【手続補正書】
【提出日】平成26年4月8日(2014.4.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
HE4aタンパク質のN-WFDCドメインに特異的に結合する結合剤であって、検出可能なマーカで標識されていてもよい、結合剤。
【請求項２】
ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、二特異性抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体、または、該ポリクローナル、モノクローナル、二特異性、キメラ、ヒト化、もしくは単鎖抗体の抗原結合フラグメントである、請求項1記載の結合剤。
【請求項３】
配列番号17で定義されるHE4aタンパク質の領域に特異的に結合する、請求項1記載の結合剤。
【請求項４】
特許受託番号10091401としてECACCに寄託されたハイブリドーマ細胞株12A2により産生されるモノクローナル抗体のアミノ酸配列に対して、少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項1記載の結合剤。
【請求項５】
HE4aのN-WFDCドメイン、HE4aのC-WFDCドメイン、またはその中のエピトープを含む、トランケート型HE4aポリペプチド。
【請求項６】
配列番号17または配列番号19のアミノ酸配列からなる、請求項5記載のトランケート型HE4aポリペプチド。
【請求項７】
請求項5または請求項6記載のトランケート型HE4aポリペプチドと異種ポリペプチドとを含む、融合タンパク質。
【請求項８】
異種ポリペプチドが、アフィニティータグポリペプチド配列、免疫グロブリン定常領域ポリペプチド、または、所定の、細胞内、細胞膜、もしくは細胞外位置に前記融合タンパク質を向かわせるポリペプチドを含む、請求項7記載の融合タンパク質。
【請求項９】
請求項5もしくは請求項6記載のトランケート型HE4aポリペプチドまたは請求項7もしくは請求項8記載の融合タンパク質をコードする、核酸分子。
【請求項１０】
請求項9記載の核酸分子を含む、発現ベクター構築物。
【請求項１１】
請求項10記載の発現ベクター構築物を含む、単離された宿主細胞。
【請求項１２】
請求項1〜4のいずれか一項記載の結合剤、請求項5もしくは請求項6記載のトランケート型ポリペプチド、請求項7もしくは請求項8記載の融合タンパク質、請求項9記載の核酸分子、請求項10記載の発現ベクター構築物、または請求項11記載の単離された宿主細胞を含む、キット。
【請求項１３】
請求項1記載の結合剤を含み、さらに、HE4aタンパク質のC-WFDCドメインに特異的に結合する結合剤、検出可能に標識されていてもよい第二の結合剤を含む、請求項12記載のキット。
【請求項１４】
以下の抗体を含む、請求項12記載のキット：HE4aタンパク質のN-WFDCドメインにおける別個のエピトープに特異的に結合する二つの抗体；HE4aタンパク質のC-WFDCドメインにおける別個のエピトープに特異的に結合する二つの抗体；または、HE4aタンパク質のN-WFDCドメイン中のエピトープに特異的に結合する一つの抗体およびHE4aタンパク質のC-WFDCドメイン中のエピトープに特異的に結合する一つの抗体。
【請求項１５】
以下の段階を含む、対象における卵巣癌の存在をスクリーニングするまたは卵巣癌を有する対象を診断する方法：
(a)対象からの生物学的試料を、(i)該試料中で可溶性形態にある天然由来分子または(ii)細胞表面分子が該生物学的試料中に存在することを測定するために、HE4a抗原ポリペプチドに特異的な少なくとも一つの抗体と接触させる段階であって、ここで、(i)または(ii)の分子は、該少なくとも一つの抗体と反応性がある抗原決定基を有し、かつ、該試料を、該抗原決定基に対する該抗体の結合を検出するのに十分な条件および時間で接触させる、段階；ならびに
(b)該生物学的試料が、該少なくとも一つの抗体によって特異的に結合される分子を含む、卵巣癌を検出するまたは卵巣癌を有する対象を診断する段階。
【請求項１６】
対象からの生物学的試料を少なくとも二つの抗体と接触させる段階をさらに含み、ここで、該二つの抗体が、HE4a抗原ポリペプチドのN-WFDCドメイン中の別個のエピトープ、HE4a抗原ポリペプチドのC-WFDCドメイン中の別個のエピトープ、または、HE4aタンパク質のN-WFDCドメイン中の一つのエピトープおよびHE4a抗原ポリペプチドのC-WFDCドメイン中の一つのエピトープに特異的に結合する、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
前記分子が天然に可溶性形態で生じ、かつ、前記試料が、血液、血清、漿液（serosal fluid）、血漿、リンパ、尿、脳脊髄液、唾液、粘膜分泌液、膣分泌液、コンディション培地、および洗浄液を含む、請求項15または請求項16記載の方法。
【請求項１８】
少なくとも一つの抗体が固体担体上で固定化されている、請求項15、16、または17のいずれか一項記載の方法。
【請求項１９】
二抗体サンドイッチアッセイとして構成されている、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
前記対象が卵巣癌の処置を受け、かつ、該疾患の経過をモニタリングするために方法が実施される、請求項15、16、または17のいずれか一項記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００６】
本発明は、対象における卵巣癌を診断する、および卵巣癌を有する確率の高い対象を同定する、組成物および方法を包含する。該組成物は、卵巣癌で過剰発現されるＨＥ４／ＨＥ４ａの可溶性形態および細胞表面形態に特異的に結合するモノクローナル抗体、それらの変異体およびフラグメントを含む。開示されたＨＥ４ａ抗体の結合特性を有するモノクローナル抗体も、提供される。ＨＥ４／ＨＥ４ａモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株も、開示される。開示された組成物は、卵巣癌を有する確率の高い対象を同定するための診断方法およびスクリーニング方法において使用を有する。詳細には診断方法は、免疫組織化学（ＩＨＣ）アッセイまたはダブルサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイを含むことができる。開示されたＨＥ４ａモノクローナル抗体の１種以上を含む、本発明の方法を実践するためのキットも、提供される。ＨＥ４ａエピトープのアミノ酸配列を含むポリペプチド、および抗体の産生においてこれらのポリペプチドを使用する方法も、開示される。
[本発明1001]
（ａ）特許受託番号10091401としてＥＣＡＣＣに寄託されたハイブリドーマ細胞株12Ａ2により産生されたモノクローナル抗体、
（ｂ）特許受託番号14Ｅ2ＥＣＡＣＣ番号＿としてＥＣＡＣＣに寄託されたハイブリドーマ細胞株14Ｅ2により産生されたモノクローナル抗体、
（ｃ）配列番号ＨＥ4ａ  Ｎ−ＷＦＤＣに示されたアミノ酸配列に結合するモノクローナル抗体、
（ｄ）（ａ）〜（ｃ）のモノクローナル抗体の抗原結合フラグメントであり、前記フラグメントがＨＥ4ａに特異的に結合する能力を保持する、モノクローナル抗体、
からなる群より選択される、ＨＥ4ａに特異的に結合し得るモノクローナル抗体。
[本発明1002]
特許受託番号10091401としてＥＣＡＣＣに寄託されたハイブリドーマ細胞株12Ａ2。
[本発明1003]
特許受託番号14Ｅ2ＥＣＡＣＣ番号＿としてＥＣＡＣＣに寄託されたハイブリドーマ細胞株14Ｅ2。
[本発明1004]
本発明1001のモノクローナル抗体を産生し得るハイブリドーマ細胞株。
[本発明1005]
本発明1001の少なくとも1種のモノクローナル抗体を含む卵巣癌を診断するキット。
[本発明1006]
配列番号17に示されたアミノ酸配列に結合するモノクローナル抗体と、配列番号19に示されたアミノ酸配列に結合する追加のモノクローナル抗体と、を含む卵巣癌を診断するキット。
[本発明1007]
ａ）固体担体上に固定された、第一のＨＥ4ａ抗体である捕捉抗体と、
ｂ）検出可能な物質で標識された第二のＨＥ4ａ抗体である、タグ抗体と、
を含み、前記第一または第二のＨＥ4ａ抗体が、本発明1001のモノクローナル抗体である、患者における卵巣癌を診断するキット。
[本発明1008]
（ａ）免疫反応を誘発する条件下、配列番号1、3または5に示されたアミノ酸配列を含むポリペプチドで動物を免疫化すること、
（ｂ）前記動物から抗体を産生する細胞を単離すること、
（ｃ）抗体を産生する細胞を不死化培養細胞と融合して、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を形成すること、
（ｄ）前記ハイブリドーマ細胞を本発明1001に従って培養すること、ならびに
（ｅ）モノクローナル抗体を培養物から単離すること、
を含む、ＨＥ4ａモノクローナル抗体を産生する方法。
[本発明1009]
（ａ）配列番号1のＮ−ＷＦＤＣドメイン、
（ｂ）配列番号17によりコードされたアミノ酸配列、
（ｃ）ＨＥ4ａによりコードされたアミノ酸配列、または
（ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれか1つの変異体もしくはフラグメント、
に結合するＨＥ4ａ結合剤。
[本発明1010]
抗ＨＥ4ａ抗体またはＨＥ4ａ抗原結合フラグメントである、本発明1009の結合剤。
[本発明1011]
ＨＥ4ａ  Ｎ−ＷＦＤＣ（配列番号17）に選択的に結合する、本発明1010の結合剤。
[本発明1012]
ポリクローナル、モノクローナル、二特異性、キメラもしくはヒト化抗体、またはそれらの抗原結合フラグメントである、本発明1009の結合剤。
[本発明1013]
ポリクローナル、モノクローナル、二特異性、キメラもしくはヒト化抗体、または抗原結合フラグメントである、本発明1010の結合剤。
[本発明1014]
ポリクローナル、モノクローナル、二特異性、キメラもしくはヒト化抗体、または抗原結合フラグメントである、本発明1011の結合剤。
[本発明1015]
検出可能なマーカで標識されている、本発明1010の結合剤。
[本発明1016]
本発明1001のモノクローナル抗体のアミノ酸配列に対して少なくとも90％の同一性を有する、精製されたアミノ酸配列。
[本発明1017]
ａ）フォワードおよびリバースプライマーを含み、配列番号21（Ｖ4Ｆ）と配列番号23（Ｖ4Ｒ）、配列番号25（Ｖ2Ｆ）と配列番号27（Ｖ2Ｒ）からなる群より選択されるプライマーセットで、試料から核酸を増幅させること；ｂ）増幅された核酸を単離すること、を含む、ＨＥ4ａポリペプチドをコードする核酸配列を得る方法。
[本発明1018]
配列番号17であるＨＥ4ａ  Ｎ−ＷＦＤＣの配列に結合する結合蛋白質をコードする単離された核酸分子であって、前記結合蛋白質の可変性重鎖のアミノ酸配列が、本発明1001のモノクローナル抗体のアミノ酸配列に対して少なくとも90％の同一性を有する、単離された核酸分子。
[本発明1019]
本発明1018の単離された核酸分子を含むベクター。
[本発明1020]
本発明1019のベクターを含む単離された宿主細胞。
[本発明1021]
ａ）調節要素に作動可能に連結された本発明1018の核酸分子を含むベクターを構築するステップ、
ｂ）得られたベクターを宿主細胞に形質転換するステップ、
ｃ）前記結合蛋白質を産生するのに十分な時間および条件で、前記宿主細胞を培養するステップ、
を含む、Ｎ−ＷＦＤＣに結合し得る結合剤を生成する方法。
[本発明1022]
本発明1021の方法により生成された、単離された結合剤。
[本発明1023]
配列番号17であるＨＥ4ａ  Ｎ−ＷＦＤＣのアミノ酸配列を含むＦｃ受容体ポリペプチドに連結された異種ＨＥ4ａポリペプチドを含む単離された融合蛋白質。
[本発明1024]
ポリペプチドが、配列番号29（Ｗ1Ｆ）、配列番号31（Ｗ1Ｒ）、配列番号33（Ｗ2Ｆ）、配列番号35（Ｗ2Ｒ）によりコードされるプライマーを用いて核酸増幅することにより得られる、本発明1022の単離された融合蛋白質。
[本発明1025]
ＨＥ4ａ抗原ポリペプチドが、スプライス変異体である、本発明1023の融合蛋白質。
[本発明1026]
対象からの生物学的試料を、ＨＥ4ａ抗原ポリペプチドに特異的な少なくとも1種の抗体と、抗原決定基への前記抗体の結合を検出するのに十分な条件および時間で接触させて、前記試料中で可溶性形態であり少なくとも1種の抗体と反応性がある抗原決定基を有する天然由来分子が前記生物学的試料中に存在することを測定すること、ならびにその後、悪性状態の存在を検出すること、を含む、対象における悪性状態の存在をスクリーニングする方法。
[本発明1027]
生物学的試料が、血液、血清、漿液（ｓｅｒｏｓａｌ  ｆｌｕｉｄ）、血漿、リンパ、尿、脳脊髄液、唾液、粘膜分泌液、膣分泌液、腹水、肋膜液、心膜液、腹腔液、腹部液体（ａｂｄｏｍｉｎａｌ  ｆｌｕｉｄ）、培地、コンディション培地および洗浄液からなる群より選択される、本発明1026の方法。
[本発明1028]
対象の細胞を含む生物学的試料を、ＨＥ4ａ抗原ポリペプチドに特異的な少なくとも1種の抗体と、抗原決定基への前記抗体の結合を検出するのに十分な条件および時間で接触させて、少なくとも1種の前記抗体と反応性のある前記抗原決定基を有する細胞表面分子が、前記生物学的試料中に存在することを測定すること、ならびにこうして悪性状態の存在を検出すること、を含む、対象における悪性状態の存在をスクリーニングする方法。
[本発明1029]
少なくとも1種の抗体が検出可能に標識されている、本発明1026の方法。
[本発明1030]
少なくとも1種の抗体が検出可能に標識されている、本発明1028の方法。
[本発明1031]
少なくとも1種の抗体が検出可能に標識されておらず、抗原決定基に対する抗体の結合の検出が間接的である、本発明1026の方法。
[本発明1032]
少なくとも1種の抗体が検出可能に標識されておらず、抗原決定基に対する抗体の結合の検出が間接的である、本発明1028の方法。
[本発明1033]
ＨＥ4ａ抗原ポリペプチドに特異的な少なくとも1種の固定化第一抗体をＨＥ4ａ抗原ポリペプチドに特異的に結合させることにより免疫複合体を形成するのに十分な条件および時間で、対象からの生物学的試料を第一抗体と接触させて、試料中の分子の存在を測定すること；第一抗体に特異的に結合しない試料の構成成分を除去すること；ならびにＨＥ4ａ抗原ポリペプチドに特異的で抗原結合部位が固定化第一抗体の抗原結合部位を拮抗阻害しない第二抗体の、ＨＥ4ａ抗原ポリペプチドへの特異的結合を検出するのに十分な条件および時間で、前記免疫複合体を少なくとも1種の第二抗体と接触させ、こうして卵巣癌の存在を検出すること、を含む、対象における卵巣癌の存在をスクリーニングする方法。
[本発明1034]
固定化第一抗体が、12Ａ2、14Ｅ2、2Ｈ5および3Ｄ8からなる群より選択される、本発明1033の方法。
[本発明1035]
第二抗体が、12Ａ2、14Ｅ2、2Ｈ5および3Ｄ8からなる群より選択される、本発明1033の方法。
[本発明1036]
固定化第一抗体が14Ｅ2である、本発明1033の方法。
[本発明1037]
第二抗体が12Ａ2である、本発明1033の方法。
[本発明1038]
ａ）対象の検査試料中のＨＥ4ａ抗原を検出すること、
ｂ）抗体／抗原複合体の形成に十分な時間および条件で、前記検査試料を、ＨＥ4ａ  Ｎ−ＷＦＤＣに結合する抗原結合ドメインを有する抗体と接触させること、および
ｃ）前記複合体の存在をディスプレイ上で検出すること、
を含み、検査試料中のＨＥ4ａの存在を示す複合体の存在が卵巣癌の存在と相関する、卵巣癌の対象を診断する方法。
[本発明1039]
抗体が、ＨＥ4ａのアミノ酸Ｎ−ＷＦＤＣに結合する抗原結合ドメインを含む、本発明1038の方法。
[本発明1040]
抗体が、特許受託番号10091401としてＥＣＡＣＣを有するハイブリドーマ細胞株により産生されたモノクローナル抗体である、本発明1038の方法。
[本発明1041]
ａ）対象の検査試料中のＨＥ4ａ抗原を検出すること、
ｂ）前記検査試料を、ＨＥ4ａのアミノ酸Ｎ−ＷＦＤＣに結合する抗原結合ドメインを有する第一抗体と、第一抗体／抗原複合体の形成に十分な時間および条件で接触させること、
ｃ）検出可能なシグナルを発生し得るシグナル発生化合物に付着された第二抗体を含むコンジュゲートを、第一抗体／抗原複合体に、第一抗体／抗原／第二抗体複合体を形成するのに十分な時間および条件で添加すること、ならびに
ｄ）シグナル発生化合物により発生されたシグナルの存在をディスプレイ上で検出すること、
を含み、検査試料中のＨＥ4ａ抗原の存在を示すシグナルの存在が卵巣癌の存在と相関する、卵巣癌の対象を診断する方法。
[本発明1042]
抗体の少なくとも1種が、ＨＥ4ａのアミノ酸Ｎ−ＷＦＤＣに結合する抗原結合ドメインを含む、本発明1041の方法。
[本発明1043]
抗体が、特許受託番号10091401としてＥＣＡＣＣを有するハイブリドーマ細胞株により産生される、本発明1042の方法。
[本発明1044]
ａ）対象の検査試料中のＨＥ4ａ抗原を検出すること、
ｂ）前記検査試料を、ＨＥ4ａ  Ｎ−ＷＦＤＣに結合する抗原結合ドメインを有する抗体と、抗体／抗原複合体の形成に十分な時間および条件で接触させること、ならびに
ｃ）前記複合体の存在をディスプレイ上で検出すること、
を含み、検査試料中のＨＥ4ａ抗原の存在を示す前記複合体の存在が卵巣癌のステージと相関する、卵巣癌の対象の予後判定の方法。
[本発明1045]
抗体が、ＨＥ4ａのアミノ酸Ｎ−ＷＦＤＣに結合する抗原結合ドメインを含む、本発明1044の方法。
[本発明1046]
抗体が、特許受託番号10091401としてＥＣＡＣＣを有するハイブリドーマ細胞株により産生されたモノクローナル抗体である、本発明1044の方法。
[本発明1047]
ａ）対象の検査試料中のＨＥ4ａ抗原を検出すること、
ｂ）前記検査試料を、ＨＥ4ａのアミノ酸Ｎ−ＷＦＤＣに結合する抗原結合ドメインを有する第一抗体と、第一抗体／抗原複合体の形成に十分な時間および条件で接触させること、
ｃ）検出可能なシグナルを発生し得るシグナル発生化合物に付着された第二抗体を含むコンジュゲートを、第一抗体／抗原複合体に、第一抗体／抗原／第二抗体複合体を形成するのに十分な時間および条件で添加すること、ならびに
ｄ）シグナル発生化合物により発生されたシグナルの存在をディスプレイ上で検出すること、
を含み、検査試料中のＨＥ4ａ抗原の存在を示すシグナルの存在が卵巣癌のステージと相関する、卵巣癌の対象の予後判定の方法。
[本発明1048]
少なくとも1つの抗体が、ＨＥ4ａのアミノ酸Ｎ−ＷＦＤＣに結合する抗原結合ドメインを含む、本発明1047の方法。
[本発明1049]
抗体が、特許受託番号10091401としてＥＣＡＣＣを有するハイブリドーマ細胞株により産生される、本発明1047の方法。
[本発明1050]
ａ）対象の検査試料中のＨＥ4ａ抗原を検出すること、
ｂ）前記検査試料を、ＨＥ4ａ  Ｎ−ＷＦＤＣに結合する抗原結合ドメインを有する抗体と、抗体／抗原複合体の形成に十分な時間および条件で接触させること、ならびに
ｃ）前記複合体の存在をディスプレイ上で検出すること、
を含み、検査試料中のＨＥ4ａ抗原の存在を示す前記複合体の存在が処置の応答性と相関する、卵巣癌の処置を受ける対象をモニタリングする方法。
[本発明1051]
抗体が、ＨＥ4ａのアミノ酸Ｎ−ＷＦＤＣに結合する抗原結合ドメインを含む、本発明1050の方法。
[本発明1052]
抗体が、特許受託番号10091401としてＥＣＡＣＣを有するハイブリドーマ細胞株により産生されたモノクローナル抗体である、本発明1050の方法。
[本発明1053]
ａ）対象の検査試料中のＨＥ4ａ抗原を検出すること、
ｂ）前記検査試料を、ＨＥ4ａのアミノ酸Ｎ−ＷＦＤＣに結合する抗原結合ドメインを有する第一抗体と、第一抗体／抗原複合体の形成に十分な時間および条件で接触させること、
ｃ）検出可能なシグナルを発生し得るシグナル発生化合物に付着された第二抗体を含むコンジュゲートを、第一抗体／抗原複合体に、第一抗体／抗原／第二抗体複合体を形成するのに十分な時間および条件で添加すること、ならびに
ｄ）シグナル発生化合物により発生されたシグナルの存在をディスプレイ上で検出すること、
を含み、検査試料中のＨＥ4ａ抗原の存在を示すシグナルの存在が処置への応答性と相関する、卵巣癌の処置を受ける対象をモニタリングする方法。
[本発明1054]
抗体の少なくとも1種が、ＨＥ4ａのアミノ酸Ｎ−ＷＦＤＣに結合する抗原結合ドメインを含む、本発明1053の方法。
[本発明1055]
抗体が、特許受託番号10091401としてＥＣＡＣＣを有するハイブリドーマ細胞株により産生される、本発明1053の方法。
[本発明1056]
対象から得られた検査卵巣組織試料を、配列番号ＨＥ4に示されたポリペプチドに特異的に結合する抗体と接触させること；検査卵巣癌組織試料中のポリペプチドに結合する抗体の量を検出すること；および検査卵巣癌組織試料中のポリペプチドに結合する抗体の量を、所定のカットオフ値と比較すること、を含み、検査卵巣組織試料中のポリペプチドに結合する抗体の量が所定のカットオフ値を超えている場合には検査卵巣癌組織試料が卵巣癌について陽性となり、それにより対象における卵巣癌の有無を検出する、患者における子宮頸癌の有無を検出する方法。
[本発明1057]
検査卵巣癌組織試料中のポリペプチドに結合する抗体の量が、免疫組織化学を利用して測定される、本発明1056の方法。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
【図１】ＨＥ４ａドメインおよびヒト／マウスＩｇＧを含む例示的ＨＥ４ａ融合蛋白質の実施形態を示す。
【図２】ＨＥ４ａの全長ＨＥ４ａ、ＨＥ４ａ−Ｖ４およびＨＥ４ａ−Ｖ２ドメインへの、モノクローナル抗体の実施形態（１２Ａ２および１４Ｅ２抗体）の幾つかの結合特異性を示す。この実施例において、ＭＡｂｓ  １２Ａ２および１４Ｅ２は、ＨＥ４ａ−Ｖ４変異体および全長ＨＥ４ａに結合したが、ＨＥ４ａ−Ｖ２ドメインには結合しなかった。１２Ａ２および１４Ｅ２  ＭＡｂが、ＨＥ４ａ  Ｎ−ＷＦＤＣドメインに結合したことが示される。
【図３】融合蛋白質への参照モノクローナル抗体（２Ｈ５および３Ｄ８抗体）の結合特異性を示す。この実施例において、参照ＭＡｂは、ＨＥ４ａ−Ｖ２ドメインおよび全長ＨＥ４ａに結合するが、ＨＥ４ａ−Ｖ４ドメインには結合せず、それらがＨＥ４ａ  Ｃ−ＷＦＤＣドメイン内のエピトープを認識したことが示される。
【図４】Ｎ−ＷＦＤＣおよびＣ−ＷＦＤＣ  ＨＥ４ａドメインを含むＨＥ４ａヌクレオチド（配列番号６）およびペプチド（配列番号１）配列を示す。
【図５】Ｎ−ＷＦＤＣおよびＣ−ＷＦＤＣへの例示的モノクローナル抗体（１２Ａ２）の結合相互作用を示す。この実施例において、１２Ａ２の結合特異性は、ＭＡｂをＨＥ４ａ  Ｎ−ＷＦＤＣファージ  ｐＶＩＩＩ融合蛋白質のみと反応させたファージＥＬＩＳＡ形式を利用して実証される。
【図６】１４Ｅ２  ＭＡｂと変性および還元ＨＥ４ａ−ｈＩｇ融合蛋白質との反応性を示す。変性および還元ＨＥ４ａ−ｈＩｇ融合蛋白質への結合は、１４Ｅ２  ＭＡｂがＨＥ４ａ蛋白質の線状エピトープを認識したことを示す。
【図７】捕捉ＭＡｂとして１４Ｅ２を用い、検出ＭＡｂとして３Ｄ８または１２Ａ２ＭＡＢを用いた、サンドイッチイムノアッセイの用量反応曲線を示す。１４Ｅ２  ＭＡｂと１２Ａ２  ＭＡｂとの組み合わせの結果から、それらが同時に結合し得ること、つまりＨＥ４ａ  Ｎ−ＷＦＤＣドメインの独立したエピトープを検出し得ることが示される。
【図８】幾つかの例のサンドイッチイムノアッセイおよび２Ｈ５  ＭＡｂと組み合わせた１２Ａ２  ＭＡｂと１４Ｅ２  ＭＡｂとの結合を示す。この実施例において、ＭＡｂ  １２Ａ２および１４Ｅ２は、全長ＨＥ４ａのみと反応するが、３Ｄ８および２Ｈ５のＭＡｂ組み合わせは、ＦＬ  ＨＥ４ａおよびＨＥ４ａ−Ｖ２の両方の変異体と反応した。その結果から、１２Ａ２および１４Ｅ２  ＭＡｂが、ＨＥ４ａ  Ｎ−ＷＦＤＣドメイン内で暴露されたエピトープを認識する証拠を更に裏づけている。
【図９】全長ＨＥ４ａ  ＥＩＡの用量反応曲線を示す。このアッセイは、捕捉抗体としての２Ｈ５  ＭＡｂおよび検出ＭＡｂとしてのＨＲＰコンジュゲート１２Ａ２  ＭＡｂに基づいた。その手順を、実施例３に記載された通り実施した。
【図１０】実施例３に記載された通りＦＬ  ＨＥ４ａ  ＥＩＡで測定された、健常な対象、良性婦人科疾患の患者および卵巣癌患者におけるＨＥ４ａレベルを示す。
【図１１】卵巣癌の臨床経過をモニタリングするための例示的全長ＨＥ４ａイムノアッセイを示す（ＳＤ＝安定した疾患；Ｒ＝応答している；ＰＤ＝進行性疾患）。この実施例において、全長ＨＥ４ａが、卵巣癌と診断された患者の疾患の臨床経過を追跡するのに有用であることが、全長ＨＥ４ａから実証された。
【図１２】ＨＥ４ａ  Ｎ−ＷＦＤＣドメインに特異的な例示的ＭＡｂを用いた良性および悪性卵巣組織のＩＨＣを示す。この実施例において、例示的１２Ａ２  ＭＡｂは、卵巣癌内の癌細胞に強く結合したが、良性腫瘍内の細胞には結合しなかった。Ａ：漿液性腺癌；Ｂ：漿液性腺癌；Ｃ：子宮内膜様卵巣癌；Ｄ：漿液性腺癌；Ｅ：線維腫；Ｆ：線維莢膜細胞腫。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
別の態様において、本発明は、配列番号１７  ＨＥ４ａ  Ｎ−ＷＦＤＣに示されたアミノ酸配列に結合するモノクローナル抗体、および配列番号１９  ＨＥ４ａ  Ｃ−ＷＦＤＣ
2014507153.tif 000001
に示されたアミノ酸配列に結合する追加のモノクローナル抗体を含む卵巣癌を診断するキットを提供する。第一のＨＥ４ａ抗体である固体担体上に固定された捕捉抗体と、検出可能な物質で標識された第二のＨＥ４ａ抗体であるタグ抗体と、を含み、前記第一または第二のＨＥ４ａ抗体が、特許受託番号（１４Ｅ２  ＥＣＡＣＣＮｏ    ）としてＥＣＡＣＣに寄託され、および／または配列番号１７  ＨＥ４ａ  Ｎ−ＷＦＤＣ
2014507153.tif 000002
に示されたアミノ酸配列に結合するハイブリドーマ細胞株１４Ｅ２により産生されたモノクローナル抗体である、患者における卵巣癌を診断するキットも、提供される。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２８】
本発明は、対象から得られた検査卵巣組織試料を、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、または１５（ＨＥ４）のいずれかに示されたポリペプチドに特異的に結合する抗体と接触させること；検査卵巣癌組織試料中のポリペプチドに結合する抗体の量を検出すること；および検査卵巣癌組織試料中のポリペプチドに結合する抗体の量を、所定のカットオフ値と比較すること、を含み、検査卵巣組織試料中のポリペプチドに結合する抗体の量が、所定のカットオフ値を超えている場合には検査卵巣癌組織試料が卵巣癌について陽性となり、それにより対象における卵巣癌の有無を検出する、患者における卵巣癌の有無を検出する方法も提供する。一実施形態において、検査卵巣癌組織試料中ポリペプチドに結合する抗体の量は、免疫組織化学を利用して測定される。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６６】
本発明は、更に、ＨＥ４ａポリペプチド、例えば配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、または１５（ＨＥ４）のいずれかの推定されたアミノ酸配列を有するヒトＨＥ４ａポリペプチド、のフラグメント、類似体および誘導体をコードする本明細書に記載された核酸の変異体に関する。ＨＥ４ａをコードする核酸の変異体は、核酸の天然由来対立遺伝子もしくはスプライス変異体、または非天然由来変異体であってもよい。当該技術分野で公知の通り、対立遺伝子変異体は、コードされたＨＥ４ａポリペプチドの機能を実質的に変化させない、１種以上のヌクレオチドの置換、欠失または付加のうちの少なくとも１つを有し得る核酸配列の代替形態である。ＨＥ４ａの変異体および誘導体は、ＨＥ４ａポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の突然変異により得てもよい。ネイティブアミノ酸配列の改変は、複数の従来法のいずれかにより実行されてもよい。突然変異は、制限部位がフランクされてネイディブ配列のフラグメントがライゲートされた、突然変異配列を含むオリゴヌクレオチドを合成することにより、特定の遺伝子座に導入することができる。ライゲーションの後、得られた制限配列は、所望のアミノ酸挿入、置換、または欠失を有する類似体をコードする。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１２】
ヒトまたはマウスＩｇＧ  Ｆｃドメインに融合された完全なＨＥ４ａ遺伝子産物を取り込んだ融合蛋白質を構築した。クローニングのための適切な制限部位をコードし、最終的な構築物の蛋白質ドメインの必要なインフレーム融合を作製したプライマーを設計した。５'プライマー（配列番号２：５'−ＧＴＴＧＴＴＡＡＧＣ  ＴＴＧＣＣＧＣＣＡＴ  ＧＣＣＴＧＣＴＴＧＴ  ＣＧＣＣＴＡＧＧＣ−３'）は、ＨｉｎｄＩＩＩ部位、最初のＡＴＧに隣接する発現を改善するコザック配列、およびＨＥ４ａ配列に基づくＨＥ４ａリーダーペプチドの部分を含んだ。３'プライマー（配列番号４：５'−ＧＴＴＧＴＴＧＧＡＴ  ＣＣＧＡＡＡＴＴＧＧ  ＧＡＧＴＧＡＣＡＣＡ  ＧＧＡＣＡＣ−３'）は、終止コドンの直前でトランケートされたＨＥ４ａコード配列の３'末端を有する、ヒト／マウスＩｇテイルｃＤＮＡへの融合のためのインフレームのＢａｍＨＩ部位を含んだ。ＰＣＲ増幅反応は、鋳型としてＨＥ４ａ／ｐＳＰＯＲＴプラスミド  １００ｎｇを用いて、製造業者の使用説明書に従い（ＥｘＴａｑ；Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ，  Ｉｎｃ．，  Ｏｔｓｕ，  Ｓｈｉｇａ，  Ｊａｐａｎ）実施し、増幅（９４℃で１分間、５５℃で１分間、および７２℃で３０秒間）を３０サイクル実施した。全長ＨＥ４ａの予測サイズ（４００ｂｐ）のＰＣＲ産物を得て、その後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  （Ｑｉａｇｅｎ，  Ｖａｌｅｎｃｉａ，  ＣＡ）を用いて精製した。精製されたＰＣＲフラグメントを制限消化し、ＱＩＡＥｘ  ＩＩ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  （Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製し、マウスＩｇＧ２ａ  Ｆｃ（ｍＩｇＧ２ａ）およびヒトＩｇＧ１  Ｆｃ（ｈＩｇＧ１）を有する融合物中で、先に記載されたｐＣＤＮＡ  ３の誘導体であるホ乳類発現ベクターｐＤ１８にライゲートした。図１は、ＦＬ  ＨＥ４ａ−ｍＩｇＧ２ａおよびＦＬ  ＨＥ４ａ−ｈＩｇＧ１  ｃＤＮＡ構築物がＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩフラグメントとしてｐＤ１８のマルチクローニング部位に挿入された方法を概略的に示す。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１５】
フォワードプライマー配列番号２１：
2014507153.tif 000003
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１６】
リバースプライマー配列番号２３：
2014507153.tif 000004
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１８】
フォワードプライマー配列番号２５：
2014507153.tif 000005
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１９】
リバースプライマー配列番号２７：
2014507153.tif 000006
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３５】
（表２）ＨＥ４ａ  Ｎ−およびＣ−ＷＦＤＣの増幅に用いられたＰＣＲプライマー
2014507153.tif 000007
【手続補正１３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２】
2014507153.tif 000008
【手続補正１４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図３】
2014507153.tif 000009
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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