(57)【要約】【課題】　感染性で癌性の自己−免疫又は免疫疾患を防止し、阻害し、安定化し又は治すことができるベクター構造物を担持する組換えレトロウィルスを供給すること。【解決手段】　ｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子、およびｅｎｖ遺伝子のうち１つを欠失する、複製欠陥組換えレトロウィルスであって、該レトロウィルスに感染した標的細胞における発現のためのプロモーターに作動可能に連結された抗原又はその改変形をコードする遺伝子を含むベクター構造体を有し、該抗原又はその改変形が、動物内の免疫応答を刺激可能であり、ここで該レトロウイルスは、該レトロウイルスにより担持されるｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子およびｅｎｖ遺伝子のうちの１つを欠失するパッケージング細胞によって産生される、複製欠陥組換えレトロウィルス。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子、およびｅｎｖ遺伝子のうち１つを欠失する、複製欠陥組換えレトロウィルスであって、該レトロウィルスに感染した標的細胞における発現のためのプロモーターに作動可能に連結された抗原又はその改変形をコードする遺伝子を含むベクター構造体を有し、該抗原又はその改変形が、動物内の免疫応答を刺激可能であり、ここで該レトロウイルスは、該レトロウイルスにより担持されるｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子およびｅｎｖ遺伝子のうちの１つを欠失するパッケージング細胞によって産生される、複製欠陥組換えレトロウィルス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
　本発明は、一般的にレトロウィルス、及びより詳しくは、影響されやすい標的細胞にベクター構造体を運ぶことができる組換えレトロウィルスに関する。これらのベクター構造体は、典型的には、所望するタンパク質、たとえば免疫原性活性を刺激し、又は一定の細胞環境下で条件的に活性的であるタンパク質を標的細胞中で発現するように企画されている。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
　細菌性疾病は一般的に、抗生物質により容易に治療できるけれども、ほとんど効果的でない処置又は予防が多くのウィルス性、癌性及び他の非細菌性疾病、たとえば遺伝的疾病に対して存在する。これらの疾病を治療するための伝統的な試みは、化学的薬物の使用であった。一般的に、これらの薬物は、特異性を欠いており、高い全体的な毒性を示し、そして従って治療的に無効果であった。
【０００３】
　多くの非細菌性疾病を治療するためのもう１つの伝統的な技法は、病原体の非感染形、たとえば殺害されたウィルスの投与を通してその病原体、たとえばウィルスに対する免疫応答を誘導し、それによって免疫刺激物として作用する病原体から抗原を供給することを包含する。
【０００４】
　ウィルス性疾病、たとえば後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）及び関連する障害の治療のための最近のアプローチは、ウィルスエンベロープタンパク質との複合体を受ける又は形成することからＨＩＶによる感染に敏感な細胞上の受容体を阻止することを包含する。たとえば、Ｌｉｆｓｏｎなど．（Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３２　：　１１２３〜１１２７、１９８６）は、ＣＤ４（Ｔ４）受容体に対する抗体が感染された及び感染されていないＣＤ４存在細胞の間の細胞融合（シンシチウム）を生体外で阻止することを示した。モノクローナル抗体を用いての類似するＣＤ４阻止効果が、ＭｃＤｏｕｇａｌなど．（Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３１　：３８２〜３８５，　１９８６）により提案された。他方、Ｐｅｒｔなど．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８３：９２５４〜９２５８、１９８６）は、Ｔ４受容体を結合し、そしてヒトＴ細胞のＨＩＶ感染を阻止する合成ペプチドの使用を報告しており、そしてＬｉｆｓｏｎなど．（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．　１６４：２１０１、１９８６）は、ウィルスエンベロープ糖タンパク質と相互作用するレクチンを用い、それによってそれがＣＤ４受容体により受容されることを阻止することによって、シンシチウム及びウィルス／Ｔ４細胞融合の両者を阻止することを報告した。
【０００５】
　四番目に、ＲＮＡを転写する病原体、たとえばウィルスを阻止するための最近提案された技法は、翻訳を阻止するために、転写されたＲＮＡの少なくとも一部を補足し、そしてそれらに結合するアンチセンスＲＮＡを供給することである（Ｔｏなど．，　Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．　６：７５８、１９８６）。
【０００６】
　しかしながら、上記技法の主な欠点は、それらは、薬物、抗体、ブロッキング剤又はアンチセンスＲＮＡが利用される時間、位置又は程度に関しての制御に容易に役立たないことである。特に、上記技法は処理剤の外因性適用（すなわち生体外情況においてサンプルに対して外因性である）を必要とするので、それらは病原体の存在に直接応答しにくい。たとえば、病原体による感染のすぐ後、高い量で発現される免疫刺激物を有することが所望される。さらに、アンチセンスＲＮＡの場合、動物における有用な治療のためには多量が必要とされ、これは、現在の技法下では、それが実際必要とされる位置、すなわち病原体により感染された細胞位置に無関係に投与される。
【０００７】
　外因性適用の代用として、治療物質を内因的に生成するための技法が提案された。より詳しくは、ＤＮＡウィルス、たとえばアデノウィルス、ＳＶ４０、ウシ乳頭腫ウィルス及びワクシニアウィルスに基づくウィルスベクターから発現されたタンパク質が調べられた。例により、Ｐａｎｉｃａｌｉなど．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８０：５３６４、１９８３）は、インフルエンザウィルス赤血球凝集素及びＢ型肝炎表面抗原をワクシニアゲノム中に導入し、そしてそのような組換え遺伝子から生成されたウィルス粒子により動物を感染せしめた。感染の後、動物はワクシニアウィルス及びＢ型肝炎抗原の両者に対する免疫性を得た。
【０００８】
　しかしながら、多くの困難が、ＤＮＡウィルスに基づくウィルスベクターに関して、今日までに経験されて来た。これらの困難は、（ａ）病因又は所望するタンパク質の抑制を導くことができる他のウィルスタンパク質の生成；（ｂ）宿主において未制御的に複製するベクターの能力及びそのような未制御された複製の病原性効果；（ｃ）ウィルス血症を導くことができる野生型ウィルスの存在；及び（ｄ）他の非細菌性疾病、たとえば遺伝的疾病を包含する。
【０００９】
　感染された標的細胞におけるそれらの発現の非一時的な性質により、レトロウィルスは、遺伝的疾病の治療のための有用なビークルとして提供されて来た（たとえば、Ｆ．Ｌｅｄｌｅｙ，　Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ　１１０：１、１９８７を参照のこと）。しかしながら、多くの問題の観点において、遺伝的疾病の治療におけるレトロウィルスの使用が試みられて来ていない。そのような問題は、（ａ）入手しにくい組織（たとえば脳）における多量の細胞を感染するための明らかな必要性；（ｂ）非常に制御された及び永久的な態様でこれらのベクターの発現を引き起こす必要性；（ｃ）クローン化された遺伝子の欠乏；（ｄ）代謝の異常性による組織及び器官への取り返しのできない損傷；及び（ｅ）ある実例における他の部分的に有効な治療の利用性に関係する。
【００１０】
　遺伝的疾病の他に、他の研究者は、非遺伝的疾病を治療するためにレトロウィルスベクターを用いることに集中して来た（たとえば、ＥＰ２４３，２０４−Ｃｅｔｕｓ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；Ｓｔａｎｆｏｒｄ，　Ｊ．Ｔｈｅｏｒ．Ｂｉｏ１．　１３０；４６９、１９８８；Ｔｅｌｌｉｅｒなど．，　Ｎａｔｕｒｅ　３１８：４１４、１９８５；及びＢｏｌｏｇｎｅｓｉなど．，　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ，　４５：４７００、１９８５を参照のこと）。
【００１１】
　Ｔｅｌｌｉｅｒなどは、ＨＩＶ　ＲＮＡにアンチセンスＲＮＡを発現することができるゲノムを有する「不完全な」ＨＩＶにより幹細胞を明らかに感染することによるＴ細胞クローンの保護を示唆した。Ｂｏｌｏｇｎｅｓｉなどは、幹細胞から生成されるＴ４細胞がウィルスの非ビルレント形の妨害を行ない、そしてそれによって、ビルレントＨＩＶによる感染からこれらの細胞を保護するように幹細胞を感染するための非ビルレントＨＩＶ株の生成の概念を示唆した。しかしながら、前記文献の両者に使用される「弱められた」又は「不完全な」ＨＩＶウィルスは、得られるウィルスが、前に存在するＨＩＶ又は他の配列との組換えの高められた危険性の可能性を伴って他の細胞を感染し、アテニュエーションの損失を導くように生殖することができる（すなわち、不完全な複製でない）ことは明らかであろう。非−非複製形は、ＨＩＶのための不完全なヘルパー又はパッケージング系を必要とするであろう。しかしながら、ＨＩＶ遺伝子の発現の制御は複雑であるので、そのような細胞は、今日まで構成されていない。さらに、感染性の弱められた又は不完全なウィルスはキメラ性（「非キメラ性」レトロウィルスは、同じレトロウィルス種からのそのベクターの実質的にすべてを有するものである）であるので、たとえそれらが、不可欠な成分のそれらのゲノムからの欠失により複製を不完全にする場合でさえ、感染性ウィルス粒子の得られる生成により宿主細胞内での組換えのための有意な可能性が存在する。
【００１２】
　Ｓａｎｆｏｒｄ（Ｊ．Ｔｈｅｏｒ．Ｂｉｏ１．　１３０：４６９、１９８８）はまた、ＨＩＶのための遺伝的治療の使用を提案したが、抗−ＨＩＶ遺伝子を担持する治療用レトロウィルスベクターと天然のＡＩＤＳウィルスとの間の遺伝子組換えを通して新規のウルレントウィルスを創造するために存在する可能性により、ＡＩＤＳのためのレトロウィルス遺伝子療法は実際的でないかも知れないことを彼は示唆する。同様に、ＭｃＣｏｒｍｉｃ及びＫｒｉｅｇｌｅｒ（ＥＰ２４３，２０４Ａ２）はタンパク質、たとえば腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）のための遺伝子を運搬するためにレトロウィルスベクターの使用を提案したが、彼らが記載する技法は多くの欠点を有する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
　感染性で癌性の自己−免疫又は免疫疾患を防止し、阻害し、安定化し又は治すことができるベクター構造物を担持する組換えレトロウィルスを供給すること。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
　簡単に言えば、本発明は、感染性で癌性の自己−免疫又は免疫疾患を防止し、阻害し、安定化し又は治すことができるベクター構造物を担持する組換えレトロウィルスを供給する。そのような疾病は、ＨＩＶ感染、黒色腫、糖尿病、ＧＶＨ反応、アルツハイマー病及び心臓疾患を包含する。
【００１５】
　本発明は、（ａ）抗原又は病原性抗原に対する体液性又は細胞介在のいづれかの特異的免疫応答を刺激し；（ｂ）病原体、たとえばウィルスの機能を阻害し；そして（ｃ）組換えレトロウィルスの使用を通して、宿主細胞受容体と病原体との相互作用を阻害するための方法に一部向けられる。
【００１６】
　より詳しくは、本発明の１つの観点においては、感染された標的細胞において抗原又はその変性された形の発現を指図するベクター構造物を担持する組換えレトロウィルスにより感応性の標的細胞を感染せしめることを含んで成る、特異的免疫応答を刺激するための方法が提供される。免疫応答が病原性抗原に対して刺激される場合、組換えレトロウィルスは好ましくは、免疫応答を刺激し、そして天然の抗原に対する病原性を減じている抗原の変性された形を発現するように企画されている。免疫応答はまた、適切なＭＨＣ分子の情況下で対象の抗原を認識する特異的Ｔ細胞受容体又は対象の抗原を認識する免疫グロブリンのための遺伝子を、適切な免疫細胞（たとえばＴリンパ球）にトランスファーすることによっても達成され得る。
【００１７】
　ＨＩＶ感染により引き起こされる疾病の特別な場合において、免疫刺激が所望される場合、組換えレトロウィルスゲノムから生成される抗原は、ＨＬＡクラスＩ−又はクラスＩＩ−制限性免疫応答のいづれか又は両者を誘発するであろう形のものである。ＨＩＶエンベロープ抗原の場合、抗原は好ましくは、それらの病原性を減じるために変性されたｇｐ１６０、ｇｐ１２０及びｇｐ４１から選択される。特に、その選択される抗原は、シンシチアの可能性を減じるように変性される。他のＨＩＶ遺伝子、たとえばｇａｇ、ｐｏｌ、ｖｉｆ、ｎｅｔ、等からの抗原もまた、特定の場合において保護を提供することができる。
【００１８】
　本発明のもう１つの観点においては、疾病、たとえばウィルス感染、癌又は免疫異常性により引き起こされる疾病のために必要な病原体の機能を阻止するための方法が開示されている。そのような阻止は、疾患細胞に対して毒性である緩和物を発現し、病原性遺伝子の発現又は効果を選択的に阻止する緩和物を発現し、アンチセンスＲＮＡを発現し、又はその機能を崩壊するために病原性ゲノム中に配列を挿入することにより達成される。
【００１９】
　より詳しくは、本発明は、病原体の集合の阻止を導く病原体の欠陥構造タンパク質を発現する、たとえばウィルス粒子の集合の阻止を導くウィルス粒子の欠陥構造タンパク質を発現する組換えレトロウィルスゲノムを供給する。
【００２０】
　毒性緩和物が組換えウィルスゲノムを含む細胞により生成される場合、それは細胞内に存在する前駆体から生成され得又はさらに、毒性物質に前駆体を外因的に供給することにより生成され得る。後者の場合、そのウィルス構造体は、毒性物質に前駆体を転換する生成物をコードする。両者の場合、毒性物質は、病原性条件に関係するウィルス構造体及び他の物質を含む細胞に単に位置するであろう。たとえば他の物は、細胞に存在する病原性ウィルスゲノムの転写及び翻訳を通して生成されるタンパク質であり得る。病原性条件に対する特異性はまた、その病原性条件により影響される細胞への組換えレトロウィルスの侵入の標的を通して達成され、又はさらに増強され得る。細胞においていづれかの物質を「発現する」又は「生成する」ウィルス構造物が言及される場合、これは実際、細胞におけるウィルスＲＮＡの逆転写に続くその得られるプロウィルスの作用を言及する。
【００２１】
　関連する観点において、本発明はまた、所望されない又は有害な免疫応答を減じ又は排除するための方法も提供する。適切な場合、免疫抑制が、免疫抑制性遺伝子、たとえばアデノウィルスのウィルス起源Ｅ３遺伝子の標的発現により達成され得る。
【００２２】
　本発明のもう１つの観点においては、ウィルス粒子と細胞、細胞と細胞又は細胞と因子との相互作用を阻止するための方法が開示される。その方法は一般的に、感染された阻止成分の発現を指図する組換え体複製欠陥レトロウィルスにより敏感な細胞を感染せしめることを含んで成り、ここで前記阻止成分は、細胞受容体が細胞間又は細胞表面上に存在する場合、その受容体（好ましくは、宿主細胞受容体）と結合することができる。
【００２３】
　組換えレトロウィルスが上記のように免疫原性又は阻害作用に影響を及ぼす手段にもかかわらず、そのレトロウィルスのゲノムは「複製欠陥」である（すなわち、それにより感染された細胞において生殖することができない）ことが好ましい。従って、インビトロ又はインビボ適用においては、一段階の感染のみが存在し、これによって挿入突然変異形成の可能性を実質的に減じる。好ましくは、この末端において助けるために、組換えレトロウィルスは少なくとも１種のｇａｇ、ｐｏｌ又はｅｎｖ遺伝子を欠く。さらに、組換えウィルスベクターは、好ましくは、キメラである（すなわち、所望する結果を生成する遺伝子はレトロウィルスの残りの物よりも他の異なった源からのものである）。キメラ構造体は、組換えレトロウィルスにより感染された細胞内での組換えの可能性をさらに減じ、これはウィルス粒子を生成することができるゲノムを生成することができる。
【００２４】
　本発明のもう１つの観点においては、上記方法を実施し、そして他の治療遺伝子を担持することにおいて有用である組換えレトロウィルスが開示される。本発明はまた、レトロウィルスのゲノムがカプシド及びエンベロープ、好ましくはパッケージング細胞の使用によりパッケージされるような組換えレトロウィルスを生成するための方法を提供する。そのパッケージング細胞は、生存するレトロウィルス粒子の生成のために必要なすべての細胞を生成するウィルスタンパク質−コード配列、すなわちレトロウィルス粒子へのＲＮＡのパッケージングを向けるであろうパッケージングシグナルと共に所望する遺伝子を担持するであろうＲＮＡウィルス構造物を、所望により２種のプラスミドの形で供給される。
【００２５】
　本発明はさらに、下記のことを促進することができる組換えレトロウィルスを生成するための多くの技法を供給する：
　ｉ）パッケージング細胞から高い力価の生成；
　ｉｉ）パッケージング細胞の使用を含まない手段によるベクター構造体のパッケージング；
　ｉｉｉ）前もって選択された細胞系のために標的を決定され得る組換えレトロウィルスの生成；及び
　ｉｖ）細胞のゲノムにおける前もって選択された部位又は複数の部位中へのプロウィルス構造体の組込み。
【００２６】
　パッケージング細胞から高い力価を生成するための１つの技法は、パッケージング細胞からの力価を制限することができる多くの要因の発現を利用し、ここで前記最大の制限の１つは、パッケージングタンパク質、すなわちｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖタンパク質の発現のレベル及びプロウィルスベクターからのレトロウィルスベクターＲＮＡの発現のレベルである。この技法は、前記パッケージングタンパク質及びベクター構造体ＲＮＡの高レベルの発現を有する（すなわち高い濃度を生成する）パッケージング細胞の選択を可能にする。より詳しくは、この技法は、パッケージングタンパク質（たとえばｇａｇ、ｐｏｌ又はｅｎｖタンパク質）又は標的細胞のゲノム中に担持される対象の遺伝子（典型的にはベクター構造物）のいづれかである「一次物質」として本発明に言及される高レベルのものを生成するパッケージング細胞の選択を可能にする。これは、パッケージング細胞に一次物質を発現する遺伝子（「一次遺伝子」）及び選択可能な遺伝子、好ましくは一次遺伝子から下流の遺伝子を担持するゲノムをパッケージング細胞に供給することによって達成される。選択可能な遺伝子は、パッケージング細胞において選択可能なタンパク質、好ましくは細胞毒性薬物に対する耐性を運ぶタンパク質を発現する。次に、その細胞が、臨界レベルで選択可能なタンパク質を発現するこれらの細胞の同定を可能にする選択物質、好ましくは細胞毒性薬物に暴露される（すなわち、細胞毒性薬物の場合、生存のために必要とされるレベルの耐性タンパク質を生成しないこれらの細胞を殺害することにより）。
【００２７】
　好ましくは、上記に簡単に記載された技法においては、選択可能な遺伝子及び一次遺伝子の両者の発現が同じプロモーターにより制御される。この事については、レトロウィルス５’　ＬＴＲを使用することが好ましい。パッケージング細胞からの組換えレトロウィルスの力価を最大にするためには、まずこの技法を用いて、必要とされるすべてのパッケージングタンパク質を高レベルで発現するパッケージング細胞を選択し、そして所望するプロウィルス構造体によるトランスフェクションの後、組換えレトロウィルスの最高力価を生成するこれらの細胞を選択する。
【００２８】
　パッケージング細胞の使用を包含しない手段によるベクター構造物のパッケージングのための技法がまた提供される。これらの技法は、ＤＮＡウィルス、たとえばバキュロウィルス、アデノウィルス又はワクシニアウィルス、好ましくはアデノウィルスを使用する。これらのウィルスは、その中に供給される外因性遺伝子からタンパク質を、比較的高レベルで発現することが知られている。そのようなＤＮＡウィルスベクターのためには、組換えＤＮＡウィルスが、ウィルスＤＮＡとレトロウィルス又はレトロウィルスのベクター遺伝子を担持するプラスミドとの間の組織培養におけるインビボ組換えにより生成され得る。レトロウィルスタンパク質又はレトロウィルスベクターＲＮＡをコードするいづれかの配列を担持するその得られたＤＮＡウィルスベクターは、高い力価の原液に精製される。他方、その構造物は、インビトロで構成され、そして続いて、ＤＮＡベクターに欠失するトランスウィルス機能を提供する細胞中にトランスフェクトされる。その生成方法にもかかわらず、高い力価（１０7〜１０11単位／ｍｌ）の原液が調製され、これは、敏感な細胞の感染に基づいて、レトロウィルスタンパク質（たとえばｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ）又はＲＮＡレトロウィルスベクターゲノムもしくは両者の高レベルの発現を引き起こす。これらの原液のみ又は組合して含む培養における細胞の感染は、その原液がウィルスタンパク質及びウィルスベクター遺伝子を担持する場合、レトロウィルスベクターの高レベルの生成を導くであろう。アデノウィルス又は他の哺乳類ベクターと共に使用される場合、この技法は、組換えレトロウィルスベクターを生成するために一次細胞（たとえば組織片又は細胞、たとえばワクチンの生成に使用されるＷＩ３８からの）の使用を可能にする。
【００２９】
　前記技法に代わる技法においては、組換えレトロウィルスが、まず、前記技法に類似する態様で適切な組換えＤＮＡウィルスにより感染された細胞系からｇａｇ／ｐｏｌ及びｅｎｖタンパク質を生成することによって生成される（但し、前記細胞系は、ベクター構造物を担持するＤＮＡウィルスにより感染されていない）。続いて、そのタンパク質は精製され、そしてインビトロで製造された所望するウィルスベクターＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リポソーム、及びｅｎｖタンパク質をリポソーム中において処理するための細胞抽出物と接触せしめ、その結果、ウィルスベクターＲＮＡを担持する組換えレトロウィルスが生成される。この技法においては、前記混合物の残留物とそれらとを接触する前、リポソーム中にｅｎＶタンパク質を処理することが必要である。
【００３０】
　ｇａｇ／ｐｏｌ及びｅｎｖタンパク質はまた、真核細胞、酵母又は細菌中におけるプラスミド介在トランスフェクションの後、製造され得る。
【００３１】
　前もって選択された細胞系のために標的を定めされ得る組換えレトロウィルスを生成するための技法は、第１レトロウィルス表現型の細胞質セグメント及び前記第１レトロウィルス表現型に対して外因性の細胞外結合セグメントを含んで成るｅｎｖ遺伝を有する組換えレトロウィルスを利用する。前記結合セグメントは、第２ウィルス表現型又は所望する標的に結合するであろうペプチドとして発現されるように選択される所望する結合性質を有する他のタンパク質からである。
【００３２】
　標的細胞のＤＮＡにおける特異的部位でレトロウィルスゲノムを組込むための技法は、相同組換えの使用又は標的細胞ゲノム上での特異的部位を認識するであろう変性されたインテグラーゼ酵素の使用を包含する。そのような部位特異的挿入は、挿入突然変異の機会を最少にし、ＤＮＡ上の他の配列からの妨害を最少にし、そして標的細胞のＤＮＡにおける所望しない遺伝子（たとえばウィルス遺伝子）の発現を減じ又は排除するために特異的な標的部位での配列の挿入を可能にするであろう標的細胞のＤＮＡ上での部位で遺伝子の挿入を可能にする。
【００３３】
　適切には、上記技法のいづれかが、特別な情況下で単独で使用され、又は１又は複数の残る技法と一緒に使用され得る。
【００３４】
　本発明は、組換えレトロウィルスであって、感染性、癌性、自己免疫又は免疫疾患を、妨げ、阻害し、安定化し、又は反転することができるベクター構造体を担持するレトロウィルスを提供する。
【００３５】
　１つの実施態様では、上記ベクター構造体は、上記レトロウィルスにより感染された標的細胞においてそのタンパク質又はその一部の発現を指図する。
【００３６】
　１つの実施態様では、上記ベクター構造体は、上記レトロウィルスにより感染された標的細胞においてその抗原又は変性された形の発現を指図し、上記抗原又はその変性された形が動物内で免疫応答を刺激することができる。
【００３７】
　１つの実施態様では、上記ベクター構造体は、上記レトロウィルスにより感染された標的細胞において病原性抗原の変性された形の発現を指図し、上記変性された抗原は動物内で免疫応答を刺激することができ、そして病原性抗原に対する低められた病原性を有する。
【００３８】
　好ましい実施態様では、上記発現された抗原は細胞介在の免疫応答を誘発する。
【００３９】
　好ましい実施態様では、上記発現された抗原はＨＬＡクラスＩ−及び／又はクラスＩＩ−制限免疫応答を誘発する。
【００４０】
　好ましい実施態様では、上記発現された抗原は、ｇｐ１６０、ｇｐ１２０及びｐｇ４１又はその変性された形から成る群から選択されたＨＩＶタンパク質である。
【００４１】
　１つの実施態様では、上記ベクター構造体は、対象の抗原を認識する特異的Ｔ細胞受容体又は免疫グロブリンの発現を指図する。
【００４２】
　１つの実施態様では、上記ベクター構造体は、上記レトロウィルスにより感染された細胞において緩和剤の発現を指図し、上記緩和剤は病原性のために必要な病原体の機能を阻害することができる。
【００４３】
　好ましい実施態様では、上記病原体はウィルスであり、そして上記阻害された機能は感染された細胞からのウィルスの吸着、複製、遺伝子発現、集合及び退去から成る群から選択される。
【００４４】
　好ましい実施態様では、上記病原体は癌細胞又は癌促進性成長因子であり、そして上記阻害された機能は細胞複製、外部シグナルに対する感受性及び抗腫瘍遺伝子の産生の欠乏から成る群から選択される。
【００４５】
　好ましい実施態様では、上記ベクター構造体は上記病原体に関係する生物の上記細胞における存在に応答して感染された標的細胞に毒性緩和剤の発現を指図する。
【００４６】
　好ましい実施態様では、上記緩和剤は病原性遺伝子の発現又は効果を選択的に阻害することができる。
【００４７】
　さらに好ましい実施態様では、上記緩和剤はウィルスプロテアーゼに対して特異的な阻害ペプチドを含んで成る。
【００４８】
　好ましい実施態様では、上記緩和剤は病原性のために必要なＲＮＡ配列に相補的なアンチセンスＲＮＡを含んで成る。
【００４９】
　好ましい実施態様では、上記緩和剤は、病原性ゲノム中への組換え又は組込みを、その機能を破壊するために促進する。
【００５０】
　好ましい実施態様では、上記緩和剤は、病原体の欠陥構造タンパク質を含んで成り、上記タンパク質は病原体の集合を阻害することができる。
【００５１】
　好ましい実施態様では、上記ベクター構造体は、不活性前駆体を病原体の活性インヒビターに活性化することができるＨＳＶＴＫ遺伝子生成物又は他の遺伝子生成物の発現を指図する。
【００５２】
　好ましい実施態様では、上記ベクター構造体は腫瘍サプレッサー遺伝子の発現を指図する。
【００５３】
　好ましい実施態様では、上記ベクター構造体は、病原体の存在下で毒性生成物に、ほとんど又はまったく細胞毒性でない化合物を活性化し、それによって病原体に対して局在された治療をもたらすタンパク質の発現を指図する。
【００５４】
　より好ましい実施態様では、上記タンパク質はヘルペスチミジンキナーゼである。
【００５５】
　より好ましい実施態様では、上記タンパク質はＣＤ４である。
【００５６】
　より好ましい実施態様では、上記ベクター構造体は、病原体に由来するタンパク質によるプロセッシング又は変性に基づいて毒性であるタンパク質の発現を指図する。
【００５７】
　好ましい実施態様では、上記ベクター構造体は、レトロウィルスにより感染され、そして病変体を含む標的細胞の表面上にレポーター生成物を発現する。
【００５８】
　１つの実施態様では、上記ベクター構造体は、上記レトロウィルスにより感染された標的細胞において免疫システムを抑制することができる遺伝子の発現を指図する。
【００５９】
　１つの実施態様では、上記ベクター構造体は、上記レトロウィルスにより感染された細胞において阻害成分の発現を指図し、上記阻害成分は、受容体／病原体の相互反応が阻害されうるように受容体又は病原体のいづれかに結合することができる。
【００６０】
　１つの実施態様では、上記ベクター構造体は、上記レトロウィルスにより感染された細胞において阻害成分の発現を指図し、上記阻害成分は、受容体／エンベロープタンパク質の相互反応が阻害されるように受容体又はエンベロープタンパク質に結合することができる。
【００６１】
　好ましい実施態様では、上記阻害成分は感染された細胞から分泌される。
【００６２】
　１つの実施態様では、上記レトロウィルスは複製欠陥である。
【００６３】
　本発明は、組換えレトロウィルスを生成するための方法であって：上記の複製欠陥組換えレトロウィルスが生成されるようにベクター構造体をカプシド及びエンベロープにパッケージングすることを含んで成る方法を提供する。
【００６４】
　本発明は、上記のいづれかの組換えレトロウィルスにより感染されたＥＸ　ｖｉｖｏ細胞を提供する。
【００６５】
　本発明は、上記のいづれかの組換えレトロウィルスにより感染された真核細胞であって、上記細胞が上記ベクター構造体のいづれか１つを含む感染性粒子を生成することができる真核細胞を提供する。
【００６６】
　本発明は、上記のいづれかのレトロウィルス及び生理学的に許容できるキャリヤー又は希釈剤を含んで成る医薬組成物を提供する。１つの実施態様では、この医薬組成物は、活性治療物質として使用される。
【００６７】
　本発明は、特定の遺伝子を担持するウィルスの存在についてサンプルを試験するための方法であって、ここで上記遺伝子が（１）マーカー生成物を発現することができるマーカー遺伝子；及び（２）発現状態と非発現状態との間にマーカー遺伝子の発現を変えることにより同定タンパク質の存在に応答する制御配列を有する指示細胞において同定タンパク質を発現することができ；指示細胞とサンプルとを接触し、そしてマーカー生成物の存在について試験することを含んで成る方法を提供する。
【００６８】
　本発明は、細胞サンプルにおける特定の遺伝子の存在について試験するための方法（上記遺伝子は同定タンパク質を発現することができる）であって：（１）細胞サンプルにおいてマーカー生成物を発現することができるマーカー遺伝子；及び（２）発現状態と非発現状態との間にマーカー遺伝子の発現を変えることによりサンプル内の細胞において同定タンパク質の存在に応答する制御配列をコードするベクター構造体を含んで成る組換えレトロウィルスによりサンプル内の細胞を感染せしめ；そしてマーカー生成物の存在について試験することを含んで成る方法を提供する。１つの実施態様では、上記制御配列は、転写状態と非転写状態との間にマーカー遺伝子を変えることによりそのマーカー生成物の発現を変える。
【００６９】
　本発明は、指示細胞において同定タンパク質を発現することができる特定の遺伝子を担持するウィルスの存在について試験するために適切な指示細胞であって、その指示細胞が、（１）指示細胞においてマーカー生成物を発現することができるマーカー遺伝子；及び（２）発現状態と非発現状態との間にマーカー遺伝子の発現を変えることにより指示細胞において同定タンパク質の存在に応答する制御配列をコードするゲノムを有することを特徴とする指示細胞を提供する。
【００７０】
　本発明は、細胞を感染せしめ、そして同定タンパク質を生成する特定の遺伝子の存在について試験するために適切な組換えレトロウィルスであって、（１）上記細胞においてマーカー生成物を発現することができるマーカー遺伝子；及び（２）発現状態と非発現状態との間にマーカー遺伝子の発現を変えることにより、細胞における同定タンパク質の存在に応答する制御配列をコードするゲノムを有する組換えレトロウィルスを提供する。
【００７１】
　本発明は、パッケージングタンパク質及び対象の遺伝子生成物から選択された高レベルの一次物質を生成するパッケージング細胞を選択するための方法であって：（ａ）一次物質を発現する一次遺伝子及び上記一次物質よりも低いレベルで選択可能なタンパク質を発現する選択可能な遺伝子を含んで成るゲノムをパッケージング細胞に供給し（ここで上記一次遺伝子及び選択可能な遺伝子の発現レベルは比例する）；（ｂ）臨界レベルで選択可能なタンパク質を発現するこれらの細胞の同定を可能にする選択物質に上記パッケージング細胞を暴露し；そして（ｃ）高レベルの一次物質を発現するこれらのパッケージング細胞を検出することを含んで成る方法を提供する。
【００７２】
　本発明は、組換えレトロウィルスを生成するための方法であって：ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖタンパク質を生成することができる組換えウィルスにより感染された細胞系から上記タンパク質を生成せしめ；そしてウィルスベクターＲＮＡを担持する組換えレトロウィルスを生成するために、粒子集合のための機能の不足を補足するウィルスベクターＲＮＡ、ｔＲＮＡ、リポソーム及び細胞抽出物と上記タンパク質とを接触せしめることを含んで成る方法を提供する。
【００７３】
　本発明は、組換えレトロウィルスを生成するための方法であって：（ａ）別々に、又は一緒に、ｇａｇ／ｐｏｌ、ｅｎｖ及びレトロウィルスベクターゲノムをコードする組換えウィルスベクターを生成し；（ｂ）上記ベクターの高い力価の原液を生成し；そして（ｃ）組換えレトロウィルスベクターを生成するために一次細胞又は他の細胞を同時感染せしめることを含んで成る方法を提供する。
【００７４】
　本発明は、レトロウィルスの生成方法であって：（ａ）対象の遺伝子及び第一レトロウィルス表現型のパッケージングシグナル；（ｂ）パッケージングシグナルのない上記第一レトロウィルス表現型のｇａｇ及びｐｏｌ遺伝子；（ｃ）パッケージングシグナルを欠くハイブリッドｅｎｖ遺伝子（該ハイブリッドｅｎｖ遺伝子の生成物は、第一レトロウィルス表現型の細胞質セグメント及び第一レトロウィルス表現型に対して外因性の結合セグメントを含んで成る）を含んで成るゲノムを有する生産体細胞を増殖せしめることを含んで成る方法を提供する。
【００７５】
　本発明は、標的細胞に対象の遺伝子を選択的に担持することができるレトロウィルスを調製するために有用なハイブリッドｅｎｖ遺伝子であって、（ａ）第一レトロウィルス表現型の細胞質セグメント；及び（ｂ）上記第一レトロウィルス表現型に対して外因性の結合セグメント（該結合セグメントは、標的細胞に選択的に結合することができる）をコードするｅｎｖ遺伝子を提供する。
【００７６】
　本発明は、ベクター構造体を担持する組換えレトロウィルスであって：（ａ）標的細胞のゲノム上の予備選択された部位に挿入されるべき外因性遺伝子；及び（ｂ）上記予備選択された部位に隣接する標的細胞のゲノムの対応する配列に実質的に相同なセグメント（上記配列は、相同性組換えが予備選択された部位で標的細胞のゲノムと上記ベクター構造体との間で生じるように十分な長さのものである）を含んで成る組換えレトロウィルスを提供する。
【００７７】
　本発明は、標的細胞のゲノム上の予備選択された部位中に外因性遺伝子を挿入する方法であって、（ａ）外来性遺伝子；（ｂ）上記予備選択された部位に隣接する標的細胞のゲノムの対応する配列に実質的相同なセグメント（上記配列は、予備選択された部位で標的細胞のゲノムとベクター構造体との間での相同性組換えを促進するために十分な長さである）を含んで成るゲノムを有する組換えレトロウィルスに上記標的細胞を暴露することを含んで成る方法を提供する。
【００７８】
　本発明は、標的細胞のゲノム上の予備選択された部位中にそのゲノムを組込むことができる組換えレトロウィルスを生成するための方法であって：ベクターをカプシド及びエンベロープにパッケージングし、そして上記予備選択された部位中にレトロウィルスのゲノムを組込むことができるインテグラーゼの変性された形をウィルス粒子に含むことを含んで成る方法を提供する。
【００７９】
　本発明は、組換えレトロウィルスの生成方法であって：ｇａｇ／ｐｏｌ−ｅｎｖウィルス構造体を含むトランスジニック動物又は昆虫とプロモーターを含むベクター構造体を含むトランスジニック動物又は昆虫とを交配し；上記トランスジニック動物又は昆虫の子孫を分離し；上記子孫から選択された細胞を分離し；上記細胞を適切な培地中で増殖せしめ；そしてその細胞から組換えレトロウィルスを分離することを含んで成る方法を提供する。
【００８０】
　本発明は、トランスジニックパッケージング動物又は昆虫を生成するための方法であって；パッケージングのために必要な（いくつかの、但しすべてではない）ウィルスタンパク質をコードするベクター構造体を含むトランスジニック動物又は昆虫と上記必要なウィルスタンパク質の残りをコードするベクター構造体を含むトランスジニック動物又は昆虫とを交配し；そして上記トランスジニック動物又は昆虫の子孫を分離することを含んで成る方法を提供する。
【００８１】
　１つの実施態様では、高力価の組換えレトロウィルスを産生することができる一次細胞を産生するために、上記子孫とベクター構造体を含むトランスジニック動物又は昆虫とを交配する段階をさらに含んで成る。
【００８２】
　１つの実施態様では、高力価の組換えレトロウィルスを産生することができる一次細胞を産生するために、ベクター構造体を含む組換えレトロウィルスにより、上記子孫から移植された細胞を感染せしめる段階をさらに含んで成る。
【００８３】
　本発明のこれらの及び他の観点は、次の発明の実施の形態及び添付の図面により明らかになるであろう。
【発明の効果】
【００８４】
　本発明によって、感染性で癌性の自己−免疫又は免疫疾患を防止し、阻害し、安定化し又は治すことができるベクター構造物を担持する組換えレトロウィルスが提供された。
【発明を実施するための最良の形態】
【００８５】
　Ｉ．免疫刺激
　外来性病原体を認識し、そして定義する能力は、免疫システムの機能の中心である。免疫認識を通して、このシステムは、「非自己」（外来性）と「自己」とを区別することができ、これは欠陥機構が宿主組織に対するよりもむしろ侵入する実在物に向けられることを確保することが不可欠である。免疫システムの基本特徴は、高い多形性細胞表面認識構造物（受容体）及び侵入する病原体の破壊のためのエフェクター機構（抗体及び細胞溶解性細胞）の存在である。
【００８６】
　細胞溶解性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）は、ＭＨＣクラスＩ又はクラスＩＩ細胞表面タンパク質と共に処理された病原特異的ペプチドの表示により通常誘発される。本発明の１つの態様において、適切なＭＨＣ分子における免疫原性ウィルス決定因子の表示は、病原体に患者を暴露しないで最適なＣＴＬ応答を効果的に誘発する。この免疫刺激へのベクターアプローチは、保護的な及び治療的なＣＴＬ応答を誘発するより効果的な手段を提供する。なぜならば、ベクターにより誘発される免疫性の型は、天然の感染への暴露により誘発される型に非常に似ているからである。いくつかのウィルスシステムの現在の知識に基づけば、外来的に供給された非複製ウィルス抗原、たとえばペプチド及び精製された組換えタンパク質は、最適なクラスＩ−制限ＣＴＬ応答を誘発するのに十分な刺激を供給するであろう見込みはない。他方、本発明に記載されるような標的細胞内での選択されたウィルスタンパク質のベクター担持発現は、そのような刺激を供給する。
【００８７】
　例によれば、ＨＩＶ−１感染の場合、患者は、種々のウィルスエンベロープ−領域抗原決定基に対して特異的な抗体を増殖し、これらのいくつかは、インビトロにおいてウィルスを中和することができる。それにもかかわらず、疾病の進行は続き、そして患者は、結果的に疾病に負ける。感染された患者の細胞（Ｐｌａｔａなど．、Ｎａｔｕｒｅ　３２８：３４８〜３５１、１９８７）及びＨＩＶ、ｇａｇ、ｐｏｌ又はｅｎｖを発現する組換えワクシニアベクターにより感染された標的細胞（Ｗａｌｋｅｒなど．、Ｎａｔｕｒｅ　３２８：３４５〜３４８、１９８７；Ｗａｌｋｅｒなど．、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４０：６４〜６６、１９８８）に対する低レベルのＣＴＬ応答は、いく人かのＨＩＶ−１血清陽性患者に検出された。さらに、ネズミ及びヒトＣＴＬが、トランスフェクションを通してＨＩＶ　ｇｐ１２０を発現する同源の刺激細胞により誘発され得る（Ｌａｎｇｌａｄｅ−Ｄｅｍｏｙａｎなど．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．　１４１：１９４９、１９８８）。改良されたＣＴＬ誘発は、注入された患者に対して治療的に好都合であり、そして非感染性条件下で個人に効果的な予防治療を提供する。ＨＩＶ感染自体は、ＨＩＶ感染に関係する他の要素が適切な免疫刺激を妨げないので、適切なＣＴＬ応答を生成しないかも知れない。さらに、感染された細胞によるＴ細胞の刺激は、刺激されたＴ細胞の感染を導く相互作用であるかも知れない。
【００８８】
　例１は、パッキング細胞にレトロウィルスベクターを生成することができるプラスミドを構成するための方法を記載し、ここで前記ベクターは、ＨＩＶウィルス抗原の発現を導く。
【実施例】
【００８９】
　例１
　ＨＩＶ抗原を発現するベクター
　Ａ．Ｅｎｖ発現ベクター（第１図を参照のこと）：
　２．７ＫｂのＫｐｎ−ＸｈｏＩＤＮＡフラグメントを、ＨＩＶプロウィルスクローンＢＨ１Ｏ−Ｒ３（たとえば、Ｒａｔｎｅｒなど．、Ｎａｔｕｒｅ　３１３：２７７、１９８５）から分離し、そしてＩＩＩｅｘＥ７ｄｅｌｔａｅｎｖ（Ｂａｌ３１欠失−ｎｔ．５４９６）からの約４００ｂｐのＳａｌ−ＫｐｎＩＤＮＡフラグメントを、プラスミドＳＫ+のＳａｌＩ部位中に連結した。このクローンから、ｅｎｖ発現のために不可欠なｒｅｖをまたコードする３．１Ｋｂのｅｎｖ　ＤＮＡフラグメント（ＸｈｏＩ−ＣｌａＩ）を精製し、そしてｐＡＦＶＸＭ（Ｋｒｉｅｇｌａｒなど．、Ｃｅｌｌ　３８：４８３、１９８４を参照のこと）と呼ばれるレトロウィルスベクター中に連結した。このベクターを変性し、すなわち、ＢｇｌＩＩ部位が、ＨＩＶ　ｅｎｖコードＤＮＡフラグメントのクローニングを促進するためにＸｈｏＩ部位にリンカーの挿入により変えられた。ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子の発現を誘導するＳＶ４０初期プロモータから成る優性の選択可能なマーカー遺伝子を、感染され、そしてトランスフェクトされた細胞系の単離を促進するためにＣｌａＩ部位でベクター中に挿入した。
【００９０】
　ベクターにおけるＥＮＶ遺伝子から上流のＸｈｏＩ部位は、ＲＳＶプロモーター、ＳＶ４０初期又は後期プロモーター、ＣＭＶ即時初期（ＩＥ）プロモーター、ヒトβ−バクチンプロモーター及びＭｏｌｏｎｙネズミＭＬＶ　ＳＬ３−３プロモーターとしてベクター構造物中に追加のプロモーターを挿入するための便利な部位を供給する。
【００９１】
　１つのそのようなプロモーター、すなわちＣＭＶ即時初期遺伝子プロモータ（６７３ｂｐのＨｉｎｃＩＩ〜ＥａｇＩＤＮＡフラグメント）は、親構造物ｐＡＦ　ＥＮＶr　ＳＶ2　Ｎｅｏと比較する場合、ＳｕｐＴＩと呼ばれるヒトＴ細胞系におけるＥＮＶ発現の１０倍の上昇をもたらす。
【００９２】
　Ｂ．Ｇａｇ発現ベクター：
　２．５ＫｂのＳａｃＩ−ＥｃｏＲＶ　ＤＮＡフラグメントをｐＢＨ１Ｏ−Ｒ３（Ｒａｔｎｅｒなど．、ｏｐ．ｃｉｔ．を参照のこと）から単離し、そしてｐＵＣ３１のＳａｃＩ−ＳａｌＩ部位中に連絡した。ｐＵＣ３１は、ポリリンカーのＥｃｏＲＩ及びＫｐｎＩ部位の間に挿入される追加のＸｈｏＩ、ＢｇｌＩＩ、ＢｓｓｔＩＩ及びＮｃｏＩ部位を有するｐＵＣ１９に由来する。しかしながら、この構造物は、ＨＩＶからの主要スプライス供与体（ＳＤ）部位を含み、そして従ってウィルスの世代において問題を有する。そのＳＤ部位は、２．１ＫｂのＣｌａＩ−ＢａｍＨＩ　ＤＮＡフラグメント及び７０ｂｐのＲｓａＩ−ＣｌａＩフラグメントをＳＫ+のＨｉｎｃＩＩ−ＢａｍＨＩ部位中にサブクローンすることによって除去された。ＢａｍＨＩ部位を、リンカー挿入によりＣｌａＩ部位中に転換した。この構造物を、ＳＫ+　ｇａｇプロテアーゼＳＤデルタと命名した。
【００９３】
　ＳＫ+　ｇａｇプロテアーゼＳＤデルタからの２．５ＫｂのＸｈｏＩ−ＣｌａＩＤＮＡフラグメントを、上記のようにしてベクターｐＡＦＶＸＭのＸｈｏＩ／ＣｌａＩ部位中に挿入した。
【００９４】
　適切なパッケージング細胞に配置される場合、これらのプラスミドは、パッケージングシグナルを含むレトロウィルスベクター構造物を発現した。このパッケージングシグナルは、キャプシド及びエンベロープ並びに生存するレトロウィルス粒子のために必要とされるすべての追加のタンパク質中へのベクター構造物のパッケージングを指図した。キャプシド、エンベロープ及び他のタンパク質は、好ましくは、パッケージング細胞に配置される適切なゲノムを含む１又は複数のプラスミドから生成される。そのようなゲノムはプロウィルス構造物であり、これは、単純な場合、欠失されたパッケージングシグナルを単に有することができる。結果として、単にベクターがパッケージされるであろう。適切なパッケージング又はパッケージング細胞系、及びそのようなパッケージングを達成するために必要なゲノムは、Ｍｉｌｌｅｒなど．（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ．　６：２８９５、１９８６）に記載され、これは引用により本明細書に組込まれる。Ｍｉｌｌｅｒなどにより記載されるように、複製欠陥でないウィルス粒子の生成をもたらすことができる、パッケージング細胞系内に生じる組換え出来事の機会を減じるために、追加の変化が、パッケージングシグナルの単純な欠失以外のプロウィルス構造物に行なわれることが好ましい。
【００９５】
　例１は、ＨＩＶエンベロープ糖タンパク質（ｇｐ）又は他のウィルス抗原を生成するための方法の単なる例示であることが理解されるであろう。少ないＴ細胞変性効果を伴って、免疫応答を同様に刺激するであろう標的細胞上に変性されたＨＩＶエンベロープｇｐを発現するプロウィルスベクター構造物を供給することもまた可能である。エンベロープ糖タンパク質は、たとえばＫｏｗａｌｓｋｉなど（Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３７：１３５１、１９８７）（引用により本明細書に組込まれる）の論文の開示の使用により、当業者において良く知られている技法を用いて適切に変性され得る。従って、プロウィルス構造物は、そのような適切に変性されたｇｐを発現するレトロウィルス構造物を生成する上記技法により構成され得る。次に、この構造物を、上記のようにしてパッケージング細胞に配置する。パッケージング細胞系から生成されたその得られた組換えレトロウィルスは、敏感な標的細胞の感染を通して免疫応答を刺激するためにインビトロ及びインビボで使用され得る。ＨＩＶゲノムから発現される他のタンパク質、たとえばｇａｇ、ｐｏｌ、ｖｉｆ、ｎｅｆ、等がまた、ＨＩＶ感染の個人において有益な細胞応答を誘発することができる。プロウィルスベクター、たとえば下記のものは、臨床的に有益な免疫応答を促進するために、そのようなタンパク質を発現するように企画されている。ｒｅｖコード配列及びｒｅｖ応答成分を含むことがあるベクターのために必要である（Ｒｏｓｅｎなど．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．　８５：２０７１、１９８８）。
【００９６】
　次の例は、マウスにおけるＣＴＬ応答を誘発するためにこのタイプの処理の能力を例示する。
【００９７】
　例２
　レトロウィルスベクターをコードする抗原に対する免疫応答
　ネズミの腫瘍細胞系（Ｂ／Ｃ１０ＭＥ）（Ｈ−２d）を、ＨＩＶ　ｅｎｖをコードするｐＡＦ　ｅｎｖr　ＳＶ４０　Ｎｅｏベクター構造物により感染せしめた。次に、１つのクローン化されたＨＩＶ−ｅｎｖ発現細胞系（Ｂ／Ｃ１０ＭＥ−２９）を用いて、同系（すなわちＭＨＣと同一の）のＢａｌｂ／ｃ（Ｈ−２d）マウスにおけるＨＩＶ−ｅｎｖ−特異的ＣＴＬを刺激した。マウスを、Ｂ／Ｃ１０ＭＥ−２９細胞（４×１０7個の細胞）による腹膜内注射により免疫化し、そして７〜１４日目に追加免疫した。応答物の脾臓細胞懸濁液をこれらの免疫化されたマウスから調製し、そしてその細胞を１：５０の刺激物：応答物細胞の比で、Ｂ／Ｃ１０ＭＥ−２９又はＢ／Ｃ１０ＭＥマイトシン−Ｃ−処理細胞のいづれかの存在下で４日間インビトロで培養した。そのエフェクター細胞をこれらの培養物から収穫し、計数し、そして標準の４〜５時間の51Ｃｒ−開放アッセイにおいて、種々のエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）細胞比で放射性ラベルされた（51Ｃｒ）標的細胞（すなわちＢ／Ｃ１０ＭＥｅｎｖ−２９又はＢ／Ｃ１０ＭＥ）と共に混合した。インキュベーションの後、マイクロタイタープレートを遠心分離し、培養上清液１００μｌを除き、そして溶解された細胞から開放された放射性ラベルの量を、Ｂｅｃｋｍａｎ　γ分光計で定量した。標的細胞の溶解率を次のようにして計算した：％標的溶解率＝　Ｅｘｐ　ＣＰＭ−ＳＰ　ＣＰＭ／ＭＲ　ＣＰＭ−ＳＲ　ＣＰＭ×１００、ここで１分当たりの実験的な計数（Ｅｘｐ　ＣＰＭ）はエフェクター＋標的を表わし；自発的な開放（ＳＰ）ＣＰＭは標的のみを表わし；そして最大の開放（ＭＲ）ＣＰＭは１ＭのＨＣｌの存在下での標的を表わす。
【００９８】
　その結果（第４図）は、Ｂ／Ｃ１０ＭＥ標的よりも一層効果的にＨＩＶ−ｅｎｖ−発現標的細胞（Ｂ／Ｃ１０ＭＥｅｎｖ−２９）を特異的に溶解するＣＴＬエフェクターが誘発されたことを示す。非−ＨＩＶ−ｅｎｖ−発現対照細胞（Ｂ／Ｃ１０ＭＥ）によりインビトロで再刺激された感作脾臓細胞は、特に低いＥ：Ｔ細胞比で、Ｂ／Ｃ１０ＭＥｅｎｖ−２９又はＢ／Ｃ１０ＭＥ標的のいづれに対する有意なＣＴＬ活性も示さなかった。Ｂ／Ｃ１０ＭＥｅｎｖ−２９によりインビトロで再刺激された免疫化されていない実験用Ｂａｌｂ／ｃマウスから得られた脾臓細胞は、ＣＴＬを生成せず、従って、インビボでの感作及び追加免疫化の重要性を示した。この実験をくり返し、そして類似する結果を得た。
【００９９】
　他の実験においては、同じｐＡＦ　ｅｎｖr　ＳＶ４０　Ｎｅｏ（ＨＩＶ−ｅｎｖ）ベクター構造物により感染された異なったＨ−２d　ＨＩＶ−ｅｎｖ−発現腫瘍細胞クローン（Ｌ３３−４１）により免疫化され、追加免疫化され、そしてインビトロで再刺激されたＢａｌｂ／ｃマウスから得られたエフェクター細胞は、Ｂ／Ｃ１０ＭＥｅｎｖ−２９標的細胞を溶解することができた。これは、これらのマウスに生成されたＣＴＬは、これらの細胞上でユニークな腫瘍細胞抗原よりもむしろＨＩＶ−ｅｎｖの発現形を特異的に認識する追加の支持を提供する。この結果はまた、ベクター担持抗原が２種の腫瘍細胞系により類似する態様で与えられることも示唆する。
【０１００】
　ヒトにおけるこの免疫刺激適用の手段は、（１）対照の抗原をコードする遺伝子が細胞に送られ、（２）抗原が適切な細胞において発現され、そして（３）ＭＨＣ制限の必要条件、すなわちクラスＩ及びクラスＩＩ抗原の相互作用が満たされることを必要とする。ベクターの調製は、通常の培地において生成細胞を増殖し、１０ｍｇ／ｍｌでのＰＢＳ及びヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）溶液により細胞を洗浄し、次にＰＢＳ及びＨＳＡにおいて８〜１６時間、その細胞を増殖せしめることによって行なわれる。得られた力価は、ベクター、パッケージング細胞系又は特に生成系のクローンに依存して、典型的には１０4〜１０6／ｍｌである。ベクター上清液を濾過し、細胞を除き、そして１００，０００又は３００，０００通過Ａｍｉｃｏｎフィルターを通しての濾過により１００倍に濃縮する（Ｗｏｌｆｆなど．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．　８４：３３４４、１９８７）。これは、１００，０００又は３００，０００の球状タンパク質の通過を可能にするが、しかし感染性粒子としてウィルスベクターの９９％を保持する。原液は貯蔵のために凍結され得る。なぜならば、それらは凍結及び融解で感染性単位の約５０％を失うからである。最も直接的な方法は、適切な遺伝子担持ベクターの個人への投与及び続いて免疫応答の刺激を開始することができる、適切な細胞に効果的に標的を定めるベクターの能力に対する信用性を包含する。その投与量は、Ｋｇ体重当たり１０5〜１０6の感染単位であろう。しかしながら、より実用的なアプローチは、それぞれの個人から得られた患者の末梢血液リンパ球（ＰＢＬ）、繊維芽細胞又は他の細胞のベクターによる体外処理を包含する。ＰＢＬは、マイトジェン（植物凝集素）又はリンホカイン（たとえばＩＬ−２）の使用により培養物に維持され得る。このタイプのアプローチは、指図されたベクター感染、注射の前での抗原を与える細胞集団の発現及び拡張の調節及びそれぞれの患者へのベクター発現細胞の返還を可能にする。他のタイプの細胞もまた、体外培養され、ベクター導入され、そしてその細胞は患者に返還され得る。単に、適度な数の感染された細胞（１０5〜１０6個／Ｋｇ体重）が、強い免疫応答を誘発するために必要である。
【０１０１】
　異なった形の投与は、レトロウィルスベクター粒子を製造する生成細胞系の移植である。これらは、免疫学的に相手のいない従来の生成細胞系又は患者自身の細胞であり、これらは培養基へ移され、処理され、そして返還される（ＶＩ　Ａｌｔｅｒ−ｎａｔｉｖｅ　Ｖｉｒａｌ　Ｖｅｃｔｏｒ　Ｐａｃｋａｇｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓを参照のこと）。両タイプの移植（１０5〜１０6／Ｋｇ体重）は、患者における制限された寿命期間を有するが、しかし身体中において多量（１０7〜１０10個）の細胞を感染するレトロウィルスベクターを導くであろう。
【０１０２】
　いづれの場合においても、その処理の成功は、少量の血液を除き、そしてｅｎｖ発現を導くベクターにより感染された個人自身の細胞を用いてＣＴＬ応答を測定することによって試みられ得る。
【０１０３】
　病原体、たとえばＨＩＶ以外の病原性ウィルスに対するＭＨＣクラスＩ又はクラスＩＩ制限免疫応答を刺激することが所望される場合、免疫応答を刺激するであろうそのようなレトロウィルスに関係するエンベロープ又は他の抗原の適切な形は、当業者により確かめられ得る。一般的に、病原体に関係する抗原の適切な形（これらの病原体に対する免疫応答を刺激するであろう）は、容易に選択され得る。
【０１０４】
　所望する免疫応答を生ぜしめるための他のアプローチは、適切な細胞、たとえばＴ細胞に抗原−特異的Ｔ細胞受容体遺伝子を送ることである。他の可能な受容体は、細胞毒性免疫応答が制限されたＭＨＣでないＮＫ細胞である。特異的な免疫グロブリン遺伝子は、Ｂ−細胞に送られる場合、同様に有用である。
【０１０５】
　ＩＩ．阻止剤
　多くの感染性疾病、癌、自己免疫疾患、及び他の疾病は、ウィルス粒子と細胞、細胞と細胞又は細胞と因子との相互作用を包含する。ウィルス感染においては、ウィルスは通常、敏感な細胞の表面上の受容体を通して細胞に侵入する。癌においては、細胞は、他の細胞又は因子からのシグナルに不適切に応答し、又はまったく応答しない。自己免疫疾患においては、「自己」マーカーの不適切な認識が存在する。本発明においては、そのような相互作用は、相互作用におけるいづれかのパートナーの類似体をインビボで生成することによって阻止され得る。
【０１０６】
　この阻止作用は、細胞内で、細胞膜上で又は細胞外で生じる。ウィルス又は特に、阻止剤のための遺伝子を担持するレトロウィルスベクターの阻止作用は、敏感な細胞を内部から介在され得又は病原体の相互作用を局部的に阻止するために阻止タンパク質を分泌することによって介在され得る。
【０１０７】
　ＨＩＶの場合、相互作用の２種の物質は、ｇｐ１２０／ｇｐ４１エンベロープタンパク質及びＣＤ４受容体分子である。従って、適切な阻止剤は、病原効果を引き起こさないでＨＩＶの侵入を阻止するＨＩＶ　ｅｎｖ類似体又はＣＤ４受容体の類似体のいづれかを発現するベクター構造物であろう。そのＣＤ４類似体は分泌され、そして隣接する細胞を保護するために機能し、ところがｇｐ１２０／ｇｐ４１は分泌され、又はベクター含有細胞のみを保護するために細胞内でのみ生成される。安定性を強化するためには、ヒト免疫グロブリンＨ鎖又は他の成分をＣＤ４に添加することが好都合である。そのようなハイブリッド−可溶性ＣＤ４をコードするレトロウィルスベクターの宿主への送出は、適切なハイブリッド分子の連続する供給をもたらす。
【０１０８】
　ＨＩＶ　ｅｎｖの発現を導くベクター粒子は、上記のようにして構成され得る。その一部が、明白な病原性の副作用を伴わないでウィルス吸着を阻止することができることは当業者に明らかであろう（Ｗｉｌｌｅｙなど．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．　６２：１３９、１９８８；Ｆｉｓｈｅｒなど．、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３３：６５５、１９８６）。次の例は、感染性ベクター粒子が製造されるＣＤ４ベクターの構成法を記載する。
【０１０９】
　例３
　ｓＣＤ４ベクター
　１．ｐＭＶ７．Ｔ４（Ｍａｄｄｏｎなど．、Ｃｅｌｌ　４７：３３３、１９８６）からの１．７ＫｂのＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ　ＤＮＡフラグメントを、ＳＫ+のＨｉｎｃＩＩ部位にブラント末端連結した。
【０１１０】
　２．ＸｂａＩ部位を含む一般的な翻訳終結配列を、ＣＤ４フラグメントのＮｈｅＩ部位中に挿入した。
【０１１１】
　３．１．７ＫｂのＸｈｏＩ−ＣｌａＩフラグメントを切り出し、そしてｐＸＦＶＸＭのＸｈｏＩ−ＣｌａＩ部位中にクローン化した。これらのベクタープラスミドを用いて、例１に記載されているようにして感染性ベクター粒子を生成することができる。
【０１１２】
　そのような感染性阻止ベクターは、培養においてヒトＴ細胞系中に入れられる場合、ＨＩＶ感染の広がりを阻害することができる。感染性レトロウィルスベクター調製物の調製法、濃縮及び貯蔵は、免疫刺激物に関する通りである。投与路もまた、同じであり、そして投与量は約１０倍、多量である。使用され得る他の経路は、骨髄の吸引、レトロウィルスベクターによる感染及びこの感染された骨髄の患者への返還である（Ｇｒｕｂｅｒなど．、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３０：１０５７、１９８５）。骨髄の複製は、細胞の複製を通してベクター発現を増幅するので、免疫刺激物の範囲の量が使用され得る（１０5〜１０6／Ｋｇ体重）。
【０１１３】
　いづれの場合においても、処置の効果は、疾病進行の通常の指示物、たとえば抗体レベル、ウィルス抗原の産生、感染性ＨＩＶレベル又は非特異的感染のレベルを測定することによって試験され得る。
【０１１４】
　ＩＩＩ．緩和剤の発現
　上記技法に類似する技法を用いて、病原体又は遺伝子の機能を阻止することができる物質（又は「緩和剤」）の発現を指図するベクター構造物を有する組換えレトロウィルスを生成することができる。本発明において、「機能を阻止することができる」とは、緩和剤が直接的に、病原体の機能を阻止し、又はたとえば病原体の機能を通常、阻止しない物質から阻止する物質に、細胞に存在する物質を転換することによって、間接的にその機能を阻止することを意味する。ウィルス疾病についてのそのような機能の例は、吸着、複製、遺伝子発現、集合及び感染された細胞からウィルスの退去を包含する。癌性疾病についてのそのような機能の例は、細胞、複製、外部シグナルに対する感受性（たとえば接触阻害）及び抗腫瘍遺伝子の生成の欠乏を包含する。
【０１１５】
　（ｉ）緩和性阻害剤
　本発明の１つの観点においては、ベクター構造物は、病原性ウィルス、たとえばＨＩＶ（又は病原性遺伝子、たとえば腫瘍遺伝子）のＲＮＡに対するアンチセンスＲＮＡの発現を指図し、それによってその複製又は病原を阻害する。そのような発現は、実質的に連続的であり、又は病原性条件に関係する他の物質（「同定物質」）の細胞における存在に応答して連続的であることができる。他方、その発現は、ベクター侵入の標的の決定により又はベクターにおける組織特異的制御配列により組織特異性であることができる。
【０１１６】
　１つの態様において、重要な病原性遺伝子転写物（たとえばウィルス遺伝子生成物又は活性化された細胞性腫瘍遺伝子）に相補的なＲＮＡを発現するレトロウィルスを用いて、その転写物のタンパク質への翻訳を阻害し、たとえばＨＩＶ　ｔａｔタンパク質の翻訳を阻害することができる。このタンパク質の発現は、ウィルス複製のために不可欠であるので、そのベクターを含む細胞は、ＨＩＶ複製に対して耐性であろう。
【０１１７】
　第２の観点においては、病原体がパッケージングシグナルを有する一本鎖ウィルスである場合、ウィルスパッケージングシグナル（たとえば緩和剤がＨＩＶに対して向けられる場合、ＨＩＶパッケージングシグナル）に相補的なＲＮＡが発現され、その結果、ウィルスパッケージングシグナルとこれらの分子との会合が、レトロウィルスの場合、レトロウィルスのＲＮＡゲノムの正しいキャプシド化又は複製のために必要とされるステムループ形成又はｔＲＮＡプライマー結合を阻害する。
【０１１８】
　第３の観点においては、病原性状態を妨害するタンパク質を発現するレトロウィルスベクターを導入することができる。ＨＩＶの場合、１つの例は、ＨＩＶ　ＬＴＲからの発現をトランス活性化（ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｅ）する能力を欠乏し、そしてｔａｔタンパク質の正常な機能を妨害する（トランスドミナント態様で）突然変異体ｔａｔタンパク質である。そのような突然変異体は、ＨＴＬＶ　ＩＩ　ｔａｔタンパク質のために同定された（「ＸＩＩ　Ｌｅｕ5」突然変異体；Ｗａｃｈｓｍａｎなど．、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３５：６７４、１９８７を参照のこと）。突然変異体トランスリプレッサーｔａｔは、ＨＳＶ−１における相同の突然変異体リプレッサーのために示されて来たように、複製を阻害すべきである（Ｆｒｉｅｄｍａｎｎなど．，Ｎａｔｕｒｅ　３３５：４５２、１９８８）。
【０１１９】
　そのような転写リプレッサータンパク質は、発現がウィルス特異性トランス活性化タンパク質により刺激される（上記のようにして）いづれかのウィルス特異性転写プロモーターを用いて、組織培養において選択され得る。ＨＩＶの特別な場合、ＨＩＶ　ｔａｔタンパク質を発現する細胞系及びＨＩＶプロモーターにより作動されるＨＳＶＴＫ遺伝子は、ＡＣＶの存在下で死滅するであろう。しかしながら、一連の突然変異ｔａｔ遺伝子がそのシステムに導入される場合、適切な性質（すなわち野生型ｔａｔの存在下でＨＩＶプロモーターからの転写を抑制する）を有する突然変異体は増殖し、そして選択されるであろう。次に、その突然変異体の遺伝子を、これらの細胞から再単離することができる。条件的に致死のベクター／ｔａｔシステムの複数のコピーを含む細胞系を用いて、生存する細胞クローンがこれらの遺伝子における内因性突然変異により引き起こされないことを確かめることができる。次に、一式のランダムに突然変異誘発されたｔａｔ遺伝子は、「求済可能な」レトロウィルスベクター（すなわち、突然変異体ｔａｔタンパク質を発現し、そして複製の細菌性起源及び細菌における増殖及び選択のための耐薬物性マーカーを含むもの）を用いて、これらの細胞中に導入される。これは、多数のランダム突然変異の評価を可能にし、そして所望する突然変異細胞系の続く容易な分子クローニングを可能にする。この方法は、可能性ある抗ウィルス治療のために種々のウィルス転写活性化物質／ウィルスプロモーターシステムにおける突然変異を同定し、そして利用するために使用され得る。
【０１２０】
　第４の態様においては、ＨＳＶＴＫ遺伝子生成物は、潜在的に抗ウィルス性のヌクレオシド類似体、たとえばＡＺＴ又はｄｄＣをより効果的に代謝するために使用される。そのＨＳＶＴＫ遺伝子は、構成マクロファージ又はＴ細胞特異的プロモーターの制御下で発現され、そしてこれらの細胞型中に導入される。ＡＺＴ（及び他のヌクレオシド抗ウィルス）は、レトロウィルス逆転写酵素及び従ってＨＩＶ複製を特異的に阻害するために細胞機構によりヌクレオチド三リン酸形に代謝されるべきである（Ｆｕｒｍａｎなど．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８３：８３３３〜８３３７、１９８６）。ＨＳＶＴＫの構成発現（ヌクレオチド及び非常に広い基質特異性を有するヌクレオチドホスフェートキナーゼ）は、それらの生物学的に活性的なヌクレオチド三リン酸形へのこれらの薬物のより効果的な代謝をもたらす。ＡＺＴ又はｄｄＣ治療は、より効果的であり、低い投与量を可能にし、ほとんど毒性を生成せず、そして生産性感染に対して高い可能性を有するであろう。ヌクレオチド三リン酸形がレトロウィルスの逆転写酵素のための選択性を示すが、しかし細胞ヌクレオシド及びヌクレオチドキナーゼの基質特異性の結果として、リン酸化されない追加のヌクレオシド類似体が、一層効果的にされるであろう。この方法の説明は、例４に示される。
【０１２１】
　例４
　ＡＺＴ及び類似体の抗ウィルス効果を強化するように企画されたベクター
　次のレトロウィルスベクターのすべては、「Ｎ２」ベクター（Ｋｅｌｌｅｒなど．、Ｎａｔｕｒｅ　３１８：１４９〜１５４、１９８５を参照のこと）に基づかれている。従って、５’及び３’　ＥｃｏＲＩ　ＬＴＲフラグメント（それぞれ２．８及び１．０Ｋｂ）をまず、ポリリンカーを含むプラスミド中にサブクローンし（ＳＫ+にサブクローンし、ｐＮ２Ｒ５〔＋／−〕を得；ｐＵＣ３１中にサブクローンし、ｐ３１Ｎ２Ｒ５〔＋／−〕及びｐ３１Ｎ２Ｒ３〔＋／−〕を得る）、ベクター構成を促進した。１つの場合、１．２ＫｂのＣｌａＩ／ＥｃｏＲＩ５’ＬＴＲフラグメントを、ＳＫ+ベクターの同じ部位中にサブクローンし、ｐＮ２Ｃを得た。他の場合、スプライス供与体配列の６ｂｐ欠失を含む５’ＬＴＲを、１．８ＫｂのＥｃｏＲＩフラグメントとしてｐＵＣ３１（ｐ３１Ｎ２５ｄｅｌｔａ〔＋〕）中にサブクローンした。ＨＳＶ−１チミジンキナーゼ遺伝子のコード領域及び転写終結シグナルをプラスミド３２２ＴＫ（ｐＢＲ３２２のＢａｍＨＩ中にクローンされたＨＳＶＴＫの３．５ＫｂのＢａｍＨＩフラグメント）から１．８ＫｂのＢｇｌＩＩ／ＰｖｕＩＩフラグメントとして単離し、そしてＢｇｌＩＩ／ＳｍａＩにより消化されたｐＵＣ３１（ｐＵＣＴＫ）中にクローンした。ターミネーターシグナルの欠失を必要とする構造体のために、ｐＵＣＴＫをＳｍａＩ及びＢａｍＨＩにより消化した。残るコード配列及び付着端のＢａｍＨＩオーバーハングを、次のオリゴマー：５’ＧＡＧ　ＡＧＡ　ＴＧＧ　ＧＧＧ　ＡＧＧ　ＣＴＡ　ＡＣＴ　ＧＡＧ　３’（配列番号１）及び５’ＧＡＴ　ＣＣＴ　ＣＡＧ　ＴＴＡ　ＧＣＣ　ＴＣＣ　ＣＣＣ　ＡＴＣ　ＴＣＴ　Ｃ　３’（配列番号２）から製造された二本鎖オリゴヌクレオチドと共に再構成し、構造体ｐＴＫｄｅｌｔａＡを形成した。
【０１２２】
　診断目的のために、それらのオリゴは、翻訳されたタンパク質を変えないでそのＡｖａＩ部位を維持しながら、ＳｍａＩ部位を破壊するように企画された。
【０１２３】
　０．６ＫｂのＨＩＶプロモーター配列を、ｐＣＶ−１（Ａｒｙａなど．、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２２９：６９〜７３、１９８５を参照のこと）からのＤｒａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントとして、ＨｉｎｃＩＩ／ＨｉｎｄＩＩＩにより切断されたＳＫ+（ＳＫＨＬ）中にクローンした。
【０１２４】
　Ａ．ＴＫ−１及びＴＫ−３レトロウィルスベクターの構成
　　（第６図を参照のこと）
　１．５ＫｂのＸｈｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ　５’ＬＴＲ及びプラスミド配列を、ｐ３１Ｎ２Ｒ５（＋）から単離した。
【０１２５】
　２．転写終結配列を欠くＨＳＶＴＫコード配列を、ｐＴＫｄｅｌｔａＡからの１．２ＫｂのＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩフラグメントとして単離した。
【０１２６】
　３．３’ＬＴＲ配列を、ｐＮ２Ｒ３（−）からの１．０ＫｂのＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントとして単離した。
【０１２７】
　４．段階１〜３からのフラグメントを混合し、連結し、細菌中に形質転換し、そして個々のクローンを、制限酵素分析（ＴＫ−１）により同定した。
【０１２８】
　５．ＴＫ−３を、ＢａｍＨＩによりＴＫ−１を線状化し、５’オーバーハングをフィルインし、そして細菌性ｌａｃ　ＵＶ５プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター及びＴｎ５　Ｎｅｏr遺伝子を含む５’−フィルドＣｌａＩフラグメントをブラント末端連結することによって構成した。耐カナマイシン性クローンを分離し、そして個々のクローンを制限酵素分析による適切な配向のためにスクリーンした。
【０１２９】
　これらの構造体を用いて、上記のようにして、パッケージング細胞系及び感染性組換えベクター粒子を生成した。
【０１３０】
　ヒトＴ細胞及びマクロファージ／単球細胞系へのこれらのレトロウィルスベクターの投与は、レトロウィルスベクター処理によらない同じ細胞に比べて、ＡＺＴ及びｄｄＣの存在下でＨＩＶに対するそれらの耐性を高めることができる。
【０１３１】
　レトロウィルスベクター調製物の調製法、濃縮及び貯蔵は、上記の通りである。処理は前に記載された通りであるが、しかし、患者の細胞のｅｘ　ｃｏｒｐｏｒｅ処理が感染されていない潜在的に敏感なＴ細胞又は単球に向けられる。敏感な細胞に目標を定めるための１つの好ましい方法は、ＣＤ４+細胞へのベクター粒子の吸収を向けるためにＨＩＶ　ｅｎｖ又はハイブリッドｅｎｖ（セクションＶＩＩＩの細胞系特異的レトロウィルスを参照のこと）を担持するベクターによるものである。正常な成人は、彼らの血液中に約５×１０9個のＴ４細胞及びほぼ同じ数の単球を有する。
【０１３２】
　好ましい投与方法は、白血球泳動（ｌｅｕｋｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）であり、ここで個人のＰＢＬの約２０％が一度で除かれ、そしてインビトロで操作され得る。従って、約２×１０9個の細胞が処理され、そして交換される。現在の最大の力価は約１０6／ｍｌであるので、これは２〜２０ｌの出発ウィルス上清液を必要とする。反復処理が行なわれる。他方、骨髄を処理し、そして上記のようにしてその効果の増幅を可能にする。ＡＺＴによる処理は、毒性副作用を回避するために正常なレベルよりも低いレベルで存在するが、しかしＨＩＶの広がりを効果的に阻害する。その処理の進行は、阻止剤について記載されているようにして行なわれる。
【０１３３】
　緩和性阻止剤を製造するための第５の態様は、ウィルス集合を阻止する欠陥性妨害ウィルス構造タンパク質の発現を包含する。ベクターは、欠陥ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ又は他のウィルス粒子タンパク質又はペプチドをコードし、そしてこれらはウィルス粒子の集合を優性態様で阻止する。これは、ウィルス粒子の正常なサブユニットの相互作用が欠陥サブユニットとの相互作用により妨害されるので生じる。
【０１３４】
　第６のそのような態様は、ウィルスプロテアーゼに対して特異的な阻害ペプチドの発現を包含する。ウィルスプロテアーゼは、ウィルスｇａｇ及びｇａｇ／ｐｏｌタンパク質を多くの小さなペプチドに分解する。すべての場合において、この分解の不足は、感染性レトロウィルス粒子の生成の完全な阻害を導く。ＨＩＶプロテアーゼは、アスパルチルプロテアーゼであることが知られており、そしてこれらはタンパク質又は類似物からのアミノ酸から製造されたペプチドにより阻害されることが知られている。ＨＩＶを阻害するためのベクターは、そのようなペプチド阻害剤の１又は複数の融合コピーを発現するであろう。
【０１３５】
　第７の態様は、欠失され又は細胞型で発現されない場合、その細胞型での腫瘍形成を導くサプレッサー遺伝子の送出を包含する。ウィルスベクターによる欠失遺伝子の再導入は、これらの細胞における腫瘍表現型の退化を導く。そのような癌の例は、網膜芽腫及びＷｉｌｍｓ腫瘍である。悪性は、細胞増殖と比べて、細胞末端分化の阻害であると思われるので、レトロウィルスの送出及び腫瘍の分化を導く遺伝子生成物の発現が一般的に、退化を導く。
【０１３６】
　第８の態様においては、レトロウィルス構造体は、それ自体をウィルス、腫瘍遺伝子又は病原性遺伝子中に挿入し、それにより病原のために必要とされる機能を阻害することによって治療効果を提供する。この態様は、相同組換え、インテグラーゼによる変性又は他の方法（下記に説明される）によりゲノムにおける特異的部位へのレトロウィルスの組込みの指図を必要とする。
【０１３７】
　（ｉｉ）条件毒性緩和剤
　病原体を阻害するためのもう１つのアプローチは、病原条件を発現する細胞に対して毒性である緩和剤を発現することである。この場合、プロウィルスベクターからの緩和剤の発現は、非病原性細胞の破壊を回避するために病原状態を同定するある細胞内シグナルの存在により制限される。この細胞タイプの特異性はまた、病原条件を有する又はその条件に対して敏感な細胞にベクターを担持する組換えレトロウィルスの標的を決定することによって感染のレベルで付与され得る。
【０１３８】
　この方法の１つの態様においては、組換えレトロウィルス（好ましくは、但し必ずしも必要ではないが、組換えＭＬＶレトロウィルス）は、出来事−特異的プロモーター、たとえば細胞周期−依存性プロモーター（たとえばヒト細胞チミジンキナーゼ又はトランスフェリン受容体プロモーター）から発現される細胞毒性遺伝子（たとえばリシン）を含むベクター構造体（急速に増殖する細胞、たとえば腫瘍においてのみ、転写的に活性であろう）を担持する。この態様においては、これらのプロモーターからの転写を活性化することができる因子を含む、急速に複製する細胞が、プロウィルス構造体により生成される細胞毒性物質により選択的に破壊される。
【０１３９】
　第２の態様において、細胞毒性物質を生成する遺伝子は、組織特異的プロモーターの制御下に存在し、ここで前記組織特異性は腫瘍の起源に対応する。ウィルスベクターは、複製細胞（たとえば正常な肝臓細胞は複製しないが、しかし肝細胞癌は複製する）のゲノム中に選択的に組込まれるので、これらの２種の特異性のレベル（ウィルスの組込み／複製及び組織特異性転写調節）は、腫瘍細胞の選択的な殺害を導く。さらに、出来事−特異性及び組織−特異性プロモーター成分は、細胞毒性遺伝子生成物が両基準を満たす細胞タイプにおいてのみ発現されるように人工的に組合される（たとえば、上記例においては、組合されたプロモーター成分は、急速に分裂する肝細胞においてのみ機能する）。転写的制御成分はまた、細胞タイプ特異性を増強するために増幅され得る。
【０１４０】
　これらの転写プロモーター／エンハンサー成分は、内部プロモーター（ウィルスＬＴＲ間に存在する）として必ずしも存在する必要はないが、しかし条件−特異的転写発現が変性されたウィルスＬＴＲから直接的に生じるように、それら自体転写プロモーターである、ウィルスＬＴＲにおける転写制御成分に付加され又は置換することができる。この場合、最大の発現のための条件がレトロウィルスパッケージング細胞系において模倣される必要があり（たとえば、増殖条件を変え、発現の必要なトランスレギュレーターを供給し、又はパッケージング細胞系のための親として適切な細胞系を用いることによって）、又はＬＴＲ変性が、最大の組換えウィルス力価を得るために３’ＬＴＲ　Ｕ３領域に制限される。後者の場合、１回目の感染／組込みの後、３’ＬＴＲ　Ｕ３がまた、所望する組織特異的発現を付与する５’ＬＴＲ　Ｕ３でもある。
【０１４１】
　第３の態様においては、プロウィルスベクター構造体は、同様に活性化されるが、しかしそれ自体細胞毒性でなく、そしてほとんど又はまったく細胞毒性でない化合物又は薬物を標的細胞内で処理するタンパク質を、細胞毒性であるもの（「条件的に致死性」である遺伝子生成物）の中に発現する。特に、プロウィルスベクター構成体は、ＨＩＶプロモーター（転写的に活動しないことが知られているが、但し、ＨＩＶ　ｔａｔタンパク質により活性化される場合を除く）の下流及び転写制御下に単純ヘルペスウィルスのチミジンキナーゼ（「ＨＳＶＴＫ」）を担持する。ＨＩＶにより感染され、そしてプロウィルスベクター構造体を担持するヒト細胞におけるｔａｔ遺伝子生成物の発現は、ＨＳＶＴＫの高められた生成を引き起こす。次に、その細胞（インビトロ又はインビボのいづれか）を、薬物、たとえばアシクロビル又はその類似物（ＦＩＡＵ、ＦＩＡＣ、ＤＨＰＧ）に暴露する。これらの薬物は、ＨＳＶＴＫにより（但し、細胞チミジンキナーゼによってではない）それらの対応する活性ヌクレオチド三リン酸塩形にリン酸化されることが知られている（たとえば、Ｓｃｈａｅｆｆｅｒなど．、Ｎａｔｕｒｅ　２７２：５８３、１９７８を参照のこと）。アシクロビル及びＦＩＡＵ三リン酸塩は、一般的に、トランス遺伝子マウスにＨＳＶＴＫを発現する細胞の特異的破壊を導く細胞ポリメラーゼを阻害する（Ｂｏｒｒｅｌｌｉなど．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８５：７５７２、１９８８を参照のこと）。組換えベクターを含み、そしてＨＩＶ　ｔａｔタンパク質を発現するこれらの細胞は、これらの薬物の特定の量の存在により選択的に殺害される。さらに、特別なレベルの特異性が、ＨＩＶ　ｒｅｖタンパク質、応答性のＣＲＳ／ＣＡＲ配列をベクター中に含むことによって達成される。ＣＲＳ配列の存在下で、遺伝子発現は抑制されるが、但しＣＡＲ配列及びｒｅｖタンパク質の存在下では除く。例５は、この技法の例示を提供する。
【０１４２】
　例５
　ＡＣＶ又はその類似体の毒性作用を条件的に強化するためのベクター
　ベクターの構成
　Ａ．ｐＫＴＶＩＨＡＸの構成（第７図を参照のこと）
　１．９．２ＫｂのＡｓｕＩＩ／ＸｈｏＩフラグメントを、ベクターｐＮ２　ＤＮＡから単離した。
【０１４３】
　２．０．６ＫｂのＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩプロモーターフラグメントを、プラスミドｐＳＫＨＬから単離した。
【０１４４】
　３．０．３ＫｂのＢｇｌＩＩ／ＡｃｃＩ及び１．５ＫｂのＡｃｃＩ／ＡｃｃＩフラグメントを、ｐＵＣＴＫから精製した。
【０１４５】
　４．１、２及び３からのフラグメントを連結し、細菌中に形質転換し、そして一定構造の適切なＡｍｐrクローンを制限酵素分析により同定した。
【０１４６】
　Ｂ．ｐＫＴＶＩＨ−５及びｐＫＴＶＩＨ５　Ｎｅｏレトロウィルスベクターの構成（第８図を参照のこと）
　１．４．５Ｋｂの５’ＬＴＲ及びベクターを、ベクターｐ３１Ｎ２５ｄｅｌｔａ（＋）からＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩフラグメントとして単離した。
【０１４７】
　２．１．０Ｋｂの３’ＬＴＲを、ｐＮ２Ｒ３（＋）フラグメントからＡｐａＩ／ＢａｍＨＩフラグメントとして単離した。
【０１４８】
　３．０．６ＫｂのＨＩＶプロモーター成分を、ｐＳＫＨＬからＡｐａＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントとして単離した。
【０１４９】
　４．ＨＳＶＴＫコード配列及び転写終結配列を、ｐＵＣＴＫから１．８ＫｂのＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩフラグメントとして単離した。
【０１５０】
　５．１〜４からのフラグメントを、組合し、連結し、細菌中に形質転換し、そして得られた構造体のクローンを、制限酵素分析により同定した（ｐＫＴＶＩＨ−５）。
【０１５１】
　６．ｐＫＴＶＩＨ５　Ｎｅｏを、ＣｌａＩによりｐＫＴＶＩＨ５を線状化し、細菌性ｌａｃ　ＵＶ５プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター及びＴｎ５　Ｎｅｏrマーカーを含む１．８ＫｂのＣｌａＩフラグメントと共に混合し、連結し、細菌中に形質転換し、そして耐カナマイシン性について選択することによって構成した。示された配向で挿入体を有するクローンを、制限分析により同定した。
【０１５２】
　Ｃ．ＭＨＭＴＫ　Ｎｅｏレトロウィルスベクターの構成
　　（第９図を参照のこと）
　１．中間プラスミドＭＨＭ−１の構成：
　ａ）プラスミドｐＮ２ＣＲ５を、ＦｏＫＩにより部分的に消化することにより線状化し、５’オーバーハングをクレノウＤＮＡポリメラーゼを用いてデオキシヌクレオチド三リン酸によりフィルインし、そしてＨｉｎｄＩＩＩリンカーを挿入した。細菌中への形質転換の後、ＭＬＶ　ＬＴＲ　ＦｏＫＩ部位に挿入されたＨｉｎｄＩＩＩリンカーを有するクローンを制限酵素分析により同定した（ｐＮ２ＣＲ５ＦＨ）。
【０１５３】
　ｂ）ｐＮ２ＣＲ５ＦＨをＮｈｅＩにより線状化し、５’オーバーハングをクレノウポリメラーゼによりフィルインし、ＨｉｎｄＩＩＩにより消化し、そしてプロモーターを有さないＭＬＶ配列を有する４．３Ｋｂのフラグメントを単離した。
【０１５４】
　ｃ）０．５ＫｂのＥｃｏＲＶ／ＨｉｎｄＩＩＩ　ＨＩＶプロモーター配列をｐＳＫＨＬから単離した。
【０１５５】
　ｄ）ｂ及びｃを混合し、連結し、それを用いて細菌を形質転換し、そしてＭＨＭ−１の構造体を制限酵素分析により同定した。
【０１５６】
　２．ＭＨＭ−１から単離された０．７ＫｂのＥｃｏＲＶ／ＢａｌＩフラグメントを、プラスミドＩ３０ＢのＥｃｏＲＶ部位中にサブクローンした（変性されたＩＢＩ３０プラスミドは追加のＢｇｌＩＩ、ＢｓｔＩＩ、ＮｅｏＩ及びＮｄｅＩ部位をポリリンカーに含む）。細菌を形質転換した後、適切な配向を有するクローンを、制限酵素分析により同定した（ｐＭＨＭＢ）。
【０１５７】
　３．ｐＭＨＭＢをＡｐａＩ及びＸｈｏＩにより消化し、そしてゲル精製した。
【０１５８】
　４．ＭＨＭ−１をＡｐａＩ／ＢａｍＨＩにより消化し、そして１．８ＫｂのＭＨＭＬＴＲ／リーダー配列をゲル精製した。
【０１５９】
　５．Ｎｅｏrを動かすＳＶ４０初期プロモーターの上流にＨＳＶＴＫコード領域を含む２．８ＫｂのＢｇｌＩＩ／ＳａｌＩフラグメントを、ｐＴＫ−３から分離した（第３図を参照のこと）。
【０１６０】
　６．３〜５を混合し、連結し、それを用いて細菌を形質転換し、そして適切なクローンを制限酵素分析により同定した。
【０１６１】
　Ｄ．ｔａｔ及び抗−ｔａｔ発現ベクターの構成（第１０図を参照のこと）
　これらのベクターを、ｔａｔ−依存性ＨＳＶＴＫベクターを試験活性化するために偽−ＨＩＶとして使用した。
【０１６２】
　１．Ｈｉｓr発現ベクターｐＢａｍＨｉｓを、ＢａｍＨＩにより線状化し、そしてウシの腸のホスファターゼにより処理した。
【０１６３】
　２．ｐＣＶ−１のＳａｃＩ部位をＢａｍＨＩ部位に突然変異誘発し、そしてＨＩＶ　ｔａｔの３５０ｂｐのＢａｍＨＩコード配列を単離した。
【０１６４】
　３．第１及び２段階で精製されたフラグメントを、混合し、連結し、それを用いて細菌を形質転換し、そして両配向にｔａｔを有するクローンを、制限酵素分析により同定した。
【０１６５】
　これらの構造体を用いて、上記のようにして感染性組換えベクター粒子及びパッケージング細胞系、たとえばＰＡ３１７を生成した。
【０１６６】
　これらのレトロウィルスベクターの生物学的性質は、この後説明される。ＨＩＶ　ｔａｔ遺伝子（「ｔａｔｈｉｓ」ベクター、第１０図を参照のこと）をマウスＰＡ３１７細胞中にトランスフェクトした。５種の個々のヒスチジノール耐性サブクローン（ＴＨ１〜５）（ＨＩＶ　ｔａｔを発現する）を得た。これらの細胞は、ＨＩＶ感染のための実験モデルである。ベクターＫＴＶＩＨＡＸ、ＫＴＶＩＨ５ＮＥＯ及びＭＨＭＴＫＮＥＯを、これらのｔａｔ−発現細胞系及びｔａｔを欠くそれらの親細胞系中に、感染により連続的に導入する。次に、細胞の生存率を、ＨＳＶＴＫ−特異的細胞毒性薬物、アシクロビルの種々の濃度で決定した。そのデータは、ＬＤ５０（５０％の毒性が観察される薬物濃度）として本明細書に報告される。前記ベクターを含むが、しかしｔａｔを欠く親細胞系（非−ＨＩＶ−感染モデル）は、試験された濃度でＡＣＶによる検出不可能な毒性を示した。従って、これらの細胞は、細胞毒性のために１００μＭ又はそれ以上のＡＣＶを必要とする。これはまた、ベクターを欠くこれらの細胞についても真実である。従って、ベクター単独で、ＡＣＶ単独で又はベクター＋ＡＣＶでさえ、細胞毒性でない。しかしながら、ＨＩＶ　ｔａｔ（ＨＩＶ感染の実験的な表示）を発現する細胞系は、ＡＣＶにより効果的に殺害される。これは、試験されるすべての３種のベクターに関して種々の程度で真実である。これらのデータは、ＨＩＶ感染細胞が、ＡＣＶ及び「ポテンシエーター（ｐｏｔｅｎｔｉａｔｏｒ）」ベクターの存在下で殺害されるであろうことを指摘する。
【０１６７】
　同様に、ヒトＴ細胞系＋／−ＦＩＡＵのＨＩＶ感染は、ＨＩＶ感染の選択的な阻害（細胞殺害を通して）を付与する。培養物をまず、ベクターにより処理し、次に低い多重感染ＨＩＶにより４日間、挑戦せしめた。ウィルス上清液の力価を、セクションＩＶに記載されるようにして、ＨＩＶを用いて測定した。
【０１６８】
　ＨＩＶ感染細胞の場合、条件的に致死性のＨＳＶＴＫ遺伝子の発現は、最適活性のために追加のＨＩＶ遺伝子生成物、ｒｅｖを必要とする、転写物「ＣＲＳ／ＣＡＲ」）におけるｃｉｓ−作用成分の含有により、さらに一層、ＨＩＶを特異的にした（Ｒｏｓｅｎなど．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８５：２０７１、１９８８）。より一般的には、ｍＲＮＡに存在するｃｉｓ成分は、ある場合、ｍＲＮＡの安定性又は翻訳能力を調節することが示されている。このタイプの配列（すなわち遺伝子発現の転写後調節）は、ベクター遺伝子発現の出来事−又は組織や特異的調節のために使用され得る。これらの配列（すなわちＨＩＶのためのｒｅｖ−応答性「ＣＲＳ／ＣＡＲ」又はｔａｔ−応答性「ＴＡＲ」成分）の多重化は、さらに高い特異性をもたらすことができる。細胞における不活性前駆体の活性生成物へのこの種の条件活性化は、短い期間の効果を有する他のウィルスベクター、たとえばアデノウィルスベクターを用いて達成され得ることが注目される。
【０１６９】
　ベクター調製物の調製法、濃縮及び貯蔵は、これまで記載されている通りである。投与は、これまでのように直接的なインビボ投与により又はＰＢＬ及び／又は骨髄のｅｘ　ｃｏｒｐｏｒｅ処理による。投与量は例４における量とほぼ同じレベルであろう。ウィルスベクター感染の標的決定は、ＣＤ４受容体を通してではなく、ｇｐ１２０発現細胞（すなわちＨＩＶにより感染された細胞）の標的を決定するためにハイブリッドＭＬＶｅｎｖ−ＣＤ４「エンベロープ」タンパク質（セクションＶＩＩを参照のこと）を有するベクター粒子を製造することを通して達成され得る。実際に感染された細胞の標的を定めるために正常なウィルス−受容体相互作用のこの転換は、すべてのタイプのウィルスに関して使用され得る。
【０１７０】
　前記態様に類似する態様においては、レトロウィルスベクター構造体は、プリン−又はピリミジン−基材薬物のリン酸化、ホスホリボシル化、リボシル化又は他の代謝のための遺伝子を担持することができる。この遺伝子は哺乳類細胞においては等しくなく、そしてウィルス、細菌、菌類又は原生動物のような生物から生じる。この例は、チオキサンチンの存在下で致死性である、Ｅ．コリのグアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子生成物であろう（Ｂｅｓｎａｒｄなど．、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．　７：４１３９〜４１４１、１９８７を参照のこと）。このタイプの条件的に致死性の遺伝子生成物は、効果的な細胞毒性物質になるために、細胞内リボシル化又はリン酸化をしばしば必要とする、多くの現在既知のプリン−又はピリミジン−基材の抗癌剤への可能性ある適用を有する。条件的に致死性の遺伝子生成物はまた、プリン又はピリミジン類似体でない非毒性薬物を細胞毒性形に代謝する。
【０１７１】
　哺乳類ウィルスは一般的に、他のウィルスプロモーター成分からの、続く転写活性化のために必要である「即時初期」遺伝子を有する傾向がある。この性質の遺伝子生成物は、ウィルス感染の細胞内シグナル（又は「同定物質」）のための卓越した候補体である。従って、これらのウィルス「即時初期」遺伝子生成物に応答する転写プロモーター成分からの条件的に致死性の遺伝子は、いづれか特定のウィルスにより感染された細胞を特異的に殺害することができる。さらに、ヒトα及びβインターフェロンプロモーター成分は、広範囲の種類の非関連ウィルスによる感染に応答して転写的に活性化されるので、たとえばこれらのウィルス応答成分（ＶＲＥ）からの、ＨＳＶＴＫのような条件的に致死性の遺伝子生成物を発現するべクターの導入は、種々の異なったウィルスにより感染された細胞の破壊をもたらすことができる。
【０１７２】
　第５の態様においては、組換えレトロウィルスは、それ自体毒性でないが、しかしウィルス又は他の病原体に対して特異的であるプロテアーゼにより処理される場合、毒性形に転換される生成物を特定化する遺伝子を担持する。
【０１７３】
　第６の態様においては、レトロウィルス構造体は、細胞における同定物質（たとえばＨＩＶ　ｔａｔタンパク質）の存在に応答して標的細胞の表面上に「レポーター生成物」を発現することができる。この表面タンパク質は、細胞毒性物質、たとえばレポータータンパク質に対する抗体により、又は細胞毒性Ｔ細胞により認識され得る。類似する態様において、そのようなシステムは、同定タンパク質を発現する特定の遺伝子、たとえばＨＩＶ　ｔａｔ遺伝子を有するこれらの細胞を簡単に同定するために検出システム（下記参照のこと）として使用され得る。
【０１７４】
　同様に、第６の態様においては、それ自体、治療的に有益である表面タンパク質が発現される。ＨＩＶの特定の場合、ＨＩＶ−感染細胞におけるヒトＣＤ４タンパク質の発現は、下記の２つの手段において有益である：
　１．ＨＩＶ　ｅｎｖへのＣＤ４の細胞内結合は、そのタンパク質は膜に結合したまま存続し、そして内因性ＣＤ４（これに対して、患者は免疫学的に耐性であるべきである）に構造的に同一であるので、可能性ＣＤ４が遊離ウィルスの代役をすることが示されているように、但し系統的なクリアランス及び可能性ある免疫原性の問題を伴わないで、生存性ウィルス粒子の形成を阻害する。
【０１７５】
　２．ＣＤ４／ＨＩＶ　ｅｎｖ複合体は細胞の死の原因として含蓄されるので、ＣＤ４の追加の発現（ＨＩＶ−感染細胞に存在する過剰のＨＩＶ−ｅｎｖの存在下で）が、より急速な細胞の死を導びき、そして従ってウィルスの拡散を阻害する。これは特に、単球及びマクロファージに適用することができ、これはＨＩＶ−誘発細胞毒性に対するそれらの相対的な免疫性の結果としてウィルス産生のためのレザーバーとして作用する（それらの細胞表面上でのＣＤ４の相対的な欠乏により明らかである）。
【０１７６】
　（ｉｉｉ）免疫ダウン−レギュレーション
　たとえば慢性肝炎又は異種組織、たとえば骨髄の移植における不適切な又は所望しない免疫応答の特異的ダウン−レギュレーションは、抗−ＭＨＣクラスＩ遺伝子、たとえば免疫抑制ウィルス遺伝子を用いて構成され得る。グループＣのアデノウィルスＡｄ２及びＡｄ５は、ウィルスのＥ３領域にコードされる１９Ｋｄの糖タンパク質（ｇｐ１９）を有する。このｇｐ１９分子は、細胞の小胞体におけるクラスＩＭＨＣ分子に結合し、そして細胞表面へのクラスＩＭＨＣの末端グリコシル化及び翻訳を妨害する。たとえば、骨髄移植の前、供与体骨髄細胞は、ｇｐ１９の発現に基づいて、ＭＨＣクラスＩ移植抗原の表面発現を阻害するｇｐ１９−コードベクター構造体により感染され得る。これらの供与体細胞は、移植片拒絶の低い危険性を伴って移植され得、そして移植患者のために最少の免疫抑制法を要する。これは、許容できる供与体−受容体キメラ状態のより少ない複雑性を伴っての存在を可能にすることができる。類似する処置を使用して、いわゆる自己免疫疾患、たとえばエリテマトーデス、多発性硬化症、リウマチ様関節炎又は慢性Ｂ型肝炎の範囲を処理することができる。
【０１７７】
　ＩＶ．マーカーの発現
　ある同定物質に応答して、細胞中に緩和剤を発現する上記技法はまた、同定タンパク質を発現する細胞中の特定の遺伝子（たとえば特定のウィルスにより担持される遺伝子）の検出を可能にし、そして従って、そのウィルスを担持する細胞の検出を可能にするように変性され得る。さらに、この技法は、ウィルスに関連する同定タンパク質を担持する細胞の臨床サンプルにおけるウィルス（たとえばＨＩＶ）の検出を可能にする。
【０１７８】
　この変性は、生成物（該生成物の存在は、容易に同定され得る）（「マーカー生成物」）をコードし、そしてプロモーターを担持するゲノムを供給することによって違成され得、ここでプロモーターは、発現及び非発現状態の間でレポーター生成物の発現を変えることによって指示細胞における同定タンパク質の存在に応答する。たとえば、ＨＩＶは、それが適切な指示細胞を感染する場合、ｔａｔ及びｒｅｖを製造する。従って指示細胞は、マーカー遺伝子、たとえばβ−ガラクトシダーゼ遺伝子、アルカリホスファターゼ遺伝子又はルシフェラーゼ遺伝子、及びマーカー遺伝子の発現を制御するプロモーター、たとえばＨＩＶプロモーターをコードするゲノム（たとえば、適切な組換えレトロウィルスによる感染により）を供給され得る。指示細胞が試験されるべき臨床サンプルに暴露され、そしてそのサンプルがＨＩＶを含む場合、その指示細胞はＨＩＶにより感染され、その中でｔａｔ及び／又はｒｅｖの発現（同定タンパク質）をもたらす。次に、指示細胞におけるＨＩＶ発現の制御は、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェリン又はアルカリホスファターゼ（マーカー生成物）をコードする遺伝子の発現を、通常「切り」から「入り」にスイッチを変えることによって、ｔａｔ及び／又はｒｅｖタンパク質に応答するであろう。β−ガラクトシダーゼ又はアルカリホスファターゼの場合、基質相同体への細胞の暴露は、サンプルがＨＩＶに対して陽性である場合、色又は螢光の変化をもたらす。ルシフェラーゼの場合、ルシフェリンヘのサンプルの暴露は、サンプルがＨＩＶに対して陽性である場合、発光をもたらすであろう。細胞内酵素、たとえばβ−ガラクトシダーゼに関しては、ウィルス力価が、着色された又は螢光細胞を計数し、又は細胞抽出物を製造し、そして適切なアッセイを行なうことによって、直接的に測定され得る。分泌された酵素、たとえばアルカリホスファターゼの構成された形に関しては、培養上清液の少量のサンプルが活性についてアッセイされ、その時間にわたっての単一の培養物の連続したモニターを可能にする。従って、このマーカーシステムの異なった形が、種々の目的のために使用され得る。これらは、活性ウィルスの計数又は培養物におけるウィルスの拡散の敏感で且つ簡単な測定及び種々の薬物によるこの拡散の阻害を包含する。
【０１７９】
　追加の特異性は、ウィルスの存在について、そのウィルスに対する中和抗体が存在するか又は存在しないかにより試験することによって前記システム中に組込まれ得る。たとえば、試験される臨床サンプルの一部においては、ＨＩＶに対する中和抗体が存在し；ところが他の部分においては、中和抗体が存在しない。この試験が、抗体が存在するシステムにおいて陰性であり、そして抗体が存在しないシステムにおいて陽性である場合、これはＨＩＶの存在の確認を助けるであろう。
【０１８０】
　インビトロアッセイのための類似するシステムにおいて、特定の遺伝子、たとえばウィルス遺伝子の存在は、細胞サンプルにおいて決定され得る。この場合、サンプルの細胞は、対象のウィルスの発現制御に連結されるレポーター遺伝子を担持する適切なレトロウィルスベクターにより感染される。サンプル細胞に入った後、そのレポーター遺伝子は、宿主細胞が適切なウィルスタンパク質を発現する場合にのみ、そのレポーター生成物（たとえばβ−ガラクトシダーゼ又はルシフェラーゼ）を発現するであろう。
【０１８１】
　これらのアッセイはより敏速且つ敏感である。なぜならば、レポーター遺伝子は、増幅効果をもたらす、存在する同定物質よりも多量のレポーター生成物を発現することができるからである。例６は、同定タンパク質を発現する遺伝子を検出するための代表的な技法を記載する。
【０１８２】
　例６
　ＨＩＶ−特異的マーカーシステム又はアッセイ
　Ａ．構造体
　ＨＩＶ発現システムの制御下でのレポーター構造体は、第１２図（組換えレトロウィルスベクター）及び第１３図（トランスフェクションにより使用される単純なプラスミド）に示される。これらの好ましいベクター及びレポータープラスミドの断片は次の通りにして得られた：
　レトロウィルス主鎖は、構造体ｐＡＦＶＸＭ（Ｋｒｉｅｇｅｒなど．、Ｃｅｌｌ　３８：３８４、１９８４）に由来し、これはＸｈｏＩ及びＣｌａＩを用いて線状化されている。ＳＶ2ｎｅｏを、１．８ＫｂのＣｌａＩフラグメントの単離により、プラスミドｐＫｏｎｅｏ（Ｈａｎａｈｅｎ、未公開）から得た。
【０１８３】
　ＨＩＶ　ＬＴＲを、プラスミドｐＣ１５ＣＡＴ（Ａｒｙａなど．、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２２９：６９、１９８５）から０．７ＫｂのＨｉｎｄＩＩＩフラグメントとして単離した。β−ｇａｌを、プラスミドｐＳＰ６５　β−ｇａｌ（Ｃｅｐｋｏ、ｐｅｒｓ．ｃｏｍｍ．）からＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｍＩフラグメントとして得た。ヒト胎盤アルカリホスファターゼの分泌形を、アルカリホスファターゼの細胞表面形のアミノ酸４８９の後に、一般的なターミネーター配列の導入により生成した（Ｂｅｒｇｅｒなど．，Ｇｅｎｅ　６６：１、１９８８）。分泌されたアルカリホスファターゼ遺伝子を、１．８ＫｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＫｐｎＩフラグメントとして単離した。ＨＩＶ　ｅｎｖからのＣＲＳ−ＣＡＲ配列を、ＨＴＬＶＩＩＩＢ／ＢＨ１０Ｒ3（Ｆｉｓｈｅｒなど．、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３３：６５５、１９８６）から２．１ＫｂのＫｐｎＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを単離することによって得た。このフラグメントをＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩにより線状化されたｐＵＣ３１中に挿入した。
【０１８４】
　ｐＵＣ３１は、ｐＵＣ１９のＥｃｏＲＩとＫｐｎＩ部位との間に別のＸｈｏＩ、ＢｇｌＩＩ、ＢｓｓｈＩＩ及びＮｃｏＩ部位を有するｐＵＣ１９（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎなど．、Ｇｅｎｅ　３３：１０３、１９８５）である。得られた構造体のＢａｍＨＩ部位を、ＮｃｏＩ部位に転換し、ＮｃｏＩによる消化によるＣＲＳ−ＣＡＲ配列の再切断を可能にした。ＳＶ４０ｔイントロンを、ｐＳＶＯＬ（ｄｅＷｅｔなど．、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．　７：７２５、１９８７）から０．８ＫｂのＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩフラグメントとして得た。
Ｂ．指示細胞及びレトロウィルスベクター
　ヒトＴ細胞（Ｈ−９、ＣＥＭ及びＳｕｐＩ）及び単球（Ｕ−９３７）細胞系を、ＡＴＣＣから得、そして１０％のウシ胎児血清及び１％ぺニシリン／ストレプトマイシンにより補足されたＲＰＭＩ　１６４０培地に維持した。
【０１８５】
　非レトロウィルスベクターを、Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｇｅｎｅ　Ｐｕｌｓｅｒを用いてのエレクトロポレーションにより細胞系に導入した。その細胞系を、安定したＧ−４１８R細胞系を得るために２〜３週間、Ｇ−４１８（１ｍｇ／ｍｌ）において選択し、そしてクローン性細胞系を得るために希釈クローンした。
【０１８６】
　ｐＡＦベクターを、リン酸カルシウム沈殿物としてＰＡ３１７パッケージング細胞系中にトランスフェクトした（Ｗｉｇｌｅｒなど．、Ｃｅｌｌ　１６：７７７、１９７９）。ウィルス産生ＰＡ３１７細胞を、ポリブレンの存在下で２４時間、ヒト単球細胞系と共に同時培養し、この後その懸濁細胞を除き、そしてＧ−４１８中で選択し、そして上記のようにいてサブクローンした。
【０１８７】
　Ｃ．アッセイ
　安定細胞系をＨＩＶ（ＨＴＬＶＩＩＩB）により感染せしめ、そしてその細胞（β−ｇａｌ）又は培地（アルカリホスファターゼ）を、感染の後、６日間、毎日アッセイした。
【０１８８】
　β−ガラクトシダーゼアッセイ
　感染された細胞を、次のいづれかによりアッセイした：
（ｉ）ＭａｃＧｒｅｇｏｒなど．（Ｓｏｍａｔｉｃ　Ｃｅｌｌ　ａｎｄ　Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　１３：２５３、１９８７）により記載されるような現場組織化学的染色；又は（ｉｉ）基質としてＯＮＰＧを含む溶液酵素アッセイにおける細胞抽出物を用いて（Ｎｏｒｔｏｎ及びＣｏｆｆｉｎ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌ．Ｂｉｏｌ．　５：２８１、１９８５）。
【０１８９】
　可溶性アルカリホスファターゼアッセイ
　培地を感染された細胞から除き、１０秒間、マイクロ遠心分離し、そして次に６８℃に１０分間加熱し、内因性ホスファターゼを破壊した。次に、その培地を２分間マイクロ遠心分離し、そしてアリコート（１０〜５０μｌ）をアッセイのために除去した。緩衝液（１Ｍのジエタノールアミン、ｐＨ９．８；０．５ｍＭのＭｇＣｌ2；１０ｍＨのＬ−ホモアルギニン）１００μｌを添加し、そして次に１２０ｍＭのｐ−ニトロフェニルホスフェート（緩衝液中）２０μｌを添加した。その反応混合物のＡ405を、自動プレート読取機を用いてモニターした。
【０１９０】
　第１４及び１５図は、種々の濃度の抗ウィルス剤の存在下でアルカリホスファターゼアッセイを用いてＳｕｐＴＩ細胞の感染の時間進行の典型的な結果を示す。６日目での「＋」及び「−」は、シンシチアの存在又は不在を示す。
【０１９１】
　本発明は、多くの他の技法を提供し、これは、それらの性能を高めるために、上記で使用されたレトロウィルスベクターシステムと共に使用することができる。他方、これらの技法は、他の遺伝子−送出システムと共に使用され得る。
【０１９２】
　Ｖ．パッケージングの細胞の選択
　本発明のこの観点は、パッケージング細胞から低い組換えウィルス力価の主要原因及びこれらの原因を修正するための技法の発見に一部基づかれる。基本的には、少なくとも５種の要因が、低い組換えウィルス力価のための原因として仮定される：
　１．ウィルスパッケージングタンパク質の制限された利用性；
　２．レトロウィルスベクターＤＮＡゲノムの制限された利用性；
　３．組換えレトロウィルスの発芽のための細胞膜の制限された利用性；
　４．レトロウィルスベクターゲノムの制限された本質的なパッケージング効力；及び
　５．与えられたレトロウィルスのエンベロープに対して特異的な受容体の密度。
【０１９３】
　上記のように、ウィルスパッケージングタンパク質の制限された利用性は、パッケージング細胞からの組換えレトロウィルス生成における初期の制限因子である。パッケージング細胞におけるパッケージングタンパク質のレベルが高められる場合、力価は約１０5感染単位／ｍｍｌに上昇し、この後、上昇するパッケージングタンパク質のレベルは、力価に対してさらに効果を有さない。しかしながら、パッケージングのために利用できるレトロウィルスベクターゲノムのレベルを高めることによって、力価はさらに増大され得る。従って、ここに記載されるように、最大レベルのパッケージングタンパク質及びレトロウィルスベクターゲノムを産生する生成体細胞を選択することが好都合である。「発明の背景」のセクション下で記載された、パッケージング細胞及び生成体細胞の同定及び従って選択の方法は、下記理由のために低い力価を生成する多くの生成体細胞の選択を導く傾向があることが発見された。
【０１９４】
　本発明は、５’ＬＴＲ又は他のプロモーターから下流の遺伝子及び介在遺伝子によりそれらから間隔を開けられている前記遺伝子のタンパク質発現レベルは、前記介在遺伝子が不在の場合よりも実質的に低いこれまでの欠点事実を利用する。本発明においては、選択可能な遺伝子は、パッケージングゲノムの遺伝子又はベクター構造体により担持される対象の遺伝子から下流に配置されるが、しかしいづれのスプライス供与体又はスプライス受容体部位もなしに、ウィルス５’ＬＴＲ又は他のプロモーターの制御下でなお、転写される。これは２種の事実を完結せしめる。まず第１に、パッケージング遺伝子又は対象の遺伝子はそれらとプロモーターとの間に介在遺伝子を伴わないで下流に存在するので、それらの対応するタンパク質（パッケージングタンパク質又は対象のタンパク質）は、選択可能なタンパク質よりも高レベル（５〜２０倍）で発現されるであろう。第２に、選択可能なタンパク質は、低レベルの方に移る発現のレベルの分布を伴って、平均して低レベルで発現されるであろう。ｐｈｌｅｏrタンパク質の場合、この分布の移動は、第１６図に示される点線の曲線により示される。しかしながら、耐フレオマイシンに対する選択レベルは、同じで存続し、その結果、上部端の発現細胞のみが残存する。パッケージングタンパク質又は対照のタンパク質のレベルは、なお比例し、この場合においてのみ、選択可能なタンパク質のレベルが高くなるほど、パッケージングタンパク質又は対照のタンパク質のレベルはより高くなる。
【０１９５】
　好ましくは、前記方法は、プロウィルスｇａｇ／ｐｏｌ又はｅｎｖパッケージング遺伝子の１つ及び初めの選択可能な遺伝子を担持するプラスミドを用いて行なわれる。次に、これらの細胞は、ｅｎｖ（又はたぶんｇａｇ／ｐｏｌ）に対する抗体と第２螢光抗体との反応により最高レベルのタンパク質を生成する細胞についてスクリーンされ、そして次に螢光活性化細胞ソーターにより分類される。他方、タンパク質レベルについての他の試験も使用され得る。続いて、前記方法及びスクリーニングがこれらの選択された細胞及び他のｇａｇ／ｐｏｌ又はｅｎｖパッケージング遺伝子を用いてくり返される。この段階においては、第２の選択可能な遺伝子（第１のものとは異なる）はパッケージング遺伝子から下流に必要とされ、そして多量の第２ウィルスタンパク質を生成する細胞が選択される。次に前記方法及びスクリーニングが、対象の遺伝子及び第１又は第２の選択可能な遺伝子とは異なる第３の選択可能な遺伝子を生ぜしめるプロウィルスベクター構造体を担持するプラスミドを有する生存細胞を用いてくり返される。この方法の結果として、高い力価の所望する組換えレトロウィルスを生成する細胞が選択され、そしてこれらは、組換えレトロウィルスを供給する必要がある場合、培養され得る。さらに、ｇａｇ及びｐｏｌがそれぞれ導入され、そして選択される。
【０１９６】
　例７は、これらの方法を使用するように企画されたｇａｇ／ｐｏｌ及びｅｎｖプラスミドの構成法を説明する。
【０１９７】
　例７
　高レベルのパッケージングタンパク質を製造するように企画されたプラスミド（第７図）
　１．アンフォトロープ性ｅｎｖセグメントを含むｐＡＭＡ（Ｍｉｌｌｅｒなど．、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．　５：４３１、１９８５）からの２．７ＫｂのＸｂａＩフラグメントを、ＸｂａＩ部位でｐＵＣ１８中にクローン化し、次にＨｉｎｄＩＩＩ及びＳｍａＩにより除去した。このフラグメントを、ＨｉｎｄＩＩ及びＰｖｕＩＩにより切断されたベクターｐＲＳＶ　ｎｅｏ（Ｇｏｒｍａｎなど．、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．　２：１０４４、１９８２；Ｓｏｕｔｈｅｒｎなど．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．　１：３２７、１９８２）中にクローンし、ｐＲＳＶ　ｅｎｖを得た。フィルインされたＢｓｔＥＩＩ末端を有するプラスミドｐＵＴ５０７（Ｍｕｌｓａｎｔなど．、Ｓｏｍａｔ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．　１４：２４３、１９８８）からの０．７ＫｂのＢａｍＨＩ〜ＢｓｔＥＩＩフラグメントは、ｐｈｌｅｏ耐性コード配列を担持する。４．２ＫｂのＢａｍＨＩ〜ＸｈｏＩフラグメント、ＲＳＶｅｎｖからの隣接する１．６ＫｂのＸｈｏＩ〜ＸｂａＩ（フィルインされたＸｂａＩ）及びｐｈｌｅｏフラグメントを連結し、ｐＲＳＶｅｎｖ−ｐｈｌｅｏを得た。
【０１９８】
　２．ＭＬＹ（ＲＮＡ　Ｔｕｍｏｒ　Ｖｉｒｕｓｅｓ、第ＩＩ巻、１９８５、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ）のヌクレオチド５６３でのＰｓｔＩ部位〜５８７０でのＳｃａＩ部位のフラグメントは、ｐＭＬＶ−Ｋ（Ｍｉｌｌｅｒなど．，１９８５，　ｏｐ．ｃｉｔ）に由来し、そしてＳＶ４０プロモーター、耐アンピシリン性ｐＢＲ３２２及び複製の起点、及びＳＶ４０ポリＡ部位を有するｐ４ａＡ８（Ｊｏｌｌｙなど．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８０：４７７、１９８８）からのＰｓｔＩ〜ＢａｍＨＩ（フィルインされたＢａｍＨＩ）フラグメント中にクローンされた。これはｐＳＶｇｐを付与する。ｐＳＶｇｐＤＨＦＲを次のフラグメントを用いて製造した：ＳＶ４０プロモーター及びＭＬＹ　ｇａｇ並びにいくつかのｐｏｌ配列を含むｐＳＶｇｐからの３．６ＫｂのＨｉｎｄＩＩ〜ＳａｌＩフラグメント；ｐｏｌ遺伝子の残りを有するｐＭＬＶ−Ｋからの２．１ｋｂのｋｂ　ＳａｌＩ〜ＳｃａＩフラグメント、ＤＨＦＲ遺伝子及及びｐｏｌｙＡ部位、ｐＢＲ３２２起点及び耐アンピシリン遺伝子を有するｐＦ４００からの３．２ＫｂのＸｂａＩ（フィルインされたＸｂａＩ）〜ＰｓｔＩフラグメント；耐アンピシリン性遺伝子の他の半分を有するｐＢＲ３２２からのＯ．７ＫｂのＰｓｔＩ〜ＨｉｎｄＩＩＩフラグメント。これはｐＳＶｇｐ−ＤＨＦＲを付与する。すべてのこれらの構造体は第７図に示される。これらのプラスミドは３Ｔ３細胞又は他の細胞中にトランスフェクトされ得、そして高レベルのｇａｇ、ｐｏｌ又はｅｎｖが得られる。
【０１９９】
　選択を完結するための追加の方法は、１段階での遺伝子選択及び続く段階でのそのアンチセンスを使用することである。たとえば、ｇａｇ／ｐｏｌが、ＨＰＲＴ遺伝子を有するＨＰＲＴ−欠失細胞中に導入され、そしてプリンのサルベージのためにＨＰＲＴを必要とする培地を用いて、この遺伝子の存在について選択される。次の段階においては、ＨＰＲＴに対するアンチセンスがｅｎｖの下流に送られ、そして細胞がＨＰＲＴ−欠失表現型のために６−チオグアニン中において選択される。多量のアンチセンスＨＰＲＴが、逆戻りが生じないなら、ＨＰＲＴ遺伝子転写を不活性化するために必要とされる。
エンベロープ置換
　ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ機能を別々に発現する能力は、これらの機能の独立した操作を可能にする。十分な量のｇａｇ　ｐｏｌを発現する細胞系が、ｅｎｖに関する力価の問題を提供するために使用され得る。低い力価をもたらす１つの要因は、標的細胞又は組織上での適切な受容体分子の密度である。ｅｎｖ発現が別の単位から付与される場合、種々の源からの種々のエンベロープ遺伝子（異なった受容体タンパク質を必要とする）、たとえばキセノトロープ性、ポリトロープ性又はアンフォトロープ性ｅｎｖが、特定の標的組織に対する最高の力価について試験され得る。さらに、非ネズミレトロウィルス源からのエンベロープが、ベクターを偽型にするために使用され得る。さらに、ハイブリッドエンベロープ（下記に説明される）が、レトロウィルスベクターの同性を合せ（そして力価を効果的に高める）るために、このシステムにおいて同様に使用され得る。逆に、十分な量の与えられたエンベロープ遺伝子を発現する細胞系が、ｇａｇ及びｐｏｌに関する力価の問題を提供するために使用され得る。
【０２００】
　ＶＩ．他のウィルスベクターパッケージング技法
　２種の追加の他のシステムがベクター構造体を担持する組換えレトロウィルスを生成するために使用され得る。これらのシステムのそれぞれは、昆虫ウィルス、バキュロウィルス及び哺乳類ウィルス、ワクシニア及びアデノウィルスが多量のいづれか一定のタンパク質を製造するために最近適合された（このためにはその遺伝子がクローンされている）事実を利用する。たとえば、Ｓｍｒｉｔｈなど．（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．　３：１２、１９８３）；Ｐｉｃｃｉｎｉなど．（Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｍｏｌｏｇｙ，１５３：５４５、１９８７）；及びＭａｎｓｏｕｒなど．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８２：１３５９、１９８５）を参照のこと。
【０２０１】
　これらのウィルスベクターは、適切な遺伝子のウィルスベクター中への挿入により組織培養細胞中でタンパク質を生成するために使用され得、そして従ってレトロウィルスベクター粒子を製造するために適合され得る。
【０２０２】
　アデノウィルスは、核複製ウィルスに由来し、そして欠陥性である。遺伝子は、ベクター中に挿入され、そしてインビトロ構成（Ｂａｌｌａｙなど．，　ＥＮＢＯ　Ｊ．　４：３８６１、１９８５）又は細胞中での組換え（Ｔｈｕｍｍｅｌなど．，　Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　１：４３５、１９８２）のいづれかにより哺乳類細胞中にタンパク質を発現するために使用され得る。
【０２０３】
　１つの好ましい方法は、（１）ｇａｇ／ｐｏｌ、（２）ｅｎｖ、（３）変性されたウィルスベクター構造体を操作するアデノウィルスの主要後期プロモーター（ＭＬＰ）を用いてプラスミドを構成することである。変性されたウィルスベクター構造体は、ウィルスベクタープロモーターを含む、５’ＬＴＲのＵ３領域が他のプロモーター配列により置換され得るので可能である（たとえばＨａｒｔｍａｎ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１６：９３４５、１９８８を参照のこと）。この部分は、１段階の逆転写酵素の後、３’ＬＴＲからのＵ３により置換されるであろう。
【０２０４】
　次に、これらのプラスミドは、アデノウィルスゲノムをインビトロで製造するために使用され得（Ｂａｌｌａｙなど．，　ｏｐ．ｃｉｔ．）、そしてこれらを２９３細胞（アデノウィルスＥ１Ａタンパク質を製造するヒト細胞系）にトランスフェクトされ（このためにはアデノウィルスベクターは欠陥性であり）、欠陥アデノウィルスベクターに別々に担持されるｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ及びレトロウィルスベクターの純粋原液が得られる。そのようなベクターの力価は典型的には１０7〜１０11／ｍｌであるので、これらの原液は、組織培養細胞を高い多重性で同時に感染せしめるために使用され得る。次に、細胞は、レトロウィルスタンパク質及びレトロウィルスベクターゲノムを高レベルで生成するためにプログラムされるであろう。アデノウィルスベクターは欠陥性であるので、多量の直接的な細胞溶解は生ぜず、そしてレトロウィルスベクターはその細胞上清液から収穫され得る。
【０２０５】
　他のシステム（より細胞外性である）においては、次の成分が使用される：
　１．Ｓｍｒｉｔｈなど．（前記）により記載されたのと類似する態様でバキュロウィルスシステムにおいて製造されたｇａｇ／ｐｏｌ及びｅｎｖタンパク質（又は他のタンパク質生成システム、たとえば酵母又はＥ．コリにおいて）；
　２．既知のＴ７又はＳＰ６又は他のインビトロでのＲＮＡ生成システムにおいて製造されたウィルスベクターＲＮＡ（たとえばＦｌａｍａｎｔ及びＳｏｒｇｅ，　Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２：１８２７、１９８８を参照のこと）；
　３．（２）におけるようにして製造され又は酵母又は哺乳類組織培養細胞から精製されたｔＲＮＡ；
　４．リポソーム（固定されたｅｎｖタンパク質を有する）；
　５．ｅｎｖプロセッシング及びいづれか又は他の必要な細胞由来機能を提供する細胞抽出物又は精製された必要な成分（固定される場合）（典型的にはマウス細胞から）。
【０２０６】
　この方法においては、（１）、（２）及び（３）が混合され、そして次に、ｅｎｖタンパク質、細胞抽出物及びプレリポソーム混合物（適切な溶媒中における脂質）が添加される。しかしながら、（１）、（２）及び（３）の混合物にその得られたリポソーム固定ｅｎｖを添加する前、リポソームにおけるｅｎｖタンパク質を早めに固定することが必要である。その混合物は処理され（たとえば音波処理、温度操作又は回転透析により）、医薬物のリポソームカプシド化に関して、Ｇｏｕｌｄ−Ｆｏｇｅｒｉｔｏなど．，　Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．　１４８：１５、１９８５）に記載されているのと類似する態様で、脂質＋固定されたｅｎｖタンパク質による新生ウィルス粒子のカプシド化を可能される。この方法は、病原性レトロウィルス又は複製コンピテントレトロウィルスによる汚染を伴わないで、高い力価の複製インコンピテント組換えレトロウィルスの生成を可能にする。
【０２０７】
　ＶＩＩ．細胞系−特異的レトロウィルス−「ハイブリッドエンベロープ」
　レトロウィルスの宿主細胞範囲特異性を、ｅｎｖ遺伝子生成物により一部決定する。たとえば、Ｃｏｆｆｉｎ．Ｊ．（ＲＮＡ　Ｔｕｍｏｒ　Ｖｉｒｕｓｅｓ　２：２５〜２７、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、１９８５）は、ネズミ白血病ウィルス（ＭＬＶ）及びＲｏｕｓ　Ｓａｒｃｏｍａウィルス（ＲＳＶ）からのタンパク質の細胞外成分が特定の受容体結合を担当することを示す。他方、エンベロープタンパク質の細胞質ドメインは、ビリオン形成の役割を演ずることが理解されている。偽型化（すなわち他の種のウィルスタンパク質による１つの種からのウィルスＲＮＡのカプシド化）が、低い頻度で生じる場合、エンベロープタンパク質は、与えられたレトロウィルスのビリオン形成のためにある特異性を有する。本発明は、ハイブリッドｅｎｖ遺伝子生成物（すなわち、特に、天然において同じタンパク質分子に存在しない細胞質領域及び外因性結合領域を有するｅｎｖタンパク質）を創造することによって、宿主範囲の特異性は、細胞質機能かち独立的に変更され得ることを示す。従って、前もって選択された標的細胞に特異的に結合するであろう組換えレトロウィルスが生成され得る。
【０２０８】
　受容体結合成分及び細胞質成分が異なったレトロウィルスからであるハイブリッドタンパク質を製造するためには、組換えのための好ましい位置づけが、細胞質成分の腹−スパン領域内に存在する。例８は、ＭＬＶエンベロープタンパク質の細胞質ドメインに結合されるＨＩＶエンベロープタンパク質のＣＤ４結合部分を有するタンパク質を発現するハイブリッドｅｎｖ遺伝子の構造体を記載する。
【０２０９】
　例８
　ハイブリッドＨＩＶ−ＭＬＶエンベロープ
　ハイブリットエンベロープ遺伝子を、連結の適切な点に新しい制限部位を導入するためにインビトロ突然変異誘発（Ｋｕｎｋｅｌ，　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８２：４８８〜４９２、１９８５）を用いて調製する。他方、２種のエンベロープ配列が同じプラスミド上に存在する場合、それらは、インビトロ突然変異誘発を用いていづれか所望する点に直接連結され得る。いづれの場合でも、最終結果物は、ＨＩＶ　ｇｐ１６０の５’末端及びＭＬＢ　ｐ１５Ｅの３’末端を含むハイブリッド遺伝子である。その得られた組換え遺伝子により発現されるハイブリッドタンパク質は第１８図に示され、そしてＨＩＶ　ｇｐ４１の細胞外部分（ｇｐ１２０結合領域及び融合領域）、ＨＩＶ　ｇｐ１２０（ＣＤ４受容体結合タンパク質）及びＭＬＶ　ｐ１５Ｅの細胞質部分並びに宿主膜内のいくつかの点のいづれかで存在する連結部を含む。第１８図に示される新規のＥｃｏＲＩ部位での融合により製造されるハイブリッド遺伝子は、ヒトＳｕｐＴＩ細胞におけるＣＭＶＩＥ遺伝子の制御下で発現され、そして真のＨＩＶ　ｅｎｖ遺伝子によくあることであるが、シンシチアを導く。従って、そのハイブリッドは、細胞表面に正しく運ばれ、そしてそこで表示される。
【０２１０】
　例８は、２種の異なったレトロウィルスから生成される１つのハイブリッドタンパク質を示すが、その可能性は、レトロウィルス又は単に他のウィルスに限定されない。たとえばヒトインターロイキン−２のβ−受容体部分は、ＭＬＶのエンベロープタンパク質と組合され得る。この場合、組換えは、好ましくは、損なわれていないｐ１５Ｅタンパク質を残して、ＭＬＶ　ｅｎｖ遺伝子のｇｐ７０部分に位置する。さらに、前記技法を用いて、抗体Ｆｃセグメントを認識するエンベロープタンパク質を有する組換えレトロウィルスを創造することができる。次に、前もって選択された標的細胞のみを認識するモノクローナル抗体は、そのようなエンベロープタンパク質を示すそのような組換えレトロウィルスに結合され、その結果そのレトロウィルスはそれらの前もって選択された標的細胞に結合し、そしてそれらの細胞を感染せしめる。
【０２１１】
　ＶＩＩＩ．部位特異的組込み
　染色体上の予定された位置へのレトロウィルスベクターの目標決定は、遺伝子送出しシステムの利益を高める。高い安定性が染色体上の「安全な」スポットヘの直接的な組込みにより得られ、すなわちベクターの挿入から有害な結果を有さないことが証明された。もう１つの可能性ある利益は、染色体の「開放」領域に遺伝子を向ける能力であり、ここでその発現は最大にされる。特定の部位にレトロウィルスを組込むための２種の技法が下記に示される。
【０２１２】
　（ｉ）相同性組換え
　標的細胞のＤＮＡにおける特定の部位中に組換えレトロウィルスのベクター構造体の外因性遺伝子を組込むための１つの技法は、相同性組換え法を使用する。ゲノム配列に相同である約３００ｂｐ以上のＤＮＡ配列を含むプラスミドは、そのような相同性の不在下での特定の相互反応にわたって１０3倍以上の割合で、それらのゲノム配列と相互作用（置換又は挿入により）することが示された（Ｔｈｏｍａｓ及びＣａｐｅｃｃｈｉ，　Ｃｅｌｌ　５１：５０３〜１２、１９８７；及びＤｏｅｔｓｃｈｅｍａｎなど．、Ｎａｔｕｒｅ　３３０：５７６〜７８、１９８７を参照のこと）。挿入又は置換は、ベクターの特定の企画により操作され得ることが示された。
【０２１３】
　部位特異的レトロウィルス組込みに相同性組換え法を使用するためには、ベクター構造体は、（ａ）相同配列（標的の細胞ゲノムに対して）が適切な位置でその構造体中に組込まれ；そして（ｂ）組込みの正常な機構が相同配列により生じる目標決定を妨害しないように変性されるべきである。これに関する好ましいアプローチは、Ｕ３逆方向反復体から下流に、３’ＬＴＲに相同配列（約３００ｂｐ以上の配列）を付加することである。このアプローチにおいては、構造体は初め、Ｕ３におけるＮｈｅＩ部位で３’ＬＴＲに挿入された相同の領域により製造される。宿主細胞中での逆転写は、挿入された反復体（ＩＲ）の末端の３１ｂｐ内で５’ＬＴＲにおける相同の領域の重複をもたらすであろう。宿主ゲノム中への組込みは、正常な組込み機構の存在又は不在下で生じるであろう。ベクター中の遺伝子は、ＬＴＲからであろうと、又は内部プロモーターからであろうと発現され得る。このアプローチは、二本鎖レトロウィルスベクターゲノムの可能性ある自由端近くに相同の領域を配置する効果を有する。自由端は、約１０倍、相同性組換えの頻度を高めることが知られている。このアプローチにおいては、組込みの正常な機構を打ち破り、又はその工程を遅くするためにそれを少なくとも変性し、相同性ＤＮＡの列挙する時間を考慮する必要がある。この後者の変性が特定の場合に必要とされるかどうかは、当業者により容易に確められ得る。
【０２１４】
　（ｉｉ）インテグラーゼ変性
　標的細胞のゲノムの前もって選択された特定の部位にベクター構造体を組込むためのもう１つの技法は、インテグラーゼ変性を包含する。
【０２１５】
　レトロウィルスｐｏｌ遺伝子生成物は一般的に４種の部分に処理される：（ｉ）ウィルスｇａｇ及びｐｏｌ生成物を処理するプロテアーゼ；（ｉｉ）逆転写酵素；（ｉｉｉ）ＲＮＡ／ＤＮＡ複合体のＲＮＡを分解するＲＮａｓｅ　Ｈ；及び（ｉｖ）エンドヌクレアーゼ又は「インテグラーゼ」。
【０２１６】
　一般的なインテグラーゼ構造は、Ｊｏｈｎｓｏｎなど．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８３：７６４８〜７６５２、１９８６）により分析された。このタンパク質は、レトロウィルス配列を組込む前、宿主ＤＮＡと相互作用する亜鉛結合フィンガーを有する。
【０２１７】
　他のタンパク質においては、そのような「フィンガー」は、特定の配列でＤＮＡへのそのタンパク質への結合を可能にする。１つの代表的な例は、ステロイド受容体である。この場合、エストロゲン受容体遺伝子におけるエストロゲン受容体フィンガーセグメントの代わりに、グルココルチコイド受容体「フィンガー」（すなわちＤＮＡ結合セグメント）を単純に置換することによって、エストロゲンに応答するエストロゲン受容体をグルココルチコイドに応答するグルココルチコイド受容体の効果にすることができる。この例においては、ゲノムにおける位置（これにタンパク質が目標を定められる）が変えられた。そのような指図配列はまた、存在する亜鉛フィンガーの代わりにインテグラーゼ遺伝子中に置換され得る。たとえば、ヒトエストロゲン受容体遺伝子のＤＮＡ結合領域をコードするセグメントは、パッキングゲノムにおけるインテグラーゼのＤＮＡ結合領域の代わりに置換され得る。最初に、特異的組込みがインビトロ組込みシステム（Ｂｒｏｗｎなど．、Ｃｅｌｌ　２９：３４７〜３５６、１９８７）により試験される。特異性がインビボで見られることを確かめるために、このパッケージングゲノムを用いて、感染性ベクター粒子を製造し、そしてエストロゲン−感受性及びエストロゲン−非感受性細胞の感染及びそれらの細胞への組込みを培養において比較する。
【０２１８】
　この技法の使用により、得られるウィルスベクターは、インテグラーゼゲノム中にスプライスされた部位特異性ＤＮＡ結合タンパク質セグメントのゲノム結合性質により指図される、標的細胞のゲノム上の予備選沢された部位中への組込みに向けられ得る。組込み部位は実際、変性されたインテグラーゼのフィンガーを受け入れるべきであることは当業者により理解されるであろう。たとえば、ほとんどの細胞はグルココルチコイドに対して感受性であり、そして従って、それらのクロマチンはグルココルチコイド受容体のための部位を有する。従って、ほとんどの細胞に関しては、グルココルチコイド受容体フィンガーを有する変性されたインテグラーゼは、これらのグルココルチコイド受容体結合部位でプロウィルスベクター構造体を組込むのに適切である。
【０２１９】
　ＩＸ．トランスジニック動物での組換えレトロウィルスベクターの生成
　レトロウィルスベクターのヘルパー系生成に関してこれまで記載された２つの問題は：（ａ）多量のベクターの生成の困難性；及び（ｂ）ベクターを製造するために一次細胞の代わりに永久的な細胞を使用する現在の必要性である。これらの問題は、トランスジニック動物に生成される生産体又はパッケージング系により克服され得る。これらの動物は、パッケージングゲノム及びレトロウィルスベクターゲノムを担持する。現在の技法は、一次細胞でのパッケージング細胞系及び所望するベクター産生系の生成をそれらの制限された寿命期間のために可能としない。現在の技法は、一次細胞の使用を排除する広範な特徴づけが必要である。しかしながら、トランスジニック動物の個々の細胞系は、パッケージング機能、たとえばｇａｇ、ｐｏｌ又はｅｎｖを生成する本明細書に提供される方法により生成され得る。次にこれらの動物の細胞系は、パッケージング機能を転写するハウスキーピング又は組織特異性プロモーターの選択的な使用を通して完全な動物又は標的を定められた組織のいづれかにおける発現のために特徴づけられる。送出されるべきベクターもまた、組織特異的プロモーター又はハウスキーピングプロモーターを有するトランスジニック動物系に挿入される。上記で論じたように、ベクターは、５’ＬＴＲのＵ３領域を置換するそのようなプロモーターを排除され得る（第１９図）。このトランス遺伝子は、その発現において誘発性であり、又は遍在性である。しかしながら、このベクターはパッケージされない。次にこれらの動物系は、ｇａｇ／ｐｏｌ／ｅｎｖ動物と交配され、そして続く子孫がパッケージされたベクターを生成する。実質的に同一であるそれらの子孫が特徴づけられ、そして一次産生細胞の無限な源を提供する。他方、ｇａｇ／ｐｏｌ及びｅｎｖを製造し、そしてトランスジニック動物に由来する一次細胞は、一次細胞産生系を製造するためにレトロウィルスベクターにより多量、感染され又はトランスフェクトされ得る。多くの異なったトランスジニック動物又は昆虫、たとえばマウス、ラット、鶏、豚、ウサギ、牛、羊、魚及びハエは、それらのベクターを産生することができる。そのベクター及びパッケージングゲノムは、組織特異性プロモーター及び種々のエンベロープタンパク質の使用により、種感染特異性及び組織特異性発現のために適合される。そのような方法の例は、第２０図に示される。
【０２２０】
　一次パッケージング系のトランスジニック生成の次の例はマウスについてのみ記載されているが、これらの方法は当業者により他の種に拡張され得る。マウスゲノムにおいてＭＬＶ配列に対する相同性が与えられる場合、その最終的に好ましい動物はマウスでない。
【０２２１】
　例９
　トランスジニック動物における遍在性発現のためにハウスキーピングプロモーターを用いてのＧａｇ−Ｐｏｌタンパク質の産生
　十分に特徴づけられたハウスキーピングプロモーターの例は、ＨＰＲＴプロモーターである。ＨＰＲＴは、すべての組織において発現するプリンサルベージ酵素である（Ｐａｔｅｌなど．、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．　６：４〜４０３、１９８６及びＭｅｌｔｏｎなど．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．　８１：２１４７〜２１５１、１９８４を参照のこと）。このプロモーターは、組換えＤＮＡ技法（Ｍａｎｉａｔｉｓなど．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　Ｍａｎｕａｌ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、１９８２を参照のこと）を用いて、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミド（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ，　Ｉｎｃ．）でクローンされる種々のｇａｇ／ｐｏｌフラグメント（たとえばＢａｌＩ／ＳｃａＩ；ＡａｔＩＩ／ＳｃａＩ；ＭｏＭＬＶのＰｓｔＩ／ＳｃａＩ；ＲＮＡ　Ｔｕｍｏｒ　Ｖｉｒｕｓｅｓ　２、１９８５　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８５を参照のこと）の前に挿入される。その得られたプラスミドを精製し（Ｍａｎｉａｔｉｓなど．、ｏｐ．ｃｉｔ．）、そして適切な遺伝子情報をＧｅｎｅｃｌｅａｎ（Ｂｉｏ　１０１）又はエレクトロエルーシヨン（Ｈｏｇａｎなど．（出版社）Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ　ｔｈｅ　Ｍｏｕｓｅ　Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ．　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｂｏｒ、１９８６を参照のこと）を用いて分離する。
【０２２２】
　これらの十分に特徴づけられたＤＮＡを、２μｇ／ｍｌの濃度で受精されたマウスの卵子の前核にマイクロインジェクトする。生存する生まれたマウスを、テイルブロット分析（Ｈｏｇａｎなど．、ｏｐ．ｃｉｔ．を参照のこと）によりスクリーンする。トランスジニック−陽性動物を、放射性ラベルされた一次細胞、たとえば繊維芽細胞の免疫沈殿法によりｇａｇ−ｐｏｌタンパク質の発現レベルについて特徴づける（Ｈａｒｌｏｗなど．、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ；Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、１９８８を参照のこと）。次に、動物を、ｇａｇ−ｐｏｌの特徴づけられたレベルを産生する動物系の確保のために、ホモ接合度に繁殖せしめる。
【０２２３】
　例１０
　トランスジニック動物における遍在性発現のためにハウスキーピングプロモーターを用いてのｅｎｖタンパク質／ハイブリッドエンベロープタンパク質の産生
　この例は、エンベロープ又はハイブリッドエンベロープタンパク質のいづれかの発現のためにＨＰＲＴプロモーターを使用する。このエンベロープタンパク質は、ＭＬＬの場合において、適切なｇａｇ−ｐｏｌを補うことができるいづれかのレトロウィルスからである。例は、エコトロピックＭＬＶ、アンフォトロピックＭＬＶ、キセノトロピックＭＬＶ、ポリトロピックＭＬＶ又はハイブリッドエンベロープである。上記のように、エンベロープ遺伝子は、組換えＤＮＡ技法（Ｍａｎｉａｔｉｓなど．、ｏｐ．ｃｉｔ．を参照のこと）を用いて、ＨＰＲＴプロモーターの後ろにクローンされる。得られた「小遺伝子（ｍｉｎｉｇｅｎｅ）」は単離され（Ｈｏｇａｎなど．、ｏｐ．ｃｉｔ．を参照のこと）、そしてエンベロープタンパク質の発現が決定される（Ｈａｒｌｏｗなど．、ｏｐ．ｃｉｔ．）。トランスジニックエンベロープ動物を、十分に特徴づけられたエンベロープ動物を得るために、ホモ接合度に繁殖せしめる。
【０２２４】
　例１１
　トランスジニック動物における遍在性発現のためにハウスキーピングプロモーターを用いてのｇａｇ−ｐｏｌ−ｅｎｖ動物の産生
　これは、十分に特徴づけられたｇａｇ−ｐｏｌ動物及び永久的なｇａｇ−ｐｏｌ／エンベロープ動物系の確立のための動物を使用する。これは、ホモ接合度への繁殖及び十分に特徴づけられた系統の確立を包含する。次に、これらの系統は、組織培養においてパッケージングベクターのために使用され得る一次マウス胚系を得るために使用される。さらに、レトロウィルスベクターを含む動物は、この系統中に繁殖される。
【０２２５】
　例１２
　トランスジニック動物におけるｇａｇ−ｐｏｌ−ｅｎｖ又はハイブリッドエンベロープの組織特異性発現の産生
　この例は、特定の組織、たとえばＴ細胞へのｇａｇ　ｐｏｌ、エンベロープ又はハイブリッドエンベロープの組織発現を指図することである。これは、位置及びコピー数を付与されているＣＤ２配列（Ｌａｎｇなど．、ＥＭＢＯ　Ｊ．　７：１６７５〜１６８２、１９８８を参照のこと）の使用を包含する。ＣＤ２遺伝子からの１．５ＫｂのＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを、組換えＤＮＡ技法を用いてｇａｇ−ｐｏｌ、エンベロープ又はハイブリッドエンベロープフラグメントの前に挿入する。これらの遺伝子を、マイクロインジェクションにより受精されたマウスの卵子中に注入する。トランスジニック動物を前のようにして特徴づける。Ｔ細胞の発現を確立する。動物をホモ接合度に繁殖し、トランスジニック動物の十分に特徴づけられた系統を確立する。Ｇａｇ−ｐｏｌ動物とエンベロープ動物とを接合し、Ｔ細胞のみを発現するｇａｇ−ｐｏｌ−ｅｎｖ動物を得る。次に、これらの動物のＴ細胞は、レトロウィルスベクターをパッケージングできるＴ細胞のための源である。再び、ベクター動物とこれらのｇａｇ−ｐｏｌ−ｅｎｖ動物とを交配し、ベクターを発現するＴ細胞を得る。
【０２２６】
　この技法は、他の組織特異性プロモーター、たとえばミルク特異性（Ｗｈｅｙ）プロモーター、膵臓（インシュリン又はエラスターゼ）プロモーター、又はニューロン（ミエリン基材タンパク質）プロモーターの使用を可能にする。プロモーター、たとえばミルク特異性プロモーターの使用を通して、組換えレトロウィルスが、その子孫の生物学的流体から直接的に単離される。
【０２２７】
　例１３
　トランスジニック動物におけるハウスキーピング又は組織特異性レトロウィルスベクターのいづれかの産生
　トランスジニック動物の生殖系中へのレトロウィルス又はレトロウィルスベクターの挿入は、ほとんど又はまったく発現をもたらさない。Ｊａｅｎｉｓｃｈ（Ｊａｈｎｅｒなど．、Ｎａｔｕｒｅ　２９８：６２３〜６２８、１９８２を参照のこと）により記載されるこの結果は、５’レトロウィルスＬＴＲ配列のメチル化によるものである。
【０２２８】
　この技法は、レトロウィルスベクター／レトロウィルスを発現するハウスキーピング又は組織特異性プロモーターのいづれかを置換することによってそのメチル化効果を克服する。エンハンサー成分を含む、５’ＬＴＲのＵ３領域を、ハウスキーピング又は組織特異性プロモーターからの調節配列により置換する。その３’ＬＴＲは、ウィルスＲＮＡのポリアデニル化及び組込みのために必要な配列を含むように、十分に保持される。レトロウィルスの複製の一般的な性質の結果として、組込まれたプロウィルスの５’ＬＴＲのＵ３領域は、感染ウィルスの３’ＬＴＲのＵ３領域により生成される。従って、３’は必要であるが、しかし５’のＵ３はなくてもよい。５’ＬＴＲのＵ３配列とプロモーターとの置換及びトランスジニック動物の生殖系中への挿入は、レトロウィルスベクター転写物を産生できる動物系をもたらす。次に、これらの動物をｇａｇ−ｐｏｌ−ｅｎｖ動物に交配し、レトロウィルス産生動物を生成する（第２０図を参照のこと）。
【０２２９】
　前述の発明は、明確に理解するために例示的且つ例的にいくらか詳細に記載されているけれども、請求の範囲内で修飾及び変更を行なうことができる。
【図面の簡単な説明】
【０２３０】
【図１】図１は、ＨＩＶ　ｅｎｖを生成するために使用されるベクターの３種の異なった種類を示し、そしてこれは挿入される選択可能なＳＶ−Ｎｅｏカセットを有しても良く又は有さなくても良い。
【図２】図２は、示されるベクターによりトランスフェクトされたヒトＳｕｐＴＩ細胞の抽出物のＨＩＶ　ｅｎｖ特異的ラジオイムノ沈殿物のポリアクリルアミドゲル電気泳動に見出されるＨＩＶ　ｅｎｖ発現レベルを示す。マーカーはキロドルトンで存在し、ｇｐ１６０及びｇｐ１２０は適切なタンパク質を示し、そして５１７＋ｔａｔは陽性の対照（ｔａｔの存在下でのＨＩＶ　ＬＴＲ推進性ｅｎｖ）である。
【図３】図３は、ＨＩＶ　ｅｎｖ（このベクターはｐＡＦ／ｅｎｖ−ＳＶ−Ｎｅｏである）を発現する有性生殖性腫瘍細胞により注射されたマウスに誘発されるＴ細胞殺害を試験するための方法を示す。
【図４】図４は、図３の実験方法の結果を図的に示す。特異的殺害は、ＢＣ１０ＭＥｅｎｖ−２９殺害ｖｓ．殺害に対するＢ／Ｃ１０ＭＥ耐性のグラフの上部に見られる。
【図５】図５は、ｓＣＤ４を発現するように企画されたベクターを示す。
【図６】図６は、ベクターＴＫ１（ＳＶ−Ｎｅｏを含まない）及びＴＫ３（ＳＶ−Ｎｅｏを含む）を担持するプラスミドの構成を示す。
【図７】図７は、ベクターＫＴＶＩＨＡＸを担持するプラスミドの構成を示す。
【図８】図８は、ベクターＫＴＶＩＨ５（ＳＶ−Ｎｅｏを有さない）及びＫＴＶＩＨＮｅｏ（ＳＶ−Ｎｅｏを有する）を担持するプラスミドの構成を示す。
【図９】図９は、ベクターＭＨＭＴＫ−Ｎｅｏを担持するプラスミドの構成を示す。
【図１０】図１０は、ｔａｔ−ｈｉｓ（センス方向におけるｔａｔ）又はαｔａｔ（アンチセンス方向におけるｔａｔ）ベクターを担持するプラスミドの構成を示す。
【図１１】図１１は、３種の条件づけされた致死ベクターによる感染及びアシクロバー（ＡＣＶ）による処理に基づいて、対照ＰＡ３１７に比べてのｔａｔｈｉｓベクター（５個のクローン、ＴＨ１〜５）により感染されたＰＡ３１７細胞の選択的な殺害を図的に示す。
【図１２】図１２は、ＨＩＶ誘発性マーカー／レポーター遺伝子、たとえばアルカリホスファターゼ（ＡＰ）を担持するウィルスベクターの構成を示す。
【図１３】図１３は、細胞中にトランスフェクトされ得るプラスミド上に担持されるＨＩＶ誘発性マーカー／レポーター遺伝子の構造を示す。
【図１４】図１４は、ＡＺＴの種々の濃度で、ＨＩＶを有する図１３のＡＰマーカーを担持するＳｕｐＴＩ細胞のＨＩＶ感染の時間経過を図的に示す。ＨＩＶ感染のレベルは、上清液の少量のアリコートを取ることによって測定された。
【図１５】図１５は、図１４におけるのと同じ実験の結果を図的に示すが、しかしＨＩＶインヒビターとしてｄｄＣを用いる。
【図１６】図１６は、プロモーター（右）から直接的なフレオマイシン耐性遺伝子を発現するプラスミド及びそれとプロモーターの間に位置するコード配列を有するＰＲＧを発現するもう１つのプラスミドによる細胞のトランスフェクションに基づくフレオマイシン選択の後、生存する細胞の数を図的に示す。
【図１７】図１７は、哺乳類細胞においてレトロウィルスタンパク質を発現するように企画された４種のプラスミドを示す。ｐＳＶｇｐ及びｐＲＳＶｅｎｖは選択可能なマーカーにより同時トランスフェクトされ、そしてｐＳＶｇｐ−ＤＨＦＲ及びｐＲＳＶｅｎｖ−ｐｈｌｅｏは、ウィルスタンパク質−コード領域の下流に位置する選択可能なマーカーを有する同等のプラスミドである。
【図１８】図１８は、新規の適合する制限酵素部位を創造するために両コード配列の特定部位を突然変異誘発した後のＨＩＶ　ｅｎｖ及びＭＬＶ　ｅｎｖの融合の３種の部位を示す。Ｎ末端配列は、両者において左側に存在する。数字はヌクレオチド数に応じる。ＳＴ、ＳＲ、ＳＥはｔａｔ，　ｒｅｖ及びｅｎｖの開始であり、ＴＴ、ＴＲ及びＴＥはその対応する終結部位である。
【図１９】図１９は、領域におけるＳａｃＩ，　ＢｓｓｔＩＩ又は他の部位のいづれかに融合され得る異種プロモーター／エンハンサーによる５’ＬＴＲのＵ３の置換を示す。
【図２０】図２０は、ウィルスタンパク質又はベクターＲＮＡを発現するトランス遺伝子性マウスを交差するための代表的な方法を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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