【手続補正書】
【提出日】平成26年4月15日(2014.4.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４６４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４６４】
ゲノム研究所（ＴＩＧＲ、Institute for Genomic Research）（ｗｗｗ．ｔｉｇｒ．ｏｒｇ）および／または国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ、National Center for Biotechnology Information）（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）により維持されているデータベース等の公開データベース中のエントリーと関連する受入番号を参照する任意のポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列も、参照によりそれらの全体が組み込まれる。
本発明の一つの面によれば、以下の発明が提供される。
（１）ｉｎ  ｖｉｔｒｏで無蛍光活性化基質に対するサーチュインデアセチラーゼ活性を活性化する化合物を検出する方法であって、
サーチュインデアセチラーゼを、候補化合物と、前記サーチュインのアセチル化ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質基質を含んでなる無蛍光活性化基質とで接触させること、
前記候補化合物の存在下で前記無蛍光活性化基質に対するサーチュインデアセチラーゼ活性のレベルを検出すること、および
前記候補化合物の存在下での前記無蛍光活性化基質に対するサーチュインデアセチラーゼ活性のレベルを、前記候補化合物の非存在下での前記無蛍光活性化基質に対するサーチュインデアセチラーゼ活性のレベルと比較することを含んでなり、
前記候補化合物の非存在下での前記無蛍光活性化基質に対するサーチュインデアセチラーゼ活性のレベルと比較して、前記候補化合物の存在下での前記無蛍光活性化基質に対するサーチュインデアセチラーゼ活性のレベルが増加することが、前記化合物がサーチュイン活性化因子であることを示す、方法。
（２）前記サーチュインデアセチラーゼがＳＩＲＴ１である、前記（１）に記載の方法。
（３）前記サーチュインデアセチラーゼが、ＳＩＲＴ２、ＳＩＲＴ３、ＳＩＲＴ４、およびＳＩＲＴ５からなる群から選択される、前記（１）に記載の方法。
（４）前記候補化合物が、蛍光基を含有するアセチル化ペプチドまたはポリペプチド基質のＳＩＲＴ１活性化因子である、前記（１）に記載の方法。
（５）前記蛍光基を含有するペプチド基質が、ＴＡＭＲＡペプチド：Ａｃ−ＥＥＫ（ビオチン）ＧＱＳＴＳＳＨＳＫＡｃＮｌｅＳＴＥＧＫ（５−ＴＭＲ）ＥＥ−ＮＨ２である、前記（４）に記載の方法。
（６）前記サーチュインデアセチラーゼを、ＮＡＤの存在下で無蛍光活性化基質と候補化合物とで接触する、前記（１）に記載の方法。
（７）前記サーチュインデアセチラーゼを、加水分解性ＮＡＤ類似体の存在下で無蛍光活性化基質と候補化合物とで接触する、前記（１）に記載の方法。
（８）前記無蛍光活性化基質が、ビオチン化ポリペプチドである、前記（１）に記載の方法。
（９）前記無蛍光活性化基質が、ｄｅｓＴＡＭＲＡペプチド：Ａｃ−ＥＥＫ（ビオチン）ＧＱＳＴＳＳＨＳＫＡｃＮｌｅＳＴＥＧＫＥＥ−ＮＨ２である、前記（１）に記載の方法。
（１０）前記無蛍光活性化基質が、蛍光基ＴＡＭＲＡ（テトラメチル−６−カルボキシローダミン）およびＡＭＣ（７−アミド−４−メチルクマリン）を含んでいないアセチル化ペプチドまたはポリペプチドである、前記（１）に記載の方法。
（１１）前記無蛍光活性化基質が、Ａｃ−ＲＨＫＫＡｃＦ−ＮＨ２およびＡｃ−ＲＨＫＫＡｃＷ−ＮＨ２からなる群から選択されるアセチル化ペプチドである、前記（１）に記載の方法。
（１２）前記無蛍光活性化基質が、前記サーチュインのアセチル化ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質基質および活性化補助因子坦持アクセサリータンパク質を含んでなる、前記（１）に記載の方法。
（１３）前記活性化補助因子坦持アクセサリータンパク質が、ＤＢＣ１（乳癌１では欠失）、ＨＩＣ１（癌１では過剰メチル化）、ＡＲＯＳ（ＳＩＲＴ１の活性調節因子）、およびＣＬＯＣＫからなる群から選択される、前記（１２）に記載の方法。
（１４）前記アセチル化タンパク質が、ヒストンＨ１、ヒストンＨ３、ヒストンＨ４、ｐ５３、ｐ３００、ＦＯＸＯ１、ＦＯＸＯ３ａ、ＦＯＸＯ４、ｐ６５、ＨＩＶＴａｔ、ＰＧＣ−１α、ＰＣＡＦ、ＭｙｏＤ、ＰＰＡＲγ、およびＫｕ７０からなる群から選択される、前記（１）に記載の方法。
（１５）前記サーチュインデアセチラーゼ活性のレベルが、ＮＡＤ加水分解の速度を測定することにより検出される、前記（１）に記載の方法。
（１６）サーチュインデアセチラーゼ活性のレベルが、無蛍光活性化基質脱アセチル化の速度を測定することにより検出される、前記（１）に記載の方法。
（１７）前記化合物が、無蛍光活性化基質のＳＩＲＴ１脱アセチル化の活性化因子である、前記（１）に記載の方法。
（１８）前記化合物が、下記式またはその塩を有し、
【化８２】
2013523189.tif 000001
式中、
Ｒ１が、−（ＣＨ２）３ＣＨ３、および−（ＣＨ２）ＣＨ（ＣＨ３）２から選択され、かつ
Ｒ２が、−ピペリジンおよび−（ＣＨ２）２−ＮＨ−ＣＨ３から選択される、前記（１７）に記載の方法。
（１９）前記化合物またはその塩が、
【化８３】
2013523189.tif 000002
【化８４】
2013523189.tif 000003
【化８５】
2013523189.tif 000004
からなる群から選択される、前記（１８）に記載の方法。
（２０）ＳＩＲＴ１活性化因子である候補化合物を選択すること、および
前記ＳＩＲＴ１活性化因子を試験細胞と接触させ、前記試験細胞でのＳＩＲＴ１活性化特異的変化を検出することを更に含んでなる、前記（１）に記載の方法。
（２１）前記ＳＩＲＴ１活性化特異的変化が、ＦＧＦ２１産生の増加である、前記（２０）に記載の方法。
（２２）前記ＳＩＲＴ１活性化特異的変化が、ＬＰＳ誘導性ＴＮＦα産生の減少である、前記（２０）に記載の方法。
（２３）ＳＩＲＴ１活性化因子である候補化合物を選択すること、および
前記ＳＩＲＴ１活性化因子を試験対象体に投与し、前記試験対象体でのＳＩＲＴ１活性化特異的変化を検出することを更に含んでなる、前記（１）に記載の方法。
（２４）前記試験対象体が、糖尿病モデルマウスであり、前記ＳＩＲＴ１活性化特異的変化が、血糖の低下である、前記（２３）に記載の方法。
（２５）前記試験対象体が、神経変性疾患モデルマウスであり、前記ＳＩＲＴ１活性化特異的変化が、神経変性疾患プロセスまたはマーカーの減少である、前記（２３）に記載の方法。
（２６）前記神経変性疾患が、アルツハイマー病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病、ハンチントン病、および多発性硬化症（ＭＳ）からなる群から選択される、前記（２５）に記載の方法。
（２７）Ａｃ−ＲＨＫＫＡｃＦ−ＮＨ２およびＡｃ−ＲＨＫＫＡｃＷ−ＮＨ２からなる群から選択される構造式を有する無蛍光サーチュイン基質。
（２８）式（Ｉ）の化合物またはその塩。
【化８６】
2013523189.tif 000005
（２９）式（ＩＩ）の化合物またはその塩。
【化８７】
2013523189.tif 000006
（３０）式（ＩＩＩ）の化合物またはその塩。
【化８８】
2013523189.tif 000007
（３１）式（ＩＶ）の化合物またはその塩。
【化８９】
2013523189.tif 000008
（３２）式（Ｖ）の化合物またはその塩。
【化９０】
2013523189.tif 000009
（３３）式（ＶＩ）の化合物またはその塩。
【化９１】
2013523189.tif 000010
（３４）式（ＶＩＩ）の化合物またはその塩。
【化９２】
2013523189.tif 000011
（３５）式（ＶＩＩＩ）の化合物またはその塩。
【化９３】
2013523189.tif 000012
（３６）式（ＩＸ）の化合物またはその塩。
【化９４】
2013523189.tif 000013
（３７）式（Ｘ）の化合物。
【化９５】
2013523189.tif 000014
（３８）前記（２８）〜（３７）のいずれかに記載の化合物またはその薬学的に許容される塩と、薬学的に許容される担体とを含んでなる医薬組成物。
（３９）追加の活性剤を更に含んでなる、前記（３８）に記載の医薬組成物。
（４０）インスリン抵抗性、メタボリック症候群、糖尿病、またはそれら合併症を罹患しているか、または感受性である対象体を治療するための、あるいは対象体のインスリン感受性を増加させるための方法であって、前記（３８）に記載の組成物をその必要性のある前記対象体に投与にすることを含んでなる方法。
（４１）式（ＸＸＸＩ）の化合物またはその塩。
【化９６】
2013523189.tif 000015
（式中、
ＸおよびＹの一方は、−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ１または−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−Ｒ１から選択され、ＸおよびＹの他方はＨであり、ここで
Ｒ１は、フェニルまたは融合ヘテロ環から選択され、Ｒ１は、−Ｃ≡Ｎ、Ｃ１〜Ｃ２フルオロ置換アルキル、および−（Ｃ０〜Ｃ２アルキル）−飽和ヘテロ環から独立して選択される１〜２個の置換基で置換されていてもよく、
Ｒ１がフェニルである場合、Ｒ１は、−ＣＨ２−Ｏ−飽和ヘテロ環で置換されていてもよく、前記飽和ヘテロ環は、ピペリジン、ピロリジン、またはピペラジンから選択され、
Ｒ１が融合ヘテロ環から選択される場合、前記融合ヘテロ環は、ベンゾ［ｄ］チアゾールから選択され、また、Ｒ１は、−ＯＣＨ３で置換されていてもよく、
Ｚ１およびＺ２の一方はＮであり、他方はＣＲ２であり、ここでＲ２は、−ＮＨ（Ｃ１〜Ｃ３アルキル）、−ＮＨ（Ｃ１〜Ｃ３アルキル）−Ｎ（ＣＨ３）２、−（Ｃ０〜Ｃ２アルキル）−モルホリン、−（Ｃ０〜Ｃ２アルキル）−ピペラジン、または−Ｎ（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）２から選択され、Ｒ２が、−（Ｃ０〜Ｃ２アルキル）−飽和ヘテロ環である場合、前記飽和ヘテロ環は、モルホリンまたはピペラジンから選択される。）
（４２）以下のものからなる群から選択される式（ＸＸＸＩ）を有する、前記（４１）に記載の化合物またはその塩。
【化９７】
2013523189.tif 000016
【化９８】
2013523189.tif 000017
【化９９】
2013523189.tif 000018
【化１００】
2013523189.tif 000019
【化１０１】
2013523189.tif 000020
【化１０２】
2013523189.tif 000021
【化１０３】
2013523189.tif 000022
【化１０４】
2013523189.tif 000023
および
【化１０５】
2013523189.tif 000024
（４３）式（ＸＸＸＩＩ）の化合物またはその塩。
【化１０６】
2013523189.tif 000025
（式中、
Ｒ１は、−（Ｃ０〜Ｃ２アルキル）−ピロリジンまたは−（Ｃ０〜Ｃ２アルキル）−ピペラジンで置換されていてもよいフェニルであり、かつ
Ｒ２は、−Ｃ１〜Ｃ３アルキルまたは−（Ｃ１〜Ｃ３アルキル）−Ｎ（ＣＨ３）２から選択される。）
（４４）以下のものからなる群から選択される式（ＸＸＸＩＩ）を有する、前記（４３）に記載の化合物またはその塩。
【化１０７】
2013523189.tif 000026
【化１０８】
2013523189.tif 000027
および
【化１０９】
2013523189.tif 000028
（４５）式（ＸＸＸＩＩＩ）の化合物またはその塩。
【化１１０】
2013523189.tif 000029
（式中、
Ｒ１は、−（Ｃ０〜Ｃ２アルキル）−ピペラジンで置換されていてもよいフェニルであり、かつ
Ｒ２は、−Ｃ１〜Ｃ３アルキルおよび−（Ｃ１〜Ｃ３）−Ｎ（ＣＨ３）２から選択される。）
（４６）以下のものからなる群から選択される式（ＸＸＸＩＩＩ）を有する、前記（４５）に記載の化合物またはその塩。
【化１１１】
2013523189.tif 000030
および
【化１１２】
2013523189.tif 000031
（４７）式（ＸＸＸＩＶ）の化合物またはその塩。
【化１１３】
2013523189.tif 000032
（式中、
Ｚ１およびＺ２の一方はＮであり、他方はＣＲ２から選択され、ここで
Ｒ２は、−（Ｃ０〜Ｃ２アルキル）−モルホリン、−（Ｃ０〜Ｃ２アルキル）−ピペラジン、および−Ｎ（Ｃ１〜Ｃ4）２から選択され、
Ｒ１は、−ＯＣＨ３で置換されていてもよいフェニルおよびベンゾ［ｄ］チアゾールから選択され、ここでＲ１は、−Ｃ≡Ｎ、Ｃ１〜Ｃ２フルオロ置換アルキルから独立して選択される１〜２個の置換基で更に置換されていてもよく、Ｒ１がフェニルである場合、Ｒ１は、−ＣＨ２−Ｏ−ピペリジンで更に置換されていてもよい。）
（４８）以下のものからなる群から選択される式（ＸＸＸＩＶ）を有する、前記（５８）に記載の化合物またはその塩。
【化１１４】
2013523189.tif 000033
【化１１５】
2013523189.tif 000034
【化１１６】
2013523189.tif 000035
および
【化１１７】
2013523189.tif 000036
（４９）前記（４１）〜（４８）のいずれか一項に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩と、薬学的に許容される担体とを含んでなる医薬組成物。
（５０）追加の活性剤を更に含んでなる、前記（４９）に記載の医薬組成物。
（５１）インスリン抵抗性、メタボリック症候群、糖尿病、またはそれら合併症を罹患しているか、または感受性である対象体を治療するための、あるいは対象体のインスリン感受性を増加させるための方法であって、前記（５０）に記載の組成物をその必要性のある前記対象体に投与にすることを含んでなる方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで無蛍光活性化基質に対するＳＩＲＴ１サーチュインデアセチラーゼ活性を活性化する化合物を検出する方法であって、
ＳＩＲＴ１サーチュインデアセチラーゼを、候補化合物と、活性化補助因子部分を含むアセチル化ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質基質を含んでなる無蛍光活性化基質とで接触させること、
前記候補化合物の存在下で活性化補助因子部分を含む前記無蛍光活性化基質に対するＳＩＲＴ１サーチュインデアセチラーゼ活性のレベルを検出すること、および
前記候補化合物の存在下での活性化補助因子部分を含む前記無蛍光活性化基質に対するＳＩＲＴ１サーチュインデアセチラーゼ活性のレベルを、前記候補化合物の非存在下での活性化補助因子部分を含む前記無蛍光活性化基質に対するＳＩＲＴ１サーチュインデアセチラーゼ活性のレベルと比較することを含んでなり、
前記候補化合物の非存在下での前記無蛍光活性化基質に対するＳＩＲＴ１サーチュインデアセチラーゼ活性のレベルと比較して、前記候補化合物の存在下での前記無蛍光活性化基質に対するＳＩＲＴ１サーチュインデアセチラーゼ活性のレベルが増加することが、前記化合物がＳＩＲＴ１サーチュイン活性化因子であることを示す、方法。
【請求項２】
前記候補化合物が、蛍光基を含有するアセチル化ペプチドまたはポリペプチド基質のＳＩＲＴ１活性化因子である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記蛍光基を含有するペプチド基質が、ＴＡＭＲＡペプチド：Ａｃ−ＥＥＫ（ビオチン）ＧＱＳＴＳＳＨＳＫＡｃＮｌｅＳＴＥＧＫ（５−ＴＭＲ）ＥＥ−ＮＨ２である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記サーチュインデアセチラーゼを、ＮＡＤの存在下で無蛍光活性化基質と候補化合物とで接触する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記サーチュインデアセチラーゼを、加水分解性ＮＡＤ類似体の存在下で無蛍光活性化基質と候補化合物とで接触する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記無蛍光活性化基質が、ビオチン化ポリペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記無蛍光活性化基質が、ｄｅｓＴＡＭＲＡペプチド：Ａｃ−ＥＥＫ（ビオチン）ＧＱＳＴＳＳＨＳＫＡｃＮｌｅＳＴＥＧＫＥＥ−ＮＨ２である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記無蛍光活性化基質が、蛍光基ＴＡＭＲＡ（テトラメチル−６−カルボキシローダミン）およびＡＭＣ（７−アミド−４−メチルクマリン）を含んでいないアセチル化ペプチドまたはポリペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記無蛍光活性化基質が、Ａｃ−ＲＨＫＫＡｃＦ−ＮＨ２およびＡｃ−ＲＨＫＫＡｃＷ−ＮＨ２からなる群から選択されるアセチル化ペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記無蛍光活性化基質が、前記サーチュインのアセチル化ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質基質および活性化補助因子坦持アクセサリータンパク質を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記活性化補助因子坦持アクセサリータンパク質が、ＤＢＣ１（乳癌１では欠失）、ＨＩＣ１（癌１では過剰メチル化）、ＡＲＯＳ（ＳＩＲＴ１の活性調節因子）、およびＣＬＯＣＫからなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記アセチル化タンパク質が、ヒストンＨ１、ヒストンＨ３、ヒストンＨ４、ｐ５３、ｐ３００、ＦＯＸＯ１、ＦＯＸＯ３ａ、ＦＯＸＯ４、ｐ６５、ＨＩＶＴａｔ、ＰＧＣ−１α、ＰＣＡＦ、ＭｙｏＤ、ＰＰＡＲγ、およびＫｕ７０からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記サーチュインデアセチラーゼ活性のレベルが、ＮＡＤ加水分解の速度を測定することにより検出される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
サーチュインデアセチラーゼ活性のレベルが、無蛍光活性化基質脱アセチル化の速度を測定することにより検出される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記化合物が、無蛍光活性化基質のＳＩＲＴ１脱アセチル化の活性化因子である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記化合物が、下記式またはその塩を有し、
【化１】
2013523189.tif 000037
式中、
Ｒ１が、−（ＣＨ２）３ＣＨ３、および−（ＣＨ２）ＣＨ（ＣＨ３）２から選択され、かつ
Ｒ２が、−ピペリジンおよび−（ＣＨ２）２−ＮＨ−ＣＨ３から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記化合物またはその塩が、
【化２】
2013523189.tif 000038
【化３】
2013523189.tif 000039
【化４】
2013523189.tif 000040
からなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ＳＩＲＴ１活性化因子である候補化合物を選択すること、および
前記ＳＩＲＴ１活性化因子を試験細胞と接触させ、前記試験細胞でのＳＩＲＴ１活性化特異的変化を検出することを更に含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＳＩＲＴ１活性化特異的変化が、ＦＧＦ２１産生の増加である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＳＩＲＴ１活性化特異的変化が、ＬＰＳ誘導性ＴＮＦα産生の減少である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
ＳＩＲＴ１活性化因子である候補化合物を選択すること、および
前記ＳＩＲＴ１活性化因子を試験対象体に投与し、前記試験対象体でのＳＩＲＴ１活性化特異的変化を検出することを更に含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記試験対象体が、糖尿病モデルマウスであり、前記ＳＩＲＴ１活性化特異的変化が、血糖の低下である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記試験対象体が、神経変性疾患モデルマウスであり、前記ＳＩＲＴ１活性化特異的変化が、神経変性疾患プロセスまたはマーカーの減少である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記神経変性疾患が、アルツハイマー病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病、ハンチントン病、および多発性硬化症（ＭＳ）からなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
Ａｃ−ＲＨＫＫＡｃＦ−ＮＨ２およびＡｃ−ＲＨＫＫＡｃＷ−ＮＨ２からなる群から選択される構造式を有する無蛍光サーチュイン基質。
【請求項２６】
ＳＩＲＴ１の無蛍光アセチル化ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質基質が、リシンアセチル化の位置に対して＋１でのトリプトファンまたはフェニルアラニンからなる基から選択される活性化補助因子部分を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
ＳＩＲＴ１の無蛍光アセチル化ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質基質が、リシン活性化の位置に対して＋１でのトリプトファン活性化補助因子部分を含んでなる、請求項１に記載の方法。