(57)【要約】【課題】少なくとも一つの細胞または一つの生体のゲノムの調査対象のシトシンのメチル化度を決定する方法。【解決手段】下記のステップを実施することを特徴とする、少なくとも一つの細胞または生体のゲノム中の調べるべきシトシンのメチル化度の決定方法。ＤＮＡ試料の重亜硫酸塩による処理及びこれに続く、これら処理されたＤＮＡの選択された断片の増幅。次いで、増幅産物の配列の解析の実施、電気泳動図で解析結果を表示。そのハイブリッド挙動を重亜硫酸塩処理によって変える、塩基の信号強度が塩基の、重亜硫酸塩処理によって変化されない信号強度に比例しその際、場合によっては、検出配列及び／またはその逆相補的な配列が関係することを特徴とする、重亜硫酸塩処理の結果によるシトシンからウラシルへの変化比率の決定。前記第三ステップで決定される変化比率を考慮して、調べるべきシトシンの現実のメチル化度の計算。【選択図】　　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記のステップを実施することを特徴とする、少なくとも一つの細胞または生体のゲノム中の調べるべきシトシンのメチル化度の決定方法。
ａ）ＤＮＡ試料の重亜硫酸塩による処理及びこれに続く、これら処理されたＤＮＡの選択された断片の増幅。
ｂ）増幅産物の配列の解析の実施、電気泳動図で解析結果を表示する。
ｃ）そのハイブリッド挙動を重亜硫酸塩処理によって変える、塩基の信号強度が塩基の、重亜硫酸塩処理によって変化されない信号強度に比例し、その際、場合によっては、検出配列及び／またはその逆相補的な配列が関係することを特徴とする、重亜硫酸塩処理の結果によるシトシンからウラシルへの変化比率の決定。
ｄ）ステップｃ）で決定される変化比率を考慮して、調べるべきシトシンの現実のメチル化度の計算。
【請求項２】
増幅産物の配列解析において、ＤＮＡのチミン配列のみか、または、逆相補的鎖中のアデニン配列のみを調べ、その結果を電気泳動図で示すことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
塩基Ｂの信号強度ＩＢ、このとき、ＢはＣ、Ａ、ＧまたはＴであり、それによって塩基の種類が限定され、その強度は下記式で表される、電気泳動図におけるピーク下の平坦部分を意味し、このとき、ｆ（ｘ）は単位ｘについて、強度信号の変化を示す曲線である。Ｘはクロマトグラフ分離後の、二つの塩基間の距離を示す時間を再現する、請求項１または２に記載の方法。
2004008217.tif 000007
このときＷ１及びＷ２は最大値ｆｍａｘのｘ値に最も近い位置にある変曲点のｘ座標である。Ｗ１はｘ値の左に、Ｗ２はｘ値の右にある。
【請求項４】
信号強度ＩＢが下記式で表される請求項１または２に記載の方法。
2004008217.tif 000008
このときＭ１及びＭ２は最大値ｆｍａｘのｘ値に最も近い位置にある最小値のｘ座標である。Ｍ１はｘ値の左に、Ｍ２はｘ値の右にある。
【請求項５】
信号強度ＩＢが下記式で表される請求項１または２に記載の方法。
2004008217.tif 000009
このときＨ１及びＨ２は最大値ｆｍａｘのｘ値に最も近い曲線上のｆ（ｘ）がｆｍａｘの値の１／２にあたる位置のｘ座標である。Ｈ１はｘ値の左に、Ｈ２はｘ値の右にある。
【請求項６】
信号強度ＩＢが下記式で表される請求項１または２に記載の方法。
2004008217.tif 000010
このとき、
Ｄ１＝ｘ−（ｘ−ｘ　左）／２及び
Ｄ２＝ｘ＋（ｘ　右−ｘ）／２、
このとき、ｘは求める信号強度の位置Ａのｘ座標、
ｘ　左は最大値の左のｘ座標であり、
ｘ　右は最大値の右のｘ座標である。
【請求項７】
信号曲線の平坦部分の位置Ａの信号の信号強度ＩＢが下記式で計算される請求項１または２に記載の方法。
2004008217.tif 000011
その際、限界値Ｘ１及びＸ２としては、既に記載されたＷ１、Ｗ２　、Ｈ１、Ｈ２、Ｍ１、Ｍ２、Ｄ１またはＤ２の任意の組合わせのＸ座標が使用され、Ｘ１は、位置Ａを決める、ｘ値の左に、Ｘ２はｘ値の右にある。
【請求項８】
配列解析を鎖解体法により行なう請求項１または２に記載の方法。
【請求項９】
ステップｂ）で二つの異なる塩基についての配列解析が行なわれ、次のステップがそれに続くことを特徴とする請求項１に記載の方法。
ここで、１種またはより多くの残りの塩基の信号強度平均値に対するＣ、Ｔ、ＡまたはＧの塩基のうちの少なくとも１種の信号強度平均値の標準化が為され、その際、増幅産物の任意の限定領域内の塩基の少なくとも、二つの位置の平均が調べられる。
【請求項１０】
所謂、ステップｃ）における変化比率の決定のために、標準的信号強度が使用されることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
調べるべきシトシンの現実のメチル化度の計算のために、標準化信号強度及び標準化信号強度を考慮して得られた変化比率が使用されることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
チミン信号の信号強度に対しシトシン信号の信号強度を標準化するか、または、逆相補的鎖の配列情報を利用する際、アデニン信号の信号強度に対しグアニン信号の信号強度を標準化することを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
標準化因子ｆＮが下記から計算される請求項９に記載の方法。
ｆＮ＝＜ＩＣＣＧ＞／（＜ＩＴＴ＞−＜ＩＴＣＧ＞　）から、またはその逆数
ｆＮ−１＝（＜ＩＴＴ＞−＜ＩＴＣＧ＞　）／＜ＩＣＣＧ＞
または逆相補的鎖の配列情報の利用において、
ｆＮ＝＜ＩＧＣＧ＞／（＜ＩＡＡ＞−＜ＩＡＣＧ＞）またはその逆数
ｆＮ−１＝（＜ＩＡＡ−＜ＩＡＣＧ＞）／＜ＩＧＣＧ＞
このとき、＜ＩＴＴ＞はチミンの信号強度＜ＩＴ＞の平均、＜ＩＡＡ＞はアデニンの信号強度（ＩＡ）の平均、各々はチミンまたはアデニンの重亜硫酸塩処理前の位置にあった。
このとき、＜ＩＴＣＧ＞及び＜ＩＣＣＧ＞はＣｐＧにおけるシトシンの位置の、チミン及びシトシンの信号強度の平均値であり、＜ＩＡＣＧ＞及び＜ＩＧＣＧ＞は各々ＣｐＧにおけるグアニンの位置の、チミン及びシトシンの信号強度の平均値が再生され、そして、このとき、任意に限定される配列範囲内の考慮すべき全位置に亘って、平均が計算される。
【請求項１４】
標準化因子ｆＮが下記から計算される請求項９に記載の方法。
ｆＮ＝＜ＩＣＣ＞／（＜ＩＴＴ＞−＜ＩＴＣ＞）
またはその逆数
ｆＮ−１＝（＜ＩＴＴ−＜ＩＴＣ＞）／＜ＩＣＣ＞
または逆相補的鎖の配列情報の利用において、
ｆＮ＝＜ＩＧＧ＞／（＜ＩＡＡ＞−＜ＩＡＧ＞）
またはその逆数
ｆＮ−１＝（＜ＩＡＡ＞−＜ＩＡＧ＞）／＜ＩＧＧ＞
このとき、＜ＩＴＴ＞はチミンの信号強度＜ＩＴ＞の平均値、＜ＩＡＡ＞はアデニンの信号強度（ＩＡ）の平均値、各々はチミンまたはアデニンの重亜硫酸塩処理の前の位置にあった。このとき、＜ＩＴＣ＞及び＜ＩＣＣ＞はシトシン位置のチミン及びシトシンの信号強度の平均値であり、＜ＩＡＧ＞と＜ＩＧＧ＞はＣｐＧ位置に存在しない、グアニン位置のアデニンとグアニンの信号強度の平均値であり、そしてこのとき、任意に限定される配列範囲内の考慮すべき全位置に亘って、平均が計算される。
【請求項１５】
標準化因子ｆＮが下記から計算される請求項９に記載の方法。
ｆＮ＝＜ＩＴＡ、Ｇ＞／＜ＩＣＡ、Ｇ＞
またはその逆数
ｆＮ−１＝＜ＩＣＡ、Ｇ＞／＜ＩＴＡ、Ｇ＞
または逆相補的鎖の配列情報の利用において、
ｆＮ＝＜ＩＡＴ、Ｃ＞／＜ＩＧＴ、Ｃ＞
またはその逆数
ｆＮ−１＝＜ＩＧＴ、Ｃ＞／＜ＩＡＴ、Ｃ＞
このとき、＜ＩＴＡ、Ｇ＞チミンの信号強度（ＩＴ）の平均値であり、＜ＩＣＡ、Ｇ＞はシトシンの信号強度（ＩＣ）の平均値であり、各々はアデニンまたはグアニン位置に再生される。そしてこのとき、＜ＩＡＴ、Ｃ＞はアデニンの信号強度（ＩＡ）の平均値であり、＜ＩＧＴ、Ｃ＞はグアニンの信号強度（ＩＧ）の平均値であり、チミンまたはシトシンの位置に再生される。そしてこのとき、任意に限定される配列範囲内の考慮すべき全位置に亘って、平均が計算される。
【請求項１６】
変化比率ｆＣＯＮが下記から計算される請求項９に記載の方法。
ｆＣＯＮ＝ＩＴＣ／（ｆＮＩＣＣ＋ＩＴＣ）
または
ｆＣＯＮ＝＜ＩＴＣ／（ｆＮＩＣＣ＋ＩＴＣ）＞
またはその逆数
ｆＣＯＮ−１＝（ｆＮＩＣＣ＋ＩＴＣ）／ＩＴＣ
または
ｆＣＯＮ−１＝＜（ｆＮＩＣＣ＋ＩＴＣ）／ＩＴＣ＞
または逆相補的鎖の配列情報の利用において、
ｆＣＯＮ＝ＩＡＧ／（ｆＮＩＧＧ＋ＩＡＧ）
または
ｆＣＯＮ＝＜ＩＡＧ／（ｆＮＩＧＧ＋ＩＡＧ）＞
またはその逆数
ｆＣＯＮ−１＝（ｆＮＩＧＧ＋ＩＡＧ）／ＩＡＧ
または
ｆＣＯＮ−１＝＜（ｆＮＩＧＧ＋ＩＡＧ）／ＩＡＧ＞
このとき、標準化が使用された後、請求項１３、１４または１５記載の標準化因子ｆＮ、チミン信号強度ＩＴＣ及びＣｐＧ位置に存在しない、シトシンのシトシン信号強度ＩＣＣ及び各々ＣｐＧ位置に存在しないグアニンの、アデニン信号強度ＩＡＧ及びグアニン信号強度ＩＧＧが重亜硫酸塩処理後に再生される。そしてこのとき、任意に限定された配列範囲内の全ての考慮された位置の対応する商の平均を形成するかまたはシトシンまたはグアニン位置を考慮するかの何れか。
【請求項１７】
変化比率ｆＣＯＮが下記から計算される請求項１に記載の方法。
ｆＣＯＮ＝＜ＩＴＣ＞／＜ＩＴＴ＞
またはその逆数
ｆＣＯＮ−１＝＜ＩＴＴ＞／＜ＩＴＣ＞
または、または逆相補的鎖の配列情報の利用において、
ｆＣＯＮ＝＜ＩＡＧ＞／＜ＩＡＡ＞
またはその逆数
ｆＣＯＮ−１＝＜ＩＡＡ＞／＜ＩＡＧ＞
このとき、＜ＩＴＣ＞はＣｐＧ位置に存在しないチミンのチミン信号強度の平均、＜ＩＡＧ＞は重亜硫酸塩処理後に再生しない、ＣｐＧ位置に存在しないグアニンのアデニン信号強度の平均、そして、＜ＩＴＴ＞はチミン位置のチミン信号強度の平均であり、＜ＩＡＡ＞はアデニン位置で再生するアデニン信号強度の平均であり、任意に限定される配列範囲内の考慮すべき全位置に亘って、平均が計算される。
【請求項１８】
メチル化比率ｆＭＥＴが下記の式によって計算される請求項９に記載の方法。
ｆＭＥＴ＝１−ＩＴＣＧ／［ｆＣＯＮ（ｆＮＩＣＣＧ＋ＩＴＣＧ）］
または、逆相補的鎖の配列情報の利用において、
ｆＭＥＴ＝１−ＩＡＣＧ／［ｆＣＯＮ（ｆＮＩＧＣＧ＋ＩＡＣＧ）］
その際、ＩＴＣＧ及びＩＣＣＧメチミン及びＣｐＧ位置の調べるべきシトシンのシトシン信号強度、ＩＡＣＧ及びＩＧＣＧはアデニン及びＣｐＧ位置の調べるべきグアニンのグアニン信号強度が再生される。このとき、メチル化比率は１〜１００％メチル化に対応する。
【請求項１９】
メチル化比率ｆＭＥＴが下記の式によって計算される請求項１に記載の方法。
ｆＭＥＴ＝１−ＩＴＣＧ／ｆＣＯＮ＜ＩＴＴ＞
または、逆相補的鎖の配列情報の利用において、
ｆＭＥＴ＝１−ＩＡＣＧ／ｆＣＯＮ＜ＩＡＡ＞
このとき、ＩＴＣＧＣｐＧ位置のシトシンのチミン信号強度及び＜ＩＴＴ＞チミン位置のチミン信号強度の平均が再生される。このとき、ＩＡＣＧＣｐＧ位置のグアニンのアデニン信号強度及び＜ＩＡＡ＞アデニン位置のアデニン信号強度が再生される。このとき、メチル化比率は１〜１００％メチル化に対応する。
【請求項２０】
一種類の塩基の配列、部分的に知られた、少なくとも３種類の異なるヌクレオチッドを含むヌクレオチッド配列を、統計的及び信号理論的方法、蓋然性のある方法の助けを借りて、二つの任意の塩基間の距離を調べることにより決める請求項２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、少なくとも一つの細胞または一つの生体のゲノムの調査対象のシトシンのメチル化度の決定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
５−メチルシトシンは最も頻繁に共有結合反応される真核細胞のＤＮＡにおける塩基である。これは、例えば、ゲノム刷り込み及び腫瘍形成時に、転写の規制で、一つの役割を演じる。遺伝情報の構成部分としての５−メチルシトシンの同定については、関心が高まりつつある。５−メチルシトシンはシトシンと同様の塩基対挙動を示すので、その位置は配列化によっては同定できない。従がって、ＰＣＲ増幅では５−メチルシトシンが有している後成的情報は完全に失われる。
【０００３】
この問題解決のための多くの方法が知られている。多くはゲノムＤＮＡの化学反応またはその酵素処理である。このためには、メチルシトシンのシトシンを分離しなければならぬ。通常の方法は、重亜硫酸塩によるゲノムＤＮＡの変換である。この方法は、アルカリ加水分解後の第二ステップで、シトシン塩基のウラシルへの変換が行なわれる［Ｓｈａｐｉｒｏ、Ｒ．、Ｃｏｈｅｎ、Ｂ．　ｕｎｄ　Ｓｅｒｖｉｓ、Ｒ．　（１９７０）　Ｎａｔｕｒｅ　２２７、１０４７］。５−メチルシトシンはこの条件下では変化しない。シトシンのウラシルへの変換は塩基配列の変化に通じ、配列化により、元の５−メチルシトシンが確認される（ただ、これはＣシュプールでバンドを形成する）。
【０００４】
５−メチルシトシンを実証する公知の他の方法についての概観は、それに属する次ぎの概観刊行物から読み取れる。Ｒｅｉｎ、Ｔ．、ＤｅＰａｍｐｈｉｌｉｓ、Ｍ．．　Ｌ．　ｕｎｄ　Ｚｏｒｂａｓ、Ｈ．（１９９８）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　２６、２２５５。
【０００５】
ＤＮＡに結合し、プライマー分子として機能し、ＤＮＡポリメラーゼ及び十分なｄＮＴＰｓ及び鎖分解に導くｄｄＮＴＰｓの補助によって、伸長される好適なオリゴヌクレオチッドの付加によって塩基配列を決定することは公知である。この方法は以下の鎖分解法またはサンガー配列化法と命名される。大部分の公知の配列化法は自動化され、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）及びコンピューターによる評価プログラムを内容とする構想に基づく。
【０００６】
ＤＮＡのＰＣＲによる増幅は公知である。同様に、自動的配列解析も公知である。主として、自動化のために、サンガー配列化法が使用され、基礎的に多くの反応が分類され、そこではテンプレート及び４個の塩基に対する４個のｄＮＴＰｓがｄｄＮＴＰｓとして付け加えられる。これは、塩基毎ののポリメラーゼ反応の中断に通じる。もし、４種の反応生成物を決め、一処方毎に特殊な蛍光マーカー付加したオリゴヌクレオチッドプライマーを使用すれば、好適な検出器で、反応完結後の生成物の混合後どの生成物から分子ができたかが決められる。このようにして、痕跡の大きさにしたがってこれら混合物の分離を行う。
【０００７】
比較的高価なオリゴヌクレオチッドプライマーの蛍光マーカーを扱うために、各種の色の蛍光をマークされたジデオキシヌクレオチド分解物が使用される。この場合、４種の反応成生物の分離残り、４種の分解反応が起こる。
【０００８】
反応完結後、蛍光マーカーを付された反応生成物が電気泳動により、アクリルアミドゲル痕跡中でその大きさにしたがって分離される。検出器をその大きさの順に通過するＤＮＡ分解断片はレーザー光を照射され、このレーザー光は蛍光色素を刺激して、その特殊な波長の放出を誘導する。この波長は検出器で記録、図化され、好適なコンピュータープログラムによって配列情報化される。
【０００９】
今日、行なわれている自動化方法は電気泳動法のデータの集積結果及びこれら４種の色素毎のデータのグラフ的図表化を生み出した。各色素は特定の核酸に対応し得、これから、オリジナル配列の塩基配列が確認される。
【００１０】
従来技術の重亜硫酸塩配列化、重亜硫酸塩処理ＤＮＡに関する幾つかの刊行物を以下に紹介する。例えば、重亜硫酸塩配列化技法及びヒト前立腺癌における男性ホルモン受容体の静止転写最小プロモーターのメチル化解析［Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ　ｅｔ　ａｌ．、男性ホルモン受容体の最小プロモーターのメチル化　（２０００）　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ６０：　３６２３〜３６３０］及びグルタチオン−Ｓ−転移酵素−π−（ＧＳＴＰ１）遺伝子のメチル化解析［Ｍｉｌｌａｒ　ｅｔ　ａｌ．　（１９９９）；　前立腺癌におけるグルタチオン−Ｓ−転移酵素−π−遺伝子のメチル化解析に関する詳説。Ｏｎｃｏｇｅｎｅ　１８：　１３１３〜１３２４］などが前立腺癌におけるその役割の説明に引用されている。両刊行物において、著者等はＳｕｓａｎ　Ｊ．　Ｃａｒｋ　ｅｔ　ａｌ．の刊行物［メチル化シトシンの感受性図。（１９９４）Ｃｌａｒｋｅｔ　ａｌ．；Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ　２２：　２９９０〜２９９７］を引用し、その中で、重亜硫酸塩配列化について記載している。
【００１１】
配列化法によるシトシンのメチル化の量的決定に関する従来技術は主として、ポール及びクラークの著書から得られる。その中で、異なるマーカーを帯びたチミン及びシトシン塩基の使用下の配列法が記載されている［Ｐａｕｌ　Ｃ．　Ｌ．　ａｎｄ　Ｃｌａｒｋ　Ｓ．　Ｊ．　（１９９６）　シトシンメチル化：自動化されたゲノム配列化及び遺伝子スキャン解析。Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．　２１　（１）：　１２６〜３３］。この方法は数量的メチル化度の解析に好適である。だがこの方法は、チミン、シトシンの異なる構成比率による、また、異なる色素の使用による、正確な数量化は困難であるという問題を解決できない。この問題は、本発明で提案されている標準化で解決できる。その他、クラークとポールの方法は、成果に本質的にに影響する、塩記中の非メチル化シトシンをチミンのハイブリッド化挙動で変化させる反応の効率を全く考慮していない。本発明の方法では、重亜硫酸塩変換比を正確に考慮している。
【００１２】
電気泳動法の問題点及び解決法の記述は上記したように、塩基配列の順序は経過曲線として示されている。理論的に経過曲線の各ピークは元の配列の塩基の浮上に対応する。それで、４種の異なる色素のグラフは交互に、配列全体を確認するために描かれている。
【００１３】
個々の配列で一回だけ各位置を占めることができ、且つ、各位置は少なくとも一つの塩基で代表されねばならぬので、理想的には、全ての信号は同じ強度を持たねばならぬ。信号強度はピークの大きさ、正確に言えば、ピーク下の平坦によって決定される。これらは分解ヌクレオチッドの構成が偶然性をもって分布しているか、または、均一分布である限り、同じ大きさである。ある位置が好ましい分解ヌクレオチッドの構成になると、これら産物は増加し、対応するピークは大きくなる。塩基配列はそのまま手付かずで残る。
【００１４】
使用された蛍光色素の強度の差異は信号強度の差異の条件になる。もしその塩基配列において、各位置が異なり、その特殊な配列の比率が相互の決められるような、配列の混合物を調べれば、配列自体の数量的確認に対してなんの役割も果たしていなし、正確なピーク強度の調査が決定的な意味を有する。ピーク強度は前記位置に特殊性の塩基があるＤＮＡ混合物の分子数を反映する。例えば、異なるヌクレオチッドの位置に二つの対立が示されれば、電気泳動図には、同じ位置に半分の強度のピークが得られる。いわば、重複である。これは例えば、ポイント突然変異を解析時に、これが対立上に突然現われるケースである。
【００１５】
類似配列の混合物から、既定の塩基配列の部分を数量化するときには、ピーク強度の決定は重要な意味を持つ。これは一つまたは複数のシトシンのメチル化度を決定しようとする場合にあたる。シトシンのメチル化度の数量的決定は、メチル化及び非メチル化ＤＮＡ分子の混合物のメチル化ＤＮＡ分子の部分の決定であると理解される。
【００１６】
好適な変換方法、例えば、重亜硫酸塩処理によって、メチル化シトシンが比メチル化シトシンから、変換後の、ＰＣＲによるハイブリッド化挙動の差異にしたがって区別される。従がって、ＰＣＲ後、個々のヌクレオチッドを互いに区別する分子の混合物をそれ自体有する状況になる。例えば、ＣｐＧ位置の２０％の分子がメチル化されれば、重亜硫酸塩処理ＤＮＡの配列化では、シトシン検出電気泳動図の前記位置で、２０％の信号強度のピーク及びチミン検出電気泳動図で、他の残りの信号強度の８０％の信号強度のピークが現われる。ピーク強度を正確な数量化に使用することができるためには、勿論、得られた信号強度が４つの色素全て同等であるとの前提が必要である。この場合はそれに当てはまらない。
【００１７】
逆に、４種の蛍光色素の全てが同じ強度で検出されることもなく、また４種の構成成分全てが、同様に効果的であることもない。特に、重亜硫酸塩処理ＤＮＡの配列では、比較的少量のシトシンが変化した配列中に存在し、その信号がそのために、本質的に、強く現われるという問題が出現する。異なる色素でマークした配列断片の不等重量はマーカー化シトシンの信号強度の過大評価に繋がり、そのために、配列解析の結果を悪化させる。
【００１８】
より信頼性のある配列情報を得るために、特に、品質的に可否の返答を得るだけでなく、配列の特殊な位置の塩基の部分の数量的確認を行なえば、種々の信号の標準化が推奨すべきものになる。重亜硫酸塩処理されたシトシンの乏しい配列におけるシトシン部分の確認が重要であり、特に、シトシン信号の標準化が差し迫って要求される。
【００１９】
更に、他の本質的な問題は、しばしば、完全な変換によって為された非メチル化シトシンのウラシルへの変化の問題である。例えば、変換比率８０％が以下の結果を与える。即ち、本来、変換後ウラシル及びＰＣＲ後チミン信号を与えるべき２０％のシトシンがこれを行なわないという結果である。従がって、平均的グアニン信号強度が、シトシンが１００％メチル化されていないところの、ＣｐＧ位置の非メチル化シトシンの位置のチミンの信号強度の８０％のみであることの比較が記載されている。変換比率の知見なしに、受領下、変換は完全に経過し、この信号強度は８０％が非メチル化、２０％がメチル化されているＣｐＧ位置として説明される。従がって、シトシンのメチル化度の正確な数量化への変換比率の把握が、強度の標準化が同様に差し迫って必要である。
【００２０】
文献の中で、凌駕している部分は、“遺伝子抑制”という語で表される遺伝子転写の抑制であり、それと、メチル化は一つまたは僅かなＣｐＧ位置の解析に基づき、メチル化感受性の制限酵素の補助の下に限定される、品質的メチル化解析に基づき行なわれる。そして、例えば、異なる対立にあるメチル化度を調べ、クローン［Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ　ｅｔ　ａｌ．、２０００；Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　６０、３６２３〜３６３０］の配列化に基づく解析：調べるゲノムＤＮＡは抽出され、重亜硫酸塩処理される。興味のあるＤＮＡ範囲はＰＣＲで増幅され、得られた増幅産物はサブクローン化される。
【００２１】
例えば、特殊な対立のメチル化状態は重亜硫酸塩処理ＤＮＡのＰＣＲ増幅産物はサブクローン化され、大腸菌（Ｅ　ｃｏｌｉ）中に形質転換される。それに続いて、クローン毎に、１０〜２５のクローンが調べられる。一つの対立のメチル化解析では、そこでは成果はまだゼロか、一つか、または二つしか得られていないが、既に、比較的僅かな数のクローンについて、配列により説得力のある成果を得ている。一般に、クローンを研究すればするほど、ますます、その成果は現実のメチル化度に対応するものになることが知られている。引用されている報告（Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ　ｅｔ　ａｌ．　２０００）では、１０〜２５の大腸菌培養が引用され、そのプラスミドＤＮＡが分離されている。この１０〜２５のプラスミドＤＮＡ試料は、全てそれぞれ配列化され、メチル化及び非メチル化の比率によって、対立のメチル化度が決定される。
【００２２】
度重なるＤＮＡの配列化、とりわけ、クローン化のステップを付け加えることによって、このプロセスはコスト的、原料的及び人件費的に強いものになった。
【００２３】
前記研究（Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ　ｅｔ　ａｌ．、２０００及びＭｉｌｌａｒ　ｅｔ　ａｌ．、１９９９）は実施例でも、クローン化しないでＣｐＧ位置のメチル化度の量的決定をする試みが記載されている。データの解明は重亜硫酸塩効果抜きで決定する場合、及びそれを現実のメチル化度の計算に使用する場合の二通りがある。信号強度のゆがみが問題になることは少ない。従来の、配列化によるＣｐＧ位置のＤＮＡのメチル化度の量的決定方法はそれ故、高コストで時間がかかるだけでなく、とりわけ、複雑な混合試料のためによくない結果に繋がる可能性がある。
【００２４】
前記の従来技術の問題点、不利な点は本発明の方法により解決される。
【００２５】
【発明が解決しようとする課題及び課題を解決するための手段】
課題は本発明の少なくとも一つの細胞または一つの生体のゲノムの調査対象のシトシンのメチル化度決定方法であって、以下のステップを実行することによって解決する。
ａ）ＤＮＡ試料の重亜硫酸塩による処理及びこれに続く、これら処理されたＤＮＡの選択された断片の増幅。
ｂ）増幅産物の配列の解析の実施、電気泳動図で解析結果を表示する。
ｃ）そのハイブリッド挙動を重亜硫酸塩処理によって変える、塩基の信号強度が塩基の、重亜硫酸塩処理によって変化されない信号強度に比例しその際、場合によっては、検出配列及び／またはその逆相補的は配列が関係することを特徴とする、重亜硫酸塩処理の結果によるシトシンからウラシルへの変化比率の決定。
ｄ）ステップｃ）で決定される変化比率を考慮して、調べるべきシトシンの現実のメチル化度の計算。
【００２６】
【発明の実施の形態】
このとき、本発明においては、増幅産物の配列解析において、ＤＮＡのチミン配列のみかまたは逆相補的鎖中のアデニン配列のみを調べ、その結果を電気泳動図で示すすることが好ましい。
【００２７】
本発明においては、塩基Ｂの信号強度ＩＢ、このとき、ＢはＣ、Ａ、ＧまたはＴであり、それによって塩基の種類が限定され、その強度は下記式で表される、電気泳動図におけるピーク下の平坦部分を意味し、このとき、ｆ（ｘ）は単位ｘについて、強度信号の変化を示す曲線である。Ｘはクロマトグラフ分離後の、二つの塩基間の距離を示す時間を再現することが好ましい。
2004008217.tif 000002
このときＷ１及びＷ２は最大値ｆｍａｘのｘ値に最も近い位置にある変曲点のｘ座標である。Ｗ１はｘ値の左に、Ｗ２はｘ値の右にある。
【００２８】
本発明においては、信号強度ＩＢが下記式で表される。
2004008217.tif 000003
このときＭ１及びＭ２は最大値ｆｍａｘのｘ値に最も近い位置にある最小値のｘ座標である。Ｍ１はｘ値の左に、Ｍ２はｘ値の右にある。
【００２９】
本発明においては、信号強度ＩＢが下記式で表される。
2004008217.tif 000004
このときＨ１及びＨ２は最大値ｆｍａｘのｘ値に最も近い曲線上のｆ（ｘ）がｆｍａｘの値の１／２にあたる位置のｘ座標である。Ｈ１はｘ値の左に、Ｈ２はｘ値の右にある。
【００３０】
本発明においては、信号強度ＩＢが下記式で表される。
2004008217.tif 000005
このとき、
Ｄ１＝ｘ−（ｘ−ｘ　左）／２及び
Ｄ２＝ｘ＋（ｘ　右−ｘ）／２、
このとき、ｘは求める信号強度の位置Ａのｘ座標、
ｘ　左は最大値の左のｘ座標であり、
ｘ　右は最大値の右のｘ座標である。
【００３１】
最後に、本発明においては、信号曲線の平坦部分の位置Ａの信号の信号強度ＩＢが下記式で計算されうる。
2004008217.tif 000006
その際、限界値Ｘ１及びＸ２としては、既に記載されたＷ１、Ｗ２　、Ｈ１、Ｈ２、Ｍ１、Ｍ２、Ｄ１またはＤ２の任意の組合わせのＸ座標が使用され、Ｘ１は、位置Ａを決める、ｘ値の左に、Ｘ２はｘ値の右にある。
【００３２】
本発明においては、配列解析を鎖解体法により行なう。
【００３３】
本発明においては以下のようにすることが特に好ましい。ステップｂ）で二つの異なる塩基についての配列解析が行なわれ、次ぎのステップがそれに続く。ここで、１種またはより多くの残りの塩基の信号強度平均値に対するＣ、Ｔ、ＡまたはＧの塩基のうちの少なくとも１種の信号強度平均値の標準化が為され、その際、増幅産物の任意の限定領域内の塩基の多くの位置の平均が調べられる。多くの位置のなかで、少なくとも二つの位置が本発明に関与することが理解される。しかし、二つ以上１００及びそれ以上でも関与はあり得る。平均値を得るには数学的に裏付けられ及び／または統計的に信頼性のある値を用いるのが、有力である。
【００３４】
さらにこのとき、ステップｃ）における変化比率の決定のために、標準的信号強度が使用されることが好ましい。
【００３５】
調べるべきシトシンの現実のメチル化度の計算のために、標準化信号強度及び標準化信号強度を考慮して得られた変化比率が使用されることが特に好ましい。
【００３６】
チミン信号の信号強度に対しシトシン信号の信号強度を標準化するか、または、逆相補的鎖の配列情報を利用する際、アデニン信号の信号強度に対しグアニン信号の信号強度を標準化することが、本発明においては特に好ましい。
【００３７】
本発明においては、標準化の因子ｆＮが以下のようにして計算される。
ｆＮ＝＜ＩＣＣＧ＞／（＜ＩＴＴ＞−＜ＩＴＣＧ＞　）から、またはその逆数
ｆＮ−１＝（＜ＩＴＴ＞−＜ＩＴＣＧ＞　）／＜ＩＣＣＧ＞
または逆相補的鎖の配列情報の利用において、
ｆＮ＝＜ＩＧＣＧ＞／（＜ＩＡＡ＞−＜ＩＡＣＧ＞）またはその逆数
ｆＮ−１＝（＜ＩＡＡ−＜ＩＡＣＧ＞）／＜ＩＧＣＧ＞
このとき、＜ＩＴＴ＞はチミンの信号強度（ＩＴ）の平均、＜ＩＡＡ＞はアデニンの信号強度（ＩＡ）の平均、各々はチミンまたはアデニンの重亜硫酸塩処理前の位置にあった。
このとき、＜ＩＴＣＧ＞及び＜ＩＣＣＧ＞はＣｐＧにおけるシトシンの位置の、チミン及びシトシンの信号強度の平均値であり、＜ＩＡＣＧ＞及び＜ＩＧＣＧ＞は各々ＣｐＧにおけるグアニンの位置の、チミン及びシトシンの信号強度の平均値が再生され、そして、このとき、任意に限定される配列範囲内の考慮すべき全位置に亘って、平均が計算される。
【００３８】
本発明においては標準化因子ｆＮが下記から、また、計算される。
ｆＮ＝＜ＩＣＣ＞／（＜ＩＴＴ＞−＜ＩＴＣ＞）
またはその逆数
ｆＮ−１＝（＜ＩＴＴ−＜ＩＴＣ＞）／＜ＩＣＣ＞
または逆相補的鎖の配列情報の利用において、
ｆＮ＝＜ＩＧＧ＞／（＜ＩＡＡ＞−＜ＩＡＧ＞）
またはその逆数
ｆＮ−１＝（＜ＩＡＡ＞−＜ＩＡＧ＞）／＜ＩＧＧ＞
このとき、＜ＩＴＴ＞はチミンの信号強度（ＩＴ）の平均値、＜ＩＡＡ＞はアデニンの信号強度（ＩＡ）の平均値、各々はチミンまたはアデニンの重亜硫酸塩処理の前の位置にあった。このとき、＜ＩＴＣ＞及び＜ＩＣＣ＞はシトシン位置のチミン及びシトシンの信号強度の平均値であり、＜ＩＡＧ＞と＜ＩＧＧ＞はＣｐＧ位置に存在しない、グアニン位置のアデニンとグアニンの信号強度の平均値であり、そしてこのとき、任意に限定される配列範囲内の考慮すべき全位置に亘って、平均が計算される。
【００３９】
更に、本発明においては、標準化因子ｆＮが下記から計算される。
ｆＮ＝＜ＩＴＡ、Ｇ＞／＜ＩＣＡ、Ｇ＞
またはその逆数
ｆＮ−１＝＜ＩＣＡ、Ｇ＞／＜ＩＴＡ、Ｇ＞
または逆相補的鎖の配列情報の利用において、
ｆＮ＝＜ＩＡＴ、Ｃ＞／＜ＩＧＴ、Ｃ＞
またはその逆数
ｆＮ−１＝＜ＩＧＴ、Ｃ＞／＜ＩＡＴ、Ｃ＞
このとき、＜ＩＴＡ、Ｇ＞チミンの信号強度（ＩＴ）の平均値であり、＜ＩＣＡ、Ｇ＞はシトシンの信号強度（ＩＣ）の平均値であり、各々はアデニンまたはグアニン位置に再生される。そしてこのとき、＜ＩＡＴ、Ｃ＞はアデニンの信号強度（ＩＡ）の平均値であり、＜ＩＧＴ、Ｃ＞はグアニンの信号強度（ＩＧ）の平均値であり、チミンまたはシトシンの位置に再生される。そしてこのとき、任意に限定される配列範囲内の考慮すべき全位置に亘って、平均が計算される。
【００４０】
本発明においては、変化比率ｆＣＯＮが下記から計算される。
ｆＣＯＮ＝ＩＴＣ／（ｆＮＩＣＣ＋ＩＴＣ）
または
ｆＣＯＮ＝＜ＩＴＣ／（ｆＮＩＣＣ＋ＩＴＣ）＞
またはその逆数
ｆＣＯＮ−１＝（ｆＮＩＣＣ＋ＩＴＣ）／ＩＴＣ
または
ｆＣＯＮ−１＝＜（ｆＮＩＣＣ＋ＩＴＣ）／ＩＴＣ＞
または逆相補的鎖の配列情報の利用において、
ｆＣＯＮ＝ＩＡＧ／（ｆＮＩＧＧ＋ＩＡＧ）
または
ｆＣＯＮ＝＜ＩＡＧ／（ｆＮＩＧＧ＋ＩＡＧ）＞
またはその逆数
ｆＣＯＮ−１＝（ｆＮＩＧＧ＋ＩＡＧ）／ＩＡＧ
または
ｆＣＯＮ−１＝＜（ｆＮＩＧＧ＋ＩＡＧ）／ＩＡＧ＞
このとき、標準化が使用された後、請求項１３、１４または１５記載の標準化因子ｆＮ、チミン信号強度ＩＴＣ及びＣｐＧ位置に存在しない、シトシンのシトシン信号強度ＩＣＣ及び各々ＣｐＧ位置に存在しないグアニンの、アデニン信号強度ＩＡＧ及びグアニン信号強度ＩＧＧが重亜硫酸塩処理後に再生される。そしてこのとき、任意に限定された配列範囲内の全ての考慮された位置の対応する商の平均を形成するか、または、シトシンまたはグアニン位置を考慮するかの何れかである。
【００４１】
本発明においては、変化比率ｆＣＯＮが下記から計算される。
ｆＣＯＮ＝＜ＩＴＣ＞／＜ＩＴＴ＞
またはその逆数
ｆＣＯＮ−１＝＜ＩＴＴ＞／＜ＩＴＣ＞
または、または逆相補的鎖の配列情報の利用において、
ｆＣＯＮ＝＜ＩＡＧ＞／＜ＩＡＡ＞
またはその逆数
ｆＣＯＮ−１＝＜ＩＡＡ＞／＜ＩＡＧ＞
このとき、＜ＩＴＣ＞はＣｐＧ位置に存在しないチミンのチミン信号強度の平均、＜ＩＡＧ＞は重亜硫酸塩処理後に再生しない、ＣｐＧ位置に存在しないグアニンのアデニン信号強度の平均、そして、＜ＩＴＴ＞はチミン位置のチミン信号強度の平均であり、＜ＩＡＡ＞はアデニン位置で再生するアデニン信号強度の平均であり、任意に限定される配列範囲内の考慮すべき全位置に亘って、平均が計算される。
【００４２】
本発明においては、メチル化比率ｆＭＥＴが下記の式によって計算される。
ｆＭＥＴ＝１−ＩＴＣＧ／［ｆＣＯＮ（ｆＮＩＣＣＧ＋ＩＴＣＧ）］
または、逆相補的鎖の配列情報の利用において、
ｆＭＥＴ＝１−ＩＡＣＧ／［ｆＣＯＮ（ｆＮＩＧＣＧ＋ＩＡＣＧ）］
その際、ＩＴＣＧ及びＩＣＣＧメチミン及びＣｐＧ位置の調べるべきシトシンのシトシン信号強度、ＩＡＣＧ及びＩＧＣＧはアデニン及びＣｐＧ位置の調べるべきグアニンのグアニン信号強度が再生される。このとき、メチル化比率は１〜１００％メチル化に対応する。
【００４３】
本発明においては、メチル化比率ｆＭＥＴが下記の式によって計算される。
ｆＭＥＴ＝１−ＩＴＣＧ／ｆＣＯＮ＜ＩＴＴ＞
または、逆相補的鎖の配列情報の利用において、
ｆＭＥＴ＝１−ＩＡＣＧ／ｆＣＯＮ＜ＩＡＡ＞
このとき、ＩＴＣＧ、ＣｐＧ位置のシトシンのチミン信号強度及び＜ＩＴＴ＞、チミン位置の平均チミン信号強度が再生される。このとき、ＩＡＣＧ、ＣｐＧ位置のグアニンのアデニン信号強度及び＜ＩＡＡ＞アデニン位置のアデニン信号強度が再生される。このとき、メチル化比率は１〜１００％メチル化に対応する。
【００４４】
更に、本発明においては、一種類の塩基の配列、部分的に知られた、少なくとも３種類の異なるヌクレオチッドを含むヌクレオチッド配列を、統計的及び信号理論的方法、蓋然性のある方法の助けを借りて、二つの任意の塩基間の距離を調べることにより決めることが特に好ましい。
【００４５】
一般的な発明思考の下に、以下に述べる本発明の方法が形成される。
【００４６】
本発明の、少なくとも一つの細胞または一つの生体のゲノムの調査対象のシトシンのメチル化度決定方法の一つであって、以下のステップを実行することによって行なわれる。
ａ）ＤＮＡ試料の重亜硫酸塩による処理及びこれに続く、これら処理されたＤＮＡの選択された断片の増幅。
ｂ）増幅産物の配列解析の実施であって、この実施では、ＤＮＡの異なる塩基または空間で分離された痕跡が解析され、または異なる色素標識の付加によって痕跡の内部が解析され、そして、成果が電気泳動図の形で示される。
ｃ）一つまたは多数の残りの他の塩基の平均信号強度に対する塩基（Ｃ、Ｔ、ＡまたはＧ）の少なくとも一種の平均信号強度の標準化であって、このとき、任意に限定された範囲の増幅産物内部の塩基の複数の位置の平均が確認され、
ｄ）少なくとも、ステップｃ）で標準化された、そのハイブリッド化の挙動を重亜硫酸塩処理によって変える、位置の一つの信号強度が少なくとも、他の信号強度の一つと関係付けられる、そのとき、センス配列もその逆相補的配列も同様に利用される、重亜硫酸塩処理の順に、シトシンからウラシルへの変化比率の決定。
ｅ）標準化された信号強度及びステップｄ）で決定された変化比率を考慮して、調べるシトシンの現実的メチル化度の決定。
【００４７】
本発明の、少なくとも一つの細胞または一つの生体のゲノムの調査対象のシトシンのメチル化度決定方法の他の方法であって、以下のステップを実行することによって行なわれる。
ａ）ＤＮＡ試料の重亜硫酸塩による処理及びこれに続く、重亜硫酸塩処理ＤＮＡの選択された断片の増幅。
ｂ）チミン鎖または逆相補的鎖、ＤＮＡのアデニン配列のみが確認され、成果が電気泳動図で示される。
ｃ）そのハイブリッド化の挙動を重亜硫酸塩処理によって変える、塩基の信号強度へと関係付け、重亜硫酸塩処理によって変化しない、センス配列もその逆相補的配列も同様に利用される、重亜硫酸塩処理の順に、シトシンからウラシルへの変化比率の決定。
ｄ）ステップｃ）で決定された変化比率を考慮して、調べるシトシンの現実的メチル化度の決定。
【００４８】
本発明に付いては、以下で、更に詳しく説明する。本発明は重亜硫酸塩処理された核酸の数量的配列方法であり、更に詳しく述べると、調べるＤＮＡ領域のゲノム配列が知られているときは、塩基配列３’−ＣＧ−５’における一つ、または、それ以上のシトシンのメチル化度の決定方法である。特に、本発明はＣｐＧ位置でメチル化されている、核酸混合物の核酸分子の決定方法であり、重亜硫酸塩処理核酸混合物の配列解析に基づく、メチル化及び非メチル化シトシンを示す。
本発明は重亜硫酸塩処理ＤＮＡの配列化における配列情報の有効性を利用可能にする。特に、他の配列化方法で得られるデータが、先ず、その信号強度に関し標準化され、重亜硫酸塩処理の結果、このデータからシトシンのウラシルへの変化比率が決定され、これら変化比率によって、現実のメチル化度の改善された評価が成功することが記載されている。
【００４９】
本発明においては、個々に、信号強度が電気泳動図によって相互に標準化され且つ、電気泳動図に含まれる情報によって、重亜硫酸塩反応の変化比率が計算されることが示される。この因子によって、メチル化シトシン及び非メチル化シトシンの混合物中のシトシン部分についての、本質的に正確な陳述可能になる。
これによって、本発明は、ＤＮＡ試料のメチル化度の解析のために、大いに有益で、且つ、それによって、例えば、メチル化特殊性疾病の診断が著しく改善されることを証明する。
【００５０】
本発明は単一の細胞におけるＤＮＡ混合物の解析にまで及び、同様に複数の細胞からのＤＮＡ混合物、その細胞は一つの生体または異なる生体からのものである、の解析にまで及ぶ。この出願で述べられている、少なくとも一つの細胞のゲノムの、少なくとも一つの、調べるべきシトシンのメチル化度の決定方法で、重亜硫酸塩処理されていないＤＮＡのゲノムヌクレオチッド配列であることが公知であることが前提である。この方法の第一ステップは調べるゲノムＤＮＡ試料を重亜硫酸塩処理する。このとき、非メチル化ウラシル塩基は変化し、続くＰＣＲでチミン塩基と同じハイブリッド化挙動を示す。一方、５−メチルシトシン塩基はもとのまま変化しない。ＰＣＲによって得られた二本鎖ＤＮＡ増幅産物は非メチル化シトシンの代わりにセンス鎖にチミンと逆相補鎖に対応するアデニンを含有する。したがって、チミンの信号強度の確認によって、ＣｐＧ配列のもとのシトシンの位置で、混合物におけるＣｐＧ位置にある非メチル化シトシンの部分の大きさが決定される。
【００５１】
本発明の方法の第一の変法もその対象になる。そこでは、増幅産物をまず、配列化し、標識を付した反応産物を先ず、それらの大きさにしたがって空間的に分けられたシュプール、または、異なる色素標識によって、区別が可能なシュプール内で解析する。例えば、四個の異なる蛍光標識されたｄｄＮＴＰｓが使用され、確認による解析で、四個の塩基配列より少なく限定することが可能である。配列解析は従来技術に対応して、他の方法で、塩基配列の品質的決定に利用される、電気泳動図を獲得することで完了する。本発明においては、この電気泳動図及び本来の配列とデータとの比較から、重亜硫酸塩処理されていないＤＮＡの配列もまた、シトシンのメチル化度に関する数量的報告が得られる。
【００５２】
次に、電気泳動図データの標準化がなされる。少なくともＣ、Ｔ、ＡまたはＧの塩基の平均信号強度は一種またはそれ以上の他の塩基の平均信号強度と関係がある。特に好ましい方法の変形では、シトシンの信号強度がチミンのそれと関係がある。ここでの、平均値の計算は任意に限定した増幅産物の範囲内の塩基の信号強度値を基になされる。これは増幅産物全体でも、そのほんの一部でも可能である。
【００５３】
標準化信号強度からの、次段階でのステップで、シトシンからウラシルへの変化比率（ｆｃｏｎ）が重亜硫酸塩処理によって計算される。そこでは、非メチル化シトシン塩基の関係が述べられている。シトシン塩基のハイブリッド化挙動は、重亜硫酸塩処理によって、チミンのハイブリッド化挙動に変化する。全ての非メチル化シトシン塩基について、それが、限定された配列範囲内で、そのハイブリッド化挙動が変化すると、しないとに拘らず、チミンのハイブリッド化挙動に変化する。考慮範囲は全増幅産物または、僅か、その一部の長さを含む。
【００５４】
標準化を考慮し、この変化比率（ｆｃｏｎ）により、最終ステップで、現実性のある、または、少なくとも、現実により近いメチル化比率（ｆＭＥＴ）が決定される。
【００５５】
本発明の対象となる第二の、使用される変法は、重亜硫酸塩処理されていない、メチル化度の決定の前提知見となる、公知のＤＮＡのゲノムのヌクレオチッド配列、及び、重亜硫酸塩処理ＤＮＡのチミンの電気泳動図が、解析のために利用されるべきであり、または、利用され得る場合のためのメチル化比率の決定法である。本発明の対象は、シトシン塩基配列、グアニン塩基配列、アデニン塩基配列
の知見なしで、単に、チミンの電気泳動図から、先ず、変化比率ｆｃｏｎかを決定することができ、且つ、それによって、メチル化比率が計算されることである。この場合、変化比率の計算は、データの標準化が可能でもなく必須でもないので、益々重要になる。
【００５６】
シトシンの信号強度がチミンの信号強度に対して標準化されることを特徴とする両変法が好ましい。
【００５７】
信号強度の標準化のため、並びに、できるだけ詳しい、信号強度自体に関する知見に基づく、変化比率の計算用の標準化因子の計算。
【００５８】
最初の方法の好ましい変法において、標準化因子は、以下のように計算される。電気泳動図が、単位時間あたりの検出信号の、再度（配列化法の固有の指標として、二つの塩基の空間距離を反映する、数値の経過曲線を表すので、信号強度及び信号を帯びる分子数がピーク下の平坦部またはこの曲線の部分的最高値によって、計算される。この曲線を積分することによって、考慮される平坦が最も良好に描かれる。この平坦部分は積分限界Ｘ１及びＸ２によって確定される。積分はその都度、部分的最高値の左に位置するＸ１から、部分的最高値の右に位置するＸ２まで計算される。信号強度の計算のために、ここでは、部分的最高値下の平坦部の積分用に以下の可能な積分限界値が特に好ましい。
【００５９】
信号強度の数値尺度が以下のようになるとき、それに応じた方法が特に好ましい。
部分的最高値の左で、これに最も近い位置にある変曲点から、部分的最高値の右で、これに最も近い位置にある変曲点までの積分。
部分的最高値の左で、これに最も近い位置にある部分的最小値から、その右であって、最も近い位置にある部分的最小値までの積分。
部分的最高値の左で、これに最も近い位置にある半数値の点のＸ座標値、但し、半数値は部分的最高値ｆ（ｘ）の１／２であるが、から、部分的最高値の右で、これに最も近い位置にある半数値の点のＸ座標値までの信号経過の下の平坦部の積分。
信号経過の下の平坦部の積分が、値Ｄ１から値Ｄ２まで行なわれ、ここでＤ１及びＤ２は二つの部分的最高値間の厳密に中央に位置する点のＸ座標であって、Ｄ１は決められた最高値の左に、Ｄ２は決められた最高値の右に位置する。
または、前記限界値の任意の組み合わせを含むことによる、信号経過の平坦部の積分により行なわれる。
【００６０】
使用された重亜硫酸塩処理済配列の情報が鎖分解法によって決められることを特徴とする両方法の好ましい変法。
【００６１】
ＣｐＧ位置のシトシンの平均シトシン信号強度の関係及びチミン位置の平均チミン信号強度とＣｐＧ位置のシトシンの平均チミン信号強度の間の差異から標準化因子計算される方法が特に好ましい。
ｆＮ＝＜ＩＣＣＧ＞／（＜ＩＴＴ＞−＜ＩＴＣＧ＞　）から、またはその逆数
ｆＮ−１＝（＜ＩＴＴ＞−＜ＩＴＣＧ＞　）／＜ＩＣＣＧ＞
【００６２】
明らかに好ましい本発明の変法では、逆相補的鎖の配列データが利用される方法を実施する場合には、チミン及びシトシン信号強度がここではアデニン及びグアニン信号強度で置換されることが明らかである。
ｆＮ＝＜ＩＧＣＧ＞／（＜ＩＡＡ＞−＜ＩＡＣＧ＞）またはその逆数
ｆＮ−１＝（＜ＩＡＡ−＜ＩＡＣＧ＞）／＜ＩＧＣＧ＞
【００６３】
第１の方法の、全く特に好ましい、変法は標準化因子がＣｐＧ位置の外のシトシンの平均シトシン信号強度の関係及びチミンの平均チミン信号強度とＣｐＧ位置の外のシトシンの平均チミン信号強度との間の差異から計算されることを特徴とする。
ｆＮ＝＜ＩＣＣ＞／（＜ＩＴＴ＞−＜ＩＴＣ＞）
またはその逆数
ｆＮ−１＝（＜ＩＴＴ−＜ＩＴＣ＞）／＜ＩＣＣ＞
【００６４】
明らかに好ましい本発明の変法では、逆相補的鎖の配列データが利用される方法を実施する場合には、チミン及びシトシン信号強度がここではアデニン及びグアニン信号強度で置換されることが明らかである。
ｆＮ＝＜ＩＧＧ＞／（＜ＩＡＡ＞−＜ＩＡＧ＞）
またはその逆数
ｆＮ−１＝（＜ＩＡＡ＞−＜ＩＡＧ＞）／＜ＩＧＧ＞
【００６５】
他の、特に好ましい変法は、アデニン及びグアニン位置の平均チミン及びシトシン信号強度の関係から、標準因子が計算されることを特徴とするものである。ｆＮ＝＜ＩＴＡ、Ｇ＞／＜ＩＣＡ、Ｇ＞
またはその逆数
ｆＮ−１＝＜ＩＣＡ、Ｇ＞／＜ＩＴＡ、Ｇ＞
【００６６】
逆相補的鎖の重亜硫酸塩処理配列データの利用において、これら標準化因子の計算が、チミン及びシトシン位置の平均アデニン及びグアニン信号強度の関係から、行なわれるのが妥当である。
ｆＮ＝＜ＩＡＴ、Ｃ＞／＜ＩＧＴ、Ｃ＞
またはその逆数
ｆＮ−１＝＜ＩＧＴ、Ｃ＞／＜ＩＡＴ、Ｃ＞
【００６７】
全ての所謂平均値の計算には、これが、常に固定された全増幅産物の長さを含み、且つ、塩基の最小値のみからなり得る、配列範囲に亘って、形成されることが妥当である。
【００６８】
本発明の方法はその他のステップで、変化比率ｆＣＯＮの決定を含む。
【００６９】
第一の方法の特に好ましい変法は、変化比率ｆＣＯＮが、チミンに変換されたシトシンの関係及び変化し、または、変化しない限定された範囲内のシトシンの全ての和、から計算されることを特徴とする。そのために、重亜硫酸塩処理前に、シトシンで占められ、ＣｐＧ位置ではない、位置のチミン信号強度の関係及び、このチミン及び前記位置にある標準化シトシン信号強度の和が計算される。
ｆＣＯＮ＝ＩＴＣ／（ｆＮＩＣＣ＋ＩＴＣ）
または
ｆＣＯＮ＝＜ＩＴＣ／（ｆＮＩＣＣ＋ＩＴＣ）＞
またはその逆数
ｆＣＯＮ−１＝（ｆＮＩＣＣ＋ＩＴＣ）／ＩＴＣ
または
ｆＣＯＮ−１＝＜（ｆＮＩＣＣ＋ＩＴＣ）／ＩＴＣ＞
または逆相補的鎖の配列情報の利用において、
ｆＣＯＮ＝ＩＡＧ／（ｆＮＩＧＧ＋ＩＡＧ）
または
ｆＣＯＮ＝＜ＩＡＧ／（ｆＮＩＧＧ＋ＩＡＧ）＞
またはその逆数
ｆＣＯＮ−１＝（ｆＮＩＧＧ＋ＩＡＧ）／ＩＡＧ
または
ｆＣＯＮ−１＝＜（ｆＮＩＧＧ＋ＩＡＧ）／ＩＡＧ＞
【００７０】
両方法の好ましい変法は、この変化比率が唯一チミン信号強度によって計算されることを特徴とする。そのためには、重亜硫酸塩処理前に、シトシンで占められ、ＣｐＧ位置には存在しない、チミン位置のチミン信号強度が形成される位置でチミン信号強度の関係が形成される。
ｆＣＯＮ＝＜ＩＴＣ＞／＜ＩＴＴ＞
またはその逆数
ｆＣＯＮ−１＝＜ＩＴＴ＞／＜ＩＴＣ＞
または、または逆相補的鎖の配列情報の利用において、
ｆＣＯＮ＝＜ＩＡＧ＞／＜ＩＡＡ＞
またはその逆数
ｆＣＯＮ−１＝＜ＩＡＡ＞／＜ＩＡＧ＞
【００７１】
変化比率の計算方法の好ましい変法としては、配列範囲の変化比率、または、単独シトシンの変化比率を計算するために、限定された配列範囲の多くの位置に亘る平均値または単独の平均値が利用される。
ｆＭＥＴ＝１−ＩＴＣＧ／［ｆＣＯＮ（ｆＮＩＣＣＧ＋ＩＴＣＧ）］
または、逆相補的鎖の配列情報の利用において、
ｆＭＥＴ＝１−ＩＡＣＧ／［ｆＣＯＮ（ｆＮＩＧＣＧ＋ＩＡＣＧ）］
【００７２】
同様に、第一の方法の好ましい変法は、調べる配列範囲内の、ＣｐＧ位置に存在する、シトシン毎の確認された標準化因子及び変化比率によって、メチル化比率ｆＭＥＴが計算される。このメチル化比率は、ときとして、重限定された亜硫酸塩反応の効果も、部分的に著しく悪化した信号強度も両方とも考慮に入れられる。
ｆＭＥＴ＝１−ＩＴＣＧ／［ｆＣＯＮ（ｆＮＩＣＣＧ＋ＩＴＣＧ）］
【００７３】
ここで、全ての信号強度Ｉはシトシンに関連する。ＩＣＧ・ＩＴＣＧはシトシンへの、即ち、変化したシトシンの持分へのチミンの信号強度である。この値は、変換比率ｆＣＯＮを考慮することにより真の値に近づく。ＩＣＣＧはＣｐＧ位置のシトシンのシトシン信号強度である。ＩＣＣＧはメチル化シトシンも非メチル化シトシンも、ＣｐＧ位置の変化しないシトシン標準化因子ｆＮの取り入れによって、真の値に近づく。終わりに、ｆＭＥＴは現実のメチル化シトシンの比率を正確に表し、ｆＭＥＴの値は０と１の間の値を取り得る。
【００７４】
もし、ＣｐＧ位置のシトシンが、完全にメチル化されれば（メチル化１００％）、これはｆＭＥＴ１に対応する。この場合、チミンの信号が得られない（ＩＴＣＧ＝０）このとき、　ｆＭＥＴ＝１−０／［ｆＣＯＮ（ｆＮＩＣＣＧ＋０）］＝１
【００７５】
もし、ＣｐＧ位置のシトシンが、メチル化されていないならば（メチル化０％）、これはｆＭＥＴ０に対応する。変化比率１００％の場合、変化比率ｆＣＯＮ＝１、シトシン信号は得られず、ｆＮＩＣＣＧ＝０。従がって、ｆＭＥＴ＝１−ＩＴＣＧ／（ｆＣＯＮＩＴＣＧ）＝１−１／ｆＣＯＮ＝０。
【００７６】
１００％変換が行なわれないときは、シトシンがメチル化されないときでも、常にシトシン信号が得られる。
【００７７】
シトシン位置が５０％メチル化された場合、及び１００％の変化比率の場合、標準化シトシン信号及びチミン信号の持分は同じ大きさである。これは下記のようになる。
ｆＭＥＴ＝１−ＩＴＣＧ／［ｆＣＯＮ（ｆＮＩＣＣＧ＋ＩＴＣＧ）］
ｆＭＥＴ＝１−ＩＴＣＧ／［ｆＣＯＮ（２★ＩＴＣＧ）］
ｆＭＥＴ＝１−１／（ｆＣＯＮ★２）
ｆＭＥＴ＝１−１／２
【００７８】
逆相補的鎖の配列情報利用では、同じ公式が使用される。しかし、全てのチミンがアデニンで、全てのシトシンがグアニンで置き換えられねばならぬ。例えば、
ｆＭＥＴ＝１−ＩＡＣＧ／［ｆＣＯＮ（ｆＮＩＧＣＧ＋ＩＡＣＧ）］
【００７９】
その他の第二の方法の好ましい変法は、塩基配列の基礎で、即ち、重亜硫酸塩処理されたＤＮＡのチミン配列で、メチル化比率ｆＭＥＴが下記公式で計算されることを特徴とするものである。。
ｆＭＥＴ＝１−ＩＴＣＧ／ｆＣＯＮ＜ＩＴＴ＞
【００８０】
ここでは、チミン＜ＩＴＴ＞の平均チミン信号強度に話しを戻す。逆相補的鎖の配列情報の利用では下記公式が使用される。
ｆＭＥＴ＝１−ＩＡＣＧ／ｆＣＯＮ＜ＩＡＡ＞
【００８１】
このとき、アデニン＜ＩＡＡ＞の平均アデニン信号強度が引き合いに出される。
【００８２】
両ケースで、ｆＭＥＴ値０〜１の値をとり得、且つ、メチル化比率が１〜１００％メチル化に対応する。
【００８３】
変法では、一種類の塩基配列の場合、即ち、チミン配列または他の各塩基単独の場合、アデニン配列の逆相補的鎖が利用される。このとき、信号強度を一義的に組み入れることができないという難点が生じる。長い範囲に亘って、チミンが存在せず、場合によっては、最小の信号、所謂、欠陥信号が示されると、配列が公知のゲノムヌクレオチッド配列に組込まれることが困難になる。既に公知の、重亜硫酸塩処理ヌクレオチッド配列に単独塩基配列を組み入れることを意図しても、これはもっと困難である。
【００８４】
だから、この更なる本発明の対象に関しては、特に好ましい変法がある。この方法では、先ず、統計的且つ、信号理論的方法で、二つのピーク間の距離、即ち、二つの潜在的塩基位置間の距離が確認され。且つ、可能性ある方法の補助により、公知であって、ゲノム配列から導かれる位置への組入れが試みられる。
【００８５】
【実施例】
以下の実施例により本発明を説明する。
【００８６】
実施例１：
配列解析による遺伝子ｐ１６のメチル化度の研究
下記の実施例は遺伝子ｐ１６の断片についてのものである。ここでは、特定のＣｐＧ位置に関してメチル化度を調べた。この実施例では予め提供者（ヒト）の血液から分離され、市販されているＤＮＡを購入して使用した。
【００８７】
最初のステップで、ゲノム配列が重亜硫酸塩等（酸性亜硫酸塩、亜硫酸水素塩）で処理され、塩基の５位置に無いメチル化シトシンは変化して、塩基対挙動の異なる塩基が生成する。他方、塩基の５位置のメチル化シトシンは変化せず、そのまま残存する。反応に重亜硫酸塩が使用されれば、非メチル化シトシンに付加反応が起こる。それには、変性剤または溶剤並びにラジカル捕捉剤が使用される。続くアルカリ加水分解で、非メチル化シトシンがウラシルへ変化する。この変化したＤＮＡはメチル化シトシンを非メチル化シトシンから区別し、メチル化シトシンをこれによって実証することに役立っている。本発明の方法の第二ステップでは、処理済みＤＮＡ試料を水または水性溶剤で希釈する。ついでＤＮＡの脱スルフォン化が行なわれることが好ましい。更なるステップにおいて、ＤＮＡ試料がポリメラーゼ連鎖反応により増幅される。この場合、遺伝子ｐ１６のシトシンが調べられる。そのために、特殊なプライマーオリゴヌクレオチッドＰ１（Ｓｅｑ−ＩＤ１参照）及びＰ２（Ｓｅｑ−ＩＤ２参照）で、２５６ｂｐ長の断片が増幅される。この場合、ＰＣＲ産物は調べるべきＣｐＧ位置にあるシトシンまたはチミンを示す増幅産物からのＤＮＡ混合物である。この増幅産物からの混合物は、後続する環状配列化反応のテンプレートとしての役割を果たす。配列化反応にはポリメラーゼ連鎖反応と同様に、プライマーオリゴヌクレオチッドが使用される。配列化の結果は図１に電気泳動図で再掲示される。
【００８８】
図１において、上部（電気泳動図−対Ａ）に、二つの電気泳動図が示され、これは遺伝子ｐ１６の配列の一部を示し、そこでは、市販用収得物のメチル化度が示されている。電気泳動図の下部には（電気泳動図−対Ｂ）同じ配列範囲を示す二つの電気泳動図が示されている。図の上部との差異はこの配列化の基礎になるＤＮＡが、既に、行なわれたステップでメチル化されていることである。シトシンのメチル化度は殆ど１００％達成される。
【００８９】
電気泳動図の上部の電気泳動図−対Ａ及びＢは、配列自動化ノソフトウエアによって得られる。これらは従来得られている電気泳動図を示す。下部の電気泳動図−対Ａ及びＢは、本発明の実施によって示される。未知の信号発生、基線のノイズは明らかに減少する。
【００９０】
電気泳動図の下部では、二つの配列がその都度、塩基を示す文字配列として示される。上部の塩基配列は下部の最適の、下部塩基配列が理論的に期待される配列を示すような、且つ、既知のゲノム配列で重亜硫酸塩処理後に、期待される配列自動化によって、発生するデータとの比較に役立つような電気泳動図に関係する。
【００９１】
塩基位置で、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニン、Ｔはチミンを、そして、ｔは重亜硫酸塩塩処理後に、初めてチミンのハイブリッド化挙動を示し、ゲノム配列ではシトシンであった。（塩基は四種類の色で表示されている：チミン＝Ｔ＝赤、シトシン＝Ｃ＝ブルー、アデニン＝Ａ＝緑、グアニン＝Ｇ＝黒）
【００９２】
塩基配列の下部には数値が示されている。これは、その都度、ＣｐＧ位置のシトシンの、前記方法を使用して計算されたメチル化度を百分率で示している。
【００９３】
実施例２
重亜硫酸塩配列化後、本発明の方法を使用し、または、使用せずして、得られる電気泳動図の表示。
図２には二つの電気泳動図が、複雑に交雑して示されている。図の下部縁にある数字は配列化された増幅産物の塩基位置を示し、且つ、これは位置確認に役立つ。図２は３７９塩基対までの、二つの電気泳動図である。上部の電気泳動図には四種類の異なる塩基配列（四種類の異なる色、チミン＝Ｔ＝赤、シトシン＝Ｃ＝ブルー、アデニン＝Ａ＝緑、グアニン＝Ｇ＝黒）が、標準化または変化比率を考えずに、また、本発明の方法を使用せずに、掲載されている。下部の電気泳動図は、本発明の方法の変法によって、示されている。この図から、上部の電気泳動図のシトシン信号はシトシン信号強度が標準化された後、全て、本質的に下の図のそれより大きい。同様に、ノイズはより小さくなる。例えば、３７３から３７９ｂｐまでの範囲でこれがよく解る。ＣｐＧ位置のシトシンの下部の百分率表示値は、シトシンのメチル化度を前記方法によって計算した結果与えられる。
【図面の簡単な説明】
【図１】上部に、遺伝子ｐ１６の配列の一部を示す二つの電気泳動図が示され、下部には、同じ配列範囲を示す二つの電気泳動図が示されている。
【図２】二つの電気泳動図が、交雑して示されている。上部の電気泳動図には四種類の異なる塩基配列が、標準化または変化比率を考えずに、また、本発明の方法を使用せずに、掲載されている。下部の電気泳動図は、本発明の方法の変法によって示されている。
【図１】
2004008217.tif 000012
【図２】
2004008217.tif 000013