【手続補正書】
【提出日】平成25年12月10日(2013.12.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
発酵微生物を少なくとも１つ、キシラン含有バイオマスを少なくとも１つ、セルラーゼを少なくとも１つ、ヘミセルラーゼを少なくとも１つ、及び反転型β−キシロシダーゼを少なくとも１つ含む完全発酵培地を、発酵生成物の生成に好適な期間及び条件下で培養することを包含し、
前記発酵生成物がアルコールであり、
前記反転型β−キシロシダーゼがＧＨ４３ファミリー酵素であり、
前記完全発酵培地が、モル基準において、分子量基準において、又はモル基準及び分子量基準の両方において、保持型β−キシロシダーゼの量よりも多い反転型β−キシロシダーゼの量を含む、
同時糖化発酵（ＳＳＦ）の方法。
【請求項２】
前記完全発酵培地が、前記反転型β−キシロシダーゼを含まない対照発酵培地が生成する短鎖アルキル−β−キシロピラノシド（「ＡＸＰ」）の量よりも、前記完全発酵培地が生成するＡＸＰの量が少なくなるように、有効な量の前記反転型β−キシロシダーゼを含み、
任意に、前記完全発酵培地が、前記反転型β−キシロシダーゼを含まない対照発酵培地が生成するＡＸＰよりも前記完全発酵培地が生成するＡＸＰが少なくとも４０パーセント、少なくとも５０パーセント、少なくとも６０パーセント、又は少なくとも７０パーセント減少するように、生成する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＡＸＰが、メチル−β−キシロピラノシド（ＭＸＰ）、エチル−β−キシロピラノシド（ＥＸＰ）、プロピル−β−キシロピラノシド（ＰＸＰ）、又はブチル−β−キシロピラノシド（ＢＸＰ）である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
（ｉ）前記完全発酵培地が、前記反転型β−キシロシダーゼを含まない対照発酵培地の培養から得られる前記発酵生成物の収率と比較して、前記発酵生成物の収率を増加させるのに有効な量の前記反転型β−キシロシダーゼを含み、任意に、前記発酵生成物の収率が、少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも５％、少なくとも７．５％、又は少なくとも１０％増加する、及び／又は
（ｉｉ）前記アルコールがメタノール、エタノール、プロパノール、プロパン−１，３−ジオール、又はブタノールである、
請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記反転型β−キシロシダーゼが、Ｆｖ４３Ｄ、Ｐｆ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｅ、Ｆｖ４３Ｂ、Ａｆ４３Ａ、Ｆｏ４３Ａ、Ｇｚ４３Ａ又はＸｙｎＢ３ポリペプチドである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
（ｉ）前記Ｆｖ４３Ｄポリペプチドが、配列番号２、又は配列番号２の残基２１〜３５０に相当するアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、又は
（ｉｉ）前記Ｐｆ４３Ａポリペプチドが、配列番号８、又は配列番号８の残基２１〜４５５に相当するアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、又は
（ｉｉｉ）前記Ｆｖ４３Ｅポリペプチドが、配列番号１０、又は配列番号１０の残基１９〜５３０に相当するアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、又は
（ｉｖ）前記Ｆｖ４３Ｂポリペプチドが、配列番号１２、又は配列番号１２の残基１７〜５７４に相当するアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、又は
（ｖ）前記Ａｆ４３Ａポリペプチドが、配列番号１４、又は配列番号１４の残基１５〜５５８に相当するアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、又は
（ｖｉ）前記Ｆｏ４３Ａポリペプチドが、配列番号２４、又は配列番号２４の残基２１〜３４８に相当するアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、又は
（ｖｉｉ）前記Ｇｚ４３Ａポリペプチドが、配列番号２２、又は配列番号２２の残基１９〜３４０に相当するアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、又は
（ｖｉｉｉ）前記ＸｙｎＢ３ポリペプチドが、配列番号２５に相当するアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、
請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記反転型β−キシロシダーゼが、
（ｉ）前記キシラン含有バイオマス中のキシラン１グラム当たり０．３ｍｇ〜１０ｍｇの濃度で、又は
（ii）前記キシラン含有バイオマス中のキシラン１グラム当たり０．４ｍｇ〜１０ｍｇの濃度で、又は
（iii）前記キシラン含有バイオマス中のキシラン１グラム当たり０．３ｍｇ〜３ｍｇの濃度で、
前記完全発酵培地中に存在する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
連続式、バッチ式、又はフェドバッチ式ＳＳＦプロセスとして実施される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記完全発酵培地を調製する工程を更に含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記完全発酵培地を調製する工程が、（ａ）前記発酵微生物、（ｂ）前記キシラン含有バイオマス、（ｃ）前記セルラーゼ、（ｄ）前記ヘミセルラーゼ、（ｅ）前記反転型β−キシロシダーゼ、及び（ｆ）（ａ）〜（ｅ）の１つ以上又はすべてを含まない培地、を混合すること含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記セルラーゼが、全セルラーゼ調製物の形態で存在し、任意に、前記全セルラーゼ調製物が、ヘミセルラーゼを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記全セルラーゼ調製物が、糸状菌の培養から得られる培養ブロスであり、任意に、前記糸状菌がトリコデルマ・リーゼイ（T.  reesei）である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記糸状菌がトリコデルマ・リーゼイ（T.  reesei）であり、前記天然β−キシロシダーゼ遺伝子が欠失する又は不活性化するように遺伝子操作された、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
(i)前記発酵微生物が真菌であり、任意に、前記真菌がサッカロマイセス・セレヴィシエ（Saccharomyces  cerevisiae）酵母である、又は
（ii）前記発酵微生物がバクテリアであり、任意に、前記バクテリアがザイモモナス・モビリス（Zymomonas  mobilis）である、
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記キシラン含有バイオマスが、トウモロコシ茎葉、バガス、モロコシ、大きな根茎のある多年生草本（giant  reed）、エレファントグラス（elephant  grass）、茅、杉、麦わら、スイッチグラス、広葉樹パルプ、又は針葉樹パルプであり、
（i）任意に、前記キシラン含有バイオマスがスラリーである、及び／又は（ii）前記キシラン含有バイオマスが前処理された、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記発酵生成物を回収する工程を更に含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
（i）前記完全発酵培地中の前記反転型β−キシロシダーゼ対前記保持型β−キシロシダーゼの比が、モル基準において、分子量基準において、又はモル基準及び分子量基準の両方において、少なくとも２：１である、又は
（ii）、保持型β−キシロシダーゼ活性を有する酵素（１つ又は複数）は、完全発酵培地には含まれず、又は検出不能である、又は
（iii）完全発酵培地中の保持型β−キシロシダーゼの活性は検出不能である、
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
トリコデルマ・リーゼイ（T.  reesei）細胞であって、
前記天然β−キシロシダーゼ遺伝子を欠失する、又は検出可能なβ−キシロシダーゼ活性を有さないように遺伝子操作され、遺伝子組換えによりＧＨ４３ファミリー酵素を発現するよう遺伝子操作された、前記トリコデルマ・リーゼイ（T.  reesei）細胞。
【請求項１９】
遺伝子組換えによりＦｖ４３Ｄ、Ｐｆ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｅ、Ｆｖ４３Ｂ、Ａｆ４３Ａ、Ｆｏ４３Ａ、Ｇｚ４３Ａ、又はＸｙｎＢ３ポリペプチドを発現するよう遺伝子操作された、請求項１７に記載のトリコデルマ・リーゼイ（T.  reesei）細胞。
【請求項２０】
（i）前記Ｆｖ４３Ｄポリペプチドが、配列番号２、又は配列番号２の残基２１〜３５０に相当するアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、又は
（ii）前記Ｐｆ４３Ａポリペプチドが、配列番号８、又は配列番号８の残基２１〜４４５に相当するアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、又は
（iii）前記Ｆｖ４３Ｅポリペプチドが、配列番号１０、又は配列番号１０の残基１９〜５３０に相当するアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、又は
（iｖ）前記Ｆｖ４３Ｂポリペプチドが、配列番号１２、又は配列番号１２の残基１７〜５７４に相当するアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、又は
（ｖ）前記Ａｆ４３Ａポリペプチドが、配列番号１４、又は配列番号１４の残基１５〜５５８に相当するアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、又は
（ｖi）前記Ｆｏ４３Ａポリペプチドが、配列番号２４、又は配列番号２４の残基２１〜３４８に相当するアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、又は
（ｖii）前記Ｇｚ４３Ａポリペプチドが、配列番号２２、又は配列番号２２の残基１９〜３４０に相当するアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、又は
（ｖiii）前記ＸｙｎＢ３ポリペプチドが、配列番号２５に相当するアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、
請求項１８又は１９に記載のトリコデルマ・リーゼイ（T.  reesei）細胞。
【請求項２１】
前記セルラーゼ調製物の生成を得られる条件下で、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載のトリコデルマ・リーゼイ（T.  reesei）細胞を培養することを含み、任意に、セルラーゼ調製物を回収することを更に含む、セルラーゼ調製物の生成方法。
【請求項２２】
請求項２１に記載の方法を実施することで得られるセルラーゼ調製物。
【請求項２３】
請求項１８〜２０のいずれか一項に記載のトリコデルマ・リーゼイ（T.  reesei）細胞を培養することで生成される培養ブロス。
【請求項２４】
前記バイオマスと、
（i）請求項２２に記載のセルラーゼ調製物、又は
（ii）請求項２３に記載の培養ブロス
を接触させることを含む、バイオマス糖化方法。
【請求項２５】
発酵微生物を少なくとも１つ、キシラン含有バイオマスを少なくとも１つ、セルラーゼを少なくとも１つ、ヘミセルラーゼを少なくとも１つ、及び反転型β−キシロシダーゼを少なくとも１つ含み、
前記反転型β−キシロシダーゼがＧＨ４３ファミリー酵素であり、
前記反転型β−キシロシダーゼが、モル基準において、分子量基準において、又はモル基準及び分子量基準の両方において、保持型β−キシロシダーゼの量よりも多い反転型β−キシロシダーゼの量を含む、組成物。
【請求項２６】
（i）前記反転型β−キシロシダーゼが、請求項５又は６に記載されたものである、及び／又は
（ii）前記キシラン含有バイオマスが、トウモロコシ茎葉、バガス、モロコシ、大きな根茎のある多年生草本（giant  reed）、エレファントグラス（elephant  grass）、茅、杉、麦わら、スイッチグラス、広葉樹パルプ、又は針葉樹パルプである、及び／又は
（iii）前記発酵微生物が真菌又はバクテリアであり、任意に、前記真菌がサッカロマイセス・セレヴィシエ（Saccharomyces  cerevisiae）酵母である、又は任意に、前記バクテリアがザイモモナス・モビリス（Zymomonas  mobilis）である、及び／又は
（iv）前記セルラーゼが全セルラーゼ調製物の形態で存在し、任意に、前記全セルラーゼ調製物が、ヘミセルラーゼを含む、
請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
前記組成物が、保持型β−キシロシダーゼを実質的に含まず、又は検出可能な保持型β−キシロシダーゼ活性を有さない、請求項２５又は２６に記載の組成物。
【請求項２８】
請求項２５〜２７のいずれか一項に記載の組成物を一定期間培養することを含み、
前記発酵生成物がアルコールであり、
任意に、前記アルコールがメタノール、エタノール、プロパノール、プロパン−１，３−ジオール、又はブタノールである、
発酵生成物の生成方法。