(57)【要約】【課題】本発明は、ラン藻カーボニックアンヒドラーゼのＣ末端ドメインの機能を解明し、当該ドメインを利用する方法を開発することを目的とする。【解決手段】さまざまなカーボニックアンヒドラーゼ改変遺伝子の導入実験により、ラン藻カーボニックアンヒドラーゼのＣ末端ドメインが機能発現に必須のものであることが明らかとなった。本発明は、当該ドメインを利用することによりラン藻に選択的に作用する成長阻害剤をスクリーニングする方法を提供する。また、ラン藻カーボニックアンヒドラーゼ欠損株、及びラン藻カーボニックアンヒドラーゼのＣ末端ドメインが切り詰められた変異株を利用することにより、光呼吸が少なく生産性の高い光合成能を有する株を開発する方法を提供する。【参照図】図２2004008123.tif 000044
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（Ａ）及び（Ｂ）からなる群から選択されるペプチドであって、ラン藻カーボニックアンヒドラーゼの活性発現に必須であるＣ末端ドメインを構成するペプチド。
（Ａ）：　次に示されるアミノ酸配列からなるペプチド。
Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−
Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−
Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ａｓｎ−
Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−
Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｓｅｒ
（Ｂ）：　アミノ酸配列（Ａ）において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチド。
【請求項２】
Ｃ末端から数えて１〜６６アミノ酸のいずれかの長さのペプチドが欠失したラン藻カーボニックアンヒドラーゼであり、カーボニックアンヒドラーゼ活性の強さが調節されたタンパク質。
【請求項３】
ラン藻以外の生物由来のカーボニックアンヒドラーゼと請求項１に記載のペプチドの融合タンパク質であり、ラン藻の細胞内でカーボニックアンヒドラーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項４】
ラン藻以外の生物由来のカーボニックアンヒドラーゼがシロイヌナズナ由来のカーボニックアンヒドラーゼである、請求項３に記載のタンパク質。
【請求項５】
請求項１に記載のペプチドをコードする遺伝子。
【請求項６】
以下の（ａ）及び（ｂ）から選択されるＤＮＡであって、ラン藻カーボニックアンヒドラーゼの活性発現に必須であるＣ末端ドメインをコードするＤＮＡからなる遺伝子。
（ａ）：　次に示される塩基配列からなるＤＮＡ。
ｔｇｔｃｃａｇｔｇｃｇｔｔｔｇｃｃｃｇｇｃａｇｃｃａｇｇａｇａａａｇｃｃａｔｔｃｔｃｇｇｔｃｇｔｔｇ　　　５０
ｔｇｔｃｇｔｃｃｃｃｃｔｇａｃｃｇａａｇａａｇｔｇｇｃｃｇｔｔｇｃｔｃｃａｃｃａｇａｇｃｃｇｇａｇｃ　　　１００
ｃｔｇｔｇａｔｃｇｃｇｇｃｔｇｔｇｇｃｇｇｃｔｃｃａｃｃｃｇｃｃａａｃｔａｃｔｃｃａｇｔｃｇｃｇｇｔ　　　１５０
ｔｇｇｔｔｇｇｃｃｃｃｔｇａａｃａａｃａａｃａｇｃｇｇａｔｔｔａｔｃｇｃｇｇｃａａｔｇｃｔａｇｃ　　　　１９８
（ｂ）：　塩基配列（ａ）からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
【請求項７】
請求項２〜４に記載のタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項８】
以下の（ｃ）及び（ｄ）からなる群から選択されるＤＮＡであって、Ｃ末端から数えて１〜６６アミノ酸のいずれかの長さのペプチドが欠失したラン藻カーボニックアンヒドラーゼをコードするＤＮＡからなる遺伝子。
（ｃ）：　配列番号４で示される塩基配列のうち７１１〜９０８番目の塩基からなるコード領域に終始コドンを挿入した塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｄ）：　（ｃ）に記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
【請求項９】
以下の（ｅ）、（ｆ）からなる群から選択されるＤＮＡであって、シロイヌナズナ由来のカーボニックアンヒドラーゼと請求項１に記載のペプチドの融合タンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子。
（ｅ）：　配列番号６で示される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｆ）：　配列番号６で示される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
【請求項１０】
請求項５〜９のいずれかに記載の遺伝子もしくは当該遺伝子の中のタンパク質をコードする遺伝子を含むベクター。
【請求項１１】
ベクターが相同組み換えを行うためのベクターである請求項１０に記載のベクター。
【請求項１２】
ベクターが発現プラスミドである請求項１０に記載のベクター
【請求項１３】
請求項１０〜１２のいずれかに記載のベクターで形質転換された形質転換体。
【請求項１４】
請求項６に記載の塩基配列の中の連続する１４塩基以上の部分配列もしくはその相補配列を含むヌクレオチド。
【請求項１５】
請求項１に記載のペプチドを用いて、ラン藻に特異的に作用する成長阻害剤をスクリーニングする方法。
【請求項１６】
カーボニックアンヒドラーゼ遺伝子を欠損したラン藻変異株作成法で、以下の各工程からなる変異株作成法。
（イ）：　染色体由来のＤＮＡ断片であってカーボニックアンヒドラーゼ遺伝子を含む断片をクローニングし、このＤＮＡ断片のカーボニックアンヒドラーゼをコードする領域を薬物耐性遺伝子に置き換えたＤＮＡ断片を作成する。
（ロ）：　（イ）で作成したＤＮＡ断片をラン藻に導入して相同組み換えを行う。
（ハ）：　（ロ）で得られたラン藻を、高濃度二酸化炭素条件下、選抜薬物存在下において選抜する。
【請求項１７】
請求項１６に記載の方法で得られたカーボニックアンヒドラーゼ欠損形質転換体。
【請求項１８】
細胞の有するカーボニックアンヒドラーゼ遺伝子を請求項８に記載の遺伝子へと置き換えることにより、細胞の有する炭酸濃縮機構を弱めて高濃度ＣＯ２条件下でなければ生育できない細胞へと形質転換する方法。
【請求項１９】
請求項１８に記載の方法により得られた形質転換体。
【請求項２０】
光呼吸が少なく生産性の高い光合成能を有する変異株をスクリーニングする方法であって、以下の各工程からなるスクリーニング方法。
（あ）：　請求項１７又は１９に記載の形質転換体に無作為に変異を導入する。
（い）：　（あ）で得られた変異株を低濃度ＣＯ２条件下で選抜する。
（う）：　（い）で選抜された株に野生株のカーボニックアンヒドラーゼ遺伝子を導入する。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ラン藻カーボニックアンヒドラーゼのＣ末端に存在する活性発現に必須なドメインに関する。
また本発明は、当該ドメインを、生産性の高い光合成能を有する変異株の開発やラン藻に選択的に作用する生育阻害剤の開発のために利用する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ラン藻は、植物と同じ光合成を行う原核生物である。光合成による二酸化炭素固定はルビスコ（リブロース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ）という巨大な酵素のカルボキシラーゼ活性により行われる。それまで、細胞中に存在していた（溶存）二酸化炭素がリブロース二リン酸とともに基質としてホスホグリセリン酸に「固定」される。
ラン藻のカルボキシラーゼ活性は、Ｃ３植物のそれに比べて非常に低く（Ｋｍ＞１５０μＭ）（Ｐｒｉｃｅ　ｅｔ　ａｌ．　１９９８）、溶存二酸化炭素濃度（１０μＭ〜２０μＭ）における炭酸固定活性は極めて低い。しかしながら、ラン藻には炭酸濃縮機構（ＣＯ２−Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｎｇ　Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ，ＣＣＭ）が機能するので、ルビスコ周辺の二酸化炭素濃度は５〜２０倍に上昇し（Ｋａｐｌａｎ　ｅｔ　ａｌ．　１９９４）、効率のよい炭酸固定を行うことができる。
ラン藻の二酸化炭素濃縮機構は少なくとも次の２段階に分けられる。（ｉ）エネルギー依存性トランスポーターによって細胞内に重炭酸イオン（ＨＣＯ３−）が蓄積する。（ｉｉ）カーボニックアンヒドラーゼ（ＣＡ）が重炭酸イオンを脱水して二酸化炭素を生成し、活性なルビスコの多くが存在するカルボキシソームに二酸化炭素を供給する。
陸上植物のカーボニックアンヒドラーゼに関して述べると、カーボニックアンヒドラーゼはＣ３植物では葉緑体に存在し、Ｃ４植物では葉肉細胞の細胞質に存在する。Ｃ４植物では、カーボニックアンヒドラーゼはＣＯ２をＨＣＯ３−へ水和する反応を触媒し、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの基質となるＨＣＯ３−を生成する。すなわちラン藻のカーボニックアンヒドラーゼはＣ４植物の細胞質に存在するカーボニックアンヒドラーゼとは、異なる役割を果たしている。
ラン藻は光合成研究の格好のモデル生物として研究されてきた生物である。また、温暖化防止を目的とするラン藻による二酸化炭素の固定、ラン藻によるデンプンの生産などを視野に入れて、ラン藻の光合成の研究が活発に行われている。
【０００３】
本発明者らは以前に、ラン藻のカーボニックアンヒドラーゼをコードする遺伝子を得た。
この遺伝子は、シネココッカスＰＣＣ７９４２株（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．　ＰＣＣ７９４２）の変異株で高濃度二酸化炭素を生育に必要とする変異株の原因遺伝子として単離された。この遺伝子は２７２アミノ酸残基のタンパク質をコードする遺伝子であると予想された。更に、この遺伝子を破壊した野生型株を作製したところ、この遺伝子破壊株は高濃度ＣＯ２要求性の表現型を呈した。そして、この遺伝子破壊株はルビスコの活性が野生株と比べて同じであり、細胞に蓄積される重炭酸イオンも野生株と同じであったが、効率的に炭素固定をすることができなかった。それゆえ、この遺伝子は無機炭素の固定に必須の遺伝子ｉｃｆＡ（ＧｅｎｅＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　Ｍ７７０９５）と名付けられた（Ｆｕｋｕｚａｗａ，Ｓｕｚｕｋｉ，Ｋｏｍｕｋａｉ，Ｍｉｙａｃｈｉ．，　１９９２，　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，　Ｖｏｌ．８９，　ｐｐ．４４３７−　４４４１）。この遺伝子のコードするタンパク質は植物の葉緑体のカーボニックアンヒドラーゼと有意な配列の相同性（エンドウの葉緑体とは２２％、ホウレンソウの葉緑体とは２２％）を示した。従って、この遺伝子は二酸化炭素濃縮機構においてルビスコに二酸化炭素を供給するカーボニックアンヒドラーゼをコードするものと予想された。
ラン藻のカーボニックアンヒドラーゼは、植物の葉緑体由来のものに比べＣ末端領域が６５アミノ酸残基長い。このＣ末端の領域の機能としては、カルボキシソームへ局在化するための配列である可能性が考えられてきた。なぜなら、ラン藻の細胞質（可溶性画分）における動物由来のカーボニックアンヒドラーゼの発現は、重炭酸イオンの濃縮を解消させ、炭酸固定能を消失させることが報告されているからである。
【０００４】
ラン藻はこのように有用性があり研究が活発に行われている一方で、人間にとって脅威となる存在ともなりつつある。
湖、池などの水が春から夏にかけて緑色に濁ることが多い。これが近年話題となっているアオコ（青粉）であるが、そのほとんどがラン藻である。
アオコは光合成によって酸素呼吸をし、魚介類の餌となるので繁殖が適切であれば問題はない。しかし、異常に増殖したりすると魚介類を一斉に殺す事がある。恐らく夜間の水中の酸素の消費量が増大し過ぎたり、魚のエラが繁殖したアオコでつまるためではないか、と考えられている。
ラン藻が他の生物に与える被害は、酸欠などによる魚介類への被害以外にも、それ自身が持つ毒素によるものもある。１００年ほど前から、ラン藻の仲間には有毒種があることが知られている。事実、野生動物や家畜がラン藻を含む水を飲んで死亡する事件が、アメリカ、オーストラリア、南アフリカ、中東などで数多く報告されている。また、ある種のラン藻毒は癌の増殖に関与する、ともいわれている。中国のある地域では肝臓癌が多発することが知られているが、この原因として飲料水に低濃度のラン藻の肝臓毒が含まれていると推測されている。
ラン藻毒は、神経毒と肝臓毒の２つのグループに分けられている。神経毒はアナトキシンａ、サキシトキシン等４つの化合物が知られている。肝臓毒は世界各地でその被害が報告され、現在までに５０種以上が確認されている。それらは何れも複数のアミノ酸が化合したポリペプチドである。このようなラン藻による被害については対策が求められているが、決定的な解決方法が見いだされていない。
このように、ラン藻は大きな利用可能性を持ったものであり、その光合成機能の研究の進展が望まれていた。また、ラン藻の被害に対処するためにもラン藻の生理機能の研究の進展が望まれていた。光合成に関わるラン藻カーボニックアンヒドラーゼのＣ末端に存在するドメインは、他の植物のカーボニックアンヒドラーゼにはないものであり、その機能の解明が上記の目的に貢献することが期待された。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ラン藻のカーボニックアンヒドラーゼのＣ末端に存在するドメインの機能を解明することを目的とする。また、生産性の高い光合成能を有する変異株の開発やラン藻に選択的に作用する成長阻害剤の開発など、当該ドメインを利用する方法を探索することを目的とする。その他の目的については、以下の記載により明らかである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、ラン藻カーボニックアンヒドラーゼのＣ末端に存在するドメインの生理機能を明らかにすることを目的として、ラン藻カーボニックアンヒドラーゼ変異株への改変遺伝子の導入実験を行った。本発明を完成させるに到った実験の概要を図１に示す。
すなわち、シネココッカス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．）ＰＣＣ７９４２株のカーボニックアンヒドラーゼ遺伝子（２７２アミノ酸残基）について、ＰＣＲ法を利用してコード領域内に終止コドンを導入し、Ｃ末端を切りつめたカーボニックアンヒドラーゼ遺伝子を作成した。図２にそのアミノ酸配列を示す。これをシャトルプラスミドに連結し、カーボニックアンヒドラーゼ遺伝子欠失株に形質転換した。カーボニックアンヒドラーゼ遺伝子欠失株は、高ＣＯ２濃度要求性なので、大気（低ＣＯ２）条件での生育能の回復を指標として、必要領域の特定を行った。その結果、２７２残基のカーボニックアンヒドラーゼを導入した株は、野生株と同等の生育を示したのに対し、２６４アミノ酸残基以降の配列を欠失した場合、生育は著しく低下し、２０６残基のカーボニックアンヒドラーゼ（植物カーボニックアンヒドラーゼと同一のＣ末端）を導入した株では、低ＣＯ２条件下での生育が全く認められなかった。
従って、ラン藻のカーボニックアンヒドラーゼに独特のＣ末端ドメインは、この酵素の活性発現に必須であることが示された。このＣ末端ドメインを用いることによりラン藻に選択的に作用する成長阻害剤のスクリーニングが可能となる。また、ラン藻のカーボニックアンヒドラーゼのＣ末端を切りつめることにより活性の調節されたカーボニックアンヒドラーゼが得られることが明らかとなった。
【０００７】
ラン藻における植物カーボニックアンヒドラーゼの機能発現の可否を調べるために、シロイヌナズナのカーボニックアンヒドラーゼにラン藻カーボニックアンヒドラーゼのＣ末端領域を付加した融合遺伝子を導入した結果、変異株の相補が起こった。ところが、ラン藻カーボニックアンヒドラーゼの配列を加えないシロイヌナズナの遺伝子を導入した場合にも、変異株の低ＣＯ２条件における生育能が回復した。
ラン藻カーボニックアンヒドラーゼのＣ末端領域の機能として、従来、ルビスコを主成分とするタンパク質の複合体、カルボキシソームへ局在化するための配列であると考えられてきた。なぜなら、ラン藻の細胞質（可溶性画分）における動物由来のカーボニックアンヒドラーゼの発現は、重炭酸イオンの濃縮を解消させ、炭酸固定能を消失させることが報告されているからである。この予想に反して本研究の結果、ラン藻固有の配列を持たない植物遺伝子の産物がラン藻細胞内で局在化、活性発現を起こすことが示された。
ラン藻カーボニックアンヒドラーゼのＣ末端領域より更に上流の配列は生物種間において相同性が低く、植物においてはこのＣ末端上流領域が酵素サブユニットの会合に関わることが報告されている。このことから、ラン藻のカーボニックアンヒドラーゼは植物の酵素とは異なる会合状態をとっており、この会合にＣ末端領域が重要な役割を持つものと思われる。すなわちこのＣ末端領域はラン藻のカーボニックアンヒドラーゼにのみ特異的でかつ活性発現に必須のものであるため、利用価値の高いものであることがわかった。
以上のことを見いだし、本発明を完成させるに至った。
【０００８】
すなわち本発明は、ラン藻のカーボニックアンヒドラーゼのＣ末端に存在する活性に必須のドメイン、それをコードする遺伝子、及びこれらを利用する方法に関するものである。
【０００９】
本発明のラン藻カーボニックアンヒドラーゼの活性発現に必須であるＣ末端のドメインを構成するペプチドは、以下の（Ａ）及び（Ｂ）からなる群から選択されるペプチドである。
（Ａ）：　次に示されるアミノ酸配列からなるペプチド。
Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−
Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−
Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ａｓｎ−
Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−
Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｓｅｒ
（Ｂ）：　アミノ酸配列（Ａ）において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチド。
尚、アミノ酸配列（Ａ）は、後期配列表の配列番号１に示す。
【００１０】
本発明のラン藻カーボニックアンヒドラーゼの活性発現に必須なＣ末端ドメインをコードするＤＮＡからなる遺伝子は、以下の（ａ）及び（ｂ）から選択されるＤＮＡからなる遺伝子である。
（ａ）：　次に示される塩基配列からなるＤＮＡ。
ｔｇｔｃｃａｇｔｇｃｇｔｔｔｇｃｃｃｇｇｃａｇｃｃａｇｇａｇａａａｇｃｃａｔｔｃｔｃｇｇｔｃｇｔｔｇ　　　５０
ｔｇｔｃｇｔｃｃｃｃｃｔｇａｃｃｇａａｇａａｇｔｇｇｃｃｇｔｔｇｃｔｃｃａｃｃａｇａｇｃｃｇｇａｇｃ　　　１００
ｃｔｇｔｇａｔｃｇｃｇｇｃｔｇｔｇｇｃｇｇｃｔｃｃａｃｃｃｇｃｃａａｃｔａｃｔｃｃａｇｔｃｇｃｇｇｔ　　　１５０
ｔｇｇｔｔｇｇｃｃｃｃｔｇａａｃａａｃａａｃａｇｃｇｇａｔｔｔａｔｃｇｃｇｇｃａａｔｇｃｔａｇｃ　　　　１９８
（ｂ）：　塩基配列（ａ）からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
尚、塩基配列（ａ）は、後記配列表の配列番号２に示す。
【００１１】
また本発明は、ラン藻カーボニックアンヒドラーゼのＣ末端ドメインが活性に必須のものであることを利用して作成された組み換えタンパク質を提供する。
すなわち、以下のタンパク質を提供する。
Ｃ末端から数えて１〜６６アミノ酸のいずれかの長さのペプチドが欠失したラン藻カーボニックアンヒドラーゼであり、カーボニックアンヒドラーゼ活性の強さが調節されたタンパク質。
ラン藻以外の生物由来のカーボニックアンヒドラーゼと、本発明のＣ末端ドメインの融合タンパク質であり、ラン藻の細胞内でカーボニックアンヒドラーゼ活性を有するタンパク質。
シロイヌナズナ由来のカーボニックアンヒドラーゼと、本発明のＣ末端ドメインの融合タンパク質であり、ラン藻の細胞内でカーボニックアンヒドラーゼ活性を有するタンパク質。
さらに本発明は、上記のタンパク質をコードする遺伝子を提供する。
本発明はまた、ラン藻カーボニックアンヒドラーゼのＣ末端ドメインをコードする遺伝子の塩基配列の中の、連続する１４塩基以上の部分配列もしくはその相補配列を含むヌクレオチドを提供する。
【００１２】
本発明は、ラン藻カーボニックアンヒドラーゼの活性発現に必須のＣ末端ドメインを用いて、ラン藻に選択的に作用する成長阻害剤をスクリーニングする方法を提供する。
【００１３】
本発明はまた、カーボニックアンヒドラーゼ遺伝子の欠損した変異株の作成方法及び当該方法により得られた形質転換体、ラン藻のカーボニックアンヒドラーゼのＣ末端ドメインを切りつめることにより低濃度ＣＯ２条件下では生育できない細胞へと形質転換する方法及び当該方法により得られた形質転換体、光呼吸が少なく生産性の高い光合成能を有する変異株をスクリーニングする方法を提供する。
【００１４】
【発明の実施の形態】
本発明のラン藻カーボニックアンヒドラーゼのＣ末端ドメインは、活性発現に必須のものであり、また他の生物のカーボニックアンヒドラーゼが有しない特異なドメインである。
従って、このＣ末端ドメインを切りつめることにより発現活性の調節されたカーボニックアンヒドラーゼを作製することを可能にするものである。Ｃ末端を切りつめる手法は簡便であり、また切りつめる長さに応じ発現活性を調節することも可能なものである。
さらに、ラン藻カーボニックアンヒドラーゼが特異的に有する当該Ｃ末端ドメインを用いることにより、ラン藻に選択的に作用する成長阻害剤を開発することを可能にする。
本発明のＣ末端ドメインを構成するペプチドのアミノ酸配列を後記配列表の配列番号１に示す。配列番号１には６６アミノ酸残基からなるアミノ酸配列が記載されている。本発明のＣ末端ドメインをコードするＤＮＡ配列を後記配列表の配列番号２に示す。
【００１５】
本発明のＣ末端ドメインを構成するペプチドとしては、配列番号１に示されたアミノ酸配列を有するもののほか、例えば配列番号１で示されたアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸の欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有するペプチドが挙げられる。アミノ酸の欠失、置換もしくは付加は、カーボニックアンヒドラーゼの活性発現に必要な機能が失われない程度であればよく、通常１〜約１３個、好ましくは１〜約７個である。このようなタンパク質は、配列番号１で示されたアミノ酸配列と通常、１〜８０％、好ましくは１〜９０％のアミノ酸配列のホモロジーを有する。
また本発明のＣ末端ドメインをコードするＤＮＡとしては、配列番号２で示された塩基配列を有するもののほか、配列番号２で示された塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るＤＮＡを含むものが挙げられる。このようにハイブリダイズし得るＤＮＡは、そのＤＮＡにコードされるペプチドがカーボニックアンヒドラーゼ活性発現に必要な機能を有するものであればよい。このようなＤＮＡは配列番号２で示された塩基配列と通常、７０％以上、好ましくは８０％以上の塩基配列のホモロジーを有する。このようなＤＮＡとしては、自然界で発見される変異型遺伝子、人為的に改変した変異型遺伝子、異種生物由来の相同遺伝子等が含まれる。
【００１６】
本発明において、ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションは、通常、ハイブリダイゼーションを、５×ＳＳＣ又はこれと同等の塩濃度のハイブリダイゼーション溶液中、３７〜４２℃の温度条件下、約１２時間行い、５×ＳＳＣ又はこれと同等の塩濃度の溶液などで必要に応じて予備洗浄を行った後、１×ＳＳＣ又はこれと同等の塩濃度の溶液中で洗浄を行うことにより実施できる。
【００１７】
本発明の、Ｃ末端から数えて１〜６６アミノ酸のいずれかの長さのペプチドが欠失したラン藻カーボニックアンヒドラーゼであり、カーボニックアンヒドラーゼ活性の強さが調節されたタンパク質は、以下の方法で作成することができる。すなわち、後記配列表の配列番号４に記載される塩基配列からなるＤＮＡにおいてコード領域の任意の部位に終止コドンが挿入されたＤＮＡを利用することにより、Ｃ末端欠失タンパク質の作製が可能となる。終止コドンをを挿入する方法としては、適当なカーボニックアンヒドラーゼ遺伝子を鋳型として用い、終止コドンを挿入したプライマーを用いてＰＣＲを行う方法などが挙げられる。
Ｃ末端を切り詰めた本発明のカーボニックアンヒドラーゼは、切り詰められた長さに応じ発現活性が損なわれたものであり、光合成機能の変異した株の作製等に利用できる。
Ｃ末端を切り詰める長さとしては、後記配列表の配列番号３で示されるアミノ酸配列及びこれに類似のアミノ酸配列からなるラン藻カーボニックアンヒドラーゼのＣ末端ドメインのうち、Ｃ末端から数えて１〜６６アミノ酸の長さのものいずれでもよい。ただし、発現活性が中程度に損なわれたカーボニックアンヒドラーゼを得るためには１〜１２アミノ酸の長さの欠失が好ましい。発現活性をほとんど失わせるためにはそれ以上の長さの欠失が好ましい。
【００１８】
ラン藻以外の生物由来のカーボニックアンヒドラーゼとラン藻カーボニックアンヒドラーゼＣ末端ドメインの融合タンパク質は、以下の方法で作成できる。
すなわち、ラン藻以外の生物由来のカーボニックアンヒドラーゼをコードするＤＮＡと、本発明のＣ末端ドメインをコードするＤＮＡとが連結されたＤＮＡを利用することにより可能となる。ラン藻以外の生物由来のカーボニックアンヒドラーゼとしては、植物の葉緑体由来のカーボニックアンヒドラーゼが好ましい。それ以外の生物由来のもであってもよいが、ラン藻の細胞内において発現活性を有することを確認することが必要である。
後記配列表の配列番号５に、シロイヌナズナ由来カーボニックアンヒドラーゼのＮ末端１５残基を欠失したタンパク質と、ラン藻カーボニックアンヒドラーゼＣ末端ドメインとの融合タンパク質のアミノ酸配列を示す。また、それをコードする塩基配列を配列番号６に示す。
【００１９】
本発明のＤＮＡとしては後記配列表に記載された塩基配列からなるＤＮＡなどが挙げられるが、その塩基配列に限定されることなく、アミノ酸配列に対応するＤＮＡを設計しポリペプチドをコードするＤＮＡとして用いることもできる。この場合、ひとつのアミノ酸をコードするコドンは各々１〜６種類知られており、用いるコドンの選択は任意で良いが、例えば発現に利用する宿主のコドン使用頻度を考慮して、より発現効率の高い配列を設計することができる。設計した塩基配列を持つＤＮＡは、ＤＮＡの化学合成、前記ｃＤＮＡの断片化と結合、塩基配列の一部改変等によって取得できる。人為的な塩基配列の一部改変、変異導入は、所望の改変をコードする合成オリゴヌクレオチドからなるプライマーを利用して部位特異的変異導入法（ｓｉｔｅ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）［Ｍａｒｋ，　Ｄ．Ｆ．　ｅｔ　ａｌ．、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１９８４、Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ、８１、ｐ５６６２−５６６６］等によって実施できる。
【００２０】
本発明のタンパク質は、それをコードするｃＤＮＡを用い、遺伝子組換え技術により生産することができる。例えば、Ｃ末端を切り詰められたラン藻カーボニックアンヒドラーゼをコードするＤＮＡ（ｃＤＮＡ等）を適当な発現ベクターに組み込み、得られた組換えＤＮＡを適当な宿主細胞に導入することができる。ポリペプチドを生産するための発現系（宿主−ベクター系）としては、例えば、細菌、酵母の発現系等が挙げられる。このうち、機能タンパクを得るためには、細菌を用いることが好ましい。
本発明は、前記した本発明の遺伝子もしくは当該遺伝子の中のタンパク質をコードする遺伝子を含むベクター、好ましくは相同組み換えのためのベクター又は発現ベクター、及び当該ベクターを用いて形質転換された宿主細胞（形質転換体）を提供する。
【００２１】
本発明はまた、配列番号２で示される塩基配列の中の連続する１４塩基以上、好ましくは２０塩基以上の部分配列もしくはその相補的な配列を含むヌクレオチドを提供するものである。
本発明のヌクレオチドは、ラン藻カーボニックアンヒドラーゼのＣ末端欠失タンパク質、及びラン藻以外の生物由来のカーボニックアンヒドラーゼとラン藻カーボニックアンヒドラーゼＣ末端ドメインとの融合タンパク質の作製、に使用するものである。
【００２２】
ラン藻カーボニックアンヒドラーゼのＣ末端ドメインを構成するペプチドを用いて、ラン藻に特異的に作用する成長阻害剤をスクリーニングする方法としては、例えば次の方法が挙げられる。
すなわち、当該ペプチドに結合する物質をスクリーニングすることにより、ラン藻に特異的に作用する成長阻害剤の候補となる化合物を得た後、その薬剤活性を検定する方法が挙げられる。例えば、本発明のペプチドをフィルター及びメンブレンなどの担体に結合させ、このタンパク質に親和性を有する物質をドラッグライブラリーの中から分離・検出する。この親和性を有する物質は成長阻害剤及び光合成阻害剤としての有用性が期待される物質であり、その作用を実際に確かめることによりラン藻に特異的に作用する成長阻害剤として使用することが可能となる。
また、ラン藻カーボニックアンヒドラーゼＣ末端ドメインの立体構造解析を行い、そこに作用する物質を新薬として設計する構造薬品設計（ＳＢＤＤ：ＳｔｒｕｃｔｕｒｅＢａｓｅｄＤｒｕｇＤｅｓｉｇｎ）による薬剤開発であってもよい。
この方法により得られたラン藻に選択的に作用する成長阻害剤は、例えば養殖池などで使用することができ、動物及び植物のカーボニックアンヒドラーゼに影響することなくラン藻（アオコ）の発生を防ぐことができる。また、観賞用の水槽などで用いることもできるが、この場合にも魚や水草に影響することなくラン藻（アオコ）の発生を防ぐことができる。
【００２３】
カーボニックアンヒドラーゼ遺伝子を欠損した変異株作成法は、以下の各工程からなるものである。
（イ）：　染色体由来のＤＮＡ断片であってカーボニックアンヒドラーゼ遺伝子を含む断片をクローニングし、このＤＮＡ断片のカーボニックアンヒドラーゼをコードする領域を薬物耐性遺伝子に置き換えたＤＮＡ断片を作成する。
（ロ）：　（イ）で作成したＤＮＡ断片をラン藻に導入して相同組み換えを行う。
（ハ）：　（ロ）で得られたラン藻を、高濃度二酸化炭素条件下、選抜薬物存在下において選抜する。
この変異株作製法において、（イ）の薬物耐性遺伝子としては例えば、カナマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子などが挙げられる。また（イ）、（ロ）の工程においては適当なベクターを用いることが好ましいが、この場合のベクターは取り扱いが簡便で、ラン藻における相同組み換えに使用できるものがよい。具体的には、ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔやｐＵＣ１９などで可能である。（ハ）の選抜薬物とは、導入した耐性遺伝子に対応した選抜薬物である。
実施例２において、この方法を具体的に例示する。
本発明はまた、この方法により得られた形質転換体を提供する。
【００２４】
細胞の有するカーボニックアンヒドラーゼ遺伝子を請求項８に記載の遺伝子へと置き換えることにより、細胞の有する炭酸濃縮機構を弱めて高濃度ＣＯ２条件下でなければ生育できない細胞へと形質転換する方法としては、例えば次の手法によって可能となる。
すなわち、前段落番号の段落に記載した方法によって得られたカーボニックアンヒドラーゼを欠損した変異株に、請求項８に記載の遺伝子をベクター等を用いて導入することにより可能となる。請求項８に記載の遺伝子とは、Ｃ末端から数えて１〜６６アミノ酸のいずれかの長さのペプチドが欠失したラン藻カーボニックアンヒドラーゼをコードする遺伝子である。この遺伝子はラン藻カーボニックアンヒドラーゼ遺伝子のＣ末端コード領域に終始コドンを挿入した遺伝子である。この終止コドンを挿入する方法としては、適当なカーボニックアンヒドラーゼ遺伝子を鋳型として用い、終止コドンを挿入したプライマーを用いてＰＣＲを行う方法などが挙げられる。
実施例４において、この方法を具体的に例示する。
本発明はまた、この方法により得られた形質転換体を提供する。
【００２５】
光呼吸が少なく生産性の高い光合成能を有する変異株をスクリーニングする方法は、以下の各工程からなるものである。
（あ）：　請求項１７又は１９に記載の形質転換体に無作為に変異を導入する。（い）：　（あ）で得られた変異株を低濃度ＣＯ２条件下で選抜する。
（う）：　（い）で選抜された株に野生株のカーボニックアンヒドラーゼ遺伝子を導入する。
（あ）の請求項１７又は１９に記載の形質転換体とは、カーボニックアンヒドラーゼ欠損株、又はＣ末端の切り詰められたラン藻カーボニックアンヒドラーゼを有する変異株を指す。
（あ）の無作為に変異を導入する方法としては、化学物質により遺伝子に無作為に変異を導入する方法、放射線により遺伝子に無作為に変異を導入する方法、トランスポゾンを用いた無作為変異導入法などが可能である。例えば、トランスポゾンプラスミドｐＡＭ１０３７を用いたシネココッカス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）の無作為変異導入法（Ｍｉｔｓｕｎｏｒｉ　Ｋａｔａｙａｍａ　ｅｔ　ａｌ．、１９９９、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ　１８１、Ｎｏ．１１、ｐ３５１６−３５２４）などが可能である。
（い）の低濃度ＣＯ２条件下とは、カーボニックアンヒドラーゼが欠損あるいは変異している株が生育できない条件であり、カーボニックアンヒドラーゼ欠損株では大気条件である。この条件で生育できる株が得られないときには、ＣＯ２濃度を高めた条件で選抜すればよいが、カーボニックアンヒドラーゼ欠損株が生育できるほど高濃度であってはならない。
この方法によって得られた、光呼吸が少なく生産性の高い光合成能を有する変異株は、例えば次のような利用が可能である。すなわち、光呼吸が少なく生産性の高い光合成能を有するラン藻の変異株を得ることによって、ラン藻を用いた効率よい工業的デンプン生産が可能となる。
【００２６】
【実施例】
次に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００２７】
実施例１．ラン藻カーボニックアンヒドラーゼ遺伝子のクローニング
本発明者らは以前に、ラン藻カーボニックアンヒドラーゼの遺伝子を単離し、その塩基配列を決定した。以下にその詳細を記載する。
温度感受性で高濃度ＣＯ２を要求する変異株Ｃ３Ｐ−Ｏの欠損機能を回復するゲノムＤＮＡ断片として、３６ｋｂのＥｃｏＲＩ切断断片、３．８ｋｂのＢａｍＨＩ切断断片、０．８７ｋｂのＰｓｔＩ切断断片、そして１５ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ切断断片を得た。すなわち、これらのそれぞれの断片を含むプラスミドによりＣ３Ｐ−Ｏの欠損機能の回復が起こった。これらの断片は、図３に示すようにＨｉｎｄＩＩＩ−ＰｓｔＩ領域において０．４３ｋｂの重複があった。この領域はＲｕＢＰカルボキシラーゼ／オキシゲナーゼのサブユニットのコード領域から２０ｋｂ下流に存在するものであった。
変異株の欠損機能を回復するゲノム領域の解析をするために、１６６２塩基対のＳａｃＩ−ＢｇｌＩＩ領域（図３）の塩基配列を決定した。この領域は０．４３ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＰｓｔＩ領域を含むものである。おそらく２７２個のアミノ酸からなるポリペプチド（分子量、３０，１８４）をコードするものであるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ２７２）は、０．４３ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＰｓｔＩ領域と重複領域をもつものであるＨｉｎｄＩＩＩ−ＢｇｌＩＩ領域に見つかった。ＯＲＦ２７２のコード領域はＨｉｎｄＩＩＩサイトの６１塩基対下流から始まり、ＢｇｌＩＩサイトの２８塩基対上流で終止していた。リボソーム結合配列（ＧＡＧ）と思われるものが、翻訳開始コドンの１０塩基対上流に見つかった。
【００２８】
更に、この遺伝子を破壊した野生型株を作製したところ、この遺伝子破壊株は高濃度ＣＯ２要求性の表現型を呈した。そして、この遺伝子破壊株はルビスコの活性が野生株と比べて同じであり、細胞に蓄積される重炭酸イオンも野生株と同じであったが、効率的に炭素固定をすることができなかった。それゆえ、この遺伝子は無機炭素の固定に必須の遺伝子ｉｃｆＡと名付けられた。
この遺伝子のコードするタンパク質は植物の葉緑体のカーボニックアンヒドラーゼと有意な配列の相同性（エンドウの葉緑体とは２２％、ホウレンソウの葉緑体とは２２％）を示した。従って、この遺伝子は二酸化炭素濃縮機構においてルビスコに二酸化炭素を供給するカーボニックアンヒドラーゼをコードするものと予想された。
【００２９】
実施例２．Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ変異株の作成
本発明を完成させるために、以下の実験を行った。
Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．　ＰＣＣ　７９４２株の染色体上にあるカーボニックアンヒドラーゼ遺伝子（後記配列表の配列番号４に記載）を、プラスミドｐＵＣ４Ｋ（アマルシャム・ファルマシア社）由来のカナマイシン耐性遺伝子に置き換えた変異株を作成した（後記配列表の配列番号８に記載）。
まず、ＣＡ遺伝子を含む３．５ｋｂのＢａｍＨＩ断片をプラスミドＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩにクローン化した。クローン化に先立ち、ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩは、ＨｉｎｄＩＩＩ，Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで順次処理することにより、ＨｉｎｄＩＩＩ部位を破壊しておいた。シネココッカス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）染色体由来の３．５ｋｂＢａｍＨＩ断片をこれにクローン化した後、組み換えプラスミドをＨｉｎｄＩＩＩ及びＢｇｌＩＩで処理し、ＣＡ遺伝子の全長を取り除いた。これをさらにＴ４ＤＮＡポリメラーゼで処理することにより、末端を平滑化した。このＤＮＡと、ｐＵＣ４Ｋ由来のカナマイシン耐性遣伝子を含む１．２ｋｂＨｉｎｃＩＩ断片を連結し、新たなプラスミドｐｉｃｆＡ：：ａｐｈを得た（図４）。
【００３０】
プラスミドｐｉｃｆＡ：：ａｐｈを用い、定法に従ってＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓの形質転換を行い、高二酸化炭素条件下での培養によりカナマイシン耐性株を選択した。
野生株とカナマイシン耐性形質転換株からそれぞれゲノムＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ法により、ＣＡ遣伝子の検出を行った。野生株ではＣＡ遣伝子に相当する０．８ｋｂのＤＮＡ断片が認められたのに対し、形質転換株では、これが消失し、代わりにカナマイシン耐性遣伝子に相当する１．２ｋｂの断片が検出された（図５Ａ）。従って、形質転換株では、相同的組換えによりＣＡ遺伝子の全長が失われたことが示唆された。以下、この形質転換株をＣＡ変異株と呼ぶ。
【００３１】
実施例３．カーボニックアンヒドラーゼ遺伝子の全長が失われた変異株（ＣＡ変異株）の生育の測定
野生株、およびＣＡ変異株の液体培地中での生育を測定した。３％ＣＯ２濃度条件では、両株の生育は同等であったのに対し、空気中（０．０４％のＣＯ２を含む）での生育は、ＣＡ変異株において著しく低下した（図５Ｂ）。
ＣＡは、光合成において細胞内に蓄積したＨＣＯ３−（重炭酸イオン）をＣＯ２に変換する反応を触媒し、反応産物のＣＯ２は、固定酵素リブロースビスリン酸カルボキシラーゼ（ＲｕＢｉｓＣＯ）の基質となる。ＣＡ遣伝子を欠失することにより、変異株では光合成におけるＣＯ２固定効率が低下し、その結果、生育に高濃度のＣＯ２を要求するようになったものと考えられた。
【００３２】
実施例４．Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ変異株に導入するための植物遺伝子の改変
Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓと植物のＣＡにはアミノ酸配列の相同性が認められるが、ＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓのＣＡは植物のものに比べＣ末端領域が６６アミノ酸残基長い。このＣ末端領域の生理機能を明らかにすることを目的として、以下のような改変遺伝子の作成を行った。
【００３３】
Ｓｙ２７２　　：２７２アミノ酸残基からなるＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓの野生型ＣＡ遺伝子。後記配列表の配列番号１０に記載。
Ｓｙ２６４　　：Ｃ末端の８残基を欠失した、２６４アミノ酸残基からなるＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓのＣＡ遺伝子。後記配列表の配列番号１２に記載。
Ｓｙ２０６　　：Ｃ末端の６６残基を欠失した、２０６アミノ酸残基からなるＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓのＣＡ遺伝子。植物のＣＡと同一箇所にＣ末端を持つ。後記配列表の配列番号１４に記載。
ＡｔＳｙ　　　：シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ）ＣＡの２０８アミノ酸残基、およびＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓＣＡのＣ末端領域６６アミノ酸残基を連結した融合型遺伝子。後記配列表の配列番号６に記載。
Ａｔ＿ｎａｔ　：２９８アミノ酸残基からなるＡ．ｔｈａｌｉａｎａＣＡ遺伝子。後記配列表の配列番号１６に記載。
【００３４】
これら改変遺伝子は、ＰＣＲおよび制限酵素処理により作成した。ＰＣＲの鋳型として、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓの遣伝子については野生株から定法により単離したゲノムＤＮＡを用いた。プロモーターおよびリボソーム結合配列は、野生株由来のものを用いた。Ｃ末端領域の欠失は、ＰＣＲプライマーに終止コドンを挿入することにより行った。
Ａ．ｔｈａｌｉａｎａの遺伝子については、オハイオ州立大学Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｒｅｓｏｕｒｃｅ　Ｃｅｎｔｅｒから分譲を受けたＥＳＴクローン１３４Ｇ１３Ｔ７を鋳型として用いた。ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓＣＡのＮ末端は、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓのものに比べ、１５残基長い。そこで、１６番目のアミノ酸残基であるバリンをメチオニンに置換し、これを翻訳開始コドンとした。リボソーム結合配列はＰＣＲプライマーに挿入し、これを用いて遺伝子の増幅を行った。プロモーターとしてｐＫＫ２２３−３（アマルシャム・ファルマシア社）由来のｔａｃプロモーターを含むＤＮＡ断片を、ＰＣＲで増幅した遺伝子の上流に連結した。
上記の改変型遺伝子はいずれもＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓにおいて複製するプラスミドｐＥＣＡＮ８（Ｌａｕ　ａｎｄ　Ｓｔｒａｕｓ　１９８５）にサブクローニングし、形質転換によりＣＡ変異株に導入した。
【００３５】
実施例５．植物遺伝子を導入した形質転換株の性質
ＣＡ遺伝子欠失株は、高ＣＯ２濃度要求性であるのに対し、上記Ｓｙ２７２遺伝子は欠失部分に相当するので、これを導入した形質転換株では、大気（低ＣＯ２）条件での生育能が回復することが予測された。従って、この低ＣＯ２条件での生育能を指標として、改変型遺伝子の機能発現を評価した（図６）。
その結果、２７２残基のＣＡ（Ｓｙ２７２）を導入した株は、野生株と同等の生育を示したのに対し、２６４アミノ酸残基以降の配列を欠失した遺伝子（Ｓｙ２６４）を導入した場合、生育は著しく低下し、２０６残基のＣＡ（Ｓｙ２０６）を導入した株では、低ＣＯ２条件下での生育が全く認められなかった。従って、ＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓのＣＡに独特のＣ末端領域は、この酵素の活性発現に必須であることが示された。
ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓのＣＡにＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓＣＡのＣ末端領域を付加した融合遺伝子（ＡｔＳｙ）を導入した結果、大気中での生育が認められた。ＳｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓＣＡの配列を加えないＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓの遺伝子（Ａｔ＿ｎａｔ）を導入した場合にも、変異株の低ＣＯ２条件における生育能が回復した。
【００３６】
【発明の効果】
本発明のラン藻カーボニックアンヒドラーゼのＣ末端に存在する活性に必須のドメインを利用することにより、ラン藻に選択的に作用する成長阻害剤をスクリーニングすることが可能となる。また、ラン藻カーボニックアンヒドラーゼのＣ末端ドメインが切り詰められた変異株を利用することにより、光呼吸が少なく生産性の高い光合成能を有する変異株をスクリーニングすることが可能となる。
【００３７】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明を完成させるに到った実験の概要を示す。
【図２】本発明のペプチド及びタンパク質の配列、並びにラン藻野生株のカーボニックアンヒドラーゼ（ＣＡ）を示す。Ｓｙ２７２，Ｓｙ２６４，Ｓｙ２０６は、ＡｔＳｙは実施例４に記載した改変遺伝子のコードするタンパク質を示す。シロイヌナズナＣＡはシロイヌナズナのカーボニックアンヒドラーゼ（ＣＡ）であってＮ末端部位を欠失したタンパク質のアミノ酸配列を示す。カナマイシン耐性は、実施例２に記載した変異株のカナマイシン耐性遺伝子のコードするタンパク質を示す。
【図３】高濃度ＣＯ２を要求するラン藻の変異株Ｃ３Ｐ−Ｏの欠損機能を回復するゲノムＤＮＡ断片である３．８ｋｂのＢａｍＨＩ切断断片。カーボニックアンヒドラーゼをコードするすると思われるｉｃｆＡ遺伝子を含む。
【図４】ラン藻カーボニックアンヒドラーゼ欠損株を得るための組み換えプラスミドの構築を示す。
【図５】（Ａ）野生株とカナマイシン耐性形質転換株からそれぞれゲノムＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ法によりＣＡ遣伝子の検出を行った実験を示す。
（Ｂ）野生株、およびＣＡ変異株の液体培地中での生育を測定した。３％ＣＯ２濃度条件、及び空気中（０．０４％のＣＯ２を含む）での生育を測定した。
【図６】低ＣＯ２条件での生育能を指標として、改変型遺伝子の機能発現を評価した実験を示す図。ＣＡ遺伝子欠失株は高ＣＯ２濃度要求性であるが、改変型遺伝子をコードするタンパク質の機能がラン藻野生株のカーボニックアンヒドラーゼと同じであれば、大気（低ＣＯ２）条件での生育能が回復するはずである。従って、この低ＣＯ２条件での生育能を指標として、改変型遺伝子の機能発現を評価した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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