(57)【要約】【課題】培養細胞にダメージを与えることなく重層化の程度を認識できる。【解決手段】比率Ｒは、グルコース濃度の時間変化分ΔＣｇｌｕｃに対するＮＨ４＋濃度の時間変化分ΔＣＮＨ４＋の比ΔＣＮＨ４＋／（−ΔＣｇｌｕｃ）である。培養時間ｔと比率Ｒとの関係を表すグラフは培養時間ｔと接着細胞濃度Ｘａとの関係を表すグラフと良好な相関が見られた。また、接着細胞濃度の時間変化分が実質的にゼロになった時点では、重層化した培養細胞シートの基底層での細胞増殖と角質層での細胞剥離とがほぼ平衡に達したとみなして、その時点に対応する比率Ｒの時間変化分ΔＲ（前回と今回の比率Ｒの差分）をグラフから求め、そのΔＲを重層化の終点を判断する際の閾値ＫＲとし、次回細胞培養を行う際に比率Ｒの時間変化分ΔＲをモニタリングしながら細胞培養を行い、そのΔＲが閾値ＫＲ以下になったときを重層化の終点とみなして細胞培養を中止することが可能となる。【選択図】  図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養細胞の重層化の程度を判定する方法であって、
前記培養細胞の培養液を採取する採取工程と、
前記採取工程で採取した培養液に含まれる細胞生存関連成分の少なくとも一つを分析する分析工程と、
前記分析工程で得られた前記細胞生存関連成分の分析結果に基づいて培養細胞の重層化の程度を判定する判定工程と
を含む重層化判定方法。
【請求項２】
前記判定工程では、前記培養細胞の重層化の程度として重層化の終点を判定する、請求項１に記載の重層化判定方法。
【請求項３】
前記判定工程では、前記分析工程で得られた前記細胞生存関連成分の分析結果を、予め経験的に求めた培養細胞の重層化の終点と前記細胞生存関連成分の分析結果との関係に照らして前記培養細胞の重層化の終点か否かを判定する、請求項２に記載の重層化判定方法。
【請求項４】
前記判定工程では、前記分析工程で得られた前記細胞生存関連成分の分析結果として、前記細胞生存関連成分の時間変化量を用いる、請求項１〜３のいずれかに記載の重層化判定方法。
【請求項５】
前記細胞生存関連成分は、細胞が消費するグルコース、細胞が排出するアンモニア及び同じく細胞が排出する乳酸からなる群より選ばれた少なくとも一つである、請求項１〜４のいずれかに記載の重層化判定方法。
【請求項６】
前記判定工程では、前記分析工程で得られた前記細胞生存関連成分の分析結果として、異なる代謝系における細胞が消費する成分と細胞が排出する成分との比を用いる、請求項１〜３のいずれかに記載の重層化判定方法。
【請求項７】
前記判定工程では、前記分析工程で得られた前記細胞生存関連成分の分析結果として、異なる代謝系における細胞が消費する成分の時間変化量と細胞が排出する成分の時間変化量との比を用いる、請求項６に記載の重層化判定方法。
【請求項８】
前記異なる代謝系における細胞が消費する成分と細胞が排出する成分は、それぞれグルコースとアンモニアである、請求項６又は７に記載の重層化判定方法。
【請求項９】
培養細胞の重層化の程度を判定する装置であって、
前記培養細胞の培養液を採取する採取手段と、
前記採取手段によって採取された培養液に含まれる細胞生存関連成分の少なくとも一つを分析する分析手段と、
前記分析手段によって得られた前記細胞生存関連成分の分析結果に基づいて培養細胞の重層化の程度を判定する判定手段と
を備えた重層化判定装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、培養細胞の重層化の程度を判定する方法及びその装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
特許文献１には、細胞をインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で培養することにより得られる培養細胞シートが開示されている。このような培養細胞シートは、１９８０年頃より臨床で利用されるようになっている。
【０００３】
特許文献２には、ＣＣＤカメラで容器底面を観察することで培養状態を観察する装置が開示されている。この装置によれば、単層培養時の培養状態を観察することが可能である。
【０００４】
【特許文献１】
特公平２−２３１９１号公報
【特許文献２】
特開２００１−２７５６５９号公報
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、特許文献２では、単層培養時の培養状態を観察できるものの、容器底面を観察する手法であるため、三次元的な層を成す重層培養時の培養状態を観察することはできなかった。つまり、これまでは別途観察用の組織切片を作製しなければ重層化の程度を知ることはできなかったため、組織の一部を切除して組織切片に利用したり、組織切片の作製に手間が掛かったりした。
【０００６】
本発明は上述した問題に鑑みなされたものであり、培養細胞にダメージを与えることなく非侵襲かつ容易に重層化の程度を認識することのできる重層化判定方法及び重層化判定装置を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段及び発明の効果】
本発明の第１は、培養細胞の重層化の程度を判定する方法であって、
前記培養細胞の培養液を採取する採取工程と、
前記採取工程で採取した培養液に含まれる細胞生存関連成分の少なくとも一つを分析する分析工程と、
前記分析工程で得られた前記細胞生存関連成分の分析結果に基づいて培養細胞の重層化の程度を判定する判定工程と
を含むものである。
【０００８】
この重層化判定方法によれば、培養細胞の培養液に含まれる細胞生存関連成分の分析結果から重層化の程度を判定するため、培養細胞にダメージを与えることなく非侵襲かつ容易に重層化の程度を認識することができる。
【０００９】
ここで、「培養細胞」としては、重層化する性質を有する細胞であればどのような細胞であってもよいが、接着依存性細胞（培養面に直接又は間接的に接着したあとその接着面積を広げていき、その後細胞分裂する細胞、足場依存性細胞ともいう）が好ましく、ヒト、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、サル等の温血動物から採取された種々の接着依存性細胞が特に好ましい。この種の細胞としては、例えば、角化細胞（ケラチノサイト）、上皮細胞、粘膜細胞、内皮細胞、線維芽細胞などが挙げられる。また、「細胞生存関連成分」とは、細胞が生存（増殖、維持、移動等）するうえで消費するか排出する成分であり、このような成分としては、例えばグルタミン、グルコース、グルタミン酸、アンモニア（アンモニウムイオンを含む、以下同じ）、乳酸などが挙げられる。このうち、グルタミンは細胞に消費される成分であり細胞の代謝によってグルタミン酸やアンモニアとして排出され、グルコースは細胞に消費される成分であり細胞の代謝によって乳酸として排出される。したがって、グルタミンとグルタミン酸とアンモニアは同じ代謝系であり、グルコースと乳酸は同じ代謝系である。
【００１０】
なお、「重層化の程度」とは、例えば、重層化が終点に達したか否かとか、重層した層数がどの程度であるかとか、重層した層数が上限に達したか否か等が挙げられる。また、本明細書における「重層化の終点」とは、重層化した培養細胞シートの基底層での細胞増殖と角質層での細胞剥離とがほぼ平衡に達し、それ以上に層が形成されない状態を云うものとする。
【００１１】
本発明の重層化判定方法において、前記判定工程では、前記培養細胞の重層化の程度として重層化の終点を判定してもよい。こうすれば、重層化の終点だと判定されたときに細胞培養を終了すればよく、無駄に細胞培養を続けてしまうことがない。このとき、前記判定工程では、前記分析工程で得られた前記細胞生存関連成分の分析結果を、予め経験的に求めた培養細胞の重層化の終点と前記細胞生存関連成分の分析結果との関係に照らして前記培養細胞の重層化の終点か否かを判定してもよい。こうすれば、重層化の終点を的確に判定することができる。
【００１２】
本発明の重層化判定方法において、前記判定工程では、前記分析工程で得られた前記細胞生存関連成分の分析結果として、前記細胞生存関連成分の時間変化量を用いてもよい。このとき、例えば、予め経験的に重層化の終点における細胞生存関連成分の時間変化量を求めておき、その値と培養中の細胞生存関連成分の時間変化量とを比較して重層化の終点を判定してもよいし、細胞生存関連成分の時間変化量が実質ゼロになった時点を重層化の終点と判定してもよい。
【００１３】
本発明の重層化判定方法において、前記細胞生存関連成分は、細胞が消費するグルコース、細胞が排出するアンモニア及び乳酸からなる群より選ばれた少なくとも一つとしてもよい。これらの成分の分析結果は、実験の再現性が高いため、判定精度が高まる。
【００１４】
本発明の重層化判定方法において、前記判定工程では、前記分析工程で得られた前記細胞生存関連成分の分析結果として、異なる代謝系における細胞が消費する成分と細胞が排出する成分との比を用いてもよい。この比は、重層化の終点が停止するという代謝が変わるときの良好な判断指標となり得る。また、この比として、異なる代謝系における細胞が消費する成分の時間変化量と細胞が排出する成分の時間変化量との比を用いることが好ましい。更に、異なる代謝系における細胞が消費する成分と細胞が排出する成分は、それぞれグルコースとアンモニアであることが好ましい。
【００１５】
本発明の第２は、培養細胞の重層化の程度を判定する装置であって、
前記培養細胞の培養液を採取する採取手段と、
前記採取手段によって採取された培養液に含まれる細胞生存関連成分の少なくとも一つを分析する分析手段と、
前記分析手段によって得られた前記細胞生存関連成分の分析結果に基づいて培養細胞の重層化の程度を判定する判定手段と
を備えたものである。
【００１６】
この重層化判定装置では、培養細胞の培養液に含まれる細胞生存関連成分の分析結果から重層化の程度を判定するため、培養細胞にダメージを与えることなく非侵襲かつ容易に重層化の程度を認識することができる。
【００１７】
この重層化判定装置において、前記判定手段は、前記培養細胞の重層化の程度として重層化の終点を判定してもよい。このとき、前記判定手段は、前記細胞生存関連成分の分析結果を、予め経験的に求めた培養細胞の重層化の終点と前記細胞生存関連成分の分析結果との関係に照らして前記培養細胞の重層化の終点か否かを判定してもよい。また、前記細胞生存関連成分の分析結果として、前記細胞生存関連成分の時間変化量を用いてもよい。更に、前記細胞生存関連成分は、細胞が消費するグルコース、細胞が排出するアンモニア及び乳酸からなる群より選ばれた少なくとも一つを選択することが好ましい。あるいは、前記判定手段は、前記分析工程で得られた前記細胞生存関連成分の分析結果として、異なる代謝系における細胞が消費する成分と細胞が排出する成分との比を用いることが好ましく、異なる代謝系における細胞が消費する成分の時間変化量と細胞が排出する成分の時間変化量との比を用いることがより好ましい。このとき、異なる代謝系における細胞が消費する成分と細胞が排出する成分は、それぞれグルコースとアンモニアであることが好ましい。
【００１８】
【実施例及び発明の実施の形態】
［実施例］
１．使用細胞
本実験系では細胞として、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）を安定に発現するｉｎｆｉｎｉｔｙＴＭテロメラーゼ不死化細胞株ｈＴＥＲＴ−ＨＭＥ１（クロンテック社）を用いた。このｈＴＥＲＴ−ＨＭＥ１は、ヒト乳腺上皮由来の角化細胞（ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ）であり、テロメアの長さを維持し、細胞が正常な機能と表現型を保持したまま、無期限に分裂することを可能とする。
【００１９】
２．前培養
細胞懸濁液から細胞を７５ｃｍ２Ｔ型フラスコへ接種し、ヒト角化細胞用無血清培地（ＨｕＭｅｄｉａ−ＫＧ２、クラボウ社）を深さが４ｍｍとなるように加えた。そのＴ型フラスコを５％ＣＯ２濃度の加湿空気で充填された温度３７℃のＣＯ２インキュベータ（ＭＣＯ−１７ＡＩＣ、三洋電機社）内に静置し培養を行った。培養中、培地交換は７２時間毎に行い、細胞がサブコンフルエントの状態に達したところで、次の継代を行い、同様に継代培養を繰り返していった。なお、ヒト角化細胞用無血清培地は、カルシウムイオン濃度が０．１５ｍｍｏｌ／ｌである。
【００２０】
３．本培養（単層培養及び重層培養）
ここでは、培養面として親水性テフロンフィルム（Ｔｅｆｌｏｎ  ＦＥＰ  Ｆｌｕｏｒｏｃａｒｂｏｎ  Ｆｉｌｍ  Ｔｙｐｅ  Ｃ−２０，デュポン社製、テフロンは登録商標）を用いた、面積４ｃｍ２の４穴の小型の培養容器（以下、小型容器という）を使用した。また、本培養の概要は次のとおりである。即ち、単層培養時には上記２．で述べた継代サイクル中に使用していたものと同じ培地（以下、通常培地という）を用いた。増殖が進行し、培養面が細胞でほぼコンフルエントの状態に達した後には、重層培養に切り替えるべく、分化を誘導する培地として、通常培地にカルシウムイオンを濃度１．２ｍｍｏｌ／ｌとなるように添加した培地（以下、カルシウム添加培地という）を作製し、使用した。
【００２１】
本培養の詳細は次のとおりである。まず、上記２．で示す７５ｃｍ２Ｔ型フラスコで継代サイクル中の細胞をサブコンフルエントの状態になるまで前培養した。フラスコ内部を少量のリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で２回洗浄後、０．１％トリプシン１：２５０（シグマ社製）と０．０２％ＥＤＴＡ（シグマ社製）からなるトリプシン溶液を約１．５ｍｌ滴下して３７℃インキュベータ内で５分、インキュベートし、フラスコに適度な物理的衝撃を与えることによって細胞をフラスコから剥離した。酵素反応を停止させるために、細胞が剥離した細胞懸濁液に０．１％トリプシンインヒビター（シグマ社製）溶液をトリプシン溶液と同量滴下した。得られた細胞懸濁液を１５ｍｌ遠沈管に移し、さらにフラスコ内に残った細胞をＰＢＳで洗浄しながら、遠沈管に回収した。この遠沈管を室温の下、１０００ｒｐｍで８分間遠心分離し、細胞を底部に集積させて上澄み液を捨てた。得られた細胞を約１０ｍｌの通常培地で再懸濁し、この細胞懸濁液のうち０．２ｍｌを採取し、トリパンブルー染色法により死細胞を染色し、血球計算盤上にて生存細胞数をカウントすることで、懸濁液中の生存細胞濃度を算出した。求めた濃度から、細胞懸濁液を小型容器に接種細胞濃度Ｘ０＝１．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２となるように接種し、通常培地を加え、液深さを４ｍｍとするために全体として１．６ｍｌとした。この小型容器を３７℃インキュベータ内に設置して培養を行った。小型容器では細胞がほぼコンフルエント（約９０％）の状態に達した培養時間ｔ＝１２０ｈからは、培地を通常培地からカルシウム添加培地に交換し、重層培養を行った。
【００２２】
培地成分濃度の測定は以下のようにして行った。即ち、培養中の培地成分濃度Ｃｉ［ｍｏｌ／ｌ］（ｉ：グルタミン（Ｇｌｎ）、グルコース（Ｇｌｕｃ）、アンモニウムイオン（ＮＨ４＋）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、乳酸（Ｌａｃ））は、培地をエッペンドルフチューブにサンプルとして採取し、培地成分分析装置（ＢｉｏＰｒｏｆｉｌｅ２００、ヤマト科学社製）により測定した。実際の培地成分濃度は、培地交換が行われるごとに初期値にリセットされてしまうため、計算上の培地成分濃度として、今回の濃度から前回の濃度を減じた値ΔＣＧｌｎ、ΔＣＧｌｕｃ、ΔＣＮＨ４＋、ΔＣＧｌｕ、ΔＣＬａｃを求め、その累積値ΣΔＣＧｌｎ、ΣΔＣＧｌｕｃ、ΣΔＣＮＨ４＋、ΣΔＣＧｌｕ、ΣΔＣＬａｃを採用した。ここで、グルタミンとグルコースは細胞が消費する成分であるため、これらの累積値ΣΔＣＧｌｎ、ΣΔＣＧｌｕｃは負の数となり、一方、ＮＨ４＋とグルタミン酸と乳酸は細胞より排出される成分であるため、これらの累積値ΣΔＣＮＨ４＋、ΣΔＣＧｌｕ、ΣΔＣＬａｃは正の数となる。また、細胞の代謝系について説明すると、グルタミンを消費してグルタミン酸とＮＨ４＋とを排出するという代謝系と、グルコースを消費して乳酸を排出するという代謝系とが存在する。
【００２３】
単層培養時の接着細胞濃度は以下のようにして算出した。即ち、小型容器のうち細胞が接着している培養面（底面）をＣＣＤカメラを付設した位相差顕微鏡によって撮影し、得られた画像をパソコンに取り込み、画像上の細胞をカウントして細胞数を測定し、数１式に基づき、カウントされた細胞数と撮像面積とで培養中の接着細胞濃度を算出した。なお、数１式中、Ｘａ：接着細胞濃度［ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２］、Ｎ：画像中の細胞数［ｃｅｌｌｓ］、Ａ：撮像面積［ｃｍ２］である。画像は１つの培養面に対して異なる位置で３点ずつ撮影し、それぞれ３つのＸａの平均値をとった。
【００２４】
【数１】
Ｘａ＝Ｎ／Ａ
【００２５】
重層化培養時の接着細胞濃度は以下のようにして算出した。即ち、複数の小型容器を用いて同条件下で培養を行い、接着細胞濃度の測定時期に至るごとにそのうちの一つを取り出して以下の処理を行った。即ち、まず接着細胞にトリプシン溶液を適量滴下し、細胞を培養面から剥離及び細胞間の結合を切断し、個々の細胞を分離した。酵素反応をトリプシン溶液と同量のトリプシンインヒビター溶液によって停止させ、ＰＢＳで洗浄しながら１５ｍｌ遠沈管に回収した。この遠沈管を室温の下、１０００ｒｐｍで８分間遠心分離し、細胞を底部に集積させて上澄み液を捨てた。得られた細胞を所定量の通常培地で再懸濁し、懸濁液の細胞濃度を血球計算盤を用いて計測し、元の接着細胞濃度を算出した。
【００２６】
４．結果
図１は培養時間ｔと接着細胞濃度Ｘａとの関係を表すグラフであり、図２（ａ）〜（ｅ）は培養時間ｔと培地成分濃度ΣΔＣｉ（ｉは前出のとおり）との関係を表すグラフである。これらのグラフから明らかなように、培養時間ｔと培地成分濃度ΣΔＣｉとの関係を表すグラフはいずれも培養時間ｔと接着細胞濃度Ｘａとの関係を表すグラフと相関が見られた。また、培養時間ｔとアンモニウムイオン濃度ΣΔＣＮＨ４＋、培養時間ｔとグルコース濃度ΣΔＣＧｌｕｃ、培養時間ｔと乳酸濃度ΣΔＣＬａｃとの関係を表すグラフ（図２（ａ），（ｄ），（ｅ）参照）は、培養時間ｔと接着細胞濃度Ｘａとの関係と良好な相関が見られたばかりでなく、同様の実験を繰り返した際の再現性も良好であった。
【００２７】
ここで、接着細胞濃度Ｘａの時間変化分（例えば今回と前回の接着細胞濃度Ｘａの差分）が実質的にゼロになった時点では、重層化した培養細胞シートの基底層での細胞増殖と角質層での細胞剥離とがほぼ平衡に達したとみなすことができる。このため、その時点に対応する培地成分濃度の時間変化分ΔＣｉ（ｉは前出のとおり）をグラフから求め、そのΔＣｉを重層化の終点を判断する際の閾値Ｋｉとし、次回細胞培養を行う際に培地成分濃度の時間変化分ΔＣｉをモニタリングしながら細胞培養を行い、そのΔＣｉが閾値Ｋｉ以下になったときを重層化の終点とみなして細胞培養を中止することが可能となる。ここで、適格性や再現性を考慮すれば、ΔＣＮＨ４＋、ΔＣＧｌｕｃ、ΔＣＬａｃのうちのいずれかをモニタリングするのが好ましい。なお、培地成分濃度の時間変化分としては、上述したようにΔＣｉを用いてもよいが、それ以外に単位時間当たりの濃度変化分を用いてもよいし、培地成分濃度の時間微分値を用いてもよい。
【００２８】
図３は、培養時間ｔと比率Ｒとの関係を表すグラフであり、比較しやすいように培養時間ｔと接着細胞濃度Ｘａとの関係を表すグラフも併記した。比率Ｒは、グルコース濃度の時間変化分ΔＣｇｌｕｃに対するＮＨ４＋濃度の時間変化分ΔＣＮＨ４＋の比ΔＣＮＨ４＋／（−ΔＣｇｌｕｃ）であるが、分母にマイナスを付すことで比率Ｒを正の数として表した。ここで、グルコースを消費する代謝系では乳酸が排出され、グルタミンを消費する代謝系ではＮＨ４＋とグルタミン酸が排出されることから、グルコースとＮＨ４＋とは異なる代謝系の成分である。このグラフから明らかなように、培養時間ｔと比率Ｒとの関係を表すグラフは培養時間ｔと接着細胞濃度Ｘａとの関係を表すグラフと良好な相関が見られた。
【００２９】
ここでも、接着細胞濃度Ｘａの時間変化分が実質的にゼロになった時点では、重層化した培養細胞シートの基底層での細胞増殖と角質層での細胞剥離とがほぼ平衡に達したとみなすことができるため、その時点に対応する比率Ｒの時間変化分ΔＲ（今回と前回の比率Ｒの差分）をグラフから求め、そのΔＲを重層化の終点を判断する際の閾値ＫＲとし、次回細胞培養を行う際に比率Ｒの時間変化分ΔＲをモニタリングしながら細胞培養を行い、そのΔＲが閾値ＫＲ以下になったときを重層化の終点とみなして細胞培養を中止することが可能となる。このように、異なる代謝系の消費成分と排出成分とを組み合わせた比率Ｒが重層化の停止の判断指標となり得ることが明らかとなった。
【００３０】
ところで、重層化が進行している培養細胞シートの見かけの層数ｎａｐｐは、接着細胞濃度Ｘａを１層の接着細胞濃度Ｘａ，１  で除した値（Ｘａ／Ｘａ，１）として表すことができる。このため、前出の重層化の終点は、重層化の層数の上限に達した時点と見ることもできる。
【００３１】
［実施形態］
次に、培養細胞の重層化の程度を判定するのに適した一実施形態である、組織培養装置１０について説明する。図４は、組織培養装置１０の概略説明図である。この組織培養装置１０は、主として、リアクタ１２と、このリアクタ１２を支持する傾斜ステージ１４と、リアクタ１２の底面を撮影するカメラ１６と、このカメラ１６を支持する電動キャリア１８と、培地交換時に作動する培地交換ポンプＰ１及び第１〜第３培地交換バルブＶ１〜Ｖ３と、サンプリング時に作動する第１〜第３サンプリングバルブＶ４〜Ｖ６及びサンプリングポンプＰ２と、培地成分分析装置２０と、コンピュータ２２とを備えたものである。
【００３２】
リアクタ１２は、ボンベ２４から５％炭酸ガス含有エアが加湿器２６を介して供給されるように配管され、また、リアクタ１２中の排ガス成分を外部へ放出可能なように配管されている。このリアクタ１２は、小型容器と同じ親水性テフロンフィルム（Ｔｅｆｌｏｎ  ＦＥＰ  Ｆｌｕｏｒｏｃａｒｂｏｎ  Ｆｉｌｍ  Ｔｙｐｅ  Ｃ−２０，デュポン社製）からなる培養面を持ち、その培養面の面積は２５ｃｍ２である。
【００３３】
傾斜ステージ１４は、コンピュータ２２から制御信号が入力されると、図示しない電動シリンダが作動してリアクタ１２を支持する支持面を水平位置か傾斜位置のいずれかに位置決めする。
【００３４】
カメラ１６は、周知のＣＣＤカメラであり、ＬＥＤランプ２８がリアクタ１２の上方からリアクタ１２を照らし出している状態でコンピュータ２２から制御信号が入力されると、リアクタ１２の底面を撮影し、撮影した画像データをコンピュータ２２へ出力する。
【００３５】
電動キャリア１８は、カメラ１６を移動可能に支持しており、コンピュータ２２から制御信号が入力されるとカメラ１６をリアクタ１２の下方のうち制御信号に応じた指定位置に位置決めする装置である。
【００３６】
培地交換時に作動する培地交換ポンプＰ１は、リアクタ１２と第１〜第３培地交換バルブＶ１〜Ｖ３との途中に設けられ、コンピュータ２２からの制御信号に応じてリアクタ１２から第１〜第３培地交換バルブＶ１〜Ｖ３側へ送液するか第１培地交換バルブＶ１〜Ｖ３側からリアクタ１２へ送液するかが切り替わる。各培地交換バルブＶ１〜Ｖ３は次のように作動する。第１培地交換バルブＶ１は、リアクタ１２から培地が抜き出されるときに開放され、それ以外のときには閉鎖されている。第２培地交換バルブＶ２は、通常培地ボトル３２からリアクタ１２へ通常培地を送液するときに開放され、それ以外のときには閉鎖される。第３培地交換バルブＶ３は、カルシウム添加培地ボトル３４からリアクタ１２へカルシウム添加培地を送液するときに開放され、それ以外のときには閉鎖される。リアクタ１２から培地を抜き取る際には、第１培地交換バルブＶ１を開放し第２，第３培地交換バルブＶ２，Ｖ３を閉鎖する。また、リアクタ１２へ通常培地を供給する際には、第１，第３培地交換バルブＶ１，Ｖ３を閉鎖し第２培地交換バルブＶ２を開放する。更に、リアクタ１２へカルシウム添加培地を供給する際には、第１，第２培地交換バルブＶ１，Ｖ２を閉鎖し第３培地交換バルブＶ３を開放する。なお、通常培地は、前出のとおり単層培養時に用いられる培地であり、カルシウム添加培地は、前出のとおり重層培養時に用いられる培地で通常培地にカルシウムイオンを濃度が１．２ｍｍｏｌ／ｌになるように添加した培地である。
【００３７】
サンプリング時に作動するサンプリングポンプＰ２は、コンピュータ２２からの制御信号に応じて培地成分分析装置２０のサンプリングセル２１に液体を供給するかサンプリングセル２１から液体を排出するかが切り替わる。各サンプリングバルブＶ４〜Ｖ６は次のように作動する。即ち、リアクタ１２から培地を採取してサンプリングセル２１へ供給するときには、第１サンプリングバルブＶ４はリアクタ１２と第２サンプリングバルブＶ５とを連通させ、第２サンプリングバルブＶ５は第１サンプリングバルブＶ４とサンプリングポンプＰ２とを連通させる。また、サンプリングセル２１の液体を廃液ボトル３６に捨てるときには、第２サンプリングバルブＶ５はサンプリングポンプＰ２と廃液ボトル３６とを連通させる。更に、洗浄液をサンプリングセル２１へ供給するときには、第３サンプリングバルブＶ６は洗浄液ボトル３８と第１サンプリングバルブＶ４とを連通させ、第１サンプリングバルブＶ４は第３サンプリングバルブＶ６と第２サンプリングバルブＶ５とを連通させ、第２サンプリングバルブＶ５は第１サンプリングバルブＶ４とサンプリングポンプＰ２とを連通させる。なお、洗浄時には、サンプリングセル２１の液体を廃液ボトル３６に捨てる操作と、洗浄液をサンプリングセル２１へ供給する操作を何度か繰り返す。
【００３８】
培地成分分析装置２０は、細胞培養プロセスをモニターするための自動分析装置として市販されているＢｉｏＰｒｏｆｉｌｅ（ヤマト科学）であり、コンピュータ２２からの制御信号に応じてサンプリングセル２１に採取された培地の培地成分としてグルコース、グルタミン、アンモニウムイオン、乳酸、グルタミン酸の濃度を分析し、得られた分析結果をコンピュータ２２へ出力する。
【００３９】
コンピュータ２２は、周知のパーソナルコンピュータであり、傾斜ステージ１４、カメラ１６、電動キャリア１８、培地交換ポンプＰ１、第１〜第３培地交換用バルブＶ１〜Ｖ３、サンプリングポンプＰ２、第１〜第３サンプリングバルブＶ４〜Ｖ６及び培地成分分析装置２０に信号を出力可能なように接続され、カメラ１６及び培地成分分析装置２０から信号を入力可能なように接続されている。
【００４０】
次に、組織培養装置１０を使用例について説明する。まず、上述した実施例と同様にして細胞懸濁液を接種細胞濃度Ｘ０＝１．０×１０４［ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２］となるようにリアクタ１２に接種し、通常培地を加えて液深さを４ｍｍとする。このリアクタ１２を３７℃のインキュベータに設置し、ボンベ２４から５％炭酸ガス含有エアを加湿器２６を介してリアクタ１２へ供給し、培養を開始する。
【００４１】
単層培養における培地交換は定期的な作業として次のように行う。即ち、培地交換時期になると、図５に示すように、コンピュータ２２は、傾斜ステージ１４を傾斜位置に位置決めし（ステップＳ１００）、培地交換ポンプＰ１に接続された配管の先端がリアクタ１２内の培地に浸かるようにしたあと、第１培地交換バルブＶ１を開き第２及び第３培地交換バルブＶ２，Ｖ３を閉じて培地交換ポンプＰ１を作動させ、リアクタ１２内の培地を廃培地ボトル３０へ抜き取る（ステップＳ１１０）。続いて、コンピュータ２２は、傾斜ステージ１４を水平位置に位置決めし（ステップＳ１２０）、第２培地交換バルブＶ２を開き第１及び第３培地交換バルブＶ１，Ｖ３を閉じて培地交換ポンプＰ１を作動させ、通常培地ボトル３２から所定量の通常培地を吸い上げてリアクタ１２内へ供給し（ステップＳ１３０）、このルーチンを終了する。
【００４２】
単層培養から重層培養への切替は次にように行う。即ち、細胞がほぼコンフルエントの状態（約９０％）に達したか否かを判定し、細胞がほぼコンフルエントの状態に達したとき、コンピュータ２２は、通常培地からカルシウム添加培地に培地を切り換えることにより、単層培養から重層培養へ移行する。このときの培地交換は、図６に示すようにコンピュータ２２が単層培養とほぼ同様の手順により実行する（ステップＳ２００〜Ｓ２３０）が、通常培地ではなくカルシウム添加培地を使用するため、ステップＳ２３０では第３培地交換バルブＶ３を開き第１及び第２培地交換バルブＶ１，Ｖ２を閉じて培地交換ポンプＰ１を作動させることにより、カルシウム添加培地ボトル３４から所定量のカルシウム添加培地をリアクタ１２内へ供給する。また、その後の重層培養における定期的な培地交換も図６に示すルーチンにしたがって実行される。なお、コンフルエントの状態に達したか否かは、カメラ１６で得られた画像データを解析することによりコンピュータ２２が判断してもよいし、オペレータが目視により判断してもよい。後者の場合には、オペレータがキーボード又はマウスを操作してコンピュータ２２に重層培養への切換を指示する。
【００４３】
重層培養におけるサンプリングは予め決められたサンプリング時期に至るごとに次の作業を行う。即ち、サンプリング時期になると、図７に示すように、コンピュータ２２は、傾斜ステージ１４を傾斜位置に位置決めし（ステップＳ３００）、サンプリングポンプＰ２に接続された配管の先端がリアクタ１２内の培地に浸かるようにしたあと、リアクタ１２とサンプリングセル２１とが第１，第２サンプリングバルブＶ４，Ｖ５及びサンプリングポンプＰ２を介して連通するように各バルブＶ４，Ｖ５を制御し、この状態でサンプリングポンプＰ２を作動させてリアクタ１２内の培地を所定量（最低０．５ｍｌ）抜き取り、サンプリングセル２１へ供給し（ステップＳ３１０）、傾斜ステージ１４を元の水平位置に戻す（ステップＳ３２０）。その後、コンピュータ２２は、培地成分分析装置２０へサンプリングセル２１内の培地の分析を開始するように指令する（ステップＳ３３０）。すると、培地成分分析装置２０はサンプリングセル２１内の培地につき、グルコース、グルタミン、アンモニウムイオン、乳酸、グルタミン酸の濃度を分析し、得られた分析結果をコンピュータ２２へ出力する。この分析結果を入力したコンピュータ２２は、この分析結果を図示しないＨＤＤに保存し（ステップＳ３４０）、続いてサンプリングセル２１と廃液ボトル３６とがサンプリングポンプＰ２及び第２サンプリングバルブＶ５を介して連通するように第２サンプリングバルブＶ５を制御し、この状態でサンプリングポンプＰ２を作動させてサンプリングセル２１内の培地を廃液ボトル３６へ排出する（ステップＳ３５０）。その後、サンプリングセル２１と洗浄液ボトル３８とがサンプリングポンプＰ２、第１〜第３サンプリングバルブＶ４〜Ｖ６を介して連通するように各バルブＶ４〜Ｖ６を制御し、この状態でサンプリングポンプＰ２を作動させて洗浄液ボトル３８から洗浄液をサンプリングセル２１へ供給したあと、先ほどと同様の手順でサンプリングセル２１内の洗浄液を廃液ボトル３６へ排出する、という洗浄操作を数度繰り返し（ステップＳ３６０）、このルーチンを終了する。
【００４４】
重層化の終点の判定は以下の手順で実行する。即ち、コンピュータ２２は、培地成分分析装置２０から新たに分析結果を入力すると、図８に示すように、その分析結果に基づいて各培地成分濃度の時間変化量ΔＣｉを求め（ステップＳ４００）、これを予め実験で求めた重層化の終点と各培地成分濃度の時間変化量ΔＣｉとの関係に照らして重層化の終点に達したか否かを判定する。具体的には、培地成分の時間変化量ΔＣｉが予め経験的に求めておいた閾値Ｋｉ以下になったか否かを判定し（ステップＳ４１０）、ΔＣｉが閾値Ｋｉより大きいときにはそのままこのルーチンを終了し、ΔＣｉが閾値Ｋｉ以下になったときには重層化が終了した旨をディスプレイに表示するかスピーカから出力することにより報知し（ステップＳ４２０）、このルーチンを終了する。なお、各培地成分濃度のうちの少なくとも１つについてステップＳ４００、Ｓ４１０を実行すればよい。あるいは、コンピュータ２２は、図９に示すように、その分析結果に基づいて比率Ｒの時間変化量ΔＲを求め（ステップＳ５００）、これを予め実験で求めた重層化の終点と比率Ｒの時間変化量ΔＲとの関係に照らして重層化の終点に達したか否かを判定する。具体的には、比率Ｒの時間変化量ΔＲが予め経験的に求めておいた閾値ＫＲ以下になったか否かを判定し（ステップＳ５１０）、ΔＲが閾値ＫＲより大きいときにはそのままこのルーチンを終了し、ΔＲが閾値ＫＲ以下になったときには重層化が終了した旨をディスプレイに表示するかスピーカから出力することにより報知し（ステップＳ５２０）、このルーチンを終了する。オペレータは、ステップＳ４２０又はＳ５２０の報知によって重層化が終了したことを認識でき、細胞培養を終了する。
【００４５】
以上詳述した組織培養装置１０によれば、培養細胞の培地に含まれる細胞生存関連成分であるＮＨ４＋、グルコース、グルタミン、グルタミン酸、乳酸の分析結果から重層化の程度を判定するため、培養細胞にダメージを与えることなく非侵襲かつ容易に重層化の程度を認識することができる。また、重層化の終点だと判定されたときに細胞培養を終了すればよいため、無駄に細胞培養を続けてしまうことがない。更に、細胞を重層化しているときの培地を取り出しその培地に含まれる各培地成分濃度の時間変化量ΔＣｉを求め、予め実験で求めた重層化の終点と各培地成分濃度の時間変化量ΔＣｉとの関係に照らして重層化の終点に至ったか否かを判定するため、重層化の終点を的確に判定することができる。更にまた、細胞生存関連成分としてグルコース、アンモニウムイオン、乳酸のうちの一つを選択すれば、実験の再現性が高いため判定精度が高まる。そしてまた、細胞が消費する成分であるグルコースと細胞が排出する成分であるアンモニウムイオンとは代謝系が異なる成分であるが、両濃度の時間変化量の比率Ｒ（ΔＣＮＨ４＋／（−ΔＣＧｌｕｃ））を重層化の終点の良好な判定指標として用いることができる。
【００４６】
なお、本発明は上述した実施例や実施形態に何等限定されるものではなく、本発明の技術的範囲を逸脱しない範囲内において、種々なる形態で実施し得ることは勿論である。
【図面の簡単な説明】
【図１】培養時間ｔと接着細胞濃度Ｘａとの関係を表すグラフである。
【図２】培養時間ｔと培地成分濃度ΣΔＣｉとの関係を表すグラフである。
【図３】培養時間ｔと比率Ｒとの関係を表すグラフである。
【図４】組織培養装置１０の概略説明図である。
【図５】単層培養の培地交換のフローチャートである。
【図６】重層培養の培地交換のフローチャートである。
【図７】重層培養のサンプリングのフローチャートである。
【図８】重層化判定のフローチャートである。
【図９】重層化判定のフローチャートである。
【符号の説明】
１０  組織培養装置、１２  リアクタ、１４  傾斜ステージ、１６  カメラ、１８  電動キャリア、２０  培地成分分析装置、２１  サンプリングセル、２２  コンピュータ、２４  ボンベ、２６  加湿器、２８  ＬＥＤランプ、３０  廃培地ボトル、３２  通常培地ボトル、３４  カルシウム添加培地ボトル、３６  廃液ボトル、３８  洗浄液ボトル、Ｐ１  培地交換ポンプ、Ｐ２  サンプリングポンプ、Ｖ１〜Ｖ３  第１〜第３培地交換バルブ、Ｖ４〜Ｖ６  第１〜第３サンプリングバルブ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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