【手続補正書】
【提出日】平成24年6月1日(2012.6.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
トリインフルエンザウイルス（ＡＩＶ）に結合し、ウイルスの増殖を阻害する融合ペプチドを保有する、単離され、精製された組換えファージ。
【請求項２】
融合ペプチドがアミノ酸配列ＮＤＦＲＳＫＴ（配列番号２）又はそれと少なくとも６０％のホモロジーを有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の組換えファージ。
【請求項３】
請求項１又は２に記載した融合ペプチドに由来するアミノ酸配列を含む合成ペプチド。
【請求項４】
ウイルスに結合することによってＡＩＶの増殖を阻害する、請求項３に記載の合成ペプチド。
【請求項５】
前記ペプチドが配列ＣＮＤＦＲＳＫＴＣ（配列番号１）を有する、請求項３に記載の合成ペプチド。
【請求項６】
前記ペプチドが１００μＭ未満のＩＣ５０値を有する、請求項３に記載の合成ペプチド。
【請求項７】
請求項１及び２のいずれか一項に記載の組換えファージを含む薬剤組成物。
【請求項８】
請求項３から６までのいずれか一項に記載の合成ペプチドを含む薬剤組成物。
【請求項９】
請求項１及び２のいずれか一項に記載の組換えファージを含む診断用試薬。
【請求項１０】
請求項３から６までのいずれか一項に記載の合成ペプチドを含む診断用試薬。
【請求項１１】
請求項１及び２のいずれか一項に記載の組換えファージを含むワクチン。
【請求項１２】
請求項３から６までのいずれか一項に記載の合成ペプチドを含むワクチン。
【請求項１３】
トリインフルエンザウイルスＨ９Ｎ２表面糖タンパク質ＨＡ及びＮＡに結合する、請求項３から６までのいずれか一項に記載の合成ペプチド。
【請求項１４】
トリインフルエンザの治療又は診断の方法における使用のための、請求項１または２に記載の組換えファージあるいは請求項３から６までのいずれか一項に記載の合成ペプチド。
【請求項１５】
トリインフルエンザの治療用薬剤の製造における、請求項１または２に記載の組換えファージあるいは請求項３から６までのいずれか一項に記載の合成ペプチドの使用。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００１】
本発明は、トリインフルエンザウイルス（ＡＩＶ）サブタイプＨ９Ｎ２に対して作用する、新規な抗ウイルスペプチド及び融合ファージに関する。より詳しくは、融合ファージは、ＡＩＶ  Ｈ９Ｎ２に結合するその表面タンパク質Ｐ３上に配列ＣＮＤＦＲＳＫＴＣ（配列番号１）をディスプレイし、ＩＣ５０値は１０１３ｐｆｕ／１００μｌ未満である。直鎖状又は環状の立体配座のいずれかにおけるアミノ酸配列ＣＮＤＦＲＳＫＴＣ（配列番号１）を有する合成ペプチドは、約１００μＭ未満のＩＣ５０値でＡＩＶ  Ｈ９Ｎ２の増殖を阻害した。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
新規な抗ウイルス分子を同定するために、ジスルフィド拘束ランダムヘプタペプチド配列をディスプレイする組換えファージの集団を、ウイルスに対してスクリーニングした。次いで、融合ファージの表面上にディスプレイされたペプチドを、化学的に合成した。この単離されたペプチドはＮＤＦＲＳＫＴ（配列番号２）の配列を有し、ＩＣ５０値は１００μＭ未満である。インフルエンザウイルスＡ  Ｈ９Ｎ２に対する組換えファージの特異性は、抗体−ファージ競合アッセイによって証明され、このアッセイにおいてファージは、ウイルス表面タンパク質上の結合部位に対してポリクローナル抗体と競合することが可能であった。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
本発明において、単離された配列の１つをベースにした合成ペプチドは、直鎖状又は環状の立体配置のいずれかにおいて［例えば合成ペプチドＣＮＤＦＲＳＫＴＣ（配列番号１）など］、ＮＤＶの増殖を阻害することができ、それによって疾患及び感染の伝播を防ぐ。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
高親和性の結合ファージを選択するために、選択のストリンジェンシーを、（ｉ）室温（２８℃）でバイオパニングを行い、（ｉｉ）速度に対して速いリガンドを選択するために結合の時間を１時間に短縮し（Ｋ０）、（ｉｉｉ）ウエルを徹底的に洗浄して（１０回）低親和性の結合ファージを除去し、（ｉｖ）バイオパニングを４ラウンド繰り返して高親和性結合クローンを濃縮することによって増大させた。第４ラウンドのパニングから分析されたファージの４７％は、融合ペプチド配列ＮＤＦＲＳＫＴ（配列番号２）を保有しており、１０．５％がＱＨＳＴＫＷＦ（配列番号３）モチーフを含んでおり、その後に各５％のＬＰＹＡＡＫＨ（配列番号４）及びＩＬＧＤＫＶＧ（配列番号５）、並びに他の非関連の配列が続く（表１）。ストレプトアビジン標的を、クローン全てにおいてＨＰＱ配列のコンセンサスモチーフを与える陽性対照として用いたが、これはＤｅｖｌｉｎら（１９９０年）によって報告されたものと良好に一致した。陰性対照として用いられたウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）では、認識できるコンセンサス配列は観察されなかった。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２４】
本明細書で用いられる「融合ペプチド」の語は、一般的にバクテリオファージによってコードされ、ファージのコートタンパク質に物理的に連結しているアミノ酸配列を意味する。特許請求の融合ペプチドは、アミノ酸配列ＮＤＦＲＳＫＴ（配列番号２）：（ｉ）特許請求のアミノ酸配列よりも短く、又は長いアミノ酸配列、（ｉｉ）アミノ酸配列における変形、とりわけ以下に記載するのと同じカテゴリー内のアミノ酸の置換、（ｉｉｉ）特許請求の融合ペプチドのアミノ酸配列と少なくとも６０％のホモロジーを共有するアミノ酸配列、及び（ｉｖ）直鎖状又は限定立体配置のいずれかを含んでいるが、これらに限定されない。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
ＡＩＶは２種の表面糖タンパク質ＨＡ及びＮＡを所有し、これらはウイルスの脂質二重層膜から突出している。これらの糖タンパク質はそれぞれ宿主細胞内及び宿主細胞外へのウイルスの侵入及びウイルスの放出に不可欠である。配列ＮＤＦＲＳＫＴ（配列番号２）を保有するファージは溶液中のビリオンに結合するので、これらの配列は、ある程度、完全なビリオンと相互作用する宿主細胞の受容体上の領域に類似することがある。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２６】
ファージはＡＩＶ上の結合部位に対して抗体と競合する
表面糖タンパク質ＨＡ及びＮＡは、宿主における抗体の生成を誘発する２つの重要なタンパク質である。ファージ−抗体競合アッセイにおいて、ファージはミモトープの１つに結合することができ、したがってビリオンに対して産生された抗体の結合を阻害することができた。図１は、バイオパニング実験から選択された、ペプチドＮＤＦＲＳＫＴ（配列番号２）をディスプレイする組換えファージが、ＡＩＶ上の結合部位に対して抗体と競合できたことを示している。抗体の存在下、ウイルスでコーティングされたウエルに結合したファージの数は、ウイルス上の同じ結合部位に対するこれら２つの分子間の競合の結果として劇的に低下した。したがって、組換えファージ分子は、ＡＩＶ感染に対する潜在的な診断薬として働き得る。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３８】
【表１】
2011522561.tif 000001
【表２】
2011522561.tif 000002