(57)【要約】　　　（修正有）【課題】中枢神経系に発現し、カルシトニン受容体に作用する新規かつ有用な蛋白質、その遺伝子、及びそれを含有してなる医薬組成物を提供する。【解決手段】次の（１）〜（６）の性質、（１）中枢神経系において発現し、（２）カルシトニン受容体に強く作用し、（３）細胞のｃＡＭＰ産生能を促進させ、（４）ナトリウムイオンを濃度依存的に取り込む作用を有し、（５）カルシウムイオンの取り込みを抑制し、（６）細胞増殖を抑制する作用を有するペプチドに関する。より具体的には、ブタ脳由来の特定なアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列の一部が欠失、置換若しくは付加を受けたアミノ酸配列を有する前記のペプチドに関する。また、本発明は、これらのペプチドをコードする遺伝子、及びそれを含有してなる医薬組成物に関する。【選択図】　　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の（１）〜（６）の性質、
（１）中枢神経系において発現し、（２）カルシトニン受容体に強く作用し、（３）細胞のｃＡＭＰ産生能を促進させ、（４）ナトリウムイオンを濃度依存的に取り込む作用を有し、（５）カルシウムイオンの取り込みを抑制し、（６）細胞増殖を抑制する作用を有するペプチド。
【請求項２】
少なくとも次ぎのアミノ酸配列、
Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−　　　　１０
Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−　　　　２０
Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−　　　　３０
Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−ＮＨ２　　　　　　　３８
又はこれらのアミノ酸配列の一部が欠失、置換若しくは付加を受けたアミノ酸配列を有する請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
ペプチドが少なくとも配列表の配列番号１、配列番号２、配列番号６、配列番号９、配列番号１２、配列番号１６、若しくは配列番号１９で示されるアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列の一部が欠失、置換若しくは付加を受けたアミノ酸配列を有する請求項１又は２に記載のペプチド。
【請求項４】
哺乳動物由来のペプチドである請求項１〜３のいずれかに記載のペプチド。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載のペプチドをコードする遺伝子。
【請求項６】
遺伝子が、配列表の配列番号３、配列番号７、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１７、又は配列番号２０で示される塩基配列を有するものである請求項５に記載の遺伝子。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれかに記載のペプチド、及び製薬上許容される担体とからなる医薬組成物。
【請求項８】
医薬組成物が、骨粗鬆症の予防・治療剤、癌の予防・治療剤、利尿剤、食欲抑制剤、又は鎮痛剤である請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
医薬組成物が、降圧剤、又はＰＴＣＡ（経皮的冠動脈形成術）後の再狭窄を防ぐための薬剤である請求項７に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規かつ有用なペプチド、それをコードする遺伝子、及びそれを含有してなる医薬組成物に関する。より詳細には、本発明は、次の（１）〜（１０）の性質、（１）中枢神経系において発現し、（２）カルシトニン受容体に強く作用し、（３）細胞のｃＡＭＰ産生能を促進させ、（４）ナトリウムイオンを濃度依存的に取り込む作用を有し、（５）カルシウムイオンの取り込みを抑制し、（６）細胞増殖を抑制する作用を有するペプチド、それをコードする遺伝子、及びそれを含有してなる医薬組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
既知ペプチドであるカルシトニンは、３２個のアミノ酸からなるポリペプチドホルモンである。哺乳動物では甲状腺のＣ細胞から分泌され、血液カルシウムを低下させる作用を有する。高カルシウム血症や代謝性骨疾患などの治療薬として利用されている。カルシトニンは、甲状腺など末梢系に存在するとされていて中枢神経系には発現していないとされていた。しかし、カルシトニン受容体は中枢神経系にも存在し、中枢神経系におけるカルシトニン受容体の存在意義や作用についての解明が求められていた。
また、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）はアミノ酸３７個からなる蛋白質であり、カルシトニンと同じ遺伝子から転写されたｍＲＮＡが、カルシトニンとは異なるスプライシングを受けて生成されるものである。カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）は、カルシトニンと同様な血液カルシウム濃度を低下させる作用も有するが、カリウムイオンチャンネルの活性化作用やアセチルコリン受容体の数を増加させる作用などもあり、神経伝達物質である可能性もあるとされている。
しかし、これらの蛋白質は中枢神経系のカルシトニン受容体に直接作用するものであると確認されておらず、中枢神経系のカルシトニン受容体に直接作用するペプチドの決定が求められていた。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、中枢神経系に発現し、カルシトニン受容体に作用する新規かつ有用なペプチド、その遺伝子、及びそれを含有してなる医薬組成物を提供することを目的としている。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、中枢神経系からｃＡＭＰ産生を指標にして新規な生理活性ペプチドを探索してきた結果、カルシトニン受容体を介して細胞に作用すると考えられる新規なペプチドを単離、精製した。この構造は、データベース（Ｇｅｎｂａｎｋ，ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ，ＤＤＢＪ）の検索結果から新規配列であることが確認された。本発明者らはこの新規なペプチドがカルシトニン受容体に作用することからカルシトニン受容体刺激ペプチド（Ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ　Ｐｅｐｔｉｄｅ（ＣＲＳＰ））と命名した。
【０００５】
即ち、本発明は、次の（１）〜（６）の性質、
（１）中枢神経系において発現し、（２）カルシトニン受容体に強く作用し、（３）細胞のｃＡＭＰ産生能を促進させ、（４）ナトリウムイオンを濃度依存的に取り込む作用を有し、（５）カルシウムイオンの取り込みを抑制し、（６）細胞増殖を抑制する作用を有するペプチドに関する。より詳細には、本発明は少なくとも次ぎのアミノ酸配列、
Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−　　　　１０
Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−　　　　２０
Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−　　　　３０
Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−ＮＨ２　　　　　　　３８
又はこれらのアミノ酸配列の一部が欠失、置換若しくは付加を受けたアミノ酸配列を有する前記のペプチドに関する。より具体的には、配列表の配列番号１、配列番号２、配列番号６、配列番号９、配列番号１２、配列番号１６、若しくは配列番号１９で示されるアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列の一部が欠失、置換若しくは付加を受けたアミノ酸配列を有する前記のペプチドに関する。
【０００６】
また、本発明のペプチドはカルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）と相同性を有するペプチドを含むものであるから、ＣＲＳＰの有する効果に加えてＣＧＲＰに類似した生理活性も期待できる場合がある。即ち、本発明のペプチドは、前記の（１）〜（６）の性質に加えて、（７）カルシトニン関連ペプチド受容体に強く作用し、（８）血管の弛緩作用を有し、（９）利尿を促進させ、（１０）血管内皮細胞や血管平滑筋、線維芽細胞の増殖能を変化させる作用などのＣＧＲＰが有する作用と類似した作用を有することも期待される場合もある。
【０００７】
また、本発明は前記した本発明のペプチドをコードする塩基配列を有する遺伝子に関する。より詳細には、本発明は、遺伝子が、配列表の配列番号３、配列番号７，配列番号１０，配列番号１３，配列番号１７，若しくは配列番号２０で示される塩基配列を有する前記した遺伝子に関する。
さらに、本発明は、前記した本発明のペプチド少なくとも１種、及び製薬上許容される担体からなる医薬組成物に関する。より詳細には、本発明は、医薬組成物が、骨粗鬆症の予防・治療剤、癌の予防・治療剤、利尿剤、食欲抑制剤、鎮痛剤、降圧剤、又はＰＴＣＡ（経皮的冠動脈形成術）後の再狭窄を防ぐための薬剤である前記した医薬組成物に関する。
【０００８】
本発明者らは、ブタ脳抽出液から腎臓上皮細胞のｃＡＭＰ産生を指標にして２種の新規な生理活性ペプチドを精製した。得られたペプチドのアミノ酸配列を解析したところ、
Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−　　　　１０
Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−　　　　２０
Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−　　　　３０
Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−ＮＨ２　　　　　　　３８
という３８個のアミノ酸からなるペプチド（以下、このペプチドをＣＲＳＰという。）と、そのＣ末端にさらにグリシンが結合した、
【０００９】
Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−　　　　１０
Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−　　　　２０
Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−　　　　３０
Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＯＨ　　　　　３９
という３９個のアミノ酸からなるペプチド（以下、このペプチドをＣＲＳＰ−Ｇｌｙという。）であることがわかった。
そして、これらのペプチドのアミノ酸配列をデータベース（Ｇｅｎｂａｎｋ，ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ，ＤＤＢＪ）で検索したところ、いずれも新規なアミノ酸配列を有するものであることが確認された。
これらのアミノ酸配列を配列表の配列番号１及び２にそれぞれ示す。
【００１０】
得られたペプチドのアミノ酸配列に基づいて合成プライマーを作成し、ブタ遺伝子を鋳型にＰＣＲ法で増幅することにより、目的の遺伝子をクローニングした。
用いたプライマーは、アミノ酸配列を基にＮ末端側として、
ＴＧ（Ｃ／Ｔ）ＡＡ（Ｃ／Ｔ）ＡＣ（Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｔ）ＧＣ（Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｔ）ＡＣ（Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｔ）ＴＧ（Ｃ／Ｔ）ＡＴＧＡＣ、及び、
Ｃ末端側として、
ＣＣ（Ａ／Ｇ）ＡＡ（Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｔ）ＡＣ（Ｃ／Ｔ）ＴＴ（Ａ／Ｇ）ＡＡ（Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｔ）ＣＣＣＡＴＡ
であった。
得られた遺伝子の塩基配列を配列表の配列番号３に示し、それがコードしているアミノ酸配列を以下に示す。
【００１１】
Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−　　　　１０
Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−　　　　２０
Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−　　　　３０
Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−　　　　４０
Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−　　　　５０
Ａｌａ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−　　　　６０
Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｌａ−　　　　７０
Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−　　　　８０
Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−　　　　９０
Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−　　　　１００
Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−　　　　１１０
Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−　　　　１２０
Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ　　　　　　　　　　　　１２６
（式中、下線を引いた８１番目〜１１８番目までがＣＲＳＰである。）
このアミノ酸配列を配列表の配列番号４に示す。
【００１２】
ブタＣＲＳＰをプローブにしてウシ及びイヌ甲状腺ｃＤＮＡライブラリーから本発明のペプチドを得た。
ウシのアミノ酸配列は、アミノ酸の１文字コードで示すと、
ＡＣＮＴＡＴＣＭＴＨＲＬＡＧＷＬＳＲＳＧ
ＳＭＶＲＳＮＬＬＰＴＫＭＧＦＫＩＦＮＧＰ−ＯＨ
である。これをアミノ酸の３文字コードで示すと次のようになる。
【００１３】
Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−　　　　１０
Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−　　　　２０
Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−　　　　３０
Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＯＨ　　　４０
【００１４】
また、イヌのアミノ酸配列は、アミノ酸の１文字コードで示すと、
ＳＣＮＳＡＴＣＶＡＨＷＬＧＧＬＬＳＲＡＧ
ＳＶＡＮＴＮＬＬＰＴＳＭＧＦＫＶＹＮ−ＯＨ
である。これをアミノ酸の３文字コードで示すと次のようになる。
【００１５】
Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−　　　　１０
Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−　　　　２０
Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−　　　　３０
Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−ＯＨ　　　　　　　３８
【００１６】
これらのアミノ酸配列、塩基配列、及び遺伝子がコードしている全アミノ酸配列をそれぞれ配列表に示す。
ウシの本発明のペプチドのアミノ酸配列を配列表の配列番号６に示し、その遺伝子の塩基配列を配列表の配列番号７に示し、その遺伝子に基づくペプチドのアミノ酸配列を配列番号８にそれぞれ示す。
また、イヌの本発明のペプチドのアミノ酸配列を配列表の配列番号９に示し、その遺伝子の塩基配列を配列表の配列番号１０に示し、その遺伝子に基づくペプチドのアミノ酸配列を配列番号１１にそれぞれ示す。
【００１７】
ブタＣＲＳＰのコード領域全長をプローブとして、ブタ遺伝子ライブラリーよりＣＲＳＰと相同性を有するペプチドをコードする遺伝子を得た。この遺伝子の産物であるペプチドをそれぞれ、ＣＲＳＰ−２、ＣＲＳＰ−３と名付けた。
また、同様にして、ブタカルシトニン（ＣＴ）と相同性を持つペプチドをコードする遺伝子を得た。この遺伝子の産物であるペプチドをＣＴ−２と名付けた。ＣＲＳＰ−２のアミノ酸配列は、アミノ酸の３文字コードで示すと次のようになる。
【００１８】
Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−　　　　１０
Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−　　　　２０
Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−　　　　３０
Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−ＮＨ２　　　　　　　　３７
【００１９】
ＣＲＳＰ−３のアミノ酸配列は、アミノ酸の３文字コードで示すと次のようになる。
Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−　　　　１０
Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−　　　　２０
Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−　　　　３０
Ａｓｎ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−ＮＨ２　　　　　　　　　３７
【００２０】
ＣＴ−２のアミノ酸配列は、アミノ酸の３文字コードで示すと次のようになる。
Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−　　　　１０
Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−　　　　２０
Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−　　　　３０
Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−ＮＨ２　　　　　　　　　　　　　　　　　３３
【００２１】
ＣＲＳＰ−２のアミノ酸配列を後記配列表の配列番号１２に示し、そのｃＤＮＡの塩基配列を配列番号１３に、そのｃＤＮＡに基づくペプチド（前駆体ペプチド）のアミノ酸配列を配列番号１４にそれぞれ示す。また、ＣＲＳＰ−２遺伝子の塩基配列を配列番号１５に示す。
ＣＲＳＰ−３のアミノ酸配列を配列表の配列番号１６に示し、そのｃＤＮＡの塩基配列を配列番号１７に、そのｃＤＮＡに基づくペプチド（前駆体ペプチド）のアミノ酸配列を配列番号１８にそれぞれ示す。
ＣＴ−２のアミノ酸配列を配列表の配列番号１９に示し、そのｃＤＮＡの塩基配列を配列番号２０に、そのｃＤＮＡに基づくペプチド（前駆体ペプチド）のアミノ酸配列を配列番号２１にそれぞれ示す。また、ＣＲＳＰ−３遺伝子及びＣＴ−２遺伝子の塩基配列を配列番号２２に示す。
【００２２】
図１に本発明のペプチドの例としてブタＣＲＳＰの構造を模式的に示す。この例のペプチドの場合は、２番目のＣｙｓと７番目のＣｙｓが−Ｓ−Ｓ−結合している。
また、図２に、本発明のブタＣＲＳＰ（ｐＣＲＳＰ）、ブタカルシトニン遺伝子関連ペプチド（ｐＣＧＲＰ−Ｉ）、ヒトカルシトニン遺伝子関連ペプチドＩ（ｈＣＧＲＰ−Ｉ）、ヒトカルシトニン遺伝子関連ペプチドＩＩ（ｈＣＧＲＰ−ＩＩ）、ヒトアミリン（ｈＡｍｙｌｉｎ）、ブタカルシトニン（ｐＣＴ）、及びヒトアドレノメデュリン（ｈＡＭ）のアミノ酸配列を比較したものを示す。
本発明の、ＣＲＳＰはブタカルシトニン遺伝子関連ペプチド（ｐＣＧＲＰ）と７１．１％、ヒトＣＧＲＰ−Ｉと６３．２％、ヒトＣＧＲＰ−ＩＩと７１．１％とそれぞれアミノ酸配列上の相同性を有している。
また、ブタ由来のペプチドについて、各ＣＲＳＰとＣＲＧＰやＡＭ、ＣＴ−２とＣＴのアミノ酸の比較を行ったものを図２３に示す。
【００２３】
次にＣＲＳＰの発現部位を調べるためにノーザンブロッティングを行った結果を図３に図面に代わる写真で示す。図３中の矢印は、ＣＲＳＰｍＲＮＡの位置を示している。また、各組織のペプチドの含有量をＣＲＳＰの抗体を用いてラジオイムノアッセイにより測定した。この測定結果を次の表１に示す。
【００２４】
【表１】
2004008027.tif 000002
【００２５】
この結果、本発明のＣＲＳＰは、中枢神経系においては中脳、視床下部に、末梢においては甲状腺に多くの遺伝子発現がみられた。また橋・延髄にも中程度の発現が見られ、大脳、下垂体においても僅かではあるが発現が観察される。一方組織含量は下垂体後葉、甲状腺が最も多く、中脳、視床下部、下垂体前葉にも高い組織含量が観察された。
【００２６】
次に、ＣＲＳＰの生理活性について検討した。
まず、ＬＬＣ−ＰＫ１細胞を用いてＣＲＳＰのｃＡＭＰ産生活性を検討した。ＬＬＣ−ＰＫ１細胞の培地にＤＭＥＭに溶解したＣＲＳＰを添加して、分泌されてきたｃＡＭＰの量をｃＡＭＰ特異的な抗体を用いたラジオイムノアッセイにより定量した。結果を図４に示す。図４の縦軸はｃＡＭＰの産生量（ｐｍｏｌ／１０５細胞／３０分）を示し、横軸は各ペプチドの濃度の逆対数（−ｌｏｇ（ペプチド濃度（Ｍ）））を示す。図４の黒丸（●）は本発明のＣＲＳＰを示し、白丸（○）はブタカルシトニン遺伝子関連ペプチド（ｐｉｇＣＧＲＰ）を示し、白菱形（◇）はブタカルシトニン（ｐｉｇＣＴ）をそれぞれ示す。この結果、本発明のＣＲＳＰは、ブタ腎上皮細胞由来のＬＬＣ−ＰＫ１細胞の細胞内アデニル酸シクラーゼ活性を濃度依存的に非常に強く（ＥＤ５０は約１．５ｎＭ）上昇させる。この活性はブタカルシトニン（ＥＤ５０は約８．７ｎＭ）より約６倍、ブタＣＧＲＰ（ＥＤ５０は約６２ｎＭ）より約４０倍強かった。
【００２７】
次に本発明のＣＲＳＰのナトリウムイオン、カルシウムイオンの取り込みの促進作用を検討した。
ＬＬＣ−ＰＫ１細胞の培養液をハンクス−塩化コリン液に置換し、一定量の放射活性をもつ塩化ナトリウム（２２Ｎａ）及びＣＲＳＰをそれぞれ終濃度０Ｍ、１０−８Ｍ、１０−７Ｍ、１０−６Ｍになるように添加し、１０分後、細胞を洗浄して細胞外液に含まれる２２Ｎａを完全に除去し、細胞内に取り込まれた放射活性をガンマカウンターにより測定した。また同様にＬＬＣ−ＰＫ１細胞の培養液をハンクス−塩化コリン液に置換し、一定量の放射活性を持つ塩化ナトリウム（２２Ｎａ）及びそれぞれＣＲＳＰとＮａ／Ｈ共輸送体阻害剤であるアミロライド誘導体５−（Ｎ−エチル−Ｎ−イソプロピル）−アミロライド（５−（Ｎ−ｅｔｈｙｌ−Ｎ−ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ）−ａｍｉｌｏｒｉｄｅ（ＥＩＰＡ））を終濃度ＣＲＳＰ ０Ｍ＋ＥＩＰＡ ０Ｍ、ＣＲＳＰ　１０−６Ｍ＋ＥＩＰＡ ０Ｍ、ＣＲＳＰ１０−６Ｍ＋ＥＩＰＡ１０−８Ｍ、ＣＲＳＰ１０−６Ｍ＋ＥＩＰＡ１０−７Ｍ、ＣＲＳＰ１０−６Ｍ＋ＥＩＰＡ１０−６Ｍ、ＣＲＳＰ ０Ｍ＋ＥＩＰＡ１０−６Ｍとなるよう添加し、１０分後、細胞を洗浄して細胞外液に含まれる２２Ｎａを完全に除去し、細胞内に取り込まれた放射活性をガンマカウンターにより測定した。
結果を図５（ＥＩＰＡ非存在下でのナトリウムイオンの取り込み）、図６（ＥＩＰＡ存在下でのナトリウムイオンの取り込み）、及び図７（カルシウムイオンの取り込み）にそれぞれ示す。図５、図６及び図７の縦軸は各イオンの取り込み量（ｃｐｍ）を示し、横軸に左端はコントロール（ペプチド無添加）を示し、その右は各濃度のＣＲＳＰを示す。図６の横軸のコントロールの右はＣＲＳＰ単独投与の場合を示し、その右はＣＲＳＰとＥＩＰＡの共投与の各濃度を示し、右端はＥＩＰＡ単独投与の場合を示す。図７中のｓＣＴは、サケカルシトニンを示す。図５，図６，及び図７中、＊印はｐ＜０．０５で、＊＊印はｐ＜０．０１で、＊＊＊印はｐ＜０．００１で有意差があったことを示す。
この結果、ＣＲＳＰはＬＬＣ−ＰＫ１細胞上のアミロライド感受性Ｎａ／Ｈ共輸送体を活性化して細胞内へのナトリウムの取り込みを促進する。また細胞内へのカルシウムの取り込みを抑制することがわかった。
【００２８】
次にＣＲＳＰによる細胞増殖の抑制作用について検討した。
ＬＬＣ−ＰＫ１細胞に各濃度の各ペプチドのＤＭＥＭ溶液を添加し、１２５Ｉで標識したブロモデオキシウリジンを含むＤＭＥＭ（０．１％ＢＳＡを含む）を各ウエルに添加して、５時間後核内に取り込まれた放射活性をガンマカウンターにより測定し、細胞増殖に伴って合成されたＤＮＡ量を測定した。結果を図８に示す。図８の縦軸は１２５Ｉ−ＤＵの取り込み量（×１００ｃｐｍ／ウエル）を示し、横軸は各ペプチドの濃度の逆対数（−ｌｏｇ（ペプチド濃度（Ｍ）））を示す。図８の黒丸（●）は本発明のＣＲＳＰを示し、白丸（○）はブタカルシトニン（ブタＣＴ）を示し、白菱形（◇）はサケカルシトニン（サケＣＴ）をそれぞれ示す。
また、細胞の増殖数は、１０，０００細胞／ウェルのＬＬＣ−ＰＫ１細胞に各濃度のＣＲＳＰのＤＭＥＭ溶液を添加し、培養後、培養皿上の細胞をトリプシン−ＥＤＴＡ溶液で剥がし、細胞数を計数板にて計測した。結果を図９に示す。図９の縦軸は細胞数（×１，０００細胞／ウエル）を示し、横軸は左端はコントロール（ＣＲＳＰ無添加）を示し、その右は各濃度のＣＲＳＰを示す。＊印はｐ＜０．０５で有意差があったことを示す。
これらの結果、ＣＲＳＰはＬＬＣ−ＰＫ１細胞の増殖を抑制する作用を有することがわかった。
【００２９】
次に、本発明のＣＲＳＰによるカルシトニン受容体への作用を検討した。
ブタカルシトニン受容体（ＣＴＲ）を哺乳類発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１に導入し、アカゲザル腎細胞（ＣＯＳ−７）に発現させてＣＲＳＰ刺激によるｃＡＭＰ産生量をラジオイムノアッセイにより測定した。同様にオポッサム腎細胞（ＯＫ細胞）にＣＴＲを発現させてＣＲＳＰ刺激によるｃＡＭＰ産生量をラジオイムノアッセイ法により、ナトリウムイオンの取り込みを放射活性を持つ塩化ナトリウム（２２Ｎａ）の取り込みをガンマカウンターで計測することにより測定した。結果を図１０（遺伝子工学的にカルシトニン受容体を発現している細胞（ＣＯＳ−７）のＣＲＳＰ刺激によるｃＡＭＰ産生能の変化）、図１１（ブタカルシトニン受容体（ＣＴＲ）を発現させたオポッサム腎上皮細胞のｃＡＭＰ産生能の変化）、及び図１２（ブタカルシトニン受容体（ＣＴＲ）を発現させたオポッサム腎上皮細胞のナトリウムイオンの取り込みの変化）に示す。
図１０の縦軸はｃＡＭＰの産生量（ｐｍｏｌ／ウエル／３０分）を示し、横軸は各ペプチド（リガンド）の濃度の逆対数（−ｌｏｇ（リガンド濃度（Ｍ）））を示す。図１０の黒丸（●）は本発明のＣＲＳＰを示し、白菱形（◇）はブタカルシトニン（ｐＣＴ）をそれぞれ示す。図１１の縦軸はｃＡＭＰの産生量（ｆｍｏｌ／ウエル／１時間）を示し、横軸はＣＲＳＰの濃度の逆対数（−ｌｏｇ（ＣＲＳＰ濃度（Ｍ））を示す。図１１の黒丸（●）はブタカルシトニン受容体（ＣＴＲ）を導入したオポッサム腎上皮細胞の場合を示し、黒四角（■）はオポッサム腎上皮細胞（ＯＫ細胞）の場合を示す。図１２の縦軸はナトリウムイオンの取り込み量の比（コントロールを１００とする）を示し、横軸はＣＲＳＰの濃度の逆対数（−ｌｏｇ（ＣＲＳＰ濃度（Ｍ）））を示す。図１２の黒丸（●）はブタカルシトニン受容体（ＣＴＲ）を導入したオポッサム腎上皮細胞の場合を示し、黒四角（■）はオポッサム腎上皮細胞（ＯＫ細胞）の場合を示す。図１２において、＊＊＊印はｐ＜０．００１で有意差があったことを示す。
この結果、ＣＴＲをＣＯＳ−７に発現させてＣＲＳＰで刺激すると、細胞内アデニル酸シクラーゼ活性が上昇（ＥＤ５０は約０．２ｎＭ）する。この活性はブタカルシトニン（ＥＤ５０は約７１ｎＭ）より約３５０倍強かった。ＣＲＳＰのこの作用はブタのカルシトニンより約３５０倍も強力で、既知の生理活性ペプチドの中で最も強いものである。同様にオポッサム腎上皮細胞（ＯＫ細胞）にＣＴＲを発現させてＣＲＳＰで刺激すると、細胞内アデニル酸シクラーゼ活性が上昇するのと同時にアミロライド感受性Ｎａ／Ｈ共輸送体を活性化して細胞内へのナトリウムの取り込みを促進する効果が観察された。
【００３０】
さらに、ＣＲＳＰのラットの血圧及び血漿中イオン濃度の変化について検討した。
生理食塩水に溶解した１６ｎｍｏｌ／ｋｇに相当する量のＣＲＳＰを麻酔条件下でラット頸静脈より短期間に一度に投与して、血漿中カルシウム濃度及び血圧を測定した。結果を図１３（ＣＲＳＰ投与による血中カルシウム濃度の変化）及び図１４（ＣＲＳＰ投与による血圧の変化）に示す。図１３の縦軸は血中カルシウム濃度（ｍＭ）を示し、横軸は時間（分）を示す。図１４の縦軸は血圧（ｍｍＨｇ）を示し、横軸は時間（分）を示す。図１３中の＊＊印はｐ＜０．０１で有意差があったこと示す。
この結果、ＣＲＳＰの投与により、一過性に血漿中カルシウム濃度が低下するが、一方血圧に対しては明確な変動を及ぼさないことがわかった。
【００３１】
続いて、ＣＲＳＰとＣＲＳＰ−ＧｌｙのｃＡＭＰ産生促進活性の違いについて検討した。
ブタカルシトニン受容体（ＣＴＲ）を哺乳類発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１に導入し、アカゲザル腎細胞（ＣＯＳ−７）に発現させてＣＲＳＰ刺激によるｃＡＭＰ産生量をラジオイムノアッセイにより測定した。結果を図１５に示す。
この結果、ＣＲＳＰとＣＲＳＰ−Ｇｌｙはほぼ同等のｃＡＭＰ産生活性を有することがわかった。
【００３２】
また、ウシ及びイヌから単離してきた本発明のペプチド（ウシＣＲＳＰ及びイヌＣＲＳＰ）について、前記したのと同様にしてＬＬＣ−ＰＫ１細胞を用いたＣＲＳＰのｃＡＭＰ産生活性を検討した。結果を図１６に示す。図１６の縦軸はｃＡＭＰの産生量（ｐｍｏｌ／ウエル／１０分）を示し、横軸は添加したＣＲＳＰの濃度を示す。
この結果、ウシやイヌのＣＲＳＰでもブタＣＲＳＰの場合とほぼ同様な結果が得られることがわかった。
【００３３】
本発明のペプチドの各種、ＣＲＳＰ、ＣＲＳＰ−２、ＣＲＳＰ−３、ＣＴ−２、ＣＴ，ＣＧＲＰ，ＧＡＰＤＨの遺伝子発現量をＲＴ−ＰＣＲによる高感度定量により測定した。その結果を図２４に示す。
ＣＲＳＰ−２及びＣＲＳＰ−３は中枢及び甲状腺、卵巣に発現が観察された。一方ＣＴ−２は何れの組織でもバンドが増幅されず、発現が観察されなかった。ＣＴ−２は図２４に示された組織以外に限局して発現しているものと考えられる。
【００３４】
以上のように、本発明のペプチドは、カルシトニンより強くカルシトニン受容体を刺激し、アデニル酸シクラーゼを活性化することが示された。このことは、本発明のペプチドがカルシトニン受容体の真の内因性のリガンドであることを示している。
従って、本発明のペプチドは、末梢の組織のカルシトニン受容体に作用して以下のような薬効を奏するものと考えられる。
カルシトニンはその受容体であるカルシトニン受容体を介して骨へのカルシウムの取り込みを促進させる。本発明のペプチドはカルシトニンと同様にカルシトニン受容体に作用して骨へのカルシウムの取り込みを促進させると考えられる。実際に図１３で示したようにラットにおいてこのペプチドの投与により、血漿中のカルシウム濃度の減少が観察された。この結果は骨へのカルシウムの取り込みの促進を裏付けていると考えられる。この作用を利用して骨粗鬆症により低下した骨密度を健常状態に回復させるための薬剤として利用が可能であり、骨粗鬆症の予防・治療剤として使用することができる。
また図１３に示されるように、本ペプチドは、血漿中のカルシウム濃度を低下させる活性を持っており、アルカローシス等に伴う高カルシウム血症の血漿中カルシウム濃度を通常レベルにまで下げるための薬剤への応用が可能であり、高カルシウム血症の治療・予防剤として使用することができる。
本ペプチドは、腎上皮細胞のアミロライド感受性Ｎａ／Ｈ共輸送体の作用を活性化する。これはカリウム保持性の利尿剤であるアミロライドの反対方向の活性であり、抗利尿剤として使用できる。
本発明のペプチドは、図８及び図９で示したようにカルシトニン受容体を介して腎上皮細胞の増殖を強く抑制する。カルシトニンはカルシトニン受容体を介して腺ガン細胞等の増殖を強く抑制する事が報告されている（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．　１９８５，　４５，　４８９０−４８９４他）ため、同様に本発明のペプチドもカルシトニン受容体を介してこれらのガン細胞の増殖をカルシトニンよりも強力に抑制すると考えられ、ガンの治療、予防薬として使用できる。
【００３５】
本発明のペプチドは、中枢に大量に発現していることが示された。従来から知られてきたアゴニストであるカルシトニンは中枢における発現が認められず、一方カルシトニン受容体は中枢に発現しているため、この事は本発明のペプチドが中枢における真の内因性リガンドであることを示している。カルシトニンを脳室内に投与すると、食欲の抑制、鎮痛作用を示すことが報告されている。カルシトニンは脳内に発現していないため、本ペプチドが脳内でこれらの作用を担っているものと考えられる。
したがって、本発明のペプチドは、中枢神経系のカルシトニン受容体に作用して以下のような薬効を奏するもとの考えられる。
カルシトニンは中枢神経系で食欲の抑制に働いていることが報告されている（Ｓｃｉｅｎｃｅ　１９７９，　２０６，　８５０−８５２、ＴＨＥ　ＢＯＮＥ　１９９２，　６，　６９−７４他）。カルシトニン受容体をカルシトニンよりも強く活性化する事ができる本発明のペプチドは強い食欲抑制作用を示す可能性が強い。本発明のペプチドの投与により肥満及びそれに伴う疾患（高血圧、高脂血症等）の治療・予防薬として使用することができる。
さらに、従来よりカルシトニン製剤がガンの転移や骨粗鬆症等による骨の痛み、偏頭痛、膵炎による痛み等に対し鎮痛作用を示すことが報告されている（Ａｍ．　Ｊ．　Ｍｅｄ．　Ｓｃｉ．　１９９７，　３１３，　１３−１６他）。カルシトニン受容体をカルシトニンよりも強く活性化する本発明のペプチドは、カルシトニンと同様に強い鎮痛作用を示す可能性が高く、これらの痛みに対する鎮痛剤として有効性を有する。
【００３６】
本発明のペプチドは、（１）中枢神経系において発現し、（２）カルシトニン受容体に強く作用し、（３）細胞のｃＡＭＰ産生能を促進させ、（４）ナトリウムイオンを濃度依存的に取り込む作用を有し、（５）カルシウムイオンの取り込みを抑制し、（６）細胞増殖を抑制する作用を有することを特徴とするものである。これらの作用を有するペプチドであれば、前記したアミノ酸配列を有するものに限定されないが、カルシトニンやカルシトニン遺伝子関連ペプチドのアミノ酸配列と５０％以上、好ましくは６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるペプチドが好ましい。前記した例ではブタからの本発明のペプチドであるＣＲＳＰを示してきたが、本発明のペプチドはブタ由来のものに限定されるものではなく、ヒト、ラット、イヌ、ウシなどの哺乳動物、サケなどの魚類動物などに由来するペプチドを包含している。
本発明のペプチドは、天然から抽出などの操作により、分離精製することもできる。また、通常のペプチド合成法により合成することもできる。さらに、本発明の遺伝子を適当なベクターに組み込んで、原核細胞や真核細胞を宿主細胞として遺伝子組換え技術により製造することもできる。
【００３７】
本発明の医薬組成物は、本発明のペプチドと製薬上許容される担体からなるものである。本発明の医薬組成物は、非経口投与又は経口投与することができ、好ましくは静脈投与、筋肉投与などの非経口投与される。
本発明の医薬組成物は、注射用製剤、凍結乾燥製剤、直腸投与製剤などに製剤化することができる。また、貼付デバイス、軟膏、貼付剤などの外用剤として製剤化することもできる。さらに、舌下錠として製剤化することもできる。製剤化は通常のペプチド製剤の方法により行うことができる。
本発明の医薬組成物は、有効成分として本発明のペプチドのほかに他の有効成分を組み合わせて使用することもできる。本発明の医薬組成物の投与量としては、有効成分の本発明のペプチドの量として、通常は１日、体重あたり１μｇ／ｋｇ〜１０００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ〜５００ｍｇ／ｋｇの範囲で投与することができるが、患者の性状や疾患の症状に応じて適宜変更することができる。本発明のペプチドは、カルシトニンよりも強くカルシトニン受容体に作用するものであることから、従来のカルシトニン製剤と同様に疾患に適用することもできる。
【００３８】
本発明のペプチドはまた、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）に相同性を有するペプチドも含まれるため、上記に記載した目的で利用できるのみならず、ＣＧＲＰに類似した生理活性を利用することが可能である。
ＣＧＲＰの生理活性としては、ＣＧＲＰ受容体に強く作用し、細胞内のｃＡＭＰ産生を促進させる作用が知られている。また、ＣＧＲＰは血管の弛緩作用を揺すること（Ｒｅｇｕｌ　Ｐｅｐｔ．　１９８６，　１５，　１−２３等）、利尿を促進させること（Ｐｒｏｃ　ＳｏｃＥｘｐ　Ｂｉｏｌ　Ｍｅｄ　１９９８，　１８８，　３１６−３２２等）、血管内皮細胞や血管平滑筋、線維芽細胞などの細胞の増殖能を変化させること（Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ．１９９０，　８７，　３２９９−３３０３：Ｒｅｇｕｌ　Ｐｅｐｔ　２００１，　１０１，　１６９−１７８等）が報告されている。
【００３９】
したがって、本発明のペプチドのなかのある種のもの、特にＣＧＲＰとの相同性の高いペプチドについては、（１）中枢神経系において発現し、（２）カルシトニン受容体に強く作用し、（３）細胞のｃＡＭＰ産生能を促進させ、（４）ナトリウムイオンを濃度依存的に取り込む作用を有し、（５）カルシウムイオンの取り込みを抑制し、（６）細胞増殖を抑制する作用を有する、ことに加え、（７）カルシトニン関連ペプチド受容体に強く作用し、（８）血管の弛緩作用を有し、（９）利尿を促進させ、（１０）血管内皮細胞や血管平滑筋、線維芽細胞の増殖能を変化させる作用などのＣＧＲＰが有する作用と類似する作用も合わせ持つものであることが期待されるが、必ずしも本発明のペプチドのすべてが（７）〜（１０）に示される作用を有するものではない。
このようなＣＧＲＰの有する作用に基づけば、本発明のペプチドを含む医薬組成物は、前記した本発明の医薬組成物の使用法の他に次の目的に使用する製剤として利用可能である。すなわち、血管の弛緩作用を直接利用した降圧剤、中枢及び末梢神経系を介した血管弛緩作用を利用した降圧剤、利尿剤、血管平滑筋の増殖の抑制を利用したＰＴＣＡ（経皮的冠動脈形成術）後の再狭窄を防ぐための薬剤などとしても使用できる可能性がある。
【００４０】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
【００４１】
実施例１　（ＣＲＳＰペプチドの抽出、単離）
ブタ脳２０ｋｇを４倍量の水中で１０分間煮沸し、冷却後、最終的に１Ｍになるよう酢酸を添加してホモジェナイズし、遠心分離で不溶物を除去してブタ脳抽出液を作成した。これを限外濾過（ペリコンカセットＰＬＡＣ　＃０００−０５，ミリポア社）で脱塩し、脱塩後の抽出液に氷冷下、終濃度６６％になるようにアセトンをゆっくり加えた。沈殿を遠心分離により除去し、上精をエバポレーターによりアセトンを除去した後、逆相のカラム（ＬＣ−ＳＯＲＢ　ＳＰＷ−Ｃ−ＯＤＳ、ケムコ、１．５　ｌ）に吸着させた。カラムを３倍量の０．５Ｍ酢酸で洗浄した後、３倍量の溶出バッファー（水：アセトニトリル：１０％トリフルオロ酢酸＝４０：６０：１）でペプチド画分を溶出した。溶出液はエバポレーターによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥した。
凍結乾燥標品は秤量後１Ｍ酢酸に溶解し、陽イオン交換樹脂（ＳＰ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ、ファルマシア社、３×２８　ｃｍ）の充填されたオープンカラムに吸着させ、素通り画分（ＳＰ−Ｉ）、２Ｍピリジン（ｐＨ８．０）で溶出された溶出画分（ＳＰ−ＩＩ）、２Ｍピリジン−酢酸（ｐＨ５．０）で溶出された画分（ＳＰ−ＩＩＩ）に分画し、ＳＰ−ＩＩＩ強イオン性画分を得た。この画分を凍結乾燥した後１Ｍ酢酸に溶解し、ゲル濾過（Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−５０、ファルマシア社、７．５×１４５　ｃｍ、１Ｍ酢酸、流速１００ｍｌ／ｈ）で分子量に応じてフラクションに分画し、分子量１ｋＤａから５ｋＤａに相当する部分を集めた。これを再びゲル濾過（Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２５、ファルマシア社、７．５×１４５　ｃｍ、１Ｍ酢酸、流速１００ｍｌ／ｈ）で、分子量に応じた画分に分離し、分子量２ｋＤａから４ｋＤａに相当する部分を集め、凍結乾燥した。
【００４２】
凍結乾燥標品をイオン交換クロマトグラフィー（ＣＭ５２、Ｗｈａｔｍａｎ社、２．４×４５ｃｍ、Ａ液：１０ｍＭギ酸アンモニウム（ｐＨ６．５）：アセトニトリル＝９：１、Ｂ液：１Ｍギ酸アンモニウム（ｐＨ６．５）：アセトニトリル＝９：１、流速３５ｍｌ／ｈ）を用いて、１０ｍＭから０．５Ｍまでギ酸アンモニウムによる濃度勾配溶出を行った。
ここで各画分の１／１０００量を凍結乾燥し、凍結乾燥標品をダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、０．０５％牛血清アルブミンを含む）に溶解した培地でブタ腎臓由来の上皮細胞ＬＬＣ−ＰＫ１を刺激して３７℃１時間インキュベーションし、培地に分泌されるｃＡＭＰ量をラジオイムノアッセイにより定量した。
方法は未知量のｃＡＭＰを含む培地及び既知濃度のｃＡＭＰを含む培地１００μｌに、４％になるように無水コハク酸を溶解したジオキサン−トリエチルアミン混合液（ジオキサン：トリエチルアミン＝４：１）を等量加え、３０分間室温で放置してｃＡＭＰをサクシニル化し、遠心エバポレーターで乾固した後、１ｍｌの緩衝液（５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ６．２）、１ｍＭＥＤＴＡ、０．０２５％アジ化ナトリウム、０．５％血清アルブミン、０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００）に溶解し、その内１００μｌずつを試験管に取り分け、５０μｌずつ放射性標識したサクシニル化ｃＡＭＰ及び抗体を加え、４℃で４８時間放置した。次に１００μｌの１％γ−グロブリン及び５００μｌの２５％ポリエチレングリコールを添加してよく混和し、遠心分離を行って沈殿の放射活性をガンマカウンターを用いて測定し、既知濃度のｃＡＭＰにより作成した標準曲線の放射活性と比較することでｃＡＭＰ量を定量した。
ｃＡＭＰ量の上昇が観察された画分（ギ酸アンモニウム（ｐＨ６．５）約０．３Ｍ）をさらに陽イオン交換ＨＰＬＣ（ＴＳＫ−ｇｅｌ　ＣＭ−２ＳＷ　、東ソー、７．８×３００ｍｍ、Ａ液：１０ｍＭ　ギ酸アンモニウム（ｐＨ３．８）：アセトニトリル＝９：１、Ｂ液：１Ｍギ酸アンモニウム（ｐＨ３．８）：アセトニトリル＝９：１、流速２ｍｌ／ｍｉｎ）でギ酸アンモニウムの濃度勾配溶出を行った。再びそれぞれの画分の１／１０００量を取り、活性を測定し、活性の観察された画分（ギ酸アンモニウム（ｐＨ３．８）約０．３６Ｍ）を、さらに逆相ＨＰＬＣ（Ｃ１８　２１８ＴＰ５４、Ｖｙｄａｃ社、４．６×２５０ｍｍ、Ａ液：水：アセトニトリル：１０％トリフルオロ酢酸＝９０：１０：１、Ｂ液：水：アセトニトリル：１０％トリフルオロ酢酸＝４０：６０：１、流速１ｍｌ／ｍｉｎ）でアセトニトリルによる濃度勾配溶出を行い、活性を持つ画分（アセトニトリル約３２％）を得た。これを再び逆相ＨＰＬＣ（ｄｉｐｈｅｎｙｌ　２１９ＴＰ５２１５、Ｖｙｄａｃ社、２．１×１５０ｍｍ、Ａ液：水：アセトニトリル：１０％トリフルオロ酢酸＝９０：１０：１、Ｂ液：水：アセトニトリル：１０％トリフルオロ酢酸＝４０：６０：１、流速０．２ｍｌ／ｍｉｎ）にて分離し、（アセトニトリル約２９％）最終的な精製標品を得た。
約５０ｐｍｏｌのペプチドが得られた。このペプチドの分子量は４０９９で理論上の等電点は１２．８１と算出された。また上述の通りＶｙｄａｃ社のＣ１８カラム（４．６×２５０ｍｍ、２１８ＴＰ５４）で０．１％ＴＦＡ存在下、アセトニトリル濃度約３２％で溶出される程度の疎水性を持っていた。
【００４３】
実施例２　（ＣＲＳＰのアミノ酸配列の決定）
アミノ酸配列はエドマン法による自動アミノ酸シーケンサーを用いて決定した。まず、５ｐｍｏｌの精製標品をＮ末端からアミノ酸シーケンサーを用いて解析し、　Ｓｅｒ−Ｘａａ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｘａａ−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−
Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−Ｖａｌを決定した。次に１０ｐｍｏｌの精製標品をトリプシン分解し、逆相ＨＰＬＣ（Ｃ１８　２１８ＴＰ５２１５、Ｖｙｄａｃ社、２．１×１５０ｍｍ、Ａ液：水：アセトニトリル：１０％トリフルオロ酢酸＝９０：１０：１、Ｂ液：水：アセトニトリル：１０％トリフルオロ酢酸＝４０：６０：１、流速０．２ｍｌ／ｍｉｎ）でアセトニトリルによる濃度勾配溶出を行った。得られたピークをアミノ酸シーケンサーで解析し、
Ｓｅｒ−Ｘａａ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｘａａ−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ、
Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ、
Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ａｒｇ、
Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ、
Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、
Ｖａｌ−Ｐｈｅ
の６個のシーケンスを得ることができた。これらの配列とデータベースとの比較から本ペプチドがカルシトニン遺伝子関連ペプチドと相同性を持ち、このペプチドが
Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−
Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−
Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−ＮＨ２
という配列であると考えられた。
【００４４】
一方、質量分析計により分子量を測定したところ、４１３０．６±０．７Ｄａという結果が得られた。これはアミノ酸配列から予想される４０４２Ｄａと約８９Ｄａ異なっていたが、この差異は２個のメチオニンの酸化（１６Ｄａ×２）とアミノ酸シーケンサーで判読できなかったＣ末端のグリシン（５７Ｄａ）の存在によるものではないかと予想された。最終的には次の実施例３よりこれらの予想通りに、
Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−
Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−
Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−ＮＨ２
（２番目のＣｙｓと７番目のＣｙｓの間でジスルフィド結合を形成する。）
であることが明らかになった。
得られたＣＲＳＰのアミノ酸配列を配列表の配列番号１に示し、ＣＲＳＰ−Ｇｌｙのアミノ酸配列を配列番号２に示す。
【００４５】
実施例３　（相補的ＤＮＡ塩基配列及び前駆体アミノ酸配列）
プローブは実施例２のアミノ酸配列を基にＮ末端側
（ＴＧ（Ｃ／Ｔ）ＡＡ（Ｃ／Ｔ）ＡＣ（Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｔ）ＧＣ（Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｔ）ＡＣ（Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｔ）ＴＧ（Ｃ／Ｔ）ＡＴＧＡＣ）
及びＣ末端側
（ＣＣ（Ａ／Ｇ）ＡＡ（Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｔ）ＡＣ（Ｃ／Ｔ）ＴＴ（Ａ／Ｇ）ＡＡ（Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｔ）ＣＣＣＡＴＡ）
で合成プライマーを作成し、ブタ遺伝子を鋳型にＰＣＲ法で増幅することにより作成した。
相補的ＤＮＡ　λファージライブラリーはブタ視床下部ｍＲＮＡ（３μｇ）よりファルマシア社Ｔｉｍｅ　ｓａｖｅｒ　ｃＤＮＡ作成キット及びＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社のλＺＡＰＩＩを用いて作成した。スクリーニングの方法は大腸菌をλファージ（約１０万個の独立したクローンを持つ）に感染させてＬＢ培地を含む０．７％アガロースと混合し、ＬＢ培地を含む１．５％寒天培地を敷いた培養皿に播き、３７℃で８時間ほど培養した。冷蔵庫で２時間ほど冷却した後、形成したプラークをナイロンフィルターに転写し、アルカリ変性（０．５Ｍ水酸化ナトリウム＋１．５Ｍ塩化ナトリウム溶液で２分間、０．５Ｍトリス−塩酸塩（ｐＨ７．５）＋１．５Ｍ塩化ナトリウム溶液で２分間、４５ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）＋４５０ｍＭ塩化ナトリウムで５分間処理を行う）後、フィルターを８０℃で２時間乾燥させた。次に乾燥したフィルターをプレハイブリダイゼーション液（５０％ホルムアミド、０．０９Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、０．９Ｍ塩化ナトリウム、０．５％牛血清アルブミン、０．５％フィコール、０．５％ポリビニルピロリドン、０．５％ラウリル硫酸ナトリウム）に３７℃で２時間浸し、そこに３２Ｐで標識したプローブを加え、４２℃で１６時間ハイブリダイゼーションを行う。フィルターは洗浄液で洗浄（３０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、３００ｍＭ塩化ナトリウム、０．１％ラウリル硫酸ナトリウム溶液、室温５分間を２回、３ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、３０ｍＭ　塩化ナトリウム、０．１％ラウリル硫酸ナトリウム溶液、６５℃１時間を２回行う）後、Ｘ線フィルムに感光させ、放射線により感光する部分を培養皿上のプラークと照合し、プラークから陽性クローンを単離した。
単離された陽性λファージクローンはＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社ヘルパーファージＲ４０８を用いてＤＮＡシーケンスに適したベクターであるプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔに変換し、塩基配列はサンガー法により決定した。
決定された塩基配列を配列表の配列番号３に示し、そのアミノ酸配列を配列番号４に示す。
得られたＣＲＳＰは、ブタカルシトニン（ＣＴ）遺伝子関連ペプチド　（ＣＧＲＰ）と７１．１％、ヒトＣＧＲＰ−Ｉと６３．２％、ヒトＣＧＲＰ−ＩＩと７１．１％　のアミノ酸配列上の相同性を有していた（図２参照）。
【００４６】
実施例４　（発現部位）
遺伝子の発現量のためのＲＮＡの調製は酸性グアニジンフェノールクロロホルム抽出法により行った。約１ｇのブタ組織を５ｍｌの変性液（４Ｍグアニジンチオシアン塩、２５ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、０．１Ｍ ２−メルカプトエタノール、０．５％サルコシン酸ナトリウム）でホモジェナイズし、１／１０量の２Ｍ酢酸ナトリウム、等量の水飽和フェノール、１／５量のクロロホルムを加えよく攪拌した後、遠心分離を行った。次に水層を分離してそこに等量の２−プロパノールを加えよく攪拌し−２０℃で１時間静置し、再び遠心分離し、沈殿（ＲＮＡ）を回収した。このＲＮＡのうち３０μｇをホルムアルデヒド−アガロース変性ゲル（１％アガロース、２．２Ｍホルムアルデヒド、２０ｍＭ　Ｍｏｐｓ（ｐＨ７）、８ｍＭ酢酸ナトリウム、１ｍＭ　ＥＤＴＡ）を用いて電気泳動を行い、泳動後のゲルを十分水洗してホルムアルデヒドを除去した後、０．０５Ｍ水酸化ナトリウムに１５分間、０．３Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ７）＋３Ｍ塩化ナトリウム溶液で４５分間処理した。次にゲルに含まれるＲＮＡをキャピラリブロット法でナイロンフィルターに転写し、ＲＮＡを転写したフィルターを８０℃で乾燥させた。次にフィルターをＡｍｂｉｏｎ社のＵＬＴＲＡｈｙｂハイブリダイゼーション液に３７℃２時間浸した後、ＣＲＳＰを暗号化している部分（ｃＤＮＡ上の３４６番目−４８８番目の間の塩基対）を３２Ｐで標識したプローブを加え、４２℃で１６時間ハイブリダイゼーションさせた。ハイブリダイゼーション後、フィルターを洗浄液で洗浄（３０ｍＭ　クエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、３００ｍＭ塩化ナトリウム、０．１％ラウリル硫酸ナトリウム溶液、室温５分間を２回、１．５ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、１５ｍＭ塩化ナトリウム、０．１％ラウリル硫酸ナトリウム溶液、６５℃１時間を２回行う）後、Ｘ線フィルムに感光させ、ＲＮＡの定量を行った。
結果を図３に示す。
【００４７】
実施例５　（発現量の測定）
各組織のペプチド含量は合成ペプチドに対して作成した抗体を利用してラジオイムノアッセイにより測定した。組織約１ｇを１０倍量の水で煮沸し、氷冷後酢酸を１Ｍになるよう加え、ホモジェナイズ後、遠心分離により不溶物を除去して抽出液を作成した。この抽出液を凍結乾燥後、緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）８０ｍＭ塩化ナトリウム、２５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００，０．５％牛血清アルブミン０．０５％アジ化ナトリウム）に溶解し、１００μｌずつ試験管に取り分けた。これらのＣＲＳＰを含む緩衝液及び既知濃度のＣＲＳＰを溶解した緩衝液に等量の放射性標識したＣＲＳＰ及び抗体を加えて攪拌し、４８時間４℃で静置した後、１００μｌのγ−ｇｌｏｂｕｌｉｎ及び５００μｌの２３％ポリエチレングリコールを添加してよく混和し、遠心後、沈殿の放射活性を既知濃度のＣＲＳＰにより作成した標準曲線の放射活性と比較することでＣＲＳＰ量を定量した。
結果を表１に示す。表１は段落番号２４に記載したものである。
【００４８】
実施例６　（ＬＬＣ−ＰＫ１細胞におけるＣＲＳＰのｃＡＭＰ産生促進作用）
ＬＬＣ−ＰＫ１細胞を栄養培地（１０％牛胎児血清を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ））中で培養し、２日後、０．０５％牛血清アルブミンを含むＤＭＥＭに溶解したＣＲＳＰを細胞の栄養培地と置き換えて３０分間インキュベーション後、培地を回収して、分泌されてきたｃＡＭＰの量をｃＡＭＰ特異的な抗体を用いたラジオイムノアッセイにより定量した。
結果を図４に示す。
【００４９】
実施例７　（ＬＬＣ−ＰＫ１細胞におけるＣＲＳＰ存在下でのナトリウムイオン、カルシウムイオンの取り込みの作用）
ＬＬＣ−ＰＫ１細胞を６ウェル培養皿上、ＤＭＥＭ（１０％ＦＣＳを含む）中で２日間培養した。ナトリウムイオンの取り込みの測定は以下のように行った。ＬＬＣ−ＰＫ１細胞の培養液をハンクス−塩化コリン液に置換し、一定量の放射活性をもつ塩化ナトリウム（２２Ｎａ）及びＣＲＳＰをそれぞれ終濃度０Ｍ、１０−８Ｍ、１０−７Ｍ、１０−６Ｍになるように添加し、１０分後、細胞を洗浄して細胞外液に含まれる２２Ｎａを完全に除去し、細胞内に取り込まれた放射活性をガンマカウンターにより測定した。また同様にＬＬＣ−ＰＫ１細胞の培養液をハンクス−塩化コリン液に置換し、一定量の放射活性を持つ塩化ナトリウム（２２Ｎａ）及びそれぞれＣＲＳＰとＮａ／Ｈ共輸送体阻害剤であるアミロライド誘導体５−（Ｎ−エチル−Ｎ−イソプロピル）−アミロライド（５−（Ｎ−ｅｔｈｙｌ−Ｎ−ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ）−ａｍｉｌｏｒｉｄｅ（ＥＩＰＡ））を終濃度ＣＲＳＰ ０Ｍ＋ＥＩＰＡ ０Ｍ、ＣＲＳＰ１０−６Ｍ＋ＥＩＰＡ ０Ｍ、ＣＲＳＰ１０−６Ｍ＋ＥＩＰＡ１０−８Ｍ、ＣＲＳＰ１０−６Ｍ＋ＥＩＰＡ１０−７Ｍ、ＣＲＳＰ１０−６Ｍ＋ＥＩＰＡ１０−６Ｍ、ＣＲＳＰ ０Ｍ＋ＥＩＰＡ１０−６Ｍとなるよう添加し、１０分後、細胞を洗浄して細胞外液に含まれる２２Ｎａを完全に除去し、細胞内に取り込まれた放射活性をガンマカウンターにより測定した。
ＥＩＰＡの非存在下における結果を図５に、またＥＩＰＡ存在下における結果を図６にそれぞれ示す。
【００５０】
カルシウムイオンの取り込みは以下のように行った。ＬＬＣ−ＰＫ１細胞は塩化カルシウム濃度を０ｍＭに下げたハンクス液（カルシウムフリーハンクス液）で洗浄した。ＣＲＳＰと共に塩化カルシウム（４５Ｃａ）を細胞上のカルシウムフリーハンクス液に添加し、１０分後、細胞を洗浄して細胞外液に含まれる４５Ｃａを完全に洗浄し、細胞内に取り込まれた放射活性を液体シンチレーションカウンターにより測定した。
結果を図７に示す。
【００５１】
実施例８　（ＣＲＳＰによる細胞増殖の抑制）
ＬＬＣ−ＰＫ１細胞を２４ウェルコラーゲンプレート上、ＤＭＥＭ（１０％ＦＣＳを含む）中で２日間培養し、細胞をＤＭＥＭで一度洗った後、０，１０−１２〜１０−６ＭのＣＲＳＰを含むＤＭＥＭ（１０％ＦＣＳを含む）に置換し培養した。２時間後、１２５Ｉで標識したブロモデオキシウリジンを含むＤＭＥＭ（０．１％ＢＳＡを含む）を各ウエルに添加して、５時間後核内に取り込まれた放射活性をガンマカウンターにより測定し、細胞増殖に伴って合成されたＤＮＡ量を測定した。
結果を図８に示す。
同様に１０，０００細胞／ウェルのＬＬＣ−ＰＫ１細胞を２４ウェルコラーゲンプレートに播き、ＤＭＥＭ（１０％ＦＣＳを含む）で２４時間培養した。各ウェルをＤＭＥＭで一度洗った後、０Ｍ、１０−８Ｍ、１０−６Ｍの濃度のＣＲＳＰを含むＤＭＥＭ（１０％ＦＣＳを含む）に培地を置換し培養した。２４時間後、培養皿上の細胞をトリプシン−ＥＤＴＡ溶液で剥がし、細胞数を計数板にて計測した。
結果を図９に示す。
【００５２】
実施例９　（カルシトニン受容体へのＣＲＳＰの作用）
ブタカルシトニン受容体（ＣＴＲ）を哺乳類発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１に導入し、アカゲザル腎細胞（ＣＯＳ−７）に発現させてＣＲＳＰ刺激によるｃＡＭＰ産生量をラジオイムノアッセイにより測定した。
結果を図１０に示す。
同様にオポッサム腎細胞（ＯＫ細胞）にＣＴＲを発現させてＣＲＳＰ刺激によるｃＡＭＰ産生量をラジオイムノアッセイ法により、ナトリウムイオンの取り込みを放射活性を持つ塩化ナトリウム（２２Ｎａ）の取り込みをガンマカウンターで計測することにより測定した。
結果を図１１及び図１２にそれぞれ示す。
【００５３】
実施例１０　（ＣＲＳＰのラットの血圧及び血漿中イオン濃度の変化）
生理食塩水に溶解した１６ｎｍｏｌ／ｋｇに相当する量のＣＲＳＰを麻酔条件下でラット頸静脈より短期間に一度に投与した。
結果を図１３及び図１４に示す。
【００５４】
実施例１１　（ＣＲＳＰ−Ｇｌｙペプチドの抽出、単離）
ブタ脳２０ｋｇを４倍量の水中で１０分間煮沸し、冷却後、最終的に１Ｍになるよう酢酸を添加してホモジェナイズし、遠心分離で不溶物を除去してブタ脳抽出液を作成した。これを限外濾過（ペリコンカセットＰＬＡＣ＃０００−０５，ミリポア社）で脱塩し、脱塩後の抽出液に氷冷下、終濃度６６％になるようにアセトンをゆっくり加えた。沈殿を遠心分離により除去し、上精をエバポレーターによりアセトンを除去した後、逆相のカラム（ＬＣ−ＳＯＲＢ　ＳＰＷ−Ｃ−ＯＤＳ、ケムコ、１．５　ｌ）に吸着させた。カラムを３倍量の０．５Ｍ酢酸で洗浄した後、３倍量の溶出バッファー（水：アセトニトリル：１０％トリフルオロ酢酸＝４０：６０：１）でペプチド画分を溶出した。溶出液はエバポレーターによりアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥した。凍結乾燥標品は秤量後１Ｍ酢酸に溶解し、陽イオン交換樹脂（ＳＰ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ、ファルマシア社、３×２８ｃｍ）の充填されたオープンカラムに吸着させ、素通り画分（ＳＰ−Ｉ）、２Ｍピリジン（ｐＨ８．０）で溶出される溶出画分（ＳＰ−ＩＩ）、２Ｍピリジン−酢酸（ｐＨ５．０）で溶出される画分（ＳＰ−ＩＩＩ）に分画し、ＳＰ−ＩＩＩ強イオン性画分を得た。この画分を凍結乾燥した後１Ｍ酢酸に溶解し、ゲル濾過（ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−５０、ファルマシア社、７．５×１４５ｃｍ、１Ｍ酢酸、流速１００ｍｌ／ｈ）で分子量に応じてフラクションに分画し、分子量１ｋＤａから５ｋＤａに相当する部分を集めた。これを再びゲル濾過（ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５、ファルマシア社、７．５×１４５ｃｍ、１Ｍ酢酸、流速１００ｍｌ／ｈ）で、分子量に応じた画分に分離し、分子量２ｋＤａから４ｋＤａに相当する部分を集め、凍結乾燥した。
【００５５】
凍結乾燥標品をイオン交換クロマトグラフィー（ＣＭ５２、Ｗｈａｔｍａｎ社、２．４×４５ｃｍ、Ａ液：１０ｍＭギ酸アンモニウム（ｐＨ６．５）：アセトニトリル＝９：１、Ｂ液：１Ｍギ酸アンモニウム（ｐＨ６．５）：アセトニトリル＝９：１、流速３５ｍｌ／ｈ）を用いて、１０ｍＭから０．５Ｍまでギ酸アンモニウムによる濃度勾配溶出を行った。
ここで各画分の１／１０００量を凍結乾燥し、凍結乾燥標品をダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、０．０５％　牛血清アルブミンを含む）に溶解した培地でブタ腎臓由来の上皮細胞ＬＬＣ−ＰＫ１を刺激して３７℃１時間インキュベーションし、培地に分泌されるｃＡＭＰ量をラジオイムノアッセイにより定量した。
方法は未知量のｃＡＭＰを含む培地及び既知濃度のｃＡＭＰを含む培地１００μｌに、４％になるように無水コハク酸を溶解したジオキサン−トリエチルアミン混合液（ジオキサン：トリエチルアミン＝４：１）を等量加え、３０分間室温で放置してｃＡＭＰをサクシニル化し、遠心エバポレーターで乾固した後、１ｍｌの緩衝液（５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ６．２）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０２５％アジ化ナトリウム、０．５％血清アルブミン、０．０１％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００）に溶解し、その内１００μｌずつを試験管に取り分け、５０μｌずつ放射性標識したサクシニル化ｃＡＭＰ及び抗体を加え、４℃で４８時間放置した。次に１００μｌの１％γ−グロブリン及び５００μｌの２５％ポリエチレングリコールを添加してよく混和し、遠心分離を行って沈殿の放射活性をガンマカウンターを用いて測定し、既知濃度のｃＡＭＰにより作成した標準曲線の放射活性と比較することでｃＡＭＰ量を定量した。
ＣＲＳＰ−ＧｌｙによるｃＡＭＰ産生の上昇はギ酸アンモニウム（ｐＨ６．５）約０．２７Ｍで溶出される画分に観察された。さらに陽イオン交換ＨＰＬＣ（ＴＳＫ−ｇｅｌ　ＣＭ−２ＳＷ、東ソー、７．８×３００ｍｍ、Ａ液：１０ｍＭギ酸アンモニウム（ｐＨ３．８）：アセトニトリル＝９：１、Ｂ液：１Ｍギ酸アンモニウム（ｐＨ３．８）：アセトニトリル＝９：１、流速２ｍｌ／ｍｉｎ）でギ酸アンモニウムの濃度勾配溶出を行った。再びそれぞれの画分の１／１０００量を取り、活性を測定し、活性の観察された画分（ギ酸アンモニウム（ｐＨ３．８）約０．３６Ｍで溶出）を、さらに逆相ＨＰＬＣ（Ｃ１８　２１８ＴＰ５４、Ｖｙｄａｃ社、４．６×２５０ｍｍ、Ａ液：水：アセトニトリル：１０％トリフルオロ酢酸＝９０：１０：１、Ｂ液：水：アセトニトリル：１０％トリフルオロ酢酸＝４０：６０：１、流速１ｍｌ／ｍｉｎ）でアセトニトリルによる濃度勾配溶出を行い、活性を持つ画分（アセトニトリル約３２％で溶出）を得た。これを再び逆相ＨＰＬＣ（ｄｉｐｈｅｎｙｌ　２１９ＴＰ５２１５、Ｖｙｄａｃ社、２．１×１５０ｍｍ、Ａ液：水：アセトニトリル：１０％トリフルオロ酢酸＝９０：１０：１、Ｂ液：水：アセトニトリル：１０％トリフルオロ酢酸＝４０：６０：１、流速０．２ｍｌ／ｍｉｎ）にて分離し、（アセトニトリル約２９％で溶出）最終的な精製標品を得た。
実際の精製行程において約５０ｐｍｏｌのペプチドが得られた。このペプチドの分子量は４１５７Ｄａで理論上の等電点は１１．４１と算出された。また上述の通りＶｙｄａｃ社のＣ１８カラム（４．６×２５０ｍｍ、２１８ＴＰ５４）で０．１％ＴＦＡ存在下、アセトリトリル濃度約３２％で溶出される程度の疎水性を持っていた。
【００５６】
実施例１２　（ＣＲＳＰ−ＧｌｙのｃＡＭＰ産生促進作用）
ブタカルシトニン受容体（ＣＴＲ）を哺乳類発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１に導入し、アカゲザル腎細胞（ＣＯＳ−７）に発現させてＣＲＳＰ又は、ＣＲＳＰ−Ｇｌｙ刺激によるｃＡＭＰ産生量をラジオイムノアッセイにより測定した。
結果を図１５に示す。
【００５７】
実施例１３　（イヌ・ウシＣＲＳＰの遺伝子クローニング）
ＲＮＡはイヌ及びウシの甲状腺より、酸性グアニジンフェノールクロロホルム抽出法により抽出した。ｍＲＮＡの精製は宝酒造Ｏｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０ｍＲＮＡ精製キットを用いて行った。相補的ＤＮＡλファージライブラリーはイヌ及びウシの甲状腺ｍＲＮＡ（３μｇ）よりファルマシア社Ｔｉｍｅ　ｓａｖｅｒｃＤＮＡ作成キット及びＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社　λＺＡＰＩＩを用いて作成した。プローブはブタカルシトニン受容体刺激ペプチドの全長約７００ｂｐを用いた。スクリーニングの方法は大腸菌をλファージ（約３０万個の独立したクローンを持つ）に感染させてＬＢ培地を含む０．７％アガロースと混合し、ＬＢ培地を含む１．５％寒天培地を敷いた培養皿に播き、３７℃で８時間ほど培養した。冷蔵庫で２時間ほど冷却した後、形成したプラークをナイロンフィルターに転写し、アルカリ変性（０．５Ｍ水酸化ナトリウム＋１．５Ｍ塩化ナトリウム溶液で２分間、０．５Ｍトリス−塩酸塩（ｐＨ７．５）＋１．５Ｍ塩化ナトリウム溶液で２分間、４５ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）＋４５０ｍＭ塩化ナトリウムで５分間処理を行う）後、フィルターを８０℃で２時間処理した。次にフィルターをプレハイブリダイゼーション液（２０％ホルムアミド、０．０９Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、０．９Ｍ塩化ナトリウム、０．５％牛血清アルブミン、０．５％フィコール、０．５％ポリビニルピロリドン、０．５％ラウリル硫酸ナトリウム）に３７℃で２時間浸し、そこに３２Ｐで標識したプローブを加え、４２℃で１６時間ハイブリダイゼーションを行った。フィルターは洗浄液で洗浄（３０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、３００ｍＭ塩化ナトリウム、０．１％ラウリル硫酸ナトリウム溶液、室温５分間を２回、１５ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．１％ラウリル硫酸ナトリウム溶液、６０℃１時間を２回行う）後、Ｘ線フィルムに感光させ、放射線により感光する部分を培養皿上のプラークと照合し、プラークから陽性クローンを単離した。単離された陽性λファージクローンはＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社ヘルパーファージＲ４０８を用いてＤＮＡシーケンスに適したベクターであるプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔに変換し、塩基配列はサンガー法により決定した。
決定されたウシＣＲＳＰをコードするｃＤＮＡの塩基配列を後記配列表の配列番号７に示し、そのコードするウシＣＲＳＰの前駆体ペプチドのアミノ酸配列を配列番号８に示す。また、ウシＣＲＳＰのアミノ酸配列を配列番号６に示す。
決定されたイヌＣＲＳＰをコードするｃＤＮＡの塩基配列を後記配列表の配列番号１０に示し、そのコードするイヌＣＲＳＰの前駆体ペプチドのアミノ酸配列を配列番号１１に示す。また、イヌＣＲＳＰのアミノ酸配列を配列番号９に示す。
【００５８】
実施例１４（ウシＣＲＳＰ又はイヌＣＲＳＰ刺激によるｃＡＭＰ産生量の定量）
ＬＬＣ−ＰＫ１細胞を栄養培地（１０％牛胎児血清を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ））中で培養した。２日後、細胞を０．０５％牛血清アルブミンを含むＤＭＥＭで２回洗浄し、培養皿中の培地を０．５ｍＭの３−イソブチル−１−メチルキサンチン（３−ｉｓｏｂｕｔｙｌ−１−ｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｉｎｅ）及び０．０５％牛血清アルブミンを含むＤＭＥＭ（ＤＭＥＭ／ＢＳＡ／ＩＢＭＸ）に置き換えて３７℃で３０分間インキュベーションした。インキュベーション後、培地を０Ｍ及び１０−１２〜１０−６ＭになるようＣＲＳＰを溶解したＤＭＥＭ／ＢＳＡ／ＩＢＭＸに置換し、３７℃で１０分間インキュベーションした。インキュベーション後、培養皿中の培地を除き、そこにエタノールを加え、細胞を破砕するために培養皿を冷凍庫で一回凍結させた。次にエタノールを試験管に移し、遠心エバポレーターを用いて標品を乾固させた。乾固した標品はＤＭＥＭに溶解し、１００μｌずつ取り分け、４％になるように無水コハク酸を溶解したジオキサン−トリエチルアミン混合液（ジオキサン：トリエチルアミン＝４：１）を等量加え、３０分間室温で放置してｃＡＭＰをサクシニル化させた。再び遠心エバポレーターで乾固した後、１ｍｌの緩衝液（５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ６．２）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０２５％アジ化ナトリウム、０．５％血清アルブミン、０．０１％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００）に溶解し、その内１００μｌずつを試験管に取り分け、５０μｌの放射性標識したサクシニル化ｃＡＭＰ及び５０μｌの抗体を加え、４℃で４８時間放置した。次に１００μｌの１％　γ−グロブリン及び５００μｌの２５％ポリエチレングリコールを添加してよく混和し、遠心分離を行って沈殿の放射活性をガンマカウンターを用いて測定し、既知濃度のｃＡＭＰにより作成した標準曲線の放射活性と比較することでｃＡＭＰ量を定量した。
結果を図１６に示す。
【００５９】
実施例１５（ＣＲＳＰ−２及びＣＲＳＰ−３／ＣＴ−２前駆体遺伝子のクローニング）
ブタ遺伝子ライブラリーはクローンテック社から購入した。プローブはブタカルシトニン受容体刺激ペプチドの前駆体ｃＤＮＡ全長約７００ｂｐを用いた。スクリーニングの方法は大腸菌をブタ遺伝子が挿入されたλファージ（約１００万個の独立したクローンを持ち、その内約３０万個について行った）に感染させてＬＢ培地を含む０．７％アガロースと混合し、ＬＢ培地を含む１．５％寒天培地を敷いた培養皿に播き、３７℃で８時間ほど培養した。冷蔵庫で２時間ほど冷却した後、形成したプラークをナイロンフィルターに転写し、アルカリ変性（０．５Ｍ水酸化ナトリウム＋１．５Ｍ塩化ナトリウム溶液で２分間、０．５Ｍトリス−塩酸塩（ｐＨ７．５）＋１．５Ｍ塩化ナトリウム溶液で２分間、４５ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）＋４５０ｍＭ塩化ナトリウムで５分間処理を行う）後、フィルターを８０℃で２時間処理した。次にフィルターをプレハイブリダイゼーション液（２０％ホルムアミド、０．０９Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、０．９Ｍ塩化ナトリウム、０．５％牛血清アルブミン、０．５％フィコール、０．５％ポリビニルピロリドン、０．５％ラウリル硫酸ナトリウム）に３７℃で２時間浸し、そこに３２Ｐで標識したプローブを加え、４２℃で１６時間ハイブリダイゼーションを行った。フィルターは洗浄液で洗浄（３０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、３００ｍＭ塩化ナトリウム、０．１％ラウリル硫酸ナトリウム溶液、室温５分間を２回、７．５ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、７５ｍＭ塩化ナトリウム、０．１％ラウリル硫酸ナトリウム溶液、５５℃、１時間を２回行った）後、Ｘ線フィルムに感光させ、放射線により感光する部分を培養皿上のプラークと照合し、プラークから陽性クローンを単離した。単離された陽性λファージクローンは種々の制限酵素を用いて切断し、サザンブロッティング法により解析を行って制限酵素地図を作製した後、適当な制限酵素を用いて陽性クローンを含むＤＮＡをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにサブクローニングした。塩基配列はサンガー法により決定した。スクリーニングの結果、２５個の陽性クローンを得ることができた。制限酵素による解析及び塩基配列決定の結果、１０個のクローンはＣＲＳＰの遺伝子をコードしていることが判明した（図１７）。残りの１５個のクローンの内、９個は別の遺伝子を（図１８及び図１９）、６個はさらに別の遺伝子をコードしていることが判った。９個の遺伝子はＣＲＳＰと相同性を持つ配列を有していた。この遺伝子をＣＲＳＰ−２と名付けた。また別の６個の遺伝子はＣＲＳＰとＣＴに相同性を有する配列を持っていた。これら遺伝子をＣＲＳＰ−３及びＣＴ−２と名付けた。図１７〜１９において下線部がエクソンを示す。
ＣＲＳＰ遺伝子の塩基配列を後記配列表の配列番号５に記載する。また、ＣＲＳＰ−２遺伝子を配列表の配列番号１５に記載する。ＣＲＳＰ−３遺伝子とＣＴ−２遺伝子を含むＤＮＡ断片の塩基配列を配列表の配列番号２３に記載する。
【００６０】
ＣＲＳＰやＣＴ／ＣＧＲＰの遺伝子配列を参考に推定したｃＤＮＡ配列は図２０〜２２に示す（図２０：ＣＲＳＰ−２、図２１：ＣＲＳＰ−３、図２２：ＣＴ−２）。図２０〜２２において、実線で囲まれた部分が成熟ペプチドで、灰色がアミドに変換されると推定されるグリシン、斜体部がシグナルペプチド、図２２における成熟体のＮ末端側にあるグルタミンはピログルタミン酸に変換されると推定される。また各ＣＲＳＰとＣＧＲＰやＡＭ、ＣＴ−２とＣＴのアミノ酸の比較を行ったものが図２３である。
ＣＲＳＰ−２のｃＤＮＡの塩基配列を後記配列表の配列番号１３に、ＣＲＳＰ−３のｃＤＮＡを配列番号１７に、ＣＴ−２のｃＤＮＡを配列番号２１に記載する。
ＣＲＳＰ−２、ＣＲＳＰ−３とＣＴ−２の成熟体アミノ酸配列は以下であると予想される。
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ＣＲＳＰ−２のアミノ酸配列を後記配列表の配列番号１２に、ＣＲＳＰ−３を配列番号１６に、ＣＴ−２を配列番号１９に記載する。
【００６１】
実施例１６（ＣＲＳＰ−２の前駆体ｃＤＮＡクローニング）
ｃＤＮＡライブラリーはＣＲＳＰのｃＤＮＡクローニングを行った時に作成したブタ視床下部ｃＤＮＡが挿入されたλファージライブラリーを用いた。プローブはブタカルシトニン受容体刺激ペプチドの全長約７００ｂｐを用いた。スクリーニングの方法は大腸菌をブタ視床下部ｃＤＮＡが挿入されたλファージに感染させてＬＢ培地を含む０．７％アガロースと混合し、ＬＢ培地を含む１．５％寒天培地を敷いた培養皿に播き、３７℃で８時間ほど培養した。冷蔵庫で２時間ほど冷却した後、形成したプラークをナイロンフィルターに転写し、アルカリ変性（０．５Ｍ水酸化ナトリウム＋１．５Ｍ塩化ナトリウム溶液で２分間、０．５Ｍトリス−塩酸塩（ｐＨ７．５）＋１．５Ｍ塩化ナトリウム溶液で２分間、４５ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）＋４５０ｍＭ塩化ナトリウムで５分間処理を行う）後、フィルターを８０℃で２時間処理した。次にフィルターをプレハイブリダイゼーション液（２０％ホルムアミド、０．０９Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、０．９Ｍ塩化ナトリウム、０．５％牛血清アルブミン、０．５％フィコール、０．５％ポリビニルピロリドン、０．５％ラウリル硫酸ナトリウム）に３７℃で２時間浸し、そこに３２Ｐで標識したプローブを加え、４２℃で１６時間ハイブリダイゼーションを行った。フィルターは洗浄液で洗浄（３０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、３００ｍＭ塩化ナトリウム、０．１％ラウリル硫酸ナトリウム溶液、室温５分間を２回、１５ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．１％ラウリル硫酸ナトリウム溶液、６０℃１時間を２回行う）後、Ｘ線フィルムに感光させ、放射線により感光する部分を培養皿上のプラークと照合し、プラークから陽性クローンを単離した。単離された陽性λファージクローンはＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社ヘルパーファージＲ４０８を用いてＤＮＡシーケンスに適したベクターであるプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔに変換し、塩基配列はサンガー法により決定した。以上の結果、１３個の陽性クローンを得ることができた。その内６個は全てＣＲＳＰ前駆体ｃＤＮＡのほぼ全長を含むクローンであり、また別の６個は全てＣＲＳＰ−２前駆体ｃＤＮＡのほぼ全長を含むクローンであった（図２０）。残りの１個はＣＲＳＰ−３の３’非翻訳領域をコードする短いクローンであった。
【００６２】
実施例１７（ＣＲＳＰ−３及びＣＴ−２ ｃＤＮＡのクローニング）
ブタ視床下部ｃＤＮＡ（ｍＲＮＡで２０ｎｇ分）を鋳型にし、プライマー
（ＣＲＳＰ−３：ＧＣＣＣＡＧＣＴＴＡＣＧＴＣＴＣＣＴＴＴ及びＴＣＡＧＧＴＡＡＣＴＧＣＡＡＴＧＡＴＴＴ、ＣＴ−２：ＡＧＣＡＧＣＴＴＴＧＡＴＴＣＴＧＣＣＡＣ及びＡＣＣＴＣＣＴＣＴＣＴＧＡＴＡＴＴＣＣＡ）及び宝酒造ＰｙｒｏｂｅｓｔＤＮＡポリメラーゼを用いて、９４℃１５秒−５５℃１５秒−７２℃１分−３０サイクルのＰＣＲ法を行った。増幅されたＤＮＡはアガロースゲル電気泳動を行い、エチジウムブロマイドで染色されたバンドをアガロースゲルから回収した後、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩにサブクローニングし、サンガー法により塩基配列を決定した。
ＣＲＳＰ−３のプライマーを用いて増幅されたＤＮＡの塩基配列の解析を行った結果、ＣＲＳＰ−３をコードしている事が判明した（図５）。一方ＣＴ−２のプライマーを用いたＰＣＲではＤＮＡの増幅が観察されなかった。
【００６３】
実施例１８（ＲＴ−ＰＣＲによるＣＲＳＰ、ＣＲＳＰ−２、ＣＲＳＰ−３、ＣＴ−２、ＣＴ、ＣＧＲＰ、ＧＡＰＤＨの遺伝子発現量の高感度定量）
ブタの各組織のｔｏｔａｌ ＲＮＡ（４μｇ）及びｏｌｉｇｏ ｄＴプライマー及び東洋紡Ｒｅｖｅｒｔｒａ　Ａｃｅ逆転写酵素キットを用いて鋳型ｃＤＮＡを作成し、そのうち１／４０をＲＴ−ＰＣＲに用いた。各遺伝子ｃＤＮＡを増幅するためのＰＣＲは東洋紡ｒＴａｑポリメラーゼを用いて９４℃１５秒−６０℃１５秒−７２℃１分−３０サイクルで行い、プライマーは以下の配列を用いた。
ＣＲＳＰ：ＣＴＣＴＣＴＧＡＧＧＡＧＧＡＡＴＣＡＣＧ及び　ＧＡＧＴＴＣＡＧＡＧＴＣＡＴＡＧＴＡＡＣＣ
ＣＲＳＰ−２：　ＣＴＣＡＣＡＧＡＧＧＡＧＧＡＡＧＴＧＴＣ及びＴＡＧＡＧＴＴＣＡＧＴＴＣＣＴＴＧＧＴＧ
ＣＲＳＰ−３：　ＡＧＣＡＧＣＴＴＴＧＡＴＴＣＴＧＣＣＡＣ及びＴＧＣＡＧＴＧＡＡＡＧＣＡＡＣＴＴＧＡＧ
ＣＴ−２：　ＡＧＣＡＧＣＴＴＴＧＡＴＴＣＴＧＣＣＡＣ及びＡＣＣＴＣＣＴＣＴＣＴＧＡＴＡＴＴＣＣＡ
ＣＴ：　ＧＣＣＡＣＴＣＡＧＴＧＡＧＡＡＧＧＡＡＧ及びＴＧＡＧＧＣＡＴＧＡＧＧＧＡＴＧＡＡＧＣ
ＣＧＲＰ：ＧＣＣＡＣＴＣＡＧＴＧＡＧＡＡＧＧＡＡＧ及びＴＣＡＣＣＴＴＡＣＡＴＧＴＧＴＣＣＣＣＡ
ＧＡＰＤＨ：ＴＣＡＣＴＧＣＣＡＣＣＣＡＧＡＡＧＡＣＴ及びＡＧＴＧＧＴＣＧＴＴＧＡＧＧＧＣＡＡＴＧ
増幅されたＤＮＡは３％アガロースゲルで電気泳動を行い、フジフィルムＦＬＡ２０００を用いて解析した。結果としてＣＲＳＰ−２及びＣＲＳＰ−３は中枢及び甲状腺、卵巣に発現が観察された。一方ＣＴ−２は何れの組織でもバンドが増幅されず、発現が観察されなかった（図２４）。ＣＴ−２は図２４に示された組織以外に限局して発現しているものと考えられる。
【００６４】
【発明の効果】
本発明は、中枢神経に発現し、カルシトニン受容体に強く作用する新規かつ有用なペプチドを提供するものである。本発明のペプチドは、カルシトニン遺伝子関連ペプチドと高い相同性を有し、カルシトニンよりも強い作用を有する。また中枢神経系に多量に発現しており、新規なカルシトニン様ペプチドとして骨粗鬆症や鎮痛剤などとして極めて有用なペプチドである。
【００６５】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明のペプチドのＣＲＳＰの構造を模式的に示すものである。
【図２】図２は、本発明のペプチドのＣＲＳＰ（ｐＣＲＳＰ）のアミノ酸配列と、ブタカルシトニン遺伝子関連ペプチド（ｐＣＧＲＰ−Ｉ）、ヒトカルシトニン遺伝子関連ペプチドＩ（ｈＣＧＲＰ−Ｉ）、ヒトカルシトニン遺伝子関連ペプチドＩＩ（ｈＣＧＲＰ−ＩＩ）、ヒトアミリン（ｈＡｍｙｌｉｎ）、ブタカルシトニン（ｐＣＴ）、及びヒトアドレノメデュリン（ｈＡＭ）のアミノ酸配列との比較を示すものである。
【図３】図３は、本発明のペプチドのＣＲＳＰの発現部位を調べるためにノーザンブロッティングを行った結果を示す図面に代わる写真である。図３中の矢印は、ＣＲＳＰの位置を示している。
【図４】図４は、ＬＬＣ−ＰＫ１細胞を用いた本発明のペプチドのＣＲＳＰのｃＡＭＰ産生活性を検討した結果を示すものである。図４の縦軸はｃＡＭＰの産生量（ｐｍｏｌ／１０５細胞／３０分）を示し、横軸は各ペプチドの濃度の逆対数（−ｌｏｇ（ペプチド濃度（Ｍ））を示す。図４の黒丸（●）は本発明のＣＲＳＰを示し、白丸（○）はブタカルシトニン遺伝子関連ペプチド（ｐｉｇＣＧＲＰ）を示し、白菱形（◇）はブタカルシトニン（ｐｉｇＣＴ）をそれぞれ示す。
【図５】図５は、ＬＬＣ−ＰＫ１細胞を用いた本発明のペプチドのＣＲＳＰによるＥＩＰＡ非存在下でのナトリウムイオンの取り込み試験の結果を示すものである。図５の縦軸は各イオンの取り込み量（ｃｐｍ）を示し、横軸に左端はコントロール（ペプチド無添加）を示し、その右は各濃度のＣＲＳＰを示す。＊＊＊はｐ＜０．００１で有意差があったことを示す。
【図６】図６は、ＬＬＣ−ＰＫ１細胞を用いた本発明のペプチドのＣＲＳＰによるＥＩＰＡ存在下でのナトリウムイオンの取り込み試験の結果を示すものである。図６の縦軸は各イオンの取り込み量（ｃｐｍ）を示し、横軸に左端はコントロール（ペプチド無添加）を示し、その右は各濃度のＣＲＳＰとＥＩＰＡを示す。＊＊＊はｐ＜０．００１で有意差があったことを示す。
【図７】図７は、ＬＬＣ−ＰＫ１細胞を用いた本発明のペプチドのＣＲＳＰによるカルシウムイオンの取り込み試験の結果を示すものである。図７の縦軸は各イオンの取り込み量（ｃｐｍ）を示し、横軸に左端はコントロール（ペプチド無添加）を示し、その右はｓＣＴ（サケカルシトニン）及びＣＲＳＰを示す。＊はｐ＜０．０５で、＊＊はｐ＜０．０１で有意差があったことを示す。
【図８】図８は、ＬＬＣ−ＰＫ１細胞における本発明のペプチドのＣＲＳＰによる細胞増殖に伴って合成されたＤＮＡ量の測定結果を示す。図８の縦軸は１２５Ｉ−ＤＵの取り込み量（×１００ｃｐｍ／ウエル）を示し、横軸は各ペプチドの濃度の逆対数（−ｌｏｇ（ペプチド濃度（Ｍ）））を示す。図８の黒丸（●）は本発明のＣＲＳＰを示し、白丸（○）はブタカルシトニン（ブタＣＴ）を示し、白菱形（◇）はサケカルシトニン（サケＣＴ）をそれぞれ示す。
【図９】図９は、ＬＬＣ−ＰＫ１細胞における本発明のペプチドのＣＲＳＰによる細胞増殖に伴う細胞数を計数板にて計測結果を示す。図９の縦軸は細胞数（×１，０００　細胞／ウエル）を示し、横軸は左端はコントロール（ＣＲＳＰ無添加）を示し、その右は各濃度のＣＲＳＰを示す。＊印はｐ＜０．０５で有意差があったことを示す。
【図１０】図１０は、遺伝子工学的にカルシトニン受容体を発現している細胞（ＣＯＳ−７）における本発明のペプチドのＣＲＳＰ刺激によるｃＡＭＰ産生能測定結果を示す。図１０の縦軸はｃＡＭＰの産生量（ｐｍｏｌ／ウエル／３０分）を示し、横軸は各ペプチド（リガンド）の濃度の逆対数（−ｌｏｇ（リガンド濃度（Ｍ））を示す。図１０の黒丸（●）は本発明のＣＲＳＰを示し、白菱形（◇）はブタカルシトニン（ｐＣＴ）をそれぞれ示す。
【図１１】図１１は、ブタカルシトニン受容体（ＣＴＲ）を発現させたオポッサム腎上皮細胞における本発明のペプチドのＣＲＳＰ刺激によるｃＡＭＰ産生能測定結果を示す。図１１の縦軸はｃＡＭＰの産生量（ｆｍｏｌ／ウエル／１時間）を示し、横軸はＣＲＳＰの濃度の逆対数（−ｌｏｇ（ＣＲＳＰ濃度（Ｍ）））を示す。図１１の黒丸（●）はブタカルシトニン受容体（ＣＴＲ）を導入したオポッサム腎上皮細胞の場合を示し、黒四角（■）はオポッサム腎上皮細胞（ＯＫ細胞）の場合を示す。
【図１２】図１２は、ブタカルシトニン受容体（ＣＴＲ）を発現させたオポッサム腎上皮細胞における本発明のペプチドのＣＲＳＰ刺激によるナトリウムイオンの取り込み試験の結果を示す。図１２の縦軸はナトリウムイオンの取り込み量の比（コントロールを１００とする）を示し、横軸はＣＲＳＰの濃度の逆対数（−ｌｏｇ（ＣＲＳＰ濃度（Ｍ）））を示す。図１２の黒丸（●）はブタカルシトニン受容体（ＣＴＲ）を導入したオポッサム腎上皮細胞の場合を示し、黒四角（■）はオポッサム腎上皮細胞（ＯＫ細胞）の場合を示す。　図１２中の＊＊＊印はｐ＜０．００１で有意差があったことを示す。
【図１３】図１３は、ラットにおける本発明のペプチドのＣＲＳＰ投与による血中カルシウム濃度の変化を測定した結果を示す。図１３の縦軸は血中カルシウム濃度（ｍＭ）を示し、横軸は時間（分）を示す。図１３中の＊＊印はｐ＜０．０１で有意差があったこと示す。
【図１４】図１４は、ラットにおける本発明のペプチドのＣＲＳＰ投与による血圧の変化を測定した結果を示す。図１４の縦軸は血圧（ｍｍＨｇ）を示し、横軸は時間（分）を示す。
【図１５】図１５は、ブタカルシトニン受容体（ＣＴＲ）を哺乳類発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１に導入し、アカゲザル腎細胞（ＣＯＳ−７）に発現させた細胞に対し、ＣＲＳＰ又はＣＲＳＰ−Ｇｌｙ刺激によるｃＡＭＰ産生量をラジオイムノアッセイにより測定した結果を示す。縦軸はｃＡＭＰの産生量（ｐｍｏｌ／ウエル／１３０分）を示し、横軸はＣＲＳＰの濃度の逆対数（−ｌｏｇ（ＣＲＳＰ濃度（Ｍ）））を示す。
【図１６】図１６は、ＬＬＣ−ＰＫ１細胞を用いた本発明のペプチドのブタＣＲＳＰ、ウシＣＲＳＰ及びイヌＣＲＳＰのｃＡＭＰ産生促進活性を検討した結果を示すものである。縦軸はｃＡＭＰの産生量（ｐｍｏｌ／ウエル／１０分）を示し、横軸はＣＲＳＰの濃度の逆対数（−ｌｏｇ（ＣＲＳＰ濃度（Ｍ）））を示す。図１６の（■）はブタＣＲＳＰを示し、（●）はウシＣＲＳＰを示し、（▲）はイヌＣＲＳＰをそれぞれ示す。
【図１７】図１７は、ＣＲＳＰ遺伝子の塩基配列を示す。下線部がエクソンを示す。下線部の下にＣＲＳＰ遺伝子のコードするアミノ酸配列を示す。
【図１８】図１８は、ＣＲＳＰ−２遺伝子の塩基配列の前半部分（１〜３８４０塩基）を示す。
【図１９】図１９は、ＣＲＳＰ−２遺伝子の塩基配列の後半部分（３８４１〜７６７３塩基）を示す。下線部がエクソンを示す。下線部の下にＣＲＳＰ−２遺伝子のコードするアミノ酸配列を示す。
【図２０】図２０は、ＣＲＳＰ−２のｃＤＮＡ塩基配列を示す。図２０において、実線で囲まれた部分が成熟ペプチドで、灰色がアミドに変換されると推定されるグリシンを示す。
【図２１】図２１は、ＣＲＳＰ−３のｃＤＮＡ塩基配列を示す。図２１において、実線で囲まれた部分が成熟ペプチドで、灰色がアミドに変換されると推定されるグリシンを示す。
【図２２】図２２は、ＣＴ−２のｃＤＮＡ塩基配列を示す。図２２において、実線で囲まれた部分が成熟ペプチドで、灰色がアミドに変換されると推定されるグリシンを示す。図２２における成熟体のＮ末端側にあるグルタミンはピログルタミン酸に変換されると推定される。
【図２３】図２３は、各ＣＲＳＰとＣＧＲＰやＡＭ、ＣＴ−２とＣＴのアミノ酸の比較を行った図を示す。
本発明のペプチドのＣＲＳＰ（ｐＣＲＳＰ）、ＣＲＳＰ−２（ｐＣＲＳＰ−２）、ＣＲＳＰ−３（ｐＣＲＳＰ−３）、ＣＴ−２（ｐＣＴ−２）のアミノ酸配列と、ブタカルシトニン遺伝子関連ペプチド（ｐＣＧＲＰ）、ブタカルシトニン（ｐＣＴ）、及びブタアドレノメデュリン（ｐＡＭ）のアミノ酸配列との比較を示すものである。
【図２４】図２４は、ＣＲＳＰ、ＣＲＳＰ−２、ＣＲＳＰ−３、ＣＴ−２、ＣＴ、ＣＧＲＰの遺伝子発現量をＲＴ−ＰＣＲにより高感度定量した結果を示す。図の縦軸に各種遺伝子を、横軸に遺伝子発現量を測定したブタの組織を示す。トータルＲＮＡ量の補正のためにＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素）の発現量についても測定した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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