(57)【要約】【課題】本発明の課題は、基質阻害を受けにくい変異型D-アミノアシラーゼ、並びにその用途の提供である。【解決手段】  Alcaligenes denitrificans subsp. xylosoxydans MI-4株由来のD-アミノアシラーゼを構成するアミノ酸配列中、特定の部位のアミノ酸残基を改変した変異型D-アミノアシラーゼが提供された。本発明の変異体は、高度な反応特異性を有するとともに、基質阻害を受けにくい。本発明により、高濃度のN-アシル-DL-アミノ酸を基質として、収率良くD-アミノ酸を生成することができる。本発明の変異体は、特にD-トリプトファンの製造に有用である。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の（ａ）または（ｂ）に記載のアミノ酸配列を含む蛋白質であって、N-アセチル-D-トリプトファン存在下でD-トリプトファンを生成する活性を有する蛋白質。
（ａ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列において、１５４位のアラニン、３４７位のメチオニン、および３７４位のアルギニンからなる群から選択された少なくとも１つのアミノ酸残基が、他のアミノ酸へ置換されたアミノ酸配列
（ｂ）（ａ）に記載のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列
【請求項２】
配列番号：１に記載のアミノ酸配列において、以下の（Ａ）−（Ｃ）からなる群から選択されるいずれかに記載のアミノ酸残基の置換を有するアミノ酸配列を含む請求項１に記載の蛋白質。
（Ａ）１５４位のアラニンの、バリン、システイン、およびスレオニンからなる群から選択されたいずれかのアミノ酸への置換、
（Ｂ）３４７位のメチオニンの、グリシン、グルタミン、セリン、アスパラギン、アラニン、イソロイシン、およびプロリンからなる群から選択されたいずれかのアミノ酸への置換、および
（Ｃ）３７４位のアルギニンの、フェニルアラニン、リジン、ロイシン、タイロシン、ヒスチジン、イソロイシン、およびトリプトファンからなる群から選択されたいずれかのアミノ酸への置換
【請求項３】
配列番号：１に記載のアミノ酸配列において、１５４位のアラニン、３４７位のメチオニン、および３７４位のアルギニンからなる群から選択された２つ以上のアミノ酸残基が、他のアミノ酸へ置換された変異を含むアミノ酸配列を含む請求項１に記載の蛋白質。
【請求項４】
配列番号：１に記載のアミノ酸配列において、１５４位のアラニン、３４７位のメチオニン、および３７４位のアルギニンが、他のアミノ酸へ置換された変異を含むアミノ酸配列を含む請求項３に記載の蛋白質。
【請求項５】
１２０ g/LのN-アセチル-DL-トリプトファンを基質として、該基質中のN-アセチル-D-トリプトファンを特異的に加水分解し、80%以上の収率でD-トリプトファンを生成する請求項１に記載の蛋白質。
【請求項６】
N-アセチル-D-トリプトファンおよびN-アセチル-L-トリプトファン存在下でD-トリプトファンを生成する活性を有する請求項１に記載の蛋白質。
【請求項７】
配列番号：１に記載のアミノ酸配列において、（１）〜（１０）のいずれかに記載の変異を含むアミノ酸配列を含む蛋白質。
（１）１５４位：アラニンからバリンへの変異、および
３４７位：メチオニンからアラニンへの変異
（２）３４７位：メチオニンからアラニンへの変異、および
３７４位：アルギニンからヒスチジンへの変異
（３）３４７位：メチオニンからアラニンへの変異、および
３７４位：アルギニンからフェニルアラニンへの変異
（４）３４７位：メチオニンからグルタミンへの変異、および
３７４位：アルギニンからヒスチジンへの変異
（５）１５４位：アラニンからバリンへの変異、
３４７位：メチオニンからアラニンへの変異、および
３７４位：アルギニンからフェニルアラニンへの変異
（６）１５４位：アラニンからバリンへの変異、
３４７位：メチオニンからグルタミンへの変異、および
３７４位：アルギニンからヒスチジンへの変異
（７）１５４位：アラニンからスレオニンへの変異、
３４７位：メチオニンからアラニンへの変異、および
３７４位：アルギニンからヒスチジンへの変異
（８）１５４位：アラニンからスレオニンへの変異、
３４７位：メチオニンからアラニンへの変異、および
３７４位：アルギニンからフェニルアラニンへの変異
（９）１５４位：アラニンからスレオニンへの変異、
３４７位：メチオニンからグルタミンへの変異、および
３７４位：アルギニンからヒスチジンへの変異
（１０）１５４位：アラニンからスレオニンへの変異、
３４７位：メチオニンからグルタミンへの変異、および
３７４位：アルギニンからフェニルアラニンへの変異
【請求項８】
請求項１または請求項７に記載の蛋白質をコードするDNA。
【請求項９】
配列番号：３に記載の塩基配列において、以下の（ａ）−（ｃ）からなる群から選択されるいずれかに記載の塩基配列の置換を含む塩基配列を含む請求項８に記載のDNA。
（ａ）460-462の塩基配列gcgの、gta、tgc、およびacaからなる群から選択されたいずれかの塩基配列への置換、
（ｂ）1039-1041の塩基配列atgの、ggt、caa、tct、aac、gca、ata、およびcccからなる群から選択されたいずれかの塩基配列への置換
（ｃ）1120-1122の塩基配列cgcの、ttt、aaa、ctt、tat、cac、ata、およびtggからなる群から選択されたいずれかの塩基配列への置換
【請求項１０】
配列番号：３に記載の塩基配列において、460-462の塩基配列gcg、1039-1041の塩基配列atg、および1120-1122の塩基配列cgcからなる群から選択された２つ以上の領域の塩基配列が、他の塩基配列へ置換された変異を含む塩基配列を含む請求項８に記載のDNA。
【請求項１１】
配列番号：３に記載の塩基配列において、460-462の塩基配列gcg、1039-1041の塩基配列atg、および1120-1122の塩基配列cgcの塩基配列が、他の塩基配列へ置換された変異を含む塩基配列を含む請求項１０に記載のDNA。
【請求項１２】
配列番号：３に記載の塩基配列を有するDNA。
【請求項１３】
請求項８に記載のDNAが挿入されたベクター。
【請求項１４】
請求項１３に記載のベクターを保持する形質転換体。
【請求項１５】
DNAが請求項９に記載のDNAであり、宿主が大腸菌である請求項１４に記載の形質転換体。
【請求項１６】
請求項１４に記載の形質転換体を培養する工程を含む、請求項１または請求項７に記載の蛋白質を製造する方法。
【請求項１７】
以下の（ａ）から（ｃ）から選択された少なくとも１つの酵素活性物質をN-アシル-DL-アミノ酸に接触させ、生成するD-アミノ酸を回収する工程を含む、D-アミノ酸の製造方法。
（ａ）請求項１または請求項７に記載の蛋白質、
（ｂ）請求項１４に記載の形質転換体、および
（ｃ）（ｂ）に記載の形質転換体の処理物
【請求項１８】
N-アシル-DL-アミノ酸がN-アシル-DL-トリプトファンである請求項１７に記載の製造方法。
【請求項１９】
N-アシル-DL-トリプトファンがN-アセチル-DL-トリプトファンである請求項１８に記載の製造方法。
【請求項２０】
N-アセチル-DL-トリプトファンの濃度が１２０ g/L以上である請求項１９に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、変異型D-アミノアシラーゼ、該変異体をコードする遺伝子、それらの製造方法、及び該D-アミノアシラーゼを用いたD-アミノ酸、特にD-トリプトファンの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
酵素は高い触媒機能をもつだけでなく、基質特異性、反応特異性とともに、立体特異性を示す。酵素の立体特異性は、いくつかの例外はあるものの、ほとんど絶対的といえる。
さて、近年における研究の精密化に伴い、医薬品、農薬、飼料、香料などの分野で光学活性体を扱うことの重要性が増している。光学異性体は生理活性をまったく異にする場合があるため、それらを特異的に得るための技術は重要である。従って、光学的に純粋な対掌体をいかにして入手（合成または分割）するかは、産業上重要な課題となっている。
【０００３】
D-アミノ酸は非タンパク性アミノ酸であり、天然では、D-アミノ酸の存在は小さな環状ペプチドまたは細菌細胞壁のペプチドグリカン、ペプチド系抗生物質に存在することが古くから知られていた。近年、神経ペプチドの構成成分、歯のエナメル質、目の水晶体や脳のタンパク質中に結合型として存在することが明らかにされ、D-アミノ酸の生理的意義の解明、酵素法によるD-アミノ酸の合成法などが研究されている。
D-アミノ酸は農薬、医薬品等の合成の重要中間体として広く使用されており、D-トリプトファンは、性機能改善薬の合成中間体などに利用されている。
【０００４】
D-アミノ酸を生産する方法として、例えば以下の方法が知られている。
１）対応する5位置換ヒダントインを化学的に加水分解してDL-アミノ酸を製造し、これを光学分割してD-アミノ酸とする方法。
２）5位置換ヒダントインに微生物の培養液、菌体、その処理物を作用させて光学活性なD-N-カルバミルアミノ酸を生成させた後、亜硝酸ソーダによりD-アミノ酸とする方法、あるいはD-カルバモイラーゼによりD-アミノ酸とする方法（特許文献１／WO94/03613）が知られている。また、5位置換ヒダントインにある種の微生物の培養液、菌体、その処理物を作用させて直接にD-アミノ酸とする方法も公知である。この方法に用いることができる微生物としては次のような微生物が知られている。
シュードモナス（Pseudomonas）属（特許文献２／特開昭54-2398）
モラキセラ（Moraxella）属（特許文献３／特開昭54-89089）
ハンセニュラ（Hansenula）属（特許文献４／特開昭61-177991）
３）DL-アミノ酸に、L体を分解する能力を有する微生物の培養液、菌体、その処理物を作用させた後、残存するD-アミノ酸を分離、採取することによってD-アミノ酸とする方法 （特許文献５／特開平09-75097）。
【０００５】
４）L-アミノアシラーゼを用いてN-アセチル-DL-アミノ酸の一方のエナンチオマーであるN-アセチル-L-アミノ酸を加水分解し、残存するN-アセチル-D-アミノ酸を分離、採取し、それを化学的に加水分解してD-アミノ酸とする方法（文献１／Methods in Enzymology. 3, 554）。
５）DL-アミノ酸アミドのうち、D体を選択的に加水分解するD-アミダーゼ、又はD-アミダーゼ活性を有する微生物、その処理物を作用させてD-アミノ酸とする方法（特許文献６／特開平02-234678）、またはDL-アミノ酸アミドのうち、L体のみを選択的に加水分解するL-アミダーゼ、又はL-アミダーゼ活性を有する微生物、その処理物を作用させて残存したD-アミノ酸アミドを化学的に加水分解し、D-アミノ酸とする方法（特許文献７／特開昭57-013000）。
６）D-アミノ酸をアミノ基供与体とし、D-アミノ酸トランスアミナーゼにより、α-ケト酸から対応するD-アミノ酸を生成させる方法（特許文献８／特開昭62-205790）。
７）DL-トリプトファンにトリプトファナーゼ、又はトリプトファナーゼ活性を有する微生物、その処理物を作用させることにより、L-トリプトファンを選択的に分解し、残存D-トリプトファンを分離、採取する方法（特許文献９／特開平11-042097）。
【０００６】
しかし、これらの方法は、原料が高価、工程が煩雑、収率が低い、などの問題があり、D-トリプトファンを高収率、安価に製造することは非常に困難である。これらの方法に対し、次に示すようなD-アミノ酸製造方法も知られている。
８）D-アミノアシラーゼを用いてN-アセチル-DL-アミノ酸の一方のエナンチオマーであるN-アセチル-D-アミノ酸を加水分解し、D-アミノ酸を生産する方法（特許文献１０／特開昭53-059092）。
この方法は、安価に入手できるL-トリプトファンと無水酢酸から合成されるN-アセチル-DL-トリプトファンを出発物質として一段階の酵素的反応により、D-トリプトファンを製造することができる。
【０００７】
D-アミノアシラーゼを生産する微生物として、以下の微生物が報告されている。
シュードモナス（Pseudomonas）属；
シュードモナス スピーシーズ AAA6029（Pseudomonas sp. AAA6029）（文献２／Chem. Pharm. Bull., 26, 2698（1978））
シュードモナス スピーシーズ 1158（Pseudomonas sp. 1158）（文献３／J. Antibiot., 33, 550 （1980））
シュードモナス スピーシーズ 5f-1（Pseudomonas sp. 5f-1）（文献４／Appl. Environ. Microbiol. 57, 2540（1991））
【０００８】
ストレプトマイセス（Streptomyces）属；
ストレプトマイセス オリバセウス（Streptomyces olivaceus）（文献５／Argric. Biol. Chem., 42, 107 （1978））
ストレプトマイセス オリバセウス 62-3（Streptomyces olivaceus 62-3）（文献６／Argric. Biol. Chem., 44, 1089（1980））
ストレプトマイセス オリバセウス S-62（Streptomyces olivaceus S-62）（特許文献１０／特開昭53-59092）
ストレプトマイセス サーモニトリフィカンス CS5-9（Streptomyces thermonitrificans CS5-9）（特許文献１１／特開2002-45179）
【０００９】
アルカリゲネス（Alcaligenes）属；
アルカリゲネス デニトリフィカンス サブスピーシーズ デニトリフィカンス DA181（Alcaligenes denitrificans subsp. denitrificans DA181）（文献７／Appl. Environ. Microbiol., 54, 984（1988））
アルカリゲネス フェーカリス DA1（Alcaligenes faecalis DA1）（文献８／Appl. Environ. Microbiol., 57, 1259（1991））
アルカリゲネス キシロースオキシダンス サブスピーシーズ キシロースオキシダンス A-6（Alcaligenes xylosoxydans subsp. xylosoxydans A-6）の酸性N-アシル-D-アミノ酸に作用する酵素（文献９／FEBS, 289, 44（1991）、文献１０／Biosci. Biotech. Biochem., 57, 1145（1993））と中性N-アシル-D-アミノ酸に作用する酵素（文献１１／Biosci. Biotech. Biochem., 57, 1149（1993））
アルカリゲネス デニトリフィカンス サブスピーシーズ キシロースオキシダンス MI-4（Alcaligenes denitrificans subsp. xylosoxydans MI-4）（文献１２／J. Ferment. Bioeng., 71, 79（1991））
アルカリゲネス スピーシーズ（Alcaligenes sp.）（特許文献１２／WO00/23598）、
【００１０】
ステノトロフォモナス マルトフィリア（Stenotrophomonas maltophilia）（文献１３／J. Industrial Microbiol. Biotechnol., 21, 296（1998））
アースロバクター ハイドロカーボグルタミカス（Arthrobacter hydrocarboglutamicus）（特許文献１３／特開平11-113592）
アミコラトプシス オリエンタリス（Amycolatopsis orientaris）（特許文献１４／特開平11-98982）
セベキア ベニハナ（Sebekia benihana）（特許文献１５／特開平11-318442）
ヒポマイセス マイコフィラス（Hypomyces mycophilus）（特許文献１６／特開2000-41684）
ロドコッカス ロドクロス（Rhodococcus rhodochrous）
ピメロバクター シンプレックス（Pimelobacter  simplex）（特許文献１７／特開平06-22789）、
メチロバクテリウム メソフィリカム（Methylobacterium mesophilicum）
ノカルディオイデス サーモリラシナス（Nocardioides thermolilacinus）（特許文献１８／WO02/061077）
トリコデルマ ハージアナム （Trichoderma harzianum）
【００１１】
これら公知のD-アミノアシラーゼの中で、ステノトロフォモナス（Stenotrophomonas）属、ロドコッカス（Rhodococcus） 属、及びピメロバクター（Pimelobacter）属由来の酵素の精製に関しては報告されておらず、その性質は解明されていない。アースロバクター（Arthrobacter）属由来の酵素では、精製酵素が報告されているが、その性質は未だ解明されていない。
シュードモナス（Pseudomonas）属由来のN-アシル-D-グルタミン酸アミドヒドロラーゼ、及びアルカリゲネス（Alcaligenes）属のA-6株由来のN-アシル-D-グルタミン酸デアセチラーゼ、N-アシル-D-アスパラギン酸アミドヒドロラーゼ、D-アミノアシラーゼでは、N-アセチル-D-トリプトファンに対して不活性であると報告されている。
【００１２】
また、文献記載値より、シュードモナス（Pseudomonas）属、ストレプトマイセス（Streptomyces）属、トリコデルマ（Trichoderma）属、及びアミコラトプシス（Amycolatopsis）属由来の酵素では、N-アセチル-D-トリプトファンに対する活性が10 U/mg以下、又は、N-アセチル-D-トリプトファンに対する作用が報告されていない。
さらに、アルカリゲネス（Alcaligenes）属の他の種DA1株、ヒポマイセス（Hypomyces）属、及びセベキア（Sebekia）属由来の酵素の活性は100 U/mg以下である。一方、アルカリゲネス（Alcaligenes）属の他の種DA181株では、N-アセチル-D-トリプトファンに対して約600 U/mgと高い活性が報告されている。しかしこの酵素はN-アセチル-L-トリプトファンに対しても約11 U/mgの活性を有しており、厳密な立体選択性を有していない。
【００１３】
また、アルカリゲネス スピーシーズ （Alcaligenes sp.）由来の新規D-アミノアシラーゼ（特許文献１２／WO00/23598）がN-アセチル-D-トリプトファンに作用することが報告されている。しかし、25 mMのN-アセチル-DL-トリプトファン、又は10 mMのN-アセチル-D-トリプトファンに対する加水分解活性を有するという報告があるに過ぎない。また、そのD-アミノアシラーゼは、10 g/Lの濃度のN-アセチル-D-トリプトファンの加水分解反応を触媒できる新規酵素であると報告されている。
これに対して公知のアルカリゲネス・デリトニフィカンス・サブスピーシーズ・キシロースオキシダンス MI-4（Alcaligenes denitrificans subsp. xylosoxydans MI-4）株由来のD-アミノアシラーゼにおいては、図１に示したように、150 g/LのN-アセチル-DL-トリプトファン、つまり75 g/LのN-アセチル-D-トリプトファン相当の基質から約2.5 g/LのD-トリプトファンを生成することができた。したがって該酵素は、このような濃度の基質に対しても加水分解する能力を十分に有していることを確認した。
【００１４】
また、メチロバクテリウム メソフィリカム（Methylobacterium mesophilicum）、及びノカルディオイデス サーモリラシナス（Nocardioides thermolilacinus）由来のD-アミノアシラーゼは、N-アセチル-D-トリプトファンに作用し、100g/Lの濃度によっても触媒反応に対する阻害を受けにくいことが報告されている。しかしながら、両酵素におけるN-アセチル-L-トリプトファンによる拮抗阻害に関しては何も記載がない。また、両酵素に関して詳細な報告がなく、特にノカルディオイデス サーモリラシナス（Nocardioides thermolilacinus）由来の酵素に関しては、精製されておらず、諸性質が不明である。
【００１５】
メチロバクテリウム メソフィリカム（Methylobacterium mesophilicum）由来のD-アミノアシラーゼ遺伝子を含むDNAによって形質転換した大腸菌は、100 g/Lの濃度のN-アセチル-DL-トリプトファンに作用し、その基質中のN-アセチル-D-トリプトファンから約90%の収率でD-トリプトファンを生成することが報告されている（特許文献１８／WO02/061077）。しかし、それ以上の基質濃度におけるD-トリプトファンの生成に関する報告はない。工業的にN-アセチル-DL-トリプトファンから加水分解反応によりD-トリプトファンを製造するためには、より高濃度でD-トリプトファンを製造できることが望ましい。
【００１６】
【非特許文献１】Methods in Enzymology. 3, 554
【非特許文献２】Chem. Pharm. Bull., 26, 2698（1978）
【非特許文献３】J. Antibiot., 33, 550 （1980）
【非特許文献４】Appl. Environ. Microbiol. 57, 2540（1991）
【非特許文献５】Argric. Biol. Chem., 42, 107 （1978）
【非特許文献６】Argric. Biol. Chem., 44, 1089（1980）
【非特許文献７】Appl. Environ. Microbiol., 54, 984（1988）
【非特許文献８】Appl. Environ. Microbiol., 57, 1259（1991）
【非特許文献９】FEBS, 289, 44（1991）
【非特許文献１０】Biosci. Biotech. Biochem., 57, 1145（1993）
【非特許文献１１】Biosci. Biotech. Biochem., 57, 1149（1993）
【非特許文献１２】J. Ferment. Bioeng., 71, 79（1991）
【非特許文献１３】J. Industrial Microbiol. Biotechnol., 21, 296（1998）
【特許文献１】WO94/03613
【特許文献２】特開昭54-2398
【特許文献３】特開昭54-89089
【特許文献４】特開昭61-177991
【特許文献５】特開平09-75097
【特許文献６】特開平02-234678
【特許文献７】特開昭57-013000
【特許文献８】特開昭62-205790
【特許文献９】特開平11-042097
【特許文献１０】特開昭53-059092
【特許文献１１】特開2002-45179
【特許文献１２】WO00/23598
【特許文献１３】特開平11-113592
【特許文献１４】特開平11-98982
【特許文献１５】特開平11-318442
【特許文献１６】特開2000-41684
【特許文献１７】特開平06-22789
【特許文献１８】WO02/061077
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明は、高濃度のN-アセチル-DL-トリプトファンを基質として、高濃度のD-トリプトファンを立体選択的に生成するD-アミノアシラーゼ変異体と、それをコードする遺伝子の提供を課題とする。更に本発明は、これらのD-アミノアシラーゼ変異体やその遺伝子を用いたD-アミノ酸の製造方法の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明者等は、アルカリゲネス・デリトニフィカンス・サブスピーシーズ・キシロースオキシダンス MI-4（Alcaligenes denitrificans subsp. xylosoxydans MI-4）株由来のD-アミノアシラーゼがN-アセチル-D-メチオニンに極めて高い比活性（404 U/mg）を有することに着目した。しかし該D-アミノアシラーゼは、文献記載値によると、N-アセチル-D-トリプトファンに対して20 U/mgの活性しか有しないと報告されている。しかし、本研究者等が該酵素遺伝子を大腸菌においてクローニングし、そのクローン化酵素を精製したところ、該酵素はN-アセチル-D-トリプトファンに対して528 U/mgの非常に高い活性を有していることを確認した。また、該酵素はN-アセチル-L-トリプトファンに対しては不活性な酵素であり、N-アセチル-DL-トリプトファンからD-トリプトファンを生産するために有用な酵素であると考えられる。
【００１９】
しかし、本発明者等が、該D-アミノアシラーゼを用いてN-アセチル-DL-トリプトファンの加水分解反応によるD-トリプトファンの生産を試みたところ、一定濃度以上の基質濃度では、D-トリプトファン生成量が減少することが確認された。本発明者らは、D-トリプトファン生成量の減少の原因を追求した。その結果、該D-アミノアシラーゼは、一定濃度以上のN-アセチル-D-トリプトファン、あるいはN-アセチル-L-トリプトファンにより、強い阻害を受けることを確認した。
【００２０】
D-アミノ酸の工業的な製造においては、できるだけ高い濃度でD-アミノ酸を生成しうる酵素が必要である。そのためには、高い基質濃度においても酵素活性を維持できることが重要な条件となる。したがってD-トリプトファンを製造するためには、N-アセチル-D-トリプトファンによる触媒反応の阻害を受けにくいD-アミノアシラーゼの提供が望まれる。
【００２１】
近年、遺伝子工学技術の進歩により、タンパク質アミノ酸配列を人為的に改変することによって、タンパク質のもつ諸性質を、より工業的に優位な性質に改変することが可能となってきた。本発明者らは、上記課題の解決を目的として、アルカリゲネス・デニトリフィカンス・サブスピーシーズ・キシロースオキシダンス MI-4（Alcaligenes denitrificans subsp. xylosoxydans MI-4）由来D-アミノアシラーゼ遺伝子の改変を試みた。その結果、高濃度のN-アセチル-DL-トリプトファンを変換し、高濃度のD-トリプトファンを生産することができる変異型D-アミノアシラーゼを得ることに成功した。。
さらに本発明者等は、改変したD-アミノアシラーゼ変異体を適当な条件下でN-アシル-DL-アミノ酸に作用させることにより、効率的にD-アミノ酸を製造することが可能であることを見出した。特に本発明者等が見出したD-アミノアシラーゼ変異体は、野生型D-アミノアシラーゼと比べて、N-アセチル-D-トリプトファンによる阻害を受けにくい。この特徴により、本発明のD-アミノアシラーゼ変異体は、高濃度でのD-トリプトファンの製造に適しており、産業上の有用性に優れた酵素であることが確認された。
【００２２】
すなわち本発明は、以下の変異型D-アミノアシラーゼ、及びその用途に関する。
〔１〕次の（ａ）または（ｂ）に記載のアミノ酸配列を含む蛋白質であって、N-アセチル-D-トリプトファン存在下でD-トリプトファンを生成する活性を有する蛋白質。
（ａ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列において、１５４位のアラニン、３４７位のメチオニン、および３７４位のアルギニンからなる群から選択された少なくとも１つのアミノ酸残基が、他のアミノ酸へ置換されたアミノ酸配列
（ｂ）（ａ）に記載のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列
〔２〕配列番号：１に記載のアミノ酸配列において、以下の（Ａ）−（Ｃ）からなる群から選択されるいずれかに記載のアミノ酸残基の置換を有するアミノ酸配列を含む〔１〕に記載の蛋白質。
（Ａ）１５４位のアラニンの、バリン、システイン、およびスレオニンからなる群から選択されたいずれかのアミノ酸への置換、
（Ｂ）３４７位のメチオニンの、グリシン、グルタミン、セリン、アスパラギン、アラニン、イソロイシン、およびプロリンからなる群から選択されたいずれかのアミノ酸への置換、および
（Ｃ）３７４位のアルギニンの、フェニルアラニン、リジン、ロイシン、タイロシン、ヒスチジン、イソロイシン、およびトリプトファンからなる群から選択されたいずれかのアミノ酸への置換
〔３〕配列番号：１に記載のアミノ酸配列において、１５４位のアラニン、３４７位のメチオニン、および３７４位のアルギニンからなる群から選択された２つ以上のアミノ酸残基が、他のアミノ酸へ置換された変異を含むアミノ酸配列を含む〔１〕に記載の蛋白質。
〔４〕配列番号：１に記載のアミノ酸配列において、１５４位のアラニン、３４７位のメチオニン、および３７４位のアルギニンが、他のアミノ酸へ置換された変異を含むアミノ酸配列を含む〔３〕に記載の蛋白質。
〔５〕１２０ g/LのN-アセチル-DL-トリプトファンを基質として、該基質中のN-アセチル-D-トリプトファンを特異的に加水分解し、80%以上の収率でD-トリプトファンを生成する〔１〕に記載の蛋白質。
〔６〕N-アセチル-D-トリプトファンおよびN-アセチル-L-トリプトファン存在下でD-トリプトファンを生成する活性を有する〔１〕に記載の蛋白質。
〔７〕配列番号：１に記載のアミノ酸配列において、（１）〜（１０）のいずれかに記載の変異を含むアミノ酸配列を含む蛋白質。
（１）１５４位：アラニンからバリンへの変異、および
３４７位：メチオニンからアラニンへの変異
（２）３４７位：メチオニンからアラニンへの変異、および
３７４位：アルギニンからヒスチジンへの変異
（３）３４７位：メチオニンからアラニンへの変異、および
３７４位：アルギニンからフェニルアラニンへの変異
（４）３４７位：メチオニンからグルタミンへの変異、および
３７４位：アルギニンからヒスチジンへの変異
（５）１５４位：アラニンからバリンへの変異、
３４７位：メチオニンからアラニンへの変異、および
３７４位：アルギニンからフェニルアラニンへの変異
（６）１５４位：アラニンからバリンへの変異、
３４７位：メチオニンからグルタミンへの変異、および
３７４位：アルギニンからヒスチジンへの変異
（７）１５４位：アラニンからスレオニンへの変異、
３４７位：メチオニンからアラニンへの変異、および
３７４位：アルギニンからヒスチジンへの変異
（８）１５４位：アラニンからスレオニンへの変異、
３４７位：メチオニンからアラニンへの変異、および
３７４位：アルギニンからフェニルアラニンへの変異
（９）１５４位：アラニンからスレオニンへの変異、
３４７位：メチオニンからグルタミンへの変異、および
３７４位：アルギニンからヒスチジンへの変異
（１０）１５４位：アラニンからスレオニンへの変異、
３４７位：メチオニンからグルタミンへの変異、および
３７４位：アルギニンからフェニルアラニンへの変異
〔８〕〔１〕または〔７〕に記載の蛋白質をコードするDNA。
〔９〕配列番号：３に記載の塩基配列において、以下の（ａ）−（ｃ）からなる群から選択されるいずれかに記載の塩基配列の置換を含む塩基配列を含む〔８〕に記載のDNA。
（ａ）460-462の塩基配列gcgの、gta、tgc、およびacaからなる群から選択されたいずれかの塩基配列への置換、
（ｂ）1039-1041の塩基配列atgの、ggt、caa、tct、aac、gca、ata、およびcccからなる群から選択されたいずれかの塩基配列への置換
（ｃ）1120-1122の塩基配列cgcの、ttt、aaa、ctt、tat、cac、ata、およびtggからなる群から選択されたいずれかの塩基配列への置換
〔１０〕配列番号：３に記載の塩基配列において、460-462の塩基配列gcg、1039-1041の塩基配列atg、および1120-1122の塩基配列cgcからなる群から選択された２つ以上の領域の塩基配列が、他の塩基配列へ置換された変異を含む塩基配列を含む〔８〕に記載のDNA。
〔１１〕配列番号：３に記載の塩基配列において、460-462の塩基配列gcg、1039-1041の塩基配列atg、および1120-1122の塩基配列cgcの塩基配列が、他の塩基配列へ置換された変異を含む塩基配列を含む〔１０〕に記載のDNA。
〔１２〕配列番号：３に記載の塩基配列を有するDNA。
〔１３〕〔８〕に記載のDNAが挿入されたベクター。
〔１４〕〔１３〕に記載のベクターを保持する形質転換体。
〔１５〕DNAが〔９〕に記載のDNAであり、宿主が大腸菌である〔１４〕に記載の形質転換体。
〔１６〕〔１４〕に記載の形質転換体を培養する工程を含む、〔１〕または〔７〕に記載の蛋白質を製造する方法。
〔１７〕以下の（ａ）から（ｃ）から選択された少なくとも１つの酵素活性物質をN-アシル-DL-アミノ酸に接触させ、生成するD-アミノ酸を回収する工程を含む、D-アミノ酸の製造方法。
（ａ）〔１〕または〔７〕に記載の蛋白質、
（ｂ）〔１４〕に記載の形質転換体、および
（ｃ）（ｂ）に記載の形質転換体の処理物
〔１８〕N-アシル-DL-アミノ酸がN-アシル-DL-トリプトファンである〔１７〕に記載の製造方法。
〔１９〕N-アシル-DL-トリプトファンがN-アセチル-DL-トリプトファンである〔１８〕に記載の製造方法。
〔２０〕N-アセチル-DL-トリプトファンの濃度が１２０ g/L以上である〔１９〕に記載の製造方法。
【発明の効果】
【００２３】
本発明により、N-アセチル-D-トリプトファンによる基質阻害、又は/及びN-アセチル-L-トリプトファンによる拮抗阻害が低減した変異型D-アミノアシラーゼを効率良く製造することができる。
本発明の変異型D-アミノアシラーゼを高濃度N-アセチル-DL-トリプトファンの立体選択的加水分解反応に用いることで、D-トリプトファンの製造効率を向上させることができる。高濃度、例えば200 g/LのN-アセチル-DL-トリプトファンを基質として、その基質中のN-アセチル-D-トリプトファンの加水分解反応により80%以上の収率でD-トリプトファンを合成することができるほど基質阻害、拮抗阻害が低減したD-アミノアシラーゼはこれまでに知られていない。本発明のD-アミノアシラーゼによって高効率に合成することができるD-トリプトファンは、医薬品原料等として有用な化合物である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
本発明は、アルカリゲネス・デニトリフィカンス・サブスピーシーズ・キシロースオキシダンス MI-4（Alcaligenes denitrificans subsp. xylosoxydans MI-4）由来D-アミノアシラーゼの変異体を提供する。
【００２５】
本発明において、D-アミノアシラーゼとは、N-アシル-D-アミノ酸に作用して、有機酸、及びD-アミノ酸の生成を触媒する酵素を言う。またこのD-アミノアシラーゼに対する阻害とは、N-アセチル-D-トリプトファンに対する基質阻害及び／またはN-アセチル-L-トリプトファンに対する拮抗阻害を言う。本発明において、D-アミノアシラーゼ活性は、当業者によって一般的に行われる方法によって測定することができる。例えば、D-アミノアシラーゼ活性の測定方法として次の方法を例示することができる。
【００２６】
酵素反応は、20 mMのN-アセチル-D-トリプトファン（Sigma製）、50 mMのトリス-塩酸緩衝液（pH7.5）、及び酵素液を含む全量1.0 mLの反応系で、30℃、10分間行い、TCA反応停止液（0.11 M トリクロロ酢酸、0.22 M 酢酸ナトリウム、0.33 M 酢酸から成る）を0.5 mL添加することによって反応を停止する。生成したD-トリプトファンは、TNBS法（Biosci. Biotech.Biochem., 58, 24（1994））に定量することができる。
例えば、0.25 mLの反応終了液に0.25 mLの100 mM Na2B4O7を加え、更に、10 μLの110 mM TNBS（Trinitrobenzenesulfonic acid）溶液を加え、素早く攪拌する。5分間静置した後、1.5 mMのNa2SO3を含む100 mM NaHPO4を1 mL加え、呈色反応を停止し、その溶液の420 nmにおける吸光度を測定する。酵素活性は、30℃において1分間に1 μmolのD-トリプトファンの生成を触媒する酵素量を1単位（unit）として表される。
【００２７】
本発明において、酵素反応、又は菌体反応によって生成したD-トリプトファン量は、ODSカラムを用いた高速液体クロマトグラフィー（カラム：Wakosil II 5C18（φ4.6x250mm）（和光純薬株式会社製）、溶離液：CH3CN / 50mM KH2PO4・H3PO4（pH2.5）=2:8、検出 A280nm、流速 1.0mL/min、カラム温度 40℃）によって、定量することができる。保持時間は、D-トリプトファンが 3.8分、N-アセチル-DL-トリプトファンが 10.7分であった。また、タンパク質量の測定は、Bio-Rad Protein Assay Kit（Bio-Rad 製）を用いて測定した。標準タンパク質としては、Bovine Plasma Albuminを用いた。
【００２８】
本発明においては、アミノ酸配列におけるアミノ酸残基の改変を次のように記載する。すなわち、配列番号：１におけるアミノ酸の位置をN末端を１とする数字で表し、その左側に野生型のアミノ酸残基を、そして右側に改変するアミノ酸残基を示す。たとえば、154位のAlaをアミノ酸Xに置き換えられたことをA154Xと記載する。同様に、347位のMetをアミノ酸Yに置き換えられたことをM347Y、374位のArgをアミノ酸Zに置き換えられたことをR374Zと記載する。そして、これら３つのアミノ酸残基が他のアミノ酸X、Y、及びZに置き換えられたことをA154X/M347Y/R374Zと表記する。
【００２９】
アルカリゲネス・デニトリフィカンス・サブスピーシーズ・キシロースオキシダンス MI-4（Alcaligenes denitrificans subsp. xylosoxydans MI-4）由来のD-アミノアシラーゼのアミノ酸配列を配列番号：１に示す。本発明のD-アミノアシラーゼ変異体は、配列番号：１に記載のアミノ酸配列において、１５４位のアラニン、３４７位のメチオニン、および３７４位のアルギニンからなる群から選択された少なくとも１つのアミノ酸残基が、他のアミノ酸へ置換されたアミノ酸配列を有する。本発明において、これら３ヵ所のアミノ酸残基のうちの少なくとも１つ、たとえば任意の１〜２ヶ所、あるいは任意の１〜３ヶ所のアミノ酸残基を、他のアミノ酸残基に置換することにより、本発明の変異体とすることができる。
【００３０】
１５４位の置換アミノ酸は、好ましくはバリン、システイン、又はスレオニンであり、より好ましくはバリンである。３４７位の置換アミノ酸は、好ましくは、グリシン、グルタミン、セリン、アスパラギン、アラニン、イソロイシン、又はプロリンであり、より好ましくはアラニンである。３７４位の置換アミノ酸は、好ましくは、フェニルアラニン、リジン、ロイシン、チロシン、ヒスチジン、イソロイシン、又はトリプトファンであり、より好ましくはフェニルアラニンである。
【００３１】
本発明は、配列番号：１に記載のアミノ酸配列において、１５４位のアラニン、３４７位のメチオニン、および３７４位のアルギニンからなる群から選択された少なくとも１つのアミノ酸残基が、他のアミノ酸へ置換されたアミノ酸配列を有する蛋白質を提供する。本発明の蛋白質は、D-アミノアシラーゼ活性を有し、かつアルカリゲネス・デニトリフィカンス・サブスピーシーズ・キシロースオキシダンス MI-4（Alcaligenes denitrificans subsp. xylosoxydans MI-4）由来のD-アミノアシラーゼに比較して、N-アセチル-D-トリプトファンによる基質阻害を受けにくい蛋白質である。以下、アルカリゲネス・デニトリフィカンス・サブスピーシーズ・キシロースオキシダンス MI-4（Alcaligenes denitrificans subsp. xylosoxydans MI-4）由来のD-アミノアシラーゼを、野生型D-アミノアシラーゼと記載する場合がある。本発明の好ましい態様においては、野生型に比較して、前記基質阻害に加えてN-アセチル-L-トリプトファンによる拮抗阻害をも受けにくい蛋白質が提供される。
【００３２】
本発明の蛋白質の好ましいアミノ酸配列は、配列番号：１に記載のアミノ酸配列において、１５４位のアラニン、３４７位のメチオニン、および３７４位のアルギニンがそれぞれ表１のように改変されたアミノ酸配列を有する。このような変異を有する蛋白質は、前記基質阻害、および前記拮抗阻害の両者に対する耐性を有する本発明における好ましい蛋白質である。
【００３３】
〔表１〕
------------------------------------------------
１５４位    ３４７位    ３７４位
アラニン    メチオニン  アルギニン
------------------------------------------------
（１）  バリン      アラニン      −            
（２）    −        アラニン    ヒスチジン      
（３）    −        アラニン    フェニルアラニン
（４）    −        グルタミン  ヒスチジン      
（５）  バリン      アラニン    フェニルアラニン
（６）  バリン      グルタミン  ヒスチジン      
（７）  スレオニン  アラニン    ヒスチジン      
（８）  スレオニン  アラニン    フェニルアラニン
（９）  スレオニン  グルタミン  ヒスチジン      
（１０）スレオニン  グルタミン  フェニルアラニン
------------------------------------------------
−：置換なし
【００３４】
本発明の変異体は、上記のアミノ酸配列の変異を有し、かつN-アセチル-D-トリプトファン、及び/又はN-アセチル-L-トリプトファンによる阻害が低減されていれば、上記変異に加えて、更に付加的に１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入などの変異を有していてもよい。このような変異は、人為的に導入することもできるし、自然界において生じることもある。本発明の変異体には、これら双方の変異体が含まれる。本発明の変異体における変異するアミノ酸数は、通常、50アミノ酸以内であり、好ましくは30アミノ酸以内であり、さらに好ましくは10アミノ酸以内（例えば、5アミノ酸以内、3アミノ酸以内）である。
【００３５】
本発明の変異体において、１５４位、３４７位、あるいは３７４位以外の位置にアミノ酸の欠失、付加、あるいは挿入などの変異を伴うときには、N末端からカウントしたこれらのアミノ酸残基の位置が変動する場合がある。このような場合には、変動後のアミノ酸配列における、配列番号：１において１５４位、３４７位、あるいは３７４位に相同な位置にあるアミノ酸残基を他のアミノ酸配列に置換して、本発明による変異体とする。すなわち本発明の蛋白質には、配列番号：１に記載のアミノ酸配列において、１５４位のアラニン、３４７位のメチオニン、および３７４位のアルギニンに相同な位置のアミノ酸残基からなる群から選択された少なくとも１つのアミノ酸残基が、他のアミノ酸へ置換されたアミノ酸配列を有し、かつN-アセチル-D-トリプトファン、及び/又はN-アセチル-L-トリプトファンによる阻害が低減された蛋白質が含まれる。
【００３６】
相同な位置は、これら変異位置の周辺のアミノ酸配列を配列番号：１における変異位置周辺のアミノ酸配列と整列させることによって明らかにすることができる。このような操作は、アミノ酸配列のアライメントと呼ばれる。アライメントのためのアルゴリズムとして、たとえばBLASTを示すことができる。当業者は、異なる長さのアミノ酸配列の間で、アライメントにより相同なアミノ酸の位置を明らかにすることができる。したがって、このようにして明らかにされた相同な位置においてたとえば表１に示すようなアミノ酸残基に置換されたアミノ酸残基を有するアミノ酸配列を含む蛋白質は、本発明における好ましい変異体である。
【００３７】
本発明において、１５４位のアラニン、３４７位のメチオニン、および３７４位以外の位置に付加的な変異を含むアミノ酸配列は、配列番号：１に記載のアミノ酸配列と高い相同性を維持することが望ましい。高い相同性とは、たとえば８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上の相同性を言う。
【００３８】
本発明における付加的な変異は、保存的置換であることが望ましい。一般に蛋白質の機能の維持のためには、置換するアミノ酸は、置換前のアミノ酸と類似の性質を有するアミノ酸であることが好ましい。このようなアミノ酸残基の置換は、保存的置換と呼ばれている。
【００３９】
例えば、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Met、Phe、Trpは、共に非極性アミノ酸に分類されるため、互いに似た性質を有する。また、非荷電性としては、Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn、Glnが挙げられる。また、酸性アミノ酸としては、AspおよびGluが挙げられる。また、塩基性アミノ酸としては、Lys、Arg、Hisが挙げられる。
【００４０】
本発明の蛋白質は、アルカリゲネス・デニトリフィカンス・サブスピーシーズ・キシロースオキシダンス MI-4（Alcaligenes denitrificans subsp. xylosoxydans MI-4）由来のD-アミノアシラーゼと比較して、N-アセチル-D-トリプトファンによる基質阻害、及び/又はN-アセチル-L-トリプトファンによる拮抗阻害が低減されていることによって特徴付けられる。基質阻害、あるいは拮抗阻害が低減される化合物は、これらの化合物に限定されない。すなわち、N-アセチル-D-トリプトファンによる基質阻害、及び/又はN-アセチル-L-トリプトファンによる拮抗阻害に対する耐性を有する限り、更に付加的にこれらの化合物以外の化合物による基質阻害、または拮抗阻害が低減された場合も含まれる。また、更なる遺伝子改変によって、基質阻害や拮抗阻害に対する耐性以外の付加的な形質を導入された変異体とすることもできる。
【００４１】
本発明の蛋白質は、12%以上の濃度のN-アセチル-DL-トリプトファンに作用し、80%以上の収率でD-トリプトファンを生産することができる。本発明の望ましい蛋白質は、15%以上、あるいは17%の濃度のN-アセチル-DL-トリプトファンに作用し、80%以上の収率でD-トリプトファンを生産することができる。
加えて本発明における望ましい蛋白質は、20%以上の濃度のN-アセチル-DL-トリプトファンに作用し、50%以上の収率でD-トリプトファンを生産することができる。更に好ましい蛋白質は、22%以上の濃度のN-アセチル-DL-トリプトファンに作用し、50%以上の収率でD-トリプトファンを生産することができる。
上記の収率は、10 U/mLの酵素量で30℃、pH8.0の反応液において、基質中のN-アセチル-D-トリプトファンから80%以上、または50%以上の収率でD-トリプトファンを生産することをいう。
【００４２】
例えば、ろ過や遠心分離で集めた菌体を緩衝液に懸濁し、Bead-Beater（BIOSPEC PRODUCT）を用いて破砕処理し、野生型D-アミノアシラーゼ、又はD-アミノアシラーゼ変異体抽出液を得る。こうして得られた10 U/mLの酵素液、300 mM トリス-塩酸緩衝液（pH8.0）、及び12%、15%、17%、20%、及び22%のN-アセチル-DL-トリプトファンをそれぞれ含む反応液を30℃、24時間振とうしながら反応させることにより、12%、15%、17%の基質からは80%以上の収率で、20%、22%の基質からは50%以上の収率でD-トリプトファンを生産することができる。
【００４３】
また本発明は、本発明の蛋白質をコードするDNAに関する。配列番号：１のアミノ酸配列をコードする塩基配列と配列番号：２に示した。したがって、配列番号：１に記載のアミノ酸配列において、１５４位のアラニン、３４７位のメチオニン、および３７４位のアルギニンに相同な位置のアミノ酸をコードするコドンを置換後のアミノ酸残基に対応するコドンに置換した塩基配列からなるDNAが、本発明のDNAに含まれる。アミノ酸配列をコードする塩基配列は、遺伝暗号にしたがって各アミノ酸をコードするコドンを対応させることによって明らかにすることができる。アミノ酸をコードするコドンは単一ではなく、縮重によって複数のコドンが対応することは周知の事項である。したがって、配列番号：１に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列には、配列番号：２に示す塩基配列のみならず、異なるコドンに基づくあらゆる塩基配列が含まれる。
【００４４】
本発明は、このようにして得られた本発明のD-アミノアシラーゼをコードするDNAを、公知の発現ベクターに挿入することによって作製されるD-アミノアシラーゼ発現ベクターを提供する。該発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養することにより、本発明のD-アミノアシラーゼを、組換え体タンパク質として得ることができる。
【００４５】
本発明の蛋白質は、以下のようにして得ることができる。たとえば、野生型のD-アミノアシラーゼ遺伝子を元に、目的とする位置にアミノ酸の変異を導入することにより、本発明の蛋白質をコードする遺伝子を得ることができる。野生型のアルカリゲネス・デニトリフィカンス・サブスピーシーズ・キシロースオキシダンス MI-4（Alcaligenes denitrificans subsp. xylosoxydans MI-4）由来のD-アミノアシラーゼ遺伝子の塩基配列を配列番号：２に示した。
【００４６】
本発明によるDNAは、本発明の蛋白質の製造に有用である。本発明のDNAを適当な宿主において発現させることにより、組み換え蛋白質として目的のアミノ酸配列を有する蛋白質を得ることができる。宿主におけるDNAの発現にあたり、生産性を向上させるための様々な改変をDNAに加えることができる。たとえば、宿主におけるレアコドンの除去や、コドン使用頻度やGC含量を宿主本来の条件に適合させるように、改変することができる。塩基配列の改変においては、遺伝暗号の縮重を利用して、同じコドンに変換することによって、DNAによってコードされるアミノ酸配列を維持することができる。
【００４７】
たとえば、大腸菌内におけるD-アミノアシラーゼの生産量を向上させるため、また大腸菌内での該D-アミノアシラーゼ遺伝子の安定性を向上させるために、DNAの塩基配列を改変することができる。すなわち大腸菌におけるレアコドンを除き、コドン使用頻度と構造遺伝子中のGC含量を大腸菌に合わせて調整することができる。本発明の変異体をコードする塩基配列からなるDNAを、大腸菌における発現に有利な塩基配列に改変した塩基配列を配列番号：３に示す。配列番号：３に記載の塩基配列は、配列番号：１に記載のアミノ酸配列をコードする。
【００４８】
したがって、配列番号：３に記載の塩基配列を改変して、本発明の変異体をコードするDNAをデザインすることによって、大腸菌における本発明による変異体の発現に有利なDNAを得ることができる。以下に、１５４位、３４７位、および３７４位における本発明の好ましい置換アミノ酸残基をコードする塩基配列を例示した。配列番号：３に記載の塩基配列において、460-462、1039-1041、および1120-1122からなる群から選択された少なくとも１つの領域が、それぞれ以下に示す塩基配列に置換された塩基配列を有するDNAは、本発明の好ましいDNAとして示すことができる。
１５４位      ：バリン/gta
(Ala/460-gcg)   システイン/tgc
スレオニン/aca
３４７位      ：グリシン/ggt
(Met/1039-atg)  グルタミン/caa
セリン/tct
アスパラギン/aac
アラニン/gca
イソロイシン/ata
プロリン/ccc
３７４位      ：フェニルアラニン/ttt
(Arg/1120-cgc)  リジン/aaa
ロイシン/ctt
タイロシン/tat
ヒスチジン/cac
イソロイシン/ata
トリプトファン/tgg
【００４９】
また本発明は、本発明の蛋白質をコードするDNAを発現ベクターに挿入することによって作製されるD-アミノアシラーゼ発現ベクターを提供する。該発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養することにより、本発明の該D-アミノアシラーゼ変異体を、組換えタンパク質として得ることができる。改変遺伝子として例えば、配列番号：３に示す塩基配列を有するDNAを挙げることができる。このDNAを含むプラスミドpSL-ADD6は国際寄託されている。該プラスミドに挿入されたDNAは、本発明の変異体の大腸菌による作製において好適に利用することができる。
寄託機関の名称・あて名
名称：独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター
（旧名称：通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所）
あて名：日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号中央第６（郵便番号305-8566）
寄託日  平成１５年１０月１７日（原寄託日  平成１４年１１月１２日）
受託番号  ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８５０８（原寄託番号  ＦＥＲＭ  Ｐ−１９０９４）
【００５０】
D-アミノアシラーゼ変異体を取得するためには、該遺伝子への部位特異的変異導入やランダム変異誘発等のような当業者によって一般的に行われる公知の変異導入技術を利用することができ、例えば、error-prone PCR、部位特異的saturation mutagenesis、cassette mutagenesis、DNA shuffling、StEP等のような変異導入技術を利用することができる（Appl. Microbiol. Biotechnol., 55, 519, 2001）。例えば、変異を導入したいDNAを鋳型として、Taq DNAポリメラーゼの塩基取り込みエラー率を高めたエラー頻度の高いPCR法（error-prone PCR）によってDNAを複製させることにより、目的のDNAへランダムに変異を導入できる。
【００５１】
具体的には、１）PCR反応液組成中のMgCl2濃度を増加させる、２）反応液にMnCl2を添加する、３）反応液中の4種のヌクレオチド濃度を不均等にする、４）反応液へヌクレオチド類似物質を混合させることによって、Taq DNAポリメラーゼの塩基取り込みエラー率を高めたerror-prone PCRを行うことができる。あるいは、高いGC含量を有するなど、塩基置換が導入されやすい鋳型DNAを使用する場合、比較的に間違った塩基の取り込み率が高いTaq DNAポリメラーゼを利用することにより、上記操作の必要なしに行うこともできる。
【００５２】
複製したDNA断片を公知の発現ベクターに挿入し、該発現ベクターで形質転換した形質転換体を得ることにより、変異体ライブラリーを作製することができる。N-アセチル-L-トリプトファンによる拮抗阻害が低減した、又は/且つN-アセチル-D-トリプトファンによる基質阻害が低減した変異体を取得する場合、例えばN-アセチル-L-トリプトファンの濃度比率を高めたN-アセチル-DL-トリプトファン混合物を基質として反応し、D-トリプトファンの生成量を野生型と比較することによって行うことができる。
【００５３】
例えば、形質転換体を培養した培養液を用いて、5%N-アセチル-DL-トリプトファンと1%N-アセチル-L-トリプトファンの混合物を基質として反応し、その反応液のD-トリプトファン生成量が野生型よりも高いものをN-アセチル-L-トリプトファンによる拮抗阻害が低減した、又は/且つN-アセチル-D-トリプトファンによる基質阻害が低減した変異体として得ることができる。
【００５４】
ランダム変異導入により、目的とする効果のある変異部位（アミノ酸置換部位）が明らかになった場合、次の方法により、部位特異的に、且つランダムなアミノ酸置換導入を行うことができ、最適なアミノ酸置換を選択することができる。例えば、アミノ酸置換を導入したい部位に相当するコドンをNNN（NはA、T、G、Cの混合からなる）とし、それを含む計64通りのプライマーを設計、合成する。また、これとセットとなるように、野生型DNAの適当な位置に相当する塩基配列をもつプライマーを合成する。好ましくは、それぞれのプライマーの5’-末端に制限酵素等の認識部位を導入しておく。この2つのプライマーセットを用い、野生型DNAを鋳型としたPCRにより、部位特異的に、あらゆる天然型アミノ酸をコードするコドンを有するDNA断片のライブラリーを作製することができる。
【００５５】
増幅したDNA断片の両端を適当な制限酵素等で切断し、同様に処理した野生型DNAを含む発現ベクターに連結、該発現ベクターで形質転換した形質転換体を得ることにより、特定の部位が他の天然型アミノ酸に置換された酵素を発現するようになった形質転換体ライブラリーを作製することができる。N-アセチル-L-トリプトファンによる拮抗阻害、又は/且つN-アセチル-D-トリプトファンによる基質阻害を低減させるための最適なアミノ酸置換を選抜するためには、N-アセチル-L-トリプトファンの濃度比率をより高めたN-アセチル-DL-トリプトファン混合物を基質として反応し、D-トリプトファンの生成量が高いものを選抜することによって行うことができる。
【００５６】
例えば、形質転換体を培養した培養液を用いて、5% N-アセチル-DL-トリプトファンと2% N-アセチル-L-トリプトファンの混合物を基質として反応し、その反応液のD-トリプトファン生成量が高いものをN-アセチル-L-トリプトファンによる拮抗阻害、又は/且つN-アセチル-D-トリプトファンによる基質阻害を低減させるための最適なアミノ酸残基を有する変異体として得ることができる。2ヶ所以上の好ましいアミノ酸置換部位、及びアミノ酸残基が明らかになった場合、それらのアミノ酸置換を作為的に、あるいはランダムに組み合わせることにより、さらに目的の性質が向上した変異体を得ることができる。例えば、3ヶ所のアミノ酸部位について、各3種類のアミノ酸残基をランダムに組み合わせたい場合、それぞれの変異型酵素遺伝子を含むプラスミドを、3ヶ所の適当な部位で制限酵素等により切断し、アミノ酸置換が起こっている部位を含むDNA断片を精製し、回収する。
【００５７】
変異型酵素遺伝子の全長を生ずるように、それぞれの処理物を全て混合し、T4 DNAリガーゼでランダムに連結することによって、あらゆる変異部位の組み合わせを有する、3アミノ酸置換変異体を含むプラスミドライブラリーを作製することができる。この時、3種類のアミノ酸残基中、1種類を野生型由来のDNA断片にすることにより、2アミノ酸置換変異体、及び1アミノ酸置換変異体を含むプラスミドライブラリーも同時に作製することができる。プラスミドライブラリーで形質転換した形質転換体を得ることにより、1から3アミノ酸置換を有する変異体酵素を発現することができる形質転換体ライブラリーを得ることができる。
【００５８】
N-アセチル-L-トリプトファンによる拮抗阻害、又は/且つN-アセチル-D-トリプトファンによる基質阻害を低減させるための最適なアミノ酸置換の組み合わせを選抜するためには、N-アセチル-L-トリプトファンの濃度比率をさらに高めたN-アセチル-DL-トリプトファン混合物を基質として反応し、D-トリプトファンの生成量が高いものを選抜することにより行うことができる。
【００５９】
例えば、形質転換体を培養した培養液を用いて、2% N-アセチル-DL-トリプトファンと3.5% N-アセチル-L-トリプトファンの混合物を基質として反応し、その反応液のD-トリプトファン生成量が高いものをN-アセチル-L-トリプトファンによる拮抗阻害、又は/且つN-アセチル-D-トリプトファンによる基質阻害を低減させるために最適なアミノ酸置換の組み合わせを有する変異体として得ることができる。
【００６０】
本発明のD-アミノアシラーゼを発現させるために、形質転換の対象となる微生物は、D-アミノアシラーゼをコードするDNAを含む組み換えベクターにより形質転換され、D-アミノアシラーゼを発現することができる生物であれば特に制限されない。このような形質転換体および該形質転換体を培養する工程を含む本発明のD-アミノアシラーゼを製造する方法も本発明に包含される。形質転換体の宿主生物として利用可能な微生物は、例えば以下のような微生物を示すことができる。
【００６１】
宿主ベクター系の開発されている細菌；
エシェリヒア（Escherichia）属
バチルス（Bacillus）属
シュードモナス（Pseudomonas）属
セラチア（Serratia）属
ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属
コリネバクテリイウム（Corynebacterium）属
ストレプトコッカス（Streptococcus）属
ラクトバチルス（Lactobacillus）属等
【００６２】
宿主ベクター系の開発されている放線菌；
ロドコッカス（Rhodococcus）属
ストレプトマイセス（Streptomyces）属等
【００６３】
宿主ベクター系の開発されている酵母；
サッカロマイセス（Saccharomyces）属
クライベロマイセス（Kluyveromyces）属
シゾサッカロマイセス（Schizosaccharomyces）属
チゴサッカロマイセス（Zygosaccharomyces）属
ヤロウイア（Yarrowia）属
トリコスポロン（Trichosporon）属
ロドスポリジウム（Rhodosporidium）属
ピキア（Pichia）属
キャンディダ（Candida）属等
【００６４】
宿主ベクター系の開発されているカビ；
ノイロスポラ（Neurospora）属
アスペルギルス（Aspergillus）属
セファロスポリウム（Cephalosporium）属
トリコデルマ（Trichoderma）属等
【００６５】
形質転換体の作製のための手順および宿主に適合した組み換えベクターの構築は、分子生物学、生物工学、遺伝子工学の分野において慣用されている技術に準じて行うことができる（例えば、Sambrookら、モレキュラー・クローニング、Cold Spring Harbor Laboratories）。
【００６６】
微生物菌体内などにおいて、本発明のD-アミノアシラーゼの変異体遺伝子、又は改変型D-アミノアシラーゼ遺伝子を発現させるためには、まず微生物中で安定に存在するプラスミドベクターまたはファージベクターへ本発明のDNAを導入し、その遺伝情報を転写・翻訳させる。そのためには、転写・翻訳を制御するユニットにあたるプロモーターを本発明のDNA鎖の5'-側上流に、より好ましくはターミネーターを3'-側下流に、それぞれ組み込めばよい。このプロモーター、ターミネーターとしては、宿主として利用する微生物中において機能することが知られているプロモーター、ターミネーターを用いる。これら各種微生物において利用可能なベクター、プロモーター、ターミネータ−等に関しては、例えば「微生物学基礎講座８遺伝子工学・共立出版」、特に酵母に関しては、Adv. Biochem. Eng. 43, 75-102 （1990）、Yeast 8, 423-488 （1992）、等に詳細に記載されている。
【００６７】
エシェリヒア属、特に大腸菌エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）においては、プラスミドベクターとして、例えばpBR、pUC系プラスミドを利用でき、lac（β−ガラクトシダーゼ）、trp（トリプトファンオペロン）、tac、trc （lac、trpの融合）、λファージ PＬ、PＲ等に由来するプロモーター等が利用できる。また、ターミネーターとしては、trpA由来、ファージ由来、rrnBリボソーマルRNA由来のターミネーター等を用いることができる。
【００６８】
バチルス属においては、ベクターとしてpUB110系プラスミド、pC194系プラスミド等が利用可能であり、染色体にインテグレートさせることも可能である。また、プロモーターまたはターミネーターとしてapr（アルカリプロテアーゼ）、 npr（中性プロテアーゼ）、またはamy（α−アミラーゼ）等が利用できる。
【００６９】
シュードモナス属においては、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）、シュードモナス・セパシア（Pseudomonas cepacia）等の宿主ベクター系が開発されている。トルエン化合物の分解に関与するプラスミドTOLプラスミドを基本にした広宿主域ベクター（RSF1010等に由来する自律的複製に必要な遺伝子を含む）pKT240等が利用可能である。プロモーターまたはターミネーターとしては、リパーゼ（特開平5-284973）遺伝子等が利用できる。
【００７０】
ブレビバクテリウム属、特にブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）においては、pAJ43（Gene 39, 281 （1985））等のプラスミドベクターが利用可能である。プロモーターまたはターミネーターとしては、大腸菌で使用されているプロモーター、ターミネーターがそのまま利用可能である。
【００７１】
コリネバクテリウム属、特にコリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）においては、pCS11（特開昭57-183799）、pCB101（Mol. Gen. Genet. 196, 175 （1984）等のプラスミドベクターが利用可能である。
【００７２】
ストレプトコッカス（Streptococcus）属においては、pHV1301（FEMS Microbiol. Lett. 26, 239 （1985）、pGK1（Appl. Environ. Microbiol. 50, 94 （1985））等がプラスミドベクターとして利用可能である。
【００７３】
ラクトバチルス（Lactobacillus）属においては、ストレプトコッカス属用に開発されたpAMβ1（J. Bacteriol. 137, 614 （1979））等が利用可能であり、プロモーターとして大腸菌で利用されているものが利用可能である。
【００７４】
ロドコッカス（Rhodococcus）属においては、ロドコッカス・ロドクロウス（Rhodococcus rhodochrous）から単離されたプラスミドベクター等が利用可能である （J. Gen. Microbiol. 138,1003 （1992） ）。
【００７５】
ストレプトマイセス（Streptomyces）属においては、HopwoodらのGenetic Manipulation of Streptomyces: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratories （1985）に記載の方法に従って、プラスミドを構築することができる。特に、ストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans）においては、pIJ486 （Mol. Gen. Genet. 203, 468-478, 1986）、pKC1064（Gene 103,97-99 （1991） ）、pUWL-KS （Gene 165,149-150 （1995） ）等が使用できる。また、ストレプトマイセス・バージニア（Streptomyces virginiae）においても、同様のプラスミドを使用することができる（Actinomycetol. 11, 46-53 （1997） ）。
【００７６】
サッカロマイセス（Saccharomyces）属、特にサッカロマイセス・セレビジアエ（Saccharomyces cerevisiae） においては、YRp系、YEp系、YCp系、YIp系プラスミド等が利用可能であり、染色体内に多コピー存在するリボソームDNAとの相同組み換えを利用したインテグレーションベクター（EP 537456など）は、多コピーで遺伝子を導入でき、かつ安定に遺伝子を保持できるため極めて有用である。また、ADH（アルコール脱水素酵素）、GAPDH（グリセルアルデヒド−3−リン酸脱水素酵素）、PHO（酸性フォスファターゼ）、GAL（β−ガラクトシダーゼ）、PGK（ホスホグリセレートキナーゼ）、ENO（エノラーゼ）等のプロモーターおよびターミネーターが利用可能である。
【００７７】
クライベロマイセス属、特にクライベロマイセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）においては、サッカロマイセス・セレビジアエ由来2μm系プラスミド、pKD1系プラスミド（J. Bacteriol. 145, 382-390 （1981））、キラー活性に関与するpGKl1由来プラスミド、クライベロマイセス属における自律増殖遺伝子KARS系プラスミド、リボソームDNA等との相同組み換えにより染色体中にインテグレート可能なベクタープラスミド（EP 537456など）などが利用可能である。また、ADH、PGK等に由来するプロモーター、ターミネーターが利用可能である。
【００７８】
シゾサッカロマイセス（Schizosaccharomyces）属においては、シゾサッカロマイセス・ポンベ由来のARS （自律複製に関与する遺伝子）、およびサッカロマイセス・セレビジアエ由来の栄養要求性を相補する選択マーカーを含むプラスミドベクター等が利用可能である（Mol. Cell. Biol. 6, 80 （1986））。また、シゾサッカロマイセス・ポンベ由来のADHプロモーターなどが利用できる（EMBO J. 6, 729 （1987））。特に、pAUR224は、宝酒造から市販されており容易に利用できる。
【００７９】
チゴサッカロマイセス属（Zygosaccharomyces）においては、チゴサッカロマイセス・ロウキシ （Zygosaccharomyces rouxii）由来の pSB3（Nucleic Acids Res. 13, 4267 （1985））などに由来するプラスミドベクター等が利用可能であり、サッカロマイセス・セレビジアエ由来 PHO5 プロモーター、およびチゴサッカロマイセス・ロウキシ由来 GAP-Zr（グリセルアルデヒド−3−リン酸脱水素酵素）のプロモーター（Agri. Biol. Chem. 54, 2521 （1990））等が利用可能である。
【００８０】
ピキア（Pichia）属においては、ピキア・アンガスタ（Pichia angusta、旧名：ハンゼヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha））において宿主ベクター系が開発されている。ベクターとしては、ピキア・アンガスタ由来自律複製に関与する遺伝子（HARS1、HARS2）も利用可能であるが、比較的不安定であるため、染色体への多コピーインテグレーションが有効である（Yeast 7, 431-443 （1991））。また、メタノールなどで誘導されるAOX（アルコールオキシダーゼ）、FDH（ギ酸脱水素酵素）のプロモーター等が利用可能である。また、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）などにピキア由来自律複製に関与する遺伝子 （PARS1、PARS2）等を利用した宿主ベクター系が開発されており（Mol. Cell. Biol. 5, 3376 （1985））、高濃度培養とメタノールで誘導可能なAOXなど強いプロモーターが利用できる（Nucleic Acids Res. 15, 3859 （1987））。
【００８１】
キャンディダ（Candida）属においては、キャンディダ・マルトーサ（Candida maltosa）、キャンディダ・アルビカンス（Candida albicans）、キャンディダ・トロピカリス（Candida tropicalis）、キャンディダ・ウチルス （Candida utilis） 等において宿主ベクター系が開発されている。キャンディダ・マルトーサにおいてはキャンディダ・マルトーサ由来ARSがクローニングされ（Agri. Biol. Chem. 51, 51, 1587 （1987））、これを利用したベクターが開発されている。また、キャンディダ・ウチルスにおいては、染色体インテグレートタイプのベクターの強力なプロモーターが開発されている（特開平08-173170）。
【００８２】
アスペルギルス（Aspergillus）属においては、アスペルギルス・ニガー （Aspergillus niger） 、アスペルギルス・オリジー （Aspergillus oryzae） 等がカビの中で最もよく研究されており、プラスミド、および染色体へのインテグレーションの利用が可能であり、菌体外プロテアーゼやアミラーゼ由来のプロモーターが利用可能である（Trends in Biotechnology 7, 283-287 （1989））。
【００８３】
トリコデルマ（Trichoderma）属においては、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）を利用したホストベクター系が開発され、菌体外セルラーゼ遺伝子由来プロモーター等が利用できる（Biotechnology 7, 596-603 （1989））。
【００８４】
また、微生物以外でも、植物、動物において様々な宿主・ベクター系が開発されており、特に蚕を用いた昆虫（Nature 315, 592-594 （1985））、菜種、トウモロコシ、またはジャガイモ等の植物中に大量に異種タンパク質を発現させる系が開発されており好適に利用できる。
【００８５】
本発明のD-アミノアシラーゼは、該酵素をコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターで形質転換された微生物を常法に従って培養し、その培養物から調製される。培地としては炭素源、窒素源、無機物およびその他の栄養素を適量含有する培地ならば、合成培地または天然培地のいずれでも使用可能であり、液体培地または固体培地を使用することができる。
【００８６】
具体的には、炭素源として、グルコース、フルクトース、マルトース、ガラクトース、澱粉、澱粉加水分解物、糖蜜、廃糖蜜などの糖類、麦、とうもろこしなどの天然炭水化物、グリセロール、メタノール、エタノールなどのアルコール類、酢酸、グルコン酸、ピルビン酸、クエン酸などの脂肪酸類、ノルマルパラフィンなどの炭化水素類、グリシン、グルタミン、アスパラギンなどのアミノ酸類等の一般的な炭素源より、適宜一種または二種以上選択して使用する。窒素源としては、肉エキス、ペプトン、酵母エキス、大豆加水分解物、ミルクカゼイン、カザミノ酸、各種アミノ酸、コーンスティープリカー、その他の動物、植物、微生物の加水分解物などの有機窒素化合物、アンモニア、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウムなどのアンモニウム塩、硝酸ナトリウムなどの硝酸塩、尿素などの無機窒素化合物より、適宜一種または二種以上選択して使用する。
【００８７】
さらに、無機塩として微量のマグネシウム、マンガン、カリウム、カルシウム、ナトリウム、銅、亜鉛などのリン酸塩、塩酸塩、硝酸塩、酢酸塩等より適宜一種または二種以上を選択して使用することができる。また、必要に応じて植物油、界面活性剤、シリコンなどの消泡剤を添加してもよい。
【００８８】
培養は前記培地成分を含有する液体培地中で振とう培養、通気攪拌培養、連続培養、流加培養などの通常の培養方法を用いて行うことができる。
培養条件は、培養の種類、培養方法により適宜選択すればよく、該菌株が増殖し、D-アミノアシラーゼを産生できる条件であれば特に制限はない。通常は、培養開始時のpHを4から10、好ましくは6から8に調節し、15から50℃、好ましくは25から35℃の温度条件下で培養することが望ましい。
【００８９】
十分に菌体が増殖した後に、あるいは増殖過程において、形質転換体の外来遺伝子の発現を誘導する条件を与える。たとえばlacプロモーターに対しては、IPTGを与えることにより、その下流に連結されている外来遺伝子の発現が誘導される。あるいは温度感受性プロモーターであれば、発現に必要な温度条件で培養を行う。
培養時間は、十分量のD-アミノアシラーゼ活性を有する菌体が得られれば特に制限はなく、通常は1日から14日、好ましくは1日から3日培養する。遺伝子発現に伴って生産蓄積された本発明のD-アミノアシラーゼは、次のような方法で採取、分取することができる。
【００９０】
D-アミノアシラーゼが菌体内に蓄積される場合には、培養終了後、菌体をろ過、遠心分離等の方法で集め、緩衝液、生理食塩水等で菌体を洗浄後、例えば、凍結融解処理、超音波処理、加圧処理、浸透圧差処理、磨砕処理などの物理手段、もしくはリゾチームなどの細胞壁溶解酵素処理のような生化学的処理もしくは界面活性剤との接触処理などの化学的処理を単独または組み合わせて行うことにより菌体を破砕し、D-アミノアシラーゼを抽出することができる。こうして得られた粗D-アミノアシラーゼは、塩析、有機溶媒などによる分別沈殿、塩析クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、色素クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーなどの各種クロマトグラフィーをオープンカラム、中圧クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）によって行う分離および等電点電気泳動、native-電気泳動などの電気泳動法による分離等の手段を単独もしくは組み合わせて用いることにより精製することができる。
【００９１】
具体的には、例えば、ろ過や遠心分離で集めた菌体を凍結、粉砕処理後緩衝液に懸濁し、Bead-Beater（BIOSPEC PRODUCT）を用いて破砕処理し、野生型D-アミノアシラーゼ、又はD-アミノアシラーゼ変異体抽出液を得て、その後、硫安を用いた塩析処理、Phenyl-Sepharose FF疎水クロマトグラフィー、Mono Q イオン交換クロマトグラフィーを行い、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動的に単一のバンドに精製することができる。
【００９２】
このようにして精製されたアルカリゲネス・デニトリフィカンス・サブスピーシーズ・キシロースオキシダンス MI-4（Alcaligenes denitrificans subsp. xylosoxydans MI-4）由来の野生型D-アミノアシラーゼ、及び本発明のD-アミノアシラーゼ変異体のN-アセチル-D-トリプトファン、及びN-アセチル-L-トリプトファンに対する反応速度定数の測定は、「生物化学実験講座21 酵素反応速度論実験入門」、「蛋白質・酵素の基礎実験法 改訂第2版」に記載の方法に従って行うことができる。ミカエリス（Michaelis）定数をKm、最大速度をVmax、阻害物質定数をKi、過剰の基質による反応阻害の定数をKs’と表記する。
【００９３】
また、本発明は、本発明のD-アミノアシラーゼ、又はD-アミノアシラーゼを発現する形質転換体、又はその処理物を用いたD-トリプトファンの製造方法に関する。
本発明のD-アミノアシラーゼは、種々のN-アシル-D-アミノ酸に作用して、D-アミノ酸を生じる性質を有する。本発明のD-アミノアシラーゼは、D-アミノ酸の工業的な製造に有用である。例えば、本発明のD-アミノアシラーゼをD体とL体の混合物であるN-アシル-DL-アミノ酸に作用させて、D-アミノ酸を特異的に製造することができる。すなわち本発明は、下記の（ａ）から（ｃ）から選択された少なくとも１つの酵素活性物質をN-アシル-DL-アミノ酸に接触させ、生成するD-アミノ酸を回収する工程を含む、D-アミノ酸の製造方法に関する。
（ａ）本発明のD-アミノアシラーゼ蛋白質、
（ｂ）本発明のD-アミノアシラーゼを発現する形質転換体、および
（ｃ）本発明のD-アミノアシラーゼを発現する形質転換体の処理物
【００９４】
本発明の適用可能なN-アシル-DL-アミノ酸としては特に制限されず、広い範囲の化合物から選択できる。代表的なN-アシル-DL-アミノ酸を、式（１）に示す。
【化１】
2004215656.tif 000002
（式中、R1、R2は、同一または異なる、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、アリル基、またはアラルキル基であり、、これらの基はさらにハロゲン、単鎖アルコキシル基、ニトロ基、水酸基などで置換されていてもよい。より具体的には、好ましいR2の置換基として、メチル基、クロロメチル基、またはフェニル基を示すことができる。また好ましいR1としては、次のような置換基を示すことができる。カッコ内に当該置換基を有するN-アシル-DLアミノ酸の名前を記載した。
インドリル基（N-アシル-DL-トリプトファン）
ベンジル基（N-アシル-DL-フェニルアラニン）
チオメチルエチル基（N-アシル-DL-メチオニン）
イソプロピル基（N-アシル-DL-バリン）
2-メチル-プロピル基（N-アシル-DL-ロイシン）
【００９５】
本発明における好ましいN-アシル-DL-アミノ酸として、N-アセチル-DL-アミノ酸が挙げらる。N-アセチル-DL-アミノ酸の具体的な例を以下に示す。これらのN-アセチル-DL-アミノ酸の中でも、特にN-アセチル-DL-トリプトファンは産業上重要な化合物であるD-トリプトファンを与える基質として有用である。
N-アセチル-DL-メチオニン
N-アセチル-DL-バリン
N-アセチル-DL-トリプトファン
N-アセチル-DL-アスパラギン
N-アセチル-DL-フェニルアラニン
N-アセチル-DL-アラニン
N-アセチル-DL-ロイシン
【００９６】
本発明の製造方法には、前記（ａ）−（ｃ）に示した任意の酵素活性物質が用いられる。酵素活性物質としては、精製酵素の他、部分精製酵素、該D-アミノアシラーゼ産生能を有する形質転換体、又はその処理物を用いることも可能である。すなわち、該D-アミノアシラーゼ産生能を有する形質転換体、又はその処理物を直接N-アセチル-DL-アミノ酸に作用させて、D-アミノ酸を製造することも可能である。
【００９７】
本発明における形質転換体の処理物とは、凍結融解処理、超音波処理、加圧処理、浸透圧差処理、磨砕処理などの物理的処理、リゾチームなどの細胞壁溶解酵素処理のような生化学的処理、もしくは界面活性剤、トルエン、キシレン、又はアセトンなどの有機溶媒との接触処理などの化学的処理等を行った形質転換体を指す。このような処理によって細胞膜の透過性を変化させた微生物、あるいはガラスビーズや酵素処理によって菌体を破砕した無細胞抽出液や、それを部分精製したものなどは処理物に含まれる。
【００９８】
一般に酵素や微生物は、固定化することによって安定化される。固定化する方法としては、イオン交換樹脂への結合によるポリアクリルアミドゲル法、含硫多糖ゲル法（カラギーナンゲル法）、アルギン酸ゲル法、寒天ゲル法などの公知の方法を用いることができる。固定化した酵素や微生物による反応時間は、D-アミノアシラーゼの量と基質量に左右される。当業者は、経験的にこれらの条件を最も理想的な条件に最適化することができる。通常は10〜100時間の反応により、目的とする反応生成物を効率良く得ることができる。
【００９９】
本発明の該D-アミノアシラーゼ、D-アミノアシラーゼ産生能を有する形質転換体、又はその処理物をN-アシル-D-アミノ酸に作用させる際には、該D-アミノアシラーゼの活性や安定性、D-アミノアシラーゼ産生能を有する形質転換株の反応性にとって好ましい条件を選択する。本発明によるD-アミノアシラーゼは、Zn2+、Ni2+、あるいはCo2+等の2価金属イオンにより、活性が促進、又は阻害を受ける場合がある。2価金属イオンにより阻害を受ける場合には、反応液にEDTAなどのキレート剤を添加することができる。
【０１００】
反応の基質であるN-アシル-DL-アミノ酸の濃度は制限されない。通常0.1〜50%程度、好ましくは1〜40%、より好ましくは5〜30%の濃度が用いられる。本発明による酵素反応、または菌体反応において、基質として用いられているN-アシル-DL-アミノ酸は、N-アシル-D-アミノ酸とN-アシル-L-アミノ酸の混合物である。その混合物中のD体とL体の比率(D体：L体)は任意である。通常、その比率は10:90〜90：10であり、好ましくは25:75〜75：25、より好ましくは50：50である。50：50とは、N-アシル-アミノ酸のラセミ体であることを意味する。
本発明において、高濃度のN-アセチル-DL-トリプトファンとは、120 g/L以上の濃度のN-アセチル-DL-トリプトファンを指し、好ましくは150 g/L以上、より好ましくは200 g/L以上を指す。
【０１０１】
なお、本発明における「%」は、いずれも「重量/容量（w/v）」を意味するものとし、「反応収率」とは、反応液中のN-アセチル-D-トリプトファンが全てD-トリプトファンに変換された時を100%とする。
また、基質は反応開始時に一括して添加することも可能であるが、反応液中に連続的、もしくは間欠的に添加することも可能である。使用するD-アミノアシラーゼの量は、通常は0.01〜100000 U/mL、好ましくは0.1〜10000 U/mL、より好ましくは1〜1000 U/mL程度用いられる。反応温度は本発明の酵素がその活性を発現でき、反応できる温度であれば良く、通常5から70℃、好ましくは10から50℃、より好ましくは20〜40℃で行うことができる。また反応pHも、本発明の酵素がその活性を発現でき、反応できるpHであれば良く、通常はpH3から11、好ましくは、pH5から10、より好ましくはpH6〜9で行うことができる。また、反応は攪拌下、あるいは静置下で行うことができる。
【０１０２】
例えば、A154V/M347A/R374Fの変異を有するD-アミノアシラーゼ変異体を発現する形質転換体を培養して得られた培養液と40% N-アセチル-DL-トリプトファンをそれぞれ同量ずつ混合し、30℃、24時間攪拌しながら反応させることにより、80%以上の収率でD-トリプトファンを生産することができる。
【０１０３】
反応液から反応により生じたD-アミノ酸は、例えば、濃縮、等電点沈殿などによる直接結晶法やイオン交換樹脂処理、膜分離などの公知の方法により回収することができる。例えばN-アセチル-DL-トリプトファンを基質としてD-トリプトファンを生成した場合、反応液を強酸性陽イオン交換樹脂に通し、D-トリプトファンを吸着させ、該樹脂を水洗後、0.5Ｎアンモニア水で溶出させることによって、反応液からD-トリプトファンを採取する。溶出液を濃縮して得た粗D-トリプトファン結晶粉末を少量の50％熱エタノール水に溶解し、活性炭処理して脱色し、冷却後、D-トリプトファンの結晶を得ることができる。
【０１０４】
本発明のD-アミノ酸の製造方法においては、反応後にN-アシル-L-アミノ酸が残る。残存するN-アシル-L-アミノ酸は、ラセミ化によってN-アシル-DL-アミノ酸とし、再利用することができる。酵素的（特開平1-137973）、あるいは化学的な反応(Biochem. Z., 203, 280 (1929))によって、N-アシル-L-アミノ酸をラセミ化する方法は公知である。
【実施例】
【０１０５】
以下に、本発明を実施例を挙げて説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
[実施例1]  アルカリゲネス・デニトリフィカンス・サブスピーシーズ・キシロースオキシダンス MI-4（Alcaligenes denitrificans subsp. xylosoxydans MI-4）株からの染色体ＤＮＡの調製
アルカリゲネス・デニトリフィカンス・サブスピーシーズ・キシロースオキシダンス MI-4（Alcaligenes denitrificans subsp. xylosoxydans MI-4）株（FERM P-9413）より、Nucleic Acids Res. 8, 4321 （1980）の方法に従って染色体ＤＮＡを精製した。
【０１０６】
[実施例2]   アルカリゲネス・デニトリフィカンス・サブスピーシーズ・キシロースオキシダンス MI-4（Alcaligenes denitrificans subsp. xylosoxydans MI-4）株由来D-アミノアシラーゼ遺伝子のPCRによるクローニング
文献（Biosci. Biotech. Biochem., 59, 2115（1995））に記載のアルカリゲネス  キシロースオキシダンス  サブスピーシーズ  キシロースオキシダンス  A-6（Alcaligenes xylosoxydans subsp. xylosoxydans A-6）株由来のD-アミノアシラーゼ遺伝子の5’-、及び3’-非翻訳領域よりセンスプライマーADD-ATG1（配列番号：１）、アンチセンスプライマーADD-TGA1（配列番号：５）を合成した。PCR反応は、アルカリゲネス・デニトリフィカンス・サブスピーシーズ・キシロースオキシダンス MI-4（Alcaligenes denitrificans subsp. xylosoxydans MI-4）株由来染色体DNA70 ng、1.0 U ExTaq DNAポリメラーゼ、Taq用緩衝液、  0.2 mM dNTP、5% DMSO、10 pmolのプライマーADD-ATG1、ADD-TGA1のセットを含む50 μLの反応液で94℃, 30秒、72℃, 2分、30サイクルを行った。その結果、特異性の高い約1.5 kbpのPCR産物を得た。
【０１０７】
[実施例3]  PCR産物の配列解析
実施例2で得られたDNA断片を、GFX Kit（ファルマシア製）により精製した。精製したDNA断片の塩基配列を解析した。DNA塩基配列の解析には、BigDye Terminator Cycle Sequencing ready Reaction Kit （アプライドバイオシステムズ製）を用いてPCRを行い、PRISM 310 Genetic Analyzer（アプライドバイオシステムズ製）により行った。プライマーには、ADD-189R（配列番号：６）、ADD-524R （配列番号：７）、ADD-466F （配列番号：８） 、ADD-1032R（配列番号：９）、ADD-987F（配列番号：１０）、ADD-TGA1を使用した。
【０１０８】
結果の配列を配列番号：１に示した。該D-アミノアシラーゼの配列は、公知のクローニングされたアルカリゲネス  キシロースオキシダンス  サブスピーシーズ  キシロースオキシダンス  A-6（Alcaligenes xylosoxydans subsp. xylosoxydans A-6）由来D-アミノアシラーゼと比較すると、塩基配列では、開始コドンATGのAを1位として、360-T→C、435-C→Tの2塩基が異なるのみであり、アミノ酸配列は完全に同一のものであった。また、アルカリゲネス スピーシーズ CMC3352, CMC3353（Alcaligenes sp. CMC3352, CMC3353）由来D-アミノアシラーゼと比較すると、4-T→G（Ser2→Ala）、7-C→G（Gln3→Glu）、41-C→T（Ala14→Val）、234-T→C（Arg78→Arg）、306-G→A（Ala102→Ala）、363-T→G（Ser121→Ser）、369-T→C（Arg123→Arg）、450-A→G（Ser150→Ser）、676-G→C（Gly2→Arg）、718-G→C（Gly240→Arg）、724-G→A（Glu242→Lys）の11塩基が異なっており、そのうち6ヶ所がアミノ酸残基においても異なっていた。
【０１０９】
[実施例4]   アルカリゲネス・デニトリフィカンス・サブスピーシーズ・キシロースオキシダンス MI-4（Alcaligenes denitrificans subsp. xylosoxydans MI-4）株由来D-アミノアシラーゼ遺伝子のPCRによるクローニング2
実施例3で明らかとなったDNA断片の塩基配列をもとにセンスプライマーADD-ATG2（配列番号：１１）、アンチセンスプライマーADD-TAA2（配列番号：１２）を合成した。PCR反応は、実施例2で得られたPCR産物10ngを鋳型として、2.5 U PfuTurbo DNAポリメラーゼ、PfuTurbo用緩衝液、  0.2 mM dNTP、5% DMSO、10 pmolのプライマー ADD-ATG2、ADD-TGA2のセットを含む50 μLの反応液で95℃, 30秒、70℃, 2分40秒、30サイクルを行った。その結果、特異性の高い約1.5 kbpのPCR産物を得た。
【０１１０】
[実施例5]   D-アミノアシラーゼ遺伝子を含む発現プラスミドの構築
実施例4で得られたＤＮＡ断片を、GFX Kit（ファルマシア製）で精製した後、制限酵素EcoRI、HindIIIで二重消化し、アガロースゲル電気泳動を行い、目的とするバンドの部分を切り出し、Sephaglas （ファルマシア製） により精製した。
得られたDNA断片を、同じ制限酵素で二重消化したpSE420D（特開2000-189170）とT4 DNAリガーゼを用いて連結し、大腸菌JM109株を形質転換した。
【０１１１】
形質転換株をアンピシリン（50 μg/mL）を含むLB培地プレート上で生育させ、いくつかのコロニーよりプラスミドを精製し、挿入断片の塩基配列を解析した。該D-アミノアシラーゼ遺伝子を持つプラスミドをそれぞれpSL-ADD2、pSL-ADD3、pSL-ADD4、pSL-ADD5とした。これらのプラスミドに含まれるD-アミノアシラーゼ遺伝子の塩基配列を実施例2で得られたPCR産物の塩基配列（本来のアルカリゲネス・デニトリフィカンス・サブスピーシーズ・キシロースオキシダンス MI-4由来D-アミノアシラーゼの塩基配列）と比較すると、pSL-ADD2ではORFの開始コドンATGを1位として、679-GAGがGGGに置換（Glu227→Gly）、991-AAGがAGGに置換（Lys331→Arg）されており、pSL-ADD4では1012-CTGがCCGに置換（Leu338→Pro）されていた。pSL-ADD2、及びpSL-ADD4ではD-アミノアシラーゼ活性がほとんど認められず、該D-アミノアシラーゼ活性の触媒能に悪影響を及ぼすアミノ酸置換であった。
【０１１２】
一方で、pSL-ADD3では103-GGCからGACに置換（Gly35→Asp）、634-AGCからAGTに置換（Ser212→Ser）、973-GCCがGCTに置換（Ala325→Ala）されており、pSL-ADD5では43-GGCがGGAに置換（Gly15→Gly）、1009-GAG が GGG に置換（Glu337→Gly） されていた。しかし、pSL-ADD3、及びpSL-ADD5においてはD-アミノアシラーゼ活性があることを確認し、このアミノ酸置換は該D-アミノアシラーゼの触媒能に影響をもたらすものではなかった。
【０１１３】
[実施例6]  大腸菌におけるコドン使用頻度に調整した改変型D-アミノアシラーゼ遺伝子の作製
（1）改変型D-アミノアシラーゼ遺伝子を含む発現プラスミドの構築
アルカリゲネス・デニトリフィカンス・サブスピーシーズ・キシロースオキシダンス MI-4（Alcaligenes denitrificans subsp. xylosoxydans MI-4）株由来のD-アミノアシラーゼ遺伝子は、その構造遺伝子中に、大腸菌におけるレアコドンをいくつか含み、GC含量も非常に高い。大腸菌内での該D-アミノアシラーゼ遺伝子の安定性、および該D-アミノアシラーゼの生産量の向上を目的として、実施例4に記載したPCRクローニングにおいて生じた塩基置換を修正し、大腸菌におけるレアコドンを該D-アミノアシラーゼ遺伝子から除去した。合わせて、コドン使用頻度と構造遺伝子中のGC含量を、宿主である大腸菌に合わせて調整した。塩基配列の改変によってアミノ酸配列が変化しないように、塩基配列を設計し、再構築した。得られたDNAの塩基配列を配列番号：３に示した。
【０１１４】
両末端にPciI、XbaI認識部位が導入されるように設計した改変型D-アミノアシラーゼ遺伝子の塩基配列情報に基づき、Oligo DNA Assemble法によるdsDNAをpUC系ベクターに合成した。得られたクローンの塩基配列を確認した後、PciI、XbaIの2つの制限酵素で二重消化し、pSE420DをNcoI、XbaIの2つの制限酵素で二重消化したものとT4 DNA リガーゼで連結し、改変型D-アミノアシラーゼ遺伝子を発現可能なプラスミドpSL-ADD6を得た。該改変型D-アミノアシラーゼ遺伝子を含むプラスミドpSL-ADD6は、2003年10月17日付けでFERM BP-08508として独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに国際寄託された。このプラスミドにより、大腸菌JM109株を形質転換した。
【０１１５】
（2）改変型D-アミノアシラーゼ遺伝子から産生するD-アミノアシラーゼの活性測定
実施例5（1）で得られた形質転換株をアンピシリン（50 μg/mL）を含む液体 LB培地上で終夜 26℃、終夜振盪培養し、0.1 mM IPTGを加えた後、さらに 4時間、30℃で振盪培養を行なった。菌体を遠心分離により集菌後、0.02% 2-メルカプトエタノールを含む 100 mM トリス-塩酸緩衝液（pH 9.0）に懸濁し、密閉式超音波破砕装置UCD-200TM（コスモバイオ製）を用いて3分間処理することで、菌体を破砕した。菌体破砕液を遠心分離し、その上清を菌体抽出液として回収、D-アミノアシラーゼ活性を測定した。野生型D-アミノアシラーゼの活性が34 U/mgであったのに対し、改変型D-アミノアシラーゼ遺伝子から産生したD-アミノアシラーゼの活性は86 U/mgであり、塩基配列の改変が比活性の向上に寄与したことを確認した。
【０１１６】
[実施例7]   アルカリゲネス・デニトリフィカンス・サブスピーシーズ・キシロースオキシダンス MI-4（Alcaligenes denitrificans subsp. xylosoxydans MI-4）由来D-アミノアシラーゼへのPCRによる変異導入
実施例6で構築したD-アミノアシラーゼ発現ベクターpSL-ADD6をもとにして、エラー頻度の高いDNAポリメラーゼを利用したPCR法によって該D-アミノアシラーゼ遺伝子を複製し、その塩基配列中にランダムに塩基置換を導入した。大腸菌JM109株を形質転換後、形質転換株を得た。
【０１１７】
目的のDNA断片を増幅するためのプライマーとしてADD-ATG2、ADD-TAA2を使用した。PCRは、Taq用緩衝液、0.2 mM dNTP、10pmolのプライマー ADD-ATG2、ADD-TAA2 のセット、2.0 U Taq DNAポリメラーゼ、及び125 ngのpSL-ADD6から成る反応液50 μL中で、94℃, 30秒、72℃, 1分45秒、30サイクル行った。得られたPCR増幅断片をEcoRI、HindIII の2つの制限酵素で二重消化した。この制限酵素消化したPCR断片とEcoRI、HindIIIの2つの制限酵素で二重消化したpSE420DをT4 DNA リガーゼで連結し、ランダムに塩基置換が導入された様々なD-アミノアシラーゼ遺伝子を含むプラスミドのライブラリーを得た。このプラスミドライブラリーにより、大腸菌JM109株を形質転換し、変異を含むD-アミノアシラーゼ遺伝子を有する形質転換株ライブラリーを得た。
【０１１８】
[実施例8]  変異株のスクリーニング
大腸菌形質転換株は、LB寒天平板培地上に塗布された。平板培地上に出現した各コロニーを、50 μg/mLのアンピシリン、0.02 mMのIPTGを含む150 μLのLB培地を加えたマイクロタイタープレートの各ウェルに爪楊枝で植菌し、Breathable Sealing Membrane（Nalgene製）で蓋をした後、37℃、18時間振とう培養を行った。10 μLの培養液を、300 mMのトリス-塩酸緩衝液（pH8.0）、0.1%の臭化セチルピリジニウム、5%のN-アセチル-DL-トリプトファン、1%のN-アセチル-L-トリプトファン、及び蒸留水を含む反応液に添加し、マイクロタイタープレートのウェル中で25℃、1時間振とう反応した。ここでN-アセチル-D-トリプトファンから生成するD-トリプトファンを、TNBS法により比色定量した。
【０１１９】
野生株を用いて同時に反応を行い、反応後、野生株よりも高いD-トリプトファン生成活性を示した株を単離した。約3000個のコロニーをスクリーニングした結果、4個の変異株を取得した。得られた4個の変異株を50 μg/mLのアンピシリン、0.02 mMのIPTGを含むLB培地で30℃、18時間振とう培養した。培養液を用いて5%のN-アセチル-DL-トリプトファン、1%のN-アセチル-L-トリプトファン存在下反応し、遊離したD-トリプトファン量を野生株と比較することにより、N-アセチル-L-トリプトファンによるD-トリプトファン生成阻害の低減を確認した。このようにして、4個の変異型D-アミノアシラーゼAD-0103、AD-1064、AD-1089、AD-1927を得た。
【０１２０】
[実施例9]  変異型D -アミノアシラーゼの変異個所の解析
大腸菌形質転換株から、変異遺伝子を含む組換えDNAを常法により精製した。上記のように得られた阻害が低減した変異型酵素遺伝子の塩基配列を解析した。その結果、変異型D-アミノアシラーゼAD-0103、AD-1089においては、共に347位のMet残基（ATG）がVal残基（GTG）に置換されていた。変異型D-アミノアシラーゼAD-1064においては、154位のAla残基（GCC）がVal残基（GTC）に置換されていた。変異型D-アミノアシラーゼAD-1927においては、154位のAla残基（GCC）がThr残基（ACC）に、374位のArg残基（CGC）がHis残基（CAC）に置換されていた。このアミノ酸置換は、いずれのアルカリゲネス（Alcaligenes）属のD-アミノアシラーゼの公開配列においても認められなかった。
【０１２１】
[実施例10]  変異株の高濃度N-アセチル-DL-トリプトファン変換反応への効果
実施例8で得られた3株の阻害が低減された変異型D-アミノアシラーゼAD-0103、AD-1064、AD-1927を発現するプラスミドにより形質転換された大腸菌HB101株を液体LB培地に植菌し、30℃で終夜培養した後、培地2×YT（2% バクトトリプトン、1% バクト-酵母エキス、1.0% 塩化ナトリウム、pH 7.2）に植菌し、30℃で18時間培養した。得られた大腸菌を集菌し、これを用いてN-アセチル-D-トリプトファン加水分解反応を行った。
【０１２２】
培養液5 mLより調製した各大腸菌形質転換株、300 mMトリス-塩酸緩衝液（pH 8.0）、5%、及び10% N-アセチル-DL-トリプトファンを含む10mLの反応液を、攪拌下25℃で反応させた。コントロールとしては、野生型D-アミノアシラーゼを含むプラスミドpSL-ADD6をもつ大腸菌HB101株を使用した。5%N-アセチル-DL-トリプトファンが基質の場合、野生型では収率約50%であったのに対し、4種の変異型では何れにおいても収率約100%であった。10%N-アセチル-DL-トリプトファンが基質の場合、野生型では収率約15%であったのに対し、変異型AD-0103、AD-1089では共に収率約25%、変異型AD-1064では収率約40%、変異型AD-1927では収率約60%であった。実施例8で得られた阻害低減変異株は、高濃度のN-アセチル-DL-トリプトファン変換反応における能力も高いことを確認した。
【０１２３】
[実施例11]  第2世代変異株の作製
実施例9で基質阻害、並びに/もしくは拮抗阻害の低減に効果があった変異部位である154位のAla、347位のMet、374位のArgにランダム変異を導入し、更に効果の大きなアミノ酸残基のスクリーニングを行った。
【０１２４】
実施例6で構築した、改変型D-アミノアシラーゼ遺伝子をもつ発現ベクターpSL-ADD6をもとにして、アルカリゲネス・デニトリフィカンス・サブスピーシーズ・キシロースオキシダンス MI-4（Alcaligenes denitrificans subsp. xylosoxydans MI-4）由来D-アミノアシラーゼの154位のAlaを他のアミノ酸残基へランダムに変えるためのプライマーとしてADDm-55F （配列番号：１３）、ADDm-460mix （配列番号：１４）を、347位のMetを他のアミノ酸残基へランダムに変えるためのプライマーとして ADDm-627F （配列番号：１５）、ADDm-1039mix （配列番号：１６）、を、374位のArgを他のアミノ酸残基へランダムに変えるためのプライマーとしてADDm-627F、ADDm-1120mix （配列番号：１７）を合成した。これらのプライマーを用いてPCR法により目的部位へランダムなアミノ酸置換変異を導入した。
【０１２５】
プラスミドpSL-ADD6を鋳型として、それぞれのプライマーセットを用いてPCR（95℃, 30秒、60℃, 60秒、72℃, 60秒、25サイクル）を行った。ADDm-55F、ADDm-460mixのセットで得られたPCR増幅断片をAvaI、BglIIで、ADDm-627F、ADDm-1039mixのセットで得られたPCR増幅断片をBlpI、BsrGIで、ADDm-627F、ADDm-1120mixのセットで得られたPCR増幅断片をBlpI、KpnIの2つの制限酵素でそれぞれ二重消化した。これらの制限酵素消化したPCR増幅断片とそれぞれ同様の2つの制限酵素で二重消化したpSL-ADD6をT4 DNA リガーゼで連結し、154位のAlaが他のアミノ酸残基へランダムに置き換えられたプラスミドの混合物、347位のMetが他のアミノ酸残基へランダムに置き換えられたプラスミドの混合物、374位のArgが他のアミノ酸残基へランダムに置き換えられたプラスミドの混合物を得た。これら3種のプラスミドライブラリーそれぞれにより、大腸菌JM109株を形質転換し、3種のライブラリーを構築した。
【０１２６】
[実施例12]  第2世代変異株のスクリーニング
実施例11で得られた3種の大腸菌形質転換株ライブラリーをLB寒天平板培地上に塗布した。平板培地上に出現した各コロニーを、50 μg/mLのアンピシリン、0.02 mMのIPTGを含む150 μLのLB培地を加えたマイクロタイタープレートの各ウェルに爪楊枝で植菌し、Breathable Sealing Membrane（Nalgene製）で蓋をした後、37℃、18時間振とう培養を行った。10 μLの培養液を、300 mMのトリス-塩酸緩衝液（pH8.0）、0.1%の臭化セチルピリジニウム、5%のN-アセチル-DL-トリプトファン、2%のN-アセチル-L-トリプトファン、及び蒸留水を含む反応液に添加し、マイクロタイタープレートのウェル中で25℃、1時間振とう反応した。ここでN-アセチル-D-トリプトファンから生成するD-トリプトファンを、D-トリプトファンを標準としたTNBS法により比色定量した。野生株を用いて同時に反応を行い、反応後、野生株よりも高いD-トリプトファン生成活性を示した株を阻害が低減した変異株として単離した。それぞれ約200個のコロニーをスクリーニングした結果、多数の拮抗阻害低減が認められる変異株を取得した。
【０１２７】
[実施例13]  第2世代D -アミノアシラーゼ変異株の変異個所の解析
実施例12で得られた阻害が低減した3種類の第2世代変異型酵素遺伝子の塩基配列を解析した。それぞれの大腸菌形質転換株から、阻害の低減が認められた株を、A154Xについて上位7株、M347Xについて上位18株、R374Xについて上位18株の変異部位がどのアミノ酸残基に置換されているか解析した。それぞれの変異遺伝子を含む組換えDNAを常法により精製した。該組換えDNAに含まれる変異を受けたD-アミノアシラーゼ遺伝子の塩基配列を決定した。
【０１２８】
その結果、それぞれの変異体が含むアミノ酸置換と、それぞれのアミノ酸置換の効果を、5％N-アセチル-DL-トリプトファン、及び2%N-アセチル-L-トリプトファン存在下におけるD-トリプトファン生成活性で示したものを表２に示す。ここでいう活性は、「反応終了液のTNBS法による比色定量値（Abs. 420）／菌株の生育（OD600）」である。
【０１２９】
【表２】
2004215656.tif 000003
【０１３０】
[実施例14]  第3世代変異株の作製
実施例13で得られた第2世代変異体の中から、特に阻害の低減に効果が高いアミノ酸置換を含む変異型D-アミノアシラーゼを各2種類ずつ選抜し、A154-0043（A154Vのアミノ酸置換を含む） 、A154-0183（A154Tのアミノ酸置換を含む） 、M347-0073（M347Qのアミノ酸置換を含む）、M347-0133（M347Aのアミノ酸置換を含む）、R374-0017（R374Fのアミノ酸置換を含む）、R374-0062（R374Hのアミノ酸置換を含む）を得た。それぞれの各変異部位を組み合わせることにより、更に阻害が低減した第3世代変異体酵素の取得を行った。以降、A154-0043をコードするDNAを含むプラスミドをpA154-0043、A154-0183をコードするDNAを含むプラスミドをpA154-0183、M347-0073をコードするDNAを含むプラスミドをpM347-0073、M347-0133をコードするDNAを含むプラスミドをpM347-0133、R374-0017をコードするDNAを含むプラスミドをpR374-0017、R374-0062をコードするDNAを含むプラスミドをpR374-0062とする。
【０１３１】
pA154-0043、及びpA154-0183をそれぞれAvaI、BlpIの2つの制限酵素で消化し、エタノール沈殿後、アガロース電気泳動を行い、約0.6 kbp のバンドを切り出し、Sephaglas BandPrep（Amersham Pharmacia Biotech製）により精製、回収した。pA154-0043、及びpA154-0183に由来する約0.6 kbpのDNA断片は、A154V、及びA154T変異部位をそれぞれ有し、pA154-0043/AvaI/BlpI、pA154-0183/AvaI/BlpIと表記する。pM347-0073、及びpM347-0133をそれぞれBlpI、BsrGIの2つの制限酵素で消化し、エタノール沈殿後、アガロース電気泳動を行い、約0.4 kbp のバンドを切り出し、Sephaglas BandPrep（Amersham Pharmacia Biotech製）により精製、回収した。
【０１３２】
pM347-0073、及びpM347-0133に由来する約0.4 kbpのDNA断片は、M347Q、及びM347A変異部位をそれぞれ有し、pM347-0073/BlpI/BsrGI、pM347-0133/ BlpI/BsrGIと表記する。pR374-0017、及びpR374-0062をそれぞれAvaI、BlpI、BsrGIの3つの制限酵素で消化し、エタノール沈殿後、回収した。pR374-0017、pR374-0062に由来するDNA断片は、それぞれ約0.6 kbpの断片、約0.4 kbpの断片、約5 kbpの断片から成り、その3つの断片の混合物をpR374-0017/AvaI/BlpI/BsrGI、pR374-0062/AvaI/BlpI/BsrGIと表記する。両混合物中の約5 kbpの断片は、それぞれR374F、及びR374H変異を有する。pSL-ADD6をAvaI、BlpI、BsrGIの3つの制限酵素で消化し、エタノール沈殿後、回収した。pSL-ADD6に由来するDNA断片は、アミノ酸置換を含まない約0.6 kbpの断片、約0.4 kbpの断片、約5 kbpの断片から成り、その3つの断片の混合物をpSL-ADD6/AvaI/BlpI/BsrGIと表記する。
【０１３３】
[pR374-0017/AvaI/BlpI/BsrGI、pR374-0062/AvaI/BlpI/BsrGI、pSL-ADD6/AvaI/BlpI/BsrGI]：[pA154-0043/AvaI/BlpI、pA154-0183/AvaI/BlpI]：[pM347-0073/BlpI/BsrGI、pM347-0133/ BlpI/BsrGI]を、mol比で1：3：3で混合し、T4 DNAリガーゼでランダムに連結し、3ヶ所、各3種類の変異部位がランダムに組み合わされた2アミノ酸置換変異体、及び3アミノ酸置換変異体を含むプラスミドの混合物を得た。このプラスミド混合物により、大腸菌JM109株を形質転換し、形質転換株を得た。
【０１３４】
[実施例15]  第3世代変異株のスクリーニング
実施例9で得られた大腸菌形質転換株は、LB寒天平板培地上に塗布された。平板培地上に出現した各コロニーを、50 μg/mLのアンピシリン、0.02 mMのIPTGを含む150 μLのLB培地を加えたマイクロタイタープレートの各ウェルに爪楊枝で植菌し、Breathable Sealing Membrane（Nalgene製）で蓋をした後、37℃、18時間振とう培養を行った。10 μLの培養液を、300 mMのトリス-塩酸緩衝液（pH8.0）、0.1%の臭化セチルピリジニウム、2%のN-アセチル-DL-トリプトファン、3.5%のN-アセチル-L-トリプトファン、及び蒸留水を含む反応液に添加し、マイクロタイタープレートのウェル中で25℃、30分振とう反応した。ここでN-アセチル-D-トリプトファンから生成するD-トリプトファンを、D-トリプトファンを標準としたTNBS法により比色定量した。野生株を用いて同時に反応を行い、反応後、野生株よりも高いD-トリプトファン生成活性を示した株を阻害が低減した変異株として単離した。約200個のコロニーをスクリーニングした結果、多数の拮抗阻害低減が認められる変異株を取得した。
【０１３５】
[実施例16]  第3世代D -アミノアシラーゼ変異株の変異個所の解析
実施例15で得られた阻害が低減した第3世代変異型酵素遺伝子の塩基配列を解析した。それぞれの大腸菌形質転換株から、阻害の低減が認められた上位20株の変異遺伝子を含む組換えDNAを常法により精製した。該組換えDNAに含まれる変異を受けたD-アミノアシラーゼ遺伝子の塩基配列を決定した。
その結果、それぞれの変異体が含むアミノ酸置換を表３に示す。
【０１３６】
【表３】
2004215656.tif 000004
【０１３７】
[実施例17]  第3世代D -アミノアシラーゼ変異株の反応評価
実施例16で得られた合計10株の大腸菌JM109形質転換株から、組換えプラスミドDNAを常法により精製した。これらの組換えプラスミドDNAにより、大腸菌HB101株を形質転換し、形質転換株を得た。平板培地上に出現した各コロニーを、50 μg/mLのアンピシリン、0.02 mMのIPTGを含む150 μLのLB培地を加えたマイクロタイタープレートの各ウェルに爪楊枝で植菌し、Breathable Sealing Membrane（Nalgene製）で蓋をした後、37℃、18時間振とう培養を行った。100 μLの培養液、300 mMのトリス-塩酸緩衝液（pH8.0）、7%のN-アセチル-DL-トリプトファン、及び蒸留水を含む合計200 μLの反応液で、マイクロタイタープレートのウェル中で25℃、8時間振とう反応した。基質中のN-アセチル-D-トリプトファンが全てD-トリプトファンに変換された場合の収率を100%とすると、野生型では約70%収率であったのに比較し、実施例11で得られた第3世代変異体では、ほぼ100%収率であり、拮抗阻害の低減が確認された。
【０１３８】
[実施例18]  最良な変異株の選択
実施例17で得られた第3世代変異体のうち、2アミノ酸置換変異体である3AD-0013（M347Q/R374H）、及び3アミノ酸置換変異体である3AD-0089（A154V/M347A/R374P）を発現するプラスミドにより形質転換された大腸菌HB101株を液体LB培地に植菌し、30℃で終夜培養した後、培地（2×YT）に植菌し、30℃で18時間培養した。得られた大腸菌を集菌し、これを用いてN-アセチル-D-トリプトファン加水分解反応を行った。
【０１３９】
培養液5 mLより調製した各大腸菌、300 mMトリス-塩酸緩衝液（pH 8.0）、15% N-アセチル-DL-トリプトファンを含む10mLの反応液を、攪拌下25℃で24時間反応させた。コントロールとしては、野生型であるpSL-ADD6をもつ大腸菌HB101株を使用した。その結果、野生型では収率約15%であったのに対し、2アミノ酸置換変異体3AD-0013では収率約30%、3アミノ酸置換変異体3AD-0089では収率約80%であった。実施例15で得られた第3世代変異株は、より高濃度のN-アセチル-DL-トリプトファン加水分解反応における能力が高いことを確認した。
【０１４０】
[実施例19]  野生型D-アミノアシラーゼの酵素精製
野生型D-アミノアシラーゼをコードするDNAを含むプラスミドpSL-ADD6を有する大腸菌形質転換株を液体LB培地に植菌し、30℃で終夜培養した後、培地（2×YT）に植菌し、30℃で終夜培養した。遠心分離により菌体を調製し、得られた湿菌体を100 mM リン酸緩衝液（pH8.0）、0.02% 2-メルカプトエタノール及び2 mM フェニルメタンスルホニルフルオリド（PMSF）で澱懸し、ビードビーター（Biospec社製） により破砕後、遠心分離により菌体残渣を除去し、無細胞抽出液を得た。この無細胞抽出液にプロタミン硫酸を添加し、遠心分離により除核酸した上清を得た。その上清に硫安を30%飽和になるまで添加し、30%硫安を含む標準緩衝液（10 mMリン酸緩衝液（pH8.0）、0.01％ 2-メルカプトエタノール、10% グリセロール）で平衡化したPhenyl-Sepharose HP（2.6 cm×10 cm）に供し、硫安濃度を30%-0%の勾配溶出を行った。D-アミノアシラーゼ活性は、勾配溶出部分に認められた。溶出したピーク部分を回収し、限外濾過により濃縮した。
【０１４１】
濃縮した酵素液を標準緩衝液に対して透析した後、同緩衝液で平衡化したMono-Q（1.6 cm×10 cm）に添加し、0-0.5 M塩化ナトリウムの勾配溶出を行った。溶出した活性画分を回収し、限外ろ過により濃縮酵素液を得た。
精製酵素の比活性は528 U/mgであった。
【０１４２】
[実施例20]  変異型D-アミノアシラーゼA154-0043（A154Vのアミノ酸置換を含む）の酵素精製
実施例19に記載の方法と同様にして、変異型D-アミノアシラーゼ A154-0043をコードするDNAを含むプラスミドpSL-AD07を有する大腸菌形質転換株から変異型D-アミノアシラーゼ A154-0043を精製した。
精製酵素の比活性は758 U/mgであった。
【０１４３】
[実施例21]   変異型D-アミノアシラーゼ M347-0133（M347Aのアミノ酸置換を含む）の酵素精製
実施例19に記載の方法と同様にして、変異型D-アミノアシラーゼ M347-0133をコードするDNAを含むプラスミドpSL-AD08を有する大腸菌形質転換株から変異型D-アミノアシラーゼ M347-0133を精製した。
精製酵素の比活性は1099 U/mgであった。
【０１４４】
[実施例22]   変異型D-アミノアシラーゼ R374-0017（R374Fのアミノ酸置換を含む）の酵素精製
実施例19に記載の方法と同様にして、変異型D-アミノアシラーゼ R374-0017をコードするDNAを含むプラスミドpSL-AD09を有する大腸菌形質転換株から変異型D-アミノアシラーゼ R374-0017を精製した。
精製酵素の比活性は855 U/mgであった。
【０１４５】
[実施例23]   変異型D-アミノアシラーゼ3AD-0089（A154V/M347A/R374Fのアミノ酸置換を含む）の酵素精製
実施例19に記載の方法と同様にして、変異型D-アミノアシラーゼ3AD-0089をコードするDNAを含むプラスミドpSL-AD10を有する大腸菌形質転換株から変異型D-アミノアシラーゼ 3AD-0089を精製した。
精製酵素は約70%の純度で324 U/mgであった。
【０１４６】
[実施例24]   変異型D-アミノアシラーゼのN-アセチル-D-トリプトファン、及びN-アセチル-L-トリプトファンによる阻害の影響の確認
実施例20から23で精製したD-アミノアシラーゼのN-アセチル-D-トリプトファン、及びN-アセチル-L-トリプトファンによる阻害の影響について確認した。N-アセチル-D-トリプトファン、及びN-アセチル-L-トリプトファンに対する反応速度定数の測定を「生物化学実験講座21 酵素反応速度論実験入門」、「蛋白質・酵素の基礎実験法 改訂第2版」に記載の方法に従って行った。ミカエリス（Michaelis）定数をKm、最大速度をVmax、阻害物質定数をKi、過剰の基質による反応阻害の定数をKs’と表記する。Km、及びVmaxをLineweaver-Burkの逆数プロット、Kiを2次プロット（Royer）、Ks’を[S]-1/v プロットによって測定した。結果を表４に示す。
【０１４７】
いずれのD-アミノアシラーゼ変異体においてもN-アセチル-D-トリプトファンによる基質阻害の低減、及びN-アセチル-L-トリプトファンによる拮抗阻害の低減を確認した。
特に、3AD-0089（A154V/M347A/R374Fのアミノ酸置換を含む）は、99 mMの濃度のN-アセチル-D-トリプトファンにおいても基質阻害を受けず、89 mMの濃度のN-アセチル-L-トリプトファンにおいても拮抗阻害を受けず、阻害の低減が大きいことを確認した。
【０１４８】
【表４】
2004215656.tif 000005
【０１４９】
[実施例25]  野生型、及び変異型D-アミノアシラーゼを用いたN-アセチル-DL-トリプトファンからのD-トリプトファンの生産
5 unitの実施例19、及び実施例23の酵素精製過程において得られたそれぞれの無細胞抽出液、12%、15%、17%、20%、及び22%のそれぞれの濃度のN-アセチル-DL-トリプトファン、300 mM トリス-塩酸緩衝液（pH8.0）を含む0.5 mLの反応液を攪拌下、30℃で24時間反応させた。結果を表５に示す。野生型では、何れの基質濃度においてもD-トリプトファンの収率は10%未満であったが、変異体3AD-0089では、17%までの基質濃度において、D-トリプトファンの収率は80%以上であった。また、20%の基質濃度においても66%の収率、22%の基質濃度においても58%の収率でD-トリプトファンを生成することができることを確認した。
【０１５０】
【表５】
2004215656.tif 000006
【０１５１】
[実施例26]  変異型D-アミノアシラーゼ 3AD-0089（A154V/M347A/R374Fのアミノ酸置換を含む）をコードするDNAを含むプラスミドpSL-AD10を有する組換え大腸菌による高濃度のN-アセチル-DL-トリプトファンからのD-トリプトファンの生産
実施例18で取得した3AD-0089（A154V/M347A/R374Fのアミノ酸置換を含む）の変異型D-アミノアシラーゼを発現するプラスミドpSL-AD10により形質転換された大腸菌HB101株を液体LB培地に植菌し、30℃で終夜培養した後、培地（2×YT）に植菌し、30℃で18時間培養した。得られた大腸菌培養液を用いてN-アセチル-D-トリプトファン加水分解反応を行った。
大腸菌培養液、15% N-アセチル-DL-トリプトファンを含む400 mLの反応液を、攪拌下30℃で24時間反応させた。コントロールとしては、野生型であるpSL-ADD1をもつ大腸菌HB101株を使用した。結果を図1に示す。野生型では収率約4%であったのに対し、pSL-AD10を含む組換え大腸菌では収率90%以上であった（図１）。
【０１５２】
[実施例27]  変異型D-アミノアシラーゼ 3AD-0089（A154V/M347A/R374Fのアミノ酸置換を含む）を含むプラスミドpSL-AD10を有する組換え大腸菌による高濃度のN-アセチル-DL-トリプトファンからのD-トリプトファンの生産2
実施例26に記載と同様の方法で、N-アセチル-DL-トリプトファン濃度を20%として加水分解反応を行った。結果を図2に示す。変異型D-アミノアシラーゼ 3AD-0089（A154V/M347A/R374Fのアミノ酸置換を含む）をコードするDNAを含むプラスミドpSL-AD10を有する組換え大腸菌では収率90%以上であった。生成したトリプトファンの光学純度を次のようにして分析した。CROWNPAK CR（+）（ダイセル化学工業株式会社製）を用い、HClO4溶液（pH2.0）を溶離液として、40℃、1.0 mL/minの流速、280 nmで検出することにより分析した。保持時間は、D体が16分、L体が19分であった。その結果、生成したトリプトファンは光学純度がほぼ100%e.e.でD体であることが確認でき、変異を導入したことによっても立体選択性に変化を及ぼさなかったことを確認した（図２）。
【図面の簡単な説明】
【０１５３】
【図１】野生型または変異型D-アミノアシラーゼ を生産する組換え大腸菌の培養液を用いて、15% N-アセチル-DL-トリプトファンの加水分解によりD-トリプトファンを生成した結果を示す。縦軸はD-トリプトファン生成量（g/L）または収率（%）、横軸は反応時間（h）を示す。
【図２】変異型D-アミノアシラーゼを生産する組換え大腸菌の培養液を用いて 、20% N-アセチル-DL-トリプトファンの加水分解によりD-トリプトファンを生成した結果を示す。縦軸はD-トリプトファン生成量（g/L）または収率（%）、横軸は反応時間（h）を示す。
【図１】
2004215656.tif 000007
【図２】
2004215656.tif 000008
【配列表】
2004215656000001.app