(57)【要約】　　　（修正有）【解決手段】アスペルギルス・オリゼー由来の特定のアミノ酸配列からなる蛋白質、あるいは該タンパク質の１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつプロリンイミノペプチダーゼ活性を有する蛋白質。該蛋白質をコードするプロリンイミノペプチダーゼ遺伝子。【効果】本発明により、新規なプロリンイミノペプチダーゼ、プロリンイミノペプチダーゼ遺伝子、組み換えベクター及びプロリンイミノペプチダーゼの製造法が提供された。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）の蛋白質。
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつプロリンイミノペプチダーゼ活性を有する蛋白質
【請求項２】
配列番号２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列相同性を示すアミノ酸配列からなる蛋白質又はその部分断片であり、かつプロリンイミノペプチダーゼ活性を有する蛋白質。
【請求項３】
以下の（ａ）又は（ｂ）の蛋白質をコードするプロリンイミノペプチダーゼ遺伝子。
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつプロリンイミノペプチダーゼ活性を有する蛋白質
【請求項４】
請求項２に記載の蛋白質をコードするプロリンイミノペプチダーゼ遺伝子。
【請求項５】
以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡからなるプロリンイミノペプチダーゼ遺伝子。
（ａ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列鎖からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつプロリンイミノペプチダーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
【請求項６】
配列番号１で表される塩基配列と７５％以上の配列相同性を示し、かつプロリンイミノペプチダーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡからなるプロリンイミノペプチダーゼ遺伝子。
【請求項７】
請求項３、４、５又は６に記載の遺伝子を含有する組み換えベクター。
【請求項８】
請求項７記載の組み換えベクターを含む形質転換体又は形質導入体。
【請求項９】
請求項８記載の形質転換体又は形質導入体を培養し、培養物からプロリンイミノペプチダーゼを採取することを特徴とするプロリンイミノペプチダーゼの製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、プロリンイミノペプチダーゼ、プロリンイミノペプチダーゼ遺伝子、組み換えベクター及びプロリンイミノペプチダーゼの製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
プロリンイミノペプチダーゼ（プロリルアミノペプチダーゼ、ＥＣ３．４．１１．５３、本明細書ではプロリンイミノペプチダーゼという）は、Ｎ末端にプロリン残基を有するペプチドを加水分解してプロリンを遊離させる酵素である。
これまでに多くのプロリンイミノペプチダーゼの酵素学的性質が決定され、解析されてきた。例えば、バクテリアでは、Ｅ．　ｃｏｌｉ〔Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２３４，　１７４０−１７４４（１９５９）〕、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｏａｇｕｌａｎｓ〔Ｊ．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．　１７４，　７９１９−７９２５（１９９２）〕，Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ〔Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　９，　１２０３−１２１１（１９９３）〕，　　Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ〔Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　１４０，　５２４−５３５　（１９９４）〕，　Ａｅｒｏｍｏｎａｓ　ｓｏｂｒｉａ〔Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．　１１６，８１８−８２５（１９９４）〕由来のもの等が知られている。またＢａｃｉｌｌｕｓ　ｃｏａｇｕｌａｎｓ，　Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ，　Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ　，　Ａｅｒｏｍｏｎａｓ　ｓｏｂｒｉａについては、遺伝子配列についても報告されている。
【０００３】
麹カビ（黄麹菌）であるアスペルギルス・オリゼー及びアスペルギルス・ソーヤは、味噌・醤油・日本酒等の日本における醸造食品の製造に古くから使われてきており、高い酵素生産性と、長年の利用による安全性に対する信頼の高さから、産業上特に重要な微生物である。これら黄麹菌を含むアスペルギルス属については、アスペルギルス・ニガー及びアスペルギルス・ニドランス由来のプロリンイミノペプチダーゼのみが遺伝子データベースであるＧｅｎｂａｎｋに遺伝子配列情報の報告がある（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ；ＡＪ３１５５６５，　ＡＪ３１５５６６）。またアスペルギルス・ニガーについては蛋白質の配列の報告（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ；ＣＡＣ４０６４７）もあるが、精製酵素及び該遺伝子産物のプロリンイミノペプチダーゼ活性についての報告はなされていない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
醤油製造の際に、原料の分解は、麹菌により生産されるプロテアーゼによって先ずポリペプチドに分解される。更にロイシンアミノペプチダーゼ（以下、ＬＡＰと略称する。）によりアミノ末端から、酸性カルボキシペプチダーゼによりカルボキシル末端から分解され、アミノ酸及びジペプチドを主体とした低分子ペプチドに分解される。しかしながらＬＡＰは、ペプチド中にプロリンが存在する場合、プロリンのイミノ基側にアミノ酸が一つ結合したＸａａ−Ｐｒｏ−ｐｅｐｔｉｄｅの状態で作用が停止する。そのため醤油諸味中でＸａａ−Ｐｒｏ−ｐｅｐｔｉｄｅからのＸａａ及びそれに続くプロリンの遊離を行う酵素が強く望まれている。
【０００５】
アミノペプチダーゼＰは、ＬＡＰが作用しないＸａａ−Ｐｒｏ−ｐｅｐｔｉｄｅからＮ末端のＸａａを遊離させる。ここにプロリンイミノペプチダーゼが作用することによりＮ末端のプロリンが遊離され、再びＬＡＰの基質となりうる。プロリンは、呈味性を有するアミノ酸であるため、呈味の改変が可能となる。Ｎ末にプロリンを有するペプチドは、苦味と関連があることが判っているので、プロリンイミノペプチダーゼの作用によってプロリンが遊離することにより、苦味の低減効果が期待できる。従って、麹菌からプロリンイミノペプチダーゼが見い出され、その作用を強化することができれば醤油及び酵素分解調味料の製造においてアミノ化率の向上と呈味性の改善が期待できる。そのため、酵素の大量調製が比較的容易な微生物からプロリンイミノペプチダーゼを得ることが待ち望まれており、麹菌のような安全性の高い微生物より単離されることは更に強く望まれている。
これ故、本発明は、醤油及び酵素分解調味料中に存在するＰｒｏ−ｐｅｐｔｉｄｅを分解することができる新規プロリンイミノペプチダーゼ、該酵素をコードする新規遺伝子、該遺伝子を含む組み換えベクター、該ベクターによって形質転換された形質転換体及び該形質転換体を用いたプロリンイミノペプチダーゼの製造法を提供することを目的とするものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
そこで本発明者等は、上記課題を解決するため鋭意研究を重ねた結果、黄麹菌より新規プロリンイミノペプチダーゼ遺伝子をクローニングすることに成功し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、
１．以下の（ａ）又は（ｂ）の蛋白質。
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつプロリンイミノペプチダーゼ活性を有する蛋白質
２．配列番号２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列相同性を示すアミノ酸配列からなる蛋白質又はその部分断片であり、かつプロリンイミノペプチダーゼ活性を有する蛋白質。
３．以下の（ａ）又は（ｂ）の蛋白質をコードするプロリンイミノペプチダーゼ遺伝子。
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつプロリンイミノペプチダーゼ活性を有する蛋白質
４．請求項２に記載の蛋白質をコードするプロリンイミノペプチダーゼ遺伝子。
５．以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡからなるプロリンイミノペプチダーゼ遺伝子。
（ａ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列鎖からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつプロリンイミノペプチダーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
６．配列番号１で表される塩基配列と７５％以上の配列相同性を示し、かつプロリンイミノペプチダーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡからなるプロリンイミノペプチダーゼ遺伝子。
７．請求項３、４、５又は６に記載の遺伝子を含有する組み換えベクター。
８．請求項７記載の組み換えベクターを含む形質転換体又は形質導入体。
９．請求項８記載の形質転換体又は形質導入体を培養し、培養物からプロリンイミノペプチダーゼを採取することを特徴とするプロリンイミノペプチダーゼの製造法。
である。
【０００７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
１．本発明のプロリンイミノペプチダーゼ
本発明のプロリンイミノペプチダーゼは、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質である。該酵素は、例えば、アスペルギルス・ソーヤあるいはアスペルギルス・オリゼー等の黄麹菌の培養物から精製することができる。また、該酵素は、上記黄麹菌等からクローニングしたプロリンイミノペプチダーゼ遺伝子を適当な宿主−ベクター系で発現させることにより得ることができる。
本発明のプロリンイミノペプチダーゼは、該酵素活性を有する限り、配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されていてもよい。更に、プロリンイミノペプチダーゼ活性を有する限り、配列番号２で表されるアミノ酸配列全長と８０％以上、望ましくは８５％以上の配列相同性を示すアミノ酸配列からなる蛋白質又はその部分断片であってもよい。
２つのアミノ酸配列又は塩基配列における配列相同性を決定するために、配列は比較に最適な状態に前処理される。例えば、一方の配列にギャップを入れることにより、他方の配列とのアラインメントの最適化を行う。その後、各部位におけるアミノ酸残基又は塩基が比較される。第一の配列における、ある部位に、第二の配列の相当する部位と同じアミノ酸残基又は塩基が存在する場合、それらの配列は、その部位において同一である。２つの配列における配列相同性は、配列間での同一である部位数の全部位（全アミノ酸又は全塩基）数に対する百分率で示される。
【０００８】
上記の原理に従い、２つのアミノ酸配列又は塩基配列における配列相同性は、Ｋａｒｌｉｎ及び　Ａｌｔｓｃｈｕｌのアルゴリズム（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　８７：２２６４−２２６８，　１９９０及びＰｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　９０：５８７３−５８７７，　１９９３）により決定される。このようなアルゴリズムを用いたＢＬＡＳＴプログラムがＡｌｔｓｃｈｕｌ等によって開発された（Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．　２１５：４０３−４１０，　１９９０）。更に、Ｇａｐｐｅｄ　ＢＬＡＳＴは、ＢＬＡＳＴより感度良く配列相同性を決定するプログラムである（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　２５：３３８９−３４０２，　１９９７）。上記のプログラムは、主に与えられた配列に対し、高い配列相同性を示す配列をデータベース中から検索するために用いられる。これらは、例えば、米国Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのインターネット上のウェブサイトにおいて利用可能である。
配列間の配列相同性として、本明細書では、Ｔａｔｉａｎａ　Ａ．　Ｔａｔｕｓｏｖａ等によって開発されたＢＬＡＳＴ　２　Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓソフトウェア（ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　Ｌｅｔｔ．，１７４：２４７−２５０，１９９９）を用いて決定した値を用いる。このソフトウェアは、米国Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのインターネット上のウェブサイトにおいて利用可能であり、入手も可能である。用いるプログラム及びパラメーターは、以下の通りである。アミノ酸配列の場合、ｂｌａｓｔｐプログラムを用いパラメーターとしては、Ｏｐｅｎ　ｇａｐ：　１１　ａｎｄ　ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ　ｇａｐ：１　ｐｅｎａｌｔｉｅｓ，　ｇａｐ　ｘ＿ｄｒｏｐｏｆｆ：　５０，　ｅｘｐｅｃｔ：　１０，　ｗｏｒｄ　ｓｉｚｅ：　３，　Ｆｉｌｔｅｒ：　ＯＮを用いる。塩基配列の場合、ｂｌａｓｔｎプログラムを用いパラメーターとしては、Ｒｅｗａｒｄ　ｆｏｒ　ａ　ｍａｔｃｈ：　１，　Ｐｅｎａｌｔｙ　ｆｏｒ　ａ　ｍｉｓｍａｔｃｈ：　−２，　Ｓｔｒａｎｄ　ｏｐｔｉｏｎ：　Ｂｏｔｈ　ｓｔｒａｎｄｓ，　Ｏｐｅｎ　ｇａｐ：　５　ａｎｄ　ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ　ｇａｐ：２　　ｐｅｎａｌｔｉｅｓ，　　ｇａｐ　ｘ＿ｄｒｏｐｏｆｆ：　５０，　ｅｘｐｅｃｔ：　１０，　ｗｏｒｄ　ｓｉｚｅ：　１１，　Ｆｉｌｔｅｒ：　ＯＮを用いる。いずれのパラメーターも、ウェブサイト上でデフォルト値として用いられているものである。
【０００９】
ただし、上記ＢＬＡＳＴソフトウェアで有意な配列相同性を示す配列が見つからない場合には、更に高感度なＦＡＳＴＡソフトウェア（Ｗ．Ｒ．　Ｐｅａｒｓｏｎ　ａｎｄ　Ｄ．Ｊ．　Ｌｉｐｍａｎ，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．，　８５：２４４４−２４４８，　１９８８）を用いて配列相同性を示す配列をデータベースから検索することもできる。ＦＡＳＴＡソフトウェアは、例えば、ゲノムネットのウェブサイトで利用できる。この場合も、パラメーターは、デフォルト値を用いる。例えば、塩基配列についての検索を行う場合は、データベースにｎｒ−ｎｔを用い、ｋｔｕｐ値は６を用いる。
ただし、いずれの場合も、全体の３０％以上、５０％以上、又は７０％以上のオーバーラップを示さない場合は、機能的に相関しているとは必ずしも推定されないため、２つの配列間の配列相同性を示す値としては用いない。
【００１０】
２．プロリンイミノペプチダーゼ遺伝子のクローニング
本発明のプロリンイミノペプチダーゼ遺伝子は、例えば、アスペルギルス・ソーヤあるいはアスペルギルス・オリゼー等の黄麹菌、その他の糸状菌、又はその他の真菌類から得ることができる。更に具体的には、例えば、アスペルギルス・オリゼーＲＩＢ４０株（Ａｓｐｅｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ　ｖａｒ．　ｖｉｒｉｄｉｓ　Ｍｕｒａｋａｍｉ，ａｎａｍｏｒｐｈ；ＡＴＣＣ４２１４９）が挙げられる。これらの菌体を、プロリンイミノペプチダーゼを生産する条件の培地で培養したものから、常法により全ＲＮＡを回収する。培地としては、例えば、ふすま培地（２．７８ｇの小麦ふすまに２．２２ｇの脱イオン水を加え、１２１℃・５０分オートクレーブしたもの）を用いることができる。上記培地で適当な時間、例えば、３０時間培養したのち、液体窒素を満たした乳鉢中に適量（例えば１ｇ）を移し、乳棒を用いて粉砕し、Ｃａｔｈａｌａ等の方法〔ＤＮＡ，　２（４）：３２９−３３５，　１９８３〕で全ＲＮＡを調製する。
このようにして得られた全ＲＮＡを鋳型として、ＲＴ−ＰＣＲを行う。プライマーとしては、本発明のプロリンイミノペプチダーゼ遺伝子を増幅することのできる組み合わせであれば如何なる組み合わせのものを用いてもよく、例えば、配列番号３及び配列番号４の配列のオリゴヌクレオチドを用いることができる。ＲＴ−ＰＣＲは、市販のキット、例えば、ＲＮＡ　ＬＡ−ＰＣＲ　Ｋｉｔ（宝酒造製）を用いて常法により行うことができる。得られた本発明のプロリンイミノペプチダーゼ遺伝子を含むＤＮＡは、例えば、常法によりプラスミドに組み込むことができる。このようにして得られたＤＮＡの塩基配列は、サンガー法により、市販の試薬及びＤＮＡシークエンサーを用いて決定することができる。このようにして得られる本発明のプロリンイミノペプチダーゼ遺伝子を含むＤＮＡ及びそれによりコードされるプロリンイミノペプチダーゼ遺伝子の例を夫々配列番号１及び配列番号２に例示する。
【００１１】
本発明のプロリンイミノペプチダーゼ遺伝子は、上記のもののほか、プロリンイミノペプチダーゼ活性を有する限り、配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含む蛋白質をコードしているものであってもよい。このような遺伝子は、後述するハイブリダイゼーションによる選択のほか、種々の公知の変異導入方法によって得ることもできる。
【００１２】
本発明のプロリンイミノペプチダーゼ遺伝子は、以下のように、ハイブリダイゼーションによる選択法を用いて得ることもできる。遺伝子源としては、例えば、アスペルギルス・ソーヤあるいはアスペルギルス・オリゼー等黄麹菌が挙げられる。これらの生物から、常法によりＲＮＡ又はゲノムＤＮＡを調製し、プラスミド又はバクテリオファージに組み込み、ライブラリーを調製する。次いで、プローブとして用いる核酸を検出法に応じた方法で標識する。プローブとして用いる核酸は、充分な特異性を得られる長さであればよく、例えば、配列番号１に記載の配列の少なくとも１００塩基以上、望ましくは２００塩基以上、最も望ましくは４５０塩基以上の部分又は全体を含むものが挙げられる。次いで、標識したプローブにストリンジェントな条件でハイブリダイズするクローンを上記ライブラリーから選択する。ハイブリダイゼーションは、プラスミドライブラリーならコロニーハイブリダイゼーションによって、ファージライブラリーならプラークハイブリダイゼーションによって行うことができる。ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドのシグナルが非特異的なハイブリッドのシグナルと明確に識別される条件であり、使用するハイブリダイゼーションの系と、プローブの種類、配列及び長さによって異なる。そのような条件は、ハイブリダイゼーションの温度を変えること、洗浄の温度及び塩濃度を変えることにより決定可能である。例えば、非特異的なハイブリッドのシグナルまで強く検出されてしまう場合には、ハイブリダイゼーション及び洗浄の温度を上げると共に、必要により洗浄の塩濃度を下げることにより特異性を上げることができる。また、特異的なハイブリッドのシグナルも検出されない場合には、ハイブリダイゼーション及び洗浄の温度を下げると共に、必要により洗浄の塩濃度を上げることにより、ハイブリッドを安定化させることができる。このような最適化は、本技術分野の研究者が容易に行いうるものである。
【００１３】
ストリンジェントな条件の具体例としては、例えば、ハイブリダイゼーションは、５×ＳＳＣ、１．０　％（Ｗ／Ｖ）核酸ハイブリダイゼーション用ブロッキング試薬（ベーリンガ・マンハイム社製）、０．１　％（Ｗ／Ｖ）　Ｎ−ラウロイルサルコシン、０．０２　％（Ｗ／Ｖ）ＳＤＳを用い一晩（８−１６時間程度）で行い、洗いは、０．５×ＳＳＣ、０．１％（Ｗ／Ｖ）ＳＤＳ、好ましくは０．１×ＳＳＣ、０．１％（Ｗ／Ｖ）ＳＤＳを用い、１５分間、２回行う。ハイブリダイゼーションと洗いの温度は、５７℃以上、好ましくは６２℃以上、最も好ましくは６７℃以上である。
また、配列番号１に記載の塩基配列全長と７５％以上、望ましくは８０％以上、最も望ましくは８５％以上の配列相同性を示すような塩基配列は、本発明のプロリンイミノペプチダーゼと実質的に同等の活性を有する蛋白質をコードしていると考えられる。
上記のような塩基配列の配列相同性あるいはコードするアミノ酸配列の配列相同性を示すようなＤＮＡは、上記のようにハイブリダイゼーションを指標に得ることもできるが、ゲノム塩基配列解析等によって得られた機能未知のＤＮＡ群あるいは公共データベースのなかから、例えば、前述のＢＬＡＳＴソフトウェアを用いた検索により発見することも容易である。このような検索は、本技術分野の研究者が通常用いている方法である。
このようにして得られたＤＮＡがプロリンイミノペプチダーゼ活性を有する蛋白質をコードしていることは、後述のように、適当なベクターに組み込み、適当な宿主を形質転換し、形質転換体を培養してプロリンイミノペプチダーゼ活性を測定することにより確認することができる。
【００１４】
３．組み換えベクターの作製
本発明の組み換えベクターは、本発明のプロリンイミノペプチダーゼ遺伝子を適当なベクター上に連結することにより得ることができる。ベクターとしては、形質転換あるいは形質導入する宿主中でプロリンイミノペプチダーゼを生産させうるものであれば如何なるものでも用いることができる。例えば、プラスミド、コスミド、バクテリオファージ、ウイルス、染色体組み込み型、人工染色体等のベクターを用いることができる。
上記ベクターには、形質転換あるいは形質導入された細胞を選択することを可能にするためのマーカー遺伝子が含まれていてもよい。マーカー遺伝子としては、例えば、ＵＲＡ３、ｎｉａＤのような、宿主の栄養要求性を相補する遺伝子又はアンピシリン、カナマイシン若しくはオリゴマイシン等の薬剤に対する抵抗遺伝子等が挙げられる。また、組み換えベクターは、宿主細胞中で本発明の遺伝子を発現することのできるプロモーター又はその他の制御配列（例えば、エンハンサー配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列等）を含むことが望ましい。プロモーターとしては、具体的には、例えば、ＧＡＬ１プロモーター、ａｍｙＢプロモーター、ｌａｃプロモーター等が挙げられる。また、精製のためのタグをつけることもできる。例えば、プロリンイミノペプチダーゼ遺伝子の下流に適宜リンカー配列を接続し、ヒスチジンをコードする塩基配列を６コドン以上接続することにより、ニッケルカラムを用いた精製を可能にすることができる。
【００１５】
４．形質転換体又は形質導入体の取得
本発明の形質転換体又は形質導入体は、宿主を、本発明の組み換えベクターで形質転換又は形質導入することにより得られる。宿主としては、本発明のプロリンイミノペプチダーゼを生産することができるものであれば特に限定されず、例えば、サッカロミセス・セルビシエ、チゴサッカロミセス・ルキシー等の酵母、アスペルギルス・ソーヤ、アスペルギルス・オリゼー、アスペルギルス・ニガー等の糸状菌、エシェリシア・コリ、バチルス・ズブチルス等の細菌であってもよい。形質転換は、宿主に応じて公知の方法で行うことができる。酵母の場合は、例えば、酢酸リチウムを用いる、Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ．，　５，　２５５−２６９（１９９５）の方法等を用いることができる。糸状菌の場合は、例えば、プロトプラスト化した後ポリエチレングリコール及び塩化カルシウムを用いる、Ｍｏｌ．　Ｇｅｎ．　Ｇｅｎｅｔ．，　２１８，　９９−１０４（１９８９）の方法を用いることができる。細菌を用いる場合は、例えば、エレクトロポレーションによる、Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．，　１９４，　１８２−１８７（１９９０）の方法等を用いることができる。
また形質導入は、例えば、エシェリシア・コリの場合、ビー・ホーン（Ｂ．Ｈｏｈｎ）の方法〔メソズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、第６８巻、第２９９−３０９頁（１９７９年）〕によって行なうことができる。
【００１６】
５．プロリンイミノペプチダーゼの製造
本発明のプロリンイミノペプチダーゼの製造法は、本発明の形質転換体又は形質導入体を培養し、得られる培養物からプロリンイミノペプチダーゼを採取することからなる。培地及び培養方法は、宿主の種類及び組え換えベクター中の発現制御配列によって適当なものを選択すればよい。例えば、宿主がサッカロミセス・セルビシエであり、発現制御配列がＧＡＬ１プロモーターである場合、例えば、ラフィノースを炭素源とする液体最少培地で前培養した菌体を、ガラクトース及びラフィノースを炭素源とする液体最少培地に希釈・接種し、培養することにより、本発明のプロリンイミノペプチダーゼを生産させることができる。また、例えば、宿主がアスペルギルス・ソーヤであり、発現制御配列がａｍｙＢプロモーターである場合、例えば、マルトースを炭素源とする液体最少培地で培養することにより、本発明のプロリンイミノペプチダーゼを生産させることができる。
【００１７】
また、例えば、宿主が大腸菌であり、発現制御配列がｌａｃプロモーターである場合、ＩＰＴＧを含有する液体培地で培養することにより本発明のプロリンイミノペプチダーゼを生産させることができる。本発明のプロリンイミノペプチダーゼが菌体内又は菌体表面に生産された場合は、菌体を培地から分離し、その菌体を適当に処理することにより本発明のプロリンイミノペプチダーゼを得ることができる。例えば、サッカロミセス・セルビシエの菌体表面に生産された場合、菌体そのものを酵素剤として用いることもでき、破砕した後、Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００，　Ｔｗｅｅｎ−２０，　Ｎｏｎｉｄｅｔ　Ｐ−４０等の非イオン性の界面活性剤を低濃度で作用させ、遠心分離した上清に本発明のプロリンイミノペプチダーゼを回収することができる。培養液中に本発明のプロリンイミノペプチダーゼが生産された場合は、遠心分離・ろ過等により菌体を除去することにより本発明のプロリンイミノペプチダーゼを得ることができる。何れの場合も、硫安分画、各種クロマトグラフィー、アルコール沈殿、限外ろ過等を用いた常法により、本発明のプロリンイミノペプチダーゼを更に純度の高いものとして得ることもできる。
【００１８】
［プロリンイミノペプチダーゼ活性測定法］
本発明のプロリンイミノペプチダーゼの活性は、ｐｒｏｌｉｎｅ−ｐ−ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｄｅを基質とし、酵素作用によって遊離するｐ−ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｎｅを用いて測定できる。
基質溶液：　Ｐｒｏ−ｐ−ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｄ　（シグマ）を終濃度２０ｍＭとなるように２０　ｍＭ　　　　トリス緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解させた溶液
反応停止液：氷酢酸
酵素溶液１０μｌに２０　ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）　３９０μｌを加えて、３７℃、５分間プレインキュベートした後、基質溶液を１００μｌ加えて、３７℃で１０分間反応させ、５００μｌの反応停止液を加えて、酵素反応を停止させた後、４０５ｎｍの吸光度を測定する。上記の条件下で１分間あたり１μモルのｐ−ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｎｅを生成する酵素量を１単位（Ｕ）とする。
【００１９】
【実施例】
以下に実施例を示し、本発明をより具体的に説明する。
実施例
アスペルギルス・オリゼーのプロリンイミノペプチダーゼ遺伝子のクローニング
アスペルギルス・オリゼーＲＩＢ４０株（Ａｓｐｅｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ　ｖａｒ．　ｖｉｒｉｄｉｓ　Ｍｕｒａｋａｍｉ，ａｎａｍｏｒｐｈ；ＡＴＣＣ４２１４９）の分生子約１００，０００個を１５０ｍｌ容の三角フラスコに入った５ｇのふすま培地（前述）に接種し、３０℃で、３０時間静置培養した。液体窒素を注いで冷却してある乳鉢に培養物を入れ、液体窒素を追加した後、液体窒素で冷却してある乳棒を用いて念入りに粉砕した。粉砕された菌体から、Ｃａｔｈａｌａ等の方法〔ＤＮＡ，　２（４）：３２９−３３５，　１９８３〕で全ＲＮＡを抽出した。更に、ＤＮＡ−ｆｒｅｅキット（Ａｍｉｂｉｏｎ製）を用いてＤＮａｓｅ　Ｉ処理を行い、混入していたＤＮＡを分解した。得られた全ＲＮＡ１．０　ｕｇを鋳型として、Ｍａｒａｔｈｏｎ　ｃＤＮＡ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。
【００２０】
逆転写反応のプライマーは、オリゴｄＴの３’側にアダプター配列の付いた、キットに付属のものを用い、逆転写反応は、４２℃で６０分行った。次いで、上記逆転写反応産物に、キットに添付の説明書に従い、ＲＮａｓｅＨ、ＤＮＡポリメラーゼ及びＤＮＡリガーゼ等を含んだカクテルを加え、１６℃で９０分反応させた後、更にＴ４ＤＮＡポリメラーゼを加え、１６℃で５０分反応させ、２本鎖ｃＤＮＡのライブラリーを合成した。次いで、上記反応物にアダプターＤＮＡ、ＤＮＡリガーゼ等を加え、アダプターを結合させた二本鎖ｃＤＮＡのライブラリーを合成した。夫々反応液組成及び反応条件は、全て添付の説明書に従った。
次いで、上記で得られた二本鎖ｃＤＮＡのライブラリーを鋳型として、配列番号３及び配列番号４のプライマーを用いて、ＰＣＲを行い、５’側は、開始コドンの直前から、３’側は終止コドン直後から増幅した。耐熱性　ＤＮＡポリメラーゼとしては、　Ｔａｋａｒａ　ＥＸ　Ｔａｑ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）を用い、反応液の組成は、ポリメラーゼに添付の説明書に従った。
ＰＣＲ反応は、９４℃、２分の後、９４℃、３０秒、５５℃、３０秒、７２℃、２分を３０サイクル行い、７２℃、５分を行った。増幅産物の一部を０．７％アガロースゲルで電気泳動したところ、約１．５ｋｂのバンドが確認された。なお、サーマルサイクラーとしては、ＧｅｎｅＡｍｐ　５７００　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ（ＰＥ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用い、温度コントロール法はカリキュレートコントロールによった。
【００２１】
次いで、ＴＯＰＯ　ＴＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、上記増幅産物をｐＣＲ２．１ＴＯＰＯベクター上に組み込み、大腸菌ＴＯＰ１０Ｆ’株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を形質転換し、形質転換体を得た。形質転換体よりＱＩＡｐｒｅｐ　ｓｐｉｎ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いてプラスミドを抽出し、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用いてシークエンス反応を行い、ＬＩ−ＣＯＲ　ＭＯＤＥＬ４２００Ｌシークエンサー（ＬＩ−ＣＯＲ社製）で塩基配列を決定した。その結果、配列番号１に示す約１．３ｋｂのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のＤＮＡ配列が明らかとなった。このプラスミドｐＡＯＰＩＰ１は、独立行政法人　産業技術総合研究所　特許生物寄託センターにＦＥＲＭ　ＢＰ−８０６５として寄託されている。
プラスミドｐＡＯＰＩＰ１に含まれるクローンの開始コドンから終始コドンの直前までの塩基配列を配列番号１に記載する。上記塩基配列を解析したところ、このＤＮＡは、４４７アミノ酸残基からなる蛋白質をコードしていることが分かった。このアミノ酸配列を、配列番号２に記載する。更に、このアミノ酸配列を公知のアミノ酸配列データベースに対して配列相同性の高い配列を検索した。検索には、ＮＣＢＩｂｌａｓｔｐ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）を用い、データベースとしては、ｎｒを指定した。その結果、一致する配列はなく、最も高い配列相同性を示したのは、アスペルギルス・ニガーのプロリンイミノペプチダーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＪ３１５５６５）であり、７７．８％の配列相同性を示した。
【００２２】
また、配列番号１の塩基配列について配列相同性の高い配列を検索した。検索には、ＮＣＢＩ　ｂｌａｓｔｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）を用い、データベースとしては、ｎｒを指定した。その結果、一致する配列はなく、最も高い配列相同性を示したのは、上記アスペルギルス・ニドランスのプロリンイミノペプチダーゼをコードする遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ：　ＡＪ２９６６４６）であった。コード領域全長の配列相同性を解析ソフトＧＥＮＥＴＹＸ−Ｍａｃ　Ｖｅｒ．１０．１で調べたところ、１３４１塩基にわたり、７１．３％の配列相同性であった。
【００２３】
【発明の効果】
本発明により、新規なプロリンイミノペプチダーゼ、プロリンイミノペプチダーゼ遺伝子、組み換えベクター及びプロリンイミノペプチダーゼの製造法が提供された。
本発明により、上記プロリンイミノペプチダーゼの蛋白質工学的な改良が行えるようになった。また本発明は、食品加工用の酵素生産、醸造食品の生産に用いる微生物の改良にも用いることができる。
【００２４】
【配列表】
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【００２５】
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【００２６】
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【００２７】
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