(57)【要約】【課題】脈管炎の評価方法の提供。【解決手段】血管内皮細胞増殖因子をコードする遺伝子又は該因子の受容体をコードする遺伝子の遺伝子多型を解析し、得られる解析結果から、脈管炎又はその合併症の発症の危険性を評価することを特徴とする脈管炎の評価方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
血管内皮細胞増殖因子をコードする遺伝子又は該因子の受容体をコードする遺伝子の遺伝子多型を解析し、得られる解析結果から、脈管炎又はその合併症の発症の危険性を評価することを特徴とする脈管炎の評価方法。
【請求項２】
脈管炎が川崎病である請求項１記載の方法。
【請求項３】
合併症が冠動脈病変である請求項２記載の方法。
【請求項４】
血管内皮細胞増殖因子をコードする遺伝子の遺伝子多型が一塩基多型である請求項１〜３のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５】
一塩基多型がVEGF g.-634 G>C多型である請求項４記載の方法。
【請求項６】
血管内皮細胞増殖因子の受容体をコードする遺伝子の遺伝子多型がマイクロサテライト型多型である請求項１〜３のいずれか1項に記載の方法。
【請求項７】
マイクロサテライト型多型がKDR g.+4422(AC)11-14多型である請求項６記載の方法。
【請求項８】
血管内皮細胞増殖因子をコードする遺伝子の遺伝子多型解析が、配列番号１及び２に示す塩基配列からなるプライマーセットを用いて該遺伝子を増幅させ、得られる増幅産物について多型分析を行うものである請求項１〜３のいずれか1項に記載の方法。
【請求項９】
血管内皮細胞増殖因子の受容体をコードする遺伝子の遺伝子多型解析が、配列番号11及び12に示す塩基配列からなるプライマーセットを用いて該遺伝子を増幅させ、得られる増幅産物について多型分析を行うものである請求項１〜３のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１０】
配列番号１及び２に示す塩基配列からなるプライマーセット、並びに配列番号11及び12に示す塩基配列からなるプライマーセットから選ばれる少なくとも１組のプライマーセット。
【請求項１１】
請求項10記載のプライマーセットを含む、脈管炎の評価用キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、血管内皮細胞増殖因子遺伝子又はその受容体遺伝子の遺伝子多型を利用した脈管炎の評価方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
川崎病（KD)は、生後3ヶ月から4歳位の乳幼児に発症し全身の血管に炎症を起こす急性発熱性脈管炎であり、高熱を出す原因不明の病気として知られている。そして、患者の約5〜16％に冠動脈病変（CAL)が生じる（Beiser A, et al., Am J Cardiol. 1998; 81: 1116-1120.;  Nagashima M, et al., J Pediatr. 1987;110:710-712.）。主な症状としては、▲１▼5日以上続く高熱、▲２▼手足の紅斑と硬性浮腫、膜様落屑（回復期に指の先から皮がむけること）、▲３▼不定形発疹、▲４▼両側眼球結膜の充血、▲５▼口唇が赤くなり、イチゴ舌、口腔粘膜が充血する等の症状、▲６▼首のリンパ節腫脹などが挙げられる。
【０００３】
川崎病に対しては、高用量の免疫グロブリンを静脈内投与する治療(IVIG)が試みられているが、IVIGを導入した後であっても、川崎病においてCALが発症し、心筋梗塞のみならず、心不全、心臓弁膜症、不整脈などの生命を脅かす心疾患の合併症を引き起こす（Taubert K, et al., J Pediatr. 1991;119:279-282.; Yanagawa H, et al., Arch Pediatr Adolesc Med. 1995;149:779-783.）。従って、CALの発症のリスクを有する川崎病患者をできるだけ早く同定することが重要である。
【０００４】
川崎病の急性期においては、サイトカイン（例えば腫瘍壊死因子（TNF)-α、インターフェロン（INF)-γ、インターロイキン（IL)-1、IL-2、IL-6、IL-8等）の血清レベルの上昇を伴う免疫システムの活性化が、内皮細胞を損傷させる原因になると考えられる。川崎病患者における血管組織の病理学的所見として、内皮細胞下の浮腫、血管損傷、ギャップ形成、及び内皮細胞の穴形成がある。
【０００５】
ところで、血管内皮細胞増殖因子（vascular endothelial growth factor: VEGF)は微小血管の透過性過敏を促進するタンパク質であり、そして川崎病においてVEGFが全身に過剰生産されることが示されている。従って、VEGFは川崎病の病態生理学、特にCALの発症に関与すると考えられている。川崎病におけるVEGFは、免疫細胞によって大量に生産される上記サイトカインとは異なり、主に血管平滑筋細胞によって産生されるようである。そして、脈管炎による平滑筋細胞の刺激又は破壊によってVEGFの放出が誘導されたときの血清VEGFレベルは、脈管炎の重症度に反映する。さらに、VEGFは、腸コラゲナーゼ、メタロプロテイナーゼ及びプラスミノーゲンアクチベータの合成、並びに小静脈及び毛細管の内皮の穴形成を誘導するため、VEGFは血管壁破壊を増大させ、また冠動脈病変の発生をもたらす可能性がある。
【０００６】
VEGFはまた、単球に対する有力な化学走性誘引物質であり、内皮細胞上に接着分子の発現を誘導する。従って、VEGFは、いくつかのメカニズムを通して内皮細胞上でその破壊効果を働かせる物質であるといえる。さらに、川崎病の診断時及び発熱中での血清VEGFレベルは、一変量及び多変量解析によりCALの発症に対する独立した主要なリスクファクターであることが分かった。VEGFの産生、及びVEGF又は他のサイトカインに対する応答は、刺激のタイプ及び量、並びに患者の遺伝的背景を含む多くの因子によって影響されることが知られており、いくつかの研究では、免疫分子のある遺伝子多型が、川崎病の発症、又は川崎病におけるCALの発症と関連することが示された（Huang F, et al., Exp Clin Immunogenet. 2000; 17:130-137.(非特許文献１); Quasney M, et al., Pediatr Res. 2001; 49: 686-690.(非特許文献２)）。
【０００７】
しかしながら、そのような遺伝子多型が川崎病におけるCALの発症を予測するためにどの程度重要なのかは、他の臨床及び実験データと比較しても未だに知られていない。
【０００８】
【非特許文献１】
Huang F, et al., Exp Clin Immunogenet. 2000;17:130-137.
【０００９】
【非特許文献２】
Quasney M, et al., Pediatr Res. 2001;49:686-690.
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、血管内皮細胞増殖因子遺伝子又はその受容体遺伝子の遺伝子多型を利用した脈管炎の評価方法を提供することを目的とする。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
VEGF遺伝子についての最近の研究では、VEGF遺伝子の2つの遺伝子多型がVEGFタンパク質の生産を調節することが示されている（Renner W, et al., J Vasc Res. 2000;37:443-448.; Watson C, et al., Cytokine. 2000;12:1232-1235.）。VEGF-R1(FLT-1: fms-related tyrosine kinase-1（fms関連チロシンキナーゼ1）)及びVEGF-R2(KDR: キナーゼインサートドメイン受容体）として知られる2つの主な受容体は、血管内皮細胞上に発現する。本発明者は、VEGF及びその受容体遺伝子のこれらの遺伝的変異によって、VEGFの生産に変化が生じるものと考えた。そして、VEGFは血管炎患者の血管内皮細胞に関与するものと考え、鋭意研究を行なった。さらに、本発明者は、VEGF及びその受容体遺伝子の遺伝子多型を解析し、これらの遺伝子が脈管炎の発症及びその合併症の発症に関与するか否かを調べた。
【００１２】
その結果、VEGFをコードする遺伝子又はVEGF受容体遺伝子の特定の遺伝子多型が、脈肝炎、特に川崎病のリスクファクター（マーカー）として解析し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
すなわち、本発明は以下の通りである。
【００１４】
(1) 血管内皮細胞増殖因子をコードする遺伝子又は該因子の受容体をコードする遺伝子の遺伝子多型を解析し、得られる解析結果から、脈管炎又はその合併症の発症の危険性を評価することを特徴とする脈管炎の評価方法。
【００１５】
上記方法において、脈管炎としては例えば川崎病が挙げられ、合併症としては例えば川崎病における冠動脈病変が挙げられる。また、血管内皮細胞増殖因子の遺伝子多型としては一塩基多型、例えばVEGF g.-634 G>C多型が挙げられる。また、本発明の方法においては、血管内皮細胞増殖因子の受容体をコードする遺伝子の遺伝子多型としてマイクロサテライト型多型のものを用いることができる。マイクロサテライト型多型としては、例えばKDR g.+4422(AC)11-14多型が挙げられる。
【００１６】
血管内皮細胞増殖因子をコードする遺伝子の遺伝子多型解析を行なう場合は、例えば配列番号１及び２に示す塩基配列からなるプライマーセットを用いて該遺伝子を増幅させ、得られる増幅産物について多型分析を行うことができる。また、血管内皮細胞増殖因子の受容体をコードする遺伝子の遺伝子多型解析を行なう場合は、配列番号11及び12に示す塩基配列からなるプライマーセットを用いて該遺伝子を増幅させ、得られる増幅産物について多型分析を行うことができる。
【００１７】
(2) 配列番号１及び２に示す塩基配列からなるプライマーセット、並びに配列番号11及び12に示す塩基配列からなるプライマーセットから選ばれる少なくとも１組のプライマーセット。
【００１８】
(3) 上記プライマーセットを含む、脈管炎の評価用キット。
【００１９】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２０】
【発明の実施の形態】
本発明は、脈管炎又はその合併症の発症の危険因子を解析するため、特に川崎病（KD)に注目して、血管内皮細胞増殖因子遺伝子及びその受容体遺伝子の多型をDNAマーカーとして提供することを特徴とするものである。
【００２１】
本発明者は、健常人及び川崎病患者において血管内皮細胞増殖因子（VEGF)の遺伝子多型及びVEGF受容体（FLT-1, KDR)の遺伝子多型を解析することにより、どの遺伝子多型が川崎病の発症及び/又は川崎病における冠動脈病変の発症の一因となるのか、SNPと表現型との関連性を見出した。
１．脈管炎
本発明において解析の対象となる脈管炎は、特に限定されるものではなく、血管炎、あるいはリンパ管の炎症（リンパ管炎）等のいずれでもよい。血管炎としては、延長性血管炎（周囲の組織の炎症過程の波及により生じる血管炎）、霜状分枝血管炎（木の枝状の外見を示す血管周囲の鞘状炎症を特徴とする血管炎）、過敏性血管炎（抗原物質又は個体が異常な血管感作を示すような薬剤に対する特異反応の結果起こる血管炎）、壊死性血管炎（組織（特に血管壁）の類線維素壊死をもたらす血管炎）などがある。川崎病である急性発熱性脈管炎も、本発明の方法により評価の対象となる。
２．遺伝子多型
本発明において解析し得る遺伝子多型としては、一塩基多型（SNP）、VNTR(variable number of tandem repeat)による多型、マイクロサテライト型多型などが挙げられる。SNPとは、個人間でのDNA塩基配列の一塩基の違いによる多型を意味する。この一塩基の違いには、一塩基の置換、一塩基の欠失又は一塩基の挿入が含まれ、本発明においてもこれと同様に取り扱うこととする。
【００２２】
VNTRは、ゲノム中に存在する繰り返し配列を意味する。このうち２〜４塩基の繰り返し配列による多型をマイクロサテライト型多型という。
【００２３】
多型の検出法としては、RFLP法（ゲノムを制限酵素で処理した後にゲル電気泳動を行ない、泳動パターンの違いによって多型を検出する方法）、直接シークエンス法、DNAチップを用いた方法、SSCP(single strand DNA conformation polymorphism)を用いた方法などが挙げられる。また、TaqMan アッセイ法、インベーダー法などもある。さらに、MALDI-TOF/MSなど質量分析の手法を応用した方法を用いてもよい。これらの手法は公知であり、市販のキットを使用することができる。例えば、SSCP法ではGene Gel Excel 12./24とDNA silver stainning kit、及びAutomated Gel Stainner（アマシャム・ファルマシア社製）が挙げられる。また、直接シーケンス法ではDNA Sequencing KitとABI PRISM 3100 genetic analyzer（アプライド・バイオシステムズ社製）が挙げられる。
【００２４】
本発明において遺伝子多型の解析対象となる遺伝子は、VEGFをコードする遺伝子（VEGF遺伝子という）、及び該因子に対する受容体をコードする遺伝子（VEGF受容体遺伝子という）である。VEGF受容体遺伝子としては、KDR、FLT-1が挙げられる。
３．多型部位の選択
本発明の方法において解析する対象（候補）となる多型部位は、以下の(a)〜(c)の少なくとも１つを満たす基準に従って選択することができる。
【００２５】
(a) プロモーター領域にあること
(b) アミノ酸翻訳領域であり、かつその多型により翻訳するアミノ酸が変化すること（但し、アミノ酸が変化しない多型もある。）
(c) エンハンサー領域である可能性のある、イントロン内の多型であること。
【００２６】
遺伝子多型は、den Dunnenらの提唱法（http://www.dmd.nl/mutnomen.html）に従って命名することができる。塩基番号は転写開始点であるATG配列のAを+1とし、下流に向かって+2、+3、・・・とする。またATG配列のAよりも一つ上流（5'側）の位置を-1とし、上流に向かって-2、-3、・・・とする。多型名の最初のアルファベットは用いた塩基配列の種類を示す。すなわち「g」はgenomic DNA、「c」はcDNAにおける位置であることを示す。
【００２７】
例えば、VEGF遺伝子（ゲノムDNA）の転写開始点ATGの「A」から18487番目の塩基がAとTの多型の場合は、「VEGF g.+18487 A>T」と表示する。「A>T」のように不等号「＞」を用いたときの左辺の塩基（この場合「A」)は、頻度の高いアリルであることを意味し、右辺の塩基（この場合「T」)は頻度の低いアリルであることを意味する。
【００２８】
繰り返し配列の多型の場合は、カッコの中に繰り返す塩基を、カッコの外側に繰り返し数を記載する。例えば、KDR遺伝子（ゲノムDNA）の転写開始点ATGの「A」から4422番目の塩基が、AGが8〜10回繰り返される多型の場合は、「KDR g.(AG)8-10」と表示する。
【００２９】
なお、本発明において、アレル（allele）とは2本のDNAのうちの1本の塩基配列であり、ゲノタイプ（genotype）とは2本のDNAの両方の塩基配列をいう。
４．脈管炎の評価
まず、上記多型部位を含む鋳型DNA断片を調製する。鋳型DNAの調製は、例えば市販のキット（QIA amp blood kit（QIAGEN社製））を用いることができる。次に、上記の通り選択された多型部位を含み、増幅断片が100-500bpとなるようにプライマーを設計し、多型部位を含むDNA断片を増幅する。なお、後述の解析方法の違いにより増幅断片の大きさは変わるため、プライマーは、目的とする増幅断片の大きさを考慮して適宜設計する。増幅は、市販のキットを用いたポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により行うことができる。
【００３０】
増幅断片をRFLP、SSCP、シーケンス法、蛍光プライマーを用いたゲノタイプ判別法、アリル特異的PCR法等にかけて、その得られた情報を統計解析する。そして、遺伝子多型と脈管炎の発症又はその合併症の発症との因果関係を解析する。統計処理は、多変量解析、単変量解析（χ>2>検定、マン・ホイットニー検定）などを利用することができる。
【００３１】
例えば、遺伝子多型と川崎病との関係について統計解析を行なった場合、統計解析の結果、▲１▼コントロール群（正常人又はCAL未発症患者）における多型と、試験群（川崎病患者又は川崎病におけるCAL合併患者）における多型とを比較する。あるいは、▲２▼川崎病患者（CAL未発症）における多型と川崎病患者（CAL発症）における多型とを比較する。そして、両者に有意差の出た遺伝子多型を、川崎病の発症の危険性又は川崎病における合併症（CAL)の発症の危険性があると評価する。
５．プライマーセット
本発明においては、後述の実施例で示す通り、VEGF g.-634 G>C多型及びKDR g.+4422(AC)11-14多型が川崎病発症又はCALの発症の危険性を評価するのに好ましい多型であることが分かった。本発明において、これら多型を含むDNA断片を増幅するプライマーセットとしては、以下のものが挙げられる。
▲１▼ VEGF g.-634 G>C多型部位を含むDNA断片増幅用プライマーセット
フォワードプライマー: atttatttttgcttgccatt（配列番号１）
リバースプライマー: gtctgtctgtctgtccgtca（配列番号２）
▲２▼ KDR g.+4422(AC)11-14多型部位を含むDNA断片増幅用プライマーセット
フォワードプライマー：gcttgtagtaattgttcataagtgg （配列番号11）
リバースプライマー：gagcgtatgtctactatacgcca （配列番号12）
本発明のプライマーセットは、本発明の評価方法に使用する多型情報を得るためのキットとして使用される。本発明のキットは、上記プライマーセットのほかにポリメラーゼ、緩衝液、制限酵素、アガロースゲル、ゲノタイプ解析装置（ABI 310 genetic analyzer及びジーンスキャン解析ソフトウェア）などを含めることができる。
【００３２】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００３３】
〔実施例1〕 血管内皮増殖因子（VEGF）及びその受容体遺伝子多型の川崎病冠動脈病変への関与
(1)検体
患者は川崎病研究班による診断基準に沿って診断した。冠動脈の内径が3mm（5才以上は4mm）以上、または隣接する部位の内径が3mm（5才以上は4mm）以上であり、隣接する部位の1.5倍以上の拡大が認められた場合に、冠動脈病変（CAL）であると定義した。
【００３４】
本人又は両親に説明し同意を得て、また、九州大学又は福岡こども病院の倫理委員会の承認を受けて、検体として末梢血を採取した。
【００３５】
診療記録から臨床、検査データ、経過などを調べた。その結果CAL群41例、非CAL群62例、正常コントロール144例を試験対象とした。患者群の平均月齢は25.1±23.6月であり、87例（84.5％）がガンマグロブリンの投与（IVIG）を平均5.2±2.0病日に受けていた。性差、IVIG施行率にはCAL群、非CAL群間で有意差はなかった。他の臨床、検査データを表1に示す。
【００３６】
【表１】
2004194591.tif 000002
(2) DNA抽出とcDNA合成
血液中の白血球よりQIA amp blood kit（QIAGEN社製）を用いてgenomic DNAを抽出した。また、血液中の単核球（PBMC）よりRNeasy blood kitを用いてtotal RNAを抽出し、これよりFirst-Strand cDNA synthesis kitを用いてcDNAを合成した。
(3) VEGF遺伝子多型の制限酵素断片長多型（RFLP）による解析
VEGF g.-634 G>CとVEGF g.+13553 C>Tの2つの一塩基多型（SNP）のタイピングは、RFLP法で行った。すなわち、各々のSNPを含む遺伝子領域（VEGF g.-634 G>Cは304塩基、VEGF g.+13553 C>Tは208塩基の長さ）をPCR法で増幅する。各々のプライマーセットは以下の通りである。
【００３７】
▲１▼ -634 G>C
フォワードプライマー: atttatttttgcttgccatt（配列番号１）
リバースプライマー: gtctgtctgtctgtccgtca（配列番号２）
▲２▼ +13553 C>T
フォワードプライマー: aaggaagaggagactctgcgcagagc（配列番号３）
リバースプライマー:taaatgtatgtatgtgggtgggtgtgtctacagg（配列番号４）
次にこのPCR産物を制限酵素と緩衝液で消化する。各々の酵素名と消化条件は以下の通りである。
【００３８】
▲１▼ -634 G>C
制限酵素BsmFI (NEW ENGLAND BioLabs社製）、65℃で3時間消化。
【００３９】
▲２▼ +13553 C>T
制限酵素NlaIII (NEW ENGLAND BioLabs社製）、37℃で3時間消化。
【００４０】
-634 G>C多型のGを持つアリルは消化により切断されるのに対し、Cを持つアリルは切断されない。同様に+13553 C>T多型のTを持つアリルは切断されるが、Cを持つアリルはされない。この切断の有無によるPCR産物の塩基長の違いを、アガロースゲル上で電気泳動した際の移動度の違いとして判定した。
(4) KDR遺伝子多型の探索
アミノ酸翻訳領域（coding region）の未知の多型を見つけるため、cDNAを用い4071塩基の翻訳領域を6カ所に分けてnested PCRを行った。各々のPCR産物をABI PRISM 3100 genetic analyzerとDNA sequencing analysis softwareを用いてダイレクトシーケンスし、配列を解読した。またこの領域でインターネット上に公開されている多型のうちアミノ酸変化をきたす7カ所について、PCRとダイレクトシーケンスで24サンプルをスクリーニングし、日本人での多型の有無を確認した。
【００４１】
5’非翻訳領域（5'UTR)の未知の多型の検索と既知の多型の確認のため、32サンプルについて、-1049から-1までの塩基配列をPCRとシーケンスでスクリーニングした。
【００４２】
イントロン1内の既知のSNP3カ所について前述の方法でスクリーニングした。
【００４３】
KDRの遺伝子配列（genomic DNA）全体から多型となりうる2塩基の繰り返し配列を選び、PCRとシーケンスでスクリーニングした。
(5) KDR遺伝子多型の判定
アニーリング温度を除く全てのPCR条件は同じで以下の通りである。
【００４４】
すなわち、加熱変性94℃で30秒、アニーリング30秒、伸長反応72℃30秒を１サイクルとし、これを35サイクル行なった。
【００４５】
エクソン11内のKDR g.+18487 A>T多型は以下のプライマーを用い、アニーリング温度58℃でPCR反応を行った。
【００４６】
フォワードプライマー：ggtaggctgcgttggaagttatt （配列番号５）
リバースプライマー：cctggaagtcctccacacttct （配列番号６）
反応物を制限酵素NlaIIIで切断し、2％アガロースゲル上で電気泳動することによりRFLPの判定を行った。188塩基のPCR産物は、KDR g.+18487 Tアレルを持つ場合は124と64塩基に切断されるのに対し、Aアレルを持つ場合は切断されないことにより、塩基長を示すバンドの位置に基づいてアレルを判定した。
【００４７】
5'UTRのKDR g.-273G>A多型は以下のプライマーを用い、アニーリング温度58℃でPCRを行い、シーケンスにより多型を判定した。
【００４８】
フォワードプライマー：agctcccaccctgcactga （配列番号７）
リバースプライマー：tcccagcgcctgtctagag （配列番号８）
イントロン1内のKDR g.+1786T>A多型は以下のプライマーを用い、アニーリング温度54℃でPCRを行った。
【００４９】
フォワードプライマー：atttgaagttattgagagccttgt （配列番号９）
リバースプライマー：cggctaccaaaatcagaaac （配列番号10）
多型の判定はSingle Strand Conformation Polymorphism（SSCP）で行った。
【００５０】
KDR g.+4422(AC)11-14二塩基繰り返し多型は、以下のプライマーを用い、アニーリング温度53℃でPCRを行った。
【００５１】
フォワードプライマー：gcttgtagtaattgttcataagtgg （配列番号11）
リバースプライマー：gagcgtatgtctactatacgcca （配列番号12）
このフォワードプライマーの5'側が蛍光色素6-FAMでラベルされており、ABI PRISM 310 genetic analyzerとGene Scan analysis softwareを用いて繰り返し数を判定した。
(6) FLT1遺伝子多型の判定
FLT1 c.+6724(TG)13-23多型の判定は、蛍光プライマーを用いたゲノタイプ判別法(Parry R, et al., Eur J Immunogenet. 1999;26:321-323.）で行った。
(7) 統計解析
臨床及び検査データの比較は、Mann-Whitney U-testを用いた。アレル又はゲノタイプの頻度の比較はカイ二乗（χ2）検定を用い、p<0.05を有意とした。補正p値（pc）はBonferroniの方法に従ってp値に検定回数を乗ずることにより算出し、pc<0.05を有意とした。
【００５２】
川崎病群における２組の多型のアレルの組み合わせ頻度の比較はEHプログラムを用いた。連鎖不平衡係数D'(=D/Dmax)とχ2値はLewontinの方法に従い、最高頻度のアレルの組み合わせの比較により算出した。
【００５３】
表1に示したデータに性差、IVIGの有無とそのタイミング（早、遅）などの名義変数、並びにVEGF g.-634 G>C及びKDRg.+4422(AC)11-14のゲノタイプを加えstepwise logistic regression analysisにより多変量解析を行い、独立した危険因子を導出した。
(8)結果
▲１▼ VEGF遺伝子多型のアレル及びゲノタイプ頻度
表2に示すようにVEGF g.-634 G>C多型のGアレルの頻度がCAL群で非CAL群や正常群より有意に高かった。これは、主にGGゲノタイプがCAL群で高頻度のためである。なお、非CAL群と正常群では有意差はなかった。VEGF g.-13553 C>T多型についてはどの群間にもアレル頻度の差はなかった。
【００５４】
【表２】
2004194591.tif 000003
▲２▼ KDR遺伝子多型の確認とこれらの連鎖不平衡
5'UTRにおいて既知の2カ所と新規4カ所、翻訳領域で既知の2カ所、イントロン1内で既知の1カ所、並びにイントロン2内で欠失/挿入多型及びこれまで報告されていたACリピート多型1カ所を確認した。表3に今回検討した多型を示す。5'UTRの5カ所とイントロン1の1カ所とイントロン2の1カ所はお互いに連鎖不平衡を示した。
【００５５】
【表３】
2004194591.tif 000004
▲３▼ KDR遺伝子多型のアレル及びゲノタイプ頻度
多型の部位、頻度、連鎖不平衡などから4カ所（翻訳領域、5'UTR、イントロン1、イントロン2からそれぞれ1カ所ずつ）を選んでCAL発生についての関連性を検討した。KDR g.-273 G>A及びKDR g.-1786 A>Tは、KDR g.+4422(AC)11-14と連鎖不平衡を示しており、正常コントロールのサンプル数は48で行った。これらの結果を表4に示す。
【００５６】
【表４】
2004194591.tif 000005
g.+4422(AC)11-14多型について、A1（11ACリピート）、A2（12ACリピート）、A3（13ACリピート）及びA4（14ACリピート）の4種類のアレルが確認されたが、A3、A4アレルはコントロールにおいてそれぞれ1アレルずつの低頻度であった。A1とA2アレルのアレル頻度をCAL群と非CAL群で比較すると、A1アレルがCAL群で有意に高く、コントロールと比較しても高かった。これはA1A1ゲノタイプがCAL群で有意に高頻度なためであった。
▲４▼ 多変量解析による危険因子
stepwise logistic regression analysisでは、3つの因子、すなわちKDR g.+4422(AC)11-14多型のA1A1ゲノタイプ、長い有熱期間及び高い血小板濃度がCAL発生と相関を認めた。（表5）
【００５７】
【表５】
2004194591.tif 000006
(9) まとめ
VEGFが川崎病CAL発生に関与するとの所見に一致して、本発明者はVEGF g.-634G>C多型のGアレル、及びKDR g.+4422(AC)11-14多型のA1アレルが、CAL群で非CAL群又はコントロール群よりも高頻度にみられた。さらに多変量解析により、KDRg.+4422(AC)11-14多型のA1A1ゲノタイプが、CAL発生に対する独立した危険因子であることがわかった。
【００５８】
VEGF g.-634 G>C多型は、プロモーター領域に存在し、転写調節因子MZF1蛋白の結合部位における多型である。実際、この多型のGGゲノタイプをもつヒトの末梢血単核球（PBMC)では、リポ多糖類（LPS）刺激によるVEGF産生が他のゲノタイプより多いことが報告されている。よって、この多型のGGゲノタイプの患者は川崎病の急性期において全身的VEGF産生が多く、CALの発生頻度が高くなるものと評価することができる。
【００５９】
【発明の効果】
本発明により、血管内皮細胞増殖因子の遺伝子多型を用いた川崎病発症の評価方法が提供される。本発明の評価方法により、川崎病患者におけるCALの発生頻度を予測することができるため、本発明の方法は川崎病患者の治療（予後予測、医薬の選択等）に有用である。
【００６０】
【配列表】
2004194591.tif 000007
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【００６１】
【配列表フリーテキスト】
配列番号１：合成DNA
配列番号２：合成DNA
配列番号３：合成DNA
配列番号４：合成DNA
配列番号５：合成DNA
配列番号６：合成DNA
配列番号７：合成DNA
配列番号８：合成DNA
配列番号９：合成DNA
配列番号10：合成DNA
配列番号11：合成DNA
配列番号12：合成DNA