【誤訳訂正書】
【提出日】平成24年1月13日(2012.1.13)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１５】
この側面の幾つかの態様において、本発明は、GSHEをコードする異種ポリヌクレオチドに作動可能に結合し、糸状菌宿主細胞転写活性を有する、プロモーターを含むDNA構築体で糸状菌宿主細胞を形質転換させる工程と、GSHEを発現させるために適切な培地において、形質転換された宿主細胞を培養する工程と、及びGSHEを生産する工程とを含む、糸状菌宿主細胞においてGSHEを生産する方法に関係する。他の態様において、GSHEを発現する異種ポリヌクレオチドはフミコーラグリセア(Humicola grisea)又はアスペルギウスアワモリ(Aspergillus awamori)から提供される。他の態様において、GSHEは配列番号3と少なくとも90%の配列同一性を有し、配列番号6と少なくとも90%の同一性を有する。更なる態様において、組換え宿主細胞により生産されたGSHEは回収される。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１６】
第二の側面において、本発明は組換えトリコデルマレーシ(Trichoderma reesei)の培地から生産された発酵ブロスを含む。この態様において、トリコデルマレーシは、配列番号3と少なくとも90%の配列同一性を有するか、又は、配列番号6と少なくとも90%の配列同一性を有するGSHEをコードする異種ポリヌクレオチドを含む。
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２０】
第六の側面において、本発明は、グルコースシロップを得るために、顆粒デンプン基質を、アルファアミラーゼ及び顆粒デンプン加水分解酵素(GSHE)に同時に接触させる工程を含む、グルコースシロップの製造方法に関係する。このGSEHは、糸状菌株から分泌され、前記糸状菌株はフミコーラ株由来のGSHEをコードする異種ポリヌクレオチドを含んでおり及び配列番号3と少なくとも90%の配列同一性を有しグルコースシロップを得る。一の態様において、このグルコースは更に所望の生成物に転換される。
【誤訳訂正４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１０２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１０２】
一の態様において、GSHEは配列番号3で定義されるアミノ酸配列と、少なくとも50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、93%、95%、97%、98%及び99%の配列同一性を有する。他の態様において、GSHEは、配列番号3と少なくとも80%配列同一性を有するアミノ酸を含む。他の態様において、配列番号3のアミノ酸配列を含むGSHE、又は配列番号3と少なくとも80%の配列同一性を有するGSHEは配列番号1と少なくとも70%、80%、85%、90%、93%、95%、97%、98%及び99%の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされる。
【誤訳訂正５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１０３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１０３】
他の態様において、GSHEは配列番号6で定義されるアミノ酸配列と、少なくとも50%、55%、60%、65%、70%、75、80%、85%、90%、93%、95%、97%、98%及び99%の配列同一性を有する。他の態様において、GSHEは、配列番号6と少なくとも80%配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。他の態様において、配列番号6のアミノ酸配列を含むGSHE、又は配列番号6と少なくとも80%の配列同一性を有するGSHEは配列番号4と少なくとも70%、80%、85%、90%、93%、95%、97%、98%及び99%の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされる。
【誤訳訂正６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１０４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１０４】
他の配列に対して、所定のパーセンテージ(例えば、 80%、85%、90%、93%、95%、97%、または99%)の配列同一性を有するポリヌクレオチド、または、ポリペプチドは、２の配列をアラインメントさせて比較したときに、そのパーセンテージの同じ塩基または、同じアミノ酸を有するものを意味する。このアラインメントおよびパーセント相同性(homology)または、同一性(identity)は、例えば、CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY ( Ausubel et al., eds., 1987 Supplement 30, section 7.7.18. )に記載されている。好ましいプログラムは、GCG Pileup プログラム、FASTA、及びBLASTを含む。他の好ましいアラインメントプログラムは、ALINGN Plus及びTFASTである。
【誤訳訂正７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１０９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１０９】
幾つかの態様において、この糸状菌宿主はフミコーラグリセア(Humicola grisea)由来のGSHEをコードするポリヌクレオチドを含んでいる。一の態様において、組換えrGSHEは、配列番号3で定義するアミノ酸配列と少なくとも50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、93%、95%、97%、98%及び99%の配列同一性 を有する。他の態様において、配列番号3のGSHEをコードするポリヌクレオチドは、配列番号1で定義される配列と少なくとも70%、80%、85%、90%、95%、97%及び98%の配列同一性を有する。特に好ましい態様において、このGSHEはトリコデルマレーシ株(Trichoderma reesei)において発現され、配列番号3の配列と80%、85%、90%、95%、97%及び98%の配列同一性を有する。
【誤訳訂正８】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１１０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１１０】
他の態様において、糸状菌宿主は、アスペルギウスアワモリ(Aspergillus awamori)由来のGSHEをコードするポリヌクレオチドを発現するために遺伝的に修飾されている。一の態様において、rGHSEは、配列番号6で定義されるアミノ酸配列と少なくとも50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、93%、95%、97%、98%及び99%の配列同一性を有する。他の態様において、配列番号6のGSHEをコードしているポリヌクレオチドは、配列番号4で定義される配列と少なくとも70%、80%、85%、90%、95%、97%及び98%の配列同一性を有する。特に好ましい態様において、このGSHEは、トリコデルマレーシ(Trichoderma reesei)株において発現され、配列番号6の配列と80%、85%、90%、95%、97%及び98%の配列同一性を有する。
【誤訳訂正９】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１１１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１１１】
幾つかの態様において、組換え的に発現されたGSHEのグリコシル化レベルは、天然GSHEのグリコシル化レベルと異なる(例えば、フミコーラグリセア（H. grisea）又はアスペルギウスアワモリ(A. awamor)由来のGSHEはトリコデルマ(Trichoderma)において発現されたGSHEのグリコシル化レベルと異なるグリコシル化レベルを有する)。一の態様において、このグリコシル化レベルは、rGSHEにおいて天然のGSHEに対応するアミノ酸と少なくとも80%、85%、90%、95%の同一性を有している場合でも異なる。幾つかの態様において、トリコデルマ、特にトリコデルマレーシ(T. reesei)において発現されたrGSHEは対応するnGSHEのレベルと異なるグリコシル化レベルを有する。他の態様において、このグリコシレーションレベルは高いが、他の態様においては低い場合もある。
【誤訳訂正１０】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１１３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１１３】
他の態様において、本発明に従って製造された組換え技術を用いて生産されたGSHEは、適切な温度レベルにおいて、対応する天然GSHEよりも低pHにおける安定性が高い。より具体的には、トリコデルマ(Trichoderma)で発現された、フミコーラグリセアvar.セルモイデア(Humicola grisea var. thermoidea)由来のrGSHEは、45乃至55℃の温度において、対応するnGSHEと比較するとpH3.5乃至4.0における安定性が高い。 安定性における幾つかの条件下で、rGSHE、特にトリコデルマレーシ(Trichoderma reesei)の中で発現されたフミコーラグリセアvar.セルモイデア(H. grisea var. thermoidea)配列番号1の  
安定性は、nGSHEの安定性の水準よりも2倍以上高い。
【誤訳訂正１１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１１７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１１７】
幾つかの態様において、GSHEコード配列は、シグナル配列に作動可能に結合している。このシグナル配列をコードするDNAは、発現されるべきGSHE遺伝子に関連していることが好ましい。好ましくは、このシグナル配列はGSHEをコードしているフミコーラグリセア(Humicola grisea)又はアスペルギウスアワモリ(Aspergillus awamori)遺伝子によりコードされている。より好ましくは、このシグナル配列は、図2A及び図6Aに示す配列と、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、あるいは、少なくとも99%の配列同一性を有する。追加的な態様において、糸状菌宿主細胞の中に導入されるDNA構築体又はベクターを含む。このシグナル配列及びプロモーター配列は同じ源から提供される。例えば、幾つかの態様において、シグナル配列は、cbh1プロモーターに作動可能に結合しているcbh1シグナル配列である。
【誤訳訂正１２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１４４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１４４】
幾つかの態様において、組換え的に発現されたGSHEはトリコデルマ(Trichoderma)宿主由来である。他の態様において、トリコデルマ(Trichoderma)宿主はフミコーラグリセア(Humicola grisea)株、特にフミコーラグリセアvar.セルモイデア(Humicola grisea var. thermoidea)の株由来のGSHEをコードしている異種のポリヌクレオチドを発現する。他の態様おいて、トリコデルマ(Trichoderma)は、組換えGSHEを発現し、その異種のポリヌクレオチドは配列番号3と少なくとも50%の配列同一性を有するGSHEをコードしている。
【誤訳訂正１３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１４５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１４５】
幾つかの態様において、トリコデルマ宿主は、アスペルギウスアワモリ(Aspergillus awamori)株、特に、アスペルギウスアワモリvar.カワチ(A. awamori var. kawachi)由来のGSHEをコードする異種ポリヌクレオチドを発現する。他の態様において、当該トリコデルマは、組換えGSHEを発現し、その異種ポリヌクレオチドは配列番号6と少なくとも50%の配列同一性を有するGSHEをコードしている。
【誤訳訂正１４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１４９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１４９】
一の態様において、顆粒デンプンは、無細胞ろ過物(GSHEが培養培地から単離されている)として利用可能であるGSHEに接触させる。他の態様において、この顆粒デンプン基質は、
分泌されたGSHE及び糸状菌細胞を含む培養培地中にあるGSHEと接触させる。好ましくは、このGSHEは、顆粒デンプン加水分解活性を有し、 配列番号3又は配列番号6と少なくとも、90%、少なくとも95%、及び少なくとも98%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする異種のポリヌクレオチドを含むトリコデルマレーシ(Trichoderma reesei)から分泌される。
【誤訳訂正１５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１７３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１７３】
トリコデルマレーシ(Trichoderma reesei)におけるフミコーラグリセアvar.セルモイデア(Humicola grisea var. thermoidea)GSHE遺伝子の発現
A.フミコーラグリセアvar.セルモイデア(Humicola grisea var. thermoidea)GSHE遺伝子のクローニング
凍結スキタリジウムセルモフィリラム(Scytalidium thermophilum)(ATCC 16453、アナモルフ(anamorph)、フミコーラグリセアvar.セルモイデア(H. grisea var. thermoidea)
の菌糸からゲノムDNA (配列番号1)を抽出した。この凍結菌糸をコーヒーミルの中でドライアイスと一緒に粉砕し、Easy DNAプロトコル(インビトロジェン)によりDNAを抽出した。クロロホルム/フェノール/イソアミルアルコール抽出工程をこの標準的な手順に追加した。NCBI データベース登録番号＃M89475 配列にもとづいてPCRプライマーを設計した。以下のプライマーはpENTR/Dベクター(インビトロジェン)内でクローニングするためのモチーフを含んでいる。
【誤訳訂正１６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１７５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１７５】
インビトロジェンゲートウェイシステムプロトコルに従ってPCR生成物をpENTR/D内へクローンした。このベクターは、その後化学的にコンピテント(competent)なTop10大腸菌  を形質転換し、カナマイシン選択された。幾つかのクローンからのプラスミドDNAが正確なサイズの挿入を確認するために制限酵素で消化された。いくつかのクローンからのgla1挿入が配列決定(Sequetech, Mountain View, CA)された。一のクローンからのプラスミドDNA、pENTR/D_N13pをTrex3glamdSデスティネーション(destination)ベクターDNAと共にLRクロナーゼ反応(インビトロジェン ゲートウェイシステム)に添加した。LPクロナーゼ反応における組換えは、デスティネーションベクターのCmR及びccdB遺伝子と、pENTR/Dベクターからのフミコーラグリセア(H. grisea)gal1とを置換した。組換えは、gal1を、デスティネーションベクターのcbh1プロモーターとターミネータとの間に挿入した。48及び50bpの組換え部位配列はそれぞれgal1の上流及び下流に残っていた。LRクロナーゼ反応のアリコートは化学的にコンピテントなTop10大腸菌  を形質転換し、一晩、カルベニシリンで選択条件で育成した。いくつかのクローンからのプラスミドDNAが正しい挿入サイズを確認するために適切な制限酵素で消化された。cbh1プロモーター：gla1：cbh1ターミネーター：amdSを含む発現カセットを切り離すためにクローンからのプラスミドDNA、pTrex3g_N13(図3及び図4参照)をXbal1で消化した。6.6kbのカセットを標準技術を用いたアガロースゲル抽出法により精製し、以下でさらに述べるようにして、公知の入手可能なQM6aのトリコデルマレーシ(T. reesei)株を形質転換した。