(57)【要約】【課題】タンパク質相互作用を阻害するインヒビターのスクリーニングを、簡便に、また高速で大量に行うことを課題とする。【解決手段】相互作用するタンパク質Ｘおよびタンパク質Ｙを用意し、タンパク質Ｘとタンパク質Ｙとが相互作用することにより転写が活性化されるレポーター遺伝子を含む発現系を有する宿主細胞に、タンパク質Ｘ−ＤＮＡ結合ドメイン複合体をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドを有する発現ベクターと、タンパク質Ｙ−転写活性化ドメイン複合体をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドを有する発現ベクターとを導入すると共に、相互作用のインヒビター候補を前記宿主細胞に接触させ、レポーター遺伝子の転写活性化が検出されない場合に、前記インヒビター候補を、タンパク質ＸおよびＹの相互作用を阻害するインヒビターとして認定する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質Ｘとタンパク質Ｙとは相互作用するタンパク質であり、
タンパク質Ｘとタンパク質Ｙとが相互作用することにより転写が活性化されるレポーター遺伝子を含む発現系を有する宿主細胞に、タンパク質Ｘ−ＤＮＡ結合ドメイン複合体をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドを有する発現ベクターと、タンパク質Ｙ−転写活性化ドメイン複合体をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドを有する発現ベクターとを導入すると共に、
相互作用のインヒビター候補を前記宿主細胞に接触させ、
レポーター遺伝子の転写活性化が検出されない場合に、前記インヒビター候補を、タンパク質ＸおよびＹの相互作用を阻害するインヒビターとして認定する、相互作用インヒビターの検出方法。
【請求項２】
相互作用するｎ組のタンパク質ＸｍおよびＹｍの組み合わせである（タンパク質Ｘ１，タンパク質Ｙ１）、（タンパク質Ｘ２，タンパク質Ｙ２）、・・・・・、（タンパク質Ｘｎ，タンパク質Ｙｎ）〔但し、ｎは１以上の整数、ｍは１〜ｎの任意の整数〕について、タンパク質Ｘｍ−ＤＮＡ結合ドメイン複合体をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドを有する発現ベクター（Ｘｍ）と、タンパク質Ｙｍ−転写活性化ドメイン複合体をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドを有する発現ベクター（Ｙｍ）とを作製し、
タンパク質Ｘｍとタンパク質Ｙｍとが相互作用することにより転写が活性化される細胞毒性遺伝子を含む発現系を有する宿主細胞に、相互作用するタンパク質ＸｍおよびＹｍの組み合わせごとに発現ベクター（Ｘｍ）および（Ｙｍ）を導入してｎ種の宿主細胞を作製し、
前記ｎ種の宿主細胞に相互作用のインヒビター候補を接触させ、
細胞毒性遺伝子の転写活性化が検出されない場合に、前記インヒビター候補を、タンパク質相互作用を阻害するインヒビターとして認定する、相互作用インヒビターの検出方法。
【請求項３】
前記インヒビター候補が複数あり、各インヒビター候補ごとに、ｎ種の宿主細胞とインヒビター候補とを接触させる、請求項２に記載の相互作用インヒビターの検出方法。
【請求項４】
前記細胞毒性遺伝子の発現系が、所定の温度条件下ではタンパク質の相互作用が生じても細胞毒性遺伝子の転写が活性化されない温度感受性を有しており、インヒビター候補を、細胞毒性遺伝子の転写活性化が可能な温度条件下で前記宿主細胞に接触させる、請求項２または３に記載の相互作用インヒビターの検出方法。
【請求項５】
ＤＮＡ結合ドメイン、転写活性化ドメイン、細胞毒性遺伝子の発現制御領域内のＤＮＡ結合ドメイン結合部、細胞毒性遺伝子の発現制御領域内の転写装置結合部のうち少なくとも１種が、所定の温度条件下では不活性となり細胞毒性遺伝子の転写が活性化されない、請求項４に記載の相互作用インヒビターの検出方法。
【請求項６】
ＤＮＡ結合ドメインが、温度感受性λｃＩ、温度感受性ＧＡＬ４および温度感受性ＬｅｘＡからなる群より選ばれる、請求項５に記載の相互作用インヒビターの検出方法。
【請求項７】
前記細胞毒性遺伝子の遺伝子産物が、所定の温度条件下では細胞毒性活性を有しない温度感受性を有しており、インヒビター候補を、前記遺伝子産物が細胞毒性活性を有する温度条件下で前記宿主細胞に接触させる、請求項２から６のいずれか一項に記載の相互作用インヒビターの検出方法。
【請求項８】
前記宿主細胞が、大腸菌または枯草菌である、請求項１から７のいずれか一項に記載の相互作用インヒビターの検出方法。
【請求項９】
相互作用するｎ組のタンパク質ＸｍおよびＹｍの組み合わせである（タンパク質Ｘ１，タンパク質Ｙ１）、（タンパク質Ｘ２，タンパク質Ｙ２）、・・・・・、（タンパク質Ｘｎ，タンパク質Ｙｎ）〔但し、ｎは１以上の整数、ｍは１〜ｎの任意の整数〕について、タンパク質Ｘｍ−ＤＮＡ結合ドメイン複合体をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドを有する発現ベクター（Ｘｍ）と、タンパク質Ｙｍ−転写活性化ドメイン複合体をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドを有する発現ベクター（Ｙｍ）とを作製し、
タンパク質Ｘｍとタンパク質Ｙｍとが相互作用することにより転写が活性化される細胞毒性遺伝子を含む発現系を有する宿主細胞に、相互作用するタンパク質ＸｍおよびＹｍの組み合わせごとに発現ベクター（Ｘｍ）および（Ｙｍ）を導入してｎ種の宿主細胞を作製し、
相互作用の複数のインヒビター候補を、各インヒビター候補ごとに前記ｎ種の宿主細胞に接触させて得られ、かつ、細胞毒性遺伝子の転写活性化を阻害するインヒビターを含む、相互作用インヒビターライブラリー。
【請求項１０】
前記細胞毒性遺伝子の発現系が、タンパク質の相互作用が生じても所定の温度条件下では細胞毒性遺伝子の転写が活性化されない温度感受性を有し、細胞毒性遺伝子が転写可能な温度条件下で、相互作用の複数のインヒビター候補を、各インヒビター候補ごとに前記ｎ種の宿主細胞に接触させて得られる、請求項９に記載の相互作用インヒビターライブラリー。
【請求項１１】
前記細胞毒性遺伝子の遺伝子産物が、所定の温度条件下では細胞毒性活性を有しない温度感受性を有しており、インヒビター候補を、前記遺伝子産物が細胞毒性活性を有する温度条件下で前記宿主細胞に接触させて得られる、請求項９または１０に記載の相互作用インヒビターライブラリー。
【請求項１２】
ＤＮＡ結合ドメインが組み込まれた発現ベクターと、転写活性化ドメインが組み込まれた発現ベクターと、ＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメインにより転写活性が調節される細胞毒性遺伝子が導入された宿主細胞とを備える、相互作用インヒビター検出キット。
【請求項１３】
ＤＮＡ結合ドメインが組み込まれた発現ベクターと、転写活性化ドメインが組み込まれた発現ベクターと、ＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメインにより転写活性が調節される細胞毒性遺伝子の発現系が組み込まれた発現ベクターと、宿主細胞とを備える、相互作用インヒビター検出キット。
【請求項１４】
ＤＮＡ結合ドメイン、転写活性化ドメイン、細胞毒性遺伝子の発現制御領域内のＤＮＡ結合ドメイン結合部、細胞毒性遺伝子の発現制御領域内の転写装置結合部のうちの少なくとも１種が、所定の温度条件下では不活性となり細胞毒性遺伝子の転写が活性化されない温度感受性を有する、請求項１２または１３に記載の相互作用インヒビター検出キット。
【請求項１５】
細胞毒性遺伝子の遺伝子産物が、所定の温度条件下では細胞毒性活性を有しない温度感受性を有する、請求項１２から１４のいずれか一項に記載の相互作用インヒビター検出キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、タンパク質相互作用を阻害するインヒビターの検出に関し、詳しくは、多数のインヒビター候補の中からインヒビターを高速でスクリーニングできるインヒビターの検出方法、インヒビター検出キット、検出試験の結果得られるインヒビターライブラリーに関する。
【０００２】
【従来の技術】
タンパク質は主要な生体構成分子であり、タンパク質とタンパク質との相互作用は、生体における代謝、シグナル伝達などの様々なプロセスにおいて不可欠なものである。また、近年のゲノム解析の進展等により、次々に新規なタンパク質が見出されている。このような状況で、タンパク質の相互作用を系統立て解析し、タンパク質の機能を解析することが、学術的のみならず、バイオテクノロジーに関わるすべての産業界において急務とされている。具体的には、新規医薬の開発や遺伝的疾病の治療研究などにおいては、タンパク質相互作用を阻害する物質を発見し同定することは極めて有用である（以下、阻害物質のことを「インヒビター」という）。
【０００３】
タンパク質の機能を阻害する阻害物質を検出するには、対象のタンパク質の種類、機能などにより様々な手法が採られるが、いずれにせよタンパク質の精製を行い、これにインヒビターの候補となる物質（以下、「インヒビター候補」という）が結合するか否かをまず確認するのが一般的である。しかし、タンパク質の精製作業は繁雑であり、また多数のインヒビター候補について試験を行うほど多量に精製し実験を行うことは作業負担が大きい。
【特許文献１】
米国特許第５９２５５２３号明細書
【特許文献２】
米国特許第５４６８６１４号明細書
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は上記のような観点からなされたものであり、タンパク質相互作用を阻害するインヒビターのスクリーニングを、簡便に、また高速で大量に行うことを課題とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を進め、タンパク質の相互作用を検定する方法の１つであるツーハイブリッドシステムに着目した。一般に、ツーハイブリッドシステムは、新規に相互作用をするタンパク質の組み合わせを検出する目的で用いられる。ツーハイブリッドシステムは、ＦｉｅｌｄｓおよびＳｏｎｇにより酵母を用いたシステムが構築され、タンパク質相互作用の同定手法に大きな進展をもたらした（米国特許第５９２５５２３号、米国特許第５４６８６１４号）。
【０００６】
酵母ツーハイブリッド系の一例を挙げ、ツーハイブリッドシステムの原理を説明する。酵母ツーハイブリッド系は、２つの分離可能な機能性ドメインを保有する多種多様な真核生物転写因子の特徴を利用する。２つのドメインのうちの一方は、シスエレメントを特異的に認識して結合するＤＮＡ結合ドメイン（「ＤＢＤ」と略称する場合がある）であり、他方は、転写を活性化する転写活性化ドメイン（「ＡＤ」と略称される場合がある）である。このツーハイブリッド系では、ＤＮＡ結合ドメイン（ＧＡＬ４ｂｄまたはｌｅｘＡ）と関心のあるタンパク質「Ａ」とを含むいわゆるｂａｉｔタンパク質が酵母内で融合タンパク質として発現される。同じ酵母細胞はまた、同時に、ＤＮＡ活性化ドメイン（ＧＡＬ４ａｄまたはＶＰ１６）およびタンパク質「Ｂ」を含むいわゆるｆｉｓｈタンパク質も発現する。ｂａｉｔタンパク質とｆｉｓｈタンパク質とが相互作用すると、これらの融合タンパク質のＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメインが近接するようになり、その結果生じるタンパク質複合体がレポーター遺伝子（例えばＨＩＳ３またはｌａｃＺ）の発現を誘発する。この発現は、ヒスチジン不含の選択培地上での該酵母細胞の培養により、またはｌａｃＺ遺伝子の活性化により容易にモニターできる。例えば未知のｆｉｓｈタンパク質をコードするＤＮＡ配列は、対応するプラスミドを単離し、続いて塩基配列分析を行うことにより容易に同定可能である。なお、ツーハイブリッドシステムにおいては、試験対象となる一方のタンパク質であって、探索の標的となるタンパク質のことを標的タンパク質、ｐｒｅｙ（プレイ：獲物）タンパク質またはｆｉｓｈ（フィッシュ）タンパク質などといい、標的タンパク質の相方となるタンパク質のことをｂａｉｔ（ベイト：餌）タンパク質ということがある。上記のようにツーハイブリッドシステムは新たにタンパク質の相互作用を検出する目的で用いられる。
【０００７】
しかし、本発明者らは、予め相互作用することが判明しているタンパク質の組み合わせを用い、通常とは逆に相互作用しない場合を検出するという着想に基づき、相互作用しないことを検出できる実験系を構築することにより、大量のインヒビターのスクリーニングを可能とする方法を見出し、さらに、簡便な操作でインヒビターの有無を容易に確認できる系を開発し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は次の通りである。
【０００８】
〔１〕  タンパク質Ｘとタンパク質Ｙとは相互作用するタンパク質であり、
タンパク質Ｘとタンパク質Ｙとが相互作用することにより転写が活性化されるレポーター遺伝子を含む発現系を有する宿主細胞に、タンパク質Ｘ−ＤＮＡ結合ドメイン複合体をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドを有する発現ベクターと、タンパク質Ｙ−転写活性化ドメイン複合体をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドを有する発現ベクターとを導入すると共に、
相互作用のインヒビター候補を前記宿主細胞に接触させ、
レポーター遺伝子の転写活性化が検出されない場合に、前記インヒビター候補を、タンパク質ＸおよびＹの相互作用を阻害するインヒビターとして認定する、相互作用インヒビターの検出方法。
〔２〕  相互作用するｎ組のタンパク質ＸｍおよびＹｍの組み合わせである（タンパク質Ｘ１，タンパク質Ｙ１）、（タンパク質Ｘ２，タンパク質Ｙ２）、・・・・・、（タンパク質Ｘｎ，タンパク質Ｙｎ）〔但し、ｎは１以上の整数、ｍは１〜ｎの任意の整数〕について、タンパク質Ｘｍ−ＤＮＡ結合ドメイン複合体をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドを有する発現ベクター（Ｘｍ）と、タンパク質Ｙｍ−転写活性化ドメイン複合体をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドを有する発現ベクター（Ｙｍ）とを作製し、
タンパク質Ｘｍとタンパク質Ｙｍとが相互作用することにより転写が活性化される細胞毒性遺伝子を含む発現系を有する宿主細胞に、相互作用するタンパク質ＸｍおよびＹｍの組み合わせごとに発現ベクター（Ｘｍ）および（Ｙｍ）を導入してｎ種の宿主細胞を作製し、
前記ｎ種の宿主細胞に相互作用のインヒビター候補を接触させ、
細胞毒性遺伝子の転写活性化が検出されない場合に、前記インヒビター候補を、タンパク質相互作用を阻害するインヒビターとして認定する、相互作用インヒビターの検出方法。
〔３〕  前記インヒビター候補が複数あり、各インヒビター候補ごとに、ｎ種の宿主細胞とインヒビター候補とを接触させる、上記〔２〕に記載の相互作用インヒビターの検出方法。
〔４〕  前記細胞毒性遺伝子の発現系が、所定の温度条件下ではタンパク質の相互作用が生じても細胞毒性遺伝子の転写が活性化されない温度感受性を有しており、インヒビター候補を、細胞毒性遺伝子の転写活性化が可能な温度条件下で前記宿主細胞に接触させる、上記〔２〕または〔３〕に記載の相互作用インヒビターの検出方法。
〔５〕  ＤＮＡ結合ドメイン、転写活性化ドメイン、細胞毒性遺伝子の発現制御領域内のＤＮＡ結合ドメイン結合部、細胞毒性遺伝子の発現制御領域内の転写装置結合部のうち少なくとも１種が、所定の温度条件下では不活性となり細胞毒性遺伝子の転写が活性化されない、上記〔４〕に記載の相互作用インヒビターの検出方法。
〔６〕  ＤＮＡ結合ドメインが、温度感受性λｃＩ、温度感受性ＧＡＬ４および温度感受性ＬｅｘＡからなる群より選ばれる、上記〔５〕に記載の相互作用インヒビターの検出方法。
〔７〕  前記細胞毒性遺伝子の遺伝子産物が、所定の温度条件下では細胞毒性活性を有しない温度感受性を有しており、インヒビター候補を、前記遺伝子産物が細胞毒性活性を有する温度条件下で前記宿主細胞に接触させる、上記〔２〕から〔６〕のいずれか一項に記載の相互作用インヒビターの検出方法。
〔８〕  前記宿主細胞が、大腸菌または枯草菌である、上記〔１〕から〔７〕のいずれか一項に記載の相互作用インヒビターの検出方法。
〔９〕  相互作用するｎ組のタンパク質ＸｍおよびＹｍの組み合わせである（タンパク質Ｘ１，タンパク質Ｙ１）、（タンパク質Ｘ２，タンパク質Ｙ２）、・・・・・、（タンパク質Ｘｎ，タンパク質Ｙｎ）〔但し、ｎは１以上の整数、ｍは１〜ｎの任意の整数〕について、タンパク質Ｘｍ−ＤＮＡ結合ドメイン複合体をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドを有する発現ベクター（Ｘｍ）と、タンパク質Ｙｍ−転写活性化ドメイン複合体をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドを有する発現ベクター（Ｙｍ）とを作製し、
タンパク質Ｘｍとタンパク質Ｙｍとが相互作用することにより転写が活性化される細胞毒性遺伝子を含む発現系を有する宿主細胞に、相互作用するタンパク質ＸｍおよびＹｍの組み合わせごとに発現ベクター（Ｘｍ）および（Ｙｍ）を導入してｎ種の宿主細胞を作製し、
相互作用の複数のインヒビター候補を、各インヒビター候補ごとに前記ｎ種の宿主細胞に接触させて得られ、かつ、細胞毒性遺伝子の転写活性化を阻害するインヒビターを含む、相互作用インヒビターライブラリー。
〔１０〕  前記細胞毒性遺伝子の発現系が、タンパク質の相互作用が生じても所定の温度条件下では細胞毒性遺伝子の転写が活性化されない温度感受性を有し、細胞毒性遺伝子が転写可能な温度条件下で、相互作用の複数のインヒビター候補を、各インヒビター候補ごとに前記ｎ種の宿主細胞に接触させて得られる、上記〔９〕に記載の相互作用インヒビターライブラリー。
〔１１〕  前記細胞毒性遺伝子の遺伝子産物が、所定の温度条件下では細胞毒性活性を有しない温度感受性を有しており、インヒビター候補を、前記遺伝子産物が細胞毒性活性を有する温度条件下で前記宿主細胞に接触させて得られる、上記〔９〕または〔１０〕に記載の相互作用インヒビターライブラリー。
〔１２〕  ＤＮＡ結合ドメインが組み込まれた発現ベクターと、転写活性化ドメインが組み込まれた発現ベクターと、ＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメインにより転写活性が調節される細胞毒性遺伝子が導入された宿主細胞とを備える、相互作用インヒビター検出キット。
〔１３〕  ＤＮＡ結合ドメインが組み込まれた発現ベクターと、転写活性化ドメインが組み込まれた発現ベクターと、ＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメインにより転写活性が調節される細胞毒性遺伝子の発現系が組み込まれた発現ベクターと、宿主細胞とを備える、相互作用インヒビター検出キット。
〔１４〕  ＤＮＡ結合ドメイン、転写活性化ドメイン、細胞毒性遺伝子の発現制御領域内のＤＮＡ結合ドメイン結合部、細胞毒性遺伝子の発現制御領域内の転写装置結合部のうちの少なくとも１種が、所定の温度条件下では不活性となり細胞毒性遺伝子の転写が活性化されない温度感受性を有する、上記〔１２〕または〔１３〕に記載の相互作用インヒビター検出キット。
〔１５〕  細胞毒性遺伝子の遺伝子産物が、所定の温度条件下では細胞毒性活性を有しない温度感受性を有する、上記〔１２〕から〔１４〕のいずれか一項に記載の相互作用インヒビター検出キット。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態について、（１）本発明の相互作用インヒビター検出方法および相互作用インヒビターライブラリー、（２）相互作用インヒビター検出キットの順に説明する。なお、本発明における遺伝子工学的な処理、例えば、プラスミド、ＤＮＡ断片、種々の酵素、形質転換体などの調製、形質転換体の選抜などを扱う諸操作については、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ，  Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｊ．  Ｓａｍｂｒｏｏｋら編、１９８９、ＣＯＬＤ  ＳＰＲＩＮＧ  ＨＡＲＢＯＲ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＰＲＥＳＳ等の既知の実験マニュアルを採用することができる。
【００１０】
（１）本発明の相互作用インヒビター検出方法
本発明の相互作用インヒビター検出方法（以下、「インヒビター検出方法」という）は、相互作用することが予め判明しているタンパク質ＸおよびＹについてのツーハイブリッドシステムを構築し、インヒビターの可能性がある物質を接触させ、宿主細胞に組み込まれているレポーター遺伝子が発現しないものを検出し、レポーター遺伝子が発現しないということからタンパク質ＸおよびＹの相互作用を阻害するインヒビターの存在を確認するというものである。
なお「タンパク質相互作用」は、「タンパク質−タンパク質相互作用」、「ポリペプチド−タンパク質相互作用」、「ポリペプチド−ポリペプチド相互作用」のいずれの形態も含まれる。また、「ポリペプチド」の語句にはオリゴヌクレオチドが含まれる。なお、本明細書では「タンパク質相互作用検出方法」のことを「相互作用検出方法」と略称する場合がある。
【００１１】
本発明のインヒビター検出方法では、相互作用することが確認されているタンパク質Ｘとタンパク質Ｙを用いたツーハイブリッドシステムを構築する。すなわち、タンパク質Ｘ−ＤＮＡ結合ドメイン複合体をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドを有する発現ベクターと、タンパク質Ｙ−転写活性化ドメイン複合体をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドを有する発現ベクターとを作製し、タンパク質Ｘとタンパク質Ｙとが相互作用することにより転写が活性化されるレポーター遺伝子を含む発現系を有する宿主細胞に導入する。
【００１２】
図１に示す一例に沿って、ツーハイブリッドシステムについてより具体的に説明する。ツーハイブリッドシステムは、転写調節因子内に２つのドメインがあり、その機能発現のためには２つのドメインが結合している必要があるが、その結合は、ドメイン間に他のタンパク質などを挟んでいても機能し得るという性質を利用したものである。ツーハイブリッドシステムは、標的となるタンパク質を単離・精製する手間を要せず、生体内の生理条件下でタンパク質相互作用を確認できるという特性を有する。
【００１３】
本明細書では、相互作用する２種のタンパク質ペアのうちの一方をタンパク質Ｘ、他方をタンパク質Ｙという。本明細書において、タンパク質Ｘとは、ＤＮＡ結合ドメイン（「ＤＢＤ」と略称する場合がある）と複合体を形成するように設計されているほうのタンパク質またはポリペプチドをいう。タンパク質Ｙとは、転写活性化ドメイン（「ＡＤ」と略称する場合がある）と複合体を形成するように設計されているほうのタンパク質またはポリペプチドをいう。
【００１４】
これらタンパク質Ｘおよびタンパク質Ｙが発現するような発現系を構築する。図１に示す例では、発現系を構成する組換えベクターであるｐＸベクターおよびｐＹベクターに、プラスミドベクターを用いている。ｐＸベクターにはタンパク質ＸをコードするＤＮＡ（ｐＸベクター中「ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｘ」と表示）が組み込まれ、他方、ｐＹベクター中にはタンパク質ＹをコードするＤＮＡ（ｐＹベクター中「ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｙ」と表示）が組み込まれている。ｐＸベクターには、さらにＤＢＤをコードするＤＮＡが組み込まれており、発現時に、タンパク質Ｘ−ＤＢＤ複合体が生成されるように設計される。他方、ｐＹベクターには、さらにＡＤをコードするＤＮＡが組み込まれており、発現時にタンパク質Ｙ−ＡＤ複合体を形成するように設計される。
【００１５】
本発明では、プラスミドなどベクターの母体種類、プロモーター、選択マーカーなどは、発現ベクターとして用いられる種々の構成を採用することができる。具体例を挙げると次の通りである。
【００１６】
ベクターとしては、例えば、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，ｐＵＣ１３、市販品としてｐＢＴ  Ｖｅｃｔｏｒ，  ｐＴＲＧ  Ｖｅｃｔｏｒ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）など）、酵母由来プラスミド（例、ＹＥｐ２４、ＹＣｐ５０など）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス，ワクシニアウイルス，バキュロウイルスなどの動物ウイルスなどの他、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏなどが用いられる。また、枯草菌に好適に用いられるプラスミドとして、例えば、ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４などが挙げられる。
【００１７】
プロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主細胞に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、宿主細胞がエシェリヒア属菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーター、Ｔ７プロモーターなどが、宿主細胞がバチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなどが挙げられる。また、宿主細胞が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが挙げられる。宿主細胞が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが挙げられる。また、動物細胞を宿主細胞として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＨＩＶ・ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、ＨＳＶ−ＴＫプロモーターなどが挙げられる。
【００１８】
発現ベクターは、組換え操作についての扱いやすさの観点からマルチクローニングサイトを有することが好ましい。また、以上の他に、発現ベクターには、所望により選択マーカー、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、ＳＶ４０複製オリジン（以下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）、ターミネーターなどを組み込むことができる。選択マーカーとしては、例えば、アンピシリン耐性遺伝子（カルベニシリン耐性遺伝子でもある。以下、Ａｍｐｒと略称する場合がある）、クロラムフェニコール耐性遺伝子（以下、Ｃａｍｒと略称する場合がある）、テトラサイクリン耐性遺伝子（以下、Ｔｅｔｒと略称する場合がある）、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ｄｈｆｒと略称する場合がある）遺伝子〔メソトレキセート（ＭＴＸ）耐性〕、ネオマイシン耐性遺伝子（以下、Ｎｅｏｒと略称する場合がある、Ｇ４１８耐性）等があげられる。また、必要に応じて、宿主細胞に合ったシグナル配列を付加する。宿主細胞がエシェリヒア属菌である場合は、ＰｈｏＡ・シグナル配列、ＯｍｐＡ・シグナル配列などが、宿主細胞がバチルス属菌である場合は、α−アミラーゼ・シグナル配列、サブチリシン・シグナル配列などが、宿主細胞が酵母である場合は、ＭＦα・シグナル配列、ＳＵＣ２・シグナル配列など、宿主細胞が動物細胞である場合には、インシュリン・シグナル配列、α−インターフェロン・シグナル配列、抗体分子・シグナル配列などをそれぞれ利用できる。
【００１９】
上記のようにして作製された発現ベクターを、レポーター遺伝子を保有する所定の宿主細胞に導入する。レポーター遺伝子は、タンパク質Ｘとタンパク質Ｙとが相互作用を生じた場合に、それを検出するために組み込まれている遺伝子である。レポーター遺伝子はＡＤが基本転写装置を活性化することにより発現する。レポーター遺伝子は宿主細胞内で、プラスミドのように独立的に存在していても、染色体ＤＮＡに組み込まれていてもよい。
【００２０】
宿主細胞としては、例えば、連鎖球菌（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）、ブドウ球菌（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ）、エシェリヒア属菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、ストレプトミセス属菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）および枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などの細菌細胞；酵母、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）などの真菌細胞；ドロソフィラＳ２（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｓ２）およびスポドプテラＳｆ９（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  Ｓｆ９）などの昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＢＨＫ、ＨＥＫ２９３、ボウズ（Ｂｏｗｓ）黒色腫細胞および血球系細胞などの動物細胞；ならびに植物細胞が挙げられる。本発明のインヒビター検出方法において用いられる宿主細胞として、より好ましくは、酵母細胞、大腸菌細胞、枯草菌細胞、哺乳動物細胞などが挙げられ、特に好ましくは、大腸菌細胞、枯草菌細胞などを用いることができる。大腸菌を用いると、極めて短時間に結果を出すことができる。大腸菌を宿主とした場合、増殖時間が１．５日と短期間であり、全体として約７〜１０日程度で１サイクルの実験を完了させることが可能である。枯草菌細胞（グラム陽性菌）は大腸菌細胞（グラム陰性菌）とは異なり、細胞壁の外側にリポ多糖がなく、低分子の浸透性が高い。すなわち枯草菌は、インヒビターの可能性がある物質が大腸菌に比べて細胞内に取り込まれやすい、という点で特に好ましい。
【００２１】
発現ベクターの宿主細胞への導入は、Ｄａｖｉｓら、ＢＡＳＩＣ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ（１９８６）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）のような、多くの標準的な実験マニュアルに記載される方法により行うことができる。より具体的には、例えばリン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、マイクロインジェクション、陽イオン脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、トランスダクション、スクレープ負荷、バリスティック導入または感染等がある。
【００２２】
宿主の培養は、宿主の種類等に応じて調節して行えばよい。宿主の種類は多数に上るが、いくつかの具体例を挙げると次の通りである。例えば、宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する場合、培養に使用される培地は液体培地でも寒天培地でもよく、その中には形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他を配合する。炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無機塩としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどがあげられる。また、酵母エキス、ビタミン類、成長促進因子などを添加してもよい。培地のｐＨは約５〜８が望ましい。エシェリヒア属菌を培養する際の好適な培地として具体的には、酵母エキス、トリプトン、塩（ＮａＣｌ）を含むＬＢ培地などが例示される。ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせるために、例えば、イソプロピル１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシドのような誘導剤を添加してもよい。宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない、必要により通気や撹拌を加える。
【００２３】
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ最小培地、０．５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地などが挙げられる。培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０℃〜３５℃で約２４〜７２時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
【００２４】
また、宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、培地としては、Ｇｒａｃｅ’ｓ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｒａｃｅ，  Ｔ．Ｃ．Ｃ．，  Ｎａｔｕｒｅ、１９５、７８８（１９６２））に非動化した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のｐＨは約６．２〜６．４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３〜５日間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
【００２５】
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ、１９９巻、５１９（１９６７））、１９９培地（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ  ｏｆｔｈｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、７３巻、１（１９５０））などが用いられる。ｐＨは約６〜８であることが好ましい。培養は通常約３０〜４０℃で約１５〜６０時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。また必要に応じて、ＣＯ２濃度の調節を行う。
【００２６】
レポーター遺伝子は、少なくともレポーター遺伝子が転写されたことを示すｍＲＮＡ、タンパク質などの遺伝子産物を、直接または間接的に検出できるものを用いる。すなわち、視覚的検査、放射活性、化学発光、蛍光、光度、分光、赤外線、比色、共鳴検出などの周知の方法により、定性的または定量的にレポーター遺伝子の発現を検出できるものであればよい。例えば、レポーター遺伝子としては、発現ベクターに選択マーカーとして用いられる各種の耐性遺伝子、酵素遺伝子あるいは細胞毒性遺伝子などを用いることができる。細胞毒性遺伝子を用いると、相互作用が阻害されて細胞毒性遺伝子が発現せず宿主細胞が生存した場合に、インヒビター候補は真のインヒビターであると認定される。生存したものを選別することは容易であり、新たに見出されたインヒビターで阻害されるタンパク質ペアの選抜、増幅などを容易に行うことができる。
【００２７】
図１に示すように、ｐＸベクターとｐＹベクターとが宿主細胞内で発現すると、タンパク質Ｘ−ＤＢＤ複合体とタンパク質Ｙ−ＡＤ複合体とが生成する。ＤＢＤはＤＢＤ結合部位に結合する。すると、タンパク質Ｘとタンパク質Ｙとが相互作用する場合、「ＤＢＤ−タンパク質Ｘ−タンパク質Ｙ−ＡＤ複合体」が形成される。ＡＤが基本転写装置を活性化して、レポーター遺伝子が発現する。レポーター遺伝子の発現の有無により、相互作用の有無を確認することができる。
本発明の相互作用検出方法では、上記のようなｐＸベクター、ｐＹベクター、レポーター遺伝子を有する宿主細胞として、周知または市販されている発現ベクター、宿主細胞等を用いることができる。また、近年、酵母、大腸菌などを用いたツーハイブリッドシステムのキットが市販されており、これらを用いることもできる。
【００２８】
ツーハイブリッドシステムでは、ＤＢＤとＡＤとの間に２種のタンパク質を介在させてＡＤが基本転写装置を活性化する。しかし、ＡＤがうまく基本転写装置を活性化させる位置に配置されないと、タンパク質の相互作用が生じていてもレポーター遺伝子が発現しないという偽陰性を生じることがあり得る。このような場合には、ＤＢＤ結合ドメインと基本転写装置との距離を調節することにより解決できる場合がある。または、タンパク質Ｘ−ＤＢＤ複合体におけるタンパク質ＸとＤＢＤの連結部位、あるいはタンパク質Ｙ−ＡＤ複合体におけるタンパク質ＹとＡＤの連結部位の長さを調節することによっても、偽陰性の発生を抑制できる場合がある。この連結部位の調製は、タンパク質Ｘ−ＤＢＤ複合体を例にすると、組換えＤＮＡに組み込む際に、一つの転写単位領域内でＤＢＤとタンパク質Ｘとの距離を調節することにより行うことができる。
【００２９】
ｐＸベクターおよびｐＹベクターが導入された宿主細胞に、レポーター遺伝子が発現可能な条件下で、インヒビター候補を接触させる。より具体的には、例えば、宿主細胞を含む溶液をインヒビター候補溶液に添加するなどすればよい。インヒビター候補とは、タンパク質相互作用を阻害する可能性のあるものとして試験に供される物質である。タンパク質相互作用を阻害する可能性がある物質として試験に供することを所望する物質であればよく、化学薬品、または、ＤＮＡもしくはタンパク質などの生体物質など様々な物質をインヒビター候補とすることができる。ｐＸベクター及びｐＹベクターの宿主細胞への導入と、宿主細胞にインヒビターを接触させる処理の順序はいずれでもよいが、インヒビター候補の種類などによってはインヒビター候補が直接発現ベクターに作用したり、発現ベクター導入に用いる他の薬品と反応するなど、インヒビター候補がベクター導入操作に影響を及ぼすおそれを考慮すると、発現ベクターを導入し、その後、インヒビター候補に接触させるほうがリスクが少ないと考えられる。
【００３０】
タンパク質Ｘおよびタンパク質Ｙは相互作用するペアであるので、インヒビター候補によって相互作用が阻害されなければ、レポーター遺伝子の転写が活性化し、レポーター遺伝子の発現が検出できる。他方、インヒビター候補によりタンパク質Ｘおよびタンパク質Ｙの相互作用が阻害されれば、レポーター遺伝子の転写は活性化されない。したがって、レポーター遺伝子に由来する遺伝子産物、例えば、レポーター遺伝子に由来のＲＮＡ、レポーター遺伝子がコードするタンパク質などが生じたことが検出されなければ、インヒビター候補が、タンパク質Ｘおよびタンパク質Ｙを阻害するインヒビターであると認定することができる。
【００３１】
１種のタンパク質ペアに対して複数種のインヒビター候補の検定を行う場合は、複数種のインヒビター候補のそれぞれについて、ツーハイブリッドシステムが組み込まれた宿主細胞に接触させて検出試験を行えばよい。例えば、９６穴マイクロプレートの各ウエルに１種類ずつインヒビター候補を入れておき、各ウエルに宿主細胞を添加する。
【００３２】
次に、本発明のインヒビター検出方法を、複数のタンパク質ペアについて実施する形態について図２に沿いつつ説明する。なお、本明細書では、ｎ種の組み合わせのタンパク質ペア、すなわち、（タンパク質Ｘ１，タンパク質Ｙ１）、（タンパク質Ｘ２，タンパク質Ｙ２）、（タンパク質Ｘ３，タンパク質Ｙ３）、・・・・・、（タンパク質Ｘｎ−１，タンパク質Ｙｎ−１）、（タンパク質Ｘｎ，タンパク質Ｙｎ）を一般化した表示として（タンパク質Ｘｍ，タンパク質Ｙｍ）と表す。ｎは１以上の整数であり、ｍは１〜ｎの任意の整数を示す。
【００３３】
複数のタンパク質ペアについて本発明の方法を実施する場合、相互作用するペアごとにツーハイブリッドシステムが組み込まれた複数種の宿主細胞が作製される。すなわち、宿主細胞に組み込む発現ベクターとして、タンパク質Ｘｍ−ＤＮＡ結合ドメイン複合体をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドを有する発現ベクター（Ｘｍ）と、タンパク質Ｙｍ−転写活性化ドメイン複合体をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドを有する発現ベクター（Ｙｍ）とを作製する。宿主細胞には、相互作用するタンパク質ＸｍおよびＹｍの組み合わせごとに発現ベクター（Ｘｍ）および（Ｙｍ）を導入してｎ種の宿主細胞が作製される。そして、前記ｎ種の宿主細胞に相互作用のインヒビター候補を接触させ、レポーター遺伝子の転写が活性化されたか否かを確認する。レポーター遺伝子の転写活性が検出されなかった宿主細胞に接触させたインヒビター候補が、インヒビターとして認定される。
【００３４】
ところで、１組のタンパク質ＸおよびＹと、１種のインヒビター候補とを１対１で検定する場合には、レポーター遺伝子が発現しなかったことは容易に識別できる。しかし、複数種のタンパク質Ｘおよびタンパク質Ｙの組み合わせが混在する状態の場合、転写活性化するものの中に転写活性化しないものが混在することがあり得る。このような場合、レポーター遺伝子が発現しなかったタンパク質ペアを検出し同定するのは容易ではない。
【００３５】
そこで、本発明の好ましい一形態では、レポーター遺伝子として細胞毒性遺伝子を用いる。細胞毒性遺伝子をレポーター遺伝子として用いることにより、インヒビター候補がインヒビターではなかった場合には、細胞毒性遺伝子が発現し、宿主細胞は生存できなくなる。しかし、インヒビター候補が真にインヒビターである場合には、細胞毒性遺伝子は発現せず宿主細胞は生存可能であり、生存した宿主細胞を増殖させることにより、容易にインヒビターおよびそのインヒビターにより相互作用が阻害されるタンパク質ペアを識別することができる。本発明で用いられる細胞毒性遺伝子は、その遺伝子産物が宿主細胞を完全に死に至らしめるものの他、宿主細胞の増殖を抑制して上記のようにタンパク質相互作用の阻害の有無を判別可能なものであればよい。また、細胞毒性遺伝子は、細胞毒性遺伝子が発現した宿主細胞に対して毒性作用を及ぼし、他の宿主細胞には毒性作用が及ばないような遺伝子産物をコードするものが好ましい。このような細胞毒性遺伝子を用いることにより、インヒビターにより細胞毒性遺伝子が発現せず本来生存していなければならない宿主細胞が混在している場合に、本来生存していなければならない宿主細胞まで死滅させてしまうようなことを避けるようなことができる。このような細胞遺伝子は、例えば、宿主細胞にその細胞毒性遺伝子の受容体がないことが判明しているものなどが含まれる。より具体的には、宿主細胞の種類などに応じて細胞毒性遺伝子は選択できる。大腸菌などを宿主細胞とする場合、細胞毒性遺伝子として好ましくは、Ｂａｘ（ＢＩＯＣＨＥＭＩＣＡＬ  ＡＮＤ  ＢＩＯＰＨＹＳＩＣＡＬ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ  ＣＯＭＭＵＮＩＣＡＴＩＯＮＳ  ２４３，  Ｎｏ．  ２，  ６０９−６１６  （１９９８））、ＧＡＴＡ−１（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２０，  Ｎｏ．  ４，  ６８４−６９３  （１９９６））、ｌｄｒＤ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ４５，  Ｎｏ．  ２，  ３３３−３４９  （２００２））などが挙げられる。
【００３６】
レポーター遺伝子として細胞毒性遺伝子を用いることにより、複数種のタンパク質ペアが混在する溶液を用いても、容易にその中からレポーター遺伝子が発現しなかったペアが存在することを識別することができる。また、多数種のタンパク質ペアについて１度に試験をすることができるため、多数の組み合わせについて短期間に試験することができ、膨大なスクリーニングを容易に行うことができる。
【００３７】
細胞毒性遺伝子をレポーター遺伝子として用いる場合、インヒビター候補が宿主細胞に作用する前までは、宿主細胞が死滅しないようにする。一つの実施形態としては、インヒビター候補と宿主を接触させ、インヒビター候補の作用が宿主細胞に及ぶ前段階でタンパク質ＸおよびＹの相互作用が生じることを抑制する。すなわち、ｐＸベクターおよびｐＹベクターが宿主細胞に導入され、かつ、インヒビター候補が宿主細胞に接触する条件が整った後に、タンパク質Ｘおよびタンパク質Ｙの相互作用が生じ得るようにすることが望ましい。より具体的な好ましい一形態を挙げると、タンパク質Ｘおよびタンパク質Ｙの相互作用の他に、さらにレポーター遺伝子の発現を制御する機構をレポーター遺伝子の発現系に取り入れる。そのような発現系としては、例えば、イソプロピル１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシドなどの誘導剤の添加によりレポーター遺伝子の発現が活性化される発現系、温度感受性を有するレポーター遺伝子の発現系などが挙げられる。誘導剤を用いる場合には誘導剤がインヒビター候補に悪影響を与えることがないことを確認すべきであるが、温度感受性を有するレポーター遺伝子の発現系では、そのような必要性はなく、また宿主細胞等の管理温度を調節するという簡便な操作で宿主細胞を維持することができるという点で好ましい。
【００３８】
温度感受性を有するレポーター遺伝子の発現系を用いた本発明の実施形態について、より具体的に説明する。発現系に関し温度感受性とは、温度条件によって発現系に何らかの変化が生じる性質をいう。本発明のインヒビター検出方法では、所定の温度条件下ではタンパク質ＸおよびＹの相互作用が生じても細胞毒性遺伝子の転写が活性化されない温度感受性を有する発現系を用いることが好適である。温度感受性を有するレポーター遺伝子発現系が組み込まれた宿主細胞を用いることにより、宿主細胞の温度管理を調節することによって、インヒビター候補を作用させるまでの間に、タンパク質相互作用が生じて細胞毒性遺伝子の遺伝子産物により宿主細胞が死滅してしまうことを防ぐことができる。そして、インヒビター候補を宿主細胞に接触させ、他の試験条件がすべて整った段階で、細胞毒性遺伝子の転写活性が可能な温度条件に調節することにより、インヒビター候補がインヒビターとして機能するか否か試験することができる。すなわち、温度条件を調節するという簡便な操作で、細胞毒性遺伝子を用いた場合であっても、インヒビターの検出を的確に実施することができる。
【００３９】
温度感受性を有するレポーター遺伝子の発現系は、ＤＮＡ結合ドメイン、転写活性化ドメイン、細胞毒性遺伝子の発現制御領域内のＤＮＡ結合ドメイン結合部、細胞毒性遺伝子の発現制御領域内の転写装置結合部のうち少なくとも１種に、所定の温度条件下では不活性となり細胞毒性遺伝子の転写が活性化されないものを用いることにより構築することができる。より具体的には、温度感受性を有するＤＮＡ結合ドメインとしては、温度感受性λｃＩ、温度感受性ＧＡＬ４、温度感受性ＬｅｘＡなどが例示される。また、温度感受性を有する転写活性化ドメインとしては、例えば、温度感受性ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  α、温度感受性ＧＡＬ４、温度感受性ＶＰ１６などが挙げられる。また、細胞毒性遺伝子の発現制御領域内のＤＮＡ結合ドメイン結合部としては、例えば、温度感受性λｃＩ結合部位、温度感受性ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  σ結合部位、温度感受性ＧＡＬ４結合部位、温度感受性ＬｅｘＡ結合部位などが挙げられる。
【００４０】
また、細胞毒性遺伝子を用いる、他の好ましい実施形態として、細胞毒性遺伝子に起因する細胞毒性遺伝子産物が、所定の温度条件下では細胞毒性活性を有しない温度感受性を有する形態が挙げられる。このような形態を採用することにより、温度感受性の発現系を採用した場合と同様に、宿主細胞の操作・管理を行うことができる。遺伝子産物が細胞毒性を有し、かつ、温度感受性を有する細胞毒性遺伝子としては、例えば、温度感受性Ｂａｘ、温度感受性ＧＡＴＡ−１、温度感受性ｌｄｒＤなどが挙げられる。
【００４１】
上記のようにして、複数種の宿主細胞が作製され、複数種の宿主細胞をインヒビターに接触させ、細胞毒性遺伝子の転写活性化が検出されない場合に、前記インヒビター候補を、タンパク質相互作用を阻害するインヒビターとして認定する。すなわち、タンパク質ＸおよびＹが相互作用し細胞毒性を有する遺伝子産物が生じ得る条件下であっても、生存／増殖が可能な宿主細胞を識別することにより、インヒビターとそのインヒビターが阻害するタンパク質ペアを検出することができる。インヒビター候補も複数種ある場合には、インヒビター候補同士の相互作用の影響を避けるため、各インヒビター候補ごとに複数種の宿主細胞を接触させることが好ましい。例えば、図３に示すように、９６穴マクロプレートの各ウエルに１種類ずつインヒビター候補を入れておき、ここに宿主細胞を含む溶液を添加する。宿主の種類等にもよるが、生存／増殖している宿主細胞が含まれているウエルは、目視により容易に判別できる。宿主細胞の生存または増殖が確認されたウエルに添加したインヒビター候補は、インヒビターである。
【００４２】
相互作用が阻害されたタンパク質ペアの同定は、例えば、ウエルに含まれる溶液を寒天培地、もしくは生存／増殖が確認されたウェルに添加してあるインヒビターを含む寒天培地に播き、増殖した宿主細胞を回収し、回収した宿主細胞に含まれる発現ベクター内の所定の塩基配列部分をＰＣＲで増幅し、単離・精製して塩基配列を同定する。ＰＣＲで増幅する際のプライマーは、宿主細胞に導入した発現ベクターの設計に基づいて作製できる。このような同定は、形質転換体等を用いた遺伝子工学的実験において行われる、塩基配列やアミノ酸配列の解析、分析手法に従って行うことができる。
【００４３】
本発明のインヒビター検出方法によれば、大量のインヒビター候補および大量のタンパク質ペアに関して、短期間に検出試験を行うことが可能である。また、本発明のインヒビター検出方法は、インヒビター候補の数を増やしても作業負担はあまり大きくならず、多数のインヒビター候補について１サイクルで容易に試験を行うことが可能である。発明のインヒビター検出方法は、極めて多数の候補物質についてスクリーニングすることが求められる、インヒビターの第一次スクリーニングなどとして好適である。したがって、本発明のインヒビター検出方法は、様々な医薬品の開発にも極めて有用である。
【００４４】
本発明のインヒビター検出方法により得られたインヒビターの集合体は、インヒビターのライブラリーとすることができる。すなわち、本発明は、上記のように本発明のインヒビター検出方法で得られ、かつ、細胞毒性遺伝子などのレポーター遺伝子の転写活性化を阻害するインヒビターを含む、相互作用インヒビターライブラリーを提供する。本発明のインヒビターライブラリーは、上記のインヒビター検出方法により得られた結果物をそのままライブラリーとしてもよいし、インヒビターだけを集約して整理したものをライブラリーとしてもよい。本発明のインヒビターライブラリーは、多数のインヒビター候補が混在するマイクロプレートなどの容器からインヒビターを選抜することが容易である。また、上記のインヒビター検出方法の結果物をそのままライブラリーにしてもよく、維持、管理も簡便である。
【００４５】
（２）本発明の相互作用インヒビター検出キット
本発明の相互作用インヒビター検出キットは、上記本発明のインヒビター検出方法を実施するのに好適な検出キットである。本発明の相互作用インヒビター検出キットの一形態としては、ＤＮＡ結合ドメインが組み込まれた発現ベクターと、転写活性化ドメインが組み込まれた発現ベクターと、ＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメインにより転写活性が調節される細胞毒性遺伝子が導入された宿主細胞とを備える。また、他の一形態としては、ＤＮＡ結合ドメインが組み込まれた発現ベクターと、転写活性化ドメインが組み込まれた発現ベクターと、ＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメインにより転写活性が調節される細胞毒性遺伝子の発現系が組み込まれた発現ベクターと、宿主細胞とを備える。
【００４６】
ＤＮＡ結合ドメインが組み込まれた発現ベクター、転写活性化ドメインが組み込まれた発現ベクター、宿主細胞、レポーター遺伝子としての細胞毒性遺伝子については、上記「（１）本発明のインヒビター検出方法および相互作用インヒビターライブラリー」の欄で説明したものと同様のものを好ましく用いることができる。
【００４７】
より好ましい形態としては、ＤＮＡ結合ドメイン、転写活性化ドメイン、細胞毒性遺伝子の発現制御領域内のＤＮＡ結合ドメイン結合部、細胞毒性遺伝子の発現制御領域内の転写装置結合部のうちの少なくとも１つとして、所定の温度条件下では不活性となり細胞毒性遺伝子の転写が活性化されない温度感受性を有するものを用いる。また別の好ましい形態としては、細胞毒性遺伝子の遺伝子産物が、所定の温度条件下では細胞毒性活性を有しない温度感受性を有するような、細胞毒性遺伝子を用いる。温度感受性ＤＮＡ結合ドメイン等についても、上記「（１）本発明のインヒビター検出方法および相互作用インヒビターライブラリー」の欄で説明したものと同様のものを好ましく用いることができる。
【００４８】
また、発現ベクターには必要に応じて、上記「（１）本発明のインヒビター検出方法および相互作用インヒビターライブラリー」の欄で説明したプロモーター、選択マーカー、エンハンサー、ＳＶ４０Ｏｒｉ、ターミネーターなどが組み込まれる。さらに、実験操作の容易性から、組換えＤＮＡとしてプラスミドベクターが好ましく、また宿主細胞としては、大腸菌、枯草菌、酵母などが好ましい。実験の結果が早期に分かるという点に関しては、大腸菌が特に好ましい。ヒトなどの哺乳類における相互作用を検証する上では、その生理的な条件が近くなるように哺乳類由来の細胞を宿主として用いることが好適である。また、本発明のキットには、上記のタンパク質相互作用検出方法を実施するための容器、試薬、制限酵素、宿主細胞培養のための培地等を備えるようにしてもよい。
【００４９】
【実施例】
以下、本発明の実施例を示し、本発明についてさらに詳細に説明するが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。また、分子生物学的な基本的手法については、ＢＡＳＩＣ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ（１９８６）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）、細胞工学ハンドブック、黒木登志夫ら編、羊土社（１９９２）、新遺伝子工学ハンドブック改訂第３版、村松ら編、羊土社（１９９９）などの記載に従って行うことができる。
【００５０】
＜実施例１＞温度感受性ツーハイブリッドシステムの構築
＜１−１＞発現ベクターの作製
相互作用タンパク質ペアを発現させるための発現ベクターとして、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社ＢａｃｔｅｒｉｏＭａｔｃｈ（登録商標）Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｖｅｃｔｏｒ  ＫｉｔのｐＢＴ  Ｂａｉｔ  Ｖｅｃｔｏｒ（以下「ｐＢＴベクター」と記載する）およびｐＴＲＧ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｖｅｃｔｏｒ（以下、「ｐＴＲＧベクター」と記載する）を用いた。
【００５１】
また、相互作用をするタンパク質ペアとして、転写因子ｐ５３の４量体形成ドメインを用いた。転写因子ｐ５３はヒトの癌の５０％以上で失活が見られる因子として周知の遺伝子であり、生体内では互いに相互作用し４量体を形成し機能している。さらに４量体形成ドメインに関しては、その立体構造がＸ線結晶解析法により解明されている（Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２６７，  １４９８−１５０２  （１９９５））。ｐ５３タンパク質の４量体形成ドメイン（以下「ｐ５３Ｔ」という）のアミノ酸配列をコードするＤＮＡは、ヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリー（タカラバイオ社製）を鋳型にＰＣＲを行なうことにより得た。ＰＣＲに用いたプライマー、５３−ｆＮと５３−ｒＸの配列は、配列表の配列番号１および配列番号２に示す。なお、上記ｐＢＴベクターおよびｐＴＲＧベクターに組み込むため、５３−ｆＮには制限酵素ＮｏｔＩを、５３−ｒＸには制限酵素ＸｈｏＩサイトと終止コドンであるＴＧＡを付加している。得られたｃＤＮＡ断片は、ＴＡクローニングベクターであるｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に組み込み塩基配列を確認後、制限酵素ＮｏｔＩ、ＸｈｏＩで処理を行い、ｐＢＴベクターおよびｐＴＲＧベクターに導入した。これによりλｃＩタンパク質とｐ５３Ｔの融合タンパク質を発現するプラスミド、ｐ５３Ｔ／ｐＢＴと、ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅαとｐ５３Ｔの融合タンパク質を発現するプラスミド、ｐ５３Ｔ／ｐＴＲＧを得た（図４）。ｐ５３ＴのｃＤＮＡ配列を配列表の配列番号３に、そのアミノ酸配列を配列番号４に示す。
【００５２】
なお、マーカーとしてｐＢＴベクターにはクロラムフェニコール耐性遺伝子が、ｐＴＲＧベクターにはテトラサイクリン耐性遺伝子が組み込みこまれている。ベクターへの組み込みの操作は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社ＢａｃｔｅｒｉｏＭａｔｃｈ（登録商標）Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｋｉｔのマニュアルの記載に沿って行った。
【００５３】
Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社ＢａｃｔｅｒｉｏＭａｔｃｈ（登録商標）Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｋｉｔを用いて相互作用を生じるか確認したところ、ｐ５３Ｔどうしが相互作用することが確認された。
【００５４】
＜１−２＞温度感受性発現系を有するツーハイブリッドシステムの作製
ｐＢＴベクターのλｃＩタンパク質をコードするＤＮＡ領域を、λファージの温度感受性変異株８５７のλｃＩタンパク質をコードするＤＮＡ領域に生じている点突然変異を参考に改変し、温度によりλｃＩ結合部位に対し結合性が変わる、すなわち温度感受性を有する、ツーハイブリッド系を次のようにして調製した。
【００５５】
温度感受性変異株８５７のλｃＩタンパク質は、正常λｃＩタンパク質の６７番目のＡｌａをＴｈｒに置換することにより得られる。変異型のλｃＩは、３７℃付近の温度条件下ではλｃＩ結合部位に結合せず、２７℃付近では、λｃＩ結合部位に結合するという特性を有する。キットに付属されたｐＢＴベクターが有する正常λｃＩタンパク質をコードするＤＮＡに、上記のようにアミノ酸配列の６７番目のＡｌａがＴｈｒになるようにＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いて変異を導入し、変異型λｃＩをＤＢＤとして発現するｐＢＴ８５７ベクターを作製した。変異型λｃＩタンパク質のアミノ酸配列を、配列表の配列番号５に示す。さらに、ｐＢＴ８５７ベクターにｐ５３ＴをコードするＤＮＡを組み込み、変異型λｃＩタンパク質とｐ５３Ｔの融合タンパク質を発現するｐ５３Ｔ／ｐＢＴ８５７ベクターを作製した。なお、ｐ５３Ｔ／ｐＢＴ８５７ベクターには、マーカー遺伝子としてクロラムフェニコール耐性遺伝子が組み込まれており、また、ｐ５３Ｔ／ｐＴＲＧベクターにはテトラサイクリン耐性遺伝子が組み込まれている。
【００５６】
上記のようにして得られた、ｐ５３Ｔ／ｐＢＴプラスミドおよびｐ５３Ｔ／ｐＴＲＧプラスミドをＢａｃｔｅｒｉｏＭａｔｃｈ（登録商標）ＲｅｐｏｒｔｅｒＳｔｒａｉｎのコンピテント細胞に導入し形質転換を行った。このコンピテント細胞にはレポーター遺伝子としてカルベニシリン耐性遺伝子（アンピシリン耐性遺伝子）が導入されており、相互作用が生じることにより発現するように設計されている。また、コンピテント細胞には、レポーター遺伝子が組み込まれた発現ベクターが細胞内に存在することを確認するためのマーカー遺伝子として、相互作用の有無にかかわらず発現するカナマイシン耐性遺伝子の発現系が組み込まれている。形質転換後、菌培養液をＴＣＫ寒天培地（ＬＢ培地にテトラサイクリンを１５μｇ／ｍｌ、クロラムフェニコールを３４μｇ／ｍｌ、カナマイシン５０μｇ／ｍｌとなるよう加えたもの）とＣＴＣＫ寒天培地（ＬＢ培地にカルベニシリンを２５０μｇ／ｍｌ、テトラサイクリンを１５μｇ／ｍｌ、クロラムフェニコールを３４μｇ／ｍｌ、カナマイシンを５０μｇ／ｍｌとなるよう加えたもの）に５０μｌずつ塗抹した。これらを３７℃および２５℃のそれぞれの温度条件下において、３７℃の場合は１８時間、２５℃の場合は４８時間培養後、ＴＣＫ寒天培地とＣＴＣＫ寒天培地、各々に生育してくる大腸菌のコロニーを比較し、温度感受性を備えているかを確認した。結果を図５に示す。
【００５７】
図５に示されるように、３７℃のＣＴＣＫ寒天培地ではコロニーは形成されなかった。すなわち、３７℃ではカルベニシリン耐性が検出されず、２５℃ではカルベニシリン耐性が検出された。このことから、上記のようにして作製されたツーハイブリッド系が、３７℃付近では相互作用を生じさせず、２５℃付近で相互作用を生じ得る温度感受性を備えていることが確認された。
【００５８】
＜実施例２＞細胞毒性遺伝子を組み込んだツーハイブリッドシステムの構築
＜２−１＞細胞毒性遺伝子をレポーター遺伝子として有する宿主細胞の作製
ＢａｃｔｅｒｉｏＭａｔｃｈ（登録商標）Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ｓｔｒａｉｎのコンピテント細胞に、相互作用を生じることにより細胞毒性遺伝子が発現する発現系を新たに組み込むことにより、細胞毒性遺伝子をレポーター遺伝子として有する宿主細胞を作製し、温度感受性を有し、かつ、相互作用を生じると細胞毒性遺伝子が発現してコロニーの形成が抑制されるツーハイブリッドシステムを構築した。
【００５９】
レポーター遺伝子の発現調節領域は、米国特許第５９２５５２３号明細書の３０カラム４７行目から５３行目の記載に基づき、大腸菌のｌａｃＺ遺伝子の上流配列のうちＣＲＰ蛋白質（ｃｙｃｌｉｃ  ＡＭＰ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ）の結合配列を、λｃＩ結合配列に置き換えたものを設計、作製した。
【００６０】
細胞毒性遺伝子は、大腸菌が持つｌｄｒＤ遺伝子を使用した。ＬｄｒＤタンパク質は、大腸菌自身が保持している３５アミノ酸からなるタンパク質で、通常その発現は抑制されている。この遺伝子産物の発現量を遺伝子工学手法により増加させることにより、大腸菌は致死となる事が報告されている（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ４５，  Ｎｏ．２，  ３３３−３４９  （２００２）  ）。ｌｄｒＤ遺伝子のＤＮＡ配列を配列表の配列番号６に、そのアミノ酸配列を配列番号７に示す。
【００６１】
ＬｄｒＤタンパク質をコードするＤＮＡ断片は、大腸菌のゲノムＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行なうことにより得た。ＰＣＲに用いたプライマー、Ｌ−ＮｄｅＩとＬ−ＳｐｅＩの配列は、配列表の配列番号８および配列番号９に示す。なお上記、発現調節領域と連結するため、Ｌ−ＮｄｅＩには制限酵素ＮｄｅＩを、Ｌ−ＳｐｅＩには制限酵素ＳｐｅＩサイトを付加している。得られたＰＣＲ産物は、ＴＡクローニングベクターであるｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に組み込み塩基配列を確認後、制限酵素ＮｄｅＩ、ＳｐｅＩで処理によりＬｄｒＤタンパク質をコードするＤＮＡ断片を切り出し、上述の発現調節領域と連結した。
【００６２】
細胞毒性遺伝子を発現する発現ベクターは、ｐＢＴベクターおよびｐＴＲＧベクターと共存可能なプラスミドベクターであるｐＭＷ１１８ベクター（株式会社ニッポンジーン）を改変して用いた。複数のプラスミドを同一の細菌細胞に共存させる場合、プラスミド不和合性を考慮する必要がある。プラスミド不和合性とは、同一の細菌細胞に近縁の複数種のプラスミドが安定して共存できない現象のことである。不和合性は、近縁のプラスミドではその複製開始調節機構が類似しているため、互いに干渉して共存を許さないためおこる現象である。ここでｐＢＴベクターはプラスミドｐ１５Ａ由来の、ｐＴＲＧベクターはプラスミドＣｏｌＥ１由来の、ｐＭＷ１１８ベクターはプラスミドｐＳＣ１０１由来のプラスミドベクターであり、各々由来の異なる複製開始調節領域を利用して大腸菌内で自律複製を行うため、これら３種類のベクターは同一の大腸菌細胞内で共存可能である。
【００６３】
ｐＭＷ１１８ベクターの改変は、以下の手順で行った。まず、ｐＭＷ１１８にあるｌａｃＺ遺伝子の上流配列とｌａｃＺ遺伝子の領域を制限酵素ＡｌｗＮＩとＥｃｏＮＩを用いて取り除いた。さらに、ＤＮＡ  Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社）を用いてＤＮＡ末端の平滑化、ＢａｍＨＩリンカー（タカラバイオ社：ｐＢａｍＨ  Ｉ）のライゲーションを行った。これを制限酵素ＢａｍＨＩで処理し、Ｔ４  ＤＮＡライゲースで自己環状化することによりｐＥＨ１を得た。次いで、ｐＥＨ１が保持しているアンピシリン耐性遺伝子の部分を、ゼオシン耐性遺伝子に置き換えた。まずｐＥＨ１を制限酵素ＰｓｈＢＩとＡａｔＩＩで処理する事により、アンピシリン耐性遺伝子の部分を取り除き、ＤＮＡ  Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社）を用いてＤＮＡ末端の平滑化を行った。ゼオシン耐性遺伝子はＺｅｏＣａｓｓｅｔｔｅＴＭ  Ｖｅｃｔｏｒ，  ｐＥＭ７／Ｚｅｏ（インビトロジェン社）を制限酵素ＸｈｏＩとＥｃｏＲＩで処理する事により取り出し、さらにＤＮＡ  Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社）を用いてＤＮＡ末端の平滑化を行った。これらをライゲーションする事により、クローニングサイトとして制限酵素ＢａｍＨＩが、薬剤選択マーカーとしてはゼオシンが使用可能なベクターｐＥＨ１／Ｚｅｏを作製した。
【００６４】
このｐＥＨ１／ＺｅｏのＢａｍＨＩサイトに、上述した発現調節領域とｌｄｒＤ遺伝子を連結したものを挿入した。以上の手順によりツーハイブリッドシステムに使用可能な、細胞毒性遺伝子を含むプラスミドｐＬＤＲ１／Ｚｅｏが構築された（図６）。
【００６５】
＜２−２＞レポーター遺伝子発現試験１
ｐ５３Ｔ／ｐＢＴ８５７ベクター、ｐ５３Ｔ／ｐＴＲＧベクター、ｐＬＤＲ１／Ｚｅｏベクターを、ＢａｃｔｅｒｉｏＭａｔｃｈ（登録商標）Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ｓｔｒａｉｎのコンピテント細胞に導入し形質転換を行った。このようにしてツーハイブリッド系を構築した宿主細胞の概念図を図７に示す。図７は、相互作用が生じている場合の状況を示している。
【００６６】
形質転換後、菌培養液をＺ−ＴＣＫ寒天培地（ＬＢ培地に、ゼオシンを２５μｇ／ｍｌ、テトラサイクリンを１５μｇ／ｍｌ、クロラムフェニコールを３４μｇ／ｍｌ、カナマイシン５０μｇ／ｍｌとなるよう加えたもの）に５０μｌずつ塗抹した。菌培養液を塗抹した培地を、３７℃および２５℃のそれぞれの温度条件下において、３７℃の場合は１８時間、２５℃の場合は４８時間培養後、各々に生育してくる大腸菌のコロニー形成を比較した。結果を図８に示す。図８に示されるように、３７℃の条件下では、４９２個のコロニーが観察されたのに対し、２５℃の条件下ではコロニーは観察されなかった。
【００６７】
＜２−３＞レポーター遺伝子発現試験２（スポットアッセイ）
３７℃の条件下で培養して得られたコロニーを任意に８個選び、各コロニーから得られた菌体を、２枚のＺ−ＴＣＫ寒天培地それぞれに播種し、２枚の培地のうちの一方を３７℃の条件下で、他方を２５℃の条件下で培養し、コロニーの形成能を調べた。結果を図９に示す。
【００６８】
図９中、上段が３７℃条件下で培養した結果であり、下段が２５℃で培養した結果であり、上下にそれぞれ同じコロニー由来のスポット結果が対応している。図９に示されるように、３７℃の条件下においてはコロニーが形成されるが、２５℃の条件下ではｌｄｒＤ遺伝子が発現するため、コロニーを形成せず増殖できないことが示された。以上のように、ｐＢＴ８５７ベクターとｐＬＤＲ１／Ｚｅｏベクターを使用することにより、相互作用するペアを保持した大腸菌株を３７℃で生育維持し、２５℃にシフトすることによりその大腸菌株が増殖しなくなるツーハイブリッド系が構築された。したがって、インヒビターの阻害を検出しようとする場合、例えば、インヒビターをＺ−ＴＣＫ寒天培地に添加し、３７℃および２５℃の双方条件下でコロニーが形成されれば、真のインヒビターであると確認される。このツーハイブリッド系では、２５℃の温度条件下でインヒビターによる阻害を受けなければ相互作用を生じ図９に示されるようにコロニーは形成されず、その結果、相互作用が阻害された細胞が形成するコロニーを回収することは極めて容易である。また、３７℃の温度条件下におくことによっても相互作用が生じないように制御できるため、取り扱い上の利便性が高い。
【００６９】
【発明の効果】
本発明によれば、インヒビターの候補の中からタンパク質相互作用のインヒビターを簡便な操作で容易に判別できる。また、本発明によれば、タンパク質相互作用をする多数のタンパク質の組み合わせについて阻害されるか否かの検定を高速で行うことが可能であり、また、多数のインヒビター候補についてもインヒビターか否かの検定を高速で行うことができる。すなわち、本発明によれば、タンパク質相互作用のインヒビターに関する情報を短期間で多量に取得することができる。
【００７０】
また、本発明によれば、簡便な操作でインヒビターの有無を容易に判別でき、インヒビターの阻害対象となるタンパク質を容易に判別または抽出可能な、インヒビターのライブラリーが得られる。
【００７１】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ツーハイブリッドシステムの概要を示す図である。
【図２】複数のタンパク質ペアについてインヒビターを検出する方法を示す図である。
【図３】化合物ライブラリーを用いたハイスループットスクリーニングの態様を示した図である。
【図４】ｐＢＴベクターおよびｐＴＲＧベクターのそれぞれにｐ５３Ｔを導入した図である。
【図５】３７℃および２５℃のそれぞれ条件下で、ＴＣＫ培地およびＣＴＣＫ培地のそれぞれにおいて形質転換細胞を培養した結果を示す図である。左上が３７℃、ＴＣＴ培地であり、右上が３７℃、ＣＴＣＫ培地であり、左下が２５℃、ＴＣＫ培地であり、２５℃、ＣＴＣＫ培地での培養結果である。
【図６】ｌｄｒＤ遺伝子をレポーター遺伝子として導入するための発現ベクターの設計図である。
【図７】λｃＩとＡの融合タンパク質の発現プラスミド、ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅαとＢの融合タンパク質の発現プラスミド、ｐＬＤＲ１／Ｚｅｏプラスミドを、ＢａｃｔｅｒｉｏＭａｔｃｈ（登録商標）Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ｓｔｒａｉｎのコンピテント細胞に導入した様子を模式的に示す図である。なおＡとＢは相互作用を示すタンパク質のペアとする。
【図８】３７℃および２５℃のそれぞれの条件下で、Ｚ−ＴＣＫ培地において培養した結果を示す図である。
【図９】スポットアッセイの結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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