【手続補正書】
【提出日】平成26年7月30日(2014.7.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト患者の腸の炎症状態を検出し、診断し、予測するために、特異的抗ＨＭＧＢ１抗体を用いることを特徴とする、ヒト患者の糞便サンプル中のＨＭＧＢ１タンパク質のレベルを検出する方法。
【請求項２】
前記特異的抗ＨＭＧＢ１抗体は、抗ＨＭＧＢ１ポリクローナル抗体および／または抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記抗ＨＭＧＢ１ポリクローナル抗体が、ヒトＨＭＧＢ１の１６５−１８０アミノ酸に対応する合成ペプチドを免疫原として用いてウサギ中で産生されたものである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体が、マウス骨髄腫と、組み換えヒトＨＭＧＢ１タンパク質に由来する精製大腸菌で免疫化されたマウスから得たＢ細胞とを融合して得られるハイブリドーマのクローン１１５６０３に対応する、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記糞便サンプル中のＨＭＧＢ１レベルは、ウェスタンブロット分析における特異的抗原抗体反応により明らかにされ、前記特異的抗ＨＭＧＢ１抗体は、抗ＨＭＧＢ１ポリクローナル抗体または抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記糞便サンプル中のＨＭＧＢ１レベルは、ＥＬＩＳＡアッセイにおける特異的抗原抗体反応により明らかにされ、前記特異的抗ＨＭＧＢ１抗体は、抗ＨＭＧＢ１ポリクローナル抗体および抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
以下の工程
・糞便サンプルおよびＰＢＳ抽出バッファー中の懸濁物の重量の測定、
・サンプルの均質化および糞便の上澄み抽出物を遠心分離した後の抽出、
・ブラッドフォードアッセイによるタンパク質濃度の評価、
・ウェスタンブロットまたはＥＬＩＳＡアッセイによる糞便抽出物のＨＭＧＢ１レベルの検出、
を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記腸の炎症状態が慢性炎症性腸疾患（ＩＢＤ）である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記腸の炎症状態が、クローン病（ＣＤ）および潰瘍性大腸炎（ＣＵ）からなる群から選択される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ヒト患者が、ＩＢＤを患う小児患者である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
糞便サンプル中のＨＭＧＢ１タンパク質のレベルの低下を、ＩＢＤの治療に対する応答マーカーとして使用する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
抗ＨＭＧＢ１ポリクローナル抗体および／または抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体を含み、特異的抗原−抗体反応に基づいて、ヒト患者の糞便サンプル中のＨＭＧＢ１タンパク質を検出する、ヒト患者の腸の炎症状態を検出し、診断し、予測するための比色分析キット。
【請求項１３】
前記抗ＨＭＧＢ１ポリクローナル抗体が、ヒトＨＭＧＢ１の１６５−１８０アミノ酸に対応する合成ペプチドを免疫原として用いてウサギ中で産生されたものである、請求項１２に記載の比色分析キット。
【請求項１４】
前記抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体が、マウス骨髄腫と、組み換えヒトＨＭＧＢ１タンパク質に由来する精製大腸菌で免疫化されたマウスから得たＢ細胞とを融合して得られるハイブリドーマのクローン１１５６０３に対応する、請求項１２に記載の比色分析キット。
【請求項１５】
前記糞便サンプル中のＨＭＧＢ１レベルは、ウェスタンブロット分析および／またはＥＬＩＳＡアッセイにおける特異的抗原抗体反応により明らかにされる、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の比色分析キット。
【請求項１６】
以下の工程
・糞便サンプルおよびＰＢＳ抽出バッファー中の懸濁物の重量の測定、
・サンプルの均質化および糞便の上澄み抽出物を遠心分離した後の抽出、
・ブラッドフォードアッセイによるタンパク質濃度の評価、
・ウェスタンブロットまたはＥＬＩＳＡアッセイによる糞便抽出物のＨＭＧＢ１レベルの検出、
を行うための、請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の比色分析キット。
【請求項１７】
前記腸の炎症状態が慢性炎症性腸疾患（ＩＢＤ）である、請求項１２〜１６のいずれか１項に記載の比色分析キット。
【請求項１８】
前記腸の炎症状態が、クローン病（ＣＤ）および潰瘍性大腸炎（ＣＵ）からなる群から選択される、請求項１２〜１６のいずれか１項に記載の比色分析キット。
【請求項１９】
前記ヒト患者が、ＩＢＤを患う小児患者である、請求項１２に記載の比色分析キット。
【請求項２０】
糞便サンプル中のＨＭＧＢ１タンパク質のレベルの低下を、ＩＢＤの治療に対する応答マーカーとして使用する、請求項１２〜１９のいずれか１項に記載の比色分析キット。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４１】
（糞便抽出物のウェスタンブロットによる分析）
糞便タンパク質抽出物２０μｇに、同じ容積の２×サンプルバッファー（１００ｍＭ  トリス−Ｃｌ  ｐＨ６．８、１０％β−メルカプトエタノール、４％ＳＤＳ、２０％グリセロール、０．２％ブロモフェノールブルー）を加え、次いで、サンプルを５分間沸騰させ、ウェスタンブロット（ＷＢ）による抽出物の分析に進む前に軽く遠心分離処理した。糞便タンパク質抽出物を、１２％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを用いて分離し、次いで、７０ボルトで１時間、電子移動によってＰＶＤＦフィルタ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に移した。フィルタ上の非特異的な部位は、ブロッキングバッファー（０．０２Ｍ  トリス−Ｃｌ  ｐＨ７．６、０．１３７Ｍ  ＮａＣｌ、５％無脂肪乳粉末）を用いて室温で１時間インキュベーションすることによってブロックされ、次いで、抗体バッファー（０．０２Ｍ  トリス−Ｃｌ  ｐＨ７．６、０．１３７Ｍ  ＮａＣｌ、３％無脂肪乳粉末）で１：１０００に希釈した抗ＨＭＧＢ１ポリクローナル抗体（カタログ番号Ｈ９５９３、Ｓｉｇｍａ）、または抗体バッファーで１：５００に希釈した抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体（カタログ番号ＭＡＢ  １６９０、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＵＳＡ）を用い、このフィルタを４℃で１６時間インキュベーションした。次いで、ＴＢＳ−Ｔ  ０．１％  Ｔｗｅｅｎ（０．０２Ｍ  トリス−Ｃｌ  ｐＨ７．６、０．１３７Ｍ  ＮａＣｌ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ）で５分間洗浄を３回行い、その後に、Ｓｉｇｍａ製の抗ＨＭＧＢ１を用いるときは抗ウサギ二次抗体を用い、抗ＨＭＧＢ１抗体Ｒ＆Ｄシステムを用いてインキュベーションする場合には、抗マウス二次抗体を用い、フィルタを室温で１時間インキュベーションした。いずれの場合も、ペルオキシダーゼ（Ｓａｎｔａｃｒｕｚ）と複合体化しており、抗体バッファーで１：４０００に希釈した。抗ＨＭＧＢ１ポリクローナル抗体（カタログ番号Ｈ９５９３、Ｓｉｇｍａ）は、ヒトＨＭＧＢ１の１６５〜１８０番目のアミノ酸配列に相当する合成ペプチドを抗原として、ウサギ中で産生されたものであり、一方、抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体（カタログ番号ＭＡＢ  １６９０、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＵＳＡ）は、マウスミエローマとＢ細胞との融合の結果であるハイブリドーマのクローン１１５６０３は、マウス骨髄腫と、組み換えヒトＨＭＧＢ１タンパク質に由来する精製大腸菌で免疫化されたマウスから得たＢ細胞とを融合して得られるハイブリドーマのクローン１１５６０３に対応する。ＴＢＳ−Ｔ＋０．１％  Ｔｗｅｅｎで５分間洗浄をさらに３回行い、次いで、ＥＣＬｐｌｕｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）およびオートラジオグラフィー膜（Ｋｏｄａｋ）を用いた化学発光シグナルの検出へと進んだ。