(57)【要約】      （修正有）【課題】  組織培養物中のヒト及び動物の細胞等からの抽出物におけるウリジン−二リン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンの形成あるいは阻害性等を測定するための方法を提供する。【解決手段】グルタミン：フルクトース6-リン酸アミドトランスフェラーゼの活性を測定するための方法であって、（ａ）グルタミン：フルクトース6-リン酸アミドトランスフェラーゼ、フルクトース6-リン酸およびグルタミンの混合物を形成する段階；（ｂ）(a)における混合物を、グルコサミン6-リン酸が形成されるのに十分な時間にわたって生理的条件下でインキュベートする段階；（ｃ）(b)におけるグルコサミン6-リン酸をアセチル化してN-アセチルグルコサミン6-リン酸を形成する段階；（ｄ）(c)におけるN-アセチルグルコサミン6-リン酸をエールリッヒ試薬と反応させる段階；ならびに（ｅ）(d)における混合物の500〜610nmでの光学密度を計測することによって(d)に存在するN-アセチルグルコサミン6-リン酸の量を測定する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
組織培養物中のヒトおよび動物の組織または細胞からの抽出物におけるウリジン-二リン酸-N-アセチルグルコサミンの形成を測定するための方法であって、
（a）組織培養下にあるヒトまたは動物の組織または細胞からの抽出物を加水分解し、ウリジン-二リン酸-N-アセチルグルコサミンをN-アセチルグルコサミンに変換する段階；
（b）(a)におけるN-アセチルグルコサミンをエールリッヒ試薬と反応させる段階；および
（c）(b)における混合物の500〜610nmでの光学密度を計測することによって(b)に存在するN-アセチルグルコサミンの量を測定し、(b)におけるN-アセチルグルコサミンの量をN-アセチルグルコサミンの対照試料と比較し、それによってウリジン-二リン酸-N-アセチルグルコサミンの形成を定量する段階、
を含む方法。
【請求項２】
抽出物がヒトの組織または細胞に由来する、請求項1記載の方法。
【請求項３】
(a)における加水分解の段階が、塩酸に続けて四ホウ酸カリウムを添加して10〜30分間にわたって行われる、請求項1〜2のいずれか一項記載の方法。
【請求項４】
(a)における加水分解の段階が、塩酸に続けて四ホウ酸カリウムを添加して10分間にわたって行われる、請求項1〜2のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
(a)における加水分解の段階が、塩酸に続けて四ホウ酸カリウムを添加して37℃よりも高温で行われる、請求項1〜2のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
(b)におけるエールリッヒ試薬が、p-ジメチルアミノベンズアルデヒド2g、水0.3ml、濃塩酸2.2mlおよび酢酸17.4mlを含み、これを酢酸で1：2に希釈する、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
(a)における加水分解の段階が微量遠心管内で行われる、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
(c)における測定の段階がマイクロタイタープレート中で行われる、請求項1〜7のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
細胞におけるウリジン-二リン酸-N-アセチルグルコサミン形成に対する被験化合物の阻害活性を測定するための方法であって、
（a）被験化合物を組織培養下にある細胞とともに、被験化合物がグルタミン:フルクトース6-リン酸アミドトランスフェラーゼを阻害し、ウリジン二リン酸-N-アセチルグルコサミンの細胞レベルが低下するのに十分な時間にわたって生理的条件下でインキュベートする段階；
（b）(a)におけるウリジン-二リン酸-Nアセチルグルコサミンを抽出する段階；
（c）(b)におけるウリジン-二リン酸-N-アセチルグルコサミンを加水分解してN-アセチルグルコサミンを形成する段階；
（d）(c)におけるN-アセチルグルコサミンをエールリッヒ試薬と反応させる段階；ならびに
（e）(d)における混合物の500〜610nmでの光学密度を計測することによって(d)におけるN-アセチルグルコサミンの量を測定し、(d)中のN-アセチルグルコサミンの量を、被験化合物とインキュベートしていない組織培養下の細胞およびN-アセチルグルコサミンの対照試料における量と比較し、それによって被験化合物の阻害活性を決定する段階、
を含む方法。
【請求項１０】
(a)における細胞が、ヒト腎293細胞、GFATβをトランスフェクトしたヒト腎293細胞、またはサル腎COS細胞、GFATβをトランスフェクトしたサル腎COS細胞、ならびに哺乳動物細胞、酵母細胞および細菌細胞からなる群より選択される、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
(c)における加水分解の段階が、塩酸に続けて四ホウ酸カリウムを添加して10〜30分間にわたって行われる、請求項9〜10のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
(c)における加水分解の段階が、塩酸に続けて四ホウ酸カリウムを添加して10分間にわたって行われる、請求項9〜10のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
(a)における加水分解の段階が、塩酸に続けて四ホウ酸カリウムを添加して37℃よりも高温で行われる、請求項9〜10のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
(d)におけるエールリッヒ試薬が、p-ジメチルアミノベンズアルデヒド2g、水0.3ml、濃塩酸2.2mlおよび酢酸17.4mlを含み、これを酢酸で1：2に希釈する、請求項9〜13のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５】
(c)における加水分解の段階が微量遠心管内で行われる、請求項9〜14のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６】
(e)における測定の段階がマイクロタイタープレート中で行われる、請求項9〜15のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７】
ヒトまたは動物におけるウリジン-二リン酸-N-アセチルグルコサミン形成に対する被験化合物の阻害活性を測定するための方法であって、
（a）被験化合物がグルタミン:フルクトース6-リン酸アミドトランスフェラーゼによるウリジン二リン酸-N-アセチルグルコサミンの形成を阻害するのに十分な時間にわたって生理的条件下で、ヒトまたは動物に被験化合物を投与する段階；
（b）(a)におけるヒトまたは動物から組織を採取して、組織からウリジン-二リン酸-N-アセチルグルコサミンを抽出する段階；
（c）(b)におけるウリジン-二リン酸-N-アセチルグルコサミンを加水分解して、N-アセチルグルコサミンを形成する段階；
（d）(c)におけるN-アセチルグルコサミンをエールリッヒ試薬と反応させる段階；および
（e）(d)における混合物の500〜610nmでの光学密度を計測することによって(d)におけるN-アセチルグルコサミンの量を測定し、(d)におけるN-アセチルグルコサミンの量を、被験化合物を投与されていないヒトまたは動物およびN-アセチルグルコサミンの対照試料における量と比較し、それによって被験化合物の阻害活性を決定する段階、
を含む方法。
【請求項１８】
(a)における投与が、1日当たり1〜2回、1日〜2週間の期間にわたって経口的または静脈内に行われる、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
(a)における動物がヒト、マウスまたはラットである、請求項17〜18のいずれか一項記載の方法。
【請求項２０】
(c)における加水分解の段階が、塩酸に続けて四ホウ酸カリウムを添加して10〜30分間にわたって行われる、請求項17〜19のいずれか一項記載の方法。
【請求項２１】
(c)における加水分解の段階が、塩酸に続けて四ホウ酸カリウムを添加して10分間にわたって行われる、請求項17〜19のいずれか一項記載の方法。
【請求項２２】
(c)における加水分解の段階が、塩酸に続けて四ホウ酸カリウムを添加して37℃よりも高温で行われる、請求項17〜19のいずれか一項記載の方法。
【請求項２３】
(d)におけるエールリッヒ試薬が、p-ジメチルアミノベンズアルデヒド2g、水0.3ml、濃塩酸2.2mlおよび酢酸17.4mlを含み、これを酢酸で1：2に希釈する、請求項17〜22のいずれか一項記載の方法。
【請求項２４】
(c)における加水分解の段階が微量遠心管内で行われる、請求項17〜23のいずれか一項記載の方法。
【請求項２５】
(e)における測定の段階がマイクロタイタープレート中で行われる、請求項17〜24のいずれか一項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グルタミン:フルクトース6-リン酸アミドトランスフェラーゼの活性を測定するための方法、およびグルタミン:フルクトース6-リン酸アミドトランスフェラーゼに対する被験化合物の阻害活性を測定するための方法に関する。本発明はまた、組織培養物中のヒトおよび動物の組織または細胞からの抽出物におけるウリジン-二リン酸-N-アセチルグルコサミンの形成を測定するための方法、細胞におけるウリジン-二リン酸-N-アセチルグルコサミン形成に対する被験化合物の阻害活性を測定するための方法、および、ヒトまたは動物におけるウリジン-二リン酸-N-アセチルグルコサミン形成に対する被験化合物の阻害活性を測定するための方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
グルコサミン6-リン酸およびウリジン-二リン酸-N-アセチルグルコサミン（UDP-N-アセチルグルコサミン、UDP-GlcNAc）を分析するための方法は公知である。グルコサミン6-リン酸は、ヘキソースアミン生合成経路における律速酵素であるグルタミン:フルクトース6-リン酸アミドトランスフェラーゼ（GFAT）の最初の生成物である。UDP-N-アセチルグルコサミンはヘキソースアミン生合成経路における最終生成物であり、これは続いて、タンパク質のN-結合型およびO-結合型グリコシル化に用いられる。さらに、これはO-N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼによる作用を受けて、単一のN-アセチルグルコサミン残基をアミノ酸セリンまたはトレオニンに対して転移する。これらの経路はタンパク質グリコシル化の調節に重要であり、インスリン感受性およびグルコース調節とも関連づけられている。グルコサミン6-リン酸の測定は、1）試料の抽出および精製に続いてのHPLC/MS分析（非特許文献1）；または2）試料を水中で煮沸するかもしくは試料を過塩素酸で抽出した後に中和する段階と、遠心処理の段階とを必要とする分光光度法、といった2種類の検出方法のいずれを用いても手間がかかる。これらの方法はハイスループットアッセイ法に適さない。
【０００３】
このグルコサミン6-リン酸定量法は、GFAT阻害剤を同定するため、さらにはそれらを引き続いて最適化するために用いられる。UDP-GlcNAcの測定は、GFAT阻害剤のインビボでの効果、ならびにヘキソースアミン経路内の酵素に対する種々の調節物質の効果を明らかにするために用いられる。
【０００４】
グルコサミン6-リン酸およびUDP-N-アセチルグルコサミンを分析するためのこれらの方法は、希アルカリ溶液中でN-アセチルグルコサミンとp-ジメチルアミノベンズアルデヒド（エールリッヒ試薬）とが示す呈色反応に基づく（非特許文献2）。ホウ酸緩衝液を用いるこの当初の手順を改変し、より安定的なpHとすることにより、収率は2倍に高まり、呈色までの時間も短縮されたが、これは高温での加熱およびml単位の量の試薬を必要とした（非特許文献3）。希無水酢酸アセトン溶液に続いてホウ酸アルカリ溶液を用い、グルコース6-リン酸をアセチル化することにより、グルコサミンのN-アセチルグルコサミンへの定量的な変換が可能になったが、これもml単位の容積および熱湯中での加熱を要した（非特許文献4）。この方法は種々の組織におけるグルコサミン6-リン酸の測定が可能であるが、蓋をしたチューブ内で加熱する段階を必要とする（非特許文献5）。より少ない量でのGFAT活性の測定も行われているが、この方法は、反応を停止させるための過塩素酸の添加、水酸化カリウムによる中和、遠心処理および分析用の上清を移すことを必要とする（非特許文献6）。UDP-N-アセチルグルコサミンの定量のための分光光度法は記載されていない。現行の方法は、試料の精製およびHPLC/MSによる分析を必要とする（非特許文献7）。
【０００５】
Zymogeneticsの特許文献1は、ヒトのグルタミン:フルクトース6-リン酸アミドトランスフェラーゼをコードするDNA分子を開示している。これらのDNA分子は、グルタミン:フルクトース-6-リン酸アミドトランスフェラーゼのアンタゴニストをスクリーニングするための方法に用いられる。ヒトのグルタミン:フルクトース-6-リン酸アミドトランスフェラーゼをコードするDNA分子を適した宿主細胞において発現させ、組換えグルタミン:フルクトース-6-リン酸アミドトランスフェラーゼを産生させる。被験物質を、フルクトース-6-リン酸およびグルタミンの存在下で組換えヒトグルタミン:フルクトース-6-リン酸アミドトランスフェラーゼに対して曝露させる。被験物質の非存在下における活性と比較してグルタミン:フルクトース-6-リン酸アミドトランスフェラーゼの活性が低下すれば、その化合物がヒトグルタミン:フルクトース-6-リン酸アミドトランスフェラーゼを阻害することが示される。
【０００６】
Nishiらの特許文献2は、グルタミン:フルクトース-6-リン酸アミドトランスフェラーゼ；このタンパク質をコードするDNA；組換えベクター；形質転換体；このタンパク質の生産のための方法；このタンパク質を含む薬学的組成物；およびこのタンパク質またはその部分的ペプチドに対する抗体を開示している。このタンパク質およびDNAは低血糖に対する予防的または治療的な薬剤として用いられる。抗体はタンパク質のアッセイ法に用いられ、タンパク質は医用化合物の候補をスクリーニングするための試薬として用いられる。
【０００７】
【特許文献１】国際公開公報第93/21330号
【特許文献２】米国特許第5,876,713号
【非特許文献１】K.A. Robinson, M.L. Weinstein, G.E. LindenmayerおよびM.G. Buse、「Diabetes」、1995年、第44巻、p.1438-1446
【非特許文献２】W.J. MorganおよびL.A. Elson、「Biochem J.」、1934年、p.988-995
【非特許文献３】J.L. Reissig, J.L. StromingerおよびL.F. LeLoir、「JBC」、1955年、第217巻、p.959-966
【非特許文献４】G.A. LevvyおよびA. McAllan、「Biochem J」、1959年、第73巻、p.127-132
【非特許文献５】T.C. RichardsおよびO. Greengard、「Biochemica et Biophysica Acta」、1973年、第304巻、p.842-850
【非特許文献６】G.L. McKnight, S.L. Mudri, S.L. Mathewest, R.R. Traxinger, S. Marshall, P.O. SheppardおよびP.J. O'Hara、「JBC」、1992年、第267巻、p.25204-25212
【非特許文献７】K.A. Robinson, M.L. Weinstein, G.E. LindenmayerおよびM.G. Buse、「Diabetes」、1995年、第44巻、p.441438-1446
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、組織培養物中のヒトおよび動物の組織または細胞からの抽出物におけるウリジン-二リン酸-N-アセチルグルコサミンの形成を測定するための方法、細胞におけるウリジン-二リン酸-N-アセチルグルコサミン形成に対する被験化合物の阻害活性を測定するための方法、および、ヒトまたは動物におけるウリジン-二リン酸-N-アセチルグルコサミン形成に対する被験化合物の阻害活性を測定するための方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、グルタミン:フルクトース6-リン酸アミドトランスフェラーゼの活性を測定するための方法であって、（a）グルタミン:フルクトース6-リン酸アミドトランスフェラーゼ、フルクトース6-リン酸およびグルタミンの混合物を形成する段階；（b）(a)における混合物を、グルコサミン6-リン酸が形成されるのに十分な時間にわたって生理的条件下でインキュベートする段階；（c）(b)におけるグルコサミン6-リン酸をアセチル化してN-アセチルグルコサミン6-リン酸を形成する段階；（d）(c)におけるN-アセチルグルコサミン6-リン酸をエールリッヒ試薬と反応させる段階；ならびに（e）(d)における混合物の500〜610nmでの光学密度を計測することによって(d)に存在するN-アセチルグルコサミン6-リン酸の量を測定し、(d)におけるN-アセチルグルコサミン6-リン酸の量を、N-アセチルグルコサミン6-リン酸の対照試料、およびインキュベートしていないグルタミン:フルクトース6-リン酸アミドトランスフェラーゼの対照試料またはグルタミンもしくはフルクトース6-リン酸の非存在下でインキュベートしたグルタミン:フルクトース6-リン酸アミドトランスフェラーゼの対照試料と比較する段階を含む方法を提供する。
【００１０】
グルタミン:フルクトース6-リン酸アミドトランスフェラーゼは、グルタミンに対するKmが1.49mMであってフルクトース6-リン酸に対するKmが1.85mMであるグルタミン:フルクトース6-リン酸アミドトランスフェラーゼ-ヒトα型、または、グルタミンに対するKmが1.99mMであってフルクトース6-リン酸に対するKmが6.8mMであるグルタミン:フルクトース6-リン酸アミドトランスフェラーゼ-ヒトβ型であることが好ましい。グルタミン:フルクトース6-リン酸アミドトランスフェラーゼは細胞にトランスフェクトされていてもそうでなくてもよい。好ましくは、(a)における混合物は、グルタミン:フルクトース6-リン酸アミドトランスフェラーゼ（0.25〜25μl）、グルタミン（2〜40mM）、フルクトース6-リン酸（2〜40mM）、リン酸緩衝食塩水pH 7.4、エチレンジアミン四酢酸（5mM）およびジチオトレイトール（1mM）を含み、(b)におけるインキュベーションの段階は37℃で5分間〜5時間にわたって行われ、(c)におけるアセチル化の段階はアセトン中0.09375％無水酢酸に続けて62.5mM四ホウ酸カリウムを添加して80℃で25分間にわたって行われる。(d)におけるエールリッヒ試薬は好ましくはp-ジメチルアミノベンズアルデヒド2g、水0.3ml、濃塩酸2.2mlおよび酢酸17.4mlを含み、これを酢酸で1：2に希釈する。1つの好ましい態様において、(a)における混合物はマイクロタイタープレート中で形成され、さらに、(b)におけるインキュベーション段階の後に、N-アセチルグルコサミン6-リン酸の対照試料、およびインキュベートしていないグルタミン:フルクトース6-リン酸アミドトランスフェラーゼの対照試料またはグルタミンもしくはフルクトース6-リン酸の非存在下でインキュベートしたグルタミン:フルクトース6-リン酸アミドトランスフェラーゼの対照試料をマイクロタイタープレートに添加することを含む。
【００１１】
本発明はまた、グルタミン:フルクトース6-リン酸アミドトランスフェラーゼに対する被験化合物の阻害活性を測定するための方法であって、（a）被験化合物、グルタミン:フルクトース6-リン酸アミドトランスフェラーゼ、フルクトース6-リン酸およびグルタミンの混合物を形成する段階；（b）(a)における混合物を、被験化合物がグルタミン:フルクトース6-リン酸アミドトランスフェラーゼによるグルコサミン6-リン酸の形成を阻害するのに十分な時間にわたって生理的条件下でインキュベートする段階；（c）(b)におけるグルコサミン6-リン酸をアセチル化してN-アセチルグルコサミン6-リン酸を形成する段階；（d）(c)におけるN-アセチルグルコサミン6-リン酸をエールリッヒ試薬と反応させる段階；および（e）(d)における混合物の500〜610nmでの光学密度を計測することによって(d)におけるN-アセチルグルコサミン6-リン酸の量を測定し、(d)におけるN-アセチルグルコサミン6-リン酸の量を、被験化合物を含まないグルタミン:フルクトース6-リン酸アミドトランスフェラーゼの対照試料およびN-アセチルグルコサミン6-リン酸の対照試料と比較し、それによって被験化合物の阻害活性を決定する段階を含む方法も提供する。
【００１２】
グルタミン:フルクトース6-リン酸アミドトランスフェラーゼは、グルタミンに対するKmが1.49mMであってフルクトース6-リン酸に対するKmが1.85mMであるグルタミン:フルクトース6-リン酸アミドトランスフェラーゼ-ヒトα型、または、グルタミンに対するKmが1.99mMであってフルクトース6-リン酸に対するKmが6.8mMであるグルタミン:フルクトース6-リン酸アミドトランスフェラーゼ-ヒトβ型であることが好ましい。グルタミン:フルクトース6-リン酸アミドトランスフェラーゼは細胞にトランスフェクトされていてもそうでなくてもよい。好ましくは、(a)における混合物は、被験化合物、グルタミン:フルクトース6-リン酸アミドトランスフェラーゼ（0.25〜25μl）、グルタミン（10mM）、フルクトース6-リン酸（10mM）、リン酸緩衝食塩水pH 7.4、エチレンジアミン四酢酸（5mM）およびジチオトレイトール（1mM）を含み、(b)におけるインキュベーションの段階は37℃で1時間にわたって行われ、(c)におけるアセチル化の段階はアセトン中0.09375％無水酢酸に続けて62.5mM四ホウ酸カリウムを添加して80℃で25分間にわたって行われる。(d)におけるエールリッヒ試薬は好ましくはp-ジメチルアミノベンズアルデヒド2g、水0.3ml、濃塩酸2.2mlおよび酢酸17.4mlを含み、これを酢酸で1：2に希釈する。1つの好ましい態様において、(a)における混合物はマイクロタイタープレート中で形成され、さらに、(b)におけるインキュベーション段階の後に、N-アセチルグルコサミン6-リン酸の対照試料、およびインキュベートしていないグルタミン:フルクトース6-リン酸アミドトランスフェラーゼの対照試料、またはグルタミンもしくはフルクトース6-リン酸の非存在下でインキュベートしたグルタミン:フルクトース6-リン酸アミドトランスフェラーゼの対照試料をマイクロタイタープレートに添加することを含む。
【００１３】
本発明はさらに、組織培養物中のヒトおよび動物の組織または細胞からの抽出物におけるウリジン-二リン酸-N-アセチルグルコサミンの形成を測定するための方法であって、（a）組織培養下にあるヒトまたは動物の組織または細胞からの抽出物を加水分解し、ウリジン-二リン酸-N-アセチルグルコサミンをN-アセチルグルコサミンに変換する段階；（b）(a)におけるN-アセチルグルコサミンをエールリッヒ試薬と反応させる段階；および（c）(b)における混合物の500〜610nmでの光学密度を計測することによって(b)に存在するN-アセチルグルコサミンの量を測定し、(b)におけるN-アセチルグルコサミンの量をN-アセチルグルコサミンの対照試料と比較し、それによってウリジン-二リン酸-N-アセチルグルコサミンの形成を定量する段階を含む方法を提供する。
【００１４】
抽出物はヒトの組織または細胞に由来することが好ましい。好ましくは、(a)における加水分解の段階は0.1N塩酸に続けて62.5mM四ホウ酸カリウムを添加して80℃で10分間にわたって行われ、(b)におけるエールリッヒ試薬はp-ジメチルアミノベンズアルデヒド2g、水0.3ml、濃塩酸2.2mlおよび酢酸17.4mlを含み、これを酢酸で1：2に希釈する。1つの好ましい態様において、(a)における加水分解の段階は微量遠心管内で行われ、(c)における測定の段階はマイクロタイタープレート中で行われる。
【００１５】
本発明はさらにまた、細胞におけるウリジン-二リン酸-N-アセチルグルコサミン形成に対する被験化合物の阻害活性を測定するための方法であって、（a）被験化合物を組織培養下にある細胞とともに、被験化合物がグルタミン:フルクトース6-リン酸アミドトランスフェラーゼを阻害し、ウリジン二リン酸-N-アセチルグルコサミンの細胞レベルが低下するのに十分な時間にわたって生理的条件下でインキュベートする段階；（b）(a)におけるウリジン-二リン酸-Nアセチルグルコサミンを抽出する段階；（c）(b)におけるウリジン-二リン酸-N-アセチルグルコサミンを加水分解してN-アセチルグルコサミンを形成する段階；（d）(c)におけるN-アセチルグルコサミンをエールリッヒ試薬と反応させる段階；ならびに（e）(d)における混合物の500〜610nmでの光学密度を計測することによって(d)におけるN-アセチルグルコサミンの量を測定し、(d)におけるN-アセチルグルコサミンの量を、被験化合物とインキュベートしていない組織培養下の細胞、およびN-アセチルグルコサミンの対照試料における量と比較し、それによって被験化合物の阻害活性を決定する段階を含む方法にも関する。
【００１６】
(a)における細胞は、ヒト腎293細胞、GFATβをトランスフェクトしたヒト腎293細胞、またはサル腎COS細胞、GFATβをトランスフェクトしたサル腎COS細胞、ならびに哺乳動物細胞、酵母細胞および細菌細胞からなる群より選択されることが好ましい。好ましくは、(c)における加水分解の段階は塩酸0.1Nに続けて62.5mM四ホウ酸カリウムを添加して80℃で10分間にわたって行われ、(d)におけるエールリッヒ試薬はp-ジメチルアミノベンズアルデヒド2g、水0.3ml、濃塩酸2.2mlおよび酢酸17.4mlを含み、これを酢酸で1：2に希釈する。
【００１７】
本発明はさらにまた、ヒトまたは動物におけるウリジン-二リン酸-N-アセチルグルコサミン形成に対する被験化合物の阻害活性を測定するための方法であって、（a）被験化合物がグルタミン:フルクトース6-リン酸アミドトランスフェラーゼによるウリジン二リン酸-N-アセチルグルコサミンの形成を阻害するのに十分な時間にわたって生理的条件下で、ヒトまたは動物に被験化合物を投与する段階；（b）(a)におけるヒトまたは動物から組織を採取して、組織からウリジン-二リン酸-N-アセチルグルコサミンを抽出する段階；（c）(b)におけるウリジン-二リン酸-N-アセチルグルコサミンを加水分解して、N-アセチルグルコサミンを形成する段階；（d）(c)におけるN-アセチルグルコサミンをエールリッヒ試薬と反応させる段階；および（e）(d)における混合物の500〜610nmでの光学密度を計測することによって(d)中のN-アセチルグルコサミンの量を測定し、(d)中のN-アセチルグルコサミンの量を、被験化合物を投与されていないヒトまたは動物およびN-アセチルグルコサミンの対照試料における量と比較し、それによって被験化合物の阻害活性を決定する段階を含む方法にも関する。
【００１８】
好ましくは、(a)における投与は、1日当たり1〜2回、1日〜2週間にわたって経口的または静脈内に行われ、(a)における動物はヒト、マウスまたはラットである。好ましくは、(c)における加水分解の段階は、塩酸0.1Nに続けて62.5mM四ホウ酸カリウムを添加して80℃で10分間にわたって行われる。
【００１９】
本発明は、グルコサミン6-リン酸レベルのハイスループット・マイクロタイタープレート分析のための迅速分光光度法に関する。本方法は、さまざまな源からのUDP-GlcNAcの簡易な測定および定量化も可能にする。記載される分光光度法は、好ましくは、マイクロタイタープレート中で行われ、希アルカリ溶液中のN-アセチルグルコサミンとp-ジメチルアミノベンズアルデヒド（エールリッヒ試薬）との呈色反応に基づく。この分光光度法は、HPLC/MS法に必要な多くの精製段階を必要とせず、多数の試料を一度にアッセイすることができる。本方法は、UDP-N-アセチルグルコサミンをN-アセチルグルコサミンへと加水分解し、それを続いてN-アセチルグルコサミンに対する分光光度法によって測定することを含む。
【００２０】
本発明に係る方法においては、（１）組織培養物中のヒトおよび動物の組織または細胞からの抽出物におけるウリジン-二リン酸-N-アセチルグルコサミンの形成を測定するための方法であって、
（a）組織培養下にあるヒトまたは動物の組織または細胞からの抽出物を加水分解し、ウリジン-二リン酸-N-アセチルグルコサミンをN-アセチルグルコサミンに変換する段階；
（b）(a)におけるN-アセチルグルコサミンをエールリッヒ試薬と反応させる段階；および
（c）(b)における混合物の500〜610nmでの光学密度を計測することによって(b)に存在するN-アセチルグルコサミンの量を測定し、(b)におけるN-アセチルグルコサミンの量をN-アセチルグルコサミンの対照試料と比較し、それによってウリジン-二リン酸-N-アセチルグルコサミンの形成を定量する段階を含む方法であることを特徴とする。
【００２１】
本発明に係る方法においては、（２）抽出物がヒトの組織または細胞に由来する、(1)記載の方法であることを特徴とする。
【００２２】
本発明に係る方法においては、（３）(a)における加水分解の段階が、塩酸に続けて四ホウ酸カリウムを添加して10〜30分間にわたって行われる、(1)〜(2)のいずれか一項記載の方法であることを特徴とする。
【００２３】
本発明に係る方法においては、（４）(a)における加水分解の段階が、塩酸に続けて四ホウ酸カリウムを添加して10分間にわたって行われる、(1)〜(2)のいずれか一項記載の方法であることを特徴とする。
【００２４】
本発明に係る方法においては、（５）(a)における加水分解の段階が、塩酸に続けて四ホウ酸カリウムを添加して37℃よりも高温で行われる、(1)〜(2)のいずれか一項記載の方法であることを特徴とする。
【００２５】
本発明に係る方法においては、（６）(b)におけるエールリッヒ試薬が、p-ジメチルアミノベンズアルデヒド2g、水0.3ml、濃塩酸2.2mlおよび酢酸17.4mlを含み、これを酢酸で1：2に希釈する、(1)〜(5)のいずれか一項記載の方法であることを特徴とする。
【００２６】
本発明に係る方法においては、（７）(a)における加水分解の段階が微量遠心管内で行われる、(1)〜(6)のいずれか一項記載の方法であることを特徴とする。
【００２７】
本発明に係る方法においては、（８）(c)における測定の段階がマイクロタイタープレート中で行われる、(1)〜(7)のいずれか一項記載の方法であることを特徴とする。
【００２８】
本発明に係る方法においては、（９）細胞におけるウリジン-二リン酸-N-アセチルグルコサミン形成に対する被験化合物の阻害活性を測定するための方法であって、
（a）被験化合物を組織培養下にある細胞とともに、被験化合物がグルタミン:フルクトース6-リン酸アミドトランスフェラーゼを阻害し、ウリジン二リン酸-N-アセチルグルコサミンの細胞レベルが低下するのに十分な時間にわたって生理的条件下でインキュベートする段階；
（b）(a)におけるウリジン-二リン酸-Nアセチルグルコサミンを抽出する段階；
（c）(b)におけるウリジン-二リン酸-N-アセチルグルコサミンを加水分解してN-アセチルグルコサミンを形成する段階；
（d）(c)におけるN-アセチルグルコサミンをエールリッヒ試薬と反応させる段階；ならびに
（e）(d)における混合物の500〜610nmでの光学密度を計測することによって(d)におけるN-アセチルグルコサミンの量を測定し、(d)中のN-アセチルグルコサミンの量を、被験化合物とインキュベートしていない組織培養下の細胞およびN-アセチルグルコサミンの対照試料における量と比較し、それによって被験化合物の阻害活性を決定する段階を含む方法であることを特徴とする。
【００２９】
本発明に係る方法においては、（１０）(a)における細胞が、ヒト腎293細胞、GFATβをトランスフェクトしたヒト腎293細胞、またはサル腎COS細胞、GFATβをトランスフェクトしたサル腎COS細胞、ならびに哺乳動物細胞、酵母細胞および細菌細胞からなる群より選択される、(9)記載の方法であることを特徴とする。
【００３０】
本発明に係る方法においては、（１１）(c)における加水分解の段階が、塩酸に続けて四ホウ酸カリウムを添加して10〜30分間にわたって行われる、(9)〜(10)のいずれか一項記載の方法であることを特徴とする。
【００３１】
本発明に係る方法においては、（１２）(c)における加水分解の段階が、塩酸に続けて四ホウ酸カリウムを添加して10分間にわたって行われる、(9)〜(10)のいずれか一項記載の方法であることを特徴とする。
【００３２】
本発明に係る方法においては、（１３）(a)における加水分解の段階が、塩酸に続けて四ホウ酸カリウムを添加して37℃よりも高温で行われる、(9)〜(10)のいずれか一項記載の方法であることを特徴とする。
【００３３】
本発明に係る方法においては、（１４）(d)におけるエールリッヒ試薬が、p-ジメチルアミノベンズアルデヒド2g、水0.3ml、濃塩酸2.2mlおよび酢酸17.4mlを含み、これを酢酸で1：2に希釈する、(9)〜(13)のいずれか一項記載の方法であることを特徴とする。
【００３４】
本発明に係る方法においては、（１５）(c)における加水分解の段階が微量遠心管内で行われる、(9)〜(14)のいずれか一項記載の方法であることを特徴とする。
【００３５】
本発明に係る方法においては、（１６）(e)における測定の段階がマイクロタイタープレート中で行われる、(9)〜(15)のいずれか一項記載の方法であることを特徴とする。
【００３６】
本発明に係る方法においては、（１７）ヒトまたは動物におけるウリジン-二リン酸-N-アセチルグルコサミン形成に対する被験化合物の阻害活性を測定するための方法であって、
（a）被験化合物がグルタミン:フルクトース6-リン酸アミドトランスフェラーゼによるウリジン二リン酸-N-アセチルグルコサミンの形成を阻害するのに十分な時間にわたって生理的条件下で、ヒトまたは動物に被験化合物を投与する段階；
（b）(a)におけるヒトまたは動物から組織を採取して、組織からウリジン-二リン酸-N-アセチルグルコサミンを抽出する段階；
（c）(b)におけるウリジン-二リン酸-N-アセチルグルコサミンを加水分解して、N-アセチルグルコサミンを形成する段階；
（d）(c)におけるN-アセチルグルコサミンをエールリッヒ試薬と反応させる段階；および
（e）(d)における混合物の500〜610nmでの光学密度を計測することによって(d)におけるN-アセチルグルコサミンの量を測定し、(d)におけるN-アセチルグルコサミンの量を、被験化合物を投与されていないヒトまたは動物およびN-アセチルグルコサミンの対照試料における量と比較し、それによって被験化合物の阻害活性を決定する段階、
を含む方法であることを特徴とする。
【００３７】
本発明に係る方法においては、（１８）(a)における投与が、1日当たり1〜2回、1日〜2週間の期間にわたって経口的または静脈内に行われる、(17)記載の方法であることを特徴とする。
【００３８】
本発明に係る方法においては、（１９）(a)における動物がヒト、マウスまたはラットである、(17)〜(18)のいずれか一項記載の方法であることを特徴とする。
【００３９】
本発明に係る方法においては、（２０）(c)における加水分解の段階が、塩酸に続けて四ホウ酸カリウムを添加して10〜30分間にわたって行われる、(17)〜(19)のいずれか一項記載の方法であることを特徴とする。
【００４０】
本発明に係る方法においては、（２１）(c)における加水分解の段階が、塩酸に続けて四ホウ酸カリウムを添加して10分間にわたって行われる、(17)〜(19)のいずれか一項記載の方法であることを特徴とする。
【００４１】
本発明に係る方法においては、（２２）(c)における加水分解の段階が、塩酸に続けて四ホウ酸カリウムを添加して37℃よりも高温で行われる、(17)〜(19)のいずれか一項記載の方法であることを特徴とする。
【００４２】
本発明に係る方法においては、（２３）(d)におけるエールリッヒ試薬が、p-ジメチルアミノベンズアルデヒド2g、水0.3ml、濃塩酸2.2mlおよび酢酸17.4mlを含み、これを酢酸で1：2に希釈する、(17)〜(22)のいずれか一項記載の方法であることを特徴とする。
【００４３】
本発明に係る方法においては、（２４）(c)における加水分解の段階が微量遠心管内で行われる、(17)〜(23)のいずれか一項記載の方法であることを特徴とする。
【００４４】
本発明に係る方法においては、（２５）(e)における測定の段階がマイクロタイタープレート中で行われる、(17)〜(24)のいずれか一項記載の方法であることを特徴とする。
【発明の効果】
【００４５】
本発明により、組織培養物中のヒトおよび動物の組織または細胞からの抽出物におけるウリジン-二リン酸-N-アセチルグルコサミンの形成を測定するための方法、細胞におけるウリジン-二リン酸-N-アセチルグルコサミン形成に対する被験化合物の阻害活性を測定するための方法、および、ヒトまたは動物におけるウリジン-二リン酸-N-アセチルグルコサミン形成に対する被験化合物の阻害活性を測定するための方法が提供された。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４６】
本明細書で用いる「生理的条件」という用語は、生きた生物体との適合性がある、および/または、生きた培養動物細胞もしくは哺乳動物細胞の細胞内に一般に存在する、濃度、温度、pH、イオン強度、粘性、時間および種々の生化学的パラメーターのことを指す。インビトロ酵素反応に適した反応条件は一般に生理的条件である。グルタミン:フルクトース6-リン酸アミドトランスフェラーゼ、フルクトース6-リン酸およびグルタミンの混合物のインキュベーションは、一般に、グルコサミン6-リン酸が形成されるのに十分な時間にわたって生理的条件下で行われる。グルコサミン6-リン酸の測定のための好ましい生理的条件は、pH 7.4および37℃で150mM NaClを含む。ウリジン-二リン酸-N-アセチルグルコサミンの測定のためには、10％ウシ胎仔血清を加えたダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）、pH 7.4中で細胞を増殖させることが好ましい。実施者が従来の方法に従って特定の水性条件を選択してもよく、その際には選択的に二価カチオンおよび/または金属キレート剤および/または非イオン性界面活性剤および/または膜画分および/または消泡剤を添加してもよい。
【００４７】
GFAT阻害剤はグルコサミン6-リン酸の産生を抑制または阻害し、最終的にはUDP-N-アセチルグルコサミンの産生を抑制または阻害する。グルタミン:フルクトース6-リン酸アミドトランスフェラーゼを用いるインビトロの方法はグルコサミン6-リン酸の測定のみを可能にする。患者の治療に用いうる可能性があるGFAT阻害剤の同定に際してもう1つ考慮すべき事項は、被験化合物がインビボにおいて細胞内に入るか否かである。生理的条件下の細胞内では、酵素などの生物因子が、UDP-GlcNAcの産生にかかわるヘキソースアミン生合成経路に関連して産生される。細胞内のGFAT酵素活性を阻害することが判明した化合物は、それらが組織中に入り、GFAT活性を阻害し、UDP-GlcNAcの産生を阻害するか否かを明らかにするために動物で試験することができる。
【００４８】
N-アセチルグルコサミン6-リン酸の測定のためには、GFAT酵素反応および産物の分析をマイクロタイタープレート中で直接行うことが好ましい。好ましい100μlの反応容積は、基質であるグルタミン（10mM）およびフルクトース6-リン酸（10mM）、リン酸緩衝食塩水（PBS）pH 7.4、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）（5mM）、ジチオトレイトール（DTT）（1mM）、およびGFAT酵素調製物または組織抽出物（0.25〜50μl）からなる。インキュベーション混合物をプレートに添加し、プレートを密封して、37℃水浴上で1時間浮遊させる。標準試料および対照試料に添加するための別のインキュベーション混合物は氷上に保っておく。インキュベーションの後に、インキュベートしていない対照試料およびグルコサミン6-リン酸の標準試料を、冷却したインキュベーション混合物とともに、プレート中の適切なウェルに添加する。インキュベーション混合物中で生成されたグルコサミン6-リン酸を、まず1.5％無水酢酸（アセトン中）（10μl）を添加し、その後に200mM四ホウ酸カリウム（50μl）を添加することによってアセチル化する。プレートを密封し、マイクロシェーカーで2分間振盪した上で80℃水浴上に25分間置く。プレートを氷上に5分間置くことによって冷却した後に、エールリッヒ試薬（130μl）を添加する（エールリッヒ試薬2g＋水0.3ml＋濃塩酸2.2ml＋酢酸17.4ml、これを使用前に酢酸で1：2に希釈する）。続いて、プレートを37℃水浴上に20分間置き、ODを500〜610nm、好ましくは585nmで計測する。
【００４９】
組織培養物中のヒトおよび動物の組織または細胞からの抽出物におけるUDP-N-アセチルグルコサミンの測定のためには、抽出試料をまず80℃の0.1N HCl中で10分間加水分解してN-アセチルグルコサミンを生成させる。次に試料を氷上で5分間冷却し、0.1N KOHで中和する。続いて四ホウ酸カリウム（62.5mM［最終］）を添加し、試料を80℃で25分間インキュベートした後に、氷上で5分間冷却する。続いてエールリッヒ試薬を添加し、試料を37℃に20分間保った後に、ODを500〜610nm、好ましくは585nmで計測する。
【００５０】
グルコサミン6-リン酸に関するマイクロタイタープレートアッセイ用の保存試薬
2004194659.tif 000002
【００５１】
グルコサミン6-リン酸に関するマイクロタイタープレートアッセイ用のインキュベーション量
2004194659.tif 000003
【００５２】
標準曲線用の試料として十分なものを含む反応混合物を作製し、氷上に保つ。インキュベーション試薬をマイクロタイタープレートに添加し、プレートを密封した上で、プレートを37℃の水浴中に1時間置くことによって反応を開始させる。標準曲線用の試料をプレートに添加して2.5〜30nmol/ウェル/10μlとし、冷却した混合物を対照試料および標準曲線用の試料に添加する。グルコサミン6-リン酸のリン酸化は、1.5％無水酢酸/アセトン10μl＋四ホウ酸カリウム200mM 50μlを用い、プレートを密封し、2分間振盪して80℃水浴上に25分間置いた後に氷上で5分間冷却することによって行う。希釈したエールリッヒ試薬130μlを添加し、プレートを37℃水浴上に20分間置く。ODを585nmで計測する。
【００５３】
UDP-N-アセチルグルコサミンを測定するための分光光度アッセイ用の保存試薬
2004194659.tif 000004
【００５４】
UDP-N-アセチルグルコサミンを測定するための分光光度アッセイ用のインキュベーション混合物
2004194659.tif 000005
【００５５】
反応混合物をグルコサミン6-リン酸アッセイ法に関して上に記載した通りに作製するが、この場合は、反応を微量遠心管内で開始させることが好ましい。試料が過度に多くのタンパク質を含む場合には、アセトニトリルを添加し、タンパク質をまず沈殿させて溶液を透明化する。続いて試料を80℃の0.1N HCl中で10分間加水分解し、氷上で冷却した上で、タンパク質含有量が多い場合には残渣を除去するために5分間の遠心処理を行う。この試料をKOH O.1Nで中和する。K２B４O７（最終濃度59mM）を添加し、試料を80℃で25分間インキュベートした後に、氷上で5分間冷却する。エールリッヒ試薬を添加して37℃で20分間おき、試料を2分間遠心した上で上清の200μlをマイクロタイタープレートに添加する。ODを585nmで計測する。
【００５６】
本開示の全体を通じて、出願者はさまざまな理論または機序を提案するが、それによって本発明は機能を果たすと考えられる。出願者は本発明を説明するためにさまざまな機序を提示するが、出願者は理論によって拘束されることを望んではいない。これらの理論は本発明がより良く理解されるために提案されるものであり、特許請求の範囲の有効な範囲を限定することを意図したものではない。
【００５７】
本出願の全体を通じて、さまざまな刊行物が参照されている。これらの刊行物の開示内容は、当技術分野の水準をより詳細に説明する目的で、参照として本明細書に組み入れられる。
【００５８】
本発明を以下の実施例によってさらに例示するが、これらは本発明の化合物および組成物の調製について示すことを目的として提示され、それらを限定するものではない。
【実施例１】
【００５９】
グルコサミン6-リン酸の測定
酵素調製物
GFATα（GenBankアクセッション番号M90516）およびGFATβ（アクセッション番号AB016789）を、SF9昆虫細胞、Hi5昆虫細胞、COS細胞、293細胞および大腸菌へのトランスフェクションのために、pET12ベクターおよびpEF-BOS Cベクター（New England BioLabs）中にクローニングする。非トランスフェクト細胞における各細胞系の内因性活性も測定した。各細胞系における酵素の発現は、大型の24×24cmプレート中で増殖させ、トランスフェクションから20時間後に回収することによって行う。培地を除去し、プレートをPBS 15mlで洗う。可溶化バッファー（1X PBS、50mM KCl、10mM EDTAのほか、プロテアーゼ阻害剤であるロイペプチン10ug/ml、PMSF 20ug/ml、A-プロチニン30ug/mlおよびペプスタチン10ug/mlを含む）1.5mlを各プレートに添加し、大型のプラスチック製セルスクレーパーを用いて細胞を採取する。これによって最終容積は約3mlとなる。細胞数/可溶化液量は約4×10７個/mlである。この懸濁液をマイクロチップを用いて氷上で15秒間にわたり超音波処理する（Branson超音波処理器、設定2.5〜3）。超音波処理した細胞抽出物は微量遠心管に入れて-80℃で保存する。使用前に、抽出物を15000×g、4℃で5分間遠心する。各酵素調製物の滴定を行い、37℃で60分間インキュベートした反応混合物中、グルコサミン6-リン酸20〜30nmolを生成する容積が決定される（図1Aおよび1B）。
【００６０】
GFAT活性の賦活化
飽和レベルの基質の存在下では、酵素反応は経時的に直線的であることが明らかになった（図2）。ほとんどの試験では、37℃で60分間のインキュベーションを96ウェルマイクロタイタープレート中で行う。最適な熱伝達が得られるように、プレートをコスター（Costar）プレート密封剤で密封し、37℃水浴上に浮遊させる。すべてのウェルに適切な熱伝達が確実に得られるように、プレートの底面から気泡を除く。100μlの反応容積は、10mMグルタミン、10mMフルクトース6-リン酸、1X PBS、5mM EDTA、1mM DTT および酵素調製物からなる。インキュベーション試薬の混合物を氷上に保ち、混合物をプレートに加える直前に酵素を添加する。標準試料および対照試料に添加するために別のインキュベーション混合物を氷上に保っておく。反応は4℃では起こらなかった。被験物質を用いる場合には、インキュベーション混合物の添加の前に10μlを適切なウェルに添加し、対照ウェルには溶媒を添加する。15個のウェルは対照試料および標準グルコサミン6-リン酸試料の添加用に空けておく。インキュベーションの後に、適切な溶媒（DMSO）中に構成した標準試料10μlを適切なウェルに添加する。2.5〜30nmolの濃度範囲は曲線の直線的部分であり、インキュベーション条件下で生成されるグルコサミン6-リン酸の量をカバーする（図4）。冷却した混合物を標準試料用のウェルに添加し、続いてグルコサミン6-リン酸を定量する。
【００６１】
SF9昆虫細胞において発現されたGFATαおよびGFATβ酵素の活性を、GFATの既知の阻害剤を用いて調べた（図5）。DON（6-ジアゾ-5-オキソ-L-ノルロイシン）はいずれの酵素も18μM（IC50）で阻害した。UDP-N-アセチルグルコサミンはGFATαを8μM（IC50）で阻害したが、GFATβを阻害するには12倍もの多くのUDP-N-アセチルグルコサミンを要した（IC50は100μMであった）。グルコサミン類似体FMDP（N3-(-4-メトキシフマロイル)-L-2,3-ジアミノプロパン酸）はGFATαを4μM（IC50）で阻害し、GFATβを2.3μM（IC50）で阻害した。N3-(ブロモアセチル)-L-2,3-ジアミノプロパン酸はGFATαを0.38μM（IC50）で阻害し、GFATβを0.27μM（IC50）で阻害した。このように、UDP-N-アセチルグルコサミンによる阻害はGFATαとGFATβとを識別するものであり、この2つの酵素の機能的役割に関する情報をもたらす。
【００６２】
グルコサミン6-リン酸の測定
インキュベーション混合物をマイクロタイタープレート中の適切なウェルに添加し、プレートを37℃水浴上に置くことによって反応を開始する。適切なインキュベーション時間後に、1.5％無水酢酸10μl（最終濃度0.09375％）を添加し、続いて200mM四ホウ酸カリウム50μl（最終濃度62.5mM）を添加することによって反応を停止させる。プレートを密封し、マイクロシェーカー上に2分間置く。続いてプレートを、プレート下方の気泡を除去するように配慮しながら80℃水浴上に30分間浮遊させる。80℃（20℃〜80℃の範囲内）での0.09375％無水酢酸（0.00625％〜0.625％の範囲内）がグルコサミン6-リン酸のアセチル化にとって最適な濃度であり（図6）、80℃（65℃〜80℃の範囲内）で30分間（10〜30分間の範囲内）が良好なインキュベーション条件であることが判明した（図7）。80℃でのアセチル化の後に、プレートを氷上で5分間冷却する。アセチル化されたグルコサミンをMorganおよびElsonの呈色反応によって測定する（Morgan, W.T.J. & Elson, L.A. (1934). Biochem. J. 28、988）。エールリッヒ試薬130μl（p-ジメチルアミノベンズアルデヒド2g＋水0.3ml＋2.2mlの濃HCl＋酢酸17.4ml、これを使用前に酢酸で1：2に希釈する）を各ウェルに添加し、水浴上に20分間浮遊させることによって37℃でインキュベートする。ODを585nmで計測し、SoftmaxProプログラムにODを挿入し、生成されたnmolを標準曲線から導き、生成されたグルコサミン6-リン酸の量を標準曲線から算出する。
【実施例２】
【００６３】
細胞および組織におけるUDP-N-アセチルグルコサミンの測定
組織抽出物
アッセイする組織を-80℃で凍結し、調製および秤量の工程中はドライアイス上に保つ。組織をヘビーホイル（heavy foil）で包み、それをドライアイスの上に乗せた金属ブロック上に置き、それが微粉末になるまでハンマーで素早く叩くことにより、組織を粉砕して微粉末にする。続いてそれをタールが塗られた（tarred）微量遠心管内に入れ、秤量するまでドライアイス上に保つ。組織をクロロホルム：水（1mg＋クロロホルム2μl＋水2μl）によって抽出する。この懸濁液を氷上で約5秒間超音波処理して（Branson超音波処理器、設定3〜5、マイクロチップを使用）、塊を分解する。その後、抽出物は-80℃で保存できる。分析の前に組織抽出物を解凍し、15000×g、4℃で20分間遠心する。
【００６４】
細胞抽出物
培養下にある細胞を、GFAT阻害剤の存在下または非存在下で35mm培養皿中でインキュベートし、グルコースを投与してUDP-N-アセチルグルコサミンを産生させる。DMEM-4.5mMグルコース＋10％ウシ胎仔血清中で、細胞を通常は約80％の集密度まで増殖させる。続いて培地をDMEM（グルコース非含有）＋10％ウシ胎仔血清に交換し、12〜16時間おく。GFAT阻害剤が存在する場合は、それを添加して30分間おいた後、25mMグルコースを添加して1時間〜24時間おく。培地を除去し、細胞を1X PBSで洗った後にクロロホルム：水（1：1）200μlで抽出する。この懸濁液を氷上で約5秒間超音波処理して塊を分解する。抽出物は-80℃で保存できる。分析の前には組織抽出物を解凍し、15000×g、4℃で20分間遠心する。
【００６５】
組織抽出物中のUDP-N-アセチルグルコサミンの分析
組織抽出物50μl（出発材料組織25mg）を微量遠心管に入れ、アセトニトリル50μlを添加する。これは試料中の過剰なタンパク質を沈殿させるために必要であり、試料を透明化するのに役立つ。試料中のUDP-N-アセチルグルコサミンを加水分解するために、1N HCl 10μlを添加し、試料をボルテックス処理する。この混合物を80℃で20分間加熱する。続いて、形成された凝集物を除去するために、試料を15000×g、室温で15秒間遠心する。試料を1N KOH 10μlの添加によって中和する。この結果得られる生成物であるN-アセチルグルコサミンをMorganおよびElsonの呈色反応によって測定する。200mM四ホウ酸カリウム50μlを添加し、試料を80℃で25分間加熱した後に氷上で5分間冷却する。エールリッヒ試薬150μlを添加して混合する。37℃で20分間おいた後、試料を15000×g、室温で2分間遠心する。上清200μlを96ウェルプレートに添加し、ODを585nmで計測する。N-アセチルグルコサミンの量を、Softmax-Proプログラムを用いてN-アセチルグルコサミンの標準試料から算出する。標準曲線用の試料は、組織試料と同様の様式で、2.5〜30nmol/ウェルのN-アセチルグルコサミンから作製する。生成されたN-アセチルグルコサミンの分析を確認するための比較実験を3種類の方法によって行った。これらの実験により、1）無水酢酸＋四ホウ酸カリウムでアセチル化したグルコサミン6-リン酸、2）四ホウ酸カリウムで処理したN-アセチルグルコサミン、および3）0.1N HClおよびその後の四ホウ酸カリウムで加水分解したUDP-N-アセチルグルコサミン、のすべてにおいて同様の結果が得られたことが示された（図8）。このデータから、UDP-N-アセチルグルコサミンが、80℃の0.1N HClにより20分間でN-アセチルグルコサミンへと完全に加水分解されることも示された。時間（5〜120分間）および温度（20、37および80℃）に関する試験からは、UDP-N-アセチルグルコサミンがN-アセチルグルコサミンに完全に加水分解されるのに十分な条件は、80℃、5分間であることが示されている（図9）。これらの試験は、四ホウ酸カリウムで処理したUDP-N-アセチルグルコサミンがエールリッヒ試薬と反応して呈色しないことも示している。加水分解法およびHPLC/MS法によっても同等の結果が得られることを検証するために、COS細胞の抽出物を2つの方法によって分析した。GFATβをトランスフェクトし、グルコース非含有培地中で16時間培養したCOS細胞に対して25mMグルコースを5時間曝露させた。グルコース処理により、細胞のUDP-N-アセチルグルコサミンレベルは上昇した。グルコース非存在下および25mMグルコースで刺激した細胞での測定レベルは2つの方法とも同程度であった（図10）。
【００６６】
図1は、グルコサミン6-リン酸の産生がGFAT酵素の量に依存することを示している。図1Aは、GFATα酵素の濃度に対するグルコサミン6-リン酸産生の依存性を示したグラフである。図1Bは、GFATβ酵素の濃度に対するグルコサミン6-リン酸産生の依存性を示したグラフである。100mMグルタミン10μl、100mMフルクトース6-リン酸10μl、10X PBS 10μl、50mM EDTA 10μl、10mM DTT 10μlおよび水（100μlになるまで）を含むインキュベーション混合物を、1、2、5、10、15、20および25μlのGFATα細胞抽出物または0.25、0.5、1、2および5μlのGFATβ細胞抽出物に添加する。インキュベーション混合物を96ウェルマイクロタイタープレートの適切なウェルに添加し、各酵素に対して別個のプレートを用い、プレートを37℃水浴上に置く（浮遊させる）ことによってインキュベーションを開始する。60分間のインキュベーションの後に、プレートを水浴から取り出し、標準曲線用の試料をプレートの適切なウェルに添加する。この後に1.5％無水酢酸10μlおよび200mM四ホウ酸カリウム50μlをすべてのウェルに加え、プレートをマイクロシェーカー上にて室温で2分間振盪する。プレートを80℃水浴上に30分間置く（浮遊させる）ことにより、プレートを80℃でインキュベートする。プレートを氷上で5分間冷却する。エールリッヒ試薬130μlをすべてのウェルに加えて37℃で20分間おき、ODをすべてのウェルに関して585nmで計測する。各ウェル中のグルコサミン6-リン酸のnmol数を酵素の各濃度に対して定量する。
【００６７】
GFATαとGFATβとの識別は、UDP-N-アセチルグルコサミンに対するそれらの感度によって行いうる。GFATαはUDP-N-アセチルグルコサミンによって8μM（IC50）で阻害される。GFATβはUDP-N-アセチルグルコサミンによって100μM（IC50）で阻害される。
【００６８】
図2は、Hi5昆虫細胞において発現させた場合、GFAT活性がインキュベーション時間に依存することを示したグラフである。GFAT活性を経時的に定量するために、Hi5昆虫細胞において発現されたGFATαおよびGFATβの抽出物を180分間にわたってインキュベートする。この反応は96ウェルマイクロタイタープレート中で行う。インキュベーション混合物は、1）100mMグルタミン10μl、100mMフルクトース6-リン酸10μl、10X PBS 10μl、50mM EDTA 10μl、10mM DTT 10μl、GFATα Hi5細胞抽出物5μlおよび水45μl、ならびに2）100mMグルタミン10μl、100mMフルクトース6-リン酸10μl、10X PBS 10μl、50mM EDTA 10μl、10mM DTT 10μl、GFATβ Hi5細胞抽出物0.25μlおよび水49.75μlである。反応混合物を氷上に保ち、GFATαおよびGFATβ酵素を異なるプレート中でインキュベートする。反応は100μlのインキュベーション混合物をプレートに添加することによって開始し、180分間おくことから始めて最後は0時間とする。プレートを氷上に置くことによって反応を停止させる。標準試料をプレートの適切なウェルに添加し、その後にアセトン中1.5％無水酢酸10μlおよび200mM四ホウ酸カリウム50μlを添加する。プレートを室温で2分間振盪し、水浴上を浮遊させることによって80℃で30分間インキュベートする。続いてプレートを氷上に5分間置き、その後にエールリッヒ試薬130μlを添加する。37℃での20分間のインキュベーションの後に585nmでのODをプレート上のすべてのウェルについて計測し、N-アセチルグルコサミン6-リン酸の量を定量する。さまざまな源から調製したGFAT酵素により同様の結果が得られている。
【００６９】
図3は、GFATαおよびGFATβの酵素活性に対する、種々の基質濃度のグルタミンおよびフルクトース6-リン酸の影響を示している。図3Aは、200mMグルタミン10μl＋3.125、6.25、12.5、25、50、100および200mMのフルクトース6-リン酸10μlとのインキュベーションを示したグラフである。図3Bは、200mMフルクトース6-リン酸10μl＋3.125、6.25、12.5、25、50、100および200mMのグルタミン10μlとのインキュベーションを示したグラフである。トランスフェクトされたSF9昆虫細胞からのGFATα抽出物10μlおよびGFATβ抽出物5μlを、1）200mMグルタミン10μl＋3.125、6.25、12.5、25、50、100および200mMのフルクトース6-リン酸10μl、ならびに2）200mMフルクトース6-リン酸10μl＋3.125、6.25、12.5、25、50、100および200mMのグルタミン10μlとともに、10X PBS 10μl、50mM EDTA 10μl、10mM DTT 10μlおよび水（100μlになるまで）を含むインキュベーション培地中でインキュベートする。プレートをコスター（Costar）プレート密封剤で密封し、水浴上を浮遊させることによって37℃で60分間インキュベートする。標準試料および対照試料に添加するための別のインキュベーション混合物は氷上に置いておく。インキュベーションの後、標準試料を冷却インキュベーション混合物とともにプレート上の適切なウェルに添加し、その後、無水酢酸10μlおよび200mM四ホウ酸カリウム50μlをすべてのウェルに添加する。プレートを2分間振盪し、水浴上に浮遊させることによって80℃でインキュベートする。プレートを氷上で5分間冷却し、その後、エールリッヒ試薬を各ウェルに添加する。37℃で20分間のインキュベーションの後に、ODを各ウェルに関して585nmで計測する。
【００７０】
図3Cは、図3Aおよび3Bで得られたデータから算出した、GFATαおよびGFATβ酵素に関する基質のKm値を示した表である。ラインウィーバー-バーク（Lineweaver-Burk）プロット（Lineweaver, H.およびBurk, D (1934) J. Amer. Chem. Soc. 56、658-666）を用いたデータのプロットにより、報告のKm値を得た。この表において、GFATαおよびGFATβに対するグルタミンのKmはそれぞれ1.49mMおよび1.99mMである。GFATβに対するフルクトース6-リン酸のKmは6.8mMであり、GFATαに対しては1.85mMである。
【００７１】
図4は、50％DMSO中に40mMの濃度で調製したD-グルコサミン6-リン酸の標準物質（Sigma-Aldrichカタログ番号G5509）を示したグラフである。この保存溶液から希釈液を作製し、10μlの試料中に0、2.5、5、10、20および30nmolとする。プレートに関するすべての測定値から、0mMでDMSO溶媒のみのODを差し引く。標準試料10μlをプレートの適切なウェル（各2つずつのウェル）に添加する。プレートをコスター（Costar）プレート密封剤で密封し、水浴上に浮遊させることによって37℃で60分間インキュベートする。インキュベーションの間、インキュベーション混合物は氷上に保っておく。インキュベーション混合物は、100mMグルタミン10μl、100mMフルクトース6-リン酸10μl、10X PBS 10μl、50mM EDTA 10μl、10mM DTT 10μl、GFATαをトランスフェクトしたCOS細胞の酵素抽出物2μl、および水48μlからなる。インキュベーション後に冷却したインキュベーション混合物90μlを添加する。1.5％無水酢酸10μlを添加し、その後に200mM四ホウ酸カリウム50μlをすべてのウェルに添加することによって反応を停止させる。プレートを2分間振盪し、水浴上を浮遊させることによって80℃で30分間インキュベートする。プレートを氷上で5分間冷却した後、エールリッヒ試薬をすべてのウェルに添加する。37℃で20分間のインキュベーションの後に、すべてのウェルに関してODを585nmで計測する。
【００７２】
図5は、GFATαおよびGFATβ酵素に対する感度に関してGFATの公知の阻害剤を試験した結果を示している。インキュベーション混合物は100mMグルタミン10μl、100mMフルクトース6-リン酸10μl、10X PBS 10μl、50mM EDTA 10μl、10mM DTT 10μl、GFATα 5μlまたはGFATβ 0.25μl、被験化合物を含む50％DMSO 10μlまたは50％DMSOのみ10μl、および最終容積を100μlにするための水からなる。化合物を96ウェルマイクロタイタープレートの適切なウェルに添加した後に、GFATαおよびGFATβ用のインキュベーション培地90μlを適切なウェルに添加する。プレートを水浴上に置くことによってプレートを37℃で60分間インキュベートする。続いて標準試料をプレートに添加し、その後に1.5％無水酢酸10μlおよび200mM四ホウ酸カリウム50μlをすべてのウェルに添加する。プレートを2分間振盪した後に、プレートを80℃で30分間インキュベートする。プレートを氷上で5分間冷却し、エールリッヒ試薬130μlをすべてのウェルに添加して37℃で20分間おく。各ウェルのODを585nmで計測し、生成されたグルコサミン6-リン酸の量を算出する。化合物による阻害の量を、DMSOのみの存在下での酵素活性から決定する。阻害はIC50、すなわち最大賦活化の50％を阻害する濃度として表す。
【００７３】
図6は、種々の濃度の無水酢酸によるグルコサミン6-リン酸のアセチル化を示したグラフである。反応は96ウェルマイクロタイタープレート中で行う。インキュベーション混合物は、1μmolグルコサミン6-リン酸100μl＋無水酢酸をアセトン中に初期濃度0.1％〜10％、最終濃度にして0.00625％〜0.625％としたもの10μl＋200mM四ホウ酸カリウム50μlからなる。プレートをコスター（Costar）プレート密封剤で密封してプレートを80℃水浴上に浮遊させることにより、混合物を80℃で30分間インキュベートする。インキュベーションの後に、プレートを氷上で5分間冷却する。エールリッヒ試薬130μlをすべてのウェルに添加し、プレートを密封した上でプレートを37℃水浴上に浮遊させることによって37℃で20分間インキュベートする。ODをすべてのウェルに関して585nmで計測し、データを種々の濃度の無水酢酸で生じた光学密度として表す。
【００７４】
図7は、時間および温度を変更することによる、マイクロタイタープレートのウェル中でグルコサミン6-リン酸をアセチル化するための至適条件を示した棒グラフである。アッセイ法をマイクロタイタープレート中で行うためには、100℃未満の温度が必要である。このアッセイ法では、さまざまな条件を容易に扱えるように、インキュベーションは微量遠心管で行う。1μmolグルコサミン6-リン酸水溶液100μl＋22.5μlの1.5％無水酢酸/アセトン＋200mM四ホウ酸カリウム50μl＋水80μlをさまざまな条件下でインキュベートする。各インキュベーション後にチューブを氷上で5分間冷却し、エールリッヒ試薬140μlを各チューブに添加して37℃で20分おく。ODを585nmで計測する。以下のインキュベーション条件を行う：1）標準としては、5分間インキュベートしたアセチル化混合物を熱水浴中に5分間置く、2）四ホウ酸カリウムとともに加熱する段階が必要であることを示すために、無水酢酸のみで100℃、5分間インキュベートした後に室温の四ホウ酸カリウムと5分間インキュベートする、3）65℃で10分間インキュベートする、4）65℃で30分間インキュベートする、5）65℃で60分間インキュベートする、6）75℃で30分間インキュベートする、7）75℃で60分間インキュベートする、8）80℃で30分間インキュベートする。温度が上昇するに伴ってODが上昇しており、これは感度の増大を示している。時間が延長するに伴ってODが上昇しており、これは感度の増大を示している。
【００７５】
図8は、種々の方法によって生成されたN-アセチルグルコサミンを比較して示した棒グラフである。グルコサミン6-リン酸（Sigma-Aldrich G5509）、N-アセチルグルコサミン（Sigma-Aldrich A8625）およびUDP-N-アセチルグルコサミン（Sigma-Aldrich U4375）の標準溶液を水に溶解して濃度を4mMとし、2.5および5nmol/10μlに希釈する。標準溶液は以下の様式で処理する：1）10μlの各溶液を水90μl、1N HCl 10μl、1N KOH 10μlおよび1.5％無水酢酸10μlに添加し、続いて200mM四ホウ酸カリウム50μlを添加することにより、グルコサミン6-リン酸をアセチル化する。混合物を水浴中で80℃で30分間加熱し、その後に氷上で5分間冷却する。2）10μlのN-アセチルグルコサミン溶液を水90μl、1N HCl 10μl、1N KOH 10μlおよび200mM四ホウ酸カリウム50μlに添加する。混合物を水浴中で80℃で30分間加熱し、その後に氷上で5分間冷却する。3）10μlのUDP-N-アセチルグルコサミンの各標準溶液を水90μlおよび1N HCl 10μlに添加する。この混合物を80℃水浴中で10分間加熱することによって加水分解し、続いて15000×gで15秒間遠心する。1N KOH 10μlおよび200mM四ホウ酸カリウム50μlを各チューブに添加し、水浴中で80℃で30分間加熱する。反応物を氷上で5分間冷却する。エールリッヒ試薬150μlをアセチル化された生成物に添加し、方法の項に記載された通りに分析する。
【００７６】
図9は、UDP-N-アセチルグルコサミンのN-アセチルグルコサミンへの加水分解に対する、時間および温度の影響を示したグラフである。UDP-N-アセチルグルコサミンのN-アセチルグルコサミンへの加水分解に必要な温度および時間を決定するために、20nmolのUDP-N-アセチルグルコサミンを0.1N HClとともに20、37および80℃で5、30、60および120分間インキュベートする。UDP-N-アセチルグルコサミン10μl＋1N HCl 10μl ＋水80μlを微量遠心管内で指定された時間および温度でインキュベートする。200mM四ホウ酸カリウム50μlを添加して80℃で30分間おいた後、氷上で5分間冷却する。エールリッヒ試薬130μlを各チューブに添加して37℃に20分間おき、試料を96ウェルマイクロタイタープレートに移してODを585nmで計測する。20nmolのUDP-N-アセチルグルコサミンを含むが0.1N HClを含まない試料はN-アセチルグルコサミンを生成せず、このことはHClまたは別の適した酸溶液がUDP-N-アセチルグルコサミンの加水分解に必要なことを示している。20℃でも37℃でも生成物は形成されなかったため、これらの結果は37℃を上回る温度が必要であることを示している。
【００７７】
図10は、GFATβをトランスフェクトしたCOS細胞の抽出物における、本明細書に記載のHPLC/MS法および酸加水分解法によって得られた、UDP-N-アセチルグルコサミンレベルの測定値を比較して示した棒グラフである。COS-GFATβ細胞を35mmプレートに播き、それらが各80％の集密度に達した時点で、DMEM培地から、グルコースを含まないDMEM＋10％ウシ胎仔血清に交換し、16時間おく。続いて、グルコースを最終濃度25mMとして添加して5時間おく。培地を吸引して細胞を1X PBSで洗い、0.5mlのPBS中に剥離させて微量遠心管に移す。細胞を15000×g、4℃で2分間遠心し、ペレットを水200μl＋クロロホルム200μl中に抽出する。抽出物をマイクロチップを用いて氷上で15秒間超音波処理した後に、15000×g、4℃で5分間遠心して上清を採取する。10μlの抽出物をHPLC/MS法による分析用に用意する。150μlの抽出物をアセトニトリル50μl＋1N HCl 20μlとともに微量遠心管に入れる。この混合物を80℃で10分間加熱する。1N KOH 20μlを200mM四ホウ酸カリウム50μlとともに各チューブに添加し、80℃に30分間加熱した後に氷上で5分間冷却する。150μlのエールリッヒ試薬を各チューブに添加して37℃で20分間おき、300μlを96ウェルマイクロタイタープレートに移してODを585nmで計測する。N-アセチルグルコサミンのnmolをN-アセチルグルコサミンの標準曲線から算出する。
【００７８】
本発明の数多くの態様を示してきたが、本発明の精神および範囲を逸脱することなく、本発明を利用した他の態様を提供するために基本的な構成が変更されうることは明らかである。例示的に提示した特定の態様ではなく、添付の特許請求の範囲によって定義されるように、このようなすべての修正および変形物は本発明の範囲に含まれるものとする。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】グルコサミン6-リン酸の生成が、反応混合物に添加されるGFAT酵素の量に依存することを示している。図1Aは、GFATα酵素の量に対するグルコサミン6-リン酸産生の依存性を示したグラフである。図1Bは、GFATβ酵素の量に対するグルコサミン6-リン酸生成の依存性を示したグラフである。
【図２】グルコサミン6-リン酸の生成レベルがGFAT酵素とのインキュベーション時間に依存することを示したグラフである。
【図３】GFATαおよびGFATβによって生成されるグルコサミン6-リン酸のレベルに対する、種々の基質濃度のグルタミンおよびフルクトース6-リン酸の影響を示している。図3Aは、GFATを、200mMグルタミン10μl＋3.125、6.25、12.5、25、50、100および200mMのフルクトース6-リン酸10μlとともに、37℃の標準的なインキュベーション条件下で60分間インキュベートした結果を示したグラフである。図3Bは、GFATを、200mMフルクトース6-リン酸10μl＋3.125、6.25、12.5、25、50、100および200mMのグルタミン10μlとともに、37℃の標準的なインキュベーション条件下で60分間インキュベートした結果を示したグラフである。図3Cは、図3Aおよび3Bで得られたデータから算出した、GFATαおよびGFATβ酵素に関する基質のKm値を示した表である。
【図４】50％DMSO中、40mMの濃度で行った、既知の量のD-グルコサミン6-リン酸に関する585nmでの光学密度の測定を示している。D-グルコサミン6-リン酸は、活性のあるGFAT酵素の非存在下で標準的なインキュベーション混合物に添加した。
【図５】公知のGFAT阻害剤をGFATαおよびGFATβ酵素に対する効果に関して試験した結果をまとめた表である。
【図６】種々の濃度の無水酢酸によるグルコサミン6-リン酸のアセチル化の影響を示したグラフである。
【図７】反応混合物における585nmでの光学密度（OD）によって評価した、マイクロタイタープレート中でのグルコサミン6-リン酸のアセチル化に対する時間および温度の影響を示した棒グラフである。
【図８】種々の方法によって生成されたN-アセチルグルコサミンを比較して示した棒グラフである。
【図９】UDP-N-アセチルグルコサミンのN-アセチルグルコサミンへの加水分解に対する時間および温度の影響を示したグラフである。
【図１０】GFATβをトランスフェクトしたCOS細胞の抽出物における、HPLC/MS法および酸加水分解法によって得られた、UDP-N-アセチルグルコサミンレベルの測定値を比較して示した棒グラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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