(57)【要約】【課題】バルキングの原因となる糸状微生物の増殖抑制方法を提供する。【解決手段】活性汚泥のバルキングの原因となる糸状微生物に感染して溶菌させる性質を有するバクテリオファージを活性汚泥に添加することを特徴とする糸状微生物の増殖抑制方法。【選択図】　　　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
活性汚泥のバルキングの原因となる糸状微生物に感染して溶菌させる性質を有するバクテリオファージを活性汚泥に添加することを特徴とする糸状微生物の増殖抑制方法。
【請求項２】
該糸状微生物は、Ｔｙｐｅ０２１Ｎ、Ｔｈｉｏｔｈｒｉｘ、Ｔｙｐｅ００４１、Ｔｙｐｅ０９６１、Ｓｐｈａｅｒｏｔｉｌｕｓ　ｎａｔａｎｓ、Ｍｉｃｒｏｔｈｒｉｘ　ｐａｒｖｉｃｅｌｌａ、Ｈａｌｉｓｃｏｍｅｎｏｂａｃｔｅｒ　ｈｙｄｒｏｓｓｉｓ、Ｔｙｐｅ００９２、Ｎｏｃａｒｄｉａ、Ｔｙｐｅ１８５１、Ｔｙｐｅ１７０１、Ｔｙｐｅ０６７５、Ｔｙｐｅ０９１４、Ｎｏｓｔｏｃｏｉｄａ　ｌｉｍｉｃｏｌａ、及びＢｅｇｇｉａｔｏａからなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項１に記載の糸状微生物の増殖抑制方法。
【請求項３】
該バクテリオファージは、活性汚泥に１０２ｐｆｕ／ｍｌ以上１０８ｐｆｕ／ｍｌ以下の量で添加される、請求項１または２に記載の糸状微生物の増殖抑制方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、糸状微生物の増殖抑制方法に関するものである。より詳しくは、本発明は、糸状微生物に感染するバクテリオファージを用いて糸状微生物の異常増殖を抑制する方法、およびそれに伴って活性汚泥のバルキングを防止する技術に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
活性汚泥を利用した水処理において、活性汚泥の圧密性が低下して浮かび上がる現象をバルキングという。バルキングによって、活性汚泥の分離性は悪化し、水処理効率が低下する。バルキングの原因の大半は活性汚泥での糸状微生物の異常増殖によることが知られている。バルキングの原因となる糸状微生物についてはＥｉｋｅｌｂｏｏｍによって詳細な分類がなされている（Ｅｉｋｅｌｂｏｏｍ，Ｄ．Ｈ．：　Ｗａｔｅｒ　Ｒｅｓ．，９，３６５　（１９７５））。例えば、活性汚泥のバルキングの原因となる糸状微生物としては、Ｔｙｐｅ０２１Ｎ、Ｔｈｉｏｔｈｒｉｘ、Ｔｙｐｅ００４１、Ｔｙｐｅ０９６１、Ｓｐｈａｅｒｏｔｉｌｕｓ　ｎａｔａｎｓ、Ｍｉｃｒｏｔｈｒｉｘ　ｐａｒｖｉｃｅｌｌａ、Ｈａｌｉｓｃｏｍｅｎｏｂａｃｔｅｒ　ｈｙｄｒｏｓｓｉｓ、Ｔｙｐｅ００９２、Ｎｏｃａｒｄｉａ、Ｔｙｐｅ１８５１、Ｔｙｐｅ１７０１、Ｔｙｐｅ０６７５、Ｔｙｐｅ０９１４、Ｎｏｓｔｏｃｏｉｄａ　ｌｉｍｉｃｏｌａ、及びＢｅｇｇｉａｔｏａが知られている。
【０００３】
糸状微生物によって活性汚泥の沈降性や圧密性が悪化することにより、バルキングが起こるが、この対策としては、大きく分けて下記二つの対策方法：即ち、（イ）バルキングの原因となる糸状微生物の増殖を抑制する方法；及び（ロ）活性汚泥の沈降性や圧密性を直接改善する方法が考えられる。
【０００４】
まず、（イ）バルキングの原因となる糸状微生物の増殖を抑制することについて説明する。
【０００５】
一般に、糸状微生物の異常増殖による活性汚泥のバルキングは完全混合方式の好気槽で起こりやすい。これは糸状微生物が一般に酸素を利用できる好気条件を生育環境として好むことに起因する。そこで、バルキングの原因となる糸状微生物の増殖を抑制するには、酸素の利用が困難な無酸素条件あるいは嫌気条件が有効ということになる。したがって、溶存酸素濃度を低下させることにより糸状微生物の増殖を抑制してバルキングを防止することが可能である。例えば、好気槽の前段に無酸素槽あるいは嫌気槽を設置することでバルキングの原因となる糸状微生物の増殖を抑制して、バルキングを抑制することができる。このような活性汚泥法は、無酸素−好気活性汚泥法あるいは嫌気−好気活性汚泥法とも呼ばれる。また、このような無酸素槽や嫌気槽を多段に設けることで、糸状微生物の増殖抑制に効果を上げることができる。
【０００６】
上記（イ）において、曝気槽についても完全混合式ではなく、回分式やプラグフロー（押し出し流れ）式にした方が糸状微生物の増殖を抑制でき、バルキング抑制に効果がある。これは、回分式やプラグフロー（押し出し流れ）式では時間の経過と共に糸状微生物の栄養となる基質濃度が低濃度へと変化するため、基質の貯蔵能力が低い糸状微生物が増殖しにくくなるためと考えられる。特に回分式では一槽で空気の供給および停止、撹拌などによって無酸素−好気条件あるいは嫌気−好気条件を設定することができる。したがって、前述の無酸素−好気活性汚泥法あるいは嫌気−好気活性汚泥法と同様にバルキングの原因となる糸状微生物の増殖を抑制することが可能で、活性汚泥のバルキングを抑制することが可能となる。
【０００７】
この方法に加えて、糸状微生物を捕食する原生動物による捕食作用を利用して糸状微生物の増殖を選択的に抑制することも提案されている。例えば、Ｔｒｏｃｈｉｌｉｏｉｄｅｓ　ｒｅｃｔａ、Ｃｈｉｌｏｄｏｎｅｌｌａ　ｃｕｃｕｌｌｕｌｕｓ、Ｔｒｉｔｈｉｇｍｏｓｔｏｍａ　ｃｕｃｕｌｌｕｌｕｓなどの原生動物は糸状微生物を捕食する。したがって、これら原生動物を利用して、バルキングの原因となる糸状微生物の増殖を抑制することにより活性汚泥のバルキングを抑制する技術が提案されている。捕食による方法では、活性汚泥の抽出液やスティグマステロール類を活性汚泥に添加することにより、糸状微生物を捕食する原生動物の増殖を促進することも提案されている。
【０００８】
また、塩素、次亜塩素酸、過酸化水素、オゾン、第四級アミンなどの殺菌剤を用いてバルキングの原因となる糸状微生物を殺菌して糸状微生物の増殖を抑制することにより活性汚泥のバルキングを防止することも可能である。例えば、塩素（５〜１０ｇ／ｋｇ活性汚泥浮遊物（ＭＬＳＳ）／日、返送汚泥へ間欠添加）あるいは過酸化水素（４０〜２００ｍｇ／ｌ、間欠添加）などの殺菌剤を活性汚泥に添加することにより糸状微生物の増殖を抑制してバルキングを抑制することも可能である。
【０００９】
以上のように、バルキングの原因となる糸状微生物の増殖を抑制してバルキングを抑制するさまざまな従来技術がある。
【００１０】
次に、（ロ）活性汚泥フロックの沈降性および圧密性を改善することについて説明する。
【００１１】
これは、バルキングでは活性汚泥が浮上してしまうことにより、水処理性能が著しく悪影響を受けるのに対して、活性汚泥の沈降性を高めてバルキング問題を解決しようとする考えに基づく。まず、凝集剤を添加して活性汚泥フロックの沈降性を増加させることによってバルキングを抑制することが可能である。凝集剤としては、硫酸第一鉄、水酸化第二鉄などの鉄塩、硫酸アルミニウム、水酸化アルミニウムなどのアルミニウム塩、石灰、二酸化ケイ素などが使用される。この方法の特徴は、たとえバルキングの原因となる糸状微生物の増殖が起こっても凝集沈澱により活性汚泥のバルキングを抑制できる点にある。例えば、塩化第二鉄（５〜５０ｍｇ／ｌ、活性汚泥槽への連続添加）あるいは硫酸アルミニウム（１０〜１００ｍｇ／ｌ、活性汚泥槽への連続添加）などの凝集剤添加によりバルキングを抑制できる。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上記したような活性汚泥のバルキングを防止するための従来技術には以下に示されるような解決すべき課題があり、バルキングの根本的な防止技術となっていない。
【００１３】
まず、上記（イ）バルキングの原因となる糸状微生物の増殖を選択的に抑制することの問題点について説明する。一般に、糸状微生物の異常増殖による活性汚泥のバルキングは完全混合方式の好気槽で起こりやすい。これは糸状微生物が一般に酸素が利用できる好気条件を生育環境として好むことに起因する。したがって、酸素の利用が困難な無酸素条件あるいは嫌気条件が有効とされている。好気槽の前段に無酸素槽あるいは嫌気槽を設置することで無酸素−好気活性汚泥法あるいは嫌気−好気活性汚泥法などのバルキング抑制方法がある。しかしながら、酸素の利用を制限する無酸素条件や嫌気条件は、活性汚泥中の糸状微生物以外の他の微生物の酸素の利用にも著しい影響を及ぼし、好気環境を好む微生物に対しても増殖抑制作用をもたらしてしまう。したがって、活性汚泥の生物処理の機能を担う微生物に悪影響を与えかねない。さらに、無酸素−好気活性汚泥法及び嫌気−好気活性汚泥法共に、好気槽では糸状微生物の異常増殖の可能性は否定できない。この点からもバルキングの防止技術としては不完全である。
【００１４】
また、完全混合式と比較して回分式やプラグフロー（押し出し流れ）式ではバルキングが発生しにくいことが経験的に知られている。回分式やプラグフロー（押し出し流れ）式では時間の経過と共に微生物の栄養となる基質濃度が低濃度へと変化するため、基質の貯蔵能力が低い糸状微生物が増殖しにくくなるためであるが、基質濃度が充分に低下しない場合には、糸状微生物の異常増殖は継続する可能性がある。また、回分式で一槽で空気の供給および停止、撹拌などによって無酸素−好気条件あるいは嫌気−好気条件を設定することにより前述の無酸素−好気あるいは嫌気−好気活性汚泥法と同様にバルキングの原因となる糸状微生物の増殖を抑制することは可能であるものの、水処理プロセスの運転制御が非常に複雑なものになってしまう。活性汚泥の浄化性能を維持しつつ、どのように空気の供給および停止、撹拌など運転制御すれば糸状微生物の異常増殖を防止できるか、いまだ根本的な方法論が確立された状態にあるとはいえない。
【００１５】
さらに、糸状微生物を捕食する原生動物を利用して糸状微生物の増殖を抑制してバルキングを防止する方法についても、これら原生動物の捕食の糸状微生物への選択性は、必ずしも高いものではない。したがって、バルキングの原因となる糸状微生物ではない活性汚泥の機能に寄与している微生物をも捕食してしまう可能性がある。また、このような原生動物を添加するために大量増殖しようとする場合、原生動物の培養は難しく、かつ、増殖速度が非常に遅いため、大量生産には適さない。また、糸状微生物を捕食する原生動物の増殖および定着化させるための条件が充分には明らかになっていない。糸状微生物が出現した時に植種できるようにこれら原生動物を大量に培養しておく技術も未確立である。したがって、バルキングの対策技術としてはまだ確立していない。
【００１６】
また、殺菌によって糸状微生物の増殖を抑制することによってバルキングを防止することについても、塩素、次亜塩素酸、過酸化水素、オゾン、第四級アミンなどの殺菌剤は、バルキングの原因となる糸状微生物以外に、活性汚泥中の他の微生物に対しても殺菌作用（毒性）を示す。このため、活性汚泥の浄化機能の発現に関わる微生物への影響など活性汚泥機能の劣化や、これら殺菌剤の環境への影響が懸念される。
【００１７】
次に、上記（ロ）凝集剤を添加して活性汚泥フロックの沈降速度を増加させることによってバルキングを防止する方法については、バルキングの原因となる糸状微生物の増殖に関係なく活性汚泥のバルキングを防止することができる。しかしながら、凝集剤の使用は新たなコスト発生要因となる他、汚泥発生量が大幅に増加する。したがって、汚泥の沈降性は改善されるものの、汚泥（スラッジ）発生量の増加が問題になる。汚泥発生量の増加は、新たな処理コストの増加、廃棄物増加となるので、経済的な観念から不利であるためである。
【００１８】
したがって、本発明は、バルキングの原因となる糸状微生物のみの増殖を選択的に抑制することによって、糸状微生物以外の微生物の増殖を妨げることなく、かつ環境に悪影響を与えずに、活性汚泥のバルキングを防止する方法を提供することを目的とする。
【００１９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記目的を達成するために鋭意研究を行なった結果、従来のバルキング対策技術では糸状微生物の増殖を選択的に抑制することが困難であったが、微生物に感染するウィルスであるバクテリオファージが宿主である微生物に対して選択的に感染して溶菌できる点に着目し、バルキングの原因となる糸状微生物に選択的に感染、溶菌させる性質を有するバクテリオファージを用いて糸状微生物の増殖を選択的に抑制することによって、活性汚泥のバルキングを予防あるいは解消できることを見出した。また、このような性質を有するバクテリオファージは、活性汚泥や活性汚泥と接する水あるいは下水原水などバルキングの原因となる糸状微生物が棲息している水から分離することで、大量に増殖させることが可能であることをも見出した。なお、本発明に関わる糸状微生物とは、活性汚泥のバルキングの原因となる糸状微生物であり、例えば、Ｔｙｐｅ０２１Ｎ、Ｔｈｉｏｔｈｒｉｘ、Ｔｙｐｅ００４１、Ｔｙｐｅ０９６１、Ｓｐｈａｅｒｏｔｉｌｕｓ　ｎａｔａｎｓ、Ｍｉｃｒｏｔｈｒｉｘ　ｐａｒｖｉｃｅｌｌａ、Ｈａｌｉｓｃｏｍｅｎｏｂａｃｔｅｒ　ｈｙｄｒｏｓｓｉｓ、Ｔｙｐｅ００９２、Ｎｏｃａｒｄｉａ、Ｔｙｐｅ１８５１、Ｔｙｐｅ１７０１、Ｔｙｐｅ０６７５、Ｔｙｐｅ０９１４、Ｎｏｓｔｏｃｏｉｄａ　ｌｉｍｉｃｏｌａ、及びＢｅｇｇｉａｔｏａが挙げられる。
【００２０】
すなわち、上記目的は、下記（１）〜（３）によって達成される。
【００２１】
（１）　活性汚泥のバルキングの原因となる糸状微生物に感染して溶菌させる性質を有するバクテリオファージを活性汚泥に添加することを特徴とする糸状微生物の増殖抑制方法。
【００２２】
（２）　上記糸状微生物は、Ｔｙｐｅ０２１Ｎ、Ｔｈｉｏｔｈｒｉｘ、Ｔｙｐｅ００４１、Ｔｙｐｅ０９６１、Ｓｐｈａｅｒｏｔｉｌｕｓ　ｎａｔａｎｓ、Ｍｉｃｒｏｔｈｒｉｘ　ｐａｒｖｉｃｅｌｌａ、Ｈａｌｉｓｃｏｍｅｎｏｂａｃｔｅｒ　ｈｙｄｒｏｓｓｉｓ、Ｔｙｐｅ００９２、Ｎｏｃａｒｄｉａ、Ｔｙｐｅ１８５１、Ｔｙｐｅ１７０１、Ｔｙｐｅ０６７５、Ｔｙｐｅ０９１４、Ｎｏｓｔｏｃｏｉｄａ　ｌｉｍｉｃｏｌａ、及びＢｅｇｇｉａｔｏａからなる群より選ばれる少なくとも１種である、前記（１）に記載の糸状微生物の増殖抑制方法。
【００２３】
（３）　上記バクテリオファージは、活性汚泥に１０２ｐｆｕ／ｍｌ以上１０８ｐｆｕ／ｍｌ以下の量で添加される、前記（１）または（２）に記載の糸状微生物の増殖抑制方法。
【００２４】
【発明の実施の形態】
本発明は、Ｔｙｐｅ０２１Ｎ、Ｔｈｉｏｔｈｒｉｘ、Ｔｙｐｅ００４１、Ｔｙｐｅ０９６１、Ｓｐｈａｅｒｏｔｉｌｕｓ　ｎａｔａｎｓ、Ｍｉｃｒｏｔｈｒｉｘ　ｐａｒｖｉｃｅｌｌａ、Ｈａｌｉｓｃｏｍｅｎｏｂａｃｔｅｒ　ｈｙｄｒｏｓｓｉｓ、Ｔｙｐｅ００９２、Ｎｏｃａｒｄｉａ、Ｔｙｐｅ１８５１、Ｔｙｐｅ１７０１、Ｔｙｐｅ０６７５、Ｔｙｐｅ０９１４、Ｎｏｓｔｏｃｏｉｄａ　ｌｉｍｉｃｏｌａ、及びＢｅｇｇｉａｔｏａからなる群より選ばれる少なくとも１種の糸状微生物に感染して溶菌させる性質を有するバクテリオファージを活性汚泥に添加することを特徴とする糸状微生物の増殖抑制方法である。
【００２５】
以下、本発明を実施するための方法について詳細に説明する。
【００２６】
本発明において、バクテリオファージは、活性汚泥のバルキングの原因となる糸状微生物（例えば、Ｔｙｐｅ０２１Ｎ、Ｔｈｉｏｔｈｒｉｘ、Ｔｙｐｅ００４１、Ｔｙｐｅ０９６１、Ｓｐｈａｅｒｏｔｉｌｕｓ　ｎａｔａｎｓ、Ｍｉｃｒｏｔｈｒｉｘ　ｐａｒｖｉｃｅｌｌａ、Ｈａｌｉｓｃｏｍｅｎｏｂａｃｔｅｒ　ｈｙｄｒｏｓｓｉｓ、Ｔｙｐｅ００９２、Ｎｏｃａｒｄｉａ、Ｔｙｐｅ１８５１、Ｔｙｐｅ１７０１、Ｔｙｐｅ０６７５、Ｔｙｐｅ０９１４、Ｎｏｓｔｏｃｏｉｄａ　ｌｉｍｉｃｏｌａ、及びＢｅｇｇｉａｔｏａからなる群より選ばれる少なくとも１種）に感染して溶菌できるものであれば特に制限されず、ＤＮＡファージとＲＮＡファージのいずれでもよい。本発明に係るバクテリオファージは、例えば、活性汚泥や活性汚泥と接する水あるいは下水原水などバルキングの原因となる糸状微生物が棲息している水から分離することができる。以下、本発明で使用されるバクテリオファージを分離する方法について、詳細に説明する。
【００２７】
すなわち、活性汚泥や活性汚泥と接する水あるいは下水原水などバルキングの原因となる糸状微生物が棲息している水を０．２２〜０．４５μｍ孔径のメンブレンフィルタでろ過する。このろ液中にバクテリオファージが含まれるので、ろ液を０．１μｍ孔径のメンブレンフィルタでろ過する。さらに得られたろ液を分子量１００００以上でカットする限外ろ過膜を使用してろ過する。そしてろ過されずに残った分子量１００００以上の物質を含んだ濃縮液を回収する。この濃縮液中に、目的とするバクテリオファージが含まれる。
【００２８】
次に、濃縮液中のバクテリオファージを分離するための糸状微生物を別途培養する。ここで、糸状微生物の培養方法は、特に制限されるものではなく、公知の培養方法が使用できる。例えば、用水と排水、３１巻第５号（１９８９）に記載される糸状微生物培養用の培地を基本組成とする液体培地を用いて活性汚泥から単離した糸状微生物を培養しておく。また、寒天濃度が１〜２質量％である糸状微生物用の寒天平板培地を作製しておく。さらに、寒天濃度が０．２〜０．６質量％の糸状微生物用の軟寒天培地を作製しておき、４５〜５０℃に保温する。この保温しておいた軟寒天培地に糸状微生物の培養液を添加してすみやかに混和した後、先に作製しておいた寒天平板培地上へ流し込み、室温にて、この重層した軟寒天が固化するのを待つ。この糸状微生物を含む重層寒天平板培地上に、上述の分子量１００００カットの限外ろ過膜でろ過されずに残ったバクテリオファージを含む濃縮液を滴下する。この際、濃縮液の滴下量は、特に制限されず、バクテリアファージの濃度や寒天平板培地の播種面積などによって異なるが、例えば、９ｃｍ径のシャーレを用いた重層寒天平板培地の場合では、０．１〜０．２ｍｌ程度、濃縮液を滴下することが好ましい。この濃縮液が寒天培地に完全に浸潤、乾燥するのを待つ。２０℃以上３５℃以下の温度で、１〜３日間程度培養して、寒天培地上で糸状微生物がバクテリオファージによって溶菌され、プラーク（溶菌斑）が形成されることで溶菌性バクテリオファージの存在が確認できるので、プラーク（溶菌斑）を白金耳等で掻き出してバクテリオファージを粗分離する。しかし、このままではバクテリオファージは純化されていない。
【００２９】
そこで、糸状微生物に対する溶菌性バクテリオファージを純化・分離する必要があるが、この純化・分離方法は、特に制限されず公知の方法が使用できる。例えば、糸状微生物に対する溶菌性バクテリオファージの純化・分離は以下のようにして実施される。すなわち、上記のようにして溶菌性バクテリオファージの存在が確認された分子量１００００カットの限外ろ過膜でろ過されず残ったバクテリオファージを含む濃縮液を段階希釈する。例えば、このバクテリオファージを含む濃縮液１ｍｌを糸状微生物の液体培地９ｍｌを用いて順次１０倍ずつ段階希釈した希釈系列の液を準備する。通常、分子量１００００カットの限外ろ過膜でろ過されずに残ったバクテリオファージを含む濃縮液を１０６〜１０８倍程度にまで希釈して、その希釈液０．５ｍＬ程度を寒天濃度が１〜２質量％の寒天培地上に滴下する。また、上記と同様にしてあらかじめ４５〜５０℃に保温しておいた寒天濃度が０．２〜０．６質量％の軟寒天培地３ｍＬ程度に、バクテリオファージを感染させて溶菌させる糸状微生物をホモジナイズして懸濁したものを、糸状微生物の切断片数あるいは細胞数で１０個〜１００個程度加えて撹拌し、上記の寒天培地上に流して、先に添加したバクテリオファージを含む液とすばやく混和する。このようにして重層された寒天培地を、２０℃以上３５℃以下の温度で１〜３日間培養後、寒天培地に生じたプラーク（溶菌斑）を白金耳等で取り出す。この操作を繰り返して実施することによって、糸状微生物を溶菌させるバクテリオファージを純化・分離することができる。通常、上記バクテリオファージの分離操作は２〜３回程度の繰り返しが必要である。
【００３０】
次に、このようにして分離したバクテリオファージを増殖させて濃縮および保存する。この際、分離したバクテリオファージの増殖ならびに濃縮および保存方法は特に制限されず、公知の方法が使用できるが、その一例を以下に説明する。すなわち、上記分離操作で最終的に白金耳等で取り出したプラークを糸状微生物の培養液に接種する。２０〜３５℃の温度で６〜２４時間、静置あるいは振とう培養することによって、バクテリオファージを糸状微生物に吸着、感染、溶菌させる。このようにしてバクテリオファージを増殖させることができる。溶菌が起こった培養液中には増殖したバクテリオファージが含まれるので、この培養液を１５０００ｍ／ｓ２以上４００００ｍ／ｓ２以下の遠心分離の加速度で１０分以上４０分以下の条件で遠心分離することによって上澄み液を回収する。この上澄み液中には増殖したバクテリオファージが密に含まれる。この上澄み液にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を５％（質量／体積）以上７％（質量／体積）以下となるように加えて充分に撹拌する。さらに必要であれば４℃程度に冷却した状態で２４時間程度静置する。この液を再び１５０００ｍ／ｓ２以上４００００ｍ／ｓ２以下の遠心分離の加速度で１０分以上４０分以下の条件で遠心分離して生じた沈澱を回収する。この沈澱を例えば１％酢酸アンモニウム−０．０１ｍｏｌ／ｌ塩化マグネシウム混合溶液に懸濁する。ここで、酢酸アンモニウムの濃度は０．５％（質量／体積）以上２％（質量／体積）以下の範囲、塩化マグネシウムの濃度は、０．００５ｍｏｌ／ｌ以上０．０２ｍｏｌ／ｌ以下の範囲であれば変更可能である。この懸濁液を３００００ｍ／ｓ２以上１０００００ｍ／ｓ２以下の遠心分離の加速度で１０分以上４０分以下の条件で遠心分離することによって得られる上澄み液を回収する。この上澄み液を０．２２μｍ孔径のメンブランフィルター等を用いてろ過して、ろ液を回収する。このろ液がバクテリオファージの濃縮液となる。冷蔵庫（２〜１０℃程度）に保存することで濃縮したバクテリオファージを保存することが可能である。溶菌性バクテリオファージの濃縮液中のバクテリオファージの濃度は、濃縮液単位体積（ｍＬ）あたりの宿主となる糸状微生物のプラーク（溶菌斑）形成単位（ｐｆｕ；ｐｌａｑｕｅ　ｆｏｒｍｉｎｇ　ｕｎｉｔ）で表すことができる。このようにして調製されたバクテリオファージ濃縮液中のバクテリオファージ濃度は、重層寒天培地を用いて調べたところ、通常、１０８〜１０１０ｐｆｕ／ｍＬ程度である。ただし、バクテリオファージ濃度は、上記範囲に制限されず、これ以外のバクテリオファージ濃度となることもあるが、以下に記載するように、活性汚泥への添加時に調節すればよく、使用には差し支えない。
【００３１】
次に、糸状微生物を溶菌するバクテリファージを添加することにより、活性汚泥のバルキングを防止する方法について説明する。活性汚泥のバルキングの原因となる糸状微生物としては、以下に制限されるものではないが、例えば、Ｔｙｐｅ０２１Ｎ、Ｔｈｉｏｔｈｒｉｘ、Ｔｙｐｅ００４１、Ｔｙｐｅ０９６１、Ｓｐｈａｅｒｏｔｉｌｕｓ　ｎａｔａｎｓ、Ｍｉｃｒｏｔｈｒｉｘ　ｐａｒｖｉｃｅｌｌａ、Ｈａｌｉｓｃｏｍｅｎｏｂａｃｔｅｒ　ｈｙｄｒｏｓｓｉｓ、Ｔｙｐｅ００９２、Ｎｏｃａｒｄｉａ、Ｔｙｐｅ１８５１、Ｔｙｐｅ１７０１、Ｔｙｐｅ０６７５、Ｔｙｐｅ０９１４、Ｎｏｓｔｏｃｏｉｄａ　ｌｉｍｉｃｏｌａ、及びＢｅｇｇｉａｔｏａなどがある。この際、糸状微生物は、１種類であってもあるいは２種類以上の混合物の形態であってもよい。それぞれの活性汚泥でバルキングの原因となる糸状微生物が異なるものと考えられる。そこで、どの種類の糸状微生物が活性汚泥のバルキングに寄与しているのかを調べることが好ましい。この際、糸状微生物の特定方法は、特に制限されず、公知の特定方法が使用できる。具体的には、浮上汚泥の顕微鏡による形態観察する方法、およびＤＮＡ抽出を行ない、１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子等のＤＮＡ配列を読み取る方法などにより、バルキングの原因となっている糸状微生物を特定化する。このようにしてバルキングの原因となっている糸状微生物が特定化されれば、この糸状微生物に対して特異的に溶菌活性を示すバクテリオファージを用いることで、糸状微生物の増殖を効果的に抑制できる。したがって、本発明の方法によれば、糸状微生物の異常増殖に起因するバルキングを予防できる他、既にバルキングが起こってしまった状況に対してもバルキングを解消することができる。
【００３２】
本発明は、バルキングの原因となっている糸状微生物に感染・溶菌できるバクテリオファージを活性汚泥に添加することにより、糸状微生物の増殖を抑制するものである。この際、バクテリオファージの活性汚泥への添加濃度は、所望の糸状微生物の増殖を抑制できる濃度であれば特に制限されず、また、所望の効果（例えば、バルキングの予防や既に糸状微生物が異常増殖しているまたはバルキングが起こっている状況下でのバルキングの解消など）によって、異なる。バクテリオファージの活性汚泥への添加濃度は、通常、１０２〜１０１０ｐｆｕ／ｍＬ、より好ましくは１０２〜１０８ｐｆｕ／ｍＬとすることが好ましい。この際、１０２ｐｆｕ／ｍＬ未満の添加濃度では、バクテリオファージの添加濃度が低すぎて、活性汚泥中の糸状微生物に十分に接触、吸着、感染することができず、バクテリオファージによる糸状微生物の増殖抑制効果が十分期待できない場合がある。したがって、バクテリオファージの活性汚泥への好ましい添加濃度は１０２ｐｆｕ／ｍＬ以上とした。また、バクテリオファージを濃縮しても通常１０８〜１０１０ｐｆｕ／ｍＬ程度のバクテリアファージ濃度しか得られない。また、バクテリオファージ濃度の高いバクテリアファージの濃縮液を調製する作業はコスト的にも時間的にも大きな付加となる。したがって、バクテリオファージの使用量は可能な限り節約されることが好ましいため、バクテリオファージのより実際的な添加濃度を１０８ｐｆｕ／ｍＬ以下とした。また、バクテリオファージの添加濃度は濃縮液の濃度を超えることはないため、バクテリオファージの活性汚泥への好ましい添加濃度は１０１０ｐｆｕ／ｍＬ以下とした。
【００３３】
特にバルキングの予防を目的とする場合には、バクテリオファージの活性汚泥への添加濃度は、１０２〜１０４ｐｆｕ／ｍＬであることがより好ましい。一方、既に糸状微生物の異常増殖あるいはバルキングが発生している場合には、予防に比べて高濃度のバクテリオファージが必要であり、１０４ｐｆｕ／ｍＬ以上、さらにより好ましくは１０５ｐｆｕ／ｍＬ以上、特に好ましくは１０７ｐｆｕ／ｍＬ以上のバクテリオファージの添加濃度がより好ましい範囲として推奨される。この際、バクテリオファージの添加濃度の上限は、上記と同様、好ましくは１０１０ｐｆｕ／ｍＬ、より好ましくは１０８ｐｆｕ／ｍＬである。また、バクテリオファージは、必要であれば活性汚泥に段階的にあるいは連続して添加してもよいが、バクテリオファージを活性汚泥に添加してしまうと、バクテリオファージは自発的に糸状微生物に感染して、糸状微生物を溶菌すると共に、バクテリオファージは糸状微生物細胞内で自己増殖するので、バクテリオファージはさらに添加する必要はなく、後のメンテナンスを不要にすることも可能である。
【００３４】
なお、本明細書において、「ＳＶ３０」とは、汚泥の沈降性を評価するための指標であり、試料１リットルをメスシリンダーにとり、３０分間静置した後の沈澱量　ａ（ｍｌ）を読み取った場合の、試料に対する沈殿量の体積比（％）として表わされ、即ち、次式によって算出された活性汚泥沈澱率（ｖ／ｖ％）である。また、静置時間が１８０分の場合には、「ＳＶ１８０」と表わす。
【００３５】
【数１】
2004008896.tif 000002
【００３６】
【実施例】
以下、本発明を実施例に基づいて詳細に説明する。
【００３７】
製造例１：バクテリオファージの濃縮液の調製
本例では、下水活性汚泥の糸状微生物に感染、溶菌するバクテリオファージの分離と濃縮および保存について、説明する。
【００３８】
グルコース０．１５ｇ／ｌ、酢酸ナトリウム０．１５ｇ／ｌ、硫酸アンモニウム０．５ｇ／ｌ、塩化カリウム０．０５ｇ／ｌ、硫酸マグネシウム七水和物０．０５ｇ／ｌ、炭酸カルシウム０．０５ｇ／ｌ、硝酸カルシウム０．０１ｇ／ｌ、リン酸二ナトリウム０．３１２ｇ／ｌ、リン酸一ナトリウム０．０２ｇ／ｌ、塩化第二鉄六水和物０．０００５ｇ／ｌ、ビタミンミックス（組成：パントテン酸カルシウム２０ｍｇ／ｌ、ニコチン酸２０ｍｇ／ｌ、ビオチン１ｍｇ／ｌ、シアノコバラミン１ｍｇ／ｌ、葉酸１ｍｇ／ｌ、塩酸ピリドキシン２０ｍｇ／ｌ、パラアミノ安息香酸２０ｍｇ／ｌ、コカルボキシラーゼ２０ｍｇ／ｌ、イノシット２０ｍｇ／ｌ、塩酸チアミン２０ｍｇ／ｌ、リボフラビン２０ｍｇ／ｌ、アデニン２ｍｇ／ｌ、ウラシル２ｍｇ／ｌ、チミン２ｍｇ／ｌ）５ｍｌ／ｌ、ｐＨ７．０からなる１．５質量％寒天平板培地を調製した。この１．５質量％寒天平板培地上で、採取された下水処理活性汚泥を用いて、スプレッド法（日本下水道協会（１９９７）下水試験方法　上巻）によって糸状微生物を２５℃で培養、単離した。このようにして単離された糸状微生物を、寒天を含まない以外は上記と同様の組成を有する液体培地を用いて培養、増殖させた。この培養液の一部を取って吸光度ＯＤ６６０ｎｍが０．８である培養液を調製し、以下のバクテリオファージの確認に使用した。
【００３９】
また、別途、下水１Ｌを０．２２μｍ孔径のメンブレンフィルタでろ過した。ろ液をさらに０．１μｍ孔径のメンブレンフィルタでろ過する。得られたろ液を分子量１００００カットの限外ろ過膜を使用してろ過することによって、ろ過されずに残った分子量１００００以上の物質を含んだ濃縮液を回収した。
【００４０】
寒天濃度を０．２〜０．６質量％とした以外は上記１．５質量％寒天平板培地と同じ組成を有する軟寒天培地３．５ｍｌを４５℃に保温しておき、ここへ上記で単離・培養された糸状微生物の培養液０．２ｍｌを添加してすみやかに混和後、上記と同様にして作製された１．５質量％寒天平板培地上へ流し込んだ。後から重層した軟寒天培地が固化するまで、室温にて放置した。このようにして作製された糸状微生物を含む重層寒天平板培地上に、上述の分子量１００００カットの限外ろ過膜でろ過されずに残った分子量１００００以上の物質を含んだ濃縮液を０．２ｍｌ滴下した。この液が寒天培地に完全に浸潤、乾燥するのを待った。この寒天培地を２５℃で２日間培養して、寒天培地上で糸状微生物の溶菌が起こり、プラークが形成されることを確認した。これにより、糸状微生物に感染して溶菌する性質を有するバクテリオファージの存在が確認できたので、以下の操作によりこのバクテリオファージを分離することを試みた。
【００４１】
上記と同様にして、糸状微生物用の培地を用いて下水活性汚泥から単離した糸状微生物を培養しておいた。また、上述の分子量１００００カットの限外ろ過膜でろ過されずに残った分子量１００００以上の物質を含んだバクテリオファージの存在が認められた濃縮液１ｍｌについて、液体培地９ｍｌを用いて順次１０倍ずつ段階希釈した希釈系列の液を準備した。バクテリオファージの存在が認められた濃縮液を１０４〜１０８倍まで希釈し、この希釈液を０．５ｍＬ、１．５質量％寒天平板培地上に滴下した。別途、あらかじめ４５℃に保温しておいた軟寒天３ｍＬに、上記で培養された宿主である糸状微生物の新鮮培養液を加えて撹拌し、上記の１．５質量％寒天培地上に流してバクテリオファージの濃縮液とすばやく混和した。この重層培地を２５℃で一晩培養した後、寒天培地に生じた単離溶菌斑（プラーク）を白金耳で取り出した。上記の操作を繰り返してバクテリオファージを純化して分離した。
【００４２】
さらに、糸状微生物の溶菌斑（プラーク）を白金耳等を用いて採取して、再び溶菌を確認した糸状微生物と同一種の糸状微生物を培養している培養液に接種した。この培養液を２５℃で２４時間振とう培養して、バクテリオファージを糸状微生物に吸着、感染させ、バクテリオファージを増殖させて糸状微生物を溶菌させた。培養後、培養液を遠心分離の加速度が２３０００ｍ／ｓ２で２０分間、遠心分離することによって上澄み液を回収した。この上澄み液中には増殖したバクテリオファージが密に含まれる。この上澄み液にポリエチレングリコール（平均分子量が４０００〜６０００程度のＰＥＧ（ＰＥＧ４０００〜６０００））を６％（質量／体積）となるように加えて充分に撹拌した。４℃に冷却した状態で２４時間静置した。静置後、この液を再び遠心分離の加速度が２３０００ｍ／ｓ２で２０分間、遠心分離をすることによって、生じた沈澱を回収した。この沈澱を１％酢酸アンモニウム−０．０１Ｍ塩化マグネシウム混合溶液に懸濁した。この懸濁液を遠心分離の加速度が５２０００ｍ／ｓ２で１５分間、遠心分離することによって得られた上澄み液を回収した。この上澄み液を０．２２μｍ孔径のメンブランフィルターを用いてろ過して、ろ液を回収した。このろ液がバクテリオファージの濃縮液である。これを使用するまで、冷蔵庫（４℃）に保存した。
【００４３】
このようにして調製されたバクテリオファージ濃縮液におけるバクテリオファージ濃度を重層寒天培地を用いたバクテリアファージによる糸状微生物の溶菌斑（プラーク）発生数で調べたところ、２×１０９ｐｆｕ／ｍＬであり、これからバクテリオファージの濃縮液が得られたことが確認された。
【００４４】
実施例１：バクテリオファージによる糸状微生物　Ｔｙｐｅ０２１Ｎに対する溶菌活性の確認
バルキングの原因となる糸状微生物の中で代表的な糸状微生物　Ｔｙｐｅ０２１Ｎに対する分離したバクテリオファージの溶菌活性の確認を、以下のように行った。
【００４５】
グルコース０．３ｇ／ｌ、酢酸ナトリウム０．３ｇ／ｌ、硫酸アンモニウム０．１ｇ／ｌ、塩化カリウム０．０５ｇ／ｌ、硫酸マグネシウム七水和物０．０５ｇ／ｌ、炭酸カルシウム０．０２ｇ／ｌ、塩化第二鉄六水和物０．０００５ｇ／ｌ、リン酸二ナトリウム０．３１２ｇ／ｌ、リン酸一ナトリウム０．０２ｇ／ｌ、ビタミンミックス（組成：パントテン酸カルシウム２０ｍｇ／ｌ、ニコチン酸２０ｍｇ／ｌ、ビオチン１ｍｇ／ｌ、シアノコバラミン１ｍｇ／ｌ、葉酸１ｍｇ／ｌ、塩酸ピリドキシン２０ｍｇ／ｌ、パラアミノ安息香酸２０ｍｇ／ｌ、コカルボキシラーゼ２０ｍｇ／ｌ、イノシット２０ｍｇ／ｌ、塩酸チアミン２０ｍｇ／ｌ、リボフラビン２０ｍｇ／ｌ、アデニン２ｍｇ／ｌ、ウラシル２ｍｇ／ｌ、チミン２ｍｇ／ｌ；以下、同様）５ｍｌ／ｌからなる培地（ｐＨ７．０）２００ｍｌに、糸状微生物　Ｔｙｐｅ０２１Ｎを供試菌として植菌し、３０℃にて１日間振盪培養を行なった。培養後、培養液を遠心分離（１５，０００ｍ／ｓ２×２０分）して糸状微生物　Ｔｙｐｅ０２１Ｎ菌体を分離し、この菌体を５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）に懸濁して、ホモジナイズした。この懸濁液に、製造例１で調製されたバクテリオファージの濃縮液を、バクテリオファージ濃度が２×１０４ｐｆｕ／ｍＬとなるように添加した。添加直後の吸光度を６６０ｎｍの波長で測定した（ＯＤ６６０）。
【００４６】
続いて、この混合液を３０℃でインキュベーションし、一定時間ごとに吸光度を測定して、糸状微生物　Ｔｙｐｅ０２１Ｎの溶菌状態を観察した。なお、対照区としては、バクテリオファージ濃縮液を添加していないものを使用した。結果を図１に示す。図１において、「菌残存率」は、試験開始時の吸光度（ＯＤ６６０ｎｍ）を１００％として各インキュベーション時間での吸光度の比率（％）である。図１に示されるように、本発明によるバクテリオファージ濃縮液を添加したものは、対照区に比べて、有意な菌残存率の低下を示し、これから本発明によるバクテリオファージはバルキングの主要な原因である糸状微生物　Ｔｙｐｅ０２１Ｎに対して溶菌作用を示すことが確認された。したがって、本発明によるバクテリオファージは、糸状微生物　Ｔｙｐｅ０２１Ｎを溶菌してその増殖を抑制し、これにより糸状微生物
Ｔｙｐｅ０２１Ｎによる活性汚泥のバルキングを防止できると考えられる。
【００４７】
実施例２：バクテリオファージによる糸状微生物　Ｔｈｉｏｔｈｒｉｘに対する溶菌活性の確認
バルキングの原因となる糸状微生物の中で代表的な糸状微生物　Ｔｈｉｏｔｈｒｉｘに対する分離したバクテリオファージの溶菌活性の確認を、以下のように行った。
【００４８】
グルコース０．３ｇ／ｌ、酢酸ナトリウム０．３ｇ／ｌ、硫酸アンモニウム０．１ｇ／ｌ、塩化カリウム０．０５ｇ／ｌ、硫酸マグネシウム七水和物０．０５ｇ／ｌ、炭酸カルシウム０．０２ｇ／ｌ、塩化第二鉄六水和物０．０００５ｇ／ｌ、リン酸二ナトリウム０．３１２ｇ／ｌ、リン酸一ナトリウム０．０２ｇ／ｌ、ビタミンミックス５ｍｌ／ｌからなる培地（ｐＨ７．０）に２００ｍｌに、糸状微生物　Ｔｈｉｏｔｈｒｉｘを供試菌として植菌し、３０℃にて１〜３日間振盪培養を行った。培養後、培養液を遠心分離（２０，０００ｍ／ｓ２×２０分）して糸状微生物　Ｔｈｉｏｔｈｒｉｘ菌体を分離し、この菌体を５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）に懸濁させ、ホモジナイズした。この懸濁液に、製造例１で調製されたバクテリオファージの濃縮液を、バクテリオファージ濃度が３×１０４ｐｆｕ／ｍＬとなるように添加した。添加直後の吸光度を６６０ｎｍの波長で測定した（ＯＤ６６０）。
【００４９】
続いて、この混合液を３０℃でインキュベーションし、一定時間ごとに吸光度を測定し、糸状微生物　Ｔｈｉｏｔｈｒｉｘの溶菌状態を観察した。なお、対照区としては、バクテリオファージ濃縮液を添加していないものを使用した。結果を図２に示す。図２において、「菌残存率」は、試験開始時の吸光度（ＯＤ６６０ｎｍ）を１００％として各インキュベーション時間での吸光度の比率（％）である。図２に示されるように、本発明によるバクテリオファージ濃縮液を添加したものは、対照区に比べて、有意な菌残存率の低下を示し、これから本発明によるバクテリオファージはバルキングの主要な原因である糸状微生物　Ｔｈｉｏｔｈｒｉｘに対して溶菌作用を示すことが確認された。したがって、本発明によるバクテリオファージは、糸状微生物　Ｔｈｉｏｔｈｒｉｘを溶菌してその増殖を抑制し、これにより糸状微生物　Ｔｈｉｏｔｈｒｉｘによる活性汚泥のバルキングを防止できると考えられる。
【００５０】
実施例３：バクテリオファージによる活性汚泥沈降性（ＳＶ）の改善とバルキングの抑制効果の確認（糸状微生物　Ｓｐｈａｅｒｏｔｉｌｕｓ　ｎａｔａｎｓの適用例）
バルキングの原因となる糸状微生物の中で代表的な糸状微生物　Ｓｐｈａｅｒｏｔｉｌｕｓｎａｔａｎｓに対する分離したバクテリオファージの活性汚泥沈降性（ＳＶ）の改善とバルキングの抑制効果の確認を、以下のように行なった。
【００５１】
グルコース８７０ｍｇ／ｌ、ペプトン２５０ｍｇ／ｌ、塩化ナトリウム３００ｍｇ／ｌ、リン酸二カリウム３９．１ｍｇ／ｌ、硝酸アンモニウム４３ｍｇ／ｌの合成廃水を調製した。この合成廃水を用いて、合成廃水の流入量１ｌ／日、ＭＬＳＳ　２，０００ｐｐｍ、室温２０〜２５℃で、活性汚泥の培養を行ない、糸状微生物によるバルキングを発生させ、以下の実験を行なった。活性汚泥中、糸状微生物としてＳｐｈａｅｒｏｔｉｌｕｓ　ｎａｔａｎｓが確認された。
【００５２】
この活性汚泥に、製造例１で調製されたバクテリオファージの濃縮液を、バクテリオファージ濃度が２×１０６ｐｆｕ／ｍＬとなるように添加した（試験区）。なお、対照区としては、バクテリオファージ濃縮液を添加していないものを使用した。２４時間後、対照区及び試験区のそれぞれの活性汚泥の沈降度を測定し、また、活性汚泥の顕微鏡観察を行なった。結果を表１に示す。
【００５３】
【表１】
2004008896.tif 000003
【００５４】
表１に示されるように、本発明によるバクテリオファージを添加した試験区では、活性汚泥の浮上（バルキング）が起こらなかったが、対照区では、活性汚泥が浮上し、ゆえに、本発明のバクテリオファージを添加することによって、活性汚泥の沈降度が大きく改善される、即ち、バルキングが防止できることが示される。また、両者の活性汚泥を顕微鏡で観察したところ、対照区では、糸状微生物Ｓｐｈａｅｒｏｔｉｌｕｓ　ｎａｔａｎｓが繁殖していたのに対し、試験区では、糸状微生物　Ｓｐｈａｅｒｏｔｉｌｕｓ　ｎａｔａｎｓはほとんど観察されなかった。また、試験区では、活性汚泥のフロックもしっかりしていた。これらの結果から、本発明によるバクテリオファージはバルキングの主要な原因である糸状微生物　Ｓｐｈａｅｒｏｔｉｌｕｓ　ｎａｔａｎｓに感染して溶菌させる性質を有することが示唆され、ゆえに本発明によるバクテリオファージの添加によって、活性汚泥沈降性が有意に改善され、バルキングが抑制される効果が確認された。
【００５５】
実施例４：バクテリオファージによる活性汚泥沈降性（ＳＶ）の改善とバルキングの抑制効果の確認（糸状微生物　Ｍｉｃｒｏｔｈｒｉｘ　ｐａｖｉｃｅｌｌａの適用例）
バルキングの原因となる糸状微生物の中で代表的な糸状微生物　Ｍｉｃｒｏｔｈｒｉｘ　ｐａｖｉｃｅｌｌａに対する分離したバクテリオファージの活性汚泥沈降性（ＳＶ）の改善とバルキングの抑制効果の確認を、以下のように行なった。
【００５６】
グルコース８７０ｍｇ／ｌ、ペプトン２５０ｍｇ／ｌ、塩化ナトリウム３００ｍｇ／ｌ、リン酸二カリウム３９．１ｍｇ／ｌ、硝酸アンモニウム４３ｍｇ／ｌの合成廃水を調製した。この合成廃水を用いて、合成廃水の流入量１ｌ／日、ＭＬＳＳ　２，０００ｐｐｍ、室温２０〜２５℃で、活性汚泥の培養を行ない、糸状微生物によるバルキングを発生させ、以下の実験を行なった。活性汚泥中、糸状微生物としてＭｉｃｒｏｔｈｒｉｘ　ｐａｖｉｃｅｌｌａが確認された。
【００５７】
この活性汚泥に、製造例１で調製されたバクテリオファージの濃縮液を、バクテリオファージ濃度が５×１０７ｐｆｕ／ｍＬとなるように添加した（試験区）。なお、対照区としては、バクテリオファージ濃縮液を添加していないものを使用した。２４時間後、実施例３と同様にして、対照区及び試験区のそれぞれの活性汚泥の沈降度を測定し、また、活性汚泥の顕微鏡観察を行なった。結果を表２に示す。
【００５８】
【表２】
2004008896.tif 000004
【００５９】
表２に示されるように、本発明によるバクテリオファージを添加した試験区では、活性汚泥の浮上（バルキング）が起こらなかったが、対照区では、活性汚泥が浮上し、ゆえに、本発明のバクテリオファージを添加することによって、活性汚泥の沈降度が大きく改善される、即ち、バルキングが防止できることが示される。また、両者の活性汚泥を顕微鏡で観察したところ、対照区では、糸状微生物Ｍｉｃｒｏｔｈｒｉｘ　ｐａｖｉｃｅｌｌａが視野一杯に広がっていたのに対し、試験区では、糸状微生物　Ｍｉｃｒｏｔｈｒｉｘ　ｐａｖｉｃｅｌｌａはほとんど観察されなかった。また、試験区では、活性汚泥のフロックもしっかりしていた。これらの結果から、本発明によるバクテリオファージはバルキングの主要な原因である糸状微生物　Ｍｉｃｒｏｔｈｒｉｘ　ｐａｖｉｃｅｌｌａに感染して溶菌させる性質を有することが示唆され、ゆえに本発明によるバクテリオファージの添加によって、活性汚泥沈降性が有意に改善され、バルキングが抑制される効果が確認された。
【００６０】
実施例５：バクテリオファージの添加濃度による糸状微生物　Ｔｙｐｅ０２１Ｎによるバルキングの抑制効果について
グルコース０．３ｇ／ｌ、酢酸ナトリウム０．３ｇ／ｌ、硫酸アンモニウム０．１ｇ／ｌ、塩化カリウム０．０５ｇ／ｌ、硫酸マグネシウム七水和物０．０５ｇ／ｌ、炭酸カルシウム０．０２ｇ／ｌ、塩化第二鉄六水和物０．０００５ｇ／ｌ、リン酸二ナトリウム０．３１２ｇ／ｌ、リン酸一ナトリウム０．０２ｇ／ｌ、ビタミンミックス５ｍｌ／ｌからなる培地（ｐＨ７．０）２００ｍｌに、糸状微生物　Ｔｙｐｅ０２１Ｎを供試菌として植菌し、３０℃にて２日間振盪培養を行なった。培養後、培養液を遠心分離（２０，０００ｍ／ｓ２×２０分）して糸状微生物Ｔｙｐｅ０２１Ｎ菌体を分離し、この菌体を５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）に懸濁して、ホモジナイズして、糸状微生物　Ｔｙｐｅ０２１Ｎの細胞濃度が１０３個／ｍＬおよび１０５個／ｍＬとなるように、それぞれ、培養液を調製した。それぞれの培養液に、製造例１で調製されたバクテリオファージの濃縮液を、それぞれ、バクテリオファージ濃度が１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９及び１０１０ｐｆｕ／ｍＬとなるように添加した。なお、対照区としては、バクテリオファージ濃縮液を添加していないものを使用した。
【００６１】
まず、各バクテリオファージの添加濃度条件ごとに、添加直後の吸光度を６６０ｎｍの波長で測定した（ＯＤ６６０）。続いて、この混合液を３０℃でインキュベーションし、７２時間後にも吸光度ＯＤ６６０ｎｍを測定して、糸状微生物Ｔｙｐｅ０２１Ｎの増殖状態を観察した。糸状微生物　Ｔｙｐｅ　０２１Ｎの初期細胞濃度が１０３個／ｍＬ及び１０５個／ｍＬである場合の糸状微生物の増殖抑制効果（バルキング防止効果）の結果を、それぞれ、表３及び４に示す。表３及び４において、７２時間後のＯＤ６６０ｎｍが添加直後のＯＤ６６０ｎｍに対して増加していない場合は、糸状微生物の増殖が抑制されており、バルキング防止に高い効果ありということで◎とした。また、７２時間後のＯＤ６６０ｎｍが添加直後のＯＤ６６０ｎｍに対して増加しているものの、バクテリオファージを添加しない場合と比較してＯＤ６６０ｎｍの増加分が９０％以下のものについては、上記◎に比べると効果は少ないものの、糸状微生物の増殖は抑制されており、バルキング防止に効果ありということで○とした。一方、バクテリオファージを添加しない場合と比較してＯＤ６６０ｎｍの増加分が９０％を超える場合については糸状微生物の増殖抑制効果が無いということで×とした。
【００６２】
【表３】
2004008896.tif 000005
【００６３】
【表４】
2004008896.tif 000006
【００６４】
表３及び表４から、初期細胞濃度が１０３（個／ｍＬ）の場合（表３）および１０５（個／ｍＬ）（表４）の場合共に、１０２（ｐｆｕ／ｍＬ）以上のバクテリオファージの添加で、糸状微生物の増殖抑制に効果があることが示される。したがって、１０２ｐｆｕ／ｍＬ以上のバクテリオファージの添加で糸状微生物の増殖抑制効果によりバルキングを抑制する効果があると考えられる。
【００６５】
【発明の効果】
以上の説明から明らかなように、本発明は、活性汚泥のバルキングの原因となる糸状微生物に感染して溶菌させる性質を有するバクテリオファージを活性汚泥に添加することを特徴とする糸状微生物の増殖抑制方法である。したがって、本発明の方法によれば、糸状微生物に感染して溶菌させる性質を有するバクテリオファージを活性汚泥に添加することで糸状微生物の増殖を抑制することが可能である。ゆえに、本発明の方法によれば、糸状微生物の異常増殖に起因するバルキングを予防、解消することが可能であり、活性汚泥利用水処理に有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】は、実施例１において、各インキュベーション時間での菌残存率を示すグラフである。
【図２】は、実施例２において、各インキュベーション時間での菌残存率を示すグラフである。
【図１】
2004008896.tif 000007
【図２】
2004008896.tif 000008