【手続補正書】
【提出日】平成25年11月22日(2013.11.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を生成する方法であって、
血管芽細胞を提供する工程、
前記血管芽細胞を、メチルセルロース、並びにＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ１５、ＳＣＦ、およびＦＬを含む第１のサイトカイン混合物上で培養する工程、
前記培養した細胞を回収する工程、および
前記回収した細胞を、ヒト血清、並びにＩＬ７、ＩＬ１５、ＳＣＦ、およびＦＬを含む第２のサイトカイン混合物を含む液体培地中で培養してＮＫ細胞を生成する工程
を含む方法。
【請求項２】
前記メチルセルロースが、Ｈ４２３６メチルセルロースである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記メチルセルロースが、Ｈ４５３６メチルセルロースである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ＩＬ２の濃度が、約５〜１０ｎｇ／ｍｌであり、ＩＬ３が約１〜１０ｎｇ／ｍｌであり、ＩＬ６が約１〜１０ｎｇ／ｍｌであり、ＩＬ７が約５〜２０ｎｇ／ｍｌであり、ＩＬ１５が約５〜１０ｎｇ／ｍｌであり、ＳＣＦが約１０〜５０ｎｇ／ｍｌであり、ＦＬが約１
０〜５０ｎｇ／ｍｌである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記血管芽細胞の培養が、約６〜８日間である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記回収した細胞の培養が、約１４〜２１日間である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
培地を週１回変更して、前記第２のサイトカイン混合物を新しくする工程を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記血管芽細胞が、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）から分化する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記血管芽細胞が、誘導多能性（ｉＰＳ）細胞から分化する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＮＫ細胞が、未熟ＮＫ細胞であり、ＣＤ５６＋およびＣＤ１６−である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＮＫ細胞が、成熟ＮＫ細胞であり、ＣＤ５６−およびＣＤ１６＋であるか、またはＣＤ５６ｌｏおよびＣＤ１６＋である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法により生成されるナチュラルキラー（ＮＫ）細胞。
【請求項１３】
請求項１２に記載のＮＫ細胞をある量含む薬学的に許容される組成物。
【請求項１４】
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を生成する方法であって、
血管芽細胞を提供する工程、
前記血管芽細胞を、ヒト血清、並びにＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ１５、およびＳＣＦを含む第１のサイトカイン混合物を含む液体培地中で培養する工程、
前記培養した細胞を回収する工程、および
前記回収した細胞を、ヒト血清、並びにＩＬ７、ＩＬ１５、ＳＣＦ、およびＦＬを含む第２のサイトカイン混合物を含む液体培地中で培養して前記ＮＫを生成する工程
を含む方法。
【請求項１５】
ＩＬ２の濃度が、約５〜１０ｎｇ／ｍｌであり、ＩＬ３が約１〜１０ｎｇ／ｍｌであり、ＩＬ６が約１〜１０ｎｇ／ｍｌであり、ＩＬ７が約５〜２０ｎｇ／ｍｌであり、ＩＬ１５が約５〜1０ｎｇ／ｍｌであり、ＳＣＦが約１０〜５０ｎｇ／ｍｌであり、ＦＬが約１
０〜５０ｎｇ／ｍｌである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記血管芽細胞の培養が、約６〜８日間である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記回収した細胞の培養が、約１４〜２１日間である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
培地を週１回変更して、前記第２のサイトカイン混合物を新しくする工程を更に含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記血管芽細胞が、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）から分化する、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
前記血管芽細胞が、誘導多能性（ｉＰＳ）細胞から分化する、請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＮＫ細胞が、未熟ＮＫ細胞であり、ＣＤ５６＋およびＣＤ１６−である、請求項１４に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＮＫ細胞が、成熟ＮＫ細胞であり、ＣＤ５６−およびＣＤ１６＋であるか、またはＣＤ５６ｌｏおよびＣＤ１６＋である、請求項１４に記載の方法。
【請求項２３】
請求項１４〜２２のいずれか一項に記載の方法により生成されるナチュラルキラー（ＮＫ）細胞。
【請求項２４】
請求項２４に記載のＮＫ細胞をある量含む薬学的に許容される組成物。
【請求項２５】
樹状細胞（ＤＣ）を生成する方法であって、
血管芽細胞を提供する工程、
前記血管芽細胞を、ヒト血清、ＳＣＦ、ＦＬ、ＩＬ３、およびＧＭ−ＣＳＦを含む液体培地中で培養する工程、
前記液体培地にＩＬ４を添加する工程、および
前記血管芽細胞を更に培養して、前記ＤＣを生成する工程
を含む方法。
【請求項２６】
前記血管芽細胞の培養が、約７〜１１日間である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＩＬ４添加の後の前記血管芽細胞の培養が、約８〜１０日間である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
ＩＬ１ｂ、ＴＮＦα、およびＩＬ６を含むサイトカイン混合物を添加して、前記ＤＣの成熟化を誘導する工程を更に含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記サイトカイン混合物が、約４８時間添加される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記サイトカイン混合物が、ＰＧＥ２、ＩＦＮα２ｂ、Ｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃ、ＩＦＮγ、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるサイトカインを更に含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
ＬＰＳ、ＩＦＮγ、および／またはＳ−２８４６３を添加して、前記ＤＣからのＩＬ１２ｐ７０産生および／または前記ＤＣからのＨＬＡ−ＤＲ発現を刺激する工程を更に含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項３２】
ＳＣＦの濃度が、約２０〜１００ｎｇ／ｍｌであり、ＦＬが約１０〜５０ｎｇ／ｍｌであり、ＩＬ３が約５〜５０ｎｇ／ｍｌであり、ＧＭ−ＣＳＦが約５０〜１００ｎｇ／ｍｌであり、ＩＬ４が約５０〜１００ｎｇ／ｍｌである、請求項２５に記載の方法。
【請求項３３】
ＩＬ１ｂの濃度が、約１０ｎｇ／ｍｌであり、ＴＮＦγが、約１０ｎｇ／ｍｌであり、ＩＬ６が約１５０ｎｇ／ｍｌである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３４】
ＰＧＥ２の濃度が、約１μｇ／ｍｌであり、ＩＦＮα２ｂが約３０００単位／ｍｌであり、ｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃが約２０μｇ／ｍｌであり、ＩＦＮγが約２０ｎｇ／ｍｌである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
前記ＤＣが、成熟ＤＣであり、ＣＤ８３を発現する、請求項２５に記載の方法。
【請求項３６】
前記ＤＣが、成熟ＤＣであり、ＣＤ２０９、ＨＬＡ  ＤＲ、および／またはＣＤ１１ｃの発現が増加される、請求項２５に記載の方法。
【請求項３７】
請求項２５〜３６のいずれか一項に記載の方法により生成される樹状細胞（ＤＣ）。
【請求項３８】
請求項３７に記載のＤＣ細胞をある量含む薬学的に許容される組成物。
【請求項３９】
前記血管芽細胞が、以下：
（ａ）ｈＥＳＣの胚様体への分化を誘導するのに十分な量の少なくとも一つの成長因子の存在下で無血清培地中に前記ｈＥＳＣを含む、細胞培養物を培養する工程；および
（ｂ）胚様体を含む前記培養物に、少なくとも二つの成長因子を添加して、無血清培地中の前記培養物を培養し続ける工程であって、前記成長因子は、前記胚様体培養物中で血管芽細胞を増殖させるのに十分な量で存在する、工程
を含む方法により、ｈＥＳＣから分化し、
前記ｈＥＳＣ、胚様体、および血管芽細胞は、前記方法の工程（ａ）および（ｂ）にわたって、無血清培地中で増殖し、そして
工程（ｂ）における、前記少なくとも二つの成長因子は、ＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、および／またはｂＦＧＦを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項４０】
前記血管芽細胞が、以下：
（ａ）ｉＰＳ細胞の胚様体への分化を誘導するのに十分な量の少なくとも一つの成長因子の存在下で無血清培地中に前記ｉＰＳ細胞を含む、細胞培養物を培養する工程；および
（ｂ）胚様体を含む前記培養物に、少なくとも二つの成長因子を添加して、無血清培地中の前記培養物を培養し続ける工程であって、前記成長因子は、前記胚様体培養物中で血管芽細胞を増殖させるのに十分な量で存在する、工程
を含む方法により、ｉＰＳ細胞から分化し、
前記ｉＰＳ細胞、胚様体、および血管芽細胞は、前記方法の工程（ａ）および（ｂ）にわたって、無血清培地中で増殖し、そして
工程（ｂ）における、前記少なくとも二つの成長因子は、ＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、および／またはｂＦＧＦを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項４１】
前記血管芽細胞が、以下：
（ａ）ｈＥＳＣの胚様体への分化を誘導するのに十分な量の少なくとも一つの成長因子の存在下で無血清培地中に前記ｈＥＳＣを含む、細胞培養物を培養する工程；および
（ｂ）胚様体を含む前記培養物に、少なくとも二つの成長因子を添加して、無血清培地中の前記培養物を培養し続ける工程であって、前記成長因子は、前記胚様体培養物中で血管芽細胞を増殖させるのに十分な量で存在する、工程
を含む方法により、ｈＥＳＣから分化し、
前記ｈＥＳＣ、胚様体、および血管芽細胞は、前記方法の工程（ａ）および（ｂ）にわたって、無血清培地中で増殖し、そして
工程（ｂ）における、前記少なくとも二つの成長因子は、ＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、および／またはｂＦＧＦを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項４２】
前記血管芽細胞が、以下：
（ａ）ｉＰＳ細胞の胚様体への分化を誘導するのに十分な量の少なくとも一つの成長因子の存在下で無血清培地中に前記ｉＰＳ細胞を含む、細胞培養物を培養する工程；および
（ｂ）胚様体を含む前記培養物に、少なくとも二つの成長因子を添加して、無血清培地中の前記培養物を培養し続ける工程であって、前記成長因子は、前記胚様体培養物中で血管芽細胞を増殖させるのに十分な量で存在する、工程
を含む方法により、ｉＰＳ細胞から分化し、
前記ｉＰＳ細胞、胚様体、および血管芽細胞は、前記方法の工程（ａ）および（ｂ）にわたって、無血清培地中で増殖し、そして
工程（ｂ）における、前記少なくとも二つの成長因子は、ＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、および／またはｂＦＧＦを含む、請求項２０に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２６】
本発明の種々の実施形態は、本発明の方法のいずれかにより生成された樹状細胞（ＤＣ）細胞を提供する。本発明の他の実施形態は、本発明の方法のいずれかにより生成されたＤＣをある量含む薬学的に許容される組成物を提供する。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を生成する方法であって、
血管芽細胞を提供すること、
前記血管芽細胞を、メチルセルロース、並びにＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ１５、ＳＣＦ、およびＦＬを含む第１のサイトカイン混合物上で培養すること、
前記培養した細胞を回収すること、および
前記回収した細胞を、ヒト血清、並びにＩＬ７、ＩＬ１５、ＳＣＦ、およびＦＬを含む第２のサイトカイン混合物を含む液体培地中で培養してＮＫ細胞を生成することを含む方法。
（項目２）
前記メチルセルロースが、Ｈ４２３６メチルセルロースである、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記メチルセルロースが、Ｈ４５３６メチルセルロースである、項目１に記載の方法。
（項目４）
ＩＬ２の濃度が、約５〜１０ｎｇ／ｍｌであり、ＩＬ３が約１〜１０ｎｇ／ｍｌであり、ＩＬ６が約１〜１０ｎｇ／ｍｌであり、ＩＬ７が約５〜２０ｎｇ／ｍｌであり、ＩＬ１５が約５〜1０ｎｇ／ｍｌであり、ＳＣＦが約１０〜５０ｎｇ／ｍｌであり、ＦＬが約１
０〜５０ｎｇ／ｍｌである、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記血管芽細胞の培養が、約６〜８日間である、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記回収した細胞の培養が、約１４〜２１日間である、項目１に記載の方法。
（項目７）
培地を週１回変更して、前記第２のサイトカイン混合物を新しくすることを更に含む、項目１に記載の方法。
（項目８）
前記血管芽細胞が、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）から分化する、項目１に記載の方法。
（項目９）
前記血管芽細胞が、誘導多能性（ｉＰＳ）細胞から分化する、項目１に記載の方法。
（項目１０）
前記ＮＫ細胞が、未熟ＮＫ細胞であり、ＣＤ５６＋およびＣＤ１６−である、項目１に記載の方法。
（項目１１）
前記ＮＫ細胞が、成熟ＮＫ細胞であり、ＣＤ５６−およびＣＤ１６＋であるか、またはＣＤ５６ｌｏおよびＣＤ１６＋である、項目１に記載の方法。
（項目１２）
項目１〜１１のいずれか一項に記載の方法により生成されるナチュラルキラー（ＮＫ）細胞。
（項目１３）
項目１２に記載のＮＫ細胞をある量含む薬学的に許容される組成物。
（項目１４）
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を生成する方法であって、
血管芽細胞を提供すること、
前記血管芽細胞を、ヒト血清、並びにＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ１５、およびＳＣＦを含む第１のサイトカイン混合物を含む液体培地中で培養すること、
前記培養した細胞を回収すること、および
前記回収した細胞を、ヒト血清、並びにＩＬ７、ＩＬ１５、ＳＣＦ、およびＦＬを含む第２のサイトカイン混合物を含む液体培地中で培養して前記ＮＫを生成することを含む方法。
（項目１５）
ＩＬ２の濃度が、約５〜１０ｎｇ／ｍｌであり、ＩＬ３が約１〜１０ｎｇ／ｍｌであり、ＩＬ６が約１〜１０ｎｇ／ｍｌであり、ＩＬ７が約５〜２０ｎｇ／ｍｌであり、ＩＬ１５が約５〜1０ｎｇ／ｍｌであり、ＳＣＦが約１０〜５０ｎｇ／ｍｌであり、ＦＬが約１
０〜５０ｎｇ／ｍｌである、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記血管芽細胞の培養が、約６〜８日間である、項目１４に記載の方法。
（項目１７）
前記回収した細胞の培養が、約１４〜２１日間である、項目１４に記載の方法。
（項目１８）
培地を週１回変更して、前記第２のサイトカイン混合物を新しくすることを更に含む、項目１４に記載の方法。
（項目１９）
前記血管芽細胞が、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）から分化する、項目１４に記載の方法。
（項目２０）
前記血管芽細胞が、誘導多能性（ｉＰＳ）細胞から分化する、項目１４に記載の方法。
（項目２１）
前記ＮＫ細胞が、未熟ＮＫ細胞であり、ＣＤ５６＋およびＣＤ１６−である、項目１４に記載の方法。
（項目２２）
前記ＮＫ細胞が、成熟ＮＫ細胞であり、ＣＤ５６−およびＣＤ１６＋であるか、またはＣＤ５６ｌｏおよびＣＤ１６＋である、項目１４に記載の方法。
（項目２３）
項目１４〜２２のいずれか一項に記載の方法により生成されるナチュラルキラー（ＮＫ）細胞。
（項目２４）
項目２４に記載のＮＫ細胞をある量含む薬学的に許容される組成物。
（項目２５）
樹状細胞（ＤＣ）を生成する方法であって、
血管芽細胞を提供すること、
前記血管芽細胞を、ヒト血清、ＳＣＦ、ＦＬ、ＩＬ３、およびＧＭ−ＣＳＦを含む液体培地中で培養すること、
前記液体培地にＩＬ４を添加すること、および
前記血管芽細胞を更に培養して、前記ＤＣを生成することを含む方法。
（項目２６）
前記血管芽細胞の培養が、約７〜１１日間である、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
前記ＩＬ４添加の後の前記血管芽細胞の培養が、約８〜１０日間である、項目２５に記載の方法。
（項目２８）
ＩＬ１ｂ、ＴＮＦα、およびＩＬ６を含むサイトカイン混合物を添加して、前記ＤＣの成熟化を誘導することを更に含む、項目２５に記載の方法。
（項目２９）
前記サイトカイン混合物が、約４８時間添加される、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
前記サイトカイン混合物が、ＰＧＥ２、ＩＦＮα２ｂ、Ｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃ、ＩＦＮγ、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるサイトカインを更に含む、項目２８に記載の方法。
（項目３１）
ＬＰＳ、ＩＦＮγ、および／またはＳ−２８４６３を添加して、前記ＤＣからのＩＬ１２ｐ７０産生および／または前記ＤＣからのＨＬＡ−ＤＲ発現を刺激することを更に含む、項目２５に記載の方法。
（項目３２）
ＳＣＦの濃度が、約２０〜１００ｎｇ／ｍｌであり、ＦＬが約１０〜５０ｎｇ／ｍｌであり、ＩＬ３が約５〜５０ｎｇ／ｍｌであり、ＧＭ−ＣＳＦが約５０〜１００ｎｇ／ｍｌであり、ＩＬ４が約５０〜１００ｎｇ／ｍｌである、項目２５に記載の方法。
（項目３３）
ＩＬ１ｂの濃度が、約１０ｎｇ／ｍｌであり、ＴＮＦγが、約１０ｎｇ／ｍｌであり、ＩＬ６が約１５０ｎｇ／ｍｌである、項目２８に記載の方法。
（項目３４）
ＰＧＥ２の濃度が、約１μｇ／ｍｌであり、ＩＦＮα２ｂが約３０００単位／ｍｌであり、ｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃが約２０μｇ／ｍｌであり、ＩＦＮγが約２０ｎｇ／ｍｌである、項目３０に記載の方法。
（項目３５）
前記ＤＣが、成熟ＤＣであり、ＣＤ８３を発現する、項目２５に記載の方法。
（項目３６）
前記ＤＣが、成熟ＤＣであり、ＣＤ２０９、ＨＬＡ  ＤＲ、および／またはＣＤ１１ｃの発現が増加される、項目２５に記載の方法。
（項目３７）
項目２５〜３６のいずれか一項に記載の方法により生成される樹状細胞（ＤＣ）。
（項目３８）
項目３７に記載のＤＣ細胞をある量含む薬学的に許容される組成物。