【手続補正書】
【提出日】平成26年10月17日(2014.10.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
メタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞の増殖および／または遊走を調節する１つまたは複数の作用物質のインビトロ同定方法であって、前記方法は、メタカリオート幹細胞を含む培養組織細胞を１つまたは複数の候補作用物質と接触させること、および前記培養細胞の核の形態を評価することを含み、前記候補作用物質と接触していない対照細胞と比較した、増殖しているメタカリオート幹細胞または遊走するメタカリオート幹細胞の数の変化から、メタカリオート幹細胞の増殖および／または遊走を調節する前記作用物質の有効性が示される、方法。
【請求項２】
前記培養細胞は、葉巻状の核、弾丸状の核、ソーセージ状の核、腎臓状の核、不規則な紡錘状の核およびこれらの組み合わせなどの核の形態を持つ細胞をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記培養細胞は哺乳動物から採取される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記哺乳動物は創傷治癒障害を有する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記創傷治癒障害は血管の創傷治癒障害である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記培養細胞は初代細胞である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記培養細胞は、臍帯、血管の外膜、間葉系組織、大動脈弓、脊髄およびニューロン組織から選択される組織から採取される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記培養細胞は適切な染色条件下で蛍光を発する、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
前記培養物は非対称無糸分裂を行うメタカリオート幹細胞を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記培養物は平滑筋細胞または骨格筋細胞から選択される筋細胞を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記培養物は心筋細胞を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記創傷治癒障害は異常かつ過剰な組織発生を特徴とする多クローン性障害である請求項４または５に記載の方法。
【請求項１３】
前記創傷治癒障害は異常かつ不十分な組織発生を特徴とする、請求項４または５に記載の方法。
【請求項１４】
前記方法は、メタカリオート幹細胞の増殖および／または遊走を増強する作用物質を同定する、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記方法は、メタカリオート幹細胞の増殖および／または遊走を阻害する作用物質を同定する、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
創傷治癒障害を治療する１つまたは複数の作用物質を同定する方法であって、前記方法は、
ａ）  候補作用物質で処置された哺乳動物から単離された組織サンプル中に含まれる細胞の核の形態を決定すること、ここで、前記組織サンプルは、実質的に約５０ミクロンまでの最大直径を有する核内の核構造物の完全性を保持する方法により調製される；および
ｂ）  前記候補作用物質で処置された前記哺乳動物由来の前記組織サンプル中の前記細胞の前記核の形態を、前記候補作用物質で処置されていない対照哺乳動物から単離された組織サンプル中に含まれる細胞と比較すること
を含み、
前記候補作用物質で処置されていない前記対照哺乳動物の前記組織サンプルと比較しての前記候補作用物質で処置された前記哺乳動物の
ｉ）前記組織サンプル中のメタカリオート幹細胞の数の変化；
ｉｉ）前記組織サンプル中の増殖しているメタカリオート幹細胞の数の変化；または
ｉｉｉ）前記組織サンプル中のメタカリオート幹細胞の遊走の変化
から、創傷治癒障害を治療する前記作用物質の有効性が示される、方法。
【請求項１７】
前記組織サンプルは、葉巻状の核、弾丸状の核、ソーセージ状の核、腎臓状の核、不規則な紡錘状の核およびこれらの組み合わせなどの異形の核の形態型を持つ細胞をさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記哺乳動物はブタである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記哺乳動物は齧歯動物であり、前記齧歯動物はラット、マウスまたはモルモットである、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記細胞は適切な染色条件下で蛍光を発する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記創傷治癒障害は血管の創傷治癒障害である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
前記創傷治癒障害は異常かつ過剰な組織発生を特徴とする多クローン性障害である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２３】
前記創傷治癒障害は異常かつ不十分な組織発生を特徴とする、請求項１６に記載の方法。
【請求項２４】
増殖しているメタカリオート幹細胞の数の減少は前記細胞の非対称無糸分裂の減少に関連する、請求項１６に記載の方法。
【請求項２５】
前記非対称有糸分裂は、平滑筋細胞に特徴的である不規則な核を含む細胞の産生に関連する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記方法は、メタカリオート幹細胞の数、増殖しているメタカリオート幹細胞の数、またはメタカリオート幹細胞の遊走を増加させる１つまたは複数の作用物質を同定する、請求項１６〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記方法は、メタカリオート幹細胞の数、増殖しているメタカリオート幹細胞の数、またはメタカリオート幹細胞の遊走を減少させる１つまたは複数の作用物質を同定する、請求項１６〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
増殖しているメタカリオート幹細胞に関連する創傷治癒障害を検出するための方法であって、前記方法は、
ａ）  間葉系組織を含む単離された組織サンプル中の細胞の核を可視化すること、ここで、前記組織サンプルは実質的に約５０ミクロンまでの最大直径を有する核内の核構造物の完全性を保持する方法により調製される；ならびに
ｂ）  前記組織サンプル中の増殖しているメタカリオート幹細胞の存在および／または非存在を検出すること
を含み、
前記組織サンプル中の増殖しているメタカリオート幹細胞の存在から、創傷治癒障害が示される、方法。
【請求項２９】
前記組織サンプルは血管組織を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記創傷治癒障害は血管の創傷治癒障害である、請求項２８または２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記血管の創傷治癒障害は、損傷により誘発される新生内膜過形成および再狭窄からなる群から選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記血管壁障害は再狭窄である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記細胞は、物理的にまたは化学的に固定される、請求項１〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記組織サンプルは凍結される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記組織サンプルは、アルコール、アルデヒド、有機酸およびこれらの組み合わせからなる群から選択される１つまたは複数の化学固定剤で処理される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記固定剤はメタノールおよび酢酸を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記組織サンプル中の前記細胞は、細胞の核分解の前に固定される、請求項１６〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
前記組織サンプルの前記細胞は、組織解離（ｍａｃｅｒａｔｉｏｎ）および展開により部分的に分離される、請求項１６〜３２または３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
前記細胞は染色され、それにより核の可視化を可能にする、請求項１〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
ＤＮＡは染色され、それにより核の可視化を可能にする、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記細胞は単離から３０分以内に固定される、請求項１〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
前記組織サンプルは多細胞動物から採取される、請求項１６〜３２または３７〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
前記多細胞動物は脊椎動物である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記脊椎動物は哺乳動物である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記哺乳動物は、霊長類、齧歯動物、イヌ、ネコ、ブタ、ヒツジ、ウシおよびウサギからなる群から選択される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記哺乳動物はヒトである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記組織サンプルは、葉巻状の核、弾丸状の核、ソーセージ状の核、腎臓状の核、不規則な紡錘状の核およびこれらの組み合わせなどの異形の核の形態型を持つ細胞をさらに含む、請求項１６〜３２、３７〜３８または４２〜４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
前記組織サンプルは外膜を含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記方法は、
ｃ）  前記組織サンプル中の増殖しているメタカリオート幹細胞の空間分布および／または数分布を検出すること
をさらに含み、
増殖しているメタカリオート幹細胞の前記空間分布および／または数分布は、前記組織サンプルをさらに特徴付ける、請求項１６〜３２、３７〜３８または４２〜４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
前記メタカリオート細胞は、無糸分裂の対称核分裂を示す構造と関連する、請求項１〜４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
前記メタカリオート幹細胞は、不規則な紡錘状の核を生じる非対称無糸分裂を行う、請求項１〜４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
前記被検体は死亡している、請求項１６〜３２、３７〜３８または４２〜４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
前記組織サンプルは血管組織および外膜から本質的になる、請求項１６〜３２、３７〜３８または４２〜４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
前記組織サンプルは血管組織から本質的になる、請求項４５に記載の方法。