(57)【要約】【課題】　細胞に感染することができ、大量の遺伝物質を効率的に保持しかつ発現することができ、しかもその細胞に対して細胞障害性を有しない、ガンなどの遺伝子病の体細胞治療や遺伝子治療に有用ないウイルスベクターの提供。【解決手段】　標的細胞の細胞質中で細胞当たりに生産される子孫が１を越えない低い複製効率を有するウイルスから誘導され、標的細胞中で発現することができるプロモーターに機能的に連結されている異種の核酸セグメントを含む少なくとも１個の挿入部位を有し、異種の核酸セグメントが標的細胞の染色体中に組み込まれない型（非−組み込み型）のものであり、１週間〜２ヶ月の間標的細胞中で核酸セグメントを発現することができる、体細胞または遺伝子治療のためのウイルスベクターが前記課題を解決した。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）標的細胞の細胞質中で細胞当たりに生産される子孫が１を越えない低い複製効率を有するウイルスから誘導され、
（ｂ）標的細胞中で発現することができるプロモーターに機能的に連結されている異種の核酸セグメントを含む少なくとも１個の挿入部位を有し、
（ｃ）異種の核酸セグメントが標的細胞の染色体中に組み込まれない型（非−組み込み型）のものであり、
（ｄ）１週間〜２ヶ月の間標的細胞中で核酸セグメントを発現することができる、
体細胞または遺伝子治療のためのウイルスベクター。
【請求項２】
　非−組み込み型ウイルスが細胞質ウイルスである、請求項１記載のウイルスベクター。
【請求項３】
　細胞質ウイルスがポックスウイルス、イリドウイルス、コロナウイルス(coronaviruses) 、トガウイルス（togaviruses)、カリチウイルス（caliciviruses)及びピコルナウイルス(picornaviruses)からなる群より選択されるものである、請求項２記載のウイルスベクター。
【請求項４】
　細胞質ウイルスがポックスウイルスである、請求項３記載のウイルスベクター。
【請求項５】
　ポックスウイルスが、スイポックス(suipox)ウイルス、アビポックス(avipox)ウイルス及びカプリポックス(capripox)ウイルスからなる群より選択されるものである、請求項４記載のウイルスベクター。
【請求項６】
　異種核酸セグメントが遺伝子である、請求項１記載のウイルスベクター。
【請求項７】
　遺伝子が、ホルモン、成長因子、酵素、サイトカイン、受容体及び腫瘍サプレッサーの各遺伝子をコードする遺伝子の群から選択されるものである、請求項６記載のウイルスベクター。
【請求項８】
　標的細胞が腫瘍浸潤性リンパ球である、請求項１記載のウイルスベクター。
【請求項９】
　腫瘍浸潤性リンパ球が哺乳動物由来のものである、請求項８記載のウイルスベクター。
【請求項１０】
　哺乳動物が霊長類、家畜又はイヌ又はネコである、請求項９記載のウイルスベクター。
【請求項１１】
　ベクターが非−溶菌性（non-lytic)のものである、請求項１記載のウイルスベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
　本発明は、永久的な形質転換が必要でない多種類の細胞に対するイン・ビボおよびエクス・ビボ（ex vivo）での遺伝子送達用ベクターに関する。
【背景技術】
【０００２】
　近年、イン・ビボ遺伝子治療の有望性に対して大きな注目が寄せられてきた。この言葉は多様な異種物質を細胞に送達するための組換えバイオテクノロジー技法を使用する幅広い方法を記述するために使用されてきた。このような方法は、例えば、遺伝子、アンチセンスＲＮＡ、細胞障害性物質等のベクターによる哺乳動物、好ましくはヒト細胞へのイン・ビボ又はエクス・ビボ送達を含んでいる。初期の研究の大部分はこれらの細胞を形質転換するためのレトロウイルスベクターの使用に焦点を当ててきた。この焦点は細胞に感染しそして高い効率で宿主細胞中にそれらの遺伝物質を組み込ませるレトロウイルスの能力から産まれたものであった。レトロウイルスベクターとしては、レトロウイルスゲノム全体のパッケージングを妨げるように欠失させられたパッケージング配列をもつ修飾されたモロニーネズミ白血病ウイルス（modified Moloney Murine Leukemia Virus(MMLV)） が代表的である。
【０００３】
　しかしながら、レトロウイルスについては多くの困難が報告されてきた。例えば、ある細胞を感染させる際に問題が生じた。レトロウイルスは典型的には受容体を介して細胞内に侵入する、そしてこのような受容体が細胞上に存在しないとき、又は多数存在しないときは、感染できないか又は効率的には感染できまい。これらのウイルスは他のウイルスに比べて比較的不安定でもある。組換えウイルス生産性の細胞株からの野性型ウイルスの発生（outbreak) も、それ自体が病気を引き起こすベクターについて報告されてきた。さらに、これらのウイルスは分裂しつつある細胞中で発現するだけである。
　また、レトロウイルス媒介遺伝子移転法は、典型的には標的細胞の安定な形質転換をもたらす。これはときには長所とみられるが、好ましくない副作用がその中止を命ずるときでも、患者の体細胞の安定な形質転換は処置法を逆転させることを困難にする。さらに、遺伝的形質転換が細胞を悪性の形質転換に導くかも知れないという懸念が常に存在する。
【０００４】
　アデノウイルス、アデノ−随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルスなどの他のウイルスがベクターとして提案されてきた。また、リガンド−ＤＮＡコンジュゲートなどの種々の非−ウイルス性ベクターが提案されてきた。それにもかかわらず、これらのベクターはすべてある種の問題を抱えている。例えば、ベクターそれ自体が処置された個体への潜在的感染源となってはいけない。しかしながら、上に論じたように、野生型レトロウイルスの発生がある種の細胞株で報告されている。同様にベクターとしてのヘルペスウイルスの使用はウイルスの永続を生ずることが見出されている。ワクシニアウイルスのベクターとしての使用は免疫無防備状態の個体にとっては致命的であることが証明された。このような個体は遺伝子治療の一つの主要な標的である。さらに、これらのベクターの多くは比較的少量の遺伝物質しか含まずそして発現しない。このことは複数の産物を発現する能力が好ましい多くの状況にとって好ましいことではない。従って、細胞に感染することができ、大量の遺伝物質を効率的に保持しかつ発現することができそしてその細胞に細胞障害性でないベクター系を持つことは有用であろう。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
　われわれは、リンパ球や腫瘍細胞などの細胞中に遺伝子を挿入する目的で、低い複製効率を持つ非−組み込み型ウイルスベクターを使用することが体細胞治療や遺伝子治療に使用する目的でかかる細胞を形質転換するための好ましい系であることを発見した。これらのベクターは核のウイルスベクターに対立するものとしての細胞質ウイルスベクターであることが好ましい。好ましい細胞質ベクターとしては、ポックスウイルスやイリドウイルスなどのＤＮＡウイルス及びピコルナウイルス、カリチウイルス及びトガウイルスなどのＲＮＡウイルスが挙げられる。使用するウイルスは標的細胞中で持続した複製をすることができないことがより好ましい。例えば、ヒト細胞に対する好ましいポックスウイルスはアビポックスであり、またはワクシニアなどのオルソポックスウイルスと対照的なスイポックスである。
【０００６】
　標的細胞中に挿入される遺伝子（群）は、相同組換えやユニークな挿入部位の使用などの標準的手段によりベクターに挿入される。次いで、このベクターは既知の方法により標的細胞中に導入される。
　形質転換された細胞は体細胞治療又は生体内遺伝子治療に使用することができる。使用されるベクター系は標的の染色体中に組み込まれず、性の複製や他の細胞の感染を生じない。
　従って、ウイルスベクターや付加された遺伝子への長時間曝露の危険は著しく減少する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
　われわれは、非−組み込み型ウイルス、好ましくは細胞質ウイルスを使用することが遺伝物質の送達用の好ましいベクターであることをいまや発見した。これらのベクターにより保持される遺伝物質（遺伝子群）は、従って、特に望ましい場合を除き、標的細胞の核には存在しない。このベクターは標的細胞中で低い複製効率を有することが好ましい。
　従来、遺伝子送達ベクターはレトロウイルスやヘルペスウイルスなどの感染性の核ウイルスの修飾体であるべきだと信じられてきた。しかしながら、われわれはこれらの型のベクターは多くの目的にとって好ましくないことを発見した。このことは、長期間の発現が不必要であるばかりでなく宿主に対し危険を及ぼすことがある遺伝子産物（例えば、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ），Ｂ７−１，Ｂ７−２や顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ））の短期間送達を目的とする場合に特に妥当する。同様に、ある種のウイルスベクターは極めて強力であるため宿主細胞を圧倒し２４〜４８時間以内にその細胞を死に至らしめる。従って、使用するウイルスベクターは４８時間のタイムスパン内で、より好ましくは９６時間のタイムスパン内で、そしてさらに一層好ましくは１２０時間又はそれ以上の長時間のタイムスパン内で、すべての標的細胞に対し非−溶菌的でないウイルスをベースにする。ここで非−溶菌的という言葉が使用されるとき、ウイルスは、生きている感染細胞が遺伝子産物を発現している間の短い期間内に宿主動物又は組織培養中で標的細胞の大部分を殺さないウイルスである。例えば、かかるウイルスはそれが使用されている標的細胞の約２５％以上を好ましくは４８時間以内に、より好ましくは７２時間以内に、さらにより好ましくは９６時間以内に殺さないものである。より好ましくは、それが使用されている宿主動物又は組織培養内で標的細胞の約１０％以上を４８時間以内に、より好ましくは７２時間、そしてさらに一層好ましくは９６時間以内に殺さないものである。このような形質転換された標的細胞集団は初期感染の後１〜２週間の期間送達された遺伝子産物を発現していることがさらに好ましい。このことは、標的細胞の試料の生存率を試験することにより、例えばトリパンブルーで染色することにより、そして遺伝子発現を試験することにより、例えばＥＬＩＳＡでタンパク質生産を測定することにより、容易に測定することができる。
【０００８】
　本明細書に述べる「短期間」送達系という言葉は、少なくとも約１週間の間目的の遺伝物質を発現することができるが、この遺伝子産物の一過性の発現を生ずるベクター系の使用を意味することが好ましい。この発現は約２か月未満であることが好ましく、１か月未満であることがさらに好ましい。また、選択された宿主動物に対し無毒なウイルスを使用することにより、該ウイルスはこの宿主に病気を引き起こすことはない。もし何らかの副作用が観察されるときその副作用は以下に述べるようにさらに低減させることができる。さらに、本明細書に述べる送達系は、一定の期間にわたって目的タンパク質の特定量を連続的に発現させることにより、該目的タンパク質の「制御された放出」を可能とする。
　非−組み込み型ウイルスはそのＤＮＡが宿主細胞の染色体中に組み込まれないウイルスである。しかしながら、以下に論ずるように、遺伝子（又は遺伝子群）の組み込みが望まれるある種の場合には、ベクター中に「組み込み」系を取込むように宿主細胞の核酸中に組み込むことができる遺伝子（群）を該ベクターが保持するように該ベクターを設計することが可能である。例えば、アデノ−随伴ウイルス（ＡＡＶ）は宿主細胞の染色体中の特定部位に組み込まれる。外来遺伝子を含む組換えＡＡＶが構築された。この組換えＡＡＶゲノムはウイルスベクターゲノム（例えば、スイポックスウイルス）中に取り込まれることができる。このウイルスベクターはＡＡＶを宿主細胞に送達することができ、そしてこのＡＡＶは宿主ゲノム中へ組換えＤＮＡを組み込むことができる。
　好ましい非−組み込み型ウイルスは細胞質ウイルスである。これらはＤＮＡウイルス及びＲＮＡウイルスの両方を含む。ＤＮＡウイルスはスイポックス(suipox)（例えば豚痘）、カプリポックス(capripox)、レポリポックス(leporipox)、アビポックス(avipox)（例えば、鶏痘、カナリポックス(canary pox)、及びオルソポックス(orthopox)（例えば、エクトメリア(ectomelia) 、ウサギ痘）などのポックスウイルスを含む。他のＤＮＡウイルスとしては、種々の昆虫ウイルス及び蛙ウイルスなどのイリドウイルス(iridoviruses)が挙げられる。
【０００９】
　ＲＮＡウイルスには、ピコルナウイルス(picornaviruses)、カリチウイルス(caliciviruses) 、トガウイルス(togaviruses) 、ラブドウイルス(rhabdoviruses) 及びコロナウイルス(coronaviruses)が含まれる。ピコルナウイルスには、エンテロウイルス(enterovirus) 、カルジオウイルス(cardiovirus) 、ライノウイルス(rhinovirus)、アプトウイルス(apthovirus)、及びヘパタイティスＡ(hepatitis A) が含まれる。カリチウイルスには、豚、イヌ又はミンクの水泡性発疹ウイルス、ネコのカリチウイルス及びウシ、ブタ、イヌ、ニワトリ及びチンプス(chimps)のカレシオルウイルス(caleciorviruses) が含まれる。トガウイルスには、ウシウイルス性下痢ウイルス、ブタコレラ、及びヒツジの境界病(border disease of sheep) が含まれる。ラブドウイルスには、水泡性口内炎ウイルスなどの水泡性ウイルス(vesiculoviruses) 及び狂犬病などのリッサウイルス(Lyssaviruses)が含まれる。コロナウイルスには、ニワトリの感染性気管支炎ウイルス、ブタの伝染性胃腸炎ウイルス、ブタの血球凝集素脳脊髄炎ウイルス(hemagglutinin envcephalimyelitis virus of swine) 、七面鳥の青トサカウイルス(turkey bluecomb virus) 、ウシのコロナウイルス及びネコの伝染性腹膜炎ウイルスが含まれる。
【００１０】
　ＤＮＡウイルスがベクターとして使用されるのは好ましい。ポックスウイルスがベクターとして使用されるのはさらに好ましい。
　例えば、ポックスウイルスは良く知られた細胞質ウイルスである。従って、このようなウイルスベクターにより発現される遺伝物質は通常細胞質内に留まり、そして上述のような特殊な工程が採られない限り、運びこまれた遺伝物質が宿主細胞遺伝子中に偶然取り込まれるというおそれはない。さらに、これらのベクターは大きなゲノムを持つので、複数の遺伝子を含む広範な遺伝物質を送達する（即ち、多価ベクターとして作用する）目的に容易に使用することができる。
　このウイルスベクターは標的細胞中で低い複製効率を持つことが好ましい。これは、細胞当たりに生産される子孫が１を越えないことが好ましく、細胞当たり０．１を越えないことがさらに好ましいことを意味する。複製効率は標的細胞の感染後にウイルスの力価測定を行うことにより経験的に容易に測定することができる。
　複製効率が低いこと及びベクターの性質が非−組み込み型でかつ細胞質であることの結果として、このベクター系は持続した複製や他の細胞への感染を生じない。従って、このベクター及び形質転換された細胞は標的細胞が存在する位置から離れた位置にある宿主動物の細胞に悪影響を与えない。
【００１１】
　本明細書に記載された遺伝子送達系はどのような宿主にも使用することができる。宿主は哺乳動物や鳥類が好ましい。哺乳動物としては、ヒトやチンパンジーなどの霊長類、ウマ、ウシ、ブタ等の家畜類、及びイヌやネコなどのペット類が好ましい。より好ましい宿主動物は霊長類又は家畜である。宿主動物がヒトなどの霊長類であることがさらに一層好ましい。
　特定の宿主動物に使用されるウイルスベクターがその動物に無毒であることをさらに保証するために、上記の規範に加えて、ウイルスベクターをスクリーニングしてそのウイルスの宿主範囲及び組織特異性を容易に求めることができる。例えば、一つの方法はウイルスの本来の宿主範囲を求めるものである。選択されるウイルスベクターは、遺伝子送達系がその中で使用される動物とは異なる宿主動物がその感染の一次的範囲であるウイルスから作られることが好ましい。例えば、宿主がヒトなどの霊長類であるときは、ウイルスベクターとして豚痘が使用できる。しかしながら、宿主がブタである家畜病の目的のためにはこのベクターは好ましくない。通常の宿主範囲では毒性を持たない、修飾されたオルソポックスウイルスなどのある種の高度に減弱された又は修飾された株（例えば、ワクシニアのＭＶＡ株又はその通常の宿主範囲でもしくは目的の宿主細胞中で非−毒性となるように遺伝的に修飾された株）は、しかしながら、使用することができる。組織特異性も感染性や複製効率を予めスクリーニングするために使用することができる。具体的なスクリーニング試験は実施例に示し、後に説明する。
【００１２】
　宿主がヒトの場合は、好ましいベクターとしては、ポックスベクター、例えば豚痘などのスイポックス、鶏痘やカナリポックスや鳩ポックスなどのアビポックス、及びカプリポックスウイルスが挙げられる。また、蛙ウイルスなどのイリドウイルス、及びアフリカ豚熱病ウイルスも好ましい。
　この送達方法は体細胞治療及び生体内遺伝子治療などの広範囲の治療に使用することができる。例えば、それは腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）治療に、遺伝的欠損を是正するため又は細胞に新たな機能を与えるために気管内皮細胞又は肝細胞に、その他に、使用することができる。腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）治療では、使用される宿主細胞は腫瘍を標的とするリンパ球亜集団である。使用される宿主細胞はヒトＴＩＬ細胞であるのが好ましい。これらの細胞はエクス・ビボ（ex vivo)遺伝子送達（しばしば体細胞治療と呼ばれる）を行うことがが特に可能である。さらに、送達の対象となる遺伝子は、ＴＮＦや、インターロイキン（ＩＬ）（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２）、インターフェロン（ＩＦＮ）（例えば、ＩＦＮ−γ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）及び同時刺激因子（co-stimulatory factor)（例えば、Ｂ７）などのサイトカイン類のような、腫瘍を標的としこれと闘う該細胞の能力を高めるものとなるであろう。例えば、ＴＮＦとＩＬ−２の両者を同時に送達する多価ベクターを使用するのが好ましい。
【００１３】
　イン・ビボ遺伝子送達用の望ましい宿主の一つはヒトであるから、ベクター系の効率及び有用性を測るためのある試験モデルを開発し、そしてこの分野で受け容れられた。これはイン・ビトロ試験、エクス・ビボ試験及びマーカー遺伝子の使用を含む。従って、細胞の感染への感受性及びウイルスベクターによる遺伝子発現は通常レポーター遺伝子についての試験により測定される。β−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）、クロラムフェニコール・アセチル・トランスフェラーゼ（ＣＡＴ）などをコードするマーカー遺伝子は、タンパク質がその細胞中でそのベクターにより発現され得るか否か、そして発現の量及び持続期間を測定するために便利に使用される。それは、これらのタンパク質の存在を試験するのは容易であるからである。しかしながら、これらのマーカー遺伝子は、該細胞中で同サイズの異種タンパク質も発現されるか否かの指標として使用されている。遺伝子送達ビーイクルの有効性を測る目的でマーカー遺伝子、例えばネオマイシンをこのように使用することは、目的遺伝子についてヒト試験を行う前に行われた。従って、この開示に基づいて当業者は特定の標的組織及び宿主において特定ベクターの有効性を容易に求めることができる。
【００１４】
　本発明者らは、鶏痘ベクター及び豚痘ベクターが両者共、ＴＩＬ及び悪性腫瘍細胞を含む目的の広範なヒト細胞に感染し、そして該細胞に迅速な細胞変性を与えることなく一時的に異種遺伝子を発現することを証明した。また、これらのベクターは休止時の細胞に感染しその中で異種遺伝子を発現することができる。
　宿主系の細胞の迅速な死滅をもたらすことなく真核細胞中で目的の遺伝子を発現することができるウイルスから誘導される非−組み込み型ウイルスベクターが好ましく使用され得る。送達の対象となる遺伝子をベクター中に挿入し、そしてそれを次いで当業者に知られた手段により標的宿主細胞中に導入する。本明細書で述べるウイルスベクターは低い複製効率を有し、そして全く複製しないか又は限られた生産的複製（即ち、該ウイルスの１５％未満が、より好ましくは１０％未満が、より一層好ましくは５％未満が、さらに一層好ましくは１％未満が感染性の子孫を作る）を生ずることがより一層好ましい。従って、感染性の子孫はあるとしてもほとんどなく、そして「感染」は自己限定的である。ウイルスベクターはその宿主動物には実質的に認められず、そして付近の組織にも該ベクターの拡散は生じない。従って、発現タンパク質への長期間暴露の危険は減少する。
　もし発現タンパク質への付加的な暴露が必要であるときは、目的の遺伝子を標的細胞に再導入することができる。
【００１５】
　ヒト細胞での使用のためのウイルスベクターは、アビポックス（テイラー(Taylor)ら、Vaccine, 6：497-503 (1985)、及びジェンキンス(Jenkins)ら、AIDS Research And Human Retroviruses 7: 991-998 (1991)) 、及びスイポックス（フェラー(Feller)ら、Virology, 183: 578-585 (1991) ）などの非−溶菌性の、無毒のポックスウイルスであることが好ましい。
　本発明のベクターを用い標的のＴＩＬ細胞に送達される遺伝物質は遺伝子、例えば抗ガン剤や抗ウイルス剤を含む多様なタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。このような遺伝子としては、ホルモン類、成長因子類、酵素類、サイトカイン類、受容体類、ＭＨＣ分子類及びその他類似のものをコードする遺伝子が挙げられる。「遺伝子」という言葉は、その中にウイルスベクター、例えばヒトＴＮＦ遺伝子を含む豚痘などのポックスウイルスが導入される細胞にとって外因性及び内因性両方の核酸配列を含む。送達用の遺伝子として使用するのに特に有益なのは、網膜芽細胞腫遺伝子産物、ウイルム腫瘍（Wilm's Tumor）遺伝子産物、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）又は免疫グロブリンなどの腫瘍サプレッサー遺伝子産物のような、遺伝病を罹患している個体において全く欠如しているか、僅かな量しか生産されないか、又は変異型で生産されるポリペプチドをコードする遺伝子である。さらに、遺伝子がコードするタンパク質により全身的効果を与えるように、標的細胞から分泌されるポリペプチドをコードする遺伝子を使用することも有益である。有益な特定遺伝子としては、ＴＮＦ、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、ヘモグロビン、インターロイキン−１、インターロイキン−２、インターロイキン−３、インターロイキン−４、インターロイキン−５、インターロイキン−６、インターロイキン−７、インターロイキン−８、インターロイキン−９、インターロイキン−１０、インターロイキン−１１、インターロイキン−１２等、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ヒト成長因子、同時刺激因子(co−stimulatoryfactor)Ｂ７、インスリン、ファクターVIII、ファクターIX、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、ＮＧＦ、ＩＬ−ｉｒａ、ＥＰＯ、β−グロビンなど並びにこれらのタンパク質の生物学的に活性な変異タンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。ウイルスベクター中に挿入するための遺伝子としては、多様な種由来のものが挙げられる。しかしながら、目的の遺伝子の資源としては、目的の遺伝子を含むウイルスベクターが挿入される種のものであることが好ましい。この遺伝子は、他の遺伝子産物の発現を制御する産物又は敗血症経路などの生物学的経路の１以上のステップを遮断する産物をさらにコードしていてもよい。また、この遺伝子はポリペプチドに融合した毒素、例えば受容体リガンド、又は腫瘍細胞もしくはウイルスなどの標的に毒素を指向させる抗体をコードしていてもよい。同様に、この遺伝子は病気に罹っている組織もしくは器官に治療的効果を送達することを目的として標的化ポリペプチドに融合された治療用のタンパク質をコードしていてもよい。
【００１６】
　該遺伝子はβーガラクトシダーゼ、ＣＡＴ、ネオマイシン耐性又はメトトレキセート耐性などのマーカーをコードしていてもよい。これにより、標的細胞が選択され又は検出される。このようなマーカーの使用により当業者は特定の標的宿主細胞中で非−溶菌的な又は細胞変性を起こさない種々のウイルスベクターをスクリーニングすることができる。（参考実施例２を参照。）例えば、βーガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）をコードする遺伝子をウイルスベクター中に挿入することができ、次いで修飾された該ウイルスベクターを標的宿主細胞中に導入し、そしてβーガラクトシダーゼの生産を測定する。β−ｇａｌの発現はウイルス感染及び遺伝子発現の指標となる。実施例３は細胞変性効果のスクリーニング方法を示す。実施例４は複製効率のスクリーニング方法を示す。
　ウイルス中への遺伝子挿入の基本的技法は当業者に知られており、例えば、ドナープラスミド中の遺伝子を挟んでいるウイルスＤＮＡ配列と該親ウイルス中に存在する相同配列との間の組換えを含むものである（マケット(Mackett)ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 7415-7419 (1982))。例えば、遺伝子送達に使用するためのポックスウイルスなどの組換えウイルスは当該技術分野で公知のそして米国特許Ｎｏ．５，０９３，２５８号に記述された鶏痘ウイルスの合成組換え体の作成法に類似の二段階で構築することができる。上記の米国特許の開示は参照により本明細書に取り込まれる。他の技法としては、親ウイルスベクター中に初めから存在する又は人為的に挿入されたユニークな制限エンドヌクレアーゼ部位を利用するものが挙げられる。
【００１７】
　第一に、ウイルス中に挿入すべきＤＮＡ遺伝子配列をプラスミド、例えばポックスウイルスのＤＮＡなどのＤＮＡ部分に相同的なＤＮＡが挿入された大腸菌プラスミド構築物中に入れることができる。別に、挿入すべきＤＮＡ遺伝子配列をプロモーターに連結する。プロモーター−遺伝子連結物が、望ましい挿入領域であるポックスＤＮＡ領域を挟んでいるＤＮＡ配列に相同なＤＮＡにより両端が挟まれるように、該プロモーター−遺伝子連結物は該プラスミド構築物中に置かれる。得られるプラスミド構築物を次いで大腸菌内での増殖により増幅させ、そして単離する。このプラスミドは大腸菌の複製起点などの複製起点及び大腸菌内での増殖と選択のための抗生物質耐性遺伝子などのマーカーをも含んでいることが好ましい。
【００１８】
　第二に、挿入対象であるＤＮＡ遺伝子配列を含む単離されたプラスミドをポックスウイルスと共に細胞培養、例えばニワトリ胚繊維芽細胞中にトランスフェクトさせる。該プラスミド中の相同なポックスＤＮＡとウイルスゲノムそれぞれの間の組換えから、そのゲノムのウイルス生存に悪影響を与えない部位にプロモーター−遺伝子構築物が存在することにより修飾されたポックスウイルスを生ずる。
　上述のように、得られる組換えウイルスのウイルス生存に悪影響を与えないウイルス領域（挿入領域）に該遺伝子が挿入される。当業者はウイルス中のこのような領域を容易に同定することができる。例えば、組換え体のウイルス生存率に深刻な影響を与えることなく組換え体を形成せしめる領域についてウイルスＤＮＡの断片を無差別に試験することにより同定することができる。容易に使用することができそして多くのウイルスに存在する一つの領域はチミジンキナーゼ遺伝子である。例えば、それは試験されたポックスウイルスゲノムの全てにおいて見つかっている（レポリポックスウイルス：ユプトン(Upton) ら，J. Virology, 60: 920 (1986)(ショープ繊維腫ウイルス）、カプリポックスウイルス：ゲルション(Gershon)ら，J. Gen. Virol., 70: 525 (1989)( ケニア  シープ−１）、オルソポックスウイルス：ワイア(Weir)ら、J. Virol., 46: 530 (1983) （ワクシニア）、エスポジト(Esposito)ら，Virology, 135: 561 (1984)（モンキーポックス及びバリオラウイルス）、ルビー(Hruby)ら，PNAS, 80: 3411 (1983)（ワクシニア）、キルパトリック(Kilpatrick)ら，Virology, 143: 399 (1985) （ヤバ　モンキー腫瘍ウイルス）、アビポックスウイルス：ビンズ(Binns) ら，J. Gen. Virol. 69: 1275 (1988)（鶏痘）、ボイル(Boyle) ら，Virology, 156: 355 (1987)（鶏痘）、シュニッツライン(Schnitzlein)ら，J. Virological Methods, 20: 341 (1988)（鶏痘、クエイルポックス(quailpox))、エントモポックス(entomopox)（リトビン(Lytvyn)ら，J. Gen. Virol. 73: 3235-3240 (1992) ）。
【００１９】
　鶏痘では、ＴＫ領域の他に他の挿入領域が含まれる。例えばＢａｍＨＩ　Ｊ（ジェンキンス(Jenkins) ら，AIDS Research and Human Retroviruses 7: 991-998  (1991) ）ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄIII断片、ＢａｍＨＩ断片、ＥｃｏＲＶ−ＨｉｎｄIII 断片、ＢａｍＨＩ断片及びＥＰＯ出願Ｎｏ．０　３０８　２２０Ａ１号に記載されたＨｉｎｄIII 断片が含まれる（カルバート(Calvert) ら，J. Virology, 67: 3069-3076 (1993) 、テイラー(Taylor)ら，Vaccine 6: 497-503 (1988) 、スペーナー(Spehner)ら（１９９０）及びバースネル (Boursnell)ら，J. Gen. Virol. 71: 621-628 (1990)）。
　豚痘では、好ましい挿入部位としてはチミジンキナーゼ遺伝子領域が挙げられる。
　挿入領域に遺伝子が挿入されるべき要件に加えて、修飾されたポックスウイルスによる挿入された遺伝子の発現が成功するためには目的遺伝子に機能的に連結した、即ち挿入された遺伝子に対し適当な関係にあるプロモーターの存在が要求される。このプロモーターは発現されるべき遺伝子の上流に位置するように配置されねばならない。プロモーターとは当技術分野でよく知られており、標的にしようとする宿主及び細胞型に応じて容易に選択することができる。例えばポックスウイルスでは、ワクシニア７．５ｋ、４０ｋ、鶏痘などのポックスウイルスプロモーターが使用されるべきである。発現レベルを高めるためにエンハンサー成分を組み合わせて使用することもできる。さらに、ある態様においては、当該分野でよく知られてもいる誘導性のプロモーターを使用することが好ましい。
【００２０】
　例えば、該プロモーターが外部因子または外部キューにより調節される構築物を作成すること、そして今度は該ベクターによって生産されるポリペプチドのレベルをその外部因子または外部キューを活性化することにより制御することが可能である。例えば、熱ショックタンパク質はそのプロモーターが温度によって調節されている遺伝子によりコードされたタンパク質である。金属含有タンパク質であるメタロチオネインをコードする遺伝子のプロモーターはＣｄ＋ イオンに応答する。このプロモーター又は外部キューにより影響される別のプロモーターの取込みによってもタンパク質の生産を調節することが可能である。
　上に述べたような本発明のベクターはＴＩＬなどの標的宿主細胞に複数の遺伝子を送達するために有用である。多種類の遺伝子（multiple genes)を送達することができるポックスウイルスベクターのような多価(multivalent)ベクターの構築は当該技術分野のレベル内にあり、そして既知の方法論により実施することができる。ＧＭ−ＣＳＦなどのリンホカインとガン抗原などの抗原性ポリペプチドとのポックスウイルスベクターによる同時発現は、それらが極めて限定された場所で同一標的宿主細胞により一緒に生産されることを保証するものである。このような発現はガン抗原に対する免疫学的応答を顕著に高めることが示された（タオ(Tao)ら，Nature 362: 755 (1993)）。
　このベクターは特定の疾病又は腫瘍と闘う免疫系の能力を高めることを目的として遺伝子を送達するためにも使用することができる。例えば、免疫系を増強するために１種以上のサイトカイン（例えば、ＩＬ−２）及び／又は１種以上の抗原を送達するベクターである。
【００２１】
　本発明のベクターの使用に適する他のガン治療の方法は、腫瘍細胞中への腫瘍サプレッサー遺伝子（例えば、網膜繊維芽腫）の導入（フリードマン(T. Friedmann)，Cancerp 70: 1810 (1992))、オンコジーン（例えば、ｒａｓ，ｎｅｕ）の腫瘍細胞中での発現の阻止（ムコパドヒエイ(Mukhopadhyay)ら，Cancer Res., 51: 1744 (1991))、骨髄細胞の化学療法の毒作用への耐性化（ポッダ(S. Podda)ら，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 9676  (1992)、ソレンチノ(S.P. Sorrentino)ら，Science 257: 99 (1992)) 、及び腫瘍細胞中への条件付き毒性遺伝子の導入（ショート(M. P. Short) ら，Neurosci. Res., 27: 427 (1990)、カルバー（K. N. Culver) ら，Science 256: 1550 (1992)） が含まれる。
　ヒトにおける遺伝子治療の最初の使用は標的細胞として腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬｓ）に関するものであった（ローゼンバーグ(Rosenberg) ら, New Engl. J. Med. 9: 570-578 (1990) を参照) 。ＴＩＬｓは腫瘍部位へ抗ガン治療法の送達のためのビーイクルとして有望であるリンパ球の亜集団である。これらのリンパ球は免疫応答を行うために宿主の免疫系による試みの一部として腫瘍の中へ浸潤する。
【００２２】
　遺伝子送達のため標的宿主細胞として使用するＴＩＬ細胞は、腎腫瘍、腸腫瘍又は乳房腫瘍、黒色腫、及び肉腫などの切除されたヒト腫瘍をイン・ビトロでインターロイキン−２（ＩＬ−２）を含む適当な組織培養培地中でインキュベートすることによりイン・ビトロで調製することができる。培地中のＩＬ−２は、腫瘍すなわちＴＩＬ細胞内でＴ細胞の拡大及び活性化そしてその腫瘍細胞又は腫瘍組織の破壊をもたらす。培養の２〜８週間後に、腫瘍細胞は破壊されそして培養は主として細胞溶解性のＴリンパ球（ＣＴＬ）の表現型を持つリンパ系細胞を含む（例えば、ローゼンバーグ(Rosenberg) ら，New Engl. J. Med. 319: 1676-1680 (1988) 、ムール(Muul)ら, J. Immunol. 138: 989-995 (1987) 、及びトパリアン(Topalian)ら，J. Immunol. 142: 3714-3725 (1987) ）。
　一般に、各注入(infusion)当たり１×１０５ 細胞と最大２×１０１１細胞の間の細胞が、例えば各々２００〜２５０ｍｌの注入液１〜３個に３０〜６０分の時間かけて投与される。注入の終了後に、患者を体重キログラム当たり７２０，０００ＩＵの投与量で８時間毎に静脈注射により組換えインターロイキン−２で治療してもよい。投与の一部はこの薬物に対する患者の寛容性に応じ省略してもよい。
【００２３】
　ＴＩＬｓはＴＮＦをコードするＤＮＡ含有ウイルスベクターの導入により修飾して、ＴＩＬ細胞の抗腫瘍活性を高めるため宿主に再導入することもできる。他のサイトカイン類も使用することができる。
　ＴＩＬ細胞は、それらが腫瘍を標的とし、そして所望のタンパク質をコードするＤＮＡの挿入により修飾し、培養し、その患者に再導入することができるオートロガス細胞源であるから、遺伝子治療、特にガン治療の方法における使用が有望である（カリトン(Culliton)，「News and Comment」in Science, 244: 1430-1433 (1989)及びカシド (Kasid)ら，Proc. Natl. Acad. Sci. 87: 473-477 (1990)）。
【００２４】
　本発明のベクターは、例えばＴＮＦ及び／又はインターロイキン−２（ＩＬ−２）をコードする遺伝子を腫瘍細胞に送達することを目的として使用することができる。これらのサイトカイン類の分泌は他の部位における腫瘍の破壊や注入された腫瘍細胞の部位の近くのリンパ節からのより効果的なＴＩＬを取得することを可能とする、腫瘍特異的免疫応答を刺激することが期待される。
　送達の対象となる遺伝子を持つウイルスベクターを標的細胞へ導入するには当業者に知られるどの方法を使用することもできる。
　目的器官におけるタンパク質の血清濃度が約１ｐｇ／ｍｌ〜２０μｇ／ｍｌの範囲で得られるように、ウイルスベクターの十分量を注入する。約０．１μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌの血清濃度がより好ましい。約０．５μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌの血清濃度がさらに一層好ましい。
　送達された遺伝物質の効果はこの系を用いて慎重にモニターし調節することができる。豚痘などの好ましいベクターは約２週間遺伝物質を発現するだけである。従って、処理されている状態がその時間枠内で緩和されるときは、このベクター系は自己限定的であるので不必要な物質はその期間後には生産されない。追加の投与が必要なときは、その物質の追加の投与はその注射を反復することにより達成できる。場合によっては、第２、第３、等の物質をこれらのベクターと共に添加することもできる。
【発明の効果】
【００２５】
　本発明のウイルスベクターは、細胞に感染することができ、大量の遺伝物質を効率的に標的細胞の細胞質中に保持しかつ発現することができ、しかもその細胞に対する細胞障害性や溶菌性が無いか極めて低いので、ガンなどの遺伝子病の体細胞治療や遺伝子治療に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
　本発明は下記の実施例によりさらに例示される。これらの実施例は本発明の理解を助けるために記載するもので、本発明を制限するものと解すべきではない。
〔参考実施例１〕
【００２７】
　非−溶菌性、非−細胞変性性のベクターの構築
親ウイルス
　レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、及びポックスウイルスを含む多数のウイルスが異種タンパク質の発現のための生きたウイルスベクターとして開発されてきた（セプコ(Cepko)ら，Cell 37: 1053-1062 (1984) 、モリン(Morin) ら，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 4626-4630 (1987) 、ローベ（Lowe) ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3896-3900 (1987) 、パニカリとパオレッティ(Panicali and Paoletti), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 4927-4931 (1982)、マチェット (Machett)ら, Proc. Natl.Acad. Sci. USA 79: 7415-7419 (1982))。非−溶菌性、非−細胞変性性という上の定義に合致するウイルスは親ウイルスとして使用するために容易に選択することができる。代表的な鶏痘ウイルス及び豚痘ウイルスはＡＴＣＣからそれぞれ寄託番号ＶＲ−２２９及びＶＲ−３６３として入手することができる。
【００２８】
親ウイルスとのイン・ビボ組換えのためのＤＮＡベクター
　目的のポリペプチドをコードする遺伝子は、親ウイルスタンパク質の正常な補体(complement)の発現と一緒にそのウイルスにより該遺伝子が発現し得るように親ウイルスのゲノムの中に挿入される。これは親ウイルスとのイン・ビボ組換えのためのＤＮＡドナーベクターをまず構築することにより達成することができる。
【００２９】
　一般に、ＤＮＡドナーベクターは下記の要素を含んでいる、
（ｉ）このベクターが原核細胞宿主中で増幅することができるように、原核細胞の複製起点、
（ii)マーカーをコードする遺伝子（例えば、抗生物質耐性をコードする遺伝子）、これはこのベクターを含む原核宿主細胞の選択を可能とする、
（iii)遺伝子の発現を指示することができる転写プロモーターに隣接して置かれた目的のタンパク質をコードする少なくとも１個の遺伝子、及び
（iv)外来遺伝子（群）が挿入される親ウイルスゲノムの領域に相同な複数のＤＮＡ配列であって、要素（iii)の構築物の両側を挟んで隣接する(flanking)ＤＮＡ配列。
【００３０】
　ポックスウイルス中に多種類の外来遺伝子を導入するためのドナープラスミドを構築する方法はＷＯ９１／１９８０３に記載されており、その技法は参照により本明細書に取り込まれる。一般に、ドナーベクターの構築用のＤＮＡ断片はすべて、転写プロモーターを含む断片及び外来遺伝子が挿入される親ウイルスゲノムの領域に相同な配列を含む断片を含むが、これらはゲノムＤＮＡ又はクローニングされたＤＮＡ断片から取得することができる。ドナープラスミドは１価、２価又は多価であってもよい（即ち、１個又はそれ以上の挿入された外来遺伝子配列を含むことができる）。
【００３１】
　ドナーベクターは、挿入された外来ＤＮＡを含む組換えウイルスの同定を可能とするマーカーをコードする付加的な遺伝子を含有することが好ましい。数種のタイプのマーカー遺伝子を組換えウイルスの同定及び単離を可能とするために使用することができる。これらは抗生物質耐性又は化学物質耐性（例えはスピロポウロス(Spyropoulos)ら，J. Virol., 62: 1046 (1988)、フォークナーとモス(Falkner and Moss), J. Virol., 62: 1849 (1988)、フランク (Franke)ら，Mol. Cell. Biol., 5: 1918 (1985))あるいは呈色試験（パニカリ(Panicali)ら, Gene, 47: 193-199 (1986))により組換えウイルスプラークの同定を可能とする大腸菌ｌａｃＺ遺伝子などの遺伝子を含む。
【００３２】
ウイルスゲノム中への外来ＤＮＡ配列の組み込みと組換え体の単離
　ドナープラスミドＤＮＡと感染細胞中のウイルスＤＮＡとの間の相同組換えにより、目的の要素を取り込んでいる組換えウイルスが形成される。イン・ビボ組換えに適する宿主細胞は一般にそのウイルスによって感染されそしてそのプラスミドベクターによってトランスフェクトされ得る真核細胞である。ポックスウイルスを用いる場合に使用に適する細胞の例としては、ニワトリ胚繊維芽細胞、ＨｕＴＫ１４３（ヒト）細胞、及びＣＶ−１及びＢＳＣ−４０（両方ともモンキー腎臓）細胞である。ポックスウイルスでの細胞の感染及びこれらの細胞のプラスミドベクターでのトランスフェクションは、当技術分野の標準的技法により行われる( パニカリ及びパオレッティ（Panicali and Paoletti), U.S.Patent No.4,603,112, WO89/03429）。
【００３３】
　イン・ビボ組換えに続いて、組換えウイルスの子孫を数種の技法の一つで同定することができる。例えば、ＤＮＡドナーベクターが親ウイルスのチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子中に外来遺伝子を挿入するように設計されているときは、組み込まれたＤＮＡを含むウイルスがＴＫであり、そしてこれを基に選択することができる（マケット(Mackett)ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 7415(1982))。あるいは上述のような目的の外来遺伝子（群）と共にマーカー遺伝子又は指示遺伝子をコードする遺伝子の同時組み込みも組換え体子孫の同定に使用することができる。好ましい指示遺伝子の一つは大腸菌ｌａｃＺ遺伝子である、β−ガラクトシダーゼを発現する組換えウイルスはこの酵素の発色性基質を使用して選択することができる（パニカリ(Panicali)ら, Gene 47: 193 (1986))。
　イン・ビボ組換えに続いて、組換えウイルスの子孫を数種の技法の一つで同定することができる。組み込まれた外来ＤＮＡの存在はこの挿入されたＤＮＡに特異的な標識化ＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーションにより検出することができる。しかしながら、選択の技法として好ましいのは、上述のような目的遺伝子と一緒にマーカー遺伝子又は指示遺伝子をコードする遺伝子を同時発現させることに基づくものである。好ましい指示遺伝子は酵素β−ガラクトシダーゼをコードする大腸菌ｌａｃＺ遺伝子である。β−ガラクトシダーゼを発現する組換えウイルスの選択はこの酵素の発色性基質を用いることにより行うことができる。例えば、組換えウイルスは基質である５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactosidase) 又は他のハロゲン化−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ（例えば、ＢｌｕＧａｌＴＭ）の存在する場合に青色のプラークとして検出される。
【００３４】
組換えウイルスが発現するウイルス抗原の特性解明
　組換えウイルスが一旦同定されれば、挿入された遺伝子がコードするポリペプチドの発現を試験するために種々の方法を使用することができる。これらの方法としては、ブラック・プラーク試験（ウイルスプラーク上で行われるイン・サイテュ・エンザイムイムノアッセイ）、ウエスタン・ブロット分析、ラジオイムノプリシピテーション（ＲＩＰＡ）、及びエンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）が挙げられる。
【００３５】
〔参考実施例２〕
非−溶菌性、非−細胞変性性ベクターの選択
　親の組換えウイルスを選択すると、次に挿入部位を決定する。これは既知の部位の使用、通常ＴＫ遺伝子を使用することができるポックスウイルスを用いる本質的でない親ウイルス中の部位の決定を含む種々の技法によることができる。目的の遺伝子、好ましくはβ−ｇａｌのようなマーカー遺伝子は挿入部位に挿入される。次いで、ウイルスベクターを標準的技法で標的ＴＩＬ細胞中に導入する。次いで、宿主に対するベクターの妥当性を決定するためにマーカーの発現を測定する。
【実施例１】
【００３６】
ベクターの構築
　ベクターが標的宿主を形質転換する能力はβ−ガラクトシダーゼ、ＣＡＴ等などのマーカー遺伝子を使用することにより容易に測定することができる。このマーカーは目的遺伝子の移転の妥当性を決定するため特定の宿主細胞とベクターの相互作用を容易に同定しかつ定量することを可能とする。検出の容易さ以外はマーカー遺伝子と別の遺伝子の発現における差異はない。
　組換え鶏痘ウイルス（ＦＰＶ）は先に記述された方法（ジェンキンス(Jenkins) ら, AIDS Research and Human Retroviruses 7: 991-998 (1991)) に類似の方法で相同組換えにより構築した。外来配列類はＦＰＶゲノムのＢａｍＨＩ　Ｊ領域内のＢｇｌII部位に挿入された。ＦＰＶ１２−１はプラスミドベクターｐＡｂＴ２３００を用いて構築し、ワクシニア４０Ｋプロモーターの制御下にある大腸菌ｌａｃＺ遺伝子を含む（ロゼル(Rosel)ら, J. Virol. 60: 436-439  (1986) においてＨ６と命名された）。ＦＰＶ６６、６７、７２及び７５はプラスミドベクターｐＡｂＴ４１２５、ｐＡｂＴ４１２３、ｐＡｂＴ４１３２、及びｐＡｂＴ８５９をそれぞれ用いて構築した。これらはそれぞれＦＰＶ　Ｃ１プロモーター（ジェンキンス(Jenkins) ら，上掲（1991) ）の制御下にあるｌａｃＺ遺伝子を含む、これらの４個の組換え体はそれぞれ１個の付加的な遺伝子、即ちそれぞれＨＩＶＩＩＩＢｅｎｖ遺伝子、ＳＩＶｍａｃ２５１ｅｎｖ遺伝子、エイメリア・テネラ（Eimeria tenella)遺伝子、又はＨＩＶＩＩＩＢｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子を含み、それぞれ４０Ｋプロモーターの制御下にある。ｖＴ３２はプラスミドベクターｐＡｂＴ１０１６を用いて構築された、そしてこれはワクシニア４０Ｋの制御下にあるサイトカイン腫瘍壊死因子をコードする遺伝子及びＦＰＶ　Ｃ１プロモーターの制御下にあるｌａｃＺ遺伝子を含む。
　組換え豚痘ウイルス（ＳＰＶ）は先に記述された方法（マケット(Mackett)ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 7415-7419(1982)）に類似の方法で相同組換えにより構築した。外来配列類は、ＳＰＶゲノム（フェラー(Feller)ら, 上掲（1991））のチミジンキナーゼ領域内のＮｄｅＩ部位に挿入された。ＳＰＶｖ１７ａはプラスミドベクターｐＪＡＦ：ｌａｃＺを用いて構築された、そしてこれはワクシニア１１Ｋプロモーターの制御下にあるｌａｃＺ遺伝子を含む。ＳＰＶｖＴ６ＲはプラスミドベクターｐＴ１０５を用いて構築された、そしてワクシニア７．５Ｋプロモーターの制御下にあるＨＩＶｇａｇｐ５５遺伝子ＷＯ９１／１９８０３及び１１Ｋプロモーターの制御下にあるｌａｃＺ遺伝子を含む。ワクシニア／ＴＮＦ及びワクシニア／ＩＬ−２組換え体はそれぞれプラスミドベクターｐＴ１０２１及びｐＴ２００４を用いて構築した。それぞれはワクシニア４０Ｋプロモーターの制御下にあるサイトカインＴＮＦ又はＩＬ−２及び鶏痘Ｃ１プロモーターの制御下にあるｌａｃＺ遺伝子を含む。
　プラスミドｐＴ１０１６及びｐＴ１０５の試料はブダペスト条約に基づきアメリカン・タイプ・カルチュア・コレクション（ＡＴＣＣ）、１２３０１、パークローン・ドライブ、ロックビル、メリーランド，ＵＳＡに１９９４年５月２日に寄託され、それぞれＡＴＣＣ寄託番号７５７６５及び７５７６６を受けた。
【実施例２】
【００３７】
組換えＦＰＶ又はＳＰＶで感染させた腫瘍浸潤性リンパ球及びヒトリンパ球細胞株における感染性、生存率及びベクター媒介遺伝子発現の期間
　感染多重度のそれぞれに対し、所望の多重度となるように緩衝液とウイルスの混合物中にＴＩＬ細胞を懸濁した。３７℃で１５分間インキュベートした後、細胞をＩＬ−２及び抗生物質を含むＡＩＭ　Ｖ培養基中に希釈した。次いで、各穴に１０６個の細胞がはいるように細胞を多穴組織培養プレート中に入れた。細胞を３７℃で種々の時間インキュベートした。各時間において、各多重度の２つの穴から独立に収穫し、トリパンブルーで染色して生細胞の総数を計測し、次いでグルタルデハイドで固定しそしてβ−ガラクトシダーゼを発現している細胞を検出するためＸ−ｇａｌで染色した。実験の結果を以下に示す。
【００３８】
実験１（ヒトＴＩＬ＋ＦＰＶ１２−１）
【表１】
2004008224.tif 000002
【００３９】
　実験２（ヒトＴＩＬ＋ＦＰＶ１２−１）
【表２】
2004008224.tif 000003
＊ 細胞は４日で 4×10５ 細胞／穴まで分裂した。
＊＊培養は６日までに汚染された。
【００４０】
　実験３（マウスＭＣ−３８ＴＩＬ＋ＦＰＶ１２−１）
【表３】
2004008224.tif 000004
＊ 細胞１日で 2.5×10５ 細胞／穴まで分裂した。
＊＊培養は５日までに汚染された。
＊＊＊ ＮＤ＝実験せず。
【００４１】
　実験４（ヒトＴＩＬ＋ＳＰＶｖ１７ａ）
【表４】
2004008224.tif 000005
＊ 細胞は３日で10６ 細胞／穴まで分裂した。
【００４２】
【表５】
2004008224.tif 000006
＊ 細胞は３日で10６ 細胞／穴まで分裂した。
【実施例３】
【００４３】
ヒトリンパ球における外来タンパク質の組換えＦＰＶに指令された発現
　細胞を表に記載されたＭＯＩで感染させ、そして外来タンパク質の発現を感染２４時間後に試験した。エンベロープ糖タンパク質の発現を試験するため、細胞を顕微鏡下に観察しシンシチウムの存在をチェックした。ｌａｃＺの発現を試験するため、単細胞青色分析（single cell blue analysis)を行った。発現は感染２４時間後に分析した。全ての実験で負の対照として野性型のＦＰＶを用いた。
【００４４】
【表６】
2004008224.tif 000007
１  SUP-T1 及びHUT-78はＣＤ４を発現するヒトＴ細胞株である。JY-LCLはヒトＢ細胞株である。
２ MOI:感染多重度。
３ ND: 測定せず。力価測定していないウイルスを使用した。
【実施例４】
【００４５】
　種々の感染多重度（ＭＯＩ＝２、５、又は２０ｐｆｕ／細胞）を用い１２−１（ＦＰＶ／ｌａｃＺ）で感染させたＴＩＬ細胞を蛍光活性化セルソーターを用いて感染の１、２、３、４及び７日後に分析した。標準と比較すると、β−ガラクトシダーゼを発現する細胞の数の指標が得られる。データは、より高いＭＯＩ（５及び２０）の場合は、β−ガラクトシダーゼの発現はＭＯＩ＝５で３日間検出され、そしてＭＯＩ＝２０では少なくとも４日間検出され得ることを示した。７日後までには、試験したどのＭＯＩでも検出できる発現は残っていなかった。
　同一患者由来のＴＩＬ細胞を用いて、トランスダクションを受けた細胞のパーセントをＭＯＩの関数として測定しそして感染後の日数を測定した。トランスダクションを受けた細胞のパーセントは低い値に留まった（ＭＯＩ＝２で１５％、ＭＯＩ＝５で３３％）、そして低ＭＯＩ及び中間のＭＯＩでは２日にピークがあった。高ＭＯＩ（ＭＯＩ＝２０）では、トランスダクション効率は高く、２日後で９９％に達し、そして４日後まで比較的高い値に留まった（４４％）。トランスダクションを受けた細胞のパーセントは７日後までにバックグラウンドのレベルに戻った。同じ期間の間、ＦＰＶ／ｌａｃＺで感染させた細胞は未感染対照と比較して正常に成長し続けた。
　別の患者のＴＩＬ細胞中での１２−１（ＦＰＶ／ｌａｃＺ）発現とｖ１７ａ（ＳＰＶ／ｌａｃＺ）発現の比較によれば、この２つのベクターの間のトランスダクションレベルの間や発現の持続期間の間に有為の差異は示されなかった。細胞の成長はいずれのベクターの感染によっても影響を受けなかった。
　ｌａｃＺ及びＴＮＦ両者を発現する組換えＦＰＶｖＴ３２をｌａｃＺのみを発現するベクターであるＦＰＶ１２−１と比較した。両組換え体共に高ＭＯＩの場合、低ＭＯＩまたは対照と比べて大きなパーセンテージの細胞に感染した。１２−１又はｖＴ３２のいずれかによるβ−ガラクトシダーゼの発現は、少なくとも３日間は初期値に留まった、そして単一遺伝子挿入体である１２−１については、感染後７日間の長期にわたって初期値に留まった。細胞の成長は実験の期間にわたって正常に留まった。
【実施例５】
【００４６】
ＳＰＶを感染させた種々の細胞株における感染性、遺伝子発現、及び細胞変性効果
　豚痘ウイルス（ＳＰＶ）の感染能及び様々な種由来の細胞中での遺伝子発現を受ける能力を研究するため、感染したブタ細胞（ＰＫ−１５）、感染ウサギ細胞（ＲＫ−１３）、及び感染霊長類細胞（ＶＥＲＯ及びＢＳＣ４０）で遺伝子発現を評価した。細胞類は、ｌａｃＺ遺伝子を含むＳＰＶ組換え体ｖ１７ａを用いＭＯＩ５又は１ｐｆｕ／細胞で感染させた。２４時間後に細胞を細胞変性効果（ＣＰＥ）について顕微鏡的に観察し、そしてＳＰＶにコードされたｌａｃＺ遺伝子の発現を観察するためにＸｇａｌで染色した。青色細胞のパーセンテージを測定したところ、ＳＰＶによる感染及びβ−ガラクトシダーゼの発現を示した。その結果を表（７）に示す。
【００４７】
【表７】
2004008224.tif 000008
この結果はＳＰＶが細胞変性効果（ＣＰＥ）を惹起することなくＢＳＣ−４０細胞を感染させることができること及びこれらの細胞中でβ−ガラクトシダーゼを発現することができることを明らかにする。
【実施例６】
【００４８】
ＳＰＶの低複製効率
　ＳＰＶの複製効率を試験するために、それぞれが約１０６ 細胞を含むＢＳＣ−４０細胞及びＰＫ−１５細胞の６ｃｍプレートにＳＰＶを０．１又は０．０１ｐｆｕ／細胞のＭＯＩで感染させた。ウイルスを感染５日後に収穫し、ＰＫ−１５細胞上で力価を測定した。この結果を以下の表（８）に示す。
【００４９】
【表８】
2004008224.tif 000009
【００５０】
　これらの結果はＳＰＶがＢＳＣ−４０細胞上で約０．７ｐｆｕ／細胞のそしてＰＫ−１５細胞上で１７ｐｆｕ／細胞の複製効率を持つことを示す。
【実施例７】
【００５１】
感染細胞によるＳＰＶ−媒介タンパク質発現の期間
　非−豚細胞中でタンパク質発現を指示する組換えＳＰＶの能力を評価するために、ＢＳＣ−４０細胞を大腸菌ｌａｃＺ遺伝子を含む組換えＳＰＶｖ１７ａで感染させ、そしてｌａｃＺの発現をβ−ガラクトシダーゼに対するモノクローナル抗体を用いるウエスタン・ブロットにより評価した。ＢＳＣ−４０細胞は、ｌａｃＺ遺伝子を含むＳＰＶ組換え体を用い、１又は０．１ｐｆｕ／細胞のＭＯＩで感染させ、そして感染の２、３及び４日後に細胞溶菌液を調製した。ウエスタン分析はβ−ガラクトシダーゼに対し特異的なモノクローナル抗体を用いて行った。β−ガラクトシダーゼの発現は全ての試料中で検出された。
　次いで、ＨＩＶｇａｇｐ５５前駆体ポリペプチドを発現するＳＰＶ組換えｖＴ６Ｒを用いて同様な発現分析を行った。ＢＳＣ−４０細胞とＰＫ−１５細胞を０．１ｐｆｕ／細胞のＭＯＩで感染させた。培地を感染２日後に除去し高速で遠心分離して存在するすべてのＨＩＶ様粒子をペレット化し、そして細胞にＤＭＥ＋５％ＦＣＳを補充した。２日後に、培地を再度収穫し高速遠心分離で分画し、そして感染細胞をＰＭＳＦを含む低張液中で溶解した。ウエスタン・ブロット分析はヒトＨＩＶ＋抗血清を用いて行った。この実験により、細胞溶菌液及び培地の高速遠心分離後のぺレット化物の両方共がｐ５５ｇａｇ前駆体ポリペプチドを含むことが示された。これらの実験はＳＰＶ−媒介遺伝子発現が感染細胞中で少なくとも４日間は継続することを示唆する。
　次の実験は３種の異なる細胞株中でのＳＰＶ−媒介遺伝子発現の持続期間を試験するために設計された。これらの実験では、血清濃度、細胞の再フィード、及び多数回培地収穫などの種々の細胞培養パラメーターが評価された。ｖＴ６Ｒを用い０．１ｐｆｕ／細胞のＭＯＩで細胞を感染させ、上述のように細胞溶菌液と培養培地を処理した。この実験は感染細胞が高ＣＰＥを示すまで続けた。実験のプロトコールの概略を表（９）に示す。
【００５２】
【表９】
2004008224.tif 000010
【００５３】
　粒子調製物はｐ２４−特異的モノクローナル抗体を用いるウエスタン・ブロットで分析し、ＳＰＶの存在について力価を測定した。また、調製物の一部についてｐ２４　ＥＬＩＳＡで分析した。その結果はＰＫ−１５細胞株及びＢＳＣ−４０細胞株が最高量のＨＩＶ−１ｇａｇｐ５５粒子を生産しそしてＲＫ−１３細胞はより少量しか生産しないことを示した。遺伝子発現は高ＣＰＥが観察されるまで６〜７日間観察した。ＳＰＶ力価は、培地（残りの添加ウイルスを除く）を除去しそして低複製効率を示す感染単一層を再フィードした後に減少した。
　実験は、種々の量の血清を含む培地中、０．１ｐｆｕ／細胞のＭＯＩでｖＴ６Ｒにより感染させたＢＳＣ−４０細胞を用いて繰り返された。接種ウイルスは感染後２４時間後に除去し、単一層を種々の量の血清を含むＤＭＥで２回洗浄した。多数回収穫(multiple harvesting) 及び再フィーディングを行った。粒子調製物を調製し、ウエスタン・ブロット分析、ＳＰＶ力価測定、及びｐ２４　ＥＬＩＳＡに付した。その結果から、６日間がＨＩＶ様粒子生産の良好なレベルを示すことが確認された。また、低複製効率を示すＳＰＶの低力価が得られた。
【実施例８】
【００５４】
組換え鶏痘ウイルス（ＦＰＶ）で感染させた腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬｓ）中での生存率及びベクター−媒介遺伝子発現の持続期間性
　ヒトＴＩＬ細胞、患者番号１３０６を、ｌａｃＺ遺伝子を含む組換え鶏痘ウイルス１２−１の感染多重度（ＭＯＩ）１０で感染させた。感染細胞は感染後の種々の時間にＸｇａｌで染色し、そして存在する青色細胞のパーセンテージを顕微鏡下に調べたところ、ＦＰＶによる感染及びβ−ガラクトシダーゼの発現が示された。また、細胞をトリパンブルーで染色し感染後種々の時間における生細胞のパーセンテージを測定した。細胞の成長を持続させるために、収穫しサブコンフルエントの密度に再接種することにより３日後及び８日後に細胞を分割した。試料は２連で分析した。その結果を表（１０）に示す。
【００５５】
　ＦＰＶ／ｌａｃＺ−感染ＴＩＬ細胞中での生存率及びＬａｃＺの発現
【表１０】
2004008224.tif 000011
【００５６】
　この結果は、ＦＰＶがヒトＴＩＬｓを感染することができ、そして少なくとも９日間はβ−ガラクトシダーゼを発現することを示す。また、感染細胞において、高レベルの細胞生存率が維持される。
　別の実験では、４種の異なるヒトＴＩＬ細胞（患者番号１３９４、１３９５、１３６２及び１３５９）を、サイトカインである腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）を発現する鶏痘組換え体、ｖＴ３２を用いて種々のＭＯＩで感染させた。ＴＮＦは通常発現されそして感染細胞の培養培地中に分泌される。培養培地を４日間の感染期間にわたる種々の時間で回収し、そしてＥＬＩＳＡ（Quantikine Kit, R & D システム）によりＴＮＦについて試験した。細胞生存率もこの期間にわたってモニターした。結果を表（１１）及び（１２）に示す。
【００５７】
ＦＰＶ／ＴＮＦ−感染ＴＩＬ細胞の生存率（％）
【表１１】
2004008224.tif 000012
【００５８】
　ＦＰＶ／ＴＮＦ−感染ＴＩＬ細胞におけるＴＮＦの発現
【表１２】
2004008224.tif 000013
　＊ ＮＤ＝測定せず。
　＊＊ＴＮＦレベルは、ピコグラムＴＮＦ／ 5×10５ 細胞／ｍｌ／24時間として表す。
　非感染ＴＩＬｓはこの試験では低いバックグラウンドレベルのＴＮＦ反応性を示す。しかしながら、ＴＮＦを含む鶏痘組換え体で感染させた細胞ではＴＮＦレベルは遙に高い。表（１０）〜（１２）に示す結果は、組換え鶏痘が種々のＴＩＬ細胞を感染させることができ、そして高レベルの細胞生存率及びベクター媒介遺伝子発現を維持することができることを明らかにする。
【実施例９】
【００５９】
組換え鶏痘ウイルスで感染させたヒト腫瘍細胞株の生存率及びベクター媒介遺伝子発現の持続期間
　ヒトＴＩＬ細胞（患者番号１３２７）及びヒトメラノーマ腫瘍細胞株（患者番号１１４３）をｌａｃＺ遺伝子を含む組換えＦＰＶ、即ちＦＰＶ１２−１を用い種々のＭＯＩで感染させた。生存率及びβ−ガラクトシダーゼ発現を感染の１日後及び５日後にモニターした。試料は２連で分析した。その結果を表（１３）に示す。
【００６０】
ＦＰＶ／ｌａｃＺ−感染ＴＩＬ細胞及び腫瘍細胞の生存率及びＬａｃＺの発現
【表１３】
2004008224.tif 000014
【００６１】
　この結果は、組換えＦＰＶで感染した１３２７ＴＩＬ細胞及びヒトメラノーマ細胞株１１４３の両者共高い感染性及びＦＰＶにコードされたｌａｃＺ遺伝子の発現を示した。非感染メラノーマ細胞の生存率はＴＩＬのそれよりもより高い生存率を示した。しかし、組換えＦＰＶでの感染はこの実験の５日間の期間では細胞の生存率を変えなかった。
　生存率及びＦＰＶ−媒介遺伝子発現については、ＴＮＦ遺伝子又はｌａｃＺ遺伝子を含む組換えＦＰＶで感染させたさらに２種の腫瘍細胞株（メラノーマ患者番号１１８２及びメラノーマ患者番号１１９９）について評価した。細胞を０及び２０のＭＯＩで感染させそして感染後３日間モニターした。細胞生存率を評価しそして培養培地中の感染細胞からのＴＮＦレベルをＥＬＩＳＡによって測定した。その結果を表（１４）に示す。
【００６２】
ＦＰＶ／ＴＮＦ−感染腫瘍細胞株の生存率及びＴＮＦ発現
【表１４】
2004008224.tif 000015
＊ ＮＤ＝測定せず。
　組換えＦＰＶで感染させたヒト腫瘍細胞株中で、高レベルのベクター媒介ＴＮＦ発現がこの実験の３日間にわたって観察された。
【実施例１０】
【００６３】
組換え鶏痘ウイルスで感染させた新鮮ヒト腫瘍細胞におけるベクター媒介遺伝子発現の持続期間
　腫瘍細胞は３人の異なる患者（１３７６、１３６０、及び１３９４）由来のメラノーマ腫瘍から抽出された。ｖＴ３２を用い０又は５０のＭＯＩで細胞を感染させ、そして感染後種々の時間に採取した培養培地についてＥＬＩＳＡによりＴＮＦ生産を評価した。結果を表（１５）に示す。
【００６４】
　ＦＰＶ／ＴＮＦ−感染新鮮腫瘍細胞におけるＴＮＦの発現
【表１５】
2004008224.tif 000016
【実施例１１】
【００６５】
　減弱下ワクシニアウイルスで感染させたＴＩＬ細胞におけるベクター媒介遺伝子発現の持続期間
　ワクシニアウイルスは通常細胞に対し細胞変性的であり、急速に細胞を死滅させる。組換えワクシニアウイルスは、ワクシニアウイルスのニューヨーク　シティ　ボード　オブ　ヘルス株中にＴＮＦ遺伝子を挿入することによって構築された。ＴＩＬ細胞、患者番号１３９５をこのウイルスの種々のＭＯＩで感染させた。感染後種々の時間に細胞生存率を評価した。その結果を表（１６）に示す。
【００６６】
　非減弱化ワクシニアウイルスで感染させたＴＩＬ細胞の生存率
【表１６】
2004008224.tif 000017
【００６７】
　ワクシニアウイルスの減弱化株は、ワクシニアの「正常」株よりも感染及び遺伝子発現のより長い持続期間を達成することができ、従って短期間遺伝子治療のための候補ベクターとなり得る。ワクシニアウイルスのワイエス（Wyeth)天然痘ワクチン株は他のワクシニアウイルス株よりもさらに減弱化されている。さらに、個々のウイルスプラークを選択し精製することによって天然痘ワクチンから誘導されたウイルスストックは、マウスの神経毒性により測定すると元のワイエス株よりもさらに一層減弱化されている。このワクシニアウイルスはＴＢＣ−Ｗｙと命名されている。
　ヒトＩＬ−２をコードする遺伝子を、ワクシニア株ＴＢＣ−ＷｙのゲノムのＨｉｎｄIII Ｍ領域中に挿入し、これを使用して感染したＴＩＬ細胞中でのこの減弱化組換えワクシニアウイルスにより媒介される遺伝子発現の持続性を評価した。ＴＩＬ細胞の白色株を、ＶＴ２００４と命名されたこの組換え体で、種々のＭＯＩで感染させた。ＩＬ−２の発現は感染後の種々の時間に培養培地を収穫した後ＥＬＩＳＡ（Quantikine Kit, R & D システムス）で測定した。その結果を表（１７）に示す。
【００６８】
ワクシニア／ＩＬ−２感染１３５８ＴＩＬ細胞の生存率及びＩＬ−２発現
【表１７】
2004008224.tif 000018
【００６９】
　生存率は感染細胞中で高く維持されている。ＩＬ−２のバックグラウンドレベルは非感染細胞で観察される。しかし感染細胞は実質的により高いレベルのＩＬ−２を示す。
　さらに２種のＴＩＬ細胞、患者番号１３７６及び１３８１中で、ＴＢＣ−Ｗｙワクシニア／ＩＬ−２組換え体をさらに試験した。ＴＩＬｓを１０及び３０のＭＯＩで感染させ、４日の感染期間にわたって培養培地を収穫しＥＬＩＳＡでＩＬ−２を試験した。細胞生存率を表（１８）にそしてＩＬ−２発現を表（１９）に示す。
【００７０】
　　ワクシニア／ＩＬ−２−感染ＴＩＬ細胞：生存率
【表１８】
2004008224.tif 000019
【００７１】
　　ワクシニア／ＩＬ−２−感染ＴＩＬ細胞：ＩＬ−２発現
【表１９】
2004008224.tif 000020
【００７２】
　表（１７）〜（１９）に示す結果は、減弱化ワクシニアウイルスで感染させたＴＩＬｓは高レベルの組換えタンパク質を発現しながら驚くべき高レベルの生存率を維持することを示す。
　本明細書において引用された参考文献は参照により本明細書にインコーポレートされる。
　本発明はそれらの好ましい態様を含め詳細に記述された。しかし、当業者はこの開示の考察に基づき、請求の範囲に記載された発明の精神及び範囲から逸脱することなく、それらについて修飾及び改良をすることができることを認めるであろう
【産業上の利用可能性】
【００７３】
　本発明のウイルスベクターは、細胞に感染することができ、大量の遺伝物質を効率的に保持しかつ発現することができ、しかもその細胞に対して細胞障害性を有しないので、ガンなどの遺伝子病の体細胞治療や遺伝子治療に極めて有用である。