(57)【要約】【課題】トルエンまたは安息香酸を出発物質として、生化学的な反応によって４−ヒドロキシ安息香酸を製造するための方法を提供する。【解決手段】特定の微生物を前記出発物質に作用させることによって、穏やかな条件下で４−ヒドロキシ安息香酸を製造することができる。本発明の方法は、既知の反応を利用した製造方法に比べて、４−ヒドロキシ安息香酸の収量が高い。本発明には、たとえばロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属、カルノバクテリウム（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、あるいはレンジテス（Ｌｅｎｚｉｔｅｓ）属等の微生物を用いることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、ブレブンディモナス（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ）属、マイコプラナ（Ｍｙｃｏｐｌａｎａ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、およびロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属からなる群から選択されるいずれかの属に属し、トルエンより４−ヒドロキシ安息香酸を生成する能力を有する微生物の培養物、菌体、あるいはその処理物をトルエンに作用させ、生成する４−ヒドロキシ安息香酸を採取する工程を含む４−ヒドロキシ安息香酸の製法。
【請求項２】
微生物が、次の群から選択されたいずれかの微生物である請求項１に記載の製法。
ロドコッカス・ゾフィ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｚｏｐｆｉｉ）、
ブレブンディモナス・ジミヌタ（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ  ｄｉｍｉｎｕｔａ）、
マイコプラナ・ブラタ（Ｍｙｃｏｐｌａｎａ  ｂｕｌｌａｔａ）、
セラチア・グリメシイ（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｇｒｉｍｅｓｉｉ）、および
ロドトルラ・ムシラギノサ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａ）
【請求項３】
微生物が、次の群から選択されたいずれかの微生物である請求項２に記載の製法。
ロドコッカス・ゾフィ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｚｏｐｆｉｉ）ＪＣＭ  ９９１９、
ブレブンディモナス・ジミヌタ（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ  ｄｉｍｉｎｕｔａ）ＩＦＯ  １２６９７、
マイコプラナ・ブラタ（Ｍｙｃｏｐｌａｎａ  ｂｕｌｌａｔａ）ＩＦＯ  １３２９０、
セラチア・グリメシイ（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｇｒｉｍｅｓｉｉ）ＡＴＣＣ  １４４６０、および
ロドトルラ・ムシラギノサ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａ）ＩＦＯ  ０６９６
【請求項４】
カルノバクテリウム（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、アミコラトプシス（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）属、シュドジマ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ）属、ネオコスモスポラ（Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ）属、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属、ベウベリア（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ）属、ヒポマイセス（Ｈｙｐｏｍｙｃｅｓ）属、アルタナリア（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ）属、ゲラシノスポラ（Ｇｅｌａｓｉｎｏｓｐｏｒａ）属、ステムフィリウム（Ｓｔｅｍｐｈｙｌｉｕｍ）属、ユーロティウム（Ｅｕｒｏｔｉｕｍ）属、カバティエラ（Ｋａｂａｔｉｅｌｌａ）属、クルブラリア（Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ）属、ペスタロティア（Ｐｅｓｔａｌｏｔｉａ）属、ピコノポラス（Ｐｙｃｎｏｐｏｒｕｓ）属、およびレンジテス（Ｌｅｎｚｉｔｅｓ）属からなる群から選択されるいずれかの属に属し、安息香酸より４−ヒドロキシ安息香酸を生成する能力を有する微生物の培養物、菌体、あるいはその処理物を安息香酸に作用させ、生成する４−ヒドロキシ安息香酸を採取する工程を含む４−ヒドロキシ安息香酸の製法。
【請求項５】
微生物が、次の群から選択されたいずれかの微生物である請求項４に記載の製法。
カルノバクテリウム・ジバージェンス（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｖｅｒｇｅｎｓ）、
アミコラトプシス・メタノリカ（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、
シュドジマ・アフィディス（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ  ａｐｈｉｄｉｓ）、
ネオコスモスポラ・バシンフェクタ（Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ  ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ）、
フザリウム・ソラニ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｏｌａｎｉ）、
フザリウム・アングイオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ａｎｇｕｉｏｉｄｅｓ）、
フザリウム・カウカシカム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃａｕｃａｓｉｃｕｍ）、
ベウベリア・バシアナ（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ  ｂａｓｓｉａｎａ）、
ベウベリア・ブロングリアルティ（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ  ｂｒｏｎｇｒｉａｒｔｉｉ）、
ヒポマイセス・クリソスペルムス（Ｈｙｐｏｍｙｃｅｓ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｅｒｍｕｓ）、
ヒポマイセス・ロゼウス（Ｈｙｐｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｓｅｌｌｕｓ）、
アルタナリア・バタチコラ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｂａｔａｔｉｃｏｌａ）、
ゲラシノスポラ・レティキュロスポラ（Ｇｅｌａｓｉｎｏｓｐｏｒａ  ｒｅｔｉｃｕｌｏｓｐｏｒａ）、
ステムフィリウム・ロティ（Ｓｔｅｍｐｈｙｌｉｕｍ  ｌｏｔｉ）、
ユーロティウム・アムステロダミ（Ｅｕｒｏｔｉｕｍ  ａｍｓｔｅｌｏｄａｍｉ）、
カバティエラ・ゼアエ（Ｋａｂａｔｉｅｌｌａ  ｚｅａｅ）、
クルブラリア・ファラクス（Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｆａｌｌａｘ）、
ペスタロティア・ジオスピリ（Ｐｅｓｔａｌｏｔｉａ  ｄｉｏｓｐｙｒｉ）、
ピコノポラス・コッシネウス（Ｐｙｃｎｏｐｏｒｕｓ  ｃｏｃｃｉｎｅｕｓ）、および
レンジテス・ベツリナ（Ｌｅｎｚｉｔｅｓ  ｂｅｔｕｌｉｎａ）
【請求項６】
微生物が、次の群から選択されたいずれかの微生物である請求項５に記載の製法。
カルノバクテリウム・ジバージェンス（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｖｅｒｇｅｎｓ）ＮＲＩＣ  １６２９、
アミコラトプシス・メタノリカ（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）ＪＣＭ  ８０８７、
シュドジマ・アフィディス（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ  ａｐｈｉｄｉｓ）ＩＦＯ  １０１８２、
ネオコスモスポラ・バシンフェクタ（Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ  ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ）ＩＦＯ  ８９６３、
フザリウム・ソラニ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｏｌａｎｉ）ＩＦＯ  ５２３２、
フザリウム・ソラニ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｏｌａｎｉ）ＩＦＯ  ９９７５、
フザリウム・アングイオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ａｎｇｕｉｏｉｄｅｓ）ＩＦＯ  ４４６７、
フザリウム・カウカシカム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃａｕｃａｓｉｃｕｍ）ＩＦＯ  ５９７９、
ベウベリア・バシアナ（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ  ｂａｓｓｉａｎａ）ＩＦＯ  ４８４８、
ベウベリア・バシアナ（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ  ｂａｓｓｉａｎａ）ＩＦＯ  ５８３８、
ベウベリア・ブロングリアルティ（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ  ｂｒｏｎｇｒｉａｒｔｉｉ）ＩＦＯ  ５２９９、
ヒポマイセス・クリソスペルムス（Ｈｙｐｏｍｙｃｅｓ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｅｒｍｕｓ）ＩＦＯ  ６８１７、
ヒポマイセス・ロゼウス（Ｈｙｐｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｓｅｌｌｕｓ）ＩＦＯ  ６９１１、
アルタナリア・バタチコラ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｂａｔａｔｉｃｏｌａ）ＩＦＯ  ６１８７、
ゲラシノスポラ・レティキュロスポラ（Ｇｅｌａｓｉｎｏｓｐｏｒａ  ｒｅｔｉｃｕｌｏｓｐｏｒａ）ＩＦＯ  ８３６７、
ステムフィリウム・ロティ（Ｓｔｅｍｐｈｙｌｉｕｍ  ｌｏｔｉ）ＩＦＯ  ７２９９、
ユーロティウム・アムステロダミ（Ｅｕｒｏｔｉｕｍ  ａｍｓｔｅｌｏｄａｍｉ）ＩＦＯ  ６６６７、
カバティエラ・ゼアエ（Ｋａｂａｔｉｅｌｌａ  ｚｅａｅ）ＩＦＯ  ９６６４、
クルブラリア・ファラクス（Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｆａｌｌａｘ）ＩＦＯ  ８８８５、
ペスタロティア・ジオスピリ（Ｐｅｓｔａｌｏｔｉａ  ｄｉｏｓｐｙｒｉ）ＩＦＯ  ５２８２、
ピコノポラス・コッシネウス（Ｐｙｃｎｏｐｏｒｕｓ  ｃｏｃｃｉｎｅｕｓ）ＩＦＯ  ６４９５、
レンジテス・ベツリナ（Ｌｅｎｚｉｔｅｓ  ｂｅｔｕｌｉｎａ）ＩＦＯ  ４９６３、および
レンジテス・ベツリナ（Ｌｅｎｚｉｔｅｓ  ｂｅｔｕｌｉｎａ）ＩＦＯ  ６２６６
【請求項７】
以下の微生物からなる群から選択されたいずれかの微生物の培養物、菌体、あるいはその処理物を安息香酸に作用させ、生成する４−ヒドロキシ安息香酸を採取する工程を含む４−ヒドロキシ安息香酸の製法。
ロドトルラ・グルチニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｉｓ）、
ロドトルラ・ムシラギノサ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａ）、
ロドトルラ・フジサエンシス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｆｕｊｉｓａｎｅｎｓｉｓ）、
ロドトルラ・ムスコラム（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｍｕｓｃｏｒｕｍ）、
ロドトルラ・ノトファギ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｎｏｔｈｏｆａｇｉ）、
ロドトルラ・アラウカリアエ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ａｒａｕｃａｒｉａｅ）、および
ロドトルラ・フラガリア（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｆｒａｇａｒｉａ）
【請求項８】
微生物が、次の群から選択されたいずれかの微生物である請求項７に記載の製法。
ロドトルラ・グルチニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｉｓ）ＩＦＯ  １０９９、
ロドトルラ・ムシラギノサ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａ）ＩＦＯ  ０６９６、
ロドトルラ・フジサエンシス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｆｕｊｉｓａｎｅｎｓｉｓ）ＪＣＭ  １０３１０、
ロドトルラ・ムスコラム（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｍｕｓｃｏｒｕｍ）ＪＣＭ  １６９７、
ロドトルラ・ノトファギ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｎｏｔｈｏｆａｇｉ）ＪＣＭ  ９０３４、
ロドトルラ・アラウカリアエ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ａｒａｕｃａｒｉａｅ）ＩＦＯ  １００５４、および
ロドトルラ・フラガリア（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｆｒａｇａｒｉａ）ＩＦＯ  １０４１１
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は微生物を用いた４−ヒドロキシ安息香酸の製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
４−ヒドロキシ安息香酸は工業的にはフェノールを原料として製造されている。つまり、フェノールをカリウム塩として脱水後、加圧、加熱条件下で二酸化炭素と化学的に反応させるコルベ・シュミット法により一般に製造されている。しかし化学的な反応を利用した製造法には、高温、かつ高圧の反応条件が必要である。したがって従来の製造方法には、エネルギー消費量が大きく、また、アルカリ塩を多量に使用するなどの問題があった。
【０００３】
一方、微生物を用いた４−ヒドロキシ安息香酸の製造法は常温、常圧で進行する。そのため、エネルギー消費量を小さくすることができ、環境負荷も小さい。微生物による４−ヒドロキシ安息香酸の製造法には、次のような物質を出発物質として用いる反応が知られている。
トルエン
ｐ−クレゾール
安息香酸
これらの出発物質から４−ヒドロキシ安息香酸を生成するためには、トルエンあるいは安息香酸を位置選択的に水酸化しなければならない。更に出発物質がトルエンの場合には、メチル基の酸化が必要である。
【０００４】
このうちトルエンを出発物質とする反応として、シュードモナス・メンドシナ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍｅｎｄｏｃｉｎａ）ＫＲ１株、およびシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）ＤＯＴ−Ｔ１株による４−ヒドロキシ安息香酸の生成例が報告されている。しかしこれらの野生型の微生物による反応においては、トルエンの代謝中間体として微量の４−ヒドロキシ安息香酸が検出されているに過ぎない。
【０００５】
最近遺伝子組み換え技術を用いて、培地中に４−ヒドロキシ安息香酸を蓄積させる試みが報告されている。トルエンのｐ−位を特異的に水酸化する酵素であるトルエン４−モノオキシゲナーゼが、次のような微生物に見出されている。
シュードモナス・メンドシナ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍｅｎｄｏｃｉｎａ）ＫＲ１株（文献１／Ｗｈｉｔｅｄ，Ｇ．  Ｍ．  ａｎｄ  Ｇｉｂｓｏｎ，  Ｄ．，  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，  １７３（９），  ３０１０−３０１６  （１９９１）．）
ブルクホルデリア・エスピー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐ．）ＪＳ１５０株（文献２／Ｊｏｈｎｓｏｎ，  Ｇ．  Ｒ．  ａｎｄ  Ｏｌｓｅｎ，  Ｒ．  Ｈ．，  Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６３（１０）：４０４７−５２  （１９９７）．）
シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）ＤＯＴ−Ｔ１株（文献３／Ｒａｍｏｓ，  Ｊ．  Ｌ．    ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，  １７７（１４）  ３９１１−３９１６  （１９９５）．）
【０００６】
ｐ−位を水酸化するＰ．  ｍｅｎｄｏｃｉｎａ  ＫＲ１株のトルエン４−モノオキシゲナーゼ、およびメチル基を酸化するＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａのｐ−クレゾールメチルヒドロキシラーゼは、ともにその遺伝子がクローニングされた。更にこれらの遺伝子で形質転換したシュードモナス属菌を用いて、トルエンを出発物質とする４−ヒドロキシ安息香酸の生産が検討された。しかし４−ヒドロキシ安息香酸の蓄積濃度は、トルエンを逐次添加する方法によっても３５ｍｇ／Ｌに留まっている（文献４／Ｍｉｌｌｅｒ，  Ｅ．  Ｓ．  Ｊｒ，  ａｎｄ  Ｐｅｒｅｔｔｉ，  Ｓ．  Ｗ．，．  Ｇｒｅｅｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  （６），  １４３−１５２  （１９９９）．）。生成物の蓄積濃度の向上が難しい原因としては、次のような原因が考えられた。
トルエンの宿主に対する毒性のため基質（トルエン）濃度を上げられない
トルエン４−モノオキシゲナーゼ酵素が不安定
４−ヒドロキシ安息香酸自体も宿主に対する毒性がある
【０００７】
一方、ｐ−クレゾールを出発物質とする場合、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、ミコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属微生物による製法が知られている（特許文献１／特開平５−３２８９８０、特許文献２／特開平５−３２８９８１、特許文献３／特開平５−３３６９８０、特許文献４／特開平９−２３８９１）。しかし、これらの報告における４−ヒドロキシ安息香酸の生成濃度は約０．１％と低い。また、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属微生物によるｐ−クレゾールのメチル基の酸化も知られているが（文献５／Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ５９（４），  １１２５−３０  （１９９３）．）、その応用は見当たらない。
【０００８】
更に、安息香酸を原料とする場合、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属微生物による水酸化方法（特許文献５／特開平６−７８７８０）が公知である。しかしこの報告における４−ヒドロキシ安息香酸の蓄積濃度は１ｇ／Ｌ程度に過ぎない。また収率も極めて低い。また、トリコデルマ・リグノラム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｌｉｇｎｏｒｕｍ）が安息香酸を水酸化し、代謝産物として４−ヒドロキシ安息香酸を生ずることも知られている（文献６／Ａｎｎ．  Ｉｎｓｔ．  Ｐａｓｔｅｕｒ，  Ｐａｒｉｓ，  １１７（１），  ４７−５７  （１９６９）．）。
【０００９】
安息香酸のｐ−位を水酸化する安息香酸４−ヒドロキシラーゼ遺伝子をクローニングすれば、当該遺伝子による組み換え微生物を用いた反応が実現できる可能性がある。しかし現状ではそのような報告を見出すことはできない。安息香酸４−ヒドロキシラーゼが単離、あるいは確認された微生物を以下に示す。
Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｍｉｎｕｔａ（文献７／Ｆｕｋｕｄａ，  Ｈ．，  Ｎａｋａｍｕｒａ，  Ｋ．，  Ｓｕｋｉｔａ，  Ｅ．，  Ｏｇａｗａ，  Ｔ．，  ａｎｄ  Ｆｕｊｉｉ，  Ｔ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  １１９（２），  ３１４−３１８  （１９９６）．）
Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｒａｍｉｎｉｓ（文献８／ＭｃＮａｍｅｅ，  Ｃ．  Ｇ．ａｎｄ  Ｄｕｒｈａｍ，  Ｄ．  Ｒ．，．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．，  １２９（２），  ４８５−４９２  （１９８５）．）
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ（文献９／Ｓａｈａｓｒａｂｕｄｈｅ，  Ｓ．  Ｒ．  ａｎｄ  Ｍｏｄｉ，  Ｖ．  Ｖ．，．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．，  １０（４），  ５２５−５２９  （１９８５）．）
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ（文献１０／Ａｒｃｈ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ，  １７７（２），  ４８８−９８  （１９７６）．）
以上に述べたように、トルエンあるいは安息香酸を出発物質として、酵素、あるいは微生物を用いて、工業的に実施可能なレベルで４−ヒドロキシ安息香酸を製造する方法は未だ確立されていない。
【００１０】
【文献１】Ｗｈｉｔｅｄ，  Ｇ．  Ｍ．  ａｎｄ  Ｇｉｂｓｏｎ，  Ｄ．，  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，  １７３（９），  ３０１０−３０１６（１９９１）
【文献２】Ｊｏｈｎｓｏｎ，  Ｇ．  Ｒ．  ａｎｄ  Ｏｌｓｅｎ，  Ｒ．  Ｈ．，  Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６３（１０）：４０４７−５２  （１９９７）
【文献３】Ｒａｍｏｓ，  Ｊ．  Ｌ．    ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，  １７７（１４）  ３９１１−３９１６  （１９９５）
【文献４】Ｍｉｌｌｅｒ，  Ｅ．  Ｓ．  Ｊｒ，  ａｎｄ  Ｐｅｒｅｔｔｉ，  Ｓ．  Ｗ．，．  Ｇｒｅｅｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  （６），  １４３−１５２  （１９９９）
【文献５】Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ５９（４），  １１２５−３０  （１９９３）
【文献６】Ａｎｎ．  Ｉｎｓｔ．  Ｐａｓｔｅｕｒ，  Ｐａｒｉｓ，  １１７（１），  ４７−５７  （１９６９）
【文献７】Ｆｕｋｕｄａ，  Ｈ．，  Ｎａｋａｍｕｒａ，  Ｋ．，  Ｓｕｋｉｔａ，  Ｅ．，  Ｏｇａｗａ，  Ｔ．，  ａｎｄ  Ｆｕｊｉｉ，  Ｔ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  １１９（２），  ３１４−３１８  （１９９６）
【文献８】ＭｃＮａｍｅｅ，  Ｃ．  Ｇ．ａｎｄ  Ｄｕｒｈａｍ，  Ｄ．  Ｒ．，．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．，  １２９（２），  ４８５−４９２  （１９８５）
【文献９】Ｓａｈａｓｒａｂｕｄｈｅ，  Ｓ．  Ｒ．  ａｎｄ  Ｍｏｄｉ，  Ｖ．  Ｖ．，．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．，  １０（４），  ５２５−５２９  （１９８５）
【文献１０】Ａｒｃｈ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ，  １７７（２），  ４８８−９８  （１９７６）
【特許文献１】特開平５−３２８９８０
【特許文献２】特開平５−３２８９８１
【特許文献３】特開平５−３３６９８０
【特許文献４】特開平９−２３８９１
【特許文献５】特開平６−７８７８０
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、微生物の作用を利用した、トルエンまたは安息香酸から４−ヒドロキシ安息香酸を生成する方法の提供である。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、トルエンあるいは安息香酸を出発物質とする、４−ヒドロキシ安息香酸の生化学的な製造方法を鋭意検討した。その結果、特定の微生物が、トルエンまたは安息香酸に作用して４−ヒドロキシ安息香酸を生成する能力を有することを見出した。そしてこれらの微生物によって生成される４−ヒドロキシ安息香酸の収量が、工業的な製造方法に応用できる水準にあることを確認して本発明を完成した。
【００１３】
すなわち本発明は、以下の４−ヒドロキシ安息香酸の製造方法に関する。
〔１〕ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、ブレブンディモナス（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ）属、マイコプラナ（Ｍｙｃｏｐｌａｎａ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、およびロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属からなる群から選択されるいずれかの属に属し、トルエンより４−ヒドロキシ安息香酸を生成する能力を有する微生物の培養物、菌体、あるいはその処理物をトルエンに作用させ、生成する４−ヒドロキシ安息香酸を採取する工程を含む４−ヒドロキシ安息香酸の製法。
〔２〕微生物が、次の群から選択されたいずれかの微生物である〔１〕に記載の製法。
ロドコッカス・ゾフィ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｚｏｐｆｉｉ）、
ブレブンディモナス・ジミヌタ（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ  ｄｉｍｉｎｕｔａ）、
マイコプラナ・ブラタ（Ｍｙｃｏｐｌａｎａ  ｂｕｌｌａｔａ）、
セラチア・グリメシイ（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｇｒｉｍｅｓｉｉ）、および
ロドトルラ・ムシラギノサ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａ）
〔３〕微生物が、次の群から選択されたいずれかの微生物である〔２〕に記載の製法。
ロドコッカス・ゾフィ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｚｏｐｆｉｉ）ＪＣＭ  ９９１９、
ブレブンディモナス・ジミヌタ（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ  ｄｉｍｉｎｕｔａ）ＩＦＯ  １２６９７、
マイコプラナ・ブラタ（Ｍｙｃｏｐｌａｎａ  ｂｕｌｌａｔａ）ＩＦＯ  １３２９０、
セラチア・グリメシイ（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｇｒｉｍｅｓｉｉ）ＡＴＣＣ  １４４６０、および
ロドトルラ・ムシラギノサ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａ）ＩＦＯ  ０６９６
〔４〕カルノバクテリウム（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、アミコラトプシス（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）属、シュドジマ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ）属、ネオコスモスポラ（Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ）属、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属、ベウベリア（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ）属、ヒポマイセス（Ｈｙｐｏｍｙｃｅｓ）属、アルタナリア（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ）属、ゲラシノスポラ（Ｇｅｌａｓｉｎｏｓｐｏｒａ）属、ステムフィリウム（Ｓｔｅｍｐｈｙｌｉｕｍ）属、ユーロティウム（Ｅｕｒｏｔｉｕｍ）属、カバティエラ（Ｋａｂａｔｉｅｌｌａ）属、クルブラリア（Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ）属、ペスタロティア（Ｐｅｓｔａｌｏｔｉａ）属、ピコノポラス（Ｐｙｃｎｏｐｏｒｕｓ）属、およびレンジテス（Ｌｅｎｚｉｔｅｓ）属からなる群から選択されるいずれかの属に属し、安息香酸より４−ヒドロキシ安息香酸を生成する能力を有する微生物の培養物、菌体、あるいはその処理物を安息香酸に作用させ、生成する４−ヒドロキシ安息香酸を採取する工程を含む４−ヒドロキシ安息香酸の製法。
〔５〕微生物が、次の群から選択されたいずれかの微生物である〔４〕に記載の製法。
カルノバクテリウム・ジバージェンス（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｖｅｒｇｅｎｓ）、
アミコラトプシス・メタノリカ（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、
シュドジマ・アフィディス（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ  ａｐｈｉｄｉｓ）、
ネオコスモスポラ・バシンフェクタ（Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ  ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ）、
フザリウム・ソラニ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｏｌａｎｉ）、
フザリウム・アングイオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ａｎｇｕｉｏｉｄｅｓ）、
フザリウム・カウカシカム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃａｕｃａｓｉｃｕｍ）、
ベウベリア・バシアナ（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ  ｂａｓｓｉａｎａ）、
ベウベリア・ブロングリアルティ（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ  ｂｒｏｎｇｒｉａｒｔｉｉ）、
ヒポマイセス・クリソスペルムス（Ｈｙｐｏｍｙｃｅｓ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｅｒｍｕｓ）、
ヒポマイセス・ロゼウス（Ｈｙｐｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｓｅｌｌｕｓ）、
アルタナリア・バタチコラ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｂａｔａｔｉｃｏｌａ）、
ゲラシノスポラ・レティキュロスポラ（Ｇｅｌａｓｉｎｏｓｐｏｒａ  ｒｅｔｉｃｕｌｏｓｐｏｒａ）、
ステムフィリウム・ロティ（Ｓｔｅｍｐｈｙｌｉｕｍ  ｌｏｔｉ）、
ユーロティウム・アムステロダミ（Ｅｕｒｏｔｉｕｍ  ａｍｓｔｅｌｏｄａｍｉ）、
カバティエラ・ゼアエ（Ｋａｂａｔｉｅｌｌａ  ｚｅａｅ）、
クルブラリア・ファラクス（Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｆａｌｌａｘ）、
ペスタロティア・ジオスピリ（Ｐｅｓｔａｌｏｔｉａ  ｄｉｏｓｐｙｒｉ）、
ピコノポラス・コッシネウス（Ｐｙｃｎｏｐｏｒｕｓ  ｃｏｃｃｉｎｅｕｓ）、および
レンジテス・ベツリナ（Ｌｅｎｚｉｔｅｓ  ｂｅｔｕｌｉｎａ）
〔６〕微生物が、次の群から選択されたいずれかの微生物である〔５〕に記載の製法。
カルノバクテリウム・ジバージェンス（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｖｅｒｇｅｎｓ）ＮＲＩＣ  １６２９、
アミコラトプシス・メタノリカ（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）ＪＣＭ  ８０８７、
シュドジマ・アフィディス（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ  ａｐｈｉｄｉｓ）ＩＦＯ  １０１８２、
ネオコスモスポラ・バシンフェクタ（Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ  ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ）ＩＦＯ  ８９６３、
フザリウム・ソラニ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｏｌａｎｉ）ＩＦＯ  ５２３２、
フザリウム・ソラニ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｏｌａｎｉ）ＩＦＯ  ９９７５、
フザリウム・アングイオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ａｎｇｕｉｏｉｄｅｓ）ＩＦＯ  ４４６７、
フザリウム・カウカシカム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃａｕｃａｓｉｃｕｍ）ＩＦＯ  ５９７９、
ベウベリア・バシアナ（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ  ｂａｓｓｉａｎａ）ＩＦＯ  ４８４８、
ベウベリア・バシアナ（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ  ｂａｓｓｉａｎａ）ＩＦＯ  ５８３８、
ベウベリア・ブロングリアルティ（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ  ｂｒｏｎｇｒｉａｒｔｉｉ）ＩＦＯ  ５２９９、
ヒポマイセス・クリソスペルムス（Ｈｙｐｏｍｙｃｅｓ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｅｒｍｕｓ）ＩＦＯ  ６８１７、
ヒポマイセス・ロゼウス（Ｈｙｐｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｓｅｌｌｕｓ）ＩＦＯ  ６９１１、
アルタナリア・バタチコラ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｂａｔａｔｉｃｏｌａ）ＩＦＯ  ６１８７、
ゲラシノスポラ・レティキュロスポラ（Ｇｅｌａｓｉｎｏｓｐｏｒａ  ｒｅｔｉｃｕｌｏｓｐｏｒａ）ＩＦＯ  ８３６７、
ステムフィリウム・ロティ（Ｓｔｅｍｐｈｙｌｉｕｍ  ｌｏｔｉ）ＩＦＯ  ７２９９、
ユーロティウム・アムステロダミ（Ｅｕｒｏｔｉｕｍ  ａｍｓｔｅｌｏｄａｍｉ）ＩＦＯ  ６６６７、
カバティエラ・ゼアエ（Ｋａｂａｔｉｅｌｌａ  ｚｅａｅ）ＩＦＯ  ９６６４、
クルブラリア・ファラクス（Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｆａｌｌａｘ）ＩＦＯ  ８８８５、
ペスタロティア・ジオスピリ（Ｐｅｓｔａｌｏｔｉａ  ｄｉｏｓｐｙｒｉ）ＩＦＯ  ５２８２、
ピコノポラス・コッシネウス（Ｐｙｃｎｏｐｏｒｕｓ  ｃｏｃｃｉｎｅｕｓ）ＩＦＯ  ６４９５、
レンジテス・ベツリナ（Ｌｅｎｚｉｔｅｓ  ｂｅｔｕｌｉｎａ）ＩＦＯ  ４９６３、および
レンジテス・ベツリナ（Ｌｅｎｚｉｔｅｓ  ｂｅｔｕｌｉｎａ）ＩＦＯ  ６２６６
〔７〕以下の微生物からなる群から選択されたいずれかの微生物の培養物、菌体、あるいはその処理物を安息香酸に作用させ、生成する４−ヒドロキシ安息香酸を採取する工程を含む４−ヒドロキシ安息香酸の製法。
ロドトルラ・グルチニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｉｓ）、
ロドトルラ・ムシラギノサ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａ）、
ロドトルラ・フジサエンシス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｆｕｊｉｓａｎｅｎｓｉｓ）、
ロドトルラ・ムスコラム（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｍｕｓｃｏｒｕｍ）、
ロドトルラ・ノトファギ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｎｏｔｈｏｆａｇｉ）、
ロドトルラ・アラウカリアエ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ａｒａｕｃａｒｉａｅ）、および
ロドトルラ・フラガリア（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｆｒａｇａｒｉａ）
〔８〕微生物が、次の群から選択されたいずれかの微生物である〔７〕に記載の製法。
ロドトルラ・グルチニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｉｓ）ＩＦＯ  １０９９、
ロドトルラ・ムシラギノサ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａ）ＩＦＯ  ０６９６、
ロドトルラ・フジサエンシス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｆｕｊｉｓａｎｅｎｓｉｓ）ＪＣＭ  １０３１０、
ロドトルラ・ムスコラム（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｍｕｓｃｏｒｕｍ）ＪＣＭ  １６９７、
ロドトルラ・ノトファギ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｎｏｔｈｏｆａｇｉ）ＪＣＭ  ９０３４、
ロドトルラ・アラウカリアエ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ａｒａｕｃａｒｉａｅ）ＩＦＯ  １００５４、および
ロドトルラ・フラガリア（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｆｒａｇａｒｉａ）ＩＦＯ  １０４１１
本発明に用いられる微生物は、いずれもトルエンあるいは安息香酸から４−ヒドロキシ安息香酸を生成する能力を有していることは知られていなかった。
【００１４】
【発明の実施の形態】
本発明で使用するトルエンより４−ヒドロキシ安息香酸を生成する能力を有する微生物は、以下に示す属に分類される微生物群から選択することができる。これらの属に属する微生物から、トルエンを基質として４−ヒドロキシ安息香酸を生成する微生物を単離できることは知られていなかった。
ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、
ブレブンディモナス（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ）属、
マイコプラナ（Ｍｙｃｏｐｌａｎａ）属、
セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、および
ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属
【００１５】
生化学的性状等に基づいて、微生物を分類する方法は公知である。更に上記属に属する微生物が目的とする活性を有していることは、たとえば実施例に示すような方法に基づいて確認することができる。すなわち、被験微生物をトルエンを含む培地で培養し、培養物に蓄積する４−ヒドロキシ安息香酸を検出することによって、目的とする活性を有していることが確認される。４−ヒドロキシ安息香酸は、高速液体クロマトグラフィーやＬＣ／ＭＳなどの手法によって同定することができる。
【００１６】
本発明において、トルエンに作用して４−ヒドロキシ安息香酸を生成することができる微生物として、たとえば以下のような種を示すことができる。土壌、河川、あるいは湖沼などの材料からこれらの種を単離し同定する方法は公知である。たとえば細菌、真菌、およびカビの単離および同定方法については以下のような文献を参照することができる。
細菌：Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，  ９ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｊｏｈｎ  Ｇ．  Ｈｏｌｔ，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，  Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ
酵母：Ｔｈｅ  Ｙｅａｓｔ：Ａ  Ｔａｘｏｎｏｍｉｃ  ｓｔｕｄｙ，  ４ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃ．Ｐ．  Ｋｕｒｔｚｍａｎ  ａｎｄ  Ｊ．Ｗ．Ｆｅｌｌ（ｅｄｓ．），  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ（１９９８）．
カビ：”Ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｒａ  ｏｆ  Ｈｙｐｈｏｍｙｃｅｔｅｓ  ｆｒｏｍ  ｓｏｉｌ”，  Ｇ．Ｌ．Ｂａｒｒｏｎ，  Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，  Ｍａｒｙｌａｎｄ，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ（１９６８）．  ”Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  ｓｏｉｌ  Ｆｕｎｇｉ”，  Ｋ．Ｈ．  Ｄｏｍｓｈ，  Ｗ．  Ｇａｍｓ，  Ｔ．  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９８０）．
ロドコッカス・ゾフィ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｚｏｐｆｉｉ）
ブレブンディモナス・ジミヌタ（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ  ｄｉｍｉｎｕｔａ）
マイコプラナ・ブラタ（Ｍｙｃｏｐｌａｎａ  ｂｕｌｌａｔａ）
セラチア・グリメシイ（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｇｒｉｍｅｓｉｉ）、および
ロドトルラ・ムシラギノサ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａ）
【００１７】
より具体的には、トルエンより４−ヒドロキシ安息香酸を生成する微生物として以下の微生物菌株を示すことができる。これらの菌株は、それぞれのアクセション番号をもとに各セルバンクから入手することができる。
ロドコッカス・ゾフィ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｚｏｐｆｉｉ）ＪＣＭ  ９９１９、
ブレブンディモナス・ジミヌタ（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ  ｄｉｍｉｎｕｔａ）ＩＦＯ  １２６９７、
マイコプラナ・ブラタ（Ｍｙｃｏｐｌａｎａ  ｂｕｌｌａｔａ）ＩＦＯ  １３２９０、
セラチア・グリメシイ（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｇｒｉｍｅｓｉｉ）ＡＴＣＣ  １４４６０、
ロドトルラ・ムシラギノサ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａ）ＩＦＯ  ０６９６
【００１８】
また本発明で使用する安息香酸より４−ヒドロキシ安息香酸を生成する能力を有する微生物は、以下に示す属に分類される微生物群から選択することができる。これらの属に属する微生物から、安息香酸を基質として４−ヒドロキシ安息香酸を生成する微生物を単離できることは知られていなかった。
カルノバクテリウム（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、
アミコラトプシス（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）属、
シュドジマ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ）属、
ネオコスモスポラ（Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ）属、
フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属、
ベウベリア（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ）属、
ヒポマイセス（Ｈｙｐｏｍｙｃｅｓ）属、
アルタナリア（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ）属、
ゲラシノスポラ（Ｇｅｌａｓｉｎｏｓｐｏｒａ）属、
ステムフィリウム（Ｓｔｅｍｐｈｙｌｉｕｍ）属、
ユーロティウム（Ｅｕｒｏｔｉｕｍ）属、
カバティエラ（Ｋａｂａｔｉｅｌｌａ）属、
クルブラリア（Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ）属、
ペスタロティア（Ｐｅｓｔａｌｏｔｉａ）属、
ピコノポラス（Ｐｙｃｎｏｐｏｒｕｓ）属、および
レンジテス（Ｌｅｎｚｉｔｅｓ）属
【００１９】
生化学的性状等に基づいて、微生物を分類する方法は公知である。更に上記属に属する微生物が目的とする活性を有していることは、たとえば実施例に示すような方法に基づいて確認することができる。すなわち、被験微生物を安息香酸を含む培地で培養し、培養物に蓄積する４−ヒドロキシ安息香酸を検出することによって、目的とする活性を有していることが確認される。４−ヒドロキシ安息香酸は、高速液体クロマトグラフィーやＬＣ／ＭＳなどの手法によって同定することができる。
【００２０】
本発明において、安息香酸に作用して４−ヒドロキシ安息香酸を生成することができる微生物として、たとえば以下のような種を示すことができる。土壌、河川、あるいは湖沼などの材料からこれらの種を単離し同定する方法は公知である。たとえば細菌、真菌、およびカビの単離および同定方法については以下のような文献を参照することができる。
細菌：Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，  ９ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｊｏｈｎ  Ｇ．  Ｈｏｌｔ，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，  Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ
酵母：Ｔｈｅ  Ｙｅａｓｔ：Ａ  Ｔａｘｏｎｏｍｉｃ  ｓｔｕｄｙ，  ４ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃ．Ｐ．  Ｋｕｒｔｚｍａｎ  ａｎｄ  Ｊ．Ｗ．Ｆｅｌｌ（ｅｄｓ．），  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ（１９９８）．
カビ：”Ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｒａ  ｏｆ  Ｈｙｐｈｏｍｙｃｅｔｅｓ  ｆｒｏｍ  ｓｏｉｌ”，  Ｇ．Ｌ．Ｂａｒｒｏｎ，  Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，  Ｍａｒｙｌａｎｄ，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ（１９６８）．  ”Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  ｓｏｉｌ  Ｆｕｎｇｉ”，  Ｋ．Ｈ．  Ｄｏｍｓｈ，  Ｗ．  Ｇａｍｓ，  Ｔ．  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９８０）．
カルノバクテリウム・ジバージェンス（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｖｅｒｇｅｎｓ）、
アミコラトプシス・メタノリカ（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、
シュドジマ・アフィディス（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ  ａｐｈｉｄｉｓ）、
ネオコスモスポラ・バシンフェクタ（Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ  ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ）、
フザリウム・ソラニ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｏｌａｎｉ）、
フザリウム・アングイオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ａｎｇｕｉｏｉｄｅｓ）、
フザリウム・カウカシカム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃａｕｃａｓｉｃｕｍ）、
ベウベリア・バシアナ（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ  ｂａｓｓｉａｎａ）、
ベウベリア・ブロングリアルティ（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ  ｂｒｏｎｇｒｉａｒｔｉｉ）、
ヒポマイセス・クリソスペルムス（Ｈｙｐｏｍｙｃｅｓ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｅｒｍｕｓ）、
ヒポマイセス・ロゼウス（Ｈｙｐｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｓｅｌｌｕｓ）、
アルタナリア・バタチコラ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｂａｔａｔｉｃｏｌａ）、
ゲラシノスポラ・レティキュロスポラ（Ｇｅｌａｓｉｎｏｓｐｏｒａ  ｒｅｔｉｃｕｌｏｓｐｏｒａ）、
ステムフィリウム・ロティ（Ｓｔｅｍｐｈｙｌｉｕｍ  ｌｏｔｉ）、
がユーロティウム・アムステロダミ（Ｅｕｒｏｔｉｕｍ  ａｍｓｔｅｌｏｄａｍｉ）、
カバティエラ・ゼアエ（Ｋａｂａｔｉｅｌｌａ  ｚｅａｅ）、
クルブラリア・ファラクス（Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｆａｌｌａｘ）、
ペスタロティア・ジオスピリ（Ｐｅｓｔａｌｏｔｉａ  ｄｉｏｓｐｙｒｉ）、
ピコノポラス・コッシネウス（Ｐｙｃｎｏｐｏｒｕｓ  ｃｏｃｃｉｎｅｕｓ）、および
レンジテス・ベツリナ（Ｌｅｎｚｉｔｅｓ  ｂｅｔｕｌｉｎａ）、
【００２１】
また本発明において、安息香酸に作用して４−ヒドロキシ安息香酸を生成することができる微生物として、たとえば以下のような種を示すこともできる。土壌、河川、あるいは湖沼などの材料からこれらの種を単離し同定する方法は公知である。たとえば細菌、真菌、およびカビの単離および同定方法については以下のような文献を参照することができる。
細菌：Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，  ９ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｊｏｈｎ  Ｇ．  Ｈｏｌｔ，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，  Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ
酵母：Ｔｈｅ  Ｙｅａｓｔ：Ａ  Ｔａｘｏｎｏｍｉｃ  ｓｔｕｄｙ，  ４ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃ．Ｐ．  Ｋｕｒｔｚｍａｎ  ａｎｄ  Ｊ．Ｗ．Ｆｅｌｌ（ｅｄｓ．），  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ（１９９８）．
カビ：”Ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｒａ  ｏｆ  Ｈｙｐｈｏｍｙｃｅｔｅｓ  ｆｒｏｍ  ｓｏｉｌ”，  Ｇ．Ｌ．Ｂａｒｒｏｎ，  Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，  Ｍａｒｙｌａｎｄ，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ（１９６８）．  ”Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  ｓｏｉｌ  Ｆｕｎｇｉ”，  Ｋ．Ｈ．  Ｄｏｍｓｈ，  Ｗ．  Ｇａｍｓ，  Ｔ．  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９８０）．
ロドトルラ・グルチニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｉｓ）、
ロドトルラ・ムシラギノサ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａ）、
ロドトルラ・フジサエンシス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｆｕｊｉｓａｎｅｎｓｉｓ）、
ロドトルラ・ムスコラム（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｍｕｓｃｏｒｕｍ）、
ロドトルラ・ノトファギ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｎｏｔｈｏｆａｇｉ）、
ロドトルラ・アラウカリアエ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ａｒａｕｃａｒｉａｅ）、および
ロドトルラ・フラガリア（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｆｒａｇａｒｉａ）
ロドトルラ属に属する次の微生物からは、安息香酸４−ヒドロキシラーゼが単離された報告がある。しかし上記の種が、安息香酸に作用して４−ヒドロキシ安息香酸を生成する作用を有することは知られていなかった。
Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｍｉｎｕｔａ（Ｆｕｋｕｄａ，  Ｈ．，  Ｎａｋａｍｕｒａ，  Ｋ．，  Ｓｕｋｉｔａ，  Ｅ．，  Ｏｇａｗａ，  Ｔ．，  ａｎｄ  Ｆｕｊｉｉ，  Ｔ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  １１９（２），  ３１４−３１８  （１９９６）．）
Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｒａｍｉｎｉｓ（ＭｃＮａｍｅｅ，  Ｃ．  Ｇ．ａｎｄ  Ｄｕｒｈａｍ，  Ｄ．  Ｒ．，．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．，  １２９（２），  ４８５−４９２  （１９８５）．）
【００２２】
また、安息香酸より４−ヒドロキシ安息香酸を生成する微生物として以下の微生物菌株を示すことができる。これらの菌株は、それぞれのアクセション番号をもとに各セルバンクから入手することができる。
カルノバクテリウム・ジバージェンス（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｖｅｒｇｅｎｓ）ＮＲＩＣ  １６２９、
アミコラトプシス・メタノリカ（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）ＪＣＭ  ８０８７、
シュドジマ・アフィディス（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ  ａｐｈｉｄｉｓ）ＩＦＯ  １０１８２、
ネオコスモスポラ・バシンフェクタ（Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ  ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ）ＩＦＯ  ８９６３、
フザリウム・ソラニ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｏｌａｎｉ）ＩＦＯ  ５２３２、ＩＦＯ  ９９７５、
フザリウム・アングイオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ａｎｇｕｉｏｉｄｅｓ）ＩＦＯ  ４４６７、
フザリウム・カウカシカム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃａｕｃａｓｉｃｕｍ）ＩＦＯ  ５９７９、
ベウベリア・バシアナ（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ  ｂａｓｓｉａｎａ）ＩＦＯ  ４８４８、ＩＦＯ  ５８３８、
ベウベリア・ブロングリアルティ（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ  ｂｒｏｎｇｒｉａｒｔｉｉ）ＩＦＯ  ５２９９、
ヒポマイセス・クリソスペルムス（Ｈｙｐｏｍｙｃｅｓ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｅｒｍｕｓ）ＩＦＯ  ６８１７、
ヒポマイセス・ロゼウス（Ｈｙｐｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｓｅｌｌｕｓ）ＩＦＯ  ６９１１、
アルタナリア・バタチコラ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｂａｔａｔｉｃｏｌａ）ＩＦＯ  ６１８７、
ゲラシノスポラ・レティキュロスポラ（Ｇｅｌａｓｉｎｏｓｐｏｒａ  ｒｅｔｉｃｕｌｏｓｐｏｒａ）ＩＦＯ  ８３６７、
ステムフィリウム・ロティ（Ｓｔｅｍｐｈｙｌｉｕｍ  ｌｏｔｉ）ＩＦＯ  ７２９９、
ユーロティウム・アムステロダミ（Ｅｕｒｏｔｉｕｍ  ａｍｓｔｅｌｏｄａｍｉ）ＩＦＯ  ６６６７、
カバティエラ・ゼアエ（Ｋａｂａｔｉｅｌｌａ  ｚｅａｅ）ＩＦＯ  ９６６４、
クルブラリア・ファラクス（Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｆａｌｌａｘ）ＩＦＯ  ８８８５、
ペスタロティア・ジオスピリ（Ｐｅｓｔａｌｏｔｉａ  ｄｉｏｓｐｙｒｉ）ＩＦＯ  ５２８２、
ピコノポラス・コッシネウス（Ｐｙｃｎｏｐｏｒｕｓ  ｃｏｃｃｉｎｅｕｓ）ＩＦＯ  ６４９５、
レンジテス・ベツリナ（Ｌｅｎｚｉｔｅｓ  ｂｅｔｕｌｉｎａ）ＩＦＯ  ４９６３、ＩＦＯ  ６２６６、
ロドトルラ・グルチニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｉｓ）ＩＦＯ  １０９９、
ロドトルラ・ムシラギノサ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａ）ＩＦＯ  ０６９６、
ロドトルラ・グラミニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｒａｍｉｎｉｓ）ＩＦＯ  １０７４７、
ロドトルラ・フジサエンシス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｆｕｊｉｓａｎｅｎｓｉｓ）ＪＣＭ  １０３１０、
ロドトルラ・ムスコラム（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｍｕｓｃｏｒｕｍ）ＪＣＭ  １６９７、
ロドトルラ・ノトファギ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｎｏｔｈｏｆａｇｉ）ＪＣＭ  ９０３４、
ロドトルラ・アラウカリアエ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ａｒａｕｃａｒｉａｅ）ＩＦＯ  １００５４、
ロドトルラ・フラガリア（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｆｒａｇａｒｉａ）ＩＦＯ  １０４１１
【００２３】
また、安息香酸より４−ヒドロキシ安息香酸を生成する微生物として以下の微生物菌株を示すこともできる。これらの菌株は、それぞれのアクセション番号をもとに各セルバンクから入手することができる。
ロドトルラ・グルチニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｉｓ）ＩＦＯ  １０９９、
ロドトルラ・ムシラギノサ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａ）ＩＦＯ  ０６９６、
ロドトルラ・フジサエンシス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｆｕｊｉｓａｎｅｎｓｉｓ）ＪＣＭ  １０３１０、
ロドトルラ・ムスコラム（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｍｕｓｃｏｒｕｍ）ＪＣＭ  １６９７、
ロドトルラ・ノトファギ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｎｏｔｈｏｆａｇｉ）ＪＣＭ  ９０３４、
ロドトルラ・アラウカリアエ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ａｒａｕｃａｒｉａｅ）ＩＦＯ  １００５４、および
ロドトルラ・フラガリア（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｆｒａｇａｒｉａ）ＩＦＯ  １０４１１
これらの微生物は、野生株、変異株、または、細胞融合、もしくは遺伝子操作などの遺伝的手法より誘導される組み換え株など、いずれの株も好適に用いることができる。
【００２４】
なおここに示した菌株のうち、ＩＦＯ番号の付された微生物は、財団法人・発酵研究所発行の微生物カタログ第１１版（２０００年）に記載されており、現在生物遺伝資源センター（ＮＢＲＣ）より入手することができる。ＪＣＭ番号の付された微生物は、理化学研究所発行の菌株カタログ第８版（２００２年）に記載されており、同研究所より入手することができる。ＮＲＩＣ番号の付された微生物は東京農業大学菌株保存室発行の東京農業大学菌株カタログ第３版（２０００年）に記載されており、同保存室より入手することができる。ＡＴＣＣ番号の付された微生物はアメリカン・タイプカルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）発行のバクテリア＆バクテリオファージカタログ第１９版（１９９６）に記載されており、同機関より入手することができる。
【００２５】
本発明に用いる微生物を培養するための培地は、その微生物が増殖しうるものであれば特に制限はない。例えば、炭素源としては上記微生物が利用可能な任意の炭素源を使用することができる。具体的には、グルコース、フルクトース、シュクロース、デキストリンなどの糖類、ソルビトール、グリセロールなどのアルコール類、フマール酸、クエン酸、酢酸、プロピオン酸等の有機酸類およびその塩類、パラフィンなどの炭化水素類、トルエン、クレゾール、安息香酸などあるいはこれらの混合物を使用することができる。
【００２６】
窒素源としては例えば、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウムなどの無機酸のアンモニウム塩、フマル酸アンモニウム、クエン酸アンモニウムなどの有機酸のアンモニウム塩、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー、カゼイン加水分解物、尿素、などの無機有機含窒素化合物、あるいはこれらの混合物を使用することができる。他に無機塩、微量金属塩、ビタミン類など、通常の培養に用いられる栄養源を適宜混合して用いることができる。また、必要に応じて微生物の増殖を促進する因子、本発明の目的化合物の生成能力を高める因子、あるいは培地のｐＨ保持に有効なＣａＣＯ３などの物質も添加できる。
【００２７】
培養方法としては、培地ｐＨは３〜１１、好ましくは４〜８、培養温度は１５〜６０℃、好ましくは２０〜４５℃で、嫌気的あるいは好気的に、その微生物の生育に適した条件下５〜２４０時間、好ましくは１２〜１２０時間程度培養する。
【００２８】
基質であるトルエンあるいは安息香酸またはその塩は酵素の基質阻害が起らない濃度範囲で、一括あるいは間欠的に、あるいは連続して培養物に添加することができる。更に、ロドトルラ・ムシラギノサ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａ）のようにトルエンと安息香酸のいずれからでも４−ヒドロキシ安息香酸を生成する作用を有する微生物においては、基質としてトルエンと安息香酸の混合物を与えることもできる。本発明において、基質は通常０．００１から５％（ｗｔ／ｗｔ）程度添加する。基質は、そのまま水に溶解あるいは分散して添加することができる。あるいは基質を反応に影響を与えない有機溶媒に溶解したり、界面活性剤などに分散させて添加することもできる。微生物と基質とは、たとえば次のような方法で接触させることができる。
１）培地に最初から基質を添加しておき、培養する方法、
２）培養液をそのまま用い、該培養液にトルエンあるいは安息香酸を添加する方法、
３）遠心分離などにより菌体を分離し、これをそのまま、あるいは洗浄した後、緩衝液、水などに再懸濁したものに、トルエンあるいは安息香酸を添加し、反応させる方法
【００２９】
本発明において、菌体は生菌体のままでもよいし、菌体破砕物、アセトン処理、トルエン処理、凍結乾燥などの処理を施したものでもよい。微生物菌体はカラギーナンゲル、アルギン酸ゲル、ポリアクリルアミドゲル、セルロース、寒天などに公知の方法で固定化することもできる。更に微生物菌体と基質とが限外ろ過膜などを介して接触する構造を持つ反応容器中で両者を反応させることもできる。
【００３０】
菌体と基質は、５〜７０℃、望ましくは１５〜６０℃の温度で反応させる。反応ｐＨは酵素が反応する範囲で適宜選択することができる。反応時のｐＨを適切な範囲に維持するために、通常ｐＨ４〜１０、望ましくはｐＨ５〜９を与える緩衝液、あるいはｐＨスタットを用いることができる。反応液は、静置、振とう、あるいは攪拌することができる。反応に用いる溶媒は通常水、あるいは水性溶媒である。反応液には、反応に影響を与えない範囲でアルコールなどの有機溶媒を加えることができる。
【００３１】
本発明による４−ヒドロキシ安息香酸の製法は、上記微生物の培養物、菌体、あるいはその処理物をトルエンおよび／または安息香酸に作用させ、生成する４−ヒドロキシ安息香酸を採取する工程を含む４−ヒドロキシ安息香酸の製法である。上記微生物によって生成された４−ヒドロキシ安息香酸は、限外ろ過、濃縮、カラムクロマトグラフィー、抽出、活性炭処理、晶析など通常の方法を組み合せることで回収し、更に精製することができる。
【００３２】
【実施例】
次に本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されない。以下、実施例中では４−ヒドロキシ安息香酸は４−ＨＢＡと略す。以下の実施例において、トルエン、安息香酸、および４−ＨＢＡは高速液体クロマトグラフィーで定量した。定量方法は次のとおりである。
【００３３】
安息香酸、および４−ＨＢＡの定量
カラム：Ｗａｋｏｓｉｌ  ＩＩ  ＯＤＳ  ＨＧ，  φ４．６ｍｍ×２５０ｍｍ
移動相：４０ｍＭ  リン酸緩衝液ｐＨ２．５／アセトニトリル［９：１］
カラム温度：４０℃
流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
検出：２５４ｎｍ
生成した４−ＨＢＡは、ＨＰＬＣに接続した多波長検出器の紫外〜可視吸収スペクトル、およびＬＣ／ＭＳスペクトロメトリーで同定した。
【００３４】
トルエン代謝物、安息香酸代謝物の同定
カラム：ＹＭＣ−ｐａｃｋ  ＯＤＳ−ＡＭ（φ４．６ｍｍ×１５０ｍｍ）
移動相：０．１％ギ酸／アセトニトリル［９：１］
流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
温度：４０℃
検出：多波長検出器  ２００〜６００ｎｍ
ＨＰＬＣ／多波長システム
Ｗａｔｅｒｓ６００Ｅ  （システムコントローラー、ポンプ）
Ｗａｔｅｒｓ９９６  （多波長検出器）
【００３５】
ＬＣ／ＭＳの測定条件
イオン化：ＥＳＩ
検出：ｎｅｇａｔｉｖｅ
カラム：ＹＭＣ−ｐａｃｋ  ＯＤＳ−ＡＭ（φ４．６ｍｍ×１５０ｍｍ）
移動相：０．１％ギ酸／アセトニトリル［９：１］
流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
温度：４０℃。
ＬＣ／ＭＳシステム
Ｗａｔｅｒｓ  ａｌｌｉａｎｃｅ２６９０  （ポンプ、オートサンプラー、カラムオーブン）
Ｗａｔｅｒｓ２４８７  （ＵＶ検出器）
ＴｈｅｒｍｏＱｕｅｓｔ  ＬＣＱ  （ＭＳ）
【００３６】
また、以下の実施例で用いている「培地Ａ」、および「培地Ｂ」の組成は以下のとおりである。
［培地Ａ］：エールリッヒの肉エキス５ｇ（ディフコ）、ポリペプトン（日本製薬）３ｇ、塩化ナトリウム１０ｇを混合し、脱イオン水を加えて溶解し総容量１０００ｍＬとし、ｐＨ７．２に合わせる。
［培地Ｂ］：グルコース１０ｇ、酵母エキス（極東製薬）３ｇ、麦芽エキス（極東製薬）３ｇ、ポリペプトン（日本製薬）５ｇを混合し、脱イオン水を加えて溶解し総容量１０００ｍＬとし、ｐＨ６．０に合わせる。
［培地Ｃ］：培地Ａに安息香酸ナトリウムを２ｇ／Ｌ添加する。
［培地Ｄ］：培地Ｂに安息香酸ナトリウムを２ｇ／Ｌ添加する。
【００３７】
［実施例１］
各微生物用の培地をφ２１ｍｍの試験管にそれぞれ５ｍＬ入れ、１２１℃、２０分間滅菌した。滅菌した培地に、保存スラントより表１に示す微生物の一白金耳を植菌し、２４℃で２４時間振とう培養した。表１に示した菌株のうち、１）〜４）は培地Ａ、５）は培地Ｂに接種した。各試験管にトルエンのエタノール溶液（１０ｇ／Ｌ）を２５μＬ添加し、さらに２４℃にて２４時間振盪した。反応終了後、遠心分離により上清を分離し、上清中の４−ＨＢＡ濃度を高速液体クロマトグラフィーにて分析した。分析結果を表１に示す。生成量はそれぞれのトルエン無添加の場合との差で示した。
【００３８】
【表１】
2004215586.tif 000002
【００３９】
［実施例２］
培地Ｃをそれぞれ５ｍＬずつφ２１ｍｍの試験管に入れ、滅菌後、表２に示す菌株の一白金耳を植菌した。２４℃で４８時間振とう培養した。培養液を遠心分離し、生成した４−ＨＢＡを液体クロマトグラフィーで定量した。結果を表２に示す。
【００４０】
【表２】
2004215586.tif 000003
【００４１】
［実施例３］
【００４２】
培地Ｄをそれぞれ５ｍＬずつφ２１ｍｍの試験管に入れ、滅菌後、表３に示す菌株の一白金耳を植菌した。２４℃で４８〜１６８時間、それぞれの菌株について十分な生育が見られるまで振とう培養を行った。培養液を遠心分離し、生成した４−ＨＢＡを高速液体クロマトグラフィーで定量した。結果を表３に示す。
【００４３】
【表３】
2004215586.tif 000004
【００４４】
［実施例４］
培地Ｂ、および培地Ｄのそれぞれ５０ｍＬを５００ｍＬ容のヒダ付き三角フラスコに入れ、１２１℃、２０分間滅菌した。冷却後、ロドトルラ・ムシラギノサ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａ）ＩＦＯ  ０６９６株をそれぞれ一白金耳植菌し、２４℃、４８時間培養した。培地Ｂのフラスコには１０ｇ／Ｌのトルエン溶液（エタノールに溶解）を２５０μＬ添加し、さらに２４時間、２４℃で振盪反応を行った。反応終了後、遠心分離で上清を分離し、ＨＣｌにてｐＨを２．０に調整した。この上清を酢酸エチル５０ｍＬで抽出し、有機層を分離し、減圧下に濃縮、乾固した。残渣を０．１％ギ酸／アセトニトリル［９：１］に溶解し、多波長検出器を接続した高速液体クロマトグラフィーにて４−ＨＢＡに相当するピークの紫外〜可視部の吸収スペクトルを解析した。その結果、標準品（図１）と同様のスペクトルであることが判明した（図２）。さらに、同ピークのＬＣ／ＭＳスペクトルを解析したところ、４−ＨＢＡ標準品のスペクトルと一致し、生成した化合物が４−ＨＢＡであることが確かめられた（図３〜図４）。
【００４５】
［実施例５］
実施例１のロドトルラ・ムシラギノサ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａ）ＩＦＯ  ０６９６株以外の株、実施例２、実施例３の内、ロドトルラ・ムシラギノサ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａ）ＩＦＯ  ０６９６株以外の株の培養／反応液について、実施例４と同様にしてサンプルを調製した。多波長検出器を接続した高速液体クロマトグラフィーを用いて、反応生成物の４−ＨＢＡに相当するピークの紫外〜可視部の吸収スペクトルを解析した。その結果、いずれも４−ＨＢＡの標準品と同様のスペクトルを持つことが判明し、４−ＨＢＡが生成していることが確かめられた。
【００４６】
［実施例６］
ロドトルラ・ムシラギノサ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａ）ＩＦＯ  ０６９６株を５０ｍＬの培地Ｂをいれたヒダ付き三角フラスコで２４℃、４８時間振盪培養し、前培養した。次いで。培地Ｄの１２００ｍＬを丸菱バイオエンジ製ＭＤＬ−２００型２．０Ｌ容ミニジャーに入れ、１２１℃、２０分間滅菌した。冷却後、ロドトルラ・ムシラギノサ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａ）ＩＦＯ  ０６９６株の前培養液１２ｍＬを植菌し、６００回転、２４℃、０．５ｖｖｍで通気しながら４８時間培養した。培養液中には４−ＨＢＡが０．８２ｇ／Ｌ生成していた。培養終了後、遠心分離にて菌体を除去し、上清を分離した。次いで、Ｈ２ＳＯ４でｐＨを２．０に調整し、１２００ｍＬの酢酸エチルで２回抽出し、有機層を集め、減圧下に濃縮、乾固した。残渣をキシレン−エタノール［１：１］に溶かして再結晶し、４−ＨＢＡの結晶０．６９ｇを得た。純度９５％、一貫収率２８．７％。
【００４７】
【発明の効果】
本発明の４−ヒドロキシ安息香酸の製造方法によれば、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、ブレブンディモナス（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ）属、マイコプラナ（Ｍｙｃｏｐｌａｎａ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、およびロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属に属する微生物をトルエンに作用させることにより４−ヒドロキシ安息香酸を容易に得ることができる。
【００４８】
また本発明は、カルノバクテリウム（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、アミコラトプシス（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）属、シュドジマ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ）属、ネオコスモスポラ（Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ）属、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属、ベウベリア（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ）属、ヒポマイセス（Ｈｙｐｏｍｙｃｅｓ）属、アルタナリア（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ）属、ゲラシノスポラ（Ｇｅｌａｓｉｎｏｓｐｏｒａ）属、ステムフィリウム（Ｓｔｅｍｐｈｙｌｉｕｍ）属、ユーロティウム（Ｅｕｒｏｔｉｕｍ）属、カバティエラ（Ｋａｂａｔｉｅｌｌａ）属、クルブラリア（Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ）属、ペスタロティア（Ｐｅｓｔａｌｏｔｉａ）属、ピコノポラス（Ｐｙｃｎｏｐｏｒｕｓ）属、およびレンジテス（Ｌｅｎｚｉｔｅｓ）属に属する微生物を安息香酸に作用させることにより４−ヒドロキシ安息香酸を容易に得ることができる方法を提供した。
【００４９】
更に本発明は、ロドトルラ・グルチニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｉｓ）、ロドトルラ・ムシラギノサ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａ）、ロドトルラ・フジサエンシス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｆｕｊｉｓａｎｅｎｓｉｓ）、ロドトルラ・ムスコラム（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｍｕｓｃｏｒｕｍ）、ロドトルラ・ノトファギ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｎｏｔｈｏｆａｇｉ）、ロドトルラ・アラウカリアエ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ａｒａｕｃａｒｉａｅ）、あるいはロドトルラ・フラガリア（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｆｒａｇａｒｉａ）を安息香酸に作用させることにより４−ヒドロキシ安息香酸を容易に得ることができる方法を提供した。
【００５０】
反応に必要な酵素の遺伝子を有する形質転換体による製造法においては、基質や生成物の宿主に対する毒性が、４−ヒドロキシ安息香酸の生産量を制限する要因となっていた。これに対して本発明に用いる微生物は、もともと基質であるトルエンや安息香酸、あるいは生成物である４−ヒドロキシ安息香酸に対する耐性を有していることが期待できる。したがって、基質濃度を高く設定することも可能である。また、生成物である４−ヒドロキシ安息香酸の蓄積による、微生物活動の低下を避けることができる。
【００５１】
本発明の４−ヒドロキシ安息香酸の製造方法は、既知の反応に比べて４−ヒドロキシ安息香酸の収量に優れる。また微生物の培養物あるいは菌体を使った生化学的な反応を利用しているので、エネルギー消費量を小さく抑えることができる。本発明によって製造された４−ヒドロキシ安息香酸は、プラスチック原料モノマー、液晶原料、あるいは防腐剤として重要なヒドロキシカルボン酸化合物である。
【図面の簡単な説明】
【図１】多波長検出器による４−ヒドロキシ安息香酸（標品）の同定結果を示す吸収スペクトル（上）、およびクロマトグラム（下）である。
【図２】ロドトルラ・ムシラギノサ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａ  ）ＩＦＯ  ０６９６株に、安息香酸を基質として加えたときに培養液中に蓄積した生成物の、吸収スペクトル（上）、およびクロマトグラム（下）である。
【図３】ロドトルラ・ムシラギノサ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａ  ）ＩＦＯ  ０６９６株に、安息香酸を基質として加えたときに培養液中に蓄積した生成物のＬＣ／ＭＳスペクトル解析におけるクロマトグラムである。図中、上がＵＶ２８０ｎｍ、中がＵＶ２２０ｎｍ、下が全ｉｏｎ（ｔｏｔａｌ  ｉｏｎ）検出時のクロマトグラムである。
【図４】図３におけるメインピークに対応する成分のＭＳスペクトルである。
【図１】
2004215586.tif 000005
【図２】
2004215586.tif 000006
【図３】
2004215586.tif 000007
【図４】
2004215586.tif 000008