【手続補正書】
【提出日】平成25年11月18日(2013.11.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号３に少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するβ−グルコシダーゼ１（ＢＧＬ１）変異体において、
（ａ）前処理済みトウモロコシ茎葉（ＰＣＳ）加水分解活性、
（ｂ）セロビアーゼ活性、
（ｃ）タンパク質発現、
（ｄ）アンモニアで前処理したトウモロコシ穂軸（ＣＣ）の存在下でのセロビアーゼ活
性又はＣＣ加水分解活性のいずれかにより測定されるβ−グルコシダーゼ活性、
（ｅ）熱安定性、
（ｆ）リン酸膨潤セルロース（ＰＡＳＣ）加水分解活性、及び
（ｇ）グルコース存在下での加水分解活性、
からなる群から選択される少なくとも２つの活性が配列番号３のアミノ酸配列を有する野生型β−グルコシダーゼ１（ＢＧＬ１）よりも改良されており、
上記ＢＧＬ１変異体が配列番号３のＩ５６７、Ｑ２２６、Ｅ１７０、Ｎ２６３、Ｓ６８３、及びＮ２３８から選択される位置に対応する位置における置換を含むＢＧＬ１変異体。
【請求項２】
請求項１に記載のＢＧＬ１変異体において、
（１）置換位置がＱ２２６である場合、前記置換はＱ２２６Ｙ又はＣ２２６Ｆであり、
（２）置換位置がＥ１７０である場合、前記置換はＥ１７０Ｆであり、
（３）置換位置がＮ２６３である場合、前記置換はＮ２６３Ｃ又はＮ２６３Ｔであり、
（４）置換位置がＳ６８３である場合、前記置換はＳ６８３Ｗであり、
（５）置換位置がＮ２３８である場合、前記置換はＮ２３８Ｆである、ＢＧＬ１変異体。
【請求項３】
請求項２に記載のＢＧＬ１変異体において、該変異体が（１）の置換を有する場合、更に配列番号３のＥ１７０、Ｔ２４２、Ｓ３１２、Ｎ３６９、Ｇ３７２、Ｖ６０３、Ｐ６６１、及び／又はＴ６６６に対応する位置における１つ以上の置換を更に含むＢＧＬ１変異体。
【請求項４】
請求項３に記載のＢＧＬ１変異体において、前記置換がＥ１７０Ｆ、Ｔ２４２Ｓ，Ｓ３１２Ｙ、Ｎ３６９Ｙ、Ｇ３７２Ａ、Ｖ６０３Ｇ、Ｐ６６１Ｆ、及び／又はＴ６６６ＣであるＢＧＬ１変異体。
【請求項５】
請求項２に記載のＢＧＬ１変異体において、該変異体が（２）の置換を有する場合、更に配列番号３のＱ２２６、Ｔ２４２，Ｓ３１２、Ｎ３６９、Ｇ３７２、Ｖ６０３、Ｐ６６１、及び／又はＴ６６６に対応する位置における１つ以上の置換を更に含むＢＧＬ１変異体。
【請求項６】
請求項５に記載のＢＧＬ１変異体において、前記置換がＱ２２６Ｙ、Ｔ２４２Ｓ，Ｓ３１２Ｙ、Ｎ３６９Ｙ、Ｇ３７２Ａ、Ｖ６０３Ｇ、Ｐ６６１Ｆ、及び／又はＴ６６６ＣであるＢＧＬ１変異体。
【請求項７】
請求項２に記載のＢＧＬ１変異体において、該変異体が（３）の置換を有する場合、更に配列番号３のＫ３４５、Ｎ３６９、Ｇ３７２、Ｋ４２８、Ｐ６６１、及び／又はＳ６８３に対応する位置における１つ以上の置換を更に含むＢＧＬ１変異体。
【請求項８】
請求項７に記載のＢＧＬ１変異体において、前記置換がＫ３４５Ｅ、Ｎ３６９Ｅ、Ｎ３６９Ｔ、Ｇ３７２Ａ、Ｋ４２８Ｎ、Ｐ６６１Ｅ、及び／又はＳ６８３ＷであるＢＧＬ１変異体。
【請求項９】
請求項２に記載のＢＧＬ１変異体において、該変異体が（４）の置換を有する場合、更に配列番号３のＮ２６３、Ｋ３４５、Ｎ３６９、Ｇ３７２、Ｋ４２８、及び／又はＰ６６１、に対応する位置における１つ以上の置換を更に含むＢＧＬ１変異体。
【請求項１０】
請求項９に記載のＢＧＬ１変異体において、前記置換がＮ２６３Ｃ、Ｋ３４５Ｅ、Ｎ３６９Ｅ、Ｎ３６９Ｔ、Ｇ３７２Ａ、Ｋ４２８Ｎ、Ｐ６６１Ｅ、Ｐ６６１Ｌ、及び／又はＳ６８３ＷであるＢＧＬ１変異体。
【請求項１１】
請求項２に記載のＢＧＬ１変異体において、該変異体が（５）の置換を有する場合、更に配列番号３のＲ１７９、Ｎ２３８、Ｎ２６４、Ｎ２６５、Ｎ３６９、Ｄ３７０、及び／又はＫ６５６に対応する位置における１つ以上の置換を更に含むＢＧＬ１変異体。
【請求項１２】
請求項１１に記載のＢＧＬ１変異体において、前記置換がＲ１７９Ｖ、Ｎ２３８Ｆ、Ｎ２６４Ｍ、Ｎ２６５Ｍ、Ｎ３６９Ｉ、Ｄ３７０Ｗ、及び／又はＫ６５６ＲであるＢＧＬ１変異体。
【請求項１３】
請求項１に記載のＢＧＬ１変異体において、
（ｉ）置換がＩ５６７Ｑである場合、改良された活性が（ａ）および（ｂ）である、
（ｉｉ）置換がＩ５６７Ｖである場合、改良された活性が（ｂ）、（ｃ）および（ｅ）である、
（ｉｉｉ）置換がＩ５６７Ｅである場合、改良された活性が（ｂ）および（ｄ）である、
（ｉｖ）置換がＩ５６７Ｋである場合、改良された活性が（ｂ）および（ｃ）である、
（ｖ）置換がＩ５６７Ｒである場合、改良された活性が（ｂ）および（ｃ）である、
（ｖｉ）置換がＩ５６７Ｓである場合、改良された活性が（ａ）および（ｄ）である、
（ｖｉｉ）置換がＩ５６７Ｖである場合、改良された活性が（ｂ）、（ｃ）、および（ｅ）である、
（ｖｉｉｉ）置換がＩ５６７Ｙである場合、改良された活性が（ｅ）および（ｇ）である、変異体。
【請求項１４】
請求項１乃至４のいずれか１項に記載のＢＧＬ１変異体であって、前記ＢＧＬ１変異体が配列番号３に対応する位置における１つ以上の置換を含み、前記置換が
Ｑ２２６Ｆ；
Ｅ１７０Ｆ｜Ｑ２２６Ｙ｜Ｔ２４２Ｓ｜Ｓ３１２Ｙ｜Ｇ３７２Ａ｜Ｖ６０３Ｇ｜Ｐ６６１Ｆ｜Ｔ６６６Ｃ；
Ｑ２２６Ｙ｜Ｔ６６６Ｃ；
Ｅ１７０Ｆ｜Ｑ２２６Ｙ｜Ｎ３６９Ｙ｜Ｇ３７２Ａ｜Ｐ６６１Ｆ；
Ｅ１７０Ｆ｜Ｑ２２６Ｙ｜Ｎ３６９Ｙ｜Ｇ３７２Ａ；
Ｑ２２６Ｙ｜Ｔ２４２Ｓ｜Ｇ３７２Ａ｜Ｐ６６１Ｆ；
Ｅ１７０Ｆ；
Ｅ１７０Ｆ｜Ｖ６０３Ｇ；
Ｅ１７０Ｆ｜Ｓ３１２Ｙ｜Ｎ３６９Ｙ；
Ｅ１７０Ｆ｜Ｑ２２６Ｙ｜Ｎ３６９Ｙ｜Ｇ３７２Ａ｜Ｔ６６６Ｃ；
Ｅ１７０Ｆ｜Ｔ２４２Ｓ｜Ｎ３６９Ｙ｜Ｇ３７２Ａ｜Ｖ６０３Ｇ｜Ｔ６６６Ｃ；
Ｎ２６３Ｃ｜Ｋ３４５Ｅ｜Ｎ３６９Ｅ；
Ｎ２６３Ｃ｜Ｋ３４５Ｅ｜Ｎ３６９Ｔ｜Ｋ４２８Ｎ；
Ｎ２６３Ｃ｜Ｋ３４５Ｅ｜Ｎ３６９Ｅ｜Ｐ６６１Ｌ；
Ｎ２６３Ｃ｜Ｋ３４５Ｅ｜Ｎ３６９Ｅ｜Ｇ３７２Ａ；
Ｎ２６３Ｃ｜Ｋ３４５Ｅ｜Ｎ３６９Ｅ｜Ｇ３７２Ａ｜Ｐ６６１Ｅ；
Ｎ２６３Ｃ｜Ｋ３４５Ｅ｜Ｎ３６９Ｅ｜Ｇ３７２Ａ｜Ｋ４２８Ｎ｜Ｐ６６１Ｅ｜Ｓ６８３Ｗ；
Ｓ６８３Ｗ；
Ｎ３６９Ｅ｜Ｓ６８３Ｗ；
Ｋ４２８Ｎ｜Ｓ６８３Ｗ；
Ｎ２６３Ｃ｜Ｎ３６９Ｔ｜Ｓ６８３Ｗ；
Ｎ２６３Ｃ｜Ｐ６６１Ｌ｜Ｓ６８３Ｗ；
Ｋ３４５Ｅ｜Ｎ３６９Ｅ｜Ｓ６８３Ｗ；
Ｋ３４５Ｅ｜Ｐ６６１Ｅ｜Ｓ６８３Ｗ；
Ｋ３４５Ｅ｜Ｋ４２８Ｎ｜Ｓ６８３Ｗ；
Ｎ３６９Ｔ｜Ｐ６６１Ｅ｜Ｓ６８３Ｗ；
Ｎ３６９Ｔ｜Ｐ６６１Ｌ｜Ｓ６８３Ｗ；
Ｇ３７２Ａ｜Ｐ６６１Ｅ｜Ｓ６８３Ｗ；
Ｎ２６３Ｃ｜Ｎ３６９Ｔ｜Ｐ６６１Ｅ｜Ｓ６８３Ｗ；
Ｋ３４５Ｅ｜Ｎ３６９Ｅ｜Ｇ３７２Ａ｜Ｓ６８３Ｗ；
Ｋ３４５Ｅ｜Ｎ３６９Ｅ｜Ｋ４２８Ｎ｜Ｓ６８３Ｗ；
Ｋ３４５Ｅ｜Ｎ３６９Ｅ｜Ｐ６６１Ｅ｜Ｓ６８３Ｗ；
Ｎ３６９Ｔ｜Ｇ３７２Ａ｜Ｋ４２８Ｎ｜Ｓ６８３Ｗ；
Ｎ３６９Ｔ｜Ｇ３７２Ａ｜Ｐ６６１Ｌ｜Ｓ６８３Ｗ；
Ｋ３４５Ｅ｜Ｎ３６９Ｔ｜Ｇ３７２Ａ｜Ｐ６６１Ｅ｜Ｓ６８３Ｗ；
Ｎ２６３Ｃ｜Ｋ３４５Ｅ｜Ｎ３６９Ｔ｜Ｇ３７２Ａ｜Ｋ４２８Ｎ｜Ｐ６６１Ｅ｜Ｓ６８３Ｗ；
Ｎ２３８Ｆ；
Ｒ１７９Ｖ｜Ｎ２３８Ｆ｜Ｄ３７０Ｗ；
Ｒ１７９Ｖ｜Ｎ２３８Ｆ｜Ｋ６５６Ｒ；
Ｒ１７９Ｖ｜Ｎ２３８Ｆ｜Ｒ２６５Ｍ；
Ｎ２３８Ｆ｜Ｒ２６５Ｍ｜Ｎ３６９Ｉ；
Ｎ２３８Ｆ｜Ｎ２６４Ｍ｜Ｒ２６５Ｍ｜Ｎ３６９Ｉ；から選択される、ＢＧＬ１変異体。
【請求項１５】
（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、および（ｇ）から選択される任意の２つ、任意の３つ、任意の４つ、任意の５つ、任意の６つ、又は７つ全ての活性が改善されている請求項１乃至２１および１４のいずれか一項に記載のＢＧＬ１変異体。
【請求項１６】
請求項１乃至１５のいずれか一項に記載のＢＧＬ１変異体を含む組成物。
【請求項１７】
前記ＢＧＬ１変異体を豊富に含む組成物である、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
請求項１乃至１５のいずれか一項に記載のＢＧＬ１変異体をコードする単離核酸。
【請求項１９】
請求項１８の核酸を含む発現ベクター。
【請求項２０】
前記単離された核酸が調節配列に制御可能に結合している、請求項１９の発現ベクター。
【請求項２１】
請求項１８の核酸を含む宿主細胞。
【請求項２２】
好適な条件下で請求項２１の宿主細胞を培養してＢＧＬ１変異体を生成する工程を含むＢＧＬ１変異体の生産方法。
【請求項２３】
請求項１乃至１５のいずれか一項に記載のＢＧＬ１変異体とバイオマスとを接触させる工程を含むバイオマスを糖へと変換させる方法。