【手続補正書】
【提出日】平成26年2月10日(2014.2.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単一の核酸テンプレートと複数のプライマー対とを含む微小液滴であって、各プライマー対は、異なるターゲット部位に特異的であり、前記微小液滴内の一つのみのプライマー対が、前記テンプレートに結合する、微小液滴。
【請求項２】
前記液滴内で生産されたアンプリコンにハイブリダイズする複数のプローブをさらに含む、請求項１に記載の微小液滴。
【請求項３】
前記単一の核酸テンプレートがＤＮＡまたはＲＮＡである、請求項１に記載の微小液滴。
【請求項４】
ポリメラーゼ連鎖反応を行うための試薬をさらに含む、請求項１に記載の微小液滴。
【請求項５】
前記複数のプローブの構成員が検出可能標識を含有する、請求項２に記載の微小液滴。
【請求項６】
前記複数のプローブが、様々な濃度のプローブの１つ以上の群を含む、請求項６に記載の微小液滴。
【請求項７】
前記プローブの１つ以上の群の構成員それぞれが、同じ検出可能標識を含む、請求項６に記載の微小液滴。
【請求項８】
前記複数のプローブの構成員それぞれが、異なる検出可能標識を含む、請求項５に記載の微小液滴。
【請求項９】
前記検出可能標識が蛍光標識である、請求項５に記載の微小液滴。
【請求項１０】
ターゲット核酸を分析するための方法であって、
単一ターゲット核酸と１つ以上の増幅試薬とを含有する液滴を形成する工程；
前記液滴内の前記ターゲットを増幅する工程；
前記ターゲットからのアンプリコンと、ポリメラーゼエラーにより生じた前記ターゲットの変異体からのアンプリコンとを含有する液滴を、二つの別様に標識されたハイブリダイゼーションプローブを用いて識別する工程であって、一つは前記ターゲットにハイブリダイズし、一つは前記ターゲットの特異的変異体にハイブリダイズする、工程；および
ターゲットアンプリコンを分析する工程
を含む方法。
【請求項１１】
前記増幅する工程が、ポリメラーゼ連鎖反応であり、および前記１つ以上の増幅試薬が、１つ以上のプライマー対を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記識別する工程が、前記液滴をマイクロ流体チャネル内に流す工程を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記分析する工程が、検出可能に標識されたプローブへのハイブリダイゼーションにより前記アンプリコンを検出する工程を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記分析する工程が、前記識別する工程で識別されなかった液滴からのアンプリコンに対して行われる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記形成する工程が、
核酸を含む第一のサンプル流体のストリームを、流れているキャリア流体の２つの対向するストリームを交差するように流し、それによって、前記第一のサンプル流体を含む複数の第一の液滴を形成する工程であって、前記キャリア流体は前記サンプル流体と不混和性である、工程と；および
前記第一のサンプル流体を含む複数の第一の液滴のそれぞれと、１つ以上の増幅試薬を含む第二の流体の部分とを合体させる工程であって、前記第二の流体の部分は場合により液滴である、工程と
を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
前記キャリア流体が油である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記油が界面活性剤を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記界面活性剤がフッ素系界面活性剤である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記分析する工程が、
野生型ターゲットのみを含有する液滴の数を決定する工程；
前記ターゲットの変異体のみを含有する液滴の数を決定する工程
を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項２０】
前記変異体のみを含有する液滴の存在が疾患の指標となる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記疾患が癌である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記変異体が対立遺伝子変異体である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記対立遺伝子変異体が一塩基多型である、請求項２２に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
他の態様において、本発明は、一般に、患者における癌の再発を検出するための方法を
提供する。これらの方法は、患者のサンプルから採取した単一のターゲット核酸を含有す
るサンプル液滴を形成すること、前記サンプル液滴を、チャネルを通して流すこと、前記
液滴内の前記ターゲットを増幅すること、前記液滴内の増幅されたターゲットを検出する
こと、アンプリコンの不均一集団を含む液滴を排除すること、および排除されなかった液
滴を分析して再発の指標となる突然変異体対立遺伝子を決定することを含み得る。一定の
実施形態において、前記分析工程は、標識された捕捉プローブを使用して前記液滴から得
られたアンプリコンを捕捉することを含む。前記サンプルは、ヒト組織または体液であり
得る。例示的体液は、膿、痰、精液、尿、血液、唾液、糞便および脳脊髄液である。本発
明の他の態様では、低レベルのターゲット核酸を多数の他の核酸源を有する環境で法医学
的に同定する方法を一般に提供する。そのような方法を、液滴以外にまたは液滴に加えて
容器内で区画された流体を使用して実施することもできる。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
単一の核酸テンプレートと前記テンプレート上の複数のターゲット部位に特異的な複数
のプライマー対とを含む微小液滴。
（項目２）
前記液滴内で生産されたアンプリコンにハイブリダイズする複数のプローブをさらに含
む、項目１に記載の微小液滴。
（項目３）
前記単一の核酸テンプレートがＤＮＡまたはＲＮＡである、項目１に記載の微小液滴
。
（項目４）
ポリメラーゼ連鎖反応を行うための試薬をさらに含む、項目１に記載の微小液滴。
（項目５）
前記複数のプローブの構成員が検出可能標識を含有する、項目２に記載の微小液滴。
（項目６）
前記複数のプローブが、様々な濃度のプローブの１つ以上の群を含む、項目６に記載
の微小液滴。
（項目７）
前記プローブの１つ以上の群の構成員それぞれが、同じ検出可能標識を含む、項目６
に記載の微小液滴。
（項目８）
前記複数のプローブの構成員それぞれが、異なる検出可能標識を含む、項目５に記載
の微小液滴。
（項目９）
前記検出可能標識が蛍光標識である、項目５に記載の微小液滴。
（項目１０）
生体サンプル中の複数のターゲットを検出するための方法であって、
ａ）単一の核酸テンプレート、およびそれぞれが前記テンプレート上の複数のターゲッ
ト部位に特異的なプライマー対とプローブの不均一混合物をそれぞれが含む、１つ以上の
微小液滴を形成する工程；
ｂ）前記１つ以上の微小液滴内の前記核酸テンプレートを増幅する工程；および
ｃ）前記１つ以上の微小液滴を分析する工程
を含む方法。
（項目１１）
前記形成工程が、
ａ）単一の核酸テンプレートを含む第一の流体を供給すること；
ｂ）それぞれが前記テンプレート上の複数のターゲット部位に特異的な複数のプライマ
ーおよび複数のプローブを含む第二の流体を供給すること；
ｃ）前記第一の流体と前記第二の流体を合体させて、前記単一の核酸テンプレートおよ
びプライマー対とプローブの不均一混合物を含む液滴を形成すること
を含む、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記第一の流体および前記第二の流体が、前記流体に対する電場の存在下で合体される
、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記第一の流体および前記第二の流体が微小液滴である、項目１１に記載の方法。
（項目１４）
前記第二の流体が、ポリメラーゼ連鎖反応を行うための試薬をさらに含む、項目１１
に記載の方法。
（項目１５）
前記単一の核酸テンプレートがＤＮＡまたはＲＮＡである、項目１０に記載の方法。
（項目１６）
前記分析工程が、前記１つ以上の微小液滴内の前記複数のターゲットの存在または不在
を検出することを含む、項目１０に記載の方法。
（項目１７）
前記複数のプローブの構成員が、検出可能標識を含有する、項目１０に記載の方法。
（項目１８）
前記複数のプローブが、様々な濃度のプローブの１つ以上の群を含む、項目１７に記
載の微小液滴。
（項目１９）
前記プローブの１つ以上の群の構成員それぞれが、同じ検出可能標識を含む、項目１
８に記載の微小液滴。
（項目２０）
前記複数のプローブの構成員それぞれが、異なる検出可能標識を含む、項目１７に記
載の微小液滴。
（項目２１）
前記検出可能標識が蛍光標識である、項目１７に記載の微小液滴。
（項目２２）
ターゲット核酸を分析するための方法であって、
単一ターゲット核酸と１つ以上の増幅試薬とを含有する液滴を形成する工程；
前記液滴内の前記ターゲットを増幅する工程；
前記ターゲットからのアンプリコンおよび前記ターゲットの変異体からのアンプリコン
とを含有する液滴を排除する工程；および
ターゲットアンプリコンを分析する工程
を含む方法。
（項目２３）
前記増幅工程が、ポリメラーゼ連鎖反応であり、および前記１つ以上の増幅試薬が、１
つ以上のプライマー対を含む、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記排除工程が、前記液滴をマイクロ流体チャネル内に流すことを含む、項目２２に
記載の方法。
（項目２５）
前記分析工程が、検出可能に標識されたプローブへのハイブリダイゼーションにより前
記アンプリコンを検出することを含む、項目２２に記載の方法。
（項目２６）
前記分析工程が、前記排除工程で排除されなかった液滴からのアンプリコンに対して行
われる、項目２２に記載の方法。
（項目２７）
前記形成工程が、
核酸を含む第一のサンプル流体のストリームを、流れているキャリア流体の２つの対向
するストリームを交差するように流し、それによって、前記第一のサンプル流体を含む複
数の第一の液滴を形成することであって、前記キャリア流体は前記サンプル流体と不混和
性である、形成すること；および
前記第一のサンプル流体を含む複数の第一の液滴のそれぞれと、１つ以上の増幅試薬を
含む第二の流体の部分とを合体させることであって、前記第二の流体の部分は場合により
液滴である、合体させること
を含む、項目２２に記載の方法。
（項目２８）
前記キャリア流体が油である、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
前記油が界面活性剤を含む、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
前記界面活性剤がフッ素系界面活性剤である、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
前記分析工程が、
野生型ターゲットのみを含有する液滴の数を決定すること；
前記ターゲットの変異体のみを含有する液滴の数を決定すること
を含む、項目２２に記載の方法。
（項目３２）
前記変異体のみを含有する液滴の存在が疾患の指標となる、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
前記疾患が癌である、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
前記変異体が対立遺伝子変異体である、項目３１に記載の方法。
（項目３５）
前記対立遺伝子変異体が一塩基多型である、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
核酸サンプルを加工するための方法であって、
１つの核酸ターゲットを含む液滴を得る工程；
前記液滴内の前記核酸を増幅する工程；および
アンプリコンの不均一集団を含む液滴を、アンプリコンの均一集団を含有する液滴から
分離する工程
を含む方法。
（項目３７）
患者における癌の再発を検出するための方法であって、
平均して各液滴が患者サンプルから採取された単一ターゲット核酸を含む、サンプル液
滴を形成する工程；
前記サンプル液滴を、チャネルを通して流す工程；
前記液滴内のターゲットを増幅する工程；
前記液滴内の増幅されたターゲットを検出する工程；
アンプリコンの不均一集団を含む液滴を排除する工程；および
排除されなかった液滴を分析して、再発の指標となる突然変異体対立遺伝子の存在を決
定する工程
を含む方法。
（項目３８）
前記形成工程が、
核酸を含むサンプル流体のストリームを、流れているキャリア流体の２つの対向するス
トリームを直行するように流すことであって、前記キャリア流体は前記サンプル流体と不
混和性である、流すこと
を含む、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
前記サンプルがヒト組織または体液である、項目３７に記載の方法。
（項目４０）
前記体液が、膿、痰、精液、尿、血液、唾液および脳脊髄液から成る群より選択される
、項目３９に記載の方法。
（項目４１）
前記分析工程が、標識された捕捉プローブを使用して前記液滴から得られたアンプリコ
ンを捕捉することを含む、項目３７に記載の方法。
（項目４２）
ターゲット核酸を分析するための方法であって、
各部分が単一ターゲット核酸を含有する複数の部分に第一の流体を区画化する工程；
前記部分中のターゲットを増幅する工程；
前記ターゲットからのアンプリコンおよび前記ターゲットの変異体からのアンプリコン
を含有する部分を排除する工程；および
ターゲットアンプリコンを分析する工程
を含む、方法。
（項目４３）
区画が、マイクロ流体デバイス内のチャンバを含む、項目４２に記載の方法。
（項目４４）
ターゲット核酸を分析するための方法であって、
単一ターゲット核酸を含有するサンプル液滴を形成する工程；
前記液滴内のターゲットを増幅する工程；
前記ターゲットからのアンプリコンおよび前記ターゲットの変異体からのアンプリコン
を含有する液滴を排除する工程；および
ターゲットアンプリコンを分析する工程
を含む、方法。
（項目４５）
前記第一の流体が第一の液滴内に含有され、および前記第二の流体がストリームの第一
の部分であり、ならびにさらに、工程（ｃ）が、前記第一の液滴を前記第一の部分と合体
させることを含む、項目１１に記載の方法。
（項目４６）
前記第二の流体が第一の液滴内に含有され、および前記第一の流体がストリームの第一
の部分であり、ならびにさらに、工程（ｃ）が、前記第一の液滴を前記第一の部分と合体
させることを含む、項目１１に記載の方法。