【誤訳訂正書】
【提出日】平成26年9月24日(2014.9.24)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
増幅反応混合物中の標的配列を濃縮するための方法であって、
前記方法は、
ａ）  少なくとも以下の成分：    
参照配列を有し、および、前記参照配列に少なくとも５０％相同するとともに前記参照配列と同じプライマー対によって増幅可能でもある１以上の標的配列を有すると想定される核酸配列と、プライマー対結合部位間の参照配列の鎖の１つの配列の少なくとも一部と完全に相補的な参照配列の量と比較して過剰なモル濃度の参照ブロック配列、を含む増幅反応混合物を調製する工程と、
ｂ）  変性された参照鎖と変性された標的鎖を形成するために、二本鎖参照配列の溶解温度（Ｔｍ）以上および二本鎖標的配列の融解温度（Ｔｍ）より高い第１の変性温度、前記標的配列を有すると想定される反応混合物の温度を上昇させる工程と、
ｃ）  参照ブロック配列と相補的な参照鎖との二本鎖、および、参照ブロック配列と標的鎖とのヘテロ二本鎖の形成を可能にするように、反応混合物の温度を下げる工程と、
ｄ）  参照ブロック配列と標的鎖との前記二本鎖の変性を、参照ブロック配列と参照配列の二本鎖の変性よりも優先的な変性を可能にするのに十分な臨界温度（Ｔｃ）に、前記反応混合物の温度を上昇させる工程と、
e）前記プライマー対を反応混合物中の変性標的鎖と任意の変性参照鎖にアニールすることができるように、反応混合物中の温度を下げる工程と、
f) 反応混合物中で変性標的配列および変性参照配列にアニーリングした前記プライマー対を伸長する工程、および
g)  前記参照配列と比較してより標的配列を濃縮するためにb)からf)の工程を２回以上繰り返す工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記参照ブロック配列の３’−末端は伸長を阻害するためにブロックされることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記参照ブロック配列鎖上の５’−末端は、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼによる５’から３’のエキソヌクレオリシスを妨げるヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。  
【請求項４】
前記参照ブロック配列は一本鎖核酸参照ブロック配列として工程ａ）に提供されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記参照ブロック配列は、反応混合物が第１の変性温度にさらされる際に工程ｂ）で一本鎖にされた参照ブロック配列を形成するために変性する二本鎖核酸参照ブロック配列として工程ａ）で提供されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記参照ブロック配列は、一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド核酸、または、ロックト核酸の１つであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記参照ブロック配列は、一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド核酸またはロックト核酸、あるいは、別の修飾ヌクレオチドの間のキメラであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項８】
キメラ配列上のペプチド核酸またはロックト核酸の位置は、変異が存在しそうな位置にマッチするように選択され、それによって、参照ブロック配列と標的鎖とのヘテロ二本鎖を変性するために必要な温度と、参照ブロック配列と相補的な参照鎖とのヘテロ二本鎖を変性するために必要な温度の差を最大化することを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記参照ブロック配列は、そのプライマー結合部位間の参照配列の鎖の１つと完全に相補的であるか、または、プライマー結合部位のいずれかの末端で重複することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記参照ブロック配列は参照配列と同じか、参照配列よりも短いことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
冷却工程ｃ）は１分未満であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記参照ブロック配列は、２５ｎＭにほとんど等しい量で反応混合物中に存在することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
二本鎖標的配列の溶解温度は、二本鎖参照配列の溶解温度よりも高いか、該溶解温度と等しいこと、および第一変性温度が二本鎖標的配列の溶解温度より高いことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記参照および標的配列は、ＰＣＲに核酸サンプルをさらし、その後、請求項１の濃縮方法に増幅された核酸サンプルの少なくとも一部をさらすことによって、まず増幅されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記標的配列はホモ接合変異を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記標的配列は、参照配列から差次的にメチル化され、核酸サンプル上で請求項１の方法を実施する前に、核酸サンプルは亜硫酸水素ナトリウムで処理されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記参照および標的配列は、少なくとも２５の塩基対を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ、ＨＲ−融解、ジデオキシ配列決定法、単一分子配列決定、ピロシーケンス、第二世代ハイスループット配列決定、ＳＳＣＰ、ＲＦＬＰ、ｄＨＰＬＣ、ＣＣＭ、デジタルＰＣＲ、および、定量的ＰＣＲからなる群から選択される１以上の方法を用いて、濃縮した標的配列で前記混合反応物を分析する工程をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記Ｔｃは１秒−６０秒で適用されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記反応混合物は核酸検出色素を含有することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記方法はリアルタイムＰＣＲ装置で実行されることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項２２】
前記方法は標識化されたプローブを用いるリアルタイム反応条件下で実行されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
請求項１に記載の方法を実行するためのプログラム命令を含む、コンピュータ読み取り可能な媒体。
【請求項２４】
プライマー伸長工程f)がアニーリングされたプライマーの伸長を促進するため反応混合物の温度を上昇させる工程を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０００８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０００８】
ｆｕｌｌ  ＣＯＬＤ−ＰＣＲの相対的非効率は、主として、とりわけｆｕｌｌ  ＣＯＬＤ−ＰＣＲの初期のサイクル中に形成されるヘテロ二本鎖の不足によるものと信じられている。たとえばハイブリダイゼーション工程の間にゆっくりとした冷却が最適化され（例えば、９４℃から７０℃まで８分間徐々に冷却される）ても、とりわけ初期のサイクル中の非常に低い濃度の標的（例えば、変異体）は、ヘテロ二本鎖を形成する能力を低下させる。ハイブリダイゼーションによる冷却のための時間の増加は望ましいことではなく、どのような場合においても、濃縮を改善するのにとりわけ有効であるとは分かっていない。
ｆｕｌｌ  ＣＯＬＤ−ＰＣＲがｆａｓｔ  ＣＯＬＤ−ＰＣＲほど比較的効率的ではないという別の理由は、後のｆｕｌｌ  ＣＯＬＤ−ＰＣＲのサイクル中の増幅産物はヘテロ二本鎖を形成するよりもホモ二本鎖を再形成する傾向があるということである。
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１４】
修飾されたｆｕｌｌ  ＣＯＬＤ−ＰＣＲ方法は、核酸サンプルを含有する増幅反応混合物の調製を含む。核酸サンプルは、野生型の配列のような参照配列と、１つ以上の変異型配列のような１つ以上の標的配列を含有していると想定される。言及されたように、本発明の目的は、標的配列の濃度を濃縮することであり、したがって、ほとんどの状況では、標的配列が（存在するとして）低含量である場合、該方法が使用される。該方法は約１乃至１０のヌクレオチド配列の変化を含む突然変異対立遺伝子を濃縮するのに適しているが、本発明に従う標的配列は、参照配列に使用されたものと同じ対のプライマーを含むＰＣＲによって増幅可能である。言及されたように、本発明は、超過濃度レベルの反応物混合物に参照ブロック配列の存在を含んでいる。参照ブロック配列は、少なくともそのプライマー部位間の参照配列鎖の１つの少なくとも一部と相補的であるか、または、プライマー部位に部分的に重複する核酸配列である。反応混合物に加えられる参照ブロック配列は、一本鎖であるのが望ましい。（だが、最初の変性工程が変性した一本鎖の参照ブロック配列をもたらすため、二本鎖でもありうる）。
【誤訳訂正４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１６】
その後、反応混合物は、参照ブロック配列からの標的鎖の優先的な変性を可能にするの
に十分な臨界温度（例えば、Ｔｃ＝８４．５°Ｃ）にさらされる。臨界温度（Ｔｃ）は、
反応混合物がＴｃインキュベートされる場合、参照ブロック鎖と相補参照鎖の二本鎖が
ほとんど変性されないままであるが、参照ブロック鎖と標的鎖はほとんど変性されるように選択される。「ほとんど」という用語は、所定の変性型または未変性型の少なくとも６０％、好ましくは少なくとも９０％、または、さらに好ましくは少なくとも９８％を意味する。参照ブロック配列と標的鎖の二本鎖の融解温度は、参照ブロック配列と相補配列鎖の二本鎖の溶解温度よりも常に低い。なぜなら、前者はミスマッチを含むが、後者はミスマッチを含まないためである。
【誤訳訂正５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１９】
参照ブロック配列の長さは、標的または参照配列の長さと等しいか、または、標的または参照の配列の長さよりも短いか、あるいは、長くてもよい。好ましい実施形態では、参照ブロック配列は、プライマーが参照配列にあまり結合しないように、配列の各側で標的と参照の配列よりもいくつかの塩基分小さい。従って、参照ブロック配列は、標的配列を増幅するプライマーによって伸長することができない。この目的のために、随意に、参照ブロック配列の３’ＯＨはＤＮＡポリメラーゼ伸長に対してブロック可能である。同様に、随意に、参照ブロック配列の５’―末端は、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（すなわち、ハイブリダイズされた参照ブロック配列の分解）による５’から３’のエキソヌクレオリシス（ｅｘｏｎｕｃｌｅｏｌｙｓｉｓｉ）が避けられるように、部分的に重複するヌクレオチド配列で設計されてもよい。
【誤訳訂正６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２３】
本明細書で使用されているように、「標的配列を濃縮する」という用語は、標的配列の量を増加させて、サンプル中の対応する参照配列に対する標的配列の割合を増やすことを言う。例えば、サンプル中で標的配列と参照配列の割合は当初５％対９５％である場合、標的配列は３０％の参照配列に対して７０％の標的配列の割合をもたらすように、増幅反応で、優先的に増幅されてもよい。したがって、参照配列に対する標的配列の１４倍の濃縮がある。
【誤訳訂正７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３０】
本明細書に使用されるように、用語「融解温度」または「Ｔｍ」は、ポリヌクレオチドがその相補的配列から解離する温度を指す。一般的に、Ｔｍは、二本鎖核酸分子中のワトソン・クリック塩基対の半分が破壊または解離し（すなわち、「溶解している」）、その一方で、ワトソン・クリック塩基対のもう半分が二本鎖立体構造中で変化しない温度として定義されてもよい。言いかえれば、Ｔｍは、２つの相補配列のヌクレオチドの５０％がアニールされ（二本鎖）、ヌクレオチドの５０％が変性される（一本鎖）温度として定義される。したがって、Ｔｍは、二本鎖から一本鎖の核酸分子への移行時（または、逆に、一本鎖から二本鎖の核酸分子への移行時）の中間点を定義する。
【誤訳訂正８】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００４２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００４２】
（サンプル）
本明細書で使用されているように、「サンプル」は、対象の核酸（標的および参照の配列）を含有しているかまたは含有すると推定される任意の物質、あるいは、対象の核酸を含有しているかまたは含有すると推定される核酸そのものを指す。用語「サンプル」は、このように核酸（ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ）、細胞、生物、組織、液体、または、物質のサンプルを含み、限定されないが、例えば、血漿、血清、髄液、リンパ液、滑液、尿、涙、便、皮膚の外分泌液、気道、腸管、および、泌尿生殖器、唾液、血球、腫瘍、器官、組織、インビトロの細胞培養成分のサンプル、自然分離株（飲料水、海水、固形物質など）、微生物標本（ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ）、および、核酸トレーサー分子で「マーキングされた」物体または標本を含む。
【誤訳訂正９】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００４５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００４５】
消化緩衝液中のサンプルは、５０℃で１２−１８時間（振りながら）インキュベートされ、その後、等量のフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールを用いて抽出される。相が遠心分離工程（１７００ｘｇ、１０分間）後に分解しない場合、別の容量の消化緩衝液（プロテイナーゼＫを含まない）が加えられ、遠心分離工程が繰り返される。厚い白い物質が二相の界面に明瞭に存在する場合、有機抽出工程が繰り返される。抽出後、上の水層は新しい管に移され、該管には、１／２の容量の７．５Ｍ酢酸アンモニウムと２容量の１００％エタノールが加えられる。核酸は、１７００ｘｇで２分間のペレット状にされ、７０％エタノールで洗浄され、空気乾燥され、１ｍｇ／ｍｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）中で再懸濁される。残りのＲＮＡは０．１％ＳＤＳと１μｇ／ｍｌのデオキシリボヌクレアーゼを含まないリボヌクレアーゼの存在下で、３７℃で１時間サンプルをインキュベートすることによって、および、抽出とエタノール沈殿工程を繰り返すことによって、取り除かれる。本方法によるゲノムＤＮＡの収量は、およそ２ｍｇＤＮＡ／１ｇ細胞または組織であると推定される（Ａｕｓｕｂｅｌら。上記参照）。この方法によって分離されたゲノムＤＮＡは、本発明にしたがって使用することができる。
【誤訳訂正１０】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００５２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００５２】
次に、増幅反応混合物の温度は、標的配列と参照配列がハイブリダイズするのを可能にするほど低い（図１Ａ、工程２）。このアニーリング工程は、標的―標的、参照―参照、および、標的―参照の配列の二本鎖の形成をもたらすが、標的―参照の二本鎖を形成するために最適化されなければならない。この方法で使用されるＰＣＲプライマーは、該プライマーがこの中間温度で標的と参照の配列に結合するのを妨げる融解温度を有するように設計される。上に言及されるように、標的―参照ハイブリダイゼーションと冷却に係る比較的長い時間の要件は、少なくともいくつかの適用でｆｕｌｌ  ＣＯＬＤ−ＰＣＲの有効性を制限することがわかっている（図１Ａ、工程２）
【誤訳訂正１１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００５５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００５５】
この方法の工程は、標的と参照の配列の十分な増幅を得るために、多数のサイクルで繰り返されるのが一般的である。１つの実施形態では、方法の工程は、５乃至４０のサイクルが繰り返され、より好ましくは、１０−３０のサイクルが繰り返される。サイクルの最適な数は、当業者によって決定されることができる。好ましくは、本方法は、ＰＣＲ装置で、より好ましくはＳＭＡＲＴＣＹＣＬＥＲリアルタイムＰＣＲ装置（カリフォルニア州サニーベールのＣｅｐｈｅｉｄ）やＭｘ３００５ＰリアルタイムＰＣＲ装置（カリフォルニア州ラホーヤのＳｔｒａｔａｇｅｎｅ）のようなリアルタイム検出ＰＣＲ装置で行われる。この実施形態では、反応混合物は、反応の増幅産物を定量化するか、および／または、モニタリングするために、核酸検出剤（例えば、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ色素またはＬＣ−Ｇｒｅｅｎ色素のような核酸検色素、あるいは、蛍光染料に適切につながれたプローブ）を含んでもよい。ひとたび標的配列の濃縮が完全であれば、サンプルはさらに処理されてもよく、例えば、配列決定反応にさらされてもよい。濃縮した対立遺伝子は、以下のものを含む様々な手順によってさらに処理されてもよい：ＭＡＬＤＩ―ＴＯＦ、ＨＲ−融解、ジデオキシ配列決定方法、単一の分子配列決定、第二世代ハイスループット配列決定（ｓｅｃｏｎｄ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈ  ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ），ピローシケンス，ＲＦＬP，デジタルＰＣＲ、および、定量的ＰＣＲ（図１Ｂを参照）。診断アッセイと同様にこれらの処理技術のさらに具体的な記載は、「Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｔａｒｇｅｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ」と題された上記の特許文献２に含まれており、該文献は参照によって本明細書に組み込まれる。
【誤訳訂正１２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００５６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００５６】
（反応混合物中の過剰な参照ブロック配列によるｆｕｌｌ  ＣＯＬＤ−ＰＣＲサイクル）図２は、本発明の修飾されたｆｕｌｌ  ＣＯＬＤ−ＰＣＲ方法に従って標的配列の濃縮を説明する。初めに（図２、工程１）、核酸サンプルは、二本鎖の参照配列（１０）（例えば、野生型の配列）を含有しており、二本鎖の標的配列（１２）（例えば変異体配列）を含有している。増幅反応混合物は、サンプル、他のＰＣＲ成分、および、本発明に従って、２５ｎＭのような過剰な濃度レベルの参照ブロック配列（１４）を含有している。図２では、描かれた参照ブロック配列（１４）は、そのプライマー部位間の参照配列（１０）の鎖（１０Ａ）の一つと相補的な一本鎖核酸配列である。
【誤訳訂正１３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００５７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００５７】
図２の工程１の反応混合物は、３０秒間、例えば９５℃の第１の変性温度にさらされ、その結果、参照配列（１０Ａ）、（１０Ｂ）と、標的配列（１２Ａ）、（１２Ｂ）の変性鎖がもたらされる。その後、反応混合物はハイブリダイゼーションを促進するために冷やされる（例えば７０℃で、３０秒間）が、これは、先行技術での通常の８分間の冷却からの劇的な減少である。冷却は過剰な量の山参照ブロック配列（１４）の存在下で起こるため、参照ブロック配列（１４）は、参照配列の相補鎖（１０Ａ）と標的配列の相補鎖（１２Ａ）と優先的にハイブリダイズする。図２の工程２は、７０℃までのハイブリダイゼーション冷却後の反応混合物の状態を説明する。参照ブロック配列（１４）および相補的な参照鎖（１０Ａ）のヘテロ二本鎖（１６）と、参照ブロック配列（１４）および相補的な標的鎖（１２Ａ）のヘテロ二本鎖（１８）に加えて、反応混合物は、参照と標的の配列の変性したマイナス鎖（１０Ｂ）および（１２Ｂ）をそれぞれ含有している。
【誤訳訂正１４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００５９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００５９】
図２の工程４を参照すると、優先的な変性の後、反応混合物の温度が６０℃に下げられることで、プライマー対（２０Ａ）（２０Ｂ）は、反応混合物中の遊離標的鎖（１２Ａ）（１２Ｂ）と遊離参照鎖（１０Ｂ）とアニールすることが可能となる。参照番号（２０Ａ）はフォワードプライマーを、参照番号（２０Ｂ）はリバースプライマーを指す。先に記載されたように、標的配列（１２）は、参照配列（１０）に使用されるものと同じ対のプライマー（２０Ａ）（２０Ｂ）を介して増幅可能である。図２の工程５は、第１の変性工程と比較した標的配列の２つの遊離鎖（１２Ａ）（１２Ｂ）と、たった１つの遊離参照鎖（１０Ｂ）を説明している。もう一方の参照鎖（１０Ａ）は、参照ブロック配列（１４）によってハイブリダイズされ、したがって、増幅には利用できない。その後、反応混合物の温度が例えば７２℃に上げられることによって、アニールされたプライマー（２０Ａ）（２０Ｂ）を伸長し、そうすることで参照配列（１０）に対する反応混合物中の標的配列（１２）の濃度を濃縮する。この方法は５乃至３０サイクル繰り返される傾向にある。