【手続補正書】
【提出日】平成26年5月28日(2014.5.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物細胞のゲノムにおいて予め定められた部位に外来ＤＮＡ分子を導入するための方法であって、
ａ．前記の予め定められた部位において二本鎖ＤＮＡ切断を誘導する工程；
ｂ．前記の植物細胞に前記の外来ＤＮＡ分子を導入する工程；および
ｃ．前記の外来ＤＮＡが前記の予め定められた部位に導入されている植物細胞を選択する工程
を含み、前記の予め定められた部位は、ストレプトミセス・ハイグロスコピクス（Streptomyces hygroscopicus）によってコードされるホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ領域内（ｂａｒコード領域）に含まれ、そして前記の二本鎖ＤＮＡ切断は、前記の予め定められた部位を認識しそして前記の二本鎖切断を誘導する一本鎖メガヌクレアーゼの導入か、または前記の予め定められた部位を協調して認識しそして前記の二本鎖切断を誘導するメガヌクレアーゼの対の導入かによって誘導されることを特徴とする、前記方法。
【請求項２】
植物細胞のゲノムにおいて予め定められた部位に外来ＤＮＡ分子を導入するための方法
であって、
ａ．前記の予め定められた部位において二本鎖ＤＮＡ切断を誘導する工程；
ｂ．前記の植物細胞に前記の外来ＤＮＡ分子を導入する工程；および
ｃ．前記の外来ＤＮＡが前記の予め定められた部位に導入されている植物細胞を選択す
る工程
を含み、前記の予め定められた部位は、配列番号１または配列番号２のヌクレオチド配列
を含み、そして前記の二本鎖ＤＮＡ切断は、前記の予め定められた部位を認識しそして前
記の二本鎖切断を誘導する一本鎖メガヌクレアーゼの導入か、または前記の予め定められ
た部位を協調して認識しそして前記の二本鎖切断を誘導するメガヌクレアーゼの対の導入
かによって誘導されることを特徴とする、前記方法。
【請求項３】
前記のメガヌクレアーゼまたは前記のメガヌクレアーゼの対がＩ−ＣｒｅＩに由来し、そして以下のアミノ酸がメガヌクレアーゼユニット１に存在し：
ａ．３２位におけるＳ；
ｂ．３３位におけるＹ；
ｃ．３８位におけるＥ；
ｄ．４０位におけるＲ；
ｅ．６６位におけるＫ；
ｆ．８０位におけるＱ；
ｇ．４２位におけるＴ；
ｈ．７７位におけるＲ；
ｉ．６８位におけるＲ；
ｊ．７０位におけるＲ；
ｋ．４４位におけるＱ；
ｌ．２４位におけるＩ；
ｍ．２６位におけるＳ；
ｎ．２８位におけるＳ；
ｏ．３０位におけるＲ、
そして以下のアミノ酸が、メガヌクレアーゼユニット２に存在する：
ｐ．７０位におけるＲ；
ｑ．４４位におけるＴ；
ｒ．２４位におけるＩ；
ｓ．２６位におけるＳ；
ｔ．２８位におけるＳ；
ｕ．３０位におけるＮ；
ｖ．３２位におけるＳ；
ｗ．３３位におけるＲ；
ｘ．３８位におけるＱ；
ｙ．８０位におけるＱ；
ｚ．４０位におけるＲ；
ａａ．６６位におけるＫ；
ｂｂ．４２位におけるＴ；
ｃｃ．７７位におけるＲ；
ｄｄ．６８位におけるＲ、
請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
前記のメガヌクレアーゼの対は義務的にヘテロダイマーを形成するか、または前記メガヌクレアーゼは、リンカーによって共有結合的に接続されたＩ−ＣｒｅＩに由来する２つのドメインを含む一本鎖メガヌクレアーゼである、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
前記のメガヌクレアーゼの対がそれぞれ配列番号５および配列番号６のアミノ酸配列を含むか、前記のメガヌクレアーゼの対が配列番号４のヌクレオチド２００４位からヌクレオチド２５２５位までまたは２５２２位までのヌクレオチド配列、および配列番号４のヌクレオチド４８８５位からヌクレオチド５４０５位までまたは５４０３位までのヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされるか、または前記の一本鎖のメガヌクレアーゼが、配列番号１８の１位から１６７位までおよび２０６位から３６２位までのアミノ酸配列を含むか、または前記の一本鎖メガヌクレアーゼが、配列番号１７のヌクレオチド１２６７位から１６０５位までおよび１７９５位から１９５６位までおよび２０７１位から２５４１位までのヌクレオチド配列を含む核酸分子によってコードされるか、あるいは、前記の一本鎖メガヌクレアーゼが、配列番号１７の１２６７位から１６０５位までおよび１７９５位から２５４１位までのヌクレオチド配列を含む核酸分子によってコードされる、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
前記の外来ＤＮＡが、対象の植物で発現可能な遺伝子を含み、前記の対象の植物で発現可能な遺伝子が、除草剤耐性遺伝子、昆虫耐性遺伝子、疾病耐性遺伝子、非生物的ストレス耐性遺伝子、油生合成、炭水化物生合成に関与する酵素、線維の強度または線維の長さに関与する酵素、二次代謝物の生合成に関与する酵素の群から選択される、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
前記の植物細胞がさらに植物へと再生される、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項記載の方法によって得られた、前記の外来ＤＮＡが前記の予め定められた部位に導入されている植物細胞、植物、またはその繁殖材料。
【請求項９】
化学物質を前記植物に、または前記植物が成長している基質に適用する工程を含む、請求項８記載の植物を成長させる方法。
【請求項１０】
請求項８の植物細胞から実質的になる植物を、別の植物またはそれ自体と交雑させ、そして場合により種子を収穫する工程を含む、ｂａｒコード領域に組み込まれた外来ＤＮＡを含む植物を産生するための方法。
【請求項１１】
化合物を、請求項８記載の植物の種子に適用する工程を含む、処理された種子を産生する方法。
【請求項１２】
外来ＤＮＡをｂａｒコード領域に導入するための請求項１〜５のいずれか１項に記載の通りのメガヌクレアーゼまたはメガヌクレアーゼの対の使用。
【請求項１３】
対象の外来ＤＮＡを植物細胞のゲノムにおいて予め定められた部位に導入するためのカスタムメイドのメガヌクレアーゼの使用。
【請求項１４】
植物細胞のゲノムにおいて予め定められた部位に外来ＤＮＡ分子を導入するための方法であって、
ａ．前記の予め定められた部位に二本鎖ＤＮＡ切断を誘導する工程；
ｂ．前記の植物細胞に前記の外来ＤＮＡ分子を導入する工程；および
ｃ．前記の外来ＤＮＡが前記の予め定められた部位に導入されている植物細胞を選択する工程
を含み、前記の二本鎖ＤＮＡ切断は、協調して前記の予め定められた部位を認識し、そして前記の二本鎖切断を誘導する天然には存在しない一本鎖メガヌクレアーゼの導入か、または天然には存在しないメガヌクレアーゼの対の導入かによって誘導されることを特徴とする、前記方法。
【請求項１５】
トランスジェニック植物細胞のゲノムにおいて予め定められた部位に外来ＤＮＡ分子を導入するための方法であって、
ａ．前記の予め定められた部位に二本鎖ＤＮＡ切断を導入する工程；
ｂ．前記の植物細胞に前記の外来ＤＮＡ分子を導入する工程；および
ｃ．前記の外来ＤＮＡが前記の予め定められた部位に導入されている植物細胞を選択する工程
を含み、前記の予め定められた部位は、天然に存在するメガヌクレアーゼのための認識部位とは異なるヌクレオチド配列であり、前記の予め定められた部位は、トランスジェニック植物において導入遺伝子の一部として一般的に導入されるヌクレオチド配列であり、そして二本鎖ＤＮＡ切断は、前記の予め定められた部位を認識しそして前記の二本鎖切断を誘導する天然には存在しない一本鎖メガヌクレアーゼの導入か、または前記の予め定められた部位を協調して認識しそして前記の二本鎖切断を誘導する天然には存在しないメガヌクレアーゼの対の導入かによって誘導されることを特徴とする、前記方法。