(57)【要約】【課題】カスパーゼ−８阻害剤の提供。【解決手段】本発明は、ツバキ科チャノキ葉エキス、バラ科トルメンチラエキス、ツバキ科コウチャエキス、ツバキ科アッサムチャエキス、シナノキ科ボダイジュエキス、ブドウ科ブドウ葉エキス、ユーカリエキス、ムラサキ科コンフリーエキス、ユリアニア科クアチャララーテエキス、ダテ科地上部エキス、ツツジ科葉エキス、オトギリソウ科樹皮エキス、シナノキ科幹エキス、クスノキ科樹皮エキス、カンラン科樹皮エキス、ハイノキ科樹皮エキス、クワ科樹皮エキス及びノウゼンカズラ科樹皮エキス、から成る群から選ばれる１又は複数の生薬エキスをカスパーゼ−８活性阻害成分として含んで成る、カスパーゼ−８阻害組成物を提供する。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ツバキ科チャノキ葉（Ｔｈｅａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ  Ｌ．（Ｔｈｅａｃｅａｅ））エキス、バラ科トルメンチラ（Ｐｏｔｅｎｔｉｌｌａ  ｔｏｒｍｅｎｔｉｌｌａ  Ｎｅｃｋ．）エキス、ツバキ科コウチャ（Ｔｈｅａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ  Ｌ．）エキス、ツバキ科アッサムチャ（Ｔｈｅａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ  Ｌ．  ｖａｒ．  ａｓｓａｍｉｃａ  Ｐｉｅｒｒｅ）エキス、シナノキ科ボダイジュ（Ｔｉｌｉａ  ｃｏｒｄａｔａ  Ｍｉｌｌｅｒ（和名：フエボダイジュ）エキス、ブドウ科ブドウ葉（Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ  Ｌ．）エキス、ユーカリ（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｇｌｏｂｕｌｕｓ  Ｌａｂｉｌｌａｒｄｉｅｒｅ）エキス、ムラサキ科コンフリー（Ｓｙｍｐｈｙｔｕｍ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ  Ｌ．（和名：ヒレハリソウ））エキス、ユリアニア科クアチャララーテ（Ｊｕｌｉａｎｉａ  ａｄｓｔｒｉｎｇｅｎｓ）エキス、ダテ科（Ｒｕｍｅｘ  ｓａｌｉｃｉｆｏｌｉｕｓ  Ｗｅｉｎｍ）地上部エキス、ツツジ科（Ａｒｃｔｏｓｔａｐｈｙｌｏｓ  ｐａｔｕｌａ  Ｇｒｅｅｎｅ）葉エキス、オトギリソウ科（Ｃａｌｏｐｈｙｌｌｕｍ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ  Ｃａｍｂｅｓｓ）樹皮エキス、シナノキ科（Ｇｒｅｗｉａ  ｓａｌｕｔａｒｉｓ  Ｓｐａｎ）幹エキス、クスノキ科（Ｐｅｒｓｅａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ  Ｍｉｌｌ）樹皮エキス、カンラン科（Ｂｏｓｗｅｌｌｉａ  ｓｅｒｒａｔａ）樹皮エキス、ハイノキ科（Ｓｙｍｐｌｏｃｏｓ  ｒａｃｅｍｏｓａ）樹皮エキス、クワ科（Ｆｉｃｕｓ  ｒｅｌｉｇｉｏｓａ）樹皮エキス及びノウゼンカズラ科（Ｓｔｅｒｅｏｓｐｅｒｍｕｍ  ｓｕａｖｅｏｌｅｎｓ）樹皮エキス、から成る群から選ばれる１又は複数の生薬エキスをカスパーゼ−８活性阻害成分として含んで成る、カスパーゼ−８阻害組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、カスパーゼ−８の活性を阻害する組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
アポトーシスは発生過程における不要細胞の排除、恒常性維持のための細胞の除去、感染症や癌に対する生体防御の目的で引き起こされる細胞死であり、様々なシグナル伝達系を介して実行される。アポトーシスは様々な疾患における病態に関与していることも報告され、その人為的な制御は様々な疾患の治療に有効であるものと考えられている。このアポトーシス分子機構に深く関与しているのがシステインプロテアーゼであるカスパーゼ分子群であり、現在までにヒト、マウスに由来のものを含め、約１５種類の存在が知られている。
【０００３】
アポトーシスの分子機構は大きく分けてミトコンドリアを介する経路で活性化が行われる内因系活性化系と、ミトコンドリアを介さない経路で活性化が行われる外因系活性化系との二つの経路がある。
外因系活性化経路においては、アポトーシスを誘導するＴＮＦファミリーに属するデスリガンドとしてＴＮＦ−α、Ｆａｓリガンド、ＴＲＡＩＬ（ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド）等が知られており、それぞれ標的細胞の特異的なデスレセプターに結合してアポトーシスを誘導する。デスレセプターの細胞内領域にはデスドメインと称される特異的なアミノ酸配列領域がある。デスリガンドが作用するとこの領域にＦＡＤＤ、ＴＲＡＤＤといったアダプター分子がそのデスドメインを介して結合する。このアダプター分子はさらにＤＥＤ（デスエフェクタードメイン）と称される領域をもち、同様にＤＥＤを有するカスパーゼ−８に結合し、それを活性化する。活性化されたカスパーゼ−８は、アポトーシス実行に関わる実行カスパーゼ−３、６、７を活性化する。このように、カスパーゼ−８が外因系活性化経路における開始カスパーゼを担う。
【０００４】
カスパーゼ−８は他のカスパーゼ分子群と同様活性中心にシステイン残基をもつプロテアーゼであり、不活性型のプロカスパーゼの状態で存在し、切断されることで活性化される。カスパーゼ−８の全長配列についてはｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｐｅｒｓｏｎａｌ．ｕｍｉｃｈ．ｅｄｕ／￣ｉｎｏ／Ｌｉｓｔ／３１９１９．ｈｔｍにおいて公開されている。
【０００５】
開始カスパーゼを司ることで、カスパーゼ−８は様々な疾患、例えば脳梗塞等の脳神経疾患、アルツハイマー病、ハンチントン病等の変性疾患に関与することが示唆されている（実験医学  Ｖｏｌ．１８，  Ｎｏ．３（８月号）２０００）。カスパーゼ−８の他にＦａｓ誘導アポトーシスやヒト黒色腫細胞のＵＶＢ照射によるカスパーゼ−３媒介アポトーシス経路の活性化などが報告されている（Ｐａｒｋ  Ｋ．Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｈｏｔｏｄｅｒｍａｔｏｌ  Ｐｈｏｔｏｉｍｍｕｎｏｌ  Ｐｈｏｔｏｍｅｄ  ２００１  Ｏｃｔ．  １７（５）：２１８−２２２及びＣｏｌｌｉｎ  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  Ｖｏｌ．２７６，  Ｎｏ．４０．  ２００１，  ｐｐ．  ３７６０２−  ３７６１１）。このように、カスパーゼ−８は様々な疾患における病態やＵＶＢによる皮膚細胞死に関与していることから、その人為的な制御は神経疾患を含む様々な疾患の治療・予防に有効となり得るものと考えられている。
【非特許文献１】
実験医学  Ｖｏｌ．１８，  Ｎｏ．３（８月号）２０００
【非特許文献２】
Ｃｏｌｌｉｎ  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  Ｖｏｌ．２７６，  Ｎｏ          ．４０．  ２００１，  ｐｐ．  ３７６０２−  ３７６１１
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記カスパーゼ−８の活性を阻害し、その結果カスパーゼ−８の存在が関与する疾患の予防・治療に使用できる、またはＵＶＢによる皮膚細胞死を抑制できる医薬又は化粧製剤の提供を課題とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者は数ある生薬の中から、下記の生薬がカスパーゼ−８の酵素活性を効果的に阻害できることを見出し、本発明を完成するに至った：
ツバキ科チャノキ葉（Ｔｈｅａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ  Ｌ．（Ｔｈｅａｃｅａｅ））  エキス
バラ科トルメンチラ（Ｐｏｔｅｎｔｉｌｌａ  ｔｏｒｍｅｎｔｉｌｌａ  Ｎｅｃｋ．）エキス
ツバキ科コウチャ（Ｔｈｅａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ  Ｌ．）エキス
ツバキ科アッサムチャ（Ｔｈｅａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ  Ｌ．  ｖａｒ．  ａｓｓａｍｉｃａ  Ｐｉｅｒｒｅ）エキス
シナノキ科ボダイジュ（Ｔｉｌｉａ  ｃｏｒｄａｔａ  Ｍｉｌｌｅｒ（和名：フエボダイジュ）エキス
ブドウ科ブドウ葉（Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ  Ｌ．）エキス
ユーカリ（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｇｌｏｂｕｌｕｓ  Ｌａｂｉｌｌａｒｄｉｅｒｅ）エキス
ムラサキ科コンフリー（Ｓｙｍｐｈｙｔｕｍ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ  Ｌ．（和名：ヒレハリソウ））エキス
ユリアニア科クアチャララーテ（Ｊｕｌｉａｎｉａ  ａｄｓｔｒｉｎｇｅｎｓ）エキス
ダテ科（Ｒｕｍｅｘ  ｓａｌｉｃｉｆｏｌｉｕｓ  Ｗｅｉｎｍ）地上部エキス
ツツジ科（Ａｒｃｔｏｓｔａｐｈｙｌｏｓ  ｐａｔｕｌａ  Ｇｒｅｅｎｅ）葉エキス
オトギリソウ科（Ｃａｌｏｐｈｙｌｌｕｍ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ  Ｃａｍｂｅｓｓ）樹皮エキス
シナノキ科（Ｇｒｅｗｉａ  ｓａｌｕｔａｒｉｓ  Ｓｐａｎ）幹エキス
クスノキ科（Ｐｅｒｓｅａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ  Ｍｉｌｌ）樹皮エキス
カンラン科（Ｂｏｓｗｅｌｌｉａ  ｓｅｒｒａｔａ）樹皮エキス
ハイノキ科（Ｓｙｍｐｌｏｃｏｓ  ｒａｃｅｍｏｓａ）樹皮エキス
クワ科（Ｆｉｃｕｓ  ｒｅｌｉｇｉｏｓａ）樹皮エキス
ノウゼンカズラ科（Ｓｔｅｒｅｏｓｐｅｒｍｕｍ  ｓｕａｖｅｏｌｅｎｓ）樹皮エキス。
【０００８】
従って、本発明は上記生薬を１又は複数種、カスパーゼ−８活性阻害成分として含んで成る、カスパーゼ−８阻害組成物を提供する。
【０００９】
【発明の実施の形態】
カスパーゼ−８の属するカスパーゼ分子群はシステインプロテアーゼであり、Ａｓｐ−Ｘ結合（ここで「Ｘ」は任意のアミノ酸である）基質切断活性を有する。従って、カスパーゼ−８の活性、即ち、基質切断活性は、この酵素を例えば合成蛍光基質アセチル−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−メチルクマリンアミド（Ａｃ−ＩＥＴＤ−ＭＣＡ）に作用させ、Ａｓｐ−Ｘ結合の切断結果遊離する蛍光物質メミノメチルクマリンに由来する蛍光を測定することで決定することができる。従って、本発明でいうカスパーゼ−８活性とは、カスパーゼ−８がもつＡｓｐ−Ｘ結合特異的基質切断活性を意味し得る。
【００１０】
本発明者はカスパーゼ−８の基質切断特性を阻害する生薬をスクリーニングするため、上記基質を用いて種々の生薬のカスパーゼ−８活性阻害作用を調べた。詳しくは、Ａｃ−ＩＥＴＤ−ＭＣＡを含む緩衝液にリコンビナントカスパーゼ−８および種々のサンプル生薬を加えてインキュベートして酵素反応させ、遊離したアミノメチルクマリンの蛍光強度を、サンプル生薬を加えずに同様の条件下で酵素反応させたコントロールの値と比較することで、各生薬のカスパーゼ−８活性阻害作用を調べた。
【００１１】
リコンビナントカスパーゼ−８は例えばＫｏｅｐｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  １８，  ３７８−３８７，  ２０００の記載に従い作製でき、具体的には以下のようにして作製できる。
カスパーゼ−８はどのような細胞でも発現しているので、適当な培養細胞から例えばＩｓｏｇｅｎなどを用いてＲＮＡを取得し、ＲＴ−ＰＣＲによりその遺伝子のｃＤＮＡを得ることができる。通常、６個のヒスチジン残基の結合した（Ｈｉｓ−ｔａｇ）リコンビナントタンパク質として作製することができる。これには、ｐＱＥ３０（ＱＩＡＧＥＮ）というプラスミドベクタ−を用いる。ｃＤＮＡを適当な制限酵素サイトを付加したリンカープライマーを用いて増幅し、当確ベクターに組み込む。これを大腸菌（例えばＪＭ１０９やＢＬ２１）にトランスフォームし、ＬＢ倍地中で一晩培養する。ＩＰＴＧ添加により、目的のタンパク質を合成させ、しばらく培養した後、大腸菌を溶解し、上清をニケルカラムにアプライする。良く洗浄した後、２５０ｍＭ程度のイミダゾールを含む緩衝液をカラムに流すことにより、結合したＨｉｓ−ｔａｇのついたリコンビナントカスパーゼ−８を精製することができる。
【００１２】
カスパーゼ−８の活性を効果的に阻害することのできる本発明に係る植物生薬エキスを得るには、好ましくは抽出植物材料を乾燥し、必要に応じて小片化又は破砕してよい。抽出剤としては、水、有機液剤、水に混和性の有機溶剤と水との混合溶剤等が使用でき、水に混和性の有機溶剤と水との混合溶液が特に好ましい。有機溶剤としては、エタノール、メタノール等が挙げられる。エタノール水溶液が好ましく、特に７０％エタノール水溶液が好ましい。抽出濃度としては、室温〜抽出剤の沸点までの温度を使用することができ、２０℃〜３７℃が特に好ましい。抽出は３時間〜７日間行ってよい。
【００１３】
エキスは、減圧蒸発等常法に従って溶剤を除去して乾燥することもでき、また抽出溶剤として非毒性の溶剤、例えば、水、エタノール水溶液等を使用した場合には、抽出液をそのままで、又は適当に濃縮して用いることができる。
【００１４】
本発明に係るカスパーゼ−８の活性阻害組成物はカスパーゼ−８の活性を抑制する様々な目的に使用することができる。例えば、本発明にかかる阻害組成物はカスパーゼ−８の存在が関与する神経疾患、例えば脳梗塞等の脳神経疾患、アルツハイマー病、ハンチントン病等の変性疾患の治療又は予防のための医薬製剤、ＵＶＢ照射を原因とする皮膚細胞死による皮膚老化の治療又は予防のための医薬製剤又は化粧製剤等として利用できる。
【００１５】
上記医薬製剤又は化粧製剤は、通常、上記生薬エキスを水やエタノール等の水性溶媒に含有させて用いられる。本発明にかかる生薬エキスの配合量は特に限定されないが、例えば０．０１〜１０重量％、特に０．１〜５．０重量％程度の範囲が好ましい。上記水性溶媒としては、低級アルコールが好ましく、低級アルコールの含有量は、当該医薬製剤又は化粧製剤中に、２０〜８０重量％、さらに好ましくは４０〜６０重量％である。
【００１６】
また、上記医薬製剤又は化粧製剤には、上記必須成分以外に、通常化粧品や医薬品等の皮膚外用剤に用いられる成分、例えば、その他の美白剤、保湿剤、酸化防止剤、油性成分、紫外線吸収剤、界面活性剤、増粘剤、アルコール類、粉末成分、色剤、水性成分、水、各種皮膚栄養剤等を必要に応じて適宜配合することができる。
【００１７】
その他、薬剤の用途に合わせ、エデト酸二ナトリウム、エデト酸三ナトリウム、クエン酸ナトリウム、ポリリン酸ナトリウム、メタリン酸ナトリウム、グルコン酸等の金属封鎖剤、カフェイン、タンニン、ベラパミル、トラネキサム酸およびその誘導体、甘草抽出物、グラブリジン、カリンの果実の熱水抽出物、各種生薬、酢酸トコフェロール、グリチルリチン酸およびその誘導体またはその塩等の薬剤、ビタミンＣ、アスコルビン酸リン酸マグネシウム、アスコルビン酸グルコシド、アルブチン、コウジ酸等の他の美白剤、グルコース、フルクトース、マンノース、ショ糖、トレハロース等の糖類、レチノイン酸、レチノール、酢酸レチノール、パルミチン酸レチノール等のビタミンＡ類なども適宜配合することができる。
【００１８】
上記医薬製剤又は化粧製剤剤は、その用途に合わせ、例えば化粧料、医薬品、医薬部外品等の外用剤、例えば化粧水、クリーム、乳液、ローション、パック、浴用剤、軟膏、ヘアーローション、ヘアートニック、ヘアーリキッド、シャンプー、リンス、養毛・育毛剤等、従来皮膚外用剤に用いるものであればいずれでもよく、剤型は特に問わない。
【００１９】
以下に本発明の限定でない実施例を提供する。
【００２０】
【実施例】
カスパーゼ−８の活性阻害物質のスクリーニング法
カスパーゼ−８の活性測定は、合成の蛍光基質アセチル−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−メチルクマリンアミド（Ａｃ−ＩＥＴＤ−ＭＣＡ）を用いて行った。１０ｍＭのＡｃ−ＩＥＴＤ−ＭＣＡ  １０μｌ、１００ｍＭのジチオスレイトール１μｌ、１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）５μｌ、蒸留水７５μｌを含む緩衝液に４μｌのリコンビナントカスパーゼ−８およびサンプル生薬５μｌ（５０μｇ）を加えて、３７℃で３０分間インキュベートした。
【００２１】
反応は０．１Ｍクロロ酢酸２ｍｌを添加して停止させ、遊離したメミノメチルクマリンの４６０ｎｍの蛍光強度（励起波長３８０ｎｍ）をフルオロメーターで測定した。サンプルのカスパーゼ−８阻害活性は、溶媒コントロールに対する値として示す。
【００２２】
その結果、以下の生薬エキスがカスパーゼ−８の活性を有為に阻害した：
2004307456.tif 000002
【００２３】
【発明の効果】
上記生薬含有組成物はカスパーゼ−８の特異的基質切断活性を阻害できる。従って、上記生薬含有組成物は、カスパーゼ−８の存在が関与する神経疾患、例えば脳梗塞等の脳神経疾患、アルツハイマー病、ハンチントン病等の変性疾患の治療又は予防のための医薬製剤、ＵＶＢ照射を原因とする皮膚細胞死による皮膚老化の治療又は予防のための医薬製剤又は化粧製剤等として利用できる。