【誤訳訂正書】
【提出日】平成24年1月18日(2012.1.18)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体のフリッツルド−関連蛋白質−１  ｍＲＮＡの発現を減衰させるための組成物であって、
有効量の、１９ないし４９ヌクレオチドの長さを有する干渉性ＲＮＡ、および医薬上許容される担体を含み、
該干渉性ＲＮＡは、配列番号２、配列番号８ないし配列番号１９０、および配列番号１９２のうちのいずれか１つに対応するｍＲＮＡの３’末端の最後から２番目のヌクレオチドから連続する１３ヌクレオチドに対して少なくとも９０％の配列相補性または少なくとも９０％の配列同一性を有する少なくとも１３連続するヌクレオチドの領域を含む、
組成物。
【請求項２】
前記組成物がさらに、１９ないし４９ヌクレオチドの長さを有し、かつ配列番号２、配列番号８ないし配列番号１９０、および配列番号１９２のいずれか１つに対応する第２のｍＲＮＡの３’末端の最後から２番目のヌクレオチドから連続する１３ヌクレオチドに対して、少なくとも９０％の配列相補性、または少なくとも９０％の配列同一性を有する少なくとも１３連続するヌクレオチドの領域を含む第２の干渉性ＲＮＡを含む請求項１記載の組成物。
【請求項３】
前記干渉性ＲＮＡが、配列番号２、配列番号８ないし配列番号１９０、および配列番号１９２のいずれか１つに対応するｍＲＮＡの３’末端の最後から２番目のヌクレオチドから連続する１４ヌクレオチドに対して、少なくとも８５％の配列相補性、または少なくとも８５％の配列同一性を有する少なくとも１４連続するヌクレオチドの領域を含む請求項１記載の組成物。
【請求項４】
前記干渉性ＲＮＡが、配列番号２、配列番号８ないし配列番号１９０、および配列番号１９２のいずれか１つに対応するｍＲＮＡの３’末端の、各々、最後から２番目のヌクレオチドから連続する１５、１６、１７、または１８ヌクレオチドに対して、少なくとも８０％の配列相補性、または少なくとも８０％の配列同一性を有する少なくとも１５、１６、１７、または１８連続するヌクレオチドの領域を含む請求項１記載の組成物。
【請求項５】
前記干渉性ＲＮＡがｓｈＲＮＡである請求項１記載の組成物。
【請求項６】
前記組成物が局所、硝子体内、経強膜、眼周囲、結膜、テノン嚢下、前眼房内、網膜下、結膜下、眼球後、小管内、または脈絡板上経路を介する投与に適する、請求項１記載の組成物。
【請求項７】
前記干渉性ＲＮＡが、該干渉性ＲＮＡを発現させることができる発現ベクターからのイン・ビボ発現を介する投与に適するものである、請求項１記載の組成物。
【請求項８】
前記干渉性ＲＮＡがｍｉＲＮＡである請求項１記載の組成物。
【請求項９】
前記干渉性ＲＮＡがｓｉＲＮＡである請求項１記載の組成物。
【請求項１０】
被験体における緑内障の治療用の医薬の調製における、有効量の、１９ないし４９ヌクレオチドの長さを有する干渉性ＲＮＡ、および医薬上許容される担体を含む組成物の使用であって、
該干渉性ＲＮＡは、配列番号２、配列番号８ないし配列番号１９０、および配列番号１９２のいずれか１つに対応するｍＲＮＡの３’末端の最後から２番目のヌクレオチドから連続する１３ヌクレオチドに対して、少なくとも９０％の配列相補性、または少なくとも９０％の配列同一性を有する少なくとも１３連続するヌクレオチドの領域を含む、
使用。
【請求項１１】
前記組成物が、さらに、１９ないし４９ヌクレオチドの長さを有し、かつ配列番号２、配列番号８ないし配列番号１９０、および配列番号１９２のいずれか１つに対応する第２のｍＲＮＡの３’末端の最後から２番目のヌクレオチドから連続する１３ヌクレオチドに対して、少なくとも９０％の配列相補性、または少なくとも９０％の配列同一性を有する少なくとも１３連続するヌクレオチドの領域を含む第２の干渉性ＲＮＡを含む請求項１０記載の使用。
【請求項１２】
前記干渉性ＲＮＡが、配列番号２、配列番号８ないし配列番号１９０、および配列番号１９２のいずれか１つに対応するｍＲＮＡの３’末端の最後から２番目のヌクレオチドから連続する１４ヌクレオチドに対して、少なくとも８５％の配列相補性、または少なくとも８５％の配列同一性を有する少なくとも１４連続するヌクレオチドの領域を含む請求項１０記載の使用。
【請求項１３】
前記干渉性ＲＮＡが、配列番号２、配列番号８ないし配列番号１９０、および配列番号１９２のうちのいずれか１つに対応するｍＲＮＡの３’末端の各々、最後から２番目のヌクレオチドから連続する１５、１６、１７、または１８ヌクレオチドに対して、少なくとも８０％の配列相補性、または少なくとも８０％の配列同一性を有する少なくとも１５、１６、１７、または１８連続するヌクレオチドの領域を含む請求項１０記載の使用。
【請求項１４】
前記干渉性ＲＮＡがｓｈＲＮＡである請求項１０記載の使用。
【請求項１５】
前記組成物が局所、硝子体内、経強膜、眼周囲、結膜、テノン嚢下、前眼房内、網膜下、結膜下、眼球後、小管内、または脈絡板上投与のために調製される請求項１０記載の使用。
【請求項１６】
前記組成物が、前記干渉性ＲＮＡを発現することができる発現ベクターからイン・ビボ発現を介する投与のために調製される請求項１０記載の使用。
【請求項１７】
前記干渉性ＲＮＡがｍｉＲＮＡである請求項１０記載の使用。
【請求項１８】
前記干渉性ＲＮＡがｓｉＲＮＡである請求項１０記載の使用。
【請求項１９】
前記少なくとも１３連続するヌクレオチドの領域が、配列番号２、および配列番号８ないし配列番号１９０のいずれか１つに対応するｍＲＮＡの３’末端の最後から２番目のヌクレオチドから連続する１３ヌクレオチドに対して、少なくとも９０％の配列相補性、または少なくとも９０％の配列同一性を有する請求項１０記載の使用。
【請求項２０】
前記少なくとも１３連続するヌクレオチドの領域が、配列番号１９２に対応するｍＲＮＡの３’末端の最後から２番目のヌクレオチドから連続する１３ヌクレオチドに対して、少なくとも９０％の配列相補性または少なくとも９０％の配列同一性を有する請求項１０記載の使用。
【請求項２１】
被験体のフリッツルド関連蛋白質−１  ｍＲＮＡの発現を減衰するための組成物であって
有効量の、１９ないし４９ヌクレオチドの長さを有する干渉性ＲＮＡ、および医薬上許容される担体を含み、
該干渉性ＲＮＡは、センスヌクレオチド鎖、アンチセンスヌクレオチド鎖および少なくとも１９ヌクレオチドの少なくとも８０％の連続配列相補性または少なくとも８０％の連続配列同一性の領域を含み、
ここで、該アンチセンス鎖は生理学的条件下で配列番号１または配列番号１９１に対応するｍＲＮＡの部分に対してハイブリダイズし、かつ、各々、配列番号１または配列番号１９１に対応するｍＲＮＡのハイブリダイズする部分に対して少なくとも１９ヌクレオチドの少なくとも８０％の連続配列相補性または少なくとも８０％の連続配列同一性の領域を有する、
組成物。
【請求項２２】
前記アンチセンス鎖が生理学的条件下で、配列番号１に対応するｍＲＮＡの一部に対してハイブリダイズし、かつ配列番号１に対応するｍＲＮＡのハイブリダイズする部分に対して少なくとも１９ヌクレオチドの少なくとも８０％の連続配列相補性または少なくとも８０％の連続配列同一性の領域を有する請求項２１記載の組成物。
【請求項２３】
前記アンチセンス鎖が、生理学的条件下で、配列番号１９１に対応するｍＲＮＡの部分に対してハイブリダイズし、かつ配列番号１９１に対応するｍＲＮＡのハイブリダイズする部分に対して少なくとも１９ヌクレオチドの少なくとも８０％の連続配列相補性または少なくとも８０％の連続配列同一性の領域を有する請求項２１記載の組成物。
【請求項２４】
前記干渉性ＲＮＡのアンチセンス鎖が、ヌクレオチド
【化１】
2008533050.tif 000001
を含む配列番号１に対応するｍＲＮＡを標的とするように設計された請求項２１記載の組成物。
【請求項２５】
前記干渉性ＲＮＡのアンチセンス鎖が、ヌクレオチド３３５２を含む配列番号１９１に対応するｍＲＮＡを標的とするように設計された請求項２１記載の組成物。
【請求項２６】
さらに、１９ないし４９ヌクレオチドの長さを有し、かつセンスヌクレオチド鎖、アンチセンスヌクレオチド鎖、および少なくとも１９ヌクレオチドの少なくとも８０％の連続配列相補性または少なくとも８０％の連続配列同一性の領域を含む第２の干渉性ＲＮＡを含み、
ここで、該第２の干渉性ＲＮＡのアンチセンス鎖は、生理学的条件下で、配列番号１または配列番号１９１に対応するｍＲＮＡの第２の部分に対してハイブリダイズし、および該アンチセンス鎖は、各々、配列番号１または配列番号１９１に対応するｍＲＮＡの第２のハイブリダイズする部分に対して少なくとも１９ヌクレオチドの少なくとも８０％の連続配列相補性または少なくとも８０％の連続配列同一性の領域を有する、
請求項２１記載の組成物。
【請求項２７】
前記センスヌクレオチド鎖および前記アンチセンスヌクレオチド鎖がループヌクレオチド鎖によって連結される請求項２１記載の組成物。
【請求項２８】
前記組成物が局所、硝子体内、経強膜、眼周囲、結膜、テノン嚢下、前眼房内、網膜下、結膜下、眼球後、小管内、または脈絡板上経路を介する投与に適するものである、請求項２１記載の組成物。
【請求項２９】
前記干渉性ＲＮＡが、該干渉性ＲＮＡを発現することができる発現ベクターからのイン・ビボ発現を介する投与に適するものである、請求項２１記載の組成物。
【請求項３０】
被験体における緑内障の治療用の医薬の調製における、有効量の、１９ないし４９ヌクレオチドの長さを有する干渉性ＲＮＡ、および医薬上許容される担体を含む組成物の使用であって、
該干渉性ＲＮＡはセンスヌクレオチド鎖、アンチセンスヌクレオチド鎖、および少なくとも１９ヌクレオチドの少なくとも８０％の連続配列相補性または少なくとも８０％の連続配列同一性の領域を含み、
ここで、該アンチセンス鎖は、生理学的条件下で配列番号１または配列番号１９１に対応するｍＲＮＡの部分に対してハイブリダイズし、かつ各々、配列番号１または配列番号１９１に対応するｍＲＮＡのハイブリダイズする部分に対して少なくとも１９ヌクレオチドの少なくとも８０％の連続配列相補性または少なくとも８０％の連続配列同一性の領域を有し、
該干渉性ＲＮＡのアンチセンス鎖は、ヌクレオチド
【化１Ａ】
2008533050.tif 000002
を含む配列番号１に対応するｍＲＮＡを標的とするように設計されているか、あるいは
該干渉性ＲＮＡのアンチセンス鎖は、ヌクレオチド３３５２を含む配列番号１９１に対応するｍＲＮＡを標的とするように設計されている、
使用。
【請求項３１】
前記アンチセンス鎖は、生理学的条件下で配列番号１に対応するｍＲＮＡの部分に対してハイブリダイズし、かつ配列番号１に対応するｍＲＮＡのハイブリダイズする部分に対して少なくとも１９ヌクレオチドの少なくとも８０％の連続配列相補性または少なくとも８０％の連続配列同一性の領域を有する請求項３０記載の使用。
【請求項３２】
前記アンチセンス鎖は、生理学的条件下で配列番号１９１に対応するｍＲＮＡの部分に対してハイブリダイズし、かつ配列番号１９１に対応するｍＲＮＡのハイブリダイズする部分に対して少なくとも１９ヌクレオチドの少なくとも８０％の連続配列相補性または少なくとも８０％の連続配列同一性の領域を有する請求項３０記載の使用。
【請求項３３】
前記干渉性ＲＮＡのアンチセンス鎖は、ヌクレオチド
【化２】
2008533050.tif 000003
を含む配列番号１に対応するｍＲＮＡを標的とするように設計された請求項３０記載の使用。
【請求項３４】
前記干渉性ＲＮＡのアンチセンス鎖が、ヌクレオチド３３５２を含む配列番号１９１に対応するｍＲＮＡを標的とするように設計された請求項３０記載の使用。
【請求項３５】
前記組成物はさらに、１９ないし４９ヌクレオチドの長さを有し、かつセンスヌクレオチド鎖、アンチセンスヌクレオチド鎖および少なくとも１９ヌクレオチドの少なくとも８０％の連続配列相補性または少なくとも８０％の連続配列同一性の領域を含む第２の干渉性ＲＮＡを含む、請求項３０記載の使用であって、
ここで該第２の干渉性ＲＮＡの該アンチセンス鎖は、生理学的条件下で、配列番号１または配列番号１９１に対応するｍＲＮＡの第２の部分に対してハイブリダイズし、かつ該アンチセンス鎖が、各々、配列番号１または配列番号１９１に対応するｍＲＮＡの第２のハイブリダイズする部分に対して少なくとも１９ヌクレオチドの少なくとも８０％の連続配列相補性または少なくとも８０％の連続配列同一性の領域を有する、
使用。
【請求項３６】
前記センスヌクレオチド鎖および該アンチセンスヌクレオチド鎖がループヌクレオチド鎖によって連結された請求項３０記載の使用。
【請求項３７】
前記組成物が局所、硝子体内、経強膜、眼周囲、結膜、テノン嚢下、前眼房内、網膜下、結膜下、眼球後、小管内、または脈絡板上投与のために調製される請求項３０記載の使用。
【請求項３８】
前記組成物が、前記干渉性ＲＮＡを発現することができる発現ベクターからのイン・ビボ発現を介する投与のために調製される請求項３０記載の使用。
【請求項３９】
被験体のフリッツルド関連蛋白質−１  ｍｉＲＮＡの発現を減衰させるための組成物であって、
有効量の、１９ないし４９ヌクレオチドの長さを有する一本鎖干渉性ＲＮＡ、および医薬上許容される担体を含み、
ここで、該一本鎖干渉性ＲＮＡは、生理学的条件下で、ヌクレオチド
【化３】
2008533050.tif 000004
を含む配列番号１に対応するｍＲＮＡの部分にハイブリダイズし、および該干渉性ＲＮＡは配列番号１に対応するｍＲＮＡのハイブリダイズする部分に対して少なくとも８０％の連続配列相補性または少なくとも８０％の連続配列同一性の領域を有するか；
あるいは、該一本鎖干渉性ＲＮＡは、生理学的条件下で、ヌクレオチド３３５２を含む配列番号１９１に対応するｍＲＮＡの部分に対してハイブリダイズし、かつ該干渉性ＲＮＡは、配列番号１９１に対応するｍＲＮＡのハイブリダイズする部分に対して少なくとも１９ヌクレオチドの少なくとも８０％の連続配列相補性または少なくとも８０％の連続配列同一性の領域を有する、
組成物。
【請求項４０】
前記組成物が局所、硝子体内、経強膜、眼周囲、結膜、テノン嚢下、前眼房内、網膜下、結膜下、眼球後、小管内、または脈絡板上経路を介する投与に適するものである、請求項３９記載の組成物。
【請求項４１】
前記干渉性ＲＮＡが、該干渉性ＲＮＡを発現させることができる発現ベクターからのイン・ビボ発現を介する投与に適する、請求項３９記載の組成物。
【請求項４２】
前記干渉性ＲＮＡがｍｉＲＮＡである請求項３９記載の組成物。
【請求項４３】
前記干渉性ＲＮＡがｓｉＲＮＡである請求項３９記載の組成物。
【請求項４４】
１９ないし４９ヌクレオチドの長さを有し、かつ配列番号２、配列番号８〜１７、配列番号１９〜配列番号１４５、配列番号１４７〜配列番号１９０および配列番号１９２のいずれか１つに対応するヌクレオチド配列またはその相補体を含む干渉性ＲＮＡ；および医薬上許容される担体を含む組成物。
【請求項４５】
前記干渉性ＲＮＡがｓｈＲＮＡである請求項４４記載の組成物。
【請求項４６】
前記干渉性ＲＮＡがｓｉＲＮＡである請求項４４記載の組成物。
【請求項４７】
前記干渉性ＲＮＡがｍｉＲＮＡである請求項４４記載の組成物。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【発明の詳細な説明】
【発明の名称】緑内障を処置するためのフリッツルド関連蛋白質―１のＲＮＡＩ媒介性阻害
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、フリッツルド関連蛋白質―１（ＦＲＰ−１）の発現の阻害による緑内障の治療のための干渉性ＲＮＡ組成物の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
緑内障は、ある種の臨床的特徴を共有する視神経障害の不均一な群である。緑内障における視覚の喪失は、視野における特徴的変化、神経線維層欠陥、および視神経乳頭（ＯＮＨ）の進行性杯形成によって臨床的に診断される神経網膜中の網膜神経節細胞の選択的死滅によるものである。緑内障の発生についての主な危険因子の１つは眼高血圧（上昇した眼内圧力、ＩＯＰ）の存在である。適切な眼内圧は眼の形状を維持するのに、および圧力勾配を供して、房水の無血管角膜およびレンズへの流動を可能とするのに必要である。ＩＯＰレベルは、ＩＯＰ降下性投薬から利益を受ける患者によって証明されるように、正常眼圧緑内障（ＮＴＧ）の病因にも関連付けることができる。一旦、中枢角膜の厚みについての調整がＮＴＧ患者におけるＩＯＰの読みに対してなされると、これらの多くの患者は眼高血圧であることが判明し得る。
【０００３】
緑内障に伴う上昇したＩＯＰは、小柱網（ＴＭ）、前眼房の虹彩−角膜角度に位置する小さな特殊化された組織における上昇した房水流出抵抗によるものである。ＴＭに対する緑内障の変化はＴＭ細胞における喪失、および蛋白質性プラーク−様物質を含めた細胞外デブリスの沈積および蓄積を含む。加えて、緑内障のＯＮＨにおいて起こる変化もある。緑内障の眼においては、ＯＮＨ神経膠細胞における形態学的および移動性変化がある。上昇したＩＯＰおよび／または一過性虚血性傷害に応答して、ＯＮＨ細胞外マトリックスの組成の変化、および神経膠細胞および網膜神経節細胞軸索形態の変化がある。
【０００４】
原発性緑内障は、解剖学的または生理学的ベースを有する眼内流体の流動における乱れに由来する。二次的緑内障は、眼に対する負傷または外傷あるいは既に存在する病気の結果として起こる。慢性または単純緑内障としても知られる原発開放隅角緑内障（ＰＯＡＧ）は、全ての原発性緑内障の９０％を表す。ＰＯＡＧは小柱網の変性によって特徴付けられ、その結果、眼からの流体の排出に対して異常に高い抵抗が生じる。そのような抵抗の結果は、増大した抵抗にわたって眼によって通常生じる流体を駆動するのに必要なＩＯＰの増大である。
【０００５】
現在の抗−緑内障療法は、房水形成の抑制剤、またはブドウ膜強膜流出を促進する剤の使用、排出を改良するための濾過処置であるレーザー線維柱帯形成術またはトラベクレクトミーによるＩＯＰの降下を含む。医薬的な抗−緑内障アプローチは、種々の望ましくない副作用を呈した。例えば、ピロカルピンのような縮瞳薬は、視覚の不鮮明化および他の負の視覚的副作用を引き起こしかねない。全身投与される炭酸脱水酵素阻害剤（ＣＡＩ）もまた嘔吐、消化不良、疲労および代謝アシドーシスを引き起こしかねない。さらに、ある種のベータ−ブロッカーは、益々、肺組織におけるベータ−２受容体に対するそれらの効果に帰される深刻な肺副作用に関連付けられるようになった。シンパトミメティックスは頻脈、不整脈および高血圧を引き起こす。そのような負の副作用は減少した患者のコンプライアンスまたは治療の停止に至りかねない。加えて、現在のＩＯＰ降下療法の効果は比較的短く、毎日の間における反復した投与を必要とし、ある場合には、効能は経時的に減少する。
【０００６】
緑内障の重要性、および治療の従来の方法の不適切性に鑑み、改良された治療方法を有するのは望ましいであろう。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要旨）
本発明は、緑内障およびプレ−緑内障関連疾患のかなり強力かつ効果的な治療、予防または介入を提供することによって先行技術のこれらのおよび他の欠陥を克服する。一態様において、本発明の方法は、ＦＲＰ−１  ｍＲＮＡの発現をサイレントとする干渉性ＲＮＡを投与し、かくして、Ｗｎｔシグナリング経路に干渉し、緑内障およびプレ−緑内障細胞活性に関連する事象のカスケードを予防することによって、緑内障を有する、または緑内障を発症する危険性がある被験体を治療することを含む。
【０００８】
本明細書中で用いられる用語「緑内障」は、高血圧および眼の緑内障疾患のような眼のプレ−緑内障疾患を含む、緑内障および緑内障−関連疾患に直接的にまたは間接的に至るＦＲＰ−１−ｍＲＮＡの発現に由来する細胞変化を含む。本明細書中において提供される干渉性ＲＮＡは、非特異的剤による毒性副作用を回避しつつそのようなサイレンシングを提供する。
【０００９】
本発明は、ＦＲＰ−１  ｍＲＮＡを標的とし、それにより、ＦＲＰ−１  ｍＲＮＡ発現に干渉する干渉性ＲＮＡに向けられる。本発明の干渉性ＲＮＡは緑内障を持つ、または緑内障を発症する危険性がある患者を治療するのに有用である。
【００１０】
本発明の実施形態は、被験体のフリッツルド関連蛋白質−１  ｍＲＮＡの発現を減衰させる方法であり、該方法は、被験体に、１９ないし４９ヌクレオチドの長さを有する有効量の干渉性ＲＮＡおよび医薬上許容される担体を含む組成物を投与することを含む。フリッツルド関連蛋白質−１  ｍＲＮＡの発現はそれにより減衰される。
【００１１】
本発明のもう１つの実施形態は、それを必要とする被験体において緑内障を治療する方法である。該方法は、被験体の眼に、１９ないし４９ヌクレオチドの長さを有する有効量の干渉性ＲＮＡおよび医薬上許容される担体を含む組成物を投与することを含む。緑内障はそれにより治療される。被験体はヒトであり、該ヒトは、本発明の一実施形態においては緑内障を有する。もう１つの実施形態において、被験体はヒトであり、該ヒトは緑内障を発症する危険性がある。
【００１２】
前記した実施形態では、干渉性ＲＮＡは、配列番号２、配列番号８ないし配列番号１９０および配列番号１９２のいずれか１つに対応するｍＲＮＡの３’末端の終わりから２番目のヌクレオチドから連続する１３ヌクレオチドに対して少なくとも９０％の配列相補性、または少なくとも９０％の配列同一性を有する少なくとも１３の連続するヌクレオチドの領域を含む。
【００１３】
前記方法のさらなる実施形態において、組成物は、さらに、１９ないし４９ヌクレオチドの長さを有し、かつ配列番号２、配列番号８ないし配列番号１９０および配列番号１９２のいずれか１つに対応する第二のｍＲＮＡの３’末端の終わりから２番目のヌクレオチドから連続する１３ヌクレオチドに対して少なくとも９０％の配列相補性、または少なくとも９０％の配列同一性を有する少なくとも１３の連続するヌクレオチドの領域を含む第二の干渉性ＲＮＡを含む。
【００１４】
本発明のなおもう１つの実施形態において、被験体のフリッツルド関連蛋白質−１  ｍＲＮＡの発現を減衰させる方法は、被験体に、１９ないし４９ヌクレオチドの長さを有する有効量の干渉性ＲＮＡ、および医薬上許容される担体を含む組成物を投与することを含み、該干渉性ＲＮＡはセンスヌクレオチド鎖、アンチセンスヌクレオチド鎖、および少なくとも１９ヌクレオチドの少なくとも殆ど完全な連続相補性の領域を含み、ここに、該アンチセンス鎖が生理学的条件下で配列番号１または配列番号１９１に対応するｍＲＮＡの部分にハイブリダイズし、各々、配列番号１または配列番号１９１に対応するｍＲＮＡのハイブリダイズする部分に対して少なくとも１９ヌクレオチドの少なくとも殆ど完全な連続相補性の領域を有する。フリッツルド関連蛋白質−１  ｍＲＮＡの発現はそれにより減衰される。
【００１５】
それを必要とする被験体において緑内障を治療する方法は本発明の実施形態であり、該方法は、被験体の眼に、１９ないし４９ヌクレオチドの長さを有する有効量の干渉性ＲＮＡ、および医薬上許容される担体を含む組成物を投与することを含み、該干渉性ＲＮＡはセンスヌクレオチド鎖、アンチセンスヌクレオチド鎖、および少なくとも１９ヌクレオチドの少なくとも殆ど完全な連続相補性の領域を含み；ここに、該アンチセンス鎖は、生理学的条件下で、配列番号１または配列番号１９１に対応するｍＲＮＡの部分にハイブリダイズし、各々、配列番号１または配列番号１９１に対応するｍＲＮＡのハイブリダイズする部分に対して少なくとも１９ヌクレオチドの少なくとも殆ど完全な連続相補性の領域を有する。緑内障はそれにより治療される。
【００１６】
前記した方法では、干渉性ＲＮＡのアンチセンス鎖は、ヌクレオチド
【００１７】
【化４】
2008533050.tif 000005
を含む配列番号１に対応するｍＲＮＡを標的とするように設計される。さらなる実施形態において、干渉性ＲＮＡのアンチセンス鎖は、ヌクレオチド３３５２を含む配列番号１９１に対応するｍＲＮＡを標的とするように設計される。
【００１８】
１９ないし４９ヌクレオチドの長さを有する第二の干渉性ＲＮＡもまた被験体に投与することができる；第二の干渉性ＲＮＡはセンスヌクレオチド鎖、アンチセンスヌクレオチド鎖、および少なくとも１９ヌクレオチドの少なくとも殆ど完全な相補性の領域を含み、ここに、該第二の干渉性ＲＮＡのアンチセンス鎖は、生理条件下で、配列番号１または配列番号１９１に対応するｍＲＮＡの第二の部分にハイブリダイズし、該アンチセンス鎖は、各々、配列番号１または配列番号１９１に対応するｍＲＮＡの第二のハイブリダイズする部分に対して少なくとも１９ヌクレオチドの少なくとも殆ど完全な連続相補性の領域を有する。
【００１９】
被験体のフリッツルド関連蛋白質−１  ｍＲＮＡの発現を減衰させる方法は、被験体に、１９ないし４９ヌクレオチドの長さを有する有効量の一本鎖干渉性ＲＮＡ、および医薬上許容される担体を含む組成物を投与することを含み、ここに、該一本鎖干渉性ＲＮＡは、生理学的条件下で、前記で確認されたヌクレオチドを含む配列番号１または配列番号１９１に対応するｍＲＮＡの部分にハイブリダイズすることが、本発明のさらなる実施形態である。
【００２０】
本発明は、さらなる実施形態として、１９ないし４９ヌクレオチドの長さを有し、かつ配列番号２、配列番号８ないし配列番号１９０および配列番号１９２のいずれか１つに対応するヌクレオチド配列、またはその相補体を含む干渉性ＲＮＡ、および医薬上許容される担体を含む組成物を含む。
【００２１】
本明細書中に記載されたＦＲＰ−１  ｍＲＮＡの発現を減衰させるための医薬の調製における本明細書中に記載された実施形態のいずれかの使用もまた本発明の実施形態である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
（発明の詳細な説明）
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を用いて遺伝子発現をサイレントとするプロセスである。理論に拘束されるつもりはないが、ＲＮＡｉはＲＮａｓｅＩＩＩ−様酵素、ダイサーによるより長いｄｓＲＮＡの小さな干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の切断で開始される。ＳｉＲＮＡは、長さが通常は約１９ないし２８ヌクレオチド、または２０ないし２５ヌクレオチド、または２１ないし２２ヌクレオチドであり、しばしば、２−ヌクレオチド３’突出、および５’リン酸および３’ヒドロキシル末端を含有するｄｓＲＮＡである。ｓｉＲＮＡの１つの鎖は、ＲＮＡ−誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）として知られたリボヌクレオ蛋白質複合体に取り込まれる。ＲＩＳＣはこのｓｉＲＮＡ鎖を用いて、取り込まれたｓｉＲＮＡ鎖に対して少なくとも部分的に相補的なｍＲＮＡ分子を同定し、次いで、これらの標的ｍＲＮＡを切断し、またはそれらの翻訳を阻害する。従って、ＲＩＳＣに一体化されるｓｉＲＮＡ鎖はガイド鎖またはアンチセンス鎖として知られている。パッセンジャー鎖またはセンス鎖として知られた他のｓｉＲＮＡ鎖はｓｉＲＮＡから排除され、かつ標的ｍＲＮＡに対して少なくとも部分的に相同である。当業者であれば、原理的には、ｓｉＲＮＡのいずれかの鎖はＲＩＳＣに取り込まれ、ガイド鎖として機能することができることも認識する。しかしながら、ｓｉＲＮＡ設計（例えば、アンチセンス鎖の５’末端における減少したｓｉＲＮＡ二重鎖安定性）は、アンチセンス鎖のＲＩＳＣへの取込に好都合となり得る。
【００２３】
ガイド鎖に対して少なくとも部分的に相補性である配列を有するｍＲＮＡのＲＩＳＣ−媒介切断は、そのｍＲＮＡの、およびこのｍＲＮＡによってコードされる対応する蛋白質の定常レベルの減少に導く。別法として、ＲＩＳＣは、標的ｍＲＮＡの切断無くして、翻訳抑制を介して対応する蛋白質の発現を減少させることができる。他のＲＮＡ分子およびＲＮＡ−様分子もまたＲＩＳＣと相互作用し、遺伝子発現をサイレントとすることができる。ＲＩＳＣと相互作用できる他のＲＮＡ分子の例は短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、一本鎖ｓｉＲＮＡ、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ダイサー−基質２７マー二重鎖を含む。本明細書中で用いられる用語「ｓｉＲＮＡ」とは、他に断りのない限り二本鎖干渉性ＲＮＡをいう。ＲＩＳＣと相互作用することができるＲＮＡ−様分子の例は、１以上の化学的に修飾されたヌクレオチド、１以上のデオキシリボヌクレオチド、および／または１以上の非−ホスホジエステル結合を含むＲＮＡ分子である。本議論の目的では、ＲＩＳＣと相互作用でき、遺伝子発現のＲＩＳＣ−媒介変化に参画することができる全てのＲＮＡまたはＲＮＡ−様分子は、「干渉性ＲＮＡ」といわれる。ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよびダイサー−基質２７マー二重鎖は、従って、「干渉性ＲＮＡ」のサブセットである。
【００２４】
本発明の実施形態の干渉性ＲＮＡは標的ｍＲＮＡの切断に対して触媒方式で作用するように見え、すなわち、干渉性ＲＮＡは不足当量において標的ｍＲＮＡの阻害を行うことができる。アンチセンス療法と比較して、有意に低い干渉性のＲＮＡは、そのような切断条件下で治療効果を供するのに必要である。
【００２５】
本発明は、フリッツルド関連蛋白質−１（ＦＲＰ−１）ｍＲＮＡの発現を阻害し、それにより、Ｗｎｔシグナリング経路に干渉し、緑内障およびプレ−緑内障細胞活性に関連する事象のカスケードを予防するための干渉性ＲＮＡの使用に関する。本発明によると、外因的に供された、または内因的に発現された干渉性ＲＮＡは、他の組織において、フリッツルド関連蛋白質−１（ＦＲＰ−１）ｍＲＮＡをサイレントとするにおいて特に効果的である。
【００２６】
フリッツルド関連蛋白質（ＦＲＰ）は、細胞外Ｗｎｔに結合し、それが膜−結合フリッツルド蛋白質受容体と相互作用するのを妨げることによって、あるいはフリッツルド受容体（Ｂａｆｉｃｏ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４（２３）：１６１８０−１６１８７（１９９９））とで非機能的複合体を形成し、それにより、１つの細胞のもう１つの細胞への、ならびに細胞外マトリックスへの異なる接着に関連する事象のカスケードを妨げることによって、Ｗｎｔシグナリング経路に拮抗する分泌蛋白質のファミリーである。
【００２７】
本発明者らは、他の者と一緒になって、（ここに引用してその全体を一体化させる）Ｈｅｌｌｇｅｒｇ，ｅｔ  ａｌ．，に対する米国公開特許出願第２００４／０１８６１５９号、出願第１０／４８８，４９６号によって記載されているように、フリッツルド関連蛋白質（ＦＲＰ）は多数の緑内障小柱網細胞系において異なって発現されると決定した。培養に維持された灌流されたヒトの前眼セグメントを介するＦＲＰ−１の灌流の結果、流速の減少、および毛様体および小柱網（ＴＭ）におけるβ−カテニン蛋白質レベルの対応する減少をもたらした。培養された前方セグメントにおける減少した流速は、無傷眼における流失に対する抵抗（眼内圧の増大）における増加をモデル化する。
【００２８】
さらに、本発明者らは、他の者と一緒になって、ＦＲＰ−１の発現が緑内障小柱網組織および細胞においてアップレギュレートされることを示した（ここに引用してその全体を援用する、２００１年２月２８日に出願された「Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ｆｏｒ  Ｇｌａｕｃｏｍａ」と題された米国公開特許第２００２／００４９１７７号、出願第０９／７９６，００８号）。
【００２９】
これらの結果は、小柱網および毛様体において活動的なＷｎｔシグナリング経路があることを示し、この経路は、ＴＭを介する流出を維持し、それにより、ＩＯＰを制御することについて、少なくとも部分的に原因となることを示唆する。
【００３０】
本明細書中に引用された核酸配列は、他に断りのない限り、５’から３’への方向で書かれる。本明細書中で用いる用語「核酸」とは、ＤＮＡ（アデニン「Ａ」、シトシン「Ｃ」、グアニン「Ｇ」、チミン「Ｔ」）、またはＲＮＡ（アデニン「Ａ」、シトシン「Ｃ」、グアニン「Ｇ」、ウラシル「Ｕ」）に存在するプリンまたはピリミジン塩基を含むＤＮＡまたはＲＮＡまたはそれらの修飾形態のいずれかをいう。本明細書中で提供される干渉性ＲＮＡは、特に３’末端において、「Ｔ」塩基を含むことができるが、「Ｔ」塩基はＲＮＡにおいては天然に起こらない。「核酸」は用語「オリゴヌクレオチド」、および「ポリヌクレオチド」を含み、一本鎖分子または二本鎖分子をいうことができる。二本鎖分子は、ＡおよびＴ塩基、ＣおよびＧ塩基の間の、およびＡおよびＵ塩基の間のワトソン−クリック塩基対合によって形成される。二本鎖分子の鎖は相互に対して部分的、実質的または十分な相補性を有することができ、二重鎖ハイブリッドを形成し、その結合の強さは塩基の配列の相補性の性質および程度に依存する。
【００３１】
ｍＲＮＡ配列は対応するＤＮＡ配列の配列から容易に推定される。例えば、配列番号１は、ＦＲＰ−１についてのｍＲＮＡに対応するＤＮＡのセンス鎖配列を提供する。該ｍＲＮＡ配列は「Ｔ」塩基が「Ｕ」塩基で置き換えられたＤＮＡセンス鎖配列と同一である。
【００３２】
従って、ＦＲＰ−１のｍＲＮＡ配列は配列番号１から知られ、ＦＲＰ−１の同等体のｍＲＮＡ配列は配列番号１９１から知られる。
【００３３】
フリッツルド関連蛋白質（ＦＲＰ−１）  ｍＲＮＡ：ＧｅｎＢａｎｋデータベースは、配列番号１として「配列表」に掲げられているアクセション番号ＡＦ０５６０８７としてＦＲＰ−１に対するＤＮＡ配列を提供する。配列番号１は、（「Ｕ」塩基の代わりの「Ｔ」塩基を例外として）ＦＲＰ−１をコードするｍＲＮＡに対応するＤＮＡのセンス鎖配列を提供する。ＦＲＰ−１についてのコーディング配列はヌクレオチド３０３ないし１２４４からのものである。
【００３４】
先に引用したＦＲＰ−１  ｍＲＮＡ配列の同等物は代替スプライス形態、対立遺伝子形態、イソ酵素、またはその同族体である。同族体は、配列番号１に対して相同であるもう１つの哺乳動物種からのフリッツルド関連蛋白質−１  ｍＲＮＡである（すなわち、オルソログ）。配列番号１に関連するＦＲＰ−１核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＭ＿００３０１２（前記で引用）、ＢＣ０３６５０３、ＡＦ００１９００、ＢＣ００４４６６、ＡＦ０１７９８７、およびＢＴ０１９６７７を有するものを含む。
【００３５】
ＧｅｎＢａｎｋデータベースは、配列番号１９１として「配列表」に掲げられ、配列番号１と同等であると考えられるアクセション番号ＮＭ＿００３０１２としてＦＲＰ−１に対してさらなるＤＮＡ配列を提供する。配列番号１９１は、（「Ｕ」塩基の代わりの「Ｔ」塩基を例外として）ＦＲＰ−１をコードするｍＲＮＡに対応するＤＮＡのセンス鎖配列を提供する。分泌されたＦＲＰ−１についてのコーディング配列はヌクレオチド３０３ないし１２４７からのものである。
【００３６】
ｍＲＮＡの発現の減衰：本明細書中で用いられるフレーズ「ｍＲＮＡの発現の減衰」は、ある量の干渉性ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）を投与し、または発現させて、ｍＲＮＡ切断を介して、または翻訳の直接的阻害を介して標的ｍＲＮＡの蛋白質への翻訳を低下させることを意味する。標的ｍＲＮＡまたは対応する蛋白質の発現の低下が、通常は「ノック−ダウン」といわれ、非−標的化対照ＲＮＡ（例えば、非−標的化対照ｓｉＲＮＡ）の投与または発現に続いて存在するレベルに対して報告される。５０％および１００％を含み、かつそれらの間の量の発現のノック−ダウンが本明細書中における実施形態によって考えられる。しかしながら、そのようなノック−ダウンレベルは本発明の目的で達成する必要はない。一実施形態において、単一の干渉性ＲＮＡ標的化ＦＲＰ−１  ｍＲＮＡを投与する。他の実施形態において、ＦＲＰ−１  ｍＲＮＡを標的化する２以上の干渉性ＲＮＡを投与する。
【００３７】
ノック−ダウンは、定量的ポリメラーゼ鎖反応（ｑＰＣＲ）増幅を用いてｍＲＮＡレベルを測定することによってあるいはウェスタンブロットまたは酵素−結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）により蛋白質レベルを測定することによって通常は評価される。蛋白質レベルの分析は、ｍＲＮＡ切断ならびに翻訳阻害双方の評価を供する。ノック−ダウンを測定するためのさらなる技術はＲＮＡ溶液ハイブリダイゼーション、ヌクレアーゼ保護、ノーザンハイブリダイゼーション、マイクロアレイでの遺伝子発現モニタリング、抗体結合、ラジオイムノアッセイ、および蛍光活性化細胞分析を含む。
【００３８】
また、ＦＲＰ−１の阻害は、ここに引用して先に一体化させた米国公開特許出願２００４／０１８６１５９号に記載されたように、ＦＲＰ−１レベル、β−カテニンレベルまたはヒトの目の灌流された前方セグメントにおける流出速度を調べることによってイン・ビトロで決定することもできる。簡単に述べれば、目前方セグメントに１１ｍｍ  Ｈｇの一定圧力でダルベッコウの修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）を灌流する。各目の流出速度は、特定の期間においてその貯蔵庫の重量を測定することによって測定される。安定化期間の後、目にビークル対照、スクランブルドｓｉＲＮＡ配列対照、またはＦＲＰ−１を減衰させるための本明細書中に記載されたｓｉＲＮＡいずれかを灌流し、目の流出速度を２ないし５日間モニターした。房水流出速度は、特異的期間においてその貯蔵庫の重量を測定することによって測定される。対照値と比較した流出の増加は、ｓｉＲＮＡがＦＲＰ−１を減衰するにおいて効果的であることを示す。
【００３９】
また、ＦＲＰ−１の阻害は、例えば、眼内圧力の改良、視野の喪失の改良、または視神経乳頭変化の改良のような緑内障の症状の改良を観察することによってヒトまたは哺乳動物で推定される。
【００４０】
干渉性ＲＮＡ：本発明の一実施形態において、干渉性ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）はセンス鎖およびアンチセンス鎖を有し、センスおよびアンチセンス鎖は少なくとも１９ヌクレオチドの少なくとも殆ど完全な連続相補性の領域を含む。本発明のさらなる実施形態において、干渉性ＲＮＡは、ｍＲＮＡ内の対応する標的配列の３’末端の、各々、最後から２番目のヌクレオチドから連続する１３、１４、１５、１６、１７、または１８ヌクレオチドに対して配列相補性のパーセンテージを有し、またはそれに対して配列同一性のパーセンテージを有する少なくとも１３、１４、１５、１６、１７、または１８連続するヌクレオチドの領域を含む。
【００４１】
干渉性ＲＮＡの各鎖の長さは１９ないし４９ヌクレオチドを含み、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、または４９ヌクレオチドの長さを含むことができる。
【００４２】
ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、アンチセンス鎖がＲＩＳＣに取り込まれ、かくして、ＲＩＳＣが、切断または翻訳抑制のためにアンチセンスｓｉＲＮＡ鎖に対して少なくとも部分的相補性を持つ標的ｍＲＮＡを同定するのを可能とする、ｓｉＲＮＡの活性ガイディング剤である。
【００４３】
本発明の実施形態において、標的ｍＲＮＡ配列内の干渉性ＲＮＡ標的配列（例えば、ｓｉＲＮＡ標的配列）は利用可能な設計ツールを用いて選択される。次いで、標的ｍＲＮＡを発現する細胞のトランスフェクション、続いての前記したようなノックダウンの評価によって、ＦＲＰ−１標的配列に対応する干渉性ＲＮＡをテストする。
【００４４】
ｓｉＲＮＡについての標的配列を選択するための技術は、ｔｈｅ  Ｒｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙウェブサイトで利用可能な２００４年５月６日に改正されたＴｕｓｃｈｌ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，”Ｔｈｅ  ｓｉＲＮＡ  Ｕｓｅｒ  Ｇｕｉｄｅ”によって；ＡｍｄｉｏｎウェブサイトにおけるＴｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ♯５０６、ｓｉＲＮＡ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  Ａｍｂｉｏｎ  Ｉｎｃ．によって；および、例えば、ｔｈｅ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｄｈａｒｍａｃｏｎ，Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ，またはＰｒｏｌｉｇｏウェブサイトにおける他のウェブ−ベースの設計ツールによって供される。初期のサーチパラメータは３５％および５５％の間のＧ／Ｃ含有量、および１９および２７ヌクレオチドの間のｓｉＲＮＡ長さを含むことができる。標的配列はコーディング領域において、あるいはｍＲＮＡの５’または３’非−翻訳領域において位置させることができる。
【００４５】
ＦＲＰ−１  ｍＲＮＡについての１９−ヌクレオチドＤＮＡ標的配列の実施形態は、配列番号１のヌクレオチド５０９ないし５２７に存在する。
【００４６】
【化５】
2008533050.tif 000006
配列番号２の対応するｍＲＮＡ配列を標的化するための、かつ２１−ヌクレオチド鎖および２−ヌクレオチド３’突出を有する本発明のｓｉＲＮＡは：
【００４７】
【化６】
2008533050.tif 000007
である。各「Ｎ」残基はいずれのヌクレオチド（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、Ｔ）とすることもでき、あるいは修飾されたヌクレオチドとすることができる。３’末端は１、２、３、４、５、および６の間のおよびそれらを含めた多数の「Ｎ」残基を有することができる。いずれかの鎖の「Ｎ」残基は同一の残基（例えば、ＵＵ、ＡＡ、ＣＣ、ＧＧ、またはＴＴ）とすることができ、あるいは、それらは異なるもの（例えば、ＡＣ、ＡＧ、ＡＵ、ＣＡ、ＣＧ、ＣＵ、ＧＡ、ＧＣ、ＧＵ、ＵＡ，ＵＣ、またはＵＧ）とすることができる。３’突出は同一のものとすることができ、あるいは、異なるものとすることができる。一実施形態において、双方の鎖は３’ＵＵ突出を有する。
【００４８】
配列番号２の対応するｍＲＮＡ配列を標的とするための、かつ２１−ヌクレオチド鎖および各鎖上の３’ＵＵ突出を有する本発明のｓｉＲＮＡは
【００４９】
【化７】
2008533050.tif 000008
である。
【００５０】
干渉性ＲＮＡはヌクレオチドの５’突出を有してもよく、あるいは、それは平滑末端を有してもよい。配列番号２の対応するｍＲＮＡ配列を標的化するための、かつ１９−ヌクレオチド鎖および平滑末端を有する本発明のｓｉＲＮＡは
【００５１】
【化８】
2008533050.tif 000009
である。
【００５２】
二本鎖干渉性ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）の鎖を連結させてヘアピンまたはステム−ループ構造を形成してもよい（例えば、ｓｈＲＮＡ）。配列番号２の対応するｍＲＮＡ配列を標的化し、かつ１９ｂｐの二本鎖ステム領域および３’ＵＵ突出を有する本発明のｓｈＲＮＡは
【００５３】
【化９】
2008533050.tif 000010
である。ＮはヌクレオチドＡ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、あるいは当業者に知られた修飾された形態である。ループ中のヌクレオチドＮの数は３ないし２３または５ないし１５または７ないし１３、または４ないし９、または９ないし１１の間、およびそれらを含む数であるか、またはヌクレオチドＮの数は９である。ループ中のヌクレオチドのいくつかは、ループ中の他のヌクレオチドとの塩基−対相互作用に関与することができる。ループを形成するのに用いることができるオリゴヌクレオチド配列の例は５’−ＵＵＣＡＡＧＡＧＡ−３’（Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ，Ｔ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９６：  ５５０）および５’−ＵＵＵＧＵＧＵＡＧ−３’（Ｃａｓｔａｎｏｔｔｏ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（２００２）ＲＮＡ  ８：１４５４）を含む。得られた単一鎖オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡｉマシーナリーと相互作用できる二本鎖領域を含むステム−ループまたはヘアピン構造を形成することは当業者によって認識されるであろう。
【００５４】
前記で確認されたｓｉＲＮＡ標的配列は３’末端で延長してダイサ−基質２７マー二重鎖設計を容易とすることができる。ＦＲＰ−１  ＤＮＡ配列（配列番号１）で確認された１９−ヌクレオチドＤＮＡ標的配列（配列番号２）の６ヌクレオチドだけの延長は、配列番号１のヌクレオチド５０９ないし５３３：
【００５５】
【化１０】
2008533050.tif 000011
に存在する２５−ヌクレオチドＤＮＡ標的配列を生じる。配列番号１９５の対応するｍＲＮＡ配列を標的化するための本発明ダイサ−基質２７マー二重鎖
【００５６】
【化１１】
2008533050.tif 000012
である。センス鎖の３’末端における２つのヌクレオチド（すなわち配列番号１９６のＵＧヌクレオチド）は、増強されたプロセッシングのためのデオキシヌクレオチド（すなわち、ＴＧ）であってよい。本明細書中で提供されるような１９ないし２１ヌクレオチド標的配列からのダイサ−基質２７マー二重鎖の設計は、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）ウェブサイトによって、およびＫｉｍ，Ｄ．−Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，（２００５年２月）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２３：２；２２２−２２６によってさらに議論されている。
【００５７】
干渉性ＲＮＡが化学合成によって生産される場合、一方または（存在する場合）双方の鎖の５’末端におけるヌクレオチドの５’位置でのリン酸化はｓｉＲＮＡ有効性および結合されたＲＩＳＣ複合体の特異性を増強させることができるが、それは要求されるものではない、というのは、リン酸化は細胞内で起こり得るからである。
【００５８】
表１は、それから本発明のｓｉＲＮＡが前記したように設計される配列番号１および配列番号１９１のＦＲＰ１  ＤＮＡ標的配列の例をリストする。ＦＲＰ１は前記したようにフリッツルド関連蛋白質―１をコードする。
【００５９】
【表１】
2008533050.tif 000013
【００６０】
【表２】
2008533050.tif 000014
【００６１】
【表３】
2008533050.tif 000015
【００６２】
【表４】
2008533050.tif 000016
【００６３】
【表５】
2008533050.tif 000017
前記例で引用したように、当業者は表１に掲げられた標的配列情報を用いて、配列番号１または配列番号１９１中の配列の位置に言及し、および、各々、配列番号１または配列番号１９１に対して相補的な、または殆ど相補的なヌクレオチドを加え、欠失することによって、表１に掲げられた配列よりも短いまたは長い長さの配列を有する干渉性ＲＮＡを設計することができる。
【００６４】
ｓｉＲＮＡおよび干渉性ＲＮＡの他の形態によってガイドされる標的ＲＮＡ切断反応は高度に配列特異的である。一般に、標的ｍＲＮＡの一部に対する配列において同一であるセンスヌクレオチド鎖、および標的ｍＲＮＡの部分に対して正確に相補的であるアンチセンスヌクレオチド鎖を含有するｓｉＲＮＡは、本明細書中で引用したｍＲＮＡの阻害のためのｓｉＲＮＡの実施形態である。しかしながら、アンチセンスｓｉＲＮＡ鎖および標的ｍＲＮＡの間の、あるいはアンチセンスｓｉＲＮＡ鎖およびセンスｓｉＲＮＡ鎖の間の１００％の配列相補性は、本発明を実施するのに必要ではない。かくして、例えば、本発明は、遺伝子突然変異、株多形または進化の発散により期待されるであろう配列変異を可能とする。
【００６５】
本発明の一実施形態において、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、標的ｍＲＮＡとの少なくとも１９のヌクレオチドの少なくとも殆ど完全な連続相補性を有する。本明細書中で用いる「殆ど完全な」は、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖が標的ｍＲＮＡの少なくとも一部に対して「実質的に相補性」であり、ｓｉＲＮＡのセンス鎖は標的ｍＲＮＡの少なくとも部分に対して「実質的に同一である」を意味する。当業者によって知られた「同一性」は、配列の間のヌクレオチドの順序および同一性をマッチングされることによって決定されるヌクレオチド配列の間の配列関連性の程度である。一実施形態において、標的ｍＲＮＡ配列に対して８０％および８０％ないし１００％の間の相補性、例えば、８５％、９０％または９５％相補性を有するｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は殆ど完全な相補性と考えられ、本発明で用いてもよい。「完全な」連続的相補性は隣接塩基対の標準ワトソン−クリック塩基対合である。「少なくとも殆ど完全な」連続的相補性は本明細書中で用いる「完全な」相補性を含む。同一性または相補性を決定するためのコンピューター方法は、最大程度のヌクレオチド配列のマッチングを同定するように設計される。例えば、ＢＬＡＳＴＮ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０）。
【００６６】
用語「パーセント同一性」は、第二の核酸分子における同一長さの連続するヌクレオチドの組において同一である、第一の核酸分子における連続するヌクレオチドのパーセンテージを記載する。用語「パーセント相補性」は、第二の核酸分子における連続するヌクレオチドの組とワトソン−クリックの意味で塩基対合できる第一の核酸分子における連続するヌクレオチドのパーセンテージを記載する。
【００６７】
標的ｍＲＮＡ（センス鎖）およびｓｉＲＮＡの１つの鎖（センス鎖）の間の関係は同一性のそれである。ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、もし存在すれば、パッセンジャー鎖とも呼ばれる。標的ｍＲＮＡ（センス鎖）およびｓｉＲＮＡの他の鎖（アンチセンス鎖）の間の関係は相補性のそれである。ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖はガイド鎖とも呼ばれる。
【００６８】
５’から３’への方向に書かれる核酸配列中の最後から二番目の塩基は最後の塩基の次、すなわち、３’塩基の次の塩基である。５’から３’への方向に書かれる核酸配列の最後から二番目の塩基から連続する１３塩基は３’塩基の次の配列の最後の１３塩基であり、かつ３’塩基を含まない。同様に、５’から３’への方向に書かれる核酸配列の最後から二番目の塩基から連続する１４、１５、１６、１７、または１８塩基は、各々、３’塩基の次であり、３’塩基を含まない配列の最後の１４、１５、１６、１７、または１８塩基である。
【００６９】
フレーズ「（配列アイデンティファイヤー）のいずれか１つに対応するｍＲＮＡの３’末端の最後から二番目のヌクレオチドから連続する１３ヌクレオチドに対して少なくとも９０％の配列相補性または少なくとも９０％の配列同一性を有する少なくとも１３の連続するヌクレオチドの領域」は１つのヌクレオチド置換を可能とする。二つのヌクレオチド置換（すなわち、１１／１３＝８５％同一性／相補性）はそのようなフレーズに含まれない。
【００７０】
本発明の一実施形態において、連続するヌクレオチドの領域は、各配列アイデンティファイヤーによって確認される配列に対応するｍＲＮＡの３’末端の最後から二番目のヌクレオチドから連続する１４ヌクレオチドに対して少なくとも８５％の配列相補性、または少なくとも８５％の配列同一性を有する少なくとも１４の連続するヌクレオチドの領域である。２つのヌクレオチド置換（すなわち、１２／１４＝８６％同一性／相補性）はそのようなフレーズに含まれる。
【００７１】
本発明のさらなる実施形態において、連続するヌクレオチドの領域は、配列アイデンティファイヤーの配列に対応するｍＲＮＡの３’末端の最後から二番目のヌクレオチドから連続する１４ヌクレオチドに対して、少なくとも８０％の配列相補性または少なくとも８０％の配列同一性を有する少なくとも１５、１６、１７または１８連続するヌクレオチドの領域である。３つのヌクレオチドの置換がそのようなフレーズに含まれる。
【００７２】
配列番号１または配列番号１９１に対応するｍＲＮＡ中の標的配列はｍＲＮＡの５’または３’非翻訳領域に、ならびにｍＲＮＡのコーディング領域にあってよい。
【００７３】
二本鎖干渉性ＲＮＡの鎖の一方又は双方は、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドまたはその混合物であり得る、１ないし６ヌクレオチドの３’突出を有してもよい。突出のヌクレオチドは塩基−対合していない。本発明の一実施形態において、干渉性ＲＮＡはＴＴまたはＵＵの３’突出を含む。本発明の他の実施形態において、干渉性ＲＮＡは少なくとも１つの平滑末端を含む。末端は、通常、５’リン酸基または３’ヒドロキシル基を有する。他の実施形態において、アンチセンス鎖は、５’リン酸基を有し、センス鎖は５’ヒドロキシル基を有する。なお他の実施形態において、末端は、他の分子または官能基の共有結合付加によってさらに修飾される。
【００７４】
二本鎖ｓｉＲＮＡのセンスおよびアンチセンス鎖は前記した２つの単一鎖の二重鎖形成におけるものであってもよく、あるいは単一分子であってよく、そこでは、相補性の領域は塩基−対合されており、ヘアピンループによって共有結合されて、単一鎖を形成する。ヘアピンはダイサーと呼ばれる蛋白質によって細胞内で切断されて、２つの個々の塩基−対合ＲＮＡ分子の干渉性ＲＮＡを形成すると考えられている。
【００７５】
干渉性ＲＮＡは、１以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換または修飾によって天然に生じるＲＮＡから異なってもよい。非−ヌクレオチド物質は５’末端において、３’末端において、または内部で干渉性ＲＮＡに結合してもよい。そのような修飾は、干渉性ＲＮＡのヌクレアーゼ抵抗性を増大させ、細胞の摂取を改良し細胞標的化を増強させ、干渉性ＲＮＡを追跡するにおいて助け、安定性をさらに改良し、またはインターフェロン経路の活性化に対する潜在能力を低下させるように設計される。例えば、干渉性ＲＮＡは突出の末端においてプリンヌクレオチドを含むことができる。例えば、ピロリジンリンカーによってｓｉＲＮＡ分子のセンス鎖の３’末端に対するコレステロールのコンジュゲーションもまた、ｓｉＲＮＡに対して安定性を供する。
【００７６】
さらなる修飾は、例えば、３’末端ビオチン分子、細胞−貫通特性を有することが知られたポリペプチド、ナノ粒子、ペプチドミメティック、蛍光色素、またはデンドリマーを含む。
【００７７】
ヌクレオチドはそれらの塩基部分で、それらの糖部分で、あるいは本発明の実施形態における分子および機能のリン酸部分で修飾してもよい。修飾は、例えば、アルキル、アルコキシ、アミノ、デアザ、ハロ、ヒドロキシル、チオール基またはその組合せでの置換を含む。ヌクレオチドは、例えば、デオキシリボヌクレオチドでリボヌクレオチドを置き換える、あるいは、例えば、２’アミノ基、２’Ｏ−メチル基、２’メトキシエチル基、または２’Ｏ、４’Ｃメチレンブリッジによって置き換えられた２’ＯＨ基のような糖修飾を有する、より大きな安定性を持つアナログで置換されていてもよい。ヌクレオチドのプリンまたはピリミジンアナログの例はキサンチン、ヒポキサンチン、アザプリン、メチルチオアデニン、７−デアザ−アデノシンおよびＯ−およびＮ−修飾ヌクレオチドを含む。ヌクレオチドのリン酸基は、窒素、または硫黄でリン酸基の酸素の１以上を置き換えることによって修飾することができる（ホスホロチオエート）。修飾は、例えば、機能を増強するのに、安定性または浸透性を改良するのに、または局所化または標的化を指令するのに有用である。
【００７８】
配列番号１または配列番号１９１の部分に対して相補性でないアンチセンス干渉性ＲＮＡ鎖の領域又は複数領域があってもよい。非−相補性領域は相補性領域の３’、５’または双方の末端におけるものであってよく、あるいは２つの相補性領域の間であってもよい。
【００７９】
干渉性ＲＮＡは化学合成によって、イン・ビトロ転写によって、またはダイサーまたは同様な活性を持つもう１つの適当なヌクレアーゼでのより長い二本鎖ＲＮＡの切断によって外因的に生じさせることができる。慣用的なＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザーを用いて保護されたリボヌクレオシドホスホルアミダイトから生じた、化学的に合成された干渉性ＲＮＡは、Ａｍｂｉｏｎ  Ｉｎｃ．（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ），Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ），またはＤｈａｒｍａｃｏｎ（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＣＯ）のような商業的な供給業者から得ることができる。干渉性ＲＮＡは、例えば、溶媒または樹脂での抽出、沈殿、電気泳動、クロマトグラフィーまたはその組合せによって精製される。別法として、干渉性ＲＮＡは、試料の加工による喪失を回避するのに、もしあっても精製で殆ど用いることができない。
【００８０】
また、干渉性ＲＮＡは、プラスミドまたはウイルス発現ベクターから、あるいは最小発現カセット、例えば、１以上のプロモーターおよび干渉性ＲＮＡのための適当な鋳型または複数鋳型を含むＰＣＲで生じた断片から内因的に発現させることもできる。ｓｈＲＮＡのための商業的に入手可能なプラスミド−ベースの発現ベクターの例は、ｐＳｉｌｅｎｃｅｒシリーズ（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）のメンバーおよびｐＣｐＧ−ｓｉＲＮＡ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を含む。干渉性ＲＮＡの発現のためのウイルスベクターは、アデノウイルス、アデノ−関連ウイルス、レンチウイルス（例えば、ＨＩＶ、ＦＩＶ、およびＥＩＡＶ）およびヘルペスウイルスを含めた種々のウイルスから由来してもよい。ｓｈＲＮＡ発現のための、商業的に入手可能なウイルスベクターの例はｐＳｉｌｅｎｃｅｒ  ａｄｅｎｏ（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）およびｐＬｅｎｔｉ６／ＢＬＯＣＫ−ｉＴＴＭ−ＤＥＳＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を含む。ウイルスベクターの選択、ベクターからの干渉性ＲＮＡを発現する方法、およびウイルスベクターを送達する方法は当業者の通常の技量内のことである。ＰＣＲ−生成ｓｈＲＮＡ発現カセットの生産上のキットの例はＳｉｌｅｎｃｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）およびｓｉＸｐｒｅｓｓ（Ｍｉｒｕｓ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を含む。第一の干渉性ＲＮＡは第一の干渉性ＲＮＡを発現することができる第一の発現ベクターからのイン・ビボ発現を介して投与してもよく、第二の干渉性ＲＮＡは第二の干渉性ＲＮＡを発現させることができる第二の発現ベクターからのイン・ビボ発現を介して投与してもよく、あるいは双方の干渉性ＲＮＡは、双方の干渉性ＲＮＡを発現することができる単一発現ベクターからイン・ビボ発現を介して投与してもよい。
【００８１】
干渉性ＲＮＡは、Ｕ６またはＨ１プロモーターのようなｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターまたはサイトメガロウイルスプロモーターのようなｐｏｌ  ＩＩプロモーターを含めた、当業者に知られた種々の真核生物プロモーターから発現させることができる。当業者であれば、これらのプロモーターは干渉性ＲＮＡの誘導可能な発現を可能とするのに適合させることもできることを認識するであろう。
【００８２】
生理学的条件下でのハイブリダイゼーション：本発明のある実施形態において、干渉性ＲＮＡのアンチセンス鎖はＲＩＳＣ複合体の一部としてイン・ビボにてｍＲＮＡとハイブリダイズする。
【００８３】
「ハイブリダイゼーション」とは、相補的なまたは殆ど相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸が相互作用して、ハイブリッドと呼ばれる水素−結合複合体を形成するプロセスをいう。ハイブリダイゼーション反応は感受性であって、かつ選択的である。イン・ビトロにおいて、ハイブリダイゼーションの特異性（すなわち、ストリンジェンシー）はプレハイブリダイゼーションにおける塩またはホルムアミドの濃度およびハイブリダイゼーション溶液によって、例えば、ハイブリダイゼーション温度によって制御され、そのような手法は当該分野で良く知られている。特に、ストリンジェンシーは、塩の濃度を低下させ、ホルムアミドの濃度を増大させ、またはハイブリダイゼーション温度を上昇させることによって増加する。
【００８４】
例えば、高ストリンジェンシー条件は３７℃ないし４２℃における約５０％ホルムアミドで起こり得る。低下したストリンジェンシー条件は３０℃ないし３５℃における約３５％ないし２５％ホルムアミドにおいて起こり得る。ハイブリダイゼーションのためのストリンジェンシー条件の例はＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．に供される。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件のさらなる例は、４００ｍＭ  ＮａＣｌ、４０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ  ｐＨ６．４、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１２ないし１６時間の５０℃または７０℃、続いての、洗浄、あるいは１ＸＳＳＣ中の７０℃、または１ＸＳＳＣ中の５０℃、５０％ホルムアミドでのハイブリダイゼーション、続いての０．３ＸＳＳＣ中での７０℃における洗浄、または４ＸＳＳＣ中での７０℃または４ＸＳＳＣ中での５０℃、５０％ホルムアミドでのハイブリダイゼーション、続いての１ＸＳＳＣ中での６７℃における洗浄を含む。ハイブリダイゼーションのための温度はハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）の５−１０℃低く、ここに、Ｔｍは以下の計算を用いて、長さが１９および４９の間の塩基対のハイブリッドについて決定され：Ｔｍ℃＝８１．５＋１６．６  （ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］＋０．４１（％  Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ）、ここに、Ｎはハイブリッドにおける塩基の数であり、および「Ｎａ＋」はハイブリダイゼーション緩衝液中のナトリウムイオンの濃度である。
【００８５】
前記したイン・ビトロハイブリダイゼーションアッセイは、候補ｓｉＲＮＡおよび標的の間の結合が特異性を有するか否かを予測する方法を提供する。しかしながら、ＲＩＳＣ複合体の関係では、標的の特異的な切断は、イン・ビトロでのハイブリダイゼーションのための高いストリンジェンシーを示さないアンチセンス鎖でも起こり得る。
【００８６】
一本鎖干渉性ＲＮＡ：前記したように干渉性ＲＮＡは最後には単一鎖として機能する。一本鎖（ｓｓ）干渉性ＲＮＡは、二本鎖ＲＮＡよりも低い効率にかかわらず、ｍＲＮＡサイレンシングを行うことが見出された。従って、本発明の実施形態は、生理学的条件下で配列番号１または配列番号１９１の部分に対してハイブリダイズしおよび、各々、配列番号１または配列番号１９１のハイブリダイズする部分との少なくとも１９ヌクレオチドの少なくとも殆ど完全な連続的相補性の領域を有するｓｓ干渉性ＲＮＡの投与を提供する。ｓｓ干渉性ＲＮＡは、前記したｄｓ干渉性ＲＮＡに関して１９ないし４９ヌクレオチドの長さを有する。ｓｓ干渉性ＲＮＡは５’リン酸を有し、５’位置においてインサイチュウまたはイン・ビボでリン酸化される。用語「５’リン酸化された」は、例えば、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの５’末端における糖（例えば、リボース、デオキシリボース、またはそのアナログ）のＣ５ヒドロキシルへエステル結合を介して結合されたリン酸基を有するポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを記載するために使用される。
【００８７】
ｓｓ干渉性ＲＮＡは化学的に、またはイン・ビトロ転写によって合成され、あるいはｄｓ干渉性ＲＮＡに関してはベクターまたは発現カセットから内因的に発現される。５’リン酸基はキナーゼを介して付加することができ、あるいは、５’リン酸はＲＮＡのヌクレアーゼ切断の結果であり得る。送達はｄｓ干渉性ＲＮＡの通りである。一実施形態において、保護された末端およびヌクレアーゼ抵抗性修飾を有するｓｓ干渉性ＲＮＡはサイレンシングのために投与される。ｓｓ干渉性ＲＮＡは貯蔵のために乾燥し、あるいは水性溶液に溶解させてもよい。溶液はアニーリングを阻害するための、または安定化のための緩衝液または塩を含有することができる。
【００８８】
ヘアピン干渉性ＲＮＡ：ヘアピン干渉性ＲＮＡは、ステム−ループまたはヘアピン構造中に干渉性ＲＮＡのセンスおよびアンチセンス鎖を共に含む単一分子（例えば、単一オリゴヌクレオチド鎖）である（例えば、ｓｈＲＮＡ）。例えば、ｓｈＲＮＡは、センス干渉性ＲＮＡ鎖をコードするＤＮＡオリゴヌクレオチドが短いスペーサーによって逆相補性アンチセンス干渉性ＲＮＡ鎖をコードするＤＮＡオリゴヌクレオチドに連結したＤＮＡベクターから発現させることができる。もし選択された発現ベクターで必要であれば、３’末端Ｔおよび制限部位を形成するヌクレオチドを加えてもよい。得られたＲＮＡ転写体はそれ自体に折り畳まれて、ステム−ループ構造を形成する。
【００８９】
投与の形態：干渉性ＲＮＡは、眼周囲、結膜、テノン嚢下（ｓｕｂｔｅｎｏｎ）、前眼房内、硝子体内、眼内、網膜下、結膜下、眼球後、小管内、または脈絡板上投与のような眼組織投与によって；注射によって、カテーテル、あるいは網膜ペレット、眼内インサート、多孔性、非−多孔性またはゼラチン状物質を含む座薬またはインプラントのような他の配置デバイスを用いる眼への直接的適用によって；局所的な点眼剤または軟膏によって；盲管中の、または強膜に隣接して移植された（経強膜）または眼内の徐放デバイスによって眼へ直接的に送達することができる。前眼房内注射は角膜を通って前房に入れて、剤が小柱網に到達するのを可能とすることができる。小管内注射はシュレム管を排出させる静脈コレクターチャネルまたはシュレム管へ行うことができる。全身または非経口投与が考えられ、限定されるものではないが、静脈内、皮下、経皮、および経口送達を含む。
【００９０】
被験体：緑内障についての治療を必要とする、または緑内障を発症する危険性がある被験体は緑内障を有する、あるいは本明細書中で言及するＦＲＰ−１の望まないまたは不適切な発現または活性に関連する高血圧のような緑内障−関連疾患を発症する危険性があるヒトまたは他の哺乳動物である。そのような障害に関連する眼の構造は、例えば、眼、網膜、脈絡膜、レンズ、角膜、小柱網、虹彩、視神経、視神経乳頭、強膜、眼房、硝子体眼房、毛様体または後方セグメントを含むことができる。被験体は眼細胞、細胞培養、器官またはエクス・ビボ器官または組織であってもよい。
【００９１】
処方および用量：医薬処方は水、緩衝液、生理食塩水、グリシン、ヒアルロン酸、マンニトールなどのような生理学上許容される眼科担体媒体と混合された９９重量％までの本発明の干渉性ＲＮＡ、またはその塩を含む。
【００９２】
本発明の干渉性ＲＮＡは溶液、懸濁液、またはエマルジョンとして投与される。以下に示すのは本発明によって具体化された可能な処方の例である。
【００９３】
【表６】
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一般に、本明細書中において提供される組合せ組成物の用量は変化するが、これは有効量であり、これは、重複する時間間隔の間に一緒に作用する干渉性ＲＮＡの組合せの量をいい、これは、血管新生または血管形成の退行を効果的に阻害し、または引き起こし、それにより、例えば、ヒト患者において、網膜浮腫、ＡＭＤ、ＤＲ、網膜虚血症に関連する続発症、またはＰＳＮＶを予防しまたは治療する。
【００９４】
一般に、本発明の実施形態の干渉性ＲＮＡの有効量は、１００ｐＭないし１００ｎＭ、または１ｎＭないし５０ｎＭ、または５ｎＭないし約１０ｎＭ、または約２５ｎＭの標的細胞の表面における細胞外濃度をもたらす。この局所的濃度を達成するのに必要な用量は、送達方法、送達の部位、送達部位および標的細胞または組織の間の細胞層の数、送達が局所的または全身的であるかなどを含めた多数の因子に依存して変化するであろう。送達部位における濃度は、標的細胞または組織の表面におけるよりもかなり高くなり得る。局所組成物は、技量のある臨床家のルーチン的裁量に従って１日当たり１ないし４回、あるいは毎日、毎週、２週間毎に、毎月、またはそれ以上のような延長された送達スケジュールで眼の表面に送達される。処方のｐＨは約ｐＨ４ないし９、またはｐＨ４．５ないしｐＨ７．４である。
【００９５】
ＦＲＰ−１  ｍＲＮＡに対して向けられたｓｉＲＮＡを使用しての患者の治療的処置は、作用の持続期間を増加させ、それにより、より少ない頻度の投与、およびより大きな患者のコンプライアンスを可能とすることによって、小分子局所的点眼剤よりも利点があると予測される。
【００９６】
正確なレジメンは臨床家の裁量に委ねられるが、干渉性ＲＮＡは臨床家によって指令されるように各眼に一滴を入れることによって投与することができる。処方の有効量は、例えば、被験体の年齢、人種および性別、眼高血圧の重篤度、標的遺伝子転写体／蛋白質代謝回転の速度、干渉性ＲＮＡの効力、および干渉性ＲＮＡ安定性のような因子に依存し得る。一実施形態において干渉性ＲＮＡは眼に局所送達され、治療用量にて小柱網、網膜または視神経乳頭に到達し、それにより、緑内障の疾患の過程を軽減する。
【００９７】
許容される担体：眼科的に許容される担体とは、眼の刺激をせいぜいほとんどまたは全く引き起こさず、必要であれば適当な保存を供し、均一用量における本発明の１以上の干渉性ＲＮＡを送達する担体をいう。本発明の実施形態の干渉性ＲＮＡの投与用の許容される担体はカチオン性脂質−ベースのトランスフェクション試薬ＴｒａｎｓＩＴ（登録商標）−ＴＫＯ（Ｍｉｒｕｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）、リポフェクタミン、ＯＬＩＧＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥＴＭ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）またはＤＨＡＲＭＡＦＥＣＴＴＭ  （Ｄｈａｒｍａｃｏｎ，Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＣＯ）；ポリエチレンイミンのようなポリカチオン；Ｔａｔ、ポリアルギニン、またはペネトラチン（Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ）（Ａｎｔｐペプチド）のようなカチオン性ペプチド；またはリポソームを含む。リポソームは、標準的な小胞−形成脂質およびコレステロールのようなステロールから形成され、例えば、内皮細胞表面抗原に対して結合親和性を有するモノクローナル抗体のような標的化分子を含んでもよい。さらに、リポソームはＰＥＧ化リポソームであってよい。
【００９８】
干渉性ＲＮＡは溶液中にて、懸濁液中にて、または生体侵食性または非−生体侵食性送達デバイス中にて送達することができる。干渉性ＲＮＡは単独で、あるいは規定された共有結合コンジュゲートの成分として送達することができる。干渉性ＲＮＡはカチオン性脂質、カチオン性ペプチドまたはカチオン性ポリマーと複合体化させることもでき；蛋白質、融合蛋白質、または核酸結合特性を持つ蛋白質ドメイン（例えば、プロタミン）と複合体化させることもでき；あるいはナノ粒子中にカプセル化することもできる。組織−または細胞−特異的送達は、抗体または抗体断片のような適当な標的化部位を含めることによって達成することができる。
【００９９】
眼送達では、干渉性ＲＮＡは眼科的に許容される保存剤、共−溶媒、界面活性剤、粘度増強剤、浸透増強剤、緩衝剤、塩化ナトリウムまたは水と組み合わせて水性、滅菌眼懸濁液もしくは溶液を形成してもよい。眼溶液処方は、干渉性ＲＮＡを生理学的に許容される等張水性緩衝液中に溶解させることによって調製することができる。さらに、眼溶液は阻害剤を溶解させるのを助けるための眼科的に許容される界面活性剤を含むことができる。ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどのような粘度形成剤を本発明の組成物に加えて、化合物の滞留を改良することができる。
【０１００】
滅菌眼科軟膏処方を調製するためには、干渉性ＲＮＡを、鉱油、液体ラノリン、または白色ペトロラタムのような適当なビークル中にて保存剤と組み合わせる。滅菌眼科ゲル処方は、他の眼科処方について当該分野で知られた方法に従って、干渉性ＲＮＡを、例えば、ＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）−９４０（ＢＦ  Ｇｏｏｄｒｉｃｈ，Ｃｈａｒｌｏｔｔｅ，ＮＣ）などの組合せから調製された親水性基材に懸濁させることによって調製することができる。ＶＩＳＣＯＡＴ（登録商標）（Ａｌｃｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｏｒｔ  Ｗｏｒｔｈ，ＴＸ）は、例えば、眼内注射のために用いることができる。本発明の他の組成物は、干渉性ＲＮＡが眼の中にあまり浸透しない場合、クレメフォールおよびＴＷＥＥＮ（登録商標）８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）のような浸透促進剤を含有することができる。
【０１０１】
キット：本発明の実施形態は、細胞中の本明細書中に記載されたｍＲＮＡの発現を減衰させるための試薬を含むキットを提供する。該キットはｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ発現ベクターを含有する。ｓｉＲＮＡおよび非−ウイルスｓｈＲＮＡ発現ベクターでは、キットはトランスフェクション試薬または他の適当な送達ビークルを含有することもできる。ウイルスｓｈＲＮＡ発現ベクターでは、キットはウイルスベクターおよび／またはウイルスベクター生産に必要な成分（例えば、パッケージング細胞系ならびにウイルスベクター鋳型を含むベクターおよびパッケージングのためのさらなるヘルパーベクター）を含有することができる。該キットは陽性および陰性対照ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ発現ベクター（例えば、非−標的化対照ｓｉＲＮＡまたは無関係なｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡ）を含有することもできる。該キットは、意図した標的遺伝子のノックダウンを評価するための試薬（例えば、標的ｍＲＮＡを検出するための定量的ＰＣＲのためのプライマーおよびプローブならびに／またはウェスタンブロット用の対応する蛋白質に対する抗体）を含有することもできる。別法として、該キットはｓｉＲＮＡ配列またはｓｈＲＮＡ配列、およびイン・ビトロ転写によってｓｉＲＮＡを生じさせるのに、またはｓｈＲＮＡ発現ベクターを構築するのに必要な指示書および物質を含むことができる。
【０１０２】
パッケージされた組合せにて、それと共に密接に封入される容器手段、および干渉性ＲＮＡ組成物および眼科的に許容される担体を含めた第一の容器手段を受け取るのに適合されたキャリアー手段を含むキット形態の医薬組合せがさらに提供される。そのようなキットは、所望であれば、当業者に容易に明らかなように、例えば、１以上の医薬上許容される担体、さらなる容器などと共に容器のような種々の慣用的な医薬キット成分の１以上をさらに含むことができる。投与すべき成分の量、投与についてのガイドラインおよび／または成分を混合するためのガイドラインを示す添付文書としての、または標識としての印刷された指示書もキットに含めることができる。
【０１０３】
例えば、ヒト小柱網（ＴＭ）細胞中の内因性ＦＲＰ−１発現のレベルをノックダウンするＦＲＰ−１干渉性ＲＮＡの能力は以下のように行われる。ＧＴＭ３またはＨＴＭ−３（Ｐａｎｇ，Ｌ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，．１９９４．Ｃｕｒｒ．Ｅｙｅ  Ｒｅｓ．１３：５１−６３参照）と命名された形質転換されたヒトＴＭ細胞系のトランスフェクションは、１：１（ｗ／ｖ）比率の本明細書中で記載された標準イン・ビトロ濃度のＦＲＰ−１干渉性ＲＮＡ（１００ｎＭ）およびＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥＴＭ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて達成される。スクランブルドおよびラミンＡ／Ｃ  ｓｉＲＮＡ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）を対照として用いる。ＱＰＣＲ  ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）順方向および逆方向プライマー、および標的部位を含むプローブ組を用いて、ｍＲＮＡ切断の程度を評価する。そのようなプライマー／プローブ組は、例えば、ＡＢＩ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）によって合成することができる。非−特異的オフ標的効果の機会を低下させるために、ＦＲＰ−１  ｍＲＮＡ発現を阻害するための最低限の可能性のあるｓｉＲＮＡ濃度をｓｉＲＮＡについて決定する。ＦＲＰ−１  ｍＲＮＡノックダウンは、適当なプライマー／プローブ組を用いてＱＰＣＲ増幅によって評価する。ＧＴＭ３細胞におけるＦＲＰ−１  ｓｉＲＮＡの用量応答は、例えば、０、１、３、１０、３０、および１００ｎＭ用量範囲のｓｉＲＮＡでの２４時間処理後にＧＴＭ３細胞で観察される。データは、可変傾き、シグモイド用量応答アルゴリズムおよび１００％の頂部拘束にてＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ４ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて適合させる。ＩＣ５０はテストした特定のｓｉＲＮＡで得られる。
【実施例】
【０１０４】
（実施例１）
（ＦＲＰ１をサイレントとするための干渉性ＲＮＡ）
本実験は、ＣＯＳ細胞における内因性ＦＲＰ１  ｍＲＮＡのレベルをノックダウンするＦＲＰ１干渉性ＲＮＡの能力を調べる。
【０１０５】
ＣＯＳ−７細胞をトランスフェクションの前日に１２−ウェルプレート中にて〜２０％集密にて平板培養した。トランスフェクションの時点において、細胞は５０ないし７０％集密であるように見えた。細胞をトランスフェクションから１および３日後に収穫した。センス鎖配列５’ＡＡＧＡＡＧＡＵＵＧＵＣＣＣＣＡＡＧＡＡＧ３’（５’ＡＡを加えた配列番号１８である配列番号１４６；Ｄｈａｒｍａｃｏｎ，Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，Ｃｏｌｏｒａｄｏから購入）を有する二本鎖ＦＲＰ１−ｓｉＲＮＡのトランスフェクションを、三連での１２−ウェルプレートの各ウェルにつき、ＯＬＩＧＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥＴＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）および１００ナノモルのｓｉＲＮＡを用いて行った。対照はｓｉＲＮＡなしである。ＲＮＡ抽出はＰＣＲ（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）用のＲＮＡｑｕｅｏｕｓＴＭによるものであり、ｃＤＮＡをＴＡＱＭＡＮＴＭ逆転写剤（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ））で合成した。ＱＰＣＲは、ＴＡＱＭＡＮＴＭユニバーサルＰＣＲマスターミックスおよび７７００  ＳＤＳ（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて三連で行った。リボソームＲＮＡ（１８ｓ、ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を多重ＱＰＣＲにて正規化対照として用いた。ＱＰＣＲデータを図１に掲げ、対照と比較して、トランスフェクション後の１日（２２％、Ｐ＝０．０４）および３日（３２％、Ｐ＝０．００２）においてＦＲＰ１  ｍＲＮＡの有意な阻害を示す。
【０１０６】
本明細書中で引用した文献は、それらが例示的手法または本明細書中に記載したものを補充する他の詳細を提供する限りにおいて、ここに引用して具体的に一体化させる。
【０１０７】
当業者であれば、本開示に徴して、本明細書中に開示された実施形態の明白な修飾を、本発明の精神および範囲を逸脱することなく行うことができるのを認識するであろう。本明細書中に開示された実施形態の全ては、本開示に徴して過度な実験なくして行い、実行することができる。本発明の全範囲は該開示およびその同等な実施形態に記載される。明細書は、本発明がその権利を有する保護の全範囲を不当にも狭くすると解釈されるべきではない。
【０１０８】
本明細書中で用いるように、かつ他に断りがなければ用語「ある」は「１つの」、「少なくとも１つの」、「１以上の」を意味するように取られる。
【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１】図１は、ＱＰＣＲによって測定して、ＣＯＳ７細胞における内因性ＦＲＰ１  ｍＲＮＡのレベルに対する干渉性ＲＮＡの効果を示す。ＦＲＰ１  ｍＲＮＡの有意な阻害は実施例１に記載されたように対照と比較して、トランスフェクションから１日後に（２２％、Ｐ＝０．０４）および３日後に（３２％、Ｐ＝０．００２）観察された。