【誤訳訂正書】
【提出日】平成24年2月16日(2012.2.16)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単球走化性タンパク質（ＭＣＰ−１)に結合する単離抗体であって、配列番号２７の重鎖可変配列および配列番号２８の軽鎖可変配列を含んでなる、上記抗体。
【請求項２】
重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む、ＭＣＰ−１に結合する単離抗体であって、前記重鎖可変領域が配列番号６、７および９の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）アミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域が配列番号１３、１４および１６の軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列を含んでなる、上記抗体。
【請求項３】
１０−９Ｍ〜１０−１２Ｍの親和性でＭＣＰ−１と結合する、請求項１または２に記載の抗体。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体、および製薬学的に受容可能な担体または希釈剤を含んでなる医薬組成物。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体を溶液または凍結乾燥形態で含んでなる包装材料および容器を含んでなる製造品。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【発明の詳細な説明】
【発明の名称】抗ＭＣＰ−１抗体、組成物、方法および使用
【関連出願との関係】
【０００１】
本出願は、２００５年５月１９日付けの米国仮特許出願第６０／６８２６５４号明細書および同第６０／６８２６２０号明細書に対する優先権を請求するものであり、それらの
内容が引用することにより完全に組み込まれている。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、少なくとも１つのヒト単球化学誘引性（ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ）タンパク質−１（ＭＣＰ−１）タンパク質またはそのフラグメントについて特異的な、特定された部分または変異体を含む抗体、ならびに抗イディオタイプ抗体、およびかかる抗ＭＣＰ−１抗体をコードする核酸、相補的核酸、ベクター、宿主細胞および、治療用処方、投与およびデバイスを含めたその製造および使用方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
７６個のアミノ酸残基を含有する８．６ｋＤａのタンパク質であるヒト単球化学誘引性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）（ＣＣＬ−２とも呼ばれる）は、サイトカインのケモカイン・ベータ（またはＣ−Ｃ）ファミリの一員である。ケモカインは、組織損傷部位での白血球の特異的サブセットの血管周囲の通り抜けおよび蓄積において中心的役割を果たすことが示されてきた低分子量（８〜１０ｋＤａ）で誘発可能な分泌型炎症性走化性サイトカインである。４つの保存されたシステインの位置づけに応じて、２つの主要なファミリが定義されてきた。ＣＸＣまたはα−ケモカインは、主に好中球を誘引し、一方ＣＣまたはβ−ケモカインは主に単球およびその他の白血球を誘引するが、好球中は誘引しない（非特許文献１）。単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）ファミリの成員は、ケモカインのＣ−Ｃファミリの主要な構成要素を形成し、単球、マクロファージおよび活性化リンパ球の可動化に関与する主要なケモカインとみなされている。異なる種からのＭＣＰ−１の相同性を見てみると、ヒトとサルのＭＣＰ−１は、２つのアミノ酸においてのみ異なっており、９７％の配列同一性を明らかにしているが、１２５個のアミノ酸残基を含有する１３．８ｋＤａのタンパク質であるマウスＭＣＰ−１は、グリコシル化の範囲および分子サイズがヒトＭＣＰ−１と異なっている。
【０００４】
ケモカインレセプターは、Ｇタンパク質共役型の７つの膜貫通（７ＴＭ）ドメインレセプター（ＧＰＣＲ、蛇行レセプターとも呼ばれる）の大きなファミリに属している。１９９６年の走化性サイトカインに関するゴードン研究会議で作成されたレセプター命名法に基づくと、ＣＸＣケモカインを結合させるケモカインレセプターは、ＣＸＣＲと呼称され、ＣＣケモカインを結合させるレセプターはＣＣＲと呼称される。
【０００５】
ＭＣＰ−１は、ケモカインレセプターＣＣＲ２を通して結合し、シグナル伝達することが知られている。ＣＣＲ２は、単球、Ｔ細胞、Ｂ−細胞および好塩基球を含む数多くの細胞上で発現される７回膜貫通全域Ｇタンパク質共役型レセプターである。ＭＣＰ−１のナノモル（ｎＭ）濃度に応答してシグナル伝達する２つのＭＣＰ−１特異的レセプターＣＣＲ２ＡおよびＣＣＲ２Ｂがクローニングされてきた。ＣＣＲ２Ａ（ＣＣ−ＣＫＲ２Ａ）およびＣＣＲ２Ｂ（ＣＣ−ＣＫＲ２Ａ）は、選択的スプライスを受けたカルボキシル尾部をもつ２つのＭＣＰ−１特異的レセプターをコードする２つのｃＤＮＡを表わす。ＭＣＰ−１は、高い親和性で両方のイソタイプに結合する。ＭＣＰ−１はＣＣＲ２Ｂを発現する細胞中でカルシウム流出を誘発するが、ＣＣＲ２Ａを発現する細胞内ではこれを誘発しない。ＣＣＲ２Ａを発現する細胞と比べてＣＣＲ２Ｂを発現する細胞内では５分の１のＭＣＰ−１で走化性が誘発される。
【０００６】
ヒトＭＣＰ−１に対するある種の機能的および配列上の相同性を有するその他のタンパク質が知られている。特にＭＣＰ−１（ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＰ＿００２９７３）に類似しているのは、ＭＣＰ−２（ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＰ＿００５６１４）およびエオタキシン（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｐ＿５１６７１）であり、ＭＣＰ−１に対してＭＣＰ−２は６１．８パーセントの配列同一性をもち、エオタキシン−１は６３．２パーセントの配列同一性を有する。ヒトホメオスタシス機構および病理におけるこれらのタンパク質の関与スペクトル
および活動の範囲は、ＭＣＰ−１相同体についてはさほどよく理解されていない。例えばＭＣＰ−２（ＣＣＬ８と改名）はＭＣＰ−１およびＭＣＰ−３（ＣＣＬ７と改名、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＰ＿００６２６４）に密に関係づけされており、その機能的レセプターとしてＣＣＲ１ならびにＣＣＲ２Ｂの両方を使用する。ＭＣＰ−３は、Ｄ６と呼称されるレセプターに結合する。ＭＣＰ−３は同様にＣＣＲ１０およびＣＣＲ１にも結合する。ＭＣＰ−３タンパク質（アミノ酸９７個）配列はＭＣＰ−１と７４パーセントの同一性を示し、ＭＣＰ−２と５８パーセントの相同性を示す。分泌されたＭＣＰ−３はＮ−グリコシル化されているという点でＭＣＰ−１と異なっている。ＭＣＰ−４（ＣＣＬ１３と改名、ＧｅｎＢａｎｋＮＰ＿００５３９９）は、３つの既知の単球走化性タンパク質と５６〜６１パーセントの配列同一性を共有し、エオタキシン−１と６０パーセント同一である。ＭＣＰ−４の機能は、ＭＣＰ−３およびエオタキシンのものときわめて類似しているものと思われる。ＭＣＰ−３と同様に、ＭＣＰ−４は単球およびＴ−リンパ球について強力な化学誘引性を有する。これは、好中球上で不活性である。単球上では、ＭＣＰ−４は、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−３、ＲＡＮＴＥＳ（ＣＣＬ５）およびエオタキシン（ＣＣＲ１およびＣＣＲ３レセプター）を認識するレセプターに結合し、エオタキシン−１と完全な交差脱感作を示す。ＭＣＰ−５はマウスＣＣ−ケモカインであり、ヒトＭＣＰ−１に最も密に関係している（６６％のアミノ酸同一性）。ＭＣＰ−５についての遺伝子記号はＳＣＹＡ１２（ＣＣＬ１２に改名）である。ケモカインレセプターＣＣＲ２でトランスフェクトされた細胞は、ＭＣＰ−５に応答することが示されてきた。サイトカインおよびケモカインに関する一般的情報についてはｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｏｐｅｗｉｔｈｃｙｔｏｋｉｎｅｓ．ｄｅ／ｃｏｐｅ．ｃｇｉを、又現行の分類系については非特許文献２を参照のこと。
【０００７】
１２５Ｉ−ＭＣＰ−１は単球に結合し、スカッチャード（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ）プロット分析は、単球が約２ｎＭのＫｄで細胞１個あたり最低約１７００個の結合部位を有することを示した（非特許文献３）。ヒト単球でのその後の平衡結合実験は、０．７７ｎＭのＫｄで細胞１個あたり約３０００個の結合部位の存在を明らかにしている（非特許文献４）。１２５Ｉ−ＭＣＰ−１は同様に、０．４ｎＭのＫｄ値でＣＣＲ２レセプターを発現するｄＥｏＬ−３細胞に対する高親和性結合も実証し（非特許文献５）、ＭＣＰ−１のそのレセプターに対するサブナノモル親和性を確認した。そのレセプターＣＣＲ２と接触するＭＣＰ−１の領域を同定するために、全ての表面露出残基がアラニンと置換させられた。一部の残基は、特定の位置での電荷、疎水性または芳香性の重要性を同定するために、その他のアミノ酸に突然変異させられた。３５Ａ疎水性溝で分離された主として塩基性である残基（Ｒ２４、Ｋ３５、Ｋ３８、Ｋ４９およびＹ１３）の２つのクラスターが結合レベルを１５−１００分の１に低減させた。データは、ＭＣＰ−１の大きな表面積がレセプターと接触する１つのモデルを示唆しており、数多くの弱い相互作用の蓄積の結果、野生型（ＷＴ）タンパク質について３５ｐＭの親和性が観察された（非特許文献６）。文献中の２ｎＭから３５ｐＭまでの親和性範囲は、使用された検定およびそれぞれの検定の制限に起因するものであるかもしれない。
【０００８】
ヒトＭＣＰ−１に対するある種の機能的および配列上の相同性を伴うその他のタンパク質が知られている。特にＭＣＰ−１（ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＰ＿００２９７３）に類似しているのは、ＭＣＰ−２（ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＰ＿００５６１４）およびエオタキシン（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｐ＿５１６７１）であり、ＭＣＰ−２はＭＣＰ−１に対する６１．８パーセントの配列同一性をもち、エオタキシン−１は６３．２パーセントの配列同一性を有する。ヒトホメオスタシス機構および病理におけるこれらのタンパク質の関与スペクトルおよび活動の範囲は、ＭＣＰ−１相同体についてはさほどよく理解されていない。例えばＭＣＰ−２はＭＣＰ−１およびＭＣＰ−３（ＧｅｎＢａｎｋＮＰ＿００６２６４）に密に関係づけされており、その機能的レセプターとしてＣＣＲ１ならびにＣＣＲ２Ｂの両方を使用する。ＭＣＰ−３は、Ｄ６と呼称されるレセプターに結合する。ＭＣＰ−３は同様にＣＣＲ１０にも結合する。ＭＣＰ−３タンパク質（アミノ酸９７個）配列はＭＣＰ−１と７
４パーセントの同一性を示し、ＭＣＰ−２と５８パーセントの相同性を示す。分泌されたＭＣＰ−３はＮ−グリコシル化されているという点でＭＣＰ−１と異なっている。ＭＣＰ−４（ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＰ＿００５３９９）は、３つの既知の単球走化性タンパク質と５６〜６１パーセントの配列同一性を共有し、エオタキシン−１と６０パーセント同一である。ＭＣＰ−４の機能は、ＭＣＰ−３およびエオタキシンのものときわめて類似しているものと思われる。ＭＣＰ−３と同様に、ＭＣＰ−４は単球およびＴ−リンパ球について強力な化学誘引性を有する。これは、好中球上で不活性である。単球上では、ＭＣＰ−４は、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−３およびＲＡＮＴＥＳ（ＣＣR２）を認識するレセプターに結合する。好酸球上では、ＭＣＰ−４はＭＣＰ−３、ＲＡＮＴＥＳおよびエオタキシンと類似の有効性および効力を有する。ＭＣＰ−４は、エオタキシン（ＣＣＲ１およびＣＣＲ３）とレセプターを共有し、エオタキシン−１と完全な交差脱感作を示す。
【０００９】
ＭＣＰ−１を結合できるその他の抗体が報告されている：すなわち特許文献１は、単離血球から得た抗体を開示しており、特許文献２は、ＩｇＭ抗ヒトＭＣＰ−１を分泌するハイブリドーマを開示している。より最近では、ＭＣＰ−１を含む複数のベータケモカインを結合する能力をもつ抗体（特許文献３）および同じくエオタキシンも結合させるＭＣＰ−１結合抗体（特許文献４）が開示された。
【特許文献１】日本特開平０９−０６７３９９号公報
【特許文献２】日本特開平０５−２７６９８６号公報
【特許文献３】国際公開第０３／０４８０８３号パンフレット
【特許文献４】米国特許出願公開第２００４／００４７８６０号明細書
【非特許文献１】レオナルドおよび吉村（Ｌｅｏｎａｒｄ  ａｎｄ  Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ）ら、１９９０年
【非特許文献２】ズロトニック（Ｚｌｏｔｎｉｋ）Ａ．、ヨシエ（Ｙｏｓｈｉｅ）Ｏ．、２０００年、「Ｃｅｍｏｋｉｎｅｓ：ａ  ｎｅｗ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ」、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ第１２号、１２１〜１２７頁
【非特許文献３】吉村およびレオナルド（ＬＥＯＮＡＲＤ）、１９９０年
【非特許文献４】エルンスト（Ｅｒｎｓｔ）ら、１９９４年
【非特許文献５】サロー（Ｓａｒａｕ）ら、１９９７年
【非特許文献６】ヘマリッヒ（Ｈｅｍｍｅｒｉｃｈ）ら、１９９９年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
従って、ＭＣＰ−１依存性疾患の症候を軽減または除去するための療法において使用するためのヒトＭＣＰ−１に特異的なヒト抗体、ならびに既知の抗体またはそのフラグメントに対する改良を提供する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、当該技術分野において既知のものと組合せた形で、本明細書に記載された通りに、単離ヒト、霊長類、ゲッ歯類、哺乳動物、キメラ、ヒト化および／またはＣＤＲ移植型抗ＭＣＰ−１抗体およびその他の免疫グロブリン由来のタンパク質、フラグメント、分割産物およびそのその他の特定された部分および変異体、ならびに抗−ＭＣＰ−１抗体組成物、コーディングまたは相補的核酸、ベクター、宿主細胞、組成物、処方物、デバイス、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物およびその製造および使用方法を提供している。本明細書に記載されている通りの本発明の抗体の組成物に加えて、本発明の抗体は、ヒトＭＣＰ−１についてのその親和性、ヒトＭＣＰ−１についての特異性およびヒトＭＣＰ−１の生物活性を遮断する能力により定義される。
【００１２】
本発明は同様に、本明細書に記載されている通りの少なくとも１つの抗体、抗体融合タ
ンパク質またはフラグメントといったような（ただしこれらに限定されるわけではない）少なくとも１つの単離抗ＭＣＰ−１抗体をも提供している。本発明に従った抗体には、さらにヒト免疫グロブリンの少なくともＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２またはＣＨ３が場合により含まれていてもよく、表４Ｃに記載されている通りのフレームワーク領域（例えばＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４）またはそのフラグメント（配列番号２〜５）と場合によって機能的に会合させられている、表４Ａ、Ｂ、ＤおよびＥ（配列番号６〜２６）内に提供されている通りの重鎖または軽鎖可変領域、重鎖または軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）またはそのリガンド結合部分といった（ただしこれらに限定されるわけではない）少なくとも１つのリガンド結合ドメインといった（ただしこれらに限定されるわけではない）免疫グロブリン分子の少なくとも一部分を含んでなるあらゆるタンパク質またはペプチド含有分子が含まれる。少なくとも１つの抗体アミノ酸配列はさらに、場合により、本明細書に記載されているかまたは当該技術分野において既知のとおりの少なくとも１つの特定された置換、挿入または欠失を含んでなり得る。
【００１３】
一実施形態においては、抗体のリガンド結合部分は、配列番号２７および２８を含んでなる。一態様においては、本発明は、配列番号２７または２８を含む少なくとも１つの可変領域を含んでなる、少なくとも１つの単離哺乳動物抗−ＭＣＰ−１抗体を提供する。
【００１４】
もう１つの態様においては、本発明は（ｉ）配列番号６、７および９の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）アミノ酸配列の全て；または（ｉｉ）配列番号１３、１４および１６の軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列の全て、のいずれかを含んでなる少なくとも１つの単離哺乳動物抗−ＭＣＰ−１抗体を提供している。
【００１５】
本発明は、１つの態様において、少なくとも１つの特定された配列、ドメイン、部分またはその変異体を含む特定の抗ＭＣＰ−１抗体をコードするポリヌクレオチドを含むかまたはこれに対し相補的な、またはこれに対しハイブリッド形成する単離核酸分子を提供している。本発明はさらに、前記抗ＭＣＰ−１抗体核酸分子を含む組換え型ベクター、かかる核酸および／または組換え型ベクターを含有する宿主細胞、ならびにかかる抗体核酸、ベクターおよび／または宿主細胞の製造および／または使用方法をも提供している。
【００１６】
本発明の少なくとも１つの抗体は、配列番号１中に提供されているもののような少なくとも１つのＭＣＰ−１タンパク質または変異体または誘導体に特異的な少なくとも１つの特定されたエピトープを結合させる。該少なくとも１つのエピトープは、前記タンパク質の少なくとも一部分を含んでなる少なくとも１つの抗体結合領域を含んでなり得、このエピトープは好ましくは、前記タンパク質の少なくとも１つの機能的、細胞外、可溶性、親水性、外部または細胞質ドメインまたはその任意の部分といった（ただしこれらに限定されるわけではない）その少なくとも一部分の少なくとも１〜５個のアミノ酸で構成されている。
【００１７】
少なくとも１つの抗体は、少なくとも１つの定常領域または可変フレームワーク領域またはその任意の部分を場合によりさらに含んでなる、配列番号６、７、９、１３、１４および１６として提供されている少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）（例えば、それぞれ配列番号２７および２８として提供されている重鎖または軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３）の少なくとも１つの特定された部分を場合により含んでなり得、ここで該抗体は、細胞表面上のレセプターに対するＭＣＰ−１結合、ＣＣＲ２レセプター内在化、ＭＣＰ−１刺激型Ｃａ２＋可動化またはその他のあらゆる適切な既知のＭＣＰ−１検定といったような（ただしこれらに限定されるわけではない）少なくとも１つの活性を遮断、阻害または防止する。かくして、抗ＭＣＰ−１抗体は、ＭＣＰ−１タンパク質に向かっての少なくとも１つの生物活性といった（ただしこれらに限定されるわけではない）対応する活性について、既知の方法に従ってスクリーニングされ得る。
【００１８】
本発明はさらに、本発明の少なくとも１つのＭＣＰ−１抗体に対する少なくとも１つのＭＣＰ−１抗イディオタイプ抗体を提供する。該抗イディオタイプ抗体は、本発明の抗イディオタイプ抗体の中に取込むことのできる、重鎖または軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）またはそのリガンド結合部分、重鎖または軽鎖可変領域、重鎖または軽鎖定常領域、フレームワーク領域、またはその任意の部分といった（ただしこれらに限定されるわけではない）少なくとも１つのリガンド結合部分（ＬＢＰ）といった（ただしこれらに限定されるわけではない）免疫グロブリン分子の少なくとも一部分を含んでなるあらゆるタンパク質またはペプチド含有分子を内含する。本発明の抗イディオタイプ抗体は、ヒト、マウス、ウサギ、ラット、ゲッ歯類、霊長類などといった（ただしこれらに限定されるわけではない）あらゆる哺乳動物を含むかまたはこれらから誘導され得る。
【００１９】
本発明は、一態様において、少なくとも１つの特定された配列、ドメイン、部分またはその変異体を含んでなる、少なくとも１つのＭＣＰ−１抗イディオタイプ抗体をコードするポリヌクレオチドを含んでなるか、これに対し相補的であるかまたはこれに対しハイブリッド形成する単離核酸分子を提供している。本発明はさらに、核酸分子をコードする前記ＭＣＰ−１抗イディオタイプ抗体を含んでなる組換え型ベクター、このような核酸および／または組換え型ベクターを含有する宿主細胞、ならびに、かかる抗イディオタイプ抗体核酸、ベクターおよび／または宿主細胞の製造および／または使用方法を提供している。
【００２０】
本発明は同様に、少なくとも１つの抗ＭＣＰ−１抗体が検出可能かつ／または回収可能な量で発現される条件下で、本明細書に記載された通りの宿主細胞を培養する工程を含んでなる、宿主細胞中で少なくとも１つの抗ＭＣＰ−１抗体またはＭＣＰ−１抗イディオタイプ抗体を発現させるための少なくとも１つの方法をも提供している。
【００２１】
本発明は同様に、（ａ）本明細書に記載されている通りの核酸および／または抗体をコードする単離抗ＭＣＰ−１抗体；および（ｂ）適切な担体または希釈剤を含んでなる少なくとも１つの組成物をも提供する。担体または希釈剤は場合により、既知の担体または希釈剤に従って製薬学的に受容可能であり得る。組成物は場合により、さらに少なくとも１つのさらなる化合物、タンパク質または組成物を含むことができる。
【００２２】
本発明はさらに、当該技術分野で既知のとおりのおよび／または本明細書に記載されている通りの関連する身体条件の前後またはその間に、かつ／または細胞、組織、器官、動物または患者の中の少なくとも１つのＭＣＰ−１関連の身体条件を変調または治療するべく治療上有効な量を投与するための、少なくとも１つの抗ＭＣＰ−１抗体方法または組成物を提供している。
【００２３】
本発明は同様に、本発明に従った治療的または予防的有効量の少なくとも１つの抗ＭＣＰ−１抗体の少なくとも１つの送達用組成物、デバイスおよび／または方法をも提供している。
【００２４】
本発明はさらに、当該技術分野で既知のとおりのおよび／または本明細書に記載されている通りの関連する身体条件の前後またはその間に、かつ／または細胞、組織、器官、動物または患者の中の少なくとも１つのＭＣＰ−１関連の身体条件について診断を下すための、少なくとも１つの抗ＭＣＰ−１抗体方法または組成物を提供している。
【００２５】
本発明は同様に、本発明に従った少なくとも１つの抗ＭＣＰ−１抗体の診断目的の少なくとも１つの送達用組成物、デバイスおよび／または方法をも提供している。
【００２６】
１つの態様においては、本発明は、配列番号２７または２８を含んでなる少なくとも１つの可変領域を含んでなる少なくとも１つの単離哺乳動物抗−ＭＣＰ−１抗体を提供している。
【００２７】
もう１つの態様においては、本発明は（ｉ）配列番号６、７および８または９の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）アミノ酸配列の全て；または（ｉｉ）配列番号１３、１４および１５または１６の軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列の全て、のいずれかを含んでなる少なくとも１つの単離哺乳動物抗−ＭＣＰ−１抗体を提供している。
【００２８】
もう１つの態様においては、本発明は（ｉ）配列番号６、７および８または９の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）アミノ酸配列の全て；または（ｉｉ）配列番号１３、１４および１５または１６の軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列の全て、のうちの少なくとも一方を含んでなる少なくとも１つの単離哺乳動物抗−ＭＣＰ−１抗体を提供している。
【００２９】
少なくとも１つの抗体は場合により、少なくとも１０−９Ｍ、少なくとも１０−１０Ｍ、少なくとも１０−１１Ｍまたは少なくとも１０−１２Ｍから選択された少なくとも１つの親和性でＭＣＰ−１を結合させること、または少なくとも１つのＭＣＰ−１タンパク質の少なくとも１つの活性を実質的に中和することのうちの少なくとも１つのことを行なうことができる。同様に提供されているのは、少なくとも１つの単離哺乳動物抗ＭＣＰ−１抗体をコードする単離核酸、単離核酸を含んでなる単離核酸ベクターおよび／または単離核酸を含んでなる原核生物宿主または真核生物宿主細胞である。該宿主細胞は、場合により、ＮＳＯ、ＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ２１、ＣＨＯ、ＢＳＣ−１、ＨｅｐＧ２、ＹＢ２／０、ＳＰ２／０、ＨｅＬａ、骨髄腫またはリンパ腫細胞、またはそのあらゆる誘導体、不死化または形質転換細胞から選択された少なくとも１つのものであり得る。同様に提供されているのは、ＭＣＰ−１抗体が検出可能なまたは回収可能な量で発現されるようにインビトロ、インビボまたはインサイチュ（ｉｎ  ｓｉｔｕ）条件下で核酸をコードする抗体を翻訳する工程を含んでなる、少なくとも１つの抗ＭＣＰ−１抗体の生産方法である。
【００３０】
同様に提供されているのは、少なくとも１つの単離哺乳動物抗ＭＣＰ−１抗体および少なくとも１つの製薬学的に受容可能な担体または希釈剤を含んでなる組成物である。
【００３１】
同様に提供されているのは、細胞、組織、器官または動物内のＭＣＰ−１関連の身体条件を診断し治療するための方法であって、（ａ）前記細胞、組織、器官または動物と有効量の本発明の少なくとも１つの単離哺乳動物抗ＭＣＰ−１抗体を含んでなる組成物と接触させる工程またはそれらに対しかかる組成物を投与する工程を含んでなる方法である。
【００３２】
同様に提供されているのは、非経口、皮下、筋内、静脈内、関節内、気管支内、腹内、関節包内、軟骨内、洞内、腔内、小脳内、脳室内、結腸内、頸管内、胃内、肝臓内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊髄内、滑液嚢内、胸郭内、子宮内、膀胱内、病巣内、ボーラス、膣内、直腸、口腔内、舌下、鼻腔内または経皮から選択された少なくとも１つの様式により、少なくとも１つの抗ＭＣＰ−１抗体を投与または接触させる工程に適している本発明の少なくとも１つ単離哺乳動物抗ＭＣＰ−１抗体を含んでなる医療デバイスである。
【００３３】
同様に提供されているのは、本発明の少なくとも１つの単離哺乳動物抗ＭＣＰ−１抗体を溶液、微粒子または凍結乾燥形態で含んでなる包装材料および容器を含んでなる、ヒトの製薬または診断用途向けの製造品である。
【００３４】
同様に提供されているのは、抗体を回収可能な量で発現する能力をもつ宿主細胞または
トランスジェニック動物またはトランスジェニック植物または植物細胞を提供する工程を含んでなる、本発明の少なくとも１つの単離哺乳動物抗ＭＣＰ−１抗体の生産方法である。さらに本発明において提供されているのは、上述の方法により生産された少なくとも１つの抗ＭＣＰ−１抗体である。
【００３５】
本発明はさらに、本明細書に記載のあらゆる発明を提供している。
【００３６】
【表１】
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【発明を実施するための最良の形態】
【００３７】
本発明は、少なくとも１つの精製、単離、組換え型および／または合成抗ＭＣＰ−１ヒト、霊長類、ゲッ歯類、哺乳動物、キメラ、ヒト化、改変(engineered)またはＣＤＲ移植抗体およびそれに対するＭＣＰ−１抗イディオタイプ抗体、ならびに少なくとも１つの抗ＭＣＰ−１抗体または抗イディオタイプ抗体をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含んでなる組成物およびコーディング核酸分子を提供している。本発明はさらに、診断用および治療用組成物、方法およびデバイスを含めた、かかる核酸および抗体および抗イディオタイプ抗体の製造および使用方法を内含するが、これらに限定されない。
【００３８】
引用：本明細書で引用されている全ての刊行物または特許は、本発明の時点における技術的現状を示すことから、かつ／または本発明の描写および使用可能性を提供する目的で、その全体が本明細書に参照により援用されている。刊行物というのは、あらゆる科学的または特許刊行物、または全ての記録、電子または印刷形式を含めた任意のメディア形式で利用可能なその他のあらゆる情報を意味する。以下の参考文献はその全体が本明細書に参照により援用されている：アウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら編、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．、ニューヨーク州ニューヨーク（１９８７〜２００４年）；サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨーク（１９８９年）；ハーロウおよびレーン（Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ）、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨーク（１９８９年）；コリガン（Ｃｏｌｌｉｇａｎ）ら編、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．、ニューヨーク（１９９４〜２００４年）；コリガンら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ニューヨーク州ニューヨーク（１９９７〜２００４年）。
【００３９】
略号
ａａ：アミノ酸；  ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン；  ＣＤＲ：相補的決定領域；  ＥＣＬ：電気化学発光；  ＨｕＣＡＬ（登録商標）：ヒトコンビナトリアル抗体ライブラリ；  ＨＳＡ：ヒト血清アルブミン；  ＭＣＰ−１：単球化学誘引性タンパク質−１；  Ｉｇ：免疫グロブリン；  ＩＰＴＧ：イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトシド；  ｍＡｂ：モノクローナル抗体；  ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４；  ＳＥＴ：溶解平衡滴定；  ＶＨ：免疫グロブリン重鎖可変領域；  ＶＬ：免疫グロブリン軽鎖可変領域。
【００４０】
定義
本明細書で使用されている「抗ＣＣＬ２抗体」、「抗ＭＣＰ−１抗体」、「抗ＭＣＰ−１抗体部分」、または「抗ＭＣＰ−１抗体フラグメント」および／または「抗ＭＣＰ−１抗体変異体」などという用語には、本発明の抗体の中に取込むことのできる、ＭＣＰ−１レセプターまたは結合タンパク質の少なくとも１部分または、重鎖または軽鎖の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）またはそのリガンド結合部分、重鎖または軽鎖可変領域、重鎖または軽鎖定常領域、フレームワーク領域またはその任意の一部分といった（ただしこれらに限定されるわけではない）免疫グロブリン分子の少なくとも一部分を含んでなるあらゆるタンパク質またはペプチド含有分子が含まれている。かかる抗体は場合によりさらに、特定のリガンドに影響を及ぼし、例えばかかる抗体は、インビトロ、インサイチュおよび／またはインビボで少なくとも１つのＭＣＰ−１活性または結合またはＭＣＰ−１レセプター活性または結合に、変調、低減、増大、拮抗、作動、軽減、緩和、遮断、
阻害、無効化および干渉（ただしこれらに限定されるわけではない）という影響を及ぼす。制限的意味のない例として、本発明の適切な抗ＭＣＰ−１抗体、その特定された部分または変異体は、少なくとも１つのＭＣＰ−１またはその特定された部分、変異体またはドメインを結合させることができる。
【００４１】
本明細書で使用されている「エピトープ」という用語は、抗体に対して特異的に結合する能力をもつタンパク質のセグメントまたは特長を意味する。エピトープは通常、アミノ酸または糖側鎖といったような分子の化学的に活性な表面集団で構成されており、通常、特異的な３次元構造特性ならびに比電荷特性を有する。立体構造エピトープと非立体構造エピトープは、変性溶媒の存在下で立体構造エピトープに対する結合が失なわれるが非立体構造エピトープについては失なわれないという点で区別される。ＭＣＰ−１分子の線形配列の異なる部分からのアミノ酸が３次元空間内で近接して集まる場合に発生するＭＣＰ−１分子の立体構造折畳みの結果としてもたらされるタンパク質エピトープが内含される。
【００４２】
「ＭＣＰ−１」というのは、ＮＣＢＩ記録登録番号ＮＰ＿００２９７３の中で言及されＭＣＰ（単球走化性タンパク質）、ＳＭＣ−ＣＦ（平滑筋細胞走化性因子）、ＬＤＣＦ（リンパ球由来走化性因子）、ＧＤＣＦ（神経膠腫由来単球走化性因子）、ＴＤＣＦ（腫瘍由来走化性因子）、ＨＣ１１（ヒトサイトカイン１１）、ＭＣＡＦ（単球走化性および活性化因子）としてさまざまな形で知られている７６個のアミノ酸配列を意味する。遺伝子記号は、ヒト染色体１７上のＪＥ遺伝子であるＳＣＹＡ２であり、新規名称はＣＣＬ２である（ズロトニック、ヨシエ、２０００年、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ第１２号：１２１〜１２７頁）。ＪＥは、ヒトＭＣＰ−１／ＣＣＬ２のマウス相同体である。
【００４３】
本明細書で使用されている「ヒト抗体」という用語は、タンパク質の実質的にすべての部分（例えばＣＤＲ、フレームワーク、ＣＬ、ＣＨドメイン（例えばＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）、ヒンジ、（ＶＬ、ＶＨ））がヒト生殖細胞系列免疫グロブリン遺伝子配列の組換え事象からまたは成熟ヒト抗体配列から誘導されている抗体を意味する。ヒト単離抗体に加えて、かかるヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン生殖細胞系列遺伝子を有し免疫応答を開始する能力をもつトランスジェニックマウスを免疫化することによって得ることができ（ロンバーグ（Ｌｏｎｂｅｒｇ）ら、Ｉｎｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ第１３巻（１）：６５〜９３頁（１９９５年）およびフィシュワルド（Ｆｉｓｈｗａｌｄ）ら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ第１４巻（７）：８４５〜８５１頁（１９９６年））、そうでなければ本明細書に記載されているようなヒト抗体レパートリライブラリから選択することができる。かかるヒト遺伝子配列の供給源は、ヒト抗体遺伝子（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｉｍｔ−ｄｏｃ）またはその翻訳産物のデータベースであるＶＢＡＳＥといったようなあらゆる適切なライブラリ内かまたはそのアミノ酸配列類似性に基づいた集団へと分類されたヒト抗体を示すｈｔｔｐ：／／ｐｅｏｐｌｅ．ｃｒｙｓｔ．ｂｂｋ．ａｃ．ｕｋ／〜ｕｂｃｇ０７ｓ／に見出すことができる。この定義の範囲に入るのは、１個もしくはそれ以上のヒト抗体配列からのフレームワーク領域および２つの異なるヒトまたは非ヒト供給源からのＣＤＲ領域を含む複合抗体またはヒト複合抗体の機能的フラグメントである。「ヒト抗体」の定義に入るのは、生殖細胞系列および再配置の両方のヒト抗体配列からのフレームワーク領域および２つの異なる供給源抗体からのＣＤＲ領域を含有する複合抗体またはヒト複合抗体の機能的フラグメントである。本開示に従ったヒト複合抗体またはその機能的フラグメントは、１個もしくはそれ以上のヒト抗体配列からのフレームワーク領域およびヒトまたは非ヒト抗体配列から誘導されたＣＤＲ領域を内含し、そうでなければ、完全に合成であってもよい。かくしてヒト抗体は、キメラまたはヒト化抗体とは全く異なっている。ヒト抗体が、機能的に再配置されたヒト免疫グロブリン（例えば重鎖および／または軽鎖）遺伝子を発現する能力をもつ非ヒト動物または原核または真核細胞により産生され得るということが指摘される。さらに、ヒト抗体が
１本鎖抗体である場合、これは未変性ヒト抗体(native human antibodies)の中に見出されないリンカーペプチドを含んでなる可能性がある。例えば、Ｆｖは、重鎖の可変領域および軽鎖の可変領域を接続する２〜約８個のグリシンまたはその他のアミノ酸残基といったようなリンカーペプチドを含んでなり得る。かかるリンカーペプチドはヒト由来のものとみなされる。
【００４４】
非ヒト（例えばマウス）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリンから誘導された実質的に置換された配列部分を有するキメラ抗体である。ヒト化抗体は、大部分、レシピエントのＣＤＲ（超可変領域としても知られている相補性決定領域）残基が所望の特異性、親和性および能力をもつマウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類といったような非ヒト種（ドナー抗体）からのＣＤＲ残基で置き換えられている、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。一部のケースでは、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基が、対応する非ヒト残基により置き換えられる。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体内に見出されない残基を含み得る。これらの修飾は、抗体性能をさらに高めるように行なわれる。一般に、ヒト化抗体は、超可変領域の全てまたは実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲの全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のものである、少なくとも１つそして標準的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含んでなることになる。ヒト化抗体は、場合により、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部分、標準的にはヒトＩｇＧ免疫グロブリンの少なくとも一部分を含んでなることになる。さらなる詳細については、ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）ら、Ｎａｔｕｒｅ第３２１巻：５２２〜５２５頁（１９８６年）；ライヒマン（Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ）ら、Ｎａｔｕｒｅ第３３２巻：３２３〜３２９頁（１９８８年）；およびプレスタ（Ｐｒｅｓｔａ）、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．第２巻：５９３〜５９６頁（１９９２年）を参照のこと。
【００４５】
本明細書で使用される抗体のＫｄというのは、予め定められた抗原についての抗体、解離定数ＫＤを意味し、特異的標的に対する抗体の親和性の尺度である。高親和性抗体は、予め定められた抗原について１０−８Ｍ以下、より好ましくは１０−９Ｍ以下、さらに一層好ましくは１０−１０Ｍ以下のＫＤを有する。本明細書で使用される「Ｋｄｉｓ」または「ＫＤ」または「Ｋｄ」という用語は、特定の抗体−抗原相互作用の解離速度を意味するように意図されている。「ＫＤ」は、「オフ速度（Ｋｏｆｆ）」とも呼ばれる解離速度（ｋ２）と会合速度（ｋ１）または「オン速度（ｋｏｎ）」の比である。かくしてＫＤはｋ２／ｋ１またはｋｏｆｆ／ｋｏｎに等しく、モル濃度（Ｍ）として表現される。そのため、ＫＤが小さくなればなるほど結合は強くなる。１０−６ＭのＫＤ（または１マイクロＭ）は、１０−９Ｍ（または１ｎＭ）に比べて弱い結合を表わす。
【００４６】
本明細書で使用される「〜に対する特異性」、および「特異的結合」および「特異的に結合する」という用語は、その他の抗原またはタンパク質に対してよりも大きな親和性をもつ予め定められた抗原に対する抗体結合を意味する。標準的には、抗体は１０−７Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）で結合し、予め定められた抗原以外の非特異的抗原（例えばＢＳＡ、カゼイン、またはその他のあらゆる特定されたポリペプチド）に対して結合するためのそのＫＤよりも少なくとも２分の１小さいＫＤで、予め定められた抗原に対し結合する。「１抗原を認識する抗体」および「１抗原に特異的な抗体」という語句は、ここでは「１抗原に対し特異的に結合する抗体」または「抗原特異的抗体」例えばＭＣＰ−１特異的抗体、という用語と互換的に用いられる。
【００４７】
１．発明の抗体の調製
単離および／またはＭＣＰ−１タンパク質またはその一部分（合成ペプチドといった合成分子を含む）といったようなヒトＭＣＰ−１タンパク質またはそのフラグメントに対し特異的なヒト抗体の調製は、当該技術分野において既知のあらゆる適切な技術を用いて実
施可能である。ヒト抗体は、当該技術分野において既知のさまざまな技術を用いて生産可能である。一実施形態においては、ヒト抗体は、１つのファージライブラリから選択され、ここでこのファージライブラリはヒト抗体を発現する（ヴォーガン（Ｖａｕｇｈａｎ）ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ第１４巻：３０９〜３１４頁（１９９６年）：シーツ（Ｓｈｅｅｔｓ）ら、ＰＩＴＡＳ（ＵＳＡ）第９５巻：６１５７〜６１６２頁（１９９８年））；フーゲンブームおよびウィンター（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ａｎｄ
Ｗｉｎｔｅｒ）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．第２２７巻：３８１頁（１９９１年）；マークス（Ｍａｒｋｓ）ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．第２２２巻：５８１頁（１９９１年））。
【００４８】
ヒト抗体は、内部で内因性免疫グロブリン遺伝子が部分的にまたは完全に不活性化される例えばマウスなどのトランスジェニック動物の中にヒト免疫グロブリン遺伝子座を導入することによって作ることもできる。例えば、機能的に再配置されたヒト免疫グロブリン重鎖トランス遺伝子および機能的再配置を受けることのできるヒト免疫グロブリン軽鎖遺伝子座からのＤＮＡを含んでなるトランス遺伝子を含んでなるトランスジェニックマウスを、ヒトＭＣＰ−１またはそのフラグメントで免疫化して、抗体の産生を惹起することができる。所望の場合、本明細書に記載されている通りおよび／または当該技術分野において既知の通りに、抗体産生細胞を単離し、ハイブリドーマまたはその他の不死化された抗体産生細胞を調製することができる。代替的には、抗体、特定された部分または変異体を、適切な宿主細胞内で、コーディング核酸またはその一部分を用いて発現することができる。
【００４９】
適切な抗原での攻撃誘発（challenge）時点で、ヒト抗体産生が観察され、これは、遺伝子再配置、組立ておよび抗体レパートリを含めた全ての面でヒトにおいて見られるものと酷似している。このアプローチは、例えば米国特許第５，５４５，８０７号明細書；同第５，５４５，８０６号明細書；同第５，５６９，８２５号明細書；同第５，６２５，１２６号明細書；同第５，６３３，４２５；同第５，６６１，０１６号号明細書中および、マークスら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ第１０巻：７７９〜７８３頁（１９９２年）；ロンバーグら、Ｎａｔｕｒｅ第３６８巻：８５６〜８５９頁（１９９４年）；モリソン（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ）、Ｎａｔｕｒｅ第３６８巻：８１２〜１３頁（１９９４年）；フィシュワイルド（Ｆｉｓｈｗｉｌｄ）ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ第１４巻：８４５〜５１頁（１９９６年）；ニューベルガー（Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ第１４巻：８２６頁（１９９６年）；ロンバーグおよびヒューザー（Ｈｕｅｚａｒ）、Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ；Ｉｍｍｕｎｏｌ、第１３巻：６５〜９３頁（１９９５年）といった科学的刊行物中に記載されている。代替的には、ヒト抗体は、標的抗原に対し向けられた抗体を産生するヒトＢリンパ球の不死化を介して調製可能である（このようなＢリンパ球は、個体から回収することもできるし、又インビトロで免疫化されていてもよい）。例えばコール（Ｃｏｌｅ）ら、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ
ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ」、アラン、Ｒ．リス（Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ）、７７頁（１９８５年）；ボエルナー（Ｂｏｅｒｎｅｒ）ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第１４７巻（１）：８６〜９５頁（１９９１年）；および米国特許第５，７５０，３７３号明細書を参照のこと。抗体産生細胞は、問題の抗原で免疫化されたヒトまたはその他の適切な動物の末梢血または好ましくは脾臓またはリンパ節から得ることもできる。本発明の抗体、特定されたそのフラグメントまたは変異体をコードする異種または内因性の核酸を発現させるために、その他の任意の適切な宿主細胞を使用することも可能である。選択的培養条件またはその他の適切な既知の方法を用いて融合細胞（ハイブリドーマ）または組換え型細胞を単離し、限界希釈法または細胞選別或いはその他の既知の方法によりクローニングすることができる。所望の特異性をもつ抗体を産生する細胞を、適切な検定（例えばＥＬＩＳＡ）により選択することができる。
【００５０】
１つのアプローチでは、適切な不死細胞系列（例えばＳｐ２／０、Ｓｐ２／０−ＡＧ１４、ＮＳＯ、ＮＳ１、ＮＳ２、ＡＥ−１、Ｌ．５、＞２４３、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３、Ｓｐ２ＳＡ３、Ｓｐ２ＭＡＩ、Ｓｐ２ＳＳ１、Ｓｐ２ＳＡ５、Ｕ９３７、ＭＬＡ１４４、ＡＣＴＩＶ、ＭＯＬＴ４、ＤＡ−１、ＪＵＲＫＡＴ、ＷＥＨＩ、Ｋ−５６２、ＣＯＳ、ＲＡＪＩ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＨＬ−６０、ＭＬＡ１４４、ＮＡＭＡＩＷＡ、ＮＥＵＲＯ２Ａなどといった（ただしこれらに限定されるわけではない）骨髄腫細胞系列またはヘテロ骨髄腫、その融合産物またはそれから誘導されたあらゆる細胞または融合細胞または当該技術分野において既知の通りのその他のあらゆる適切な細胞系列、例えばｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ．ｗｗｗ．ｌｉｆｅｔｅｃｈ．ｃｏｍ．参照など）を、単離またはクローニングされた脾臓、末梢血、リンパ液、へんとう腺またはその他の免疫またはＢ細胞含有細胞、または内因性または異種核酸としてかまたは組換え型または内因性、ウイルス、細菌、藻類、原核生物、両生類、昆虫、は虫類、魚類、哺乳動物、ゲッ歯類、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ヒツジ、霊長類、真核生物、ゲノミックＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｒＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡまたはＲＮＡ、葉緑体ＤＮＡまたはＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、１本鎖、２本鎖または３本鎖、ハイブリッド形成されたものなどまたはそれらの任意の組合せのいずれかとして重鎖または軽鎖定常または可変またはフレームワークまたはＣＤＲ配列を発現するその他のあらゆる細胞といったような（ただしこれらに限定されるわけではない）抗体産生細胞と融合させることによって、ハイブリドーマが産生される。例えば全体が本明細書に参照により援用されているアウスベル、上掲書、およびコリガン、「Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、上掲書、第２章を参照のこと。
【００５１】
ヒトＭＣＰ−１に結合し、定義された重鎖または軽鎖可変領域を含んでなるヒト抗体は、ファージ表示法（カツベ（Ｋａｔｓｕｂｅ）Ｙら、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．第１巻（５）：８６３〜８６８頁（１９９８年））といったような適切な方法を用いて調製可能である。ペプチドまたはタンパク質ライブラリ（例えばバクテリオファージ、リボソーム、オリゴヌクレオチド、ＲＮＡ、ｃＤＮＡなど、表示ライブラリ；例えば英国ケンブリッジシャーのケンブリッジ・アンチボディ・テクノロジーズ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）；デンマークＭａｒｔｉｎｓｒｅｉｄ／Ｐｌａｎｅｇｇのモルフォシス（ＭｏｒｐｈｏＳｙｓ）；英国スコットランド、アバディーンのバイオヴェーション（Ｂｉｏｖａｔｉｏｎ）；スウェーデンＬｕｎｄのバイオインベント（ＢｉｏＩｎｖｅｎｔ）；ダイアックス（Ｄｙａｘ  Ｃｏｒｐ．）、エンゾン（Ｅｎｚｏｎ）、アフィマックス／バイオサイト（Ａｆｆｙｍａｘ／Ｂｉｏｓｉｔｅ）；カリフォルニア州バークレーのゾーマ（Ｘｏｍａ）；イクシス（Ｉｘｓｙｓ）。から入手可能なもの、例えば、欧州特許第３６８，６８４号明細書、ＰＣＴ／ＧＢ第９１／０１１３４号明細書；ＰＣＴ／ＧＢ第９２／０１７５５号明細書；ＰＣＴ／ＧＢ第９２／００２２４０号明細書；ＰＣＴ／ＧＢ第９２／００８８３号明細書；ＰＣＴ／ＧＢ第９３／００６０５号明細書；米国特許第０８／３５０２６０号明細書（５／１２／９４）；ＰＣＴ／ＧＢ第９４／０１４２２号明細書；ＰＣＴ／ＧＢ第９４／０２６６２号明細書；ＰＣＴ／ＧＢ第９７／０１８３５号明細書；（ＣＡＴ／ＭＲＣ）；国際公開第９０／１４４４３号パンフレット；国際公開第９０／１４４２４号パンフレット；国際公開第９０／１４４３０号パンフレット；ＰＣＴ／ＵＳ９４／１２３４号明細書；国際公開第９２／１８６１９号パンフレット；国際公開第９６／０７７５４号パンフレット；（スクリップス（Ｓｃｒｉｐｐｓ））；国際公開第９６／１３５８３号パンフレット、国際公開第９７／０８３２０号パンフレット（モルフォシス）；国際公開第９５／１６０２７号パンフレット（バイオインベント）；国際公開第８８／０６６３０号パンフレット；国際公開第９０／３８０９号パンフレット（ダイアックス）；米国特許第４，７０４，６９２号明細書（エンゾン）；ＰＣＴ／ＵＳ第９１／０２９８９号明細書（アフィマックス）；国際公開第８９／０６２８３号パンフレット；欧州特許第３７１９９８号明細書；欧州特許第５５０４００号パンフレット（ゾーマ）；欧州特許第２２９０４６号明細書；ＰＣＴ／ＵＳ９１／０７１４９号明細書（イクシス）；または参照（ただしこれらに限定されるわけではない）；または確率
的に生成されたペプチドまたはタンパク質（米国特許第５７２３３２３、５７６３１９２、５８１４４７６、５８１７４８３、５８２４５１４、５９７６８６２号明細書、国際公開第８６／０５８０３号パンフレット、欧州特許第５９０６８９号明細書（イクシス、現在のアプライド・モレキュラー・エボリューション（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ（ＡＭＥ））（各々全体が本明細書に参照により援用されている））から組換え型抗体を選択する方法か、またはトランスジェニック動物（例えばＳＣＩＤマウス、各々全体が本明細書に参照により援用されているグエン（Ｎｇｕｙｅｎ）ら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第４１巻：９０１〜９０７頁（１９９７年）；サンドュー（Ｓａｎｄｈｕ）ら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．第１６巻：９５〜１１８頁（１９９６年）；エラン（Ｅｒｅｎ）ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．第９３巻：１５４〜１６１頁（１９９８年））の免疫化に依存している方法を含めた（ただしこれらに限定されるわけではない）、必要な特異性の抗体を産生または単離させるその他の適切な方法を使用することが可能である。
【００５２】
特定的な実施形態
出願人らは、ファージ表示法ヒトＦａｂライブラリから出発して、ヒトＭＣＰ−１に向かう所望の親和性、特異性および生物活性をもつヒト抗体を選択し作製する方法を例証した。要約すると、１０回のパニング全てから１７８５６のクローンがスクリーニングされ、１１０４の一次ヒットそして最終的に２６のユニークＦａｂを導いた。
【００５３】
天然発生のＭＣＰ−１レセプターに結合する抗原保持能力を例証したユニークリガンドを提供するために、ヒトＭＣＰ−１およびその類似体または「突然変異タンパク質（muteins）」を化学的に合成し、選択、親和性および生物学的検定における特異的使用のために修飾した。初期固相パニングならびに抗体選択および親和性成熟検定のその他の態様においてヒトＭＣＰ−１Ｉｌｅ４１およびヒトＭＣＰ−１Ｔｙｒ４３を使用し、ここでは、ＭＣＰ−１突然変異タンパク質のビオチニル化バージョンすなわちＩｌｅ４１、Ｌｙｓ（ビオチン−PＥＧ４）６９）および（Ｉｌｅ４１、Ｌｙｓ（ビオチン−ＰＥＧ４）７５（配列番号１）と同様に記述した。
【００５４】
２６個のユニークＦａｂのいずれも、特定された生物学的検定において所望のＩＣ５０値またはＫＤ＜０．５ｎＭとして測定された親和性を有していなかったことから、成熟が不可欠であった。親和性成熟候補をＦａｂとして選択し、それぞれのＩｇＧを成熟プロセスと並行して分析した。選択基準は、１）全細胞レセプター結合検定における活性、２）カルシウム可動化検定における活性、３）ヒトＭＣＰ−１に対する親和性、４）ヒトＭＣＰ−１に対する特異性、および５）カニクイザルＭＣＰ−１(cyno MCP-1)に対する親和性および未変性ＭＣＰ−１に対する結合、であった。
【００５５】
溶解状態のＭＣＰ−１でのＦａｂ捕捉モードでのバイアコア（ＢｉａＣｏｒｅ）親和性測定は、成熟候補の等級づけのためにうまく行なわれ、親和性は４９〜４０６ｎＭの範囲内にあった。最高の親Ｆａｂは、５０ｎＭの親和性を示し、これは、親和性成功基準に達するべく少なくとも１００倍親和性を最適化しなくてはならないということを表わしていた。さらに、カニクイザルおよび未変性ヒトＭＣＰ−１に対する結合は、Ｆａｂ捕捉モードで検出でき、これは、成熟のための付加的な前提条件であった。カニクイザルＭＣＰ−１に対する親和性は、ヒトＭＣＰ−１の場合と同じ範囲内にあった。例えばグリコシル化といった潜在的修飾に起因して、抗体が合成または組換え型ＭＣＰ−１を認識するばかりでなく、内因的に発現されヒトＰＡＮＣ−１細胞上清から精製された未変性ＭＣＰ−１をも認識するということが示されなくてはならなかった。
【００５６】
ＭＣＰ−１に対する特異性は、各々のケモカインを１００ｎＭずつ添加し、結合シグナルを検出して、バイアコア内で抗体捕捉モードで測定された。成熟のための候補Ｆａｂの
大部分は特異的であり、一方、一対は相同体ケモカインに対する幾分かの交叉反応性を示した。
【００５７】
Ｆａｂの非常に重要な特徴は中和活性であり、複数の異なる検定がこの活性を分析するべくセットアップされた。１２５ＩＭＣＰ−１ＴＨＰ−１細胞結合検定は最も感応性の高い検定であり、これは、最適化の後に特に重要であった。親Ｆａｂは、１０〜６５０ｎＭのＩＣ５０値を示した。放射性リガンド結合検定の他に、その他の２次的な生物学的検定が、ＭＣＰ−１の下流側シグナル伝達経路の異なるレベルで中和活性を立証するために計画された。
【００５８】
単球の誘引は、ＭＣＰ−１の主要な機能の１つであるが、最も高い確率で活性欠如、同時精製された因子または内毒素に起因して、親Ｆａｂは走化性検定内で働かず、従って、この検定で働くＦａｂを獲得しようとする代りにそれぞれのＩｇＧ１のみをテストすることで同意された。もう１つの下流側シグナル伝達事象は、細胞質内へのカルシウム放出である。実際、放射性リガンド結合検定内の中和活性を示した全てのＦａｂが、０．１〜３μＭのＩＣ５０範囲でＴＨＰ−１細胞内のＭＣＰ−１により誘発されたカルシウム可動化を阻害した。ＩｇＧ形式への転換後、親Ｆａｂの生物学的活性は完全に保持されるということを示さなくてはならなかった。予想通り、それぞれのＩｇＧは全て、放射性リガンド結合検定、カルシウム可動化検定、さらには走化性検定において活性を示し、最終的に全てのＩｇＧｓがＦａｂ形式で見られた活性を保持したこと、そしてさらにはＭＣＰ−１誘発型走化性を阻害したことを証明した。
【００５９】
親和性成熟については、放射性リガンド結合検定内の１０〜６５０ｎＭの範囲内のＩＣ５０値および１０〜４００ｎＭの範囲内のＫＤをもつ７つの異なるＦａｂがその特性に従って選択された。その後、これらを、ライブラリクローニングおよびその後の選択のため３つのグループに分けた。並行してＬ−ＣＤＲ３およびＨ−ＣＤＲ２最適化を実施した。高品質ライブラリが生成された。選択プロセスのために溶液パニングを使用し、抗原の削減、オフ速度選択および非常に長い洗浄工程により、選択のストリンジェンシーを増大させた。後続するスクリーニングプロセスについては、最適化された結合剤のハイスループット等級付けを可能にするバイオベリス（Ｂｉｏ  Ｖｅｒｉｓ）スクリーニングが使用された。スクリーニングは、改良型結合剤の同定のためにきわめて効率良く機能にした。さらに、Ｌ−ＣＤＲ３およびＨ−ＣＤＲ２で最適化されたＦａｂを同定することができ、ＭＯＲ０３４７１およびＭＯＲ０３５４８誘導体のための交叉クローニングが可能となった。特に、ＭＯＲ０３４７１誘導体の交叉クローニングが非常に成功し、２つの最適化された出発Ｆａｂに比べてさらに１００倍改善された親和性まで導いた。１７個の最適化されたＦａｂのうち、１６個は、詳細な特徴づけのために選択され、最終的に全ての成功基準を満たした４つの結合剤が親ＭＯＲ０３４７１から誘導され、うち２つがＬ−ＣＤＲ３のみの中で最適化され、２つが交叉クローニングに由来した。親和性成熟した候補分析および配列は、例３および４、表４〜６および配列番号２〜２８の中で詳述されている。
【００６０】
成熟の後、主として検出限界に達したために、最適化された結合剤の親和性をバイアコア内で分析することはできなかった。モルフォシス（ＭｏｒｐｈｏＳｙｓ）では、バイオベリス技術と組合わせた溶解平衡滴定（ＳＥＴ）である、非常に感受性の高いＫＤ決定方法が使用された。ＦａｂおよびＩｇＧのための適切な適合モデルを用いて、１価の解離定数を計算することができた。親和性測定に加えて、この方法は、交叉反応性研究のために用いられた。最終候補の親和性は、バイオベリス内で測定されセントコア（Ｃｅｎｔｏｃｏｒ）にてキネックス（Ｋｉｎｅｘ）Ａにより確認され、ヒトおよびカニクイザルＭＣＰ−１に対して１０〜３２０ｐＭの範囲内であった。バイオベリスを用いた特異性テストは、テストされた全ての１６ＦａｂおよびＩｇＧｓについてヒトＭＣＰ−２に対する交叉反応性を全く示さなかった。いくつかのＦａｂおよびＩｇＧは、同様にヒトエオタキシン（
Ｅｏｔａｘｉｎ）に対しても有意な交叉反応性を全く示さなかった。成功基準に従って、バイアコア抗体捕捉モードで１００ｎＭの相同体ヒトＭＣＰ−２、３、４および１００ｎＭのヒトエオタキシン１、２および３に対する結合無しとして特異性基準を定められた。バイオコアＦａｂ捕捉モードにおいて、全ての選択されたＦａｂは、ＭＣＰ−２およびエオタキシンとの異なった程度の交叉反応性を示した。ＩｇＧに比べたＦａｂの推定上のわずかに増大した不安定度およびケモカインの一般的な非特異的結合能力は、非特異的結合に寄与した可能性がある。選択されたＩｇＧのうちのいくつかは、相同体ケモカインに対する有意な結合シグナルを全く示さず、バイアコアＩｇＧ捕捉モードでの特異性成功基準を満たした。バイオベリスを用いた溶解平衡滴定実験においては、いくつかのＦａｂでさえ交叉反応性を全く示さなかった。バイアコア内で検出されたＭＣＰ−２に対するＦａｂ結合活性が中和活性に形を変えるか否かを分析するために、セントコアで放射線リガンド全細胞結合検定が開発された。この検定内でテストされたＦａｂは、Ｔｈｐ−１細胞上でのＣＣＲ２レセプターに対する１２５Ｉ標識されたＭＣＰ−２の結合の有意な阻害を全く示さなかった（ＩC５０≧２μＭ）。
【００６１】
必要とされるＭＣＰ−１の量が１ｎｇ／ｍｌと低いことから、放射性リガンド結合検定は、Ｆａｂについては約１００ｐＭさらにＩｇＧについては２０ｐＭという検定ＩＣ５０限界で、このプロジェクトにおいて最も感応性の高い検定であった。親和性以外に、この検定における活性は、詳細な特徴づけのための最適化された結合剤の等級付けおよび選択のために用いられた。最適化の間の活性の全体的改善は、最高１０００倍の倍率であったが、最終的に、１つのＭＯＲ０３４７１誘導Ｆａｂ、ＭＯＲ０３８７８が１１０ｐＭで最高の親和性を示した。テストされた全てのＩｇＧは放射性リガンド結合検定において活性を保持した。４つの最終的ＩｇＧ候補、ＭＯＲ０３７８１、ＭＯＲ０３７９０、ＭＯＲ０３８５０およびＭＯＲ０３８７８のＩＣ５０値は、２０〜５０ｐＭの範囲内にあり、Ｆａｂのそれぞれの活性に比べてわずかに優れてさえいた。改善された活性の１つの理由は、２価のＩｇＧが分子１個あたり２つのＭＣＰ−１を中和する（倍率２倍）ということにある。ＩｇＧは純粋なスケールアップされた生産に由来し、従って、もう１つの理由は抗体の純度、安定性または活性にあったのかもしれない。二次的生物学検定として、ＭＣＰ−１誘発型ＣＣＲ２レセプターの内在化の阻害を測定するＦＡＣＳベースの検定の開発が成功した。最後に、検定は、ＩＣ５０の決定および等級付けさえ可能にした。最終的な４つの候補Ｆａｂ、ＭＯＲ０３７９０、ＭＯＲ０３８５０、ＭＯＲ０３７８１およびＭＯＲ０３８７８は、３〜５ｎＭの範囲内でＩＣ５０値を示した。
【００６２】
合成または組換え型ＭＣＰ−１に対して単離されたＭＣＰ−１抗体の活性を確認するためには未変性ＭＣＰ−１が必要であった。未変性ＭＣＰ−１がＰＡＮＣ１上清から精製され、カルシウム放出の誘発のために使用された。最適化されたＦａｂは、基準抗体Ｃ７７５に比べて高い活性で、未変性ＭＣＰ−１誘発型カルシウム可動化の阻害を示した。ＭＯＲ０３５４８由来の予め選択されたＦａｂは全て、競合ＥＬＩＳＡにおいてＭＣＰ１に対するＣ７７５の結合を完全に阻害した。ＭＯＲ０３４７１由来の予め選択されたＦａｂは全て、ＥＬＩＳＡ内で部分的（約６０％）の競合を示し、エピトープが少なくとも重複していることを表わしていた。最終的に、４つの抗体ＭＯＲ０３７８１、ＭＯＲ０３７９０、ＭＯＲ０３８５０およびＭＯＲ０３８７８は、特異性基準および未変性ＭＣＰ−１の中和を含めた全ての成功基準を満たした。
【００６３】
抗体を生産するその他の適切な方法
当該技術分野で既知でありかつ／または本明細書に記載されている通り、本発明の抗体を産生するためのその他の方法が、ヒト抗体のレパートリを生産する能力を有している。かかる技術としては、リボソーム表示法（ヘインズ（Ｈａｎｅｓ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第９４巻：４９３７〜４９４２頁（１９９７年５月）；ヘインズら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第９５巻：１４１３０〜
１４１３５頁（１９９８年１１月））号；単一細胞抗体生成技術（例えば、選択リンパ球抗体方法（“ＳＬＡＭ”）（米国特許第５，６２７，０５２号明細書、ウェン（Ｗｅｎ）ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第１７巻：８８７〜８９２頁（１９８７）；バブコック（Ｂａｂｃｏｏｋ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第９３巻：７８４３〜７８４８頁（１９９６年））；ゲル微液滴とフローサイトメトリ（ポーウェル（Ｐｏｗｅｌｌ）ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．第８巻：３３３〜３３７頁（１９９０年）；マサチューセッツ州Ｃａｍｂｒｉｄｇｅのワンセルシステムズ（Ｏｎｅ  Ｃｅｌｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ））；グレイ（Ｇｒａｙ）ら、Ｊ．Ｉｍｍ．Ｍｅｔｈ．第１８２巻：１５５〜１６３頁（１９９５年）；ケニー（Ｋｅｎｎｙ）ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．第１３巻：７８７〜７９０頁（１９９５年））；「Ｂ−ｃｅｌｌ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ」スティーンベッカーズ（Ｓｔｅｅｎｂａｋｋｅｒｓ）ら、Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｏｒｔｓ第１９巻：１２５〜１３４頁（１９９４年）；ヨナク（Ｊｏｎａｋ）ら、Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、第５巻、Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」、ボアベック（Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ）、編、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｂ．Ｖ．、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、オランダ（１９８８年））が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【００６４】
非ヒトまたはヒト抗体を工学処理するかまたはヒト化するための方法も同様に使用でき、当該技術分野において周知である。一般に、ヒト化されたまたは工学処理された抗体は、例えばマウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類またはその他の哺乳動物といった（ただしこれらに限定されるわけではない）ヒト以外の供給源からの１個もしくはそれ以上のアミノ酸残基を有する。これらのヒトアミノ酸残基は、標準的に既知のヒト配列の「インポート」可変、定常またはその他のドメインから取られる「インポート」残基と呼ばれることが多い。既知のヒトＩｇ配列は当該技術分野において周知であり、任意の既知の配列であり得る。工学処理されたヒト化抗体の結合、立体配座および免疫原性減少を最適化するためのさまざまな戦略が、例えばプレスタ（Ｐｒｅｓｔａ）ら．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．第１５１号：２６２３〜２６３２頁、１９９３年；国際公開第２００３／０２０１９号パンフレットおよび国際公開第２００５／０８０４３２号パンフレット中などで記述されてきた。
【００６５】
かかるインポートされた配列は、免疫原性を減少させるかまたは当該技術分野において既知の通り、結合、親和性、オン速度、オフ速度、結合力（avidity）、特異性、半減期またはその他の適切な任意の特性を削減、増強または修飾するために使用することができる。一般に、可変および定常領域の非ヒト配列がヒトまたはその他のアミノ酸と置き換えられている一方で、非ヒトまたはヒトＣＤＲ配列の一部分または全てが維持される。抗体は同様に場合により、抗原に対する高い親和性およびその他の有利な生物学的特性を保持してヒト化することもできる。この目的を達成するため、場合によりヒト化抗体を、親およびヒト化配列の３次元モデルを使用した親配列およびさまざまな概念ヒト化産物の分析プロセスによって調製することが可能である。３次元免疫グロブリンモデルが一般に利用可能であり、当業者にとってなじみ深いものである。選択された候補免疫グロブリン配列の確率の高い３次元立体配座構造を例示し表示するコンピュータプログラムが利用可能である。これらの表示を検討することで、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の考えられる役割の分析、すなわち候補免疫グロブリンがその抗原に結合する能力に影響を及ぼす残基の分析が可能となる。このようにして、標的抗原に対する親和性の増大といったような所望の抗体特性が達成されるような形で、コンセンサスおよびインポート配列から、ＦＲ残基を選択し組合せることができる。一般に、ＣＤＲ残基は抗原結合に影響を及ぼすことに直接的にかつ最も実質的に関与している。本発明の抗体のヒト化または工学処理は、各々全体が本明細書に参照により援用されている、ウィンター（Ｗｉｎｔｅｒ）（ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）ら、Ｎａｔｕｒｅ第３２１巻：５２２頁（１９８６年）；ライヒマン（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ）ら、Ｎａｔｕｒｅ第３３２巻：３２３頁（１９８８年）；ヴ
ァホーヤン（Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２３９巻：１５３４頁（１９８８年））、シムス（Ｓｉｍｓ）ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第１５１巻：２２９６頁（１９９３年）；ショティア（Ｃｈｏｔｈｉａ）およびレスク（Ｌｅｓｋ）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．第１９６巻：９０１頁（１９８７年）、カーター（Ｃａｒｔｅｒ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．第８９巻：４２８５頁（１９９２年）；プレスタら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第１５１巻：２６２３頁（１９９３）、米国特許第５７２３３２３号明細書、同第５９７６８６２号明細書、同第５８２４５１４号明細書、同第５８１７４８３号明細書、同第５８１４４７６号明細書、同第５７６３１９２号明細書、同第５７２３３２３号明細書、同第５，７６６８８６号明細書、同第５７１４３５２号明細書、同第６２０４０２３号明細書、同第６１８０３７０号明細書、同第５６９３７６２号明細書、同第５５３０１０１号明細書、同第５５８５０８９号明細書、同第５２２５５３９号明細書、同第４８１６５６７号明細書、国際出願ＰＣＴ／：ＵＳ第９８／１６２８０号明細書、同ＵＳ第９６／１８９７８号明細書、同ＵＳ第９１／０９６３０号明細書、同ＵＳ第９１／０５９３９号明細書、同ＵＳ第９４／０１２３４号明細書、英国特許第８９／０１３３４号明細書、同第９１／０１１３４号明細書、同第９２／０１７５５号明細書；国際公開第９０／１４４４３号パンフレット、同第９０／１４４２４号パンフレット、同第９０／１４４３０号パンフレット、欧州特許第２２９２４６号明細書（その中に引用されている参考文献を含む）中で記述されたものといったような（ただしこれらに限定されるわけではない）任意の既知の方法を用いて実施可能である。
【００６６】
ヒト抗原に結合するヒト抗体のレパートリを産生できるトランスジェニックマウスは、既知の方法で生産可能である（例えば、各々その全体が本明細書に参照により援用されているロンバーグらに交付された米国特許第５，７７０，４２８号明細書、同第５，５６９，８２５号明細書、同第５，５４５，８０６号明細書、同第５，６２５，１２６号明細書、同第５，６２５，８２５号明細書、同第５，６３３，４２５号明細書、同第５，６６１，０１６号明細書および同第５，７８９，６５０号明細書；ヤコボビッツ（Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ）ら、国際公開第９８／５０４３３号パンフレット、ヤコボビッツら、国際公開第９８／２４８９３号パンフレット、ロンバーグら、国際公開第９８／２４８８４号パンフレット、ロンバーグら、国際公開第９７／１３８５２号パンフレット、ロンバーグら、国際公開第９４／２５５８５号パンフレット、クシェルラペイト（Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｅ）ら、国際公開第９６／３４０９６号パンフレット、クシェルラペイトら、欧州特許第０４６３，１５１Ｂ１号パンフレット、クシェルラペイトら、欧州特許出願公開第０７１０，７１９Ａ１号明細書、スラニ（Ｓｕｒａｎｉ）ら、米国特許第５，５４５，８０７号明細書、ブラッグマン（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ）ら、国際公開第９０／０４０３６号パンフレット、ブラッグマンら、欧州特許第０４３８，４７４Ｂ１号パンフレット、ロンバーグら、欧州特許出願公開第０８１４，２５９Ａ２号明細書、ロンバーグら、英国特許第２，２７２，４４０Ａ号明細書、ロンバーグら、Ｎａｔｕｒｅ、第３６８巻：８５６〜８５９頁（１９９４年）、Ｔａｙｌｏｒ（テイラー）ら、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第６巻（４）５７９〜５９１頁（１９９４年）、グリーン（Ｇｒｅｅｎ）ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ第７巻：１３〜２１頁（１９９４年）、メンデス（Ｍｅｎｄｅｚ）ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ第１５巻：１４６〜１５６頁（１９９７年）、テイラーら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第２０巻（２３）：６２８７〜６２９５頁（１９９２年）、ツアイヨン（Ｔｕａｉｌｌｏｎ）ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、第９０巻（８）：３７２０〜３７２４頁（１９９３年）、ロンバーグら、Ｉｎｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ第１３巻（１）：６５〜９３頁（１９９５年）およびフィッシュワルドら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ第１４巻（７）：８４５〜８５１頁（１９９６年）など（ただしこれらに限定されるわけではない））。一般に、これらのマウスは、機能的に再配置されているかまたは機能的再配置を受けることのできる少なくとも１つのヒト免疫グロブリン遺伝子座からのＤＮＡを含んでなる少なくとも１つのトランス遺伝子を含んでなる。かかるマウスの体内の内因性免疫グロブリン遺伝子座を分
断または欠失させて、内因性遺伝子によりコードされた抗体を産生する該動物の能力を無くすることができる。
【００６７】
類似のタンパク質またはフラグメントに対する特異的結合について抗体をスクリーニングすることは、ペプチド表示ライブラリを用いて都合よく達成可能である。この方法には、所望の機能または構造をもつ個々の成員について大きなペプチド収集物をスクリーニングすることも関与している。ペプチド表示ライブラリの抗体スクリーニングは、当該技術分野において周知である。表示されたペプチド配列の長さは３〜５０００またはそれ以上のアミノ酸、頻繁に５〜１００アミノ酸そして往々にして約８〜２５のアミノ酸であり得る。ペプチドライブラリを生成するための直接的化学合成方法に加えて、複数の組換え型ＤＮＡ方法も記述されてきた。１つのタイプには、バクテリオファージまたは細胞の表面上のペプチド配列の表示が関与している。各バクテリオファージまたは細胞は、特定の表示されたペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を含有する。かかる方法はＰＣＴ特許公開第９１／１７２７１号明細書、同第９１／１８９８０号明細書、同第９１／１９８１８号明細書および同第９３／０８２７８号明細書の中で記載されている。ペプチドのライブラリを生成するためのその他のシステムは、インビトロ化学合成および組換え型方法の両方の特徴を有している。ＰＣＴ特許公開第９２／０５２５８号明細書、同第９２／１４８４３号明細書および同第９６／１９２５６号明細書を参照のこと。米国特許第５，６５８，７５４号明細書および同第５，６４３，７６８号明細書も参照のこと。ペプチド表示ライブラリ、ベクターおよびスクリーニングキットはインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）およびケンブリッジ・アンチボディーズ・テクノロジーズ（英国Ｃａｍｂｒｉｄｇｅｓｈｉｒｅ）といった供給業者から市販されている。例えばエンゾンに譲渡された米国特許第４７０４６９２号明細書、同第４９３９６６６号明細書、同第４９４６７７８号明細書、同第５２６０２０３号明細書、同第５４５５０３０号明細書、同第５５１８８８９号明細書、同第５５３４６２１号明細書、同第５６５６７３０号明細書、同第５７６３７３３号明細書、同第５７６７２６０号明細書、同第５８５６４５６号明細書；ダイアックスに譲渡された同第５２２３４０９号明細書、同第５４０３４８４号明細書、同第５５７１６９８号明細書、同第５８３７５００号明細書；アフィマックスに譲渡された米国特許第５４２７９０８号明細書および同第５５８０７１７号明細書；ケンブリッジ・アンチボディーズ・テクノロジーズに譲渡された米国特許第５８８５７９３号明細書；ジェンテックに譲渡された米国特許第５７５０３７３号明細書；ゾーマに譲渡された米国特許第５６１８９２０号明細書、同第５５９５８９８号明細書、同第５５７６１９５号明細書、同第５６９８４３５号明細書、同第５６９３４９３号明細書、同第５６９８４１７号明細書；コリガン、上掲書；アウスベル、上掲書またはサンブルック、上掲書を参照のこと。なお上述の特許および刊行物の各々は、その全体が本明細書に参照により援用されている。
【００６８】
２．発明の核酸
配列番号２〜５および２７〜２８のうちの少なくとも１つの連続するアミノ酸の少なくとも７０〜１００％をコードするヌクレオチド配列、その特定されたフラグメント、変異体またはコンセンサス配列といったような本明細書に提供されている情報を用いて、少なくとも１つの抗−ＭＣＰ−１抗体をコードする本発明の核酸分子を、本明細書に記載されている方法または当該技術分野で既知の通りの方法を使用して得ることができる。本発明の単離核酸分子には例えば、少なくとも１つの重鎖（例えば配列番号６〜１２、２２および２３）または軽鎖（例えば配列番号１３〜２１および２４〜２６）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３といった少なくとも１つのＣＤＲの少なくとも１つの特定された部分といった（ただしこれに制限されるわけではない）１個もしくはそれ以上のイントロンを場合により伴う読取り枠（ＯＲＦ）を含んでなる核酸分子；抗ＭＣＰ−１抗体または可変領域のためのコーディング配列（例えば配列番号２〜５、２７および２８）を含んでなる核酸分子；および、上記のものと実質的に異なる核酸配列を含んでなるものの、遺
伝コードの縮重に起因して、本明細書に記載されている通りのおよび／または当該技術分野において既知のとおりの少なくとも１つの抗ＭＣＰ−１抗体をなおもコードする核酸分子が含まれる。当然のことながら、遺伝コードは当該技術分野において周知である。かくして、本発明の特異的抗ＭＣＰ−１抗体についてコードするこのような縮退核酸変異体を生成することは、当業者にとっては日常的な作業であると思われる。例えば、アウスベルら、前掲書を参照のこと。又かかる核酸変異体は本発明内に含まれている。
【００６９】
本明細書に記されているように、抗ＭＣＰ−１抗体をコードする核酸を含んでなる本発明の核酸分子には、単独で抗体フラグメントのアミノ酸配列をコードするもの；全抗体またはその一部分についてのコーディング配列；１つの抗体、フラグメントまたは一部分についてのコーディング配列ならびに付加的配列、例えばスプライシングおよびポリアデニル化シグナルを含めた、転写、ｍＲＮＡプロセッシングにおいて１つの役割を果たす転写された未翻訳配列（例えばリボソーム結合およびｍＲＮＡの安定性）といった非コーディング５’および３’配列を含む（ただしこれらに限定されるわけではない）付加的な非コーディング配列と共に、少なくとも１つのイントロンといったような前述の付加的なコーディング配列を伴うまたは伴わない、少なくとも１つのシグナルリーダーまたは融合ペプチドのコーディング配列；付加的な官能基を提供するもののような付加的なアミノ酸についてコードする付加的なコーディング配列、が含まれうるがこれらに限定されるわけではない。かくして、抗体をコードする配列は、抗体フラグメントまたは部分を含んでなる融合された抗体の精製を容易にするペプチドをコードする配列といったようなマーカー配列に対して融合され得る。
【００７０】
本明細書に記載されている通りのポリヌクレオチドに対して選択的にハイブリッド形成するポリヌクレオチド：本発明は、選択的ハイブリダイゼーション条件下で本明細書に開示されているポリヌクレオチドにハイブリッド形成する単離核酸を提供する。かくして、本実施形態のポリヌクレオチドは、かかるポリヌクレオチドを含んでなる核酸を単離、検出および／または定量化するために使用可能である。例えば、本発明のポリヌクレオチドは、寄託されたライブラリ内の部分的または全長クローンを同定、単離または増幅するために使用することができる。一部の実施形態においては、ポリヌクレオチドはゲノミックまたはｃＤＮＡ配列単離されているが、またはその他の形でヒトまたは哺乳動物核酸ライブラリ由来のｃＤＮＡに対して相補的である。
【００７１】
好ましくは、ｃＤＮＡライブラリは少なくとも８０％の全長配列、好ましくは少なくとも８５％または９０％の全長配列そしてより好ましくは少なくとも９５％の全長配列を含む。ｃＤＮＡライブラリは、稀な配列の発現量を増大させるべく正規化され得る。低または中ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件が標準的に（但し排他的にではなく）、相補的配列に比べて低い配列同一性をもつ配列について利用される。中および高ストリンジェンシー条件は、より高い同一性をもつ配列のために場合により利用可能である。低ストリンジェンシー条件は、約７０％の配列同一性をもつ配列の選択的ハイブリダイゼーションを可能にし、オーソロガスまたはパラロガス配列を同定するために利用可能である。
【００７２】
場合により、本発明のポリヌクレオチドは本明細書に記載されているポリヌクレオチドによってコードされた抗体の少なくとも一つの部分をコードすることになる。本発明のポリヌクレオチドは、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドに対する選択的ハイブリダイゼーションのために利用可能な核酸配列を包含する。例えば、各々その全体が本明細書に参照により援用されている、アウスベル、上掲書；コリガン、上掲書を参照のこと。
【００７３】
核酸の構築：本発明の単離核酸は、当該技術分野において周知の通り、（ａ）組換え型方法、（ｂ）合成技術、（ｃ）精製技術またはその組合せを用いて作ることができる。
【００７４】
核酸を構築するための組換え型方法：ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノミックＤＮＡまたはそのあらゆる組合せといったような本発明の単離核酸組成物は、当業者にとっては既知の任意の数のクローニング方法を用いて生物学的供給源から得ることができる。一部の実施形態においては、本発明のポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下で選択的にハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドプローブが、ｃＤＮＡまたはゲノミックＤＮＡライブラリ内の所望の配列を同定するために使用される。ＲＮＡの単離およびｃＤＮＡおよびゲノミックライブラリの構築は、当業者にとって周知の作業である（例えば、アウスベル、上掲書；またはサンブルック、上掲書を参照のこと）。
【００７５】
核酸スクリーニングおよび単離方法：本明細書で開示されているもののような本発明のポリヌクレオチドの配列に基づいたプローブを用いて、ｃＤＮＡまたはゲノミックライブラリをスクリーニングすることができる。同じまたは異なる生体内の相同な遺伝子を単離するべくゲノミックＤＮＡまたはｃＤＮＡ配列をハイブリッド形成するためにプローブを使用することができる。当業者であれば、検定中でさまざまな度合のハイブリダイゼーションストリンジェンシーを用いることができ、ハイブリダイゼーションまたは洗浄のいずれかの培地がストリンジェントであり得るということを認識するだろう。ハイブリダイゼーションのための条件がよりストリンジェントになるにつれて、２重鎖形成が起こるのにプローブと標的の間に必要な相補性度は高くなる。ストリンジェンシー度は、温度、イオン強度、ｐＨおよびホルムアミドといったような部分的に変性する溶媒の存在のうちの１個もしくはそれ以上のものによって制御され得る。例えば、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、例えば０％〜５０％の範囲内のホルムアミド濃度の操作などを通して反応物溶液の極性を変更することにより都合良く変動させられる。検出可能な結合のために必要とされる相補性（配列同一性）度は、ハイブリダイゼーション培地および／または洗浄培地のストリンジェンシーに従って変動することになる。相補性度は、最適には１００％または７０〜１００％またはその中の任意の範囲または値である。しかしながら、プローブおよびプライマ内のわずかな配列変動は、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄培地のストリンジェンシーを低減させることで相殺できるということを理解すべきである。
【００７６】
ＲＮＡまたはＤＮＡの増幅方法は、当該技術分野において周知であり、本明細書中で紹介する教示および指針に基づいて過度の実験無く本発明に従って使用可能である。ＤＮＡおよびＲＮＡ増幅の既知の方法には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）および関連する増幅プロセスが含まれるが、これらに限定されるわけではない（マリス（Ｍｕｌｌｉｓ）ら、米国特許第４，６８３，２０２号明細書（１９８７年）；およびイニス（Ｉｎｎｉｓ）ら、「ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ｅｄｓ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．、カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ（１９９０年））。
【００７７】
核酸を構築するための合成方法：本発明の単離核酸は、同様に、既知の方法による直接化学合成によっても調製可能である（例えば、アウスベルら、上掲書を参照のこと）。化学合成は一般に、相補的配列でのハイブリダイゼーションまたは鋳型として１本鎖を用いたＤＮＡポリメラーゼでの重合によって２本鎖ＤＮＡへと転換可能である１本鎖オリゴヌクレオチドを生成する。当業者であれば、ＤＮＡの化学合成は約１００以上の塩基の配列に制限され得るものの、より短かい配列のライゲーションによりさらに長い配列を得ることができる、ということを認識するだろう。コーディング配列の化学的合成のための特に好ましい方法が米国特許第６５２１４２７号明細書および同第６６７０１２７号明細書の中で教示されている。
【００７８】
３．ベクターと発現系
本発明は、抗ＭＣＰ−１抗体をコードする核酸を含有するかまたは、さまざまな抗体ＨＣまたはＬＣ遺伝子またはその一部分を含有するプラスミドを得るために使用することのできるベクター、好ましくは発現ベクターを提供する。本明細書で使用されている「ベクター」という用語は、連結されたもう１つの核酸を輸送する能力をもつ核酸分子を意味する。１つのベクタータイプは「プラスミド」であり、これは、付加的なＤＮＡセグメントを中にライゲートできる円形の２本鎖ＤＮＡループを意味する。もう１つのタイプのベクターは、ウイルスゲノム内に付加的ＤＮＡセグメントをライゲートできるウイルスベクターである。本発明は同様に、本発明の単離核酸分子を内含するベクター、組換え型ベクターで遺伝的に工学処理されている宿主細胞、および当該技術分野において周知であるような組換え技術による少なくとも１つの抗ＭＣＰ−１抗体の生産にも関する。例えば各々その全体が本明細書に参照により援用されているサンブルックら、上掲書；アウスベルら、上掲書、を参照のこと。
【００７９】
抗体またはその抗体フラグメントの発現のためには、部分的または全長軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡを、遺伝子が転写および翻訳制御配列に対し作動的に連結されるような形で発現カセットまたはベクター内に挿入することができる。抗体をコードするカセットを、１つの構成体として組立てることができる。当該技術分野において既知の方法を用いて、構成体を調製することができる。より大きなプラスミドの一部として、構成体を調製することができる。このような調製は、適正な構成の選択およびクローニングを効率良く可能にする。構成体は、それらを残りのプラスミド配列から容易に単離できるような形でプラスミドまたはその他のベクター上の都合の良い制限部位の間に位置設定され得る。
【００８０】
一般に、プラスミドベクターは、リン酸カルシウム沈殿物といったような沈殿物内、またはＤＥＡＥ−デキストランの荷電膜質との錯体の中に導入される。ベクターがウイルスである場合、それは適切なパッケージング細胞系列を用いてインビトロでパッケージングされ、その後宿主細胞内に形質導入され得る。宿主細胞内へのベクター構成体の導入は同様に、電気穿孔またはその他の既知の方法により行なうこともできる。かかる方法については、サンブルック、上掲書、第１〜４および１６〜１８章；アウスベル、上掲書、第１、９、１３、１５、１６章といったように当該技術分野において記載されている。
【００８１】
これに関連して、「作動的に連結された」という用語は、ベクター内部の転写および翻訳制御配列が抗体遺伝子の転写および翻訳を調節するその意図された機能に役立つような形で、抗体遺伝子が１つのベクター内にライゲートされることを意味するものと意図されている。発現ベクターおよび発現制御配列は、使用される発現宿主細胞と相容性があるように選択される。抗体軽鎖遺伝子および抗体重鎖遺伝子は別々のベクター内に挿入され得、そうでなければ、より標準的に、両方の遺伝子が同じ発現ベクター内に挿入される。抗体遺伝子は、標準方法により発現ベクター内に挿入される（例えば、抗体遺伝子フラグメントおよびベクター上の相補的制限部位のライゲーション、または制限部位が全く存在しない場合には平滑末端ライゲーション）。
【００８２】
本明細書に記載されている抗体の軽鎖および重鎖可変領域は、ＶＨセグメントがベクター内部でＣＨセグメントに対し作動的に連結され、ＶＩセグメントがベクター内でCLセグメントに対し作動的に連結されるような形で所望のイソタイプの重鎖定常および軽鎖定常領域をすでにコードしている発現ベクター内に挿入することによって任意の抗体イソタイプの全長抗体遺伝子を作り上げるために使用可能である。付加的にまたは代替的に、組換え型発現ベクターは、宿主細胞からの抗体鎖の分泌を促進するシグナルペプチドをコードすることができる。抗体鎖遺伝子は、シグナルペプチドが枠内で抗体鎖遺伝子のアミノ末端に連結されるような形でベクター内にクローニングされ得る。シグナルペプチドは免疫グロブリンシグナルペプチドまたは非相同シグナルペプチド（すなわち非免疫グロブリンタンパク質由来のシグナルペプチド）であり得る。
【００８３】
原核生物または真核生物宿主細胞のいずれかの中で発明の抗体を発現させることは理論的には可能であるが、真核細胞特に哺乳動物細胞は原核細胞よりも、適切に折畳まれ免疫学的に活性な抗体を組立て分泌する確率が高いことから、真核細胞内そして最も好ましくは哺乳動物宿主細胞内の抗体の発現が最も好ましい。
【００８４】
一般に、哺乳動物発現ベクターは、（１）通常ウイルスプロモータまたはエンハンサ配列の形をしており広い宿主および組織範囲により特徴づけされる調節要素；（２）プラスミドベクター内部への抗体コーディング配列を含んでなるＤＮＡフラグメントの挿入を促進する「ポリリンカー」配列および（３）ｍＲＮＡ転写産物のポリアデニル化およびイントロンスプライシングを相当する配列を含有することになる。プロモーターポリリンカー・ポリアデニル化部位のこの隣接する領域は、一般に転写単位と呼ばれる。ベクターは同様に、（４）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内の初期陽性形質転換体の選択を可能にする、抗生物質（例えばアンピシリン）に対する耐性を付与することの多い選択可能なマーカー遺伝子（例えばベータ・ラクタマーゼ遺伝子）；および（５）細菌および哺乳動物の両方の宿主中のベクターの複製を促進する配列をも含有する確率が高くなる。プラスミド複製起点が、大腸菌内での発現構成体の伝播のために内含され、Ｃｏｓ細胞内の過渡的発現のためには、ＳＶ４０複製起点が発現プラスミド中に内含される。
【００８５】
プロモータは、ＳＶ４０プロモータ（例えば晩期または早期ＳＶ４０プロモータ、ＣＭＶプロモータ（米国特許第５，１６８，０６２号明細書；同第５，３８５，８３９号明細書）、ＨＳＶｔｋプロモータ、ｐｇｋ（ホスホグリセラートキナーゼ）プロモータ、ＥＦ−１アルファプロモータ（米国特許第５，２６６，４９１号明細書）、少なくとも１つのヒト免疫グロブリンプロモータから選択され得る。
【００８６】
発現ベクターは好ましくは、ただし場合により、少なくとも１つの選択可能なマーカーを内含する。かかるマーカーには、例えばメトトレキサート（ＭＴＸ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ、米国特許第４，３９９，２１６号明細書；同第４，６３４，６６５号明細書；同第４，６５６，１３４号明細書；同第４，９５６，２８８号明細書；同第５，１４９，６３６号明細書；同第５，１７９，０１７号明細書、アンピシリン、ネオマイシン（Ｇ４１８）、ミコフェノール酸、または真核細胞培養のためのグルタミンシンセターゼ（ＧＳ、米国特許第５，１２２，４６４号明細書；同第５，７７０，３５９号明細書；同第５，８２７，７３９号明細書）耐性および大腸菌またはその他の細菌または原生生物中での培養のためのテトラサイクリンまたはアンピシリン耐性遺伝子（上述の特許はその全体が本明細書に参照として援用されている）が含まれるが、これらに限定されるわけではない。上述の宿主細胞についての適切な培地および条件は、当該技術分野において既知である。適切なベクターは、当業者にとって直ちに明白である。
【００８７】
真核宿主細胞が利用される場合、ベクター内にポリアデニル化または転写ターミネータ配列が標準的に取込まれる。ターミネータ配列の一例は、ウシ成長ホルモン遺伝子からのポリアデニル化配列である。写しの正確なスプライシングのための配列も同様に内含させることができる。スプライシング配列の一例としては、ＳＶ４０由来のＶＰ１イントロンがある（（スプラーグ（Ｓｐｒａｇｕｅ）ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．第４５巻：７７３〜７８１頁（１９８３年））。付加的には、宿主細胞内の複製を制御するための遺伝子配列を、当該技術分野において既知の通りにベクター内に取込むことができる。同様に、重鎖分子の高い表面発現を回避するためには、膜貫通ドメイン変異体スプライスを無くする発現ベクターを使用する必要があるかもしれない。
【００８８】
付加的な要素としては、エンハンサ、コザック配列およびＲＮＡスプライシングのためのドナーおよびアクセプタ部位によりフランキングされた介在配列が含まれる。高効率の
転写は、ＳＶ４０由来の早期および晩期プロモータ、レトロウイルスからの長末端反復（ＬＴＲＳ）例えばＲＳＶ、ＨＴＬＶＩ、ＨＩＶＩ、およびサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の早期プロモータで達成可能である。しかしながら、細胞要素も同様に使用可能である（例えばヒトアクチンプロモータ）。本発明を実践する上で使用するための適切な発現ベクターとしては例えば、ｐＩＲＥＳ１ｎｅｏ、ｐＲｅｔｒｏ−Ｏｆｆ、ｐＲｅｔｒｏ−Ｏｎ、ＰＬＸＳＮ、またはｐＬＮＣＸ（カリフォルニア州Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏのクローンテック・ラブス（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ  Ｌａｂｓ）、）、ｐｃＤＮＡ３．１（＋／−）、ｐｃＤＮＡ／Ｚｅｏ（＋／−）またはｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｙｇｒｏ（＋／−）（インビトロジェン）、ＰＳＶＬおよびＰＭＳＧ（スウェーデンＵｐｐｓａｌａのファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））、ｐＲＳＶｃａｔ（ＡＴＣＣ３７１５２）、ｐＳＶ２ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ３７１４６）およびｐＢＣ１２ＭＩ（ＡＴＣＣ６７１０９）といったベクターが含まれる。
【００８９】
代替的には、染色体内に組込まれた遺伝子を含有する安定した細胞系列の中で、抗体配列をコードする核酸を発現させることができる。ｄｈｆｒ、ｇｐｔ、ネオマイシンまたはハイグロマイシンといったような選択可能なマーカーでの同時トランスフェクションにより、コードされた抗体を大量に発現するトランスフェクションを受けた細胞の同定および単離が可能となる。ＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸レダクターゼ）マーカーは、問題の遺伝子の数百さらには数千のコピーを担持する細胞系列を開発するのに有利である。もう１つの有用な選択マーカーは、酵素グルタミンシンターゼ（ＧＳ）である（マーフィー（Ｍｕｒｐｈｙ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．第２２７巻：２７７〜２７９頁（１９９１年）；ベビントン（Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ）ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ第１０巻：１６９〜１７５頁（１９９２年））。これらのマーカーを用いて、哺乳動物細胞は選択培地内で成長させられ、最高の耐性をもつ細胞が選択される。これらの細胞系列は、染色体内に組込まれた増幅された遺伝子を含有する。抗体の産生のためには、チャイニーズハムスタ卵巣（ＣＨＯ）およびＮＳＯ細胞が用いられることが多い。
【００９０】
本発明の抗体の生産において用いられるＤＮＡ構成体は、任意には少なくとも１つのインシュレータ配列を含む。「インシュレータ」、「インシュレータ配列」および「インシュレータ要素」は本明細書では互換的に使用される。インシュレータ要素は、その活動範囲内に置かれた遺伝子の転写を絶縁するものの、遺伝子発現をマイナスまたはプラスのいずれにも混乱させない制御要素である。好ましくは、インシュレータ配列は、転写されるべきＤＮＡ配列のいずれかの側に挿入される。例えば、インシュレータは、問題の遺伝子の３’末端でプロモータから少なくとも約１ｋｂ〜５ｋｂ、プロモータから５’、約２００ｂｐ〜約１ｋｂのところに位置づけされ得る。プロモータおよび問題の遺伝子の３’末端からのインシュレータ配列の距離は、問題の遺伝子の相対的サイズ、構成体中で用いられるエンハンサおよびプロモータに応じて、当業者により決定され得る。さらに、２つ以上のインシュレータ配列をプロモータから５’のところまたはトランス遺伝子の３’末端に位置づけできる。例えば、プロモータから５’のところに２つ以上のインシュレータ配列を位置づけすることができる。トランス遺伝子の３’末端にあるインシュレータは、問題の遺伝子の３’末端または３’調節配列の３’末端例えば３’未翻訳領域（ＵＴＲ）または３’フランキング配列に位置づけされ得る。
【００９１】
適切な誘発性非融合大腸菌発現ベクターの例としては、ｐＴｒｃ（アマン（Ａｍａｎｎ）ら、（１９８８年）Ｇｅｎｅ第６９巻：３０１〜３１５頁）およびｐＥＴ１１ｄ（スタジア（Ｓｔｕｄｉｅｒ）ら、「Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」、１８５、カリフォルニア州Ｓａｎ  ＤｉｅｇｏのＡｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、（１９９０年）６０〜８９頁）が含まれる。ｐＴｒｃベクターからの標的遺伝子発現は、ハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃ融合プロモータからの宿主ＲＮＡポリメラーゼ転写に依存している。ｐＥＴ１１ｄベクターからの標的
遺伝子発現は、同時発現されたウイルスＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７ｇｎ１）により媒介されたＴ７ｇｎ１０−ｌａｃ融合プロモータからの転写に依存する。このウイルスポリメラーゼは、ｌａｃＵＶ５プロモータの転写制御下でＴ７ｇｎ１遺伝子を宿す常在λプロフィージからの宿主菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）またはＨＭＳ１７４（ＤＥ３）によって供給される。
【００９２】
もう１つの実施形態においては、発現ベクターは、酵母発現ベクターである。酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ内での発現のためのベクターの例としては、ｐＹｅｐＳｅｃ１（バルダリ（Ｂａｌｄａｒｉ）ら、（１９８７年）ＥＭＢＯ  Ｊ．第６巻：２２９〜２３４頁）、ｐＭＦａ（クルジャン（Ｋｕｒｊａｎ）およびヘルコヴィッツ（Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ）、（１９８２年）Ｃｅｌｌ、第３０巻：９３３〜９４３頁）、ｐＪＲＹ８８（シュルツ（Ｓｃｈｕｌｔｚ）ら、（１９８７年）、Ｇｅｎｅ、第５４巻：１１３〜１２３頁）、ｐＹＥＳ２（カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏのインビトロジェン・コーポレーション（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ））およびｐＰｉｃＺ（カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏのインビトロジェン・コーポレーション）がある。
【００９３】
代替的には、発現ベクターは、バキュロウイルス発現ベクターである。培養された昆虫細胞（例えばＳｆ９細胞）内でのタンパク質の発現のために利用可能なバキュロウイルスベクターには、ｐＡｃシリーズ（スミス（Ｓｍｉｔｈ）ら、（１９８３年）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．第３巻：２１５６〜２１６５頁）およびｐＶＬシリ−ズ（ラックロウ（Ｌｕｃｋｌｏｗ）およびサマーズ（Ｓｕｍｍｅｒｓ）（１９８９年）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ第１７０巻：３１〜３９頁）が含まれる。
【００９４】
さらにもう１つの実施形態においては、哺乳動物発現ベクターを用いて哺乳動物細胞内で本発明の核酸が発現される。哺乳動物発現ベクターの例としては、ｐＣＤＭ８（シード（Ｓｅｅｄ）（１９８７年）、Ｎａｔｕｒｅ第３２９巻：８４０頁）およびｐＭＴ２ＰＣ（カウフマン（Ｋａｕｆｍａｎ）ら、（１９８７年）ＥＭＢＯ  Ｊ．第６巻：１８７〜１９５頁）が含まれる。哺乳動物細胞内で使用される場合、発現ベクターの制御機能は往々にしてウイルス調節要素により提供される。例えば、一般的に使用されるプロモータは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルスおよびシミアンウイルス４０から誘導される。原核および真核の両方の細胞のために適したその他の発現系については、サンブルックら、上掲書の第１６章および１７章を参照のこと。
【００９５】
もう１つの実施形態においては、組換え型哺乳動物発現ベクターは、リンパ腫細胞（例えばマウス骨髄腫細胞）といったような特定の細胞型の中で優先的に核酸の発現を導く能力をもつ。特定の細胞型においては、核酸を発現するために組織特異的調節要素が使用される。組織特異的調節要素は当該技術分野において既知である。適切な組織特異的プロモータの制限的意味のない例としては、アルブミン・プロモータ（肝臓特異的；ピンカート（Ｐｉｎｋｅｒｔ）ら、（１９８７年）、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．第１巻：２６８〜２７７頁）、リンパ系特異的プロモータ（カラム（Ｃａｌａｍｅ）およびイートン（Ｅａｔｏｎ）（１９８８年）、Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第４３巻：２３５〜２７５頁）、特に、Ｔ細胞レセプターのプロモータ（ウィノト（Ｗｉｎｏｔｏ）およびバルチモア（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ）（１９８９年）、ＥＭＢＯ  Ｊ．第８巻：７２９〜７３３頁）および免疫グロブリン（バネルジ（Ｂａｎｅｒｊｉ）ら、（１９８３年）、Ｃｅｌｌ第３３巻：７２９〜７４０頁；クイーン（Ｑｕｅｅｎ）およびバルチモア（１９８３年）、Ｃｅｌｌ第３３巻：７４１〜７４８頁）、ニューロン特異的プロモータ（例えば、ニューロフィラメントプロモータ；バーン（Ｂｙｒｎｅ）およびラッドル（Ｒｕｄｄｌｅ）（１９８９年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ第８６巻：５４７３〜５４７７頁）、膵臓特異的プロモータ（エドランド（Ｅｄｌｕｎｄ）ら、（１９８５年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２３０巻：９１２〜９１６頁）、および乳腺特異的プロモータ（例えば、乳清プロモータ
；米国特許第４，８７３，３１６号明細書および欧州特許出願公開第２６４，１６６号明細書）が含まれている。例えば、マウスホックス（hox）プロモータ（ケッセル（Ｋｅｓｓｅｌ）およびグラス（Ｇｒｕｓｓ）（１９９０年）Ｓｃｉｅｎｃｅ第２４９巻：３７４〜３７９頁）およびα−フェトタンパク質プロモータ（カンペルス（Ｃａｍｐｅｓ）およびティルマン（Ｔｉｌｇｈｍａｎ）（１９８９年）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．第３巻：５３７〜５４６頁）などにより、発生学的に調節されているプロモータも包含されている。
【００９６】
本発明はさらに、アンチセンス配向で発現ベクター内にクローニングされたＤＮＡ分子を含む組換え型発現ベクターを提供する。すなわち、ＤＮＡ分子は、ポリペプチドをコートするｍＲＮＡに対しアンチセンスであるＲＮＡ分子の（ＤＮＡ分子の転写による）発現を可能にするような形で調節配列に作動的に連結されている。さまざまな細胞型内でアンチセンスＲＮＡ分子の連続的発現を導くアンチセンス配向でクローニングされた核酸に作動的に連結された調節配列を選択することができる。例えば、アンチセンスＲＮＡの構成性、組織特異的または細胞型特異的発現を導くウイルスプロモータおよび／またはエンハンサまたは調節配列を選択することができる。アンチセンス発現ベクターは、ベクターが導入される細胞型によって活性が決定され得る、内部で高効率調節領域の制御下でアンチセンス核酸が産生される弱毒化ウイルス、組換え型プラスミド、ファージミド（phagemid）の形をしている可能性がある。アンチセンス遺伝子を用いた遺伝子発現の調節の論述については、ワイントローブ（Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ）ら、「Ｒｅｖｉｅｗｓ−Ｔｒｅｎｄｓ
ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ」、第１巻（１）、１９８６年）を参照のこと。
【００９７】
骨髄腫細胞のクローニングおよび発現
ｃＭ−Ｔ４１２（その全体が参照により援用されている欧州特許第０５１１３０８号明細書）として知られているヒトＣＤ４に対するキメラマウス／ヒトＩｇＧ１Ｋモノクローナル抗体が、トランスフェクションを受けた骨髄腫細胞内で高レベルに発現されることが観察された（ルーニー（Ｌｏｏｎｅｙ）ら、１９９２年、Ｈｕｍ  Ａｎｉｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ、第３巻（４）：１９１〜２００頁）。培養条件を最適化するのに多大な努力を払うことなく、５００ｍｇ／Ｌを超える生産レベル（一日細胞一個あたりのｐｇに基づく比生産性はわかっていない）が、１９９０年ペンシルバニア州Ｍａｌｖｅｒｎのセントコール（Ｃｅｎｔｏｃｏｒ、Ｉｎｃ）で容易に得られた。これらの発現ベクターの構成要素をベースとして、遺伝子プロモータ／転写開始核酸配列、５’未翻訳配列および翻訳開始核酸配列、シグナル配列をコードする核酸配列、シグナルイントロンおよびＪ−Ｃイントロンのためのイントロン／エキソンスプライスドナー配列、およびＪ−Ｃイントロンエンハンサ核酸配列を含めた、ＨＣおよびＬＣクローニングにとって有用な抗体クローニングベクターが開発された。ｐＵＣ１９プラスミドであるプラスミドｐ１３９は、全マウスＭ−Ｔ４１２Ａｂを分泌するＣ１２３ハイブリドーマ細胞からクローニングされた５．８ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩゲノミックフラグメントを含有し、該フラグメントは、ｃＭ−Ｔ４１２ＨＣ遺伝子のＶ領域部分およびプロモータを含有する。ＬＣＶ領域ベクター工学処理用の出発材料は、Ｃ１２３ハイブリドーマからクローニングされた３ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩゲノミクフラグメントを含有するｐＵＣプラスミドであるプラスミドｐ３９であった。このフラグメントはｃＭ−Ｔ４１２ＬＣ遺伝子のＶ領域部分およびプロモータを含有する。Ｐ１３９およびｐ３９から誘導された工学処理済みベクターは、１）Ｖ領域ベクター内の特異的に調製された制限部位間で問題の配列をコードするＤＮＡをクローニングし、かくして、Ｖ領域コーディング配列がベクターコードされたシグナル配列のすぐ下流側ならびに遺伝子プロモータの一部分または全部の下流側に位置づけされることになる工程；および２）Ｖ領域ベクターからＣ領域ベクターまで適正な配位で挿入済み配列全体にわたるフラグメントを移送し、かくして、結果として得られたプラスミドが細胞内での発現に適した最終的発現プラスミドを構成することになる工程を伴う２段階プロセスにおいて哺乳動物宿主細胞内で発現するのに適したＨＣまたはＬＣ遺伝子の適切な組立てを可能にするように設計された（スカロン（Ｓｃａｌｌｏｎ
）ら、１９９５年、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ第７巻（８）：７５９〜７６９頁）。
【００９８】
ＣＨＯ細胞内でのクローニングおよび発現
プラスミドｐＣ４は、プラスミドｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ登録番号第３７１４６号）の誘導体である。該プラスミドは、ＳＶ４０早期プロモータの制御下でマウスＤＨＦＲ遺伝子を含有する。これらのプラスミドでトランスフェクトされ、ジヒドロ葉酸活性が欠如したチャイニーズハムスタの卵巣またはその他の細胞を、化学療法剤メトトレキサートで補足された選択培地（例えば、アルファマイナスＭＥＭ、メリーランド州Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇのライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））の中で細胞を成長させることによって選択することができる。メトトレキサート（ＭＴＸ）に対する耐性をもつ細胞内のＤＨＦＲ遺伝子の増幅は、充分に立証されてきた（例えば、Ｆ．Ｗ．アルト（Ａｌｔ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２５３巻：１３５７〜１３７０頁（１９７８年）；Ｊ．Ｌ．ハムリン（Ｈａｍｌｉｎ）およびＣ．マー（Ｍａ）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ第１０９７巻：１０７〜１４３頁（１９９０年）；およびＭ．Ｊ．ペイジ（Ｐａｇｅ）およびＭ．Ａ．シンデナム（Ｓｙｄｅｎｈａｍ）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ第９巻：６４〜６８頁（１９９１年）を参照のこと）。増大する濃度のＭＴＸ中で成長させられた細胞は、ＤＨＦＲ遺伝子の増幅の結果として標的酵素ＤＨＦＲを過剰産生することにより、薬物に対する耐性を発生させる。第２の遺伝子がＤＨＦＲ遺伝子に連結される場合、それは通常同時増幅され過剰発現される。当該技術分野においては、増幅された遺伝子１０００コピー超を担持する細胞系列を発生させるためにこのアプローチを使用できることがわかっている。その後、メトトレキサートが引き抜かれた時点で、宿主細胞の１個もしくはそれ以上の染色体の中に組込まれた増幅された遺伝子を含有する細胞系列が得られる。
【００９９】
プラスミドｐＣ４は、問題の遺伝子を発現するために、ラウス肉腫ウイルスの長末端反復（ＬＴＲ）の強いプロモータ（カレン（Ｃｕｌｌｅｎ）ら、Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．第５巻：４３８〜４４７（１９８５年））とヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の前初期遺伝子のエンハンサから単離されたフラグメント（ボシャート（Ｂｏｓｈａｒｔ）ら、Ｃｅｌｌ第４１巻：５２１〜５３０頁（１９８５年））を含有している。該プロモータの下流側には、遺伝子の組込みを可能にするＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ、およびＡｓｐ７１８制限部位がある。これらのクローニング部位の後ろに、該プラスミドは、ラットプレプロインシュリン遺伝子の３’イントロンおよびポリアデニル化部位を含んでいる。発現のためには、ヒトｂ−アクチンプロモータ、ＳＶ４０早期または晩期プロモータまたはＨＩＶおよびＨＴＬＶＩなどのその他のレトロウイルスからの長末端反復といったその他の高効率プロモータを使用することもできる。哺乳動物細胞内で調節された形でＭＣＰ−１抗体を発現するためには、クローンテック社のテットオフ（Ｔｅｔ−Ｏｆｆ）およびテットオン（Ｔｅｔ−Ｏｎ）遺伝子発現系および類似の系を使用することができる（Ｍ．ゴッセン（Ｇｏｓｓｅｎ）およびＨ．ブジャール（Ｂｕｊａｒｄ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ第８９巻：５５４７〜５５５１頁（１９９２年））。ｍＲＮＡのポリアデニル化のためには、例えばヒト成長ホルモンまたはグロビン遺伝子からのその他のシグナルを使用することもできる。
【０１００】
抗体産生用の宿主細胞
本発明の少なくとも１つの抗ＭＣＰ−１抗体は、当該技術分野において周知の通りの細胞系列、混合細胞系列、不死化細胞または不死化細胞のクローン集団によって場合により産生され得る。例えば各々全体が本明細書に参照により援用されている、アウスベルら編、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．、ニューヨーク州ニューヨーク（１９８７〜２００４年）；サンブルックら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」）、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ
ｏｒ、ニューヨーク（１９８９年）；ハーロウおよびレーン、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨーク（１９８９年）；コリガンら編、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．、ニューヨーク（１９９４〜２００４年）；コリガンら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ニューヨーク州ニューヨーク（１９９７〜２００４年）を参照のこと。
【０１０１】
生物薬剤学製品を生産するためには、組換え型ポリペプチドの効率の良い再生可能な発現の能力ある生産細胞系列が必要とされる。該細胞系列は安定していて確かなものである。この目的でさまざまな宿主細胞を利用することができる。細胞機構がいかに生物療法製品の最終的量および組成物に影響を及ぼすかという複雑さを理解するにつれて、製品の生産および組成に対し必要な属性を付与することになる宿主細胞系列の選択はより明白なものとなる。
【０１０２】
連続的ゲノミックＤＮＡ配列から転写される大部分の遺伝子とは異なり、抗体遺伝子は、生殖細胞系内で広く分離され得る遺伝子セグメントから組立てられる。特に、抗体の可変（Ｖ）、多様性（Ｄ）および接合（Ｊ）／定常（Ｃ）領域をコードする３つのゲノミックセグメントの組合せにより、重鎖遺伝子が形成される。
【０１０３】
Ｖ領域をコードするものとＪ／Ｃ領域をコードするものという２つの遺伝子セグメントを接合することにより、機能的軽鎖遺伝子が形成される。重鎖およびカッパ軽鎖遺伝子座の両方が、１０００ｋｂをはるかに超えて広がると推定される数多くのＶ遺伝子セグメント（推定値は１００ｓと１０００ｓの間で変動する）を含む。これとは対照的に、ラムダ遺伝子座は、はるかに小さく、マウス内の染色体１６上で約３００ｋｂにわたることが示されてきた。それは、２つの可変遺伝子セグメントと４つの接合／定常（Ｊ／Ｃ）領域遺伝子セグメントから成る。機能的遺伝子の形成には、ＶおよびＪ／Ｃ要素の間の組換えが必要である。
【０１０４】
抗体が自然に生産されるＢ細胞の中では、再配置重鎖およびカッパ軽鎖遺伝子の両方の転写の制御がＶ領域の上流側の組織特異的プロモータおよびＪ−Ｃイントロン内にある組織特異的エンハンサの活性に共に左右される。これらの要素は相乗的に作用する。同様に第２のＢ細胞特異的エンハンサが、カッパ軽鎖遺伝子座内で同定されてきた。このさらなるエンハンサは、Ｃｋａｐｐａの下流側の９ｋｂのところに位置設定されている。かくして、抗体発現遺伝子を不死化するハイブリドーマ方法は、親Ｂ細胞系統の内因性プロモータおよびエンハンサ配列に依存している。代替的には、本発明の核酸は、本発明の抗体をコードする内因性ＤＮＡを含有する宿主細胞内で（操作により）オン切換えすることにより宿主細胞中で発現され得る。かかる方法は、例えばその全体が本明細書に参照により援用されている米国特許第５，５８０，７３４号明細書、同第５，６４１，６７０号明細書、同第５，７３３，７４６号明細書および同第５，７３３，７６１号明細書中で記載されている通り、当該技術分野において周知である。
【０１０５】
人工ベクター内への抗体ゲノミックＤＮＡのクローニングは、抗体発現能力をもつ宿主細胞を作り上げるもう１つの方法である。しかしながら、強いプロモータの後ろでのモノクローナル抗体の発現は、高生産性細胞系列を同定しモノクローナル抗体のより高い収量を得る確率を増大させる。本発明の抗体は、例えば、当該技術分野において周知であるように（例えば、モリソン、Ｓ．（１９８５年）Ｓｃｉｅｎｃｅ第２２９巻：１２０２頁）組換え型ＤＮＡ技術および遺伝子トランスフェクション方法の組合せを用いて宿主細胞トランスフェクトーマの中で生産され得る。
【０１０６】
異なるさまざまな宿主細胞中の抗体を含む生物薬品のクローニングおよび発現のための系は周知である。適切な宿主細胞としては、細菌、哺乳動物細胞、植物細胞、酵母およびバキュロウイルス系およびトランスジェニック植物および動物が含まれる。非相同ポリペプチド無傷グリコシル化タンパク質の発現のための当該技術分野において利用可能な哺乳動物細胞系列としては、チャイニーズハムスタ卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ）、ＮＳＯマウス黒色腫細胞および誘導された細胞系列、例えばＳＰ２／０、ＹＢ２／０（ＡＴＣ  ＣＲＬ−１６６２）ラット骨髄腫細胞、ヒト胚腎臓細胞（ＨＥＫ）、ヒト胚網膜細胞ＰｅｒＣ．６細胞、ｈｅｐ  Ｇ２細胞、ＢＳＣ−１（例えばＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２６）および例えばバージニア州Ｍａｎａｓｓａｓのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ
Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、（ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ）から入手可能なその他の数多くのものが含まれる。一般的な好ましい細菌宿主細胞は、大腸菌である。
【０１０７】
非相同遺伝子の安定した発現のためには、ＣＨＯ細胞、骨髄腫細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＢＨＫ細胞（ＢＨＫ２１、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１０）、マウスＬｔｋ−細胞およびＮＩＨ３Ｔ３細胞といったような哺乳動物細胞が用いられることが多かった。これとは対照的に、Ｃｏｓ（ＣＯＳ−１  ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５０；ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６５１）およびＨＥＫ２９３といったような細胞系列が、組換え型タンパク質の過渡的な発現のために日常的に用いられる。
【０１０８】
本発明の組換え型抗体を発現するための好ましい哺乳動物宿主細胞としては、その高い発現速度のため、Ｓｐ２／０、ＹＢ２／０（ＡＴＣ  ＣＲＬ−１６６２）、ＮＳＯおよびＰ３Ｘ６３．Ａｇ８．６５３（例えば、ＳＰ２／０−Ａｇ１４）といったような骨髄腫細胞がある。特に、ＮＳＯ骨髄腫細胞について使用するためのもう１つの好ましい発現系は、国際公開第８７／０４４６２号パンフレット、国際公開第８９／０１０３６号パンフレットおよび欧州特許第３３８，８４１号明細書において開示されているＧＳ遺伝子発現系である。抗体遺伝子をコードする組換え型発現ベクターが哺乳動物宿主細胞内に導入された時点で、宿主細胞内での抗体の発現またはより好ましくは該宿主細胞が内部で成長させられる培地内への抗体の分泌を可能にするのに充分な時間宿主細胞を培養することによって、抗体が産生される。抗体は、標準的なタンパク質精製方法を用いて培地から回収可能である。
【０１０９】
抗体、その特定された部分または変異体の産生にとって有用な細胞培養の一例としては哺乳動物細胞がある。哺乳動物細胞系は、細胞の単層の形をとることが多いが、哺乳動物細胞の懸濁液またはバイオリアクタも同様に使用可能である。
【０１１０】
当該技術分野においては、無傷のグリコシル化タンパク質を発現する能力をもつ数多くの適切な宿主細胞系列が開発されており、これには例えば、バージニア州Ｍａｎａｓｓａｓのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ）から容易に入手可能なＣＯＳ−１（例えば、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５０）、ＣＯＳ−７（例えば、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６５１）、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ２１（例えば、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１０）、ＣＨＯ（例えば、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６１０）およびＢＳＣ−１（例えば、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２６）細胞系、Ｃｏｓ−７細胞、ＣＨＯ細胞、ｈｅｐ  Ｇ２細胞、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３、ＳＰ２／０−Ａｇ１４、２９３細胞、ＨｅＬａ細胞など、が含まれる。好ましい宿主細胞としては、骨髄腫およびリンパ腫細胞といったようなリンパ由来の細胞が含まれる。特に好ましい宿主細胞はＰ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３細胞（ＡＴＣＣ登録番号ＣＲＬ−１５８０）およびＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞（ＡＴＣＣ登録番号ＣＲＬ−１８５１）である。
【０１１１】
問題の遺伝子の増幅は、例えば薬物メトトレキサート（ＭＴＸ）を用いた選択可能かつ
増幅可能なマーカーＤＨＦＲの取込みによって可能になることから（Ｒ．Ｊ．カウフマン、１９９０年、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、第１８５巻：５３７〜５６６頁）、高レベルのタンパク質産生のためには、ＣＨＯ−Ｋ１およびＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞ＤＧ４４およびＤＵＫ−Ｂ１１（Ｇ．ウアラウプ（Ｕｒｌａｕｂ）、Ｌ．Ａ．チェイシン（Ｃｈａｓｉｎ）、１９８０年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．第７７巻、４２１６〜４２２０頁）が使用される。高レベルで組換え型ｍＡｂｓを産生するためには、ＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞を使用するとうまくいく。ＤＨＦＲ−ＣＨＯは、一日１０６個の細胞あたり８０〜１１０ｍｇまたは２００ｍｇ超の速度でａｎｔ−ＭＣＰ−１抗体を産生し得る。例えばｂ−アクチンプロモータ、ヒトＣＭＶ  ＭＩＥプロモータ、Ａｄウイルス主要晩期プロモータ（ＭＬＰ）、ＲＳＶプロモータおよびマウス白血病ウイルスLTRといったさまざまなプロモータが、これらのＣＨＯ細胞内でのＨ鎖およびＬ鎖
の発現を得るために使用されてきた。ｍＡｂ発現のための数多くのベクターが文献中で記述されており、ここでは、独立した選択可能／増幅可能なマーカーと共に２つの異なるプラスミドにより２つのＩｇ鎖が提供されている。ＤＨＦＲマーカーに連結されたＨ鎖およびＮｅｏｒマーカーを伴うＬ鎖発現カセットなどの１つの抗体鎖またはその反対を含有するベクターを用いて、スピナーフラスコ内で７日１Ｌあたり最高１８０ｍｇのヒト化ｍＡｂを得ることができる。初期選択およびその後の増幅のために用いられる方法は変えることができ、当業者にとって周知のものである。一般に、以下の工程を用いて、高レベルのｍＡｂ発現を得ることができる：すなわち、候補クローンの初期選択およびその後の増幅、同時選択（例えばＨ鎖およびＬ鎖発現ベクターの両方がＤＨＦＲ発現単位を担持している場合）および増幅、異なる増幅可能マーカーを用いた同時増幅、および大量培養中の初期選択および増幅とそれに続く個々の高発現クローンを同定するための希釈クローニング。組込み部位がＨ鎖およびＬ鎖の発現および全体的ｍＡｂ発現の効率に影響を及ぼし得ることから、２つのＩｇ鎖発現単位が縦一列に置かれている単一のベクターが作り出された。これらのベクターは同様に、ＮｅｏｒおよびＤＨＦＲ発現カセットといったような優勢選択可能マーカーを担持している。再考のためには、ガングリー（Ｇａｎｇｕｌｙ）、Ｓ．およびＡ．シャッツマン（Ｓｈａｔｚｍａｎ）、「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ」、１９９９年、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ
＆  Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃによる「Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ、Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓ、ａｎｄ  Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ」を参照のこと。
【０１１２】
コケット（Ｃｏｃｋｅｔｔ）ら、（１９９０年、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ第８巻、６６２〜６６７頁は、ＣＨＯ細胞中での非相同遺伝子の高レベル発現のためのＧＳ系を開発した。ＣＨＯ−Ｋ１細胞内への（ｈＣＭＶプロモータの転写制御下での）ｃＤＮＡおよび（ＳＶ４０晩期プロモータの制御下での）ＧＳミニ遺伝子を含有する発現ベクターのトランスフェクション（とそれに続く２０ｍＭ〜５００ｍＭのＭＳＸでの選択）を用いて、ＤＨＦＲ−ＣＨＯ系のものと比較可能な収率で本発明の抗体を発現するクローンを生成することができる。ＧＳ系については欧州特許第０，２１６，８４６号明細書、同第０，２５６，０５５号明細書および同第０，３２３，９９７号明細書および欧州特許出願第８９３０３９６４．４号明細書に関連して、全体的にまたは部分的に論述される。
【０１１３】
制限的意味のない例としては、例えば誘発可能なプロモータを用いて、組換え型タンパク質を大量に提供するべく、組換え型タンパク質を発現するトランスジェニックタバコ葉が成功裡に用いられてきた。例えばクラマー（Ｃｒａｍｅｒ）ら、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第２４０巻：９５〜１１８頁（１９９９年）およびその中で引用された参考文献を参照のこと。同様に、トランスジェニックトウモロコシを用いて、その他の組換え型系の中で産生されるかまたは天然の供給源から精製されたものと等価の生物活性で、商業的生産レベルで哺乳動物タンパク質が発現されてきた。例えば、フード（Ｈｏｏｄ）ら、Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．第４６４巻：１２７〜１４
７頁（１９９９年）およびその中で引用されている参考文献を参照のこと。タバコの種子およびジャガイモ塊茎を含めた１本鎖抗体（ｓｃＦｖ’ｓ）といったような抗体フラグメントを含むトランスジェニック植物種子からも同様に大量に抗体が生産されてきた。例えばコンラッド（Ｃｏｎｒａｄ）ら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．第３８巻：１０１〜１０９頁（１９９８年）およびその中で引用されている参考文献を参照のこと。かくして、本発明の抗体は、既知の方法に従ってトランスジェニック植物を用いて生産することも可能である。例えば、フィッシャー（Ｆｉｓｃｈｅｒ）ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．第３０巻：９９〜１０８頁（Ｏｃｔ．、１９９９年）、マーら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．第１３巻：５２２〜７頁（１９９５年）；マーら、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．第１０９巻：３４１〜６頁（１９９５年）；ホワイトラム（Ｗｈｉｔｅｌａｍ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．第２２巻：９４０〜９４４頁（１９９４年）；およびその中で引用されている参考文献も参照のこと。同様に、抗体の植物発現について一般的には（ただし制限的な意味なく）米国特許第５９５９１７７号明細書を参照のこと。上述の参考文献の各々はその全体が本明細書に参照により援用されている。
【０１１４】
５．抗体の精製
プロテインＡ精製、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィ、ホスホセルロースクロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、親和性クロマトグラフィ、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィおよびレクチンクロマトグラフィを含めた（ただしこれらに限定されるわけではない）周知の方法により、組換え型細胞培養から、抗ＭＣＰ−１抗体を回収し精製することができる。精製には高性能液体クロマトグラフィ（「ＨＰＬＣ」）を利用することもできる。例えば各々その全体が本明細書に参照により援用されているコリガン、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」または「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ニューヨーク州ニューヨーク、（１９９７〜２００１年）の例えば、第１、４、６、８、９、１０章を参照のこと。
【０１１５】
本発明の抗体には、天然に精製された生成物、化学合成手順の生成物、および例えば酵母、高等植物、昆虫および哺乳動物細胞を含めた真核生物宿主から組換え技術により生産された生成物が含まれる。組換え生産手順において利用される宿主に応じて、本発明の抗体は、グリコシル化されていてもいなくてもよいが、グリコシル化抗体が好まれる。かかる方法については、その全てが本明細書中に参照により援用されている、サンブルック、上掲書、第１７．３７−１７．４２節；アウスベル、上掲書、第１０、１２、１３、１６、１８および２０章、コリガン、「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ」、上掲書、第１２−１４章、といったような数多くの標準的実験室マニュアルの中で記載されている。
【０１１６】
６．発明の抗体
本発明の方法および組成物において有用な抗ＭＣＰ−１抗体（抗−ＣＣＬ−２抗体またはＭＣＰ−１抗体とも呼ばれる）は、場合により、ＭＣＰ−１に対する高い親和性結合、ＭＣＰ−１に対するきわめて特異的な結合、ＭＣＰ−１と結びつけられた生物活性のうち１個もしくはそれ以上のものを阻害する能力そして場合によりかつ好ましくは低い毒性を有すること、によって特徴づけされ得る。
【０１１７】
本発明の抗体は、広範囲の親和性（ＫＤ）で、ヒトＭＣＰ−１と結合し得る。好ましい実施形態においては、本発明の少なくとも１つのヒトｍＡｂが場合により高い親和性でヒトＭＣＰ−１を結合させる。例えば、ヒトｍＡｂは、０．１〜９．９（または任意の範囲またはその中の値）×１０−７、１０−８、１０−９、１０−１０、１０−１１、１０−１２、１０−１３または任意の範囲またはその中の値といったような（ただしこれらに限
定されるわけではない）、約１０−７Ｍ以下のＫＤでヒトＭＣＰ−１を結合させることができる。
【０１１８】
１抗原についての１抗体の親和性または結合力は、任意の適切な方法を用いて経験的に決定可能である（例えば、ベルゾフスキー（Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ）ら、「Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」中の「Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ」、Ｐａｕｌ、Ｗ．Ｅ．、Ｅｄ．、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ：ニューヨーク州ニューヨーク（１９８４年）；クビー（Ｋｕｂｙ）、ジャニス（Ｊａｎｉｓ）、「Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ：ニューヨーク州ニューヨーク（１９９２年）；および本明細書中に記載されている方法を参照のこと）。特定の抗体−抗原相互作用の測定された親和性は、異なる条件（例えば塩濃度、ｐＨ）下で測定された場合に変動し得る。かくして、親和性およびその他の抗原結合パラメータ（例えばＫＤ、Ｋａ、Ｋｄ）の測定は好ましくは、標準化された抗体および抗原の溶液および標準化された緩衝液例えば本明細書中に記述された標準溶液および緩衝液を用いて行なわれる。
【０１１９】
本発明の単離された抗体は、任意の適切なポリヌクレオチドによってコードされた本明細書で開示されている抗体アミノ酸配列または任意の単離または調製された抗体を含んでなる。好ましくは、ヒト抗体または抗原結合フラグメントはヒトＭＣＰ−１を結合させ、かくして、部分的または実質的に該タンパク質の少なくとも１つの生物活性を中和する。少なくとも１つのＭＣＰ−１タンパク質またはフラグメントの少なくとも１つの生物活性を部分的にまたは好ましくは実質的に中和する抗体またはその特定された部分または変異体は、該タンパク質またはフラグメントを結合させかくしてＭＣＰ−１のＭＣＰ−１レセプターに対する結合を通してかまたはその他のＭＣＰ−１依存性または媒介型機序を通して媒介される活性を阻害することができる。本明細書で使用される「中和抗体」という用語は、ＭＣＰ−１依存性活性を約２０〜１２０％、好ましくは検定に応じて少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％以上だけ阻害できる抗体のことを意味する。ＭＣＰ−１依存性活性を阻害する抗ＭＣＰ−１抗体の能力は、好ましくは、本明細書に記載されている通りおよび／または当該技術分野において知られている通り、少なくとも１つの適切なＭＣＰ−１タンパク質またはレセプター検定によって査定される。本発明のヒト抗体は、あらゆるクラス（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤなど）またはイソタイプのものであり得、カッパまたはラムダ軽鎖を含んでなることができる。一実施形態においては、ヒト抗体は例えばイソタイプ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４のうちの少なくとも１つといったＩｇＧ重鎖または画定されたフラグメントを含んでなる。このタイプの抗体は、トランスジェニックマウスまたは、本明細書に記載されているかつ／または当該技術分野において既知の通りの少なくとも１つのヒト軽鎖（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＭ（例えばγ１、γ２、γ３、γ４））導入遺伝子を含むその他のトランスジェニック非ヒト哺乳動物を用いることによって調製可能である。もう１つの実施形態においては、抗ヒトＭＣＰ−１ヒト抗体はＩｇＧ１重鎖およびＩｇＧ１軽鎖を含んでなる。
【０１２０】
本発明の少なくとも１つの抗体は、少なくとも１つのＭＣＰ−１タンパク質、そのフラグメント、一部分または任意の組合せに特異的な少なくとも１つの特定されたエピトープを結合させる。該少なくとも１つのエピトープは、タンパク質の少なくとも一部分を含んでなる少なくとも１つの抗体結合領域を含んでなり得、このエピトープは好ましくは、配列番号１の連続するアミノ酸の少なくとも１〜３個のアミノ酸から特定された部分全体で構成されている。
【０１２１】
一般に、本発明のヒト抗体または抗原結合フラグメントは、少なくとも１つのヒト相補
性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）または少なくとも１つの重鎖可変領域の変異体および少なくとも１つのヒト相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）または少なくとも１つの軽鎖可変領域の変異体を含んでなる抗原結合領域を含んでなることになる。制限的意味のない例としては、抗体または抗原結合部分または変異体は、配列番号９または１２のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３および／または配列番号１５〜１７、２０または２１のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３のうちの少なくとも１つを含んでなることができる。特定の一実施形態においては、抗体または抗原結合フラグメントは、対応するＣＤＲ１、２および／または３のアミノ酸配列（例えば配列番号６〜１２および／または２２、２３および２６）を有する少なくとも１つの重鎖ＣＤＲ（すなわちＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３）の少なくとも一部分を含んでなる抗原結合領域を有することができる。もう１つの特定の実施形態においては、抗体または抗原結合部分または変異体は、対応するＣＤＲ１、２および／または３のアミノ酸配列（例えば配列番号１３〜２１および／または２４および２５）を有する少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲ（すなわちＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３）の少なくとも一部分を含んでなる抗原結合領域を有することができる。好ましい実施形態においては、抗体または抗原結合フラグメントの３つの重鎖ＣＤＲおよび３つの軽鎖ＣＤＲは、本明細書に記載されている通りのＦａｂ  ＭＯＲ０３３６、ＭＯＲ０３４６４、ＭＯＲ０３４６８、ＭＯＲ０３４７０、ＭＯＲ０３４７１、ＭＯＲ０３４７３、ＭＯＲ０３５４８のうちの少なくとも１つのものの対応するＣＤＲから誘導されたアミノ酸配列およびＶＨ３抗体から誘導された重鎖フレームワーク領域（配列番号２）およびカッパ型抗体から誘導された軽鎖フレームワーク領域（配列番号４）を。かかる抗体は、従来の技術を用いて抗体のさまざまな部分（ＣＤＲおよびフレームワーク）を化学的に接合させることによってかまたは、組換え型ＤＮＡ技術の従来の技術を用いて抗体をコードする核酸分子を調製し発現させることによってか、またはその他の適切な任意の方法を用いることによって調製可能である。
【０１２２】
抗ＭＣＰ−１抗体は、フレームワーク領域内に画定されたアミノ酸配列を有する重鎖または軽鎖可変領域のうちの少なくとも１つを含んでなり得る。例えば、好ましい実施形態において、抗−ＭＣＰ−１抗体は、場合により配列番号２または３のアミノ酸配列を有する少なくとも１つの重鎖可変領域および／または場合により配列番号４または５のアミノ酸配列を有する少なくとも１つの軽鎖可変領域のうちの少なくとも１つを含んでなる。
【０１２３】
抗体のクラスまたはイソタイプ（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧまたはＩｇＭ）は、重鎖定常領域遺伝子によりコードされる定常領域によって付与される。ヒトＩｇＧクラスの中には、最高から出発して最低まで血清中のその天然の存在度の順に命名されたＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４という４つのサブクラスまたはサブタイプが存在する。ＩｇＡ抗体は、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２という２つのサブクラスとして見出される。本明細書で使用されるような「イソタイプスイッチング」という用語も、ＩｇＧサブクラスまたはサブタイプの間での変更を意味している。
【０１２４】
本発明は同様に、本明細書に記載されているアミノ酸配列と実質的に同じである配列内のアミノ酸を含む抗体、抗原結合フラグメント、免疫グロブリン鎖およびＣＤＲにも関する。好ましくは、このような抗体または抗原結合フラグメントおよびかかる鎖またはＣＤＲを含んでなる抗体は、高い親和性（例えば約１０−９Ｍ以下のＫＤ）で、ヒトＭＣＰ−１を結合させることができる。本明細書に記載されている配列を実質的に同じであるアミノ酸配列は、保存的アミノ酸置換ならびにアミノ酸欠失および／または挿入を含んでなる配列を内含する。保存的アミノ酸置換というのは、第１のアミノ酸のものと類似した化学および／または物理的特性（例えば電荷、構造、極性、疎水性／親水性）をもつ第２のアミノ酸による第１のアミノ酸の置き換えを意味する。保存的置換には、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）およびヒスチジン（Ｈ）；アスパラギン酸（Ｄ）およびグルタミン酸（Ｅ）；アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、チロシ
ン（Ｙ）、Ｋ、Ｒ、Ｈ、ＤおよびＥ；アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、プロリン（Ｐ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、メチオニン（Ｍ）、システイン（Ｃ）およびグリシン（Ｇ）；Ｆ、ＷおよびＹ；Ｃ、ＳおよびＴという群の中に入るもう１つのアミノ酸による１つのアミノ酸の置き換えが含まれる。
【０１２５】
本発明の抗ＭＣＰ−１抗体は、ヒト生殖系列遺伝子配列から誘導され、ＶＨ１Ａ、ＶＨ１Ｂ、ＶＨ２などと呼称されたファミリに配列親似性によっておよびカッパまたはラムダサブグループとして軽鎖により分類される可変領域についてクナピック（Ｋｎａｐｐｉｋ）ら、米国特許第６８２８４２２号明細書中で教示されているかまたは本明細書で特定されている通りの人間による操作または天然の突然変異のいずれかに由来する、１個もしくはそれ以上のアミノ酸置換、欠失または付加を内含し得る。これらの配列および本発明において使用可能なその他の配列としては、本明細書で教示されている通り本発明のＩｇ誘導されたタンパク質の中でその一部分を使用することのできる、重鎖および軽鎖可変および定常ドメイン配列、フレームワーク、サブドメイン、領域および置換の例を示す、全体が本明細書に参照により援用されている２００４年６月２１日出願のＰＣＴ公報国際公開第０５／００５６０４号パンフレットおよび米国特許出願第１０／８７２，９３２号明細書の図１〜４２にさらに描かれている通り、表１に提示された立体配置が含まれるがこれらに限定されるわけではない。
【０１２６】
【表２】
2008546374.tif 000002
【０１２７】
当業者が行なうと思われるアミノ酸置換の数は、上述のものを含めた数多くの要因により左右される。一般的に言うと、任意の与えられた抗ＭＣＰ−１抗体、フラグメントまたは変異体についてのアミノ酸置換、挿入または欠失の数は、本明細書で規定されているように、１〜３０またはその中の任意の範囲または値といったように４０、３０、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１を超えないものとなる。
【０１２８】
機能上不可欠である本発明の抗ＭＣＰ−１抗体内のアミノ酸は、部位特異的突然変異誘発またはアラニン走査突然変位誘発といったような当該技術分野において既知の方法により同定可能である（例えば、アウスベル、上掲書、第８、１５章；カニンガム（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ）およびウェルズ（Ｗｅｌｌｓ）、Ｓｃｉｅｎｃｅ第２４４巻：１０８１〜１０８５頁（１９８９年））。後者の手順は、分子内のすべての残基において単一アラニ
ン突然変異を導入する。次に、結果として得られた突然変異体分子が、例えば（ただしこれに制限されるわけではない）少なくとも１つのＭＣＰ−１中和活性といったような生物活性についてテストされる。抗体結合にとってきわめて重要である部位も又、結晶化、核磁気共鳴または光親和性標識といったような構造分析によって同定可能である（スミス（Ｓｍｉｔｈ）ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．第２２４巻：８９９〜９０４頁（１９９２年）およびデボス（ｄｅ  Ｖｏｓ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ第２５５巻：３０６〜３１２頁（１９９２年））。
【０１２９】
本発明の抗―ＭＣＰ−１抗体は、配列番号２〜５および２７〜２８のうちのいずれか１つのものの連続するアミノ酸のうちの５個乃至全てのアミノ酸から選択された少なくとも１つの部分、配列または組合せを含むことができるが、これらに限定されるわけではない。
【０１３０】
抗ＭＣＰ−１抗体はさらに、場合により、配列番号２７および２８のうちの少なくとも１つの配列番号の１つのポリペプチドを含んでなる。一実施形態においては、免疫グロブリン鎖のアミノ酸配列またはその一部分は、抗−ＭＣＰ−１抗体の結合特異性を変えない保存的置換を除いて、配列番号２７〜２８の少なくとも１つの対応する鎖のアミノ酸配列に対する約１００％の同一性を有する。例えば、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号４または５の配列と比較可能であるか、そうでなければ、重鎖のアミノ酸配列を配列番号２または３と比較することができる。好ましくは、アミノ酸同一性は、当該技術分野で既知の通り、適切なコンピュータアルゴリズムを用いて決定される。
【０１３１】
当業者であれば認識するように、本発明には、本発明の少なくとも１つの生物活性ある抗体が含まれている。生物活性ある抗体は、未変性（非合成）内因性または関連するおよび既知の抗体のものの少なくとも２０％、３０％または４０％そして好ましくは少なくとも５０％、６０％または７０％、かつ最も好ましくは少なくとも８０％、９０％または９５％〜１００％の比活性を有する。酵素活性および基質特異性の検定および定量化措置の方法は、当業者にとって周知であり、本明細書中に記載されている。
【０１３２】
もう１つの態様においては、本発明は、有機部分の共有結合付着により修飾される本明細書に記載されている通りのヒト抗体および抗原結合フラグメントに関する。かかる修飾は、改善された薬学速度論的特性（例えば増大したインビボ血清半減期）をもつ抗体または抗原結合フラグメントを生成することができる。有機部分は、線形または有枝親水性重合体基、脂肪酸基または脂肪酸エステル基であり得る。特定の実施形態においては、該親水性重合体基は、約８００〜約１２０，０００ダルトンの分子量を有することができ、ポリアルカングリコール（例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ））、炭水化物重合体、アミノ酸重合体またはポリビニルピロリドンであり得、脂肪酸または脂肪酸エステル基は、約８個〜約４０個の炭素原子を含むことができる。
【０１３３】
本発明の修飾済み抗体および抗原結合フラグメントは、抗体に対し直接または間接的に共有結合される１個もしくはそれ以上の有機部分を含んでなることができる。本発明の抗体または抗原結合フラグメントに結合した各々の有機部分は、独立して、親水性重合体基、脂肪酸基または脂肪酸エステル基であり得る。本明細書で使用されている「脂肪酸」という用語は、モノカルボン酸およびジカルボン酸を包含する。本明細書で使用されている「親水性重合体基」という用語は、オクタン中よりも水中でより溶解度が高い有機重合体を意味する。例えば、ポリリシンは、オクタン中よりも水中でさらに溶解度が高い。かくして、ポリリシンの共有結合付着により修飾された抗体が、本発明により包含されている。本発明の抗体を修飾するのに適した親水性重合体は、線形または有枝であり得、たとえばポリアルカングリコール（例えば、ＰＥＧ、モノメトキシ−ポリエチレンングリコール
（ｍＰＥＧ）、ＰＰＧなど）、炭水化物（例えば、デキストラン、セルロース、オリゴ糖、多糖類など）、親水性アミノ酸の重合体（例えば、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリアスパラギン酸塩など）、酸化ポリアルカン（例えば、酸化ポリエチレン、酸化ポリプロピレンなど）およびポリビニルピロリドンを内含する。好ましくは、本発明の抗体を修飾する親水性重合体は、別の分子的実体として約８００〜約１５０，０００ダルトンの分子量を有する。例えば、ＰＥＧ５０００およびＰＥＧ２０，０００（なおここで下付き文字はダルトン単位の重合体の平均分子量である）が使用可能である。親水性重合体基は、１個乃至約６個アルキル、脂肪酸または脂肪酸エステル基で置換可能である。脂肪酸または脂肪酸エステル基で置換される親水性重合体は、適切な方法を用いることによって調製可能である。例えば、アミン基を含む重合体を脂肪酸または脂肪酸エステルのカルボン酸塩にカップリングさせることができ、脂肪酸または脂肪酸エステル上の（例えばＮ、Ｎ−カルボニルジイミダゾールで活性化された）活性化カルボン酸塩を重合体上のヒドロキシル基にカップリングさせることができる。
【０１３４】
本発明の抗体を修飾するのに適した脂肪酸および脂肪酸エステルは飽和可能であり、そうでなければ１個もしくはそれ以上の不飽和単位を含有し得る。本発明の抗体を修飾するのに適した脂肪酸には、例えばｎ−ドデカン酸塩（Ｃ１２、ラウリン酸塩）、ｎ−テトラデカン酸塩（Ｃ１４、ミリスチン酸塩）、ｎ−オクタデカン酸塩（Ｃ１８、ステアリン酸塩）、ｎ−エイコサン酸塩（Ｃ２０、アラキドン酸塩）、ｎ−ドコサン酸塩（Ｃ２２、ベヘン酸塩）、ｎ−トリアコンタン酸塩（Ｃ３０）、ｎ−テトラコンタン酸塩（Ｃ４０）、ｃｉｓ−Δ９−オクタデカン酸塩（Ｃ１８、オレイン酸塩）、全てのｃｉｓ−Δ５，８，１１，１４−エイコサテトラエン酸塩（Ｃ２０、アラキドン酸塩）、オクタン二酸、テトラデカン二酸、オクタデカン二酸、ドコサン二酸、などが含まれる。適切な脂肪酸エステルには、線形または有枝低級アルキル基を含むジカルボン酸モノエステルが含まれる。低級アルキル基は１個乃至約１２個、好ましくは１〜約６個の炭素原子を含み得る。
【０１３５】
１個もしくはそれ以上の修飾剤との反応などにより適切な方法を用いて、修飾済みヒト抗体および抗原結合フラグメントを調製することができる。本明細書で使用される「修飾剤」という用語は、活性化基を含んでなる適切な有機基（例えば親水性重合体、脂肪酸、脂肪酸エステル）を意味する。「活性化基」というのは、適切な条件下で第２の化学基と反応しかくして修飾剤と第２の化学基の間に共有結合を形成することのできる化学部分または官能基である。例えば、アミン反応性活性化基は、トシラート、メシラート、ハロ（クロロ、ブロモ、フルオロ、ヨード）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル（ＮＨＳ）などといったような求電子基を内含する。チオールと反応し得る活性化基は、例えばマレイミド、ヨードアセチル、アクリロリル、ピリジルジスルフィド、５−チオール−２−ニトロベンゼン酸チオール（ＴＮＢ−チオール）などを内含する。アミンまたはヒドラジド含有分子に対しアルデヒド官能基をカップリングさせることができ、アジド基が、３価のリン基と反応してホスホルアミダートまたはホスホルイミド連結を形成することができる。分子中に活性基を導入するための適切な方法が、当該技術分野において既知である（例えばハーマンソン（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ）、Ｇ．Ｔ．、「Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ
Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ：カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ（１９９６年）を参照のこと）。有機基（例えば親水性重合体、脂肪酸、脂肪酸エステル）に対して直接、或いはリンカー部分例えば２価のＣ１−Ｃ１２基（なおここで１個もしくはそれ以上の炭素原子を酸素、窒素または硫黄といったようなヘテロ原子で置き換えることができる）を通して、活性化基を結合させることができる。適切なリンカー部分としては例えば、テトラエチレングリコール、−（ＣＨ２）３−、−ＮＨ−（ＣＨ２）６−ＮＨ−、−（ＣＨ２）２−ＮＨ−およびＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ−ＮＨ−が含まれる。リンカー部分を含む修飾剤は例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）の存在下でモノ−Ｂｏｃ−アルキルジアミン（例えばモノ−Ｂｏｃ−エチレンジアミン、モノ−Ｂｏｃ−ジ
アミノへキサン）を脂肪酸と反応させて遊離アミンと脂肪酸カルボキシラートの間のアミド結合を形成することによって、生産可能である。Ｂｏｃ保護基を、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）での処理により生成物から除去し、記載されている通りもう１つのカルボン酸塩にカップリングされ得る一級アミンを露出させることができ、そうでなければこれを無水マレイン酸と反応させ、結果として得られた生成物を環化させて脂肪酸の活性化マレイミド誘導体を生成することができる（例えばその教示全体が本明細書に参照により援用されている、トンプソン（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ）ら、国際公開第９２／１６２２１号パンフレットを参照のこと）。
【０１３６】
本発明の修飾された抗体は、修飾剤とヒト抗体または抗原結合フラグメントを反応させることによって生産可能である。例えば、ＰＥＧのＮＨＳエステルといったアミン反応性修飾剤を利用することによって、有機部分を非部位特異的に抗体に結合させることができる。抗体または抗原結合フラグメントのジスルフィド結合（例えば鎖内ジスルフィド結合）を還元させることによって、修飾済みヒト抗体または抗原結合フラグメントを調製することもできる。このとき、還元された抗体または抗原結合フラグメントをチオール反応性修飾剤と反応させて、本発明の修飾された抗体を産生させることが可能である。本発明の抗体の特異的部位に結合された有機部分を含んでなる修飾済みヒト抗体および抗原結合フラグメントを、逆タンパク質分解（フィッシュ（Ｆｉｓｃｈ）ら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．第３巻：１４７〜１５３頁（１９９２年）；ワーレン（Ｗｅｒｌｅｎ）ら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．第５巻：４１１〜４１７頁（１９９４年）；クマラン（Ｋｕｍａｒａｎ）ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．第６巻（１０）：２２３３〜２２４１頁（１９９７年）；イトウ（Ｉｔｏｈ）ら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．第２４巻（１）：５９〜６８頁（１９９６年）；カペラス（Ｃａｐｅｌｌａｓ）ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．第５６巻（４）：４５６〜４６３頁（１９９７年））およびハーマンソン、Ｇ．Ｔ．、「Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ：カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ（１９９６年）に記載されている方法といったような適切な方法を用いて調製することが可能である。
【０１３７】
７．抗ＭＣＰ−１抗体に対する抗イディオタイプ抗体
モノクローナルまたはキメラ抗−ＭＣＰ−１抗体に加えて、本発明は同様に、本発明のかかる抗体に特異的な抗イディオタイプ（抗−Ｉｄ）抗体にも向けられている。抗Ｉｄ抗体は、一般にもう１つの抗体の抗原結合領域と会合されたユニーク決定基を認識する抗体である。抗Ｉｄは、抗体またはそのＣＤＲ含有領域を伴うＩｄ抗体の供給源と同じ種および遺伝子型（例えばマウス株）の動物を免疫化することによって調製可能である。免疫化された動物は、免疫化抗体のイディオタイプ決定基を認識しこれに応答し、抗Ｉｄ抗体を産生する。抗Ｉｄ抗体は同様に、さらにもう１つの動物の体内で免疫応答を誘発し、いわゆる抗−抗−Ｉｄ抗体を産生するための「免疫原」としても使用可能である。
【０１３８】
８．さらなる治療活性ある成分を含んでなる抗体組成物
組成物は、場合によりさらに、皮膚病薬、抗炎症薬、鎮痛剤、腎臓作用薬（例えばアンギオテンシンレセプター遮断薬（ＡＲＢ）またはアンタゴニスト）、抗感染症薬、心臓血管（ＣＶ）系作用薬、中枢神経系（ＣＮＳ）薬、自律神経系（ＡＮＳ）薬、呼吸管薬、消化（ＧＩ）管作用薬、ホルモン薬、体液または電解質平衡作用薬、血液製剤、抗新生物薬、免疫調節薬、眼科耳鼻科薬、局所作用薬、栄養薬などのうちの少なくとも１つから選択された少なくとも１つの化合物またはタンパク質を有効量含んでなることができる。かかる薬物は、各々について本明細書で提示されている処方、適応症、用量決定および投与方法を含め、当該技術分野において周知のものである（例えば、各々その全体が本明細書に参照により援用されている「Ｎｕｒｓｉｎｇ  ２００１  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ」、第２１版、ペンシルバニア州ＳｐｒｉｎｇｈｏｕｓｅのＳｐｒｉｎｇｈｏｕｓｅ  Ｃｏｒｐ．、２００１年；「Ｈｅａｌｔｈ  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ’ｓ  Ｄｒｕ
ｇ  Ｇｕｉｄｅ  ２００１」、シャノン（Ｓｈａｎｎｏｎ）、ウィルソン（Ｗｉｌｓｏｎ）、スタング（Ｓｔａｎｇ）編、ニュージャージー州Ｕｐｐｅｒ  Ｓａｄｄｌｅ  ＲｉｖｅｒのＰｒｅｎｔｉｃｅ−Ｈａｌｌ、Ｉｎｃ、；「Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ」、ウェルズら編、コネチカット州ＳｔａｍｆｏｒｄのＡｐｐｌｅｔｏｎ
＆  Ｌａｎｇｅ、を参照のこと）。
【０１３９】
本発明の抗−ＭＣＰ−１抗体組成物は、さらにその変調、治療または療法を必要としている細胞、組織、器官、動物または患者に対する少なくとも１つの抗ＭＣＰ−１抗体を含んでなり、場合によりさらに、少なくとも１つのＴＮＦアンタゴニスト（例えば制限的な意味なく、ＴＮＦ化学物質またはタンパク質アンタゴニスト、ＴＮＦモノクローナルまたはポリクローナル抗体またはフラグメント、可溶性ＴＮＦレセプター（例えばｐ５５、ｐ７０またはｐ８５）またはそのフラグメント、融合ポリペプチド、または小分子ＴＮＦアンタゴニスト例えばＴＮＦ結合タンパク質ＩまたはＩＩ（ＴＢＰ−１またはＴＢＰ−ＩＩ）、ネレリモンマブ、インフリキシマグ、エンテラセプト、ＣＤＰ−５７１、ＣＤＰ−８７０、アフェリモマブ、レネルセプトなど）、抗リウマチ剤（例えば、メトトレキサート、オーラノフィン、オーロチオグルコース、アザチオプリン、エタネルセプト、金チオリンゴ酸ナトリウム、硫酸ヒドロキシクロロキン、レフルノミド、スルファサルジン）、筋肉弛緩剤、睡眠薬、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、鎮痛薬、麻酔剤、鎮静薬、局所麻酔薬、神経筋遮断薬、抗菌剤（例えば、アミノグリコシド、抗真菌薬、駆虫薬、抗ウイルス薬、カルバペネム、セファロスポリン、フルオロキノロン、マクロライド、ペニシリン、スルホンアミド、テトラサイクリン、その他の抗菌剤）、乾癬治療薬、コルチコステロイド、アナボリックステロイド、糖尿病関連作用剤、ミネラル、栄養薬、甲状腺作用剤、ビタミン、カルシウム関連ホルモン、止瀉薬、鎮咳薬、制吐薬、抗潰瘍薬、便秘薬、抗凝血剤、エリスロポイエチン（例えば、エポエチンアルファ）、フィルグラスチム（例えば、Ｇ−ＣＳＦ、ニューポゲン（Ｎｅｕｐｏｇｅｎ））、サルグラモスチム（ＧＭ−ＣＳＦ、ロイキン（Ｌｅｕｋｉｎｅ））、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）作用薬、抗線維症剤、予防接種、免疫グロブリン、免疫抑制薬（例えば、バシリキシマブ、シクロスポリン、ダクリズマブ）、成長ホルモン、ホルモン補充薬、エストロゲンレセプター調節物質、散瞳薬、毛様筋調節薬、アルキル化剤、代謝拮抗物質、分裂抑制剤、放射性医薬品、抗うつ薬、抗躁薬、精神病治療薬、抗不安薬、催眠剤、交換神経様作用薬、興奮剤、ドネペジル、タクリン、喘息治療薬、ベータアゴニスト、吸引ステロイド薬、ロイコトリエン阻害剤、メチルキサンチン、クロモリン、エピネフリンまたは類似体、ドルナーゼアルファ（プルモザイム（Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅ））、サイトカインまたはサイトカインアンタゴニストから選択された少なくとも１つのものをさらに含んでなる組成物または薬学組成物（医薬組成物（pharmaceutical composition））を任意の適切な量および有効量のうちの少なくとも一方を含んでなり得る。かかるサイトカインの制限的意味のない例としては、ＩＬ−１〜ＩＬ−２９のいずれかが含まれるが、これらに限定されるわけではない。適切な投与量は、当該技術分野において周知である。例えばその各々の参考文献各々の全体が本明細書に参照により援用されている、ウェルズら編、「Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｇｙ
Ｈａｎｄｂｏｏｋ」第２版、コネチカット州ＳｔａｍｆｏｒｄのＡｐｐｌｅｔｏｎ  ａｎｄ  Ｌａｎｇｅ、（２０００年）；「ＰＤＲ
Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ」、「Ｔａｒａｓｃｏｎ  Ｐｏｃｋｅｔ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ、２０００」、豪華版、Ｔａｒａｓｃｏｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、カリフォルニア州Ｌｏｍａ  Ｌｉｎｄａ（２０００年）、を参照のこと。
【０１４０】
このような抗癌または抗感染薬は同様に、本発明の少なくとも１つの抗体と含合、結合、同時処方または同時投与される毒素分子をも内含することができる。毒素は場合により、選択的に病的細胞または組織を殺すように作用することができる。病的細胞は癌またはその他の細胞であり得る。かかる毒素は、例えばリシン、ジフテリア毒素、毒液毒素または細菌毒素のうちの少なくとも１つから選択された毒素の少なくとも１つの機能的細胞毒
性ドメインを含んでなる精製済みまたは組換え型毒素または毒素フラグメントであり得るが、これらに限定されるわけではない。毒素という用語は同様に、結果として死をもたらす可能性のある毒素ショックを含め、ヒトおよびその他の哺乳動物の体内で任意の病的状態をひき起こし得る任意の天然発生型、突然変異型または組換え型細菌またはウイルスにより産生される内毒素および外毒素の両方を内含する。かかる毒素は、腸管毒素産生大腸菌易熱性腸管毒素（ＬＴ）、耐熱性腸管毒素（ＳＴ）、赤痢菌細胞毒素、アエロモナス腸管毒素、毒素性ショック症候群毒素−１（ＴＳＳＴ−１）、ブドウ球菌腸管毒素Ａ（ＳＥＡ）、Ｂ（ＳＥＢ）またはＣ（ＳＥＣ）、連鎖球菌腸管毒素などを内含し得るが、これらに限定されるわけではない。かかる細菌には腸管毒素産生大腸菌（ＥＴＥＣ）、腸管出血性大腸菌（例えば、０１５７：Ｈ７血清型菌株）、ブドウ球菌種（例えば、黄色ブドウ球菌、化膿性ブドウ球菌）、赤痢菌種（例えば、志賀赤痢菌、箕田赤痢菌、Ｃ群赤痢菌およびＤ群赤痢菌）、サルモネラ菌種（例えば、サルモネラ・チフィ（チフス菌）、サルモネラ・コレラスイス、サルモネラ・エンテリティディス（腸炎菌））、クロストリジウム種（例えば、クロストリジウム・パーフリンジェンス、クロストリジウム・ディフィシル、クロストリジウム・ボツリナム（ボツリヌス菌））、カンフロバクター種（例えば、カンフロバクター・ジェジュニ、カンフロバクター・フェタス）、ヘリコバクター種、（例えば、ヘリコバクターピロリ）、アエロモナス種（例えば、アエロモナス・ソブリア、アエロモナス・ヒドロフィラ、アエロモナス・カビエ）、プレシオモナス・シゲロイデス、エルシニア・エンテロコリチカ、ビブリオ種（例えば、ビブリオ・コレレ、ビブリオ・パラヘモリティカス（腸炎ビブリオ））、クレブシエラ種、シュードモナス・アエルギノサ（緑膿菌）および連鎖球菌、といった種の菌株が含まれるが、これらに限定されるわけではない。例えば、その内容全体が本明細書に参照により援用されている例えば、スタイン（Ｓｔｅｉｎ）編、「ＩＮＴＥＲＮＡＬ  ＭＥＤＩＣＩＮＥ」、第３版、１〜１３頁、Ｌｉｔｔｌｅ、Ｂｒｏｗｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．、ボストン、（１９９０年）；エヴァンズ（Ｅｖａｎｓ）ら編、「Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎｓ：Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌ」、第２版、２３９〜２５４頁、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｂｏｏｋ  Ｃｏ．、ニューヨーク（１９９１年）；マンデル（Ｍａｎｄｅｌｌ）ら、「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ」、第３版、Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ  Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ、ニューヨーク（１９９０年）；ベルコフ（Ｂｅｒｋｏｗ）ら編、「Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｍａｎｕａｌ」、第１６版、Ｍｅｒｃｋ  ａｎｄ  Ｃｏ．、ニュージャージー州Ｒａｈｗａｙ、１９９２年；ウッド（Ｗｏｏｄ）ら、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第７６巻：１２１〜１３４頁（１９９１年）；マラック（Ｍａｒｒａｃｋ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２４８巻：７０５〜７１１頁（１９９０年）を参照のこと。
【０１４１】
本発明の抗ＭＣＰ−１抗体化合物、組成物または組合せはさらに、希釈剤、結合剤、安定剤、緩衝液、塩、親油性溶媒、防腐剤、アジュバントなどといった（ただしこれらに限定されるわけではない）任意の適切な補助作用物質のうちの少なくとも１つを含んでなり得る。製薬学的に受容可能な助剤が好ましい。かかる無菌溶液の制限的意味のない例およびその調製方法は、ジェンナラ（Ｇｅｎｎａｒｏ）編、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、第１８版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．（ペンシルベニア州Ｅａｓｔｏｎ）１９９０年といったように（ただしこれらに限定されるわけではない）、当該技術分野において周知である。当該技術分野において周知の通りまたは本明細書に記載されている通りの抗−ＭＣＰ−１抗体、フラグメントまたは変異体組成物の投与様式、溶解度および／または安定性に適した製薬学的に受容可能な担体を、日常的に選択することができる。
【０１４２】
当該組成物において有用な製薬学的賦形剤および添加剤には、単独でまたは組合せた形で１〜９９．９９重量％または体積％を構成する、単独でまたは組合せた形で存在し得る
タンパク質、ペプチド、アミノ酸、脂質および炭水化物（例えば、単糖類、２糖類、３糖類、４糖類およびオリゴ糖；導体化された糖、例えばアルジトール、アルドン酸、エステル化糖など；および多糖類または糖重合体を含む糖）が含まれるが、これらに限定されるわけではない。タンパク質賦形剤の例としては、血清アルブミン、例えばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、組換え型ヒトアルブミン（ｒＨＡ）、ゼラチン、カゼインなどが含まれる。緩衝能力においても機能しうる代表的なアミノ酸／抗体構成要素としては、アラニン、グリシン、アルギニン、ベタイン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、システイン、リジン、ロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン、フェニルアラニン、アスパルタームなどが含まれている。１つの好ましいアミノ酸はグリシンである。
【０１４３】
本発明において使用するのに適した炭水化物賦形剤としては、例えば単糖類例えばフルクトース、マルトース、ガラクトース、グルコース、Ｄ−マンノース、ソルボースなど；２糖類、例えばラクトース、スクロース、トレハロース、セロビオースなど；多糖類、例えばラフィノース、メレジトース、マルトデキストリン、デキストラン、でんぷんなど；およびアルジトール、例えばマンニトール、キシリトール、マルチトール、ラクチトール、キシリトール、ソルビトール（グルシトール）、ミオイノシトールなどが含まれる。本発明において使用するための好ましい炭水化物賦形剤は、マンニトール、トレハロースおよびラフィノースである。
【０１４４】
抗ＭＣＰ−１抗体組成物は同様に、緩衝液またはｐＨ調整剤を内含し得る。標準的には、緩衝液は有機酸または塩基から調製された塩である。代表的緩衝液には有機酸塩例えばクエン酸、アスコルビン酸、グルコン酸、炭酸、酒石酸、コハク酸、酢酸またはフタル酸の塩；トリス、塩酸トロメタミンまたはリン酸緩衝液が含まれる。当該組成物中で使用するための好ましい緩衝液は、クエン酸といったような有機酸塩である。
【０１４５】
付加的には、本発明の抗ＭＣＰ−１抗体組成物は、ポリビニルピロリドン、フィコール（重合体糖）、デキストラート（例えば、シクロデキストリン、例えば２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン）、ポリエチレンングリコール、着香剤、抗菌剤、甘味料、抗酸化剤、静電防止剤、界面活性剤（例えば、ポリソルバート、例えば「トゥイーン２０」および「トゥイーン８０」）、脂質（例えば、リン脂質、脂肪酸）、ステロイド（例えば、コレステロール）、およびキレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）といったような重合体賦形剤／添加剤を内含することができる。
【０１４６】
本発明に従った抗ＭＣＰ−１抗体、部分または変異体組成物の中で使用するために適したこれらのおよび付加的な既知の製薬学的賦形剤および／または添加剤は、例えばその開示全体が本明細書に参照により援用されている「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＆  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ」、第１９版、Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｌｉａｍｓ、（１９９５年）、および「Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ」、第５２版、Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ、ニュージャージー州Ｍｏｎｔｖａｌｅ（１９９８年）に列挙されている通り、当該技術分野において既知のものである。好ましい担体または賦形剤材料は、炭水化物（例えば糖類およびアルジトール）および緩衝液（例えばクエン酸塩）または重合体剤である。
【０１４７】
９．処方物
上述の通り、本発明は、製薬学的に受容可能な処方物中に少なくとも１つの抗−ＭＣＰ−１抗体を含む、薬学または獣医学での使用に適した安定した処方物を提供する。
【０１４８】
上述の通り、本発明は、包装材料および場合により水性希釈剤中の規定の緩衝液および／または防腐剤を伴う少なくとも１つの抗−ＭＣＰ−１抗体の溶液を含んでなる少なくとも１つのバイアルを含んでなる製造品において、前記包装材料が、かかる溶液を１、２、
３、４、５、６、９、１２、１８、２０、２４、３０、３６、４０、４８、５４、６０、６６、７２時間以上の期間にわたり保持できることを記したラベルを含んでなる、製造品を提供している。本発明はさらに、包装材料、凍結乾燥された少なくとも１つの抗ＭＣＰ−１抗体を含んでなる第１のバイアルおよび規定の緩衝液または防腐剤の水性希釈剤を含んでなる第２のバイアル含んでなる製造品において、前記包装材料が、患者に対し水性希釈剤中で少なくとも１つの抗ＭＣＰ−１抗体を復元して２４時間以上の期間にわたり保持され得る溶液を形成するように指示するラベルを含んでなる、製造品を含んでなる。
【０１４９】
本発明の製品中の少なくとも１つの抗ＭＣＰ−１抗体の範囲には、湿潤／乾燥系内にある場合、復元した時点で約１．０μｇ／ｍｌ〜約１０００ｍｇ／ｍｌの濃度を生み出す量が含まれているが、さらに低いおよび高い濃度も操作可能であり、これは意図された送達ビヒクルによって左右され、例えば溶液処方物は経皮パッチ、肺、経粘膜または浸透圧またはマイクロポンプ方法とは異なることになる。
【０１５０】
水性希釈剤は場合により、さらに、製薬学的に受容可能な防腐剤を含んでなる。好ましい防腐剤には、フェノール、ｍ−クレゾール、ｐ−クレゾール、ｏ−クレゾール、クロロクレゾール、ベンジルアルコール、アルキルパラベン（メチル、エチル、プロピル、ブチルなど）、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、ジヒドロ酢酸ナトリウムおよびチメロサール、またはそれらの混合物から成る群から選択されるものが含まれる。処方中で使用される防腐剤の濃度は、抗菌効果を生み出すのに十分な濃度である。かかる濃度は選択された防腐剤により左右され、当業者により容易に決定される。
【０１５１】
その他の賦形剤例えば等張性剤、緩衝剤、酸化防止剤、防腐剤エンハンサを場合によりそして好ましくは希釈剤に添加することができる。グリセリンといったような等張性剤が、既知の濃度で一般に使用される。改善されたｐＨ制御を提供するべく、好ましくは生理的に寛容された緩衝液が添加される。処方物は、約ｐＨ４〜約ｐＨ１０といった広範囲のｐＨそして好ましくは約ｐＨ５〜約ｐＨ９の範囲、最も好ましくは約６．０〜約８．０の範囲を網羅し得る。好ましくは、本発明の処方物は約６．８〜約７．８の間のｐＨを有する。好ましい緩衝液には、リン酸緩衝液、最も好ましくはリン酸ナトリウム、特にリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が含まれる。
【０１５２】
場合により、凝集を削減するべく処方物または組成物に対して他の添加剤、例えば以下のような製薬学的に受容可能な溶解剤、トゥイーン２０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウラート）、トゥイーン４０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノパルミタート）、トゥイーン８０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレアート）、プルロニックＦ６８（ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロック共重合体）およびＰＥＧ（ポリエチレンングリコール）または非イオン性界面活性剤、例えばポリソルバート２０または８０またはポロキサマー１８４または１８８、プルロニック（登録商標）ポリル、その他のブロック共重合体およびキレート化剤、例えばＥＤＴＡおよびＥＧＴＡを添加することができる。これらの添加物は、処方物を投与するためにポンプまたはプラスチック容器が使用される場合に特に有用である。製薬学的に受容可能な界面活性剤の存在は、タンパク質が凝集する性向を軽減させる。
【０１５３】
本発明の処方物は、所望の濃度でタンパク質を提供するのに充分な量で少なくとも１つの抗ＭＣＰ−１抗体および緩衝溶液を混合する工程を含んでなるプロセスによって調製され得る。当業者であれば、このプロセスの変形形態を認識するものと思われる。例えば、構成要素の添加順序、付加的な添加剤が使用されるか否か、処方物が調製される濃度およびｐＨは、全て、使用される投与手段および濃度について最適化され得る因子である。
【０１５４】
請求対象の処方物は、患者に対して溶液としてかまたは、水性希釈剤中の選択された塩
および水、防腐剤および／または賦形剤、好ましくは、リン酸緩衝液および／または生理食塩水の入った第２のバイアルを用いて復元される凍結乾燥された少なくとも１つの抗ＭＣＰ−１抗体のバイアルを含んでなるデュアルバイアルとして提供され得る。シングル溶液バイアルまたは復元を必要とするデュアルバイアルのいずれも、何回でも再利用可能であり、単一回または多数回の患者治療サイクルに充分であり得、かくして現在利用可能なものにさらに便利な治療処方計画を提供することができる。
【０１５５】
ここで請求されている製造品は、即刻乃至は２４時間以上の期間にわたる投与にとって有用である。従って、ここで請求されている製造品は患者に対し多大な利点を提供する。本発明の処方物は、場合により、約２℃〜約４０℃の温度で安全に貯蔵され得、長時間にわたりタンパク質の生物活性を保持し、かくして、該溶液が６、１２、１８、２４、３６、４８、７２または９６時間以上の期間にわたり保持されかつ／または使用され得ることを示す包装ラベルの貼付を可能にする。保存希釈剤が使用される場合には、かかるラベルに最高１〜１２ヵ月、半年、１．５年および／または２年までの使用を内含することができる。
【０１５６】
請求対象の製品は、水性希釈剤の入った第２のバイアルを用いて戻される凍結乾燥した少なくとも１つの抗ＭＣＰ−１抗体のバイアルを含む２重バイアルまたは透明溶液を薬局、診療所またはその他のかかる機関および施設に提供することによって、患者に対し間接的に提供され得る。この場合、透明溶液は最高１リットルまたはさらにはそれ以上のサイズを有し、大きなタンクが提供され、そこから薬局または診療所が、少なくとも１つの抗体溶液のより小さい部分を１回または多数回取出してより小さなバイアルに移し、顧客および／または患者に提供する。
【０１５７】
これらのシングルバイアルシステムを含んでなる認定されたデバイスとしては、例えばベクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｅｎ（ニュージャージー州Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ｗｗｗ．ｂｅｃｔｏｎｄｉｃｋｅｎｓｏｎ．ｃｏｍ）、ディセトロニック（Ｄｉｓｅｔｒｏｎｉｃ）（スイスＢｕｒｇｄｏｒｆ、ｗｗｗ．ｄｉｓｅｔｒｏｎｉｃ．ｃｏｍ；バイオジェクト（Ｂｉｏｊｅｃｔ）、オレゴン州Ｐｏｒｔｌａｎｄ、（ｗｗｗ．ｂｉｏｊｅｃｔ．ｃｏｍ）；ナショナル・メディカルプロダクツ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、ウェストン・メディカル（Ｗｅｓｔｏｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ）（英国Ｐｅｔｅｒｂｏｒｏｕｇｈ、ｗｗｗ．ｗｅｓｔｏｎ−ｍｅｄｉｃａｌ．ｃｏｍ）、メデイジェット・コープ（Ｍｅｄｉ−Ｊｅｃｔ  Ｃｏｒｐ）（ミネソタ州Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ｗｗｗ．ｍｅｄｉｊｅｃｔ．ｃｏｍ）が製造または開発したＢＤ  Ｐｅｎｓ、ＢＤ  Ａｕｔｏｊｅｃｔｏｒ（登録商標）、Ｈｕｍａｊｅｃｔ（登録商標）、ＮｏｖｏＰｅｎ（登録商標）、Ｂ−Ｄ（登録商標）Ｐｅｎ、ＡｕｔｏＰｅｎ（登録商標）、および  ＯｐｔｉＰｅｎ（登録商標）、ＧｅｎｏｔｒｏｐｉｎＰｅｎ（登録商標）、Ｇｅｎｏｔｒｏｎｏｒｍ  Ｐｅｎ（登録商標）、Ｈｕｍａｔｒｏ  Ｐｅｎ（登録商標）、Ｒｅｃｏ−Ｐｅｎ（登録商標）、Ｒｏｆｅｒｏｎ  Ｐｅｎ（登録商標）、Ｂｉｏｊｅｃｔｏｒ（登録商標）、Ｉｊｅｃｔ（登録商標）、Ｊ−ｔｉｐ  Ｎｅｅｄｌｅ−Ｆｒｅｅ  Ｉｎｊｅｃｔｏｒ（登録商標）、Ｉｎｔｒａｊｅｃｔ（登録商標）、Ｍｅｄｉ−Ｊｅｃｔ（登録商標）といったような溶液の送達用ペンインジェクタデバイスがある。２重バイアルシステムを含んでなる認定されたデバイスとしては、Ｈｕｍａｔｒｏ  Ｐｅｎ（登録商標）といったような復元された溶液の送達用のカートリッジの中で凍結乾燥された薬物を復元するためのペン−インジェクタシステムがある。
【０１５８】
ここで請求されている製品には、包装材料が含まれる。包装材料は、規制機関により必要とされる情報に加えて、製品を使用できる条件を提供している。本発明の包装材料は、水性希釈剤中で少なくとも１つの抗ＭＣＰ−１抗体を復元して溶液を形成し、２バイアル湿潤／乾燥製品については２〜２４時間以上の期間に該溶液を使用する指示を、患者に対
して提供している。シングルバイアル溶液製品については、該ラベルは、２〜２４時間以上の期間にわたりかかる溶液を使用できるということを指示している。ここで請求されている製品はヒト用薬学製品用途に有用である。
【０１５９】
抗ＭＣＰ−１抗体を安定化するその他の処方物または方法は結果として、前記抗体を含む凍結乾燥粉末の透明な溶液以外のものをもたらし得る。非透明溶液としては、微粒子懸濁液を含んでなる処方物があり、かかる微粒子は、ミクロスフェア、微小粒子、ナノ粒子、ナノスフェアまたはリポソームとしてさまざまな形で知られる、可変的寸法の構造内に抗ＭＣＲ−１抗体を含有する組成物である。活性薬剤を含有するこのような比較的均質で基本的に球形の微粒子処方物は、米国特許第４，５８９，３３０号明細書中で教示されている活性薬剤および重合体を含有する水相と非水相を接触させその後非水相を蒸発させて水相からの粒子の合体をひき起こすことによって形成可能である。連続溶媒中に分散した重合体および活性薬剤を含有する第１の相を用い、米国特許第４，８１８，５４２号明細書中に教示されているような凍結乾燥または希釈−抽出−沈殿により懸濁液から前記溶媒を除去することで多孔質微小粒子を調製することができる。このような調製物のための好ましい重合体は、ゼラチン、寒天、でんぷん、アラビノガラクタン、アルブミン、コラーゲン、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、グリコリド−Ｌ（−）ラクチドポリ（ε−カプロラクトン、ポリ（ε−カプロラクトン−ＣＯ−乳酸）、ポリ（ε−カプロラクトン−ＣＯ−グリコール酸）、ポリ（β−ヒドロキシ酪酸）、酸化ポリエチレン、ポリエチレンン、ポリ（アルキル−２−シアノアクリラート）、ポリ（ヒドロキシエチルメタクリラート）、ポリアミド、ポリ（アミノ酸）、ポリ（２−ヒドロキシエチルＤＬ−アスパルトアミド）、ポリ（エステル尿素）、ポリ（Ｌ−フェニルアラニン／エチレングリコール／１，６−ジイソシアナートへキサン）およびポリ（メチルメタクリラート）から成る群から選択された天然または合成の共重合体または重合体である。特に好ましい重合体は、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、グリコリド−Ｌ（−）ラクチドポリ（ε−カプロラクトン、ポリ（ε−カプロラクトン−ＣＯ−乳酸）、およびポリ（ε−カプロラクトン−ＣＯ−グリコール酸）といったポリエステルである。重合体および／または活性薬剤を溶解させるのに有用な溶媒としては水、ヘキサフルオロイソプロパノール、塩化メチレン、テトラヒドロフラン、へキサン、ベンゼンまたはヘキサフルオロアセトンセスキ水和物がある。第２の相で活性薬剤含有相を分散させるプロセスには、ノズル内のオリフィスに前記第１相を圧力で強制的に通過させて液滴形成に作用する工程が含まれていてよい。
【０１６０】
乾燥粉末処方物は、例えば水性または非水性溶媒を除去するための１個もしくはそれ以上の工程が後続する結晶質組成物の沈殿または蒸発による溶媒抽出または噴霧乾燥といったような凍結乾燥以外のプロセスの結果として得ることもできる。噴霧乾燥された抗体調製物の調製は、米国特許第６，０１９，９６８号明細書中で教示されている。抗体ベースの乾燥粉末組成物は、抗体の溶液またはスラリーそして場合により賦形剤を呼吸用乾燥粉末を提供するための条件下で溶媒中で噴霧乾燥させることによって生産可能である。溶媒には、容易に乾燥可能な水およびエタノールといったような極性化合物が含まれていてよい。抗体安定性は、乾燥用気体として窒素を使用することによってかまたは窒素ブランケット下といったような酸素不在下での噴霧乾燥手順を実施することによって増強させることができる。もう１つの比較的乾燥した処方物は、国際公開第９９１６４１９号パンフレット中で教示されているようなヒドロフルオロアルカン高圧ガスを標準的に含んでなる懸濁培地中に分散させられた複数の有孔微細構造の分散である。安定化された分散は、計量式吸入器を用いて患者の肺に投与され得る。噴霧乾燥された薬剤の商業的製造において有用な機器は、ブッチ株式会社（Ｂｕｃｈｉ  Ｌｔｄ．）またはニロ株式会社（Ｎｉｒｏ．Ｃｏｒｐ）により製造されている。
【０１６１】
本明細書に記載されている安定または保存処方物または溶液のいずれかの中の少なくとも１つの抗ＭＣＰ−１抗体は、本発明に従って、ＳＣまたはＩＭ注入；経皮、肺内、経粘
膜、インプラント、浸透圧ポンプ、カートリッジ、マイクロポンプまたは当該技術分野において周知の通りの当業者により評価されているその他の手段を含めたさまざまな送達方法を介して、患者に投与され得る。
【０１６２】
１０．治療的応用
本発明は同様に、本発明の少なくとも１つのＭＣＰ−１抗体を用いて、本明細書に記載されているようにまたは当該技術分野において既知の通り、細胞、組織、器官、動物または患者の体内の少なくとも１つのＭＣＰ−１関連疾患を変調させるかまたは治療するための方法をも提供している。本発明は同様に、悪性疾患、代謝性疾患、免疫または炎症性関連疾患、心臓血管疾患、感染性疾患または神経系疾患のうちの少なくとも１つを含めた（ただしこれらに限定されるわけではない）、細胞、組織、器官、動物または患者における少なくとも１つのＭＣＰ−１関連疾患を変調させるかまたは治療するための方法をも提供している。
【０１６３】
かかる身体条件は、細胞粘着および／または血管形成により媒介される疾病または身体条件から選択されるが、これらに限定されるわけではない。かかる疾病または身体条件には、免疫障害または疾患、心臓血管障害または疾患、感染性、悪性および／または神経系障害または疾患またはその他の既知のまたは特定されたＭＣＰ−１関連身体条件が含まれる。特に、抗体は、血管形成が関与する疾病例えば眼疾患および腫瘍性疾患、再狭窄といった組織再形成およびある種の細胞型の増殖特に上皮および扁平上皮細胞癌の治療にとって有用である。特別な適応症としては、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、癌転位、関節リウマチ、糖尿病性網膜症および黄斑変性症の治療における使用が含まれる。本発明の中和抗体は同様に、例えば骨粗しょう症において見られる、または一部の腫瘍によるＰＴＨｒＰ過剰発現の結果もたらされる、望ましくない骨吸収または骨分解を防止または治療するためにも有用である。抗体は同様に、特発性肺線維症、糖尿病性腎症、肝炎および肝硬変といったようなさまざまな線維症の治療においても有用であり得る。
【０１６４】
かくして、本発明は、本発明の少なくとも１つのＭＣＰ−１抗体を用いて、当該技術分野において既知のまたは本明細書に記載されている通りに、細胞、組織、器官、動物または患者における少なくとも１つのＭＣＰ−１関連疾患を変調または治療するための方法を提供している。特別な指摘については以下に論述する。
【０１６５】
肺疾患
本発明は同様に、肺炎；肺膿瘍；粉塵、ガスまたは飛沫の形をした作用物質を原因とする職業性肺疾患；喘息、閉塞性繊維性細気管支炎、呼吸不全、過敏性肺炎（外因性アレルギー性肺胞炎）、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症および薬物反応を含む肺の過敏性疾患；成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、グッドバスチャー症候群、慢性閉塞性気道疾患（ＣＯＰＤ）、特発性間質性肺疾患、例えば特発性肺線維症およびサルコイドーシス、剥離性間質性肺炎、急性間質性肺炎、呼吸細気管支炎関連間質性肺疾患、気質性肺炎を伴う特発性閉塞性細気管支炎、リンパ球性間質性肺炎、ランゲルハンス細胞肉芽腫症、特発性肺ヘモジデリン沈着症；急性気管支炎、肺胞タンパク症、気管支拡張症、胸膜疾患、無気肺、嚢胞性線維症および肺腫瘍、および肺栓塞症のうちの少なくとも１つを含む（ただしこれらに限定されるわけではない）、細胞、組織、器官、動物または患者における少なくとも１つの悪性疾患を変調または治療するための方法をも提供している。
【０１６６】
悪性疾患
本発明は同様に、白血病、急性白血病、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、Ｂ−細胞、Ｔ−細胞またはＦＡＢ  ＡＬＬ、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、有毛細胞白血病、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、リンパ腫、ホジキン病、悪性リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、
多発性骨髄腫、カポジ肉腫、直腸結腸癌腫、膵臓癌腫、腎臓細胞癌腫、乳癌、鼻咽頭癌腫、悪性組織球増殖症、腫瘍随伴症候群／悪性高カルシウム血症、充実性腫瘍、腺癌腫、扁平上皮細胞癌腫、肉腫、悪性黒色腫、特に転移性の黒色腫、血管腫、転移性疾患、癌関連骨吸収、癌関連骨痛などのうちの少なくとも１つを含む（ただしこれらに限定されるわけではない）、細胞、組織、器官、動物または患者における少なくとも１つの悪性疾患を変調または治療するための方法をも提供している。
【０１６７】
免疫関連疾患
本発明は同様に関節リウマチ、若年性関節リウマチ、全身発症性若年性関節リウマチ、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、胃潰瘍、血清反応陰性関節症、骨関節炎、炎症性大腸疾患、潰瘍性大腸炎、全身性紅斑性狼瘡、抗リン脂質症候群、虹彩毛様体炎／ブドウ膜炎／視神経炎、特発性肺線維症、全身性血管炎／ヴェーゲナー肉芽腫症、サルコイドーシス、精巣炎／精管切除後再疎通術、アレルギー性／アトピー性疾患、喘息、アレルギー性鼻炎、湿疹、アレルギー性接触皮膚炎、アレルギー性結膜炎、過敏性肺炎、移植、臓器移植拒絶反応、移植片対宿主病、全身性炎症反応症候群、敗血症候群、グラム陽性菌敗血症、グラム陰性菌敗血症、培養陰性敗血症、真菌性敗血症、好中球減少性発熱、尿路性敗血症、髄膜炎菌血症、外傷／出血、火傷、電離放射線曝露、急性膵炎、成人呼吸窮迫症候群、関節リウマチ、アルコール性肝炎、慢性炎症性病理、サルコイドーシス、クローン病病理、鎌状赤血球貧血、糖尿病、ネフローゼ、アトピー性疾患、過敏反応、アレルギー性鼻炎、花粉症、通年性鼻炎、結膜炎、子宮内膜症、喘息、蕁麻疹、全身性アナフィラキシー、皮膚炎、悪性貧血、溶血性疾患、血小板減少症、任意の臓器または組織の移植片拒絶反応、腎臓移植拒絶反応、心臓移植拒絶反応、肝臓移植拒絶反応、膵臓移植拒絶反応、肺移植拒絶反応、骨髄移植片（ＢＭＴ）拒絶反応、皮膚同種移植片拒絶反応、軟骨移植片拒絶反応、骨移植片拒絶反応、小大腸移植片拒絶反応、胎児胸腺移植片拒絶反応、副甲状腺移植片拒絶反応、任意の臓器または組織の異種移植片拒絶反応、同種移植片拒絶反応、抗−レセプター過敏性反応、グレーブス（バゼドウ）病、レーノー病、Ｂ型インスリン抵抗性糖尿病、喘息、重症筋無力症、抗体媒介性細胞毒性、ＩＩＩ型過敏反応、全身性紅斑性狼瘡、ＰＯＥＭＳ症候群（多発性ニューロパシー、臓器巨大症、内分泌障害、モノクローナル高ガンマグロブリン血症および皮膚変化症候群）、多発性ニューロパシー、臓器巨大症、内分泌傷害、モノクローナル高ガンマグロブリン血症、皮膚変化症候群、抗リン脂質症候群、天疱瘡、強皮症、混合結合組織病、特発性アディソン病、真性糖尿病、慢性活動性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、白斑、血管炎、ＭＩ後心臓切開症候群（ｐｏｓｔ−ＭＩ  ｃａｒｄｉｏｔｏｍｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、ＩＶ型過敏性、接触皮膚炎、過敏性肺炎、同種移植片拒絶反応、細胞内生物に起因する肉芽種、薬物感受性、代謝性／特発性、ウィルソン病、ヘモクロマトーシス、α−１−アンチトリプシン欠損症、糖尿病性網膜症、橋本甲状腺炎、骨粗鬆症、視床下部−下垂体−副腎軸評価、原発性胆汁性肝硬変、甲状腺炎、脳脊髄炎、悪液質、嚢胞性線維症、新生児慢性肺疾患、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、家族性血球貪食性リンパ組織球増殖症、皮膚病状態、乾癬、脱毛症、ネフローゼ症候群、腎炎、糸球体腎炎、急性腎臓不全、血液透析、尿毒症、毒性、子癇前症、ＯＫＴ３療法、抗ＣＤ３療法、サイトカイン療法、化学療法、放射線療法（例えば、無力症、貧血、悪液質など、ただしこれらに限定されるわけではない）、慢性サリチル酸中毒などのうちの少なくとも１つを含む（ただしこれらに限定されるわけではない）、細胞、組織、器官、動物または患者における少なくとも１つの免疫関連疾患を変調または治療するための方法をも提供している。例えば、各々その全体が参照により援用されているメルクマニュアル、第１２〜１７版、Ｍｅｒｃｋ  ＆  Ｃｏｍｐａｎｙ、ニュージャージー州Ｒａｈｗａｙ（１９７２年、１９７７年、１９８２年、１９８７年、１９９２年、１９９９年）、薬物療法便覧、ウェルズら編、第２版、Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ａｎｄ  Ｌａｎｇｅ、コネチカット州Ｓｔａｍｆｏｒｄ（１９９８年、２０００年）を参照のこと。
【０１６８】
心臓血管疾患
本発明は同様に、心筋気絶症候群、心筋梗塞、うっ血性心不全、脳卒中、虚血性脳卒中、出血、動脈硬化症、アテローム硬化症、再狭窄、糖尿病性アテローム硬化疾患、高血圧、動脈性高血圧、腎血管性高血圧、失神、ショック、心臓血管系の梅毒、心不全、肺性心、原発性肺高血圧、心臓不整脈、心房異所性拍動、心房粗動、心房細動（持続性または発作性）、潅流後症候群、心肺バイパス炎症性応答、無秩序または多病巣性の心房性頻脈、規則的狭ＱＲＳ頻脈、特異的不整脈、心室細動、ヒス束不整脈、房室ブロック、脚ブロック、心筋虚血性疾患、冠動脈疾患、狭心症、心筋梗塞、心筋症、拡張型うっ血性心筋症、拘束型心筋症、心臓弁膜症、心内膜炎、心膜疾患、心臓腫瘍、大動脈および末梢大動脈瘤、大動脈解離、大動脈の炎症、腹大動脈およびその分岐部の閉塞、末梢血管障害、閉塞性動脈障害、末梢アテローム硬化疾患、閉塞性血栓血管炎、末梢動脈機能障害、レーノー現象および疾患、肢端チアノーゼ、肢端紅痛症、静脈疾患、静脈血栓症、静脈瘤、動静脈瘻、リンパ水腫、脂肪性浮腫、不安定狭心症、再潅流傷害、ポストポンプ症候群（ｐｏｓｔ
ｐｕｍｐ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、虚血性再潅流傷害などのうちの少なくとも１つを含む（ただしこれらに限定されるわけではない）、細胞、組織、器官、動物または患者における少なくとも１つの心臓血管疾患を変調または治療するための方法をも提供している。かかる方法は、場合により、少なくとも１つの抗ＭＣＰ−１抗体を含んでなる有効量の組成物または薬学組成物を、かかる変調、治療または療法を必要としている細胞、組織、器官、動物または患者に対し投与する工程を含んでなる。
【０１６９】
神経系疾患
本発明は同様に、神経変性疾患、多発性硬化症、片頭痛、エイズによる認知症、脱髄疾患、例えば多発性硬化症および急性横断性脊髄炎；錐体外路および小脳疾患、例えば皮質脊髄系の病変；基底核の疾患または小脳疾患；多動性障害、例えばハンチントン舞踏病および老年舞踏病；薬物誘発型運動障害、例えばＣＮＳドーパミンレセプターをブロックする薬剤によって誘発されるもの；運動減退障害、例えばパーキンソン病；進行性核上性麻痺；小脳の構造的病変；脊柱小脳変性、例えば脊髄性運動失調症、フリードライヒ失調症、小脳皮質変性、多系統変性症（メンセル、デジェリン・トーマス、シャイ・ドレガーおよびマチャド・ジョセフ）；全身性疾患（レフサム病、無βリポタンパク血症、運動失調、毛細血管拡張症およびミトコンドリア多系統疾患）；脱髄性コア障害（ｄｅｍｙｅｌｉｎａｔｉｎｇ  ｃｏｒｅ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ）、例えば多発性硬化症、急性横断性脊髄炎；および運動単位、例えば脊髄性筋萎縮症（前角細胞変性、例えば萎縮性側索硬化症、乳児脊髄性筋萎縮症および若年性脊髄性筋萎縮症）；アルツハイマー病；中年期ダウン症候群；びまん性レビー小体病；レビー小体型の老年性認知症；ウエルニッケ・コルサコフ症候群；慢性アルコール中毒；クロイツフェルト・ヤコブ病；亜急性硬化性全脳炎、ハレルフォルデン・スパッツ病；およびボクサー認知症などのうちの少なくとも１つを含む（ただしこれらに限定されるわけではない）、細胞、組織、器官、動物または患者における少なくとも１つの神経系疾患を変調または治療するための方法をも提供している。かかる方法は、場合により、少なくとも１つのＴＮＦ抗体または特定された部分または変異体を含んでなる有効量の組成物または薬学組成物を、かかる変調、治療または療法を必要としている細胞、組織、器官、動物または患者に対し投与する工程を含んで成ることができる。例えば、メルクマニュアル、第１６版、Ｍｅｒｃｋ  ＆  Ｃｏｍｐａｎｙ、ニュージャージー州Ｒａｈｗａｙ（１９９２年）を参照のこと。
【０１７０】
線維性身体条件
上述の身体条件および疾病に加えて、本発明は同様に肝臓線維症（アルコール性肝硬変、ウイルス性肝硬変、自己免疫性肝炎を含むがこれらに限定されるわけではない）；肺線維症（強皮症、特発性肺線維症を含むがこれらに限定されるわけではない）；腎臓線維症（強皮症、糖尿病性腎炎、糸球体腎炎、ループス腎炎を含むがこれらに限定されるわけではない）；皮膚線維症（強皮症、肥厚性およびケロイド瘢痕、火傷を含むがこれらに限定されるわけではない）；骨髄線維症；神経線維腫症；線維腫；腸線維症；および外科手術
の結果としての線維化付着といったようなさまざまな病因の線維性身体条件を変調または治療するための方法をも提供している。
【０１７１】
本発明は同様に、胸部、腹部、頭蓋または口腔外科手術を含めた外科手術に付随する肉体的損傷または外傷のうちの少なくとも１つを含む（ただしこれらに限定されるわけではない）、または創傷が非感染創、挫傷、切創、裂創、非穿通創、開放創、穿通創、穿孔創、穿刺創、感染創、栓塞および皮下創からなる群から選択されている、または創傷が虚血性潰瘍、辱瘡、瘻孔、重度の咬傷、熱傷および採取部位創からなる群から選択されている、または創傷がアフタ創、外傷またはヘルペス関連創である、細胞、組織、器官、動物または患者における少なくとも１つの創傷、外傷または組織傷害またはそれらから生じるか、もしくはそれらに関連する慢性身体条件を変調または治療するための方法をも提供している。ドナー部位創傷は、例えば移植に関連して、体の一部分から体のもう１つの部分への硬組織の除去に関連して発生する創傷である。このような手術の結果としての創傷はきわめて苦痛が激しく、従って治癒の改善は非常に価値のあることである。創傷線維症も同様に、創傷部域に最初に侵入する細胞が好中球とそれに続くマクロファージにより活性化された単球であることから、抗ＭＣＰ−１抗体療法に適している。マクロファージは、それらも病原体の食作用お
よび組織残屑の片付けを担当することから、効率の良い創傷治癒にとって不可欠であると考えられている。さらにこれらは、後続する治癒プロセスの事象に関与する数多くの因子を放出する。マクロファージは、コラーゲンの産生を開始させる線維芽細胞を誘引する。ほぼ全ての組織修復プロセスが早期結合組織形成を含み、このおよび後続するプロセスの刺激が組織の治癒を改善させるが、結合組織およびコラーゲンの過剰産生は、非弾性の低酸素組織として特徴づけされる線維性組織を導く可能性がある。本発明の抗ＭＣＰ−１抗体は、創傷治癒のかかる続発症を変調、治療または予防するための方法において使用可能である。
【０１７２】
本発明の当該抗体は、心臓移植片といったような移植された器官、組織または細胞の慢性的拒絶の少なくとも１つの症候を変調または治療するための方法において使用することもできる。
【０１７３】
抗ＭＣＰ−１抗体のその他の治療的使用
本発明は同様に、細菌性、ウイルス性および真菌性感染、ＨＩＶ感染／ＨＩＶニューロパシー、髄膜炎、肝炎（Ａ，ＢまたはＣ型など）、敗血症性関節炎、腹膜炎、肺炎、咽頭蓋炎、大腸菌０１５７：ｈ７、溶血性尿毒性症候群／血栓溶解性血小板減少性紫斑病、マラリア、デング出血熱、リーシュマニア症、ハンセン病、毒素性ショック症候群、連鎖球菌筋炎、ガス壊疽、ヒト型結核、細胞内トリ型結核菌、ニューモシスティスカリニ肺炎、骨盤炎症性疾患、精巣炎／副睾丸炎、レジオネラ、ライム病、インフルエンザａ、エプスタイン・バールウイルス、ウイルス関連血球貧食症候群、ウイルス脳炎／非感染髄膜炎などを含む急性または慢性細菌感染、急性および慢性寄生性または感染性過程、のうちの少なくとも１つを含む（ただしこれらに限定されるわけではない）細胞、組織、器官、動物または患者における少なくとも１つの感染性疾患を変調または治療するための方法をも提供している。
【０１７４】
本発明のあらゆる方法が、かかる変調、治療または療法を必要としている細胞、組織、器官、動物または患者に対して、少なくとも１つの抗ＭＣＰ−１抗体を含んでなる有効量の組成物または薬学組成物を投与する工程を含んでなることができる。かかる方法は場合によりさらに、少なくとも１つのＴＮＦアンタゴニスト（例えばＴＮＦ抗体またはフラグメント、可溶性ＴＮＦレセプターまたはフラグメント、その融合タンパク質または小分子ＴＮＦアンタゴニスト、ただしこれらに限定されるわけではない）、抗リウマチ剤（例えば、メトトレキサート、オーラノフィン、オーロチオグルコース、アザチオプリン、エタ
ネルセプト、金チオリンゴ酸ナトリウム、硫酸ヒドロキシクロロキン、レフルノミド、スルファサルジン）、筋肉弛緩剤、麻酔薬、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、鎮痛薬、睡眠薬、鎮静剤、局所麻酔剤、神経筋遮断薬、抗菌薬（例えば、アミノグリコシド、抗真菌薬、駆虫薬、抗ウイルス薬、カルバペネム、セファロスポリン、フルオロキノロン、マクロライド、ペニシリン、スルホンアミド、テトラサイクリン、その他の抗菌薬）、乾癬治療薬、コルチコステロイド（デキサメタゾン）、アナボリックステロイド（テストステロン）、糖尿病関連作用剤、ミオネラル、栄養薬、甲状腺作用薬、ビタミン、カルシウム関連ホルモン、止瀉薬、鎮咳薬、制吐薬、抗潰瘍薬、便秘薬、抗凝血剤、エリスロポイエチン（例えば、エポエチンアルファ）、フィルグラスチム（例えば、Ｇ−ＣＳＦ、ニューポゲン）、サルグラモスチム（ＧＭ−ＣＳＦ、ロイキン）、予防接種、免疫グロブリン（リツキシマブ）、免疫抑制薬（例えば、バシリキシマブ、シクロスポリン、ダクリズマブ）、成長ホルモン、ホルモンアンタゴニスト、生殖ホルモンアンタゴニスト（フルタミド、ニルタミド）、ホルモン放出調節因子（ロイプロリド、ゴセレリン）、ホルモン補充薬、エストロゲンレセプター調節物質（タモキシフェン）、レチノイド（トレチノイン）、トポイソメラーゼ阻害剤（エトポシド、イリノテカン）、細胞毒（ドキソルビシン）、散瞳薬、毛様筋調節薬、アルキル化剤（カルボプラチン）、ナイトロジェンマスタード（メルファレン、クロラブシル）、ニトロソウレア（カルムスチン、エストラムスチン）、代謝拮抗物質（メトトレキサート、シタラビン、フルオロウラシル）、分裂抑制剤（ビンクリスチン、タキソール）、放射性医薬品（イオジン１３１−トシツモマブ）、放射性増感剤（ミソニダゾール、チラパザミン）、抗うつ薬、抗躁薬、精神病治療薬、抗不安薬、催眠薬、交換神経様作用薬、興奮剤、ドネペジル、タクリン、喘息治療薬、ベータアゴニスト、吸引ステロイド薬、ロイコトリエン阻害剤、メチルキサンチン、クロモリン、エピネフリンまたは類似体、ドルナーゼアルファ（プルモジム）、サイトカイン（インターフェロンα−２、ＩＬ２）またはサイトカインアンタゴニスト（インフリキシマブ）から選択された少なくとも１つをできる。適切な投薬量は当該技術分野において周知である。例えば、各々全体が本明細書に参照により援用されている、ウェルズら編、「Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ」第２版、Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ａｎｄ  Ｌａｎｇｅ、コネチカット州Ｓｔａｍｆｏｒｄ（２０００年）；「ＰＤＲ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ、Ｔａｒａｓｃｏｎ  Ｐｏｃｋｅｔ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ、２０００」、豪華版、Ｔａｒａｓｃｏｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、カリフォルニア州Ｌｏｍａ  Ｌｉｎｄａ（２０００年）、を参照のこと。
【０１７５】
腫瘍性疾患の治療のための特殊な組合せは、アルキル化剤、ナイトロジェンマスタード、ニトロソウレア、抗生物質、代謝拮抗物質、ホルモンアゴニストまたはアンタゴニスト、免疫調節剤などといったような抗腫瘍薬を、前後および／または同時に投与することによる同時投与または組合せ療法を含んでなる。転移性悪性黒色腫およびその他の腫瘍性疾患で使用するためには、好ましい組合せは、デカルバジン、インターフェロンα、インターロイキン−２、テモゾロミド、シスプラチン、ビンブラスチン、メシル酸イマチニブ、カルムスチン、パクリタキセルなどと共に抗体を同時投与することにある。転移性黒色腫のためには、デカルバジンが好ましい。
【０１７６】
１１．投薬量と投与方法
本発明の方法は、かかる変調、治療または療法を必要とする細胞、組織、器官、動物または患者に対して少なくとも１つの抗ＭＣＰ−１抗体を含んでなる有効量の組成物または薬学組成物を投与する工程を含んでなる、ＭＣＰ−１媒介型障害を治療するための方法を含んでなり得る。かかる方法は、かかる疾病または障害を治療するための同時投与または組合せ療法を場合によりさらに含んでなり、ここで前記少なくとも１つの抗ＭＣＰ−１抗体、その特定された部分または変異体の投与工程はさらに、前後および／または同時に、腎臓作用薬、皮膚病薬、抗血管形成薬、抗感染症薬、心臓血管（ＣＶ）系作用薬、中枢神経系（ＣＮＳ）薬、自律神経系（ＡＮＳ）薬、呼吸管薬、消化（ＧＩ）管作用薬、ホルモ
ン薬、体液または電解質平衡のための作用薬、血液製剤、抗新生物薬、免疫調節薬、眼科耳鼻科薬、局所作用薬、栄養薬など、少なくとも１つのＴＮＦアンタゴニスト（例えば、ＴＮＦ抗体またはフラグメント、可溶性ＴＮＦレセプターまたはフラグメント、その融合タンパク質、または小分子ＴＮＦアンタゴニスト、ただしこれらに制限されない）、抗リウマチ剤（例えば、メトトレキサート、オーラノフィン、オーロチオグルコース、アザチオプリン、エタネルセプト、金チオリンゴ酸ナトリウム、硫酸ヒドロキシクロロキン、レフルノミド、スルファサルジン）、筋肉弛緩剤、睡眠薬、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、鎮痛薬、麻酔剤、鎮静剤、局所麻酔剤、神経筋遮断薬、抗菌薬（例えば、アミノグリコシド、抗真菌薬、駆虫薬、抗ウイルス薬、カルバペネム、セファロスポリン、フルオロキノロン、マクロライド、ペニシリン、スルホンアミド、テトラサイクリン、その他の抗菌薬）、乾癬治療薬、コルチコステロイド、アナボリックステロイド、糖尿病関連作用剤、ミネラル、栄養薬、甲状腺作用薬、ビタミン、カルシウム関連ホルモン、止瀉薬、鎮咳薬、制吐薬、抗潰瘍薬、便秘薬、抗凝血剤、エリスロポイエチン（例えば、エポエチンアルファ）、フィルグラスチム（例えば、Ｇ−ＣＳＦ、ニューポゲン）、サルグラモスチム（ＧＭ−ＣＳＦ、ロイキン）、予防接種、免疫グロブリン、免疫抑制薬（例えば、バシリキシマブ、シクロスポリン、ダクリズマブ）、成長ホルモン、ホルモン補充作用薬、エストロゲンレセプター調節物質、散瞳薬、毛様筋調節薬、アルキル化剤、代謝拮抗物質、分裂抑制剤、放射性医薬品、抗うつ薬、抗躁薬、精神病治療薬、抗不安薬、催眠薬、交換神経様作用薬、興奮剤、ドネペジル、タクリン、喘息治療薬、ベータアゴニスト、吸引ステロイド薬、ロイコトリエン阻害剤、メチルキサンチン、クロモリン、エピネフリンまたは類似体、ドルナーゼアルファ（プルモジム）、サイトカインまたはサイトカインアンタゴニストから選択された少なくとも１つのものを投与することを含んでなる。かかる薬物は、本明細書に提示されている各々についての処方、適応症、用量決定および投与を含めて、当該技術分野において周知である（例えば各々その全体が本明細書に参照により援用されている「Ｎｕｒｓｉｎｇ  ２００１  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ」、第２１版、Ｓｐｒｉｎｇｈｏｕｓｅ  Ｃｏｒｐ．、ペンシルバニア州Ｓｐｒｉｎｇｈｏｕｓｅ、２００１年；「Ｈｅａｌｔｈ  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ‘ｓ  Ｄｒｕｇ  Ｇｕｉｄｅ  ２００１」、シャノン、ウィルソン、スタン編、Ｐｒｅｎｔｉｃｅ−Ｈａｌｌ、Ｉｎｃ、ニュージャージー州Ｕｐｐｅｒ  Ｓａｄｄｌｅ  Ｒｉｖｅｒ；「Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ」、ウェルズら編、Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ、コネチカット州Ｓｔａｍｆｏｒｄ、を参照のこと）。
【０１７７】
標準的には、病的状態の治療は、組成物の中に含まれているものの比活性に応じて合計で１用量あたり患者の体重１ｋｇあたり平均して少なくとも約０．０１〜５００ミリグラムの少なくとも１つの抗ＭＣＰ−１抗体の範囲、好ましくは、単回または多数回投与あたり患者の体重１ｋｇにつき平均して少なくとも約０．１〜１００ミリグラムの抗体の範囲となる有効量または投薬量の少なくとも１つの抗ＭＣＰ−１抗体組成物を投与することによって行なわれる。代替的には、有効な血清濃度は、単回または多数回投与あたり０．１〜５０００μｇ／ｍｌの血清濃度を含むことができる。適切な投薬量は医療従事者にとって既知であり、当然のことながら、特定の疾病状態、投与対象の組成物の比活性および治療対象の特定の患者によって左右されることになる。一部のケースでは、所望の治療量を達成するためには、反復投与すなわち特定の監視されたまたは計量された用量の反復的な個々の投与を提供することが必要であり得、この場合、個々の投与は、所望の日用量または効果が達成されるまで反復される。
【０１７８】
好ましい用量としては、場合により、投与１回、体重１ｋｇあたり０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４
８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９および／または１００〜５００ｍｇまたはその任意の範囲、値または分散(fraction)、または単回または多数回投与あたり０．１、０．５、０．９、１．０、１．１、１．２、１．５、１．９、２．０、２．５、２．９、３．０、３．５、３．９、４．０、４．５、４．９、５．０、５．５、５．９、６．０、６．５、６．９、７．０、７．５、７．９、８．０、８．５、８．９、９．０、９．５、９．９、１０、１０．５、１０．９、１１、１１．５、１１．９、２０、１２．５、１２．９、１３．０、１３．５、１３．９、１４．０、１４．５、４．９、５．０、５．５、５．９、６．０、６．５、６．９、７．０、７．５、７．９、８．０、８．５、８．９、９．０、９．５、９．９、１０、１０．５、１０．９、１１、１１．５、１１．９、１２、１２．５、１２．９、１３．０、１３．５、１３．９、１４、１４．５、１５、１５．５、１５．９、１６、１６．５、１６．９、１７、１７．５、１７．９、１８、１８．５、１８．９、１９、１９．５、１９．９、２０、２０．５、２０．９、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９６、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、
１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００および／または５０００μｇ／ｍｌまたはその任意の範囲、値または分散の血清濃度を達成するための用量が含まれ得る。
【０１７９】
代替的には、投与された投薬量は、特定の作用物質の薬力学的特性およびその投与様式および投与経路；レシピエントの年令、健康状態および体重；症候の内容および範囲、同時治療の種類、治療の頻度、および所望の効果といったような既知の因子に応じて変動し得る。通常、活性成分の投薬量は、体重１キロあたり約０．１〜１００ミリグラムであり得る。所望の結果を得るためには、持続放出形態でまたは投与一回あたり１キログラムにつき通常０．１〜５０、好ましくは０．１〜１０ミリグラムが有効である。
【０１８０】
制限的な意味のない例としては、ヒトまたは動物の治療は、単回用量、注入量または反復用量を用いて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０日目のうちの少なくとも１つの日に、又、代替的にまたは付加的には１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１または５２週目のうちの少なくとも１つの週、又、代替的にまたは付加的には、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０年のうちの少なくとも１つの間、またはそのいずれかの組合せで、一日あたり体重１ｋｇにつき０．５、０．９、１．０、１．１、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０または１００ｍｇといった０．１〜１００ｍｇ／ｋｇの１回または周期的投薬量の本発明の少なくとも１つの抗体として、提供可能である。
【０１８１】
内部投与に適した剤形（組成物）は一般に、一単位または一容器あたり約０．００１〜約５００ミリグラムの活性成分を含有する。これらの薬学組成物においては、活性成分は通常、組成物の合計重量に基づいて約０．５〜９９．９９９重量％の量で存在することに
なる。
【０１８２】
非経口投与のためには、抗体を、製薬学的に受容可能な非経口ビヒクルと合わせた状態のまたはそれと別途供給される溶液、懸濁液、エマルジョン、粒子、粉末、または凍結乾燥された粉末として処方され得る。かかるビヒクルの例としては、水、生理食塩水、リンガー溶液、デキストロース溶液、および１〜１０％のヒト血清アルブミンがある。リポソームおよび非水性ビヒクル例えば固定油も同様に使用可能である。ビヒクルまたは凍結乾燥された粉末は、等張性（例えば塩化ナトリウム、マンニトール）および化学的安定性（例えば緩衝液および防腐剤）を維持する添加剤を含有し得る。処方物は、既知のまたは適切な技術により滅菌される。適切な製薬学的担体は、この分野での標準的参考テキストである「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、Ａ．オソール編の最新版の中で記載されている。
【０１８３】
代替的投与
本発明に従った少なくとも１つの抗ＭＣＰ−１抗体を製薬学的に有効な量だけ投与するために数多くの既知のおよび開発された投与様式を本発明に従って使用することができる。以下の記述では肺投与が用いられているが、本発明に従ってその他の投与様式を使用して、適当な結果を得ることもできる。本発明のＭＣＰ−１抗体は、担体中で、溶液、エマルジョン、コロイドまたは懸濁液としてまたは乾燥粉末として、吸入によるかまたは当該技術分野の範囲内のまたは当該技術分野で既知の本明細書に記載したその他の様式による投与に適したさまざまなデバイスおよび方法のいずれかを用いて送達可能である。
【０１８４】
非経口処方物および投与
非経口投与のための処方は、一般的賦形剤として滅菌水または生理食塩水、ポリアルキレングリコール例えばポリエチレングリコール、植物性油、水素化ナフタリンなどを含有し得る。注射用の水性または油性懸濁液は、既知の方法に従って、適切な乳化剤または加湿剤および懸濁剤を使用することによって調製可能である。注入剤は、溶媒中の無菌注射溶液または懸濁液または水溶液といった非毒性で経口投与不能の希釈剤であり得る。使用可能なビヒクルまたは溶媒としては、水、リンガー溶液、等張食塩水などが許容される。通常の溶媒または懸濁溶媒としては、無菌不揮発性油を使用することができる。これらの目的では、天然または合成のまたは半合成の脂肪油または脂肪酸；天然または合成または半合成のモノまたはジまたはトリグリセリドを含めた、あらゆる種類の不揮発性油および脂肪酸を使用することができる。非経口投与は当該技術分野において既知であり、これには当該技術分野において周知の通りの従来の注射手段、ガス加圧式無針注入デバイスまたはレーザー穿孔機デバイスが含まれるがこれらに限定されるわけではない（例えば全体が本明細書に参照により援用されている米国特許第５，８５１，１９８号明細書および米国特許第５，８３９，４４６号明細書に開示されている材料および方法、これらに限定されるわけではない）。
【０１８５】
代替的送達
本発明はさらに、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、関節内、気管支内、腹内、関節包内、軟骨内、洞内、腔内、小脳内、脳室内、結腸内、頚管内、胃内、肝内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊髄内、液嚢内、胸郭内、子宮内、膀胱内、病巣内、ボーラス、膣内、直腸、口腔内、舌下、鼻腔内、または経皮手段による少なくとも１つの抗ＭＣＰ−１抗体の投与に関する。少なくとも１つの抗ＭＣＰ−１抗体組成物を、特に液体溶液または懸濁液の形での非経口（皮下、筋肉または静脈内）またはその他のあらゆる投与に使用するため；クリームまたは座薬といった（ただしこれらに限定されるわけではない特に半固体形態での膣内または直腸内投与で使用するため；錠剤またはカプセルの形での（ただしこれらに限定されるわけではない）口腔内または舌下投与のため；または粉末、点鼻薬、またはエアロゾルまたは一部の
作用物質の形で（ただしこれらに限定されるわけではない）鼻腔内で；または皮膚構造を修飾するかまたは経皮パッチ内の薬物濃度を増大させるためジメチルスルホキンドといったような化学的エンハンサを伴う（全体が本明細書に参照により援用されているユンギンガー（Ｊｕｎｇｉｎｇｅｒ）ら、「Ｄｒｕｇ  Ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ  Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ」；シエ（Ｈｓｉｅｈ）、Ｄ．Ｓ．編、５９〜９０頁（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ１９９４年、）または皮膚上へのタンパク質およびペプチドを含有する処方の塗布（国際公開第９８／５３８４７号パンフレット）または電気穿孔といった過渡的輸送経路を作り出すかまたはイオントフォレーシスといったように皮膚を通して荷電薬物の易動性を増大させるための電界の適用、またはソノフォレーシスといったような超音波の適用（米国特許第４，３０９，９８９号明細書および同第４，７６７，４０２号明細書）を可能にする酸化剤を伴うゲル、軟こう、ローション、懸濁液またはパッチ送達系といった（ただしこれらに限定されるわけではない）ように経皮的に投与するために、調製することができる（上述の刊行物および特許はその全体が本明細書に参照により援用されている）。
【０１８６】
肺／鼻腔内投与
肺投与のためには、好ましくは少なくとも１つの抗−ＭＣＰ−１抗体組成物が、肺または洞の下気道に達するのに有効な粒度で送達される。本発明に従うと、少なくとも１つの抗ＭＣＰ−１抗体は、吸入される治療薬の投与のため当該技術分野において既知のさまざまな吸入または鼻腔内デバイスのいずれかにより送達可能である。患者の洞腔または肺胞内にエアロゾル化した処方物を被着させる能力のあるこれらのデバイスには、計量式吸入器、ネブライザ、乾燥粉末発生器、噴霧器などが含まれる。当該技術分野においては、抗体の肺または鼻腔内投与を導くのに適したその他のデバイスも知られている。このようなデバイスは全てエアロゾル中の抗体送り出しのための投与に適した処方物を使用することができる。かかるエアロゾルは、溶液（水性および非水性の両方）または固体粒子のいずれかで構成され得る。Ｖｅｎｔｏｌｉｎ（登録商標）計量式吸入器のような計量式吸入器は推進剤ガスを使用し、標準的に、吸息中の作動を必要とする（例えば、国際公開第９４／１６９７０号パンフレット、国際公開第９８／３５８８８号パンフレットを参照のこと）。例えばＴｕｒｂｕｈａｌｅｒＴＭ（アストラ（Ａｓｔｒａ））、Ｒｏｔａｈａｌｅｒ（登録商標）（グラクソ（Ｇｌａｘｏ））、Ｄｉｓｋｕｓ（登録商標）（グラクソ）、ＳｐｉｒｏｓＴＭ吸入器（ドュラ（Ｄｕｒａ））、インヘイル・テラプティックス（Ｉｎｈａｌｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）により市販されているデバイス、およびＳｐｉｎｈａｌｅｒ（登録商標）パウダー吸入器（ファイソンズ（Ｆｉｓｏｎｓ））といったような乾燥粉末吸入器は、混合粉末の呼気作動を用いる（米国特許第４６６８２１８号明細書（アストラ）、欧州特許第２３７５０７号明細書（アストラ）、国際公開第９７／２５０８６号パンフレット（グラクソ）、国際公開第９４／０８５５２号（ドュラ）、米国特許第５４５８１３５号明細書（インヘイル）、国際公開第９４／０６４９８号パンフレット（ファイソンズ）はその全体が本明細書に参照により援用されている）。ＡＥＲｘＴＭアラダイム（Ａｒａｄｉｇｍ）、Ｕｌｔｒａｖｅｎｔ（登録商標）ネブライザ（マリンクロッド（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ））、およびＡｃｏｒｎ  ＩＩ（登録商標）ネブライザ（マークエスト・メディカル・プロダクツ（Ｍａｒｑｕｅｓｔ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ））（米国特許第５４０４８７１号明細書、アラダイム、国際公開第９７／２２３７６号パンフレット）といったネブライザ（以上の参考文献はその全体が本明細書に参照により援用されている）は、溶液からエアロゾルを生成するのに対し、計量式吸入器、乾燥粉末吸入器、などは小粒子エアロゾルを生成する。市販の吸入デバイスのこれらの特異的例は、本発明の実施に適した特定的デバイスを代表するものとして意図されており、本発明の範囲を制限するものとして意図されていない。好ましくは、少なくとも１つの抗ＭＣＰ−１抗体を含む組成物は、乾燥粉末吸入器または噴霧器によって送達される。本発明の少なくとも１つの抗体を投与するための吸入デバイスには複数の望ましい特長が存在する。例えば、吸入デバイスによる送達は、有利には信頼性が高く、再現可能でありかつ
精確である。吸入デバイスは場合により、うまく呼吸できるように例えば約１０μｍ未満、好ましくは約１〜５μｍの小さな乾燥粒子を送達することができる。
【実施例】
【０１８７】
実施例１：制限的な意味のない例としてファージ表示法を用いたＭＣＰ−１に特異的なＭＣＰ−１抗体の生成
出願人らは、Ｃ７７５と呼ばれかつ出願人の同時係属特許出願である米国特許出願第１１／１７０４５３号明細書（それぞれ重鎖および軽鎖可変領域についてのこの出願の配列番号７および８）および関連する出願の中で記載されているマウス抗ヒトＭＣＰ−１抗体の望ましい治療特性について、以前に示した。当該研究努力の目標は、ヒトケモカインＭＣＰ−１の生物活性を中和し類似の属性を提示するＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤ（登録商標）からの少なくとも１つのヒト抗体を同定することにあった。Ｃ７７５抗体ひいては所望のヒト抗ＭＣＰ−１抗体の属性を、以下に概略的に示した成功基準により定義づけした。
少なくとも１つの治療用抗体のための成功基準：
−  固相形式でヒトＭＣＰ−１に結合する；
−  相同タンパク質ヒトＭＣＰ−２、３、４およびヒトエオタキシン１、２、および３に対する１００ｎＭでの結合の欠如として特異性が定義づけされる。
−  Ｔｈｐ−１細胞上のそのヒトレセプターＣＣＲ２に対するヒトＭＣＰ−１結合を阻害し、ＩＣ５０の値は基準ＦａｂＣ７７５の場合より低い。
−  ＴＨＰ−１細胞のヒトＭＣＰ−１媒介型走化性を阻害し、ＩＣ５０の値は基準ＦａｂＣ７７５の場合よりも低い。
−  定量的検定において基準ＦａｂＣ７７５に匹敵する効力で、または定性的イエス／ノー基準として、第２の生物学的検定（例えばＣａ２＋可動化またはＣＣＬ−２誘発されたレセプター内在化）におけるヒトＭＣＰ−１媒介型活性を阻害する。
−  Ｋｄ＜０．５ｎＭでヒトＭＣＰ−１に結合する。
−  ＫＤ＜２０ｎＭ、好ましくは＜１０ｎＭで、カニクイザルＭＣＰ−１に結合する；
−  匹敵する効力で未変性ヒトＭＣＰ−１および化学合成されたヒトＭＣＰ−１生物活性を阻害する。
−  比較器としてのＣ７７５の全長ＩｇＧ形態に基づいて、ＩｇＧとしてのＦａｂの再工学処理の後基準１〜８を保持する。
【０１８８】
選択プロセスの要約
ＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤ（登録商標）を用いて異なるパニングを実施し、１７８５６個のクローンをスクリーニングし、結果として１１０４の一次ヒットを得た。最終的に、ＥＬＩＳＡにおいて合成ヒトＭＣＰ−１を結合する２６のユニークＦａｂを同定した。これらのうち、カニクイザルおよび未変性ヒトＭＣＰ−１に対する親和性、生物活性、特異性および結合に従って、親和性成熟について７個の異なるＦａｂを選択した。親Ｆａｂの親和性は、１０〜４００ｎＭの範囲内にあり、放射性リガンド結合検定におけるＩＣ５０値は、１０〜６００ｎＭであった。
【０１８９】
材料および方法
ＤＮＡ制限および修飾酵素ならびにポリメラーゼを、インビトロジェン（米国カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）、ニューイングランド・バイオラブス（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）（米国マサチューセッツ州Ｂｅｖｅｒｌｙ）、ロシュ・ダイアグノステックス（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）（ドイツ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ）およびＭＢＩフェルメンタス（リトアニア、Ｖｉｌｎｉｕｓ）から購入した。フラグメント特異的でＰＯＤコンジュゲートされたヤギ抗ヒトＩｇＧＦ（ａｂ’）２は、ジャクソンズ（Ｊａｃｋｓｏｎｓ）（米国ペンシルバニア州Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ）により供給され、Ｆｄフラグメント特異的なヒツジ抗ヒトＩｇＧ抗体はザ・バインディング・サイト（Ｔｈｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅ）（英国Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ）により供給され、アルカ
リホスファターゼにコンジュゲートされたストレプトアビジン（ＺｙＭＡＸＴＭグレード）はザイメド・ラボラトリーズ（Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（米国カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）によりコンジュゲートされた。組換え型ヒトケモカイン、ｈＭＣＰ−１、２、３、４およびｈエオタキシン１、２および３（ＲアンドＤシステムズ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ））試薬、リガンドおよび抗体：ヒトＭＣＰ−１特異的ｍＡｂ２７９、（ＲアンドＤシステムズ）；合成ｈＭＣＰ−１（ベイケム（Ｂａｃｈｅｍ））；ｍＡｂｌマウス抗ｈＣＣＲ２ビオチン（ＲアンドＤシステムズ）；ヒトガンマグロブリン（ジャクソンズ・イムノ・リサーチ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ））；マウスガンマグロブリン（ジャクソンズ・イムノ・リサーチ）；ｍＡｂ
ｍＩｇＧ２ｂイソタイプ制御ビオチン（ＲアンドＤシステムズ）；ストレプトアビジン−ＰＥ（ＢＤファルミゲン（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ））；Ｖｅｒｓｅｎｅ（インビトロジェン；ＰＢＳ（インビトロジェン）；ＦＣＳ（ＰＡＮ）；Ｖ底ウェル平板（グレイナー（Ｇｒｅｉｎｅｒ））；およびＵ底ウェル平板（ナンク（Ｎｕｎｃ））。
【０１９０】
ＭＣＰ−１ポリペプチドおよび類似体の調製
出願人の同時係属出願である米国仮特許出願第６０／６８２６２０号明細書およびクラスジンスキー（Ｋｒｕｓｚｙｎｓｋｉ）ら、２００６年、Ｊ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｃｉ．第１２巻：２５〜３２頁内で記載されている通りの生物活性をもつ、単離された全長かつ成熟（７６個のアミノ酸）し適正に折畳まれ場合により修飾されたヒトＭＣＰ−１および変異体を提供するための、段階的な固相ペプチド合成および親和性精製。未変性表面トポロジーおよびペプチド主鎖構造を示すように設計された変異体は、Ａ４０Ｓ、Ｖ４１ＩおよびＦ４３Ｙを内含する。化学合成は同様に、レセプター結合に関与しないリジンのイプシロンアミノ基を用いたヒトＭＣＰ−１の部位特異的ビオチニル化のための方法を提供しており、そうでなければＫ６９およびＫ７５における表面活性は構造内で無秩序化される（米国仮特許出願第６０／６８２６２０号明細書およびクラスジンスキーら、２００６年、Ｊ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｃｉ．第１２巻：３５４〜３６０頁）。４つのエチレンオキシ単位（ＰＥＧ４）の親水性スペーサが、リジン残基のε−アミノ基とビオチンの間に挿入された。ビオチンアミドから末端カルボシルまでの鎖長は１９．２Åである。スペーサは、溶解度を増大させストレプトアビジンコンジュゲートを結合させるのに充分なスペーサ長を提供するように選択された。ＭＣＰ−１および変異体の配列は、配列番号１に記されている。変異体は、ＴＨＰ−１細胞内でＣａ２＋可動化を誘発する能力を保持するものと判定された。スクリーニング、確立および親和性判定において並列してビオチン・Ｌｙｓ６９およびビオチン・Ｌｙｓ７５ＭＣＰ−１を比較し、有意な差異は全く観察されなかった。バイアコアを用いて、３５個の最適化したＦａｂをＭＣＰ−１Ｉｌｅ４１、Ｌｙｓ（ビオチン−ＰＥＧ４）６９およびＭＣＰ−１Ｉｌｅ４１上で分析し、並行してＬｙｓ（ビオチン−ＰＥＧ４）７５をストレプトアビジンチップ上で固定化した。一般に、ＭＣＰ−１Ｋ６９およびＫ７５上での測定された親和性は比較可能なものであった。
【０１９１】
ファージＦａｂライブラリ
ファージミドライブラリは、ＨｕＣＡＬ（登録商標）の概念（クナピックら、２０００年）に基づくものであり、ファージ表面上でＦａｂを提示するためにＣｙｓ  ＤｉｓｐｌａｙＴＭ技術を用いている（ローニング（Ｌｏｅｈｎｉｎｇ）、２００１年）。該ライブラリは、小外皮タンパク質ｐＩＩＩに対する融合としてＭ１３バクテリオファージ上に提示された約１０１０個のユニークＦａｂをコードする。選択のため、ＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤ（登録商標）抗体−ファージを、異なるＶＨマスター遺伝子を含む３つのプールに分割した。さらに、１つのプール（ＶＨ１−６）中で全ライブラリを使用した。各パニングのために２×１０１３個のＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤ（登録商標）投入ファージを使用した。それぞれヒトＭＣＰ−１類似体１（Ｖ４１Ｉ、Ｉｌｅ４１）および類似体−２（Ｆ４３Ｙ、Ｔｙｒ４３）についての３回のパニングラウンドおよび１−２−１および２−１−２の順での類似体に対する２つの交互パニングを含め、４つの異なるパニング戦略を適用した。
【０１９２】
固相パニング
４℃で一晩、Ｍａｘｉｓｏｒｐ（登録商標）ウェル（ナルゲン・ヌンク（Ｎａｌｇｅｎ
Ｎｕｎｃ、ニューヨーク州Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ）上でＰＢＳ中５０μｇ／ｍｌ、ｐＨ７．４でヒトＭＣＰ−１類似体−１（Ｖ４１Ｉ）または類似体−２（Ｆ４３Ｙ）の１００μｌのアリコートを直接コーティングした。コーティングされたウェルを洗浄し、５％のＭＰＢＳ（ＰＢＳ、５％の低脂肪粉乳）で遮断した。１ウェルあたり１００μｌの遮断したＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤ（登録商標）ファージを室温で２時間添加した。複数の洗浄工程の後、結合したファージを１０分間室温でインキュベートしたｐＨ８．０の１０ｍＭのトリス／ＨＣｌ中の１００μｌの２０ｍＭＤＴＴによって溶出させた。中相大腸菌ＴＧ１（ストラタジーン、オランダ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）を感染させるために該溶出液を使用し、記載されている通りに（クレブス（Ｋｒｅｂｓ）ら、２００１）ファージミドを増幅させた。
【０１９３】
中和Ｆａｂ分子を結果としてもたらすヒトＭＣＰ−１類似体−１（Ｖ４１Ｉ）および類似体−２（Ｆ４３Ｙ）に対する半溶解パニング。溶解状態のＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤ（登録商標）ファージと共に２つのビオチニル化されたヒトＭＣＰ−１誘導体、Ｖ４１Ｉ、Ｋ６９−ＰＥＧ−ビオチンまたはＶ４１Ｉ、Ｋ７５−ＰＥＧ−ビチオン（配列番号１）をインキュベートしその後Ｒｅａｃｔｉ−Ｂｉｎｄのニュートラビジン（Ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ）でコーティングされたポリスチレンマイクロタイター平板ストリップ（ＰＥＲＢＩＯ）にファージ抗原複合体を捕捉することにより、半溶解パニングを実施した。パニングのためには、１．５ｍｌ入りのエッペンドルフ管を４℃でＰＢＳＯ／Ｎで１対１希釈したケミブロッカ（ケミコンインターナショナル）で遮断させた。翌日、Ｒｅａｃｔｉ  ＢｉｎｄＴＭニュートラビジン（ピアース（Ｐｉｅｒｃｅ）、米国イリノイ州Ｒｏｃｋｆｏｒｄ）マイクロタイター平板ストリップ（結合能力：２５Ｐｍｏｌｅｓビオチン／ウェル；ＰＥＲＢＩＯ）を、ニュートラビジン結合剤の数を削減するための２回の予備吸着工程に必要な２×３００μｌＰＢＳで洗い流した。１００μｌの５０％ケミブロッカー（ケミコン）、０．０５％トゥイーン２０（シグマ）中のＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤ（登録商標）ライブラリからの１ウェルあたり２×１０１３個のファージを添加し、穏やかに振とうさせながら室温で１時間遮断させた。２回目の予備吸着工程のために、ファージ溶液を新しいＲｅａｃｔｉ−Ｂｉｎｄニュートラビジンがコーティングされたポリスチレンマイクロタイター平板ストリップに移し、穏やかに振とうしながら室温で１時間インキュベートした。その後、予備吸着したファージおよびビオチニル化抗原（ビオチニル化のためには３：１のビオチン対抗原比：２００ｎＭの最終濃度）を予め遮断した１．５ｍｌのエッペンドルフ管に添加し、回転ホイール上で室温で１時間インキュベートした。並行して、２×３００μｌのＰＢＳでさらなるＲｅａｃｔｉ−Ｂｉｎｄ  Ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎコーティングされたポリスチレンマイクロタイター平板ストリップを洗い流し、１時間ＰＢＳで１：１希釈した３００μｌのケミブロッカーで遮断させ、１×３００μｌのＰＢＳで洗浄した。マイクロタイター平板ストリップ内に１ウェルあたり１００μｌのビオチン−抗原−ファージ複合体をピペットでとり、穏やかに振とうしながら室温で一時間インキュベートした。複数の洗浄工程の後、１０分間室温でインキュベートさせたｐＨ８．０の１０ｍＭのトリス／Ｈｃｌ中で１１０μｌの２０ｍＭのＤＴＴにより結合したファージを溶出させた。溶出液は、中相大腸菌ＴＧ１（ストラタジーン、オランダＡｍｓｔｅｒｄａｍ）を感染させるために使用され、記載されている通りに（クレブスら、２００１年）ファージミドを増幅させた。
【０１９４】
選択されたＦａｂフラグメントのサブクローニングおよびミクロ発現。可溶性Ｆａｂの急速な発現を促進するため、ＸｂａＩおよびＥｃｏＲＩを介して発現ベクターｐＭＯＲＰＨ（登録商標）×９＿ＦＨ内に、選択されたＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤ（登録商標）ファージのインサートをコードするＦａｂをサブクローニングした。ＦａｂフラグメントはＣ末端
ＦＬＡＧＴＭタグ（（プリケット（Ｐｒｉｃｋｅｔｔ）ら、１９８９年）そして第２のＣ末端タグとして６×Ｈｉｓ−タグ（チェン（Ｃｈｅｎ）ら、１９９４年））を担持している。ＴＧ１−Ｆ−単―クローンの形質転換後、ＨｕＣＡＬ（登録商標）−Ｆａｂフラグメントを含有するペリプラズム抽出物の発現および調製が、先に記述された通り（（ラウヘンベルガー（Ｒａｕｃｈｅｎｂｅｒｇｅｒ）ら、２００３年）に実施された。
【０１９５】
上述の通りに、ヒトＭＣＰ−１類似体―１（Ｖ４１Ｉ）についての固相形式結合検定を実施した。遮断の後、ペリプラズム抽出物を添加した。ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント特異的抗体と共にインキュベートすることにより、Ｆａｂ−フラグメントの検出を実施した。
【０１９６】
４℃で１６時間ｐＨ７．４のＰＢＳ中で希釈させた０．５μｌ／ｍのビオチニル化ｈＭＣＰ−１類似体−１（Ｖ４１Ｉ）または類似体−２（Ｆ４３Ｙ）２０μｌでコーティングしたＲｅａｃｔｉ−ＢｉｎｄＴＭニュートラビジンＴＭ３８４ウェル平板（ピアース、米国イリノイ州Ｒｏｃｋｆｏｒｄ）を用いて、固定化したビオチニル化ｈＭＣＰ−１Ｖ４１Ｉについてのスクリーニングを実施した。室温で１時間、ＴＢＳ中の１％ＢＳＡ、０．０５％のトゥイーン２０（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、米国ミズーリ州Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ））で遮断した後、ペリプラズム抽出物を添加した。ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント特異的抗体とのインキュベーションにより、Ｆａｂ−フラグメントの検出を実施した。
【０１９７】
４℃で１６時間ｐＨ７．４のＰＢＳ中で１：１０００希釈させた２０μｌのヒツジ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｄフラグメント特異的抗体でＭａｘｉｓｏｒｐ（ヌンク（Ｎｕｎｃ）、米国ニューヨーク州Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ）３８４ウェル平板をコーティングすることにより、ビオチニル化ｈＭＣＰ−１類似体−１（Ｖ４１Ｉ）での溶液相スクリーニングを実施した。室温で２時間、ＴＢＳ中の３％のＢＳＡ、０．０５％のトゥイーン２０（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、米国ミズーリ州Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ））で遮断させた後、ペリプラズム抽出物を添加した。その後、捕捉されたＨｕＣＡＬ（登録商標）−ＦａｂフラグメントをＴＢＳ中の０．２μｇ／ｍｌのビオチニル化ｈＭＣＰ−１類似体−１（Ｖ４１Ｉ）に結合させ、これをアルカリホスファターゼにコンジュゲートされたストレプトアビジンでのインキュベージョンとそれに続くＡｔｔｏ  Ｐｌｏｓ蛍光基質（ロシュ・ダイアグノステックス、ドイツ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ）の添加により検出した。５３５ｎｍの蛍光放射を、４３０ｎｍの励起で記録した。
【０１９８】
生物活性検定
細胞培養
加湿されたインキュベータの中で３７℃、５％ＣＯ２で標準化された条件下で全ての細胞を培養した。標準培地内で、ＣＣＲ２を発現する細胞を成長させた。さらに、２ｍＭのＬ−グルタミン１．５ｇ／Ｌの重炭酸ナトリウム、４．５ｇ／Ｌのグルコース、１０ｍＭのＨＥＰＥＳおよび１．０ｍＭのピルビン酸ナトリウムを含有するＲＰＭＩ９０％；１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ；Ｖｉｔａｃｅｌｌ  ＲＰＭＩ２０−２００１、ＡＴＣＣ、バージニア州Ｍａｎａｓｓａｓ）の中で３７℃、５％ＣＯ２で、４〜８×１０５細胞／ｍＬの密度で、ＴＨＰ−１細胞（ヒト急性単球性白血病細胞）を培養させた。
【０１９９】
放射性リガンド結合検定。  ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）フィルタ平板、（マサチューセッツ州Ｂｅｄｆｏｒｄのミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））内で競合検定を実施した。異なる濃度の組換え型ヒト（ｒｈ）ＭＣＰ−１（２７９−ＭＣ、ＲアンドＤシステムズ、ミネソタ州Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ）または合成タンパク質と合わせて１２５Ｉ−ＭＣＰ−１（１ｎｇ／ｍｌ；パーキンエルマ・ライフサイエンス（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）、マサチューセッツ州Ｂｏｓｔｏｎ）と共に１×１０６
個のＴＨＰ−１細胞／ウェルをインキュベートした。ＲＰＭＩ培地１６４０（インビトロジェン、ニューヨーク州Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ）および０．１％のＢＳＡから成る結合緩衝液中で全ての試薬を希釈させた。競合を室温で１時間進行させ、１５０μｌ／ウェルの洗浄緩衝液（結合緩衝液＋１ＭのＮａＣｌ）で３回ウェルを洗浄した。Ｗａｌｌａｃ
Ｗｉｚａｒｄ１４７０自動ガンマ計数器（パーキンエルマ・ライフサイエンシーズ、マサチューセッツ州Ｂｏｓｔｏｎ）を用いてフィルタ上の放射能を計数した。変動する用量の組換え型または合成ＭＣＰ−１のいずれかによる１２５Ｉ―ＭＣＰ−１のＣＣＲ２に対する結合の阻害百分率を計算した。阻害百分率値を次にグラフパッド・プリズム（Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ）プログラム内にインポートし、最低値＝０および最高値＝１００の定数および可変勾配を伴うＳ字形用量−応答曲線を用いてプロットした。
【０２００】
カルシウム可動化検定。非接着性細胞のためのメーカーのプロトコルに従ってＦＬＥＸｓｔａｔｉｏｎＴＭＣａ２＋プラス検定キット（モレキュラー・デバイシーズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）、カリフォルニア州Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ）およびＦＬＥＸｓｔａｔｉｏｎＴＭ（モレキュラー・デバイシーズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）、カリフォルニア州Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ）を用いて、９６ウェル形式で、Ｃａ２＋可動化検定を実施した。ピークＲＦＵ値を、分析のグラフパッド・プリズム内にインポートした。
【０２０１】
ＭＣＰ−１誘発型ＣＣＲ２レセプター内在化ＦＡＣＳ検定。リガンド濃度（合成ＭＣＰ−１のＥＣ５０、約１００ｎｇ／ｍｌ）およびインキュベーション時間（１時間後に最大の内在化が発生した）の最適化の後、異なる濃度の抗体を添加することによりＩＣ５０を判定した。培養したＣＣＲ２発現細胞をＰＢＳで洗浄し、３７℃で約１０分間ヴェルシーン（Ｖｅｒｓｅｎｅ）（インビトロジェン）で切り離した。細胞の全ての遠心分離工程は約２００×ｇで行なわれた。細胞をＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ／３％ＦＣＳ）で２回洗浄し、計数し、生存率について検査した（トリパンブルー）。９６Ｖ底ウェル平板（グレイナー）に、１ウェルにつき１００μｌ中約２．５×１０５個の細胞を充てんし、氷上に置いた。９６Ｕ底ウェル平板（ヌンク（Ｎｕｎｃ）の中で、細胞培地（ＭＥＭＥ）中に抗体を希釈させて、約２００μｇ／ｍｌから０．００１μｇ／ｍｌまでのトリプリケート試料を得た。異なる濃度の抗体を室温で１０分間、１００ｎｇ／ｍｌの最終濃度の合成ＭＣＰ−１（Ｂａｃｈｅｍ）と共に予備インキュベートさせた。細胞を、予備インキュベートした１００μｌのＭＣＰ−１／抗体混合物と共に再懸濁させ、レセプター内在化のためインキュベータ内で３７℃で１時間インキュベートさせた。内在化の後、細胞を一回１８０μｌの低温ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄したが、さらなる内在化を防ぐため全ての後続工程について平板を氷上に保たなくてはならない。ＦＡＣＳ緩衝液内で１：１０の割合でビオチニル化マウス抗−ｈＣＣＲ２ｍＡｂ（ＲアンドＤシステムズ）を希釈した。対照としてマウスＩｇＧ２ｂイソタイプビオチンｍＡｂ（ＲアンドＤシステムズ）も同様にＦＡＣＳ緩衝液内で１：１０に希釈した。１０μｇ／ｍｌの最終濃度のヒトおよびマウスガンマグロブリンの１：１混合物（ジャクソンズ・イムノ・リサーチ）を、抗−ｈＣＣＲ２および対照ｍＡｂの両方に添加してＦｃ−レセプターを遮断した。細胞を５０μｌの抗−ＣＣＲ２／ガンマグロブリンミックス（または対照ＩｇＧ２ｂ／ガンマグロブリンミックス）の中に再懸濁させ、氷上で１時間インキュベートした。細胞を２回１８０μｌのＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、５０μｌの１：４００の希釈ストレプトアビジン−ＰＥ（ＢＤファーミゲン（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ））内で再懸濁させ、暗所で氷上にて４℃で１時間インキュベートした。１８０μｌのＦＡＣＳ緩衝液で２回、細胞を洗浄し、１００μｌの２％ＰＦＡ／ＰＢＳ中で再懸濁させ、固定のため４℃で一晩貯蔵した（代替的には、ＰＦＡ固定無しの直接的測定が可能である）。ＦＡＣＳ測定のために、細胞を２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液で再懸濁させ、少なくとも５０００個の細胞を各々計数した。
【０２０２】
親和性検定
ＫＤ判定用溶解平衡滴定（ＳＥＴ）方法およびバイオベリスを用いた交叉反応性研究。溶解状態の親和性判定を基本的に文献中で記載されている通りに実施した（フリゲ（Ｆｒｉｇｕｅｔ）ら、１９８５年）。ＳＥＴ方法の感度および精度を改善するために、それを従来のＥＬＩＳＡからＥＣＬベースのバイオベリス技術に移した（ハーネル（Ｈａｅｎｅｌ）ら、２００５年、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ中に公表受諾されたもの）。メーカーの指示に従って、１ｍｇ／ｍｌのヤギ抗−ヒト（Ｆａｂ）２またはヤギ抗マウスＩｇＧ、Ｆｃ  フラグメント特異的抗体（ジャクソンズ・イムノ・リサーチ）を、ＢＶ−ｔａｇＴＭＮＨＳ−Ｅｓｔｅｒ（バイオベリス・ユアロップ（Ｂｉｏｖｅｒｉｓ  Ｅｕｒｏｐｅ）、英国オックスフォードシャーＷｉｔｎｅｙ）で標識した。検定緩衝液として０．５％のＢＳＡおよび０．０２％のＴｗｅｅｎ２０を伴うｐＨ７．４のＰＢＳでポリプロピレンマイクロタイター平板内で実験を実施した。４ｎ段階で未標識抗原を希釈した。ヒトおよびカニクイザルＭＣＰ−１については１０ｐＭ〜４０ｎＭの濃度範囲そして交叉反応性コントロール（エオキシンおよびＭＣＰ−２）については４０ｐＭ〜１６０ｎＭの濃度範囲を選択した。抗原無しのウェルを用いてＳｍａｘ値を判定した。１００ｐＭのＦａｂまたはＩｇＧ（７５μＬの最終体積中の濃度）の添加後、混合物を室温で２時間インキュベートした。その後、抗ヒトＦａｂについて１：４０００または抗マウスＩｇＧについて１：２０００の最終希釈物中の０．２５μｇ／ｍｌのビオチニル化ＭＣＰ−１（Ｋ６９）およびＢＶ−ｔａｇ標識された検出抗体でコーティングされた２５μｌのＤｙｎａｂｅａｄｓ（０．４ｍｇ／ｍｌのＭ−２８０ストレプトアビジン、ＤＹＮＡＬ、Ｈａｍｂｕｒｇ）の混合物を１ウェルにつき添加した。室温でエッペンドルフ振とう器（７００ｒｐｍ）上で３０分間インキュベートした後、Ｍ−３８４シリーズ（登録商標）ワークステーション（バイオベリス・ユアロップ）を用いて電気化学発光シグナルを検出した。カストマイズされた適合モデルを応用するＯｒｉｇｉｎ５．０（Ｍｉｃｒｏｃａｌ）ソフトウェア（Ｆａｂについてはハーネルら、２００５年、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ中に公表受諾されたもの；ＩｇＧについてはピーラー（Ｐｉｅｈｌｅｒ）ら、１９９７年に従う）で、データを評価した。
【０２０３】
直接コーティングされた抗原についてのバイアコアＫＤ判定。速度定数ＫｏｎおよびＫｏｆｆを、バイアコア３０００計器（バイアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ）、スウェーデンＵｐｐｓａｌａ）を用いて共有結合により固定化されたＭＣＰ−１に結合するそれぞれのＦａｂの段階希釈物で判定した。共有結合性抗原固定化のためには、標準時ＥＤＣ−ＮＨＳアミンカップリング化学が用いられた。反応速度測定を、１．５〜５００ｎＭのＦａｂ濃度範囲を用いて２０μｌ／分の流速でＰＢＳ（１３６ｍＭのＮａＣｌ、２．７ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、１．７６ｍＭのＫＨ２ＰＯ４  ｐＨ７．４）中で行なった。各濃度についての注入時間は１分でありそれに３分間の解離段階が続いた。再生のためには、５μｌの１０ｍＭのＨＣｌを使用した。ＢＩＡ評価ソフトウェア３．１（バイアコア）を用いて全てのセンソグラムを適合させた。Ｂｉｏｔｉｎ−Ｋ６９ヒトＭＣＰ−１およびカニクイザルＭＣＰ−１についてのバイアコアＫＤ判定。ストレプトアビジンチップ表面に対してビオチン−Ｋ６９ヒトＭＣＰ−１およびビオチニル化カニクイザルＭＣＰ−１をコーティングし、ＣＭ５チップに対し直接カニクイザルＭＣＰ−１をコーティングした。標準的方法を用いてＦａｂの結合をテストした。
【０２０４】
抗体捕捉モードでのバイアコアＫＤ判定。ＣＭ５チップ（流速５μｌ／分）上で抗−ｈＦａｂ（ｓ．３．１５）を用いて５００ｎＭでＦａｂを捕捉し、各類似体（ＭＣＰ１、２、３、４およびエオタキシン、エオタキシン−２および３）の溶液を注入した。全てのサイトカインに担体を含まず、親和性判定のための検体として１５〜５００ｎＭ（最適化前の親Ｆａｂについて）の濃度範囲で使用された。ＢＩＡ評価ソフトウェアを用いて、センサーグラムを分析した。バイアコアの検出限界に達したため最適化された結合剤について抗体捕捉モードでのＭＣＰ−１に対するバイアコア親和性判定は不可能であった。
【０２０５】
Ｆａｂの特異性分析のためには、捕捉検定を用いる表面プラズモン共鳴を使用した（バイアコア３０００、スウェーデンＵｐｐｓａｌａ）。Ｆａｂを捕捉し、さまざまなタンパク質（ＭＣＰ−２、−３、−４およびエオタキシン−１、−２および３）を検体として使用した。ＣＭ５チップ（バイアコア、スウェーデン）を、標準的ＥＤＣ−ＮＨＳアミンカップリング化学を用いて４フローセル全てについて、６５００〜８０００ＲＵの抗−Ｆ（ａｂ）２（ダイアアノヴア（Ｄｉａｎｏｖａ）、Ａｆｆｉｐｕｒｅ  Ｆ（ａｂ）２フラグメントヤギ抗−ヒトＩｇＧ、Ｆ（ａｂ）２フラグメント特異的；１０ｍＭ酢酸塩緩衝液、ｐＨ４．５）でコーティングした。フローセル２〜４を、特異的抗−ＭＣＰ−１  Ｆａｂで捕捉した（１０μｌ／ｍｌの流速で２０μｌの５００ｎＭ  Ｆａｂ、結果としての捕捉密度３００〜４００ＲＵ）。Ｆａｂの捕捉後、１００ｎＭの濃度でケモカインを注入した（２０μｌ、流速２０μｌ／分、ＰＢＳ  ｐＨ７．４）。小さなアリコートの形でケモカインを貯蔵し、測定のためには、最大１回の凍結−解凍サイクルで解凍されたばかりの材料のみを使用した。抗Ｆａｂ／Ｆａｂ相互作用およびＦａｂ特異的相互作用、ＭＣＰ−１のオフ速度により刺激される複数のオフ速度の組合せを避けるために、抗Ｆａｂ／Ｆａｂ相互作用の解離を判定するべく緩衝液を注入した。達成した緩衝液センサーグラムを特異的なものから減算した。応答単位は、表面上への捕捉抗体の量に正規化した。
【０２０６】
抗体捕捉モード内での未変性ＭＣＰ−１に対する結合。上述の通りの方法を使用した。ＰＡＮＣ１上清から未変性ＭＣＰ−１を精製し、結合分析のために使用した。Ｆａｂ捕捉モードでの未変性ＭＣＰ−１に対する結合は、検出限界をはるかに上回っていたが、未変性ＭＣＰ−１の適正な濃度を覆い隠す抽出物中の不純物のせいで、真の親和性測定は不可能であった。
【０２０７】
ＩｇＧへの変換
全長ＩｇＧを発現する目的で、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ４、キメラヒト／マウスＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａについてＦａｂ発現ベクターから適切なｐＭｏｒｐｈ＿ｈＩｇベクターへと、重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）の可変ドメインフラグメントをサブクローニングした。制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＭｆｅＩ、ＢＩｐＩをｐＭｏｒｐｈ＿ｈＩｇＧ１．１、ｐＭｏｒｐｈ＿ｈＩｇＧ４．１、ｐＭｏｒｐｈ＿ｍＩｇＧ１．１またはｐＭｏｒｐｈ＿ｍＩｇＧ２ａ．１へのＶＨドメインフラグメントのサブクローニングのために、そしてＥｃｏＲＶ、ＢｓｉＷＩをｐＭｏｒｐｈ＿ｈＩｇκ＿１、ｐＭｏｒｐｈ＿ｈＩｇλ＿１、ｐＭｏｒｐｈ＿ｍＩｇκ＿１またはｐＭｏｒｐｈ＿ｍＩｇλ＿１ベクターへのＶＬドメインフラグメントのサブクローニングのために、それぞれ使用した。結果としてのＩｇＧ構成体はＣＮＴＯにおいて発現させられた。
【０２０８】
結果
Ｍａｘｉｓｏｒｐ平板に直接コーティングされたｈＭＣＰ−１（４１Ｉ）およびｈＭＣＰ−１（４３Ｙ）上で固相パニングを実施した。各々３つの選択ラウンドを含む４つの異なるパニング戦略を応用した。発現ベクターｐＭＯＲＰＨ×９＿Ｆａｂ＿ＦＨ内へのサブクローニングの後、直接コーティングされたｈＭＣＰ−１（４１Ｉ）およびビオチニル化ｈＭＣＰ−１について、固相スクリーニングを実施した。合計８８３２個のクローンを一次スクリーニングにおいて分析し、９８３の一次ヒットを得た。最終的に５個のユニークＦａｂを同定したが、５つのＦａｂ全てが細胞検定内でＭＣＰ−１を中和せず、Ｍａｘｉｓｏｒｐに対する直接的コーティングが、中和エピトープの立体配座または少なくともアクセス可能性を損う可能性があることを表わしていた。
【０２０９】
溶解状態のＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤ（登録商標）ファージと共にビオチニル化されたヒトＭＣＰ−１類似体−１（Ｖ４１Ｉ）および類似体−２（Ｆ４３Ｙ）をインキュベートし続いて記載されている通り、ファージ抗原複合体を捕捉して、半溶解パニングを実施した。それぞれビオチニル化ヒトＭＣＰ−１タンパク質類似体−１（Ｖ４１Ｉ）および類似体−
２（Ｆ４３Ｙ）（交互パニング無し）に対する３ラウンドのパニングを含む２つの異なる主パニング戦略を応用した。合計９０２４のクローンを一次スクリーニングにおいて分析し、１２１の一次ヒットを得、最終的に１８個のユニーク結合剤が明らかとなった。ビオチニル化ヒトＭＣＰ−１タンパク質類似体−１（Ｖ４１Ｉ）についてのパニングからの１９２クローンのＬｕｍｉｎｅｘベースの再スクリーニングにより、９つの付加的な一次ヒットおよび３つの付加的なユニーク結合剤が導かれ、Ｌｕｍｉｒｅｘスクリーニングが捕捉スクリーニングに対する適切な代替的スクリーニング方法であることを示している。半溶解パニングから合計２１のユニーク結合剤が同定され、そのうち１４の結合剤が中和活性を示した。ＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤ（登録商標）からの中和Ｆａｂは全て、このパニングに由来していた。
【０２１０】
ＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤ（登録商標）Ｆａｂの特徴づけ
ユニークＦａｂを発現させ、さらなる特徴づけのために精製した。バイアコアによりｈＭＣＰ−１結合親和性を決定し、１）１２５Ｉ―ＣＣＬ−２のＴｈｐ−１細胞に対する結合の阻害、および２）Ｔｈｐ−１細胞中のｈＭＣＰ−２誘導型Ｃａ２＋可動化の阻害という検定の中でＦａｂを特徴づけした。細胞ベースの検定において中和活性を示したＦａｂをさらに、１）合成カニクイザルｈＭＣＰ−２に対する結合；２）結合特異性のためのｈＭＣＰ−２ファミリ関連ヒトケモカインに対する結合（すなわちＭＣＰ−２、３、４およびエオタキシン１、２、３）；および３）合成ｈＭＣＰ−２ペプチドを用いて選択されたＦａｂが未変性ｈＭＣＰ−２を確実に認識するようにするための未変性ヒトｈＭＣＰ−２に対する結合、についてテストした。付加的な親和性成熟のために、最適な特性をもつ７つのＦａｂを選択した。
【０２１１】
親和性成熟のために選択されたＦａｂの特性は表２にまとめられている。親和性成熟のために選択された７つのＦａｂは、ライブラリクローニングおよび選択のため３つのグループに割当てられた。Ｌ−ＣＤＲ３およびＨ−ＣＤＲ２最適化が並行して実施された。軽および重可変鎖の並行な最適化は、さらなる改良型抗体さえも生成するべく交叉クローニングを介して改良型重鎖および軽鎖を組合せ潜在的可能性を作り出した。
【０２１２】
【表３】
2008546374.tif 000003
【０２１３】
実施例２：ＦＡＢＳからの高親和性ＭＣＰ−１特異的抗体の評価
指摘した通り、親和性成熟のための候補の選択は、遊離Ｆａｂ形式の候補について実施
された。選択基準は、放射性リガンド結合検定における活性、Ｃａ２＋可動化検定における活性、バイアコアにより測定されるヒトＭＣＰ−１に対する親和性、ヒトＭＣＰ−１に対する特異性、カニクイザルＭＣＰ−１に対する親和性およびバイアコア内で検出された未変性ＭＣＰ−１に対する結合であった。親Ｆａｂをグループ化するための付加的な基準は、ＥＬＩＳＡにおけるＣ７７５競合であり、可変重鎖および軽鎖のフレームワークファミリに基づいていた。特に走化性検定におけるＩｇＧとしての成熟候補の特徴づけを、成熟選択プロセスと並行して実施した。
【０２１４】
成熟のため選択された７つのＦａｂは、３つの異なる配列クラスに入った。１つのクラス（グループ１、表２）では、Ｆａｂ０３３３６、０３４６４、０３４６８および０３４７０が、２つの異なる重鎖フレームワークの１つと共にＶλ３軽鎖フレームワークを有していた。Ｆａｂ０３３３６および０３４６４はＶＨ３重鎖フレームワークを有し、Ｆａｂ０３４６８および０３４７０は、ＶＨ１Ｂ重鎖フレームワークを有していた。Ｆａｂの第２のクラス（グループ２、表２）０３４７１および０３４７３は、ＶＨ１Ａ重鎖フレームワークおよびＶκ３軽鎖フレームワークを有していた。Ｆａｂ０３５４８は、第１のクラス内のＦａｂのうちの２つ（ＶＨ３、Ｖλ３）と同じ重鎖および軽鎖フレームワークを有していたが、例外的に強力な生物活性およびエオタキシンとの結合交叉反応性を有していたことから別々に維持された（グループ３、表２）。本明細書で使用されている可変領域配列分類の完全な記述については、全体が本明細書に参照により援用されている米国特許第６８２８４２２号明細書を参照のこと。後者の成熟の最終目的は、特異性を増大させながらＣＣＬ−２に対する０３５４８の親和性を改善することにあった。
【０２１５】
成熟の前に、カニクイザルおよび未変性ヒトＭＣＰ−１に対する親和性ではなくこれらに対する結合のみがバイアコアＦａｂ捕捉モードで判定された。７つの親Ｆａｂは全て、成熟のための前提条件であるカニクイザルおよび未変性−ＭＣＰ−１の両方に対する結合を示した。
【０２１６】
親ＩｇＧの結合特異性
７つの親Ｆａｂ全てのＩｇＧ１への転換後、ＩｇＧ形態について交叉反応性研究を反復した。エオタキシン３はセンサーチップ上でデキストラン表面に非特異的に結合し、この非特異的結合はカルボキシルメチルデキストランを添加することにより競合させて取去ることができた。その他のケモカインのデキストラン表面に対する非特異的結合も可能であったことから、全てのバイアコア特異性検定においてカルボキシルメチルデキストランを添加した。Ｆａｂとは対照的に、２つのＩｇＧがヒトＭＣＰ−１に対する有意な結合を全く示さず、興味深いことに、全ての成功基準を満たした４つの最終結合剤全てが１つの親Ｆａｂから来ていた。
【０２１７】
表面上の捕捉抗体の量により、ＭＣＰ−１の結合シグナル（応答単位）を正規化した。すなわちモル結合比＝（結合した抗原のＲＵ／抗原のＭＷ）×（ｍＡｂのＭＷ／表面上に捕捉されたｍＡｂのＲＵ）であり、０．５未満のモル結合比が有意でないものと予想された。４つのＩｇＧが、ＭＣＰ−１に対して０．５超のそして、全相同体ケモカインに対し０．５未満の正規化された結合比を示し、従って、ＩｇＧレベルで特異的と称された。１つのＩｇＧも同様に、Ｆａｂレベルですでに検出されたエオタキシンおよびＭＣＰ−２に対する幾分かの結合を示したが、この交叉反応性はＩｇＧレベルで削減された。ＭＯＲ０３４６８ＩｇＧのデータは示されていない。
【０２１８】
ＴＨＰ−１細胞（ＣＮＴＯ）に対するＩ１２５ＭＣＰ−１結合の阻害
ＩｇＧ１形式での親結合剤の中和活性を最初に放射性リガンド結合検定においてテストした。無関係のヒトＩｇＧ１を添加することによりＴＨＰ−１細胞上のＦＣレセプターを遮断した後、全ての親ＩｇＧについてＭＣＰ−１結合の阻害を検出することができた。４
つのＩｇＧが、基準ＩｇＧＣ７７５の範囲内のＩＣ５０値でＴＨＰ−１細胞に対する放射性標識されたヒトＭＣＰ−１の阻害を示した。
【０２１９】
カルシウム可動化（ＣＮＴＯ）の阻害
全ての親ＩｇＧは、ＴＨＰ−１細胞内でＭＣＰ−１誘発型のカルシウム可動化を阻害した。４つのＩｇＧが、基準ＩｇＧＣ７７５に比べて高い抗体濃度でＭＣＰ−１誘発型のカルシウム可動化の阻害を示した。
【０２２０】
ＭＣＰ−１誘発型走化性（ＣＮＴＯ）の阻害
親Ｆａｂを走化性検定においてテストすることができなかったことから、ＭＣＰ−１誘発型走化性の阻害をＩｇＧ形式でテストした。テストされた親ＩｇＧは全て走化性検定において活性であり、４つのＩｇＧは基準ＩｇＧＣ７７５に比べて高い抗体濃度でＭＣＰ−１誘発型走化性の阻害を示した。
【０２２１】
実施例３：Ｌ−ＣＤＲ３／Ｈ−ＣＤＲ２カセットの並行交換による選択されたＦＡＢの親和性成熟
親和性成熟プロセスの要約
第１の成熟ラウンドにおいて、Ｌ−ＣＤＲ３最適化およびＨ−ＣＤＲ２最適化が並行して実施された。各々のＦａｂクラスからのＤＮＡを、成熟ライブラリ構築のためにプールした。各々のＤＮＡプールについてランダム化された配列によりもとの重鎖ＣＤＲ２および軽鎖ＣＤＲ３配列を置き換え、結果として６つの新しいライブラリすなわち３つのランダム化されたＨ−ＣＤＲ２と３つのランダム化されたＬ−ＣＤＲ３ライブラリを得た。６つのライブラリの各々の多様性は、１０８超のユニークＦａｂであった。ニュートラビジンがコーティングされたプラスチックウェル上で捕捉されたビオチンペプチドの溶液パニングまたはパニングのいずれかのために、合成ＣＣＬ−２−４１Ｉ―ビオチン−Ｋ６９ペプチドを使用した。６つのライブラリの各々をさまざまな条件下でパニングして、緩慢なオフ速度（すなわち長時間洗浄、削減された抗原濃度）でＦａｂについて富化させた。溶液および半溶解パニングを含めた３６の並行パニングを実施した。抗原濃度の削減、オフ速度選択および長期洗浄の結果、ストリンジェントパニング条件が得られた。バイオベリス（前ＩＧＥＮ）電気化学発光（ＥＣＬ）ベースのプラットフォームを用いて、親和性スクリーニングを実施し、改善された親和性での高生産性親和性等級付けおよびＦａｂ分子の同定が可能となった。
【０２２２】
Ｈ１ＡおよびＨ１Ｂの重鎖Ｈ−ＣＤＲ２ライブラとしての親和性成熟用ライブラリを別々にクローニングし、７つの異なる可変領域ライブラリをクローニングした。その後２つのＨ１ＡおよびＨ１Ｂライブラリを選択に先立ちプールし、６つの選択ライブラリを得た。ライブラリサイズは、１０８〜８×１０９の範囲内であった。理論的多様性の０．６２５倍がなおも網羅されていたＭＯＲ０３５４８λ３Ｌ−ＣＤＲ３ライブラリを除いて、全てのライブラリについて全ての理論的多様性が網羅された。無作為に取り上げたクローンの配列決定により、ライブラリの品質管理を実施した。配列の７５中７１（９５％）が適正で多様であったが、７５の配列のうち４つについて、フレームシフトが検出された。全ての親Ｆａｂの誘導体がそのそれぞれのライブラリ内で発見された。
【０２２３】
選択された抗体フラグメントの親和性および生物活性を増大させるために、フレームワーク領域が恒常に保たれる一方で、トリヌクレオチド誘導突然変異誘発（ヴィルネカス（Ｖｉｒｎｅｋａｅｓ）ら、１９９４年）を用いたカセット突然変異誘発により並行してＬ−ＣＤＲ３およびＨ−ＣＤＲ２領域を最適化した。親和性成熟のためのクローニングに先立ち、全ての親Ｆａｂフラグメントを対応する発現ベクター（ｐＭＯＲＰＨ（登録商標）×９＿ＦＨ）からＸｂａＩ／ＥｃｏＲＩを介してＣｙｓＤｉｓｐｌａｙＴＭベクターｐＭＯＲＰＨ（登録商標）２５＿ＬＨＣ内に移送した。Ｈ−ＣＤＲ２最適化のためのライブラ
リクローニングと干渉する１つのＢｓｓＨＩＩ部位の除去により、ＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤ（登録商標）表示ベクターｐＭＯＲＰＨ（登録商標）２３＿ＬＨＣからｐＭＯＲＰＨ（登録商標）２５＿ＬＨＣを作り出した。親ＦａｂフラグメントのプールのＬ−ＣＤＲ３を最適化するために、結合剤プールの軽鎖（４０５ｂｐ）の定常領域、Ｌ−ＣＤＲ３およびフレームワーク４をＢｐｉＩ／ＳｐｈＩにより除去し、定常ドメインおよびフレームワーク４と共に多様化されたＬ−ＣＤＲ３ｓのレパートリで置き換えた。このＬ−ＣＤＲ３カセットの設計、合成およびクローニングについては、別途記述する予定である（原稿準備中）。５μｇの結合剤プールベクターを、多様化されたＬ−ＣＤＲ３ｓを担持するインサートフラグメントの３倍モル余剰分でライゲートさせた。第２のライブラリセットにおいては、結合するフレームワーク領域が定常に保たれる一方で、Ｈ−ＣＤＲ２（ＸｈｏＩ／ＢｓｓＨＩＩ）を多様化させた。クローニング効率を監視するために、親Ｈ−ＣＤＲ２をダミーで置き換えてから、多様化したＨ−ＣＤＲ２カセットを中にクローニングした。４ｍｌの大腸菌ＴＯＰ１０Ｆ細胞内で７つの異なるライブラリのライゲーション混合物を電気穿孔させ（インビトロジェン、米国カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）、１×１０８〜８×１０９個の独立したコロニーを生成した。このライブラリサイズは、理論的多様性を確実に網羅した。ライブラリの増幅を、前述の通りに実施した（ラウヘンベルガーら、２００３年）。品質管理のため、単一のクローンを無作為に取上げ、配列決定した（セキサーブ（ＳｅｑｕｉＳｅｒｖｅ）、ドイツ、Ｖａｔｅｒｓｔｅｔｔｅｎ）。
【０２２４】
親和性成熟のためのヒトビオチン−Ｋ６９ＭＣＰ−１（Ｖ４１Ｉ）に対する半溶解パニング
最適化ライブラリから取返した１×１０１３個のファージを、レアクティ・バインド・ニュートラビジン（Ｒｅａｃｔｉ−Ｂｉｎｄ  Ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ）でコーティングされたポリスチレンマイクロタイター平板ストリップ上に２回予備吸着させ、その後ケミ・ブロッカー（Ｃｈｅｍｉ  ＢＬＯＣＫＥＲ）で遮断した（ケミコン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、米国カリフォルニア州Ｔｅｍｅｃｕｌａ）。予備吸着させたファージおよび異なる濃度のビオチンＫ６９ＭＣＰ−１（０．０２〜５０ｎＭ）を溶解状態で２２℃で１．５時間インキュベートし、その後、レアクティ・バインド・ニュートラビジンでコーティングされたポリスチレンマイクロタイター平板ストリップ（ＰＥＲＢＩＯ）に対しファージ−抗原複合体を捕捉した。２２℃での洗浄工程を、１２時間まで延長させた。１０ｍＭのトリス／ＨＣｌ、ｐＨ８．０中の２０ｍＭのＤＴＴによる溶出および各々のパニングラウンド間のファージミド増幅を、上述の通り行なった。
【０２２５】
親和性成熟のためのヒトビオチン−Ｋ６９ＭＣＰ−１（Ｖ４１Ｉ）に対する溶液パニング
上述の通りの親和性成熟ライブラリから取返した１×１０１３個のファージをケミブロッカー（ケミコン、米国カリフォルニア州Ｔｅｍｅｃｕｌａ）、０．０５％トゥイーン２０（シグマ、米国ミズーリ州Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）で遮断し、トゥイーン２０無しでケミブロッカーにより遮断されたダイナビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）（登録商標）Ｍ−２８０ストレプトアビジン（ダイナル・バイオテク、ノルウェーＯｓｌｏ）上で２回予備吸着させた。抗原の削減を３回のパニングラウンド中に適用し、ビオチン−Ｋ６９ＭＣＰ−１の濃度は０．０１から５ｎＭまでの範囲内であった。ビオチニル化抗原に結合されたファージを捕捉するために、遮断されたＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）および磁気粒子分離装置、ＭＰＣ−Ｅ（ダイナル・バイオテク、ノルウェーＯｓｌｏ）を使用した。洗浄工程（ラウヘンエルガーら、２００３年）、１０ｍＭのトリス／ＨCｌ、ｐＨ８．０中の２０ｍＭのＤＴＴによる溶出および各々のパニングラウンド間のファージミド増幅を上述の通りに行なった。さらに、パニングストリンジェンシーを、オフ速度選択（ホーキンス（Ｈａｗｋｉｎｓ）ら、１９９２年）および長時間洗浄工程（最高６時間）によりさらに増大させた。
【０２２６】
３３１２個のクローンをスクリーニングし、７つの親Ｆａｂのうちの４つに由来する８
５の最適化されたＦａｂを同定した。Ｌ−ＣＤＲ３およびＨ−ＣＤＲ２の両方において最適化されたＦａｂを同定し、２つの異なる親クローンの誘導体について、改良型軽鎖および重鎖の交叉クローニングを実施し、最高１００倍の親和性（ＫＤ）のさらなる改善を導いた。約１−１０ｎＭで推定されたＫｄをもつ上位結合剤（約１００個）を配列決定して、４１個のユニークな改良型Ｆａｂの同定を導いた。改良型結合剤の大部分は、グループＩＩＩ（０３５４８）に由来していた。グループＩおよびグループＩＩにおいて付加的なスクリーンを行なって、これらの成熟群においてより改良されたＦａｂを同定した。２９の付加的なクラスＩおよびＩＩの結合剤を同定した。全体として、７個の親Ｆａｂのうちの５つに由来する８７個のユニークＦａｂを成熟プロセスにおいて同定した。表３は、成熟パニングの結果をまとめたものである。
【０２２７】
【表４】
2008546374.tif 000004
【０２２８】
親クローン０３７４１および０３５４８のＨ−ＣＤＲ２またはＬ−ＣＤＲ３のいずれかの中に、成熟したＦａｂ内のアミノ酸変化が位置づけされていた。Ｆａｂの最良の軽鎖ＣＤＲ３と最良の改良型重鎖ＣＤＲ２の交叉クローニングを次に実施して、さらに高い親和性をもつＦａｂを生成しようと試みた。約３６の交叉クローンが生成された。全てのユニークＦａｂ配列を同様に、Ｎ−連結されたグリコシル化部位の予測についてスクリーニングした。重鎖ＣＤＲ２内のグリコシル化のためのＮＩＳコンセンサス配列をもつわずかなＦａｂを同定した。これらのＦａｂをさらなる特徴づけから除外した。合計８４のＦａｂを発現させ、モルフォシス（Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ）で精製し、生物学的特徴づけのためセントコール（Ｃｅｎｔｏｃｏｒ）に移した。
【０２２９】
バイアコアを用いた親和性測定のための感度限界には、最適化Ｆａｂで達した。従って、ＥＣＬベースの溶解平衡滴定（ＳＥＴ）により、親和性の値を判定した（ハーネルら、２００４年、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ中での公表に提出されたもの）。親和性成熟の後、約１０ｐＭのＫＤが達成され、値をＫｉｎｅｘＡを用いて確認した。放射性リガンド検定におけるＦａｂ結合は、１１０ｐＭのＩＣ５０を達成した。かくして、ＭＣＰ−１親和性および結合反応速度の両方が、親Ｆａｂに比べて最高１０００倍まで改善した。４つの最適化Ｆａｂは、９つの全ての成功基準を満たした。２つはＬ−ＣＤＲ３最適化Ｆａｂであり、２つはＬ−ＣＤＲ３およびＨ−ＣＤＲ２の最適化鎖から成る交叉クローンであった。４個は全てＩｇＧ１に転換され、放射性リガンド結合検定において２０ｐＭの最良のＩＣ５０および１０ｐＭの最良のＫＤで、全てのテスト対象検定において活性を保持した。１つの付加的な交叉クローンＭＯＲ０３８９９は、ＦａｂとしてではなくＩｇＧ１として全ての成功基準を満たした。成功基準を満たした全ての結合剤は、ＭＯＲ０３４７１親Ｆａｂ（配列番号２、４）から誘導されていた。ユニークＦａｂ、ＭＯＲ０３７９０は、表４Ｄおよび配列番号６、７、９、１３、１４および１６内で記されている重鎖および軽鎖可変領域配列を含みＭＯＲ０３４７１に基づく動物モデル内での
インビボ評価、スケールアップ製造開発、およびＩｇＧ産生のため選択された。
【０２３０】
親和性成熟中のバイオベリススクリーニング
ＥＣＬベースのハイスループット親和性スクリーニングバイオベリス検定により、親和性改良型Ｆａｂクローンを同定した。ヒット選択後、４つのサブクローンを同じ方法で確立した。
【０２３１】
親和性成熟のためのパニング戦略
合計で３６個の異なるパニングを実施した。ストレプトアビジンビーズに対するファージ−抗原複合体の捕捉を伴うビオチン−Ｋ６９ＭＣＰ−１（Ｖ４１Ｉ）に対する１８回の溶液パニング。抗原濃度の削減、オフ速度選択および長時間洗浄により、選択プロセス中のストリンジェンシーを増大させた。さらに、ビオチン−Ｋ６９ＭＣＰ−１に対する１８回の半溶解パニングを実施し、ニュートラビジン平板にファージ−抗原複合体を捕捉した。これらのパニングにおいては、抗原の削減および長い洗浄によりストリンジェンシーを増大させた。
【０２３２】
親和性成熟についてのバイオベリススクリーニング
成熟パニングにおいてと同様バイオベリスベースのスクリーニングのためにも、抗原ビオチン−Ｋ６９ＭＣＰ−１４１Ｉを使用した。改良型結合剤の同定のために、スクリーニングが非常に効率良く機能した。３６のパニング条件の各々について、９２のクローンをスクリーニングし、結果として３３１２のスクリーン済みクローンが得られた。合計して８５の異なるユニーク最適化結合剤を同定した。３つのグループ全てから最適化Ｆａｂを発見した。さらに、Ｌ−ＣＤＲ３およびＨ−ＣＤＲ２の中で最適化したＦａｂを同定することができ、ＭＯＲ０３４７１およびＭＯＲ０３５４８誘導体と呼称されたＦａｂについての交叉クローニングが可能となった。４６個の最適化ＦａｂがＭＯＲ０３５４８に由来し、Ｈ−ＣＲＤ２最適化に由来したＦａｂのうち３５個が、１１Ｌ−ＣＤＲ３で最適化されたＦａｂに比べ高い親和性および活性を示した。しかしながら親ＭＯＲ０３４７１も同様に、この成熟において非常にうまく最適化されており、２３個のＦａｂがＬ−ＣＤＲ３内で、又１個がＨ−ＣＤＲ２内で最適化された。７個の親Ｆａｂのうちの４個から改良型Ｆａｂが由来し、このことは各々の親結合剤が異なる最適化潜在性を有することを表わしていた。最終的に、全ての成功基準を満たす４つのＦａｂが、ＭＯＲ０３４７１に由来し、２つがＬ−ＣＤＲ３のみにおいて最適化され、交叉クローニングからの２つがＬ−ＣＤＲ３およびＨ−ＣＤＲ２において最適化された。
【０２３３】
最適化されたＦａｂ分子の交叉クローニング
Ｈｕ  ＣＡＬ（登録商標）技術のモジュラー構造は、クローニング工程において２つの最適化された鎖を組合せるだけで、同じ親クローンから誘導された最適化Ｆａｂの最適化軽鎖および重鎖の急速な交叉クローニングを可能にする。交叉クローニングは、付加的な成熟ラウンド無くさらに改善された抗体を得る潜在性をもつ高速方法である。一方では、２個のＬ−ＣＤＲ３最適化ＭＯＲ０３５４８誘導体を６個のＨ−ＣＤＲ２最適化ＭＯＲ０３５４８と交叉クローニングさせて、１２個の交叉クローンを導いた。他方では、２２個のＬ−ＣＤＲ３最適化ＭＯＲ０３４７１を１つの利用可能なＨ−ＣＤＲ２最適化ＭＯＲ０３４７１クローンと交叉クローニングさせた。このプロジェクトにおいては、交叉クローニングは成功し、２つの異なるＭＯＲ０３４７１由来の交叉クローン、ＭＯＲ０３８５０およびＭＯＲ０３８７８を導き、これらは最終的に全ての成功基準を満たした。
【０２３４】
１６個の予備選択された抗体の詳細な特徴づけ
親和性スクリーニングから同定された８５個の最適化Ｆａｂおよび付加的な３４個の交叉クローン（以上参照）が結果として、全ての利用可能な検定によっても全ては特徴づけされなかった合計１１９個の異なるユニークな最適化Ｆａｂをもたらした。従って、１６
の最適化Ｆａｂを、放射性リガンド結合阻害におけるそのＩＣ５０、カルシウム放出検定における活性、ＣＤＲ中のＮ―グリコシル化部位の欠如（表４ＡおよびＢ）および親和性に従って予備選択した。さらなる詳細な特徴づけには、特異性試験、未変性ＭＣＰ−１に対する結合およびその中和、ヒトおよびカニクイザルＭＣＰ−１に対する親和性、走化性検定における活性および全ての転換済みＩｇＧ１の特徴づけが含まれていた。
【０２３５】
最適化Ｆａｂを表わすクローンは、表４Ａ−Ｃに示された配列によって表わされており、ここで、クローンＭＯＲ０３４７１親ＦａｂはＶＨ３ｘカッパ３フレームワークを有し、ＭＯＲ０３５４８はＶＨ１Ａｘラムダ３フレームワークを有する。所望の物理化学属性（ＣＤＲ中のＮ−グリコシル化部位無し）および親和性および生物活性の最適化された特性をもつ１７個の選択されたＦａｂは、使用されたフレームワーク（ＶＨ３およびＶＨ１Ａ）内で、いくつかのユニークＣＤＲ配列、およびＨＣ−ＣＤＲ２およびＬＣ  ＣＤＲ３配列間の代表的コンセンサス配列、ならびにより一般的に全てのＨＣ−ＣＤＲ１間のコンセンサスを示す。これらのコンセンサス配列は、表４Ｃ−４Ｅおよび配列番号２〜２６に示されている。
【０２３６】
【表５】
2008546374.tif 000005
【０２３７】
【表６】
2008546374.tif 000006
【０２３８】
【表７】
2008546374.tif 000007
【０２３９】
【表８】
2008546374.tif 000008
【０２４０】
【表９】
2008546374.tif 000009
【０２４１】
【表１０】
2008546374.tif 000010
【０２４２】
バイアコアにより測定された未変性ＭＣＰ−１に対する結合
未変性ＭＣＰ−１に対する結合をバイアコアＦａｂ捕捉モードでテストし、選択された全てのＦａｂは未変性ＭＣＰ−１に対する結合を示した。特に、最適化されたＦａｂでバイアコア内でのＫＤ決定についての検出限界に達したことから、親和性判定および特異性確認のための代替的方法を使用しなければならなかった。
【０２４３】
ＩｇＧ転換
詳細な特徴づけのために選択された全ての最適化ＦａｂをＩｇＧ１形式に転換させ、さらに４つのＦａｂをＩｇＧ４形式にサブクローニングした。テスト対象のヒトＩｇＧ４の異なる検定における活性および発現データはそれぞれのＩｇＧ１のものと同じ位優れていた。
【０２４４】
バイオベリスを用いた溶解平衡滴定
敏感なＫＤ判定のための代替的方法として、バイオベリス技術を用いた溶解平衡滴定（ＳＥＴ）を実施した。ＦａｂおよびＩｇＧのための適切な適合モデルを用いて一価の解離定数を計算した。この方法は、親和性測定および交叉反応性研究に適していた。バイオベリスを用いた溶解平衡滴定（ＳＥＴ）により全ての選択された１６の結合剤を分析し（表５および表６）、これらの親和性値を最終的親和性値とみなした。ＦａｂおよびＩｇＧとしてのＭＯＲ０３７５７、ＭＯＲ０３７８１、ＭＯＲ０３７９０、ＭＯＲ０３８５０、ＭＯＲ０３８７８、およびＩｇＧとしてのＭＯＲ０３８９９を含めた複数の結合剤が、０．５ｎＭ未満であるヒトＭＣＰ−１および２０ｎＭ未満であるカニクイザルＭＣＰ−１に対する親和性成功基準を満たした。ヒトＭＣＰ−１に対する最良の親和性はＦａｂのレベルで２０〜４０ｐＭであり、ＩｇＧのレベルで１０〜２０ｐＭであった（表５）。カニクイザルＭＣＰ−１に対する最良の親和性は、Ｆａｂレベルで１０〜４０ｐＭであり、ＩｇＧレベルで２０ｐＭであった（表６）。
【０２４５】
バイオベリスを用いた特異性試験
親和性以外にも特異性特にエオタキシンおよびＭＣＰ−２に対する交叉反応性をバイオ
ベリスを用いて溶解平衡滴定（ＳＥＴ）において分析した。テスト対象の選択された１６個のＦａｂおよび１５個のＩｇＧ（１６個の選択されたＩｇＧのうちの１つは利用不可能であった）について、ヒトＭＣＰ−２に対する交叉反応性は全く検出不可能であった。ヒトＭＣＰ−１と同様、ヒトＭＣＰ−２は主としてＣＣＲ２レセプターに結合し、一方ヒトエオタキシンは大部分ＣＣＲ３レセプターに結合する。バイオベリスでＭＯＲ０３７４４、ＭＯＲ０３７４７、ＭＯＲ０３７９０およびＭＯＲ０３７８１ＦａｂおよびＩｇＧについてはヒトエオタキシンに対する交叉反応性は全く検出不可能であり、一方ＭＯＲ０３８５０を含めた１２個の選択された結合剤は、ＦａｂまたはＩｇＧ形式でエオタキシンに対する幾分かの交叉反応性を示した（データ示さず）。
【０２４６】
バイアコア抗体捕捉モード（ＣＮＴＯ）での最適化抗体の特異性
選択されたＩｇＧで特異性評価を実施した。バイアコア内で、捕捉された最適化抗体に対して１００ｎＭのヒトＭＣＰ−１、ヒトＭＣＰ−２、３、４およびヒトエオタキシン１、２および３を添加した。ＭＯＲ０３７９０、ＭＯＲ０３７９１、ＭＯＲ０３７４７、ＭＯＲ０３８５０、ＭＯＲ０３７４４、ＭＯＲ０３８４９、ＭＯＲ０３８７８、ＭＯＲ０３８８５、ＭＯＲ３８９９およびＭＯＲ０３７８１ＩｇＧは、相同体ケモカインに対する有意な結合シグナルを全く示さず、特異性成功基準を満たした（表６）。
【０２４７】
ＭＣＰ−２に結合するＦａｂは、Ｔｈｐ−１細胞（ＣＮＴＯ）に対する１２５ＩＭＣＰ２結合を阻害しない。バイアコア内で検出されたエオタキシンおよびＭＣＰ−２に対するＦａｂ結合活性が中和活性の形をとったか否かを分析するために、セントコールにおいて放射性リガンド全細胞結合検定を開発した。Ｉ１２５ＭＣＰ−２は、Ｔｈｐ−１細胞に対する優れた結合を示し、結合は、ＭＣＰ−１特異的基準抗体Ｃ７７５の添加によってではなく未標識ＭＣＰ−２の添加によって阻害された。結果は、結合／中和特異性をテストするための重要な機能的検定を提供した。レセプター結合検定においては１ｎｇ／ｍｌのＭＣＰ−１が使用されたのに対し、ＭＣＰ−２標識（MCP-2  labeling）が活性の損失をひき起こした可能性があるため、この検定では約１００ｎｇ／ｍｌのＭＣＰ−２が必要であった。ＭＯＲ０３７５４は、Ｔｈｐ−１細胞上のＣＣＲ２レセプターに対する１２５Ｉ標識されたＭＣＰ−２結合の有意な阻害を全く示さなかった（ＩＣ５０≧２μＭ）。
【０２４８】
成熟したＦａｂは、ＴＨＰ−１細胞（ＣＮＴＯ）に対するＩ１２５ＭＣＰ−１結合を強力に阻害する。必要とされるＭＣＰ−１が１ｎｇ／ｍｌと少量であるため、この検定は、Ｆａｂについては約１００ｐＭそしてＩｇＧについてはさらに２０ｐＭ（表５）という検定ＩＣ５０限界で、このプロジェクト中最も感度の高い検定であった。最適化の後、Ｆａｂは、基準ＦａｂＣ７７５より低いＩＣ５０でＴｈｐ−１細胞上のそのヒトレセプターＣＣＲ２に対するヒトＭＣＰ−１結合を阻害することになった。親ＭＯＲ０３４７１Ｆａｂは１８０ｎＭのＩＣ５０を示し、最適化ＭＯＲ０３４７１Ｆａｂ誘導体（１８０ｐＭのＭＯＲ０３７８１、２６０ｐＭのＭＯＲ０３７９０、１６０ｐＭのＭＯＲ０３８５０、１１０ｐＭのＭＯＲ０３８７８および１３０ｐＭのＭＯＲ０３８９９）は、最高１０００倍の倍率で最適化中に活性の全体的改善を示した。この検定はこのプロジェクトにおいて利用可能な最も感度の高い生物学的検定であったが、この検定においてさえ、最適化結合剤は検定限界に達したように思われた。
【０２４９】
成熟したＩｇＧはＴＨＰ−１細胞（ＣＮＴＯ）に対するＩ１２５ＭＣＰ−１結合を強力に阻害する。無関係のヒトＩｇＧ１を添加することによるＦｃレセプター結合部位の遮断は、放射性リガンドの結合およびカルシウム可動化検定にとって重要であった。テストされた全てのＩｇＧ１は放射性リガンド結合検定における活性を保持した。最適化されたＭＯＲ０３７８１のＩＣ５０値は２０ｐＭであり、ＭＯＲ０３７９０については３０ｐＭ、ＭＯＲ０３８５０については５０ｐＭ、ＭＯＲ０３８７８については３０ｐＭそしてＭＯＲ０３８９９については５０ｐＭであった。ＭＣＰ−１誘発型ＣＣＲ２レセプター内在化
の阻害  ＦＡＣＳ検定の開発。レセプター内在化検定は、ＴＨＰ−１細胞よりも高いＣＣＲ２発現を示すＣＣＲ−２を発現する細胞を用いて実施され、より優れた信号対雑音比を導いた。第１に合成ヒトＭＣＰ−１を検定内で滴定してＥＣ５０値を決定した。ＭＣＰ−１についてのＥＣ５０値は１１６ｎｇ／ｍｌであることがわかった。従って、さらなるＦＡＣＳ検定のためには１００ｎｇ／ｍｌ（約１１ｎＭ）のＭＣＰ−１を選択した。さらに、完全な内在化を得るための最適なインキュベーション時間を３７℃で評価した。大部分の内在化は最初の３０分以内に発生した。従って、全ての後続する検定においては、１時間のインキュベーション時間を用いた。ＩＣ５０の判定を可能にするように、検定をうまく開発した。ＭＣＰ−１誘発型レセプター内在化を阻害するために用いられる０．００１〜２００μｇ／ｍｌの間のＦａｂまたはＩｇＧの活性および等級付けを測定した。選択された最適化結合剤は、ＭＣＰ−１誘発型レセプター内在化の優れた阻害を示した（データは示さず）。Ｆａｂの２つの異なるバッチを並行してテストし、再現性が実証された。
【０２５０】
Ｆａｂを用いた内在化検定に関しては、ＭＯＲ０３７９０については５ｎＭのＩＣ５０を、ＭＯＲ０３８５０については４ｎＭ、ＭＯＲ０３７８１については７ｎＭ、ＭＯＲ０３８７８については５．３ｎＭ、そしてＭＯＲ０３８９９については３．３ｎＭのＩＣ５０を検出した（表６）。ＭＯＲ０３７８１ＩｇＧ１も同様に７ｎＭを示し、これは、ＩｇＧ転換の後活性が保持されたことを表わしていた。
【０２５１】
カルシウム可動化（ＣＮＴＯ）の阻害
ＭＣＰ−１は、フルオロフォアの助けを借りて検出できるＴＨＰ−１細胞内のカルシウム可動化を誘発する。最適化された抗体は、カルシウム可動化の強力な阻害を示し、４つの最終的候補ＭＯＲ０３７８１、ＭＯＲ０３７９０、ＭＯＲ０３８５０およびＭＯＲ０３８７８Ｆａｂは、１８〜２８ｎＭのＩＣ５０値を示した。それぞれのＩｇＧは又活性を保持し、１ＩｇＧにつき２つのＭＣＰ−１分子を中和するその能力のため約６〜１０ｎＭのわずかに優れたＩＣ５０値さえ示した。ここでも又、約１０ｎＭで検定限界に達したように思われた。
【０２５２】
未変性ＭＣＰ−１誘発型カルシウム可動化の阻害
ＰＡＮＣ１上清から未変性ＭＣＰ−１を精製し、カルシウム放出の誘発のために使用した。最適化Ｆａｂは、基準抗体Ｃ７７５に比べてさらに高い活性で、未変性ＭＣＰ−１誘発型カルシウム可動化の阻害を示した。ここでも又、検定限界には約１０〜２０ｎＭの未変性ＭＣＰ−１で達するように思われた。
【０２５３】
走化性阻害
潜在的非特異性効果に起因して、親Ｆａｂを走化性検定においてテストすることはできなかったが、成熟後はテスト対象の最適化Ｆａｂ全てが特異的に走化性を阻害し、これは活性の増大によるものであると考えられた。テスト対象の全ての最適化ＩｇＧは走化性検定において活性であった。検定は半定量的であることから、適切なＩＣ５０値は全く判定できなかった。
【０２５４】
基準抗体Ｃ７７５での結合競合。ＭＯＲ０３５４８由来の全ての予め選択されたＦａｂは、競合固相形式でＣ７７５のＭＣＰ１に対する結合を完全に阻害した。７つのＭＯＲ０３４７１由来の予め選択されたＦａｂは全て、この検定において部分的（約６０％）競合を示した。
【０２５５】
要約データ
【表１１】
2008546374.tif 000011
【０２５６】
実施例４：治療候補の選択
最終治療候補、ＣＮＴＯ８８８の選択と生成
その軽鎖ＣＤＲ３配列（表４ＢおよびＤ、配列番号１５および１６）のみが異なっている２つのｍＡｂｓ、３７８１および３７９０は、検定においてほぼ同一の生物学的活性を示した。潜在的ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドを同定し、候補がＨＬＡ結合エピトープに関して有意に異なっているか否かを判定するためにインシリコ免疫原性分析を実施した。分析は、ｍＡｂ３７９０が免疫原性についてｍＡｂ３７８１より低い潜在性を示すことを予測した。この分析そして表６に示したその他の生化学的および生物学的分析に基づいて、重鎖ＶＨ１Ａフレームワーク領域（配列番号２）および重鎖ＣＤＲ領域、配列番号６、７、および９；および軽鎖カッパ３フレームワーク（配列番号４）およびＣＤＲ領域、配列番号１３、１４および１６を含んでなる３７９０を最終的な治療用ｍＡｂとして選択した。
【０２５７】
ｍＡｂ３７９０のＮ−末端配列は、クローニング中に導入されたアミノ酸変化に起因してヒト生殖細胞系列配列からの一定の変動。さらに、アミノ酸コドン（すなわち、ＤＮＡ配列）は原核細菌細胞内での偏向された最大発現であった。生殖細胞系列配列に対する不完全なＮ−末端アラインメントを修正し、高度に発現されたヒトタンパク質において好まれるものに対するコドン偏向を変更するようにＭＡｂ  ＤＮＡを再合成した。配列修飾された３７９０ｍＡｂは、それぞれ配列番号２７および２８の重鎖および軽鎖可変領域配列を含んでなるＣＮＴＯ８８８として呼称され、以下に（ＣＤＲｓに下線付き）、ここで重
鎖のＮ−末端残基は、ＱＶＱ（Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ）でありかつ／または軽鎖はＥＩＶ（Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ）である。
【０２５８】
ＣＮＴＯ８８８重鎖可変配列（配列番号：２７）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＳＹＧＩＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＧＩＩＰＩＦＧＴＡＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＹＤＧＩＹＧＥＬＤＦＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
ＣＮＴＯ８８８軽鎖可変（配列番号：２８）
ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＤＡＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＤＡＳＳＲＡＴＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＨＱＹＩＱＬＨＳＦＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ
【０２５９】
ＣＮＴＯ８８８の生化学的および生物物理化学的特徴づけ
ＣＮＴＯ８８８は、完全ヒトＩｇＧ１カッパ抗体である。該配列中には、予測されたＮ−連結型グリコシル化部位は全く存在しない。ＣＮＴＯ８８８（ＨＥＫ２９３細胞中で過渡的に発現され、タンパク質Ａ親和性クロマトグラフィにより精製されたもの）の生化学的および生物物理学的特性を、結合親和性（Ｋｄ）および特異性について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）、質量スペクトル（ＭＳ）およびバイアコアにおいて特徴づけした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは、未変性ＣＮＴＯ８８８は、約１５０ｋＤａで単一バンドとして移動する。還元され／アルカリ化されたＩｇＧは、約６０ｋＤａおよび３３ｋＤａで２バンドとして移行する。ＣＮＴＯ８８８のサイズ排除クロマトグラフィは、ＩｇＧが、レミケードＩｇＧ対照（データ示さず）について測定されたものと同じ溶出体積で単一峰として溶出することを実証した。最終的に、ＭＳ分析はＣＮＴＯ８８８が１４７，０００Ｄａの質量を有することを示した（データ示さず）。バイアコア分析は、ヒトおよびカニクイザルＣＣＬ−２に対するＣＮＴＯ８８８結合親和性（Ｋｄ）が、それぞれ３０および１０ｐＭであることを実証した。ＣＮＴＯ８８８は、ＣＣＬ−２関連ケモカイン、すなわちＭＣＰ−２、３、４およびエオタキシン１、２および３に対しバイアコア内での検出可能な結合を示さなかった。
【０２６０】
ＣＮＴＯ８８８のインビトロ特徴づけ
ＣＮＴＯ８８８の生物活性を、細胞ベースの様々な検定中で評価した。全ての成功基準検定において評価された過渡的に発現されたＣＮＴＯ８８８は、親ｍＡｂ３７９０と区別不能である活性を有していた（表５）。
【０２６１】
実施例５：抗ＭＣＰ−１抗体のクローニングおよび発現
ＣＮＴＯ８８８プラスミドｐ２８４４およびｐ２８８２を伴うＥ．ｃｏｌｉのアリコートは、それぞれ抗体重鎖および軽鎖を含有する。プラスミドｐ２８４４は、抗−ＣＤ４重鎖プロモータの下でＣＮＴＯ８８８コーディング領域の最適化重鎖コーディング配列を含有し、プラスミドｐ２８８２は、抗−ＣＤ４軽鎖プロモータの下でＣＮＴＯ８８８コーディング領域の最適化軽鎖を含有する。両方の構成体共、ｇｐｔ選択遺伝子を内含して、ＭＨＸ（ミコフェノール酸、ヒポキサンチンおよびキサンチン）に対する化学的耐性を与えている。各々のプラスミドを精製し、特徴づけし、定量しかつ配列決定した。
【０２６２】
Ｃ４６３Ａ宿主細胞系列の指数関数培養由来の細胞、化学的に規定された組成培地（ＣＤ−ハイブリドーマ）中での成長に適応させたＳｐ２／０誘導体を、線形化されたｐ２８４４およびｐ２８８２で同時電気穿孔した。４８時間後、細胞を１倍のＭＨＸ（ミコフェノール酸０．５ｍｇ／Ｌ、ヒポキサンチン２．５ｍｇ／Ｌおよびキサンチン５０ｍｇ／Ｌ）に曝露した。選択から３日後に、細胞生存率は１３％未満に低下し、この時点で約９０，０００個の生存細胞をメチルセルロース中に平板固定した。細胞を８〜１３日間乱さな
い状態でインキュベートし、その後Ｈａｌｏ手順を用いてスクリーニングし、２４−ウェル平板中に採取した。培養を膨張させ、２４−ウェル過成長滴定量を得た。
【０２６３】
最高の親細胞系列（１Ｃ４）は、７０ｍｇ／Ｌの２４−ウェル過成長滴定量および振とうフラスコ中（ＣＤ−ハイブリドーマ  培地中）で１０８．５ｍｇ／Ｌの滴定量を有していた。この親細胞系列Ｃ１２６２Ａを、振とうフラスコ中でのさらなる評価のために選択した。Ｃ１２６２Ａを、開発細胞バンク（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋ（ＤＣＢ））生成のため細胞バンキンググループ（Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ）に提出した。Ｃ１２６２Ａ：ＤＣＢ；０２ＳＥＰ０４と呼称されたたＤＣＢからの細胞を、マイコプラズマおよび不稔性ついてテストし陰性であった。（大豆ペプトンの添加を伴う）振とうフラスコ中におけるＣ１２６２Ａ細胞からのさらなる調査研究の支援を目的としたＣＮＴＯ８８８の生産は、２３０ｍｇ／Ｌの滴定量に達し、２Ｌの培養から３６６ｍｇの精製ＣＮＴＯ８８８を生み出した。並行して、Ｃ１２６２Ａ細胞の付加的な９−Ｌ培養により、初期精製および処方物開発用の約２ｇの粗製ＣＮＴＯ８８８材料が生産された。
【０２６４】
親細胞系列、Ｃ１２６２Ａを、Ｈａｌｏ手順を用いてサブクローニングし、５つの高生産性サブクローン細胞系列を生み出した。最良のサブクローン細胞系列（４Ｄ５）は、１５０．５ｍｇ／Ｌの２４−ウェル過成長滴定量および振とうフラスコ中（ＣＤ−ハイブリドーマ中）の１６７ｍｇ／Ｌの滴定量を有していた。このサブクローンされた細胞系列を、Ｃ１２６２Ｂとコード化した。
【０２６５】
実施例６：ＣＮＴＯ８８８でのヒト膵臓腫瘍の治療
本研究は、（ヒト腫瘍由来細胞が生成した）腫瘍ＭＣＰ−１の遮断が、マウス異種移植片中での腫瘍成長を抑制するか否かを調査するものである。腫瘍並びに宿主ＭＣＰ−１相同体、ＪＥ、成長における役割および悪性疾患の進行を測るために、抗−ヒトＭＣＰ−１および抗−マウスＪＥ抗体の両方を、インビボでのヒト膵臓腫瘍の成長を抑制する能力についてテストした。
【０２６６】
ＢｘＰＣ−３膵臓腫瘍を有するマウスを、ヒトＩｇＧ１定常領域に融合された可変領域配列（配列番号２７および２８）含んでなるＣＮＴＯ８８８と呼称されたヒト抗−ヒトＭＣＰ−１抗体で処理した。ＣＮＴＯ８８８のインビボ活性を、宿主効果の阻害に最も効果的であることがわかった以前にテストされたマウス抗体と比較するために、ＣＮＴＯ８８８およびマウス抗−ヒトＭＣＰ−１（Ｃ７７５）の両方を抗−ｍｕＪＥ（Ｃ１１４２）と組合せて投与した。最終的な腫瘍重量の測定に基づくと、ヒト（ＣＮＴＯ８８８）およびマウス（Ｃ７７５）の抗−ヒトＭＣＰ−１Ｍａｂｓは両方共、腫瘍成長を有意に阻害した。
【０２６７】
材料および方法
ＢｘＰＣ−３はヒト膵臓癌由来細胞である。エンゲルブレスホルムスワム（Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍ（ＥＨＳ））腫瘍から調製されたマトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）ＴＭは、ベクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）（０．２ＥＵ／ｍｇ、マサチューセッツ州Ｂｅｄｆｏｒｄ）から入手した。
【０２６８】
Ｃ７７５は、マウス抗−ヒトＭＣＰ−１Ｍａｂであり、C１１４２はラット／マウスキメラ抗−マウスＪＥ抗体であり、ラット可変およびマウス定常領域の両方が出願人の同時係属特許出願である米国特許出願第１１／１７０４５３号明細書および関連出願中で記載されている。対照抗体ｃＶａＭは、Ｃ１１４２およびＣ７７５についてのイソタイプ対照として役立つラット可変およびマウス定常領域からなるラット／マウスキメラＩｇＧ２ａｋである。臨床グレードのヒトＩｇＧをベケット・アポテキャリー（Ｂｅｃｋｅｔｔ  Ａ
ｐｏｔｈｅｃａｒｙ）およびペンシルバニア州Ｓｈａｒｏｎ  Ｈｉｌｌのホーム・ヘルス・ケアー社（Ｈｏｍｅ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃａｒｅ、Ｉｎｃ）から入手し、これはＣＮＴＯ８８８のための対照として役立っている。
【０２６９】
本研究では、チャールス・リバー（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）（ノースカロライナ州Ｒａｌｅｉｇｈ）から入手した雌のＳＣＩＤマウス（生後６〜８週目）を使用した。マウスを、フィルタートップのプラスチックケージ内に集団収容し、加圧殺菌食および水を供給した。
【０２７０】
ＢｘＰＣ−３細胞を、１０％のＦＢＳを含有するＲＰＭＩ１６４０培地（完全培地）中で培養した。研究開始の４８時間前に細胞を１：３に分割した。研究当日に、単一細胞懸濁液を生成するために細胞をトリプシン処理し、トリプシンを中和するために該細胞懸濁液を１０体積の完全培地で洗浄した。細胞を遠心沈降させ、無血清ＲＰＭＩ中で再懸濁させた。マトリゲルＴＭを一晩４°Ｃで解凍した。等体積のマトリゲルＴＭ溶液およびＢｘＰＣ−３細胞を混合することによってマトリゲルＴＭ・腫瘍細胞懸濁液を調製した。癌細胞懸濁液の最終濃度は５ｍｇ／ｍｌマトリゲルＴＭ中５×１０６細胞／ｍＬであった。
【０２７１】
０日目に、８０匹の雌ＳＣＩＤマウスに０．２ｍｌのＢｘＰＣ−３細胞懸濁液を皮下移植した。０．２ｍｌの細胞懸濁液は、１×１０６のＢｘＰＣ−３細胞および１．０ｍｇのマトリゲルＴＭを含有していた。マトリゲルＴＭの重合を避けるために低温のシリンジを使用した。
【０２７２】
【表１２】
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【０２７３】
全ての動物を、研究の開始時および研究中は週に１回計量した。ひとたび腫瘍の成長が観察されたならば（３．０ｍｍ３）、キャリパを用いてミリメートル単位（ｍｍ）で２次元（長さおよび幅）で腫瘍を測定した。腫瘍の成長ついてマウスを観察し、［長さ×幅×幅］／２、の公式に基づいて腫瘍の体積（ｍｍ３）を計算した。
【０２７４】
腫瘍細胞の移植後１４日目に、約５０ｍｍ３の平均腫瘍体積を有するマウスを５つのグループにランダム化した（ｎ＝１０／グループ）。治療（表７）を１４日目に開始し、研究の残りの期間、治療を週に２回投与した（１４日目に治療を開始した後５２日間）。研究の残りの期間、週に１回腫瘍を測定した。研究の終了時点で、ＣＯ２窒息によりマウスを安楽死させた。腫瘍を切除し、デジタル天秤上で秤量し、固定した。腫瘍をデジタルカメラを用いて撮影した。５０日目に、グループ３内の１匹のマウスが研究指針に基づく許容可能な限度を超過する腫瘍を有しており、これを屠殺した。この動物の体積および重量は最終分析に内含されている。
【０２７５】
腫瘍の重量に関して、データを標準線形モデルおよび分散分析（ＡＮＯＶＡ）を介して分析した。別途指示のある場合を除いて、全てのテストおよび比較について０．０５未満のＰ−値が有意と見なされた。等分散および正規分布形状の根底にある前提がより良く満たされることから、対数目盛りを用いた。腫瘍をもたないマウスについての半ダースのゼロ値を、小スプライン補間値（０．００７２４０５３８）で置き換え、これによりデータ構造の破壊なく対数目盛り中において統計分析が容易になった。
【０２７６】
腫瘍体積に関しては、反復測定モデルを、一次自己相関共分散構造を仮定したデータに適合させた。時間プロファイルにおける傾向の曲率を柔軟にモデリングするために、自然スプラインを使用した。各時間点でグループ間における一対比較を行った。計算は、Ｒソフトウェア環境で実施した。
【０２７７】
結果
ＰＢＳおよびｃＶａｍ／ｈｕＩｇＧの両方の負の対照グループが、５１日後に約３５０ｍｍ３に達する類似の腫瘍成長を示した。このことは、不適切な抗体による抗体治療が腫瘍成長を阻害しないことを表している。３つのテストグループ（Ｃ７７５／Ｃ１１４２およびＣＮＴＯ８８８／Ｃ１１４２）における腫瘍の成長が負の対照グループよりも緩慢であったが、このことは抗−ＣＣＬ２／抗−ＪＥ治療が腫瘍の成長に対してインパクトをもつことを表していた。Ｃ７７５／Ｃ１１４２およびＣＮＴＯ８８８／Ｃ１１４２（２ｍｇ／ｋｇ）グループは、１８日目から研究終了まで腫瘍体積によって測定されるように、ＰＢＳ対照グループに比較して有意な腫瘍の阻害を示した。ＣＮＴＯ８８８／Ｃ１１４２（２０ｍｇ／ｋｇ）グループは、ＰＢＳ対照グループと比較して、１８日目から３９日目まで有意な阻害を示した。
【０２７８】
５１日目の研究終了時点で腫瘍重量を得た（表８）。ＰＢＳグループ１（マウス１匹）、Ｃ７７５／Ｃ１１４２グループ３（マウス３匹）およびＣＮＴＯ８８８／Ｃ１１４２グループ４（マウス２匹）には腫瘍のないマウスがいた。腫瘍重量を比較した場合、ＣＮＴＯ８８８テストグループは各々、ＰＢＳ対照グループに比較して腫瘍重量の有意な削減を示した（表８）。２ｍｇ／ｋｇで投薬されたＣＮＴＯ８８８／Ｃ１１４２グループにおける阻害百分率は、８０％（Ｐ＝０．００６）であったが、一方２０ｍｇ／ｋｇで投薬されたＣＮＴＯ８８８／Ｃ１１４２グループについては、阻害は６８％（Ｐ＝０．０４６）であった。Ｃ７７５／Ｃ１１４２グループも同様に腫瘍成長の有意な阻害を示した（Ｐ＝０．００４）。腫瘍体積対腫瘍重量の結果の統計的解釈に見られた差異はおそらく、動物から切除された腫瘍秤量の精確さに比較して、キャリパによる腫瘍の体積測定が不精確であることに起因すると思われる。
【０２７９】
【表１３】
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【０２８０】
集合的に、これらの結果は、確立されたＢｘＰＣ−３モデルにおいて、ＭＣＰ−１およびマウスＪＥの遮断が腫瘍の成長を有意に阻害していること、およびＣＮＴＯ８８８が抗−腫瘍活性を有することを表している。
【０２８１】
以上の記述および実施例中で特に記されたものとは別な形で本発明を実施できるということは明白であろう。
【０２８２】
以上の教示に照らして、本発明の数多くの修正および変形形態が可能であり、従ってこれらは、添付の特許請求の範囲内に入るものである。
【０２８３】
参考文献
【表１４−１】
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【表１４−２】
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【表１４−３】
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【表１４−４】
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【表１４−５】
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【表１４−６】
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