【誤訳訂正書】
【提出日】平成24年6月8日(2012.6.8)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１７３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１７３】
抗体の有効なインビボ投薬量は、約５μｇ〜約５００μｇ／ｋｇ患者体重の範囲である。抗体をコードするポリヌクレオチドの投与では、有効なインビボ投薬量は約１００ｎｇ〜約５００μｇのＤＮＡの範囲である。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１７９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１７９】
ファージミドレスキューおよびファージ増幅
ＴＧ１細胞中のＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤ  Ｆａｂファージミドを３４μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールおよび１％のグルコースを補足した２ｘＴＹ培地において増幅した。３７℃で３０分間のヘルパーファージ感染（ＶＣＳＭ１３  〜２−６ｘ１０11ｐｆｕ／ｍｌ）の後に、ＴＧ１細胞を遠心分離により濃縮した。３４μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンおよび０．２５ｍＭのＩＰＴＧを含有する２ｘＴＹにおける感染したＴＧ１細胞の２２℃で一晩のインキュベーションによりファージを増幅した。ファージを含有する上清をファージパンニングに使用した。
【実施例３】
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１８０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１８０】
固相パンニング
固相パンニングは、ＭａｘｉＳｏｒｐTMプレート（Ｎａｌｇｅｎｅ  Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）もしくはＤｙｎａｂｅａｄｓTM（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）をＰＢＳにおいてヒトＭＮタンパク質（１μｇ／ウェルもしくは１μｇ／１ｍｇのビーズ）で被覆することにより実施した。ＭＮタンパク質は、精製のためのＣ末端ｈｉｓタグを有するタンパク質の全細胞外ドメインに相当する。ＭＮタンパク質は、当業者に周知である標準的な方法を用いて哺乳類細胞系ＨＫＢ−１１において発現させそしてＮｉ−ＮＴＡクロマトグラフィーにより精製した。結合したＭＮタンパク質を含有するウェルをＰＢＳ中５％のミルクでブロックし、ＰＢＳにおいて洗浄し、続いて１ｘ１０12のＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤ  Ｆａｂファージを含有するあらかじめブロックしたＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤファージライブラリーのアリコートと室温で２時間インキュベーションした。結合したファージを洗浄し、そして次にｐＨ８．０の１０ｍＭ  Ｔｒｉｓバッファー中２０ｍＭのＤＴＴで溶出した。ファージ増幅を上記のように各回の間に行って３回のパンニングを行った。非特異的結合を減らすために各回のパンニング間で洗浄ストリンジェンシーを増加した。
【誤訳訂正４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１８１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１８１】
エシェリキア・コリにおける発現のための選択したＦａｂフラグメントのサブクローニング
ＥＬＩＳＡスクリーニングのための可溶性Ｆａｂの迅速な発現を容易にするために選択したＦａｂをｐＭＯＲＰＨ(R)２３ディスプレイベクターからｐＭＯＲＰＨ(R)ｘ９＿Ｆａｂ＿ＦＨ発現ベクターにクローン化した。ｐＭＯＲＰＨ(R)２３ベクターのＤＮＡ調製物をＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで消化し、このようにして全Ｆａｂをコードするフラグメント（ｏｍｐＡ−ＶＬ−ＶＬおよびｐｈｏＡ−Ｆｄ）を切り出した。その後の精製後に、調製したｐＭＯＲＰＨｘ９＿Ｆａｂ＿ＦＨ  ベクター（同様にＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩで消化しそして精製した）にフラグメントを連結した。Ｆａｂインサートを含有するベクターを電気穿孔によりコンピテントエシェリキア・コリＴＧ１  Ｆ−細胞にトランスフェクションした。形質転換したエシェリキア・コリ細胞を３４μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールおよび１％のグルコールを含有するＬＢプレート上で３７℃でｏ／ｎ培養した。コロニーを選択し、そして３４μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールおよび１％のグルコールを含有する培養培地に置いた。グリセロールを２０％になるように加え、そしてこれらのストックスターター培養物をＥＬＩＳＡに必要とされるまで−８０℃で保存した。精製されたＦａｂを得るために、このベクターを保有するエシェリキア・コリ形質転換体を当業者に周知である方法を用いて典型的には多数の１Ｌ振盪フラスコ培養において培養し、採取し、そしてＮｉ−ＮＴＡ親和性クロマトグラフィーを使用して精製した。
【実施例４】
【誤訳訂正５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１８２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１８２】
ＥＬＩＳＡによるＭＮに結合するＦａｂフラグメントの同定
Ｍａｘｉｓｏｒｐ  ９６ウェルＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳ中５μｇ／ｍｌの濃度の精製されたヒトＭＮタンパク質の溶液１００μｌ／ウェルで被覆した。開始ストック培養物から３４μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含有する２ｘＴＹ培地において培養したエシェリキア・コリ形質転換体を用いてＦａｂを発現させた。採取の１２時間前にＩＰＴＧ（０．５ｍＭの最終濃度）の添加によりＦａｂ発現を誘導した。細胞を溶解し、そしてＭＮをプレコートしそしてミルクでブロックしたＭａｘｉｓｏｒｐプレートのウェル内で１００μｌの溶解物を室温で２時間インキュベーションした。次に、非特異的結合を除くためにプレートをＴＢＳおよびＴｗｅｅｎを含有するＴＢＳにおいて洗浄した。結合したＦａｂは、アルカリホスファターゼに連結したヤギ抗ヒト（Ｆａｂ’）2抗体（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）で検出した。基質ＡｔｔｏＰｈｏｓ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ）を製造業者の説明書に従って使用し、励起は４３０ｎｍであり、そして発光は５３５ｎｍで読み取った。
【誤訳訂正６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１８４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１８４】
ＭＮに結合するＦａｂおよびＩｇＧの同定
ＭＮタンパク質と本発明の抗体との間の結合相互作用をＢＩＡｃｏｒｅ  ３０００装置（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）上で表面プラズモン共鳴技術を用いて分析した。全長ＩｇＧ（１ｅ４，１ａａ１および３ｅｅ９）の結合には、標準的なアミンカップリングキット（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いてヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃを高密度でＣＭ５バイオセンサーチップに共有結合的に連結した。次に、３００応答単位ＢＩＡｃｏｒｅシグナルを目指して、捕獲アッセイを用いてこれらのＩｇＧを抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ固定化表面に結合した。ＢＩＡｃｏｒｅを２５℃およびＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０を含有するかもしくは１０ｍＭ  Ｎａ−ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ／３ｍＭ  ＥＤＴＡ／０．００５％Ｔｗｅｅｎ  ２０を含有する１０μｌ／分のランニングバッファーの流速で操作した。リガンド結合後に、流速を次に２５μｌ／分に上げ、そして会合相をモニターすることができるように様々な濃度のＭＮ検体（例えば、５０ｎＭ〜１ｎＭの範囲）を１０分間表面上に流した。次に、解離が３５分間進み、続いて１００μｌの１０ｍＭリン酸で１００μｌ／分で抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ固定化表面を再生した。速度定数を計算するために１：１ラングミュア結合モデルを用いてセンサーグラムをフィッティングした。抗ヒトＦａｂ  ＩｇＧをチップ上に固定し、そしてＭＮ結合の評価の前にＦａｂを捕獲するために用いたことを除いて、ＭＮへのＦａｂの結合を同様に決定した。図５は、精製ＭＮタンパク質への開示される抗体の結合の得られる結合定数を示す。抗体の各々は、０．１５〜５０ｎＭの間であるＫｄ値を示してＭＮに結合した。
【実施例６】
【誤訳訂正７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１８６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１８６】
軽鎖発現ベクター．ｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ＋（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）のマルチクローニング部位を２つの異なる部位で置き換えた。κ部位は、κリーダー（ＮｈｅＩ／ＥｃｏＲＶ）、ＨｕＣＡＬ−ｓｃＦｖ  Ｖｋ−ドメイン（ＥｃｏＲＶ／ＢｓｉＷＩ）およびκ鎖定常領域（ＢｓｉＷＩ／ＡｐａＩ）の挿入のための制限部位を与えた。λ部位における対応する制限部位は、ＮｈｅＩ／ＥｃｏＲＶ（ｌリーダー）、ＥｃｏＲＶ／ＨｐａＩ（Ｖｌドメイン）およびＨｐａＩ／ＡｐａＩ（λ鎖定常領域）であった。κリーダー（ＥＭＢＬ  Ｚ０００２２）ならびにλリーダー（ＥＭＢＬ  Ｌ２７６９２）は両方とも、コザック配列を備えていた。ヒトκ鎖（ＥＭＢＬ  Ｊ００２４１）およびλ鎖（ＥＭＢＬ  Ｍ１８６４５）の定常領域は、上記のように重複伸長ＰＣＲにより組み立てた。
【誤訳訂正８】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１８９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１８９】
細胞接着アッセイ
ＰＢＳ中の精製されたＭＮの１μｇ／ｍＬ溶液の５０μＬを無処理の９６ウェルプレート上に４℃で一晩吸着させた。溶液を除き、そしてウェルをＰＢＳで３ｘすすいだ。ウェルをＲＰＭＩ１６４０倍地中５０％のＦＢＳ２００μＬで１時間ブロックした。次に、ウェルをＰＢＳ中１％のＢＳＡにおける１００μｇの１ｅ４抗ＭＮ抗体、ＰＢＳ中１％のＢＳＡにおけるコントロールＩｇＧもしくはＰＢＳ中１％のＢＳＡで処理した。ＰＢＳで洗浄した後に、５０００のＭａＴｕ細胞（ＭＮ＋細胞）をウェルに加え、そしてプレートを３７℃で５％ＣＯ2で一晩インキュベーションした。ＭＮ被覆ウェルへのＭａＴｕ細胞の接着を阻止する抗ＭＮ抗体の能力をＰＢＳでの洗浄後に評価した。この実験の例は図６に示され、ここで、１００μｇの抗ＭＮ抗体１ｅ４は細胞接着を阻止し、一方、コントロールＩｇＧもしくはバッファー賦形剤はそうしない。
【実施例８】
【誤訳訂正９】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１９１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１９１】
蛍光活性化細胞選別アッセイ（ＦＡＣＳアッセイ）
診断手段としてＭＮ発現について細胞をアッセイすることができる。接着性ＭＮ発現ＰＣ−３  ｍｍ２細胞および非ＭＮ発現ＤＬＤ１細胞を５〜１０分間ＰＢＳ溶液中１：１０のトリプシン／バーセン（Ｖｅｒｓｅｎｅ）でそれらのフラスコからはがした。細胞を沈降させ（１０００ｒｐｍ、５分）、よく冷えたＲＰＭＩ  １０％ＦＢＳで１回洗浄し、そしてよく冷えた染色バッファー（Ｃａ+  Ｍｇ+フリーのＰＢＳ、２％ＢＳＡおよび０．０５％アジ化ナトリウム）に６ｘ１０6細胞／ｍｌで再懸濁した。２５μｇ／ｍＬの一次抗体、ヒト抗ＭＮ  ＩｇＧ１もしくはコントロールヒトＩｇＧ１抗体を６ｘ１０5細胞と氷上で１時間インキュベーションした。結合していない抗体をよく冷えた染色バッファーで細胞から洗浄した。細胞をＰＢＳ中２％のホルムアルデヒドで１０分間固定し、次に染色バッファーで２回洗浄した。抗ヒトＡｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ４８８二次抗体（最終濃度．１：２００，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を含有する１００μｌのよく冷えた染色バッファーに細胞ペレットを再懸濁し、そして氷上で１時間インキュベーションした。結合していない抗体をフローバッファー（２％ＢＳＡを含有するＰＢＳ）で２回細胞から洗浄し、そして細胞を１ｍＬのフローバッファーに再懸濁した。再懸濁した細胞のＦＡＣＳ分析をＢｅｃｋｍａｎ  ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｅｒ装置で行った。図８は、ＰＣ−３  ｍｍ２ヒト前立腺癌細胞がＦＡＣＳによりアッセイした場合にＭＮを発現し、一方、ＤＬＤ−１細胞はそうでなかったことを示す。
【実施例１０】
【誤訳訂正１０】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１９５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１９５】
表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ）材料および方法
ＨＫＢ１１により発現されるヒトＭＮタンパク質とヒト全長抗ＭＮ  ＭＡｂとの間の結合相互作用をＢＩＡｃｏｒｅ  ３０００装置（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）で表面プラズモン共鳴技術を用いて分析した。チップ調製には、ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃを標準的なアミンカップリングキット（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いてＣＭ５バイオセンサーチップに共有結合的に連結した。次に、３００共鳴単位ＢＩＡｃｏｒｅシグナルを目指して、捕獲アッセイを用いて興味のある抗体を抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ固定化表面に結合した。ＢＩＡｃｏｒｅは、２５℃で１０ｕｌ／分の流速および１０ｍＭ  Ｎａ−ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ／３ｍＭ  ＥＤＴＡ／０．００５％Ｔｗｅｅｎ  ２０を含有するランニングバッファーで操作した。リガンド結合後に、流速を２５ｕｌ／分に上げ、そして会合相をモニターすることができるようにＭＮ検体（５０ｎＭ〜１ｎＭ）を表面上に１０分間流した。次に、解離が３５分間進み、続いて１０ｍＭのリン酸で１００ｕｌ／分で抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ固定化表面を再生した。速度定数を計算するために１：１ラングミュア結合モデルを用いてセンサーグラムをフィッティングした（以下の表１）。
【誤訳訂正１１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０２２４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０２２４】
Ｃｏｌｏ−２０５異種移植片モデルにおけるゼローダ(R)との組み合わせ
他の癌化学療法剤と併せて３ｅｅ９／ＭＭＡＥを使用することの実現可能性を調べた。ゼローダ(R)は、転移性結腸直腸癌を有する患者の一次治療として用いられる。３ｅｅ９／ＭＭＡＥおよびゼローダ(R)を使用する併用療法の活性および耐容性を評価した。３ｅｅ９／ＭＭＡＥは、Ｑ４Ｄｘ３スケジュールでそして１．２５、２．５および１０ｍｇ／ｋｇの用量レベルでｉ．ｖ．投与した。ゼローダ(R)は、２５０および５００ｍｇ／ｋｇの用量レベルで毎日１回９日間経口投与した。２．５および１０ｍｇ／ｋｇで単独で投与した３ｅｅ９／ＭＭＡＥは、強い腫瘍増殖阻害をもたらした（それぞれ、７３および９６％のＴＧＩ）（図２６ａ）。しかしながら、３ｅｅ９／ＭＭＡＥの１．２５ｍｇ／ｋｇ群は比較的効果がなく、３１％のＴＧＩのみをもたらした。２５０および５００ｍｇ／ｋｇの用量レベルで単独で投与したゼローダ(R)もまた、それぞれ、７８および８６％の強いＴＧＩをもたらした。
【誤訳訂正１２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０２２８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０２２８】
各蛍光標識抗体の注射の１２日前に、Ｈａｒｌａｎ  Ｂａｌｂ／ＣヌードにＭＩＡＰａＣａ−２（低ＭＮ発現；５０％のマトリゲル中７．５ｘ１０6細胞）を右横腹に皮下に、そしてｈｕＭＮ−ＭＩＡＰａＣａ２（ＭＮでトランスフェクションした安定な細胞系；５０％のマトリゲル中５ｘ１０6細胞）を左横腹に皮下に移植した。４μｇの連結抗体を各動物に０日（移植後１２日）に注射した。４日、５日および１０日に画像化を行った。麻酔し（１００ｍｇ／ｋｇのケタミン／１０ｍｇ／ｋｇのキシラジン、ｉ．ｐ．）そして画像化システム内部に置いた動物を用いてデータを集めた。マルチスペクトル画像キューブ（一連の画像）は、近赤外（ＮＩＲ）範囲を含む、６８０〜９５０ｎｍのスペクトル範囲の全体にわたって１０ｎｍごとの間隔の画像で得られた。
【誤訳訂正１３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０２３０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０２３０】
インビボ作用機序
３ｅｅ９／ＭＭＡＥのインビボ作用機序を研究するために腫瘍を５ｘ１０6のＨＴ−２９細胞でマウスの右横腹で皮下に移植した。８日後に、ＨＴ−２９腫瘍を保有する無胸腺マウスを賦形剤でもしくは１．２５および５ｍｇ／ｋｇ（Ｑ１Ｄｘ１）で３ｅｅ９／ＭＭＡＥで処置した。３ｅｅ９／ＭＭＡＥの投与後４時間そして１、３および５日で腫瘍を集め、そしてホルマリンにおいて固定した。次に、サンプルをパラフィンに包埋し、５μｍで切片にし、脱パラフィンし、そしてマウス抗体：抗α／β−チューブリン、抗ホスホ−ヒストンＨ３およびＤＮＡを用いてヒト組織の蛍光免疫組織化学の標準的なプロトコルを使用して染色した。次に、スライドを蛍光顕微鏡下で観察し、そして代表的な画像を３つの別個のカラーチャンネルを通して撮った。
【誤訳訂正１４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０２３６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０２３６】
細胞クローン３ｅｅ９．２５の単離
ＣＨＯ−Ｓ細胞をベクター３ｅｅ９H+LｐＣＭＶUCOE８でトランスフェクションするために、８ｍＭのＬ−グルタミンおよびＨＴ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で完全にしそしてＰｅｎＳｔｒｅｐを欠く２ｍＬのＣＤ  ＣＨＯ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃１０７４３−０２９）に６０μｇのＤＮＡを希釈した。次に、２ｍｌのＣＤ  ＣＨＯ完全培地を２５０ｍｌのエルレンマイヤーフラスコに加えた。次に、１５０μＬのＤＭＲＩＥ−Ｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｃａｔ＃１０４５９−０１４）をフラスコに加え、そしてＲＴで１０分間インキュベーションした。次に、希釈したＤＮＡを希釈したＤＭＲＩＥ−Ｃと混合し、５％ＣＯ2でフラッシュし、そしてＲＴで３０分間インキュベーションした。インキュベーション中に、５ｘ１０6ｃ／ｍＬで４ｍｌのＣＨＯ−Ｓ細胞（２ｘ１０7の総細胞）をＣＤ  ＣＨＯ完全（Ｐ／Ｓなし）において調製した。インキュベーション後に、細胞をＤＮＡ−ＤＭＲＩＥ−Ｃ複合体を有するフラスコに加え、そして次に穏やかに回転させて混合した。次に、フラスコを５％ＣＯ2でフラッシュし、そして１２５ｒｐｍで３７℃で４ｈｒ振盪した。次に、Ｐｅｎ  Ｓｔｒｅｐを有さない３２ｍｌのＣＤ  ＣＨＯ完全培地をフラスコに加え、５％ＣＯ2でフラッシュし、そして次にシェーカー（３７℃）に一晩戻した。２４ｈｒ後に、細胞を計数し、沈降させ、そしてプレーティングに適切な細胞密度で２０％のならし培地および抗生物質（１２．５μｇ／ｍｌのピューロマイシン）を有するＣＤ  ＣＨＯ完全と５．５ｍＬ／ＬのＰｅｎＳｔｒｅｐに再懸濁した。細胞を９６ウェルプレートにおいて１００、３００、９００および２７００細胞／ウェルでプレーティングした。次に、プレートを５％ＣＯ2インキュベーターにおいて約３週間インキュベーションした。プレートを乱さないように注意した。