【手続補正書】
【提出日】平成15年3月17日(2003.3.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】発明の詳細な説明
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、生物発光タンパク質類に関し、特に、例えば化学的手段によって又は遺伝子工学によって修飾された生物発光タンパク質類に関する。
【０００２】
【従来の技術】
このような修飾された生物発光タンパク質類は、以下で“レインボウタンパク質類”と呼び、細胞とか、細菌・ウイルスおよび原生動物のような微生物類、および基質類・代謝物類・細胞内および細胞外シグナル類・酵素類・抗原類・抗体類および核酸類のような生物学的に重要な物質類、の検出および定量に使用することができる。
【０００３】
生物発光は、有機分子である“ルシフェリン”の酸素またはその代謝物類のひとつによる酸化であり、光を発するものである。この反応は、ルシフェリンが周囲の液体中に拡散しないルシフェラーゼと非常に緊密にまたは共有結合で結合しているとき、通常“ルシフェラーゼ”または“発光タンパク質”として知られているタンパク質によって触媒される。
【０００４】
Ｏ２（またはＯ２−  または  Ｈ２Ｏ２）＋ルシフェリン＋ルシフェラーゼ（または発光タンパク質）→オキシルシフェリン＋光
【０００５】
光を発するためまたはその色を変化させるため、３種までの他の物質類が同様に存在することが必要となることがあり、それらは下記のとおりである：
（ａ）Ｈ＋、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋のようなカチオン、またはＣｕ＋／Ｃｕ２＋、Ｆｅ２＋／Ｆｅ３＋  のような遷移金属。
（ｂ）ＮＡＤＨ，ＦＭＮ，またはＡＴＰのような補因子。
（ｃ）エネルギー転移受容体としてのフルオアー（ｆｌｕｏｒ）  。
【０００６】
これまでに５種の化学属のルシフェリンが確認されている。（付属図面の図１参照）：
（ａ）アルデヒド類（細菌、淡水リンペット・ラティア（Ｌａｔｉａ）  およびミミズ中に見られる）。
（ｂ）イミダゾロピラジン類（有毛根足類、刺胞動物、有櫛動物、一部の節足動物、一部の軟体動物、一部の脊索動物）。
（ｃ）ベンゾチアゾール（ホタル類およびツチボタル類のような甲虫類に見られる）。
（ｄ）直鎖テトラピロール類（双鞭毛藻類、オキアミ、一部の魚類に見られる）。
（ｅ）フラビン類（細菌、真菌、多毛類および一部の軟体動物に見られる）。
【０００７】
これらのルシフェリン類が関与する反応の結果、紫、青、青緑、緑、黄または赤色光および時には紫外線または赤外線（ＩＲ）の発光が起り、このような発光は、直線にまたは円に偏光されることもある。生物発光反応についてのこれ以上の説明については、Ａ．Ｋ．Ｃｈａｍｐｂｅｌｌ  著、Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ（化学発光の原理および生物および医学における応用）（１９８８年、Ｈｏｒｗｏｏｄ／ＶＣＨ  Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ  Ｗｅｉｎｈｅｉｍ  発行）を参考のこと。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
さて、修飾された生物発光性または“レインボウ”タンパク質が関与する生物発光反応によって発生した光の強度、色または偏光度が変化する可能性があることが知られている。したがってこのような変化を細胞、微生物および生体分子類の検出、位置特定および測定のためのさまざまなアッセイに使用できる。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
この例では、前記細胞または物質は、遺伝子工学で産生されたルシフェラーゼのようなレインボウタンパク質に物理的またはリン酸化のような化学的変化を引き起こし、発光の強度、色または偏光に変化をもたらす。前記生物発光反応は、例えば、ルシフェリンを添加することによって惹起され、そして、測定すべき細胞または物質によって前記ルシフェラーゼが修飾されると、より短波長またはより長波長の光を発光する反応を引き起こす。
【００１０】
これによって、生細胞中において、細胞小器官内部または形質膜の内または外表面において、それらを切断開裂する必要もなくまた結合フラクションおよび非結合フラクションを分離する必要もなく、特異的反応を検出し定量化できる。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明の１つの態様においては、異なる物理的、化学的、生化学的または生物学的条件下において改変された特徴をもつ光または放射線を生成する生物発光反応に関与できる生物発光タンパク質が提供される。
【００１２】
このレインボウタンパク質は、前記ルシフェラーゼまたは発光タンパク質の末端からまたはその内部において１個以上のアミノ酸（類）を改変、置換、添加または除去することによって生成される。その結果、オキシルシフェリンからの発光は、物理的または化学的条件に応じて異なる色または異なる状態の偏光となることができる。レインボウスペクトルの別の部分への色の変化は、以下のものによって誘発できる。
【００１３】
（ａ）Ｈ、Ｃａ、Ｍｇまたは遷移金属などのカチオン濃度の変化、
（ｂ）Ｃｌ−  またはリン酸基のようなアニオンの濃度の変化、
（ｄ）リン酸化または脱リン酸化反応（セリン／スレオニン、ヒスチジン、およびチロシンキナーゼ類およびホスファターゼ類を含む）、トランスグルタミネーション、タンパク質分解反応、ＡＤＰリボシル化、グリーまたはグルコシル化、ハロゲン化、酸化、メチル化およびミリスチン化を起こす酵素類による前記新規タンパク質の共有結合修飾、
【００１４】
（ｄ）抗原、サイクリックＡＭＰのような細胞内シグナル、サイクリックＧＭＰ，Ｉｐ３，Ｉｐ４，ジアシルグリセロール、ＡＴＰ，ＡＤＰ，ＡＭＰ，ＧＴＰ全てのオキシ，またはデオキシリボヌクレオシドまたはヌクレオチド、基質、薬物、核酸、遺伝子調節タンパク質のレインボウタンパク質への結合、
（ｅ）生細胞内部でのその核酸の発現、および細胞内部におけるプロモータ類、エンハンサー類または癌遺伝子類のような遺伝子発現によるそれの修飾または調節。
【００１５】
ＤＮＡ片（例、ＰＣＲ生成物）中にある単一または多重の突然変異および欠失は、前記“レインボウタンパク質”を上記のＤＮＡの１末端に連結させ、さらにエネルギー転移受容体またはクエンチャーを他の末端に連結することによって検出できる。突然変異におけるヌクレアーゼの攻撃によって、前記レインボウタンパク質は上記受容体またはクエンチャーと区分され、それによって、発光の強度、色または偏光状態の変化が生ずる。
【００１６】
１種以上のアミノ酸（類）のこのような改変、置換、添加または除去は、化学的手段によって達成できる。
酸の改変には、アルキル化（例  メチル化）、リン酸化および本文に概略した種類のさまざまな他の共有結合的修飾が含まれる。あるいは、ルシフェラーゼまたは発光タンパク質のコードを指定する核酸は、結果として生成されるタンパク質がカチオン類、アニオン類、細胞内シグナル、測定すべきタンパク質類または核酸の共有結合的修飾と、相互作用する部位を獲得するかまたは喪失するように、１種以上のヌクレオチド類を修飾、置換、挿入または欠失することによって改変することができる。
【００１７】
ヌクレオチド類の前記挿入または欠失は、通常、部位特異的突然変異誘発によって、または、前記遺伝子を特異的制限酵素で切断開裂し、選択したヌクレオチド配列を挿入または欠失させ次に前記遺伝子を再度つなぎ合わせ、またはポリメラーゼ連鎖反応で特異的プライマー類を使用して、引き起こされる。この核酸は、次にｍＲＮＡに転写され、次いで翻訳されて細菌または真核生物細胞の内部でか、あるいはインビトロで例えばウサギ網状赤血球溶解液を用いるか、のいずれかでレインボウタンパク質を産生する。
【００１８】
この新規の核酸は、Ｔ７、ＳＰ６のようなＲＮＡポリメラーゼプロモータ、または、アクチン、ミオシン、ミエリンタンパク質類、ＭＭＴ−Ｖ、ＳＶ４０、抗体、Ｇ６Ｐデヒドロゲナーゼのような哺乳類プロモータ類を含有してもよく、そして、前記ポリメラーゼ連鎖反応によってインビトロで増幅させることができる。この結果、前記レインボウタンパク質は、癌細胞のような生細胞中で、または、インビトロで酵素反応を用いて細胞なしで産生できる。
【００１９】
前記未改変または改変生物発光タンパク質をコードするＤＮＡの５’または３’末端へ組織特異的プロモータまたはエンハンサー配列を付加すると、それがレポータ遺伝子として使用可能になり、そして、特定の細胞または組織において特異的に発現されることが可能となり、その発現は、光強度、色または偏光度の変化の出現によって検出できる。
【００２０】
レインボウタンパク質のためのＤＮＡ調製の別の方法は、前記生物発光タンパク質のための元のＤＮＡを２つの半分に分離することである。そして、ＤＮＡまたは遺伝子一片は、その５’末端に上記の１つの半分を結合し、そしてその３’末端に上記の他の半分を結合することによって、前記２つの半分の間に挿入される。
【００２１】
さらに別の方法として、前記レインボウタンパク質ＤＮＡはポリメラーゼ連鎖反応によって産生することができ、その際、センスプライマーは５’末端に結合したレインボウタンパク質ＤＮＡの１部分を有し、アンチセンスプライマーは３’末端に結合した他の部分（すなわちアンチセンス）を有している。
【００２２】
中間にある対象とするＤＮＡまたは遺伝子の片類は、２つの別々の遺伝子類から由来することができる。例えば、ひとつがエネルギー転移タンパク質を、他が生物発光タンパク質をコードすることができる。上記２つがペプチド（ＤＮＡ／ＲＮＡ由来）を介して連結されるときにのみ、前記レインボウタンパク質が産生されて色のシフトが起こる。
【００２３】
エネルギー転移タンパク質は、前記タンパク質と共有結合または非共有結合で結合したいかなるフルオアーであることもでき、例えば、オワンクラゲ、ヤクチクラゲ、ウスカワミジンコまたは他の刺胞動物類由来の緑色蛍光タンパク質、または発光性細菌類由来の青または黄色蛍光タンパク質、またはフラビンタンパク質（ｆｌａｖｏｐｒｏｔｅｉｎ）またはフィオビロプロテイン（ｐｈｙｏｂｉｌｏｐｒｏｔｅｉｎ）  であることができる。
【００２４】
前記タンパク質全体としてでもまたはその蛍光領域のみでも使用できる。前記生物発光タンパク質は、例えば、細菌、ホタル、ツチボタル、またはカイアシなどのルシフェラーゼでもよく、または、例えばエクオリン、オベリン、サラシコリンのようなラジオラリンのためのいかなる発光タンパク質であってもよい。
【００２５】
前記タンパク質またはそのＤＮＡまたはＲＮＡは、ウイルス、プラスミド、リン酸カルシウム・トランスフェクション、電気穿孔法、リポゾーム融合、または膜孔形成性タンパク質類を用いて、生細菌または真核細胞中に取り込むことができる。いったん内部に入ると、適当な生化学性質を有する生細胞のみが前記“レインボウ”効果をもたらす。
【００２６】
前記“レインボウタンパク質”遺伝子を胚、卵母細胞、精子、種子または実生に取り込むことによって、トランスジェニック動物または植物が産生され、前記“レインボウ効果”を用いて遺伝子発現、細胞制御、薬物作用または細胞障害のそれぞれの器官中における位置特定できしかも測定できるようになる。これらの新規有機体は、家庭用飼育水槽中で、飛行機滑走路上で、海上の安全灯として、および室内鉢植え草花用などにも使用できる。
【００２７】
前記レインボウタンパク質は、また、化学的手段によってまたは前記タンパク質を遺伝子工学処理によって形質膜の内または外表面または特定の細胞内小器官（例  パーオキシゾーム、ミトコンドリア、クロロプラスト、小胞体、ゴルジ、分泌小胞、核またはエンドゾーム）内部に位置するようにシグナルペプチドを含有させることによって、細胞の種々の部分に取り込ませることもできる。
【００２８】
化学的にまたは遺伝子工学によってシグナルペプチドを添加することによって、前記正常または改変ルシフェラーゼまたは発光タンパク質を細胞内部の特定の細胞小器官または形質膜の内または外表面上にターゲットさせることができる。例えば、Ｎ末端の配列ＭＬＳＲＬＳＬＲＬＬＳＲＹＬＬ  は前記生物発光タンパク質をミトコンドリア内に位置させ、そして、Ｎ末端のＫＫＳＡＬＬＡＬＭＹＶＣＰＧＫＡＤＫＥ  は前記タンパク質を小胞体へターゲットさせ、Ｃ末端のＫＤＥＬ配列は、それをそこに保持する。
【００２９】
元のルシフェラーゼまたは発光タンパク質またはその遺伝子は、生物発光で公知の化学物質（図１参照）のいずれかから、または少なくとも１６個の門を代表する７００以上の属から由来する広い範囲の未解析の発光性有機体から、由来することができる。前記ルシフェリンは化学的に合成されてもよく、そして、前記生体反応または細胞に添加されて光を発することもできる。
【００３０】
あるいは、ルシフェリン生成を担っている酵素類をコードする遺伝子は、前記“レインボウタンパク質”遺伝子と結合され、その結果、人工オペロンまたは融合遺伝子が発現して、生細胞中でアミノ酸のような正常な細胞成分からレインボウタンパク質およびルシフェリンを生成する。
【００３１】
本発明の第２の実施態様によれば、化学的手段または前記タンパク質をコードする核酸の遺伝子工学的手段によって、前記タンパク質に対する１個以上のアミノ酸を改変、置換、添加または欠失させることによって、生物発光タンパク質を調製する方法を提供する。
【００３２】
本発明のさらに別の実施態様によれば、先に定義された生物発光タンパク質をコードする核酸が提供される。
前記レインボウタンパク質またはそれをコードする核酸は、
（ａ）微生物類（原生動物、細菌、位置特定類）の検出、位置特定および測定、（ｂ）癌細胞の検出および位置特定、
（ｃ）細胞または体液中における酵素類、細胞内シグナル伝達およびその他の代謝回転反応測定、
（ｄ）ＤＮＡおよびＲＮＡ結合アッセイ、
（ｅ）イムノアッセイおよびその他のタンパク質結合アッセイのような生物研究領域で使用できる。
【００３３】
前記レインボウタンパク質およびそれらの元の核酸類は、また、遺伝子工学においてトランスジェニック動物類、植物類および微生物類の開発、および園芸においても使用できる。
【００３４】
本発明のさらに別の実施態様によれば、微生物類、細胞類または生体分子類またはその中での反応のような生物学上関心を寄せられる物質類の検出、位置特定または測定のための、前記レインボウタンパク質またはこのレインボウタンパク質をコードする核酸の用途が提供される。
【００３５】
この実施態様において、生物学上重要な反応または物質類は、レインボウタンパク質またはその元の核酸と相互作用させられる。このような相互作用には、非共有結合または共有結合のような直接的または間接的結合、およびエネルギー転移過程が含まれる。
【００３６】
【実施例】
本発明を上述してきたが、それが、上記に述べたかまたは下記に記載の特徴のいかなる発明の組み合わせも含むことを理解すべきである。
本発明はさまざまな方法で実施することができ、また、下記のいくつかの実施例を参照にしてさらに説明する：
【００３７】
実施例１
レインボウタンパク質のリン酸化の検出
ケンプチドとして公知のペプチドｌｅｕ  ａｒｇ  ａｒｇ  ａｌａ  ｓｅｒ  ｌｅｕ  ｇｌｙまたはマランチドとして公知のＲＴＫＲＳＧＳＶＹＥＰＬＫＴを、ジサクシニル・スベラートを用いてｐＨ３でホタルのルシフェラーゼに共有結合させた。プロテインキナーゼＡ１２５μｌ＋サイクリックＡＭＰ（２００μＭ）＋１２５μＭＡＴＰを添加して前記ケンプチドをリン酸化させ、それによってルシフェラーゼに結合させた。
【００３８】
ｐＨ７．８  における黄緑色から赤色への色のシフト、またはｐＨ６．５  における赤色から黄緑色への色のシフトを二波長ケミ・ルミノメータにおける比率として測定し、前記キナーゼによるタンパク質リン酸化の割合をアッセイし、ホスファターゼによって誘発された脱リン酸化を前記比率の逆数によってアッセイした。
【００３９】
実施例２
人工ホタル・ルシフェラーゼ
ホタル・ルシフェラーゼをコードするｃＤＮＡは、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモータと共に用いられる下記の５’センスプライマー類と、３’アンチセンスプライマー類、を用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅させた：プライマーコードを以下に示す。
【００４０】
５’センス・プライマー類
（１０５）ＣＡＣＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＡＴＧＧＡＡＧＡＣＧＣＣＡＡＡＡＡＣ
（１０７）ＡＧＡＡＣＴＧＣＣＴＧＣＣＧＣＡＧＡＴＴＣＴＣＧＣＡ
（１１０）ＡＴＧＣＴＧＴＣＣＣＧＧＣＴＧＴＣＣＣＴＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧＴＣＣＣＧＧＴＡＣＣＴＧＣＴＧＡＡＧＡＣＧＣＣＡＡＡＡＡＣ
（１１１）ＣＡＣＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＡＴＧＣＴＧＴＣＣＣＧＧＣＴＧＴＣＣ
【００４１】
３’アンチセンス・プライマー類
（１００）ＴＣＴＣＧＣＴＧＡＡＴＡＣＡＧＴＴＡＣ
（１０６）ＣＣＣＣＡＡＧＣＴＴＡＧＡＴＣＴＣＴＣＴＧＡＴＴＴＴＴＣＴＴＧＣＧＴ
（１０８）ＴＧＣＧＡＧＡＡＴＣＴＧＣＧＧＣＡＧＧＣＡＧＴＴＣＴ
【００４２】
下記のホタル・ルシフェラーゼｃＤＮＡ類は、以下のプライマー類を用いて構築された：
（ａ）全長（１０５＋１００）
（ｂ）−３６ｂｐすなわち、パーオキシソマル・シグナルペプチド欠失（１０５＋１０６）
（ｃ）タンパク質中央部のプロテインキナーゼＡ部位（ＲＲＸＳ）
（段階１：１０５＋１０８および１０７＋１００；  段階２：段階１からの半分２個＋１０５＋１００）
（ｄ）Ｎ末端のミトコンドリア・シグナル
（段階１：１１０  ＋１００  ；  段階２：段階１の試料＋１１１＋１００）。
【００４３】
５０μｌ中におけるＰＣＲ反応は、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ    ｐＨ８．３、０．０１％ゼラチン、０．４Ｕ  Ｔａｑポリメラーゼ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２  、各０．２ｍＭのｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＣＴＰ，０．５μＭの各プライマー、１μｌのＤＮＡ（およそ１−１００ｎｇ）を含有していた。
【００４４】
本反応は、５０μｌの鉱物油でカバーされ、パーキンエルマー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ）サーマルサイクラー中で２５サイクル、即ち、９４℃−１分、５５℃−１分、７２℃−２分＋各サイクルの５秒延長、でインキュベートし、さらに、１ＵのＥ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼ（クレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ  ）断片）とともに３７℃で３０分間、インキュベートした。
【００４５】
ＰＣＲの成功は、アガロースゲル電気泳動のバンドによって確認した。ｃＤＮＡはセントリコンによって精製し、プライマー類を除去し、そして、緩衝フェノール：ＣＨＣｌ３  ：２級アミルアルコール（２５：２４：１）で抽出後、７０％エタノール、０．７ｍＭ  酢酸アンモニウム中で沈澱させた。
【００４６】
前記ＤＮＡ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ０．１  または１ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ７．４  〜７．５  中に溶解した０．５〜１μｇ）は、３７℃で４時間まで（最適には１〜２時間）、４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，  ｐＨ７．４  〜７．５，    ５．６ｍＭ  ＭｇＣｌ２  、１０ｍＭ  ジチオスレイトール、０．１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、２ｍＭ  スパーミジン、各０．５ｍＭのＡＴＰ，ＣＴＰ，ＵＴＰ，０．１ｍＭのＧＴＰ，０．５ｍＭのｃａｐ  ｍ７  Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ，１０００ＵのＲＮＡ  ｓｉｎ／ｍｌ、８００ＵのＴ７  ＲＮＡ  ポリメラーゼ±２μ、Ｃ３２Ｐ−ＵＴＰを含有する緩衝液中で、前記のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ中に転写した。
【００４７】
本反応は、氷冷フェノール：ＣＨＣｌ３：２級アミルアルコール（２５：２４：１）中で停止させ、そして、前記ＲＮＡを７０％エタノール＋０．７Ｍ  ＮＨ４Ａｃで沈澱させ、−２０℃で保存した。
【００４８】
前記ＲＮＡを遠心分離し、２０μｌの７０ｍＭ    Ｔｒｉｓ、１ｍＭ  ＥＤＴＡｐＨ７．４〜７．５中に再溶解させ、そして、１μｌを５〜１０μｌのウサギ網状赤血球溶解液とともに３０℃で１時間インキュベートして、ルシフェラーゼを合成した。１／１００希釈後のルシフェラーゼを、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、０．１〜０．２ｍＭルシフェリン、０．５〜５ｍＭ  ＡＴＰ中ｐＨ７．８  で直接発光をアッセイするかまたは等電点電気泳動によって単離する。
【００４９】
突然変異体（ＲＲＸＳ）ルシフェラーゼは、およそ７．１または６．８のｐＩを有し、そして、正常のルシフェラーゼは、およそ６．８のｐＩを有している。ミトコンドリア・シグナルを有するルシフェラーゼは、また、正常ルシフェラーゼから分離された。この改変ルシフェラーゼを含有するウサギ網状赤血球溶解液を添加すると、それは、遠心分離およびミトコンドリアおよびルシフェラーゼからの発光によっても示されるように、添加されたミトコンドリアによって取り込まれた。
【００５０】
プロテインキナーゼＡ、サイクリックＡＭＰ（０．２ｍＭ），  ＡＴＰ（０．１−１ｍＭ）ｐＨ７とともにＲＲＸＳを含むルシフェラーゼのリン酸化によって、ルシフェラーゼのｐＩを再度６．８に戻すように変化させその色をシフトさせた。ＲＲＸＳルシフェラーゼは、干渉フィルター付二波長ケミルミノメータを用いて検出した時に未改変ルシフェラーゼよりも強い緑色の発光を有していた（最大透過率およそ５４５および６０３ｍＭ）。
【００５１】
ケンプチドヌクレオチドセンスまたはアンチセンス配列（ＬＲＲＡＳＬＧ  ）またはマランチド  ＲＴＫＲＳＧＳＶＹＥＰＬＫＩ  を含有するプライマー類は、同様に、１または２段階のＰＣＲ反応を用いてＮまたはＣ末端のいずれかに添加された。これらは、また、リン酸化されることができるルシフェラーゼを産生し、それによって、その強度および色を変化させた。
【００５２】
実施例３
工学処理されたエクオリンの調製
ｃＤＮＡすなわちＣａ２＋活性化発光タンパク質のゲノムコードは、ホタル・ルシフェラーゼのそれと同様の方法でＰＣＲされた。１または２段階ＰＣＲを用いて、プロテインキナーゼＡ認識ペプチド・ケンプチド（ＬＲＲＬＡＬＧ  ）またはマランチド（実施例２に同じ）をＮ末端に添加した。突然変異エクオリンは、異なるキネティック特性を有しており、改変エクオリン（上記）をリン酸化することによってプロテイン・キナーゼＡを検出可能とした。
【００５３】
正常エクオリン・プライマー類＝５’センス  ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＧＡＧＡＧＡＡＴＧＧＴＣＡＡＧＣＴＴＴＡＣＡＴＣＡＧＡＣＴＴＣＧＡＣ  と、３’アンチセンス  ＧＡＡＴＴＣＴＴＡＧＧＧＧＡＣＡＧＣＴＣＣＡＣＣＧＴＡ    であった。Ｎ末端へのケンプチド挿入のために、ＬＲＲＡＳＬＧ  と等価のヌクレオチド配列をエクオリンの５’末端から最初の１５塩基（ＡＴＧを含む）に結合させた。
【００５４】
段階２において、前記Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ・プロモータを添加して、インビトロ・リン酸化のためにケンプチド−エクオリンをインビトロで形成した。ゲノム・エクオリンＤＮＡ（ＰＣＲによって作製）は、逆転写酵素ＰＣＲによってｍＲＮＡから製造されたそれと少なくとも同じくらい活性であった。
【００５５】
実施例４
血中の癌細胞の検出
血液試料（１ｍｌ）を図１のベンゾチアゾール反応３を触媒するレインボウタンパク質類をコードするｍＲＮＡ含有リポゾーム類の懸濁液に混合する。このｍＲＮＡは、下記のようにして産生された：
【００５６】
ホタル・ルシフェラーゼをコードする遺伝子は、最初に、（ｐＣＤＶ１プラスミドプライマー）＋（ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼプロモータ含有ホンジョー（Ｈｏｎｊｏ）リンカー）を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ中のｃＤＮＡライブラリから単離した。ｍｙｃ癌遺伝子のチロシンキナーゼ活性のためのリン酸化部位を示すヌクレオチド配列
ＧＣＴＣＧＴＣＴＴＡＴＴＧＡＡＧＡＴＡＡＴＧＡＡＴＡＴＡＣＴＧＣＴＣＧＴＴＴＴＧＧＴ
を、５’末端のＡＴＧから３０塩基対下流のＥｃｏＲＩ制限部位に挿入した。
【００５７】
前記ＤＮＡを再び連結し、再クローン化し、そして、前記プラスミド挿入物はインビトロでＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼによって転写されてレインボウタンパク質のためのｍＲＮＡを産生した。前記の元のタンパク質は黄緑光を発生したが、しかし、レインボウタンパク質は細胞中でリン酸化されたときに赤色光を発生した。したがって、癌細胞の存在は、二波長ケミルミノメータ中で赤色（６０３ｎｍ）に対する黄緑色（５４５ｎｍ）の光の比率を測定することによって、白血病患者の血液試料中で検出された。
【００５８】
実施例５
サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）の検出
ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼプロモータを含有する実施例４のレインボウタンパク質のためのｃＤＮＡを、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ファージ中に挿入した。このファージをサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）に添加すると、レインボウタンパク質を発現させおよび赤色光を発生させ、２０ｍｌ当たり１個しかない細菌も検出できた。
【００５９】
実施例６
ＨＩＶ  ＲＮＡの検出
ＡＩＤＳ患者の血液試料（１ｍｌ）を４Ｍグアニジウムイソチオシアナートによって抽出し、そして、前記核酸をエタノール／ＮＨ酢酸によって沈澱させた。前記発光タンパク質オベリンから産生したレインボウタンパク質で標識したオリゴヌクレオチド（１０μｌ，１μＭ）を、１００μｌの再溶解ＲＮＡに５０℃で添加して、この混合物を０℃で１０分間冷却した。
【００６０】
このオリゴヌクレオチドは、ＨＩＶコートタンパク質中の配列に特異的であった。これをＨＩＶ  ＲＮＡに結合して、レインボウタンパク質の発光を淡青（４７５ｎｍ）から青（４４０ｎｍ）にシフトさせた。これは、二重光電子増倍管ケミルミノメータ中におけるこれら二波長における発光の比率のシフトとして検出された。
【００６１】
実施例７
血液中テストステロンの測定
テストステロン・カルボキシオキシムを、発光タンパク質オベリン由来レインボウタンパク質と反応させ、テストステロン・レインボウタンパク質結合物（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）  を形成させる。この１ｎｍｏｌを含有する５μｌを、さまざまな濃度の標準テストステロンの存在下または非存在下に、テストステロン（５０μｌ）ｐＨ７．４  に対してフルオロセイン標識した抗体溶液とともに、３０分間インキュベートした。
【００６２】
生物発光反応は、Ｃａの添加によって惹起され、そして、４７５ｎｍの光の５３０ｎｍの光に対する比率を測定した。標準テストステロン濃度を増加するとともに、４７５／５３０比率が増大した。本操作は、遊離抗原から結合抗原を分離する必要もなく実行することができた。
【００６３】
実施例８
リステリア菌の検出
疑いのある食品試料を沸騰させ、ＤＮＡを抽出する。特異的リステリア菌遺伝子またはオベリンｃＤＮＡ＋５Ｐ６ＲＮＡポリメラーゼプロモーターに共有結合で結合した領域に対するセンスプライマ、およびアンチセンス緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）ｃＤＮＡに共有結合で結合したアンチセンスプライマー、を用いて、ポリメラーゼ連鎖反応を用いてリステリア菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）遺伝子を増幅させる。この結果、新規レインボウタンパク質のコードを指定し且つＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼによって転写可能なＤＮＡとなる。
【００６４】
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【００６５】
このＤＮＡは転写され、そして、ｍＲＮＡは、ウサギ網状赤血球溶解液を用いて翻訳される。コエレンテラジンを添加しオベリンを再活性化する。オベリン単独に対するレインボウタンパク質に対応する５１０／４７５ｎｍにおける光の比率は、食品試料中に最初から存在するリステリア菌ＤＮＡの量に直接比例する。リステリア菌が全く存在しないとき、比率の割合は１である。
【００６６】
実施例９
偏光による核酸ハイブリダイゼーションの測定
実施例６に記載の反応を実施したが、光発光は、偏向板を互いに９０°として偏向フイルター付き２光電子増倍管ケミルミノメータで検出した。上記２個の光電子増倍管の比は、存在するＨＩＶ  ＲＮＡの量に関連していた。
【００６７】
実施例１０
サイクリックＡＭＰまたはＩｐ３の測定
実施例２または３に記載の２段階ＰＣＲ反応を用いて、前記細菌性ＣＡＰタンパク質または小胞体受容体のＩｐ３結合領域からのサイクリックＡＭＰ結合領域を、前記ＮまたはＣ末端にまたはホタル・ルシフェラーゼまたはエクオリンに添加した。前記改変タンパク質類は、実施例２または３に記載のようにしてＰＣＲＤＮＡ生成物からインビトロで作製され、そして、発光サイクリックＡＭＰまたはＩｐ３の活性および発光色によって特性解析した。
【００６８】
強度および色の両方の変化によって、細胞抽出物または生細胞中でＣＡＭＰまたはＩｐ３が測定可能となった。イメージ・インテンシファイアーを用いて、ＣＡＭＰまたはＩｐ３“クラウド”は、この１個の細胞の中で可視化できた。同様に、エクオリンまたはルシフェラーゼは、もしそれが最初にそれ（＋ＫＤＥＬ）とＣ末端で結合したＥＲまたはミトコンドリ・アシグナルで調製されたならば、ＥＲまたはミトコンドリオン内部で見ることができた。
【００６９】
生物発光タンパク質が、生物によって産生されたタンパク質の修飾による代わりに、アミノ酸配列から、またはＤＮＡまたはＲＮＡ合成技術を用いて合成できることが理解されるであろう。
【００７０】
【配列表】
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