【手続補正書】
【提出日】平成26年1月24日(2014.1.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中のビタミンＤ分析物を定量するための方法であって、前記ビタミンＤ分析物が、ビタミンＤ２、ビタミンＤ３、ビタミンＤ２の代謝体、およびビタミンＤ３の代謝体のうちの１つまたは複数を含み、前記方法が、
ビタミンＤ分析物をジエノフィル試薬で処理して、ディールス・アルダー付加物を形成させること；
前記ディールス・アルダー付加物をアミノキシマススペクトロメトリー（ＭＳ）タグ化試薬で標識して、標識付加物を形成させること；および
マススペクトロメトリーを用いて前記標識付加物を分析すること、
を含む、方法。
【請求項２】
前記アミノキシＭＳタグ化試薬が、以下の構造：
Ｒ−（ＣＨ２）ｎ−ＯＮＨ２
（式中、Ｒは、
【化１６】
2013518258.tif 000001
であり、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は、各々独立に、水素原子またはアルキル基であり、かつｎは１〜２０である。）を有する化合物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記アミノキシＭＳタグ化試薬が、以下の構造：
Ｒ−（ＣＨ２）ｎ−ＯＮＨ２
（式中、Ｒは、次の５つの構造
【化１７】
2013518258.tif 000002
のうちの１つまたは複数を含み、かつｎは１〜２０である。）を有する化合物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
既知濃度の既知ビタミンＤ分析物を含む標準を提供すること；
前記標準中の前記既知ビタミンＤ分析物をジエノフィル試薬で処理して、標準ディールス・アルダー付加物を形成させること；
前記標準ディールス・アルダー付加物をアミノキシＭＳタグ化試薬で標識して、標識標準付加物を形成させること；
前記標識標準付加物と前記標識付加物を混合して、混合物を形成させること；および
前記混合物を分離して、分離された標識分析物を形成させること
をさらに含み、ここで、前記標識付加物を分析することが、前記分離された分析物を分析することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記標準ディールス・アルダー付加物を標識するのに用いられる前記アミノキシＭＳタグ化試薬が、等圧タグのセットに由来する第１の等圧タグを含み、かつ前記ディールス・アルダー付加物を標識するのに用いられる前記アミノキシＭＳタグ化試薬が、前記第１の等圧タグとは異なる前記等圧タグのセットに由来する第２の等圧タグを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
マススペクトロメトリーを用いて前記標識付加物を分析することが、前記標識付加物のＬＣ−ＭＳＭＳ分析を用いることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
三連四重極ＭＳプラットフォームを用いる前記標識分析物の親娘イオントランジションモニタリング（ＰＤＩＴＭ）をさらに含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記標識付加物が、ＭＳＭＳ時にニュートラルロスを経て、荷電分析物種であるレポーターイオンを残す、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記標識付加物が、ＭＳＭＳ時に荷電フラグメントを失う、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記アミノキシＭＳタグ化試薬が、ＭＳＭＳ時にタグフラグメントであるレポーターイオンを形成させる、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
前記ビタミンＤ分析物が複数の異なるビタミンＤ分析物を含み、かつ前記標識することが、複数の異なるタグ化試薬で標識することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記ビタミンＤ２の代謝体が、ビタミンＤ２のモノヒドロキシ代謝体および／またはジヒドロキシ代謝体を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ビタミンＤ３の代謝体が、ビタミンＤ３のモノヒドロキシ代謝体および／またはジヒドロキシ代謝体を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
包装中に、ジエノフィル試薬およびアミノキシＭＳタグ化試薬を含むキット。
【請求項１５】
前記アミノキシＭＳタグ化試薬が、以下の構造：
Ｒ−（ＣＨ２）ｎ−ＯＮＨ２
（式中、Ｒは、
【化１８】
2013518258.tif 000003
であり、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は、各々独立に、水素原子またはアルキル基であり、かつｎは１〜２０である。）を有する化合物を含む、請求項１４に記載のキット。
【請求項１６】
前記アミノキシＭＳタグ化試薬が、以下の構造：
Ｒ−（ＣＨ２）ｎ−ＯＮＨ２
（式中、Ｒは、次の５つの構造
【化１９】
2013518258.tif 000004
のうちの１つまたは複数を含み、かつｎは１〜２０である。）を有する化合物を含む、請求項１４に記載のキット。
【請求項１７】
既知ビタミンＤ分析物を含む標準を含む、請求項１４に記載のキット。
【請求項１８】
既知濃度の既知ビタミンＤ分析物を含む標準を含む、請求項１４に記載のキット。
【請求項１９】
前記アミノキシＭＳタグ化試薬が、等圧タグのセットに由来する等圧タグを含み、かつ前記キットが、前記等圧タグのセットに由来する等圧タグをそれぞれ含む複数の異なるアミノキシＭＳタグ化試薬をさらに含む、請求項１４に記載のキット。
【請求項２０】
前記ビタミンＤ分析物を標識するための指示書を含む、請求項１４に記載のキット。
【請求項２１】
試料中のビタミンＤ分析物を定量するための方法であって、前記ビタミンＤ分析物が、ビタミンＤ２、ビタミンＤ３、ビタミンＤ２の代謝体、およびビタミンＤ３の代謝体のうちの１つまたは複数を含み、前記方法が、
ビタミンＤ分析物をジエノフィル含有１段階タグ化試薬で処理して、標識ディールス・アルダー付加物を形成させること；および
マススペクトロメトリーを用いて前記標識付加物を分析すること
を含む、方法。
【請求項２２】
前記１段階タグ化試薬が以下の構造：
【化１２】
2013518258.tif 000005
（式中、
【化１３】
2013518258.tif 000006
である。）を有する化合物を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記１段階タグ化試薬が以下の構造：
【化１４】
2013518258.tif 000007
（式中、
【化１５】
2013518258.tif 000008
である。）を有する化合物を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
既知濃度の既知ビタミンＤ分析物を含む標準を提供すること；
前記標準中の前記既知ビタミンＤ分析物を１段階ジエノフィル含有標識ディールス・アルダー試薬で処理して、標識標準付加物を形成させること；
前記標識標準付加物と前記標識付加物を混合して、混合物を形成させること；および
前記混合物を分離して、分離された標識分析物を形成させること；
をさらに含み、ここで、前記標識付加物を分析することが、前記分離された分析物を分析することを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記標準を標識するのに用いられる前記１段階ジエノフィル含有ディールス・アルダー試薬が、等圧タグのセットに由来する第１の等圧タグを含み、かつ前記試料を標識するのに用いられる前記１段階ジエノフィル含有ディールス・アルダー試薬が、前記第１の等圧タグとは異なる前記等圧タグのセットに由来する第２の等圧タグを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
マススペクトロメトリーを用いて前記標識付加物を分析することが、前記標識付加物のＬＣ−ＭＳＭＳ分析を用いることを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
三連四重極ＭＳプラットフォームを用いる前記標識分析物の親娘イオントランジションモニタリング（ＰＤＩＴＭ）をさらに含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記ビタミンＤ分析物が、複数の異なるビタミンＤ分析物を含み、かつ前記標識することが、複数の異なるタグ化試薬で標識することを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２９】
前記ビタミンＤ２の代謝体がビタミンＤ２のモノヒドロキシ代謝体および／またはジヒドロキシ代謝体を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項３０】
前記ビタミンＤ３の代謝体が、ビタミンＤ３のモノヒドロキシ代謝体および／またはジヒドロキシ代謝体を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項３１】
包装中に、ジエノフィルを含有する標識ディールス・アルダー試薬を含む、キット。
【請求項３２】
前記標識ディールス・アルダー試薬が、以下の構造：
【化２０】
2013518258.tif 000009
（式中、Ｒは、
【化２１】
2013518258.tif 000010
であり、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は、各々独立に、水素原子またはアルキル基であり、かつｎは１〜２０である。）を有する化合物を含む、請求項３１に記載のキット。
【請求項３３】
前記アミノキシＭＳタグ化試薬が、以下の構造：
【化２２】
2013518258.tif 000011
（式中、
【化２３】
2013518258.tif 000012
である。）を有する化合物を含む、請求項３１に記載のキット。
【請求項３４】
既知ビタミンＤ分析物を含む標準を含む、請求項３１に記載のキット。
【請求項３５】
既知濃度の既知ビタミンＤ分析物を含む標準を含む、請求項３１に記載のキット。
【請求項３６】
前記標識ディールス・アルダー試薬が、等圧タグのセットに由来する等圧タグを含み、かつ前記キットが、前記等圧タグのセットに由来するそれぞれの等圧タグを含む複数の異なる１段階タグ化試薬をさらに含む、請求項３１に記載のキット。
【請求項３７】
前記ビタミンＤ分析物を標識するための指示書を含む、請求項３１に記載のキット。
【請求項３８】
前記複数の異なるタグ化試薬が等圧タグを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項３９】
前記等圧タグが以下の構造：
【化２４】
2013518258.tif 000013
から選択される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記複数の異なるタグ化試薬が質量差タグを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項４１】
前記質量差タグが以下の構造：
【化２５】
2013518258.tif 000014
から選択される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記複数の異なるタグ化試薬が等圧タグを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項４３】
前記等圧タグが以下の構造：
【化２６】
2013518258.tif 000015
から選択される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記複数の異なるタグ化試薬が質量差タグを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項４５】
前記質量差タグが以下の構造：
【化２７】
2013518258.tif 000016
から選択される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記アミノキシＭＳタグ化試薬が、質量差タグのセットに由来する質量差タグを含み、かつ前記キットが、前記質量差タグのセットに由来する質量差タグをそれぞれ含む複数の異なるアミノキシＭＳタグ化試薬をさらに含む、請求項２４に記載のキット。
【請求項４７】
前記標識ディールス・アルダー試薬が、質量差タグのセットに由来する質量差タグを含み、かつ前記キットが、前記質量差タグのセットに由来するそれぞれの質量差タグを含む複数の異なる１段階タグ化試薬をさらに含む、請求項３１に記載のキット。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００６】
いくつかの実施形態では、ビタミンＤ分析物のファミリー中のジエン官能基を利用する２段階誘導体化プロセスを提供する。いくつかの実施形態では、ビタミンＤ分析物は、１段階プロセスで誘導体化される。試験試料中の分析物の定量は、ＬＣ−ＭＳＭＳおよびＭＲＭ作業フローを用いて達成することができる。試薬設計によって、アッセイの感度が高まり、多重化能が提供される。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
試料中のビタミンＤ分析物を定量するための方法であって、前記ビタミンＤ分析物が、ビタミンＤ２、ビタミンＤ３、ビタミンＤ２の代謝体、およびビタミンＤ３の代謝体のうちの１つまたは複数を含み、前記方法が、
ビタミンＤ分析物をジエノフィル含有１段階タグ化試薬で処理して、標識ディールス・アルダー付加物を形成させること；および
マススペクトロメトリーを用いて前記標識付加物を分析すること
を含む、方法。
（項目２）
前記１段階タグ化試薬が以下の構造：
【化１２】
2013518258.tif 000017
（式中、
【化１３】
2013518258.tif 000018
である。）を有する化合物を含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記１段階タグ化試薬が以下の構造：
【化１４】
2013518258.tif 000019
（式中、
【化１５】
2013518258.tif 000020
である。）を有する化合物を含む、項目１に記載の方法。
（項目４）
既知濃度の既知ビタミンＤ分析物を含む標準を提供すること；
前記標準中の前記既知ビタミンＤ分析物を１段階ジエノフィル含有標識ディールス・アルダー試薬で処理して、標識標準付加物を形成させること；
前記標識標準付加物と前記標識付加物を混合して、混合物を形成させること；および
前記混合物を分離して、分離された標識分析物を形成させること；
をさらに含み、ここで、前記標識付加物を分析することが、前記分離された分析物を分析することを含む、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記標準を標識するのに用いられる前記１段階ジエノフィル含有ディールス・アルダー試薬が、等圧タグのセットに由来する第１の等圧タグを含み、かつ前記試料を標識するのに用いられる前記１段階ジエノフィル含有ディールス・アルダー試薬が、前記第１の等圧タグとは異なる前記等圧タグのセットに由来する第２の等圧タグを含む、項目４に記載の方法。
（項目６）
マススペクトロメトリーを用いて前記標識付加物を分析することが、前記標識付加物のＬＣ−ＭＳＭＳ分析を用いることを含む、項目１に記載の方法。
（項目７）
三連四重極ＭＳプラットフォームを用いる前記標識分析物の親娘イオントランジションモニタリング（ＰＤＩＴＭ）をさらに含む、項目６に記載の方法。
（項目８）
前記ビタミンＤ分析物が、複数の異なるビタミンＤ分析物を含み、かつ前記標識することが、複数の異なるタグ化試薬で標識することを含む、項目１に記載の方法。
（項目９）
前記ビタミンＤ２の代謝体がビタミンＤ２のモノヒドロキシ代謝体および／またはジヒドロキシ代謝体を含む、項目１に記載の方法。
（項目１０）
前記ビタミンＤ３の代謝体が、ビタミンＤ３のモノヒドロキシ代謝体および／またはジヒドロキシ代謝体を含む、項目１に記載の方法。
（項目１１）
試料中のビタミンＤ分析物を定量するための方法であって、前記ビタミンＤ分析物が、ビタミンＤ２、ビタミンＤ３、ビタミンＤ２の代謝体、およびビタミンＤ３の代謝体のうちの１つまたは複数を含み、前記方法が、
ビタミンＤ分析物をジエノフィル試薬で処理して、ディールス・アルダー付加物を形成させること；
前記ディールス・アルダー付加物をアミノキシマススペクトロメトリー（ＭＳ）タグ化試薬で標識して、標識付加物を形成させること；および
マススペクトロメトリーを用いて前記標識付加物を分析すること、
を含む、方法。
（項目１２）
前記アミノキシＭＳタグ化試薬が、以下の構造：
Ｒ−（ＣＨ２）ｎ−ＯＮＨ２
（式中、Ｒは、
【化１６】
2013518258.tif 000021
であり、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は、各々独立に、水素原子またはアルキル基であり、かつｎは１〜２０である。）を有する化合物を含む、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記アミノキシＭＳタグ化試薬が、以下の構造：
Ｒ−（ＣＨ２）ｎ−ＯＮＨ２
（式中、Ｒは、次の５つの構造
【化１７】
2013518258.tif 000022
のうちの１つまたは複数を含み、かつｎは１〜２０である。）を有する化合物を含む、項目１１に記載の方法。
（項目１４）
既知濃度の既知ビタミンＤ分析物を含む標準を提供すること；
前記標準中の前記既知ビタミンＤ分析物をジエノフィル試薬で処理して、標準ディールス・アルダー付加物を形成させること；
前記標準ディールス・アルダー付加物をアミノキシＭＳタグ化試薬で標識して、標識標準付加物を形成させること；
前記標識標準付加物と前記標識付加物を混合して、混合物を形成させること；および
前記混合物を分離して、分離された標識分析物を形成させること
をさらに含み、ここで、前記標識付加物を分析することが、前記分離された分析物を分析することを含む、項目１１に記載の方法。
（項目１５）
前記標準ディールス・アルダー付加物を標識するのに用いられる前記アミノキシＭＳタグ化試薬が、等圧タグのセットに由来する第１の等圧タグを含み、かつ前記ディールス・アルダー付加物を標識するのに用いられる前記アミノキシＭＳタグ化試薬が、前記第１の等圧タグとは異なる前記等圧タグのセットに由来する第２の等圧タグを含む、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
マススペクトロメトリーを用いて前記標識付加物を分析することが、前記標識付加物のＬＣ−ＭＳＭＳ分析を用いることを含む、項目１１に記載の方法。
（項目１７）
三連四重極ＭＳプラットフォームを用いる前記標識分析物の親娘イオントランジションモニタリング（ＰＤＩＴＭ）をさらに含む、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記標識付加物が、ＭＳＭＳ時にニュートラルロスを経て、荷電分析物種であるレポーターイオンを残す、項目１６に記載の方法。
（項目１９）
前記標識付加物が、ＭＳＭＳ時に荷電フラグメントを失う、項目１６に記載の方法。
（項目２０）
前記アミノキシＭＳタグ化試薬が、ＭＳＭＳ時にタグフラグメントであるレポーターイオンを形成させる、項目１６に記載の方法。
（項目２１）
前記ビタミンＤ分析物が複数の異なるビタミンＤ分析物を含み、かつ前記標識することが、複数の異なるタグ化試薬で標識することを含む、項目１１に記載の方法。
（項目２２）
前記ビタミンＤ２の代謝体が、ビタミンＤ２のモノヒドロキシ代謝体および／またはジヒドロキシ代謝体を含む、項目１１に記載の方法。
（項目２３）
前記ビタミンＤ３の代謝体が、ビタミンＤ３のモノヒドロキシ代謝体および／またはジヒドロキシ代謝体を含む、項目１１に記載の方法。
（項目２４）
包装中に、ジエノフィル試薬およびアミノキシＭＳタグ化試薬を含むキット。
（項目２５）
前記アミノキシＭＳタグ化試薬が、以下の構造：
Ｒ−（ＣＨ２）ｎ−ＯＮＨ２
（式中、Ｒは、
【化１８】
2013518258.tif 000023
であり、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は、各々独立に、水素原子またはアルキル基であり、かつｎは１〜２０である。）を有する化合物を含む、項目２４に記載のキット。
（項目２６）
前記アミノキシＭＳタグ化試薬が、以下の構造：
Ｒ−（ＣＨ２）ｎ−ＯＮＨ２
（式中、Ｒは、次の５つの構造
【化１９】
2013518258.tif 000024
のうちの１つまたは複数を含み、かつｎは１〜２０である。）を有する化合物を含む、項目２４に記載のキット。
（項目２７）
既知ビタミンＤ分析物を含む標準を含む、項目２４に記載のキット。
（項目２８）
既知濃度の既知ビタミンＤ分析物を含む標準を含む、項目２４に記載のキット。
（項目２９）
前記アミノキシＭＳタグ化試薬が、等圧タグのセットに由来する等圧タグを含み、かつ前記キットが、前記等圧タグのセットに由来する等圧タグをそれぞれ含む複数の異なるアミノキシＭＳタグ化試薬をさらに含む、項目２４に記載のキット。
（項目３０）
前記ビタミンＤ分析物を標識するための指示書を含む、項目２４に記載のキット。
（項目３１）
包装中に、ジエノフィルを含有する標識ディールス・アルダー試薬を含む、キット。
（項目３２）
前記標識ディールス・アルダー試薬が、以下の構造：
【化２０】
2013518258.tif 000025
（式中、Ｒは、
【化２１】
2013518258.tif 000026
であり、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は、各々独立に、水素原子またはアルキル基であり、かつｎは１〜２０である。）を有する化合物を含む、項目３１に記載のキット。
（項目３３）
前記アミノキシＭＳタグ化試薬が、以下の構造：
【化２２】
2013518258.tif 000027
（式中、
【化２３】
2013518258.tif 000028
である。）を有する化合物を含む、項目３１に記載のキット。
（項目３４）
既知ビタミンＤ分析物を含む標準を含む、項目３１に記載のキット。
（項目３５）
既知濃度の既知ビタミンＤ分析物を含む標準を含む、項目３１に記載のキット。
（項目３６）
前記標識ディールス・アルダー試薬が、等圧タグのセットに由来する等圧タグを含み、かつ前記キットが、前記等圧タグのセットに由来するそれぞれの等圧タグを含む複数の異なる１段階タグ化試薬をさらに含む、項目３１に記載のキット。
（項目３７）
前記ビタミンＤ分析物を標識するための指示書を含む、項目３１に記載のキット。
（項目３８）
前記複数の異なるタグ化試薬が等圧タグを含む、項目８に記載の方法。
（項目３９）
前記等圧タグが以下の構造：
【化２４】
2013518258.tif 000029
から選択される、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
前記複数の異なるタグ化試薬が質量差タグを含む、項目８に記載の方法。
（項目４１）
前記質量差タグが以下の構造：
【化２５】
2013518258.tif 000030
から選択される、項目４０に記載の方法。
（項目４２）
前記複数の異なるタグ化試薬が等圧タグを含む、項目２１に記載の方法。
（項目４３）
前記等圧タグが以下の構造：
【化２６】
2013518258.tif 000031
から選択される、項目４２に記載の方法。
（項目４４）
前記複数の異なるタグ化試薬が質量差タグを含む、項目２１に記載の方法。
（項目４５）
前記質量差タグが以下の構造：
【化２７】
2013518258.tif 000032
から選択される、項目４４に記載の方法。
（項目４６）
前記アミノキシＭＳタグ化試薬が、質量差タグのセットに由来する質量差タグを含み、かつ前記キットが、前記質量差タグのセットに由来する質量差タグをそれぞれ含む複数の異なるアミノキシＭＳタグ化試薬をさらに含む、項目２４に記載のキット。
（項目４７）
前記標識ディールス・アルダー試薬が、質量差タグのセットに由来する質量差タグを含み、かつ前記キットが、前記質量差タグのセットに由来するそれぞれの質量差タグを含む複数の異なる１段階タグ化試薬をさらに含む、項目３１に記載のキット。