【手続補正書】
【提出日】平成23年8月19日(2011.8.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＫＫ１の過剰発現及び上方制御のいずれか又は両方を特徴とする癌を治療する方法であって、薬学的に許容可能な担体と共に、少なくとも１つの抗ＤＫＫ１抗体又は抗体断片の有効量を投与する工程を含む、方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
本発明の様々な態様及び用途は、以下の図面の簡単な説明、及び本発明の詳細な説明、及びその好ましい実施形態を鑑みて当業者に明らかとなる。
[請求項1001]
ＤＫＫ1の過剰発現及び上方制御のいずれか又は両方を特徴とする癌を治療する方法であって、薬学的に許容可能な担体と共に、少なくとも1つの抗ＤＫＫ1抗体又は抗体断片の有効量を投与する工程を含む、方法。
[請求項1002]
ＤＫＫ1の過剰発現及び上方制御のいずれか又は両方を特徴とする癌の転移を阻害する方法であって、薬学的に許容可能な担体と共に、ＤＫＫ1と特異的に結合する少なくとも1つの抗体又は抗体断片の有効量を投与する工程を含む、方法。
[請求項1003]
ＤＫＫ1の過剰発現及び上方制御のいずれか又は両方を特徴とする癌の浸潤又は移動を阻害する方法であって、ＤＫＫ1と特異的に結合する少なくとも1つの抗体又は抗体断片の有効量、及び薬学的に許容可能な担体を投与する工程を含む、方法。
[請求項1004]
前記癌が膵臓癌、胃癌、肝臓癌、前立腺癌、乳癌、胆管癌、子宮頸癌、肺癌、及び食道癌の群から選択される、請求項1001〜1003のいずれか1項に記載の方法。
[請求項1005]
前記抗体又は抗体断片が中和活性を有する、請求項1001〜1003のいずれか1項に記載の方法。
[請求項1006]
ＤＫＫ1の過剰発現及び上方制御のいずれか又は両方を特徴とする癌を治療するための医薬組成物であって、ＤＫＫ1に特異的に結合する少なくとも1つの抗体又は抗体断片、及び薬学的に許容可能な担体を含む、医薬組成物。
[請求項1007]
ＤＫＫ1の過剰発現及び上方制御のいずれか又は両方を特徴とする癌の転移を阻害するための医薬組成物であって、ＤＫＫ1に特異的に結合する少なくとも1つの抗体又は抗体断片、及び薬学的に許容可能な担体を含む、医薬組成物。
[請求項1008]
ＤＫＫ1の過剰発現及び上方制御のいずれか又は両方を特徴とする癌の浸潤又は移動を阻害するための医薬組成物であって、ＤＫＫ1に特異的に結合する少なくとも1つの抗体又は抗体断片、及び薬学的に許容可能な担体を含む、医薬組成物。
[請求項1009]
前記癌が膵臓癌、胃癌、肝臓癌、前立腺癌、乳癌、胆管癌、子宮頸癌、肺癌、及び食道癌の群から選択される、請求項1006〜1008のいずれか1項に記載の医薬組成物。
[請求項1010]
前記抗体又は抗体断片が中和活性を有する、請求項1006〜1008のいずれか1項に記載の医薬組成物。
[請求項1011]
被験体から得た生体試料におけるＤＫＫ1遺伝子の発現レベルを決定する工程を含む、被験体において癌、又は癌の発症の素因、癌又は転移を診断する方法であって、前記遺伝子の正常対照レベルと比較した場合の発現レベルの上昇が、前記被験体が癌、癌又は転移を患っているか、又はそれを発症する危険性があることを示唆する、方法。
[請求項1012]
前記癌が膵臓癌、胃癌、肝臓癌、前立腺癌、乳癌、胆管癌、子宮頸癌、肺癌、及び食道癌である、請求項1011に記載の方法。
[請求項1013]
前記発現レベルが前記正常対照レベルより少なくとも10％高い、請求項1011に記載の方法。
[請求項1014]
前記発現レベルが、
（ａ）前記遺伝子のｍＲＮＡを検出すること、
（ｂ）前記遺伝子によりコードされるタンパク質を検出すること、及び
（ｃ）前記遺伝子によりコードされる前記タンパク質の生物活性を検出すること
から成る群から選択されるいずれかの方法により決定される、請求項1011に記載の方法。
[請求項1015]
前記生体試料が生検材料、痰、血液、又は尿を含む、請求項1011に記載の方法。
[請求項1016]
血液における前記発現レベルの検出をＥＬＩＳＡにより行なう、請求項1015に記載の方法。
[請求項1017]
被験体において癌、又は癌の発症の素因、癌又は転移を診断するためのキットであって、
（ａ）ＤＫＫ1遺伝子のｍＲＮＡを検出するための試薬、
（ｂ）ＤＫＫ1タンパク質を検出するための試薬、及び
（ｃ）ＤＫＫ1タンパク質の生物活性を検出するための試薬
から成る群から選択される試薬を含む、キット。
[請求項1018]
前記試薬がＤＫＫ1タンパク質に対する抗体である、請求項1017に記載のキット。
[請求項1019]
前記癌が膵臓癌、胃癌、肝臓癌、前立腺癌、乳癌、胆管癌、子宮頸癌、肺癌、及び食道癌である、請求項1017に記載のキット。
[請求項1020]
癌を治療又は予防するための化合物をスクリーニングする方法であって、
ａ）試験化合物を、ＤＫＫ1のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドと接触させる工程、
ｂ）前記ポリペプチドと前記試験化合物との間の結合活性を検出する工程、及び
ｃ）前記ポリペプチドに結合する前記試験化合物を選択する工程
を含む、方法。
[請求項1021]
癌を治療又は予防するための化合物をスクリーニングする方法であって、
ａ）試験化合物を、ＤＫＫ1のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドと接触させる工程、
ｂ）工程（ａ）のポリペプチドの生物活性を検出する工程、及び
ｃ）前記試験化合物の非存在下で検出されるポリペプチドの生物活性と比較して、ＤＫＫ1のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの生物活性を抑制する前記試験化合物を選択する工程
を含む、方法。
[請求項1022]
前記生物活性が細胞増殖、癌の移動、癌浸潤、癌転移、又は細胞外分泌の促進である、請求項1021に記載の方法。
[請求項1023]
癌を治療又は予防するための化合物をスクリーニングする方法であって、
ａ）候補化合物を、ＤＫＫ1を発現する細胞と接触させる工程、及び
ｂ）前記試験化合物の非存在下で検出される発現レベルと比較して、ＤＫＫ1の発現レベルを低下させる前記候補化合物を選択する工程
を含む、方法。
[請求項1024]
癌を治療又は予防するための化合物をスクリーニングする方法であって、
ａ）候補化合物を、ＤＫＫ1の転写調節領域及び該転写調節領域の制御下で発現されるレポーター遺伝子を含むベクターを導入した細胞と接触させる工程、
ｂ）前記レポーター遺伝子の発現又は活性を測定する工程、並びに
ｃ）対照と比較して、前記レポーター遺伝子の発現又は活性レベルを低下させる候補化合物を選択する工程
を含む、方法。
[請求項1025]
前記癌が膵臓癌、胃癌、肝臓癌、前立腺癌、乳癌、胆管癌、及び子宮頸癌である、請求項1020〜1024のいずれか1項に記載の方法。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
さらに、ＤＫＫ１ポリペプチドを試験化合物と接触させる工程、及びＤＫＫ１ポリペプチドの生物活性を抑制する試験化合物を選択する工程を含む、癌を治療する化合物をスクリーニングする方法を提供することが本発明のさらなる目的である。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
【図１】図１は様々な癌細胞におけるＤＫＫ１の発現、及び癌患者におけるＤＫＫ１の血清レベルを示す図である。パネル（Ａ）は、幾つかの器官（膵臓、胃、肝臓、前立腺、及び乳腺）における臨床癌組織においてＤＫＫ１転写産物の発現が上昇することを示す。パネル（Ｂ）は、様々な種類の癌の患者におけるＤＫＫ１の血清レベルを示す。血清ＤＫＫ１タンパク質のレベルは、膵臓癌を除いて（Ｐ＝０．２８６；マンホイットニーＵ検定）、健常ドナーにおいてよりも癌患者において有意に高かった（Ｐ＜０．００１；マンホイットニーＵ検定）。黒線：平均血清レベル。
【図２】ＤＫＫ１発現の影響を示す図である。パネル（Ａ）は、半定量的ＲＴ−ＰＣＲにより検証した、早期の原発性ＡＤＣ（Ｉ期〜ＩＩＩ  Ａ期）、進行した原発性ＡＤＣ（ＩＩＩ  Ｂ期〜ＩＶ期）、及びＡＤＣに由来する転移性脳腫瘍の臨床試料におけるＤＫＫ１の発現を示す。パネル（Ｂ）は、ＤＫＫ１発現プラスミド又はモック（mock）ベクターをトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞を用いた創傷移動アッセイ（wound migration assay）の結果を示す。
【図３】抗ＤＫＫ１抗体による細胞浸潤活性の阻害を示す図である。パネル（Ａ）は、ＤＫＫ１発現プラスミドを一過性にトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞の浸潤に対する、抗ＤＫＫ１抗体（５０ｎＭ又は１００ｎＭ；ｙ軸）の効果を評価するマトリゲル浸潤アッセイの結果を示す。ＤＫＫ１の過剰発現及び／又は上方制御に起因する細胞浸潤は、抗ＤＫＫ１抗体をそれらの培養培地に添加することにより抑制された。各実験は三連で行なった。パネル（Ｂ）及びパネル（Ｃ）は、ＤＫＫ１を過剰発現するＮＳＣＬＣ細胞株Ａ５４９（Ｂ）、及びＤＫＫ１を発現しないＮＳＣＬＣ細胞株ＰＣ−１４（Ｃ）の浸潤に対する抗ＤＫＫ１抗体（５０ｎＭ又は１００ｎＭ；ｙ軸）の効果を評価するマトリゲル浸潤アッセイの結果を示す。マトリゲルアッセイを用いて検出されるＡ５４９細胞の細胞浸潤は、培養培地への抗ＤＫＫ１抗体の添加により用量依存的に抑制されたが、ＤＫＫ１をほとんど検出不可能なレベルでしか発現しないＰＣ−１４細胞の細胞浸潤は影響を受けなかった。各実験は三連で行なった。
【図４】ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける抗ＤＫＫ１抗体による細胞成長の阻害を示す図である。パネル（Ａ）は、ＤＫＫ１を過剰発現するＮＳＣＬＣ細胞株Ａ５４９の成長に対する、抗ＤＫＫ１抗体（５０ｎＭ又は１００ｎＭ；ｙ軸）の効果を評価するＭＴＴアッセイの結果を示し、パネル（Ｂ）は、ＤＫＫ１を発現しないＮＳＣＬＣ細胞株ＰＣ−１４及びＳＢＣ−３の成長に対する、抗ＤＫＫ１抗体（１００ｎＭ；ｙ軸）の効果を評価するＭＴＴアッセイの結果を示す。ＭＴＴアッセイを用いて検出されるＡ５４９細胞の細胞成長は、培養培地への抗ＤＫＫ１抗体の添加により用量依存的に抑制されたが、ＤＫＫ１をほとんど検出不可能なレベルでしか発現しないＰＣ−１４細胞及びＳＢＣ−３細胞の細胞成長は影響を受けなかった。各実験は三連で行なった。
【図５】ヌードマウスに移植したＤＫＫ１発現肺癌細胞に対する抗ＤＫＫ１抗体の成長抑制効果、及び抗ＤＫＫ１抗体を用いた組織病理学検査を示す図である。パネル（Ａ）及びパネル（Ｂ）には、抗ＤＫＫ１抗体又はＩｇＧ（対照）で処理した３匹のマウスの平均腫瘍体積をプロットした。各々の抗体は腹腔内注射により動物に投与した（１００μｇ／５００μｌ／動物；１日目、３日目、５日目、７日目、及び９日目（合計で５回の注射））。ＤＫＫ１発現Ａ５４９細胞に由来する移植腫瘍の成長は、抗ＤＫＫ１抗体により有意に抑制されたが（Ａ）、ＤＫＫ１をほとんど発現しないＰＣ−１４細胞の成長は影響を受けなかった（Ｂ）。パネル（Ｃ）は、抗ＤＫＫ１抗体で処理したＨＥ染色腫瘍（Ａ５４９）の組織病理学検査の結果を示す。抗ＤＫＫ１抗体で処理した腫瘍組織において、対照ＩｇＧで処理した腫瘍組織と比較して有意な線維化及び生癌細胞数の減少が観察された。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３４】
（ｉ）ポリクローナル抗体：
ポリクローナル抗体は、動物において関連抗原及びアジュバントの頻回皮下（ｓｃ）又は腹腔内（ｉｐ）注射により生じさせるのが好ましい。二官能性物質又は誘導体化剤、例えばマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を介する共役）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リシン残基を介する）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣ１２、又はＲ’Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ（式中、Ｒ’及びＲは異なるアルキル基である）を用いて、免疫化される種において免疫原性のあるタンパク質、例えばキーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、又はダイズトリプシン阻害因子と関連抗原とを共役させることが有用であり得る。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４３】
モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばMunson et al., Anal. Biochem., 107: 220 (1980)のスキャッチャード解析によって決定することができる。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４４】
所望の特異性、親和性、及び／又は活性を有する抗体を産生するハイブリドーマ細胞を同定した後、そのクローンを限界希釈法によってサブクローニングし、標準的な方法（Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)）によって成長させてもよい。この目的に適した培養培地には、例えばＤ−ＭＥＭ培地又はＲＰＭＩ−１６４０培地が含まれる。また、ハイブリドーマ細胞を動物において腹水腫瘍として、ｉｎ  ｖｉｖｏで成長させてもよい。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５７】
ヒト抗体はまた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性化Ｂ細胞によって作り出してもよい（米国特許第５，５６７，６１０号明細書及び同第５，２２９，２７５号明細書を参照）。ＳＣＩＤマウスを用いてヒト抗体を作り出す好ましい手段は、共願の（commonly-owned）同時係属中の出願に開示されている。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８５】
本明細書における治療剤は、癌の治療に有用な化学物質（chemical compound）である化学療法剤に含まれる。化学療法剤の例としては、以下の薬剤及びそれらの薬学的に許容可能な塩、酸、及び誘導体が挙げられるが、これらに限定されない：チオテパ及びシクロホスファミド等のアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン、及びピポスルファン等のスルホン酸アルキル；ベンゾドーパ（benzodopa）、カルボコン、メツレドーパ（meturedopa）、及びウレドーパ（uredopa）等のアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド、及びトリメチロールメラミンを含むエチレンイミン及びメチルメラミン；クロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノブエンビキン、フェネステリン（phenesterine）、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード等のナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチン等のニトロソウレア；アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アントラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリチアマイシン、カルビシン、カルミノマイシン、カルチノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポルフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン（quelamycin）、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン等の抗生物質；メトトレキサート及び５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）等の代謝拮抗物質；デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン（pteropterin）、トリメトレキサート等の葉酸類似体；フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン（thiamiprine）、チオグアニン等のプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン、５−ＦＵ等のピリミジン類似体；カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン等のアンドロゲン；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン等の抗アドレナリン剤（anti-adrenal）；フロリン酸等の葉酸補充薬；アセグラトン；アルドホスファミド配糖体；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトレキセート；デフォファミン（defofamine）；デメコルチン；ジアジコン；エフロールニチン；酢酸エリプチニウム；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ&commat；ラゾキサン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾ���酸；トリアジコン；２，２’，２’’−トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（gacytosine）；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えばパクリタキセル（ＴＡＸＯＬＯ，Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，NJ）及びドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ，Rhone-Poulenc Rorer，Antony，France）；クロラムブシル；ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；シスプラチン及びカルボプラチン等の白金類似体；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン；ノバントロン；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；ＣＰＴ−１１；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ  ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸；エスペラミシン；並びにカペシタビン。また、この定義には、腫瘍に対するホルモン作用を調節又は阻害するように働く抗ホルモン剤、例えばタモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害４（５）−イミダゾール、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、オナプリストン、及びトレミフェン（Ｆａｒｅｓｔｏｎ）等の抗エストロゲン；並びにフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、リュープロリド、及びゴセレリン等の抗アンドロゲン；並びに上記のいずれかの薬学的に許容可能な塩、酸、又は誘導体が含まれる。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９５】
本発明の方法において有用な酵素の例としては、リン酸塩を含有するプロドラッグを遊離薬物に変換するのに有用なアルカリフォスファターゼ；硫酸塩を含有するプロドラッグを遊離薬物に変換するのに有用なアリールスルファターゼ；非毒性５−フルオロシトシンを抗癌薬（フルオロウラシル）に変換するのに有用なシトシンデアミナーゼ；ペプチドを含有するプロドラッグを遊離薬物に変換するのに有用なプロテアーゼ、例えばセラチア菌（serratia）プロテアーゼ、サーモリシン、サブチリシン、カルボキシペプチダーゼ、並びにカテプシン（カテプシンＢ及びカテプシンＬ等）；Ｄ−アミノ酸置換基を含有するプロドラッグを変換するのに有用なＤ−アラニルカルボキシペプチダーゼ；グリコシル化プロドラッグを遊離薬物に変換するのに有用な炭水化物分解酵素、例えばβ−ガラクトシダーゼ及びノイラミニダーゼ；β−ラクタムで誘導体化された薬物を遊離薬物に変換するのに有用なβ−ラクタマーゼ；並びにアミン窒素がフェノキシアセチル基又はフェニルアセチル基で誘導体化された薬物を、遊離薬物に変換するのに有用なペニシリンアミダーゼ、例えばそれぞれペニシリンＶアミダーゼ又はペニシリンＧアミダーゼが挙げられるが、これらに限定されない。代替的には、当該技術分野において「抗体酵素」としても知られる、酵素活性を有する抗体を、本発明のプロドラッグを遊離活性薬物に変換するために使用することができる（例えばMassey, Nature 328: 457-458 (1987)を参照）。抗体−抗体酵素複合体は、抗体酵素を腫瘍細胞集団に送達するために、本明細書中に記載されるように調製することができる。