【手続補正書】
【提出日】平成26年5月12日(2014.5.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも第１および第２多能性幹細胞系を含む細胞系のインビトロセットであって、前記第１および第２系が、それぞれ、外因性発現カセットを含み、前記第１および第２系由来の前記外因性発現カセットが分化反応性調節エレメントの制御下で選択可能またはスクリーン可能なマーカーを含み、前記第１細胞系の前記外因性発現カセットの前記分化反応性調節エレメントが、前記第２細胞系の前記外因性発現カセットの前記分化反応性調節エレメントと異なるので、前記第１細胞系における前記カセットの前記マーカーは、前記細胞が第１分化状態にある場合にのみ発現され、そして前記第２細胞系における前記カセットの前記マーカーは、前記細胞が第２分化状態にある場合にのみ発現され、前記第１および第２細胞系の前記外因性発現カセット由来の前記選択可能またはスクリーン可能なマーカーの発現を、同じ方法を用いてスクリーンまたは選択することができる、インビトロセット。
【請求項２】
前記多能性幹細胞が１以上の誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞を含む、請求項１記載の細胞系のインビトロセット。
【請求項３】
前記ｉＰＳ細胞が本質的に外因性レトロウイルス遺伝因子を含まない、請求項２記載の細胞系のインビトロセット。
【請求項４】
前記第１または第２細胞系の前記外因性発現カセットが、前記多能性幹細胞のゲノムの所定の位置で含まれる、請求項１記載の細胞系のインビトロセット。
【請求項５】
前記セットの１以上の細胞系が、トランスポゾン系中に含まれるさらなる外因性発現カセットを含む、請求項４記載の細胞系のインビトロセット。
【請求項６】
各細胞系における前記さらなる外因性発現カセットが、薬物反応性調節エレメントの制御下で選択可能またはスクリーン可能なマーカーを含む、請求項５記載の細胞系のインビトロセット。
【請求項７】
少なくとも５〜１０の異なる多能性幹細胞系を含み、それぞれが、異なる分化反応性調節エレメントを有する異なる外因性発現カセットを含む、請求項１記載の細胞系のインビトロセット。
【請求項８】
前記第１または第２細胞系の前記外因性発現カセットが少なくとも２つの別の外因性発現カセットを含み、それぞれが、異なる条件反応性調節エレメントを含む、請求項１記載の細胞系のインビトロセット。
【請求項９】
各多能性幹細胞系が、細胞系の前記セット中の他の細胞系と異なる別の容器中に含まれる、請求項１記載の細胞系のインビトロセット。
【請求項１０】
前記分化反応性調節エレメントが、
組織特異的プロモーターを含むか、または
前記細胞系の前記多能性幹細胞が選択された細胞系統に分化する場合に、選択可能またはスクリーン可能なマーカーの発現を引き起こす細胞特異的プロモーターを含む、請求項１記載の細胞系のインビトロセット。
【請求項１１】
細胞系の前記セットの１以上の細胞系が、薬物反応性調節エレメントの制御下で選択可能またはスクリーン可能なマーカーを含むさらなる外因性発現カセットを含む、請求項１記載の細胞系のインビトロセット。
【請求項１２】
前記さらなる外因性発現カセットがトランスポゾン系に含まれる、請求項１１記載の細胞系のインビトロセット。
【請求項１３】
前記細胞特異的プロモーターが、
神経前駆細胞特異的プロモーター、肝細胞前駆細胞特異的プロモーター、造血前駆細胞特異的プロモーターまたは心筋前駆細胞特異的プロモーターであるか、
選択された高分化型細胞について特異的なプロモーターであるか、あるいは
心室心筋細胞特異的プロモーター、心房心筋細胞特異的プロモーター、結節心筋細胞特異的プロモーター、動脈内皮細胞特異的プロモーター、静脈内皮細胞特異的プロモーター、リンパ内皮細胞特異的プロモーター、血液脳関門内皮細胞特異的プロモーター、ドーパミン作動性ニューロン特異的プロモーター、コリン作動性ニューロン特異的プロモーター、ＧＡＢＡ作動性ニューロン特異的プロモーター、または運動ニューロン特異的プロモーターである、請求項１０記載の細胞系のインビトロセット。
【請求項１４】
前記組織特異的プロモーターが、腎臓特異的プロモーター、腎臓髄質特異的プロモーター、腎臓皮質特異的プロモーター、心臓特異的プロモーター、汎心臓プロモーター、心房特異的プロモーター、心室特異的プロモーター、肝臓特異的プロモーター、神経特異的プロモーター、膵臓特異的プロモーター、肺特異的プロモーター、内皮特異的プロモーター、血液特異的プロモーターまたは腸特異的プロモーターを含む、請求項１０記載の細胞系のインビトロセット。
【請求項１５】
前記薬物反応性調節エレメントが薬物代謝酵素遺伝子のプロモーターを含む、請求項６記載の細胞系のインビトロセット。
【請求項１６】
前記プロモーターが、チトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ、チオプリンメチルトランスフェラーゼまたはジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼをコード化する遺伝子のプロモーターである、請求項１５記載の細胞系のインビトロセット。
【請求項１７】
前記薬物反応性調節エレメントが、薬物反応性シグナリング経路が活性化される細胞において選択可能またはスクリーン可能なマーカーの発現を引き起こす薬物シグナリング経路反応性プロモーターを含む、請求項６記載の細胞系のインビトロセット。
【請求項１８】
前記薬物シグナリング経路が、チロシンキナーゼ経路、ヘテロトリマーＧタンパク質経路、低分子量ＧＴＰａｓｅ経路、セリン／トレオニンタンパク質キナーゼ経路、ホスファターゼ経路、脂質キナーゼ経路、ヒドロラーゼ経路、サイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）介在経路、サイクリックＧＭＰ（ｃＧＭＰ）介在経路、ホスファチジルイノシトール三リン酸（ＰＩＰ３）介在経路、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）介在経路、イノシトール三リン酸（ＩＰ３）介在経路、カルモジュリンのＥＦハンドドメイン介在シグナリング経路、キナーゼタンパク質ＡＫＴのプレクストリン相同ドメイン介在シグナリング経路、クロマチン調節シグナリング経路、ＭＡＰＫシグナリング経路、アポトーシス／オートファジー
経路、翻訳制御経路、細胞周期／チェックポイント経路、ＤＮＡ損傷経路、Ｊａｋ／Ｓｔａｔシグナリング経路、ＮＦ−κΒシグナリング経路、ＴＧＦ−β／Ｓｍａｄシグナリング経路、リンパ球シグナリング経路、脈管形成経路、小胞輸送経路、細胞骨格シグナリング経路、接着経路、グルコース代謝経路、Ｗｎｔ／Ｈｅｄｇｅｈｏｇ／Ｎｏｔｃｈシグナリング経路、幹細胞系統特異化経路、核受容体介在経路、またはタンパク質フォールディングおよび安定性シグナリング経路である、請求項１７記載の細胞系のインビトロセット。
【請求項１９】
前記選択可能なマーカーが、抗生物質耐性遺伝子もしくは抗原性エピトープを含むか、または前記スクリーン可能なマーカーが、蛍光、発光もしくは生物発光タンパク質を発現する遺伝子としてさらに定義される、請求項１記載の細胞系のインビトロセット。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４２】
本発明の他の目的、特性および利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかし、詳細な説明および具体例は、本発明の好ましい実施形態を示すが、例示のためだけに提示されると理解されるべきである。なぜなら、本発明の精神および範囲内の種々の変更および修飾は、この詳細な説明から当業者には明らかになるからである。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
選択可能またはスクリーン可能なマーカーを発現させる分化反応性調節エレメントを含む第１外因性発現カセットおよびスクリーン可能なマーカーを発現させる薬物反応性調節エレメントを含む第２外因性発現カセットを含む多能性幹細胞系。
（項目２）
前記多能性幹細胞系が誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞系である、項目１記載の多能性幹細胞系。
（項目３）
前記多能性幹細胞系が外因性レトロウイルス遺伝因子を本質的に含まない、項目１記載の多能性幹細胞系。
（項目４）
前記第１または第２外因性発現カセットが多能性幹細胞系のゲノムの所定の位置で含まれる、項目１記載の多能性幹細胞系。
（項目５）
前記第１または第２外因性発現カセットがトランスポゾン系に含まれる、項目４記載の多能性幹細胞。
（項目６）
前記第１発現カセットがスクリーン可能なマーカーを含み、前記第１および第２発現カセットからの発現を、同じ方法を用いてスクリーンすることができる、項目１記載の多能性幹細胞系。
（項目７）
各スクリーン可能なマーカーが蛍光タンパク質であり、各蛍光タンパク質が異なる発光波長を含む、項目６記載の多能性幹細胞系。
（項目８）
前記第１発現カセットの前記分化反応性調節エレメントが細胞特異的プロモーターを含む、項目１記載の多能性幹細胞系。
（項目９）
前記細胞特異的プロモーターが、選択された細胞系統において優先的に発現された遺伝子のバイオインフォーマティクス分析によって同定される、項目８記載の多能性幹細胞系。
（項目１０）
前記細胞特異的プロモーターが、神経前駆細胞特異的プロモーター、肝細胞前駆細胞特異的プロモーター、造血前駆細胞特異的プロモーター、または心筋前駆細胞特異的プロモーターである、項目８記載の多能性幹細胞系。
（項目１１）
前記細胞特異的プロモーターが、選択された高分化型細胞について特異的なプロモーターである、項目８記載の多能性幹細胞系。
（項目１２）
前記細胞特異的プロモーターが、心室心筋細胞特異的プロモーター、心房心筋細胞特異的プロモーター、結節心筋細胞特異的プロモーター、動脈内皮細胞特異的プロモーター、静脈内皮細胞特異的プロモーター、リンパ内皮細胞特異的プロモーター、血液脳関門内皮細胞特異的プロモーター、ドーパミン作動性ニューロン特異的プロモーター、コリン作動性ニューロン特異的プロモーター、ＧＡＢＡ作動性ニューロン特異的プロモーター、または運動ニューロン特異的プロモーターである、項目１１記載の多能性幹細胞系。
（項目１３）
前記第１発現カセットの前記分化反応性調節エレメントが、組織特異的プロモーターを含む、項目１記載の多能性幹細胞系。
（項目１４）
前記組織特異的プロモーターが、腎臓特異的プロモーター、腎臓髄質特異的プロモータ
ー、腎臓皮質特異的プロモーター、心臓特異的プロモーター、汎心臓プロモーター、心房特異的プロモーター、心室特異的プロモーター、肝臓特異的プロモーター、神経特異的プロモーター、膵臓特異的プロモーター、肺特異的プロモーター、内皮特異的プロモーター、血液特異的プロモーター、または腸特異的プロモーターを含む、項目１３記載の多能性幹細胞系。
（項目１５）
前記第２発現カセットの前記薬物反応性調節エレメントが、薬物受容体、薬物標的、または薬物シグナリング経路反応性調節エレメントを含む、項目１記載の多能性幹細胞系。
（項目１６）
前記第２発現カセットの前記薬物反応性調節エレメントが薬物代謝酵素遺伝子のプロモーターを含む、項目１記載の多能性幹細胞系。
（項目１７）
前記プロモーターが、チトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ、チオプリンメチルトランスフェラーゼ、またはジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼをコード化する遺伝子のプロモーターである、項目１６記載の多能性肝細胞系。
（項目１８）
前記第２発現カセットの前記薬物反応性調節エレメントが、選択された薬物シグナリング経路が活性化される細胞においてスクリーン可能なマーカーを発現させる薬物シグナリング経路反応性プロモーターを含む、項目１６記載の多能性肝細胞系。
（項目１９）
前記選択された薬物シグナリング経路が、チロシンキナーゼ経路、ヘテロトリマーＧタンパク質経路、低分子量ＧＴＰａｓｅ経路、セリン／トレオニンタンパク質キナーゼ経路、ホスファターゼ経路、脂質キナーゼ経路、ヒドロラーゼ経路、サイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）介在経路、サイクリックＧＭＰ（ｃＧＭＰ）介在経路、ホスファチジルイノシトール三リン酸（ＰＩＰ３）介在経路、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）介在経路、イノシトール三リン酸（ＩＰ３）介在経路、カルモジュリンのＥＦハンドドメイン介在シグナリング経路、キナーゼタンパク質ＡＫＴのプレクストリン相同ドメイン介在シグナリング経路、クロマチン調節シグナリング経路、ＭＡＰＫシグナリング経路、アポトーシス／オートファジー経路、翻訳制御経路、細胞周期／チェックポイント経路、ＤＮＡ損傷経路、Ｊａｋ／Ｓｔａｔシグナリング経路、ＮＦ−κＢシグナリング経路、ＴＧＦ−β／Ｓｍａｄシグナリング経路、リンパ球シグナリング経路、脈管形成経路、小胞輸送経路、細胞骨格シグナリング経路、接着経路、グルコース代謝経路、Ｗｎｔ／Ｈｅｄｇｅｈｏｇ／Ｎｏｔｃｈシグナリング経路、幹細胞系統特異化経路、核受容体介在経路、またはタンパク質フォールディングおよび安定性シグナリング経路である、項目１８記載の多能性幹細胞系。
（項目２０）
前記選択可能なマーカーが抗生物質耐性遺伝子または抗原性エピトープを含む、項目１記載の多能性幹細胞系。
（項目２１）
前記スクリーン可能なマーカーが、蛍光、発光または生物発光タンパク質を発現する遺伝子としてさらに定義される、項目１記載の多能性幹細胞系。
（項目２２）
項目１記載の少なくとも２つの細胞系を含む細胞系のインビトロセットであって、前記第１または第２外因性発現カセットの前記調節エレメントが前記細胞系間で異なる、インビトロセット。
（項目２３）
応答を測定するための方法であって：
（ａ）項目１〜２２のいずれか１項に記載の多能性細胞系を、前記第１発現カセットの
発現を引き起こすために十分な分化条件下で培養し；
（ｂ）細胞を薬物と接触させ；そして
（ｃ）前記第２発現カセットの発現を測定することによって、薬物に対する応答を測定することを含む、方法。
（項目２４）
少なくとも第１および第２多能性幹細胞系を含む細胞系のインビトロセットであって、前記第１および第２系が、それぞれ、外因性発現カセットを含み、前記第１および第２系由来の前記外因性発現カセットが分化反応性調節エレメントの制御下で選択可能またはスクリーン可能なマーカーを含み、前記第１細胞系の前記外因性発現カセットの前記分化反応性調節エレメントが、前記第２細胞系の前記外因性発現カセットの前記分化反応性調節エレメントと異なるので、前記第１細胞系における前記カセットの前記マーカーは、前記細胞が第１分化状態にある場合にのみ発現され、そして前記第２細胞系における前記カセットの前記マーカーは、前記細胞が第２分化状態にある場合にのみ発現され、前記第１および第２細胞系の前記外因性発現カセット由来の前記選択可能またはスクリーン可能なマーカーの発現を、同じ方法を用いてスクリーンまたは選択することができる、インビトロセット。
（項目２５）
前記多能性幹細胞が１以上の誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞を含む、項目２４記載の細胞系のインビトロセット。
（項目２６）
前記ｉＰＳ細胞が本質的に外因性レトロウイルス遺伝因子を含まない、項目２５記載の細胞系のインビトロセット。
（項目２７）
前記第１または第２細胞系の前記外因性発現カセットが、前記多能性幹細胞のゲノムの所定の位置で含まれる、項目２４記載の細胞系のインビトロセット。
（項目２８）
前記セットの１以上の細胞系が、トランスポゾン系中に含まれるさらなる外因性発現カセットを含む、項目２７記載の細胞系のインビトロセット。
（項目２９）
各細胞系における前記さらなる外因性発現カセットが、薬物反応性調節エレメントの制御下で選択可能またはスクリーン可能なマーカーを含む、項目２８記載の細胞系のインビトロセット。
（項目３０）
少なくとも５〜１０の異なる多能性幹細胞系を含み、それぞれが、異なる分化反応性調節エレメントを有する異なる外因性発現カセットを含む、項目２４記載の細胞系のインビトロセット。
（項目３１）
前記第１または第２細胞系の前記外因性発現カセットが少なくとも２つの別の外因性発現カセットを含み、それぞれが、異なる条件反応性調節エレメントを含む、項目２４記載の細胞系のインビトロセット。
（項目３２）
各多能性幹細胞系が、細胞系の前記セット中の他の細胞系と異なる別の容器中に含まれる、項目２４記載の細胞系のインビトロセット。
（項目３３）
前記分化反応性調節エレメントが組織特異的プロモーターを含む、項目２４記載の細胞系のインビトロセット。
（項目３４）
前記分化反応性調節エレメントが、前記細胞系の前記多能性幹細胞が選択された細胞系統に分化する場合に、選択可能またはスクリーン可能なマーカーの発現を引き起こす細胞特異的プロモーターを含む、項目２４記載の細胞系のインビトロセット。
（項目３５）
細胞系の前記セットの１以上の細胞系が、薬物反応性調節エレメントの制御下で選択可能またはスクリーン可能なマーカーを含むさらなる外因性発現カセットを含む、項目２４記載の細胞系のインビトロセット。
（項目３６）
前記さらなる外因性発現カセットがトランスポゾン系に含まれる、項目３５記載の細胞系のインビトロセット。
（項目３７）
前記細胞特異的プロモーターが、神経前駆細胞特異的プロモーター、肝細胞前駆細胞特異的プロモーター、造血前駆細胞特異的プロモーターまたは心筋前駆細胞特異的プロモーターである、項目３３記載の細胞系のインビトロセット。
（項目３８）
前記細胞特異的プロモーターが、選択された高分化型細胞について特異的なプロモーターである、項目３４記載の細胞系のインビトロセット。
（項目３９）
前記細胞特異的プロモーターが、心室心筋細胞特異的プロモーター、心房心筋細胞特異的プロモーター、結節心筋細胞特異的プロモーター、動脈内皮細胞特異的プロモーター、静脈内皮細胞特異的プロモーター、リンパ内皮細胞特異的プロモーター、血液脳関門内皮細胞特異的プロモーター、ドーパミン作動性ニューロン特異的プロモーター、コリン作動性ニューロン特異的プロモーター、ＧＡＢＡ作動性ニューロン特異的プロモーター、または運動ニューロン特異的プロモーターである、項目３８記載の細胞系のインビトロセット。
（項目４０）
前記組織特異的プロモーターが、腎臓特異的プロモーター、腎臓髄質特異的プロモーター、腎臓皮質特異的プロモーター、心臓特異的プロモーター、汎心臓プロモーター、心房特異的プロモーター、心室特異的プロモーター、肝臓特異的プロモーター、神経特異的プロモーター、膵臓特異的プロモーター、肺特異的プロモーター、内皮特異的プロモーター、血液特異的プロモーターまたは腸特異的プロモーターを含む、項目３３記載の細胞系のインビトロセット。
（項目４１）
前記薬物反応性調節エレメントが薬物代謝酵素遺伝子のプロモーターを含む、項目２９記載の細胞系のインビトロセット。
（項目４２）
前記プロモーターが、チトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ、チオプリンメチルトランスフェラーゼまたはジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼをコード化する遺伝子のプロモーターである、項目４１記載の細胞系のインビトロセット。
（項目４３）
前記薬物反応性調節エレメントが、薬物反応性シグナリング経路が活性化される細胞において選択可能またはスクリーン可能なマーカーの発現を引き起こす薬物シグナリング経路反応性プロモーターを含む、項目２９記載の細胞系のインビトロセット。
（項目４４）
前記薬物シグナリング経路が、チロシンキナーゼ経路、ヘテロトリマーＧタンパク質経路、低分子量ＧＴＰａｓｅ経路、セリン／トレオニンタンパク質キナーゼ経路、ホスファターゼ経路、脂質キナーゼ経路、ヒドロラーゼ経路、サイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）介在経路、サイクリックＧＭＰ（ｃＧＭＰ）介在経路、ホスファチジルイノシトール三リン酸（ＰＩＰ３）介在経路、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）介在経路、イノシトール三リン酸（ＩＰ３）介在経路、カルモジュリンのＥＦハンドドメイン介在シグナリング経路、キナーゼタンパク質ＡＫＴのプレクストリン相同ドメイン介在シグナリング経路、クロマチン調節シグナリング経路、ＭＡＰＫシグナリング経路、アポトーシス／オートファジー
経路、翻訳制御経路、細胞周期／チェックポイント経路、ＤＮＡ損傷経路、Ｊａｋ／Ｓｔａｔシグナリング経路、ＮＦ−κΒシグナリング経路、ＴＧＦ−β／Ｓｍａｄシグナリング経路、リンパ球シグナリング経路、脈管形成経路、小胞輸送経路、細胞骨格シグナリング経路、接着経路、グルコース代謝経路、Ｗｎｔ／Ｈｅｄｇｅｈｏｇ／Ｎｏｔｃｈシグナリング経路、幹細胞系統特異化経路、核受容体介在経路、またはタンパク質フォールディングおよび安定性シグナリング経路である、項目４３記載の細胞系のインビトロセット。
（項目４５）
前記選択可能なマーカーが、抗生物質耐性遺伝子もしくは抗原性エピトープを含むか、または前記スクリーン可能なマーカーが、蛍光、発光もしくは生物発光タンパク質を発現する遺伝子としてさらに定義される、項目２４記載の細胞系のインビトロセット。
（項目４６）
多能性幹細胞を提供する方法であって：
（ａ）多能性幹細胞の細胞系のインビトロセットであって、それぞれが、細胞または組織特異的発現を調節する分化反応性調節エレメントの制御下で異なる外因性発現カセットを含むインビトロセットを提供するステップ；
（ｂ）薬物反応性調節エレメントの制御下で１以上のさらなる発現カセットを提供するステップ；および
（ｃ）１以上のさらなる発現カセットを細胞系のインビトロセットに導入するステップ
を含む、方法。
（項目４７）
分化細胞を提供する方法であって：
（ａ）項目２４〜４４のいずれか１項にしたがって、多能性幹細胞の細胞系のインビトロセットを提供するステップ；および
（ｂ）多能性幹細胞を分化させる条件下で多能性幹細胞を培養して、分化細胞を提供するステップ
を含む、方法。
（項目４８）
化合物を、特定の細胞または組織型の分化に対するその影響について試験する方法であって：
（ａ）項目２４〜４４のいずれか１項にしたがって、多能性幹細胞の細胞系のインビトロセットを提供するステップ；
（ｂ）多能性幹細胞を試験化合物の存在下、分化条件下で培養するステップ；および
（ｃ）多能性幹細胞の選択された細胞系統または組織型への分化に対する試験化合物の影響について、選択可能またはスクリーン可能なマーカーの発現を測定するステップ
を含む、方法。