【手続補正書】
【提出日】平成26年1月22日(2014.1.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ネイティブ霊長類シスタチオニンγリアーゼと比較して少なくとも1個のアミノ酸置換を含む霊長類シスタチオニンγリアーゼバリアントを含むポリペプチドであって、該シスタチオニンγリアーゼバリアントが、L-メチオニン分解について10M-1s-1〜×106M-1s-1の触媒特異性定数（catalytic specificity constant）kcat/KMを有し、
少なくとも1個のアミノ酸置換が、SEQ ID NO:1のE59、E119、および／またはR339に相当するアミノ酸の位置におけるものであり、かつ
59位、119位、および／または339位のアミノ酸における置換が、R119L置換、E339V置換、およびE59VまたはE59Nの置換を含み、かつ
ネイティブ霊長類シスタチオニンγリアーゼが、SEQ ID NO:1の配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有する、
前記ポリペプチド。
【請求項２】
シスタチオニンγリアーゼバリアントが、L-メチオニン分解について少なくとも104M-1s-1のkcat/KMを有する、請求項1記載のポリペプチド。
【請求項３】
シスタチオニンγリアーゼバリアントが、L-ホモシスチン分解について50M-1s-1未満のkcat/KMを有する、請求項1記載のポリペプチド。
【請求項４】
ネイティブ霊長類シスタチオニンγリアーゼが、SEQ ID NO:18〜20のいずれかの配列からなる、請求項1記載のポリペプチド。
【請求項５】
ネイティブ霊長類シスタチオニンγリアーゼが、SEQ ID NO:1に記載のヒトシスタチオニンγリアーゼである、請求項1記載のポリペプチド。
【請求項６】
霊長類シスタチオニンγリアーゼバリアントが、SEQ ID NO:10〜17からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、請求項1記載のポリペプチド。
【請求項７】
異種ペプチドセグメントをさらに含む、請求項1記載のポリペプチド。
【請求項８】
異種ペプチドセグメントがXTENペプチドである、請求項7記載のポリペプチド。
【請求項９】
ポリエチレングリコールと結合している、請求項1〜8のいずれか一項記載のポリペプチド。
【請求項１０】
1個または複数個のLys残基またはCys残基を介してPEGと結合している、請求項9記載のポリペプチド。
【請求項１１】
請求項1〜10のいずれか一項記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなる核酸。
【請求項１２】
細菌における発現のためにコドンが最適化されている、請求項11記載の核酸。
【請求項１３】
請求項11記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項１４】
請求項11記載の核酸を含む宿主細胞。
【請求項１５】
細菌である、請求項14記載の宿主細胞。
【請求項１６】
遺伝子ilvAおよびmetAの欠失を有する大腸菌（E.coli）株である、請求項15記載の宿主細胞。
【請求項１７】
薬学的に許容される担体中に請求項1記載のポリペプチドまたは請求項11記載の核酸を含む、薬学的製剤。
【請求項１８】
対象における腫瘍細胞の処置のための、
・請求項1〜10のいずれか一項記載のポリペプチド、
・請求項11または12のいずれか一項記載の核酸、
・請求項13記載の発現ベクター、
・請求項17記載の薬学的製剤
を含む、組成物。
【請求項１９】
対象がメチオニン制限食で維持される、請求項18記載の組成物。
【請求項２０】
対象が普通食で維持される、請求項18記載の組成物。
【請求項２１】
対象がヒト患者である、請求項18記載の組成物。
【請求項２２】
腫瘍細胞が、乳癌、前立腺癌、神経芽腫、または膵癌の細胞である、請求項18記載の組成物。
【請求項２３】
腫瘍細胞の栄養培地中にある、請求項18記載の組成物。
【請求項２４】
栄養培地が、血液、リンパ液、または脊髄液である、請求項23記載の組成物。
【請求項２５】
以下の工程を含む、L-メチオニン分解活性を有する霊長類シスタチオニンγリアーゼバリアントを同定する方法：
（a）請求項1〜10のいずれか一項に定義される霊長類シスタチオニンγリアーゼバリアントの集団を、遺伝子ilvAおよびmetAの欠失を有する大腸菌株の細胞において発現させる工程；ならびに
（b）L-メチオニン分解活性を有する霊長類シスタチオニンγリアーゼバリアントを同定する工程であって、該同定されるバリアントを発現する細胞が、ネイティブ霊長類シスタチオニンγリアーゼを発現するがそれ以外は同一の条件にある細胞と比較して、L-メチオニンが補充された最少培地において、より高い増殖速度を有する、工程。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２９】
[本発明1001]
ネイティブ霊長類シスタチオニンγリアーゼと比較して少なくとも1個のアミノ酸置換を含む霊長類シスタチオニンγリアーゼバリアントを含むポリペプチドであって、該シスタチオニンγリアーゼバリアントが、L-メチオニン分解について約10M-1s-1〜約1×106M-1s-1の触媒特異性定数（catalytic specificity constant）（kcat/KM）を有する、前記ポリペプチド。
[本発明1002]
少なくとも1個のアミノ酸置換が、ネイティブシスタチオニンγリアーゼの基質認識部位の1個または複数個の荷電残基におけるものである、本発明1001のポリペプチド。
[本発明1003]
少なくとも1個のアミノ酸置換が、ネイティブシスタチオニンγリアーゼの59位、119位、および／または339位のアミノ酸におけるものである、前記本発明のいずれかのポリペプチド。
[本発明1004]
少なくとも1個のアミノ酸置換が、SEQ ID NO:1の59位、119位、および／または339位のアミノ酸におけるものである、前記本発明のいずれかのポリペプチド。
[本発明1005]
59位、119位、および／または339位のアミノ酸における置換が、アスパラギン酸（N）、バリン（V）、またはロイシン（L）である、前記本発明のいずれかのポリペプチド。
[本発明1006]
59位、119位、および／または339位のアミノ酸における置換が、R119L置換およびE339V置換を含む、前記本発明のいずれかのポリペプチド。
[本発明1007]
59位、119位、および／または339位のアミノ酸における置換が、E59VまたはE59Nの付加的な置換を含む、前記本発明のいずれかのポリペプチド。
[本発明1008]
シスタチオニンγリアーゼバリアントが、L-メチオニン分解について少なくとも約104M-1s-1のkcat/KMを有する、本発明1001のポリペプチド。
[本発明1009]
シスタチオニンγリアーゼバリアントが、L-ホモシスチン分解について約50M-1s-1未満のkcat/KMを有する、前記本発明のいずれかのポリペプチド。
[本発明1010]
ネイティブ霊長類シスタチオニンγリアーゼが、SEQ ID NO:1の配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有する、前記本発明のいずれかのポリペプチド。
[本発明1011]
ネイティブ霊長類シスタチオニンγリアーゼが、SEQ ID NO:1の配列に対して少なくとも98％の配列同一性を有する、前記本発明のいずれかのポリペプチド。
[本発明1012]
ネイティブ霊長類シスタチオニンγリアーゼが、SEQ ID NO:18〜20のいずれかの配列を有する、前記本発明のいずれかのポリペプチド。
[本発明1013]
ネイティブ霊長類シスタチオニンγリアーゼが、ヒトシスタチオニンγリアーゼ（SEQ ID NO:1）である、前記本発明のいずれかのポリペプチド。
[本発明1014]
異種ペプチドセグメントをさらに含む、前記本発明のいずれかのポリペプチド。
[本発明1015]
異種ペプチドセグメントがXTENペプチドである、前記本発明のいずれかのポリペプチド。
[本発明1016]
ポリエチレングリコール（PEG）と結合している、前記本発明のいずれかのポリペプチド。
[本発明1017]
1個または複数個のLys残基またはCys残基を介してPEGと結合している、前記本発明のいずれかのポリペプチド。
[本発明1018]
前記本発明のいずれかのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
[本発明1019]
細菌における発現のためにコドンが最適化されている、本発明1018の核酸。
[本発明1020]
本発明1019の核酸を含む発現ベクター。
[本発明1021]
本発明1019の核酸を含む宿主細胞。
[本発明1022]
細菌である、本発明1021の宿主細胞。
[本発明1023]
遺伝子ilvAおよびmetAの欠失を有する大腸菌（E.coli）株である、本発明1022の宿主細胞。
[本発明1024]
薬学的に許容される担体中に本発明1001のポリペプチドまたは本発明1018の核酸を含む、薬学的製剤。
[本発明1025]
対象における腫瘍細胞の処置のための、本発明1001〜1017のいずれかのポリペプチド、本発明1018または1019のいずれかの核酸、本発明1020の発現ベクター、本発明1024の薬学的製剤を含む、組成物。
[本発明1026]
対象がメチオニン制限食で維持される、本発明1025の組成物。
[本発明1027]
対象が普通食で維持される、本発明1025の組成物。
[本発明1028]
対象がヒト患者である、本発明1025〜1027のいずれかの組成物。
[本発明1029]
腫瘍細胞が、乳癌、前立腺癌、神経芽腫、または膵癌の細胞である、本発明1025〜1028のいずれかの組成物。
[本発明1030]
腫瘍細胞の栄養培地中にある、本発明1025〜1029のいずれかの組成物。
[本発明1031]
栄養培地が、血液、リンパ液、または脊髄液である、本発明1030の組成物。
[本発明1032]
以下の工程を含む、L-メチオニン分解活性を有する霊長類シスタチオニンγリアーゼバリアントを同定する方法：
（a）ネイティブ霊長類シスタチオニンγリアーゼと比較して少なくとも1個のアミノ酸置換を含む霊長類シスタチオニンγリアーゼバリアントの集団を、遺伝子ilvAおよびmetAの欠失を有する大腸菌株の細胞において発現させる工程；ならびに
（b）L-メチオニン分解活性を有する霊長類シスタチオニンγリアーゼバリアントを同定する工程であって、該同定されるバリアントを発現する細胞が、ネイティブ霊長類シスタチオニンγリアーゼを発現するがそれ以外は同一の条件にある細胞と比較して、L-メチオニンが補充された最少培地において、より高い増殖速度を有する、工程。
本発明のその他の目的、特色、および利点は、以下の詳細な説明より明白になるであろう。しかしながら、本発明の本旨および範囲に含まれる様々な変化および変更が、この詳細な説明から、当業者には明白になるため、詳細な説明および具体例は、本発明の好ましい態様を示すものであって、例示のためにのみ与えられていることが、理解されるべきである。