【手続補正書】
【提出日】平成26年3月24日(2014.3.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２２５】
【表１９】
2013530679.tif 000001
表９の結果より、Ｙ４３０５Ｕにおける、ＰＰ経路酵素のＧ６ＰＤＨおよび６ＰＧＬの協調的に調節された過剰発現は、総脂質含量［「ＴＦＡ％ＤＣＷ」］、ＥＰＡ生産性［「ＥＰＡ  ％  ＤＣＷ」］およびＥＴＡ＋ＥＰＡ生産性［「ＥＴＡ＋ＥＰＡ  ％  ＤＣＷ」］ならびにＥＰＡタイター［「ＥＰＡ％ＴＦＡ」］を増加させた。この効果はＧ６ＰＤＨによりもたらされた細胞ＮＡＤＰＨアベイラビリティの増加に起因する。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２２６】
以上、本発明を要約すると下記のとおりである。
１．トランスジェニック微生物であって：
（ａ）グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子と；
（ｂ）６−ホスホグルコノラクトナーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子と；
（ｃ）目的の非天然生産物をコードする少なくとも１つの異種遺伝子と；
を含み、
目的の非天然生産物の生合成が、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を必要とする少なくとも１つの酵素反応を含み；
（ａ）および（ｂ）の協調的に調節された過剰発現が、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸量の増加をもたらし；そして
（ｃ）を含み、（ａ）および（ｂ）を欠いているか、または協調的調節様式で（ａ）および（ｂ）を過剰発現していないかのいずれかであるトランスジェニック微生物により生産されるニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸の量および目的生産物の量と比較すると、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸量の増加により、トランスジェニック微生物における（ｃ）の発現によって生産される目的生産物の量が増加している；上記トランスジェニック微生物。
２．グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子および６−ホスホグルコノラクトナーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子の協調的に調節された過剰発現が：
（ａ）グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子を、第１のプロモーターに作動可能に連結させ、６−ホスホグルコノラクトナーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子を、第２のプロモーターに作動可能に連結させる手段であって、ここで第１のプロモーターが、第２のプロモーターと比較すると、同等または減少した活性を有する、該手段；
（ｂ）グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子を、多コピーで発現させ、６−ホスホグルコノラクトナーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子を、多コピーで発現させる手段であって、ここでグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子のコピー数が、６−ホスホグルコノラクトナーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子のコピー数と比較すると、同等であるかまたは減少する、該手段；
（ｃ）グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子の酵素活性を、マルチザイムとして６−ホスホグルコノラクトナーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子の酵素活性に連結させる手段；および
（ｄ）（ａ）、（ｂ）および（ｃ）に記載された手段の任意の組合せ；
からなる群から選択される手段によって達成される、上記１に記載のトランスジェニック微生物。
３．（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の遺伝子に加えて、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子が発現する、上記１に記載のトランスジェニック微生物。
４．目的の非天然生産物が、多価不飽和脂肪酸、カロテノイド、アミノ酸、ビタミン、ステロール、フラボノイド、有機酸、ポリオールおよびヒドロキシエステルからなる群から選択される、上記１に記載のトランスジェニック微生物。
５．目的の非天然生産物が、オメガ−３脂肪酸およびオメガ−６脂肪酸からなる群から選択され；そして（ｃ）の少なくとも１つの異種遺伝子が、デルタ−１２デサチュラーゼ、デルタ−６デサチュラーゼ、デルタ−８デサチュラーゼ、デルタ−５デサチュラーゼ、デルタ−１７デサチュラーゼ、デルタ−１５デサチュラーゼ、デルタ−９デサチュラーゼ、デルタ−４デサチュラーゼ、Ｃ１４／１６エロンガーゼ、Ｃ１６／１８エロンガーゼ、Ｃ１８／２０エロンガーゼ、Ｃ２０／２２エロンガーゼおよびデルタ−９エロンガーゼからなる群から選択される、上記４に記載のトランスジェニック微生物。
６．微生物が、藻類、酵母、ユーグレナ類、ストラメノパイル、卵菌類および菌類からなる群から選択される、上記１に記載のトランスジェニック微生物。
７．酵母が、油性酵母である、上記６に記載のトランスジェニック微生物。
８．トランスジェニック油性酵母であって：
（ａ）グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子と；
（ｂ）６−ホスホグルコノラクトナーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子と；
（ｃ）目的の非天然生産物をコードする少なくとも１つの異種遺伝子であって、目的の生産物が、少なくとも１つの多価不飽和脂肪酸、少なくとも１つのキノン由来化合物、少なくとも１つのカロテノイドおよび少なくとも１つのステロールからなる群から選択される、該異種遺伝子と；
を含み、
（ａ）および（ｂ）の協調的に調節された過剰発現が、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸量の増加をもたらし；そして
（ｃ）を含み、（ａ）および（ｂ）を欠いているか、または協調的調節様式で（ａ）および（ｂ）を過剰発現していないかのいずれかであるトランスジェニック油性酵母により生産されるニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸の量および目的生産物の量と比較すると、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸量の増加により、トランスジェニック油性酵母における（ｃ）の発現によって生産される目的生産物の量が増加している；トランスジェニック油性酵母。
９．油性酵母が、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）である、上記８に記載のトランスジェニック油性酵母。
１０．前記少なくとも１つの多価不飽和脂肪酸が、リノール酸、ガンマ−リノレン酸、エイコサジエン酸、ジホモ−ガンマ−リノレン酸、アラキドン酸、ドコサテトラエン酸、オメガ−６ドコサペンタエン酸、アルファ−リノレン酸、ステアリドン酸、エイコサトリエン酸、エイコサテトラエン酸、エイコサペンタエン酸、オメガ−３ドコサペンタエン酸およびドコサヘキサエン酸からなる群から選択される、上記８または９に記載のトランスジェニック油性酵母。
１１．（ｃ）を含み、（ａ）および（ｂ）を欠いているか、または協調的調節様式で（ａ）および（ｂ）を過剰発現していないかのいずれかであるトランスジェニック油性酵母により生産される総脂質含量と比較すると、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸量および少なくとも１つの多価不飽和脂肪酸量に加えて、総脂質含量が増加している、上記１０に記載のトランスジェニック油性酵母。
１２．少なくとも１つのカロテノイドが、アンテラキサンチン、アドニルビン、アドニキサンチン、アスタキサンチン、カンタキサンチン、カプソルブリン、β−クリプトキサンチン、α−カロテン、β−カロテン、β、ψ−カロテン、δ−カロテン、ε−カロテン、エキネノン、３−ヒドロキシエキネノン、３’−ヒドロキシエキネノン、γ−カロテン、ψ−カロテン、４−ケト−γ−カロテン、ζ−カロテン、α−クリプトキサンチン、デオキシフレキサンチン、ジアトキサンチン、７，８−ジデヒドロアスタキサンチン、ジデヒドロリコペン、フコキサンチン、フコキサンチノール、イソレニエラテン、β−イソレニエラテン、ラクツカキサンチン、ルテイン、リコペン、ミクソバクトン、ネオキサンチン、ニューロスポレン、ヒドロキシニューロスポレン、ペリジニン、フィトエン、フィトフルエン、ロドピン、ロドピングルコシド、４−ケト−ルビキサンチン、シホナキサンチン、スフェロイデン、スフェロイデノン、スピリロキサンチン、トルレン、４−ケト−トルレン、３−ヒドロキシ−４−ケト−トルレン、ウリオリド、ウリオリドアセテート、ビオラキサンチン、ゼアキサンチン−β−ジグルコシド、ゼアキサンチン、ＣＣ３０カロテノイドおよびそれらの組合せからなる群から選択される、上記８に記載のトランスジェニック油性酵母。
１３．少なくとも１つのキノン由来化合物が、ユビキノン、ビタミンＫ化合物およびビタミンＥ化合物ならびにそれらの組合せからなる群から選択される、上記８に記載のトラン
スジェニック油性酵母。
１４．少なくとも１つのステロール化合物が、スクアレン、ラノステロール、チモステロール、エルゴステロール、７−デヒドロコレステロール（プロビタミンＤ３）およびそれらの組合せからなる群から選択される、上記８に記載のトランスジェニック油性酵母。
１５．目的の非天然生産物の生産のための方法であって：
（ａ）トランスジェニック微生物を備えるステップであって：
（ｉ）グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子と；
（ｉｉ）６−ホスホグルコノラクトナーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子と；
（ｉｉｉ）目的の非天然生産物をコードする少なくとも１つの異種遺伝子と；
を含み、
（ｉ）および（ｉｉ）が協調的調節様式で過剰発現され、（ｉ）および（ｉｉ）を欠いているか、または協調的調節様式で過剰発現していないかのいずれかであるトランスジェニック微生物により生産されるニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸量と比較すると、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸量の生産が増加している、該ステップと；
（ｂ）発酵性炭素源の存在下でステップ（ａ）のトランスジェニック微生物を増殖させ、それによって、目的の非天然生産物の生産を（ｉｉｉ）の発現によりもたらすステップと；
（ｃ）場合によって、目的の非天然生産物を回収するステップと；
を含む、上記方法。
【手続補正３】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
トランスジェニック微生物であって：
（ａ）グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子と；
（ｂ）６−ホスホグルコノラクトナーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子と；
（ｃ）目的の非天然生産物をコードする少なくとも１つの異種遺伝子と；
を含み、
目的の非天然生産物の生合成が、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を必要とする少なくとも１つの酵素反応を含み；
（ａ）および（ｂ）の協調的に調節された過剰発現が、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸量の増加をもたらし；そして
（ｃ）を含み、（ａ）および（ｂ）を欠いているか、または協調的調節様式で（ａ）および（ｂ）を過剰発現していないかのいずれかであるトランスジェニック微生物により生産されるニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸の量および目的生産物の量と比較すると、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸量の増加により、トランスジェニック微生物における（ｃ）の発現によって生産される目的生産物の量が増加している；上記トランスジェニック微生物。
【請求項２】
トランスジェニック油性酵母であって：
（ａ）グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子と；
（ｂ）６−ホスホグルコノラクトナーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子と；
（ｃ）目的の非天然生産物をコードする少なくとも１つの異種遺伝子であって、目的の
生産物が、少なくとも１つの多価不飽和脂肪酸、少なくとも１つのキノン由来化合物、少なくとも１つのカロテノイドおよび少なくとも１つのステロールからなる群から選択される、該異種遺伝子と；
を含み、
（ａ）および（ｂ）の協調的に調節された過剰発現が、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸量の増加をもたらし；そして
（ｃ）を含み、（ａ）および（ｂ）を欠いているか、または協調的調節様式で（ａ）および（ｂ）を過剰発現していないかのいずれかであるトランスジェニック油性酵母により生産されるニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸の量および目的生産物の量と比較すると、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸量の増加により、トランスジェニック油性酵母における（ｃ）の発現によって生産される目的生産物の量が増加している；トランスジェニック油性酵母。
【請求項３】
目的の非天然生産物の生産のための方法であって：
（ａ）トランスジェニック微生物を備えるステップであって：
（ｉ）グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子と；
（ii）６−ホスホグルコノラクトナーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子と；
（iii）目的の非天然生産物をコードする少なくとも１つの異種遺伝子と；
を含み、
（ｉ）および（ii）が協調的調節様式で過剰発現され、（ｉ）および（ii）を欠いているか、または協調的調節様式で過剰発現していないかのいずれかであるトランスジェニック微生物により生産されるニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸量と比較すると、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸量の生産が増加している、該ステップと；
（ｂ）発酵性炭素源の存在下でステップ（ａ）のトランスジェニック微生物を増殖させ、それによって、目的の非天然生産物の生産を（iii）の発現によりもたらすステップと；
（ｃ）場合によって、目的の非天然生産物を回収するステップと；
を含む、上記方法。