(57)【要約】【課題】免疫賦活作用及び腫瘍抑制効果有する海藻抽出物を含む組成物を提供する。【解決手段】スジメの水性媒体抽出物を有効成分とする抗腫瘍剤及びスジメの酸抽出物を有効成分とする免疫賦活剤。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
スジメの抽出物を含む、食料品又は飲料。
【請求項２】
スジメの抽出物が、酸抽出物である、請求項１記載の食料品又は飲料。
【請求項３】
スジメの抽出物が、水抽出物である、請求項１記載の食料品又は飲料。
【請求項４】
スジメの抽出物が、アルカリ抽出物である、請求項１記載の食料品又は飲料。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、免疫賦活作用及び又は抗腫瘍細胞効果を有する、褐藻類であるスジメからの抽出物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
北海道東部では、アイヌワカメ、スジメ、カレキグサ、ヒバマタ等の海藻が天然に生育し、大量に採取可能であるが、食用に適さないこと等から、資源としては活用されていなかった。
【０００３】
さらに、歯舞漁業協同組合では、コンブ等の有用資源保護の観点から、根室近海に生育するスジメやアイヌワカメなどの未利用海藻を年間６００トン駆除しており、アイヌワカメ、スジメ等の雑海藻の処分が深刻な問題となっている。
【０００４】
一方、近年、海藻類に含まれる生理活性物質についての研究が進み、海藻類中には、アルギン酸、フコイダン、カラギナン等の高分子多糖体が含まれていることが分かってきた。この高分子多糖体は生体においてマクロファージやナチュラルキラー細胞などの免疫細胞を活性化することでガン細胞への攻撃を高め、抗腫瘍効果を示すと考えられている（特許文献１〜３）。海藻類のほかにも、担子菌類より抽出された高分子多糖体成分、シイタケのレンチナン、カワラタケのクレスチン、スエヒロタケのシゾフィラン糖はすでに医薬品の免疫療法剤としてガン治療に２０年以上用いられてきている（特許文献４及び５）。
【０００５】
しかし、海藻成分に由来する抗腫瘍物質や免疫賦活物質等の生理活性物質については、まだ研究が少なく、今後の研究対象としての必要性は高い。
【０００６】
そこで、本発明者は、鋭意研究を重ねた結果、スジメの抽出物が抗腫瘍物活性や免疫賦活活性を有することを発見し、本発明を完成させた。
【０００７】
【特許文献１】
特開平１０−１５８１５６号公報
【特許文献２】
特開平５−１３９９８８号公報
【特許文献３】
特開平６−２５６２０８号公報
【特許文献４】
特開平７−２１５９９０号公報
【特許文献５】
特開平１０−１９５１０６号公報
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、スジメの抽出物を含む、食料品又は飲料を提供する。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明で用いる海藻としては、スジメやアイヌワカメ等を挙げることができ、特にスジメが好ましい。これらの海藻は、そのままでも用いられるが、水洗し汚れを除き、乾燥した後、スライス状に裁断したもの又は粉砕した乾燥粉末として用いるのが好ましい。
【００１０】
洗浄した乾燥海藻に水性溶媒を加えて抽出操作を行う。水性溶媒としては水が好ましいが、水に塩酸等の酸又は水酸化ナトリウム等のアルカリ性水溶液を用いることもできる。
【００１１】
抽出温度は、室温〜沸点であり、好ましくは５０〜９０℃であり、より好ましくは８０〜９５℃である。抽出時間は、５分〜７２時間であり、好ましくは３０分〜２０時間、より好ましくは１〜３時間である。また、抽出操作は１回でもよいが、２回以上繰り返して行うこともできる。
【００１２】
得られた抽出液から、ろ過、遠心分離、デカンテーション等によって固形分を除去する。
【００１３】
得られた抽出液は、そのままか、又は必要に応じ、中和、脱塩、濃縮して使用することができるが、通常は、さらに一般的な精製処理を行うことが好ましい。精製処理としては、有機溶媒による沈殿、硫安、食塩、塩化カリウム等を用いる塩析、透析、限外ろ過、逆浸透処理、デキストラン、ポリアクリルアミドゲル等を充填したカラムを用いるゲルろ過等を用いることができる。また、これらの処理を２つ以上組み合わせて行うこともできる。
【００１４】
以上の操作で得られた活性成分を含む抽出物は、そのまま免疫賦活剤又は抗腫瘍剤として用いることができるが、通常は、さらに、噴霧乾燥、凍結乾燥、真空乾燥、熱風乾燥等によって乾燥することができる。
【００１５】
本発明の抽出物は、大量に接種しても生体に悪影響を及ぼさないという利点を有することから、抽出物それ自体又は種々の栄養分を加えて、又は飲食品中に含有させた免疫賦活作用又は抗腫瘍作用を有する機能性食品又は健康食品として提供することができる。具体的には、各種のビタミン類、ミネラル類等の栄養分を加えて、例えば、栄養ドリンク、豆乳、スープ等の液状の食品や各種形状の固形食品、さらには、粉末状としてそのままか、又は各種食品へ添加して用いることもできる。かかる機能性食品、健康食品としての本発明の抽出物の有効成分の含有量は、成人１日体重１ｋｇ当たり１０〜１０００ｍｇ、好ましくは３０〜３６０ｍｇであり、単回又は２〜３回に分けて摂取することができる。
【００１６】
【実施例】
実験方法  海藻由来高分子多糖体の抽出と分画
図１に操作の流れを示す。乾燥スジメ１００ｇをスライス状に裁断し、水２０００ｇ中に入れ、８０〜９５℃にて２時間抽出を行った。ろ紙による吸引ろ過を行ない、ろ液１，２６５ｇを得た。このろ液はエキス抽出量として２９．２ｇに相当した。先のろ液から６００ｇをミリポア製ペリコンＸＬモジュールＢｉｏｍａｘ−１０の限外ろ過装置（分画分子量１０，０００）にて透析処理を行った。濃縮液が１５０ｍｌになったところで３倍量の水を加えて６００ｍｌとし、２度目の透析を行った。この操作を繰り返し、合計４回の透析処理にて高分子多糖体の精製を行った。
【００１７】
４回目の濃縮液１５０ｍｌは減圧濃縮にて約５０ｍｌとし、無水エタノールにより沈殿を析出させた。
残りのろ液６６５ｇについても同様の操作で沈殿を析出し、先の析出沈殿と合わせ、ろ過および減圧乾燥後にスジメ高分子多糖体水抽出物２．３ｇを最終的に得た。乾燥スジメからの高分子多糖体回収率は２．３％であった。
【００１８】
他に０．１Ｍ  ＮａＯＨおよび０．１Ｍ  ＨＣｌの溶媒を用いてエキス抽出を行い、同様の分画処理にて、スジメ高分子多糖体アルカリ抽出物、スジメ高分子多糖体酸抽出物を調製した。さらに乾燥アイヌワカメよりアイヌワカメ高分子多糖体水抽出物、アイヌワカメ高分子多糖体アルカリ抽出物、アイヌワカメ高分子多糖体酸抽出物を調製した。一般にアルギン酸はうすいアルカリ溶液で、フコイダンはうすい塩酸溶液で抽出されるといわれている（山田信夫、海藻利用の科学（２０００））。
【００１９】
免疫賦活作用、抗腫瘍作用等に係る科学的評価
インビトロでのスクリーニング「ＷＳＴ−１アッセイ［新本洋士ら、日本食品科学工学会誌、６４−６８，４３（１９９６）］」
１）細胞
ＷＳＴ−１アッセイはマイクロカルチャープレートを用いる細胞増殖測定法である。生細胞によって生成される水溶性ホルマザンをプレートリーダーで測定することにより、細胞増殖を迅速に測定することができる。
今回ヒューマンサイエンス研究資源バンクより分譲を受けたヒト由来接着性細胞株３株（肺ガン細胞株Ａ５４９、胃ガン細胞株ＭＫＮ２８、類表皮ガンＡ−４３１）を用いた。細胞はそれぞれＲＰＭＩ１６４０（旭テクノグラス）、ＥＭＥＭ（Ｇｉｂｏｏ）ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｏｏ）に１０％牛胎児血清を添加した培地で培養した。細胞をトリプシン処理により回収し、２〜４日毎に１：１０から１：５の希釈倍率で継代培養した。培養は３７℃、５％炭酸ガス９５％空気、湿度９０％以上の条件下で行った。
【００２０】
２）海藻抽出物および対照物
調製した海藻由来高分子多糖体はスジメ水抽出物、スジメアルカリ抽出物、スジメ酸抽出物、アイヌワカメ水抽出物、アイヌワカメアルカリ抽出物、アイヌワカメ酸抽出物の６種類であった。コントロールとして抗悪性腫瘍剤クレスチン（ＰＳＫ、三共）、アルギン酸ナトリウム（和光純薬）、フコイダン（シグマ）を用いた。
【００２１】
３）培養細胞の海藻抽出物存在下での培養
１〜２．５×１０４／ｍｌの密度の細胞懸濁液１００μｌをマイクロカルチャープレートに分注し、３７℃で２４時間培養後、培地を除き、培地に溶解した海藻抽出物をろ過滅菌後、１００μｌ添加し、３日間培養後、細胞増殖をＷＳＴ−１アッセイで測定した。また、対照として細胞無添加区、抽出物無添加区（培地のみ）も測定した。
【００２２】
４）ＷＳＴ−１アッセイ
細胞を培養したマイクロカルチャープレートにセルカウンティングキット（同仁）で調製したＷＳＴ−１溶液１０μユを添加し、３７℃で２時間インキュベート後、マイクロプレートリーダー（バイオラッド５５０）で主波長４５０ｎｍ、参照波長６３０ｎｍで吸光度を測定し、細胞無添加区の吸光度を差し引き、抽出物無添加区（培地のみ）の吸光度を１００％ととして生存率を求めた。
【００２３】
インビボでの抗腫瘍作用および免疫賦活作用（マウス経口投与）
抗腫瘍物質のスクリーニングは、１９４８年、マウスリンパ性白血病Ｌ−１２１０が見出されたことに始まり、米国国立ガン研究所（ＮＣＩ）のスクリーニング組織では、Ｌ−１２１０に加え、Ｓａｒｃｏｍａ１８０及びＣａ７５５の３種類の腫瘍株を用いた術式が１９５９年頃より採用されるようになった。その後、多くの腫瘍株が使用されるようになったが、スクリーニング系において最も重要なことは、臨床上有用な薬剤の効果を予言しうるような系を用いることである（Ｒ．Ｉ．Ｇｅｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍ．  Ｒｅｐ．  Ｐａｒｔ  ２，  ３（１９７２）、塚越茂著、ガンの薬物療法開発と効果判定、リアライズ社、東京、２１−２７頁、１９８５年）。
【００２４】
現在臨床で使用されているほとんど全ての制ガン剤は、Ｃａ７５５に対して有効性が確かめられていることから、Ｃａ７５５を使用した抗腫瘍作用の検討は有用であると考える（塚越茂（１９８５）：癌の薬物療法開発と効果判定、リアライズ社、東京、２１〜２７頁）。
【００２５】
１）被験物質
インビトロでのスクリーニング（ＷＳＴ−１アッセイ）で効果の高かったスジメアルカリ抽出物を中心とし、スジメ水抽出物と、対象とてクレスチンを選んで行った。
【００２６】
２）使用動物
５〜６週齢のＳｌｃ：ＢＤＦ１雄性マウスを日本工スエルシー株式会社より購入し、１週間の検疫期間を含む予備飼育の後、一般状態に異常が認められなかった動物を選択して試験に使用した。実験開始時の体重は、２０．１〜２６．１ｇであった。動物は耳パンチ及び尾へのフェルトペンによる動物番号の記載により個体識別を行った。また、収容したケージには、実験中、群及び動物番号を記入したカードを付した。
【００２７】
３）飼育条件
予備飼育及び実験期問を通じ、温度２２±３℃、湿度５０±２０％、照明１２時間（８：００〜２０：００）、換気回数１３〜１７回／時間の環境下で、ステンレス製可動ラック（１７９０Ｗ×４７０Ｄ×１６５０Ｈ（ｍｍ））に装着したポリザルフォン製ケージ（外径２６５Ｗ×４２７Ｄ×２０４Ｈ（ｍｍ））に５〜６匹の集団で収容した。飼料はステンレス製固型飼料給餌器により固型飼料、ラボ服ストック（日本農産工業（株））を、水はポリザルフォン製給水器（先管ステンレス製）により水道水を、各々自由に与えた。
【００２８】
４）試験方法
６〜７週齢のＢＤＦ１マウスを、体重を指標として層別連続無作為化法によって群分けし、表１の群構成に基づき使用した。Ｇ群を除いた全ての群においては、マウスに被験物質を１目１回７日間経口投与した。投与７日目に、Ｃ５７ＢＬ／６マウスで継代維持した１４目目の腫瘍細胞アデノカルシノーマ７５５（以下、Ｃａ７５５と略）を、試験用マウスの腹側部皮下に１×１０５細胞／０．０５ｍｌ／マウスの割合で移植した。腫瘍移植後、同様に１４日間連続で合計２１日間被験物質を経口投与した。Ｇ群については腫瘍移植翌目より１日１回１４日間連続で経口投与した。被験物質投与終了翌目、エーテル麻酔下で抗凝固剤にヘパリンナトリウムを用いて後大静脈から採血し、血漿を分画した。採血終了後、腫瘍を摘出して湿重量を測定した。群Ａ，Ｃ，Ｆ，Ｉ及びＫの血漿からＩＬ−２，ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４及びＩＬ−１０濃度をＥＬＩＳＡ法（ＥＮＤＯＧＥＮ，Ｉｎｃ．）により定量した。
【００２９】
【表１】
2004215506.tif 000002
【００３０】
インビトロでの免疫賦活作用（リンパ球混合培養による増殖反応、ｍｉｘｅｄ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎ、ＭＬＲ［藤原大美ら、免疫研究法ハンドブック、１１３−１１７（１９９６）］）
１）ヒトＭＬＲ
実験に用いたヒト末梢血リンパ球（ＰＢＬ）は、健常人ボランティア末梢血より分離した。一人のドナーのＰＢＬは、マイトマイシンＣを２０分間処理した後、１０６細胞／ｍｌに調整し、刺激細胞として用いた。
もう一人のドナーから得たＰＢＬはナイロンウールカラムにアプライし、３７℃で１時間インキュベーションした。ナイロンウールに吸着しないＴ細胞を回収し、１０画６細胞／ｍｌに調整した（以下、レスポンダーＴ細胞（ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ  Ｔ  ｃｅｌｌｓという）。上記のＡＰＣとレスポンダーＴ細胞を１：１の比率で混合し、９６ウェル丸底プレートに分注した。その後各スルフォリピッドを添加した。
３−４日間培養後、３Ｈ−チミジンを各ウェルに添加し、さらに２４時間培養した。ＳＫＡＴＲＯＮ  ｈａｒｖｅｓｔｅｒで細胞を採取し、シンチレーションカウンターでレスポンダーＴ細胞の放射線活性を測定した。
【００３１】
２）抽出物の調製
１０ｍｇ／ｍｌの濃度になるように超純水で溶解後、５分間の煮沸で滅菌した。ＭＬＲにおける抽出物の最終濃度は１０〜５００μｇ／ｍｌとした。
【００３２】
活性成分である高分子多溶体の物理化学的性状の解明
インビトロでのスクリーニング（ＷＳＴ−１アッセイ）で効果の高かったスジメアルカリ抽出物を中心とし、スジメ水抽出物、アイヌワカメ水抽出物、参考として食用のナガコンブ水抽出物を供試試料として用いた。
【００３３】
各エキスの酸川水分解による構成糖の分析
エキス１ｍｇを水４ｍｌに溶解して、そのうち０．８ｍｌをアンプル管に移し、エバポレーターで乾固させた。２．５Ｍトリフルオロ酢酸０．８ｍｌを加え、ドライアイス−エタノール冷媒で凍結させた。アンプル管を真空下で冷媒から出し、内容物がゆっくり融けるのを待ち、液中の気泡を除いた。封管後、アルミブロックヒーターで１００℃、２４時間加熱した。アンプル管を開封後、内容物をエッペンドルフチューブに移し、エバポレーターで乾固させ、２０μｌの水で溶解した。これを１５００ｒｐｍ，３分間遠心分離して、上清を薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）分析に供した。ＴＬＣにはシリカゲルを用いて、展開溶媒にはｎ−ブタノール：酢酸：水＝２：１：１（ｖ／ｖ／ｖ）、呈色試薬にはオルシノール硫酸を用いた。ＴＬＣ標品として、Ｄ−グルコース（和光純薬工業）および同条件で加水分解した試薬のアルギン酸（和光純薬工業）加水分解物を用いた。
【００３４】
各エキスのウロン酸含量の定量
各エキスは褐藻抽出物であるので、アルギン酸に特徴的なＤ−マンニュロン酸やＬ−グルロン酸などのウロン酸を大量に含むことが予想される。よって、各エキスのウロン酸含量を測定した。あらかじめ試薬Ａ（ホウ酸ナトリウム０．９５ｇを濃硫酸１００ｍｌに溶解した）および試薬Ｂ（カルバゾール０．１２５ｇを無水メタノール１００ｍｌに溶解した）を調製しておいた。１０μｇ／ｍｌの各エキス溶液１ｍｌを氷冷しながら、氷冷した試薬Ａ５ｍｌを加え、１００℃、１０分間加熱したあと氷冷した。試薬Ｂ０．２ｍｌを加え、１００℃、１５分間加熱したあと室温まで冷却し、５３０ｎｍで吸光値を測定した。検量線はＤ−グルクロン酸を用いて求めた。ウロン酸量は、Ｄ−グルクロン酸当量として求めた。
【００３５】
各エキスの多糖類の分別
１）アルギン酸
アルギン酸はナトリウム塩として得られるアルカリ抽出法を用いた。各エキスを適当量秤取した。０．２Ｎ硫酸５ｍｌを加え、室温で１夜振盪した。ろ紙（東洋濾紙Ｎｏ．１）を用いてろ過し、ろ液を除いた。残渣を水１ｍｌで洗浄後に、１％炭酸ナトリウム水溶液を５ｍｌ加えて、１夜振盪した。水２０ｍｌを加えたあとにろ過した。ろ液に２倍容のエタノールを加えてアルギン酸を析出させた。ガラス棒で粗アルギン酸ナトリウムを集めた。得られた粗アルギン酸ナトリウムを水に溶解後、３倍容のエタノールを加えてアルギン酸ナトリウムを析出させた。さらに２回同じ操作を繰り返した。得られたアルギン酸ナトリウムを乾燥して重量を測定した。
【００３６】
２）不溶性ラミナラン
不溶性ラミナランは塩酸抽出法を用いた。各エキスを適当量秤敢した。０．１２５Ｎ塩酸２．５ｍｌと３７％ホルマリン１μｌを加え、７０℃で攪拌した。ろ紙（東洋濾紙  Ｎｏ．１）を用いでろ過した。残渣をさらに７０℃の水０．２ｍｌで２回洗浄した。ろ液と洗浄液をあわせた。室温で３時間撹枠後に２目闇静置した。沈殿した粗不溶性ラミナランを遠心分離（３０００ｒｐｍｍ、５分間）で集めた。乾燥後にエタノールおよびジエチルエーテルそれぞれ０．２ｍｌで洗浄後、減圧下で乾燥させて重量を測定した。
【００３７】
３）可溶性ラミナラン
粗可溶性ラミナランは塩酸糊出法を用いた。各エキスを適当量秤取した。０．０９Ｎ  塩酸２．５ｍｌを加え、室温で２時間撹拝した。遠心分離（３０００ｒｐｍ，５分間）して上清を別の容器に移した包。沈殿をさらに０．０５Ｎ塩酸０．５ｍｌで２回洗浄した。上清液と洗浄液をあわせた。エタノールを８５％になるまで加えて沈殿を生成させた。沈殿を遠心分離（３０００ｒｐｍ，５分間）で集め、エタノールおよびジエチルエーテルそれぞれ０．５ｍｌで洗浄後、減圧下で乾燥させて重量を測定した。
【００３８】
４）フコイダン
フコイダンは塩酸抽出法を用いた。各エキスを適当量秤取した。０．１７Ｎ塩酸１．３ｍｌを加え、６５〜７０℃で１時間抽出した。抽出液を水酸化ナトリウムで中和した後、減圧濃縮した。残渣を水０．５ｍｌに溶解した。エタノールを１ｍｌ加えて、遠心分離で粗フコイダンを沈殿させた。乾燥後に水２．５ｍｌに溶解後に、さらに４Ｍ塩化カルシウム１ｍｌを加えて、アルギン酸カルシウムの沈殿を遠心分離で除いた。この上清に５％セチルピリジニウムクロリド（ＣＰＣ）水溶液３ｍｌを加えた。続いて塩化カルシウムの終濃度が０．５Ｍになるように水を加えて、一晩静置した。遠心分離（３０００ｒｐｍ、５分間）によってＣＰＣ複合体を沈殿させ、３Ｍ塩化カルシウム１．５ｍｌに溶解して、エタノール７ｍｌを加えた。生成した沈殿を遠心分離（３０００ｒｐｍ、５分間）で集め、減圧下で乾燥させて重量を測定した。
【００３９】
実験結果
海藻由来高分子多糖体の抽出と分画
乾燥原料１００ｇより実験室レベルで得られた高分子多糖体の粉末は１〜８ｇであった。結果を図２に示す。アルカリ抽出では水抽出よりもエキス抽出量はあまり多くはないが、これはろ過によるロスが増えているためで、実際のアルカリエキス抽出量はさらに多いと思われる。アルカリ抽出では粘性の高い溶液となる。酸抽出ではアルカリ抽出や水抽出よりもエキス抽出量は増えているが、高分子多糖体粉末としての収量は少なかった。この理由は加水分解により、低分子へと変化するものが多いと考えられる。
【００４０】
免疫賦活作用、抗腫瘍作用等に係る科学的評価
インビトロでのスクリーニング（ＷＳＴ−１アッセイ）
１）Ａ５４９の増殖に対するスジメ、アイヌワカメの抽出物の影響
いずれの試料も濃度が高くなると細胞の生存率は減少した。対照のフコイダン、クレスチンは、増殖を強く抑制した。フコイダンは、０．５ｍｇ／ｍｌで生存率３０％であり、クレスチンは１ｍｇ／ｍｌで１０％以下であった。また、褐藻類に含まれるアルギン酸は５ｍｇ／ｍｌで５０％程度であったが、海藻抽出物ではスジメは酸、アルカリ抽出物ともに５ｍｇ／ｍｌで５０％以下を示した。（図３）
【００４１】
ＭＫＮ２８の増殖に対するスジメ、アイヌワカメの抽出物の影響
フコイダン、クレスチンは１ｍｇ／ｍｌで４０％の生存率であったが、アルギン酸は濃度を高くしてもあまり効果がみられなかった。スジメ抽出物はいずれも濃度が高くなると生存率は減少し、５ｍｇ／ｍｌで５０％以下であった。アイヌワカメは酸、アルカリ抽出物５ｍｇ／ｍｌで５０％以下の生存率であった。（図４）
【００４２】
Ａ−４３１の増殖に対するスジメ、アイヌワカメの抽出物の影響
クレスチシは１ｍｇ／ｍｌで５０％の生存率であったが、スジメのアルカリ抽出物では０．５ｍｇ／ｍｌで５０％以下の生存率を示し、海藻抽出物の中では最も高い増殖抑制効果を示した。（図５）
【００４３】
インビボでの抗腫瘍作用および免疫賦活作用（マウス経口投与）
各被験物質投与終了目の翌日に、全ての動物から腫瘍を摘出し湿重量を測定した。その結果を図６−１に示す。対照群の摘出腫瘍重量は３２２４ｍｇであった。クレスチン１００及び３００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ投与群の腫瘍重量は、それぞれ２４７９ｍｇ及び１７１７ｍｇを示し、対照群と比較していずれも有意な増殖抑制が認められた。腫瘍増殖抑制率は、それぞれ２３．１及び４６．７％と算出された。
スジメアルカリ抽出物３０，１００及び３００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ、２１日間投与群の腫瘍重量は、それぞれ３０４３、２６８４及び２１７８ｍｇを示し、対照群と比較して１００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ以上の投与で有意な増殖抑制が認められた。腫瘍増殖抑制率は、それぞれ５．６、１６．８及び３２．５％と算出された。
スジメアルカリ抽出物３００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ、１４日間投与群の腫瘍重量は２８４６ｍｇを示し、対照群と比較して有意な抑制が認められたものの、腫瘍増殖抑制率は１１．８％と低かった。スジメ水抽出物１００及び３００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ投与群の腫瘍重量は、それぞれ２７２９及び２２９８ｍｇを示し、対照群と比較していずれも有意な抑制が認められた。腫瘍抑制率は、それぞれ１５．４及び２８．７％と算出された。
【００４４】
インビトロでの免疫賦活作用（ＭＬＲ）
スジメ水抽出物は低濃度で増殖促進傾向がみられたが、高濃度（＞２００μｇ／ｍｌ）での培養は不可能であった。スジメアルカリ抽出物では、効果がみとめられなかった。スジメ酸抽出物は濃度依存的に増殖促進傾向（１０〜５００μｇ／ｍｌ）を示した。アイヌワカメ水抽出物では、増殖促進傾向は認められたが、バラツキが大きかった。アイヌワカメアルカリ抽出物では、効果が認められなかった。アイヌワカメ酸抽出物は低濃度（１０〜１００μｇ／ｍｌ）で増殖促進傾向を示した（図７）。
【００４５】
活性成分である高分子多糖体の物理化学的性状の解明
各エキスの酸加水分解による構成糖の分析
それぞれのエキス酸加水分解のＴＬＣ分析（図８）を行った。スジメアルカリ抽出物はアルギン酸加水分解物と一致したので、アルギン酸が主成分と決定できた。スジメ水抽出物は１個のスポットのみが検出されたが、同定には至らなかった。アイヌワカメ水抽出物はアルギン酸加水分解物に対応するスポットのほか、未同定のスポットが検出された。ナガコンブ水抽出物はアルギン酸加水分解物の他にＤ−グルコースに対応するスポットが検出されることから、アルギン酸の他に、ラミナランなどのグルカンが含まれていると予想される。
【００４６】
各エキスのウロン酸含量の定量
ウロン酸量はＤ−グルクロン酸量で求め、エキス中の重量％で示した（表２）。スジメアルカリ抽出物およびアイヌワカメ水抽出物でウロン酸の割合が高かった。これらのエキスはアルギン酸が多いと予想される。
【００４７】
表２    各エキス中のウロン酸の含有率
【００４８】
【表２】
2004215506.tif 000003
【００４９】
各エキスの多糖類の分別
スジメアルカリ抽出物は各多糖の含有率の合計は７３％程度であるが、その他のエキスは各多糖の含有率の合計が１００％を大きく超えた（表７）。これらの原因として、アルギン酸はＮａ塩で、可溶性ラミナランは粗収量で求めたこと、また本分画で得られたものをすべて当該多糖とみなしているため等の理由が考えられるが、おおまかな傾向は読み取れる。
スジメアルカリ抽出物はアルギン酸が主成分であった。スジメ水抽出物ではラミナランやフコイダンが比較的多かった。アイヌワカメ水抽出物ではアルギン酸が主成分であった。ナガコンブ水抽出物ではラミナランが多かった。
【００５０】
表３  各エキス中の多糖の含有率（％）
【００５１】
【表３】
2004215506.tif 000004
【００５２】
考察
海藻由来高分子多糖体の抽出と分画において、未利用資源であるスジメ、アイヌワカメを原料とし、乾燥物１００ｇより実験室レベルで得られた高分子多糖体の粉末は１〜８ｇであった。
【００５３】
アルカリ抽出では水抽出よりもエキス抽出量は多いと思われるが、粘性の高い溶液となる。
【００５４】
酸抽出ではアルカリ抽出や水抽出よりもエキス抽出量は増えているが、高分子多糖体粉末としての収量は少なくなっている。この理由は加水分解により、高分子多糖体が低分子へと変化するものが多いと考えられる。
【００５５】
今回、海藻抽出物（高分子多糖体粉末）各濃度につき、ＷＳＴ−１アッセイを用い、ヒト由来ガン細胞に対する生存率を求めた。対照としてクレスチン、アルギン酸ナトリウム、フコイダンを用い、比較検討を行った。
【００５６】
低濃度で効果が見られたのは対照試料のフコイダンやクレスチンである。海藻抽出物試料でも濃度依存的に生存率が低く（細胞増殖抑制が高い）なったが、低濃度で効果が見られた海藻抽出物試料はスジメのアルカリ抽出物のＡ−４３１（類表皮ガン細胞株）に対する効果であった。
【００５７】
試験結果
試験結果を図６−２に示した。スジメアルカリ抽出物では、投与量３０ｍｇ／ｋｇでは効果は認められなかったものの、投与量１００ｍｇ／ｋｇで１７％、投与量３００ｍｇ／ｋｇで３２％の有意な腫瘍増殖抑制効果が得られた（ｐ＜０．０１）。スジメ水抽出物でもスジメアルカリ抽出物と同様の効果が得られた。
【００５８】
移植後に投与した群（合計１４日間投与）は、移植７日前より投与した群（合計２１日間投与）よりも効果は低かった。これはスジメアルカリ抽出物を経口摂取することによって非特異的な免疫賦活活性が高められるものの、その効果が発揮されるには数日を要するものと考えられる。
【００５９】
なおクレスチンでは投与量３００ｍｇ／ｋｇで４７％の腫瘍増殖抑制効果が得られている。抗悪性腫瘍剤クレスチンの用法用量は３ｇ／日のため、６０ｋｇのヒトが１日３ｇ摂取すると、マウス投与量換算で約５０ｍｇ／ｋｇ／日となる。これは今回試験した腫瘍細胞Ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ７５５の腫瘍増殖抑制率から限って類推すると、スジメアルカリ抽出物投与量１００ｍｇ／ｋｇにほぼ相当するものと予測される。換言すればスジメアルカリ抽出物を１日６ｇ摂取すると、抗悪性腫瘍剤クレスチンを１日３ｇ服用したことと同等の効果に匹敵する。
【００６０】
インビトロによる免疫賦活作用では、レスポンダーＴ細胞がスジメ酸抽出物により濃度依存的に明らかな増殖促進傾向（１０〜５００μｇ／ｍｌ）を示した。アイヌワカメ酸抽出物も低濃度（１０〜１００μｇ／ｍｌ）で増殖促進傾向を示した。
【００６１】
特にスジメ酸抽出物には樹状細胞等の抗原提示細胞を刺激し、不細胞増殖を促進させる物質が含まれていることが示唆される。３２％の有意な腫瘍増殖抑制効果が得られたスジメアルカリ抽出物以上に、スジメ酸抽出物が抗腫瘍効果有することが期待できる。
【００６２】
スジメの抽出物（酸、アルカリ、水抽出物）についてインビボでの抗腫瘍作用および免疫賦活作用（マウス経口投与）
【００６３】
使用動物
５週齢のＳｌｃ：ＢＤＦ１雄性マウスを日本エスエルシー株式会社より購入し、１週間の検疫期間を含む予備飼育の後、一般状態に異常が認められなかった動物を選択し試験に使用した。実験開始時の体重は、２５．０〜２９．８ｇであった。動物は、耳パンチ及び尾へのフェルトペンによる動物番号の記載により個体を識別した。また、収容したゲージには、実験中、処理群及び動物番号を記入したカードを付した。
【００６４】
飼育条件
予備飼育及び実験期間を通じ、温度２２±３℃、湿度５０±２０％、照明１２時間（８：００〜２０：００）、換気回数１３〜１７回／時間の環境下で、ステンレス製可動ラック（１７９０Ｗ×４７０Ｄ×１６５０Ｈｍｍ）に装着したポリサルフォン製ケージ（２６５Ｗ×４２７Ｄ×２０４Ｈｍｍ）に５〜６匹の集団で収容した。飼料は、ステンレス製固形飼料給餌器により固形飼料、ラボＭＲストック（日本農産工業株式会社）を、水は、ポリサルフォン製給水器（先管ステンレス製）により水道水を、各々自由に与えた。
【００６５】
試験方法
６週齢のＢＤＦ１マウスを、表４の群構成に基づき使用した。投与７日目に、Ｃ５７ＢＬ／６マウスで継代維持した１０〜１４日目の腫瘍細胞を試験用マウスの腹側部皮下に１×１０５細胞／０．０５ｍｌ／マウスの量で移植した。被験物質を１日１回経口投与した。被験物質投与最終日の翌日に、エーテル麻酔下にマウスの腹部大動脈より採血し、その後腫瘍を摘出しその重量を測定した。体重測定は、２回／週の割合で行った。得られた血液は、血漿を分画し、−８０℃で保存した。
【００６６】
【表４】
2004215506.tif 000005
【００６７】
統計処理
各群で得られた数値の平均値及び標準誤差を算出した。各群間の統計分析は、Ｂａｒｔｌｅｔｔ法（有意水準５％）による等分散性の検定、等分散の場合は、さらに一元配置分散分析を行い、有意な場合には、Ｔｕｒｋｅｙ法により平均値の比較を行った。不等分散の場合は、Ｋｒｕｓｋａｌ−ＷａｌｌｉｓのＨ検定を行い、有意な場合はＴｕｒｋｅｙ法により平均順位の比較を行った。有意水準は、危険率５％及び１％とした。
【００６８】
また、平均摘出腫瘍重量について、対照群に対する被験物質投与群の割合（Ｔ／Ｃ）から、米国国立癌研究所（ＮＣＩ）の評価基準（Ｇｃｒａｎ，  Ｒ．Ｉ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍ．  Ｒｅｐ．  Ｐａｒｔ３，  ｖｏｌ３  （１９７２））に従い、以下のように腫瘍抑制率（％）を算出し、抗腫瘍効果の判定を行った。
Ｔ／Ｃ（％）＝（被験物質投与群の平均摘出腫瘍重量（ｍｇ）／対照群の平均摘出
腫瘍重量（ｍｇ））×１００
腫瘍抑制率（％）＝１００−Ｔ／Ｃ≧３０％を抗腫瘍効果ありとした。
【００６９】
試験結果
試験結果を図６−２に示した。
１．スジメ酸抽出物
対照群の摘出腫瘍重量は、２３９０ｍｇであった。
スジメ酸抽出物３０、１００及び３００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙの２１日間投与群では、腫瘍重量は、それぞれ６０８、４９８及び３９２ｍｇを示し、１００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ以上の投与で対照群と比較して有意な抑制が認められた。３００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙの１４日間投与群では、腫瘍重量は、８３４ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙを示し、対照群と比較して抑制傾向が認められた。腫瘍抑制率は、３０、１００及び３００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙの２１日投与群では、それぞれ７４．６、７９．２及び８３．６％、３００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙの１４日間投与群では、６５．１％と算出され、いずれも抗腫瘍効果ありと判定された。
【００７０】
２．スジメアルカリ抽出物
スジメアルカリ抽出物３００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙの２１日間投与群では、腫瘍重量は、５６９ｍｇを示し、対照群と比較して有意な抑制が認められた。腫瘍抑制率は、７６．２％と算出され、抗腫瘍効果ありと判定された。
【００７１】
３．スジメ水抽出物
スジメ水抽出物３００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙの２１日間投与群では、腫瘍重量は、４１８ｍｇを示し、対照群と比較して有意な抑制が認められた。腫瘍抑制率は、８２．５％と算出され、抗腫瘍効果ありと判定された。
【００７２】
４．スジメ乾燥粉末
スジメ乾燥粉末３００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙの２１日間投与群では、腫瘍重量は、６８５ｍｇを示し、対照群と比較して有意な抑制が認められた。腫瘍抑制率は、７１．４％と算出され、抗腫瘍効果ありと判定された。
【００７３】
高分子多糖体の構造の解析
褐藻類にはアルギン酸、フコイダン、フコイダンなどの高分子多糖体が含まれる。一般にアルギン酸はうすいアルカリで、フコイダンはうすい塩酸で抽出されるといわれる。よってＴＬＣ分析、ウロン酸含量、多糖類の分別により高分子多糖体の構造の解析を行った。
【００７４】
スジメアルカリ抽出物はアルギン酸が主成分であり、スジメ水抽出物ではラミナランやフコイダンが比較的多かった。アイヌワカメ水抽出物ではアルギン酸が主成分であり、アイヌワカメアルカリ抽出物ではアルギン酸が主成分と考えられる。
【００７５】
インビトロによる免疫賦活作用で、レスポンダーＴ細胞が濃度依存的に明らかな増殖促進傾向を示した試料は、スジメアルカリ抽出物でなくスジメ酸抽出物であった。よって樹状細胞等の抗原提示細胞を刺激し、Ｔ細胞増殖を促進させる物質はラミナランもしくはフコイダンに関係するものと推測される。
【００７６】
本抽出物は、安全かつ廉価であり、その免疫賦活性及び腫瘍抑制効果を利用した機能性食品の原料として利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】海藻由来高分子多糖体製造フローである。
【図２】海藻由来高分子多糖体の抽出・分析結果である。
【図３】各種抽出物添加時のＡ５４９の生存率である。
【図４】各種抽出物添加時のＭＫＮ２８の生存率である。
【図５】各種抽出物添加時のＡ４３１の生存率である。
【図６】インビボでの抗腫瘍作用である。
【図７】インビボでの抗腫瘍作用である。
【図８】レスポンダーＴ細胞の増殖である。
【図９】海藻エキスの酸加水分解物の分析ＴＬＣである。
【図１】
2004215506.tif 000006
【図２】
2004215506.tif 000007
【図３】
2004215506.tif 000008
【図４】
2004215506.tif 000009
【図５】
2004215506.tif 000010
【図６】
2004215506.tif 000011
【図７】
2004215506.tif 000012
【図８】
2004215506.tif 000013
【図９】
2004215506.tif 000014