【誤訳訂正書】
【提出日】平成23年12月5日(2011.12.5)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物を検知し、識別し又は列挙する装置であって、
栄養を付与して微生物の成長を維持する培地の容器と、
栄養素培地に接して、栄養素培地と抗体が通過することを許して細胞の成長を維持する多孔性の要素であって、識別のために、指標又は視覚検査を用いた次の処理の為に容器から移動可能であり、透明で、水が透過でき、栄養物質及び指標物質に対して透過性がある多孔性の要素とを具えた装置。
【請求項２】
多孔性の要素は、微生物に対しては透過性はないが、オートクレーブ可能であり、親水性であり、非蛍光性であり、無色であり、分泌された細胞酵素に耐性がある透過性のあるメンブレンである、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
培地は、微生物の成長を阻止せず又は禁止しない物質のみを含み、培地は固形の汎用栄養素培地又は選択的若しくは鑑別培地の何れかである、請求項１に記載の装置。
【請求項４】
多孔性の要素は、更なる培地の上層を有し又は有さない容器内の培地上に配備された、請求項１に記載の装置。
【請求項５】
多孔性の要素は、再生セルロース、セロファン、キュプロファン、及び透析メンブレンから成るグループから選択される、請求項１に記載の装置。
【請求項６】
多孔性の要素は、１０００−１０7Ｄaの範囲内の規則的な又は不規則的な孔を具えた透過性のあるメンブレンである、請求項１に記載の装置。
【請求項７】
培地は、固体、半固体又は液体状態であって、多孔性の要素は、栄養と抗体を培地から多孔性の要素の上方又は上に位置する微生物へ伝達する、請求項１に記載の装置。
【請求項８】
更に、
平行テスト用に平行に配列された培地上又は培地内に配備された複数の多孔性の要素を具える、請求項１に記載の装置。
【請求項９】
微生物を検知し、識別し又は列挙するテストキットシステムであって、
栄養を付与して微生物の成長を維持する培地の容器と、
栄養素培地に接する多孔性の要素であって、多孔性の要素上、又は多孔性の要素上の培地上のコロニーを支持し、栄養素培地と抗体が通過することを許して細胞の成長を維持し、識別のために、次の指標処理工程へコロニーを移動し、透明で、水が透過でき、栄養物質及び指標物質に対して透過性がある多孔性の要素と、
指標分子を着色コロニーへ解放するキャリアとして作動する第２の培地を具えるテストキットシステム。
【請求項１０】
第２の培地は、アガロース、カラゲナン、ゼラチン及び伝達可能なゲルからなるグループから選択され、ゲルの濃度は水溶液、バッファ、食塩水又は液状栄養素培地内にて約０.１％−１０％の範囲である、請求項９に記載のテストキットシステム。
【請求項１１】
微小コロニーの指標は、１又は複数の色素形成基質及び/又は蛍光発生基質である、請求項９に記載のテストキットシステム。
【請求項１２】
微生物を検知し、識別し又は列挙する方法であって、
培地の容器を提供する工程であって、培地の天面に又は天面の下に多孔性の要素が配備され、培地は微生物の成長を維持する栄養と、微生物を識別するための抗体とを有する工程と、
多孔性の要素上方の領域にて、容器に液体サンプルを注ぐ工程と、
濾過要素内又は多孔性の要素上方の培地上の微生物を捉える工程と、
容器を培養する工程と、
内部の微生物を評価する目的で、指標とともに、容器から第２の培地へ多孔性の要素及び該要素上方の培地を移動する工程と、
微生物を検知、識別又は列挙すべくコロニーの形状を検討する工程を含む方法。
【請求項１３】
検討する工程は、手動又は自動化された画像識別及び認識装置を用いて実行される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
更に、
生存可能な微小コロニー(ＴＶＯ)の総数を検知する工程を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
細胞を検知し且つ識別する装置は、顕微鏡又は自動化された画像検知システムである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
第２の培地は、多孔性の要素上の微生物の識別を手助けする指標物質を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
多孔性の要素は、濾過不可能又は濾過可能なサンプルの何れかを捉える、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
微生物の検知装置を製造する方法であって、
培地の容器を供給する工程と、
容器内の培地の天面に多孔性の要素を堆積させる工程と、
多孔性の要素上及び容器内の培地の天面に更なる液体培地を注ぐ工程を有し、
容器内の培地又は更なる液体培地の何れかは、細胞の成長を促進する栄養素を有する方法。
【請求項１９】
更に、
濾過要素を受け入れる空隙を培地の天面に形成する工程と、
濾過要素の天面が培地の天面と同一面又は天面以下になるように、濾過要素を空隙に挿入する工程と、
如何なる培地も無い濾過要素が天面よりも低くなるように、如何なる培地も無い濾過要素を空隙に堆積させる工程を有する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
更に、空隙を形成する工程は、
培地の天面にスペーサを置く工程と、
スペーサ上及び培地の容器の天面上に液体培地を注ぐ工程と、
液体培地が凝固するのを許し、スペーサ上に培地の薄い層を付与する工程と、
スペーサ上の培地の薄い層とともに、スペーサを除去して、培地内に空隙を形成する工程を有する、請求項１９に記載の方法。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】発明の名称
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【発明の名称】透過性を有するメンブレン上の微生物の検知及び識別
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０００１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０００１】
発明の分野
本願は、発明の名称が「透過性を有するメンブレン上の微生物の検知及び識別」である米国仮特許出願第60/896,321号に基づく優先権を主張し、その内容全体は引用を以て本願への記載加入とする。
【誤訳訂正４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０００８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０００８】
発明の要約
本開示は、従来技術による制限を克服する装置、方法及び材料を提供する。特に、本開示は微生物を検知し、識別し、又は列挙する装置を用いてこれを達成し、装置は微生物の成長を維持すべく、栄養を供給する培地のコンテナ、栄養素培地と接触する多孔性の要素(流動床)又は多孔性のメンブレン(membrane)を含む。多孔性の要素自体は、栄養素培地が通り抜けることを許して、従来の普通サイズのコロニー及び微小コロニー(一緒に「コロニー」と呼ぶ)の両方について成長を維持する。そして、多孔性の要素はコンテナから、指標及び更なる視覚的な検査を介した更なる処理の為に、他の箇所に移送可能である。
【誤訳訂正５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１１】
便利な試験を提供すべく、テストキットシステムは、微生物の成長を促進するために栄養素を提供する培地のコンテナ；浸透性のメンブレン；及び以下のグループから含まれる第２の培地を含み、該グループはアガロース、カラゲーニン、ゼラチン、又は色素形成基質、蛍光発生基質あるいは蛍光性か、ラジオ標識抗体のような指標分子を解放させることができるキャリアであり得る他のジェルからなる。
【誤訳訂正６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２８】
メンブレン. メンブレン、即ち多孔性の要素は、微小コロニーを見易くし、特定の形を調査するように、成長及びラベルを張り付けることを許す重要な資料である。このメンブレン用の必要条件は下記である:
顕微鏡を用いて使用される時、光の透過を許すために光透明性でなければならない;
微小コロニーの形成中に微生物に食物を与えて、かつ続いてそれらの微小コロニーに色をつけるために、水及び栄養素培地の栄養物質、及び第２の培地からの指標物質に対して浸透性がなければならない;
ラベル付けした分子が、微小コロニーの細胞に対して浸透し反応することを可能にしなければならない;細胞に対して非浸透性で(上層に培地層を具えた多孔質膜の有名な例外を有して)、細胞がメンブレンの片側でのみ成長しなければならない；メンブレン構造を無傷に保ち、半浸透性を維持すべく、外部の細胞酵素に耐性がなければならない；メンブレンが使用の前に無菌でなければならないので、オートクレーブ可能(autoclavable)でなければならない；水及び大多数の物質が浸透することができるように、親水性でなければならず、親水性のメンブレンは、斯種の浸透に強い耐性がある；非蛍光性で無色でなければならない、何故なら背景の蛍光は蛍光分析法には極めて過度であり、色が微小コロニーの色を覆うからである；微生物の成長を防ぐか禁じる物質を含んではならない。更に、メンブレンは濾過メンブレンが有するような可視の粒子又はファイバーを含んではならない、何故なら粒子又はファイバーは微小コロニーの成長を妨げ、微小コロニーの成長時間と形状を変えることができるからである(多孔質膜より上層の培地層の有名な例外を有して)。
実験は、これらの目的のための最良のポリマーが再生されたセルロースであり、及びセロハン、キュプロフェン、及び透析膜のようなその派生物であることを示す。同じ品質を示す他のポリマーも用いられ得る。自然に発生した気孔又は人工的に生成された気孔を有する有機材料又は向き材料のようなメンブレン用の他の多くのタイプの材料が用いられ得る。
メンブレンは、結果を最前に見るべく光を透過する透明であるが、半透明でもよく、又は白や他の色でも良いが、見るには望ましくない結果となる。
【誤訳訂正７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２９】
第２の培地
第２の培地は、指標物質又は標識抗体へのキャリアとして役立つジェル、ポリマー又はBioNanoChannel(商標)プレートである。その主たる機能は、液体(水又は緩衝溶液)又は抗体に溶解された指標物質を運び、それらを単純拡散によってメンブレンを通って、微小コロニーに搬送することである。
純粋なアガー(アガロース)のようなジェル、ゼラチン、カラギーナン(Carrageenan)、又は重合体の長い分子を有する他の適切な多糖が、液体と半固体形状の物質を結び付けるのに使用することができる。
実際の溶液がメンブレンに素早く浸透し、全ての微小コロニーが分離し、それらの形を失い、再び合併して、細胞の１つの大きな塊を形成する大きな領域を形成するから、指標として溶液を使用することは、普通は避けられる(BioNanoChannelの有名な例外を有して)。しかし、標識付けられた抗体は、比較的大きな分子(IgGは、凡そ150,000daのサイズを持っている)で、ゲルの重合体構造から容易に放されることができない。
この場合に於いて、BioNanoChannelプレートは有名なゲルの代わりに使用することができる。各プレートは10μm又はそれ未満の直径を有する、何百万もの小さなナノチャンネルから構成される。
従って、標識付けられた抗体はナノチャンネルより何千倍も小さく、プレートの片側からナノチャンネルへ液体内で自由に移動することができる。しかし、一旦液体がナノチャンネルに入れば、それは強い毛管力によって捉えられ、メンブレンを通って素早く移動せず、自由な液体が行うように、微小コロニーを崩れさせない。
【誤訳訂正８】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３０】
指標
現在の発明の領域では、指標は微小コロニーに特定に又は非特定に、ラベルを付けることができる物質である。それらは、発色体及び／又は蛍光発生基質、あるいはそれらの混合及び標識付けられた抗体である。
発色体及び蛍光発生基質は、特定又は非特定の酵素、あるいは一群の酵素との反応の後に、光吸収性物質又は蛍光物質を生産する。
これらの基質の小さな分子は自由にゲルから離れ、メンブレンを通り抜けて、生きた細胞の酵素と反応することができる。蛍光色素又はラジオアイソトープによって標識付けられ、BioNanoChannel(商標)プレートへ導入された抗体は、例えばメンブレンが１０６Ｄa又はそれ以上の大きさの孔であれば、ナノチャンネルを自由に出て、メンブレンを通過することができる。
反応しなかった標識抗体は、別のBioNanoChannel(商標)プレートにメンブレンを１回以上転送することにより除去される。
【誤訳訂正９】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３１】
検知、区別及び識別
「検知」の語は、それらの分類と無関係にあらゆる微小コロニーも明らかにし、数え／列挙する能力を意味するものと、一般に理解される。「区別」の語は、メンブレン上の２又は３以上の種を、それらの形、色、又は蛍光の波長／色によって互いに区別するのに用いられた方法の能力を意味する。「識別」の語は、所定の微小コロニーの種類及び種の決定を意味する。検知は色原体か蛍光発生基質だけを必要とする。区別は、微小コロニーの形か色の差に基づく。識別には、抗体、好ましくは単クローンの使用が必要である。
【誤訳訂正１０】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３２】
図１を参照して、本開示の一実施例に従って、溶液内の細胞と共にサンプルを評価する多孔性且つ構造的な要素、及び成長培地要素の２つの実施例の空間的且つ機能的な関係を示す機能ブロック図(10)が示されている。
第１の実施例は、成長培地手段(16)の天面(17)に配備された多孔性且つ構造的な要素、即ち手段(14A)を利用して、試料液(12)の液体部分(18B)は濾過要素手段(14A)を通り抜け、成長培地(16)を保持する容器の底部に向けて成長培地(16)を下向きに通り、一方、試料液(12)の細胞部分(2OB)は、メンブレンの空孔サイズが阻止されるべき所望の細胞のサイズよりも小さいことにより、多孔性要素手段(14A)を通過することから捕捉され、即ち通過を阻止される。
成長培地手段(16)からの栄養素(22)は、メンブレン手段(14)を通って、多孔性要素機能(14A)の天面に位置する細胞(20B)に達する。
【誤訳訂正１１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３３】
第１の実施例とは対照的に、図１の第２の実施例は、多孔性且つ構造的な要素手段(14A)の上層又は該要素手段上の成長培地の更なる任意の層(13)を用いる。この方法に於いて、サンプル溶液(12)の液体部分(18A)は成長培地(16)を通って、成長培地(13)の更なる層及び多孔性の要素手段(14A)の両方を通過するが、液体は培地を通り抜けるが、細胞は通り抜けることができない故に、サンプル溶液(12)の細胞部分(20A)は捉えられ、又は成長培地(13)の更なる層を通ることが阻止される。これにより、第２実施例のメンブレン手段(14A)は、孔が阻止することが所望される細胞サイズよりも小さいとの要求を満たす必要はない。
むしろ、第２の実施例の多孔性要素手段(14A)には、移送手段(24)に、成長培地の更なる層(13)及び細胞及びその上の微小コロニーの支持構造を付与する主要な機能がある。
第２の実施例の多孔性の要素手段(14A)の２次的な機能は、成長培地(16)から細胞及び成長培地の更なる層(13)上に位置する微小コロニーへ栄養素(22)を伝えることであり、成長培地の更なる層(13)自体が同じ目的の栄養素を有する。
これにより、濾過要素は、この構造の要求及び栄養素の伝達を満たす幅広い材料及び気孔サイズを選択することができる。
【誤訳訂正１２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３４】
全ての実施例についてのメンブレンの重要な機能は、多孔性の要素(14A)又はその上に配備された成長培地(13)上に位置した濾過され、捉えられ、即ち濾過された(strained)細胞を移送又は抽出する機能(24)であり、指標(23)との相互作用によって、変更された多孔性の要素/構造要素(14B)上の指標段階(31)にて、次の捕捉され又は阻止された細胞又は微少コロニーを処理する。生存可能な細胞及び微小コロニーの一体性を維持しつつ、それらを移送する能力により、細胞及び微小コロニーの成長段階及び指標段階が、最適な結果に分離されることが可能になる。それは、本来ならば成長を遅らせる有害な指標がその中になくて、細胞が速く成長する成長段階(21)、及びより小さなサイズの微少コロニーが素早く検知されることを効果的に可能にする着色及び識別専用の指標段階(31)である。更に、細胞が初期の微少コロニーサイズで早い段階で評価されるならば、それらは本発明を用いて効果的に検知されるから、連続希釈法はなおさら必要ではない。
このようにして、本発明は、コロニーが互いに大きくなりすぎるのを防ぐ連続希釈法の後に、例えばCHROMagarによって延長された孵化から、従来の普通サイズのコロニーを本質的に要求する従来技術による制限を克服する。
【誤訳訂正１３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３５】
図２Ａについて、本開示の一実施例に従って、１つの容器内のサンプルの平行テスト用に、その上に多数のメンブレン(204)を具えた寒天培地(203)の容器(202)が示される。容器(202)は、栄養素培地(203)を収容するように供給された従来のペトリプレートであり、微生物の成長を妨害し又は阻害せず、テストの応答時間を最速にするように微小コロニーの抑制されない成長を促進する基質のみを含む。
培地(203)の別の実施例は、固体の汎用栄養素培地、又は選択的な別の液体又は半固体の培地、又は微生物の成長に適切に影響するだけの基質を具えた培地を含む。
【誤訳訂正１４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３６】
多孔性の要素(204)は、試料液及び栄養素培地が通過することを許す多孔性の要素である。多孔性の要素は、メンブレン、透過性のメンブレン、透析メンブレン、又はセルロース、孔を有するプラスチック材料を含むあらゆるタイプの既存の濾過要素であり得る。特定のタイプの多孔性の要素(204)は、更なる培地の層がその上にあるか否かに基づいて選択される。多孔性の要素は、透明で、水が透過し、栄養素基質及び指標基質が透過可能であるが、付随的に微生物は透過できない。他の実施例に於いて、多孔性の要素は、１又は２以上の以下の特性及び1000-107ダルトン(Ｄa)の範囲内の規則的又は不規則的な孔を有する透過性のメンブレンである：それはオートクレーブ可能、親水性、非蛍光性、無色、分泌された細胞酵素に対する耐性である。
多孔性の要素材料は、再生セルロース、セロハン、キュプロファン(cuprophane)、透析メンブレン及び適切な孔サイズ及びここに言及された他の特性を満たす他の材料から成るグループから選択され得る。微生物を育てるために必要とされる栄養素のような或るサイズの物質/分子には、透析膜は非常に透過性であることが知られている。透析膜の孔は1,000から数十万Ｄada(ダルトン)の範囲である。孔のサイズが大きいと、多くの物質がメンブレンを通って移動することができる。
しかし、微生物学的な固形培地で使用されるガラクトース寒天内のガラクトース・ポリマーのような長い分子を有するポリマーは、透析膜を透過することができない。実験は、栄養素がメンブレンを通って成長する細胞に容易に浸透するために、メンブレンが固体の栄養素培地上に置かれる場合、微生物が透析膜の表面で成長することができることを示している。固体の栄養素培地の表面上の透析膜、又は寒天の層に組み込まれた透析膜は、その表面に現われるコロニー又は微小コロニーが、指標物質で満たされた別の表面へ移動することを許す。
【誤訳訂正１５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００４１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００４１】
他の検定法に於いて、コロニー及び微小コロニーは、蛍光染料でラベル付けられた抗体を用いて識別される。一実施例に於いて、この検定法は抗体に対するキャリアとしてBioNanoChannel(「ＢＮＣ」)検知装置(330)を用いて達成される。
この場合、抗体はナノチャンネルの内部の溶液内に付与され、ナノチャンネル上にはコロニーを有する多孔性の要素が置かれる。ＢＮＣの天面は、多孔性の要素(204D-4)を支持し、既存のコロニーの一体性と粘着性を維持し、その一方、抗体の大きな分子がナノチャンネルに浮かび、且つオープンチャンネルの直接上にある多孔性の要素(204D-4)上のあらゆるコロニーに伝えられることを個別に可能にする。コロニーに移送されるのに好ましい特定の抗体について適切な大きさである、例えば１6Ｄa又はそれ以上、又は特定の抗体について適切な十分に大きな孔を具えた多孔性のメンブレンが、コロニーに移送されることが所望された。抗体がコロニーに接すると、適切なコロニー(抗原)だけが反応するだろう。
多孔性要素上に出現する過度にラベル付けられた抗体は、１又は２回以上移送されることによって除去され、他のＢＮＣへの多孔性要素は蛍光分子無しで溶媒又はバッファを有する。対照的に、大きな抗体分子は、寒天又はゲル内で運動性を有さない、何故ならそれらの大きなサイズが運動性を邪魔するからである。更に、多孔性の要素を、抗体を具えた液体培地のオープン容器上に直に置くことは、メンブレンが液体によって浸透され、浸水され、洗い流され、それによってコロニーを溶解し、移動させるから、コロニーの一体性を維持しないだろう。このようにして、多孔性のメンブレンの支持及びラベル付けられた抗体の搬送機構を付与するＢＮＣプレートに関連して、本開示の移送可能な多孔性のメンブレンを用いると、従来技術の制限を克服する非常に効果的な解決策を提供する。
【誤訳訂正１６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００５０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００５０】
実施例
生存可能な微生物(TVO)の総数の検知は、世界で最も必要とされる研究手順の１つである。微生物の総数の検知は、食品、生物工学の産業、環境、及び他の産業にて微生物汚染の存在及びレベルを示す。普通のＴＶＯは、バッファ、液体培養液又は０.９％のＮａＣｌ溶液中のサンプルを数(３−１２)１０倍に稀釈し、次に１ミリリットルの各希釈液を、適切な寒天培地で満たされた普通のペトリプレートの表面上に拡げることにより実施される。プレートは、３２−３７℃にて２４−４８時間培養される。この後、プレートは培養器から除去され、コロニーが列挙される。この手順は、希釈に３−１２本のチューブ、及び長時間の培養を必要とする。結果は僅か２４−４８時間後に現れる。この簡単な手順は毎年世界中で、数億回繰り返される。ここに記載した本開示の方法は、より早く(３−６時間)、１０倍の希釈を必要とせず、予め組み込まれたメンブレンを具えた１−２枚のプレートのみを必要とする。メンブレンの組込みは、ペトリプレート内で凝固された栄養素寒天の表面に、幾つかの円形で、殺菌された(１２１℃、１５分)透析メンブレン(気孔サイズ１２,０００-１８,０００Ｄa)を置くことにより行われる。異なる気孔サイズを備えた他のメンブレン又はセロハンメンブレンを、同様に用いることができる。
その後、メンブレンを備えたプレートの全面は１−２秒間、熱い(８０−９０℃)固形の栄養素培地によって覆われる;１−２秒間の凝固の後に、凝固しなかった余分な培地は、吐き出される。これは、全てのメンブレンは栄養素培地の薄い(０.１−０.２ｍｍ)層に覆われることを意味する。上層は下側の培地と自由に交換し、これは２つの層間で水及びポリマーアガロース以外の栄養素基質を全て転送することができることを意味している。
【誤訳訂正１７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００５１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００５１】
本発明に従った手順は、以下である：１ミリリットルのサンプルが、組み込まれたメンブレン(図２)を具えたペトリプレートの表面に移送され、且つ拡げられる。サンプルからの液体は培地に吸収され、プレートは培養され、生きた細胞がもし有れば成長を開始し、微小コロニーを形成し始める。
実験は、調査された全てのバクテリアが３５−３７℃で５時間以内に微小コロニーを形成することを示す。これらの微小コロニーは、数十から数百の非着色で基本的に不可視の細胞から成る。それらを着色する為に、メンブレンは無菌のピンセットを使用して、プレートから剥がされ、第２の培地に移送される。
標準的な方法による第２の培地は、０.１５Ｍの燐バッファ内の１％の純粋なアガロースであり、ｍｌ当たり０.７ｍｇの濃度の色素形成基質3-(4,5-ジメチルチアゾリル-2)-3,5-ジフェニルテトラゾリウム臭化物を具えたｐＨ７.５である。この僅かに黄色い基質は、生きた細胞の脱水素酵素との反応の後に、暗い紫色になる能力を持っている。
この基質は、既知の全ての好気性・嫌気細菌及びイーストの色を変更する能力を持っている、なぜなら微生物の電子伝達鎖の最終段階で反応するからである。換言すれば、基質は細胞の早死に繋がる呼吸鎖の開始や中間部を妨害しない。
このようにして、色の生成は、細胞のメソゾーム(細胞内部の脱水素酵素の位置)の表面上にて、濃い濃度で集められ、細胞本体に暗紫色か黒色を付与する。
微小コロニーを着色するのに必要な時間は、一般的に３０−４０℃で１０−２０分の範囲である。この時間は、基質の分子を解放し、該分子が拡散によって、メンブレン及び固形の栄養素培地の薄い層を通ることを許し、且つ脱水素酵素と反応することを可能にするのに十分である。反応が終了した後に、第２の培地及び着色された微小コロニーを具えたプレートは、光学顕微鏡の下で移動され、微小コロニーは列挙される。微小コロニーのサイズ及び形は、種を区別する(図５.１−５.８)ための補足的な特性になりえる。
【誤訳訂正１８】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００５３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００５３】
蛍光性の実施例
本方法に用いられるメンブレンは、非蛍光性で透明な材料である再生セルロースから作られる。しかし、栄養素培地はそれ自体高い蛍光性物質を含んでいる。一実施例に記載されたように、これにより多孔性要素又はメンブレン上方の栄養素培地の薄い層の使用は制限される。この場合の推奨されるメンブレンは、100,000Ｄaの透析膜である。このメンブレンの比較的大きなサイズの孔により、微小コロニー上に培地の薄い層がなくとも、微小コロニーの十分な成長が可能となる。本実施例に於いて、湿度を高めることも、また有用である、何故ならそれは微小コロニーの形成に更に好ましい条件(微気候)を生成するからである。５−６時間の成長の後、メンブレンは１又は２以上の蛍光発生基質で充填された第２の培地に移動される。 ＴＶＯ検知について、新たに用意されたアセトン１ｍＬ当たり、０.１ｍｇの4-メチルウンベリフェリ燐酸及び4-メチルウンベリフェリ酢酸塩の混合物が使用される。この混合物は、微小コロニーを含むメンブレンが第２の培地上に備えられる前に、数分間第２の培地(蒸留水内の１％のアガロース)の表面上に注がれる。培養は３５−４０℃で１０−１５分かかる。全ての微小コロニーは、使用される基質の混合物が、全ての生きた細胞内に存在する多くのホスファターゼ及びエステラーゼと反応するから、蛍光顕微鏡にて非常に可視的な青い蛍光を得る。
光透過性で非蛍光のメンブレンにより、下から上に向く励起ＵＶ(例えば波長350-380nm)光を用いる安価な蛍光顕微鏡の使用ができるが、高価な落射蛍光(epi-fluorescent)顕微鏡も同様に用いることができる。
【誤訳訂正１９】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００５４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００５４】
免疫蛍光検査法の実施例;識別
光色素(FITC、フルオレスセイン、ロダマイン又はその他)でラベルが付けられた抗体による微生物の識別は、上記の固形の栄養素培地の層が無い、多孔性要素又はメンブレンの使用によって実行される。抗体として使用される免疫グロブリンは、非常に大きなタンパク質分子錯体である。例えば、頻繁に用いられている免疫グロブリンG(IgG)は約150,000Ｄaである。
そのような大きな錯体は、メンブレンを通り抜けて、細胞の抗原の露出された面と反応(抗原と抗体の相互作用)することができる。従って、メンブレンの孔のサイズは、例えば１０6Ｄa又はそれ以上と大きい。
【誤訳訂正２０】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００５５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００５５】
方法を実行すべく、目標である種を含む異なる種の生存細胞を含むサンプルは、メンブレンの表面に広げられる。液体は寒天成長培地に染み込み、プレートは微小コロニーを形成すべく、高湿度条件で３５−３７℃で、５−６時間培養される。この後、表面上に微小コロニーを具えたメンブレンは、目標である微生物(例えばIgG-FITC)に相補的なラベル付けられた抗体を含む溶液で満たされたBioNanoChannelプレート上に置かれる。
ラベル付けられた抗体の分子は、ナノチャンネルの内側で自由に浮かび、各ナノチャンネルは１０μＭの直径と、５００μＭの長さを有する。約２５０万本のナノチャンネルがBioNanoChannelプレートを覆い、該プレートは２５ｍｍの直径を有する。このようにして、抗体を具えた溶液は、小さなガラスチャンネルの膨大な集まりの内側に「捕捉」される。
これは微小コロニーを溶かすことができ、目標である細胞を他の種の細胞と混合することができる余分な液体を有する濡れた領域を防ぐのに重要である。
また、BioNanoChannelプレートは大きなIgG分子が自由に自由に移動することを可能にし、それに対し、他の実施例(小さな分子についての実施例)で使用されるアガロースは、その重合体の構造からIgGを解放することができないので、BioNanoChannelプレートの使用は重要である。
【誤訳訂正２１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００５６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００５６】
ラベル付けられたＩｇＧの分子は、拡散によって全ての微小コロニーに達し、目標とする抗原と反応する。この工程は、室温で０.５−１.０時間かかる。反応しなかった分子は、洗浄液(ＰＢＳ、ｐＨ７.５)で充填された他のBioNanoChannel(商標)プレート上のメンブレンに１０−２０分間置くことにより、除去される。この後、ラベル付けられ及びラベル付けられていない(蛍光及び非蛍光又は弱く蛍光)微小コロニーを具えたメンブレンは、蛍光顕微鏡の下に置かれ、蛍光(目標)である微小コロニーが検知され、列挙される。
【誤訳訂正２２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００５９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００５９】
異なるサイズの孔及び他の特性のメンブレンは、ウィルス学、特に細胞の菌株が、細胞層内の孔を通るウィルスの成長と検知に使用される場合に有用である。
【誤訳訂正２３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００６０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００６０】
汚染除去品質
流行病、致命的な疾病を持った人の存在、又はテロリスト或いは外国の軍隊の生物攻撃の後の屋内環境の汚染除去は、全ての平均的な微生物学者にとって、非常に重要なジレンマである。汚染除去の後に残存する細胞の存在及び量により、浄化された設備が更に使用される可能性が定められる。
特に重要な公共設備が含まれている場合(空港、政府か、軍事施設、或いは公衆が頻繁にアクセスし、重要な他の場所)、この分析はまさに短時間で終了させなければならない。この状況で、生きて／残存する細胞だけが検知されなければならない。そして、細胞の実際の成長だけが、生きた微生物を検知する最も信頼できる方法であることが知られている。
コロニーを形成する通常の成長は、２４−４８時間又はそれ以上かかる。本発明は、５−６時間で同じ結果を可能にし、高価でなく、手動処理をそれほど必要とせず、それによって、多くのサンプルが分析されることができることを意味する。例えば、領域がバシラス・アンスラシス因子によって汚染され、汚染除去が栄養細胞及び因子を全て殺す場合、病原菌の因子だけが残存することができる。
クロストリディウム、放線菌及び菌類の因子は、異なる理由故に、B.anthracisに使用された培地上で育てられない。このようにして、この培地上で成長する病原菌のただ一つの種はB.anthracisである。この場合、ＴＳＡを使用することができる。設備の別の部分からの液体試料は、メンブレンを具えたＴＳＡ上に置かれ、メンブレンはＴＳＡの上方に薄い層を具える。
３７℃にて５時間培養した後に、できるだけの微小コロニーを具えたメンブレンは、3-(4,5-ジメツルシアゾール-2)-3,5-ジフェニルテトラナトリウム臭化物(ＰＢＳ ｐＨ７.５内の純粋な１％のアガロース)を具えたプレートに転送される。
１０−２０分で、特定の形をした濃い有色の微小コロニーが、他の病原菌類から認識される(例えば、図５.４はBac.anthracis研究のモデルとして知られる枯草菌に見えるものを示す)。これらの微小コロニーはB.anthracisの残存する汚染除去の確認の為の迅速なＰＣＲ(１―１.５時間)によって除去し分析することができる。このようにして、設備の継続使用の許可は２４−４８時間以上ではなく、６−８時間後で可能である。
【誤訳訂正２４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００６１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００６１】
耐抗生物質性の微生物の検知
ヒトのサンプル中、及び院内感染(黄色ブドウ球菌、緑膿菌、クレブシェラオキシトカ及び他のもの)としての耐抗生物質性の微生物の検知は、急成長している医学的な問題である。感染した人の生命は、抗生物質耐性菌の迅速な診断に大いに依存する。
抗生物質がある状態でコロニーを成長させ生成することは、抗生物質耐性菌の診断法に広く用いられる唯一の信頼できる方法である。栄養素培地及び抗生物質(CHROMagar、MRSA又はその他)を備えたプレート上で成長/コロニーを見出すのに現在２４時間かかる。
この分析を６−８時間に制限することは、１年当たり世界中の何万もの命を救うことができる。例えば、黄色ブドウ球菌を迅速に検知する一般的な方法は、以下の通りである:おそらく耐抗生物質性の黄色ブドウ球菌を含んでいるサンプル(血液又は大気)は、組み込まれたメンブレンを用いて、メチシリン(ＭＲＳＡ培地)にて満たされたプレートに広げられる。５−６時間の後、メンブレンはアガロース及び色素形成基質を備えたプレートに移送される。１０−１５分の後、微小コロニーは全て暗い紫色を得て、目に見えるようになる。特定の形(図７)の微小コロニーは、耐抗生物質性の黄色ブドウ球菌と認められる。
【誤訳訂正２５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００６２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００６２】
大腸菌の素早い検知
食物及び環境サンプル内の大腸菌(Ｅ.coli)の存在は、糞便汚染の信頼性のある特性であることが知られている。生きた細胞だけが結果の列挙を得るのに重要であり、免疫学的方法及びＰＣＲ法はこの場合、有効ではない。コロニーを形成する能力は、生きた大腸菌の最も信頼性のある特性である。大腸菌の成長と検知について、MacConkey寒天が、グラム陰性微生物、ラクトース陽性微生物に対して広く用いられる。
或いは、CIRCLEGROW(商標)培地が大腸菌の素早い成長に用いられる。ＬＢ寒天も使用され得る。これらの全ての培地は、大腸菌の微小コロニーの成長に適しており、他のいくつかの微生物もサンプル内に存在する。培地の表面に組み込まれた多孔性の要素、即ちメンブレンは、天面に寒天培地の薄い層を有してはならず、例えば50,000-100,000Ｄaの適切なサイズの孔を有している。大腸菌は３７℃に於ける４−６時間の培養の後に、可視性の良好な微小コロニーを形成する。培養時間の後に、大腸菌と他の種の微小コロニーの両方を含むメンブレンは、４−メチルウンベリフェリル−β−ガラクトピラノサイド(３５％のエタノール内の０.１ｍｇ/ｍｌ)で充填されたBioNanoChannelプレートに移送される。培養の５−１０分後、大腸菌の微小コロニーは、励起する３５０−３８０ｎｍの紫外線にて、蛍光顕微鏡の下、明るい青色蛍光を得る。他の微小コロニーは無色のままである。
【誤訳訂正２６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００６３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００６３】
他の実施例
本記載は、広範な種々の用途に適用可能であり、本開示に記載された如何なる特定のタイプの検定法、培地、フィルタ、メンブレン又は微生物にも限定されない。ここに記載された実施例から見て、本開示は、多数の連続希釈法、過度の時間及び研究所の資源消費及び不十分な結果のような従来技術による制限を克服する方法及び装置を提供するように示される。