【手続補正書】
【提出日】平成24年10月3日(2012.10.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【発明の名称】生体活性材料をカプセル化したナノスフェアおよびナノスフェアの製剤化のための方法
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照。本出願は、２００８年９月２９日に、生体活性材料をカプセル化したナノスフェアおよびナノスフェアの製剤化のためのワンステップ法（ＮＡＮＯＳＰＨＥＲＥＳ  ＥＮＣＡＰＳＵＬＡＴＩＮＧ  ＢＩＯＡＣＴＩＶＥ  ＭＡＴＥＲＩＡＬ  ＡＮＤ  ＯＮＥ  ＳＴＥＰ  ＭＥＴＨＯＤ  ＦＯＲ  ＦＯＲＭＵＬＡＴＯＩＮ  ＯＦ  ＮＡＮＯＳＰＨＥＲＥＳ）というタイトルで出願され、かつ本出願の出願人に共通に譲渡された同時係属の米国仮特許出願第６１／１００，８８６号の利益を主張するものであり、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本開示は、カプセル薬送達系に関する。本開示はさらに、生体活性組成物をカプセル化し、細胞への取込み後に実質的な生体活性を保持するナノメートルサイズ範囲の粒子を生成するために抗原性のない生体分解性材料を用いてカプセル薬を調製する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
標的とされる部位や特定の罹患部位への薬物の送達は、患者における副作用の軽減を助け、それにより毒性を防ぐことができる。標的とされない部分への薬物の曝露は悪影響を及ぼすことがある。ナノスフェア（「ＮＳ」）製剤中の薬物を用いることにより、罹患していない器官や組織への薬物の曝露を防ぐかまたは実質的に減らすことができる。本開示の目的のために、ナノスフェアサイズの粒子は、約５０〜約９９９ナノメートルの範囲の一般的な平均サイズを有する粒子を意味する。ナノスフェアは、制御された形で薬物を放出し、それによって、薬物を頻繁に投与する必要性を最小限に抑えることもできる。これらのナノスフェアは、カプセル薬がナノサイズであるために、細胞にトランスフェクトするのに効果的に使用することができる。これらのナノスフェアは、そのサイズが小さく、効果的な腸溶性コーティングのおかげで胃の厳しい酸性環境下で分解されることなく、腸のパイエル板にワクチン材料をターゲッティングし、送達することができる。また、そのサイズが小さいために、ナノスフェアは、かなり容易に腫瘍に浸透することができる。
【０００４】
生体活性材料のいくつかの例としては、タンパク質、ペプチド、抗体、酵素、化学的実体、薬物が挙げられるが、これらに限定されない。免疫抑制剤（例えば、ＦＫ−５０６）や抗炎症薬（例えば、デキサメタゾンやプレドニソロンなどのステロイド）などの、他の薬物は、移植ドナーの状況にある移植臓器の生存率を変化させるのに有用であることが示される可能性がある。噴霧乾燥により調製されるアルブミンナノスフェアは、オリゴヌクレオチドを送達するための、見込みのある薬物送達方法となり得る。本開示の目的のために、「薬物」は、本明細書に記載の生体活性材料のいずれをも含むと看做される。
【発明の概要】
【０００５】
本開示には、本発明のいくつかの例示的な実施形態が記載されている。本開示の一態様は、生体活性材料を含有するマイクロスフェアを形成するための方法であって、第１の容器中で、アルブミンまたはβ−シクロデキストリンなどの、ポリマーマトリックスを水性媒体に溶解させること；溶解したポリマーマトリックスを、グルタルアルデヒドなどの、架橋剤と接触させて、ポリマーマトリックスと架橋剤を架橋すること；架橋が実質的に完了した後、全ての余分な架橋剤を硫酸水素ナトリウムで中和すること；第２の容器中で、生体活性材料を、限定されるものではないが、水、生理食塩水およびリン酸緩衝生理食塩水などの、水溶液に可溶化すること；可溶化した生体活性材料を、溶液状態の中和し架橋したポリマーマトリックスと一緒に混合して、混合物を形成すること；ならびに混合物を噴霧乾燥して、ナノスフェアを生成することを含み、生体材料の実質的な生体活性が細胞への取込み時に保持される、方法を提供する。
【０００６】
本開示の別の態様は、生体活性材料を含有するマイクロスフェアを形成するための方法であって、第１の容器中でポリマーマトリックスを水性媒体に溶解させること；第２の容器中で生体活性材料を緩衝水溶液に可溶化すること；腸溶性コーティング材料を水性媒体に可溶化すること；可溶化した生体活性材料と可溶化した腸溶性コーティング材料を混合して、溶液を形成すること；および混合物を噴霧乾燥して、ナノスフェアを生成することを含み、生体材料の実質的な生体活性が細胞への取込み時に保持される、方法を提供する。
【０００７】
本開示の別の態様は、マクロファージなどの食細胞における生体活性材料の細胞内濃度を高める方法であって、本明細書に開示された方法によって生成されるナノスフェアを準備すること；および導入後に生体活性材料がナノスフェアから放出され、ナノスフェア中の生体活性材料の実質的な生体活性が保持され、生体材料の細胞内濃度が増加するように、ナノスフェアを食細胞に導入することを含む、方法を提供する。
【０００８】
本開示の別の態様は、生体活性材料を細胞に送達する方法であって、本明細書に記載の方法によって生成される生体活性材料のナノスフェアを準備すること；ナノスフェアと担体とを混合すること；細胞がナノスフェアを貪食し、生体活性材料が、生体材料の実質的な生体活性が保持されるように細胞内でマイクロスフェアから放出されるように混合物を患者に導入することを含む、方法を提供する。
【０００９】
本開示の別の態様は、投与後に免疫を誘導するためのアジュバントを含まないワクチン製剤を送達する方法であって、本明細書に記載の方法によって生成されるワクチン製剤のナノスフェアを準備すること；および細胞がナノスフェアを貪食し、生体活性材料が、ワクチン製剤の実質的な生体活性が保持されるように細胞内でマイクロスフェアから放出されるようにナノスフェアを患者に導入することを含む、方法を提供する。
【００１０】
本開示の別の態様は、本明細書に記載の方法によって生成される生体活性材料（単数または複数）を含有する新規のナノスフェアを提供し、この生体活性材料（単数または複数）は、細胞への取込み後に実質的な生体活性を保持する。
【００１１】
本開示は、ナノメートル規模のサイズであるがゆえに、非経口投与の適用規模がより大きく、様々な疾患状態および疾患臓器（例えば、腫瘍など）へのより効果的なターゲッティングが可能な、カプセル薬を調製する方法を提供する。
【００１２】
本開示はまた、カプセル薬送達系に関する。特に、本開示は、ａ）体内の薬物レベルを長期間にわたって治療的レベルに持続するように制御された形で薬物を放出することができ；ｂ）アジュバントを使用せずにワクチンを送達する効果的な方法として使用することができ；ｃ）マクロファージなどの食細胞、内皮細胞、クッパー細胞、樹状細胞などをターゲッティングするために使用することができ；ｄ）タンパク質（例えば、インスリンおよびヘパリン）などの生体活性薬物を送達するために使用することができ；かつｅ）生体分解性コーティングを消化して、無傷の薬物または活性成分を細胞内または疾患部位のいずれかに放出する、罹患臓器（例えば、肝臓、腎臓、肺、心臓、脾臓）または罹患部位（例えば、腫瘍、関節炎の関節）をターゲッティングするために使用することができるカプセル化組成物に対して抗原性のない生体分解性材料を用いるプロセスでカプセル薬を調製する方法に関する。これらの組成物は、疾患の治療および予防に有用である。
【００１３】
本開示によるナノスフェアを生成する方法は連続的なプロセスである。本方法は、製造プロセスの間維持することができる実質的に完全な無菌状態を提供する。生体分子を変性させる傾向のある有機溶媒は含まれない。バースト放出はごくわずかであり、ナノスフェアは、ゼータ電位値に基づく優れた懸濁安定性を有する。本方法は、生体活性薬物の構造を変化させない。本方法は、実験室規模の生産から大規模な工業生産への簡単な拡大に適している。
【００１４】
本開示の一態様は、スプレードライヤーの使用を伴う方法を用いて、アルブミンやβ−シクロデキストリンナノスフェアに含まれる水溶性化合物をカプセル化するための方法を提供する。
【００１５】
本開示に従って形成されるナノスフェアは、制御された薬物送達系としての役割を果たすことができる。
【００１６】
本開示のナノスフェア送達系は、ＮＦ−κＢに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドなどの一本鎖ＤＮＡを細胞にトランスフェクトする効果的な方法としての役割を果たすことができる。
【００１７】
本開示のナノスフェア送達系は、腸にターゲッティングされるワクチンを胃の厳しい酸性環境下でワクチンを変性させることなく経口投与経路で送達する効果的な方法としての役割を果たすことができる。
【００１８】
本開示のナノスフェア送達系は、黒色腫などの腫瘍に薬物をターゲッティングする効果的な方法としての役割を果たすことができる。
【００１９】
本開示のナノスフェア送達系は、腫瘍を同定するための効果的な診断ツールとしての役割を果たすことができる。
【００２０】
本開示のナノスフェア送達系は、炎症促進性サイトカインの大部分を産生するマクロファージ／単球などの食細胞をターゲッティングすることができる。この技術は、サイトカインを阻害する化合物、例えば、ＮＦ−κＢに対するアンチセンスオリゴマー、デキサメタゾン、カタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、ＣＮＩ−１４９３の効力を改善することが示されている。
【００２１】
本開示のナノスフェア送達系は、カプセル化形態のゲンタマイシンやバンコマイシンなどの抗生物質を感染臓器や感染細胞に送達することができる。
【００２２】
本開示のナノスフェア送達系は、ＡＩＤＳなどの疾患状態の細胞内に抗ＨＩＶウイルス薬を送達することができる。
【００２３】
本開示のナノスフェア送達系は、カプセル化形態のカタラーゼやスーパーオキシドジスムターゼなどの薬物を敗血性ショックなどの疾患状態に送達することができる。
【００２４】
本開示のナノスフェア送達系は、抗真菌薬のアムホテリシンＢを含有するステルスナノスフェアの製剤化と評価の一部であることができる。
【００２５】
本開示のナノスフェア送達系は、糖タンパク質薬のナノスフェアである、経口投与ヘパリンを送達することができる。
【００２６】
本開示のナノスフェア送達系は、経口投与後、糖尿病状態にインスリンを送達することができる。
【００２７】
本開示における「１つの」生体活性材料に対する言及は、１つまたはいくつかの生体活性材料を含むことが意図されることが理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
本発明の態様を以下の図面で説明する：
【図１】関節炎ラットモデルでの、１５日目のラット後肢腫脹に対するカプセル化アンチセンスＮＦ−κＢオリゴマーと可溶性アンチセンスＮＦ−κＢオリゴマーの効果のグラフである。
【図２】アルブミンナノスフェアの腎取込みを示す４枚１組の顕微鏡写真である。
【図３】エクスビボ腎移植モデルでの研究群間のＴＮＦ−αレベルのグラフである。
【図４】エクスビボ腎移植モデルでの研究群間のＩＬ−１βレベルのグラフである。
【図５】エクスビボ腎移植モデルでの研究群間の一酸化窒素（ＮＯ）レベルのグラフである。
【図６】インビボ（ラット）敗血性ショックモデルでのＩＬ−１β放出に対するカタラーゼ製剤の効果のグラフである。
【図７】カプセル化されていないヒト結核菌（Ｍｔｂ）全細胞ライセートおよびブランクＢＳＡナノスフェアの生体活性と比較したときのカプセル化されたＭｔｂ全細胞ライセートの生体活性のグラフである。
【図８】試験ラットおよび対照ラットのＭｔｂ抗原特異的血清ＩｇＧの光学密度のグラフである。
【図９】試験ラットおよび対照ラットにおける全細胞抗原の経口ワクチン接種後の血清ＩｇＡレベルのグラフである。
【図１０】試験ラットおよび対照ラットにおける様々な体液中のＭｔｂ抗原特異的血清ＩｇＡの光学密度のグラフである。
【図１１】ブランクナノ粒子群、経口ワクチンナノ粒子群および経口ワクチン溶液群における血清ＩｇＧ応答のグラフである。
【図１２】ナノスフェアおよび溶液を投与した後のマクロファージにおけるアンチセンスＮＦ−κＢオリゴヌクレオチドの細胞内濃度のグラフである。
【図１３】ナノスフェア製剤および溶液製剤でのヒト微小血管内皮細胞内へのＮＦ−κＢアンチセンスオリゴヌクレオチドの取込みのグラフである。
【図１４】黄色ブドウ球菌感染ラットの予防的バンコマイシン処置後の細菌カウントのグラフである。
【図１５】黄色ブドウ球菌感染ラットの同時バンコマイシン処置後の細菌カウントのグラフである。
【図１６】黄色ブドウ球菌感染ラットの遅延型バンコマイシン処置後の細菌カウントのグラフである。
【図１７】製剤Ｆ−１（ポリエチレングリコールなし）およびＦ−２（ポリエチレングリコールあり）のヒト微小血管内皮細胞（ＨＭＥＣ）への比較取込みのグラフである。
【図１８】マクロファージ細胞株（ＲＡＷ細胞）による製剤Ｆ−１（ポリエチレングリコールなし）およびＦ−２（ポリエチレングリコールあり）の比較取込みのグラフである。
【図１９】ナノスフェア製剤を２４時間かけて単回経口投与した後の低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）の血漿抗第Ｘａ因子活性レベルのグラフである。
【図２０】ラットにおける静脈内（ＩＶ）、皮下（ＳＣ）および経口（ＭＳ．３）経路後のＬＭＷＨ溶液の薬物動態プロファイルのグラフである。
【図２１】血糖値に対するナノスフェア製剤中のインスリンの経口投与の効果のグラフである。
【図２２】ウサギの眼の瞳孔対角膜の長さ比に対する標準アトロピン１％溶液および低力価の硫酸アトロピンカプセル化ナノスフェア（０．６６％）の効果の比較のグラフである。
【図２３】ブランクナノ粒子の顕微鏡写真（ＳＥＭ）である。
【図２４】不活化ウイルスワクチンの経口ワクチン接種が防御免疫を誘導する結果のグラフである。
【図２５】ターゲッティングレクチンの存在下でのＮＳのＣａｃｏ２およびＭ細胞への取込みを示すグラフである。
【図２６】腸のパイエル板の微絨毛におけるナノスフェア（緑色の点）分布の顕微鏡写真である。
【図２７】黒色腫経口ワクチンの効力を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本開示は、以下のものを提供する：
１）ナノスフェアを調製する方法。
２）薬物を身体に送達する方法。
３）制御され、持続される薬物送達系。
４）腫瘍を同定するための効果的な診断ツールを調製する方法。
５）従来のアジュバントを用いずに、ワクチンを経口投与した後に免疫を誘導するために使用することができる効果的なワクチン製剤を調製し、送達する方法、ならびに
６）従来のアジュバントを使用せずに、ワクチンを吸入および全身投与した後に免疫を誘導するために使用することができる効果的なワクチン製剤を調製し、送達する方法。
【００３０】
本開示の一態様では、ナノスフェアを、ミニスプレードライヤーを用いるプロセスを用いて、生体活性材料を目に見えるほどは変性させることなく調製することができる。本開示の一態様では、ポリマーマトリックスをグルタルアルデヒドで事前架橋し、次いで、余分なグルタルアルデヒドを硫酸水素ナトリウムで中和し、次いで、事前架橋および中和したマトリックスに生体活性材料を添加する。この後、生体活性マトリックスを含有する架橋したポリマーマトリックスを噴霧乾燥する。ナノスフェアを得るために、限定されるものではないが、入口温度、ポンプフロー、吸引速度および空気圧などの、スプレードライヤーについての様々なパラメータを最適化した。アルブミンをマトリックスとして使用してもよい。グルタルアルデヒドを架橋剤として使用した。グルタルアルデヒド濃度の平均粒径に対する影響を、グルタルアルデヒドの濃度を変化させることにより検討した。アルブミンマトリックスの事前架橋時間、硫酸水素ナトリウムによる余分なグルタルアルデヒドの中和の時間、架橋時間および生体活性や平均粒径に影響を及ぼす他の要因を全て検討した。
【００３１】
本開示は、生体活性材料を事前架橋および中和したポリマーマトリックスにカプセル化することによってナノスフェアを生成する方法を提供する。
【００３２】
本開示の別の態様では、薬物をカプセル化するためのポリマーマトリックスとして（アルブミンの代わりに）β−シクロデキストリンを用いて、ナノスフェアを調製した。
【００３３】
本明細書に記載の方法の１つの利点は、費用対効果ベースで工業規模の大規模な無菌製造プロセスに拡大することができるということである。本プロセスを用いれば、薬物が溶液製剤から最終的なナノスフェア形態に直接変換されるので、粒子の形成後に粒子から溶媒を除去するための分離工程が必要なくなる。本発明を用いれば、粒子は乾燥粉末形態に直接変換される。乾燥粉末形態に変換されるので、薬物は非常に安定であり、したがって、薬物の溶液製剤と比較したとき、保存期間がより長いと考えられる。本プロセスを用いれば、水性相を除去するための追加のフリーズドライ工程が必要なくなり、より上質な生成物が得られる。
【００３４】
別の利点は、アルブミンポリマーマトリックスの架橋の程度を制御することによって、薬物の放出を非常に効果的に制御および設計することができるという事実である。アルブミンポリマーマトリックスの架橋が多ければ多いほど、ポリマーマトリックスからの薬物の放出は遅くなる。
【００３５】
本発明のナノメートルサイズのカプセル化材料の粒径が小さいために、細胞内へのより効果的な取込み、ひいては身体の特定の臓器や疾患部位へのより効果的な全体としてのターゲッティングが可能になる。
【００３６】
本発明の態様を、説明のためにのみ示される以下の実施例に関連してさらに説明する。そのような実施例に見られる部分およびパーセンテージは、特に規定されない限り、重量によるものである。
【００３７】
実施例１：関節炎でのヌクレオチド化合物、すなわち、ＮＦ−κＢに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドのナノスフェアの評価
【００３８】
目的
【００３９】
本研究の目的は、ＮＦ−κＢに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを含有するナノスフェアが、ラットのアジュバント多発性関節炎で関節炎を改善させるかどうかを明らかにすることであった。
【００４０】
方法
【００４１】
ＮＦ−κＢに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを含有するナノスフェアを製剤化するための１つの例示的な方法は、以下の工程を含む：
【００４２】
ａ）アルブミンを水に溶解させる；
【００４３】
ｂ）溶解したアルブミンをグルタルアルデヒドで４〜２４時間事前架橋する；
【００４４】
ｃ）架橋が完了した後で余分なグルタルアルデヒドを硫酸水素ナトリウムで中和する；
【００４５】
ｄ）別の容器中でＮＦ−κＢに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド（オリゴマー）をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に可溶化する；
【００４６】
ｅ）可溶化したＮＦ−κＢに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド（オリゴマー）を、溶液状態の中和し架橋したアルブミンと一緒に混合する；および
【００４７】
ｆ）事前架橋したアルブミンとＮＦ−κＢに対するアンチセンスヌクレオチドとを含有する溶液を噴霧乾燥して、ナノスフェアを生成する。スプレードライヤーの設定は、以下の通りである。ポンプ２％、アスピレーター５０％、入口温度１１０℃、エアフロー６００ｐｓｉ。
【００４８】
生成物を回収し、密封容器中に保存した。平均粒径およびゼータ電位（図１に示す）を、マルバーンゼータサイザーを用いて測定した。
【００４９】
【表１】
2012504150.tif 000001
【００５０】
１マイクロメーター未満の所望のサイズ範囲のナノスフェアを、噴霧乾燥の条件を最適化することにより調製した。
【００５１】
動物研究：
【００５２】
雄のスプラーグ・ドーリーラットの右後肢の足底部に、軽油に懸濁した熱殺菌Ｍ．ブチリカム（フロイントの完全アジュバント）を注射した。対測肢に、対照として鉱油のみを注射した。ラットを２つの群に分けた。
【００５３】
複数回用量研究：
【００５４】
ａ）ナノスフェア製剤中のアンチセンス（１５ｍｇ／ｋｇおよび３０ｍｇ／ｋｇ）
【００５５】
ｂ）従来の溶液製剤中のアンチセンス（１５ｍｇ／ｋｇおよび３０ｍｇ／ｋｇ）
【００５６】
複数回用量群については、アジュバント注射後４、５、６、８、１０、１２、１４日目に、用量（１０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内投与した。
【００５７】
左右の後肢をプレチスモグラフィーにより水銀置換法で測定した。
【００５８】
結果
【００５９】
図１は、１５日目に得られた注射された後肢と注射されていない後肢の両方についての肢容積測定値を示す。図に示すように、従来の溶液製剤の同等の用量と比較したとき、１５および３０ｍｇ／ｋｇ用量について陽性対照と比較して右（注射された）肢の容積に有意差が見られた（ｐ＜０．０５）。同等の溶液群と比較したとき、両方のナノスフェア投与群について、左（注射されていない）肢の容積にも有意差が見られた（ｐ＜０．０５）。これは、この関節炎ラットモデルで試験したときにより良好な効力を示すカプセル化製剤の有効性を明確に示している。
【００６０】
実施例２：腎移植モデルでの腎臓の生存に関するヌクレオチド化合物、すなわち、ＮＦ−κＢに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドナノスフェアの評価
【００６１】
目的
【００６２】
本研究の目的は、ＮＦ−κＢに対するアンチセンスオリゴマーのナノスフェアが、腎移植モデルでの腎臓の生存に何らかの効果を有するかどうかを明らかにすることであった。
【００６３】
序論
【００６４】
腎臓などの臓器への血流の遮断は、臓器の機能に深刻な影響を及ぼす虚血性変化をもたらす。虚血性の血流減少の結果である急性腎不全がインビボでの腎臓の機能に影響を及ぼすのに対し、腎臓の移植提供は、レシピエントにおけるこの臓器のその後の機能に影響を及ぼす。核因子κβ（ＮＦ−κＢ）は、臓器移植の急性拒絶の発症に高度に関与する一連のサイトカインおよび接着分子の遺伝子の協調的なトランス活性化において極めて重要な役割を果たす。ＮＦ−κＢ活性の増加は、腎虚血／再灌流傷害で示されている。同様に、虚血／再灌流傷害時の酸化ストレスの増加も、ＮＦ−κＢ活性化の増加を引き起こし得る。移植に伴う温虚血傷害または冷虚血傷害の初期事象は、初期の移植片機能と後期の変化の両方に影響を及ぼし得る。したがって、本発明者らは、ドナーの腎臓中にＮＦ−κＢに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いてＮＦ−κＢ活性化を阻害することにより、急性拒絶が抑えられ、移植片の生存が延長し、それにより、急性腎拒絶の効果的な治療法が提供されるという仮説を立てた。
【００６５】
ＮＦ−κＢに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを含有するナノスフェアを、上記実施例１に記載の方法により調製した。
【００６６】
ＮＦ−κＢに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドのナノスフェアの腎取込みの評価
【００６７】
まずラットを安楽死させ、腎動脈と腎静脈にカニューレを挿入した。腎臓にヘパリン化生理食塩水およびウィスコンシン大学（ＵＷ）臓器保存溶液を灌流させた。生理食塩水に懸濁したアルブミンナノスフェア（３ｍｇ／ｍｌ）を腎動脈に注射した。腎臓を３７℃で２時間置き、その後、２４時間まで４℃で保存した。腎臓の組織学切片を採取し、蛍光顕微鏡を用いて画像を取得した。
【００６８】
ＮＦ−κＢ活性の阻害の評価
【００６９】
表２は腎移植モデルでのＮＦ−κＢ活性の阻害のエクスビボ評価のための研究デザインを示す。腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）および一酸化窒素（ＮＯ）をＮＦ−κＢ活性のマーカーとして用いた。文献に報告されている方法の通りに、腎臓にカニューレを挿入した。リポ多糖（ＬＰＳ）刺激を伴う研究群については、カニューレ挿入後、腎臓にまずＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）１ｍｌを注射した。ＮＦ−κＢに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドが充填されたアルブミンナノスフェアを腎臓に注射した。腎臓にＵＷ臓器保存溶液を灌流させることにより、試料を２、４、８および２４時間で採取した。灌流液由来のＴＮＦ−αおよびＩＬ−１βをＥＬＩＳＡで測定すると同時に、一酸化窒素をグリース反応に基づく分光光度アッセイで測定した。
【００７０】
【表２】
2012504150.tif 000002
【００７１】
結果：
【００７２】
図２は、アルブミンナノスフェアの腎取込みを示す。
【００７３】
図３は、エクスビボ腎移植モデルでの研究群間のＴＮＦ−αレベルを示す。ラットにヘパリンナトリウム（２００Ｕ／Ｋｇ）を腹腔内（ＩＰ）注射した。注射の３０分後に、ラットを安楽死させ、腎動脈と腎静脈にすぐにカニューレを挿入した。カニューレを挿入した腎臓に、生理食塩水（０．５ｍｌ）、溶液形態およびナノスフェア形態のアンチセンスＮＦ−κＢ（１５ｍｇ／Ｋｇ）、ならびにブランクナノスフェアを注射した。腎臓を３７℃で２時間置き、その後、２４時間まで４℃で保存した。摘出した腎臓に２、４、８および２４時間でＵＷ臓器保存溶液を灌流させ、灌流液を回収した。ＴＮＦ−αレベルをＥＬＩＳＡで測定した。（平均＋Ｓ．Ｅ．、全ての実験についてｎ＝６）。
【００７４】
図４は、エクスビボ腎移植モデルでの研究群間のＩＬ−１βレベルを示す。ラットにヘパリンナトリウム（２００Ｕ／Ｋｇ）をＩＰ注射した。注射の３０分後に、ラットを安楽死させ、腎動脈と腎静脈にすぐにカニューレを挿入した。カニューレを挿入した腎臓に、生理食塩水（０．５ｍｌ）、溶液形態およびナノスフェア形態のアンチセンスＮＦ−κＢ（１５ｍｇ／Ｋｇ）、ならびにブランクナノスフェアを注射した。腎臓を３７℃で２時間置き、その後、２４時間まで４℃で保存した。摘出した腎臓に２、４、８および２４時間でＵＷ臓器保存溶液を灌流させ、灌流液を回収した。ＩＬ−１βレベルをＥＬＩＳＡで測定した。（平均＋Ｓ．Ｅ．、全ての実験についてｎ＝６）。
【００７５】
図５は、エクスビボ腎移植モデルでの研究群間の一酸化窒素（ＮＯ）レベルを示す。ラットにヘパリンナトリウム（２００Ｕ／Ｋｇ）をＩＰ注射した。注射の３０分後に、ラットを安楽死させ、腎動脈と腎静脈にすぐにカニューレを挿入した。カニューレを挿入した腎臓に、生理食塩水（０．５ｍｌ）、溶液形態およびナノスフェア形態のアンチセンスＮＦ−κＢ（１５ｍｇ／Ｋｇ）、ならびにブランクナノスフェアを注射した。腎臓を３７℃で２時間置き、その後、２４時間まで４℃で保存した。摘出した腎臓に２、４、８および２４時間でＵＷ臓器保存溶液を灌流させ、灌流液を回収した。ＮＯレベルをグリース反応に基づく分光光度アッセイで測定した。
【００７６】
結論：
【００７７】
図２に見られるように、アルブミンナノスフェアが腎細胞に取り込まれたのは明白であり、したがって、微粒子送達ビヒクルを用いて虚血性臓器に薬物を送達することができることを示している。ＮＦ−κＢ活性の阻害を評価するために、ＬＰＳに似た既知のサイトカイン産生刺激因子を腎臓に注射した。図３、４、５は、ＬＰＳ刺激後の研究群におけるそれぞれ２、４、８および２４時間でのＴＮＦ−α、ＩＬ−１βおよびＮＯのレベルを示す。本発明のナノスフェア製剤中のアンチセンスＮＦ−κＢが、溶液形態のアンチセンスＮＦ−κＢと比較して、ＮＦ−κＢの活性化を有意に阻害し、それによりサイトカインの産生を阻害することができるということがデータから明らかに明白である。ＮＦ−κＢに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを含有するナノスフェアは、溶液形態のアンチセンスＮＦ−κＢと比較して、ＮＦ−κＢの活性化を有意に阻害した。
【００７８】
免疫抑制薬（例えば、ＦＫ−５０６）、および抗サイトカイン薬（例えば、デキサメタゾン）などの他の薬物は、移植ドナー状況で細胞の生存率を変化させるときに有用であることが示される可能性がある。噴霧乾燥により調製されたアルブミンナノスフェアは、オリゴヌクレオチドを送達するための見込みある薬物送達方法となり得る。
【００７９】
実施例３：敗血性ショックモデルにおける生体活性タンパク質、すなわち、カタラーゼを含有するナノスフェアの製剤化
【００８０】
序論：
【００８１】
敗血性ショックは、病原体感染に対する宿主自然免疫応答または虚血によって開始される細胞事象のカスケードの最終段階である。これらの細胞事象は、主に、内皮細胞と白血球で起こる。これにより、炎症促進性サイトカインの放出が増加する。腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）は、炎症時のアポトーシス性細胞死と細胞増殖とを引き起こす。インターロイキン１β（ＩＬ−１β）は、Ｂ細胞成熟、炎症および増殖を刺激する。インターロイキン６（ＩＬ−６）は、抗菌活性と筋活動を刺激する。スーパーオキシドアニオン（Ｏ２）、一酸化窒素（ＮＯ）および過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）などの、反応性酸化種（ＲＯＳ）は、高濃度で細菌や内皮に細胞毒性がある。ＲＯＳはまた、核因子κＢ（ＮＦ−κＢ）を刺激して、炎症促進性遺伝子発現を誘導する。一酸化窒素または内皮由来弛緩因子も、平滑筋弛緩を引き起こす。
【００８２】
結果として生じる全身性炎症応答症候群（ＳＩＲＳ）、難治性低血圧および多臓器不全は全て、敗血性ショックの非定型のものである。主に白血球ペリオキシソームで産生される内在性酸化防止物質であるカタラーゼは、ＮＦ−κＢ活性化の増強を含むＲＯＳの毒性を軽減するが、敗血性ショックでは押さえ込まれる。
【００８３】
カタラーゼの治療的使用の可能性は、その短い静脈内半減期と低い細胞内取込みによって限定されている。カプセル化カタラーゼ製剤（ナノスフェア）は、インビトロでカタラーゼ溶液に優る内皮細胞やマクロファージへの細胞内取込みの増強を示している。血管内皮組織やマクロファージに対する潜在的なカタラーゼ治療は、過剰なＲＯＳの毒性や炎症促進性サイトカイン産生を防御し得る。
【００８４】
方法：
【００８５】
カタラーゼナノスフェアを以下の方法により製剤化した。
【００８６】
ａ．アルブミンを水に溶解させる；
【００８７】
ｂ．溶解したアルブミンをグルタルアルデヒドで４〜２４時間事前架橋する；
【００８８】
ｃ．架橋が完了した後で余分なグルタルアルデヒドを硫酸水素ナトリウムで中和する；
【００８９】
ｄ．別の容器中でカタラーゼをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（または水もしくは生理食塩水などの他の水性溶媒）に可溶化する；
【００９０】
ｅ．可溶化したカタラーゼを、溶液状態の中和し架橋したアルブミンと一緒に混合する；および
【００９１】
ｆ．事前架橋したアルブミンとカタラーゼとを含有する溶液を噴霧乾燥して、ナノスフェアを生成する。スプレードライヤーの設定は、以下の通りである。ポンプ２％、アスピレーター５０％、入口温度１１０℃、エアフロー６００ｐｓｉ。
【００９２】
生成物を回収し、密封容器中に保存した。平均粒径およびゼータ電位を、マルバーンゼータサイザーを用いて測定した。
【００９３】
動物研究：
【００９４】
大腸菌感染敗血症動物モデル（ラット）で炎症促進性サイトカイン放出に対するカタラーゼ製剤の効果を評価した。３つ全ての群の腹腔内に、カタラーゼ製剤：１５ｍｇ／ｋｇ、次いで、大腸菌ＬＰＳ  １μｇ／ｍｌ／ｋｇを４時間前処置した。この３つの群は、（１）陽性対照（ＬＰＳのみ）；（２）カタラーゼ溶液；および（３）カタラーゼナノスフェアであった。２４時間で血液試料を採取し、血清をＩＬ−１βについてＥＬＩＳＡでアッセイした。
【００９５】
結果：
【００９６】
溶液製剤と比較したとき、カプセル化製剤は優れた特性を示した。
【００９７】
図６は、インビボ（ラット）敗血性ショックモデルでのＩＬ−１β放出に対するカタラーゼ製剤の効果を示す。
【００９８】
結論
【００９９】
カタラーゼナノスフェアは、インビボ動物モデルでＩＬ−１β放出を阻害した。アルブミンナノスフェアは、敗血性ショックの治療における潜在的治療薬としての内在性抗酸化物質カタラーゼのための潜在的に効果的な送達ビヒクルを提供した。
【０１００】
実施例４：ワクチン送達系の例：経口ワクチン：ＴＢ抗原に対するナノスフェアを用いたヒト結核菌（ＴＢ）に対する粘膜免疫の誘導
【０１０１】
目的：本実施例で、本発明者らは、経口ＴＢワクチンの製剤化と試験を報告する。
【０１０２】
序論
【０１０３】
何十年もの努力と巨額の出費にもかかわらず、結核（ＴＢ）は、世界の最も悲惨な疾患の１つであり続けている。また、ＢＣＧ（カルメット−ゲラン菌）を含むほとんどのワクチンは全身投与され、そのため、強い全身免疫応答を発生させるが、通常、それらは、弱い粘膜免疫しか刺激せず、感染の樹立を効果的に予防することができない。最近、経口経路による抗原の粘膜適用が全身性応答と粘膜応答の両方を誘導することができることが多くの研究者らにより伝えられている。ＴＢに対するワクチンの経口投与にはいくつかの利点があり、それには、投与の容易さ、費用の安さ、および針刺しの回避とそれに伴う病気を移すリスクの低下が含まれる。さらに、経口免疫は、より効果的に粘膜免疫応答を標的とする。モルモットやマウスをＭ．ボビスＢＣＧで経口免疫すると、脾臓やリンパ節の細胞集団における免疫応答および精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ）特異的な遅延型の過敏症と抗体応答が誘導されることが示されている。高用量のＭ．ボビスＢＣＧで経口または胃内に免疫したマウスは、皮下経路から免疫したマウスと同じレベルの防御免疫を示し、ヒト結核菌（Ｍｔｂ）の静脈内投与に対する防御を誘導した。これらの報告は、粘膜免疫が防御的な全身免疫応答を誘導する効果的な手段であり得ることを示唆している。効率的な抗原提示や微生物特異的Ｔリンパ球によるＩＦＮ−γ産生がＭｔｂに対する防御に必要なので、この発見は、ＢＣＧワクチン接種の低い効力をさらに説明し得る。それゆえ、効率的な抗原提示能力を有するより効果的な送達系は、疾患と戦うためのより効果的な方法となる可能性がある。
【０１０４】
以下は、ヒト結核菌死細胞抗原を経口送達するための生体分解性非毒性ナノスフェアの開発を説明したものである。
【０１０５】
方法
【０１０６】
ナノスフェア製剤
【０１０７】
腸溶性コーティング特性を有するヒト結核菌死細胞抗原を含有するナノスフェアを製剤化するための方法の１つの例示的な実施形態は、以下のプロセスを含む：
【０１０８】
ａ）アルブミンを水（またはＰＢＳもしくは生理食塩水などの他の水性溶媒）に溶解させる；
【０１０９】
ｂ）溶解したアルブミンをグルタルアルデヒドで４〜２４時間事前架橋する；
【０１１０】
ｃ）架橋が完了した後で余分なグルタルアルデヒドを硫酸水素ナトリウムで中和する；
【０１１１】
ｄ）別の容器中でヒト結核菌全細胞抗原（ナノスフェアは５０％ｗ／ｗの抗原を含有していた）をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に可溶化する；
【０１１２】
ｅ）限定されるものではないが、メチルメタクリレートなどの腸溶性コーティングポリマーを水に可溶化する；
【０１１３】
ｆ）可溶化した抗原と可溶化した腸溶性コーティングポリマーとを、溶液状態の中和し架橋したアルブミンと一緒に混合する；および
【０１１４】
ｇ）事前架橋したアルブミンと抗原とを含有する溶液を噴霧乾燥して、ナノスフェアを生成する。スプレードライヤーの設定は、以下の通りである。ポンプ２％、アスピレーター５０％、入口温度１１０℃、エアフロー６００ｐｓｉ。生成物を回収し、密封容器中に保存した。平均粒径およびゼータ電位を、マルバーンゼータサイザーを用いて測定した。
【０１１５】
使用可能な他のポリマーとしては、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、オイドラギット、それらの組合せおよび混合物などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１６】
表３は、２つの製剤のナノスフェアの生成収率、粒径およびゼータ電位の結果を示す。これらの結果は、生成収率が高かったことを示し、大きな損失を伴わずにこのプロセスを使用することができることを示す。粒径およびゼータ電位は、マクロファージなどの抗原提示細胞による食作用に理想的であることが立証されている範囲内であった。
【０１１７】
【表３】
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【０１１８】
生体活性研究
【０１１９】
製剤中の抗原の免疫原性（生体活性）を明らかにするために、Ｍｔｂ全細胞ライセートをモデル抗原としてナノスフェアの製剤中で使用した。研究は、６匹のラットに対して、ラットへの経口投与のために特別に設計され、メチルメタクリレートで腸溶性コーティングされた、小型カプセル中のカプセル化抗原を経口投与することによって行なわれた。メチルメタクリレートは、ｐＨ５．５よりも上で可溶化し、十二指腸での標的薬物送達に有用なｐＨ依存的アニオン性ポリマーである。カプセル１個当たりに充填されたナノスフェアの平均重量は１５ｍｇであり、カプセル１個当たりの細胞数は６．５２５×１０９個であることが分かった。抗原のブースターは、初回投与後１週目、１０週目および１２週目に投与した。対照ラットにはブランクナノスフェアのカプセルを３個投与した。
【０１２０】
１５０μｌの５００ｎｇ／ｍｌ  ピロカルピン（シグマ）を腹腔内注射して、唾液の流れを誘導した後に、唾液を採取した。糞試料を回収し、重さを量り、０．１％アジ化ナトリウムを含有するＰＢＳに溶解させた。１００ｍｇの糞ペレットを１ｍｌのＰＢＳに懸濁した。１０分間ボルテックスして懸濁した後、糞試料を遠心分離し、分析のために上清を回収した。鼻腔を５０μｌのＰＢＳで３回（合計１５０μｌ）洗浄することにより鼻分泌物を回収した。血液試料は尾部採血により回収し、遠心分離後、血清を得た。
【０１２１】
血清および糞試料は、初回投与の当日、１週目、３週目、７週目および１８週目に回収した。唾液および鼻洗浄液は１８週目に回収した。酵素連結免疫吸着アッセイを用いて、血清中の抗原特異的ＩｇＧと回収した全ての試料中のＩｇＡをプロービングした。
【０１２２】
図７は、Ｍｔｂ全細胞ライセート特異的抗体でプロービングしたときの非カプセル化Ｍｔｂ全細胞ライセート対照、カプセル化Ｍｔｂ全細胞ライセートおよびＢＳＡブランク対照の光学密度を示す。ＭｔｂライセートとＭｔｂナノスフェアは両方とも、ブランクナノスフェアの吸光度とは有意に（ｐ＜０．０５）異なる吸光度を示した。全細胞ライセート陽性対照の光学密度とカプセル化Ｍｔｂ全細胞ナノスフェアの光学密度の間には有意差がなかった。Ｍｔｂ全細胞ライセートとカプセル化Ｍｔｂ全細胞ライセートナノスフェアは両方ともブランクナノスフェアの吸光度と有意に（ｐ＜０．０５）異なる吸光度を示した。
【０１２３】
図７〜１０は、試験動物および対照動物における血清および選択された粘膜表面由来の試料中での抗体産生を示す。
【０１２４】
図７は、抗Ｍｔｂ全細胞ライセート抗体でプロービングしたときの、非カプセル化Ｍｔｂ全細胞ライセートおよびブランクＢＳＡナノスフェアの生体活性と比較したカプセル化ヒト結核菌（Ｍｔｂ）全細胞ライセートの生体活性を示す。
【０１２５】
血清ＩｇＧ：図８は、初回免疫後第７週までのおよびナノスフェアのブースター投与５週後の抗原特異的ＩｇＧの光学密度を示す。ブースター後２週までは、試験動物と対照の間に有意差は見られなかった。それ以降、抗原特異的ＩｇＧレベルは、第７週まで試験動物で有意により高い状態が続いた。
【０１２６】
図８は、試験ラットおよび対照ラットにおけるＭｔｂ抗原特異的血清ＩｇＧの光学密度を示す（対照と比較してｐ＜０．０５）。
【０１２７】
血清ＩｇＡ：図９は、第１８週までの抗原特異的ＩｇＡの光学密度を示す。第３週およびブースター後２週までは、試験動物と対照との間に有意差は見られなかった。抗原特異的ＩｇＡレベルは、第１８週まで試験動物で有意により高い状態が続いた。第１８週目の試験動物のＩｇＡレベルは、第３および第７週目のＩｇＡレベルよりも有意に高かった（ｐ＜０．０５）。これは、第１０週および第１２週目に投与されるブースターの有意な効果を示す。
【０１２８】
図９は、試験ラットおよび対照ラットにおける全細胞抗原の経口ワクチン接種後の血清ＩｇＡレベルを示す。
【０１２９】
粘膜表面ＩｇＡ：図１０に示す結果は、全ての粘膜表面でのカプセル化ヒト結核菌全細胞抗原に対する抗体の著しい産生を示す。サンプリングした全ての粘膜表面において、試験動物と対照動物の間に有意差があった（ｐ＜０．０５）。唾液分泌物と鼻洗浄液の両方において、産生されたＭｔｂ全細胞抗原特異的ＩｇＡの量は、産生された全ＩｇＡの大きな割合を形成した（ＮＳ鼻洗浄液およびＮＳ唾液分泌物）。鼻洗浄液中の産生された抗原特異的ＩｇＡは、産生された全鼻ＩｇＡの３７．８５％であり、一方、唾液分泌物中の産生された抗原特異的ＩｇＡは、全唾液ＩｇＡの８０．９７％を形成した。
【０１３０】
図１０は、試験ラットおよび対照ラットにおける様々な体液中のＭｔｂ抗原特異的血清ＩｇＡの光学密度を示す（対照と比較してｐ＜０．０５）。
【０１３１】
産生されたＩｇＡの有意差は、対照と比較したときに試験試料の糞試料で見られたが、抗体の全般的なレベルは、他の粘膜表面と比較して非常に低かった。
【０１３２】
結論
【０１３３】
ほとんどの医薬品の製剤化プロセスは、ほとんどのタンパク質薬のネイティブ構造や立体構造を変化させるのに十分な様々な物理化学的ストレスを伴う。タンパク質薬、特に抗原の製剤化と送達における大きな課題は、その構造完全性、すなわち、その生体活性を、その作用部位に到達するまで保持することである。抗体の力価は、抗原のブースターで増加したが、これはＢＣＧでは示されていないことである。図７〜１０に示すように、試験動物と対照の間のＩｇＡとＩｇＧの力価には有意差が見られた。ゼロ時間および初回抗原投与１週後の抗体力価とブースター投与後の抗体力価の間にも有意差があった。
【０１３４】
これらの結果は、抗原提示細胞によるその取込みを助けることができる方法で調製された場合にカプセル化死細胞が免疫応答を誘導することができることと、マイクロカプセル化が免疫応答用の抗原を提示する理想的な方法であることとを示している。これらの結果は、噴霧乾燥法によるＢＳＡのマイクロカプセル化が、抗原の生体活性に影響を及ぼさなかったことも示している。経口投与も、全身免疫応答と粘膜免疫応答の両方を誘導することができた。
【０１３５】
実施例５：ワクチン送達系の例：経口腫瘍ワクチン：経口黒色腫ワクチン抗原に対する粘膜免疫の誘導
【０１３６】
目的：経口黒色腫ワクチン調製物を製剤化し、試験すること
【０１３７】
序論
【０１３８】
免疫応答の誘導は、評価のために無傷の免疫系を必要とする複雑でかつ入り組んだプロセスである。そこで、マウス腫瘍モデルを用いて、ナノカプセル化細胞外抗原（ＭＥＣＡ）ワクチン調製物を評価した。ワクチンで使用される抗原は、培養で増殖したＢ１６マウス黒色腫細胞から得られた。Ｂ１６マウス黒色腫細胞と同系のＣ５７ＢＬ／６マウスを用いた。これは、予防的腫瘍ワクチンに相当し、この場合には、抗腫瘍応答を誘導するために、マウスに最初にワクチンを接種した。次に、マウス黒色腫の樹立を拒絶する能力を伴って抗腫瘍応答が誘導されたかどうかを明らかにするために、マウスに黒色腫細胞を投与した。
【０１３９】
方法
【０１４０】
黒色腫ワクチン調製物の調製：ナノカプセル化ワクチン調製物を、実施例１に記載の方法により調製した。
【０１４１】
動物研究
【０１４２】
免疫および腫瘍防御研究
【０１４３】
ＭＥＣＡ（合計８０μｇのＭＥＣＡ中に２０μｇのＥＣＡを含有する）およびブランクナノ粒子（ＮＰ）を、実施例１に記載の噴霧乾燥プロセスにより調製した。最初の研究で使用された等量のナノ粒子（合計８０μｇのＭＥＣＡ）中の２０μｇの細胞外抗原の抗腫瘍効果を評価するために、３つの群の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス、８〜１２週齢の皮下にワクチンを接種した。これら３つの群に、それぞれ、合計８０μｇのカプセル化細胞外抗原（ＭＥＣＡ）に含まれる２０μｇの細胞外抗原（ＥＣＡ）（ＰＢＳで総容量１００μｌ中に懸濁されたもの）、ＰＢＳ中の細胞外抗原溶液（ＥＣＡ溶液）およびＰＢＳ中のブランクナノ粒子（ブランクＮＰ）をワクチン接種した。合計４回注射するために、マウスに３週間毎週ブーストした。最後のブーストの７日後に、マウスの対側部位に７×１０５個の生きたＢ１６黒色腫細胞を皮下投与した。その後、マウスを腫瘍の発生について６０日間観察し、腫瘍サイズと腫瘍発生率を記録した。
【０１４４】
結果および考察
【０１４５】
雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスの皮下にＭＥＣＡ（８０μｇの全ＭＥＣＡに含まれる２０μｇのＥＣＡ）、ブランクＮＰまたはＥＣＡ溶液をワクチン接種した。最初のワクチン接種の後、マウスに、週１回３週間ブーストした。最後のワクチン接種ブーストの７日後、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの遠位部位に７×１０５個の生きた同系Ｂ１６黒色腫細胞を接種した。その後、マウスを腫瘍の発生についてモニタリングし、腫瘍発生率を記録した（図１１）。
【０１４６】
本研究のＭＥＣＡ群は、６０日で８０％に腫瘍がない状態であった。これとは反対に、ブランクマイクロ粒子群では４０％に腫瘍がなく、ＥＣＡ溶液群では０％に腫瘍がなかった。
【０１４７】
マウスの皮下に、４回の注射で合計ＰＢＳ１００マイクロリットルをワクチン接種した。注射は毎週行なった。最後の注射の７日後に、マウスに７×１０５個の生きた腫瘍細胞（Ｂ１６）を投与し、ＭＥＣＡ群と対照群：ＥＣＡ溶液（ＥＣＡ  ＳＯＬＮ）およびブランクナノ粒子（ブランクＮＰ）で、腫瘍発生率をモニタリングした。
【０１４８】
図１１は、ブランクマイクロ粒子、経口ワクチンナノ粒子および経口ワクチン溶液群における血清ＩｇＧ応答を示す。６週まで、マウスに用量５０．０ｍｇ／０．５ｍｌナノ粒子を毎週投与した。本研究期間中、毎週採血し、ＥＬＩＳＡアッセイを用いてＩｇＧ応答を解析した。
【０１４９】
結論
【０１５０】
インビボ用量応答研究から、８０μｇの全ＭＥＣＡに含まれる２０μｇのワクチン用量のＥＣＡが本研究で非常によく作用することが明らかになった。この用量のＭＥＣＡワクチンは、最大で６０日の研究期間の間、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの８０％に腫瘍がない状態をもたらした。これらの研究は、腫瘍抗原のカプセル化が、プロフェッショナルな抗原提示細胞をターゲッティングすることによって免疫を腫瘍誘導するときにアジュバント効果を有し得ることを示唆する。図１１は、ブランクナノスフェア投与と比較したときに、ＩｇＧのレベルが、ワクチンの経口投与後に有意に高かったことを示す。
【０１５１】
Ｂ１６マウス黒色腫腫瘍は非常に厳しい腫瘍モデルである。このため、これは、ヒト状況での癌のより典型的なものである可能性がある。これらの結果は、ナノ粒子がより大きい抗腫瘍効果を誘導することを実際に示すものである。
【０１５２】
実施例６：細胞トランスフェクション系：ＮＦ−κＢに対するアンチセンスオリゴマーを用いた細胞へのＤＮＡ材料のトランスフェクション
【０１５３】
目的：ナノスフェアおよび溶液製剤中のアンチセンスＮＦ−κＢを用いてＤＮＡの細胞内レベルを明らかにすることによって細胞の全体的なトランスフェクション効率を明らかにすること
【０１５４】
序論：ナノスフェアは、細胞への遺伝材料のトランスフェクションのための効果的なツールとして使用することができる。現在の細胞トランスフェクション方法の中には、マイクロポレーションなどの、トランスフェクションプロセスの間に、相当な数の細胞死をもたらすものもある。本発明者らの研究で使用されるナノスフェアは、サイズが１ミクロン未満なので、細胞に容易に取り込まれ、ナノスフェア中の薬物／材料を直接細胞に移すことができる。
【０１５５】
ナノスフェアの製剤化：ＮＦ−κＢに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを含有するナノスフェアを、実施例１に記載の方法により調製した。
【０１５６】
以下のように２つの異なる細胞株を用いて２つの研究を行なった：
【０１５７】
研究ａ：貪食性のＲＡＷマクロファージ細胞株におけるアンチセンスＮＦ−κＢオリゴヌクレオチドのトランスフェクション（ナノスフェア対溶液製剤）
【０１５８】
目的
【０１５９】
本研究の目的は、ナノスフェア製剤が、マクロファージなどの食細胞でアンチセンスＮＦ−κＢオリゴマーの細胞内濃度を高めることができるかどうかを明らかにすることであった。
【０１６０】
方法
【０１６１】
取込み研究
【０１６２】
ＲＡＷマクロファージを２４ウェル細胞培養プレートに入れた。細胞をインキュベートし、ウェルに２時間接着させ、次に、リポ多糖（１μｇ／ｍｌ）で１時間処置した。次に、細胞を洗浄し、遊離またはカプセル化形態のフルオレセイン標識アンチセンスＮＦ−κＢで処置した。所定の時間間隔（１、４、８、２４時間）で、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で５回洗浄し、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ（１％）とともに４℃でインキュベートした。次に、蛍光プレートリーダー（フェニックスリサーチプロダクツから入手可能）を用いて、細胞ライセートをフルオレセインについて解析した。
【０１６３】
例えば、ＳＤＳなどの、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ以外の界面活性剤を使用することができる。
【０１６４】
結果
【０１６５】
以下の図１４に示すように、アンチセンスＮＦ−κＢは、各時点でカプセル化群により高濃度で見られた。ナノスフェア群では、１時間と４時間または８時間と２４時間のアンチセンスＮＦ−κＢ濃度に有意差はなかった。しかしながら、４時間と８時間の濃度には有意な増加があった。溶液群の中では時間依存的なアンチセンスＮＦ−κＢ濃度の増加があるように見えたが、有意な増加は認められなかった。
【０１６６】
図１２は、ナノスフェアおよび溶液投与後のマクロファージにおけるアンチセンスＮＦ−κＢオリゴヌクレオチドの細胞内濃度を示す。
【０１６７】
研究ｂ：非食細胞、すなわち、ヒト微小血管内皮細胞（ＨＭＥＣ）におけるアンチセンスＮＦ−κＢオリゴヌクレオチドの細胞内レベル（ナノスフェア対溶液製剤）
【０１６８】
目的
【０１６９】
本研究の目的は、ナノスフェア製剤が、非食細胞、すなわち、内皮細胞においてアンチセンスＮＦ−κＢオリゴマーの細胞内濃度を高めることができるかどうかを明らかにすることであった。
【０１７０】
方法
【０１７１】
取込み研究
【０１７２】
ＨＭＥＣを２４ウェル細胞培養プレートに入れ、インキュベートし、ウェルに２４時間接着させた。細胞を、遊離またはカプセル化形態の１．８７５μｇ／ｍｌのフルオレセイン標識アンチセンスＮＦ−κＢで処置した（Ｎ＝３）。所定の時間間隔（１、４、８、２４時間）で、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で５回洗浄し、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００（１％）とともに４℃でインキュベートした。次に、蛍光プレートリーダー（フェニックスリサーチプロダクツ）を用いて、細胞ライセートをフルオレセインについて解析した。
【０１７３】
結果
【０１７４】
以下の図１３に示すように、アンチセンスＮＦ−κＢは、各時点でカプセル化群により高濃度で見られた（溶液と比較してｐ＜０．０５）。マイクロスフェア群の中では、どの時点の間にもアンチセンスＮＦ−κＢ濃度の有意な増加はなかった。溶液群の中では時間依存的な濃度の増加があるように見えたが、有意差は認められなかった。
【０１７５】
図１３は、ナノスフェアおよび溶液製剤でのヒト微小血管内皮細胞におけるＮＦ−κＢアンチセンスオリゴヌクレオチドの取込みを示す。
【０１７６】
実施例７：敗血性ショックでの抗生物質薬、すなわち、ゲンタマイシンおよびバンコマイシンのナノスフェアの評価
【０１７７】
目的：敗血性ショックで抗生物質薬ゲンタマイシンおよびバンコマイシンを含有するナノスフェアを評価すること。限定されるものではないが、シプロフロキサシリンなどの他の抗生物質薬も、このようにして使用し得る。
【０１７８】
序論
【０１７９】
動物における内毒素症は、活性化マクロファージや多形核細胞からのＴＮＦ−αやＩＬ−１βなどの多面的サイトカインの放出に関連している。これらのサイトカインの効果を阻害する実験薬、例えば、モノクローナル中和抗体（ＴＮＦ−αモノクローナル抗体）、受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１受容体アンタゴニスト）および受容体融合タンパク質が、敗血性ショックでのその効力について、動物および臨床で評価されている。ゲンタマイシンは、グラム陰性細菌に対して効果的である。他方、バンコマイシンは、ほとんどのグラム陽性細菌に対して殺菌性があり、メチシリン耐性ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）の感受性株によって引き起こされる重篤なまたは重度の感染症の治療に適応する。バンコマイシンは細胞外の細菌に対しては効果があるが、細胞内の細菌に対抗するのは依然として課題となっている。細菌性敗血症の原因病原体のほとんどは内皮細胞の中に逃げ込み、それにより、抗微生物剤の効果をかわす。それゆえ、薬物を細胞内コンパートメントにターゲッティングすることが必要である。これは、ナノスフェアなどの微粒子送達系の使用を利用することにより達成することができる。
【０１８０】
方法：
【０１８１】
ゲンタマイシンおよびバンコマイシンナノスフェアの調製。
【０１８２】
ゲンタマイシンおよびバンコマイシンをカプセル薬として使用することを除き、ゲンタマイシンおよびバンコマイシンのナノスフェア製剤を実施例１に従って作製した。
【０１８３】
動物研究−ゲンタマイシン
【０１８４】
体内の大腸菌分布を評価するために、溶液およびナノスフェア形態のゲンタマイシンをラットにおいて試験し、また、２つの製剤を敗血性ショックラットモデルでも評価した。
【０１８５】
第１群．ゲンタマイシンのカプセル化製剤および溶液製剤の効力の決定［事前処置群］
【０１８６】
動物に大腸菌（腹腔内；１．１×１０９ｃｆｕ／ｍＬ）を注射する４時間前に、ナノスフェアおよび溶液ゲンタマイシン製剤（１５ｍｇ／ｋｇを１日２回、３日間）またはブランクナノスフェア（対照）を様々な動物群に注射した。０、４、２４、４８、９６および１２０時間での細菌カウントを測定するために、血液試料を採取した。
【０１８７】
第２群．ゲンタマイシンのカプセル化製剤および溶液製剤の効力の決定［同時処置群］
【０１８８】
この実験セットでは、大腸菌細菌（１．１×１０９ｃｆｕ／ｍＬ）を腹腔内投与し、同時にＮＳおよび溶液ゲンタマイシン製剤（１５ｍｇ／ｋｇを１日２回、３日間）またはブランクナノスフェア（対照）を様々なラット群に皮下注射した。０、４、２４、４８、９  
６および１２０時間での細菌カウントを測定するために、血液試料を採取した。
【０１８９】
第３群．ゲンタマイシンのナノスフェアおよび溶液製剤の効力の決定［遅延処置群］
【０１９０】
この実験セットでは、大腸菌細菌（１．１×１０９ｃｆｕ／ｍＬ）を様々なラット群に腹腔内投与し、感染４時間後に、ＮＳおよび溶液ゲンタマイシン製剤（１５ｍｇ／ｋｇを１日２回、３日間）またはブランクナノスフェア（対照）を注射した。０、４、２４、４８、９６および１２０時間での細菌カウントを測定するために、血液試料を採取した。
【０１９１】
結果および考察−ゲンタマイシン動物研究
【０１９２】
第１群
【０１９３】
ブランクＢＳＡナノスフェアの投与を伴う対照群が血液中のより多くの菌血カウントを示しているのに対し、ゲンタマイシン溶液またはナノスフェアで処置した群は、有意により少ない細菌カウントを示している。溶液処置群が菌血の約３５％阻害を示したのに対し、ナノスフェア群は、１２０時間の最後に血液中の細菌増殖の８０％阻害を示した（表４）。この処置群では全てのラットが生存した。
【０１９４】
【表４】
2012504150.tif 000004
【０１９５】
第２群
【０１９６】
ブランクＢＳＡナノスフェアの投与を伴う対照群が血液中のより多くの菌血カウントを示したのに対し、ゲンタマイシン溶液またはナノスフェアで処置した群は、有意により少ない細菌カウントを示した。溶液処置群は菌血の約７５％阻害を示したのに対し、ナノスフェア群は、１２０時間の最後に血液中の細菌増殖の８４％阻害を示した（表５）。生存データ（表６）は、ゲンタマイシン溶液処置群の５５％および対照群の３５％と比較して、ゲンタマイシンナノスフェア処置群の７５％というより高い生存率を示している。
【０１９７】
【表５】
2012504150.tif 000005
【０１９８】
【表６】
2012504150.tif 000006
【０１９９】
第３群
【０２００】
ブランクＢＳＡナノスフェアの投与を伴う対照群が血液中のより多くの菌血カウントを示しているのに対し、ゲンタマイシン溶液またはナノスフェアで処置した群は、有意により少ない細菌カウントを示している。溶液処置群が菌血の約１５％阻害を示したのに対し、ナノスフェア群は、１２０時間の最後に血液中の細菌増殖の５０％阻害を示した（表７）。この処置群では全てのラットが生存した。
【０２０１】
【表７】
2012504150.tif 000007
【０２０２】
まとめおよび結論
【０２０３】
これらのインビボでの結果は、ゲンタマイシンナノスフェアが、ゲンタマイシン溶液形態と比較して、血液中の細菌カウントを低下させるのにより効果的であり、ゲンタマイシンナノスフェアが、１２０分の間で、同時群では溶液形態よりも９％効果的に細菌増殖を阻害し、予防群では溶液形態よりも４５％効果的であり、遅延群では溶液形態よりも３５％効果的であることを示している。これらの結果は、ゲンタマイシンナノスフェアが、従来的な溶液製剤と比較して、より持続的かつ長時間の作用持続時間を提供すること、したがって、これらのナノスフェアを投薬投与の頻度を減らすために使用し、それにより、薬物と関連する毒性を減少させることができることを示している。
【０２０４】
バンコマイシン動物研究
【０２０５】
溶液製剤と比較したバンコマイシンナノスフェアの効力を敗血性ショックラットモデルで明らかにした。
【０２０６】
３つのシナリオを評価した：
【０２０７】
第１群．バンコマイシンのカプセル化製剤および溶液製剤の効力の決定［事前処置群］
【０２０８】
動物に黄色ブドウ球菌（腹腔内；１．０×１０８ｃｆｕ／ｍＬ）を注射する４時間前に、ナノスフェアおよび溶液バンコマイシン製剤（１５ｍｇ／ｋｇを１日２回、３日間）またはブランクナノスフェア（対照）を様々な動物群に注射した。０、４、２４、４８、９６および１２０時間での細菌カウントを測定するために、血液試料（０．５ｍＬ）を採取した。
【０２０９】
第２群．バンコマイシンのカプセル化製剤および溶液製剤の効力の決定［同時処置群］
【０２１０】
この実験セットでは、黄色ブドウ球菌細菌（１．０×１０８ｃｆｕ／ｍＬ）を腹腔内投与し、同時にＮＳおよび溶液バンコマイシン製剤（１５ｍｇ／ｋｇを１日２回、３日間）またはブランクナノスフェア（対照）を様々なラット群に皮下注射した。０、４、２４、４８、９６および１２０時間での細菌カウントを測定するために、血液試料（０．５ｍＬ）を採取した。
【０２１１】
第３群．バンコマイシンのナノスフェアおよび溶液製剤の効力の決定［遅延処置群］
【０２１２】
この実験セットでは、黄色ブドウ球菌細菌（１．０×１０８ｃｆｕ／ｍＬ）を様々なラット群に腹腔内投与し、感染４時間後に、ＮＳおよび溶液バンコマイシン製剤（１５ｍｇ／ｋｇを１日２回、３日間）またはブランクナノスフェア（対照）を注射した。０、４、２４、４８、９６および１２０時間での細菌カウントを測定するために、血液試料（０．５ｍＬ）を採取した。
【０２１３】
結果および考察−バンコマイシン動物研究
【０２１４】
第１群
【０２１５】
ブランクＢＳＡナノスフェアの投与を伴う対照群が血液中のより多くの菌血カウントを示しているのに対し、バンコマイシン溶液またはナノスフェアで処置した群は、有意により少ない細菌カウントを示している（図１４）。この処置群では全てのラットが生存した。
【０２１６】
第２群
【０２１７】
ブランクＢＳＡナノスフェアの投与を伴う対照群が血液中のより多くの菌血カウントを示したのに対し、バンコマイシン溶液またはナノスフェアで処置した群は、有意により少ない細菌カウントを示した（図１５）。生存データ（表８）は、バンコマイシン溶液処置群の４０％および対照群の２５％と比較して、バンコマイシンナノスフェア処置群で８０％というより高い生存率を示している。
【０２１８】
【表８】
2012504150.tif 000008
【０２１９】
第３群
【０２２０】
ブランクＢＳＡナノスフェアの投与を伴う対照群が血液中のより多くの菌血カウントを示しているのに対し、バンコマイシン溶液またはナノスフェアで処置した群は、有意により少ない細菌カウントを示している（図１６）。この処置群では全てのラットが生存した。
【０２２１】
まとめおよび結論
【０２２２】
これらのインビボでの結果は、バンコマイシンナノスフェアが、溶液製剤と比較して、血液中の細菌カウントを低下させるのにより効果的であったことを示している。さらに、これらの結果は、これらのナノスフェアが、従来的な溶液製剤と比較して、より持続的かつ長時間の作用持続時間を提供したこと、したがって、これらのナノスフェアを投薬投与の頻度を減らすために使用し、それにより、薬物と関連する毒性を減少させることができることを示している。
【０２２３】
実施例８：抗真菌薬のアムホテリシンＢを含有するステルスナノスフェアの製剤化および評価
【０２２４】
目的：
【０２２５】
循環中により長い期間滞留し、かつカプセル薬アムホテリシンの持続放出によって全体的な毒性が標準的な溶液製剤よりも低くなるような、ステルス様特性を有するナノスフェアを生成するために、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を有する架橋アルブミンナノスフェアの製剤Ｆ−２およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を有さない架橋アルブミンナノスフェアの製剤Ｆ−１を製剤化し、特徴付けること。限定されるものではないが、ケトコナゾールなどの他の抗真菌薬や、他の水溶性抗真菌薬も、このようにして使用し得る。
【０２２６】
序論：
【０２２７】
本研究で、本発明者らは、ナノスフェアにステルス特性を与えるために、架橋前にポリエチレングリコールをＢＳＡマトリクスに取り込ませることを利用している。ナノスフェアにステルス特性を与えることによって、これらのナノスフェアは、循環中により長い期間滞留し、それにより、これらが血管の内側にある内皮細胞に取り込まれる機会をより多く与えるか、またはより高い血中薬物濃度を生じさせることができる。様々な研究により、リポソームや薬物分子中でＰＥＧのステルス特性が利用されている。これは、分子にＰＥＧを共有結合させることにより達成され、これによって修飾薬物分子が生じる。これらの薬物分子は、この部分のサイズが大きいために、細胞膜を横断するのが難しい。ＰＥＧが（インビボで）ＰＥＧ−薬物分子連結から加水分解された後、遊離のＰＥＧは、主に腎臓によって速やかに体外に排出される。
【０２２８】
本発明者らが知る限り、一般に認められる、ＢＳＡナノスフェアに対するＰＥＧのステルス効果を評価するための手法を示した報告はない。本研究では、ＰＥＧの存在下でＢＳＡを架橋し、その後、本明細書に記載の噴霧乾燥プロセスでナノスフェアを作製することによって、ＰＥＧをＢＳＡマトリックスに取り込ませた。このプロセスにより、水溶性ＰＥＧが封入され、注射後すぐに水性媒体に溶解することがなくなり、結果としてステルスの延長がもたらされる。限定されるものではないが、ケトコナゾールなどの他の抗真菌薬や他の水溶性抗真菌薬も、このようにして使用し得る。
【０２２９】
様々な濃度のＰＥＧを、ナノスフェアからの薬物放出について試験し、検討した。ヒト微小血管内皮細胞（ＨＭＥＣ）を用いて、好適な製剤中でのＰＥＧのステルス効果を明らかにした。
【０２３０】
ヒト微小血管内皮細胞（ＨＭＥＣ）およびマウスマクロファージ細胞株（ＲＡＷ）へのインビトロ取込みを評価するための実験
【０２３１】
結果：
【０２３２】
図１７および１８は、それぞれ、２つの異なる細胞株、すなわち、内皮細胞（ＨＭＥＣ）およびマクロファージ（ＲＡＷ）へのＰＥＧを有するおよびＰＥＧを有さない粒子の取込みを示す。
【０２３３】
図１７は、ヒト微小血管内皮細胞（ＨＭＥＣ）への製剤Ｆ−１（ポリエチレングリコールなし）およびＦ−２（ポリエチレングリコールあり）の比較取込みを示す。
【０２３４】
図１８は、マクロファージ細胞株（ＲＡＷ細胞）による製剤Ｆ−１（ポリエチレングリコールなし）およびＦ−２（ポリエチレングリコールあり）の比較取込みを示す。
【０２３５】
結論：
【０２３６】
この実験は、ＰＥＧを有する製剤Ｆ−２が、ＨＭＥＣ細胞およびＲＡＷ細胞によるかなりの貪食を避け、したがって、一定のステルス特性を達成したことを示している。これは、ＰＥＧ（粒子の周りに水の塊を生成し、それにより粒子にステルス特性を与える）を含有する製剤の取込みが低いことによって示されている。
【０２３７】
製剤Ｆ−１およびＦ−２ナノスフェアに由来するアムホテリシンＢの毒性効果を評価し、それをアムホテリシンＢの従来の溶液（ＳＯＬ）製剤と比較するための実験
【０２３８】
研究の目的：
【０２３９】
カリウムは赤血球（ＲＢＣ）内に高濃度で見られる。膜が何らかの損傷を受けると、カリウムがＲＢＣから漏れ出す。本研究の目的は、ＳＯＬ、製剤Ｆ−１、および製剤Ｆ−２に由来するアムホテリシンＢの膜結合効果を評価し、したがって、これらの製剤に由来する薬物毒性を示すことである。
【０２４０】
結果および結論：
【０２４１】
製剤Ｆ−１およびＦ−２は、どの実験濃度でもカリウムレベルの増加を示さなかった。しかしながら、アムホテリシンＢの溶液製剤は、ＲＢＣからの最大０．０８ｍｇ／ｍｌのかなりのカリウム放出を示し、これは、より高い薬物濃度でも同じであった。この研究は、その溶液製剤と比較したとき、アムホテリシンＢのカプセル化製剤の優れた性質をはっきりと示している。
【０２４２】
実施例９：経口投与を用いた、糖タンパク質薬：ヘパリンのナノスフェアの評価
【０２４３】
目的：経口送達用の低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）を含有するナノスフェアの簡単な調製方法を開発すること。
【０２４４】
方法：この実施例ではヘパリンを薬物として使用したことを除き、ナノスフェアを、実施例１に記載の方法により調製した。
【０２４５】
【表９】
2012504150.tif 000009
【０２４６】
結果：
【０２４７】
図１９は、様々な製剤の投与後のヘパリンの吸収を示す。ヘパリンは、６０％のアルブミンマトリックス中に、３０％の低分子量ヘパリン、１０％のパパインを含有する製剤Ｆ４の経口投与後によく吸収される。
【０２４８】
図１９は、ラットにおける抗凝固活性について様々なナノスフェア製剤を２４時間かけて単回経口投与した後のＬＭＷＨの血漿抗第Ｘａ因子活性レベルを示す。
【０２４９】
図２０は、静脈内（ＩＶ）、皮下（ＳＣ）および経口（ＭＳ．３）投与後のＬＭＷＨ溶液の薬物動態プロファイルを示す。
【０２５０】
結論：
【０２５１】
噴霧乾燥の条件を最適化することにより、所望のサイズ範囲のナノスフェアを調製した。製剤Ｆ−２が最も優れていた。この例示的方法は、特に、薬物の送達および開発の分野での幅広い用途のために大規模にナノスフェアを調製するために容易に最適化することができる。
【０２５２】
実施例１０：タンパク質ナノスフェア：糖尿病でのカプセル化インスリンの経口送達
【０２５３】
序論：インスリンは、糖尿病の治療に必要な、内生的に産生されるタンパク質である。投与したインスリンは肝臓／筋肉細胞により取り込まれ、これらの細胞は、後に、グルコースとグリコーゲンを変換する。インスリンは、２つのアミノ酸鎖（Ａ＆Ｂ）で構成されるタンパク質分子である。これら２つの鎖は５１個のアミノ酸を含有し、ジスルフィド結合を介して連結している。
【０２５４】
経口送達は、最も一般的な薬物送達方法である。しかしながら、タンパク質分子の経口送達では、２つの主な問題が生じる。第１に、インスリンは、消化管（ＧＩＳ）系（主に胃と、小腸の近位領域）の消化酵素によって不活化される。この不活化は、胃の厳しい環境からインスリンを保護した後に、より好ましいＧＩＴの領域に放出することができる担体を設計することによって克服することができる。さらに、薬物製剤中のプロテアーゼ阻害剤が、タンパク質分解酵素によるインスリン分解を防ぐのに役立つ可能性がある。第２の主な障害は、インスリンが大腸の内膜を越えて血流中に輸送されるのが遅いことである。インスリンは、親水性薬物分子の傍細胞輸送機構を守るタイトジャンクションを通過しなければならない。巨大分子をＧＩＴを越えて輸送しやすくする吸収増強剤を使用することで、この遅さを克服しようとすることができる。
【０２５５】
本開示の製剤化方法および送達系においてインスリンの代わりに使用し得る他のタンパク質薬には、限定されるものではないが、通常は胃での分解に感受性のあるモノクローナル抗体、成長ホルモン、および他のタンパク質薬が含まれるが、それは、この方法が、胃内の厳しい酸性環境からタンパク質を保護し、さらに腸内で持続的に薬物を放出するからである。
【０２５６】
本研究では、本発明者らは、アルブミンポリマーマトリックスにカプセル化した後、インスリンの経口送達を試みている。
【０２５７】
インスリンを含有するナノスフェアの製剤化のための１つの例示的な方法は、以下のプロセスを含む：
【０２５８】
ａ．βシクロデキストリンを水に溶解させる；
【０２５９】
ｂ．別の容器中でインスリンをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（または水もしくは生理食塩水などの他の水性溶媒）に可溶化する；
【０２６０】
ｃ．限定されるものではないが、エチルセルロースなどの、腸溶性コーティング材料を水に可溶化する；
【０２６１】
ｄ．可溶化したインスリンとエチルセルロースをβ−シクロデキストリンと一緒に混合する；および
【０２６２】
ｅ．溶解したβシクロデキストリンとインスリンを含有する溶液を噴霧乾燥して、ナノスフェアを生成する。スプレードライヤーの設定は、以下の通りである：ポンプ２％、アスピレーター５０％、入口温度１１０℃、エアフロー６００ｐｓｉ。
【０２６３】
動物研究：ラットで糖尿病を誘導し、栄養チューブで経口投与されるインスリンナノスフェアで処置した。ベースライン時点およびその後２４時間の様々な時点で血液試料を採取し、グルコメーターを用いて、血糖値を測定した。
【０２６４】
図２１は、血糖値に対するナノスフェア製剤中のインスリン経口投与の効果を示す。
【０２６５】
結論：図２１に見られるように、経口投与されるインスリンナノスフェアの単回投与後４時間にわたって、血糖値は有意に低下した。
【０２６６】
実施例１１．眼送達系：眼送達用のテトラカインおよびアトロピンナノスフェアの調製および特徴付け
【０２６７】
テトラカインは、白内障の眼科手術の時に使用される。しかしながら、現在、これは１％溶液として市販されている。この溶液を白内障手術に使用する場合、その麻酔作用の持続時間が短いために、薬物を１０分ごとに繰り返し投与しなければならない。これは、患者にとって大きな不快感となり、かつ溶液製剤を繰り返し注入しなければならない執刀医にとって大きな障害となる。したがって、テトラカインの持続放出製剤が必要とされている。本研究の目的は、キトサン−アルブミンをカプセル化マトリックスとして用いたナノスフェア製剤中の塩酸テトラカインを調製し、試験することであった。
【０２６８】
アトロピンは、散瞳作用（すなわち、瞳孔拡大を誘導する）のために眼に対して現在使用されている。しかしながら、これは非常に強力な薬物であり、現在市販されている溶液製剤の投与は、子供の死亡を含む、重大な副作用をもたらす。本研究の目的は、この薬物の投与で見られることが多い毒性を低下させるためにアトロピンの持続放出製剤を調製することである。
【０２６９】
ポリマーマトリックス中に正の電荷を帯びたキトサンが存在すると、眼内滞留時間がより長くなり、結果として薬物が持続放出され、作用の持続時間がより長くなり、毒性が低くなる。
【０２７０】
ここに記載する製剤化方法を用いて、眼科用で薬物を持続的に放出させることができる製剤を調製することができる。
【０２７１】
塩酸テトラカインナノスフェアの調製：
【０２７２】
どちらの方法、すなわち、溶液架橋と表面架橋のどちらによって、作用の持続時間がより長いナノスフェアが生成されるかを明らかにするために、２つの異なるナノスフェア調製技術を用いた。
【０２７３】
１）溶液架橋ナノスフェアの調製：
【０２７４】
ａ）５％ｗ／ｖウシ血清アルブミン−キトサン（ＢＳＡ−ＣＳＮ）溶液を調製し、上記の０．７５％グルタルアルデヒドで架橋した。
【０２７５】
ｂ）塩酸テトラカインを、架橋したＢＳＡ−ＣＳＮマトリックスに添加し、１０％の薬物充填を達成した。
【０２７６】
ｃ）ブランクナノスフェアについては、ＢＳＡ−ＣＳＮのみを脱イオン水に溶解させ、上記のように架橋した。
【０２７７】
ｄ）架橋した溶液を、ビュッヒ１９１ミニスプレードライヤー（ビュッヒ１９１、スイスから入手可能）を用いて噴霧乾燥し、化学的に安定なテトラカインＨＣｌが充填されたＢＳＡ−ＣＳＮナノスフェアまたはブランクナノスフェアを得た。
【０２７８】
スプレードライヤーの様々なパラメータ、すなわち、入口温度、ポンプフロー、吸引速度および空気圧を最適化した。
【０２７９】
様々な量比のＢＳＡとＣＳＮを用いて、様々な製剤（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅなど）を得た。これらのナノスフェアを生成物コレクターから回収して、４℃で保存した。
【０２８０】
２）表面架橋ナノスフェアの調製：
【０２８１】
ａ）５％ｗ／ｖウシ血清アルブミン−キトサン（ＢＳＡ−ＣＳＮ）溶液を架橋せずに調製した。
【０２８２】
ｂ）塩酸テトラカインをこのＢＳＡ−ＣＳＮ溶液に添加し、１０％の薬物充填を達成した。
【０２８３】
ｃ）ブランクナノスフェアについては、ＢＳＡ−ＣＳＮのみを脱イオン水に溶解させた。
【０２８４】
ｄ）この溶液を、ビュッヒ１９１ミニスプレードライヤー（ビュッヒ１９１、フラウィル、スイス）を用いて噴霧乾燥し、化学的に安定なテトラカインＨＣｌが充填されたＢＳＡ−ＣＳＮナノスフェアを得た。
【０２８５】
ｅ）これらのナノスフェアを生成物コレクターから回収し、表面を２−ブタノール中の１％グルタルアルデヒドで４時間架橋した。得られた懸濁液を濾紙を用いて濾過した。これらのナノスフェアを乾燥させ、４℃で保存した。
【０２８６】
ナノスフェアの特徴付け
【０２８７】
粒径分布
【０２８８】
レーザー回折粒径分析計（ナノゼータサイザー、マルバーンインスツルメンツ、ＵＫから入手可能）を用いて、ＢＳＡ−ＣＳＮナノスフェアの粒径分布を測定した。この手順のために、０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を含有する蒸留水（２ｍｇ／ｍｌ）にナノスフェアを懸濁した。ナノスフェアの粒径を下記の表１０に記載する。狭い径分布を有するナノスフェアが得られたことが結果から明らかである。
【０２８９】
ゼータ電位
【０２９０】
ゼータ電位測定のために、ナノスフェアを１ｍＭ  ＫＣｌ溶液に最終濃度２ｍｇ／ｍｌで懸濁し；この懸濁液を光学ウェルに充填し、マルバーンゼータサイザー、ＺＥＮ１６００を用いてゼータ電位を測定した。ゼータ電位を下記の表１０に記載する。
【０２９１】
【表１０】
2012504150.tif 000010
【０２９２】
表面形態および収率
【０２９３】
走査電子顕微鏡（ＪＥＯＬ  ＪＳＭ  ５８００ＬＶ、東京、日本）を用いてナノスフェアの表面特徴を評価した。表面は滑らかであることが分かった。
【０２９４】
インビトロ放出研究
【０２９５】
テトラカインＨＣｌが充填されたナノスフェアのインビトロ放出研究を、改良されたＵＳＰＩ型溶出装置中で天然涙液ｐＨ７．４（１００ｍｌ）を用いて３７℃で実施した。テトラカインナノスフェア（２５ｍｇ）を分子量カットオフ１２〜１４ｋＤａの透析袋内の天然涙液３ｍｌに懸濁した。溶出装置を１００ｒｐｍに設定し、試料を所定の時間間隔で採取した。これらの試料を３１０ｎｍでＵＶ／Ｖｉｓ分光光度計により分析した。表面架橋ナノスフェアの放出プロファイルにおいて大量の初期バースト放出があった。しかしながら、溶液架橋の放出プロファイルは、ごくわずかな初期バースト放出しか示さなかった。
【０２９６】
カプセル化効率
【０２９７】
テトラカインが充填されたアルブミン−キトサンナノスフェア１０ｍｇを  ２％トリプシンを含む１００ｍＭ  ＰＢＳ  ｐＨ７．４  １０ｍｌに懸濁した。等量のブランクナノスフェアを対照として用いた。このナノスフェア懸濁液を３７℃で２４時間撹拌した。３１０ｎｍでＬａｍｂｄａ  ４Ｂ  ＵＶ／Ｖｉｓ分光光度計を用いて、得られたＰＢＳ懸濁液をテトラカインについて分析した。カプセル化効率は、９６％であることが分かった。
【０２９８】
次に、動物モデルにおけるインビボ効力を評価した。
【０２９９】
ウサギにおけるインビボでのテトラカインマイクロスフェア製剤の効果の評価
【０３００】
本研究では、その全体的な効力を測定し、比較するために、ナノスフェア製剤（試験）および溶液製剤（対照）中のテトラカインを評価した。これは、まばたき反応モデルを用いて行なわれた。このモデルでは、試験溶液または対照溶液のいずれかを２滴、ウサギの眼に注入した。綿棒で触れたときに眼が２回連続してまばたき反応を示すまで様々な時点で動物の眼を注意深く観察した。
【０３０１】
これらのインビボの結果は、２つのナノスフェア製剤間の作用の発現と標準的な市販薬の作用の発現の間に統計学的な差がないことを示した。しかしながら、テトラカインの作用持続時間は、溶液架橋形態に関する限り、約４倍増加した。表面架橋形態から得られた結果もまた、標準的な市販形態の溶液と比較して、テトラカインの作用の持続時間の約３倍の増加を示した（表１１）。
【０３０２】
【表１１】
2012504150.tif 000011
【０３０３】
硫酸アトロピンが充填された眼送達用のキトサン−アルブミンナノスフェアの調製および特徴付け
【０３０４】
目的
【０３０５】
本研究の目的は、キトサン−アルブミンをカプセル化マトリックスとして用いて、硫酸アトロピンナノスフェアを調製し、特徴付け、かつそれらを粒径、ゼータ電位、％収率、カプセル化効率および表面形態ならびにインビボ効力について特徴付けることであった。
【０３０６】
ナノスフェアの調製：
【０３０７】
上記のテトラカインナノスフェアについて上で記載したのと同じように硫酸アトロピンナノスフェアを調製し、特徴付けた。結果を表１２に示す。
【０３０８】
【表１２】
2012504150.tif 000012
【０３０９】
パーセンテージ収率、カプセル化効率、表面形態および放出パターンは、テトラカインナノスフェアについて得られたものと同様であった。溶液法によって調製された硫酸アトロピンナノスフェアのみをインビボ研究で用いた。
【０３１０】
次に、本発明者らは、溶液製剤との比較で、製剤化されたアトロピンナノスフェアの効力を評価した。
【０３１１】
ウサギの眼の瞳孔散大に関するアトロピンナノスフェア製剤の評価および対応するアトロピン溶液製剤との比較。
【０３１２】
瞳孔対角膜の長さの比を測定することにより、散瞳作用を測定した。この実験では、薬物を眼の角膜に、特定の時点で投与し、ウサギの眼の軸に沿って角膜と瞳孔の長さを測定した。
【０３１３】
硫酸アトロピンナノスフェア製剤（０．６６％）の懸濁液をウサギの眼に適用した（ｎ＝１２）。各眼に２滴滴下した。１匹の動物において、一方の眼は被験物としての役割を果たし、対側の眼は対照としての役割を果たす。パナソニック３０Ｘデジタルカメラを用いて、各ウサギの眼をビデオ撮影した。図２２は、アトロピン溶液製剤（１％）と比較したマイクロスフェア製剤（０．６６％）のデータを示す。ここで、硫酸アトロピンナノスフェア懸濁液（０．６６％）の強度は、標準的な市販溶液（１％）の強度よりも低いが、低濃度（０．６６％）でのナノスフェア製剤の散瞳作用は、標準１％溶液の散瞳作用よりも上であった（図２２）。
【０３１４】
図２２は、標準アトロピン１％溶液とより強度の低い硫酸アトロピンカプセル化ナノスフェア（０．６６％）のウサギの眼における瞳孔対角膜の長さ比に対する影響の比較を示す。
【０３１５】
実施例１２：ＨＩＶ感染を予防するためのＨＩＶ−１阻害剤カラギーナンを含有するナノスフェアの開発
【０３１６】
目的：
【０３１７】
カラギーナンは、マイクロビサイドと呼ばれる一群の化合物に属する。マイクロビサイドは、膣または直腸に適用されたときに、ＨＩＶおよび場合によっては、性感染する他の感染症の感染を大幅に低下させることができる。λカラギーナンは、ゲル製剤でインビトロでＨＩＶ−１感染を阻止することが示されているカラギーナン中の活性のある薬学的成分である。しかしながら、第３相臨床試験におけるその使用は、ＨＩＶ−１の性感染を低下させることができなかった。この臨床試験の失敗と関連する考えられる要因は、不適切なゲル使用や、ゲル製剤の短い滞留時間である可能性がある。本発明者らは、水溶性形態でヒトの膣に送達し、持続放出とより長い滞留時間を提供し得るナノスフェア製剤を開発した。他の抗ＨＩＶ薬物も、このようにカプセル化し、製剤化し、使用し得る。
【０３１８】
方法：
【０３１９】
以下の製剤化方法を使用した：
【０３２０】
ａ）１％ｗ／ｖカラギーナンとＨＰＭＣとを脱イオン水中で別々に調製し、混合して、１対１の薬物対ポリマー比を得た。
【０３２１】
ｂ）上記の溶液を、０．７５％グルタルアルデヒドで事前架橋した２．５％アルブミン溶液に添加した。
【０３２２】
ｃ）架橋した薬物ポリマー溶液をビュッヒ１９１ミニスプレードライヤー（ビュッヒ１９１、スイスから入手可能）を用いて噴霧乾燥し、化学的に安定化されたナノスフェアを得た。
【０３２３】
結果：
【０３２４】
噴霧乾燥したマイクロ粒子の収率は５１％〜５８％であった。室温での薬物放出は、ｐＨ６および７の溶液中で、２４時間で完了したが、ｐＨ４およびｐＨ５の溶液中での放出は最大９６時間までなかった。３７℃で、ｐＨ４およびｐＨ５の溶液中での薬物放出は、１時間で３０％、２４時間で４０％であった。３７℃で、放出は、ｐＨ６および７の溶液中で１時間以内に９０％完了し、２４時間で完全に放出された（表１３）。
【０３２５】
【表１３】
2012504150.tif 000013
【０３２６】
結論：
【０３２７】
健常ヒト膣中のｐＨ条件は、通常、４．２〜５のより酸性のｐＨに向かう傾向がある。これは、乳酸を産生する常在菌である乳酸菌が存在することによる。この酸性環境は、感染や炎症に対する天然のバリアを提供している。膣のｐＨが変化し、より塩基性になると、それによって天然の防御機構の弱体化が起こる。本発明者らは、様々なｐＨ条件でカラギーナンアルブミン−ＨＰＭＣナノスフェア製剤のインビトロでの薬物放出を研究した。室温および３７℃で検討を行ない、マイクロ粒子生成物の製剤化および保存の基準を得た。ｐＨ４〜５／室温でのマイクロ粒子からのカラギーナンの放出は最大９６時間観察されなかった。本発明者らの試験結果は、３７℃での、１時間から２４時間の時点におけるｐＨ６〜７でのカラギーナンの持続放出、およびｐＨ４〜５でのゆっくりとした放出を示した。このカラギーナンマイクロ粒子製剤は、ｐＨ４〜５の溶液中で、室温で製剤化し、保存することができた。したがって、カプセル化製剤中のカラギーナンは、ＨＩＶ感染を予防するためのヒト膣への送達系として使用できる可能性がある。
【０３２８】
実施例１３：ポックスウイルス疾患の治療用のフルオロキノロンなどの抗ウイルス薬ナノスフェアの製剤化および評価
【０３２９】
目的：
【０３３０】
天然痘の撲滅は、ポックスウイルス生物学、ウイルス−細胞相互作用、および関連性のある宿主防御の分子細胞特性の研究に必要な分子ツールが限られているときに行なわれた。２００１年９月１１日に米国本土に対して行なわれたテロ攻撃と（テロ攻撃に続く数週間の間の）意図的な炭疽菌の放出により、天然痘の病原体である、天然痘ウイルスの未廃棄ストックが存在するかも知れないという懸念が高まった。天然痘ウイルスを用いた生物テロの脅威と、他のポックスウイルスによって引き起こされる疾患の罹患率の上昇を理由として、ポックスウイルス感染に対する新しい治療を開発する研究が再び行なわれている。この研究は、フルオロキノロンと呼ばれる、一群の抗生物質と、原型ポックスウイルスであるオルソポックスウイルスワクシニアに対するその効力とを研究するために行なわれた。標準化されたアッセイを開発し、複数のフルオロキノロンと、ワクシニアに対するその効力を試験し、比較した。
【０３３１】
溶液製剤中のフルオロキノロンは、ポックスウイルスに対する優れたインビトロでの抗ウイルス活性を示し、ポックスウイルス疾患の治療における良い治療薬候補であり得るが、これらには重篤な副作用がある。幼児（動物およびヒト）では、フルオロキノロンは、関節毒性を示す。小児では、関節痛（関節の痛み）、腱障害、異常歩行および関節炎が報告されている。複数の動物種（マウス、ラット、ウサギ、イヌ、およびウマを含む）では、関節病変、プロテオグリカンの損失、および軟骨細胞の異常が示された。
【０３３２】
それゆえ、本発明者らは、これらの関節毒性のいくつかを軽減または完全に予防するために、フルオロキノロンのカプセル化に関心がある。また、カプセル化は、フルオロキノロン薬をポックスウイルス複製の部位（樹状細胞、マクロファージ、脾臓、肺、肝臓、骨髄）にターゲッティングするとともに、フルオロキノロンの高容量の分布を減らし、かつ薬物を関節軟骨から離れるように改良し；それにより、前述のような若年性関節毒性を低下させるはずである。
【０３３３】
方法：
【０３３４】
以下の製剤化方法を使用した：
【０３３５】
ａ）表１３に記載のフルオロキノロンを、各々脱イオン水に溶解させてカプセル化し、５％ｗ／ｖ溶液を作製した。
【０３３６】
ｂ）上記の溶液を、０．７５％グルタルアルデヒドで事前架橋した２．５％アルブミン溶液に添加した。
【０３３７】
ｃ）架橋した薬物ポリマー溶液をビュッヒ１９１ミニスプレードライヤー（ビュッヒ１９１、スイスから入手可能）を用いて噴霧乾燥し、化学的に安定化されたナノスフェアを得た。
【０３３８】
結果：
【０３３９】
複数のフルオロキノロン化合物の効力の決定−ワクシニアに対して最も強力なフルオロキノロン化合物の決定。
【０３４０】
表１４に阻害濃度（ＩＣ５０）を記載する。クリナフロキサシンとサラフロキサシンが最も強力であり、オフロキサシンやレボフロキサシンよりもほぼ１０倍高い抗ポックスウイルス活性を有する。
【０３４１】
【表１４】
2012504150.tif 000014
【０３４２】
結論：
【０３４３】
クリナフロキサシンとサラフロキサシンが最も強力であり、オフロキサシンやレボフロキサシンよりもほぼ１０倍高い抗ポックスウイルス活性を有する。
【０３４４】
したがって、これらの研究は、同等の溶液製剤と比較したときのナノスフェア製剤の効力の増加をはっきりと示している。本開示の製剤化方法は自動化できるプロセスなので、医学における新たな戦略や技術革新を達成するためのナノスフェアやナノテクノロジーの進歩において大いに役立つことができる。
【０３４５】
代替のポリマーマトリックスならびにタンパク質、ワクチンおよび他の水溶性薬物の経口および経皮送達などの代替の送達方法の開発
【０３４６】
ワクチン、および薬物のナノ粒子およびマイクロ粒子の経口送達
【０３４７】
本発明者らの方法で調製されたナノ粒子およびマイクロ粒子を用いた経口薬物送達とワクチン接種を論じる。過去数十年にわたって、油中水型エマルジョンなどの経口インフルエンザワクチンを用いた前臨床動物研究が行なわれてきた。送達ビヒクルとして働く現在市販されているいくつかのアジュバント、例えば、リポソーム、オイルアジュバント、およびフロイントアジュバントは、抗原を免疫担当細胞にターゲッティングするのに役立ち得るが、生産コストが高い（例えば、リポソーム）または重篤な毒性の問題（例えば、フロイントアジュバントおよびオイルアジュバント）などの欠点がある。これまでの臨床研究により、インフルエンザワクチンの経口免疫が安全であること、さらには経口ワクチン接種が、気道における粘膜ＩｇＡ抗体応答を誘導することができることが示された。より重要なのは、粘膜ＩｇＡ抗体は、変異体ウイルスとのより大きい交差反応性を示すことが示されているので、経口ワクチン接種によって誘導される粘膜免疫応答により、抗原変異を生じた株に対するより幅広い防御が与えられる可能性があることである。これらの経口免疫は、残念なことに、低レベルでしか血清ＩｇＧを誘導しなかったが、粘膜部位ではＩｇＡ抗体を誘導した。しかしながら、防御効力は低いおよび／または防御は不十分であった。効果的なインフルエンザ経口ワクチンの開発にはいくつかの課題があり、これには、インフルエンザ抗原安定性の維持、免疫寛容の回避、および強力な防御免疫の誘導が含まれる。
【０３４８】
経口ワクチン送達は、単純で、簡単で、かつ安全なワクチン接種方法であり、魅力的な免疫方法である。経口免疫は、一般的な粘膜免疫系と、腸のパイエル板での抗原処理とを刺激することによって、免疫応答を誘導することができる。投与のために訓練された医療人員が必要ないので、大量のワクチン接種には、経口免疫が好ましい経路である。また、経口ワクチン接種は、筋肉内注射よりも合併症が少ない。経口ワクチンは自分で投与することができ、かつ経口ポリオワクチン接種が示すように、免疫接種範囲を改善することができる。世界的規模での人々への年１回のインフルエンザワクチン接種は、大きな負担であり、それゆえ、効果的な経口ワクチンの開発は、大衆にとっての大きな健康上の利益となるであろう。
【０３４９】
本発明者らは、胃の酸性条件下で感受性の生体活性タンパク質、ワクチン抗原および薬物を安定化する新規の方法を開発した。エチルセルロース材料などの腸溶性コーティングを含有するマトリックス中に抗原をカプセル化することにより、感受性の抗原が胃の酸性条件下で分解されないようになることが分かった。さらに、カプセル化によって、カプセル化された材料を持続的に放出することができるナノ粒子およびマイクロ粒子が生成されることになり、さらに、ナノ粒子およびマイクロ粒子は、免疫系に抗原を提示する好ましい形態である、免疫刺激アジュバントとしての役割を果たす。可溶性抗原は、ほとんどの場合、経口免疫後に、免疫寛容を誘導する。対照的に、微粒子性のカプセル化抗原は、免疫寛容を伴わずに所望の免疫応答を誘導する独特な形態の抗原である。これらのカプセル化抗原を、カプセル化ワクチンを取り込んで、免疫を発生させる、樹状細胞、リンパ球および（例えば、Ｍ細胞抗体またはリガンドを用いて）腸のパイエル板に存在する貪食Ｍ細胞に戦略的にターゲッティングすることができる。
【０３５０】
本発明者らは、インフルエンザワクチン抗原を使用した。しかしながら、このワクチン投与方法は、本発明者らが試験した他のワクチン、例えば、乳癌抗原、前立腺癌抗原、卵巣癌抗原、黒色腫癌抗原などに適用することができる。試験された他の生体活性薬物としては、インスリン、Ｂ型肝炎抗原、腸チフス抗原、およびＴＢ抗原が挙げられる。これらの微粒子形態の抗原は極めて効果的であることが分かった。例えば、死滅インフルエンザによる免疫により誘導された防御免疫応答は、マウスで１４カ月間の長きにわたって続いた。さらに、インフルエンザによる単回免疫によって防御免疫が誘導された。このインフルエンザワクチン方式は、高病原性の鳥インフルエンザウイルスまたは豚起源のインフルエンザウイルスの２００９Ａ／カリフォルニア流行株に対するワクチン候補を生産するのに容易に適用できる。
【０３５１】
経口、皮下または経皮用のワクチンまたは薬物の製剤化の方法
【０３５２】
エチルセルロース（ＥＣ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテート（ＨＰＭＣＡＳ）およびシクロデキストリンの組合せを含む持続放出マトリックス製剤を含有する、経口、皮下または経皮投与することができる新規のマイクロ粒子／ナノ粒子のカプセル化製剤を以下で論じる。
【０３５３】
実施例１４：本発明者らは、エチルセルロース（ＥＣ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテート（ＨＰＭＣＡＳ）およびシクロデキストリンの組合せを含む持続放出マトリックスを含有する製剤を調製した。以下に記載される様々な用途のために、様々な薬物およびタンパク質をナノ粒子およびマイクロ粒子中にカプセル化した：
【０３５４】
ａ）ＥＣおよびＨＰＭＣＡＳを水に溶解させた（ＰＢＳ、生理食塩水といった、水性溶媒の１つを使用することもできる）。
【０３５５】
ｂ）シクロデキストリンを水（またはＰＢＳもしくは生理食塩水などの他の水性溶媒）に溶解させ、上記２つの溶液を混合した。
【０３５６】
ｃ）様々な薬物、生体活性タンパク質、ワクチン、または他の水溶性化合物を、水（またはＰＢＳもしくは生理食塩水などの他の水性溶媒）に別々に溶解させた。
【０３５７】
ｄ）これら３つの水性溶媒を混合し、スプレードライヤーを用いて噴霧乾燥した（今回のケースでは、本発明者らは、ビュッヒ１９１を使用したが、これらの粒子を噴霧乾燥するために、どのスプレードライヤーを使用してもよい）。
【０３５８】
ｅ）スプレーノズルを冷却循環水または他の水性溶媒中に維持し、ノズルを冷やした状態に保った。これにより、噴霧乾燥される薬物または化合物の分解が抑えられる。
【０３５９】
ｆ）スプレードライヤーを以下の条件に設定した：入口温度１２１〜１３０℃、アスピレーター５０〜９０％吸入速度、圧縮空気５００〜９００
【０３６０】
ｇ）噴霧される材料を回収容器に回収し、材料の性質に応じて４〜８５℃で保存した。
【０３６１】
ｈ）製剤化したナノ粒子／マイクロ粒子製剤を、以下に概要が示されるいくつかの用途および研究に用いた：
【０３６２】
図２３は、ブランクナノ粒子の顕微鏡写真（ＳＥＭ）である。サイズは、マルバーンゼータサイザーを用いて測定した。サイズ範囲は、４５〜８５ｎｍ（平均６８ｎｍ）であった。
【０３６３】
実施例１５：インフルエンザウイルスを用いた経口ワクチン接種研究は免疫を与えることができる
【０３６４】
経口ワクチン接種の概念を証明するものを試験するために、マウス（Ｂａｌｂ／ｃ）に不活化ＰＲ８ウイルスワクチン（約７．５ｕｇ  ＨＡ）を３回（第０週、第４週、および第８週）経口免疫した。経口免疫したマウスは、ウイルス特異的血清ＩｇＧ抗体応答を誘導した。粘膜免疫応答は測定中である。免疫血清中の血球凝集阻害（ＨＡＩ）や中和活性（ＮＡ）などの機能性抗体の誘導は、防御免疫応答のより良い指標である。ブースト免疫の後に、相当なレベルのＨＡＩおよびＮＡ力価が検出された（図２４Ａ）。防御免疫が経口ワクチン接種によって誘導されるかどうかを明らかにするために、２回目のブースト免疫の１０週間後に、免疫したマウスに致死用量（５×ＬＤ５０）のマウス馴化相同ウイルス（Ａ／ＰＲ８）を投与した。免疫していない（ナイーブ）マウスは全て死んだ。免疫したマウスは、一時的な体重減少を経験したものの、１００％防御された（図２４Ｃ）。経口ワクチン接種は、防御免疫を誘導するために高用量の不活化インフルエンザウイルスワクチンを必要とした。それゆえ、経口ワクチン接種によって防御免疫を誘導するのは、極めて実現可能性が高い。しかしながら、経口ワクチン接種による防御効力を改善することが課題として残っている。
【０３６５】
図２４は、不活化ウイルスワクチンの経口ワクチン接種によって防御免疫が誘導されるという結果のグラフを示す。
【０３６６】
Ａ）経口ワクチン接種によって誘導される血清ＨＡＩ応答。第１の棒は、ナイーブな、免疫していない対照；第２の棒は、１回目のブースト免疫後の第１の免疫したマウス；第３の棒は、２回目のブースト免疫後の第２の免疫したマウス。
【０３６７】
Ｂ）中和活性。ＰＲ８ｉｎａ、不活化Ａ／ＰＲ８ウイルスによる経口ワクチン接種。
【０３６８】
Ｃ）致死量投与による感染後の体重変化。
【０３６９】
実施例１６：マウスにおける黒色腫経口ワクチン試験
【０３７０】
本研究では、本発明者らは、研究期間中の腫瘍増殖を測定することにより、経口免疫の有効性を評価した。これは、予防的腫瘍ワクチンに相当し、この場合には、抗腫瘍応答を誘導するために、マウスに最初に１０週間経口ワクチン接種した。次に、本発明者らは、様々なマウスの群にワクチン製剤を経口投与した。ブースター用量のワクチンを毎隔週投与し、１０週間後、生きたＢ−１６黒色腫腫瘍細胞を動物に肩の部分に皮下投与した。
【０３７１】
経口ワクチンの製剤化
【０３７２】
Ｂ−１６黒色腫癌細胞を、サブコンフルエントになるまで、９５％ＣＯ２インキュベーターにて７５ｃｍ２組織培養フラスコ中で３日間培養した。細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．４で洗浄した。次に、細胞を、インキュベーターにてＰＢＳ中で３日間インキュベートした。細胞懸濁液を回収し、１００×ｇで１０分間遠心分離した。細胞ペレットを低張緩衝液中でホモジナイズし、１２００ｒｐｍで５分間遠心分離して、核とその他の破片を除去する。膜断片と細胞質タンパク質とを含有する上清を回収し、ワクチンを調製するために使用した。標準アッセイでタンパク質含有量を測定した。
【０３７３】
上記のような噴霧乾燥プロセスにより、ワクチン抗原のナノスフェア（ＮＳ）を調製した。経口ワクチン製剤は、培養で増殖したＢ−１６黒色腫癌細胞に由来する抗原を含有する。一般的なワクチン製剤化手順は、事前架橋アルブミンを生体分解性ポリマーマトリックスとして使用することを含む。ワクチン材料を胃内の胃酸中での分解から保護するための腸溶性コーティング材料として、エチルセルロースもポリマーマトリックスに取り込ませる。
【０３７４】
本発明者らは、経口ワクチンがインビトロで実際に腸部分に輸送されることも最初に示すことにする。この場合、ウッシング拡散装置にラット小腸の切片を取り付ける。ワクチンＮＳを腸組織切片の上（頂端側）にスラリー状で置く。腸を横断するＮＳを測定するために、試料を下のチャンバーから採取した。
【０３７５】
予備的研究において、本発明者らは、以下のレクチンターゲッティング剤を試験した：
【０３７６】
ａ）コムギ胚芽凝集素（ＷＧＡ）、
【０３７７】
ｂ）ユレックス・ユーロパウエス１（ＵＥＡ−１）、および
【０３７８】
ｃ）コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）
【０３７９】
これらのレクチンは、パイエル板中のＭ細胞へのターゲッティングを促進することが示されている。
【０３８０】
試験した３つのうち、コムギ胚芽凝集素（ＷＧＡ）とユレックス・ユーロパウエス１（ＵＥＡ−１）がＭ細胞への優れたターゲッティングを示した（図２５）。
【０３８１】
本発明者らは、ナノスフェアがパイエル板に非常に効率的に取り込まれることも示した（図２６）。この研究では、ウッシング拡散装置に取り付けられた小腸の切片を使用する。この場合、ナノスフェアからのワクチン材料の放出と輸送を非常に体系的に評価することができ、これは、腸におけるワクチンナノスフェアの取込みを表す優れたモデルである。ワクチンナノスフェアを腸組織切片の上（腸の内側に相当する頂端側）にスラリー状で置く。試料を、生理食塩水を含む下のチャンバーから採取する。この試料は、腸部分を越えて輸送されるナノ粒子に相当する。
【０３８２】
図２５は、ターゲッティングレクチンの存在下で、ＮＳのＣａｃｏ２およびＭ細胞への取込みを示すグラフである。図２６は、腸のパイエル板の微絨毛におけるナノスフェア（緑色の点）分布の顕微鏡写真である。
【０３８３】
この次のインビボ研究で、本発明者らは、研究期間中の腫瘍増殖を測定することにより、経口免疫の有効性を評価した。これは、予防的腫瘍ワクチンに相当し、この場合には、抗腫瘍応答を誘導するために、マウスに最初に１０週間経口ワクチン接種した。次に、本発明者らは、様々なマウスの群にワクチン製剤を経口投与した。ブースター用量のワクチンを毎隔週投与し、１０週間後、肩の部分に皮下注射される、生きたＢ−１６黒色腫腫瘍細胞を動物に投与した。
【０３８４】
図２７Ａ〜Ｃは、黒色腫経口ワクチンの効力を示すグラフである。図２７Ａ：Ｂ１６黒色腫細胞を投与した後の平均腫瘍サイズ。図２７Ｂ：経口免疫したマウスの糞便ＩｇＡ動力学。図２７Ｃ：経口免疫したマウスの血清ＩｇＧレベル。
【０３８５】
ノギスを用いて腫瘍サイズを毎週４週間測定した（図２７Ａ）。この研究では、固形腫瘍の発生に影響を及ぼす能力とともに、抗腫瘍応答が経口ワクチン接種後に誘導されるかどうかを調べた。経口ワクチン接種群では、腫瘍発生の開始は、対照での６日と比較して、１６日であった。腫瘍サイズは、ワクチン接種群で有意により小さかった。図２７Ｂおよび２７Ｃで、ＩｇＧとＩｇＡの両方のレベルは、同等の溶液製剤または対照（ブランクマイクロスフェア）と比較したとき、経口ワクチン接種後１０週間の研究期間の最後で、および腫瘍投与期間中（第１１〜１４週）、有意に高かった。要約すると、経口ワクチン接種は、腫瘍の発生と進行を遅延させ、高い抗体力価を生じさせた。
【０３８６】
経口的および経皮的に試験される他の腫瘍ワクチンおよびＢ型肝炎ナノ粒子／マイクロ粒子ワクチン
【０３８７】
実施例１７：乳癌ワクチン：
【０３８８】
乳癌ワクチンについては、Ｂ−１６黒色腫ワクチン法について記載したワクチン製剤に４Ｔ０７マウス乳癌抗原を使用し、Ｂａｌｂ／ｃマウスで試験した。ナノ粒子およびマイクロ粒子中にカプセル化した４Ｔ０７マウス乳癌抗原を８週間にわたって経口または経皮のいずれかでワクチン接種したマウスは、腫瘍を発生させず、カプセル化ワクチンの経口または経皮投与の後に、強い抗体力価（ＩｇＡとＩｇＧの両方）を示した。対照動物またはこの癌抗原の溶液製剤で処置した動物は、腫瘍を発生させ、死亡した。
【０３８９】
実施例１８：前立腺癌ワクチン：
【０３９０】
前立腺癌ワクチンについては、Ｂ−１６黒色腫ワクチン法について記載したワクチン製剤にＴＲＡＭＣ１前立腺抗原を使用し、Ｃ−５７ｂ／ｌ６マウスで試験した。ナノ粒子およびマイクロ粒子中にカプセル化したＴＲＡＭＣ１前立腺抗原を８週間にわたって経口または経皮のいずれかでワクチン接種したマウスは、腫瘍を発生させず、経皮投与後の強い抗体ＩｇＧおよび経口投与後のＩｇＧとＩｇＡの両方の抗体力価の発生を示した。対照動物またはこの癌抗原の溶液製剤で処置した動物は、腫瘍を発生させ、死亡した。
【０３９１】
実施例１９：卵巣癌ワクチン：
【０３９２】
卵巣癌ワクチンについては、Ｂ−１６黒色腫ワクチン法について記載したワクチン製剤に４３０６卵巣癌細胞から得られた抗原を使用し、Ｂａｌｂ／ｃマウスで試験した。ナノ粒子およびマイクロ粒子中にカプセル化した４３０６卵巣癌抗原を８週間にわたって経口または経皮のいずれかでワクチン接種したマウスは、腫瘍を発生させず、経皮投与後の強い抗体ＩｇＧおよび経口投与後のＩｇＧとＩｇＡの両方の抗体力価の発生によって示されるような強い免疫を示した。対照動物またはこの癌抗原の溶液製剤で処置した動物は、腫瘍を発生させ、死亡した。
【０３９３】
実施例２０：Ｂ型肝炎ワクチン：
【０３９４】
Ｂ型肝炎ワクチンについては、Ｂ−１６黒色腫ワクチン法について記載したワクチン製剤に肝炎プラスミドワクチンを使用し、Ｂａｌｂ／ｃマウスで試験した。ナノ粒子またはマイクロ粒子中にカプセル化したこのプラスミドワクチンを７〜８週間にわたって経口または経皮のいずれかでワクチン接種したマウスは、経皮投与後の強い抗体ＩｇＧおよび経口投与後のＩｇＧとＩｇＡの両方の抗体力価の発生によって示されるような強い免疫を示した。
【０３９５】
本開示は、限定されるものではないが、以下を含む、本発明のいくつかの実施形態を提供する：
【０３９６】
ナノスフェアを調製する方法、
【０３９７】
薬物を身体に送達する方法、
【０３９８】
制御され、持続される薬物送達系、
【０３９９】
腫瘍を同定するための効果的な診断ツールを調製する方法、
【０４００】
従来のアジュバントを用いずに、ワクチンの経口投与後に免疫を誘導するために使用することができる効果的なワクチン製剤を調製し、送達する方法、ならびに
【０４０１】
従来のアジュバントを用いずに、ワクチンの吸入および全身投与後に免疫を誘導するために使用することができる効果的なワクチン製剤を調製し、送達する方法。
【０４０２】
本発明のいくつかの例示的な実施例のみが上で詳細に記載されているが、当業者は、本発明の新規の教示や利点から大きく逸脱することなく、多くの修正が、これらの例示的な実施形態において可能であることを容易に理解するであろう。したがって、このような修正は全て、以下の特許請求の範囲で規定される本発明の範囲内に含まれることが意図される。本明細書で参照される任意の特許、出願および刊行物はその全体が参照により本明細書に組み込まれることにもさらに留意すべきである。