【手続補正書】
【提出日】平成24年4月3日(2012.4.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｅｘ  ｖｉｖｏで、静止状態が誘導又は維持され、生物活性が持続される、体性幹細胞。
【請求項２】
前記細胞が、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）である、請求項１に記載の体性幹細胞。
【請求項３】
前記間葉系幹細胞が、骨髄由来間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、腎幹細胞、肝由来幹細胞、骨格筋由来ＭＳＣ、骨由来ＭＳＣ、歯髄ＭＳＣ、心筋由来ＭＳＣ、滑液由来ＭＳＣ、臍帯ＭＳＣ、又は脂肪由来ＭＳＣである、請求項２に記載の体性幹細胞。
【請求項４】
体性幹細胞の膜上のインテグリンと結合する細胞外物質を含むゲル又はゲルマトリックスであって、ｉｎ ｖｉｖｏで同じタイプの体性幹細胞の優勢なｉｎ ｖｉｖｏ生物学的微小環境の弾性と実質的に類似の弾性を有するゲル又はゲルマトリックスに、前記体性幹細胞を接触させる工程と、前記体性幹細胞の生物活性をｅｘ  ｖｉｖｏで持続させるための栄養物質を前記体性幹細胞に与える工程を含む、ｅｘ  ｖｉｖｏでの体性幹細胞における静止状態を誘導又は維持し、前記生物活性を持続させるための方法。
【請求項５】
前記ゲル又はゲルマトリックスが、２次元又は３次元である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記体性幹細胞が、間葉系幹細胞（ＭＳＣ)である、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記接触工程前に前記体性幹細胞が静止期ではない、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
体性幹細胞の表面のインテグリンと結合されるゲル又はゲルマトリックスであって、弾性が前記体性細胞のｉｎ ｖｉｖｏ生物学的微小環境での弾性よりも低いゲル又はゲルマトリックスを含む増殖誘導材料に、前記体性幹細胞をｅｘ  ｖｉｖｏで接触させる工程と、前記体性幹細胞及びその後代のｅｘ  ｖｉｖｏでの増殖を促進し、その生物活性を持続させるための栄養成長物質を与える工程と、を含む、請求項４に記載のｅｘ  ｖｉｖｏでの体性幹細胞における増殖を誘導するための方法。
【請求項９】
前記増殖誘導材料の体性幹細胞にとっての弾性が、前記体性幹細胞と同じタイプのｉｎ ｖｉｖｏ体性幹細胞の生物学的微小環境における優勢なｉｎ ｖｉｖｏ材料の弾性の約０．４から０．５倍未満である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
請求項４又は８に記載のｅｘ  ｖｉｖｏでの体性幹細胞における分化を誘導するための方法であって、前記体性幹細胞から所定の細胞型への分化を刺激するよう選択される機械的及び／又は化学的な刺激を含む分化材料と前記体性幹細胞とを接触させる工程と、前記分化細胞に前記分化細胞の生物活性を持続させるための分化細胞栄養物質を与える工程と、を含む、方法。
【請求項１１】
前記体性幹細胞が、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞であり、前記分化細胞が、骨芽細胞、軟骨細胞、筋細胞、脂肪細胞、膵島β細胞、ニューロン細胞又は結合組織細胞である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
剛性が１５０〜７５０Ｐａの範囲にあるゲル又はゲルマトリックス中で間葉系幹細胞集団を培養する工程を含む、間葉系幹細胞集団を保存する方法。
【請求項１３】
前記ゲル又は前記ゲルマトリックス中のゲルが、ゲル化剤とアクリルアミド−ビスアクリルアミド混合物とを含み、前記ゲルマトリックスが、接着タンパク質をさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記接着タンパク質が、コラーゲン、フィブロネクチン、又はこれらの組み合わせである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
（ａ）前記間葉系幹細胞集団のテロメアの長さを維持し、及び／又は
（ｂ）前記間葉系幹細胞集団を静止期に維持し、及び／又は
（ｃ）前記間葉系幹細胞集団が、脂肪細胞又は骨芽細胞から選択される細胞型に分化する能力を保持し、及び／又は
（ｄ）前記ゲル又は前記ゲルマトリックスが、血清をさらに含み、及び／又は
（ｅ）前記間葉系幹細胞集団をゲル又はゲルマトリックス中で培養する工程の前に、組織培養装置にて前記間葉系幹細胞集団を培養する工程を実施し、及び／又は
（ｆ）生物試料からの前記間葉系幹細胞集団の単離、精製又は富化の直後に、前記培養工程を実施する、
請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
後に組織培養装置にて前記間葉系幹細胞集団を平板培養する工程をさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
ゲル化剤を含むゲル又はゲルマトリックス中で間葉系幹細胞を懸濁させることによってｅｘ  ｖｉｖｏでの間葉系幹細胞における静止状態を誘発又は維持し、生物活性を保持する工程であって、前記ゲルマトリックスが接着タンパク質、フィブロネクチン、又はこれらの組み合わせでコーティングされ、かつ前記ゲル又はゲルマトリックスが所定の剛性で維持される工程と、前記ゲル又は前記ゲルマトリックスを成長調節因子に曝露する工程と、を含む、間葉系幹細胞の発生を調節する方法。
【請求項１８】
（ａ）前記成長調節因子が、物理的因子、化学的因子、又はそれらの組み合わせであり、及び／又は
（ｂ）前記ゲル又は前記ゲルマトリックスが、２次元又は３次元であり、及び／又は
（ｃ）前記ゲル又は前記ゲルマトリックスが、血清をさらに含み、及び／又は
（ｄ）前記誘導工程において、前記ゲル又は前記ゲルマトリックスの剛性が１５０Ｐａ〜７５０Ｐａであり、及び／又は
（ｅ）前記ゲルマトリックスが、コラーゲンをさらに含み、及び／又は
（ｆ）前記ゲルマトリックスが、フィブロネクチン／コラーゲン混合物を含み、前記フィブロネクチン／コラーゲン比が好ましくは約１：５である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
（ａ）前記物理的因子が、圧力、温度又はそれらの組み合わせであり、及び／又は
（ｂ）前記ゲル又は前記ゲルマトリックスが、誘導培地である化学的因子をさらに含み、及び／又は
（ｃ）前記化学的因子又は物理的因子への曝露により、前記ゲル又は前記ゲルマトリックスの剛性が増大する、
請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ゲル又は前記ゲルマトリックスの剛性が、前記間葉系幹細胞が分化しようとしている微小環境でのＥＣＭの剛性に合わせて増大する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
体性幹細胞においてＲｈｏタンパク質の活性を阻害することを含む、ｅｘ  ｖｉｖｏでの体性幹細胞における静止状態を誘導する方法。
【請求項２２】
ゲル化剤とアクリルアミド−ビスアクリルアミド混合物とを含むゲルを含むゲルマトリックスであって、前記ゲルは、コラーゲン及びフィブロネクチンでコーティングされ、かつ１５０〜７５０Ｐａの範囲である、ゲルマトリックス。
【請求項２３】
前記コラーゲンが、Ｉ型コラーゲンである、請求項２２に記載のゲルマトリックス。
【請求項２４】
（ａ）前記ゲルマトリックスが、約７５０：１〜６：１アクリルアミド：ビスアクリルアミド混合比を有し、及び／又は
（ｂ）前記ゲルマトリックスが、３〜７．５％のアクリルアミド総濃度を有し、及び／又は
（ｃ）前記ゲルマトリックスが、２次元又は３次元ゲルマトリックスであり、及び／又は
（ｄ）前記ゲルマトリックスが、血清をさらに含む、
請求項２２に記載のゲルマトリックス。
【請求項２５】
剛性が１５０〜７５０Ｐａの範囲のコーティングされたポリアクリルアミドゲルであるゲルマトリックスの製造方法であって、アクリルアミド：ビスアクリルアミド混合比が７５０：１〜６：１であるアクリルアミドとビスアクリルアミドとを含む組成物を重合する工程と、前記ポリアクリルアミドゲルにコラーゲン、フィブロネクチン、又はそれらの組み合わせを含む組成物をコーティングして前記ゲルマトリックスを製造する工程と、を含む、方法。
【請求項２６】
前記コラーゲンが、Ｉ型コラーゲンである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
（ａ）前記ゲルが、２次元又は３次元であり、及び／又は
（ｂ）前記ゲルが、血清をさらに含み、及び／又は
（ｃ）アクリルアミドとビスアクリルアミドとを含む前記組成物のアクリルアミド総濃度が３〜７．５％である、
（ｄ）前記組成物のアクリルアミド：ビスアクリルアミド混合比が約１００：１〜３０：１である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
剛性が０．１〜２．５ｋＰａの範囲にあるフィブリンゲルマトリックスの製造方法であって、フィブリン又はフィブリノゲンタンパク質を含む組成物を重合することによって柔らかいフィブリンゲルを生成する工程であって、前記柔らかいフィブリンゲル中の前記フィブリン又はフィブリノゲンタンパク質の濃度が１〜２０ｍｇ／ｍｌである工程と、前記柔らかいフィブリンゲルを接着分子を含む組成物でコーティングして前記フィブリンゲルマトリックスを製造する工程と、を含む、方法。
【請求項２９】
（ａ）前記接着分子が、コラーゲン又はフィブロネクチンであり、及び／又は
（ｂ）前記ゲルマトリックスが、血清をさらに含み、及び／又は
（ｃ）前記ゲルマトリックスが、プロテアーゼ阻害剤をさらに含み、及び／又は
（ｄ）前記ゲルマトリックスが、２次元又は３次元ゲルマトリックスである、
請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記体性幹細胞が、骨髄由来間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、腎幹細胞、肝幹細胞、骨格筋由来幹細胞、骨由来幹細胞、歯髄ＭＳＣ、心筋由来ＭＳＣ、滑液由来ＭＳＣ、臍帯ＭＳＣ、及び脂肪由来ＭＳＣからなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項３１】
前記（ａ）における前記ゲルマトリックスが、約１００：１〜３０：１のアクリルアミド：ビスアクリルアミド混合比を有する、請求項２４に記載の方法。