【手続補正書】
【提出日】平成24年1月20日(2012.1.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程：
（ａ）以下のものを含むターゲットベクターを提供する工程、
（ｉ）構成性プロモーターを含有する第１の発現コントロール配列（Ｐ１）に作動可能に連結されたレポーター遺伝子（ＲＧ１）、
（ｉｉ）第２の発現コントロール配列（Ｐ２）に作動可能に連結された第１の選択マーカー遺伝子（ＳＭ１）、
（ｉｉｉ）発現コントロール配列に対する作動可能な連結なしの第２の非機能性選択マーカー遺伝子（ＳＭ２）、
その際、配列（ｉ）は５′位に存在し、配列（ｉｉ）は（ｉ）と（ｉｉｉ）との間に存在し、配列（ｉｉｉ）は３′位に存在する、
（ｉｖ）二重鎖切断媒介酵素のための第１の及び第２の認識部位、その際第１の認識部位は第１の発現コントロ−ル配列（Ｐ１）と第１のレポーター遺伝子（ＲＧ１）との間に存在し、第２の認識部位は配列（ｉｉ）と配列（ｉｉｉ）との間に存在する、
（ｂ）ターゲットベクターを宿主細胞中に、宿主細胞のゲノム中へのターゲットベクターのランダムな組み込みを可能にする条件下で導入する工程、
（ｃ）安定に組み込まれたターゲットベクターを有し、かつ、レポーター遺伝子（ＲＧ１）の高転写活性を示す宿主細胞を選択する工程、
（ｄ）以下のものを含有する交換ベクターを提供する工程、
（ｉ）興味のある遺伝子（ＧＯＩ）及び
（ｉｉ）第３の発現コントロ−ル配列（Ｐ３）に作動可能に連結された不活性な第２の選択マーカー遺伝子（ΔＳＭ２）、
その際、交換ベクターは、第１の５′−相同性配列と第２の３′−相同性配列とを含有し、これはターゲットベクターの配列との組み換えを可能にする、
（ｅ）（ａ）（ｉｖ）で定義された第１の及び／又は第２の認識部位での二重鎖切断及び二重鎖切断媒介相同性組み換えによる宿主細胞のゲノム中への交換ベクターの組み込みを可能にする条件下で、工程（ｃ）で得られた宿主細胞中に交換ベクターを導入する工程、
これにより、この不活性な第２の選択マーカー遺伝子（ΔＳＭ２）は、ターゲットベクターとの相同性組み換えによる交換ベクターの組み込みにより活性化される、
（ｆ）組み込まれたターゲットベクターとの相同性組み換えによる組み込まれた交換ベクターを有する高生産者細胞を選択する工程、その際、この生産者細胞はＧＯＩを発現する、
を含む組み換え遺伝子産物の製造のための高生産者宿主細胞の作成方法。
【請求項２】
宿主細胞が、真核細胞、特に哺乳類細胞、例えばＣＨＯ細胞である請求項１記載の方法。
【請求項３】
レポーター遺伝子（ＲＧ１）が、酵素又はルミネッセンスの又は蛍光の遺伝子産物をコードする請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
第１の発現コントロール配列（Ｐ１）が、構成性プロモーターとして、ＣＭＶプロモーターを含有し、場合によりこれはＣＭＶイントロンＡで補われている請求項１から３までのいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
二重鎖切断誘発酵素がメガヌクレアーゼ又はホーミングヌクレアーゼであり、これは少なくとも１０、有利には少なくとも１２、より有利には１８ヌクレオチドの認識部位を有し、かつ、例えばＩ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＣｅｕＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩＩ、ＨＯ及びＥｎｄｏ  ＳｃｅＩから選択される請求項１から４までのいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
宿主細胞の染色体の単一部位中に特に単一コピーとして組み込まれたターゲットベクターを有する細胞が選択される請求項１から５までのいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
選択工程（ｃ）が、第１の選択マーカー遺伝子（ＳＭ１）活性の検出を基礎とする請求項１から６までのいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
交換ベクターが、機能性発現コントロール配列なしの興味のある遺伝子（ＧＯＩ）を含有し、これが特に、ターゲットベクター中の第１の発現コントロール配列（Ｐ１）の３′−部と実質的に同一である部分発現コントロール配列を有する請求項１から７までのいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
交換ベクターが、第３の発現コントロール配列（Ｐ３）に作動可能に連結された不完全な第２の選択マーカー遺伝子（ΔＳＭ２）を含有し、特にこれが構成性プロモーター、例えばＳＶ４０プロモーターを含有する請求項１から８までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
第１の５′−相同性配列が少なくとも約７００ヌクレオチドの長さを有し、かつ／又は、第２の３′−相同性配列が少なくとも約７００ヌクレオチドの長さを有する請求項１から９までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
交換ベクターがさらに、
（ｉｖ）ネガティブ選択マーカー遺伝子、特に自殺遺伝子、例えばＨＳＶチミジンキナーゼ遺伝子を含有し、これが第１の５′−及び第２の３′−相同性配列により定義される配列の外側に存在する請求項１から１０までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
更に以下の工程
（ｉ）二重鎖切断媒介酵素をコードする核酸配列又は二重鎖切断媒介酵素をコードするｍＲＮＡを含有するベクターを、工程（ｅ）前又は間に宿主細胞中に導入し、工程（ｅ）の性能を発揮させるためにこの酵素を発現させる工程、又は
（ｉｉ）二重鎖切断媒介酵素を工程（ｅ）前又は間に宿主細胞中に導入し、工程（ｅ）の性能を発揮させるためにこの酵素を提供する工程
を含む請求項１から１１までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
さらに興味のある遺伝子（ＧＯＩ）を発現させ、かつ、この発現した遺伝子産物を獲得することを含む請求項１から１２までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】
以下の工程：
（ａ）以下のものを含むターゲットベクターを提供する工程、
（ｉ）構成性プロモーターを含有する第１の発現コントロール配列（Ｐ１）に作動可能に連結されたレポーター遺伝子（ＲＧ１）、
（ｉｉ）第２の発現コントロール配列（Ｐ２）に作動可能に連結された第１の選択マーカー遺伝子（ＳＭ１）、
（ｉｉｉ）発現コントロール配列に対する作動可能な連結なしの第２の非機能性選択マーカー遺伝子（ＳＭ２）、
その際、配列（ｉ）は５′位に存在し、配列（ｉｉ）は（ｉ）と（ｉｉｉ）との間に存在し、配列（ｉｉｉ）は３′位に存在する、
（ｉｖ）二重鎖切断媒介酵素、特にメガヌクレアーゼのための第１の及び第２の認識部位、その際第１の認識部位は第１の発現コントロ−ル配列（Ｐ１）と第１のレポーター遺伝子（ＲＧ１）との間に存在し、第２の認識部位は配列（ｉｉ）と配列（ｉｉｉ）との間に存在する、
（ｂ）ターゲットベクターを宿主細胞中に、宿主細胞のゲノム中へのターゲットベクターのランダムな組み込みを可能にする条件下で導入する工程、及び
（ｃ）安定に組み込まれたターゲットベクターを有し、かつ、レポーター遺伝子（ＲＧ１）の高転写活性を示す宿主細胞を選択する工程
を含む興味のある遺伝子（ＧＯＩ）の導入のためのワイルドカード宿主細胞の作成方法。
【請求項１５】
以下の工程：
（ａ）以下のものを含む発現カセットをそのゲノム中に組み込んで有するワイルドカード宿主細胞を提供する工程、
（ｉ）構成性プロモーターを含有する第１の発現コントロール配列（Ｐ１）に作動可能に連結されたレポーター遺伝子（ＲＧ１）、
（ｉｉ）第２の発現コントロール配列（Ｐ２）に作動可能に連結された第１の選択マーカー遺伝子（ＳＭ１）、
（ｉｉｉ）発現コントロール配列に対する作動可能な連結なしの第２の非機能性選択マーカー遺伝子（ＳＭ２）、
その際、配列（ｉ）は５′位に存在し、配列（ｉｉ）は（ｉ）と（ｉｉｉ）との間に存在し、配列（ｉｉｉ）は３′位に存在する、
（ｉｖ）二重鎖切断媒介酵素のための第１の及び第２の認識部位、その際第１の認識部位は第１の発現コントロ−ル配列（Ｐ１）と第１のレポーター遺伝子（ＲＧ１）との間に存在し、第２の認識部位は配列（ｉｉ）と配列（ｉｉｉ）との間に存在する、
その際発現カセットは宿主細胞ゲノム中に安定に組み込まれており、かつ、レポーター遺伝子（ＲＧ１）の高転写活性を示す、
（ｂ）以下のものを含有する交換ベクターを提供する工程、
（ｉ）興味のある遺伝子（ＧＯＩ）及び
（ｉｉ）第３の発現コントロ−ル配列（Ｐ３）に作動可能に連結された不活性な第２の選択マーカー遺伝子（ΔＳＭ２）、
その際、交換ベクターは、第１の５′−相同性配列と第２の３′−相同性配列とを含有し、これはターゲットベクターの配列との組み換えを可能にする、
（ｃ）（ａ）（ｉｖ）で定義された第１の及び／又は第２の認識部位での二重鎖切断及び二重鎖切断媒介相同性組み換えによる宿主細胞のゲノム中への交換ベクターの組み込みを可能にする条件下で、工程（ａ）で提供された宿主細胞中に交換ベクターを導入する工程、
これにより、この不活性な第２の選択マーカー遺伝子（ΔＳＭ２）は、交換ベクターの組み込みにより活性化される、
（ｄ）組み込まれたターゲットベクターとの相同性組み換えによる組み込まれた交換ベクターを有する高生産者細胞を選択する工程、その際、この生産者細胞はＧＯＩを発現する、
を含む組み換え遺伝子産物の製造方法。
【請求項１６】
以下の工程：
（ａ）高転写活性を支持する宿主細胞のゲノムの部位中に標的化した相同性組み換えにより二重鎖切断媒介酵素のための第１の及び第２の認識部位を含有する核酸配列を導入する工程、
（ｂ）安定に組み込まれた第１の及び第２の認識部位を有するワイルドカード宿主細胞を選択する工程、
（ｃ）以下のものを含有する交換ベクターを提供する工程、
（ｉ）興味のある遺伝子（ＧＯＩ）及び
（ｉｉ）第１の５′−相同性配列及び第２の３′−相同性配列、これにより第１の及び／又は第２の組み込み部位の組み込み部位での配列との組み換えが可能になる、
（ｄ）（ａ）で定義された第１の及び／又は第２の認識部位での二重鎖切断及び二重鎖切断媒介相同性組み換えによる宿主細胞のゲノム中への交換ベクターの組み込みを可能にする条件下で、工程（ｂ）で得られた宿主細胞中に交換ベクターを導入する工程、及び
（ｅ）相同性組み換えによる組み込まれた交換ベクターを有する高生産者細胞を選択する工程、その際、この生産者細胞はＧＯＩを発現する、
を含む組み換え遺伝子産物の製造のための高生産者宿主細胞の作成方法。
【請求項１７】
以下の工程：
（ａ）高転写活性を支持する宿主細胞のゲノムの部位中に標的化した相同性組み換えにより二重鎖切断媒介酵素のための第１の及び第２の認識部位を含有する核酸配列を導入する工程、及び
（ｂ）安定に組み込まれた第１の及び第２の認識部位を有するワイルドカード宿主細胞を選択する工程
を含む興味のある遺伝子（ＧＯＩ）の導入のためのワイルドカード宿主細胞の製造方法。
【請求項１８】
（ａ）二重鎖切断媒介酵素のための第１の及び第２の認識部位を含有する核酸配列をそのゲノム中に組み込んで有するワイルドカード宿主細胞を提供し、
その際この核酸配列は高転写活性を支持する部位で宿主細胞ゲノム中に安定に組み込まれている、
（ｂ）以下のものを含有する交換ベクターを提供し、
（ｉ）興味のある遺伝子（ＧＯＩ）及び
（ｉｉ）第１の５′−相同性配列及び第２の３′−相同性配列、これにより第１の及び／又は第２の認識部位の組み込み部位での配列との組み換えが可能になる、
（ｃ）（ａ）で定義された第１の及び／又は第２の認識部位での二重鎖切断及び二重鎖切断媒介相同性組み換えによる宿主細胞のゲノム中への交換ベクターの組み込みを可能にする条件下で、工程（ａ）で提供された宿主細胞中に交換ベクターを導入し、かつ
（ｄ）相同性組み換えによる組み込まれた交換ベクターを有する高生産者細胞を選択し、その際、この生産者細胞はＧＯＩを発現する、
を含む組み換え遺伝子産物の製造のための方法。
【請求項１９】
（ａ）構成性プロモーターを含有する第１の発現コントロール配列（Ｐ１）に作動可能に連結されたレポーター遺伝子（ＲＧ１）、
（ｂ）第２の発現コントロール配列（Ｐ２）に作動可能に連結された第１の選択マーカー遺伝子（ＳＭ１）、
（ｃ）発現コントロール配列に対する作動可能な連結なしの非機能性の第２の選択マーカー遺伝子（ＳＭ２）、
その際、配列（ｉ）は５′位に存在し、配列（ｉｉ）は（ｉ）と（ｉｉｉ）との間に存在し、配列（ｉｉｉ）は３′位に存在する、
（ｄ）二重鎖切断媒介酵素、特にメガヌクレアーゼのための第１の及び第２の認識部位、その際第１の認識部位は第１の発現コントロ−ル配列（Ｐ１）と第１のレポーター遺伝子（ＲＧ１）との間に存在し、第２の認識部位は配列（ｉｉ）と配列（ｉｉｉ）との間に存在する、
を含有するターゲットベクター。