(57)【要約】【課題】好熱性ファージを利用して耐熱性タンパク質を効率良く産生すること。【解決手段】（１）好熱性ファージのＤＮＡに耐熱性タンパク質をコードする遺伝子を組み込む工程、（２）前記（１）の工程で得られた組換えＤＮＡを宿主細胞に導入する工程、（３）該宿主細胞内で耐熱性タンパク質をコートタンパク質上に有する好熱性ファージを増殖させる工程、を含む耐熱性タンパク質の製造方法。【選択図】  図３
2004236621.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）のアミノ酸配列からなる好熱性ファージのコートタンパク質；
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列、
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において、１又は複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列であって、好熱性ファージのコートタンパク質を構成するアミノ酸配列。
【請求項２】
以下の（ｃ）又は（ｄ）のアミノ酸配列からなる好熱性ファージのコートタンパク質；
（ｃ）配列番号４で表されるアミノ酸配列、
（ｄ）アミノ酸配列（ｃ）において、１又は複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列であって、好熱性ファージのコートタンパク質を構成するアミノ酸配列。
【請求項３】
以下の（イ）、（ロ）、（ハ）又は（ニ）からなるＤＮＡ；
（イ）配列番号１で表される遺伝子配列、
（ロ）上記（ｂ）で表されるアミノ酸配列をコードする遺伝子配列、
（ハ）（イ）の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つ、好熱性ファージのコートタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ニ）（ロ）の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つ、好熱性ファージのコートタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項４】
以下の（ホ）、（ヘ）、（ト）又は（チ）からなるＤＮＡ；
（ホ）配列番号３で表される遺伝子配列、
（ヘ）上記（ｄ）で表されるアミノ酸配列をコードする遺伝子配列、
（ト）（ホ）の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つ、好熱性ファージのコートタンパク質をコードするＤＮＡ、
（チ）（ヘ）の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つ、好熱性ファージのコートタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項５】
（１）好熱性ファージのＤＮＡに耐熱性タンパク質をコードする遺伝子を組み込む工程、（２）（１）の工程で得られた組換えＤＮＡを宿主細胞に導入する工程、（３）該宿主細胞内で耐熱性タンパク質をコートタンパク質上に発現させた好熱性ファージを増殖させる工程、を含む耐熱性タンパク質の製造方法。
【請求項６】
好熱性ファージのコートタンパク質上に発現させる耐熱性タンパク質をコードする遺伝子を含む好熱性ファージのＤＮＡ。
【請求項７】
請求項６に記載のＤＮＡを含む宿主細胞。
【請求項８】
請求項５に記載の方法で得られた耐熱性タンパク質。
【請求項９】
コートタンパク質上に耐熱性タンパク質を発現させた好熱性ファージ。
【請求項１０】
（１）好熱性ファージのＤＮＡにタンパク質をコードする遺伝子を組み込む工程、（２）（１）の工程で得られた組換えＤＮＡに変異を起こす工程、（３）（２）の工程で得られた変異ＤＮＡを宿主細胞に導入する工程、（４）該宿主細胞内でタンパク質をコートタンパク質上に発現させた好熱性ファージを増殖させる工程、を含むタンパク質の耐熱化方法。
【請求項１１】
好熱性ファージがφＩＮ９３である請求項５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、好熱性ファージ及びその使用方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ファージは、一般的に遺伝子情報を担うＤＮＡ（もしくはＲＮＡ）と、それを包むコートタンパク質から構成されている。大腸菌に感染する常温性ファージであるＭ１３やλについては遺伝子解析が進み、コートタンパク質の遺伝子配列が決定されている。
【０００３】
しかし、好熱性細菌由来のファージであるφＹＳ４０（例えば、非特許文献１参照。）は、好熱菌のＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ２７に感染することが知られているが、遺伝子解析はなされていない。
【０００４】
また、発明者が以前に分離した、好熱菌のＴｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ  ＴＺ２菌に感染する好熱性ファージφＩＮ９３（例えば、特許文献１参照。）は、二本鎖環状ＤＮＡ（約１９．６  Ｋｂｐ）を保有し、該菌体内でＤＮＡの複製が行われ、ファージとして増幅することがわかった。
【０００５】
そのφＩＮ９３の二本鎖環状ＤＮＡの複製に関する遺伝子配列は解析が進み（例えば、未公開特許文献１参照。）、プロモーター配列も解析されている（例えば、未公開特許文献２参照。）。しかし、ファージ粒子を構成するコートタンパク質に関する情報については、これまで解明されていない。
【０００６】
大腸菌に感染する常温性ファージのＭ１３では、コートタンパク質の遺伝子に外来遺伝子をつなげて、融合タンパク質としてファージ粒子表面に発現させた例が報告されている（例えば、非特許文献２参照）。しかし、好熱性ファージではこれまで無かった。
【０００７】
【非特許文献１】
Ｓａｋａｋｉ，Ｙ．  ａｎｄ  Ｏｓｈｉｍａ，Ｔ．著，「Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｔｏ  ａｎ  ｅｘｔｒｅｍｅ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅ，  Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８．」，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１５，ｐ．１４４９−１４５３，１９７５年
【０００８】
【非特許文献２】
Ｋａｔｓｕｍｉ  Ｍａｅｎａｋａ  ａｎｄ  Ｍａｓａｒｕ  Ｆｕｒｕｔａ著，「Ａ  Ｓｔａｂｌｅ  Ｐｈａｇｅ−Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｕｓｉｎｇ  ａ  Ｐｈａｇｅｍｉｄ  Ｖｅｃｔｏｒ：  Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  ｏｆ  Ｈｅｎ  Ｅｇｇ  Ｗｈｉｔｅ  Ｌｙｓｏｚｙｍｅ  （ＨＥＬ），  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ，  ａｎｄ  Ａｎｔｉ−ＨＥＬ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ，  ＨｙＨＥＬ  １０」，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，２１８，ｐ．６８２−６８７，１９９６年
【０００９】
【特許文献１】
特開平７−６７６３３号公報
【００１０】
【未公開特許文献１】
特願２００１−２１８９３４
【００１１】
【未公開特許文献２】
特願２００１−２０１０８５
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の主な目的は、好熱性ファージを利用して耐熱性タンパク質を効率良く産生することである。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、好熱性ファージのコートタンパク質上に耐熱性タンパク質を発現させる方法を見出し、本発明の完成に至った。
【００１４】
すなわち、本発明は、以下の項１〜１１に記載の発明に関する。
【００１５】
１．以下の（ａ）又は（ｂ）のアミノ酸配列からなる好熱性ファージのコートタンパク質；
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列、
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において、１又は複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列であって、好熱性ファージのコートタンパク質を構成するアミノ酸配列。
【００１６】
２．以下の（ｃ）又は（ｄ）のアミノ酸配列からなる好熱性ファージのコートタンパク質；
（ｃ）配列番号４で表されるアミノ酸配列、
（ｄ）アミノ酸配列（ｃ）において、１又は複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列であって、好熱性ファージのコートタンパク質を構成するアミノ酸配列。
【００１７】
３．以下の（イ）、（ロ）、（ハ）又は（ニ）からなるＤＮＡ；
（イ）配列番号１で表される遺伝子配列、
（ロ）上記（ｂ）で表されるアミノ酸配列をコードする遺伝子配列、
（ハ）（イ）の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つ、好熱性ファージのコートタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ニ）（ロ）の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つ、好熱性ファージのコートタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００１８】
４．以下の（ホ）、（ヘ）、（ト）又は（チ）からなるＤＮＡ；
（ホ）配列番号３で表される遺伝子配列、
（ヘ）上記（ｄ）で表されるアミノ酸配列をコードする遺伝子配列、
（ト）（ホ）の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つ、好熱性ファージのコートタンパク質をコードするＤＮＡ、
（チ）（ヘ）の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つ、好熱性ファージのコートタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００１９】
５．（１）好熱性ファージのＤＮＡに耐熱性タンパク質をコードする遺伝子を組み込む工程、（２）（１）の工程で得られた組換えＤＮＡを宿主細胞に導入する工程、
（３）該宿主細胞内で耐熱性タンパク質をコートタンパク質上に発現させた好熱性ファージを増殖させる工程、を含む耐熱性タンパク質の製造方法。
【００２０】
６．好熱性ファージのコートタンパク質上に発現させる耐熱性タンパク質をコードする遺伝子を含む好熱性ファージのＤＮＡ。
【００２１】
７．上記項６に記載のＤＮＡを含む宿主細胞。
【００２２】
８．上記項５に記載の方法で得られた耐熱性タンパク質。
【００２３】
９．コートタンパク質上に耐熱性タンパク質を発現させた好熱性ファージ。
【００２４】
１０．（１）好熱性ファージのＤＮＡにタンパク質をコードする遺伝子を組み込む工程、（２）（１）の工程で得られた組換えＤＮＡに変異を起こす工程、（３）（２）の工程で得られた変異ＤＮＡを宿主細胞に導入する工程、（４）該宿主細胞内でタンパク質をコートタンパク質上に発現させた好熱性ファージを増殖させる工程、を含むタンパク質の耐熱化方法。
【００２５】
１１．好熱性ファージがφＩＮ９３である上記項５に記載の方法。
【００２６】
【発明の実施の形態】
本発明において、好熱性ファージとは、好熱菌に感染することができるファージを意味し、その種類は限定されず、例えば、φＩＮ９３、φＹＳ４０等が挙げられる。また、好熱菌とは、例えば、約５５℃以上で生育できる菌を指し、その種類についても限定されない。好熱性ファージが感染できる好熱菌としては、例えば、Ｔｈｅｒｍｕｓ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ属等に属する細菌が挙げられる。
【００２７】
例えば、ファージとしてφＩＮ９３を用いる場合には、宿主細胞として好熱菌のＴｈｅｒｍｕｓ属細菌を用いるのが好ましい。当該ファージは、約１９．６  Ｋｂｐの二本鎖菌ＤＮＡを保有し、菌体内でＤＮＡの複製が行われ、ファージとして増幅する。
【００２８】
Ｔｈｅｒｍｕｓ属細菌としては、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ  ＴＺ２株（産業技術総合研究所特許生物寄託センターにＦＥＲＭ  Ｐ−１３７１３として１９９３年６月２９日に寄託、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ  Ｘ−１株（Ｒｏｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，（１９５０），  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｅｄ．Ｒｅｓ．，  ２，  １−７３）、  Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ  ＹＴ−１株（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  ９８，  ２８９−２９７，（１９６９）等）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｎｏｎｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ等を例示できる。
【００２９】
本発明者は、今回初めて、好熱性ファージφＩＮ９３におけるコートタンパク質のアミノ酸配列（配列番号２（コートタンパク質Ａ）及び配列番号４（コートタンパク質Ｂ））、及び当該タンパク質をそれぞれコードする遺伝子配列（配列番号１（コートタンパク質Ａ）及び配列番号３コートタンパク質（Ｂ））を見出した。
【００３０】
更に、発明者は、そのコートタンパク質をコードする遺伝子の下流部分に耐熱性タンパク質をコードする遺伝子（以下、「外来遺伝子」という。）を導入することにより、好熱性ファージのコートタンパク質上に耐熱性タンパク質を発現させることができることを初めて見出した。
【００３１】
本発明において、好熱性ファージのコートタンパク質（以下、「本発明のタンパク質」ということがある。）は、配列番号２又は４で表される。また、配列番号２又は４において１又は複数、好ましくは１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であっても、好熱性ファージのコートタンパク質を構成すれば、本発明のタンパク質に含まれる。
【００３２】
本発明はまた、好熱性ファージのコートタンパク質をコードするＤＮＡ（以下、「本発明のＤＮＡ」ということがある。）も含む。例えば、（Ｉ）配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ（好ましくは、それぞれ配列番号１又は３で表される配列）、（ＩＩ）配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列において、１又は複数、好ましくは１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列であって、好熱性ファージのコートタンパク質を構成するアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、（ＩＩＩ）上記（Ｉ）で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つ、好熱性ファージのコートタンパク質をコードするＤＮＡ、（ＩＶ）上記（ＩＩ）で表される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つ、好熱性ファージのコートタンパク質をコードするＤＮＡ等を挙げることができる。
【００３３】
ここで、上記のＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡとは、例えば、以下のものが例示できる；
（Ｉ）０．１％ＳＤＳを含む０．２×ＳＳＣ中５０℃または０．１％ＳＤＳを含む１×ＳＳＣ中６０℃の条件下で、配列番号１で示される塩基配列からなるＤＮＡとハイブリダイズする塩基配列を有するＤＮＡ分子
（ＩＩ）０．１％ＳＤＳを含む０．２×ＳＳＣ中５０℃または０．１％ＳＤＳを含む１×ＳＳＣ中６０℃の条件下で、配列番号３で示される塩基配列からなるＤＮＡとハイブリダイズする塩基配列を有するＤＮＡ分子
本発明のタンパク質は、本発明のＤＮＡを用いて公知の生物工学的手法により得ることができる。例えば、本発明のＤＮＡをＰＣＲ法等の公知の方法により増幅させ、当該遺伝子配列の多数のコピー（ＰＣＲ産物）を得ることができる。
【００３４】
このＰＣＲ法において使用されるプライマーは、上記ＤＮＡの配列に基いて適宜設定することができ、公知の方法によって合成することができる。また、増幅させたＰＣＲ産物は、公知の方法により単離、精製、確認することができる。
【００３５】
本発明のタンパク質は、公知の遺伝子組換え技術（例えば、Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２２４，  １４３１，  （１９８４）；  Ｂｉｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍ．，  １３０，  ６９２  （１９８５）；  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ＵＳＡ．，  ８０，  ５９９０  （１９８３）等参照）によって得ることができる。
【００３６】
例えば、本発明のタンパク質は、これをコードする遺伝子が宿主細胞中で発現できる組換えＤＮＡ（発現ベクター）を作成し、これを宿主細胞に導入して形質転換し、該形質転換体を培養し、次いで、得られる培養物から回収することができる。
【００３７】
上記の宿主細胞としては、原核生物及び真核生物のいずれも用いることができる。原核生物の宿主としては、例えば、大腸菌、枯草菌などの一般的に用いられるものが広く挙げられる。好ましくは大腸菌、特にＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ．  Ｃｏｌｉ−ＪＭ１０９等が挙げられる。
【００３８】
真核生物の宿主細胞には、脊椎動物、酵母などの細胞が含まれる。脊椎動物の細胞としては、例えばサルの細胞であるＣＯＳ細胞〔Ｃｅｌｌ，  ２３：  １７５  （１９８１）〕、チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞およびそのジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損株〔Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ＵＳＡ．，  ７７：  ４２１６  （１９８０）〕などを好適に使用できる。酵母の細胞としては、サッカロミセス属酵母細胞などを好適に利用できる。勿論、これらに限定される訳ではない。
【００３９】
原核生物細胞を宿主とする場合は、該宿主細胞中で複製可能なベクターを用いて、このベクター中に本発明遺伝子が発現できるように該遺伝子の上流にプロモーターおよびＳＤ（シャイン・アンド・ダルガーノ）核酸配列、更にタンパク合成開始に必要な開始コドン（例えばＡＴＧ）を付与した発現プラスミドを好適に利用できる。
【００４０】
上記ベクターとしては、一般に大腸菌由来のプラスミド、例えばｐＥＴ−２１ｄ、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３などがよく用いられるが、これらに限定されず既知の各種のベクターを利用することができる。大腸菌を利用した発現系に利用される上記ベクターの市販品としては、例えばｐＧＥＸ−４Ｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）、ｐＭＡＬ−Ｃ２，ｐＭＡｌ−Ｐ２（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）、ｐＥＴ２１，ｐＥＴ２１／ｌａｃｑ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ｐＢＡＤ／Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）などを例示できる。これらの中でも、特にｐＥＴ−２１ｄが好ましい。
【００４１】
プロモーターとしても特に限定なく、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属菌を宿主とする場合は、例えば、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ＰＬ／ＰＲプロモーターなどを好ましく利用できる。宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰ０１プロモーター、ＳＰ０２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなどが好ましい。酵母を宿主とする場合のプロモーターとしては、例えばｐＨ０５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどを好適に利用できる。また、動物細胞を宿主とする場合の好ましいプロモーターとしては、ＳＶ４０由来のプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、ＳＲαプロモーターなどを例示できる。
【００４２】
本発明遺伝子の発現ベクターとしては、通常の融合タンパク発現ベクターも好ましく利用できる。該ベクターの具体例としては、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合蛋白として発現させるためのｐＧＥＸ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）などを例示できる。
【００４３】
成熟ポリペプチドのコード配列が宿主細胞からのポリペプチドの発現、分泌を助ける核酸配列としては、分泌配列及びリーダ配列が例示できる。本発明タンパク質（キチナーゼ）の製造には、これらの配列を利用することもできる。また、本発明タンパク質の製造に当たっては、細菌宿主に対して融合成熟ポリペプチドの精製に使用されるマーカー配列（ヘキサヒスチジン・タグ、ヒスチジン・タグ）、哺乳動物細胞の場合はヘマグルチニン（ＨＡ）・タグなどを利用することもできる。
【００４４】
所望の組換えＤＮＡ（発現ベクター）の宿主細胞への導入法及びこれによる形質転換法としては、特に限定されず、一般的な各種方法を採用することができる。
【００４５】
形質転換体は、常法に従い培養でき、該培養により所望のように設計した遺伝子によりコードされる本発明の目的タンパク質（酵素）が、形質転換体の細胞内、細胞外又は細胞膜上に発現、生産（蓄積、分泌）される。
【００４６】
培養に用いられる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種の培地を適宜選択利用できる。培養も宿主細胞の生育に適した条件下で実施できる。
【００４７】
上記のようにして得られる本発明の組換えタンパク質は、所望により、その物理的性質、化学的性質などを利用した各種の分離操作〔「生化学データーブックＩＩ」、１１７５−１２５９  頁、第１版第１刷、１９８０年  ６月２３日株式会社東京化学同人発行；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ２５（２５），  ８２７４  （１９８６）；  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  １６３，  ３１３  （１９８７）など参照〕により分離、精製できる。
【００４８】
該方法としては、具体的には、通常の再構成処理、タンパク沈澱剤による処理（塩析法）、遠心分離、浸透圧ショック法、超音波破砕、限外濾過、分子篩クロマトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などの各種液体クロマトグラフィー、透析法、これらの組合せが例示できる。
【００４９】
本発明のタンパク質が耐熱性であることから、加熱することにより精製することもできる。例えば、加熱することにより常温性のタンパク質は変性して沈降するが、耐熱性タンパク質は変性しないために上清に存在することができる。この手法を利用して耐熱性タンパク質を容易に分離することができる。
【００５０】
また、本発明のタンパク質は、化学的な合成によっても得ることができる。化学的な合成法としては、公知のポリペプチド合成法、例えば、液相合成法あるいは固相合成法によって製造することができる。
【００５１】
このようにして、配列番号２又は４で表される本発明の好熱性ファージのコートタンパク質を得ることができる。本発明のタンパク質は、耐熱性ファージのコートタンパク質を構成すれば、これらのアミノ酸配列の１又は複数、好ましくは１又は数個のアミノ酸が、欠失、置換又は付加されたものであってもよい。
【００５２】
本発明のタンパク質は、精製した後に、Ｎ末端配列を解析することにより、コートタンパク質であることが確認できる。
【００５３】
本発明において、外来遺伝子は、ファージを用いた通常の遺伝子組換え技術により、ファージのＤＮＡ中に組み込むことができる（例えば、Ｓｃｏｔｔ，  Ｊ．  Ｍ．  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，  Ｇ．  Ｐ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２４９，  ３８６−３９０（１９９０）；Ｓｍｉｔｈ，  Ｇ．  Ｐ．  ａｎｄ  Ｓｃｏｔｔ，  Ｊ．  Ｋ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  ２１７，  ２２８−２５７（１９９３）等参照。）。
【００５４】
ファージのＤＮＡにおいて外来遺伝子を組み込む場所としては、コートタンパク質上に耐熱性タンパク質が発現されれば限定されないが、好ましくは、コートタンパク質をコードするＤＮＡの下流部分が挙げられる。好熱性ファージが複数のコートタンパク質を有する場合には、どのコートタンパク質をコードするＤＮＡの下流部分に組み込んでも良い。
【００５５】
より詳細には、例えば、好熱性ファージとしてφＩＮ９３を使用する場合、φＩＮ９３はコートタンパク質（Ａ）（配列番号２）とコートタンパク質（Ｂ）（配列番号４）を有しているが、そのどちらのタンパク質をコードするＤＮＡの下流部分に外来遺伝子を組み込んでも良い。
【００５６】
より好ましくは、コートタンパク質（Ａ）をコードするＤＮＡ（配列番号１）の下流付近に存在する「ＮｒｕＩサイト」に外来遺伝子を組み込むことができる。このようにして、この部分に外来遺伝子を組み込むことにより、コートタンパク質上に耐熱性タンパク質を発現させることができる。
【００５７】
好熱性ファージのＤＮＡに組み込む外来遺伝子としては特に制限はなく、任意の遺伝子を用いることができるが、好ましくは耐熱性タンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。耐熱性タンパク質をコードする遺伝子とは、４０℃以上、好ましくは５０℃以上、より好ましくは６０℃以上、特に７０℃以上の温度下でも活性を保持できるタンパク質（例えば、酵素、抗体等）をコードする遺伝子を意味する。
【００５８】
より詳細には、耐熱性カナマイシン耐性遺伝子、耐熱性β−グルコシダーゼ遺伝子、耐熱性グルタミナーゼ遺伝子、耐熱性プロテアーゼ遺伝子などの熱安定性酵素をコードする遺伝子、熱ショックタンパク質をコードする遺伝子、ｇｒｏＥＬ遺伝子、ｇｒｏＥＳ遺伝子、ｄｎａＫ遺伝子、ｈｓｐ７０遺伝子などが挙げられる。
【００５９】
得られた組換えＤＮＡは、公知の方法により、宿主細胞（好熱菌）に導入（トランスフェクション）することができる。例えば、好熱菌と本発明の組換えＤＮＡを共に培養することが挙げられる（例えば、特開２０００−２８７６８６等参照。）。
【００６０】
このようにして得られた宿主細胞を培養することにより、コートタンパク質上に耐熱性タンパク質を発現させた好熱性ファージを増殖させることができる。増殖したファージのうち、所望の耐熱性タンパク質を発現させた好熱性ファージを精製し、精製したファージを更に宿主細胞に感染させ、増殖させることができる。
【００６１】
精製する方法は特に限定されず、通常用いられているタンパク質を精製する方法を使用することができる。例えば、発現させた耐熱性タンパク質に特異的又は選択的に結合する抗体を用いて、免疫沈降法、アフィニティークロマトグラフィー等を行うことによって精製することができる。
【００６２】
このようにして、所望の耐熱性タンパク質を発現させた好熱性ファージを高純度にしかも大量に産生することができる。得られたファージから公知の方法により耐熱性タンパク質を分離、精製することにより、所望の耐熱性タンパク質を高純度に大量に（効率良く）得ることができる。
【００６３】
また、好熱性ファージ、該ファージが感染する宿主細胞及び耐熱性タンパク質に特異的又は選択的に結合できる抗体を、バイオパニングキットとして使用することもできる。
【００６４】
本発明はまた、タンパク質の耐熱化方法を提供することもできる。より詳細には、好熱性ファージのコートタンパク質をコードするＤＮＡの下流部分に、常温で機能するタンパク質をコードする遺伝子を組み込むことができる。次に、突然変異誘発物質（例えば、ＵＶ、ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）、アクリジンオレンジ、エチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）等）により、得られた組換えＤＮＡに変異を起こすことができる。そして、当該変異ＤＮＡを宿主細胞に導入することにより、耐熱性タンパク質をコートタンパク質上に発現させた好熱性ファージが得られる。
【００６５】
このようにして、常温で効果を発揮するタンパク質を耐熱化することもできる。更に、その耐熱化したタンパク質を含むファージのＤＮＡを解析することにより、耐熱化したタンパク質のＤＮＡ配列も解析することができる。
【００６６】
【実施例】
以下に実施例を示し、本発明の特徴とするところをより一層明瞭にする。
【００６７】
実施例１：好熱性ファージφＩＮ９３のコートタンパク質の遺伝子配列の決定
Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ  ＴＺ２菌をＡ２培地（０．１％  ｔｒｙｐｔｏｎｅ  （Ｄｉｆｃｏ），  ０．１％  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ  （Ｄｉｆｃｏ）  ａｎｄ  Ｃａｓｔｅｎｈｏｌｔｚ  ｂａｓａｌ  ｓａｌｔｓ  ｐＨ  ７．５）を用いて、７０℃で一晩培養し、その培養液１ｍｌを１００ｍｌのＡ２培地に植菌し直し、同様に７０℃で培養した。
【００６８】
濁度としてＯＤ＝０．２（波長６６０ｎｍで測定）に増殖した段階で、好熱性ファージφＩＮ９３（１×１０９ｐｆｕ／ｍｌの濃度）を  １００μｌを添加し、７０℃で３〜４時間培養した。その結果、培養液中に、２×１０１０ｐｆｕ／ｍｌの濃度の好熱性ファージφＩＮ９３が確認された。
【００６９】
培養液を３０００ｒｐｍで１０分間遠心して、沈殿した菌体破片を除いた上清に、ＰＥＧ８０００溶液（ポリエチレングリコール（分子量８０００）２０％、２ＭのＮａＣｌ）を１００ｍｌ添加して混合し、４℃で１時間放置後、１００００ｒｐｍで３０分間遠心し、得られたファージを１ｍｌの蒸留水に溶解し濃縮した。
【００７０】
次に、ファージの濃縮液をセシウムクロライドを用いた密度勾配遠心（５５０００ｒｐｍで１５時間遠心）により、菌体破片物等の不純物を除いたファージのみに精製した。セシウムクロライドは蒸留水で透析して除き、精製されたファージは最終１ｍｌの溶液として回収した。
【００７１】
精製したファージ溶液５０μｌを９５℃で３０分間煮沸した。この試料を１５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルに添加して、電気泳動によりタンパク質の分離を行った。電気泳動後に分離されたタンパク質をクマシーブリリアントブルーにより染色した結果、コートタンパク質として２種類のタンパク質が確認できた（図２）。
【００７２】
分離した２種類のタンパク質をトランスブロット法によりニトロセルロース膜に転写し、アミノ酸シークエンサーを用いて、Ｎ末端側から１０残基目までのアミノ酸の分析を行った。
【００７３】
その結果、２種類のコートタンパク質（Ａ、Ｂ）に関して、それぞれのＮ末端アミノ酸配列である（Ａ’）ＭＡＤＴＡＡＩＡＡＱＤと（Ｂ’）ＭＳＥＮＴＬＬＧＩＡＡの配列が得られた。
【００７４】
決定したＮ末端アミノ酸配列をＤＮＡ配列に変換して、φＩＮ９３のＤＮＡの全塩基配列を基に、ＧＥＮＥＴＹＸ（日立ソフトウエアー社）を用いて検索した。その結果、２種類のコートタンパク質（それぞれ配列番号２及び４）に対応する遺伝子の位置を決定した。
【００７５】
得られた本発明のコートタンパク質のアミノ酸配列及びそれをコードするＤＮＡ配列を配列番号１〜４に示す。
【００７６】
実施例２：耐熱性タンパク質のコートタンパク質上での発現
コートタンパク質の遺伝子（配列番号２）の下流にある制限酵素のＮｒｕＩサイトを切断した。プラスミドｐＧＦＰ由来のＧＦＰタンパク質遺伝子を制限酵素ＡｇｅＩと制限酵素ＥｃｏＲＩで切断し、図１に示すリンカー（Ｌ１、Ｌ２）を用いて、１６℃でリガーゼ反応を行った。
【００７７】
反応後のＤＮＡをＴｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ  ＴＺ２菌へトランスフェクションを行った（特開２０００−２８７６８６）。Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ  ＴＺ２菌を  Ａ２培地を用いて、７０℃で一晩培養し、その培養液５０μｌを５ｍｌのＡ２培地に植菌し直し、同様に７０℃で培養した。濁度としてＯＤ＝０．２（波長６６０ｎｍで測定）に増殖した段階で、上記の反応後のＤＮＡ（全量約１００ｎｇ）を１０μｌ添加し、１２時間  ７０℃で培養を行った。
【００７８】
上記培養液を３０００ｒｐｍで１０分間遠心後、その上清を、別途Ａ２培地にて５時間培養したＴｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ  ＴＺ２菌と、５０℃〜６０℃に保温した約１．０％寒天を含むＡ２培地に混ぜて、３％寒天のＡ２培地プレート上に塗布し、７０℃で１晩培養することでプラークを形成させた。
【００７９】
φＩＮ９３のコートタンパク質遺伝子の下流にＧＦＰ遺伝子が導入されたファージは、コートタンパク質上でＧＦＰタンパク質が発現し、緑色に発光した。
【００８０】
【発明の効果】
本発現系により７０℃以上の高温下でも機能する耐熱性タンパク質を大量に生産することが可能である。ファージのコートタンパク質上で発現することから、ファージを回収する方法と同様の方法で、発現させたタンパク質を回収することができるため、回収率が高く容易に行うことができる。
【００８１】
また、常温において機能を発揮する酵素のうち耐熱化したものを効率良くスクリーニングすることもできる。
【００８２】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】実施例で用いたリンカーを示す図である。
【図２】本発明のタンパク質を電気泳動で確認した結果を示す。
【図３】ファージに外来遺伝子を組み込み、コートタンパク質上に耐熱性タンパク質を発現する際の模式図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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