(57)【要約】【課題】脂質ヒドロペルオキシドの測定用標準物質として正確かつ簡便に測定可能な標準物質を提供すること。また、経口摂取した場合に生体内の脂質ヒドロペルオキシドを上昇させることができ、各種疫病の予防や治療に利用することが可能な、安定性を有する脂質ヒドロペルオキシドを提供すること。【解決手段】一般式（Ｉ）で表される脂肪酸誘導体を構成脂肪酸とする脂質誘導体を含むことを特徴とする、脂質ヒドロペルオキシド測定用標準物質。【化１】2004307397.tif 000023式中、ｍは０〜２９の整数を表し、ｎは０〜１３の整数を表す。【選択図】    図１
2004307397.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）で表される脂肪酸誘導体を含むことを特徴とする、脂質ヒドロペルオキシド測定用標準物質。
【化１】
2004307397.tif 000016
式中、ｍは０〜２９の整数を表し、ｎは０〜１３の整数を表す。
【請求項２】
一般式（Ｉ）で表される脂肪酸誘導体を構成脂肪酸とする脂質誘導体を含むことを特徴とする、脂質ヒドロペルオキシド測定用標準物質。
【化２】
2004307397.tif 000017
式中、ｍは０〜２９の整数を表し、ｎは０〜１３の整数を表す。
【請求項３】
脂質がリン脂質またはリゾリン脂質である、請求項２に記載の脂質ヒドロペルオキシド測定用標準物質。
【請求項４】
一般式（ＩＩ）で表されるステロール誘導体を含むことを特徴とする、脂質ヒドロペルオキシド測定用標準物質。
【化３】
2004307397.tif 000018
式中、Ｒ１は炭素数１〜２２個のアルキル基を表し、Ｒ２は水素または炭素数１〜２２個のアシル基でこのアシル基は酸化されていてもよく、Ｒ３は炭素数３〜１０個のアルキル基を表す。
【請求項５】
請求項１乃至４のいずれか１項に記載の脂質ヒドロペルオキシド測定用標準物質を用いて脂質ヒドロペルオキシドを検知・定量することを特徴とする、脂質ヒドロペルオキシドの検知・定量方法。
【請求項６】
一般式（Ｉ）で表される脂肪酸誘導体を構成脂肪酸とする脂質誘導体を含む脂質ヒドロペルオキシドを含有する、機能性食品または医薬組成物。
【化４】
2004307397.tif 000019
式中、ｍは０〜２９の整数を表し、ｎは０〜１３の整数を表す。
【請求項７】
請求項６に記載の脂質がリン脂質またはリゾリン脂質であるリン脂質ヒドロペルオキシドを含有する、機能性食品または医薬組成物。
【請求項８】
一般式（ＩＩ）で表されるステロール誘導体を含むステロールヒドロペルオキシドを含有する、機能性食品または医薬組成物。
【化５】
2004307397.tif 000020
式中、Ｒ１は炭素数１〜２２個のアルキル基を表し、Ｒ２は水素または炭素数１〜２２個のアシル基でこのアシル基は酸化されていてもよく、Ｒ３は炭素数３〜１０個のアルキル基を表す。
【請求項９】
一般式（Ｉ）で表される脂肪酸誘導体が、脂質を含む食品原料又は飲料をオゾン処理して得られることを特徴とする、請求項６又は７に記載の機能性食品または医薬組成物。
【請求項１０】
一般式（ＩＩ）で表されるステロール誘導体が、脂質を含む食品原料又は飲料をオゾン処理して得られることを特徴とする、請求項８に記載の機能性食品または医薬組成物。
【請求項１１】
食品原料が生きている魚介類である、請求項９または１０に記載の機能性食品または医薬組成物。
【請求項１２】
魚介類が生牡蠣である、請求項１１に記載の機能性食品または医薬組成物。
【請求項１３】
オゾンおよびアルコールを含む水溶液中で、生きている魚介類を蓄養し、魚介類の内蔵中に前記水溶液を取り込ませることにより、該魚介類の内臓中に脂質ヒドロペルオキシドを生成させることを特徴とする、魚介類の蓄養方法。
【請求項１４】
魚介類の内臓中に生成した前記脂質ヒドロペルオキシドが、一般式（Ｉ）で表される脂肪酸誘導体を構成脂肪酸とする脂質誘導体を含むことを特徴とする、請求項１３に記載の魚介類の蓄養方法。
【化６】
2004307397.tif 000021
式中、ｍは０〜２９の整数を表し、ｎは０〜１３の整数を表す。
【請求項１５】
魚介類の内臓中に生成した前記脂質ヒドロペルオキシドが、一般式（ＩＩ）で表されるステロール誘導体を含むことを特徴とする、請求項１３に記載の魚介類の蓄養方法。
【化７】
2004307397.tif 000022
式中、Ｒ１は炭素数１〜２２個のアルキル基を表し、Ｒ２は水素または炭素数１〜２２個のアシル基でこのアシル基は酸化されていてもよく、Ｒ３は炭素数３〜１０個のアルキル基を表す。
【請求項１６】
魚介類が生牡蠣である、請求項１３乃至１５のいずれか１項に記載の魚介類の蓄養方法。
【請求項１７】
請求項１４に記載の脂質誘導体および／または請求項１５に記載のステロール誘導体を検知することにより、魚介類の内臓中に脂質ヒドロペルオキシドが生成したことを検知し、魚介類の蓄養方法が施されたことを確認する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、特に食品および生体に作用し、品質劣化および各種疫病に関与する脂質ヒドロペルオキシド（過酸化脂質）の測定用標準物質に係わる。本発明はまた、これらの物質を含む機能性食品等、および蓄養魚介類、並びにその製造、蓄養方法に係わる。
【０００２】
【従来の技術】
従来、脂質ヒドロペルオキシドの測定用標準物質としては、過酸化水素、クメンヒドロペルオキシドや、脂質を光酸化、自動酸化もしくは酵素的に酸化することにより得られる脂質ヒドロペルオキシドが専ら用いられてきた（例えば、非特許文献１参照。）。これらの標準物質を用いて、食品もしくは生体の脂質ヒドロペルオキシドを測定する方法としては、酵素法（例えば、非特許文献２参照）、比色法（例えば、非特許文献３参照）、化学発光法（例えば、非特許文献４参照）、蛍光発酵法（例えば、非特許文献５参照）、電気化学検出法（例えば、非特許文献６参照）などがある。
【０００３】
脂質ヒドロペルオキシドは食品の劣化や生体内での酸化ストレスによって自然に生成するものである。酸化ストレスとなる活性酸素は大気汚染、放射線などの要因により生体内に発生し、遺伝子損傷を引き起こすことで癌や動脈硬化などの各種疫病を引き起こす。一方、活性酵素は体内に侵入した細菌・ウィルスなどの撃退はホルモン産生など生体維持に不可欠な役割も果たしている。脂質ヒドロペルオキシドは活性酸素と同様、様々な生理作用を有することが知られている。したがって、生体や食品中の脂質ヒドロペルオキシドを測定することは重要である。脂質ヒドロペルオキシド以外に酸化反応によって生成し、特有の機能性を有する脂質としては、ステロールをオゾン酸化により、その５位と６位の間を開裂させたセコステロールが血清資質低下作用を有することが知られている（例えば、特許文献１及び２参照。）。
【０００４】
【特許文献１】
特開平１−２９０６２４号公報
【０００５】
【特許文献２】
特開２０００−１８９１０３号公報
【０００６】
【非特許文献１】
化学と生物  実験ライン２  脂質過酸化実験法ｐ．  ２６−４８
【０００７】
【非特許文献２】
ファルマシア  ２５，  １２４６−１２５２  （１９８９）
【０００８】
【非特許文献３】
アメリカ油化学会誌（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｏｉｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔ’ｓ  Ｓｏｃｉｅｔｙ．），  ６２：  １４９５−１５００  （１９８５）
【０００９】
【非特許文献４】
アナリティカル・レター（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ．  Ｌｅｔｔｅｒ．），  ２０：  ９１５−９２５  （１９８７）
【００１０】
【非特許文献５】
アナリティカル・レター（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ．  Ｌｅｔｔｅｒ．），  ２１：  ９６５−９７５  （１９８８）
【００１１】
【非特許文献６】
リピッズ（Ｌｉｐｉｄｓ），  ２２：  １２５−１２８  （１９８７）
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
脂質ヒドロペルオキシドの測定用標準物質として従来から用いられている前記過酸化水素、クメンヒドロペルオキシドは、脂質と比較して明らかに分子量や極性が異なるため、これらの物質を脂質ヒドロペルオキシドの標品として使用した場合には、正確な値が得られにくいと言う問題点があった。また、脂質を光酸化、自動酸化もしくは酵素的に酸化することにより脂質ヒドロペルオキシドを得る方法では、脂質ヒドロペルオキシドのほかに様々な化合物が生成するため、各種実験用の標品として脂質ヒドロペルオキシドを利用するためには、カラムクロマトグラフィーや高速液体クロマトグラフィーなどを用いて、未酸化脂質の分離や単一成分の分離が必要となり、作業が煩雑になることに加え、脂質ヒドロペルオキシドの収率も悪いという問題点を有していた。
【００１３】
一方、ウィルスの撃退などを目的として、生体内の脂質ヒドロペルオキシドを上昇させ、各種疫病の予防に利用しようとする場合に、脂質ヒドロペルオキシドを経口投与する手段では、従来の脂質ヒドロペルオキシドは非常に不安定なため、そのままの形で体内に吸収されることは殆どなく、生体内の脂質ヒドロペルオキシドを上昇させることは困難であった。
【００１４】
本発明は、上記問題点を解決すべく開発されたものであり、脂質ヒドロペルオキシドの測定用標準物質として正確かつ簡便に測定可能な標準物質を提供することを目的とする。本発明はまた、経口摂取した場合に生体内の脂質ヒドロペルオキシドを上昇させることができ、各種疫病の予防や治療に利用することが可能な、安定性を有する脂質ヒドロペルオキシドを提供することを目的とする。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は前記課題を解決すべく鋭意検討した結果、脂質にオゾンとアルコールを作用させると脂質ヒドロペルオキシドが生成し、かかる化合物が従来の自動酸化や光酸化、酵素酸化により生成した脂質ヒドロペルオキシドに比較し安定性に優れ、また合成や精製が容易であるため脂質ヒドロペルオキシドを測定するための標品として適していることを見出した。
【００１６】
一方、本発明者等がかかるオゾン酸化により得られる脂質ヒドロペルオキシドの各種生理作用を検討した結果、血清脂質低下作用やがん細胞増殖抑制作用など各種疫病の予防、治療に有効な機能を有することを見出すと共に、食品中にもこのオゾン酸化脂質ヒドロペルオキシドを生成させることが可能であり、かつ経口摂取した場合でも該物質に特有の安定性から、そのままの形態で生体内に吸収されやすいことを初めて明らかにしたものである。
【００１７】
すなわち、本発明は以下の構成を有するものである。
【００１８】
（１）  一般式（Ｉ）で表される脂肪酸誘導体を含むことを特徴とする、脂質ヒドロペルオキシド測定用標準物質。
【００１９】
【化８】
2004307397.tif 000003
【００２０】
式中、ｍは０〜２９の整数を表し、ｎは０〜１３の整数を表す。
【００２１】
（２）  一般式（Ｉ）で表される脂肪酸誘導体を構成脂肪酸とする脂質誘導体を含むことを特徴とする、脂質ヒドロペルオキシド測定用標準物質。
【００２２】
【化９】
2004307397.tif 000004
【００２３】
式中、ｍは０〜２９の整数を表し、ｎは０〜１３の整数を表す。
【００２４】
（３）  脂質がリン脂質またはリゾリン脂質である、（２）項に記載の脂質ヒドロペルオキシド測定用標準物質。
【００２５】
（４）  一般式（ＩＩ）で表されるステロール誘導体を含むことを特徴とする、脂質ヒドロペルオキシド測定用標準物質。
【００２６】
【化１０】
2004307397.tif 000005
【００２７】
式中、Ｒ１は炭素数１〜２２個のアルキル基を表し、Ｒ２は水素または炭素数１〜２２個のアシル基でこのアシル基は酸化されていてもよく、Ｒ３は炭素数３〜１０個のアルキル基を表す。
【００２８】
（５）  （１）項乃至（４）項のいずれか１項に記載の脂質ヒドロペルオキシド測定用標準物質を用いて脂質ヒドロペルオキシドを検知・定量することを特徴とする、脂質ヒドロペルオキシドの検知・定量方法。
【００２９】
（６）  一般式（Ｉ）で表される脂肪酸誘導体を構成脂肪酸とする脂質誘導体を含む脂質ヒドロペルオキシドを含有する、機能性食品または医薬組成物。
【００３０】
【化１１】
2004307397.tif 000006
【００３１】
式中、ｍは０〜２９の整数を表し、ｎは０〜１３の整数を表す。
【００３２】
（７）  （６）項に記載の脂質がリン脂質またはリゾリン脂質であるリン脂質ヒドロペルオキシドを含有する、機能性食品または医薬組成物。
【００３３】
（８）  一般式（ＩＩ）で表されるステロール誘導体を含むステロールヒドロペルオキシドを含有する、機能性食品または医薬組成物。
【００３４】
【化１２】
2004307397.tif 000007
【００３５】
式中、Ｒ１は炭素数１〜２２個のアルキル基を表し、Ｒ２は水素または炭素数１〜２２個のアシル基でこのアシル基は酸化されていてもよく、Ｒ３は炭素数３〜１０個のアルキル基を表す。
【００３６】
（９）  一般式（Ｉ）で表される脂肪酸誘導体が、脂質を含む食品原料又は飲料をオゾン処理して得られることを特徴とする、（６）項又は（７）項に記載の機能性食品または医薬組成物。
【００３７】
（１０）  一般式（ＩＩ）で表されるステロール誘導体が、脂質を含む食品原料又は飲料をオゾン処理して得られることを特徴とする、（８）項に記載の機能性食品または医薬組成物。
【００３８】
（１１）  食品原料が生きている魚介類である、（９）項または（１０）項に記載の機能性食品または医薬組成物。
【００３９】
（１２）  魚介類が生牡蠣である、（１１）項に記載の機能性食品または医薬組成物。
【００４０】
（１３）  オゾンおよびアルコールを含む水溶液中で、生きている魚介類を蓄養し、魚介類の内蔵中に前記水溶液を取り込ませることにより、該魚介類の内臓中に脂質ヒドロペルオキシドを生成させることを特徴とする、魚介類の蓄養方法。
【００４１】
（１４）  魚介類の内臓中に生成した前記脂質ヒドロペルオキシドが、一般式（Ｉ）で表される脂肪酸誘導体を構成脂肪酸とする脂質誘導体を含むことを特徴とする、（１３）項に記載の魚介類の蓄養方法。
【００４２】
【化１３】
2004307397.tif 000008
【００４３】
式中、ｍは０〜２９の整数を表し、ｎは０〜１３の整数を表す。
【００４４】
（１６）  魚介類の内臓中に生成した前記脂質ヒドロペルオキシドが、一般式（ＩＩ）で表されるステロール誘導体を含むことを特徴とする、（１３）に記載の魚介類の蓄養方法。
【００４５】
【化１４】
2004307397.tif 000009
【００４６】
式中、Ｒ１は炭素数１〜２２個のアルキル基を表し、Ｒ２は水素または炭素数１〜２２個のアシル基でこのアシル基は酸化されていてもよく、Ｒ３は炭素数３〜１０個のアルキル基を表す。
【００４７】
（１６）  魚介類が生牡蠣である、（１３）項乃至（１５）項のいずれか１項に記載の魚介類の蓄養方法。
【００４８】
（１７）  （１４）項に記載の脂質誘導体および／または（１５）項に記載のステロール誘導体を検知することにより、魚介類の内臓中に脂質ヒドロペルオキシドが生成したことを検知し、魚介類の蓄養方法が施されたことを確認する方法。
【００４９】
【発明の実施の形態】
本発明は脂質ヒドロペルオキシドに係わるものであり、本発明における脂質ヒドロペルオキシドには、脂肪酸ヒドロペルオキシドを構成脂肪酸として含有するものと含有しないものとが含まれ、例えば、脂肪酸ヒドロペルオキシド、リン脂質ヒドロペルオキシド、ステロールヒドロペルオキシド、トリグリセリドヒドロペルオキシド等が挙げられる。以下、本発明を詳細に説明する。
【００５０】
本発明の脂質ヒドロペルオキシド測定用標準物質は、既述の通り、脂質をオゾン酸化することにより得られるものであり、脂質ヒドロペルオキシドを正確かつ簡便に測定可能な標準物質として極めて有効である。
【００５１】
本発明の脂質ヒドロペルオキシド測定用標準物質は、下記一般式（Ｉ）で表される脂肪酸誘導体を構成脂肪酸とする脂質誘導体を含む脂質ヒドロペルオキシドである。
【００５２】
【化１５】
2004307397.tif 000010
【００５３】
式中、ｍは０〜２９の整数を表し、ｎは０〜１３の整数を表す。
【００５４】
本発明の脂質ヒドロペルオキシド測定用標準物質により好適に測定可能な物質には、前記脂質がリン脂質またはリゾリン脂質であるリン脂質ヒドロペルオキシド等が含まれる。
【００５５】
また、本発明の脂質ヒドロペルオキシド測定用標準物質は、下記一般式（ＩＩ）で表されるステロール誘導体を含む脂質ヒドロペルオキシドである。
【００５６】
【化１６】
2004307397.tif 000011
【００５７】
式中、Ｒ１は炭素数１〜２２個のアルキル基を表し、Ｒ２は水素または炭素数１〜２２個のアシル基でこのアシル基は酸化されていてもよく、Ｒ３は炭素数３〜１０個のアルキル基を表す。
【００５８】
上記物質の中、本発明のリン脂質ヒドロペルオキシド測定用標準物質としては、１−パルミトイル−２−（９−エトキシ−９−ヒドロペルオキシノナノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１  −  ｐａｌｍｉｔｏｙｌ  −  ２  −  （９  −  ｅｔｈｏｘｙ  −  ９  −  ｈｙｄｒｏｐｅｒｏｘｙｎｏｎａｎｏｙｌ）  −  ｓｎ  −  ｇｌｙｃｅｒｏｌ  −  ３  −  ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ）が最良と思われる。その合成方法は公知の方法（リピッズ（Ｌｉｐｉｄｓ），  ３７：  １００７−１０１２  （２００２）  など）を用いて行うことができる。
【００５９】
リン脂質以外に脂肪酸（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ７６：  １８４−１９１  （１９７６））、トリグリセリドなどの場合も同様な操作により、上記化１の構造を含む物質を合成することができる。
【００６０】
また、本発明のコレステロールヒドロペルオキシド測定用標準物質としては、３β−ヒドロキシ−７α−エトキシ−５α−Ｂ−ホモ−６−オキソコレスタン−５−ヒドロペルオキシド（３β  −  ｈｙｄｒｏｘｙ  −  ７α  −  ｅｔｈｏｘｙ  −５α  −  Ｂ  −  ｈｏｍｏ  −  ６  −  ｏｘｏｃｈｏｌｅｓｔａｎｅ  −  ５  −  ｈｙｄｒｏｐｅｒｏｘｉｄｅ）が最良と思われる。その合成方法は公知の方法（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  １０５：  １９７２−１９７９（１９８３）  ，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５３：  ５４５−５５４  （１９８８），  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２６：  １０４−１０７（１９８８），  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ．  Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  １：  １２２２−１２２３．  （１９９０），  Ｓｔｅｒｏｉｄｓ  ６１：  ４０１−４０６．  （１９９６），  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ．  Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  ２：  ２３１３−２３１８．  （１９９７）  など）を用いて行うことができる。
【００６１】
本発明の標準物質を用いた脂質ヒドロペルオキシドの測定方法について以下に説明する。
【００６２】
本発明の標準物質（オゾン酸化脂質ヒドロペルオキシド）は、比色定量法などにより一斉に全脂質ヒドロペルオキシド量の測定を行うための標品として適することはもちろんであるが、高速液体クロマトグラフィーなどを用いて分子種毎の脂質ヒドロペルオキシド量を測定する場合の標品として特に有効である。従来の標品脂質ヒドロペルオキシドは自然に生成するものと同一のものを使用するため、内部標準物質として使用することができない。しかしながら、本発明の標準物質のうち、通常天然には存在しないペンタノールやヘキサノールを用いて合成した脂質ヒドロペルオキシドを用いることで、自動酸化や光酸化等で生成した脂質ヒドロペルオキシドと分離して検出することが可能である。
【００６３】
例えば、ヒト血漿中のリン脂質ヒドロペルオキシドを測定しようとする場合、化学発光検出器を備えた高速液体クロマトグラフィーに、カラムはＦｉｎｅ  Ｐａｋ  ＳＩＬを、移動相はクロロホルム：メタノール：１−プロパノール：水（１：９：４：０．１）を用いる方法があるが（例えば、Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １０３：  ７４４−７４６（１９８８）参照）、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンに、オゾンとヘキサノールを反応させて合成した本発明の化合物１ｆ（後述の（実施例１）参照）を内部標準物質として、ヒト血漿中の脂質ヒドロペルオキシドを測定した場合、保持時間８分にヒト血漿由来のホスファチジルコリンヒドロペルオキシドが、保持時間９分に化合物１ｆが検出される。ヒト血漿由来のホスファチジルコリンヒドロペルオキシドの量は、既知量の化合物１ｆを予め血漿中に加えてから、脂質抽出操作および高速液体クロマトグラフィーに供することで、化合物１ｆとホスファチジルコリンヒドロペルオキシドの高速液体クロマトグラムでの化学発光強度の比から簡単に求めることができる。
【００６４】
上記本発明の標準物質、すなわち前記一般式（Ｉ）で表される脂肪酸誘導体を構成脂肪酸とする脂質誘導体、または前記一般式（ＩＩ）で表されるステロール誘導体を含む脂質ヒドロペルオキシドは、脂質ヒドロペルオキシドの測定用標準物質として有効なだけでなく、血清脂質低下作用やがん細胞増殖抑制作用など各種疫病の予防、治療に有効な機能を有する。そして、これら本発明の脂質ヒドロペルオキシドおよびステロールヒドロペルオキシドは食品や飲料（以下、単に食品と言う。）中や生体内に生成させることが可能であり、更にこれら物質は安定性に優れることから、そのままの形態で生体内に吸収されやすい。
【００６５】
以下に本発明の脂質ヒドロペルオキシドを含む医薬品組成物および機能性食品について説明する。
医薬品組成物または機能性食品に含有される本発明の脂質ヒドロペルオキシドの原料となる脂質は、食品原料から抽出したものでも、合成したものでもどちらでもよく、必ずしも脂質としての純度が高くなくてもよい。本発明において用いられる食品原料としては、農海産物、加工食品など脂質を含むすべての食品や飲料が含まれ、具体例としては生きている魚介類を挙げることができる。魚介類としては生牡蠣等が挙げられる。また食品原料を物理的、化学的および生物的処理をして得られる脂質を含む食品抽出物を含む。医薬品組成物に含有される本発明の脂質ヒドロペルオキシドを製造する場合は、すべての化学薬品を用いることができる。一方、機能性食品に含有させるために用いる本発明の脂質ヒドロペルオキシドを製造する場合には、食品添加物として認可された物質を使用する。たとえば、アルコールとしては、エタノールを用いることが望ましい。本発明の機能性食品は粗生成物をそのまま利用してもよく、他の食品と混合して用いてもよい。これらの医薬品組成物および機能性食品は、ヒト以外の家畜飼料としても利用できることは言うまでもない。
【００６６】
本発明の脂質ヒドロペルオキシドを生体中に生成させるために利用する医療器具および健康器具について、以下に説明する。医療器具としての使用の一形態としては、被検体から採取した血液にオゾンを含むエタノールを接触もしくは投入することで血液中の脂質と接触させる。オゾンを含むエタノールには血液との混合に必要な、ヘパリンなどの試薬を含むことは差し支えない。この処理済みの血液を任意の適切な方法（最も好ましくは、筋肉内注射であるが、皮下注射、腹腔内注射、および経口投与、鼻投与または直腸投与、動脈内注射または静脈内注射もまた含む）によって被験体の身体内に再導入する。
【００６７】
また、本発明の脂質ヒドロペルオキシドを生きている魚介類の内臓中に生成させる手段について説明する。すなわち、オゾンおよびアルコールを含む水溶液中で、生きている魚介類（例えば、生牡蠣等）を蓄養し、該魚介類の内蔵中に前記水溶液を取り込ませることにより、魚介類の内臓中に本発明の脂質ヒドロペルオキシドを生成させることができる。
【００６８】
なお、この発明は、上記実施形態をそのままに限定されるものではなく、実施段階ではその要旨を逸脱しない範囲で構成要素を変形して具体化できる。また、上記実施形態に開示されている複数の構成要素の適宜な組み合わせにより種々の発明を形成できる。例えば、実施形態に示される全構成要素からいくつかの構成要素を削除してもよい。更に、異なる実施形態に亘る構成要素を適宜組み合わせてもよい。
【００６９】
【実施例】
次に本発明を実施例により更に詳細に説明するが、実施例は例示のために提示するものであって、どのようにも本発明を限定することを意図するものではない。
【００７０】
（実施例１）１−パルミトイル−２−（９−エトキシ−９−ヒドロペルオキシノナノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンの製造
１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１  −  ｐａｌｍｉｔｏｙｌ  −  ２  −  ｏｌｅｏｙｌ  −  ｓｎ  −  ｇｌｙｃｅｒｏｌ  −  ３  −  ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ）（５μｍｏｌ）をヘキサン／エタノール（９：１）３ｍｌに溶解し、１．３％のオゾンを含む酸素で３分間バブリングした。溶媒を減圧下留去し、残渣を高速液体クロマトグラフィーにて精製し、１−パルミトイル−２−（９−エトキシ−９−ヒドロペルオキシノナノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン  １．２４μｍｏｌを得た。
【００７１】
本明細書において、一般式（Ｉ）で表される脂肪酸（但し、ｎ＝７）が２位に、パルミチン酸が１位に結合しているホスファチジルコリンを化合物１と称し、そのうち、一般式（Ｉ）においてｍ＝０、１、２、３、４又は５であるものをそれぞれ化合物１ａ、１ｂ、１ｃ、１ｄ、１ｅ、１ｆと称する。このうち化合物１ｂが上記合成方法により得られた１−パルミトイル−２−（９−エトキシ−９−ヒドロペルオキシノナノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンであり、溶媒としてエタノールに変えて、メタノール、プロパノール、ブタノール、ペンタノール、ヘキサノールを用いて製造された化合物が各々１ａ、１ｃ、１ｄ、１ｅ、１ｆである。
【００７２】
本発明の化合物１ｂの特性は、次の通りである。
【００７３】
１Ｈ−ＮＭＲ  （６００ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）：  ｄ  ０．８５  （ｔ，  ３Ｈ），  １．１８  （ｔ，  ３Ｈ），  １．２５−１．３０  （ｍ，  ３２Ｈ），  １．４８−１．６０  （ｍ，  ６Ｈ），  ２．２０−２．３０  （ｍ，  ４Ｈ），  ３．３５  （ｓ，  ９Ｈ），  ３．５５  （ｍ，  １Ｈ），  ３．８７  （ｍ，  １Ｈ），  ３．９０  （ｍ，  ２Ｈ），  ４．００  （ｍ，  ２Ｈ），  ４．０８  （ｍ，  １Ｈ），  ４．２８  （ｍ，  １Ｈ），  ４．３７  （ｍ，  ２Ｈ），  ４．７５  （ｍ，  １Ｈ），  ５．１８  ｐｐｍ  （ｍ，  １Ｈ）； １３Ｃ−ＮＭＲ（１５０ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）：  ｄ  １３．５，  １４．１，  ２４．３，  ２８．４−２９．１，  ３３．５，  ５４．２，  ６０．０，  ６２．２，  ６４．１，  ６４．８，  ６５．７，  ６９．８，  １０７．５  ｐｐｍ；  高分解能（＋）ＦＡＢ−ＭＳ：  ［Ｍ＋Ｈ］＋  ｍ／ｚ  ７１２．４７６７  （ｃａｌｃｄ．  ｆｏｒ  ［Ｃ３５Ｈ７１ＮＯ１１Ｐ］  ＋  ｍ／ｚ  ７１２．４６８６）；  （＋）ＥＳＩ／ＴＯＦ−ＭＳ：  ［Ｍ＋Ｈ］＋  ｍ／ｚ  ７１２．４。
【００７４】
（実施例２）３β−ヒドロキシ−７α−エトキシ−５α−Ｂ−ホモ−６−オキソコレスタン−５−ヒドロペルオキシドの製造
コレステロール（４６０ｍｇ）をクロロホルム／エタノール（１：１）１００ｍｌに溶解し、１．３％のオゾンを含む酸素で２０分間バブリングした。溶媒を減圧下留去し、残さを高速液体クロマトグラフィーにて精製し、３β−ヒドロキシ−７α−エトキシ−５α−Ｂ−ホモ−６−オキソコレスタン−５−ヒドロペルオキシド４２０ｍｇを得た。
【００７５】
本明細書において、一般式（ＩＩ）で表されるステロール誘導体（但し、Ｒ２＝Ｈ、Ｒ３＝Ｃ８Ｈ１７）で表される物質を化合物２と称し、そのうち、Ｒ１のアルキル基が、ＣＨ３，  Ｃ２Ｈ５，  Ｃ３Ｈ７，  Ｃ４Ｈ９，  Ｃ５Ｈ１１のものをそれぞれ化合物２ａ，２ｂ、２ｃ、２ｄ、２ｅと称する。このうち化合物２ｂが上記合成方法により得られた３β−ヒドロキシ−７α−エトキシ−５α−Ｂ−ホモ−６−オキソコレスタン−５−ヒドロペルオキシドであり、溶媒としてエタノールに変えて、メタノール、プロパノール、ブタノール、ペンタノールを用いて製造された化合物が各々２ａ、２ｃ、２ｄ、２ｅ、２ｆである。
【００７６】
本発明の化合物２ｂの特性は次のようになる。
【００７７】
白色粉末、融点１３２−１３５  ℃、１Ｈ−ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）：  ｄ  ２．００  （ｍ，  ２Ｈ），  ２．６５  （ｄ，  １Ｈ），  ３．９９  ａｎｄ  ３．５８（ＡＢＸ３ｍ，  ２Ｈ），  ３．８９  （ｍ，  １Ｈ），  ４．７４  （ｔ，  １Ｈ），  １０．２６ｐｐｍ  （ｓ，  １Ｈ）；  １３Ｃ−ＮＭＲ（１５０ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）：  ｄ  １５．１  （ＯＣＨ２ＣＨ３），  ６３．９  （ＯＣＨ２ＣＨ３），  ６６．８  （Ｃ−３），  １００．７  （Ｃ−７），  １１．８  ｐｐｍ  （Ｃ−５）；  （−）ＦＡＢ−ＭＳ：  ［Ｍ−Ｈ］＋  ｍ／ｚ  ４７９；  （＋）ＦＡＢ−ＭＳ：  ［Ｍ−Ｃ２Ｈ５ＯＨ−Ｈ２Ｏ＋Ｈ］＋  ｍ／ｚ  ４１７；  （＋）ＥＳＩ／ＴＯＦ−ＭＳ：  ［Ｍ−Ｃ２Ｈ５ＯＨ］＋  ｍ／ｚ  ４３４，  ［Ｍ−Ｃ２Ｈ５ＯＨ−Ｈ２Ｏ］＋  ｍ／ｚ  ４１６。
【００７８】
（実施例３）ラットにおける血中脂質濃度の測定
本発明の前記化合物１ａ、１ｂ、１ｃ、１ｄ、１ｅ及び１ｆと、比較化合物１として１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンを、試験試料として表１の組成の飼料に配合したものを、各々本発明例１〜６および比較例１とした（表２参照）。４週齢ＳＤ系雄ラットを個別飼育用ケージで市販固形飼料にて予備飼育した後、上記飼料（本発明例１〜６、比較例１）を制限食給餌により２週間投与した。各群の飼育数は５匹で行った。飼育後、ラットを解剖して採血し、血漿中の総コレステロール、遊離コレステロール、ＨＤＬコレステロール、トリグリセリドを測定した。尚、測定方法はそれぞれ、コレステロールＣテストワコー、遊離コレステロールＣテストワコー、ＨＤＬ−コレステロールテストワコー、トリグリセライドテストワコー（いずれも和光純薬社製）を用いた。その結果を表３に示した。統計処理実験データは平均値±ＳＤ（標準偏差）で示した。結果の統計解析は、ｓｔｕｄｅｎｔ  ｔ−ｔｅｓｔ  （ｐ＜０．０５）を用いた。比較例１に対して有意差が認められるものは＊で示した。この結果を見ると、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンを用いて比較例１に比べて、本発明の化合物を用いた本発明例１〜６は血漿中の総コレステロール、遊離コレステロール、トリグリセリドが優位に低かった。本発明の化合物１ａ、１ｂ、１ｃ、１ｄ、１ｅ、１ｆが優れた血清脂質代謝改善作用を有することが明らかとなった。
【００７９】
【表１】
2004307397.tif 000012
【００８０】
【表２】
2004307397.tif 000013
【００８１】
【表３】
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【００８２】
（実施例４）
５６℃、３０分間処理した牛胎児血清（フロー社製）を１０％、２ｍｇ／ｍｌの炭酸水素ナトリウム、１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ−１６４０培地（シグマ社製）にて３７℃で培養したヒト前骨髄性白血病細胞ＨＬ−６０（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１９６４）を、１×１０５  個／ｍｌとなるように希釈した。この希釈液を９６穴マイクロプレートに１００μｌづつ分注し、３７℃、５％二酸化炭素存在下で２４時間培養した。
【００８３】
これとは別に牛胎児血清を含まないＲＰＭＩ−１６４０培地を１０ｍｌを６つ用意し、それぞれエタノール、化合物２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄ、２ｅのエタノール溶液（２０ｍｇ／ｍｌ）を１０μｌ添加した（試験用培地）。２４時間培養した９６穴マイクロプレートを遠心し上層の培地を取り除いた後、各試験用培地を１００μｌづつ１６穴に添加し、３７℃、５％二酸化炭素存在下で２４時間培養した。次ぎにＭＴＴ溶液（ＭＴＴ３０ｍｇ  をＰＢＳ１０ｍｌに溶解した溶液）を５０μｌずつ加え、３時間培養後、２００μｌのＰＢＳを添加・遠心し、上層を取り除いて、２００μｌの酸性イソプロピルアルコール（４ｍｏｌ／ｍｌ塩酸を１／１００容量イソプロピルアルコールに添加）を加えた。１０分後にマイクロプレートリーダーで５７０ｎｍおよび６３０ｎｍの吸光度を測定した。エタノール添加（サンプル非添加、コントロール）の場合の吸光度（５７０ｎｍ−６３０ｎｍ）の平均値で各サンプルの吸光度を割り、１００倍した値を生細胞数％として計算した。その結果を表４に示した。ＨＬ−６０に対して細胞致死活性を有することは明らかである。またＨＬ−６０の代わりに、肺がん細胞（Ａ５４９）、肝がん細胞（ＨｅｐＧ２）、大腸がん細胞（ＤＬＤ−１）、子宮頸がん細胞（ＨｅＬａ）を用い細胞致死活性を上記に準じ測定し、同様の結果を得た。
【００８４】
【表４】
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【００８５】
（実施例５）
５６℃、３０分間処理した牛胎児血清（フロー社製）を１０％、２ｍｇ／ｍｌの炭酸水素ナトリウム、１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ−１６４０培地（シグマ社製）にて３７℃で培養したヒト前骨髄性白血病細胞ＨＬ−６０（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１９６４）を牛胎児血清を含まないＲＰＭＩ−１６４０培地にて１×１０５  個／ｍｌとなるように懸濁した。この懸濁液１０ｍｌを６つ用意し、それぞれの懸濁液に対し、それぞれエタノール、化合物２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄ、２ｅのエタノール溶液（２０ｍｇ／ｍｌ）を１０μｌ添加し、３７℃、５％二酸化炭素存在下で４８時間培養した。培養した細胞を遠心分離により上清と分離した。得られた細胞を１０ｍＭのエチレンジアミンテトラアセテート及び０．５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む１０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）１００μｌにて懸濁し、１０分放置後、１６，０００ｒｐｍで５遠心した。ＤＮＡ断片を含む上層を別の容器に取り、１０ｍｇ／ｍｌのリボヌクレアーゼＡを２μｌ添加して３７℃、６０分間処理した後、１０ｍｇ／ｍｌのプロティネースＫを２μｌ添加して５０℃、３０分間処理した。処理後の細胞をサンプルとして、２％のアガロースゲルを用いて１００Ｖの定電圧の下で電気泳動を行った。このゲルをエチジウムブロミド溶液に３０分間浸した後、トランスイルミネータを用いてゲル中のＤＮＡの状態を確認したところ、エタノール添加（サンプル非添加、コントロール）の場合を除く全ての化合物で、アポトーシスに特有のＤＮＡラダーが確認された。更に確認のためアポトーシスを誘発する試薬として知られているアクチノマイシンＤの１０μｇ／ｍｌ溶液を上記の各化合物の代りに用いて同様に操作したところ、培養２４時間で、本発明の化合物の場合と同じＤＮＡラダーが確認できた。この結果より、ＨＬ−６０細胞は化合物２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄ、２ｅによりアポトーシスを誘発されることが明らかとなった。またＨＬ−６０の代わりに、肺がん細胞（Ａ５４９）、肝がん細胞（ＨｅｐＧ２）、大腸がん細胞（ＤＬＤ−１）、子宮頸がん細胞（ＨｅＬａ）を用いアポトーシス誘発作用を上記に準じ測定し、同様の結果を得た。
【００８６】
（実施例６）
凍結乾燥した卵黄から含水エタノール抽出して得られた粗脂肪をアセトンに懸濁し、上清のアセトン可溶性画分（主として中性脂肪を含む）を吸引除去して、アセトン不溶性画分（主としてリン脂質を含む）を得た。このアセトン処理を４回行った後、アセトン不溶性画分を水に分散させ、減圧濃縮機を用いて大部分のアセトンを除去した。次いで分散液に同量のエタノールを加え、２０分間０．５％のオゾン処理をした後、凍結乾燥し機能性食品を製造した。この乾燥物の組成は、リン脂質８０％を含み、その主要成分は、ホスファチジルコリン４２％、ホスファチジルエタノールアミン８％、スフィンゴミエリン１０％であった。次ぎに、乾燥物１ｇを少量のクロロホルム−メタノール（４：１）に溶解し、ケイ酸カラムクロマトグラフィー（６０ｇのケイ酸−ケイソウ土（２：１）を使用）にて、クロロホルム−メタノール（４：１）  ４００ｍｌ、クロロホルム−メタノール（３：２）  １６０ｍｌで溶出した成分を捨て、次のクロロホルム−メタノール（３：２）  ３２０ｍｌで溶出する成分を取り、減圧濃縮機を用いて溶剤を除去し、ホスファチジルコリン画分３７０ｍｇを得た。この画分をメタノールに溶解し、化学発光検出器を備えた高速液体クロマトグラフィー（カラムとして逆相ＯＤＳシリカカラムを装着）に供した。実施例１において合成した本発明の化合物１ｂを用いて図１に示すような検量線を作成し、この検量線に基づいてホスファチジルコリン画分中の化合物１ｂの含量を求めた結果、およそ６３ｍｇであった。
【００８７】
（実施例７）
ラットに５ｍｌのエタノールを経口投与し５分経過後、ヘパリン処理した注射筒を用いて、ラットから１０ｍｌの血液を採取し、この血液に１％のオゾンを含む酸素をバブリングした。この血液を再度被検体ラットに輸血した。輸血して２時間経過後に、ヘパリン処理した注射筒を用いて被検体から採血し、４℃で１０分間遠心分離を行い、上層の血漿を得る。この血漿１ｍｌに、クロロホルム−メタノール（２：１）を加えよく混合し、４℃で１０分間遠心分離を行い下層のクロロホルム層を得る。この抽出操作を数回繰り返して集めたクロロホルム層を脱水後濃縮乾固し、５０μＬのクロロホルム−メタノール（２：１）に再溶解し、化学発光検出器および質量分析装置（Ｍａｒｉｎｅｒ  ＥＳＩ／ＴＯＦ−ＭＳ）を備えた高速液体クロマトグラフィー（カラムとして順相アミノプロピルカラムを装着）に供した。実施例１において合成した本発明の化合物１ｆ（但しここでは１−ヘキサノールを用いて合成した化合物を使用）を内部標準物質に使用し、血漿１ｍｌ中の化合物１ｆの含量を求めた結果、およそ５０ｎＭであった。
【００８８】
（実施例８）
１％のエタノールを含む人工海水からなる蓄養水を作製し、オゾン発生装置および気液混合装置を備えた蓄養水槽に入れ、蓄養水中のオゾン濃度がおよそ１ｐｐｍとなるように制御した。この蓄養水槽に、生きたままの牡蠣を投入し、３日間蓄養した。３日後に牡蠣の中腸線を取り、その５ｇに水３ｍｌとクロロホルム−メタノール（１：２）３０ｍｌを加え、ホモジネート後、遠心し上清を分取した。残部にクロロホルム−メタノール−水（１：２：０．８）３８ｍｌを加え、ホモジナイズと遠心を繰り返した。２つの上清を合わせ、クロロホルムと水をそれぞれ２０ｍｌずつ加え、下層のクロロホルム槽を脱水後、減圧濃縮機を用いて濃縮乾固した。得られた全脂質のうち、２００ｍｇを少量のヘキサンに溶解し、フロリシルカラムクロマトグラフィー（３０ｇの７％含水フロリシルを使用）にて、ヘキサン５０ｍｌ、ヘキサン−エーテル（９５：５）  １２０ｍｌ、ヘキサン−エーテル（８５：１５）  １５０ｍｌで順次溶出した成分を捨て、次のヘキサン−エーテル（７５：２５）  １５０ｍｌで溶出する成分を取り、減圧濃縮機を用いて溶剤を除去し、コレステロール画分３１ｍｇを得た。この画分をクロロホルムに溶解し、化学発光検出器および質量分析装置（Ｍａｒｉｎｅｒ  ＥＳＩ／ＴＯＦ−ＭＳ）を備えた高速液体クロマトグラフィー（カラムとして逆相ＯＤＳシリカカラムを装着）に供した。その結果を図２に示した。尚、化合物２ｂの生成は、ＥＳＩ／ＴＯＦ−ＭＳにより、［Ｍ−Ｃ２Ｈ５ＯＨ］＋  ｍ／ｚ  ４３４，  ［Ｍ−Ｃ２Ｈ５ＯＨ−Ｈ２Ｏ］＋  ｍ／ｚ  ４１６が得られたことからも支持された。また実施例２において記述した方法で合成した化合物２ｂを用いて検量線を作成し、この検量線に基づいてコレステロール画分中の化合物２ｂの含量を求めた結果、およそ４ｍｇであった。
【００８９】
このように、アルコールを含むオゾン水で蓄養した牡蠣などの魚介類の内臓中に本発明の脂質ヒドロペルオキシドが生成し、かつ上記蓄養方法が施されたことを容易に証明できることがわかった。
【００９０】
【発明の効果】
本発明により、安価で安定性の高い脂質ヒドロペルオキシドおよびステロールヒドロペルオキシドの測定用標準物質の提供が可能となった。かかる標準物質は特に食品および生体に作用し、各種疾病に関与する物質の定量評価用物質として有用である。また、本発明により、これらの物質を含む医薬組成物並びに機能性を有する食品および飲料、蓄養魚介類が提供され、さらに、該物質を魚介類の内臓中に生成させるための蓄養方法並びに食料品中の該物質の検知方法が提供された。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の脂質ヒドロペルオキシド測定用標準物質を用いて作成した検量線を示すグラフ。
【図２】本発明の魚介類の蓄養方法により得られた物質の化学発光強度および質量分析結果を示すグラフ。
【図１】
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【図２】
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