(57)【要約】【課題】  新規な糖転移酵素、β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼを提供する。【解決手段】  以下の酵素学的性質：作用；ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンからＮ−アセチルグルコサミンをα−６−Ｄ−マンノシドに転移する；分子量；約７３，０００（還元剤非存在下ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる）並びに約７３，０００及び約６０，０００（還元剤存在下ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる）；を有するβ１, ６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも配列番号：８で示されるアミノ酸配列を含んで成るアミノ酸配列、又はこのアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が修飾されているアミノ酸配列を有するβ１, ６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ。
【請求項２】
請求項１に記載のβ１, ６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ。
【請求項３】
配列番号：８に示す塩基配列を有する請求項３に記載のＤＮＡ。
【請求項４】
請求項２又は３に記載のＤＮＡを含んで成る発現ベクター。
【請求項５】
請求項４に記載の発現ベクターにより形質転換された宿主。
【請求項６】
請求項１に記載のβ１, ６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ酵素の製造方法において、該酵素をコードするＤＮＡを含んで成る発現ベクターにより形質転換された宿主を培養又は飼育し、該宿主から前記酵素を採取することを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンからＮ−アセチルグルコサミンを  α−６−Ｄ−マンノシドに転移する酵素（ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン：α−６−Ｄ−マンノシド, β１, ６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、以下ＧｎＴ−Ｖと略称する）、それをコードする遺伝子系、及びＧｎＴ−Ｖの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖タンパク質中に見いだされるアスパラギン型糖鎖（Ａｓｎ型糖鎖）は、その構成糖および分岐の型から高マンノース型、複合型および混合型の３タイプに分類される。これらＡｓｎ型糖鎖の生合成は、先ず、粗面小胞体の内腔側で脂質中間体からその糖鎖部分が、翻訳中のポリペプチド鎖のアスパラギンにひとまとめに転移されることから始まる。
【０００３】
その後、粗面小胞体でグルコースと一部のマンノースが除去されるが、一部の粗面小胞体局在性のAsn 型糖鎖をもつ糖タンパク質はこのままとどまるため、高マンノース型糖鎖のままとなる。その他のオルガネラ糖タンパク質、細胞表層糖タンパク質あるいは分泌糖タンパク質は、ベシクル輸送によりゴルジ体に移り、さらにマンノースが除去される。このゴルジ体では、ゴルジ体酵素であるＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ群の作用のよりＮ−アセチルグルコサミンが導入され、分枝構造をとるようになる。この分枝構造の形成により、高マンノース型糖鎖から混成型糖鎖および複合型糖鎖への変換が始まり、フコースの導入、また、トランスゴルジ領域でのガラクトースの導入を経て、最後に、シアル酸が導入されてＡｓｎ型糖鎖の生合成が完成する。
【０００４】
これら一連のＡｓｎ型糖鎖合成のそれぞれのステップで、種々の酵素が触媒として働いていることがわかっている。そのうち、Ａｓｎ型糖鎖の種々の分枝構造の形成における、Ｎ−アセチルグルコサミンの転移導入反応を触媒している酵素として、６種のＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼが知られている。Ｓｃｈａｃｈｔｅｒら（Ｂｒｏｃｋｈａｕｓｅｎ，Ｉ．，Ｃａａｒｖｅｒ，Ｊ．，ａｎｄ  Ｓｃｈａｃｈｔｅｒ，Ｈ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，６６，１１３４（１９８８））は、Ｍａｎα１−３（Ｍａｎα１−６）Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃのトリマンノシル構造のコア構造に、Ｎ−アセチルグルコサミンを転移するこの６種の酵素をＧｎＴ−ＩないしＧｎＴ−ＶＩと命名した。
【０００５】
このうち、ＧｎＴ−Ｖは、β（１，６）ｂｒａｎｃｈ構造（−［ＧｌｃＮＡｃ−β（１，６）Ｍａｎ−α（１，６）Ｍａｎ］−）の形成に関わる酵素である。β（１，６）ｂｒａｎｃｈ構造は、細胞の形質転換株や腫瘍形成性細胞に、顕著に増加している事が知られている（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｍ．，Ａｒａｎｇｏ，Ｊ．，Ｔａｈｉｒ，Ｓ．Ｈ．，ａｎｄ  Ｈｉｎｄｓｇａｕｌ，Ｏ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１４６，６７９−６８４（１９８７）およびＡｒａｎｇｏ，Ｊ．，ａｎｄ  Ｐｉｅｒｃｃｅ，Ｍ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２５７，１３４２１−１３４２７（１９８２））。
【０００６】
また、腫瘍形成性細胞の癌転移能とβ（１，６）ｂｒａｎｃｈの出現との間に関連があることが示されている（Ｈｉｒａｉｚｕｍｉ，Ｓ．，Ｔａｋａｓａｋｉ，Ｓ．，Ｓｈｉｒｏｋｉ，Ｋ．，Ｋｏｃｈｉｂｅ，Ｎ．，ａｎｄ  Ｋｏｂａｔａ，Ａ．，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２８０，９−１９，（１９９０））。ヒトでも、乳癌の生検例において、５０％の例でβ（１，６）ｂｒａｎｃｈの発現が亢進していると報告されている（Ｄｅｎｎｉｓ，Ｊ．Ｗ．，ａｎｄ  Ｌａｆｅｒｔｅ，Ｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４９，９４５−９５０，（１９８９））。
【０００７】
いずれの場合でも、β（１，６）ｂｒａｎｃｈ構造の出現は、ＧｎＴ−Ｖ活性の上昇をともなっていることがわかっている。このように、ＧｎＴ−Ｖは、糖鎖生合成経路においてβ（１，６）ｂｒａｎｃｈ構造の形成を触媒する点で重要であるばかりでなく、癌細胞の易転移能および悪性度と関連するという点においても、重要な鍵となる酵素である。
【０００８】
これら６種のN-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼのうちＧｎＴ−Ｉについては、ヒトおよびウサギのｃＤＮＡ  構造が明かとなった（Ｋｕｍａｒ，Ｒ．，Ｙａｎｇ，Ｊ．，Ｌａｒｓｅｎ，Ｒ．Ｄ．，ａｎｄ  Ｓｔａｎｌｅｙ，Ｐ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７，９９４８−９９５２，（１９９０）およびＳａｒｋａｒ，Ｍ．，Ｈｕｌｌ，Ｅ．，Ｎｉｓｈｉｋａｗａ，Ｙ．，Ｓｉｍｐｓｏｎ，Ｒ．Ｊ．，Ｍｏｒｉｔｚ，Ｒ．Ｌ．，Ｄｕｎｎ，Ｒ．，ａｎｄ  Ｓｃｈａｃｈｔｅｒ，Ｈ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８８，２３４−２３８，（１９９１））。
【０００９】
一方、ＧｎＴ−Ｖについては、酵素活性からその存在が推定されており、生体内の各組織から精製することが試みられているが、本酵素を可溶化する際、極度に不安定な性質のために精製することが極めて困難であった（Ｎｉｓｈｉｋａｗａ，Ａ．，Ｇｕ，Ｊ．，Ｆｕｊｉｉ，Ｓ．，およびＴａｎｉｇｕｃｈｉ，Ｎ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ１０３５巻，３１３−３１８，（１９９０））。しかし最近、ラット腎よりＧｎＴ−Ｖが単離、精製された例が報告されている（Ｓｈｏｒｅｉｂａｈ，Ｍ．，Ｇ．，Ｈｉｎｄｇａｕｌ，Ｏ．，ａｎｄ  Ｐｉｅｒｃｅ，Ｍ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７，２９２０−２９２７，（１９９２））。
【００１０】
しかしながら、純化したラットＧｎＴ−Ｖからは、当該酵素の遺伝子に関する詳細な情報は得られていない。さらに、ヒトＧｎＴ−Ｖについては、その酵素学的性質を含め、何らの情報も得られていない。ＧｎＴ−Ｖは、癌化した細胞の悪性度のマーカーとして診断上非常に有用であるばかりでなく、本酵素を用いて本酵素の特異的阻害剤のスクリーニング系を確立することにより癌転移防止剤を設計することが初めて可能となるので、ヒト由来のＧｎＴ−Ｖの単離、精製及び遺伝子を含むその構造解析や大量生産の方法が望まれている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は上記の実情を鑑みてなされたものであり、その目的はヒト由来のＧｎＴ−Ｖを提供するものである。さらに、本発明は当該酵素に係る遺伝子を単離し、当該遺伝子を用いて当該酵素を大量に生産する方法を開発するとともに、遺伝子操作による有用物質生産における糖鎖の均一生産をも可能にすることを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、本酵素を精製するための出発材料として、癌細胞の培養上清に着目した。しかしながら、本発明者らは、ウシ血清等を添加しなければ増殖できないような癌細胞の培養上清では、精製が困難であると考えた。そこで、各種癌細胞を無タンパク質培地に馴化するべく鋭意検討を重ね、数十種の無タンパク質培地に馴化した癌細胞を樹立することに成功した。そのうち、ヒト肺癌（小細胞癌）由来のＱＧ細胞の無タンパク質培地の培養上清中に本酵素活性を認め、本酵素を精製することに成功した。
【００１３】
従って本発明は、以下の酵素学的性質：
（１）作用；ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンからＮ−アセチルグルコサミンをα−６−Ｄ−マンノシドに転移する；
（２）基質特異性；ＧｎＧｎ−ｂｉ−ＰＡを受容体とした時を１００とした場合、ＧｎＧｎＦ−ｂｉ−ＰＡで約７８％、ＧｎＧｎＧｎ−ｔｒｉ−ＰＡで約１２５％、ＧｎＭ−ＰＡで約６６％の反応性を示す；
（３）至適ｐＨ；６．２−６．３；
（４）阻害、活性化及び安定化；活性の発現にＭｎ2+を必要とせず、また、２０mMＥＤＴＡ存在下においても活性は阻害されない；
【００１４】
（５）分子量；約７３，０００（還元剤非存在下ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる）並びに約７３，０００及び約６０，０００（還元剤存在下ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる）；
（６）Ｋｍ値；受容体ＧｎＧｎ−ｂｉ−ＰＡ及び供与体ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃに対するＫｍ値は、各々１３３μＭ、３．５ｍＭである；並びに
（７）以下のペプチドフラグメントを有する：
（１）Thr-Pro-Trp-Gly-Lys 
（２）Asn-Ile-Pro-Ser-Tyr-Val 
（３）Val-Leu-Asp-Ser-Phe-Gly-Thr-Glu-Pro-Glu-Phe-Asn-His-Ala-Asn-Tyr-Ala
（４）Asp-Leu-Gln-Phe-Leu-Leu 、
（５）Asn-Thr-Asp-Phe-Phe-Ile-Gly 
を有するβ１, ６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼを提供する。
【００１５】
本発明のβ１, ６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼは、例えば少なくとも配列番号：８に示すアミノ酸配列を含んで成るアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が修飾されているアミノ酸配列を有する。ここでアミノ酸の修飾とは、アミノ酸が付加、除去及び／又は置換されていることを意味する。
本発明はさらにヒト肺癌由来のＱＧ細胞又はヒト大腸癌細胞ＣＬ０２０１細胞を培養し、該培養物から該酵素を採取することを特徴とする前記酵素の製造方法を提供する。
【００１６】
本発明はさらに、前記β１, ６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ酵素の製造方法において、該酵素をコードするＤＮＡを含んで成る発現ベクターにより形質転換された宿主を培養又は飼育し、該宿主から前記酵素を採取することを特徴とする方法を提供する。
本発明はさらに、前記酵素をコードする遺伝子系、すなわちＤＮＡ、発現ベクター、及び形質転換された宿主に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
ヒト肺癌（小細胞癌）由来のＱＧ細胞は、動物細胞の培養に常用されている任意の方法により培養することができる。また、タンパク質を全く含まない培地を用いて静置培養することも可能である。具体的な一例を実施例１に記載する。なお、当該ヒト肺癌（小細胞癌）由来のＱＧ細胞は、Ｈｕｍａｎ  ｌｕｎｇ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ＳＢＭ３３１と命名され、１９９２年８月１８日付けで工業技術院微生物工業技術研究所に受託番号微工研条寄第３９６７号（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３９６７）としてブダペスト条約に基づき国際寄託されている。
【００１８】
酵素の活性測定法は、受容体を放射性同位元素あるいは、蛍光物質により標識した後、当該酵素を反応させ、反応生成物をＨＰＬＣで分離することにより容易に測定することができる。具体的には、谷口等の既報の方法（Ｔａｎｉｇｉｃｈｉ，Ｎ．，Ｎｉｓｈｉｋａｗａ，Ａ．，Ｆｕｊｉｉ，Ｓ．，ａｎｄ  Ｇｕ，Ｊ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１７９，３９７−４０８（１９８９）；Ｎｉｓｈｉｋａｗａ，Ａ．，Ｇｕ，Ｊ．，Ｆｕｊｉｉ，Ｓ．，ａｎｄ  Ｔａｎｉｇｉｃｈｉ，Ｎ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １０３５，３１３−３１８（１９９０））に従うことができる。
【００１９】
即ち、ＧｎＧｎ−２−ａｍｉｎｏｐｙｒｉｄｉｎｅ（ＧｎＧｎ−ｂｉＰＡ）を受容体、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ（Ｓｉｇｍａ）を供与体として、ＧｎＴ−Ｖの酵素活性を測定することができる。活性強度は転移されたＮ−アセチルグルコサミン／時間／ｍｇタンパク質で表わされる。なお、タンパク質量は既報（Ｒｅｄｉｎｂａｕｇｈ，Ｍ，Ｇ．，ａｎｄ  Ｔｕｒｌｅｙ，Ｒ．Ｂ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５３，２６７−２７１（１９８６））に従い、ＢＣＡキット（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）にてウシアルブミンを標準として測定することができる。
【００２０】
培養上清からの本酵素の単離、精製は、タンパク質の精製に常用されている複数の方法を組み合わせることにより行なうことができる。また、本酵素の有用な精製方法として、受容体および供与体に対する親和性を利用することが可能である。本発明においては、無タンパク質培養上清を、先ず限外濾過法により濃縮し、次に、Ｐｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを用いる疎水性クロマトグラフィーにより活性画分を得る。
【００２１】
さらにＨｙｄｒｏｘｙｌａｐａｔｉｔｅによる吸着後、活性画分を溶出させ、受容体カラムクロマトグラフィー（ＵＤＰ−ｈｅｘａｎｏｌａｍｉｎｅ−Ａｇａｒｏｓｅ）および供与体カラムクロマトグラフィー（ＧｎＧｎ−Ａｓｎ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）の２つのアフィニティクロマトグラフィーを行い、還元剤非存在下ドデシル硫酸ナトリウムーポリアクリルアミド電気泳動を行うことにより単一バンドを示すポリペプチドが得られる。これらの単離精製操作の具体例を実施例２に記載する。
【００２２】
上記のように鋭意検討の結果、本発明者らはヒト肺癌（小細胞癌）由来ＱＧ細胞の無タンパク質培養上清の濃縮液から４段階の精製操作により約２０，０００倍濃縮純化してＧｎＴ−Ｖを単離、精製することに成功し、さらに当該酵素の部分アミノ酸配列をも明らかにした。本発明に係る酵素は常用のタンパク質の単離、精製方法を特定の組み合わせにより選択し、それを特定の条件下で行うことにより初めて得られたものである。
【００２３】
一旦、精製、単離され、後記のごとくその物質的、構造的性質が解明されれば、それらの性質を指標として、常用のタンパク質の分離、精製方法を任意に組み合わせて、本明細書に記載するものとは異なる種々の方法により純化することができる。また、本発明により開示された酵素の部分アミノ酸配列に基づいて適当な合成プローブを作製し、鳥類、両生類、哺乳類等、由来の染色体ライブラリーやｃＤＮＡライブラリーから常法により遺伝子を単離し、さらに単離された遺伝子を組換えＤＮＡ技術により大量に製造することは所謂当業者にとって容易になしえるものである。
【００２４】
単離、精製された酵素は、以下の酵素学的性質を有する。
１．作用；ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンからＮ−アセチルグルコサミンをα−６−Ｄ−マンノシドに転移する。
２．基質特異性；ＧｎＧｎ−ｂｉ−ＰＡを受容体とした時を１００とすると、ＧｎＧｎＦ−ｂｉ−ＰＡで約７８％、ＧｎＧｎＧｎ−ｔｒｉ−ＰＡで約１２５％、ＧｎＭ−ＰＡで約６６％の反応性を示す。
３．至適ｐＨ；６．２−６．３
４．阻害、活性化及び安定化；活性の発現にMn2+を必要としない。また、２０mM EDTA 存在下においても活性は阻害されない。
【００２５】
５．分子量；ドデシル硫酸ナトリウムーポリアクリルアミド（ＳＤＳ）電気泳動分析の結果、非還元条件下において分子量が約７３，０００の単一バンドを示し、還元条件下では、前述のバンドに加えて約６０，０００の分子量の小さいバンドが認められる。また、単離、精製した該酵素を、ネイティブポリアクリルアミド電気泳動した後、ゲルより当該バンドを切り出して本酵素活性を測定した場合、該当するバンドの濃さに応じて該酵素活性が認められる。以上のことから単離、精製されたタンパク質が目的とするＧｎＴ−Ｖであることが確認された。具体例を実施例３に記載する。
【００２６】
また、還元条件下ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動における二つのバンドの各々をＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動ゲルより切り出し、トリプシン消化後、逆相高速液体クロマトグラフィーによるペプチドマッピングを試みたところ、６０ｋＤａおよび７３ｋＤａの溶出パターンについては同様のパターンが得られた。この結果より両タンパク質は一部酵素的切断を受けている可能性があるものの、同一タンパク質由来と結論づけられた。具体例を実施例４に記載する。
【００２７】
６．Ｋｍ値；受容体ＧｎＧｎ−ｂｉ−ＰＡと供与体ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃに対するＫｍ値は、各々１３３μＭ、３．５ｍＭである。
７．ペプチドフラグメント；トリプシン消化ポリペプチド断片を用いてアミノ酸配列を同定したところ、以下に示す部分アミノ酸配列が得られた。
（１）Thr-Pro-Trp-Gly-Lys 
（２）Asn-Ile-Pro-Ser-Tyr-Val 
（３）Val-Leu-Asp-Ser-Phe-Gly-Thr-Glu-Pro-Glu-Phe-Asn-His-Ala-Asn-Tyr-Ala
（４）Asp-Leu-Gln-Phe-Leu-Leu 
（５）Asn-Thr-Asp-Phe-Phe-Ile-Gly 
【００２８】
さらに、上記のペプチドフラグメントを用いて予想されるオリゴヌクレオチドを作製し、当該オリゴヌクレオチドをプローブとして染色体ライブラリーやｃＤＮＡライブラリーを常法によりスクリーニングすることにより、本発明に係るＧｎＴ−Ｖをコードする遺伝子を得ることができる。
【００２９】
本発明の遺伝子はｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、化学合成ＤＮＡのいずれであってもよい。ｃＤＮＡは、例えば、前記のようにしてヒト細胞、例えばヒト肺癌由来のＱＧ細胞から精製したＧｎＴ−Ｖの、実施例５に示すような部分アミノ酸配列に基いて設計したＤＮＡ（ヌクレオチド）プライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）によりクローニングすることができる。クローニングの具体的な１例を実施例８に示す。
【００３０】
本発明の遺伝子はさらに、ＧｎＴ−Ｖ活性を有する蛋白をコードし、配列番号：８のヌクレオチド配列とハイブリダイズするＤＮＡも含まれる。
実施例８においてクローニングされた、本発明のＧｎＴ−ＶをコードするＤＮＡのヌクレオチド配列及び該ヌクレオチド配列から推定されるアミノ酸配列を配列番号：８に示す。
【００３１】
こうして、一旦アミノ酸配列が決定されれば、この天然アミノ酸配列に１〜複数のアミノ酸が付加されておりなおＧｎＴ−Ｖ活性を維持しているポリペプチド、前記天然アミノ酸配列から１〜複数個のアミノ酸が除去されておりなおＧｎＴ−Ｖ活性を維持しているポリペプチド、前記天然アミノ酸配列中の１〜複数個のアミノ酸が他のアミノ酸により置き換えられておりなおＧｎＴ−Ｖ活性を維持しているポリペプチド、さらには、上記のアミノ酸付加修飾、アミノ酸除去修飾及びアミノ酸置換修飾が組合わされた修飾を有しなおＧｎＴ−Ｖ活性を維持しているポリペプチドなど、種々の修飾型ＧｎＴ−Ｖを設計し、それを製造することができる。
【００３２】
上記アミノ酸の付加、除去及び置換等の修飾におけるアミノ酸の数は、特に限定されないが、付加については、例えば、本発明のＧｎＴ−Ｖとのハイブリッド蛋白に用いられる機能性蛋白のアミノ酸の数（例えば、マルト−スバインディングプロテイン（ｍａｌｔｏｓｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）等の公知の抽出精製もしくは安定化用蛋白または各種生理活性蛋白、例えばＩＬ−３，ＩＬ−１１のようなサイトカイン）や本因子に付加されたシグナルペプチドのそれに依存し、すなわち、当該修飾の目的に依存して決定される。例えば、１〜３０、好ましくは、１〜１０の付加があげられる。
【００３３】
また、除去については、除去されるアミノ酸の数は、ＧｎＴ−Ｖ活性が維持されるように設計、決定され、例えば、１〜３０、好ましくは１〜２０、また、本因子の活性領域以外の領域のアミノ酸の数があげられる。さらに、置換については、置換されるアミノ酸の数は、ＧｎＴ−Ｖが維持されるように設計、決定され、例えば、１〜１０、好ましくは、１〜５があげられる。
【００３４】
本発明においては、ＧｎＴ−Ｖをコードする遺伝子のヌクレオチド配列として配列番号：８に示すヌクレオチド配列を開示するが、本発明のＧｎＴ−Ｖの遺伝子はこれに限定されない。一旦、天然ＧｎＴ−Ｖのアミノ酸配列が決定され、又は修飾型ＧｎＴ−Ｖのアミノ酸配列が設計されれば、コドンの縮重に基き、同じアミノ酸配列をコードする種々のヌクレオチド配列を設計し、それを調製することができる。この場合、使用すべき宿主により高頻度で用いられるコドンを使用するのが好ましい。
【００３５】
本発明の天然ＧｎＴ−Ｖをコードする遺伝子を得るには、実施例８に記載する様にしてｃＤＮＡを得ることができるが、これに限定されない。すなわち、天然ＧｎＴ−Ｖのアミノ酸配列をコードする１つのヌクレオチド配列が決定されれば天然ＧｎＴ−Ｖをコードする遺伝子は、本発明に具体的に開示するストラテジーとは異なるストラテジーによりｃＤＮＡとしてクローニングすることができ、さらにはそれを生産する細胞のゲノムからクローニングすることもできる。
【００３６】
ゲノムからクローニングする場合、実施例８において使用した種々のプライマーヌクレオチド又はプローブヌクレオチドを、ゲノムＤＮＡ断片の選択のためプローブとして使用することができる。また、配列番号：８に記載するヌクレオチド配列に基いて設計された他のプローブを用いることもできる。ゲノムから目的とするＤＮＡをクローニングするための一般的方法は当業界においてよく知られている（Current Protocols In Molecular Biology, John Wiley & Sons 社、第５章及び第６章）。
【００３７】
本発明の天然ＧｎＴ−Ｖをコードする遺伝子はまた、化学合成によっても調製することができる。ＤＮＡの化学合成は当業界において自動ＤＮＡ合成機、例えばアプライドバイオシステム社３９６ＤＮＡ／ＲＮＡ合成機など採用して容易である。従って、当業者は、配列番号：８に示されるヌクレオチド配列のＤＮＡを容易に合成することができる。
【００３８】
本発明の天然型ＧｎＴ−Ｖを生来のコドンとは異なるコドンによりコードする遺伝子、及び修飾型ＧｎＴ−Ｖをコードする遺伝子は、前記のごとく化学合成により調製することもでき、また配列番号：８に示すヌクレオチド配列を有するＤＮＡ又はＲＮＡを鋳型として変異誘発プライマーと共に用いる部位特定変異誘発法（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔｎｇｅｎｅｓｉｓ）等常法に従って得ることもできる（例えば、Current Protocols In Molecular Biology, John Wiley & Sons 社、第８章を参照のこと）。
【００３９】
上記のようにして本発明のＧｎＴ−Ｖの遺伝子が得られると、これを用いて、常用の遺伝子組換え法により組換えＧｎＴ−Ｖを製造することができる。すなわち、本発明のＧｎＴ−ＶをコードするＤＮＡを適当な発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを適当な宿主細胞に導入し、該宿主細胞を培養し、そして得られた培養物（細胞又は培地）から目的とするＧｎＴ−Ｖを採取する。
【００４０】
宿主としては原核生物又は真核生物を用いることができる。原核生物としては細菌、特に大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、バシルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細菌、例えばバシルス・ズブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等を用いることができる。真核生物としては酵母、例えばサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属酵母、例えばサッカロミセス・セレビシエー（Ｓ．ｓｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、等の真核性微生物、昆虫細胞、例えば、ヨガ細胞（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、キャベツルーパー細胞（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ）、カイコ細胞（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）、動物細胞、例えばヒト細胞、サル細胞、マウス細胞等を使用することができる。本発明においてはさらに、生物体それ自体、例えば昆虫、例えばカイコ、キャベツルーパー等を用いることもできる。
【００４１】
発現ベクターとしては、プラスミド、ファージ、ファージミド、ウィルス（バキュロ（昆虫）、ワクチニア（動物細胞））等が使用できる。発現ベクター中のプロモーターは宿主細菌に依存して選択され、例えば細菌用プロモーターとしてはｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター等が使用され、酵母用プロモーターとしては、例えば、ａｄｈｌプロモーター、ｐｑｋプロモーター等が使用される。また、昆虫用プロモーターとしてはバキュロウィルスポリヘドリンプロモーター等、動物細胞としてはＳｉｍｉａｎ  Ｖｉｒｕｓ４０のｅａｒｌｙまたはｌａｔｅプロモーター等があげられる。
【００４２】
発現ベクターによる宿主の形質転換は、当業界においてよく知られている常法により行うことができ、これらの方法は例えば、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 社、に記載されている。形質転換体の培養も常法に従って行うことができる。
培養物からのＧｎＴ−Ｖの精製は、タンパク質を単離・精製するための常法に従って、例えば、限外濾過、各種カラムクロマトグラフィー、例えばセフアロースを用いるクロマトグラフィー等により行うことができる。
【実施例】
【００４３】
以下、実施例により本発明を詳細に説明する。
実施例１．ＧｎＴ−Ｖ産生細胞の培養と培養上清の調製
ヒト肺癌（小細胞癌）由来のＱＧ細胞（微工研条寄第３９６７号）をオプチセル５３００（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｉｎｃ．，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）にて培養した。多孔性のセラミック成育チャンバー（有効表面積＞３２，０００cm2 ）に２Ｘ１０9 細胞を植え、５％子牛血清（ＧＩＢＣＯ）含有Ｈａｍ，ｓＦ−１２培養液（Ｆｌｏｗ）を用いて、コンフルエントになるまで培養した。
【００４４】
次に、１０-8Ｍ  ｓｏｄｉｕｍ  ｓｅｌｅｎｉｔｅ含有タンパク質無添加Ｈａｍ，ｓ  Ｆ−１２  培養液を連続的に添加することにより、血清量を逓減させた。２週間の培養後、１４０Ｌの培養上清が得られた。この培養上清をＵＦ−メンブレン（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を濾過膜とする超濾過装置を用いて約１００倍濃縮した。濃縮した培養上清１．４リットルを精製材料に供した。
【００４５】
実施例２．濃縮した培養上清からの本酵素の精製
（１）ＵＤＰ−ヘキサノルアミンアガロースとＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−３−（ＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−６）Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−アスパラギン（ＧｎＧｎ−Ａｓｎ）セファロースの調製  ＵＤＰ−ヘキサノルアミンアガロースは、Ｓｉｇｍａ社（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）より購入した。ＧｎＧｎ−Ａｓｎはヒトトランスフェリンから調製した。先ず、ヒトトランスフェリンを０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０）中３７℃でプロナーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ社）で１２時間、２回繰り返し消化した後、１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）で予め平衡化したゲル濾過カラム（Ｔｏｙｏｐｅｒｌ  ＨＷ−４０、２．６ｘ１００ｃｍ、Ｔｏｓｏｈ、Ｔｏｋｙｏ）により、糖ペプチドを分離した。
【００４６】
次に、分離した糖ペプチドをシアリターゼ（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｃｅ、Ｎａｃａｌａｉ  Ｔｅｓｑｕｅ、Ｋｙｏｔｏ）及びβ−ガラクトシダーゼ（ｊａｃｋ  ｂｅａｎ、Ｓｅｉｋａｇａｋｕ  Ｃｏ、Ｊａｐａｎ）で酵素消化することによりＧｎＧｎ−Ａｓｎを得た。ＧｎＧｎ−Ａｓｎセファロースは１００μｍｏｌのＧｎＧｎ−Ａｓｎに１０ｍｌの活性化ＣＨ−セファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を反応させることにより結合させて得た。
【００４７】
（２）フェニル−セファロースカラムクロマトグラフィー
4.5 ｘ 18 cm  のカラムに２８０ｍｌのフェニル−セファロースを充填し、１．５Ｌの２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．８，４０％飽和硫安含有）で平衡化させた。実施例１で調製した濃縮細胞培養上清１．３リットルを硫安４０％飽和にし、３０００ｇで３０分間の遠心操作後、遠心上清を当該カラムに吸着させた。
【００４８】
溶出は、硫安４０％を含む２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．８）を用いて、硫安濃度を０％まで下げるリニアグラジエントで行なった。その時の流速は、３ｍｌ／分とした。溶出画分の２８０ｎｍの吸光度とＧｎＴ−Ｖ酵素活性を測定した。図１に示したごとく、ＧｎＴ−Ｖ酵素活性のピークは、２８０ｎｍの吸収ピークより後半に溶出された。
【００４９】
（３）ハイドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィー
フェニル−セファロースカラムクロマトグラフィーより溶出させたＧｎＴ−Ｖ酵素活性画分を集め、さらに、ＡｍｉｃｏｎＹＭ−３０メンブランを用いて濃縮と同時に、２０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．８）との溶媒交換を行なった。これを、３００ｍｌの２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．８）で予め平衡化した５５ｍｌのハイドロキシルアパタイトに吸着させた。溶出は、３ｍｌ／分で５０ｍＭ−３００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．８）のリニアグラジエントにより行なった。ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーの溶出パターンを図２に示す。ＧｎＴ−Ｖ酵素活性ピークは、他の大部分の蛋白質から分離して溶出された。
【００５０】
（４）ＵＤＰ−ヘキサノールアミンアガロース−カラムクロマトグラフフィー
次に、ハイドロキシアパタイトカラムからの活性画分を集め、ＡｍｉｃｏｎＹＭ−３０メンブランを用いて、１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．２５）に溶媒を変換したものを、１００ｍｌの１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．２５）で予め平衡化した２０ｍｌのＵＤＰ−ヘキサノールアミンアガロース−カラムに吸着させた。酵素は、０．３ＭＮａＣｌ含有１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．２５）を流速１５ｍｌ／時間で流して溶出した。この溶出パターンを図３に示す。
【００５１】
（５）ＧｎＧｎ−Ａｓｎセファロース−カラムクロマトグラフィー
最後に、ＧｎＧｎ−Ａｓｎセファロース−カラムクロマトグラフィーを実施した。ＵＤＰ−ヘキサノールアミンアガロース−カラムからの活性画分を２０ｍｌの０．３ＭＮａＣｌ含有１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．２５）で平衡化した４ｍｌのＧｎＧｎ−Ａｓｎセファロースに吸着させ、同じ緩衝液で洗った後に、０．３ＭＮａＣｌ含有３０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）流速３ｍｌ／時間で溶出した。この結果を図４に示す。
以上、いままでの精製の収率を表１に示した。各ステップとも、７０％以上の収率で、最終的に約２０，０００倍精製された。
【００５２】
【表１】
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【００５３】
実施例３．ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動およびネイティブポリアクリルアミド電 気泳動
ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動は、既報の方法（Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｕ．Ｋ．，Ｎａｔｕｒｅ，２２７，６８０−６８５，（１９７０））に従い、１０−１５％のグラディエントポリアクリルアミドゲルを用いて還元ならびに非還元条件下で行なった。α−Ｌａｃｔｏａｌｂｕｍｉｎ，Ｓｏｙｂｅａｎ  ｔｒｙｐｓｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，Ｃａｒｂｏｎｉｃ  ａｎｈｙｄｒａｓｅ，Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ，Ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ，Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ  ｂ  をそれぞれ分子量１４，４００、２０，１００、３０，０００、４３，０００、６７，０００、９４，０００の分子量マーカーとして用いた。
【００５４】
最終精製した本酵素を、クマシ−ブリリアントブルーで染色したこのゲルの写真を図５に示す。非還元条件下でのＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動では、上述の分子量マーカーに基づいて、７３ｋＤａの単一なバンドが確認された。一方、還元条件下でのＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動では、ゲル上に７３ｋＤａ以外に６０ｋＤａのバンドを確認した。また、ネイティブポリアクリルアミド電気泳動のクマシ−ブリリアントブルーで染色したゲルの写真及びネイティブポリアクリルアミド電気泳動ゲルから切り出した本酵素活性を図６に示す。バンドの濃さに応じて本酵素活性が認められた。
以上のことより単離、精製されたタンパク質が目的のＧｎＴ−Ｖであることが確認された。
【００５５】
実施例４．ペプチドマッピング分析
還元条件下でＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動を行ない、そのゲルから６０ｋＤａおよび７３ｋＤａに該当するバンドを、それぞれ、切り出した。スライスしたゲル片に０．５％ＳＤＳを含む３０ｍＭ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ６．５）を加え、ボイルした後、手製の電気抽出装置でタンパク質を抽出した。抽出後、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解した２００ｎｇのトリプシン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）と３７℃で１１時間反応させた。
【００５６】
酵素消化後、逆相高速液体クロマトグラフィーカラム（Ｃｈｅｍｃｏｓｏｒｂ  ３  ＯＤＳ−Ｈ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ，２．１×７５ｍｍ）にかけ、酸性条件下（０．１％ＴＦＡ）０−６０％のアセトニトリルのグラジエントで溶出した。その時の溶出パターンを図７に示す。６０ｋＤａおよび７３ｋＤａの溶出パターンは、同様のパターンを示し、このことから、両タンパク質は、一部酵素的消化を受けている可能性もあるが、大部分は共通のポリペプチドからなると結論づけられた。
【００５７】
実施例５．部分アミノ酸配列の決定
アミノ酸配列を知るために、上記実施例２で得られた精製ＧｎＴ−Ｖのペプチド断片をＧａｓ−ｐｈａｓｅシークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ  Ｉｎｃ．、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）にかけたところ、以下に示すペプチドフラグメントが得られた。
（１）Thr-Pro-Trp-Gly-Lys 
（２）Asn-Ile-Pro-Ser-Tyr-Val 
（３）Val-Leu-Asp-Ser-Phe-Gly-Thr-Glu-Pro-Glu-Phe-Asn-His-Ala-Asn-Tyr-Ala
（４）Asp-Leu-Gln-Phe-Leu-Leu 
（５）Asn-Thr-Asp-Phe-Phe-Ile-Gly 
【００５８】
実施例６．基質特異性
糖受容体として次に示したものを用いて、前述の酵素活性の測定法に従い基質特異性を測定した。
【００５９】
【化１】
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【００６０】
【化２】
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【００６１】
【化３】
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【００６２】
ＧｎＧｎＦ−，ＧｎＧＦ−，ＧＧｎＦ−，Ｇｎ（Ｇｎ）ＧｎＦ−，Ｇｎ（Ｇｎ）Ｇｎ−，ＧＧ−，ＧｎＧｎ−，ＭＭ−およびＧｎＭ−は、ウシＩｇＧを無水ヒドラジン処理した後、Ｈａｓｅらの方法（Ｈａｓｅ，ｓ．，Ｉｂｕｋｉ，Ｔ．，ａｎｄ  Ｉｋｅｈａｒａ，Ｔ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９５，１９７−２０３（１９８４））により蛍光標識した。精製したＧｎＴ−ＶはＰＢＳ緩衝液にて最終濃度０．１ｍｇ蛋白質／ｍｌになるように希釈した後、各蛍光標識糖受容体との反応を行なった。結果を表２に示した。
【００６３】
【表２】
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【００６４】
本酵素はＧｎＧｎＦ−ｂｉ−ＰＡ、ＧｎＭ−ＰＡ及びＧｎＧｎＧｎ−ｔｒｉ−ＰＡの何れとも反応することが判明した。
【００６５】
実施例７．至適pH
pH６．０、６．２５、６．５及び７．０の０．２５Ｍリン酸カリウム緩衝液に、最終濃度０．２Ｍ  ＧｌｃＮＡｃ，４０mM  ＥＤＴＡ，１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，４０mM  ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを含むアッセイ混液を調製した。
アッセイ混液２５μｌに対して被験サンプル１５μｌおよび基質（ＧｎＧｎ−ｂｉ−ＰＡ）１０μｌを加え、３７℃で４時間インキュベーションした。結果を図８に示す。
【００６６】
実施例８．ＧｎＴ−ＶｃＤＮＡの単離・同定及び発現ベクターの作製
実施例５で得られた配列番号３で表されるアミノ酸配列を基に配列表・配列番号６で表されるオリゴマーＳ１８を合成し、さらに配列表・配列番号５で表されるアミノ酸配列を基に配列表・配列番号７で表されるオリゴマーＡ２１を合成した。
【００６７】
ＱＧ細胞のポリＡを有するＲＮＡから、ｃＤＮＡ Synthesis kit  (Pharmacia社製) を用いて２本鎖ｃＤＮＡを合成した。次に、このｃＤＮＡを鋳型としてオリゴマーＳ１８とＡ２１を用いてAmpli-Taq （Takara  社製）にてＰＣＲを行った。その結果、ＧｎＴ−ＶｃＤＮＡ断片である約５００塩基対のＤＮＡ断片を得た。
【００６８】
次に、得られたｃＤＮＡ断片をプローブとして、さらに、ｃＤＮＡのクローニングを実施した。即ち、このｃＤＮＡを鋳型にしてランダムプライマーラベリングキット(Amersham 社製) でα32Ｐ−ＣＴＰラベルした。得られたプローブを用い、ヒト胎児肝ｃＤＮＡライブラリー（クローンテック社製）を常法によりスクリーニングした。得られたクローンのうち、最も長いクローンをEcoRI で切り出し、pBluescript II ks (+)   (Strategene 社製）にサブクローニングした。インサート内にEcoRI サイトがあるため、２つの断片が得られた。２つの断片のそれぞれを、シークエンスした結果、約８００ｂｐのＢフラグメント及び約１２００ｂｐのＦフラグメントが得られた。
【００６９】
以上のようにして得られたＤＮＡ断片のシークエンスをSequenase （USB 社製）で決定した結果を配列表・配列番号８に示す。このＤＮＡ断片は、実施例５で得られた５つのアミノ酸配列をコードする塩基配列を全て含むことが確認された。
なお、今回得られたＧｎＴ−ＶｃＤＮＡ断片は３’末端が終止コドンに達していない。従って、３’末端に未決定の塩基対が存在することは明らかであるが、当該未決定の塩基対を決定することは、当業者にとって容易なことである。
【００７０】
次に、ＧｎＴ−ＶｃＤＮＡ断片を動物細胞で発現するために、発現ベクターに組み込んだ。即ち、発現ベクターｐＳＶＫ３（Pharmacia 社製）をEcoRI 及びSmaIで酵素的に消化したのち、前述のＦフラグメントをEcoRI サイト及びインサート内のSmaIサイトで切り出して挿入した（図９参照）。
次いで、Ｆフラグメントを挿入したベクターをEcoRI で切断したのち、Self-ligation を防ぐためにＣＩＰ（Calf intestinal phosphatase ）処理後、EcoRI サイトで切り出したＢフラグメントを挿入することにより、発現ベクターに組み込んだ。
【００７１】
実施例９．クローニングしたＧｎＴ−ＶｃＤＮＡの発現及び発現した蛋白質の酵素活性
実施例８で作製した発現ベクターを用いて、ＧｎＴ−ＶｃＤＮＡ断片を動物細胞に発現させ、発現した蛋白質にＧｎＴ−Ｖ酵素活性があるか否か検討した。
発現用動物細胞としてＣＯＳ−１細胞を用い、エレクトロポレーション法によりＧｎＴ−ＶｃＤＮＡ断片を含む発現ベクターをトランスフェクションした。即ち、予め用意したＣＯＳ−１細胞約５×１０6 細胞をＨＥＢＳ緩衝液（20 mM Hepes, 137 mM NaCl, 5mM KCl, 0.7 mM Na2HPO4, 6mM Dexrose, pH 7.05 ）に浮遊させ、上述のプラスミド６０μｇを加え、終容量８００μｌをエレクトロポレーター（Bio-Rad 社製）で２５０Ｖ、９６０ｍＦの条件で実施した。
【００７２】
次に、ＧｎＴ−Ｖ遺伝子をトランスフェクションしたＣＯＳ−１細胞の全量を直径６cmのシャーレにまき、３７℃、５％ＣＯ2 存在下、４８時間培養した。培養した細胞は、ラバーポリスマンで集め、５０μｌのＰＢＳ緩衝液に懸濁した後、ソニケーターで細胞を破砕した。その後、遠心操作により上清を集め、そのうちの１５μｌにつき前述の方法により、酵素活性を測定した。測定結果を図１０に示す。
以上の結果から、今回クローニングしたＧｎＴ−ＶｃＤＮＡ断片は、活性発現に最低必要な長さを含むことが確認された。
【００７３】
発明の効果
ヒト肺癌（小細胞癌）由来のＱＧ細胞の無タンパク質培養上清から、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン：α−６−Ｄ−マンノシド, β１, ６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼを単離精製し、その性質、部分アミノ酸構造を決定した。また、本発明者らは、今回初めて精製した酵素を用いて、各種糖受容体に対しての基質特異性を明らかにした。これらの特異性を持った糖転移酵素は、生体内における糖鎖生合成経路の調節を担う重要な酵素の一つである。また、細胞の癌化あるいは悪性化に伴い、本酵素が糖鎖の修飾に関与していることが明らかになりつつある。
【００７４】
このことから、本発明に係る酵素は癌化した細胞の悪性度のマーカーとして診断上の有用性を有するばかりでなく、本酵素を用いて本酵素の特異的阻害剤のスクリーニング系を確立することにより癌転移防止剤を設計することが初めて可能となる。さらに、本酵素を用いて例示した各種糖受容体にβ（１，６）ｂｒａｎｃｈ構造を導入することができるため、反応生成物としてのβ（１，６）ｂｒａｎｃｈ構造を持ったオリゴサッカライドを工業的に製造できるようになった。また、糖鎖工学上の観点から、本酵素を大量に生産することにより、遺伝子操作による有用物質の生産において糖鎖の均一生産をも可能にすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】フェニルセファロースカラムクロマトグラフィーの溶出パターンを示すグラフである。白丸実線はタンパク質の溶出パターンを、黒丸実線はＧｎＴ−Ｖ活性を示す。溶出は、４０％から０％へ硫安濃度を下げることにより行なった。硫安濃度を点線で示す。
【図２】ハイドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィーの溶出パターンを示すグラフである。白丸実線はタンパク質の溶出パターンを、黒丸実線はＧｎＴ−Ｖ活性を示す。図中の矢印は、溶出バッファーの開始点を示す。溶出は、５０ｍＭから３００ｍＭのリン酸緩衝液の濃度勾配を形成させることにより行なった。リン酸緩衝液の濃度を点線で示した。
【図３】ＵＤＰ−ヘキサノールアミンアガロース−カラムクロマトグラフフィーの溶出パターンを示すグラフである。白丸実線はタンパク質の溶出パターンを、黒丸実線はＧｎＴ−Ｖ活性を示す。図中の矢印は、溶出バッファーの開始点を示す。溶出は、０．３ＭＮａＣｌを３ｍｌ／時間流すことにより行なった。
【図４】ＧｎＧｎ−Ａｓｎセファロース−カラムクロマトグラフィーの溶出パターンを示すグラフである。白丸実線はタンパク質の溶出パターンを、黒丸実線はＧｎＴ−Ｖ活性を示す。図中の矢印は、溶出バッファーの開始点を示す。溶出は、０．３ＭＮａＣｌを３ｍｌ／時間流すことにより行なった。
【図５】ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動の結果を示す図面に代る写真である。
【図６】ネイティブポリアクリルアミド電気泳動の結果を示す図面に代る写真である。
【図７】ペプチドマッピング分析の結果を示す図である。
【図８】本発明の酵素の至適pHを示すグラフである。
【図９】図９は本発明の発現ベクターの作製を示す図である。
【図１０】図１０は、本発明の発現生成物であるＧｎＴ−Ｖにより基質（ＧｎＧｎ−ｂｉ−ＰＡ）から生成物（ＧｎＧｎＧｎ−ｔｒｉ′−ＰＡ）が生成したことを示す高速液体クロマトグラフィーの溶出図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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