(57)【要約】【課題】新規な遺伝子またはタンパク質（未知因子）を効率よく予測する方法、未知因子を効率よく検出する方法並びに、未知因子を取得する方法および当該取得方法により得られる未知因子を提供することを課題とする。【解決手段】探索対象とする未知因子と関連するタンパク質群に共通の配列を特定しキー配列を設定し、キー配列と類似する配列を検索し、コア配列候補群を得て、コア配列候補群を構成する各コア配列候補に優先順位を付け、コア配列候補群から優先順位に従って配列を選択し、第１のコア配列を設定し、第１のコア配列の端部を伸長可能な重複部位を有する配列を検索し、検索された配列を第１のコア配列の端部に重ねて第１のコア配列を伸長させ第２のコア配列を作成し、第２のコア配列がＯＲＦ条件を備える配列であるか判別して、未知因子の予測する。さらに、予測された未知因子が実在するかを実際に細胞において確認する。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
探索対象とする未知因子と関連するタンパク質群に共通の配列を特定しキー配列を設定する、キー配列設定工程と、
キー配列と類似する配列を検索し、コア配列候補群を得る、コア配列候補群検索工程と、
コア配列候補群を構成する各コア配列候補に優先順位を付ける、優先順位付け工程と、
コア配列候補群から優先順位に従って配列を選択し、第１のコア配列を設定し、第１のコア配列の端部を伸長可能な重複部位を有する配列を検索し、検索された配列を第１のコア配列の端部に重ねて第１のコア配列を伸長させ第２のコア配列を作成し、第２のコア配列がＯＲＦ条件を備える配列であるか判別する新規配列作成工程と、
を備える、未知因子の配列予測方法。
【請求項２】
コア配列候補群検索工程におけるキー配列と類似する配列の検索、および、新規配列作成工程における重複部位を有する配列の検索を、ＥＳＴデータベースに納められたデータから検索することを特徴とする、請求項１に記載の未知因子の配列予測方法。
【請求項３】
第２のコア配列がＯＲＦ条件を備えない場合、当該第２のコア配列を新たに第１のコア配列として設定し、
第１のコア配列を伸長させ第２のコア配列を作成し第２のコア配列がＯＲＦ条件を備える配列であるか判別する処理を繰り返すことを特徴とする、請求項１または２に記載の未知因子の配列予測方法。
【請求項４】
前記繰り返す処理を所定基準に従って停止し、コア配列候補群の次の優先順位が付けられたコア配列候補を、新たな第１のコアに設定する、請求項３に記載の未知因子の配列予測方法。
【請求項５】
コア配列候補群に付ける優先順位の基準を、コア配列候補とキー配列との類似性に基づいて設定することを特徴とする、請求項１または２に記載の未知因子の配列予測方法。
【請求項６】
コア配列候補群に付ける優先順位の基準を、キー配列とコア配列候補の対応部分との類似性が５０〜７０％の間の数値に定め、定められた基準値に近似する順とする、請求項３に記載の未知因子の配列予測方法。
【請求項７】
探索対象とする未知因子と関連するタンパク質群に共通の配列を特定しキー配列を設定する、キー配列設定工程と、
前記関連するタンパク質群からキー配列と類似する配列を検索し、コア配列候補群を得る、コア配列候補群検索工程と、
コア配列候補群を構成する各コア配列候補に優先順位を付ける、優先順位付け工程と、
コア配列候補群から優先順位に従って配列を選択し、第１のコア配列を設定し、第１のコア配列の端部を伸長可能な重複部位を有する配列を検索し、検索された配列を第１のコア配列の端部に重ねて第１のコア配列を伸長させ第２のコア配列を作成し、第２のコア配列がＯＲＦ条件を備える配列であるか判別する、新規配列作成工程と、
新規配列作成工程で得られた配列が、実在するかを確かめる実験工程と、
を備える、未知因子の検出方法。
【請求項８】
探索対象とする未知因子と関連するタンパク質群に共通の配列を特定しキー配列を設定する、キー配列設定工程と、
前記関連するタンパク質群からキー配列と類似する配列を検索し、コア配列候補群を得る、コア配列候補群検索工程と、
コア配列候補群を構成する各コア配列候補に優先順位を付ける、優先順位付け工程と、
コア配列候補群から優先順位に従って配列を選択し、第１のコア配列を設定し、第１のコア配列の端部を伸長可能な重複部位を有する配列を検索し、検索された配列を第１のコア配列の端部に重ねて第１のコア配列を伸長させ第２のコア配列を作成し、第２のコア配列がＯＲＦ条件を備える配列であるか判別する、新規配列作成工程と、
新規配列作成工程で得られた配列が実在するか確かめ、実在が確認された未知因子を取得する取得工程と、
を備える未知因子の取得方法。
【請求項９】
請求項８に記載の取得方法により得られるタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、未知の遺伝子またはタンパク質（未知因子）の配列予測方法等に関し、詳しくは、未知因子の配列を効率よく予測する方法、当該方法を用いて未知因子を検出する方法、取得する方法、および当該取得方法により得られた未知因子に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、ある遺伝子のリン酸化あるいは脱リン酸化による活性化状態への変化などのように現象としての状態変化は判っていても、これを実行する因子を効率よく絞り込む方法は実質上、実験的に特定していかざるを得ず、極めて煩雑であり多大な労力を要した。しかも、最終的に結果を得るまでは、未知因子を特定できるかどうか予測することが困難であった。
【０００３】
生物情報処理関係では、ゲノム解読等で新しい核酸配列が判明したとき、それが、既存のタンパク質として存在するかどうか調べる方法は存在しており（例えば非特許文献１など）、配列の類似性などからその大雑把な機能を推定することは試みられていた。しかし、既知の配列情報に基づいて、新規なタンパク質を具体的な機能と共に予測することを効率的に行う方法は確立されていなかった。
【０００４】
また、既知の配列情報からプローブやプライマーを作製し、類縁関係にある遺伝子またはタンパク質を探索することも試みられている。しかしながら、新規な遺伝子またはタンパク質の探索には未だ多大の労力を要するのが実状であった。
【０００５】
【非特許文献１】
Ｂｉｏｉｎｆｏｍａｔｉｃｓ：Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，  Ｄａｖｉｄ  Ｗ．  Ｍｏｕｎｔ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  ２００１
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記のような状況の下、新規な遺伝子やタンパク質（未知因子）を効率よく予測する方法を提供することを課題とする。また、本発明は、未知因子を効率よく検出する方法を提供することを課題とする。また、本発明は、未知因子を取得する方法および当該取得方法により得られる遺伝子またはタンパク質を提供することを課題とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明は、上記課題を解決するものであり、類似性をもつ配列部位を手がかりにしてコアとなる配列を設定し、それを含む配列を伸長していき、新たな配列のコード領域を予測する方法であり、さらに、予測された配列について実細胞より得られるｃＤＮＡ等と比較照合して確認することで、新たな配列に基づく新たな遺伝子やタンパク質を特定していく方法であり、極めて効果的に未知因子を絞り込める方法である。なお、本明細書において「未知因子」とは、遺伝子またはタンパク質のことを指す。
【０００８】
本発明は下記のような手段を採用するものである。
〔１〕  探索対象とする未知因子と関連するタンパク質群に共通の配列を特定しキー配列を設定する、キー配列設定工程と、
キー配列と類似する配列を検索し、コア配列候補群を得る、コア配列候補群検索工程と、
コア配列候補群を構成する各コア配列候補に優先順位を付ける、優先順位付け工程と、
コア配列候補群から優先順位に従って配列を選択し、第１のコア配列を設定し、第１のコア配列の端部を伸長可能な重複部位を有する配列を検索し、検索された配列を第１のコア配列の端部に重ねて第１のコア配列を伸長させ第２のコア配列を作成し、第２のコア配列がＯＲＦ条件を備える配列であるか判別する、新規配列作成工程と、
を備える、未知因子の配列予測方法。
【０００９】
上記〔１〕の構成を採ることにより、実在する関連するタンパク質群の配列に基づいてキー配列を設定し、キー配列と類似性を有するコア配列候補に優先順位をつけて、適宜コア配列を伸長させていくため、実在する可能性が高く、また、既存の配列とは異なる、未知因子の配列を効率よく予測し、配列を特定することができる。また、漠然とした機能・現象しか判明しておらず、具体的に関与する因子が特定されないような状況下で、関連する因子を新たに見いだそうとする場合に好適である。
【００１０】
〔２〕  コア配列候補群検索工程におけるキー配列と類似する配列の検索、および、新規配列作成工程における重複部位を有する配列の検索を、ＥＳＴデータベースに納められたデータから検索することを特徴とする、上記〔１〕に記載の未知因子の配列予測方法。
【００１１】
ＥＳＴデータベースに納められている配列は、配列精度の誤差が大きいとも言われるが、ＥＳＴデータベースの情報量は膨大であり、未知のタンパク質を予測するのに適している。
【００１２】
〔３〕  第２のコア配列がＯＲＦ条件を備えない場合、当該第２のコア配列を新たに第１のコア配列とし、
第１のコア配列を伸長させ第２のコア配列を作成し第２のコア配列がＯＲＦ条件を備える配列であるか判別する処理を繰り返すことを特徴とする、上記〔１〕または〔２〕に記載の未知因子の配列予測方法。
【００１３】
上記〔３〕のような繰り返し処理を行うことにより、ＯＲＦの条件を満たす配列が見いだされるまで、順次配列を伸長させていくことができる。
【００１４】
〔４〕  前記繰り返す処理を所定基準に従って停止し、コア配列候補群の次の優先順位が付けられたコア配列候補を、新たな第１のコアに設定する、上記〔３〕に記載の未知因子の配列予測方法。
【００１５】
上記〔４〕の構成を採用することにより、探索対象の未知因子を見いだすために無意味なコア配列の伸長を避け、新たなコア配列候補に基づき処理が進められるため、効率的な未知因子の予測が可能である。
【００１６】
〔５〕  コア配列候補群に付ける優先順位の基準を、コア配列候補とキー配列との類似性に基づいて設定することを特徴とする、上記〔１〕または〔２〕に記載の未知因子の配列予測方法。
【００１７】
上記〔５〕の構成を採用することにより、予測方法の確実性および効率を調整することが可能である。すなわち、類似性の高い配列の優先順位を高くすると、作成される配列が実在する可能性は高いものの、既知の配列と実質同じ配列になる可能性も高くなりやすい。他方、類似性の低い配列の優先順位を高くすると、実在する可能性が低くなり、また新たな配列を作成するまでの処理量が増える可能性もあるが、まったく異なる系統の未知因子を見いだすことができる可能性が高まる。
【００１８】
〔６〕  コア配列候補群に付ける優先順位の基準を、キー配列とコア配列候補の対応部分との類似性が５０〜７０％の間の数値に定め、定められた基準値に近似する順とする、上記〔３〕に記載の未知因子の配列予測方法。
【００１９】
優先順位の基準を、コア配列候補とキー配列との類似性が５０〜７０％、より好ましくは５５〜６５％、特に好ましくは約６０％とすることにより、新規なタンパク質を探し出すという目的と、探し出すまでの処理の量を抑制しつつ、実在可能性の高い、新規なタンパク質を予測するという目的を効率的に達成できる。
【００２０】
〔７〕  探索対象とする未知因子と関連するタンパク質群に共通の配列を特定しキー配列を設定する、キー配列設定工程と、
前記関連するタンパク質群からキー配列と類似する配列を検索し、コア配列候補群を得る、コア配列候補群検索工程と、
コア配列候補群を構成する各コア配列候補に優先順位を付ける、優先順位付け工程と、
コア配列候補群から優先順位に従って配列を選択し、第１のコア配列を設定し、第１のコア配列の端部を伸長可能な重複部位を有する配列を検索し、検索された配列を第１のコア配列の端部に重ねて第１のコア配列を伸長させ第２のコア配列を作成し、第２のコア配列がＯＲＦ条件を備える配列であるか判別する、新規配列作成工程と、
新規配列作成工程で得られた配列が、実在するかを確かめる実験工程と、
を備える、未知因子の検出方法。
【００２１】
上記〔１〕から〔６〕で作成される遺伝子またはタンパク質の配列は、データベースなどの配列情報に基づき創作された仮想の配列である。したがって、実在を確かめる実験工程を加えることにより、新たな遺伝子またはタンパク質を見つけ出すという当初の目的が達成される。また、実験によってまったく新規に遺伝子またはタンパク質を探索するのに比べ、〔７〕のような構成を採用することにより、新規であって実在する可能性が高い配列の対象が絞られるため、新規遺伝子またはタンパク質探索に要する実験労力を大幅に低減することができる。また、従来は既知の配列からプローブやプライマーを作成し、類縁関係にある配列を見いだすという手法が採られていたが、〔７〕のような構成の検出方法によれば、全体の配列自体は創作であるため、同じ機能を有するタンパク質であって配列の類縁性が低いもの、すなわち、新規性の高い配列を見いだせる可能性がある。なお、本明細書において新規性が高いというのは、従来の知見と異なる程度が大きい、あるいは、斬新なという意味で用いる。
【００２２】
〔８〕  探索対象とする未知因子と関連するタンパク質群に共通の配列を特定しキー配列を設定する、キー配列設定工程と、
前記関連するタンパク質群からキー配列と類似する配列を検索し、コア配列候補群を得る、コア配列候補群検索工程と、
コア配列候補群を構成する各コア配列候補に優先順位を付ける、優先順位付け工程と、
コア配列候補群から優先順位に従って配列を選択し、第１のコア配列を設定し、第１のコア配列の端部を伸長可能な重複部位を有する配列を検索し、検索された配列を第１のコア配列の端部に重ねて第１のコア配列を伸長させ第２のコア配列を作成し、第２のコア配列がＯＲＦ条件を備える配列であるか判別する、新規配列作成工程と、
新規配列作成工程で得られた配列が実在するか確かめ、実在が確認された未知因子を取得する取得工程と、
を備える未知因子の取得方法。
【００２３】
上記〔８〕の構成を採用することにより、ごくわずかな手がかりから新規な遺伝子またはタンパク質を効率的に取得することができる。
【００２４】
〔９〕  上記〔８〕に記載の取得方法により得られるタンパク質。
上記〔８〕により、探索対象タンパク質として取得されたタンパク質は、探索対象タンパク質の既知の関連タンパクし従来とは系統の異なるものである可能性が高い。また、このようにして得られたタンパク質は、従来とはまったく異なる方法により見いだされるものであり、機能や配列を解析することにより、配列情報解析に基づくタンパク質の研究、技術開発に寄与することが期待される。
【００２５】
本明細書において、単に「配列」という場合は、核酸またはアミノ酸の配列を指すものとする。また、核酸配列は、コドン表に従ってアミノ酸に翻訳される。
【００２６】
【発明の実施の形態】
本発明の実施形態について図面に沿ってさらに詳細に説明するが、本発明は下記にて説明する実施の形態に限定されるものではない。以下の例では、未知因子として新規なタンパク質を予測する場合を例として挙げる。図１から５は、本発明の予測方法の一実施形態（第１の実施形態）の手順を示す流れ図である。また、図６から図１０は、第１の実施形態に沿って実施した場合のより具体的な例のイメージを示す図である。まず先に、図１から図５に示す第１の実施形態の流れ図にそって説明し、次に図６から図１０に示す、より具体的な例を説明する。
【００２７】
＜１．第１の実施形態＞
図１は、本発明のタンパク質検出方法のメインの工程を示す図である。図１の工程（ＳＡ−１）から（ＳＡ−４）までが、本発明の予測方法が対応し、さらに工程（ＳＡ−５）の実験工程が加えられて本発明のタンパク質検出方法が構成される。図２は、キー配列を設定する工程（ＳＡ−１）の具体的な処理例を示す図である。図３は、コア配列候補群を検索する工程の具体的な処理例を示す。図４は、コア配列候補の優先順位付けを行う工程の具体的な処理例を示す。図５は、新規な配列を作成する工程の具体的な処理例を示す。なお、下記の各工程または全行程は、それぞれプログラム化して実行することも可能であるし、また、全体をプログラム化せずとも、予測を行う者（以下、「実験者」ともいう）が既知のデータベースを利用して実施することも可能である。
【００２８】
第１の実施形態では、工程（ＳＡ−１）から（ＳＡ−４）までで新規な配列が予測され、さらに工程（ＳＡ−５）によってその実在が確認される（図１）。キー配列設定工程（ＳＡ−１）では、予測する際の手がかりとなるキー配列を設定する。次にコア配列候補群の検索工程（ＳＡ−２）、キー配列に基づいて、予測しようとする新規な配列の最初に特定される部位となるコア配列の候補の集合が検索される。優先順位付け工程（ＳＡ−３）では、コア配列候補群の各配列について、処理順を定める優先順位が付けられる。新規配列作成工程（ＳＡ−４）では、コア配列が設定され、コア配列の重複配列を検索して、配列を伸長していき、伸長させた配列がＯＲＦを含むか確認する。ＯＲＦであることが確認された配列は新規なタンパク質の配列であると予測される。さらに、実験工程（ＳＡ−５）において、予測された配列が、実在するかを確認する。
【００２９】
第１の実施形態では、図２に示すようにキー配列設定工程（ＳＡ−１）において、まず予測しようとするタンパク質の対象、すなわち探索対象タンパク質が定められる。どのようなタンパク質を探索対象タンパク質とするかは任意である。本発明の方法は、未だ漠然とした情報しかないような条件下で新規にタンパク質の探索を開始する際にも好適である。探索対象タンパク質は、例えば、プロテインキナーゼ、プロテインフォスファターゼ、ヌクレアーゼなどの基本的な作用に基づく分類に従ってもよい。但し、探索対象が最初から絞られていてもよく、その場合は、最終的に結論を得るまでの処理量を減らすことができる。
【００３０】
探索対象となるタンパク質が特定されたら、次に、その探索対象タンパク質と関連のあるタンパク質群を選抜する。例えば、プロテインキナーゼが探索対象タンパク質であるとすると、プロテインキナーゼに属する、或いは関連する既知のタンパク質を選び出す。関連タンパク質として選抜する際も、具体的に探索目的が絞られていればそれにより関連したタンパク質を選抜することが好ましいが、関連タンパク質の選択の幅を広げれば、それだけ新規性の高い配列が得られる可能性を高めることができる。また、選抜される関連タンパク質の数に特に制限はないが、キー配列の材料であるので、目的とする探索対象と関連のある範囲で多い方が確実性はあがる。
【００３１】
関連タンパク質群に共通する配列を求めて、その共通配列をキー配列として設定する。第１の実施形態では、工程（ＳＢ−１）で検索された複数のタンパク質のアミノ酸配列についてマルチプルアライメントによる解析（マルチプル相関性解析ともいう）を行い、共通配列を作成することが望ましい。多数の配列を解析するアルゴリズムに特に限定はなく、例えば、モチーフ検索（コンセンサス法、重ね行列法）、ホモロジープロファイリング法、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ、ＰＨＩ−ＢＬＡＳＴ、隠れマルコフモデルなどが例示される。まず最初にキー配列の設定することにより、新規な配列の予測を探索対象のタンパク質に適切に絞り込む処理がなされる。
【００３２】
キー配列設定工程における「共通の配列」は、関連するタンパク質群間で完全に共通な配列であることが特に好ましいが、これに限られるわけではない。「共通の配列」は、タンパク質群を構成する少なくとも２種以上のタンパク質に共通する配列特徴を備えたアミノ酸配列または塩基配列であればよい。また、関連するタンパク質群に属する個々のタンパク質が多数存在するような場合には、例えば、いくつかの代表的なタンパク質を選択して共通する部分を求めてもよい。
【００３３】
また、「共通の配列」の好ましい長さは特に限定されるものではなく、探索対象としている未知因子の種類や長さ或いは既知の配列情報の集積量などに応じて適宜調整してよい。アミノ酸配列の場合、「共通の配列」の長さの目安としては、１０アミノ酸残基以上が好ましい。傾向として、長くするほど「共通の配列」とし得る部位が存在する確率は低くなる一方、キー配列の設定は容易になる。また、短くするほど「共通の配列」と言い得る部位が存在する確率が高くなるが、キー配列とし得る配列の数が増え、キー配列の設定効率が低下する場合がある。
【００３４】
キー配列が設定された後は、コア配列候補群検索工程において、キー配列と類似する配列を検索し、コア配列の候補群を得る（図３）。図３に示すように、第１の実施形態では、コア配列候補群の検索を、工程（ＳＣ−１）および工程（ＳＣ−２）により行っている。
【００３５】
工程（ＳＣ−１）では、ＥＳＴデータベース（ＥＳＴＤＢ）などの配列データベース内のデータを検索してキー配列と関連のあるＥＳＴを検索してくる（なお、ＥＳＴとは、Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｔａｇである）。ＥＳＴデータベースは、特に限定されないが、例えば、ＤＤＢＪ（ＤＮＡ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ  ｏｆＪａｐａｎ）、ＥＭＢＬ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｒｙ，  ＥＭＢＬ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｄａｔａ  ｌｉｂｒａｒｙ）、ＧｅｎＢａｎｋ（Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｄａｔａ  ｂａｎｋ）などよりサービスの提供を受けることができる。
【００３６】
本明細書においては、配列の近似性を示す用語として「類似性」という用語を用いる。「類似性」とは、ある配列と、他の配列が似ているかどうかの程度を示す広く一般的な概念で用いる。したがって、配列どうしが似ているか似ていないかの程度を表す指標はすべて「類似性」の概念に含まれるものとし、このような概念を具体的に求めるためのアルゴリズムなどに限定されない。また、複数の配列を比較の対象としてもよい。但し、比較するために類似性を求めるアルゴリズムなどの手法は統一して行うことが望ましい。したがって、「類似性」を具体的に表すために、いわゆるホモロジー検索等を用いてもよい。
【００３７】
コア配列候補を選ぶ選択基準は、キー配列との類似性の程度により定めればよく、さらに優先順位付け工程にて用いる優先順位の基準や検索結果（ヒット数）などを考慮して設定・変更してよい。
【００３８】
コア候補の選択基準として、より具体的には、例えば、少なくとも類似性５０％以上、あるいは７０％以上などのように定めることができる。類似性の閾値を下げれば、コア配列候補の数は増えるが、効率は下がるおそれがある。類似性の閾値をあげれば、効率は上げられる可能性はあるが、目的のタンパク質が結局得られないおそれが高まる。類似性の程度は、探索目的のタンパク質などの条件によって適宜定めることができるが、５０％程度をひとつの目安とすることが好ましいと考えられる。
【００３９】
また、コア候補を選択する他の具体例としては、例えば、キー配列との類似性が５０％〜７０％の部分を有するコア配列候補を効率よく検索するために、好ましくは４０％〜８０％または４５〜７５％の類似性を示すものをコア配列候補群として検索する。これにより、必要な配列を漏らすことなく、かつ、コア配列候補群を構成する配列数が膨大になりすぎることなく、検索を実行することができる。
【００４０】
工程（ＳＣ−２）は、工程（ＳＣ−１）で絞り込まれたＥＳＴ群を更に絞り込んでいる。コア配列候補群は工程（ＳＣ−１）の結果のみでもよいが、ＥＳＴデータベースの情報量は膨大であることから、工程（ＳＣ−１）のみでは候補となる配列があまりに多すぎる状況となることも想定される。このような場合、効率を上げる観点から、コア配列候補群を定める段階で、絞り込みをかける処理を施すことが好ましい。工程（ＳＣ−１）で得られたＥＳＴ群を、種々のパラメーター、例えば、由来、配列長、より具体的な機能、などに基づきより具体的に絞り込むことができる。
【００４１】
コア配列候補群が作成されたら、コア候補群を構成する各配列に優先順位を付ける（図４）。優先順位に従って、各候補が次に続く工程での処理に供される。
【００４２】
図４に示すように、第１の実施形態では、工程（ＳＤ−１）として、コア配列候補の各配列と、キー配列との類似性を表す数値を求めているが、この数値は、上記工程（ＳＣ−１）においてデータベースからコア配列候補を選び出すために求めた類似性の数値をそのまま使ってもよいし、改めて別の手法で類似性を求めてもよい。工程（ＳＤ−２）では、類似性に基づき優先順位を付けるための基準が定められる。工程（ＳＤ−３）では、優先順位の基準に照らして、コア配列候補群の各配列が順位付けされる。
【００４３】
優先順位を付けるための基準は、探索対象のタンパク質の種類や、実験者のノウハウなど様々な要因に従って適宜定めることができる。一つの好ましい基準の作成方法としては、例えば、類似性を表す所定の数値を基準にして、そこからの絶対値の差が少ない、すなわち、より基準値に近似した配列を高い順位とする、などの手法が挙げられる。類似性を表す数値を用いることにより、機械的に優先順位を付けることができ、本処理をプログラム等で実施する場合も、予めデフォルトとして設定することができる点などで好ましい。優先順位を付けるに際し、類似性を基準とする場合、類似性が高い方がより良いとは限らない。なぜなら、類似性が高いものを選ぶほど、最終的に得られる配列も既知の配列に極めて近似したものとなる可能性が高まると考えられるからである。他方、低すぎても、実在しない配列となってしまう可能性や、処理量が増え効率が低下するおそれもある。したがって、類似性を基準とする場合、好ましくは類似性５０〜７０％の間の数値、より好ましくは類似性５５〜６５％の間の数値、特に好ましくは類似性６０％程度とすることが、一つの目安として挙げられる。このような優先順位を付けることにより、探索対象の範囲で、新規性の高い配列を見いだす可能性を高めることができる。また、このような優先順位をつけることにより、作業量を抑制し、より効率の良い予測方法とすることができる。
【００４４】
次に、図５に示すように、新規な配列の作成がなされる。新規配列作成工程には、
（ａ）コア配列候補群から優先順位に従って配列を選択する工程、
（ｂ）第１のコア配列を設定する工程、
（ｃ）第１のコア配列の端部を伸長可能な重複部位を有する配列を検索する工程、
（ｄ）検索された配列を第１のコア配列の端部に重ねて第１のコア配列を伸長させ第２のコア配列を作成する工程、
（ｅ）第２のコア配列がＯＲＦ条件を備える配列であるか判別する工程、
が含まれている。
【００４５】
まず、コア配列候補群から優先順位に従って、優先順位が最も高い配列が選択される。新規配列作成工程の処理が初めて行われる場合、コア配列候補群から選ばれた配列がそのまま第１のコア配列として設定される。第１のコア配列とは、次の工程（ＳＥ−２）に供される配列、すなわち重複部位を探し、伸長する処理にかけられる配列を意味する。後に説明するが、処理の過程において第１のコア配列はコア配列候補群から選ばれるものに限らず、後に説明する伸長処理を継続させる配列も新たに第１のコア配列とされる場合がある。
【００４６】
工程（ＳＥ−１）では、第１のコア配列のＮ末端領域およびＣ末端領域について、重複する配列をＥＳＴデータベースなどの配列データベースから検索する。重複する配列は、必ずしも１００％一致している場合に限られず、１から数個の置換、欠失、挿入などの変異が含まれていてもよい。どの程度の変異を許容するかは、探索対象のタンパク質、キー配列の特性、コア配列候補群の数、求められる効率などにより適宜選択することができるが、アミノ酸残基数にして好ましくは７以下、より好ましくは５以下、特に好ましくは３以下である。
【００４７】
重複部位を含むＥＳＴが見いだされたら、その重複部位を重ねてコア配列とＥＳＴとを結びつけ、コア配列を伸長させる（工程（ＳＥ−４））。この際、重複部位を有するＥＳＴがコア配列を伸長させることができる配列を選ぶ。例えば、コア配列のＮ末端領域に重複する配列を有するＥＳＴが見いだされた場合、ＥＳＴの重複部位を重ねた結果、Ｃ末端方向に配列を伸長するような配列ではなく、できるだけＮ末端を延長させる方向に配列が伸びているものを選ぶことが望ましい。すなわち、コア配列のＮ末端、Ｃ末端のそれぞれについて伸長可能な配列を選択する。なお、必ずしもＮ末端、Ｃ末端の双方が伸長する必要はなく、少なくともいずれか一端が伸長可能であればよい。
【００４８】
コア配列の末端を伸長可能なＥＳＴを、コア配列のそれぞれの末端に重ねて結びつけ、新たな配列（第２のコア配列）を作成する。重ねて結びつける際は、重複部位はいずれか一方の配列を優先させことが望ましい。例えば、重複部位についてはコア配列側の配列をそのまま採用し、コア配列を超える部分について、検索されたＥＳＴ配列を付加すればよい。
【００４９】
得られた第２のコア配列は、工程（ＳＥ−５）においてＯＲＦ（Ｏｐｅｎ  Ｒｅａｄｉｎｇ  Ｆｒａｍｅ）の条件を満たす配列を含むか確認される。ＯＲＦの存否は、例えば、核酸配列に換算して開始コドン、終始コドンが含まれているかを確認することによって行うことができる。ＯＲＦが見いだされれば、その配列は、検索対象のタンパク質のアミノ酸配列または核酸配列であると推定される。
【００５０】
また、図５には示していないが、得られた配列について既知のデータベース中に存在するか検索にかけ、存在しなければ新規な配列であると裏付けられたことになる。また、まったく同一ではなくても類似性などを調べることにより、当初目的としていた探索対象タンパク質に関するものであるかどうかなど機能についてもさらに予測し、探索の確実性を向上させることができる。
【００５１】
工程（ＳＥ−２）において、重複部位を含む配列が見いだされなかった場合は、そのコア配列はそれ以上伸長できないため、放棄する。そして、工程（ＳＥ−１）に戻り、コア配列候補群の中から次の優先順位が付けられている配列を選び、これを改めて第１のコア配列と設定する。
【００５２】
工程（ＳＥ−５）において、第２のコア配列がＯＲＦ条件を備えないことが判明した場合、この第２のコア配列を、新たに第１のコア配列として設定しなおし、再度末端を伸長させるための処理を繰り返す。すなわち、工程（ＳＥ−５）でＮｏの場合、工程（ＳＥ−２）に戻り、工程（ＳＥ−３）、（ＳＥ−４）、（ＳＥ−５）の工程を繰り返す。このようにして、ＯＲＦが見いだせるまで順次、コア配列を伸長する作業が繰り返される。
【００５３】
工程（ＳＥ−５）において、第２のコア配列がＯＲＦではない場合には、上記のように伸長処理が繰り返されるが、探索対象のタンパク質となり得ない確率が高くなった場合には、それ以上繰り返し処理を継続しないようにすることが望ましい。第１の実施形態では、工程（ＳＥ−６ｂ）にあるように、ＯＲＦではないと判断された場合に、さらに伸長を継続するか否かの判断を行う。この判断は、実験者が、配列を見て決めてもよいし、また、繰り返しの回数や配列の長さについて上限を定め、これを超えた場合に、伸長処理の繰り返しを停止するようにしても良い。このような工程を設けることにより、無駄な処理を継続することなく、効率の良い予測方法とすることができる。伸長処理の停止が決められた場合には、工程（ＳＥ−１）に戻り、次の優先順位の配列を選択し、改めて第１のコア配列として設定する。
【００５４】
上記のように、工程（ＳＥ−３）、工程（ＳＥ−６ｂ）での判断を介して、新規な配列が見いだされない場合には順次コア配列候補の中から効率的に配列が選ばれていき、新規な配列の予測が行われる。
【００５５】
上記のように本発明の未知因子の配列予測方法においては、それぞれの工程において核酸またはアミノ酸の配列が用いられる。本発明の未知因子の配列予測方法の最も具体的な一態様としては、キー配列をアミノ酸配列として取得し、このキー配列に類似するアミノ酸配列をコード可能な塩基配列を持つＥＳＴデータベースから検索してコア配列候補群を得、さらに第１のコア配列の端部を伸長可能な重複部分を有する塩基配列をＥＳＴデータベースから検索することにより第２のコア配列を作成する、という態様が例示される。
【００５６】
上記の予測方法により作成された配列は、仮想の配列である。したがって、これが実在するかは、実際に細胞等を用いて検証することが望ましい。既知配列に基づいて、その配列を有する核酸またはアミノ酸を検出可能な方法であれば、実験の方法に限定はない。具体的には、例えば、細胞からｍＲＮＡを抽出し、逆転写酵素（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）を用いて、ｍＲＮＡと相補的なｃＤＮＡを作り、これをＲＴ−ＰＣＲ法で増幅させて、そこに出てくるＤＮＡ配列を、前記で求めた未知因子のＤＮＡ配列と比較することで検証していく。これで、一致するところがあれば、実細胞のｍＲＮＡから出てきたものなので、これをノーザンハイブリダイゼーションなどを使って、ｍＲＮＡの長さや発現量を測定し、遺伝子特定を確かなものにしていく。
【００５７】
なお、分子生物学的な基本的手法については、ＢＡＳＩＣ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ（１９８６）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）、細胞工学ハンドブック、黒木登志夫ら編、羊土社（１９９２）、新遺伝子工学ハンドブック改訂第３版、村松ら編、羊土社（１９９９）など、多くの標準的な実験マニュアルがある。
【００５８】
＜２．図６から図１０に示す具体例＞
第１の実施形態を実施した場合のより具体的な例を図６から図１０に沿って示す。なお、図６から図１０中、の（ＳＢ−１）、（ＳＣ−１）等の記号は、前記図１から図５に示される各種工程との対応を示すものである。本具体例では、不明因子が脱リン酸化機能を有する因子とする。
【００５９】
まず、脱リン酸化機能に関連するタンパク質群を選抜する。脱リン酸化機能に関連するタンパク質として、プロテインフォスファターゼ関連のタンパク質である、ＰＰ２Ａ−５Ａ、ＰＰ２Ａ−５Ｂ、ＰＰ２Ａ−５Ｄ、ＰＰ２Ａ−５Ｅ、ＰＰ２Ａ−５Ｇを選抜する（図６）。
【００６０】
図６の（ＳＢ−２）工程に示されるように、ＰＰ２Ａ−５Ａから５Ｇのアミノ酸配列についてマルチプルアライメントをとり、類似性の高い保存領域と認定される領域を見いだす。見いだされた領域がＰＰ２Ａ−５Ａにおける配列番号５１から８４の領域であり、これをキー配列（Ｋ１）とする。
【００６１】
次に、図７に示すように、キー配列（Ｋ１）と類似の配列をＥＳＴデータベース内で検索し、遺伝子番号１から２５０の対応する塩基配列および対応するアミノ酸配列を得た。図７に示すように、本検索において類似配列を得るためになされた類似性の演算は、相同性検索に用いられるプログラムであるＢＬＡＳＴの一種であるｔｂｌａｓｔｎによる。ｔｂｌａｓｔｎでは、核酸データベースを６通りの読み枠で翻訳し、アミノ酸配列と対比する。この結果は、キー配列と、遺伝子番号１の対応するアミノ酸配列との類似性は９１％、遺伝子番号２のアミノ酸配列との類似性は８０％、遺伝子番号２５０のアミノ酸配列との類似性は５０％である。この段階ではコア配列候補として２５０種のアミノ酸配列が列挙されたことになる。
【００６２】
（ＳＣ−１）工程で得られた配列の中から機能的に関連しそうなタンパク質群をさらに絞り込む（図７、（ＳＣ−２）工程）。本例では、由来として「ヒューマン」、より具体的な機能として「スレオニンフォスファターゼ」のキーワードで絞り込み検索を行う。この結果、遺伝子番号２、５、〜９３にかけての遺伝子６０種を得て、これを最終的にコア配列候補群とする。
【００６３】
図８に示すように、（ＳＤ−１）工程から（ＳＤ−３）工程にかけ、コア配列候補群を構成する各コア配列に優先順位が付けられる。本具体例では、前記ｔｂｌａｓｔｎにより求められた演算結果をそのまま類似性の数値として使用する。また、優先順位を付けるための基準値は類似性６０％に設定した。基準値６０％と、各コア配列候補の類似性とを対比し、基準値６０％との差の絶対値がより近いものがより高い順位になるように、コア配列候補を整列する。この結果は、優先順位の第１位に遺伝子番号５のアミノ酸配列が、第２位に遺伝子番号９３のアミノ酸配列が、最下位に遺伝子番号２のアミノ酸配列が並ぶ。
【００６４】
次に、図９に示すように、優先順位付けされた配列の第１位の配列をコア配列として選ぶ。すなわち、今回は、遺伝子番号５のアミノ酸配列（アミノ酸残基数４２）がコア配列（図９等、ＣＯＲＥ１）として選択される。遺伝子番号５のアミノ酸配列を伸長可能な配列を探索するために、遺伝子番号５のアミノ酸配列のＮ末端領域（図９中、５Ｓ）およびＣ末端領域（図９中、５Ｅ）のそれぞれの塩基配列にして３０塩基分について、重複する配列を検索する。検索はＥＳＴデータベースを用い、類似性の演算は、ｔｂｌａｓｔｎ（またはｔｂｌａｓｔｘ）を用いる。検索は、少なくとも類似性６５％以上であることを条件とする。図９の工程（ＳＥ−２〜ＳＥ−３）では、Ｎ末端領域（５Ｓ）について例示している。Ｎ末端領域（５Ｓ）に類似性を示す断片がｎ個見つかり、類似性の高い順に、Ｎ５１からＮ５ｎと番号を付ける。Ｎ５１はＮ末端領域（５Ｓ）に対し類似性は８０％を示す配列を含んでおり、Ｎ５２はＮ末端領域（５Ｓ）に対し、類似性７０％を示す配列を含み、Ｎ５ｎはＮ末端領域（５Ｓ）に対し、類似性６５％を示す配列を含む。
【００６５】
Ｎ５１からＮ５ｎの配列中から、Ｎ末端領域（５Ｓ）を伸長可能な配列を探す。すなわち、類似性をもつ、ほぼ重複した配列のうち、重複部位を重ね合わせてコア配列のＮ末端をさらに伸長可能な配列を選ぶ。図９の工程（ＳＥ−４）の上段に示すように、Ｎ５２配列とコア配列のＮ末端領域とを重ねると、全体としてＣＮ５２のようにコア配列（ＣＯＲＥ１）のＮ末端を伸長させることができる。しかし、Ｎ５ｎ配列はコア配列（ＣＯＲＥ１）との重複部位がＮ５ｎのＮ末端側にあるため、重複領域をかさねると、コア配列（ＣＯＲＥ１）のＮ末端を殆ど伸長させない。したがって、コア配列（ＣＯＲＥ１）との類似性の高い領域を含み、コア配列（ＣＯＲＥ１）のＮ末端を最も長く伸長可能な配列として、Ｎ５２配列を選択し、コア配列（ＣＯＲＥ１）のＮ末端領域（５Ｓ）と重ね合わせ、コア配列を伸長させる。なお、本具体例では、伸長の際、配列はコア配列側の配列を優先させ、コア配列を超える領域についてＮ５２の配列を付加する。
【００６６】
コア配列（ＣＯＲＥ１）のＣ末端領域（５Ｅ）についても同様の処理を行い、結果として、コア配列（ＣＯＲＥ１）のＮ末端およびＣ末端にそれぞれＣＮ５２およびＣＣ５３という配列を用いて伸長した新たな配列が作成される。ＣＮ５２は塩基配列にして３３０塩基分だけコア配列（ＣＯＲＥ１）のＮ末端側を伸長でき、ＣＣ５３は塩基配列にして４６０塩基分だけコア配列（ＣＯＲＥ１）のＣ末端側を伸長するため、結果として、新たに塩基数９３６（３５０＋１２６＋４６０＝９３６塩基、アミノ酸残基数に換算して３１２）の配列が作成される。
【００６７】
次に、工程（ＳＥ−４）で得られた配列が、遺伝子の形態（ＯＲＦ形式）を含むか否かを検索する（図５の工程（ＳＥ−５））。具体的には、塩基数９３６の核酸配列において、開始（ＡＵＧ）と終了（ＵＡＧ、ＵＡＡまたはＵＧＡ）を含む形式になっているかどうかを確認することにより行う。ＯＲＦではないことが判明した場合には、改めてこれを第１のコア配列として更にＮ末端またはＣ末端の伸長を繰り返す（図１０、（１）から（３））。Ｎ末端またはＣ末端の伸長ができない場合には、遺伝子番号５の配列を最初のコア配列として新規な配列を作成することを放棄し、コア配列候補群中の２番目の順位づけられていた遺伝子番号９３の配列を新たな最初のコア配列として選択し、末端の伸長処理を上記と同様に繰り返す。また、Ｎ末端またはＣ末端伸長が可能であっても、繰り返しの回数が過剰に増えたり、または、配列長が明らかに長すぎるような状況に成った場合には、遺伝子番号５の配列を最初のコア配列とすることを放棄し、遺伝子番号９３の配列を新たな最初のコア配列とする。遺伝子番号９３についても、新規な配列の作成ができない場合には、さらにコア配列候補の次の優先順位を付けられた配列を最初のコア配列として選択する。新規な配列の作成がうまく行かない場合には、最終的に、コア配列候補で最下位にランクされた遺伝子番号２の配列をコア配列として、新規な配列の作成を試みる。
【００６８】
伸長された配列（第２のコア配列）がＯＲＦであるかを判別し、ＯＲＦであると判別された場合には、得られた配列が新規な配列であるかをｃＤＮＡデータベースやタンパク質データベースを検索して確認する。データベースに該当するもがなければ、新規なタンパク質についての配列であると推定される。
【００６９】
【発明の効果】
本発明によれば、新規なタンパク質およびその機能を効率よく予測可能である。本発明は、大枠の機能についてはある程度予測されているが、具体的な因子として特定されてはいない新規なタンパク質の予測に特に好適である。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のメインの工程を示すフローチャートである。
【図２】キー配列を設定する工程の一例を示すフローチャートである。
【図３】コア配列候補群を検索する工程の一例を示すフローチャートである。
【図４】コア配列候補群に優先順位付けをする工程の一例を示すフローチャートである。
【図５】新規配列を作成をする工程の一例を示すフローチャートである。
【図６】キー配列を設定する工程における操作のイメージを示す図である。
【図７】コア配列候補群を検索する工程のイメージを示す図である。
【図８】コア配列候補群に優先順位付けをする工程のイメージを示す図である。
【図９】新規配列を伸長させる工程のイメージを示す図である。
【図１０】ＯＲＦを含むか確認する工程と、配列の伸長を繰り返す工程のイメージを示す図である。
【符号の説明】
Ｋ１・・・キー配列１
ＣＯＲＥ１・・・コア配列１
５Ｓ・・・遺伝子名（番号）５のＮ末端領域
５Ｅ・・・遺伝子名（番号）５のＣ末端領域
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2004236543.tif 000008
【図８】
2004236543.tif 000009
【図９】
2004236543.tif 000010
【図１０】
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