(57)【要約】【課題】２種以上の特定の細胞を簡単、大量、安全に分離、回収できる材料、特にヒト血液および臍帯血中に存在する造血幹細胞、神経幹細胞、血管内皮前駆細胞、多能性幹細胞や樹状細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞などの表面抗原とリガンドとの相互作用を利用することにより、治療に有用な特定の細胞を２種以上、回収するカラムを提供する。【解決手段】２種以上のリガンドと前記リガンドを固定化するための基材からなるリガンド固定化材料を含むカラムであって、基材に固定化された２種以上のリガンドを外部刺激により脱離できることを特徴とするリガンド固定化カラム。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
２種以上のリガンドと前記リガンドを固定化するための基材からなるリガンド固定化材料を含むカラムであって、基材に固定化された２種以上のリガンドを外部刺激により脱離できることを特徴とするリガンド固定化カラム。
【請求項２】
２種以上のリガンドのそれぞれがカラム内の一区域内に分けて固定化されており、かつそれら区域が分離できることを特徴とする請求項１に記載のリガンド固定化カラム。
【請求項３】
少なくとも一区域において、基材の形状が繊維状、中空糸膜状または平膜状であることを特徴とする請求項１または２に記載のリガンド固定化カラム。
【請求項４】
前記基材が多孔質であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のリガンド固定化カラム。
【請求項５】
前記基材が海島型繊維であることを特徴とする請求項１または２のいずれかに記載のリガンド固定化カラム。
【請求項６】
前記基材がポリスルホン、セルロース、ポリメチルメタクリレート、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレンからなる群より選択される１種以上の高分子化合物を含むことを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載のリガンド固定化カラム。
【請求項７】
前記基材が親水性高分子を含むことを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載のリガンド固定化カラム。
【請求項８】
前記親水性高分子がポリビニルピロリドンであることを特徴とする請求項７に記載のリガンド固定化カラム。
【請求項９】
前記リガンドと前記基材とが化学結合を介して固定化されており、前記化学結合が前記外部刺激によって切断されることにより前記リガンドが脱離可能であることを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載のリガンド固定化カラム。
【請求項１０】
前記外部刺激が還元剤による還元反応であることを特徴とする請求項１〜９のいずれかに記載のリガンド固定化カラム。
【請求項１１】
前記リガンドが前記基材にジスルフィド結合を介して固定化されていることを特徴とする請求項１〜１０のいずれかに記載のリガンド固定化カラム。
【請求項１２】
前記リガンドが抗体あるいはレセプターであることを特徴とする請求項１〜１１のいずれかに記載のリガンド固定化カラム。
【請求項１３】
細胞を分離回収するために用いられることを特徴とする請求項１〜１２のいずれかに記載のリガンド固定化カラム。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれかに記載のリガンド固定化カラムであって、分離して得られた細胞が癌または自己免疫疾患または脳梗塞またはパーキンソン病またはアルツハイマー病または糖尿病または心筋梗塞または血管再生の治療又はワクチンとして用いられることを特徴とする疾病治療用カラム。
【請求項１５】
前記細胞が造血幹細胞、Ｔ細胞、神経幹細胞のいずれかであることを特徴とする請求項１４に記載の疾病治療用カラム。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、血液中の病因物質や有用物質を除去回収、特に幹細胞やリンパ球系の細胞などの特定の細胞を２種以上、分離回収するための外部刺激により基材に固定化したリガンドが脱離することを特徴とするリガンド固定化カラムに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
近年、造血幹細胞、特にＣＤ３４陽性細胞移植において、骨髄、臍帯血、動員末梢血からＣＤ３４陽性細胞のみを分離して、それを移植に用いられようとしている。しかし、骨髄、臍帯血、動員末梢血内にはＣＤ３４陽性細胞のみならず、免疫系のＴ細胞、Ｂ細胞や神経幹細胞、血管内皮前駆細胞など種々の貴重な細胞源が含まれているにもかかわらず、ＣＤ３４陽性細胞のみが用いられ、残りの細胞は廃棄されてしまっている。
【０００３】
ＣＤ３４陽性細胞のような特定の細胞を分離する際には、リガンド、特に抗体を用いて、抗体と相互作用する細胞を選択的に分離する試みがなされている。方法としては、フローサイトメトリーによる方法や磁気ビーズ法などがあげられるが、いずれも少量の細胞を対象としており、さらに、細胞と標識抗体とを反応させた後、分離作業をするという非常に煩雑な操作が必要であり、特定の細胞を大量に回収する際は、時間、コストがかかることが問題であった。さらに、２種以上の細胞を分離する際は、繰り返し同じ操作を繰り返す必要があった。
【０００４】
さらに、抗体を担体に固定化した材料を用い、ここに血液細胞などの細胞群を流すことにより、抗体と相互作用する特定の細胞だけを除去する技術が検討されている。
【０００５】
例えば、ヒト表面抗原を認識する抗体を不織布に固定化し、特定の血球成分を除去することが試みられている（例えば、特許文献１参照）。しかし、このような技術では、抗体と相互作用する細胞が除去されるだけであり、それらの細胞を担体表面から回収し、さらに利用することは困難である。
【０００６】
また、リガンドを固定化したカラム担体を用いて目的物質を回収する技術として、プロテインＧセファロース、キレートカラム、グルタチオンカラムなどが知られており（例えば、非特許文献１参照）、これらの技術は固定化したリガンドが何らかの外部刺激で脱離できるような構造をもつことにより、一度リガンドに吸着した物質を、外部刺激によりリガンドと共に脱離、回収することができるものとなっている。しかし、これらの技術では、担体としてゲルや微粒子を使用しているため、細胞群など比較的大きな目的物質を対象とする場合、目的物質が空孔を通過する際に空孔を塞いでしまうため、目的物質の回収率が低かったり、あるいは、リガンドと目的物質の適切な相互作用ができないことが問題であった。さらに、これら従来の回収技術で血液から特定の細胞を回収する場合には、一度血液を体外に取り出した後に、血液を分離材料へ添加するという方法をとる必要があり、大気中の雑菌や微生物が混入する危険性がある。さらに、体外へ取り出せる血液量に限界があるため、処理できる血液量が少なく、回収できる細胞数が少なくなる傾向にある。そのため、血液を体外に取り出す前にＧ−ＣＳＦ等の医薬品により目的とする細胞数を上昇させるなどの方法が行われているが、これら医薬品による副作用が重大な問題となってくる。
【０００７】
【特許文献１】
国際公開第９７／０２７８７８号パンフレット
【０００８】
【非特許文献１】
ファルマシアバイオテク株式会社，「アフィニティクロマトグラフィー」、１９９４年、ｐ４１〜１０２
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明では、上記従来技術の欠点を解消するものであり、２種以上の特定の細胞を簡単、大量、安全に分離、回収できる材料、特にヒト血液および臍帯血中に存在する造血幹細胞、神経幹細胞、血管内皮前駆細胞、多能性幹細胞や樹状細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞などの表面抗原とリガンドとの相互作用を利用することにより、治療に有用な特定の細胞を２種以上、回収するカラムを提供することを目的としている。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するために、本発明は下記構成を有する。
（１）２種以上のリガンドと前記リガンドを固定化するための基材からなるリガンド固定化材料を含むカラムであって、基材に固定化された２種以上のリガンドを外部刺激により脱離できることを特徴とするリガンド固定化カラム。
（２）２種以上のリガンドのそれぞれがカラム内の一区域内に分けて固定化されており、それら区域が分離できる（１）に記載のリガンド固定化カラム。
（３）少なくとも一区域において、基材の形状が繊維状、中空糸膜状または平膜状であることを特徴とする（１）または（２）に記載のリガンド固定化カラム。
（４）前記基材が多孔質であることを特徴とする（１）〜（３）に記載のリガンド固定化カラム。
（５）該基材が海島型繊維であることを特徴とする（１）または（２）のいずれかに記載のリガンド固定化カラム。
（６）前記基材がポリスルホン、セルロース、ポリメチルメタクリレート、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレンからなる群より選択される高分子化合物を含むことを特徴とする（１）〜（５）のいずれかに記載のリガンド固定化カラム。
（７）前記基材が親水性高分子を含むことを特徴とする（１）〜（６）のいずれかに記載のリガンド固定化カラム。
（８）前記親水性高分子がポリビニルピロリドンであることを特徴とする（７）に記載のリガンド固定化カラム。
（９）前記リガンドと前記基材とが化学結合を介して固定化されており、前記化学結合が前記外部刺激によって切断されることにより前記リガンドが脱離可能であることを特徴とする（１）〜（８）のいずれかに記載のリガンド固定化カラム。
（１０）前記外部刺激が還元剤による還元反応であることを特徴とする（１）〜（９）のいずれかに記載のリガンド固定化カラム。
（１１）前記リガンドが前記基材にジスルフィド結合を介して固定化されていることを特徴とする（１）〜（１０）のいずれかに記載のリガンド固定化カラム。
（１２）前記リガンドが抗体あるいはレセプターであることを特徴とする（１）〜（１１）のいずれかに記載のリガンド固定化カラム。
（１３）細胞を分離するために用いられることを特徴とする（１）〜（１２）のいずれかに記載のリガンド固定化カラム。
（１４）（１）〜（１３）のいずれかに記載のリガンド固定化カラムであって、分離して得られた細胞が癌または自己免疫疾患または脳梗塞またはパーキンソン病またはアルツハイマー病または糖尿病または心筋梗塞または血管再生の治療又はワクチンとして用いられることを特徴とする疾病治療用カラム。
（１５）前記細胞が造血幹細胞、Ｔ細胞、神経幹細胞のいずれかであることを特徴とする（１４）に記載の疾病治療用カラム。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明においてリガンドを固定化する基材としては、血液などの細胞群を一度に大量に処理できる体外循環に使用可能な基材が好ましく、基材の形状としては平膜状、中空糸膜状、繊維状、粒子状、ゲル状、スポンジ状など何でもよいが、閉鎖系で圧力損失を伴わず、細胞を傷つけず体外循環できる利点から平膜状、中空糸膜状、繊維状が望ましく、また、表面積を確保し、細胞とリガンドとの相互作用を大きくする点から、繊維状の不織布などにおいて、極細化されていても良い。
【００１２】
本発明のリガンド固定化カラムは、２種以上のリガンドのそれぞれがカラム内の各区域内に分けて固定化されており、それら区域が容易に分離でき、それぞれの区域のリガンドが外部刺激により脱離できる構造となっている。例えば、基材に中空糸膜を用いた場合は、区域が糸方向に分割できるように、それぞれ異なるリガンドを基材に固定化した２種以上のカラムが組み込まれている。編み地や不織布のような布帛を用いる場合は、面方向に分割できるように、それぞれ異なるリガンドを基材に固定化した２種以上のカラムが組み込まれている（図１および２参照）。
【００１３】
ここでいう区域とは、カラムを構成する複数のブロックのことを指し、カラムで複数の細胞を補足後、ブロックを分離し、それを小カラムとして、それぞれのブロックに捕捉された細胞を回収することができる。
【００１４】
本発明において、基材に使用される素材は、医療用に用いられている素材が好ましく、例えば、ポリ塩化ビニル、セルロース系ポリマー、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、ポリカーボネート、ポリスルホン、ポリウレタン、ポリエステル、ポリアミド、ポリエチレン、ポリプロピレンなどが挙げられる。
【００１５】
また、ポリスルホンなど疎水性の高分子を血液や細胞と接触するような用途で使用する際は、その接触面を親水化することが好ましい。親水化の方法としては、ポリビニルピロリドンやポリエチレングリコールなどのポリスルホン系高分子との相溶性に優れる親水性高分子を加工前のポリスルホン溶液に添加したり、血液や細胞との接触面を親水性の化合物でコーティングすることにより達成できる。これらのうちで血液適合性の観点からポリビニルピロリドンが好適に用いられる。
【００１６】
ポリメチルメタクリレートは、アイソタクチック構造部分とシンジオタクチック構造部分をもつが、アイソタクチックリッチのポリマーを単独で用いてもよいし、シンジオタクチックリッチのポリマーを単独で用いてもよい。しかし、アイソタクチシチの高いポリメチルメタクリレートと、シンジオタクチシチの高いポリメチルメタクリレートとは、ある条件下において構造的な絡み合い、いわゆるステレオコンプレックスを形成できるため、成形性の観点から両者をブレンドしてステレオコンプレックス構造をもたせたものが望ましい。
【００１７】
また、本発明において、基材にリガンドを固定化するためには基材表面に活性基や官能基を含有させ、それを利用してリガンドを固定化する方法や、基材表面に陰性荷電をもたせ、カチオン性ポリマーと複合化したリガンドを静電的相互作用により固定化する方法や、ポリエチレングリコールと複合化したリガンドを疎水性相互作用によりポリメチルメタクリレート系含水材料に固定化する方法などがある。
【００１８】
活性基または官能基としては臭化シアンによる活性基、プラズマ処理による活性基、スクシンイミド基やα−クロロアセトアミドメチル基、クロロメチル基に加え、アミノ基、カルボキシル基、硫酸基、水酸基、リン酸基、イソシアネート基、ニトロ基、アルデヒド基、ピリジルジスルフィド基などが挙げられるが、リガンドの固定化反応の容易さと水溶液で中での安定性からアミノ基が好適である。
【００１９】
基材にアミノ基を含有させる方法としては、あらかじめ成形のための溶液にアミノ基を有する物質をブレンドしておいてから成形する方法や、成形した材料にアミノ基を含有する物質を含む溶液に浸漬または付着させ、放射線照射により固定化する方法、材料に活性基を導入しておき、アミノ基含有物質を固定化する方法などが用いられる。例えば、ポリスルホン／ポリビニルピロリドンブレンド基材を十分水洗した後、１ｗｔ％のポリエチレンイミン水溶液に浸漬して、２５ｋＧｙにてγ線照射して基材にアミノ基を含有させる方法、あるいは、ポリスチレン基材をＮ−メチロール−α−クロロアセトアミド、ニトロベンゼン、硫酸、パラホルムアルデヒドの混合液で反応させ、クロロアセトアミドメチル化架橋ポリスチレン基材を得て、さらに、ポリエチレンイミンをトリエチルアミン、ジメチルスルホキシドの混合溶液に溶解し、この溶液にクロロアセトアミドメチル化架橋基材を加えて攪拌、洗浄して、ポリスチレン基材へアミノ基を導入することができるが、これらの方法に限定されない。
【００２０】
基材にアミノ基を含有させる場合は、材料全体にアミノ基を含有させてもよいし、血液や細胞の接触する部分だけにアミノ基を含有させてもよい。中空糸膜の内表面を用いる場合は、アミノ基含有高分子量物質を内側からろ過し、充填することにより内表面にアミノ基を集積させることができる。
【００２１】
基材にアミノ基を含有させる際に使用するアミノ基を有する物質としては、ポリマーであっても低分子であってもよい。低分子の場合は、アンモニア、テトラエチレンペンタミン、デンドリマー、アグマチンなどが用いられる。ポリマーの場合は、ポリアルキレンイミン、ポリアリルアミン、ポリビニルアミン、ポリリジン、アジリジン（エチレンイミン）化合物を有するポリマー、ポリエチレンイミン誘導体、キトサン、グリシンエステル化ポリエチレングリコール、ヒドラジド化ポリエチレングリコール、ω−ヒドロキシ−α−アミンポリエチレングリコール、ω−アミノ−α−カルボキシルポリエチレングリコールおよびそれらに置換基の導入されたもの、およびこれらを構成するモノマー単位からなる共重合体などが挙げられるがこれらに限定されない。
【００２２】
これらアミノ基を有するポリマーの中でも毒性の低さ、入手のしやすさ、取り扱いのしやすさなどから、分岐状のポリエチレンイミンが特に好適に用いられる。ポリエチレンイミンは、分子量６００以上の直鎖状、分岐状のものが好ましく用いられ、また、ポリエチレンイミンの誘導体としては、ポリエチレンイミンをアルキル化、カルボキシル化、フェニル化、リン酸化、スルホン化、メルカプト化、ピリジルジスルフィド化など、所望の割合で誘導体化したものが挙げられる。
【００２３】
また、上記の成形した材料にアミノ基を含有する物質を含む溶液に浸漬または付着させ、放射線照射により固定化する方法をとる際の放射線処理としては、湿潤状態でγ線・電子線などを照射すればよい。ここでいう湿潤状態とは、材料を乾燥させない状態のことを言う。その程度は特に限定されるものではないが、通常、材料が１重量％以上の水分を含んでいることが好ましい。
【００２４】
放射線の吸収線量は湿潤状態で１０〜５０ｋＧｙ程度が好ましく、２０ｋＧｙを超える線量を照射した場合は、滅菌処理を同時に行うことも可能である。この際、吸収線量は線量測定ラベルをモジュールの表面に貼り付けるなどして測定することができる。得られたアミノ基含有材料を医療用途に用いる場合は、リガンド固定化操作を無菌下で行うことが望ましい。
【００２５】
ポリメチルメタクリレートからなる材料は、加水分解によりカルボキシル基を導入し、カルボジイミドなどの縮合剤を用いて、アミノ基を有するリガンドを固定化することができる。また、多孔質状で含水状態であると、ポリエチレングリコールと疎水性相互作用により結合できるので、リガンドをポリエチレングリコールと複合化すれば、リガンドをポリメチルメタクリレートに固定化できる。
【００２６】
陰性荷電を表面をもつ材料には、カチオン性ポリマーと複合化したリガンドを静電的相互作用により固定化することができる。陰性荷電を表面をもつ材料は、化学反応、グラフト反応、放射線架橋、共重合、ブレンド、イオン注入、真空蒸着、コーティングなど材料表面にアニオン性を付与できる方法であれば何でも良い。
【００２７】
例えば、セルロースにアミノ基を導入し、カルボジイミドでヘパリンを固定化させてやることにより、アニオン性表面を導入できる。ポリスルホンとポリビニルピロリドンからなる材料の場合は、デキストラン硫酸の水溶液中で放射線を照射することにより、材料表面にアニオン性を付与できる。また、ポリスチレンからなる材料の場合は、濃硫酸で処理してやることにより、表面に硫酸基を導入でき、表面にアニオン性官能基を導入できる。また、ポリメチルメタクリレートを通常のラジカル重合によって得る際、カルボキシル基や、スルホン酸基などのアニオン性基を含有するビニルモノマーと共重合したものを、材料に成形することにより、材料表面にアニオン性を付与できる。また、アニオン性ポリマーをポリメチルメタクリレートのようなポリマーとブレンドして成形することによっても材料表面にアニオン性を付与することができる。ナイロンやポリエステルにアクリル酸をグラフトすることによっても得ることができる。金属の負イオン注入によっても得ることができる。
【００２８】
本発明のリガンド固定化カラムにおいては、材料に固定化したリガンドが外部刺激により脱離できる特徴をもつことにより、基材上のリガンドにより捕捉した物質を容易に回収することができる。このような外部刺激としては、光、熱、ｐＨ、塩濃度、化学反応などがあげられるが、リガンドの安定性などから化学反応により化学結合を切断してリガンドが脱離される材料が好ましく、化学的な結合が切断される反応として、加水分解反応、酸化反応、還元反応、酵素反応などがあげられる。担体がセルロースである場合には、リガンドを直接固定化して、セルラーゼを用いて、担体を酵素処理してリガンドに結合した細胞を回収したり、担体とリガンドをＤＮＡを介して結合し、ＤＮＡ分解酵素（ＤＮａｓｅ）で酵素処理して、リガンドと結合した細胞を回収することもできるが、取り扱い性、コスト、水中での安定性や細胞の生存率維持の必要性から還元反応が好ましい。特に、ジスルフィド結合を還元剤による還元反応により切断させる反応は、タンパク質のリフォールディングなど生体内で良く行われる反応であり、リガンドを脱離する反応として好適であるため、基材にジスルフィド結合を介してリガンドを固定化することが望ましい。ここで使用する還元剤としてジチオスレイトール、メルカプトエタノール、システイン、還元型グルタチオンなどがあげられる。
【００２９】
基材にジスルフィド結合を介してリガンドを固定化する方法としては、基材に直接ジスルフィド結合を介してリガンドを固定化してもよいし、ポリエチレングリコールやポリエチレンイミンのように、基材と相互作用をもつ分子をリガンドとジスルフィド結合で複合化したものをそれぞれポリメチルメタクリレート系含水材料や陰性荷電表面をもつ材料に固定化してもよい。
【００３０】
リガンドがタンパク質である場合は、タンパク質自身もジスルフィド結合を有することもあるので、リガンドを直接材料に固定しても良いが、通常、メルカプト基同士の酸化反応、あるいはジスルフィド交換反応を利用してジスルフィド結合を形成させる方法をとる。ジスルフィド交換反応を利用する方法としては、ピリジルジスルフィド基とメルカプト基の交換反応を用いるのが反応性の点から好ましく、ピリジルジスルフィド基やメルカプト基を基材、リガンド、被複合ポリマーに導入して結合、複合化させる。この際、通常架橋剤を利用する。
【００３１】
上記のようなジスルフィド結合を介した固定化、複合化に利用できるような架橋剤としては、基材表面の官能基同士あるいはリガンド同士、被複合ポリマー同士の結合を防ぐため二種類の違った官能基と反応する活性化基をもつ架橋剤を使用することが好ましく、活性化基として、アミノ基と反応するＮ−ヒドロキシスクシンイミド基、イミドエステル基、ニトロアリールハライド基、メルカプト基と反応するマレイミド基、ピリジルジスルフィド基、チオフタルイミド基、活性化ハロゲン基、光化学反応により架橋するフェニルアジド基、ジアゾカルベン基、などを持つような架橋剤を利用することができる。なかでも、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基とピリジルジスルフィド基を持つような架橋剤を利用することにより、上記で作製したようなアミノの基を有する基材や抗体などのアミノ基を有するリガンド、アミノ基を有する被複合ポリマーにピリジルジスルフィド基を導入できる。また、このピリジルジスルフィド基を還元剤により還元することによりメルカプト基に変換できる。このような架橋剤として、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオネート、スクシンイミジル６−［３’−（２−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド］ヘキサノエートや水溶性のスルフォスクシンイミジル６−［３’−（２−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド］ヘキサノエートなどが挙げられる。水に不溶性の架橋剤を用いる場合は、ジメチルスルホキシドやメタノールなどの可溶性の有機溶媒に溶解後、水系の反応液に添加することにより利用できるが、材料に反応させる際は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基とピリジルジスルフィド基を持つような架橋剤はポリスルホン系材料に吸着しやすいため、メタノール、ジエチレングリコール、グリセリンなどの架橋剤を溶解し、ポリスルホン系材料を溶解しない有機溶媒で洗浄することが望ましい。
【００３２】
上記のような架橋剤などを利用して基材または被複合ポリマーにピリジルジスルフィド基が導入される場合には、例えば下記反応式（１）のような反応を用いて固定化できる。リガンドの方に上記のような架橋剤を利用してピリジルジスルフィド基を導入、還元してメルカプト基を導入する、あるいは、リガンドが抗体である場合には、抗体をペプシンで消化してメルカプト基を生成させ、これらリガンドのメルカプト基と基材上のピリジルジスルフィド基のジスルフィド交換反応によりジスルフィド結合を介してリガンドを基材に固定化する。ここで、リガンドにピリジルジスルフィド基を導入して還元する際には、リガンドが抗体である場合、抗体自体の還元による失活を防ぐために酢酸緩衝液中などで還元することにより抗体自身の還元を抑えることができる。
【００３３】
【化１】
2004194720.tif 000002
【００３４】
また、上記のような架橋剤などを利用して基材または被複合ポリマーにメルカプト基が導入されている場合、例えば下記反応式（２）のような反応を用いて固定化できる。リガンドに上記のような架橋剤ピリジルジスルフィド基を導入したもの使用し、リガンドのピリジルジスルフィド基と基材上のメルカプト基のジスルフィド交換反応によりジスルフィド結合を介してリガンドを基材に固定化することができる。
【００３５】
【化２】
2004194720.tif 000003
【００３６】
基材へ導入されるピリジルジスルフィド基あるいはメルカプト基の密度は高い方が望ましいが、反応に用いる架橋剤の濃度や反応時間により制御することができるので、適宜選ぶことができる。
【００３７】
リガンドおよび被複合ポリマーへのピリジルジスルフィド基の導入率はリガンド１モル当たり１モル以上であることが必要であるが、導入率を上げるためにピリジルジスルフィド化剤の仕込量を上げるとリガンドがタンパク質の場合は失活したり、凝集したりするおそれがある。望ましくは仕込量はリガンド１モルあたり１０モル以下が望ましい。
【００３８】
基材にリガンドを固定化する際のリガンドの濃度は、固定化密度を上げるためには高い方が望ましいが、コスト面から考えて、１ｍｇ／ｍｌ以上が望ましい。０．５ｍｇ／ｍｌ以下の場合は固定化されるリガンドの量が少なくなり、機能が低下する恐れがある。
【００３９】
以上の示したようなような反応を利用してリガンドを基材にジスルフィド結合を介して固定化させる方法の例を以下に示すが、固定化の方法はこれらに限定されない。
【００４０】
例えば、アミノ基を含有するポリスルホン基材を架橋剤としてＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオネート（以下ＳＰＤＰ）を溶解したジメチルスルホキシド溶液に浸漬し反応させた後、ジチオスレイトールを含むリン酸緩衝液で還元し、メルカプト基を有するポリスルホン平膜を得る。さらに、ヒト免疫グロブリンＧにＳＰＤＰを溶解したジメチルスルホキシド溶液を抗体１モルに対して１０モル添加し、室温で３０分反応させて、免疫グロブリンＧにピリジルジスルフィド基を導入した後、精製する。メルカプト基を有するポリスルホン平膜にピリジルジスルフィド基を導入したヒト免疫グロブリンＧを反応させ、ヒト免疫グロブリンＧをポリスルホン平膜にジスルフィド結合を介して固定化した材料を作製する。この材料を還元剤としてジチオスレイトールを含むリン酸緩衝液に浸漬して、ジスルフィド結合を還元することによりヒト免疫グロブリンＧを脱離させることができる。
【００４１】
本発明で使用するリガンドは、細胞などのターゲット物質と相互作用をもつものであれば、合成品でも天然物でもよいが、特異性の点から抗体およびレセプターを好ましく用いることができる。用いる抗体としては、例えば、抗ＣＤ１ａ抗体、抗ＣＤ１ｂ抗体、抗ＣＤ１ｃ抗体、抗ＣＤ２抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ８抗体、抗ＣＤ１０抗体、抗ＣＤ１１ａ抗体、抗ＣＤ１１ｂ抗体、抗ＣＤ１１ｃ抗体、抗ＣＤｗ１２抗体、抗ＣＤ１３抗体、抗ＣＤ１４抗体、抗ＣＤ１５抗体、抗ＣＤ１６ａ抗体、抗ＣＤ１６ｂ抗体、抗ＣＤ１８抗体、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ２２抗体、抗ＣＤ２３抗体、抗ＣＤ２４抗体、抗ＣＤ２５抗体、抗ＣＤ２６抗体、抗ＣＤ２７抗体、抗ＣＤ２８抗体、抗ＣＤ３０抗体、抗ＣＤ３１抗体、抗ＣＤ３２抗体、抗ＣＤ３３抗体、抗ＣＤ３４抗体、抗ＣＤ３８抗体、抗ＣＤ４０抗体、抗ＣＤ４２ａ抗体、抗ＣＤ４４抗体、抗ＣＤ４５抗体、抗ＣＤ４５ＲＡ抗体、抗ＣＤ４５ＲＯ抗体、抗ＣＤ４９ｄ抗体、抗ＣＤ５０抗体、抗ＣＤ５４抗体、抗ＣＤ５６抗体、抗ＣＤ５７抗体、抗ＣＤ５８抗体、抗ＣＤ６１抗体、抗ＣＤ６２Ｌ抗体、抗ＣＤ６２Ｐ抗体、抗ＣＤ６６抗体、抗ＣＤ６９抗体、抗ＣＤ７０抗体、抗ＣＤ７１抗体、抗ＣＤ８０抗体、抗ＣＤ８１抗体、抗ＣＤ８６抗体、抗ＣＤ９５抗体、抗ＣＤ１０２抗体、抗ＣＤ１０５抗体、抗ＣＤ１０６抗体、抗ＣＤ１０９抗体、抗ＣＤｗ１１９抗体、抗ＣＤ１２０ａ抗体、抗ＣＤ１２０ｂ抗体、抗ＣＤ１２１ａ抗体、抗ＣＤｗ１２１ｂ抗体、抗ＣＤ１２２抗体、抗ＣＤ１２３抗体、抗ＣＤ１２６抗体、抗ＣＤｗ１２８ａ抗体、抗ＣＤ１３０抗体、抗ＣＤｗ１３１抗体、抗ＣＤ１３２抗体、抗ＣＤ１３３抗体、抗ＣＤ１３４抗体、抗ＣＤ１０５抗体、抗ＣＤ１３８抗体、ＣＤ１５２抗体、抗ＣＤ１５４抗体、抗ＣＤ１９９抗体、抗低比重リポ蛋白質（ＬＤＬ）抗体、抗酸化ＬＤＬ抗体、抗β２ミクログロブリン抗体、抗ＣＣＲ１抗体、抗ＣＣＲ２抗体、抗ＣＣＲ３抗体、抗ＣＣＲ４抗体、抗ＣＣＲ５抗体、抗ＣＣＲ７抗体、抗ＣＸＣＲ３抗体、抗ＣＸ３ＣＲ１抗体、抗ＣＸＣＲ５抗体、抗ＣＸＣＲ１抗体などが挙げられるが、これらに限定されない。また、レセプターとしては例えば、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ７、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ３、ＣＸ３ＣＲ１、ＣＸＣＲ５等のサイトカインレセプターやＦｃγ，Ｆｃε等のイムノグロブリンレセプター、ＲＡＧＥ，ＬＤＬレセプター等のスカベンジャ−レセプター等，Ｔ細胞レセプターや主要組織適合性抗原等の細胞認識レセプター等が挙げられるが、これらに限定されない。これらの抗体やレセプターは単独で固定化しても良いし、複数の抗体やレセプターを組み合わせても良い。抗体は、アフィニティーの高さからモノクローナル抗体が好ましい。
【００４２】
これら抗体やレセプターは目的によって種々選定することができる。例えば、抗ＣＤ３４抗体を固定化した区域と抗ＣＤ４抗体を固定化した区域をもつカラムを用いれば、臍帯血などの血液を循環し、細胞を捕捉後、解体した区域について外部刺激することにより、それぞれ造血幹細胞およびＴ細胞が得られる。
【００４３】
本発明のリガンド固定化カラムを利用すれば、上記で示したようなターゲットとなる２種以上の細胞をカラムの各区域のリガンドにより捕捉でき、さらに、外部刺激により各区域からリガンドを基材から離脱させることにより、捕捉した２種以上の細胞を回収する事が可能である。また、細胞を捕捉あるいは回収する際に使用する溶媒として、様々なｐＨ値のリン酸、酢酸、クエン酸などの緩衝液を用いることができ、さらに緩衝液の中にウシ血清アルブミンや抗体などのタンパク質あるいはカチオン性、アニオン性などのポリマーなどを含有していても良い。
【００４４】
さらに素材として多孔質材料を用いた場合は、透析やろ過機能を付与することができ、血液浄化、細胞分離用途のみならず、バイオリアクターなどの細胞培養用材料としても用いることができる。
【００４５】
細胞を回収する際は全血と作用させてもよいし、血漿分画や単核球分画などにした後、作用させてもよい。
【００４６】
また、本発明のリガンド固定化カラムにおいて、基材に中空糸膜を用いる場合、例えば以下のようにしてカラムの一区域を製造することができるが、これに限定されるものではない。まず、中空糸膜は公知の方法により製造する。次に、中空糸膜を必要な長さに切断し、必要本数を束ねた後、筒状ケースに入れる。その後両端に仮のキャップをし、中空糸膜両端部にポッティング剤を入れる。このとき遠心機でモジュールを回転させながらポッティング剤を入れる方法は、ポッティング剤が均一に充填されるために好ましい方法である。ポッティング剤が固化した後、中空糸膜の両端が開口するように両端部を切断し、中空糸膜モジュールを得ることができる。このように作製した中空糸膜モジュールをカラムの一区域とし、これを並列もしくは直列に複数組み合わせ本発明のリガンド固定カラムとする。
【００４７】
基材に繊維を用いる場合、例えば以下のようにして得られる。円柱型のモジュール内径と同径の円形に打ち抜いた編み地または不織布を積層し、両端部に細胞群を流せる開口部を作製し、小モジュールする。このように作製した小モジュールをカラムの一区域とし、これを並列もしくは直列に複数組み合わせ、ヘッダーを取り付けて本発明のリガンド固定カラムとする。
【００４８】
基材に中空糸膜および編み地を利用した場合のカラムの例を、図１および２に示した。図１（ａ）は中空糸膜を利用した場合のカラムであって、４つのモジュール（区域）を並列に組み合わせたものである。各モジュール（区域）内の基材にはそれぞれ異なるリガンドが固定化されており、したがって少なくとも４種の細胞等を捕捉することができる。その後、図１（ｂ）のように、各モジュール（区域）を分離（解体）し、リガンドを外部刺激によって脱離させることにより、捕捉した細胞等をそれぞれ別に回収することができる。また、図２は編み地を利用した場合のカラムであって、円形に打ち抜いた編み地を複数積層したモジュール（区域）を作製し、それを３つ直列に組み合わせたものである。細胞等を捕捉後、図２（ｂ）のように分離（解体）し、リガンドを外部刺激によって脱離させることにより捕捉した細胞等をそれぞれ別に回収することができる。細胞等の回収については、各モジュール（区域）に上述の様々な外部刺激を与える物質を含む緩衝液を流すことにより行うことができる。なお、組み合わせるモジュール（区域）の数には制限はないが、それぞれの細胞回収に必要な表面積とカラムの大きさのバランスから考えて２〜１０個が好ましい。
【００４９】
以上のような方法で、回収した２種以上の細胞を分析に用いることが可能である。また、それを培養し、分析や治療などに利用できる。例えば、リガンドとして抗ＣＤ３４抗体および抗ＣＤ４抗体を使用し、このリガンドをジスルフィド結合を介して各区域の基材に固定化した本発明の材料に血液を通してＣＤ３４陽性細胞およびＣＤ４陽性細胞を捕捉し、各区域ごとにジチオスレイトールなどの還元剤でリガンドを脱離することにより、捕捉したそれぞれの細胞を大量に回収し、この細胞に様々な刺激を加えて増殖、活性化させ体内に戻すことにより、癌、アレルギー、感染症、臓器移植、あるいは自己免疫疾患の治療やワクチンとして用いることができる。
【００５０】
また、外部刺激によりジスルフィド結合を解離してリガンドを脱離した後の材料は、表面にメルカプト基を有するので、再びピリジルジスルフィドを有するリガンドを固定化し、再利用することもできる。
【００５１】
【実施例】
作製例１．メルカプト基を導入した修飾ポリスチレン繊維の作製
５０重量比の海成分（４６重量比のポリスチレンと４重量比のポリプロピレンの混合物）と５０重量比の島成分（ポリプロピレン）とからなる海島型複合繊維（厚さ：２．６デニール、島の数１６）を、３５ｇのＮ−メチロール−α−クロロアセトアミド、２３２．５ｇのニトロベンゼン、２３２．５ｇの９８％硫酸、０．５ｇのパラホルムアルデヒドの混合液を１０℃で２時間反応させた。繊維をニトロベンゼンで洗浄し、メタノールで反応を停止させた。これによりクロロアセトアミドメチル化架橋ポリスチレン繊維（以下ＡＭＰＳｔ繊維と略す）を得た。得られたＡＭＰＳｔ繊維を編地とした（以下ＡＭＰＳｔ編地と略す）。ポリエチレンイミン（分子量１万、和光純薬製）０．５７ｇを、トリエチルアミン０．９５ｇ、ジメチルスルホキシド４８．５ｇに溶解し、この溶液に上で作製したＡＭＰＳｔ編地を１．０２ｇ（クロロ基含量２．６ｍｍｏｌ相当）加え攪拌した。反応は３０℃で３時間行った。その後ジメチルスルホキシド、メタノール、純水で洗浄し、アミノ基を含有するＡＭＰＳｔ編地１を得た。
【００５２】
上記のＡＭＰＳｔ編地１をＮａＣｌを０．１５ｍＭ含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）にＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオネート（ピアース社製、以下ＳＰＤＰ）を２７ｍＭに溶解したジメチルスルホキシド溶液に０．５時間浸漬した（室温）。反応させたＡＭＰＳｔ編地１をリン酸緩衝液洗浄した後、洗浄した材料を１００ｍＭのジチオスレイトールを含むリン酸緩衝液で還元し、その後１００ｍｌの上記リン酸緩衝液で洗浄し、表面にメルカプト基をもつをＡＭＰＳｔ編地２を得た。
【００５３】
作製例２．抗ＣＤ３４抗体および抗ＣＤ４抗体へのピリジルジスルフィド基導入
０．１５ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に１．１ｍｇ／ｍｌとなるように抗ＣＤ３４抗体および抗ＣＤ４抗体を溶解した溶液に、ジメチルスルホキシドに溶解した２７ｍＭのＳＰＤＰを抗体１モルに対してＳＰＤＰが１０モルになるように添加し、室温で３０分反応させた。その後、ＰＤ−１０カラム（ファルマシア社製）でゲル濾過し高分子量分画のみを分画してＳＰＤＰ化抗ＣＤ３４抗体およびＳＰＤＰ化抗ＣＤ４抗体を精製した。それぞれのＳＰＤＰ化抗体をメルカプトエタノールで還元して生成するチオピリジン濃度を３４３ｎｍの吸収で測定して算出したＳＰＤＰ化率はいずれも２ｍｏｌＳＰＤＰ／１ｍｏｌ抗体であった。
【００５４】
作製例３．リガンド固定化カラムの作製
作製例１．で作製したメルカプト基が導入されたＡＭＰＳｔ編地２を作製例２．で得られたＳＰＤＰ化抗ＣＤ３４抗体およびＳＰＤＰ化抗ＣＤ４抗体を含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に室温で１８時間浸漬し、基材のメルカプト基と抗体のＳＰＤＰを反応させて、抗体をＡＭＰＳｔ編地２にジスルフィド結合を介して固定化し、リガンド固定化材料を作製した。ＳＰＤＰとメルカプト基の反応時に生成してくるピリジン−２−チオンの濃度を３４３ｎｍの吸収で測定することにより、固定化抗体の量を定量したところ、１ｇの実施例１あたり、いずれも２５μｇの抗体が固定化されていた。
【００５５】
得られた抗ＣＤ３４抗体固定化編み地および抗ＣＤ４抗体固定化編み地を１ｃｍの円形に打ち抜き、それぞれ１０枚ずつを別々のカラムに積層し、２つのカラムを接合したカラムを作製した。
【００５６】
作製例４．  ジスルフィド結合を介して結合したポリエチレングリコール（ＰＥＧ）化抗ＣＤ３４抗体およびＰＥＧ化抗ＣＤ４抗体の調製
ＮａＣｌを０．１５ｍＭ含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に５ｍｇ／ｍｌに溶解した抗ＣＤ３４抗体および抗ＣＤ４抗体にＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオネート（ピアス社製、ＳＰＤＰ）を２０ｍＭに溶解したジメチルスルホキシド溶液をそれぞれの抗体１モルに対して１０倍モル量添加し、室温で３０分反応させた後、ＰＤ−１０カラム（ファルマシア社製）で高分子量分画に精製した。抗ＣＤ３４抗体および抗ＣＤ４抗体が１モルに対してＳＰＤＰ導入量はいずれも４モルであった。これを、ＮａＣｌを０．１５ｍＭ含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に５ｍｇ／ｍｌに溶解したアミノ化メトキシＰＥＧ（シェアウォーター社、分子量５０００、片末端アミノ基、片末端メトキシ基）に上記ＳＰＤＰ溶液を５倍モル量添加し、３０分室温で反応させた後、ジチオスレイトールを２５ｍＭとなるように添加し、片末端がメルカプト基のメトキシＰＥＧを得た。１モルのＳＰＤＰ化抗ＣＤ３４抗体およびＳＰＤＰ化抗ＣＤ４抗体に対して片末端がメルカプト基のメトキシＰＥＧを５倍モル量添加し、ジスルフィド結合を介して結合したＰＥＧ化抗ＣＤ３４抗体およびＰＥＧ化抗ＣＤ４抗体を得た。得られたジスルフィド結合を介して結合したＰＥＧ化抗ＣＤ３４抗体およびＰＥＧ化抗ＣＤ４抗体は無菌ろ過滅菌により滅菌した。
【００５７】
作製例５．脱離可能な抗体固定化中空糸膜およびカラムの作製
２５ｋＧｙでγ線滅菌された東レポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）製人工腎臓“フィルトライザー”ＢＧを解体して中空糸膜を取り出し、中空糸膜を３６本束ね、中空糸膜中空部を閉塞しないようにエポキシ系ポッティング剤で両末端をモジュールケースに固定し、ミニモジュールを作製した。該ミニモジュールは１ｃｍ×１ｃｍの正方形の断面で、長さは約１０ｃｍである。
【００５８】
ミニモジュール内部に抗体として作製例４．で得られたＰＥＧ化抗ＣＤ３４抗体およびＰＥＧ化抗ＣＤ４抗体の０．５ｍｇ／ｍｌ含むリン酸緩衝液１．５ｍｌを室温で１時間灌流し洗浄することにより、抗ＣＤ３４抗体および抗ＣＤ４抗体をＰＭＭＡ中空糸膜内表面にジスルフィド結合を介して固定化した抗ＣＤ３４抗体および抗ＣＤ４抗体固定化中空糸カラムを得た。
【００５９】
得られた２種の中空糸カラムを横方向に接合し、細胞を灌流できるようにヘッダーを上下に取り付けたリガンド固定化カラムを作製した。
【００６０】
＜実施例１および２＞
ヒト末梢血（ヘパリン含有）をＡＸＩＳ  ＳＨＩＥＬＤ社製”リンフォプレップ”（登録商標）で処理して単核球成分を分離し、単核球成分１．０×１０＾７個をリン酸緩衝液１．５ｍｌに懸濁し、該懸濁液を作製例３および５のカラムに室温で通過させた。処理後のカラムをリン酸緩衝液を１時間灌流させて洗浄した後、カラムを解体した後、それぞれにヘッダーを取り付けて、２５ｍＭのジチオスレイトールを含むリン酸緩衝液を１時間灌流させて細胞を回収した。解体されたそれぞれのカラムから回収されたＣＤ３４陽性細胞およびＣＤ４陽性細胞の割合はいずれも９割以上であった。以上の細胞の分析はフローサイトメーターにより行った。
【００６１】
【発明の効果】
本発明のリガンド固定化カラムは、２種以上のリガンドを異なる区域に固定化することにより、一度の灌流操作で、２種以上の細胞を容易に回収することができる。
【００６２】
また、本発明のリガンド固定化カラムで大量に回収した特定の細胞を利用することにより、癌または自己免疫疾患または脳梗塞またはパーキンソン病またはアルツハイマー病または糖尿病または心筋梗塞または血管再生の治療又はワクチンとして用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のリガンド固定化カラムであって、中空糸膜を用いた場合の一態様の概略を示す図である（（ａ）全体図、（ｂ）分離時、（ｃ）モジュール内部）。
【図２】本発明のリガンド固定化カラムであって、編み地を用いた場合の一態様の概略を示す図である（（ａ）全体図、（ｂ）分離時）。
【符号の説明】
１：リガンド固定化カラム
２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄ：各区域
３：中空糸膜の束
４：リガンド固定化カラム
５ａ、５ｂ、５ｃ：各区域
６：積層した編み地
【図１】
2004194720.tif 000004
【図２】
2004194720.tif 000005