【手続補正書】
【提出日】平成26年2月26日(2014.2.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
kpsF、kpsE、kpsD、kpsU、kpsC、kpsS、kfoA、kfoC、およびkfoFを含む遺伝子クラスターを含むコンストラクトであって、該遺伝子クラスターが、kfoD、orf3（kfoI）、kfoE、またはorf1（kfoH）の1つまたは複数の機能的遺伝子を含有せず、かつ該コンストラクトが非病原性細菌宿主細胞においてコンドロイチンを生産するのに適している、コンストラクト。
【請求項２】
遺伝子クラスターがkpsMおよびkpsTをさらに含む、請求項1記載のコンストラクト。
【請求項３】
pDD66、pDD67、pCX040、pCX041、pCX042、pCX043、pCX096、またはpBR1052を含む、請求項1記載のコンストラクト。
【請求項４】
kfoA、kfoC、およびkfoFを含む遺伝子クラスターを含むコンストラクトであって、該遺伝子クラスターが、kpsM、kpsT、kpsE、kpsD、kpsC、またはkpsSの1つまたは複数の機能的遺伝子を含有せず、かつ該コンストラクトが非病原性細菌宿主細胞においてコンドロイチンを生産するのに適している、コンストラクト。
【請求項５】
kfoA、kfoB、kfoC、kfoF、kfoG、およびそれらの組合せからなる群より選択される遺伝子を含むコンストラクトであって、kpsM、kpsT、kpsE、kpsD、kpsC、またはkpsSの1つまたは複数の機能的遺伝子を含有せず、かつ非病原性細菌宿主細胞においてコンドロイチンを生産するかまたはコンドロイチンの量を増加させるのに適している、コンストラクト。
【請求項６】
kfoD、orf3、kfoE、またはorf1の1つまたは複数の機能的遺伝子も含有しない、請求項4または5記載のコンストラクト。
【請求項７】
遺伝子クラスターがkfoG、kfoB、またはそれらの組合せをさらに含む、請求項1または4記載のコンストラクト。
【請求項８】
kfoA、kfoB、kfoC、kfoF、およびkfoGを含む、請求項4または5記載のコンストラクト。
【請求項９】
pCX039、pCX044、またはpCX092を含む、請求項4または5記載のコンストラクト。
【請求項１０】
pCX075、pCX081、pCX082、pCX101、pBR1102、pBR1100、またはpBR1101を含む、請求項5記載のコンストラクト。
【請求項１１】
pCX045またはpCX048を含む、請求項6記載のコンストラクト。
【請求項１２】
1つまたは複数の遺伝子が、細菌宿主細胞において最適なコドン使用頻度になるように修飾されている、請求項1〜11のいずれか一項記載のコンストラクト。
【請求項１３】
K4遺伝子クラスターを含む、請求項1〜12のいずれか一項記載のコンストラクト。
【請求項１４】
請求項1〜13のいずれか一項記載のコンストラクトを含む、非病原性細菌宿主細胞。
【請求項１５】
kfoA遺伝子、kfoC遺伝子、およびkfoF遺伝子を含む組換え細菌細胞であって、kfoD、orf3（kfoI）、kfoE、またはorf1（kfoH）の1つまたは複数の機能的遺伝子を含有せず、かつ非フルクトシル化コンドロイチンを生産することができる、組換え細菌細胞。
【請求項１６】
kfoA遺伝子、kfoC遺伝子、およびkfoF遺伝子を含む遺伝子修飾微生物であって、kfoD、orf3（kfoI）、kfoE、またはorf1（kfoH）の1つまたは複数の遺伝子を欠失または不活性化するように遺伝子修飾され、非フルクトシル化コンドロイチンを生産することができる、遺伝子修飾微生物。
【請求項１７】
請求項15記載の組換え細菌細胞または請求項16記載の遺伝子修飾微生物を、非フルクトシル化コンドロイチンの生産にとって十分な発酵条件下で培養する工程を含む、非フルクトシル化コンドロイチンを生産するための方法。
【請求項１８】
（a）請求項1〜13のいずれか一項記載のコンストラクトを非病原性細菌宿主細胞に移入する工程、および
（b）コンドロイチンが細菌宿主細胞によって生産される発酵条件下で細菌宿主細胞を培養する工程
を含む、コンドロイチンを生産するための方法。
【請求項１９】
請求項1〜13のいずれか一項記載のコンストラクトを含む非病原性細菌宿主細胞を、コンドロイチンの生産にとって十分な発酵条件下で培養する工程を含む、コンドロイチンを生産するための方法。
【請求項２０】
請求項1〜13のいずれか一項記載のコンストラクトを非病原性細菌宿主細胞に移入する工程を含む、請求項1〜13のいずれか一項記載のコンストラクトを含む非病原性細菌宿主細胞を作製するための方法。
【請求項２１】
非フルクトシル化コンドロイチンを生産することができる、kfoA遺伝子、kfoC遺伝子、およびkfoF遺伝子を含む細菌細胞を作製するための方法であって、kfoD、orf3（kfoI）、kfoE、orf1（kfoH）、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される該細胞における遺伝子を不活性化する工程を含む、方法。
【請求項２２】
（a）請求項17〜19のいずれか一項記載の方法によってコンドロイチンを生産する工程、および
（b）コンドロイチンを硫酸化する工程
を含む、コンドロイチン硫酸を生産するための方法。
【請求項２３】
請求項17〜19のいずれか一項記載の方法によって生産された、コンドロイチン。
【請求項２４】
請求項22記載の方法によって生産されたコンドロイチン硫酸。
【請求項２５】
請求項23記載のコンドロイチンまたは請求項24記載のコンドロイチン硫酸を含む、組成物。
【請求項２６】
KpsFのSEQ ID NO：92、KpsEのSEQ ID NO：93、KpsDのSEQ ID NO：94、KpsUのSEQ ID NO：95、KpsCのSEQ ID NO：96、KpsSのSEQ ID NO：97、KpsTのSEQ ID NO：91、KfoAのSEQ ID NO：83、KfoBのSEQ ID NO：84、KfoCのSEQ ID NO：85、KfoI（Orf3）のSEQ ID NO：86、KfoEのSEQ ID NO：87、KfoH（Orf1）のSEQ ID NO：88、KfoFのSEQ ID NO：89、およびKfoGのSEQ ID NO：90の群から選択されるアミノ酸配列に結合する、抗体または抗体フラグメント。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４８】
本発明は、KpsFのSEQ ID NO：92、KpsEのSEQ ID NO：93、KpsDのSEQ ID NO：94、KpsUのSEQ ID NO：95、KpsCのSEQ ID NO：96、KpsSのSEQ ID NO：97、KpsTのSEQ ID NO：91、KfoAのSEQ ID NO：83、KfoBのSEQ ID NO：84、KfoCのSEQ ID NO：85、KfoI（Orf3）のSEQ ID NO：86、KfoEのSEQ ID NO：87、KfoH（Orf1）のSEQ ID NO：88、KfoFのSEQ ID NO：89、およびKfoGのSEQ ID NO：90の群から選択されるアミノ酸配列に結合する抗体または抗体フラグメントに向けられる。
[本発明1001]
kpsF、kpsE、kpsD、kpsU、kpsC、kpsS、kfoA、kfoC、およびkfoFを含む遺伝子クラスターを含むコンストラクトであって、該遺伝子クラスターが、kfoD、orf3（kfoI）、kfoE、またはorf1（kfoH）の1つまたは複数の機能的遺伝子を含有せず、かつ該コンストラクトが非病原性細菌宿主細胞においてコンドロイチンを生産するのに適している、コンストラクト。
[本発明1002]
コンドロイチンが非フルクトシル化体である、本発明1001のコンストラクト。
[本発明1003]
コンドロイチンが宿主細胞から分泌される、本発明1001のコンストラクト。
[本発明1004]
遺伝子クラスターがkfoGをさらに含む、本発明1001のコンストラクト。
[本発明1005]
遺伝子クラスターがkfoBをさらに含む、本発明1001のコンストラクト。
[本発明1006]
遺伝子クラスターがkpsMおよびkpsTをさらに含む、本発明1001のコンストラクト。
[本発明1007]
pDD66、pDD67、pCX040、pCX041、pCX042、pCX043、pCX096、またはpBR1052を含む、本発明1001のコンストラクト。
[本発明1008]
kfoA、kfoC、およびkfoFを含む遺伝子クラスターを含むコンストラクトであって、該遺伝子クラスターが、kpsM、kpsT、kpsE、kpsD、kpsC、またはkpsSの1つまたは複数の機能的遺伝子を含有せず、かつ該コンストラクトが非病原性細菌宿主細胞においてコンドロイチンを生産するのに適している、コンストラクト。
[本発明1009]
kfoA、kfoB、kfoC、kfoF、kfoG、およびそれらの組合せからなる群より選択される遺伝子を含むコンストラクトであって、kpsM、kpsT、kpsE、kpsD、kpsC、またはkpsSの1つまたは複数の機能的遺伝子を含有せず、かつ非病原性細菌宿主細胞においてコンドロイチンを生産するかまたはコンドロイチンの量を増加させるのに適している、コンストラクト。
[本発明1010]
コンドロイチンが宿主細胞から分泌されない、本発明1008または1009のコンストラクト。
[本発明1011]
kfoD、orf3、kfoE、またはorf1の1つまたは複数の機能的遺伝子も含有しない、本発明1008または1009のコンストラクト。
[本発明1012]
コンドロイチンが非フルクトシル化体である、本発明1008または1009のコンストラクト。
[本発明1013]
遺伝子クラスターがkfoG、kfoB、またはそれらの組合せをさらに含む、本発明1008のコンストラクト。
[本発明1014]
kfoA、kfoB、kfoC、kfoF、およびkfoGを含む、本発明1008または1009のコンストラクト。
[本発明1015]
pCX039、pCX044、またはpCX092を含む、本発明1008または1009のコンストラクト。
[本発明1016]
pCX075、pCX081、pCX082、pCX101、pBR1102、pBR1100、またはpBR1101を含む、本発明1009のコンストラクト。
[本発明1017]
pCX045またはpCX048を含む、本発明1011のコンストラクト。
[本発明1018]
1つまたは複数の遺伝子が、細菌宿主細胞において最適なコドン使用頻度になるように修飾されている、本発明1001〜1017のいずれかのコンストラクト。
[本発明1019]
さらにプロモーターを含む、本発明1001〜1018のいずれかのコンストラクト。
[本発明1020]
プロモーターが、Pm、Plac、Ptrp、Ptac、λpL、PT7、PphoA、ParaC、PxapA、Pcad、およびPrecAからなる群より選択される、本発明1019のコンストラクト。
[本発明1021]
プロモーターがPmである、本発明1020のコンストラクト。
[本発明1022]
第2のプロモーターをさらに含む、本発明1001〜1021のいずれかのコンストラクト。
[本発明1023]
第2のプロモーターが、Pm、Plac、Ptrp、Ptac、λpL、PT7、PphoA、ParaC、PxapA、Pcad、およびPrecAからなる群より選択される、本発明1022のコンストラクト。
[本発明1024]
第2のプロモーターがPmである、本発明1023のコンストラクト。
[本発明1025]
第2のプロモーターが1つまたは複数の遺伝子に機能的に連結されている、本発明1022のコンストラクト。
[本発明1026]
第2のプロモーターがkpsFEDUCSに機能的に連結されている、本発明1025のコンストラクト。
[本発明1027]
xylS調節遺伝子をさらに含む、本発明1001〜1026のいずれかのコンストラクト。
[本発明1028]
抗生物質耐性遺伝子をさらに含む、本発明1001〜1027のいずれかのコンストラクト。
[本発明1029]
抗生物質耐性遺伝子が、クロラムフェニコール（CamR）、カナマイシン（KanR）、アンピシリン（AmpR）、テトラサイクリン（TetR）、ブレオマイシン（BleR）、スペクチノマイシン（SpcR）、スルホンアミド（SuR）、ストレプトマイシン（StrR）、カルベニシリン（CbR）、およびエリスロマイシン（EryR）からなる群より選択される、本発明1028のコンストラクト。
[本発明1030]
K4遺伝子クラスターを含む、本発明1001〜1029のいずれかのコンストラクト。
[本発明1031]
細菌宿主細胞が、エシェリキア（Escherichia）、シュードモナス（Pseudomonas）、キサントモナス（Xanthomonas）、メチロモナス（Methylomonas）、アシネトバクター（Acinetobacter）、およびスフィンゴモナス（Sphingomonas）からなる群より選択される非病原性生物であるか、または該非病原性生物に由来する、本発明1001〜1030のいずれかのコンストラクト。
[本発明1032]
本発明1001〜1031のいずれかのコンストラクトを含む、非病原性細菌宿主細胞。
[本発明1033]
MSC279、MSC280、MSC315、MSC316、MSC317、MSC319、MSC322、MSC323、MSC324、MSC325、MSC326、MSC328、MSC346、MSC347、MSC348、MSC350、MSC356、MSC359、MSC392、MSC402、MSC403、MSC404、MSC405、MSC410、MSC411、MSC436、MSC437、MSC438、MSC439、MSC458、MSC459、MSC460、MSC461、MSC466、MSC467、MSC469、MSC480、MSC494、MSC498、MSC499、MSC500、MSC510、MSC511、MSC522、MSC526、MSC537、MSC551、MSC561、MSC562、MSC563、MSC564、MSC566、MSC567、MSC619、MSC625、MSC627、MSC640、MSC641、MSC643、MSC646、MSC650、MSC656、MSC657、MSC658、MSC659、MSC660、MSC669、MSC670、MSC671、MSC672、MSC673、MSC674、MSC675、MSC676、MSC677、MSC678、MSC679、MSC680、MSC681、MSC682、MSC683、MSC684、MSC687、MSC688、MSC689、MSC690、MSC691、MSC692、MSC693、MSC694、MSC700、MSC701、MSC702、MSC722、MSC723およびMSC724からなる群より選択される菌株である、本発明1032の非病原性細菌宿主細胞。
[本発明1034]
（a）本発明1001〜1031のいずれかのコンストラクトを非病原性細菌宿主細胞に移入する工程、および
（b）コンドロイチンが細菌宿主細胞によって生産される発酵条件下で細菌宿主細胞を培養する工程
を含む、コンドロイチンを生産するための方法。
[本発明1035]
本発明1001〜1031のいずれかのコンストラクトを含む非病原性細菌宿主細胞を、コンドロイチンの生産にとって十分な発酵条件下で培養する工程を含む、コンドロイチンを生産するための方法。
[本発明1036]
本発明1001〜1031のいずれかのコンストラクトを非病原性細菌宿主細胞に移入する工程を含む、本発明1001〜1031のいずれかのコンストラクトを含む非病原性細菌宿主細胞を作製するための方法。
[本発明1037]
コンストラクトの遺伝子クラスターまたは遺伝子が細菌宿主細胞の染色体中に組み込まれる、本発明1034〜1036のいずれかの方法。
[本発明1038]
2コピーまたはそれ以上の遺伝子クラスターまたは遺伝子が細菌宿主細胞の染色体に組み込まれる、本発明1037の方法。
[本発明1039]
コンドロイチンが非フルクトシル化体である、本発明1034または1035の方法。
[本発明1040]
コンドロイチンを硫酸化する工程をさらに含む、本発明1034または1035の方法。
[本発明1041]
（a）本発明1034または1035の方法によってコンドロイチンを生産する工程、および
（b）コンドロイチンを硫酸化する工程
を含む、コンドロイチン硫酸を生産するための方法。
[本発明1042]
硫酸化する工程が、ホルムアミド中で三酸化硫黄-トリエチルアミン錯体またはクロロスルホン酸をコンドロイチンと混合することを含む、本発明1040または1041の方法。
[本発明1043]
細菌宿主細胞が、エシェリキア、シュードモナス、キサントモナス、メチロモナス、アシネトバクター、およびスフィンゴモナスからなる群より選択される非病原性生物であるか、または該非病原性生物に由来する、本発明1034〜1036のいずれかの方法。
[本発明1044]
細菌宿主細胞がグラム陰性生物であるか、またはグラム陰性生物に由来する、本発明1034〜1036のいずれかの方法。
[本発明1045]
細菌宿主細胞がキサントモナス・カンペストリス（Xanthomonas campestris）である、本発明1043の方法。
[本発明1046]
キサントモナス・カンペストリス（X.campestris）が、MSC255、MSC256、MSC257、MSC225、およびMSC226からなる群より選択される菌株である、本発明1045の方法。
[本発明1047]
細菌宿主細胞が非病原性大腸菌（E.coli）である、本発明1043の方法。
[本発明1048]
非病原性大腸菌が大腸菌K-12および大腸菌Bからなる群より選択される、本発明1047の方法。
[本発明1049]
大腸菌K-12が、MSC188およびMSC175からなる群より選択される菌株である、本発明1048の方法。
[本発明1050]
大腸菌Bが菌株MSC364である、本発明1048の方法。
[本発明1051]
細菌宿主細胞の内因性遺伝子が、相同組換えによって欠失または不活化される、本発明1034〜1050のいずれかの方法。
[本発明1052]
細菌宿主細胞が、該宿主細胞にとって内因性の細胞外多糖を発現しない、本発明1034〜1050のいずれかの方法。
[本発明1053]
細菌宿主細胞が実験室クローニング株からの接合伝達に適している、本発明1034〜1050のいずれかの方法。
[本発明1054]
細菌宿主細胞からコンドロイチンを回収する工程をさらに含む、本発明1034または1035の方法。
[本発明1055]
細胞外培養培地からコンドロイチンを回収する工程をさらに含む、本発明1034または1035の方法。
[本発明1056]
1g/L〜50g/Lのコンドロイチンが、24〜72時間で、細菌宿主細胞から分泌される、本発明1034または1035の方法。
[本発明1057]
5g/L〜50g/Lのコンドロイチンが、24〜72時間で、細菌宿主細胞から分泌される、本発明1056の方法。
[本発明1058]
15g/L〜50g/Lのコンドロイチンが、24〜72時間で、細菌宿主細胞から分泌される、本発明1057の方法。
[本発明1059]
コンドロイチンを精製する工程をさらに含む、本発明1034または1035の方法。
[本発明1060]
細菌宿主細胞が、25℃〜37℃で培養される、本発明1034または1035の方法。
[本発明1061]
細菌宿主細胞が、グリセリンを含む培地で培養される、本発明1034または1035の方法。
[本発明1062]
本発明1034〜1035または1037〜1061のいずれかの方法によって生産された、コンドロイチン。
[本発明1063]
本発明1062のコンドロイチンを含む、組成物。
[本発明1064]
KpsFのSEQ ID NO：92、KpsEのSEQ ID NO：93、KpsDのSEQ ID NO：94、KpsUのSEQ ID NO：95、KpsCのSEQ ID NO：96、KpsSのSEQ ID NO：97、KpsTのSEQ ID NO：91、KfoAのSEQ ID NO：83、KfoBのSEQ ID NO：84、KfoCのSEQ ID NO：85、KfoI（Orf3）のSEQ ID NO：86、KfoEのSEQ ID NO：87、KfoH（Orf1）のSEQ ID NO：88、KfoFのSEQ ID NO：89、およびKfoGのSEQ ID NO：90の群から選択されるアミノ酸配列に結合する、抗体または抗体フラグメント。