(57)【要約】【課題】キシレンモノオキシゲナーゼにより、キシレン上の両メチル基が酸化された一連の酸化物の製造法を提供する。また、安価なキシレンなどを出発原料として、キシレンモノオキシゲナーゼ等を用いて、分離抽出操作なしにキシリレングリコール類を製造する方法を提供する。【解決手段】キシレン、メチルベンジルアルコール、及び／又はトルアルデヒドを、キシレンモノオキシゲナーゼを産生する微生物により酸化させ、ヒドロキシメチルベンズアルデヒド及び／又はフタルアルデヒドを製造する。またこのようにして得たヒドロキシメチルベンズアルデヒド及び／又はフタルアルデヒドを、当該微生物が有する還元酵素により還元させ、キシリレングリコールを製造する。【選択図】　　図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
キシレン、メチルベンジルアルコール、及び／又はトルアルデヒドを、キシレンモノオキシゲナーゼを産生する微生物により酸化させることを特徴とする、ヒドロキシメチルベンズアルデヒド及び／又はフタルアルデヒドの製造方法。
【請求項２】
キシレン、メチルベンジルアルコール、及び／又はトルアルデヒドを、キシレンモノオキシゲナーゼを産生する微生物により酸化させ、ヒドロキシメチルベンズアルデヒド及び／又はフタルアルデヒドを得、それを当該微生物が有する還元酵素により還元させることを特徴とする、キシリレングリコールの製造方法。
【請求項３】
キシレンモノオキシゲナーゼを産生する微生物が、キシレンモノオキシゲナーゼをコードする遺伝子を含んだプラスミドで形質転換された大腸菌であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
キシレン、メチルベンジルアルコール、及び／又はメチルベンズアルデヒドがパラ体又はメタ体であることを特徴とする、請求項１〜３いずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、キシレンモノオキシゲナーゼを産生する微生物による酸化反応を利用した化合物の製造方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
酸化酵素であるキシレンモノオキシゲナーゼはキシレン類やトルエンあるいはそれらの誘導体、芳香族５員複素環化合物、芳香族６員複素環化合物などの分子中のメチル基を酸化する酵素として知られており、キシレンのメチル基を直接酸化することができる。この酵素の代表的なものにはシュードモナス・プチダｍｔ−２（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ　ｍｔ−２）のキシレンモノオキシゲナーゼ（特許２７９２０５２号）、シュードモナス・プチダＨＳ１（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ　ＨＳ１）のキシレンモノオキシゲナーゼがある。またシュードモナス・オレオボランス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ）のアルカン−１−モノオキシゲナーゼや、メタン資化菌の例えばメチロコッカス・カプスラタスＢａｔｈ（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ　Ｂａｔｈ）のメタンモノオキシゲナーゼにもトルエンのメチル基を酸化してベンジルアルコールを生成する酵素活性があることが知られている。いずれのモノオキシゲナーゼも複数のコンポーネントからなる酵素である。
【０００３】
シュードモナス・プチダｍｔ−２のキシレンモノオキシゲナーゼは、ＴＯＬ−プラスミドｐＷＷＯ上の、ｘｙｌＭ遺伝子がコードするヒドロキシラーゼ（ＸｙｌＭ）とｘｙｌＡ遺伝子がコードするＮＡＤＨ：アクセプター・レダクターゼ（ＸｙｌＡ）とから構成されている。
【０００４】
これまでキシレンモノオキシゲナーゼが有する酸化酵素活性によりベンゼン環上に直接結合したメチル基が酸化されてゆく過程を示した例として、トルエンがベンジルアルコール、ベンズアルデヒドを経て安息香酸へと酸化された例、シュードクメンが３，４−ジメチルベンジルアルコール、３，４−ジメチルベンズアルデヒドを経て３，４−ジメチル安息香酸へと酸化された例が報告されている（Ｂｒｕｎｏ　Ｂｕｈｌｅｒら（２０００）Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　Ｖｏｌ．２７５，Ｎｏ．１４　１００８５−１００９２）。また、キシレンモノオキシゲナーゼは様々な置換基を有するベンゼン環上のメチル基を酸化する、幅広い基質特異性を持つことが知られている（Ｍａｒｃｅｌ　Ｇ　Ｗｕｂｂｏｌｔｓら（１９９４）Ｅｎｚｙｍｅ　Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．Ｖｏｌ．１６，６０８−６１５）。
【０００５】
しかしこれらの例では、いずれもベンゼン環上の一つのメチル基が酸化された現象しか報告されておらず、例えばキシレン類を基質として用いた場合に、キシレン上の両メチル基の酸化反応が進行するという報告はこれまで成されていなかった。また、基質として芳香族５員複素環化合物、芳香族６員複素環化合物を用いた場合においても、複素環上の両メチル基の酸化反応が進行するという報告はこれまで成されていない（特開平５−１３０８７５号公報）。
【０００６】
また、工業的利用価値が高い化合物である１，４−シクロヘキサンジメタノールや１，３−ビスメチルシクロヘキサンジイソシアネートは、キシレン上の両メチル基が酸化された化合物である１，４−ベンゼンジメタノール或いは１，３−ベンゼンジメタノールからそれぞれ化学的に誘導することができる。これらのベンゼンジメタノール類の製法としては、フタル酸エステル、フタルアルデヒドなどの還元、またはビスクロロメチルベンゼンのアルカリ加水分解などの方法があるが、いずれも、比較的高価な原料を用いている点、還元法では多くの有機溶媒を用いる点、廃棄物の発生などが問題点として挙げられる。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明はこれまでキシレンモノオキシゲナーゼを用いたケースでは報告例の無い、キシレン上の両メチル基が酸化された一連の酸化物の製造法を提供することを目的とする。また、安価なキシレンなどを出発原料として、酸化酵素を利用して、分離抽出操作なしでもキシリレングリコール類を製造することができる方法を提供するものである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
前記目的を達成するために本発明者らは鋭意検討した結果、本発明に到達した。即ち本発明は、キシレン、メチルベンジルアルコール、及び／又はトルアルデヒドを、キシレンモノオキシゲナーゼを産生する微生物により酸化させることを特徴とする、ヒドロキシメチルベンズアルデヒド及び／又はフタルアルデヒドの製造方法である。また本発明は、前述のようにしてヒドロキシメチルベンズアルデヒド及び／又はフタルアルデヒドを得、それを当該微生物が有する還元酵素により還元させることを特徴とする、キシリレングリコールの製造方法である。以下、本発明を更に詳細に説明する。
【０００９】
本発明に用いられる微生物としては、キシレンモノオキシゲナーゼを産生するものであれば特に限定はないが、キシレンモノオキシゲナーゼを効率よく産生する微生物が好ましい。例えば大腸菌の形質転換体である、Ｃ６００ＭＡ、ＭＣ４１００ＭＡなどのＸｙｌＭＡ活性の高い形質転換体を用いることが望ましい。
【００１０】
本発明では、キシレン、メチルベンジルアルコール、及び／又はトルアルデヒドを、キシレンモノオキシゲナーゼで酸化させる。これらの化合物にはオルト体、メタ体、パラ体の異性体が存在するが、なかでもメタ体、パラ体が好ましい。以下、パラ体の反応式（１）を例に説明する。
【００１１】
【化１】
2004008149.tif 000003
式中、実線の矢印はキシレンモノオキシゲナーゼによる酸化反応を、点線の矢印は微生物由来の還元酵素による還元反応を示す。
【００１２】
例えばｐ−キシレンを基質として添加した場合、キシレンモノオキシゲナーゼの作用により、ｐ−キシレン上の一方のメチル基がヒドロキシメチル基へとまず酸化されｐ−メチルベンジルアルコールが生成し、そのヒドロキシメチル基が更にアルデヒド基へと酸化されることによりｐ−トルアルデヒドが系内に生成する。次にキシレンモノオキシゲナーゼの作用により、ｐ−トルアルデヒド上のメチル基がヒドロキシメチル基へと酸化され、ｐ−ヒドロキシメチルベンズアルデヒドが生成し、そのヒドロキシメチル基がさらにアルデヒド基へと酸化されることにより、テレフタルアルデヒドが系内に生成する。
【００１３】
従ってｐ−キシレンばかりでなく、ｐ−キシレン上の一方のメチル基が酸化された化合物であるｐ−メチルベンジルアルコール及び／又はｐ−トルアルデヒドを出発原料として用いた場合も同様の経路により反応が進行し、ｐ−キシレン上の両メチル基が酸化された化合物を得ることができる。
【００１４】
一方、酸化反応により生成したｐ−ヒドロキシメチルベンズアルデヒド及び／又はテレフタルアルデヒドに存在するアルデヒド基は、当該微生物の有する還元酵素の作用により還元されてアルコール基となる。従って、テレフタルアルデヒドは、まず一方のアルデヒド基が還元されてｐ−ヒドロキシメチルベンズアルデヒドが生成し、更にもう一方のアルデヒド基が還元されて、最終的にｐ−キシリレングリコールが生じる。
【００１５】
以上、パラ体を例に反応を説明したが、メタ体でも以下の反応式（２）のように、同様の反応が進行する。
【００１６】
【化２】
2004008149.tif 000004
式中、実線の矢印はキシレンモノオキシゲナーゼによる酸化反応を、点線の矢印は微生物由来の還元酵素による還元反応を示す。
【００１７】
以上のように、本発明によりキシレン、メチルベンジルアルコール、及び／又はトルアルデヒドを酸化させて、ヒドロキシメチルベンズアルデヒド及び／又はフタルアルデヒドを得ることができ、さらにそれを当該微生物が有する還元酵素により還元させてヒドロキシメチルベンズアルデヒド及び／又はキシリレングリコールを得ることができる。本発明ではこのような化合物群を混合物として、あるいは反応条件のコントロールにより、特定の物質を主生成物として得ることが可能である。
【００１８】
【実施例】
以下、本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例により限定されるものではない。
【００１９】
実施例１　形質転換体の作製
最初に、目的とする遺伝子をＰＣＲ反応によって増幅するための鋳型となるＤＮＡ（ＴＯＬ−プラスミドｐＷＷＯ）を、シュードモナス・プチダｍｔ−２からアルカリＳＤＳ法により調製した。
【００２０】
次にＴＯＬ−プラスミドｐＷＷＯを鋳型とし、プライマー１（配列番号１）とプライマー２（配列番号２）を用いて、キシレンモノオキシゲナーゼのｘｙｌＭ遺伝子とキシレンモノオキシゲナーゼのＮＡＤＨ：アクセプター・レダクターゼ遺伝子（ｘｙｌＡ遺伝子）を含むＤＮＡを増幅し（ＴａＫａＲａ製、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ　ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）、ＮｃｏＩとＰｓｔＩで切断した。これを予めＮｃｏＩとＰｓｔＩで切断したｐＴｒｃ９９Ａ（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）に挿入することにより、ｘｙｌＭ遺伝子とｘｙｌＡ遺伝子の間にノンコード領域をもつプラスミドｐＴｒｃＭＡを得た。
【００２１】
エシェリヒア・コリＣ６００、エシェリヒア・コリＭＣ４１００、エシェリヒア・コリＪＭ１０１、エシェリヒア・コリＪＭ１０９、エシェリヒア・コリＷ３１１０、エシェリヒア・コリＲＢ７９１のそれぞれのコンピテントセルをｐＴｒｃＭＡで形質転換して、Ｃ６００ＭＡ、ＭＣ４１００ＭＡ、ＪＭ１０１ＭＡ、ＪＭ１０９ＭＡ、Ｗ３１１０ＭＡ、ＲＢ７９１ＭＡを作製した。
【００２２】
またエシェリヒア・コリＣ６００、エシェリヒア・コリＭＣ４１００、エシェリヒア・コリＪＭ１０１、エシェリヒア・コリＪＭ１０９、エシェリヒア・コリＷ３１１０のそれぞれのコンピテントセルにｐＴｒｃ９９Ａで形質転換して、Ｃ６００Ｖ、ＭＣ４１００Ｖ、ＪＭ１０１Ｖ、ＪＭ１０９Ｖ、Ｗ３１１０Ｖを作製した。
【００２３】
形質転換体は１％トリプトンペプトン、０．５％Ｙｅａｓｔ　Ｅｘｔｒａｃｔ、１％ＮａＣｌ、０．００５Ｍ　ＮａＯＨ、０．０５ｍｇ／ｍｌカルベニシリン（ｃａｒｂｅ）、２％Ｂａｃｔｏアガーからなる培地で平板培養して得られたコロニーを１％トリプトンペプトン、０．５％Ｙｅａｓｔ　Ｅｘｔｒａｃｔ、１％ＮａＣｌ、０．００５Ｍ　ＮａＯＨ、０．０５ｍｇ／ｍｌカルベニシリン（ｃａｒｂｅ）からなる培地（ＬＢ−ｃａｒｂｅ培地）で液体培養して増殖させ、その菌から調製したプラスミドのサイズおよびそのプラスミドの制限酵素消化断片のサイズから選別した。
【００２４】
実施例２　Ｃ６００ＭＡおよびＭＣ４１００ＭＡによるｐ−キシレン上の両メチル基の酸化反応
実施例１に記載の形質転換体であるＣ６００ＭＡ、ＭＣ４１００ＭＡ、Ｃ６００Ｖ、ＭＣ４１００Ｖを用いてｉｎ　ｖｉｖｏでのｐ−キシレンおよびｐ−キシレンの酸化物を基質とした酸化反応を行った。１．６％トリプトンペプトン、１％Ｙｅａｓｔ　Ｅｘｔｒａｃｔ、０．５％ＮａＣｌ、０．００５Ｍ　ＮａＯＨ、０．０５ｍｇ／ｍｌカルベニシリン（ｃａｒｂｅ）からなる培地（２×ＹＴ−ｃａｒｂｅ培地）３０ｍｌに対し、Ｃ６００ＭＡ、ＭＣ４１００ＭＡ、Ｃ６００Ｖ、ＭＣ４１００Ｖのグリセロールストックを３０μｌ添加したバッフル付き三角フラスコをそれぞれ１本ずつ用意し、菌体密度がＯＤ６００でＣ６００ＭＡは９．３、ＭＣ４１００ＭＡは８．９、Ｃ６００Ｖは９．６、ＭＣ４１００Ｖは８．５になるまでそれぞれ３７℃で攪拌速度１７０ｒｐｍでの攪拌下で１６．５時間終夜液体培養を行った。
【００２５】
次に２×ＹＴ−ｃａｒｂｅ培地１２０ｍｌに対し、それぞれの終夜培養物を２．５ｍｌ添加したバッフル付き三角フラスコを計４本用意し、菌体密度がＯＤ６００でＣ６００ＭＡは０．４、ＭＣ４１００ＭＡは０．７、Ｃ６００Ｖは０．５、ＭＣ４１００Ｖは０．８になるまでそれぞれ３７℃（攪拌速度１７０ｒｐｍ）で８０分間培養を行った。次にそれぞれの三角フラスコ中にイソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）を１ｍＭになるよう添加した後、引き続き３７℃（攪拌速度１７０ｒｐｍ）で３時間培養を行った。培養後の菌体密度はそれぞれＯＤ６００でＣ６００ＭＡは２．２、ＭＣ４１００ＭＡは６．９、Ｃ６００Ｖは５．５、ＭＣ４１００Ｖは７．４であった。次にこれらの菌体をそれぞれ回収し、１％グルコースを含む５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．４で２回洗浄後、同緩衝液で菌体を懸濁し、それぞれ菌体密度がＯＤ６００でＣ６００ＭＡは９．７、ＭＣ４１００ＭＡは１０．１、Ｃ６００Ｖは９．９、ＭＣ４１００Ｖは１０．１の懸濁液を調製した。
【００２６】
調製したこれら４種類の菌体密度がＯＤ６００で１０付近の懸濁液を、それぞれ１ｍｌずつ８ｍｌ容の栓つき試験管中に分注し、エタノールで３０ｍＭに調製したｐ−キシレン、ｐ−メチルベンジルアルコール、ｐ−トルアルデヒド、ｐ−キシリレングリコール、テレフタルアルデヒドをそれぞれ基質として、各菌体を分注した１本の栓つき試験管に対し５０μｌ添加した。栓つき試験管は密閉し水平に寝かせた状態で、３０℃で左右方向に２８０回／分で１時間および２時間振とうを行い、振とう後のサンプルは氷冷下で１０％過塩素酸水溶液を菌体懸濁液の８％体積だけ加えてｐＨ２とし、反応停止を行った。次に塩化ナトリウム５００ｍｇと０．２ｍＭ　ｎ−ドデカンのエーテル溶液１ｍｌを加え密閉し、栓つき試験管を水平に寝かせた状態で３０℃で左右方向に２８０回／分で振とうして塩化ナトリウムを水相に飽和させた後、遠心分離して、エーテル相をガスクロマトグラフィーにより分析した。
【００２７】
各反応液に検出された基質および生成物の濃度を図１〜４に示す。図中、横軸のＡ〜Ｅはそれぞれ生成物
Ａ；ｐ−キシレン
Ｂ；ｐ−メチルベンジルアルコール
Ｃ；ｐ−トルアルデヒド
Ｄ；ｐ−ヒドロキシメチルベンズアルデヒド
Ｅ；ｐ−キシリレングリコール
を示す。また基質欄は、
（−ＯＨ）；ｐ−メチルベンジルアルコール
（−ＣＨＯ）；ｐ−トルアルデヒド
（−ＯＨ）２；ｐ−キシリレングリコール
（−ＣＨＯ）２；テレフタルアルデヒド
を示す。
【００２８】
Ｃ６００ＶおよびＭＣ４１００Ｖを用いた場合は、ｐ−キシレン、ｐ−メチルベンジルアルコール、ｐ−キシリレングリコールを基質とした場合には変化は認められず、ｐ−トルアルデヒドおよびテレフタルアルデヒドを基質とした場合は大腸菌の持つ還元酵素の働きによりｐ−トルアルデヒドはｐ−メチルベンジルアルコールへ、テレフタルアルデヒドはｐ−ヒドロキシメチルベンズアルデヒドを経てｐ−キシリレングリコールへとそれぞれ変換反応が確認された。Ｃ６００ＭＡおよびＭＣ４１００ＭＡを用いた場合は、ｐ−キシレン→ｐ−メチルベンジルアルコール→ｐ−トルアルデヒド→ｐ−ヒドロキシメチルベンズアルデヒドの順で酸化反応が進行し、同時に大腸菌の還元酵素の働きによるｐ−トルアルデヒド→ｐ−メチルベンジルアルコール、テレフタルアルデヒド→ｐ−ヒドロキシメチルベンズアルデヒド→ｐ−キシリレングリコールの還元反応が進行することで、結果としてｐ−キシリレングリコールが蓄積することが明らかとなった。
【００２９】
Ｃ６００ＭＡがＭＣ４１００ＭＡよりもｐ−キシリレングリコール生成量が多いことは、Ｃ６００ＭＡの場合の方がＭＣ４１００ＭＡの場合よりもキシレンモノオキシゲナーゼの活性が高いことに起因していると考えられる。この結果からキシレンモノオキシゲナーゼの活性が高い形質転換体を用いることにより、ｐ−キシレン、ｐ−メチルベンジルアルコール、あるいはｐ−トルアルデヒドを基質としてｐ−キシリレングリコールが得られることが示された。
【００３０】
実施例３　Ｃ６００ＭＡによるｍ−キシレン上の両メチル基の酸化反応
実施例１に記載の形質転換体であるＣ６００ＭＡを用いてｉｎ　ｖｉｖｏでのｍ−キシレンおよびｍ−キシレンの酸化物を基質とした酸化反応を行った。２×ＹＴ−ｃａｒｂｅ培地３０ｍｌに対し、Ｃ６００ＭＡのグリセロールストックを３０μｌ添加したバッフル付き三角フラスコを１本用意し、菌体密度がＯＤ６００で９．９になるまで３７℃で攪拌速度１７０ｒｐｍでの攪拌下で１６時間終夜液体培養を行った。次に２×ＹＴ−ｃａｒｂｅ培地１２０ｍｌに対し、終夜培養物を２．５ｍｌ添加した三角フラスコを１本用意し、菌体密度がＯＤ６００で０．６になるまで３７℃（攪拌速度１７０ｒｐｍ）で８０分間培養を行った。次にＩＰＴＧを１ｍＭになるよう添加した後、引き続き３７℃（攪拌速度１７０ｒｐｍ）で３時間培養を行った。
【００３１】
次に菌体を回収し、１％グルコースを含む５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．４で２回洗浄後、同緩衝液で菌体を懸濁し、菌体密度がＯＤ６００で１０．１の懸濁液を調製した。この懸濁液を１ｍｌずつ８ｍｌ容栓つき試験管中に分注し、エタノールで３０ｍＭに調製したｍ−キシレン、ｍ−メチルベンジルアルコール、ｍ−トルアルデヒド、ｍ−ヒドロキシメチルベンズアルデヒド、イソフタルアルデヒド、ｍ−キシリレングリコールをそれぞれ基質として、１本の栓つき試験管に対し５０μｌ添加した。栓つき試験管は密閉し水平に寝かせた状態で、３０℃で左右方向に２８０回／分で反応時間０、１０、３０分で振とうを行い、振とう後のサンプルは氷冷下で１０％過塩素酸水溶液を菌体懸濁液の８％体積だけ加えてｐＨ２とし、反応停止を行った。次に塩化ナトリウム５００ｍｇと０．２ｍＭ　ｎ−ドデカンのエーテル溶液１ｍｌを加え密閉し、栓つき試験管を水平に寝かせた状態で３０℃で左右方向に２８０回／分で振とうして塩化ナトリウムを水相に飽和させた後、遠心分離して、エーテル相をガスクロマトグラフィーにより分析した。
【００３２】
反応後の生成物濃度の分布を図５，６に示す。図中、横軸のＡ〜Ｆはそれぞれ生成物
Ａ；ｍ−キシレン
Ｂ；ｍ−メチルベンジルアルコール
Ｃ；ｍ−トルアルデヒド
Ｄ；ｍ−ヒドロキシメチルベンズアルデヒド
Ｅ；イソフタルアルデヒド
Ｆ；ｍ−キシリレングリコール
を示す。また基質欄は、
（−ＯＨ）；ｍ−メチルベンジルアルコール
（−ＣＨＯ）；ｍ−トルアルデヒド
（−ＯＨ）２；ｍ−キシリレングリコール
（−ＣＨＯ）２；イソフタルアルデヒド
（−ＯＨ）（−ＣＨＯ）；ｍ−ヒドロキシメチルベンズアルデヒド
を示す。
【００３３】
ｍ−キシレン、ｍ−メチルベンジルアルコールを基質とした場合の反応時間１０、３０分の結果においてｍ−キシリレングリコールが生成していないことから、ｍ−メチルベンジルアルコール→ｍ−キシリレングリコールの酸化反応は進行せず、ｍ−キシレン→ｍ−メチルベンジルアルコール→ｍ−トルアルデヒド→ｍ−ヒドロキシメチルベンズアルデヒドの順に酸化反応が進行していることが明らかとなった。
【００３４】
実施例４　Ｃ６００ＭＡおよびＭＣ４１００ＭＡによるｍ−キシレン上の両メチル基の酸化反応
実施例１に記載の形質転換体であるＣ６００ＭＡ、ＭＣ４１００ＭＡ、Ｃ６００Ｖ、ＭＣ４１００Ｖを用いてｉｎ　ｖｉｖｏでのｍ−キシレンおよびｍ−キシレンの酸化物を基質とした酸化反応を行った。２×ＹＴ−ｃａｒｂｅ培地３０ｍｌに対し、Ｃ６００ＭＡ、ＭＣ４１００ＭＡ、Ｃ６００Ｖ、ＭＣ４１００Ｖのグリセロールストックを３０μｌ添加したバッフル付き三角フラスコをそれぞれ１本ずつ用意し、菌体密度がＯＤ６００でＣ６００ＭＡは９．６、ＭＣ４１００ＭＡは８．０、Ｃ６００Ｖは９．９、ＭＣ４１００Ｖは９．１になるまでそれぞれ３７℃で攪拌速度１７０ｒｐｍでの攪拌下で１６．５時間終夜液体培養を行った。
【００３５】
次に２×ＹＴ−ｃａｒｂｅ培地１２０ｍｌに対し、それぞれの終夜培養物を２．５ｍｌ添加したバッフル付き三角フラスコを計４本用意し、菌体密度がＯＤ６００でＣ６００ＭＡは０．６、ＭＣ４１００ＭＡは０．９、Ｃ６００Ｖは０．６、ＭＣ４１００Ｖは０．８になるまでそれぞれ３７℃（攪拌速度１７０ｒｐｍ）で８５分間培養を行った。次にそれぞれの三角フラスコ中にＩＰＴＧを１ｍＭになるよう添加した後、引き続き３７℃（攪拌速度１７０ｒｐｍ）で３時間培養を行った。次にこれらの菌体をそれぞれ回収し、１％グルコースを含む５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．４で２回洗浄後、同緩衝液で菌体を懸濁し、それぞれ菌体密度がＯＤ６００でＣ６００ＭＡは１０．３、ＭＣ４１００ＭＡは９．８、Ｃ６００Ｖは１０．７、ＭＣ４１００Ｖは１０．０の懸濁液を調製した。
【００３６】
調製したこれら４種類の菌体密度がＯＤ６００で１０付近の懸濁液を、それぞれ１ｍｌずつ栓つき試験管中に分注し、エタノールで３０ｍＭに調製したｍ−キシレン、ｍ−メチルベンジルアルコール、ｍ−トルアルデヒド、ｍ−キシリレングリコール、イソフタルアルデヒドをそれぞれ基質として、各菌体を分注した１本の栓つき試験管に対し５０μｌ添加した。栓つき試験管は密閉し水平に寝かせた状態で、３０℃で左右方向に２８０回／分で反応時間１時間および２時間で振とうを行い、振とう後のサンプルは氷冷下で１０％過塩素酸水溶液を菌体懸濁液の８％体積だけ加えてｐＨ２とし、反応停止を行った。次に塩化ナトリウム５００ｍｇと０．２ｍＭ　ｎ−ドデカンのエーテル溶液１ｍｌを加え密閉し、栓つき試験管を水平に寝かせた状態で３０℃で左右方向に２８０回／分で振とうして塩化ナトリウムを水相に飽和させた後、遠心分離して、エーテル相をガスクロマトグラフィーにより分析した。
【００３７】
各反応液に検出された基質および生成物の濃度を図７〜１０に示す。図中、横軸のＡ〜Ｅはそれぞれ生成物
Ａ；ｍ−キシレン
Ｂ；ｍ−メチルベンジルアルコール
Ｃ；ｍ−トルアルデヒド
Ｄ；ｍ−ヒドロキシメチルベンズアルデヒド
Ｅ；ｍ−キシリレングリコール
を示す。また基質欄は、
（−ＯＨ）；ｍ−メチルベンジルアルコール
（−ＣＨＯ）；ｍ−トルアルデヒド
（−ＯＨ）２；ｍ−キシリレングリコール
（−ＣＨＯ）２；イソフタルアルデヒド
を示す。
【００３８】
Ｃ６００ＶおよびＭＣ４１００Ｖを用いた場合は、ｍ−キシレン、ｍ−メチルベンジルアルコール、ｍ−キシリレングリコールを基質とした場合には変化は認められず、ｍ−トルアルデヒドおよびイソフタルアルデヒドを基質とした場合は大腸菌の持つ還元酵素の働きによりｍ−トルアルデヒドはｍ−メチルベンジルアルコールへ、イソフタルアルデヒドはｍ−ヒドロキシメチルベンズアルデヒドを経てｍ−キシリレングリコールへとそれぞれ変換反応が確認された。
【００３９】
また実施例３の結果を併せて考慮すると、Ｃ６００ＭＡおよびＭＣ４１００ＭＡを用いた場合は、ｍ−キシレン→ｍ−メチルベンジルアルコール→ｍ−トルアルデヒド→ｍ−ヒドロキシメチルベンズアルデヒドの順で酸化反応が進行し、同時に大腸菌の還元酵素の働きによるｍ−トルアルデヒド→ｍ−メチルベンジルアルコール、イソフタルアルデヒド→ｍ−ヒドロキシメチルベンズアルデヒド→ｍ−キシリレングリコールの還元反応が進行することで、結果としてｍ−キシリレングリコールが蓄積することが明らかとなった。Ｃ６００ＭＡがＭＣ４１００ＭＡよりもｍ−キシリレングリコール生成量が多いことは、Ｃ６００ＭＡの場合の方がＭＣ４１００ＭＡの場合よりもキシレンモノオキシゲナーゼの活性が高いことに起因していると考えられる。この結果からキシレンモノオキシゲナーゼの活性が高い形質転換体を用いることで、ｍ−キシレン、ｍ−メチルベンジルアルコール、ｍ−トルアルデヒドを基質としてｍ−キシリレングリコールが得られることが示された。
【００４０】
実施例５　キシレン上の両メチル基の酸化還元経路における各工程での酵素活性の解析
実施例１に記載の形質転換体であるＣ６００ＭＡとＣ６００Ｖを用いてｐ−キシレンとｍ−キシレン、およびそれぞれの酸化物を基質としたｉｎ　ｖｉｖｏでの酸化反応を行った。２×ＹＴ−ｃａｒｂｅ培地３０ｍｌに対し、Ｃ６００ＭＡ、Ｃ６００Ｖのグリセロールストックを３０μｌ添加した三角フラスコをそれぞれ用意し、菌体密度がＯＤ６００でＣ６００ＭＡは９．６、Ｃ６００Ｖは９．３になるまでそれぞれ３７℃で攪拌速度１７０ｒｐｍでの攪拌下で１６時間終夜液体培養を行った。次に２×ＹＴ−ｃａｒｂｅ培地１２０ｍｌに対し、それぞれの終夜培養物を２．５ｍｌ添加した三角フラスコを用意し、菌体密度がＯＤ６００でＣ６００ＭＡは０．５、Ｃ６００Ｖは０．５になるまでそれぞれ３７℃（攪拌速度１７０ｒｐｍ）で８５分間培養を行った。
【００４１】
次にそれぞれの三角フラスコ中にＩＰＴＧを１ｍＭになるよう添加した後、引き続き３７℃（攪拌速度１７０ｒｐｍ）で３時間培養を行った。次にこれらの菌体をそれぞれ回収し、１％グルコースを含む５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．４で２回洗浄後、同緩衝液で菌体を懸濁し、それぞれ菌体密度がＯＤ６００でＣ６００ＭＡは９．８、Ｃ６００Ｖは１０．４の懸濁液を調製した。各懸濁液を、それぞれ１ｍｌずつ８ｍｌ容の栓つき試験管中に分注し、エタノールで３０ｍＭに調製したｐ−キシレン、ｐ−メチルベンジルアルコール、ｐ−トルアルデヒド、ｐ−ヒドロキシメチルベンズアルデヒド、ｐ−キシリレングリコール、テレフタルアルデヒド、ｍ−キシレン、ｍ−メチルベンジルアルコール、ｍ−トルアルデヒド、ｍ−ヒドロキシメチルベンズアルデヒド、ｍ−キシリレングリコール、イソフタルアルデヒドをそれぞれ基質として、各菌体を分注した１本の栓つき試験管に対し５０μｌ添加した。
【００４２】
栓つき試験管は密閉し水平に寝かせた状態で、３０℃で左右方向に２８０回／分で反応時間１０分で振とうを行い、振とう後のサンプルは氷冷下で１０％過塩素酸水溶液を菌体懸濁液の８％体積だけ加えてｐＨ２とし、反応停止を行った。次に塩化ナトリウム５００ｍｇと０．２ｍＭ　ｎ−ドデカンのエーテル溶液１ｍｌを加え密閉し、栓つき試験管を水平に寝かせた状態で３０℃で左右方向に２８０回／分で振とうして塩化ナトリウムを水相に飽和させた後、遠心分離して、エーテル相をガスクロマトグラフィーにより分析した。
【００４３】
ｐ−キシレンとｍ−キシレンの両メチル基の酸化還元経路の各工程における酸化力又は還元力の酵素活性をＵ（μｍｏｌ生成物／ｍｉｎ）／ｇ（菌体乾重量）単位で反応式（３），（４）に示す。
【００４４】
【化３】
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【表１】
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【化４】
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【表２】
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太い矢印で示したものはＣ６００ＭＡの結果である。複数の同一模様の矢印は１つの基質から複数段階の酸化反応が進行していることを表し、各段階の反応を区別するためにａ−１とａ−２、ｂ−１とｂ−２とした。例えばｐ−キシレンを基質とした場合では２３．５Ｕ／ｇの酵素活性でｐ−メチルベンジルアルコールが生成し（ａ−１）、さらに２１．１Ｕ／ｇの活性でｐ−メチルベンジルアルコールからｐ−トルアルデヒドが生成している（ａ−２）。また、ｐ−メチルベンジルアルコールを基質とした場合では３３．８Ｕ／ｇの酵素活性でｐ−トルアルデヒドが生成し（ｂ−１）、さらに４．４Ｕ／ｇの活性でｐ−トルアルデヒドからｐ−ヒドロキシメチルベンズアルデヒドが生成している（ｂ−２）。
【００４５】
各工程の酵素活性はキシレンモノオキシゲナーゼによる酸化力と大腸菌の持つ還元酵素の還元力の総和に相当すると解釈できる。一方、点線の矢印で示したものはＣ６００Ｖの結果であり、大腸菌の還元酵素の働きによる、アルデヒド基を含む化合物から対応するアルコール基への還元活性を示しており、それぞれトルアルデヒドを基質とした場合のメチルベンジルアルコールへの還元活性（ｆ）、フタルアルデヒドを基質とした場合のヒドロキシメチルベンズアルデヒドへの還元活性（ｈ）、ヒドロキシメチルベンズアルデヒドを基質とした場合のキシリレングリコールへの還元活性（ｇ）を意味している。
【００４６】
この結果からｐ−キシレン、ｍ−キシレン両者の場合共に、キシレン→メチルベンジルアルコール→トルアルデヒド→ヒドロキシメチルベンズアルデヒドの経路で進行する酸化反応と、トルアルデヒド→メチルベンジルアルコール、フタルアルデヒド→ヒドロキシメチルベンズアルデヒド→キシリレングリコールの経路で進行する還元反応の両者が同時に働くことにより、実施例２、実施例４での長時間の反応でキシリレングリコールが蓄積することが説明できる。また、実施例２と実施例４においては明らかに生成物の分布に差異が認められる。すなわちｍ−キシレンおよびｍ−メチルベンジルアルコールを基質とした場合では反応産物がｍ−メチルベンジルアルコールとｍ−キシリレングリコールの両者となる傾向があるが、本実施例の結果から、ｍ−メチルベンジルアルコールはｐ−メチルベンジルアルコールに比べキシレンモノオキシゲナーゼによる酸化を受けにくい基質であることがその原因であることが明らかとなった。
【００４７】
【発明の効果】
以上の説明のように、本発明はこれまでキシレンモノオキシゲナーゼを用いたケースでは報告例の無い、キシレン上の両メチル基が酸化された一連の酸化物を製造することがてきる。また、安価なキシレンなどを出発原料として、分離抽出操作なしでもキシリレングリコールを得ることができる。ハロゲン化された原料や中間体を経ないプロセスでベンゼンジメタノール類を製造できることから、環境負荷の低減に寄与することが期待される。
【配列表】
ＳＥＱＵＥＮＣＥ　ＬＩＳＴＩＮＧ
＜１１０＞ＴＯＳＯＨ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ
＜１２０＞キシレンモノオキシゲナーゼを用いた製造方法
＜１３０＞ＰＡ２１１−０７８３
＜１６０＞２
＜２１０＞１
＜２１１＞３０
＜２１２＞ＤＮＡ
＜２１３＞Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ
＜４００＞１
ａｔｇａａｔｔｃｃａ　ｔｇｇａｃａｃｇｃｔ　ｔｃｇｔｔａｔｔａｃ　　　　　　　　　　　　　　　３０＜２１０＞２
＜２１１＞２８
＜２１２＞ＤＮＡ
＜２１３＞Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ
＜４００＞２
ａｃｃｔｇｃａｇｃｔ　ａｇｃａａｇｇａｇｇ　ｔｃｔａｔｔａｔ　　　　　　　　　　　　　　　　　２８
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例２でＣ６００ＭＡを用いた場合の各生成物の濃度を示したグラフである。
【図２】実施例２でＭＣ４１００ＭＡを用いた場合の各生成物の濃度を示したグラフである。
【図３】実施例２でＣ６００Ｖを用いた場合の各生成物の濃度を示したグラフである。
【図４】実施例２でＭＣ４１００Ｖを用いた場合の各生成物の濃度を示したグラフである。
【図５】実施例３で、Ｃ６００ＭＡによる反応を行った場合の各生成物の濃度を示したグラフである。
【図６】実施例３で、Ｃ６００ＭＡによる反応を行った場合の各生成物の濃度を示したグラフである。
【図７】実施例４で、Ｃ６００ＭＡを用いて反応を行った場合の各生成物の濃度を示したグラフである。
【図８】実施例４で、ＭＣ４１００ＭＡを用いて反応を行った場合の各生成物の濃度を示したグラフである。
【図９】実施例４で、Ｃ６００Ｖを用いて反応を行った場合の各生成物の濃度を示したグラフである。
【図１０】実施例４で、ＭＣ４１００Ｖを用いて反応を行った場合の各生成物の濃度を示したグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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