【手続補正書】
【提出日】平成23年1月21日(2011.1.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳癌患者の腫瘍転移と関連したリスクの測定を補助する方法であって、
（ａ）前記乳癌患者のエストロゲン受容体陽性の腫瘍細胞の試料における遺伝子ＣＥＮＰＡ、ＰＫＭＹＴ１、ＭＥＬＫ、ＭＹＢＬ２、ＢＵＢ１、ＲＡＣＧＡＰ１、ＴＫ１、ＵＢＥ２Ｓ、ＤＣ１３、ＲＦＣ４、ＰＲＲ１１、ＤＩＡＰＨ３、ＯＲＣ６ＬおよびＣＣＮＢ１の発現レベルを測定し、それによって、前記遺伝子の発現レベルに基づく転移スコア（ＭＳ）を得る工程を包含し、
（ｂ）ここで、前記転移スコアと所定の転移スコアのカットオフ閾値（ＭＳ閾値）との比較が、前記乳癌患者の腫瘍転移のリスクを示す、
方法。
【請求項２】
工程（ｂ）において、ＭＳが所定のＭＳ閾値よりも高いことが、腫瘍転移のリスクの増加を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程（ｂ）において、ＭＳが所定のＭＳ閾値よりも低いことが、腫瘍転移のリスクの減少を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
工程（ｂ）において、２以上のＭＳ閾値に対する前記転移スコアの比較が、前記乳癌患者について腫瘍転移のリスクを示す、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記乳癌患者が、リンパ節において検出可能な腫瘍細胞を有さない、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記乳癌患者が、腫瘍転移を発症するリスクが増加している、請求項１に記載方法。
【請求項７】
前記エストロゲン受容体陽性の腫瘍細胞が、ホルマリン固定されたパラフィン包埋された切片に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記エストロゲン受容体陽性の腫瘍細胞が、腫瘍生検由来である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記エストロゲン受容体陽性の腫瘍細胞が、凍結腫瘍組織由来である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記遺伝子のｍＲＮＡが、エストロゲン受容体陽性の腫瘍細胞から得られ、ｃＤＮＡに逆転写され、前記ｃＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応増幅によって検出される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記ｍＲＮＡが、逆転写およびＰＣＲ増幅前に濃縮される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記遺伝子の各々のｍＲＮＡが、逆転写され、表３の配列番号１〜３０に示される対応する遺伝子と関連した２つのプライマーによって増幅される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記遺伝子の発現レベルが、あるハウスキーピング遺伝子または２以上のハウスキーピング遺伝子の平均の発現レベルに対して標準化される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ハウスキーピング遺伝子が、ＮＵＰ２１４、ＰＰＩＧおよびＳＬＵ７で構成される群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ハウスキーピング遺伝子のｍＲＮＡが、逆転写され、表３に列挙される、配列番号２９〜３４の前記ハウスキーピング遺伝子と関連した２つのプライマーによって増幅される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記発現レベルが、マイクロアレイによって検出される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記転移スコア（ＭＳ）が、下記：
【数８】
2010516292.tif 000001
（式中、
Ｍは１４であり、Ｇｉは１４個の前記遺伝子の各遺伝子（ｉ）の発現レベルであり、ａ０は０．０２２であり、ａｉは前記遺伝子の各々について表２にある値に対応する）
によって計算される、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記各々の遺伝子（ｉ）の発現レベルが、下記：
Δ（ΔＣｔ）＝（ＣｔＧＯＩ−ＣｔＥＣ）ｔｅｓｔＲＮＡ−（ＣｔＧＯＩ−ＣｔＥＣ）ｒｅｆＲＮＡ
（式中、
Ｃｔは指数関数的な標的増幅のＰＣＲ閾値サイクルであり、ＧＯＩは対象とする遺伝子であり、ＥＣは内在性対照であり、ｔｅｓｔＲＮＡは患者の試料ＲＮＡであり、ｒｅｆ  ＲＮＡは参照ＲＮＡである）
によって遺伝子発現値Ｇｉに算定される、請求項１7に記載の方法。
【請求項１９】
ａ０が０であり、ａｉが１である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記転移スコア（ＭＳ）が、下記：
【数９】
2010516292.tif 000002
（式中、
Ｍが１４であり、Ｇｉが１４個の前記遺伝子の各遺伝子（ｉ）の基準化された発現レベルであり、ａ０が０．０２２であり、ｂが−０．２５１であり、ａｉが前記遺伝子の各々について表２に示される値に対応する）
によって計算される、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記転移スコア（ＭＳ）が、下記：
【数１０】
2010516292.tif 000003
（式中、
Ｍが１４であり、Ｇｉが１４個の前記遺伝子の各遺伝子（ｉ）の発現レベルであり、ａ０が０．８６５７であり、ｂが−０．０４７７８であり、ａｉが前記遺伝子の各々について１である）
によって計算される、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記転移スコア（ＭＳ）が、下記：
【数１１】
2010516292.tif 000004
（式中、Ｇｉが１４個の前記遺伝子の各遺伝子（ｉ）の発現レベルである）
によって計算される、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記転移スコア（ＭＳ）が、１４個の前記遺伝子の各遺伝子の発現レベルを一緒に加えることによって計算される、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
遺伝子ＣＥＮＰＡ、ＰＫＭＹＴ１、ＭＥＬＫ、ＭＹＢＬ２、ＢＵＢ１、ＲＡＣＧＡＰ１、ＴＫ１、ＵＢＥ２Ｓ、ＤＣ１３、ＲＦＣ４、ＰＲＲ１１、ＤＩＡＰＨ３、ＯＲＣ６ＬおよびＣＣＮＢ１の発現レベルを検出するための試薬（複数）、および酵素；並びにバッファーを含むキット。
【請求項２５】
１以上のハウスキーピング遺伝子の発現レベルを検出するための試薬（複数）またはその組み合せをさらに含む、請求項２４に記載のキット。
【請求項２６】
前記ハウスキーピング遺伝子が、ＮＵＰ２１４、ＰＰＩＧおよびＳＬＵ７で構成される群から選択される、請求項２５に記載のキット。
【請求項２７】
遺伝子ＣＥＮＰＡ、ＰＫＭＹＴ１、ＭＥＬＫ、ＭＹＢＬ２、ＢＵＢ１、ＲＡＣＧＡＰ１、ＴＫ１、ＵＢＥ２Ｓ、ＤＣ１３、ＲＦＣ４、ＰＲＲ１１、ＤＩＡＰＨ３、ＯＲＣ６ＬおよびＣＣＮＢ１にハイブリダイズするポリヌクレオチドを含むマイクロアレイ。
【請求項２８】
ハウスキーピング遺伝子にハイブリダイズするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項２７に記載のマイクロアレイ。
【請求項２９】
前記ハウスキーピング遺伝子が、ＮＵＰ２１４、ＰＰＩＧおよびＳＬＵ７からなる群から選択される、請求項２８に記載のマイクロアレイ。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２９】
本発明の別の局面では、遺伝子ＣＥＮＰＡ、ＰＫＭＹＴ１、ＭＥＬＫ、ＭＹＢＬ２、ＢＵＢ１、ＲＡＣＧＡＰ１、ＴＫ１、ＵＢＥ２Ｓ、ＤＣ１３、ＲＦＣ４、ＰＲＲ１１、ＤＩＡＰＨ３、ＯＲＣ６ＬおよびＣＣＮＢ１にハイブリダイズするポリヌクレオチドを含むマイクロアレイに関する。
本発明はまた、以下の項目を提供する。
（項目１）
乳癌患者の腫瘍転移と関連したリスクを測定する方法であって、
（ａ）上記乳癌患者のエストロゲン受容体陽性の腫瘍細胞における遺伝子ＣＥＮＰＡ、ＰＫＭＹＴ１、ＭＥＬＫ、ＭＹＢＬ２、ＢＵＢ１、ＲＡＣＧＡＰ１、ＴＫ１、ＵＢＥ２Ｓ、ＤＣ１３、ＲＦＣ４、ＰＲＲ１１、ＤＩＡＰＨ３、ＯＲＣ６ＬおよびＣＣＮＢ１の発現レベルを測定し、それによって、上記遺伝子の発現レベルに基づく転移スコア（ＭＳ）を得て；
（ｂ）上記転移スコアと所定の転移スコアのカットオフ閾値（ＭＳ閾値）とを比較することによって、上記乳癌患者の腫瘍転移のリスクを測定する
ことを含む方法。
（項目２）
工程（ｂ）において、上記乳癌患者のＭＳが所定のＭＳ閾値よりも高い場合に、上記乳癌患者は、腫瘍転移のリスクが増加していると決定される、項目１に記載の方法。
（項目３）
工程（ｂ）において、そのＭＳが所定のＭＳ閾値よりも低い場合に、上記乳癌患者は、腫瘍転移のリスクが減少していると決定される、項目１に記載の方法。
（項目４）
工程（ｂ）において、２以上のＭＳ閾値が、上記乳癌患者について腫瘍転移のリスクの決定に用いられる、項目１に記載の方法。
（項目５）
上記乳癌患者が、リンパ節において検出可能な腫瘍細胞を有さない、項目１に記載の方法。
（項目６）
上記乳癌患者が、腫瘍転移を発症するリスクが増加している、項目１に記載方法。
（項目７）
上記エストロゲン受容体陽性の腫瘍細胞が、ホルマリン固定されたパラフィン包埋された切片に由来する、項目１に記載の方法。
（項目８）
上記エストロゲン受容体陽性の腫瘍細胞が、腫瘍生検由来である、項目１に記載の方法。
（項目９）
上記エストロゲン受容体陽性の腫瘍細胞が、凍結腫瘍組織由来である、項目１に記載の方法。
（項目１０）
上記遺伝子のｍＲＮＡが、エストロゲン受容体陽性の腫瘍細胞から得られ、ｃＤＮＡに逆転写され、上記ｃＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応増幅によって検出される、項目１に記載の方法。
（項目１１）
上記ｍＲＮＡが、逆転写およびＰＣＲ増幅前に濃縮される、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
上記遺伝子の各々のｍＲＮＡが、逆転写され、表３の配列番号１〜３０に示される対応する遺伝子と関連した２つのプライマーによって増幅される、項目１に記載の方法。
（項目１３）
上記遺伝子の発現レベルが、あるハウスキーピング遺伝子または２以上のハウスキーピング遺伝子の平均の発現レベルに対して標準化される、項目１に記載の方法。
（項目１４）
上記ハウスキーピング遺伝子が、ＮＵＰ２１４、ＰＰＩＧおよびＳＬＵ７で構成される群から選択される、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
上記ハウスキーピング遺伝子のｍＲＮＡが、逆転写され、表３に列挙される、配列番号２９〜３４の上記ハウスキーピング遺伝子と関連した２つのプライマーによって増幅される、項目１３に記載の方法。
（項目１６）
上記発現レベルが、マイクロアレイによって検出される、項目１に記載の方法。
（項目１７）
上記転移スコア（ＭＳ）が、下記：
【数８】
（式中、
Ｍは１４であり、Ｇｉは１４個の上記遺伝子の各遺伝子（ｉ）の発現レベルであり、ａ０は０．０２２であり、ａｉは上記遺伝子の各々について表２にある値に対応する）
によって計算される、項目１に記載の方法。
（項目１８）
上記各々の遺伝子（ｉ）の発現レベルが、下記：
Δ（ΔＣｔ）＝（ＣｔＧＯＩ−ＣｔＥＣ）ｔｅｓｔＲＮＡ−（ＣｔＧＯＩ−ＣｔＥＣ）ｒｅｆＲＮＡ
（式中、
Ｃｔは指数関数的な標的増幅のＰＣＲ閾値サイクルであり、ＧＯＩは対象とする遺伝子であり、ＥＣは内在性対照であり、ｔｅｓｔＲＮＡは患者の試料ＲＮＡであり、ｒｅｆ  ＲＮＡは参照ＲＮＡである）
によって遺伝子発現値Ｇｉに算定される、項目１7に記載の方法。
（項目１９）
ａ０が０であり、ａｉが１である、項目１７に記載の方法。
（項目２０）
上記転移スコア（ＭＳ）が、下記：
【数９】
（式中、
Ｍが１４であり、Ｇｉが１４個の上記遺伝子の各遺伝子（ｉ）の基準化された発現レベルであり、ａ０が０．０２２であり、ｂが−０．２５１であり、ａｉが上記遺伝子の各々について表２に示される値に対応する）
によって計算される、項目１に記載の方法。
（項目２１）
上記転移スコア（ＭＳ）が、下記：
【数１０】
（式中、
Ｍが１４であり、Ｇｉが１４個の上記遺伝子の各遺伝子（ｉ）の発現レベルであり、ａ０が０．８６５７であり、ｂが−０．０４７７８であり、ａｉが上記遺伝子の各々について１である）
によって計算される、項目１に記載の方法。
（項目２２）
上記転移スコア（ＭＳ）が、下記：
【数１１】
（式中、Ｇｉが１４個の上記遺伝子の各遺伝子（ｉ）の発現レベルである）
によって計算される、項目１に記載の方法。
（項目２３）
上記転移スコア（ＭＳ）が、１４個の上記遺伝子の各遺伝子の発現レベルを一緒に加えることによって計算される、項目１に記載の方法。
（項目２４）
遺伝子ＣＥＮＰＡ、ＰＫＭＹＴ１、ＭＥＬＫ、ＭＹＢＬ２、ＢＵＢ１、ＲＡＣＧＡＰ１、ＴＫ１、ＵＢＥ２Ｓ、ＤＣ１３、ＲＦＣ４、ＰＲＲ１１、ＤＩＡＰＨ３、ＯＲＣ６ＬおよびＣＣＮＢ１の発現レベルを検出するための試薬（複数）、および酵素；並びにバッファーを含むキット。
（項目２５）
１以上のハウスキーピング遺伝子の発現レベルを検出するための試薬（複数）またはその組み合せをさらに含む、項目２４に記載のキット。
（項目２６）
上記ハウスキーピング遺伝子が、ＮＵＰ２１４、ＰＰＩＧおよびＳＬＵ７で構成される群から選択される、項目２５に記載のキット。
（項目２７）
遺伝子ＣＥＮＰＡ、ＰＫＭＹＴ１、ＭＥＬＫ、ＭＹＢＬ２、ＢＵＢ１、ＲＡＣＧＡＰ１、ＴＫ１、ＵＢＥ２Ｓ、ＤＣ１３、ＲＦＣ４、ＰＲＲ１１、ＤＩＡＰＨ３、ＯＲＣ６ＬおよびＣＣＮＢ１にハイブリダイズするポリヌクレオチドを含むマイクロアレイ。
（項目２８）
ハウスキーピング遺伝子にハイブリダイズするポリヌクレオチドをさらに含む、項目２７に記載のマイクロアレイ。
（項目２９）
上記ハウスキーピング遺伝子が、ＮＵＰ２１４、ＰＰＩＧおよびＳＬＵ７からなる群から選択される、項目２８に記載のマイクロアレイ。
配列リスト
添付された配列リストは、全体として参照により本明細書中に援用される。配列リストは、表３に示されるオリゴヌクレオチド（配列番号１〜３４）を与える。これらのオリゴヌクレオチドは、表３に列挙された遺伝子のＲＴ−ＰＣＲ増幅における例示的なプライマーである。