【手続補正書】
【提出日】平成24年10月18日(2012.10.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
様々な態様において、本発明は、カラシナ植物、種子、細胞、核酸配列のアレル変異、及び油を提供する。本発明の植物の種子における食用油は、他のカラシナ植物の種子において見出されるものより有意に高いオレイン酸含有量及び低いリノレン酸含有量を有し得る。多数の高オレイン酸／低リノレン酸（「ＨＯＬＬ」）カラシナ系統を本発明において開示する。１つの実施形態において、カラシナ系統は、国際公開ＵＳ２００６／０２４８６１１Ａ１号（その内容が本明細書中で参考として援用される）に開示され、図１及び３、並びに配列番号１〜４に例示されているＦＡＤ２及びＦＡＤ３遺伝子を含む。結果として生ずる突然変異体アレルは、デルタ−１２脂肪酸デサチュラーゼタンパク質をコードし、これらは図２並びに配列番号５〜７に例示されている。他の実施形態において、カラシナ系統は、ｆａｄ−ａ及びｆａｄ３−ａ遺伝子座での突然変異を含むことがあり、結果として生ずる突然変異体アレルは、予測されるＢｊＦＡＤ２−Ａ及びＢｊＦＡＤ３−Ａタンパク質の配列において１つ又はそれ以上の突然変異をコードすることがある。本発明での使用に適するｆａｄ２−ａ及びｆａｄ３−ａ突然変異遺伝子及びタンパク質の代表例としては、国際公開ＷＯ２００６／０７９５６７Ａ２号（例えば、図１及び２）、例えば、配列番号８及び９；国際公開ＷＯ２００７／１０７５９０Ａ２号、例えば、配列番号：１０〜２１）；米国特許第６，９６７，２４３号Ｂ２（例えば、図２及び３）、例えば、配列番号２２〜２７）；及び欧州公報第１８６２５５１号Ａ１（例えば、図１から１０）、例えば、配列番号２８〜３９に開示されているものも挙げられるが、それらに限定されない。上記各外国特許公開の内容が本明細書中で参考として援用される。別の実施形態において、ＢＮｆａｄ２−ａ及びＢｎｆａｄ２３−ａ変換系統は、ＢｎＦａｄ２Ａ、ＢｎＦａｄ３Ａ含有カラシナ植物における脂肪酸プロフィールの有意な変化を検出できるので、アブラナ属植物におけるＢＪＦＡＤ２Ｂ及びＢＪＦＡＤ３Ｂの自然変異を探すために使用し得る。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１−１】ＤＭＳ１００及びＱｕａｎｔｕｍからクローニングしたｆａｄ２遺伝子の部分的ゲノムヌクレオチド配列を図示するものである。上は、ＤＭＳ１００配列（配列番号１）であり、下は、Ｑｕａｎｔａｕｍ配列（配列番号２）である。矢印は、終止コドン（ＴＡＧ）（陰影付き）を生じさせた、ＣからＴへの単一ヌクレオチド突然変異を示す。ＰＣＲに基づく突然変異体アレル特異的マーカーについてのフォワード及びリバースプライマを太字にし、下線を引く。
【図１−２】ＤＭＳ１００及びＱｕａｎｔｕｍからクローニングしたｆａｄ２遺伝子の部分的ゲノムヌクレオチド配列を図示するものである。上は、ＤＭＳ１００配列（配列番号１）であり、下は、Ｑｕａｎｔａｕｍ配列（配列番号２）である。矢印は、終止コドン（ＴＡＧ）（陰影付き）を生じさせた、ＣからＴへの単一ヌクレオチド突然変異を示す。ＰＣＲに基づく突然変異体アレル特異的マーカーについてのフォワード及びリバースプライマを太字にし、下線を引く。
【図２】 ＤＭＳ１００（配列番号５）、Ｑｕａｎｔｕｍ（配列番号６）からクローニングしたゲノムヌクレオチド配列からの、及び公表されているセイヨウアブラナＦＡＤ２遺伝子（ＢＮＦＡＤ２）（配列番号７）からの、縮重したｆａｄ２遺伝子のアミノ酸配列を提供している。矢印は、ＤＭＳ１００における単一ヌクレオチド突然変異（ＣからＴ）の結果として生ずる終止コドンの位置を示す。
【図３】 ＤＭＳ１００及びＱｕａｎｔｕｍからクローニングしたｆａｄ３ｃ遺伝子のゲノムヌクレオチド配列を示す。上は、ＤＭＳ１００配列（配列番号３）であり、下は、Ｑｕａｎｔｕｍ配列（配列番号４）である。エキソンを枠で囲み、イントロンは枠で囲まない。これらは、アブラナ及びシロイヌナズナ属におけるｆａｄ３遺伝子のエキソン４、５、６及び７、並びにイントロン４、５及び６に対応する。矢印は、ＧからＡへの単一ヌクレオチド突然変異を示す。ＰＣＲに基づく突然変異体アレル特異的マーカーについてのフォワード及びリバースプライマを太字にし、下線を引く。
【図４】本発明の原理による抗オレイン酸−低リノレン酸選択物とカラシナ親（Ｚｅｍ１、Ｚｅｍ２及びＺＥスコロスペルカ（ZE Skorospelka））の間の１回又はそれ以上の戻し交配（ＢＣ３およびＢＣ４）を図示する図である。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６０】
１つの実施形態において、カラシナ系統は、国際公開ＵＳ２００６／０２４８６１１Ａ１号（その内容が本明細書中で参考として援用される）に開示され、その図１及び３に例示されているｆａｄ２及びｆａｄ３遺伝子を含有する。ｆａｄ２及びｆａｄ３遺伝子は、配列番号１〜４によって本明細書中で例示されている。結果として生ずるアレルは、デルタ−１２脂肪酸デサチュラーゼタンパク質をコードし、これらは、国際公開ＵＳ２００６／０２４８６１１Ａ１の図２に例示され、さらに本明細書中で配列番号５〜７に例示されている。他の実施形態において、カラシナ系統は、ｆａｄ２−ａ及びｆａｄ３−ａ遺伝子座での突然変異を含むことがあり、結果として生ずる突然変異体アレルは、予測されるＢＪＦＡＤ２−ａ及びＢＪＦＡＤ３−ａタンパク質の配列に１つ又はそれ以上の突然変異をコードすることがある。本発明での使用に適するｆａｄ２−ａ及びｆａｄ３−ａ突然変異遺伝子及びタンパク質の代表例としては、国際公開ＷＯ２００６／０７９５６７Ａ２号（例えば、図１及び２）、例えば、配列番号８及び９；国際公開ＷＯ２００７／１０７５９０Ａ２号、例えば、配列番号：１０〜２１；米国特許第６，９６７，２４３号Ｂ２（例えば、図２及び３）、例えば、配列番号２２〜２７；及び欧州公報第１８６２５５１号Ａ１（例えば、図１から１０）、例えば、配列番号２８〜３９に開示されているものも挙げられるが、それらに限定されない。上記の特許公開の各々の内容が本明細書中で参考として援用される。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７８】
本発明の様々な実施形態を本明細書に開示するが、当業者の世間一般の知識に従って本発明の範囲内で多くの改変及び変更を加えることができる。そのような変 更は、公知の等価物で本発明の任意の態様を置換して実質的に同じ方法で同じ結果を達成することを含む。数値範囲は、その範囲を定義する数値を含む。本発明 は、実質的に上で説明したような並びに実施例及び図に関しての、すべての実施形態及び変形形態を含む。
［配列の説明］
添付の配列表に示した核酸配列は、３７  Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２に規定されるヌクレオチド塩基のための標準文字略号を用いて示されている。各核酸配列の１つの鎖のみが示されているが、相補鎖が表示される鎖に対する参照により含まれることが理解される。添付の配列表において、
配列番号１は、アブラナ属種であるＤＭＳ１００（国際公開ＵＳ２００６／０２４８６１１Ａ１において配列番号７として参照されている）からクローニングされたＦＡＤ２遺伝子を示す。
配列番号２は、アブラナ属種であるＱｕａｎｔｕｍ（国際公開ＵＳ２００６／０２４８６１１Ａ１において配列番号９として参照されている）からクローニングされたＦＡＤ２遺伝子を示す。
配列番号３は、アブラナ属種であるＤＭＳ１００（国際公開ＵＳ２００６／０２４８６１１Ａ１において配列番号１２として参照されている）からクローニングされたＦＡＤ３遺伝子を示す。
配列番号４は、アブラナ属種であるＱｕａｎｔｕｍ（国際公開ＵＳ２００６／０２４８６１１Ａ１において配列番号１３として参照されている）からクローニングされたＦＡＤ３遺伝子を示す。
配列番号５は、アブラナ属種であるＤＭＳ１００（国際公開ＵＳ２００６／０２４８６１１Ａ１において配列番号８として参照されている）からクローニングされたＦＡＤ２遺伝子によってコードされるデルタ−１２脂肪酸デサチュラーゼタンパク質のアミノ酸配列を示す。
配列番号６は、アブラナ属種であるＱｕａｎｔｕｍ（国際公開ＵＳ２００６／０２４８６１１Ａ１において配列番号１０として参照されている）からクローニングされたＦＡＤ２遺伝子によってコードされるデルタ−１２脂肪酸デサチュラーゼタンパク質のアミノ酸配列を示す。
配列番号７は、アブラナ属種（国際公開ＵＳ２００６／０２４８６１１Ａ１において配列番号１１として参照されている）からクローニングされた公開されたＦＡＤ２遺伝子（Ｂｎｆａｄ２）によってコードされるデルタ−１２脂肪酸デサチュラーゼタンパク質のアミノ酸配列を示す。
配列番号８は、国際公開ＷＯ２００６／０７９５６７Ａ２に開示される変異体ｆａｄ２−ａ遺伝子を示す。
配列番号９は、配列番号８によってコードされる変異体ｆａｄ２−ａ遺伝子を示す。
配列番号１０は、国際公開ＷＯ２００７／１０７５９０Ａ２において配列番号１として参照されているアブラナ属種由来のｆａｄ２−ａ遺伝子を示す。
配列番号１１は、配列番号１０によってコードされるｆａｄ２−ａタンパク質のアミノ酸配列を示す。
配列番号１２は、国際公開ＷＯ２００７／１０７５９０Ａ２において配列番号３として参照されているアブラナ属種由来のｆａｄ２−ａ遺伝子を示す。
配列番号１３は、配列番号１２によってコードされるｆａｄ２−ａタンパク質のアミノ酸配列を示す。
配列番号１４は、国際公開ＷＯ２００７／１０７５９０Ａ２において配列番号５として参照されているアブラナ属種由来のｆａｄ２−ａ遺伝子を示す。
配列番号１５は、配列番号１４によってコードされるｆａｄ２−ａタンパク質のアミノ酸配列を示す。
配列番号１６は、国際公開ＷＯ２００７／１０７５９０Ａ２において配列番号７として参照されているアブラナ属種由来のｆａｄ２−ａ遺伝子を示す。
配列番号１７は、配列番号１６によってコードされるｆａｄ２−ａタンパク質のアミノ酸配列を示す。
配列番号１８は、国際公開ＷＯ２００７／１０７５９０Ａ２において配列番号９として参照されているアブラナ属種由来のｆａｄ２−ａ遺伝子を示す。
配列番号１９は、国際公開ＷＯ２００７／１０７５９０Ａ２において配列番号１０として参照されているアブラナ属種由来のｆａｄ２−ａ遺伝子を示す。
配列番号２０は、国際公開ＷＯ２００７／１０７５９０Ａ２において配列番号１１として参照されているアブラナ属種由来のｆａｄ２−ａ遺伝子を示す。
配列番号２１は、国際公開ＷＯ２００７／１０７５９０Ａ２において配列番号１２として参照されているアブラナ属種由来のｆａｄ２−ａ遺伝子を示す。
配列番号２２は、米国特許６，９６７，２４３において配列番号１１として参照されているアブラナ属種由来の変異体「Ｆａｄ２−Ｄ」遺伝子を示す。
配列番号２３は、米国特許６，９６７，２４３において配列番号１２として参照されている配列番号２２によってコードされるアミノ酸配列を示す。
配列番号２４は、米国特許６，９６７，２４３において配列番号１５として参照されているアブラナ属種由来の変異体「Ｆａｄ２−Ｆ」遺伝子を示す。
配列番号２５は、米国特許６，９６７，２４３において配列番号１６として参照されている配列番号２４によってコードされるアミノ酸配列を示す。
配列番号２６は、米国特許６，９６７，２４３において配列番号１７として参照されているアブラナ属種由来の変異体「Ｆａｄ２−Ｆ」遺伝子を示す。
配列番号２７は、米国特許６，９６７，２４３において配列番号１８として参照されている配列番号２６によってコードされるアミノ酸配列を示す。
配列番号２８は、欧州特許公開第１８６２５５１Ａ１において配列番号２２として参照されている変異体アブラナ属種ｆａｄ２遺伝子を示す。
配列番号２９は、欧州特許公開第１８６２５５１Ａ１において配列番号２３として参照されている変異体アブラナ属種ｆａｄ２遺伝子産物を示す。
配列番号３０は、欧州特許公開第１８６２５５１Ａ１において配列番号２４として参照されている変異体アブラナ属種ｆａｄ２−ａ遺伝子を示す。
配列番号３１は、欧州特許公開第１８６２５５１Ａ１においてそのアミノ酸配列が配列番号２５として参照されている配列番号３０の変異体アブラナ属種ｆａｄ２−ａ遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を示す。
配列番号３２は、欧州特許公開第１８６２５５１Ａ１において配列番号２６として参照されている変異体アブラナ属種ｆａｄ２−ａ遺伝子を示す。
配列番号３３は、欧州特許公開第１８６２５５１Ａ１においてそのアミノ酸配列が配列番号２７として参照されている配列番号３２の変異体アブラナ属種ｆａｄ２−ａ遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を示す。
配列番号３４は、欧州特許公開第１８６２５５１Ａ１において配列番号２８として参照されている変異体アブラナ属種ｆａｄ２−ａ遺伝子を示す。
配列番号３５は、欧州特許公開第１８６２５５１Ａ１においてそのアミノ酸配列が配列番号２９として参照されている配列番号３４の変異体アブラナ属種ｆａｄ２−ａ遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を示す。
配列番号３６は、欧州特許公開第１８６２５５１Ａ１において配列番号３０として参照されている変異体アブラナ属種ｆａｄ２−ａ遺伝子を示す。
配列番号３７は、欧州特許公開第１８６２５５１Ａ１においてそのアミノ酸配列が配列番号３１として参照されている配列番号３６の変異体アブラナ属種ｆａｄ２−ａ遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を示す。
配列番号３８は、欧州特許公開第１８６２５５１Ａ１において配列番号３２として参照されている変異体アブラナ属種ｆａｄ２−ａ遺伝子を示す。
配列番号３９は、欧州特許公開第１８６２５５１Ａ１においてそのアミノ酸配列が配列番号３３として参照されている配列番号３８の変異体アブラナ属種ｆａｄ２−ａ遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を示す。
【手続補正５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１−１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１−１】
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【手続補正６】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１−２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１−２】
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