【手続補正書】
【提出日】平成26年5月9日(2014.5.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
図６に規定したアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：１０１又は配列ＩＤ番号：１０２）に対して少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む変異型Ｃｓｙ４エンドリボヌクレアーゼであって、Ｈｉｓ−２９の位置にアミノ酸置換を含む、変異型Ｃｓｙ４エンドリボヌクレアーゼ。
【請求項２】
イミダゾールの非存在時には酵素的に不活性であり、イミダゾールの存在時には活性化可能である、請求項１に記載の変異型Ｃｓｙ４エンドリボヌクレアーゼ。
【請求項３】
アミノ酸置換がＨｉｓ２９からＡｌａ２９への置換である、請求項１に記載の変異型Ｃｓｙ４エンドリボヌクレアーゼ。
【請求項４】
検出可能なシグナルを提供する部分を含み、当該部分が、フルオロフォア、量子ドット、エンドリボヌクレアーゼ以外の酵素、またはナノ粒子から任意に選択される、請求項１に記載の変異型Ｃｓｙ４エンドリボヌクレアーゼ。
【請求項５】
任意にビーズであってよい不溶性支持体上に固定化されてている、請求項１に記載の変異型Ｃｓｙ４エンドリボヌクレアーゼ。
【請求項６】
ヌクレオチド配列５’−ＧＵＵＣＡＣＵＧＣＣＧＵＡＵＡＧＧＣＡＧＣＵＡＡＧＡＡＡ−３’（配列ＩＤ番号：１）を含むＲＮＡ基質に結合する、請求項１に記載の変異型Ｃｓｙ４エンドリボヌクレアーゼ。
【請求項７】
ヘアピン構造を有するＲＮＡ基質に結合し、ここでヘアピン構造のヌクレオチド１〜５および１１〜１５が塩基対形成して正規のＡ型螺旋ステムを形成する、請求項１に記載の変異型Ｃｓｙ４エンドリボヌクレアーゼ。
【請求項８】
請求項１に記載の変異型Ｃｓｙ４エンドリボヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項９】
請求項１に記載の変異型Ｃｓｙ４エンドリボヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクター。
【請求項１０】
変異型Ｃｓｙ４エンドリボヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列が、任意に誘導プロモーターであってよいプロモーターに操作可能な形で結合されている、請求項９に記載の組換え発現ベクター。
【請求項１１】
請求項９に記載の組換え発現ベクターを含む、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで遺伝子修飾された宿主細胞。
【請求項１２】
核酸の混合ポピュレーション中に存在する標的ＲＮＡを精製するためのキットであり、任意に不溶性支持体上に固定化されている請求項１に記載の変異型Ｃｓｙ４エンドリボヌクレアーゼを含むキット。
【請求項１３】
５’から３’の順番で、操作可能な結合で：
ａ）請求項１に記載の変異型Ｃｓｙ４エンドリボヌクレアーゼによって特異的に結合されるＲＮＡ基質をコードするヌクレオチド配列；
ｂ）標的ＲＮＡをコードする核酸の挿入に適した多重クローニングサイト
を含む組換え発現ベクターをさらに含む、請求項１２に記載のキット。
【請求項１４】
ＲＮＡ基質をコードするヌクレオチド配列が任意に誘導プロモーターであってよいプロモーターに操作可能な形で結合されている、請求項１３に記載のキット。
【請求項１５】
ＲＮＡ基質がヌクレオチド配列５’−ＧＵＵＣＡＣＵＧＣＣＧＵＡＵＡＧＧＣＡＧＣＵＡＡＧＡＡＡ−３’（配列ＩＤ番号：１）を含む、請求項１３に記載のキット。
【請求項１６】
ヘアピン構造を有するＲＮＡ基質に結合し、ここでヘアピン構造のヌクレオチド１〜５および１１〜１５が塩基対形成して正規のＡ型螺旋ステムを形成する、請求項１２に記載のキット。
【請求項１７】
組換え発現ベクターが、多重クローニングサイトに挿入された、標的ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１３に記載のキット。
【請求項１８】
ａ）イミダゾール；
ｂ）１つまたは複数の洗浄緩衝剤；及び
ｃ）ポジティブコントロール発現ベクター
の１つまたは複数をさらに含む、請求項１２に記載のキット。
【請求項１９】
核酸の混合ポピュレーション中に存在する標的ＲＮＡを単離する方法であって、
ａ）核酸の混合ポピュレーションを、請求項１に記載の変異型Ｃｓｙ４エンドリボヌクレアーゼに接触させ、タグ付けされた標的ＲＮＡ−固定化された変異型Ｃｓｙ４エンドリボヌクレアーゼ複合体を形成すること、ここで、変異型Ｃｓｙ４エンドリボヌクレアーゼは不溶性支持体上に固定化されていて、核酸の混合ポピュレーションは、固定化された変異型Ｃｓｙ４エンドリボヌクレアーゼにより特異的に結合される認識ヌクレオチド配列を含む、タグ付けされた標的ＲＮＡを含んでおり、前記接触はイミダゾールを含まない結合溶液中で実行される；
ｂ）結合溶液に最終濃度が約１００ｍＭから約５００ｍＭになるようにイミダゾールを添加し、それにより、固定化した変異型Ｃｓｙ４エンドリボヌクレアーゼを酵素的に再活性化する再活性化溶液を形成し、再活性化され、固定化された変異型Ｃｓｙ４エンドリボヌクレアーゼによりタグから標的ＲＮＡを開裂すること；および
ｃ）放出された標的ＲＮＡを回収すること
を含む方法。
【請求項２０】
ステップ（ａ）の後で、かつステップ（ｂ）の前に実行される洗浄ステップをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
標的ＲＮＡに結合するポリペプチドを単離する方法であって、
ａ）固定化された複合体を標的ＲＮＡに結合するポリペプチドを含む溶液に接触させること、ここで、前記固定化された複合体は、請求項１に記載の変異型Ｃｓｙ４エンドリボヌクレアーゼと、当該変異型Ｃｓｙ４エンドリボヌクレアーゼが特異的に結合する認識ヌクレオチド配列を含むタグ付けされた標的ＲＮＡとを含み、前記接触によってポリペプチドが標的ＲＮＡに結合し、前記接触がイミダゾールを含まない結合溶液で実施されるものとする；および
ｂ）結合したポリペプチドを溶出すること
を含む方法。
【請求項２２】
真核細胞における標的ＲＮＡの産生を調節する方法であって、遺伝子修飾された宿主細胞と誘導プロモーターを活性化する薬剤とを接触させることを含み、ここで、
前記遺伝子修飾された宿主細胞は、基質ポリリボヌクレオチドにおける配列特異的な開裂部位での開裂を触媒する酵素的に活性な配列特異的Ｃｓｙ４エンドリボヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターで遺伝子修飾されており、
前記酵素をコードするヌクレオチド配列は誘導プロモーターに操作可能な形で結合されており、誘導プロモーターの活性化により、酵素が細胞内で産生され、前記標的ＲＮＡが前駆体ＲＮＡから開裂される、方法。
【請求項２３】
標的ＲＮＡの種類が調節ＲＮＡである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前駆体ＲＮＡからの前記標的ＲＮＡの開裂により、前駆体ＲＮＡが不活性化される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
任意に固体支持体上に固定化されていてもよい標的ポリリボヌクレオチドにおける特定配列を検出する方法であって、
ａ）オリゴヌクレオチドプローブと標的ポリリボヌクレオチドとの二本鎖形成に有利な条件下において、標的ポリリボヌクレオチドを、前記特定配列を含むオリゴヌクレオチドプローブおよび酵素的に活性な配列特異的Ｃｓｙ４エンドリボヌクレアーゼに接触させること、ただし、ここで前記二本鎖はＣｓｙ４エンドリボヌクレアーゼにより開裂される；および
ｂ）オリゴヌクレオチドプローブと標的ポリリボヌクレオチドとの特異的結合を検出すること、ただし、ここでオリゴヌクレオチドプローブと標的ポリリボヌクレオチドとの間の二本鎖形成の検出が、標的ポリリボヌクレオチドにおいて特定配列が存在することを表す；
を含む方法。
【請求項２６】
オリゴヌクレオチドプローブがペプチドに結合され、前記ペプチドがＣｓｙ４エンドリボヌクレアーゼによる二本鎖の開裂時に放出され、検出ステップが放出されたペプチドの検出を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
放出されたペプチドがそのペプチドに対して特異的な抗体への結合によって検出され、当該抗体が任意に固定化されていてもよい、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
標的ポリリボヌクレオチドが病原体のポリリボヌクレオチドである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
酵素的に活性なＣｓｙ４エンドリボヌクレアーゼが、配列ＩＤ番号：６、８または９のいずれか一つに対して少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２５に記載の方法。