【手続補正書】
【提出日】平成24年1月6日(2012.1.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）コモウイルス科（Ｃｏｍｏｖｉｒｉｄａｅ）の２分節ＲＮＡウイルスのＲＮＡ−２ゲノムセグメント由来の発現エンハンサー配列であって、前記ＲＮＡ−２ゲノムセグメントの開始部位が変異され、
前記コモウイルス科（Ｃｏｍｏｖｉｒｉｄａｅ）のウイルスの前記ＲＮＡ−２ゲノムセグメントは、同じトリプレットリーディングフレームに位置する２つの異なる翻訳開始部位を介して２つのカルボキシ共末端タンパク質をコードし、
変異された前記開始部位は、前記２つの開始部位のうちの第１であり、ササゲモザイクウイルス（ＣＰＭＶ）の野生型ＲＮＡ−２セグメントの１６１位の開始部位に相当する、発現エンハンサー配列と、
（ｂ）目的のタンパク質をコードする遺伝子の、遺伝子発現系への挿入を促進するための異種配列であって、前記エンハンサー配列内の変異された前記開始部位の下流に位置する異種配列と、必要に応じて
（ｃ）３’ＵＴＲと、
を含む、遺伝子発現構築物を含む、遺伝子発現系。
【請求項２】
（ａ）コモウイルス科（Ｃｏｍｏｖｉｒｉｄａｅ）の２分節ＲＮＡウイルスのＲＮＡ−２ゲノムセグメント由来の発現エンハンサー配列であって、前記ＲＮＡ−２ゲノムセグメントの開始部位が変異され、
前記コモウイルス科（Ｃｏｍｏｖｉｒｉｄａｅ）のウイルスの前記ＲＮＡ−２ゲノムセグメントは、同じトリプレットリーディングフレームに位置する２つの異なる翻訳開始部位を介して２つのカルボキシ共末端タンパク質をコードし、
変異された前記開始部位は、前記２つの開始部位のうちの第１であり、ササゲモザイクウイルス（ＣＰＭＶ）の野生型ＲＮＡ−２セグメントの１６１位の開始部位に相当する、発現エンハンサー配列と、
（ｂ）目的のタンパク質をコードする遺伝子であって、前記目的のタンパク質をコードする遺伝子は、前記エンハンサー配列の下流に位置し、前記目的のタンパク質をコードする遺伝子は、プロモーターおよび終結配列に作動可能に連結される、目的のタンパク質をコードする遺伝子と、
を含む、遺伝子発現系。
【請求項３】
３’ＵＴＲを含むか、またはさらに含み、前記３’ＵＴＲは必要に応じて、同じ２分節ＲＮＡウイルス由来である、請求項２に記載の遺伝子発現系。
【請求項４】
前記２分節ＲＮＡウイルスがコモウイルスである、請求項２または３に記載の遺伝子発現系。
【請求項５】
前記コモウイルスが（ＣＰＭＶ）である、請求項４に記載の遺伝子発現系。
【請求項６】
前記エンハンサー配列が、変異された前記開始部位を有するコモウイルスＲＮＡ−２ゲノムセグメント配列の少なくともヌクレオチド１０〜５１２、２０〜５１２、３０〜５１２、４０〜５１２、５０〜５１２、１００〜５１２、１５０〜５１２、１〜５１４、１０〜５１４、２０〜５１４、３０〜５１４、４０〜５１４、５０〜５１４、１００〜５１４、１５０〜５１４、１〜５１１、１０〜５１１、２０〜５１１、３０〜５１１、４０〜５１１、５０〜５１１、１００〜５１１、１５０〜５１１、１〜５０９、１０〜５０９、２０〜５０９、３０〜５０９、４０〜５０９、５０〜５０９、１００〜５０９、１５０〜５０９、１〜５０７、１０〜５０７、２０〜５０７、３０〜５０７、４０〜５０７、５０〜５０７、１００〜５０７、または１５０〜５０７を含む、請求項４または請求項５に記載の遺伝子発現系。
【請求項７】
前記エンハンサー配列が、表１に示されるＣＰＭＶ  ＲＮＡ−２ゲノムセグメント配列のヌクレオチド１０〜５１２、２０〜５１２、３０〜５１２、４０〜５１２、５０〜５１２、１００〜５１２、１５０〜５１２、１〜５１４、１０〜５１４、２０〜５１４、３０〜５１４、４０〜５１４、５０〜５１４、１００〜５１４、１５０〜５１４、１〜５１１、１０〜５１１、２０〜５１１、３０〜５１１、４０〜５１１、５０〜５１１、１００〜５１１、１５０〜５１１、１〜５０９、１０〜５０９、２０〜５０９、３０〜５０９、４０〜５０９、５０〜５０９、１００〜５０９、１５０〜５０９、１〜５０７、１０〜５０７、２０〜５０７、３０〜５０７、４０〜５０７、５０〜５０７、１００〜５０７、または１５０〜５０７を含み、野生型ＣＰＭＶ  ＲＮＡ−２ゲノム配列の１６１位の開始部位が変異されている、請求項６に記載の遺伝子発現系。
【請求項８】
前記エンハンサー配列が、表１に示されるＣＰＭＶ  ＲＮＡ−２ゲノムセグメント配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％または５０％の同一性を有し、野生型ＣＰＭＶ  ＲＮＡ−２ゲノムセグメントの１６１位の開始部位が変異されている、請求項４または請求項５に記載の遺伝子発現系。
【請求項９】
（ａ）プロモーターと、
（ｂ）１６１位のＡＵＧが表２に示されるように変異され、前記プロモーターの下流に位置する、表１に示されるササゲモザイクウイルスＲＮＡ−２ゲノムセグメント配列のヌクレオチド１〜５０７と、
（ｃ）（ｂ）に規定される配列の下流に位置する目的のタンパク質をコードする遺伝子と、
（ｄ）表１に示され、前記目的のタンパク質をコードする遺伝子の下流に位置する、ササゲモザイクウイルスＲＮＡ−２ゲノムセグメント配列のヌクレオチド３３０２〜３４８１と、
（ｅ）（ｄ）に規定される配列の下流に位置するノパリン合成ターミネーターと、
を含むか、または
（ａ）プロモーターと、
（ｂ）表１に示されるササゲモザイクウイルスＲＮＡ−２ゲノムセグメント配列のヌクレオチド１〜５０７と少なくとも７０％の同一性を有する発現エンハンサー配列であって、１６１位のＡＵＧは変異され、前記プロモーターの下流に位置する、発現エンハンサー配列と、
（ｃ）（ｂ）に規定される配列の下流に位置する目的のタンパク質をコードする遺伝子と、
（ｄ）表１に示され、前記目的のタンパク質をコードする遺伝子の下流に位置する、ササゲモザイクウイルスＲＮＡ−２ゲノムセグメント配列のヌクレオチド３３０２〜３４８１と、
（ｅ）（ｄ）に規定される配列の下流に位置するノパリン合成ターミネーターと、
を含む、遺伝子発現系。
【請求項１０】
（ａ）プロモーターおよび終結配列に作動可能に連結された目的の異種タンパク質をコードする少なくとも１つの外来性遺伝子を保有するコモウイルス科（Ｃｏｍｏｖｉｒｉｄａｅ）の２分節ウイルスゲノムの切断されたＲＮＡ−２由来の配列を含む第１の遺伝子構築物であって、前記遺伝子構築物は前記外来性遺伝子の上流に変異された開始部位を含み、
前記コモウイルス科（Ｃｏｍｏｖｉｒｉｄａｅ）のウイルスの前記ＲＮＡ−２ゲノムセグメントは、同じトリプレットリーディングフレームに位置する２つの異なる翻訳開始部位を介して２つのカルボキシ共末端タンパク質をコードし、
変異された前記開始部位は、前記２つの開始部位のうちの第１であり、ＣＰＭＶの野生型ＲＮＡ−２セグメントの１６１位の開始部位に相当する、第１の遺伝子構築物と、必要に応じて、
（ｂ）プロモーターおよび終結配列に作動可能に連結された遺伝子サイレンシングの抑制因子を含む、前記第１の遺伝子構築物内に必要に応じて組み込まれる第２の遺伝子構築物と、
を含む、遺伝子発現系。
【請求項１１】
前記２分節ＲＮＡウイルスはＣＰＭＶであり、１１５位のＡＵＧも変異される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の遺伝子発現系。
【請求項１２】
ＤＮＡバイナリーベクターである、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の遺伝子発現系。
【請求項１３】
コモウイルス科（Ｃｏｍｏｖｉｒｉｄａｅ）の２分節ＲＮＡウイルスのＲＮＡ−２ゲノムセグメント由来の配列の発現または翻訳を増強する活性を増加させるためのプロセスであって、前記配列内の開始部位を変異させることを含み、
前記コモウイルス科（Ｃｏｍｏｖｉｒｉｄａｅ）のウイルスの前記ＲＮＡ−２ゲノムセグメントは、同じトリプレットリーディングフレームに位置する２つの異なる翻訳開始部位を介して２つのカルボキシ共末端タンパク質をコードし、
変異された前記開始部位は、前記２つの開始部位のうちの第１であり、ＣＰＭＶの野生型ＲＮＡ−２セグメントの１６１位の開始部位に相当する、プロセス。
【請求項１４】
前記２分節ＲＮＡウイルスが、必要に応じてササゲモザイクウイルスである、コモウイルスである、請求項１３に記載のプロセス。
【請求項１５】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の遺伝子発現系を用いて、宿主生物内で目的のタンパク質を発現させるための方法。
【請求項１６】
前記宿主生物は真核性宿主であり、前記真核性宿主は植物または昆虫である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
コモウイルス科（Ｃｏｍｏｖｉｒｉｄａｅ）の２分節ウイルスのＲＮＡ２ゲノムセグメント由来の配列に作動可能に連結される、目的の異種タンパク質をコードする遺伝子またはオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）から前記目的の異種タンパク質の翻訳を増強する方法であって、
前記コモウイルス科（Ｃｏｍｏｖｉｒｉｄａｅ）のウイルスの前記ＲＮＡ２ゲノムセグメントは、同じトリプレットリーディングフレームに位置する２つの異なる翻訳開始部位を介して２つのカルボキシ共末端タンパク質をコードし、
前記ＲＮＡ２由来の配列内の２つの開始部位のうちの第１を変異させることを含み、変異された前記開始部位は、ＣＰＭＶの野生型ＲＮＡ−２セグメントの１６１位の開始部位に相当する、方法。
【請求項１８】
以下の工程：
（ａ）プロモーターおよび終結配列に作動可能に連結された目的の異種タンパク質をコードする少なくとも１つの外来性遺伝子を保有するコモウイルス科（Ｃｏｍｏｖｉｒｉｄａｅ）の２分節ウイルスゲノムの切断されたＲＮＡ−２由来の配列を含む第１の遺伝子構築物を含む遺伝子発現構築物を導入する工程であって、
前記遺伝子構築物は、植物細胞内に前記外来性遺伝子の上流に変異された開始部位を含み、
前記コモウイルス科（Ｃｏｍｏｖｉｒｉｄａｅ）のウイルスの前記ＲＮＡ−２ゲノムセグメントは、同じトリプレットリーディングフレームに位置する２つの異なる翻訳開始部位を介して２つのカルボキシ共末端タンパク質をコードし、
変異された前記開始部位は、前記２つの開始部位のうちの第１であり、ＣＰＭＶの野生型ＲＮＡ−２セグメントの１６１位の開始部位に相当する、工程と、必要に応じて、
（ｂ）植物細胞内にプロモーターおよび終結配列に作動可能に連結された遺伝子サイレンシングの抑制因子を含む、前記第１の遺伝子構築物内に必要に応じて組み込まれる第２の遺伝子構築物を導入する工程と、
を含む、植物においてタンパク質を発現させる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
請求項２〜１０のいずれか一項に記載の遺伝子発現系を宿主細胞に導入することによって得たか、または得られる宿主生物であって、目的のタンパク質をコードする遺伝子が、向上したレベルで発現される、宿主生物。
【請求項２０】
請求項２〜１２のいずれか１項に記載の遺伝子発現系で一過性または安定にトランスフェクトされる宿主生物。
【請求項２１】
前記宿主生物は植物または植物細胞である、請求項１９または２０に記載の宿主生物。
【請求項２２】
請求項１９〜２１のいずれか１項に記載の宿主生物を使用することと、必要に応じて、目的のタンパク質が発現される組織を収集することと、前記組織から前記目的のタンパク質を単離することと、を含む、目的のタンパク質を産生するための方法。