(57)【要約】【課題】従来は困難であった基質高濃度での酵素を用いた酸化反応を進行させ、酸化反応生成物の収量を増大させる酸化方法を提供する。【解決手段】キシレンモノオキシゲナーゼを産生する微生物により、基質（例えばトルエン、スチレン、キシレン類、芳香族五員複素環式化合物、芳香族六員複素環式化合物、これらの誘導体、またはこれらの基質のキシレンモノオキシゲナーゼによる酸化物など）を酸化する方法において、反応系にシクロデキストリン類（例えばαシクロデキストリン、βシクロデキストリン、γシクロデキストリン、またはこれらのシクロデキストリン誘導体など）の、１種または２種以上を共存させて行う。【選択図】　　図１
2004008150.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
キシレンモノオキシゲナーゼを産生する微生物による基質の酸化方法において、反応系にシクロデキストリン類を共存させることを特徴とする方法。
【請求項２】
微生物が、キシレンモノオキシゲナーゼをコードする遺伝子群を含む発現ベクターにより形質転換されたものであることを特徴とする、請求項１に記載の酸化方法。
【請求項３】
シクロデキストリン類が、αシクロデキストリン、βシクロデキストリン、γシクロデキストリン、またはこれらのシクロデキストリン誘導体の、１種または２種以上であることを特徴とする、請求項１または２に記載の酸化方法。
【請求項４】
基質が、トルエン、スチレン、キシレン類、芳香族五員複素環式化合物、芳香族六員複素環式化合物、これらの誘導体、またはこれらのキシレンモノオキシゲナーゼによる酸化物であることを特徴とする、請求項１〜３いずれかに記載の酸化方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、キシレンモノオキシゲナーゼを産生する微生物を利用した酸化反応において、シクロデキストリン類を反応系内に共存させることにより、酸化されるべき基質を包摂させ、酸化反応生成物の収量を増大させる酸化方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
シクロデキストリン類はグルコースがα−１，４結合で環状に連なった化合物であり、６、７、８個環状に結合したものは、それぞれα、β、γシクロデキストリンと呼ばれる。シクロデキストリンは内側が疎水性で、外側が親水性という構造を持つことから、内部に多種多様な疎水性の分子を取り込んで包摂化合物を作ることが知られており、これにより不安定物質を安定化できる。産業面では香料、農薬などの安定化剤として幅広く用いられている。さらにα、β、γのシクロデキストリンには物性、機能に限界が有るため、新しいシクロデキストリン誘導体開発のために多くの研究が成されており、合成化学、電気化学、食品、化粧品、建材などその応用分野は多岐にわたると考えられる。
【０００３】
一般に微生物中に存在する有機化合物を基質とした微生物変換では、基質の有機化合物が難水溶性であるために酵素との接触効率が悪い、基質の有機化合物および酵素反応により生成した有機化合物が微生物に対して毒性が有る、あるいは酵素を失活させるといった理由から、基質を高濃度に作用させた状態で比較的収率良く反応を行うことは困難であった。一方、シクロデキストリン類は様々な難水溶性有機化合物を包摂することにより、包摂化合物としてこれらの有機化合物を水溶液中に可溶化でき、更に基質が揮発性有機化合物であっても包摂化合物として水溶液中に沈殿の状態で存在させることが出来るため、これら揮発性有機化合物の揮発を抑え、溶液中の濃度を一定に保つ働きが有ることが知られている。また、一般にシクロデキストリン類自体は本来微生物が産生する物質であり、微生物や酵素自体には無害である。
【０００４】
このようなシクロデキストリンの機能・性質を微生物変換に応用した例としては、ベンズアルデヒドとαシクロデキストリン、バニリンとβシクロデキストリンを用いて、アルデヒドから対応するアルコールへの還元効率を高めた例（Ｒａｐｈａｅｌ　Ｂａｒ（１９８９）Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　３１　２５−２８）、シクロデキストリン誘導体を用いてコレステロールの酸化効率を高めた例（Ｊｅｒｉｅｓ　Ｊａｄｏｕｎら（１９９３）Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　４０　２３０−２４０）、１α，２４−ジヒドロキシビタミンＤ３の製造にシクロデキストリン類を添加し反応効率を高めた例（特開２０００−２９５９９９号公報）等が報告されている。
【０００５】
一方、酸化酵素であるキシレンモノオキシゲナーゼはキシレン類やトルエンあるいはそれらの誘導体、芳香族五員複素環式化合物、芳香族六員複素環式化合物などの分子中のメチル基を酸化する酵素として知られており、キシレンのメチル基を直接酸化することができる。この酵素の代表的なものにはシュードモナス・プチダｍｔ−２（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ　ｍｔ−２）のキシレンモノオキシゲナーゼ（特許２７９２０５２号公報）、シュードモナス・プチダＨＳ１（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ　ＨＳ１）のキシレンモノオキシゲナーゼがある。またシュードモナス・オレオボランス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ）のアルカン−１−モノオキシゲナーゼや、メタン資化菌の例えばメチロコッカス・カプスラタスＢａｔｈ（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ　Ｂａｔｈ）のメタンモノオキシゲナーゼにもトルエンのメチル基を酸化してベンジルアルコールを生成する酵素活性があることが知られている。いずれのモノオキシゲナーゼも複数のコンポーネントからなる酵素である。
【０００６】
シュードモナス・プチダｍｔ−２のキシレンモノオキシゲナーゼは、ＴＯＬ−プラスミドｐＷＷＯ上の、ｘｙｌＭ遺伝子がコードするヒドロキシラーゼ（ＸｙｌＭ）とｘｙｌＡ遺伝子がコードするＮＡＤＨ：アクセプター・レダクターゼ（ＸｙｌＡ）とから構成されている。
【０００７】
キシレンモノオキシゲナーゼとシクロデキストリンを組み合わせて用いた例としては、トルエンやｐ−トルイル酸を炭素源としてシュードモナス・プチダを培養する際、シクロデキストリンを添加する事でこれらの化合物が菌体に及ぼす毒性を緩和できること（Ａｄｒｉａｎ　Ｓｃｈｗａｒｔｚら（１９９５）Ａｐｐｌｉｅｄ　ａｎｄ　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　６１，２７２７−２７３１）が報告されているのみで、キシレンモノオキシゲナーゼが作用する基質と共にシクロデキストリンを反応系内に添加することにより、酸化反応生成物の収量を増大させたという報告はこれまで成されていない。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
そこで本発明では、酸化酵素を利用した酸化反応において、シクロデキストリン類を１種または２種以上反応系内に共存させることにより、酸化されるべき基質を包摂させ、従来は困難であった基質高濃度での酵素を用いた酸化反応を進行させ、酸化反応生成物の収量を増大させる酸化方法を提供する事を目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは前記目的を達成するために鋭意検討した結果、本発明に到達した。即ち本発明は、キシレンモノオキシゲナーゼを産生する微生物による基質の酸化方法において、反応系にシクロデキストリン類を共存させることを特徴とする方法である。以下に本発明を更に詳細に説明する。
【００１０】
本発明に用いられる微生物としては、キシレンモノオキシゲナーゼを産生するものであれば特に限定はないが、キシレンモノオキシゲナーゼを効率よく産生する微生物が好ましい。例えばキシレンモノオキシゲナーゼをコードする遺伝子群を含む発現ベクターにより形質転換された微生物等があげられる。この場合、形質転換された微生物としては特に限定されないが、大腸菌の形質転換体である、Ｃ６００ＭＡ、ＭＣ４１００ＭＡ等のキシレンモノオキシゲナーゼ活性の高い形質転換体が好ましい。
【００１１】
酸化反応に用いられる基質としてはキシレンモノオキシゲナーゼが酸化作用を有する基質であれば特に限定されず、例えばトルエン、スチレン、キシレン類、芳香族五員複素環式化合物、芳香族六員複素環式化合物、あるいはこれらの誘導体が含まれる。この場合、これらの化合物中に存在するベンゼン環あるいは芳香族複素環上の水素原子が直接置換されたメチル基またはビニル基が、キシレンモノオキシゲナーゼの作用により、それぞれメチル基はアルコール、アルデヒド、酸等へと酸化され、ビニル基はエポキシドへと酸化される。また、誘導体中における置換基としては、アルコール基、アルデヒド基、炭化水素基、ハロゲン基、アルコキシ基、ニトロ基等様々な官能基が例示できる。基質としては、特にトルエン、ｐ−キシレン、ｍ−キシレンが好ましい。
【００１２】
また、これらトルエン、スチレン、キシレン類、芳香族五員複素環式化合物、芳香族六員複素環式化合物、又はこれらの誘導体がキシレンモノオキシゲナーゼの作用により酸化される過程で生じる中間生成物も酸化反応の基質として用いられる。例えばｐ−キシレンを基質として反応を行った場合、まずキシレンモノオキシゲナーゼの作用によりｐ−メチルベンジルアルコールが生成するが、この物質もやはりキシレンモノオキシゲナーゼによる酸化を受けｐ−メチルベンズアルデヒドへと変換されるため、実際には系内で同時に複数の化合物に対してキシレンモノオキシゲナーゼによる段階的酸化反応が進行する事となる。この場合、ｐ−メチルベンズアルデヒドを反応産物として得るためには、初めからキシレンの酸化物であるｐ−メチルベンジルアルコールを基質として用いても良い。
【００１３】
反応系に共存させるシクロデキストリン類としては、キシレンモノオキシゲナーゼが作用する基質と包摂化合物を形成するものであれば良く、特に限定されない。例えば、αシクロデキストリン、βシクロデキストリン、γシクロデキストリン、またはこれらのシクロデキストリン誘導体を、１種又は２種以上、任意の比率で用いる事ができる。シクロデキストリン誘導体としては、例えばシクロデキストリンの水酸基が１個または複数個、置換基で置換されているものや、シクロデキストリンが重合したものなどがあげられる。
それぞれのシクロデキストリン類がどの様な化合物と包摂化合物を形成し易いかについては、例えば沈殿率がその一つの尺度となる（Ｔａｋａｓｈｉ　Ｍｏｒｉｔａら（１９９６）Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　５６，３１１−３２４）。
【００１４】
また、シクロデキストリン類を反応系に共存させる方法については特に限定されず、あらかじめシクロデキストリン類と酸化すべき基質を混合し包摂化合物の沈殿を生じせしめてから菌体の懸濁液を添加する方法、菌体の懸濁液にシクロデキストリン類を加えておき次に酸化すべき基質を添加する方法、菌体の懸濁液にシクロデキストリン類と酸化すべき基質を同時に添加する方法等、いずれの方法でも可能である。シクロデキストリン類の共存量としては特に限定されないが、好ましくは１〜２００ｍＭ、更に好ましくは１０〜１５０ｍＭである。
【００１５】
シクロデキストリン類を反応系に共存させる効果については、以下の２点が重要である。まず１点は、酸化反応の基質として用いられるトルエン、キシレンなどの有機化合物、および酸化反応により生成されるアルコール、アルデヒド、酸等の有機化合物を、シクロデキストリン類がその疎水性空洞に内包するため、有機化合物が一般に有する微生物に対する毒性や酸化酵素に対する阻害作用を緩和することができる。もう１点は酸化反応に用いられる基質の水への溶解度を高め、酵素との接触効率即ち反応効率を高めることができる。
【００１６】
【実施例】
以下、本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例により限定されるものではない。
【００１７】
実施例１　形質転換体の作製
最初に目的とする遺伝子をＰＣＲ反応によって増幅するための鋳型となるＤＮＡ（ＴＯＬ−プラスミドｐＷＷＯ）をシュードモナス・プチダｍｔ−２からアルカリＳＤＳ法により調製した。
【００１８】
次にＴＯＬ−プラスミドｐＷＷＯを鋳型とし、プライマー１（配列番号１）とプライマー２（配列番号２）を用いてキシレンモノオキシゲナーゼのｘｙｌＭ遺伝子とキシレンモノオキシゲナーゼのＮＡＤＨ：アクセプター・レダクターゼ遺伝子（ｘｙｌＡ遺伝子）を含むＤＮＡを増幅し（ＴａＫａＲａ製、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ　ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）、ＮｃｏＩとＰｓｔＩで切断した。これを予めＮｃｏＩとＰｓｔＩで切断したｐＴｒｃ９９Ａ（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）に挿入することにより、ｘｙｌＭ遺伝子とｘｙｌＡ遺伝子の間にノンコード領域をもつプラスミドｐＴｒｃＭＡを得た。
【００１９】
エシェリヒア・コリＣ６００、エシェリヒア・コリＭＣ４１００、エシェリヒア・コリＪＭ１０１、エシェリヒア・コリＪＭ１０９、エシェリヒア・コリＷ３１１０、エシェリヒア・コリＲＢ７９１のそれぞれのコンピテントセルをｐＴｒｃＭＡで形質転換して、Ｃ６００ＭＡ、ＭＣ４１００ＭＡ、ＪＭ１０１ＭＡ、ＪＭ１０９ＭＡ、Ｗ３１１０ＭＡ、ＲＢ７９１ＭＡを作製した。
【００２０】
形質転換体は１％トリプトンペプトン、０．５％Ｙｅａｓｔ　Ｅｘｔｒａｃｔ、１％ＮａＣｌ、０．００５Ｍ　ＮａＯＨ、０．０５ｍｇ／ｍｌカルベニシリン（ｃａｒｂｅ）、２％Ｂａｃｔｏアガーからなる培地で平板培養して得られたコロニーを１％トリプトンペプトン、０．５％Ｙｅａｓｔ　Ｅｘｔｒａｃｔ、１％ＮａＣｌ、０．００５Ｍ　ＮａＯＨ、０．０５ｍｇ／ｍｌカルベニシリン（ｃａｒｂｅ）からなる培地（ＬＢ−ｃａｒｂｅ培地）で液体培養して増殖させ、その菌から調製したプラスミドのサイズおよびそのプラスミドの制限酵素消化断片のサイズから選別した。
【００２１】
実施例２　シクロデキストリンを利用したＪＭ１０９ＭＡによるトルエンの酸化反応
実施例１に記載の形質転換体であるＪＭ１０９ＭＡを用いてｉｎ　ｖｉｖｏでのトルエン酸化反応を行った。ＬＢ−ｃａｒｂｅ培地３０ｍｌに対し、ＪＭ１０９ＭＡのグリセロールストックを３０μｌ添加したバッフル付き三角フラスコを２個用意し、菌体密度がＯＤ６００で４．２になるまで３７℃で攪拌速度１７０ｒｐｍでの攪拌下で１６時間終夜液体培養を行った。次にＬＢ−ｃａｒｂｅ培地１１９ｍｌに対し、この終夜培養物を６ｍｌ添加した三角フラスコを６つ用意し、菌体密度がＯＤ６００で０．８になるまで３７℃（攪拌速度１７０ｒｐｍ）で８０分間培養を行った後、それぞれイソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）を濃度１ｍＭとなるように添加し、引き続き菌体密度がＯＤ６００で２．２になるまで３７℃（攪拌速度１７０ｒｐｍ）で３時間培養を行った。菌体を回収し、１％グルコースを含む５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．４で２回洗浄後、同緩衝液で菌体を懸濁し、菌体密度がＯＤ６００で１７．８の懸濁液（ａ）と９．１の懸濁液（ｂ）を調製した。
【００２２】
一方、以下の組成のシクロデキストリン懸濁液をそれぞれ調製した。
【００２３】
１）αシクロデキストリン懸濁液の組成
１％グルコースを含む５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．４　１５ｍｌとαシクロデキストリン４７６ｍｇ
（αシクロデキストリン仕込み量３２．６ｍＭ）。
【００２４】
２）βシクロデキストリン懸濁液の組成
１％グルコースを含む５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．４　１５ｍｌとβシクロデキストリン５５５ｍｇ
（βシクロデキストリン仕込み量３２．６ｍＭ）。
【００２５】
３）γシクロデキストリン懸濁液の組成
１％グルコースを含む５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．４　１５ｍｌとγシクロデキストリン６３４ｍｇ
（γシクロデキストリン仕込み量３２．６ｍＭ）。
【００２６】
これらの懸濁液１）〜３）からそれぞれ２ｍｌずつ５本分、計１５本分の６４ｍｌ容栓つき試験管に分注した後、エタノールで３００ｍＭに調製したトルエン溶液をそれぞれ２００μｌ加え密閉し、３０℃で約１時間、栓つき試験管を水平に寝かせた状態で左右方向に２８０回／分振とうした。その後これらの栓つき試験管に対し、前述の菌体密度がＯＤ６００で１７．８の懸濁液（ａ）をそれぞれ２ｍｌ添加し、各シクロデキストリン仕込み量１６．３ｍＭ、トルエン仕込み量１５ｍＭとして密閉した後、栓つき試験管を水平に寝かせた状態で反応時間０分、１５分、３０分、６０分、９０分の条件でそれぞれ３０℃で左右方向に２８０回／分振とうした。またシクロデキストリンを添加しないコントロールサンプルとして、栓つき試験管中に前述の菌体密度がＯＤ６００で９．１の懸濁液（ｂ）を４ｍｌずつ計４本分注し、エタノールで各々３００ｍＭ、２００ｍＭ，１００ｍＭ，３０ｍＭに調製したトルエン溶液をそれぞれ２００μｌ加え、シクロデキストリン仕込み量０ｍＭ、トルエン仕込み量をそれぞれ１５、１０、５、１．５ｍＭとして同様に３０℃で左右方向に２８０回／分振とうを行った。
【００２７】
振とう後の栓つき試験管は、氷冷下で１０％過塩素酸水溶液を菌体懸濁液の８％体積だけ加えてｐＨ２とし、反応停止を行った。次に塩化ナトリウム２ｇと０．１ｍＭ　ｎ−ドデカンのエーテル溶液４ｍｌを加え密閉し、栓つき試験管を水平に寝かせた状態で３０℃で左右方向に２８０回／分で振とうして塩化ナトリウムを水相に飽和させた後、遠心分離して、エーテル相をガスクロマトグラフィーにより分析した。
【００２８】
生成したベンジルアルコール濃度の経時変化を図１に示す。シクロデキストリン無添加（ｎｏＣＤと表示）のコントロールサンプルの場合ではトルエン濃度１０ｍＭと１５ｍＭで極端にベンジルアルコール生成量が低いことから、１０ｍＭ以上の高濃度のトルエンが菌体や酵素に悪影響を及ぼし、酸化反応を阻害していることが解る。一方シクロデキストリンを添加した場合ではα、β、γいずれのシクロデキストリンを用いた場合でも、トルエンを１５ｍＭ仕込んでいるにも関わらず、モル等量以上のシクロデキストリンを共存させることにより、ベンジルアルコールの生成量が直線的に増加する傾向を示し、反応速度の初速度が維持されていることが解る。この結果から本実験で用いたＪＭ１０９ＭＡが阻害を受けるような高濃度のトルエンを基質として作用させた場合でも、シクロデキストリンを添加することで菌体内酵素による酸化反応の反応初速度を維持し、生成物の収量を増大させることができることが示された。
【００２９】
実施例３　シクロデキストリンを利用したＣ６００ＭＡによるキシレン類の酸化反応
実施例１に記載の形質転換体であるＣ６００ＭＡを用いてｉｎ　ｖｉｖｏでのｐ−キシレンおよびｍ−キシレンの酸化反応を行った。バッフル付き三角フラスコ中１．６％トリプトンペプトン、１％Ｙｅａｓｔ　Ｅｘｔｒａｃｔ、０．５％ＮａＣｌ、０．００５Ｍ　ＮａＯＨ、０．０５ｍｇ／ｍｌカルベニシリン（ｃａｒｂｅ）からなる培地（２×ＹＴ−ｃａｒｂｅ培地）３０ｍｌに対し、Ｃ６００ＭＡのグリセロールストックを３０μｌ添加した物を１個用意し、菌体密度がＯＤ６００で９．８になるまで３７℃で攪拌速度１７０ｒｐｍでの攪拌下で１５．５時間終夜液体培養を行った。
【００３０】
次にバッフル付き三角フラスコ中２×ＹＴ−ｃａｒｂｅ培地１２５ｍｌに対しこの終夜培養物を２．５ｍｌ添加した物を３個用意し、菌体密度がＯＤ６００で０．４になるまで３７℃（攪拌速度１７０ｒｐｍ）で８５分間培養を行った後、それぞれＩＰＴＧを濃度１ｍＭとなるように添加した。引き続き菌体密度がＯＤ６００で２．７になるまで３７℃（攪拌速度１７０ｒｐｍ）で４時間培養後、菌体を回収し菌体量を二分割した後、一方は１％グルコースを含む５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．４で２回洗浄後、同緩衝液で菌体を懸濁し、菌体密度がＯＤ６００で２０．６の懸濁液（ａ）を調製した。また一方はあらためて２×ＹＴ−ｃａｒｂｅ培地に再懸濁させ、菌体密度がＯＤ６００で２１．３の懸濁液（ｂ）を調製した。
【００３１】
また６４ｍｌ容の密閉した栓つき試験管中に以下の組成の懸濁液を用意し、栓つき試験管の蓋を密閉し直立させた状態で、３０℃で約２時間、左右方向に２８０回／分で振とうを行うことにより、シクロデキストリン−ｐ−キシレン包摂化合物、シクロデキストリン−ｍ−キシレン包摂化合物を含む懸濁液をそれぞれ調製した。
【００３２】
１）αシクロデキストリン−ｐ−キシレン（またはｍ−キシレン）包摂化合物を含む１％グルコース含有５０ｍＭリン酸バッファ懸濁液の組成
１％グルコースを含む５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．４：１ｍｌ
αシクロデキストリン：９３．４ｍｇ（仕込み量９６ｍＭ）
０．８Ｍｐ−キシレン（またはｍ−キシレン）／エタノール溶液：１００μｌ（仕込み量８０ｍＭ）。
【００３３】
２）βシクロデキストリン−ｐ−キシレン（またはｍ−キシレン）包摂化合物を含む１％グルコース含有５０ｍＭリン酸バッファ懸濁液の組成
１％グルコースを含む５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．４：１ｍｌ
βシクロデキストリン：１０９．０ｍｇ（仕込み量９６ｍＭ）
０．８Ｍｐ−キシレン（またはｍ−キシレン）／エタノール溶液：１００μｌ（仕込み量８０ｍＭ）。
【００３４】
３）αシクロデキストリン−ｐ−キシレン（またはｍ−キシレン）包摂化合物およびβシクロデキストリン−ｐ−キシレン（またはｍ−キシレン）包摂化合物を含む１％グルコース含有５０ｍＭリン酸バッファ懸濁液の組成
１％グルコースを含む５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．４：１ｍｌ
αシクロデキストリン：４６．７ｍｇ（仕込み量４８ｍＭ）
βシクロデキストリン：５４．５ｍｇ（仕込み量４８ｍＭ）
０．８Ｍｐ−キシレン（またはｍ−キシレン）／エタノール溶液：１００μｌ（仕込み量８０ｍＭ）。
【００３５】
４）αシクロデキストリン−ｐ−キシレン（またはｍ−キシレン）包摂化合物を含む２％グルコース含有２×ＹＴ−ｃａｒｂｅ培地懸濁液の組成
２％グルコース含有２×ＹＴ−ｃａｒｂｅ培地：１ｍｌ
αシクロデキストリン：９３．４ｍｇ（仕込み量９６ｍＭ）
０．８Ｍｐ−キシレン（またはｍ−キシレン）／エタノール溶液：１００μｌ（仕込み量８０ｍＭ）。
【００３６】
５）βシクロデキストリン−ｐ−キシレン（またはｍ−キシレン）包摂化合物を含む２％グルコース含有２×ＹＴ−ｃａｒｂｅ培地懸濁液の組成
２％グルコース含有２×ＹＴ−ｃａｒｂｅ培地：１ｍｌ
βシクロデキストリン：１０９．０ｍｇ（仕込み量９６ｍＭ）
０．８Ｍｐ−キシレン（またはｍ−キシレン）／エタノール溶液：１００μｌ（仕込み量８０ｍＭ）。
【００３７】
６）αシクロデキストリン−ｐ−キシレン（またはｍ−キシレン）包摂化合物およびβシクロデキストリン−ｐ−キシレン（またはｍ−キシレン）包摂化合物を含む２％グルコース含有２×ＹＴ−ｃａｒｂｅ培地懸濁液の組成
２％グルコース含有２×ＹＴ−ｃａｒｂｅ培地：１ｍｌ
αシクロデキストリン：４６．７ｍｇ（仕込み量４８ｍＭ）
βシクロデキストリン：５４．５ｍｇ（仕込み量４８ｍＭ）
０．８Ｍｐ−キシレン（またはｍ−キシレン）／エタノール溶液：１００μｌ（仕込み量８０ｍＭ）。
【００３８】
上述１）〜３）の１％グルコース含有５０ｍＭリン酸緩衝液懸濁液については菌体懸濁液（ａ）を１ｍｌ添加し、反応初期菌体密度１０．３（ＯＤ６００）、ｐ−キシレン（またはｍ−キシレン）仕込み量４０ｍＭ、シクロデキストリン仕込み量４８ｍＭ（αシクロデキストリンとβシクロデキストリンを混合して用いた場合はそれぞれ２４ｍＭ、合計４８ｍＭ）、グルコース濃度１％の条件で、栓つき試験管の蓋を密閉し直立させた状態で３０℃で左右方向に２８０回／分で２４時間振とうを行った。４）〜６）の２％グルコース含有２×ＹＴ−ｃａｒｂｅ培地懸濁液については菌体懸濁液（ｂ）を１ｍｌ添加し、反応初期菌体密度１０．６（ＯＤ６００）、ｐ−キシレン（またはｍ−キシレン）仕込み量４０ｍＭ、シクロデキストリン仕込み量４８ｍＭ（αシクロデキストリンとβシクロデキストリンを混合して用いた場合はそれぞれ２４ｍＭ、合計４８ｍＭ）、グルコース濃度１％の条件として、同様に２４時間振とうを行った。
【００３９】
また、１）〜３）の懸濁液の組成においてシクロデキストリン類を加えない物、４）〜６）の懸濁液の組成においてシクロデキストリン類を加えない物についてもそれぞれ調製を行い、同様の手法で１）〜３）の場合は菌体懸濁液（ａ）を、４）〜６）の場合は菌体懸濁液（ｂ）をそれぞれ１ｍｌ添加した後同様に２４時間振とうを行い、コントロールサンプルとした。振とう後の栓つき試験管は、氷冷下で１０％過塩素酸水溶液を菌体懸濁液の８％体積だけ加えてｐＨ２とし、反応停止を行った。次に塩化ナトリウム１ｇと０．２ｍＭ　ｎ−ドデカンのエーテル溶液２ｍｌを加え密閉し、栓つき試験管を水平に寝かせた状態で、３０℃で左右方向に２８０回／分で振とうして塩化ナトリウムを水相に飽和させた後、８０℃１５分の加熱処理を行い、室温まで冷却したサンプルを遠心分離して、エーテル相をガスクロマトグラフィーにより分析した。
【００４０】
ｐ−キシレンを反応させた場合のｐ−メチルベンジルアルコールとｐ−トルアルデヒド生成量を図２に、またｍ−キシレンを反応させた場合のｍ−メチルベンジルアルコールとｍ−トルアルデヒド生成量を図３に示す。図中、
−ＯＨ：基質のキシレンに対応するメチルベンジルアルコール
−ＣＨＯ：基質のキシレンに対応するトルアルデヒド
Ｐ：１％グルコース含有５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．４
ＹＴ：１％グルコース含有２×ＹＴ−ｃａｒｂｅ培地
ＮＥ：シクロデキストリン無添加
α：αシクロデキストリン添加
β：βシクロデキストリン添加
α＋β：αシクロデキストリンとβシクロデキストリンを混合して添加
をそれぞれ示す。
【００４１】
βシクロデキストリンを単独で用いた場合、αシクロデキストリンとβシクロデキストリンを混合して用いた場合に付いては、ｐ−キシレンを反応させた場合、ｍ−キシレンを反応させた場合共に生成するアルコールとアルデヒドの収量が増大することが示された。すなわち酸化反応に用いる基質を包摂することができる適当なシクロデキストリンを選択することにより、酸化反応の効率を増大させることが可能であり、本実験で用いた基質・生成物に対しβシクロデキストリンは包摂化合物形成能が強く、反応効率の増大が認められたと考えられる。また１％グルコース含有２×ＹＴ−ｃａｒｂｅ培地を用いて反応させた場合は、１％グルコース含有５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．４を用いて反応させた場合よりも生成するアルコールとアルデヒドの収量が多いことから、シクロデキストリンを添加した系において反応を行う場合、より微生物の生育に適した環境で行うことでさらに生成物の収量を増大させることができることが明らかとなった。
【００４２】
実施例４　βシクロデキストリンを利用したＣ６００ＭＡによるｐ−キシレンの酸化反応
実施例１に記載の形質転換体であるＣ６００ＭＡを用いてｉｎ　ｖｉｖｏでのｐ−キシレンの酸化反応を行った。バッフル付き三角フラスコ中２×ＹＴ−ｃａｒｂｅ培地３０ｍｌに対し、Ｃ６００ＭＡのグリセロールストックを３０μｌ添加した物を１個用意し、菌体密度がＯＤ６００で９．６になるまで３７℃で攪拌速度１７０ｒｐｍでの攪拌下で１６．５時間終夜液体培養を行った。次にバッフル付き三角フラスコ中２×ＹＴ−ｃａｒｂｅ培地１２５ｍｌに対しこの終夜液体培養物を２．５ｍｌ添加した物を４個用意し、菌体密度がＯＤ６００で０．４になるまで３７℃（攪拌速度１７０ｒｐｍ）で８０分間液体培養を行った後、それぞれＩＰＴＧを濃度１ｍＭになるように添加した。引き続き菌体密度がＯＤ６００で２．７になるまで３７℃（攪拌速度１７０ｒｐｍ）で４時間液体培養後、菌体を回収し、２×ＹＴ−ｃａｒｂｅ培地に再懸濁させ、菌体密度がＯＤ６００で５６．５の懸濁液（ａ）、３２．２の懸濁液（ｂ）、２２．２の懸濁液（ｃ）を調製した。
【００４３】
一方、以下の組成の混合物懸濁液を６４ｍｌ容の栓つき試験管中にそれぞれ調製し、栓つき試験管の蓋を密閉し直立させた状態で、３０℃で左右方向に２８０回／分で約２時間振とうを行うことにより、シクロデキストリン−ｐ−キシレンの包摂化合物を含む懸濁液をそれぞれ調製した。
【００４４】
１）βシクロデキストリン−ｐ−キシレン包摂化合物を含む２×ＹＴ−ｃａｒｂｅ培地懸濁液の組成
２×ＹＴ−ｃａｒｂｅ培地：１ｍｌ
βシクロデキストリン：３２６．９ｍｇ（仕込み量２８８ｍＭ）
２．４Ｍ　ｐ−キシレン／エタノール溶液：１００μｌ（仕込み量２４０ｍＭ）。
【００４５】
２）βシクロデキストリン−ｐ−キシレン包摂化合物を含む２％グルコース含有２×ＹＴ−ｃａｒｂｅ培地懸濁液の組成
２％グルコース含有２×ＹＴ−ｃａｒｂｅ培地：１ｍｌ
βシクロデキストリン：３２６．９ｍｇ（仕込み量２８８ｍＭ）
２．４Ｍ　ｐ−キシレン／エタノール溶液：１００μｌ（仕込み量２４０ｍＭ）。
【００４６】
３）βシクロデキストリン−ｐ−キシレン包摂化合物を含む１０％グルコース含有２×ＹＴ−ｃａｒｂｅ培地懸濁液の組成
１０％グルコース含有２×ＹＴ−ｃａｒｂｅ培地：１ｍｌ
βシクロデキストリン：３２６．９ｍｇ（仕込み量２８８ｍＭ）
２．４Ｍ　ｐ−キシレン／エタノール溶液：１００μｌ（仕込み量２４０ｍＭ）。
【００４７】
４）βシクロデキストリン−ｐ−キシレン包摂化合物を含む２０％グルコース含有２×ＹＴ−ｃａｒｂｅ培地懸濁液の組成
２０％グルコース含有２×ＹＴ−ｃａｒｂｅ培地：１ｍｌ
βシクロデキストリン３２６．９ｍｇ：（仕込み量２８８ｍＭ）
２．４Ｍ　ｐ−キシレン／エタノール溶液：１００μｌ（仕込み量２４０ｍＭ）。
【００４８】
上述１）〜４）の２×ＹＴ−ｃａｒｂｅ培地懸濁液それぞれ１ｍｌに対し、前述の菌体密度がＯＤ６００で５６．５の懸濁液（ａ）を１ｍｌ加えたものを調製し、反応初期菌体密度２８．２、ｐ−キシレン仕込み量１２０ｍＭ、βシクロデキストリン仕込み量１４４ｍＭ、グルコース濃度はそれぞれ０％、１％、５％、１０％の条件で、栓つき試験管の蓋を開放し直立させた状態で３０℃で左右方向に２８０回／分で振とうし、２４時間反応を行った。また菌体密度がＯＤ６００で３２．２の懸濁液（ｂ）を１ｍｌ加えたもの、２２．２の懸濁液（ｃ）を１ｍｌ加えたものについても同様にそれぞれ反応初期菌体密度１６．１、１１．１として、ｐ−キシレン仕込み量１２０ｍＭ、βシクロデキストリン仕込み量１４４ｍＭ、グルコース濃度はそれぞれ０％、１％、５％、１０％として同様に反応を行った。
【００４９】
また、１）の２×ＹＴ−ｃａｒｂｅ培地懸濁液の組成においてシクロデキストリンを無添加のもの１ｍｌを調製し、これに対し懸濁液（ｃ）を１ｍｌ加えたもの、および４）の２×ＹＴ−ｃａｒｂｅ培地懸濁液の組成においてシクロデキストリンを無添加のもの１ｍｌを調製し、これに対し懸濁液（ａ）を１ｍｌ加えたものを用意し、同様の手法で反応を行い、コントロールサンプルとした。振とう後の栓つき試験管は、氷冷下で１０％過塩素酸水溶液を菌体懸濁液の８％体積だけ加えてｐＨ２とし、反応停止を行った。次に液量を増やして包摂化合物を解離し易くするため２×ＹＴ−ｃａｒｂｅ培地をそれぞれのサンプルに４ｍｌずつ加え、全量６ｍｌとした後、塩化ナトリウム３ｇと０．２ｍＭ　ｎ−ドデカンのエーテル懸濁液６ｍｌを加え密閉し、栓つき試験管を水平に寝かせた状態で、３０℃で左右方向に２８０回／分で振とうして塩化ナトリウムを水相に飽和させた後、８０℃１５分の加熱処理を行い、室温まで冷却したサンプルを遠心分離して、エーテル相をガスクロマトグラフィーにより分析した。
【００５０】
それぞれの条件でのｐ−メチルベンジルアルコールとｐ−トルアルデヒド生成量を図４に示す。図中、
＃：シクロデキストリン無添加、栓つき試験管の蓋を密閉した状態で反応させたサンプル
−ＯＨ：ｐ−メチルベンジルアルコール
−ＣＨＯ：ｐ−トルアルデヒド
をそれぞれ示す。
【００５１】
この結果から、ｐ−キシレン仕込み量を１２０ｍＭで反応を行った場合でもβシクロデキストリンをモル等量以上共存させ、栄養源の豊富なグルコース含有２×ＹＴ−ｃａｒｂｅ培地を用い、開放系で酸素の供給が有る状態で反応させた場合は、生成するｐ−メチルベンジルアルコールとｐ−トルアルデヒドの量は最大で各々１２ｍＭ以上にまで達することが明らかとなった。以上から酵素を用いた酸化反応において、シクロデキストリン類を共存させ、栄養源や初期菌体密度などの条件の調節を行い、あるいは開放系で反応を行い酸素と酵素との接触効率を高めるなどの工夫をすることで、飛躍的に酸化反応生成物の収量を増大させることができることが明らかとなった。
【００５２】
【発明の効果】
以上本発明は、通常の状態では酵素による酸化反応が阻害されるような高濃度の基質存在下においても、シクロデキストリン類を共存させることで、菌の生命活動と酵素の安定性を維持した状態で酸化反応を進行させ、生成物収量を増大する方法を提供する。本法は菌体を用いた酸化プロセスであり、多段階の酸化反応でも途中の分離操作を必要とせず、シクロデキストリン類は反応後に回収し再利用することが可能であるため、反応を極めて効率的に行うことができる。また、本法は従来キシレンモノオキシゲナーゼ活性を有する微生物を用いた酸化反応としては例の無い、基質高濃度で反応を行うことができ、酸化生成物の収量を増大させることが可能である。
【配列表】
ＳＥＱＵＥＮＣＥ　ＬＩＳＴＩＮＧ
＜１１０＞ＴＯＳＯＨ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ
＜１２０＞微生物による基質の酸化方法
＜１３０＞ＰＡ２１１−０７８４
＜１６０＞２
＜２１０＞１
＜２１１＞３０
＜２１２＞ＤＮＡ
＜２１３＞Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ
＜４００＞１
ａｔｇａａｔｔｃｃａ　ｔｇｇａｃａｃｇｃｔ　ｔｃｇｔｔａｔｔａｃ　　　　　　　　　　　　　　　　　３０＜２１０＞２
＜２１１＞２８
＜２１２＞ＤＮＡ
＜２１３＞Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ
＜４００＞２
ａｃｃｔｇｃａｇｃｔ　ａｇｃａａｇｇａｇｇ　ｔｃｔａｔｔａｔ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２８
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例２におけるベンジアルコール濃度の経時変化を示した図である。
【図２】実施例３におけるｐ−メチルベンジルアルコールとｐ−トルアルデヒドの生成量を示す図である。
【図３】実施例３におけるｍ−メチルベンジルアルコールとｍ−トルアルデヒドの生成量を示す図である。
【図４】実施例４におけるｐ−メチルベンジルアルコールとｐ−トルアルデヒドの生成量を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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