが必須である。
【００４１】
本発明で使用するアセトアセチルＣｏＡ合成酵素遺伝子は、実質的にアセトアセチルＣｏＡ合成酵素、即ち２分子のアセチルＣｏＡからアセトアセチル  ＣｏＡを生成する反応を触媒する活性をもつ酵素蛋白質をコードするＤＮＡ配列であればよい。また、酵素反応にＮＡＤＰＨ等の補助因子を必要としてもしなくても構わない。
【００４２】
本発明で使用するＨＭＧ  ＣｏＡ合成酵素遺伝子は、実質的にＨＭＧ  ＣｏＡ合成酵素、即ちアセトアセチルＣｏＡとアセチルＣｏＡからＨＭＧ  ＣｏＡを生成する反応を触媒する活性をもつ酵素蛋白質をコードするＤＮＡ配列であればよい。また、酵素反応にＮＡＤＰＨ等の補助因子を必要としてもしなくても構わない。
【００４３】
また、本発明で使用するＨＭＧ  ＣｏＡ還元酵素遺伝子は、実質的にＨＭＧ  ＣｏＡ還元酵素、即ちＨＭＧ  ＣｏＡからメバロン酸を生成する反応を触媒する活性をもつ酵素蛋白質をコードするＤＮＡ配列であればよい。また、酵素反応にＮＡＤＰＨ等の補助因子を必要としてもしなくても構わない。
【００４４】
上記アセトアセチルＣｏＡ合成酵素遺伝子、上記ＨＭＧ  ＣｏＡ合成酵素遺伝子及び上記ＨＭＧ  ＣｏＡ還元酵素遺伝子は、いずれも、メバロン酸経路を持つ生物に由来するものであればよく、放線菌等の微生物由来のもの、動物細胞由来のもの、植物細胞由来のもの等が挙げられるが、これらの中でも放線菌由来のものが好ましく、放線菌ストレプトマイセス  ｓｐ．  ＣＬ１９０株由来のものが特に好ましい。
【００４５】
上記アセトアセチルＣｏＡ合成酵素遺伝子、上記ＨＭＧ  ＣｏＡ合成酵素遺伝子及び上記ＨＭＧ  ＣｏＡ還元酵素遺伝子は、いかなる生物由来であっても構わないが、宿主である放線菌の細胞中で酵素遺伝子から産生される酵素蛋白質の発現効率が高いことが好ましい。また、発現した酵素蛋白質が高い触媒機能を発現できる細胞との組合せが好ましい。これらの点から、宿主としてメバロン酸経路を持たない放線菌を用いる本発明のメバロン酸の製造方法においては、放線菌由来の酵素遺伝子を用いるのが好ましく、放線菌ストレプトマイセス  ｓｐ．  ＣＬ１９０由来の酵素遺伝子がさらに好ましい。とりわけ、アセトアセチルＣｏＡ合成酵素遺伝子、ＨＭＧ  ＣｏＡ合成酵素遺伝子及びＨＭＧ  ＣｏＡ還元酵素遺伝子の３種類すべてが、放線菌由来、特に放線菌ストレプトマイセス  ｓｐ．  ＣＬ１９０由来であることが好ましい。また、アセトアセチルＣｏＡ合成酵素遺伝子の形質転換に用いるＤＮＡの好ましい一例としては、配列番号１の塩基配列を有するＤＮＡがあげられる。
【００４６】
得られた３種類の酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片を放線菌細胞中で発現させるために、まず、目的とする該ＤＮＡ断片を制限酵素あるいはＤＮＡ分解酵素で該遺伝子を含む適当な長さのＤＮＡ断片とした後、発現ベクター中においてプロモーターの下流に挿入する。次いで、上記ＤＮＡを挿入した発現ベクターを、発現ベクターに適合した放線菌細胞中に導入することにより、上記の３種類のＤＮＡを有する形質転換体が得られる。
【００４７】
本発明のメバロン酸の製造方法においては、宿主としてメバロン酸経路を有しない放線菌を使用する。該放線菌としては、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｈｒｏｍｏｆｕｓｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｅｘｆｏｌｉａｔｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｒｇｅｎｔｅｏｒｕｓが好ましく、これらの中でもＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓが特に好ましい。
【００４８】
上記発現ベクターとしては、宿主である放線菌の細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組込みが可能で、上記目的とするＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。上記ＤＮＡを発現させるための発現ベクターは、該放線菌中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、上記ＤＮＡ及び転写終結配列より構成された組換えベクターであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
【００４９】
上記発現ベクターとしては、例えば、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（いずれもベーリンガーマンハイム社より市販）、ｐＫＫ２３３−２（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＳＥ２８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＧＥＭＥＸ−１（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）、ｐＱＥ−８（ＱＩＡＧＥＮ社製）、ｐＱＥ−３０（ＱＩＡＧＥＮ社製）、ｐＫＹＰ１０（特開昭５８−１１０６００号公報）、ｐＫＹＰ２００〔Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ４８，  ６６９  （１９８４）〕、ｐＬＳＡ１〔Ａｇｒｉｃ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ５３，  ２７７  （１９８９）〕、ｐＧＥＬ１〔Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８２，  ４３０６  （１９８５）〕、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ＋、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭＢＰ−５４０７）、ｐＴｒＳ３２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０８）、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＥＴ−３（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）、ｐＴｅｒｍ２（ＵＳ４６８６１９１、ＵＳ４９３９０９４、ＵＳ５１６０７３５）、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４、ｐＵＣ１８〔ｇｅｎｅ，  ３３，  １０３  （１９８５）〕、ｐＵＣ１９〔Ｇｅｎｅ，  ３３，  １０３  （１９８５）〕、ｐＳＴＶ２８（宝酒造社製）、ｐＳＴＶ２９（宝酒造社製）、ｐＵＣ１１８（宝酒造社製）、ｐＰＡ１（特開昭６３−２３３７９８号公報）、ｐＥＧ４００〔Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，  １７２，  ２３９２（１９９０）〕、ｐＱＥ−３０（ＱＩＡＧＥＮ社製）等を例示することができる。
【００５０】
上記プロモーターとしては、宿主である放線菌の細胞中で発現できるものであればいかなるものでもよい。例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター（Ｐｌａｃ）、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、ＰＳＥプロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーター、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等をあげることができる。また、Ｐｔｒｐを２つ直列させたプロモーター（Ｐｔｒｐｘ２）、ｔａｃプロモーター、ｌｅｔＩプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーターのように、人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
【００５１】
上記リボソーム結合配列としては、宿主である放線菌の細胞中で発現できるものであればいかなるものでもよいが、シャイン−ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。
【００５２】
本発明のメバロン酸の製造方法においては、形質転換においてプラスミドベクターを用いるのが好ましく、該プラスミドベクターとしては、大腸菌とのシャトルベクターが特に好ましい。
【００５３】
上記組換えベクター等の発現ベクターの導入方法としては、宿主である放線菌の細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ６９，  ２１１０  （１９７２）〕、プロトプラスト法（特開昭６３−２４８３９４２号公報）、又はＧｅｎｅ，  １７，  １０７  （１９８２）やＭｏｌｅｃｕｌａｒ  ＆  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  １６８，  １１１  （１９７９）に記載の方法等をあげることができる。
【００５４】
３番目に、Ｃ）該形質転換体でのこれらの酵素蛋白質の発現及びこれらの酵素蛋白質の作用による天然型のＲ−メバロン酸の発酵生産について詳述する。
【００５５】
これらの酵素蛋白質の発現及びこれらの酵素蛋白質の作用による天然型のＲ−メバロン酸の発酵生産のためには、Ｂ）において作製した、上記ＤＮＡを組み込んだ組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体を培地に培養する。この培養によって、該形質転換体の細胞中に、アセトアセチルＣｏＡ合成酵素蛋白質、ＨＭＧ  ＣｏＡ合成酵素蛋白質及びＨＭＧ  ＣｏＡ還元酵素蛋白質が発現し、次いで、これらの酵素蛋白質の作用による発酵生産により、天然型のＲ−メバロン酸が生成され、培養物中に天然型のＲ−メバロン酸を蓄積させることができる。培養物中に蓄積された天然型のＲ−メバロン酸は、該培養物より採取されて、各種用途に供される。
【００５６】
天然型のＲ−メバロン酸の生合成能力を付与した上記形質転換体を培地に培養する方法は、宿主である放線菌の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
【００５７】
上記形質転換体である放線菌を培養する培地は、放線菌が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有するものであれば、天然培地、合成培地のいずれでもよいが、形質転換体の培養を効率的に行える培地が好ましい。
【００５８】
上記炭素源としては、放線菌が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類が用いられる。
【００５９】
上記窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の各種無機酸や有機酸のアンモニウム塩、その他含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕及び大豆粕加水分解物、各種発酵菌体及びその消化物等が用いられる。
【００６０】
上記無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が用いられる。
【００６１】
培養は、振盪培養又は深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行うのが好ましい。培養温度は１５〜４０℃がよく、培養時間は、通常１６時間〜７日間である。培養中、ｐＨは、３．０〜９．０に保持するのが好ましい。ｐＨの調整は、無機酸、有機酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行う。
【００６２】
また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン、チオストレプトン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００６３】
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した放線菌を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した放線菌を培養するときには、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）等を培地に添加してもよく、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した放線菌を培養するときにはインドールアクリル酸（ＩＡＡ）等を培地に添加してもよい。
【００６４】
形質転換体の培養物からの天然型のＲ−メバロン酸の採取は、メバロン酸ないしメバロン酸の分子内エステルであるメバロノラクトンの通常の単離精製方法、即ち、形質転換体の分離、抽出、蒸留、クロマトグラフィ、再結晶等を適宜組み合わせることにより行うことが出来る。
【００６５】
メバロン酸は、分子量（ｍｗ：１４８）が小さいことから、多くの場合、形質転換体の細胞膜を透過できるため培養ろ液中に蓄積し、形質転換体の細胞中で検出されるメバロン酸は比較的僅かである。このため、培養ろ液を得るために形質転換体を遠心分離やろ過により除去することが好ましい。ただし、形質転換体の細胞内に蓄積する場合は、形質転換体もしくは形質転換体を含めた培養ろ液から抽出してもよい。
【００６６】
メバロン酸の抽出は、通常の酸性有機物の抽出方法に従って行うことが出来る。即ち、培養物を有機酸ないし無機酸を用いてｐＨ１．０〜４．０とした後、酢酸エチル、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、酢酸ブチル、アセトン等の有機溶媒を用いて抽出できる。また、必要に応じて、培養物に塩化ナトリウム等の電解質を溶解させてもよい。さらに、抽出液中に含有する水分を減らす必要があれば、無水硫酸ナトリウム等で脱水してもよい。得られた抽出液から蒸留や減圧下で抽出溶媒を留去することにより、抽出物を得ることが出来る。ただし、メバロン酸は、有機溶媒で抽出すると、容易に分子内エステル化（ラクトン化）して、メバロノラクトンとなる。メバロノラクトンをメバロン酸として使用したい場合は、メバロノラクトンと等モル量の水酸化ナトリウム等のアルカリを用いて中和することにより、メバロン酸のナトリウム塩を得ることが出来る。
【００６７】
抽出物はシリカゲルクロマト等のカラムクロマトグラフィーに吸着させヘキサン／酢酸エチル等の溶媒を用いて溶出することで精製することが可能である。また、蒸留により直接メバロノラクトンを精製することも可能である。また、適当な溶媒を用いることにより結晶化することも可能である。
【００６８】
以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
なお、実施例で示した遺伝子組換え実験は、特に言及しない限り、モレキュラークローニング  第二版に記載の方法（以下、常法と呼ぶ）を用いて行った。
【実施例】
〔実施例１〕放線菌ストレプトマイセス  ｓｐ．  ＣＬ１９０株からのアセトアセチルＣｏＡ合成酵素遺伝子のクローニング
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．  ＣＬ１９０株を１白金耳、１００ｍｌのＫＧ液体培地（グルコース２％、可溶性でんぷん２．５％、大豆粉１．５％、ドライイースト０．２％、炭酸カルシウム０．４％、ｐＨ  ６．２）に植菌し、３０℃で３日間培養した。
該菌体より、常法に従い染色体ＤＮＡを単離・精製した。
【００６９】
配列番号２の塩基配列と配列番号３の塩基配列との組合せを有するセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを、ＤＮＡ合成機を用いて合成した。尚、配列番号２の塩基配列において、４番目の塩基から９番目の塩基までの部位「ｇａａｔｔｃｃ」はＥｃｏＲＩ切断部位を示し、ｓはｇ又はｃを、ｈはａ、ｃ又はｔを、ｒはａ又はｇを示す。配列番号３の塩基配列において、４番目の塩基から９番目の塩基までの部位「ａａｇｃｔｔ」はＨｉｎｄＩＩＩ切断部位を示し、ｓはｇ又はｃを、ｖはａ、ｃ又はｇを示す。
染色体ＤＮＡを鋳型として、これらプライマーと、ＴａＫａＲａ  ＬＡ−ＰＣＲ（登録商標）  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２（宝酒造社製）、Ｅｘｐａｎｄ（登録商標）  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（ロシュ社製）又はＴａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用い、ＤＮＡ増幅装置  （ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）でＰＣＲを行った。
ＰＣＲは、９５℃で３０秒間、５５℃で１分間、７２℃で２分間からなる反応工程を１サイクルとして、３０サイクル行った後、７２℃で１０分間反応させる条件で行った。
ＰＣＲ終了後、該反応液をアガロースゲル電気泳動し、約８００ｂｐのＤＮＡ断片を取得した。
【００７０】
上記で取得したＤＮＡ断片をｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）と混合した後、エタノール沈殿を行い、得られたＤＮＡ沈殿物を５μｌの蒸留水に溶解し、ライゲーション反応を行うことにより組換え体ＤＮＡを取得した。
該組換え体ＤＮＡを用い、Ｅ．  ｃｏｌｉ（東洋紡より購入）ＤＨ５α株を常法に従って形質転換後、該形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩培養した。
生育してきたアンピシリン耐性の形質転換体のコロニー数個について、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地５ｍｌで３７℃にて１６時間振盪培養した。
【００７１】
得られた培養液を遠心分離することにより菌体を取得した。
該菌体より常法に従ってプラスミドを単離した。
該方法により単離したプラスミドの塩基配列を決定することにより、目的のアセトアセチルＣｏＡ合成酵素遺伝子の一部分を含むＤＮＡ断片が挿入されているプラスミドであることを確認し、本プラスミドをｐＡＡＳ−ＰＣＲ１と命名した。
【００７２】
ｐＡＡＳ−ＰＣＲ１をＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩ消化後、制限酵素処理ＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動し、約０．８ｋｂのＤＮＡ断片を取得した。本断片をプローブに用い、常法により、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．  ＣＬ１９０株染色体ＤＮＡとのサザンハイブリダイゼーションを行った結果、約３．０  ｋｂのＢａｍＨＩ断片とハイブリダイズした。
【００７３】
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．  ＣＬ１９０株染色体ＤＮＡをＢａｍＨＩ消化後、制限酵素処理ＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動し、約３．０ｋｂのＤＮＡ断片を取得した。
上記で取得された約３．０ｋｂのＢａｍＨＩ処理ＤＮＡ断片を、ＢａｍＨＩ処理ｐＵＣ１１８（寶酒造より購入）断片と混合した後、エタノール沈殿を行い、得られたＤＮＡ沈殿物を５μｌの蒸留水に溶解し、ライゲーション反応を行うことにより組換え体ＤＮＡを取得した。
【００７４】
該組換え体ＤＮＡを用い、Ｅ．  ｃｏｌｉ（東洋紡より購入）ＤＨ５α株を常法に従って形質転換後、該形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩培養した。
生育してきたアンピシリン耐性の形質転換体のコロニーを、常法によりナイロンメンブレンフィルターに移植し、上記ｐＡＡＳ−ＰＣＲ１をＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩ消化後、アガロースゲル電気泳動により精製した約０．８ｋｂのアセトアセチルＣｏＡ合成酵素遺伝子の一部分を含むＤＮＡ断片をプローブに用いて、常法によりコロニー・ハイブリダイゼーションを行った。
該方法により同定した、アセトアセチルＣｏＡ合成酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片が挿入されたｐＵＣ１１８を保持する形質転換体のコロニーをアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地５ｍｌで３７℃にて１６時間振盪培養した。
【００７５】
培養液を遠心分離することにより菌体を取得した。
該菌体より常法に従ってプラスミドを単離した。
該方法により単離したプラスミドを各種制限酵素で切断して構造を調べ、塩基配列を決定することにより、目的のＤＮＡ断片が挿入されているプラスミドであることを確認した。
配列番号１記載の塩基配列２９４９  ｂｐを有するＤＮＡをｐＡＡＳ２と命名した。
【００７６】
〔実験例１〕Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．  ＣＬ１９０株由来のＨＭＧ  ＣｏＡ  合成酵素遺伝子及びＨＭＧ  ＣｏＡ還元酵素遺伝子、並びにこれらの遺伝子の上流域の塩基配列を含むＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属の形質転換用プラスミドｐＳＥＭＶ３４の構築
１−１）  大腸菌と放線菌で複製可能なシャトルベクターｐＳＥ１０１の構築：
ｐＵＣ１９（宝酒造）を制限酵素ＡａｔＩＩで消化後、ＢｇｌＩＩリンカー（宝酒造）をライゲーションし、ＡａｔＩＩサイトをＢｇｌＩＩサイトに変えたプラスミドベクターｐＵＣ１９Ｂを作成した。
ｐＵＣ１９Ｂを、制限酵素ＢｇｌＩＩ及びＫｐｎＩで消化後、アガロースゲル電気泳動を行い、ＢｇｌＩＩ−ＫｐｎＩ処理ｐＵＣ１９Ｂ断片を取得した。
放線菌用ベクターｐＩＪ７０２  （Ｊｏｈｎ  Ｉｎｎｅｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）を、制限酵素ＢｇｌＩＩ及びＫｐｎＩで消化後、アガロースゲル電気泳動を行い、ＢｇｌＩＩ−ＫｐｎＩ処理ｐＩＪ７０２断片を取得した。
【００７７】
上記で取得されたＢｇｌＩＩ−ＫｐｎＩ処理ｐＵＣ１９Ｂ断片とＢｇｌＩＩ−ＫｐｎＩ処理ｐＩＪ７０２断片とを混合した後、エタノール沈殿を行い、得られたＤＮＡ沈殿物を５μｌの蒸留水に溶解し、ライゲーション反応を行うことにより組換え体ＤＮＡを取得した。
該組換え体ＤＮＡを用い、Ｅ．  ｃｏｌｉ（東洋紡より購入）ＤＨ５α株を常法に従って形質転換後、該形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩培養した。
生育してきたアンピシリン耐性の形質転換体のコロニー数個について、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地５ｍｌで３７℃にて１６時間振盪培養した。
【００７８】
得られた培養液を遠心分離することにより菌体を取得した。
該菌体より常法に従ってプラスミドを単離した。
該方法により単離したプラスミドを各種制限酵素で切断して構造を調べ、目的のＤＮＡ断片が挿入されているプラスミドであることを確認した。
得られたプラスミドは、大腸菌と放線菌の両方で複製可能なシャトルベクターであり、ｐＳＥ１０１と命名した。
【００７９】
１−２）  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．  ＣＬ１９０株由来のメバロン酸経路遺伝子クラスター及び該クラスターの上流のプロモーター領域を含むｐＵＭＶ３３の構築：
特開２００１−１６１３７０号公報記載のｐＵＭＶ１９は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．  ＣＬ１９０株由来のメバロン酸経路遺伝子クラスターを含むプラスミドであり、ＨＭＧ  ＣｏＡ  合成酵素遺伝子及びＨＭＧ  ＣｏＡ還元酵素遺伝子を含む（ＰＣＴ／ＪＰ００／０８６２０、放線菌由来のメバロン酸経路に関与する酵素の遺伝子）。ｐＵＭＶ１９にクローニングされている６７９８  ｂｐからなるＤＮＡ断片の塩基配列を配列番号４に記す。
【００８０】
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．  ＣＬ１９０株を１白金耳、１００ｍｌのＫＧ液体培地（グルコース２％、可溶性でんぷん２．５％、大豆粉１．５％、ドライイースト０．２％、炭酸カルシウム０．４％、ｐＨ  ６．２）に植菌し、３０℃で３日間培養した。
該菌体より、常法に従い染色体ＤＮＡを単離・精製した。
【００８１】
配列番号５の塩基配列と配列番号６の塩基配列との組合せを有するセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを、ＤＮＡ合成機を用いて合成した。
染色体ＤＮＡを鋳型として、これらプライマーと、ＴａＫａＲａ  ＬＡ−ＰＣ  Ｒ  （登録商標）  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２（宝酒造社製）、Ｅｘｐａｎｄ（登録商標）  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（ロシュ社製）又はＴａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用い、ＤＮＡ増幅装置  （ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）でＰＣＲを行った。
ＰＣＲは、９５℃で３０秒間、６０℃で１分間、７２℃で２分間からなる反応工程を１サイクルとして、３０サイクル行った後、７２℃で１０分間反応させる条件で行った。
【００８２】
ＰＣＲ終了後、該反応液をアガロースゲル電気泳動し、約２．３ｋｂのＥｃｏＲＩサイトを両端に持つＤＮＡ断片を取得した。
上記で取得したＤＮＡ断片をｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）と混合した後、エタノール沈殿を行い、得られたＤＮＡ沈殿物を５μｌの蒸留水に溶解し、ライゲーション反応を行うことにより組換え体ＤＮＡを取得した。
該組換え体ＤＮＡを用い、Ｅ．  ｃｏｌｉ（東洋紡より購入）ＤＨ５α株を常法に従って形質転換後、該形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩培養した。
生育してきたアンピシリン耐性の形質転換体のコロニー数個について、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地５ｍｌで３７℃１６時間振盪培養した。
【００８３】
得られた培養液を遠心分離することにより菌体を取得した。
該菌体より常法に従ってプラスミドを単離した。
該方法により単離したプラスミドを各種制限酵素で切断して構造を調べ、塩基配列を決定することにより、目的のＤＮＡ断片が挿入されているプラスミドであることを確認した。
配列番号７記載の塩基配列２３７０  ｂｐを有するＤＮＡをｐＣＬ３３０１６と命名した。
【００８４】
ｐＣＬ３３０１６をＥｃｏＲＩ消化後、制限酵素処理ＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動し、約２．３  ｋｂのＥｃｏＲＩ処理ＤＮＡ断片を取得した。
ｐＵＭＶ１９を、制限酵素ＥｃｏＲＩで消化後、アガロースゲル電気泳動を行い、ＥｃｏＲＩ処理ｐＵＭＶ１９断片を取得した。
【００８５】
上記で取得された約２．３  ｋｂのＥｃｏＲＩ処理ＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩ処理ｐＵＭＶ１９断片と混合した後、エタノール沈殿を行い、得られたＤＮＡ沈殿物を５μｌの蒸留水に溶解し、ライゲーション反応を行うことにより組換え体ＤＮＡを取得した。
該組換え体ＤＮＡを用い、Ｅ．  ｃｏｌｉ（東洋紡より購入）ＤＨ５α株を常法に従って形質転換後、該形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩培養した。
生育してきたアンピシリン耐性の形質転換体のコロニー数個について、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地５ｍｌで３７℃１６時間振盪培養した。
【００８６】
得られた培養液を遠心分離することにより菌体を取得した。
該菌体より常法に従ってプラスミドを単離した。
該方法により単離したプラスミドを各種制限酵素で切断して構造を調べ、塩基配列を決定することにより、目的のＤＮＡ断片が挿入されているプラスミドであることを確認した。
配列番号８記載の塩基配列８７１９  ｂｐを有するＤＮＡをｐＵＭＶ３３と命名した。
【００８７】
１−３）  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．  ＣＬ１９０株由来のＨＭＧ  ＣｏＡ還元酵素遺伝子、ＨＭＧ  ＣｏＡ合成酵素遺伝子及び異なる塩基長のプロモーター領域を含むｐＵＭＶ３４とｐＵＭＶ３５の構築：
ｐＵＭＶ３３を制限酵素Ａｏｒ５１ＨＩで完全消化後、引き続き、制限酵素ＳｎａＢＩで部分消化し、約７．５  ｋｂと約６．４  ｋｂのＤＮＡを回収した。得られたＤＮＡ断片それぞれを５μｌの蒸留水に溶解し、それぞれセルフライゲーション反応を行うことにより組換え体ＤＮＡを取得した。
【００８８】
それぞれの該組換え体ＤＮＡを用い、Ｅ．  ｃｏｌｉ（東洋紡より購入）ＤＨ５α株を常法に従って形質転換後、該形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩培養した。
生育してきたそれぞれのアンピシリン耐性の形質転換体のコロニー数個ずつについて、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地５ｍｌで３７℃にて１６時間振盪培養した。
【００８９】
得られた培養液を遠心分離することにより菌体を取得した。
該菌体より常法に従ってプラスミドを単離した。
該方法により単離したプラスミドを各種制限酵素で切断して構造を調べ、塩基配列を決定することにより、目的のＤＮＡ断片が挿入されているプラスミドであることを確認した。
配列番号９記載の塩基配列を有するＤＮＡをｐＵＭＶ３４と命名した。
配列番号１０記載の塩基配列を有するＤＮＡをｐＵＭＶ３５と命名した。
【００９０】
１−４）  ｐＢＭＶ３４の構築（両端に制限酵素サイトを付与するためブルースクリプトへのベクター交換）：
ｐＵＭＶ３４を制限酵素ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後、制限酵素処理ＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動し、約３．２  ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ処理ｐＵＭＶ３４を取得した。
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を、制限酵素ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後、アガロースゲル電気泳動を行い、ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ処理ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）断片を取得した。
【００９１】
上記で取得された約３．２  ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ処理ｐＵＭＶ３４をＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ処理ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）と混合した後、エタノール沈殿を行い、得られたＤＮＡ沈殿物を５μｌの蒸留水に溶解し、ライゲーション反応を行うことにより組換え体ＤＮＡを取得した。
該組換え体ＤＮＡを用い、Ｅ．  ｃｏｌｉ（東洋紡より購入）ＤＨ５α株を常法に従って形質転換後、該形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩培養した。
生育してきたアンピシリン耐性の形質転換体のコロニー数個について、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地５ｍｌで３７℃にて１６時間振盪培養した。
【００９２】
得られた培養液を遠心分離することにより菌体を取得した。
該菌体より常法に従ってプラスミドを単離した。
該方法により単離したプラスミドを各種制限酵素で切断して構造を調べ、目的のＤＮＡ断片が挿入されているプラスミドであることを確認した。
得られたプラスミドをｐＢＭＶ３４と命名した。
【００９３】
１−５）  放線菌発現プラスミドｐＳＥＭＶ３４  （プロモーター領域０．８  ｋｂを含む）の構築：
ｐＢＭＶ３４を制限酵素ＸｂａＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後、制限酵素処理ＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動し、約３．２  ｋｂのＸｂａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ処理ｐＢＭＶ３４を取得した。
ｐＳＥ１０１を、制限酵素ＸｂａＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後、アガロースゲル電気泳動を行い、ＸｂａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ処理ｐＳＥ１０１断片を取得した。
【００９４】
上記で取得された約３．２  ｋｂのＸｂａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ処理ｐＢＭＶ３４をＸｂａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ処理ｐＳＥ１０１と混合した後、エタノール沈殿を行い、得られたＤＮＡ沈殿物を５μｌの蒸留水に溶解し、ライゲーション反応を行うことにより組換え体ＤＮＡを取得した。
該組換え体ＤＮＡを用い、Ｅ．  ｃｏｌｉ（東洋紡より購入）ＤＨ５α株を常法に従って形質転換後、該形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩培養した。
生育してきたアンピシリン耐性の形質転換体のコロニー数個について、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地５ｍｌで３７℃にて１６時間振盪培養した。
【００９５】
得られた培養液を遠心分離することにより菌体を取得した。
該菌体より常法に従ってプラスミドを単離した。
該方法により単離したプラスミドを各種制限酵素で切断して構造を調べ、目的のＤＮＡ断片が挿入されているプラスミドであることを確認した。
得られたプラスミドをｐＳＥＭＶ３４と命名した。
【００９６】
〔実験例２〕プラスミドｐＳＥＭＶ３４  による放線菌Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ  ＴＫ２３株の形質転換
プラスミドｐＳＥＭＶ３４  による、放線菌Ｓ．  ｌｉｖｉｄａｎｓ  ＴＫ２３株の形質転換は、Ｐｒａｃｔｉｃａｌ    Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ    Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  （ＩＳＢＮ  ０−７０８４−０６２３−８、Ｔｏｂｉａｓ  Ｋｉｅｓｅｒ他、ｔｈｅ  Ｊｏｈｎ  Ｉｎｎｅｓ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ社）に記載の方法を用いて行った。
【００９７】
得られた形質転換体のコロニー数個について、チオストレプトン５μｇ／ｍｌを含む１０ｍｌのＳＫ−ＩＩ液体培地（可溶性でんぷん２％、グルコース０．５％、酵母エキス０．５％、ＢａｃｔｏＴＭ  Ｐｅｐｔｏｎｅ  ０．３％、肉エキス０．３％、ＫＨ２ＰＯ４  ０．０２％、ＭｇＳＯ４  ０．００６％）で３０℃、３日間振盪培養した。
得られた培養液を遠心分離することにより菌体を取得した。
該菌体より常法に従ってプラスミドを単離した。
該方法により単離したプラスミドを各種制限酵素で切断して構造を調べ、目的のＤＮＡ断片が挿入されているプラスミドであることを確認した。
上記で得られたＳ．  ｌｉｖｉｄａｎｓ  ＴＫ２３株の形質転換体の一株をＳ．  ｌｉｖｉｄａｎｓ  ３４−１株と命名した。この菌株は独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに、受託番号「ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１２０」として寄託されている。
【００９８】
〔実験例３〕Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．  ＣＬ１９０株由来のＨＭＧ  ＣｏＡ  合成酵素遺伝子及びＨＭＧ  ＣｏＡ還元酵素遺伝子、及び、これらの遺伝子の上流域の塩基配列を含むＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属の形質転換用プラスミドベクター（ｐＳＥＭＶ３５）の構築
３−１）  ｐＢＭＶ３５の構築（両端に制限酵素サイトを付与するためブルースクリプトへのベクター交換）：
ｐＵＭＶ３５を制限酵素ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後、制限酵素処理ＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動し、約４．３  ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ処理ｐＵＭＶ３５を取得した。
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を、制限酵素ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後、アガロースゲル電気泳動を行い、ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ処理ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）断片を取得した。
【００９９】
上記で取得された約４．３  ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ処理ｐＵＭＶ３５をＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ処理ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）と混合した後、エタノール沈殿を行い、得られたＤＮＡ沈殿物を５μｌの蒸留水に溶解し、ライゲーション反応を行うことにより組換え体ＤＮＡを取得した。
該組換え体ＤＮＡを用い、Ｅ．  ｃｏｌｉ（東洋紡より購入）ＤＨ５α株を常法に従って形質転換後、該形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩培養した。
生育してきたアンピシリン耐性の形質転換体のコロニー数個について、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地５ｍｌで３７℃にて１６時間振盪培養した。
【０１００】
得られた培養液を遠心分離することにより菌体を取得した。
該菌体より常法に従ってプラスミドを単離した。
該方法により単離したプラスミドを各種制限酵素で切断して構造を調べ、目的のＤＮＡ断片が挿入されているプラスミドであることを確認した。
得られたプラスミドをｐＢＭＶ３５と命名した。
【０１０１】
３−２）  放線菌発現プラスミドｐＳＥＭＶ３５の構築  （プロモーター領域１．９  ｋｂを含む）：
ｐＢＭＶ３５をＥ制限酵素ＸｂａＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後、制限酵素処理ＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動し、約４．３  ｋｂのＸｂａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ処理ｐＢＭＶ３５を取得した。
ｐＳＥ１０１を、制限酵素ＸｂａＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後、アガロースゲル電気泳動を行い、ＸｂａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ処理ｐＳＥ１０１断片を取得した。
【０１０２】
上記で取得された約４．３  ｋｂのＸｂａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ処理ｐＢＭＶ３５をＸｂａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ処理ｐＳＥ１０１と混合した後、エタノール沈殿を行い、得られたＤＮＡ沈殿物を５μｌの蒸留水に溶解し、ライゲーション反応を行うことにより組換え体ＤＮＡを取得した。
該組換え体ＤＮＡを用い、Ｅ．  ｃｏｌｉ（東洋紡より購入）ＤＨ５α株を常法に従って形質転換後、該形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩培養した。
生育してきたアンピシリン耐性の形質転換体のコロニー数個について、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地５ｍｌで３７℃にて１６時間振盪培養した。
【０１０３】
得られた培養液を遠心分離することにより菌体を取得した。
該菌体より常法に従ってプラスミドを単離した。
該方法により単離したプラスミドを各種制限酵素で切断して構造を調べ、目的のＤＮＡ断片が挿入されているプラスミドであることを確認した。
得られたプラスミドをｐＳＥＭＶ３５と命名した。
【０１０４】
〔実験例４〕プラスミドベクター  ｐＳＥＭＶ３５  による放線菌Ｓ．  ｌｉｖｉｄａｎｓ  ＴＫ２３株の形質転換
プラスミドｐＳＥＭＶ３５  による、放線菌Ｓ．  ｌｉｖｉｄａｎｓ  ＴＫ２３株の形質転換は、Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  （ＩＳＢＮ  ０−７０８４−０６２３−８、Ｔｏｂｉａｓ  Ｋｉｅｓｅｒ他、ｔｈｅ  ＪｏｈｎＩｎｎｅｓ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ社）  に記載の方法を用いて行った。
【０１０５】
得られた形質転換体のコロニー数個について、チオストレプトン５μｇ／ｍｌを含む１０ｍｌのＳＫ−ＩＩ液体培地で３０℃、３日間振盪培養した。
得られた培養液を遠心分離することにより菌体を取得した。
該菌体より常法に従ってプラスミドを単離した。
該方法により単離したプラスミドを各種制限酵素で切断して構造を調べ、目的のＤＮＡ断片が挿入されているプラスミドであることを確認した。
上記で得られたＳ．  ｌｉｖｉｄａｎｓ  ＴＫ２３株の形質転換体の一株をＳ．  ｌｉｖｉｄａｎｓ  ３５−６株と命名した。この菌株は独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに、受託番号「ＦＥＲＭ  Ｐ−１９１２２」として寄託されている。
【０１０６】
〔実施例２〕Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ    ｓｐ．  ＣＬ１９０株由来のアセトアセチルＣｏＡ合成酵素遺伝子、ＨＭＧ  ＣｏＡ  合成酵素遺伝子及びＨＭＧ  ＣｏＡ還元酵素遺伝子、及び、これらの遺伝子の上流域の塩基配列を含むＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属の形質転換用プラスミドｐＳＥＭＶ３４ＡＳの構築と、ｐＳＥＭＶ３４ＡＳによる放線菌Ｓ．  ｌｉｖｉｄａｎｓ  ＴＫ２３株の形質転換
配列番号１１の塩基配列と配列番号１２の塩基配列との組合せを有するセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを、ＤＮＡ合成機を用いて合成した。尚、配列番号１１の塩基配列において、５番目の塩基から１０番目の塩基までの部位「ｔｃｔａｇａ」は、Ｘｂａ  Ｉ切断部位を示し、配列番号１２の塩基配列において、４番目の塩基から９番目の塩基までの部位「ｇａａｔｔｃ」は、ＥｃｏＲＩ切断部位を示す。
実施例１で取得したｐＡＡＳ２を鋳型として、これらプライマーと、ＴａＫａＲａ  ＬＡ−ＰＣＲ（登録商標）  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２（宝酒造社製）、Ｅｘｐａｎｄ（登録商標）  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（ロシュ社製）又はＴａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用い、ＤＮＡ増幅装置  （ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）でＰＣＲを行った。
ＰＣＲは、９５℃で３０秒間、  ６０℃で１分間、７２℃で２分間からなる反応工程を１サイクルとして、３０サイクル行った後、７２℃で１０分間反応させる条件で行った。
ＰＣＲ終了後、該反応液をアガロースゲル電気泳動し、約１．３ｂｐのＸｂａＩサイトとＥｃｏＲＩサイトを両端に持つＤＮＡ断片を取得した。
【０１０７】
上記で取得したＤＮＡ断片を、ＸｂａＩとＥｃｏＲＩで切断した  ｐＵＣ１１８ベクター（寶酒造社製）と混合した後、エタノール沈殿を行い、得られたＤＮＡ沈殿物を５μｌの蒸留水に溶解し、ライゲーション反応を行うことにより組換え体ＤＮＡを取得した。
該組換え体ＤＮＡを用い、Ｅ．  ｃｏｌｉ（東洋紡より購入）ＤＨ５α株を常法に従って形質転換後、該形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩培養した。
生育してきたアンピシリン耐性の形質転換体のコロニー数個について、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地５ｍｌで３７℃にて１６時間振盪培養した。
【０１０８】
得られた培養液を遠心分離することにより菌体を取得した。
該菌体より常法に従ってプラスミドを単離した。
該方法により単離したプラスミドの塩基配列を決定することにより、目的のアセトアセチルＣｏＡ合成酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片が挿入されているプラスミドであることを確認した。
配列番号１３の塩基配列１３０８  ｂｐを有するＤＮＡをｐＡＡＳ３と命名した。
【０１０９】
ｐＡＡＳ３をＸｂａＩとＥｃｏＲＩ消化後、制限酵素処理ＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動し、約１．３ｋｂのＤＮＡ断片を取得した。
前記実験例１で構築したｐＳＥＭＶ３４を、制限酵素ＸｂａＩとＥｃｏＲＩで消化後、アガロースゲル電気泳動を行い、ＸｂａＩとＥｃｏＲＩ処理ｐＳＥＭＶ３４を取得した。
上記で取得した２つのＤＮＡ断片を混合した後、エタノール沈殿を行い、得られたＤＮＡ沈殿物を５μｌの蒸留水に溶解し、ライゲーション反応を行うことにより組換え体ＤＮＡを取得した。
該組換え体ＤＮＡを用い、Ｅ．  ｃｏｌｉ（東洋紡より購入）ＤＨ５α株を常法に従って形質転換後、該形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩培養した。
生育してきたアンピシリン耐性の形質転換体のコロニー数個について、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地５ｍｌで３７℃にて１６時間振盪培養した。
【０１１０】
得られた培養液を遠心分離することにより菌体を取得した。
該菌体より常法に従ってプラスミドを単離した。
該方法により単離したプラスミドを各種制限酵素で切断して構造を調べ、目的のＤＮＡ断片が挿入されているプラスミドであることを確認した。
得られたプラスミドをｐＳＥＭＶ３４ＡＳと命名した。
【０１１１】
プラスミドｐＳＥＭＶ３４ＡＳによる、放線菌Ｓ．  ｌｉｖｉｄａｎｓ  ＴＫ２３株の形質転換は、Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  （ＩＳＢＮ  ０−７０８４−０６２３−８、Ｔｏｂｉａｓ  Ｋｉｅｓｅｒ他、ｔｈｅ  Ｊｏｈｎ  Ｉｎｎｅｓ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ社）  に記載の方法を用いて行った。
得られた形質転換体のコロニー数個について、チオストレプトン５μｇ／ｍｌを含む１０ｍｌのＳＫ−ＩＩ液体培地で３０℃、３日間振盪培養した。
【０１１２】
得られた培養液を遠心分離することにより菌体を取得した。
該菌体より常法に従ってプラスミドを単離した。
該方法により単離したプラスミドを各種制限酵素で切断して構造を調べ、目的のＤＮＡ断片が挿入されているプラスミドであることを確認した。
上記で得られたＳ．  ｌｉｖｉｄａｎｓ  ＴＫ２３株の形質転換体のうちの２株をＳ．  ｌｉｖｉｄａｎｓ  ３４ＡＳ−１株及びＳ．  ｌｉｖｉｄａｎｓ  ３４ＡＳ−１０株とそれぞれ命名した。
【０１１３】
〔実施例３〕Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ    ｓｐ．  ＣＬ１９０株由来のアセトアセチルＣｏＡ合成酵素遺伝子、ＨＭＧ  ＣｏＡ  合成酵素遺伝子及びＨＭＧ  ＣｏＡ還元酵素遺伝子、並びにこれらの遺伝子の上流域の塩基配列を含むＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属の形質転換用プラスミドｐＳＥＭＶ３５ＡＳの構築と、ｐＳＥＭＶ３５ＡＳによる放線菌Ｓ．  ｌｉｖｉｄａｎｓ  ＴＫ２３株の形質転換
実施例２で取得したｐＡＡＳ３をＸｂａＩとＥｃｏＲＩ消化後、制限酵素処理ＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動し、約１．３ｋｂのＤＮＡ断片を取得した。
前記実験例３で構築したｐＳＥＭＶ３５を、制限酵素ＸｂａＩとＥｃｏＲＩで消化後、アガロースゲル電気泳動を行い、ＸｂａＩとＥｃｏＲＩ処理しＤＮＡ断片を取得した。
上記で取得した１．３ｋｂ及びｐＳＥＭＶ３５由来の２つのＤＮＡ断片を混合した後、エタノール沈殿を行い、得られたＤＮＡ沈殿物を５μｌの蒸留水に溶解し、ライゲーション反応を行うことにより組換え体ＤＮＡを取得した。
【０１１４】
該組換え体ＤＮＡを用い、Ｅ．  ｃｏｌｉ（東洋紡より購入）ＤＨ５α株を常法に従って形質転換後、該形質転換体をアンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩培養した。
生育してきたアンピシリン耐性の形質転換体のコロニー数個について、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地５ｍｌで３７℃１６時間振盪培養した。
【０１１５】
得られた培養液を遠心分離することにより菌体を取得した。
該菌体より常法に従ってプラスミドを単離した。
該方法により単離したプラスミドを各種制限酵素で切断して構造を調べ、目的のＤＮＡ断片が挿入されているプラスミドであることを確認した。
得られたプラスミドをｐＳＥＭＶ３５ＡＳと命名した。
【０１１６】
プラスミドｐＳＥＭＶ３５ＡＳによる、放線菌Ｓ．  ｌｉｖｉｄａｎｓ  ＴＫ２３株の形質転換は、Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  （ＩＳＢＮ  ０−７０８４−０６２３−８、Ｔｏｂｉａｓ  Ｋｉｅｓｅｒ他、ｔｈｅ  Ｊｏｈｎ  Ｉｎｎｅｓ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ社）  に記載の方法を用いて行った。
得られた形質転換体のコロニー数個について、チオストレプトン５μｇ／ｍｌを含む１０ｍｌのＳＫ−ＩＩ液体培地で３０℃、３日間振盪培養した。
【０１１７】
得られた培養液を遠心分離することにより菌体を取得した。
該菌体より常法に従ってプラスミドを単離した。
該方法により単離したプラスミドを各種制限酵素で切断して構造を調べ、目的のＤＮＡ断片が挿入されているプラスミドであることを確認した。
上記で得られたＳ．  ｌｉｖｉｄａｎｓ  ＴＫ２３株の形質転換体のうちの２株をＳ．  ｌｉｖｉｄａｎｓ  ３５ＡＳ−３株及びＳ．  ｌｉｖｉｄａｎｓ  ３５ＡＳ−７株とそれぞれ命名した。
【０１１８】
〔実施例４〕形質転換株Ｓ．  ｌｉｖｉｄａｎｓ  ３４ＡＳ−１株によるメバロン酸発酵生産
実施例２で形質転換して得たＳ．  ｌｉｖｉｄａｎｓ  ３４ＡＳ−１株を、チオストレプトン５μｇ／ｍｌを含むＳＫ−ＩＩ液体培地１０  ｍｌに１白金耳植菌し、振とう培養器で３０℃、１２０  ｒｐｍで２日間培養を行った。得られた培養液を２  ｍｌずつ、チオストレプトン５μｇ／ｍｌを含むＫＧ液体培地１００  ｍｌを入れたバッフル付き三角フラスコに分注し、さらに７日間培養を継続した。得られた培養液を３５００  ｒｐｍで１０分遠心分離を行い、培養ろ液９０  ｍｌを得た。
この培養ろ液２  ｍｌに、リン酸３滴、無水硫酸ナトリウム１  ｇ及び酢酸エチル４  ｍｌを添加し、３０秒間撹拌後３５００  ｒｐｍで１０分間遠心分離した。次に、上層である酢酸エチル層２  ｍｌを別の試験菅にとり、遠心エバポレーターで乾固後、抽出物をイソプロパノール０．１  ｍｌに溶解し、以下に示す分析条件でＨＰＬＣを用いて分析を行った。
【０１１９】
（分析条件）
カラム：ヌクレオジル５Ｎ（ＣＨ３）２  （ドイツ、Ｍ．  ナーゲル社製）、サイズ直径４．６  ｍｍ×  長さ２５０  ｍｍ、４０  ℃
移動層：Ｎ−ヘキサン／イソプロパノール＝９／１、流速２．０  ｍｌ／分
検出：示差屈折計  （昭和電工（株）製、ＳＥ−６１型）、注入量  ０．００５  ｍｌ
【０１２０】
分析の結果、Ｓ．  ｌｉｖｉｄａｎｓ  ３４ＡＳ−１株の培養ろ液中から得られた物質はメバロノラクトンの標品と一致し、メバロノラクトン濃度は０．３０  ｍｇ／ｍｌであった。
【０１２１】
〔実施例５〜７〕形質転換株によるメバロン酸発酵生産
前記実施例４で用いたＳ．  ｌｉｖｉｄａｎｓ  ３４ＡＳ−１株の代わりに、実施例２で作製した形質転換株Ｓ．  ｌｉｖｉｄａｎｓ  ３４ＡＳ−１０株（実施例５）、実施例３で作製した形質転換株して得たＳ．  ｌｉｖｉｄａｎｓ  ３５ＡＳ−３株（実施例６）、Ｓ．  ｌｉｖｉｄａｎｓ  ３５ＡＳ−７株（実施例７）を用いた以外は、実施例４と同様の操作を実施し、得られた培養ろ液をＨＰＬＣで分析した結果、生成したメバロノラクトンはそれぞれ０．１７  ｍｇ／ｍｌ（実施例５）、０．４６  ｍｇ／ｍｌ（実施例６）、０．４６  ｍｇ／ｍｌ（実施例７）、であった。
【０１２２】
【発明の効果】
本発明によれば、効率的で安価に天然型のＲ−メバロン酸を提供することができる。
【０１２３】
【配列表】
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