【誤訳訂正書】
【提出日】平成24年9月4日(2012.9.4)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０００７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０００７】
ある実施態様においては、本発明は少なくとも一つフィターゼ及び少なくとも一つのアルファ‐アミラーゼを含む酵素組成物に関する。いくつかの実施態様においては、フィターゼは細菌ブティアウクセラ種（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ  ｓｐ．）及び変異体及びそれらの修飾体由来のものである。いくつかの実施態様においては、フィターゼは、配列番号１に記載の配列又は配列番号１の変異体（例えば、配列番号２又は配列番号３）に少なくとも７５％同一性を有する野生型配列を含むフィターゼである。いくつかの実施態様においては、アルファ‐アミラーゼは、バシルス  ステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）又はバシルス  リチェニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のようなバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）由来である。さらなる実施態様においては、アルファ‐アミラーゼはバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）から得られる親アルファ‐アミラーゼの変異体である。いくつかの実施態様においては、フィターゼ及びアルファ‐アミラーゼ酵素を混合製剤又は混合物で提供する。いくつかの実施態様においては、本発明による酵素組成物はフィターゼに加えて少なくとも二つのアルファ‐アミラーゼ（例えば、バシルス  ステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のアルファ‐アミラーゼ及びバシルス  リチェニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来のアルファ‐アミラーゼ）を含んでよい。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０００９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０００９】
さらなる実施態様においては、本発明は乾燥又は湿式製粉プロセスのいずれかの、デンプン基質を含むスラリー中のデンプンを液化する方法に関し、その方法は約ｐＨ４．０からｐＨ６．２未満までに基質含有スラリーのｐＨを調整すること、フィターゼ及びアルファ‐アミラーゼの組み合わせを任意の順序でスラリーに添加すること、該フィターゼが野生型及びそれらの変異体を含むブティアウクセラ種（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ  ｓｐ．）由来であることを特徴とし、及び液化デンプンを得るために約４０から１１０℃の温度で５分から８時間の間スラリーを反応することを含む。
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１０】
さらなる実施態様においては、本発明は粒状デンプン含有基質からデンプンを液化する方法に関し、ａ）約４．０から約６．２のｐＨ範囲で、約２分から約４時間の間、基質の初期デンプンゼラチン化温度より０から約３０℃まで低い温度で、フィターゼ及びアルファ‐アミラーゼと粒状デンプン基質含有基質を含むスラリーをインキュベーションすること、ｂ）ｐＨ約４．０から約６．２の間のｐＨで、約５分から約６時間の間、初期デンプンゼラチン化温度より０から約４５℃高い温度まで上昇させ、液化デンプンを得ることを含む方法である。さらに、方法はデキストリンを得るために液化デンプンを糖化すること及びデキストリンを回収することを含んでよい。いくつかの実施態様においては、さらに、方法は、アルコール（例えば、エタノール）、有機酸類（例えば、コハク酸、乳酸）、糖アルコール類（例えば、グリセロール）、アスコルビン酸中間体（例えば、グルコネート、ＤＫＧ，ＫＬＧ）、アミノ酸（例えば、リジン）、及び蛋白質類の（例えば、抗体及びそれらのフラグメント）ような最終産物を得るために、適切な発酵条件下、デキストリンを発酵することを含む。ある実施態様においては、方法は第一及び／又は第二液状化段階において任意の順序でＢＰ−１７及び少なくとも一つのアルファ‐アミラーゼの組み合わせを同時に又は分離してスラリーに添加することを含む。
【誤訳訂正４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３２】
用語「グルコースシロップ（ｇｌｕｃｏｓｅ  ｓｙｒｕｐ）」は、グルコースの固体を含む水溶性の組成物をいう。グルコースシロップは少なくとも２０のＤＥを有する。いくつかの実施態様においては、グルコースシロップは２１％より多い水分を含まず、デキストロースとして換算して２５％未満の還元糖を含まない。ある実施態様においては、グルコースシロップは少なくとも９０％のＤ‐グルコースを含み、他の実施態様においては、少なくとも９５％のグルコースを含む。いくつかの実施態様においては、用語グルコース及びグルコースシロップは互換可能に用いる。
【誤訳訂正５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３５】
本明細書にて同定されたアミノ酸配列又は核酸配列に関して本明細書で用いる「配列同一性割合（％）（ｐｅｒｃｅｎｔ(％)ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」は、必要であれば、最大の割合の配列同一性を達成するように、いずれの同類置換をも配列同一性の一部として考慮することなく、配列を整列し及びギャップを挿入した後、配列中のアミノ酸残基又はヌクレオチドと同定された候補配列におけるアミノ酸残基又はヌクレオチドとの割合で定義される。周知である配列整列をする方法と配列同一性の決定は過度の実験をせずに行うことができ、同一性値の計算は確定的に得られる。例えばＡｕｓｕｂｅｌ他編、(１９９５)Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ,  １９章(Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｅｌｙ‐Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ,  ＮｅｗＹｏｒｋ)及びＡＬＩＧＮ  ｐｒｏｇｒａｍ（Ｄａｙｈｏｆｆ  （１９７８）Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ５:Ｓｕｐｐｌｅ  ３（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ,  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ,  Ｄ.Ｃ.）を参照願いたい。多くのアルゴリズムは配列を整列させ、配列同一性を決定するのに利用可能である。例えばＮｅｅｄｌｅｍａｎ他のｔｈｅ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ（１９７０）Ｊ.Ｍｏｌ.Ｂｉｏｌ.４８:４４３、スミス他のｔｈｅ  ｌｏｃａｌ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ（１９８１）Ａｄｖ.Ａｐｐｌ.Ｍａｔｈ.２:４８２,  Ｐｅａｒｓｏｎ他のｔｈｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｆｏｒ  ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ  ｍｅｔｈｏｄ  (１９８８)  Ｐｒｏｃ.  Ｎａｔｌ.  Ａｃａｄ.  Ｓｃｉ.  ８５:２４４４,  ｔｈｅ  Ｓｍｉｔｈ‐Ｗｓｔｅｒｍａｎ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ  (Ｍｅｔｈ.Ｍｏｌ.Ｂｉｏｌ.７０:１７３‐１８７(１９９７)及びＢＬＡＳＴＰ,  ＢＬＡＳＴＩＮ,  ａｎｄ  ＢＬＡＳＴＸ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ(参照Ａｌｔｓｃｈｕｌ他（１９９０）J.Ｍｏｌ.Ｂｉｏｌ.２１５:４０３−４１０)を参照されたい。これらのアルゴニズムに使用するコンピュータープログラムは入手可能であり、以下のものを含むがこれらに限定はされない。即ち、ＡＬＩＧＮ又はＭｅｇａｌｉｎｇ(ＤＡＮＳＴＡＲ)ソフトウエア又はＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２(Ａｌｔｓｃｈｕｌ他、Ｍｅｔｈ.  Ｅｎｚｙｍ.,  ２６６:４６０-４８０(１９９６))、又はＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ(Ａｌｔｓｃｈｕｌ他)上記、ＦＡＳＴＡ及びＧｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ  (ＧＣＧ)パッケージ、バージョン８、マジソン、ウィスコン州米国にて入手可能なＴＦＡＳＴＡ及びＩｎｔｅｌｌｉｇｅｎｃｅｓ,  Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、カリフォルニア州による  ＣＬＵＳＴＡＬ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＰＣ/Ｇｅｎｅ  ｐｒｏｇｒａｍである。当業者であれば比較される配列の長さに渡って最大の配列比較を達成するために必要であるアルゴリズムを含め、整列を測定する適切なパラメーターを決定できる。好ましくは、配列同一性はプログラムによって決定されたデフォルトパラメーターを使用することにより決定される。特に、配列同一性はＳｍｉｔｈ-Ｗａｔｅｒｍａｎ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｓｅａｒｃｈ  ａｌｇｏ���ｉｔｈｍ  (Ｍｅｔｈ.  Ｍｏｌ.  Ｂｉｏｌ.  ７０:  １７３-１  ８７  (１９９７))  によって決定される。このアルゴリズムは次のサーチパラメーターで、すなわち１２のギャップ開始ペナルティ及び１のギャップ伸長ペナルティで、アファインギャップサーチを使用しているＭＳＰＲＣＨ  ｐｒｏｇｒａｍ  (Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ)  で実行される。好ましくは対のアミノ酸の比較はＧｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ,  Ｉｎｃ.,  Ｍａｄｉｓｏｎ,  Ｗｉｓ.の１２のギャップウエイトと２のレングスウエイトをもつＢＬＯＳＵＭ６２アミノ酸置換行列を使用しているＧＣＧ配列分析ソフトウエアパッケージの使用により実行される。二つのアミノ酸配列の最適整列に関して、種々のアミノ酸配列の連続セグメントは参照アミノ酸配列に対して追加アミノ酸残基又は欠損アミノ酸残基をもってもよい。参照アミノ酸配列と比較するために使用した連続セグメントは少なくとも２０アミノ酸残基を含んでもよく、３０、４０、５０又はそれ以上のアミノ酸残基を含んでもよい。誘導体のアミノ酸配列中ギャップを含む関係で増加した配列同一性の補正はギャップペナルティを割り当てることにより実行できる。
【誤訳訂正６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３６】
用語「％ホモロジー（％  ｈｏｍｏｌｏｇｙ）」は用語「％同一性（％  ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」と本明細書にて互換可能に用いる。二つの配列間の同一性を決定するために用いることのできる典型的なコンピュータプログラムは、一連のＢＬＡＳＴプログラム、例えば、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ、及びＴＢＬＡＳＴＸ、ＢＬＡＳＴＰとＴＢＬＡＳＴＮ、及びインターネットで公的に入手可能なもの(例えばＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎウェブサイト上ＢＬＡＳＴページを参照)を含むが、これらに限定されない。また、Ａｌｔｓｃｈｕｌ,  他、１９９０及びＡｌｔｓｃｈｕｌ、他、１９９７を参照願いたい。
【誤訳訂正７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３８】
二以上の配列間で「％同一性」を決定するために、選択される配列の好ましいアラインメントを、例えば、Ｍａｃ  Ｖｅｃｔｏｒバージョン６．５のＣＬＵＳＴＡＬ‐Ｗプログラムを用いて行い、オープンギャップペナルティ１０．０、拡張ギャップペナルティ０．１、及びＢＬＯＳＵＭ‐３０相似行列を含むデフォルトパラメータで操作する。
【誤訳訂正８】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００４２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００４２】
用語「ゼラチン化温度未満（ｂｅｌｏｗ  ｔｈｅ  ｇｅｌａｔｉｎｉｚａｔｉｏｎ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）」は、ゼラチン化温度より低い温度をいう。
【誤訳訂正９】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００６７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００６７】
好ましい実施態様においては、本発明に有用なフィターゼは、配列番号１（表１を参照）記載の及びそれらの変異体のアミノ酸配列に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％及び少なくとも９９％配列同一性を有する。好ましい実施態様においては、フィターゼはブティアウクセラ種（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ  ｓｐ．）由来である。より好ましくは、本発明に有用なフィターゼは配列番号１に記載の又はそれらの変異体のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％から９９％の配列同一性を有する。いくつかの実施態様においては、フィターゼは配列番号１のアミノ酸配列を含む。
2010517573.tif 000001
【誤訳訂正１０】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００６８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００６８】
いくつかの実施態様においては、フィターゼは配列番号１に少なくとも９５％配列同一性を含むアミノ酸配列のフラグメントであり、そのフラグメントは、少なくとも３５０アミノ酸、少なくとも３７５アミノ酸、少なくとも４００アミノ酸を含む。いくつかの実施態様においては、フラグメントはフィターゼ活性を有する。いくつかの実施態様においては、フラグメントは、配列番号１の親又は野生型フィターゼのフィターゼ活性に対して少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は１００％の活性を有する。
【誤訳訂正１１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００７２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００７２】
本発明のいくつかの実施態様においては、フィターゼは、配列番号２のアミノ酸配列又はそれに少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％及び少なくとも９９％アミノ酸配列同一性を有するフィターゼを含む、又はからなる。また、本明細書の配列番号２のアミノ酸配列を含む、又はから成るフィターゼは、野生型ブティアウクセラ種（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ  ｓｐｐ．）の変異体としてＷＯ  ２００６/０４３１７８に開示される。この変異体は本明細書にてＢＰ−１１という。配列番号１（ＢＰ−ＷＴ）とＢＰ−１１変異体（配列番号２）のアミノ酸配列の間には１１のアミノ酸残基が異なり、表２の配列番号２においてこれらの残基を太字及び下線にて示す。いくつかの実施態様においては、フィターゼＢＰ−１１を含んでよく、１、２、３、又はそれ以上のアミノ酸変異をしてよい。
2010517573.tif 000002
【誤訳訂正１２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００７３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００７３】
本発明のいくつかの実施態様においては、変異体は、配列番号１のA89、D92、T134、F174、T186、A188、K207、A209、S248、Q256、A261、及びN269に位置する残基に相当するアミノ酸残基おける置換を含む又はからなる。いくつかの実施態様においては、フィターゼは配列番号３又はそれに少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％及び少なくとも９９％アミノ酸配列同一性を有するフィターゼを含む、又はからなる。配列番号３の変異体は本明細書にてＢＰ−１７という。配列番号１とＢＰ−１７変異体（配列番号３）のアミノ酸配列の間では１２のアミノ酸残基が異なり、これらは次の置換のとおりである。即ち、A89T、D92A、T134I、F174S、T186K、A188P、K207E、A209S、S248L、Q256Y、A261E、及びN269Kである。さらに、ＢＰ−１７は、９２番目の残基に相当する位置で一つのアミノ酸置換がＢＰ−１１と異なる。つまり、いくつかの実施態様においては、変異体は、配列番号１に対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、及び９９％配列同一性を有し、少なくとも９２番目のアミノ酸がアラニンである。他の実施態様においては、変異体は、配列番号３に対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、及び９９％配列同一性を有し、少なくとも９２番目のアミノ酸がアラニンである。他の実施態様においては、変異体は、配列番号１に対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、及び９９％配列同一性を有し、少なくとも９２番目のアミノ酸がアラニン、及びA89T、T134I、F174S、T186K、A188P、K207E、A209S、S248L、Q256Y、A261E、及びN269Kの群から選択される少なくとも一つの他のアミノ酸置換を有する。ＢＰ−ＷＴとＢＰ−１７残基間の違いは下記表３の太字及び下線で示す。
2010517573.tif 000003
【誤訳訂正１３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００７４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００７４】
いくつかの実施態様においては、配列番号２又は配列番号３に対して少なくとも９５％配列同一性を有するフィターゼは、同類アミノ酸置換（ａ  ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）を含んでよい。例えば、同類アミノ酸置換はＡｌａをＧｌｙ又はＣｙｓと置換し、ＡｒｇをＬｙｓ、Ｍｅｔ、又はＩｌｅと置換し、ＡｓｎをＡｓｐ又はＧｌｕと置換し、ＡｓｐをＡｓｎ又はＧｌｎと置換し、ＣｙｓをＭｅｔ又はＴｈｒと置換し、ＧｌｎをＡｓｎ、Ｇｌｕ又はＡｓｐと置換し、ＧｌｙをＡｌａ又はＰｒｏと置換し、ＩｌｅをＶａｌ、Ｌｅｕ、又はＭｅｔと置換し、ＬｅｕをＶａｌ又はＭｅｔと置換し、ＬｙｓをＡｒｇ、Ｍｅｔ又はＩｌｅと置換し、ＭｅｔをＣｙｓ、Ｉｌｅ，Ｌｅｕ、又はＶａｌと置換し、ＰｈｅをＴｙｒ、Ｈｉｓ、Ｔｒｐと置換し、ＳｅｒをＴｈｒ、Ｍｅｔ又はＣｙｓと置換し、ＴｈｒをＳｅｒ、Ｍｅｔ又はＶａｌと置換し、ＴｙｒをＰｈｅ又はＨｉｓと置換し、及びＶａｌをＬｅｕ、Ｉｌｅ又はＭｅｔと置換する場合を含む。いくつかの実施態様においては、同類アミノ酸置換は少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は１００％の配列番号１の親又は野生型フィターゼのフィターゼ活性を有する。いくつかの実施態様においては、同類アミノ酸置換はフィターゼ活性を有する。
【誤訳訂正１４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００７５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００７５】
いくつかの実施態様においては、フィターゼは、配列番号２又は配列番号３に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列のフラグメントであり、そのフラグメントは、少なくとも３５０アミノ酸、少なくとも３７５アミノ酸、少なくとも４００アミノ酸を含む。いくつかの実施態様においては、フラグメントはフィターゼ活性を有する。いくつかの実施態様においては、フラグメントは、配列番号１の親又は野生型フィターゼのフィターゼ活性に対して少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は１００％の活性を有する。
【誤訳訂正１５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００８１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００８１】
いくつかの実施態様においては、アルファ‐アミラーゼはターマミル（Ｔｅｒｍａｍｙｌ）のようなアルファ‐アミラーゼである。ターマミル様アルファ‐アミラーゼはアミノ酸レベルがバシルス  リチェニフォルミス（Ｂ．  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）アルファ‐アミラーゼと実質的に相同性を有するアルファ‐アミラーゼを示すことを意味し、例えば、ＷＯ  ０６／０６６５９４の配列番号4に設計されるバシルス  リチェニフォルミス（Ｂ．  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）アルファ‐アミラーゼと少なくとも約７５％配列同一性を有し、８０％、８５％、  ９０％、  ９５％、９９％、及び１００％の配列同一性を含む。
【誤訳訂正１６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００８２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００８２】
本発明よって含まれる酵素組成物は混合される又は製剤設計される酵素組成物を含んでもよい。酵素成分は一緒に（混合物）混合される少なくとも二つの酵素成分又は一以上のプロセス段階の間に個々に添加される酵素成分を含む混合製剤として用いてよい。これは経時的に別々の酵素成分を加えることによりアミラーゼに対するフィターゼの酵素比を維持するようにしてもよく、その結果、例えば、その成分等を同時に添加してもよい。製剤設計される酵素組成物とは、酵素が一定の製剤様式で、例えば一定の割合で、提供されることを意味する。いくつかの実施態様においては、組成物は配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を有するフィターゼ及び／又は配列番号２と少なくとも９５％の配列同一性を有するフィターゼ及び／又は配列番号３と少なくとも９５％の配列同一性を有するフィターゼ及びアルファ‐アミラーゼを含んでよい。
【誤訳訂正１７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００８４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００８４】
いくつかの実施態様においては、酵素組成物又は混合物はａ）ＢＰ‐ＷＴ、スペザイム  エクストラ（ＳＰＥＺＹＭＥ  ＸＴＲＡ）、及び任意にスペザイム  フレッド（ＳＰＥＺＹＭＥ  ＦＲＥＤ）、b)ＢＰ‐ＷＴ変異体、スペザイム  エクストラ（ＳＰＥＺＹＭＥ  ＸＴＲＡ）、及び任意にスペザイム  フレッド（ＳＰＥＺＹＭＥ  ＦＲＥＤ）、c)ＢＰ−１７、スペザイム  エクストラ（ＳＰＥＺＹＭＥ  ＸＴＲＡ）及び任意にスペザイム  フレッド（ＳＰＥＺＹＭＥ  ＦＲＥＤ）を含む。いくつかの実施態様においては、組成物は、アルファ‐アミラーゼ及びブティアウクセラ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）フィターゼを含む。いくつかの実施態様においては、組成物は、スペザイム（商標）エクストラ（ＳＰＥＺＹＭＥ（商標）ＸＴＲＡ）及びＢＰ‐ＷＴを含む。いくつかの実施態様においては、組成物はスペザイム（商標）エクストラ（ＳＰＥＺＹＭＥ（商標）ＸＴＲＡ）及び配列番号１、配列番号２及び／又は配列番号３に少なくとも７５％、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％及び９９％の配列同一性を有するフィターゼを含む。いくつかの実施態様においては、組成物はスペザイム（商標）フレッド（ＳＰＥＺＹＭＥ（商標）ＦＲＥＤ）及びＢＰ−WTを含む。いくつかの実施態様においては、組成物は、スペザイム（商標）フレッド（ＳＰＥＺＹＭＥ（商標）ＦＲＥＤ）及びＢＰ−１７を含む。いくつかの実施態様においては、組成物は、スペザイム（商標）フレッド（ＳＰＥＺＹＭＥ（商標）ＦＲＥＤ）及び少なくとも配列番号１、配列番号２及び／又は配列番号３に約７５％の配列同一性を有するフィターゼを含み、さらに８０％、８５％、９０％、９５％、及び９９％の配列同一性を有するフィターゼを含む。
【誤訳訂正１８】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００９１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００９１】
また、グルコアミラーゼは、タラロミセス  エマーソニー（Ｔ.  ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）、タラロミセス  レイセタヌス（Ｔ.  ｌｅｙｃｅｔｔａｎｕｓ）、タラロミセス  デュポンティ（Ｔ.  ｄｕｐｏｎｔｉ）、及びタラロミセス  テルモフィラス（Ｔ.  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）  (例えば、ＷＯ  ９９／２８４８８；  ＵＳＰ  Ｎｏ.  ＲＥ：  ３２，１５３；  ＵＳＰ  Ｎｏ.  ４，５８７，２１５を参照)のようなタラロミセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）の菌株、トリコデルマ  レーシ（Ｔ．  ｒｅｅｓｅｉ）及び特に、ＵＳ  Ｐａｔ.  Ｐｕｂ.  Ｎｏ.  ２００６‐００９４０８０に記載の配列番号４と少なくとも約８０％、８５％、９０％及び９５％の配列同一性を有するグルコアミラーゼのようなトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）の菌株、リゾプス  ニベウス（Ｒ.  ｎｉｖｅｕｓ）及びリゾプス  オリザエ（Ｒ.  ＯＲＹＺＡＥ）のようなリゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）の菌株、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）の菌株、フミコーラ  グリセア（Ｈ．  ｇｒｉｓｅａ）（例えば、Ｂｏｅｌ他、（１９８４）  ＥＭＢＯ  Ｊ.  ３：１０９７−１１０２；  ＷＯ  ９２／００３８１  ；  ＷＯ  ００／０４１３６；  Ｃｈｅｎ他、（１９９６）  Ｐｒｏｔ.  Ｅｎｇ.  ９：４９９−５０５；  Ｔａｙｌｏｒ他、（１９７８）  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓ.  ６１  ：３０１−３０８；  ＵＳＰ.  ４，５１４，４９６；  ＵＳＰ  ４，０９２，４３４；  ＵＳＰ  ４，６１８，５７９；  Ｊｅｎｓｅｎ他、（１９８８）  Ｃａｎ.  Ｊ.  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ.  ３４：２１８−２２３及びＷＯ  ２００５／０５２１４８の配列番号３を参照）のようなフミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）の菌株から得られる。いくつかの実施態様においては、グルコアミラーゼは、ＷＯ  ０５／０５２１４８記載の配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも約８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％及び９９％の配列同一性を有する。本発明に有用な他のグルコアミラーゼは、アセリア  ロルフシイ（Ａｔｈｅｌｉａ  ｒｏｌｆｓｉｉ）及びそれらの変異体(例えば、ＷＯ  ０４／１１１２１８を参照)から得られるものを含む。また、本明細書の単糖化について述べている他のグルコアミラーゼの例を参照願いたい。
【誤訳訂正１９】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１０５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１０５】
いくつかの実施態様においては、本発明のフィターゼ及びアルファ‐アミラーゼの組み合わせを製粉デンプン基質（例えば、製）のスラリーに添加できる。いくつかの実施態様においては、スラリーは約４．０から約６．５未満の範囲のｐＨで、また、約４．０から約６．２未満の範囲のｐＨで、また、約４．５から約６．０未満のｐＨで及び好ましくは約５．０から約６．０（例えば、約５．４から約５．８まで）に維持され、液化デンプンを得るために、スラリー中の製粉粒状デンプンは２分から８時間（例えば、５分から６時間、５分から４時間及び３０分から４時間）の間酵素組成物と接触できる。いくつかの実施態様においては、温度は４０から１１５℃の範囲である。いくつかの実施態様においては、温度は４０から１１０℃、また５０から１１０℃、また６０から１１０℃、また６０から１００℃及びまた７０から９５℃の範囲である。
【誤訳訂正２０】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１１１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１１１】
インキュベーション段階はデンプン基質（例えば、粉砕穀物）を含むスラリーを粒状デンプンのデンプンゼラチン化温度より０から３０℃低い温度で本発明によるフィターゼ及び任意にアルファ‐アミラーゼに接触させることを含む。この温度はデンプンゼラチン化温度より０から２５℃、０から２０℃、０から１５℃、及び０から１０℃低くてよい。この具体的値は変化し、スラリーを含む粒状デンプンのタイプで決定される。例えば、トウモロコシのデンプンゼラチン化温度は一般的にライ又は小麦のデンプンゼラチン化温度より高い。いくつかの実施態様においては、温度は４５から８０℃の間、また５０から７５℃の間、また５０から７２℃の間及びある実施態様においては、温度は６８℃未満、６５℃未満、６２℃未満、６０℃未満、及びまた５５℃未満である。他の実施態様においては、温度は４０℃より高い、４５℃より高い、５０℃より高く及び５５℃より高い。いくつかの実施態様においては、インキュベーション温度は、約５８と７２℃の間、また約６０と約６８℃の間である。インキュベーションを約４．０から約６．５、また約４．０から約６．０及び約ｐＨ５．０から約６．０の範囲のｐＨで、約２分から約５時間（例えば、約５分から約３時間、約１５分から約２．５時間及び約３０分から約２時間）の間行う。いくつかの実施態様においては、インキュベーション段階はアルファ‐アミラーゼを有さないフィターゼの添加を含む。他の実施態様においては、フィターゼ及びアルファ‐アミラーゼをインキュベーション段階の間、混合物として添加または続けて添加する。
【誤訳訂正２１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１１２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１１２】
さらなる段階において、インキュベーションされる基質は約４．０から約６．５のｐＨで２分から８時間（例えば、２分から６時間、５分から４時間及び好ましくは１時間から２時間）の間、インキュベーションされる基質をデンプンゼラチン化温度より０から５５℃のような高い温度（例えば、６５℃から１２０℃まで、７０℃から１１０℃まで、７０℃から９０℃まで）に上昇させることにより液化する。
【誤訳訂正２２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１１４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１１４】
いくつかの実施態様においては、粒状デンプン含有基質をゼラチン化温度未満の温度で本発明によるフィターゼと接触することを含むインキュベーション段階は温度上昇段階の間アルファ‐アミラーゼの安定性を増強する。いくつかの実施態様においては、アルファ‐アミラーゼ安定性の増強は約５．８から約５．２の範囲のｐＨである。
【誤訳訂正２３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１２２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１２２】
発酵に用いる生物は所望の最終産物により決定する。典型的に、エタノールが、必要とする最終産物の場合、酵母を発酵用生物として用いる。いくつかの実施態様においては、エタノール生産微生物は酵母及び具体的にはサッカロミセス  セレビジアエ（Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（ＵＳＰ  ４，３１６，９５６）の菌株のようなサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）である。多くのサッカロミセス  セレビジアエ（Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は商業的に入手可能であり、これらはＦＡＬＩ（Ｆｌｅｉｓｃｈｍａｎｎ‘ｓ  Ｙｅａｓｔ）、ＳＵＰＥＲＳＴＡＲＴ（Ａｌｌｔｅｃｈ）、ＦＥＲＭＩＯＬ（ＤＳＭ  Ｓｐｅｃｉａｌｔｉｅｓ）、ＲＥＤ  ＳＴＡＲ（Ｌｅｓａｆｆｒｅ）及びＡｎｇｅｌ  ａｌｃｏｈｏｌ  ｙｅａｓｔ（Ａｎｇｅｌ  Ｙｅａｓｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ,  Ｃｈｉｎａ）を含むが、これらに限定されない。方法に使用する最初の酵母の量は、適切な期間に商業用十分なエタノールの量を生産する（例えば、７２時間未満で２５から４０％ＤＳを有する基質から少なくとも１０％のエタノールを生産する）のに効果的な量である。酵母細胞は一般的に１０４から１０１２の量で供給され、好ましくは、発酵培地の１ｍｌあたり１０７から１０１０生存酵母数で供給される。発酵は、さらに発酵微生物（例えば、酵母）、栄養素、酸及び／又は追加的酵素を含むことができ、フィターゼを含むことができるが、これに限定されない。
【誤訳訂正２４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１２５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１２５】
いくつかの実施態様においては、デンプン加水分解の間における本発明に含まれるフィターゼ組成物の使用は、発酵培地のフィチン酸量、蒸留残液のフィチン酸塩の量及び／又は乾燥した蒸留穀物残渣（Ｄｉｓｔｉｌｌｅｒｓ  Ｄｒｉｅｄ  Ｇｒａｉｎｓ）（ＤＤＧ）、可溶性物質添加乾燥蒸留穀物残渣（Ｄｉｓｔｉｌｌｅｒｓ  Ｄｒｉｅｄ  Ｇｒａｉｎｓ  ｗｉｔｈ  Ｓｏｌｕｂｌｅｓ）(ＤＤＧＳ)、湿った蒸留穀物残渣（Ｄｉｓｔｉｌｌｅｒｓ  ｗｅｔ  ｇｒａｉｎｓ）（ＤＷＧ）、及び可溶性物質添加湿潤蒸留穀物残渣（Ｄｉｓｔｉｌｌｅｒｓ  ｗｅｔ  ｇｒａｉｎｓ  ｗｉｔｈ  ｓｏｌｕｂｌｅｓ）（ＤＷＧＳ）のような発酵の副産物のフィチン酸含有量を低減する。いくつかの実施態様においては、本発明の方法（例えば、３０から６０分のインキュベーションを含むがこれらに限定されない）は、フィターゼのない状態での実質的に同様のプロセスと比較した場合少なくとも約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％及び９０％及びそれ以上に得られる発酵培地ろ過物のフィチン酸含有量を低減することができる。いくつかの実施態様においては、ＤＤＧＳ中に見られるフィチン酸塩含有量が、請求項記載のプロセスと実質的に同様であるが本発明によるフィターゼがない状態であって相当するプロセスからＤＤＧＳ中のフィチン酸塩含有量と比較した場合、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％及び少なくとも９０％低減される。例えば、ＤＤＧＳの商業的試料中のフィチン酸塩の％は多様であるけれども、フィチン酸塩％の一般的な範囲は約１％から約３％またはそれ以上でもよい。いくつかの実施態様においては、本発明のプロセスから得られるＤＤＧＳ中のフィチン酸塩％は１．０％未満、０．８％未満、０．５％未満及びまた０．３％未満である。いくつかの実施態様においては、蒸留残液中に見られるフィチン酸塩含有量は請求項記載のプロセスと実質的に同様であるが本発明によるフィターゼがない状態であって相当するプロセスから得られる蒸留残液中フィチン酸塩含有量と比較した場合、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、及び少なくとも９０％低減されてよい。
【誤訳訂正２５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１２６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１２６】
工業用エタノールプロセスにおいて、エタノールは、発酵ストリーム（バックセット）へリサイクルされうる及びしばしばリサイクルされる蒸留残液部分であるろ過物から蒸留されてよい。本発明は、請求項記載のプロセスと実質的に同様であるが本発明によるフィターゼがない状態であって相当するプロセスから得られる蒸留残液中フィチン酸塩含有量と比較した場合、低いフィチン酸塩を有する蒸留残液を得る。例えば、約８％ｄｓを有する蒸留残液中のフィチン酸塩（ｐｐｍ）の量は、２５００から３０００ｐｐｍの範囲でよい。本発明のいくつかの実施態様においては、蒸留残液中のフィチン酸塩含有量は、基質が本明細書に記載の方法に従って処理される場合、２０００ｐｐ未満、１０００ｐｐ未満、５００ｐｐ未満、１００ｐｐ未満、５０ｐｐ未満である。
【誤訳訂正２６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１５８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１５８】
表１２のデータはＤＤＧＳ及び蒸留残液（ｔｈｉｎ  ｓｔｉｌｌａｇｅ）におけるフィチン酸含有量に顕著な差を示した。ＢＰ−１７の使用によりＤＤＧＳ及び蒸留残液（ｔｈｉｎ  ｓｔｉｌｌａｇｅ）中のフィチン酸が９０％より多く減少する結果となった。
【誤訳訂正２７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１５９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１５９】
実施例１１から１５は野生型及び変異体ブティアウクセラ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）フィターゼを直接的に又はトリコデルマ  レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）中の融合蛋白質として発現させた。すべてのケースにおいて、１０ｇ／Ｌより多いとても高いレベルで発現が見られた。
【誤訳訂正２８】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１６０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１６０】
実施例１１：Ｋｅｘ２部位を有していない融合蛋白質としてトリコデルマ  レーシ（Ｔ．  ｒｅｅｓｅｉ）における野生型ブティアウクセラ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）フィターゼの構築及び発現
野生型ブティアウクセラ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）フィターゼのオープンリーディングフレームをコードするＤＮＡをＧＥＮＥＡＲＴ  ＡＧ  (ＢｉｏＰａｒｋ  Ｊｏｓｅｆ−Ｅｎｇｅｒｔ−Ｓｔｒ．  １１，  Ｄ−９３０５３  Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，  Ｇｅｒｍａｎｙ)によって合成した。制限酵素認識部位であるＳｐｅＩ及びＡｓｃＩをクローニング目的（表１３、配列番号４を参照）でインキュベーションした。フィターゼのオープンリーディングフレーム（配列番号４）をベクターであるｐＴｒｅｘ４のＳｐｅＩ及びＡｓｃＩ部位（図４を参照）へ挿入した。得られる構築体をバイオ‐ラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）(Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，  ＣＡ)社のＢｉｏｌｉｓｔｉｃ  ＰＤＳ−１０００／Ｈｅ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍを用いてトリコデルマ  レーシ（Ｔ．  ｒｅｅｓｅｉ）由来の菌株へバイオリスティックス的（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃａｌｌｙ）に形質転換した。形質転換の操作方法はＦｏｒｅｍａｎ（ＷＯ２００５／００１０３６）によって記載される。安定した形質転換体を得た後、これらの形質転換体をＦｏｒｅｍａｎにより記載されるようにブティアウクセラ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）フィターゼの発現分析のために振盪フラスコ培養にて増殖した。ＷＯ２００５／００１０３６に記載の形質転換及び発現分析の手順は参照によりそれらの全体が本明細書に取り込まれる。ＭＭアセトアミドプレートにて数日間培養後、安定した形態を示す形質転換体を３０ｍｌのプロフロ（Ｐｒｏｆｌｏ）培地含有２５０ｍｌ振盪フラスコに植菌した。プロフロ（Ｐｒｏｆｌｏ）培地は３０g／Ｌのアルファ‐ラクトース、６．５ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、２ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、０．３ｇ／ＬのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．２ｇ／ＬのＣａＣＬ２、ｌｍｌ／Ｌの１０００Ｘ微量元素塩液、２ｍｌ／Ｌの１０％  Ｔｗｅｅｎ  ８０、２２．５ｇ／Ｌのプロフロ（Ｐｒｏｆｌｏ）綿実粉(Ｔｒａｄｅｒｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ，  Ｍｅｍｐｈｉｓ，  ＴＮ)、及び０．７２ｇ／ＬのＣａＣＯ３を含んだ。２８℃及び２２５ｒｐｍで２日間培養後１０％プロフロ（Ｐｒｏｆｌｏ）培地を３０ｍＬのラクトース限定培地を含む２５０ｍＬの振盪フラスコに移した。ラクトース限定培地の組成物は次に示すものであった。それは、５g／Ｌ（ＮＨ４）２ＳＯ４、３３ｇ／ＬのＰＩＰＰＳ緩衝液、９ｇ／Ｌのカザミノ酸、４．５ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、１ｇ／ＬのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、５ｍｌ／ＬのＭａｚｕ  ＤＦ６０−Ｐ消泡剤(ｍａｚｕｒ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，  Ｇｕｒｎｅｅ，  ＩＬ)、ｌｍｌ／Ｌの１０００Ｘ微量元素塩液、ｐＨ５．５である。４０ｍｌ／Ｌの４０％（ｗ／ｖ）ラクトース液を滅菌後培地に加えた。ラクトース限定培地入り振盪フラスコを２から３日間２２５ｒｐｍで２８℃にてインキュベーションした。培地の上澄みのサンプルを適切な体積の還元剤含有４ＸＮｕＰＡＧＥサンプル緩衝液(インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ)と混合し、４−１２％ＮｕＰＡＧＥプレキャストゲルとＭＯＰＳ泳動用緩衝液（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）を用いてポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。ゲルをＳｉｍｐｌｙ  Ｂｌｕ���  Ｓｔａｉｎ  (インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ)を用いて蛋白質検出のために染色した。約９６ｋＤａの明らかな分子量を有する蛋白質バンドが染色ゲルに観察された。融合蛋白質の期待される分子量は約９６ｋＤａである。蛋白質は１０ｇ／Ｌより多い発現が認められた。
2010517573.tif 000004
【誤訳訂正２９】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１６１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１６１】
実施例１２：Ｋｅｘ２部位を有する融合蛋白質としてトリコデルマ  レーシ（Ｔ．  ｒｅｅｓｅｉ）における野生型ブティアウクセラ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）フィターゼの構築及び発現
野生型ブティアウクセラ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）フィターゼのオープンリーディングフレームを鋳型（表１３の配列番号４を参照）としてＧＥＮＥＡＲＴによる合成されるＤＮＡを用いてポリメレースチェーン反応（ＰＣＲ）によって増幅した。用いるＰＣＲ装置はＰｅｌｔｉｅｒ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＰＴＣ−２００  （ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）であった。ＰＣＲにて用いるＤＮＡポリメラーゼはヘラクレス（ＨＥＲｃｕｌａｓｅ）(ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）)であった。フィターゼオープンリーディングフレームを増幅するために用いたプライマーはプライマーＳＫ６６７（前方）５´CACTACTAGTGTCGCTGTGGAGAAGCGCAACGACACCCCCGCCAG‐３´（配列番号６）、及びプライマーＳＫ６６４  ５´GAGTTCGGCGCGCCTTACTGGA‐３´（配列番号７）であった。前者のプライマーは、Ｋｅｘ２プロテアーゼによって効率的に切断するためにクローニング目的のためのＳｐｅＩ部位に沿ってVAVEKR（配列番号８）のアミノ酸配列を含んだ。野生型ブティアウクセラ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）フィターゼのオープンリーディングフレームを増幅するためのＰＣＲ条件は次の通りである。段階１：９４℃１分間。段階２：９４℃３０秒間。段階３：５８℃３０秒間。段階４：７２℃１分間。段階２、３及び４をさらに２４回繰り返した。段階５：７２℃５分間。段階６：保存用４℃。ＰＣＲ産物はＱｉａｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  (キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）)を用いて精製し、制限酵素ＳｐｅＩ及びＡｓｃＩ（Ｒｏｃｈｅ）で消化した。消化ＤＮＡをＱｉａｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて精製し、ＳｐｅＩ及びＡｓｃＩ部位（図４を参照）でｐＴｒｅｘ４ベクターへライゲーションした。ライゲーション反応物をＴＯＰ１０ケミカルコンピテント大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）セル(インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）)に形質転換した。得られる構築体をバイオラッド社のＢｉｏｌｉｓｔｉｃ  ＰＤＳ−１０００／Ｈｅ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，  ＣＡ）を用いてトリコデルマ  レーシ（Ｔ．  ｒｅｅｓｅｉ）由来の菌株へバイオリスティックス的（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃａｌｌｙ）に形質転換した。形質転換の操作方法はＦｏｒｅｍａｎ（ＷＯ２００５／００１０３６）によって記載される。安定した形質転換体を得た後、これらの形質転換体を実施例１１に記載のように培養し蛋白質発現を同定した。約９６ｋＤａの明らかな分子量を有する蛋白質バンドが染色ゲルに観察された。融合蛋白質の期待される分子量は約９６ｋＤａである。蛋白質は１０ｇ／Ｌより多い発現が認められた。
【誤訳訂正３０】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１６２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１６２】
実施例１３：直接的な構築としてトリコデルマ  レーシ（Ｔ．  ｒｅｅｓｅｉ）における野生型ブティアウクセラ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）フィターゼの構築及び発現
野生型ブティアウクセラ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）フィターゼのオープンリーディングフレームを鋳型（表１３の配列番号４を参照）としてＧＥＮＥＡＲＴによる合成されるＤＮＡを用いてポリメレースチェーン反応（ＰＣＲ）によって増幅した。用いるＰＣＲ装置はＰｅｌｔｉｅｒ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＰＴＣ−２００  （ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）であった。ＰＣＲにて用いるＤＮＡポリメラーゼはヘラクレス（ＨＥＲｃｕｌａｓｅ）(ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）)であった。フィターゼオープンリーディングフレームを増幅するために用いたプライマーは、プライマーＳＫ６８０（前方）５´-CACCATGCAGACCTTCGGTGCTTTTCTCGTTTCCTTCCTCGCCGCCAGCGGCCTGGCCGCGGCCAACGACACCCCCGCCAGC-３´(配列番号９)、及びプライマーＳＫ６  ５´-CCTTACTGGAGCTGGCAG-３´(配列番号１０)であった。前者のプライマーは、ｐＥＮＴＲＹ／Ｄ−ＴＯＰＯベクター(インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）)へクローニングするために必要な５´末端にさらに４つのヌクレオチド（配列‐ＣＡＣＣ）を含んだ。野生型ブティアウクセラ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）フィターゼのオープンリーディングフレームを増幅するためのＰＣＲ条件は次の通りである。段階１：９４℃１分間。段階２：９４℃３０秒間。段階３：５８℃３０秒間。段階４：７２℃１分間。段階２、３及び４をさらに２４回繰り返した。段階５：７２℃５分間。段階６：保存用４℃。ＰＣＲ産物はＱｉａｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  (キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）)を用いて精製した。精製されるＰＣＲ産物は最初にｐＥＮＴＲＹ／Ｄ−ＴＯＰＯベクター(インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）)へクローニングされ、ＴＯＰ１０ケミカルコンピテント大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）セル(インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）)に形質転換した。フィターゼオープンリーディングフレームの正しい配列番号を有するｐＥＮＴＲＹ／Ｄ−ＴＯＰＯベクターをメーカーの使用説明書（図５を参照）にそってＬＲクロナーゼＩＩ(インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）)を用いてｐＴｒｅｘ３ｇに組み換えた。得られる構築体を形質転換し、蛋白質を実施例１１に記載のように同定した。約４６ｋＤａの明らかな分子量を有する蛋白質バンドが染色ゲルに観察された。融合蛋白質の期待される分子量は約４６ｋＤａである。蛋白質は１０ｇ／Ｌより多い発現が認められた。
【誤訳訂正３１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１６３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１６３】
実施例１４：Ｋｅｘ２部位を有する融合蛋白質としてトリコデルマ  レーシ（Ｔ．  ｒｅｅｓｅｉ）におけるＢＰ−１７変異体ブティアウクセラ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）フィターゼの構築及び発現
ＢＰ−１７変異体ブティアウクセラ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）フィターゼのオープンリーディングフレームをＧＥＮＥＡＲＴ  ＡＧ（ＢｉｏＰａｒｋ  Ｊｏｓｅｆ−Ｅｎｇｅｒｔ−Ｓｔｒ．  １  １，  Ｄ−９３０５３  Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，  Ｇｅｒｍａｎｙ)  (表１４配列番号５を参照)によって合成した。アミノ酸配列VAVEKR（配列番号８）をクローニング目的のための制限酵素認識部位ＳｐｅＩ及びＡｓｃＩに沿って、融合蛋白質のＫｅｘ２プロテアーゼ切断のために含んだ。フィターゼオープンリーディングフレームをベクターｐＴｒｅｘ４のＳｐｅＩ及びＡｓｃＩ部位へ挿入した。得られる構築体を形質転換し、蛋白質を実施例１１に記載のように同定した。約９６ｋＤａの明らかな分子量を有する蛋白質バンドが染色ゲルに観察された。融合蛋白質の期待される分子量は約９６ｋＤａである。蛋白質は１０ｇ／Ｌより多い発現が認められた。
2010517573.tif 000005
【誤訳訂正３２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１６４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１６４】
実施例１５：直接的な構築としてトリコデルマ  レーシ（Ｔ．  ｒｅｅｓｅｉ）におけるＢＰ−１７変異体ブティアウクセラ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）フィターゼの構築及び発現
ＢＰ−１７変異体ブティアウクセラ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）フィターゼのオープンリーディングフレームを鋳型としてＧＥＮＥＡＲＴ(表１４配列番号５を参照)によって合成されるＤＮＡを用いてポリメレースチェーン反応（ＰＣＲ）によって増幅した。用いるＰＣＲ装置はＰｅｌｔｉｅｒ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＰＴＣ−２００  （ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）であった。ＰＣＲにて用いるＤＮＡポリメラーゼはヘラクレス（ＨＥＲｃｕｌａｓｅ）(ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））であった。フィターゼオープンリーディングフレームを増幅するために用いるプライマーは、プライマーＳＫ６８０（前方）５´-CACCATGCAGACCTTCGGTGCTTTTCTCGTTTCCTTCCTCGCCGCCAGCGGCCTGGCCGCGGCCAACGACACCCCCGCCAGC-３´(配列番号９)、及びプライマーＳＫ６  ５´-CCTTACTGGAGCTGGCAG-３´(配列番号１０)であった。前者のプライマーは、ｐＥＮＴＲＹ／Ｄ−ＴＯＰＯベクター(インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ)）へクローニングするために必要な５´末端にさらに４つのヌクレオチド（配列‐ＣＡＣＣ）を含んだ。野生型ブティアウクセラ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）フィターゼのオープンリーディングフレームを増幅するためのＰＣＲ条件は次の通りである。段階１：９４℃１分間。段階２：９４℃３０秒間。段階３：５８℃３０秒間。段階４：７２℃１分間。段階２、３及び４をさらに２４回繰り返した。段階５：７２℃５分間。段階６：保存用４℃。ＰＣＲ産物はＱｉａｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  (キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ)）を用いて精製した。精製されるＰＣＲ産物は最初にｐＥＮＴＲＹ／Ｄ−ＴＯＰＯベクター(インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））へクローニングされ、ＴＯＰ１０ケミカルコンピテント大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）セル(インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））に形質転換した。フィターゼオープンリーディングフレームの正しい配列番号を有するｐＥＮＴＲＹ／Ｄ−ＴＯＰＯベクターをメーカーの使用説明書（図５を参照）に沿ってＬＲクロナーゼＩＩ(インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ)）を用いてｐＴｒｅｘ３ｇに組み換えた。得られる構築体を形質転換し、蛋白質発現を実施例１１に記載のように同定した。Ｓｉｍｐｌｙ  Ｂｌｕｅ染色分析により約４６ｋＤａの蛋白質バンドが観察された。融合蛋白質の期待される分子量は約４６ｋＤａである。蛋白質は１０ｇ／Ｌより多い発現が認められた。
【誤訳訂正３３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１６６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１６６】
実施例１６：アルファアミラーゼ熱安定性でのフィチン酸阻害の除去効果
全粒粉砕トウモロコシ（５０％蒸留残液含有３２‐４０％ｄｓトウモロコシ）の水溶性スラリーをｐＨ５．８、７０℃にてインキュベーションした。熱安定性フィターゼ（ＢＰ−１７）及び二つの液化熱安定性アルファ‐アミラーゼであるダニスコ  ユーエス社  ジェネンコ  ディビジョン（Ｄａｎｉｓｃｏ  ＵＳ，  Ｉｎｃ．,  Ｇｅｎｅｎｃｏｒ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）製のスペザイム（商標）エクストラ（ＳＰＥＺＹＭＥ（商標）ＸＴＲＡ）及びスペザイム（商標）エチル（ＳＰＥＺＹＭＥ（商標）ＥＴＨＹＬ）を比較実験のために用いた。
【誤訳訂正３４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１６９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１６９】
第一液状化の間ＢＰ−１７フィターゼの添加によって０．６０％ｄｓトウモロコシから０．０９％ｄｓトウモロコシまで全粒粉砕トウモロコシのフィチン酸含有量が低減した（＞８５％減少）。表１５に記載のデータは、ＤＥ進行又は粘度低下に基づいて、スペザイム（商標）エクストラ（ＳＰＥＺＹＭＥ（商標）ＸＴＲＡ）及びスペザイム（商標）エチル（ＳＰＥＺＹＭＥ（商標）ＥＴＨＹＬ）が２２５°Ｆのジェットクッカー処理温度で完全に不活化したことを示した。しかしながら、ジェットクッカー処理前のフィターゼによるフィチン酸阻害の除去によって、第二液状化段階の間８５℃でのＤＥの促進及び粘度減少によって示すようにアルファ‐アミラーゼの熱安定性における著しい増加が認められた。その結果よりフィチン酸はアルファ‐アミラーゼを阻害したこと及び阻害の除去によって液化熱安定性アルファ‐アミラーゼの熱安定性及び／又はｐＨ安定性を増加したことを示した。