【手続補正書】
【提出日】平成24年6月8日(2012.6.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）誘導能を有するペプチドであって、
(a) ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、２、４、２１、２５、２９、３２、３５、３７、４０、４９、５３、５５、５６、５７、６２、６３、６７、７５、８５、９９、１０１、１１１、１１４、１２１、１２５、１３０、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４５、１４８および１５０；または
（b）１個、２個、または数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失、または付加されている、 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、２、４、２１、２５、２９、３２、３５、３７、４０、４９、５３、５５、５６、５７、６２、６３、６７、７５、８５、９９、１０１、１１１、１１４、１２１、１２５、１３０、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４５、１４８および１５０
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、ペプチド。
【請求項２】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、２、４、２１、２５、２９、３２、３５、３７、４０、４９、５３、５５、５６、５７、６２、６３ および６７からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むペプチドが、以下の特徴の一方または両方を有する、請求項１記載のペプチド：
（a）該ＳＥＱ ＩＤ ＮＯのアミノ酸配列のＮ末端から２番目のアミノ酸が、フェニルアラニン、チロシン、メチオニン、およびトリプトファンからなる群より選択されるアミノ酸であるかまたはその群より選択されるアミノ酸に改変されている、および
（b）該ＳＥＱ ＩＤ ＮＯのアミノ酸配列のＣ末端のアミノ酸が、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、およびメチオニンからなる群より選択されるか、またはその群より選択されるアミノ酸に改変されている。
【請求項３】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８５、９９、７５、１０１、１１１、１１４、１２１、１２５、１３０、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４５、１４８および１５０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むペプチドが、以下の特徴の一方または両方を有する、請求項１記載のペプチド：
（a）該ＳＥＱ ＩＤ ＮＯのアミノ酸配列のN末端から２番目のアミノ酸がロイシンもしくはメチオニンからなる群より選択されるアミノ酸である、またはその群より選択されるアミノ酸に改変されている、および
（b）該ＳＥＱ ＩＤ ＮＯのアミノ酸配列のC末端のアミノ酸がバリンもしくはロイシンからなる群より選択されるアミノ酸である、またはその群より選択されるアミノ酸に改変されている。
【請求項４】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、８５、９９、２、４、２１、２５、２９、３２、３５、３７、４０、４９、５３、５５、５６、５７、６２、６３、６７、７５、１０１、１１１、１１４、１２１、１２５、１３０、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４５、１４８および１５０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むノナペプチドまたはデカペプチドである、請求項２または３記載のペプチド。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項記載のペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６】
以下からなる群より選択される目的のために製剤化される、薬理学的に許容される担体と組み合わされた、請求項１〜４の１種もしくは複数種のペプチド、またはそのようなペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む薬学的組成物：
（ｉ）腫瘍の治療、
（ｉｉ）腫瘍の予防、
（ｉｉｉ）腫瘍の術後再発の予防、および
（ｉｖ）それらの組み合わせ。
【請求項７】
ＨＬＡ抗原がＨＬＡ−Ａ２４またはＨＬＡ−Ａ０２である対象への投与のために製剤化されている、請求項６記載の薬学的組成物。
【請求項８】
がんの治療のために製剤化されている、請求項７記載の薬学的組成物。
【請求項９】
ワクチンを含む、請求項８記載の薬学的組成物。
【請求項１０】
請求項１〜４のいずれか一項記載のペプチドとＨＬＡ抗原とを組み合わせて含む複合体をその表面上に提示するエキソソーム。
【請求項１１】
ＨＬＡ抗原がＨＬＡ−Ａ２４である、請求項１０記載のエキソソーム。
【請求項１２】
ＨＬＡ抗原がＨＬＡ−Ａ２４０２である、請求項１１記載のエキソソーム。
【請求項１３】
ＨＬＡ抗原がＨＬＡ−Ａ０２である、請求項１０記載のエキソソーム。
【請求項１４】
ＨＬＡ抗原がＨＬＡ−Ａ０２０１である、請求項１３記載のエキソソーム。
【請求項１５】
請求項１〜４のいずれか一項記載のペプチドを用いることによる、高いＣＴＬ誘導能を有する抗原提示細胞をインビトロで誘導するための方法。
【請求項１６】
請求項１〜４のいずれか一項記載のペプチドを用いることによる、ＣＴＬをインビトロで誘導するための方法。
【請求項１７】
請求項１５記載の高いＣＴＬ誘導能を有する抗原提示細胞（ＡＰＣ）をインビトロで誘導するための方法であって、以下からなる群より選択される段階を含む方法：
（ａ）ＡＰＣを、請求項１〜４のいずれか一項記載のペプチドと、インビトロで接触させる段階；および
（ｂ）請求項１〜４記載のいずれか一項記載のペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子を、ＡＰＣに導入する段階。
【請求項１８】
請求項１６記載のＣＴＬをインビトロで誘導するための方法であって、以下からなる群より選択される段階を含む方法：
（ａ）ＣＤ８陽性Ｔ細胞を、請求項１５または１７記載の方法によって調整されたＡＰＣと混合し、共培養する段階、および
（ｂ）請求項１〜４のいずれか一項記載のペプチドに結合するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）サブユニットポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子を、Ｔ細胞に導入する段階。
【請求項１９】
請求項１〜４記載のペプチドのいずれかを標的とする、単離された細胞傷害性T細胞。
【請求項２０】
請求項１〜４のいずれか一項記載のペプチドを用いることによって誘導される、単離された細胞傷害性T細胞。
【請求項２１】
請求項１６または１８記載の方法によって誘導される、請求項１９または２０記載の細胞傷害性T細胞。
【請求項２２】
ＨＬＡ抗原と請求項１〜４のいずれか一項記載のペプチドとの複合体をその表面上に提示する、単離された抗原提示細胞。
【請求項２３】
請求項１５または請求項１７記載の方法によって誘導される、請求項２２記載の抗原提示細胞。
【請求項２４】
請求項１〜４のいずれか一項記載のペプチド、免疫学的に活性なその断片、またはそのようなペプチドもしくは断片をコードするポリヌクレオチドを含むワクチンを含む、がんに対する免疫誘導剤。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
上記に加え、本発明のその他の目的および特徴は、添付の図面および実施例と併せて以下の詳細な説明を読むことによって、より十分に明らかになるであろう。しかしながら、前述の本発明の概要および以下の詳細な説明はいずれも例示的な態様であり、本発明または本発明のその他の代替的な態様を限定するものではないことが理解されるべきである。特に、本明細書において本発明はいくつかの特定の態様を参照しながら説明されるが、その説明は本発明を例証するものであり、本発明を限定するものとして構成されていないことが理解されよう。添付の特許請求の範囲によって記載される本発明の精神および範囲から逸脱することなく、当業者は様々な変更および適用に思い至ることができる。同様に、本発明のその他の目的、特徴、利益、および利点は、本概要および以下に記載する特定の態様から明らかになると考えられ、当業者には容易に明白であろう。そのような目的、特徴、利益、および利点は、添付の実施例、データ、図面、およびそれらから引き出されるすべての妥当な推論と併せて上記から、単独で、または本明細書に組み入れられる参考文献を考慮して、明らかになるであろう。
[本発明1001]
細胞傷害性Ｔ細胞誘導能を有する単離されたノナペプチドまたはデカペプチドであって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：154のアミノ酸配列より選択されるアミノ酸配列を含む、ノナペプチドまたはデカペプチド。
[本発明1002]
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：2、4、7、21、25、29、32、35、37、40、49、53、55、56、57、62、63、67、75、85、99、101、111、114、121、125、130、139、140、141、142、143、145、148および150からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、本発明1001のノナペプチドまたはデカペプチド。
[本発明1003]
細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）誘導能を有するペプチドであって、
(a) ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：2、4、7、21、25、29、32、35、37、40、49、53、55、56、57、62、63、67、75、85、99、101、111、114、121、125、130、139、140、141、142、143、145、148および150；または
（b）1個、2個、または数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失、または付加されている、 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：2、4、7、21、25、29、32、35、37、40、49、53、55、56、57、62、63、67、75、85、99、101、111、114、121、125、130、139、140、141、142、143、145、148および150
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、ペプチド。
[本発明1004]
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：2、4、7、21、25、29、32、35、37、40、49、53、55、56、57、62、63 および67からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むペプチドが、以下の特徴の一方または両方を有する、本発明1003のペプチド：
（a）該ＳＥＱ ＩＤ ＮＯのアミノ酸配列のＮ末端から2番目のアミノ酸が、フェニルアラニン、チロシン、メチオニン、およびトリプトファンからなる群より選択されるアミノ酸であるかまたはその群より選択されるアミノ酸に改変されている、および
（b）該ＳＥＱ ＩＤ ＮＯのアミノ酸配列のＣ末端のアミノ酸が、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、およびメチオニンからなる群より選択されるか、またはその群より選択されるアミノ酸に改変されている。
[本発明1005]
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：75、85、99、101、111、114、121、125、130、139、140、141、142、143、145、148および150からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むペプチドが、以下の特徴の一方または両方を有する、本発明1003のペプチド：
（a）該ＳＥＱ ＩＤ ＮＯのアミノ酸配列のN末端から2番目のアミノ酸がロイシンもしくはメチオニンからなる群より選択されるアミノ酸である、またはその群より選択されるアミノ酸に改変されている、および
（b）該ＳＥＱ ＩＤ ＮＯのアミノ酸配列のC末端のアミノ酸がバリンもしくはロイシンからなる群より選択されるアミノ酸である、またはその群より選択されるアミノ酸に改変されている。
[本発明1006]
以下からなる群より選択される目的のために製剤化される、薬理学的に許容される担体と組み合わされた、本発明1001〜1005の1種もしくは複数種のペプチド、またはそのようなペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む薬学的組成物：
（ｉ）腫瘍の治療、
（ｉｉ）腫瘍の予防、
（ｉｉｉ）腫瘍の術後再発の予防、および
（ｉｖ）それらの組み合わせ。
[本発明1007]
ＨＬＡ抗原がＨＬＡ−Ａ24またはＨＬＡ−Ａ02である対象への投与のために製剤化されている、本発明1006の薬学的組成物。
[本発明1008]
がんの治療のために製剤化されている、本発明1007の薬学的組成物。
[本発明1009]
ワクチンを含む、本発明1008の薬学的組成物。
[本発明1010]
本発明1001〜1005のいずれかのペプチドとＨＬＡ抗原とを組み合わせて含む複合体をその表面上に提示するエキソソーム。
[本発明1011]
ＨＬＡ抗原がＨＬＡ−Ａ24である、本発明1010のエキソソーム。
[本発明1012]
ＨＬＡ抗原がＨＬＡ−Ａ2402である、本発明1010のエキソソーム。
[本発明1013]
ＨＬＡ抗原がＨＬＡ−Ａ02である、本発明1010のエキソソーム。
[本発明1014]
ＨＬＡ抗原がＨＬＡ−Ａ0201である、本発明1010のエキソソーム。
[本発明1015]
本発明1001〜1005のいずれかのペプチドを用いることによる、高いＣＴＬ誘導能を有する抗原提示細胞を誘導するための方法。
[本発明1016]
本発明1001〜1005のいずれかのペプチドを用いることによる、ＣＴＬを誘導するための方法。
[本発明1017]
本発明1001〜1005のいずれかのペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子を、抗原提示細胞に導入する段階を含む、本発明1015の高いＣＴＬ誘導能を有する抗原提示細胞を誘導するための方法。
[本発明1018]
本発明1001〜1005のペプチドのいずれかを標的とする、単離された細胞傷害性T細胞。
[本発明1019]
本発明1001〜1005のいずれかのペプチドを用いることによって誘導される、単離された細胞傷害性T細胞。
[本発明1020]
ＨＬＡ抗原と本発明1001〜1005のいずれかのペプチドとの複合体をその表面上に提示する、単離された抗原提示細胞。
[本発明1021]
本発明1015または本発明1017の方法によって誘導される、本発明1020の抗原提示細胞。
[本発明1022]
本発明1001〜1005のいずれかのペプチド、免疫学的に活性なその断片、またはそのようなペプチドもしくは断片をコードするポリヌクレオチドを含むワクチンを対象に投与する段階を含む、対象においてがんに対する免疫応答を誘導する方法。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
【図１Ａ】図１Ａおよび図１Ｂは、一連の写真（ａ）〜（ｓ）を含み、ＩＱＧＡＰ３由来のペプチドによって誘導されたＣＴＬについてのＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を示している。ＩＱＧＡＰ３−Ａ２４−９−９５５ (ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２) (ａ)によって刺激されたウェル番号＃３および＃６、ＩＱＧＡＰ３−Ａ２４−９−１１６７ (ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４) (ｂ)による＃５、ＩＱＧＡＰ３−Ａ２４−９−７７９  (ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７) (ｃ)による＃７、ＩＱＧＡＰ３−Ａ２４−９−７４ (ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１) (ｄ)による＃２、ＩＱＧＡＰ３−Ａ２４−９−２６ (ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５) (ｅ)による＃８、ＩＱＧＡＰ３−Ａ２４−９−１３７ (ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９) (ｆ)による＃４、ＩＱＧＡＰ３−Ａ２４−９−６３ (ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２) (ｇ)による＃８、ＩＱＧＡＰ３−Ａ２４−１０−１６００ (ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５) (ｈ)による＃８、ＩＱＧＡＰ３−Ａ２４−１０−１５０７ (ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７) (ｉ)による＃２、ＩＱＧＡＰ３−Ａ２４−１０−１３９ (ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０) (ｊ)による＃２、ＩＱＧＡＰ３−Ａ２４−１０−１０９７ (ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９) (ｋ)による＃５、ＩＱＧＡＰ３−Ａ２４−１０−３４５ (ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３) (ｌ)による＃７、ＩＱＧＡＰ３−Ａ２４−１０−１６１４ (ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５) (ｍ)による＃１、ＩＱＧＡＰ３−Ａ２４−１０−１９１ (ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６) (ｎ)による＃３、ＩＱＧＡＰ３−Ａ２４−１０−３１４ (ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７) (ｏ)による＃５、ＩＱＧＡＰ３−Ａ２４−１０−１３６３ (ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２) (ｐ)による＃５、ＩＱＧＡＰ３−Ａ２４−１０−１１１４ (ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３) (ｑ)による＃７ならびにＩＱＧＡＰ３−Ａ２４−１０−１２０７ (ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６７) (ｒ)による＃２のＣＴＬは、それぞれ対照と比較して強力なＩＦＮ−γ産生能を示した。対照的に、ペプチドパルスした標的細胞に対して、ＩＱＧＡＰ３−Ａ２４−９−４１７ (ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６)で刺激したＣＴＬからは、特異的なＩＦＮ−γ産生は検出されなかった（ｓ）。長方形の囲みで示したウェル中の細胞を増殖させて、ＣＴＬ株を樹立した。図中、「＋」は、適切なペプチドをパルスした標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示し、「−」は、いずれのペプチドもパルスしていない標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示す。図中においては、「＋」はウェルの中の細胞が適当なペプチドでパルスされたことを示し、「−」は細胞がペプチドによってパルスされなかったことを示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、図１Ａの続きである。
【図２Ａ】図２Ａ、ＢおよびＣは、一連の折れ線グラフ（ａ）〜（ｓ）を含み、ＩＦＮ−γＥＬＩＳＡアッセイによる、様々なＩＱＧＡＰ３ペプチド即ちＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２（ａ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４（ｂ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７（ｃ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１（ｄ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５（ｅ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９（ｆ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２（ｇ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５（ｈ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７（ｉ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０（ｊ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９（ｋ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３（ｌ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５（ｍ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６（ｎ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７（ｏ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２（ｐ）、ＳＥＱ  ＩＤ ＮＯ：６３（ｑ）およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６７（ｒ）によって刺激を受けたＣＴＬ株の樹立を示している。結果から、各ペプチドによる刺激によって樹立されたＣＴＬ株は、対照と比較して強力なＩＦＮ−γ産生を示したことが実証される。対照的に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６によって樹立されたＣＴＬ株からは、ペプチドパルス標的細胞に対する特異的なＩＦＮ−γの産生は観察されなかった（ｓ）。図中、「＋」は、適切なペプチドをパルスした標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示し、「−」は、いずれのペプチドもパルスしていない標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは図２Ａの続きである。
【図２Ｃ】図２Ｃは図2Bの続きである。
【図３】図３は、ＩＱＧＡＰ３およびＨＬＡ−Ａ*２４０２を外因的に発現する標的細胞に対する特異的なＣＴＬ活性を示す折れ線グラフである。ＨＬＡ−Ａ*２４０２遺伝子または全長のＩＱＧＡＰ３遺伝子をトランスフェクションしたＣＯＳ７細胞を対照として調製した。ＩＱＧＡＰ３−Ａ２４−９−７７９ (ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７)で樹立されたＣＴＬ株は、ＩＱＧＡＰ３およびＨＬＡ−Ａ*２４０２の双方をトランスフェクションしたＣＯＳ７細胞に対して特異的なＣＴＬ活性を示した（黒い菱形）。対照的に、ＨＬＡ−Ａ*２４０２（三角）またはＩＱＧＡＰ３（丸）のいずれかを発現する標的細胞に対して特異的な有意なＣＴＬ活性は検出されなかった。
【図４Ａ】図４Ａおよび図４Ｂは、一連の写真（ａ）〜（ｒ）からなり、ＩＱＧＡＰ３由来のペプチドによって誘導されたＣＴＬについてのＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を示している。ＩＱＧＡＰ３−Ａ０２−９−１４６ (ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７５) (ａ)によって刺激されたウェル番号＃６、ＩＱＧＡＰ３−Ａ０２−９−５５３ (ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８５) (ｂ)による＃６、ＩＱＧＡＰ３−Ａ０２−９−７５６ (ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０１) (ｃ)による＃１、ＩＱＧＡＰ３−Ａ０２−１０−９６１ (ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１) (ｄ)による＃７、ＩＱＧＡＰ３−Ａ０２−１０−７０ (ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１４) （ｅ）による＃７、ＩＱＧＡＰ３−Ａ０２−１０−１１７４ (ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２１)（ｆ）による＃５、ＩＱＧＡＰ３−Ａ０２−１０−５４８(ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２５)（ｇ）による＃８、ＩＱＧＡＰ３−Ａ０２−１０−９０３(ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３０)（ｈ）による＃１、ＩＱＧＡＰ３−Ａ０２−１０−９５３ (ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３９) （ｉ）による＃２、ＩＱＧＡＰ３−Ａ０２−１０−１５９０ (ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４０) （ｊ）による＃２、ＩＱＧＡＰ３−Ａ０２−１０−１４２４ (ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４１) （ｋ）による＃２、ＩＱＧＡＰ３−Ａ０２−１０−４１６ (ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４２) (ｌ)による＃２、ＩＱＧＡＰ３−Ａ０２−１０−６７ (ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４３) (ｍ)による＃４、ＩＱＧＡＰ３−Ａ０２−１０−１４６１ (ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４５) (ｎ)による＃６、ＩＱＧＡＰ３−Ａ０２−１０−８４２ (ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４８) (ｏ）による＃５、ＩＱＧＡＰ３−Ａ０２−１０−８９７ (ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５０) （ｐ）による＃３、ならびにＩＱＧＡＰ３−Ａ０２−９−１２３４ (ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９９) (q)による＃５ のＣＴＬは、対照に比して各々強力なＩＦＮ−γ産生能を示した。対照的に、ＩＱＧＡＰ３−Ａ０２−１０−８６８ (ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１３)によって刺激を受けたＣＴＬからは、ペプチドをパルスした標的細胞に対する特異的なＩＦＮ−γ産生は認められなかった（ｒ）。長方形で囲んで示されるウェルの細胞を増殖させ、ＣＴＬ株を樹立した。図中、「＋」は適当なペプチドをパルスした標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示し、「−」はいずれのペプチドをもパルスしていない標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示す。図中において「＋」はウェルの中の細胞が適当なペプチドでパルスされたことを示し、「−」は細胞がペプチドによってパルスされなかったことを示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは図４Ａの続きである。
【図５Ａ】図５Ａおよび図５Ｂは、一連の折れ線グラフ（ａ）〜（ｑ）を含み、ＩＦＮ−γＥＬＩＳＡアッセイにより検出された、様々なＩＱＧＡＰ３ペプチド即ちＩＱＧＡＰ３−Ａ０２−９−１４６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７５）（ａ）、ＩＱＧＡＰ３−Ａ０２−９−５５３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８５）（ｂ）、ＩＱＧＡＰ３−Ａ０２−９−７５６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０１）（ｃ）、ＩＱＧＡＰ３−Ａ０２−１０−９６１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１）（ｄ）、ＩＱＧＡＰ３−Ａ０２−１０−７０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１４）（ｅ）、ＩＱＧＡＰ３−Ａ０２−１０−１１７４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２１）（ｆ）、ＩＱＧＡＰ３−Ａ０２−１０−５４８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２５）（ｇ）、ＩＱＧＡＰ３−Ａ０２−１０−９０３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３０）（ｈ）、ＩＱＧＡＰ３−Ａ０２−１０−９５３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３９）（ｉ）、ＩＱＧＡＰ３−Ａ０２−１０−１５９０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４０）（ｊ）、ＩＱＧＡＰ３−Ａ０２−１０−１４２４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４１）（ｋ）、ＩＱＧＡＰ３−Ａ０２−１０−４１６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４２）（ｌ）、ＩＱＧＡＰ３−Ａ０２−１０−６７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４３）（ｍ）、ＩＱＧＡＰ３−Ａ０２−１０−１４６１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４５）（ｎ）、ＩＱＧＡＰ３−Ａ０２−１０−８４２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４８）（ｏ）、ＩＱＧＡＰ３−Ａ０２−１０−８９７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５０）（ｐ）およびＩＱＧＡＰ３−Ａ０２−９−１２３４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９９）（ｑ）によって刺激を受けたＣＴＬ株のＩＦＮ−γ産生を示している。結果から、各ペプチドによって刺激を受けたＣＴＬ株は、対照と比して強力なＩＦＮ−γ産生を示したことが実証される。図中において「＋」は適当なペプチドをパルスした標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示し、「−」はいずれのペプチドをもパルスしていない標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは図５Ａの続きである。
【図５Ｃ】図５Ｃは図５Ｂの続きである。
【図６】図６は、一連の折れ線グラフ（ａ）〜（ｆ）からなり、様々なＩＱＧＡＰ３ペプチド即ちＩＱＧＡＰ３−Ａ０２−９−１４６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７５）（ａ）、ＩＱＧＡＰ３−Ａ０２−９−５５３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８５）（ｂ）、ＩＱＧＡＰ３−Ａ０２−１０−１１７４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２１）（ｃ）、ＩＱＧＡＰ３−Ａ０２−１０−９０３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３０）（ｄ）、ＩＱＧＡＰ３−Ａ０２−１０−６７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４３）（ｅ）およびＩＱＧＡＰ３−Ａ０２−１０−１４６１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４５）（ｆ）により刺激を受けたＣＴＬ株から限界希釈法によって樹立されたＣＴＬクローンのＩＦＮ−γ産生を示している。結果から、ＩＱＧＡＰ３−Ａ０２−９−１４６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７５）（ａ）、ＩＱＧＡＰ３−Ａ０２−９−５５３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８５）（ｂ）、ＩＱＧＡＰ３−Ａ０２−１０−１１７４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２１）（ｃ）、ＩＱＧＡＰ３−Ａ０２−１０−９０３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３０）（ｄ）、ＩＱＧＡＰ３−Ａ０２−１０−６７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４３）（ｅ）およびＩＱＧＡＰ３−Ａ０２−１０−１４６１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４５）（ｆ）による刺激によって樹立されたＣＴＬクローンは、対照と比して強力なＩＦＮ−γ産生を示したことが実証される。図中において「＋」はＩＱＧＡＰ３−Ａ０２−９−１４６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７５）（ａ）、ＩＱＧＡＰ３−Ａ０２−９−５５３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８５）（ｂ）、ＩＱＧＡＰ３−Ａ０２−１０−１１７４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２１）（ｃ）、ＩＱＧＡＰ３−Ａ０２−１０−９０３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３０）（ｄ）、ＩＱＧＡＰ３−Ａ０２−１０−６７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４３）（ｅ）およびＩＱＧＡＰ３−Ａ０２−１０−１４６１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４５）（ｆ）をパルスした標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示し、「−」はいずれのペプチドをもパルスしていない標的細胞に対するＩＦＮ−γ産生を示す。
【図７】図７は、ＩＱＧＡＰ３およびＨＬＡ−Ａ*０２０１を外因的に発現する標的細胞に対する特異的なＣＴＬ活性を示す折れ線グラフである。ＨＬＡ−Ａ*０２０１遺伝子または全長ＩＱＧＡＰ３遺伝子をトランスフェクションしたＣＯＳ７細胞を対照として調製した。ＩＱＧＡＰ３−Ａ０２−９−５５３ (ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８５) (ａ)およびＩＱＧＡＰ３−Ａ０２−９−１２３４ (ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９９) （ｂ)によって樹立したＣＴＬクローンは、ＩＱＧＡＰ３およびＨＬＡ−Ａ*０２０１の双方をトランスフェクションしたＣＯＳ７細胞に対する特異的なＣＴＬ活性を示した（黒い菱形）。一方、ＨＬＡ−Ａ*０２０１（三角）またはＩＱＧＡＰ３（丸）のいずれかを発現する標的細胞に対して特異的な有意なＣＴＬ活性は検出されなかった。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０７】
インビトロでのＣＴＬ誘導
単球由来の樹状細胞（ＤＣ）を抗原提示細胞（ＡＰＣ）として用いて、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）上に提示されたペプチドに対する細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答を誘導した。他所に記載されているように、ＤＣをインビトロで作製した（Nakahara S et al., Cancer Res 2003 Jul 15, 63(14): 4112-8）。具体的には、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐｌａｑｕｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）溶液によって健常なボランティア（ＨＬＡ−Ａ*２４０２陽性またはＨＬＡ−Ａ*０２０１陽性）から単離した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、プラスチック製の組織培養ディッシュ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）へ付着させることによって分離し、それらを単球画分として濃縮した。２％の加熱非働化した自己血清（ＡＳ）を含むＡＩＭ−Ｖ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で、１０００ Ｕ／ｍｌの顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ）および１０００ Ｕ／ｍｌのインターロイキン（ＩＬ）−４（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ）の存在下で、単球が濃縮した集団を培養した。培養７日後、サイトカインで誘導したＤＣに、ＡＩＭ−Ｖ培地中で３時間、３７℃にて、３ ｍｃｇ／ｍｌのβ２−ミクログロブリンの存在下で２０ ｍｃｇ／ｍｌの各合成ペプチドをパルスした。作製した細胞は、その細胞表面上に、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、およびＨＬＡクラスＩＩなどのＤＣ関連分子を発現しているようであった（データは示さず）。次いで、ペプチドパルスしたこれらのＤＣを、マイトマイシンＣ（ＭＭＣ）で不活化し（３０ ｍｃｇ／ｍｌで３０分間）、ＣＤ８ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｄｙｎａｌ）を用いた陽性選択によって得られた自己ＣＤ８＋ Ｔ細胞と１：２０の比率で混合した。これらの培養物を４８ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中に準備し；各ウェルは、０．５ ｍｌのＡＩＭ−Ｖ／２％ ＡＳ培地中に、１．５×１０４個のペプチドパルスしたＤＣ、３×１０５個のＣＤ８＋ Ｔ細胞、および１０ ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ）を含んだ。３日後、これらの培養物に、ＩＬ−２（ＣＨＩＲＯＮ）を最終濃度２０ ＩＵ／ｍｌまで補充した。７日目および１４日目に、ペプチドパルスした自己ＤＣでＴ細胞をさらに刺激した。該ＤＣは上記と同じ方法によって毎回調製した。２１日目に、３回目のペプチド刺激後、ペプチドパルスしたＡ２４ＬＣＬ細胞またはＴ２細胞に対してＣＴＬを試験した（Tanaka H et al., Br J Cancer 2001 Jan 5, 84(1): 94-9;Umano Y et al., Br J Cancer 2001 Apr 20, 84(8): 1052-7;Uchida N et al., Clin Cancer Res 2004 Dec 15, 10(24): 8577-86;Suda T et al., Cancer Sci 2006 May, 97(5): 411-9;Watanabe T et al., Cancer Sci 2005 Aug, 96(8): 498-506）。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２３】
ＨＬＡ−Ａ*０２０１拘束性ＩＱＧＡＰ３由来の予測されたペプチドを用いたＣＴＬの誘導
ＩＱＧＡＰ３に由来するペプチドに対するＣＴＬを、「材料および方法」に記載したプロトコールに従って作製した。ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって、ペプチド特異的なＣＴＬ活性を測定した（図４ａ〜ｑ）。結果は、ＩＱＧＡＰ３−Ａ０２−９−１４６ (ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７５) (ａ)によって刺激されたウェル番号＃６ＩＱＧＡＰ３−Ａ０２−９−５５３ (ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８５) (ｂ)による＃６、ＩＱＧＡＰ３−Ａ０２−９−７５６ (ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０１) (ｃ）による＃１、ＩＱＧＡＰ３−Ａ０２−１０−９６１ (ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１) (ｄ）による＃７、ＩＱＧＡＰ３−Ａ０２−１０−７０ (ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１４) (ｅ）による＃７ＩＱＧＡＰ３−Ａ０２−１０−１１７４ (ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２１) (ｆ）による＃５、ＩＱＧＡＰ３−Ａ０２−１０−５４８ (ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２５) (ｇ）による＃８、ＩＱＧＡＰ３−Ａ０２−１０−９０３ (ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３０) (ｈ）による＃１、ＩＱＧＡＰ３−Ａ０２−１０−９５３ (ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３９) (ｉ）による＃２、ＩＱＧＡＰ３−Ａ０２−１０−１５９０ (ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４０) (ｊ）による＃２、ＩＱＧＡＰ３−Ａ０２−１０−１４２４ (ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４１) (ｋ）による＃２、ＩＱＧＡＰ３−Ａ０２−１０−４１６ (ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４２) (ｌ）による＃２、ＩＱＧＡＰ３−Ａ０２−１０−６７ (ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４３) (ｍ）による＃４、ＩＱＧＡＰ３−Ａ０２−１０−１４６１ (ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４５) (ｎ）による＃６、ＩＱＧＡＰ３−Ａ０２−１０−８４２ (ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４８) (ｏ）による＃５、ＩＱＧＡＰ３−Ａ０２−１０−８９７ (ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５０) (ｐ）による＃３、ならびにＩＱＧＡＰ３−Ａ０２−９−１２３４ (ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９９)（ｑ）による＃５が、対照ウェルと比較して強力なＩＦＮ−γ産生を示したことを示す。一方、表２に示された他のペプチドによる刺激によっては、それらのペプチドがＨＬＡ−Ａ*０２０１に対する潜在的な結合活性を有していたにも関わらず、強力なＩＦＮ−γ産生は全く検出できなかった。典型的なネガティブデータとして、ＩＱＧＡＰ３−Ａ０２−１０−８６８ (ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１３) によって刺激したＣＴＬからは、ペプチドをパルスした標的細胞に対する特異的なＩＦＮ−γ産生は全く認められなかった (ｒ)。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２４】
ＩＱＧＡＰ３ペプチド特異的なＣＴＬ株およびＣＴＬクローンの樹立
ＩＱＧＡＰ３−Ａ０２−９−１４６ (ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７５) (ａ)によって刺激したウェル番号＃６ＩＱＧＡＰ３−Ａ０２−９−５５３ (ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８５) (ｂ）による＃６、ＩＱＧＡＰ３−Ａ０２−９−７５６ (ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０１) (ｃ）による＃１、ＩＱＧＡＰ３−Ａ０２−１０−９６１ (ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１) (ｄ）による＃７、ＩＱＧＡＰ３−Ａ０２−１０−７０ (ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１４) (ｅ）による＃７ＩＱＧＡＰ３−Ａ０２−１０−１１７４ (ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２１) (ｆ）による＃５、ＩＱＧＡＰ３−Ａ０２−１０−５４８ (ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２５) (ｇ）による＃８、ＩＱＧＡＰ３−Ａ０２−１０−９０３ (ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３０) (ｈ）による＃１、ＩＱＧＡＰ３−Ａ０２−１０−９５３ (ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３９) (ｉ）による＃２、ＩＱＧＡＰ３−Ａ０２−１０−１５９０ (ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４０) (ｊ）による＃２、ＩＱＧＡＰ３−Ａ０２−１０−１４２４ (ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４１) (ｋ）による＃２、ＩＱＧＡＰ３−Ａ０２−１０−４１６ (ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４２) (ｌ）による＃２、ＩＱＧＡＰ３−Ａ０２−１０−６７ (ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４３)（ｍ）による＃４、ＩＱＧＡＰ３−Ａ０２−１０−１４６１ (ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４５)（ｎ）による＃６、ＩＱＧＡＰ３−Ａ０２−１０−８４２ (ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４８) (ｏ）による＃５、ＩＱＧＡＰ３−Ａ０２−１０−８９７ (ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５０) (ｐ）による＃３ならびにＩＱＧＡＰ３−Ａ０２−９−１２３４ (ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９９) による＃５における、ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって検出されたペプチド特異的なＣＴＬ活性を示した細胞を増殖させ、ＣＴＬ株を樹立した。ＩＦＮ−γＥＬＩＳＡアッセイによって、それらのＣＴＬ株のＣＴＬ活性を決定した（図５ａ〜ｑ）。全てのＣＴＬ株が、ペプチドをパルスしていない標的細胞と比較して、対応するペプチドをパルスした標的細胞に対する強力なＩＦＮ−γ産生を示すことが示された。さらに、ＣＴＬ株からの限界希釈法によってＣＴＬクローンを樹立し、ＩＦＮ−γＥＬＩＳＡアッセイによってペプチドをパルスした標的細胞に対するＣＴＬクローンからのＩＦＮ−γ産生を測定した。図６において示されるように、ＩＱＧＡＰ３−Ａ０２−９−１４６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７５）（ａ）、ＩＱＧＡＰ３−Ａ０２−９−５５３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８５）（ｂ）、ＩＱＧＡＰ３−Ａ０２−１０−１１７４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２１）（ｃ）、ＩＱＧＡＰ３−Ａ０２−１０−９０３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３０）（ｄ）、ＩＱＧＡＰ３−Ａ０２−１０−６７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４３）（ｅ）およびＩＱＧＡＰ３−Ａ０２−１０−１４６１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４５）（ｆ）で刺激されたＣＴＬクローンからは強力なＩＦＮ−γ産生が測定された。