(57)【要約】【課題】腎臓移植等により生じる腎虚血再灌流傷害の治療・改善・予防剤の提供。【解決手段】ＭＣＰ−１ドミナント・ネガティブ変異体をコードする遺伝子を挿入したプラスミドであり、大腿筋に注射で投与する腎虚血再灌流傷害の治療・改善・予防剤。腎臓移植、腎臓手術、腎損傷、腎梗塞、腎動脈狭窄、腎動脈硬化、腎硬化症、腎出血、火傷・熱傷またはショックに起因して生じる腎虚血再灌流傷害の治療・改善・予防剤として有用である。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
単球遊走因子−１（ＭＣＰ−１）機能阻害剤を有効成分とする、腎虚血再灌流傷害の治療・改善・予防剤。
【請求項２】
ＭＣＰ−１機能阻害剤が、抗ＭＣＰ−１抗体、ＭＣＰ−１アンタゴニスト、ＭＣＰ−１優性阻害（ドミナント・ネガティブ）変異体およびそれらをコードする遺伝子から選ばれた１種である、請求項１記載の腎虚血再灌流傷害の治療・改善・予防剤。
【請求項３】
ＭＣＰ−１ドミナント・ネガティブ変異体をコードする遺伝子が配列番号１で表されるものである、請求項１または２記載の腎虚血再灌流傷害の治療・改善・予防剤。
【請求項４】
遺伝子が発現ベクターに挿入されたものである、請求項１〜３のいずれかに記載の腎虚血再灌流傷害の治療・改善・予防剤。
【請求項５】
発現ベクターが、プラスミド、アデノウイルスベクター、センダイウイルス（ＨＶＪ）ベクターおよびセンダイウイルスエンベロープ（ＨＶＪ−Ｅ）ベクターから選ばれた１種である、請求項１〜４のいずれかに記載の腎虚血再灌流傷害の治療・改善・予防剤。
【請求項６】
筋肉投与する、請求項１〜５のいずれかに記載の腎虚血再灌流傷害の治療・改善・予防剤。
【請求項７】
筋肉が大腿筋である、請求項６記載の腎虚血再灌流傷害の治療・改善・予防剤。
【請求項８】
ＭＣＰ−１機能阻害剤が、ＭＣＰ−１ドミナント・ネガティブ変異体をコードする遺伝子を挿入したプラスミドであり、大腿筋に投与する、請求項１〜７のいずれかに記載の腎虚血再灌流傷害の治療・改善・予防剤。
【請求項９】
ＭＣＰ−１アンタゴニストが配列番号２で表される蛋白質である、請求項１または２記載の腎虚血再灌流傷害の治療・改善・予防剤。
【請求項１０】
腎虚血再灌流傷害が、腎臓移植、腎臓手術、腎損傷、腎梗塞、腎動脈狭窄、腎動脈硬化、腎硬化症、腎出血、火傷・熱傷またはショックに起因するものである請求項１〜９のいずれかに記載の腎虚血再灌流傷害の治療・改善・予防剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、腎臓移植等に伴って生じる腎虚血再灌流傷害の治療・改善・予防剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
腎虚血−再灌流は腎臓移植において不可避であり、大手術、腎動脈狭窄、出血、火傷、挫滅外傷、各種の理由によるショック状態とも頻繁に関連付けられる。虚血−再灌流傷害は、腎臓残存に大きな影響を持つが、数十年に及ぶ実験室および臨床調査、ならびに腎補充療法の出現にもかかわらず、急性尿細管壊死の全体的な死亡率はほとんど変わっていない。
【０００３】
さらに、腎臓移植の長期移植機能は、虚血−再灌流傷害の初期強度に関連付けられる。腎虚血−再灌流傷害の臨床上のあらゆる重要性によって、傷害の特異的な治療法を検討する必要がある。
【０００４】
ケモカインは、白血球やリンパ球に対して、遊走活性を有する一群の蛋白質である。ケモカインは、その構造から大きく４種類に分けられ、１番目と２番目のシステインが連続して配置されているものは、ＣＣケモカインと称されている。
【０００５】
ＣＣケモカインのひとつである単球遊走因子−１（ＭＣＰ−１）は、それ自身が蛋白として報告され、またほぼ同時期にｃＤＮＡ配列も明らかになった（Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １６９，  １４４９−１４５９，  １９８９；Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １６９，  １４８５−１４９０，  １９８９；ＦＥＢＳ  ｌｅｔｔ，  ２４４，  ４８７−４９３，  １９８９）。ＭＣＰ−１を認識する受容体はすでに同定され、またｃＤＮＡもクローニングされている（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９１，  ２７５２−２７５６，  １９９４；Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  ２０２，  １１５６−１１６２，  １９９４）。現在、ＣＣケモカイン受容体として１１種類の受容体が知られており、ＭＣＰ−１受容体はＣＣＲ２と呼ばれている。
【０００６】
ＭＣＰ−１は、マクロファージの浸潤および活性化において重要な役割を果たし、腎疾患を含む組織破壊を生じる。反対に、最近の研究により、ＣＣＲ２シグナル伝達も腎疾患の組織破壊に関与していることが明らかになった。
【０００７】
【特許文献１】
特開２００２−４７２０３
【特許文献２】
特開２００２−２８４６９８
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、腎臓移植等に伴って生じる腎虚血再灌流傷害の治療・改善・予防剤を提供することを課題とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
ロリンズらは、ＭＣＰ−１蛋白のアミノ酸変異体を各種作成し、そのうちいくつかは細胞遊走活性が消失することを報告した（Ｊ．  Ｂｉｏ．  Ｃｈｅｍ．  ２６９，  １５９１８−１５９２４，  １９９４）。これらの変異体のうち、Ｎ末端から数えて２から８番目のアミノ酸を欠失させた変異体７ＮＤ−ＭＣＰ−１は、ＣＣＲ２に対する結合能はあるが、細胞遊走を惹起しない、又はドミナントネガティブ（ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｎｅｇａｔｉｖｅ）として野生型ＭＣＰ−１とダイマーを形成し、ＭＣＰ−１の機能を阻害した。また、ケモカインのＮ末端欠失が、ケモカインの対応する内在性単量体とのヘテロ２量体を形成することによるケモカイン受容体の相互作用の有力などミナントネガティブ阻害剤になり得、このものが関節リウマチ、炎症性腸疾患、多発性硬化症、肺繊維症等の慢性肺炎等の炎症、自己免疫疾患等の治療に有効であることが知られている（特表平１１−５０６００５号公報）。
【００１０】
本発明者は、ＭＣＰ−１／ＣＣＲ２シグナル伝達経路の遮断がＭＣＰ−１／ＣＣＲ２仲介炎症を抑制し、それによって腎虚血−再灌流傷害が改善されると仮定し、本発明の課題を解決する手段として、７ＮＤ−ＭＣＰ−１を用いてインビボでＭＣＰ−１／ＣＣＲ２シグナル伝達経路を遮断するために、電気穿孔法による遺伝子治療を評価し、本発明を完成した。
【００１１】
本発明は、課題の解決手段として、単球遊走因子−１（ＭＣＰ−１）機能阻害剤を有効成分とする、腎虚血再灌流傷害の治療・改善・予防剤を提供するものである。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明の腎虚血再灌流傷害の治療・改善・予防剤は、ＭＣＰ−１機能阻害剤を有効成分として含有する。
【００１３】
ＭＣＰ−１機能阻害剤は、生体におけるＭＣＰ−１の機能を阻害できるものであれば特に限定されるものではなく、抗ＭＣＰ−１抗体（ポリクローナル及びモノクローナルを含む）、ＭＣＰ−１アンタゴニスト（蛋白及び非蛋白低分子化合物を含む）、ＭＣＰ−１優性阻害（ドミナント・ネガティブ）変異体（蛋白及び非蛋白低分子化合物を含む）およびそれらをコードする遺伝子から選ばれた１種を挙げることができる。
【００１４】
これらの抗体、アンタゴニスト、ドミナントネガティブ及びこれらをコードする遺伝子はすでに種々のものが知られており、また公知の手法により得ることが可能なものを本発明に用いることができる。例えば、抗ＭＣＰ−１抗体は、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  １４７，  ２２２９−２２３３，  １９９１に記載の方法により得ることができ、ＭＣＰ−１アンタゴニスト及びＭＣＰ−１ドミナントネガティブは、特表平１１−５０６００５号公報等に開示されている。
【００１５】
本発明では、蛋白としてのＭＣＰ−１機能阻害剤を生体へ投与するよりも、蛋白としてのＭＣＰ−１機能阻害剤をコードする遺伝子を導入する方が、遺伝子を生体（血）中で長く存在させることができるため好ましい。
【００１６】
本発明では、ＭＣＰ−１ドミナントネガティブ変異体（Ｎ末端変異体を含む変異型ＭＣＰ−１類、より好ましくはＮ末端から数えて２から８番目のアミノ酸を欠失させた変異体７ＮＤ−ＭＣＰ−１）、ＭＣＰ−１アンタゴニストが好ましい。
【００１７】
本発明では、ＭＣＰ−１ドミナントネガティブ変異体（Ｎ末端変異体を含む変異型ＭＣＰ−１類、より好ましくはＮ末端から数えて２から８番目のアミノ酸を欠失させた変異体７ＮＤ−ＭＣＰ−１）をコードする遺伝子、ＭＣＰ−１アンタゴニストをコードする遺伝子がより好ましい。
【００１８】
ＭＣＰ−１ドミナントネガティブをコードする遺伝子は、配列表の配列番号１で表される塩基配列を有するＤＮＡが用いられる。
【００１９】
ＭＣＰ−１アンタゴニストをコードする遺伝子は、配列表の配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質が用いられる。
【００２０】
遺伝子は発現ベクターに挿入されているものが好ましく、発現ベクターは、その機能を発揮するものであれば特に限定されるものではない。発現ベクターとして、例えばプラスミド、アデノウイルスベクター、センダイウイルス〔ＨＶＪ（Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｎｇ  Ｖｉｒｕｓ  ｏｆ  Ｊａｐａｎの略）〕ベクターおよびセンダイウイルスエンベロープ（ＨＶＪ−Ｅ）ベクターから選ばれる１種を挙げることができる。
【００２１】
発現ベクターを構築する際にはプロモーターやエンハンサーを用いてもよく、プロモーターやエンハンサーは、宿主（生体）内で機能するものであれば特に限定されるものではない。プロモーターとしては、例えばＳＶ４０プロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ−ＴＫ、ＳＲα、ＲＳＶ等を挙げることができる。
【００２２】
遺伝子を宿主（生体）内で発現させるためには、リポソームも用いることができる。この場合、遺伝子はリポソームの内部、リポソームを構成する脂質二重膜の内部又は膜の外側に存在していてもよい。遺伝子を宿主（生体）内で発現させることが可能なリポソームの組成は、種々のものが知られている。
【００２３】
本発明の腎虚血再灌流傷害の治療・改善・予防剤で有効成分として含まれるＭＣＰ−１機能阻害剤は、ＭＣＰ−１ドミナント・ネガティブ変異体をコードする遺伝子を挿入したプラスミドが好ましい。
【００２４】
本発明の治療・改善・予防剤の対象となる腎虚血再灌流傷害は、腎臓移植、腎臓手術、腎損傷、腎梗塞、腎動脈狭窄、腎動脈硬化、腎硬化症、腎出血、火傷・熱傷またはショック（例えば、外的または内的要因よる生体への衝撃）に起因するものを挙げることができる。
【００２５】
本発明の腎虚血再灌流傷害の治療・改善・予防剤の生体への投与方法は、非経口的投与が望ましい。非経口的投与の方法としては注射を挙げることができ、注射は血行再建術施行部位（血管）に行ってもよいし、動脈、静脈、筋肉、皮膚、皮下等の血行再建術施行部位以外の部位に行ってもよいが、大腿筋が最も好ましい。
【００２６】
投与法として注射を選択する場合、注射薬は、生理食塩水に等張化剤、緩衝剤、保存剤、賦形剤、無痛化剤等を添加したものを用いることができる。
【００２７】
人への投与量は、患者の症状、年齢、性別、体重等により適宜検討すればよく、例えば、蛋白の場合は、０．１〜１０００ｍｇを、遺伝子の場合は、０．０１〜１００ｍｇを、２〜４週間に１回投与すればよい。
【００２８】
【実施例】
以下に、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００２９】
〔物質および方法〕
７ＮＤの発現
カルボキシル末端にエピトープタグＦＬＡＧ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）を持つヒト７ＮＤ  ｃＤＮＡは、野生種ヒトＭＣＰ−１  ｃＤＮＡ（米国フレドクリック、ＮＣＩのＴｅｉｚｏ  Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ博士より寄贈）をテンプレートとして用いて組換えポリメラーゼ連鎖反応によって作成し、ｐｃＤＮＡ３発現ベクタープラスミド（インビトロゲン；米国カリフォルニア州カールスバッド）のＢａｍＨ１（５’）およびＮｏｄ１（３’）部位内にクローニングした。
【００３０】
骨格筋におけるＦＬＡＧを持つ７ＮＤの発現は、再灌流の４時間後に抗−ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体（シグマアルドリッチ、ドイツ、ミュンヘン）を用いて、免疫組織化学法によって検出した。血清中のＦＬＡＧ結合７ＮＤは、ＦＬＡＧウェスタン検出キット（ストラタジーン、米国カリフォルニア州ラホーヤ）を用いて検出した。
【００３１】
要約すれば、血清中の７ＮＤ  ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動は、ＳＤＳ−ｐａｇｅゲルおよびＳＤＳ溶出緩衝液を用いて実施し、次にゲルからの蛋白質バンドをニトロセルロース膜に電気ブロッティングした。ＦＬＡＧウェスタン検出キットは、免疫反応性の検出に使用した。
【００３２】
さらに本発明者は、ヒトＭＣＰ−１（Ｒ＆Ｄシステムズ、米国ミネソタ州ミネアポリス）の定量サンドウィッチ酵素イムノアッセイを用いて、７ＮＤの血清レベルを評価した。このアッセイは、マウスＭＣＰ−１を含む他のケモカインと交差反応しない。
【００３３】
動物および７ＮＤ遺伝子のトランスフェクション
８週齢の近交系オスＢａｌｂ／ｃマウスは日本チャールズリバー社（日本、神奈川、厚木）より入手した。３グループのＢａｌｂ／ｃマウスについて研究した。
【００３４】
偽処置グループ、大腿筋に空プラスミド５０μｌ（１μｇ／μｌ）の投与を受けた対照グループおよび７ＮＤ遺伝子を含む空プラスミド５０μｌ（１μｇ／μｌ）の投与を受けた７ＮＤ遺伝子導入グループであった。
【００３５】
発現を向上させるために、注射直後の注射部位に電気パルス発生器ＥＣＭ８３０（ＢＴＸ、米国カリフォルニア州サンディエゴ）を用いて電気穿孔法を動物に受けさせた。
【００３６】
動物実験で用いたすべての手順は、金沢大学宝町キャンパスの動物実験における対処および用途の指針に述べられている基準に従った。
【００３７】
腎虚血モデル
遺伝子移入の７日後、左腎臓の腎動脈および静脈を６０分間閉塞させた。再灌流の０、４、２４または４８時間後、病理検査のために、各時点で５匹のマウスから腎組織を除去した。
【００３８】
組織の調製
腎組織の一部分を１０％緩衝ホルマリン中で固定し、続いてパラフィン中に埋め込み、過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）試薬と同様にヘマトキシリンおよびエオシンを用いて染色した。実験計画の事前知識をもたない２名の独立した観察者が各組織切片を評価した。髄質外部の無作為に選択した２０の高倍率フィールド（×４００）において、間質浸潤細胞の数をカウントした。観察者は、尿細管壊死の程度を評価するために設計された下記の半定量スケールを用いて評価した。スコア〔ＡＴＮ（Ａｃｕｔｅ  Ｔｕｂｕｌａｒ  Ｎｅｃｒｏｓｉｓ）スコア〕が高いほど、損傷が深刻であることを表す。（最高スコア，４）
０：正常な腎臓
１：＜５％関与（５％以下の範囲で尿細管壊死がみられる）
２：５〜２５％関与（５−２５％の範囲で尿細管壊死がみられる）
３：２５％〜７５％関与（２５ー５０％の範囲で尿細管壊死がみられる）
４：＞７５％関与。（７５％以上の範囲で尿細管壊死がみられる）
各群５匹のマウスであり、その群のスコアを平均±標準誤差で示した。
免疫組織化学研究
ＯＣＴ化合物に埋め込み、急速凍結した再灌流２４時間後の新しい腎組織の他の部分を６μｍ切除した。
【００３９】
Ｆ４／８０−陽性マクロファージ、ＣＣＲ２−陽性細胞およびＭＣＰ−１−陽性細胞の存在は、ラット抗マウスＦ４／８０モノクローナル抗体（クローン：Ａ３−１；ＢＭＡバイオメディカルズＡＧ、スイス、アウグスト）、ヤギ抗マウスＣＣＲ２抗体（ｓｃ−６２２８；サンタクルーズバイオテクノロジー、米国カリフォルニア州サンタクルーズ）またはウサギ抗マウスＭＣＰ−１抗体（金沢大学、Ｎａｏｆｕｍｉ  Ｍｕｋａｉｄａ博士より寄贈）を用いて、免疫組織化学的に検出した。
【００４０】
切片は、最初にヤギ抗マウスＣＣＲ２抗体で一晩インキュベートした。ＰＢＳ中ですすいだ後、ラット抗マウスＦ４／８０モノクローナル抗体を加え、切片を一晩インキュベートした。
【００４１】
この抗体の特異性を評価するために、本発明者は組織試験片を正常ヤギまたはラットＩｇＧでそれぞれ染色し、ＣＣＲ２蛋白質によって抗体を吸収した。
【００４２】
ＣＣＲ２染色は、切片をＦＩＴＣ結合ロバ抗ヤギＩｇＧ抗体（１：２００；ジャクソンイムノリサーチ研究所、株式会社、米国ペンシルバニア州）によって、１２０分間インキュベートすることにより視覚化した。
【００４３】
すすいだ後、切片はＣｙ３結合ロバ抗ラットＩｇＧ抗体（１：２００；ジャクソンイムノリサーチ研究所、株式会社）を用いて１２０分間インキュベートし、Ｆ４／８０を視覚化した。画像処理にはＡｄｏｂｅ（Ｒ）Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐを使用し、３色チャネルは個別に処理した。
【００４４】
髄質外部の無作為に選択した２０の高倍率フィールド（Ｘ４００）において、間質浸潤Ｆ４／８０−陽性細胞の数をカウントした。
【００４５】
さらに、ＭＣＰ−１とＦ４／８０−陽性細胞との関係を評価するために、本発明者は、ウサギ抗マウスＭＣＰ−１抗体およびラット抗マウスＦ４／８０抗体を用いて、二重標識色免疫蛍光検査免疫組織化学法を使用した。簡単には、ベクタステインＡＢＣ−アルカリホスファターゼキット（ベクターラボ、米国カリフォルニア州バーリンゲーム）を用いてＭＣＰ−１を検出した。
【００４６】
次に、スライドをメタノール中の０．１％アジ化ナトリウムおよび０．３％Ｈ２Ｏ２で１５分間固定した。この工程の後、ベクタステインＡＢＣ−ぺルオキシダーゼキット（ベクターラボ）を使用して、Ｆ４／８０を検出した。
【００４７】
ラビット抗マウスＭＣＰ−１抗体の特異性は、正常ウサギＩｇＧを使用して評価し、ＭＣＰ−１蛋白質を用いて抗体を吸収した。
【００４８】
疾患腎臓におけるＭＣＰ−１転写物の検出
ＭＣＰ−１転写物を定量するために、全長ＲＮＡを各グループの５匹のマウスの全腎臓から、再灌流の４時間後に抽出した。
【００４９】
ｃＤＮＡは、スーパースクリプトＩＩ  ＲＮａｓｅ  Ｈ−逆転写酵素（インビトロジェン、カリフォルニア州カールスバッド）により、各グループの５匹のマウスより組合わせた全長ＲＮＡ５μｇから逆転写した（マウス１匹に付きＲＮＡ１μｇ）。
【００５０】
逆転写は次のパラメータを使用して実施した：２５℃で１０分、４８℃で３０分、および９５℃で５分。
【００５１】
すべてのＰＣＲ実験で、ライトサイクラー（ロシュダイアゴノスティックス、スイス、バーゼル）を使用した。
【００５２】
次に、ライトサイクラー−ファーストスタートＤＮＡマスタＳＹＢＲグリーンＩ（ロシュダイアゴノスティックス）を用いて、ライトサイクラー内でリアルタイムＰＣＲを実施した。
【００５３】
ＭＣＰ−１（フォワード：５’−ＡＣＴＧＡＡＧＣＣＡＧＣＴＣＴＣＴＣＴＴＣＣＴＣ−３’、リバース５’−ＴＴＣＣＴＴＣＴＴＧＧＧＧＴＣＡＧＣＡＣＡＧＡＣ−３’）（１１）およびＧＡＰＤＨ（日本遺伝子研究所、日本、仙台）のプライマー、および上で調製したｃＤＮＡ２μｌを用いて、ＭＣＰ−１およびＧＡＰＤＨを検出した。
【００５４】
反応物は９５℃で１０分間インキュベートし、次に９５℃で１５秒間、５５℃で１０秒間、および７２℃で２０秒間を４０サイクル行った。
【００５５】
各サンプルにおけるＭＣＰ−１  ｍＲＮＡ発現は、ＧＡＰＤＨ発現による修正の後、最後的に記載した。各サンプルにおけるＭＣＰ−１およびＧＡＰＤＨの発現は、個別のウェルで定量した。
【００５６】
逆転写を含まないリアルタイムＰＣＲ手順では、ＰＣＲ生成物は検出されず、ゲノムＤＮＡの汚染は無視できることが示された。
【００５７】
リアルタイムＰＣＲのＭＣＰ−１またはＧＡＰＤＨの定量後のＰＣＲ生成物のゲルは、予想されたサイズ（データは示さず）の単一バンド（それぞれ２７０および２３０ｂｐ）を示した。
【００５８】
さらに本発明者は、マウスＭＣＰ−１（Ｒ＆Ｄシステムズ）の定量サンドイッチ酵素イムノアッセイを用いて、マウスＭＣＰ−１の血清レベルを評価した。このアッセイは他のケモカインと交差反応しない。
【００５９】
統計分析
本発明で決定したすべてのパラメータに対して、平均の標準誤差（ＳＥＭ）を計算した。統計分析はＡＮＯＶＡ試験を用いて実施した。統計的に有意であるとしてｐ＜０．０５を受け入れた。
【００６０】
〔結果〕
図１（大腿筋における７ＮＤの発現）
電気穿孔法を用いて遺伝子導入を実施した骨格筋におけるＦＬＡＧを持つ７ＮＤの発現は、免疫組織化学法により検出した。７ＮＤに対する陽性の線維の数は、再灌流４時間後に７ＮＤ遺伝子導入マウスによる大腿筋で観察された（矢印）（Ａ）。
【００６１】
対照マウスによる筋肉では、ＦＬＡＧ結合７ＮＤ遺伝子のそのような発現は検出されなかった（Ｂ）。
【００６２】
血清中のＦＬＡＧ結合７ＮＤは、ウェスタンブロット分析によって検出した。７ＮＤ遺伝子導入マウスにおいて再灌流４時間および４８時間後に、血清中でブロットを検出した（Ｃ）。
【００６３】
７ＮＤは７ＮＤ遺伝子導入マウスを示す。（Ａ）および（Ｂ）の当初の倍率は×４０である。
【００６４】
図２（細胞浸潤および急性尿細管壊死が減少した７ＮＤ遺伝子導入マウス）
ＰＡＳ染色腎組織を用いて組織病理学検査を実施した。多数の浸潤細胞および尿細管壊死は主に、再灌流２４時間後（Ａ）および４８時間後（Ｂ）の対照マウスの左腎臓の髄質外部で見られた。これに対して、浸潤細胞および尿細管壊死の数は、再灌流２４時間後（Ｃ）および４８時間後（Ｄ）の７ＮＤ遺伝子導入マウスの左腎臓において減少した。パネル（Ｅ）は、偽処置左腎臓の組織学的特徴を示す。
【００６５】
７ＮＤ遺伝子導入マウスの急性尿細管壊死のスコア〔ＡＴＮスコア〕は、髄質外部における再灌流２４時間および４８時間後に、対照マウスよりも著しく低かった（Ｆ）。
【００６６】
間質浸潤細胞の合計数は、再灌流２４時間後および４８時間後に、７ＮＤ遺伝子導入マウスで著しく減少した（Ｇ）。
【００６７】
７ＮＤは７ＮＤ遺伝子導入マウスを示す。当初の倍率は×４００である。値は平均±ＳＥＭである。
【００６８】
図３（７ＮＤ遺伝子導入マウスで減少した、大半はＣＣＲ２−陽性であったＦ４／８０−陽性細胞の数）
Ｆ４／８０−陽性細胞の数は、再灌流または偽処置４時間後、２４時間後および４８時間後、髄質外部の、ランダムに選択した高倍率フィールド（×４００）でカウントした。Ｆ４／８０−陽性細胞の数は、虚血−再灌流２４時間後および４８時間後の７ＮＤ遺伝子導入マウスで著しく減少した（Ａ）。
【００６９】
Ｆ４／８０−陽性細胞は、Ｃｙ３を用いて描出し、ＣＣＲ２はＦＩＴＣを用いて染色した。Ｆ４／８０−（Ｂ）およびＣＣＲ２−（Ｄ）陽性細胞は、再灌流２４時間後に虚血−再灌流腎臓の髄質外部で検出された。間質浸潤Ｆ４／８０−陽性細胞の大半は、傷害を受けた腎臓中の陽性ＣＣＲ２でもあった（Ｃ）。ＣＣＲ２の免疫活性は、正常ヤギＩｇＧによってインキュベートされた切片中で検出されなかった（Ｅ）。
【００７０】
Ｆ４／８０−陽性細胞（茶色：矢印）は、再灌流２４時間後に対照マウスにおいてＭＣＰ−１−陽性尿細管上皮細胞（赤色）の周囲を浸潤した（Ｆ）。しかし、再灌流２４時間後の７ＮＤ遺伝子導入マウスでは、より少ない数のＦ４／８０−陽性細胞（茶色：矢印）がＭＣＰ−１−陽性尿細管上皮細胞（赤色）の周囲を浸潤した（Ｇ）。
【００７１】
７ＮＤは７ＮＤ遺伝子導入マウスを示す。値は平均±ＳＥＭである。当初の倍率は×４００である。
【００７２】
虚血−再灌流４時間後のＭＣＰ−１発現
本発明者は、再灌流４時間後に、対照マウスおよび７ＮＤ遺伝子導入マウスの腎臓の両方において同等に、尿細管上皮細胞間のＭＣＰ−１陽性細胞および間質浸潤細胞を検出した。
【００７３】
さらに傷害を受けた腎臓におけるＭＣＰ−１  ｍＲＮＡの発現は、偽処置マウスと比較して、対照マウスおよび７ＮＤ遺伝子導入マウスの両方で増加した（ＭＣＰ−１／ＧＡＰＤＨ：偽、９２．３：野生種、３１５．６；７ＮＤ、７５８．３）。
【００７４】
さらに疾患腎臓におけるＭＣＰ−１の血清レベルは、再灌流４時間後の対照マウスと７ＮＤ遺伝子導入マウスで相違がなかった（偽、５７．０±２１．０ｐｇ／ｍｌ；野生種、２０１．０±４１．７ｐｇ／ｍｌ；７ＮＤ、１９８．０±１２．３ｐｇ／ｍｌ；それぞれｎ＝５）。
【００７５】
これらの結果は、虚血−再灌流自体が再灌流４時間後の対照マウスと７ＮＤ遺伝子導入マウスの両方において腎障害を同等に誘起することを示唆した。
【００７６】
７ＮＤの発現
７ＮＤに対して陽性の線維の数は、再灌流４時間後の７ＮＤ遺伝子導入マウスによる大腿筋中に見られた（図１Ａ）。
【００７７】
これに対して、対照グループによる筋肉中には、カルボキシル末端ＦＬＡＧエピトープタグ付き７ＮＤ遺伝子は検出されなかった（図１Ｂ）。
【００７８】
さらに、ＦＬＡＧ蛋白質の血清のウェスタンブロット分析は、ＦＬＡＧエピトープタグ付き７ＮＤが７ＮＤ遺伝子導入マウスの血清中に、効果的に分泌されることを示した（図１Ｃ）。
【００７９】
さらに、実験中に７ＮＤの血清レベルが上昇した（偽、検出できず；４時間、４７．４±４．３ｐｇ／ｍｌ；２４時間、３６±６．５ｐｇ／ｍｌ；４８時間、３５．２±４．０ｐｇ／ｍｌ；それぞれｎ＝５）。
【００８０】
急性尿細管壊死および間質細胞浸潤の程度を著しく低下させた７ＮＤ処置
対照マウスにおける虚血−再灌流の４時間後、２４時間後および４８時間後、対照マウスの髄質外部の虚血−再灌流後に、顕著な急性尿細管壊死および多数の細胞浸潤が誘起された（図２Ａ、Ｂ、Ｆ、Ｇ）。
【００８１】
７ＮＤ遺伝子導入マウスにおける急性尿細管壊死のスコアは、虚血−再灌流２４時間後および４８時間後の対照マウスにおいて著しく低かった（図２Ｃ、Ｄ、Ｆ）。
【００８２】
さらに７ＮＤ処置は、対照マウスと比較して虚血−再灌流４時間後、２４時間後および４８時間後の浸潤細胞の数を減少させた（図２Ｃ、Ｄ、Ｇ）。偽処置左腎臓および右対照腎臓の組織的特徴は、正常腎臓と本質的に同じであった（図２Ｅ）。
【００８３】
７ＮＤ遺伝子導入マウスにおける間質Ｆ４／８０−陽性細胞の減少
本発明者は、対照マウスと比較して、再灌流２４時間後および４８時間後に７ＮＤ遺伝子導入マウスにおいて間質Ｆ４／８０−陽性細胞の著しい減少を観察した（図３Ａ）。
【００８４】
Ｆ４／８０−（図３Ｂ）およびＣＣＲ２−陽性細胞は、再灌流２４時間後に虚血−再灌流腎臓で検出された（図３Ｄ）。
【００８５】
大半の間質Ｆ４／８０−陽性細胞も、再灌流２４時間後に、傷害を受けた腎臓中のＣＣＲ２に対して陽性であった（図３Ｃ）。
【００８６】
Ｆ４／８０細胞は、再灌流２４時間後の対照マウスのＭＣＰ−１−陽性細胞周囲に浸潤した（図３Ｄ）。
【００８７】
しかし、より少数のＦ４／８０−陽性細胞が、再灌流２４時間後の７ＮＤ遺伝子導入マウスのＭＣＰ−１−陽性細胞の周囲に浸潤した（図３Ｆ）。
【００８８】
考察
本発明において、本発明者は、突然変異遺伝子７ＮＤの筋肉内導入によるＭＣＰ−１／ＣＣＲ２シグナル伝達経路の出生後遮断が、急性尿細管壊死および間質細胞浸潤を含む虚血−再灌流における腎傷害を著しく減少させることを証明した。付随して、大半がＣＣＲ２−陽性であるマクロファージは、７ＮＤによって大幅に減少する。全体から見ると、７ＮＤ遺伝子を用いたＭＣＰ−１／ＣＣＲ２シグナル伝達経路の抑制は、腎臓における虚血−再灌流傷害に有益な治療法である。
【００８９】
本発明は、腎虚血−再灌流傷害の治療標的として、ＭＣＰ−１／ＣＣＲ２シグナル伝達経路を強く示している。本発明者はここで、７ＮＤ遺伝子導入マウスにおいて、間質浸潤マクロファージの数が著しく減少したことを証明した。ＭＣＰ−１はマクロファージにとって最も強力な化学走化性因子の一つであり、ＣＣＲ２はＭＣＰ−１にとって重要な同族受容体である。
【００９０】
本発明者は、傷害を受けた腎臓における浸潤マクロファージのほとんどがＣＣＲ２−陽性であることを証明した。化学走化性に加えて、ＭＣＰ−１は接着分子の発現にも関与し、傷害を受けた腎臓の実質内への、マクロファージの血管外遊出を生じた。その上、ＭＣＰ−１はマクロファージからのリソゾーム酵素の放出とスーパーオキシドアニオンの生成を誘起し、組織破壊を引き起こす。付随して、ＣＣＲ２欠乏マウスは複数の疾患モデルにおいて、マクロファージの補充に失敗した。
【００９１】
これらのデータは、組織破壊につながる疾患臓器への補充と同様に、マクロファージの活性化におけるＣＣＲ２の決定的な寄与を示唆した。全体から見ると、ＭＣＰ−１／ＣＣＲ２シグナル伝達経路は、虚血−再灌流傷害にとって重要であり、その抑制は、おそらくマクロファージの浸潤および活性化の減少による腎傷害を終止させるのに効果的でありうる。
【００９２】
本発明は、虚血−再灌流傷害における７ＮＤ遺伝子導入の治療効力を明らかにした。ＲＡＮＴＥＳ（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｕｐｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ、ｎｏｒｍａｌ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ）およびＭＣＰ−３等のアミノ末端切断ケモカインは、生物反応を誘起せずにそれぞれの受容体となお結合し、それゆえ真に競合的な受容体拮抗物質であることが最近報告された。
【００９３】
さらに、ＭＣＰ−１のアミノ末端は、ＭＣＰ−１が化学誘引活性を維持するために不可欠である。その上、７ＮＤが野生種ＭＣＰ−１とともに不活性ヘテロダイマー構造を形成し、インビトロでの単球走化性を抑制することが報告された。これらに基づいて、７ＮＤ遺伝子導入は動脈硬化および管状血管組織修復の形成をこれまで保護している。それゆえ７ＮＤ遺伝子導入は、ＭＣＰ−１／ＣＣＲ２シグナル伝達経路を効率的に遮断し、ＭＣＰ−１／ＣＣＲ２関連疾患の進行を阻止しうる。本研究の期間中には明らかな副作用は観察されなかったが、将来の研究においては長期間に渡る慎重な観察が必要となるであろう。
【００９４】
本発明は、７ＮＤ処置マウスにおいて好中球の数が減少することを明らかにした。本発明者や他の研究者は、虚血−再灌流傷害における好中球の重要性を以前に報告した。最近の研究は、炎症が好中球でのＣＣＲ２発現をアップレギュレートすることを明らかにした。さらに複数の研究は、ＭＣＰ−１およびＣＣＲ２がインビボでの急性および慢性炎症状態において好中球の走化性を促進することを報告した。好中球の浸潤に関与するＣＸＣケモカインは、単球によって分泌されることが報告されているため、浸潤単球の数が減少し、７ＮＤによる単球の活性化の遮断がＣＸＣケモカイン発現を減少させうる。その上、活性化好中球は、活性酸素種および、セリンプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、チオールプロテアーゼおよびアスパラギン酸プロテアーゼ等の蛋白質分解酵素の潜在的な発生源であり、組織破損を引き起こす。７ＮＤ遺伝子導入はひとまとめにして、好中球浸潤に関与し、マウスの虚血−再灌流の初期段階における尿細管壊死を引き起こしうる。
【００９５】
炎症に対する抗ＭＣＰ−１治療に関する多くの実験および議論が検討されてきたにもかかわらず、虚血−再灌流傷害に対する特異的かつ有効な治療はこれまで利用できなかった。ＭＣＰ−１は虚血−再灌流傷害だけでなく、ＭＣＰ−１自体またはＣＣＲ２欠乏マウスを用いた各種の炎症にも関与することが証明されている。
【００９６】
したがって、マクロファージの浸潤および活性化につながるＭＣＰ−１／ＣＣＲ２シグナル伝達の調節は、腎傷害を含む炎症において治療上の潜在能力を持ちうる。それゆえ７ＮＤは、腎臓における虚血−再灌流傷害に対して非常に有効で効率的である、魅力的な治療上のアプローチとなりうる。
【００９７】
【発明の効果】
本発明のＭＣＰ−１機能阻害剤を有効成分とする腎虚血再灌流傷害の治療・改善・予防剤は、腎臓移植、腎臓手術、腎損傷、腎梗塞、腎動脈狭窄、腎動脈硬化、腎硬化症、腎出血、火傷・熱傷またはショックに起因する腎虚血再灌流傷害の治療・改善・予防剤として有用である。
【００９８】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】Ａは、遺伝子導入を実施したマウス骨格筋（大腿筋）における７ＮＤの発現を示した図である。
Ｂは、遺伝子導入しなかった対照マウスの筋肉には、７ＮＤの発現が検出されなかったことを示した図である。
Ｃは、血清中のＦＬＡＧ結合７ＮＤを、ウェスタンブロット分析によって検出した図である。
【図２】対照マウスと比較し、７ＮＤ遺伝子導入マウスにおいて、細胞浸潤および急性尿細管壊死が減少したことを示す組織病理学検査像である。
Ａは、対照マウスにおける再灌流２４時間後、左腎臓の髄質外部の組織病理学検査像である。
Ｂは、対照マウスにおける再灌流４８時間後、左腎臓の髄質外部の組織病理学検査像である。
Ｃは、７ＮＤ遺伝子導入マウスにおける再灌流２４時間後、左腎臓の髄質外部の組織病理学検査像である。
Ｄは、７ＮＤ遺伝子導入マウスにおける再灌流４８時間後、左腎臓の髄質外部の組織病理学検査像である。
Ｅは、偽処置左腎臓の組織学的特徴を示した検査像である。
Ｆは、髄質外部における急性尿細管壊死のスコア〔ＡＴＮスコア〕を、再灌流２４時間および４８時間後に、７ＮＤ遺伝子導入マウスと対照マウスで比較したグラフである。
Ｇは、間質浸潤細胞の合計数を、再灌流２４時間後および４８時間後に、７ＮＤ遺伝子導入マウスと対照マウスで比較したグラフである。
【図３】Ａは、髄質外部のＦ４／８０−陽性細胞数を、再灌流または偽処置４時間後、２４時間後および４８時間後に、７ＮＤ遺伝子導入マウスと対照マウスで比較したグラフである。
Ｂは、７ＮＤ遺伝子導入マウスにおける再灌流２４時間後の、間質浸潤Ｆ４／８０−陽性細胞を示す図である。
Ｃは、７ＮＤ遺伝子導入マウスにおける再灌流２４時間後の、間質浸潤Ｆ４／８０−陽性細胞の大半は、傷害を受けた腎臓中の陽性ＣＣＲ２であったことを示す図である。
Ｄは、７ＮＤ遺伝子導入マウスにおける再灌流２４時間後の、間質浸潤ＣＣＲ２−陽性細胞を示す図である。
Ｅは、ＣＣＲ２の免疫活性は、正常ヤギＩｇＧによってインキュベートされた切片中で検出されなかったことを示す図である。
Ｆは、Ｆ４／８０−陽性細胞は、再灌流２４時間後に対照マウスにおいてＭＣＰ−１−陽性尿細管上皮細胞の周囲を浸潤したことを示す図である。
Ｇは、再灌流２４時間後の７ＮＤ遺伝子導入マウスでは、より少ない数のＦ４／８０−陽性細胞がＭＣＰ−１−陽性尿細管上皮細胞の周囲を浸潤したことを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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