【手続補正書】
【提出日】平成24年2月16日(2012.2.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）挿入されたコンセンサス配列Ｄ／Ｅ−Ｘ−Ｎ−Ｚ−Ｓ／Ｔ［式中、ＸおよびＺは、プロリン以外の任意の天然のアミノ酸であり得る］を含むタンパク質担体；及び
（ｉｉ）前記タンパク質担体と連結した、少なくとも１つの細菌に由来する少なくとも１つの抗原性多糖であって、赤痢菌（Shigella）、大腸菌（E. coli）または緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）のうちの１つまたは複数の株に由来する少なくとも１つの細菌Ｏ抗原である、少なくとも１つの抗原性多糖と
を含むバイオコンジュゲートワクチン。
【請求項２】
前記タンパク質担体が、少なくとも１つのコンセンサス配列を含有する改変された緑膿菌外毒素（EPA）である、請求項１に記載のバイオコンジュゲートワクチン。
【請求項３】
前記ＥＰＡが２つのコンセンサス配列を含有する、請求項２に記載のバイオコンジュゲートワクチン。
【請求項４】
前記少なくとも１つの細菌Ｏ抗原が志賀赤痢菌Ｏ１に由来する、請求項１に記載のバイオコンジュゲートワクチン。
【請求項５】
前記少なくとも１つの細菌Ｏ抗原が腸外病原性大腸菌（ExPEC）に由来する、請求項１に記載のバイオコンジュゲートワクチン。
【請求項６】
前記改変されたＥＰＡが配列番号７に示す配列を有する、請求項２に記載のバイオコンジュゲートワクチン。
【請求項７】
前記少なくとも１つの細菌Ｏ抗原が、志賀赤痢菌（Shigella dysenteriae）Ｏ１、フレクスナー赤痢菌（S. flexneri）２ａ、フレクスナー赤痢菌（S. flexneri）３ａ、フレクスナー赤痢菌（S. flexneri）３ｂ、フレクスナー赤痢菌（S. flexneri）６およびソンネ赤痢菌（S. sonnei）の１つまたは複数に由来する、請求項１に記載のバイオコンジュゲートワクチン。
【請求項８】
前記少なくとも１つの細菌Ｏ抗原が、大腸菌Ｏ４：Ｋ５２（ExPEC）、大腸菌Ｏ４：Ｋ６（ExPEC）、大腸菌Ｏ６：Ｋ２（ExPEC）、大腸菌Ｏ６：Ｋ５４（ExPEC）、大腸菌Ｏ２２（ExPEC）、大腸菌Ｏ７５（ExPEC）、大腸菌Ｏ８３（ExPEC）、大腸菌Ｏ７、大腸菌Ｏ９、大腸菌Ｏ１６、大腸菌Ｏ１２１および大腸菌Ｏ１５７（EHEC）の１つまたは複数に由来する、請求項１に記載のバイオコンジュゲートワクチン。
【請求項９】
前記少なくとも１つの細菌Ｏ抗原が緑膿菌Ｏ１１に由来する、請求項１に記載のバイオコンジュゲートワクチン。
【請求項１０】
前記多糖が以下の構造を有する、請求項２に記載のバイオコンジュゲートワクチン。
【化１】
2011514155.tif 000001
【請求項１１】
前記タンパク質担体が、２つのコンセンサス配列を含有する改変されたＥＰＡである、請求項１０に記載のバイオコンジュゲートワクチン。
【請求項１２】
前記タンパク質担体が、配列番号７に示す配列を有する、請求項１０または１１に記載のバイオコンジュゲートワクチン。
【請求項１３】
さらにアジュバントを含む、請求項１に記載のバイオコンジュゲートワクチン。
【請求項１４】
配列番号５に示す配列を含むプラスミド若しくは遺伝子配列；配列番号６若しくは配列番号７に示す配列を含むアミノ酸配列；またはｐＧＶＸＮ６４で示されるベクター。
【請求項１５】
オリゴサッカリルトランスフェラーゼ（OST／OTase）をコードするヌクレオチド配列と；
タンパク質担体をコードするヌクレオチド配列と；
抗原性多糖が細菌Ｏ抗原である、少なくとも１つの細菌に由来する少なくとも１つの抗原性多糖合成遺伝子クラスターと
を含む、少なくとも１つの細菌に対するバイオコンジュゲートワクチンを生成するための発現系。
【請求項１６】
前記ＯＳＴ／ＯＴａｓｅが、配列番号２に示すアミノ酸配列を有する、請求項１５に記載の発現系。
【請求項１７】
前記タンパク質担体が、少なくとも１つのコンセンサス配列Ｄ／Ｅ−Ｘ−Ｎ−Ｚ−Ｓ／Ｔ［式中、ＸおよびＺは、プロリン以外の任意の天然のアミノ酸であり得る］を含有するように改変されているタンパク質である、請求項１５に記載の発現系。
【請求項１８】
前記タンパク質担体が、ＡｃｒＡと、少なくとも１つのコンセンサス配列Ｄ／Ｅ−Ｘ−Ｎ−Ｚ−Ｓ／Ｔ［式中、ＸおよびＺは、プロリン以外の任意の天然のアミノ酸であり得る］を含有するように改変されているＥＰＡとからなる群から選択される、請求項１５に記載の発現系。
【請求項１９】
前記ヌクレオチド配列が、配列番号６を含むタンパク質担体をコードする、請求項１５に記載の発現系。
【請求項２０】
前記細菌が、赤痢菌、大腸菌、緑膿菌Ｏ１１または野兎病菌の病原性株からなる群から選択される、請求項１５に記載の発現系。
【請求項２１】
配列番号２を有するＰｇＩＢをコードするヌクレオチド配列と；
配列番号６を有する改変されたＥＰＡをコードするヌクレオチド配列と；
配列番号５を含む多糖合成遺伝子クラスターと
を含む、志賀赤痢菌Ｏ１に対するバイオコンジュゲートワクチンを生成するための発現系。
【請求項２２】
請求項２１に記載の発現系を含む、改変された細菌であって、
ＰｇＩＢをコードするヌクレオチド配列および改変されたＥＰＡをコードするヌクレオチド配列が前記細菌のゲノム内に安定的に組み込まれており、
多糖合成遺伝子クラスターがプラスミドとして導入されている、改変された細菌。
【請求項２３】
大腸菌である、請求項２２に記載の細菌。
【請求項２４】
細菌中で、少なくとも１つのコンセンサス配列Ｄ／Ｅ−Ｘ−Ｎ−Ｚ−Ｓ／Ｔ［式中、ＸおよびＺは、プロリン以外の任意の天然のアミノ酸であり得る］を含む改変されたＥＰＡまたはＡｃｒＡと；ＰｇＩＢと；１つまたは複数のＯ１多糖とを発現させる工程と；
前記細菌を一定期間育成し、一定量の、１つまたは複数のＯ１多糖と連結したＡｃｒＡまたは改変されたＥＰＡを含むＯ１バイオコンジュゲートを生成させる工程と；
ペリプラズムタンパク質を抽出する工程と；
抽出した前記ペリプラズムタンパク質から前記Ｏ１バイオコンジュゲートを分離する工程と
を含む、バイオリアクター内でＯ１バイオコンジュゲートを生成する方法。
【請求項２５】
（ｉ）グリコシルトランスフェラーゼを使用することによって、組換え生物中で志賀赤痢菌の多糖をアセンブルさせる工程；
前記組換え生物中で、前記多糖を、１つまたは複数のＴ細胞エピトープを含有する１つまたは複数の標的タンパク質のアスパラギン残基と連結させる工程；または
（ｉｉ）標的タンパク質のＮ−グリコシル化を実施する代謝装置をコードする遺伝情報を、原核生物内に導入して、改変された原核生物を生成する工程であって、１つまたは複数の組換え標的タンパク質の発現に必要な遺伝情報が、前記原核生物内に導入され、前記代謝装置が、志賀赤痢菌の多糖を脂質担体上でアセンブルするための特異的グリコシルトランスフェラーゼおよびオリゴサッカリルトランスフェラーゼを含み、前記オリゴサッカリルトランスフェラーゼが、前記多糖を前記標的タンパク質のアスパラギン残基と共有結合させ、前記標的タンパク質が、少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含有する工程；
前記改変された原核生物の培養物を生成する工程；及び
グリコシル化されたタンパク質を培地から得る工程と
を含む、志賀赤痢菌バイオコンジュゲートワクチンを生成する方法。