【手続補正書】
【提出日】平成26年2月28日(2014.2.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効量の単離ペプチドまたはその塩を含む、対象を治療して炎症を低減させるおよび／または免疫応答を調節するための薬学的組成物であって、
該ペプチドが一般式：Tyr-X1-X2-X3を有し、
式中、X1がPro、D-LysまたはD-Ornであり；
X2が、Trp、PheまたはN-アルキル-Pheであり、ここでアルキルは1個から約6個の炭素原子を含み；且つ
X3が、Phe、Phe-NH2、D-Phe、D-Phe-NH2またはp-Y-Pheであり、ここでYはNO2、F、ClまたはBrである、前記薬学的組成物。
【請求項２】
対象がヒトである、請求項1記載の薬学的組成物。
【請求項３】
前記ペプチドがSEQ ID NO:13、1〜12、および14〜26から選択される、請求項1記載の薬学的組成物。
【請求項４】
ペプチドがSEQ ID NO:13である、請求項3記載の薬学的組成物。
【請求項５】
前記塩が、酢酸塩、アスパラギン酸(L)塩、クエン酸塩、フマル酸塩、馬尿酸塩、塩酸塩、乳酸塩、リンゴ酸(L)塩、粘液酸塩（mucate salt）、リン酸塩、硫酸塩、ヘミ硫酸塩、酒石酸(L)塩、グルコン酸(D)塩、マレイン酸塩およびコハク酸塩からなる群より選択される、請求項1記載の薬学的組成物。
【請求項６】
前記塩が、マレイン酸塩、塩酸塩、乳酸塩、アスパラギン酸塩、酢酸塩およびトリフルオロ酢酸塩からなる群より選択される、請求項1記載の薬学的組成物。
【請求項７】
炎症を低減させるために用いられる、請求項1記載の薬学的組成物。
【請求項８】
神経性炎症を低減させるために用いられる、請求項7記載の薬学的組成物。
【請求項９】
カルシトニン遺伝子関連ペプチド（CGRP）産生を低減させるために用いられる、請求項1記載の薬学的組成物。
【請求項１０】
変形性関節症、皮膚炎、炎症性腸疾患、術後の痛みおよび炎症、一般的な鈍的外傷、骨損傷、軟部組織感染、帯状疱疹、喘息、線維筋痛、湿疹、酒さ、片頭痛、乾癬、小腸炎、関節リウマチ、神経性腫脹、浮腫、挫傷、熱傷、日焼け、髄膜炎、敗血症性ショック、ならびにアレルギーからなる群より選択される炎症性状態を治療するために用いられる、請求項1記載の薬学的組成物。
【請求項１１】
乾癬、アレルギー性接触皮膚炎、湿疹、じんま疹、扁平苔癬、および疱疹状皮膚炎からなる群より選択される炎症性皮膚状態を治療するために用いられる、請求項1記載の薬学的組成物。
【請求項１２】
ステロイド化合物、ヒドロコルチゾン、非ステロイド性抗炎症化合物、アセチルサリチル酸（アスピリン）、イブプロフェン、アセトアミノフェン、インドメタシン、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される抗炎症剤と併用され、該抗炎症剤が、前記ペプチドまたはその塩の投与の前に、間にまたは後に投与される、請求項1記載の薬学的組成物。
【請求項１３】
サブスタンスP（SP）産生を低減させるために用いられる、請求項1記載の薬学的組成物。
【請求項１４】
有効量の単離ペプチドまたはその塩を含む、カルシトニン遺伝子関連ペプチドの過剰産生に関連する状態を有する対象を治療するための薬学的組成物であって、
該ペプチドが一般式：Tyr-X1-X2-X3を有し、
式中、X1がPro、D-LysまたはD-Ornであり；
X2が、Trp、PheまたはN-アルキル-Pheであり、ここでアルキルは1から約6個の炭素原子を含み；且つ
X3が、Phe、Phe-NH2、D-Phe、D-Phe-NH2またはp-Y-Pheであり、ここでYはNO2、F、ClまたはBrである、前記薬学的組成物。
【請求項１５】
対象がヒトである、請求項14記載の薬学的組成物。
【請求項１６】
前記ペプチドがSEQ ID NO:13、1〜12、および14〜26から選択される、請求項14記載の薬学的組成物。
【請求項１７】
ペプチドがSEQ ID NO:13から選択される、請求項16記載の薬学的組成物。
【請求項１８】
前記塩が、酢酸塩、アスパラギン酸(L)塩、クエン酸塩、フマル酸塩、馬尿酸塩、塩酸塩、乳酸塩、リンゴ酸(L)塩、粘液酸塩、リン酸塩、硫酸塩、ヘミ硫酸塩、酒石酸(L)塩、グルコン酸(D)塩、マレイン酸塩およびコハク酸塩からなる群より選択される、請求項14記載の薬学的組成物。
【請求項１９】
前記塩が、マレイン酸塩、塩酸塩、乳酸塩、アスパラギン酸塩、酢酸塩、およびトリフルオロ酢酸塩からなる群より選択される、請求項14記載の薬学的組成物。
【請求項２０】
変形性関節症、皮膚炎、炎症性腸疾患、術後の痛みおよび炎症、一般的な鈍的外傷、骨損傷、軟部組織感染、帯状疱疹、喘息、線維筋痛、湿疹、酒さ、片頭痛、乾癬、小腸炎、関節リウマチ、神経性腫脹、浮腫、挫傷、熱傷、日焼け、髄膜炎、敗血症性ショック、ならびにアレルギーからなる群より選択される炎症性状態を治療するために用いられる、請求項14記載の薬学的組成物。
【請求項２１】
乾癬、アレルギー性接触皮膚炎、湿疹、じんま疹、扁平苔癬、および疱疹状皮膚炎からなる群より選択される炎症性皮膚状態を治療するために用いられる、請求項14記載の薬学的組成物。
【請求項２２】
ステロイド化合物、ヒドロコルチゾン、非ステロイド性抗炎症化合物、アセチルサリチル酸（アスピリン）、イブプロフェン、アセトアミノフェン、インドメタシン、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される抗炎症剤と併用され、該抗炎症剤が、前記ペプチドまたはその塩の投与の前に、間に、または後に投与される、請求項14記載の薬学的組成物。
【請求項２３】
単離ペプチドまたはその塩、および抗炎症剤を含む組成物であって、該ペプチドが一般式：Tyr-X1-X2-X3を有し、
式中、X1がPro、D-LysまたはD-Ornであり；
X2が、Trp、PheまたはN-アルキル-Pheであり、ここでアルキルは1から約6個の炭素原子を含み；且つ
X3が、Phe、Phe-NH2、D-Phe、D-Phe-NH2またはp-Y-Pheであり、ここでYはNO2、F、ClまたはBrである、前記組成物。
【請求項２４】
抗炎症剤が、ステロイド化合物、ヒドロコルチゾン、非ステロイド性抗炎症化合物、アセチルサリチル酸（アスピリン）、イブプロフェン、アセトアミノフェン、およびインドメタシンからなる群より選択される、請求項23記載の組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
簡単な概要
本発明は、炎症、特に神経性炎症を治療するための、新規かつ有利な治療方法を提供する。この方法は、そのような治療を必要とする対象に有効量の単離されたペプチドまたはその塩を投与する工程を含み、該ペプチドは一般式：Tyr-X1-X2-X3を有し、
式中、X1は、Pro、D-LysまたはD-Ornであり；
X2はTrp、PheまたはN-アルキル-Pheであり、ここでアルキルは1から約6個の炭素原子を有し；かつ
X3はPhe、Phe-NH2、D-Phe、D-Phe-NH2またはp-Y-Pheであり、ここでYはNO2、F、ClまたはBrである。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
【図１】ラットでの実験プロトコルを記載する概略図である。
【図２】ラットでの実験プロトコルを記載する概略図である。
【図３】単離されたラット気管からの電気刺激によるCGRP放出に対するCYT-1010の効果を示す。各カラムは、n=5の実験（5×2気管）の刺激前、刺激時および刺激後8分の画分のインキュベーション培地中で測定されたCGRPの平均±標準誤差濃度を表す。*P<0.05（vs. 媒体で処置した対照実験のそれぞれの画分）、および#P<0.05、##P<0.01、###P<0.001（vs. それぞれの実験の刺激前の画分）。統計解析を一元配置分散分析、続いてDunnett post-hoc検定により行った。
【図４】単離されたラット気管からの電気刺激によるSP放出に対するCYT-1010の効果を示す。各カラムは、n=5の実験（5×2気管）の刺激前、刺激時および刺激後8分の画分のインキュベーション培地中で測定されたSPの平均±標準誤差濃度を表す。*P<0.05（vs. 媒体で処置した対照実験のそれぞれの画分）、および#P<0.05、##P<0.01、###P<0.001（vs. それぞれの実験の刺激前の画分）。統計解析を一元配置分散分析、続いてDunnett post-hoc検定により行った。
【図５】単離されたラット気管からの電気刺激によるCGRP放出に対するCYT-1010（10〜2000 nM）の阻害効果を示す濃度反応曲線を示す。基本の刺激前画分におけるペプチドの濃度をそれぞれ刺激時の画分および刺激後の画分の両方から引き、次いで、これらの値を足して絶対放出を計算した。データ点は、対照、媒体処置群（n=5）と比較したCYT-1010の阻害効果（％）を表す。
【図６】単離されたラット気管からの電気刺激によるSP放出に対するCYT-1010（10〜2000 nM）の阻害効果を示す濃度反応曲線を示す。基本の刺激前画分におけるペプチドの濃度を刺激時の画分および刺激後のそれぞれの画分の両方から引き、次いで、これらの値を足して絶対放出を計算した。データ点は、対照、媒体処置群、n=5と比較したCYT-1010の阻害効果（％）を表す。
【図７】5％カラシ油誘導性のマウスの神経性耳腫脹に対するCYT-1010の効果を示す。1％カラシ油誘導性のマウスの神経性耳腫脹に対するエンドモルフィン-1（EM-1；腹腔内）の効果。対照群では、同じ量の生理食塩水（溶媒）を腹腔内適用した。各データ点は、溶媒で処置した対照群と比較した腫脹（％）で表されるn=8〜9実験の平均±標準誤差を表す。*P<0.05；**P<0.01 vs. 媒体で処置した対照（一元配置分散分析、続いてDunnett post検定）。
【図８】急性的に除神経したラットの後足皮膚における1％カラシ油誘導性の血漿タンパク質血管外遊出に対するCYT-1010の効果を示す。対照群では、媒体（20％HPCD）を同じ量で静脈内適用した。各カラムは、n=8ラットの平均値±標準誤差を示す；***<0.001 vs. 媒体処置対照群（一元配置分散分析、続いてDunnett post検定）；##P<0.01 vs. 10 μg/kg用量、+P<0.05 vs. 1000 μg/kg用量（一元配置分散分析、続いてBonferroniのt検定）。
【図９】5％カラシ油誘導性のマウスの神経性耳腫脹に対する、非ろ過静脈内CYT-1010溶液の効果を示す。対照群では、20％ HPCD媒体をろ過せずに同じ量で静脈内適用した。各データ点は、対照群と比較した腫脹（％）で表されるn=8〜9マウスの平均値±標準誤差を表す。*P<0.05；**P<0.01 vs. 媒体で処置した対照（一元配置分散分析、続いてDunnettのpost検定）。
【図１０】5％カラシ油誘導性のマウスの神経性耳腫脹に対するろ過した静脈内CYT-1010溶液の効果を示す。対照群では、20％ HPCD媒体をろ過後に同じ量で静脈内適用した。各データ点は、対照群と比較した腫脹（％）で表されるn=8マウスの平均値±標準誤差を表す。*P<0.05；**P<0.01 vs. 媒体で処置した対照（一元配置分散分析、続いてDunnettのpost検定）。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
ペプチド
好ましい態様において、本発明は、一般式：Tyr-X1-X2-X3を有し、式中、X1がPro、D-LysまたはD-Ornであり；X2がTrp、PheまたはN-アルキル-Pheであり、ここでアルキルは1から約6個の炭素原子を有し；かつX3がPhe、Phe-NH2、D-Phe、D-Phe-NH2またはP-Y-Pheであり、ここでYはNO2、F、ClまたはBrである、ペプチドの使用に関係する。本発明の好ましいペプチドのいくつかは、
2013530147.tif 000001
である。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４６】
代謝物は典型的には、本発明の化合物の放射標識された（例えば、14Cまたは3H）同位元素を調製し、それをラット、マウス、モルモット、サルなどの動物またはヒトに検出可能な用量（例えば、約0.5 mg/kgを上回る）で非経口的に投与し、十分な時間（典型的には約30秒から約30時間）代謝物を生じさせ、尿、血液または他の生体試料からその変換生成物を単離することにより同定される。これらの生成物は、標識されているため、容易に単離される（その他は、代謝物中に残存するエピトープに結合する能力を有する抗体の使用により単離される）。代謝物の構造は、従来の様式で、例えばMS、LC/MSまたはNMR解析により決定できる。概して、代謝物の解析は、薬剤代謝物研究の技術分野の当業者に周知の技術によって行われる。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７５】
材料および方法
CYT-1010（合成環状エンドモルフィン-1アナログ；FP014; Lot #: 080811-R2; Bottle H22; MW:684）は、AmbioPharm, Inc. (North Augusta, SC 29812)から購入した。さらなる材料は以下を含む：Cyclolab Ltd., Budapest, Hungary から購入した2-ヒドロキシプロピル-βシクロデキストリン（HPCD; CY2005.5; CYL-3122）；Sandoz, Kundl, Austriaから購入したNa-チオペンタール（Thiopental- Sandoz）；Spektrum 3D, Debrecen, Hungaryから購入したウレタン；Richter-Gedeon Ltd., Budapest, Hungaryから購入したケタミン（Calypsol）；Phylaxia-Sanofi, Veterinary Biology Co. Ltd., Budapest, Hungaryから購入したキシラジン（Xylavet）；Bachem, Bubendorf, Switzerlandから購入したラットα-CGRP、Tyr-α-CGRP(23-37)；Amersham, International, Amersham, UKから購入した125I-標識SP；laboratory of the Department of Pharmacology and Pharmacotherapy, University of Pecs, Hungary で調製した125I-標識Tyr-α-CGRP(23-37)；Sigma, St. Louis, MO, USAから購入したアリルイソチオシアネート（カラシ油）、エバンスブルー色素；Szkarabeusz Ltd., Pecs, Hungaryから購入したパラフィンオイル、ホルムアミド、ジメチルスルホキシド（DMSO）。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８１】
2番目の8分間の開始時に、電気的フィールド刺激（40 V、0.1 ms、120秒間10 Hz；1200パルス）を行い、神経伝達物質放出を誘発した。0.1 msパルス幅での刺激は、神経構造の膜にのみ存在する、Na+チャネルを非常に早く選択的に活性化し（Birmingham and Wilson, 1963; Coburn and Tomita 1973; Szolcsanyi and Bartho, 1982）、そのため、平滑筋細胞などの気管の他の興奮性細胞に影響を与えることなく、神経終末を興奮させる。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０２】
非線形最小二乗曲線あてはめ法によるS字状濃度反応曲線として実験データを解析すると、最良適合値から計算されるEC50は、CGPRでは40.6 nMおよびSPでは34.0 nMであることがわかった（図5、6）。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１１】
実施例1〜3で実証したとおり、電気的フィールド刺激（EFS）は、CGRP放出をその基本的流出と比較してその3倍を上回る上昇を誘発した。絶対ペプチド放出の合計は、刺激中および刺激後に器官槽内へ500 nMおよび1 μM濃度でCYT-1010を添加することに応答して、70％および66％それぞれ減少した。さらに、電気的に誘導したSP放出はそれぞれ、刺激時画分で54％、および刺激後画分で45％であった。放出合計は、500 nMおよび1 μM CYT-1010の存在下で64％および72％有意に低下した。非線形最小二乗曲線あてはめ法によるS字状濃度反応曲線としてデータを解析すると、最良適合値から計算されるEC50は、CGPRでは40.6 nMおよびSPでは34.0 nMであることがわかった。濃度反応関係は、CGRPでは10〜500 nM、およびSPでは100〜1000 nMの濃度範囲で観察された。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
本発明の方法は、例えば、痛みを伴う炎症状態、変形性関節炎、炎症性の皮膚状態、喘息、線維筋痛、湿疹、酒さ、片頭痛、乾癬、小腸炎、関節リウマチ、神経性腫脹（neurogenic swelling）、浮腫、挫傷、熱傷、日焼け、髄膜炎、敗血症性ショック、アレルギー、および皮膚炎から選択される症状を治療するのに有用である。
[本発明1001]
治療を必要とする対象に有効量の単離ペプチドまたはその塩を投与する段階を含む、対象を治療して炎症を低減させるおよび／または免疫応答を調節するための方法であって、
該ペプチドが一般式：Tyr-X1-X2-X3を有し、
式中、X1がPro、D-LysまたはD-Ornであり；
X2が、Trp、PheまたはN-アルキル-Pheであり、ここでアルキルは1個から約6個の炭素原子を含み；且つ
X3が、Phe、Phe-NH2、D-Phe、D-Phe-NH2またはp-Y-Pheであり、ここでYはNO2、F、ClまたはBrである、前記方法。
[本発明1002]
対象がヒトである、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記ペプチドがSEQ ID NO:1〜26から選択される、本発明1001の方法。
[本発明1004]
ペプチドがSEQ ID NO:13である、本発明1003の方法。
[本発明1005]
前記塩が、酢酸塩、アスパラギン酸(L)塩、クエン酸塩、フマル酸塩、馬尿酸塩、塩酸塩、乳酸塩、リンゴ酸(L)塩、粘液酸塩（mucate salt）、リン酸塩、硫酸塩、ヘミ硫酸塩、酒石酸(L)塩、グルコン酸(D)塩、マレイン酸塩およびコハク酸塩からなる群より選択される、本発明1001の方法。
[本発明1006]
前記塩が、マレイン酸塩、塩酸塩、乳酸塩、アスパラギン酸塩、酢酸塩およびトリフルオロ酢酸塩からなる群より選択される、本発明1001の方法。
[本発明1007]
炎症を低減させるために用いられる、本発明1001の方法。
[本発明1008]
神経性炎症を低減させるために用いられる、本発明1007の方法。
[本発明1009]
カルシトニン遺伝子関連ペプチド（CGRP）産生を低減させるために用いられる、本発明1001の方法。
[本発明1010]
変形性関節症、皮膚炎、炎症性腸疾患、術後の痛みおよび炎症、一般的な鈍的外傷、骨損傷、軟部組織感染、帯状疱疹、喘息、線維筋痛、湿疹、酒さ、片頭痛、乾癬、小腸炎、関節リウマチ、神経性腫脹、浮腫、挫傷、熱傷、日焼け、髄膜炎、敗血症性ショック、ならびにアレルギーからなる群より選択される炎症性状態を治療するために用いられる、本発明1001の方法。
[本発明1011]
乾癬、アレルギー性接触皮膚炎、湿疹、じんま疹、扁平苔癬、および疱疹状皮膚炎からなる群より選択される炎症性皮膚状態を治療するために用いられる、本発明1001の方法。
[本発明1012]
ステロイド化合物、ヒドロコルチゾン、非ステロイド性抗炎症化合物、アセチルサリチル酸（アスピリン）、イブプロフェン、アセトアミノフェン、インドメタシン、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される抗炎症剤を投与する段階を含む方法であって、該抗炎症剤が、前記ペプチドまたはその塩の投与の前に、間にまたは後に投与される、本発明1001の方法。
[本発明1013]
サブスタンスP（SP）産生を低減させるために用いられる、本発明1001の方法。
[本発明1014]
治療を必要とする対象に有効量の単離ペプチドまたはその塩を投与する段階を含む、カルシトニン遺伝子関連ペプチドの過剰産生に関連する状態を有する対象を治療するための方法であって、
該ペプチドが一般式：Tyr-X1-X2-X3を有し、
式中、X1がPro、D-LysまたはD-Ornであり；
X2が、Trp、PheまたはN-アルキル-Pheであり、ここでアルキルは1から約6個の炭素原子を含み；且つ
X3が、Phe、Phe-NH2、D-Phe、D-Phe-NH2またはp-Y-Pheであり、ここでYはNO2、F、ClまたはBrである、前記方法。
[本発明1015]
対象がヒトである、本発明1014の方法。
[本発明1016]
前記ペプチドがSEQ ID NO:1〜26から選択される、本発明1014の方法。
[本発明1017]
ペプチドがSEQ ID NO:13から選択される、本発明1016の方法。
[本発明1018]
前記塩が、酢酸塩、アスパラギン酸(L)塩、クエン酸塩、フマル酸塩、馬尿酸塩、塩酸塩、乳酸塩、リンゴ酸(L)塩、粘液酸塩、リン酸塩、硫酸塩、ヘミ硫酸塩、酒石酸(L)塩、グルコン酸(D)塩、マレイン酸塩およびコハク酸塩からなる群より選択される、本発明1014の方法。
[本発明1019]
前記塩が、マレイン酸塩、塩酸塩、乳酸塩、アスパラギン酸塩、酢酸塩、およびトリフルオロ酢酸塩からなる群より選択される、本発明1014の方法。
[本発明1020]
変形性関節症、皮膚炎、炎症性腸疾患、術後の痛みおよび炎症、一般的な鈍的外傷、骨損傷、軟部組織感染、帯状疱疹、喘息、線維筋痛、湿疹、酒さ、片頭痛、乾癬、小腸炎、関節リウマチ、神経性腫脹、浮腫、挫傷、熱傷、日焼け、髄膜炎、敗血症性ショック、ならびにアレルギーからなる群より選択される炎症性状態を治療するために用いられる、本発明1014の方法。
[本発明1021]
乾癬、アレルギー性接触皮膚炎、湿疹、じんま疹、扁平苔癬、および疱疹状皮膚炎からなる群より選択される炎症性皮膚状態を治療するために用いられる、本発明1014の方法。
[本発明1022]
ステロイド化合物、ヒドロコルチゾン、非ステロイド性抗炎症化合物、アセチルサリチル酸（アスピリン）、イブプロフェン、アセトアミノフェン、インドメタシン、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される抗炎症剤を投与する段階を含む方法であって、該抗炎症剤が、前記ペプチドまたはその塩の投与の前に、間に、または後に投与される、本発明1014の方法。
[本発明1023]
単離ペプチドまたはその塩、および抗炎症剤を含む組成物であって、該ペプチドが一般式：Tyr-X1-X2-X3を有し、
式中、X1がPro、D-LysまたはD-Ornであり；
X2が、Trp、PheまたはN-アルキル-Pheであり、ここでアルキルは1から約6個の炭素原子を含み；且つ
X3が、Phe、Phe-NH2、D-Phe、D-Phe-NH2またはp-Y-Pheであり、ここでYはNO2、F、ClまたはBrである、前記組成物。
[本発明1024]
抗炎症剤が、ステロイド化合物、ヒドロコルチゾン、非ステロイド性抗炎症化合物、アセチルサリチル酸（アスピリン）、イブプロフェン、アセトアミノフェン、およびインドメタシンからなる群より選択される、本発明1023の組成物。