(57)【要約】【課題】従来は、複数の培養容器を用いて人手による培地交換作業と継代作業を行っていたため、コンタミネーションが発生しやすく、細胞へのストレスも大きく，多量の細胞培養が難しかった。【解決手段】ディスク２０００上に構成した、初代培養容器２１００と２代培養容器２２００と２２０２と２２０４を継代流路２１０５で接続し、また、２代培養容器２２００と３代培養容器２３００と２３０２と２３０４と２３０６を継代流路２２０５で接続し、継代流路２１０５または２２０５内で発生する表面張力とディスク２０００を回転させて発生する遠心力をもとにしたサイフォンの原理で継代を行い，培養容器２１００，２２００，２３００他おのおのから培地等を抜き取り、ピペッタで培地等を供給することで細胞培養を自動化する。細胞培養に関わる作業を自動化でき、コンタミネーションの発生を押さえ、細胞にストレスを与えず、多量の細胞培養を自動化できる。【選択図】      図１
2004236547.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
接着依存性細胞を培養するための細胞培養容器を複数設置し、前出細胞を含む水溶液をこれらの細胞培養容器間で継代するための流路を設置し、培地や前出細胞を接着面から剥離するための溶液や前出細胞を洗浄するための溶液を抜き取るための流路を設置し、これを回転させることで前出細胞培養容器や継代するための流路中の前出細胞を含む溶液に遠心力を発生させることが可能な１枚の円盤状または回転による振動が発生しない板状のディスクであって、サイフォンの原理を用いて前出細胞を含む溶液を継代することを特徴とする細胞培養ディスク。
【請求項２】
接着依存性細胞を培養するための細胞培養容器を複数設置し、前出細胞を含む水溶液をこれらの細胞培養容器間で継代するための流路を設置し、培地や前出細胞を接着面から剥離するための溶液や前出細胞を洗浄するための溶液を抜き取るための流路を設置し、これを回転させることで前出細胞培養容器や継代するための流路中の前出細胞を含む溶液に遠心力を発生させることが可能な１枚の円盤状または回転による振動が発生しない板状のディスクであって、前出の継代するための流路中にある前出細胞を含む溶液の送液制御に、前出の継代するための流路の壁面と前出細胞を含む溶液が接触することによって発生する表面張力を用いることを特徴とする細胞培養ディスク。
【請求項３】
接着依存性細胞を培養するための細胞培養容器を複数設置し、前出細胞を含む水溶液をこれらの細胞培養容器間で継代するための流路を設置し、培地や前出細胞を接着面から剥離するための溶液や前出細胞を洗浄するための溶液を抜き取るための流路を設置し、これを回転させることで前出細胞培養容器や継代するための流路中の前出細胞を含む溶液に遠心力を発生させることが可能な１枚の円盤状または回転による振動が発生しない板状のディスクであって、前出細胞を遠心力によって前出細胞培養容器中遠心力が最大になる部分に設置した隔室に細胞を凝集させることを特徴とする細胞培養ディスク。
【請求項４】
細胞培養における継代において、継代先の細胞培養容器が複数あって、この全ての細胞培養容器へ同時に継代することを特徴とする、請求項１から請求項３記載の細胞培養ディスク。
【請求項５】
複数の細胞培養容器から同量の培地や前出細胞を接着面から剥離するための溶液や前出細胞を洗浄するための溶液を同時に抜き取るために、全ての細胞培養容器についてこれらを抜き取るための流路の長さを同じにしたことを特徴とする、請求項１から請求項４記載の細胞培養ディスク。
【請求項６】
通気性はあるが培地や前出細胞を接着面から剥離するための溶液や前出細胞を洗浄するための溶液を漏らさず可視光について透明な薄フィルムで，接着依存性細胞を培養するための細胞培養容器の表面を封止したことを特徴とする，請求項１から請求項５記載の細胞培養ディスク。
【請求項７】
接着依存性細胞を培養するための細胞培養容器とこれらを間で細胞を継代するための流路を備えたディスクと、前出ディスクに培地や前出細胞を接着面から剥離するための溶液や前出細胞を洗浄するための溶液を供給するためのピペッタと、前出ディスクを回転させる手段と、前出ディスクに保持された培地の色や濁りを検出するための手段と，前出細胞培養容器内部で培養される細胞の形態を観察するための手段と、前出ディスク付近の二酸化炭素の濃度を検出する手段と、前出ディスク付近の温度を検出する手段と、培地や前出細胞を接着面から剥離するための溶液や前出細胞を洗浄するための溶液を４℃に保持する手段およびこれらの溶液を加熱する手段を備え、前出ディスクを回転させることで生じる遠心力をもとにサイフォンの原理を用いて前出細胞を含む溶液を継代することを特徴とする細胞培養装置。
【請求項８】
接着依存性細胞を培養するための細胞培養容器とこれらを間で細胞を継代するための流路を備えたディスクと、前出ディスクに培地や前出細胞を接着面から剥離するための溶液や前出細胞を洗浄するための溶液を供給するためのピペッタと、前出ディスクを回転させる手段と、前出ディスクに保持された培地の色や濁りを検出するための手段と，前出細胞培養容器内部で培養される細胞の形態を観察するための手段と、前出ディスク付近の二酸化炭素の濃度を検出する手段と、前出ディスク付近の温度を検出する手段と、培地や前出細胞を接着面から剥離するための溶液や前出細胞を洗浄するための溶液を４℃に保持する手段およびこれらの溶液を加熱する手段を備え、前出ディスクを回転させることで生じる遠心力をもとに前出細胞培養容器中遠心力が最大になる部分に設置した隔室に細胞を凝集させることを特徴とする細胞培養装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、接着依存性細胞を培養するための細胞培養容器と、これを用いて細胞を培養するための自動操作を行う細胞培養装置に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
接着依存性細胞を増殖させるために行う培養操作は，そのほとんどが手作業によって行われている。この主たる操作としては、培養容器内部の培地を新しく交換する作業（以下、培地交換作業）、培地容器内部に広がった細胞をより広い培養面積をもつ容器や複数の容器へ移し替える作業（以下、継代作業）がある（非特許文献１  参照）。
【０００３】
【非特許文献１】
株式会社  秀潤社発行「バイオ実験イラストレイテッド（６）すくすく育て細胞培養」Ｐ９２，９３〜９５
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
前記従来の細胞培養操作では、そのほとんどが手作業で行われていた。そのため、培養容器が多くなると操作者に多大な負担が掛かり、培養操作中にコンタミネーションが発生し細胞が死滅しやすく、目標の細胞数が得られなくなる問題がある。また、細胞培養操作のため培養容器を細胞培養に適した環境を保持した保管庫（以下、インキュベータ）から取り出すため、一時的ではあるが環境が激変しこのストレスによって細胞が弱ってしまうという問題がある。
【０００５】
本発明は、従来の手作業による細胞培養操作から発生する問題点に着目し、細胞培養操作の自動化を容易にする細胞培養容器と、これを用いて細胞を培養するための自動操作を行う細胞培養装置を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本願の特徴によれば、接着依存性細胞を培養するための細胞培養容器を複数設置し、前出細胞を含む水溶液をこれらの細胞培養容器間で継代するための流路を設置し、培地や前出細胞を接着面から剥離するための溶液や前出細胞を洗浄するための溶液を抜き取るための流路を設置し、これを回転させることで前出細胞培養容器や継代するための流路中の前出細胞を含む溶液に遠心力を発生させることが可能な１枚の円盤状または回転による振動が発生しない板状のディスクを備え、前出ディスクに培地や前出細胞を接着面から剥離するための溶液や前出細胞を洗浄するための溶液を供給するためのピペッタと、前出ディスクを回転させる手段と、前出ディスクに保持された培地の色や濁りを検出するための手段と、前出細胞培養容器内部で培養される細胞の形態を観察するための手段と、前出ディスク付近の二酸化炭素の濃度を検出する手段と、前出ディスク付近の温度を検出する手段と、培地や前出細胞を接着面から剥離するための溶液や前出細胞を洗浄するための溶液を４℃に保持する手段およびこれらの溶液を加熱する手段を備え、前出ディスクを回転させることで生じる遠心力をもとにサイフォンの原理を用いて前出細胞を含む溶液を継代するとともに、前出細胞培養容器中遠心力が最大になる部分に設置した隔室に細胞を凝集させることによって達成できる。
【０００７】
本願の別の特徴によれば、本願に係わる細胞培養ディスクは、接着依存性細胞を培養するための細胞培養容器を複数設置し、前出細胞を含む水溶液をこれらの細胞培養容器間で継代するための流路を設置し、培地や前出細胞を接着面から剥離するための溶液や前出細胞を洗浄するための溶液を抜き取るための流路を設置し、含む溶液に遠心力を発生させることが可能な１枚の円盤状または回転による振動が発生しない板状のディスクであって、サイフォンの原理を用いて前出細胞を含む溶液を継代することを特徴とする。
【０００８】
本願のさらに別の特徴によれば、上記細胞培養ディスクは、接着依存性細胞を培養するための細胞培養容器を複数設置し、前出細胞を含む水溶液をこれらの細胞培養容器間で継代するための流路を設置し、培地や前出細胞を接着面から剥離するための溶液や前出細胞を洗浄するための溶液を抜き取るための流路を設置し、これを回転させることで前出細胞培養容器や継代するための流路中の前出細胞を含む溶液に遠心力を発生させることが可能な１枚の円盤状または回転による振動が発生しない板状のディスクであって、前出の継代するための流路中にある前出細胞を含む溶液の送液制御に、前出の継代するための流路の壁面と前出細胞を含む溶液が接触することによって発生する表面張力を用いることを特徴とする。
【０００９】
本願のさらに別の特徴によれば、上記細胞培養ディスクは接着依存性細胞を培養するための細胞培養容器を複数設置し、前出細胞を含む水溶液をこれらの細胞培養容器間で継代するための流路を設置し、培地や前出細胞を接着面から剥離するための溶液や前出細胞を洗浄するための溶液を抜き取るための流路を設置し、これを回転させることで前出細胞培養容器や継代するための流路中の前出細胞を含む溶液に遠心力を発生させることが可能な１枚の円盤状または回転による振動が発生しない板状のディスクであって、前出細胞を遠心力によって前出細胞培養容器中遠心力が最大になる部分に設置した隔室に細胞を凝集させることを特徴とする。
【００１０】
本願のさらに別の特徴によれば、上記細胞培養ディスクは、細胞培養における継代において、継代先の細胞培養容器が複数あって、この全ての細胞培養容器へ同時に継代することを特徴とする
【００１１】
本願のさらに別の特徴によれば、上記細胞培養ディスクは、複数の細胞培養容器から同量の培地や前出細胞を接着面から剥離するための溶液や前出細胞を洗浄するための溶液を同時に抜き取るために、全ての細胞培養容器についてこれらを抜き取るための流路の長さを同じにしたことを特徴とする。
【００１２】
本願のさらに別の特徴によれば、上記細胞培養ディスクは、通気性はあるが培地や前出細胞を接着面から剥離するための溶液や前出細胞を洗浄するための溶液を漏らさず可視光について透明な薄フィルムで、接着依存性細胞を培養するための細胞培養容器の表面を封止したことを特徴とする。
【００１３】
本願のさらに別の特徴によれば、本願に係わる細胞培養装置は、接着依存性細胞を培養するための細胞培養容器とこれらを間で細胞を継代するための流路を備えたディスクと、前出ディスクに培地や前出細胞を接着面から剥離するための溶液や前出細胞を洗浄するための溶液を供給するためのピペッタと、前出ディスクを回転させる手段と、前出ディスクに保持された培地の色や濁りを検出するための手段と、前出細胞培養容器内部で培養される細胞の形態を観察するための手段と、前出ディスク付近の二酸化炭素の濃度を検出する手段と、前出ディスク付近の温度を検出する手段と、培地や前出細胞を接着面から剥離するための溶液や前出細胞を洗浄するための溶液を４℃に保持する手段およびこれらの溶液を加熱する手段を備え、前出ディスクを回転させることで生じる遠心力をもとにサイフォンの原理を用いて前出細胞を含む溶液を継代することを特徴とする。
【００１４】
本願のさらに別の特徴によれば、本願に係わる細胞培養装置は、接着依存性細胞を培養するための細胞培養容器とこれらを間で細胞を継代するための流路を備えたディスクと、前出ディスクに培地や前出細胞を接着面から剥離するための溶液や前出細胞を洗浄するための溶液を供給するためのピペッタと、前出ディスクを回転させる手段と、前出ディスクに保持された培地の色や濁りを検出するための手段と、前出細胞培養容器内部で培養される細胞の形態を観察するための手段と、前出ディスク付近の二酸化炭素の濃度を検出する手段と、前出ディスク付近の温度を検出する手段と、培地や前出細胞を接着面から剥離するための溶液や前出細胞を洗浄するための溶液を４℃に保持する手段およびこれらの溶液を加熱する手段を備え、前出ディスクを回転させることで生じる遠心力をもとに前出細胞培養容器中遠心力が最大になる部分に設置した隔室に細胞を凝集させることを特徴とする。
【００１５】
【発明の実施の形態】
本発明の１実施を図面に基づいて説明する。
図１ａは、本発明による細胞培養装置１０００を示したもので、前面には培養室ドア１０１０と培養液室ドア１０２０の２つのドアがあり、それぞれ培養を行うための培養室１０１５と、培養に用いる培地等の試薬を保存する培養液室１０２５（ここでは表示していない）へ別々にアクセスするために設置している。
【００１６】
図１ｂは説明のため培養室ドア１０１０と培養液室ドア１０２０を表示しないで、培養室１０１５と培養液室１０２５の内部を示したものである。培養室１０１５の上部には、撹拌扇３０８０を設置し内部の温度や湿度、二酸化炭素濃度等、細胞培養のための雰囲気を一様にする。また、培養室１０１５の奥面には、温度センサ３０６０や湿度センサ３０７０、二酸化炭素濃度センサ３０５０が設置され、これらのセンサが雰囲気の状態変化を検出し（表示しない）制御装置に信号を伝達し、それぞれに設定した範囲を超える変動が検出されたときには、この値を設定範囲に戻すような制御を加える。培養室１０１５の床部には、細胞培養容器としてディスク２０００が中心シャフト３００５を介して回転モータ３０００に接続されて設置されている。この細胞培養装置１０００の制御は、前面に設置した操作パネル１０４０を利用して、操作手順や培養条件の入力、培養操作の開始と停止等が可能で、さらに電源パネル１０３０に設置した（表示しない）外部インターフェースを介して細胞培養装置１０００とは別に設置した制御装置やコンピュータで細胞培養装置１０００を一台または複数台を制御することができる。なお、培養液室１０２５は、この内部に設置した交換用培地バッグや細胞剥離のための薬剤（例えばトリプシン等）バッグ３１００、（表示しない）リン酸緩衝食塩水用バッグの温度を４℃に保ち、これらをディスク２０００に注入する直前に細胞培養に適した温度（例えば３７℃）に加熱する機構（表示しない）を有する。
【００１７】
図２は、説明のためドアや壁、培養液室１０２５を表示せず、培養室１０１５の内部を示したものである。細胞培養容器としてディスク２０００が回転モータ３０００に接続されて設置され、回転モータ３０００はディスク２０００の内部で遠心力が５０×９０８ｍ毎秒毎秒に達するよう制御される。ディスク２０００の上部には培地モニタ３０４０が設置されていて、ディスク２０００に保持された培地について、そのｐＨ値に依存して変化する色のほか濁りを検出すし、（表示しない）制御装置に信号を伝達している。また、培地やリン酸緩衝食塩水、細胞剥離のための薬剤（例えばトリプシン等）を供給するためのピペッタ３０１０が設置されている。ピペッタ３０１０の先端には、２本以上のピペッタチューブが設置されており、図２に示したように２本の設置では、培地とリン酸緩衝食塩水を注入するためのピペッタチューブと、細胞剥離のための薬剤（例えばトリプシン等）を注入するためのピペッタチューブに分類している。これらは、（表示しない）ピペッタ駆動装置でピペッタ３０１０の回転停止位置を制御すること、及び、培養液室１０２５からの（表示しない）送液パイプ途中に設置した（表示しない）切り替え装置による流路切り替えによってディスク２０００への注入が制御されている。また、ディスク２０００から培養した細胞を取り出すためのピペッタ３０２０と、これによって取り出された細胞を格納するチューブ３１１０が設置されている。これについては後述する。ディスク２０００の下面には、位相差顕微鏡３０３０が設置されていて、ディスク２０００についてこれの反対側に設置した（表示しない）照明光源によって照明されたディスク２０００の一部の細胞の個数や形態を観察する。さらに、スライダー３０３２を用いて位相差顕微鏡３０３０をディスク２０００についてその半径方向に走査するとともに、ディスク２０００をその回転方向について走査することで、ディスク２０００の全面の細胞の個数や形態を観察する。
【００１８】
図３ａは、細胞培養容器としてディスク２０００の表面を示したもので、説明のために、ディスク面上の一部のフィルムを表示していない。ディスク２０００はポリスチレン製で、初代培養容器２１００他、２代培養容器２２００、３代培養容器２３００の他、これらを結ぶ継代流路が形成されており、この表面を防水で通気性のある通気性フィルム２０１０が覆っている。通気性フィルム２０１０には、初代培養容器２１００他、２代培養容器２２００、３代培養容器２３００へ培地等を注入するための注入穴２０４０と、これらの内部の湿度や圧力等雰囲気を培養室１０１５と均一にするための空気穴２０５０が、培養容器ごとに設置されている。
【００１９】
図３ｂは、ディスク２０００の裏面を示したもので、説明のために、ディスク面上の一部のフィルムを表示していない。この面には、初代培養容器２１００、２代培養容器２２００や３代培養容器２３００から培地等を抜き取るための培地抜き流路２１４５（表示しない）、２２４５，２４００等が設置されており、この表面を防水性フィルム２０３０が覆っている。防水性フィルム２０３０には、初代培養容器２１００，２代培養容器２２００や３代培養容器２３００からの培地等をディスク２０００から取り出すための培地抜き穴２１５０，２２６５，２４４２の他に、ディスク２０００に回転駆動力を伝えるためのピン穴２０６０や中心穴２０２０が設置されている。
【００２０】
図３ａと図３ｂに示したディスク２０００の培養容器や継代流路が形成されている部分は、ポリスチレンを射出成形して製作する他に、同じポリスチレンを板材に成形した後に切削しても製作することができる。また、ポリスチレンの材料の他に、メタクリル樹脂を射出成形やこれの切削でも製作することができる。いずれの場合でも、接着系細胞の形態や培地の様子を観察するためにディスク２０００を透明にするとともに、接着依存性細胞が増殖するために接着する初代培養容器２１００他、２代培養容器２２００、３代培養容器２３００の床面を、細胞が接着しやすくなるように、その表面にコラーゲンをコーティングしたり、プラズマ照射によってラジカルを発生させたりする。なお、樹脂材料の他にガラス材でディスク２０００を形成したり、薄いガラス材を初代培養容器２１００他、２代培養容器２２００、３代培養容器２３００の床面に貼り付けても、ディスク２０００を透明にしてその内部を観察することができ、また、細胞を培養することができる。
【００２１】
図４は、説明のためディスク２０００の一部を抜き出して表示したもので、これの表面にある通気性フィルム２０１０は特に表示していない。図４において、培養を始める細胞を培地に懸濁した溶液を（表示しない）手動のピペッタを使って初代培養容器２１００に注入する。このとき、溶液の液面が初代培養容器２１００を覆う通気性フィルムに接することがないよう注入量を多くし、接着依存性細胞以外の細胞や不純物の溶液中濃度を低くして、これらを原因とするコンタミネーションの発生を抑える。また、溶液の注入速度を高くして初代培養容器２１００内で溶液が渦を巻くようにし、細胞を初代培養容器２１００内の渦中心付近に集合させて、細胞数が少ない場合に細胞密度を高くして細胞培養を開始できるようにする。この走査の後、ディスク２０００を細胞培養装置１０００の培養室ドア１０１０を開けて中心シャフト３００５上に装着し、キャップ３００７でこれに固定する。
【００２２】
装着後しばらくして、初代培養容器２１００の壁面における培地４０００の液面が安定するようになると、底面に（表示しない）接着依存性細胞４０１０が貼り付き、この後増殖を始める。この時点で、培地４０００の交換作業を行い、接着依存性細胞４０１０とそれ以外の細胞との分別を行う。
【００２３】
この分別では、図５において、初代培養容器２１００の底面であってディスク２０００を回転させたときに生じる遠心力が最大になる場所に設置した底穴２１４０から、ディスク２０００の下面に設置した培地抜き流路２１４５と培地抜き穴２１５０を経由して中心シャフト３００５に設置された培地抜き軸穴を通して培地を抜き取る。このとき、ディスク２０００は静止しているが、抜き取る培地４０００の残液が少なくなってきたときには、ディスク２０００を回転させてこの培地４０００に１０ｍ毎秒毎秒以下の遠心力を掛けるようにしてもよい。このようにすると、残液を初代培養容器２１００底面で遠心力方向外側に設置した底穴２１４０に寄せることができ残液を残さず抜き取ることができる。
【００２４】
次に、新しい培地をピペッタ３０１０を使って初代培養容器２１００に注入する。このときは、培地の注入量を初代培養容器２１００の底面より２ｍｍ位の深さにするとともに、その注入速度を低くして水圧による細胞へのダメージを低減する。また、初代培養容器２１００は、２代培養容器２２００と３代培養容器２３００も同様であるが、その壁面が底面に対して斜めに構成して培地等の注入時に液の流入をスムーズにして、水圧による細胞へのダメージを低減する。この後、定期的、または、培地モニタ３０４０で培地の色の変化が変化した時点で、（古い）培地を抜き取り新しい培地を注入する培地交換作業を繰り返し行う。
【００２５】
次に、一定の時間が経過した後、または、顕微鏡３０３０をスライダー３０３２でディスク２０００の半径方向に移動させながらディスク２０００を回転走査させて初代培養容器２１００の底面に貼り付いた接着依存性細胞４０１０の密度を観測してこれが高くなってきたときに２代培養容器２２００への継代作業を行う。この密度の値は経験値であり、細胞の種類や培養条件によって変化する。
【００２６】
継代作業では、まず、これまでの培地交換作業と同様に培地を抜き取りる。そして、ピペッタ３０１０でリン酸緩衝食塩水を注入してから、ディスク２０００を緩やかに正逆回転させて、接着依存性細胞４０１０の表面をはじめ初代培養容器２１００内部を洗浄した後、これも同様に抜き取る。次に、接着依存性細胞４０１０を初代培養容器２１００の底面から剥離させるために、ピペッタ３０１０で細胞剥離剤、例えば５％濃度以下のトリプシン溶液を注入してから、ディスク２０００を緩やかに正逆回転させて、接着依存性細胞４０１０の剥離を促進させる。このとき、初代培養容器２１００の底面付近を顕微鏡３０３０で観察し、ディスク２０００の動きに同期して移動する細胞がなくなり、すべての細胞が剥離したことを確認する。次に、細胞剥離剤、例えば前出のトリプシン溶液の効果を押さえて細胞のダメージを抑えるため、ピペッタ３０１０でトリプシンを中和する中和剤、例えば新しい培地を注入し、ディスク２０００を緩やかに正逆回転させて中和を促進する。この状態では、細胞は培地によってその効果が押さえられたトリプシン溶液中に浮遊している状態である。
【００２７】
次に、この中から細胞を選択的に取り出し新しい２代培養容器２２００へ継代するために、ディスク２０００を回転させて遠心力を発生させる。この遠心分離によって、図６に示すように、細胞は継代流路２１０５の途中にある遠心力が最大になる流路部分２１１０に集まる。この遠心分離をしばらく続けると、細胞は遠心力が最大になる流路部分２１１０で凝集し、ディスク２０００の回転を止めて遠心力を無くしても、トリプシンと培地の溶液が初代培養容器２１００へと戻るのにつられることなく遠心力が最大になる流路部分２１１０に留まる。これに続いて、トリプシンと培地の溶液を底穴２１４０から抜き取り、替わって、ピペッタ３０１０でリン酸緩衝食塩水または新しい培地を注入し、さらに、ディスク２０００を緩やかに正逆回転させて流路部分２１１０に留まった細胞を再び懸濁し洗浄する。
【００２８】
なお、リン酸緩衝食塩水または新しい培地の液量は、先のトリプシンと培地の液量と同じく、ディスク２０００の回転中に初代培養容器２１００中にあるこれらの溶液の喫水線４０２０が継代流路２１０５の途中に設けられた流路断面の周囲長が変化する部分２１１５よりもディスク２０００の円周方向外側で流路断面の周囲長がより長い部分に位置するように決める。これは、この液量にすると、ディスク２０００の回転を止めて遠心力を無くしても、継代流路２１０５内の溶液の喫水線４０３０が表面張力によって継代流路２１０５内を２代培養容器の向きへ移動せず、おもな溶液が初代培養容器２１００へと戻るのにつられて喫水線４０３０は初代培養容器の向き（液面移動を示す矢印４０４０方向）へ移動するからである。
【００２９】
この後、再びディスク２０００を回転させて細胞を遠心分離し、これを継代流路２１０５の途中にある遠心力が最大になる流路部分２１１０に集める。この洗浄の繰り返しは、細胞へのダメージの程度または細胞を増殖させるスループットに対応するよう決定される。
【００３０】
洗浄終了後、再び、ピペッタ３０１０で新しい培地を注入しディスク２０００を緩やかに正逆回転させて流路部分２１１０に留まった細胞を再び懸濁する。そして、ディスク２０００を回転させるが、このときの注入量は、図７に示すように、ディスク２０００を回転させたときに継代流路２１０５中の喫水線４０７０が流路断面の周囲長が変化する部分２１１５よりもディスク２０００の円周方向内側で流路断面の周囲長がより短い部分に位置するように決める。また、回転数は、この回転による遠心力で細胞が遠心力が最大になる流路部分２１１０で凝集する時間がより長くなるように低くする。
【００３１】
次に、ディスク２０００の回転数を徐々に落として遠心力を小さくしてゆき、継代流路２１０５中の喫水線４０７０の部分において継代流路２１０５内壁による表面張力が遠心力よりも強くなるようにする。但し、ディスク２０００の回転は停止させないようにする。これは、初代培養容器２１００壁面での継代流路２１０５の取り入れ口に気泡が混入しないようにするためである。この結果、細胞が懸濁されている培地は表面張力によって継代流路２１０５中を２代培養容器２２００の向き（液面移動を示す矢印４０８０方向）へ移動する。そして、継代流路の集合部２１２０で３つの継代流路２１２５と２１３０と２１３５に分かれ、最終的には、それぞれの流路が２代培養容器２２００に到達する部分まで移動する。
【００３２】
次に、ディスク２０００の回転数を徐々に上げて遠心力を大きくしてゆく。すると、継代流路２１２５と２１３０と２１３５のそれぞれが２代培養容器２２０２，２２０４，２２００に到達する部分の培地４０００に掛かる遠心力は、初代培養容器２１００中の培地４０００の喫水線４０６０よりも大きくなるため、サイフォンの原理によって初代培養容器２１００中の培地４０００の全てがそれぞれの２代培養容器２２００へ移動する。このとき、継代流路２０２５と２１３０と２１３５の流路長を全て同じに構成すると、２代培養容器２２００へは同量の細胞が懸濁されている培地が移動する。
【００３３】
次に、移動先の２代培養容器２２００，２２０２，２２０４は初代培養容器２１００よりも面積が広いため、それぞれの培養容器で培地の深さが２ｍｍになるよう新たな培地を追加注入し、ディスク２０００を緩やかに正逆回転させて細胞を２代培養容器２２００の床面にわたって均一に播種する。
【００３４】
２代培養容器２２００での細胞培養については、初代培養容器２１００での培養方法と同様である。すなわち、２代培養容器２２００底面に（表示しない）接着依存性細胞４０１０が貼り付き、この後増殖を始める。次に、ピペッタ３０１０を使って新しい培地を２代培養容器２２００に注入する。このときは、培地の注入量を２代培養容器２２００の底面より２ｍｍ位の深さにするとともに、その注入速度を低くして水圧による細胞へのダメージを低減する。この後、定期的、または、培地モニタ３０４０で培地の色の変化が変化した時点で、（古い）培地を抜き取り新しい培地を注入する培地交換作業を繰り返し行う。図８ａは、初代培養容器２１００と２代培養容器２２００とこれらの間の継代流路２２０５を表示したもので、培地等を抜き取るための底穴２２４０を２代培養容器２１００の底であってディスク２０００を回転させたときに生じる遠心力が最大になる場所に設置している。底穴２２４０は、図８ｂに示すように、ディスク２０００の裏面に設置した培地抜き流路２２４５、および培地抜き穴２２６５、（表示しない）培地抜き軸穴へと接続しており、培地をこの経路を通して抜き取る。なお、図８ａで示した３つの２代培養容器２２００と２２０２と２２０４からそれぞれ培地等を抜き取るための培地抜き流路２２４５，２２５０，２２５５の流路長（培養容器の取り入れ口から培地抜き流路の集合部２２６０まで）はすべて同じにして、２代培養容器２２００と２２０２と２２０４から培地等の抜き取りが同時に終了するようにしている。これは、培養容器から培地を一つでも先に抜き取ると、その容器から培地等を抜き取る培地抜き流路に空気が流入して、残った培地を抜き取るための圧力差が小さくなってしまうからである。
【００３５】
この後、一定の時間が経過した後、または、顕微鏡３０３０をスライダー３０３２でディスク２０００の半径方向に移動させながらディスク２０００を回転走査させて２代培養容器２２００の底面に貼り付いた接着依存性細胞４０１０の密度を観測してこれが高くなってきたとき２代培養容器２３００他への継代作業を行う。
【００３６】
この継代作業は、初代培養容器２１００から２代培養容器２２００への継代方法と同様である。すなわち、図９において、２代培養容器２２００から培地を抜き取る。次に、ピペッタ３０１０でリン酸緩衝食塩水をこれに注入してから、ディスク２０００を緩やかに正逆回転させて、接着依存性細胞４０１０の表面をはじめ２代培養容器２２００内部を洗浄しこれを抜き取る。次に、接着依存性細胞４０１０を２代培養容器２２００の底面から剥離させるために、ピペッタ３０１０で細胞剥離剤、例えば５％濃度以下のトリプシン溶液を注入してから、ディスク２０００を緩やかに正逆回転させて、接着依存性細胞４０１０の剥離を促進させる。このとき、２代培養容器２２００の底面付近を顕微鏡３０３０で観察し、ディスク２０００の動きに同期して移動する細胞がなくなり、すべての細胞が剥離したことを確認する。次に、細胞剥離剤、例えば前出のトリプシン溶液の効果を押さえて細胞のダメージを抑えるため、ピペッタ３０１０でトリプシンを中和する中和剤、例えば新しい培地を注入し、ディスク２０００を緩やかに正逆回転させて中和を促進する。この状態では、細胞は培地によってその効果が押さえられたトリプシン溶液中に浮遊している状態である。次に、ディスク２０００を回転させ、溶液中の細胞を遠心分離によって継代流路２２０５中で遠心力が最大になる部分２２１０に凝集させる。ディスク２０００の回転を停止させる（細胞は、流路部分２２１０に凝集したまま）。次に、トリプシンと培地の溶液を抜き取り、替わってリン酸緩衝食塩水または新しい培地をピペッタ３０１０で注入し、さらに、ディスク２０００を緩やかに正逆回転させて流路部分２２１０に留まった細胞を再び懸濁し洗浄する。
【００３７】
なお、リン酸緩衝食塩水または新しい培地の液量は、先のトリプシンと培地の液量と同じく、ディスク２０００の回転中に２代培養容器２２００中にあるこれらの溶液の喫水線４２００が継代流路２２０５の途中に設けられた流路断面の周囲長が変化する部分２２１５よりもディスク２０００の円周方向外側で流路断面の周囲長がより長い部分に位置するように決める。これは、この液量にすると、ディスク２０００の回転を止めて遠心力を無くしても、継代流路２２０５内の溶液の喫水線４２００が表面張力によって継代流路２２０５内を２代培養容器の向きへ移動せず、おもな溶液が２代培養容器２２００へと戻るのにつられて喫水線４２１０は初代培養容器の向き（液面移動を示す矢印４２２０方向）へ移動するからである。
【００３８】
この後、再びディスク２０００を回転させて細胞を遠心分離し、これを継代流路２２０５の途中にある遠心力が最大になる流路部分２２１０に集める。この洗浄の繰り返しは、細胞へのダメージの程度または細胞を増殖させるスループットに対応するよう決定される。
【００３９】
洗浄終了後、再び新しい培地をピペッタ３０１０で注入しディスク２０００を緩やかに正逆回転させて流路部分２２１０に留まった細胞を再び懸濁する。そして、ディスク２０００を回転させるが、このときの注入量は、図１０に示すように、ディスク２０００を回転させたときに継代流路２２０５中の喫水線４２４０が流路断面の周囲長が変化する部分２２１５よりもディスク２０００の円周方向内側で流路断面の周囲長がより短い部分に位置するように決める。また、回転数は、この回転による遠心力で細胞が遠心力が最大になる流路部分２２１０で凝集する時間が長くなるように低くする。
【００４０】
次に、ディスク２０００の回転数を徐々に落として遠心力を小さくしてゆき、継代流路２２０５中の喫水線４２４０の部分において継代流路２２０５内壁による表面張力が遠心力よりも強くなるようにする。但し、ディスク２０００の回転は停止させないようにし、２代培養容器２２００壁面での継代流路２２０５の取り入れ口に気泡が混入しないようにする。この結果、細胞が懸濁されている培地は表面張力によって、継代流路２２０５中を３代培養容器２３００の向き（液面移動を示す矢印４２５０方向）へ移動しはじめ、継代流路の集合部２２２０で２つの継代用分岐流路２２２５と２２２７に分かれ、さらに、継代用分岐流路２２２５は（継代用分岐流路２２２７も同様）２つの継代用分岐流路２２３０と２２３５に分かれ、最終的には、それぞれの流路が３代培養容器２３００と２３０２に到達する部分まで移動する。
【００４１】
次に、ディスク２０００の回転数を徐々に上げて遠心力を大きくしてゆく。すると、継代用分岐流路２２３０と２２３５が３代培養容器２３００または２３０２に到達する部分の培地４０００に掛かる遠心力は、２代培養容器２２００中の培地４０００の喫水線４２３０よりも大きくなるため、サイフォンの原理によって２代培養容器２２００中の培地４０００が３代培養容器２３００または２３０２へ移動する。
【００４２】
このとき、３代培養容器２３００にある継代用分岐流路２２３０出口から継代流路の集合部２２２０までと３代培養容器２３０２にある継代用分岐流路２２３５出口から継代流路の集合部２２２０までと３代培養容器２３０４にある継代用分岐流路２２２８出口から継代流路の集合部２２２０までと３代培養容器２３０６にある継代用分岐流路２２２９出口から継代流路の集合部２２２０までの流路長を全て同じに構成すると、２代培養容器２２００から３代培養容器２３００，２３０２，２３０４，２３０６へは同量の細胞が懸濁されている培地が移動する。
【００４３】
次に、移動先の３代培養容器２３００，２３０２，２３０４，２３０６すべての面積は２代培養容器２２００よりも大きいため、それぞれの培養容器で培地の深さが２ｍｍになるよう新たに培地を追加注入し、ディスク２０００を緩やかに正逆回転させて細胞を３代培養容器２３００，２３０２，２３０４，２３０６それぞれの床面にわたって均一に播種する。
【００４４】
３代培養容器２３００での細胞培養については、初代培養容器２１００や２代培養容器２２００での培養方法と同様である。すなわち、３代培養容器２３００底面に接着依存性細胞４０１０が貼り付き、この後増殖を始める。次に、新しい培地をピペッタ３０１０を使って３代培養容器２３００に注入する。このときは、培地の注入量を３代培養容器２３００の底面より２ｍｍ位の深さにするとともに、その注入速度を低くして水圧による細胞へのダメージを低減する。この後、定期的、または、培地モニタ３０４０で培地の色の変化が変化した時点で、（古い）培地を抜き取り新しい培地を注入する培地交換作業を繰り返し行う。
【００４５】
図１１は、２代培養容器２２００と３代培養容器２３００と２３０２、これらの間の継代流路２２０５を表示したもので、３代培養容器２３００から培地等を抜き取るための底穴２３１０は、３代培養容器２３００の底であってディスク２０００を回転させたときに生じる遠心力が最大になる場所に設置している。図１２はディスク２０００の裏面を示したもので、説明のため防水フィルム２０３０は表示していない。図１２において、底穴２３１０は、ディスク２０００の裏面に設置した培地抜き流路２４００、２４３０を通って培地抜き穴２４５０、（表示しない）培地抜き軸穴へと接続しており、培地をこの経路を通して抜き取る。なお、図１１で示した３代培養容器２３００と２３０２からそれぞれ培地等を抜き取るための培地抜き流路２４００、２４１０について、培地抜き流路２４３０を通って培地抜き流路の集合部２４４０までの流路長は同じにして、３代培養容器２３００と２３０２から培地等の抜き取りが同時に終了するようにしている。その他の３代培養容器についても、培地抜き取り流路の入り口にある底穴から培地抜き流路の集合部２４４０までの流路長は同じにしている。これは、培養容器から培地を一つでも先に抜き取ることによって培地抜き流路に空気が流入し、その時点で残った培地を抜き取るための圧力差が小さくなってしまうのを防ぐためである。
【００４６】
一定の時間が経過した後、または、顕微鏡３０３０をスライダー３０３２でディスク２０００の半径方向に移動させながらディスク２０００を回転させて３代培養容器２３００他の底面に貼り付いた接着依存性細胞４０１０の密度を観測してこれが高くなってきたとき細胞の収穫を行う。
【００４７】
まず、３代培養容器２３００他すべてから培地を抜き取る。次に、ピペッタ３０１０でリン酸緩衝食塩水をこれら培養容器に注入してから、ディスク２０００を緩やかに正逆回転させて、接着依存性細胞４０１０の表面をはじめ培養容器の内部を洗浄しこれを抜き取る。次に、接着依存性細胞４０１０を培養容器の底面から剥離させるために、ピペッタ３０１０で細胞剥離剤、例えば５％濃度以下のトリプシン溶液を培養容器に注入してから、ディスク２０００を緩やかに正逆回転させて、接着依存性細胞４０１０の剥離を促進させる。このとき、３代培養容器２２００他の底面付近を顕微鏡３０３０で観察し、ディスク２０００の動きに同期して移動する細胞がなくなり、すべての細胞が剥離したことを確認する。次に、細胞剥離剤、例えば前出のトリプシン溶液の効果を押さえて細胞のダメージを抑えるため、ピペッタ３０１０でトリプシンを中和する中和剤、例えば新しい培地を培養容器に注入し、ディスク２０００を緩やかに正逆回転させて中和を促進する。この状態では、細胞は培地によってその効果が押さえられたトリプシン溶液中に浮遊している状態である。次に、ディスク２０００を回転させ、溶液中の細胞を遠心分離によって３代培養容器２３００中で遠心力が最大になる斜面２３２０の外側にある細胞収集穴２３３０に凝集させる。次に、ディスク２０００の回転を徐々に下げ停止させる（細胞は、細胞収集穴２３３０に凝集したまま）。次に、トリプシンと培地の溶液を抜き取り、替わってピペッタ３０１０でリン酸緩衝食塩水または新しい培地を注入し、ディスク２０００を緩やかに正逆回転させて細胞収集穴２３３０に留まった細胞を再び懸濁し洗浄する。次に、ディスク２０００を回転させ、溶液中の細胞を遠心分離によって３代培養容器２３００中で遠心力が最大になる斜面２３２０の外側にある細胞収集穴２３３０に凝集させる。次に、ディスク２０００の回転を徐々に下げ停止させる（細胞は、細胞収集穴２３３０に凝集したまま）。次に、ピペッタ３０１０でリン酸緩衝食塩水を注入し、ディスク２０００を緩やかに正逆回転させて細胞収集穴２３３０に留まった細胞を再び懸濁し洗浄する。
【００４８】
図１３ａは、この洗浄の様子を示したもので、ディスク２０００を回転させた状態ではリン酸緩衝食塩水４３００は３代培養容器２３００中で外側に偏っており、さらに、接着依存性細胞４０１０は細胞収集穴２３３０の中で外側に偏る。この状態からディスク２０００の回転を徐々に下げ停止させると、図１３ｂに示すように、リン酸緩衝食塩水４３００はその水面が３代培養容器２３００の底面と平行になり、接着依存性細胞４０１０を含む細胞収集穴２３３０中の溶液とは分離するようになる。また、細胞収集穴２３３０の中では、接着依存性細胞４０１０が底に、リン酸緩衝食塩水４３００がその上に積層した状態となる。そのため、わずかなリン酸緩衝食塩水４３００を用いた洗浄液が接着依存性細胞４０１０と混ざり合ってしまうので、リン酸緩衝食塩水を用いる細胞の洗浄を数度繰り返すことで、洗浄の程度を向上させる。
【００４９】
次に、ディスク２０００にある１２カ所の細胞収集穴２３３０から収穫用ピペッタ３０２０を使って収穫用チューブ３１００へ細胞を収穫する。図１４において、収穫用ピペッタ３０２０の先端には収穫用ピペッタチューブ３０２４と、このチューブがディスク２０００の表面を覆う通気性フィルム２０１０を通して接着依存性細胞４０１０を含むリン酸緩衝食塩水４３００を吸入するために通気性フィルム２０１０に穴を開ける穴開け用カッタ３０２２が取り付けられている。
【００５０】
細胞の収穫の前に、ピペッタ駆動装置３０２６で収穫用ピペッタ３０２０を持ち上げながら穴開け用カッタ３０２２を収穫用チューブ３１００の上に位置決めする。穴開け用カッタ３０２２が収穫用チューブ３１００の入り口を封止しているフィルムを突き刺して穴を開けるようピペッタ駆動装置３０２６が収穫用ピペッタ３０２０の上下位置を下げる。この収穫用チューブ３１００の入り口を封止しているフィルムは、収穫用チューブ３１００を細胞培養の開始時にインキュベータ１０００内へ装着するため、細胞の収穫までの長い時間に収穫用チューブ３１００の内部が汚染されるのを防ぐために設置している。
【００５１】
次に、細胞の収穫では、ピペッタ駆動装置３０２６で収穫用ピペッタ３０２０を持ち上げながら穴開け用カッタ３０２２を対象となる細胞収集穴２３３０の上に位置決めする（これに合わせてディスク２０００も回転方向について、対象となる細胞収集穴２３３０を穴開け用カッタ３０２２の下に位置決めする）。図１５ａにおいて、穴開け用カッタ３０２２が対象となる細胞収集穴２３３０の直上にある通気性フィルム２０１０を突き刺して穴を開けるようピペッタ駆動装置３０２６が収穫用ピペッタ３０２０の上下位置を下げる。次に、穴開け用カッタ３０２２が細胞収集穴２３３０中のリン酸緩衝食塩水４３００に触れないところまで下げた後、穴開け用カッタ３０２２の先端がディスク２０００から完全に離れるまで収穫用ピペッタ３０２０を上昇させる。次に、ピペッタ駆動装置３０２６で収穫用ピペッタ３０２０を回転させて、収穫用ピペッタチューブ３０２４が対象となる細胞収集穴２３３０の上に位置決めする。
【００５２】
次に、図１５ｂにおいて、収穫用ピペッタ３０２０がその先端を対象となる細胞収集穴２３３０の直上にある通気性フィルム２０１０に開いた穴を通してる細胞収集穴２３３０の底面まで到達するように収穫用ピペッタ３０２０を下降させ、接着依存性細胞４０１０を含むリン酸緩衝食塩水４３００を吸入する。次に、収穫用ピペッタ３０２０の先端がディスク２０００から完全に離れるまで収穫用ピペッタ３０２０を上昇させた後、収穫用ピペッタ３０２０を回転させてその先端を収穫用チューブ３１００の上に位置決めする。次に、収穫用ピペッタ３０２０がその先端を収穫用チューブ３１００の中に入るまで収穫用ピペッタ３０２０を下降させ、接着依存性細胞４０１０を含むリン酸緩衝食塩水４３００を静かに吐出する。これと同様にして、残りの細胞収集穴からも接着依存性細胞４０１０を含むリン酸緩衝食塩水４３００を収穫用チューブ３１００へ収穫する。
【００５３】
この後、収穫用チューブ３１００をインキュベータ１０００から取り出してキャップをかぶせてから、冷蔵庫内で保存する。または、収穫用チューブ３１００から手動ピペッタで接着依存性細胞４０１０を含むリン酸緩衝食塩水４３００を別のチューブに移してからこれにキャップをかぶせてから、冷蔵庫内に保存してもよい。
【００５４】
なお、トリプシンと培地の溶液や洗浄用のリン酸緩衝食塩水または新しい培地を抜き取る際、ディスク２０００の回転数を前出の回転数よりも低く設定し、これらの溶液中の細胞が継代流路２１０５の途中にある遠心力が最大になる流路部分２１１０、継代流路２２０５の途中にある遠心力が最大になる流路部分２２１０、または、細胞収集穴２３３０に凝集するまでもなくほぼ集まった時点で、ディスク２０００が回転中にそのまま溶液を抜き取る方法が、前出の構成では可能である。この方法では、ディスク細胞収集穴２３３０の回転中に溶液を抜き取るための機構として中心シャフト３００５に回転する物体側から静止側に液体を取り出す継ぎ手を使用する必要があるが、ディスク２０００の回転数を低く抑えて回転モータ３０００のコストを下げることができる、ディスク２０００酸緩衝食塩水４３００に細胞を懸濁しやすくなり細胞の洗浄時間と継代時間を短くできるという利点がある。
【００５５】
以上の説明のとおり、人手を使うことなく培地交換作業が自動化でき、細胞培養装置１０００内にディスク２０００入れたまま細胞を培養するため細胞の育成環境に変化がなく細胞へのストレスを押さえることができ、コンタミネーションも押さえることができるため、少量の細胞を培養して多量の細胞を得ることができる。
【００５６】
さらに、培地交換作業が自動化させることによって、人手による培地交換作業に比べて培地交換の頻度を高めることができ、細胞培養容器中での最大細胞培養密度を高めることができ、小さなディスクで多量の細胞を培養することができる可能性がある。また、人手による培地交換作業では難しかった古い培地を最大５０％残して、新たな培地を不足分だけ注入することが正確にできるため、細胞培養中に細胞自体が生み出す微量物質を培地交換後でも失うことがなくなるため、細胞培養条件をさらに最適化することができるという特色がある。
【００５７】
【発明の効果】
本発明によれば、接着依存性細胞を細胞培養するうえで、培地の交換作業、継代作業を自動化できるので、細胞培養のコストを下げることができること、コンタミネーションによる細胞の死滅を押さえることができること、培養環境の変化による細胞へのストレスを押さえることができるという効果がある。
【００５８】
さらに、培地交換の頻度を高められるので効率の良い細胞培養が可能、古い培地と新しい培地が混合するように培地交換できるので細胞培養条件をさらに最適化することができるという効果も期待できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】細胞培養器及び細胞培養器内部説明するための図。
【図２】細胞培養器内部を説明するための図。
【図３】細胞培養ディスクの構造を説明するための図。
【図４】細胞培養ディスク上の細胞培養容器と、継代に用いる流路とこの中を移動する溶液の様子を説明する図。
【図５】細胞培養ディスク上の細胞培養容器から培地等を抜き取るための構造とこの中を移動する溶液の様子を説明する図。
【図６】細胞培養ディスク上の細胞培養容器間で継代における溶液の様子を説明する図。
【図７】細胞培養ディスク上の細胞培養容器間で継代における溶液の様子を説明する図。
【図８】細胞培養ディスクの構造を説明するための図。
【図９】細胞培養ディスク上の細胞培養容器間で継代における溶液の様子を説明する図。
【図１０】細胞培養ディスク上の細胞培養容器間で継代における溶液の様子を説明する図である。
【図１１】細胞培養ディスク上の細胞培養容器と、継代に用いる流路とこの中を移動する溶液の様子を説明する図。
【図１２】細胞培養ディスクの構造を説明するための図。
【図１３】細胞を収穫するための構造と、中を移動する溶液の様子を説明する図。
【図１４】細胞を収穫するための構造と、動作を説明する図。
【図１５】細胞を収穫するための構造と、動作を説明する図。
【符号の説明】
１０００  細胞培養装置、２０００  ディスク、２０１０  通気性フィルム、２０３０  防水フィルム、２０４０  注入穴、２０５０  空気穴、２１００  初代培養容器、２１０５，２２０５  継代流路、２１１５，２２１５  断面の周囲長が変化する部分、２１２０，２２２０継代流路の集合部分、２１２５，２１３０，２１３５  継代分岐流路、２１４０，２２４０，２３１０  底穴、２１４５，２２４５，２４００  培地抜き流路、２１５０，２２６２，２４４２  抜き穴、２２００，２２０２２，２２０４  代培養容器、２２６０，２４２０，２４４０  培地抜き流路の集合部分、２３００，２３０２，２３０４，２３０６  ３代培養容器、２３２０  斜面、２３３０  細胞収集穴、３０００  回転モータ、３０１０  ピペッタ、３０２０  収穫用ピペッタ、３０２２  穴開け用カッタ、３０２４  収穫用ピペッタチューブ、３０２６  ピペッタ駆動装置、３０３０  位相差顕微鏡、３０４０  培地モニタ、３１１０  収穫用チューブ、４０００  培地、４０１０  接着依存性細胞、４０２０，４０３０，４０６０，４０７０，４２００，４２１０，４２３０，４２４０  喫水線
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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