(57)【要約】【課題】本発明の目的は、抗腫瘍活性を発揮し、かつＴ細胞免疫系を活性化することが可能な癌の遺伝子治療のためのベクターおよび医薬組成物を提供することである。また、本発明は、細胞死誘発剤を提供することを目的とする。さらに、本発明は、抗腫瘍医薬組成物を提供することを目的とする。【解決手段】ＰＡ２８遺伝子を組み込んだウイルスベクターを用いて癌細胞にＰＡ２８を過剰発現させることにより癌細胞の細胞周期遅延、アポトーシス誘発を引き起こすこと、並びにＰＡ２８遺伝子を導入した癌細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいても早期に退縮拒絶されることを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、ＰＡ２８遺伝子をコードする遺伝子を含む細胞死誘発ベクターを提供する。また、本発明は、上記ベクターを含むことを特徴とする細胞死誘発剤を提供する。さらに、本発明は、上記ベクターを含むことを特徴とする抗腫瘍医薬組成物を提供する。【選択図】    図１
2004236505.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＡ２８遺伝子をコードする遺伝子を含む細胞死誘発ベクター。
【請求項２】
請求項１に記載のベクターを含むことを特徴とする細胞死誘発剤。
【請求項３】
請求項１に記載のベクターを含むことを特徴とする抗腫瘍医薬組成物。
【請求項４】
請求項１に記載のベクターであって、前記ＰＡ２８遺伝子がＰＡ２８α遺伝子であるベクター。
【請求項５】
請求項２に記載の抗腫瘍剤であって、前記ＰＡ２８遺伝子がＰＡ２８α遺伝子である医薬組成物。
【請求項６】
請求項３に記載の使用であって、前記ＰＡ２８遺伝子がＰＡ２８α遺伝子である医薬組成物。
【請求項７】
前記ベクターは、ウイルスベクターである請求項１または４に記載のベクター。
【請求項８】
前記ベクターは、ウイルスベクターである請求項２または５に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記ベクターは、ウイルスベクターである請求項３または６に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＰＡ２８をコードする遺伝子を含有するベクターに関する。
【０００２】
特に、本発明は、細胞死誘発遺伝子ＰＡ２８αを含有する医薬組成物に関する。
【０００３】
【従来の技術】
ＰＡ２８は、２０Ｓプロテアソーム活性化分子である。このＰＡ２８は、ＰＡ２８αとＰＡ２８βの２種のサブユニットが交互に会合したヘテロオリゴマーとして細胞質に存在し、２０Ｓプロテアソームの両端に会合してフットボール型プロテアソームを形成することが知られている。このフットボール型プロテアソームは、タンパク質分解に関しては不活性のままであるが、ペプチド分解活性が大幅に上昇しており、内在性抗原の迅速・適応的な処理に関与することが明らかとなっている。とりわけ、ＭＨＣクラスＩ分子に提示されるペプチドの産生に重要な役割を担うことが提唱されている。すなわち、ＰＡ２８分子は、タンパク質ではなくペプチドの分解活性を促進する作用を有する調節因子であると考えられてきた。
【０００４】
しかし、最近、２０ｓプロテアソームの両端にＰＡ７００（ユビキチン化タンパク質を認識して結合する分子である）とＰＡ２８を併せ持ったプロテアソーム複合体（いわゆるハイブリッドプロテアソーム）が細胞内に存在することが明らかにされ、この発見以来、ＰＡ２８分子もタンパク質分解そのものに関与する可能性が示唆されている。
【０００５】
一方、従来より腫瘍細胞の遺伝子治療として、腫瘍細胞にインターフェロンγ、ＩＬ２、ＩＬ１２、Ｂ７などの遺伝子を導入する試みがなされており、種々のサイトカイン遺伝子導入による癌治療が試みられている。たとえば、インターフェロンγなどは、癌細胞に対してｉｎ  ｖｉｔｒｏで直接的な増殖抑制または障害活性を示す。これらは癌ワクチンとして使用されてきた（非特許文献１、２）。
【０００６】
その他に、リンパ球（たとえば、リンホカイン活性化キラー細胞（ＬＡＫ）、細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）などのリンパ球）などにサイトカイン遺伝子を導入し、導入細胞から分泌されるサイトカインによりオートクラインあるいはパラクラインでリンパ球を活性化して受動免疫能を増強することによる腫瘍細胞の遺伝子治療が試みられている。
【０００７】
また、直接抗腫瘍活性のあるＩＦＮ遺伝子またはＴＮＦ遺伝子を導入することにより腫瘍局所での抗腫瘍性を高めようとする試みもなされている（非特許文献３）。
【０００８】
しかし、免疫エフェクター機構を活性化する遺伝子の導入は、いずれの遺伝子導入においても癌細胞を認識するＴ細胞の活性化を目的としており、癌細胞自体の性状には何らの変化を与えるものではない。逆に、癌細胞に対して直接的に増殖抑制効果を示す遺伝子の導入は、免疫エフェクター機構を介した抗腫瘍効果に変化を与えるものではない。
【０００９】
【非特許文献１】
Ｆｅａｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙｐａｓｓｅｓ  Ｔ  ｈｅｌｐｅｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ．、“Ｃｅｌｌ”、（ＵＳＡ）、１９９０年、６０巻、ｐ．３９７−４０３．
【００１０】
【非特許文献２】
Ｍｅｉｊｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｄｏｐｔｉｖｅ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｗｉｔｈ  ｔｕｍｏｒ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｄｒａｉｎｉｎｇ  ｌｙｍｐｈ  ｎｏｄｅ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ａｆｔｅｒ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ＨＬＡ−Ｂ７／ｂｅｔａ２−ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｇｅｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ．、“Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．”、２００２年、２５巻、ｐ．３５９−７２。
【００１１】
【非特許文献３】
Ｎｉｓｈｉｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｕｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｉｎ  ａ  ｌｉｎｅ  ｏｆｇｌｉｏｍａ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｏｕｓｅ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ−ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｂｙ  ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  ｇａｍｍａ−ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ＤＮＡ．、“Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．”、（ＵＳＡ）、１９８８年、４８巻、ｐ．４７３０
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、本発明は、上記のような問題を解決すべく、抗腫瘍活性を発揮し、かつＴ細胞免疫系を活性化することが可能な癌の遺伝子治療のための医薬組成物を提供することである。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記問題を解決すべく鋭意研究を行った結果、以下の知見を得るに至った。
【００１４】
すなわち、ＰＡ２８遺伝子導入細胞において、細胞周期関連分子であるｃｄｃ２、Ｋｉｐ１、ｃｄｋ４、ｓｕｒｖｉｖｉｎ等の発現が著しく低下していること（ｍＲＮＡレベルは不変）、逆にＰＡ２８のドミナント−ネガティブ体の遺伝子導入細胞では、これらの発現が亢進していることを見出した。ドミナント−ネガティブ体の遺伝子導入細胞では、上記タンパク質のユビキチン化の促進も観察された。これらの事実は、ＰＡ２８がこれらのタンパク質分解を促進することを示している。また、ＰＡ２８遺伝子の導入により、細胞周期異常に伴うアポトーシスの誘発が引き起こされることを明らかにした。さらに驚いたことに、ＰＡ２８過剰発現腫瘍は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでアポトーシスを誘発するだけでなく、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいても退縮拒絶されることがマウスを用いた腫瘍の移植実験で明らかになった。
【００１５】
以上のように、ＰＡ２８は、多くのタンパク質分子の分解に関与しており、その結果の総和としてアポトーシスという現象を癌細胞に引き起こすという、全く新しいアポトーシス誘発メカニズムを見出した。
【００１６】
このように、ＰＡ２８遺伝子導入癌細胞は、即座に細胞周期異常（Ｍ期における分裂阻害）、およびそれに伴うアポトーシスの亢進をもたらす一方、ＰＡ２８遺伝子導入癌細胞では、ＭＨＣクラスＩ分子の高発現に伴う癌抗原ペプチドの発現増加により、細胞障害性Ｔ細胞によるより強力な抗原認識が行われる。したがって、ＰＡ２８遺伝子導入により癌細胞自体の細胞死を誘発すると同時にＴ細胞免疫系をも活性化することができる。
【００１７】
上記知見に基づいて、ＰＡ２８遺伝子を組み込んだウイルスベクターを用いて癌細胞にＰＡ２８を過剰発現させることにより、癌細胞の細胞周期遅延、アポトーシス誘発を引き起こすことを利用し、ＰＡ２８遺伝子を導入した癌細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいても早期に退縮拒絶されることに成功し、本発明を完成するに至った。
【００１８】
すなわち、本発明は、ＰＡ２８遺伝子をコードする遺伝子を含む細胞死誘発ベクターを提供する。
【００１９】
また、本発明は、上記ベクターを含有する細胞死誘発剤を提供する。
【００２０】
さらに、本発明は、上記ベクターを含有する抗腫瘍医薬組成物を提供する。
【００２１】
さらに、本発明は、上記ベクターであって、ＰＡ２８遺伝子がＰＡ２８α遺伝子であるベクターを提供する。
【００２２】
さらに、本発明は、上記細胞死誘発剤であって、ＰＡ２８遺伝子がＰＡ２８α遺伝子である医薬組成物を提供する。
【００２３】
さらに、本発明は、上記抗腫瘍医薬組成物であって、ＰＡ２８遺伝子がＰＡ２８α遺伝子である医薬組成物を提供する。
【００２４】
さらに、本発明は、上記ベクターは、ウイルスベクターであるベクターを提供する。
【００２５】
さらに、本発明は、上記ベクターは、ウイルスベクターである上記細胞死誘発剤を提供する。
【００２６】
さらに、本発明は、上記ベクターは、ウイルスベクターである上記抗腫瘍医薬組成物を提供する。
【００２７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２８】
本発明の細胞死誘発ベクターは、ＰＡ２８遺伝子を含むことを特徴とする。本発明の細胞死誘発剤および抗腫瘍医薬組成物は、ＰＡ２８遺伝子を含むベクター（本発明の細胞死誘発ベクター）を有効成分として含有することを特徴とする。細胞死誘発ベクターとは、細胞死を誘発するためのベクターであり、細胞に該ベクターを導入したときに、導入された細胞に細胞死（アポトーシス）を誘発することが可能なベクターを意味する。したがって、本発明の細胞死誘発ベクター、細胞死誘発剤または抗腫瘍医薬組成物が標的細胞に導入されると、該標的細胞の細胞周期の遅滞または停止を引き起こし、細胞死（アポトーシス）を誘発することができる。
【００２９】
アポトーシスは、細胞の染色体ＤＮＡのヌクレオソーム単位の断片化などを特徴とする細胞死である。このアポトーシスの検出は、たとえばＡｎｎｅｘｉｎ−Ｖ染色による解析およびＴＵＮＥＬ法、核染色などによるＤＮＡ断片化の検出等の周知の方法によって解析することができる。
【００３０】
本発明に使用されるＰＡ２８遺伝子は、ＰＡ２８α遺伝子、ＰＡ２８β遺伝子、およびその両方であってもよいが、ＰＡ２８α遺伝子であることが好ましい。また、本発明のＰＡ２８（好ましくはＰＡ２８α）遺伝子は、その起源を特に限定するものではなく、ヒトの他、マウス、ラット、ウサギなどの哺乳類由来の遺伝子が挙げられる。
【００３１】
本発明のＰＡ２８遺伝子は、ＰＡ２８類似体であってもよく、ＰＡ２８遺伝子と実質的に同等の生物学的活性を有する限り、ＰＡ２８アミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列をコードする遺伝子が包含される。したがって、ヒトＰＡ２８のアミノ酸配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上の相同性を有するアミノ酸をコードするものが本発明の範囲に含まれる。また、本発明のＰＡ２８遺伝子類似体には、上記ヒトＰＡ２８をコードする遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡも含まれる。これらの類似体は、たとえば、部位特異的突然変異／ＰＣＲ法などの周知の技術を使用することによって、遺伝子工学的にＰＡ２８（好ましくはＰＡ２８α）をコードするＤＮＡ中に変異を導入することも可能である（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”（２ｎｄ  ｅｄ）（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）に記載されているような従来の組換え技術を使用する）。上記ストリンジェントな条件としては、上記文献記載のハイブリダイゼーション条件が挙げられ、具体的には、ホルムアミド濃度：４５％（ｖ／ｖ）、塩濃度：５  ×ＳＳＰＥ、温度：４２  ℃の条件下でハイブリダイズさせ、塩濃度：  ２  ×ＳＳＰＥ、温度：４２℃の条件下で洗浄するという条件などが挙げられる。
【００３２】
本発明に使用されるＰＡ２８をコードする遺伝子（たとえばｃＤＮＡ）は、以下のような方法によって得ることができる。
【００３３】
ＰＡ２８分子は、本来正常細胞および癌細胞に多かれ少なかれ発現していることが知られている。したがって、まずこれらの細胞から、全ｍＲＮＡを精製する。具体的には、細胞を、グアニジンイソチオシアネートを含んだフェノールまたはフェノール−クロロフォルム溶液でホモジナイズし、高速遠心により水相と有機層に分離した後、水相に含まれる全ＲＮＡをイソプロパノールに加え沈殿させて回収するか、あるいはショ糖もしくはセシウムクロライド密度勾配遠心法により回収する。この全ＲＮＡをテンプレートにし、オリゴ（ｄＴ）プライマーを使用して、ｍＲＮＡ（即ち、ｐｏｌｙ（Ａ）ＲＮＡ）から逆転転写酵素による逆転写反応でｃＤＮＡを合成する。
【００３４】
このｃＤＮＡには、たとえば、あらかじめファージまたはプラスミドベクターに連結可能なように適当な制限酵素部位を作製し、これを同様の制限酵素部位をもつファージ若しくはプラスミドベクターに連結する。このようにして得られたベクターで大腸菌を形質転換またはトランスフェクションしてｃＤＮＡライブラリーを作製する。また、種々の細胞の全ＲＮＡからのｃＤＮＡライブラリーが市販されているので、これらを使用してもよい。
【００３５】
次に、上記ｃＤＮＡライブラリーには、目的のＤＮＡ以外に種々の異なった情報をもったＤＮＡ断片も挿入されているため、ＰＡ２８（好ましくは、ＰＡ２８α）をコードするＤＮＡのみを選抜する必要がある。ＰＡ２８遺伝子の塩基配列は既に明らかとなっているので、この配列情報に基づいて全長ＰＡ２８を含む配列が増幅されるようにプライマーを設計し、上記ｃＤＮＡライブラリーをテンプレートとしてＰＣＲ反応を行えば、ＰＡ２８αをコードするＤＮＡのみを増幅することができる。具体的には、たとえばヒトＰＡ２８αｃＤＮＡを増幅する場合であれば、ヒトＰＡ２８αｃＤＮＡの１〜２０位および７３５〜７５０位の塩基配列に基づいてこれらに相補的なＤＮＡ配列をプライマーとして作製し、上記ライブラリーをテンプレートとしてＰＣＲを行うことにより、ＰＡ２８αＤＮＡを特異的に増幅することができる。
【００３６】
ＰＣＲは、たとえば変性９４℃、１分；アニーリング５８℃、１分；伸長７２℃、１分を１サイクルとして２０サイクル以上、好ましくは３０サイクル以上の条件を使用できる。目的のＰＡ２８ＤＮＡをクローン化および増幅した後、このＤＮＡを回収し、電気泳動等によって精製する。これを適切な発現ベクターに組込むことにより、本発明の細胞死誘発ベクターを作製する。
【００３７】
本発明の細胞死誘発ベクターに使用するための発現ベクターは、挿入したＰＡ２８遺伝子を発現可能であれば、いずれのベクターを使用してもよい。たとえば、ウイルスベクターおよび非ウイルスベクターのいずれを使用することもできるが、好ましくは、ウイルスベクターである。
【００３８】
ウイルスベクターとしては、組換えアデノウイルス、レトロウイルス等が挙げられる。より具体的には、たとえば、無毒化したレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス、センダイウイルス、ＳＶ４０、免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）等のＤＮＡウイルスまたはＲＮＡ  ウイルスなどが挙げられる。ウイルスベクターのうち、アデノウイルスの感染効率は、他のウイルスベクターを用いた場合よりもはるかに高いことが知られており、この観点からは、アデノウイルスベクター系を用いることが好ましい。
【００３９】
一方、非ウイルス性ベクターには、哺乳類細胞用ベクターが含まれる。
【００４０】
本発明の細胞死誘発ベクターは、上述したように増幅したＰＡ２８（好ましくはＰＡ２８α）遺伝子を適切な発現ベクターに組み込むことによって構築することがでるが、ＰＡ２８遺伝子のベクターへ挿入は、任意の手段を使用することができる。たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”（２ｎｄ  ｅｄ）（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）に記載されているような従来の組換え技術、またはその他の相同組換え技術等を使用して、ＰＡ２８遺伝子を発現ベクターに挿入し、本発明のベクターを構築することができる。使用する発現ベクターにマルチクローニングサイトが存在するのであれば、該クローニングサイトにＰＡ２８遺伝子を挿入すればよい。
【００４１】
本発明の細胞死誘発ベクターは、複製開始点、選択マーカー、プロモーターを含み、必要に応じてエンハンサー、転写終結配列（ターミネーター）、リボソーム結合部位、ポリアデニル化シグナル等を含んでいてもよい。
【００４２】
選択マーカーは、形質転換宿主細胞を選択するための表現型を宿主に付与するための遺伝子であり、たとえば哺乳類細胞用ベクターには、ネオマイシン耐性遺伝子、チミジンキナーゼ遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素を使用することができる。
【００４３】
ベクターは、商業的に入手可能なものを使用することもできる。このようなベクターには、たとえば、ウイルスベクターであれば、ｐＭＳＣＶレトロウイルスベクター（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）などがある。非ウイルス性哺乳類細胞用であれば、ｐＸＴ１、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ  ＳＶ４０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）などがある。
【００４４】
本発明の細胞死誘発剤および抗腫瘍医薬組成物は、上記ベクターを単独で含むものであってもよいが、その他の成分を含有していてもよい。他の成分としては、併用するためのその他の薬剤（たとえば、その他の遺伝子を含有するベクター）、担体などが挙げられる。また、その投与経路に応じて種々の薬学的に許容可能な担体を含んでいてもよい。
【００４５】
本発明の細胞死誘発剤および抗腫瘍医薬組成物は、ＰＡ２８遺伝子を含有するベクターを細胞にまたは患者に投与するための適切な担体、賦形剤およびその他の薬剤と混合して製剤にすることにより、ＰＡ２８遺伝子の発現を向上させることができる。たとえば、製剤形態が注射剤である場合、常法に従って適切な溶剤（ＰＢＳ等の緩衝液、生理食塩水、滅菌水など）に溶解して調製されてもよい。また、リポソーム等によって投与される場合は、本発明のベクターを適切なリボソーム（たとえば商標名ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ．Ｉｎｃ．，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．）で入手できるカチオン性脂質から製造されるリポソームが好ましい）に形成して投与すればよい。特に、抗体をカップリングさせたリポソームを使用するなど、既知のドラッグデリバリー技術を使用することにより、選択した組織および細胞特異的に本発明のベクター（医薬組成物）をデリバリーすることもできる。
【００４６】
ウイルスベクターは、ｉｎ  ｖｉｖｏで細胞に摂取されて組み込まれ、挿入された構築物を含むウイルスＤＮＡを発現することは周知であり、細胞に組換えウイルスを感染させることによって、細胞内に遺伝子を導入することも可能である。
【００４７】
本発明の細胞死誘発剤および抗腫瘍医薬組成物の患者への導入法としては、細胞死誘発剤を直接体内に導入するｉｎ  ｖｉｖｏ法、並びにヒトからある種の細胞を取り出して体外で細胞死誘発剤を該細胞に導入してその細胞を体内に戻すｅｘ  ｖｉｖｏ法などの既知の方法を使用すればよい。ｉｎ  ｖｉｖｏ法により投与する場合は、細胞死誘発対象の細胞、組織、標的臓器等に応じて、上述したような適切な投与経路により投与すればよい。たとえば、静脈、動脈、皮下、皮内、筋肉内などに投与するか、または病変の認められる組織そのものに直接局所投与することができる。製剤形態としては、上記の各投与形態に合った種々の製剤形態で投与することができる。
【００４８】
その他、非ウイルス性ベクターの細胞への遺伝子導入法としては、リン酸−カルシウム共沈法、微小ガラス管を用いたＤＮＡの直接注入法などが挙げられる。また、組織への遺伝子導入法としては、リポソームによる遺伝子導入法、受容体介在性遺伝子導入法、パーティクル銃で担体（金属粒子）とともにＤＮＡ分子を細胞に移入する方法、正電荷ポリマーによる導入法などの公知となったいずれの組換え発現ベクターを細胞内に取り込ませてもよい。
【００４９】
本発明のベクター（またはベクターを含有する細胞死誘発剤もしくは抗腫瘍医薬組成物）を、腫瘍に直接投与するのが好ましい。本発明により、種々の細胞および組織に細胞死を誘発することが可能となり、また腫瘍を抑制または治療することができる。
【００５０】
【発明の効果】
本発明の細胞死誘発ベクターまたは細胞死誘発剤を細胞（特に腫瘍細胞）に導入することにより、該細胞に細胞周期異常に伴う細胞死（アポトーシス）を誘発することが可能となる。
【００５１】
また、本発明の抗腫瘍医薬組成物を腫瘍細胞（癌患者など）に導入することにより、抗腫瘍作用、すなわち腫瘍の退縮、拒絶を引き起こすことが可能となる。すなわち、導入された細胞に細胞死が誘発されると共に、ＰＡ２８によるプロテアソームの活性化により、ＭＨＣクラスＩ分子の高発現に伴う癌抗原ペプチドの発現増加がなされ、細胞障害性Ｔ細胞によるより強い抗原認識が行われる。したがって、癌細胞自体の細胞死を誘発すると同時にＴ細胞免疫応答性を活性化することができる。
【００５２】
【実施例】
（材料および方法）
１  ＰＡ２８α遺伝子発現癌細胞の樹立
１．１  ＰＡ２８α遺伝子の作製
ＰＡ２８αをコードするｃＤＮＡは、以下のように作製した。
【００５３】
マウス脾臓細胞をグアニジンイソチオシアネートを含んだフェノール−クロロフォルム溶液でホモジナイズし、高速遠心により水相と有機層に分離した後、水相に含まれる全ＲＮＡをイソプロパノールに加え沈殿させて回収した。この全ＲＮＡをテンプレートにし、オリゴｄＴプライマーを使用して、ｍＲＮＡから逆転写酵素による逆転写反応でｃＤＮＡを合成した。
【００５４】
次いで、１〜２０位および７３５〜７５０位の塩基配列に基づいてこれらに相補的なＤＮＡ配列をプライマーとして作製し、上記作製したｃＤＮＡライブラリーをテンプレートとして、ＰＡ２８αをコードするｃＤＮＡを増幅した。ＰＣＲは、変性９４℃、１分；アニーリング５８℃、１分；伸長７０℃、１分を１サイクルとして３０サイクルの条件を使用した。増幅したｃＤＮＡは、フェノール−クロロフォルム−イソアミルアルコール溶液を使用して精製し、さらにエタノール沈殿を行い回収した。
【００５５】
１．２  レトロウイルスベクターへのＰＡ２８α遺伝子の組み込み
作製したＰＡ２８αをコードするｃＤＮＡを、クローンテック社のｐＭＳＣＶレトロウイルスベクターのマルチクローニング部位に存在する５’ＨｐａＩ、３’ＥｃｏＲＩ部位にクローニングする。得られたベクター１０μｌをＤＯＴＡＰリポゾーマルトランスフェクション試薬（ベーリンガーマンハイム社）を使用してｐＴ６７レトロウイルスパッケージ細胞にトランスフェクションする。２μｇ／ｍｌピューロマイシンで培養を２週間継続してウイルス産生細胞を選択する。６ウェルプレートで培養してウェルの約８０％の面積を細胞で占拠した状態のとき、いったんピューロマイシンを培地から除去して（４ｍｌの新鮮培養液に置き換える）、さらに４８時間培養してその上清を回収する。この上清中にはレトロウイルス（１×１０７ＣＦＵ／ｍｌ）が存在している。
【００５６】
１．３  レトロウイルスベクターによるＰＡ２８α遺伝子の癌細胞への導入
上で得られたレトロウイルス上清２ｍｌにポリブレンを５μｇ／ｍｌになるように添加し、これを癌細胞１×１０６個のペレットに加えてよく攪拌した後、６ウェルプレートの一つにまく。２４時間後に新鮮培養液を２ｍｌ添加する。４８時間後に培養液２ｍｌを静かに除去して新たにピューロマイシン２．０μｇ／ｍｌを含む新鮮培養液２ｍｌと入れ替える。この状態で培養を続け過増殖にならないよう適宜新鮮培養液（ピューロマイシン２．０μｇ／ｍｌ）に入れ替えていく。ピューロマイシンの添加をはじめて約２週間後に、ＰＡ２８αを安定して発現した癌細胞が得られる。
【００５７】
このようにして得られた遺伝子導入癌細胞を用いて以下の実験を行った。
【００５８】
２  遺伝子導入癌細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける解析
２．１細胞周期（実施例１）
１×１０６個の細胞を遠心し、上清を除去する。
【００５９】
ボルテックスにて攪拌しながら−２０℃の７０％エタノール２ｍｌを注ぎ込む。
【００６０】
−２０℃で１２時間置く。軽くボルテックスで攪拌した後に遠心し、エタノールを十分に除きタッピングして細胞沈さをほぐす。
【００６１】
ＰＣＢ（Ｎａ２ＨＰＯ４  ０．２Ｍ、クエン酸４ｍＭ）１００μｌを添加し、混和して室温で約３０分放置する。
【００６２】
遠心して上清を十分に除去し、タッピングで細胞沈さをほぐす。
【００６３】
ＰＩ−ＲＮＡｓｅ溶液（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  Ｉｏｄｉｄｅ  １０μｇ／ｍｌ、ＲＮＡｓｅ１０ｍｇ／ｍｌ）を１ｍｌ添加してボルテックスで軽く攪拌する。
【００６４】
室温で２０分放置して、ＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，  Ｓａｎ  Ｊｏｅｓ，  ＣＡ，ＵＳＡ）にて解析し、横軸をｌｉｎｅａｒ  ｓｃａｌｅのＤＮＡ量、縦軸を細胞数のヒストグラムを作製する。
【００６５】
２．２  Ａｎｎｅｘｉｎ  ＶとＰＩ染色によるアポトーシス細胞の検出（実施例２）
アポトーシス細胞を含む１〜２×１０６個の細胞をＰＢＳ（−）に懸濁し、遠心して上清を除去し、タッピングで細胞沈さをほぐす。
【００６６】
結合バッファー（ＨＥＰＥＳ  １０ｍＭ、ＮａＣｌ  １５０ｍＭ、ＫＣｌ  ５ｍＭ、ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ  １ｍＭ、ＣａＣｌ２・６Ｈ２Ｏ  １．８Ｍ）にて５×１０５個／ｍｌになるように調製。
【００６７】
細胞浮遊液４９０μｌにアネキシンＶ−ＦＩＴＣを５μｌ、ＰＩ（２５０μｌ／ｍｌ：結合バッファー）溶液を５μｌ加えて穏やかに混和し、氷冷にて１０分間染色後直ちに測定する。
【００６８】
ＦＡＣＳｃａｎにて解析し、横軸をｌｏｇ  ｓｃａｌｅ（ＦＬ１：ＦＩＴＣ−アネキシンＶ）、縦軸をｌｏｇｓｃａｌｅ（ＦＬ２：ＰＩ）のドットプロット表示とする。
【００６９】
アネキシンＶ染色性（−）、ＰＩ染色性（−）：アポトーシス初期細胞であり、
アネキシンＶ染色性（＋）、ＰＩ染色性（＋）：アポトーシス後期細胞またはネクローシス細胞である。
【００７０】
２．３  ＴＵＮＥＬ法（ＴｄＴアッセイ）（実施例３）
１〜２×１０６個の細胞を遠心し、上清を除去してタッピングで細胞沈さをほぐす。
【００７１】
４℃の１％ホルムアルデヒド−ＰＢＳ  ２００μｌを添加して、ピペッティングで混和し、氷中に１５分放置する。
【００７２】
遠心後上清を十分に除き、沈さをボルテックスにて攪拌しながら−２０℃の７０％エタノール２ｍｌを注ぎ込む。−２０℃で１２時間置く。
【００７３】
遠心し、エタノールを除去して冷ＰＢＳで２回遠心洗浄する。
【００７４】
上清を十分取り除き、タッピングせずに沈さに平行緩衝液（カコジル酸カリウム０．２Ｍ、ＣｏＣｌ２  ２．５ｍＭ、ＤＴＴ  ０．１ｍＭ、ＢＳＡ  ０．２５ｍｇ／ｍｌ）１００μｌを添加し、ピペッティングで混和する。
【００７５】
遠心して上清を十分に除き、タッピングはせずにＴｄＴ反応液（ＦＩＴＣ−ｄＵＴＰ  ５μＭ、ＴｄＴ  ５ｕｎｉｔ）５０ｍｌを添加してピペッティングで混和する。
【００７６】
３７℃恒温槽で１時間遮光状態で反応させる。（この間１５分ごとにピペティングで混和する）冷ＰＢＳで２回遠心洗浄する。
【００７７】
上清を十分に除いてタッピングし、ＰＩ−ＲＮＡｓｅ溶液を１ｍｌ添加してボルテックスで軽く攪拌する。
【００７８】
遮光状態で２０分間放置し、ＦＡＣＳｃａｎにて解析し、横軸をｌｉｎｅａｒ  ｓｃａｌｅのＤＮＡ量（ＰＩ）、縦軸をＤＮＡ断裂の頻度（ＦＩＴＣ）のドットプロット表示とする。
【００７９】
３  ｉｎ  ｖｉｖｏにおける腫瘍移植実験（実施例４）
ＰＡ２８α遺伝子発現癌細胞、ここではＭｅｔｈＡ  ＰＡ２８αおよびＥ．Ｇ７  ＰＡ２８α、さらにＰＡ２８αドミナント−ネガティブＰＡ２８α（ΔＣ５）を発現したＭｅｔｈＡ  ＰＡ２８α（ΔＣ５）およびＥ．Ｇ７  ＰＡ２８α（ΔＣ５）、コントロールとしてからベクターのみを導入したＭｅｔｈＡ  ｍｏｃｋおよびＥ．Ｇ７  ｍｏｃｋを準備した。
【００８０】
ＭｅｔｈＡ  ｍｏｃｋ、ＭｅｔｈＡ  ＰＡ２８α、ＭｅｔｈＡ  ＰＡ２８α（ΔＣ５）は、各１×１０７個の生細胞を、またＥ．Ｇ７  ｍｏｃｋ、Ｅ．Ｇ７  ２８α、Ｅ．Ｇ７  ＰＡ２８α（ΔＣ５）は、各１×１０６個の生細胞を同系マウス皮下（ＭｅｔｈＡはＢＡＬＢ／ｃ、Ｅ．Ｇ７はＣ５７ＢＬ／６）に接種した。
【００８１】
腫瘍接種後、週に２〜３回腫瘍径の長径と短径を計測し、その平均値を計算して経時間的に腫瘍増殖パターンを観察した。
【００８２】
（結果）
実施例１
マウス腫瘍Ｅ．Ｇ７、ＭｅｔｈＡ、Ｂｌ６にレトロウイルスベクターを用いてＰＡ２８α、ＰＡ２８αΔＣ５（ドミナント−ネガティブ）を遺伝子導入した。薬剤耐性の安定株を樹立した後、細胞周期をＰＩ染色によって解析した。ＰＡ２８α発現腫瘍では、Ｇ２／Ｍ期における遅滞（８倍体の出現によって特徴づけられる）が観察された。ＰＡ２８αΔＣ５発現腫瘍では、Ｇ１期の亢進がいずれの細胞においても観察された（図１）。
【００８３】
実施例２
マウス腫瘍Ｅ．Ｇ７にレトロウイルスベクターを用いてＰＡ２８α、ＰＡ２８αΔＣ５（ドミナントネガティブ）を遺伝子導入した。薬剤耐性の安定株を樹立した後、ＰＩ染色と、Ａｎｎｅｘｉｎ−Ｖ染色によってアポトーシスの解析を行った。ＰＡ２８α発現腫瘍では、Ａｎｎｅｘｉｎ−Ｖ陽性細胞集団の出現が認められた。ＩＦＮ−γの存在下では、濃度依存的にＡｎｎｅｘｉｎ−Ｖ陽性が増加し、ＰＩ陽性細胞も出現してきた。また、ＰＡ２８αΔＣ５発現腫瘍では、ＩＦＮ−γの存在下でもＡｎｎｅｘｉｎ−Ｖ陽性集団は認められなかった。
【００８４】
実施例３
マウス腫瘍Ｅ．Ｇ７にレトロウイルスベクターを用いてＰＡ２８α、ＰＡ２８αΔＣ５（ドミナントネガティブ）を遺伝子導入した。薬剤耐性の安定株を樹立した後、ＰＩ染色によりＤＮＡ量（細胞周期）を検出した。また、Ｔｕｎｎｅｌ法によっても断片化したＤＮＡ（ＤＮＡ  ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ）を検出した。ＰＡ２８α発現腫瘍では、Ｍ期において分裂できない細胞集団の出現が認められた。さらに、全細胞周期にわたってＤＮＡ  ｆｒａｇｍａｎｔａｔｉｏｎが認められた。また、ＩＦＮ−γの存在下では、濃度依存的にＤＮＡ  ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎの程度が増加した。一方、ＰＡ２８αΔＣ５発現腫瘍では、ＩＦＮ−γの存在下でもＤＮＡ  ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎは認められなかった。
【００８５】
実施例４
マウス腫瘍Ｅ．Ｇ７、ＭｅｔｈＡにレトロウイルスベクターを用いてＰＡ２８α、ＰＡ２８α＞Ｃ５（ドミナントネガティブ）を遺伝子導入し、薬剤耐性の安定株を樹立した。これら安定株を同系マウスに移植した後、腫瘍増殖を観察した（一群３匹より成る）。ＰＡ２８α遺伝子を導入した腫瘍では、いずれも腫瘍の退縮、拒絶が観察された。一方、ＰＡ２８αΔＣ５（ドミナントネガティブ）を導入した細胞では、移植後の腫瘍径は次第に大きくなった。
【００８６】
（考察）
ＰＡ２８α遺伝子を導入することにより、癌細胞が細胞死（アポトーシス）に陥ることが明らかとなった。また、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいても、ＰＡ２８α遺伝子を導入することによって癌細胞に細胞死が誘発され、腫瘍増殖が退縮、拒絶されることが明らかとなった。
【００８７】
癌患者では、腫瘍自体が様々な免疫回避機構を駆使して免疫系から逃れている。また、同時にアポトーシスに対する抵抗性も獲得している。このような状況下で、ＰＡ２８遺伝子を腫瘍に導入すれば有効な遺伝子治療への道が開ける。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＰＡ２８α遺伝子を導入した細胞における細胞周期の解析を示す図。
【図２】ＰＡ２８α遺伝子を導入した細胞におけるアポトーシスの解析を示す図。
【図３】ＰＡ２８α遺伝子を導入した細胞におけるＤＮＡ断片化（ＤＮＡ  ｆｒｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ）の解析を示す図。
【図４】ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＰＡ２８α遺伝子導入の効果を示す図。
【図１】
2004236505.tif 000003
【図２】
2004236505.tif 000004
【図３】
2004236505.tif 000005
【図４】
2004236505.tif 000006