(57)【要約】　　　（修正有）【課題】カルニチンおよびアシルカルニチンを細胞内へ輸送するＯＣＴＮ２の活性を増強させる有効な手段の提供。【解決手段】本発明にかかる遺伝子は、以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡ、すなわち、（ａ）ブタ脳由来の特定な塩基配列からなること、又は、（ｂ）（ａ）の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＯＣＴＮ２のカルニチン又はアシルカルニチン輸送活性を有するタンパク質をコード化することを特徴とする。【選択図】　　　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡからなる遺伝子。
（ａ）配列表の配列番号１に示す、塩基配列１−２９２８で示される塩基配列からなることを特徴とするＤＮＡ。
（ｂ）（ａ）の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＯＣＴＮ２のカルニチン又はアシルカルニチン輸送活性を有するタンパク質をコード化するＤＮＡ。
【請求項２】
配列表の配列番号１に示す、塩基配列１−２９２８で示される塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ、ＯＣＴＮ２のカルニチン又はアシルカルニチン輸送活性を有するタンパク質をコード化することを特徴とするＤＮＡ。
【請求項３】
配列表の配列番号１に示す、塩基配列１−２９２８で示される塩基配列の一部又は全部を、化学又は物理的に修飾して得られる塩基配列からなり、かつ、ＯＣＴＮ２のカルニチン又はアシルカルニチン輸送活性を有するタンパク質をコード化することを特徴とするＤＮＡ。
【請求項４】
以下の（ａ）又は（ｂ）に示すアミノ酸配列からなることを特徴とする、ポリペプチド。
（ａ）配列表の配列番号２に示す、アミノ酸番号１−１４６で示されるアミノ酸配列からなることを特徴とする、ポリペプチド。
（ｂ）　ＯＣＴＮ２のカルニチン又はアシルカルニチン輸送活性を有し、（ａ）のアミノ酸の一部が欠失、置換若しくは付加された、ポリペプチド。
【請求項５】
配列表の配列番号２に示す、アミノ酸番号１−１４６で示されるアミノ酸配列の一部又は全部を、化学的又は物理的に修飾して得られるポリペプチドからなり、かつ、ＯＣＴＮ２のカルニチン又はアシルカルニチン輸送活性を有することを特徴とするポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規ポリペプチド及びそれをコード化する遺伝子に関し、特に、カルニチン及び／又はアシルカルニチン輸送分子である有機性陽イオン輸送分子（ＯＣＴＮ２）を活性化する新規ポリペプチド及びそれをコード化する遺伝子に関する。
【０００２】
【従来の技術】
カルニチンはミトコンドリア内における長鎖脂肪酸の代謝に必須の分子である。細胞内の脂肪酸（アシルＣｏＡ）は、カルニチンと結合してアシルカルニチンとなって初めてミトコンドリア内膜を通過できるようになり、ミトコンドリア内においてβ酸化を受け、エネルギーが産生される［Ｂｒｅｍｅｒ，Ｊ．，　Ｃａｒｎｉｔｉｎｅ−Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ　ａｎｄ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．　Ｐｈｙｓｉｏｌ．　Ｒｅｖ．，　６３，１４２０−１４８０　（１９８３）］。
【０００３】
また、カルニチンが全身性に欠乏すると、低血糖や高アンモニア血症などＲｅｙｅ症候群症状や心肥大を来たす［Ｗａｎｇ，　Ｙ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｏｒｇａｎｉｃ　ｃａｔｉｏｎ／ｃａｒｎｉｔｉｎｅ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ　ＯＣＴＮ２　ｉｎ　ｐｒｉｍａｒｙ　ｃａｒｎｉｔｉｎｅ　ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ．　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．，　ＵＳＡ．，　９６，　２３５６−２３６０　（１９９９）］。一方、長期にわたる原因不明の強い全身疲労・倦怠感を主訴とする慢性疲労症候群の患者では、血清アシルカルニチンレベルが低下し、同時に脳へのアセチルカルニチン取り込みも低下しており、アセチルカルニチンの投与でその症状が改善する。
【０００４】
さらに、アセチルカルニチンは興奮性の神経伝達物質の生合成にも利用される［倉恒弘彦　慢性疲労症候群の病因と治療，　１１１−１１８頁，疲労の科学（井上正康，倉恒弘彦，渡辺恭良編），講談社サイエンティフィク，（２００１）］。
【０００５】
このように細胞のエネルギー代謝や神経伝達物質生合成において重要なカルニチンやアセチルカルニチンは、有機性陽イオン輸送分子（以下ＯＣＴＮ２ともいう。）で輸送される［Ｔａｍａｉ，　Ｉ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆ　ｓｏｄｉｕｍ　ｉｏｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ，　ｈｉｇｈ　ａｆｆｉｎｉｔｙ　ｃａｒｎｉｔｉｎｅ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ　ＯＣＴＮ２．　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　２７３，　２０３７８−２０３８２　（１９９８）］。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、有機性陽イオン輸送分子（ＯＣＴＮ２）は、その活性調節機構が不明であるため、ＯＣＴＮ２を標的にした医薬品開発の障害となっている。
【０００７】
すなわち、カルニチン又はアセチルカルニチン欠乏は重篤な病態を惹起し、これらを補うことで症状が著しく改善されるが、その活性調節機構が不明であるため、有用な治療薬の提供を困難としているという問題を有する。それゆえ、活性調節機構を明らかにできれば、カルニチンおよびアセチルカルニチン輸送増強遺伝子治療薬、疲労回復剤のスクリーニングシステム、及び神経伝達物質生合成促進剤のスクリーニングシステムの構築に多大な利益をもたらす。しかし、かかる有機性陽イオン輸送分子（ＯＣＴＮ２）の活性増強手段について、有効な結果が得られていない。
【０００８】
そこで、本発明の目的は、カルニチンおよびアシルカルニチン（アセチルカルニチンなどを含む。）を細胞内へ輸送するＯＣＴＮ２の活性を増強させる有効な手段を提供することにある。本発明は、カルニチンおよびアシルカルニチンの細胞内への取り込みを効率的に促進させる薬剤の開発など、カルニチン欠乏症や慢性疲労症候群に対する新治療法の開発に有用である。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するために、発明者らは、カルニチンおよびアシルカルニチンを輸送するＯＣＴＮ２の活性を増強する分子に着目して鋭意検討した結果、ＯＣＴＮ２に部分的に相同性を有する小分子をコード化する新規遺伝子を単離し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
本発明の遺伝子は、以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡからなることを特徴とする。すなわち、（ａ）配列表の配列番号１に示す、塩基配列１−２９２８で示される塩基配列からなることを特徴とするＤＮＡ。
（ｂ）（ａ）の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＯＣＴＮ２のカルニチン又はアシルカルニチン輸送活性を有するタンパク質をコード化するＤＮＡ。
【００１１】
また、本発明の遺伝子は、配列表の配列番号１に示す、塩基配列１−２９２８で示される塩基配列の一部又は全部を、化学又は物理的に修飾して得られる塩基配列からなり、かつ、ＯＣＴＮ２のカルニチン又はアシルカルニチン輸送活性を有するタンパク質をコード化することを特徴とする。
【００１２】
また、本発明の遺伝子は、配列表の配列番号１に示す、塩基配列１−２９２８で示される塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ、ＯＣＴＮ２のカルニチン又はアシルカルニチン輸送活性を有するタンパク質をコード化することを特徴とする。
【００１３】
また、本発明のポリペプチドは、以下の（ａ）又は（ｂ）に示すアミノ酸配列からなることを特徴とする。すなわち、（ａ）配列表の配列番号２に示す、アミノ酸番号１−１４６で示されるアミノ酸配列からなることを特徴とする、ポリペプチド。（ｂ）ＯＣＴＮ２のカルニチン又はアシルカルニチン輸送活性を有し、（ａ）のアミノ酸の一部が欠失、置換若しくは付加された、ポリペプチド。
【００１４】
また、本発明のポリペプチドは、配列表の配列番号２に示す、アミノ酸番号１−１４６で示されるアミノ酸配列の一部又は全部を、化学的又は物理的に修飾して得られるポリペプチドからなり、かつ、ＯＣＴＮ２のカルニチン又はアシルカルニチン輸送活性を有することを特徴とする。
【００１５】
【発明の実施の形態】
本発明の遺伝子は、配列表の配列番号１において塩基配列１−２９２８で示される塩基配列からなるＤＮＡ、又は当該塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＯＣＴＮ２のカルニチン又はアセチルカルニチンなどのアシルカルニチン輸送活性を有するタンパク質をコード化するＤＮＡ、からなる。本発明の遺伝子は、適当な発現ベクターに結合させることによって、ＯＣＴＮ２のカルニチン又はアセチルカルニチンなどのアシルカルニチン輸送活性を有するタンパク質を発現し得る。さらに、本発明の遺伝子は、ＯＣＴＮ２のカルニチン又はアシルカルニチン輸送活性を有する類似タンパク質を探索するプローブとして使用することができる。
【００１６】
本発明の遺伝子を得るには、まず、脊椎動物等の脳、腎臓、睾丸等より、ＲＮＡを抽出し、アフィニティークロマトグラフィーなどの常法を用いて該ＲＮＡからｍＲＮＡを精製することから始まる。
【００１７】
得られたｍＲＮＡを逆転写酵素で逆転写することによりｃＤＮＡを得ることができる。当該ｃＤＮＡから目的とするタンパク質（ＯＣＴＮ２のカルニチン又はアセチルカルニチンなどのアシルカルニチン輸送活性を有するタンパク質）を発現し得る遺伝子をスクリーニングするには、例えば、短時間に探索することができるという観点から、ＰＣＲ法等の増幅法を利用するのが好ましい。
【００１８】
ＰＣＲ法に用いるプライマーは、既知のＯＣＴＮ２に共通する配列を参考にして設計、合成することができる。逆転写酵素により得たｃＤＮＡを鋳型として上記プライマーにより、目的とするｃＤＮＡ断片を増幅することができる。
【００１９】
また、ｃＤＮＡからのスクリーニングを常法のコロニー又はプラークハイブリダイゼーション等により行うこともできる。
【００２０】
目的とするｃＤＮＡの配列決定は、ターミネータ法等の常法を利用して行うことができる。
【００２１】
また、遺伝子組み換え技術によれば、基本となるＤＮＡの特定の部位に、当該ＤＮＡの基本的な特性を変化させることなく、人為的に変異を起こすことができる。本発明により提供される天然の塩基配列を有する遺伝子に関しても、同様に人為的に挿入、欠失、置換を行うことにより、天然の遺伝子と同様の或いは改善された特性を有するものとすることが可能であり、本発明は、そのような変異遺伝子を含むものである。
【００２２】
すなわち、本発明の遺伝子は、配列表の配列番号１に示す遺伝子の一部が欠失、置換若しくは付加された遺伝子であってもよい。
【００２３】
遺伝子の一部が欠失、置換若しくは付加された遺伝子とは、配列番号１に示す塩基配列において１０個以下、好ましくは７個以下、更に好ましくは３個以下の塩基が欠失、置換若しくは付加された配列を有する遺伝子である。また、そのような遺伝子は、配列表の配列番号１に示す遺伝子と９０％以上、好ましくは、９５％以上、更に好ましくは９９％以上の相同性を有する。また、当該遺伝子は、ストリンジェントな条件下で、配列表の配列番号１に示す遺伝子とハイブリッドを形成する。こうした遺伝子もＯＣＴＮ２のカルニチン又はアセチルカルニチンなどのアシルカルニチン輸送活性を有する限り、本発明の遺伝子に含まれる。
【００２４】
また、本発明の遺伝子は、配列表の配列番号１に示す、塩基配列１−２９２８で示される塩基配列の一部又は全部を、化学又は物理的に修飾して得られる塩基配列からなり、かつ、ＯＣＴＮ２のカルニチン又はアセチルカルニチンなどのアシルカルニチン輸送活性を有するタンパク質をコード化することを特徴とする。
【００２５】
かかる遺伝子であっても配列番号１に示す遺伝子同様に、ＯＣＴＮ２のカルニチン又はアシルカルニチン輸送活性を有するからである。化学又は物理的修飾としては、塩基のメチル化等を挙げることができる。これらの修飾は、常法に従って行うことができる。
【００２６】
また、本発明のポリペプチドは、以下の（ａ）又は（ｂ）に示すアミノ酸配列からなることを特徴とする。すなわち、（ａ）配列表の配列番号２に示す、アミノ酸番号１−１４６で示されるアミノ酸配列からなることを特徴とする、ポリペプチド。（ｂ）ＯＣＴＮ２のカルニチン又はアシルカルニチン輸送活性を有し、（ａ）のアミノ酸の一部が欠失、置換若しくは付加された、ポリペプチド。
【００２７】
遺伝子の一部が欠失、置換若しくは付加された遺伝子とは、配列番号１に示す塩基配列において１０個以下、好ましくは７個以下、更に好ましくは３個以下の塩基が欠失、置換若しくは付加された配列を有する遺伝子である。また、そのような遺伝子は、配列表の配列番号１に示す遺伝子と９０％以上、好ましくは、９５％以上、更に好ましくは９９％以上の相同性を有する。
【００２８】
また、本発明のポリペプチドは、配列表の配列番号２に示す、アミノ酸番号１−１４６で示されるアミノ酸配列の一部又は全部を、化学的又は物理的に修飾して得られるポリペプチドからなり、かつ、ＯＣＴＮ２のカルニチン又はアシルカルニチン輸送活性を有することを特徴とする。化学的又は物理的に修飾した場合であっても、ＯＣＴＮ２のカルニチン又はアセチルカルニチンなどのアシルカルニチン輸送活性を有する限り、本発明のポリペプチドに含まれる。化学的又は物理的修飾の例としては、メチル化、アミド化などのＮ末端修飾、Ｃ末端修飾等を挙げることができる。これらの修飾を常法に従って行うことができる。
【００２９】
また、本発明の活性化因子は、請求項４又は５項に記載のポリペプチドを含有することを特徴とする。本発明の活性化因子は、本発明のポリペプチドを有効的な量で含有する。
【００３０】
【実施例】
ここで、本発明の一実施例を説明するが、本発明は、下記の実施例に限定して解釈されるものではない。また、本発明の要旨を逸脱することなく、適宜変更することが可能であることは言うまでもない。
【００３１】
実施例１
まず、本発明の配列番号１に示されるＤＮＡ、及び本発明の配列番号２に示されるポリペプチドの精製を試みた。７‐１０週令の雄Ｗｉｓｔａｒラットの脳から抽出精製して得られたｐｌｏｙ（Ａ）＋　ｍＲＮＡから、ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ社のＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｓｙｓｔｅｍを使用してｃＤＮＡライブラリーを作製した。次にこのｃＤＮＡライブラリーをＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社のλＺａｐ　ｅｘｐｒｅｓｓ　ｋｉｔを使用して、ファージｃＤＮＡライブラリーを作製した。このｃＤＮＡライブラリーをラットＯＣＴＮ２　ｃＤＮＡ［Ｗｕ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ　ａｎｄ　ｔｉｓｓｕｅ　ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ　ｐａｔｔｅｒｎ　ｏｆ　ｏｒｇａｎｉｃ　ｃａｔｉｏｎ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ　２　（ＯＣＴＮ２），　ａｎ　ｏｒｇａｎｉｃ　ｃａｔｉｏｎ／ｃａｒｎｉｔｉｎｅ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ．　Ｊ．　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．　Ｅｘｐ．　Ｔｈｅｒ．　２９０，　１４８２−１４９２　（１９９）］の部分塩基配列、すなわち、２５から３７５番目の配列をプローブに用いたプラークハイブリダイゼーション法によりスクリーニングを行った。具体的には、５　ｘ　ＳＳＣ、５　ｘデンハルト試薬、０．１　％　ＳＤＳ、　３０％フォルムアミド、５０　ｍＭ　Ｎａ−リン酸緩衝液（ｐＨ　６．５、１００μｇ／ｍｌ変成サケＤＮＡを含む溶液中、５５℃で１６時間、ハイブリダイゼーションを行った。この条件下で、２ｘ１０６　個のプラークから成るラット脳ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングを行い、陽性プラークを得、各クローンについて更にハイブリダイゼーションを繰り返すことによりクローンを均一化した。最終的にヘルパーファージを反応させｃＤＮＡを組み込んだファージミドベクター（ｐＢＫ−ＣＭＶ）を切り出すことによりＯＣＴＮ２と相同性を有するｃＤＮＡクローン、２ｂ−１を得た。２ｂ−１ｃＤＮＡクローンの塩基配列をＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ３１０　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ａｎａｌｙｚｅｒ及びＬｉ−ＣＯＲ　ＤＮＡシクエンサー用いて決定したところ、本ｃＤＮＡクローンは全長が２９２８ｋｂからなる塩基配列（配列番号１）を有し、１４６個のアミノ酸配列（配列番号２）からなる新しいタンパク質をコードしていた。
【００３２】
ＯＣＴＮ２はＮ末端およびＣ末端が細胞内に存在する１２回膜貫通型構造をしていると推定されている［Ｔａｍａｉ，　Ｉ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｏｄｉｕｍ　ｉｏｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ，　ｈｉｇｈ　ａｆｆｉｎｉｔｙ　ｃａｒｎｉｔｉｎｅ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ　ＯＣＴＮ２．　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　２７３，　２０３７８−２０３８２　（１９９８）］。２ｂ−１クローンがコードするタンパク質はＯＣＴＮ２に共通のＮ末端側の第１膜貫通領域（−ＬＩＦＦＬＬＳＡＳＩＩ−）を有していることから、１回膜貫通型の膜タンパク質として細胞膜に存在していると予想された。
【００３３】
次に２ｂ−１遺伝子発現の組織分布を調べるためにノーザンハイブリダイゼーション分析とＲＴ−ＰＣＲを以下にようにして行った。　全ＲＮＡをラットの組織からセパゾールＲＮＡＩ（ｎａｃａｌａｉ　ｔｅｓｑｕｅ社製）で抽出し、ＧＥＮＥＥＬＵＴＥ　ｍＲＮＡ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｋｉｔ　（Ｓｉｇｍａ社製）を用いて得られたｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡ　（３０μｇ）をホルムアルデヒドを含有するアガロースゲルで分離し、ニトロセルロース膜（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　＆　Ｓｃｈｕｅｌｌ社製）に転写した。プローブは２ｂ−１ｃＤＮＡの０．２ｋｂ　ＰＣＲ産物（１８−２１２位）を使用した。３２Ｐ標識は、ＤＮＡ　ｌａｂｅｌｌｉｎｇ　ｋｉｔ　（タカラ社製）を使用した。ハイブリダイゼーションは２０　ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液　（ｐＨ　６．５）／５　ｘ　ＳＳＣ／０．１　％　ＳＤＳ／５　ｘデンハルト試薬／　０．０１　％　超音波処理済鮭精子ＤＮＡ／５０　％　フォルムアミド／１０　％デ硫酸キストランを含有する溶液中、４２℃で、１６時間実施した。ハイブリダイゼーション後、膜を２　ｘ　ＳＳＣ／０．１％　ＳＤＳを用いて３０分間、２５℃で洗浄し、続けて、０．１　ｘ　ＳＳＣ／０．１　％　ＳＤＳを用いて１時間、６５℃で洗浄した。放射能はＢＡＳ２０００（フジ写真フィルム社製）で測定した。ＲＴ−ＰＣＲは、各１μｇのｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡから逆転写酵素ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ　ＩＩ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＭ社製）を用いて合成したｃＤＮＡを、５’−ＣＣＴＣＡＣＧＣＣＣＴＧＧＧＴＧＴＣＴＴＴＧ−３’（塩基配列１の１８−４１）のセンスプライマーと５’−ＣＣＣＧＣＴＧＧＧＡＡＴＣＴＧＡＡＧＡＣ−３’（塩基配列１の１９３−２１２）のアンチセンスプライマーを用いて増幅した。増幅は、ＴａｑＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用い、９４℃　１５秒間、　５７℃　３０秒間、７２℃　４５秒間で２５回行った。増幅されたｃＤＮＡは２％のアガロースゲルで分離した後、エチジウムブロマイドで染色した。ノーザンブロット分析とＲＴ−ＰＣＲの結果を図１に示す。２ｂ−１ｍＲＮＡは、脳、肺、心臓、小腸、大腸、腎臓、睾丸、副睾丸、筋肉などに発現していたが、肝臓、脾臓、胃のレベルは検出限界以下であった。
【００３４】
次にＯＣＴＮ２のアセチルカルニチン輸送活性に与える２ｂ−１の影響を検討した。具体的には、ＣＯＳ−７細胞（培養液：９０　％　ＤＭＥＭ／１０　％　ＦＣＳ）を２４−ウェルプレートで、１ウェル当り、１　ｘ　１０５個／ｍｌの細胞密度で２４時間培養した後、総量で０．３μｇのプラスミドを８μｌのＰｏｌｙＦｅｃｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）と混合して添加してトランスフェクションした。４８時間培養後、細胞を１　ｍｌのＮａ含有ＯＣＴＮ２輸送活性測定用緩衝液［１２５　ｍＭ　ＮａＣｌ／４．８　ｍＭ　ＫＣｌ／５．６　ｍＭ　Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｅ／１．２　ｍＭ　ＣａＣｌ２／１．２　ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４／１．２　ｍＭ　ＭｇＳＯ４／２５　ｍＭ　ＨＥＰＥＳ，　ｐＨ　７．４（以下ＴＢと略称）］［Ｔａｍａｉ，　Ｉ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｏｄｉｕｍ　ｉｏｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ，　ｈｉｇｈ　ａｆｆｉｎｉｔｙ　ｃａｒｎｉｔｉｎｅ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ　ＯＣＴＮ２．　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　２７３，　２０３７８−２０３８２　（１９９８）］で洗浄した後、０．２　ｍｌのＴＢを加えて、１０分間３７℃でプレインキュベーションした後、１０μＭ（最終濃度５μＭ）の１４Ｃ−アセチルカルニチンを含む０．２　ｍｌのＴＢを加えて取り込み反応を開始した。３７℃で１時間反応後、氷冷した１　ｍｌのＴＢで細胞を２回洗浄して反応を停止させ、０．５　ｍｌの０．２　Ｎ　ＮａＯＨ／１　％　ＳＤＳで細胞を可溶化し、細胞内に取り込まれた１４Ｃ−アセチルカルニチン量を液体シンチレーションカウンターで測定した。２ｂ‐１単独では、アセチルカルニチンの輸送活性を示さなかったが、図２に示すようにＯＣＴＮ２と同時に発現させると、その輸送活性は２倍以上に増強された。
【００３５】
当該輸送活性の増強効果が、本発明の２ｂ−１に起因するものであるか否かを確実にするためＯＣＴＮ１を代わりに用いて比較実験を行った。その結果、図２に示すように、この増強活性は、２ｂ−１に特異的であり、別の有機性陽イオン輸送分子、例えば、ＯＣＴＮ１［Ｗｕ　ｅｔ　ａｌ．：　Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ　ａｎｄ　ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ　ａｎｄｔｉｓｓｕｅ　ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ　ｐａｔｔｅｒｎ　ｏｆ　ｒａｔ　ＯＣＴＮ１，　ａｎ　ｏｒｇａｎｉｃ　ｃａｔｉｏｎ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ，　ｃｌｏｎｅｄ　ｆｒｏｍ　ｐｌａｃｅｎｔａ］には観察されなかったことが判明した。
【００３６】
【発明の効果】
本発明のポリペプチド、遺伝子、及び活性化因子によれば、当該遺伝子等を、たとえば、アデノウィルスなど遺伝子治療で汎用されるベクターに組み込んで使用することにより、ＯＣＴＮ２の活性化を行ウことが可能であるという有利な効果を奏する。これによって、カルニチン欠乏症や慢性疲労症候群を治療することが可能となるという有利な効果も奏する。
【００３７】
また、本発明によれば、輸送活性因子のポリペプチド量を増大させ、その結果としてＯＣＴＮ２活性が増加し、カルニチン欠乏症や慢性疲労症候群を治療する新規薬剤の開発も可能となるという有利な効果を奏する。
【００３８】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】２ｂ‐１遺伝子発現のノーザンブロット分析（Ａ）とＲＴ−ＰＣＲ（Ｂ）の結果を示す。
【図２】ＯＣＴＮ２のアセチルカルニチン輸送活性に対する２ｂ‐１の効果を調べた結果を示す。
【図１】
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【図２】
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