【誤訳訂正書】
【提出日】平成26年3月3日(2014.3.3)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
虚血性心筋症の診断又は予測のための、標準試料における１つ又は複数のｍｉＲＮＡのレベルと比較した生体試料における１つ又は複数のｍｉＲＮＡの発現レベルの差の存在を確認する方法であって、
ａ．生体試料における１つ又は複数のｍｉＲＮＡの発現レベルを測定することであって、当該１つ又は複数のｍｉＲＮＡが、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ａ（配列番号２５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５（配列番号４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１００（配列番号７）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４２（配列番号１４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２８（配列番号２４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ（配列番号３０）、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ（配列番号５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２１（配列番号１７）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８６（配列番号１１）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３３ａ（配列番号１５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０（配列番号１２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２２ｂ（配列番号１６）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ（配列番号１８）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ（配列番号２２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１（配列番号２３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２２（配列番号２０）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｃ（配列番号２８）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３３ｂ（配列番号１９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２４（配列番号２１）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８４（配列番号２９）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｄ（配列番号３１）、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ｂ（配列番号４８）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｂ（配列番号４９）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｅ（配列番号５０）、及びｈｓａ−ｌｅｔ−７ｇ（配列番号５１）から選択され、
ｂ．前記生体試料における１つ又は複数のｍｉＲＮＡの発現レベルを、標準試料における１つ又は複数のｍｉＲＮＡのレベルと比較することと、
を含み、
前記標準試料における１つ又は複数のｍｉＲＮＡのレベルと比較した前記生体試料における少なくとも１つ又は複数のｍｉＲＮＡの発現レベルの差が、虚血性心筋症の診断又は予測に用いられることができる、方法。
【請求項２】
特発性拡張型心筋症の診断又は予測のための、標準試料における１つ又は複数のｍｉＲＮＡのレベルと比較した生体試料における１つ又は複数のｍｉＲＮＡの発現レベルの差の存在を確認する方法であって、
ａ．生体試料における１つ又は複数のｍｉＲＮＡの発現レベルを測定することであって、当該１つ又は複数のｍｉＲＮＡが、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ（配列番号２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５（配列番号４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１００（配列番号７）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｂ（配列番号２６）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ａ（配列番号１０）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３８２（配列番号３３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３３ａ（配列番号１５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３３ｂ（配列番号１９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２１（配列番号１７）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９７（配列番号３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｃ（配列番号１３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ（配列番号５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２（配列番号９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８６（配列番号１１）、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４２−５ｐ（配列番号１）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３９（配列番号６）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０（配列番号１２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０ｂ（配列番号３２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８３（配列番号８）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２２ｂ（配列番号１６）、及びｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ（配列番号２７）から選択され、
ｂ．前記生体試料における１つ又は複数のｍｉＲＮＡの発現レベルを、標準試料における１つ又は複数のｍｉＲＮＡのレベルと比較することと、
を含み、
前記標準試料における１つ又は複数のｍｉＲＮＡのレベルと比較した前記生体試料における少なくとも１つ又は複数のｍｉＲＮＡの発現レベルの差が、特発性拡張型心筋症の診断又は予測に用いられることができる、方法。
【請求項３】
ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５（配列番号４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１００（配列番号７）、ｈｓｈｓａ−ｍｉＲ−３４２（配列番号１４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２８（配列番号２４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ａ（配列番号２５）、及びｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ（配列番号３０）から選択される前記１つ又は複数のｍｉＲＮＡの増加、又は
ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ（配列番号５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２１（配列番号１７）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８６（配列番号１１）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３３ａ（配列番号１５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０（配列番号１２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２２ｂ（配列番号１６）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ（配列番号１８）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ（配列番号２２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１（配列番号２３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２２（配列番号２０）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｃ（配列番号２８）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３３ｂ（配列番号１９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２４（配列番号２１）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８４（配列番号２９）、及びｈｓａ−ｌｅｔ−７ｄ（配列番号３１）から選択される前記１つ又は複数のｍｉＲＮＡの減少が、
前記虚血性心筋症の診断又は予測に用いられる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ（配列番号２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５（配列番号４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１００（配列番号７）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ａ（配列番号１０）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｂ（配列番号２６）、及びｈｓａ−ｍｉＲ−３８２（配列番号３３）から選択される前記１つ又は複数のｍｉＲＮＡの増加、又は
ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ（配列番号５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２（配列番号９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８６（配列番号１１）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｃ（配列番号１３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３３ａ（配列番号１５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２１（配列番号１７）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９７（配列番号３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４２−５ｐ（配列番号１）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３９（配列番号６）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３３ｂ（配列番号１９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０（配列番号１２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０ｂ（配列番号３２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８３（配列番号８）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２２ｂ（配列番号１６）、及びｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ（配列番号２７）から選択される前記１つ又は複数のｍｉＲＮＡの減少が、
前記特発性拡張型心筋症の診断又は予測に用いられる、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
被験者において虚血性心筋症を治療又は予防するための医薬組成物であって、治療有効量のｍｉＲＮＡ模倣物を含む、医薬組成物であり、
前記ｍｉＲＮＡ模倣物が、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ（配列番号５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２１（配列番号１７）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８６（配列番号１１）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３３ａ（配列番号１５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０（配列番号１２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２２ｂ（配列番号１６）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ（配列番号１８）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ（配列番号２２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１（配列番号２３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２２（配列番号２０）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｃ（配列番号２８）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３３ｂ（配列番号１９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２４（配列番号２１）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８４（配列番号２９）、及びｈｓａ−ｌｅｔ−７ｄ（配列番号３１）から選択される１つ又は複数のｍｉＲＮＡの模倣物である、
医薬組成物。
【請求項６】
被験者において虚血性心筋症を治療又は予防するための医薬組成物であって、治療有効量のｍｉＲＮＡインヒビターを含む、医薬組成物であり、
前記ｍｉＲＮＡインヒビターが、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５（配列番号４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１００（配列番号７）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４２（配列番号１４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２８（配列番号２４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ａ（配列番号２５）、及びｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ（配列番号３０）から選択されるｍｉＲＮＡの１つ又は複数のインヒビターである、
医薬組成物。
【請求項７】
被験者において特発性拡張型心筋症を治療又は予防するための医薬組成物であって、治療有効量のｍｉＲＮＡ模倣物を含む、医薬組成物であり、
前記ｍｉＲＮＡ模倣物が、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ（配列番号５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３９（配列番号６）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８３（配列番号８）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２（配列番号９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８６（配列番号１１）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０（配列番号１２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｃ（配列番号１３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３３ａ（配列番号１５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２１（配列番号１７）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９７（配列番号３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４２−５ｐ（配列番号１）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３３ｂ（配列番号１９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ（配列番号２７）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２２ｂ（配列番号１６）、及びｈｓａ−ｍｉＲ−１０ｂ（配列番号３２）から選択される１つ又は複数のｍｉＲＮＡの模倣物である、
医薬組成物。
【請求項８】
前記ｍｉＲＮＡ模倣物が、前記１つ又は複数のｍｉＲＮＡの配列を含む、請求項５又は７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
被験者において特発性拡張型心筋症を治療又は予防するための医薬組成物であって、治療有効量のｍｉＲＮＡインヒビターを含む、医薬組成物であり、
前記ｍｉＲＮＡインヒビターが、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ（配列番号２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５（配列番号４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１００（配列番号７）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ａ（配列番号１０）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４２（配列番号１４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２８（配列番号２４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ａ（配列番号２５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｂ（配列番号２６）、及びｈｓａ−ｍｉＲ−３８２（配列番号３３）から選択される１つ又は複数のｍｉＲＮＡのインヒビターである、
医薬組成物。
【請求項１０】
前記ｍｉＲＮＡインヒビターが、前記１つ又は複数のｍｉＲＮＡと相補的な配列を含む、請求項６又は９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記ｍｉＲＮＡインヒビターがアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
第２の心臓治療薬と一緒に投与される、請求項５ないし１１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記第２の心臓治療薬が、強心薬、神経液性遮断薬、アルドステロン拮抗薬、利尿薬、血管拡張薬、エンドセリン受容体拮抗薬、及びＨＤＡＣ阻害薬からなる群から選択される、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記第２の心臓治療薬が、前記ｍｉＲＮＡ模倣物又は前記ｍｉＲＮＡインヒビターと併用投与される、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記第２の心臓治療薬が、前記ｍｉＲＮＡ模倣物又は前記ｍｉＲＮＡインヒビターの前又は後に投与される、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
薬学的に許容可能な担体をさらに含む、請求項５ないし１１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
心臓細胞に投与される、請求項５ないし１１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
被験者における虚血性心筋症又は特発性拡張型心筋症の治療をモニタする方法であって、
ａ．第１の時点で前記被験者からの第１の生体試料を得ることであって、前記第１の時点が虚血性心筋症又は特発性拡張型心筋症の薬物治療プロトコルの開始前である、ことと、
ｂ．第２の時点で前記被験者からの第２の生体試料を得ることであって、前記第２の時点が虚血性心筋症又は特発性拡張型心筋症の薬物治療プロトコルの開始後である、ことと、
ｃ．前記第１の生体試料及び前記第２の生体試料を、ｍｉＲＮＡアレイ解析、ｍＲＮＡアレイ解析又は標的プロテオーム発現解析によって処理することであって、前記虚血性心筋症の治療をモニタするための前記ｍｉＲＮＡアレイ解析が、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ａ（配列番号２５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５（配列番号４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１００（配列番号７）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４２（配列番号１４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２８（配列番号２４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ（配列番号３０）、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ（配列番号５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２１（配列番号１７）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８６（配列番号１１）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３３ａ（配列番号１５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０（配列番号１２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２２ｂ（配列番号１６）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ（配列番号１８）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ（配列番号２２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１（配列番号２３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２２（配列番号２０）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｃ（配列番号２８）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３３ｂ（配列番号１９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２４（配列番号２１）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８４（配列番号２９）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｄ（配列番号３１）、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ｂ（配列番号４８）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｂ（配列番号４９）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｅ（配列番号５０）、及びｈｓａ−ｌｅｔ−７ｇ（配列番号５１）から選択される１つ又は複数のｍｉＲＮＡの発現を測定することを含み、前記特発性拡張型心筋症の治療をモニタするための前記ｍｉＲＮＡアレイ解析が、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ（配列番号２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５（配列番号４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１００（配列番号７）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｂ（配列番号２６）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ａ（配列番号１０）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３８２（配列番号３３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３３ａ（配列番号１５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３３ｂ（配列番号１９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２１（配列番号１７）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９７（配列番号３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｃ（配列番号１３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２ａ（配列番号５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２（配列番号９）  ｈｓａ−ｍｉＲ−４８６（配列番号１１）、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４２−５ｐ（配列番号１）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３９（配列番号６）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０（配列番号１２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０ｂ（配列番号３２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８３（配列番号８）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２２ｂ（配列番号１６）、及びｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ（配列番号２７）から選択される１つ又は複数のｍｉＲＮＡの発現を測定することを含み、
ｄ．前記第１の生体試料からのｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、及びタンパク質の発現データを、前記第２の生体試料からの発現データと比較して、前記薬物治療プロトコルの有効性の指標となる遺伝子発現パターンの変化を測定することと、
を含む、方法。
【請求項１９】
前記第１の時点と前記第２の時点との間隔が、約３〜９ヶ月である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ｍＲＮＡ解析が、Affymetrixプロトコルによって実施される、請求項１８に記載の方法。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１８】
本発明はまた、被験者において心不全の治療をモニタする方法も包含する。一実施形態において、本方法は、第１の時点で被験者から第１の生体試料を採取することであって、第１の時点が心不全の薬物治療プロトコルの開始前である、ことと；第２の時点で被験者から第２の生体試料を採取することであって、第２の時点が心不全の薬物治療プロトコルの開始後である、ことと；第１の生体試料及び第２の生体試料を、ｍｉＲＮＡアレイ解析、ｍＲＮＡアレイ解析及び標的プロテオーム発現解析によって処理することと；第１の生体試料からのｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、及びタンパク質の発現データを、第２の生体試料からの発現データと比較して、遺伝子発現パターンの変化を測定することであって、遺伝子発現の変化が薬物治療プロトコルの有効性の指標となる、こととを含む。別の実施形態において、第１の時点と第２の時点との間隔は、約３〜９ヶ月である。別の実施形態において、ｍＲＮＡ解析は、Affymetrixプロトコルによって実施される。
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１９】
図面の簡単な説明
【図１】(図１Ａ）ｍｉＲＮＡの相対的発現。非不全心（ＮＦ、ｎ＝６）と特発性拡張型心筋症の不全心（ＩＤＣ、ｎ＝５）との対比。解析は、LC Sciences（Houston,TX）のSanger human miRBase 9.0対応ｍｉＲＮＡ発現アレイチップ、４７０個のｍｉＲＮＡのデータセットで実施した。データは擬似温度尺度で表され、赤色が発現の増加を表し、緑色が発現の減少を表す。有意にアップレギュレーション又はダウンレギュレーションされた（ｐ＜０．０５）ｍｉＲＮＡのみを示す。（図１Ｂ）ｍｉＲＮＡの相対的発現。ＮＦ心と虚血性心筋症の不全心（ＩＳＣ、ｎ＝５）との対比。解析は、LC Sciences（Houston,TX）のSanger human miRBase 9.0対応ｍｉＲＮＡ発現アレイチップ、４７０個のｍｉＲＮＡのデータセットで実施した。データは擬似温度尺度で表され、赤色が発現の増加を表し、緑色が発現の減少を表す。有意にアップレギュレーション又はダウンレギュレーションされた（ｐ＜０．０５）ｍｉＲＮＡのみを示す。
【図２】ヒトの非不全心（ＮＦ、ｎ＝６）と不全心（ＩＤＣ又はＩＳＣＨ、ｎ＝５，５）との対比における相対的なｍｉＲＮＡ発現をグラフで表したもの。特定のｍｉＲＮＡはいずれのタイプの不全心においてもアップレギュレーション又はダウンレギュレーションされるのに対し、他のｍｉＲＮＡは心不全のタイプによって発現が異なることに留意されたい。
【図３】差次的発現（differential expression)がｐ＜０．０５に達したｍｉＲＮＡのサブセットの相対的発現。
【図４】非不全（ＮＦ）、特発性心筋症（ＩＤＣ）又は虚血性心筋症（ＩＳＣ）の被験者から抽出されたＲＮＡから、ＲＴ−ＰＣＲによって評価したときのｍｉＲＮＡ発現レベル。ｍｉＲＮＡ発現は、非不全心と不全心とで発現が変わらないｍｉＲ−２４の発現に対して基準化した。統計解析はＡＮＯＶＡを用いて行った。
【図５】ｍｉＲ−９２模倣物又はｍｉＲ−９２インヒビターをトランスフェクトした新生仔ラット心室筋細胞における胎児遺伝子発現の変化。細胞は、トランスフェクション後２４時間で１０−７Ｍのイソプロテレノール（ＩＳＯ；黒色バー）により処置し、処置後４８時間で回収した。遺伝子発現はＲＴ−ＰＣＲによって計測した。結果は１８Ｓ ｒＲＮＡ発現レベルに対して基準化し、１と定義した対照の模倣物又はインヒビター（１のライン）をトランスフェクト細胞と比較した。グラフは、３〜４回の個別の実験の平均値を表す。
【図６】ｍｉＲ−１００模倣物又はｍｉＲ−１００インヒビターをトランスフェクトした新生仔ラット心室筋細胞における胎児遺伝子発現の変化。細胞は、トランスフェクション後２４時間で１０−７Ｍのイソプロテレノール（ＩＳＯ；黒色バー）により処置し、処置後４８時間で回収した。遺伝子発現はＲＴ−ＰＣＲによって計測した。結果は１８Ｓ ｒＲＮＡ発現レベルに対して基準化し、１と定義した対照の模倣物又はインヒビター（１のライン）をトランスフェクト細胞と比較した。グラフは、３〜４回の個別の実験の平均値を表す。
【図７】ｍｉＲ−１３３ｂ模倣物又はｍｉＲ−１３３ｂインヒビターをトランスフェクトした新生仔ラット心室筋細胞における胎児遺伝子発現の変化。細胞は、トランスフェクション後２４時間で１０−７Ｍのイソプロテレノール（ＩＳＯ；黒色バー）により処置し、処置後４８時間で回収した。遺伝子発現はＲＴ−ＰＣＲによって計測した。結果は１８Ｓ ｒＲＮＡ発現レベルに対して基準化し、１と定義した対照模倣物又はインヒビター（１のライン）をトランスフェクト細胞と比較した。グラフは、３〜４回の個別の実験の平均値を表す。
【図８】模倣物ｍｉＲＮＡ又はインヒビターｍｉＲＮＡをトランスフェクトしたときのｍｉＲＮＡレベル。ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ−１００及びｍｉＲ−１３３ｂの模倣物及びインヒビターを、新生仔ラット心室筋細胞にトランスフェクトした。各ｍｉＲＮＡの発現レベルはＲＴ−ＰＣＲによって評価した。
【図９】新生仔ラット心室筋細胞においてｍｉＲＮＡ−１３３ｂを過剰発現させるか、又はダウンレギュレーションすると、細胞肥大が調節される。細胞は、ｍｉＲ−１３３ｂ模倣物（下側パネル）又はｍｉＲ−１３３ｂインヒビター（上側パネル）をトランスフェクトし、イソプロテレノール処置に供するか（右側パネル）、又はそれ以上の処置は行わなかった（左側パネル）。図は、抗アクチニン抗体による免疫蛍光を示す。
【図１０】新生仔ラット心室筋細胞においてｍｉＲＮＡ−１３３ｂを過剰発現させるか、又はダウンレギュレーションすると、細胞肥大が調節される。細胞は、ｍｉＲ−１３３ｂ模倣物又はｍｉＲ−１３３ｂインヒビターをトランスフェクトし、トランスフェクト細胞のサブセットをイソプロテレノールに曝露した（黒色バー）。細胞サイズはImage Jソフトウェアを使用して計測した。３つの異なる領域からの合計３０個の細胞を計測した。
【図１１】ｍｉＲＮＡに基づく標的発見方法に向けた統合的な手法としての連続的遺伝子発現解析（serial analysis of gene expression：ＳＡＧＥ）の概略図。ｍｉＲＮＡアレイ解析、ｍＲＮＡ（Affymetrix）アレイ解析、及び（標的）プロテオーム発現解析用の生体試料の提供には、心不全（ＨＦ）患者からの心内膜心筋生検が用いられる。
【図１２】β遮断薬で処置したヒト患者におけるｍｉＲ−１３３の発現。β遮断薬で処置した患者からの試料に対してＲＴ−ＰＣＲ解析を実施した。末期心不全（Ａ）、処置後３ヶ月（Ｂ）及び処置後１２ヶ月（Ｃ）において一連の生検を採取した。ｍｉＲ−１３３ｂ（上のパネル）及びｍｉＲ−１３３ａ（下のパネル）の発現レベルは、ｍｉＲ−３７０（右のパネル）及び低分子ＲＮＡ ＲＮＵ６６（左のパネル）の発現に対して基準化した。患者２０、２１、２５及び３４はβ遮断薬処置に反応したが、患者１０３はこの処置に反応しなかった。
【図１３】β遮断薬で処置したヒト患者におけるｍｉＲ−１及びｍｉＲ−１９ｂの発現。β遮断薬で処置した患者からの試料に対してＲＴ−ＰＣＲ解析を実施した。末期心不全（Ａ）、処置後３ヶ月（Ｂ）及び処置後１２ヶ月（Ｃ）において一連の生検を採取した。ｍｉＲ−１（上のパネル）及びｍｉＲ−１９ｂ（下のパネル）の発現レベルは、ｍｉＲ−３７０（右のパネル）及び低分子ＲＮＡ ＲＮＵ６６（左のパネル）の発現に対して基準化した。患者２０、２１、２５及び３４はβ遮断薬処置に反応したが、患者１０３はこの処置に反応しなかった。
【図１４】β遮断薬で処置したヒト患者におけるｍｉＲ−３０ｄ及びｍｉＲ−９２ａの発現。β遮断薬で処置した患者からの試料に対してＲＴ−ＰＣＲ解析を実施した。末期心不全（Ａ）、処置後３ヶ月（Ｂ）及び処置後１２ヶ月（Ｃ）において一連の生検を採取した。ｍｉＲ−３０ｄ（上のパネル）及びｍｉＲ−９２ａ（下のパネル）の発現レベルは、ｍｉＲ−３７０（右のパネル）及び低分子ＲＮＡ ＲＮＵ６６（左のパネル）の発現に対して基準化した。患者２０、２１、２５及び３４はβ遮断薬処置に反応したが、患者１０３はこの処置に反応しなかった。
【図１５】β遮断薬で処置したヒト患者におけるｍｉＲ−２０８ｂ及びｍｉＲ−４９９の発現。β遮断薬で処置した患者からの試料に対してＲＴ−ＰＣＲ解析を実施した。末期心不全（Ａ）、処置後３ヶ月（Ｂ）及び処置後１２ヶ月（Ｃ）において一連の生検を採取した。ｍｉＲ−２０８ｂ（上のパネル）及びｍｉＲ−４９９（下のパネル）の発現レベルは、ｍｉＲ−３７０（右のパネル）及び低分子ＲＮＡ ＲＮＵ６６（左のパネル）の発現に対して基準化した。患者２０、２１、２５及び３４はβ遮断薬処置に反応したが、患者１０３はこの処置に反応しなかった。
【図１６】β遮断薬で処置したヒト患者におけるｍｉＲ−ｌｅｔ−７ｇの発現。β遮断薬で処置した患者からの試料に対してＲＴ−ＰＣＲ解析を実施した。末期心不全（Ａ）、処置後３ヶ月（Ｂ）及び処置後１２ヶ月（Ｃ）において一連の生検を採取した。ｍｉＲ−ｌｅｔ−７ｇの発現レベルは、ｍｉＲ−３７０（右のパネル）及び低分子ＲＮＡ ＲＮＵ６６（左のパネル）の発現に対して基準化した。患者２０、２１、２５及び３４はβ遮断薬処置に反応したが、患者１０３はこの処置に反応しなかった。
【図１７】（図１７Ａ）ｍｉＲ−９２ａはＰＫＣεを標的とする。ｍｉＲ−９２ａ模倣物、ｍｉＲ−９２ａインヒビター、又はスクランブル対照配列をトランスフェクトしたラット新生仔心筋細胞のウエスタンブロット解析。ＰＫＣε（ｎ＝２）を探索したブロット。ローディング対照としてカルネキシン発現を用いた。（図１７Ｂ）ｍｉＲ−９２ａはＰＤＥ１Ａを標的とする。ｍｉＲ−９２ａ模倣物、ｍｉＲ−９２ａインヒビター、又はスクランブル対照配列をトランスフェクトしたラット新生仔心筋細胞のウエスタンブロット解析。ＰＤＥ１Ａ（ｎ＝ｌ）を探索したブロット。ローディング対照としてカルネキシン発現を用いた。
【図１８】（図１８Ａ）ｍｉＲ−１３３ｂはカルモジュリンを標的とする。ｍｉＲ−１３３ｂ模倣物、ｍｉＲ−１３３ｂインヒビター、又はスクランブル対照配列をトランスフェクトしたラット新生仔心筋細胞におけるカルモジュリンのｍＲＮＡ発現のＲＴ−ＰＣＲ解析。カルモジュリン発現レベルは、１８Ｓリボソームサブユニットの発現レベルに対して基準化した。ｎ＝３。（図１８Ｂ）ｍｉＲ−１３３ｂはカルモジュリンを標的とする。カルモジュリン３’ＵＴＲに結合したルシフェラーゼコード領域を含む構築物と共に、ｍｉＲ−１３３ｂ模倣物、ｍｉＲ−１３３ｂインヒビター、又はスクランブル対照配列を共トランスフェクトしたラット新生仔心筋細胞におけるルシフェラーゼ活性。ｎ＝３。（図１８Ｃ）ｍｉＲ−１３３ｂはカルモジュリンを標的とする。ｍｉＲ−１３３ｂ模倣物、ｍｉＲ−１３３ｂインヒビター、又はスクランブル対照配列をトランスフェクトしたラット新生仔心筋細胞のカルモジュリンについてのウエスタンブロット解析。ローディング対照としてカルネキシン発現を用いた。ｎ＝３。
【誤訳訂正４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００５９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００５９】
本発明はまた、被験者において心不全の治療をモニタする方法も企図する。一実施形態において、本方法は、第１の時点で被験者から第１の生体試料を採取することであって、第１の時点が心不全の薬物治療プロトコルの開始前である、ことと；第２の時点で被験者から第２の生体試料を採取することであって、第２の時点が心不全の薬物治療プロトコルの開始後である、ことと；第１の生体試料及び第２の生体試料を、ｍｉＲＮＡアレイ解析、ｍＲＮＡアレイ解析及び標的プロテオーム発現解析によって処理することと；第１の生体試料からのｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、及びタンパク質の発現データを、第２の生体試料からの発現データと比較して、薬物治療プロトコルの有効性の指標となる遺伝子発現パターンの変化を測定すること、とを含む。第１の時点と第２の時点との間隔は、約３〜約１８ヶ月、約３〜約１２ヶ月、又は好ましくは約３〜約９ヶ月であってもよい。薬物治療プロトコルの開始後いくつかの時点で、各患者から追加の生体試料が採取されてもよい。ある実施形態において、薬物治療プロトコルの開始後２つ以上の試料が採集される。他の実施形態において、薬物治療プロトコルの開始後３つ以上の試料が採集される。試料は、約３ヶ月毎、約６ヶ月毎、約９ヶ月毎、又は約１２ヶ月毎に採集されてもよい。
【誤訳訂正５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００７０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００７０】
アレイ解析：試料をLC Sciences, LLC, Houston, Texasに提出してmicroRNA Detection Microarray Serviceに供した。バイオインフォマティクス解析を用いて４７０個のマイクロＲＮＡ（Sanger miRBase Release 9.0）の相対的発現を同定した。この解析により、非不全（ＮＦ）心と不全（ＩＳＣ及び／又はＩＤＣ）心との対比において様々に発現の異なるｍｉＲＮＡが同定された。２種類の不全心、特発性拡張型心筋症（ＩＤＣ）を有する患者に由来するもの、又は虚血性心筋症（ＩＳＣ）を有するものを調べた。ＮＦ群では、６つの心臓（ｎ＝６）を調べた。ＮＦ心をＩＤＣ心（ｎ＝５）と比較すると、図１Ａに示されるとおり、１２個のｍｉＲＮＡについて統計的に有意な変化（ｐ＜０．０５、対応のないｔ検定）が認められ、そのうち３個は増加し、そのうち９個は減少した。ＮＦ心とＩＳＣ心（ｎ＝５）との間で同様に解析すると、図１Ｂに示されるとおり、１６個のｍｉＲＮＡの発現の変化が明らかとなり、そのうち５個は増加し、そのうち１１個は減少した。ヒト心臓におけるＮＦをＩＤＣ又はＩＳＣのいずれかと比較したときのｍｉＲ発現のあらゆる有意な変化について、マイクロアレイによる平均したｍｉＲ発現を図２に示す。
【誤訳訂正６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００８７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００８７】
実施例４．ｍｉＲに基づく標的発見に向けたＳＡＧＥ手法
図１１に表される概略図は、心不全の治療標的を同定するための連続的遺伝子発現解析（ＳＡＧＥ）の手法を説明する。心不全臨床治験に関連した心不全（ＨＦ）患者が、３つの異なる時点で選択的な心内膜心筋生検を受ける。第１の時点はβ遮断薬（ＢＢ）治療の開始前であり、その他の時点は治療開始後３ヶ月及び１２ヶ月である。各患者からの各時点の生検は、ｍｉＲＮＡアレイ解析、ｍＲＮＡ（Affymetrix）アレイ解析、及び（標的）プロテオーム発現解析のために処理される。同じ試料からのｍｉＲ／ｍＲＮＡ／タンパク質発現の固有の組み合わせは、同時に、複数のレベルで遺伝子発現パターンの変化を調べる固有の機会となる。ｍｉＲＮＡ発現がｍＲＮＡ発現に影響し、続いてそれがタンパク質発現に影響するため、これまでに定義されていない調節制御の制御ポイント間の関連を調べることができる。さらには、ある期間にわたる同じ患者からの試料を解析することで、個人間の遺伝的差異に関連する重要な問題が回避される。治療標的は、同じ患者からの遺伝子発現レベルを異なる時点で比較することによって同定され得る（例えば、治療後３ヵ月と治療前等）。遺伝子発現レベルはまた、臨床転帰とも相関し得る。
【誤訳訂正７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００８８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００８８】
実施例５．β遮断薬治療で処置したヒト患者におけるｍｉＲＮＡ発現の変化
心不全におけるｍｉＲＮＡの重要性をさらに例証するため、ヒト患者においてβ遮断薬による処置前及び処置後にｍｉＲＮＡ発現を評価した。末期心不全（処置前）、β遮断薬治療による処置後３ヶ月、及び処置後１２ヶ月において、５人の患者から一連の心生検を採取した。各患者の試料の各々に対してｍｉＲＮＡアレイ解析を実施し、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−１９ｂ、ｍｉＲ−１３３ｂ、ｍｉＲ−１３３ａ、ｍｉＲ−３０ｄ、ｍｉＲ−９２ａ、ｍｉＲ−２０８ｂ、ｍｉＲ−４９９、及びｍｉＲ−ｌｅｔ−７ｇを含む、不全心でダウンレギュレーションされるいくつかのｍｉＲＮＡについての発現レベルを測定した。ｍｉＲＮＡアレイ解析で測定された発現レベルを、実施例１に記載されるとおりＲＴ−ＰＣＲによって確認した。ＲＴ−ＰＣＲの結果が図１２〜１６に示される。特定のｍｉＲＮＡの発現レベルは、対照として使用したｍｉＲ−３７０（右のパネル）又は低分子ＲＮＡ ＲＮＵ６６（左のパネル）のいずれかに対して基準化した。末期心不全（Ａ）、処置後３ヶ月（Ｂ）及び処置後１２ヶ月（Ｃ）において、ｍｉＲＮＡ発現を評価した。β遮断薬治療に反応した４人の患者（２０、２１、２５及び３４）の処置後の試料において、ｍｉＲＮＡ発現がアップレギュレーションされた。処置に反応しなかった患者（患者１０３）から採取された試料では、特定のｍｉＲＮＡのアップレギュレーションは認められなかった。この結果は、ｍｉＲＮＡのサブセットの発現レベルが心不全の重症度と相関し、実施例４に記載されるとおり特定の薬物治療に対する患者の反応をモニタするためのバイオマーカーとして使用することができることを示している。薬物治療の投薬量又はタイプは、このようなｍｉＲＮＡの１つ又は複数の発現レベルに基づき調整され得る。