【誤訳訂正書】
【提出日】平成24年7月2日(2012.7.2)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
汚染物質を含むことが疑わしい培地中の汚染物質を検出する方法であって、以下の連続工程：ａ）既知容量の前記培地を、フィルター機器中においてフィルターを通して流入側から流出側へ通過させることによって、フィルター機器中においてフィルターの流入側で汚染物質を濃縮する工程と、ｂ）フィルター機器中においてフィルターの流入側を少なくとも１つの基質を含む液体ビヒクルに接触させる工程であって、前記少なくとも１つの基質が汚染物質中に存在する酵素との相互作用により検出可能な成分を生じさせる工程と、ｃ）フィルター機器中においてフィルターの流入側で、検出可能な成分を液体ビヒクル中で検出させるのに十分なある時間間隔の間、基質を汚染物質と相互作用させる工程と、ｄ）液体ビヒクルを、この液体を押し通すことによって、フィルターの流入側からフィルターの流出側に排出させる工程と、ｅ）工程ｄ）で排出された液体ビヒクル中の検出可能な成分を定量的または定性的に検出し、成分の検出を試料中の汚染物質の量または存在に相関させる工程とを含む方法。
【請求項２】
工程ａの前に、培地を、汚染物質を保持しないがより大きな粒子を保持するプレフィルターに通す請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記汚染物質は、細菌；真菌類；藻類；原生動物；細菌からの胞子；真菌胞子；ならびに花粉およびその断片からなる群より選択される請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記真菌は、糸状菌およびイーストから選択される請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記培地は液体培地である請求項１ないし４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記液体培地は、環境水、飲料水、温水、工業水、工程水、その場での洗浄水、固体材料の液体抽出物、懸濁化または可溶化表面の試料、および液体工業製品からなる群より選択される請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記液体培地は液体工業製品であり、前記液体工業製品は化粧品、医薬品、および食品から選択される請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記液体培地の粘度を、工程ａの前に下げる請求項５ないし７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記粘度を、希釈または化学薬品による処理によって下げる請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記化学薬品は溶解促進剤および洗剤から選択される請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記培地は気体培地である請求項１ないし４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記気体培地は空気である請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記空気は、無菌施設からの空気、層流空気流機器からの空気および環境の空気から選択されるものである請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記フィルターは、培地中の全ての汚染物質を保持するのに十分小さいポアサイズを有する請求項１ないし１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記フィルターは、検出可能な成分にこのフィルターを通過させるのに十分大きいポアサイズを有する請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ポアサイズは最大で２０μｍである請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ポアサイズは少なくとも０．１μｍである請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記少なくとも１つの基質は、汚染物質に存在する酵素によって開裂することにより、検出可能な成分を生成する請求項１ないし１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記酵素は、カルボヒドラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、エステラーゼ、アミダーゼ、スルファターゼ、ヌクレアーゼおよびフォスファターゼからなる群より選択される請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記酵素はフォスファターゼであり、前記フォスファターゼはアルカリフォスファターゼである請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記酵素は、微生物によって構成的に発現される請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記少なくとも１つの基質は、検出可能な成分として青色、緑色および赤色の蛍光生成物または発光生成物をそれぞれ生成する蛍光発生基質または発色基質である請求項１８ないし２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記少なくとも１つの基質は、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート  ジナトリウム塩；９ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン−７−イル）ホスフェート  アンモニウム塩；フルオレセインジホスフェート  テトラアンモニウム塩；メチルウンベリフェリル誘導体；４−ニトロフェニルホスフェートの塩；ならびにルソルフィンホスフェートからなる群より選択される請求項１８ないし２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記メチルウンベリフェリル誘導体は、６，８−ジフルオロ−４−メチルウンベリフェリルホスフェート、４−メチルウンベリフェリルホスフェート  ジクロロヘキシルアンモニウム塩三水和物、４−メチルウンベリフェリルホスフェート遊離酸、４−メチルウンベリフェリルホスフェート  ジリチウム塩、４−メチルウンベリフェリル−β−Ｎ−アセチルグルコサミニド、およびトリフルオロメチルウンベリフェリルホスフェートから選択されるものである請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記検出可能な成分は、最大で１００ピコモルの量で検出可能である請求項１８ないし２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記検出可能な成分は、最大で５０ピコモルの量で検出可能である請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記検出可能な成分は、最大で２０ピコモルの量で検出可能である請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記検出可能な成分は、最大で１０ピコモルの量で検出可能である請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記検出可能な成分は、最大で１ピコモルの量で検出可能である請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
前記少なくとも１つの基質は、合わせて１つの単一測定信号値になる複数の信号を与える検出可能な複数の成分を生成する少なくとも２つの基質を含む請求項１ないし２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記少なくとも１つの基質は、区別できる複数の信号を与える検出可能な複数の成分を生成する少なくとも２つの基質を含む請求項１ないし２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記汚染物質が生育可能な微生物である請求項１ないし３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記液体ビヒクル中の基質の量は、前記検出可能な成分の生成速度を制限しない請求項１ないし３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記検出可能な成分の前記生成速度は、既知容量の培地中の汚染物質の量の関数である請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記関数は線形である請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
いくつかの異なる既知容量の培地を、各々、工程ａにおいてフィルターを通過させ、少なくとも１つの容量が好適な数の汚染物質を含むようにする請求項１ないし３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
前記フィルターは、クローズドな無菌フィルター機器の一部である請求項１ないし３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
前記クローズドな無菌フィルター機器は使い捨てできる請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記クローズドな無菌フィルター機器は、フィルターおよびフィルターハウジングを１つの不可逆的にクロ−ズドな構造ユニットに一体化する請求項３７または３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記クローズドな無菌フィルター機器の最長の断面軸は、１０ｃｍの長さを超えない請求項３７ないし３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
排出を、フィルターの流入側に高い圧力をかけるか、またはフィルターの流出側に低い圧力をかけることによって得る請求項１ないし４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
工程ｅにおける検出を、検出可能な成分の蛍光特性を測定することによって行う請求項１ないし４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
工程ｅにおける相関は、標準状態での汚染物質の量と検出可能な成分の量との関係を表す、予め決定された標準曲線の使用を含む請求項１ないし４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
検出をマイクロタイターシステムで行う請求項１ないし４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
汚染物質は、工程ａの前または工程ｂにおいて、信号を増強させる影響を受け、前記信号を増強させる影響は、酵素促進物質、選択的な温度または温度範囲、選択的なｐＨ、選択的な塩濃度、非選択的な成長促進剤、および選択的な成長促進物質から選択されるものである請求項１ないし４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
信号を増強させる影響は、その後の検出における全体の感度を増加させるか、特定の種類の汚染物質のその後の検出を有利にするか、特定の種類の汚染物質の検出を減少させる請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
工程ａの前に培地のインキュベーションを行う請求項１ないし４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
前記インキュベーションは、
−物質を誘導し、それによって検出可能な成分の検出を促進する、酵素による処理、
−培地を、イースト、真菌または微生物に対する選択的な物質にさらすこと、
−培地を、微生物に対する非選択的な成長促進剤にさらすこと、および
−培地を、細胞の酵素を抽出できる物質にさらすこと
からなる群より選択される少なくとも１つを伴う請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
工程ｃにおいて、フィルターの流入側で、５分ないし２４時間の時間間隔の間、基質を汚染物質と相互作用させる請求項１ないし４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
前記間隔は２０分ないし１２時間である請求項４９に記載の方法。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００４７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００４７】
本発明に従って用いられる少なくとも１つの基質は、汚染物質に特異的な酵素によって分解される（または他の方法で化学的に変換される）ことにより、検出可能な成分を生成する。このことは、当該酵素が測定する目標である汚染物質中で生化学的に活性であることを意味する。本発明は全体の汚染の測定および汚染物質のあるサブセットまたは種による汚染の検出の両方を可能にすることに留意すべきである。第１の場合においては、系統的に保存された酵素、すなわち実質的にすべての生物学的な起源の汚染物質において、すなわちほとんどの生存しているまたは生育可能な微生物において、非常に均質な形態で存在する酵素または酵素活性によって変換される基質を用いるのが便利であろう。後者の場合においては、関連する汚染物質に対して非常に特異的な酵素によって変換される基質を用いることが便利であろう。ともかく、酵素は典型的には、カルボヒドラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、エステレアーゼ、アミダーゼ、スルファターゼ、ヌクレアーゼ、およびホスファターゼたとえばアルカリ性ホスファターゼからなる群より選択される。
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００４８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００４８】
好ましい実施形態においては、基質を処理する酵素は、微生物によって構造的に発現される。このことは、汚染物質中における酵素生産の誘導が不要になるという利点をもつ。さらにこれは、酵素活性の誘導が、誘導の制御を達成するのに困難であるかもしれないので、誤差および不安定性の原因になりうることを指摘することに関連している。
【誤訳訂正４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００４９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００４９】
それゆえ、本発明方法において用いることができる酵素は微生物／細菌の細胞中で自然に生成されるものを含み、本発明によれば、検出可能な酵素活性は、好ましくは、構成的に発現される、微生物標的個体数／細菌の全成長段階で発現される、および／または微生物標的個体数／細菌の生理学的状態に独立して発現される活性である。酵素活性は細胞内および／または細胞外でよい。したがって、本方法は、基質を加水分解して標的微生物個体数／細菌の成長に必須の栄養成分を与える酵素から選択される酵素活性の検出および定量を含む。本発明の文脈において「必須の栄養成分」は、たとえばＢｒｏｃｋら、微生物の生物学、プレンティス−ホール社、イングルウッドクリフス、ニュージャージー州、アメリカにおいて定義されている栄養素を示す。したがって、必須の栄養成分はそれなしでは細胞が成長できない栄養素を含み、多量栄養素および微量栄養素を含む。したがって、本発明方法は炭水化物、タンパク質、リン酸および硫酸代謝に伴う微生物／細菌酵素の検出に基づくことができる。本方法の現在好ましい実施形態は、例からわかるように、微生物のホスファターゼ酵素の検出である。特に、リン酸エステル（第一および第二アルコール、糖アルコール、環式アルコール、フェノールおよびアミンのエステル［無機リン酸を放出する］を含む）の加水分解を含むリン酸代謝を伴うアルカリ性ホスファターゼの検出が興味深い。また、この酵素はポリリン酸エステルＰＰiを加水分解し、ＰＯ3-４基をＰＰiから（および多くのヌクレオシド  ジおよびトリホスフェートから、ならびにマンノース−６−ホスフェートから）グルコースへ転移し、グルコース−６−ホスフェートを形成する。例からわかるように、本発明によるアルカリ性ホスファターゼ活性の測定は微生物数のロバストな測定を与える。
【誤訳訂正５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００５６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００５６】
生育可能な微生物の信頼性のある測定を得るには、したがって上述した基質を選択して、生育可能な微生物に特異的な酵素によって変換されるものを用いるのがよい。１つの例は、代謝的に活性な微生物において高い代謝回転をもつ、構成的に発現される酵素であろう。