【手続補正書】
【提出日】平成23年10月6日(2011.10.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
本発明のこれらおよび他の特徴および利点は、以下の詳細な記載、添付の図面および請求項を参照すれば明らかとなる。本明細書に開示される全ての参考文献は、各々が組み込まれたのと同様に、参照により全体として本明細書に組み込まれる。
したがって、本発明は、以下の項目を提供する：
（項目１）
長さ約１００ヌクレオチド未満の小さなＲＮＡ標的配列の逆転写のための方法であり、
（ａ）上記小さなＲＮＡ標的配列を含む試料を、
（ｉ）上記小さなＲＮＡ標的配列とハイブリダイズするのに十分に上記小さなＲＮＡ標的配列に対して相補的である、プライマー、および
（ｉｉ）逆転写酵素活性を有するＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ
と接触させるステップと；
（ｂ）上記ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼの基質である少なくとも一つの塩基修飾、二重鎖安定化ｄＮＴＰを含むｄＮＴＰの混合物の存在下で、上記小さなＲＮＡ標的配列に相補的なｃＤＮＡを合成するステップと
を含む、方法。
（項目２）
上記ｄＮＴＰの混合物が、上記５−位で置換されたピリミジンである、塩基修飾、二重鎖安定化ｄＮＴＰを含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
上記ｄＮＴＰの混合物が、式：
【化１１】
2011501663.tif 000001
を有する塩基修飾、二重鎖安定化ｄＮＴＰを含み、
式中、Ｂは、
【化１２】
2011501663.tif 000002
より選択され；
Ｘは、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＣＨ３または
【化１３】
2011501663.tif 000003
より選択され；
Ｙは、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉまたは
【化１４】
2011501663.tif 000004
より選択され；
Ｒは、−Ｈ、−ＯＨ、−ＯＣＨ３または−ＮＨ２である、
項目１に記載の方法。
（項目４）
上記ｄＮＴＰの混合物が、ｄ（２−ａｍＡ）ＴＰ、ｄ（５−ＰｒＵ）ＴＰおよび／またはｄ（５−ＰｒＣ）ＴＰより選択される、塩基修飾、二重鎖安定化ｄＮＴＰを含む、項目１に記載の方法。
（項目５）
上記ｄＮＴＰの混合物が、（２−ａｍＡ）ＴＰ、ｄ（５−ＰｒＵ）ＴＰおよびｄ（５−ＰｒＣ）ＴＰおよび／またはｄＧＴＰの少なくとも二つを含む、項目１に記載の方法。
（項目６）
上記小さなＲＮＡ標的配列が、約１０〜３０ヌクレオチドの長さである、項目１に記載の方法。
（項目７）
上記小さなＲＮＡ標的配列が、ｍｉＲＮＡ配列である、項目１に記載の方法。
（項目８）
上記プライマーに、一つ以上の塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰが組み込まれている、項目１に記載の方法。
（項目９）
（ａ）一本鎖ｃＤＮＡを提供するために、上記ステップ（ｂ）で形成されるｃＤＮＡを処理するステップと；
（ｂ）二重鎖ｃＤＮＡ分子を産出するために、上記一本鎖ｃＤＮＡを、上記ｃＤＮＡに十分に相補的であるためにこれにハイブリダイズし、ＤＮＡポリメラーゼの存在下で伸長産物の合成を開始する、第二プライマーと接触させる、ステップと
をさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目１０）
上記小さなＲＮＡ標的配列およびその相補鎖に十分に相補的であるためにこれにハイブリダイズし、ＤＮＡポリメラーゼの存在下で増幅産物を産出する、増幅プライマーを用いて、核酸増幅反応を行うステップをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目１１）
上記核酸増幅反応が、ポリメラーゼ連鎖反応である、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
上記増幅プライマーの一つ以上に、塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰが組み込まれている、項目１０に記載の方法。
（項目１３）
上記増幅反応が、少なくとも一つの塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰを含むデオキシヌクレオシド５’−三リン酸の混合物の存在下で行われる、項目１０に記載の方法。
（項目１４）
長さ約１００ヌクレオチド未満の小さなＲＮＡ標的配列を増幅するための方法であり、
（ａ）上記小さなＲＮＡ標的配列を含む試料を、
（ｉ）上記小さなＲＮＡ標的配列とハイブリダイズするのに十分に上記小さなＲＮＡ標的配列に対して相補的である、プライマー、および
（ｉｉ）逆転写酵素活性を有するＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ
と接触させるステップと；
（ｂ）上記ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼのための基質である少なくとも一つの塩基修飾、二重鎖安定化ｄＮＴＰを含むｄＮＴＰの混合物の存在下で、上記小さなＲＮＡ標的配列に相補的なｃＤＮＡを合成するステップと、
（ｃ）上記小さなＲＮＡ標的配列およびその相補鎖に十分に相補的であるためにこれにハイブリダイズし、ＤＮＡポリメラーゼの存在下で増幅産物を産出する、増幅プライマーを用いて、核酸増幅反応を行うステップ
を含む、方法。
（項目１５）
上記ｄＮＴＰの混合物が、上記５−位で置換されたピリミジンである、塩基修飾、二重鎖安定化ｄＮＴＰを含む、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
上記ｄＮＴＰの混合物が、式：
【化１５】
2011501663.tif 000005
を有する塩基修飾、二重鎖安定化ｄＮＴＰを含み、式中、Ｂは、
【化１６】
2011501663.tif 000006
より選択され；
Ｘは、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＣＨ３または
【化１７】
2011501663.tif 000007
より選択され；
Ｙは、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉまたは
【化１８】
2011501663.tif 000008
より選択され；
Ｒは、−Ｈ、−ＯＨ、−ＯＣＨ３または−ＮＨ２である、
項目１４に記載の方法。
（項目１７）
上記ｄＮＴＰの混合物が、ｄ（２−ａｍＡ）ＴＰ、ｄ（５−ＰｒＵ）ＴＰおよび／またはｄ（５−ＰｒＣ）ＴＰより選択される、塩基修飾、二重鎖安定化ｄＮＴＰを含む、項目１４に記載の方法。
（項目１８）
上記ｄＮＴＰの混合物が、（２−ａｍＡ）ＴＰ、ｄ（５−ＰｒＵ）ＴＰおよびｄ（５−ＰｒＣ）ＴＰおよび／またはｄＧＴＰの少なくとも二つを含む、項目１４に記載の方法。
（項目１９）
上記小さなＲＮＡ標的配列が、約１０〜３０ヌクレオチドの長さである、項目１４に記載の方法。
（項目２０）
上記小さなＲＮＡ標的配列が、ｍｉＲＮＡ配列である、項目１４に記載の方法。
（項目２１）
上記プライマーに、一つ以上の塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰが組み込まれている、項目１４に記載の方法。
（項目２２）
（ａ）一本鎖ｃＤＮＡを提供するために、上記ステップ（ｂ）で形成されるｃＤＮＡを処理するステップと；
（ｂ）二重鎖ｃＤＮＡ分子を産出するために、上記一本鎖ｃＤＮＡを、上記ｃＤＮＡに十分に相補的であるためにこれにハイブリダイズし、ＤＮＡポリメラーゼの存在下で伸長産物の合成を開始する、第二プライマーと接触させる、ステップと
をさらに含む、項目１４に記載の方法。
（項目２３）
上記核酸増幅反応が、ポリメラーゼ連鎖反応である、項目１４に記載の方法。
（項目２４）
上記増幅プライマーの一つ以上に、塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰが組み込まれている、項目１４に記載の方法。
（項目２５）
上記増幅反応が、少なくとも一つの塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰを含むデオキシヌクレオシド５’−三リン酸の混合物の存在下で行われる、項目１４に記載の方法。
（項目２６）
（ａ）小さなＲＮＡ標的配列を含む試料と；
（ｂ）上記小さなＲＮＡ標的配列とハイブリダイズするのに十分に上記小さなＲＮＡ標的配列に対して相補的である、プライマーと；
（ｃ）逆転写酵素活性を有するＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼと；
（ｄ）上記ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼの基質である少なくとも一つの塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰを含むデオキシヌクレオシド５’−三リン酸の混合物と
を含む、反応混合物。
（項目２７）
上記ｄＮＴＰの混合物が、上記５−位で置換されたピリミジンである塩基修飾、二重鎖安定化ｄＮＴＰを含む、項目２６に記載の反応混合物。
（項目２８）
上記ｄＮＴＰの混合物が、式
【化１９】
2011501663.tif 000009
を有する塩基修飾、二重鎖安定化ｄＮＴＰを含み、
式中、Ｂは、
【化２０】
2011501663.tif 000010
より選択され；
Ｘは、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＣＨ３または
【化２１】
2011501663.tif 000011
より選択され；
Ｙは、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉまたは
【化２２】
2011501663.tif 000012
より選択され；
Ｒは、−Ｈ、−ＯＨ、−ＯＣＨ３または−ＮＨ２である、
項目２６に記載の反応混合物。
（項目２９）
上記ｄＮＴＰの混合物が、ｄ（２−ａｍＡ）ＴＰ、ｄ（５−ＰｒＵ）ＴＰおよび／またはｄ（５−ＰｒＣ）ＴＰより選択される、塩基修飾、二重鎖安定化ｄＮＴＰを含む、項目２６に記載の反応混合物。
（項目３０）
（ａ）逆転写酵素活性を有するＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼと；
（ｂ）上記ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼの基質である少なくとも一つの塩基修飾、二重鎖安定化デオキシリボヌクレオチド三リン酸
を含む、キット。
（項目３１）
上記ｄＮＴＰの混合物が、上記５−位で置換されたピリミジンである塩基修飾、二重鎖安定化ｄＮＴＰを含む、項目３０に記載のキット。
（項目３２）
上記ｄＮＴＰの混合物が、式
【化２３】
2011501663.tif 000013
を有する塩基修飾、二重鎖安定化ｄＮＴＰを含み、
式中、Ｂは、
【化２４】
2011501663.tif 000014
より選択され；
Ｘは、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＣＨ３または
【化２５】
2011501663.tif 000015
より選択され；
Ｙは、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉまたは
【化２６】
2011501663.tif 000016
より選択され；
Ｒは、−Ｈ、−ＯＨ、−ＯＣＨ３または−ＮＨ２である、
項目３０に記載のキット。
（項目３３）
上記ｄＮＴＰの混合物が、ｄ（２−ａｍＡ）ＴＰ、ｄ（５−ＰｒＵ）ＴＰおよび／またはｄ（５−ＰｒＣ）ＴＰより選択される、塩基修飾、二重鎖安定化ｄＮＴＰを含む、項目３０に記載のキット。
（項目３４）
第二プライマーであって、上記小さなＲＮＡ標的配列とハイブリダイズするのに十分に上記小さなＲＮＡ標的配列に対して相補的である第二プライマーをさらに含む、項目３０に記載のキット。
（項目３５）
小さなＲＮＡ標的配列を増幅するために有効な増幅プライマー対をさらに含む、項目３０に記載のキット。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
長さ約１００ヌクレオチド未満の小さなＲＮＡ標的配列の逆転写のための方法であり、
（ａ）前記小さなＲＮＡ標的配列を含む試料を、
（ｉ）前記小さなＲＮＡ標的配列とハイブリダイズするのに十分に前記小さなＲＮＡ標的配列に対して相補的である、プライマー、および
（ｉｉ）逆転写酵素活性を有するＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ
と接触させるステップと；
（ｂ）前記ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼの基質である少なくとも一つの塩基修飾、二重鎖安定化ｄＮＴＰを含むｄＮＴＰの混合物の存在下で、前記小さなＲＮＡ標的配列に相補的なｃＤＮＡを合成するステップと
を含む、方法。
【請求項２】
前記小さなＲＮＡ標的配列およびその相補鎖に十分に相補的であるためにこれにハイブリダイズし、ＤＮＡポリメラーゼの存在下で増幅産物を産出する、増幅プライマーを用いて、核酸増幅反応を行うステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
長さ約１００ヌクレオチド未満の小さなＲＮＡ標的配列を増幅するための方法であり、
（ａ）前記小さなＲＮＡ標的配列を含む試料を、
（ｉ）前記小さなＲＮＡ標的配列とハイブリダイズするのに十分に前記小さなＲＮＡ標的配列に対して相補的である、プライマー、および
（ｉｉ）逆転写酵素活性を有するＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ
と接触させるステップと；
（ｂ）前記ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼのための基質である少なくとも一つの塩基修飾、二重鎖安定化ｄＮＴＰを含むｄＮＴＰの混合物の存在下で、前記小さなＲＮＡ標的配列に相補的なｃＤＮＡを合成するステップと、
（ｃ）前記小さなＲＮＡ標的配列およびその相補鎖に十分に相補的であるためにこれにハイブリダイズし、ＤＮＡポリメラーゼの存在下で増幅産物を産出する、増幅プライマーを用いて、核酸増幅反応を行うステップと
を含む、方法。
【請求項４】
前記ｄＮＴＰの混合物が、
（ａ）５−位で置換されたピリミジンである、塩基修飾、二重鎖安定化ｄＮＴＰ；
（ｂ）式：
【化１５】
2011501663.tif 000017
を有する塩基修飾、二重鎖安定化ｄＮＴＰであって、式中、Ｂは、
【化１６】
2011501663.tif 000018
より選択され；
Ｘは、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＣＨ３または
【化１７】
2011501663.tif 000019
より選択され；
Ｙは、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉまたは
【化１８】
2011501663.tif 000020
より選択され；
Ｒは、−Ｈ、−ＯＨ、−ＯＣＨ３または−ＮＨ２である、塩基修飾、二重鎖安定化ｄＮＴＰ；ならびに／あるいは
（ｃ）ｄ（２−ａｍＡ）ＴＰ、ｄ（５−ＰｒＵ）ＴＰおよび／またはｄ（５−ＰｒＣ）ＴＰより選択される、塩基修飾、二重鎖安定化ｄＮＴＰ
を含む、請求項１または３に記載の方法。
【請求項５】
前記ｄＮＴＰの混合物が、ｄ（２−ａｍＡ）ＴＰ、ｄ（５−ＰｒＵ）ＴＰおよびｄ（５−ＰｒＣ）ＴＰおよび／またはｄＧＴＰの少なくとも二つを含む、請求項１または３に記載の方法。
【請求項６】
前記小さなＲＮＡ標的配列が、約１０〜３０ヌクレオチドの長さである、請求項１または３に記載の方法。
【請求項７】
前記小さなＲＮＡ標的配列が、ｍｉＲＮＡ配列である、請求項１または３に記載の方法。
【請求項８】
前記プライマーに、一つ以上の塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰが組み込まれている、請求項１または３に記載の方法。
【請求項９】
（ａ）一本鎖ｃＤＮＡを提供するために、前記ステップ（ｂ）で形成されるｃＤＮＡを処理するステップと；
（ｂ）二重鎖ｃＤＮＡ分子を産出するために、前記一本鎖ｃＤＮＡを、前記ｃＤＮＡに十分に相補的であるためにこれにハイブリダイズし、ＤＮＡポリメラーゼの存在下で伸長産物の合成を開始する、第二プライマーと接触させる、ステップと
をさらに含む、請求項１または３に記載の方法。
【請求項１０】
前記核酸増幅反応が、ポリメラーゼ連鎖反応である、請求項２または３に記載の方法。
【請求項１１】
前記増幅プライマーの一つ以上に、塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰが組み込まれている、請求項２または３に記載の方法。
【請求項１２】
前記増幅反応が、少なくとも一つの塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰを含むデオキシヌクレオシド５’−三リン酸の混合物の存在下で行われる、請求項２または３に記載の方法。
【請求項１３】
（ａ）小さなＲＮＡ標的配列を含む試料と；
（ｂ）前記小さなＲＮＡ標的配列とハイブリダイズするのに十分に前記小さなＲＮＡ標的配列に対して相補的である、プライマーと；
（ｃ）逆転写酵素活性を有するＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼと；
（ｄ）前記ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼの基質である少なくとも一つの塩基修飾二重鎖安定化ｄＮＴＰを含むデオキシヌクレオシド５’−三リン酸の混合物と
を含む、反応混合物。
【請求項１４】
（ａ）逆転写酵素活性を有するＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼと；
（ｂ）前記ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼの基質である少なくとも一つの塩基修飾、二重鎖安定化デオキシリボヌクレオチド三リン酸と
を含む、キット。
【請求項１５】
前記ｄＮＴＰの混合物が、
（ａ）５−位で置換されたピリミジンである塩基修飾、二重鎖安定化ｄＮＴＰ；
（ｂ）式：
【化２３】
2011501663.tif 000021
を有する塩基修飾、二重鎖安定化ｄＮＴＰであって、式中、Ｂは、
【化２４】
2011501663.tif 000022
より選択され；
Ｘは、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＣＨ３または
【化２５】
2011501663.tif 000023
より選択され；
Ｙは、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉまたは
【化２６】
2011501663.tif 000024
より選択され；
Ｒは、−Ｈ、−ＯＨ、−ＯＣＨ３または−ＮＨ２である、塩基修飾、二重鎖安定化ｄＮＴＰ：ならびに／あるいは
（ｃ）ｄ（２−ａｍＡ）ＴＰ、ｄ（５−ＰｒＵ）ＴＰおよび／またはｄ（５−ＰｒＣ）ＴＰより選択される、塩基修飾、二重鎖安定化ｄＮＴＰ
を含む、請求項１３に記載の反応混合物または請求項１４に記載のキット。
【請求項１６】
（ａ）第二プライマーであって、前記小さなＲＮＡ標的配列とハイブリダイズするのに十分に前記小さなＲＮＡ標的配列に対して相補的である第二プライマー；および／または
（ｂ）小さなＲＮＡ標的配列を増幅するために有効な増幅プライマー対、
をさらに含む、請求項１４に記載のキット。