(57)【要約】【課題】  肝毒性化合物、放射線暴露、遺伝的素因等による肝臓障害を予防または阻止すること。【解決手段】  本発明は、肝臓障害が起こる危険があるか肝臓障害があると診断された患者における肝臓障害の成立又は進行の防御のための、ＨＧＦ生物学的活性および所定のアンタゴニスト生物学的活性を有する分子に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＧＦ生物学的活性を有する第１のドメイン及びアクチビンアンタゴニスト生物学的活性又はＴＧＦ−βアンタゴニスト生物学的活性を有する第２のドメインを含有する分子。
【請求項２】
ＨＧＦアミノ酸配列を含む該第１のドメインを包含する１本鎖ポリペプチドである請求項１記載の分子。
【請求項３】
該第２のドメインが抗−アクチビン抗体又は抗−ＴＧＦ−β抗体である請求項１または２記載の分子。
【請求項４】
治療的に用いるための請求項１〜３のいずれかに記載の分子。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、肝臓障害を防御するための肝細胞成長因子（ＨＧＦ）の使用に関する。
【０００２】
背景技術
肝臓障害は、薬物−誘導肝毒性、ウイルス性感染、血管障害、自己免疫病及び鈍い外傷を含む多数の急性及び慢性臨床状態において生じる。さらに、生まれ付きの代謝異常に罹患している患者は、肝臓障害がおこる危険が有るだろう。これらの臨床状態の結果として生じる肝臓障害の症状には、例えば胆汁分泌停止を伴う激症肝炎、肝障害及び肝組織壊死が含まれ、多くの場合において、正常な肝臓機能の回復は、患者の生存率にとって重要である。
【０００３】
肝毒性化合物は、ほとんど全ての型の肝臓障害を誘導できる（Ｂｅｎｈａｍｏｕ，Ｊ−Ｐｉｅｒｒｅ，肝細胞及び薬物、第１６４章、３−１２頁、Ｃｏｌｌｏｑｕｅ  ＩＮＳＥＲＭ／Ｊｏｈｎ  Ｌｉｂｂｅｙ  Ｅｕｒｏｔｅｘｔ  Ｌｔｄ．、Ａ．Ｇｕｉｌｌｏｚｏ編、１９８８年）。化学試薬により肝臓が障害され易いのは、薬の代謝における肝臓の主要な役割に関係があるか又は高感受性反応の結果である。激症肝炎の場合の２５％が、医薬の副作用の結果で有り得る。肝毒性化合物もまた、脂肪肝、肝炎、肝硬変及び、肝臓の血管の及び新生物の障害を含む慢性肝臓病の重要な原因である（Ｓｉｎｃｌａｉｒら、Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（内科学のテキストブック)、５６９−５７５、１９９２年、Ｋｅｌｌｅｙ編、Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ社  出版)。
【０００４】
肝毒性化合物は、肝臓に対する直接的な細胞毒性により、又は毒性代謝物の生成による（このカデゴリーは、薬アレルギーに類似する高感受性反応を含む）肝臓障害；胆汁分泌停止、すなわち胆管の障害物に起因する胆汁の流れの停止；及び静脈閉塞病（ＶＯＤ）における様な血管の障害（この場合には血管の内皮に対する傷害は肝臓静脈の壊死を生じる）、を誘導し得る。肝毒性化合物により誘導される個々の肝臓障害の受け易さは遺伝的因子、年令、性別、栄養状態、他の薬に対する暴露及び全身的病気に影響される（上記のＳｉｎｃｌａｉｒら、内科学のテキストブック）。
【０００５】
肝臓障害を誘導することが知られている肝毒性化合物には、アセトアミノフェン、癌の処置に用いられるニトロソウレア、結核の処置に用いられるイソニアジドがある。
【０００６】
肝毒性化合物により誘導された軽症の肝臓障害においては、原因物質の投与中止は生じた障害を実質上取り消すのに十分であるかもしれないが、激症肝炎が結果として生じる多くの場合においては、Ｎ−アセチルシステインの様な解毒薬の投与などの積極的な医療治療が要求されることがある。しかし、解毒薬処置は、肝毒性化合物暴露の約１０−２４時間以上後に行われた場合には、有効でないことが多い（Ｇｏｏｄｍａｎｎ及びＧｉｌｍａｎのＴｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（治療学の薬理学的基礎）、第８巻、Ｇｉｌｍａｎら編、Ｐｅｒｇａｍｏｎ印刷、６５８−６５９頁、１９９０年）。もしもこの事態が起こったら、肝臓障害は永久的になり得るし、生命は脅かされ、治療法は生肝移植だけとなる。
【０００７】
放射線治療も肝臓障害を誘導し得る。１回かぎりの全身照射後において、低アルブミン血症及び肝血流の低下（両者とも、肝臓障害の症状である）が起こることが示された（Ｍｏｕｌｄｅｒ，Ｊ．ら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｒａｄｉａｔ  Ｏｎｃｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｐｈｙｓ  第１９巻、１３８９−１３９６頁、１９９０年）。Ａｗｗａｄ，Ｈ．ら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｒａｄｉａｔ  Ｏｎｃｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｐｈｙｓ  第１９巻（５）、１２２９−１２３２頁、１９９０年、は、非−ホジキンのリンパ腫を有する患者に対する処置として使用された半身照射後に、肺及び肝臓毒性が、放射能に関連した主な障害であることを示し、肝毒性の危険を減少するために、低い照射率又は多分割照射を勧めている。ＭｃＣｒａｃｋｅｎ，Ｊ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔ  Ｒｅｐ  ６９（１）、１２９−３１頁、１９８５年、は、放射線治療と動脈内投与の化学治療との併用は、血清酵素レベルによってモニターした結果、重大な慢性の肝臓障害を生じ得ると警告し、その治療を将来使用する場合には注意することを勧めている。Ｆａｊａｒｄｏ，Ｌ．ら、Ａｒｃｈ  Ｐａｔｈｏｌ  Ｌａｂ  Ｍｅｄ  １０４（１１）、５８４−８、１９８０年は、放射線により誘導された肝臓病は、構造的には、中心静脈の発達した繊維性閉塞（ＶＯＤ）により特徴づけられ、数名の患者においては、従来安全であると考えられていた放射線用量にて、ＶＯＤが起こることを示している。
【０００８】
肝臓障害を起こす生まれ付きの代謝障害が存在する。アリールエポキシドを無毒性のジヒドリオールに変換する能力が遺伝的に低い患者は、麻酔薬として有用な薬であるフェニトイン及びハロセインの投与により肝臓障害を生じ易いように思われる。また、避妊用ステロイドに関連した胆汁分泌停止にかかり易いのは、遺伝的要素が強いように思われる（上記のＳｉｎｃｌａｉｒら、内科学のテキストブック）。
【０００９】
いかなる起源の肝臓障害も、肝臓血流のアセスメント又はプロトロンビン凝固時間の様な肝臓マーカーの生化学的試験により、又は血清ビリルビン、血清トランスアミナーゼ及び血清アルカリ性ホスファターゼレベルの様な血清マーカーの生化学的試験により診断及びモニターされ得る（Ｃｏｒｎｅｌｉｕｓ，Ｃ．，肝毒性学（Ｈｅｐａｔｏｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ）、１８１頁、１９９１年及びＡｗｗａｄ．Ｈ．Ｉｎｔ  Ｊ．Ｒａｄｉａｔ  Ｏｎｃｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｐｈｙｓ  １９（５）、１２２９−１２３２頁、１９９０年）。肝臓障害はまた、肝臓組織の組織学的評価からモニターでき、これは、肝臓障害のタイプ及び程度を決定するのに役立つ（上記のＳｉｎｃｌａｉｒ，Ｓ．ら、内科学のテキストブック）。肝臓機能又は血清マーカーを測定するインビトロ系における生化学的試験から得られる結果及び／又は肝臓組織の生検から得られる結果は、インビボ系における肝臓障害のアセスメントと相関していることが知られている。生化学的試験、組織生検、患者の病歴及び肝臓障害を起こした原因のアセスメントの組み合わせを、肝臓障害の程度を決定するために使用することが多い。
【００１０】
肝臓細胞［肝（実質）細胞］の再生は、種々の成長刺激性及び成長阻害性の、自己分泌又は傍分泌起源のサイトカイン類によりコントロールされると信じられているが、これらの因子の正確な役割及び作用メカニズムは、完全には理解されていない。
【００１１】
インビトロ系においては、単離された肝細胞におけるＤＮＡ合成は、表皮成長因子（ＥＧＦ）及びタイプａトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ−α）の様な成長因子により刺激され、インターロイキン１β（ＩＬ−１β）（ナカムラら、Ｅｘｐ．  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．，１７９、４８８−４９７，１９８８年）、トランスフォーミング成長因子β１（ＴＧＦ−β１）（Ｂｒａｕｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５、１５３９−１５４３、１９８８年、ナカムラら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂａｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，１３３、１０４２−１０５０、１９８５年、Ｃａｒｒら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，４６、２３３０−２３３４、１９８６年、Ｃａｓｔｉｌｌａら、Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３２４、９３３−９４０、１９９２年、Ｈｏｕｃｈら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１３５、５５１−５５５、１９８８年、Ｓｔｒａｉｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１４５、４３６−４４２、１９８７年）及びアクチビン（ａｃｔｉｖｉｎ）（ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／２２３２１）により阻害されることが示された。ＴＧＦ−β１は、部分的肝切除後に起こるインビボ系におけるＤＮＡ合成を阻害することが示された。Ｒｕｓｓｅｌｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５、５１２６−５１３０、１９８８年。血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、すなわち内皮細胞有糸分裂促進物は、正常な肝臓において発現され（Ｂｅｒｓｅら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ，３（２）、２１１−２２０、１９９２年）、そこにおいて、組織の栄養摂取及び廃棄物除去の役割を果している。
【００１２】
ごく最近、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）と名付けられた、新たなタンパク質が、初代肝細胞に対する完全な有糸分裂促進物であることが明らかにされた。実験的肝臓障害後に、血清中のＨＧＦレベルが急速に増加するという観察に基づいて、激症肝炎の患者においては、ＨＧＦがインビボ系における肝臓再生の重要な媒介物であり得ることが提議され、ある実験的証拠は、この仮説を支持しているが、ＨＧＨが肝臓再生において果す役割については科学者の間に明確な合意は無い。Ｒｏｓｅｎら、細胞成長及び分化（Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）、第２巻、６０３頁、１９９１年、は、慢性肝臓病の患者における著しく上昇したＨＧＦレベルは、ＨＧＦが修復因子であるよりも、むしろ、ヒトの肝臓障害のマーカーであるか又はヒト肝臓障害の誘発物質であることを示しているかもしれないと警告している。
【００１３】
成長因子、サイトカインの様な成長因子様の活性を有するタンパク質（Ａｎｄｕｓら、肝臓学（Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ）１３（２）、３６４−３７５、１９９１年）及び組織プラスミノーゲン活性化物の様な治療薬（Ｂａｇｌｉｎら、骨髄移植（Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ）５（６）、４３９−４４１、１９９０年）は、肝臓障害の処置において示された。
【００１４】
ＨＧＦは、ナカムラらによって、部分的に肝切除したラットの血清から精製された（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１２２、１４５０−１４５９、１９８４年）。その後、ＨＧＦは、ラット血小板から精製され、そのサブユニット構造が決定された（ナカムラら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８３、６４８９−６４９３，１９８６年及びナカムラら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２２４、３１１−３１６、１９８７年）。ヒト血漿からのヒトＨＧＦ（ｈＨＧＦ）の精製は、Ｇｏｈｄａら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８１、４１４−４１９、１９８８年、により最初に記載された。Ｇｏｈｄａらによって報告された結果によると、ｈＨＧＦは、培養された肝細胞増殖の促進において、ヒト表皮成長因子（ｈＥＧＦ）またはインスリンよりもより効果的であり、最大効果のｈＥＧＦ及びインスリンとのｈＨＧＦの効果は、「相加的または相乗的」である。同様に、Ｚａｒｎｅｇａｒら、キャンサー  リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）４９、３３１４−３３２０、１９８９年、は、以前の刊行物において特性化されたｈＨＧＦの特性と非常に類似した特性を有しているヒトのヘパトプロテインＡ（ＨＰＴＡ）と呼ばれるポリペプチド成長因子の精製について記載している。著者は、それらの精製されたタンパク質のアミノ酸配列を開示していないので、その２つの因子間の構造上の類似の程度は決定することができない。
【００１５】
兎ＰＴＡのＮ−末端アミノ酸配列は、Ｚａｒｎｅｇａｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１６３、１３７０−１３７６、１９８９年によって記載された。
【００１６】
ラットＨＧＦ及びｈＨＧＦの両者は分子的にクローンされており、これには、「ｄｅｌｔａ５  ＨＧＦ」と名付けられた、クリングル１（Ｋ１）ドメイン（領域）において５アミノ酸を欠失している、天然に生じる変異体のクローニング及び配列決定を含んでいる（ミヤザワら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１６３、９６７−９７３、１９８９年、ナカムラら、ネーチャー、３４２、４４０−４４３、１９８９年、セキら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１７２、３２１−３２７、１９９０年、タシロら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７、３２００−３２０４、１９９０年、オカジマら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９３、３７５−３８１、１９９０年）。ミヤザワら及びナカムラらによって報告されたｈＧＨの配列は、いくつかの部位で異なっている。ラットＨＧＦのアミノ酸配列とｈＨＧＦのアミノ酸配列との比較により、その２つの配列は、高度に維持されており、特徴的な同じ構造上の特色を有していることが明らかにされた。ラットＨＧＦにおける４つのクリングルドメインの長さは、ｈＨＧＦにおけるクリングルドメインと正確に同じである。さらに、システイン残基が正確に同じ位置に局在しており、これは３次元構造が類似していることを示すものである（上記のオカジマら、上記のタシロら）。
【００１７】
天然に生じるｈＨＧＦ変異体は、成熟ｈＨＧＦのＮ−末端フィンガー及び最初の２つのクリングルドメインをコードしている暗号配列を含んでいるｈＨＧＦ転写物の別の切除された形態に相当するものであることが、最近同定された（Ｃｈａｎら、サイエンス  ２５４、１３８２−１３８５、１９９１年、ミヤザワら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９７、１５−２２、１９９１年）。ＨＧＦ／ＮＫ２と名付けられたこの変異体は、成熟ｈＨＧＦの競合的アンタゴニストであると提案されている。
【００１８】
ＨＧＦ受容体は、ｃ−Ｍｅｔがん原遺伝子（Ｂｏｔｔａｒｏら、サイエンス  ２５１、８０２−８０４、１９９１年、ナカムラら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ（がん遺伝子）６、５０１−５０４、１９９１年）の産物、すなわち、１９０ｋＤａ  ヘテロ二量体（ジスルフィド結合した５０−ｋＤａのａ−鎖及び１４５−ｋＤａのβ−鎖）の膜−スパンニング（ｓｐａｎｎｉｎｇ）チロシン  キナーゼ  プロテイン（Ｐａｒｋら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４、６３７９−６３８３、１９８７年）と同定された。ｃ−Ｍｅｔタンパク質は、ＨＧＦ結合によって１４５−ｋＤａのβ−サブユニットのチロシン残基がリン酸化される。
【００１９】
肝炎患者の血漿（上記のＧｏｈｄａら）及び実験的に肝臓障害を誘導した動物の血漿（Ｌｉｎｄｒｏｏｓら、Ｈｅｐａｔｏｌ．１３、７３４−７５０、１９９１年）又は血清（Ａｓａｍｉら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０９、８−１３、１９９１年）においては、ＨＧＦレベルが増加する。この反応の動力学は迅速であり、肝臓再生の間中、ＤＮＡ合成の最初のラウンドに先行し、このことはＨＧＦがこのプロセスの開始において重要な役割を果していることを示唆している。ＨＧＦは、元来、肝臓に特異的な有糸分裂促進物であると考えられていたが、ごく最近、メラニン細胞、尿細管細胞、ケラチン細胞、ある種の内皮細胞及び上皮起源の細胞を含む種々のタイプの細胞に対する有糸分裂促進物であることが明らかにされた（マツモトら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｍ．１７６、４５−５１、１９９１年、イガワら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１７４、８３１−８３８、１９９１年、Ｈａｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ３０、９７６８−９７８０、１９９１年、Ｒｕｂｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８、４１５−４１９、１９９１年）。興味深いことには、ＨＧＦは、「散乱（ｓｃａｔｔｅｒ）因子」、すなわちインビトロ系において、上皮及び血管内皮細胞の分離を増進する活性としても作用し得る（Ｓｔｏｋｅｒら、ネーチャー  ３２７、２３９−２４２、１９８７年、Ｗｅｉｄｎｅｒら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １１１、２０９７−２１０８、１９９０年、Ｎａｌｄｉｎｉら、ＥＭＢＯ  Ｊ．  １０、２８６７−２８７８、１９９１年）。さらに、ＨＧＦは上皮のモルフォゲン（形態形成物質）として最近、記載された（Ｍｏｎｔｅｓａｎｏら、Ｃｅｌｌ（細胞）６７、９０１−９０８、１９９１年）。従って、ＨＧＦは、腫瘍の侵略及び胚の発生において重要であると推定された。慢性のｃ−Ｍｅｔ／ＨＧＦ受容体活性化が、ある種の悪性腫瘍において観察された（Ｃｏｏｐｅｒら、ＥＭＢＯ  Ｊ．  ５、２６２３、１９８６年、Ｇｉｏｒｄａｎｏら、ネーチャー  ３３９、１５５、１９８９年）。
【００２０】
アクチビンは、インヒビンβサブユニットのホモ二量体又はヘテロ二量体からなり、それはβＡ又はβＢサブユニットであるかもしれない（Ｖａｌｅら、Ｒｅｃｅｎｔ  Ｐｒｏｇ．  Ｈｏｒｍ．  Ｒｅｓ．，４４、１−３４、１９８８年）。ヒト、豚、牛及びラットのアクチビンの間においては、βサブユニットの９５−１００％のアミノ酸が保存されている。βＡ及びβＢサブユニットは、特定の種の内では、約６４−７０％の相同性を有する。
【００２１】
アクチビンβＡ及びβＢホモ二量体（各々、「アクチビンＡ」及び「アクチビンＢ」）は、ろ泡流体において同定され、両者の分子は、クローンされ、それらの遺伝子は発現された（Ｍａｓｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｍ．１３５、９５７、１９８６年、１９８７年５月２０日に公開されたＥＰ公開第２２２，４９１号、Ｍａｓｏｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．３、１３５２−１３５８，１９８９年、Ｓｃｈｗａｌｌら、Ｍｏｌ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  ２、１２３７−１２４２，１９８８年、ナカムラら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６７、１６３８５−１６３８９、１９９２年）。βＢサブユニットの完全な配列は、セロノ（Ｓｅｒｏｎｏ）シンポジウム刊行物中、「インヒビン−ろ胞刺激ホルモン分泌の非−ステロイド調節」という標題にて、Ｈ．Ｇ．Ｂｕｒｇｅｒら編、Ａ．Ｊ．Ｍａｓｏｎらによる構成、第４２巻、７７ー８８頁（Ｒａｖａｎ印刷、１９８７年）において、「ヒト  インヒビン及びアクチビン：構造及び哺乳動物細胞における組換えの発現」という標題にて、公開されている。組換え分子は、皮下注射にて投与された場合、ラットにおけるＦＳＨの血清レベルを上昇することが示された。Ｓｃｈｗａｌｌら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，１２５、１４２０−１４２３、１９８９年、Ｒｉｖｉｅｒ及びＶａｌｅ、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，１２９、２４６３−２４６５、１９９１年。
【００２２】
アクチビンは最初は、ラット下垂体前葉細胞によるろ胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の分泌調節に関係する、天然の性腺ペプチドとしてろ胞流体中に見い出された。Ｖａｌｅら、ネーチャー  ３２１、７７６−７７９、１９８６年。Ｌｉｎｇら、ネーチャー  ３２１、７７９−７８２、１９８６年。ＤｅＰａｏｌｏら、Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，１９８、５００−５１２、１９９１年。Ｙｉｎｇ、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｒｅｖ．，９、２６７−２９３、１９８８年。
【００２３】
アクチビンのその後の研究は、ろ胞顆粒膜細胞の分化に対する作用（スギノら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｍ．１５３、２８１−２８８、１９８８年）、精原細胞の増殖（Ｍａｔｈｅｒら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，１２７、３２０６−３２１４、１９９０年）、赤血球の分化（１９８７年２月４日に公開されたＥＰ公開第２１０，４６１号、Ｅｔｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｍ．１４２、１０９５−１１０３、１９８７年、ムラタら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５、２４３４−２４３８、１９８８年、Ｙｕら、ネーチャー  ３３０、７６５−７６７、１９８７年）、膵臓小島によるインスリン分泌の促進（Ｔｏｔｓｕｋａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｍ．１５６、３３５−３３９、１９８８年）、繊維芽細胞増殖の促進（Ｈｅｄｇｅｒら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，６１、１３３−１３８、１９８９年）、肝細胞によるグルコース生産の促進（Ｍｉｎｅら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１２５、５８６−５９１、１９８９年）、ＥＦＧでも見られた効果である、ラット実質肝細胞におけるイノシトールホスファターゼの用量依存性増加の誘導、（Ｍｉｎｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１８６、２０５−２１０、１９９２年）、ソマトトロピン機能の調節（Ｂｉｌｌｅｓｔｒｕｐら、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，４、３５６−３６２、１９９０年）、神経細胞分化の調節（Ｓｃｈｕｂｅｒｔら、ネーチャー、３４４、８６８−８７０、１９９０年、ハシモトら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１７３、１９３−２００、１９９０年及び中胚葉誘導（Ｓｍｉｔｈら、ネーチャー、３４５、７２９−７３１、１９９０年、Ｍｉｔｒａｎｉら、細胞、６３、４９５−５０１、１９９０年）に対する効果を含む、その他の活性が明らかにされた。
【００２４】
慢性腎炎の血清は、正常な血清と同量のアクチビンを含んでいるが、正常な血清と腎炎患者の血清とは、アクチビンの特異的阻害物の含量が異なることが発見され、アクチビンは、その様な患者の貧血症治療に有効であり得ることが示唆された。シオザキら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１８３、２７３−２７９、１９９２年。インビトロ系においては、これらの活性が証明されたが、インビボ系におけるアクチビンの役割はほとんど理解されていない。
【００２５】
インヒビン及びアクチビンは、成長及び分化因子群の一因子である。この群の始原型（プロトタイプ）は、ＴＧＦ−βであり（Ｄｅｒｙｎｃｋら、ネーチャー、３１６、７０１−７０５、１９８５年）、これは１つの情報によれば、ＦＳＨ−放出活性をも有しているということである（Ｙｉｎｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１３５、９５０−９５６、１９８６年）。ＴＧＦ−β群の他の因子には、ミューラー管抑制物質、ハエのデカペンタプレジック（ｄｅｃａｐｅｎｔａｐｌｅｇｉｃ）遺伝子複合体（コンプレックス）及びアフリカツメガエルＶｇ−１  ｍＲＮＡの生産物が含まれる。
【００２６】
ＴＧＦ−β１は、肝臓成長のネガティブ調節因子であるらしく、ＴＧＦ−β分子は、胚（Ｓｉｌｂｅｒｓｔｅｉｎ及びＤａｎｉｅｌ、サイエンス、２３７、２９１−２９３、１９８７年）又は成人（上記のＫｙｐｒｉａｎｏｕ及びＩｓａａｃａ）における他の上皮組織の退化及びある種の癌の退化に関係している。Ｋｙｐｒｉａｎｏｕら、キャンサー  リサーチ、５１、１６２−１６６、１９９１年。最近、培養子宮上皮細胞において、細胞増殖及び細胞消滅が、ＴＧＦ−β１によって調和的に調節されていることが報告された。Ｒｏｔｅｌｌｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８、３４１２−３４１５、１９９１年。細胞消滅は、生理学的な細胞の死であり、核は凝縮し、細胞質は破片になる。
【００２７】
インビボ系における研究により、正常な及び新生物発生前の肝臓における消滅肝細胞はＴＧＦ−β１についての免疫染色を示すことがわかった。Ｏｂｅｒｈａｍｍｅｒら、Ｎａｕｎｙｎ−Ｓｃｈｍｉｅｄｅｂｅｒｇ’ｓ  Ａｒｃｈ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｕｐｐｌ．，３４３、Ｒ２４、１９９１年。Ｏｂｅｒｈａｍｍｅｒら、キャンサー  リサーチ、５１、２４７８−２４８５、１９９１年も参照せよ。インビトロ系においてＴＧＦ−β１によって誘導される肝細胞の死は、実際に細胞消滅（アポプトシス）であることの証拠が現在発見されている。Ｏｂｅｒｈａｍｍｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９、５４０８−５４１２、１９９２年。
【００２８】
フォリスタチン（ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ）又はＦＳＨ−抑制タンパク質（ＦＳＰ）と名付けられた性腺タンパク質因子の新しいクラスは、精製ブタ及び牛卵巣のインヒビン及びアクチビン由来のサイドフラクションから単離された。Ｙｉｎｇ、Ｅｎｄｏｃ．Ｒｅｖ．、９、２６７−２９３（１９８８）。Ｈｏｄｇｅｎら編、非ステロイド性腺因子：生理学的役割及び避妊薬開発における可能性、Ｊｏｎｅｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ発行、バージニア、１９８８年、３３−４６頁におけるＬｉｎｇら、「ろ胞刺激ホルモンの分泌を調節する性腺ポリペプチド類の単離及び特徴づけ」。フォリスタチンは最初、下垂体からのＦＳＨ分泌を抑制する能力によって特徴づけられた。フォリスタチンの作用はインヒビンの作用と類似しているように思われるが、構造上はその２つのタンパク質は全く異なっている。ウエノら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４、８２８２−８２８６、１９８７年。Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１４９、７４４−７４９、１９８７年。
【００２９】
フォリスタチンは３１から３９ｋＤａの範囲の分子量を有する形態において存在するグリコシル化された１本鎖タンパク質である。これらの形態の全ては同様のアミノ酸組成及び同一のアミノ末端アミノ酸配列を有している。フォリスタチンの遺伝子を用いたｃＤＮＡの分子クローニングにより、より小さい分子量の形態とより大きい形態の２つの形態が明らかにされ、それらは異なったスプライシングにより生成されることがわかった。小さい方の形態は大きい方の前駆体のカルボキシ末端が切除されたものである。
【００３０】
ラット組織におけるフォリスタチン遺伝子の発現の最近の研究は、フォリスタチンｍＲＮＡが性腺のみならず、腎臓、脱落性組織、膵臓、大脳皮質、下垂体などにおいても検出されることを示した。シマサキら、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，３、６５１−６５９、１９８９年。Ｋａｉｓｅｒら、内分泌学（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ）、１２６、２７６８−２７７０、１９９０年。Ｍｉｃｈｅｌら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１７３、４０１−４０７、１９９０年。
【００３１】
フォリスタチンは、培養下垂体細胞によるＦＳＨ分泌促進（Ｋｏｇａｗａら、内分泌学（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ）、１２８、１４３４−１４４０、１９９１年）及びアフリカツメガエル卵母細胞における中胚葉組織の誘導の様な種々のシステムにおいて、アクチビンの副作用を中和することができることが発見された。アサシマら、Ａｒｃｈ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，２００、４−７、１９９１年。実際に、中程度から強力な、同質の免疫活性を示す免疫活性フォリスタチンが肝臓細胞を含むラット組織に広く存在することが発見された。Ｋｏｇａｗａら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｊａｐａｎ，３８，３８３−３９１、１９９１年。その著者は、フォリスタチンは、種々のアクチビンの作用を広範に調節する偏在タンパク質であると示唆している。
【００３２】
肝臓障害を阻止するための効果的方法が必要とされている。この必要性は、例えば、肝毒性化合物、放射線暴露、ウイルス感染、自己免疫病、肝細胞成長阻害タンパク質、肝毒性タンパク質及びサイトカインが含まれるタンパク質の上昇したインビボ系レベル、又は遺伝的因子により、慢性のまたは急性の肝臓障害が誘導されるか、潜在的に誘導され得る患者集団において存在し、その場合には、その様な障害の進行を阻止することが望ましい。この必要性は、さらに、薬の過量投与の場合、感染した血液サンプルに偶然に接触した場合又は激しい化学治療又は放射線治療を含む臨床のシナリオなどの肝臓障害が展開する危険のある患者集団において存在する。多くの場合、癌の様な、深刻な、生命が脅かされる状態の処置は、用いられる化学治療試薬及び／又は放射線治療の肝毒性により、厳しい制限を受ける。患者が、重篤な肝臓障害の危険性がない、より高投与量の、その様な化学治療又は放射線治療を、長期間受けることが可能であることが望ましいであろう。肝臓障害を潜在的に誘導する臨床プロトコールに含め得る有効な肝臓障害予防試薬に関する必要性が存在する。
【００３３】
初期の介入が重要である状況における肝臓障害のさらなる進行の阻止方法を提供することが特に望ましいであろう。肝臓障害の原因因子の暴露から時間が経過したために、既知の解毒剤がもはや効果がない場合に、これは特に有益であろう。
【００３４】
従って、本発明の１つの目的は、特に、肝毒性化合物、放射線又は遺伝的素因のために肝臓障害を起こす危険がある患者において、肝臓障害を防ぐ方法を提供することである。他の目的は、すでに起こった肝臓障害の進行を防ぐ方法を提供することである。
【００３５】
さらなる目的は、肝臓障害の（さらなる）展開を防ぐことによって、潜在的に肝毒性を有する治療を患者が延長して受け、さらに／又はその様な処置のための投与量を増加することを可能とすることである。
【００３６】
さらにもう１つの本発明の目的は、肝臓障害を起こす危険がある徴候を示している患者において初期の介入方法を提供することである。
【００３７】
他の目的は、本分野で既知の解毒剤がもはや効果がない場合における肝臓障害の進行を防ぐ方法を提供することである。
【００３８】
これらの、及びさらなる目的は、本分野の当業者には明らかであろう。
【００３９】
発明の概要
本発明は、肝毒性化合物投与による予測される肝臓障害及び特に、予期された肝臓組織の壊死及び予期された血清酵素レベル上昇（両者は肝臓障害を示す）からの有効な保護をＨＧＦが提供するという実験的発見に基づいている。本発明は、また、ＨＧＦが、細胞にてアクチビン及びＴＧＦ−βが誘導する細胞死からの保護を提供するという実験的発見に基づいている。我々はさらに、ＨＧＦはすでに起こった肝臓障害の進行を防御する能力があることを発見した。ＨＧＦは肝細胞の再生に関係するが、肝臓障害の発生又はさらなる進行を防御するというＨＧＦの能力は全く予期されなかった。
【００４０】
ある側面においては、本発明は、肝臓障害が展開する危険のある患者における肝臓障害の設立を防御する方法であって、その患者に防御上有効量の肝細胞成長因子（ＨＧＦ）を投与することを含む方法に関する。その患者は哺乳動物であることが好ましく、ヒトであることがさらに好ましい。潜在的又は急性肝臓障害は、故意又は偶然の肝毒性化合物暴露、放射線暴露、遺伝的素因、肝臓の自己免疫病及びウイルス感染を含む、外部の又は内部の多数の因子に起因し得る。
【００４１】
本発明はさらに、すでに起こった肝臓障害の進行を防御する方法に関する。
【００４２】
他の側面では、本発明は、肝毒性のある治療薬を治療上有効量含有し、ＨＧＦを肝臓障害を防御できる量含有する組成物に関する。
【００４３】
さらに具体的には、本発明は、障害又は病的生理学的状態の防御又は処置に有効な、肝毒性を有する治療薬を用いて患者を処置するための方法であって、
ａ）該患者に同時に又は任意の順序で、生物学的有効量の該治療薬及び防御上有効量のＨＧＦを投与し、
ｂ）該患者について肝臓障害の徴候をモニターし、ついで
ｃ）該障害又は病的状態が消失するか又は肝臓障害の徴候があらわれるまで該処置を続けることからなる方法に関する。
【００４４】
さらに具体的には、本発明は、ウイルス性又は自己免疫性肝炎が起こる危険があるか又はウイルス性又は自己免疫性肝炎であると診断された患者における肝臓障害の成立又は進行を防御する方法であって、該患者に肝臓障害を防御できる量のＨＧＦを投与することを包含する方法に関する。
【００４５】
発明の詳細な説明
本明細書中、「肝臓障害」という用語は、最も広い意味に用いられ、直接的に又は間接的に、内因性又は外因性因子又はそれらの組合せの結果として生じる、あらゆる構造上の又は機能上の肝臓損傷を指している。肝臓障害は、肝毒性化合物に対する暴露、放射線暴露、機械的肝臓損傷、遺伝的素因、ウイルス感染、自己免疫慢性肝炎などの自己免疫病及びアクチビン及びＴＧＦ−βの様なタンパク質レベルがインビボ系において上昇する結果が含まれるが、これらに限定されない多数の因子により誘導され得る。
【００４６】
肝毒性化合物によって誘導される肝臓障害には、薬過敏反応、胆汁分泌停止及び血管内皮の損傷が含まれる直接的細胞毒性が関係する（Ｓｉｎｃｌａｉｒら、上記の内科学のテキストブック）。
【００４７】
ある種の治療薬を含む、多数の肝毒性化合物は細胞毒性を誘導する。肝毒性化合物は、直接的な化学的攻撃によって又は毒性代謝物の生産によって肝臓細胞毒性を生じ得る。肝毒性の正確なメカニズムは不明であるが、還元代謝の生産物は細胞のマイクロ分子と結合し、脂質の過酸化及び薬代謝の及び他の酵素の不活性化を引き起こす高反応性物質である。膜の損傷はミトコンドリア及び平滑小胞体からのカルシウム遊離を刺激し、通常はカルシウムがサイトソルに蓄積することを防いでいるカルシウムイオンポンプに干渉するらしい。カルシウム蓄積の結果を伴う細胞代謝に対する有害作用、細胞質からのカリウム及び酵素の消失及びミトコンドリア損傷の結果起こる必須エネルギーの消失は全て肝臓組織の壊死に寄与する。
【００４８】
多数の肝毒性化合物は、意外にも受容者の一部に肝臓障害を生じるだけである。ある患者においては、肝臓障害は過敏症反応と呼ばれ、薬の反応の過敏症反応の様であり、その場合、患者には発熱、発疹及び好酸球増加が生じ、その薬が再投与されると症状が再び起こる。他の場合には、損傷のメカニズムは不明であり、肝毒性代謝物の生産又は蓄積を起こす、感受性の強い患者における異常代謝であるかもしれない。
【００４９】
直接的な化学攻撃により細胞毒性を誘導する薬には以下のものが含まれる。
エンフルラン、フルオロキセン、ハロセイン及びメトキシフルランなどの麻酔剤。コカイン、ヒドラジド類、メチルフェニデート及び三環性物などの神経向精神薬。
フェニトイン及びバルプロ酸などの抗痙攣薬。
アセトアミノフェン、クロルゾキサゾン、ダントロレン、ジクロフェナック、イブプロフェン、インドメタシン、サリチル酸類、トリメチン及びゾキサゾラミンなどの鎮痛薬。  アセトヘキサミド、カルブタミド、グリピジド、メタヘキサミド、プロピルチオウラシル、タモキシフェン、ジエチルスチルベストロールなどのホルモン類。  アムホテリシンＢ、クリンダマイシン、ケトコナゾール、メベンダゾール、メトロニダゾール、オキサシリン、パラアミノサリチル酸、ペニシリン、リファンピシン、スルホンアミド類、テトラサイクリン及びジドブジンなどの抗菌剤。
アミオダロン、ジリタゼム、ａ−メチルドパ、メキレチン、ヒドラザリン、ニコチン酸、パパベリン、ペルヘキシリン、プロカインアミド、キニジン及びトカインアミドなどの心臓脈管薬。及び、
アスパラギナーゼ、シスプラチン、サイクロフォスファミド、ダカルバジン、ドキソルビシン、フルオロウラシル、メトトレキセート、マイトマイシン、６−ＭＰ、ニトロソウレア、タモキシフェン、チオグアニン及びビンクリスチンなどの免疫抑制剤及び抗新生物薬。及び、
ジスルフィラム、ヨードイオン、オキシフェニサチン、ビタミンＡ及びパラアミノ安息香酸などの種々雑多な薬。
【００５０】
肝臓において過敏症反応を生じる肝毒性化合物には、以下のものが含まれる。フェニトイン、パラアミノサリチル酸、クロロプロマジン、スルホンアミド類、エリスロマイシン  エストレート、イソニアジド、ハロセイン、メチルドパ及びバルプロ酸。
【００５１】
胆汁分泌停止、すなわち胆汁の流れの阻止を誘導する肝毒性化合物はいくつかの形態を取り得る。小葉中心の胆汁分泌停止は、門脈の炎症性変性を伴う。胆管の変性はエリスロマイシンの様なある薬について報告されており、一方純粋な小管の胆汁分泌停止は蛋白同化ステロイドの様な他の薬の特徴である。慢性胆汁分泌停止はメチルテストステロン及びエストラジオールの様な薬と関係づけられた。
【００５２】
胆汁分泌停止病を誘導する肝毒性化合物には以下のものが含まれる。  避妊用ステロイド、アンドロゲン様ステロイド、蛋白同化ステロイド、アセチルサリチル酸、アザチオプリン、ベンゾジアゼピン、セノデオキシコール酸、クロロジアゼポキシド、エリスロマイシン  エストレート、フルフェナゾン、フロセミド、グルセオフルビン、ハロペリドール、イミプラミン、６−メルカプトプリン、メチマゾール、メトトレキセート、メチルドパ、メチレンジアミン、メチルテストステロン、ナプロキセン、ニトロフラントイン、ペニシルアミン、ペルフェナジン、プロクロロペラジン、プロマジン、チオベンダゾール、チオリダジン、トルブタミド、トリメトプリム−スルファメトキサゾール、ひ素、銅及びパラコート。
【００５３】
ある薬物群は第１に胆汁分泌停止を生じるが、また肝毒性も生じ得るので、それらが引き起こす肝臓損傷は混合型である。混合型の肝臓損傷を引き起こす薬には例えば以下のものが含まれる。
クロロプロマジン、フェニルブタゾン、ハロセイン、クロロジアゼポキシド、ジアゼパム、アロプリノール、フェノバルビタール、ナプロキセン、プロピルチオウラシル、クロロアムフェニコール、トリメトプリム−スルファメトキサゾール、アムリノン、ジソピラミド、アザチオプリン、シメチジン及びラニチジン。
【００５４】
肝静脈の血栓症、肝小静脈の閉塞又は静脈閉塞病（ＶＯＤ）及び肝臓紫班病を含む肝臓の血管障害は薬によって生じ得る。さらに、洞様毛細血管の拡張、洞様毛細血管周囲の繊維症及び肝門脈硬化症を含む障害が起こり得る。中帯状及び中心周囲の洞様毛細血管の拡張は最初、経口的避妊治療の合併症として報告された。紫班性肝炎は、内膜バリヤーを通過して赤血球が漏れる結果生じる、血液で満たされた大きな洞からなる状態であり、洞様毛細血管周囲の繊維症がその後に続く。それは経口避妊薬、蛋白同化ステロイド、アザチオプリン及びダナゾールを服用した患者について記載された。中心肝臓静脈の損傷及び閉塞もまたブッシュ（ｂｕｓｈ）茶などのピロロリジジンアルカロイド類の摂取に関係していることが知られている。最初の障害は小静脈口径における進行性の病気を伴う中心の壊死である。これらの全障害は薬を中止した場合に部分的にのみ回復でき、肝硬変が発生し得る。
【００５５】
いくつかの型の良性及び悪性肝臓新生物は、肝毒性化合物の投与の結果として生じ得る。腺腫は、子供を生む年令の女性に限定された障害であるが、避妊用ステロイドの使用に関係し、使用期間とともにその危険が増加する。肝細胞のカルシノーマもまた、再生不能性貧血又は下垂体機能低下症のためにアンドロゲン様ホルモンを服用している患者に観察され得る。
【００５６】
肝臓障害を引き起こすことが知られている肝毒性化合物には以下のものが含まれる。
避妊用ステロイド、ピロロリジジンアルカロイド、ウレタン、アザチオプリン、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、マイトマイシン、ＢＣＮＵ、ビンクリスチン、アドリアマイシン、静脈内ビタミンＥ、蛋白同化−アンドロゲン様ステロイド、アザチオプリン、メドロキシプロゲステロンアセテート、エストロンスルフェート、タモキシフェン、非有機性ひ素、トリウム  ジオキシド、ビタミンＡ、メトトレキセート、メチルアンフェタミン塩酸塩、ビタミンＡ、コルチコステロイド、トリウム  ジオキシド及びラジウム治療。
【００５７】
他の因子により生じる肝臓障害は通常同様の形態を採る。
【００５８】
化合物、放射線治療、遺伝的素因、機械的損傷又はそれらとその他の因子とのあらゆる組合せの肝臓毒性により生じる肝臓障害はいくつかの手段で検出できる。臨床上、肝毒性の標準測定法として生化学的試験が長年使用されてきた。大部分の生化学試験は一般的に２つのカデゴリーに分けられる。例えばプロトロンビン凝固時間及び／又は肝臓血流などの特異的肝臓マーカーを測定する試験又は壊死、胆汁分泌停止、進行性繊維成長又は肝癌の検出のための血清マーカーを分析する試験（肝毒性、Ｍｅｅｋｓら編、１８１−１８５，１９９１年中のＣｏｒｎｅｌｉｕｓ，Ｃ．）。その様な試験の重要性は、それらの簡便性及びそれらが非−侵略的である事実に存在する。肝臓障害の調査において血清酵素を使用する根拠は、これらの酵素が、肝細胞内に含まれるのが正常であり、肝臓細胞が損傷された場合に全身の循環へと侵入することである。血清の酵素活性の上昇は壊死及び／又は胆汁分泌停止を示唆する。血清のビリルビン結合物のレベルの上昇は肝臓内又は肝臓外胆汁分泌停止を示唆する。しかし、血清の酵素レベルを単独の肝臓損傷の診断方法として使用することにはある種の限界が存在する。化学的に引き起こされた特異的な肝臓損傷よりもむしろ物質の全身的作用に由来して変化した透過性を有する細胞からの漏れの結果として、血清の酵素レベルが増加し得る。肝臓の組織学的試験は肝臓損傷の性質及び程度を同定し、定量する次の論理的段階である。
【００５９】
肝臓損傷のマーカーとしての血清の酵素は肝臓障害に対する特異性及び感受性に基づき４つの群に分けることができる（上記の肝毒性学において、Ｋｏｄａｖａｎｔｉら、２４１−２４４頁）。
第１群：これらの酵素が上昇した場合には、より選択的に肝臓の胆汁分泌停止を示す。例えば、アルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）、５’−ヌクレオチダーゼ（５’−ＮＤ）及びａ−グルタミル  トランスペプチダーゼ（Ｇ−ＧＴ）及びレウシン  アミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）。
第２群：これらの酵素が上昇した場合には、実質組織の損傷を示す。例えば、アスパルテート  トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）、アラニン  トランスアミナーゼ（ＡＬＴ）、フラクトース−１，６−ジホスフェート  アルドラーゼ（ＡＬＤ）、ラクテート  デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）、イソシトレート  デヒドロゲナーゼ（ＩＣＤＨ）、オルニチン−カルバモイル−トランスフェラーゼ（ＯＣＴ）及びソルビトール  デヒドロゲナーゼ（ＳＤＨ）アルギナーゼ及びグアナーゼ。
第３群：これらの酵素が上昇した場合には、他の組織の損傷を表す。例えば、クレアチン  ホスホキナーゼ（ＣＰＫ）。
第４群：これらの酵素は肝臓損傷を低下させる。例えば、コリンエステラーゼ（ＣｈＥ）。
【００６０】
他の血清のマーカーには以下のものが含まれる。肝臓の繊維成長が活性であるかどうかを調べるためのプロコラーゲン  タイプ  III ペプチドのレベル（ＰIIIＰ）。肝臓脳障害におけるアンモニア血液レベル。壊死及び肝癌におけるリガンドのレベル。肝臓の内膜細胞障害に由来するヒアルロネートのレベル。肝癌を検出するためのａ−１−フェトプロテイン（ＡＦＰ）レベル、肝臓への癌の転移を検出するための癌胎児性抗原（ＣＥＡ）レベル。ミトコンドリア、核などの種々の細胞成分及び特異的肝臓膜タンパク質に対する抗体の上昇。及びアルブミン、グロビン、アミノ酸、コレステロールなどのタンパク質及び他の脂質の検出。肝臓の生検から得られた種々のミネラル、代謝物及び酵素の生化学的分析もまた、遺伝的な、獲得された及び実験的に誘導した肝臓の異常における特異的生化学的欠陥を研究するために役立ち得る。
【００６１】
肝臓機能試験は肝臓損傷を調べるために行われ得る。肝臓機能試験には以下のものが含まれる。
第１群：ビリルビン、インドシアニングリーン（ＩＣＧ）、スルホブロモフタレイン（ＢＳＰ）及び胆汁酸などの有機アニオンの肝クリアランスの調査。
第２群：ガラクトース及びＩＣＧクリアランスの測定による肝血流の調査、及び、
第３群：アミノピリン  ブレス（ｂｒｅａｔｈ）試験及びカフェイン  クリアランス試験を用いる肝臓ミクロゾームの機能の調査。
【００６２】
例えば、血清ビリルビンを測定して、黄疸の存在及び重篤さを確認でき、実質組織の肝臓病において見られる様な高ビリルビン血症の程度を検出できる。アミノトランスフェラーゼ（トランスアミナーゼ）上昇は活性肝細胞障害の重篤さを反映し、一方、アルカリ性ホスファターゼ上昇は胆汁分泌停止及び肝臓浸潤とともに発見される（Ｈａｒｔｉｓｏｎの内科学の原理、第１２版、Ｗｉｌｓｏｎら編、２、１３０１−１３０８、１９９１年におけるＩｓｓｅｌｂａｃｈｅｒ，Ｋ．及びＰｏｄｏｌｓｋｙ，Ｄ．）。
【００６３】
血清の酵素分析を実施する方法は本分野において既知であり、例えば、上記のＫｏｄａｖａｎｔｉらに記載されている。
【００６４】
広範囲の肝臓損傷により、アルブミン、プロトロンビン、フィブリノーゲン及び肝細胞によって排他的に合成された他のタンパク質の血中レベルが下がるので、これらのタンパク質レベルを肝臓損傷の指標として測定できる。血清酵素の測定とは異なり、血清のタンパク質レベルは単なる細胞損傷よりもむしろ、肝臓の合成機能を反映する（Ｐｏｄｏｌｓｋｙ，Ｄ．Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（内科学の原理）、第１２版、Ｗｉｌｓｏｎら編、２、１３０８−１３１１、１９９１年）。
【００６５】
多くの患者においては、肝臓病の性質を同定するために、コンピュータを使う技術（ＣＴ）、超音波、シンチスキャン又は肝臓生検が必要であろう（上記のＩｓｓｅｌｂａｃｈｅｒ，Ｋ．及びＨａｒｒｉｓｏｎの内科学の原理、第１２版、Ｗｉｌｓｏｎら編、２、１３０３−１３０７、１９９１年、中のＦｒｉｅｄｍａｎ，Ｌ．及びＮｅｅｄｌｅｍａｎ．Ｌ．）。
【００６６】
本発明の文脈において使用される場合、「防御」という用語は、予期された肝臓障害の発生の完全な又は部分的な遮断及び既に発生した肝臓障害の進行の妨害又は緩和を含む。存在している肝臓障害が完全に又は部分的に逆転するかもしれないことが予想されるが、このことはこの定義における要件ではない。
【００６７】
「防御上有効量」という用語は、本明細書中、上記に定義した様な防御を達成するために有効な量を表すために用いられる。
【００６８】
「肝臓障害を起こす危険のある」患者には、肝臓障害を誘導する潜在性を有することが知られているあらゆる因子に暴露されることが予想される又は暴露された患者が含まれる。これには、通常、安全であると考えられる投与量における又は通常、安全ではないと考えられる投与量における肝毒性化合物の（治療の一部としての又は偶然の暴露による）暴露、放射線照射又は病気の処置に有効なある臨床治療であって、その臨床治療は肝臓障害を誘導することが知られているあらゆる治療を受けることが含まれる。この定義はさらに、鈍い外傷、銃弾傷又は手術を含む物理的外傷による、実際に又は潜在的に維持された肝臓損傷を含む。肝臓障害を起こす危険のある患者には、生まれ付きの代謝異常を有する患者及び遺伝的に肝臓障害が誘導され易い患者、又は遺伝的因子、年令、性、栄養状態、他の薬の投与及び全身性の病気を含む他の危険因子に起因する肝臓障害を受け易い哺乳動物の患者が含まれる。肝臓障害を起こす危険のある患者には、また、肝炎Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ又はＥ又は自己免疫慢性肝炎などのウイルスに感染することが予期された又は感染した患者が含まれる。
【００６９】
本明細書中にて、使用されている場合、「放射線」は、Ｘ線の照射又は肝毒性の副作用を有することが知られている、あらゆる他の光線の照射を表し、放射線治療の及び偶然の照射を含む。
【００７０】
本発明の文脈において使用される場合、「肝細胞成長因子」又は「ＨＧＦ」という用語は、天然の肝細胞成長因子を表すために使用され、又は本明細書中にて上記した様な標準試験において測定される様な、肝臓障害の成立又は進行を防御する能力のある、天然の肝細胞成長因子の、あらゆるフラグメント又は誘導体を表すために使用される。この用語は具体的には、ヒトの及びラットＨＧＦなどのヒト以外のもの、成熟型、プレ、プレ−プロ又はプロ型のもの、天然源から精製された、化学的に合成された又は組換えにより生成されたもの及びそれらの誘導体を含む。
【００７１】
「ヒトの肝細胞成長因子」又は「ｈＨＧＦ」という用語は、上記のミヤザワら又は上記のナカムラら、ネーチャーにより公開されたｃＤＮＡ配列によりコードされたポリペプチドを表し、それの１本鎖及び２本鎖、成熟型、プレ、プレ−プロ又はプロ型、天然源から精製された、化学的に合成された又は組換えにより生成されたもの及びそれらの、あらゆるフラグメント又は誘導体を含み、上記した標準試験のいずれかによって測定される様に、肝臓障害の成立又は進行を防御する定性的能力を保持している。
【００７２】
「天然の」「野生型」ｈＨＧＦのｃＤＮＡは、７２８アミノ酸ポリペプチド（プレープロｈＨＧＦ）をコードし、分子量（Ｍ）が約８２，０００であり、４４０アミノ酸の大きいα−サブユニット（Ｍ  ６９，０００）及び２３４アミノ酸の小さいβ−サブユニット（Ｍ  ３４，０００）から構成されたヘテロ２重鎖構造を有する。ｈＨＧＦのｃＤＮＡのヌクレオチド配列は、α−及びβ−鎖の両方が、プレ−プロ前駆体タンパク質をコードしている単一のオープン  リーディング  フレーム内に含まれることを明らかにしている。成熟ｈＨＧＦの予想される一次構造においては、α−鎖のＣｙｓ４８７及びβ−鎖のＣｙｓ６０４の間に鎖間Ｓ−Ｓ結合が形成される（上記のナカムラら、ネーチャーを参照せよ）。α−鎖のＮ−末端はメチオニンのグループから始まる５４のアミノ酸が先行する。このセグメントはシグナル配列及びプロ配列を含む。α−鎖はアミノ酸（ａａ）５５から始まり、４つのクリングル  ドメインを含んでいる。クリングル１ドメインは約ａａ１２８から約ａａ２０６まで広がり、クリングル２ドメインは約ａａ２１１及び約ａａ２８８の間であり、クリングル３ドメインは約ａａ３０３から約ａａ３８３まで広がっていると定義され、クリングル４ドメインは、ａ−鎖の約ａａ３９１から約ａａ４６４まで広がっている。種々のクリングルドメインの定義は、他のタンパク質（プロトロンビン、プラスミノーゲン）のクリングル様ドメインとそれらの相同性に基づくことが理解されるであろうし、従って上記の限定は単なる近似である。ＨＧＦ  β−鎖はセリン−プロテアーゼ様ドメインを含んでいる。ｈＨＧＦは４つの推定されているグリコシル化部位を含み、それらは、α−鎖の２９４位及び４０２位及びβ−鎖の５６６位及び６５３位に存在する。ミヤザワら及びナカムラらによって報告された天然のｈＨＧＦの配列は１４個のアミノ酸において異なる。この相違の理由は完全に明白であるというわけではない。その可能性の内には多形性又はクローニング人工産物が含まれる。両者の配列は本発明の目的のために定義した「天然のｈＨＧＦ」という用語に具体的に包含される。その用語は、具体的には、天然のヒトのｈＨＧＦの最初のクリングルドメインにおいて５個のアミノ酸が欠失されている変異体であり、上記のＳｅｋｉらによって最初に定義され、記載された「ｄｅｌｔａ５ｈＨＧＦ」を含む。
【００７３】
「誘導体」という用語は、天然の肝細胞成長因子のアミノ酸配列変異体及びグリコシル化変異体及び共有修飾物を定義するために用いられる。
【００７４】
ＨＧＦの１本鎖変異体は、１９９３年５月１７日に出願されたＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９３／０４６４８に記載されている。この１本鎖変異体は、インビボ系における１本鎖ＨＧＦプロ酵素をそれの２本鎖型へと変換する能力を有する酵素によるタンパク質の加水分解による分裂に対して耐性である。変異がない場合には、このタンパク質加水分解による分裂は、野生型ｈＨＧＦ配列のＡｒｇ  ４９４及びＶａｌ  ４９５の間で起こる。この１本鎖ｈＨＧＦ変異体は、野生型ｈＨＧＦアミノ酸配列の４９３、４９４、４９５又は４９６位のアミノ酸において又はそれに隣接して、変異を有するのが好ましい。好ましいグループにおいては、より小さい、非極性の又は酸性のアミノ酸が、４９４位のアルギニンと置換されて１本鎖ｈＨＧＦ変異体を生成する。１本鎖ｈＨＧＦ変異体の典型的代表は、例えばＲ４９４Ａ、Ｒ４９４Ｄ及びＲ４９４Ｅ  ｈＨＧＦである。
【００７５】
ＨＧＦのプロテアーゼ  ドメイン変異体は、１９９３年５月１７日に出願されたＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９３／０４６４８に記載されている。望ましいＨＧＦアミノ酸変異体は、対応する野生型ＨＧＦと比較して、受容体結合親和性が維持されているか増強されているものである。さらに、対応する野生型ＨＧＦと比較して、実質上維持された又は増強された生物学的活性を示す変異体（ＨＧＦアゴニスト）が特に好ましい。プロテアーゼ  ドメイン変異体は例えば、セリンプロテアーゼの触媒部位に対応する領域において変異を有している。ｈＨＧＦ変異体においては、野生型ｈＨＧＦの５３４、６７３及び６９２位のいずれかにおいて又はそれに隣接して、変異が存在するのが好ましい。典型的なｈＨＧＦのプロテアーゼ−ドメイン変異体にはＱ５３４Ｈ；Ｙ６７３Ｓ；Ｖ６９２Ｓ；Ｑ５３４Ｈ；Ｙ６７３Ｓ；Ｙ６７３Ｓ；Ｖ６９２Ｓ；Ｑ５３４Ｈ；Ｙ６７３Ｓ；Ｖ６９２Ｓ  ｈＨＧＦが含まれるがこれらに限定されない。
【００７６】
前記特許出願はまた、ＨＧＦのＣ−末端の先端切除及びクリングル  ドメイン欠失変異体を開示している。この様な欠失はお互いに、さらに／又はプロテアーゼ  ドメイン内の変異と、天然のＨＧＦ分子のタンパク質加水分解の開裂部位における又はその周囲における変異とを合体させ得る。
【００７７】
ＨＧＦの共有変異体には翻訳後修飾物及び有機変異試薬を用いる反応により得られた変異体が含まれるがこれらに限定されない。
【００７８】
他の変異体には、非タンパク性のポリマーに共有結合した変異体がある。この非タンパク性ポリマーは通常は、親水性の合成ポリマーであって、すなわち、天然においては、存在しないポリマーである。しかし、天然に存在し、組換え又はインビトロ法により生成されたポリマーは、天然から単離されたポリマーであるけれども有用である。親水性ポリビニルポリマー、例えばポリビニルアルコール及びポリビニルピロロリドンは本発明の範囲内である。ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールなどのポリビニルアルキレンエーテル類が特に有用である。
【００７９】
ＨＧＦは、ＵＳ特許番号第４，６４０，８３５；４，４９６，６８９；４，３０１，１４４；４，６７０，４１７；４，７９１，１９２又は４，１７９，３３７に記載の方法により、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール又はポリオキシアルキレン類などの種々の非タンパク性ポリマーと結合させ得る。
【００８０】
ＨＧＦを、例えばコアセルベーション技術又は界面重合によって調製されたマイクロカプセル内に、コロイド状の薬のデリバリーシステム内に（例えば、リポソーム、アルブミン  マイクロスフェアー、マイクロエマルジョン、ナノ−粒子及びナノカプセル）又はマイクロエマルジョン内に、包み込み得る。この様な技術はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎの医薬科学）、第１６版、Ｏｓｏｌ，Ａ．編、１９８０年に開示されている。
【００８１】
ＨＧＦ配列は免疫グロブリン定常領域配列と結合させ得る。その結果得られる分子はＨＧＦ免疫グロブリンキメラ又は免疫付着物と通常呼ばれる。この様なキメラは基本的にはＷＯ９１／０８２９８（１９９１年６月１３日公開）に記載された様にして構築することができる。
【００８２】
本明細書中、免疫付着物は、細胞表面受容体、細胞付着分子又はリガンド（「付着物」）などのタンパク質の結合特異性と、免疫グロブリン定常領域のエフェクター機能とが合体する抗体様分子である。構造上は、免疫付着物は、抗体の抗原認識及び抗体の結合部位（抗原結合部位）以外の（すなわち「ヘテロローガス」である）望ましい結合特異性を有するアミノ酸配列及び免疫グロブリン定常領域配列の融合物を含む。免疫付着物分子の付着部分は、受容体（細胞付着分子を含む）又はリガンドの結合ドメインを少なくとも含む隣接するアミノ酸配列であるのが典型的である。
【００８３】
免疫付着物はヒト抗体の価値ある化学的及び生物学的特性の多くを所有し得る。免疫付着物は、適切なヒトの免疫グロブリンのヒンジ及び定常領域（Ｆｃ）配列と結合した、望ましい特異性を有するヒトのタンパク質配列から構成され得るので、該結合特異性を、完全にヒトの成分を用いて達成することができる。その様な免疫付着物は患者に対して最小限に免疫原性であり、慢性的に又は繰り返し使用しても安全である。
【００８４】
ＨＧＦ免疫グロブリンキメラにおいては、通常、ＨＧＦ配列は、可変領域（群）の代わりに免疫グロブリンの定常領域のＮ−末端に、Ｃ−末端的において融合しているが、ＨＧＦ配列のＮ−末端融合物もまた望ましい。ＨＧＦ免疫グロブリンキメラ又は免疫付着物における免疫グロブリン定常領域は、ＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３又はＩｇＧ−４サブタイプ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭなどのいかなる免疫グロブリンからも得ることができる。
【００８５】
その様な融合物は、少なくとも機能上活性なヒンジ、免疫グロブリン重鎖の定常領域のＣＨ２及びＣＨ３領域を維持しているのが典型的である。融合は、また、定常領域のＦｃ部位のＣ−末端に対して形成されるか、重鎖のＣＨ１又は軽鎖の対応する領域に対してＮ−末端に隣接して形成される。これは通常、適切なＤＮＡ配列を構築し、それを組換え細胞培養において発現することによりなし遂げられる。しかし別法では、ＨＧＦ免疫グロブリンキメラ又は免疫付着物は既知の方法により合成され得る。
【００８６】
融合が形成される正確な部位は重要ではない。特定の部位が良く知られており、ＨＧＦ又は免疫付着物の生物学的活性、分泌又は結合特性を最適にするために選択できる。
【００８７】
好ましい具体例においては、ＨＧＦ受容体の結合部位（群）を含む配列のＣ−末端は、免疫グロブリン、例えば免疫グロブリンＧ１のエフェクター機能を含んでいる抗体（詳細にはＦｃドメイン）のＣ−末端の部分のＮ−末端と融合している。重鎖の定常領域全体を受容体結合部分（群）を含む配列と融合することが可能である。しかし、パパイン開裂部位のすぐ上流のヒンジ領域から始まる配列［化学的にはＩｇＧ  Ｆｃを定義する。２１６残基、重鎖定常領域の最初の残基を１１４として（上記のＫｏｂｅｔら）又は他の免疫グロブリンの類似部位］がその融合において使用されるのがより好ましい。特に好ましい具体例においては、受容体結合部位（群）を含むアミノ酸配列を、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ３重鎖のヒンジ領域及びＣＨ２及びＣＨ３と、又はＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ３重鎖のＣＨ１、ヒンジ及びＣＨ２及びＣＨ３領域と融合する。融合が形成される正確な部位は重要ではなく、実験を繰り返すことにより最適な部位を決定し得る。
【００８８】
文献において報告された免疫付着物にはＴ細胞受容体の融合物が含まれている（Ｇａｓｃｏｉｇｎｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４、２９３６−２９４０、１９８７年）。ＣＤ４＊（Ｃａｐｏｎら、ネーチャー、３３７、５２５−５３１、１９８９年。Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、ネーチャー、３３９、６８−７０、１９８９年。Ｚｅｔｔｍｅｉｓｓｌら、ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．ＵＳＡ  ９、３４７−３５３、１９９０年。Ｂｙｒｎら、ネーチャー  ３４４、６６７−６７０、１９９０年。Ｌ−セレクチン（ホーミング受容体）、（Ｗａｔｏｓｏｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．  １１０、２２２１−２２２９、１９９０年。Ｗａｔｓｏｎら、ネーチャー  ３４９、１６４−１６７、１９９１年）。ＣＤ４４＊（Ａｒｕｆｆｏら、細胞  ６１、１３０３−１３１３、１９９０年）。ＣＤ２８＊及びＢ７＊（Ｌｉｎｓｌｅｙら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３、７２１−７３０、１９９１年）。ＣＴＬＡ−４＊（Ｌｉｓｌｅｙら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４、５６１−５６９、１９９１年）。ＣＤ２２＊（Ｓｔａｍｅｎｋｏｖｉｃら、細胞、６６、１１３３−１１４４、１９９１年）。ＴＮＦ受容体（Ａｓｈｋｅｎａｚｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８、１０５３５−１０５３９、１９９１年。Ｌｅｓｓｌａｕｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７、２８８３−２８８６、１９９１年。Ｐｅｐｐｅｌら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４、１４８３−１４８９、１９９１年）。ＮＰ受容体（Ｂｅｎｎｅｔｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２６６、２３０６０−２３０６７、１９９１年）及びＩｇＥ受容体α鎖＊（Ｒｉｄｇｗａｙ及びＧｏｒｍａｎ、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１５、要約、１４４８、１９９１年）、ここにおいて、星印（＊）は、その受容体が免疫グロブリンのスーパーファミリーの一員であることを示している。
【００８９】
ＨＧＦ生物学的活性を示すいかなるＨＧＦ分子も本発明の目的に適していると信じられる。従って、ＨＧＦ生物学的活性の試験は、肝臓障害防御物としてのＨＧＦ誘導体の有効性の指標となり得る。
【００９０】
「生物学的活性」、「生物学的に活性な」、「活性」及び「活性な」という用語は、野生型のヒトＨＧＦによって示される分裂促進の、モトゲニック（ｍｏｔｏｇｅｎｉｃ）の又は形態形成の活性を表す。例えば、ＨＧＦ生物学的活性はインビイトロ系又はインビボ系における肝細胞成長のプロモーションをアッセイすることにより測定できる。初代培養における成獣ラット肝細胞は、肝細胞の増殖を調節する因子を探すために広く使用されてきた。従って、ＨＧＦ変異体の分裂促進作用は、ＨＧＦ分子が、初代培養におけるラット肝細胞のＤＮＡ合成を誘導する能力を試験するために適したアッセイにおいて、都合良く測定され得る。初代培養における成獣ラット肝細胞は、肝細胞増殖を調節する因子を探すために広く使用されてきたので、本分野においては、ラット肝細胞の単離及び培養は良く知られている。ヒト肝細胞は、例えば、移植を受け入れ得ないと考えられた器官における肝臓全体の還流、子供における移植のために使用された大人の肝臓の切り落とし、致死の肝臓及び他の徴候のための手術において除去された肝臓の残余から得ることができる。ヒトの肝細胞は、正常なラット肝細胞の初代培養を調製するために創作された方法と同様に培養できる。
【００９１】
例えば、肝細胞のＤＮＡ合成は、複製合成のための適切なヒドロキシ尿素コントロールと共にＤＮＡに［３Ｈ］チミジンを挿入する方法によりアッセイできる。核のラベリングはオートラジオグラフィーにより確認される。アフィジコリンを用いた又は用いない、肝細胞の初代培養における肝細胞のＤＮＡ合成の測定方法は、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１２２（３）、１４０−１４５９、１９８４年及びＪ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９４、１０２９−１０３５、１９８３年におけるナカムラらにより記載されている。
【００９２】
肝細胞の成長に対するＨＧＦの作用は、部分的肝切除後のラットにおいて又はカーボン  テトラクロリドによって引き起こされた肝臓損傷、Ｄ−ガラクトサミン誘導急性肝炎モデルなどの様な、肝臓の機能不全及び再生の動物モデルにて、インビボ系においても試験され得る。適切なプロトコールによると、肝臓毒、例えばα−ナフチリソチオシアネート（ＡＮＩＴ）を、肝臓の酵素及びビリルビンのレベルの再現可能な、有意義な上昇を引き起こし得る予定濃度、ラットに投与する。その後、ラットを試験のためにＨＧＦで処置し、殺傷し、肝臓酵素及びビリルビンのレベルを測定する。肝臓はさらに肝臓の障害を観察する。
【００９３】
肝臓障害に対するＨＧＦの能力は、１９８８年３月２２日に発行されたＵ．Ｓ．５，０８７，５７１に記載された様な、トランスジェニック動物におけるインビボ系にて最良に試験し得る。適切なプロトコールによると、肝臓病又は肝臓障害を有するトランスジェニック動物を、試験のためにＨＧＦで処置するか又はＨＧＦと病気の処置に有用な治療薬とを共に投与し、殺傷し、肝臓酵素及びビリルビンのレベルを測定する。肝臓はさらに肝臓の障害を観察する。
【００９４】
本明細書中、「アクチビン  アンタゴニスト」とは、肝細胞の死を引き起こすアクチビンの活性を阻止できる、あらゆる分子を表している。本明細書中にて使用される場合、「アクチビン」とは、インヒビンのβ鎖のホモ又はヘテロ２重鎖、プレプロ型及びプロ型及びそれらのグリコシル化変異体を表し、天然型又は合成の又は組換え型のいずれをも表している。アクチビンＡは、２つのβＡ鎖を有するアクチビンを表している。アクチビンＡＢは、βＡ及びβＢ鎖を有するアクチビンを表している。アクチビンＢは、２つのβＢ鎖を有するアクチビンを表している。
【００９５】
アクチビン  アンタゴニストは、アクチビンの活性部位に結合する蛋白質であるのが典型的であり、例えば、ＥｓｃｈらのＭｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１、８４９−８５５、１９８７年に記載された様なフォリスタチンが含まれる［Ｓｈｉｍａｓａｋｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５、４２１８−４２２２、１９８８年。Ｓｈｉｍａｓａｋｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１５２、７１７−７２３、１９８８年。Ｓｈｉｍａｓａｋｉら、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．３、６５１−６５９、１９８９年。ウエノら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４、８２８２、１９８７年。ナカムラら、サイエンス、２４７、８３６、１９９０年。Ｓｉｍｏｎａｋａら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １２８，３３１３、１９９１年］。
【００９６】
さらに、そのアンタゴニストは、アクチビン  アンタゴニストとして作用する非−蛋白質の小分子であり得る。この様な分子は、ＭＴＴアッセイの様な上記の及び実施例において記載されたアッセイを用いて、肝臓損傷又は肝臓細胞の死を起こすことにおけるアクチビンの作用を阻止するそれらの能力によって選別され得る。
【００９７】
そのアンタゴニストの定義はまた、抗−アクチビン抗体を含み、ポリクローナル又はモノクロナールのいずれをも含む。ヒトの組換えアクチビンＡ又はＢに特異的なモノクロナール抗体は、Ｃｏｒｒｉｇａｎら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １２８、１６８２、１９９１年に記載された様に製造され得る。簡潔には、同系交配のＨＧＦ−性機能低下ラット（ジャンクソン  ラボラトリーズ、ウィルミントン、ＭＡ）に、精製された組換えアクチビンＡ、Ｂ又はＡＢを用いて、後ろ脚に超免疫を行う。リンパ節排出物から収穫した細胞を次にマウスのミエローマ  ラインＸ６３−Ａｇ８．６５３と融合する。Ｋｅａｒｎｅｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２３、１５４８、１９７９年。この融合物を、組換えヒトアクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ及びインヒビンＡをコート蛋白質として使用して、ＥＬＩＳＡにおいて反応性及び特異性をスクリーニングする。Ｗｏｎｇら、臨床化学、３６、１９２、１９９０年。組換えヒトアクチビンＡ、Ｂ又はＡＢのいずれかと特異的に反応する親のハイブリドーマを限界希釈によりクローン化する。Ｂａｌｂ／ｃ  ｎｕ／ｎｕマウスにおいて、腹水液を製造し、抗体をプロテインＡ−セファロース  アフィニティ  クロマトグラフィ（Ｒｅｐｌｉｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，ケンブリッジ、ＭＡ）により、確立された手順（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．、２０、２４１、１９７８年。Ｅｙら、免疫化学、１５、４２９、１９７８年）に従って精製し、無菌状態にて、リン酸緩衝塩水（ＰＢＳ）中、４℃にて保管する。本明細書中、また適切であり得るアクチビン又はアクチビンペプチドに対する抗体は、ある程度インヒビンとも交差反応をするかもしれないが、Ｌｏｆｇｒｅｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、１２，５６５，１９９１年、シンタニら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．、１３７、２６７、１９９１年、Ｇｒｏｏｍｅ及びＬａｗｒｅｎｃｅ、ハイブリドーマ、１０、３０９、１９９１年、Ｇｒｏｏｍｅ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．、１４５、６５−６９、１９９２年及びＳｃｈｗａｌｌら、非−放射分析アッセイ：ポリペプチド及びステロイドホルモン検出における技術及び応用、２０５−２２０頁（Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８８年）に記載されているものを含む。
【００９８】
本明細書にて適切な他のアクチビン  アンタゴニストは、上記のシオザキらに記載の様なアクチビンの阻害物であるか、アクチビン受容体の可溶型である。
【００９９】
適切なアクチビン受容体の例には、米国特許第５，２１６１２６号に記載のものが含まれる。簡潔には、この受容体は、還元された１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける分子量、１３５−１５０Ｋｄを有し、Ｎ−末端配列、ＶａｌＬｅｕＴｈｒＧｌｕＧｌｕＴｈｒＧｌｕＩｌｅＩｌｅＭｅｔＰｒｏＴｈｒＰｒｏＬｙｓＰｒｏＧｌｕＬｅｕＸａａＡｌａＸａａＸａａＡｓｎ（式中、Ｘａａは、不明のアミノ酸を示す）を有するＴＧＦ−βに結合していないものとして記載されている。Ｍａｔｈｅｗｓ及びＶａｌｅ、細胞、６５、１−２０、１９９１年及びＭａｔｈｅｗｓら、サイエンス、２５５、１７０２−１７０５、１９９２年に記載された「アクチビン受容体」が、肝細胞においてアクチビンの生物学的活性を遮断するかぎり、本明細書中においてアクチビン受容体に含まれる。アクチビン受容体は、Ａｔｔｉｓａｎｏら、細胞、６８、９７−１０８、１９９２年及びＫｏｎｄｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．、１８１、６８４−６９０、１９９１年によっても報告されている。
【０１００】
アクチビン  アンタゴニストの定義はまた、アクチビン活性を遮断するのに必要な活性部位を含む上記の分子のフラグメントをも含み、抗体のＦ（ａｂ）及びＦｃフラグメントなどを含んでいる。
【０１０１】
ある種の肝臓病において、細胞の死を防御する効果は、有効量、投与されたアクチビン  アンタゴニストを用いる処置レジメにて観察される。
【０１０２】
ＴＧＦ−βアンタゴニストの例は、Ｌｕｃａｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４５、１４１５−１４２２、１９９０年、Ｄａｓｃｈら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４２、１５３６−１５４１、１９８９年、Ｅｌｌｉｎｇｓｗｏｒｔｈら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６１、１２３６２−１２３６７、１９８６年、Ｃｈｅｉｆｅｔｚら、細胞、４８、４０９ー４１５、１９８７年、Ｆｌｏｒｉｎｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６１、１６５０９−１６５１３、１９８６年、Ｒｏｂｅｒｔｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８３、４１６７−４１７１、１９８６年、Ａｓｓｏｉａｎ及びＳｐｏｒｎ、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、１０２、１２１７８−１２２３、１９８６年、Ｅｌｌｉｎｇｓｗｏｒｔｈら、Ｃｅｌｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１１４、４１、１９８８年、Ｆｌａｎｄｅｒｓら、生化学、２７、７３９、１９８８年、Ｋｅｓｋｉ−Ｏｊａら、キャンサー  リサーチ、４７、６４５１、１９８８年、Ｄａｎｉｅｌｐｏｕｒ及びＳｐｏｒｎ、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１３Ｂ、８４、１９８９年及びＤａｎｉｅｌｐｏｕｒら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１３８、７９−８６、１９８９年に記載された様なＴＧＦ−βに対する抗体を含む。
【０１０３】
さらなる適切なＴＧＦ−βアンタゴニストには、例えばＭＴＴ試験によりスクリーニングされる肝臓損傷又は肝細胞死を引き起こすＴＧＦ−βの能力を遮断することにおいて、ＴＧＦ−βアンタゴニストの様に作用する、非−蛋白質の小分子及びＴＧＦ−β受容体の可溶型又はあらゆるタイプのＴＧＦ−β結合蛋白質が含まれ、これらは例えばＬｉｎら、細胞、６８、７７５−７８５、１９９２年、Ｌｉｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｕｐｐｌ．、１６、Ｂ部、１２５頁、１９９２年、Ｗａｎｇら、細胞、６７、７９７−８０５、１９９１年、１９９０年５月２３日に公開された欧州特許３６９，８６１、Ｗａｎｇら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｕｐｐｌ．、１６、Ｂ部、１２９頁、１９９２年、Ｌｏｐｅｚ−Ｃａｓｉｌｌａｓら、細胞、６７、７８５−７９５、１９９１年、Ｏ’Ｇｒａｄｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６６、８５８３−８５８９、１９９１年、Ｓｅｇａｒｉｎｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６７、１０４８−１０５３、１９９２年、ＭａｃＫａｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６５、９３５１−９３５６、１９９０年、Ｃｈｅｉｆｅｔｚ及びＭａｓｓａｇｕｅ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６６、２０７６７−２０７７２、１９９１年、Ｃｈｅｉｆｅｔｚ及びＭａｓｓａｇｕｅ、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｕｐｐｌ．、１６、Ｂ部、１２１頁、１９９２年、Ｉｃｈｉｊｏら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６６、２２４５９−２２４６４、１９９１年、Ｂｏｒｉｓｕｔｈら、Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌ．ａｎｄ  Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．、３３、５９６−６０３、１９９２年、Ｍｉｔｃｈｅｌｌ及びＯ’Ｃｏｎｎｏｒ−ＭｃＣｏｕｒｔ、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、１１５、３、２部、２６５Ａ頁、１９９１年に記載されている。
【０１０４】
ＴＧＦ−β受容体の最近のレビューのために、Ｓｅｇａｒｉｎｉの、「ＴＧＦ−β受容体」、ＴＧＦ−βの臨床応用（Ｗｉｌｅｙ、Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ［Ｃｉｂａ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  １５７］、２９−５０頁、１９９１年）及びＭａｓｓａｇｕｅら、Ａｎｎａｌｓ  ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、５９−７２頁、１９９０年を参照せよ。もしも、アクチビン又はＴＧＦ−βに対する抗体が、アンタゴニストとして使用できるならば、それらはいかなる適切な技術によって製造してもよい。例えば、アクチビン又はアクチビンの免疫原性のフラグメントを、抗−アクチビン抗体の製造を誘導するために使用でき、それらは、お決まりのスクリーニングにより同定される。同様に、ＴＧＦ−β又はＴＧＦ−βの免疫原性フラグメントを、お決まりのスクリーニングにより同定される抗−ＴＧＦ−β抗体の製造を誘導するために使用できる。この様な抗体は、ポリクロナールであっても、モノクローナル抗体であっても良く、又はその様な抗体の抗原−結合フラグメント（例えば、Ｆ（ａｂ）又はＦ（ａｂ）２フラグメントなど）であっても良い。その抗体は、アクチビンに対して、１価性又は多価性である。アクチビンアンタゴニスト又はそれらの混合物又は他の適切なアジュバント治療試薬との混合物は、治療の単一のクールにて一般に使用される。
【０１０５】
アクチビン又はＴＧＦ−βに対するポリクロナール抗体は、一般に、アクチビンのポリペプチドをアジュバントと共に動物に複数回、皮下（ｓ．ｃ．）又は腹膜内（ｉ．ｐ．）注入を行うことにより生じさせる。アクチビン抗原ポリペプチド（その鎖及び標的のアミノ酸配列を含むフラグメントを含む）を、免疫されるべき種において免疫原性である蛋白質、例えば、スカシガイのヘモシアニン、血清アルブミン、牛チログロブリン又は大豆トプシン阻害物と、２機能性の又は誘導性の試薬、例えば、マレイミダベンゾイル  スルホサクシニミド  エステル（システイン残基による結合）、Ｎ−ヒドロキシサクシニミド（リシン残基による）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣｌ２又はＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ（式中、Ｒ及びＲ１は異なるアルキル基である）を用いて結合するのが有用である。
【０１０６】
宿主動物の抗体刺激のためのルート及びスケジュール又はそれら由来の培養された抗体−生産細胞は、一般に、抗体の刺激及び生産のための確立された都合の良い技術内にある。マウスは試験モデルとして頻繁に使用されるが、ヒトを含むあらゆる哺乳動物の対象は、この発明のプロセスに従って操作でき、ヒトを含む哺乳動物ハイブリッド細胞ライン生産の基礎として役立つことが予期される。
【０１０７】
動物は、典型的には、１ｍｇ又は１μｇのコンジュゲート（各々、兎又はマウスについて）と、３倍容量のフロイントの完全アジュバントとを混合し、その溶液を、複数の部位において皮内注射することによって、免疫原性コンジュゲート又は誘導体に対抗して免疫する。１カ月後に、フロイントの完全アジュバント（又は他の適切なアジュバント）内における元の量の１／５から１／１０のコンジュゲートを用いる、複数部位における皮下注射により動物に追加免疫を行う。７日から１４日後に、動物の血を採り、その血清を抗体力価のためにアッセイする。力価がプラトーとなるまで動物を追加免疫する。同じアクチビンポリペプチドのコンジュゲートであるが、異なる蛋白質及び／又は異なる架橋物質とコンジュゲートしたものを用いて動物を追加免疫するのが好ましい。コンジュゲートはまた、組換え細胞培養において、蛋白質融合物として作ることができる。また、ミョウバンの様な凝集物質が免疫反応を促進するために使用される。免疫された動物からの免疫細胞、典型的には脾臓細胞又はリンパ節組織からのリンパ細胞を回収し、通常の方法、例えばミエローマ細胞との融合によって又はエプスタイン・バー（ＥＢ）−ウイルスのトランスフォーメーションにより、細胞を不死化し、所望の抗体を発現するクローンをスクリーニングすることによりモノクローナル抗体が調製される。Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、６、５１１、１９７６年により元来記載され、また、モノクローナル抗体及びＴ−細胞ハイブリドーマ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，ニューヨーク、５６３−６８１頁、１９８１年中のＨａｍｍｅｒｌｉｎｇらにより記載されたハイブリドーマ技術が、多くの特異的抗原に対する高レベルのモノクローナル抗体を分泌するハイブリッド細胞ラインを製造するために広く利用された。
【０１０８】
ある種の細胞を他の種の細胞と融合することができる。しかし、免疫された抗体−生産細胞の源と、そのミエローマは同じ種由来であることが望ましい。
【０１０９】
ハイブリッド細胞ラインはインビトロ系において細胞培養培地にて維持できる。抗体を製造する細胞ラインを選択でき、さらに／又は、ハイポキサンチン−アミノプテリン  チミジン（ＨＡＴ）培地中において継続細胞ラインを有する組成物中にて維持できる。実際、一旦ハイブリドーマ細胞ラインが確立されると、種々の栄養が満たされた培地において、維持できる。さらに、ハイブリドーマ細胞ラインは、凍結及び液体窒素下の貯蔵を含むあらゆる常套手段によって貯蔵及び保存できる。凍結細胞ラインは生き返らせることができ、無期限に培養でき、モノクローナル抗体の合成を再開し、それを分泌する。
【０１１０】
分泌された抗体は、沈降、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーなどの常套手段によって組織培養上清から回収できる。本明細書中に記載された抗体は、また、ＩｇＧ又はＩｇＭを精製するための常套手段、場合により、プールされた血漿からこれらの免疫グロブリンを精製するために今まで用いられてきた、例えばエタノール又はポリエチレングリコール沈降方法により、ハイブリドーマ細胞培養から回収できる。精製された抗体を無菌濾過する。
【０１１１】
マウスモノクローナル抗体がルーチン的に使用されるが、本発明はそれに限定されない。実際、ヒト抗体が使用でき、優れていることが立証され得る。この様な抗体はヒトのハイブリドーマを用いることによって得ることができる（Ｃｏｔｅら、モノクローナル抗体及び癌治療、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ、７７頁、１９８５年）。実際、本発明によると、適切な抗原特異性のマウス抗体分子由来遺伝子を、適切な生物学的活性（肝細胞においてアクチビンの活性を遮断する能力など）のヒト抗体分子由来遺伝子とスプライシングすることによる、キメラ抗体製造のために開発された技術（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８１、６８５１、１９８４年、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、ネーチャー、３１２、６０４、１９８４年、タケダら、ネーチャー、３１４、４５２、１９８５年、欧州特許第１８４，１８７号、欧州特許第１７１，４９６号、欧州特許第１７３，４９４号、ＰＣＴ  ＷＯ  ８６／０１５３３、Ｓｈａｗら、Ｊ．Ｎａｔ．Ｃａｎｃ．Ｉｎｓｔ．８０、１５５３−１５５９、１９８８年、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、サイエンス、２２９、１２０２−１２０７、１９８５年、Ｏｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、４、２１４、１９８６年）が使用できる。この様な抗体は本発明の範囲内である。
【０１１２】
抗体分子の抗原結合領域［Ｆ（ａｂ）フラグメントとして知られている］の組換えＤＮＡバージョンの創製技術はモノクローナル抗体生産を回避するものであるが、本発明の実施の範囲内に含まれる。免疫された動物から取られた免疫システム細胞から、抗体に特異的なメッセンジャーＲＮＡを抽出して、これらを相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に転写し、このｃＤＮＡを細菌発現システムに組み込む。本発明の実行に適したこの様な技術の１例は、Ｓｃｒｉｐｐｓ／Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅにおける研究者により開発され、発現されたＦ（ａｂ）蛋白質を細胞周辺腔（細菌細胞膜及び細胞壁の間）に移動するか又は分泌する結果を生じるリーダー配列を含む、所有権のあるバクテリオファージ  ラムダ  ベクター  システムを組み合わせる。抗原に結合するもののための、多数の機能的Ｆ（ａｂ）フラグメントを迅速に製造し、スクリーニングできる。この様なアクチビンに結合する分子（アクチビンポリペプチドに対する特異性を有するＦ（ａｂ）フラグメント）は、本明細書中にて、定義され、論議され、クレームされた「抗体」という用語に具体的に包含される。
【０１１３】
細胞の死が起こったか否かを調べるのに有用な比色定量的試験は、Ｃａｒｍｉｃｈａｅｌら、キャンサー  リサーチ、４７、９３６−９４２、１９８７年により記載された様にＭＴＴの減少を測定することである。このアッセイにおいては、もしも細胞が生きているならば、そのミトコンドリアが染色ＭＴＴを取り込むので、その結果、黄色から紫へと色が変化する。もしも細胞が死んでいるならば、色の変化は無い結果となる。
【０１１４】
本明細書において、本発明は、また「ＨＧＦ及びＴＧＦ−β又はアクチビンに対する２つの特異性を有する分子」を包含し、それは、Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、ＥＭＢＯ、１０、３６５５−３６５９、１９９１年により最近報告された、いわゆる「ジャヌシン（Ｊａｎｕｓｉｎ）」構造などの、双特異性抗体／免疫付着物及び双特異性線状分子を含む。ＨＧＦ及びＴＧＦ−β又はアクチビンに対する２つの特異性を有するこの様な分子は、ＨＧＦ結合活性を有するドメイン及びアクチビン  アンタゴニスト活性又はＴＧＦ−βアンタゴニスト活性を有するドメインを有するだろう。１つの具体例においては、その分子は、１つのドメイン中のＨＧＦ結合活性及び他のドメイン中のアクチビン  アンタゴニストのアミノ酸配列又はＴＧＦ−βアンタゴニストのアミノ酸配列を有する１本鎖ポリペプチドである。アクチビン  アンタゴニスト配列は、例えばフォリスタチン配列であり得るし、又は抗−アクチビン抗体の抗体−抗原結合部位を有する配列であり得る。同様に、ＴＧＦ−βアンタゴニスト配列は抗−ＴＧＦ−β抗体又はＴＧＦ−β受容体に由来し得る。
【０１１５】
もしも、抗体様免疫付着物構造の２つの腕が２つの異なる特異性を有するならば、その免疫付着物は双特異性抗体から類推して双特異性であるといわれる。本発明において、抗体様、双特異性免疫付着物構造の１つの腕は、ＨＧＦ免疫グロブリン  キメラを含み、アクチビン又はＴＧＦ−βアンタゴニストを含む第２の腕を有する。双特異性免疫付着物は、ＷＯ  ８９／０２９２２（１９８９年４月６日公開）、欧州特許第３１４，３１７号（１９８９年５月３日公開）及び１９９２年５月２日に登録された米国特許第５，１１６，９６４号において本質的に記載されている様に、一般には集合してヘテロ多重結合物となり、具体的にはヘテロ二量体、三量体又は四量体となり得る。
【０１１６】
例えば双特異性抗体は、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、サイエンス、２２９、１２０２−１２０７、１９８５年に本質的に記載された様な、いわゆるトランスフェクトーマ法により調製できる。この方法はまた、双特異性免疫付着物の製造に適しており、この場合、望ましい結合特異性を有するキメラの（融合）蛋白質をコードする配列を有するベクターが、第２の特異性を提供する抗体を分泌するハイブリドーマへとトランスフェクトされる（Ｂｅｒｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８、４７２３、１９９１年も参照せよ）。
【０１１７】
双特異性免疫付着物及び抗体の組換え生成物は、２つの重鎖が異なる特異性を有する、２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖の対の共発現に通常基づいている。Ｍｉｌｓｔｅｉｎ及びＣｕｅｌｌｏ、ネーチャー、３０５、５３７−５３９、１９８３年。免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖のランダムな組み合わせのために、これらのハイブリドーマ（クアドーマ）は、１０個の異なる抗体分子の潜在的混合物を生成し、それらの中で、正しい双特異性構造を有する物を単離し、精製することが必要である。
【０１１８】
１９９３年８月１７日に出願されたＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９３／０７７８３において開示された改良法により、１つの腕におけるハイブリッド免疫グロブリン重鎖及び他の腕におけるハイブリッド免疫グロブリン重鎖−軽鎖対から構成される三量体の双特異性免疫付着物を調製する。これらの免疫付着物は、三量体分子を作り上げる３つの免疫グロブリン鎖をコードしているＤＮＡ配列を、好ましい宿主細胞内に個々に導入することにより製造するのが好ましい。その結果、これらのＤＮＡ配列の比率は自由に変化させ得る。１つの腕において軽鎖が無く、三量体分子の非対称構造にもかかわらず、これらの分子は、正しく集合し、折り畳まれたヘテロ三量体の形態で効率的に分泌され得る。双特異性分子の２分の１にのみにおける免疫グロブリン軽鎖の存在が、分離の容易な方法を提供するので、非対称構造は、望ましくない免疫グロブリン鎖の組み合わせからの望ましい双特異性化合物の分離を促進することが、さらに発見された。
【０１１９】
本発明の目的のために、ＨＧＦは既知の方法により、医薬的に有用な組成物を調製するために処方でき、ＨＧＦ生成物を医薬的に許容される担体を有する添加剤と混合する。好ましい担体及びそれらの処方は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎの医薬科学、第１６版、１９８０年、Ｍａｃｋ出版会社、Ｏｓｌｏら編に記載されている。これらの組成物は、ＨＧＦを有効量、例えば約０．５のオーダーから約１０ｍｇ／ｍｌまでを適切な量の担体と共に含み、患者への有効な投与に適した医薬的に許容される組成物を調製するのが典型的である。ＨＧＦは、非経口的に又はそれを有効な形態で血流へと確かに運ぶ他の方法により投与できる。
【０１２０】
ＨＧＦの臨床投与に特に良く適した組成物には、無菌の水性溶液又は凍結乾燥された蛋白質の様な無菌の水和可能粉末が含まれる。典型的には適切な量の医薬的に許容される塩も処方において使用され、処方を等張にする。
【０１２１】
その様な医薬組成物の用量及び望ましい薬物濃度は想像された具体的使用に基づいて変化させ得る。ラットの実験における典型的な有効量は、静脈内ボーラス注入投与の場合、約２５０μｇ／Ｋｇである。用量の種間のスケーリングを、例えばＭｏｒｄｅｎｔｉら、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．Ｒｅｓ．  ８、１３５１、１９９１年及びそれに引用された文献において記載された様な、本分野において既知の方法により実施できる。
【０１２２】
典型的には、本発明方法にて使用されるアクチビン又はＴＧＦ−βアンタゴニストは、周囲温度にて、適切なｐＨ及び望ましい程度のユリティ（ｕｒｉｔｙ）にて、医薬的に許容される担体、すなわち、用いられた用量及び濃度において受容者に対して毒性の無い担体と混合することにより処方される。適切な担体及びそれらの処方は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎの医薬科学、第１６版、１９８０年、Ｍａｃｋ出版会社、Ｏｓｌｏら編に記載されている。これらの組成物は、典型的にはアクチビン  アンタゴニストを有効量、例えば約０．５のオーダーから約１０ｍｇ／ｍｌまでを適切な量の担体と共に含み、患者への有効な投与に適した医薬的に許容される組成物を調製する。
【０１２３】
処方のｐＨは、アンタゴニストの個々のタイプ及び濃度の主に依存するが、該して約３から約８までの範囲が好ましい。ｐＨ５における酢酸緩衝液中の処方
が好ましい具体例である。
【０１２４】
アクチビン  アンタゴニストの臨床投与に特に良く適した組成物には、無菌の水性溶液又は凍結乾燥された蛋白質の様な無菌の水和可能粉末が含まれる。典型的には、適切な量の医薬的に許容される塩も処方において使用され、処方を等張にする。
【０１２５】
無菌性は（０．２ミクロン）膜を通す無菌濾過により容易に達成される。再構成用凍結乾燥処方は許容されるが、普通はアクチビン  アンタゴニストは水性溶液として貯蔵されるだろう。
【０１２６】
このアンタゴニストの組成物は、良い医療のプラクティスと一致する方法で処方され、用量に分けられ、投与されるだろう。この含有量における考慮のための因子には、処置されている個々の病気、処置されている個々の哺乳動物、個々の患者の臨床的状態、病気の原因、試薬の分配部位、投与方法、投与スケジュール及び医療開業者に既知の他の因子が含まれる。投与されるべきアクチビン  アンタゴニストの「治療上有効量」は、その様な考慮により支配され、その蛋白質に仲介された肝臓病を予防し、改善し、又は処置するために必要な最小量である。その様な量は、哺乳動物に対して毒性であるか、哺乳動物を感染によりかかり易くする量以下であることが好ましい。
【０１２７】
一般的比率としては、用量当たり、非経口投与されるアクチビン又はＴＧＦ−βアンタゴニストは、１日当たり約０．０１から１００ｍｇ／患者体重ｋｇの範囲であり、使用されるアクチビン  アンタゴニストの典型的な範囲は約０．１から５０ｍｇ／ｋｇ／日であろう。用量の種間のスケーリングを、例えばＭｏｒｄｅｎｔｉら、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．Ｒｅｓ．  ８、１３５１、１９９１年及びそれに引用された文献において記載された様な、本分野において既知の方法により実施できる。
【０１２８】
ＨＧＦ及びアクチビン又はＴＧＦ−βアンタゴニストは、患者に有効に投与するための適切なｐＨを有する医薬的に許容される担体中に、治療上有効量のＨＧＦ又はアンタゴニストのいずれかを有する単一の組成物に処方できる。ＨＧＦ及びアクチビン又はＴＧＦ−βアンタゴニストの製剤の各々は、投与の前にインビトロ系にて混合でき、又は同時に別々に又は連続して、どちらの順序でも投与でき、いかなる２番目の投与も、最初の投与の約１−２４時間以内に行われるのが好ましく、最初の投与の約１−５時間以内がより好ましい。
【０１２９】
この化合物は通常、医薬組成物として投与され、本分野にて既知の方法により、通常、１回投与剤形にて処方される。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎの医薬科学、Ｍａｃｋ出版会社、イーストン、ペンシルバニア、第１５版、１９７５年を参照せよ。非経口投与に対しては、ＨＧＦ及びアクチビン又はＴＧＦ−βアンタゴニストは、適切な医薬的に許容される担体と、さらに所望により他の医薬的に許容される添加物との混合物において、注射可能な溶液、懸濁液又は乳化剤の形に処方するのが典型的である。典型的な担体には、塩水、デキストロース溶液、リンガー溶液などが含まれるが、非水性担体もまた使用できる。
【０１３０】
「解毒薬」という用語は本明細書中にて使用される場合、肝毒性化合物がその受容体に結合することを阻止するか、肝毒性化合物の作用に対抗する生理学的反応を起こすか、毒物の化学的性質をより毒性の少ない型に変えることにより、又はそれの吸収を阻止するか、それの消失又は代謝を促進するかのいずれかによって、それの作用部位に到達する肝毒性化合物の量を減らすことにより、肝毒性化合物の作用を中和する物質を表す。解毒薬は限られた数の肝毒性化合物に対してのみ有効である（Ｓｍｉｔｈ，Ｃ．薬理学のテキストブック、９９８頁、１９９２年）。
【０１３１】
本明細書中、「肝毒性化合物」という用語の使用は、肝臓への暴露に関して肝臓障害を誘導する能力のある、あらゆる化合物、薬、化学物質又はエレメントを表している。
【０１３２】
「投与」又は「投与された」という用語は本明細書中にて使用される場合、ＨＧＦに関しては、肝毒性化合物、臨床上の治療により誘導される肝臓障害、放射線又は肝臓障害を誘導する他の方法の投与又は暴露の前に、同時に又は後に起こるＨＧＦの投与を表す。ＨＧＦは投与前に、インビトロ系にて肝毒性化合物と混合でき、又は同時に別々に又は連続して、どちらの順序でも投与でき、いかなる２番目の投与も、通常は最初の投与の約６時間以内に行われる。
【０１３３】
ＨＧＦ又はアクチビン  アンタゴニストは、対象の哺乳動物、好ましくはヒトに、試薬がその活性を示すことができる許容されたあらゆる投与方法により投与できる。これらの方法は、皮下及び好ましくは非経口投与を含む。非経口投与ルートの例は、静脈内、肺内、動脈内、筋肉内及び腹膜内投与があり、静脈内ルートが好ましい。投与は治療上有効なレベルを維持するために、充分な量の持続的又はボーラスの投与とできる。
【０１３４】
ＨＧＦは本発明によると、対象哺乳動物に単独で投与でき、又は血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）又は他の成長因子、サイトカイン又はサイトカイン  アンタゴニスト又は組織プラスミノーゲン活性化物などの成長因子様活性を有する蛋白質などの肝臓障害の予防又は処置において有効な他の治療薬と混合してもよい。  本明細書中、「成長因子」という用語の使用は、発達の出来事を調節することが要求されるか、発達の細胞内コミュニケーション及び協調に関係しうる他の分泌蛋白質をコードしている遺伝子の発現を調節することが要求された因子を表し、インスリン様成長因子−Ｉ及びII（ＩＧＦ−Ｉ及びII）、表皮の成長因子（ＥＧＦ）、タイプａ及びタイプｂトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ−α及びＴＧＦ−β）、表皮成長因子（ＥＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、血小板誘導成長因子（ＰＤＧＦ）、肉腫成長因子（ＳＧＦ）、顆粒細胞マクロファージ  コロニー刺激成長因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、血管上皮成長因子（ＶＥＧＦ）及び造血成長因子が含まれるが、これらに限定されない。
【０１３５】
ＶＥＧＦは微小血管の透過性を増加するために作用する内膜細胞のための特異的な有糸分裂促進物である。ＶＥＧＦは、引き出された腹膜のマクロファージと同様に肺、腎臓、副腎、心臓、肝臓及び胃粘膜を含む多くの正常な成人の器官において現れる。上記のＢｅｒｓｅらは、幾つかのヒト腫瘍における特に高いＶＥＧＦｍＲＮＡレベルを明らかにし、その場合、それは腫瘍の血管形成及び基質生成の開始に関与しているらしく、内膜細胞有糸分裂促進物としての及び間接的にその透過性を促進する作用の両者により、臨時のフィブリン  ゲル  マトリックスの沈着を導く。ＶＥＧＦのｍＲＮＡ配列はＬｅｕｎｇら（サイエンス  ２４６、１３０６−１３０９、１９８９年）に記載されている。
【０１３６】
組織プラスミノーゲン活性化物（ｔＰＡ）はインビボ系において血塊を溶解する強い能力を有し、心筋梗塞の様な血管の病気の処置において治療薬として使用される酵素である。実質上純粋な型のｔＰＡは、Ｃｏｌｌｅｎら、米国特許番号第４，７５２，６０３号により、天然源から最初に製造され、インビボ系の活性が試験された。Ｐｅｎｎｉｃａら（ネーチャー、３０１、２１４、１９８３年）はｔＰＡのＤＮＡ配列を決定し、このＤＮＡ配列からアミノ酸配列を演繹した（１９８８年８月２３日に登録された米国特許番号第４，７６６，０７５を参照せよ）。ＴＰＡは、静脈閉塞病（ＶＯＤ）の処置に有効であることが証明された（Ｂｅｇｌｉｎら、骨髄移植、５（６）、４３９−４４１、１９９０年）及び（Ｒｏｓｔｉら、Ｌａｎｃｅｔ、３３９、１４８１−１４８２、１９９２年）。
【０１３７】
サイトカインは、アミノ酸、蛋白質、炭水化物、脂質及びミネラルの中間物代謝を調節する分泌ペプチド又は蛋白質である。サイトカインは炎症を仲介する作用を行うペプチド又は蛋白質を含み、細胞増殖を調節している細胞内コミュニケーション及び炎症細胞の血管壁及び細胞外マトリックスへの付着に関与している。サイトカインは、肝臓と肝臓外の部位の間の及び肝臓自身の内部のコミュニケーションに対して重要である。サイトカインと糖質コルチコイドなどのホルモンとの相互作用は、相互のコントロールの複雑なネットワークをその結果として生じる。多くのサイトカインは、それらの特異的な前炎症作用に加えて成長因子様活性を発揮する。肝臓はサイトカイン合成の重要な部位であり、いくつかのサイトカインに対しては主要なクリアランス器官である。肝臓病においては、サイトカインは肝臓内免疫反応のオンセット、肝臓再生及び肝臓の繊維症の及び硬変のトランスフォーメーションに関与している（Ａｎｄｕｓら、肝臓学、１３（２）、３６４−３７５、１９９１年）。サイトカインはインターロイキン族のペプチド及び蛋白質、インターフェロン−α、−β、γ、腫瘍壊死因子−α及び−β及びプロスタグランジンＥ１及びＥ２を含むが、これらに限定されない。
【０１３８】
「治療薬」という用語は、本明細書中にて使用される場合、病気の又は病的生理学的状態の予防又は処置に有効な試薬を表す。
【実施例】
【０１３９】
本発明のさらなる詳細は、以下の実施例にて示されるが、これらに限定されない。
【０１４０】
実施例１
Ａ．ｈＨＧＦの組換え生成物
組換えｈＨＧＦ（ｒｈＨＧＦ）はＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／２２３２１に記載の様に生成された。
上記のＳｅｋｉらにより記載された様に、ヒトの白血球ライブラリィから単離したｈＨＧＦｃＤＮＡクローン（ＨＬＣ３）を、広く許容される親の発現ベクターｐＳＶ１６Ｂ５にクローンした。ｐＳＶ１６Ｂ５は、当該ポリペプチドをコードする、あらゆる配列を導入するために使用できる都合の良い、特異的な制限エンドヌクレアーゼ認識部位を提供するポリリンカー領域を有している。
【０１４１】
ＣＨＯ−ｄｈｆｒ細胞（Ｕｒｌａｕｂら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７、４２１６−４２２０、１９８０年）をＧｒａｈａｍ及びｖａｎ  ｄｅｓ  Ｅｂ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（ウイルス学）、５２、４５６−４５７、１９７３年の一般的手順を用いて、上記の望ましいｐＳＶ１６Ｂ５をベースとしたｈＨＧＦ発現ベクター及びｄｈｆｒ選択ベクターｐＦＤ１１（Ｓｉｍｏｎｓｅｎ及びＬｅｖｉｎｓｏｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８０、２４９５−２４９９、１９８３年）と、コントランスフェクト（ｃｏｎｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ）した。後者のプラスミドはＤＨＦＲをコードしているので、トランスフェクトされた細胞にメトトレキセート耐性を与え、ｈＨＧＦ発現形質転換細胞の選択を可能にする。形質転換されたｄｈｆｒ細胞をグリシン−ヒポキサンチン−及びチミジン−欠損培地における成育により選択した。この選択培地上に発生したコロニーを綿棒を用いて単離し、同じ培地にて数世代増殖した。細胞成育の後、細胞を増幅し、標準的技術を用いて、メトトレキセートの量を増加することにより選択した。選択培地にて成育できたクローン、従ってトランスフェクトされたＤＨＦＲを含むプラスミドが挿入された細胞について分泌ＨＧＦの存在をスクリーニグした。これらのクローンの培地中のＨＧＦ活性は、後述の有糸分裂のアッセイを用いてアッセイした。別法では、培養培地中のＨＧＦ活性は、ナカムラら、ネーチャー、３４２、４４０−４４３、１９８９年により記載された様に、初代培養におけるラット肝細胞内に１２５Ｉでラベルされたデオキシウリジンを挿入することによっても測定できる。ｈＨＧＦは上記のナカムラらにより記載された様に本質的に精製した。
【０１４２】
Ｂ．ｒｈＨＧＦを用いた処置による肝毒性からの保護
体重各１９０−２６０グラムである雄性Ｆ３４４ラットにおける、ＢｉＣＮＵ（登録商標）−カルムスチン（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ会社、腫瘍学部門）を用いた組み合わせ治療におけるＨＧＦの効果を我々は調べた。  カルムスチンは化学的には１，３−ビス（２−クロロエチル）−１−ニトロソウレアであり、ある種の新生物病の処置において使用された化学療法剤のグループに属している。ＢｉＣＮＵ（登録商標）は脳腫瘍、最初の及び転移した多発性骨髄腫にて使用され、ホジキン病には第２の治療薬として、非−ホジキン性リンパ腫において第２の治療薬として使用される。
【０１４３】
ＢｉＣＮＵ（登録商標）の１つの副作用は、トランスアミナーゼ、アルカリ性ホスファターゼ及びビリルビン  レベルの上昇で表される肝毒性である。高用量の処置を受ける患者（通常、骨髄移植の場合）には、肝腫（肝臓の増大）及び腹水（流体の蓄積）を伴う肝臓の静脈閉塞病（ＶＯＤ）が起こる危険がある。これらの所見は臨床上、ブッド−キアリィ（Ｂｕｄｄ−Ｃｈｉａｒｉ）シンドロームと類似している。骨髄移植患者の約２０％において、このシンドロームが起こり、これらの患者の約４７％においては、重篤な型のＶＯＤは致命的である。他の副作用には、遅延型蓄積性骨髄抑制、白血球減少症及び貧血よりもより重篤な血小板減少症、遅延したオンセット（数年の場合さえある）を伴う肺繊維症により特徴づけられた用量依存性肺毒性及び進行性窒素過剰症及び腎臓の大きさの減少及び腎臓不全を伴う腎毒性が含まれる。
【０１４４】
ＢｉＣＮＵ（登録商標）は分子量２１４．０６の凍結乾燥された黄色のフレークにて供給される。それは脂質及びアルコールに可溶である。ヒトに使用するためには、ＢｉＣＮＵ１００ｍｇを、エタノール３ｍｌ中にて再構成後、注射の目的のためには無菌水２７ｍｌを加え、この薬を静脈内に投与する。
【０１４５】
プロトコール
使用したｒｈＨＧＦの濃度は２．４５ｍｇ／ｍｌであり、用量は、２８０μｇ／体重ｋｇであり、担体［リン酸緩衝塩水（ＰＢＳ）＋０．１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、無菌化した］０．２５ｍｌ中にて、３０分、６、１２、２４、３０及び３６時間における静脈内注射（ＩＶ）により分配した。
【０１４６】
ラットにおいては、ＢｉＣＮＵの用量は、０時間において単一の腹膜内（ＩＰ）注射において投与された５０ｍｇ／体重ｋｇであった。担体はピーナッツ油であり、全体の用量は１．５ｍｌ中にて分配した。Ｍｏｒｄｅｎｔｉらの毒性速度論的スカーリング法（「毒性速度論における種間のスカーリング」、Ｔｏｘｉｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｎｅｗ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（毒性速度論及び新薬の開発）、Ａ  Ｙａｃｏｂｉら編、Ｐｅｒｇａｍｏｎ発行、ニューヨーク、４２−９６頁、１９８９年）及びＣｈａｐｐｅｌら（「動物からヒトまでの毒性学的及び薬理学的データーの外挿法」、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（薬のリサーチにおける進歩）、第２０巻、Ｂ．Ｔｅｓｔａ編、アカデミック発行、サンジェゴ、１−１１６頁、１９９１年）を用いると、ラットにおける５０ｍｇ／ｋｇ投与量はヒトにおける９．２ｍｇ／ｋｇ投与量に等しい。ヒトにおいて使用されるＢｉＣＮＵの臨床投与量は５−１５ｍｇ／ｋｇである。
【０１４７】
ＢｉＣＮＵのＩＰ注射４８時間後にサンプルを集めた。１セットの７匹のラットがｒｈＨＧＦとＢｉＣＮＵとの組み合わせを受け、１セットの７匹のラットがＢｉＣＮＵ及びｒｈＨＧＦ担体を受けた。１セットの７匹のラットは、ピーナッツ油及びｒｈＨＧＦ担体をＩ．Ｐ．で受け、コントロールを提供した。
【０１４８】
結果
図１に示される様に、ＢｉＣＮＵ及びｒｈＨＧＦの組み合わせ治療を受けた動物は、総ビリルビン、アルカリ性ホスファターゼ、アルカリ性アミノトランスフェラーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ及びγ−グルタミル  トランスペプチターゼが、ＢｉＣＮＵのみを受けた動物から減少したレベルを示した。
【０１４９】
肝臓の組織学的研究のプロトコール
１セットの７匹のラットはピーナッツ油のみのＩ．Ｐ．を受け、コントロールとして提供された。他の１４匹のラットは、ピーナッツ油中のＢｉＣＮＵを５０ｍｇ／体重ｋｇにて接種し、この１４匹中７匹はｒｈＨＧＦ（３０分、６、１２、２４、３０及び３６時間における、２８０μｇ／体重ｋｇＩ．Ｖ．）を受けた。ＢｉＣＮＵ又はピーナッツ油Ｉ．Ｐ．の４８時間後に、全てのラットをＣＯ２により安楽死させた。肝臓、胸骨、肺、腎臓及び脾臓のセクションをホルマリン中に固定し、パラフィン中に区分し、Ｈ＆Ｅを用いて染色し、組織学的に調べた。
【０１５０】
組織学的結果
ＢｉＣＮＵを受けたラットの肝臓、骨髄及び脾臓には障害が一貫して存在した。ＢｉＣＮＵはラットにおいて、胆のうの壊死及び肝細胞の壊死を誘発した。ｒｈＨＧＦを受けたラットは非処置ラットにおけるそれと匹敵する胆のうの壊死を有し、図２に示される様に、ｒｈＨＧＦはＢｉＣＮＵのみで処置したラットにおいて見られた肝細胞壊死の重篤さを減少した。
【０１５１】
実施例２
この実施例はアクチビン及びＴＧＦ−βにより誘導された肝細胞の死に対するＨＧＦの保護を示している。
【０１５２】
方法
肝細胞は成獣雌性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットから、Ｇａｒｒｉｓｏｎ及びｈａｙｎｅｓにより記載された様にコラゲナーゼ灌流により得た。この細胞を９６−ウエルのマイクロタイター  プレート（Ｆａｌｃｏｎ）中に４０００細胞／ウエルの密度で植えた。培養培地は、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン  スルフェート（１００μｇ／ｍｌ）、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、トランスフェリン（１０μｇ／ｍｌ）及び僅小成分（０．０１％）を供給したウイリアムのＥ培地であった。細胞を５％牛胎児血清を含む培地にて、３７℃、５％ＣＯ２にて植えた。１６時間後に、植えている培地を、以下のものを含む１００μＬの血清不含培地と交換した：コントロールに対しては添加物無し；１０、１００、１０００ｎｇ／ｍｌのＨＧＦ；アクチビン−Ａのみ（１０ｎｇ／ｍｌ）又は１０、１００、１０００ｎｇ／ｍｌのＨＧＦとの組み合わせ；又はＴＧＦ−ｂ（１ｎｇ／ｍｌ）のみ又は１０、１００、１０００ｎｇ／ｍｌのＨＧＦとの組み合わせ。
【０１５３】
２４時間後、ミトコンドリア機能の指標であるＭＴＴの減少を、本質的にＣａｒｍｉｃｈａｅｌら（キャンサー  リサーチ、４７、９３６−９４２、１９８７年）により記載された様に測定することにより生存力をアッセイした。ＭＴＴをリン酸緩衝塩水中にて５ｍｇ／ｍｌまで溶解し、各ウエルに５μｌを直ちに加えた。３７℃、４時間のインキュベーション後、プレートを丁寧に転倒し、ペーパータオルで吸水することにより、培地を除去した。ＤＭＳＯを１００μｌ、加えることにより、細胞を溶解し、その後オービタル  シェイカーにて５分間シェイクした。対照波長６９０ｎｍにおける吸収よりもより少ない、５６０ｎｍにおける吸収を自動プレート  リーダー（ＳＬＴラボ  インスツルーメント）にて測定した。細胞を１つ以上のマイクロタイターにて培養した実施例においては、各プレートにおけるコントロールに対してデーターを標準化した。
【０１５４】
結果
図３に示される様に、ミトコンドリア機能の指標であるＭＴＴ減少により測定された様に、ＨＧＦはコントロール培養における生存力を少し増加させた。アクチビンは約７０％、生存力を減少したが、培養培地がＨＧＦも含んでいる場合にはこの作用は実質上破棄された。同様に、ＴＧＦ−ｂは、アクチビンの場合の様に、肝細胞の生存力を大きく減少させ、この作用はＨＧＦの接種により大きく防御された。
【０１５５】
実施例３
この実施例は、ＨＧＦとアクチビン  アンタゴニストを共に投与する使用が肝臓障害からの保護を提供することを示した。
【０１５６】
方法
肝炎Ｂウイルス蛋白質を発現するトランスジェニック  マウスを使用してＨＧＦとフォルスタチンを共に投与することにより提供された防御作用を調べる。適切なトランスジェニック  マウスは、Ｇｉｌｌｅｓら（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６６、３９５５−３９６０、１９９２年）にて記載され、使用された、２つの属的に異なるカテゴリーのＨＢＶ−トランスジェニック  マウス（系統２３−３及び８０−２１９）である。
【０１５７】
組換えＨＧＦは実施例１に記載された様に製造する。使用されたｒｈＨＧＦの濃度は２．４５ｍｇ／ｍｌであり、投与量は、担体［リン酸緩衝塩水（ＰＢＳ）＋０．１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ、無菌化された）］０．２５ｍｌ中にて分配された２８０μｇ／体重ｋｇであり、静脈内注射された（ＩＶ）。使用されたフォリスタチンの投与量は、１日当たり約０．１から１００ｍｇ／患者体重ｋｇの範囲であり、静脈内注射（ＩＶ）により分配される。投与量の種間のスカーリングは本分野にて既知の方法、例えば上記のＭｏｒｄｅｎｔｉら及びその中にて引用された文献にて記載された様に実施し得る。
【０１５８】
１セットの動物は担体のみを受け、コントロールを提供する。他のセットの動物は１０日間の期間に渡り、６時間毎にｒｈＨＧＦを注射する。第３のセットの動物は、５日間の期間に渡り、６時間毎にｒｈＨＧＦ及びフォリスタチンの組み合わせを注射する。注射の１、３、５日後に、マウスをケタミン−キシラジンで麻酔し、心臓穿刺により血液を集め、室温にて１時間放置して凝血させた。血清の部分を−７０℃にて保管し、Ｍｏｎａｒｃｈモデル７０００自動化分析器においてビリルビン、ＡＬＴ及びＡＳＴを測定した。肝臓を結合組織から切開して離し、重さを量り、断片を中性の緩衝ホルマリン中にて固定する。パラフィンに埋め込まれた部分を４μｍに切り、ヘマトキシリン及びエオシンで染色し、組織学的に調べる。
【０１５９】
実施例３から得られたトランスジェニック  マウスのデーターを、認可された獣医学及び臨床の手順に従って哺乳動物の体重に対して補正し、馬、牛及び他の哺乳動物に外挿し得ることは合理的に予期される。標準的プロトコール及び手順を用いて、処置されるのが望ましい哺乳動物において最大の効果を達成するために、獣医又は臨床医は、ＨＧＦ及びアクチビン  アンタゴニストの投与量、スケジュール及び投与方法を調整できるだろう。ヒトは同様の方法にて反応すると信じられる。
【０１６０】
前述のものは特に好ましい具体例を表すが、本発明はそれに限定されないことが理解されよう。本発明の全体の概念から迂回することなく、種々の修飾が、開示された具体例について行われ得ることが本分野の当業者には考えられるだろう。この様な修飾は全て本発明の範囲内であることが意図されている。
【図面の簡単な説明】
【０１６１】
【図１Ａ】図１Ａは、ＢｉＣＮＵ（登録商標）又は担体のみで処置したラットと比較した、ＢｉＣＮＵ（登録商標）及び組換えヒトＨＧＦ（ｒＨＧＦ）で処置したラットにおけるアルカリ性ホスファターゼ（ＡＬＰ）酵素レベルを表している。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ＢｉＣＮＵ（登録商標）又は担体のみで処置したラットと比較した、ＢｉＣＮＵ（登録商標）及び組換えヒトＨＧＦ（ｒＨＧＦ）で処置したラットにおけるアルカリ性トランスアミナーゼ（ＡＬＴ）酵素レベルを表している。
【図１Ｃ】図１Ｃは、ＢｉＣＮＵ（登録商標）又は担体のみで処置したラットと比較した、ＢｉＣＮＵ（登録商標）及び組換えヒトＨＧＦ（ｒＨＧＦ）で処置したラットにおけるアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）酵素レベルを表している。
【図１Ｄ】図１Ｄは、ＢｉＣＮＵ（登録商標）又は担体のみで処置したラットと比較した、ＢｉＣＮＵ（登録商標）及び組換えヒトＨＧＦ（ｒＨＧＦ）で処置したラットにおけるγ−グルタミントランスペプチターゼ（ＧＧＴ）酵素レベルを表している。
【図１Ｅ】図１Ｅは、ＢｉＣＮＵ（登録商標）又は担体のみで処置したラットと比較した、ＢｉＣＮＵ（登録商標）及び組換えヒトＨＧＦ（ｒＨＧＦ）で処置したラットにおける総ビリルビンを表している。
【図１Ｆ】図１Ｆは、ＢｉＣＮＵ（登録商標）又は担体のみで処置したラットと比較した、ＢｉＣＮＵ（登録商標）及び組換えヒトＨＧＦ（ｒＨＧＦ）で処置したラットにおけるアミラーゼを表している。
【図２Ａ】図２Ａは、ＢｉＣＮＵ（登録商標）で処置したラットにおける、門脈の三つ組からほとんど中心静脈まで広がる出血を伴う肝細胞の壊死を表している。処置は実施例１に記載の様に行った。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ｒｈ−ＨＧＦで処置した、ＢｉＣＮＵ（登録商標）に暴露した、ラットの肝臓において肝細胞壊死が無いことを示している。処置は実施例１に記載の様に行った。
【図３】図３は、Ｃａｒｍｉｃｈａｅｌらの方法（キャンサー  リサーチ、４７、９３６−９４２、１９８７年）によるＭＴＴ減少により測定された、アクチビン−Ａ又はＴＧＦ−βにより誘導された肝臓障害に対抗するＨＧＦの保護を表している。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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