【誤訳訂正書】
【提出日】平成24年7月4日(2012.7.4)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般構造式（Ｉ）の構造を有する化合物、又はその薬剤的に許容される塩若しくは溶媒和物。
Ａ−Ｂ−Ｃ  （Ｉ）
式中、Ｃは、次の構造からなる群から選ばれ、
【化１】
2010531352.tif 000001
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、互いに独立して、水素及びＣ１〜Ｃ６のアルキル基からなる群より選ばれる。）；
Ｂは−（ＣＨ２）ｎ−、ｎは１〜５の整数であり；
Ａは、下記の構造からなる群から選ばれる：
【化２】
2010531352.tif 000002
（式中、Ｒ５は、水素、Ｃ１〜Ｃ６のアルコキシ基、ＣＨ２ＮＲ１０Ｒ１１、ＣＨ（ＣＨ３）ＮＲ１０Ｒ１１、
【化３】
2010531352.tif 000003
からなる群から選ばれ、
Ｒ６およびＲ７は、互いに独立して、水素、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基、Ｃ１〜Ｃ６のアルコキシ基およびハロゲンからなる群から選ばれ、
Ｒ８は、水素またはＣ１〜Ｃ６のアルキル基であり、
Ｒ９は、
【化４】
2010531352.tif 000004
から選ばれる。
（上記式中、Ｒ１０およびＲ１２は、互いに独立して、水素、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基、（ＣＨ２）ｍＣＯＯＲ１３、（ＣＨ２）ｍＣＯＮ（Ｒ１３）２、
【化５】
2010531352.tif 000005
からなる群より選ばれ、ここでｍは１から４の整数であり、ｋは１から３の整数であり、
Ｒ１３は、水素またはＣ１〜Ｃ６のアルキル基であり、
Ｒ１１は、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基、またはＡｒであり、
Ａｒは、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ基、ハロゲン、Ｎ（Ｒ１３）２、ＯＨ、ＮＯ２、ＣＮ、ＣＯＯＲ１３、ＣＯＮ（Ｒ１３）２およびＳＯ２Ｒ１３の群から選ばれた１から５つの置換基で置換されていてもよい、フェニル、ピリジル、オキサゾリル、チアゾリル、チエニル、フラニル、ピリミジニル、ピリダジニル、ピラジニル、インドリル、ベンゾフラニル、およびベンゾチオフェニルからなる群より選ばれる。））。
ただし、Ａが
【化６】
2010531352.tif 000006
又は
【化７】
2010531352.tif 000007
の場合、Ｒ５及びＲ６はそれぞれ水素ではなく、
また、式（Ｉ）の化合物には下記の化合物は含まれない。
【化８】
2010531352.tif 000008
【請求項２】
下記の構造を有する請求項１に記載の化合物、又はその薬剤的に許容される塩若しくは溶媒和物。
【化９】
2010531352.tif 000009
（式中、Ｙは、水素、ハロゲン、ＣＯＯＲ１３、ＣＯＮ（Ｒ１３）２およびＳＯ２Ｒ１３からなる群から選ばれ、
ｒは、２から５の整数である。）
【請求項３】
トロンビンを阻害する能力のある、請求項１に記載の化合物又はその薬剤的に許容される塩若しくは溶媒和物。
【請求項４】
請求項１に記載の化合物又はその薬剤的に許容される塩若しくは溶媒和物の、トロンビン阻害剤としての使用。
【請求項５】
請求項１に記載の化合物又はその薬剤的に許容される塩若しくは溶媒和物の治療有効量と、薬剤的に許容される担体とを含む、トロンビン依存血栓塞栓症の治療および／または予防に使用するための医薬組成物。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【発明の詳細な説明】
【発明の名称】抗トロンビン機能を有する新規化合物および該機能に基づいた医薬組成物
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規の化学化合物、これら化合物のトロンビン阻害剤としての応用、およびそれらを基にした医薬組成品に関する。それらはトロンビン依存の血栓塞栓症（thromboembolic events）の治療および予防に使用することができ、また研究目的にも使用することができる。
【０００２】
トロンビンは、血液凝固系の主要な酵素であり、可溶性の血漿タンパク質であるフィブリノゲンを不溶性のフィブリン塊に変換する。フィブリン重合を引き起こす過程であるトロンビン形成とトロンビン活性を抑制する過程であるトロンビン阻害との間には、不安定な平衡が存在する。過剰なトロンビン形成は、血栓症となる。
【０００３】
直接トロンビン阻害剤は、活性酵素中心に直接強く結合し、トロンビンの天然基質であるフィブリノゲンをその活性中心から遮断する阻害剤の名称である。この遮断によって、トロンビンが触媒するフィブリン重合が制限される。その結果、フィブリン血栓形成が遅延するか、完全に予防される。よって、強力な抗トロンビン活性を有するためには、直接トロンビン阻害剤は、最大限の強度でトロンビン活性中心と結合しなければならない。そのためには、直接トロンビン阻害剤は、トロンビン分子の活性中心の構造と最良の相関を示す必要がある。
【０００４】
一般に、トロンビンの活性中心は、アミド分解反応が起こる部位(point)の近傍の、その基質（フィブリノゲン）の異なるアミノ酸を受ける数個のキャビティまたはポケットからなる。ポケットＳ１は、疎水性アミノ酸残基によって形成される壁を有する深くて狭いキャビティであり、そのキャビティの底部には負の電荷が（アミノ酸Ａｓｐ１８９のカルボキシル基として）存在する。ポケットＳ１は、フィブリノゲン中の塩基性アミノ酸残基（リシンまたはアルギニン）を、（リシンまたはアルギニンのＣ末端における）ペプチド結合の切断部位で直接結合する役割をもつ。塩基性アミノ酸の長い非分岐炭化水素残基は、ポケットＳ１の全長に沿って位置しており、一方で、炭化水素残基の末端において正に帯電した塩基性断片は、ポケットＳ１の底部で負に帯電したアスパラギン酸残基と塩架橋を形成している。従って、ポケットＳ１は、フィブリノゲンのポリペプチド鎖中の塩基性アミノ酸残基を識別するのに最も適している。
【０００５】
非極性アミノ酸残基によって形成される別のポケットＳ２は、ポケットＳ１のすぐ傍に隣接し、ポケットＳ１に受けられた塩基性アミノ酸部分の後に続くフィブリノゲンのアミノ酸配列中の小サイズの疎水性アミノ酸（バリン、イソロイシンおよびロイシン）を（そのＮ末端において）認識する役割をもつ。ポケットＳ２は、ポケットＳ１よりも容積が小さく、いかなる帯電したアミノ酸残基をももたない。従って、ポケットＳ２は、非極性脂肪族アミノ酸の小さな炭化水素残基との結合に、理想的に適している。
【０００６】
ポケットＳ３は、トロンビン分子表面上でポケットＳ２の隣に位置する。これも疎水性ポケットであるが、容積がやや大きく、そして、その大部分が開放され直接溶媒にさらされているため、正確に規定されていない。ポケッＳ３は、ペプチド鎖中で切断部位から結合数個分だけ離れた、フィブリノゲンの大きな脂肪族および芳香族の疎水性アミノ酸断片を配置する役目をしている。
【０００７】
直接トロンビン阻害剤は、トロンビン分子の活性中心のこれら３つのポケットを、最適の様式で埋めなければならない。例えば、Ｘ線構造解析により見出されている通り、周知のトリペプチド阻害剤Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇは、トロンビン活性中心と次のように反応する：アルギニン残基がポケットＳ１を埋め、プロリン残基がポケットＳ２を塞ぎ、Ｄ−フェニルアラニンがポケットＳ３を占める。
【０００８】
血栓症をコントロールするために、現在、臨床で使用されている薬剤は、血液中で既に形成された過剰のトロンビンを阻害するのに必ずしも適しているわけではない。現在一般的に使用されているのは、未分画ヘパリン、低分子量ヘパリン及びビタミンＫ拮抗剤（ワルファリン）などの間接トロンビン阻害剤である。これらの全ての薬剤が、それ自身で、系に蓄積するトロンビン活性を阻害することができるわけではない。種々のヘパリンは、血漿中に存在する天然のトロンビン阻害剤であるアンチトロンビン  ＩＩＩ（ＡＴＩＩＩ）の阻害作用を促進するのみである。そのため、なんらかの理由で、患者の血漿中のＡＴＩＩＩ含有量が非常に低い場合、ヘパリンは弱い抗凝血効果しかもたない。ビタミンＫ拮抗剤は、肝臓での凝固因子の前駆体合成を抑制することによって、凝固速度を減じる。明らかに、この手段は比較的緩慢であり、血中で既に形成されているトロンビンを早急に抑制する必要がある重篤な状況では助けとはなり得ない。
【０００９】
間接凝固剤療法には制限があるので、製薬会社は強力で選択的な直接トロンビン阻害剤の開発に努力してきた。現在まで、そのようなトロンビン阻害剤が数多く開発されてきた。しかし、その大部分は、薬剤に要求される全ての特性を示すわけではない。実効時間の延長、低毒性、水溶性、経口でのバイオアベイラビリティなどの薬理学的性質を向上すべく、研究が続けられている。理想的なトロンビン阻害剤は、血塊に結合したトロンビンに対しても効果がなければならない。理想的なトロンビン阻害剤は、線維素溶解に関与するプロテアーゼを阻害することなくトロンビンに選択的で、長時間血中に残存し（肝臓内の酵素やシトクロムＰ４５０の作用に耐える）、水性媒体中で安定であり、血中タンパク質と結合せず（または、ほんの僅かにしか結合せず）、無毒でなければならない。残念ながら、化合物がこれらの要件全てに適合するかを予備試験の後に予測することは不可能である。多くの効果的な低分子量トロンビン阻害剤がすでに合成されてきたにもかかわらず、唯一、日本で合成されたアルガトロバン(Argatroban)（米国特許第５，２１４，０５２号、１９９３年）のみが、必要な臨床試験全てを通り、今日使用されている。しかしながら、アルガトロバンは、溶液中での安定性が低く（その血漿中のＴ１／２は３６分）、理想的な阻害剤でない。従って、効果的で安全な新しい合成トロンビン阻害剤の開発が依然として重要とされている。
【００１０】
今日入手可能な公開されている特許および科学研究には、多数のトロンビン阻害剤が記述されている。これら公表文献の要約を下に示す。
【００１１】
米国特許出願第２００６／００１４６９９号（Ａｓｔｒａ  Ｚｅｎｅｃａ  ＡＢ）、２００６年、および米国特許第５，７９５，８９６号（Ａｓｔｒａ  Ａｋｔｉｅｂｏｌａｇ）、１９９８年、は、メラガトラン阻害剤を含む抗血栓医薬組成物を記載している。
【００１２】
また、米国特許第５，５１０，３６９号（メルク社）、１９９６年に記載されているピロリジン誘導体や、米国特許第５，７９２，７７９号（メルク社）、１９９８年で記載されているものなどのピリジントロンビン阻害剤などのトロンビン阻害剤も公知である。
【発明の概要】
【００１３】
本出願人は、現存の阻害剤の構造や阻害剤とトロンビン分子間の反応の機序に関する情報を含む数多くの科学論文や記事を調査してきた。調査した文献（表１）は、トロンビン阻害剤として知られているほとんどすべての種類の化学化合物を網羅している。表１に示した文献のリストは、完璧でないにしても、十分に足りるものである。我々が、独自のトロンビン阻害剤を開発するにあたって、これら文献にすでに記述されている構造を意識的に避けた。我々が検討したこれらの文献には、我々が発明としてクレームした新規化合物に典型的な要素を含むトロンビン阻害剤に関する情報は発見されなかった。
【００１４】
本発明の実際の目的は、直接トロンビン阻害剤として働き得る新規の化合物を開発することである。これらの阻害剤は、様々な病態(pathologies)の中で生物に生じる急性の血栓状態の治療に用いることができる。生物における非常に多くの異なった病態が、止血系における不調に関連している。心筋梗塞、脳卒中、深部静脈血栓症または肺動脈血栓塞栓症などの疾患の結果として起こる血栓塞栓性合併症は、世界中で主な死因に入っている。よって、効果的で安全な臨床薬として働き得る薬剤、特には抗凝血性を有する抗血栓剤の開発に長期にわたり鋭意努力が重ねられてきたことは、驚きに値しない。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】様々な濃度の化合物ＨＣ−０１９ｓ−ＩＯＣ（表４を参照のこと）の存在下での、トロンビンによる発色基質クロモザイム（Chromozim）ＴＨ（ＣＴＨ）の加水分解についての典型的な反応速度曲線の例を示す図である。
【図２】ＣＴＨ加水分解阻害の程度と、非常に効果的なトロンビン阻害剤である、新規に合成された他の化合物（ＨＣ−０１８ｓ−ＩＯＣ）の系内での濃度との関係を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
特に他に指示がない限り、次の定義が、本明細書において用いられる。
【００１７】
活性部位とは、生化学反応において鍵となる役割を果たすタンパク質高分子の領域である。
【００１８】
タンパク質とは、タンパク質高分子を意味する。
【００１９】
標的タンパク質とは、結合過程に係るタンパク質高分子を意味する。
【００２０】
リガンドとは、低分子量の化学構造物の集団(collections)を意味する。 
【００２１】
結合過程とは、リガンドと標的タンパク質の活性部位との間の、ファン・デル・ワールス錯体または共有結合複合体の形成を意味する。
【００２２】
スクリーニングとは、タンパク質高分子の特定の領域に選択的に反応する化学的構造物の集団の中で、化合物の集まり(set)を同定することを意味する。
【００２３】
位置修正(correct positioning)とは、リガンド−タンパク質複合体の最小の自由エネルギーに対応する位置にリガンドを位置決めすることである。
【００２４】
選択的リガンドとは、任意の標的タンパク質に特異的に結合するリガンドを意味する。
【００２５】
バリデーションとは、実施している系の品質、およびランダムなリガンド集団から任意の標的タンパク質に確実に結合しているリガンドを選択する当該系の効率を評価する、一連の計算および比較方法論を意味する。
【００２６】
参照タンパク質とは、実験データを踏まえて、または実施している系のバリデーションの際に、モデル計算（スコアリング関数）のパラメータを調整するために、または特定の阻害剤の結合特異性を評価するために用いられるタンパク質を意味する。
【００２７】
特異的に結合するリガンドとは、特定のタンパク質にのみ結合し、他のタンパク質には結合しないリガンドを意味する。
【００２８】
阻害剤とは、任意の標的タンパク質の活性部位に結合し、生化学反応の通常の進行を妨げるリガンドを意味する。
【００２９】
ドッキングとは、タンパク質の活性部位における、リガンドの位置決めを意味する。
【００３０】
スコアリングとは、リガンドをタンパク質に結合するために要する自由エネルギーの算出を意味する。
【００３１】
結合自由エネルギー(ΔG binding)とは、（ＳＯＬソフトウェアを用いた）標的タンパク質へのリガンドの結合のための自由エネルギー計算の結果を意味する。
【００３２】
Ｃ１〜Ｃ６アルキル基とは、炭素数が１から６の非分岐または分岐の炭化水素鎖を含むアルキル基を意味する。例えば、メチル、エチル、ｎ‐プロピル、イソプロピル、ｎ‐ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ‐ブチルなどが挙げられる。
【００３３】
Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ基とは、炭素数が１から６の非分岐または分岐の炭化水素鎖を含むアルコキシ基を意味する。例えば、メトキシ、エトキシ、ｎ‐プロポキシ、イソプロポキシなどが挙げられる。
【００３４】
ハロゲンとは、塩素、臭素、ヨウ素あるいはフッ素を意味する。
【００３５】
薬剤的に許容される塩とは、毒性を呈したり、活性化合物の吸収および薬効を阻害する場合を除き、構造式（Ｉ）の活性化合物により作られた任意の塩を意味する。このような塩は、構造式（Ｉ）の化合物、および、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、メチルアミン、エチルアミンなどの有機または無機塩基との間の反応によって作られる。
【００３６】
溶媒和物とは、構造式（Ｉ）の活性化合物の結晶形態であり、その結晶格子が、水の分子、または構造式（Ｉ）の活性化合物が結晶化する他の溶媒の分子を含む結晶形態を意味する。
【００３７】
薬剤的に許容される担体とは、組成物の他の成分と混合可能で、受け手に害を及ぼさない、すなわち、それが使用される用量および濃度において細胞または哺乳類に対して無毒でなければならない担体を意味する。しばしば、薬剤的に許容される担体は、水性のｐＨ緩衝溶液である。生理学的(physiologically)に許容される担体として、例えば：
1)  リン酸塩、クエン酸塩、またはその他の有機酸の塩に基づく溶液等の緩衝溶液；
2)  アスコルビン酸等の抗酸化剤；
3)  低分子量（１０残基未満）のポリペプチド；
4)  血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなどのタンパク質；
5)  ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；
6)  グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジンなどのアミノ酸；
7)  グルコース、マンノースまたはデキストリンなどの単糖類、二糖類および他の炭水化物；
8)  ＥＤＴＡなどのキレート剤；
9)  マンニトールまたはソルビトールなどの糖アルコール
が挙げられる。
【００３８】
治療有効量とは、哺乳類生物において、所望の程度のトロンビン阻害を達成するために必要な化合物の量を意味する。
【００３９】
ここで用いられる意味において、哺乳類は、霊長類（例えば、ヒト、類人猿、非類人猿およびより下等な猿）、捕食動物（例えば、猫、犬および熊）、げっ歯動物（例えば、マウス、ラットおよびリス）、食虫類（例えば、トガリネズミとモグラ）などを含む。
【００４０】
出願人が定めた実際の目的(practical task)は、一般構造式（Ｉ）の化合物を、その薬剤的に許容される塩または溶媒和物を含め、開発することによって達成される。
Ａ−Ｂ−Ｃ  （Ｉ）
式中、Ｃは、次の構造を含む群から選ばれ：
【００４１】
【化１】
2010531352.tif 000010
【００４２】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、互いに独立して、水素またはＣ１〜Ｃ６のアルキル基を含む群から選ばれる）；
Ｂは、−（ＣＨ２）ｎ−、ｎは１〜５の整数であり；
Ａは、下記の群から選ばれる構造である：
【００４３】
【化２】
2010531352.tif 000011
【００４４】
（式中、Ｒ５は、水素、Ｃ１〜Ｃ６のアルコキシ基、ＣＨ２ＮＲ１０Ｒ１１、ＣＨ（ＣＨ３）ＮＲ１０Ｒ１１、
【００４５】
【化３】
2010531352.tif 000012
【００４６】
を含む群から選ばれ、
Ｒ６およびＲ７は、互いに独立して、水素、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基、Ｃ１〜Ｃ６のアルコキシ基およびハロゲンからなる群から選ばれ、
Ｒ８は、水素またはＣ１〜Ｃ６のアルキル基であり、
Ｒ９は、下記の群から選ばれる構造である：
【００４７】
【化４】
2010531352.tif 000013
【００４８】
（上記式中、Ｒ１０およびＲ１２は、互いに独立して、水素、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基、（ＣＨ２）ｍＣＯＯＲ１３、（ＣＨ２）ｍＣＯＮ（Ｒ１３）２、
【００４９】
【化５】
2010531352.tif 000014
【００５０】
からなる群より選ばれ、ここでｍは１から４の整数であり、ｋは１から３の整数であり、
Ｒ１３は、水素またはＣ１〜Ｃ６のアルキル基であり、
Ｒ１１は、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基、またはＡｒであり、
Ａｒは、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ基、ハロゲン，Ｎ（Ｒ１３）２、ＯＨ、ＮＯ２、ＣＮ、ＣＯＯＲ１３、ＣＯＮ（Ｒ１３）２およびＳＯ２Ｒ１３の群から選ばれた１から５つの置換基で置換されていてもよい、フェニル、ピリジル、オキサゾリル、チアゾリル、チエニル、フラニル、ピリミジニル、ピリダジニル、ピラジニル、インドリル、ベンゾフラニル、およびベンゾチオフェニルからなる群から選ばれる。））
ただし、Ａが
【００５１】
【化２７】
2010531352.tif 000015
又は
【化２８】
2010531352.tif 000016
の場合、Ｒ５及びＲ６は同時に水素ではなく、また、下記の化合物は除外される。
【化６】
2010531352.tif 000017
【００５２】
この羅列(List)から除かれた化合物は既に公知である。特に、４−アミノ−１−［３−［（２−メチルフェニル）アミノ］−３−オキソプロピル］ピリジニウムクロライドは、"Carbocyclic Derivatives Related to Indoramin" (J. Med. Chem.1974, 17(7):739-744)に記載されており、４−アミノ−１−（２−フェノキシエチル）−ピリジニウムブロマイドは、"Application of Sodium Borohydride Reduction to Synthesis of Substituted Aminopiperidines, Aminopiperazines, Aminopyridines And Hydrazines" (J. Org. Chem. 1961, 26:2740-2747)に記載されている。その他の除外された化合物は、特許文献JP 05 134337、WO 2005/094828、US 3407229に記載されていた。なお、これらの出典はこれらの化合物がトロンビン阻害剤である可能性について言及していない、という点は重要である。
【００５３】
本発明の好ましい実施態様は、次の請求項１の化合物、およびそれらの薬剤的に許容される塩または溶媒和物を記載する。
【００５４】
【化７】
2010531352.tif 000018
【００５５】
式中、Ｙは、水素、ハロゲン、ＣＯＯＲ１３、ＣＯＮ（Ｒ１３）２およびＳＯ２Ｒ１３からなる群から選ばれ、
ｒは、２から５の整数である。
【００５６】
本出願人は、構造式Ａ−Ｂ−Ｃの化合物、およびその薬剤的に許容される塩または溶媒和物が、トロンビンを阻害することができることを見出した。
【００５７】
従って、新規化合物およびその薬剤的に許容される塩または溶媒和物を、トロンビン阻害剤として実際に用いることができる。
【００５８】
トロンビン阻害剤として、実際の利用に向けて興味深くあり得る化合物、すなわち、顕著な阻害効果を示し得る化合物は、次のように選択された。我々は、一般構造式（Ｉ）で表わされる構造に焦点を当てた仮想リガンドライブラリーから、分子の三次元モデルを構築した。次の工程において、得られたリガンド構造物を、トロンビン分子の活性部位にドッキングした。トロンビン阻害剤である可能性のある分子構造のために受け取ったドッキング結果を用いて、最も見込みのある候補分子、すなわち、−５．０ｋｃａｌ／ｍｏｌより悪くない（ドッキング工程において測定された）スコアリング関数値を示す分子を選択した。ドッキング手順によって予測された、トロンビン分子の活性部位におけるこれらの化合物の位置を、可視化により検討した。もし、分子の位置決めの空間パターンがトロンビン活性部位への阻害剤の結合に関する上記の仮説を満たす場合、該分子を「バーチャルヒット(virtual hits)」とみなし、合成および阻害活性の実験的測定のための候補分子として受け入れた。合成するか否かは、推定される合成の複雑さを評価することにより最終的に決定された。
【００５９】
本発明のトロンビン阻害剤は、トロンビンの活性部位との効果的な反応についての上記要件を最適に満足する。式（Ｉ）の阻害剤の正に帯電した化学基Ｃは、アミノ酸残基Ａｓｐ１８９に塩架橋を形成しているポケットＳ１の底部に位置している。リンカーＢは、ポケットＳ１の残りの空間を占め、ポケットの壁との最適な疎水性結合を確実にしている。式（Ｉ）の化学基Ａは、ポケットＳ２およびＳ３内に位置している。下記のＲ基は、疎水性の断片である。これらラジカルのうちの一部が溶媒にさらされている。トロンビン活性部位に結合するという観点からすれば、これらの断片は、親水性および疎水性の分子グループどちらでもあり得るが、阻害剤分子の薬物動態特性の改良のためには、親水性ラジカルを選択することによって阻害剤分子の全体としての疎水性性質を部分的にバランスすることが望ましい。この目的からも、ポケットＳ３に位置する疎水性断片は、溶媒にさらされた親水性残基で修飾され得る。本明細書に記載されたトロンビン阻害剤は、上述の要件を十分に満足する。
【００６０】
このクレームの適性は、下記手順によって行なわれる選択された本発明のトロンビン阻害剤のトロンビン活性部位内での位置決め（ドッキング）によって証明される。阻害剤分子の全エネルギーの大域的最小化が行なわれた。全エネルギーは、トロンビンの活性部位に結合している阻害剤が占めているコンフォメーションにおける阻害剤分子の内部テンションエネルギー(internal tension energy)およびトロンビン分子場における阻害エネルギーからなる。続いて、トロンビン分子場は、阻害剤との、静電およびファンデルワールス相互作用、並びにトロンビン分子の各部やリガンド分子の溶媒和および脱溶媒和により起こる多くの相互作用を促す。これらの反応は、数多くの文献で記述され、当分野の研究者に良く知られている。大域的最小化は、遺伝的（genetic）アルゴリズムを用いて、数回繰り返された。最小化プログラムは、この酵素の活性部位におけるトロンビン阻害剤の幾何学的位置決め、およびトロンビン−阻害剤複合体形成のための自由エネルギーの推定値としての役割をもつスコアリング関数値をもたらす。ここに記載された阻害剤において、スコアリング関数は、常に−５ｋｃａｌ／ｍｏｌより小さく、この値は、マイクロモル以下の範囲の阻害定数と合致する。スコアリング関数を用いた予測の信頼性は、当分野の専門家の知られている様々な方法で検討することができる。特に、スコアリング関数値によってランダムなリガンドのセットから活性のある阻害剤を選択する可能性を示す、いわゆるトロンビン阻害剤反応係数は、０．８５であり、これは、十分に信頼できる予測であることの証拠である。ここで述べた、阻害剤の幾何学的位置は、前記のドッキング手順により得られたものであり、トロンビン阻害剤をトロンビン活性部位に結合する最適な条件に合致し、その位置で、トロンビンにより触媒されるフィブリノゲンアミド分解反応に関し、それらが阻害活性を発揮することができた。
【００６１】
クレームされた化合物は、有機化学の専門家に公知の一般的な方法で得ることができる。
【００６２】
生物の様々な病態(pathological conditions)の多くは、止血系における障害に関連している。血栓塞栓性心筋梗塞、脳卒中、深部静脈血栓症、肺動脈血栓塞栓症といった疾病で起こる血栓塞栓性の合併症は、世界中で、主な死因になっている。
【００６３】
本発明は、トロンビンに依存する血栓塞栓症（thromboembolic events）の治療および予防のための医薬組成物も含む。それは、治療有効量の請求項1の化合物またはその薬剤的に許容される塩若しくは溶媒和物と、薬剤的に許容される担体とを含む。
【００６４】
本発明の化合物は、血中に生体蓄積がおこるように、任意の適切なやり方で投与される。投与は、静脈、筋肉、皮内、皮下、また腹腔内注射といった非経口投与の方法でなされる。適切な組成物を経口で服用することによる、消化管を通した吸収など、他の投与方法も用いられ得る。使用が簡単なため、経口服用が好ましい。或いは、この薬剤は、膣および肛門を通して投与し得る。さらに、本発明の化合物は、皮膚を通して（例えば、経皮的に）または吸入によって投与し得る。好適な投与方法は、患者の病状、年齢、感受性によることは、明らかである。
【００６５】
経口服用用に、医薬組成品を、結合剤（例えば、解膠トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリジノンまたはヒドロキシプロピル  メチルセルロース）、賦形剤（例えば、乳糖、微結晶セルロース、リン酸水素カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、酸化シリコン、ジャガイモデンプンまたはでんぷん質のグリコール酸ナトリウム）、湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）などの薬剤的に許容される添加物とともに、例えば、錠剤またはカプセル剤に包み込むことができる。錠剤を、コートしてもよい。液体経口組成物は、溶液、シロップ、または懸濁液の形に、調製することができる。そのような液体組成物は、懸濁剤（例えば、セルロース誘導体）、乳化剤（例えば、レシチン）、希釈剤（精製植物油）および保存料（例えば、メチルまたはプロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾエート、ソルビン酸）などの薬剤的に許容される添加物を用いる一般的な方法により得ることができる。組成物は、また、適当な緩衝塩、香料、色素および甘味料も含み得る。
【００６６】
これら組成物中の活性成分の含有量は、組成物重量の０．１％から９９．９％の間にわたり、好ましくは、５％から９０％である。
【００６７】
これらトロンビン阻害剤の毒性を、実験動物で、標準的な製薬学的手順を用い、ＬＤ５０（個体群の５０％に対する致死量）で測定した。本発明の好ましい化合物については、ＬＤ５０量は、３６７ｍｇ／ｋｇを超えていたが、これは、臨床使用を承認された、ＬＤ５０＝４７５ｍｇ／ｋｇであるアルガトロバンの致死量と釣り合っている。
【００６８】
本発明の主題をより理解しやすくするため、以下に、新規阻害剤およびその合成中間体の合成を説明するいくつかの例を、クレームされた新規化合物の抗トロンビン活性を検討するための方法の説明とともに示す。
【００６９】
実施例は単なる例示であり、本発明の本質を下記実施例の範囲に制限するものではない。
【００７０】
実施例１
中間体である３−（３−クロロプロポキシ）−５−メチルフェノールの合成
【００７１】
【化８】
2010531352.tif 000019
【００７２】
３．８ｇ（２７ｍｍｏｌ）のオルシン水和物、４．８ｇ（３０ｍｍｏｌ）の１−ブロモ−３−クロロプロパンおよび４．０ｇ（２９ｍｍｏｌ）の炭酸カリウムの混合物を、３０ｍｌのアセトニトリル中で攪拌しながら３６時間還流した。溶媒を留去させた後、残部を３０ｍｌのエーテルに溶解し、１５ｍｌの炭酸カリウムの飽和溶液で２回洗った。水層を捨て、エーテル層を、１５ｍｌの１０％水酸化ナトリウム溶液で、３回抽出した。エーテル層を捨て、水層を注意深く濃ＨＣｌで酸性にし、１５ｍｌのエステルで３回抽出した。エーテル抽出物を合わせ、少量の炭酸水素ナトリウムの飽和溶液で洗った。無水硫酸ナトリウムで乾燥し，約３分の１体積部のヘキサンで希釈し、シリカゲルの層を通してろ過した。溶媒を蒸発することにより、１．７ｇの黄色の油、約７０％のオルシン（Ｒｆ０．１０）および約３０％の３−（２−クロロプロポキシ）−５−メチルフェノール（Ｒｆ０．２６、収量  約１．２ｇ（純粋な基質あたり(per pure substance)２２％）の混合物を得た。
【００７３】
同様の方法を用いて、オルシン水和物および１−ブロモ−２−クロロエタンから３−（２−クロロエトキシ）−５−メチルフェノール（Ｒｆ０．２６、収量約１．１ｇ（純粋な基質あたり(per pure substance)２０％）を生成し、オルシン水和物および１−ブロモ−４−クロロブタンから３−（４−クロロブトキシ）−５−メチルフェノールを得た。
【００７４】
実施例２
中間体であるベンゼンスルホン酸の３−（３−クロロプロポキシ）−５−メチルフェニルエステルの合成
【００７５】
【化９】
2010531352.tif 000020
【００７６】
３ｇ（１７ｍｍｏｌ）のベンゼンスルホクロライドおよび２ｇ（２０ｍｍｏｌ）のトリエチルアミンを、３０ｍｌの乾燥テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）に１．６ｇの上記実施例の混合物の溶液に加えた。混合物を７時間攪拌し、トリエチルアミン塩酸塩の沈澱をろ過して除いた。溶媒を蒸発させ、得られた油を、２０ｍｌのエーテルに溶解し、１０ｍｌの１０−１２％アンモニア水溶液で数回洗い、過剰な未反応ベンゼンベンゼンスルホクロライドを分離し（薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によってコントロール）、次に、１０ｍｌの２０％塩酸で洗った。無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を蒸発することにより、（ＴＬＣに照らして）ほぼ同量のベンゼンスルホン酸の３−（３−クロロプロポキシ）−５−メチルフェニルエステル（Ｒｆ０．３６）とオルシンのジベンゾイルスルホン酸エステル（Ｒｆ０．２５）を含む黄色の油を１．９４ｇ得た。
【００７７】
同様にして、３−（２−クロロエトキシ）−５−メチルフェノール、３−（３−クロロプロポキシ）−５−メチルフェノール、および３−（４−クロロブトキシ）−５−メチルフェノール並びに適当なアリルスルホクロリドから、次を得た。
２−クロロベンゼンスルホン酸の３−（３−クロロプロポキシ）−５−メチルフェニルエステル（純粋な物質あたり(per pure substance)７７％）、
２−フルオロベンゼンスルホン酸の３−（３−クロロプロポキシ）−５−メチルフェニルエステル（８８％）、
２−カルボメトキシベンゼンスルホン酸の３−（３−クロロプロポキシ）−５−メチルフェニルエステル（５６％）、
ベンゼンスルホン酸の３−（２−クロロエトキシ）−５−メチルフェニルエステル（７２％）、
２−クロロベンゼンスルホン酸の３−（２−クロロエトキシ）−５−メチルフェニルエステル（３５％）、
２−フルオロベンゼンスルホン酸の３−（２−クロロエトキシ）−５−メチルフェニルエステル（３４％）、
２−カルボメトキシベンゼンスルホン酸の３−（２−クロロエトキシ）−５−メチルフェニルエステル（３７％）、
ベンゼンスルホン酸の３−（４−クロロブトキシ）−５−メチルフェニルエステル（４５％）、
２−クロロベンゼンスルホン酸の３−（４−クロロブトキシ）−５−メチルフェニルエステル（２７％）、
２−フルオロベンゼンスルホン酸の３−（４−クロロブトキシ）−５−メチルフェニルエステル（３２％）、
２−カルボメトキシベンゼンスルホン酸の３−（４−クロロブトキシ）−５−メチルフェニルエステル（２１％）
【００７８】
実施例３
中間体である２−クロロベンゼンスルホン酸の３−（３−ヨードプロポキシ）−５−メチルフェニルエステルの合成
【００７９】
【化１０】
2010531352.tif 000021
【００８０】
２ｇ（１３ｍｍｏｌ）のか焼(calcined)ヨウ化ナトリウムを、上記の例と同様に生成した２−クロロベンゼンスルホン酸の３−（３−クロロプロポキシ）−５−メチルフェニルエステルを３０ｍｌの乾燥アセトン中に含む混合物２．６ｇに加え、４８時間還流した。次に、この反応混合物を、１０ｍｌのヘキサンに希釈し、蒸発した。その結果、ベンゼンスルホン酸の３−（２−ヨードエトキシ）−５−メチルフェニルエステル（Ｒｆ０．３５）および個別の(respective)オルシンのジベンゾイルスルホン酸エステル（Ｒｆ０．２５）を含む淡黄色の油を、２．４５ｇ得た。
【００８１】
同様の技法を用いて、適当な塩化物を、
ベンゼンスルホン酸の３−（３−ヨードプロポキシ）−５−メチルフェニルエステル
２−フルオロベンゼンスルホン酸の３−（３−ヨードプロポキシ）−５−メチルフェニルエステル
２−カルボメトキシベンゼンスルホン酸の３−（３−ヨードプロポキシ）−５−メチルフェニルエステル
ベンゼンスルホン酸の３−（２−ヨードエトキシ）−５−メチルフェニルエステル
２−クロロベンゼンスルホン酸の３−（２−ヨードエトキシ）−５−メチルフェニルエステル
２−フルオロベンゼンスルホン酸の３−（２−ヨードエトキシ）−５−メチルフェニルエステル
２−カルボメトキシベンゼンスルホン酸の３−（２−ヨードエトキシ）−５−メチルフェニルエステル
ベンゼンスルホン酸の３−（４−ヨードブトキシ）−５−メチルフェニルエステル
２−クロロベンゼンスルホン酸の３−（４−ヨードブトキシ）−５−メチルフェニル  エステル
２−フルオロベンゼンスルホン酸の３−（４−ヨードブトキシ）−５−メチルフェニルエステル
２−カルボメトキシベンゼンスルホン酸の３−（４−ヨードブトキシ）−５−メチルフェニルエステル
に加工した。
【００８２】
実施例４
４−アミノ−１−（３−（３−メチル−５−（２−クロロベンゼンスルホニルオキシ）フェノキシ）プロピル）−ピリジニウムイオダイド（ＨＣ＿０２３ｓ＿ＩＯＣ）の合成
【００８３】
【化１１】
2010531352.tif 000022
【００８４】
１０ｍｌの乾燥ジオキサン中に、０．５５ｇの（前記の実施例からの）「未加工のヨウ化物(raw iodide)」（７０％の純粋な物質を含有すると推定）と０．０８ｇ（０．８５ｍｍｏｌ）の４−アミノピリジンを混ぜたものを、２０時間、還流した。溶液を留去し、得られた油を、結晶になるまで、少量のエーテルで砕いた。固体沈澱をろ過し、ジオキサンとアセトニトリル（５：１）の混合物から、二度再結晶した。塩沈澱を、ろ過で取り、エステルで洗った。
真空乾燥することにより、０．３５ｇ（６５％）の白い塩を得た。
【００８５】
【数１】
2010531352.tif 000023
【００８６】
同様の技法を用いて、適当なヨウ化物および複素環式化合物、チオ尿素およびチオ尿素誘導体を加工して、次を得た。
４−アミノ−１−（３−（３−メチル−５−（ベンゼンスルホニルオキシ）フェノキシ）プロピル）−ピリジニウムイオダイド（ＨＣ＿０１６ｓ＿ＩＯＣ）
【００８７】
【化１２】
2010531352.tif 000024
【００８８】
【数２】
2010531352.tif 000025
【００８９】
２−アミノ−１−（３−（３−メチル−５−（ベンゼンスルホニルオキシ）フェノキシ）プロピル）−チアゾリウムイオダイド（ＨＣ＿０１７ｓ＿ＩＯＣ）
【００９０】
【化１３】
2010531352.tif 000026
【００９１】
【数３】
2010531352.tif 000027
【００９２】
３−（３−メチル−５−（ベンゼンスルホニルオキシ）フェノキシ）プロピル−イソチオウロニウムイオダイド（ＨＣ＿０１８ｓ＿ＩＯＣ）
【００９３】
【化１４】
2010531352.tif 000028
【００９４】
【数４】
2010531352.tif 000029
【００９５】
４−アミノ−１−（２−（３−メチル−５−（ベンゼンスルホニルオキシ）フェノキシ）エチル）−ピリジニウムイオダイド（ＨＣ＿０１９ｓ＿ＩＯＣ）
【００９６】
【化１５】
2010531352.tif 000030
【００９７】
【数５】
2010531352.tif 000031
【００９８】
２−（３−メチル−５−（ベンゼンスルホニルオキシ）フェノキシ）エチル−イソチオウロニウムイオダイド（ＨＣ＿０２０ｓ＿ＩＯＣ）
【００９９】
【化１６】
2010531352.tif 000032
【０１００】
【数６】
2010531352.tif 000033
【０１０１】
２−（３−メチル−５−（２−クロロベンゼンスルホニルオキシ）フェノキシ）エチル−イソチオウロニウムイオダイド（ＨＣ＿０２４ｓ＿ＩＯＣ）
【０１０２】
【化１７】
2010531352.tif 000034
【０１０３】
【数７】
2010531352.tif 000035
【０１０４】
３−（３−メチル−５−（２−クロロベンゼンスルホニルオキシ）フェノキシ）プロピル−イソチオウロニウムイオダイド（ＨＣ＿０２６ｓ＿ＩＯＣ）
【０１０５】
【化１８】
2010531352.tif 000036
【０１０６】
【数８】
2010531352.tif 000037
【０１０７】
４−アミノ−１−（２−（３−メチル−５−（２−クロロベンゼンスルホニルオキシ）フェノキシ）エチル）−ピリジニウムイオダイド（ＨＣ＿０２５ｓ＿ＩＯＣ）
【０１０８】
【化１９】
2010531352.tif 000038
【０１０９】
【数９】
2010531352.tif 000039
【０１１０】
同様の方法で、実施例１〜４に記載の技法によって、様々なアリールスルホニル塩化物および複素環式スルホニル塩化物から、化合物を合成した。合成した化合物の化学式、質量分析パラメーター、および算出したスコアリング関数を表２に示す。それら化合物は、ヨウ化物、臭化物、塩化物、または他の塩の形で得られる可能性がある。
【０１１１】
実施例５
化合物の合成
【０１１２】
【化２０】
2010531352.tif 000040
【０１１３】
１．４−クロロ−３−ニトロベンゼン−１−スルホニルクロライド
ｏ−ニトロクロロアニリン（１５ｇ）を３０ｍｌのクロロスルホン酸に攪拌しながら加え、１００°Ｃで２時間加熱した。引き続き、１１０°Ｃで２時間、さらに、１２７°Ｃで５時間加熱した。反応混合物を、室温まで冷却し、砕いた氷（１４０ｇ）に注いだ。沈澱をろ過し、ろ過ケーキを氷水で洗い、風乾し、１５ｇの４  クロロ−３−ニトロベンゼン−１  スルホニルクロライドを得た。
２．４−クロロ−Ｎ−メチル−３−ニトロ−Ｎ−フェニルベンゼンスルホンアミド
【０１１４】
【化２１】
2010531352.tif 000041
【０１１５】
４−クロロ−３−ニトロベンゼン−１−スルホニルクロライド（１０．６ｇ、０．０４１ｍｏｌ）を、トルエン（５０ｍｌ）に溶解し、次いで、トリエチルアミン（４．１４ｇ、０．０４１ｍｏｌ）を加えた。得られた溶液に、Ｎ−メチルアニリン（４．４ｇ、０．０４１ｍｏｌ）を攪拌しながら加えた。反応混合物を７０〜８０°Ｃで１時間加温した後、冷却した。冷した溶液を、３０ｍｌの水で２回洗い、真空下で濃縮した。残留物を、エタノールから再結晶化した。４−クロロ−Ｎ−メチル−３−ニトロ−Ｎ−フェニルベンゼン  スルホンアミドの収量は、９．４ｇ（６１％）であった。
３．Ｎ−メチル−４−（メチルアミノ）−３−ニトロ−Ｎ−フェニルベンゼンスルホンアミド
【０１１６】
【化２２】
2010531352.tif 000042
【０１１７】
４−クロロ−Ｎ−メチル−３−ニトロ−Ｎ−フェニルベンゾイルスルホンアミド（９．４ｇ、０．０２９ｍｏｌ）のエタノール溶液（５０ｍｌ）を、２５ｍｌの４０％メチルアミン水溶液と混ぜた。反応混合物を、７０°Ｃに熱し、この温度で１時間攪拌した。冷却、ろ過した後、ろ過ケーキをエタノールで洗い、６０°Ｃで乾燥した。Ｎ−メチル−４−（メチルアミノ）−３−ニトロ−Ｎ−フェニルベンゾイルスルホンアミドの収量は、９．０ｇ（９７％）であった。
４．３−アミノ−Ｎ−メチル−４−（メチルアミノ）−Ｎ−フェニルベンゼンスルホンアミド
【０１１８】
【化２３】
2010531352.tif 000043
【０１１９】
Ｎ−メチル−４−（メチルアミノ）−３−ニトロ−Ｎ−フェニルベンゾイルスルホンアミド（９ｇ、０．０２８ｍｏｌ）をイソプロパノール（９０ｍｌ）に溶解した。この溶液に、ヒドラジン水和物（１１ｍｌ）、活性炭（２ｇ）およびＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ（１０ｍｌのエタノール中に、０．５  ｇ）を加えた。反応混合物を、８時間煮沸した。炭をろ過して除き、ろ液を蒸発乾固した。３−アミノ−Ｎ−メチル−４−（メチルアミノ）−Ｎ−フェニルベンゼンスルホンアミドの収量は、８．１ｇ（９９％）であった。
５．３−クロロ−Ｎ−（５−（Ｎ−メチル−Ｎ−フェニルスルファモイル）−２−（メチルアミノ）フェニル）プロパンアミド
【０１２０】
【化２４】
2010531352.tif 000044
【０１２１】
氷上で冷やした（〜５°Ｃ）、３−アミノ−Ｎ−メチル−４−（メチルアミノ）−Ｎ−フェニルベンゼンスルホンアミド（５．４ｇ、０．０１８ｍｏｌ）およびトリエチルアミン（１．８１ｇ、０．０１８ｍｏｌ）のジメチルホルムアミド（１６ｍｌ）溶液に、クロロプロピオニルクロライド（２．３２ｇ、０．０１８ｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で５時間攪拌した。次いで、水（１４ｍｌ）とアセトニトリル（５ｍｌ）を加え、５時間後、生じた沈澱をろ過した。３−クロロ−Ｎ−（５−（Ｎ−メチル−Ｎ−フェニルスルファモイル）−２−（メチルアミノ）フェニル）プロパンアミドの収量は、３．１ｇ（４５％）であった。
６．４−アミノ−１−（３−（５−（Ｎ−メチル−Ｎ−フェニルスルファモイル）−２−（メチルアミノ）フェニルアミノ）−３−オキソプロピル）ピリジニウムクロライド
【０１２２】
【化２５】
2010531352.tif 000045
【０１２３】
３−クロロ−Ｎ−（５−（Ｎ−メチル−Ｎ−フェニルスルファモイル）−２−（メチルアミノ）フェニル）プロパンアミド（１ｇ、０．００２６ｍｏｌ）および４−アミノピリジニウム（０．７３ｇ、０．００７８ｍｏｌ）を、無水アセトン（５０ｍｌ）中で５０時間、還流した。固形残留物をろ過し、アセトニトリルとエタノールを１０：１で混合したものから、結晶化した。
４−アミノ−１−（３−（５−（Ｎ−メチル−Ｎ−フェニルスルファモイル）−２−（メチルアミノ）フェニルアミノ）−３−オキソプロピル）ピリジニウムクロライドの収量は、０．５４ｇ（４３％）であった。
７．４−アミノ−１−（２−（１−メチル−５−（Ｎ−メチル−Ｎ−フェニルスルファモイル）−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−２−イル）エチル）ピリジニウムクロライド
【０１２４】
【化２６】
2010531352.tif 000046
【０１２５】
アセトニトリル（８ｍｌ）に４−アミノ−１−（３−（５−（Ｎ−メチル−Ｎ−フェニルスルファモイル）−２−（メチルアミノ）フェニルアミノ）−３−オキソプロピル）ピリジニウムクロライド（０．２ｇ、０．０００４２ｍｏｌ）を入れた懸濁液に、塩化チオニル（０．２ｍｌ）を加えた。反応混合物を１０分間還流した後、室温で２４時間放置し、ジエチルエーテル（８ｍｌ）で希釈した。生じた沈澱を、ろ過して回収し、アセトニトリルと無水エタノールを１０：１で混合したものから、結晶化した。４−アミノ−１−（２−（１−メチル−５−（Ｎ−メチル−Ｎ−フェニルスルファモイル）−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−２−イル）エチル）ピリジニウムクロライドの収量は、０．０５５ｇ（２６％）であった。
【０１２６】
同様にして、実施例５に記載の技法によって、様々な化合物を合成した。それらの化学式、質量分析のパラメーター、および算出したスコアリング関数を表３に示す。化合物は、ヨウ化物、臭化物、塩化物、その他の塩の形で得られる可能性がある。
【０１２７】
実施例６
試験化合物のトロンビン活性に対する効果の検討
合成物質のトロンビン活性への効果を、これら化合物が存在する水性バッファー溶液および存在しない水性バッファー溶液中で、トロンビンの特異的低分子量基質の加水分解速度を測定することにより、検討した。そのような基質のひとつは、発色基質クロモザイム(Chromozim)ＴＨ（ＣＴＨ）：Ｎ−（ｐ−Ｔｏｓｙｌ）−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ｐＮＡ[Sonder SA, Fenton JW 2nd. Thrombin Specificity with Tripeptide Chromogenic Substrates: Comparison of Human and Bovine Thrombins with and without Fibrinogen Clotting Activities. Clin. Chem., 1986, 32(6):934-937]であった。多くの実験で用いられた他の基質は、蛍光基質ＢＯＣ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＡＭＣ（Ｓ）（式中、ＢＯＣは、ブトキシカルボニル残基を、ＡＭＣは、７−アミノ−４−アリールメチルクマリルを表す）[Kawabata S, Miura T, Morita T, Kato H, Fujikawa K, Ivanaga S, Takada K, Kimura T, Sakakibara S. Highly Sensitive peptide-4-methylcoumaryl-7-amide Substrates for Blood-Clotting Proteases and Trypsin. Eur. J. Biochem., 1988, 172(1): 17- 25] であった。
【０１２８】
１４０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＨＥＰＥＳおよび０．１％ポリエチレングリコール（Ｍｗ＝６，０００）を含むバッファー（ｐＨ８．０）を、一般的な９６ウェルプレートのウェルに入れた。基質（ウェルにおける最終濃度１００μＭ）、トロンビン（最終濃度１９０ｐＭ）、および異なる濃度（０．００２ｍＭ〜３．３ｍＭ）の試験化合物（提案されたトロンビン阻害剤）を加えた。発色基質を用いた場合、有色の反応産物（パラニトロアニリン）の蓄積を、分光光度Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  プレートリーダー（サーモマックス(Thermomax)、米国）上で、波長４０５ｎｍでの光学濃度の増加を測定することにより追跡した。蛍光基質の場合、トロンビンは、遊離形態で著しく蛍光を発するアミノメチルクマリンを基質から切り離す（励起波長３８０ｎｍおよび放出波長４４０ｎｍ）。反応動態は、蛍光分析Ｔｉｔｅｒｔｅｋ  Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎプレートリーダー（ＬａｂＳｙｓｔｅｍ，  フィンランド）で記録された。
【０１２９】
初期反応速度は、反応速度曲線の直線区間（記録開始から１０分〜１５分）の傾きの正接として測定した。阻害剤非存在下の反応速度を１００％とした。２つの独立した測定の算術平均値を結果として使用した。
【０１３０】
図１は、様々な濃度の化合物ＨＣ−０１９ｓ−ＩＯＣ（表４を参照のこと）の存在下での、トロンビンによる発色基質クロモザイムＴＨ（ＣＴＨ）の加水分解についての典型的な反応速度曲線の例を示す。阻害剤非存在下での加水分解反応速度曲線をコントロールとして用いた。
【０１３１】
図２は、ＣＴＨ加水分解阻害の程度と、非常に効果的なトロンビン阻害剤である、新規に合成された他の化合物（ＨＣ−０１８ｓ−ＩＯＣ）の系内での濃度との関係を示す（表４を参照のこと）。
新規に合成された多数の化合物がトロンビン活性に及ぼす阻害効果の程度に関するデータを、表４に示す。
このように、得られた結果は、新規に合成した化合物のすべてが、直接トロンビン阻害剤であることを示している。阻害の程度は、個々の化合物によって異なるが、新規化合物の大部分は、非常に効果的なトロンビン阻害剤であり、トロンビンに依存する血栓塞栓性症状を制御するのに用いる医薬組成物のベースとして使用するにも、研究用に使用するにも適している。
【０１３２】
【表１−１】
2010531352.tif 000047
【０１３３】
【表１−２】
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【０１３４】
【表１−３】
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【０１３５】
【表１−４】
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【０１３６】
【表１−５】
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【０１３７】
【表１−６】
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【０１３８】
【表１−７】
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【０１３９】
【表１−８】
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【０１４０】
【表１−９】
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【０１４１】
【表１−１０】
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【０１４２】
【表１−１１】
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【０１４３】
【表１−１２】
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【０１４４】
【表１−１３】
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【０１４５】
【表１−１４】
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【０１４６】
【表１−１５】
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【０１４７】
【表２−１】
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【０１４８】
【表２−２】
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【０１４９】
【表２−３】
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【０１５０】
【表２−４】
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【０１５１】
【表２−５】
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【０１５２】
【表３−１】
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【０１５３】
【表３−２】
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【０１５４】
【表４−１】
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【０１５５】
【表４−２】
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【０１５６】
【表４−３】
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【０１５７】
【表４−４】
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【０１５８】
【表４−５】
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