(57)【要約】【課題】接着依存性細胞の培養担体として用いるマイクロキャリアから細胞を容易に、高密度、大量かつ高回収効率で選択的に回収可能なマイクロキャリアを提供する。【解決手段】接着依存性細胞の培養担体として使用するマイクロキャリア１であって、磁性体を含有する粒子状支持体２の表面の少なくとも一部に温度感受性樹脂３を被覆する。【選択図】  図１
2004236553.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
接着依存性細胞の培養担体として使用するマイクロキャリアであって、磁性体を含有する粒子状支持体の表面の少なくとも一部に温度感受性樹脂を被覆したことを特徴とするマイクロキャリア。
【請求項２】
請求項１に記載のマイクロキャリアを使用して接着依存性細胞を培養する細胞培養装置であって、前記マイクロキャリア上で培養した細胞を温度変化により剥離するための剥離機構と、剥離したマイクロキャリアと細胞とを磁場を付与することによって分離するための磁場分離機構を備えた培養槽を有することを特徴とする細胞培養装置。
【請求項３】
請求項１に記載のマイクロキャリアを使用して接着依存性細胞を培養する細胞培養装置であって、
前記マイクロキャリア上で培養した細胞を温度変化により剥離するための剥離機構を有する培養槽と、
前記培養槽と接続され、剥離したマイクロキャリアと細胞とを磁場を付与することによって分離するための磁場分離機構を備えたマイクロキャリア回収部とを有することを特徴とする細胞培養装置。
【請求項４】
請求項１に記載のマイクロキャリアを使用して接着依存性細胞を培養する細胞培養装置であって、前記マイクロキャリア上で培養した細胞を温度変化により剥離するための剥離機構と、剥離したマイクロキャリアと細胞とを磁場を付与することによって分離するための第一の磁場分離機構及び前記培養槽と接続され、剥離したマイクロキャリアと細胞とを磁場を付与することによって分離するための第二磁場分離機構を備えたことを特徴とする細胞培養装置。
【請求項５】
磁性体を含有する粒子状支持体の表面の少なくとも一部に温度感受性樹脂を被覆したマイクロキャリアを使用して接着依存性細胞を培養する細胞培養方法であって、
本発明のマイクロキャリア上で接着依存性細胞を培養し、
培養した細胞を温度変化により前記マイクロキャリアから剥離し、
マイクロキャリアを磁気分離することによって、剥離した細胞を選択的に回収することを特徴とする細胞培養方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、接着依存性細胞の培養担体として使用するマイクロキャリア並びにこれを使用した培養装置及び培養方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
マイクロキャリアは、接着依存性の細胞、例えば幹細胞を培養するに当たって足場（担体）として使用する微粒子であり、従来種々の材料から構成されたマイクロキャリアが用いられてきた。
【０００３】
例えば、非特許文献１には種々の高分子から構成されたマイクロキャリアやガラスビーズ等を足場微粒子として使用できることが開示されている。このようなマイクロキャリアを面固定方式や動的固定方式で使用すると、接着依存性の細胞を攪拌培養することが可能となる。また、マイクロキャリアは、表面積が非常に大きいので従来のローラボトル方式やフラスコ方式の培養法と比較して、高密度で大量の接着依存性の細胞を培養することが可能である。
【０００４】
しかしながら、非特許文献１にも記載されている通り、従来のマイクロキャリアを使用して接着依存性細胞を培養する際には、培養した細胞の移植、すなわちマイクロキャリアから細胞を剥離して回収することが困難であるという課題があった。
【０００５】
一方、特許文献１によると、水に対する上限臨界溶解温度または下限臨界溶解温度が約３２℃のポリマ（温度感受性樹脂）で表面を被覆した細胞培養支持体材料が記載されている。すなわち、例えばＮ−イソプロピルアクリルアミドは、下限臨界溶解温度が約３２℃であり、このような温度感受性樹脂を支持体の表面に被覆すると、この下限臨界溶解温度（約３２℃）境として支持体の表面の親水性・疎水性が変化し、従って温度変化だけで培養・増殖後の細胞を支持体から容易に剥離し、回収することが可能であることが記載されている。特許文献１の各実施例によると、平板状のフラスコ底面にポリＮ−イソプロピルアクルアミド等の温度感受性樹脂を塗布している。支持体であるフラスコの底面から温度変化により細胞を剥離し、剥離して上澄液に移行した細胞を回収している。
【０００６】
【非特許文献１】
日本動物細胞学会編、動物細胞工学ハンドブック、朝倉書店、２０００年、第１５４〜第１５６頁
【特許文献１】
特公平６−１０４０６１号公報（全文）
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
特許文献１には、支持体として（多孔質）粒子を使用してもよいという記載があるが、浮遊培養のためのマイクロキャリアに特許文献１に記載の技術を適用した場合、たとえ細胞をマイクロキャリアから剥離できたとしても、マイクロキャリアと細胞とが培養液中に混在し、これらが懸濁した培養液から細胞だけを選択的に回収することが極めて困難であるという課題がある。
【０００８】
従って、本発明の課題は、接着依存性細胞の培養担体として用いるマイクロキャリアから細胞を容易に、高密度、大量かつ高い回収効率で選択的に回収可能なマイクロキャリアを提供することである。
本発明の別の課題は、このようなマイクロキャリアを使用して、接着依存性細胞を培養しそして、培養した細胞を容易に、高密度、大量かつ高い回収効率で選択的に回収可能な接着依存性細胞の培養装置を提供することである。
本発明の更に別の課題は、このようなマイクロキャリアを使用して、接着依存性細胞を培養しそして、培養した細胞を容易に、高密度、大量かつ高い回収効率で選択的に回収可能な接着依存性細胞の培養方法を提供することである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、前記課題に鑑み鋭意検討した結果、マイクロキャリアに磁性体を含有し、そして前記マイクロキャリアの表面の一部または全部を温度感受性樹脂によって被覆したマイクロキャリアを採用することによって前記課題を解決できることを見出して本発明を創作するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明に係るマイクロキャリアは、接着依存性細胞の培養担体として使用するマイクロキャリアであって、磁性体を含有する粒子状支持体の表面の少なくとも一部に温度感受性樹脂を被覆したことを特徴とするものである。
このように構成することによって、マイクロキャリアの表面に被覆されている温度感受性樹脂は、温度により接着性が変化するので、培養液（培地）の温度、すなわちマイクロキャリアの温度を変化させることによって、接着依存性細胞をマイクロキャリアから剥離し、そして磁場処理することによって磁性体を含有するマイクロキャリアを効果的に分離し、剥離した細胞を選択的に回収することができる。
【００１１】
本発明に係る接着依存性細胞の培養装置は、本発明のマイクロキャリアを使用して接着依存性細胞を培養する細胞培養装置であって、前記マイクロキャリア上で培養した細胞を温度変化により剥離するための剥離機構と、剥離したマイクロキャリアと細胞とを磁場を付与することによって分離するための磁場分離機構を備えた培養槽を有する；あるいは
前記マイクロキャリア上で培養した細胞を温度変化により剥離するための剥離機構を有する培養槽と、前記培養槽と接続され、剥離したマイクロキャリアと細胞とを磁場を付与することによって分離するための磁場分離機構を備えた細胞回収部とを有する；あるいは
複数の磁場分離機構を備えたことを特徴とするものである。
【００１２】
このように、既存の培養装置に剥離機構と磁場分離機構を設けることによって、あるいは既存の培養装置に剥離機構を設け、後段に磁場分離機構を設けることによって、本発明のマイクロキャリアを使用して培養された接着依存性細胞を剥離機構により容易に剥離し、マイクロキャリアを磁場分離機構により分離し、剥離した細胞を選択的に回収することが可能である。
【００１３】
本発明に係る接着依存性細胞の培養方法は、本発明のマイクロキャリアを使用して接着依存性細胞を培養する培養方法であって、
本発明のマイクロキャリア上で接着依存性細胞を培養し、
培養した細胞を温度変化により前記マイクロキャリアから剥離し、
マイクロキャリアを磁気分離することによって、剥離した細胞を選択的に回収することを特徴とするものである。
このように構成することによって、マイクロキャリアの表面上で培養された接着依存性細胞を温度変化により、前記温度感受性樹脂の接着性を変化させることにより、マイクロキャリアから剥離し、磁場処理することによってマイクロキャリアを容易に分離し、剥離した細胞を選択的に回収することができる。
【００１４】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態を添付図面に従って説明する。
〔マイクロキャリア〕
図１は、本発明の実施形態に係るマイクロキャリアの断面図である。以下、図１に基づいて本実施形態に係るマイクロキャリアを説明する。
図１に示す通り、本発明に係るマイクロキャリア１は、粒子状支持体２と前記粒子状支持体２の表面の一部または全部を被覆する温度感受性樹脂３とから主として構成されており、主としてマイクロキャリア１の表面上で接着依存性細胞４を培養するものである。
【００１５】
（接着依存性細胞）
本実施形態において培養に供せられる接着依存性細胞４とは、足場依存性細胞又は基質依存性細胞とも言い、細胞が増殖する際に付着すべき足場が必要な細胞の総称であり、上記マイクロキャリアを足場として培養可能な細胞であれば特に限定されるものではない。本実施形態に適用可能な接着依存性細胞の具体例は、限定されるものではないが例えば間葉系幹細胞、骨髄幹細胞、各種組織の幹細胞、前駆細胞、芽細胞などが挙げられる。
【００１６】
（粒子状支持体）
本実施形態において使用される粒子状支持体２とは、接着依存性細胞４を浮遊培養、すなわち流動式に培養するために使用されている粒子状支持体である。このような粒子状支持体２は、培養する接着依存性細胞４の種類及び粒子状支持体２の表面に被覆する温度感受性樹脂３の厚みを考慮して適宜選択される。一般には、本実施形態に係るマイクロキャリアの直径は数１０μｍから数１００μｍのオーダー、より好ましくは１００μｍから２００μｍである。従って、本実施形態に使用される粒子状支持体は、後述する温度感受性樹脂を表面に被覆してマイクロキャリアを形成した際に（被覆後）、このような厚みとなるように適宜選択した。
【００１７】
また、本実施形態において使用される粒子状支持体２は、細胞培養分野に公知の種々の材料、例えばガラス、改質ガラス、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート等から構成することが可能であるが、本発明においては、磁性体材料、例えばフェライトを含有していることを特徴とする。磁性体の含有量は、後述する磁場をかけた際に細胞４とマイクロキャリアとを分離できる量であれば特に限定されるものではない。また、磁性体、例えばフェライト系のセラミックスから構成される粒子状支持体を本実施形態の粒子状支持体として使用することも可能である。
【００１８】
なお、本実施形態で使用される粒子状支持体２は、それから構成されるマイクロキャリアを浮遊培養に用いるという観点から、略比重１に近いことが好ましく、より好ましくは比重０．９〜１．２、特に好ましくは約１．０である。比重が培養液（培地）のそれより高いとマイクロキャリアは沈降する傾向が高くなり、浮遊培養のためには強く撹拌する必要がある。一方、比重が培地のそれよりも小さいと培地からマイクロキャリアが浮上する傾向が高くなり、やはり強く撹拌する必要がある。従って、マイクロキャリアの比重は培地のそれ（約１）と同等であることが好ましい。
このように粒子状支持体、ひいてはマイクロキャリア全体の比重を調整するために、磁性体の導入量の選択および粒子状支持体の内部に独立した空気孔を設ける等の従来公知の手段により所望とする比重を得ることが可能である。なお、後述する培養装置の上部または低部に磁場付与手段を設けて磁場により、マイクロキャリアの浮遊性を調整することも本発明の範囲内である。
【００１９】
（温度感受性樹脂）
本実施形態に使用する温度感受性樹脂として、前記特許文献１に記載の温度感受性樹脂を使用した。以下、前記特許文献１を引用して温度感受性樹脂の構成ならびに特性について説明する。温度感受性樹脂とは、細胞支持体の表面を水溶性高分子の中でも特に上限臨界溶解温度かつ／または下限臨界溶解温度（水にある物質を混合する時、ある温度では部分的にしか溶解しないため、２層に分かれているが、温度を上げるかまたは下げてある一定の温度を過ぎると完全に溶解して１層になることがある。温度を上げて完全溶解に達した場合の温度を上限臨界溶解温度、温度を下げていって完全に溶解した場合の温度を下限臨界溶解温度と言う。）を示すようなポリマを言う。
【００２０】
本実施形態において使用可能な温度感受性樹脂としては、水溶液中で上限臨界溶解温度または下限臨界溶解温度を有する化合物を用いることができ、好ましくは８０℃〜０℃、より好ましくは５０℃〜２０℃の上限または下限臨界溶解温度を有するものである。上限または下限臨界溶解温度が８０℃を超えると細胞が死滅する可能性があるので好ましくない場合がある。また、上限または下限臨界溶解温度が０℃より低いと一般に細胞増殖速度が極度に低下するか、または細胞が死滅してしまう為、好ましくない。
【００２１】
本実施形態に用いる温度感受性樹脂（ポリマまたはコポリマ）は、以下のモノマの重合または共重合により得られる。使用し得るモノマは、これらの化合物に限定されるものではないが、例えば、アクリルアミド、メタクリルアミド等の（メタ）アクリルアミド化合物、Ｎ−エチルアクリルアミド（単独重合体の下限臨界溶解温度７２℃）、Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド（同２１℃）、Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド（同２７℃）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（同３２℃）、Ｎ−イソプロピルメタクリルアミド（同４３℃）、Ｎ−シクロプロピルアクリルアミド（同４５℃）、Ｎ−シクロプロピルメタクリルアミド（同６０℃）、Ｎ−エトキシエチルアクリルアミド（同約３５℃）、Ｎ−エトキシエチルメタクリルアミド（同約４５℃）、Ｎ−テトラヒドロフルフリルアクリルアミド（同約２８℃）、Ｎ−テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド（同約３５℃）等のＮ−アルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体、Ｎ，Ｎ−ジメチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−エチルメチルアクリルアミド（単独重合体の下限臨界溶解温度５６℃）、Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド（同３２℃）等のＮ，Ｎ−ジアルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体、更に１−（１−オキソ−２−プロペニル）−ピロリジン（同５６℃）、１−（１−オキソ−２−プロペニル）−ピペリジン（同約６℃）、４−（１−オキソ−２−プロペニル）−モルホリン、１−（１−オキソ−２−メチル−２−プロペニル）−ピロリジン、１−（１−オキソ−２−メチル−２−プロペニル）−ピペリジン、４−（１−オキソ−２−メチル−２−プロペニル）−モルホリン等の環状基を有する（メタ）アクリルアミド誘導体、メチルビニルエーテル（単独重合体の下限臨界溶解温度３５℃）等のビニルエーテル誘導体、また増殖細胞の種類によって臨界溶解温度を調節する必要がある場合や、被覆物質と細胞培養支持体との相互作用を高める必要が生じた場合や、粒子状支持体の親水、疎水性のバランスを調整する等の目的で、前記以外のモノマ類との共重合、ポリマ同士グラフトまたは共重合、あるいはポリマ、コポリマの混合物を用いてもよい。また、ポリマ本来の性質を損なわない範囲で、架橋することも可能である。
【００２２】
また、前記温度感受性樹脂３を、代表的には０．０１μｍから５０μｍの厚みで前記粒子状支持体２に被覆するが、温度感受性樹脂３は、前記粒子状支持体２の表面の一部または全部を被覆することができる。前記粒子状支持体２の表面の一部に温度感受性樹脂３を被覆しない非被覆部を設けると、温度変化により培養された細胞４を剥離する際に容易に剥離が可能となるので好ましい。
【００２３】
粒子状支持体に温度感受性樹脂を被覆する被覆方法として、（ａ）化学的な反応によって結合させる方法、（ｂ）物理的な相互作用を利用する方法、を単独でまたは併用して行なうことができる。すなわち、（ａ）化学的な反応によって結合させる場合、電子線照射（ＥＢ）、γ線照射、紫外線照射、プラズマ処理、コロナ処理、さらに支持体と被覆材料が適当な反応性官能基を有する場合は、ラジカル反応、アニオン反応、カチオン反応等の一般に用いられる有機反応を用いることができる。
温度感受性樹脂３として架橋したものを使用する場合は、温度変化によって樹脂の親水性が増した際、吸水倍率が典型的には約二桁増加するため、体積が膨張（膨潤）する。この温度感受性樹脂を被覆したマイクロキャリアにおいて温度感受性樹脂の体積分率が高い場合は、マイクロキャリアも温度変化により激しく膨潤して表面積が増大するため、マイクロキャリア表面にて互いに接着した細胞同士が引き離されて分散されるため、より剥離しやすくなる。また細胞が個別に回収されるという効果もあるため、用途によっては好ましい。
【００２４】
また、（ｂ）物理的な相互作用による方法としては、被覆材料単独または支持体との相溶性のよいマトリックスを媒体とし（例えば、支持体を形成するモノマまたは支持体と相溶性のよいモノマと被覆材料とのグラフトポリマ、ブロックポリマ等）、塗布、混練等の物理的吸着を用いる方法等がある。
このようにして、磁性体を含む粒子状支持体２の一部又は全面に温度感受性樹脂３を被覆した本実施形態に係るキャリアを作製することが可能である。
【００２５】
〔培養装置〕
次に、本実施形態に係る培養装置を図２に基づいて説明する。図２は、本実施形態に係る培養装置を示す概略図であり、図２（ａ）は、培養槽に剥離機構と磁場分離機構が付された一実施の形態を示し、図２（ｂ）は、分離部を培養槽とは別体として設けた別の実施形態を示す。
【００２６】
本実施形態に係る培養装置１０、２０は、マイクロキャリア１上で接着依存性細胞４を浮遊培養法（流動式培養法）により大量の接着依存性細胞を培養する装置である。
また、本実施形態に係る培養装置１０、２０は、剥離機構及び磁場分離機構（磁場分離部）以外は、既存の浮遊培養法（流動式培養法）と同様の構成を有する。従って、以下の説明において、剥離機構及び磁場分離機構（磁場分離部）を中心に説明し、その他の部分の説明は省略する。
【００２７】
（第一の培養装置）
まず、図２（ａ）を用いて、本実施形態に係る培養装置１０の一実施形態（以下、第一の培養装置と言う）の構成を説明する。
第一の培養装置１０は、導入口１２、排出口１３を備えた従来公知の浮遊培養槽１１において、温度変化によりマイクロキャリア１上で培養した細胞を温度変化により剥離するための剥離機構１４と、細胞を剥離したマイクロキャリアと細胞とを磁場を付与することによって分離するための磁場分離機構１５を培養槽の外部に備えている。剥離機構１４として、具体的には培養装置に本来備わる、浮遊培養槽１１の培地の温度を制御するサーモスタット機構を採用した。この剥離機構１４の機能は、サーモスタットを制御する温度制御装置の温度を手動または自動で所定温度に変化させることによって達成される。また、磁場分離機構１５は、磁場付与手段から構成されており、具体的には磁場付与手段として浮遊培養槽１１に対し着脱可能に設置したネオジミウム？鉄？硼素からなる希土類永久磁石を使用した。なお、図２（ａ）および（ｂ）において、培養槽１１に設けられた攪拌手段、酸素供給口等の従来と同様の部分の記載、説明は省略した。
【００２８】
次に、本実施形態に係る第一の培養装置の動作を説明する。本装置の動作は、大別して細胞培養工程、細胞剥離工程、細胞分離回収工程とからなる。
細胞培養工程においては、培養槽１１内に所定の培養液と、所定量の細胞を播種した本実施形態に係るマイクロキャリア１を導入した。サーモスタット機構を動作させ、培養槽１１内の温度を従来公知の条件、好ましくは３７℃に設定した。接着依存性細胞をマイクロキャリア１に接着した状態で、大量に浮遊培養した。
細胞剥離工程においては、剥離機構１４を動作させ、培養液の液温を温度感受性樹脂の上限臨界温度または下限臨界温度温度に変化させることにより、温度感受性樹脂の表面特性を疎水性から親水性へと変化させた。この温度感受性樹脂の特性変化により、マイクロキャリア上で培養された接着依存性細胞がマイクロキャリア１から剥離した。その結果、培地、マイクロキャリアから剥離した接着依存性細胞と、マイクロキャリアとの混合懸濁液が生成した。
【００２９】
具体的には、後述するように温度感受性樹脂がポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）の場合、細胞の剥離工程において、ＮＩＰＡＭの下限臨界溶解温度である３２℃以下の温度に変化させ、温度感受性樹脂の特性を、疎水性から親水性へと移行させた。本実施形態に係る第一の培養装置１０において、このように培地の温度を変化させる機能を有すれば、剥離機構１４の構成は特に限定されない。
【００３０】
細胞分離回収工程においては、第一の培養装置１０において、磁場分離機構１５を動作させ、前記細胞剥離工程において生成した培地と、接着依存性細胞と、マイクロキャリアとの混合懸濁液から、マイクロキャリアを分離し、接着依存性細胞を回収した。第一の培養装置１０に対し、磁場分離機構１５即ち磁場付与手段により磁場を作用することにより、磁性体を含む粒子状支持体を構成要素とするマイクロキャリアを引き寄せて分離した。溶液中には接着依存性細胞が残留し、この溶液を集めて固形成分を回収することにより、接着依存性細胞を回収した。
【００３１】
図２（ａ）に示す装置においては、接着依存性細胞を回収するための培養液排出口１３、すなわち接着依存性細胞回収側と反対側に、鉛直方向に移動可能な永久磁石を設け、磁場分離機構１５を構成した。
なお、磁場付与手段は、永久磁石に限定されるものではなく、例えば電磁石等により構成することも可能である。さらに、磁場の強度は、使用する粒子状支持体に含まれる磁性体材料の磁力特性に依存して適宜設定されるものである。
【００３２】
このように構成された第一の培養装置１０は、本実施形態の細胞培養工程においてマイクロキャリア１上における浮遊培養により多量の接着依存性細胞を培養し、細胞分離工程において培養した接着依存性細胞を剥離機構１４により効率よく剥離し、そして細胞分離回収工程において分離機構１５によりマイクロキャリア１を効率的に分離し、接着依存性細胞を選択的に回収することが可能である。
【００３３】
（培養装置２）
次いで、本実施形態に係る第二の培養装置２０（以下、第二の培養装置と言う）を図２（ｂ）に基づいて説明する。第二の培養装置２０は、第一の培養装置１０において分離機構１５が外付け、すなわち、排出口１３の後段に設けられている以外、第一の培養装置と同様である。
従って、第一の培養装置と同様な部分は同一の符号を付し、その説明を省略する。
【００３４】
第二の培養装置２０は、培養液導入口１２、排出口１３及び剥離機構１４を備えた浮遊培養槽１１において、排出口１３の後段に配管により接続された分離部２１を有している。
分離部２１は、細胞剥離工程において剥離機構１４によりマイクロキャリア１から接着依存性細胞を剥離した後、排出口１３から排出された浮遊培養槽１１の内容物（培地、マイクロキャリア１、細胞との混合懸濁液）から、マイクロキャリア１を磁場の付与により分離するための分離機構である。
【００３５】
第一の培養装置１０と同様にして、第二の培養装置２０における分離部２１は、下面に永久磁石または電磁石等から構成される磁場付与手段により磁場を付与し、磁性体を含む粒子状支持体２を構成要素とするマイクロキャリア１を選択的に取り込むことによって分離し、細胞を回収する。なお、磁場付与手段は上面に設置しても良く、この場合は目的細胞の比重が培地よりも大きく沈降しやすい場合であっても、マイクロキャリアを鉛直上方に引き寄せることによって両者の分離効率を上げることが出来る、という効果がある。
【００３６】
このように構成することによって、既存の浮遊培養装置に若干の改良を加えるだけでマイクロキャリアにより浮遊培養した接着依存性細胞を高い回収率で回収することが可能となる。
なお、第一の装置及び第二の装置を組合せた装置、すなわち、磁気分離機構が培養槽１１の外側部分と排出口１３の後段に設けた装置も本発明の範囲内である。
【００３７】
〔培養方法〕
次に、本実施形態に係るマイクロキャリアを用いた培養方法を説明する。なお、以下の培養方法において、図２（ａ）に示す第一の培養装置を使用し、温度感受性樹脂として、当該技術分野に代表的なＮＩＰＡＭを使用した場合を例にとって説明する。
ＮＩＰＡＭは、ＣＨ２＝ＣＨ−ＣＯＮＨＣＨ（ＣＨ３）２で表される単量体から誘導され、水溶液中で約３２℃に下限臨界溶解温度を有することが知られている（例えば、株式会社興人から入手可能）。
【００３８】
磁性体を含有する粒子状支持体、例えば直径１１０μｍ、内部に磁性体としてフェライトを含有し表面がポリスチレンで覆われた粒子状支持体の表面の一部または全部に、ＮＩＰＡＭを塗布した後、電子線照射（ＥＢ）により重合を行なうと、下限臨界溶解温度である３２℃以上ではポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドの占有体積は小さくなり、樹脂中の水分子を排除するため、粒状支持体表面は疎水性を示し、逆に３２℃以下ではポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドの占有体積は大きくなるのでポリマ中の水分子の占める体積分率が上昇するために粒子状支持体表面は親水性を示すようになる。
【００３９】
このようにして用意した本実施形態のマイクロキャリア１を使用して、従来公知の方法により接着依存性細胞の培養を行なう。
まず、培養を行なうのに先だって、消毒用エタノール、次亜塩素酸溶液等の殺菌剤により装置１０の内部を滅菌し、次いで水で洗浄する。しかる後、所定の培地を導入口１２から培養槽１１内に導入し、内部を図示しない攪拌手段により攪拌しながら所定条件（例えば３７℃、炭酸ガス濃度５％、酸素濃度２０％）に設定し、維持する。
【００４０】
次いで、従来公知の方法により播種を行なう。すなわち、培地中に分散させた本実施形態のマイクロキャリア１と接着依存性細胞４（例えば間葉系幹細胞）を導入し、攪拌して均一に分散させる。なお、この際の培地温度は、例えば３７℃であり、この温度は粒子状支持体上に被覆されているＮＩＰＡＭの下限臨界溶解温度である約３２℃よりも高い温度である。この温度条件では温度感受性樹脂の占有体積が小さく、温度感受性樹脂中の水分を排除するため、マイクロキャリア表面が疎水性となり、接着依存性細胞がマイクロキャリア上に接着する。
【００４１】
次に、ｐＨ、溶存酸素濃度等の培養条件を測定し、細胞増殖状態を評価しながら培養を行なう。また、培地の一部を排除し、新たな培地を導入することにより、培地の栄養成分の消費と代謝産物の蓄積を補償する。
【００４２】
継代の工程は以下に記載の通りである。
細胞培養支持体上にて培養した細胞４をマイクロキャリア１から剥離させるには、上限臨界溶解温度以上もしくは下限臨界溶解温度以下にてこれを剥離することによって達成される。すなわち、ＮＩＰＡＭの場合には、例えば培地温度を、剥離機構１４により２０℃にまで下げることによって、温度感受性樹脂の下限臨界溶解温度よりも低くする。すると、温度感受性樹脂の占有体積が大きくなり、樹脂中の水分子が占める体積分率が上昇するために、マイクロキャリア１表面が親水性となり、接着依存性細胞４がマイクロキャリア１から剥離する。なお、接着依存性細胞４をマイクロキャリア１から剥離しやすくするため、接着依存性細胞４がマイクロキャリア１の表面を覆いきる前に継代の工程を行なうとよい。また、マイクロキャリア１の全部でなく一部のみを温度感受性樹脂３であるＮＩＰＡＭで覆い、細胞接着性を調節してもよい。
次いで、前記と同様にして、マイクロキャリアの添加、培養の継続を行なう。
【００４３】
培養終了後、細胞４を剥離機構１４により剥離し、回収するが、回収時の剥離操作は、前記の継代における剥離動作と同様である。
このようにして、培地中で細胞４とマイクロキャリア１が分離した状態で本実施形態における回収作業を行なう。
例えば、図２（ａ）に示す装置において、分離機構１５における磁場付与手段により磁場を与える。すると、磁性体を有するマイクロキャリア１は分離機構１５側に引き寄せられ、細胞から分離する。一方、マイクロキャリアから分離された接着依存性細胞４は、培地とともに排出口１３から選択的に回収される。
【００４４】
なお、本実施形態に係るマイクロキャリアにおける粒子状支持体を例えば直径１００μｍのフェライトで構成すると、分離機構１５における磁場付与手段によりマイクロキャリア１をより効率的に捕集可能である。その際に、温度感受性樹脂の塗布量を厚くし、かつ内部に独立した空気孔を設けることによって比重を軽くすることが可能である。
また、図２（ａ）に示す培養装置１０の代わりに、図２（ｂ）で示す第二の装置２０、即ち排出口１３の後段に分離部２１を設ける構成を有する第二の培養装置２０や、分離機構１５と分離部２１の両方を有する装置（換言すると、複数の分離機構を有する装置）を使用することも可能である。
【００４５】
このように、本実施形態の細胞培養方法によると、従来技術と比較して、コンタミネーションなしで高純度の細胞を、より簡便な方法で選択的に回収することが可能となる。
【００４６】
【発明の効果】
以上説明した通り、本実施形態は以下の優れた効果を奏する。
本発明の実施形態に係るマイクロキャリアによると、マイクロキャリアの表面に被覆されている温度感受性樹脂は、温度により接着性が変化するので、培養液（培地）の温度、すなわちマイクロキャリアの温度を変化させることによって、接着依存性細胞をマイクロキャリアから剥離し、そして磁場処理することによって磁性体を含有するマイクロキャリアを効果的に分離し、剥離した細胞を選択的に回収することができる。
【００４７】
本発明の実施形態に係る培養装置によると、培養装置として既存のサーモスタットを剥離機構として利用できるため、既存の（剥離機構を含む）培養装置に磁場分離機構を設けることによって、あるいは既存の（剥離機構を含む）培養装置の後段に磁場分離機構を設けることによって、本発明のマイクロキャリアを使用して培養された接着依存性細胞を剥離機構により容易に剥離し、マイクロキャリアを磁場分離機構により分離し、分離した細胞を選択的に回収することが可能となる。
【００４８】
本発明の実施形態に係る培養方法によると、マイクロキャリアの表面において培養された接着依存性細胞を温度変化によりマイクロキャリアから剥離し、磁場処理することによってマイクロキャリアを容易に分離することができ、細胞を選択的に回収できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に係るマイクロキャリアの断面図である。
【図２】本発明に係る培養装置を示す概略図であり、図２（ａ）は、培養槽に剥離機構と磁場分離機構が付された一実施の形態を示し、図２（ｂ）は、分離部を培養槽とは別体として設けた別の実施形態を示す。
【符号の説明】
１    マイクロキャリア
２    粒子状支持体
３    温度感受性樹脂
４    接着依存性細胞
１０  第一の培養装置
１１  浮遊培養槽
１２  導入口
１３  排出口
１４  剥離機構
１５  分離機構
２０  第二の培養装置
２１  分離部
【図１】
2004236553.tif 000003
【図２】
2004236553.tif 000004