【手続補正書】
【提出日】平成25年12月9日(2013.12.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第一の分化した状態または表現型を呈する、ヒトまたは他の哺乳類の細胞を再プログラム化して、第二の分化した状態または表現型を呈する、再プログラム化した細胞を生成するための方法であって、
第一の分化した状態または表現型を呈する、前記ヒトまたは他の哺乳類の細胞に、インビトロで合成された、修飾されたｍＲＮＡ分子を含む精製されたＲＮＡ調製物を導入することであって、
前記インビトロで合成された、修飾されたｍＲＮＡ分子は、
（ｉ）少なくとも１つの修飾されていないウリジンヌクレオシドの代わりに、少なくとも１つのプソイドウリジン修飾されたヌクレオシドを含んでおり；
（ｉｉ）５’キャップを示しており；
（ｉｉｉ）５０〜２００ヌクレオチドまたは１５０を超えるヌクレオチドを含んでいる３’ポリ（Ａ）末端を示しており；
（ｉｖ）少なくとも１つのタンパク質の再プログラム化因子をコードしており；
前記精製されたＲＮＡ調製物は、前記再プログラム化した細胞の生成および生存を妨げるのに十分な、前記細胞における免疫応答を活性化するであろう量のＲＮＡ夾雑物分子がない；ならびに、
第二の分化した状態または表現型を呈する前記再プログラム化した細胞が生成されるような条件下で、複数日において前記導入することを反復することであって、当該再プログラム化した細胞は、前記精製されたｍＲＮＡの最後の前記導入することの後に、前記第二の分化した状態を維持するものであること：を包含している、方法。
【請求項２】
前記プソイドウリジンが修飾されたヌクレオシドは、
（ａ）さらに修飾されていないプソイドウリジン（Ψ）；および
（ｂ）１−メチルプソイドウリジン（ｍ１Ψ）：
から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＲＮＡ夾雑物分子は、二本鎖ＲＮＡ分子およびキャッピングされていないｍＲＮＡ分子からなる群から選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記精製されたＲＮＡ調製物は、インビトロで合成された、修飾されたｍＲＮＡ分子を含んでおり、
（ｉ）９８％を超える前記修飾されたｍＲＮＡ分子は、キャッピングされている；
（ｉｉ）前記修飾されたｍＲＮＡ分子は、キャップ１構造を備えたキャップを示しており、キャップヌクレオチドに関して、最後から２番目のヌクレオチドにおけるリボースの２’ヒドロキシルがメチル化されている；
（ｉｉｉ）実質的にすべての前記修飾されたｍＲＮＡ分子は、１５０ヌクレオチドを超えるポリＡ末端を含んでいる；
（ｉｖ）前記修飾されたｍＲＮＡ分子は、異種の５’ＵＴＲ配列、Ｋｏｚａｋ配列、ＩＲＥＳ配列または３’ＵＴＲ配列からなる群から選択される少なくとも１つの特定の配列を示し、前記特定の配列は、前記特定の配列を示さない同一のｍＲＮＡ分子と比較して、修飾されたｍＲＮＡ分子のより高い翻訳をもたらし、前記５’ＵＴＲ配列または３’ＵＴＲ配列は、アフリカツメガエルまたはヒトのアルファグロブリンまたはベータグロブリンのｍＲＮＡ由来であるか、前記５’ＵＴＲ配列はタバコエッチ病ウイルス（ＴＥＶ）のＲＮＡ由来の配列である配列を含んでいる；
（ｖ）前記少なくとも１つのプソイドウリジンの修飾されたヌクレオシドは、実質的にすべての対応する修飾されていないウリジンヌクレオシドの代わりに存在しており；
（ｖｉ）前記インビトロで合成された、修飾されたｍＲＮＡ分子は、対応する修飾されていないシチジンヌクレオシドの代わりに、少なくとも１つの５−メチルシチジン（ｍ５Ｃ）修飾されたヌクレオシドをさらに含んでいる；または
（ｖｉｉ）前記修飾されたｍＲＮＡ分子によってコードされている、前記少なくとも１つの再プログラム化因子は少なくとも１つの転写因子を含んでいる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記インビトロで合成された、修飾されたｍＲＮＡ分子は、実質的にすべての、対応する修飾されていないシチジンヌクレオシドの代わりに、５−メチルシチジン（ｍ５Ｃ）修飾されたヌクレオシドを含んでいる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記精製されたＲＮＡ調製物は、
ａ）前記精製されたＲＮＡ調製物が生成されるように、１つ以上のＲＮＡ夾雑物分子または夾雑物のＤＮＡ分子を特異的に消化する１つ以上の酵素とともに、前記修飾されたｍＲＮＡ分子を含んでいる組成物を処理することを包含している工程；
ｂ）前記精製されたＲＮＡ調製物が生成されるように、前記修飾されたｍＲＮＡ分子を含んでいる組成物をカラム精製に供することを包含している工程；および
ｃ）短鎖のＲＮａｓｅＩＩＩ消化産物が生成されるように、リボヌクレアーゼＩＩＩ（ＲＮａｓｅＩＩＩ）酵素を用いて前記修飾されたｍＲＮＡ分子を含んでいる組成物を処理することと、前記精製されたＲＮＡ調製物が生成されるように、前記修飾されたｍＲＮＡ分子から、前記短鎖のＲＮａｓｅＩＩＩ消化産物を除去することとを包含している工程：
からなる群から選択される少なくとも１つの方法を用いて生成される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記少なくとも１つの再プログラム化因子は、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８、ＮＡＮＯＧおよび少なくとも１つのＭＹＣファミリ−タンパク質からなる群から選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記複数日において導入することは、少なくとも１０〜１６日間毎日、前記導入することを反復することを包含しており、第二の分化した状態または表現型を呈する、前記再プログラム化した細胞は、脱分化した細胞または人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記再プログラム化した細胞は、
（ｉ）脱分化した細胞または人工ｉＰＳ細胞；
（ｉｉ）分化転換した細胞；または
（ｉｉｉ）再分化した細胞：である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ヒトまたは哺乳類の細胞は、培養物中にあり、前記再プログラム化した細胞は、前記精製されたｍＲＮＡ調製物の最後の前記導入することの後に、培養物において少なくとも２０日間生存し、前記再プログラム化した細胞は、ＮＡＮＯＧ、ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８、ＳＳＥＡ４、ＣＲＩＰＴＯ、ＲＥＸ１およびＴＲＡ−１−６０から選択されるｉＰＳ細胞の形態特性を示しており、且つマーカーの特性を発現している、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記再プログラム化した細胞は、培養物において少なくとも４０日間生存し、複製する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記導入することの後、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−α、ＴＮＦ−α、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−ｌαもしくはβ、ＩＬ−６、ＩＦＮ−β、ＩＬ−８、α−メラニン形成細胞刺激ホルモン（α−ＭＳＨ）、トランスフォーミング増殖因子−β１（ＴＧＦ−β１）、インスリン様増殖因子−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、ＴＧＦ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、ＩＬ−３、ＩＬ−６、エリスロポエチン、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、インスリン様増殖因子２（ＩＧＦＩＩ）、および骨誘導因子４（ＢＭＰ−４）からなる群から選択される、少なくとも１つの増殖因子および／またはサイトカインに、前記細胞を接触させることをさらに包含している、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
ＴＧＦ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、ＩＬ−３、ＩＬ−６、エリスロポエチン、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、インスリン様増殖因子２（ＩＧＦＩＩ）、骨誘導因子４（ＢＭＰ−４）、熱ショックタンパク質、ＨＳＰ７０、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）および増殖因子シグナリングを下方制御するか、拮抗するタンパク質からなる群から選択される、少なくとも１つのサイトカインまたは増殖因子をコードしている修飾されたｍＲＮＡを、前記細胞に導入することをさらに包含している、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の前記精製されたＲＮＡ調製物または前記インビトロで合成された、修飾されたｍＲＮＡ分子を含んでいる組成物であって、前記精製されたＲＮＡ調製物、または前記インビトロで合成された、修飾されたｍＲＮＡ分子は、医薬としての使用のためのものである、組成物。
【請求項１５】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の前記精製されたｍＲＮＡ調製物、または前記精製されたＲＮＡ調製物を構成している、インビトロで合成された、修飾されたｍＲＮＡ分子を包含している哺乳類の細胞を含んでいる、組成物。
【請求項１６】
第一の分化した状態または表現型を呈する、ヒトまたは他の哺乳類の細胞を再プログラム化して、第二の分化した状態または表現型を呈する、再プログラム化した細胞を生成するための方法であって、
第一の分化した状態を呈する、前記ヒトまたは他の哺乳類の細胞に、インビトロで合成された、修飾されたｍＲＮＡ分子を含む精製されたＲＮＡ調製物を導入することであって、
前記インビトロで合成された、修飾されたｍＲＮＡ分子は、
（ｉ）前記少なくとも１つの修飾されたヌクレオシドの代わりの、対応する修飾されていないヌクレオシドを除いて同一の配列を示す、対応するインビトロで合成された、修飾されていないＲＮＡ分子よりも、前記インビトロで合成された、修飾されたｍＲＮＡ分子が、類似した条件下で、前記ヒトまたは他の哺乳類の細胞において著しく低下した免疫原性であり、かつ検出可能に低下した免疫応答を誘発するように、少なくとも１つの対応する修飾されていないヌクレオシドの代わりに、少なくとも１つの修飾されたヌクレオシドを含んでおり；
（ｉｉ）５’キャップを示しており；
（ｉｉｉ）５０〜２００ヌクレオチドまたは１５０を超えるヌクレオチドを含んでいる３’ポリ（Ａ）末端を示しており；
（ｉｖ）少なくとも１つのタンパク質またはポリペプチドの再プログラム化因子をコードしており；
前記精製されたＲＮＡ調製物は、前記再プログラム化した細胞の生成および生存を妨げるのに十分な、前記細胞における免疫応答を活性化するであろう量のＲＮＡ夾雑物分子がない；ならびに、
第二の分化した状態または表現型を呈する前記再プログラム化した細胞が生成されるような条件下で、複数日において前記導入することを反復することであって、当該再プログラム化した細胞は、前記精製されたｍＲＮＡの最後の前記導入することの後に、前記第二の分化した状態を維持するものである：を包含している、方法。
【請求項１７】
前記インビトロで合成された、修飾されたｍＲＮＡ分子は、さらに修飾されていないプソイドウリジンおよび１−メチルプソイドウリジンからなる群から選択される、少なくとも１つの修飾されたヌクレオシドを含んでいる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記インビトロで合成された、修飾されたｍＲＮＡ分子は、修飾されたヌクレオシドである５−メチルシチジンを含んでいる、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記インビトロで合成された、修飾されたｍＲＮＡ分子を構成している、それぞれの前記修飾されたヌクレオシドは、実質的にすべての前記対応する修飾されていないヌクレオシドの代わりに存在している、請求項１６または１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記インビトロで合成された、修飾されたｍＲＮＡ分子は、前記対応する修飾されていないヌクレオシドの部分の代わりに、修飾されたヌクレオシドである２−チオウリジンを含んでいる、請求項１６または１８に記載の方法。