(57)【要約】【課題】コルジセビンを高率に抽出する。【解決手段】コルジセビンを含有する冬虫夏草を試料とし、この試料を粉砕し、粉砕した試料と水とを同一の容器内に入れ、この容器内の液を撹拌する。または、前記試料を粉砕し、粉砕した試料と水とを同一の容器内に入れ、この容器内の液を超音波で振動させる。前記容器内には、粉砕した試料１ｇを入れてから水５０ｍｌを加えることが好ましい。また、前記容器内の液の撹拌時間又は超音波振動時間が、５分〜１５０分であることが好ましい。【選択図】　　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
コルジセビンを含有する冬虫夏草を試料とし、この試料を粉砕し、粉砕した試料と水とを同一の容器内に入れ、この容器内の液を撹拌することを特徴とするコルジセビンの抽出方法。
【請求項２】
コルジセビンを含有する冬虫夏草を試料とし、この試料を粉砕し、粉砕した試料と水とを同一の容器内に入れ、この容器内の液を超音波で振動させることを特徴とするコルジセビンの抽出方法。
【請求項３】
前記容器内に粉砕した試料１ｇを入れてから水５０ｍｌを加える請求項１又は２に記載のコルジセビンの抽出方法。
【請求項４】
前記容器内の液の撹拌時間又は超音波振動時間が、５分〜１５０分である請求項１又は２に記載のコルジセビンの抽出方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、薬用茸の一種で、優れた抗がん効果、抗菌効果、免疫増強効果及び滋養強壮効果を有する冬虫夏草に含まれるｃｏｒｄｙｃｅｐｉｎ（コルジセビン）を抽出するコルジセビンの抽出方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
冬虫夏草は、薬用茸の一種で、昆虫などを宿生とし、菌糸が増殖して宿生を死に至らしめた後、該宿生の体内で菌糸が充満すると子実体を形成するｃｏｒｄｙｃｅｐｓ属の茸の一種であり、冬季には宿生の体内にあり、夏季になると宿生の虫体から穿ち出る子嚢菌に属する茸である。
冬虫夏草は、自然状態では地中または地上に菌糸または胞子として存在する菌であり、寄生する昆虫の幼虫期、蛹期及び成虫期全般にわたって体内に侵入して発生する。
冬虫夏草は、優れた抗がん効果、抗菌効果、免疫増強効果及び滋養強壮効果を有するものとして知られており、冬虫夏草の有効成分はｃｏｒｄｙｃｅｐｉｎ（コルジセビン）である。
【０００３】
コルジセビンを抽出する方法としては、過塩素酸法、エタノ−ル法が提案されている。
過塩素酸法は、冬虫夏草をミルにより粉砕して試料として、この１ｇの試料を５℃に冷やした過塩素酸溶液５０ｍｌに加えて、所定時間撹拌や振動を行うことにより、試料液中にコルジセビンを抽出させるものである。
エタノ−ル法は、冬虫夏草をミルにより粉砕して試料として、この１ｇの試料をエタノール溶液５０ｍｌに加えて、所定時間撹拌や振動を行うことにより、試料液中にコルジセビンを抽出させるものである。
しかし、過塩素酸法、エタノール法は、いずれもコルジセビンを抽出することができるが、より高率にコルジセビンを抽出したい。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、本発明は、このような実状に鑑みなされたものであり、その目的は、コルジセビンを高率に抽出することができるコルジセビンの抽出方法を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
前記目的を達成するために、本発明のコルジセビンの抽出方法は、コルジセビンを含有する冬虫夏草を試料とし、この試料を粉砕し、粉砕した試料と水とを同一の容器内に入れ、この容器内の液を撹拌するものである。
また、本発明のコルジセビンの抽出方法は、コルジセビンを含有する冬虫夏草を試料とし、この試料を粉砕し、粉砕した試料と水とを同一の容器内に入れ、この容器内の液を超音波で振動させるものである。
前記容器内に粉砕した試料１ｇを入れてから水５０ｍｌを加えることが好ましい。
前記容器内の液の撹拌時間又は超音波振動時間が、５分〜１５０分であることが好ましい。
【０００６】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のコルジセビンの抽出方法は、コルジセビンを含有する冬虫夏草を試料とし、この試料を粉砕し、粉砕した試料と水とを同一の容器内に入れ、この容器内の液を撹拌するか、又は超音波で振動させるものである。
【０００７】
冬虫夏草としては、ｃｏｒｄｙｃｅｐｉｎ（コルジセビン）を含有するものであれば特に限定されず、ｃｏｒｄｙｃｅｐｓに属するもので、ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ　ｍｉｌｉｔａｒｉｓであるものが好ましい。
試料（冬虫夏草）の粉砕は、特に限定されず、どのような手段を用いて行ってもよく、例えば、ミルを用いて行うようにしてもよい。
粉砕した試料の粒径は、特に限定されないが、好ましくは５００μｍ以下であり、特に好ましくは３００μｍ以下である。試料の粒径が５００μｍを超えると抽出し難いので、好ましくない。
試料と水とを入れる容器は、特に限定されず、例えばビーカーが用いられる。ビーカーに粉砕した試料を１ｇ入れ、これに水５０ｍｌを入れる。
水としては、特に限定されず、水道水、井戸水、蒸留水等が用いられる。
【０００８】
撹拌は、容器（ビーカー）内の試料と水とが撹拌されるならばどのようなものでもよく、例えばスターラを用いてもよい。
撹拌時間は、特に限定されないが、好ましくは５〜６０分がよく、特に好ましくは１０〜３０分がよい。撹拌時間が５分未満では、抽出不十分であるので好ましくない。
【０００９】
超音波振動は、特に限定されず、例えば超音波を発生する水浴容器に浸漬させながら容器内の試料液（試料と水とを含む）を振動させるようにする。超音波は、特に限定されないが、５Ｈｚ以上が好ましい。５Ｈｚ未満では抽出不十分であるので好ましくない。超音波による振動時間は、特に限定されないが、好ましくは５〜６０分がよく、特に好ましくは１０〜３０分がよい。振動時間が５分未満では、抽出不十分であるので好ましくない。
【００１０】
撹拌又は超音波振動後、試料液をろ過する。このろ過は、例えばろ紙によるろ過後に０．４５μｍのフィルターを用いてろ過することが好ましい。
ろ過後の試料液を例えば高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）にて含まれるｃｏｒｄｙｃｅｐｉｎ（コルジセビン）を測定することにより、抽出されたコルジセビンの量が分かり、過塩素酸法、エタノール法の場合に比してコルジセビンが高率に抽出されていることが分かる。
【００１１】
【実施例】
以下、実施例および比較例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれになんら限定されるものではない。
【００１２】
（冬虫夏草の培養）
菌株としては、ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ　ｍｉｌｌｉｔａｒｉｓ（Ｌｉｎｎａｅｕｓ）Ｌｉｎｋ（ＯＢＫ３）を、保存菌株用培地（スラント培地：ペプトン１ｇ、グルコース３ｇ、ＤＬ−アスパラギン０．１ｇ、ＭｇＳＯ４０．０５ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４０．１ｇ、Ｂｉｏｔｉｎ　０．００２ｍｇ、寒天３ｇ、蒸留水１００ｍｌ、ｐＨ６．８）で保存したものを用いた。
【００１３】
前々培養
平板寒天培地（ペプトン１ｇ、グルコース３ｇ、ＤＬ−アスパラギン０．１ｇ、ＭｇＳＯ４０．０５ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４０．１ｇ、Ｂｉｏｔｉｎ　０．００２ｍｇ、寒天３ｇ、蒸留水１００ｍｌ、ｐＨ６．８）をシャーレに２０ｍｌ充填し、このシャーレ培地に、前記保存した菌株を１５ｍｍ×１５ｍｍ程切り出して接種し、これを２１℃で、２週間培養した。
【００１４】
前培養
液体培地（ペプトン１ｇ、グルコース３ｇ、ＤＬ−アスパラギン０．１ｇ、ＭｇＳＯ４０．０５ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４０．１ｇ、Ｂｉｏｔｉｎ　０．００２ｍｇ、蒸留水１００ｍｌ、ｐＨ６．８）１００ｍｌを５００ｍｌ三角フラスコに分注し、オートクレーブを用いて１２１℃で２０分間滅菌処理して温度が室温に下がった後、この液体培地に、前々培養したシャーレ培地からほぼ１ｃｍ四角のコロニ−　三つを切り出して入れた。これを回転振盪機を用いて８０ｒｐｍ、２１℃で、１０日間培養した。
【００１５】
本培養
本培地１００ｍｌを５００ｍｌ三角フラスコに分注し、オートクレーブを用いて１２１℃で２０分間滅菌処理して温度が室温に下がった後、この本培地（液体培地）に、前培養した培地から１ｍｌを本培地に接種した。これを２１℃で、５０日間静置培養した。
本培地としては、グルコース３ｇ、ペプトン１ｇ、ＤＬ−アスパラギン０．１ｇ、ＭｇＳＯ４０．０５ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４０．１ｇ、Ｂｉｏｔｉｎ　０．００２ｍｇ、蒸留水１００ｍｌ、ｐＨ６．８の液体培地を用いた。
培養後に、菌糸と培地を一緒に凍結乾燥した。
【００１６】
（ｃｏｒｄｙｃｅｐｉｎ（コルジセビン）の抽出）
以上のようにして得られた冬虫夏草（凍結乾燥したもの）をミルで粉砕（３００μｍ以下に粉砕）して試料とした。
この試料を１ｇずつ６個のビーカーに入れ、各ビーカーに水（蒸留水）５０ｍｌを加えて、下記の条件でそれぞれ撹拌又は超音波振動を行った（実施例１〜６）。
▲１▼１０分間スタ−ラで攪拌
▲２▼３０分間スタ−ラで攪拌
▲３▼６０分間スタ−ラで攪拌
▲４▼１０分間超音波で振動（４３ＫＨＺ，５０Ｗ、室温２５℃）
▲５▼３０分間超音波で振動（４３ＫＨＺ，５０Ｗ、室温２５℃）
▲６▼６０分間超音波で振動（４３ＫＨＺ，５０Ｗ、室温２５℃）
撹拌又は超音波振動後、試料液をろ過（ろ紙Ｎｏ６／１２５ｍｍ）後、メスフラスコにより１００ｍｌに定容した。そして、０．４５μｍのフィルターでろ過した。
【００１７】
ろ過液を高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ（株式会社島津製作所製：ＬＣ−１０ＡＴ））を用いて分析し、含まれるコルジセビンを測定した。その結果を表１に示した。
なお、測定は、５０ｍｌのメスフラスコにコルジセビン４ｍｇを測り、水に溶解させ８０ｐｐｍの標準液を作製する。これを段階希釈し、８０、４０、２０、１０の標準液とし、試料液中のｃｏｒｄｙｃｅｐｉｎ定量用の検量線作成用とした。
測定（分析）条件は下記である。
溶媒：５０ｍＭりん酸一カリウム：アセトニトリル（９５：５）
カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ　ＯＤＳ−２（ＯＤＳ）　２５０×４．６ｍｍ
カラム温度：４０℃
流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
測定波長：２６０ｎｍ
計算方法：冬虫夏草１００ｇ中のｃｏｒｄｙｃｅｐｉｎ含量＝算出濃度／（試料重量×４０）
式中の冬虫夏草１００ｇ中のｃｏｒｄｙｃｅｐｉｎ含量の単位はｇ／１００ｇ、算出濃度はｐｐｍ、試料重量はｇである。
【００１８】
また、比較のために前記粉砕した試料を１ｇとり、これをビーカーに入れて表１に示すように過塩素酸溶液、エタノール溶液を加え、それぞれの条件下で撹拌及び超音波振動を行った（比較例１〜１５）。超音波は４３ＫＨＺ、５０Ｗ、室温２５℃で行った。
その他の条件は前記とほぼ同様にして行ったが、過塩素酸溶液の場合には、試料液をろ紙によるろ過後、ろ液２０ｍｌに３Ｍ水酸化カリウム溶液と０．３Ｍ水酸化カリウム溶液を使ってｐＨ８〜９に調整し、その後メスフラスコにより１００ｍｌに定容した後、冷蔵庫で１時間冷却放置してから０．４５μｍのフィルターでろ過した。
【００１９】
【表１】
2004008938.tif 000002
【００２０】
表１に示した結果からも明らかな通り、本発明の抽出方法は、いずれも高率にｃｏｒｄｙｃｅｐｉｎを抽出できた。これに対して、エタノ−ル抽出方法の場合にはいずれの条件においても大きな改善はなかった。また、過塩素酸抽出方法の場合については、処理時間の延長による穏やかな減少、超音波処理及び過塩素酸濃度の変化では、それぞれ時間の延長および濃度の高まりに準じてｃｏｒｄｙｃｅｐｉｎ量が低下した。条件が過酷すぎ、むしろ分解が起こってしまっていることがわかった。
【００２１】
【発明の効果】
以上要するに本発明によれば、コルジセビンを高率に抽出することができる。