【手続補正書】
【提出日】平成24年7月20日(2012.7.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ
【化１】
2011513483.tif 000001
［式中、
Ｈｔは、
【化２】
2011513483.tif 000002
【化３】
2011513483.tif 000003
または
【化４】
2011513483.tif 000004
であり、
環Ｄは、フェニル、３〜８員単環式脂環式、１〜２個のヘテロ原子を含み、炭素環原子を介してピリジンまたはピリミジン環に結合している５〜８員単環式複素脂環式、アダマンチル、または８〜１０員二環式脂環式であり（ここで、このフェニル、複素脂環式、単環式、二環式または脂環式は所望により１〜２個の−Ｒ５で置換されていてもよい）；
ＲａはＨまたはハロゲンであり；
ＲｂはＨまたはＣ１−４アルキルであり；
ＲｃはＨまたはＣ１−４アルキルであり；
Ｚ１はＮまたはＣＨであり；
Ｚ３はＮまたはＣＲＺであり；
ＲＸはＨまたはＣ１−４アルキルであり；
ＲＹはＨ、ハロゲン、所望により１個のＲ１０で置換されていてもよい４〜８員単環式非芳香族ヘテロシクリル、または所望によりＮＲ１Ｒ２、１〜３個のハロ、−ＯＲで置換されていてもよいＣ１−４アルキル、またはＯ、ＮもしくはＳから選択される１〜２個のヘテロ原子を含み、所望により−Ｒ１０で置換されていてもよい４〜８員単環式非芳香族ヘテロシクリルであるか、または
ＲＸおよびＲＹは、それらが結合している原子と一体となってフェニル、６〜８員脂環式、またはＯ、ＮもしくはＳから選択される１〜２個のヘテロ原子を含む５〜８員単環式ヘテロシクリルを形成し；
ＲＺはＨまたはＣ１−４アルキルであり；
Ｒ１はＨまたはＣ１−４アルキルであり；
Ｒ２はＨまたは所望により−Ｒ１１で置換されていてもよいＣ１−４アルキルであり；
各Ｒ５は独立にＣ１−６アルキル、ハロＣ１−６アルキルまたはハロであり；
各Ｒ１０は独立にＣ１−６アルキル、ハロＣ１−６アルキル、ハロ、ＯＲ、Ｃ（＝Ｏ）Ｒ、ＣＯ２Ｒ、Ｓ（Ｏ）Ｒ、ＳＯ２Ｒ、ＳＲ、Ｎ（Ｒ４）２、ＣＯＮ（Ｒ４）２、ＳＯ２Ｎ（Ｒ４）２、ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ、Ｎ（Ｒ４）ＣＯＲまたはＮ（Ｒ４）ＣＯ２Ｒから選択され；
各Ｒ１１は独立にハロ、ＯＲ、Ｃ（＝Ｏ）Ｒ、ＣＯ２Ｒ、Ｎ（Ｒ４）２、ＣＯＮ（Ｒ４）２、ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ、Ｎ（Ｒ４）ＣＯＲまたはＮ（Ｒ４）ＣＯ２Ｒから選択され；
各Ｒ４は独立にＨ、Ｃ１−６アルキルまたはハロＣ１−６アルキルから選択され；かつ
各Ｒは独立にＨ、Ｃ１−６アルキルまたはハロＣ１−６アルキルから選択される］
の化合物またはその薬学上許容される塩を有効成分とする、ＧＳＫ−３介在症状の処置のための医薬組成物。
【請求項２】
式Ｉの化合物において、Ｈｔが
【化５】
2011513483.tif 000005
である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
Ｚ１がＮである、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
Ｚ１がＣＨである、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項５】
Ｒａがハロゲンである、請求項２〜４のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項６】
ＲａがＦである、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
式Ｉの化合物において、Ｈｔが
【化６】
2011513483.tif 000006
である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項８】
ＲｂがＨである、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
ＲｂがＣＨ３である、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
式Ｉの化合物において、Ｈｔが
【化７】
2011513483.tif 000007
である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
ＲｃがＨである、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
ＲｃがＣＨ３である、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
式Ｉの化合物において、環Ｄが所望により−Ｒ５で置換されていてもよいフェニルである、請求項１〜１２のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１４】
フェニルが−Ｒ５で置換されている、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
フェニルがピリジンまたはピリミジン環に対してオルト置換されている、請求項１３または１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
フェニルがハロゲンで置換されている、請求項１３〜１５のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１７】
フェニルがＣｌで置換されている、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
フェニルがＣ１−６アルキルで置換されている、請求項１３〜１５のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１９】
フェニルがＣＨ３で置換されている、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
フェニルがハロＣ１−６アルキルで置換されている、請求項１３〜１５のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項２１】
フェニルがＣＦ３で置換されている、請求項２０に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
式Ｉの化合物において、環Ｄが３〜８員単環式または８〜１０員二環式脂環式である（ここで、脂環式は所望により−Ｒ５で置換されていてもよい）、請求項１〜１２のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項２３】
環Ｄが３〜８員単環式脂環式である、請求項２２に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
環Ｄが８〜１０員二環式脂環式である、請求項２２に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
式Ｉの化合物において、環Ｄが５〜８員単環式複素環式である、請求項１〜１２のいずれかの医薬組成物。
【請求項２６】
環Ｄがテトラヒドロピラニルである、請求項２５に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
式Ｉの化合物において、環Ｄがアダマンチルである、請求項１〜１２のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項２８】
式Ｉの化合物において、ＲＹが所望によりＮＲ１Ｒ２で置換されていてもよいＣ１−４アルキルまたは所望により−Ｒ１０で置換されていてもよい４〜８員単環式非芳香族ヘテロシクリルで所望により置換されていてもよいＣ１−４アルキルである、請求項１〜２７のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項２９】
ＲＹがＣＨ３である、請求項２８に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
ＲＹが所望によりＮＲ１Ｒ２で置換されていてもよいエチルまたは所望により−Ｒ１０で置換されていてもよい４〜８員単環式非芳香族ヘテロシクリルで所望により置換されていてもよいエチルである、請求項２８に記載の医薬組成物。
【請求項３１】
ＲＹが−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＲ１Ｒ２である、請求項３０に記載の医薬組成物。
【請求項３２】
ＲＹが所望により−Ｒ１０で置換されていてもよい−ＣＨ２−ＣＨ２−（４〜８員単環式非芳香族ヘテロシクリル）である、請求項３０に記載の医薬組成物。
【請求項３３】
式Ｉの化合物において、ＲＸがＨまたはＣＨ３である、請求項１〜３２のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項３４】
ＲＸがＣＨ３である、請求項３３に記載の医薬組成物。
【請求項３５】
式Ｉの化合物において、ＲＸおよびＲＹが、それらが結合している原子と一体となってフェニルを形成する、請求項１〜２６のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項３６】
式Ｉの化合物において、ＲＸおよびＲＹが、それらが結合している原子と一体となって６〜８員脂環式を形成する、請求項１〜２６のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項３７】
式Ｉの化合物において、ＲＸおよびＲＹが、それらが結合している原子と一体となって５〜８員複素環を形成する、請求項１〜２６のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項３８】
該化合物が化合物Ｉ−１〜Ｉ−５５から選択される、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３９】
ＧＳＫ−３介在症状がex vivoまたはin vitro生体サンプルにおいてＧＳＫ３活性を阻害することにより処置される、請求項１〜３８のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項４０】
ＧＳＫ−３介在症状が糖尿病、骨粗鬆症、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、ＡＩＤＳ関連痴呆、双極性障害、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、統合失調症、白血球減少症、脳卒中、神経疾患、末梢神経再生および関節リウマチから選択される、請求項１〜３９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項４１】
該疾患が脳卒中である、請求項４０に記載の医薬組成物。
【請求項４２】
該疾患が糖尿病である、請求項４０に記載の医薬組成物。
【請求項４３】
該疾患が統合失調症である、請求項４０に記載の医薬組成物。
【請求項４４】
該疾患が双極性障害である、請求項４０に記載の医薬組成物。
【請求項４５】
該疾患が白血球減少症である、請求項４０に記載の医薬組成物。
【請求項４６】
該疾患が脳卒中、脊髄損傷、外傷性脳損傷、シャルコー・マリー・トゥース病および糖尿病性神経障害から選択される、請求項４０に記載の医薬組成物。
【請求項４７】
該疾患が脳卒中である、請求項４６に記載の医薬組成物。
【請求項４８】
虚血が起こった後に投与される、請求項４７に記載の医薬組成物。
【請求項４９】
糖尿病を処置するための薬剤、骨粗鬆症を処置するための薬剤、アルツハイマー病を処置するための薬剤、ハンチントン病を処置するための薬剤、パーキンソン病を処置するための薬剤、ＡＩＤＳ関連痴呆を処置するための薬剤、双極性障害を処置するための薬剤、筋萎縮性側索硬化症を処置するための薬剤、多発性硬化症を処置するための薬剤、統合失調症を処置するための薬剤、白血球減少症を処置するための薬剤、末梢神経再生を処置するための薬剤、脳卒中を処置するための薬剤および関節リウマチを処置するための薬剤から選択される付加的治療薬と併用することを特徴とし、
ａ）該付加的治療薬が処置される疾患に適当であり；
ｂ）該付加的治療薬が単一投与形として該化合物と共に、または複数投与形の一部として該化合物とは別に投与される、
請求項１〜４８のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項５０】
脊髄損傷を処置するための薬剤、外傷性脳損傷を処置するための薬剤、シャルコー・マリー・トゥース病を処置するための薬剤または糖尿病性神経障害を処置するための薬剤から選択される付加的治療薬と併用する、請求項４９に記載の医薬組成物。
【請求項５１】
ＧＳＫ−３酵素のセリン／トレオニンキナーゼ型よりもチロシン型の自己リン酸化を選択的に阻害する薬剤を有効成分として含む、ＧＳＫ−３介在症状の処置のための請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項５２】
薬剤が請求項１〜３８のいずれかに記載の式Ｉの化合物から選択される、請求項５１に記載の医薬組成物。
【請求項５３】
ＧＳＫ−３介在症状が脳卒中後、脊髄損傷、外傷性脳損傷、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、糖尿病性神経障害、シャルコー・マリー・トゥース病、白血球減少症、糖尿病、末梢神経再生または骨粗鬆症である、請求項５１または５２に記載の医薬組成物。
【請求項５４】
ＧＳＫ−３介在症状が脳卒中後である、請求項５３に記載の医薬組成物。
【請求項５５】
ＧＳＫ−３酵素のセリン／トレオニンキナーゼ型よりもチロシン型の自己リン酸化を選択的に阻害する薬剤を有効成分として含む、ニューロン細胞の軸策および樹状分枝を増加させるための請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項５６】
薬剤が請求項１〜３８のいずれかに記載の式Ｉの化合物から選択される、請求項５５に記載の医薬組成物。
【請求項５７】
ＧＳＫ−３酵素のセリン／トレオニンキナーゼ型よりもチロシン型の自己リン酸化を選択的に阻害する薬剤を有効成分として含む、神経可塑性を促進するための請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項５８】
薬剤が請求項１〜３８のいずれかに記載されている式Ｉの化合物から選択される、請求項５７に記載の医薬組成物。
【請求項５９】
ＧＳＫ−３酵素のセリン／トレオニンキナーゼ型よりもチロシン型の自己リン酸化を選択的に阻害する薬剤を有効成分として含む、脈管形成を促進するための請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項６０】
薬剤が請求項１〜３８のいずれかに記載されている式Ｉの化合物から選択される、請求項５９に記載の医薬組成物。
【請求項６１】
ＧＳＫ−３酵素のセリン／トレオニンキナーゼ型よりもチロシン型の自己リン酸化を選択的に阻害する薬剤を有効成分として含む、神経発生を促進するための請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項６２】
薬剤が請求項１〜３８に記載されている式Ｉの化合物から選択される、請求項６１に記載の医薬組成物。
【請求項６３】
ＧＳＫ−３酵素のセリン／トレオニンキナーゼ型よりもチロシン型の自己リン酸化を選択的に阻害する薬剤を有効成分として含む、神経精神障害を処置するための請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項６４】
薬剤が請求項１〜３８のいずれかに記載されている式Ｉの化合物から選択される、請求項６３に記載の医薬組成物。
【請求項６５】
神経精神障害が躁病または鬱病である、請求項６３または６４に記載の医薬組成物。
【請求項６６】
ＧＳＫ−３介在症状の処置に有用な化合物を同定するための方法であって、１以上の試験化合物についてＧＳＫ−３酵素のセリン／トレオニンキナーゼ型に対するチロシンの自己リン酸化の量を測定することを含む、方法。
【請求項６７】
ＧＳＫ−３介在症状の処置に有用な化合物を同定するための方法であって、
ＧＳＫ−３酵素のチロシンの自己リン酸化の量を測定すること、および
β−カテニンのリン酸化の量を測定すること
を含む、方法。
【請求項６８】
測定のステップが、試験化合物に対するβ−カテニンのＩＣ５０値を得ること、ＧＳＫ−３αまたはＧＳＫ３β  ｐ−ＴＹＲのＩＣ５０値を決定すること、およびβ−カテニンのＩＣ５０値をＧＳＫ−３αまたはＧＳＫ３β  ｐ−ＴＹＲのＩＣ５０値で割ることを含む、請求項６６または６７に記載の方法。
【請求項６９】
ニューロン細胞の軸策および樹状分枝を増加させるのに有用な化合物を同定するための方法であって、１以上の試験化合物についてＧＳＫ−３酵素のセリン／トレオニンキナーゼ型に対するチロシン型の自己リン酸化の量を測定することを含む、方法。
【請求項７０】
ニューロン細胞の軸策および樹状分枝を増加させるのに有用な化合物を同定するための方法であって、
ＧＳＫ−３酵素のチロシンの自己リン酸化の量を測定すること、および
β−カテニンのリン酸化の量を測定すること
を含む、方法。
【請求項７１】
測定のステップが、試験化合物に対するβ−カテニンのＩＣ５０値を得ること、ＧＳＫ−３αまたはＧＳＫ３β  ｐ−ＴＹＲのＩＣ５０値を決定すること、およびβ−カテニンのＩＣ５０値をＧＳＫ−３αまたはＧＳＫ３β  ｐ−ＴＹＲのＩＣ５０値で割ることを含む、請求項６９または７０に記載の方法。
【請求項７２】
ＧＳＫ−３αまたはＧＳＫ３β  ｐ−ＴＹＲのＩＣ５０に対するβ−カテニンのＩＣ５０の比が約１０またはそれ以上を示す化合物を同定することをさらに含む、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記比が約３０またはそれ以上である、請求項７１に記載の方法。
【請求項７４】
ＧＳＫ−３酵素のセリン／トレオニンキナーゼ型よりもチロシン型の自己リン酸化を選択的に阻害する薬剤を有効成分として含む、脳卒中後の回復を提供するための請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項７５】
薬剤が請求項１〜３８のいずれかに記載されている式Ｉの化合物から選択される、請求項７４に記載の医薬組成物。
【請求項７６】
虚血中または虚血直後に投与される、請求項７４または７５に記載の医薬組成物。
【請求項７７】
虚血中または虚血直後および虚血後約６か月の期間投与される、請求項７６に記載の医薬組成物。
【請求項７８】
さらに理学療法を併用する、請求項７４〜７７のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項７９】
化合物Ｉ−３９ないし化合物Ｉ−５５から選択される化合物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５１】
本明細書において「保護基」は、多官能性化合物の１以上の所望の反応性部分を一時的に遮断するために用いられる薬剤を意味する。特定の実施形態において、保護基は以下の特徴の１以上、または好ましくは全てを有する：ａ）良好な収率で官能基に選択的に付加され、保護された基質が得られること、ｂ）１以上の他の反応性部位で起こる反応に対して安定であること；およびｃ）再生され、脱保護された官能基を攻撃しない試薬により、良好な収率で選択的に除去可能であること。保護基の例は、Greene, T.W., Wuts, P. G in “Protective Groups in Organic Synthesis”, Third Edition, John Wiley & Sons, New York: 1999（およびこの書籍の他の版）に詳細に示されており、この全内容は出典明示により本明細書の一部とされる。本明細書において「窒素保護基」とは、多官能性化合物の１以上の所望の窒素反応性部位を一時的に遮断するために用いられる薬剤を意味する。好ましい窒素保護基はまた上記で例示された特徴を有し、特定の窒素保護基例もGreene, T.W., Wuts, P. G in “Protective Groups in Organic Synthesis”, Third Edition, John Wiley & Sons, New York: 1999の第７章に詳細に示されており、この全内容は出典明示により本明細書の一部とされる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１４】
実施例７：ＧＳＫ−３阻害アッセイ
本発明の化合物を、標準的な結合酵素系を用い、それらのＧＳＫ−３β（ＡＡ  １−４２０）活性阻害能に関してスクリーニングした(Fox et al., Protein Sci. 1998, 7, 2249)。１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２５ｍＭ  ＮａＣｌ、３００μＭ  ＮＡＤＨ、１ｍＭ  ＤＴＴおよび１．５％ＤＭＳＯを含有する溶液で反応を行った。アッセイにおける最終基質濃度は２０μＭ  ＡＴＰ(Sigma Chemicals, St Louis, MO)および３００μＭペプチド(American Peptide, Sunnyvale, CA)であった。反応を３０℃、２０ｎＭ  ＧＳＫ−３βで行った。この結合酵素系の成分の終濃度は２．５ｍＭピルビン酸ホスホエノール、３００μＭ  ＮＡＤＨ、３０μｇ／ｍｌピルビン酸キナーゼおよび１０μｇ／ｍｌ乳酸デヒドロゲナーゼであった。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３６】
実施例１２：ＨＵＶＥＣおよび皮膚線維芽細胞を用いた脈管形成のin vitroモデル
神経可塑性に加え、新しい血管の形成である脈管形成も、脳卒中などの脳損傷からの帰納的回復に関与している可能性がある。ＧＳＫ−３の役割は、成熟の段階に応じて内皮前駆細胞（ＥＰＣ）の増殖と分化の双方の駆動に関連づけられている。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２４６】
この試験では、５−ＦＵ（骨髄破壊薬）で処理した後の末梢血および骨髄細胞の造血回復を評価し、種々の用量の試験化合物と回復を促進することが知られているサイトカインｒｈＧ−ＣＳＦの回復を比較する。化学療法薬の導入は、末梢血白血球数、特に、好中球数に低下をもたらす。さらに、大腿細胞数により評価される骨髄の細胞充実度に顕著な低下が見られる。５−ＦＵは全ての分裂細胞を死滅させ、比較的休止している始原幹細胞を助け、従って、処置により影響を受けないことで働く。処置の後、始原細胞は増殖および分化、従って通常の末梢血および大腿細胞数の回復に動員される。このモデルは、始原細胞の動員および増殖を促進可能な化合物を評価するため、および血液中の骨髄ならびに成熟細胞集団（白血球、赤血球および血小板）の回復速度を評価するために使用可能である。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２７６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２７６】
動物を１日２０〜３０分、最低１０日間、または５０％ヒットの基準に達するまで訓練する（注：これは両肢を合わせて５０％である）。ほとんどのラットはリーチのためにもっぱら利き足を用いる傾向にある。ラットが訓練１４日以内に５０％ヒットの基準に達しなければ、そのラットは試験から除外する。さらに、両利きであると思われるラットも試験から除外する。両利きのラットはリーチにどちらかの足を用いるか、またはどちらの足でも同等の成功率で同等の到達を見せることが多い。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３０７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３０７】
これらの細胞を室温で３０分間、ブロッキングバッファーとともにインキュベートする。次に、組織を室温で１時間、ブロッキングバッファーとともにインキュベートする。１°抗体をＰＢＳ＋０．１％  Ｔｗｅｅｎ＋５％ロバ血清で希釈する。ブロッキング溶液を除去し、ブロッキングバッファー中十分な量の１次抗体を加えて細胞を覆う。１次抗体を４℃で一晩インキュベートする。翌日、１次抗体を除去し、カバーガラスをＰＢＳ−Ｔで２回洗浄し、各洗浄の間に５分のインキュベーションを行う。ＰＢＳ−Ｔを除去し、ブロッキングバッファーを加える。細胞を３０分間インキュベートする。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３０９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３０９】
分析
正立顕微鏡にて１０倍と２０倍で画像を取り込み、軸索分枝は、細胞当たりのｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ  Ａｌｅｘａ  ４８８の閾値蛍光下面積の定量により測定する。樹状分枝は、細胞当たりのＭＡＰ２  Ａｌｅｘａ  ５６８の閾値蛍光下面積の定量により測定する。あるいは、分枝は細胞当たりの分岐点を手で数えることにより測定することもできる。化合物の効果は、化合物処理培養物における閾値蛍光下面積と同じ時点でのＤＭＳＯ対照を比較することにより評価する。