【手続補正書】
【提出日】平成26年5月7日(2014.5.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
非天然微生物であって、該非天然微生物は、ブタジエン経路を有し、かつ、ブタジエンを生産するために十分な量にて発現するブタジエン経路酵素をコードしている、少なくとも１つの外因性の核酸を含む微生物であり、
上記ブタジエン経路は、１つ以上のブタジエン経路酵素を用いて、クロトニル‐ＣｏＡをクロチルアルコールへと変換することを含み、
上記ブタジエン経路酵素は、
クロトニル‐ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド生成）；クロトンアルデヒドレダクターゼ（アルコール生成）；クロトニル‐ＣｏＡヒドロラーゼ、クロトニル‐ＣｏＡシンテターゼ、またはクロトニル‐ＣｏＡトランスフェラーゼ；クロトン酸レダクターゼ；およびクロトニル‐ＣｏＡレダクターゼ（アルコール生成）からなる群より選択される、
ことを特徴とする非天然微生物。
【請求項２】
上記ブタジエン経路酵素は、
クロトニル‐ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド生成）；およびクロトンアルデヒドレダクターゼ（アルコール生成）を含む、
ことを特徴とする請求項１に記載の非天然微生物。
【請求項３】
上記ブタジエン経路酵素は、
クロトニル‐ＣｏＡレダクターゼ（アルコール生成）を含む、
ことを特徴とする請求項１に記載の非天然微生物。
【請求項４】
上記ブタジエン経路酵素は、
クロトニル‐ＣｏＡヒドロラーゼ、クロトニル‐ＣｏＡシンテターゼ、またはクロトニル‐ＣｏＡトランスフェラーゼ；および、クロトン酸レダクターゼを含む、
ことを特徴とする請求項１に記載の非天然微生物。
【請求項５】
上記ブタジエン経路は、
ブタジエン経路酵素を用いてクロチルアルコールをブタジエンへと変換することをさらに含み、
上記ブタジエン経路酵素は、
（１）クロチルアルコールキナーゼ；２‐ブテニル‐４‐リン酸キナーゼ；およびブタジエンシンターゼ、または、
（２）クロチルアルコールジホスホキナーゼ；およびブタジエンシンターゼ
を含む、
ことを特徴とする請求項１から４のいずれか１項に記載の非天然微生物。
【請求項６】
上記ブタジエン経路は、
（１）アセチル‐ＣｏＡ：アセチルＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；アセトアセチル‐ＣｏＡレダクターゼ；および３‐ヒドロキシブチリル‐ＣｏＡデヒドラターゼを用いてアセチル‐ＣｏＡをクロトニル‐ＣｏＡへと変換すること、
（２）グルタコニル‐ＣｏＡデカルボキシラーゼを用いてグルタコニル‐ＣｏＡをクロトニル‐ＣｏＡへと変換すること、
（３）グルタリル‐ＣｏＡデヒドロゲナーゼを用いてグルタリル‐ＣｏＡをクロトニル‐ＣｏＡへと変換すること、
（４）３‐アミノブチリル‐ＣｏＡデアミナーゼを用いて３‐アミノブチリル‐ＣｏＡをクロトニル‐ＣｏＡへと変換すること、または、
（５）４‐ヒドロキシブチリル‐ＣｏＡデヒドラターゼを用いて４‐ヒドロキシブチリル‐ＣｏＡをクロトニル‐ＣｏＡへと変換すること、
をさらに含む、
ことを特徴とする請求項１から５のいずれか１項に記載の非天然微生物。
【請求項７】
非天然微生物であって、
上記微生物は、ブタジエンを生産するために十分な量にて発現するブタジエン経路酵素をコードしている、少なくとも１つの外因性の核酸を含むブタジエン経路を有しており、
上記ブタジエン経路は、
（ｉ）エリトロース‐４‐リン酸レダクターゼ；エリトリトール‐４‐リン酸シチジリルトランスフェラーゼ；４‐（シチジン５’‐ジホスホ）‐エリトリトールキナーゼ；エリトリトール２，４‐シクロ二リン酸シンターゼ；１‐ヒドロキシ‐２‐ブテニル４‐二リン酸シンターゼ；１‐ヒドロキシ‐２‐ブテニル４‐二リン酸レダクターゼ；およびブタジエンシンターゼ、
（ｉｉ）エリトロース‐４‐リン酸レダクターゼ；エリトリトール‐４‐リン酸シチジリルトランスフェラーゼ；４‐（シチジン５’‐ジホスホ）‐エリトリトールキナーゼ；エリトリトール２，４‐シクロ二リン酸シンターゼ；１‐ヒドロキシ‐２‐ブテニル４‐二リン酸シンターゼ；１‐ヒドロキシ‐２‐ブテニル４‐二リン酸レダクターゼ；ブテニル４‐二リン酸イソメラーゼ；およびブタジエンシンターゼ、
（ｉｉｉ）エリトリトール‐４‐リン酸シチジリルトランスフェラーゼ；４‐（シチジン５’‐ジホスホ）‐エリトリトールキナーゼ；エリトリトール２，４‐シクロ二リン酸シンターゼ；１‐ヒドロキシ‐２‐ブテニル４‐二リン酸シンターゼ；１‐ヒドロキシ‐２‐ブテニル４‐二リン酸レダクターゼ；ブタジエンシンターゼ；エリトロース‐４‐リン酸キナーゼ；エリトロースレダクターゼ；およびエリトリトールキナーゼ、
（ｉｖ）エリトリトール‐４‐リン酸シチジリルトランスフェラーゼ；４‐（シチジン５’‐ジホスホ）‐エリトリトールキナーゼ；エリトリトール２，４‐シクロ二リン酸シンターゼ；１‐ヒドロキシ‐２‐ブテニル４‐二リン酸シンターゼ；１‐ヒドロキシ‐２‐ブテニル４‐二リン酸レダクターゼ；ブテニル４‐二リン酸イソメラーゼ；ブタジエンシンターゼ；エリトロース‐４‐リン酸キナーゼ；エリトロースレダクターゼ；およびエリトリトールキナーゼ、
（ｖ）マロニル‐ＣｏＡ：アセチル‐ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３‐オキソグルタリル‐ＣｏＡレダクターゼ（ケトン還元）；３‐ヒドロキシグルタリル‐ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド生成）；３‐ヒドロキシ‐５‐オキソペンタン酸レダクターゼ；３，５‐ジヒドロキシペンタン酸キナーゼ；３‐ヒドロキシ‐５‐ホスホナトオキシペンタン酸キナーゼ；３‐ヒドロキシ‐５‐［ヒドロキシ（ホスホノオキシ）ホスホリル］オキシペンタン酸デカルボキシラーゼ；ブテニル４‐二リン酸イソメラーゼ；およびブタジエンシンターゼ、
（ｖｉ）マロニル‐ＣｏＡ：アセチル‐ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３，５‐ジヒドロキシペンタン酸キナーゼ；３‐ヒドロキシ‐５‐ホスホナトオキシペンタン酸キナーゼ；３‐ヒドロキシ‐５‐［ヒドロキシ（ホスホノオキシ）ホスホリル］オキシペンタン酸デカルボキシラーゼ；ブテニル４‐二リン酸イソメラーゼ；ブタジエンシンターゼ；３‐オキソグルタリル‐ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド生成）；３，５‐ジオキソペンタン酸レダクターゼ（アルデヒド還元）；および５‐ヒドロキシ‐３‐オキソペンタン酸レダクターゼ、
（ｖｉｉ）マロニル‐ＣｏＡ：アセチル‐ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３‐ヒドロキシ‐５‐オキソペンタン酸リダクターゼ；３，５‐ジヒドロキシペンタン酸キナーゼ；３‐ヒドロキシ‐５‐ホスホナトオキシペンタン酸キナーゼ；３‐ヒドロキシ‐５‐［ヒドロキシ（ホスホノオキシ）ホスホリル］オキシペンタン酸デカルボキシラーゼ；ブテニル４‐二リン酸イソメラーゼ；ブタジエンシンターゼ；３‐オキソグルタリル‐ＣｏＡレダクターゼ（アルデヒド生成）；および３，５‐ジオキソペンタン酸レダクターゼ（ケトン還元）、
（ｖｉｉｉ）マロニル‐ＣｏＡ：アセチル‐ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３，５‐ジヒドロキシペンタン酸キナーゼ；３‐ヒドロキシ‐５‐ホスホナトオキシペンタン酸キナーゼ；３‐ヒドロキシ‐５‐［ヒドロキシ（ホスホノオキシ）ホスホリル］オキシペンタン酸デカルボキシラーゼ；ブテニル４‐二リン酸イソメラーゼ；ブタジエンシンターゼ；５‐ヒドロキシ‐３‐オキソペンタン酸レダクターゼ；および３‐オキソ‐グルタリル‐ＣｏＡレダクターゼ（ＣｏＡ還元およびアルコール生成）、および、
（ｉｘ）マロニル‐ＣｏＡ：アセチル‐ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３‐オキソ‐グルタリル‐ＣｏＡレダクターゼ（ケトン還元）、３，５‐ジヒドロキシペンタン酸キナーゼ；３‐ヒドロキシ‐５‐ホスホナトオキシペンタン酸キナーゼ；３‐ヒドロキシ‐５‐［ヒドロキシ（ホスホノオキシ）ホスホリル］オキシペンタン酸デカルボキシラーゼ
；ブテニル４‐二リン酸イソメラーゼ；ブタジエンシンターゼ；および３‐ヒドロキシグルタリル‐ＣｏＡレダクターゼ（アルコール生成）、
から選択された経路を含んでいることを特徴とする非天然微生物。
【請求項８】
上記微生物は、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個の外因性の核酸を含み、
上記２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個の外因性の核酸は、それぞれブタジエン経路酵素をコードしていることを特徴とする請求項１から７のいずれか１項に記載の非天然微生物。
【請求項９】
上記微生物は、
（ｉ）から（ｉｘ）の中から選択された少なくとも１つの上記経路のそれぞれの上記酵素をコードしている外因性の核酸を含むことを特徴とする請求項７に記載の非天然微生物。
【請求項１０】
上記少なくとも１つの外因性の核酸は、異種性の核酸であることを特徴とする請求項１から９のいずれか１項に記載の非天然微生物。
【請求項１１】
上記非天然微生物は、実質的に嫌気性である培養媒体中に存在することを特徴とする請求項１から９のいずれか１項に記載の非天然微生物。
【請求項１２】
上記微生物は、細菌、酵母、または真菌であることを特徴とする請求項１から１１のいずれか１項に記載の非天然微生物。
【請求項１３】
請求項１から１２のいずれか１項に記載の非天然微生物を、ブタジエンを生産するための条件下で、かつ十分な時間にわたって培養する工程を含むことを特徴とするブタジエンを生産する方法。
【請求項１４】
ブタジエンを含む培養液であって、
上記ブタジエンは、請求項１から１２のいずれか１項に記載の非天然微生物によって生産されたブタジエンであることを特徴とする培養液。
【請求項１５】
生合成されたブタジエン。
【請求項１６】
生合成されたブタジエンであって、該ブタジエンは請求項１３に記載の方法を用いて生産されたものであることを特徴とする、生合成されたブタジエン。
【請求項１７】
請求項１５または１６に記載の生合成されたブタジエンを含む組成物。
【請求項１８】
請求項１５または１６に記載の生合成されたブタジエンを供給することを含む工程によって得られる有機化学物質。
【請求項１９】
請求項１５または１６に記載の生合成されたブタジエンを供給することを含む工程によって得られるポリマー。
【請求項２０】
上記ポリマーはゴムまたは樹脂であることを特徴とする請求項１９に記載のポリマー。
【請求項２１】
請求項１７に記載の組成物の製造のため；請求項１８に記載の有機化学物質の製造のため；または、請求項１９または２０に記載のポリマーの製造のための、
請求項１５または１６に記載の生合成されたブタジエンの使用。
【請求項２２】
上記製造は、化学的または酵素的な変換を含むことを特徴とする請求項２１に記載の使用。