【手続補正書】
【提出日】平成26年9月19日(2014.9.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体における早期急性腎損傷（ＡＫＩ）の指標としてＡＫＩマーカーを使用する方法であって、
（ａ）前記被験体に由来する尿試料を、エキソソームについて濃縮するステップであって、前記濃縮するステップは、少なくとも１ステップの免疫精製を含む、ステップと、
（ｂ）前記エキソソーム内の前記ＡＫＩマーカーを検出および／または定量化するステップと
を含む、方法。
【請求項２】
前記免疫精製が、腎構造の表面において発現されるタンパク質の任意のドメインに対する抗体により実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記免疫精製が、腎構造の表面においてに発現されるタンパク質の細胞内ドメインに対する抗体により実施される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記免疫精製が、腎構造の表面においてに発現されるタンパク質の細胞外ドメインに対する抗体により実施される、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記免疫精製が、腎構造の表面において好ましくかつ/または示差的に発現されるタンパク質に対する抗体により実施される、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記免疫精製ステップのための前記抗体が、抗アクアポリン１（抗ＡＱＰ１）、抗アクアポリン２（抗ＡＱＰ２）、抗アクアポリン３（抗ＡＱＰ３）、抗ＮＫＣＣ２、抗ＮＨＥ−３、抗ＮａＰｉＩＩ抗体、およびこれらの組合せからなる群より選択される、請求項２〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記抗体が抗ＡＱＰ１である、請求項２〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記腎構造が、近位尿細管、遠位尿細管、集合管およびヘンレループからなる群より選択される、請求項２〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記腎構造が、近位尿細管である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記免疫精製の前に、前記尿をエキソソームについて濃縮するステップをさらに含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記尿試料が、脱細胞化された尿試料である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＡＫＩマーカーが、ＮＧＡＬ、シスタチン−３、ＫＩＭ−１、ＩＬ−１ベータ、ＩＬ−１８、およびこれらの組合せからなる群より選択される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＡＫＩマーカーが、ＮＧＡＬである、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記検出が、前記ＡＫＩマーカーに対する一次抗体との免疫反応により実施される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記一次抗体が標識されており、そして前記標識が、酵素、蛍光化合物、赤外化合物、放射性化合物、または化合物からなる群より選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＡＫＩマーカーを定量化するステップが、前記ＡＫＩマーカーのレベルを定量化することを含み、そして前記ステップが、前記被験体における処置を決定するために使用される、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
早期ＡＫＩを評価するためのキットであって、
（ａ）尿試料をエキソソームについて濃縮するための抗体と、
（ｂ）前記エキソソーム中の急性腎損傷（ＡＫＩ）マーカーを検出するための抗体と
を含む、キット。
【請求項１８】
（ｃ）尿試料を得るための手段をさらに含む、請求項１７に記載のキット。
【請求項１９】
尿試料をエキソソームについて濃縮するための前記抗体が、抗アクアポリン１（抗ＡＱＰ１）、抗アクアポリン２（抗ＡＱＰ２）、抗アクアポリン３（抗ＡＱＰ３）、抗ＮＫＣＣ２、抗ＮＨＥ−３、抗ＮａＰｉＩＩ、およびこれらの組合せからなる群より選択される、請求項１７または１８に記載のキット。
【請求項２０】
前記免疫精製の前に、前記尿試料を濃縮するための試薬をさらに含む、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２１】
前記ＡＫＩマーカーを検出するための前記抗体が、抗ＮＧＡＬ、抗シスタチン−３、抗ＫＩＭ−１、抗ＩＬ−１ベータ、抗ＩＬ−１８、およびこれらの組合せからなる群より選択される、請求項１７〜２０のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２２】
前記ＡＫＩマーカーを検出するための前記抗体が標識されている、請求項２１に記載のキット。
【請求項２３】
標識された二次抗体をさらに含む、請求項２１に記載のキット。
【請求項２４】
前記標識が、酵素、蛍光化合物、赤外化合物、放射性化合物、および化合物からなる群より選択される、請求項２２または２３に記載のキット。
【請求項２５】
前記キットを用いるための指示書をさらに含む、請求項１７〜２４のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２６】
尿中エキソソームを精製するための方法であって、
（ａ）尿試料を、腎構造の表面において発現されるタンパク質のドメインに対する抗体と共にインキュベートし、これにより、エキソソーム−抗体複合体を形成するステップと、
（ｂ）（ａ）から得られる前記エキソソーム−抗体複合体を、前記抗体を認識し、不溶性作用物質に結合しているタグと共にインキュベートし、これにより、エキソソーム−抗体−タグ−不溶性作用物質複合体を形成するステップと、
（ｃ）前記エキソソーム−抗体−タグ−不溶性作用物質複合体を上清から分離するステップと、
（ｄ）前記エキソソーム−抗体−タグ−不溶性作用物質複合体を緩衝液で洗浄するステップと
を含む、方法。
【請求項２７】
前記尿試料が、脱細胞化された尿試料である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記タンパク質が、腎構造の表面において好ましくかつ/または示差的に発現される、請求項２６または２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記腎構造が、近位尿細管、遠位尿細管、集合管およびヘンレループからなる群より選択される、請求項２６〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記腎構造が、近位尿細管である、請求項２６〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記抗体が、抗アクアポリン１（抗ＡＱＰ１）、抗アクアポリン２（抗ＡＱＰ２）、抗アクアポリン３（抗ＡＱＰ３）、抗ＮＫＣＣ２、抗ＮＨＥ−３、抗ＮａＰｉＩＩ、およびこれらの組合せからなる群より選択される、請求項２６〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記抗体が抗ＡＱＰ１である、請求項２６〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
尿中エキソソームを免疫精製するための方法であって、
腎構造の表面において好ましくかつ/または示差的に発現されるタンパク質の任意のドメインに対する抗体または抗体の組合せを使用するステップを含む、方法。
【請求項３４】
尿中エキソソームを免疫精製するための方法であって、
抗アクアポリン１（抗ＡＱＰ１）、抗アクアポリン２（抗ＡＱＰ２）、抗アクアポリン３（抗ＡＱＰ３）、抗ＮＫＣＣ２、抗ＮＨＥ−３、抗ＮａＰｉＩＩ、およびこれらの組合せからなる群より選択される抗体または抗体の組合せを使用するステップを含む、方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３５】
本発明の方法およびキットは、任意の被験体におけるモニタリング、診断、予後診断、および／または処置の決定のために用いることができる。特に、本発明の方法およびキットは、腎移植を受けた患者における、移植と関連する虚血−再灌流過程に起因する腎損傷の発症をモニタリングするのに有用である。本発明の方法およびキットはまた、ＡＫＩを発症し、早期の検出を必要とする可能性のある、集中治療室（ＩＣＵ）の患者におけるモニタリング、診断、予後診断、および／または処置の決定にも有用である。
例えば、本発明は、以下の項目を提供する：
（項目１）
早期における急性腎損傷をモニタリング、診断、および／または予後診断し、それを患う被験体における処置を決定するための方法であって、
（ａ）尿試料を提供するステップと、
（ｂ）少なくとも１つの免疫精製ステップを用いて、上記尿試料を、上記尿試料中に存在するエキソソームについて濃縮するステップと、
（ｃ）上記エキソソーム内の急性腎損傷（ＡＫＩ）マーカーを検出および／または定量化するステップと
を含む、方法。
（項目２）
上記免疫精製ステップが、異なる腎構造の表面において好ましくかつ示差的に発現されるタンパク質の細胞内ドメイン、細胞外ドメイン、または任意のドメインに対する抗体により実施される、項目１に記載の方法。
（項目３）
上記免疫精製ステップのための上記抗体が、抗アクアポリン１（抗ＡＱＰ１）、抗アクアポリン２（抗ＡＱＰ２）、および抗アクアポリン３（抗ＡＱＰ３）、抗ＮＫＣＣ２、抗ＮＨＥ−３、抗ＮａＰｉＩＩ抗体、またはこれらの組合せの中から選択される、項目２に記載の方法。
（項目４）
上記免疫精製ステップのための上記抗体が、アクアポリン１（ＡＱＰ１）、アクアポリン２（ＡＱＰ２）、アクアポリン３（ＡＱＰ３）、ＮＫＣＣ２、ＮＨＥ−３、およびＮａＰｉＩＩの任意のドメインに対する抗体である、項目３に記載の方法。
（項目５）
上記尿試料の、エキソソームについての上記濃縮が、上記免疫精製に先立ち、エキソソームについて濃縮するための少なくとも１つのさらなる手段を含む、項目４に記載の方法。
（項目６）
上記尿試料の、エキソソームについての濃縮のための上記さらなる手段が、遠心分離ステップ、微細濾過ステップ、またはこれらの組合せであり、これにより、脱細胞化された尿試料を生成させる、項目５に記載の方法。
（項目７）
上記遠心分離が、５０００〜１００００ｒｐｍで５〜３０分間にわたり実施される、項目６に記載の方法。
（項目８）
上記遠心分離ステップが、２段階で実施される、項目６または７に記載の方法。
（項目９）
第２の遠心分離ステップが、３００００〜４５０００ｒｐｍで３０〜１２０分間にわたり実施され、これにより、全エキソソーム画分を生成させる超遠心分離ステップである、項目８に記載の方法。
（項目１０）
上記微細濾過ステップが、最大０．２２マイクロメートルのマイクロフィルターを用い、これにより、脱細胞化された尿試料を生成させる、項目６に記載の方法。
（項目１１）
上記急性腎損傷マーカーが、ＮＧＡＬ、シスタチン−３、ＫＩＭ−１、ＩＬ−１ベータ、ＩＬ−１８、またはこれらの組合せの中から選択される、項目１に記載の方法。
（項目１２）
検出が、ＮＧＡＬ、シスタチン−３、ＫＩＭ−１、ＩＬ−１ベータ、ＩＬ−１８に対する一次抗体との免疫反応により実施される、項目１に記載の方法。
（項目１３）
上記一次抗体が標識されている、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
上記検出が、ＮＧＡＬ、シスタチン−３、ＫＩＭ−１、ＩＬ−１ベータ、ＩＬ−１８に対する上記一次抗体に対する標識された二次抗体を検出することにより実施される、項目１に記載の方法。
（項目１５）
上記抗体の標識が、酵素、蛍光化合物、赤外化合物、放射性化合物、化合物の中から選択される、項目１２または１３に記載の方法。
（項目１６）
モニタリング、診断、予後診断、および／または被験体における処置の決定のために、上記特異的腎損傷マーカーの存在および／またはレベルに基づき、上記被験体における上記急性腎損傷を評価するためのステップをさらに含む、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
早期における急性腎損傷を評価するためのキットであって、
（ａ）少なくとも１つの免疫精製ステップを用いて、尿試料をエキソソームについて濃縮するための手段と、
（ｂ）急性腎損傷（ＡＫＩ）マーカーを検出するための手段と
を含む、キット。
（項目１８）
（ｃ）尿試料を得るための手段をさらに含む、項目１７に記載のキット。
（項目１９）
上記免疫精製ステップのための抗体が、抗アクアポリン１（抗ＡＱＰ１）、抗アクアポリン２（抗ＡＱＰ２）、および抗アクアポリン３（抗ＡＱＰ３）、抗ＮＫＣＣ２、抗ＮＨＥ−３、抗ＮａＰｉＩＩ、またはこれらの組合せの中から選択される、項目１７に記載のキット。
（項目２０）
上記免疫精製ステップのための上記抗体が、アクアポリン１（ＡＱＰ１）、アクアポリン２（ＡＱＰ２）、アクアポリン３（ＡＱＰ３）、ＮＫＣＣ２、ＮＨＥ−３、およびＮａＰｉＩＩの任意のドメインに対する抗体である、項目１９に記載のキット。
（項目２１）
上記尿試料の、エキソソームについての上記濃縮が、上記免疫精製に先立ち、エキソソームについて濃縮するための少なくとも１つのさらなる手段を含む、項目２０に記載のキット。
（項目２２）
上記尿試料をエキソソームについて濃縮するための上記手段が、容器、試験管、遠心分離管、抗体、免疫反応緩衝液、ブロッキング剤もしくはブロッキング溶液、上記特異的腎損傷マーカーの原液、マイクロフィルター、上記抗体で覆われた９６ウェルプレート、またはこれらの組合せの中から選択される、項目２１に記載のキット。
（項目２３）
上記急性腎損傷マーカーを検出するための上記手段が、ＮＧＡＬ、シスタチン−３、ＫＩＭ−１、ＩＬ−１ベータ、ＩＬ−１８、またはこれらの組合せに対する抗体の中から選択される抗体である、項目１７に記載のキット。
（項目２４）
上記抗体が標識されている、項目２３に記載のキット。
（項目２５）
ＮＧＡＬ、シスタチン−３、ＫＩＭ−１、ＩＬ−１ベータ、ＩＬ−１８、またはこれらの組合せに対する一次抗体に対する標識された二次抗体をさらに含む、項目２３に記載のキット。
（項目２６）
上記抗体中の上記標識が、酵素、蛍光化合物、赤外化合物、放射性化合物、化合物の中から選択される、項目２４または２５に記載のキット。
（項目２７）
上記キットを用いるための指示書をさらに含む、項目２６に記載のキット。
（項目２８）
尿中エキソソームを精製するための方法であって、
（ａ）尿試料または場合によって、脱細胞化された尿試料を、異なる腎構造の表面において好ましくかつ示差的に発現されるタンパク質の細胞内ドメイン、細胞外ドメイン、または任意のドメインに対する抗体と共にインキュベートし、これにより、エキソソーム−抗体複合体を形成するステップと、
（ｂ）（ａ）から得られる上記エキソソーム−抗体複合体を、上記抗体の任意の領域を認識し、不溶性作用物質に結合しているタグと共にインキュベートし、これにより、エキソソーム−抗体−タグ−不溶性作用物質複合体を形成するステップと、
（ｃ）上記エキソソーム−抗体−タグ−不溶性作用物質複合体を上清から分離するステップと、
（ｄ）上記エキソソーム−抗体−タグ−不溶性作用物質複合体を適切な緩衝液で洗浄するステップと
を含む、方法。
（項目２９）
上記抗体が、抗アクアポリン１（抗ＡＱＰ１）、抗アクアポリン２（抗ＡＱＰ２）、および抗アクアポリン３（抗ＡＱＰ３）、抗ＮＫＣＣ２、抗ＮＨＥ−３、抗ＮａＰｉＩＩ、またはこれらの組合せの中から選択される、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
上記抗体が、アクアポリン１（ＡＱＰ１）、アクアポリン２（ＡＱＰ２）、アクアポリン３（ＡＱＰ３）、ＮＫＣＣ２、ＮＨＥ−３、およびＮａＰｉＩＩの任意のドメインに対する抗体である、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
異なる腎構造の表面において好ましくかつ示差的に発現されるタンパク質の細胞内ドメイン、細胞外ドメイン、または任意のドメインに対する抗体または抗体の組合せの使用であって、上記抗体が尿中エキソソームを免疫精製するための抗体である、使用。
（項目３２）
抗アクアポリン１（抗ＡＱＰ１）、抗アクアポリン２（抗ＡＱＰ２）、および抗アクアポリン３（抗ＡＱＰ３）、抗ＮＫＣＣ２、抗ＮＨＥ−３、抗ＮａＰｉＩＩ、またはこれらの組合せの中から選択される抗体または抗体の組合せの使用であって、上記抗体が尿中エキソソームを免疫精製するための抗体である、使用。
（項目３３）
アクアポリン１（ＡＱＰ１）、アクアポリン２（ＡＱＰ２）、アクアポリン３（ＡＱＰ３）、ＮＫＣＣ２、ＮＨＥ−３、およびＮａＰｉＩＩの任意のドメインに対する抗体または抗体の組合せの使用であって、上記抗体が尿中エキソソームを免疫精製するための抗体である、使用。