(57)【要約】【課題】硬組織と軟組織の界面を効果的に再生する足場材料を提供し、これを利用して硬組織−軟組織欠損部を十分に補填できるインプラントを提供すること。【解決手段】生分解性高分子材料をカルシウムイオン含有溶液およびリン酸イオン含有溶液に今後浸漬することにより、生分解性高分子材料内にリン酸カルシウムが傾斜化して含有させる。該生分解性高分子材料を足場として利用し、硬組織−軟組織界面の再生を行う。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生分解性高分子材料内にリン酸カルシウムが傾斜化して含有されていることを特徴とする複合材料。
【請求項２】
生分解性高分子材料がグリコサミノグリカン、コラーゲン、およびこれらの複合体から選ばれる一種または二種以上である、請求項１記載の複合材料。
【請求項３】
生分解性高分子材料が、グリコサミノグリカンとコラーゲンの架橋体である、請求項１記載の複合材料。
【請求項４】
請求項１〜３記載の複合材料からなる、細胞の分化・増殖のための足場材料。
【請求項５】
硬組織と軟組織の界面を効果的に再生できることを特徴とする、請求項４記載の足場材料。
【請求項６】
請求項１〜３記載の複合材料を含む、硬組織−軟組織補填用インプラント。
【請求項７】
前記インプラント内にさらに細胞を含む、請求項６記載のインプラント。
【請求項８】
生分解性高分子材料の片面または一部分を、カルシウムイオン含有溶液とリン酸イオン含有溶液に交互に浸漬することにより、該生分解性高分子材料中にリン酸カルシウムが傾斜化して含有された複合材料を製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は硬組織−軟組織界面再生用足場材料に関する。より詳細には、硬組織（骨と歯）と軟組織（骨と歯以外の組織）の界面を効果的に再生しうる、リン酸カルシウムが傾斜化して含有される生分解性高分子材料からなる足場材料と、該足場材料を利用した硬組織−軟組織補填用インプラントに関する。
【０００２】
【従来の技術】
軟骨は再生能力の限られた軟組織であるため、事故や疾患等で破損・欠失した軟骨を自然再生させることは困難である。そのため、従来、軟骨欠損部の治療では、モザイクプラステイと呼ばれる荷重のかからない部位の軟骨組織を採取して患部に再移植する手法が中心であった。しかし、自家組織の使用は患者への負担が大きく、その採取量にも限界があるため、これに代る手段として、他人の軟骨組織を用いた同種移植（ａｌｌｏｇｒａｆｔ）も試みられたが、拒絶反応や感染の問題から十分な結果は得られていない。
【０００３】
一方、最近生体から取り出した自己の細胞をｉｎ　ｖｉｔｒｏで培養・組織化し、限りなく生体に近い組織を再構築して生体に戻す、再生医学の研究が進められている。この方法で再生された組織は自己に由来するため、拒絶反応や感染の問題は伴わず、組織欠損部の理想的な治療手段として注目される。特に、軟骨組織については、前述のような理由から、多くの研究機関によってそのｉｎ　ｖｉｔｒｏでの再生が試みられている。
【０００４】
ところで、細胞は生体内で細胞外マトリックスに接着して存在し、これを足場として分化・増殖を行う。したがって、ｉｎ　ｖｉｔｒｏでの細胞培養による完全な三次元組織構築のためには、細胞の分化・増殖のための適切な足場の提供が必要となる。これまで、硬組織の再生においては、コラーゲンゲルやアガロースゲル等を足場として用いることで、良好な組織再生結果が得られている。
しかしながら、再生された軟骨組織を生体内に移植しても、今度は移植部位の骨組織と再生された軟骨組織との接着が弱いために、軟骨欠損部を十分に補うことができないという新たな問題が生じる。
【０００５】
これに対し、Ｓｃｈａｅｆｅｒらは、ポリグリコール酸からなる生分解性足場材料を用いて軟骨様組織を、また（乳酸・グリコール酸共重合体とポリエチレングリコール）からなる足場材料を用いて骨様組織をそれぞれ別個に形成し、その後両者を人為的に接着して硬組織−軟組織界面様組織を作製する方法を報告している（Ｓｃｈａｅｆｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｂｉａｏｍａｔｅｒｉａｌｓ　２１　（２０００）　ｐ２５９９−２６０６）。しかし、この方法で作製される硬組織−軟組織界面様組織（骨−軟骨界面様組織）は、硬組織（骨）−軟組織（軟骨）の結合が十分ではないという問題がある。
【０００６】
一方、Ｙａｙｌａｏｇｌｕらは、凍結乾燥コラーゲンスポンジ（ＧｅｌｆｉｘＴＭメンブレン、Ａｂｄｉ−Ｉｂｒａｈｉｍ製）中にリン酸カルシウムを形成させ、これを足場として軟骨細胞を培養して、骨軟骨インプラントを作製する方法を報告している（Ｙａｙｌａｇｌｕ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｂｉａｏｍａｔｅｒｉａｌｓ　２０　（１９９９）　ｐ１５１３−１５２０）。しかし、リン酸カルシウムを単に含有させただけの材料では、硬組織（骨）との接着が不十分で、硬組織−軟組織界面（この場合は、骨−軟骨界面）を効果的に再生することはできない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、硬組織と軟組織の界面を効果的に再生する足場材料を提供し、これを利用することにより硬組織−軟組織欠損部を十分に補填できるインプラントを提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するために本発明者らは鋭意検討した結果、硬組織の接触面にこれらの構造に類似したアパタイト構造を形成させれば、硬組織との接着が向上すると考えた。そして、交互浸漬法を利用して生分解性高分子材料中にリン酸カルシウムを傾斜化して形成させることにより、硬組織との接着がよく、かつ軟組織再生機能にも優れた、足場材料が得られることを見出し本発明を完成させた。
【０００９】
すなわち、本発明は以下の（１）〜（８）を提供する。
（１）　生分解性高分子材料内にリン酸カルシウムが傾斜化して含有されていることを特徴とする複合材料。
（２）　生分解性高分子材料がグリコサミノグリカン、コラーゲン、およびこれらの複合体から選ばれる一種または二種以上である、上記（１）記載の複合材料。
（３）　生分解性高分子材料が、グリコサミノグリカンとコラーゲンの架橋体である、上記（１）記載の複合材料。
（４）　上記（１）〜（３）記載の複合材料からなる、細胞の分化・増殖のための足場材料。
（５）　硬組織と軟組織の界面を効果的に再生できることを特徴とする、上記（４）記載の足場材料
（６）　上記（１）〜（３）記載の複合材料を含む、硬組織−軟組織補填用インプラント。
（７）　前記インプラント内にさらに細胞を含む、上記（６）記載のインプラント。
（８）　生分解性高分子材料の片面または一部分を、カルシウムイオン含有溶液とリン酸イオン含有溶液に交互に浸漬することにより、該生分解性高分子材料中にリン酸カルシウムが傾斜化して含有された複合材料を製造する方法。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について詳細に説明する。
１．　リン酸カルシウムが傾斜化された複合材料
本発明は、生分解性高分子材料内にリン酸カルシウムが傾斜化して含有されていることを特徴とする複合材料に関する。
１．１　生分解性高分子材料
本発明の複合材料を構成する生分解性高分子材料は、生体内で分解・吸収される高分子材料で、例えば、ヒアルロン酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、およびケラタン硫酸等のグリコサミノグリカンやその化学修飾物、コラーゲン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリエチレングリコール、およびこれらの共重合体や架橋物、あるいはこれらの二種以上からなる複合体等を挙げることができる。
【００１１】
特に、本発明においては、軟骨マトリックス等の軟組織構成成分である、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパリン、およびヘパラン硫酸等のグリコサミノグリカン、コラーゲン、あるいはこれらの二種以上からなる複合体を生分解性高分子材料として用いることが好ましい。なお、前記複合体は、二種以上の生分解性高分子材料を単に混合して乾燥・成形するなどして複合化してもよいが、各生分解性高分子材料間に適当な架橋を導入して複合化すると、生分解性高分子材料の強度や生体内での吸収速度が向上するため好ましい。例えば、本発明で用いられる生分解性高分子材料の好適な１例として、ヒアルロン酸とＩＩ型コラーゲンからなる複合体を挙げることができる。
【００１２】
前記ヒアルロン酸の由来は、特に限定されず、鶏冠や臍帯等から抽出されたものでも、微生物によって産生されたものであってもよい。また、ヒアルロン酸の分子量も特に限定されないが、１０〜１００万程度のものが好ましい。
本発明の生分解性高分子材料に用いられるコラーゲンの由来は特に限定されず、哺乳動物（例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ウサギ、ネズミ等）、鳥類（例えば、ニワトリ等）、魚類等の組織から得られるコラーゲンを用いてもよいし、遺伝子組み替え技術によって得られるコラーゲンを用いてもよい。
【００１３】
コラーゲンには現在１９の異なる種類が知られており、そのいずれのコラーゲンを用いてもよいが、特に骨−軟骨界面再生を目的とする場合であれば、軟骨マトリックスの主成分であるＩＩ型コラーゲンが好ましい。
なお、天然のコラーゲンの大部分は不溶性であるが、これをアルカリ処理あるいは酵素処理によって可溶化した可溶化コラーゲンを用いると、取り扱いやすく、しかも抗原性を有する部分が除去されているため好ましい。また、フタル化コラーゲンはどのようなｐＨのバッファーにでも溶解し、扱いやすいという点で好ましい。
【００１４】
１．２　リン酸カルシウム
本発明の複合材料を構成する、リン酸カルシウムは、ＣａＨＰＯ４、Ｃａ３（ＰＯ４）２、Ｃａ４Ｏ（ＰＯ４）２、Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２、ＣａＰ４Ｏ１１、Ｃａ（ＰＯ３）２、Ｃａ２Ｐ２Ｏ７、Ｃａ（Ｈ２ＰＯ４）２・Ｈ２Ｏなどの化学式で示される１群の化合物である。これらのリン酸カルシウムは水溶液中に浸漬しておくと複合体中で熱力学的に安定なハイドロキシアパタイト（水酸アパタイト）に変化する。
【００１５】
ハイドロキシアパタイトは、一般組成をＣａ５（ＰＯ４）３ＯＨ、とする化合物であり、コラーゲンとともに哺乳類の硬組織（骨や歯）の主要構成成分ある。ハイドロキシアパタイトは、前述した一連のリン酸カルシウムを含むが、生体硬組織中のアパタイトのＰＯ４およびＯＨ成分は大気中のＣＯ３と置換していることが多い。本発明の複合材料においてもかかる置換がある程度（０〜１０質量％程度）含まれていてもよい。なお、ハイドロキシアパタイトは、
【００１６】
１．３　リン酸カルシウムの傾斜化
本発明の複合材料において、リン酸カルシウムは生分解性高分子材料内に傾斜化して含有される。ここで、「傾斜化」とは、一定の勾配で変化することを意味する。すなわち、リン酸カルシウムは、生分解性高分子材料の一方の側から他方の側に向けて、一定の勾配で密から疎へと変化して含有されている。
【００１７】
２．　リン酸カルシウムが傾斜化された複合材料の作製方法
２．１　生分解性高分子材料の作製
本発明の複合材料に用いられる生分解性高分子材料の好適な例として、ヒアルロン酸とＩＩ型コラーゲンからなる架橋体の作製方法について説明する。
適当な量のコラーゲンに、コラーゲンの０．１〜５０％のヒアルロン酸を０．０１〜０．５Ｍのリン酸緩衝液等の生理的緩衝液に溶解させて加える。次いで、ここに架橋剤（あるいは縮合剤）を添加して化学的架橋を導入する。用いる架橋剤としては、例えば、グルタールアルデヒド、ホルムアルデヒド等のアルデヒド系架橋剤；ヘキサメチレンジイソシアネート等のイソシアネート系架橋剤；１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩等のカルボジド系架橋剤；エチレングリコールジエチルエーテル等のポリエポキシ系架橋剤；トランスグルタミナーゼ等が挙げられるが、本発明においては４官能性架橋剤である、ＰＴＥ‐１０ＴＧＳ（ｐｅｎｔａｅｒｙｔｈｒｉｔｏｌ　ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ　ｅｔｈｅｒ　ｔｅｔｒａｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ　ｇｌｕｔａｒａｔｅ）が好適である。用いる架橋剤の濃度は、架橋対象物の組成や量に合わせて適宜設定されるが、ＰＴＥ‐１０ＴＧＳの場合であれば反応液中の最終濃度が０．１ｍＭ〜１０ｍＭ程度になるように加えることが好ましい。
なお、架橋は前記のような化学的架橋のほか、γ線、紫外線、熱脱水、電子線等を用いた物理的架橋法で導入してもよい。
【００１８】
また、架橋はコラーゲンおよびヒアルロン酸のどの官能基を架橋するものであってもよく、コラーゲンとヒアルロン酸との間のみならず、コラーゲン分子間、ヒアルロン酸分子間のにも導入される。特に、これらの分子内の水酸基とε−アミノ基、ε−アミノ基同士を架橋することが好ましい。
【００１９】
２．２　リン酸カルシウムの傾斜化（水酸アパタイトの形成）
生分解性高分子材料内へのリン酸カルシウムの傾斜化は、例えば、交互浸漬法を利用して、生分解性高分子材料の特定の面をリン酸イオン含有溶液とカルシウムイオン含有溶液に交互に浸漬することにより行うことができる。
用いられるリン酸イオン含有溶液のリン酸源としては、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸二水素カリウムおよびリン酸等が挙げられる。該リン酸イオン含有溶液の濃度は、０．１〜５００ｍＭが好ましい。
【００２０】
また、用いられるカルシウムイオン含有溶液のカルシウム源としては、例えば塩化カルシウム、炭酸カルシウム、酢酸カルシウム、水酸化カルシウム等が挙げられる。該カルシウムイオン含有溶液の濃度は、０．１〜８００ｍＭが好ましい。なお、カルシウムイオン含有溶液は均一な状態であれば懸濁液であってもよい。
【００２１】
本発明においては、生分解性高分子材料内にリン酸カルシウムを傾斜化させるために、生分解性高分子材料の一方の面のみを、リン酸イオン含有溶液またはカルシウムイオン含有溶液に浸漬する。浸漬は１つの溶液に対し１０秒〜１２０分間、少なくとも１サイクル以上繰り返すことが好ましい。こうして生分解性高分子材料内に傾斜化して含有されたリン酸カルシウムの大部分はアパタイト構造を形成する。
【００２２】
２．３　リン酸カルシウムの傾斜化の確認
前項の方法によって作成された複合材料中におけるリン酸カルシウムの分布は、Ｘ線回折、顕微鏡観察、赤外吸収スペクトル、および元素分析等の各種分析を単独あるいは組み合わせることにより確認することができる。
【００２３】
３．　硬組織−軟組織界面再生用足場材料、硬組織−軟組織補填用インプラント３．１　硬組織−軟組織界面再生用足場材料
本発明にかかる複合材料は生分解性高分子材料をマトリックスとするため、細胞培養の好適な足場として、生体外および生体内における軟組織の構築を可能にする。
また、該生分解性高分子材料内にはリン酸カルシウムが傾斜化して含有され、形成されるリン酸カルシウムの結晶性が低いために生体親和性が高い。それゆえ、本発明の複合材料は、従来の足場材料とは異なり、ハイドロキシアパタイトを高密度で含む部分において硬組織（骨や歯）に高い親和性を有し、硬組織−軟組織界面を再生することができる。
【００２４】
すなわち、本発明の複合材料は、硬組織−軟組織界面再生用足場材料として好適に用いることができる。なお、本発明において、「硬組織」とは、骨、歯といった硬い細胞間物質を持つ組織を意味し、「軟組織」とは、硬組織以外の組織（例えば、軟骨等）を意味する。
【００２５】
３．２　硬組織−軟組織補填用インプラント
さらに、本発明の複合材料に、細胞を播種して（生体外で培養後、あるいは培養せず直接に、）硬組織−軟組織欠損部に移植すれば、これは硬組織−軟組織欠損部を補填する好適なインプラントとなりうる。すなわち、移植された複合材料を足場として、播種した細胞による組織再生が進む一方、複合材料自体は徐々に吸収され、最終的に再生された軟組織に置換する。
【００２６】
特に、骨−軟骨界面再生を目的とする場合であれば、上記細胞としては、軟骨細胞、骨芽細胞、間葉系幹細胞、ＥＳ細胞等を好適に用いることができる。また、生分解性高分子材料としては、ヒアルロン酸やコラーゲン等の生体軟骨マトリックス構成成分を用いることができ、これは前述した細胞の分化・増殖のための好適な足場となりうる。
【００２７】
３．３　その他
本発明の足場材料および硬組織−軟組織補填用インプラントの形態及び形状は、特に限定されず、スポンジ、メッシュ、不繊布状成形物、ディスク状、フィルム状、棒状、粒子状、及びペースト状等、任意の形態及び形状を用いることができる。こうした形態や形状は、足場材料やインプラントの使用目的に応じて適宜選択すればよい。
【００２８】
本発明の足場材料および硬組織−軟組織補填用インプラントは、その目的と効果を損なわない範囲において、適宜他の成分を含んでいてもよい。そのような成分としては、例えば、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、血小板分化増殖因子（ＰＤＧＦ）、インスリン、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、グリア誘導神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、神経栄養因子（ＮＦ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、および血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）等の増殖因子、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）や転写因子等のその他のサイトカイン、ホルモン、Ｓｔ、Ｍｇ、Ｃａ及びＣＯ３等の無機塩、クエン酸及びリン脂質等の有機物、抗がん剤等の薬剤等を挙げることができる。
本発明の複合材料は、硬組織に高い親和性を有するため、理想的な硬組織−軟組織界面再生用足場材料または硬組織−軟組織補填用インプラントとなりうる。
【００２９】
【実施例】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１：リン酸カルシウムが傾斜化された複合材料の作製
１．試験方法
１．１　軟骨マトリックスの作製
軟骨の主成分であるＩＩ型コラーゲン（Ｃｏｌ）、ヒアルロン酸（ＨｙＡ）、コンドロイチン硫酸（ＣｈＳ）のうちのＩＩ型コラーゲン（ＩＩ型コラーゲン（ウシ由来）：新田ゼラチン社製、）、ヒアルロン酸（ヒアルロン酸（分子量６４万）：生化学工業（株）製）を用いて実験を行った。
【００３０】
調製した軟骨マトリックスは以下の通りである。
１）コラーゲン（Ｃｏｌ／Ｈｙａ０）：コラーゲンの最終濃度が１％
２）コラーゲン＋２ｗｔ％のヒアルロン酸（Ｃｏｌ／ＨｙＡ２）：２ｗｔ％ヒアルロン酸含有コラーゲンの最終濃度が１％
３）ラーゲン＋１０ｗｔ％のヒアルロン酸（Ｃｏｌ／ＨｙＡ１０）：１０ｗｔ％ヒアルロン酸含有コラーゲンの最終濃度が１％
架橋剤は、ＰＴＥ‐１０ＴＧＳ（ｐｅｎｔａｅｒｙｔｈｒｉｔｏｌ　ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ　ｅｔｈｅｒ　ｔｅｔｒａｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ　ｇｌｕｔａｒａｔｅ）を使用し、最終濃度が０．３ｍＭまたは１．０ｍＭになるように加えた。溶媒はｐＨ７．４の０．１Ｍ　Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　Ｂｕｆｆｅｒ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＰＢＳ）を用いた。
【００３１】
１．２　水酸アパタイトの形成（交互浸漬法）
調製した軟骨マトリックスを図１のようにドーナツ状のゴムに挟み、シリンジの中に挿入した。片側には反応させる溶液を、もう片側には超純水を用いた。
反応溶液にはＣａＣｌ２／Ｔｒｉｓ−ＨＣｌおよびＮａ２ＨＰＯ４を用いた。
まず、反応溶液側にＣａＣｌ２／Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ溶液（ｐＨ７．４）を入れ、３７℃で５分間放置した。その後、超純水で洗浄し、反応溶液をＮａ２ＨＰＯ４に変え、同様に３７℃、５分間放置した。この工程を１サイクルとし、３０サイクルまで行った。
【００３２】
１．３　各サンプルの分析
各サイクルのサンプルについてＸ線回析、赤外吸収スペクトル（ＦＴ−ＩＲ）による物質の同定、電子顕微鏡（ＳＥＭ）観察および元素分析を行った。無機成分量は、示差熱量分析により定量した。
【００３３】
２．試験結果
２．１　実体顕微鏡による観察
サイクル数が増加するにつれ、軟骨マトリックスに白い結晶が析出した。実体顕微鏡（ＶＨ−７０００Ｃ：ＫＥＹＥＮＣＥ社製、倍率：×３５）によって軟骨マトリックス断面を観察するとマトリックスの片側（反応面）から内部に向かって傾斜的に結晶が形成していることが確認された（図２）。
【００３４】
２．２　断面の元素分析
交互浸漬した軟骨マトリックスを凍結乾燥し、断面の元素分析を行った。ＣａとＰは反応面（ｔｏｐ側）に多く分布し、マトリックスの内部に向かうほど減少しており、マトリックスに結晶が傾斜化して形成されていることが確認された（図３）。
【００３５】
２．３　Ｘ線回折
各サイクル反応を行った後のＸ線回析をＰＨＩＬＩＰＳ社製　ＰＷ１７２９を用いて測定し、形成した白色の結晶の同定を行った（図４）。３０°付近にｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ（ＨＡｐ）の強いピークが観察され、４°付近にはｏｃｔａｃａｌｃｉｕｍ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＯＣＰ）の最強線が確認された。ピークの強度はサイクル数の増加に伴い増加した。軟骨マトリックス間での白色結晶の差異は認められなかった。
【００３６】
２．４　赤外吸収スペクトル（ＦＴ−ＩＲ）によるリン酸カルシウムの同定
ＦＴ−ＩＲは、ＰＥＲＫＩＮ　ＥＬＭＥＲ社製　ＳＰＥＣＴＲＵＭ　２０００を用いて拡散反射法により測定した。用いたゲルは各々のサンプルにおいて３０サイクルのものを交互浸漬されている部分（リン酸カルシウムが形成した部分）だけを削り取り、それを凍結乾燥した後にＦＴ−ＩＲによって同定した（図５）。
【００３７】
Ｃｏｌ／ＨｙＡ０での条件において、ＣＯＯ−：１７４４．３９ｃｍ−１、ａｍｉｄｅＩＩＩ：１２２８．８０ｃｍ−１、ａｍｉｄｅＩＩ：１５３９．９９ｃｍ−１、ａｍｉｄｅＩ：１６５３．４５ｃｍ−１、ＣＯＯ−：１３７８．２３ｃｍ−１。ＨＡｐのＯＨ：３４３７．５０ｃｍ−１、１４４７．７５ｃｍ−１、ＣＯ３２−：１４５６．８２ｃｍ−１、ＰＯ４３−：１０３３ｃｍ−１、６００．５１ｃｍ−１、５６１．９２ｃｍ−１の振動が見られた。
【００３８】
Ｃｏｌ／ＨｙＡ２での条件において、ａｍｉｄｅＩＩＩ：１２３２．５９ｃｍ−１、ａｍｉｄｅＩＩ：１５４０．２３ｃｍ−１、ａｍｉｄｅＩ：１６５１．８８ｃｍ−１、ＣＯＯ−：１３７９．０７ｃｍ−１。ＨＡｐのＯＨ：３３０４．８１ｃｍ−１、ＣＯ３２−：１４５６．０９ｃｍ−１、１４４３．　０９ｃｍ−１、ＰＯ４３−：１０３８ｃｍ−１、６００．９０ｃｍ−１、５６２．８９ｃｍ−１の振動が見られた。
【００３９】
Ｃｏｌ／ＨｙＡ１０での条件において、ａｍｉｄｅＩＩＩ：１２３１．９４ｃｍ−１、ａｍｉｄｅＩＩ：１５３０．０４ｃｍ−１、ａｍｉｄｅＩ：１６６２．３４ｃｍ−１、ＣＯＯ−：１３７９．４７ｃｍ−１。ＨＡｐのＯＨ：３３０６．２２ｃｍ−１、ＣＯ３２−：１４５６．３９ｃｍ−１、１４４３．６２ｃｍ−１、ＰＯ４３−：１０３８ｃｍ−１、６００．８８ｃｍ−１、５６３．０４ｃｍ−１の振動が見られた。
【００４０】
２．５　示差熱量分析による無機成分の定量
凍結乾燥した軟骨マトリックスをＴＲｉｇａｋｕ社製　ｈｅｒｍｏ　ｐｌｕｓ　ＴＧ　８１２０を用いて示差熱量分析を行い、有機成分を除去し、残存する無機成分含有量（％）を算出した（図６）。無機成分含有量は、サイクル数が増加するに従い増加した。ヒアルロン酸の濃度依存性は、認められなかった。用いた架橋剤の濃度範囲では、無機成分含量に差異は認められなかった。
【００４１】
２．６　電子顕微鏡観察
走査型電子顕微鏡（ＪＳＭ−５６００ＬＶ：ＪＥＯＬ社製、倍率：×１００００（反応面）、×２００（未反応面））により反応面（ｔｏｐ）と未反応面（ｂｏｔｔｏｍ）の表面観察を行った（図７）。反応面にはリン片状の物質が確認された。未反応面では細胞が入るのに充分な大きさ（５０〜２００μｍ）の細孔を持ったスポンジ状のポアサイズを持っていた。
【００４２】
【発明の効果】
本発明によれば、リン酸カルシウムが傾斜化して含有される生分解性高分子材料が提供される。該生分解性高分子材料は、硬組織との接着が良く、しかも軟組織の細胞の分化・増殖のための優れた足場となりうる。すなわち、該生分解性高分子材料は硬組織−軟組織界面再生用足場材料または硬組織−軟組織補填用インプラントとして利用しうる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明の足場材料作製のための装置を示す。
【図２】図２は、作製された足場材料を実体顕微鏡で観察した断面を示す写真である
【図３】図３は、作製された足場材料の断面を元素分析した結果を示す。
【図４】図４は、作製された足場材料のＸ線回折結果を示すグラフである（Ａ：Ｃｏｌ／ＨｙＡＯ、Ｂ：Ｃｏｌ／ＨｙＡ２、Ｃ：Ｃｏｌ／ＨｙＡ１０）。
【図５】図５は、作製された足場材料の赤外吸収スペクトルを示すグラフである。
【図６】図６は、示差熱量分析による無機成分による無機成分定量結果を示すグラフである。
【図７】図７は、電子顕微鏡による表面観察結果を示す画像である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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