【手続補正書】
【提出日】平成26年7月11日(2014.7.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
a)生物が、少なくともi)炭水化物ホスホリラーゼをコードする遺伝子、ii)炭水化物キナーゼをコードする遺伝子と組み合わせた炭水化物加水分解酵素をコードする遺伝子、またはiii)炭水化物合成酵素をコードする遺伝子の導入により遺伝子改変されていることにより、前記生物が、二糖類、オリゴ糖類、多糖類またはそれらの混合物を活性化糖類と糖類とに分割でき、
b)前記生物が、前記生物のステップa)で導入される遺伝子のいずれでもない少なくとも１つの他の遺伝子の機能が低下するかまたは非機能的になるようにさらに遺伝子改変され、前記他の遺伝子が、前記活性化糖類をバイオマスおよび/または生体触媒酵素に変換する酵素をコードする
ことを特徴とする、糖類、活性化糖類、ヌクレオシド、グリコシド、糖脂質および糖タンパク質からなる群より選択される少なくとも１の特別の生成物の生成のための代謝操作された生物。
【請求項２】
前記生物が、前記活性化糖類を特別の生成物に変換する少なくとも１つの他の遺伝子の導入によりさらに遺伝子改変されているか、または前記活性化糖類を特別の生成物に変換する前記生物の少なくとも１の他の内因性遺伝子が過剰発現されている請求項１に記載の代謝操作された生物。
【請求項３】
前記生物が、主な炭素源として二糖類、オリゴ糖類、多糖類またはそれらの混合物上で成長できる請求項１または２に記載の代謝操作された生物。
【請求項４】
ステップa)の遺伝子改変が任意選択であるか、または少なくともi)炭水化物ホスホリラーゼをコードする内因性遺伝子、ii)炭水化物キナーゼをコードする遺伝子と組み合わせた炭水化物加水分解酵素をコードする内因性遺伝子、もしくはiii)炭水化物合成酵素をコードする内因性遺伝子を過剰発現させることで置き換えられ、前記生物が、二糖類、オリゴ糖類、多糖類またはそれらの混合物を、活性化糖類と糖類とに分割できる請求項１〜３のいずれか１項に記載の代謝操作された生物。
【請求項５】
ステップb)の前記活性化糖類が、前記糖類で置き換えられ、請求項２〜４のいずれか１項に記載のさらなる遺伝子改変における前記活性化糖類が、前記糖類で置き換えられる請求項１〜４のいずれか１項に記載の代謝操作された生物。
【請求項６】
ステップa)の前記遺伝子が、二糖類、オリゴ糖類または多糖類を、２つの活性化糖類または２つの糖類に分割する請求項１〜４のいずれか１項に記載の代謝操作された生物。
【請求項７】
前記生物が、細菌、酵母、真菌細胞からなる群より選択される微生物であるか、または植物細胞もしくは動物細胞である請求項１〜６のいずれか１項に記載の代謝操作された生物。
【請求項８】
前記細菌が大腸菌であるか、または前記酵母がサッカロミセス・セレビシエである請求項７に記載の代謝操作された生物。
【請求項９】
前記活性化糖類が、アルファ-グルコース-1-ホスフェート、アルファ-ガラクトース-1-ホスフェート、ベータ-グルコース-1-ホスフェート、ベータ-ガラクトース-1-ホスフェート、UDP-グルコース、グルコース-6-ホスフェート、フラクトース-6-ホスフェートおよびUDP-ガラクトースからなる群より選択され、前記糖類が、フラクトース、グルコースおよびガラクトースからなる群より選択される請求項１〜８のいずれか１項に記載の代謝操作された生物。
【請求項１０】
前記炭水化物加水分解酵素が、ラクターゼ、インベルターゼ、スクラーゼ、マルターゼ、トレハラーゼ、スクロース-6-ホスフェート加水分解酵素および/またはアミラーゼであり前記炭水化物キナーゼが、ガラクトキナーゼ、フルクトキナーゼ、グルコキナーゼおよび/またはマンノキナーゼである請求項１〜９のいずれか１項に記載の代謝操作された生物。
【請求項１１】
- ステップa)の前記遺伝子が、スクロースホスホリラーゼをコードし、かつ/または
- ステップb)の以下の遺伝子：ベータ-ガラクトシダーゼをコードする遺伝子および/もしくはホスホグルコムターゼをコードする遺伝子および/もしくはグルコース-1-ホスフェートアデニリルトランスフェラーゼをコードする遺伝子および/もしくはホスファターゼをコードする遺伝子および/もしくはグルコース-1-ホスフェートウリジルトランスフェラーゼをコードする遺伝子および/もしくはUDP-グルコース-4-エピメラーゼをコードする遺伝子および/もしくはUDP-グルコース:ガラクトース-1-ホスフェートウリジルトランスフェラーゼをコードする遺伝子および/もしくはUDP-ガラクトピラノースムターゼをコードする遺伝子および/もしくはUDP-ガラクトース:(グルコシル)リポ多糖-1,6-ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子および/もしくはUDP-ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子および/もしくはUDP-グルコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子および/もしくはUDP-グルクロネートトランスフェラーゼをコードする遺伝子および/もしくはUDP-グルコースリピドキャリアトランスフェラーゼをコードする遺伝子および/もしくはUDP-糖加水分解酵素をコードする遺伝子および/もしくはインベルターゼをコードする遺伝子および/もしくはマルターゼをコードする遺伝子および/もしくはトレハラーゼをコードする遺伝子および/もしくは糖輸送ホスホトランスフェラーゼをコードする遺伝子および/もしくはヘキソキナーゼをコードする遺伝子が非機能的にされる、
請求項１〜３および６〜10のいずれか１項に記載の代謝操作された生物。
【請求項１２】
- ステップa)の前記遺伝子が、スクロースホスホリラーゼをコードし、
- ステップb)の前記遺伝子が、遺伝子lacZ、遺伝子pgm、遺伝子ycjU、遺伝子glgC、遺伝子agp、遺伝子ptsG、遺伝子glk、遺伝子glf、遺伝子waaB、遺伝子ushA、遺伝子wcaA、遺伝子wcaC、遺伝子wcaE、遺伝子wcaI、遺伝子wcaL、遺伝子wcaJ、遺伝子galU、遺伝子galF、遺伝子galE、遺伝子galT、遺伝子malPおよび/または遺伝子malQである、
請求項11に記載の代謝操作された生物。
【請求項１３】
- ステップa)の前記遺伝子が、スクロースホスホリラーゼをコードし、
- ステップb)の前記遺伝子が、遺伝子PGM1、遺伝子PGM2、遺伝子GLG1、遺伝子GLG2、遺伝子INM1、遺伝子INM2、遺伝子GLK1、遺伝子HXK1、遺伝子HXK2、遺伝子GAL10、遺伝子GAL7、遺伝子YHL012W、遺伝子UGP1、遺伝子GSY1、遺伝子GSY2、遺伝子DIE2、遺伝子ALG8、遺伝子ATG26、遺伝子SUC2、遺伝子MAL32、遺伝子MAL12、遺伝子YJL216Cおよび/または遺伝子YGR287Cおよび/またはFEN1および/またはFKS1および/またはGSC2および/またはTPS1である、
請求項11に記載の代謝操作された生物。
【請求項１４】
前記スクロースホスホリラーゼが、乳酸菌を起源とし、前記乳酸菌が、ビフィドバクテリウム・アドレセンティス、ロイコノストック・メセンテロイデス、ラクトバチルス・アシドフィラスまたはストレプトコッカス・ミュータンスである請求項12または13に記載の代謝操作された生物。
【請求項１５】
ステップa)の前記スクロースホスホリラーゼが、スクロース合成酵素、マルトースホスホリラーゼまたはマルトース合成酵素で置き換えられる請求項11〜14のいずれか１項に記載の代謝操作された生物。
【請求項１６】
ステップa)の前記スクロースホスホリラーゼが、ラクトースホスホリラーゼまたはラクトース合成酵素で置き換えられる請求項11〜14のいずれか１項に記載の代謝操作された生物。
【請求項１７】
- ステップa)の前記遺伝子が、スクロースホスホリラーゼをコードし、かつ/または
- ステップb)の以下の遺伝子：ベータ-ガラクトシダーゼをコードする遺伝子および/もしくはグルコース-6-ホスフェートイソメラーゼをコードする遺伝子および/もしくはグルコース-1-ホスフェートアデニリルトランスフェラーゼをコードする遺伝子および/もしくはグルコース-1-ホスファターゼをコードする遺伝子および/もしくはホスホフルクトキナーゼＡをコードする遺伝子および/もしくはホスホフルクトキナーゼＢをコードする遺伝子および/もしくはホスホグルコネート脱水酵素をコードする遺伝子および/もしくは2-ケト-3-デオキシグルコネート-6-ホスフェートアルドラーゼをコードする遺伝子および/もしくはグルコース-1-ホスフェートウリジルトランスフェラーゼをコードする遺伝子および/もしくはUDP-グルコース-4-エピメラーゼをコードする遺伝子および/もしくはUDP-グルコース:ガラクトース-1-ホスフェートウリジルトランスフェラーゼをコードする遺伝子および/もしくはUDP-ガラクトピラノースムターゼをコードする遺伝子および/もしくはUDP-ガラクトース:(グルコシル)リポ多糖-1,6-ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子および/もしくはUDP-ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子および/もしくはUDP-グルコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子および/もしくはUDP-グルクロネートトランスフェラーゼをコードする遺伝子および/もしくはUDP-グルコースリピドキャリアトランスフェラーゼをコードする遺伝子および/もしくはGDP-マンノース加水分解酵素をコードする遺伝子および/もしくはUDP-糖加水分解酵素をコードする遺伝子および/もしくはマンノース-6-ホスフェートイソメラーゼをコードする遺伝子および/もしくはUDP-N-アセチルグルコサミンエノイルピルボイルトランスフェラーゼをコードする遺伝子および/もしくはUDP-N アセチルグルコサミンアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子および/もしくはUDP-N-アセチルグルコサミン-2-エピメラーゼをコードする遺伝子および/もしくはウンデカプレニル-ホスフェート-アルファ-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼをコードする遺伝子および/もしくはグルコース-6-ホスフェート-1-脱水素酵素をコードする遺伝子および/もしくはL-グルタミン:D-フラクトース-6-ホスフェートアミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子および/もしくはマンノース-6-ホスフェートイソメラーゼをコードする遺伝子および/もしくはソルビトール-6-ホスフェート脱水素酵素をコードする遺伝子および/もしくはマンニトール-1-ホスフェート5-脱水素酵素をコードする遺伝子および/もしくはアルロース-6-ホスフェート 3-エピメラーゼをコードする遺伝子および/もしくはインベルターゼをコードする遺伝子および/もしくはマルターゼをコードする遺伝子および/もしくはトレハラーゼをコードする遺伝子および/もしくは糖輸送ホスホトランスフェラーゼをコードする遺伝子および/もしくはヘキソキナーゼをコードする遺伝子が非機能的にされる、
請求項５に記載の代謝操作された生物。
【請求項１８】
- ステップa)の前記遺伝子が、スクロースホスホリラーゼをコードする遺伝子であり、- ステップb)の前記遺伝子が、遺伝子lacZ、遺伝子pgi、遺伝子glgC、遺伝子agp、遺伝子pfkA、遺伝子pfkB、遺伝子waaB、遺伝子ushA、遺伝子eda、遺伝子edd、遺伝子wcaA、遺伝子wcaC、遺伝子wcaE、遺伝子wcaI、遺伝子wcaL、遺伝子wcaJ、遺伝子wcaB、遺伝子wcaF、遺伝子wcaK、遺伝子wcaD、遺伝子galU、遺伝子galF、遺伝子galE、遺伝子gmm、遺伝子galT、遺伝子manA、遺伝子murA、遺伝子lpxA、遺伝子rffE、遺伝子rfe、遺伝子glmS、遺伝子srlD、遺伝子mtlD、遺伝子alsEおよび/またはzwfである、
請求項17に記載の代謝操作された生物。
【請求項１９】
- ステップa)の前記遺伝子が、スクロースホスホリラーゼをコードする遺伝子であり、
- ステップb)の前記遺伝子が、遺伝子pgi1、遺伝子PFK1、遺伝子PFK2、遺伝子PFK26、遺伝子PFK27、遺伝子GND1、遺伝子GND2、遺伝子PMI40、遺伝子ZWF1、遺伝子GFA1、遺伝子GLG1、遺伝子GLG2、遺伝子INM1、遺伝子INM2、遺伝子GLK1、遺伝子HXK1、遺伝子HXK2、遺伝子GAL10、遺伝子GAL7、遺伝子YHL012W、遺伝子UGP1、遺伝子GSY1、遺伝子GSY2、遺伝子DIE2、遺伝子ALG8、遺伝子ATG26、遺伝子SUC2、遺伝子MAL32、遺伝子MAL12、遺伝子YJL216Cおよび/または遺伝子YGR287Cおよび/またはFEN1および/またはFKS1および/またはGSC2および/またはTPS1である、
請求項18に記載の代謝操作された生物。
【請求項２０】
前記スクロースホスホリラーゼが、乳酸菌を起源とし、前記乳酸菌が、ビフィドバクテリウム・アドレセンティス、ロイコノストック・メセンテロイデス、ラクトバチルス・アシドフィラスまたはストレプトコッカス・ミュータンスである請求項18または19に記載の代謝操作された生物。
【請求項２１】
前記活性化糖類を特別の生成物に変換する遺伝子が、エピメラーゼ、トランスフェラーゼ、還元酵素、(ピロ)ホスホリラーゼ、(デ)カルボキシラーゼ、脱水酵素、パーミアーゼ、合成酵素、脱水素酵素、酸化酵素またはイソメラーゼをコードする請求項２〜20のいずれか１項に記載の代謝操作された生物。
【請求項２２】
前記エピメラーゼが、UDP-ガラクトース-4-エピメラーゼまたはUDP-N-アセチルグルコサミンエピメラーゼであり、かつ/または前記トランスフェラーゼが、グリコシルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼまたはスルホトランスフェラーゼである請求項21に記載の代謝操作された生物。
【請求項２３】
前記特別の生成物が、単糖類、二糖類、三糖類、四糖類、五糖類、多糖類、ヌクレオシド、O-グリコシド、S-グリコシド、N-グリコシド、C-グリコシド、糖タンパク質、糖脂質または活性化炭水化物である請求項１〜22のいずれか１項に記載の代謝操作された生物。
【請求項２４】
i) 請求項１〜23のいずれか１項に記載の微生物を代謝操作することと、
ii) 前記遺伝子操作微生物を培養することと、
iii)特別の生成物を抽出して精製することと
を含む、請求項１〜23のいずれか１項に記載の特別の生成物を生成する方法。
【請求項２５】
フコシルラクトースを生成するための、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するキイロタマホコリカビを起源とする2-フコシルトランスフェラーゼまたは2-フコシルトランスフェラーゼ活性を有するその断片または少なくとも75%の配列同一性を有し、2-フコシルトランスフェラーゼ活性を有するそのバリアントの使用。
【請求項２６】
2-フコシルトランスフェラーゼ活性を有する前記断片が、配列番号４に示すアミノ酸配列を有する請求項25に記載の使用。
【請求項２７】
フコシルラクトースを生成するための、請求項25または26に記載の2-フコシルトランスフェラーゼをコードする核酸の使用。
【請求項２８】
前記核酸が、配列番号２、配列番号３、配列番号５または配列番号６に示す核酸配列を有する請求項27に記載の使用。