(57)【要約】　　　（修正有）【課題】新規の細胞外マトリックスタンパク質、及びその遺伝子、さらにはその抗体等を提供する。【解決手段】本発明にかかるタンパク質及びその遺伝子は、マウス由来の新規な細胞外マトリックス因子であり、特定なアミノ酸配列からなるタンパク質、及び／又は、特定なアミノ酸配列において、１又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなる細胞外マトリックスタンパク質と、これをコードする遺伝子である。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子。
（ａ）配列番号２、４、６又は８に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号２、４、６又は８に示されるアミノ酸配列において、１又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなる細胞外マトリックスタンパク質。
【請求項２】
マウス由来である請求項１記載の遺伝子。
【請求項３】
配列番号１に示される塩基配列のうち、１７１〜１６５５番目の塩基配列をオープンリーディングフレームとして有する請求項１又は２記載の遺伝子。
【請求項４】
配列番号３に示される塩基配列のうち、４９４〜２１９７番目の塩基配列をオープンリーディングフレームとして有する請求項１又は２記載の遺伝子。
【請求項５】
配列番号５に示される塩基配列のうち、１００１〜１７１１番目の塩基配列をオープンリーディングフレームとして有する請求項１又は２記載の遺伝子。
【請求項６】
配列番号７に示される塩基配列のうち、７３〜１１１９番目の塩基配列をオープンリーディングフレームとして有する請求項１又は２記載の遺伝子。
【請求項７】
配列番号２、４、６又は８に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
【請求項８】
配列番号２、４、６又は８に示されるアミノ酸配列において、１又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなる細胞外マトリックスタンパク質。
【請求項９】
分泌タンパク質である請求項７又は８のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項１０】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の遺伝子を含む組換え発現ベクター。
【請求項１１】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の遺伝子が導入された形質転換体。
【請求項１２】
請求項７〜９のいずれか１項に記載のタンパク質に対する抗体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規細胞外マトリックスタンパク質、及びその遺伝子に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
細胞外マトリックスは、組織の細胞を取り巻く細胞支持組織であり、コラーゲン、エラスチン、フィブリリンなどの繊維性タンパク質、フィブロネクチン、ラミニンなどの糖蛋白質、プロテオグリカンなどの複合糖質及びヒアルロン酸などの糖質からなる。細胞外マトリックスは、細胞表面レセプターと結合することにより細胞接着、移動、増殖、分化、形態、代謝など細胞の活動に重大な影響を与えることが知られている。したがって、生体の受精、発生、成熟、加齢、炎症、創傷治癒、免疫、腫瘍など多くの生体現象と関連することが知られている。
【０００３】
より詳細には、細胞外マトリックス因子についてこれまで以下の知見が得られており、その細胞接着活性など、生命活動において細胞外マトリックス因子が果たす役割の重要性が明らかになっている。
【０００４】
▲１▼　生体を構成する細胞は血球細胞などの浮遊系細胞を除き、常に細胞外環境に接着して存在する。その接着は、隣り合った細胞同士の接着である細胞間接着と細胞の基質との接着である細胞―基質接着の２つに分けられる。この基質の実態が細胞外マトリックスである。細胞と基質との接着は細胞の生命維持に必須であり、これら細胞は基質、すなわち細胞外マトリックスとの接着なしには生きられない。すなわち、アポトーシスを引き起こして死ぬことが知られている。この細胞外マトリックスの生存維持作用は細胞外マトリックス因子とインテグリンをはじめとする細胞表面レセプターとの結合によって細胞内のＡｋｔやＭＡＰキナーゼなどのキナーゼが活性化されることでアポトーシスが回避されている。
【０００５】
▲２▼　このように、細胞外マトリックス因子に対する細胞の接着によって誘導される現象はきわめて動的なものであり、細胞の重要な機能を制御している。たとえば、細胞の増殖も細胞外マトリックスによって制御されている。すなわち、細胞は増殖因子が存在しても、細胞外マトリックスへの接着なしには増殖できない、いわゆる基質依存性の細胞増殖が古くから知られている。その実態は、細胞増殖因子からのシグナルとともに、細胞外マトリックスへの接着による細胞内シグナル、たとえばＭＡＰキナーゼの活性化が必須である。
【０００６】
▲３▼　細胞外マトリックスへの細胞接着による細胞内シグナル伝達は異なる細胞外マトリックスによって異なっている。たとえば、間質系細胞外マトリックスの主要構成因子であるフィブロネクチンへの接着はＭＡＰキナーゼの活性化とｓｍａｌｌ　Ｇｐｒｏｔｅｉｎ　Ｒｈｏの活性化を誘導する。一方、基底膜細胞外マトリックスの主要構成因子であるラミニンへの接着はＭＡＰキナーゼの活性化とｓｍａｌｌ　Ｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｒｈｏに代わって、Ａｋｔやｓｍａｌｌ　Ｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｒａｃを活性化する。これら異なる細胞外マトリックス因子への接着によって細胞の性質は強く影響され、一般的にはフィブロネクチンは細胞を増殖型に、ラミニンは分化型に誘導する。すなわち、異なる細胞外マトリックス因子は異なる細胞内シグナルを伝達し、これにより細胞の生存、増殖、分化を制御する。
【０００７】
▲４▼　細胞接着因子である多くの細胞外マトリックス因子は、細胞の移動の主役である。細胞外マトリックス因子による細胞接着は単に細胞をその基質にとどめておくだけの作用ではない。細胞外マトリックスは細胞接着と同時に細胞の伸展を誘導する。この伸展は、細胞内のアクチンを含む細胞骨格系の再編成を必須とし、これらはｓｍａｌｌ　Ｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｒｈｏ，　Ｒａｃ　Ｃｄｃ４２の制御下にある。細胞外マトリックスはこれらｓｍａｌｌ　Ｇ　ｐｒｏｔｅｉｎの活性化レベルをドラマティックに制御することで、細胞骨格系の構築を誘導し、細胞を伸展させる。
【０００８】
▲５▼　細胞の移動は細胞外マトリックスへの接着を足がかりとして、細胞外マトリックスへの接着シグナルに応答した細胞骨格系の再構成の連続によって移動することから、細胞外マトリックスは細胞の移動に必須である。
【０００９】
▲６▼　細胞の移動は胚の初期発生から生体のボディープランの構築に必須であり、もちろんすべての組織は細胞の移動を伴って構築される。創傷や疾病の治癒もその周囲の細胞の移動、浸潤によって行われる。
【００１０】
▲７▼　浮遊系の細胞でも、白血球を含む血球、免疫系細胞の血管壁の通過や組織への浸潤、組織間の移動も細胞外マトリックス因子への接着を必要とする。がん細胞の転移もその実態は細胞の原発層からの移動である。
【００１１】
▲８▼　これらの正常、および疾患、疾病における細胞移動は細胞外マトリックスへの接着と接着シグナルに応答した細胞内シグナルによって制御されている。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
このように、細胞外マトリックス因子は細胞、組織の働きを細胞の外側から調節する重要な役割を果たしている。したがって、これら細胞外マトリックス因子の遺伝子、タンパク質やこれらタンパク質に対する抗体は、受精、胚発生、形態形成等を研究する上で、さらに、細胞外マトリックスの形成異常や代謝異常によって生じる疾患、疾病を研究する上で、非常に有用である。また、これらの遺伝子や抗体は、細胞外マトリックスの関与する病気の診断や、その治療効果の検査などにも有用である。そのため、より多くの新規細胞外マトリックス因子を見出し、これを生産し利用する方法の開発が強く望まれていた。
【００１３】
本発明は、上記の課題に鑑みなされたものであり、その目的は、新規の細胞外マトリックスタンパク質、及びその遺伝子、さらにはその抗体等を提供することにある。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記の課題に鑑み鋭意検討した結果、マウス由来のｃＤＮＡライブラリーの中から分泌シグナル配列と予想される配列を含むｃＤＮＡを選別し、これを用いてタンパク質を発現させ、その機能を解析したところ、このタンパク質が分泌タンパク質であり、新規の細胞外マトリックスタンパク質であること等を見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１５】
即ち、本発明に係るタンパク質は、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質であり、本発明に係る遺伝子は、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子である。
（ａ）配列番号２、４、６又は８に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号２、４、６又は８に示されるアミノ酸配列において、１又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなる細胞外マトリックスタンパク質。
【００１６】
上記（ａ）のタンパク質は、本発明者が今回新たに細胞外マトリックスタンパク質として単離・同定したものであり、Ｎ末端側に予想分泌シグナル配列を有する。また、後述の実施例に示すように、機能解析の結果、これらタンパク質は細胞外分泌される分泌タンパク質であり、細胞外マトリックスタンパク質であること等が実験的に確認されている。
【００１７】
本発明に係る組換え発現ベクターは、上記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子を含むものである。例えば、配列番号１、３、５又は７に示される遺伝子が挿入された組換え発現ベクターが挙げられる。組換え発現ベクターの作製には、プラスミド、ファージ、又はコスミドなどを用いることができるが特に限定されるものではない。
【００１８】
本発明に係る形質転換体は、上記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子が導入された形質転換体である。ここで、「遺伝子が導入された」とは、公知の遺伝子工学的手法（遺伝子操作技術）により、対象細胞（宿主細胞）内に発現可能に導入されることを意味する。また、上記「形質転換体」とは、細胞・組織・器官のみならず、動物個体（マウスやラット、ウサギ、ブタ、サルなどの形質転換動物）を含む意味である。特に、マウスやラットは、実験動物・病態モデル動物として広く用いられており、ノックアウトマウス等は、細胞外マトリックス因子の機能解析、同因子が関係する病気の病態解析やその病気の診断法、診断薬、治療法、治療薬の開発などに有用である。
【００１９】
本発明に係る抗体は、上記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質、又はその部分ペプチドを抗原として、公知の方法によりポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体として得られる抗体である。
【００２０】
【発明の実施の形態】
本発明の実施の一形態について図１ないし図５に基づいて説明すれば、以下の通りである。尚、本発明はこれに限定されるものではない。
【００２１】
本発明は、新規な細胞外マトリックス因子であるタンパク質とこれをコードする遺伝子とを見出すとともに、これら遺伝子及びタンパク質の機能を解析し、これらの利用方法を提案するものである。そこで以下では、本発明の遺伝子、タンパク質の配列、構造について説明し、次いでこれら遺伝子、タンパク質の機能、利用方法等について説明することとする。
【００２２】
本発明者は、マウス（Ｍｕｓ　ｍｕｓｃｕｌｕｓ）由来ｃＤＮＡライブラリーの中から分泌シグナル配列と予想される配列を含む４つのｃＤＮＡをスクリーニングし、これら４つの全長ｃＤＮＡ配列を決定し、さらにこれら４つのｃＤＮＡがコードするタンパク質のアミノ酸配列をそれぞれ決定した。
【００２３】
以下の説明では、第１の新規ｃＤＮＡを「３３１４５遺伝子」と称し、当該遺伝子にコードされるタンパク質を「３３１４５タンパク質」と称して説明する。また、配列を決定した第２の新規ｃＤＮＡを「４０２４０遺伝子」と称し、当該遺伝子にコードされるタンパク質を「４０２４０タンパク質」と称して説明する。同様に、配列を決定した第３の新規ｃＤＮＡを「５１１４０遺伝子」と称し、当該遺伝子にコードされるタンパク質を「５１１４０タンパク質」と称して説明する。また、配列を決定した第４の新規ｃＤＮＡを「３１４１８遺伝子」と称し、当該遺伝子にコードされるタンパク質を「３１４１８タンパク質」と称して説明する。
【００２４】
（１）本発明に係る遺伝子及びタンパク質の配列、構造
本発明に係る遺伝子は、前述のように、（ａ）配列番号２、４、６又は８に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子か、（ｂ）配列番号２、４、６又は８に示されるアミノ酸配列において、１又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなる細胞外マトリックスタンパク質をコードする遺伝子であればよい。
【００２５】
本実施の形態では、具体的には、▲１▼配列番号１に示される塩基配列のうち、１７１〜１６５５番目の塩基配列をオープンリーディングフレームとして有するｃＤＮＡ（３３１４５遺伝子：マウスａｄｕｌｔ　ｄｉｅｎｃｅｐｈａｌｏｎ由来）、▲２▼配列番号３に示される塩基配列のうち、４９４〜２１９７番目の塩基配列をオープンリーディングフレームとして有するｃＤＮＡ（４０２４０遺伝子：マウス０　ｄａｙ　ｎｅｏｎａｔｅ　ｈｅａｄ由来）、▲３▼配列番号５に示される塩基配列のうち、１００１〜１７１１番目の塩基配列をオープンリーディングフレームとして有するｃＤＮＡ（５１１４０遺伝子：マウス１３　ｄａｙｓ　ｅｍｂｒｙｏ　ｌｕｎｇ由来）、▲４▼配列番号７に示される塩基配列のうち、７３〜１１１９番目の塩基配列をオープンリーディングフレームとして有するｃＤＮＡ（３１４１８遺伝子：マウスａｄｕｌｔ　ｖａｇｉｎａ由来）、▲５▼これらｃＤＮＡの塩基配列に対応する塩基配列を有するｍＲＮＡが例示される。これら遺伝子はマウス由来である。
【００２６】
なお、本発明の「遺伝子」には、ＲＮＡ及びＤＮＡが含まれるものとする。ＲＮＡにはｍＲＮＡが含まれ、ＤＮＡには、例えばクローニングや化学合成技術又はそれらの組み合わせで得られるようなｃＤＮＡやゲノムＤＮＡなどが含まれる。また、ＤＮＡは二本鎖でも一本鎖でもよく、一本鎖ＤＮＡは、センス鎖となるコードＤＮＡでもよく、アンチセンス鎖となるアンチコード鎖でもよい（アンチセンス鎖は、プローブとして又はアンチセンス薬物として利用できる）。さらに、本発明の「遺伝子」は、上記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする配列以外に、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列やベクター配列（発現ベクター配列を含む）などの配列を含むものであってもよい。
【００２７】
一方、本発明に係るタンパク質は、上記（ａ）又は（ｂ）のタンパク質であればよいが、本実施の形態では、▲１▼配列番号２に示されるアミノ酸配列を有しており、４９５のアミノ酸残基からなっている３３１４５タンパク質、▲２▼配列番号４に示されるアミノ酸配列を有しており、５６８のアミノ酸残基からなっている４０２４０タンパク質、▲３▼配列番号６に示されるアミノ酸配列を有しており、２３７のアミノ酸残基からなっている５１１４０タンパク質、▲４▼配列番号４に示されるアミノ酸配列を有しており、３４９のアミノ酸残基からなっている３１４１８タンパク質が例示される。
【００２８】
＜３３１４５タンパク質＞
上記３３１４５タンパク質は、図１に示すように、アミノ末端（Ｎ末端）側に、ＳＣＰ（ｓｐｅｒｍ−ｃｏａｔｉｎｇ　ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）ドメインを、カルボキシル末端（Ｃ末端）側に、２つのＬＣＣＬ（Ｌｉｍｕｌｕｓ　ｆａｃｔｏｒ　Ｃ，　Ｃｏｃｈ−５ｂ２　ａｎｄ　Ｌｇｌ１）ドメインを有している。また、２７番目〜２９番目のＡｓｎ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ配列にて表されるＮ型糖鎖結合部位（ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　Ｎ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ　ｓｉｔｅ）を含んでいる。
【００２９】
また、その相同性を比較すると、上記３３１４５タンパク質は、ヒトＣｏｃｏａＣｒｉｓｐ（ｃｙｓｔｅｉｎ−ｒｉｃｈ　ｓｅｃｒｅｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ：４９７アミノ酸）に約７７％の相同性を有している。さらに、分子中央部分のアミノ酸配列は、ラットの機能未知のタンパク質：ＬＡＴＥ　ＧＥＳＴＡＴＩＯＮ　ＬＵＮＧ　ＰＲＯＴＥＩＮ（１８８アミノ酸）に約９０％の相同性を有している。加えて、ｐｒｏｔｅａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　１５　ｐｒｅｐｒｏｐｒｏｔｅｉｎ；　２５　ｋＤａ　ｔｒｙｐｓｉｎ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、ＧＬＩＯＭＡ　ＰＡＴＨＯＧＥＮＥＳＩＳ−ＲＥＬＡＴＥＤ　ＰＲＯＴＥＩＮ　（ＲＴＶＰ−１　ＰＲＯＴＥＩＮ）と相同性を有している。
【００３０】
上記３３１４５タンパク質のアミノ酸組成は表１に示すようになっている。
【００３１】
【表１】
2004008021.tif 000002
【００３２】
＜４０４２０タンパク質＞
上記４０４２０タンパク質は、図２に示すように、Ｎ末端側に分泌シグナル配列を有しており、２つのＮ型糖鎖結合部位（ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　Ｎ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ　ｓｉｔｅ）を有している。また、膜貫通領域は認められない。
【００３３】
さらに、その相同性を比較すると、５’側を除いた領域でヒト由来のｃＤＮＡ（ＦＬＪ２３１９１遺伝子）と核酸レベルで８２％の相同性を示す。ＦＬＪ２３１９１遺伝子はアミノ末端をコードする領域が欠損していると考えられる。配列にはフレームシフトが多く見られ、ＦＬＪ２３１９１遺伝子の予測アミノ酸配列は４０２４０タンパク質のアミノ酸配列と相同性があるが、その予測サイズは小さい。フレームをずらせばＣ末端側には大きな相同領域が認められる。
【００３４】
また、４０２４０遺伝子の塩基配列の一部は、すでに公開されているマウス由来のｃＤＮＡのＥＳＴであるＢＢ６１３７６５遺伝子及びＡＶ２４３６２１遺伝子と一致しており、同じくマウス由来のｃＤＮＡのＥＳＴであるＡＫ０１７７５９遺伝子、及びＡＫ０２０９４２遺伝子の塩基配列と相同性を示している。
【００３５】
上記４０２４０タンパク質のアミノ酸組成は表２に示すようになっており、Ｌｙｓが多く存在している（９％）。
【００３６】
【表２】
2004008021.tif 000003
【００３７】
＜５１１４０タンパク質＞
上記５１１４０タンパク質は、図３に示すように、Ｎ末端側に分泌シグナル配列を有しており、トロンボスポンディンタイプ１リピート（ＴＳＰ−１）ドメイン、Ｎ型糖鎖結合部位（ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　Ｎ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ　ｓｉｔｅ）が認められ、さらに、ＰＡＣＥ４タンパク質（Ｆｕｒｉｎ−ｌｉｋｅ　ｐｒｏｔｅａｓｅ・セリンプロテアーゼ）と相同性のあるシステインリッチ領域を有している。
【００３８】
また、その相同性を比較すると、ヒトのトロンボスポンディン（ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ）と約４７％の相同性を示す（ヒトｓｉｍｉｌａｒ　ｔｏ　ＦＬＪ１４４４０．ｐｒｎ：ＸＰ＃０２９８９０８）。ヒトのトロンボスポンディンは、ヒトの血小板α顆粒から放出される多機能な糖タンパク質であり、１４０ｋＤａのサブユニットがジスルフィド（Ｓ−Ｓ）結合した同種三量体として血中に存在するタンパク質である。しかしながら、５１１４０遺伝子は、ヒトのトロンボスポンディンをコードする遺伝子（アクセッションＮｏ．　ＮＭ＃０３２７８４、ＡＦ２５１０５７、ＢＣ０２２３６７、ＸＰ＃０２８９０８）とは無関係にクローニングされたものである。
【００３９】
また、上記トロンボスポンディンタイプ１リピート（ＴＳＰ−１）ドメインは、マウスのＲ−ｓｐｏｎｄｉｎとも相同性がある。
【００４０】
上記５１１４０タンパク質のアミノ酸組成は表３に示すようになっており、システイン、アルギニンの割合が多く、システインが約１２．２％、アルギニンが約９．７％の割合で含まれている。
【００４１】
【表３】
2004008021.tif 000004
【００４２】
＜３１４１８タンパク質＞
上記３１４１８タンパク質は、図４に示すように、Ｎ末端側に分泌シグナル配列を有しており、分子内に４つのタンデム繰り返し配列が認められ、さらに、牛プリオンタンパク質と相同性がある配列、牛プリオンタンパク質のヘパリン結合ドメインと相同性がある配列を有している。上記４つのタンデム繰り返し配列領域は、特に疎水的性質が強い。
【００４３】
また、３１４１８タンパク質は、セリン、スレオニンが多く含まれるため、Ｏ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎにより糖鎖が付加される可能性があるが、Ｎ型結合糖鎖部位が認められない。また、セリン−グリシン配列が複数認められ、コンドロイチン硫酸が結合している可能性がある。尚、上述した以外の既知のドメイン、モチーフ構造は認められない。
【００４４】
また、その相同性を比較すると、サルＴａｓｔｅ　Ｂｕｄ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎと４０％の相同性を示す。サルＴａｓｔｅ　Ｂｕｄ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎは、３１４アミノ酸からなり、味覚細胞に特異的に発現される機能未知のタンパク質であり、Ｎ末端側に分泌シグナル配列を有しているとともに、潜在的なＯ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ部位を有している。尚、本発明完成時までサルＴａｓｔｅ　Ｂｕｄ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎは機能未知であり、上記３１４１８遺伝子は、サルＴａｓｔｅ　Ｂｕｄ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎをコードするｒｍＳＴＧ遺伝子とは無関係にクローニングされたものである。
【００４５】
さらに、図５にも示すように、３１４１８タンパク質は、牛プリオンタンパク質のヘパリン結合ドメインと相同性がある配列（２２１番目から２３０番目のアミノ酸残基）を有しており、牛プリオンタンパク質と２７％の相同性を示す。特に、３１４１８タンパク質における、上記ヘパリン結合ドメインと相同性のある配列領域を含む２１０番目から２４１番目のアミノ酸残基の領域は、牛プリオンタンパク質と高い相同性を有している。尚、サルＴａｓｔｅ　Ｂｕｄ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎも、牛プリオンタンパク質と約５０％の相同性を示すタンデム繰り返し配列を有している。
【００４６】
上記３１４１８タンパク質のアミノ酸組成は表４に示すようになっており、グリシン及びセリンが約２７％、プロリンが約１５％、疎水性アミノ酸が約５９．６％の割合で含まれている。
【００４７】
【表４】
2004008021.tif 000005
【００４８】
前述のように、本発明に係るタンパク質には、前記（ｂ）のタンパク質、即ち、配列番号２、４、６又は８に示されるアミノ酸配列において、１又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなる細胞外マトリックスタンパク質も含まれるが、ここで、「１又はそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異タンパク質作製法により置換、欠失、挿入、及び／又は付加できる程度の数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されることを意味する。このように、上記（ｂ）のタンパク質は、換言すれば、上記（ａ）のタンパク質の変異タンパク質であり、ここにいう「変異」は、主として公知の変異タンパク質作製法により人為的に導入された変異を意味するが、天然に存在する同様の変異タンパク質を単離精製したものであってもよい。
【００４９】
上記変異タンパク質には、野生型の活性に異常を持つ変異タンパク質（機能欠失型の変異タンパク質と称する）が含まれていても良い。このような機能欠失型の変異タンパク質は、例えば、野生型タンパク質と構造を比較することにより、その構造の中で活性に必須な領域が明らかになるという、タンパク質の機能解析において有用である。また、本発明に係る遺伝子には、上記機能欠失型の変異タンパク質をコードする遺伝子が含まれても良い。このような遺伝子は、例えば、新たな形質転換体の作出に有用である。
【００５０】
本発明に係るタンパク質は、タンパク質の精製や検出等を容易に行うために、公知のＨＡやＦｌａｇ等の付加配列を末端に含ませてもよいし、融合タンパク質であってもよい。また、Ｎ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎなどの各種修飾を受けていてもよいし、二量体以上の多量体を形成するものであってもよい。
【００５１】
（２）新規細胞外マトリックスタンパク質の機能
上記３３１４５タンパク質、４０４２０タンパク質、５１１４０タンパク質、および３１４１８タンパク質は、何れも、新規な細胞外マトリックス因子であり、かつ、細胞外分泌型のタンパク質（分泌タンパク質）である（後述の実施例参照）。また、上記各タンパク質は、それぞれ次のような特徴的な機能を有している。
【００５２】
＜３３１４５タンパク質＞
上記３３１４５タンパク質は、細胞偏縁部の基底部分にドット状又は線維状に局在し、特に、骨髄、胃、目、心臓、子宮、肺や胎児等にて多く発現することが明らかとなっている（後述の実施例参照）。それゆえ、上記組織の発生や、上記組織を構成する細胞の活動等を、細胞の外側から調整する役割を果たしていると考えられる。
【００５３】
＜４０４２０タンパク質＞
上記４０２４０タンパク質は、マウス胚の発生およびマウス組織での発現パターンを調べると、脳、骨髄、胎児、眼、心臓、肺、リンパ節、脊髄、胃、子宮などで検出される（後述の実施例参照）。４０２４０タンパク質には、予測されるアミノ酸配列からは既知のドメイン構造との類似性は特にないが、細胞での発現実験では細胞外マトリックスに組み込まれることが予想される。上記発現パターンの解析から骨格筋や舌など筋肉の多い場所に発現している可能性が高い。
【００５４】
＜５１１４０タンパク質＞
上記５１１４０タンパク質は、Ｆｕｒｉｎ−ｌｉｋｅ　ｐｒｏｔｅａｓｅであるＰＡＳＥ４と相同性を有し、分子内に、Ｆｕｒｉｎ−ｌｉｋｅ　ｃｙｓｔｅｉｎ−ｒｉｃｈ　ｒｅｐｅａｔを有する分泌タンパク質である。
【００５５】
また、上記５１１４０タンパク質は、塩基性アミノ酸に富んだタンパク質であることから、ヘパリン、もしくはヘパラン硫酸鎖との結合が予測される。実際、５１１４０タンパク質は、ヘパリン共存下でより多く細胞培養上清に存在している（後述の実施例参照）ことから、細胞外表面のヘパラン硫酸鎖に結合して存在していると考えられる。
【００５６】
さらに、上記５１１４０タンパク質は、実際、細胞の突起や則部等細胞表面に局在している。
【００５７】
細胞外表面には、膜結合型マトリックスプロテアーゼなどのタンパク質分解酵素が多く存在している。このように細胞表面に存在するタンパク質分解酵素が関与するメカニズムとして、癌細胞の浸潤の際、細胞周囲の細胞外マトリックスを分解し破壊するため、癌細胞の移動が可能となり、癌細胞の転移が引き起こされるということが知られている。
【００５８】
それゆえ、上記５１１４０タンパク質は、細胞外表面にヘパラン硫酸鎖を解して存在し、これら酵素活性を調節したり、自らタンパク質分解を制御したりしている可能性がある。
【００５９】
さらに、トランスフォーミング増殖因子やベータファミリープロテインなどの増殖因子、並びにサイトカインの活性は厳密に制御されており、これらの増殖因子やサイトカインは、胚発生や多くの疾患、疾病に関わっていることが知られている。これらの増殖因子やサイトカインは、通常不活性型で存在しているが、そのプロペプチドがプロテアーゼによって切断されることにより活性化される。
【００６０】
それゆえ、上記５１１４０タンパク質は、増殖因子やサイトカインの活性化メカニズムにも関わっている可能性がある。
【００６１】
＜３１４１８タンパク質＞
上記３１４１８タンパク質は、牛プリオンタンパク質と高い相同性を有する配列領域を有している。この領域は、プリオンタンパク質のヘパリン結合ドメインと高い相同性を有している配列を含んでいる。
【００６２】
プリオンは、脊椎動物の脳において、ヘパラン硫酸プロテオグリカンとともに局在している。ヘパラン硫酸プロテオグリカンは、プリオンのレセプター結合を促進することが知られている。また、ヘパラン硫酸がプロテアーゼ耐性プリオンの形成を誘導することも知られている。それゆえ、プリオンのヘパリン結合活性は、プリオンの異常が原因となって引き起こされる狂牛病に大きく関与していると考えられている。
【００６３】
上記３１４１８タンパク質は、細胞外表面に局在する分泌タンパク質であるため、プリオンのレセプターを介した伝染性の疾病等に対するｎａｔｕｒａｌ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒとして機能する可能性がある。
【００６４】
このように、本発明に係る上記各タンパク質は、本発明者らによって初めて明らかにされた新規な細胞外マトリックスタンパク質であり、さらに、それぞれ上述したような特徴的な機能を有する。
【００６５】
（３）本発明に係るタンパク質、及びその遺伝子の利用方法
本発明に係る新規細胞外マトリックスタンパク質及びこれをコードする遺伝子等は、以下の有用性を有する。
【００６６】
細胞外マトリックスは、組織を構成する細胞外環境であることから、細胞接着、移動、増殖、分化、形態、又は代謝等の細胞の各種活動に重大な影響を与えるため、生体の受精、発生、成熟、加齢、炎症、創傷治癒、免疫、腫瘍等多くの生体現象と関連することが知られている。また、同様な観点から様々な組織形成を規定する働きを有することも知られており、細胞外マトリックス因子は、細胞・組織の働きを細胞の外側から調節する重要な役割を果たしている。
【００６７】
それゆえ、本発明に係る遺伝子、タンパク質、及びその抗体等は、受精、胚発生、形態形成、さらには細胞外マトリックスの形成異常や代謝異常によって生じる疾患、疾病を研究する上で大変有用な道具となり得る。また、本発明に係る遺伝子、タンパク質等は、細胞外マトリックスの関与する病気の診断薬や、その治療効果を検査するための検査薬として有効に用いることができる。加えて、細胞外マトリックスは、組織形成を規定する細胞外環境であることから、本発明に係る遺伝子、タンパク質等は、再生医学における組織再生や、生体外における人工組織形成に応用可能である。
【００６８】
また、上記各タンパク質は、その構造や、それぞれに特徴的な機能から、以下のような利用可能性がある。
【００６９】
＜３３１４５タンパク質＞
上記３３１４５タンパク質は、ＬＣＣＬドメインを有している。このＬＣＣＬドメインを有するＣｏｃｈｌｉｎタンパク質も、上記３３１４５タンパク質と同様に細胞外分泌性のタンパク質であり、ＬＣＣＬドメインをコードする領域に変異が入ると、音が聞こえなくなるａｕｔｏｓｏｍａｌ　ｄｏｍｉｎａｎｔ　ｓｅｎｓｏｒｉｎｅｕｒｏｎａｌ　ｄｅａｆｎｅｓｓを引き起こす原因遺伝子であることが知られている。
【００７０】
ＬＣＣＬドメインを有するタンパク質は、機能未知のものも含めて２１個しか知られておらず、このうち３３１４５タンパク質と、これに類似するＥＳＴクローンが５つを占める。そのため、３３１４５タンパク質は、Ｃｏｃｈｌｉｎタンパク質が関与する遺伝子疾患に関係している可能性がある。そのため、本発明に係る３３１４５タンパク質および３３１４５遺伝子は、Ｃｏｃｈｌｉｎタンパク質の変異が引き起こす難聴の診断や治療等に利用することができる可能性がある。
【００７１】
また、ＥＳＴとして報告されている上記３３１４５遺伝子のｃＤＮＡ断片は、ｔｕｍｏｒｇｒｏｓｓ　ｔｉｓｓｕｅ，　ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ　ｄｕｃｔａｌ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ，　ｐｏｏｌｅｄ　ｌｕｎｇ　ｔｕｍｏｒｓ，　ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ　ｔｕｍｏｒ　ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ　ｔｏ　ｍａｍｍａｒｙ等の癌細胞から得られている。そのため、３３１４５タンパク質は、癌細胞にて特に発現していると考えられる。それゆえ、３３１４５遺伝子は、ＲＴ−ＰＣＲ等による癌検診に利用することができる可能性がある。さらに、３３１４５タンパク質に対する抗体を用いて、癌組織の診断にも利用することが可能である。また、上記抗体を用いて、３３１４５タンパク質と他のタンパク質との相互作用を抑えることにより、癌抑制に利用することも可能である。
【００７２】
＜４０４２０タンパク質＞
上記４０２４０タンパク質は、骨格筋や舌など筋肉の多い場所に発現している可能性が高い。それゆえ、上記４０２４０タンパク質は、筋肉周辺の細胞外マトリックスに局在することが考えられ、筋肉収縮などの機能に関わっていると推定される。
【００７３】
筋肉の運動機能障害による疾患には筋ジストロフィーなどが知られ、細胞外マトリックス因子であるラミニン２の変異がこの疾患を引き起こすことが知られている。それゆえ、上記４０２４０遺伝子もその発症や病態に関わっている可能性が高い。また、舌の運動に障害があれば言語発声や食物の飲み込みに支障が出る。上記４０２４０遺伝子の機能解析はこれらの疾患に対する治療法、治療薬の開発への貢献度が高いと考えられる。
【００７４】
＜５１１４０タンパク質＞
上記５１１４０タンパク質は、細胞外表面に局在し、細胞外において、タンパク質分解を直接または間接的に制御している可能性があり、これらの細胞外プロテアーゼの活性制御に関わっていると予測される。また、各種増殖因子やサイトカインは、そのプロペプチドがプロテアーゼによって切断されることにより活性化されるため、上記５１１４０タンパク質は、増殖因子やサイトカインの活性化メカニズムにも関わっている可能性がある。
【００７５】
したがって、本発明に係る遺伝子、タンパク質、または抗体は、癌細胞の転移阻害、形態形成や組織形成異常を伴う疾患の診断、治療等に応用できる可能が考えられる。
【００７６】
また、上記５１１４０タンパク質は、トロンボスポンディンと相同性を有しているため、本発明に係る遺伝子、タンパク質、及び抗体を用いることにより、トロンボスポンディンの機能を詳細に解析し、ヒトの細胞増殖や分化等の生理機能の研究に利用することも可能である。
【００７７】
＜３１４１８タンパク質＞
上記３１４１８タンパク質は、プリオンのレセプターを介した伝染性の疾病等に対するｎａｔｕｒａｌ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒとして機能する可能性がある。
【００７８】
それゆえ、本発明に係る遺伝子、タンパク質、及び抗体は、脊椎動物における、プリオン様脳内タンパク質の異常が原因となって引き起こされる疾病等（例えば、狂牛病）の病態機序のさらなる解析という基礎研究的な利用のみならず、診断薬、診断方法、治療薬、治療方法等に利用することが可能である。
【００７９】
脳疾患の診断薬、または診断方法の利用法としては、プリオン様脳内タンパク質の異常により引き起こされる脳疾患の疑いがある脊椎動物に用いることにより、プリオン様脳内タンパク質の異常により引き起こされる脳疾患か否かを診断することへの利用、等が挙げられる。
【００８０】
脳疾患の治療薬、または治療方法の利用法としては、プリオン様脳内タンパク質の異常により引き起こされる脳疾患の脊椎動物に用いることにより、その個体における脳疾患を治療若しくは緩和することへの利用、等が挙げられる。
【００８１】
また、上記３１４１８タンパク質は、サルＴａｓｔｅ　Ｂｕｄ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎと相同性を示す。このサルＴａｓｔｅ　Ｂｕｄ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎは、サルの味覚細胞で特異的に発現している、３１４アミノ酸からなるタンパク質である。このサルＴａｓｔｅ　Ｂｕｄ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎも、Ｎ末端領域に分泌シグナル配列を有しているため、膜タンパク質または分泌タンパク質として、細胞外で味覚細胞の生理機能に関与するタンパク質と考えられている。なお、ヒトやマウスにも、このサルＴａｓｔｅ　Ｂｕｄ−ｓｐｅｃｉｆｉｃｐｒｏｔｅｉｎのホモログが存在することが示唆されている（文献　Ｎｅｉｒａ　Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｍａｍｍ　Ｇｅｎｏｍｅ　２００１　Ｊａｎ；　１２（１）：　６０−６参照）。
【００８２】
それゆえ、本発明に係る遺伝子、タンパク質、及び抗体を用いることにより、脊椎動物におけるＴａｓｔｅ　Ｂｕｄ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎの機能の解析に利用することが可能である。
【００８３】
以下では、本発明に係る遺伝子、タンパク質等の具体的な利用方法について説明する。
【００８４】
本発明に係る遺伝子又はその変異遺伝子は、各種ホスト細胞中に導入して、本発明に係る細胞外マトリックスタンパク質又はその変異タンパク質を発現させることができる。導入された本発明に係る遺伝子又は変異遺伝子は、ホスト細胞中でベクターとして存在してもよいし、ホスト細胞のゲノムＤＮＡ中に「外部」ＤＮＡ、又は「付加」ＤＮＡとして含まれてもよい。ここで言う「外部」ＤＮＡとは、ホスト細胞のゲノム中には天然に存在しないが人為的操作の結果、ホスト細胞のゲノム中に挿入されたＤＮＡを意味する。また上記「付加」ＤＮＡとは、特定のホスト細胞のゲノム中に天然に存在するが、人為的操作の結果、さらに追加してホスト細胞のゲノム中に挿入されたＤＮＡを意味する。
【００８５】
上記ベクターの具体的な種類は特に限定されるものではなく、ホスト細胞中で発現可能なベクターを適宜選択すればよい。すなわち、ホスト細胞の種類に応じて、確実に遺伝子を発現させるために適宜プロモーター配列を選択し、これと本発明に係る遺伝子を各種プラスミド等に組み込んだものを発現ベクターとして用いればよい。さらに、上記発現ベクターには、プロモーター配列だけでなくターミネーター配列を含めてもよい。
【００８６】
また、上記遺伝子又は変異遺伝子がホスト細胞に導入されたか否か、さらにはホスト細胞中で確実に発現しているか否かを確認するために、各種マーカーを用いてもよい。例えば、ホスト細胞中で欠失している遺伝子をマーカーとして用い、このマーカーを含むプラスミド等を、本発明に係る遺伝子を含む発現ベクターとともにホスト細胞に導入する。これによってマーカー遺伝子の発現から本発明に係る遺伝子の導入を確認することができる。あるいは、オワンクラゲ由来の緑色蛍光タンパク質ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　Ｐｒｏｔｅｉｎ）をマーカーとして用い、本発明に係る細胞外マトリックスタンパク質のＧＦＰ融合タンパク質を発現させてもよい。
【００８７】
上記ホスト細胞は、特に限定されるものではなく、従来公知の各種細胞を好適に用いることができる。具体的には、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）等の細菌、酵母（出芽酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅや分裂酵母Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ）、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐａｓ　ｌａｅｖｉｓ）の卵母細胞、各種哺乳動物の培養細胞、あるいは昆虫の培養細胞等を挙げることができるが、特に限定されるものではない。
【００８８】
上記発現ベクターをホスト細胞に導入する方法、すなわち形質転換方法も特に限定されるものではなく、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。
【００８９】
前述したように、本発明に係るタンパク質及びその遺伝子は、研究用の各種試薬だけでなく、細胞外マトリックスの関与する病気の診断や治療、治療効果の検査等に用いられる各種薬剤に応用することが可能となる。
【００９０】
本発明に係る遺伝子やタンパク質等の薬剤化については、従来公知の方法を適用することができ、特に限定されるものではない。例えば研究用試薬の場合、本発明に係る遺伝子を形質転換キット化したり、本発明に係る細胞外マトリックスタンパク質を異種発現系で大量生産し精製したりすればよい。
【００９１】
同様に、本発明に係るタンパク質に対する抗体の生産方法も特に限定されるものではなく、例えば、上記３７３７７タンパク質又は４８２５０タンパク質それ自体、又はその部分ペプチドを抗原として、従来公知の方法によりポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体として得ることができる。
【００９２】
また、本発明に係るこれら各遺伝子の一部配列をプローブやプライマーとして用いることができる。このようにプローブに用いる場合としては、例えば、本発明の遺伝子の一部配列をチップ上に固定してＤＮＡチップ（マイクロアレイを含む）を構成し、当該ＤＮＡチップを各種検査・診断用に用いるような場合が挙げられる。
【００９３】
（４）本発明に係るタンパク質、遺伝子の取得方法
本発明に係る上記３３４１５遺伝子、４０２４０遺伝子、５１１４０遺伝子、及び３１４１８遺伝子の取得方法は、特に限定されるものではなく、前述の開示された配列情報等に基づいて種々の方法により、上記遺伝子配列を含むＤＮＡ断片を単離し、クローニングすることができる。例えば、上記各タンパク質をコードするｃＤＮＡの一部配列と特異的にハイブリダイズするプローブを調製し、ヒトやマウスなどのゲノムＤＮＡライブラリーやｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすればよい。このようなプローブとしては、上記各タンパク質をコードするｃＤＮＡの塩基配列又はその相補配列の少なくとも一部に特異的にハイブリダイズするプローブであれば、いずれの配列・長さのものを用いてもよい。また、上記スクリーニングにおける各ステップについては、通常用いられる条件の下で行えばよい。
【００９４】
上記スクリーニングによって得られたクローンは、制限酵素地図の作成及びその塩基配列決定（シークエンシング）によって、さらに詳しく解析することができる。これらの解析によって、本発明に係る遺伝子配列を含むＤＮＡ断片を取得したか容易に確認することができる。
【００９５】
また、上記プローブの配列を、上記各タンパク質の機能上重要と考えられる領域（例えば、分泌シグナル配列又はＮ型糖結合領域）の中から選択し、ヒト・マウスやその他の生物のゲノムＤＮＡ（又はｃＤＮＡ）ライブラリーをスクリーニングすれば、上記各タンパク質と同様の機能を有する相同分子や類縁分子をコードする遺伝子を単離しクローニングできる可能性が高い。
【００９６】
本発明に係る遺伝子（ポリヌクレオチド）を取得する方法は、上記スクリーニング法以外にも、ＰＣＲ等の増幅手段を用いる方法がある。例えば、上記各タンパク質のｃＤＮＡ配列のうち、５’側及び３’側の非翻訳領域の配列（又はその相補配列）の中からそれぞれプライマーを調製し、これらプライマーを用いてヒト・マウスなどのゲノムＤＮＡ（又はｃＤＮＡ）等を鋳型にしてＰＣＲ等を行い、両プライマー間に挟まれるＤＮＡ領域を増幅することで、本発明のポリヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を大量に取得できる。
【００９７】
本発明に係る上記３３４１５タンパク質、４０２４０タンパク質、５１１４０タンパク質、及び３１４１８タンパク質を取得する方法についても、特に限定されるものではなく、例えば、上述のようにして取得された遺伝子（上記各タンパク質又はその相同分子等をコードするｃＤＮＡ等）を導入した組換え発現ベクターを作製し、周知の方法により大腸菌や酵母等の微生物又は動物細胞などに組み入れて形質転換体として、そのｃＤＮＡがコードするタンパク質を発現させ精製することで、上記各タンパク質等の本発明に係るタンパク質を容易に取得することができる。
【００９８】
上記３３４１５タンパク質、４０２４０タンパク質、５１１４０タンパク質、及び３１４１８タンパク質の変異タンパク質を作製する方法についても、特に限定されるものではなく、例えば、部位特異的突然変異誘発法（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ−Ｇｏｔｏｈ，　Ｇｅｎｅ　１５２，２７１−２７５（１９９５）他）、ＰＣＲ法等を利用して塩基配列に点変異を導入し変異タンパク質を作製する方法、あるいはトランスポゾンの挿入による突然変異株作製法などの周知の変異タンパク質作製法を用いて、上述のようにして取得された遺伝子の塩基配列において、１又はそれ以上の塩基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されるように改変を加えることによって作製することができる。また、変異タンパク質の作製には、市販のキットを利用してもよい。
【００９９】
【実施例】
以下の実施例では、本発明に係る３３１４５遺伝子、４０２４０遺伝子、５１１４０遺伝子、及び３１４１８遺伝子をマウスから取得した具体的な方法、及び本発明にかかる３３１４５タンパク質、４０２４０タンパク質、５１１４０タンパク質、及び３１４１８タンパク質の物性を調べた結果について、図１〜図１８に基づいて、順番に説明する。
【０１００】
〔実施例１：ｃＤＮＡライブラリーの作製〕
本実施例で説明するｃＤＮＡライブラリーの作製は、本発明に係る３３１４５遺伝子、４０２４０遺伝子、５１１４０遺伝子、及び３１４１８遺伝子に共通である。
【０１０１】
（１）ｍＲＮＡの調製
マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）各器官又は組織０．５ｇ〜１ｇを１０ｍｌの懸濁液でホモジェナイズし、２Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）１ｍｌと、同量のフェノール／クロロホルム（体積比５：１）混合液を加え抽出した。抽出後水層に同量のイソプロパノールを加えて、ＲＮＡを水相から分離沈澱させた。この試料を氷の上で１時間インキュベーションした後、４，０００ｒｐｍ、１５分間の条件で冷却遠心機にかけ、沈澱物を回収した。得られた沈殿物を７０％エタノールで洗い、水８ｍｌに溶解後、２ｍｌの５ＭＮａＣｌ、１％ＣＴＡＢ（ｃｅｔｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌ　ａｍｍｏｎｉｕｍ　ｂｒｏｍｉｄｅ）、４Ｍ尿素、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓを含むｐＨ７．０の水溶液１６ｍｌを加えてＲＮＡを沈澱させ、ポリサッカライドを除いた（ＣＴＡＢ沈澱）。
【０１０２】
続いて、室温で４，０００ｒｐｍ、１５分間の条件で遠心機にかけ、ＲＮＡを４ｍｌの７Ｍグアニジン−Ｃ１に溶解した。そして２倍量のエタノールを加えた後、氷上で１時間インキュベーションし、４，０００ｒｐｍ、１５分間の条件で遠心機にかけ、生じた沈澱物を７０％エタノールで洗いＲＮＡを回収した、これを再度水に溶解し、ＲＮＡの純度をＯＤ比２６０／２８０（＞１．８）と２３０／２６０（＜０．４５）を読むことによって計測した。
【０１０３】
（２）第１鎖ｃＤＮＡの調製
調製した上記ｍＲＮＡ１５μｇを用いて、逆転写酵素３，０００ｕｎｉｔにより、最終容量１６５μｌの反応液中で、５−メチル−ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰを各々０．５４ｍＭ、０．６Ｍトレハロース、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、７５ｍＭＫＣｌ、３ｍＭＭｇＣｌ２、１０ｍＭＤＴＴ、５２ｎｇ／μｌＢＳＡ、ＲＮａｓｅインヒビター５ｕｎｉｔの条件下で逆転写反応を行った。
【０１０４】
尚、プライマーとしては、次に示す制限酵素ＸｈｏＩの認識配列を含むオリゴヌクレオチド１ｓｔ　ＢＳ（配列中、ＶはＡ，Ｇ又はＣを示し、ＮはＡ，Ｇ，Ｃ又はＴを示す）を１２．６μｌ用いた。
【０１０５】
５’−ＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＡＧＧＡＴＣＣＡＡＧＡＧＣＴＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＶＮ−３’（配列番号９）
上記逆転写反応を始める際、反応液の１／４を採取し、それに１．５μｌの［α−３２Ｐ］−ｄＧＴＰ（３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ、１０μＣｉ／μｌ；Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を加えることにより、第１鎖ｃＤＮＡの合成効率を測定した。ＲＩ標識した反応液の０．５μｌをＤＥ−８１ペーパー上にスポットし、０．５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で３回洗った前後のＲＩ活性を測定し、計算した。その後、ＲＩ標識した反応液と非標識の反応液を混合し、０．５ＭＥＤＴＡ８μｌ、１０％ＳＤＳ２μｌ、プロテイナーゼ（Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）Ｋ２０μｇを加え、４５℃で１５分間加熱した。フェノール／クロロホルムによる抽出、エタノール沈澱後、沈澱をＲＮａｓｅフリーに処理してある水（以下ＲＮａｓｅフリー水とする）４７μｌに溶解した。
【０１０６】
（３）５’キャップ構造及び３’末端へのビオチン付加
ＲＮＡジオールのビオチン化ＲＮＡのジオール部位（Ｃａｐ構造のある５’末端と、ポリＡ鎖のある３’末端のリボースの双方に存在）にビオチンを結合させるために、２段階の反応を行った。この２段階の反応は、それぞれ、ジオール基の酸化とそれに続くビオチンヒドラジトと酸化ＲＮＡ体のカップリング反応である。まず、逆転写反応で得られたＲＮＡ−第１鎖ｃＤＮＡ複合体１５μｇを、６．６ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）と、酸化剤として過ヨウ素酸ナトリウムを用いて５０μｌの反応液中で処理した。この酸化反応は遮光条件の下、氷上で４５分間行った。
【０１０７】
続いて、５Ｍ塩化ナトリウム１１μｌ、１０％ＳＤＳ０．５μｌ、そして同量のイソプロパノールを加え、６０分間氷上に放置した後、４℃で１５分間１５，０００ｒｐｍ遠心し沈澱を取得した。沈澱物は７０％エタノールで洗い、ＲＮａｓｅフリー水５０μｌに再溶解させた。その試料に１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ６．１）５μｌ、１０％ＳＤＳ５μｌ、１０ｍＭビオチンヒドラジド（Ｓｉｇｍａ社製）１５０μｌを加え、室温（２２〜２６℃）で終夜反応させた。最後に、５μｌの５ＭＮａＣｌ、１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ６．１）７５μｌ、及び２．５倍量のエタノールを加え、１時間の氷上冷却後、４℃において１５分間遠心し、ビオチン化した。反応後、反応液を１５分間遠心し、再度ＲＮＡ−ＤＮＡ複合体を沈澱させた。沈澱物は７０％エタノールで１回、更に８０％エタノールで１回洗い、ＲＮａｓｅフリー水７０μｌに溶解した。
【０１０８】
（４）ＲＮａｓｅＩによる完全長ｃＤＮＡの選択
上記のようにして得られたビオチン化ＲＮＡ−ＤＮＡ複合体について、１本鎖ＲＮＡを消化するＲＮａｓｅＩで処理することにより、逆転写反応時に完全なｃＤＮＡの伸長が得られなかったｍＲＮＡ、及びｍＲＮＡの３’末端に標識されたビオチン残基を取り除いた。具体的には、上記ビオチン化ＲＮＡ−ＤＮＡ複合体の試料７０μｌに、１０×ＲＮａｓｅＩバッファー（１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５０ｍＭＥＤＴＡ、２ＭＮａＯＡｃ）１０μｌ、ＲＮａｓｅＩ（ＲＮａｓｅ　ＯｎｅＴＭ；Ｐｒｏｍｅｇａ社製）２００ｕｎｉｔを加えて、３７℃で１５分間処理することで１本鎖ＲＮＡを消化した。
【０１０９】
（５）完全長ｃＤＮＡの採取
ストレプトアビジンをコートしたマグネティックビーズにｃＤＮＡが非特異的吸着するのを防止するため、１００μｇの酵母ｔＲＮＡ（ＤＮａｓｅＩ処理したもの）を５ｍｇ（５００μｌ）のマグネティックビーズ（ｍａｇｎｅｔｉｃ　ｐｏｒｏｕｓ　ｇｌａｓｓ（ＭＰＧ）ｐａｒｔｉｃｌｅｓ　ｃｏａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（ＣＰＧ，ＮＪ））に加え、１時間氷上に放置した後、５０ｍＭＥＤＴＡ、２ＭＮａＣｌの溶液にて洗った。
【０１１０】
上記ビーズを５０ｍＭＥＤＴＡ、２ＭＮａＣｌの溶液５００μｌ中に懸濁し、上記（４）で取得したＲＮａｓｅＩ処理されたｃＤＮＡを加えた。室温にて３０分間撹拌することで、マグネティックビーズと完全長ｃＤＮＡを結合させた。
【０１１１】
完全長ｃＤＮＡを捕獲したビーズを５０ｍＭＥＤＴＡ、２ＭＮａＣｌの溶液で４回、０．４％ＳＤＳ、５０μｇ／μｌ酵母ｔＲＮＡで１回、１０ｍＭＮａＣｌ、０．２ｍＭＥＤＴＡ、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２０％グリセロールで１回、５０μｇ／μｌ酵母ｔＲＮＡ水溶液で１回、ＲＮａｓｅＨバッファー（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭＭｇＣｌ２、２０ｍＭＫＣｌ、０．１ｍＭＥＤＴＡ、０．１ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）で１回洗浄した後、ＲＮａｓｅＨ用バッファー１００μｌに懸濁し、ＲＮａｓｅＨ３ｕｎｉｔを加え、３７℃で３０分間加温した。その後、１０％ＳＤＳ１μｌ、０．５ＭＥＤＴＡ２μｌを加えて、１０分間、６５℃に曝し、その上清を回収した。
【０１１２】
回収した上清（１本鎖完全長ｃＤＮＡを含む）はフェノール／クロロホルムで抽出し、スピードバッグにて液量を１００μｌ以下に減じてからＧ２５／Ｇ１００　Ｓｅｐｈａｄｅｘクロマトグラフィーに付した。ＲＩ活性を持った分画はシリコン処理したマイクロチューブに収集するとともに、グリコーゲン２μｇを加え、エタノール沈澱にて得られた沈澱物を３０μｌの超純水に溶解した。
【０１１３】
（６）１本鎖ｃＤＮＡへのオリゴｄＧ付加
回収した１本鎖ｃＤＮＡ３０μｌを、最終容量５０μｌの反応液中で、２００ｍＭカコジル酸ナトリウム（ｐＨ６．９）、１ｍＭＭｇＣｌ２、１ｍＭＣｏＣｌ２、１ｍＭ２−メルカプトエタノール、１００μＭｄＧＴＰの条件のもと、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（宝酒造社製）３２ｕｎｉｔを用いて３７℃で３０分間のオリゴｄＧ付加反応に付した。反応終了時にＥＤＴＡを５０ｍＭとなるように加え、一連のフェノール／クロロホルムによる抽出、エタノール沈澱を経て、３１μｌの超純水に溶解した。
【０１１４】
（７）第２鎖ｃＤＮＡ合成
第１鎖ｃＤＮＡを鋳型にした第２鎖ｃＤＮＡの合成は以下のように行った。最終容量６０μｌの反応系で、第２鎖低バッファー（２００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．７５）、１００ｍＭＫＣｌ、１００ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、２０ｍＭＭｇＳＯ４、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１ｍｇ／μｌＢＳＡ）３μｌ、第２鎖高バッファー（２００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．２）、６００ｍＭＫＣｌ、２０ｍＭＭｇＣｌ２）３μｌ、ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ各々０．２５ｍＭ、β−ＮＡＤＨ６μｌ、オリゴｄＧ付加された第１鎖ｃＤＮＡ３１μｌ、第２鎖プライマー−アダプター６００ｎｇを加え、Ｅｘ　ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ　Ｅｘ　Ｔａｑ；宝酒造社製）１５ｕｎｉｔ、耐熱性ＤＮＡリガーゼ（Ａｍｐｌｉｇａｓｅ；Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ社製）１５０ｕｎｉｔ、耐熱性ＲＮａｓｅＨ（Ｈｙｂｒｉｄａｓｅ；Ｅｐｉｃｅｎｔｅｒｅ社製）３ｕｎｉｔによって第２鎖ｃＤＮＡを合成した。
【０１１５】
尚、第２鎖プライマー−アダプターとしては、次に示す配列番号１０の２ｎｄ−Ｘプライマーを用いた。
【０１１６】
ＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＴＴＣＴＣＧＡＧＴＴＡＡＴＴＡＡＡＴＴＡＡＴＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣ　（配列番号１０）
０．５ＭＥＤＴＡを１μｌ加えることで反応を停止させ、さらにタンパク質成分を分解するために、１０％ＳＤＳ１μｌ、プロテイナーゼ（Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）Ｋ１０μｇの存在下に４５℃で１５分間加熱し、最終的にフェノール／クロロホルムによる抽出、エタノール沈澱にて精製した２本鎖完全長ｃＤＮＡを得た。
【０１１７】
（８）ライブラリーの調製
ＭｏｂｉＴｅｃ社製のλＰＳベクターをｃＤＮＡ用に改変してλＰＳ（ＲＩＫＥＮ）ベクター：λ−ＦＬＣ−１ベクターを作製し、これにｃＤＮＡを挿入してｃＤＮＡライブラリーを調製した（特開２０００−３２５０８０号公報参照）。
【０１１８】
次に、本発明に係る前記各遺伝子およびタンパク質のそれぞれについて、その単離方法および物性等を調べた結果を説明する。
【０１１９】
＜３３１４５遺伝子および３３１４５タンパク質＞
〔実施例２：３３１４５遺伝子の選別〕
上記作製方法により得られたマウスａｄｕｌｔ　ｄｉｅｎｃｅｐｈａｌｏｎ由来ｃＤＮＡライブラリーに含まれるｃＤＮＡの塩基配列を決定した。この中から分泌シグナル配列と予想される配列を含むｃＤＮＡとして、３３１４５遺伝子を選択した。
【０１２０】
具体的には、ｃＤＮＡライブラリーの各クラスタからひとつの代表クローンを選択した。代表クローンはＱ−ｂｏｔ（ＧＥＮＥＴＩＸ　ＬＩＭＩＴＥＤ製）で選択し、３８４穴プレートにアレイ化した。このとき、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は３０℃で１８〜２４時間、５０μｌのＬＢ培地で培養した。このとき、ＬＢ培地には、１００ｍｇ／ｍｌのアンピシリン及び５０ｍｇ／ｍｌのカナマイシンを添加した。
【０１２１】
培養した各クローンを、さらに１００ｍｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１．３ｍｌのＨＴ液中で培養し、遠心分離により大腸菌を回収した後、ＱＩＡｐｒｅｐ　９６　Ｔｕｒｐｏ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてプラスミドＤＮＡを回収、精製した。取得されたプラスミド中に挿入されているｃＤＮＡの鎖長を調べるために、上記で取得したプラスミドＤＮＡの１／３０を制限酵素ＰｖｕＩＩで消化し、１％のアガロースゲル電気泳動を行った。
【０１２２】
得られたプラスミド中に挿入された完全長ｃＤＮＡの全長の塩基配列解析には、３種類のシークエンサを用いた。また、プラスミドは挿入配列の長さが２．５ｋｂより短いものと長いものの２つのカテゴリに分けた。このうち２．５ｋｂより短い挿入配列を有するクローンについては両端から塩基配列を解析した。
【０１２３】
このとき、次に示すセンス鎖のプライマー（配列番号１１）と、アンチセンス鎖のプライマー（配列番号１２）を用いて、Ｔｈｅｒｍｏｓｅｑｕｅｎａｓｅ　Ｐｒｉｍｅｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）で反応させ、Ｌｉｃｏｒ　ＤＮＡ４２００（ｌｏｎｇ　ｒｅａｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ）を用いて解析した。
【０１２４】
ＣＡＣＧＡＣＧＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣ（センス鎖・配列番号１１）
ＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧ（アンチセンス鎖・配列番号１２）
上記塩基配列解析により解析ができなかったギャップは、プライマウォーキング法により決定した。その際、ＡＢＩ　Ｐｒｉｓｍ　３７７及び／又はＡＢＩ　Ｐｒｉｓｍ　３７００（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｉｎｃ．製）、ＢｉｇＤｙｅ　ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　ｋｉｔ、及びＣｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ＦＳ　ｒｅａｄｅｙ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｉｎｃ．製）を用いた。
【０１２５】
また、挿入されているｃＤＮＡが２．５ｋｂより長いクローンの配列決定は、ショットガン法によって実施した。このとき、Ｓｈｉｍａｄｚｕ　ＲＩＳＡ　３８４、及びＤＹＥｎａｍｉｃ　ＥＴ　ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　ｃｙｃｌｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用いた。ショットガンライブラリを作製するために、４８の独立な代表クローンからＰＣＲで増殖した４８のＤＮＡフラグメントを用いた。増幅されたＤＮＡ断片の末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼによって平滑化した。
【０１２６】
上記ＤＮＡ断片をｐＵＣ１８ベクターへ挿入して組み換えベクターを作製し、この組み換えベクターを用いて、大腸菌ＤＨ１０Ｂを形質転換した。この大腸菌から、上記代表クローンのアレイ化と同様にしてプラスミドを調製した。
【０１２７】
各代表クローンについては、両末端からの塩基配列解析によって塩基配列を決定し、該塩基配列をコンピューター上で連結した後、Ｄｏｕｂｌｅ　Ｓｔｒｏｋｅ　Ｓｈｅａｒｉｎｇ　Ｄｅｖｉｃｅ（Ｆｉｏｒｅ　Ｉｎｃ．製）によるｓｈｅａｒｉｎｇを行った。ショットガン法による塩基配列決定は、１２〜１５クローンの重複をもって行った。この塩基配列決定により配列が決定できなかったギャップは、上記と同様にプライマウォーキングによって決定した。
【０１２８】
その結果、配列番号１に示すように、上記３３１４５遺伝子のｃＤＮＡは４９５個のアミノ酸をコードしていると考えられた。また、上記３３１４５タンパク質は、図１に示すように、１つのＳＣＰドメインと、２つのＬＣＣＬドメインとを有しており、１つのＮ型糖鎖結合部位（ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　Ｎ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ　ｓｉｔｅ）を含んでいた。また、その相同性を比較すると、ヒトＣｏｃｏａＣｒｉｓｐに約７７％の相同性を有しており、さらに、分子中央部分のアミノ酸配列は、ラットの機能未知のタンパク質：ＬＡＴＥ　ＧＥＳＴＡＴＩＯＮ　ＬＵＮＧ　ＰＲＯＴＥＩＮ（１８８アミノ酸）に約９０％の相同性を有していた。加えて、ｐｒｏｔｅａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　１５　ｐｒｅｐｒｏｐｒｏｔｅｉｎ；　２５　ｋＤａ　ｔｒｙｐｓｉｎ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、ＧＬＩＯＭＡ　ＰＡＴＨＯＧＥＮＥＳＩＳ−ＲＥＬＡＴＥＤ　ＰＲＯＴＥＩＮ　（ＲＴＶＰ−１　ＰＲＯＴＥＩＮ）と相同性を有していた。
【０１２９】
〔実施例３：３３１４５タンパク質発現用のプラスミドの作製〕
上記３３１４５タンパク質を発現させるために、次のようにして作製したプラスミドをベクターとして用いた。
【０１３０】
（１）ｐＣＩｋａｎａの作製
ｐＥＧＦＰ−Ｎ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）をＮｄｅＩサイト及びＮｏｔＩサイトにて切断し、ネオマイシン／カナマイシンを含む断片を精製した。また、ｐＣＩｎｅｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）をＮｄｅＩサイト及びＮｏｔＩサイトにて切断し、イントロンを含む断片を精製した。このイントロンを含む断片を、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１のネオマイシン／カナマイシンを含む断片のＮｄｅＩサイトとＮｏｔＩサイトとの間に挿入し、プラスミドｐＣＩｋａｎａを得た。
【０１３１】
（２）ｐＣＩｋａｎａ−ｈｒＧＦＰ２ｘＭｙｃの作製
ｈｒＧＦＰｃＤＮＡを増幅するために、ｐＩＲＥＳ−ｈｒＧＦＰ−２ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を鋳型とし、配列番号１３（フォワードプライマー）及び配列番号１４（リバースプライマー）に示すプライマーを用いてＰＣＲを行った。
【０１３２】
配列番号１３にて表すプライマーは、ｈｒＧＦＰｃＤＮＡの翻訳開始コドンＡＴＧから１コドン分３’側にあるＧＴＧ配列を含み、さらに、図６に示す、ｃＤＮＡをクローニングするためのマルチクローニングサイトを５’側に配置したものである。また、配列番号１４にて表すプライマーは、ｈｒＧＦＰｃＤＮＡの、翻訳停止コドンから１コドン分５’側にあるＧＴＧ配列を含んだ１９の塩基、１０アミノ酸のｍｙｃ　ｔａｇを２つタンデムにコードする配列、及び、上記プラスミドｐＣＩｋａｎａに組み込むためのＰｓｐＯＭＩサイトをタンデムに配したものである。
【０１３３】
５’−ＡＡＡＡＧＧＡＴＣＣＣＴＧＡＡＴＴＣＧＴＣＧＡＣＡＧＡＴＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＣＧＡＡＧＴＧＡＧＣＡＡＧＣＡＧＡＴＣＣＴＧＡＡＧＡＡＣ−３’　（配列番号１３）
５’−ＡＡＡＡＴＴＣＧＡＡ　ＣＡＧＡＴＣＣＴＣＴ　ＴＣＴＧＡＧＡＴＧＡ　ＧＴＴＴＴＴＧＴＴＣ　ＡＣＧＣＧＴＣＴＴＧ　ＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣＡＴＧＣＣＧ−３’　（配列番号１４）
上記のプライマーを用いたＰＣＲは、Ｅｘｐａｎｄ　ｈｉｇｈ−ｆｉｄｅｌｉｔｙ　ＰＣＲ　ｓｙｓｔｅｍ（ロッシュ社製）を用い、そのプロトコールに従って行った。このＰＣＲにより増幅断片をｐＣＲ　２．１−ＴＯＰＯ（ｉｎｖｉｔｏｇｅｎ社製）に挿入し、大腸菌（Ｏｎｅ　Ｓｈｏｔ　ＴＯＰ１０　Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ　ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　Ｅ．ｃｏｌｉ，ｉｎｖｉｔｏｇｅｎ社製）の形質転換を行った。形質転換した大腸菌から、増幅断片が挿入されたｐＣＲ　２．１−ＴＯＰＯを抽出し、ＥｃｏＲＩサイト及びＰｓｐＯＭＩサイトにて切断して、ｈｒＧＦＰと２つのＭｙｃタグとがつながったｃＤＮＡを含むＤＮＡ断片を精製した。この精製ＤＮＡ断片を、上記（１）にて得たプラスミドｐＣＩｋａｎａのＥｃｏＲＩサイトとＮｏｔＩサイトとの間に挿入し、プラスミドｐＣＩｋａｎａ−ｈｒＧＦＰ２ｘＭｙｃを得た。
【０１３４】
（３）ｐＣＩｋａｎａＥＧＦＰ３ｘＭｙｃの作製
ＥＧＦＰｃＤＮＡを増幅するために、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１を鋳型として、配列番号１５（フォワードプライマー）及び配列番号１６（リバースプライマー）に示すプライマーを用いてＰＣＲを行った。
【０１３５】
配列番号１５に示すプライマーは、ＥＧＦＰｃＤＮＡの、翻訳開始コドンＡＴＧから１コドン分３’側にあるＧＴＧ配列を含み、上記（２）にて得たプラスミドｐＣＩｋａｎａ−ｈｒＧＦＰ２ｘＭｙｃに組込むためのＢｓｔＢＩサイトを５’側に配置したものである。また、配列番号１６に示すプライマーは、ＥＧＦＰｃＤＮＡの、翻訳停止コドンから１コドン分５’側にあるＣＴＧ配列を含み、さらに、１０アミノ酸のｍｙｃ　ｔａｇをコードする配列、及び、上記（２）にて得たｐＣＩｋａｎａ−ｈｒＧＦＰ２ｘＭｙｃに組み込むためのＢｓｔＢＩサイトをタンデムに配したものである。
【０１３６】
５’−ＡＡＡＡＴＴＣＧＡＡＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧＡＧＣＴＧ−３’　（配列番号１５）
５’−ＡＡＡＡＴＴＣＧＡＡＣＡＧＡＴＣＣＴＣＴＴＣＴＧＡＧＡＴＧＡＧＴＴＴＴＴＧＴＴＣＡＣＧＣＧＴＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣＡＴＧＣＣＧ−３’　（配列番号１６）
上記プライマーを用いたＰＣＲは、Ｅｘｐａｎｄ　ｈｉｇｈ−ｆｉｄｅｌｉｔｙ　ＰＣＲ　ｓｙｓｔｅｍ（ロッシュ社製）を用い、そのプロトコールに従って行った。このＰＣＲによって得られた増幅断片をｐＣＲ　２．１−ＴＯＰＯ（ｉｎｖｉｔｏｇｅｎ社製）に挿入し、大腸菌（Ｏｎｅ　Ｓｈｏｔ　ＴＯＰ１０　Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ　ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　Ｅ．ｃｏｌｉ，ｉｎｖｉｔｏｇｅｎ社製）の形質転換を行った。形質転換した大腸菌から、ＥＧＦＰｃＤＮＡを含むＤＮＡ断片を精製した。この断片を、上記ｐＣＩｋａｎａ−ｈｒＧＦＰ２ｘＭｙｃの２つのＢｓｔＢＩサイト間に挿入し、プラスミドｐＣＩｋａｎａＥＧＦＰ３ｘＭｙｃを作製した。
【０１３７】
上記プラスミドｐＣＩｋａｎａＥＧＦＰ３ｘＭｙｃは、図７に示すように、５１２２塩基対からなるプラスミドで、ｐＵＣｏｒｉ、ＳＶ４０　ｐｒｏｍｏｔｅｒ、Ｋａｎｒ／Ｎｅｏｒ、ＨＳＴＫｐｏｌｙＡ、ＣＭＶ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ、ｉｎｔｒｏｎ、Ｍｕｌｔｉｃｌｏｎｉｎｇ　ｓｉｔｅ、ＥＧＦＰ、３ｘＭｙｃ　ｔａｇ、ＳＶ４０ｐｏｌｙＡを有している。上記ｐＵＣｏｒｉは、プラスミドを複製させるために必要な配列である。上記Ｋａｎｒ／Ｎｅｏｒは、カナマイシン／ネオマイシン耐性遺伝子である。上記ＳＶ４０　ｐｒｏｍｏｔｅｒは、カナマイシン／ネオマイシン耐性遺伝子を発現させるためのプロモーター配列である。
【０１３８】
また、図６に示すマルチクローニングサイトは、制限酵素サイトを複数有した配列であり、発現させたい遺伝子やｃＤＮＡ等を挿入するためのものである。マルチクローニングサイトに配された制限酵素サイトは、５’側から順に、ＮｈｅＩ、ＸｈｏＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳａｌＩ、ＢｇｌＩＩ、ＮｏｔＩ、ＢｓｔＢＩである。
【０１３９】
上記ＣＭＶ　ｐｒｏｍｏｔｅｒは、マルチクローニングサイトに挿入された遺伝子やｃＤＮＡを発現させるためのプロモーター配列である。上記ＥＧＦＰは、蛍光標識タンパク質ＧＦＰをコードする遺伝子である。３ｘＭｙｃ　ｔａｇは、標識タンパク質であるＭｙｃタグをコードする塩基配列が３つ連続して設けられているものであり、この３ｘＭｙｃ　ｔａｇの下流領域にＳＴＯＰコドン（Ｓｔｏｐ　ｃｏｄｏｎ）が設けられている。あしたがって、マルチクローニングサイトに挿入された遺伝子にコードされているタンパク質が発現されると、このタンパク質のＣ末端下流域にＥＧＦＰと３ｘＭｙｃタグとが融合されることになる。
【０１４０】
〔実施例４：３３１４５タンパク質の発現〕
上記３３１４５遺伝子のｃＤＮＡを、配列番号１７（フォワードプライマー）及び配列番号１８（リバースプライマー）に示すプライマーを用いて、ＰＣＲを行った。上記配列番号１７及び配列番号１８に示すプライマーは、上記ｐＣＩｋａｎａ−ｈｒＧＦＰ２ｘＭｙｃに、細胞外マトリクス遺伝子のｃＤＮＡを組み込んでベクターとして用いるための制限酵素部位を有している。
【０１４１】
すなわち、配列番号１７に示すプライマーは、細胞外マトリクス遺伝子のｃＤＮＡ（配列番号１）にて、翻訳開始コドンＡＴＧを含む１６５番目〜１８８番目の塩基配列と、上記ｐＣＩｋａｎａ−ｈｒＧＦＰ２ｘＭｙｃに組み込むためのＥｃｏＲＩサイトとを有している。また、配列番号１８に示すプライマーは、配列番号１で表されるｃＤＮＡの１６３６番目〜１６５５番目の塩基配列、及び、上記ｐＣＩｋａｎａ−ｈｒＧＦＰ２ｘＭｙｃに組み込むためのＮｏｔＩサイトを有している。
【０１４２】
５’−ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＧＡＡＧＣＣＡＴＧＡＧＣＴＧＴＣＴＴＣＴＧＡＡＣ−３’　（配列番号１７）
５’−ＴＴＴＴＣＣＴＴＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣＴＧＣＣＴＧＡＣＧＧＣＧＡＡＧＡＴＣＣ−３’　（配列番号１８）
上記プライマーを用いたＰＣＲによって増幅されたｃＤＮＡを、ＥｃｏＲＩサイト及びＮｏｔＩサイトにて制限酵素処理を行い、上記ｐＣＩｋａｎａＥＧＦＰ３ｘＭｙｃのＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩサイト間、すなわちＥＦＧＰ−ｍｙｃタグとの融合タンパク質として発現するように挿入し、３３１４５タンパク質発現プラスミドを作製した。次いで、この発現プラスミドを、大腸菌（Ｏｎｅ　Ｓｈｏｔ　ＴＯＰ１０　Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ　ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　Ｅ．ｃｏｌｉ，ｉｎｖｉｔｏｇｅｎ社製）に導入して形質転換を行い、大腸菌を増殖させることにより、上記ベクターを精製した。
【０１４３】
続いて、遺伝子導入試薬ＦｕＧｅｎｅ６（ロッシュ社製）を用いて、ヒト２９３Ｔ細胞に、精製した上記発現プラスミドを導入して培養を行った。培養したヒト２９３Ｔ細胞の培養上清及び細胞破砕物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（５〜２０％濃度勾配ポリアクリルアミドゲル）にて電気泳動を行い、ナイロンメンブレンに転写した。次いで、抗ＧＦＰモノクローナル抗体Ｂ−２（サンタクルーズ社）によりウェスタンブロットを行い、細胞外マトリクス遺伝子のｃＤＮＡとＥＧＦＰ−Ｍｙｃタグとの融合タンパク質（以下、融合タンパク質と記載する）を検出した。その結果を図８（ａ）・（ｂ）に示す。
【０１４４】
図８（ａ）・（ｂ）に示すように、培養上清中（図中、ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ）では、約７５ｋＤａの産物、及び約５０ｋＤａの産物が検出された。約７５ｋＤａの産物は、予想された融合タンパク質のサイズとほぼ同じであり、分泌タンパク質であると考えられる。なお、５０ｋＤａの産物は分解を受けたと推定される。
【０１４５】
一方、細胞破砕物（図中、Ｃｅｌｌ　ｌｙｓａｔｅ）では、予想された融合タンパク質のサイズとほぼ同じの約７５ｋＤａの産物、及び、約１５０ｋＤａの産物が認められた。このように、細胞破砕物にて５０ｋＤａの産物がほとんど見られず、培養上清中にて５０ｋＤａの産物が見られたことから、細胞外分泌タンパク質は細胞外で分解を受けていることがわかる。
【０１４６】
また、上記ベクターを導入したヒト２９３Ｔ細胞を２％ホルマリンで固定し、抗ＧＦＰモノクローナル抗体Ｂ−２（サンタクルーズ社製）と抗ｍｙｃモノクローナル抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）との混合物、及びローダミン標識抗マウスイムノグロブリン抗体により免疫染色を行った。その結果を図９に示す。
【０１４７】
図９に示すように、融合タンパク質は細胞外側基底面の細胞突起周辺に、ドット状または線維状に局在していることが認められた。このことから、上記細胞外マトリクス遺伝子の発現によって、新規な分泌タンパク質が得られたことがわかる。
【０１４８】
〔実施例５：３３１４５タンパク質のマウス組織での発現〕
上記３３１４５タンパク質の、マウス胚における発生及びマウス組織での発現パターンをＲＴ−ＰＣＲによって調べた。
【０１４９】
具体的には、まず、マウス全ＲＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社，Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ，　ＣＡ，　ＵＳＡ）から、当該メーカーのプロトコールに従って、オリゴｄＴプライマーおよびｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ（ＲｎａｓｅＨ−）　（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてｃＤＮＡを合成した。マウスＲＮＡとしては、１；脳、２；骨髄、３；７日目胎児、４；１１日目胎児、５；１５日目胎児、６；１７日目胎児、７；眼、８；心臓、９；腎臓、１０；肝臓、１１；肺、１２；リンパ節、１３；前立腺、１４；唾液腺、１５；平滑筋、１６；脊髄、１７；脾臓、１８；胃、１９；精巣、２０；胸腺、２１；子宮に由来するもの、の計２１種類を用意した。
【０１５０】
上記にて合成したｃＤＮＡを鋳型とし、配列番号１に示す２１６５番〜２５８１番の塩基配列を、ＲＴ−ＰＣＲを用いて増幅しｃＤＮＡの定量を行った。ＲＴ−ＰＣＲは、配列番号１９（５’末端側）及び配列番号２０（３’末端側）に示すプライマーを用いて行った。
【０１５１】
５’−ｇｃｃｔｇｇｔｇｇａｇｔｔｔｃｇａａａｃｃｔｇｇ−３’　（配列番号１９）
５’−ｃａｇｔｔｃｃｃａｔａｇｇａｇｔｔｃｃｔｃｃｔｃ−３’　（配列番号２０）
ＳＩＧＭＡ社（Ｓａｉｎｔ　Ｌｏｕｉｓ，　Ｍｏ，　ＵＳＡ）製ＲｅａｄｙＭｉｘＴＭ　ＲＥＤＴａｑＴＭ　ＰＣＲ　ＲＥＡＣＴＩＯＮ　ＭＩＸに、上記ｃＤＮＡと上記プライマーとを混合して、ＲＴ−ＰＣＲを行った。なお、ＲＴ−ＰＣＲの反応条件は、９５℃にて３分反応させた後、９５℃にて２０秒、６５℃にて３０秒、７０℃にて１分を１サイクルとして３０サイクル行い、その後、７２℃にて１０分反応させた。次いで、１．５％アガロースゲルを用いて電気泳動により分離した。
【０１５２】
その結果を図１０に示す。図１０に示すように、骨髄、胃、目、心臓、子宮、肺や胎児等でＰＣＲ増幅産物のバンドを確認した。このことから骨髄、胃、目、心臓、子宮、肺や胎児等でｍＲＮＡが多く発現していることが分かった。
【０１５３】
＜４０４２０遺伝子および４０４２０タンパク質＞
〔実施例６：４０２４０遺伝子の選別〕
前記実施例１の作製方法により得られたマウス０　ｄａｙ　ｎｅｏｎａｔｅ　ｈｅａｄ由来ｃＤＮＡライブラリーに含まれるｃＤＮＡの塩基配列を、前記実施例２と同様にして決定した。この中から分泌シグナル配列と予想される配列を含むｃＤＮＡとして、４０４２０遺伝子を選択した。
【０１５４】
その結果、配列番号３に示すように、上記４０４２０遺伝子のｃＤＮＡは５６８個のアミノ酸をコードしていると考えられた。また、上記４０２４０タンパク質は、図２に示すように、分泌シグナル配列に加えて、２つのＮ型糖鎖結合部位（ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　Ｎ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ　ｓｉｔｅ）を有しており、膜貫通領域は認められなかった。
【０１５５】
さらに、その相同性を比較すると、ヒトＦＬＪ２３１９１遺伝子（ｃＤＮＡ）と８２％の相同性を示した。ＦＬＪ２３１９１遺伝子はアミノ末端をコードする領域が欠損していると考えられる。配列にはフレームシフトが多く見られ、ＦＬＪ２３１９１遺伝子の予測アミノ酸配列は４０２４０タンパク質のアミノ酸配列と相同性があるが、その予測サイズは小さい。フレームをずらせばＣ末端側には大きな相同領域が認められた。また、４０２４０遺伝子の塩基配列の一部は、すでに公開されているマウス由来のｃＤＮＡのＥＳＴであるＢＢ６１３７６５遺伝子及びＡＶ２４３６２１遺伝子と一致しており、同じくマウス由来のｃＤＮＡのＥＳＴであるＡＫ０１７７５９遺伝子、及びＡＫ０２０９４２遺伝子の塩基配列と相同性を示した。
【０１５６】
〔実施例７：４０２４０タンパク質の発現〕
４０２４０遺伝子（ｃＤＮＡ）を、以下に示す配列番号２１（フォワードプライマー）および配列番号２２のプライマー（リバースプライマー）を用いてＰＣＲにより増幅した。フォワードプライマーは、翻訳開始コドンＡＴＧを含む、配列番号３に示す４０２４０遺伝子の４９４〜５１１番目の塩基配列、タンパク質発現効率を亢進するためのＫｏｚａｋ配列、発現ベクター組込むためにＥｃｏＲＩサイトをその５’側に配したプライマーであり、リバースプライマーは、配列番号３に示す４０２４０遺伝子の２１６９〜２１９７番目の塩基配列を含み、発現ベクター組込むためにＮｏｔＩサイトをその３’側に配したプライマーである。
【０１５７】
５’−ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＧｔａａｇｇＡＴＧＧＡＧＣＴＧＴＴＣＴＡＣＴＧＧ−３’　（配列番号２１）
５’−ＴＴＴＴＣＣＴＴＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＣＡＧＡＣＣＴＴＣＣＴＴＧＴＴＴＴＣＡＣＡＡＴＴＴＴＡＣ−３’　（配列番号２２）
上記プライマーを用いたＰＣＲによって増幅されたｃＤＮＡを、前記実施例４と同様にして、上記ｐＣＩｋａｎａＥＧＦＰ３ｘＭｙｃ（実施例３で作製）に挿入して、発現プラスミドを作製した。次いで、この発現プラスミドを、前記実施例４と同様にして精製し、ヒト２９３Ｔ細胞に導入して培養を行った。培養したヒト２９３Ｔ細胞の培養上清及び細胞破砕物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて電気泳動を行い、ナイロンメンブレンに転写した。次いで、抗ＧＦＰモノクローナル抗体Ｂ−２（サンタクルーズ社）によりウェスタンブロットを行い、細胞外マトリクス遺伝子のｃＤＮＡとＥＧＦＰ−Ｍｙｃタグとの融合タンパク質（以下、融合タンパク質と記載する）を検出した。その結果を図１１（ａ）・（ｂ）に示す。
【０１５８】
図１１（ａ）・（ｂ）に示すように、細胞破砕物で予測サイズに近い７０ｋＤａの産物が検出されているが、大部分は１５０ｋＤａから更に大きい産物が検出されている。また、培養上清中に検出されるＰＣＲ産物はわずかである。
【０１５９】
〔実施例８：４０２４０タンパク質の局在〕
発現プラスミドを導入したヒト２９３Ｔ細胞を２％ホルマリンで固定し、抗ＧＦＰモノクローナル抗体Ｂ−２（サンタクルーズ社製）と抗ｍｙｃモノクローナル抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）との混合物、およびローダミン標識抗マウスイムノグロブリン抗体により免疫染色を行い、４０２４０−ＥＦＧＰ−Ｍｙｃ融合タンパク質を検出した。その結果、図１２（ａ）・（ｂ）に示すように、４０２４０−ＥＧＦＰ−Ｍｙｃ融合タンパク質は基底面において線維状に、また、細胞側部においては細胞間に存在していることが認められた。これにより、４０２４０タンパク質は新規細胞外マトリックス因子であることが見いだされた。
【０１６０】
〔実施例９：４０２４０タンパク質マウス組織での発現〕
前記実施例５と同様にして、上記４０２４０タンパク質の、マウス胚における発生及びマウス組織での発現パターンをＲＴ−ＰＣＲによって調べた。なお、ＲＴ−ＰＣＲ用のプライマーとしては、以下に示す配列番号２３及び配列番号２４のプライマーを用いた。配列番号２３のプライマーは、配列番号３に示すｃＤＮＡの５３５〜５５７番目までの塩基配列を含み、配列番号２４に示すプライマーは、配列番号３に示されるｃＤＮＡの７８４〜８０５番目までの塩基配列の相補鎖である。
【０１６１】
５’−ａｃｔｃａｃｔｔｃａａｇｇａｃｃｃａｇａａｇｃ−３’　（配列番号２３）
５’−ｔｇａｔｃｃａｔｃｔｇｃａｃｔｇｇａｃｃｃｃ−３’　（配列番号２４）
また、ＲＴ−ＰＣＲの反応条件は、９４℃にて５分反応させた後、９４℃にて３０秒、６６℃にて４０秒、７２℃にて４０秒を１サイクルとして３０サイクル行った。
【０１６２】
得られたｃＤＮＡサンプルを１．５％アガロースゲルにて電気泳動した。その結果、図１３に示すように、脳、骨髄、１１日目胎児、１５日目胎児、１７日目胎児、眼、心臓、肺、リンパ節、脊髄、胃、子宮で転写産物が認められた。他の臓器では検出感度以下であった。
【０１６３】
〔実施例１０：抗４０２４０抗体の作製〕
（１）抗原作製
４０２４０タンパク質のアミノ酸配列の中から２ケ所を選んでＧＳＴとの融合タンパク質として発現させ、免疫原とした。抗原として選択した２ケ所はアミノ酸配列の９３〜２１１番目（抗原１）と２９４〜３８０番目（抗原２）である。その領域をコードするｃＤＮＡの塩基配列をＰＣＲ反応で増幅し、ＧＳＴ融合タンパク質発現ベクターに組み込んで融合タンパク質の大腸菌大量合成系に供した。
【０１６４】
尚、ＰＣＲ反応に用いたプライマーは、以下に示す通りで、配列番号２９のプライマーが抗原１の５’側であり、配列番号３０のプライマーが抗原１の３’側であり、配列番号３１のプライマーが抗原２の５’側であり、配列番号３２のプライマーが抗原２の３’側である。
【０１６５】
５’−ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＣＡＧＧＡＧＣＴＧＣＡＴＧＡＧＧＧＧＴＣＣ　（配列番号２９）
５’−ＡＡＣＴＣＧＡＧＴＣＡＧＴＡＣＴＣＴＡＴＧＧＧＴＴＧＴＴＴＣ　（配列番号３０）
５’−ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＧＧＡＡＡＴＡＡＡＡＡＣＡＴＴＴＴＣＡＣＡ　（配列番号３１）
５’−ＡＡＣＴＣＧＡＧＴＣＡＡＧＡＡＴＧＡＡＴＡＡＡＧＡＡＣＧＴＧ　（配列番号３２）
実施例１で作製したマウスｃＤＮＡライブラリーから選択した４０２４０遺伝子のｃＤＮＡが入ったプラスミドを鋳型として、上記抗原１および２のプライマーを用いて次の条件でＰＣＲ反応を行い、目的のバンドを得た。
【０１６６】
ＰＣＲ反応は９４℃５分の後、９４℃１分、５０℃１分、７２℃１分を１サイクルとして２５サイクル行い、１．５％アガロース上電気泳動によって目的サイズのバンドを確認した。増幅したｃＤＮＡ０．５μｌとｐＧＥＭ−Ｔ　ｅａｓｙ　ｖｅｃｔｏｒ　０．５（ｌ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を混ぜてＬｉｇａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　Ｖｅｒ．２（宝酒造社製）でライゲーション反応を行い、引き続きＴＯＰ１０　Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　Ｃｅｌｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にトランスフォーメーションを行い、アンピシリンを含むＬＢ寒天培地上で３７℃一晩培養し複数のコロニーを得た。
【０１６７】
得られたコロニーからプラスミドを回収し、クローニングサイト両端にある制限酵素ＥｃｏＲＩで切断して目的のｃＤＮＡ断片を含むかどうか確認した。アガロース電気泳動によって目的サイズのバンドが出たクローンから抗原１、抗原２についてそれぞれ２クローンずつ選び、ＡＢＩ社製ＤＮＡ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ＫｉｔによってｃＤＮＡの全塩基配列を確認した。
【０１６８】
次に、ｃＤＮＡ領域を制限酵素ＥｃｏＲＩとＸｈｏＩで切断し、アガロース電気泳動後ｃＤＮＡ断片をＱＩＡＧＥＮ社製Ｑｉａｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔで抽出し、同様にＥｃｏＲＩ、ＸｈｏＩで切断、抽出したｐＧＥＸ−４Ｔ−１　ｖｅｃｔｏｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）と混合して、宝酒造社製Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　Ｖｅｒ．２でライゲーション反応を行った。引き続きＪＭ１０９　Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　Ｃｅｌｌ（宝酒造社製）にトランスフォーメーションを行い、アンピシリンを含むＬＢ寒天培地上で３７℃一晩培養し複数のコロニーを得た。目的のｃＤＮＡ断片を含む大腸菌コロニーをクローニングサイト両端のプライマーでＰＣＲ反応をして選択した。
【０１６９】
尚、上記ＰＣＲ反応に用いたプライマー配列は、以下に示す通りで、配列番号３３のプライマーがｐＧＥＸ　５’プライマーであり、配列番号３４のプライマーがｐＧＥＸ　３’プライマーである。
【０１７０】
５’−ＧＧＧＣＴＧＧＣＡＡＧＣＣＡＣＧＴＴＴＧＧＴＧ　（配列番号３３）
５’−ＣＣＧＧＧＡＧＣＴＧＣＡＴＧＴＧＴＣＡＧＡＧＧ　（配列番号３４）
上記ＰＣＲ反応は、９４℃５分の後、９４℃３０秒、５８℃４０秒、７２℃３０秒を１サイクルとして３０サイクル行い、１．５％アガロース上電気泳動した。これによって目的サイズのバンドが出たクローンを抗原１、抗原２について１クローンずつ選び、抗原発現大腸菌クローンとした。
【０１７１】
（２）抗原の精製
上記ＧＳＴ融合抗原タンパク質を発現する大腸菌を大量培養し、その大腸菌破砕物からＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｃｏｌｕｍｎで目的のタンパク質を精製した。すなわち、一晩ＬＢ培地で増殖させた抗原発現大腸菌１ｍｌを７００ｍｌのＬＢ培地に移し、３７℃で５〜６時間振とう培養し、氷上で１５分置いた後、終濃度０．２ｍＭ　Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−（−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ（ＩＰＴＧ）を加え、さらに２０℃で６時間振とう培養した。大腸菌は遠心により回収し、−２０℃で保存した。融解した大腸菌を１０ｍｌのＬｙｓｉｓ　Ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１５ｍＭＥＤＴＡ、１５０ｍＭＮａＣｌ、２％　Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ，１００μｇ／ｍｌ　Ｌｙｓｏｚｙｍｅ、１ｍＭＤＴＴ、　ｐｒｏｔｅａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ）に懸濁し、超音波破砕によって得られた抽出液を遠心によって回収した。
【０１７２】
得られた抽出液はあらかじめＰＢＳ（−）で洗ったＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｃｏｌｕｍｎに２回通し、目的のタンパク質をカラムに結合させた。カラムをさらにＰＢＳ（−）で洗った後、結合タンパク質を２０ｍＭ　Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅを０．５ｍｌずつ添加して回収していき、目的のタンパク質を含むｆｒａｃｔｉｏｎをＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動、クマシー染色で確認した。十分量の目的のタンパク質を含むｆｒａｃｔｉｏｎをまとめて、大量のＰＢＳ（−）溶液中で透析し抗原溶液とした。濃度はＣｏｏｍａｓｓｉｅ　Ｐｌｕｓ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｓｓａｙ　Ｒｅａｇｅｎｔ　Ｋｉｔ（ＰＩＥＲＶＥ社製）で測定した。
【０１７３】
（３）抗原の免疫
得られた２種類の抗原タンパク質を重量比で１：１に混ぜ、Ｊａｐａｎｅｓｅ　Ｗｈｉｔｅ　Ｒａｂｂｉｔに免役した。免疫は（株）医学生物学研究所に依頼し、最終的に８５ｍｌの全採血後抗血清を入手した。
【０１７４】
（４）抗体の精製
免疫に用いた抗原はＧＳＴ融合タンパク質であるため、ＧＳＴタンパク質に反応する抗体を除く目的で、まずＧＳＴカラムを作製した。１ｍｌのＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅに２ｍｇの精製ＧＳＴタンパク質を結合させ、４０ｍＭのＤｉｍｅｔｈｙｌ　Ｐｉｍｅｌｉｍｉｄａｔｅ（ＰＩＥＲＣＥ社）で室温１時間反応させ結合タンパク質を架橋した後、未反応ＧＳＴを除いてＧＳＴカラムとした。そこに抗血清０．５ｍｌを通しＧＳＴ反応抗体を除いてから、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ社）で精製した。さらに、大量のＰＢＳ（−）溶液中で透析し、抗４０２４０抗体とした。抗体濃度は２８０ｎｍの光学密度（ＯＤ）を測定して算出した。
【０１７５】
（５）マウス組織サンプルの調整
約１０週齢のＩＣＲマウス（オス２匹、メス２匹）をエーテル麻酔下、心臓から冷ＰＢＳ（−）で灌流して血液を除き、脳、眼球、舌、唾液腺、肺、心臓、脾臓、肝臓、腎臓、骨格筋、精巣、卵巣、胎盤を摘出した。各臓器の質重量あたり９倍容量のプロテアーゼ阻害剤を添加した０．２５Ｍショ糖２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で懸濁し、テフロンホモジナイザーで細胞を破砕した。遠心により不溶物を除き、組織サンプルとした。タンパク質濃度はＭｉｃｒｏ　ＢＣＡＴＭ　ＰｒｏｔｅｉｎＡｓｓａｙ　Ｒｅａｇｅｎｔ　Ｋｉｔ（ＰＩＥＲＣＥ社）を用いて定量した。
【０１７６】
（６）組織での発現パターン
各組織６．５μｇを還元条件下にて９５℃５分処理で変性させ、５〜２０％アクリルアミドゲル（ＡＴＴＯ社製）でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い分離後、精製抗体ウェスタンブロッティングを行った。精製抗体は３μｇ／ｍｌの濃度で反応させ、２次抗体および検出はＡｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ社のＥＣＬシステムを使用した。また、陽性対象として２９３Ｔ細胞に発現させたＧＦＰ融合全長４０２４０タンパク質を流した。
【０１７７】
ウェスタンブロッティングの結果、図１８に示すように、精製抗体はＧＦＰ融合全長４０２４０タンパク質を認識していた。組織サンプルでは、予想サイズである約７０ｋＤａのタンパク質と、これよりも約３０ｋＤａ大きい１００ｋＤａ付近のバンドを骨格筋と舌で検出した。予想サイズよりも大きいバンドが検出された。その原因として、目的のタンパク質が修飾を受けているか、もしくは本遺伝子産物より大きいアイソフォームの存在が推定される。ＲＴ−ＰＣＲにより発現が予測された心臓と比較して、骨格筋と舌でははるかに高レベルの４０２４０タンパク質の発現が認められたことから、４０２４０タンパク質は骨格筋および舌で主に発現していると考えられる。
【０１７８】
＜５１１４０遺伝子および５１１４０タンパク質＞
〔実施例１１：５１１４０遺伝子の選別〕
前記実施例１の作製方法により得られたマウス１３　ｄａｙｓ　ｅｍｂｒｙｏ　ｌｕｎｇ由来ｃＤＮＡライブラリーに含まれるｃＤＮＡの塩基配列を、前記実施例２と同様にして決定した。この中から分泌シグナル配列と予想される配列を含むｃＤＮＡとして、５１１４０遺伝子を選択した。
【０１７９】
その結果、配列番号５に示すように、上記５１１４０遺伝子のｃＤＮＡは２３７個のアミノ酸をコードしていると考えられた。また、上記５１１４０タンパク質は、図３に示すように、分泌シグナル配列に加えて、トロンボスポンディンタイプ１リピート（ＴＳＰ−１）ドメイン、Ｎ型糖鎖結合部位が認められ、さらに、ＰＡＣＥ４タンパク質と相同性のあるシステインリッチ領域を有していた。
【０１８０】
また、その相同性を比較すると、ヒトのトロンボスポンディンと約４７％の相同性を示し、上記トロンボスポンディンタイプ１リピート（ＴＳＰ−１）ドメインは、マウスのＲ−ｓｐｏｎｄｉｎとも相同性があった。
【０１８１】
〔実施例１２：５１１４０タンパク質の発現〕
５１１４０遺伝子（ｃＤＮＡ）を、以下に示す配列番号２５（フォワードプライマー）および配列番号２６のプライマー（リバースプライマー）を用いてＰＣＲにより増幅した。フォワードプライマーは、翻訳開始コドンＡＴＧを含む、配列番号５に示す５１１４０遺伝子の９９９〜１０２５番目の塩基配列、タンパク質発現効率を亢進するためのＫｏｚａｋ配列、発現ベクター組込むためにＥｃｏＲＩサイトをその５’側に配したプライマーであり、リバースプライマーは、配列番号５に示す５１１４０遺伝子の１６８３〜１７１１番目の塩基配列を含み、発現ベクター組込むためにＮｏｔＩサイトをその３’側に配したプライマーである。
【０１８２】
５’−ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＧＣＣＧＡＧＡＴＧＣＧＴＴＴＴＴＧＣＣＴＣＴＴＣＴＣＡＴＴＴＧ−３’　（配列番号２５）
５’−ＴＴＴＴＣＣＴＴＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＣＧＧＴＴＴＣＣＡＴＣＡＴＧＡＡＴＡＡＡＴＡＧＣＡＴＴＴＡＣ−３’　（配列番号２６）
上記プライマーを用いたＰＣＲによって増幅されたｃＤＮＡを、制限酵素ＥｃｏＲＩとＮｏｔＩとで処理し、プラスミドｐＥＧＦＰ−Ｎ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）のＥｃｏＲＩサイトとＰｓｐＯＭＩサイトとの間に挿入して、発現プラスミドを作製した。次いで、この発現プラスミドを、前記実施例４と同様にして精製し、ヒト２９３Ｔ細胞に導入して培養を行った。培養したヒト２９３Ｔ細胞の培養上清及び細胞破砕物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて電気泳動を行い、ナイロンメンブレンに転写した。次いで、抗ＧＦＰモノクローナル抗体Ｂ−２（サンタクルーズ社）によりウェスタンブロットを行い、細胞外マトリクス遺伝子のｃＤＮＡとＥＧＦＰ−Ｍｙｃタグとの融合タンパク質（以下、融合タンパク質と記載する）を検出した。その結果を図１４（ａ）・（ｂ）に示す。
【０１８３】
図１４（ｂ）に示すように、培養上清中に見いだされた融合タンパク質は、ごく少量であった。このため、上記発現プラスミドを導入したヒト２９３Ｔ細胞を、ヘパリン（Ｈｅｐａｒｉｎ）５μｇ／ｍｌ存在下で培養した後、同様にウェスタンブロッティングによる融合タンパク質の検出を行った。その結果、図１４（ａ）に示すように、へパリン非存在下で培養した場合に比べ、明らかに培養上清中の融合タンパク質の量が増加していた。
【０１８４】
このことから、５１１４０タンパク質は細胞外分泌タンパク質であることが示された。また、５１１４０タンパク質は、へパリン存在下で、培養上清に可溶性タンパク質としてより多く検出されたことから、細胞表面に存在するヘパラン硫酸鎖などに結合するタンパク質であることが予想された。即ち、５１１４０タンパク質は、ヒト２９３Ｔ細胞においては、細胞外表層に局在していると考えられる。
【０１８５】
尚、検出された産物は、予想サイズ６５ｋＤａよりも大きい、約１００ｋＤａであった。このため、５１１４０タンパク質は、糖鎖修飾を含む翻訳後修飾を受けていると考えられる。
【０１８６】
〔実施例１３：５１１４０タンパク質の局在〕
前記実施例８と同様にして、５１１４０タンパク質のヒト２９３Ｔ細胞内外での局在を調べた。その結果、図１５（ａ）・（ｂ）に示すように、融合タンパク質は細胞の突起や側部などに点状に細胞外に固相化されていることが認められた。したがって、５１１４０タンパク質は新規な細胞外マトリックス因子であることがわかった。
【０１８７】
＜３１４１８遺伝子および３１４１８タンパク質＞
〔実施例１４：新規細胞外マトリックス遺伝子の選別〕
前記実施例１の作製方法により得られたマウスマウスａｄｕｌｔ　ｖａｇｉｎａ由来ｃＤＮＡライブラリーに含まれるｃＤＮＡの塩基配列を、前記実施例２と同様にして決定した。この中から分泌シグナル配列と予想される配列を含むｃＤＮＡとして、３１４１８遺伝子を選択した。
【０１８８】
その結果、配列番号７に示すように、上記３１４１８遺伝子のｃＤＮＡは３４９個のアミノ酸をコードしていると考えられた。また、上記３１４１８タンパク質は、図４に示すように、分泌シグナル配列に加えて、分子内に４つのタンデム繰り返し配列が認められ、さらに、牛プリオンタンパク質と相同性がある配列、牛プリオンタンパク質のヘパリン結合ドメインと相同性がある配列を有していた。また、Ｎ型結合糖鎖部位は認められず、セリン−グリシン配列が複数認められた。
【０１８９】
また、その相同性を比較すると、サルＴａｓｔｅ　Ｂｕｄ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎと４０％の相同性を示した。さらに、図５にも示すように、３１４１８タンパク質は、牛プリオンタンパク質のヘパリン結合ドメインと相同性がある配列（２２１番目から２３０番目のアミノ酸残基）を有しており、牛プリオンタンパク質と２７％の相同性を示した。
【０１９０】
〔実施例１５：３１４１８タンパク質の発現〕
３１４１８遺伝子（ｃＤＮＡ）を、以下に示す配列番号２７（フォワードプライマー）および配列番号２８のプライマー（リバースプライマー）を用いてＰＣＲにより増幅した。フォワードプライマーは、翻訳開始コドンＡＴＧを含む、配列番号５に示す３１４１８遺伝子の６８〜８８番目の塩基配列、タンパク質発現効率を亢進するためのＫｏｚａｋ配列、発現ベクター組込むためにＥｃｏＲＩサイトをその５’側に配したプライマーであり、リバースプライマーは、配列番号７に示す３１４１８遺伝子の１１００〜１１１９番目の塩基配列を含み、発現ベクター組込むためにＮｏｔＩサイトをその３’側に配したプライマーである。
【０１９１】
５’−ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＧＧＣＡＡＧＡＴＧＣＡＧＡＧＣＣＡＣＧＣＡＧ−３’　（配列番号２７）
５’−ＴＴＴＴＣＣＴＴＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＣＧＧＧＧＧＴＧＡＴＣＣＣＡＧＡＡＧＡＧＣ−３’　（配列番号２８）
上記プライマーを用いたＰＣＲによって増幅されたｃＤＮＡを、前記実施例４と同様にして、上記ｐＣＩｋａｎａＥＧＦＰ３ｘＭｙｃ（実施例３で作製）に挿入して、発現プラスミドを作製した。次いで、この発現プラスミドを、前記実施例４と同様にして精製し、ヒト２９３Ｔ細胞に導入して培養を行った。培養したヒト２９３Ｔ細胞の培養上清及び細胞破砕物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて電気泳動を行い、ナイロンメンブレンに転写した。次いで、抗ＧＦＰモノクローナル抗体Ｂ−２（サンタクルーズ社）によりウェスタンブロットを行い、細胞外マトリクス遺伝子のｃＤＮＡとＥＧＦＰ−Ｍｙｃタグとの融合タンパク質（以下、融合タンパク質と記載する）を検出した。その結果を図１６に示す。
【０１９２】
図１６に示すように、融合タンパク質は培養上清（ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ）中に見いだされたことから、３１４１８タンパク質は分泌タンパク質であることがわかった。融合タンパク質の予想分子サイズである７５ｋＤａの位置に検出された融合タンパク質は少なく、１００ｋＤａ、１３０ｋＤａ、１６０ｋＤａ及び、より高分子の位置に、融合タンパク質はラダー状に検出された。図４に示す一次構造から、３１４１８タンパク質は糖鎖の修飾を受けると予測される。このため、３１４１８タンパク質に修飾された糖鎖によって、融合タンパク質の分子サイズが不均一となり、予測される分子量よりも高分子側に、ラダー状に検出されたものと考えられる。
【０１９３】
〔実施例１６：３１４１８タンパク質の局在〕
前記実施例８と同様にして、３１４１８タンパク質のヒト２９３Ｔ細胞内外での局在を調べた。その結果、図１７（ａ）・（ｂ）に示すように、融合タンパク質は、基底面（ｂｏｔｔｏｍ）においてドット状に検出された。また、融合タンパク質は、細胞側面（ｍｉｄｄｌｅ）において細胞外側の輪郭に沿って検出された。したがって、３１４１８タンパク質は新規な細胞外マトリックス因子であることがわかった。
【０１９４】
【発明の効果】
以上のように、本発明は新規な細胞外マトリックス因子に関するものであり、細胞外マトリックスの機能解析等の研究に有用であるばかりでなく、細胞外マトリックスの形成異常や代謝異常によって生じる疾患、疾病の診断薬、治療薬、治療効果を検査するための検査薬、またはこれら薬剤の開発に有効利用できるものである。加えて、細胞外マトリックスは、組織形成を規定する細胞外環境であることから、本発明に係るタンパク質及びその遺伝子等は、再生医学における組織再生や、生体外における人工組織形成に利用できるものである。
【０１９５】
【配列表】
2004008021.tif 000006
2004008021.tif 000007
2004008021.tif 000008
2004008021.tif 000009
2004008021.tif 000010
2004008021.tif 000011
2004008021.tif 000012
2004008021.tif 000013
2004008021.tif 000014
2004008021.tif 000015
2004008021.tif 000016
2004008021.tif 000017
2004008021.tif 000018
2004008021.tif 000019
2004008021.tif 000020
2004008021.tif 000021
2004008021.tif 000022
2004008021.tif 000023
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2004008021.tif 000025
2004008021.tif 000026
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2004008021.tif 000051
2004008021.tif 000052
2004008021.tif 000053
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に係る３３１４５タンパク質の一次構造を示す模式図である。
【図２】本発明に係る４０２４０タンパク質のアミノ酸配列を示す図である。
【図３】本発明に係る５１１４０タンパク質のアミノ酸配列を示す図である。
【図４】本発明に係る３１４１８タンパク質のアミノ酸配列を示す図である。
【図５】本発明に係る３１４１８タンパク質と牛プリオンタンパク質とのアミノ酸配列の相同性を示す図である。
【図６】実施例にて用いたプラスミドｐＣＩｋａｎａＥＧＦＰ３ｘＭｙｃのマルチクローニングサイトを示す塩基配列である。
【図７】実施例にて用いたプラスミドｐＣＩｋａｎａＥＧＦＰ３ｘＭｙｃの構造を示す模式図である。
【図８】（ａ）・（ｂ）は、実施例にて、３３１４５−ＥＧＦＰ−Ｍｙｃ融合タンパク質を発現するベクターを導入したヒト２９３Ｔの細胞破砕物、および培養液上清のウェスタンブロッティングを示す図である。
【図９】ヒト２９３Ｔ細胞にて発現した３３１４５−ＧＦＰ−Ｍｙｃ融合タンパク質の細胞外マトリックスでの局在を示した図である。
【図１０】マウスの各組織における３３１４５ｍＲＮＡの発現をＲＴ−ＰＣＲにより解析したアガロースゲル電気泳動の結果を示す図である。
【図１１】（ａ）・（ｂ）は、４０２４０−ＥＧＦＰ−Ｍｙｃ融合タンパク質を発現するベクターを導入したヒト２９３Ｔの細胞破砕物、および培養液上清のウェスタンブロッティングを示す図である。
【図１２】（ａ）・（ｂ）は、４０２４０−ＥＧＦＰ−Ｍｙｃ融合タンパク質の細胞外マトリックスでの局在を示した図である。
【図１３】マウスの各組織における４０２４０ｍＲＮＡの発現をＲＴ−ＰＣＲにより解析したアガロースゲル電気泳動の結果を示す図である。
【図１４】（ａ）・（ｂ）は、５１１４０−ＥＧＦＰ融合タンパク質のヒト細胞での発現並びに細胞外への分泌を、ヘパリン存在下／非存在下条件で調べたウェスタンブロッティングの結果を示す電気泳動図である。
【図１５】（ａ）・（ｂ）は、５１１４０−ＥＧＦＰ融合タンパク質の細胞外マトリックスでの局在を調べた結果を示す免疫染色図及び、微分干渉像である。
【図１６】３１４１８−ＥＧＦＰ−Ｍｙｃ融合タンパク質を発現するベクターを導入したヒト２９３Ｔの細胞破砕物、および培養液上清のウェスタンブロッティングを示す図である。
【図１７】（ａ）・（ｂ）は、３１４１８−ＥＧＦＰ−Ｍｙｃ融合タンパク質の細胞外マトリックスでの局在を示した図である。
【図１８】４０２４０タンパク質の組織内での発現を特異抗体により検出した結果のウェスタンブロッティングを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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