【誤訳訂正書】
【提出日】平成26年10月20日(2014.10.20)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【発明の詳細な説明】
【発明の名称】抗ＦＧＦＲ４抗体及び使用方法
【技術分野】
【０００１】
(関連出願の相互参照)
この出願は、２０１１年４月７日に出願された米国特許出願番号６１／４７３１０６の優先権を主張するものであり、その内容を出典明記によってここに援用する。
(配列表)
本出願はＥＦＳ-Ｗｅｂを通してＡＳＣＩＩフォーマットにおいて提出されている配列表を含み、その全体を出典明記によってここに援用する。２０１２年３月２２日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、名称P4524R1WO.txtであり、サイズは３７，０２０である。
【０００２】
(発明の分野)
本発明は抗ＦＧＦＲ４抗体、及びその使用方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
線維芽細胞増殖因子(ＦＧＦ)は多様な生物学的活性を伴うポリペプチドに構造的に関連する２２のファミリーを含む；これらのシグナル伝達分子の多くはそれらの同族の受容体(ＦＧＦＲ；ＦＧＦＲ１-４と命名される)、受容体チロシンキナーゼのファミリーに結合し活性化させることによって機能する(Eswarakumar等, 2005；Ornitz 及びItoh, 2001)。これらの受容体-リガンド相互作用は、受容体二量体化及び自己リン酸化、膜結合型及び細胞質アクセサリータンパク質との複合体の形成、及び複数のシグナル伝達カスケードの開始をもたらす（Powers等, 2000）。ＦＧＦＲ-ＦＧＦシグナル伝達系は、細胞機能／プロセス、例えば増殖、分化、遊走、形態形成、及び血管新生を制御することにより、発生及び組織修復において重要な役割を果たす。
【０００４】
ＦＧＦＲにおける変更(すなわち過剰発現、変異、トランスロケーション、及びトランケーション)は、骨髄腫  乳房、胃、結腸、膀胱、膵臓、及び肝細胞癌を含む多くのヒト癌に伴われる(Bange等, 2002；Cappellen等, 1999；Chesi等, 2001；Chesi等, 1997；Gowardhan等, 2005；Jaakkola等, 1993；Jang等, 2001；Jang等, 2000；Jeffers等, 2002；Xiao等, 1998)。肝細胞癌(ＨＣＣ)は、癌に関連した死亡の主要な世界的原因の一つであり、年あたり５０万を超す死亡者をだす(Shariff等, 2009)。癌におけるＦＧＦＲ４の役割は十分に解明されないままであり、幾つかの発見はこの受容体がＨＣＣ発生及び／又は進行において重要な役割を果たしうることを示唆する。ＦＧＦＲ４はヒト肝細胞に存在する主なＦＧＦＲアイソフォームである(Kan等, 1999)；我々はまた肝臓組織が最も高い転写レベルのＦＧＦＲ４を有することを既に報告した(Lin等, 2007)。肝癌(並びに幾つかのタイプのヒト腫瘍)において過剰に発現されているＦＧＦＲ４に加えて、幾つかのミスセンス遺伝子変化がＨＣＣ患者サンプルにおいて観察されている；特に、ＦＧＦＲ４における高頻度のＧ３８８Ｒ一塩基多型(頭頸部癌では低減された生存率、並びに結腸、軟部組織、前立腺、及び乳癌では悪性表現型を伴う)が同定された(Ho等, 2009)。更に、マウスにおけるＦＧＦ１９(すなわちＦＧＦＲ４−特異的リガンド)の異所性発現が肝細胞増殖、肝細胞異形成、及び新生物形成を促進することが既に実証されている(Nicholes等, 2002)。
【０００５】
治療剤として開発に最適である臨床特性を有する薬剤に対するニーズがいまだあることが明らかである。ここに記載の発明はこのニーズを満たし、また他の利点を提供する。
ここに引用される全ての参照文献は、特許出願及び刊行物を含め、その全体が出典明記により援用される。
【発明の概要】
【０００６】
発明は抗ＦＧＦＲ４抗体及びその使用方法を提供する。
【０００７】
一態様では、発明は、ＦＧＦＲ４に結合する単離された抗体であって、≦１ｎＭの親和性でヒトＦＧＦＲ４に結合する抗ＦＧＦＲ４抗体を提供する。幾つかの実施態様では、抗ＦＧＦＲ４抗体は≦１ｎＭの親和性でヒト、マウス及びカニクイザルＦＧＦＲ４に結合する。幾つかの実施態様では、抗ＦＧＦＲ４抗体は≦０．０５ｎＭの親和性でヒトＦＧＦＲ４に結合する。
【０００８】
幾つかの実施態様では、抗ＦＧＦＲ４抗体は図１２Ｄに示すアミノ酸配列を有するマウスＣ３タンパク質に実質的に結合しない。
【０００９】
幾つかの実施態様では、抗ＦＧＦＲ４抗体は変性ＦＧＦＲ４に結合する。幾つかの実施態様では、抗ＦＧＦＲ４抗体は変性、還元ＦＧＦＲ４に結合する。幾つかの実施態様では、ＦＧＦＲ４に対する抗ＦＧＦＲ４抗体の結合はウエスタンブロットを使用して検出される。
【００１０】
幾つかの実施態様では、抗ＦＧＦＲ４抗体はＧ１６５Ａ変異を含んでなるヒトＦＧＦＲ４に有意に結合しない。幾つかの実施態様では、抗ＦＧＦＲ４抗体はアミノ酸番号１５０〜１７０の成熟ヒトＦＧＦＲ４アミノ酸配列を含んでなるか、から基本的に成るか又はから成る配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％の配列同一性又は類似性を有するポリペプチドに結合する。幾つかの実施態様では、抗ＦＧＦＲ４抗体はアミノ酸番号１５０〜１７０の成熟ヒトＦＧＦＲ４アミノ酸配列を含んでなるか、から基本的になるか又はからなるポリペプチドに結合する。
【００１１】
幾つかの実施態様では、抗ＦＧＦＲ４はＦＧＦＲ４活性のアンタゴニストである。幾つかの実施態様では、ＦＧＦＲ４活性はＦＧＦ誘導細胞増殖、ＦＧＦＲ４へのＦＧＦ結合、ＦＧＦ１９に曝露された細胞におけるＣＹＰ７α７発現のＦＧＦ１９−媒介阻害、又はＦＧＦ１９−誘導コロニー形成である。幾つかの実施態様では、ＦＧＦＲ４に対するＦＧＦ１及び／又はＦＧＦ１９結合が阻害される。幾つかの実施態様では、ＦＧＦＲ４に対するＦＧＦ１結合の阻害のＩＣ５０は約０．１０ｎＭであり、ＦＧＦＲ４に対するＦＧＦ１９結合の阻害のＩＣ５０は約０．１０ｎＭである。
【００１２】
幾つかの実施態様では、抗ＦＧＦＲ４抗体はモノクローナル抗体である。
【００１３】
幾つかの実施態様では、抗ＦＧＦＲ４抗体はヒト、ヒト化、又はキメラ抗体である。
【００１４】
幾つかの実施態様では、抗ＦＧＦＲ４抗体はＦＧＦＲ４に結合する抗体断片である。
【００１５】
幾つかの実施態様では、抗体は(ａ)配列番号：３のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ−Ｈ３、(ｂ)配列番号：６のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ−Ｌ３、及び(ｃ)配列番号：２のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ−Ｈ２を含む。  
【００１６】
幾つかの実施態様では、抗体は(ａ)配列番号：１のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ−Ｈ１、(ｂ)配列番号：２のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ−Ｈ２、及び(ｃ)配列番号：３のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ−Ｈ３を含む。幾つかの実施態様では、抗体は(ａ)配列番号：４のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ−Ｌ１、(ｂ)配列番号：５のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ−Ｌ２、及び(ｃ)配列番号：６のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ−Ｌ３を更に含む。  
【００１７】
幾つかの実施態様では、抗体は(ａ)配列番号：４のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ−Ｌ１、(ｂ)配列番号：５のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ−Ｌ２、及び(ｃ)配列番号：６のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ−Ｌ３を含む。幾つかの実施態様では、抗体は配列番号：９、１０、１１及び／又は１２の軽鎖可変ドメインフレームワーク配列を更に含む。
【００１８】
幾つかの実施態様では、抗体は配列番号：１３、１４、１５及び／又は１６の重鎖可変ドメインフレームワーク配列を更に含む。
【００１９】
幾つかの実施態様では、抗体は、(ａ)配列番号：７のアミノ酸配列に少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＨ配列；(ｂ)配列番号：８のアミノ酸配列に少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＬ配列；又は(ｃ)(ａ)のＶＨ配列及び(ｂ)のＶＬ配列を含む。幾つかの実施態様では、抗体は配列番号：７のＶＨ配列を含む。幾つかの実施態様では、抗体は配列番号：８のＶＬ配列を含む。
【００２０】
幾つかの実施態様では、抗体は配列番号：７のＶＨ配列及び配列番号：８のＶＬ配列を含む。
【００２１】
幾つかの実施態様では、抗体は完全長ＩｇＧ１抗体である。
【００２２】
発明はまた、ここに記載の何れかの抗体をコードする単離された核酸を提供する。
【００２３】
発明はまた、ここに記載の何れかの核酸を含んでなる宿主細胞を提供する。
【００２４】
発明はまた、抗体が生産されるようにここに記載の宿主細胞を培養することを含んでなる抗体の生産方法を提供する。幾つかの実施態様では、方法は宿主細胞から抗体を回収することを更に含む。
【００２５】
発明はまた、ここに記載の何れかの抗体及び細胞傷害剤を含んでなるイムノコンジュゲートを提供する。
【００２６】
発明はまた、ここに記載の何れかの抗体及び薬学的に許容可能な担体を含んでなる薬学的製剤を提供する。幾つかの実施態様では、薬学的製剤は更なる治療剤を更に含む。
【００２７】
発明はまた、医薬としての使用のためのここに記載の何れかの抗体を提供する。
【００２８】
幾つかの実施態様では、抗体は癌の治療における使用のためである。
【００２９】
幾つかの実施態様では、抗体は細胞増殖の阻害における使用のためである。
【００３０】
幾つかの実施態様では、抗体は医薬の製造における使用のためである。  
【００３１】
幾つかの実施態様では、医薬は癌の治療のためである。
【００３２】
幾つかの実施態様では、医薬は細胞増殖の阻害のためである。
【００３３】
発明はまた、癌を有する個体を治療する方法において、個体に有効量のここに記載の何れかの抗体を投与することを含んでなる方法を提供する。幾つかの実施態様では、方法は個体に更なる治療剤を投与することを更に含む。
【００３４】
発明はまた、個体における細胞増殖を阻害する方法において、細胞増殖を阻害するために個体に有効量のここに記載の何れかの抗体を投与することを含んでなる方法を提供する。
【００３５】
幾つかの実施態様では、癌は、乳房、肺、膵臓、脳、腎臓、卵巣、胃、白血病、子宮内膜、結腸、前立腺、下垂体、乳房線維腺腫、頭頸部、軟部組織、神経芽細胞腫、メラノーマ、子宮内膜、精巣、胆管細胞癌、胆嚢及び／又は肝臓の癌である。
【００３６】
ある実施態様では、癌はＦＧＦＲ４発現(例えば過剰発現)、増幅、又は活性化を呈する。ある実施態様では、癌はＦＧＦＲ４増幅を呈する。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】ＦＧＦＲ４はＦＧＦ１９−媒介肝腫瘍形成に必要である。Ａ、年齢１０ヶ月のＦＧＦ１９−ＴＧ：ＦＧＦＲ４−ＷＴマウスの肝臓表面から突出する複数の大きい隆起腫瘍(矢印)(左パネル)。年齢１０ヶ月のＦＧＦ１９−ＴＧ：ＦＧＦＲ４−ＫＯマウスからの肝臓(右パネル)。Ｂ、ＦＧＦＲ４−ＫＯ又はＦＧＦＲ４−ＷＴマウスで交配された雌(左パネル)及び雄(右パネル)ＦＧＦ１９−ＴＧ又は野生型マウスにおけるＢｒｄＵ取り込み。Ｃ、ＤＥＮで処置された年齢４ヶ月のＦＧＦ１９−ＴＧ：ＦＧＦＲ４−ＷＴマウスの肝臓の表面上の複数の大きい隆起腫瘍(矢印)。Ｄ、肉眼及び組織学的検査で決定されるＤＥＮで処置された雄及び雌ＦＧＦ１９−ＴＧマウスにおける肝腫瘍の有病率。Ｅ、ＤＥＮで処置されたＦＧＦ１９−ＴＧ又は野生型雌(左パネル)及び雄(右パネル)マウスからの肝重量。アステリスク(＊)は、肝臓の重量はＤＥＮで処置された雄ＦＧＦ１９−ＴＧマウスについては７ヶ月の時点から測定不可能であることを示し、なぜなら６ヶ月の年齢を超すと何れも生存しなかったからである。Ｆ、ＤＥＮで処置されたＦＧＦ１９−ＴＧ又は野生型雌(左パネル)及び雄(右パネル)ＦＧＦＲ４−ＫＯマウスの肝重量。
【図２】ＦＧＦＲ４へのＬＤ１結合。Ａ、ＬＤ１はヒト(ｈ)、マウス(ｍ)、及びカニクイザル(ｃ)ＦＧＦＲ４に結合するが、ｈＦＧＦＲ１、ｈＦＧＦＲ２、又はｈＦＧＦＲ３に結合しない。固定化ＦＧＦＲ−Ｆｃキメラタンパク質へのＬＤ１の結合を固相結合アッセイで決定した。Ｂ、表面プラズモン共鳴で決定されるマウス、カニクイザル、及びヒトＦＧＦＲ４へのＬＤ１結合の親和性。Ｃ、ＦＡＣＳで測定される安定してトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞の細胞表面に発現されたｈＦＧＦＲ４へのＬＤ１の結合(ＲＦＵ＝相対蛍光単位)。Ｄ、固相結合アッセイで決定される点変異を持つ固定化ｈＦＧＦＲ４−Ｆｌａｇキメラタンパク質へのＬＤ１の結合。Ｅ、ウエスタンブロットで決定される点変異を持つｈＦＧＦＲ４−Ｆｌａｇキメラタンパク質へのＬＤ１の結合。変異タンパク質を電気泳動し、ＬＤ１、抗ＦＧＦＲ４(８Ｇ１１)、及び抗Ｆｌａｇ抗体を使用して逐次的に免疫ブロットした。Ｆ、ＦＧＦ１９(灰色)に結合したＦＧＦＲ４(黒及び白)上のＧ１６５(黒)の位置を示す二量体モデル。
【図３】ＬＤ１はＦＧＦＲ４活性を阻害する。Ａ、ＬＤ１はＦＧＦ１及びＦＧＦ１９へのＦＧＦＲ４結合を阻害し、固相結合アッセイで決定される。Ｂ、ＬＤ１はＦＧＦＲ４／Ｒ１を安定に発現するＢａＦ３細胞のＦＧＦ１−刺激増殖を阻害する。Ｃ、ＬＤ１はＦＧＦＲ４を安定に発現するＬ６細胞におけるＦＧＦＲ４シグナル伝達を阻害する。Ｄ、ＬＤ１を使用したＦＡＣＳ分析で決定される肝腫瘍細胞株のサブセットにおけるＦＧＦＲ４タンパク質の細胞表面発現。
【図４】ＬＤ１は肝癌細胞株におけるＦＧＦＲ４生物学的活性を阻害する。Ａ、ＬＤ１はＨＥＰ３Ｂ細胞におけるＦＧＦＲ４シグナル伝達を阻害し、ウエスタンブロットで評価される。Ｂ、ＬＤ１はＨＥＰ３Ｂ細胞におけるＦＧＦＲ４−制御化ＣＹＰ７α１発現を阻害する。ＣＹＰ７α１レベルは未処置細胞におけるレベルに対する倍発現として表される。Ｃ、ＬＤ１は肝癌細胞株のパネルにおいてＦＧＦＲ４−制御化ｃ−Ｆｏｓ発現を阻害する。結果は未処置細胞におけるｃ−Ｆｏｓレベルに対する倍発現として表される。Ｄ、ＦＧＦＲ４ｓｈＲＮＡドキシサイクリン−誘導ベクターで安定にトランスフェクトされたＪＨＨ５細胞におけるＦＧＦＲ４発現の抑制によるコロニー形成の阻害。Ｅ、ＬＤ１はＨＣＣ細胞株コロニー形成を阻害する。Ｆ、ＬＤ１−阻害化肝癌細胞株コロニー形成の数え上げ。値は添加ＬＤ１の非存在において数え上げられたコロニーの数のパーセントとして表される。
【図５】ＬＤ１のインビボ効果。Ａ、ＬＤ１はマウス肝臓におけるＦＧＦ１９−制御化ｃ−Ｆｏｓ発現を阻害する。結果は非処置マウスの肝臓におけるｃ−Ｆｏｓレベルに対する倍発現として表される。Ｂ、ＬＤ１(３０ｍｇ／ｋｇ；週に２回)はインビボでＨＵＨ７異種移植腫瘍増殖を阻害する。Ｃ、図５ＢからのＨＵＨ−７異種移植腫瘍におけるＦＧＦＲ４、ＣＹＰ７α１、ｃ−Ｆｏｓ、及びｅｇｒ−１のｍＲＮＡ発現におけるＬＤ１の効果。Ｄ、コントロール抗体で処置されたＤＥＮ−促進化ＦＧＦ１９−ＴＧ：ＦＧＦＲ４−ＷＴマウスの肝臓表面から突出した複数の大きい隆起腫瘍(矢印)(上パネル)。ＬＤ１で処置されたＤＥＮ−促進化ＦＧＦ１９−ＴＧ：ＦＧＦＲ４−ＷＴマウスの肝臓(下パネル)。Ｅ、コントロール抗体、ＬＤ１、又は１Ａ６(抗ＦＧＦ１９抗体)で処置されたＤＥＮ−促進化ＦＧＦ１９−ＴＧ：ＦＧＦＲ４−ＷＴマウスの肝重量。
【図６】ＦＧＦＲ４発現は癌において調節解除される。Ａ、箱ひげプロットはＢｉｏＥｘｐｒｅｓｓデータベースのｍＲＮＡ分析で決定されるヒト腫瘍及び正常組織におけるＦＧＦＲ４発現を示す。中心線は中央値を示す；箱は第一及び第三四分位間の四分位範囲を表す。「ひげ」は四分位間から極値の位置まで延在する。Ｂ、乳房(Ｘ１００拡大率)及び膵臓(Ｘ１００拡大率)腺癌、及び肝細胞癌(Ｘ２００拡大率及びＸ４００拡大率)のサンプルにおけるＦＧＦＲ４免疫染色。Ｃ、ｑＲＴ−ＰＣＲで決定されるヒト正常肝及び肝腫瘍のパネルにおけるＦＧＦＲ４ｍＲＮＡ発現。各サンプルの値をサンプルＮ１において観察されるレベルに対する倍発現として表す。
【図７】肝癌細胞株におけるＦＧＦＲの発現。Ａ、ｑＲＴ−ＰＣＲで決定される肝腫瘍細胞株のパネルにおけるＦＧＦＲ４ｍＲＮＡ発現。値はＪＨＨ４細胞株におけるＦＧＦＲ１レベルに対する倍発現として表される。Ｂ、ウエスタンブロットで決定される図Ｓ１Ａにおける同じパネルの細胞株におけるＦＧＦＲ４タンパク質発現。
【図８】ＬＤ１はＨＵＨ７細胞におけるＦＧＦＲ４生物学的活性を阻害する。ＬＤ１はＨＵＨ７細胞におけるＦＧＦＲ４−制御化ＣＹＰ７α１抑制を阻害する。ＣＹＰ７α１レベルは未処置細胞におけるレベルに対する倍発現として表される。
【図９】ＬＤ１のインビボ効果。ＬＤ１(３０ｍｇ／ｋｇ)はインビボでのＨＵＨ７異種移植腫瘍増殖を阻害する。ＬＤ１の抗腫瘍効果を隔週モダリティにおいて評価した。
【図１０】抗ＦＧＦＲ４のマウス及びヒト化変異体の可変ドメイン配列。マウスＬＤ１及びヒト化変異体ｈＬＤ１．ｖＢ及びｈＬＤ１．ｖ２２のアミノ酸配列をトラスツズマブにおいて使用される(Ａ)ヒトカッパＩ(ｈｕＫＩ)及び(Ｂ)ヒトＶＨサブグループＩＩＩ(ｈｕＩＩＩ)可変ドメインフレームワークとアラインする。差異をドットボックスにおいてハイライトし、位置をＫａｂａｔに従って番号付けする。マウスＬＤ１からヒト可変カッパＩ及びサブグループＩＩＩコンセンサスフレームワークに移植された超可変領域を配列、構造及び接触ＣＤＲ定義の組合せに基づいて選択し(MacCallum RM等. J of Molec Biol (1996); 262:732-45)、ボックスで囲む。軽鎖における３つのバーニヤ位置を変更し、ヒト化の間親和性を回復した；これらの位置は曝露される表面であるとは予測されていなかった。
【図１１】抗ＦＧＦＲ４抗体変異体の薬物動態及び分布。(Ａ)ＦＧＦＲ４  ＥＬＩＳＡを使用したＦＧＦＲ４へのｃｈＬＤ１及びｈＬＤ１．ｖＢの結合の比較。(Ｂ)ＣＲＬｎｕ／ｎｕマウスにおけるＨＵＨ７ヒト肝細胞癌異種移植モデルにおけるｃｈＬＤ１、ｈＬＤ１．ｖＢ及びビヒクルの１６日目の腫瘍体積の比較。抗体を週に２回３０ｍｇ／ｋｇで投与した(１０マウス／グループ)。ｃｈＬＤ１のみがＰＢＳコントロールと比較して腫瘍増殖の低減に有効であり(ｐ値＝０．０１４)、ｈＬＤ１．ｖＢは有意には有効ではなかった(ｐ値＝０．４８６)。(Ｃ)ｃｈＬＤ１及びｈＬＤ１．ｖＢＮＣＲヌードマウスの薬物動態を１又は２０ｍｇ／ｋｇＩＶで投与し、サンプルをＦＧＦＲ４  ＥＬＩＳＡを使用して分析した。類似な結果がＩｇＧ ＥＬＩＳＡを使用して得られた(示さず)。(Ｄ)ＮＣＲヌードマウスにおける１２５Ｉ−ｃｈＬＤ１及び１２５Ｉ−ｈＬＤ１．ｖＢの組織分布。マウスに１２５Ｉ−ｃｈＬＤ１又は１２５Ｉ−ｈＬＤ１．ｖＢを投与し、組織の注入投与量／グラムのパーセント(％ＩＤ／ｇ)を方法に記載のように投与の２時間後に決定した。
【図１２】ｈＬＤ１．ｖＢ及びマウスＣ３ｄ間の相互作用の同定。(Ａ)ＰＢＳ／ＢＳＡ又はＮＣＲヌードマウス、ラット、ヒト及びカニクイザル血漿における４８時間のインキュベーション後のｃｈＬＤ１(斜線バー)及びｈＬＤ１．ｖＢ(白色バー)の検出。パーセント回収をＦＧＦＲ４ ＥＬＩＳＡを使用して決定した。(Ｂ)１２５Ｉ−ｃｈＬＤ１(中実線)及び１２５Ｉ−ｈＬＤ１．ｖＢ(点線)の血漿結合分析。トレースはオフセットである；ドットは１５０ｋＤａピークの位置を示す。抗体を０及び４８時間マウス血漿においてインキュベートし、その後サイズ排除ＨＰＬＣを使用して分析した。ＰＢＳ／ＢＳＡにおけるインキュベーションでは、ヒト血漿又はカニクイザル血漿であり、図１５を参照のこと。全インキュベーションはＩｇＧに対応する予測された１５０ｋＤａでピークを生じた。高分子量ピークはｈＬＤ１．ｖＢを含有するマウス血漿サンプルにおいてのみ観察された。最初の時間点はおよそ２７０及びおよそ５５０ｋＤａで更なるピークを示したが、４８時間では２７０ｋＤａピークのみが観察された。高分子量ピークはｈＬＤ１．ｖＢ／マウス血漿インキュベーションがｐＨ４で実施された場合には観察されず、これらの高分子量ピークの存在がｐＨ依存であることを示す(図１５)。(Ｃ)マウス血漿の免疫沈降。ｃｈＬＤ１及びｈＬＤ１．ｖＢを３７°Ｃで２４時間マウス血漿においてインキュベートし、サイズ排除ＨＰＬＣで分析した。次いでプロテインＧビーズを画分に加え、その後ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析をした。およそ３７ｋＤａでのバンドがｈＬＤ１．ｖＢ／マウス血漿サンプル(レーン３)に存在する２７０ｋＤａピークに対応する画分において検出されたが、カニクイザル又はヒト血漿又はＰＢＳ／ＢＳＡからのサンプルでは検出されなかった(図１５)。このバンドはマウス血漿のみ(レーン４)又はｃｈＬＤ１でインキュベートされたマウス血漿(レーン２)において観察されなかった。タンパク質分子量マーカーをレーン１において実行した。(Ｄ)ｈＬＤ１．ｖＢでの免疫沈降から得られたマウスＣ３のＭＳ／ＭＳ配列包括度。マウスＣ３の配列を示し(配列番号：３８)、Ｃ３ｄをコードする領域に下線をひく。同定されたペプチドは以下の通りである：ＤＶＰＡＡＤＬＳＤＱＶＰＤＴＤＳＥＴＲＩＩＬＱＧＳＰＶＶＱＭＡＥＤＡＶＤＧＥＲ(配列番号：１７)ＲＱＥＡＬＥＬＩＫＫＧＹＴＱＱＬＡＦＫ(配列番号：１８)ＡＡＦＮＮＲＰＰＳＴＷＬＴＡＹＶＶＫ(配列番号：１９)ＡＡＮＬＩＡＩＤＳＨＶＬＣＧＡＶＫ(配列番号：２０)ＱＫＰＤＧＶＦＱＥＤＧＰＶＩＨＱＥＭＩＧＧＦＲ(配列番号：２１)ＥＡＤＶＳＬＴＡＦＶＬＩＡＬＱＥＡＲＤＩＣＥＧＱＶＮＳＬＰＧＳＩＮＫＡＧＥＹＩＥＡＳＹＭＮＬＱＲＰＹＴＶＡＩＡＧＹＡＬＡＬＭＮＫ(配列番号：２２)ＷＥＥＰＤＱＱＬＹＮＶＥＡＴＳＹ(配列番号：２３)ＹＹＧＧＧＹＧＳＴＱＡＴＦＭＶＦＱＡＬＡＱＹＱＴＤＶＰＤＨＫ(配列番号：２４)ＧＴＬＳＶＶＡＶＹＨＡＫ(配列番号：２５)ＤＬＥＬＬＡＳＧＶＤＲ(配列番号：２６)ＮＴＬＩＩＹＬＥＫ(配列番号：２７)。
【図１３】Ｃ３ｄ結合を欠く親和性成熟抗ＦＧＦＲ４変異体。(Ａ)ＦＧＦＲ４ＥＬＩＳＡを使用した評価より前にＮＣＲヌード、Ｃ３野生型(ｗｔ)及びＣ３ｋｏマウス血清において１６時間インキュベートされたｃｈＬＤ１、ｈＬＤ１．ｖＢ及びｈＬＤ１．ｖ２２のＦＧＦＲ４結合の検出。サンプルをＰＢＳ／０．５％ＢＳＡにおいてインキュベートされた同一のサンプルに対して正規化した。(Ｂ)ｈＬＤ１．ｖ２２によるマウスＣ３ｄ免疫沈降の欠如。ｃｈＬＤ１(レーン２)、ｈＬＤ１．ｖＢ(レーン３)及びｈＬＤ１．ｖ２２(レーン４)を使用したＮＣＲヌードマウス血漿からの免疫沈降をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。〜３７ｋＤａでのバンドはｈＬＤ１．ｖＢ／マウス血漿サンプルにおいてのみ検出された。タンパク質分子量マーカーをレーン１において実行した。
【図１４】Ｃ３ｄ結合の欠如は薬物動態及び効果を回復させる。(Ａ)Ｃ３ｗｔ及びＣ３ｋｏマウスにおけるｃｈＬＤ１及びｈＬＤ１．ｖＢの薬物動態分析。抗体を２０ｍｇ／ｋｇで静脈内に投与した；血液におけるそれらの濃度をＦＧＦＲ４ＥＬＩＳＡを使用してモニタした。Ｃ３ｋマウスにおけるｈＬＤ１．ｖＢのクリアランスはＣ３ｋｏ及びＣ３ｗｔマウス双方におけるｃｈＬＤ１のものと類似する。(Ｂ)ＮＣＲヌードマウスにおけるｃｈＬＤ１ｈＬＤ１．ｖＢ及びｈＬＤ１．ｖ２２の薬物動態分析。抗体を２０ｍｇ／ｋｇで静脈内に投与した；血液におけるそれらの濃度をＦＧＦＲ４ ＥＬＩＳＡを使用してモニタした。ｈＬＤ１．ｖ２２のクリアランスはｃｈＬＤ１のものに類似する。(Ｃ)ＣＲＬｎｕ／ｎｕマウスにおけるＨＵＨ７ ヒトＨＣＣ異種移植モデルにおけるｃｈＬＤ１ ｈＬＤ１．ｖＢ及びｈＬＤ１．ｖ２２の比較。抗体を毎週３０ｍｇ／ｋｇで投与し(１０マウス／グループ)、腫瘍体積を４週間モニタした。２１日目にｃｈＬＤ１及びｈＬＤ１．ｖ２２(それぞれｐ値＝７ｘ１０−７及び３ｘ１０−５)はＰＢＳコントロール(中空四角)と比較して腫瘍増殖の低減に効果的であったが、ｈＬＤ１．ｖＢはわずかのみ効果的だった(ｐ値＝０．０１１)。
【図１５】インビトロ(Ａ−Ｂ)及びインビボ試験(Ｃ)サンプルからの血漿における放射標識ｃｈＬＤ１及びｈＬＤ１．ｖＢのサイズ排除ＨＰＬＣ分析。１２５Ｉ−ｈＬＤ１．ｖＢ(Ａ)及び１２５Ｉ−ｃｈＬＤ１(Ｂ)をＰＢＳ／ＢＳＡ又はマウス、ヒト及びカニクイザル血漿に加え、０又は４８時間にサイズ排除ＨＰＬＣで分析した。全トレースはＩｇＧの予測された１５０ｋＤａ(右のピーク)でピークを呈した。およそ２７０(真ん中のピーク)及びおよそ５５０ｋＤａ(左のピーク)での高分子量ピークがｈＬＤ１．ｖＢを含有する最初のマウス血漿サンプルにおいてのみ観察された；４８時間では更なる２７０ｋＤａピークのみが観察された。これらの高分子量ピークはｐＨ４．０のマウス血漿においてｈＬＤ１．ｖＢでは観察されず、高分子量ピークの生成がｐＨ依存であることを示す。高分子量ピークはカニクイザル又はヒト血漿又はｃｈＬＤ１が加えられたいかなる血漿においても観察されなかった；(Ｃ)インビボマウス血漿サンプル。マウスに、ｃｈＬＤ１については１２．５２μＣｉ／μｇ及びｈＬＤ１．ｖＢについては９．９９μＣｉ／ｕｇの比活性を有する〜０．１ｍｇ／ｋｇの抗体を投与した。血清サンプルを０．２５、２、５、２４、７２及び１２０時間で収集した。全トレースはＩｇＧの予測された１５０ｋＤａ(右のピーク)でピークを呈した。〜２７０(真ん中のピーク)及び〜５５０ｋＤａ(左のピーク)での高分子量ピークはｈＬＤ１．ｖＢ血清サンプルにおいてのみ観察された。高分子量ピークはｃｈＬＤ１では観察されなかった。
【図１６】免疫沈降及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。抗体を３７℃で２４時間血漿においてインキュベートし、次いでサイズ排除ＨＰＬＣで分画化した。プロテインＧビーズを高分子量ピークを有するサイズ排除ＨＰＬＣ分画に加えた。プルダウンサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。(Ａ)インビトロラット血漿；(Ｂ)インビトロカニクイザル血漿；(Ｃ)インビトロヒト血漿。〜３７ｋＤａのタンパク質がｈＬＤ１．ｖＢでインキュベートされたラットサンプルにおいて検出されたが、カニクイザル及びヒトサンプルでは検出されなかった(それらのそれぞれのゲルのレーン４)。いかなるブランク血漿(各ゲルのレーン２)又はｃｈＬＤ１サンプル(各ゲルのレーン３)においても〜３７ｋＤａタンパク質ではバンドは観察されなかった。タンパク質分子量マーカーをレーン１において実行した。(Ｄ)インビボマウス血漿。マウスに「方法」に記載のようにｈＬＤ１．ｖＢ又はｃｈＬＤ１を投与した。次いでプロテイン−Ｇビーズを２時間の投与後時点から収集された血清サンプルに加え、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。〜３７ｋＤａでのバンドはｈＬＤ１．ｖＢ(レーン３)において検出されたが、ｃｈＬＤ１血清サンプル(レーン２)では検出されなかった。タンパク質分子量マーカーをレーン１において実行した。
【図１７】Ｃ３ｗｔ血清、Ｃ３ｋｏマウス血清、及びＰＢＳ／ＢＳＡに加えられたｃｈＬＤ１及びｈＬＤ１．ｖＢのＥＬＩＳＡ検出。抗体を血清又はＰＢＳ／ＢＳＡにおいて一晩インキュベートし、次いでＥＬＩＳＡで分析した。ＰＢＳ／ＢＳＡと比較して、ｈＬＤ１．ｖＢはＣ３ｋｏマウス血清において十分に回収されたが、Ｃ３ｗｔマウス血清では回収されなかった。ｃｈＬＤ１は全マトリックスから十分に回収された。
【図１８】ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＢ２５７８８の例示的なヒトＦＧＦＲ４アミノ酸配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
(発明の実施態様の詳細な説明)
Ｉ．(定義)
ここでの目的のための「アクセプターヒトフレームワーク」は、下に定義するようにヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークから得られる軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)フレームワーク又は重鎖可変ドメイン(ＶＨ)フレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワーク「から得られる」アクセプターヒトフレームワークは、その同じアミノ酸配列を含むか、又はアミノ酸配列変化を含んでいてもよい。幾つかの実施態様では、アミノ酸変化の数は、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下又は２以下である。幾つかの実施態様では、ＶＬアクセプターヒトフレームワークは、ＶＬヒト免疫グロブリンフレームワーク配列又はヒトコンセンサスフレームワーク配列と配列が同一である。
【００３９】
「親和性」は、分子(例えば抗体)の単一の結合部位とその結合パートナー(例えば抗原)との間の非共有相互作用の合計の強度を意味する。特に示さない限り、ここで使用される場合、「結合親和性」は、結合対のメンバー(例えば、抗体と抗原)間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を意味する。分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、一般に、解離定数(Ｋｄ)により表すことができる。親和性は、ここに開示されたものを含む、当該分野で知られている一般的な方法により測定することができる。結合親和性を測定するための、特定の例証及び例示的実施態様を以下に記載する。
【００４０】
「親和性成熟」抗体は、一又は複数の超可変領域(ＨＶＲ)における一又は複数の変化を有する抗体であって、このような変化を持たない親抗体と比較され、このような変化は抗原に対する抗体の親和性における改善をもたらす。
【００４１】
抗血管新生剤は血管の発生をある程度、阻止又は干渉する化合物を指す。抗血管新生剤は、例えば血管新生の促進に関与する増殖因子又は増殖因子受容体に結合する小分子又は抗体でありうる。一実施態様では、抗血管新生剤は血管内皮増殖因子(ＶＥＧＦ)、例えばベバシズマブ(ＡＶＡＳＴＩＮ(登録商標))に結合する抗体である。
【００４２】
「抗ＦＧＦＲ４抗体」及び「ＦＧＦＲ４に結合する抗体」なる用語は、抗体がＦＧＦＲ４を標的にする診断及び／又は治療剤として有用であるような、十分な親和性でＦＧＦＲ４に結合できる抗体を指す。一実施態様では、無関係な非ＦＧＦＲ４タンパク質への抗ＦＧＦＲ４抗体の結合の程度は、ＦＧＦＲ４への抗体の結合の約１０％未満であり、例えばラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)で測定される。ある実施態様では、ＦＧＦＲ４に結合する抗体は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ(例えば１０−８Ｍ以下、例えば１０−８Ｍ〜１０−１３Ｍ、例えば１０−９Ｍ〜１０−１３Ｍ)の解離定数(Ｋｄ)を有する。ある実施態様では、抗ＦＧＦＲ４抗体は異なる種からのＦＧＦＲ４間で保存されているＦＧＦＲ４のエピトープに結合する。
【００４３】
「抗体」なる用語はここでは、最も広い意味において使用され、様々な抗体構造を包含し、限定するものではないがモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体(例えば二重特異性抗体)、及び所望の抗原結合活性を呈する限り抗体断片を含む。
「抗体断片」は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部を含むインタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例は、限定するものではないがＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ(ａｂ’)２；ダイアボディ；線状抗体；単鎖抗体分子(例えばｓｃＦｖ)；及び抗体断片から形成される多重特異性抗体を含む。
【００４４】
参照抗体と「同じエピトープに結合する抗体」は、参照抗体のその抗原への結合を競合アッセイにおいて５０％以上阻止する抗体を指し、逆に、参照抗体は抗体のその抗原への結合を競合アッセイにおいて５０％以上阻止する。例示的な競合アッセイがここに提供されている。
【００４５】
「ＦＧＦＲ４」なる用語は、ここで使用される場合、別段に記載される場合を除き、霊長類(例えばヒト)及びげっ歯類(例えばマウス及びラット)などの哺乳類を含む何れかの脊椎動物供給源からの何れかの天然ＦＧＦＲ４を指す。用語は「完全長」、非プロセシングＦＧＦＲ４並びに細胞におけるプロセシングから生じるＦＧＦＲ４の何れかの形態を包含する。用語はまたＦＧＦＲ４の天然に生じる変異体、例えばスプライスバリアント又は対立遺伝子多型を包含する。例示的なヒトＦＧＦＲ４のアミノ酸配列を図１８に示す。
【００４６】
「ＦＧＦＲ４活性化」は、ＦＧＦＲ４受容体の活性化、又はリン酸化を指す。一般的に、ＦＧＦＲ４活性化はシグナル伝達(例えばＦＧＦＲ４又は基質ポリペプチドにおけるチロシン残基をリン酸化するＦＧＦＲ４受容体の細胞内キナーゼドメインによって引き起こされる)をもたらす。ＦＧＦＲ４活性化は興味のＦＧＦＲ４受容体へのＦＧＦＲ４リガンド(Ｇａｓ６)結合によって媒介されうる。ＦＧＦＲ４へのＧａｓ６結合はＦＧＦＲ４のキナーゼドメインを活性化し得、これによって、ＦＧＦＲ４におけるチロシン残基のリン酸化及び／又は更なる基質ポリペプチドにおけるチロシン残基のリン酸化がもたらされる。
【００４７】
「癌」及び「癌性」なる用語は、典型的には調節されない細胞増殖／増殖によって特徴付けられる哺乳類における生理学的状態を指すか又は説明する。癌の例は、限定するものではないが、細胞腫、リンパ腫(例えばホジキン及び非ホジキンリンパ腫)、芽細胞腫、肉腫、及び白血病を含む。このような癌のより特定の例は、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、肺の扁平上皮癌、腹膜の癌、肝細胞癌、胃腸癌、膵癌、神経膠腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝細胞腫、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜又は子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、肝臓癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝細胞癌、白血病及び他のリンパ増殖性障害、及び様々なタイプの頭頸部癌を含む。
【００４８】
「細胞増殖性疾患」及び「増殖性疾患」なる用語は、ある程度の異常な細胞増殖と関係している疾患を指す。一実施態様では、細胞増殖性疾患は癌である。
【００４９】
「化学療法剤」は、癌の治療に有用な化学的化合物である。化学療法剤の例には、チオテパ及びシクロホスファミド(CYTOXAN(商標登録))のようなアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンのようなスルホン酸アルキル類；ベンゾドーパ(benzodopa)、カルボコン、メツレドーパ(meturedopa)、及びウレドーパ(uredopa)のようなアジリジン類；アルトレートアミン(altretamine)、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド及びトリメチロメラミン(trimethylolomelamine)を含むエチレンイミン類及びメチラメラミン類；アセトゲニン(特にブラタシン及びブラタシノン)；デルタ−９−テトラヒドロカンナビノール(ドロナビロール、MARINOL(登録商標))；β−ラパコン；ラパコール；コルヒチン；ベツリン酸；カンプトテシン(合成アナログトポテカン(HYCAMTIN(登録商標)、ＣＰＴ−１１(イリノテカン、CAMPTOSAR(登録商標))、アセチルカンプトテシン、スコポレチン、及び９−アミノカンプトテシンを含む)；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ-１０６５(そのアドゼレシン、カルゼレシン及びビゼレシン合成アナログを含む)；ポドフィロトキシン；ポドフィリン酸；テニポシド；クリプトフィシン(特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８)；ドラスタチン；ドゥオカルマイシン(合成アナログ、ＫＷ-２１８９及びＣＢ１-ＴＭ１を含む)；エリュテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチン；スポンジスタチン；クロラムブシル、クロルナファジン(chlornaphazine)、クロロホスファミド、エストラムスチン、イフォスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン(novembichin)、フェネステリン(phenesterine)、プレドニムスチン(prednimustine)、トロフォスファミド(trofosfamide)、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン(chlorozotocin)、フォテムスチン(fotemustine)、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンなどのニトロスレア；抗生物質、例えばエネジイン抗生物質(例えば、カリケアマイシン(calicheamicin)、特にカリケアマイシンγ１Ｉ及びカリケアマイシンωＩ１(例えばNicolaou等, Angew. Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)参照)；ＣＤＰ３２３、経口α-４インテグリンインヒビター；ダイネマイシン(dynemicin)Ａを含むダイネマイシン；エスペラマイシン；並びにネオカルチノスタチン発色団及び関連する色素タンパクエネジイン抗生物質発色団)、アクラシノマイシン類(aclacinomysins)、アクチノマイシン、オースラマイシン(authramycin)、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン(cactinomycin)、カラビシン(carabicin)、カルミノマイシン、カルジノフィリン(carzinophilin)、クロモマイシン類、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン(detorubicin)、６-ジアゾ-５-オキソ-Ｌ-ノルロイシン、ドキソルビシン(ADRIAMYCIN(登録商標)、モルホリノ-ドキソルビシン、シアノモルホリノ-ドキソルビシン、２-ピロリノ-ドキソルビシン、ドキソルビシンＨＣｌリポソーム注射(ＤＯＸＩＬ(登録商標))、リポソームドキソルビシンＴＬＣ Ｄ−９９(ＭＹＯＣＥＴ(登録商標))、ペグ化リポソームドキソルビシン(ＣＡＥＬＹＸ(登録商標))及びデオキシドキソルビシンを含む)、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マーセロマイシン(marcellomycin)、マイトマイシンＣのようなマイトマイシン、マイコフェノール酸(mycophenolic acid)、ノガラマイシン(nogalamycin)、オリボマイシン(olivomycins)、ペプロマイシン、ポルフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン(quelamycin)、ロドルビシン(rodorubicin)、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン(tubercidin)、ウベニメクス、ジノスタチン(zinostatin)、ゾルビシン(zorubicin)；代謝拮抗剤、例えばメトトレキセート、ゲムシタビン(ＧＥＭＺＡＲ(登録商標))、テガフール(ＵＦＴＯＲＡＬ(登録商標))、カペシタビン(ＸＥＬＯＤＡ(登録商標))、エポチロン及び５-フルオロウラシル(５-ＦＵ)；葉酸アナログ、例えばデノプテリン(denopterin)、メトトレキセート、プテロプテリン(pteropterin)、トリメトレキセート(trimetrexate)；プリンアナログ、例えばフルダラビン(fludarabine)、６-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジンアナログ、例えばアンシタビン、アザシチジン(azacitidine)、６-アザウリジン(azauridine)、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン(enocitabine)、フロキシウリジン(floxuridine)；アンドロゲン類、例えばカルステロン(calusterone)、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン(testolactone)；抗副腎剤、例えばアミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；葉酸リプレニッシャー(replenisher)、フロリン酸(frolinic acid)；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン(amsacrine)；ベストラブシル(bestrabucil)；ビサントレン(bisantrene)；エダトラキセート(edatraxate)；デフォファミン(defofamine)；デメコルシン(demecolcine)；ジアジコン(diaziquone)；エルフォルニチン(elfornithine)；酢酸エリプチニウム(elliptinium acetate)；エポチロン(epothilone)；エトグルシド(etoglucid)；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン(lonidainine)；メイタンシノイド(maytansinoid)類、例えばメイタンシン(maytansine)及びアンサミトシン(ansamitocine)；ミトグアゾン(mitoguazone)；ミトキサントロン；モピダモール(mopidanmol)；ニトラクリン(nitracrine)；ペントスタチン；フェナメット(phenamet)；ピラルビシン；ロソキサントロン；２-エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ(登録商標)多糖複合体(JHS Natural Products, Eugene, OR)；ラゾキサン(razoxane)；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム(spirogermanium)；テニュアゾン酸(tenuazonic acid)；トリアジコン(triaziquone)；２,２',２''-トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン類(特にＴ-２毒素、ベラクリン(verracurin)Ａ、ロリジン(roridine)Ａ及びアングイジン(anguidine))；ウレタン；ビンデシン(ＥＬＩＤＩＳＩＮＥ(登録商標)、ＦＩＬＤＥＳＩＮ(登録商標))；ダカルバジン；マンノムスチン(mannomustine)；ミトブロニトール；ミトラクトール(mitolactol)；ピポブロマン(pipobroman)；ガシトシン(gacytosine)；アラビノシド(「Ａｒａ-Ｃ」)；チオテパ；タキソイド、例えばパクリタキセル(ＴＡＸＯＬ(登録商標))、パクリタキセルのアルブミン操作ナノ粒子製剤(ＡＢＲＡＸＡＮＥＴＭ)およびドセタキセル(ＴＡＸＯＴＥＲＥ(登録商標))；クロランブシル；６-チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；プラチナ薬剤、例えばシスプラチン、オキサリプラチン(例えばＥＬＯＸＡＴＩＮ(登録商標))及びカルボプラチン；チューブリン重合が微小管を形成するのを妨げるビンカ、例えばビンブラスチン(ＶＥＬＢＡＮ(登録商標))、ビンクリスチン(ＯＮＣＯＶＩＮ(登録商標))、ビンデシン(ＥＬＤＩＳＩＮＥ(登録商標)、ＦＩＬＤＥＳＩＮ(登録商標))およびビノレルビン(ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ(登録商標))；エトポシド(ＶＰ-１６)；イホスファミド；マイトキサントロン；ロイコボリン；ノバントロン(novantrone)；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；イバンドロナート(ibandronate)；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチロールニチン(ＤＭＦＯ)；レチノイン酸などのレチノイド、例えばベキサロテン(ＴＡＲＧＲＥＴＩＮ(登録商標))；ビスホスホネート、例えばクロドロネート(例えばＢＯＮＥＦＯＳ(登録商標)又はＯＳＴＡＣ(登録商標))、エチドロン酸(ＤＩＤＲＯＣＡＬ(登録商標))、ＮＥ−５８０９５、ゾレドロン酸／ゾレドロネート(ZOMETA(登録商標))、アレンドロネート(ＦＯＳＡＭＡＸ(登録商標))、パミドロン酸(ＡＲＥＤＩＡ(登録商標))、チルドロネート(ＳＫＥＬＩＤ(登録商標))、又はリセドロネート(ＡＣＴＯＮＥＬ(登録商標))；トロキサシタビン(１,３-ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体)；アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に異常な細胞増殖に関係するシグナル伝達経路における遺伝子の発現を阻害するもの、例えばＰＫＣ−α、Ｒａｆ、Ｈ−Ｒａｓ及び上皮増殖因子レセプター(ＥＧＦ-Ｒ)；ワクチン、例えばＴＨＥＲＡＴＯＰＥ(登録商標)ワクチン及び遺伝子治療ワクチン、例えばＡＬＬＯＶＥＣＴＩＮ(登録商標)ワクチン、ＬＥＵＶＥＣＴＩＮ(登録商標)ワクチン及びＶＡＸＩＤ(登録商標)ワクチン；トポイソメラーゼ１インヒビター(例えばＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ(登録商標))；ｒｍＲＨ(例えばＡＢＡＲＥＬＩＸ(登録商標))；ＢＡＹ４３９００６(ソラフェニブ；Bayer)；ＳＵ-１１２４８(スニチニブ、ＳＵＴＥＮＴ(登録商標)、Pfizer)；ペリホシン、ＣＯＸ-２インヒビター(例えばセレコキシブ又はエトリコキシブ)、プロテオゾームインヒビター(例えばＰＳ３４１)；ボルテゾミブ(ＶＥＬＣＡＤＥ(登録商標))；ＣＣＩ-７７９；ティピファニブ(Ｒ１１５７７)；オラフェニブ(orafenib)、ＡＢＴ５１０；Ｂｃｌ−２インヒビター、例えばオブリメルセンナトリウム(ＧＥＮＡＳＥＮＳＥ(登録商標))；ピクサントロン；ＥＧＦＲインヒビター(下の定義を参照)；チロシンキナーゼインヒビター(下の定義を参照)；セリン−スレオニンキナーゼインヒビター、例えばラパマイシン(シロリムス、ＲＡＰＡＭＵＮＥ(登録商標))；ファルネシルトランスフェラーゼインヒビター、例えばロナファーニブ(ＳＣＨ６６３６、ＳＡＲＡＳＡＲＴＭ)；及び上述したものの薬学的に許容可能な塩類、酸類又は誘導体、並びに、上記のうちの２つ以上の組み合わせ、例えば、ＣＨＯＰ(シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、及びプレドニゾロンの併用療法の略称)、及びＦＯＬＦＯＸ(５−ＦＵ及びロイコボリンと組み合わせたオキサリプラチン(ＥＬＯＸＡＴＩＮＴＭ)を用いる治療計画の略称)が含まれる。
【００５０】
ここに定義される化学療法剤は、癌の増殖を促進しうるホルモンの効果を制御、低減、阻止、又は阻害するように作用する「抗ホルモン剤」又は「内分泌治療剤」を含む。それらはホルモン自体であり得、例えば限定するものではないが、混合アゴニスト／アンタゴニストプロファイルを伴う抗エストロゲン、例えばタモキシフェン(ＮＯＬＶＡＤＥＸ(登録商標))、４−ヒドロキシタモキシフェン、トレミフェン(ＦＡＲＥＳＴＯＮ(登録商標))、イドキシフェン、ドロロキシフェン、ラロキシフェン(ＥＶＩＳＴＡ(登録商標))、トリオキシフェン、ケオキシフェン、及び選択的エストロゲン受容体モジュレーター(ＳＥＲＭ)、例えばＳＥＲＭ３；アゴニスト特性をもたない純抗エストロゲン、例えばフルベストラント(ＦＡＳＬＯＤＥＸ(登録商標))、及びＥＭ８００(このような薬剤はエストロゲン受容体(ＥＲ)二量体化を阻止、ＤＮＡ結合を阻害、ＥＲターンオーバーを増加、及び／又はＥＲレベルを抑制しうる)；アロマターゼ阻害剤、例えばステロイド性アロマターゼ阻害剤、例えばホルメスタン及びエキセメスタン(ＡＲＯＭＡＳＩＮＲ(登録商標))、及び非ステロイド性アロマターゼ阻害剤、例えばアナストラゾール(ＡＲＩＭＩＤＥＸＲ(登録商標))、レトロゾール(ＦＥＭＡＲＡ(登録商標))及びアミノグルテチミド、及び他のアロマターゼ阻害剤、例えばボロゾール(ＲＩＶＩＳＯＲ(登録商標))、酢酸メゲストロール(ＭＥＧＡＳＥ(登録商標))、ファドロゾール、及び４(５)-イミダゾール；黄体形成ホルモン放出ホルモンアゴニスト、例えばリュープロリド(ＬＵＰＲＯＮ(登録商標)及びＥＬＩＧＡＲＤ(登録商標))、ゴセレリン、ブセレリン、及びトリプテレリン；性ステロイド、例えばプロゲスチン、例えば酢酸メゲストロール及び酢酸メドロキシプロゲステロン、エストロゲン、例えばジエチルスチルベストロール及びプレマリン、及びアンドロゲン／レチノイド、例えばフルオキシメステロン、全てのトランスレチノイン酸及びフェンレチニド；オナプリストン；抗プロゲステロン；エストロゲン受容体ダウンレギュレーター(ＥＲＤ)；抗アンドロゲン、例えばフルタミド、ニルタミド及びビカルタミド；及び上記の何れかの薬学的に許容可能な塩、酸又は誘導体；並びに上記の二つ以上の組合せを含む。
【００５１】
「キメラ」抗体なる用語は、重及び／又は軽鎖の一部が特定の供給源又は種に由来し、重及び／又は軽鎖の残りが異なる供給源又は種に由来する抗体を指す。
【００５２】
抗体の「クラス」は、それの重鎖が持つ定常ドメイン又は定常領域のタイプを指す。５つの主要クラスの抗体：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭがあり、これらの内幾つかはサブクラス(アイソタイプ)、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２に更に分けられ得る。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインはそれぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。
【００５３】
「細胞分裂阻害剤」なる用語は、インビトロ又はインビボで細胞の増殖を停止させる化合物又は組成物を指す。従って、細胞分裂阻害剤はＳ期における細胞のパーセンテージを有意に低減させるものでありうる。細胞分裂阻害剤の更なる例は、Ｇ０／Ｇ１停止又はＭ−期停止を誘導することによって細胞周期進行を阻止する薬剤を含む。ヒト化抗Ｈｅｒ２抗体トラスツズマブ(ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ(登録商標))はＧ０／Ｇ１停止を誘導する細胞分裂阻害剤の例である。古典的Ｍ−期ブロッカーは、ビンカ(ビンクリスチン及びビンブラスチン)、タキサン、及びトポイソメラーゼＩＩ阻害剤、例えばドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、及びブレオマイシンを含む。Ｇ１を停止させる特定の薬剤はＳ−期停止にも波及し得、例えばＤＮＡアルキル化剤、例えばタモキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキサート、５-フルオロウラシル、及びａｒａ-Ｃがある。更なる情報は、Mendelsohn及びIsrael編, The Molecular Basis of Cancer, Chapter 1, entitled "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" , Murakami等(W.B. Saunders, Philadelphia, 1995), 例えばｐ１３に見出される。タキサン(パクリタキセル及びドセタキセル)は、双方ともイチイ(yew tree)に由来する抗癌剤である。ヨーロッパイチイに由来するドセタキセル(ＴＡＸＯＴＥＲＥＲ(登録商標), Rhone-Poulenc Rorer)は、パクリタキセル(ＴＡＸＯＬ(登録商標), Bristol-Myers Squibb)の半合成類似体である。パクリタキセル及びドセタキセルはチューブリン二量体から微小管の組立てを促進し、脱重合を防ぐことによって微小管を安定化させ、細胞における有糸分裂の阻害をもたらす。
【００５４】
ここで用いられる「細胞傷害剤」なる用語は、細胞の機能を阻害又は抑制し、及び／又は細胞死又は破壊を生じせしめる物質を意味する。細胞傷害剤は、限定するものではないが、放射性同位体(例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位体)、化学療法剤又は薬物(例えばメトトレキセート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド類(ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド)、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシン又は他の挿入剤）、増殖阻害剤；酵素及びその断片、例えば核溶解性酵素、抗生物質、毒素、例えばその断片及び／又は変異体を含む小分子毒素又は細菌、糸状菌、植物又は動物起源の酵素的に活性な毒素、並びに下記に開示する種々の抗腫瘍又は抗癌剤を含む。
【００５５】
「ＦＧＦＲ４発現、増幅、又は活性化を呈する」癌又は生物学的サンプルは、診断テストにおいて、ＦＧＦＲ４を発現する(過剰発現を含む)、増幅ＦＧＦＲ４遺伝子を有する、及び／又は他にＦＧＦＲ４の活性化又はリン酸化を呈するものである。
【００５６】
「エフェクター機能」は、抗体のＦｃ領域に起因するそれらの生物学的活性を指し、抗体アイソタイプによって異なる。抗体エフェクター機能の例は：Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害(ＣＤＣ)；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞媒介性傷害(ＡＤＣＣ)；食作用；細胞表面受容体(例えばＢ細胞受容体)のダウンレギュレーション；及びＢ細胞活性化を含む。
【００５７】
「有効量」の薬剤、例えば薬学的製剤は、所望の治療的又は予防的結果を達成するために、必要な投与量及び期間での有効な量を指す。
【００５８】
ここでは「Ｆｃ領域」なる用語は、少なくとも定常領域の一部を有する免疫グロブリン重鎖のＣ-末端領域を定義するために使用される。用語は、天然配列Ｆｃ領域及び変異体Ｆｃ領域を含む。一実施態様では、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域はＣｙｓ２２６から、又はＰｒｏ２３０から、重鎖のカルボキシル末端まで伸展する。しかしながら、Ｆｃ領域のＣ-末端リジン(Ｌｙｓ４４７)は存在する場合もあればしない場合もある。ここで別段に示さない限り、Ｆｃ領域又は定常領域におけるアミノ酸残基の番号付けは、Kabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5版 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991に記載されるＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ番号付けシステムに従う。
【００５９】
「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、超可変領域(ＨＶＲ)残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、４つのＦＲドメイン：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４から一般的に成る。従って、ＨＶＲ及びＦＲ配列は一般的に次の配列ＶＨ(又はＶＬ)：ＦＲ１-Ｈ１(Ｌ１)-ＦＲ２-Ｈ２(Ｌ２)-ＦＲ３-Ｈ３(Ｌ３)-ＦＲ４において見られる。
【００６０】
「完全長抗体」、「インタクトな抗体」、及び「全抗体」なる用語は、ここでは互換的に使用され、天然抗体構造に実質的に類似した構造を有するか、又はここに定義されるＦｃ領域を有する重鎖を有する抗体を指す。
【００６１】
「宿主細胞」、「宿主細胞株」、及び「宿主細胞培養物」なる用語は互換的に使用され、外因性核酸が導入された細胞を指し、このような細胞の子孫を含む。宿主細胞は「形質転換体」及び「形質転換細胞」を含み、これは継代の回数に関係なく一次形質転換細胞及びそれに由来する子孫を含む。子孫は核酸内容において親細胞と完全に同一でなくてもよく、変異を含みうる。最初に形質転換された細胞についてスクリーニング又は選択されたのと同じ機能又は生物学的活性を有する変異体子孫がここに含まれる。
【００６２】
「ヒト抗体」は、ヒト又はヒト細胞から生産されるか又はヒト抗体レパートリー又は他のヒト抗体-コード配列を利用する非ヒト供給源から得られる抗体のものに対応するアミノ酸配列を持つものである。ヒト抗体のこの定義は非ヒト抗原結合残基を含んでなるヒト化抗体を特異的に除外する。
【００６３】
「ヒトコンセンサスフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨフレームワーク配列の選別において最も一般的に生じるアミノ酸残基を表すフレームワークである。一般に、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨ配列は、可変ドメイン配列のサブグループから選別する。一般に、配列のサブグループはKabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3におけるようなサブグループである。一実施態様では、ＶＬについて、サブグループは上掲のKabat等におけるようなサブグループκＩである。一実施態様では、ＶＨについて、サブグループは上掲のKabat等におけるようなサブグループＩＩＩである。
【００６４】
「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲからのアミノ酸残基及びヒトＦＲからのアミノ酸残基を含んでなるキメラ抗体を指す。ある実施態様では、ヒト化抗体は、全て又は実質的には全てのＨＶＲ  (例えばＣＤＲ)が非ヒト抗体のものに対応し、全て又は又は実質的には全てのＦＲがヒト抗体のものに対応する、少なくとも一つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は場合によっては、ヒト抗体由来の抗体定常領域の少なくとも一部を含みうる。抗体の「ヒト化形態」、例えば非ヒト抗体は、ヒト化を経た抗体を指す。
【００６５】
「超可変領域」又は「ＨＶＲ」なる用語は、ここで使用される場合、配列において高頻度可変であるか及び／又は構造的に定義されたループ(「超可変ループ」)を形成する抗体可変ドメインの領域の各々を称する。一般的に、天然の４鎖抗体は６つのＨＶＲ；３つはＶＨ(Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３)であり、３つはＶＬ(Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３)を含む。ＨＶＲは一般的に超可変ループから及び／又は「相補性決定領域」(ＣＤＲ)からのアミノ酸残基を含み、後者は最も高い配列可変性のものであるか及び／又は抗原認識に関与する。例示的な超可変ループは、アミノ酸残基２６−３２(Ｌ１)、５０−５２(Ｌ２)、９１−９６(Ｌ３)、２６−３２(Ｈ１)、５３−５５(Ｈ２)、及び９６−１０１(Ｈ３)で生じる。(Chothia及びLesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))。例示的なＣＤＲ(ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３)はアミノ酸残基Ｌ１の２４−３４、Ｌ２の５０−５６、Ｌ３の８９−９７、Ｈ１の３１−３５Ｂ、Ｈ２の５０−６５、及びＨ３の９５−１０２で生じる。(Kabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5版 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991))。ＶＨにおけるＣＤＲ１を除き、ＣＤＲは一般的に超可変ループからのアミノ酸残基を含む。ＣＤＲはまた「特異性決定領域」又は「ＳＤＲ」を含み、これは抗原に接触する残基である。ＳＤＲは短縮型(abbreviated-)ＣＤＲ、又はａ−ＣＤＲと呼ばれるＣＤＲの領域内に含まれる。例示的なａ−ＣＤＲ(ａ−ＣＤＲ−Ｌ１、ａ−ＣＤＲ−Ｌ２、ａ−ＣＤＲ−Ｌ３、ａ−ＣＤＲ−Ｈ１、ａ−ＣＤＲ−Ｈ２、及びａ−ＣＤＲ−Ｈ３)はアミノ酸残基Ｌ１の３１−３４、Ｌ２の５０−５５、Ｌ３の８９−９６、Ｈ１の３１−３５Ｂ、Ｈ２の５０−５８、及びＨ３の９５−１０２で生じる。(Almagro及びFransson, Front. Biosci.  13:1619-1633 (2008)を参照)。別段の記載がある場合を除き、ＨＶＲ残基及び可変ドメインにおける他の残基(例えばＦＲ残基)はここでは上掲のKabat等に従って番号付けされる。
【００６６】
「イムノコンジュゲート」は、限定するものではないが細胞傷害剤を含む一又は複数の異種性分子にコンジュゲートされた抗体である。
【００６７】
「個体」又は「被験体」は哺乳類である。哺乳類は、限定するものではないが、家畜動物(例えばウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、及びウマ)、霊長類(例えばヒト及び非ヒト霊長類、例えばサル)、ウサギ、及びげっ歯類(例えばマウス及びラット)を含む。ある実施態様では、個体又は被験体はヒトである。
【００６８】
「細胞成長又は増殖を阻害する」とは、細胞の成長又は増殖を少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は１００％低下させることを意味し、細胞死の誘導を含む。
【００６９】
「単離された」抗体は、その自然環境の構成要素から分離されたものである。幾つかの実施態様では、抗体は、例えば、電気泳動(例えばＳＤＳ-ＰＡＧＥ、等電点電気泳動(ＩＥＦ)、キャピラリー電気泳動法)かまたはクロマトグラフィー(例えばイオン交換または逆位相ＨＰＬＣ)によって測定して、９５％又は９９％純度を越えるまで精製される。抗体純度の評価のための方法の概説は、Flatman等, J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)を参照のこと。
【００７０】
「単離された」核酸は、その自然環境の構成要素から分離された核酸分子を指す。単離された核酸は通常核酸分子を含む細胞に含まれる核酸分子を含むが、核酸分子は外部染色体的にまたはその自然染色体位置と異なる染色体位置にも存在する。
【００７１】
「抗ＦＧＦＲ４抗体をコード化している単離された核酸」は抗体重鎖および軽鎖(またはそれの断片)をコード化している一つ以上の核酸分子を指し、単一のベクター又は別個のベクター中のそのような核酸分子、及び宿主細胞の一つ以上の位置に存在するこの種の核酸分子を含む。
【００７２】
本願明細書において使われるように、本発明の抗体に関する「ほとんどないしは全く結合しない」なる語句は抗体が生物学上意味がある量の結合を示さないことを意味する。当該技術分野において理解されるように、活性の量は、本発明の抗体と参照対応物との間の比較が可能な限りは、定量的にまたは定性的に決定することができる。活性は、例えばここに記載のもの等を含む、当該技術分野で知られている任意のアッセイ又は技術に従って測定又は検出することができる。本発明の抗体とその参照対応物の活性の量は、並行又は別々の実験において決定することができる。
【００７３】
ここで使用される「モノクローナル抗体」なる用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体、すなわち、集団を構成する個々の抗体が、一般的に微量に存在する変異体など、例えば天然に生じる変異を含むか又はモノクローナル抗体調製物の産生の際に生じうる可能な変異体抗体を除いて同一であり及び／又は同じエピトープに結合する抗体を指す。典型的には異なる決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を含むポリクロナール抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原の単一の決定基に対する。このように、修飾語「モノクローナル」は、抗体の実質的に均一な集団から得られているという抗体の特徴を示して、何か特定の方法による抗体の生産を必要とするものと解釈されるべきではない。例えば、本発明において使用されるモノクローナル抗体は、限定されるものではないが、ハイブリードーマ法、組換えＤＮＡ方法、ファージディスプレイ法およびヒト免疫グロブリン遺伝子座の全て又は一部を含むトランスジェニック動物を利用する方法を含む種々の技術によって作製することができ、そのような方法とモノクローナル抗体を作製するための他の例示的方法をここに記載する。
【００７４】
「ネイキッド抗体」は、異種部分(例えば細胞毒の部分)または放射標識にコンジュゲートされていない抗体を指す。ネイキッド抗体は、製薬製剤に存在してもよい。
【００７５】
「天然の抗体」は、様々な構造を有する天然に生じる免疫グロブリン分子を指す。例えば、天然ＩｇＧ抗体は約１５０，０００のダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質であり、ジスルフィド結合している２つの同一の軽鎖及び２つの同一の重鎖から成る。Ｎ末端からＣ末端まで、各々の重鎖は可変重ドメイン又は重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域(ＶＨ)を有し、３つの定常ドメイン(ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３)が続く。同様に、Ｎ末端からＣ末端まで、各々の軽鎖は可変軽ドメイン又は軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域(ＶＬ)を有し、軽鎖定常(ＣＬ)ドメインが続く。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、ラムダ(λ)及びカッパ(κ)と呼ばれる２つのタイプのうちの１つに割り当てられうる。
【００７６】
「パッケージ挿入物」なる用語は、適応症、用法、用量、投与法、併用療法、禁忌及び／又は治療用製品の使用に関する注意についての情報を含む、治療用製品の市販パッケージに常套的に含まれる指示を指すために用いられる。
【００７７】
参照ポリペプチド配列に関する「パーセント(％)アミノ酸配列同一性」とは、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を達成するために必要ならば間隙を導入し、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした後の、参照ポリペプチド配列のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ-２、ＡＬＩＧＮ、又はＭｅｇａｌｉｇｎ(ＤＮＡＳＴＡＲ)ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の完全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列のアラインメントのための適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、％アミノ酸配列同一性値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ-２を使用することによって得られる。ＡＬＩＧＮ-２配列比較コンピュータプログラムはジェネンテック社によって著作され、そのソースコードは米国著作権庁(ワシントン D.C.，20559)に使用者用書類と共に提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７の下で登録されている。ＡＬＩＧＮ-２プログラムはジェネンテック社(サウスサンフランシスコ, カリフォルニア)から公的に入手可能であり、又はソースコードからコンパイルされうる。ＡＬＩＧＮ-２プログラムは、デジタルＵＮＩＸ(登録商標)Ｖ４．０Ｄを含む、ＵＮＩＸ(登録商標)オペレーティングシステムでの使用のためにコンパイルされなければならない。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ-２プログラムによって設定され、変動しない。
【００７８】
アミノ酸配列比較にＡＬＩＧＮ-２が用いられる状況では、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂへの、それとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性(あるいは、与えられたアミノ酸配列Ｂへの、それとの、又はそれに対するある程度の％アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる)は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ-２のＡ及びＢのプログラムアラインメントによって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なることが理解されるであろう。特に断らない限りは、ここで使用される全ての％アミノ酸配列同一性値は、ＡＬＩＧＮ-２コンピュータプログラムを用いて直ぐ上の段落に記載されるようにして得られる。
【００７９】
「薬学的製剤」なる用語は、そこに含まれる活性成分の生物学的活性が効果的であるような形態であり、製剤が投与される被験体に許容できないほど毒性である付加的な成分を含まない調製物を指す。
【００８０】
「薬学的に許容可能な担体」は、被験体に対して非毒性である、活性成分以外の薬学的製剤中の成分を指す。薬学的に許容可能な担体は、限定されるものではないが、バッファー、賦形剤、安定剤、又は保存料を含む。
【００８１】
ここで使用される場合、「治療」(及び「治療する(treat)」又は「治療する(treating)」等の文法的変形語)は、治療されている個体の自然経過を変える試みの臨床的介入を指し、予防のために又は臨床病理経過中に実施されうる。治療の望ましい効果は、限定されないが、疾患の発生または再発の予防、症状の緩和、疾患の直接的または間接的な病理学的結果の減少、転移の防止、疾患進行速度の低減、病状の回復又は緩和、及び緩解又は予後の改善を含む。幾つかの実施態様では、本発明の抗体は、疾患の発症を遅延させるかまたは疾患の進行を遅くするために用いる。
【００８２】
「腫瘍」なる用語は、、悪性又は良性に関わらず、全ての腫瘍形成細胞成長及び増殖、及び全ての前癌性及び癌性細胞及び組織を指す。「癌」、「癌性」、「細胞増殖障害」、「増殖性障害」及び「腫瘍」はここで言及される通り、相互に排他的でない。
【００８３】
「可変領域」又は「可変ドメイン」なる用語は、抗体の抗原への結合に関与する抗体重鎖又は軽鎖のドメインを指す。天然抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン(それぞれＶＨ及びＶＬ)は一般に類似の構造を有しており、各ドメインが４つの保存されたフレームワーク領域(ＦＲ)と３つの高頻度可変領域(ＨＶＳ)を含む。(Kindt等 Kuby Immunology, 6版, W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)を参照。)単一のＶＨ又はＶＬドメインが、抗原結合特異性を付与するのに十分である場合がある。さらに、特定の抗原に結合する抗体は、抗原に結合する抗体からのＶＨ又はＶＬドメインを使用して相補的ＶＬ又はＶＨドメインそれぞれのライブラリーをスクリーニングすることによって単離することができる。例えば、Portolano等, J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson等, Nature 352:624-628 (1991)を参照。
【００８４】
本願明細書において使われるように、「ベクター」なる用語は、それが連結される他の核酸を増殖することができる核酸分子を指す。該用語は、それが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれるベクターと同様に、自己複製する核酸構造としてのベクターを含む。特定のベクターは、それらが作用可能に連結される核酸の発現を導くことができる。この種のベクターは、本明細書において、「発現ベクター」と称される。
【００８５】
「ＶＨサブグループＩＩＩコンセンサスフレームワーク」は、Kabat等の可変重サブグループＩＩＩのアミノ酸配列から得られるコンセンサス配列を含む。一実施態様では、ＶＨサブグループＩＩＩコンセンサスフレームワークアミノ酸配列は、次の配列：ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳ(配列番号：１３)−Ｈ１−ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶ(配列番号：１４)−Ｈ２−ＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣ(配列番号：１５)−Ｈ３−ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ(配列番号：１６)の各々の少なくとも一部又は全てを含む。
【００８６】
「ＶＬサブグループＩコンセンサスフレームワーク」は、Kabat等の可変軽カッパサブグループＩにおけるアミノ酸配列から得られるコンセンサス配列を含む。一実施態様では、ＶＨサブグループＩコンセンサスフレームワークアミノ酸配列は次の配列：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ(配列番号：２８)−Ｌ１−ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ(配列番号：２９)−Ｌ２−ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣ(配列番号：３０)−Ｌ３−ＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ(配列番号：３１)の各々の少なくとも一部又は全てを含む。
【００８７】
「消耗性」障害(例えば消耗性症候群、悪液質、サルコペニア)なる用語は、望まない及び／又は不健康な体重の減少又は体細胞量の減少に起因する疾患を指す。高齢者並びにＡＩＤＳ及び癌患者では、消耗性疾患は、脂肪及び除脂肪区画の双方を含む望まない体重の減少をもたらしうる。消耗性疾患は、疾病及び／又は老化過程に関連する不十分な食品の摂取及び／又は代謝性変化から生じうる。癌患者及びＡＩＤＳ患者、並びに広範囲の手術後又は慢性感染症、免疫疾患、甲状腺機能亢進症、クローン病、心因性疾患、慢性心不全又は他の重症な外傷を有する患者はしばしば、悪液質、代謝性及び時に摂食障害とも呼ばれる消耗性障害を患う。悪液質はまた代謝亢進及び異化亢進によって特徴づけられる。悪液質及び消耗性疾患は消耗性状態を指すのにしばしば互換的に用いられるが、除脂肪体重、特に体細胞量の減少として消耗症候群から悪液質を区別する少なくとも一体の研究がある (Mayer, 1999, J. Nutr. 129(1S Suppl.):256S-259S)。加齢個体に影響を及ぼす可能性のあるまた別のこのような障害であるサルコペニアは、筋量の減少によって典型的に特徴づけられる。上記の末期消耗性疾患は悪液質又はサルコペニアを患っている個体において発生しうる。
【００８８】
ＩＩ．組成物及び方法
一態様では、本発明は一部には、様々なＦＧＦＲ４結合剤(例えば抗体及びその断片)の同定に基づく。ある実施態様では、ＦＧＦＲ４に結合する抗体が提供される。本発明の抗体は、例えば癌、肝臓疾患、及び消耗の診断又は治療に有用である。
【００８９】
Ａ．例示的な抗ＦＧＦＲ４抗体
一態様では、発明はＦＧＦＲ４に結合する単離された抗体を提供する。
【００９０】
ある実施態様では、抗ＦＧＦＲ４抗体は≦１ｎＭの親和性でヒトＦＧＦＲ４に結合する。幾つかの実施態様では、抗ＦＧＦＲ４抗体は≦０．０５ｎＭの親和性でヒトＦＧＦＲ４に結合する。
【００９１】
ある実施態様では、抗ＦＧＦＲ４抗体は≦１ｎＭの親和性でマウスＦＧＦＲ４に結合する。
【００９２】
ある実施態様では、抗ＦＧＦＲ４抗体は≦１ｎＭの親和性でカニクイザルＦＧＦＲ４に結合する。
【００９３】
ある実施態様では、抗ＦＧＦＲ４抗体は≦１ｎＭの親和性でヒト、マウス及びカニクイザルＦＧＦＲ４に結合する。
【００９４】
ある実施態様では、抗ＦＧＦＲ４抗体はヒトＦＧＦＲ１、ヒトＦＧＦＲ２及び／又はヒトＦＧＦＲ３に実質的に結合しない。ある実施態様では、抗ＦＧＦＲ４抗体はヒトＦＧＦＲ１、ヒトＦＧＦＲ２及び／又はヒトＦＧＦＲ３にほとんどあるいは全く結合を示さない。
【００９５】
ある実施態様では、抗ＦＧＦＲ４抗体はマウスＣ３タンパク質(幾つかの実施態様では、図１２Ｄに示すアミノ酸配列を有するマウスＣ３タンパク質)に実質的に結合しない。ある実施態様では、抗ＦＧＦＲ４抗体はマウスＣ３タンパク質(幾つかの実施態様では、図１２Ｄに示すアミノ酸配列を有するマウスＣ３タンパク質)にほとんどあるいは全く結合を示さない。
【００９６】
ある実施態様では、抗ＦＧＦＲ４抗体はヒト化抗ＦＧＦＲ４抗体であり、ヒトＦＧＦＲ４への抗体の一価の親和性は、それぞれ配列番号：８及び７に記載される軽鎖及び重鎖可変配列を含んでなるマウス抗体の一価の親和性と実質的に同じである。幾つかの実施態様では、抗ＦＧＦＲ４抗体はヒト化及び親和性成熟抗体である。
【００９７】
ある実施態様では抗ＦＧＦＲ４抗体はＦＧＦＲ４活性のアンタゴニストである。
【００９８】
ある実施態様では、抗ＦＧＦＲ４抗体はＦＧＦＲ４へのＦＧＦ結合を阻害する。幾つかの実施態様では、ＦＧＦＲ４へのＦＧＦ１及び／又はＦＧＦ１９結合が阻害される。幾つかの実施態様では、ＦＧＦＲ４へのＦＧＦ１結合の阻害のＩＣ５０は約０．１０ｎＭである。幾つかの実施態様では、ＦＧＦＲ４へのＦＧＦ１９結合の阻害のＩＣ５０は約０．１０ｎＭである。
【００９９】
ある実施態様では、抗ＦＧＦＲ４抗体は細胞増殖を阻害する。幾つかの実施態様では、増殖はＦＧＦ−誘導細胞増殖である。幾つかの実施態様では、細胞増殖はＢＡＦ３／ＦＧＦＲ４トランスジェニック細胞増殖である。
【０１００】
ある実施態様では、抗ＦＧＦＲ４抗体はＦＧＦＲ４を発現する細胞のＦＧＦ(例えばＦＧＦ１)刺激増殖を阻害する。幾つかの実施態様では、細胞はＨＵＨ７細胞である。
ある実施態様では、抗ＦＧＦＲ４抗体は、ＦＧＦ１９に曝露された細胞におけるＣＹＰ７α７発現のＦＧＦ１９−媒介阻害を阻害する。
【０１０１】
ある実施態様では、抗ＦＧＦＲ４抗体は、ＦＧＦ１９に曝露された細胞におけるＦＧＦＲ４、ＭＡＰＫ、ＦＲＳ２及び／又はＥＲＫ２のＦＧＦ１９−誘導リン酸化を阻害する。
【０１０２】
ある実施態様では、抗ＦＧＦＲ４抗体はＦＧＦ１９−誘導コロニー形成を阻害する。幾つかの実施態様では、コロニー形成はＨＣＣ細胞株コロニー形成である。幾つかの実施態様では、ＨＣＣ細胞株はＪＨＨ５である。
【０１０３】
ある実施態様では、抗ＦＧＦＲ４抗体は変性ＦＧＦＲ４に結合する。幾つかの実施態様では、抗ＦＧＦＲ４抗体は還元、変性ＦＧＦＲ４に結合する。幾つかの実施態様では、還元、変性ＦＧＦＲ４の結合はウエスタンブロットを使用してアッセイされる。
【０１０４】
ある実施態様では、抗ＦＧＦＲ４抗体は細胞表面で発現されたＦＧＦＲ４に結合する。幾つかの実施態様では、細胞はＨＵＨ７又はＪＨＨ５細胞である。
【０１０５】
ある実施態様では、抗ＦＧＦＲ４抗体はＧ１６５Ａ変異を含んでなるヒトＦＧＦＲ４に実質的に結合しない。ある実施態様では、抗ＦＧＦＲ４抗体はＧ１６５Ａ変異を含んでなるヒトＦＧＦＲ４にほとんどあるいは全く結合しない。
【０１０６】
ある実施態様では、抗ＦＧＦＲ４抗体は、アミノ酸番号１５０〜１７０の成熟ヒトＦＧＦＲ４アミノ酸配列を含んでなる、から基本的に成る又はから成るポリペプチドに結合する。ある実施態様では、抗ＦＧＦＲ４抗体はアミノ酸番号１４５〜１８０の成熟ヒトＦＧＦＲ４アミノ酸配列を含んでなる、から基本的に成る又はから成るポリペプチドに結合する。
【０１０７】
ある実施態様では、抗ＦＧＦＲ４抗体はアミノ酸番号１５０〜１７０の成熟ヒトＦＧＦＲ４アミノ酸配列を含んでなる、から基本的に成る又はから成る配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％の配列同一性又は類似性を有するポリペプチドに結合する。ある実施態様では、抗ＦＧＦＲ４抗体はアミノ酸番号１４５−１８０の成熟ヒトＦＧＦＲ４アミノ酸配列を含んでなる、から基本的に成る又はから成る配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％の配列同一性又は類似性を有するポリペプチドに結合する。
【０１０８】
ある実施態様では、抗ＦＧＦＲ４抗体はＦＧＦＲ４二量体化を阻害する。
【０１０９】
ある実施態様では、抗ＦＧＦＲ４抗体はＦＧＦＲ４二量体化界面で結合する。
【０１１０】
ある実施態様では、抗ＦＧＦＲ４抗体は腫瘍増殖を阻害する。幾つかの実施態様では、腫瘍増殖は肝臓腫瘍増殖である。
【０１１１】
一態様では、発明は、(ａ)ＮＨＷＭＮのアミノ酸配列(配列番号：１)を含んでなるＨＶＲ−Ｈ１；(ｂ)ＭＩＬＰＶＤＳＥＴＴＬＥＱＫＦＫＤのアミノ酸配列(配列番号：２)を含んでなるＨＶＲ−Ｈ２；(ｃ)ＧＤＩＳＬＦＤＹのアミノ酸配列(配列番号：３)を含んでなるＨＶＲ−Ｈ３；(ｄ)ＲＴＳＱＤＩＳＮＦＬＮのアミノ酸配列(配列番号：４)を含んでなるＨＶＲ−Ｌ１；(ｅ)ＹＴＳＲＬＨＳのアミノ酸配列(配列番号：５)を含んでなるＨＶＲ−Ｌ２；及び(ｆ)ＱＱＧＮＡＬＰＹＴのアミノ酸配列(配列番号：６)を含んでなるＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも１、２、３、４、５、又は６のＨＶＲを含んでなる抗ＦＧＦＲ４抗体を提供する。
【０１１２】
一態様では、発明は(ａ)配列番号：１のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ−Ｈ１；(ｂ)配列番号：２のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ−Ｈ２；及び(ｃ)配列番号：３のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ−Ｈ３から選択される少なくとも１、少なくとも２、又は全３つのＶＨ ＨＶＲ配列を含んでなる抗体を提供する。一実施態様では、抗体は、配列番号：３のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ−Ｈ３を含む。別の実施態様では、抗体は、配列番号：３のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ−Ｈ３及び配列番号：６のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ−Ｌ３を含む。更なる実施態様では、抗体は、配列番号：３のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ−Ｈ３、配列番号：６のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ−Ｌ３、及び配列番号：２のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ−Ｈ２を含む。更なる実施態様では、抗体は、(ａ)配列番号：１のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ−Ｈ１；(ｂ)配列番号：２のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ−Ｈ２；及び(ｃ)配列番号：３のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ−Ｈ３を含む。
【０１１３】
別の態様では、発明は、(ａ)配列番号：４のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ−Ｌ１；(ｂ)配列番号：５のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ−Ｌ２；及び(ｃ)配列番号：６のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも１、少なくとも２、又は全３のＶＬ ＨＶＲ配列を含んでなる抗体を提供する。
【０１１４】
一実施態様では、抗体は、(ａ)配列番号：４のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ−Ｌ１；(ｂ)配列番号：５のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ−Ｌ２；及び(ｃ)配列番号：６のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ−Ｌ３を含む。
【０１１５】
別の態様では、発明の抗体は、(ａ)(ｉ)配列番号：１のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ−Ｈ１、(ｉｉ)配列番号：２のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ−Ｈ２、及び(ｉｉｉ)配列番号：３から選択されるアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ−Ｈ３から選択される少なくとも１、少なくとも２、又は全３つのＶＨ ＨＶＲ配列を含んでなるＶＨドメイン；及び(ｂ)(ｉ)配列番号：４のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ−Ｌ１、(ｉｉ)配列番号：５のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ−Ｌ２、及び(ｃ)配列番号：６のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ−Ｌ３から選択される少なくとも１、少なくとも２、又は全３つのＶＬ ＨＶＲ配列を含んでなるＶＬドメインを含む。
【０１１６】
別の態様では、発明は、(ａ)配列番号：１のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ−Ｈ１；(ｂ)配列番号：２のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ−Ｈ２；(ｃ)配列番号：３のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ−Ｈ３；(ｄ)配列番号：４のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ−Ｌ１；(ｅ)配列番号：５のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ−Ｌ２；及び(ｆ)  配列番号：６から選択されるアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ−Ｌ３を含んでなる抗体を提供する。
【０１１７】
別の態様では、抗ＦＧＦＲ４抗体は、ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＹＴＦＴＮＨＷＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧＭＩＬＰＶＤＳＥＴＴＬＥＱＫＦＫＤＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＴＲＧＤＩＳＬＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ  (配列番号：７)のアミノ酸配列に少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン(ＶＨ)配列を含む。
【０１１８】
ある実施態様では、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一性を有するＶＨ配列は、参照配列と比較して置換(例えば、保存的置換)、挿入、又は欠失を有するが、その配列を含んでなる抗ＦＧＦＲ４抗体はＦＧＦＲ４に結合する能力を保つ。ある実施態様では、合計で１〜１０アミノ酸が配列番号：７において置換、挿入及び／又は欠失されている。ある実施態様では、置換、挿入又は欠失はＨＶＲ外の領域において(すなわちＦＲにおいて)生じる。場合によっては、抗ＦＧＦＲ４抗体は、配列番号：７におけるＶＨ配列を含み、その配列の翻訳後修飾を含む。特定の実施態様では、(ａ)配列番号：１のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ−Ｈ１、(ｂ)配列番号：２のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ−Ｈ２、及び(ｃ)配列番号：３のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ−Ｈ３から選択される１、２、又は３のＨＶＲを含む。
【０１１９】
別の態様では、抗ＦＧＦＲ４抗体であって、ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＴＳＱＤＩＳＮＦＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＦＫＩＬＩＳＹＴＳＲＬＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＧＮＡＬＰＹＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲ(配列番号：８)のアミノ酸配列に少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)を含む抗体が提供される。
【０１２０】
ある実施態様では、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するＶＬ配列は、参照配列と比較して置換(例えば、保存的置換)、挿入、又は欠失を有するが、その配列を含んでなる抗ＦＧＦＲ４抗体はＦＧＦＲ４に結合する能力を保つ。ある実施態様では、合計で１〜１０アミノ酸が配列番号：８において置換、挿入及び／又は欠失されている。ある実施態様では、置換、挿入又は欠失はＨＶＲ外の領域において(すなわちＦＲにおいて)生じる。場合によっては、抗ＦＧＦＲ４抗体は、配列番号：８におけるＶＬ配列を含み、その配列の翻訳後修飾を含む。特定の実施態様では、ＶＬは(ａ)配列番号：４のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ−Ｌ１；(ｂ)配列番号：５のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ−Ｌ２；及び(ｃ)配列番号：６のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ−Ｌ３から選択される１、２又は３のＨＶＲを含む。
【０１２１】
別の態様では、抗ＦＧＦＲ４抗体であって、上記の実施態様の何れかに記載のＶＨ、及び上記の実施態様の何れかに記載のＶＬを含む抗体が提供される。一実施態様では、抗体はそれぞれ配列番号：７及び配列番号：８におけるＶＨ及びＶＬ配列を含み、これらの配列の翻訳後修飾を含む。
【０１２２】
何れかの上記の実施態様では、抗ＦＧＦＲ４抗体はヒト化である。一実施態様では、抗ＦＧＦＲ４抗体は上記の実施態様の何れかに記載のＨＶＲを含み、更にアクセプターヒトフレームワーク、例えばヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークを含む。発明の抗体は、何れかの好適なフレームワーク可変ドメイン配列を含むが、ＦＧＦＲ４への結合活性は実質的に保たれているとする。例えば、幾つかの実施態様では、発明の抗体はヒトサブグループＩＩＩ重鎖フレームワークコンセンサス配列を含む。これらの抗体の一実施態様では、フレームワークコンセンサス配列は位置７１、７３、及び／又は７８に置換を含む。これらの抗体の幾つかの実施態様では、位置７１はＡであり、７３はＴであり及び／又は７８はＡである。一実施態様では、これらの抗体は、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５-８の重鎖可変ドメインフレームワーク配列を含む(HERCEPTIN(登録商標), Genentech, Inc., South San Francisco, CA, USA)(米国特許第６４０７２１３号及び第５８２１３３７号、及びLee等, J. Mol. Biol. (2004), 340(5):1073-1093においても言及)。一実施態様では、フレームワーク配列は次のアクセプターヒトフレームワーク：ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ(配列番号：９)−Ｌ１−ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＦＫＩＬＩＳ(配列番号：１０)−Ｌ２−ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣ(配列番号：１１)−Ｌ３−ＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ(配列番号：１２)を含む。
【０１２３】
更なる態様では、発明はここに提供される抗ＦＧＦＲ４抗体と同じエピトープに結合する抗ＦＧＦＲ４抗体を提供する。例えば、ある実施態様では、配列番号：７のＶＨ配列及び配列番号：８のＶＬ配列を含んでなる抗ＦＧＦＲ４抗体と同じエピトープに結合する抗体が提供される。ある実施態様では、図１８に示す配列(配列番号：３９)のアミノ酸１４５−１８０から成るＦＧＦＲ４の断片内のエピトープに結合する抗体が提供される。
【０１２４】
更なる態様では、発明は、配列番号：７のＶＨ配列及び配列番号：８のＶＬ配列を含んでなる抗ＦＧＦＲ４抗体と、ヒトＦＧＦＲ４への結合について競合する抗ＦＧＦＲ４抗体を提供する。
発明の更なる態様では、上記実施態様の何れかによる抗ＦＧＦＲ４抗体はモノクローナル抗体であり、キメラ、ヒト化又はヒト抗体を含む。一実施態様では、抗ＦＧＦＲ４抗体は抗体断片、例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、又はＦ(ａｂ’)２断片である。別の実施態様では、抗体は完全長抗体、例えばインタクトなＩｇＧ１抗体又はここに定義される他の抗体クラス又はアイソタイプである。
【０１２５】
更なる態様では、上記実施態様の何れかによる抗体は、下のセクション１−７に記載される何れかの特性を単独で又は組合せて含みうる。
【０１２６】
１．抗体親和性
ある実施態様では、ここに提供される抗体は≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ(例えば１０−８Ｍ以下、例えば１０−８Ｍから１０−１３Ｍ、例えば１０−９Ｍから１０−１３Ｍ)の解離定数(Ｋｄ)を有している。
【０１２７】
一実施態様では、Ｋｄは、次のアッセイによって記載されるように、対象の抗体のＦａｂ型とその抗原を用いて実施される放射標識抗原結合アッセイ(ＲＩＡ)によって測定される。抗原に対するＦａｂの溶液結合親和性は、一連の力価の非標識抗原の存在下で、最小濃度の(１２５Ｉ)標識抗原でＦａｂを均衡にし、ついで抗Ｆａｂ抗体被覆プレートで結合抗原を捕獲することによって測定する(例えばChen等, J. Mol. Biol. 293:865-881(1999)を参照)。アッセイ条件を確立するために、ＭＩＣＲＯＴＩＴＥＲ(登録商標)マルチウェルプレート(Thermo Scientific)を５μｇ／ｍｌの５０ｍＭ炭酸ナトリウム(ｐＨ９．６)中の捕獲抗Ｆａｂ抗体(Cappel Labs)で一晩被覆し、その後ＰＢＳ中の２％(ｗ／ｖ)のウシ血清アルブミンで室温(およそ２３℃)で２から５時間、ブロックする。非吸着プレート(Nunc #269620)において、１００ｐＭ又は２６ｐＭの［１２５Ｉ］抗原を段階希釈した対象のＦａｂと混合する(例えば、Presta等, Cancer Res. 57: 4593-4599(1997)における抗ＶＥＧＦ抗体Ｆａｂ-１２の評価と一致する)。ついで対象のＦａｂを一晩インキュベートする；しかし、インキュベーションは平衡状態に達したことを確認するまでより長い時間(例えば約６５時間)継続する場合がある。その後、混合物を捕獲プレートに移し、室温で(例えば１時間)インキュベートする。ついで、溶液を取り除き、プレートをＰＢＳ中の０．１％ポリソルベート２０(Ｔｗｅｅｎ-２０(登録商標))で８回洗浄した。プレートが乾燥したら、１５０μｌ／ウェルの閃光物質(MicroScint-20ＴＭ；Packard)を加え、プレートをＴＯＰＣＯＵＮＴＴＭγカウンター(Packard)で１０分間計数する。最大結合の２０％か又はそれ以下を与える各Ｆａｂの濃度を選択して競合結合測定に用いる。
【０１２８】
他の実施態様によれば、〜１０反応単位(ＲＵ)の固定した抗原ＣＭ５チップで２５℃のＢＩＡｃｏｒｅ(登録商標)-２０００又はＢＩＡｃｏｒｅ(登録商標)-３０００(BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)を使用して表面プラズモン共鳴アッセイを行ってＫｄを測定する。簡単に言うと、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ(CM5, BIAcore Inc.)を、提供者の指示書に従ってＮ-エチル-Ｎ'-(３-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミド塩酸塩(ＥＤＣ)及びＮ-ヒドロキシスクシンイミド(ＮＨＳ)で活性化する。抗原を１０ｍＭの酢酸ナトリウム(ｐＨ４．８)で５μｇ／ｍｌ(〜０．２μＭ)に希釈した後、結合したタンパク質の反応単位(ＲＵ)がおよそ１０になるように５μｌ／分の流量で注入する。抗原の注入後、未反応群をブロックするために１Ｍのエタノールアミンを注入する。動力学的な測定では、２倍の段階希釈したＦａｂ(０．７８ｎＭから５００ｎＭ)を２５℃、およそ２５μｌ／分の流量で０．０５％ポリソルベート２０(Ｔｗｅｅｎ-２０ＴＭ)界面活性剤(ＰＢＳＴ)を含むＰＢＳに注入する。会合及び解離のセンサーグラムを同時にフィットさせることによる単純一対一ラングミュア結合モデル(simple one-to-one Langmuir binding model)(BIAcore (登録商標)Evaluationソフトウェアバージョン3.2)を用いて、会合速度(ｋｏｎ)と解離速度(ｋｏｆｆ)を算出する。平衡解離定数(Ｋｄ)をｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として算出する。例えば、Chen等, J. Mol Biol 293:865-881(1999)を参照のこと。上記の表面プラスモン共鳴アッセイにより結合速度が１０６Ｍ−１Ｓ−１を上回る場合、分光計、例えば、ストップフロー具備分光光度計(stop-flow equipped spectrophometer)(Aviv Instruments)又は撹拌キュベットを備えた８０００シリーズＳＬＭ−ＡｍｉｎｃｏＴＭ分光光度計(ThermoSpectronic)で測定される、漸増濃度の抗原の存在下で、ＰＢＳ(ｐＨ７．２)、２５℃の、２０ｎＭの抗抗原抗体(Ｆａｂ型)の蛍光放出強度(励起＝２９５ｎｍ；放出＝３４０ｎｍ、バンドパス＝１６ｎｍ)の増加又は減少を測定する蛍光消光技術を用いて結合速度を測定することができる。
【０１２９】
２．抗体断片
ある実施態様では、ここに提供される抗体は抗体断片である。抗体断片は、限定しないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆａｂ'−ＳＨ、Ｆ(ａｂ')２、Ｆｖ、及びｓｃＦｖ断片、及び以下に記載の他の断片を含む。所定の抗体断片の概説については、Hudson等 Nat. Med. 9:129-134 (2003)を参照のこと。ｓｃＦｖ断片の概説については、例えばPluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg及びMoore編,(Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994)を参照のこと；また国際公開第９３／１６１８５号；及び米国特許第５５７１８９４号及び第５５８７４５８号を参照のこと。サルベージレセプター結合エピトープ残基を含みインビボ半減期が増加したＦａｂ及びＦ(ａｂ')２断片の検討については、米国特許第５８６９０４６号を参照のこと。
【０１３０】
ダイアボディは、二価又は二重特異性でありうる二つの抗原結合部位を有する抗体断片である。例えば、欧州特許出願公開第４０４０９７号；国際公開第１９９３／０１１６１号；Hudson等, Nat. Med. 9:129-134 (2003)；及びHollinger等 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)を参照のこと。トリアボディ及びテトラボディはまたHudson等, Nat. Med. 9:129-134 (2003)に記載されている。
【０１３１】
単一ドメイン抗体は抗体の重鎖可変ドメインの全て又は一部又は軽鎖可変ドメインの全て又は一部を含む抗体断片である。ある実施態様では、単一ドメイン抗体はヒト単一ドメイン抗体である(Domantis, Inc., Waltham, MA；例えば米国特許第６２４８５１６Ｂ１号を参照)。
【０１３２】
抗体断片は、限定しないが、ここに記載されるように無傷抗体のタンパク質消化並びに組換え宿主細胞(例えば大腸菌又はファージ)による生産を含む様々な技術によって作製されうる。
【０１３３】
３．キメラ及びヒト化抗体
ある実施態様では、ここで提供される抗体はキメラ抗体である。あるキメラ抗体は、例えば米国特許第４８１６５６７号；及びMorrison等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)に記載されている。一例では、キメラ抗体は非ヒト可変領域(例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、又は非ヒト霊長類、例えばサル由来の可変領域)とヒト定常領域を含む。更なる例では、キメラ抗体はクラス又はサブクラスが親抗体のものとは変化せられた「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体はその抗原結合断片を含む。
【０１３４】
ある種の実施態様では、キメラ抗体はヒト化抗体である。典型的には、非ヒト抗体は、親非ヒト抗体の特異性及び親和性を保持しながら、ヒトに対する免疫原性を低下させるためにヒト化される。一般的に、ヒト化抗体は、ＨＶＲ、例えばＣＤＲ(又はその一部)が非ヒト抗体由来であり、ＦＲ(又はその一部)がヒト抗体配列由来である一又は複数の可変ドメインを含む。場合によっては、ヒト化抗体は、ヒト定常領域の少なくとも一部を含むであろう。幾つかの実施態様では、ヒト化抗体における幾つかのＦＲ残基は、非ヒト抗体(例えば、ＨＶＲ残基が誘導される抗体)からの対応する残基で置換され、例えば抗体特異性又は親和性が回復又は改善される。
【０１３５】
ヒト化抗体及びそれらを作製する方法は、例えばAlmagro 及び Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)に概説されており、更に例えば、Riechmann等, Nature 332:323-329 (1988)；Queen等, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989)；米国特許第５８２１３３７号、同７５２７７９１号、同６９８２３２１号、及び同７０８７４０９号；Kashmiri等, Methods 36:25-34 (2005)(ＳＤＲ(ａ-ＣＤＲ)グラフトを記載)；Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991)(「リサーフェシング(resurfacing)」を記載)；Dall'Acqua等, Methods 36:43-60 (2005) (「ＦＲシャッフリング」を記載)；及びOsbourn等, Methods 36:61-68 (2005) 及び Klimka等, Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000)(ＦＲシャッフリングに対する「案内選別(guided selection)」アプローチ法を記載)に記載されている。
【０１３６】
ヒト化に使用されうるヒトフレームワーク領域には、限定されるものではないが、「ベストフィット法」を使用して選択されるフレームワーク領域(例えば、Sims等 J. Immunol. 151:2296 (1993)を参照)；軽鎖又は重鎖可変ドメインの特定のサブグループのヒト抗体のコンセンサス配列から誘導されるフレームワーク領域(例えば、Carter等 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992)；及び Presta等 J. Immunol., 151:2623 (1993))；ヒト成熟(体細胞的に変異された)フレームワーク領域又はヒト生殖系列フレームワーク領域(例えば、Almagro及びFransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)を参照)；及びＦＲライブラリーのスクリーニング由来のフレームワーク領域(例えば、Baca等, J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997) 及び Rosok等, J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996)を参照)が含まれる。
【０１３７】
４．ヒト抗体
ある実施態様では、ここで提供される抗体はヒト抗体である。ヒト抗体は、当該技術分野で知られている様々な技術を使用して産生せしめることができる。ヒト抗体は、一般的に、van Dijk及びvan de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001)及びLonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008)に記載されている。
【０１３８】
ヒト抗体は、抗原投与に反応してインタクトなヒト抗体又はヒト可変領域を有するインタクトな抗体を産生するように修飾されたトランスジェニック動物に免疫源を投与することによって調製することができる。このような動物は、ヒト免疫グロブリン座位の全て又は一部を典型的には含み、内在性免疫グロブリン座位を置き換えるか、又は染色体外、又は動物の染色体内にランダムに組み込まれて存在する。このようなトランスジェニックマウスにおいて、内在性免疫グロブリン座位は、一般的に不活性化される。トランスジェニック動物からヒト抗体を得る方法の概説は、Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005)を参照のこと。また、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥＴＭ技術を記載する米国特許第６０７５１８１号及び同６１５０５８４号；ＨＵＭＡＢ(登録商標)技術を記載した米国特許第５７７０４２９号；Ｋ−Ｍ ＭＯＵＳＥ(登録商標)技術を記載した米国特許第７０４１８７０号；ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ(登録商標)技術を記載した米国特許出願公開第２００７／００６１９００号を参照。このような動物により産生されるインタクトな抗体からのヒト可変領域は、例えば異なるヒト定常領域と組合せることにより、更に修飾することができる。
【０１３９】
また、ヒト抗体は、ハイブリドーマベース法により作製することもできる。ヒトモノクローナル抗体の生産のためのヒトミエローマ及びマウス-ヒトヘテロミエローマ細胞株が記載されている。(例えば、Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984)；Brodeur等, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)；及びBoerner等, J. Immunol., 147: 86 (1991)を参照)。ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術を介して産生されるヒト抗体は、Li等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006)にまた記載されている。付加的な方法には、例えば米国特許第７１８９８２６号(ハイブリドーマ細胞株からのモノクローナルヒトＩｇＭ抗体の生産を記載)、及びNi, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006)(ヒト-ヒトハイブリドーマを記載)に記載されているものが含まれる。また、ヒトハイブリドーマ技術(トリオーマ技術)は、Vollmers 及びBrandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) 及び Vollmers及びBrandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005)にも記載されている。
【０１４０】
ヒト抗体は、ヒト由来ファージディスプレイライブラリーから選択されるＦｖクローン可変ドメイン配列を単離することにより産生せしめることもできる。ついで、このような可変ドメイン配列は、所望のヒト定常ドメインと組合せられうる。抗体ライブラリーからヒト抗体を選択するための技術を以下に記載する。
【０１４１】
５．ライブラリー由来抗体
本発明の抗体は、所望の活性を有する抗体についてコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることにより単離することができる。例えば、ファージディスプレイライブラリーを作製し、所望の結合特性を有する抗体について、そのようなライブラリーをスクリーニングするための様々な方法が当該技術分野で知られている。このような方法は、例えばHoogenboom等 Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien等編, Human Press, Totowa, NJ, 2001)において概説され、更に例えばMcCafferty等, Nature 348:552-554；Clackson等, Nature 352: 624-628 (1991)；Marks等, J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992)；Marks及びBradbury, Methods in Molecular Biology 248:161-175(Lo編, Human Press, Totowa, NJ, 2003)；Sidhu等, J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004)；Lee等, J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004)；Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004)；及びLee等, J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004)に記載されている。
【０１４２】
ある種のファージディスプレイ法では、ＶＨ及びＶＬ遺伝子のレパートリーが、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)により別々にクローニングされ、ファージライブラリーにおいてランダムに組換えられ、これがついで、Winter等, Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)に記載されているように、抗原-結合ファージについてスクリーニングされうる。ファージは、典型的には、単鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)断片又はＦａｂ断片として、抗体断片をディスプレイする。免疫化されたソースからのライブラリーにより、ハイブリドーマを構築する必要なく、免疫原に対して高親和性の抗体が提供される。あるいは、天然レパートリーを、Griffiths等, EMBO J, 12: 725-734 (1993)に記載されているように、免疫化をすることなく、広範囲の非自己、更には自己抗原に対するヒト抗体の単一供給源を提供するために(例えばヒトから)クローニングすることができる。最後に、ナイーブライブラリーは、幹細胞から再配置されていないＶ遺伝子セグメントをクローニングし、ランダム配列を含むＰＣＲプライマーを使用することで合成的に作製することができ、高頻度可変ＣＤＲ３領域をコードし、Hoogenboom 及び Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992)により記載されているような、再配置をインビトロで達成することができる。ヒト抗体ファージライブラリーを記載する特許文献には、例えば米国特許第５７５０３７３号、及び米国特許出願第２００５／００７９５７４号、同２００５／０１１９４５５号、同２００５／０２６６０００号、同２００７／０１１７１２６号、同２００７／０１６０５９８号、同２００７／０２３７７６４号、同２００７／０２９２９３６号、及び同２００９／０００２３６０号が含まれる。
【０１４３】
ヒト抗体ライブラリーから単離される抗体又は抗体断片は、ここでのヒト抗体又はヒト抗体断片と考えられる。
【０１４４】
６．多重特異性抗体
ある実施態様では、ここで提供される抗体は多重特異性抗体、例えば二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも二つの異なる部位に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体である。ある種の実施態様では、結合特異性の一つはＦＧＦＲ４に対してであり、他方は任意の他の抗原に対してである。ある実施態様では、二重特異性抗体は、ＦＧＦＲ４の二つの異なるエピトープに結合しうる。また二重特異性抗体はＦＧＦＲ４を発現する細胞に細胞傷害剤を局在化させるために使用することができる。二重特異性抗体は、完全長抗体又は抗体断片として調製することができる。
【０１４５】
多重特異性抗体を作製するための技術には、限定されるものではないが、異なる特異性を有する二つの免疫グロブリン重鎖-軽鎖対の組換え同時発現(Milstein及びCuello, Nature 305: 537 (1983)を参照)、国際公開第９３／０８８２９号、及びTraunecker等, EMBO J. 10: 3655 (1991))、及び「ノブ-イン-ホール」技術(例えば、米国特許第５７３１１６８号を参照)が含まれる。また、多重特異性抗体は、抗体Ｆｃヘテロ二量体分子を作製するための静電気操縦効果の設計(国際公開第２００９／０８９００４Ａ１号)；２又はそれ以上の抗体又は断片の架橋(例えば、米国特許第４６７６９８０号、及びBrennan等, Science, 229: 81 (1985)を参照)；二重特性抗体の産生のためのロイシンジッパーの使用(例えば、Kostelny等, J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992))；二重特異性抗体断片を作製するための「ダイアボディ」技術の使用(例えば、Hollinger等, Proc. Natl. Acad. Sci.  USA, 90:6444-6448 (1993)を参照)；及び単鎖Ｆｖ(ｓＦｖ)二量体の使用(例えば、Gruber等, J. Immunol., 152:5368 (1994)を参照)；及びTutt等 J. Immunol. 147: 60 (1991)に記載されているような三重特異性抗体の調製により、作製することができる。
【０１４６】
「オクトパス抗体」を含む３又はそれ以上の機能的抗原結合部位を有する操作抗体もここに含まれる(例えば、米国特許出願公開第２００６／００２５５７６Ａ１号を参照)。
【０１４７】
また、ここでの抗体又は断片は、ＦＧＦＲ４並びに他の異なる抗原に結合する抗原結合部位を含む「二重作用ＦＡｂ」又は「ＤＡＦ」も含む(例えば、米国特許出願公開第２００８／００６９８２０号を参照)。
【０１４８】
７．抗体変異体
ある実施態様では、ここに提供される抗体のアミノ酸配列変異体が考えられる。例えば、抗体の結合親和性及び／又は他の生物学的性質を改善させることが望ましい場合がある。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体をコードするヌクレオチド配列中に適切な修飾を導入して、又はペプチド合成により調製されうる。そのような修飾は、抗体のアミノ酸配列内の残基の、例えば、欠失、及び／又は挿入及び／又は置換を含む。最終コンストラクトが所望の特性、例えば抗原結合性を有している限り、欠失、挿入、及び置換をどのように組合せて、最終コンストラクトに到達してもよい。
【０１４９】
ａ)置換、挿入、及び欠失変異体
ある実施態様では、一又は複数のアミノ酸置換を有する抗体変異体が提供される。置換突然変異誘発のために関心ある部位はＨＶＲ及びＦＲを含む。保存的置換は、「保存的置換」と題して表１に示す。より実質的な変化は「例示的置換」との項目で表１に提供され、アミノ酸側鎖クラスを基準にして以下に更に記載される。アミノ酸置換は関心ある抗体に導入され得、生成物が所望の活性、例えば保持された／改善された抗原結合性、低減した免疫原性、又は改善されたＡＤＣＣ又はＣＤＣについて、スクリーニングされる。
【０１５０】
2014516511.tif 000001
【０１５１】
アミノ酸は共通の側鎖特性に基づいて群に分けることができる：
(１)疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
(２)中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
(３)酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
(４)塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
(５)鎖配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
(６)芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【０１５２】
非保存的置換は、これらのクラスの一つのメンバーを他のクラスに交換することを必要とするであろう。
【０１５３】
一タイプの置換変異体は、親抗体(例えばヒト化又はヒト抗体)の一又は複数の高頻度可変領域残基を置換することを含む。一般的に、更なる研究のために選択される得られた変異体は、親抗体に対して所定の生物学的性質(例えば親和性の増加、免疫原性の減少)に修飾(例えば改善)を有するか、及び／又は親抗体の実質的に保持された所定の生物学的性質を有しているであろう。例示的な置換変異体は、親和性成熟抗体であり、これは、例えばここに記載されたもののようなファージディスプレイベースの親和性成熟技術を使用して簡便に産生せしめることができる。簡潔に言えば、一又は複数のＨＶＲ残基を変異させ、変異体抗体をファージにディスプレイさせ、特定の生物学的活性(例えば、結合親和性)についてスクリーニングさせる。
【０１５４】
改変(例えば置換)は、例えば抗体親和性を改善するために、ＨＶＲにおいてなされうる。このような改変はＨＶＲ「ホットスポット」、つまり体細胞成熟プロセス中に高頻度で変異を受けるコドンによってコードされる残基(例えばChowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)を参照)、及び／又はＳＤＲｓ(ａ−ＣＤＲｓ)においてなされる場合があり、得られる変異体ＶＨ又はＶＬが結合親和性について試験される。二次ライブラリーを構築しそれから再選択することによる親和性成熟は、例えばHoogenboom等 Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O’Brien等編, Human Press, Totowa, NJ, (2001))に記載されている。親和性成熟の幾つかの実施態様では、様々な方法(例えばエラープローンＰＣＲ、鎖シャッフリング、又はオリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発)の何れかによって成熟のために選択された可変遺伝子中に多様性が導入される。ついで、二次ライブラリーが作製される。ついで、ライブラリーがスクリーニングされ、所望の親和性を有する任意の抗体変異体が同定される。多様性を導入する他の方法は、幾つかのＨＶＲ残基(例えば一度に４−６残基)が無作為化されるＨＶＲ指向性アプローチを含む。抗原結合に関与するＨＶＲ残基が、例えばアラニンスキャン突然変異誘発又はモデリングを使用して、特に同定されうる。特にＣＤＲ−Ｈ３及びＣＤＲ−Ｌ３がしばしば標的とされる。
【０１５５】
ある実施態様では、置換、挿入、又は欠失は、そのような改変が抗原に結合する抗体の能力を実質的に低下させない限り、一又は複数のＨＶＲ内で生じうる。例えば、結合親和性を実質的に減少させない保存的改変(例えばここで提供される保存的置換)をＨＶＲにおいてなすことができる。そのような改変はＨＶＲ「ホットスポット」又はＳＤＲの外側でありうる。上に提供された変異ＶＨ及びＶＬ配列の所定の実施態様では、何れかの各ＨＶＲが改変されず、又は一、二又は三のアミノ酸置換を含む。
【０１５６】
突然変異誘発の標的とされうる抗体の残基又は領域を同定するための有用な方法は、Cunningham及びWells (1989) Science 244:1081-1085によって記載されている「アラニンスキャンニング突然変異誘発法」と呼ばれる。この方法において、残基又は標的残基の群(例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、及びｇｌｕなどの荷電残基)が同定され、中性の又は負に荷電したアミノ酸(例えばアラニン又はポリアラニン)で置換され、抗体の抗原との相互作用に影響があるかどうかが決定される。最初の置換に対して機能的感受性を示しているアミノ酸位置に更なる置換を導入することができる。あるいは、又は付加的に、抗原-抗体複合体の結晶構造が抗体と抗原間の接触点を同定する。そのような接触残基及び近傍の残基は置換のための候補として標的にされるか又は削除されうる。変異体は、それらが所望の性質を含むかどうかを決定するためにスクリーニングされうる。
【０１５７】
アミノ酸配列挿入は、長さが１残基から百以上の残基を含むポリペプチドまで及ぶアミノ末端及び／又はカルボキシ末端融合体、並びに単一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。末端挿入の例は、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体を含む。抗体分子の他の挿入変異体は、抗体の血清半減期を増加させる酵素(例えばＡＤＥＰＴ)又はポリペプチドへの抗体のＮ又はＣ末端の融合を含む。
【０１５８】
ｂ)グリコシル化変異体
ある実施態様では、ここで提供される抗体は、抗体がグリコシル化される度合いを増大又は減少させるように改変される。抗体へのグリコシル化部位の付加又は欠失は、アミノ酸配列を、一又は複数のグリコシル化部位が作られ又は除去されるように改変させることによって、簡便に達成されうる。
【０１５９】
抗体がＦｃ領域を含む場合、そこに結合される炭水化物が改変されうる。哺乳動物細胞により産生される天然抗体は、典型的には、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７に対してＮ結合により一般的に結合する分枝状で二分岐のオリゴ糖を含む。例えば、Wright等 TIBTECH 15:26-32 (1997)を参照。オリゴ糖は様々な炭水化物、例えばマンノース、Ｎ-アセチルグルコサミン(ＧｌｃＮＡｃ)、ガラクトース、及びシアル酸、並びに二分岐オリゴ糖構造の「幹」のＧｌｃＮＡｃに結合されるフコースが含まれる。幾つかの実施態様では、本発明の抗体におけるオリゴ糖の修飾が、ある改善された特性を有する抗体変異体を生じせしめるために、なされうる。
【０１６０】
一実施態様では、Ｆｃ領域に(直接又は間接的に)結合したフコースを欠く炭水化物構造を有する抗体変異体が提供される。例えば、かかる抗体におけるフコースの量は、１％から８０％、１％から６５％、５％から６５％、又は２０％から４０％でありうる。フコースの量は、例えば国際公開第２００８／０７７５４６号に記載されているように、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によって測定して、Ａｓｎ２９７(例えば複合のハイブリッド及び高マンノース構造)に結合した全ての糖構造の合計に対してＡｓｎ２９７の糖鎖内のフコースの平均量を計算することによって決定される。Ａｓｎ２９７はＦｃ領域内の約２９７位(Ｆｃ領域残基のＥｕ番号付け)に位置したアスパラギン残基を意味する；しかしながら、Ａｓｎ２９７は、抗体中のマイナーな配列変異のために、２９７位から約±３アミノ酸上流又は下流に、つまり２９４位と３００位の間に位置している場合がありうる。そのようなフコシル化変異体は改善されたＡＤＣＣ機能を有しうる。例えば、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号(Presta, L.)；米国特許出願公開第２００４／００９３６２１号(Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd)を参照。「脱フコシル化された」又は「フコース欠損」抗体変異体に関連した刊行物の例には、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号；国際公開第２０００／６１７３９号；国際公開第２００１／２９２４６号；米国特許出願公開第２００３／０１１５６１４号；米国特許出願公開第２００２／０１６４３２８号；米国特許出願公開第２００４／００９３６２１号；米国特許出願公開第２００４／０１３２１４０号；米国特許出願公開第２００４／０１１０７０４号；米国特許出願公開第２００４／０１１０２８２号；米国特許出願公開第２００４／０１０９８６５号；国際公開第２００３／０８５１１９号；国際公開第２００３／０８４５７０号；国際公開第２００５／０３５５８６号；国際公開第２００５／０３５７７８号；国際公開第２００５／０５３７４２号；国際公開第２００２／０３１１４０号；Okazaki等 J. Mol. Biol. 336:1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等 Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)が含まれる。脱フコシル化抗体を生産可能な細胞株の例には、タンパク質フコシル化に欠けているＬｅｃ１３ＣＨＯ細胞(Ripka等 Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986)；米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８Ａ１号, Presta, L；及び国際公開第２００４／０５６３１２Ａ１号, Adams等，特に実施例１１)、及びノックアウト細胞株、例えばアルファ-１,６-フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８、ノックアウトＣＨＯ細胞(例えば、Yamane-Ohnuki等 Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)；Kanda, Y等, Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006)；及び国際公開第２００３／０８５１０７号を参照)が含まれる。
【０１６１】
例えば抗体のＦｃ領域に結合した二分オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃにより二分される二分オリゴ糖を有する抗体変異体が更に提供される。そのような抗体変異体は、フコシル化が低減され、及び／又はＡＤＣＣ機能が改善されている場合がある。そのような抗体変異体の例は、例えば国際公開第２００３／０１１８７８号(Jean-Mairet等)；米国特許第６６０２６８４号(Umana等)；及び米国特許出願公開第２００５／０１２３５４６号(Umana等)に記載されている。Ｆｃ領域に結合したオリゴ糖に少なくとも一のガラクトース残基を有する抗体変異体も提供される。このような抗体変異体は、改善されたＣＤＣ機能を有している場合がある。このような抗体変異体は、例えば国際公開第１９９７／３００８７号(Patel等)；国際公開第１９９８／５８９６４号(Raju, S.)；及び国際公開第１９９９／２２７６４号(Raju, S.)に記載されている。
【０１６２】
ｃ)Ｆｃ領域変異体
ある実施態様では、一又は複数のアミノ酸修飾が、ここに提供される抗体のＦｃ領域に導入され、それによりＦｃ領域変異体を産生せしめてもよい。Ｆｃ領域変異体は、一又は複数のアミノ酸位置にアミノ酸修飾(例えば、置換)を含んでなるヒトＦｃ領域配列(例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４Ｆｃ領域)を含みうる。
【０１６３】
ある実施態様では、本発明は、幾つかであるが全てではないエフェクター機能を持つ抗体変異体を考察し、これは、抗体を、インビボでの抗体の半減期は重要であるが、あるエフェクター機能(例えば、補体及びＡＤＣＣ)は不要か又は有害である用途のために望ましい候補とする。ＣＤＣ及び／又はＡＤＣＣ活性の減少／喪失を確認するために、インビトロ及び／又はインビボ細胞傷害性アッセイが実施されうる。例えば、Ｆｃレセプター(ＦｃＲ)結合アッセイは、抗体がＦｃγＲ結合を欠く(よってＡＤＣＣ活性を欠くと思われる)が、ＦｃＲｎ結合能力を保持していることを確かめるために実施されうる。ＡＤＣＣを媒介する一次細胞であるＮＫ細胞はＦｃγＲＩＩＩのみを発現するのに対し、単球はＦｃγＩ、ＦｃγＩＩ及びＦｃγＩＩＩを発現する。造血細胞上のＦｃＲ発現は、Ravetch及びKinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-492(1991)の４６４頁の表３に要約されている。対象とする分子のＡＤＣＣ活性を評価するための非限定的なインビトロアッセイが米国特許第５５００３６２号(例えばHellstrom, I.等 Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)を参照)及びHellstrom, I等, Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985)；５８２１３３７(Bruggemann, M.等, J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)を参照)に記載されている。別法では、非放射性アッセイ法が用いられ得る(例えば、フローサイトメトリーのためのＡＣＴＩ(商標)非放射性細胞傷害性アッセイ(CellTechnology, Inc. Mountain View, CA；及びＣｙｔｏ Ｔｏｘ９６(登録商標)非放射性細胞傷害性アッセイ(Promega, Madison, WI)を参照)。このようなアッセイのために有用なエフェクター細胞は、末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)及びナチュラルキラー(ＮＫ)細胞を含む。あるいは、又は付加的に、対象とする分子のＡＤＣＣ活性は、例えばClynes等Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 95:652-656(1998)に記載されているような動物モデルにおいてインビボで評価されうる。Ｃｌｑ結合アッセイが、抗体がＣｌｑに結合できず、よってＣＤＣ活性を欠くことを確認するためにまた実施されうる。例えば、国際公開第２００６／０２９８７９号及び国際公開第２００５／１００４０２号におけるＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを実施することができる(例えばGazzano-Santoro等, J. Immunol. Methods 202:163 (1996)；Cragg, M.S.等, Blood 101:1045-1052 (2003)；及びCragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)を参照)。ＦｃＲｎ結合及びインビボクリアランス／半減期定量も当該技術分野で知られている方法を使用して実施することがまたできる(例えば、Petkova, S.B.等, Int’l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006)を参照)。
【０１６４】
減少したエフェクター機能を有する抗体は、Ｆｃ領域残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７及び３２９の一又は複数の置換を有するものを含む(米国特許第６７３７０５６号)。このようなＦｃ変異体は、二又はそれ以上のアミノ酸位２６５、２６９、２７０、２９７及び３２７に置換を有するＦｃ変異体を含み、アラニンへの残基２６５及び２９７の置換を有するいわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体を含む(米国特許第７３３２５８１号)。
【０１６５】
ＦｃＲへの改良又は減少された結合を有するある種の抗体変異体が記載されている(例えば米国特許第６７３７０５６号；国際公開第２００４／０５６３１２号、及びShields等, J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)を参照)。
【０１６６】
ある実施態様では、抗体変異体は、ＡＤＣＣを改善する一又は複数のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の位置２９８、３３３、及び／又は３３４での置換(残基のＥＵ番号付け)を有するＦｃ領域を含む。
【０１６７】
幾つかの実施態様では、例えば米国特許第６１９４５５１号、国際公開第９９／５１６４２号、及びIdusogie等 J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)に記載されているように、改変された(つまり、改善され又は減少した)Ｃｌｑ結合及び／又は補体依存性細胞傷害性(ＣＤＣ)を生じる改変がＦｃ領域になされる。
【０１６８】
増加した半減期及び胎児への母性ＩｇＧｓの移動に関与する新生児Ｆｃレセプター(ＦｃＲｎ)(Guyer等, J. Immunol. 117:587 (1976)及びKim等, J. Immunol. 24:249 (1994))への改善された結合性を有する抗体が、米国特許出願公開第２００５／００１４９３４Ａ１(Hinton等)に記載されている。その抗体は、ＦｃＲｎへのＦｃ領域の結合を改善する一又は複数の置換をそこに有するＦｃ領域を含む。このようなＦｃ変異体は、Ｆｃ領域残基：２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４又は４３４の一又は複数での置換、例えばＦｃ領域残基４３４の置換を有するものを含む(米国特許第７３７１８２６号)。
【０１６９】
Ｆｃ領域変異体の他の例に関しては、Duncan及びWinter, Nature 322:738-40 (1988)；米国特許第５６４８２６０号；米国特許第５６２４８２１号；及び国際公開第９４／２９３５１号も参照のこと。
【０１７０】
ｄ)システイン操作抗体変異体
ある実施態様では、システイン操作抗体、例えば抗体の一又は複数の残基がシステイン残基で置換される「チオＭＡｂｓ」を作ることが望ましいことがある。特定の実施態様では、置換される残基が抗体の接近可能な部位で生じる。これらの残基をシステインと置換することによって、反応性チオール基が抗体の接近可能な部位に位置させられ、抗体を他の部分、例えば薬剤部分又はリンカー薬剤部分に結合させ、ここで更に記載されるように免疫コンジュゲートを作るために使用されうる。ある実施態様では、以下の残基の任意の一又は複数がシステインと置換されうる：軽鎖のＶ２０５(カバット番号付け)；重鎖のＡ１１８(ＥＵ番号付け)；及び重鎖Ｆｃ領域のＳ４００(ＥＵ番号付け)。システイン操作抗体は、例えば米国特許第７５２１５４１号に記載されるようにして、産生されうる。
【０１７１】
ｅ)抗体誘導体
ある実施態様では、ここに提供される抗体は、当該技術分野において知られ直ぐに利用できる更なる非タンパク質性部分を含むように更に修飾することができる。抗体の誘導体化に適した部分は、限定しないが、水溶性ポリマーを含む。水溶性ポリマーの非限定的な例には、限定されるものではないが、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ-１,３-ジオキソラン、ポリ-１,３,６-トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸(ホモポリマーかランダムコポリマー)、及びデキストラン又はポリ(ｎ-ビニルピロリドン)ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、プロリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチレン化ポリオール(例えばグリセロール)、ポリビニルアルコール、及びそれらの混合物が含まれる。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは水中におけるその安定性のために製造の際に有利でありうる。ポリマーは任意の分子量であってよく、分枝状でも非分枝状でもよい。抗体に結合するポリマーの数は変化してもよく、一を超えるポリマーが結合する場合、それらは同じでも異なった分子でもよい。一般に、誘導体化に使用されるポリマーの数及び／又はタイプは、限定されるものではないが、抗体誘導体が定まった条件下での治療に使用されるかどうか等を含む、改善される抗体の特定の性質又は機能を含む考慮事項に基づいて決定することができる。
【０１７２】
他の実施態様では、放射線への暴露によって選択的に加熱されうる非タンパク質様部分及び抗体のコンジュゲートが提供される。一実施態様では、非タンパク質様部分はカーボンナノチューブである(Kam等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005))。放射線は任意の波長のものであってよく、限定するものではないが、通常の細胞に害を与えないが、抗体-非タンパク質様部分に近位の細胞が死滅させられる温度まで非タンパク質様部分を加熱する波長が含まれる。
【０１７３】
Ｂ．組換え方法及び組成物
抗体は、例えば米国特許第４８１６５６７号に記載されているように、組換え法及び構成物を使用して製造することができる。一実施態様では、ここに記載される抗ＦＧＦＲ４抗体をコードする単離核酸が提供される。このような核酸は、抗体のＶＬを含んでなるアミノ酸配列及び／又はＶＨを含んでなるアミノ酸配列(例えば、抗体の軽及び／重鎖)をコードしてもよい。更なる実施態様では、このような核酸を含んでなる一又は複数のベクター(例えば、発現ベクター)が提供される。更なる実施態様では、このような核酸を含んでなる宿主細胞が提供される。このような一実施態様では、宿主細胞は、(１)抗体のＶＬを含んでなるアミノ酸配列及び抗体のＶＨを含んでなるアミノ酸配列をコードする核酸を含んでなるベクター、又は(２)抗体のＶＬを含んでなるアミノ酸配列をコードする核酸を含んでなる第一ベクター、及び抗体のＶＨを含んでなるアミノ酸配列をコードする核酸を含んでなる第２ベクターを含む(例えば、これらによって形質転換される)。一実施態様では、宿主細胞は真核生物、例えばチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞又はリンパ球系細胞(例えばＹ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞)である。一実施態様では、抗ＦＧＦＲ４抗体の作製方法が提供され、該方法は、上に提供された抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を、抗体の発現に適した条件下で、培養し、場合によっては宿主細胞(又は宿主細胞培養培地)から抗体を回収することを含む。
【０１７４】
抗ＦＧＦＲ４抗体の組換え生産では、例えば上述のような抗体をコードする核酸が単離され、宿主細胞での更なるクローニング及び／又は発現のために一又は複数のベクターに挿入される。このような核酸は、直ちに単離され、一般的な手順を使用して(例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能であるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって)配列決定されうる。
【０１７５】
抗体をコードするベクターのクローニング又は発現のために適した宿主細胞は、ここに記載される原核細胞又は真核細胞である。例えば、抗体は、特にグリコシル化及びＦｃエフェクター機能が必要でない場合に、細菌で生産されうる。細菌での抗体断片及びポリペプチドの発現については、米国特許第５６４８２３７号、米国特許第５７８９１９９号、及び米国特許第５８４０５２３号を参照のこと。(また大腸菌中での抗体断片の発現を記述しているCharlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254を参照)。発現後、抗体は、可溶性画分中の細菌細胞ペーストから単離され得、更に精製されうる。
【０１７６】
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母などの真核微生物が、抗体をコードするベクターのための適切なクローニング又は発現宿主であり、そのグリコシル化経路が「ヒト化」された菌及び酵母株を含み、部分的に又は完全にヒト化したグリコシル化パターンを持つ抗体の生産を生じる。Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004),及びLi等, Nat. Biotech. 24:210-215 (2006)を参照。
【０１７７】
グリコシル化抗体の発現のために適した宿主細胞は、多細胞生物(無脊椎動物及び脊椎動物)からもまた誘導される。無脊椎動物細胞の例は、植物及び昆虫の細胞を含む。特にヨウトガ細胞のトランスフェクションのために、昆虫細胞と併用されうる多くのバキュロウィルス株が同定されている。
【０１７８】
植物細胞培養もまた宿主として利用することができる。例えば米国特許第５９５９１７７号、同第６０４０４９８号、同第６４２０５４８号、同第７１２５９７８号、及び同第６４１７４２９号(遺伝子導入植物において抗体を生産するためのＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳＴＭ技術を記述)を参照。
【０１７９】
脊椎動物細胞をまた宿主として使用することができる。例えば、懸濁状態で増殖するよう適合化された哺乳動物細胞株が有用な場合がある。有用な哺乳動物細胞株の他の例は、ＳＶ４０(ＣＯＳ−７)によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株；ヒト胚腎臓株(Graham等, J. Gen Virol. 36:59 (1977)に記載された２９３又は２９３細胞)；ベビーハムスター腎細胞(ＢＨＫ)；マウスセルトリ細胞(例えばMather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)に記載されるＴＭ４細胞)；サル腎細胞(ＣＶ１)；アフリカミドリザル腎細胞(ＶＥＲＯ−７６)；ヒト子宮頸癌細胞(ＨＥＬＡ)；イヌ腎細胞(ＭＤＣＫ)；バッファローラット肝細胞(ＢＲＬ３Ａ)；ヒト肺細胞(Ｗ１３８)；ヒト肝細胞(ＨｅｐＧ２)；マウス乳腺腫瘍(ＭＭＴ０６０５６２)；Mather等, Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)に記載されるＴＲＩ細胞；ＭＲＣ  ５細胞；及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株は、ＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞を含むチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞(Urlaub等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980))；及びＹ０、ＮＳ０、及びＳｐ２／０等のミエローマ細胞株である。抗体生産のために適した哺乳類動物宿主細胞株の概説として、例えばYazaki及びWu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo編, Humana Press, Totowa, NJ), pp255-268 (2003)を参照のこと。
【０１８０】
Ｃ．アッセイ
ここに提供されている抗ＦＧＦＲ４抗体は、当分野で知られている様々なアッセイによってそれらの物理的／化学的特性及び／又は生物学的活性について同定、スクリーニング、又は特徴付けされうる。
１．結合アッセイ及び他のアッセイ
一態様では、発明の抗体は、知られている方法、例えばＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロットなどによってその抗原結合活性について試験される。
別の態様では、競合アッセイが、ＦＧＦＲ４への結合について抗体ＬＤ１と競合する抗体を同定するために使用されうる。ある実施態様では、このような競合抗体は抗体ＬＤ１に結合される同じエピトープ(例えば線形又は立体構造エピトープ)に結合する。抗体が結合するエピトープのマッピングのための詳細な例示的方法は、Morris (1996) “Epitope Mapping Protocols,” in Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ)に提供されている。
例示的な競合アッセイでは、固定化ＦＧＦＲ４が、ＦＧＦＲ４(例えば抗体  ＬＤ１)に結合する第一標識抗体及びＦＧＦＲ４への結合について第一抗体と競合するその能力について試験されている第二標識抗体を含んでなる溶液中においてインキュベートされる。第二抗体はハイブリドーマ上清中に存在しうる。コントロールとして、固定化ＦＧＦＲ４が、第一標識抗体を含むが第二非標識抗体を含まない溶液中においてインキュベートされる。ＦＧＦＲ４への第一抗体の結合が可能な条件下でのインキュベーション後、過剰な非結合抗体が取り除かれ、固定化ＦＧＦＲ４に伴う標識の量が測定される。固定化ＦＧＦＲ４に伴う標識の量がコントロールサンプルと比較して試験サンプルにおいて実質的に低減されている場合、それは第二抗体がＦＧＦＲ４への結合について第一抗体と競合していることを示す。Harlow及びLane (1988) Antibodies:  A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)を参照のこと。
【０１８１】
２．活性アッセイ
一態様では、アッセイは、生物学的な活性を有する抗ＦＧＦＲ４抗体を同定するために提供される。生物学的な活性には、例えば：ＦＧＦＲ４を発現する細胞（例えばＨＵＨ７細胞）のＦＧＦ（例えばＦＧＦ１）刺激増殖、ＦＧＦ１９に曝露された細胞におけるＣＹＰ７α７発現のＦＧＦ１９−媒介阻害、ＦＧＦ１９に曝露された細胞におけるＦＧＦＲ４、ＭＡＰＫ、ＦＲＳ２及び／又はＥＲＫ２のＦＧＦ１９−誘発リン酸化、及びＦＧＦ１９−誘発コロニー形成(幾つかの実施態様では、ＨＣＣ細胞株コロニー形成)の阻害を含みうる。
インビボ及び／又はインビトロにおいてこのような生物学的活性を有する抗体もまた提供される。
【０１８２】
ある実施態様では、本発明の抗体がこのような生物学的活性について検査される。このような生物学的活性を検査するためのアッセイがここに記載されている。
ある実施態様では、本発明の抗体は、インビトロでの細胞成長又は増殖を阻害する能力について試験される。細胞成長又は増殖の阻害のためのアッセイは当分野で周知である。本明細中に記載の「細胞殺傷」アッセイにて例示した細胞増殖のためのあるアッセイは、細胞生存度を測定する。このようなあるアッセイは、Promega (Madison, WI)から市販されているCellTiter-GloＴＭ発光細胞生存率アッセイである。このアッセイは、代謝活性のある細胞の指標であるＡＴＰの存在の量に基づいて生細胞数を決定する。Crouch等 (1993) J. Immunol. Meth. 160:81-88、米国特許第６６０２６７７号を参照。アッセイは、自動ハイスループットスクリーニング(ＨＴＳ)に用いられるように９６-又は３８４-ウェルフォーマットで行ってもよい。Cree等 (1995) AntiCancer Drugs 6:398-404を参照。アッセイ手順は、単一の試薬(ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ-Ｇｌｏ(登録商標)試薬)を直接培養細胞に加えることを伴う。この結果細胞溶解が生じ、ルシフェラーゼ反応によって生産される発光シグナルが生成される。この発光シグナルは、培養物中に存在する生細胞の数に直接比例している、ＡＴＰの存在の量に比例する。データは、ルミノメーター又はＣＣＤカメラ画像デバイスによって記録することができる。発光の結果は相対的な光の単位(ＲＬＵ)として表す。
【０１８３】
細胞増殖についての他のアッセイは「ＭＴＴ」アッセイであり、これは、ミトコンドリアレダクターゼによる３-(４,５-ジメチルチアゾール-２-イル)-２,５-ジフェニルテトラゾリウムブロマイドのホルマザンへの酸化を測定する比色アッセイである。CellTiter-GloＴＭアッセイのように、このアッセイは、細胞培養物に存在する代謝活性のある細胞の数を表す。例としてMosmann (1983) J. Immunol. Meth. 65:55-63及びZhang等 (2005) Cancer Res. 65: 3877-3882を参照。
【０１８４】
上記いずれかのインビトロアッセイに用いるための細胞には、天然でＦＧＦＲ４を発現する又はＦＧＦＲ４を発現するように操作された細胞ないしは細胞株が含まれる。このような細胞には、同じ組織起源の正常細胞と比べてＦＧＦＲ４を過剰発現する腫瘍細胞が含まれる。また、このような細胞には、ＦＧＦＲ４を発現する細胞株(腫瘍細胞株を含む)や、正常にＦＧＦＲ４を発現しないがＦＧＦＲ４をコードする核酸を形質移入してある細胞株が含まれる。上記いずれかのインビトロアッセイに用いるための本明細書中に挙げる例示的な細胞株には、ＨＣＣ細胞株ＨＵＨ７が含まれる。
【０１８５】
一態様では、抗ＦＧＦＲ４抗体は、インビボでの細胞成長又は増殖を阻害する能力について試験される。ある実施態様では、抗ＦＧＦＲ４抗体は、インビボでの腫瘍成長を阻害する能力について試験される。異種移植片モデルなどのインビボモデルシステムが前記の試験のために用いられうる。例示的な異種移植片システムでは、好適に免疫を低下させた非ヒト動物、例えば胸腺「ヌード」マウスにヒト腫瘍細胞が導入される。本発明の抗体は動物に投与される。抗体の腫瘍成長を阻害するか又は減少させる能力が測定される。上記の異種移植片システムのある実施態様では、ヒト腫瘍細胞はヒト患者の腫瘍細胞である。このような異種移植片モデルはOncotest GmbH (Frieberg, Germany)から市販されている。ある実施態様では、ヒト腫瘍細胞は、ＨＵＨ７ ＨＣＣ腫瘍細胞株などのヒト腫瘍細胞株由来の細胞である。ある実施態様では、ヒト腫瘍細胞は、乳房脂肪パッドなどの好適な部位に皮下注射によって又は移植によって好適に免疫抑制された非ヒト動物に導入される。ある実施態様では、異種移植モデルは例えばここにおいて、またnicholes等, Am J Pathol 160:2295-2307に記載されるようにＦＧＦ１９を過剰発現するトランスジェニックマウスである。
【０１８６】
上記アッセイの何れかは、抗ＦＧＦＲ４抗体の代わりに又は加えて、発明のイムノコンジュゲートを使用して実施されてもよいことが理解される。
【０１８７】
上記アッセイの何れかは、抗ＦＧＦＲ４抗体及び更なる治療剤、例えば化学療法剤を使用して実施されうることが理解される。
【０１８８】
Ｄ．免疫コンジュゲート
本発明は、また、例えば化学療法剤又は薬物、増殖阻害剤、毒素(例えばタンパク質毒素、酵素的に活性な細菌、真菌、植物、又は動物由来の毒素、又はその断片)、又は放射性同位体のような一又は複数の細胞傷害剤とここでコンジュゲートされる抗ＦＧＦＲ４抗体を含む免疫コンジュゲートを提供する。
【０１８９】
一実施態様では、免疫コンジュゲートは、限定しないが、メイタンシノイド(米国特許第５２０８０２０号、第５４１６０６４号及び欧州特許第０４２５２３５Ｂ１号を参照)；アウリスタチン、例えばモノメチルアウリスタチン薬剤部分ＤＥ及びＤＦ(ＭＭＡＥ及びＭＭＡＦ)(米国特許第５６３５４８３号及び同第５７８０５８８号及び同第７４９８２９８号を参照)；ドラスタチン；カリケアマイシン又はその誘導体(米国特許第５７１２３７４号、同第５７１４５８６号、同第５７３９１１６号、同第５７６７２８５号、同第５７７０７０１号、同第５７７０７１０号、同第５７７３００１号、及び同第５８７７２９６号；Hinman等, Cancer Res. 53:3336-3342 (1993)；及びLode等, Cancer Res. 58:2925-2928 (1998)を参照)；アントラサイクリン、例えばダウノマイシン又はドキソルビシン(Kratz等, Current Med. Chem. 13:477-523 (2006)；Jeffrey等, Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362 (2006)；Torgov等, Bioconj. Chem. 16:717-721 (2005)；Nagy等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:829-834 (2000)；Dubowchik等, Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532 (2002)；King等, J. Med. Chem. 45:4336-4343 (2002)；及び米国特許第６６３０５７９号を参照)；メトトレキセート；ビンデシン；タキサン、例えばドセタキセル、パクリタキセル、ラロタキセル、テセタキセル、及びオルタタキセル；トリコテシン及びＣＣ１０６５を含む一又は複数の薬物に抗体がコンジュゲートされる抗体薬剤コンジュゲート(ＡＤＣ)である。
【０１９０】
他の実施態様では、免疫コンジュゲートは、限定しないが、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、(緑膿菌からの)外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシン(modeccin)Ａ鎖、アルファ-サルシン、アレウリテス・フォーディ(Aleurites fordii)タンパク質、ジアンチン(dianthin)タンパク質、フィトラカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)タンパク質(ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ-Ｓ)、モモルディカ・チャランチア(momordica charantia)阻害剤、クルシン(curcin)、クロチン(crotin)、サパオナリア・オフィシナリス(sapaonaria officinalis)阻害剤、ゲロニン(gelonin)、ミトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン(phenomycin)、エノマイシン(enomycin)及びトリコテセン(tricothecene)を含む、酵素的に活性な毒素又はその断片にコンジュゲートされたここに記載された抗体を含む。
【０１９１】
他の実施態様では、免疫コンジュゲートは放射性コンジュゲートを形成するために放射性原子にコンジュゲートされるここに記載の抗体を含む。様々な放射性同位元素が放射性コンジュゲートの生産のために利用可能である。例は、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位元素を含む。放射性コンジュゲートが検出に使用される場合、それはシンチグラフィー研究用の放射性原子、例えばｔｃ９９ｍ又はＩ１２３、又は核磁気共鳴(ＮＭＲ)イメージング(磁気共鳴イメージング、ｍｒｉとしても知られている)用のスピン標識、例えばまたヨウ素-１２３、ヨウ素-１３１、インジウム-１１１、フッ素-１９、炭素-１３、窒素-１５、酸素-１７、ガドリニウム、マンガン又は鉄を含みうる。
【０１９２】
抗体と細胞傷害剤のコンジュゲートは、様々な二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオネート(ＳＰＤＰ)、スクシンイミジル-４-(Ｎ-マレイミドメチル)シクロヘキサン-１-カルボキシレート(ＳＭＣＣ)、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステル類の二官能性誘導体(例えばジメチルアジピミダートＨＣｌ)、活性エステル類(例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル)、アルデヒド類(例えば、グルタルアルデヒド)、ビスアジド化合物(例えば、ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス-ジアゾニウム誘導体(例えば、ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)エチレンジアミン)、ジイソシアネート(例えば、トリエン-２,６-ジイソシアネート)、及び二活性フッ素化合物(例えば、１,５-ジフルオロ-２,４-ジニトロベンゼン)を使用して作製することができる。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta等, Science 238:1098(1987)に記載されているようにして調製することができる。炭素-１４標識１-イソチオシアナトベンジル-３-メチルジエチレン-トリアミン五酢酸(ＭＸ-ＤＴＰＡ)が抗体に放射性ヌクレオチドをコンジュゲートするためのキレート剤の例である。国際公開第９４／１１０２６号を参照のこと。リンカーは細胞中の細胞傷害剤の放出を容易にするための「切断可能リンカー」でありうる。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ過敏性リンカー、光不安定性リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカーが使用され得る(Chari等, Cancer Research, 52：127-131(1992)；米国特許第５２０８０２０号)。
【０１９３】
ここでの免疫コンジュゲート又はＡＤＣは、限定するものではないが、(例えば、Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.Aより)市販されているＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ−ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ−ＥＭＣＳ、スルホ−ＧＭＢＳ、スルホ−ＫＭＵＳ、スルホ−ＭＢＳ、スルホ−ＳＩＡＢ、スルホ−ＳＭＣＣ、及びスルホ−ＳＭＰＢ、及びＳＶＳＢ(スクシンイミジル-(４-ビニルスルホン)安息香酸塩)を含む架橋剤を用いて調製されるコンジュゲートが明示的に考えられる。
【０１９４】
Ｅ．診断及び検出のための方法及び組成物
ある実施態様では、ここに提供される何れかの抗ＦＧＦＲ４抗体は、生物学的サンプル中におけるＦＧＦＲ４の存在の検出に有用である。「検出」なる用語は、ここで使用される場合、定量的又は定性的検出を包含する。ある実施態様では、生物学的サンプルは、細胞又は組織、例えば乳房、膵臓、食道、肺及び／又は脳を含む。
一実施態様では、診断又は検出の方法における使用のための抗ＦＧＦＲ４抗体が提供される。更なる態様では、生物学的サンプル中におけるＦＧＦＲ４の存在の検出の方法が提供される。ある実施態様では、方法は、ＦＧＦＲ４への抗ＦＧＦＲ４抗体の結合が可能な条件下で生物学的サンプルをここに記載の抗ＦＧＦＲ４抗体と接触させる工程、複合体が抗ＦＧＦＲ４抗体及びＦＧＦＲ４間で形成されているかを検出する工程を含む。このような方法はインビトロ又はインビボ方法であってよい。一実施態様では、抗ＦＧＦＲ４抗体は、抗ＦＧＦＲ４抗体による治療に適格である被験体を選択するために、例えばＦＧＦＲ４が患者の選択のバイオマーカーである場合に、使用される。
発明の抗体を使用して診断されうる例示的な障害は、癌(例えば乳房、肺、膵臓、脳、腎臓、卵巣、胃、白血病、子宮内膜、結腸、前立腺、下垂体、乳房線維腺腫、頭頸部、軟部組織、神経芽細胞腫、メラノーマ、子宮内膜、精巣、胆管細胞癌、胆嚢及び肝臓の癌)を含む。
ある実施態様では、標識化抗ＦＧＦＲ４抗体が提供される。標識は、限定するものではないが、直接検出される標識又は部分(例えば蛍光、発色団、高電子密度、化学発光、及び放射性標識)、並びに例えば酵素反応又は分子相互作用を通して間接的に検出される酵素又はリガンドなどの部分を含む。例示的な標識は、限定するものではないが、放射性同位体３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、及び１３１Ｉ、フルオロフォア、例えば希土類キレート又はフルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、ルシフェラーゼ、例えばホタルルシフェラーゼ及び細菌ルシフェラーゼ(米国特許第４７３７４５６号)、ルシフェリン、２,３−ジヒドロフタルアジネジオン、西洋ワサビペルオキシダーゼ(ＨＲＰ)、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、サッカライドオキシダーゼ、例えばグルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、及びグルコース−６−リン酸脱水素酵素、複素環オキシダーゼ、例えばウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼ(ＨＲＰ等の色素前駆体を酸化するために過酸化水素を伴う酵素にカップリングされる)、ラクトペルオキシダーゼ、又はミクロペルオキシダーゼ、ビオチン／アビジン、スピン標識、バクテリオファージ標識、安定フリーラジカルなどを含む。
【０１９５】
Ｆ．薬学的製剤
ここに記載される抗ＦＧＦＲ４抗体の薬学的製剤は、所望の純度を有するこのような抗体を一又は複数の任意の薬学的に許容可能な担体と混合することによって凍結乾燥製剤又は水溶液の形態において調製される(Remington's Pharmaceutical Sciences 16版, Osol, A.編(1980))。薬学的に許容可能な担体は一般的に、用いられる用量及び濃度でレシピエントに非毒性であり、限定するものではないが、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸などのバッファー；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；保存料(オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロライド；ヘキサメトニウムクロライド；ベンザルコニウムクロライド；ベンゼトニウムクロライド；フェノール；ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３-ペンタノール；及びｍ-クレゾールなど)；低分子量(約１０残基未満)ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリジン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体(例えば、Ｚｎ-タンパク質錯体)及び／又はポリエチレングリコール(ＰＥＧ)等の非イオン性界面活性剤を含む。ここでの例示的な薬学的に許容可能な担体は、間質(insterstitial)薬分散剤、例えば可溶性中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質(sHASEGP)、例えばヒト可溶性ＰＨ-２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質、例えばｒＨｕＰＨ２０(HYLENEX(登録商標), Baxter International, Inc.)を含む。特定の例示的なｓＨＡＳＥＧＰ及びその使用は、ｒＨｕＰＨ２０を含み、米国特許公開番号２００５／０２６０１８６及び２００６／０１０４９６８に記載されている。一態様では、ｓＨＡＳＥＧＰは一又は複数のグリコサミノグリカナーゼ、例えばコンドロイチナーゼと組み合わせられる。
例示的な凍結乾燥抗体製剤は米国特許第６２６７９５８号に記載されている。水性抗体製剤は米国特許第６１７１５８６号及び国際公開第２００６／０４４９０８号に記載されるものを含み、後者の製剤はヒスチジンアセテートバッファーを含む。
【０１９６】
ここでの製剤はまた、治療されている特定の徴候の必要に応じて２以上の活性成分、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有するものを含みうる。例えば、ＥＧＦＲアンタゴニスト(例えばエルロチニブ)、抗血管新生剤(例えばＶＥＧＦアンタゴニスト、例えば抗ＶＥＧＦ抗体)又は化学療法剤(例えばタキソイド又は白金剤)を更に提供することが望まれうる。このような活性成分は、意図される目的に有効な量において組合せで適切に存在する。
【０１９７】
活性成分は、例えばコアセルべーション技術又は界面重合により調製したマイクロカプセル、例えば、それぞれコロイド状ドラッグデリバリーシステム(例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル)又はマクロエマルジョンの、ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン-マイクロカプセル及びポリ(メチルメタクリレート)マイクロカプセル中に捕捉することもできる。このような技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences 16版, Osol, A.編(1980)に開示されている。
【０１９８】
徐放製剤を調製してもよい。徐放製剤の好適な例は、抗体を含む固形疎水性ポリマーの半透過性基質を含み、該基質は、成形品、例えばフィルム、又はマイクロカプセルの形である。
インビボ投与に使用される製剤は一般的に無菌である。無菌性は、例えば滅菌濾過膜を通す濾過によって容易に達成されうる。
【０１９９】
Ｇ．治療方法及び組成物
ここに提供される抗ＦＧＦＲ４抗体の何れかは治療方法において使用されうる。
一態様では、医薬としての使用のための抗ＦＧＦＲ４抗体が提供される。更なる態様では、癌の治療における使用のための抗ＦＧＦＲ４抗体が提供される。更なる実施態様では、肝疾患(例えば硬変)の治療における使用のための抗ＦＧＦＲ４抗体が提供される。更なる実施態様では、消耗性障害の治療における使用のための抗ＦＧＦＲ４抗体が提供される。ある実施態様では、治療の方法における使用のための抗ＦＧＦＲ４抗体が提供される。ある実施態様では、発明は、個体に有効量の抗ＦＧＦＲ４抗体を投与することを含んでなる、癌を有する個体の治療方法における使用のための抗ＦＧＦＲ４抗体を提供する。ある実施態様では、発明は、個体に有効量の抗ＦＧＦＲ４抗体を投与することを含んでなる、肝障害(例えば硬変)を有する個体の治療方法における使用のための抗ＦＧＦＲ４抗体を提供する。一つのこのような実施態様では、本方法は、個体に有効量の少なくとも１つの更なる治療剤、例えば下記のものを投与することを更に含む。更なる実施態様では、発明は、細胞増殖の阻害における使用のための抗ＦＧＦＲ４抗体を提供する。ある実施態様では、本発明は、細胞増殖を阻害するために有効量の抗ＦＧＦＲ４抗体を個体に投与することを含んでなる、個体における細胞増殖を阻害する方法における使用のための抗ＦＧＦＲ４抗体を提供する。上記実施態様の何れかによる「個体」は、好ましくはヒトである。
【０２００】
更なる態様では、発明は医薬の製造又は調製における抗ＦＧＦＲ４抗体の使用を提供する。一実施態様では、医薬は癌の治療のためである。更なる実施態様では、医薬は、癌を有する個体に有効量の医薬を投与することを含んでなる癌の治療方法における使用のためである。一実施態様では、医薬は肝障害(例えば硬変、非アルコール性脂肪性肝疾患、胆汁性肝硬変、硬化性胆管炎、進行性家族性肝内胆汁うっ滞症)の治療のためである。更なる実施態様では、医薬は、有効量の医薬を肝障害を有する個体に投与することを含んでなる肝障害(例えば硬変、非アルコール性脂肪性肝疾患、胆汁性肝硬変、硬化性胆管炎、進行性家族性肝内胆汁うっ滞症)の治療方法における使用のためである。一つのこのような実施態様では、本方法は、個体に有効量の少なくとも一つの更なる治療剤、例えば下記のものを投与することを更に含む。更なる実施態様では、医薬は細胞増殖を阻害するためである。更なる実施態様では、医薬は、細胞増殖を阻害するために有効量の医薬を個体に投与することを含んでなる、個体における細胞増殖を阻害する方法における使用のためである。上記実施態様の何れかによる「個体」はヒトでありうる。
【０２０１】
更なる態様では、発明は、癌を治療するための方法を提供する。一実施態様では、本方法は、このような癌を有する個体に有効量の抗ＦＧＦＲ４抗体を投与することを含む。一つのこのような実施態様では、本方法は、個体に有効量の少なくとも一つの更なる治療剤、例えば下記のものを投与することを更に含む。上記実施態様の何れかによる「個体」はヒトでありうる。
【０２０２】
更なる態様では、本発明は、肝障害(例えば硬変、非アルコール性脂肪性肝疾患、胆汁性肝硬変、硬化性胆管炎、進行性家族性肝内胆汁うっ滞症)を治療するための方法を提供する。一実施態様では、本方法は、このような肝障害を有する個体に有効量の抗ＦＧＦＲ４抗体を投与することを含む。一つのこのような実施態様では、本方法は、個体に有効量の少なくとも一つの更なる治療剤、例えば下記のものを投与することを更に含む。上記実施態様の何れかによる「個体」はヒトでありうる。
【０２０３】
更なる態様では、発明は、消耗性障害を治療するための方法を提供する。一実施態様では、本方法は、このような消耗性障害を有する個体に有効量の抗ＦＧＦＲ４抗体を投与することを含む。一つのこのような実施態様では、本方法は、個体に有効量の少なくとも一つの更なる治療剤、例えば下記のものを投与することを更に含む。上記実施態様の何れかによる「個体」はヒトでありうる。
【０２０４】
更なる態様では、発明は個体における細胞増殖を阻害するための方法を提供する。一実施態様では、本方法は、細胞増殖を阻害するために個体に有効量の抗ＦＧＦＲ４抗体を投与することを含む。一実施態様では、「個体」はヒトである。
【０２０５】
更なる態様では、発明は、例えば上記治療方法の何れかにおける使用のための、ここに提供される抗ＦＧＦＲ４抗体の何れかを含んでなる薬学的製剤を提供する。一実施態様では、薬学的製剤は、ここに提供される抗ＦＧＦＲ４抗体の何れか及び薬学的に許容可能な担体を含む。別の実施態様では、薬学的製剤は、ここに提供される抗ＦＧＦＲ４抗体の何れか及び少なくとも一つの更なる治療剤、例えば下記のものを含む。
【０２０６】
本発明の抗体は治療において、単独で又は他の薬剤との組合せにおいて使用されうる。例えば、本発明の抗体は少なくとも一つの更なる治療剤と共投与されうる。ある実施態様では、更なる治療剤は化学療法剤である。ある実施態様では、更なる治療剤は抗血管新生剤である。
【０２０７】
上述のかかる併用療法には、併用投与（２以上の薬剤が同一又は別個の製剤中に含まれる場合）、及び本発明の抗体の投与が、更なる治療剤及び／又はアジュバントの投与の前、同時、及び／又は後に起こりうる別個の投与が含まれる。また、本発明の抗体は放射線療法と組み合わせて用いることもできる。
【０２０８】
本発明の抗体(及び任意の更なる治療剤)は、非経口的、肺内、及び鼻腔内、そして、必要に応じて局所の治療のために、病巣内投与を含む任意の好適な手段によって投与することができる。非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹膜内、又は皮下投与を含む。投与が短期のものであるか長期のものであるかにある程度依存して、任意の好適な経路、例えば、静脈内又は皮下注射などの注射によって投与することができる。限定されるものではないが、様々な時点での単一又は複数回投与、ボーラス投与、及びパルス注入を含む、様々な投与スケジュールがここで考慮される。
【０２０９】
本発明の抗体は、良好な医療行為に一致する方式で、処方、服用、及び投与されるであろう。ここで考慮する要因は、治療する特定の疾患、治療する特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、疾患の原因、薬剤の送達部位、投与の方法、投与スケジュール、及び医師が知る他の因子を含む。抗体は、必要ではないが場合によっては、問題の疾患を予防するか又は治療するために一般に用いられる一つ以上の作用剤と共に処方されてもよい。そのような他の作用剤の有効量は、製剤中の抗体の量、疾患の型又は治療、及び上記の他の因子に依存する。これらは、一般的に、ここに記載されるものと同じ用量及び投与経路で、又はここに記載される用量の１〜９９％で、或いは経験的／臨床的に適切と判断される任意の用量及任意の投与経路で、用いられる。
【０２１０】
疾患の予防又は治療のために、本発明の抗体の好適な用量は(単独で用いる場合、又は一又は複数の他の付加的な治療剤と組み合わせて用いる場合)、治療する疾患のタイプ、抗体のタイプ、疾患の重症度及び経過、抗体を予防目的で投与するか治療目的で投与するか、以前の治療法、患者の病歴及び抗体への応答性、及び担当医師の判断に依存するであろう。抗体は一度に又は一連の治療にわたって適切に患者に投与される。疾患のタイプ及び重症度に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ(例えば０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ)の抗体を、例えば一以上の分割投与又は連続注入による患者投与の初期候補用量とすることができる。ある典型的な１日量は、上記の要因に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲であろう。症状に応じて、数日間以上にわたる繰り返し投与が、通常、所望の疾患症状の抑制が得られるまで持続される。このような用量は、間欠的に、例えば週ごと又は３週ごとに投与してもよい(例えば患者に約２〜約２０、例えば約６用量の抗体が投与される)。しかしながら、他の投与計画が有効かもしれない。この治療の進行は、従来技術及びアッセイにより容易にモニターすることができる。
【０２１１】
上記製剤又は治療方法の何れも、抗ＦＧＦＲ４抗体の代わりに又は加えて発明のイムノコンジュゲートを使用して実施されてもよいことが理解される。
【０２１２】
Ｈ．製造品
本発明の他の態様では、上記の疾患の治療、予防及び／又は診断に有用な物質を含む製造品が提供される。該製造品は容器と該容器上又は該容器に付随するラベル又はパッケージ挿入物を具備する。好適な容器には、例えば、ビン、バイアル、シリンジ、ＩＶ溶液バッグ等々が含まれる。容器は、様々な材料、例えばガラス又はプラスチックから形成されうる。容器は、組成物をそれ自体、又は病状の治療、予防及び／又は診断に有効な他の組成物と組合せて収容し、滅菌アクセスポートを有しうる(例えば、容器は皮下注射針が貫通可能なストッパーを有するバイアル又は静脈内投与溶液バッグでありうる)。組成物中の少なくとも一つの活性剤は本発明の抗体である。ラベル又はパッケージ挿入物は、組成物が選択された症状の治療に使用されることを示す。更に、製造品は、(ａ)本発明の抗体を含有する組成物を中に収容する第一の容器；と(ｂ)更なる細胞傷害剤又はそれ以外の治療薬を含有する組成物を中に収容する第二の容器とを含みうる。本発明のこの実施態様における製造品は、組成物を特定の症状の治療に使用することができることを示しているパッケージ挿入物を更に含む。あるいは、もしくは付加的に、製造品は、薬学的に許容されるバッファー、例えば注射用の静菌水(ＢＷＦＩ)、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー液及びデキストロース溶液を含む第二の(又は第三の)容器を更に具備してもよい。更に、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含む、商業上及び使用者の見地から望ましい他の材料を含んでもよい。
【０２１３】
上記製造品の何れも、抗ＦＧＦＲ４抗体の代わりに又は加えて発明のイムノコンジュゲートを含んでいてもよいことが理解される。
【実施例】
【０２１４】
ＩＩＩ．実施例
Ａ．抗ＦＧＦＲ４抗体での治療は肝細胞癌を阻害した
材料及び方法
インシリコ発現分析。発現分析では、箱ひげプロットをＢｉｏＥｘｐｒｅｓｓＴＭデータベース(Gene Logic, Gaithersburg, MD)から抽出した正規化遺伝子発現データを用いてＦＧＦＲ４について生成した。正常及び癌組織におけるＦＧＦＲ４発現の分布をプローブ２０４５７９＿ａｔに伴うシグナルを使用して評価した。
【０２１５】
免疫組織化学。ホルマリン固定パラフィン包埋組織切片をＴｒｉｌｏｇｙ(Cell Marque, Rocklin, CA)を使用して抗原回復のために処理し、次いで１０μｇ／ｍｌの抗ＦＧＦＲ４抗体(8G11; Genentech, South San Francisco, CA)と共にインキュベートした。免疫染色をビオチン化二次抗体、ＡＢＣ−ＨＲＰ試薬(Vector Laboratories, Burlingame, CA)、及び金属増感ＤＡＢ比色ペルオキシダーゼ基質(Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL)を使用して達成した。
【０２１６】
半定量的ＲＴ−ＰＣＲ。全ＲＮＡをＲＮｅａｓｙキット(Qiagen, Valencia, CA)を使用して抽出した。特異的プライマー及び蛍光発生プローブを使用し、遺伝子発現を増幅し定量化した（３１）。遺伝子特異的シグナルをＲＰＬ１９ハウスキーピング遺伝子に正規化した。全てのＴａｑＭａｎ ｑＲＴ−ＰＣＲ試薬をApplied Biosystems (Foster City, CA)から購入した。最小限の三つ組セットのデータを各条件について分析した。データを平均±ＳＥＭとして示す。
【０２１７】
免疫沈降及び免疫ブロット。培養細胞又は凍結組織の溶解物をコンプリートＥＤＴＡ−フリープロテアーゼインヒビターカクテル(Roche, Indianapolis, IN)、ホスファターゼインヒビターカクテル１及び２(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)、２ｍＭフッ化ナトリウム、及び２ｍＭオルトバナジウム酸ナトリウムが補充されたＲＩＰＡ溶解バッファー(Millipore, Billerica, MA)で調製した。等量のタンパク質がＢＣＡアッセイ(Thermo Fisher Scientific)によって決定され、ＦＧＦＲ４(8G11; Genentech)、ＦＧＦＲ３(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)、ＦＧＦＲ２(GeneTex, Irvine, CA)及びＦＧＦＲ１(Santa Cruz Biotechnology)に対する抗体を使用して免疫ブロット分析によって分析した。ヒト肝臓溶解物では、免疫ブロット分析に先行して過去に記載されたような（１６）ＦＧＦＲ４の免疫沈降を実施した。
【０２１８】
ＦＧＦＲ４モノクローナル抗体の生成。ＦＧＦＲ４ヌルマウスを組換えヒト及びマウスＦＧＦＲ４−Ｆｃキメラタンパク質(Genentech)で免疫化した。脾臓を８週間後に収集し、ハイブリドーマを生成した。培養上清を集め、免疫原に対して固相抗体結合アッセイによってスクリーニングした。陽性細胞株を、ヒト及びマウスＦＧＦＲ４に対するＦＧＦ１及びＦＧＦ１９結合を阻害する有効性について固相受容体結合アッセイを使用して更にスクリーニングした。
【０２１９】
ＬＤ１の分子クローニング。全ＲＮＡをＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ ｋｉｔ(Qiagen)を使用してｍｕＬＤ１を生産するハイブリドーマ細胞から抽出した。可変軽及び可変重ドメインを逆転写−ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を使用して増幅した。順方向プライマーは可変軽及び可変重領域のＮＨ２−末端アミノ酸配列に特異的であった。それぞれ軽鎖及び重鎖逆方向プライマーを、種にわたって高度に保存されている定常軽及び定常重ドメイン１における領域にアニールするように設計した。増幅された可変軽鎖をヒトκ定常ドメインを有する哺乳類発現ベクターにクローン化した。増幅可変重鎖を完全長ヒトＩｇＧ１定常ドメインをコードする哺乳類発現ベクターに挿入した。キメラ抗体を前述のように一過性に発現させた（１６）。実施例（図１−９を含む）のこのパートＡに記載される実験はキメラＬＤ１を使用した。
【０２２０】
固相抗体結合アッセイ。Ｍａｘｉｓｏｒｐ９６ウェルプレートを５０μｌの２μｇ／ｍｌの抗ヒト免疫グロブリンＦｃ断片特異的(Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA)又は抗FLAG抗体 (Sigma-Aldrich)で４℃で一晩コートした。非特異的結合部位を１時間２００μｌのＰＢＳ／３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で飽和させ、ＦＧＦＲｓ−ＩｇＧ (Genentech and R&D Systems, Minneapolis, MN)又はＦＬＡＧタグ−ＦＧＦＲ４（ＦＧＦＲ４ΔＴＭ−ＦＬＡＧ）を１時間、ＰＢＳ／０．３％ＢＳＡにおいてインキュベートした。プレート洗浄し、ＰＢＳ／０．３％ＢＳＡにおいて抗ＦＧＦＲ４抗体で１時間インキュベートした。結合抗体をＨＲＰ−コンジュゲート抗ＩｇＧ(Jackson ImmunoResearch Laboratories)及びＴＭＢペルオキシダーゼ発色基質(KPL, Gaithersburg, MD)を使用して検出した。
【０２２１】
フローサイトメトリー分析。フローサイトメトリー分析のための細胞を５ｍＭのＥＤＴＡを含有するＰＢＳで再懸濁させ、２％熱失活ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含有するＰＢＳで洗浄した。続く全ての工程を氷上で実施した。細胞（１ｘ１０６）を３０分間一次抗体（ＬＤ１又はアイソタイプコントロール）と共にインキュベートし、その後、フィコエリトリン（ＰＥ）−コンジュゲート抗ヒトＩｇＧ抗体(Jackson ImmunoResearch)と共にインキュベーションした。細胞をＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーター(BD Biosciences, San Jose, CA)で分析した。
【０２２２】
ＤＮＡコンストラクト。ヒトＦＧＦＲ４（ｈＦＧＦＲ４）ｃＤＮＡを前述のようにクローン化した（１６）。ＦＧＦＲ４の細胞外ドメインをまた発現ベクターｐＣＭＶ−Ｔａｇ４Ａ (Stratagene, La Jolla, CA)にサブクローニングし、Ｃ−末端でのＦＬＡＧタグ（ＦＧＦＲ４ΔＴＭ−Ｆｌａｇ）でＦＧＦＲ４の分泌形態を得た。一塩基変異をQuikChange XL Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene)を使用してＦＧＦＲΔＴＭ−Ｆｌａｇコンストラクトに導入した。我々はまた、ヒトＦＧＦＲ１の細胞質ドメイン（ＦＧＦＲ１のアミノ酸残基Ｋ３９８−Ｒ８２０）に融合されたヒトＦＧＦＲ４の細胞外及び膜貫通ドメイン（ＦＧＦＲ４のアミノ酸残基Ｍ１−Ｇ３９２）を有するヒトＦＧＦＲ４−ＦＧＦＲ１キメラコンストラクト（ｈＦＧＦＲ４／Ｒ１）を生成した。ＦＧＦＲ４（太線）をＦＧＦＲ１（プレイン）に連結したアミノ酸配列は・・・AVLLLLAGLYRGKMKSG・（配列番号：３２）・・である。ｈＦＧＦＲ４ｃＤＮＡ又はｈＦＧＦＲ４／Ｒ１ｃＤＮＡをｐＱＣＸＩＰレトロウイルスバイシストロニック発現ベクター (Clontech Laboratories, Mountain View, CA)にライゲートした。
【０２２３】
ＦＧＦＲ４ΔＴＭ−Ｆｌａｇ−条件培地。ＨＥＫ２９３細胞を野生型又は変異体ＦＧＦＲ４ΔＴＭ−Ｆｌａｇコンストラク又は対応するエンプティベクターでトランスフェクトし、７２〜９６時間、無血清ＰＳ２５培地において維持した。得られた培地を濾過し、ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．２（最終濃度４０ｍＭ）及びプロテアーゼインヒビターを補充し、使用まで４℃で保管した。
【０２２４】
細胞培養及び安定細胞株。ＨＥＫ２９３、ＨＥＰＧ２、及びＨＥＰ３Ｂ細胞をＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ(ATCC, Manassas, VA)から入手し、１０％ＦＢＳ及び２ｍＭ Ｌ−グルタミンが補充されたＦ−１２：ＤＭＥＭミックス（５０：５０）において維持した。ＨＵＨ７及びＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞をＤＭＥＭ高グルコース、１０％ＦＢＳにおいて培養した。ＪＨＨ４、ＪＨＨ５、及びＪＨＨ７細胞をJapanese Cancer Research Resources Bank (Tokyo, Japan)から購入し、１０％ＦＢＳ及び２ｍＭ Ｌ−グルタミンが補充されたＷｉｌｌｉａｍｓ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅにおいて維持した。ＳＮＵ４４９細胞をＡＴＣＣから入手し、１０％ＦＢＳ及び２ｍＭ Ｌ−グルタミンを含有するＲＰＭＩ１６４０において維持した。ＢａＦ３細胞を１０％ＦＢＳ、１ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−３、及び２ｍＭ Ｌ−グルタミンが補充されたＲＰＭＩ１６４０(Life Technologies, Carlsbad, CA)において維持した。Ｌ６細胞をＡＴＣＣから入手し、１０％ＦＢＳが補充されたＤＭＥＭ高グルコースにおいて維持した。
ＢａＦ３及びＬ６細胞の培養物を、製造者の推奨に従ってエンプティ、ｈＦＧＦＲ４、又はｈＦＧＦＲ４／Ｒ１レトロウイルス発現ベクターで感染させ、１０〜１２日間、２．５μｇ／ｍＬピューロマイシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含有する培地において選択した。選択したプールから、最も高く発現する細胞の５パーセンタイルを、抗ＦＧＦＲ４抗体（８Ｇ１１；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）を使用して蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）で単離した。高レベルのＦＧＦＲ４、高レベルのＦＧＦＲ４／Ｒ１を発現する細胞、及びエンプティベクターで安定にトランスフェクトされたコントロール細胞の得られたプールを、２．５μｇ／ｍＬピューロマイシンを含有する完全培地において維持した。
【０２２５】
分裂促進アッセイ。ＢａＦ３／コントロール、ＢａＦ３／ＦＧＦＲ４、及びＢａＦ３／ＦＧＦＲ４／Ｒ１細胞を２回洗浄し、１０％ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、及び２μｇ／ｍｌのヘパリンが補充されたＲＰＭＩ１６４０において９６−ウェルプレート（２２，５００細胞／ウェル）に播種した。ＦＧＦを各ウェルに加え、細胞を７２時間、３７°Ｃでインキュベートした。相対細胞密度を、製造者の推奨に従ってＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ (Promega, Madison, WI)を使用して測定した。
【０２２６】
ＦＧＦ経路活性化の抗ＦＧＦＲ４抗体阻害。細胞をＬＤ１又はアイソタイプコントロール抗体の有無において２４時間血清飢餓にした。次いでそれらを５ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ１(FGF acidic, R&D Systems)及び１０μｇ／ｍｌヘパリンで５分間刺激した。細胞を、コンプリートＥＤＴＡ−フリープロテアーゼインヒビターカクテル(Roche)、ホスファターゼインヒビターカクテル１及び２(Sigma-Aldrich)、２ｍＭフッ化ナトリウム、及び２ｍＭオルトバナジウム酸ナトリウムが補充されたＲＩＰＡ溶解バッファー(Millipore)で溶解させた。等量のタンパク質をホスホ−ＥＲＫ１／２、ホスホ−ＦＲＳ２、ＥＲＫ１／２(Cell Signaling Technology, Danvers, MA)、及びＦＲＳ２(Millipore)に対する抗体を使用して免疫ブロットで分析した。
【０２２７】
クローン形成アッセイ。ＨＵＨ７（５，０００細胞／ウェル）、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５（２，０００細胞／ウェル）、ＪＨＨ５（５００細胞／ウェル）、又はＪＨＨ５／ｈＦＧＦＲ４ｓｈＲＮＡ（５００細胞／ウェル）細胞を、三つ組において６ウェルプレートにおいて２ｍｌ培地／ウェルにおいて播種した。播種の３時間後、ＨＵＨ７及びＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞を抗ＦＧＦＲ４抗体(chLD1; Genentech)の有無で処理した。抗体を実験の間（１４日）週に２回かえた。ＪＨＨ５及びＪＨＨ５／ｈＦＧＦＲ４ ｓｈＲＮＡ細胞では、２ｍｇ／ｍｌドキシサイクリンの有無での処理を播種の３時間後に開始し、実験の間週に３回かえた。細胞をＰＢＳで洗浄し、０．５％クリスタルバイオレット溶液で染色した。コロニーをＭｅｔａＭｏｒｐｈソフトウェア(Molecular Devices, Sunnyvale, CA)を使用してカウントした。
【０２２８】
インビボ実験。全動物のプロトコルはInstitutional Animal Care and Use Committeeに承認された。年齢５〜６週である雌ｎｕ／ｎｕマウスをCharles River Laboratories International (Wilmington, MA)から得た。マウスには、注射の１２時間前まで、標準的な餌及び水を自由に与え、注射時に餌を取り除いた。マウスにはコントロール又は抗ＦＧＦＲ４（ｃｈＬＤ１）抗体の腹腔内（ＩＰ）注射（１０ｍｇ／ｋｇ）が与えられた。１８時間後、マウスはビヒクル（ＰＢＳ）又は１ｍｇ／ｋｇ ＦＧＦ１９静脈内（ＩＶ）を受けた。３０分後、全グループからのマウスは剖検され、組織サンプルが収集され、液体窒素において凍結され、−７０℃に保管した。凍結組織からの全ＲＮＡをＲＮｅａｓｙキット(Qiagen)を使用して調製した。３〜５匹の動物のグループを各条件について分析した。データを平均±ＳＥＭとして表し、スチューデントｔ検定によって分析した。
【０２２９】
異種移植実験では、年齢６−〜８−週のｎｕ／ｎｕの雌マウス (Charles River Laboratories International)に５ｘ１０６細胞（２００ｕｌ／マウス）及びＭａｔｒｉｇｅｌ (BD Biosciences)を皮下接種した。７日後、等量（〜１５０ｍｍ３）の腫瘍を有するマウスをグループ（ｎ＝１０）にランダム化し、週に２回ＩＰ処置した。腫瘍を電子キャリパー(Fowler Sylvac Ultra-Cal Mark III; Fred V. Fowler Company, Newton, MA)で測定し、平均腫瘍体積を式：（Ｗ２ｘＬ）／２を使用して算出し、ここでＷ及びＬはそれぞれ小直径及び大直径である。データを平均腫瘍体積±ＳＥＭとして表し、スチューデントｔ検定によって分析した。
【０２３０】
ＦＧＦ１９トランスジェニックマウスを前述のように生産した（３２）。ＦＧＦＲ４ヌル変異体（ＦＧＦＲ４−ＫＯ）動物は前に報告したように構築され、Material Transfer Agreement (University of Texas Southwestern Medical Center, Dallas, TX)のもと、W. L. McKeehanによって提供された。ＦＧＦ１９を過剰発現し、且つＦＧＦＲ４受容体を欠くマウス（ＦＧＦ１９−ＴＧ：ＦＧＦＲ４−ＫＯ）を、ヤングアダルトＦＧＦ１９−ＴＧの雄とヤングアダルトＦＧＦＲ４−ＫＯの雌とを交配させることによって作った。双方の遺伝子工学イベントの存在をテイルＤＮＡについてＰＣＲによって離乳時に確認した。
【０２３１】
結果
ＦＧＦＲ４は、ＦＧＦ１９トランスジェニック・マウスの肝臓癌形成に必要である。トランスジェニック・マウスにおけるＦＧＦ１９の外因性発現は、以前、１０ヵ月歳までにＨＣＣが生じることを示した（１８）。ＦＧＦＲ４がこのＦＧＦ１９によって媒介される腫瘍形成に関係しているかどうかを判断するために、我々は、ＦＧＦ１９をＦＧＦＲ４ノックアウト（ＦＧＦＲ４−ＫＯ）マウスまたはＦＧＦＲ４野生型（ＦＧＦＲ４−ＷＴ）マウスと共にトランスジェニック（ＦＧＦ１９−ＴＧ）マウスを育てた。様々な時点でマウスを剖検し、肉眼検査と組織学的検査を実施し、新生物発生前の肝細胞増殖（すなわちＢｒｄＵ取込）を測定することにより、肝臓発癌を評価した。ＦＧＦ１９−ＴＧ：ＦＧＦＲ４−ＷＴマウスにおけるＨＣＣの発症は先に記載された通りであった（１８）。ＦＧＦ１９−ＴＧ：ＦＧＦＲ４−ＷＴマウスとは異なり、ＦＧＦ１９−ＴＧ：ＦＧＦＲ４−ＫＯマウスは、この実験（図１Ａ）の間のいかなる時点でも、肝細胞性新生物の肉眼での又は組織学的証拠を生じさせなかった。また、新生物発生前の肝細胞性の増殖は、ＦＧＦＲ４−ＷＴ遺伝子型を有していたＦＧＦ１９−ＴＧマウスにおいて有意に上昇したが、ＦＧＦ１９−ＴＧ：ＦＧＦＲ４−ＫＯ腹仔においては明白でなかった（図１Ｂ）。雌のＦＧＦ１９−ＴＧマウスの腫瘍発生の高い頻度と重症性における以前の報告と一致して（１８）、ＢｒｄＵ取込は、対応する雄と比較して、ＦＧＦ１９−ＴＧ：ＦＧＦＲ４−ＷＴ雌において増加していた（図１Ｂの左右のパネルを比較せよ）。我々も、ＦＧＦ１９−ＴＧマウスのＨＣＣの発症に対するジエチルニトロソアミン（ＤＥＮ）（有力な肝臓発癌物質）の効果を評価した。ＤＥＮの投与は、ＦＧＦ１９−ＴＧ：ＦＧＦＲ４−ＷＴマウスのＨＣＣの発症を加速した。新生物発生前及び腫瘍性の病変−変化した（好塩基球性）肝臓病巣、中心周囲の肝細胞形成異常症、高分化型肝細胞腫瘍および高悪性度の肝細胞癌―の全ての範囲が、ＤＥＮ非処置ＦＧＦ１９−ＴＧ：ＦＧＦＲ４−ＷＴマウスでの年齢１０か月までと比較して、年齢４か月までに、全てのＤＥＮ処置ＦＧＦ１９−ＴＧ：ＦＧＦＲ４−ＷＴ動物の肝臓に見られた（図１Ｄ）。全ての時点での、ほとんど全てのＦＧＦ１９−ＴＧ：ＦＧＦＲ４−ＷＴマウスからの肝臓の主要な形態学特徴は、多数の葉上に肉眼で明白なＨＣＣの小結節が存在することであった（図１Ｃ）。腫瘍量は、肝臓重量を計量することによって評価した。全ての時点で、相対的肝臓重量は、ＤＥＮ処置ＦＧＦ１９−ＴＧ：ＦＧＦＲ４−ＷＴマウスにおいて漸次的に増加していた（図１Ｅ）。興味深いことに、肝臓重量の増加は、雄（６ヵ月で１．８倍）よりも雌（６ヵ月で２．７倍）において顕著であった（図１Ｅの左右のパネルを比較）。年齢６カ月を過ぎると、雄の何れも生き残らなかった点に留意する必要がある。ＤＥＮで処置されたＦＧＦ１９−ＴＧ：ＦＧＦＲ４−ＷＴマウスで観察された肝臓癌形成は、ＦＧＦＲ４−ＫＯマウスにおけるＦＧＦＲ４発現の除去によって消滅した。したがって、ＦＧＦ１９−ＴＧ：ＦＧＦＲ４−ＫＯマウスの相対的肝臓重量は成人期の間は一定のままだった（図１Ｆ）。これらの結果は、ＦＧＦＲ４発現がマウスにおけるＦＧＦ１９促進性肝臓癌形成のために必要なことを示唆している。
【０２３２】
抗−ＦＧＦＲ４中和モノクローナル抗体の生成。ターゲッティングＦＧＦＲ４がＨＣＣに治療的な影響を有することができたかどうか評価するために、我々は、組換えマウス及びヒトＦＧＦＲ４を用いてＦＧＦＲ４−ＫＯマウスを免疫化することによって、ＦＧＦＲ４特異性モノクローナル抗体を生成した。ＬＤ１と標記した、得られたクローンの１つを、マウス、カニクイザルおよびヒトＦＧＦＲ４に対するその結合特異性について選択した（図２Ａ）。この抗体は、マウスまたはヒトＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２またはＦＧＦＲ３と結合しなかった（図２Ａ）。表面プラスモン共鳴分析で、ＬＤ１が同等の親和性でマウス、カニクイザルおよびヒトＦＧＦＲ４に結合したことを明らかにした（図２Ｂ）。我々は、ＬＤ１が細胞表面に存在するＦＧＦＲ４に結合したかどうかを評価するために、フローサイトメトリーを使用した。ヒトＦＧＦＲ４で安定にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞へのＬＤ１の特異的結合性は、加えられる抗体量と比例していた（図２Ｃ）。空のベクターで安定にトランスフェクトしたコントロールＨＥＫ２９３細胞へは、ＬＤ１は結合しなかった。併せると、これらのデータは、ＬＤ１がマウス、カニクイザルおよびヒトＦＧＦＲ４と特異的に結合し、細胞表面に発現されたヒト受容体をまた認識することを証明する。
【０２３３】
ＬＤ１に対してＦＧＦＲ４エピトープをマッピングするために、我々は、マウスおよびヒトＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３およびＦＧＦＲ４のアミノ酸配列を比較した。８つのアミノ酸を、ＦＧＦＲ４オルソログ間のそれらの類似性およびＦＧＦＲ１−３オルソログにおけるそれらの差違に基づいて選択した。ＦＧＦＲ４のこれらのアミノ酸を、ヒトＦＧＦＲ４の８つの異なる変異体コンストラクトを生成するために、ＦＧＦＲ３の等価な位置に存在するアミノ酸と置換した。これらのコンストラクトを発現させ、固相結合アッセイを使用し、ＬＤ１結合性を評価した。ＬＤ１は、野生型ＦＧＦＲ４及び大部分の変異コンストラクトに等しく良好に結合し；Ｇ１６５Ａは、それに対するＬＤ１結合性が損なわれた唯一のＦＧＦＲ４変異体であった（図２Ｄ）。ＬＤ１は、ネガティブコントロールの野生型ＦＧＦＲ３と結合しなかった（図２Ｄ）。また、我々は、ＬＤ１をイムノブロット分析を使用し、変異コンストラクトに対するLD1の結合性について試験した。全ての先に記載されたタンパク質コンストラクトを還元させ、変性させ、電気泳動にかけ、ニトロセルロースに電荷移動させた。ニトロセルロース膜を、ＬＤ１、異なるエピトープを認識する抗−ＦＧＦＲ４抗体（８Ｇ１１）、又は抗−ＦＬＡＧ抗体と共に順次インキュベートした。抗−ＦＬＡＧ抗体及び８Ｇ１１は、野生型ＦＧＦＲ４及び全てのＦＧＦＲ４変異コンストラクトを検出する一方、ＬＤ１はＧ１６５Ａ変異体を除いて等しく全てのコンストラクトを検出した（図２Ｅ）。タンパク質バンドは、コントロールレーンの抗体の何れかによっても検出されなかった（図２Ｅ）。我々は、Ｇ１６５の位置を視覚化するために、ＦＧＦ１９の２つの分子に結合するＦＧＦＲ４ダイマーの三次元モデルを生成した（図２Ｆ）。Ｇ１６５を、２つのＦＧＦＲ４ユニットとの接触点で、ＦＧＦＲ４−ＦＧＦ１９複合体の中心に局在化させた。併せると、これらの結果は、ＬＤ１とヒトＦＧＦＲ４の相互作用にとってＧ１６５が重要であることを示している。ＬＤ１の還元及び変性ＦＧＦＲ４への結合は、エピトープが三成分の確認に依存しないことを示唆する。
【０２３４】
次に、我々は、固相受容体−結合実験を使用し、ＬＤ１がＦＧＦ１およびＦＧＦ１９のＦＧＦＲ４への結合をブロックすることができるかどうか試験した。ＦＧＦ結合のＬＤ１阻害は用量依存性であり、ＦＧＦ１に対しては０．０９３±０．００６ｎＭ、ＦＧＦ１９に対しては０．１０２±０．００３ｎＭのＩＣ５０に達する（図３Ａ）。ＬＤ１が細胞表面で発現したＦＧＦＲ４の機能を阻害することができたかどうか評価するために、我々は、最初に、ＦＧＦＲ４の細胞外ドメイン及びＦＧＦＲ１（ＢａＦ３／ＦＧＦＲ４／Ｒ１）の細胞内ドメインをコードするキメラコンストラクトで安定にトランスフェクトしたＢａＦ３マウスプロＢ細胞株を利用した。野生型ＢａＦ３細胞株は、いずれのＦＧＦＲも発現しないインターロイキン３（ＩＬ−３）依存性細胞株である。ＦＧＦＲでトランスフェクトしたＢａＦ３細胞は、ヘパリン及びＦＧＦで刺激された場合に、ＩＬ−３の不在下で増殖する（２１）。このコンストラクトのトランスフェクトにより、我々はＢａＦ３細胞の増殖を支援するためにＦＧＦｓをＩＬ−３と置換することができた。５ｎＭのＦＧＦ１が存在する場合、ＬＤ１は、１７．４±５．４ｎＭのＩＣ５０で、ＢａＦ３／ＦＧＦＲ４／Ｒ１細胞の増殖を阻害した（図３Ｂ）。
【０２３５】
また我々は、ＦＧＦシグナル伝達におけるＬＤ１の効果を評価するために、ＦＧＦＲ４（Ｌ６／ＦＧＦＲ４）を発現するベクターで安定にトランスフェクトされたＬ６ラット骨格筋細胞株を使用した。Ｌ６／ＦＧＦＲ４細胞培養物へのＦＧＦ１およびヘパリンの添加は、ＦＧＦＲ基質２（ＦＲＳ２）及び細胞外シグナル調整キナーゼ１／２（ＥＲＫ１／２）のリン酸化により示されるように、ＦＧＦＲ経路を活性化させる一方、ＬＤ１は、これらの二次メッセンジャーのリガンド誘導性リン酸化を用量依存式に阻害した（図３Ｃ）。興味あることに、ＬＤ１の添加も、これらの細胞中の全ＦＲＳ２量の増加を誘発した（図３Ｃ）。
【０２３６】
フローサイトメトリーを使用し、我々はＬＤ１の結合性を評価し、ＨＣＣ細胞株のサブセットの細胞表面でのＦＧＦＲ４の発現の確認した。ＬＤ１は、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５に最も高度に結合し、ＨＵＨ７及びＪＨＨ５細胞には少ない度合いで結合した（図３Ｄ）。さらに、ＦＧＦＲ４を発現しないためにネガティブコントロールとして使用されたＢａＦ３細胞の表面へのＬＤ１及びコントロール抗体の結合もまた無視できるものであった（図３Ｄ）。
【０２３７】
ＬＤ１は、肝癌細胞株のＦＧＦＲ４機能を阻害する。ＬＤ１の阻害活性は、様々なレベルの内因性ＦＧＦＲ（すなわちＦＧＦＲ１−４）の発現を伴う肝癌細胞株を使用して特徴づけられた（図７）。ＨＥＰ３Ｂ細胞において、ＦＧＦ１９の添加は、ＦＲＳ２及びＥＲＫ１／２のリン酸化を惹起する一方、ＬＤ１は、Ｌ６／ＦＧＦＲ４細胞に対するその効果と同様に、ＦＲＳ２のＦＧＦ１９刺激性のリン酸化を阻害した（図４Ａ）。ＬＤ１は、しかしながら、ＥＲＫ１／２のリン酸化を目に見えて変えることはなかった（図４Ａ）。
【０２３８】
チトクロームＰ４５０ ７α１（ＣＹＰ７α１）及びｃ−Ｆｏｓの発現は、肝細胞株においてＦＧＦ１９によって調節される（１６，２２）。我々は、ＬＤ１がこのＦＧＦ１９媒介性遺伝子調節を阻害することができるかどうかを試験した。ＨＥＢ３Ｂ細胞において、ＦＧＦ１９の添加は、ＣＹＰ７α１の発現を８１％減らした（図４Ｂ）。ＬＤ１の添加は、ＣＹＰ７α１の基礎発現の６７％を復元した（図４Ｂ）。加えるＦＧＦ１９の非存在下では、ＬＤ１は、ＣＹＰ７α１発現を２倍に増やした（図４Ｂ）。ＦＧＦ１９の添加がＨＵＨ７細胞中でのＣＹＰ７α１の発現に影響を及ぼさなかったけれども、ＬＤ１の添加は、ＨＥＰ３Ｂ細胞にも同様の効果を有し、ＦＧＦ１９の存在下または欠如下において、この遺伝子の発現をそれぞれ２．９倍及び３．５倍に増加させた（図８）。ネガティブコントロール抗体の添加は、ＨＥＰ３Ｂ又はＨＵＨ７細胞のいずれにおいても、ＣＹＰ７α１の発現に影響を及ぼさなかった（それぞれ図４Ｂ及び８）。興味あることに、ＬＤ１の添加は、ＨＥＰ３ＢおよびＨＵＨ７細胞の双方において、外因性に添加されたＦＧＦＲ４リガンドの非存在下でのＣＹＰ７α１発現のアップレギュレーションを生じる。これは、ＦＧＦＲ４リガンドオートクリン／パラクリンループによりおそらくは維持されるＦＧＦＲ４の基礎活性を阻害するＬＤ１の能力を証明している。
【０２３９】
ＦＧＦＲ４の基礎活性に対するＬＤ１の効果を更に評価するために、我々は、外因性に添加されるＦＧＦＲ４リガンドの非存在下でｃ−Ｆｏｓの発現を測定した。ＦＧＦＲ４経路の活性化が、ｃ−Ｆｏｓの発現を増加させることは過去に示されている（１６）。ＬＤ１の添加は、ＪＨＨ５、ＪＨＨ７およびＨＵＨ７細胞株では５０％、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞株では７５％まで、ｃ−Ｆｏｓの基礎発現を低下させた；コントロール抗体の添加は、基礎ｃ−Ｆｏｓ発現に影響を及ぼさなかった（図４Ｃ）。これらの結果は、ＦＧＦＲ４の基礎活性を阻害するＬＤ１の能力を証明している。
【０２４０】
ＬＤ１はコロニー形成を阻害する。我々は、ドキシサイクリン誘導性ＦＧＦＲ４特異性ｓｈＲＮＡ又はコントロールｓｈＲＮＡで安定してトランスフェクトしたＪＨＨ５細胞によって最初にコロニー形成を測定した。ドキシサイクリンの不存在下または存在下において、コントロールコンストラクトでトランスフェクトしたＪＨＨ５細胞のコロニーを形成する能力に差異はなかったが、ＦＧＦＲ４ ｓｈＲＮＡコンストラクトでトランスフェクトしたＪＨＨ５細胞にドキシサイクリンを添加すると、ドキシサイクリンの非存在下での細胞と比較して、コロニー形成が７６％阻害された（図４Ｄ）。この結果は、ＦＧＦＲ４が肝癌細胞株のコロニー形成に関係していることを示唆している。
【０２４１】
次に、我々は、肝癌細胞株のパネルによってコロニー形成を阻害するＬＤ１の能力を試験した。ＬＤ１をＪＨＨ５、ＨＵＨ７及びＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞の培養物へ添加することで、コロニー形成に用量依存性低減が引き起こされ、それぞれ２６％、５０％及び８２％の最大阻害度に達した（図４Ｆ）。ＰＬＣ／ＰＲＦ／５及びＨＵＨ７細胞培養物の代表例を図４Ｅに示す。コントロール抗体の添加はコロニー形成に影響を及ぼさなかった（図４Ｆ及び４Ｅ）。これらの結果は、ＬＤ１が肝癌細胞株のＦＧＦＲ４媒介性コロニー形成を阻害することを示している。
【０２４２】
ＬＤ１はＦＧＦＲ４インビボ活性を阻害する。我々は、ＬＤ１又はコントロール抗体を注射されたマウスの肝臓中のＦＧＦ１９惹起性ｃ−Ｆｏｓ誘導を測定することによって、ＬＤ１のインビボ効果を評価した。肝臓中のｃ−Ｆｏｓ誘導がＦＧＦ１９刺激に感受性であるので、我々はＦＧＦ１９に対するｃ−Ｆｏｓ反応をモニターすることを選択した（１６）。Ｃ−Ｆｏｓ発現は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で処置されたマウスの肝臓と比較して、ＦＧＦ１９で処置されたマウスの肝臓の方が５３倍高かった（図５Ａ）。ＦＧＦ１９の注射の１８時間前にＬＤ１を投与すると、ｃ−Ｆｏｓ誘導は３．５倍低減した（図５Ａ）。また、ＬＤ１はナイーブマウス中のｃ−Ｆｏｓ発現の基礎レベルを６倍減らした（図５Ａ）。コントロール抗体の注入は、未処置のマウスと比較して、ｃ−Ｆｏｓの基礎又はＦＧＦ１９刺激性発現を変えなかった（図５Ａ）。これらのデータは、基礎及びＦＧＦ１９刺激性のＦＧＦＲ４活性の阻害に対するＬＤ１のインビボ効果を証明している。
【０２４３】
ＬＤ１はインビボでの腫瘍増殖を阻害する。腫瘍増殖阻害でのＬＤ１のインビボ効果を調べるために、我々は、最初にＨＵＨ７肝癌細胞株異種移植片モデルを利用した。樹立された腫瘍（ほぼ１５０ｍｍ３）を有しているマウスに、３０ｍｇ／ｋｇのＬＤ１、３０ｍｇ／ｋｇのコントロール抗体又はＰＢＳを毎週投与した。１３日後に、ＰＢＳ又はコントロール抗体で処置されたマウスのＨＵＨ７腫瘍は、７２０ｍｍ３の平均サイズに増大した（図５Ｂ）。しかしながら、ＬＤ１で処置されたマウスのＨＵＨ７腫瘍は、２８ｍｍ３の平均サイズになり、コントロール抗体又はＰＢＳと比較して、腫瘍増殖の９６％が阻害された（図５Ｂ）。反復実験において、週に２回３０ｍｇ／ｋｇのＬＤ１を投与することによって、完全な腫瘍増殖阻害が生じた（図９）。剖検で、腫瘍を切除し、ＦＧＦＲ４及びＦＧＦＲ４調節遺伝子の発現に対するＬＤ１の効果を評価した。ＬＤ１の投与は、ＨＵＨ７異種移植片腫瘍におけるＦＧＦＲ４発現に影響を及ぼさなかった（図５Ｃ）。しかしながら、ＬＤ１は、ＰＢＳで処置されたマウスの腫瘍において測定されたＣＹＰ７α１の発現レベルと比較して、３倍ＣＹＰ７α１発現を増加させた（図５Ｃ）。また、ＬＤ１は、ＰＢＳ処置マウスと比較して、ｃ−Ｆｏｓ及びｅｇｒ−１の発現をそれぞれ１７倍および６倍、減らした（図５Ｃ）。
【０２４４】
ＬＤ１のインビボ効果を更に評価するために、我々はＦＧＦ１９−ＴＧマウスモデルを使用した。腫瘍形成を加速するために、１５日齢でＦＧＦ１９−ＴＧマウスをＤＥＮで処置し、ついで４週齢でランダムに３つのコホートに分類した。１つのグループはコントロール抗体を投与され、他の２グループは、ＬＤ１又は抗−ＦＧＦ１９抗体（１Ａ６）のいずれかを毎週の頻度で投与された。１Ａ６は、ＦＧＦ１９−ＴＧマウスにおける腫瘍形成を防止することが過去に示されている（２３）。６ヵ月後、マウスを剖検し、分析のために肝臓を切除した。コントロール抗体で処置されたマウスの肝臓は、複数の葉上に肉眼で明白な大きな小結節を有していた（図５Ｄ）。しかしながら、ＬＤ１（図５Ｄ）又は１Ａ６で処置されたマウスの肝臓には、新形成の証拠がなかった。このパラメータはＦＧＦ１９−ＴＧモデルにおいてパーセント腫瘍体積と強く相関していることが過去に示されているため（１８，２３）、我々はさらに腫瘍量を評価するために肝臓重量を計量した。ＬＤ１又は１Ａ６で処置されたマウスからの肝臓重量は、コントロール抗体で処置されたマウスからの肝臓重量より有意に低かった（それぞれｐ＝０．０３５及びｐ＝０．０５２）（図５Ｅ）。ＬＤ１で処置されたマウスと１Ａ６で処置されたマウスの間の肝臓重量の違いは有意ではなかった（ｐ＝０．４３９）（図５Ｅ）。併せると、これらのデータは、前臨床モデルにおける肝細胞癌の阻害でのＬＤ１のインビボ効果を明らかに証明している。
【０２４５】
ＦＧＦＲ４発現は癌で変化する。我々は、ＢｉｏＥｘｐｒｅｓｓデータベース(Gene Logic, Inc., Gaithersburg, MD, USA)を解析することによって、多様なヒト正常及び癌組織におけるFGFR4発現を評価した。FGFR4発現は、大部分の種類の癌において非常に可変的である。正常組織と比較して、ＦＧＦＲ４発現は、肝臓、結腸直腸、胃、食道及び精巣癌で上昇するが、腎臓、肺、リンパ、及び小腸癌においては減少する（図６Ａ）。免疫組織化学（ＩＨＣ）を使用して、我々は、肺、胸部、膵臓、及び卵巣の腺癌、肺扁平上皮癌、肝細胞癌、甲状腺癌、及び正常な肺、膵臓及び甲状腺のサンプルのパネルにおいてＦＧＦＲ４を局在化した。ＦＧＦＲ４の検出は、正常及び腫瘍性の上皮細胞で膜及び細胞質の染色を引き起こした（代表例は図６Ｂに示される）。正常組織と比較して、染色のより高い等級は一般に腫瘍サンプルで見つかった。抗−ＦＧＦＲ４による中程度ないしは著しい標識は、膵臓（標本の４１％の標本）、胸部（４６％）、肺（３１％）、卵巣（４１％）、結腸（９０％）、肝臓（３３％）及び甲状腺（１１％）からの腫瘍において明らかだった（表２及び文献２３）。
【０２４６】
表２：正常及び癌組織におけるＦＧＦＲ４発現。ＦＧＦＲ４免疫染色の病理組織学的評価によって決定される正常及び癌組織中のＦＧＦＲ４発現の有病率
2014516511.tif 000002
【０２４７】
ヒトＨＣＣにおけるＦＧＦＲ４の広範囲にわたる発現は、またインサイツハイブリッド形成によって以前に確認された（２３）。ＦＧＦＲ４とＨＣＣの間の関連性が既に示唆されているので、我々は定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応法（ｑＲＴ−ＰＣＲ）を使用し、２３のヒト原発性肝腫瘍及び１１の正常肝臓におけるＦＧＦＲ４発現を更に評価することに決めた。各々のサンプル中のＦＧＦＲ４発現を、最初の正常肝臓サンプル（Ｎ１）におけるこの受容体の発現に対して正規化した。ＦＧＦＲ４の平均レベルは正常肝臓（０．９０倍±０．０４倍）と比較して肝腫瘍（１．２２倍±０．０５倍）において中程度に増加したが、集団が全体として考慮される場合は、差異は統計的有意差（ｐ＝０．２３）に達しなかった（図６ｃ）。しかしながら、ＦＧＦＲ４発現は、腫瘍のサブセットにおいて（７／２３；３０％）有意に高かった（２倍以上）。これらの結果は、ＦＧＦＲ４発現が数種類の癌において調節解除されることを示している。肝腫瘍のサブセットにおけるＦＧＦＲ４の発現増加は、それが診断で選択された患者集団において肝癌の治療の魅力的な目標となりうることを示唆している。
【０２４８】
この研究において、ＦＧＦＲ４が肝細胞癌に関与しており、ＦＧＦＲ４不活性化抗体を用いた治療が抗腫瘍的利点を提供しうるという証拠を、我々は提供する。肝臓腫瘍形成におけるＦＧＦＲ４の関与を評価するために、我々は、遺伝子操作マウスモデルを使用した。ＦＧＦ１９の外因性発現が、肝細胞増殖、肝細胞性形成異常症およびマウスのＨＣＣ発症を促進することを示した。加えて、我々等は、ＫｌｏｔｈｏβがＦＧＦ１９の肝臓特異的活性に必要なことを証明した（１６，１９，２４）。ＫＬＢ及びＦＧＦＲ４が肝臓において最も高度に発現するので、我々はＦＧＦＲ４経路の調節解除がＦＧＦ１９媒介性肝臓腫瘍形成の原因であると仮定した。この仮説を検証するために、我々は、ＦＧＦＲ４−ＫＯマウスと共にＦＧＦ１９−ＴＧマウスを育てた。新生物発生前の肝細胞増殖及び肝細胞新形成は、ＦＧＦＲ４−ＷＴバックグラウンドのＦＧＦ１９−ＴＧマウスのみにおいて見出された。肝臓腫瘍形成は、ＦＧＦＲ４−ＫＯマウスにおいて消滅した。我々は、強力な肝癌誘発物質であるジエチルニトロソアミンを投与することによって、マウスを更に誘発した。ＤＥＮを用いた処置はＦＧＦＲ４−ＷＴバックグラウンドのＦＧＦ１９−ＴＧマウスにおいてＨＣＣ発症を促進させる一方、肝臓新形成の証拠はＦＧＦＲ４−ＫＯマウスでは見出されなかった。はっきりした結論は、ＦＧＦＲ４がＦＧＦ１９促進性肝臓腫瘍形成のために必要であるということである。
【０２４９】
併せると、これらのデータは、ＦＧＦＲ４、肝臓腫瘍形成及び肝癌進行の間の関連性を示唆するものである。従って、ＦＧＦＲ４は潜在的な治療標的であり、その阻害が肝癌患者に治療的な利点を提供しうる。このため、我々は、抗−ＦＧＦＲ４中和抗体（ＬＤ１）を開発した。ＬＤ１は、ＦＧＦＲ４と結合し、リガンド結合、経路活性化、遺伝子発現の調節、細胞増殖及びコロニー形成をインビトロで阻害する。ＬＤ１がＦＧＦＲ４と結合する部位は、ＦＧＦＲ４オルソログ間では類似しているが、ＦＧＦＲ１−３オルソログにおいては類似していない部位で、点突然変異を有するＦＧＦＲ４コンストラクトとのＬＤ１の相互作用を評価することによって局在化され；ＦＧＦＲ４のこれらのアミノ酸残基は、ＦＧＦＲ３の等価な位置に存在するアミノ酸残基によって置換された。ＬＤ１は、野生型ＦＧＦＲ４及びＧ１６５Ａ変異体を除く変異ＦＧＦＲ４コンストラクトの全てと結合した。ＦＧＦＲ４の位置１６５のアラニンによるグリシンの置換はＬＤ１結合をほぼ消滅させた。ＦＧＦＲ間のこの領域の高い同一性と組合せたＦＲＦＧ４に対するＬＤ１の精巧な特異性が、ＬＤ１結合のためのこの残基の重要性を強調する。ＦＧＦＲ４のグリシン１６５は、ＦＧＦＲ１のアラニン１７１に対応する。興味深いことに、アラニン１７１は、ＦＧＦＲ１二量体界面で最も近いアプローチの残基である（２５）。二量体の軸を越えて、１つの受容体のアラニン１７１の側鎖が、隣接した受容体のアラニン１７１と疎水的な接触をなす。ＦＧＦＲのこの領域の配列保存は、受容体−受容体界面を形成するこの領域と一致している（２５）。このように、ＬＤ１をＦＧＦＲのこの等価な領域に結合させることは、受容体二量体化を崩壊させるようである。リガンドによって誘導された受容体二量体化は、ＦＧＦＲの活性化に必須である（２６，２７）。従って、ＦＧＦＲ４二量体化の阻害は、ＬＤ１の潜在的な作用機序である。類似の作用機序は、他の治療用抗体について既に記載されている（２８）。
【０２５０】
我々は、インビボで、ＬＤ１がＦＧＦＲ４の下流の遺伝子の調節を阻害し、腫瘍増殖をブロックすることにより、肝癌異種移植片腫瘍に作用することを示した。加えて、ＬＤ１の投与が、ＦＧＦ１９−ＴＧマウスにおけるＨＣＣの形成及び発症を阻害した。
【０２５１】
これらのデータは、ＦＧＦＲ４が腫瘍形成及び癌進行の促進に関係していることを証明している。特に、我々の結果は、ＦＧＦＲ４が肝細胞癌において重要な役割を果たすことができることを示唆する。数種の証拠がこの仮説を裏付ける。ＦＧＦＲ４は、ヒト肝細胞に存在する支配的なＦＧＦＲアイソフォームである（１５）。我々は、肝臓組織が、最も高いＦＧＦＲ４及びＫＬＢ転写レベルを有していることを以前に報告したが、その両方はこのシグナル伝達複合体によるリガンド刺激性活性に必須である（１６）。さらに、マウス中でのＦＧＦ１９（すなわちＦＧＦＲ４特異的リガンド）の異所性発現が、肝細胞増殖、肝細胞性の形成異常症および新形成を促進し（１８）、ＦＧＦ１９誘発性肝細胞増殖が、ＦＧＦＲ４によって独特に媒介されることが報告されている（２４）。最近の報告は、ＦＧＦＲ４もアルファ胎仔タンパク質分泌、増殖および抗−アポトーシスを調節することによってＨＣＣ進行に有意に寄与することを示唆する（１７）。ＦＧＦＲ４発現は、また、化学療法に対する耐性を促進することも示している（２９）。あるグループは、マウスのＦＧＦＲ４について、ＨＣＣ促進効果というよりむしろ保護的役割を報告している点に留意されるべきである（３０）。リガンドの同一性及び濃度、並びにＦＧＦＲ及びコレセプター発現のレベルを含む背景因子が、腫瘍形成におけるＦＧＦＲ４の役割を調節するかもしれない可能性がある。例えば、我々はＦＧＦＲ４発現が原発性肝腫瘍のサブセットにおいて有意に増加したことを見出し、ＦＧＦＲ４が診断で選択された患者集団において肝癌の治療の魅力的なターゲットとなりうることを示唆した。肝臓腫瘍形成及びＨＣＣ進行におけるＦＧＦＲ４の関与について蓄積した証拠が与えられたからには、我々は、抗−ＦＧＦＲ４中和抗体を含む治療的介入が肝癌の治療において有益である蓋然性が高いと信じる。
【０２５２】
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【０２５３】
Ｂ．同定されＦＧＦ受容体４に対する抗体のヒト化中に除去される高度に特異的なオフターゲット結合
方法及び材料
ＦＧＦＲ４を、スルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチンを使用してビオチン化した（Ｐｉｅｒｃｅ；ｃａｔ２１３３５）。
キメラＬＤ１の生成−ここに記載されたように、ＣＨＯ細胞において発現され、記載さたようにして１４精製されたヒトＦＧＦ受容体４（ＦＧＦＲ４）の細胞外ドメインを使用し、ｂａｌｂ／ｃマウスを免疫化した。タンパク質ベースＥＬＩＳＡにおいて、ＦＧＦＲ４へのＦＧＦ１９の結合をブロックする能力についてクローンをスクリーニングした際に、ＬＤ１を発現するハイブリドーマを同定した。
【０２５４】
マウスＬＤ１可変ドメインを、標準的な方法を使用し、ＬＤ１産生ハイブリドーマ細胞から抽出した全ＲＮＡからクローニングした。可変軽鎖（ＶＬ）及び可変重鎖（ＶＨ）ドメインを、定常軽鎖（ＣＬ）及び定常重鎖ドメイン１（ＣＨ１）に対する縮重逆方向プライマーと、ＶＬ及びＶＨ領域のＮ末端アミノ酸配列に特異的な順方向プライマーを用い、ＲＴ−ＰＣＲを使用して増幅した。ついで、これらの可変ドメインを、それぞれヒト軽鎖及び重鎖定常領域を含んでいたベクター中にインフレームでクローニングした。
【０２５５】
ＬＤ１のヒト化及び親和性成熟−ＬＤ１の高頻度可変領域を、トラスツズマブに使用されたヒトカッパＩ（ｈｕＫＩ）及びヒトＶＨサブグループＩＩＩ（ｈｕＩＩＩ）可変ドメインフレームワーク中にグラフトした。フレームワーク修復を使用し、ＦＧＦＲ４結合親和性を完全に回復させたフレームワーク変化の最小限の組合せが同定されるまで、マウスバーニヤ位置の追加を介してＦＧＦＲ４結合親和性を最適化させた３３。
【０２５６】
ファージ上の一価Ｆａｂ−Ｐ３融合物として示されるｈＬＤ１．ｖＢは、ソフトランダム化戦略を使用して親和性成熟させた。マウス高頻度可変領域配列へのバイアスが、有毒なオリゴヌクレオチド合成戦略を使用して維持されるように、配列多様性を各々の高頻度可変領域中に別々に導入した３４。各々の多様化された位置について、野生型アミノ酸をコードするコドンをヌクレオチドの７０−１０−１０−１０の混合物によって有害にし、各々の位置で平均５０パーセントの突然変異率を生じさせた。
【０２５７】
ｈＬＤ１．ｖＢ多様化ファージライブラリーを、可溶性選択方法３５を使用してパニングした。このアプローチ法は、溶液中の低濃度のビオチン化ＦＧＦＲ４を用いた短い結合期間に依存し、固定化ニュートラアビジン上のＦＧＦＲ４へのファージ結合の短い５分の捕捉が続く。過剰な未標識のＦＧＦＲ４（１００ｎＭを超える）を、増加したオフ速度の選択的ストリンジェンシーでの捕捉工程の前に添加した。結合したファージを、３０分間、１００ｍＭのＨＣｌと共にウェルをインキュベートすることにより溶出させ、１Ｍのトリス（ｐＨ８）で中和し、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞及びＭ１３／ＫＯ７ヘルパーファージを使用して増幅させた。ファージ抗体を完全長ＩｇＧに再フォーマットし、哺乳動物細胞中で一過性に発現させ、プロテインＡクロマトグラフィーによって精製した。
【０２５８】
親和性の決定−親和性の決定は、ＢＩＡｃｏｒｅＴＭ−２０００を使用する表面プラスモン共鳴によって実施した。およそ５０ＲＵのｈＬＤ１．ｖＢ ＩｇＧを、ＣＭ５センサチップ上で１０ｍＭの酢酸ナトリウムｐＨ４．８中に固定し、ＰＢＳＴ中のＦＧＦＲ４（０．４８−１０００ｎＭ）の連続２倍希釈物を３０μｌ／分の流量で注入した。各サンプルを４分結合、１０分解離で分析した。各注入後、１０ｍＭのグリシンｐＨ１．７を使用して、チップを再生させた。結合応答を、類似密度で固定された無関係なＩｇＧを用い、フローセルからＲＵを減算することによって修正した。ｋｏｎ及びｋｏｆｆの同時フィッティングの１：１ Ｌａｎｇｕｉｒモデルを動態解析に使用した。
【０２５９】
異種移植実験−全動物プロトコルは、ジェネンテックの動物ケア及び使用委員会の承認を得た。７週齢の雌のｎｕ／ｎｕ（ヌード−ＣＲＬ）マウスをCharles River Laboratories Internationalから得た（株コード０８８）。マウスを、特定病原体に感染していない状況下に保持した。ＨＵＨ７細胞（５ｘ１０６；Japan Health science Research Resources Bank, cat JCRB0403)を、ＨＢＳＳ／Ｍａｔｒｉｇｅｌ（１：１ｖ／ｖ；BD Biosciences, cat354234)に０．２ｍＬの量でマウスの横腹に皮下的に移植した。腫瘍を週２回ノギスで測定し、腫瘍体積を、式Ｖ＝０．５ｘＬｘＷ２（ここで、Ｌ及びＷはそれぞれ腫瘍の長さ及び幅である）を使用して算出した。平均腫瘍体積が１４５ｍｍ３に達したとき、マウスをグループ（ｎ＝１５）に無作為化し、ビヒクル（ＰＢＳ）、３０ｍｇ／ｋｇのｃｈＬＤ１、３０ｍｇ／ｋｇのｈＬＤ１．ｖＢ又は３０ｍｇ／ｋｇのｈＬＤ１．ｖ２２の、０．２ｍＬの腹腔内注射によって１週間に１回治療した。治療後、腫瘍体積を上述のようにして測定した。パーセント腫瘍成長阻害（％ＴＧＩ）は、式：％ＴＧＩ＝１００×（（Ｃ−Ｔ）／Ｃ）を使用して算出した（ここで、Ｃ＝コントロールビヒクルグループの２１日目の平均腫瘍体積、及びＴ＝試験治療されたマウスの各グループの２１日目の平均体積）。データを解析し、ログランク検定を使用して、ＪＭＰソフトウェアＶｅｒｓｉｏｎ６．０(SAS Institute；Cary, NC)を用い、グループ間の腫瘍倍増差を評価した。データは、平均腫瘍体積±SEMとして示される。
【０２６０】
マウスの薬物動態学的研究−ＮＣＲヌードマウスはＴａｃｏｎｉｃ(cat NCRNU)によって供給された。Ｃ３ノックアウトマウス３６を少なくとも１０世代についてＣ５７ＢＬ／６マウスに戻し交配した。子孫を交雑させ、Ｃ３ノックアウトマウス及び野生型コントロールを作製した。この研究において、それらをそれぞれ、Ｃ３ ｋｏ及びＣ３ ｗｔマウスと称する。
【０２６１】
１５．５及び３８．３ｇの間の計量マウスに、尾静脈を経て１、５または２０ｍｇ／ｋｇ体重の静脈内ボーラス用量の抗−ＦＧＦＲ４抗体を投与した。後眼窩出血又は心臓スティックを介して血液サンプルを採取（時点あたりｎ＝３マウス）し、投与後２８日まで選択された時点で血清を単離した。ＥＬＩＳＡを使用して抗−ＦＧＦＲ４抗体血清濃度についてアッセイされるまで、血清サンプルは−８０℃で保存した。
【０２６２】
抗−ＦＧＦＲ４抗体血清濃度−時間のプロファイルを使用し、WinNonlin Enterprise Version 5.2.1(Pharsight Corp.)を使用してＰＫパラメーターを推定した。単一の濃度−時間プロファイルを各グループについて決定し、各ＰＫパラメーターの一推定値を得、各ＰＫパラメーターのフィッティングの標準誤差（ＳＥ）と共に、報告される。各グループに対して投与された名目用量をモデリングに使用した。
【０２６３】
放射性ヨウ素化−抗体を、間接的なヨードゲン添加法３７を使用して放射ヨウ素標識した。放射標識されたタンパク質を、予めＰＢＳで平衡化したＮＡＰ５ＴＭカラム(GE Healthcare Life Sciences, cat.17-0853-01)を使用して精製した。インビトロ研究において使用した分子の比活性は、ｃｈＬＤ１については１４．３８μＣｉ／μｇ、ｈＬＤ１．ｖＢについては１５．０５μＣｉ／μｇであった。インビボ研究において使用した分子の比活性は、ｃｈＬＤ１については１２．５２μＣｉ／μｇ、ｈＬＤ１．ｖＢについては９．９９μＣｉ／μｇであった。放射性ヨウ素化後、放射性ヨウ素化された抗体を、インタクトで、未標識抗体に結合する匹敵する抗原を保持しているとして、サイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）及びＥＬＩＳＡによって特徴付けられた。
【０２６４】
インビトロインキュベーション−血清中でのインキュベーションでは、抗体をＮＣＲヌード、Ｃ３ ｋｏ又はＣ３ ｗｔマウス血清３６、及びＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡに２００μｇ／ｍｌの最終濃度で添加した。アリコート（１００μｌ）を作製し、ゆっくりと回転させながら、３７℃でインキュベートした。サンプルを０、４、８、２４、４８及び９６時間でドライアイスに移し、ＥＬＩＳＡ分析まで−７０℃で保存した。
【０２６５】
血漿中でのインキュベーションでは、抗体をカニクイザル、ヒト、ラット(それぞれ、Bioreclamation LLC, cat. CYNPLLIHP, HMLLIHP, 及び RATPLLIHP)、及びＮＣＲヌードマウス血漿（Ｔａｃｏｎｉｃ，ｃａｔ ＮＣＲＮＵ−Ｅ）及びＰＢＳ＋最終濃度２００μｇ／ｍｌの０．５％ＢＳＡ±最終濃度５ｘ１０６ＣＰＭ／ｍｌの１２５Ｉ−抗体に添加した。アリコート（１００μｌ）を作製し、ゆっくりと回転させながら、３７℃でインキュベートした。サンプルを０、２４、及び４８時間でドライアイスに移し、サイズ排除ＨＰＬＣ分析（１２５Ｉ−抗体＋未標識サンプル）又はプロテインＧ抽出と続いてのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（未標識抗体サンプル）に供するまで、−７０℃で保存した。
【０２６６】
組織分布研究−雌ＮＣＲヌードマウスに、２０ｍｇ／ｋｇの標識のないｈＬＤ１．ｖＢ±３００μＣｉ／ｋｇの１２５Ｉ−ｈＬＤ１．ｖＢ又は２０ｍｇ／ｋｇの標識のないｃｈＬＤ１±３００μＣｉ／ｋｇの１２５Ｉ−ｈＬＤ１の静脈内ボーラス投与を受容させた。投与の１５分、２、５、２４、７２および１２０時間後に血液を収集し、血清用にプロセシングした。血清を−７０℃で凍結させた後、サイズ排除ＨＰＬＣ分析により分析しプロテインＧ抽出と続くＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離に供した。全放射性カウントを、Ｗａｌｌａｃ １４８０ Ｗｉｚａｒｄ３”(EC&GWallac, cat. 1480-011)を使用して得た。肝臓、肺、腎臓、及び心臓を投与の２、７２及び１２０時間後に収集し、全放射活性を分析するまで−７０℃で保存した。全ての動物は、ＩＡＣＵＣガイドラインに従って取り扱った。
【０２６７】
ＩｇＧ及びＦＧＦＲ４ ＥＬＩＳＡ−ＦＧＦＲ４特異性ＩｇＧをＦＧＦＲ４ ＥＬＩＳＡを使用して測定した。ＦＧＦＲ４をマイクロタイタープレートに固定し、ＬＤ１標準体（ｃｈＬＤ１、ｈＬＤ１．ｖＢ又はｈＬＤ１．ｖ２２）及びＭａｇｉｃ Ｂｕｆｆｅｒ＋０．３５ＭのＮａＣｌ（１ｘＰＢＳ ｐＨ７．４、０．５％のＢＳＡ、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０、０．２５％のＣｈａｐｓ、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．２％のＢｇＧ、０．３５ＭのＮａＣｌ、１５ｐｐｍのＰｒｏｃｌｉｎ）に希釈されたサンプルを添加し、捕捉ＩｇＧを西洋ワサビペルオキシダーゼにコンジュゲートしたＦ（ａｂ’）２ヤギ抗−ｈｕＩｇＧ Ｆｃ(HRP, Jackson, cat# 109-036〜098)を用いて検出した。
【０２６８】
全抗体を、Ｆ（ａｂ’）２ウサギ抗−ｈｕＩｇＧ Ｆｃ(Jackson, cat# 309-006〜008)が被覆されたマイクロタイタープレート上で希釈サンプルをインキュベートすることにより、ヒトＦｃ ＥＬＩＳＡを使用して決定し、ＨＲＰにコンジュゲートしたＦ（ａｂ’）２ヤギ抗−ｈｕＩｇＧ Ｆｃ(Jackson, cat# 109-036〜098)を用いて検出した。ＴＭＢペルオキシダーゼ基質溶液を発色に使用し(Moss, cat# TMBE-1000)、１ＭのＨ３ＰＯ４を添加して反応を停止させた。プレートを、マイクロプレートリーダー(Biotek EL311又は等価物)で４５０／６２０ｎｍにて読み取った。
【０２６９】
サイズ排除ＨＰＬＣ−サイズ排除ＨＰＬＣを、ｐＨ４．０及びｐＨ７．０で始めるサンプルで、ＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘａＴＭ ＢｉｏＳｅｐ−ＳＥＣ−Ｓ３０００カラム（３００×７．８ｍｍ、５μｍカラム(Torrance, cat. 00H-2146-KO)を使用し、ＰＢＳ中で実施した。ｐＨ７．０のサンプルをＰＢＳに希釈し；ｐＨ４．０のサンプルを、２００ｍＭのクエン酸（ｐＨ３．０）でｐＨを低下させることによって作製した。流量は３０分間は０．５ｍｌ／分であり、均一濃度であった。ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎアナログ−デジタル変換器を、２５０００単位／ｍＶ、ピーク幅２秒、スリット４ｎＭにセットした(Agilent Technologies；cat 35900E)。放射活性を、標準Ａｇｉｌｅｎｔ １１００ＨＰＬＣモジュールシステム(Santa Clara, CA)においてｒａｙｔｅｓｔ Ｒａｍｏｎａ９０を使用して検出した (raytest USA Inc.; Wilmington, NC)。
【０２７０】
プロテインＧビーズ抽出及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離−トリトンＸ−１００（１％（ｖ／ｖ）の最終濃度）を、サイズ排除ＨＰＬＣから収集した画分に添加し、続いてプロテインＧビーズ（ＧＥ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ，ｃａｔ．１７−０８８５−０１）を添加した。ゆっくりと回転させながら、サンプルを４℃で一晩インキュベートし、ついでビーズを１％のＰＢＳ＋１％のトリトンＸ−１００で４回洗浄した。各サンプルを分割し、サンプルの半分を、ＮｕＰａｇｅ（登録商標）サンプル還元剤（ｃａｔ．ＮＰ０００４）を使用して還元した。ビーズを、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）４ｘＬＤＳサンプルバッファー（ｐＨ８．４）（ｃａｔ．ＮＰ００００７）±ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）サンプル還元剤で処理し、９９℃で５分間インキュベートし；ついで、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）１ｘＭＯＰＳ ＳＤＳ操作用バッファー（ｃａｔ．ＮＰ０００１）を用いて、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）４−１２％ビス−トリスゲル（ｃａｔ．ＮＰ０３２１ＢＯＸ）に適用した。ゲルをクーマシーブルーＲ２５０染料で染色した。全てのＮｕＰＡＧＥ（登録商標）試薬はInvitrogen, Corpから取得した。
【０２７１】
質量分析及び生命情報科学分析−SDS-PAGEから除されたサンプルを、過去に記載されたようにして３８処理した。簡潔に述べると、急速溶液中マイクロ波支援トリプシン性消化後に、ペプチドを逆相クロマトグラフィによって分離し、2kVのスプレー電圧のナノスプレーイオン化源中に直接溶出させ、LTQ XL-Orbitrap質量分析器 (ThermoFisher)を使用して分析した。前駆体イオンは、60000解像度のFTMSで分析した。MS/MSをデータ依存モードで操作される機器を具備するLTQにおいて実施し、多い方から10のイオンをフラグメンテーションに供した。Ｍａｓｃｏｔ検索アルゴリズム(Matrix Sciences)を使用して又はデノボ解釈によって、データを検索した。
【０２７２】
Ｍａｓｃｏｔデータの検索では、検索基準は、２０ｐｐｍの完全ＭＳトレランス、Ｌｙｓ上にＧｌｙＧｌｙを有する０．５ＤａのＭＳ／ＭＳトレランス、メチオニンの酸化、Ｃｙｓ上の＋５７Ｄａ及び３つまでの切断ミスを伴う可変修飾としてＳＴ及びＹのリン酸化を含む。データは、Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔデータベースの哺乳動物サブセットに対して検索した。
【０２７３】
結果
ＬＤ１のヒト化及び特徴付け。ヒトキメラ抗体ＬＤ１（ｃｈＬＤ１）は、ヒトＦＧＦＲ４に結合し、ＦＧＦ１９及び他のＦＧＦリガンドによるシグナル伝達をブロックし、ＨＵＨ７ヒト肝細胞癌（ＨＣＣ）異種移植片モデルにおける腫瘍増殖を抑制することが示されている１４。ＬＤ１のヒト化における第１工程として、ｃｈＬＤ１の可変軽鎖及び重鎖ドメインを、トラスツズマブに使用されたヒトカッパＩ（ｈｕＫＩ）及びヒトＶＨサブグループＩＩＩ（ｈｕＩＩＩ）可変ドメインフレームワークに整列させた（図１０）。ｃｈＬＤ１からの高頻度可変領域をこれらのヒト可変フレームワーク中にグラフトし、直接のＣＤＲ−移植片（ｈＬＤ１．ｖＡ）を生成させた１５，１６。ＦＧＦＲ４結合性について表面プラスモン共鳴によってｃｈＬＤ１と比較した場合、ｈＬＤ１．ｖＡの親和性は約５倍減少した（図示せず）。可変軽鎖及び重鎖ドメイン双方における様々なバーニヤ位置のマウス配列の置換を、結合性を改善する手段として調査し、ＬＣ：Ｐ４４Ｆ、Ｌ４６Ｉ及びＹ４９Ｓにおける３つの重要なマウスバーニヤ位置の同定に至った。これらの変化はｃｈＬＤ１と同等のＦＧＦＲ４に対する親和性を有していたｈＬＤ１．ｖＢに導入された（表３）。
【０２７４】
表３．抗ＦＧＦＲ４抗体変異体の結合動態。固定化抗体変異体へのヒトＦＧＦＲ４結合の結合速度及び解離速度を表面プラズモン共鳴を使用して測定した。
2014516511.tif 000003
【０２７５】
驚くべきことに、類似したＦＧＦＲ４結合親和性（図１１Ａ）にもかかわらず、ｈＬＤ１．ｖＢは、ｎｕ／ｎｕマウス（図１１Ｂ）のＨＵＨ７ヒトＨＣＣ異種移植片モデルのｃｈＬＤ１と比較して、抗−腫瘍有効性を減弱させた。９日後に、ＰＢＳで処置されたマウスのＨＵＨ７腫瘍は、およそ７００ｍｍ３の平均体積まで増大した。ｃｈＬＤ１処置グループでは、平均ＨＵＨ７腫瘍体積はおよそ４００ｍｍ３であり、ＰＢＳ処置動物の腫瘍と比較して４３％の腫瘍増殖阻害率であった。しかしながら、ｈＬＤ１．ｖＢで処置されたマウスの平均腫瘍体積はおよそ６００ｍｍ３であり、ＰＢＳ処置動物の腫瘍と比較して１４％の腫瘍増殖阻害率であった。
【０２７６】
胸腺欠損ＮＣＲヌードマウスにおいて実施されたｃｈＬＤ１及びｈＬＤ１．ｖＢの薬物動態学的評価は、ｃｈＬＤ１及びｈＬＤ１．ｖＢの双方に対して１ｍｇ／ｋｇのＩＶ（それぞれ１４０及び１３２ｍＬ／日／ｋｇ）では、急速なクリアランスを明らかにし、標的媒介性のクリアランス機序が示唆された。このクリアランス機序は、２０ｍｇ／ｋｇの高用量ではｃｈＬＤ１について飽和するように思われた。この用量では、観察されたクリアランス（１１．７ｍＬ／日／ｋｇ；１１Ｃ図）は、マウスにおける典型的なヒト化抗体に対して観察される標的依存性クリアランスの範囲（６−１２ｍＬ／日／ｋｇ）内に存在した（文献１７及びＰ．Ｔｈｅｉｌとの個人的情報交換）。しかしながら、ｈＬＤ１．ｖＢは急速にクリアされ続けた（３４．２ｍＬ／日／ｋｇ；１１Ｃ図）。これは、ｈＬＤ１．ｖＢに対する付加的なクリアランス機序がマウス異種移植片モデルの効力の見かけ上の欠如の原因でありうることを示唆した。
【０２７７】
ＰＫ知見と一致して、１２５Ｉ−ｃｈＬＤ１及び１２５Ｉ−ｈＬＤ１．ｖＢを使用する体内分布研究は、有意に異なる分布プロファイルを明らかにした（図１１Ｄ）。肝細胞上でのＦＧＦＲ４の高発現のために１２５Ｉ−ｃｈＬＤ１は、肝臓に急速にかつ特異的に分布する一方、限定量の１２５Ｉ−ｈＬＤ１．ｖＢだけが２時間までに等価用量で肝臓に見出された（〜８０対３５％のＩＤ／ｇ）。対照的に、これらの抗体の観察された分布は血液中で逆転しており、これは、全体的放射活性の損失に至ったインビボでの抗体安定性の喪失とは異なり、競合相互作用が肝臓へのｈＬＤ１．ｖＢの分布を防止したことを示唆している。
【０２７８】
Ｃ３干渉の同定。ｃｈＬＤ１及びｈＬＤ１．ｖＢの間で観察されるインビボでの差異を調整するために、我々は、血漿中での抗体安定性並びにその機能に影響を及ぼすかもしれない潜在的オフターゲット血漿又は組織相互作用を評価した。血漿安定性は、ｃｈＬＤ１又はｈＬＤ１．ｖＢをマウス、ラット、サル又はヒト血漿中で３７℃で４８時間インキュベートし、続いて、ＦＧＦＲ４結合活性と全ヒトＩｇＧ濃度の双方を評価することにより、評価した。ＩｇＧ ＥＬＩＳＡにより測定した全ｃｈＬＤ１又はｈＬＤ１．ｖＢ濃度は変化しなかった（図示せず）一方、ＦＧＦＲ４ ＥＬＩＳＡによって検出したｈＬＤ１．ｖＢの回復は、ＰＢＳ／ＢＳＡ中のコントロールインキュベーションと比較して、マウス及びラット血漿において有意に低減していた（〜３０％）（図１２Ａ）。これに対し、試験された全ての条件において、ｃｈＬＤ１ ＦＧＦＲ４結合活性の損失はなかった。特に、げっ歯類血漿からのｈＬＤ１．ｖＢ回復の有意な低減は、損失が変性のためではなく、げっ歯類血漿において干渉複合体の形成によると思われることを示唆した。マウス血漿とｈＬＤ１．ｖＢの相互作用がより高分子量の複合体の生成を生じるかもしれないため、ヨウ化ｃｈＬＤ１及びｈＬＤ１．ｖＢをまた血漿中でインキュベートし、サイズ排除ＨＰＬＣを使用して分析した。高分子量ピークは、１２５Ｉ−ｃｈＬＤ１でなく１２５Ｉ−ｈＬＤ１．ｖＢを含んでいるマウス血漿サンプルにおいてのみ検出された。１５０ｋＤａの予想された抗体ピークに加えて、およそ２７０及びおよそ５５０ｋＤａに相当するピークがまた最初に検出された（図１２Ｂ）が、１５０及び２７０ｋＤａのピークだけは４８時間まで残った；５５０ｋＤａのピークはもはや観察されなかった。これらの高分子量ピークは、ｈＬＤ１．ｖＢを含むカニクイザル及びヒト血漿又はＰＢＳ／ＢＳＡ、あるいはｃｈＬＤ１を含む任意のサンプルにおいても検出されなかった（図１５）。興味深いことに、これらの高分子量ピークの存在は、ＦＧＦＲ４ ＥＬＩＳＡで得られた抗体回復データと直接的に相関していた。更に、分析がｐＨ４．０で実施されたときに、これらのピークの存在が減弱しており（図15)、これは、マウス血清とのhLD1.vB依存性相互作用を更に裏付けている。
【０２７９】
マウス血漿の免疫沈降は、ｃｈＬＤ１でなく、ｈＬＤ１．ｖＢを使用して、選択的に引き下げられた約３７ｋＤａのタンパク質を明らかにした（図１２Ｃ）。サイズ排除ＨＰＬＣからの知見と一致して、この３７ｋＤａのタンパク質バンドはカニクイザル及びヒト血漿サンプルではなく、ラットおいて観察された（図１６Ａ−Ｃ）。さらに、タンパク質は、ｈＬＤ１．ｖＢが投与されたマウスからの血漿中に検出された（図１６Ｄ）。３７ｋＤａのマウス血漿タンパクに由来するトリプシン性ペプチドのＭＳ／ＭＳ分析により、このバンドがマウス補体Ｃ３に由来することが同定された（図１２Ｄ）。Ｃ３の直接的関与は、Ｃ３ノックアウト（ｋｏ）マウスからの血漿中でインキュベートされたｈＬＤ１．ｖＢの完全回復によって裏付けられた（図１７）。
【０２８０】
Ｃ３結合の親和性成熟及び再評価。ｃｈＬＤ１及びｈＬＤ１．ｖＢの双方は、同じヒト定常領域及び相補性決定領域（ＣＤＲ）を共有しており、よって、それらの可変ドメインフレームワークのみが異なる。さらに、ｈＬＤ１．ｖＢのヒト化に使用される軽鎖及び重鎖可変ドメインフレームワークは、マウス血清タンパク質との相互作用を示すことは報告されていないトラスツズマブを含むいくつかのヒト化抗体と、非常に高度な相同性を共有する。よって、マウスＣ３とｈＬＤ１．ｖＢとのオフターゲット相互作用は、ヒト可変ドメインフレームワークとマウスＬＤ１ ＣＤＲの特定の組合せから生じた蓋然性が高い。
【０２８１】
我々は、ファージに表示されるＦａｂ断片の親和性成熟に起因するｈＬＤ１．ｖＢのＣＤＲ配列中のいくつかの変化が、マウスＣ３結合に付随損失を有するＦＧＦＲ４に対しての親和性改善を生じさせ得たと推論した。ファージ選択変異体はＩｇＧとして発現され、ＦＧＦＲ４結合親和性並びにＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析と連係した免疫沈降アッセイを使用してのマウスＣ３との潜在的相互作用についてスクリーニングした。ｈＬＤ１．ｖＢと比較してＣＤＲ−Ｈ２に３つのアミノ酸変化を有する一変異体ｈＬＤ１．ｖ２２（Ｈ５２Ｌ、Ｓ５３Ｖ及びＤ６０Ｅ、図１０）は、ＦＧＦＲ４（表３）に対する改善された結合親和性と、補体Ｃ３への結合性の損失の双方を示した（図１３Ｂ）。
【０２８２】
マウス補体Ｃ３がインビボでのｈＬＤ１．ｖＢ及びｈＬＤ１．ｖ２２のクリアランスを変化させた度合いを、２０ｍｇ／ｋｇでＣ３ ｋｏマウスをＣ３ ｗｔマウスと比較する薬物動態研究において評価した。ＮＣＲマウスにおいて過去に観察されたように、ｈＬＤ１．ｖＢはＣ３ ｗｔマウス（２９ｍＬ／日／ｋｇ）の循環から急速にクリアされた；しかしながら、ｃｈＬＤ１及びｈＬＤ１．ｖＢは、Ｃ３ ｋｏマウスにおいて類似の薬物動態プロファイル（それぞれ８．７及び９．３ｍＬ／日／ｋｇのクリアランス）を有していた（図１４Ａ及び表４）。
【０２８３】
表４．２０ｍｇ／ｋｇＩＶで投与された抗ＦＧＦ．Ｒ４変異体の薬物動態パラメーター
2014516511.tif 000004
【０２８４】
これらのデータは組織分布データと一致しており、インビボでのマウス補体Ｃ３との特異的な相互作用がｈＬＤ１．ｖＢの急速なクリアランスを生じることを確証している。ｈＬＤ１．ｖＢのクリアランスがＣ３ ｋｏマウスにおいて有意に改善されており、ｈＬＤ１．ｖ２２がＣ３と結合しないため、我々はｈＬＤ１．ｖ２２がＮＣＲヌードマウスにおいてｃｈＬＤ１に類似した薬物動態プロファイルを有しているであろうと予想した。図１４Ｂに示されるように、ｃｈＬＤ１とｈＬＤ１．ｖ２２のクリアランスはＮＣＲヌードマウスにおいて類似する（それぞれ１１．８及び１１．３ｍＬ／日／ｋｇ）一方、我々の以前の知見に一致して、ｈＬＤ１．ｖＢは急速にクリアされる（４６．７ｍＬ／日／ｋｇ）。
【０２８５】
ＨＵＨ７ ＨＣＣ異種移植片モデルの腫瘍増殖を阻害するｈＬＤ１．ｖ２２の能力を、ｃｈＬＤ１及びｈＬＤ１．ｖＢと比較して評価した。２１日後に、ＰＢＳで処置されたマウスのＨＵＨ７腫瘍は、およそ２１００ｍｍ３の平均体積まで増大した（図１４Ｃ）。ＰＢＳ−処置グループの１５匹の動物の中で、３匹を、腫瘍体積限界（およそ２５００ｍｍ３）のため研究終了前に安楽死させた。ｈＬＤ１．ｖＢ処置群において、平均ＨＵＨ７腫瘍体積はおよそ１２００ｍｍ３であり、ＰＢＳ処置動物の腫瘍と比較して４３％の腫瘍増殖阻害率であった。しかしながら、ｈＬＤ１．ｖ２２で処置されたマウスの平均腫瘍体積は、およそ５３０ｍｍ３であった。この結果は、平均ＨＵＨ７腫瘍体積がおよそ３５０ｍｍ３であったｃｈＬＤ１処置マウスと同等であった。ｈＬＤ１．ｖ２２及びｃｈＬＤ１処置グループの双方に対して、これは、ＰＢＳビヒクル処置グループと比較して、それぞれ７５％及び８３％の腫瘍サイズ減少である。ｈＬＤ１．ｖＢ（１２．２日）、ｈＬＤ１．ｖ２２（１５．８日）又はｃｈＬＤ１（１７．１日）で処置されたグループの腫瘍倍増時間は、ＰＢＳ処置グループ（８．２日）のものよりも有意に長い。加えて、ｈＬＤ１．ｖ２２又はｃｈＬＤ１処置グループの腫瘍倍増時間は、ｈＬＤ１．ｖＢ処置グループのものより有意に長かった。ｈＬＤ１．ｖＢと比較してのｈＬＤ１．ｖ２２及びｃｈＬＤ１双方の類似したインビボ性能は、マウス補体Ｃ３との特異的オフターゲット相互作用がクリアランスの増加を生じさせ、ｈＬＤ１．ｖＢの暴露低下及び効能低下を引き起こすことを、強く意味している。
【０２８６】
このように、抗−ＦＧＦＲ４抗体ｈＬＤ１．ｖ２２の作製は次の工程を有する：１）ＬＤ１のマウスＶＬ及びＶＨドメインとヒトＩｇＧ１定常ドメインを含むヒトキメラＬＤ１（ｃｈＬＤ１）の作製；２）ｃｈＬＤ１からの６つのマウスＨＶＲをヒトＶＬカッパＩ及びヒトＶＨサブグループＩＩＩ可変ドメインフレームワークへグラフトして、直接的ＨＣＲ移植片を作製し、抗体ｈＬＤ１．ｖＡを作製、抗体ｈＬＤ１．ｖＡはＣｈＬＤ１より約５倍少なくＦＧＦＲ４に結合；３）軽鎖変異Ｐ４４Ｆ、Ｌ４６Ｉ及びＹ４９Ｓを導入して抗体ｈＬＤ１．ｖＢを作製。抗体ｈＬＤ１．ｖＢは抗体ｃｈＬＤ１より約２倍弱くヒトＦＧＦＲ４に結合するが、ｈＬＤ１．ｖＢはｃｈＬＤ１と比較してインビボでの腫瘍効果、インビボでの急速なクリアランスを低減させ、マウス補体タンパク質Ｃ３へ結合することが見い出された；４）親和成熟を実施し、ＨＶＲ Ｈ２（Ｈ５２Ｌ、Ｓ５３Ｖ、Ｄ６０Ｅ）への３つの変化を加えると、ＦＧＦＲ４に対する結合親和性を改善し、マウス補体Ｃ３タンパク質への結合を排除した。得られたヒト化及び親和性成熟抗体、抗体ｈＬＤ１．ｖ２２は、ｃｈＬＤ１に相当するインビボ効果、ｐＫ及び組織分布性を有していた。さらに、抗体ｈＬＤ１．ｖ２２は、例えばヒト異種移植片研究における癌の阻害等、親ｃｈＬＤ１抗体に少なくとも匹敵する生物学的活性を有していると判定された。
【０２８７】
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【０２８８】
前述の発明は、理解を明確にする目的で、例証と実施例によって若干詳細に記載しているが、記載及び実施例は、本発明の範囲を限定するものと解釈してはならない。ここに引用される全ての特許及び科学文献の開示は、出典明示により、それらの全体が明示的にここに援用される。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗ＦＧＦＲ４抗体が≦１ｎＭの親和性でヒトＦＧＦＲ４に結合する、ＦＧＦＲ４に結合する単離された抗体。
【請求項２】
抗ＦＧＦＲ４抗体が≦１ｎＭの親和性でヒト、マウス及びカニクイザルＦＧＦＲ４に結合する請求項１に記載の単離された抗体。
【請求項３】
抗ＦＧＦＲ４抗体が≦０．０５ｎＭの親和性でヒトＦＧＦＲ４に結合する請求項２に記載の単離された抗体。
【請求項４】
抗ＦＧＦＲ４抗体が図１２Ｄに示すアミノ酸配列を有するマウスＣ３タンパク質に実質的に結合しない請求項１−３の何れか一項に記載の単離された抗体。
【請求項５】
抗ＦＧＦＲ４抗体がＧ１６５Ａ変異を含んでなるヒトＦＧＦＲ４に実質的に結合しない請求項１−４の何れか一項に記載の単離された抗体。
【請求項６】
抗ＦＧＦＲ４抗体がアミノ酸番号１５０〜１７０の成熟ヒトＦＧＦＲ４アミノ酸配列を含んでなるか、から基本的に成るか又はから成る配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％の配列同一性又は類似性を有するポリペプチドに結合する請求項１−５の何れか一項に記載の単離された抗体。
【請求項７】
抗ＦＧＦＲ４抗体がアミノ酸番号１５０〜１７０の成熟ヒトＦＧＦＲ４アミノ酸配列を含んでなるか、から基本的になるか又はからなるポリペプチドに結合する請求項６に記載の単離された抗体。
【請求項８】
抗ＦＧＦＲ４がＦＧＦＲ４活性のアンタゴニストである請求項１−７の何れか一項に記載の抗体。
【請求項９】
ＦＧＦＲ４活性がＦＧＦ誘導細胞増殖、ＦＧＦＲ４へのＦＧＦ結合、ＦＧＦ１９に曝露された細胞におけるＣＹＰ７α７発現のＧＦ１９−媒介阻害、又はＦＧＦ１９−誘導コロニー形成である請求項８に記載の抗体。
【請求項１０】
ＦＧＦＲ４に対するＦＧＦ１及び／又はＦＧＦ１９結合が阻害される請求項９に記載の抗体。
【請求項１１】
ＦＧＦＲ４に対するＦＧＦ１結合の阻害のＩＣ５０が約０．１０ｎＭであり、ＦＧＦＲ４に対するＦＧＦ１９結合の阻害のＩＣ５０が約０．１０ｎＭである請求項１０に記載の抗体。
【請求項１２】
モノクローナル抗体である請求項１−１１の何れか一項に記載の抗体。
【請求項１３】
ヒト、ヒト化、又はキメラ抗体である請求項１−１１の何れか一項に記載の抗体。
【請求項１４】
ＦＧＦＲ４に結合する抗体断片である請求項１−１１の何れか一項に記載の抗体。
【請求項１５】
抗体が(ａ)配列番号：３のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ−Ｈ３、(ｂ)配列番号：６のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ−Ｌ３、及び(ｃ)配列番号：２のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ−Ｈ２を含む請求項１−１４の何れか一項に記載の抗体。
【請求項１６】
抗体が(ａ)配列番号：１のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ−Ｈ１(ｂ)配列番号：２のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ−Ｈ２、及び(ｃ)配列番号：３のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ−Ｈ３を含む請求項１−１４の何れか一項に記載の抗体。
【請求項１７】
(ａ)配列番号：４のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ−Ｌ１；(ｂ)配列番号：５のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ−Ｌ２；及び(ｃ)配列番号：６のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ−Ｌ３をさらに含んでなる請求項１６に記載の抗体。
【請求項１８】
(ａ)配列番号：４のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ−Ｌ１；(ｂ)配列番号：５のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ−Ｌ２；及び(ｃ)配列番号：６のアミノ酸配列を含んでなるＨＶＲ−Ｌ３を含んでなる請求項１−１４の何れか一項に記載の抗体。
【請求項１９】
配列番号：９、１０、１１及び／又は１２の軽鎖可変ドメインフレームワーク配列を更に含んでなる請求項１−１８の何れか一項に記載の抗体。
【請求項２０】
配列番号：１３、１４、１５及び／又は１６の重鎖可変ドメインフレームワーク配列を更に含んでなる請求項１−１９の何れか一項に記載の抗体。
【請求項２１】
(ａ)配列番号：７のアミノ酸配列に少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＨ配列；(ｂ)配列番号：８のアミノ酸配列に少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＬ配列；又は(ｃ)(ａ)のＶＨ配列及び(ｂ)のＶＬ配列を含んでなる請求項１−２０の何れか一項に記載の抗体。
【請求項２２】
配列番号：７のＶＨ配列を含んでなる請求項２１に記載の抗体。
【請求項２３】
配列番号：８のＶＬ配列を含んでなる請求項２１に記載の抗体。
【請求項２４】
配列番号：７のＶＨ配列及び配列番号：８のＶＬ配列を含んでなる抗体。
【請求項２５】
完全長ＩｇＧ１抗体である請求項１−２４の何れか一項に記載の抗体。
【請求項２６】
請求項１−２４の何れか一項に記載の抗体をコードする単離された核酸。
【請求項２７】
請求項２６に記載の核酸を含んでなる宿主細胞。
【請求項２８】
抗体が生産されるように請求項２７に記載の宿主細胞を培養することを含んでなる抗体の生産方法。
【請求項２９】
宿主細胞から抗体を回収することを更に含んでなる請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
請求項１−２４の何れか一項に記載の抗体及び細胞傷害剤を含んでなるイムノコンジュゲート。
【請求項３１】
請求項１−２４の何れか一項に記載の抗体及び薬学的に許容可能な担体を含んでなる薬学的製剤。
【請求項３２】
追加の治療剤をさらに含んでなる請求項１６に記載の薬学的製剤。
【請求項３３】
医薬としての使用のための請求項１−２４の何れか一項に記載の抗体。
【請求項３４】
癌の治療における使用のための請求項１−２４の何れか一項に記載の抗体。
【請求項３５】
細胞増殖の阻害における使用のための請求項１−２４の何れか一項に記載の抗体。
【請求項３６】
医薬の製造における請求項１−２４の何れか一項に記載の抗体の使用。
【請求項３７】
医薬が癌の治療のためである請求項３６に記載の使用。
【請求項３８】
医薬が細胞増殖の阻害のためである請求項３６に記載の使用。
【請求項３９】
癌を有する個体を治療する方法において、個体に有効量の請求項１−２４の何れか一項に記載の抗体を投与することを含んでなる方法。
【請求項４０】
個体に追加の治療剤を投与することを更に含んでなる請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
個体における細胞増殖を阻害する方法において、細胞増殖を阻害するために個体に有効量の請求項１−２４の何れか一項に記載の抗体を投与することを含んでなる方法。