(57)【要約】【解決手段】リパーゼＣＳ２を有効成分とする生分解性プラスチック分解剤が提供される。リパーゼＣＳ２は、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．Ｓ−２から生産され、あるいは組換えＤＮＡ技術によって生産され、今回明らかになったそのアミノ酸配列から、クチナーゼとの類似性が高いため、ポリ乳酸等のほか、ポリエステル系プラスチック分解作用も有するものである。【効果】代表的な生分解性プラスチックであるポリ乳酸は、これを効率的に分解する酵素は実質的に見出されておらず、使用後の廃棄物処理技術が開発されていないため、有用性が最近クローズアップされているポリ乳酸の利用が妨げられていたが、本酵素によりそれが可能となり、本発明は環境汚染防止技術としてもすぐれている。【選択図】　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
リパーゼＣＳ２を有効成分とすること、を特徴とする生分解性プラスチック分解剤。
【請求項２】
リパーゼＣＳ２が、クリプトコッカス属酵母由来であること、を特徴とする請求項１に記載の分解剤。
【請求項３】
クリプトコッカス属酵母が、クリプトコッカス　エスピー．Ｓ−２（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．　Ｓ−２）（ＦＥＲＭ　Ｐ−１５１５５）であること、を特徴とする請求項２に記載の分解剤。
【請求項４】
リパーゼＣＳ２が、配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する酵素タンパク質であること、を特徴とする請求項１に記載の分解剤。
【請求項５】
酵素タンパク質が、アミノ酸配列（配列番号１）と高い類似性を有するものであるか、あるいは、アミノ酸配列（配列番号１）上クチナーゼに類似性を有するものであること、を特徴とする請求項４に記載の分解剤。
【請求項６】
生分解性プラスチックが、ポリ乳酸系プラスチック（ＰＬＡ）、コハク酸ポリエステル系プラスチック、ポリエステルアミド系プラスチック、ポリカプロラクトン系プラスチック（ＰＣＬ）、ポリヒドロキシブチレート系プラスチック（ＰＨＢ）、ポリエステル系プラスチックから選ばれる少なくともひとつであること、を特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の分解剤。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリ乳酸分解剤。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の分解剤を用いて生分解性プラスチックを処理すること、を特徴とする生分解性プラスチックの分解方法。
【請求項９】
クリプトコッカス属に属するリパーゼＣＳ２生産菌を培養し、得られた培養物又はその処理物を生分解性プラスチックと接触せしめること、を特徴とする生分解性プラスチックの分解方法。
【請求項１０】
配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子のＤＮＡであって、その塩基配列が配列番号２で示されるＤＮＡを含んでなる組換えベクターを酵母に導入し、得られた形質転換体を利用して製造したリパーゼＣＳ２活性を有するタンパク質又はその含有物を生分解性プラスチックと接触せしめること、を特徴とする生分野性プラスチックの分解方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、プラスチック、特に生分解性プラスチックの分解に関するものであり、更に詳細には、特定のリパーゼを用いて、ポリ乳酸等の生分解性プラスチックを分解する新規技術に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
日本におけるプラスチックの年間生産量は約１５００万トン（２０００年統計）であり、その内、生分解性プラスチックの生産量は低く、約２０００〜２５００トンである。このように、生分解性プラスチックは、廃棄物処理及び廃棄物による環境汚染が深刻な問題となっている今日において、非常に有用性が高いにもかかわらず、その生産量は低いままとなっているが、その理由は、主として従来のプラスチックに比して価格が高いこと、及び、生分解性とはいっても、効率的に分解する技術が確立されていないことが挙げられる。
【０００３】
近年、生分解性プラスチック（生分解性高分子）として、ポリ乳酸（ＰＬＡ）がクローズアップされている。ＰＬＡは、トウモロコシデンプンから発酵によって得た乳酸をポリマー化したものであって、成形性にすぐれ、透明性が高く、強度もあるため、容器、包装フィルム、農園芸用フィルム、土木用シート、繊維、衣料等広範な用途を有し、インプラントの材料として医薬の分野でも実用されており、植物から作られるプラスチックとして、環境、資源面でも期待されており、２００１年において大量生産が開始されている（カーギル・ダウ社、米国）。
【０００４】
ポリ乳酸は、上記のようにプラスチックとしては優れた性質を有し、価格も低減化が期待され、大きな供給拡大が予想されるが、その反面、生分解性プラスチックとはいいながら、一方で非酵素型分解プラスチックともいわれ、それを有効に分解する酵素は実質的にほとんど知られていないのが現状である。
【０００５】
生分解性プラスチックの分解作用は微生物由来の分泌酵素によるものであると考えられているが、高分子ポリ乳酸の分解においては現在のところプロテアーゼ（タンパク質分解酵素）での分解が確認されているのみである。これまでに、プロテアーゼ以外での高分子ポリ乳酸分解酵素は報告されていない。しかも、プロテアーゼによる分解作用も充分に満足できるものではない。ましてや、リパーゼによるポリ乳酸の分解に成功した例は、従来全く報告されていない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
上記したように、ポリ乳酸は植物由来のすぐれた生分解性プラスチックであって、近い将来、その利用が大幅に拡大されると、いくら生分解性を有するといってもその廃棄物処理に対しては、能動的かつ有効な処理手段を構築する必要がある。また、他の生分解性プラスチックも同様である。
そこで、本発明では、ポリ乳酸を中心として生分解性プラスチックの分解に対する有効な酵素利用を提案することを目的として新たに設定したものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
上記したように、ポリ乳酸系プラスチックは、生分解性プラスチックに分類されながら非酵素分解型プラスチックといわれ、分解の困難なプラスチックであり、それを効率よく分解する酵素はあまり知られていない。特にリパーゼに属する酵素においては、その分解性を有する酵素の報告例はない。事実、後記するところからも明らかなように、市販のリパーゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ、Ｃａｎｄｉｄａ　ｒｕｇｏｓａ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ｏｒｙｚａｅ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｓｐ．、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉ由来の市販のリパーゼ）については、いずれも、ポリ乳酸の分解活性は確認できなかった。
【０００８】
このように、ポリ乳酸系プラスチックなど、生分解性といわれるプラスチックもそれを有効に分解する酵素があまり知られておらず、通常は、土の中でその分解を行うため、リサイクルに向かないプラスチックであると言われてきた。
【０００９】
このような技術の現状において、つまり、生分解性プラスチックを有効に分解する酵素はあまり知られておらず、工業化に成功した報告はなされておらず、また、従来のリパーゼについてはポリ乳酸を分解するのではなくこれとは全く逆にポリ乳酸を分解しないことが確認されているにもかかわらず、本発明者らは、あえて再度、酵素の分解に着目して、生分解性プラスチック分解酵素の広範なスクリーニングを鋭意実施した。
【００１０】
その結果、全く予期せざることに、特定の酵母由来の酵素、しかも特定のリパーゼであるリパーゼＣＳ２が、ポリ乳酸を分解できること、しかもプロテアーゼとの比較においても本酵素がより高いポリ乳酸分解能力を示すことを新たに確認した。従来、プロテアーゼ以外では高分子ポリ乳酸分解酵素は報告されておらず、本知見は全く新規なものである。また、更なる研究の結果、リパーゼＣＳ２は他の生分解性プラスチックも分解できることも新たに確認した。
【００１１】
本発明は、これらの有用新知見に基づき、更に研究の結果、遂に完成されたものであって、生分解性プラスチック分解剤及び分解方法に関するものである。
以下、本発明について詳述する。
【００１２】
本発明における有効成分であるリパーゼＣＳ２は、本発明者らによって開発された新規酵素であって、下記の理化学的性質を有し、クリプトコッカス属に属する酵母、例えばクリプトコッカス　エスピー．Ｓ−２（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．　Ｓ−２）（ＦＥＲＭ　Ｐ−１５１５５）の培養物から分離、採取することができる（特開２００１−２５２０７２）。
【００１３】
本酵素の理化学的性質は、次のとおりである。
【００１４】
（１）作用
油脂分解性を有し、トリグリセリドに作用して、グリセリンと脂肪酸に加水分解する。
【００１５】
（２）基質特異性
トリプチリン、トリカプリリン、トリパルミチン、トリオレインをよく分解する。トリアセチン、トリカプリン、トリラウリンは中程度に分解する。トリミリスチン、トリステアリンに対する分解力は弱い。
【００１６】
（３）位置特異性
トリオレインに作用せしめると、オレイン酸と少量の１，２（２，３）−ジオレインが生成し、１，３−ジオレインとモノオレインは検出されない。
【００１７】
（４）至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲
至適ｐＨ：７．０
安定ｐＨ範囲：５〜９
【００１８】
（５）反応最適温度及び温度による失活の条件
反応最適温度：３７℃
温度による失活の条件：温度上昇による活性の失活は緩やかであり、６０℃、３０分の熱処理においても活性を維持している。
【００１９】
（６）有機溶媒に対する安定性、活性化
有機溶媒に安定であり、更に、ジメチルスルホキシド、ジエチルエーテルによって活性が上昇する。
【００２０】
（７）分子量
２２ｋＤａ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
【００２１】
上記した理化学的性質を有する本酵素は、微生物、例えばクリプトコッカス属に属するＳ−２株（ＦＥＲＭ　Ｐ−１５１５５）（以下、Ｓ−２株ということもある）の培養物から分離、取得することができる。ここに創製分離された菌株は、新規酵素（リパーゼＣＳ２）を生産分泌できる点できわめて特徴的であり、これをＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．　Ｓ−２と命名し、工業技術院生命工学工業技術研究所（現、独立行政法人　産業技術総合研究所　特許生物寄託センター）にＦＥＲＭ　Ｐ−１５１５５として寄託した。
【００２２】
本酵素は、Ｓ−２株を常法にしたがって培養し、培養物から分離、精製することにより取得することができる。例えば、ＹＭ培地（酵母エキス０．３％、麦芽エキス０．５％、ペプトン０．５％、グルコース１％）にて２５℃、４０時間前培養（５．４〜５．８×１０８ケ／ｍｌ）した菌体を通常の本培養への接種菌とする。
【００２３】
酵母エキス０．５％、ＫＨ２ＰＯ４　１％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、トリオレイン１％を基本とし、必要に応じ、窒素源、炭素源、そして誘導物質を変化させたものを酵素生産培地とした。１００ｍｌの酵素生産培地に、前培養した菌を１％（ｖ／ｖ）接種し、２５℃１００ｒｐｍの振とう培養にて、酵素の生産を行えばよい。トリオレインは添加しなくてもよいが、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．Ｓ−２によるリパーゼの生産はオリーブオイル、トリオレインなどの油脂を炭素源にすることでグルコース培地より約３倍のリパーゼの分泌が見られ、油脂を炭素源にすることでリパーゼの生産は優位に高められる。油脂としては、上記のほかにイワシ油、大豆油、トリグリセリドなどから選ばれる少なくともひとつを使用すると好適である。
【００２４】
Ｓ−２株の培養は、酵母の培養と同様に実施すればよいが、上記のように炭素源として油脂を使用すると酵素の生産が上昇する。また、窒素源として酵母エキス、糖としてラクトースを追加使用することで、酵素の生産がさらに上昇する。
【００２５】
Ｓ−２株を培養した後、本酵素を培養物から分離、精製する。その方法は常法にしたがえばよいが、例えば培養液を濃縮した後、クロマトグラフィー処理（陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー等）等既知の精製法を単独、くり返し、組み合わせて適宜実施すればよい。
【００２６】
本発明においては、有効成分として、上記した精製酵素のほか、充分に精製することなく粗製のままの酵素も使用可能である。粗製酵素としては、上記した精製工程の途中で得られる各種の中間精製物のほか、培養物、培養上清、培養液、それらの処理物（例えば、濃縮物、ペースト状物、乾燥物、乾燥粉末等）も適宜使用可能である。
【００２７】
また、リパーゼＣＳ２については、上記した発酵法、つまり酵母の培養による製法のほか、本発明者らは、更に、遺伝子レベルでの検討も行い、その結果、本酵素のアミノ酸配列及びそれをコードする遺伝子ＤＮＡの塩基配列の決定にも、今回、成功した。したがって、今回明らかにされたアミノ酸配列にしたがって酵素タンパク質を合成してもよいし、本遺伝子を含む組換えベクターも創製されたので、組換えＤＮＡ技術を利用して本酵素を工業的に製造することも可能となった。本発明においては、どのような方法で製造した酵素であっても有効成分として使用することができる。
【００２８】
リパーゼＣＳ２遺伝子の解析は、次のようにして行った。精製したリパーゼＣＳ２をタンパク質分解酵素（リシルエンドペプチダーゼ）で処理し断片化した後、そのいくつかの断片につきそのアミノ酸配列を決定した。その部分配列をもとにＤＮＡプライマー（混合プライマー）を設計し、リパーゼＣＳ２遺伝子の内部配列の決定に用いた。次に、液体培養したＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．Ｓ−２の菌体よりｍＲＮＡを調整し、逆転写によりｃＤＮＡの合成を行った。
【００２９】
上記ｃＤＮＡをテンプレートに、上記リパーゼＣＳ２断片化ペプチドより設計したプライマーを用いてリパーゼＣＳ２遺伝子の内部配列（約１８０塩基）をまず決定した。その決定した内部配列を利用し新たなプライマーを設計し、それを用いて３’−及び５’−ＲＡＣＥ法によりリパーゼＣＳ２遺伝子のｃＤＮＡ配列を決定した。このようにして決定したリパーゼＣＳ２遺伝子の全塩基配列を配列番号２（図１）に示し、この塩基配列から推定されるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号１（図１）に示す。
【００３０】
上記のように、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．Ｓ−２より本酵素のｃＤＮＡを取得後、クローニングを行った。そのＤＮＡ配列から推定アミノ酸配列が決定できた。なお、上記に取得したｃＤＮＡをＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ用発現ベクター　ｐＧ−１（ＧＰＤプロモータ、ＰＧＫターミネータ、ＴＲＰ１マーカー）のＢａｍＨＩのクローニングサイトに挿入して組換えベクターを作製した。得られた組換えベクターは、ＣＳ２Ｌｉｐａｓｅ　ｃＤＮＡ＊ｐＧ−１と命名し、これを独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センターにＦＥＲＭ　Ｐ−１８９３９として寄託した。
【００３１】
上記に取得した組換えプラスミドＣＳ２Ｌｉｐａｓｅ　ｃＤＮＡ＊ｐＧ−１（ＦＥＲＭ　Ｐ−１８９３９）を、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ＹＰＨ４９９株に形質転換したところ、トリブチレンを１％濃度で懸濁させたＹＰＤ（酵母エキス１％、ペプトン２％、グルコース２％）プレート上で、形質転換株はトリブチレン分解により生じるハローを形成した。このことで取得したｃＤＮＡが油脂分解活性を有するものであることが確認され、確かに目的のリパーゼＣＳ２をコードするものであることが示された。
【００３２】
本酵素（リパーゼＣＳ２：クチナーゼ）は、各種の生分解性プラスチックを分解することができ、例えば次のようなものが例示される：ポリ乳酸系プラスチック（ＰＬＡ）；コハク酸ポリエステル系プラスチック（ポリブチレンサクシネート（ＰＢＳ系）、ポリエチレンサクシネート（ＰＥＳ系）その他）；ポリエステルアミド系プラスチック；ポリカプロラクトン系プラスチック（ＰＣＬ）；ポリヒドロキシブチレート系プラスチック（ＰＨＢ）；その他。本酵素は、ポリ乳酸分解に対して非常に有効であることが分ったが、本酵素は高分子エステル（クチン）を分解するクチナーゼ（つまり、すぐれたエステル分解酵素）であるところから、各種のポリエステル系プラスチックも有効に分解することができる。
【００３３】
本発明にしたがって生分解性プラスチックを分解するには、酵素とプラスチックを接触させればよく、プラスチックを戸外に堆積し、あるいは地中に埋めておき、これに酵素を添加してもよいし、工業的処理を行う場合には、分解タンク（反応タンク）に必要に応じて細断、粗砕又は粉砕したプラスチックを入れ、これに酵素を添加し、所望に応じて攪拌すればよい。
【００３４】
分解処理は、固体又は液体のいずれの条件下でも実施でき、後者の場合、乳化剤（例えばプライサーフ（第一工業製薬）等）を加えて乳化しておくと好都合である。酵素としては、精製酵素のほか粗製酵素が使用でき、更には、酵母菌体培養物、培養液、これらの処理物が使用でき、また、合成酵素、組換え酵素、配列番号１のアミノ酸配列と高い類似性を有する配列を持つタンパク質、該アミノ酸配列上クチナーゼに類似性を有するタンパク質も適宜、１種又は２種以上併用することができる。
【００３５】
液状での分解において、プラスチックは、界面活性剤を用いて乳化しておくのが好ましく、エマルジョンにおけるプラスチック濃度は、その種類や使用酵素の濃度等によって適宜定められるが、一応の目安として、０．０００１〜１％程度であって、０．０１〜０．５％程度の濃度が通常は使用されるが、酵素の使用量を高めれば更に高濃度とすることも可能である。
【００３６】
このようなプラスチック液に添加する酵素量は、処理するプラスチックの種類や濃度によって相違するが、一応の目安として、上記したプラスチック液を分解する場合、液中の酵素濃度が１ｍｌあたり１ｎｇ〜１μｇ以上、好ましくは５〜５００ｎｇ以上となるように酵素添加量を設定すればよい。なお、コスト面を考慮に入れないのであれば、上記濃度範囲以上の使用ももちろん可能である。このようにして、効率的にプラスチックの分解処理が達成され、しかも、例えばＰＬＡを処理した場合には乳酸が生成するといった構成成分が生成するため、これらの構成成分を再び回収することにより、資源の再利用が図られる。
【００３７】
したがって本分解剤の調製にあたっては、本酵素を有効成分として、液剤、水和剤、乳化剤、粉剤、錠剤、顆粒剤その他常用される製剤技術にしたがって製剤すればよく、有効成分の含有量ないし配合量も、上記した酵素濃度が達成されるよう、適宜設定すればよい。非限定的ではあるが、１〜１０００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１０〜５００ｍｇ／ｍｌの含有割合での製剤が例示される。増賦剤としては、エチレングリコール等が挙げられるし、既述したように、培養物、培養液、それらの処理物をそのまま製剤として用いることも可能である。また、製剤化にあたり、プラスチック乳化用乳化剤を用時調製するよう、別途用意しておいてもよい。
【００３８】
以上、ＰＬＡを代表例とし、廃棄物処理の観点から本発明を説明してきたが、ＰＬＡは、繊維、衣料品等の製造にも使用され、その際、ＰＬＡを全体的及び／又は局部的に分解することにより、繊維、衣料品を柔軟化したり、模様を入れたりして、性質の改善、高品質化を図ったりすることも可能である。したがって、本発明は、廃棄物の分解処理だけでなく、新製品の創造という新しい面も有している点で特徴的である。
【００３９】
以下、本発明の実施例について述べる。
【００４０】
【実施例１】
（１）酵母エキス０．５％、ＫＨ２ＰＯ４　１％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、トリオレイン１％、ラクトース０．５％を含む液体培地に前培養した酵母Ｓ−２菌（ＦＥＲＭ　Ｐ−１５１５５）を１％（ｖ／ｖ）接種し、２５℃、１００ｒｐｍの振とう培養を行った。
【００４１】
（２）次いで、酵素の精製を次のようにして行った。上記により液体培養した培養物から酵母菌体を除いて培養液を得た。このようにして得た培養液を８，０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ遠心分離し、０．４５μｍのメンブランフィルターにて濾過後、限外濾過により濃縮した。陽イオン交換樹脂ＴＳＫ−ｇｅｌ　ＳＰ−５ＰＷカラムによる高速液体クロマトグラフ（ｐＨ７．０リン酸バッファ、およびそれに０．５％ＮａＣｌ添加したものによるグラジエント溶出）によってリパーゼを精製した。活性は１７．１倍、収量は１１．４％であった。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で単バンドとなり、分子量はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより２２ｋダルトンであることが判明した。
その理化学的性質は既述のとおりである。
【００４２】
【実施例２】
（１）組換えＤＮＡ技術によりリパーゼＣＳ２を製造した。先ず、実施例１（１）にしたがって振とう培養し、得られた菌体からｍＲＮＡを抽出し、このｍＲＮＡをもとにｃＤＮＡライブラリーを構築した。
【００４３】
（２）実施例１（２）したがって精製したリパーゼＣＳ２をタンパク質分解酵素（リシルエンドペプチダーゼ）で処理し断片化した後、そのいくつかの断片につきそのアミノ酸配列を決定した。その部分配列をもとにＤＮＡプライマー（混合プライマー）を設計し、リパーゼＣＳ２遺伝子の内部配列の決定に用いた。
【００４４】
（３）リパーゼＣＳ２遺伝子をクローニングするために、先ず、液体培養したＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．Ｓ−２の菌体よりｍＲＮＡを調整し、逆転写によりｃＤＮＡの合成を行った。上記プライマーを用いてリパーゼＣＳ２遺伝子の内部配列（約１８０塩基）をまず決定した。その決定した内部配列を利用し新たなプライマーを設計し、それを用いて３’−及び５’−ＲＡＣＥ法によりリパーゼＣＳ２遺伝子のｃＤＮＡ配列を決定した。このようにして決定したリパーゼＣＳ２遺伝子の全塩基配列を配列番号２（図１）に示し、この塩基配列から推定されるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号１（図１）に示す。
【００４５】
（４）上記に取得したｃＤＮＡをＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ用発現ベクター　ｐＧ−１（ＧＰＤプロモータ、ＰＧＫターミネータ、ＴＲＰ１マーカー）のＢａｍＨＩのクローニングサイトに挿入して、組換えプラスミド　ＣＳ２Ｌｉｐａｓｅ　ｃＤＮＡ＊ｐＧ−１（ＦＥＲＭ　Ｐ−１８９３９）を作成した。
【００４６】
（５）上記に取得した組換えプラスミドを用いてＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ＹＰＨ４９９株に形質転換した。得られた形質転換株は、トリブチレンを１％濃度で懸濁させたＹＰＤ（酵母エキス１％、ペプトン２％、グルコース２％）プレート上で、トリブチレン分解により生じるハローを形成した。このことで取得したｃＤＮＡが油脂分解活性を有するものであることが確認され、確かに目的のリパーゼＣＳ２をコードするものであることが示された。
【００４７】
（６）上記のとおり、リパーゼＣＳ２遺伝子（クチナーゼ）の全塩基配列（１の位置（ＡＴＧ）〜７２０の位置（ＴＡＡ）まで）を決定した（配列番号２（図１）。また、この塩基配列から推定されるタンパク質は、２３９残基であることが明らかとなった。
【００４８】
（７）このようにして、ＤＮＡ配列からリパーゼＣＳ２の推定アミノ酸配列（配列番号１：図１）が決定された。このアミノ酸配列より計算される分子量は、本精製酵素のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析による結果と矛盾しないものであった。本酵素のアミノ酸配列と既知のタンパク質配列データベースとの相同性をＢＬＡＳＴを用いて解析した結果、脂質分解酵素であるリパーゼの１種であるクチナーゼとの類似性が確認され、本発明に係るリパーゼＣＳ２は、既述の理化学的性質を有し、また、アミノ酸配列より、クチナーゼであることも確認された。また、今回決定された本発明酵素のアミノ酸配列及び塩基配列は、従来知られておらず、全く新規であることも判明した。
【００４９】
【実施例３】
（酵素分解測定法の確立）
ポリ乳酸の活性測定法としてエマルジョンを用いた、吸光度（この場合、濁度）の減少を利用した方法を検討した。
まず、本法の定量性を検証するために、吸光度とＰＬＡ濃度の線形性の確認した。すなわち、Ｓｈｉｍａｚｕ　ＵＶ−１６００を用いた吸光度とＰＬＡ濃度の線形性の確認を行い、その結果、非常によい線形性と再現性を確認できた。
【００５０】
続いて、経時的に酵素反応を測定するために、バイオフォトレコーダー（ＡＤＶＡＮＴＥＣ　ＴＮ−１５０６）の利用を試みた。測定値の信頼性を確認するために、その線形性を検討した。その結果、各ＣＨ（トータル６ＣＨ）でのばらつきはあるが、非常によい線形性を確認できた。
【００５１】
【実施例４】
ＰＬＡは、界面活性剤（プライサーフ（第一工業製薬））を用いて乳化した後、溶液状態及びアガロースプレート上での各酵素の活性を検討した。
【００５２】
（１）ＰＬＡを含むアガロースプレート上でのＰＬＡ分解活性を次のようにして検討した。
それぞれの酵素液（１００ｍｇ／ｍｌ）を２０マイクロリットルずつプレート上に添加し、３０℃、１２時間放置した。その結果、本酵素は、粗酵素（培養上清の濃縮物）及び精製酵素のいずれもがＰＬＡを分解し、しかも後者の分解度は前者よりも高いのに対し、市販のリパーゼは全くＰＬＡの分解を示さないことが確認された。
【００５３】
市販酵素（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ、Ｃａｎｄｉｄａ　ｒｕｇｏｓａ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ｏｒｙｚａｅ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｓｐ．由来）：本酵素（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．Ｓ−２由来の粗酵素及び精製酵素）。
【００５４】
（２）ＰＬＡエマルジョンに本粗酵素（５０μｌ：マイクロリットル）を添加して、３７℃、２１時間放置した。その結果、ＰＬＡエマルジョンは清澄化した。これに対して、コントロール（５０μｌ：水）では清澄化せず、混濁のままであり、ＰＬＡエマルジョンに対するリパーゼＣＳ２による分解活性が溶液レベルにおいても確認された。
【００５５】
【実施例５】
（リパーゼＣＳ２によるＰＬＡ分解：　本酵素とＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｋ及び他のリパーゼとの比較）
【００５６】
（１）下記する実験条件によりＰＬＡ分解実験を行い、図２の結果を得た。
【００５７】
（実験条件）
０．０４％ＰＬＡエマルジョン
２０ｍＭ　ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．０）
３０℃
ポリ乳酸の分解は６６０ｎｍの吸光度の減少量で評価した。
＊　Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　ＫはＭｅｒｃｋ社（Ｎｏ．１２４５６８）を使用した。
＊　μｇ：マイクログラム
【００５８】
上記結果から明らかなように、本酵素がポリ乳酸エマルジョンを分解していることを定量的に示した。
さらに、有機酸分析により分解産物として乳酸モノマーが産生していることも確認された。
【００５９】
Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｋ（Ｔｒｉｔｉｒａｃｈｉｕｍ　ａｌｂｕｍ）及び、他のリパーゼを用いてポリ乳酸分解実験を行った。これまで、ポリ乳酸の分解にはＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｋによる分解が示されてきたが、本酵素は５００倍以上（酵素重量当たり）の効率でポリ乳酸を分解することが分った。
【００６０】
さらに同じ条件下で、次の４種のリパーゼ（０．４ｍｇ／ｍｌ）についても同様の分解実験を行ったが、ポリ乳酸の分解は確認できなかった。
（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ、Ｃａｎｄｉｄａ　ｒｕｇｏｓａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｓｐ．、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉ由来リパーゼ（市販のものを利用））
【００６１】
（２）更にＰＬＡの分解反応を継続し、３０℃、１０日後におけるＰＬＡ分解反応後の反応溶液の状態を目視により観察した。その状態を図３（図面代用写真）に示した。図中、左からそれぞれ次のものを表わす。
【００６２】
コントロール（ｎｏ　ｅｎｚｙｍｅ）
Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｋ（０．８μｇ／ｍｌ）
リパーゼＣＳ２（０．８μｇ／ｍｌ）
Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｋ（４００μｇ／ｍｌ）
リパーゼＣＳ２（０．０８μｇ／ｍｌ）
【００６３】
上記結果から明らかなように、本酵素（ｃｕｔｉｎａｓｅ）で処理されたポリ乳酸エマルジョンは分解され、透明になっているのが分かる。同じ酵素濃度（０．８μｇ／ｍｌ）でポリ乳酸を処理したところ、Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｋでは、完全に分解されず、本酵素では完全に分解されている。さらに、本酵素濃度をさらに１／１０に設定（０．０８μｇ／ｍｌ）した場合でも、完全に分解されていることがわかる。
【００６４】
【実施例６】
（他の生分解性プラスチック（ＰＢＳ、ＰＣＬ）の分解）
【００６５】
（１）下記する実験条件によりＰＢＳ（ポリブチレンサクシネート）の分解実験を行い、図４の結果を得た。
【００６６】
（実験条件）
０．０４％ＰＢＳ
２０ｍＭ　ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．０）
２０〜８０ｎｇ／ｍｌ　リパーゼＣＳ２
３０℃
酵素濃度はＰＬＡの場合の１／１０以下に設定した。
（反応溶液中の酵素濃度はグラフ中に表記）。
【００６７】
上記結果から明らかなように、用いた条件下では、約３０分以内にＰＢＳは本酵素により完全に分解された。前記のポリ乳酸の場合よりも酵素濃度を１／１０以下に設定したにもかかわらず、非常に迅速に分解反応は進行した。
さらに本酵素濃度を１／５まで下げて（２０ｎｇ／ｍｌ）分解実験を行ったところ、１時間以内で速やかにＰＢＳは分解された。
【００６８】
（２）３０℃、２日後におけるＰＢＳ分解反応後の反応溶液の状態を目視により観察した。その状態を図５（図面代用写真）に示した。図中、左は、コントロール（ｎｏ　ｅｎｚｙｍｅ）、右はリパーゼＣＳ２（８０ｎｇ／ｍｌ）を表わす。
【００６９】
上記結果から明らかなように、本酵素で処理されたＰＢＳエマルジョンは分解され、透明になっているのが分かる。
【００７０】
（３）ＰＬＡ、ＰＢＳと同様に、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）についても、本酵素による分解実験を行い、３０℃、２日後におけるＰＣＬ分解反応後の反応溶液の状態を目視により観察した。その状態を図６（図面代用写真）に示した。図中、左は、コントロール（ｎｏ　ｅｎｚｙｍｅ）、右はリパーゼＣＳ２（８０ｎｇ／ｍｌ）を表わす。
【００７１】
上記結果から明らかなように、本酵素で処理されたＰＣＬエマルジョンは分解され、透明になっているのが分かる。
【００７２】
【発明の効果】
本酵素は、生分解性プラスチック（ＰＬＡ、ＰＢＳ、ＰＣＬ）の経時的酵素分解を示した。どの生分解性プラスチックに対しても、本酵素は有効に分解することが分かった。
【００７３】
特に、本酵素は、高分子ポリ乳酸の分解に非常に有効であることが示された。これまでポリ乳酸分解能を持つと言われているＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｋと比較しても、用いた条件下で５００倍以上の分解効率を示した。さらに、ＰＢＳ分解に対しても非常に有効であることが分かった。その分解能力はポリ乳酸に対するものより遥かに高いものであった。また、同様にＰＣＬに対しても本酵素は非常に高い分解能力を示した。リパーゼの中には脂質分解のみならずポリエステルに対する分解能力を持つものは存在するが、本酵素の高分子ポリエステル分解能は非常に高いものであり、なおかつ多種の基質に対して作用することから、非常に幅広い基質特異性を持つ酵素であることがわかる。
【００７４】
このように本発明は、本酵素を使用することによって、生分解性プラスチックを効率的に分解することができ、廃棄物処理技術としてすぐれており、例えば量産化が予定されているＰＬＡについても、その使用後における効率的処理が充分に可能であり、しかもその際、乳酸が生産されるため、これを再利用することができる。
【００７５】
そのうえ更に、本酵素は、これをポリ乳酸系プラスチックやその他プラスチックに作用させ、その加工に用いたり、ポリ乳酸系プラスチックやその他プラスチック繊維に作用させ、その肌触りや染色性を向上させたりして、プラスチックの性質を改善し、高品質の繊維や衣料品等の新規製造も可能とするものである。
【００７６】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】リパーゼＣＳ２のアミノ酸配列（下段）及びそれをコードするＤＮＡの塩基配列（上段）を示す。
【図２】ポリ乳酸の分解実験の結果を示す。
【図３】ポリ乳酸分解反応後の反応溶液（３０℃、１０日）の状態を示す図面代用写真である。
【図４】ポリブチレンサクシネートの分解実験の結果を示す。
【図５】ポリブチレンサクシネート分解反応後の反応溶液（３０℃、２日）の状態を示す図面代用写真である。
【図６】ポリカプロラクトン分解反応後の反応溶液（３０℃、２日）の状態を示す図面代用写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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