【手続補正書】
【提出日】平成25年12月17日(2013.12.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
イソプレンを生成するための改良された方法であって、
（ａ）イソプレンシンターゼポリペプチドをコードした異種核酸を有する細胞を、イソプレンの生成に適した培養条件下で培養する工程であって、前記細胞が、（ｉ）４０ｇ／Ｌよりも高い力価でイソプレンを生成するか、又は、（ｉｉ）イソプレン約５００ｍｇ／Ｌブロス／時間よりも高い平均のイソプレンの体積生産性を有するものである、工程と、
（ｂ）前記培養の一部を取り出す工程と、
（ｃ）前記培養の取り出した一部を濾過して透過液と保持成分とを生成する工程と、
（ｄ）前記保持成分を前記培養に戻す工程と、
（ｅ）イソプレンを生成する工程と、を含み、
前記（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）工程を行った培養細胞が、前記（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）工程を行わずに培養した同じ細胞よりも（ｉ）より高い力価でイソプレンを生成するか、又は（ｉｉ）より高い平均のイソプレンの体積生産性を有する、方法。
【請求項２】
前記濾過する工程が、タンジェンシャルフロー濾過によるものである、請求項１に記載の改良された方法。
【請求項３】
前記細胞が、約５０ｇ／Ｌよりも高い力価でイソプレンを生成する、請求項１に記載の改良された方法。
【請求項４】
前記細胞が、イソプレン約１，０００ｍｇ／Ｌブロス／時間よりも高い平均の体積生産性を有する、請求項１に記載の改良された方法。
【請求項５】
同じ細胞培養又は別の細胞培養中に前記透過液を再循環させる工程を更に含み、再循環された透過液の存在下で培養された細胞は、再循環された透過液の非存在下で培養された同じ細胞よりも高い平均のイソプレンの比生産性を有する、請求項１に記載の改良された方法。
【請求項６】
前記細胞が、再循環された透過液の非存在下で培養された同じ細胞よりも約２倍高い平均のイソプレンの比生産性を有する、請求項５に記載の改良された方法。
【請求項７】
前記培養の一部が連続的に取り出される、請求項１に記載の改良された方法。
【請求項８】
前記培養の一部が非連続的に取り出される、請求項１に記載の改良された方法。
【請求項９】
前記イソプレンシンターゼポリペプチドが、植物のイソプレンシンターゼポリペプチドである、請求項１に記載の改良された方法。
【請求項１０】
前記細胞が、イソペンチル−二リン酸イソメラーゼ（ＩＤＩ）ポリペプチドをコードした核酸を更に有する、請求項１又は９に記載の改良された方法。
【請求項１１】
前記細胞が、ＤＸＳポリペプチドをコードした核酸を更に有する、請求項１０に記載の改良された方法。
【請求項１２】
前記細胞が、ＭＶＡ経路ポリペプチドをコードした核酸を更に有する、請求項１０に記載の改良された方法。
【請求項１３】
前記細胞が細菌細胞である、請求項９に記載の改良された方法。
【請求項１４】
前記細胞がグラム陽性細菌細胞またはグラム陰性細菌細胞である、請求項１３に記載の改良された方法。
【請求項１５】
前記細胞がバシラス・サブティリス（Bacillus subtilis）細胞、大腸菌（Escherichia coli）又はパントエア・シトレア（Pantoea citrea）細胞である、請求項１４に記載の改良された方法。
【請求項１６】
前記細胞が真菌細胞である、請求項９に記載の改良された方法。
【請求項１７】
前記細胞がトリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）細胞である、請求項１６に記載の改良された方法。
【請求項１８】
前記細胞が酵母細胞である、請求項１６に記載の改良された方法。
【請求項１９】
前記細胞がサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）またはヤロウィア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）細胞である、請求項１８に記載の改良された方法。
【請求項２０】
イソプレンを生成するための改良された方法であって、
（ａ）イソプレンシンターゼポリペプチドをコードした異種核酸を有する細胞を、増殖培地が入った発酵装置中で、イソプレンの生成に適した培養条件下で培養する工程であって、前記細胞が、（ｉ）４０ｇ／Ｌよりも高い力価でイソプレンを生成するか、又は、（ｉｉ）イソプレン約５００ｍｇ／Ｌブロス／時間よりも高い平均のイソプレンの体積生産性を有するものである、工程と、
（ｂ）前記発酵装置から前記細胞培養の一部を取り出す工程と、
（ｃ）前記細胞培養の取り出した一部をフィルターに移す工程と、
（ｄ）前記細胞培養の取り出した一部を濾過して、（ｉ）使用済み増殖培地を含む透過液と、（ｉｉ）細胞及び他の培養固形分を含む保持成分と、を生成する工程と、
（ｅ）前記保持成分を前記発酵装置に戻す工程と、
（ｆ）前記透過液を回収する工程と、
（ｇ）イソプレンを生成する工程と、を含み、
前記（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）工程を行った培養細胞が、前記（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）工程を行わずに培養した同じ細胞よりも（ｉ）より高い力価でイソプレンを生成するか、又は（ｉｉ）より高い平均のイソプレンの体積生産性を有する、方法。
【請求項２１】
前記発酵装置と前記フィルターとが、循環ループ及び循環ポンプによって接続される、請求項２０に記載の改良された方法。
【請求項２２】
前記透過液が、透過液回収出口及び透過液ポンプによって前記フィルターから回収され、透過液回収タンク内に貯蔵される、請求項２０に記載の改良された方法。
【請求項２３】
前記透過液回収タンクが、該タンク内の圧力を解放するための通気口を更に有する、請求項２２に記載の改良された方法。
【請求項２４】
前記循環ポンプ及び前記透過液ポンプがペリスタルティックポンプである、請求項２１又は２２のいずれか一項に記載の改良された方法。
【請求項２５】
前記フィルターが精密濾過フィルターである、請求項２１に記載の改良された方法。
【請求項２６】
前記フィルターが限外濾過フィルターである、請求項２１に記載の改良された方法。
【請求項２７】
前記精密濾過フィルターがタンジェンシャルフローフィルターである、請求項２５に記載の改良された方法。
【請求項２８】
前記タンジェンシャルフローフィルターが、約０．００５μｍ〜約１００μｍのフィルター孔径を有する、請求項２７に記載の改良された方法。
【請求項２９】
前記限外濾過フィルターがタンジェンシャルフローフィルターである、請求項２６に記載の改良された方法。
【請求項３０】
前記タンジェンシャルフローフィルターが、約１００，０００よりも大きい公称分画分子量（ＮＭＷＣ）を有する、請求項２８に記載の改良された方法。
【請求項３１】
（ｉ）前記フィルターの入口圧力（Ｐ入口）を入口圧力ゲージによって監視する工程と、（ｉｉ）前記フィルターの出口圧力（Ｐ出口）を出口圧力ゲージによって監視する工程と、（ｉｉｉ）前記透過液回収出口内の圧力（Ｐ透過液）を透過液圧力ゲージによって監視する工程と、（ｉｖ）前記フィルターの膜間圧力（ＴＭＰ）を測定する工程と、を更に含む、請求項２７又は２９のいずれかに記載の改良された方法。
【請求項３２】
前記フィルターの正のＴＭＰを維持する工程を更に含む、請求項３１に記載の改良された方法。
【請求項３３】
前記発酵装置が、イソプレン貯蔵タンクに接続されたイソプレン回収出口を更に有する、請求項３１に記載の改良された方法。
【請求項３４】
前記細胞が、約５０ｇ／Ｌよりも高い力価でイソプレンを生成する、請求項３１に記載の改良された方法。
【請求項３５】
前記細胞が、イソプレン約１，０００ｍｇ／Ｌブロス／時間よりも高い平均の体積生産性を有する、請求項３１に記載の改良された方法。
【請求項３６】
前記回収された透過液を滅菌する工程と、同じ発酵装置又は別の発酵装置中に前記透過液を再循環させる工程と、を更に含み、再循環された透過液の存在下で培養された細胞が、再循環された透過液の非存在下で培養された同じ細胞よりも高い平均のイソプレンの比生産性を有する、請求項３１に記載の改良された方法。
【請求項３７】
前記細胞が、再循環された透過液の非存在下で培養された同じ細胞よりも約２倍高い平均のイソプレンの比生産性を有する、請求項３６に記載の改良された方法。
【請求項３８】
前記細胞の生産性が約１０％高くなっている、請求項３６に記載の改良された方法。
【請求項３９】
前記培養の一部が連続的に取り出される、請求項２０に記載の改良された方法。
【請求項４０】
前記培養の一部が非連続的に取り出される、請求項２０に記載の改良された方法。
【請求項４１】
前記イソプレンシンターゼポリペプチドが、植物のイソプレンシンターゼポリペプチドである、請求項２０に記載の改良された方法。
【請求項４２】
前記細胞が、ＩＤＩポリペプチドをコードした核酸を更に有する、請求項２０又は４１に記載の改良された方法。
【請求項４３】
前記細胞が、ＤＸＳポリペプチドをコードした核酸を更に有する、請求項４２に記載の改良された方法。
【請求項４４】
前記細胞が、ＭＶＡ経路ポリペプチドをコードした核酸を更に有する、請求項４１に記載の改良された方法。
【請求項４５】
前記細胞が細菌細胞である、請求項４１に記載の改良された方法。
【請求項４６】
前記細胞がグラム陽性細菌細胞またはグラム陰性細菌細胞である、請求項４５に記載の改良された方法。
【請求項４７】
前記細胞がバシラス・サブティリス細胞、大腸菌、又はパントエア・シトレア細胞であるである、請求項４６に記載の改良された方法。
【請求項４８】
前記細胞が真菌細胞である、請求項４１に記載の改良された方法。
【請求項４９】
前記細胞がトリコデルマ・リーゼイ細胞である、請求項４８に記載の改良された方法。
【請求項５０】
前記細胞が酵母細胞である、請求項４８に記載の改良された方法。
【請求項５１】
前記細胞がサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）またはヤロウィア・リポリティカ細胞である、請求項５０に記載の改良された方法。
【請求項５２】
イソプレンを回収する工程を更に含む、請求項１又は２０に記載の改良された方法。