【手続補正書】
【提出日】平成23年5月9日(2011.5.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
調節可能な遺伝子発現構築物であって、
コード領域に作動可能に連結されたリボスイッチを含むＲＮＡをコードする核酸分子を含み、該リボスイッチがＲＮＡのスプライシングを調節し、該リボスイッチおよび該コード領域が異種であり、該スプライシングの調節が該ＲＮＡのプロセシングに影響を及ぼす、調節可能な遺伝子発現構築物。
【請求項２】
前記リボスイッチがオルタナティブスプライシングを調節し、
該リボスイッチがアプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインを含み、該アプタマードメインと該発現プラットフォームドメインとが好ましくは異種であり、好ましくは該リボスイッチがトリガー分子によって活性化され、好ましくは該トリガー分子がＴＰＰである、請求項１に記載の構築物。
【請求項３】
前記ＲＮＡがイントロンをさらに含み、前記発現プラットフォームドメインがスプライスジャンクションを含み、
好ましくは該スプライスジャンクションが該イントロン中に存在するかまたは該イントロンの末端に存在し、
好ましくは該スプライスジャンクションがオルタナティブスプライスジャンクションである、請求項１または２に記載の構築物。
【請求項４】
前記スプライスジャンクションが、前記リボスイッチが活性化される場合に活性であるかまたは
前記スプライスジャンクションが、前記リボスイッチが活性化されない場合に活性である、請求項３に記載の構築物。
【請求項５】
前記リボスイッチがＴＰＰ応答性リボスイッチである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の構築物。
【請求項６】
前記リボスイッチが前記イントロンのスプライシングを活性化するか、
前記リボスイッチがオルタナティブスプライシングを活性化するか、
前記リボスイッチが前記イントロンのスプライシングを抑制するか、または
前記リボスイッチがオルタナティブスプライシングを抑制する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の構築物。
【請求項７】
前記ＲＮＡが分岐構造を有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の構築物。
【請求項８】
前記ＲＮＡがｐｒｅ−ｍＲＮＡである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の構築物。
【請求項９】
前記リボスイッチが前記ＲＮＡの３’非翻訳領域中に存在する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の構築物。
【請求項１０】
前記イントロンが前記ＲＮＡの３’非翻訳領域中に存在し、
好ましくは、ＲＮＡプロセシング部位が該イントロン中に存在し、
好ましくは該イントロンのスプライシングによって前記ＲＮＡから該ＲＮＡプロセシング部位が除去され、それにより、該ＲＮＡのプロセシングに影響を及ぼし、
好ましくは該ＲＮＡのプロセシングに及ぼす該影響が、該ＲＮＡプロセシング部位によって媒介される該ＲＮＡのプロセシングの排除を含み、
好ましくは該ＲＮＡのプロセシングに及ぼす該影響が、転写終結の変化を含み、
好ましくは該ＲＮＡのプロセシングに及ぼす該影響が、該ＲＮＡの分解の増加を含み、
好ましくは該ＲＮＡのプロセシングに及ぼす該影響が、該ＲＮＡのターンオーバーの増加を含む、請求項３〜９のいずれか１項に記載の構築物。
【請求項１１】
前記リボスイッチが前記イントロンの３’スプライスジャンクションと重複し、
好ましくは該イントロンのスプライシングにより、該リボスイッチが活性化される能力が低減または排除される、請求項３〜１０のいずれか１項に記載の構築物。
【請求項１２】
スプライシング調節を有する前記アプタマードメイン領域がＰ４ステムおよびＰ５ステム中に存在し、
好ましくはスプライシング調節を有する前記アプタマードメイン領域がループ５中にも存在し、
好ましくはスプライシング調節を有する前記アプタマードメイン領域がステムＰ２中にも存在する、請求項２〜１１のいずれか１項に記載の構築物。
【請求項１３】
スプライス部位が前記アプタマードメインの５’末端に対して−１３０と−１６０との間の位置に存在し、
好ましくは該ＲＮＡが第２のイントロンをさらに含み、該第２のイントロンの３’スプライス部位が前記アプタマードメインの５’末端に対して−２２０と−２７０との間の位置に存在し、
好ましくは該スプライスジャンクションが５’スプライスジャンクションである、請求項２〜１２のいずれか１項に記載の構築物。
【請求項１４】
非ヒトにおいてＲＮＡのプロセシングに影響を及ぼす方法であって、該ＲＮＡにリボスイッチを含む構築物を導入する工程であって、該リボスイッチがＲＮＡのスプライシングを調節することができ、該ＲＮＡがイントロンを含み、該スプライシングの調節が該ＲＮＡのプロセシングに影響を及ぼす、導入工程を含む方法。
【請求項１５】
前記リボスイッチがアプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインを含み、該アプタマードメインおよび該発現プラットフォームドメインが異種であり、該リボスイッチがトリガー分子によって活性化され、該トリガー分子がＴＰＰである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記発現プラットフォームドメインがスプライスジャンクションを含み、
好ましくは該スプライスジャンクションが該イントロン中に存在するかまたは該イントロンの末端に存在し、
好ましくは該スプライスジャンクションがオルタナティブスプライスジャンクションである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記スプライスジャンクションが、前記リボスイッチが活性化される場合に活性であるか、または
前記スプライスジャンクションが、前記リボスイッチが活性化されない場合に活性である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記リボスイッチがＴＰＰ応答性リボスイッチである、請求項１４〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記リボスイッチがスプライシングを活性化するか、
前記リボスイッチがオルタナティブスプライシングを活性化するか、
前記リボスイッチがスプライシングを抑制するか、または
前記リボスイッチがオルタナティブスプライシングを抑制する、請求項１４〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記スプライシングが天然に起こらない、請求項１４〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
スプライシング調節を有する前記アプタマードメイン領域がループ５中に存在する、請求項１５〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記構築物が前記イントロンをさらに含む、請求項１４〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記リボスイッチが前記ＲＮＡの３’非翻訳領域中に存在する、請求項１４〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記イントロンが前記ＲＮＡの３’非翻訳領域中に存在し、
好ましくはＲＮＡプロセシング部位が該イントロン中に存在し、
好ましくは該イントロンのスプライシングによって該ＲＮＡから該ＲＮＡプロセシング部位が除去され、それにより、該ＲＮＡのプロセシングに影響を及ぼし、
好ましくは該ＲＮＡのプロセシングに及ぼす該影響が、該ＲＮＡプロセシング部位によって媒介される該ＲＮＡのプロセシングの排除を含み、
好ましくは該ＲＮＡのプロセシングに及ぼす該影響が、転写終結の変化を含み、
好ましくは該ＲＮＡのプロセシングに及ぼす該影響が該ＲＮＡの分解の増加を含み、
好ましくは該ＲＮＡのプロセシングに及ぼす該影響が該ＲＮＡのターンオーバーの増加を含む、請求項１４〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記リボスイッチが前記イントロンの３’スプライスジャンクションと重複し、
好ましくは該イントロンのスプライシングにより、該リボスイッチが活性化される能力が低減または排除される、請求項１６〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
スプライシング調節を有する前記アプタマードメイン領域がステムＰ２中に存在する、請求項１５〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記スプライス部位が前記アプタマードメインの５’末端に対して−１３０と−１６０との間の位置に存在し、
好ましくは該ＲＮＡが第２のイントロンをさらに含み、該第２のイントロンの３’スプライス部位が該アプタマードメインの５’末端に対して−２２０と−２７０との間の位置に存在し、
好ましくは該スプライス部位が５’スプライス部位である、請求項１５〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記リボスイッチのトリガー分子と接触させ、それにより、前記ＲＮＡのプロセシングに影響を及ぼす工程をさらに含む、請求項１４〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
コード領域に作動可能に連結されたリボスイッチを含むＲＮＡをコードする核酸分子を含み、リボスイッチがＲＮＡのスプライシングを調節し、リボスイッとコード領域とが異種であり、スプライシングの調節がＲＮＡのプロセシングに影響を及ぼす、調節可能な遺伝子発現構築物を本明細書中に開示する。リボスイッチは、ＲＮＡのオルタナティブスプライシングを調節することができる。リボスイッチは、アプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインを含むことができ、アプタマードメインと発現プラットフォームドメインとは異種である。ＲＮＡは、イントロンをさらに含むことができる。リボスイッチは、ＲＮＡの３’非翻訳領域中に存在し得る。イントロンは、ＲＮＡの３’非翻訳領域中に存在し得る。ＲＮＡプロセシング部位は、イントロン中に存在し得る。イントロンのスプライシングによってＲＮＡからＲＮＡプロセシング部位を除去し、それにより、ＲＮＡのプロセシングに影響を及ぼすことができる。ＲＮＡのプロセシングに及ぼされる影響は、ＲＮＡプロセシング部位によって媒介されるＲＮＡのプロセシングの排除を含むことができる。ＲＮＡのプロセシングに及ぼされる影響は、転写終結の変化を含むことができる。ＲＮＡのプロセシングに及ぼされる影響は、ＲＮＡ分解の増加を含むことができる。ＲＮＡのプロセシングに及ぼされる影響は、ＲＮＡターンオーバーの増加を含むことができる。リボスイッチは、イントロンの３’スプライスジャンクションと重複することができる。イントロンのスプライシングにより、リボスイッチが活性化される能力が低減または排除され得る。スプライスジャンクションは、５’スプライスジャンクションであり得る。リボスイッチは、ＲＮＡのイントロン中に存在し得る。ＲＮＡプロセシングは、スプライシングの関与と無関係に、またはこれを使用せずに、調節され得るか影響を受けることもできる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
ＲＮＡのプロセシングに影響を及ぼす方法であって、ＲＮＡにリボスイッチを含む構築物を導入する工程であって、リボスイッチがＲＮＡのスプライシングを調節することができ、ＲＮＡがイントロンを含み、スプライシングの調節がＲＮＡのプロセシングに影響を及ぼす、導入工程を含む方法も開示する。リボスイッチは、アプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインを含むことができ、アプタマードメインと発現プラットフォームドメインとは、異種である。リボスイッチは、ＲＮＡのイントロン中に存在し得る。リボスイッチを、トリガー分子（ＴＰＰなど）によって活性化することができる。リボスイッチは、ＴＰＰ応答性リボスイッチであり得る。リボスイッチは、スプライシングを活性化することができる。リボスイッチは、スプライシングを抑制することができる。リボスイッチは、ＲＮＡのスプライシングを変化させることができる。スプライシングは、非天然に起こり得る。スプライシング調節を有するアプタマー領域は、例えば、ループ５中に見出すことができる。スプライシング調節を有するアプタマー領域は、例えば、ステムＰ２中にも見出すことができる。スプライス部位は、例えば、アプタマーの５’末端に対して−１３０と−１６０との間の位置に存在することができる。構築物は、イントロンをさらに含むことができる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
（ａ）コード領域に作動可能に連結されたリボスイッチを含むＲＮＡをコードする核酸分子を含む構築物を含む細胞であって、リボスイッチがＲＮＡのスプライシングを調節し、リボスイッチとコード領域とが異種であり、スプライシングの調節がＲＮＡのプロセシングに影響を及ぼす、細胞と、（ｂ）有効量のリボスイッチのトリガー分子とを接触させ、それにより、遺伝子発現に影響を及ぼす、遺伝子発現に影響を及ぼす方法も開示する。リボスイッチは、ＴＰＰ応答性リボスイッチであり得る。トリガー分子は、チアミンまたはＴＰＰであり得る。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
本明細書中に組み込まれ、且つ本明細書の一部を構成する添付の図面は、開示の方法および組成物のいくつかの実施形態を例示し、記載と共に、開示の方法および組成物の原理を説明するのに役立つ。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
調節可能な遺伝子発現構築物であって、
コード領域に作動可能に連結されたリボスイッチを含むＲＮＡをコードする核酸分子を含み、該リボスイッチがＲＮＡのスプライシングを調節し、該リボスイッチと該コード領域とが異種であり、該スプライシングの調節が該ＲＮＡのプロセシングに影響を及ぼす、調節可能な遺伝子発現構築物。
（項目２）
前記リボスイッチがオルタナティブスプライシング（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｓｐｉｃｉｎｇ）を調節する、項目１に記載の構築物。
（項目３）
前記リボスイッチがアプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインを含み、該アプタマードメインと該発現プラットフォームドメインとが異種である、項目１または２に記載の構築物。
（項目４）
前記ＲＮＡがイントロンをさらに含み、前記発現プラットフォームドメインがスプライスジャンクションを含む、項目１〜３のいずれか１項に記載の構築物。
（項目５）
前記スプライスジャンクションが前記イントロン中に存在する、項目４に記載の構築物。
（項目６）
前記スプライスジャンクションがオルタナティブスプライスジャンクションである、項目４または５に記載の構築物。
（項目７）
前記スプライスジャンクションが前記イントロンの末端に存在する、項目４に記載の構築物。
（項目８）
前記スプライスジャンクションが、前記リボスイッチが活性化される場合に活性である、項目４〜７のいずれか１項に記載の構築物。
（項目９）
前記スプライスジャンクションが、前記リボスイッチが活性化されない場合に活性である、項目４〜７のいずれか１項に記載の構築物。
（項目１０）
前記リボスイッチがトリガー分子によって活性化される、項目１〜９のいずれか１項に記載の構築物。
（項目１１）
前記トリガー分子がＴＰＰである、項目１０に記載の構築物。
（項目１２）
前記リボスイッチがＴＰＰ応答性リボスイッチである、項目１〜１１のいずれか１項に記載の構築物。
（項目１３）
前記リボスイッチが前記イントロンのスプライシングを活性化する、項目１〜１２のいずれか１項に記載の構築物。
（項目１４）
前記リボスイッチがオルタナティブスプライシングを活性化する、項目１〜１２のいずれか１項に記載の構築物。
（項目１５）
前記リボスイッチが前記イントロンのスプライシングを抑制する、項目１〜１２のいずれか１項に記載の構築物。
（項目１６）
前記リボスイッチがオルタナティブスプライシングを抑制する、項目１〜１２のいずれか１項に記載の構築物。
（項目１７）
前記ＲＮＡが分岐構造を有する、項目１〜１６のいずれか１項に記載の構築物。
（項目１８）
前記ＲＮＡがｐｒｅ−ｍＲＮＡである、項目１〜１７のいずれか１項に記載の構築物。
（項目１９）
前記リボスイッチが前記ＲＮＡの３’非翻訳領域中に存在する、項目１〜１８のいずれか１項に記載の構築物。
（項目２０）
前記イントロンが前記ＲＮＡの３’非翻訳領域中に存在する、項目４〜１９のいずれか１項に記載の構築物。
（項目２１）
ＲＮＡプロセシング部位が前記イントロン中に存在する、項目４〜２０のいずれか１項に記載の構築物。
（項目２２）
前記イントロンのスプライシングによって前記ＲＮＡから該ＲＮＡプロセシング部位が除去され、それにより、該ＲＮＡのプロセシングに影響を及ぼす、項目２１に記載の構築物。
（項目２３）
前記ＲＮＡのプロセシングに及ぼす前記影響が、該ＲＮＡプロセシング部位によって媒介される該ＲＮＡのプロセシングの排除を含む、項目２２に記載の構築物。
（項目２４）
前記ＲＮＡのプロセシングに及ぼす前記影響が、転写終結の変化を含む、項目２２または２３に記載の構築物。
（項目２５）
前記ＲＮＡのプロセシングに及ぼす前記影響が、該ＲＮＡ分解の増加を含む、項目２２〜２４のいずれか１項に記載の構築物。
（項目２６）
前記ＲＮＡのプロセシングに及ぼす前記影響が、該ＲＮＡターンオーバーの増加を含む、項目２２〜２４のいずれか１項に記載の構築物。
（項目２７）
前記リボスイッチが前記イントロンの３’スプライスジャンクションと重複する、項目４〜２６のいずれか１項に記載の構築物。
（項目２８）
前記イントロンのスプライシングにより、前記リボスイッチが活性化される能力が低減または排除される、項目２７に記載の構築物。
（項目２９）
スプライシング調節を有する前記アプタマードメイン領域がＰ４ステムおよびＰ５ステム中に存在する、項目３〜２８のいずれか１項に記載の構築物。
（項目３０）
スプライシング調節を有する前記アプタマードメイン領域がループ５中にも存在する、項目２９に記載の構築物。
（項目３１）
スプライシング調節を有する前記アプタマードメイン領域がステムＰ２中にも存在する、項目２９または３０に記載の構築物。
（項目３２）
スプライス部位が前記アプタマードメインの５’末端に対して−１３０と−１６０との間の位置に存在する、項目３〜３１のいずれか１項に記載の構築物。
（項目３３）
前記ＲＮＡが第２のイントロンをさらに含み、該第２のイントロンの３’スプライス部位が前記アプタマードメインの５’末端に対して−２２０と−２７０との間の位置に存在する、項目３〜３１のいずれか１項に記載の構築物。
（項目３４）
前記スプライスジャンクションが５’スプライスジャンクションである、項目３〜３１のいずれか１項に記載の構築物。
（項目３５）
ＲＮＡのプロセシングに影響を及ぼす方法であって、該ＲＮＡにリボスイッチを含む構築物を導入する工程であって、該リボスイッチがＲＮＡのスプライシングを調節することができ、該ＲＮＡがイントロンを含み、該スプライシングの調節が該ＲＮＡのプロセシングに影響を及ぼす、導入工程を含む方法。
（項目３６）
前記リボスイッチがアプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインを含み、該アプタマードメインと該発現プラットフォームドメインとが異種である、項目３５に記載の方法。
（項目３７）
前記発現プラットフォームドメインがスプライスジャンクションを含む、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
前記スプライスジャンクションが前記イントロン中に存在する、項目３５〜３７のいずれか１項に記載の方法。
（項目３９）
前記スプライスジャンクションがオルタナティブスプライスジャンクションである、項目３７または３８に記載の方法。
（項目４０）
前記スプライスジャンクションが前記イントロンの末端に存在する、項目３７に記載の方法。
（項目４１）
前記スプライスジャンクションが、前記リボスイッチが活性化される場合に活性である、項目３７〜４０のいずれか１項に記載の方法。
（項目４２）
前記スプライスジャンクションが、前記リボスイッチが活性化されない場合に活性である、項目３７〜４０のいずれか１項に記載の方法。
（項目４３）
前記リボスイッチがトリガー分子によって活性化される、項目３５〜４２のいずれか１項に記載の方法。
（項目４４）
前記トリガー分子がＴＰＰである、項目４３に記載の方法。
（項目４５）
前記リボスイッチがＴＰＰ応答性リボスイッチである、項目３５〜４４のいずれか１項に記載の方法。
（項目４６）
前記リボスイッチがスプライシングを活性化する、項目３５〜４５のいずれか１項に記載の方法。
（項目４７）
前記リボスイッチがオルタナティブスプライシングを活性化する、項目３５〜４５のいずれか１項に記載の方法。
（項目４８）
前記リボスイッチがスプライシングを抑制する、項目３５〜４５のいずれか１項に記載の方法。
（項目４９）
前記リボスイッチがオルタナティブスプライシングを抑制する、項目３５〜４５のいずれか１項に記載の方法。
（項目５０）
前記スプライシングが天然に起こらない、項目３５〜４９のいずれか１項に記載の方法。
（項目５１）
スプライシング調節を有する前記アプタマードメイン領域がループ５中に存在する、項目３６〜５０のいずれか１項に記載の方法。
（項目５２）
前記構築物が前記イントロンをさらに含む、項目３５〜５１のいずれか１項に記載の方法。
（項目５３）
前記リボスイッチが前記ＲＮＡの３’非翻訳領域中に存在する、項目３５〜５２のいずれか１項に記載の方法。
（項目５４）
前記イントロンが前記ＲＮＡの３’非翻訳領域中に存在する、項目３５〜５３のいずれか１項に記載の方法。
（項目５５）
ＲＮＡプロセシング部位が前記イントロン中に存在する、項目３５〜５４のいずれか１項に記載の方法。
（項目５６）
前記イントロンのスプライシングによって前記ＲＮＡから該ＲＮＡプロセシング部位が除去され、それにより、該ＲＮＡのプロセシングに影響を及ぼす、項目５５に記載の方法。
（項目５７）
前記ＲＮＡのプロセシングに及ぼす前記影響が、該ＲＮＡプロセシング部位によって媒介される該ＲＮＡのプロセシングの排除を含む、項目５６に記載の方法。
（項目５８）
前記ＲＮＡのプロセシングに及ぼす前記影響が、転写終結の変化を含む、項目５６または５７に記載の方法。
（項目５９）
前記ＲＮＡのプロセシングに及ぼす前記影響が該ＲＮＡ分解の増加を含む、項目５６〜５８のいずれか１項に記載の方法。
（項目６０）
前記ＲＮＡのプロセシングに及ぼす前記影響が該ＲＮＡターンオーバーの増加を含む、項目５６〜５８のいずれか１項に記載の方法。
（項目６１）
前記リボスイッチが前記イントロンの３’スプライスジャンクションと重複する、項目３７〜６０のいずれか１項に記載の方法。
（項目６２）
前記イントロンのスプライシングにより、前記リボスイッチが活性化される能力が低減または排除される、項目６１に記載の方法。
（項目６３）
スプライシング調節を有する前記アプタマードメイン領域がステムＰ２中に存在する、項目３６〜６２のいずれか１項に記載の方法。
（項目６４）
前記スプライス部位が前記アプタマードメインの５’末端に対して−１３０と−１６０との間の位置に存在する、項目３６〜６３のいずれか１項に記載の方法。
（項目６５）
前記ＲＮＡが第２のイントロンをさらに含み、該第２のイントロンの３’スプライス部位が前記アプタマードメインの５’末端に対して−２２０と−２７０との間の位置に存在する、項目３６〜６３のいずれか１項に記載の方法。
（項目６６）
前記スプライス部位が５’スプライス部位である、項目３６〜６３のいずれか１項に記載の方法。
（項目６７）
前記リボスイッチのトリガー分子と接触し、それにより、前記ＲＮＡのプロセシングに影響を及ぼす工程をさらに含む、項目３５〜６６のいずれか１項に記載の方法。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４８】
Ａ．リボスイッチ
リボスイッチは、発現するＲＮＡ分子の一部であり、トリガー分子によって結合した場合に状態が変化する発現調節エレメントである。リボスイッチを、典型的には、以下の２つの個別のドメインに分けることができる：１つは標的に選択的に結合するドメイン（アプタマードメイン）および他は遺伝子調節に影響を及ぼすドメイン（発現プラットフォームドメイン）である。遺伝子発現が代謝産物依存性にアロステリック調節されるこれらの２ドメイン間の動的相互作用がもたらされる。単離および組換えリボスイッチ、かかるリボスイッチを含む組換え構築物、かかるリボスイッチに作動可能に連結された異種配列、かかるリボスイッチを保有する細胞およびトランスジェニック生物、リボスイッチ組換え構築物、ならびに異種配列に作動可能に連結されたリボスイッチを開示する。異種配列は、例えば、目的のタンパク質またはペプチド（レポータータンパク質またはペプチドが含まれる）をコードする配列であり得る。好ましいリボスイッチは、天然に存在するリボスイッチであり得るか、これに由来し得る。例えば、アプタマードメインは、天然に存在するリボスイッチのアプタマードメインであり得るか、これに由来し得る。リボスイッチは、人工アプタマーを含むか、任意選択的に排除することができる。例えば、人工アプタマーには、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ進化および／またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ選択を介してデザインまたは選択されるアプタマーが含まれる。リボスイッチは、天然に存在するリボスイッチのコンセンサス配列を含むことができる。種々のリボスイッチのコンセンサス配列は、米国特許出願公開第２００５−００５３９５１号に記載されている（図１１中など）。植物ＴＰＰ応答性リボスイッチのコンセンサス配列を図１Ｂに示し、特定の例を図１Ａに示す。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４９】
コード領域に作動可能に連結されたリボスイッチを含むＲＮＡをコードする核酸分子を含み、リボスイッチがＲＮＡのスプライシングを調節し、リボスイッチとコード領域とが異種であり、スプライシングの調節がＲＮＡのプロセシングに影響を及ぼす、調節可能な遺伝子発現構築物を本明細書中に開示する。リボスイッチは、ＲＮＡのオルタナティブスプライシングを調節することができる。リボスイッチは、アプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインを含むことができ、アプタマードメインと発現プラットフォームドメインとは異種である。ＲＮＡは、イントロンをさらに含むことができる。リボスイッチは、ＲＮＡの３’非翻訳領域中に存在し得る。イントロンは、ＲＮＡの３’非翻訳領域中に存在し得る。ＲＮＡプロセシング部位は、イントロン中に存在し得る。イントロンのスプライシングによってＲＮＡからＲＮＡプロセシング部位を除去し、それにより、ＲＮＡのプロセシングに影響を及ぼすことができる。ＲＮＡのプロセシングに及ぼされる影響は、ＲＮＡプロセシング部位によって媒介されるＲＮＡのプロセシングの排除を含むことができる。ＲＮＡのプロセシングに及ぼされる影響は、転写終結の変化を含むことができる。ＲＮＡのプロセシングに及ぼされる影響は、ＲＮＡ分解の増加を含むことができる。ＲＮＡのプロセシングに及ぼされる影響は、ＲＮＡターンオーバーの増加を含むことができる。リボスイッチは、イントロンの３’スプライスジャンクションと重複することができる。イントロンのスプライシングにより、リボスイッチが活性化される能力が低減または排除され得る。スプライスジャンクションは、５’スプライスジャンクションであり得る。リボスイッチは、ＲＮＡのイントロン中に存在し得る。ＲＮＡプロセシングは、スプライシングの関与と無関係に、またはこれを使用せずに、調節され得るか影響を受けることもできる。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５１】
ＲＮＡのプロセシングに影響を及ぼす方法であって、ＲＮＡにリボスイッチを含む構築物を導入する工程であって、リボスイッチがＲＮＡのスプライシングを調節することができ、ＲＮＡがイントロンを含み、スプライシングの調節がＲＮＡのプロセシングに影響を及ぼす、導入工程を含む方法も開示する。リボスイッチは、アプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインを含むことができ、アプタマードメインと発現プラットフォームドメインとは、異種である。リボスイッチは、ＲＮＡのイントロン中に存在し得る。リボスイッチを、トリガー分子（ＴＰＰなど）によって活性化することができる。リボスイッチは、ＴＰＰ応答性リボスイッチであり得る。リボスイッチは、スプライシングを活性化することができる。リボスイッチは、スプライシングを抑制することができる。リボスイッチは、ＲＮＡのスプライシングを変化させることができる。スプライシングは、非天然に起こり得る。スプライシング調節を有するアプタマー領域は、例えば、ループ５中に見出すことができる。スプライシング調節を有するアプタマー領域は、例えば、ステムＰ２中にも見出すこともできる。スプライス部位は、例えば、アプタマーの５’末端に対して−１３０と−１６０との間の位置に存在することができる。構築物は、イントロンをさらに含むことができる。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５２】
（ａ）コード領域に作動可能に連結されたリボスイッチを含むＲＮＡをコードする核酸分子を含む構築物を含む細胞であって、リボスイッチがＲＮＡのスプライシングを調節し、リボスイッチとコード領域とが異種であり、スプライシングの調節がＲＮＡのプロセシングに影響を及ぼす、細胞と、（ｂ）有効量のリボスイッチのトリガー分子とを接触させ、それにより、遺伝子発現に影響を及ぼす、遺伝子発現に影響を及ぼす方法も開示する。リボスイッチは、ＴＰＰ応答性リボスイッチであり得る。トリガー分子は、チアミンまたはＴＰＰであり得る。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６７】
異種アプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインを含むキメラリボスイッチを開示する。すなわち、キメラリボスイッチは、ある供給源由来のアプタマードメインおよび別の供給源由来の発現プラットフォームドメインから構成される。異種供給源は、例えば、異なる特異的リボスイッチ、異なるリボスイッチ型、または異なるリボスイッチクラスに由来し得る。異種アプタマーは、非リボスイッチアプタマーにも由来し得る。異種発現プラットフォームドメインは、非リボスイッチ供給源にも由来し得る。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７４】
異種リボスイッチおよびコード領域を含むＲＮＡ分子を開示する。すなわち、かかるＲＮＡ分子は、ある供給源由来のリボスイッチおよび別の供給源由来のコード領域から構成される。異種供給源は、例えば、異なるＲＮＡ分子、異なる転写物、異なる遺伝子由来のＲＮＡまたは転写物、異なる細胞由来のＲＮＡまたは転写物、異なる生物由来のＲＮＡまたは転写物、異なる種由来のＲＮＡまたは転写物、天然の配列および人工または操作された配列、特異的リボスイッチ、異なるリボスイッチ型、または異なるリボスイッチクラスに由来し得る。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８１】
開示の構築物およびＲＮＡは、リボスイッチ、イントロン、活性な３’ＵＴＲ配列、およびスペーサー３’ＵＴＲ配列を含むことができる。上記および本明細書中の他の場所に記載のように、これらのエレメントおよび配列のいくつかは重複し得る。かかる構築物の例を、実施例１に記載し、図８に示す。図８は、かかる調節構築物の天然に存在する形態の例を示す。同一の天然に存在する調節構築物由来のリボスイッチ、イントロン、活性な３’ＵＴＲ配列、およびスペーサー３’ＵＴＲ配列を使用することが有用である。したがって、例えば、天然に存在する遺伝子中の終止コドンからリボスイッチの３’末端までの全領域を、異種コード配列に作動可能に連結された調節構築物中で共に使用することができる。かかる構築物の例を実施例１に記載する。あるいは、異なる調節構築物由来の異なる配列を置換することができるか、異なるか誘導されたリボスイッチまたはアプタマードメインを、他のイントロン、活性な３’ＵＴＲ配列、および／またはスペーサー３’ＵＴＲ配列と組み合わせることができる。例えば、コンセンサスまたは誘導されたアプタマードメインを、調節構築物中で使用することができる。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１１】
２．ウイルスプロモーターおよびエンハンサー
哺乳動物宿主細胞中のベクターからの転写を調節する好ましいプロモーターを、種々の供給源（例えば、ポリオーマ、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、および最も好ましくはサイトメガロウイルスなどのウイルスゲノム）、または異種哺乳動物プロモーター（例えば、βアクチンプロモーター）から得ることができる。ＳＶ４０ウイルスの初期および後期プロモーターを、ＳＶ４０ウイルス複製起点も含むＳＶ４０制限フラグメントとして得ることが都合が良い（Ｆｉｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２７３：  １１３（１９７８））。ヒトサイトメガロウイルスの最初期プロモーターを、ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｅ制限フラグメントとして得ることが都合が良い（Ｇｒｅｅｎｗａｙ，Ｐ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １８：  ３５５−３６０（１９８２））。勿論、宿主細胞または関連種由来のプロモーターも本明細書中で有用である。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６５】
開示の方法、その任意の一部、またはその調製を、コンピュータ制御によって調節、管理、または支援することができる。かかるコンピュータ制御を、コンピュータ制御されたプロセスまたは方法によって実施することができ、データ構造を使用および／または生成することができ、コンピュータプログラムを使用することができる。かかるコンピュータ制御、コンピュータ制御されたプロセス、データ構造、およびコンピュータプログラムが意図され、本明細書中に開示されると理解すべきである。
方法
ＲＮＡのプロセシングに影響を及ぼす方法であって、ＲＮＡにリボスイッチを含む構築物を導入する工程であって、リボスイッチがＲＮＡのスプライシングを調節することができ、スプライシングの調節がＲＮＡのプロセシングに影響を及ぼす、導入工程を含む方法を本明細書中に開示する。リボスイッチは、例えば、オルタナティブスプライシングを調節することができる。リボスイッチは、アプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインを含むことができ、アプタマードメインと発現プラットフォームドメインとが異種である。リボスイッチはＲＮＡのイントロンにあり得る。リボスイッチを、トリガー分子（ＴＰＰなど）によって活性化することができる。リボスイッチは、ＴＰＰ応答性リボスイッチであり得る。リボスイッチは、オルタナティブスプライシングを活性化することができる。リボスイッチは、オルタナティブスプライシングを抑制することができる。スプライシングは非天然で起こり得る。オルタナティブスプライシング調節を有するアプタマー領域は、例えば、ループ５中に見出すことができる。オルタナティブスプライシング調節を有するアプタマー領域は、例えば、ステムＰ２中にも見出すことができる。スプライス部位は、例えば、アプタマーの５’末端に対して−１３０と−１６０との間の位置に存在することができる。