(57)【要約】【解決手段】胚性幹細胞をノギン蛋白質の存在下又は非存在下で浮遊培養して胚様体を形成させ、次いでこれを繊維芽細胞増殖因子及びソニックヘッジホッグ蛋白質の存在下で浮遊培養することにより神経幹細胞を増殖させ、次いでこれを分化させてコリン作動性ニューロンを製造する工程において、被検体を存在させ、あるいはノギン蛋白質、繊維芽細胞増殖因子及びソニックヘッジホッグ蛋白質の少なくとも一種に代えて被検体を存在させて、コリン作動性ニューロンの分化増殖に影響を与える被検体を選択することを特徴とする記憶障害治療剤のスクリーニング方法。【効果】本発明によれば、アルツハイマー病等による記憶障害治療剤をスクリーニングできる。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
胚性幹細胞をノギン蛋白質の存在下又は非存在下で浮遊培養して胚様体を形成させ、次いでこれを繊維芽細胞増殖因子及びソニックヘッジホッグ蛋白質の存在下で浮遊培養することにより神経幹細胞を増殖させ、次いでこれを分化させてコリン作動性ニューロンを製造する工程において、被検体を存在させ、あるいはノギン蛋白質、繊維芽細胞増殖因子及びソニックヘッジホッグ蛋白質の少なくとも一種に代えて被検体を存在させて、コリン作動性ニューロンの分化増殖に影響を与える被検体を選択することを特徴とする記憶障害治療剤のスクリーニング方法。
【請求項２】
胚性幹細胞をノギン蛋白質の存在下又は非存在下で浮遊培養して胚様体を形成させ、次いでこれを繊維芽細胞増殖因子及びソニックヘッジホッグ蛋白質の存在下で浮遊培養することにより得られる神経幹細胞培養物を記憶障害モデル動物に投与し記憶障害を治療する工程において、被検体を作用させて記憶障害を治療すると工程に影響を与える被検体を選択することを特徴とする記憶障害治療剤のスクリーニング方法。
【請求項３】
胚性幹細胞をノギン蛋白質の存在下又は非存在下で浮遊培養して胚様体を形成させ、次いでこれを繊維芽細胞増殖因子及びソニックヘッジホック蛋白質に存在下で浮遊培養することにより神経幹細胞を増殖させ、次いでこれを分化させて製造されたコリン作動性ニューロンを用いて、コリン作動性ニューロンの機能に影響を与える被検体を選択することを特徴とする記憶障害治療剤のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はアルツハイマー病に代表される脳疾患による記憶障害の治療薬のスクリーニング方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
アルツハイマー病〔いわゆるアルツハイマー病（ＡＤ）及びそれ以後に発病するアルツハイマー型老年痴呆（ＳＤＡＴ）を含む〕は、痴呆、すなわち記憶障害を主症状とする知的機能障害である。その原因としては、老人斑の主成分であるβ−アミロイドタンパク質のもつ神経毒性がシナプスの脱落やニューロン死を起こすというβ−アミロイド説が有力となってきている。
【０００３】
アルツハイマー病治療薬としては、コリンエステラーゼ阻害剤であるタクリン（ｔａｃｒｉｎｅ）及びドネペジル（ｄｏｎｅｐｅｚｉｌ）が知られている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、これら従来のアルツハイマー病治療薬の効果は満足できるものではなく、新たな治療薬の開発及び新たなスクリーニング方法が望まれていた。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
そこで本発明者は、記憶障害モデル動物を用いて、種々の細胞に分化する能力を有する胚性幹細胞の移植療法を検討したところ、従来から報告されているとおり、移植部で腫瘍性増殖を示し移植ドナー細胞としては適さなかったが、胚性幹細胞から培養法によって誘導された神経幹細胞を移植したところ、有意な記憶障害改善効果が得られることを見出した。そして、さらに検討したところ、当該培養法により得られた神経幹細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化させるとコリン作動性ニューロンが効率良く製造できること、さらに、前記移植された神経幹細胞は脳内でコリン作動性ニューロンに分化していることも見出し、この胚性幹細胞の培養系を用いれば記憶障害治療剤のスクリーニングが可能になることを見出した。
【０００６】
すなわち本発明は、胚性幹細胞をノギン蛋白質の存在下又は非存在下で浮遊培養して胚様体を形成させ、次いでこれを繊維芽細胞増殖因子及びソニックヘッジホッグ蛋白質の存在下で浮遊培養することにより神経幹細胞を増殖させ、次いでこれを分化させてコリン作動性ニューロンを製造する工程において、被検体を存在させ、あるいはノギン蛋白質、繊維芽細胞増殖因子及びソニックヘッジホッグ蛋白質の少なくとも一種に代えて被検体を存在させて、コリン作動性ニューロンの分化増殖に影響を与える被検体を選択することを特徴とする記憶障害治療剤のスクリーニング方法を提供するものである。
【０００７】
また本発明は、胚性幹細胞をノギン蛋白質の存在下又は非存在下で浮遊培養して胚様体を形成させ、次いでこれを繊維芽細胞増殖因子及びソニックヘッジホッグ蛋白質の存在下で浮遊培養することにより得られる神経幹細胞培養物を記憶障害モデル動物に投与し記憶障害を治療する工程において、被検体を作用させて記憶障害を治療すると工程に影響を与える被検体を選択することを特徴とする記憶障害治療剤のスクリーニング方法を提供するものである。
【０００８】
さらにまた本発明は、胚性幹細胞をノギン蛋白質の存在下又は非存在下で浮遊培養して胚様体を形成させ、次いでこれを繊維芽細胞増殖因子及びソニックヘッジホック蛋白質に存在下で浮遊培養することにより神経幹細胞を増殖させ、次いでこれを分化させて製造されたコリン作動性ニューロンを用いて、コリン作動性ニューロンの機能に影響を与える被検体を選択することを特徴とする記憶障害治療剤のスクリーニング方法を提供するものである。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明のスクリーニング方法に用いられる神経幹細胞は、胚性幹細胞から誘導することにより得られる。胚性幹細胞（ＥＳ細胞）から神経幹細胞を誘導するには、胚性幹細胞をノギン蛋白質の存在下又は非存在下で浮遊培養して胚様体（Ｅｍｂｒｙｏｉｄ  ｂｏｄｙ：ＥＢ）を形成させ、次いでこれを繊維芽細胞増殖因子及びソニックヘッジホッグ蛋白質の存在下で浮遊培養する。このようにして得られた神経幹細胞培養物を用いるのが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏでコリン作動性ニューロンを形成させる点好ましい。
【００１０】
本発明に用いられるＥＳ細胞としては、既に培養細胞として確立されているＥＳ細胞を使用することができる。例えば、マウス、ハムスター、ブタ、ヒト等のＥＳ細胞株を使用することができる。具体例としては、１２９／Ｏｌａ系マウス由来のＥＳ細胞、ＥＢ３、Ｅ１４ｔｇ２等が挙げられる。当該ＥＳ細胞は、血清を含むＧＭＥＭ培地等にて培養継代しておくのが好ましい。
【００１１】
ＥＳ細胞から胚様体の形成には、ノギン（Ｎｏｇｇｉｎ）蛋白質を添加した培地で浮遊培養すると、ＥＳ細胞から神経幹細胞への分化誘導効率が向上する。ノギン蛋白質は、例えばアメリカツメガエルノギンを使用することができるが、アメリカツメガエルノギンの全長ｃＤＮＡをＣＯＳ７細胞に導入し、一過性にノギン蛋白質を発現させた培養上清をそのまま使用してもよい。ノギン蛋白質の培地中の濃度は、この培養上清換算で１〜５０％（ｖ／ｖ）程度が好ましい。ＥＳ細胞の浮遊培養は、例えばＥＳ細胞を血清含有α−ＭＥＭ培地にて１×１０５  ｃｅｌｌｓ／ｍＬ程度の濃度で４〜８日間行えばよい。ここで血清としてはウシ血清、ブタ血清などが挙げられ、その濃度は５〜１５％、特に８〜１２％が好ましい。またα−ＭＥＭ培地には２−メルカプトエタノールを０．０１〜０．５ｍＭ、特に０．０５〜０．２ｍＭとなるように添加するのが好ましい。培養は５％ＣＯ２条件下、３５〜４０℃で行うのが好ましい。
【００１２】
なお、ノギン蛋白質の添加は胚様体形成時、すなわち培養１〜６日目に添加しておくのが特に好ましい。
【００１３】
前記のように形成された胚様体を経由してＥＳ細胞から得られた神経幹細胞を増殖させるには、繊維芽細胞増殖因子に加えてソニックヘッジホッグ蛋白質を含有する神経幹細胞増殖培地で浮遊培養する。
【００１４】
繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）としては、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−８が好ましい。培地中のＦＧＦの含有量は５〜５０ｎｇ／ｍＬ、特に１０〜４０ｎｇ／ｍＬが好ましい。また、ソニックヘッジホッグ蛋白質としては、例えばマウスソニックヘッジホッグ蛋白質が好ましい。培地中のソニックヘッジホッグ蛋白質の含有量は１〜２０ｎＭ、特に１〜１０ｎＭが好ましい。
【００１５】
培地としては、上記成分の他にグルコース、グルタミン、インスリン、トランスフェリン、プロジェステロン、プトレシン、塩化セレン、ヘパリン等を添加したＤＭＥＭ培地を用いるのが好ましい。ＤＭＥＭ：Ｆ１２培地を用いるのが特に好ましい。培養は５％ＣＯ２条件下、３５〜４０℃で行うのが好ましい。培養時間は７〜９日間が好ましい。
【００１６】
上記の浮遊培養により、ニューロスフェア（ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ）と呼ばれる単一細胞由来の細胞凝集塊が形成する。得られたニューロスフェアは、神経幹細胞のみに由来するものであり、前記培養法による神経幹細胞への誘導効率は極めて高いことがわかる。
【００１７】
本発明においては、このようにして得られた神経幹細胞のニューロスフェアの形態で使用するのが好ましい。
【００１８】
また神経幹細胞培養物中には、種々の緩衝液の他、ＢＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＮＧＦ、ＮＴ−３、ＮＴ−４などの神経栄養因子が含まれていてもよい。
【００１９】
この神経幹細胞培養物は、アルツハイマー病の他、頭部外傷後の脳萎縮、脳卒中や脳腫瘍などの脳内占拠性病変などの術後などにしばしば起るコリン作動性神経細胞脱落に起因する記憶障害を著明に改善する効果を有する。その投与方法は、脳の損傷部位、例えばアルツハイマー病であれば老人斑のある部分への移植が好ましい。移植にあたっては、予めＭＲＩ、ＣＴスキャン等の手段により損傷部位を確認したうえで行うのが好ましい。神経幹細胞の移植量は、患者の症状、損傷部位の大きさ等により異なるが、通常成人１人１回あたり１×１０６〜１０８細胞が好ましい。
【００２０】
この神経幹細胞培養物を用いた記憶障害の治療においては、他の記憶障害治療剤、例えばタクリン、ドネペジル等を併用してもよい。
【００２１】
投与された神経幹細胞培養物は、脳内においてコリン作動性ニューロンに分化することが判明した。従来の記憶障害治療剤は、β−アミロイド蛋白産生抑制剤やコリエステラーゼ阻害剤等のコリン作動性ニューロン死の防止という予防的作用をするものであることから、既にニューロンが喪失した状態やシナプスが脱落した状態を元に戻すことができないという致命的な欠陥があった。これに対し、前記神経幹細胞培養物を用いた治療によれば、脱落したコリン作動性ニューロンを再生させることができることから、従来の記憶障害治療剤とは根本的に相違する治療法である。
【００２２】
また、前記方法により胚性幹細胞から得られた神経幹細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化させてもコリン作動性ニューロンが効率良く産生することが判明した。従って、前記胚性幹細胞からコリン作動性ニューロンを製造する工程において、被検体を存在させ、あるいはノギン蛋白質、繊維芽細胞増殖因子及びノニックヘッジホッグ蛋白質の少なくとも一種に代えて被検体を存在させ、コリン作動性ニューロンの分化増殖に影響を与える被検体を選択すれば、当該被検体が記憶障害治療剤として有用であるか否かが評価できる。このとき、コリン作動性ニューロンの分化増殖に影響を与えるか否かは、コリン作動性ニューロンの産生効率を評価すればよい。当該産生効率は、前記ノギン蛋白質、繊維芽細胞増殖因子及びソニックヘッジホッグ蛋白質を用いた場合を陽性コントロールとして評価すればよい。また、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける神経幹細胞からコリン作動性ニューロンへの分化は、通常の分化培地で培養して行うのが好ましい。ここで分化誘導体培地としては、グルコース、グルタミン、インスリン、トランスフェリン、プロジェステロン、プトレシン、塩化セレンを含むＤＭＥＭ：Ｆ１２培地、（すなわち、神経幹細胞増殖用培地からＦＧＦとヘパリンを除いた培地）を用いるのが好ましい。このとき、ソニックヘッジホッグ蛋白質は存在しても、しなくてもよい。培養は５％ＣＯ２条件下、３５〜４０℃で５〜７日間行うのが好ましい。
【００２３】
また、前記胚性幹細胞から神経幹細胞培養物を得、これを記憶障害モデル動物に投与し、記憶障害を治療する工程において、被検体を作用させて記憶障害を治療する工程に影響を与える被検体を選択すれば、記憶障害治療剤のスクリーニングができる。記憶障害を治療する工程に影響を与えるか否かは、被検体を投与した群の記憶障害の改善度を評価すればよい。記憶障害の改善度は、前記ノギン蛋白質、繊維芽細胞増殖因子及びソニックヘッジホッグ蛋白質を用いた場合を陽性コントロールとして評価すればよい。ここで記憶障害モデル動物としては、イボテン酸投与による記憶障害モデル、脳弓切断による記憶障害モデル、抗ｐ７５抗体を用いたイムノトキシンによる記憶障害モデル等が挙げられる。
【００２４】
また、前記胚性幹細胞から神経幹細胞を増殖させ、次いでこれを分化させて製造されたコリン作動性ニューロンを用いて、コリン作動性ニューロンの機能に影響を与える被検体を選択すれば、記憶障害治療剤のスクリーニングができる。被検体がコリン作動性ニューロンの機能に影響を与えるか否かは、例えば被検体の存在下に当該コリン作動性ニューロンを培養し、その機能を評価すればよい。
【００２５】
【実施例】
次に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。
【００２６】
製造例
Ａ．材料及び方法
（１）マウスＥＳ細胞の培養継代と胚様体の形成
１２９／Ｏｌａ系マウス由来のＥＳ細胞、Ｅ１４ｔｇ２ａ及びそのＯｃｔ３／４遺伝子座にブラストシジン耐性遺伝子を挿入し未分化ＥＳ細胞を選択できるＥＢ３は、１０％仔牛胎児血清、非必須アミノ酸、１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム、０．１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール及び１０００Ｕ／ｍＬ白血病抑制因子（Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ、ＬＩＦ）を含むＧｌａｓｇｏｗ  ｍｉｎｉｍｕｍ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｍｅｄｉｕｍ（ＧＭＥＭ）培地にて定法（５％ＣＯ２、３７℃、以下、単に「培養」というときは、この条件）によって培養継代した。
【００２７】
ＥＳ細胞からの胚様体（Ｅｍｂｒｙｏｉｄ  ｂｏｄｙ：ＥＢ）の形成は以下のようにして行った。ＥＳ細胞をＰＢＳで洗浄後、０．２５％トリプシン−１ｍＭ  ＥＤＴＡ処理及びその停止を行い、ピペッティングによって分散させた細胞を、１０％仔牛胎児血清及び０．１ｍＭ  ２−メルカプトエタノールを含むα−ＭＥＭ培地で満たしたバクテリア用培養皿中に１×１０５  ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度で播種し、ノギン蛋白質（アフリカツメガエルＮｏｇｇｉｎの全長ｃＤＮＡをＣＯＳ７細胞に導入し、一過性に発現させた培養上清）存在下及び非存在下で４〜８日間浮遊培養してＥＢを形成させた。
【００２８】
（２）ＥＢからの神経幹細胞の選択的培養による分離
上記のようにして形成されたＥＢは培養液とともに遠心チューブに移し、１０分間静置することによってチューブ底に集め上清を除去しＰＢＳ中に再懸濁し、再び１０分間静置する。上清を除去した後、ＥＢは０．２５％トリプシン−１ｍＭＥＤＴＡ溶液中に再懸濁し３７℃で５分間インキュベートし、１０％仔牛胎児血清を含むα−ＭＥＭ培地で蛋白質分解反応を停止させた後、ピペットで細胞を分散させた。分散させた細胞はα−ＭＥＭ培地にて遠心操作により２回洗浄し、グルコース（０．６％）、グルタミン（２ｍＭ）、インスリン（２５μｇ／ｍＬ）、トランスフェリン（１００μｇ／ｍＬ）、プロジェステロン（２０ｎＭ）、プトレシン（６０μＭ）、塩化セレン（３０ｎＭ）、ＦＧＦ−２（２０ｎｇ／ｍＬ）、ヘパリン（２μｇ／ｍＬ）を添加したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）：Ｆ１２（１：１）培地中（神経幹細胞増殖培地）に、あるいはそこへさらにマウスソニックヘッジホッグ蛋白質ｍｏｕｓｅ  ｓｏｎｉｃ  ｈｅｄｇｅｈｏｇ１（５ｎＭ）を加えた培地に５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度で播種し、７〜９日間浮遊培養することによって、ニューロスフェア（ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ）と呼ばれる単一細胞由来の細胞凝集塊を形成させた（ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ法）。これらニューロスフェアは上記の神経幹細胞増殖培地よりＦＧＦ−２とヘパリンを除いた分化培地で遠心洗浄した後、そのままあるいはピペッティングにより分散させた細胞を、分化培地で満たしたポリ−Ｌ−オルニチン（ｐｏｌｙ−Ｌ−ｏｒｎｉｔｈｉｎ）でコートした培養皿に播種し、ソニックヘッジホッグ蛋白質（５ｎＭ）存在下あるいは非存在下で５〜７日間培養することによって分化させた。また上記のようにして得たニューロスフェアを再び単一細胞に分散し、神経幹細胞増殖培地で７日間継代培養し２次ニューロスフェアを形成させ、これらも上記と同様に分化させる。
【００２９】
Ｂ．実験結果
（１）ＥＢからの神経幹細胞の選択的培養法による分離精製
まずＥＢの形成によるＥＳ細胞の初期分化において、神経幹細胞が培養のどの時期に出現してくるのかを検討した。具体的には、培養４〜８日のＥＢを単一細胞に分散し、神経幹細胞培地にて７日間培養し、ニューロスフェアを形成させた。これらニューロスフェアは分化培地に移し分化させ、その分化能を検定するとともに、継代することによって自己複製能も検定した。
図１には、浮遊培養によるＥＢの形成開始後６及び８日後、ＥＢを単一細胞に分散し、神経幹細胞の選択的培養（ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ法）を行った結果を示した。なお得られたニューロスフェアの数はＥＢ中に出現した神経幹細胞の数とした。その結果、本方法で同定される（ニューロスフェアを形成できる）神経幹細胞は、ＥＢの培養４日目まではほとんど検出できず、培養６日目で全細胞中０．２５％、８日目で１．１％と次第に増加していくことが分かった。
【００３０】
（２）ノギン蛋白質による神経幹細胞の分化誘導の効率化
ノギン蛋白質をＥＢ形成時（６日間）に添加することによって神経幹細胞の分化誘導の効率化を試みた。ノギンは、アフリカツメガエルノギンの全長ｃＤＮＡをｐＥＦ−ＢＯＳ発現ベクターに組み込みＣＯＳ７細胞に導入し、一過性に発現させた培養上清をノギン溶液とし、発現ベクターのみを導入したＣＯＳ７細胞の培養上清を対照とした。図２に示すように、ノギン培養上清の量に依存してＥＢ中で分化誘導されるニューロスフェアを形成する神経幹細胞の数は増加し、１／１０倍容でピークに達した。
【００３１】
実施例１
雄性９週齢のマウスの中隔核にイボテン酸１０μｇを外科的に投与しコリン作動性ニューロンを破壊して、記憶障害モデルマウスを作成した。この記憶障害マウスの海馬に、ＧＦＰ（ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子を導入したＥＳ細胞から分化誘導させた神経幹細胞を移植し、記憶障害改善効果を検討した。具体的には、雄性９週齢のマウスを用い、以下の４群に分けてイボテン酸投与による記憶障害モデルマウスを作成した。
【００３２】
（１）コントロール群
中隔核に１μｌ  ＰＢＳ投与＋海馬に１μｌ  ＰＢＳ投与
（２）未治療群
中隔核に１μｇイボテン酸投与＋海馬に１μｌ  ＰＢＳ投与
（３）ＥＳ細胞移植群
中隔核に１μｇイボテン酸投与＋海馬にＥＳ細胞移植
（４）ＥＳ細胞分化神経幹細胞移植群
中隔核に１μｇイボテン酸投与＋海馬に１μｌ神経幹細胞移植
【００３３】
これらの各群について、Ｍｏｒｒｉｓのｗａｔｅｒ  ｍａｚｅ  ｔｅｓｔ  （ＷＭＴ）（１．８ｍ直径の円形水槽の水面下に直径１０ｃｍのプラットホームを置き、水槽の任意の場所に浮かせたマウスがそのプラットホームまで達する時間を繰り返し測定し、記憶学習能力を測定する）により、記憶障害改善効果を検討した。その結果、図３に示すように、神経幹細胞のニューロスフェアを移植した群は、コントロール群と同等にまで記憶障害が回復していた。これに対し、ＥＳ細胞を移植した群は、従来の報告と同様、腫瘍性増殖を示し、移植ドナー細胞として適さないことが判明した。
【００３４】
また、移植部について免疫組織化学染色を行い、神経細胞の再生状態を検討した。
【００３５】
免疫染色には、移植した細胞およびその子孫細胞を同定するために抗ＧＦＰ抗体を、移植した細胞が、分裂するかどうかを確認するために抗ＢｒｄＵ抗体（移植後ホストのマウスにＢｒｄＵを１２０ｍｇ／ｋｇ投与し、ＢｒｄＵを取り込んだ細胞を検出する）を、ニューロンに分化しているかどうかを確認するために抗Ｈｕ抗体を、コリン作動性ニューロンに分化しているかどうかを確認するために抗ＣｈＡＴ抗体を、ＧＡＢＡニューロンに分化しているかどうかを確認するために抗ＧＡＤ６７抗体を、アストロサイトグリアに分化しているかどうかを確認するために抗ＧＦＡＰ抗体を、そして移植細胞由来のニューロンがシナプスを形成しているかどうかを確認するためには抗Ｓｙｎａｐｔｏｐｈｙｓｉｎ抗体を、それぞれ用いて染色した。
【００３６】
その結果を図４〜図１２に示す。図４から明らかなように、イボテン酸を投与した記憶障害マウスの中隔核においては、ＣｈＡＴ陽性細胞（コリン作動性ニューロン）はほとんど存在しなかった。図５から明らかなように、移植した細胞（ＧＦＰ陽性細胞）の多くがＢｒｄＵを取り込んでおり、移植後に分裂することが分かる。図６は移植した細胞がＨｕ陽性のニューロンに分化できることを示している。図７は移植した細胞が、ＣｈＡＴ陽性のコリン作動性ニューロンに分化することを示している。図８は移植した細胞群の中にわずかながらＧＡＤ６７陽性のＧＡＢＡ作動性ニューロンがあることを示している。図９は海馬に移植した細胞はほとんどアストロサイトに分化しないことを示している。図１０は移植細胞由来のニューロンがシナプスを形成する能力があることを示している。図１１は、移植６ヶ月後の移植部の免疫組織化学染色結果を示したものであり、海馬に移植した細胞は、Ｈｕ陽性ニューロン、そしてＣｈＡＴ陽性のコリン作動性ニューロンに分化し、移植から６ヶ月を経てもなお生存していた。図１２は、ＥＳ細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化させずに移植すると、腫瘍を形成することがあることを示している。
【００３７】
実施例２
ｃＧＭＰの誘導体であり、ｃＧＭＰを介したシグナル伝達系を活性化することが知られている８ｐＣＰＴ−ｃＧＭＰ（８−（４−クロロフェニルチオ）グアノシン−３′，５′−サイクリック  モノホスフェート）を被検体として用いて、この化合物が記憶障害治療剤として有用か否かスクリーニングした。すなわち、８ｃＣＰＴ−ｃＧＭＰは、ｃＡＭＰを介したシグナルと逆の作用を有することが知られており、最近ｃＡＭＰを介したシグナルにより阻害されることがわかっていたソニックヘッジホッグ蛋白質の作用を増強するという報告がある。従って、本発明のスクリーニング系でもソニックヘッジホッグ蛋白質の作用を増強すると考えられた。
前記製造例（２）のステップにおける１次ニューロスフェア形成過程で、ソニックヘッジホッグ蛋白質５ｎＭに代えて、ソニックヘッジホッグ蛋白質２．５ｎｇ／ｍＬ及び８ｐＣＰＴ−ｃＧＭＰ  ５０μＭをそれぞれ単独で又は併用して添加してニューロスフェアを形成させた。次いで、分化誘導体培地、すなわちグルコース、グルタミン、インスリン、トランスフェリン、プロジェステロン、プトレシン、塩化セレンを含むＤＭＥＭ：Ｆ１２培地中、５％ＣＯ２条件下、３７℃で７日間培養した。得られた細胞中のコリン作動性ニューロン数をｉｓｌ−１の発現により測定した。
結果を図１３に示す。その結果、８ｐＣＰＴ−ｃＧＭＰは、ソニックヘッジホッグ蛋白質（ｓｈｈ）と同様に、ＥＳ細胞から神経幹細胞を経由してコリン作動性ニューロンの生成を促進する作用を有し、記憶障害治療剤として有用であることが示唆された。
【００３８】
【発明の効果】
本発明によれば、アルツハイマー病等による記憶障害治療剤のスクリーニングができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】胚様体の培養日数とニューロスフェア形成との関係を示す図である。
【図２】ノギン蛋白質の添加効果を示す図である。
【図３】イボテン酸による記憶学習能力の低下と細胞移植後の回復をＭｏｒｒｉｓのｗａｔｅｒ  ｍａｚｅ  ｔｅｓｔ  （ＷＭＴ）で測定した結果を示す図である。
【図４】イボテン酸をマウス中隔核に投与するとＣｈＡＴ陽性細胞（コリン作動性ニューロンが消滅することを示す図である（正常で存在し、イボテン酸投与群で消滅）。
【図５】海馬に移植したＥＳ細胞由来の神経幹細胞が分裂していることを示す図である（ＧＦＰ、ＢｒｄＵ及び（ＧＦＰ＋ＢｒｄＵ）の対比による）。
【図６】海馬に移植したＥＳ細胞由来の神経幹細胞がニューロンに分化することを示す図である（ＧＦＰ、Ｈｕ及び（ＧＦＰ＋Ｈｕ）の対比による）。
【図７】海馬に移植したＥＳ細胞由来の神経幹細胞がコリン作動性ニューロンに分化することを示す図である（左は右の染色部の拡大図である）。
【図８】海馬に移植したＥＳ細胞由来の神経幹細胞はＧＡＢＡ作動性ニューロンにはほとんど分化しないことを示す図である（ＧＦＰ、ＧＡＤ及び（ＧＦＰ＋ＧＡＤ）の対比による）。
【図９】海馬に移植したＥＳ細胞由来の神経幹細胞はアストロサイトにはほとんど分化しないことを示す図である（ＧＦＰ、ＧＦＡＰ及び（ＧＦＰ＋ＧＦＡＰ）の対比による）。
【図１０】海馬に移植したＥＳ細胞由来の神経幹細胞はニューロンに分化しシナプスを形成することが可能であることを示す図である（ＧＦＰ、シナプトフィジン及び（ＧＦＰ＋シナプトフィジン）の対比による）。
【図１１】移植後６ヶ月後の移植部の免疫組織化学染色結果を示す図であり、海馬に移植したＥＳ細胞由来の神経幹細胞は、Ｈｕ陽性ニューロン（ＧＦＰ、Ｈｕ及び（ＧＦＰ＋Ｈｕ）の対比による）、そしてＣｈＡＴ陽性のコリン作動性ニューロン（ＧＦＰ、ＣｈＡＴ及び（ＧＦＰ＋ＣｈＡＴ）の対比による）に分化して、６ヶ月後も生存していることを示した図である。
【図１２】未分化なＥＳ細胞を海馬に移植すると移植部位において腫瘍を形成したことを示す図である（左（Ａ）は肉眼観察、右（Ｂ）は切片の図である）。
【図１３】８ｐＣＰＴ−ｃＧＭＰ及びソニックヘッジホッグ蛋白質（ｓｈｈ）のＥＳ細胞からコリン作動性ニューロン形成に及ぼす作用を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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