(57)【要約】【課題】本発明は、再生医療などに利用する神経幹細胞の分化を制御・調節する有用な方法を提供する。【解決手段】神経幹細胞におけるＯｃｔ−３／４タンパク質の発現量を制御することで、神経幹細胞から神経細胞およびグリア細胞などへの分化を調節する。より具体的には、神経幹細胞より神経細胞またはグリア細胞の、１つまたはそれ以上の形態学的、生理学的および／または免疫学的特徴を有する細胞への分化を促進または抑制する方法である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経幹細胞の分化を転写因子Ｏｃｔ−３／４タンパク質の発現量の制御により調節する方法。
【請求項２】
転写因子Ｏｃｔ−３／４タンパク質の発現量の制御が、（１）神経幹細胞を培養し、（２）培養した神経幹細胞に、Ｏｃｔ−３／４遺伝子のセンスまたはアンチセンス配列を組み込んだウイルスベクターを感染させ、ついで、（３）神経幹細胞に分化誘導刺激を与えることによる請求項１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、神経幹細胞におけるＯｃｔ−３／４タンパク質の発現量を制御することにより神経幹細胞の分化を制御・調節する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
オクタマーバインディングトランスクリプションファクター（Ｏｃｔａｍｅｒ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ：以下、Ｏｃｔと呼ぶ）−３／４は、全能性幹細胞、多能性幹細胞や発生初期胚に発現しており、ＰＯＵファミリーに属する転写因子として同定されたタンパク質である［セル（Ｃｅｌｌ）、第６０巻、第４６１−４７２頁（１９９０年）；ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、第３４４巻、第４３５−４３９頁（１９９０年）；ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、第３４５巻、第６８６−６９２頁（１９９０年）］。ここで、ＰＯＵファミリーとは、一群の転写因子のことであり、その特徴は、ＤＮＡ結合ドメインとしてＰＯＵドメインとホメオドメインを有していること、結合塩基配列の中には８塩基配列（ＡＴＧＣＡＡＡＴ）を有していることが挙げられる。また、ＰＯＵファミリーには、Ｏｃｔタンパク質の他、Ｐｉｔ１、ｕｎｃ８６などが知られている。
【０００３】
Ｏｃｔ−３／４の機能は、ノックアウトマウスを用いた研究［セル（Ｃｅｌｌ）、第９５巻、第３７９−３９１頁（１９９８年）］やＥＳ細胞を用いた研究［ネイチャー・ジェネティクス（Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、第２４巻、第３７２−３７６頁（２０００年）］により明らかとなってきている。こうした研究から、Ｏｃｔ−３／４は、胚盤胞の内部細胞塊（以下、ＩＣＭ（Ｉｎｎｅｒ  Ｃｅｌｌ  Ｍａｓｓ）と呼ぶ）や胚性幹細胞（以下、ＥＳ細胞と呼ぶ）が未分化状態を維持するために必要であることが知られている。
【０００４】
Ｏｃｔ−３／４遺伝子の発現は、発生期に応じた数多くのシス作用領域により調節されている。シス作用領域とは、転写領域を含むＤＮＡ分子と同一分子上にある遺伝子の転写活性に影響を与える領域のことを言う。例えば、ＲＡＲＥと呼ばれるプロキシマルエンハンサー領域は、胚盤葉上層やＰ１９細胞におけるＯｃｔ−３／４の発現を制御し、ディスタルエンハンサー領域は、ＥＳ細胞や胚盤胞のＩＣＭにおけるＯｃｔ−３／４の発現を制御する［エンボ・ジャーナル（ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ）、第１０巻、第２９９７−３００５頁（１９９１年）；エンボ・ジャーナル（ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ）、第１５巻、第８８８−８９９頁（１９９６年）；ディベロップメント（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）、第１２２巻、第８８１−８９４頁（１９９６年）；マンマリアン・ゲノム（Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ）、第１２巻、第３０９−３１７頁（２００１年）；モレキュラー・セル・バイオロジー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、第１４巻、第１０２６−１０３８頁（１９９４年）］。ここで、Ｐ１９細胞とは、奇形癌腫の幹細胞である胚性腫瘍細胞クローンの一種である。
しかしながら、Ｏｃｔ−３／４の発現は、生殖細胞を除いた成体細胞においては知られていなかった。
【０００５】
ところで、アルツハイマー病、ピック病、パーキンソン病、ハンチントン病、脊髄小脳変性症、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、脊髄損傷および網膜疾患などの神経疾患ならびに骨粗鬆症および骨折などの骨疾患は、神経細胞または骨芽細胞などの細胞が退化または細胞死などにより減少することにより、組織や臓器がその機能を失い発症すると考えられている。
【０００６】
一方、神経幹細胞、骨髄幹細胞および表皮幹細胞などに代表される幹細胞は、未分化の細胞であり、細胞が寿命を迎え死滅すると、その失われた細胞を補うように分化を始め、生体機能の維持に大きく貢献している。よって、神経疾患や骨疾患において、機能を失った組織にＥＳ細胞、幹細胞および／または前駆細胞を移植し、個々の生体機能を発現する細胞へ特異的に分化させることによる、あるいは分化させた細胞を移植することによる当該病態の改善・治療への試みが行われている［クリニカル・ニューロサイエンス（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ）、第１８巻、第１１号、第７１−７５頁（２０００年）；実験医学、第２０巻、第１２７６−１３１８頁（２００２年）］。
これらの治療への試みの例として、たとえば、パーキンソン病の再生医療が挙げられる。パーキンソン病の再生医療においては、ＥＳ細胞や神経幹細胞からドパミン神経を調製し、脳内に移植する方法などが実用化に向け研究されている。
一方、このような再生医療による当該病態の改善・治療においては、細胞の分化を調節することが重要である。たとえば、特開２００２−６８９７３号には、幹細胞から成熟細胞への分化誘導を促進し、神経性疾患などの細胞の退行・減少または細胞死に起因する疾患の予防および治療に有用な低分子物質が記載されている。
しかし、成熟細胞への分化のタイミングを調整し、分化の効率を改善する優れた方法は、存在しない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、神経疾患の予防および治療に有用な神経幹細胞の分化を調節する方法を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、転写因子であるＯｃｔ−３／４が、神経幹細胞に発現していることを見出した。さらに、その発現量を制御することにより、神経幹細胞の分化を調節できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明は、神経幹細胞より神経細胞またはグリア細胞の、１つまたはそれ以上の形態学的、生理学的および／または免疫学的特徴を有する細胞への分化を促進または抑制する方法に関する。
具体的には、神経幹細胞の分化を転写因子Ｏｃｔ−３／４タンパク質の発現量の制御により調節する方法であり、より具体的には、たとえば、（１）神経幹細胞を培養し、（２）培養した神経幹細胞に、Ｏｃｔ−３／４遺伝子のセンスまたはアンチセンス配列を組み込んだウイルスベクターを感染させ、ついで、（３）神経幹細胞に分化誘導刺激を与えることによる分化の調節方法である。
【００１０】
本発明における神経幹細胞の分化の調節とは、神経幹細胞から特定の生体機能を発現する細胞（神経細胞、アストロサイト、オリゴデンドロサイト）またはそれらの前駆細胞への分化を促進または抑制することをいう。
前駆細胞とは、ある分化の系譜に入り、限られた回数の分裂の後に分化を遂げるように運命づけられた細胞を意味する。
【００１１】
神経幹細胞の培養は、公知の方法に準じて行うことができる［サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第２５５巻、第１７０７−１７１０頁（１９９２年）］。具体的には、たとえば、ＩＣＲ系マウスの終脳より取り出した細胞を、非接着性の培養皿で上皮増殖因子（ＥＧＦ）および塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を含む培地で培養することにより神経幹細胞集団（以下、ニューロスフェアと呼ぶ）を形成し、これを継代培養することにより行うことができる。
【００１２】
本発明における神経幹細胞の分化は、公知の方法に準じて行うことができる［サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第２５５巻、第１７０７−１７１０頁（１９９２年）］。この際、神経幹細胞の分化誘導は、たとえば、接着刺激により誘導することができる。接着刺激は、細胞接着因子であるポリ−Ｌ−リジンや細胞外マトリクスであるコラーゲンとの接着刺激などが挙げられるが、好ましくは、ポリ−Ｌ−リジンコーティングを施したプレートとの接着が挙げられる。また、神経幹細胞の分化誘導は、分化誘導を促す因子によっても行うことができる。分化誘導を促す因子としては、たとえば、栄養因子が挙げられ、栄養因子としては、たとえば、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）およびニューロトロフィン−４（ＮＴ−４）などが挙げられる。
【００１３】
神経幹細胞の分化の調節は、細胞におけるＯｃｔ−３／４タンパク質の発現量を制御することで可能となる。
Ｏｃｔ−３／４タンパク質の発現量の制御は、エレクトロポレーションなどの物理的方法やＤＥＡＥ−デキストラン、リポソームおよびリン酸カルシウムなどを用いる化学的方法などによりセンスまたはアンチセンスＤＮＡを細胞内に導入する方法、ウイルスベクターを用いた遺伝子導入法、タンパク質発現の抑制においては、ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）を用いたＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ：ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）法などが挙げられるが、好ましくは、ウイルスベクターを用いた遺伝子導入法による発現量の制御が挙げられる。
【００１４】
ウイルスベクターを用いた遺伝子導入法で使用するウイルスは、神経幹細胞に効率よく遺伝子を導入できるものであれば特に限定されないが、たとえば、ヒト免疫不全ウイルスのようなレトロウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、ワクシニアウイルスなどが挙げられるが、アデノウイルスがより好ましい。
【００１５】
Ｏｃｔ−３／４遺伝子のセンスまたはアンチセンス配列を組み込んだウイルスベクターの調製は、公知の方法に準じて行えばよい。たとえば、「基礎からわかる  ゲノム解析実験法  中村祐介ラボ・マニュアル、羊土社、第１９１−２００頁（２００２年）」や市販の試薬やキットを用いる場合には市販品の指示書に従って実施できる。
【００１６】
Ｏｃｔ−３／４は、マウスのｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列が既に報告されている［マウスＯｃｔ−３／セル（Ｃｅｌｌ）、第６０巻、第４６１頁−第４７２頁（１９９０年）；Ｇｅｎｂａｎｋ・ＥＭＢＬ登録番号Ｍ３４３８１］［マウスＯｃｔ−４／ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、第３４４巻、第４３５頁−第４３９頁（１９９０年）；Ｇｅｎｂａｎｋ・ＥＭＢＬ登録番号Ｘ５２４７３］。
【００１７】
たとえば、これらの配列情報をもとに、同種または異種由来のＯｃｔ−３／４遺伝子の相同遺伝子およびその遺伝子産物を取得することができる。具体的には、アミノ酸配列およびｃＤＮＡ配列は既知であるので、それらの遺伝子やｃＤＮＡは、既知配列情報をもとに設計した合成プライマーやプローブを用い、適当なＤＮＡライブラリからＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）、ＲＴ−ＰＣＲ（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）、コロニーハイブリダイゼーションもしくはプラークハイブリダイゼーションなど（あるいはこれらの組合せ）により単離できる。なお、前記技術は、たとえば、「モレキュラークローニング・ア・ラボラトリー・マニュアル第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄｓ．）」などに基づき、実施できる。
【００１８】
本発明における分化した細胞の生理学的および／または免疫学的特徴は、特に制限されるものではないが、たとえば、神経細胞の特徴としては、微小管結合タンパク質２（ＭＡＰ２）、未成熟神経細胞の指標であるＴｕＪ１や成熟神経細胞のマーカーであるＮｅｕＮなど；グリア細胞のアストロサイトの特徴としては、中間系フィラメントの一種であるグリア細線維に含有される神経膠線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）など；グリア細胞のオリゴデンドロサイトの特徴としては、Ｏ４やＰＤＧＦα受容体などが挙げられる。
本発明における形態学的特徴としては、特に制限されるものではないが、たとえば、神経細胞であれば通常複数の樹状突起および１本の軸索突起を有すること；グリア細胞のアストロサイトであれば、細胞形質に富み、突起が短く密に分布するかまたは分岐しない細長い突起を有すること；グリア細胞のオリゴデンドロサイトであれば、短く分岐した突起を有することなどの形態学的特徴が挙げられる。
【００１９】
本発明の分化調節方法は、神経疾患の予防や治療においても有用である。本発明の分化調節方法により、神経疾患の細胞移植治療において移植する神経細胞、グリア細胞などをタイミングよく、さらに、効率よく提供することが可能となる。
【００２０】
また、本発明は、神経幹細胞を生体外で分化させてから治療に使用するだけでなく、神経幹細胞を生体内で分化させて、そこで発生する細胞を治療に利用することにおいても有用である。たとえば、移植した神経幹細胞の分化を調節することができ、生体に内在する神経幹細胞の分化を調節することができる。よって、本発明方法は、疾患の予防や治療に使用することも可能である。
【００２１】
神経疾患としては、再生医療による治療および神経幹細胞移植による治療が期待される神経疾患が挙げられるが、たとえば、神経変性疾患が挙げられる。神経変性疾患としては、たとえば、アルツハイマー病、脳虚血などの虚血性脳障害、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、びまん性レビー小体病、ハンチントン病および脊髄小脳変性症などのトリプレットリピート病、脊髄損傷ならびに網膜疾患などが挙げられる。
【００２２】
【実施例】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
以下の略号は、次の意味を有する。
ＰＢＳ：リン酸緩衝食塩水
神経幹細胞培養液：ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）／Ｆ１２（１：１）（ギブコ（ＧＩＢＣＯ）社製）、Ｎ２サプリメント（ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）［ギブコ（ＧＩＢＣＯ）社製：５μｇ／ｍｌ  インスリン（ｉｎｓｕｌｉｎ）、１００μｇ／ｍｌ  トランスフェリン（ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ）、２０ｎＭプロゲステロン（ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ）、１００μＭ  プトレシン（ｐｕｔｒｅｓｃｉｎｅ）、３０ｎＭ  亜セレン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｓｅｌｅｎｉｔｅ）］、２０μｇ／ｍｌ  インスリン（ｉｎｓｕｌｉｎ）、２０ｎｇ／ｍｌ  上皮増殖因子（ＥＧＦ）（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）社製）、２０ｎｇ／ｍｌ  塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂａｓｉｃ  ＦＧＦ）（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）社製）
ＲＳＢバッファー：１０ｍＭ  トリス−塩酸（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）（ｐＨ７．４）、１０ｍＭ  塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、１．５ｍＭ  塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）
ボディアン（Ｂｏｄｉａｎ）  ＩＩ：１０％ホルムアルデヒド、８０％エタノール
Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ：１５０ｍＭ  塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、０．５％  ＮＰ−４０、５０ｍＭ  トリス−塩酸（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）（ｐＨ７．５）、３ｍＭ  エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、３ｍＭ  エチレングリコールビス（２−アミノエチルエーテル）四酢酸塩（ＥＧＴＡ）、３ｍＭ  β−グリセロフォスフェート、０．１μＭ  Ｎａ３ＶＯ４、１μｇ／ｍｌ  リューペプチン（ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ）、１ｍＭ  ＰＭＳＦ
【００２３】
なお、下記実施例において、各操作は特に明示がない限り、モレキュラークローニング・ア・ラボラトリー・マニュアル第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄｓ．）（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９年））に記載の方法により行うか、または、市販の試薬やキットを用いる場合には市販品の指示書に従って使用した。
【００２４】
実施例１  神経幹細胞におけるＯｃｔ−３／４の発現
神経幹細胞におけるＯｃｔ−３／４  ｍＲＮＡの発現は、以下のように培養したニューロスフェアより、トータルＲＮＡを調製し、ＲＴ−ＰＣＲにより確認した。
（１−１）ニューロスフェアの培養
ＩＣＲ系マウス（胎齢１４．５日）より終脳を取り出し、機械的に分散して細胞を調製した。細胞は、神経幹細胞培養液中に３×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌで１０ｃｍディッシュを用いて培養した。培養開始７日後から１０日後に、確認されたニューロスフェアを単一細胞あるいは小塊に解した後、新しい神経幹細胞培養液で継代培養した。その１週間後に新たなニューロスフェアが確認された。その後、５〜７日の間隔で継代培養した。
【００２５】
（１−２）ニューロスフェアのトータルＲＮＡの調製
ニューロスフェアのトータルＲＮＡの調製は、以下の通りに行った。培養したニューロスフェアを１．５ｍｌチューブ（コーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ）社製）に回収し、ＰＢＳで洗浄後、氷上でＲＳＢバッファーに懸濁した。ＮＰ４０（最終濃度０．５％）を添加後、ピペッティングにより細胞を破壊した。低速遠心により核を除去後、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９）（最終濃度１００ｍＭ）、ＳＤＳ（最終濃度０．５％）、ＮａＣｌ（最終濃度１００ｍＭ）を添加し、フェノール・クロロホルム抽出、エタノール沈殿に供し、沈殿としてトータルＲＮＡを回収した。また、ＲＴ−ＰＣＲのポシティブコントロール用にＰ１９細胞のトータルＲＮＡを調製した。
【００２６】
（１−３）ＲＴ−ＰＣＲ
ＲＴ−ＰＣＲは、ＲＮＡ  ＬＡ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ（宝酒造社製）を使用した。
ＰＣＲ条件および使用したプライマーは、以下の通りである。
ＰＣＲ条件：９４℃２分間、９４℃１分間、５５℃１分間、７２℃１分間を２８サイクル後、７４℃７分間
Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｐｒｉｍｅｒ：５’ＡＴＧＧＣＴＧＧＡＣＡＣＣＴＧＧＣＴＴ  ３’（配列番号１）
Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒ：５’ＧＧＡＧＴＴＧＧＴＴＣＣＡＣＣＴＴＣＴ  ３’（配列番号２）
確認されるバンドがＯｃｔ−３／４のｍＲＮＡ由来であることを確認するために、ネステッドＰＣＲ（Ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ）を行った。ＰＣＲ条件および使用したプライマーは、以下の通り。
ＰＣＲ条件：９４℃２分間、９４℃１分間、５５℃１分間、７２℃１分間を２０サイクル後、７４℃７分間
Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｐｒｉｍｅｒ：５’  ＧＡＴＴＣＴＣＧＡＡＣＣＴＧＧＣＴＡ  ３’（配列番号３）
Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒ：５’  ＡＡＣＴＴＣＡＣＧＧＣＡＴＴＧＧ  ３’（配列番号４）
また、確認されるバンドがｍＲＮＡ由来であることを確認するために、トータルＲＮＡのＲＮａｓｅ処置を行った後にＲＴ−ＰＣＲを行い、バンドが得られないことを確認した。
ＰＣＲ産物の電気泳動の結果を図１に示す。
１回目のＰＣＲにより、Ｏｃｔ−３／４のｃＤＮＡに対応するバンドがみられ、ネステッドＰＣＲ（Ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ）によりＯｃｔ−３／４  ｃＤＮＡのバンドであることが確認された。また、ＲＮａｓｅ処理により、このバンドがＯｃｔ−３／４のｍＲＮＡに由来するものであることが確認された。
以上から、培養ニューロスフェアにおけるＯｃｔ−３／４のｍＲＮＡの発現が確認された。なお、Ｐ１９細胞は、ポジティブコントロールである。
【００２７】
神経幹細胞におけるＯｃｔ−３／４タンパク質の発現は、以下の方法でニューロスフェアの免疫染色およびウェスタンブロッティングを行い、確認した。
（２）ニューロスフェアの免疫染色
ニューロスフェアは、下記の抗体による免疫染色を行った。
未分化のニューロスフェアは、ポリ−Ｌ−リジンをコーティングしたカバーガラスチャンバー（ラブテック（ＬａｂＴｅｋ）社製）に接着させ、１時間後に０．１Ｍ  ＰＢＳで洗浄した後、４％  パラフォルムアルデヒド（０．１Ｍ  ＰＢＳ溶液）（ｐＨ７．４）を用い、４℃で３０分間固定処置を行った。その後ＰＢＳで４回洗浄し、一次抗体との反応を行った。
一次抗体は、抗ネスチン血清［セル（Ｃｅｌｌ）、第６０巻、第４号、第５８５−５９５頁（１９９０年）］（５０倍希釈）、抗Ｏｃｔ−３／４ポリクローナル抗体（サンタ・クルーズ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）社製）（１００倍希釈）を用い、３７℃で２時間反応させた。二次抗体は、Ｃｙａｎｉｎｅ３（以下、Ｃｙ３と呼ぶ）結合抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（１００倍希釈）、ビオチン結合抗ヤギＩｇＧ抗体（ベクター・ラボラトリーズ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）社製）（１００倍希釈）を用い、室温で１時間反応させた。その後、ビオチン結合抗ヤギＩｇＧ抗体にはＦＩＴＣ結合アビジン（アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）社製）（１００倍希釈）を室温で３０分間反応させた。
また、後の実験における分化させたニューロスフェアの免疫染色は、以下の方法により行った。
プレートに接着している分化させたニューロスフェアは、０．１Ｍ  ＰＢＳで洗浄後、４％  パラフォルムアルデヒド（０．１Ｍ  ＰＢＳ溶液）（ｐＨ７．４）を用い、室温で３０分間固定処置を行った。
固定したニューロスフェアは、０．３％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（ＰＢＳ溶液）を室温で５分間浸透し、１％過酸化水素（ＰＢＳ溶液）を室温で３０分間処置した。その後、抗ＭＡＰ２マウスモノクローナル抗体（ケミコン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）社製）（４００倍希釈）、抗ＧＦＡＰウサギ血清（ケミコン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）社製）（１０００倍希釈）あるいは抗Ｏｃｔ−３／４ヤギポリクローナル抗体（サンタ・クルーズ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）社製）（２００倍希釈）を３７℃で３０分間反応させた。二次抗体は、ＭＡＰ２とＧＦＡＰとの二重染色には、ＨＲＰ結合抗マウスＩｇＧ（医学生物学研究所、ＭＢＬ）（１０００倍希釈）、Ｃｙ３結合抗ウサギＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（４００倍希釈）を３７℃で３０分間反応させ、その後、ＨＲＰ結合抗マウスＩｇＧ  にはＦＩＴＣ結合チラミド  ｔｙｒａｍｉｄｅ（パーキンエルマー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）社製）（３００倍希釈）を室温で５分間反応させた。Ｏｃｔ−３／４とＭＡＰ２との二重染色には、ビオチン結合抗ヤギＩｇＧ（ベクター・ラボラトリーズ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）社製）（１０００倍希釈）、ＨＲＰ結合抗マウスＩｇＧ（医学生物学研究所（ＭＢＬ）社製）（１０００倍希釈）を３７℃で３０分間反応させ、ビオチン結合抗ヤギＩｇＧ  にはＦＩＴＣ結合アビジン（アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）社製）（２００倍希釈）を室温で３０分間、ＨＲＰ結合抗マウスＩｇＧ  にはＣｙ３結合チラミド  ｔｙｒａｍｉｄｅ（パーキンエルマー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）社製）（３００倍希釈）を室温で５分間反応させた。
抗体は、０．５％  スキムミルクおよび０．３％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を含むＰＢＳ溶液に希釈して使用した。
【００２８】
（３）ウェスタンブロッティング
細胞からのタンパク質抽出は、Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒを使用した。抽出サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離し、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ膜（ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）社製）に転写した。膜のブロッキング処理後、一次、二次抗体反応を行った。最後に、ＥＣＬ（アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）社製）処理した膜でＸ線フィルム（アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）社製）を感光させた。
使用した抗体は、以下の通りである。
一次抗体：抗Ｏｃｔ−３／４抗体（サンタ・クルーズ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）社製）
二次抗体：ＨＲＰ結合−抗ヤギ−ウサギＩｇＧ（ダコ（ＤＡＫＯ）社製）
免疫染色の結果を図２に、ウェスタンブロッティングの結果を図３示す。
免疫染色では、神経幹細胞のマーカーであるネスチンでほぼ全ての細胞が染色され、Ｏｃｔ−３／４でもほぼ全ての細胞が染色された。ウェスタンブロッティングでは、Ｏｃｔ−３／４タンパク質はニューロスフェアに発現しており、さらに胎齢１４．５日のマウス脳においても発現していた。
【００２９】
さらに、マウス脳におけるＯｃｔ−３／４タンパク質の発現を以下のように免疫染色により確認した。
（４）脳組織の免疫染色
組織標本は、ＩＣＲ系マウス（胎齢１４．５日）の脳を用いた。ボディアンＩＩによる組織固定後、５μｍ厚のパラフィン切片を作製した。その後、ａｎｔｉ−Ｏｃｔ４  Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（サンタ・クルーズ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）社製）によって、免疫染色を行った。二次抗体は、抗ヤギＩｇＧ（ベクター・ラボラトリーズ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）社製）を用い、ＡＢＣキット（ベクター・ラボラトリーズ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）社製）および３’，３’ジアミノベンジジンによる発色反応を行った。
免疫染色の結果を図４に示す。
Ｏｃｔ−３／４タンパク質は、側脳室（Ｌａｔｅｒａｌ  Ｖｅｎｔｒｉｃｌｅｓ）および基底核原基（Ｇｅｒｍｉｎａｌ  Ｅｍｉｎｅｎｃｅ）周辺部の細胞に発現していることが確認された。
以上から、Ｏｃｔ−３／４タンパク質は、神経幹細胞に発現していることが明らかとなった。
【００３０】
実施例２  神経幹細胞の分化
ニューロスフェアを１％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有する神経幹細胞培養液または上皮増殖因子（ＥＧＦ）および塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を含有する神経幹細胞培養液に加え、ポリ−Ｌ−リジンをコーティングしたディッシュに捲くことにより、神経幹細胞は神経細胞あるいはアストロサイトに分化した。安定した分化誘導に適していると思われた上皮増殖因子（ＥＧＦ）および塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を含有する神経幹細胞培養液を以下の実験に選択した。
分化した細胞の免疫染色は、実施例１（２）の方法に準じておこなった。微小管結合タンパク質２（ＭＡＰ２）と神経膠線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）との二重染色の結果、神経幹細胞は、ＭＡＰ２に陽性の神経細胞ならびにＧＦＡＰ陽性のアストロサイトに分化し（図５）、神経細胞はニューロスフェアの近位および遠位に、アストロサイトは近位に観察された。
ＭＡＰ２とＯｃｔ−３／４の二重染色の結果、Ｏｃｔ−３／４タンパク質の発現は、分化した神経細胞において観察されなかった（図６）。また、実施例１（３）の方法に準じてウェスタンブロッティングを行った結果、分化した細胞におけるＯｃｔ−３／４タンパク質の発現は認められなかった（図７）。
以上より、神経幹細胞が分化した細胞にＯｃｔ−３／４タンパク質は発現していないことが明らかとなった。
【００３１】
実施例３  Ｏｃｔ−３／４による神経幹細胞の分化調節
次に、Ｏｃｔ−３／４が神経幹細胞の分化に与える影響について、以下の方法により検討した。すなわち、Ｏｃｔ−３／４遺伝子のセンス鎖を導入したアデノウイルスＡｄ／Ｏｃｔ−３／４Ｓ、Ｏｃｔ−３／４遺伝子のアンチセンス鎖を導入したアデノウイルスＡｄ／Ｏｃｔ−３／４ＡＳを構築し、さらに、使用するアデノウイルスによる遺伝子導入システムが正常に働いていることを確認するために、オワンクラゲ由来の緑色蛍光タンパク質であるＥＧＦＰ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子を導入したアデノウイルスＡｄ／ＥＧＦＰを構築した。ついで、構築した組換えアデノウイルスを神経幹細胞培養液に加え、神経幹細胞に感染させた。
【００３２】
（１）コスミドの構築
コスミドベクターは、ｐＡｘＣＡｗｔ（宝酒造社製）を使用した。マウスＯｃｔ−３／４遺伝子の全長  ｃＤＮＡは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ／Ｏｃｔ−３／４［エンボ・ジャーナル（ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ）、第１０巻、第２９９７−３００５頁（１９９１年）］の制限酵素処理（ＥｃｏＲＶおよびＳｍａＩによる切断）により調製した。ここで、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ／Ｏｃｔ−３／４は、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  にＯｃｔ−３／４遺伝子の全長  ｃＤＮＡを導入したものである。ＥＧＦＰ  ｃＤＮＡは、ｐＥＧＦＰＮ１（クロンテック（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）社製）の制限酵素処理（ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩによる切断）により調製した。
Ｏｃｔ−３／４遺伝子の全長  ｃＤＮＡおよびＥＧＦＰ  ｃＤＮＡは、ｐＡｘＣＡｗｔにサブクローニングした。挿入されたＯｃｔ−３／４インサートの向きは、ＰＣＲにより確認した。ＰＣＲ条件、および使用したプライマーは、以下の通りである。
ＰＣＲ条件：９４℃２分間、９４℃３０秒間、５０℃３０秒間、７２℃３０秒間を２５サイクル
Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｐｒｉｍｅｒ：５’ＣＣＴＴＣＡＧＧＡＧＡＴＡＴＧ  ３’（配列番号５）
Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒ：５’ＡＴＣＧＡＴＴＣＴＡＧＡＣＴＡ  ３’（配列番号６）
また、挿入されたＥＧＦＰのインサートの向きは、制限酵素  Ｂａｍ  ＨＩ処理後にアガロースゲル電気泳動を行い、分解産物の大きさを確認することで行った。
選択されたクローンは、Ｇｉｇａｐａｃｋ  ＩＩＩ  ＸＬ−７（ストラタジーン（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）社製）を用いてλファージにパッケージングし、その後、大腸菌株ＤＨ５αに感染させ、大量調製した。ＤＨ５αからのコスミドＤＮＡの精製には、ＱＩＡＧＥＮ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ  （キアゲン（ＱＩＡＧＥＮ）社製）を使用した。
【００３３】
（２）組換えアデノウイルスの調製
組換えアデノウイルスは、Ｏｃｔ−３／４遺伝子のセンス鎖を導入したＡｄ／Ｏｃｔ−３／４Ｓ、Ｏｃｔ−３／４遺伝子のアンチセンス鎖を導入したＡｄ／Ｏｃｔ−３／４ＡＳ、ＥＧＦＰ  遺伝子を導入したＡｄ／ＥＧＦＰの３種類を調製した。
組換えアデノウイルスの調製は、Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて行った。その概要を簡単に記せば以下の通りである。８μｇのコスミドＤＮＡと１０μｌのＤＮＡ−ＴＰＣとを、２９３細胞に同時にトランスフェクションした。トランスフェクションには、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（キアゲン（ＱＩＡＧＥＮ）社製）を使用した。組換えアデノウイルスのインサートは、ＰＣＲにより確認した。ＰＣＲ条件および使用したプライマーは、実施例３（１）と同一である。
【００３４】
（３）組換えアデノウイルスのニューロスフェアへの感染
ニューロスフェアは６穴の非コーティングプレート（コーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ）社製）に移し、組換えアデノウイルス（Ａｄ／Ｏｃｔ−３／４Ｓ、Ａｄ／Ｏｃｔ−３／４ＡＳ、Ａｄ／ＥＧＦＰ）を増殖メディウムで１．２×１０６ｐ．ｆ．ｕ．／ｍｌに希釈しニューロスフェアとともに２４時間培養することで、組換えアデノウイルスをニューロスフェアに感染させた。また、コントロールとして非感染のニューロスフェアを調製した。
【００３５】
蛍光顕微鏡による観察により、ニューロスフェアにＥＧＦＰの発現が確認され（図８）、アデノウイルスによる遺伝子導入システムが正常に働いていることが確認された。
免疫染色により、分化誘導２日後、コントロールでは、ＭＡＰ２陽性細胞がニューロスフェア周辺部に確認されたが、神経細胞の形態学的な指標である軸索突起あるいは軸索突起様突起は観察されなかった（図９）。一方、Ａｄ／Ｏｃｔ−３／４ＡＳを感染させた場合では、コントロールに比べてＯｃｔ−３／４の発現が低下し、ＭＡＰ２陽性細胞の数が増加した（図９および図１０）。
このことから、Ｏｃｔ−３／４の発現抑制は、神経幹細胞の分化を亢進することが示された。
【００３６】
Ａｄ／Ｏｃｔ−３／４Ｓを感染させた場合では、コントロールに比べてＯｃｔ−３／４の発現が増加し、ＭＡＰ２陽性細胞の数が減少した（図９および図１０）。
このことから、Ｏｃｔ−３／４の持続的な発現は、神経幹細胞の分化を抑制することが示された。
【００３７】
同様に、ＧＦＡＰ陽性のアストロサイトに関して調べたところ、Ｏｃｔ−３／４の発現抑制は、神経幹細胞からアストロサイトへの分化を亢進することが判明した（図１１および図１２）。
【００３８】
以上、実施例１〜３より、Ｏｃｔ−３／４は、神経幹細胞の分化調節因子であることが判明した。Ｏｃｔ−３／４の発現低下は、神経幹細胞の分化を亢進し、Ｏｃｔ−３／４の持続的な発現は、神経幹細胞の分化を抑制した（図１３）。
【００３９】
【発明の効果】
本発明の方法は、神経幹細胞の分化を調節する方法であり、再生医療などの神経疾患の移植治療に有用である。
【００４０】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】Ｐ１９細胞（Ｐ１９）およびニューロスフェア（ＮＳ）より調製したトータルＲＮＡに対して、ＲＮａｓｅ処理を行った場合（＋）と行わなかった場合（−）のそれぞれにおいて、１回目のＰＣＲおよびネステッドＰＣＲ（Ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ）を行った時の結果。アガロースゲル電気泳動図の両端は、分子量マーカー（ΦＸ１７４／Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ  Ｄｉｇｅｓｔ）を示す。
【図２】培養ニューロスフェアの免疫染色後の蛍光顕微鏡像。左は、抗ネスチン抗体を用いた場合、右は、抗Ｏｃｔ−３／４抗体を用いた場合を示す。
【図３】抗Ｏｃｔ−３／４抗体を用いたウェスタンブロッティングの結果。
レーン左より、順にＰ１９細胞、ニューロスフェア、胎齢１４．５日のＣｒｂマウス脳、生後６０日のＣｒｂマウス脳を示す。
【図４】抗Ｏｃｔ−３／４抗体によるＩＣＲ系マウス脳（胎齢１４．５日）の免疫染色像。
【図５】培養ニューロスフェアの分化誘導前の位相差顕微鏡像（上段左）、分化誘導７日目の位相差顕微鏡像（上段右）および免疫染色後の蛍光顕微鏡像（下段）。
蛍光顕微鏡像の左は、抗ＭＡＰ２抗体を用いた場合、右は、抗ＧＦＡＰ抗体を用いた場合を示す。
【図６】分化誘導７日目における培養ニューロスフェアの免疫染色後の蛍光顕微鏡像。
左は、抗ＭＡＰ２抗体を用いた場合、右は、抗Ｏｃｔ−３／４抗体を用いた場合を示す。
【図７】分化誘導前および分化誘導７日目における培養ニューロスフェアを用いたＯｃｔ−３／４抗体によるウェスタンブロッティングの結果。
【図８】分化誘導２日目における培養ニューロスフェアの分化誘導２日目における位相差顕微鏡像（左図）および蛍光顕微鏡像（右図）。
【図９】分化誘導２日目における培養ニューロスフェアの位相差顕微鏡像（上段）および免疫染色後の蛍光顕微鏡像（中段および下段）。
中段は抗Ｏｃｔ−３／４抗体を用いた場合、下段は抗ＭＡＰ２抗体を用いた場合であり、左より順に、コントロール、Ａｄ／Ｏｃｔ−３／４−Ｓを感染させた場合、Ａｄ／Ｏｃｔ−３／４−ＡＳを感染させた場合を示す。
【図１０】分化誘導２日目の培養ニューロスフェアにおいて、プレートに接着しているＭＡＰ２陽性細胞を計数した結果。グラフの左よりコントロール、Ａｄ／Ｏｃｔ−３／４Ｓを感染させた場合、Ａｄ／Ｏｃｔ−３／４ＡＳを感染させた場合を示す。グラフの縦軸は、培養プレート１穴あたりのプレートに接着しているＭＡＰ２陽性細胞数を示す。アスタリスク（＊＊）は、コントロール群との間に有意差（ｐ＜０．０１）があることを示す。
【図１１】分化誘導２日目の培養ニューロスフェアにおける抗ＧＦＡＰ抗体を用いた免疫染色後の蛍光顕微鏡像。上より、コントロール、Ａｄ／Ｏｃｔ−３／４Ｓを感染させた場合、Ａｄ／Ｏｃｔ−３／４ＡＳを感染させた場合を示す。
【図１２】分化誘導２日目の培養ニューロスフェアにおいて、プレートに接着しているＧＦＡＰ陽性細胞を計数した結果。グラフの左よりコントロール、Ａｄ／Ｏｃｔ−３／４Ｓを感染させた場合、Ａｄ／Ｏｃｔ−３／４ＡＳを感染させた場合を示す。グラフの縦軸は、培養プレート１穴あたりのプレートに接着しているＧＦＡＰ陽性細胞数を示す。アスタリスク（＊＊）は、コントロール群との間に有意差（ｐ＜０．０１）があることを示す。
【図１３】本発明をまとめた概念図。
縦軸は、分化進行の程度を、横軸は、分化誘導後の時間経過を示す。Ｏｃｔ−３／４−ＡＳは、アンチセンスを発現させた場合の分化の過程を；Ｏｃｔ−３／４−Ｓは、センスを発現させた場合の分化の過程を；コントロールは、無処理の場合の分化の過程を概念的に示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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