【手続補正書】
【提出日】平成26年7月7日(2014.7.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
不死化したＢ細胞から人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を作製する方法であって、
ａ）１つ以上の不死化させるエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）要素により不死化された不死化Ｂ細胞を取得することと、
ｂ）前記不死化Ｂ細胞を、該細胞内で外来性リプログラミング因子の発現を起こすことによってリプログラミングし、それによりｉＰＳ細胞を作製することと、
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記ｉＰＳ細胞から前記ＥＢＶ要素を除去することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＥＢＶ要素を本質的に含まないｉＰＳ細胞を単離または濃縮することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
不死化前の前記Ｂ細胞が血液サンプルから取得されており、ここで特に、
前記血液サンプルが約０．０１ｍＬ〜約５ｍＬの容量を有し、とりわけ、
前記血液サンプルが約０．１ｍＬ〜約０．５ｍＬの容量を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記不死化Ｂ細胞が、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）要素を使用してＢ細胞を不死化することにより取得される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記不死化させるＥＢＶ要素が、誘導性の外来性リプログラミング発現カセットを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記不死化Ｂ細胞が、樹立リンパ芽球様細胞株から取得される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
リプログラミングは、以下：
ｉ）１つ以上のリプログラミングエピソームベクター要素を前記不死化Ｂ細胞に導入すること、あるいは
ｉｉ）前記不死化Ｂ細胞をフィーダー層の非存在下で培養すること
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
リプログラミングは、以下：
ｉ）前記不死化Ｂ細胞と１つ以上のシグナル伝達阻害剤を接触させることであって、該シグナル伝達阻害剤には、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３（ＧＳＫ−３）阻害剤、マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ（ＭＥＫ）阻害剤、トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ−β）受容体阻害剤、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、ｐ５３阻害剤、ＮＦ−κＢ阻害剤、またはこれらの組み合わせが含まれる、不死化Ｂ細胞と１つ以上のシグナル伝達阻害剤を接触させること、あるいは
ｉｉ）前記不死化Ｂ細胞を線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）と接触させることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
リプログラミングは、以下：
ｉ）Ｐａｘ−５に特異的な阻害性ヌクレオチドを前記不死化Ｂ細胞に導入することも
ｉｉ）前記不死化Ｂ細胞内における外来性Ｃ／ＥＢＰαの発現
も含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記ｉＰＳ細胞を心臓細胞、造血細胞、神経細胞、または肝細胞にインビトロで分化させることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
胚性幹細胞と比較して不完全なＢ細胞免疫グロブリン可変領域遺伝子セットを含むゲノムを有するヒトｉＰＳ細胞であって、外来性遺伝的要素を本質的に含まないヒトｉＰＳ細胞。
【請求項１３】
前記ゲノムが、選択された遺伝マーカーを含み、特に、前記選択された遺伝マーカーが、選択された疾患の遺伝マーカーである、請求項１２に記載のヒトｉＰＳ細胞。
【請求項１４】
前記ゲノムが不死化Ｂ細胞に由来し、特に、前記ヒトｉＰＳ細胞が、正常な核型を有する、請求項１２に記載のヒトｉＰＳ細胞。
【請求項１５】
請求項１２に記載のヒトｉＰＳ細胞に由来する、分化した細胞、組織、または器官。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４５】
本発明の他の目的、特徴、および利点は、以下の詳細な説明から明らかになる。しかしながら、詳細な説明および特定の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示しているが、この詳細な説明から本発明の趣旨および範囲内の様々な変更および改良が当業者に明らかになるため、単なる例示として与えられることを理解されたい。
例えば、本発明は、以下の項目を提供する：
（項目１）
不死化したＢ細胞から人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を作製する方法であって、
ａ）１つ以上の不死化させるエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）要素により不死化された不死化Ｂ細胞を取得することと、
ｂ）上記不死化Ｂ細胞を、該細胞内で外来性リプログラミング因子の発現を起こすことによってリプログラミングし、それによりｉＰＳ細胞を作製することと、
を含む、上記方法。
（項目２）
上記ｉＰＳ細胞から上記ＥＢＶ要素を除去することをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
上記ＥＢＶ要素を本質的に含まないｉＰＳ細胞を単離または濃縮することをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目４）
不死化前の上記Ｂ細胞が血液サンプルから取得されている、項目１に記載の方法。
（項目５）
上記血液サンプルが約０．０１ｍＬ〜約５ｍＬの容量を有する、項目４に記載の方法。
（項目６）
上記血液サンプルが約０．１ｍＬ〜約０．５ｍＬの容量を有する、項目５に記載の方法。
（項目７）
上記不死化Ｂ細胞が、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）要素を使用してＢ細胞を不死化することにより取得される、項目１に記載の方法。
（項目８）
上記不死化させるＥＢＶ要素が、誘導性の外来性リプログラミング発現カセットを含む、項目１に記載の方法。
（項目９）
上記不死化Ｂ細胞が、樹立リンパ芽球様細胞株から取得される、項目１に記載の方法。
（項目１０）
リプログラミングは、１つ以上のリプログラミングエピソームベクター要素を上記不死化Ｂ細胞に導入することを含む、項目１に記載の方法。
（項目１１）
リプログラミングは、上記不死化Ｂ細胞をフィーダー層の非存在下で培養することを含む、項目１に記載の方法。
（項目１２）
リプログラミングは、上記不死化Ｂ細胞と１つ以上のシグナル伝達阻害剤を接触させることをさらに含み、該シグナル伝達阻害剤には、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３（ＧＳＫ−３）阻害剤、マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ（ＭＥＫ）阻害剤、トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ−β）受容体阻害剤、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、ｐ５３阻害剤、ＮＦ−κＢ阻害剤、またはこれらの組み合わせが含まれる、項目１に記載の方法。
（項目１３）
リプログラミングは、上記不死化Ｂ細胞を線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）と接触させることをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目１４）
リプログラミングは、Ｐａｘ−５に特異的な阻害性ヌクレオチドを上記不死化Ｂ細胞に導入することを含まない、項目１に記載の方法。
（項目１５）
リプログラミングは、上記不死化Ｂ細胞内における外来性Ｃ／ＥＢＰαの発現を含まない、項目１に記載の方法。
（項目１６）
上記ｉＰＳ細胞を心臓細胞、造血細胞、神経細胞、または肝細胞にインビトロで分化させることをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目１７）
胚性幹細胞と比較して不完全なＢ細胞免疫グロブリン可変領域遺伝子セットを含むゲノムを有するヒトｉＰＳ細胞であって、外来性遺伝的要素を本質的に含まないヒトｉＰＳ細胞。
（項目１８）
上記ゲノムが、選択された遺伝マーカーを含む、項目１７に記載のヒトｉＰＳ細胞。
（項目１９）
上記選択された遺伝マーカーが、選択された疾患の遺伝マーカーである、項目１８に記載のヒトｉＰＳ細胞。
（項目２０）
上記ゲノムが不死化Ｂ細胞に由来する、項目１７に記載のヒトｉＰＳ細胞。
（項目２１）
正常な核型を有する、項目２０に記載のヒトｉＰＳ細胞。
（項目２２）
項目１７に記載のヒトｉＰＳ細胞に由来する、分化した細胞、組織、または器官。