(57)【要約】      （修正有）【課題】オオムギ渦遺伝子の有無を判定する方法及びその判定結果に基づく渦性品種の育種方法の提供。【解決手段】特定配列で示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子において、該アミノ酸配列の８５７番目のアミノ酸のヒスチジンからアルギニンへの変異を伴う塩基の変異を検出することを特徴とする、オオムギ渦遺伝子の有無を判定する方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２で示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子において、該アミノ酸配列の８５７番目のアミノ酸のヒスチジンからアルギニンへの変異を伴う塩基の変異を検出することを特徴とする、オオムギ渦遺伝子の有無を判定する方法。
【請求項２】
前記の塩基の変異が、８５７番目のアミノ酸に対応するコドンのＣＡＣからＣＧＣへの変異である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
配列番号１で示される塩基配列を有する遺伝子において、該塩基配列の２６１２番目の塩基のアデニンからグアニンへの変異を検出することを特徴とする、オオムギ渦遺伝子の有無を判定する方法。
【請求項４】
核酸試料について、ｄＣＡＰＳ法、ＰＣＲダイレクトシークエンシング法、ＡＰ−ＰＣＲ法、ＲＡＰＤ法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法からなる群より選ばれる少なくとも１つの方法によって前記変異を検出する、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
配列番号１７及び配列番号１８で示される塩基配列をそれぞれ有する２種のポリヌクレオチドからなるプライマー・セットと制限酵素Ｈｈａ  Ｉとを用いるｄＣＡＰＳ法によって、前記変異を検出する、請求項４記載の方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項記載の方法により得られた判定結果に基づいて、渦性品種を識別する方法。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか１項記載の方法により得られた判定結果に基づいて、育種親を選択することを特徴とする、渦性品種の育種方法。
【請求項８】
配列番号５で示される塩基配列の一部であって２６１２番目の塩基位置を含む少なくとも１２塩基の連続した配列若しくはそれに相補的な配列からなるポリヌクレオチド又はその標識物。
【請求項９】
以下の１）〜３）からなる群より選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド又はその標識物からなるプライマー。
１）  配列番号５で示される塩基配列の一部であって２６１２番目の塩基位置よりも５’側に位置する１２〜５０塩基の連続した配列からなるポリヌクレオチド、又はその標識物、
２）  配列番号５で示される塩基配列の一部であって２６１２番目の塩基位置よりも３’側に位置する１２〜５０塩基の連続した配列に相補的な配列からなるポリヌクレオチド、又はその標識物、
３）  配列番号１で示される塩基配列の２６１１番目の塩基位置を３’末端とする１２〜５０塩基の連続した配列について２６１０番目の位置の塩基をグアニンに変更した配列からなるポリヌクレオチド、又はその標識物。
【請求項１０】
請求項８記載のポリヌクレオチド若しくはその標識物、及び／又は請求項９記載のプライマーを含む、オオムギ渦遺伝子の有無を判定するためのキット。
【請求項１１】
配列番号５で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、オオムギ渦遺伝子の有無を判定する方法、及びその判定結果に基づく渦性品種の育種方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
オオムギ渦遺伝子は、日本古来のオオムギ半矮性遺伝子として古くから知られている遺伝子であり、１９２２年にすでにその遺伝子の遺伝学的特徴について報告されている（非特許文献１）。渦遺伝子はオオムギ３番染色体の動原体付近に座乗すると考えられている（非特許文献２）単一の劣性遺伝子であるが、この渦遺伝子の多面発現により、オオムギの渦性（うずせい）系統は半矮性で直立した厚く短い濃緑色の葉をつけ、多肥・密植に適する草型となる。このようなタイプの矮性形質である渦性に対し、遺伝的に対立関係にある普通型の表現型が並性である。
【０００３】
交配により渦遺伝子の導入されたオオムギは多収を示すことが後々の詳細な研究により示されている（非特許文献３）。この渦遺伝子は、現在でも、重要な短稈・多収遺伝子として、日本国内で栽培されているすべての裸性オオムギ、及び皮性オオムギの約半数に導入され利用されている（非特許文献４）。このように、渦遺伝子はオオムギの多収化に貢献している重要な短稈遺伝子であるが、その矮化機構に関し、遺伝的・生理的に制御しているその遺伝子の機能については不明であったため、通常の交配以外では渦遺伝子本体を利用した植物の改良方法は開発されていなかった。
【０００４】
矮性植物の矮性化機構に関しては、植物ホルモンと称される化学伝達物質との関わりで数多く研究されている。近年ではそれらの遺伝子が単離され、遺伝子そのものの利用が可能となってきている。今日、一般に植物ホルモンとして認識されている物質としては、オーキシン類、ジベレリン類、サイトカイニン類、アブシジン酸、ブラシノステロイド、およびエチレンが挙げられるが、このうち特にジベレリンは古くから植物の伸長生長に不可欠の化合物と考えられ、イネのｄｙ、ｄ１８や、トウモロコシｄ１，  ｄ２，  ｄ３，  ｄ５、Ｄ８、コムギＲｈｔなどの多くの矮性変異体は、そのジベレリン反応性と内生ジベレリンの含量より、いずれもジベレリンの生合成や受容に関する変異体であることが予測されていた。その後、これらの矮性変異体のコードする遺伝子が次々と明らかになってきており、その遺伝子そのものの利用方法も提示されているが、いずれも予測されていた通りジベレリン生合成や受容・シグナル伝達関連遺伝子であった。
【０００５】
一方、従来からジベレリンではその矮化原因が説明できなかった矮性植物も知られており、その矮化原因は長らく不明であった。近年、このような矮性変異体の一つであるシロイヌナズナの矮性変異体がブラシノステロイドの生合成変異であることが明らかとなったのを契機に、植物の矮化原因としてブラシノステロイドの生合成や受容の変異体が知られるようになった。その後多くの植物でブラシノステロイドの生合成遺伝子や受容体遺伝子が明らかになり、これらを利用した植物の改良方法も提示されてきている（特許文献１及び２、並びに非特許文献５〜７）。しかしながら、その矮性植物の多彩な表現型と矮性の原因である遺伝子変異との関係については依然として不明な点が多い。例えば、矮化の原因遺伝子として報告されているイネのブラシノステロイド受容体遺伝子については、その相補鎖を過剰発現する形質転換イネの表現型には様々なバリエーションがあることが報告されている（非特許文献７）。
【０００６】
オオムギの渦性系統については、従来からジベレリンとは無関係な矮性であることが指摘されており、その暗発芽の幼鞘の長さとオーキシン類であるインドール酢酸含量に相関があることから、オーキシン生合成関連の矮性の可能性があることが指摘されていた（非特許文献８）。一方で、オオムギの渦性系統においてこの関係がみられるのは暗発芽幼葉鞘においてのみであり、発芽から成熟までの様々な局面で見られる渦性系統の矮性としての特徴的な形態を説明できるとは考えにくく、疑問も呈されている（非特許文献９）。このように、オオムギの渦性系統はその育種的な有用性が古くから明らかになっている変異体であるにも関わらず、その矮化原因は全く不明であり、その遺伝子本体も提示されていなかった。
【０００７】
ところで、育種的にある特定の形質を持つ遺伝子を別の系統に導入する場合、交配育種の場では、交配後得られた後代でその形質の導入を判断し選抜していくが、導入する形質が遺伝的に劣性な形質などの場合、雑種第１代では目的とする形質が見られないため、多くの年限を費やすのが一般的である。最近、この年限を短縮する選抜法として、当該遺伝子と同時に遺伝する（連鎖する）ＤＮＡ断片を得、これを分子マーカーとして選抜に利用するＭＡＳ（Ｍａｒｋｅｒ  Ａｓｓｉｓｔ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）法の有用性が指摘されている。すなわち、当該遺伝子に強く連鎖するＤＮＡマーカーが得られれば、幼植物などの組織の一部から抽出するＤＮＡからその存在が確認できるため、植物を十分に栽培しなくても、その遺伝子型の推定ができるものであり、かかるＤＮＡマーカーは育種上極めて有用であると考えられる。しかしながら、これらの分子マーカーは、通常ランダムスクリーニングによって無作為に見いだされた目的遺伝子そのものとは無関係な配列である場合がほとんどである。これらは単純に目的形質を制御する遺伝子の近傍に座乗するため、同時に後代に伝わる確率が高いだけであり、目的遺伝子とはある低い確率ながら別々の遺伝をする。すなわち、分子マーカーによる遺伝子型の推定（ＭＡＳ）には一定の誤りが起こりうることが知られている（非特許文献１０）。
【０００８】
渦性は遺伝的に劣性な形質であることから、雑種第１代で渦遺伝子の有無を検出できる分子マーカーは、育種を効率化するために重要である。従来、渦遺伝子との連鎖を示す分子マーカーが報告されているが（非特許文献１１）、いずれもＡＦＬＰ法やＲＦＬＰ法などによって見いだされた単純に渦遺伝子に遺伝的に連鎖するだけのマーカーであり、渦遺伝子とは同座ではないと考えられる。そのため、これらの遺伝子マーカーによる渦遺伝子の有無の推定には一定の誤りが起こる危険性があることが十分に考えられることから、渦遺伝子を確実に検出できる手法の開発が待たれていた。
【０００９】
最近、オオムギ渦性系統におけるブラシノステロイド非感受性及び内生ブラシノステロイドの大量蓄積が報告された。ブラシノライド（ＢＬ）は、ブラシノステロイド（ＢＲｓ）の１種である植物ホルモンである。これまでにも、シロイヌナズナ等の複数の植物で、ブラシノステロイドの欠損や非感受性が矮性原因となっている様々なブラシノステロイド関連変異体が報告されている（例えば、非特許文献６［シロイヌナズナｂｒｉ１］、非特許文献７［イネｄ６１］、非特許文献１２［ブラシノステロイドと植物のステロイドホルモンの情報伝達］、及び非特許文献１３［シロイヌナズナｂｉｎ２］  を参照されたい）。なおシロイヌナズナｂｒｉ１とｂｉｎ２は、別個の遺伝子の変異体であるにも関わらず、よく似た表現型を現すことが報告されている（非特許文献１３）。これらの知見から、オオムギでもブラシノステロイド非感受性と渦性系統の矮性とが関連することが示唆された。
【００１０】
【特許文献１】
特表２００２−５０８６６５号公報
【特許文献２】
特表２００１−３２７２８７号公報
【非特許文献１】
三宅、今井，  植物学雑誌，  東京植物学会，  （１９２２）  第３６巻，  ｐ．２５−３８
【非特許文献２】
Ｂａｒｌｅｙ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｎｅｗｓｌｅｔｔｅｒ，  （Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ），  Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｍａｌｔｉｎｇ  Ｂａｒｌｅｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，  Ｉｎｃ．，  （１９９７），  Ｖｏｌ．２６，  ｐ．１３６
【非特許文献３】
高橋隆平ら、農学研究，  岡山大学資源生物科学研究所，  （１９６１），  ４９，  ｐ．６７−８７
【非特許文献４】
河田尚之、転作全書，  農山漁村文化協会，  （２００１），  「第１巻」ムギ，  ｐ．１４１−１４９
【非特許文献５】
Ｆｕｊｉｏｋａ，  Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，  （１９９７），  ９，  ｐ．１９５１−１９６２
【非特許文献６】
Ａ  ｐｕｔａｔｉｖｅ  ｌｅｕｃｉｎｅ−ｒｉｃｈ  ｒｅｐｅａｔ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｋｉｎａｓｅ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｂｒａｓｓｉｎｏｓｔｅｒｏｉｄ  ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ．，  Ｃｅｌｌ，  （１９９７），  Ｖｏｌ．９０，  ｐ．９２９−９３８
【非特許文献７】
”Ｌｏｓｓ  ｏｆ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｒｉｃｅ  ｂｒａｓｓｉｎｏｓｔｅｒｏｉｄ  ｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｅ１  ｈｏｍｏｌｏｇ  ｐｒｅｖｅｎｔｓ  ｉｎｔｅｒｎｏｄｅ  ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｂｅｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌａｍｉｎａ  ｊｏｉｎｔ．”，  Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，  （２０００），  Ｖｏｌ．１２，  ｐ．１５９１−１６０５
【非特許文献８】
Ｉｎｏｕｅ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  ＆  ｃｅｌｌ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，  （１９８２），  ２３，  ｐ．６８９−６９８
【非特許文献９】
Ｈｏｎｄａ，  Ｉ．  ｅｔ  ａｌ．，  ”Ｄｗａｒｆｉｓｍ  ｏｆ  ｄｗａｒｆ  ｂａｒｌｅｙ  ”ｕｚｕ””，  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｏｆ  ｓｅｖｅｎｔｈ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｏｆ  Ｐｒｅ−ｈａｒｖｅｓｔ  ｓｐｒｏｕｔｉｎｇ  ｉｎ  ｃｅｒｅａｌｓ  １９９５，  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｓｏｃｉｅｔｉｅｓ  Ｊａｐａｎ，  Ｏｓａｋａ，  （１９９６），  ｐ．４７７−４８２
【非特許文献１０】
池田、農林水産文献解題Ｎｏ２３，  農林統計協会，  （２０００），  ｐ．６０１−６１５
【非特許文献１１】
Ｍａｎｏ，  Ｙ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｇｅｎｏｍｅ／Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌ  Ｃａｎａｄａ，  （２００１），  ４４，  ｐ．２８４−２９２
【非特許文献１２】
Ｂｉｓｈｏｐ  Ｇ．Ｊ．  ａｎｄ  Ｋｏｎｃｚ  Ｃ．，  Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ２００２，  Ｓ９７−１１０
【非特許文献１３】
Ｌｉ，  Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，  Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２００１，  Ｖｏｌ．  １２７，  ｐ．
１４−２２
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、植物試料中のオオムギ渦遺伝子の有無を特異的かつ効率的に判定する方法、渦性品種の識別方法、及び簡便かつ確実に渦性品種を作出することができる渦性品種の育種方法を提供することを目的とする。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、オオムギ渦遺伝子が、配列番号２で示されるアミノ酸配列をコードするブラシノステロイド受容体相同遺伝子において、該アミノ酸配列の８５７番目のアミノ酸のヒスチジンからアルギニンへの１アミノ酸変異を伴う塩基の変異を有する変異型遺伝子であることを見出した。そして、オオムギの渦性の原因は、ブラシノステロイド受容体におけるそのような１アミノ酸変異であることを見出した。そこで本発明者らは、その１アミノ酸変異を伴う遺伝子変異を検出することにより渦遺伝子を特異的かつ直接的に検出する手法を開発し、それによって植物試料中のオオムギ渦遺伝子の有無を判定する方法を完成させた。本発明者らはさらに、その判定結果に基づいて、前記植物試料の由来する植物が渦性品種であるか否かを識別する方法、及び前記植物試料の由来する植物を育種親として選択することを特徴とする渦性品種の育種方法を開発した。
すなわち本発明は、以下の通りである。
【００１３】
［１］    配列番号２で示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子における、該アミノ酸配列の８５７番目のアミノ酸のヒスチジンからアルギニンへの変異を伴う塩基の変異を検出することを特徴とする、オオムギ渦遺伝子の有無を判定する方法。ここで、前記の塩基の変異は、主として、８５７番目のアミノ酸に対応するコドンのＣＡＣからＣＧＣへの変異である。
［２］    配列番号１で示される塩基配列を有する遺伝子における、該塩基配列の２６１２番目の塩基のアデニンからグアニンへの変異を検出することを特徴とする、オオムギ渦遺伝子の有無を判定する方法。
［３］    核酸試料について、好ましくはｄＣＡＰＳ法、ＰＣＲダイレクトシークエンシング法、ＡＰ−ＰＣＲ法、ＲＡＰＤ法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法からなる群より選ばれる少なくとも１つの方法によって前記変異を検出する、上記［１］又は［２］の方法。
ここで、上記［３］の方法の中でも、配列番号１７及び配列番号１８で示される塩基配列をそれぞれ有する２種のポリヌクレオチドからなるプライマー・セットと制限酵素Ｈｈａ  Ｉとを用いるＣＡＰＳ法によって、前記変異を検出する方法が好適である。
［４］    上記［１］〜［３］のいずれか１つの方法により得られた判定結果に基づいて、渦性品種を識別する方法。
［５］    上記［１］〜［３］のいずれか１つの方法により得られた判定結果に基づいて、育種親を選択することを特徴とする、渦性品種の育種方法。
［６］    配列番号５で示される塩基配列の一部であって２６１２番目の塩基位置を含む少なくとも１２塩基の連続した配列若しくはそれに相補的な配列からなるポリヌクレオチド又はその標識物。
［７］    以下の１）〜３）からなる群より選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド又はその標識物からなるプライマー。
１）  配列番号５で示される塩基配列の一部であって２６１２番目の塩基位置よりも５’側に位置する１２〜５０塩基の連続した配列からなるポリヌクレオチド、又はその標識物、
２）  配列番号５で示される塩基配列の一部であって２６１２番目の塩基位置よりも３’側に位置する１２〜５０塩基の連続した配列に相補的な配列からなるポリヌクレオチド、又はその標識物、
３）  配列番号１で示される塩基配列の２６１１番目の塩基位置を３’末端とする１２〜５０塩基の連続した配列について２６１０番目の位置の塩基をグアニンに変更した配列からなるポリヌクレオチド、又はその標識物。
［８］    上記［６］記載のポリヌクレオチド若しくはその標識物、及び／又は上記［７］記載のプライマーを含む、オオムギ渦遺伝子の有無を判定するためのキット。
［９］    配列番号５で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【００１４】
【発明の実施の形態】
本発明者らは、オオムギの渦性の原因遺伝子であるオオムギ渦遺伝子を単離して、その塩基配列及びアミノ酸配列を決定することができれば、オオムギにおいて渦性を引き起こす遺伝子変異を特定できると考えた。そして、そのような遺伝子変異を簡便に検出することができれば、オオムギ渦遺伝子を直接検出できるため、植物試料中のオオムギ渦遺伝子の有無を確実に判定することが容易になるであろうと考えた。また上記判定方法を利用して育種親を選択することにより、育種において渦性品種を確実に作出できるであろうと考えた。本発明は、このような着想に基づいて完成されたものである。
【００１５】
本発明の方法によれば、幼植物体等を含む任意の植物試料について、渦遺伝子を含有するか否か（渦遺伝子の有無）を判定することができる。すなわち本発明の方法は、育種現場における渦遺伝子の導入に伴う従来の労力を大幅に軽減できる点で特に有用である。
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１６】
１．オオムギ渦遺伝子
日本の関東以西と韓国南端部に限定的に、渦性と呼ばれる形質を有するオオムギ半矮性系統が存在する。この渦性を支配する遺伝子がオオムギ渦遺伝子である。オオムギ渦遺伝子をホモ接合体として有するオオムギ系統は、マイルドな短稈となり、多肥・密植に適していて多収・耐倒性を示すことから、育種において非常に有用に使用されてきた。
【００１７】
本明細書において、「オオムギ渦遺伝子」とは、オオムギの渦性の原因遺伝子でありオオムギ３番染色体の動原体付近に座乗する単一劣性遺伝子、又はその単離された遺伝子を指す。オオムギ渦遺伝子は、渦性を引き起こす変異型遺伝子であることから、この遺伝子に対応する野生型の遺伝子（渦性を引き起こさない）は渦遺伝子ではない。本発明において検出対象とするオオムギ渦遺伝子は、単離された形態であってもよく、ゲノム中に組み込まれた形態であってもよく、ｍＲＮＡの形態であってもよく、ＰＣＲ増幅断片やｃＤＮＡのように人工的に増幅又は合成されたポリヌクレオチド断片であってもよく、ベクター中に組み込まれた形態であってもよい。検出対象とするオオムギ渦遺伝子は、生体中に存在していてもよいし（ｉｎ  ｖｉｖｏ）、生体外に取り出されていてもよい（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）。さらに、アミノ酸変異を伴わない塩基変異が少数（例えば１〜数個）含まれる渦遺伝子も、本発明の検出対象とするオオムギ渦遺伝子に包含される。また本明細書において、用語「オオムギ渦遺伝子」は、単に「渦遺伝子」と表すこともある。また用語「渦遺伝子」は、一般に「渦性遺伝子」と称されることもある。
【００１８】
本明細書において、「オオムギ渦遺伝子の有無を判定する」とは、植物試料中にオオムギ渦遺伝子が存在するか否かを決定することを意味する。このようなオオムギ渦遺伝子の有無は、従来行われてきた方法、すなわち生長後の植物体又は交配により作出した雑種第２代の生長後の植物体について渦性の特徴を有するか否かを調べることによって、さらに確認することもできる。
【００１９】
さらに、本明細書において「渦性」とは、幼植物体ではしょう葉の長さが短く幼芽鞘先端に突起状の構造があり、また、成熟植物体では葉身の長さ、桿長、芒長、及び粒長が普通型の形質よりも短く、全体としてずんぐりした型となる多面的な形質を言う。用語「渦性」は、一般に「渦」と称されることもある。一方「並性」とは、渦性に対応する普通型の表現型を言う。具体的には「並性」は、渦性について前記で挙げた各項目に関して野生オオムギｓｓｐ．  ｓｐｏｎｔａｎｅｕｍ  （例えば、ＯＵＨ６０２系統）で見られる表現型を基準とする。
【００２０】
本明細書において、用語「渦性系統」は、渦遺伝子を有し渦性を示すオオムギの野生種若しくは栽培品種の個々の植物系統に対して又はそれらの植物系統を総称して使用される。さらに用語「並性系統」は、渦遺伝子をもたず渦性に対応する普通型の形質を示すオオムギの野生種若しくは栽培品種の個々の植物系統に対して又はそれらの植物系統を総称して使用される。一般に、「渦性系統」は「渦系統」と、「並性系統」は「並系統」と、称されることもある。
【００２１】
本明細書において、「渦性品種」とは、渦遺伝子をホモ接合体として有する植物系統又は植物個体を意味する。さらに「並性品種」とは、渦遺伝子を有しない植物系統又は植物個体を意味する。なお通常、渦遺伝子をヘテロ接合体として有する植物個体は並性を示すが、その植物個体の自家交配により、渦遺伝子をホモ接合体として有する渦性を示す植物個体（渦性品種）を得ることができる。ここで、「渦性品種」「並性品種」は、任意の植物分類に属するものであってよく、例えば双子葉植物であっても単子葉植物であってもよいし、種間又は属間雑種植物であってもよい。「渦性品種」「並性品種」は、限定するものではないが、例えばイネ科植物（イネ、コムギ、オオムギ、ライムギ、トウモロコシなど）、ユリ科植物（ネギ、タマネギ、アスパラガスなど）、マメ科植物（ダイズ、インゲンマメ、アズキ、エンドウマメなど）、ウリ科植物（スイカ、メロン、キュウリなど）、ナス科植物（ナス、トマトなど）、アブラナ科植物（キャベツ、ハクサイ、ダイコン、ブロッコリー、ナタネなど）、キク科植物（ゴボウ、レタスなど）、セリ科植物（ニンジンなど）、アカザ科植物（ホウレンソウなど）、ヒルガオ科植物（サツマイモなど）、バラ科（リンゴ、ナシ、モモ、イチゴなど）、ブナ科（クリなど）、ミカン科（ミカン、レモンなど）、カキノキ科（カキなど）、ツツジ科（ブルーベリーなど）等であってよいが、イネ科植物であることが好ましく、オオムギであることがより好ましい。また「渦性品種」「並性品種」は、野生種であっても栽培品種であってもよく、交配育種により新たに作出された植物であってもよく、放射線照射等の突然変異誘発技術、細胞融合等の細胞工学技術又は遺伝子組換え等の分子生物学的技術などを用いて遺伝的に改変された植物であってもよい。なお、用語「渦性品種」「並性品種」は、植物体だけでなく、例えば幼植物体、植物器官（例えば、葉、穂、花弁、皮、茎、根、種子、種子胚、胚乳部等）、植物組織（表皮、師部、柔組織、木部、維管束、柵状組織、海綿状組織等）、植物細胞、植物細胞培養物、カルス等に対しても使用される。
【００２２】
２．オオムギのブラシノステロイド受容体相同遺伝子の単離
本発明を完成するためには、まず、渦遺伝子の単離を行う必要がある。そこで本発明者らは最初に、ブラシノステロイド非感受性の原因遺伝子の１つとして報告されている、ブラシノステロイド受容体遺伝子の変異型遺伝子であるシロイヌナズナｂｒｉ１及びイネｄ６１に着目した。そしてこれらの変異型遺伝子と渦遺伝子との関連を調べるため、近年明らかになったイネ・オオムギ間のゲノムシンテニー（染色体上における遺伝子の配列順序の保存性）に注目して、渦遺伝子とイネｄ６１のそれぞれに関する遺伝学的知見を詳細に調査した。その結果、イネ１番染色体に座乗するイネｄ６１に強連鎖すると報告されているＲＦＬＰマーカーＣ１３７０と強連鎖が検出されているイネＲＦＬＰマーカーＣ１２７１について、オオムギ３番染色体の動原体付近に座乗するという報告（Ｓｍｉｌｄｅ，  Ｗ．  Ｄ．，  Ｇｅｎｏｍｅ，  ４４：３６１−３６７  （２００１））が存在することを見出した。この調査結果と渦遺伝子がオオムギ３番染色体の動原体付近に座乗することを考え合わせて、本発明者らは、渦遺伝子は、シロイヌナズナ及びイネのブラシノステロイド受容体遺伝子の相同遺伝子（本明細書では、ブラシノステロイド受容体相同遺伝子と称する）に対する変異型遺伝子である可能性が高いと考えるに至った。本発明者らは、この仮説に基づき、まずオオムギ並性系統のブラシノステロイド受容体相同遺伝子の単離を試みた。その結果、配列番号３で示される塩基配列を有するオオムギ並性系統のブラシノステロイド受容体相同遺伝子を得ることに成功した。また、この遺伝子がコードするタンパク質は、配列番号４で示されるアミノ酸配列を有することが示された。
【００２３】
オオムギのブラシノステロイド受容体相同遺伝子の単離は、限定するものではないが、具体的には例えば、以下のような方法に従って行うことができる。まず、オオムギ並性系統由来の植物試料（例えば、オオムギ栽培品種「ミサトゴールデン」又は「はるな二条」の種子胚）から常法により全ＲＮＡを抽出し、さらに全ＲＮＡからｍＲＮＡを精製する（例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｏｌｙｇｏ  （ｄＴ）２５  ｒｅｓｉｎ  （Ｄｙｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）使用）。このｍＲＮＡを鋳型として常法により逆転写を行ってｃＤＮＡを調製する。次いで、調製したｃＤＮＡを鋳型とし、シロイヌナズナ及びイネのブラシノステロイド受容体遺伝子に対して設計した縮重プライマーを合成して用いて、ＰＣＲ増幅を行う。縮重プライマーは、シロイヌナズナとイネで報告されているブラシノステロイド受容体遺伝子の塩基配列（シロイヌナズナ：アクセッション番号  ＡＦ０１７０５６、イネ：アクセッション番号  ＡＰ００３４５３）に基づいて設計する。塩基配列より推定されるシロイヌナズナとイネのブラシノステロイド受容体タンパク質のアミノ酸配列には高度に保存された領域が見出されるため、前記プライマーはその保存領域に対する縮重プライマーとして設計することが好ましい。この場合のプライマーの設計は、当技術分野で公知の方法に従って行えばよい。これらのプライマーには、アデニン・チミン・グアニン・シトシン以外の塩基（修飾塩基又は人工塩基等を含む）を使用することもできる。限定するものではないが、具体的には例えば、チミンの代わりにウラシル、アデニン・チミン・グアニン・シトシンの４種の混合塩基の代わりにイノシンを用いることができる。
【００２４】
ところで、シロイヌナズナとイネとの間で見出される保存領域は、ロイシンリッチリピートを持つ膜貫通型レセプター型タンパク質リン酸化酵素であるブラシノステロイド受容体のタンパク質リン酸化酵素ドメインに相当するため、ブラシノステロイド受容体以外のタンパク質リン酸化酵素でも保存されているものと思われる。また植物では、ブラシノステロイド受容体と同様のレセプター型タンパク質リン酸化酵素が複数種存在するという報告もある（非特許文献１２）。すなわち、上記保存領域に対するプライマーを用いるＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）は、ブラシノステロイド受容体以外のタンパク質リン酸化酵素遺伝子を増幅する可能性が高い。さらに、シロイヌナズナとイネのブラシノステロイド受容体においてはブラシノステロイドの受容に関与する部分の保存性はあまり高くなく、それらの遺伝子内には繰り返し配列が多いという問題もある。従って、上記縮重プライマーは、ブラシノステロイド受容体遺伝子を特異的に増幅可能となるように設計する必要がある。
【００２５】
以上のように設計される縮重プライマーとして、本発明において好適に使用できる第１の組み合わせとしては、例えば次のようなものが挙げられる。
５’−縮重プライマー：  ５’−ＡＡＲＴＧＹＡＣＩＡＡＩＹＴＩＡＡＹＴＧＧＡＴ−３’（配列番号７）
３’−縮重プライマー１：５’−ＡＲＩＧＧＹＴＴＹＴＣＲＡＡＩＧＣＩＧＣ−３’（配列番号８）
【００２６】
この第１の組み合わせのプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行う場合、得られたＰＣＲ断片を鋳型とし、さらにｎｅｓｔｉｄ−ＰＣＲを行うことが好ましい。このｎｅｓｔｉｄ−ＰＣＲで使用するプライマーは、上記ＰＣＲ増幅断片の内側を特異的に増幅することができる縮重プライマーである。このような縮重プライマーも、上記と同様の方法で設計すればよい。この工程で好適な縮重プライマーの組み合わせは次の通りである。なお、３’−縮重プライマー２は、増幅断片の内側の別の保存配列に対して設計した縮重プライマーである。
５’−縮重プライマー：  ５’−ＡＡＲＴＧＹＡＣＩＡＡＩＹＴＩＡＡＹＴＧＧＡＴ−３’（配列番号７）
３’−縮重プライマー２：５’−ＡＲＩＳＷＲＡＡＩＡＲＩＡＲＩＣＣＣＡＴＩＧＣ−３’（配列番号９）
【００２７】
このようにして得られるＰＣＲ増幅断片のサイズは、シロイヌナズナ及びイネのブラシノステロイド受容体遺伝子の塩基配列に基づいて予想することができる。例えば、上記に具体的に示した塩基配列（配列番号７〜９）の縮重プライマーを使用した場合、得られるＰＣＲ増幅断片の長さは、シロイヌナズナ及びイネのブラシノステロイド受容体遺伝子の塩基配列から約８７５ｂｐと予想される。続いてこの増幅断片を常法によりクローニングし、塩基配列を決定する。
【００２８】
次に、完全長ｃＤＮＡを単離するため、得られた増幅断片の塩基配列に基づいて遺伝子特異的プライマーを設計・作製し、それを用いて常法によりＲＡＣＥ（Ｒａｐｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  Ｅｎｄｓ）を行う。ＲＡＣＥに用いる鋳型としては、例えば、オオムギ並性系統由来の植物試料（例えば、オオムギ栽培品種「ミサトゴールデン」の種子胚）から常法により抽出した全ｍＲＮＡを用いて調製した、５’及び３’末端にアダプターを付加したｃＤＮＡ（Ｍａｒａｔｈｏｎ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  （Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用説明書に従って使用）を用いればよい。ここで、５’−ＲＡＣＥ及びｎｅｓｔｉｄ−ＰＣＲに使用する好適な遺伝子特異的プライマーは、以下の通りである。
アンチセンスプライマー１：５’−ＴＣＡＴＣＴＴＣＣＣＣＧＡＣＴＧＣＴＣＴＧＣＣＡ−３’（配列番号１０）
アンチセンスプライマー２：５’−ＴＴＧＡＧＧＧＣＧＧＴＧＡＧＣＧＡＧＧＴＧＡＧ−３’（配列番号１１）
アンチセンスプライマー３：５’−ＴＣＴＣＣＧＧＣＧＡＴＣＴＴＧＴＴＧＣＴＧＧＡＣ−３’（配列番号１２）
アダプタープライマーＡＰ１：５’−ＣＣＡＴＣＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣ−３’（配列番号１３）（Ｍａｒａｔｈｏｎ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  （Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））
【００２９】
また３’−ＲＡＣＥに使用する好適な遺伝子特異的プライマーは、以下の通りである。
センスプライマー：５’−ＴＧＧＣＡＧＡＧＣＡＧＴＣＧＧＧＧＡＡＧＡＴＧＡ−３’（配列番号１４）
アダプタープライマーＡＰ１：５’−ＣＣＡＴＣＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣ−３’（配列番号１３）（Ｍａｒａｔｈｏｎ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  （Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））
次いで、上記の通りＲＡＣＥを行って得られるＰＣＲ断片について、常法により塩基配列決定を行う。このようにして、オオムギのブラシノステロイド受容体をコードすると推定される遺伝子のｃＤＮＡ全長の塩基配列を決定することができる（３．６  ｋｂｐ以上にわたる領域について決定することが好ましい）。
【００３０】
さらに、この塩基配列を確実なものにするため、全長ｃＤＮＡの塩基配列情報を基に、５’側の非翻訳領域に対して設計した遺伝子特異的プライマー（５’−ＣＧＣＴＴＣＴＣＧＣＡＴＧＧＴＣＴＣＡＡＧＧＴＡＧ−３’（配列番号１５））及び３’の非翻訳領域に対する遺伝子特異的プライマー（５’−ＡＧＣＴＴＧＣＧＴＧＧＧＡＡＣＣＴＣＡＧＡＡＴＧ−３’（配列番号１６））を作製し、これらプライマーを用いて、オオムギ並性系統（例えば、栽培品種「ミサトゴールデン」）から常法により調製したｃＤＮＡを鋳型とするｈｉｇｈ  ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲを行うことが好ましい。好適なＰＣＲ反応条件の例としては、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）を用い、反応液組成は酵素に添付される説明書通りとすればよい。好適なＰＣＲ反応の温度サイクルは、変性９８℃１０秒、アニーリングおよび伸長反応７２℃４分を５サイクル、次いで変性９８℃１０秒、アニーリングおよび伸長反応７０℃４分を２５サイクルである。このようにして増幅されるＰＣＲ断片（３，５５８  ｂｐ）をベクター（例えば、ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ  ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））中にクローニングし、複数のクローンについて常法により塩基配列を決定して、クローン間で全長ｃＤＮＡ増幅断片の塩基配列が一致することを確認することができる。さらに、以上のようにして決定された塩基配列から推定されるアミノ酸配列をイネのブラシノステロイド受容体のアミノ酸配列と比較することにより、それらが高度の相同性（８２．３％の同一性）を有すること、並びにシロイヌナズナ及びイネのブラシノステロイド受容体に見出される特徴的なドメインを共通して含んでいることに基づいて、単離された全長ｃＤＮＡがブラシノステロイド受容体相同遺伝子であると判断することができる。
【００３１】
３．ブラシノステロイド受容体相同遺伝子変異体の単離と変異の同定
本発明者らは、上記のブラシノステロイド受容体相同遺伝子をさらに渦性系統から単離して、塩基配列を決定した。その結果、渦性系統のブラシノステロイド受容体相同遺伝子は、配列番号５で示される塩基配列を有することが示された。また渦性系統の該遺伝子がコードするタンパク質は、配列番号６で示されるアミノ酸配列を有することが示された。
【００３２】
並性系統と渦性系統との間でブラシノステロイド受容体相同遺伝子の塩基配列及びアミノ酸配列を比較すると、両者の塩基配列には、２６１２番目の塩基の位置（塩基位置）に１塩基の違いが認められる。すなわち並性系統では２６１２番目の塩基がアデニンであるのに対し、渦性系統ではグアニンである（配列番号３及び５の塩基番号２６１２を参照）。本明細書ではこの塩基の変異を「２６１２Ａ→Ｇ」としても表す。またこの位置の塩基を、それぞれ「２６１２Ａ」「２６１２Ｇ」のように表す。この１塩基の違いによって、配列番号２で示されるアミノ酸配列における８５７番目のアミノ酸は、並性系統ではヒスチジンであるのに対し、渦性系統ではアルギニンとなる（配列番号４及び６のアミノ酸番号８５７、並びに図２を参照）。本明細書ではこのアミノ酸の変異を「８５７Ｈｉｓ→Ａｒｇ」としても表す。またこの位置のアミノ酸を、それぞれ「８５７Ｈｉｓ」「８５７Ａｒｇ」のように表す。この１アミノ酸変異部位は、ブラシノステロイド受容体の機能性部位であるタンパク質リン酸化酵素の保存ドメインＩＶ中にあるため（図１）、渦性系統では、ブラシノステロイド受容体タンパク質の機能が変化していると考えられる。従って、本明細書では、渦性系統のブラシノステロイド受容体相同遺伝子をブラシノステロイド受容体相同遺伝子変異体と称する。
【００３３】
なお本明細書においては、１塩基の違いが存在する並性系統と渦性系統のブラシノステロイド受容体相同遺伝子の塩基配列を、便宜上１つの塩基配列として配列番号１として示す。同様に、１アミノ酸の違いが存在する並性系統と渦性系統のブラシノステロイド受容体タンパク質のアミノ酸配列を、便宜上１つのアミノ酸配列として配列番号２として示す。
【００３４】
上述したブラシノステロイド受容体相同遺伝子変異体の単離は、具体的には以下の通り行うことができる。まず、オオムギ渦性系統由来の植物試料から、核酸試料を調製する。オオムギ渦性系統としては任意の渦性系統を用いることができるが、例としては、例えば日本および朝鮮半島のオオムギ栽培品種である「赤神力」、「カシマムギ」、「清源在来」、「青麦」、「谷風」、「関取」及び「コビンカタギ」等の渦性系統が挙げられる。また植物試料としては、特に限定されるものではなく、植物より採取される任意の試料を使用できるが、例としては、例えば植物体、幼植物体、植物器官（例えば、葉、穂、花弁、皮、茎、根、種子、種子胚、胚乳部等）、植物組織（表皮、師部、柔組織、木部、維管束、柵状組織、海綿状組織等）、植物細胞、植物細胞培養物、カルス等が挙げられる。また植物試料から調製する核酸試料としては、限定するものではないが、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、及びｍＲＮＡ、並びにそれらの核酸増幅断片が挙げられる。なおブラシノステロイド受容体相同遺伝子は、ゲノムＤＮＡ上でイントロンを含まないことが判明したことから、ゲノムＤＮＡとｃＤＮＡのいずれに含まれるブラシノステロイド受容体相同遺伝子をＰＣＲ増幅しても得られる塩基配列は同一である。これらの核酸試料の調製は当業者に公知の方法、例えばＣＴＡＢ法等によって行うことができる。核酸試料は精製されていることが好ましい。
【００３５】
次に、調製した核酸試料を鋳型として、５’側の非翻訳領域に対する遺伝子特異的プライマー（例えば、５’−ＣＧＣＴＴＣＴＣＧＣＡＴＧＧＴＣＴＣＡＡＧＧＴＡＧ−３’（配列番号１５））及び３’の非翻訳領域に対する遺伝子特異的プライマー（例えば、５’−ＡＧＣＴＴＧＣＧＴＧＧＧＡＡＣＣＴＣＡＧＡＡＴＧ−３’（配列番号１６））を使用するＰＣＲ等の任意の核酸増幅法（好ましくは、ｈｉｇｈ  ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ）を実施する。好適なＰＣＲ反応条件の例としては、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）を用い、反応液組成は酵素に添付される説明書通りとすればよい。好適なＰＣＲ反応の温度サイクルは、変性９８℃１０秒、アニーリングおよび伸長反応７２℃４分を５サイクル、次いで変性９８℃１０秒、アニーリングおよび伸長反応７０℃４分を２５サイクルである。以上のようにして増幅される核酸断片（３，５５８  ｂｐ）は、本発明において単離されるブラシノステロイド受容体相同遺伝子変異体である。
【００３６】
４．ｄＣＡＰＳマーカーを利用したブラシノステロイド受容体相同遺伝子における一塩基の違い（２６１２Ａ→ＧのＳＮＰ）の検出
本発明者らは、並性系統と渦性系統との間のブラシノステロイド受容体相同遺伝子における一塩基の違い（２６１２Ａ→ＧのＳＮＰ）を簡便に検出できるｄＣＡＰＳマーカーを開発した。ｄＣＡＰＳマーカーを用いたそのような一塩基の違い（２６１２Ａ→ＧのＳＮＰ）の検出は、例えば以下のような手順で行うことができる。
【００３７】
まず、並性系統又は渦性系統由来の植物試料から調製した核酸試料を鋳型とし、ｄＣＡＰＳプライマー１（５’−ＧＡＡＡＴＧＧＡＧＡＣＣＡＴＴＧＧＣＡＡＧＡＴＣＡＡＧＣ−３’／配列番号：１７）及びｄＣＡＰＳプライマー２（５’−ＣＣＴＴＧＣＣＴＣＣＡＧＡＴＴＣＴＣＡＴＣＡＡＣ−３’／配列番号：１８）を用いて一塩基の違い（２６１２Ａ→ＧのＳＮＰ）が存在する部位を含むブラシノステロイド受容体相同遺伝子の部分断片をＰＣＲ増幅する。ＰＣＲの場合の反応条件の例は以下の通りである。好適なＰＣＲ反応条件の例としては、Ｅｘ  ＴａｑＴＭ（ＴａＫａＲａ）を用い、反応液組成は酵素に添付される説明書通りとすればよい。好適なＰＣＲ反応の温度サイクルは、９４℃２分の後，変性９４℃３０秒、アニーリング６０℃３０秒、および伸長反応７２℃１分を３５サイクルである。ブラシノステロイド受容体相同遺伝子上では、ｄＣＡＰＳプライマー１は２６１２Ａ→ＧのＳＮＰ部位のすぐ上流、ｄＣＡＰＳプライマー２は２６１２Ａ→ＧのＳＮＰ部位を挟んで下流に位置する（図３）。こうして得られる増幅断片においては、図３に示すように、２６１２番目の塩基がグアニンである渦性系統のブラシノステロイド受容体相同遺伝子の場合はＨｈａ  Ｉ認識部位が形成されるが、２６１２番目の塩基がアデニンである並性系統のブラシノステロイド受容体相同遺伝子の場合はＨｈａ  Ｉ認識部位は形成されない。従って、増幅断片を制限酵素Ｈｈａ  Ｉを用いて消化して電気泳動等により分画すると、渦性系統のブラシノステロイド受容体相同遺伝子については２９４  ｂｐの増幅断片が消化されて２６５  ｂｐに相当するバンドが観察されるが、並性系統のブラシノステロイド受容体相同遺伝子については２９４  ｂｐに相当するバンドが観察される。逆にいえば、２６５  ｂｐに相当するバンドが観察される試料中に含まれるブラシノステロイド受容体相同遺伝子においては、２６１２番目の塩基は２６１２Ｇであり、２９４  ｂｐに相当するバンドが観察される試料中に含まれるブラシノステロイド受容体相同遺伝子においては、２６１２番目の塩基は２６１２Ａである。このようにｄＣＡＰＳマーカーを用いることにより、観察されるバンドのサイズから、ブラシノステロイド受容体相同遺伝子における２６１２番目の塩基が２６１２Ａと２６１２Ｇのいずれであるかを判別することができ、その１塩基の違いを検出することができる。
【００３８】
５．遺伝学的解析による渦遺伝子の確認
上記の通りブラシノステロイド受容体相同遺伝子変異体がコードするブラシノステロイド受容体は、１アミノ酸変異により機能が変化していると考えられるため、ブラシノステロイド受容体相同遺伝子変異体が渦遺伝子であるとすれば、渦性系統のブラシノステロイド非感受性やブラシノステロイド蓄積を十分に説明するものと思われる。そこで、本発明者らは前述のｄＣＡＰＳマーカーを用いて、渦遺伝子の分離集団に対して、ブラシノステロイド受容体相同遺伝子変異体の１塩基の違い（２６１２Ａ→ＧのＳＮＰ）をマッピングした。その結果、ブラシノステロイド受容体相同遺伝子変異体の２６１２Ａ→ＧのＳＮＰは、渦遺伝子と同一の遺伝子座に位置付けられたため、ブラシノステロイド受容体相同遺伝子変異体は渦遺伝子そのものであることが証明された。
【００３９】
ｄＣＡＰＳマーカーを用いたブラシノステロイド受容体相同遺伝子（ＨｖＢＲＩ１）変異体の１塩基の違い（２６１２Ａ→ＧのＳＮＰ）のマッピングは、具体的には以下のようにして行えばよい。まず、渦性系統と並性系統を両親（例えば、渦性系統の赤神力と野生オオムギｓｓｐ．  ｓｐｏｎｔａｎｅｕｍ  （ＯＵＨ６０２；並性系統））とする雑種第２代（Ｆ２）集団について、ｄＣＡＰＳマーカーを用いてジェノタイピングを行う。ここで、並性系統型とは、並性系統のＨｖＢＲＩ１をホモ接合で有するタイプ、ヘテロ型とは、並性系統のＨｖＢＲＩ１とＨｖＢＲＩ１変異体をヘテロ接合で有するタイプ、渦性系統型とは、ＨｖＢＲＩ１変異体をホモ接合で有するタイプ、を示すものとする。その結果、ブラシノステロイド受容体相同遺伝子変異体中に見出したＳＮＰの２６１２Ｇをホモ接合で持つ個体の分離と、渦性を示す個体の分離とが、完全に一致すること、さらに並性系統型／ヘテロ型／渦性系統型の分離が、１  ：  ２  ：  １となり、渦遺伝子が単因子劣性の遺伝様式を示すことと合致することが確認されれば、ブラシノステロイド受容体相同遺伝子変異体の２６１２Ａ→ＧのＳＮＰは、渦遺伝子と同一の遺伝子座に位置付けられる。
【００４０】
６．渦遺伝子の有無を判定する方法
本発明により、ブラシノステロイド受容体相同遺伝子における塩基の変異に伴い、該遺伝子にコードされる配列番号２で示されるアミノ酸配列の８５７番目のアミノ酸がヒスチジンからアルギニンへ変異することによって、オオムギの渦性が引き起こされることが明らかになった。
【００４１】
従って、本発明において、渦性の原因遺伝子である渦遺伝子の有無の判定は、植物試料から調製した核酸試料について、配列番号２で示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子（すなわちブラシノステロイド受容体相同遺伝子）の塩基配列を調べ、該アミノ酸配列の８５７番目のアミノ酸のヒスチジンからアルギニンへの変異を伴う塩基の変異を検出することによって、実施すればよい。より具体的には、この渦遺伝子の有無の判定は、配列番号２で示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子（すなわち、ブラシノステロイド受容体相同遺伝子）上の、該アミノ酸配列の８５７番目のアミノ酸に対応するコドン（配列番号１で示される塩基配列においては２６１１番目〜２６１３番目の塩基位置に相当する）を調べて、そのコドンがヒスチジンをコードするＣＡＣである場合には「渦遺伝子が存在しない」、アルギニンをコードするＣＧＴ、ＣＧＣ、ＣＧＡ、ＣＧＧ、ＡＧＡ、ＡＧＧのいずれかである場合には「渦遺伝子が存在する」、と判定すればよい。より単純な判定基準としては、オオムギ栽培品種に由来する渦遺伝子を検出対象とする場合には、オオムギ栽培品種のブラシノステロイド受容体相同遺伝子変異体は８５７番目のアミノ酸に対応するコドンとしてＣＧＣを有するため、８５７番目のアミノ酸に対応するコドンがＣＡＣであれば「渦遺伝子は存在しない」、ＣＧＣであれば「渦遺伝子が存在する」、と判定することができる。さらには、渦遺伝子の有無の判定は、植物試料から調製した核酸試料について配列番号１で示される塩基配列を調べて、２６１２番目の塩基がアデニン（Ａ）であれば「渦遺伝子は存在しない」、グアニン（Ｇ）であれば「渦遺伝子が存在する」、と判定することができる。
【００４２】
また、植物は通常２倍体であるため、渦遺伝子を有する植物としてはヘテロ接合体とホモ接合体との２通りがある。渦遺伝子のヘテロ接合体植物は、渦遺伝子と、渦遺伝子に対応する野生型遺伝子との両方を有する。一方、渦遺伝子のホモ接合体植物は、２つの渦遺伝子を有する。このことから、２倍体の植物個体から得られたある植物試料について上記のようにヒスチジンからアルギニンへの変異を伴う遺伝子変異を検出する際に、「渦遺伝子が存在する」と判定されるべき結果と「渦遺伝子が存在しない」と判定されるべき結果の両方が得られた場合（例えば、配列番号１で示される塩基配列の２６１２番目の塩基として、アデニンとグアニンの両方が検出された場合）には、「渦遺伝子がヘテロ接合体で存在する」と判定することができる。同様に、「渦遺伝子が存在する」と判定されるべき結果のみが得られた場合（例えば、配列番号１で示される塩基配列の２６１２番目の塩基として、グアニンのみが検出された場合）には、「渦遺伝子がホモ接合体で存在する」と判定することができる。また「渦遺伝子が存在しない」と判定されるべき結果のみが得られた場合（例えば、配列番号１で示される塩基配列の２６１２番目の塩基として、アデニンのみが検出された場合）には、「渦遺伝子が存在せず、渦遺伝子に対応する野生型遺伝子がホモ接合体で存在する」と判定することができる。しかしながら、半数体若しくは３倍体以上の倍数体の植物又はゲノム中に組み込まれていない導入遺伝子を有するトランスジェニック植物等に由来する植物試料について上記検出を行う場合には、「渦遺伝子が存在する」と判定されるべき結果と「渦遺伝子が存在しない」と判定されるべき結果の両方が得られたとき（例えば、配列番号１で示される塩基配列の２６１２番目の塩基として、アデニンとグアニンの両方が検出された場合）には、単に「渦遺伝子が存在する」と判定することが好ましい。この場合、同様にして「渦遺伝子が存在する」と判定されるべき結果のみが得られた場合（例えば、配列番号１で示される塩基配列の２６１２番目の塩基として、グアニンのみが検出された場合）にも、単に「渦遺伝子が存在する」と判定することが好ましい。さらにこの場合に「渦遺伝子が存在しない」と判定されるべき結果のみが得られたとき（例えば、配列番号１で示される塩基配列の２６１２番目の塩基として、アデニンのみが検出された場合）にも、「渦遺伝子が存在しない」と判定することが好ましい。
【００４３】
なお、渦遺伝子の有無の判定において、配列番号２で示されるアミノ酸配列の塩基配列を調べる際に、該アミノ酸配列の８５７番目のアミノ酸に対応するコドンとは異なる位置の塩基配列における塩基の変異が１〜数個の範囲で追加的に検出される場合もありうるが、そのような追加的な塩基の変異によって配列番号２で示されるアミノ酸配列のアミノ酸が変化しない（その塩基の変異によってアミノ酸が置換、欠失又は付加されることなく、フレームシフトも起こらない場合）限りにおいては、そのような場合も本発明の「渦遺伝子の有無を判定する方法」に含まれる。
【００４４】
渦遺伝子の有無を判定する方法において被検体として使用される植物試料は、特に限定されるものではなく、植物より採取される任意の試料を使用できるが、例としては、例えば植物体、幼植物体、植物器官（例えば、葉、穂、花弁、皮、茎、根、種子、種子胚、胚乳部等）、植物組織（表皮、師部、柔組織、木部、維管束、柵状組織、海綿状組織等）、植物細胞、植物細胞培養物、カルス等が挙げられる。植物試料の供給源となる植物は、任意の植物であってよく、渦性系統であっても並性系統であってもよいし、オオムギ以外の植物、例えば双子葉植物又は単子葉植物であってもよいし、種間又は属間雑種植物であってもよい。そのような植物はさらに、野生種であっても栽培品種であってもよく、交配育種により新たに作出された植物であってもよく、放射線照射等の突然変異誘発技術、細胞融合等の細胞工学技術又は遺伝子組換え等の分子生物学的技術などを用いて遺伝的に改変された植物であってもよい。植物種としては、限定するものではないが、例えばイネ科植物（イネ、コムギ、オオムギ、ライムギ、トウモロコシなど）、ユリ科植物（ネギ、タマネギ、アスパラガスなど）、マメ科植物（ダイズ、インゲンマメ、アズキ、エンドウマメなど）、ウリ科植物（スイカ、メロン、キュウリなど）、ナス科植物（ナス、トマトなど）、アブラナ科植物（キャベツ、ハクサイ、ダイコン、ブロッコリー、ナタネなど）、キク科植物（ゴボウ、レタスなど）、セリ科植物（ニンジンなど）、アカザ科植物（ホウレンソウなど）、ヒルガオ科植物（サツマイモなど）、バラ科（リンゴ、ナシ、モモ、イチゴなど）、ブナ科（クリなど）、ミカン科（ミカン、レモンなど）、カキノキ科（カキなど）、ツツジ科（ブルーベリーなど）等が挙げられるが、イネ科植物であることが好ましく、オオムギであることがより好ましい。
【００４５】
また植物試料から調製する核酸試料としては、限定するものではないが、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、及びｍＲＮＡ、並びにそれらの核酸増幅断片が挙げられる。なおブラシノステロイド受容体相同遺伝子は、ゲノムＤＮＡ上でイントロンを含まないことが判明したことから、ゲノムＤＮＡとｃＤＮＡのいずれに含まれるブラシノステロイド受容体相同遺伝子をＰＣＲ増幅しても得られる塩基配列は同一である。これらの核酸試料の調製には、当業者が利用可能なものであればいずれの方法を利用してもよく（例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．  （Ｅｄｓ．），  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  ２ｎｄ  ｅｄ．  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ｐｐ．９．１６−９．２３，  １９８９）、ＣＴＡＢ法等を用いることもできる。なお核酸試料は、塩基の変異の検出を行う前に、精製されていることが好ましい。
【００４６】
渦遺伝子の有無を判定する方法において、塩基の変異の検出は、ＳＮＰ、塩基多型又は塩基変異を検出するために当業者が利用可能なものであれば公知の様々な方法を任意に使用して行うことができる（Ｏｒｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ８６：  ２７６６−２７７０等を参照されたい）。例えば、ｄＣＡＰＳ法〔Ｐｌａｎｔ  Ｊ  １４，  ３８１−３８５  （１９９８）〕、ＣＡＰＳ（Ｃｌｅａｖｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）法〔「モデル植物の実験プロトコール」細胞工学別冊  植物細胞工学シリーズ１５、２００１年４月２日発行、秀潤社、ｐ．６９−７６〕、ＰＣＲダイレクトシークエンス法〔Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１１，  ２４６−２４９  （１９９１）〕、ＡＰ−ＰＣＲ（Ａｒｂｉｔｒａｒｉｌｙ  Ｐｒｉｍｅｄ−ＰＣＲ）法〔Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  １８，  ７２１３−７２１８  （１９９０）〕、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ（一本鎖ＤＮＡ高次構造多型）法〔Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  １６，２９６−２９７  （１９９４），  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  ２１，  ５１０−５１４  （１９９６）〕、ＡＳＯ（Ａｌｌｅｌｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）ハイブリダイゼーション法〔Ｃｌｉｎ．  Ｃｈｉｍ．  Ａｃｔａ，  １８９，  １５３−１５７  （１９９０）〕、ＡＲＭＳ（Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｒｅｆｒａｃｔｉｎｇ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ）法〔Ｎｕｃ．  Ａｃｉｄｓ．  Ｒｅｓ．，  １９，  ３５６１−３５６７  （１９９１），  Ｎｕｃ．  Ａｃｉｄｓ．  Ｒｅｓ．，  ２０，４８３１−４８３７  （１９９２）〕、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（Ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ  Ｇｅｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ；  ＤＧＧＥ）法〔Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｓ，  ２７，  １０１６−１０１８  （１９９９）〕、ＲＮａｓｅＡ切断法〔ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １４，  ８７−９４  （１９９５）〕、化学切断法〔Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  ２１，  ２１６−２１８  （１９９６）〕、ＤＯＬ（Ｄｙｅ−ｌａｂｅｌｅｄ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ）法〔Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，  ８，  ５４９−５５６  （１９９８）〕、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法（Ｍａｔｒｉｘ  Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｌａｓｅｒ  Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ−ｔｉｍｅ  ｏｆ  Ｆｌｉｇｈｔ／Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）法〔Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，  ７，  ３７８−３８８  （１９９７），  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｃｈｅｍ．  Ｃｌｉｎ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ３５，  ５４５−５４８  （１９９７）〕、ＴＤＩ（Ｔｅｍｐｌａｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｄｙｅ−ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）法〔Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９４，  １０７５６−１０７６１  （１９９７）〕、パドロック・プローブ（Ｐａｄｌｏｃｋ  Ｐｒｏｂｅ）法〔Ｎａｔ．  Ｇｅｎｅｔ．，  ３，  ｐ２２５−２３２  （１９９８）、遺伝子医学，  ４，  ｐ５０−５１  （２０００）〕、モレキュラー・ビーコン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎｓ）法〔Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１，  ｐ４９��５３  （１９９８）、遺伝子医学、４，  ｐ４６−４８（２０００）〕、ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ法〔Ｇｅｎｅｔ．  Ａｎａｌ．，  １４，  １４３−１４９  （１９９９），  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，  ３４，  ２９３３−２９３６  （１９９６）〕、インベーダー法〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ５１０９，  ７７８−７８３（１９９３），  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ３０，  ２１３８７−２１３９４  （１９９９），  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  １７，  ２９２−２９６  （１９９９）〕、ダイナミック・アレル−スペシフィック・ハイブリダイゼーション法（Ｄｙｎａｍｉｃ  Ａｌｌｅｌｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  （ＤＡＳＨ）法〔Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１，  ｐ８７−８８，  （１９９９）、遺伝子医学，  ４，  ｐ４７−４８  （２０００）〕、ＵＣＡＮ法〔タカラ酒造株式会社ホームページ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔａｋａｒａ．ｃｏ．ｊｐ）参照〕、及びＤＮＡチップまたはＤＮＡマイクロアレイを用いる方法〔Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４，  （１９８９），  Ｄｒｍａｎａｅ，  Ｒ．，  Ｌａｂａｔ，  Ｉ．，  Ｂｒｕｋｎｅｒ，  Ｉ．  ａｎｄ  Ｃｒｋｖｅｎｊａｋｏｖ，  Ｒ．，  ｐ１１４−１２８、Ｂｉｏ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ  Ｖｏｌ．１７  Ｎｏ．４，  「ＤＮＡチップ技術」  ｐ５−１１  （２０００）〕等が挙げられるが、これらの方法に限定されるものではない。
【００４７】
これらの方法において好適に用いることができる、変異部位を検出するためのプライマー又はプローブは、並性系統のブラシノステロイド受容体相同遺伝子と渦遺伝子（ブラシノステロイド受容体相同遺伝子変異体）とを識別する上で有用であるように、配列番号１に基づいて任意に設計することができる。プライマー又はプライマー対の設計は、当業者には公知の方法に従って行えばよい。これらのプライマー又はプローブは、配列番号５で示される塩基配列を有するブラシノステロイド受容体相同遺伝子変異体のポリヌクレオチドを鋳型として又は供給源として利用して、作製することもできる。
【００４８】
ダイレクトシークエンシング法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法、ＤＯＬ法等による、塩基多型部位を含むＰＣＲ増幅断片を検出に用いる上記方法では、配列番号５で示される塩基配列に基づいて２６１２番目の塩基位置を挟むように設計したプライマーを用いることが好ましい。このプライマーは、限定するものではないが、通常は１２〜５０塩基長、好ましくは１５〜３０塩基長のものである。
【００４９】
またＡＲＭＳ法等による、塩基多型部位に対するミスマッチを利用したＰＣＲを検出に利用する方法では、３’末端に多型部位を含む、配列番号５で示される塩基配列に基づいて設計した１２〜５０塩基長、好ましくは１５〜３０塩基長のプライマーを用いることが好ましい。例えば、配列番号１で示される塩基配列の２６１２番目の塩基がアデニン（Ａ）であるかグアニン（Ｇ）であるかを判別する目的では、検出感度を高めるために、このように３’末端に多型部位（本発明では８５７番目のアミノ酸の変異を伴う塩基の変異部位）を含むプライマーを使用することが好ましい。
【００５０】
本発明においては、上記「３．ブラシノステロイド受容体相同遺伝子変異体の単離と変異の同定」に記載した方法を、任意の植物試料から調製した核酸試料に適用して、ブラシノステロイド受容体相同遺伝子全長を単離し、その塩基配列を決定し、１６１１番目〜１６１３番目の塩基位置のコドンを調べることにより、８５７番目のアミノ酸の変異を伴う塩基の変異を検出してもよい。
【００５１】
ところで、ＳＮＰ検出の方法としてよく知られた手法の一つとして、ＣＡＰＳ法が挙げられる。ＣＡＰＳ法とは、主にＲＦＬＰ（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｌｅｎｇｔｈ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）マーカーをＰＣＲマーカーに転用する際に利用する方法である。ＲＦＬＰとは、ゲノム上の制限酵素認識部位の変異を、種々の制限酵素により切断した際に生じる相同領域を含むＤＮＡ断片の長さの差として検出する方法である。しばしばＲＦＬＰマーカーのＣＡＰＳマーカー化では、ＲＦＬＰマーカーの塩基配列からプライマーを設計し、ＰＣＲ増幅した断片を制限酵素で切断して多型を検出する。
【００５２】
本発明では、ＣＡＰＳ法の変法であるｄＣＡＰＳ法を、塩基の変異を検出するために好適に使用することができる。ｄＣＡＰＳ法は、多型部位がもともと制限酵素認識部位を形成していない場合に、その多型部位を含む形で制限酵素認識部位をｐｒｉｍｅｒ部位に導入するようにプライマー配列を改変して用いるＣＡＰＳ法である。例えば渦遺伝子に特異的にみられる２６１２Ａ→ＧのＳＮＰだけを認識して切断するような制限酵素認識部位を含むＰＣＲ断片が増幅されるように、プライマーの配列を改変し、そのプライマーを用いてＰＣＲ増幅し、増幅断片の制限酵素処理を行い、その酵素による切断の有無によって本発明の配列番号５で示される塩基配列における２６１２Ａ→ＧのＳＮＰを検出する。２６１２Ａ→ＧのＳＮＰを検出する場合のｄＣＡＰＳ法では、配列番号１で示される塩基配列の２６１１番目の塩基位置を３’末端とするように設計した１２〜５０塩基長、好ましくは１５〜３０塩基長のプライマーについて、２６１０番目の位置の塩基をグアニンに変更した改変プライマーを用いて核酸試料を増幅し、制限酵素Ｈｈａ  Ｉを用いて消化する。このｄＣＡＰＳ法を用いる最適な手法としては、上記「４．ｄＣＡＰＳマーカーを利用したブラシノステロイド受容体相同遺伝子における一塩基の違い（２６１２Ａ→ＧのＳＮＰ）の検出」に記載したｄＣＡＰＳマーカーを用いたｄＣＡＰＳ法を適用すればよい。使用するプライマーは、ｄＣＡＰＳプライマー１（５’−ＧＡＡＡＴＧＧＡＧＡＣＣＡＴＴＧＧＣＡＡＧＡＴＣＡＡＧＣ−３’／配列番号：１７）及びｄＣＡＰＳプライマー２（５’−ＣＣＴＴＧＣＣＴＣＣＡＧＡＴＴＣＴＣＡＴＣＡＡＣ−３’／配列番号：１８）である。この場合、制限酵素Ｈｈａ  Ｉで消化された２６５  ｂｐの増幅断片のバンドのみが観察される植物試料は、「渦遺伝子がホモ接合体で存在する」と判定され、制限酵素Ｈｈａ  Ｉで消化されない２９４  ｂｐの増幅断片のみが観察される植物試料は、「渦遺伝子が存在しない」と判定される。また、制限酵素Ｈｈａ  Ｉで消化された２６５  ｂｐの増幅断片のバンドと、制限酵素ＨｈａＩで消化されない２９４  ｂｐの増幅断片の両方が観察される植物試料は、「渦遺伝子がヘテロ接合体で存在する」と判定される。
【００５３】
以上のようにして植物試料について渦遺伝子の有無を判定することにより、「渦遺伝子が存在する」、「渦遺伝子がホモ接合体で存在する」、又は「渦遺伝子がヘテロ接合体で存在する」と判定される場合、その植物試料の由来する植物は渦遺伝子を少なくとも１つ有する。一方、「渦遺伝子が存在しない」又は「渦遺伝子が存在せず、渦遺伝子に対応する野生型遺伝子がホモ接合体で存在する」と判定される場合、その植物試料の由来する植物は渦遺伝子を有しない。
【００５４】
７．渦性品種の識別方法及び渦性品種の育種方法
植物試料について上記方法により渦遺伝子の有無を判定した結果、「渦遺伝子がホモ接合体で存在する」と判定された場合には、その判定対象の植物試料が由来する植物を、渦性品種であるとして識別することができる。逆に、渦遺伝子の有無を判定した結果、「渦遺伝子が存在しない」と判定された場合は、その判定対象の植物試料が由来する植物を、渦性品種ではなく並性品種であるとして識別することができる。このような渦性品種の識別方法は、幼植物体、種子、葉、カルス等の矮性の判断が困難な植物試料を含む任意の植物試料にも適用できることから、例えばホモ接合体植物において早期の生長段階でその植物が渦性を示すか否かを予測することが可能になる。この渦性品種の識別方法は、任意の植物種に適用することができる。
【００５５】
さらに本発明では、植物試料について上記方法により渦遺伝子の有無を判定した結果に基づいて、渦遺伝子を有する植物を育種親として選択し、その育種親を任意の育種方法（育種技術）に用いることにより、確実に渦性品種を育種することができる。限定するものではないが、例えば、ある植物について「渦遺伝子がヘテロ接合体で存在する」と判定された場合には、その植物の示す形質は並性であるが、その自家交配により渦性を示す植物個体（ホモ接合体）がＦ２集団中で１／４の確率で得られることが予測される。従って、「渦遺伝子がヘテロ接合体で存在する」と判定された植物を育種親として選択し、その植物を自家交配することにより、渦性品種を確実に作出することができる。このような渦性品種の育種方法は、雑種第１代の自家交配を実際に行う前に、その自家交配により渦性品種を得られるか否かを予測することができることから、育種に要する時間的・経済的コストを最小限に抑えることが可能になるという利点を有する。この渦性品種の育種方法は、特にオオムギを対象とする場合に好適に用いることができる。なお、本明細書において「育種親」とは、育種方法において親系統として用いる父方と母方のいずれか一方又はその両方の植物を意味する。また、本発明において育種親を用いる育種技術としては、育種分野で公知の任意の技術を使用することができるが、具体的には例えば、自家交配、他家交配、細胞融合、戻し交配、栄養繁殖、突然変異誘発、染色体操作等が挙げられる。
【００５６】
８．その他の実施形態
本発明の他の実施形態としては、配列番号５で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドが挙げられる。このポリヌクレオチドは、ブラシノステロイド受容体相同遺伝子変異体の全体を含む。このポリヌクレオチドは、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよく、ＲＮＡである場合には配列番号５で示される塩基配列中の「Ｔ（チミン）」は「Ｕ（ウラシル）」に読み換えるものとする。配列番号５で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドは、本発明のブラシノステロイド受容体相同遺伝子変異体における塩基の変異を検出する際のプローブ又はプライマーを作製するために使用することもできる。この場合のプローブ又はプライマーの設計は、当技術分野で公知の方法に従って行えばよい。このようなプローブ又はプライマーも、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよく、ＲＮＡである場合には配列番号５で示される塩基配列中の「Ｔ（チミン）」は「Ｕ（ウラシル）」に読み換えるものとする。これらのプローブ又はプライマーには、アデニン・チミン・グアニン・シトシン以外の塩基（修飾塩基又は人工塩基等を含む）を使用することもできる。限定するものではないが、具体的には例えば、チミンの代わりにウラシル、アデニン・チミン・グアニン・シトシンの４種の混合塩基の代わりにイノシンを用いることができる。
【００５７】
本発明のプローブ又はプライマーは、本発明における渦遺伝子の有無の判定に使用する上で非常に有用である。特に、その塩基配列に２６１２Ａ→Ｇの変異部位を含む本発明のプローブ又はプライマーは、該変異部位を含む領域に対するハイブリダイゼーションを利用した変異検出法において、好適に使用することができる。このような２６１２Ａ→Ｇの変異部位を含む本発明のプローブ又はプライマーとしては、配列番号５で示される塩基配列の一部であって２６１２番目の塩基位置を含む、少なくとも１２塩基、好ましくは１２〜３００塩基、より好ましくは１２〜１００塩基、さらに好ましくは１２〜５０塩基、特に１５〜３０塩基の連続した配列若しくはそれに相補的な配列からなるポリヌクレオチドが挙げられる。
【００５８】
さらに、本発明のプライマーであって、その塩基配列に２６１２Ａ→Ｇの変異部位を含まず、該変異部位を挟む領域を増幅するためのプライマーは、主にＰＣＲ法を用いる変異検出法（例えば、ＰＣＲダイレクトシークエンス法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法等）において好適に使用することができる。そのようなプライマーとしては、以下の１）〜３）が挙げられる。
１）  配列番号５で示される塩基配列の一部であって２６１２番目の塩基位置よりも５’側に位置する１２〜５０塩基、好ましくは１５〜３０塩基の連続した配列からなるポリヌクレオチド。
２）  配列番号５で示される塩基配列の一部であって２６１２番目の塩基位置よりも３’側に位置する１２〜５０塩基、好ましくは１５〜３０塩基の連続した配列に相補的な配列からなるポリヌクレオチド。
３）  配列番号１で示される塩基配列の２６１１番目の塩基位置を３’末端とする１２〜５０塩基、好ましくは１５〜３０塩基の連続した配列について２６１０番目の位置の塩基をグアニンに変更した配列からなるポリヌクレオチド。
【００５９】
ところで、これらの１）〜３）のポリヌクレオチドの具体的な塩基配列を設計する際に、使用する検出法や実験条件により、配列番号１で示される塩基配列上の変異部位からの設計位置を考慮すべき場合がある。そのような場合、２６１２Ａ→Ｇの変異部位から離れた位置の５’プライマーが必要な場合には、配列番号１で示される塩基配列上の塩基位置の１番目〜１６００番目、好ましくは１番目〜１４００番目、より好ましくは１番目〜１０００番目の領域、又は、８００番目〜１６００番目、好ましくは１０００番目〜１５００番目、より好ましくは１２００番目〜１４００番目の領域、あるいは、３００番目〜１０００番目、好ましくは５００番目〜８００番目の領域の塩基配列に対して設計された配列からなるポリヌクレオチドを使用することが好ましい。また、上記変異部位から中程度に離れた位置のプライマーが必要な場合には、配列番号１で示される塩基配列上の塩基位置の１６００番目〜２０００番目、好ましくは１７００番目〜１９００番目の領域の塩基配列に対して設計された配列からなるポリヌクレオチドを使用することが好ましい。さらに、上記変異部位と近い位置のプライマーが必要な場合には、配列番号１で示される塩基配列上の塩基位置の２０００番目〜２６１１番目、好ましくは２２００番目〜２６１１番目、より好ましくは２３００番目〜２６１１番目の領域の塩基配列に対して設計された配列からなるポリヌクレオチドを使用することが好ましい。
【００６０】
同様に、２６１２Ａ→Ｇの変異部位から離れた位置の３’プライマーが必要な場合には、配列番号１で示される塩基配列上の塩基位置の３０００番目〜３５５８番目、好ましくは３２００番目〜３５５８番目、より好ましくは３４００番目〜３５５８番目の領域、又は、３０００番目〜３３００番目、好ましくは３０００番目〜３２００番目、より好ましくは３０００番目〜３１００番目の領域、あるいは、３２００番目〜３４００番目の領域の塩基配列に対して設計された配列からなるポリヌクレオチドを使用することが好ましい。また、上記変異部位から中程度に離れた位置のプライマーが必要な場合には、配列番号１で示される塩基配列上の塩基位置の２７００番目〜３０００番目、好ましくは２８００番目〜３０００番目の領域の塩基配列に対して設計された配列からなるポリヌクレオチドを使用することが好ましい。さらに、変異部位と近い位置のプライマーが必要な場合には、配列番号１で示される塩基配列上の塩基位置の２６１３番目〜２７００番目、好ましくは２６１３番目〜２６８０番目、より好ましくは２６１３番目〜２６５０番目の領域の塩基配列に対して設計された配列からなるポリヌクレオチドを使用することが好ましい。
【００６１】
上記のプライマー又はプローブは、検出用に好適となるように標識されたものであってもよい。例えば、プライマー又はプローブは、蛍光色素、酵素、タンパク、放射性同位体、化学発光物質、ビオチン等の標識が付加されたものであってよい。また本明細書では、ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドに付加することによって検出用に使用するオリゴヌクレオチド（例えば、変異検出のためのインベーダー法における、鋳型とは無関係な配列「フラップ」など）も、「標識」に包含する。
【００６２】
例えば、蛍光色素を用いる場合には、一般にヌクレオチドを標識して、核酸の定量、検出等に用いられる蛍光が好適に使用でき、例えば、ビオチン（Ｈｅｘａｈｙｄｒｏ−２−ｏｘｏ−１Ｈ−ｔｈｉｅｎｏ［３，４−ｄ］ｉｍｉｄａｚｏｌ−４−ｐａｎｔａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ、ｖｉｔａｍｉｎ  Ｈ）、ＨＥＸ（４，７，２’，４’，５’，７’−ｈｅｘａｃｈｌｏｒｏ−６−ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ、緑色蛍光色素）、フルオレセイン（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）、ローダミン（ｒｈｏｄａｍｉｎ）またはその誘導体（例えば、テトラメチルローダミン（ＴＭＲ））等を挙げることができるが、これらに限定されない。蛍光色素でヌクレオチドを標識する方法は、公知の標識法のうち適当なものを使用できる〔Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  １４，  ｐ３０３−３０８  （１９９６）〕参照」。また、市販の蛍光標識キットを使用することもできる（例えば、アマシャム・ファルマシア社製  オリゴヌクレオチドＥＣＬ  ３’  −オリゴラベリングシステム等）。
【００６３】
プライマー又はプローブに上記のような標識を付加することにより、変異の検出を簡便かつ高感度に行うことができる。標識を用いる各種検出方法は、当業者には公知の技術である。なお本発明における、ポリヌクレオチドの「標識物」とは、ポリヌクレオチドに上記のような任意の標識を付加したものである。
さらに、上記のプライマー及び／又はプローブを含めたオオムギ渦遺伝子の有無を判定するためのキットも、本発明の実施形態の１つである。
【００６４】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例によって制限されるものではない。
なお、以下の実施例で用いた、「ミサトゴールデン（Ｍｉｓａｔｏ  Ｇｏｌｄｅｎ）」、「赤神力（Ａｋａｓｈｉｎｒｉｋｉ）」、「カシマムギ（Ｋａｓｈｉｍａｍｕｇｕ）」、「清源在来（Ｃｈｅｏｎｇｗｅｏｎ  Ｎａｔｉｖｅ）」、「青麦（Ａｏｍｕｇｉ）」、「谷風（Ｔａｎｉｋａｚｅ）」、「関取（Ｓｅｋｉｔｏｒｉ）」及び「コビンカタギ（Ｋｏｂｉｎｋａｔａｇｉ）」は、オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ  Ｌ．）栽培品種である。これらの品種は、ミサトゴールデン及びカシマムギは独立行政法人農業技術研究機構作物研究所より入手した。それ以外は岡山大学資源生物科学研究所より入手した。また野生オオムギｓｓｐ．  ｓｐｏｎｔａｎｅｕｍ  （ＯＵＨ６０２；並性系統）は、岡山大学資源生物科学研究所より入手した。
【００６５】
［実施例１］    ブラシノステロイド受容体相同遺伝子の単離及び渦性系統における該遺伝子の変異の同定
本発明者らは、渦遺伝子が、シロイヌナズナやイネのブラシノステロイド非感受性変異体の原因遺伝子の１つとして報告されているブラシノステロイド受容体遺伝子変異体と類似した遺伝子である可能性を検討した。そのため、本発明者らはまず、オオムギにおけるブラシノステロイド受容体相同遺伝子の単離を行った。
【００６６】
オオムギのブラシノステロイド受容体相同遺伝子の単離には、並性系統として「ミサトゴールデン」、渦性系統として「赤神力」及び「カシマムギ」の計３品種を用いた。植物材料としては、前記３品種のそれぞれについて、開花後３週間程度の未熟種子より胚を採取して使用した。遺伝子の単離は、下記の手順に従い、各品種について調製したｃＤＮＡを用いてブラシノステロイド受容体をコードすると思われるｃＤＮＡの部分断片を単離し、その部分断片を利用して全長ｃＤＮＡを単離することによって行った。
【００６７】
まず、ミサトゴールデンの種子胚から、ＣＴＡＢ法（Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｒｅｐ．  １１，  １１３−１１６  （１９９３））を用いて全ＲＮＡを抽出し、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｏｌｙｇｏ  （ｄＴ）２５  ｒｅｓｉｎ  （Ｄｙｎａｌ）によりｍＲＮＡを精製した。このｍＲＮＡを鋳型として、Ｍａｒａｔｈｏｎ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）の使用説明書に従って逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを調製した。次いで調製したｃＤＮＡを鋳型として、既知のブラシノステロイド受容体の保存配列に対して設計した縮重プライマー（５’−縮重プライマー：５’−ＡＡＲＴＧＹＡＣＩＡＡＩＹＴＩＡＡＹＴＧＧＡＴ−３’／配列番号７、３’−縮重プライマー１：５’−ＡＲＩＧＧＹＴＴＹＴＣＲＡＡＩＧＣＩＧＣ−３’／配列番号８）を合成して用いて、ＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応はＴａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）とその添付バッファーを用い、説明書に従って反応溶液を調製した。ＰＣＲ反応は、１０  ｎｇ相当のｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、２５  ｐｍｏｌの各プライマーと２．５ｕｎｉｔのＴａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを含む終濃度１ｘ  ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ（２０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ８．４、５０  ｍＭ  ＫＣｌ（Ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅに添付））、０．２  ｍＭのｄＮＴＰｓ、１．５  ｍＭのＭｇＣｌ２の反応液  ２０μｌ中で行った。温度サイクルは以下の通りである。９４℃３０秒の熱変性の後、熱変性を９４℃３０秒、アニーリングを５０℃１分、伸長反応を７２℃  １．５分の反応を５サイクル、次いで、熱変性を９４℃  ３０秒、アニーリングを４５℃  １分、伸長反応を７２℃  １．５分の反応を５サイクル、さらに、熱変性を９４℃  ３０秒、アニーリングを４０℃  １分、伸長反応を７２℃  １．５分の反応を２５サイクルの反応を行った。得られたＰＣＲ断片を鋳型として、増幅断片の内側の異なる保存配列に対して設計した縮重プライマー（３’−縮重プライマー２：５’−ＡＲＩＳＷＲＡＡＩＡＲＩＡＲＩＣＣＣＡＴＩＧＣ−３’／配列番号９）と配列番号：５のプライマーを用いてｎｅｓｔｉｄ−ＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動により確認したところ、シロイヌナズナ及びイネのブラシノステロイド受容体遺伝子の塩基配列から予想されるサイズに対応する８７５ｂｐのＤＮＡ断片が得られた。次いでこのＤＮＡ断片をクローニングし、塩基配列を決定した。
【００６８】
次に、全長ｃＤＮＡを単離するため、得られたＤＮＡ断片の塩基配列を基に遺伝子特異的プライマーを調製し、これらプライマーを用いてＲＡＣＥを行った。上記と同様にしてミサトゴールデンの種子胚より調製した全ｍＲＮＡを用いて、５’及び３’末端にアダプターを付加したｃＤＮＡを調製し（Ｍａｒａｔｈｏｎ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ，  Ｃｌｏｎｔｅｃｈを使用説明書に従って使用）、ＲＡＣＥのための鋳型とした。また、ＲＡＣＥ反応は、Ａｄｖａｎｔａｇｅ２  ＰＣＲ  ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いてその説明書に従って行った。５’−ＲＡＣＥ及びｎｅｓｔｉｄ−ＰＣＲには、遺伝子特異的プライマー（アンチセンスプライマー１：５’−ＴＣＡＴＣＴＴＣＣＣＣＧＡＣＴＧＣＴＣＴＧＣＣＡ−３’／配列番号１０、アンチセンスプライマー２：５’−ＴＴＧＡＧＧＧＣＧＧＴＧＡＧＣＧＡＧＧＴＧＡＧ−３’／配列番号１１、  アンチセンスプライマー３：５’−ＴＣＴＣＣＧＧＣＧＡＴＣＴＴＧＴＴＧＣＴＧＧＡＣ−３’／配列番号１２）及びアダプタープライマーＡＰ１（５’−ＣＣＡＴＣＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣ−３’（Ｍａｒａｔｈｏｎ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ，  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）／配列番号１３）を用いた。３’−ＲＡＣＥには、遺伝子特異的プライマー（センスプライマー：５’−ＴＧＧＣＡＧＡＧＣＡＧＴＣＧＧＧＧＡＡＧＡＴＧＡ−３’／配列番号１４）及び前記のアダプタープライマーＡＰ１（配列番号１３）を用いた。続いて、このようにしてＲＡＣＥにより得られた増幅断片を塩基配列決定した。
【００６９】
上記の方法により、ミサトゴールデンにおいてブラシノステロイド受容体をコードすると推定される遺伝子のｃＤＮＡ全長の塩基配列が明らかになった。さらにこの塩基配列を確実なものにするために、５’側の非翻訳領域に対して設計した遺伝子特異的プライマー（５’−ＣＧＣＴＴＣＴＣＧＣＡＴＧＧＴＣＴＣＡＡＧＧＴＡＧ−３’／配列番号１５）及び３’の非翻訳領域に対する遺伝子特異的プライマー（５’−ＡＧＣＴＴＧＣＧＴＧＧＧＡＡＣＣＴＣＡＧＡＡＴＧ−３’／配列番号１６）を合成し、これらプライマーを用いてミサトゴールデンｃＤＮＡを鋳型としＰｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）によるｈｉｇｈ  ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応にはＰｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）を用い、反応液組成は酵素に添付される説明書通りで行った。ＰＣＲ反応の温度サイクルは、変性９８℃  １０秒、アニーリングおよび伸長反応７２℃  ４分を５サイクル、次いで変性９８℃  １０秒、アニーリングおよび伸長反応７０℃  ４分を２５サイクル行った。このようにして増幅された遺伝子断片（３，５５８  ｂｐ）をｐＣＲ４  Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ  ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローニングし、５クローンについて塩基配列の決定を行い、増幅遺伝子断片について全ての塩基配列が一致することを確認した。このようにして得られた塩基配列（ミサトゴールデンのブラシノステロイド受容体をコードすると思われる遺伝子の配列）を、配列番号３として示す。さらにこの遺伝子がコードする推定アミノ酸配列を、配列番号４として示す。この推定アミノ酸配列（配列番号４）を、シロイヌナズナ及びイネのブラシノステロイド受容体のアミノ酸配列（アクセッション番号：シロイヌナズナについてはＤＤＢＪ：ＡＦ０１７０５６、Ｇｅｎｂａｎｋ：ＡＡＣ４９８１０、イネについてはＤＤＢＪ：ＡＰ００３４５３、Ｇｅｎｂａｎｋ：ＢＡＢ６８０５３）と比較したところ、それらは高度の相同性（イネとの間で８２．３％の同一性）を示し、かつ、シロイヌナズナ及びイネのブラシノステロイド受容体遺伝子に見出される特徴的なドメインを全て含んでいた（図１）。すなわち、オオムギの並性系統のミサトゴールデンから得られた配列番号３に示される塩基配列を有する遺伝子は、シロイヌナズナ及びイネで報告されているブラシノステロイド受容体遺伝子の相同遺伝子であることが示された。本発明者らは、このようにして単離したオオムギのブラシノステロイド受容体相同遺伝子を、ＨｖＢＲＩ１と名付けた。
【００７０】
なお、ＰＣＲ断片の塩基配列決定は、自動シークエンシングシステム（ＡＢＩ３７３Ａ及びＡＢＩ３１００Ａｖａｎｔ，  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いたジデオキシヌクレオチド・チェーン・ターミネーション法により行った。また、配列の解析は、ＧＥＮＥＴＹＸコンピューターソフトウェア（Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｋａｉｈａｔｕ  Ｃｏ．、日本）を用いて実施した。
【００７１】
続いて、「赤神力」及び「カシマムギ」の渦性系統について、上記のようにして得たブラシノライド受容体相同遺伝子（ＨｖＢＲＩ１）を単離し、その塩基配列を決定した。すなわち、上述のミサトゴールデンと同様の方法で赤神力及びカシマムギの未熟種子の胚よりそれぞれｃＤＮＡを調製し、得られたｃＤＮＡを鋳型としてブラシノステロイド受容体相同遺伝子の５’及び３’非翻訳領域に対する遺伝子特異的プライマー（配列番号１５及び１６）を用いてｈｉｇｈ  ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲを行い（反応条件はミサトゴールデンの場合と同じである）、得られたＰＣＲ産物の塩基配列を決定した。この塩基配列の決定は、ミサトゴールデンと同様に各５クローンについて行い、赤神力とカシマムギのそれぞれについて各クローンの塩基配列が全て一致することを確認した。さらにこれらの塩基配列は、赤神力とカシマムギの間でも完全に一致していた。このようにして決定された赤神力及びカシマムギのブラシノステロイド受容体相同遺伝子の塩基配列を、配列番号５として示す。さらにこの遺伝子の推定アミノ酸配列を、配列番号６として示す。
【００７２】
続いて、ミサトゴールデン（並性系統）と赤神力及びカシマムギ（渦性系統）との間で、上記のようにして決定されたブラシノステロイド受容体相同遺伝子の塩基配列と推定アミノ酸配列について比較した。まず、決定された塩基配列長、すなわち、ＰＣＲでの増幅断片長は両者間で完全に一致していた。一方、比較した両者の塩基配列は、２６１２番目の位置に１塩基の違いが認められた。すなわち２６１２番目の塩基は、ミサトゴールデンでアデニンであったのに対し、赤神力及びカシマムギではグアニンであった（配列番号３及び５の塩基番号２６１２を参照）。さらにこの１塩基の違いは、配列番号３及び５に示される塩基配列とそれに対応したアミノ酸配列からも分かるように、推定アミノ酸配列において１アミノ酸変異を引き起こすことが判明した。すなわち、ミサトゴールデンではヒスチジンである８５７番目のアミノ酸が、赤神力及びカシマムギではアルギニンに変異していた（配列番号４及び６のアミノ酸番号８５７を参照）。なお、この推定アミノ酸配列の８５７番目以外のアミノ酸は、ミサトゴールデン（並性系統）と赤神力及びカシマムギ（渦性系統）との間で完全に一致していた（図２）。以上の解析から、オオムギのブラシノステロイド受容体相同遺伝子に存在する遺伝子配列の変異によって引き起こされる８５７番目のアミノ酸（配列番号４及び６で示されるアミノ酸配列の８５７番目のアミノ酸）のヒスチジンからアルギニンへの変異が、渦性の原因となっている可能性が示された。すなわち、８５７番目のアミノ酸のヒスチジンからアルギニンへの変異を引き起こす遺伝子変異を有するブラシノステロイド受容体相同遺伝子変異体が、渦遺伝子本体である可能性が示された。
【００７３】
さらに、このオオムギのブラシノステロイド受容体相同遺伝子における１アミノ酸変異を、シロイヌナズナ及びイネのブラシノステロイド感受性変異体の原因遺伝子として報告されているブラシノステロイド受容体遺伝子変異体における変異と比較した。本発明における１アミノ酸変異は、８５７番目のアミノ酸のヒスチジンからアルギニンへの変異であり、この変異部位は、既知タンパク質リン酸化酵素との比較からタンパク質リン酸化酵素の保存ドメインＩＶと推定される領域中に存在していた（図１）。一方、シロイヌナズナのブラシノステロイド受容体遺伝子変異体において報告されている変異は、６１１番目のアミノ酸のグリシンからグルタミン酸への変異であり（特許文献１及び非特許文献６）、この変異部位は、２１番目と２２番目のロイシンリッチリピートの間に存在する７７アミノ酸領域中に存在していた（図１）。それ以外にもシロイヌナズナのｂｒｉ１変異体アレルについては報告されているが、今回オオムギにおいて明らかにされた変異は、それらシロイヌナズナの変異とは異なるものであった（Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １９９９，Ｖｏｌ．１２１，  ｐｐ７４３−７５２）。またイネのブラシノステロイド受容体遺伝子変異体において報告されている変異は、９８９番目のアミノ酸のトレオニンからイソロイシンへの変異、及び４９１番目のアミノ酸のバリンからメチオニンへの変異であり、これらの変異部位は、既知タンパク質との比較から、タンパク質リン酸化酵素ドメインのサブドメインＩＸと推定される領域中、及び１７番目のロイシンリッチリピートと推定される領域中にそれぞれ存在していた。このように、オオムギのブラシノステロイド受容体相同遺伝子における並性系統と渦性系統の間の１アミノ酸変異は、シロイヌナズナ及びイネのブラシノステロイド受容体遺伝子変異体において報告されているいずれの変異とも異なるものであった。
【００７４】
［実施例２］    ブラシノステロイド受容体相同遺伝子（ＨｖＢＲＩ１）における一塩基の違い（２６１２Ａ→ＧのＳＮＰ）を直接検出できるｄＣＡＰＳマーカーの開発
実施例１で見出された並性系統と渦性系統との間のブラシノステロイド受容体相同遺伝子における一塩基の違い（２６１２Ａ→ＧのＳＮＰ）を簡便に検出できる分子マーカーの開発を試みた。
【００７５】
まず、配列番号１で示される塩基配列に基づいて、並性系統と渦性系統との間で見出されたＳＮＰ部位（２６１２Ａ→Ｇ）の１塩基上流までを含む２８塩基長の配列からｄＣＡＰＳプライマー１（５’−ＧＡＡＡＴＧＧＡＧＡＣＣＡＴＴＧＧＣＡＡＧＡＴＣＡＡＧＣ−３’／配列番号：１７）を、該ＳＮＰ部位の約２５０ｂｐ下流の２４塩基長の配列からｄＣＡＰＳプライマー２（５’−ＣＣＴＴＧＣＣＴＣＣＡＧＡＴＴＣＴＣＡＴＣＡＡＣ−３’／配列番号：１８）をそれぞれ設計した。ｄＣＡＰＳプライマー１の配列については、配列番号１で示される塩基配列においてＳＮＰ部位（２６１２Ａ→Ｇ）の２塩基上流の位置に当たるアデニンをグアニンに変更した。ｄＣＡＰＳプライマー１及び２の塩基配列及びＳＮＰ部位（２６１２Ａ→Ｇ）との位置関係を、図３に示す。このようなｄＣＡＰＳプライマー１及び２を用いて、オオムギのブラシノステロイド受容体相同遺伝子の部分断片を増幅すれば、２６１１〜２６１３番目の塩基配列が「ＣＧＣ」である場合（渦性系統）には、ｄＣＡＰＳプライマーの３’側の２塩基（ＧＣ）とそれに連続する塩基配列（ＧＣ）とで制限酵素Ｈｈａ  Ｉの認識部位（ＧＣＧＣ）が出来るはずである（図３）。
【００７６】
次いで、オオムギ栽培品種「はるな二条」と野生オオムギ「ｓｓｐ．  ｓｐｏｎｔａｎｅｕｍ  （ＯＵＨ６０２）」の２種の並性系統、および、オオムギ栽培品種「赤神力」の１種の渦性系統について、ＣＴＡＢ法でゲノムＤＮＡを調製し、それを鋳型としてｄＣＡＰＳプライマー１及び２を用いるＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は、Ｅｘ  ＴａｑＴＭ（ＴａＫａＲａ）を用い、反応液組成は酵素に添付される説明書通りに行った。ＰＣＲ反応の温度サイクルは、９４℃２分の後，変性９４℃  ３０秒、アニーリング６０℃  ３０秒、および伸長反応７２℃  １分を３５サイクルである。このようにして得られた増幅断片を含むＰＣＲ反応液１０μｌを、２  ｕｎｉｔのＨｈａ  Ｉ  を含む１ｘ制限酵素バッファー中で１時間かけて切断した。制限酵素の反応液組成は用いた制限酵素に添付される説明書通りである。さらに、制限酵素処理を行った反応液を、０．５ｘＴＢＥを含む７％アクリルアミドゲル、または、３％  Ｍｅｔａｐｈｏｒ（ＦＭＣ  ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ，  Ｒｏｃｋｌａｎｄ，  ＭＥ）アガロースゲルで電気泳動した。
【００７７】
その結果、はるな二条およびｓｓｐ．  ｓｐｏｎｔａｎｅｕｍ  （ＯＵＨ６０２）の並性系統由来のＤＮＡ試料については約２９０  ｂｐのバンドが観察されるのに対し、赤神力の渦性系統由来のＤＮＡ試料については、約２６０  ｂｐのバンドが検出された（図４）。これらのバンドサイズは、配列番号３及び５で示される塩基配列からそれぞれ予想されるバンドサイズの２９４  ｂｐ及び２６５  ｂｐと正確に一致していた。この結果は、並性系統について観察される約２９０  ｂｐの増幅断片が、Ｈｈａ  Ｉ処理により消化されてｄＣＡＰＳプライマーの一部分が失われることにより、渦性系統についてはサイズがより小さい増幅断片となったことを示す。このように、開発したｄＣＡＰＳプライマー１及び２を用いて、ＰＣＲ増幅とその増幅断片のＨｈａ  Ｉによる制限消化とを行うことにより、並性系統と渦性系統の間のブラシノステロイド受容体相同遺伝子における一塩基の違い（ＳＮＰ）を簡便に検出できることが示された。
【００７８】
［実施例３］    遺伝学的解析による渦遺伝子の確認
実施例１において渦性系統から単離した２６１２Ａ→ＧのＳＮＰを有するＨｖＢＲＩ１変異体が、渦遺伝子本体であることを遺伝学的に確認することにより、渦遺伝子を特定するため、渦性系統の分離集団に対し、実施例２で開発したｄＣＡＰＳマーカーを用いてＨｖＢＲＩ１変異体中に見出したＳＮＰをマッピングした。マッピングには、赤神力（渦性系統）及び野生オオムギｓｓｐ．  ｓｐｏｎｔａｎｅｕｍ  （ＯＵＨ６０２；並性系統）を両親とするＦ２集団１２０個体を用いた。この１２０個体全てについて、実施例２で開発したｄＣＡＰＳマーカーを用いてジェノタイピングを行った結果、ＨｖＢＲＩ１変異体中に見出したＳＮＰの２６１２Ｇをホモで持つ個体の分離は渦性を示す個体の分離と完全に一致しており、ｓｓｐ．  ｓｐｏｎｔａｎｅｕｍ  型／ヘテロ型／「赤神力」型の分離は、１  ：  ２  ：  １となり、渦遺伝子が単因子劣性の遺伝様式を示すことと合致した。この結果から、実施例１において赤神力及びカシマムギから単離した２６１２Ａ→ＧのＳＮＰを有するＨｖＢＲＩ１変異体は、渦遺伝子本体であることが遺伝学的に証明された。従って、ブラシノステロイド受容体相同遺伝子（ＨｖＢＲＩ１）における一塩基の違い（２６１２Ａ→ＧのＳＮＰ）を検出すれば、渦遺伝子を直接検出できることが示された。この２６１２Ａ→ＧのＳＮＰの検出には、実施例２で開発したｄＣＡＰＳマーカーを有利に使用できると考えられる。
【００７９】
［実施例４］    オオムギの各種栽培品種由来の核酸試料における、ｄＣＡＰＳマーカーを用いたオオムギ渦遺伝子の有無の判定
実施例２及び３により、ｄＣＡＰＳマーカーによって渦遺伝子を直接検出できることが示されたことに基づいて、オオムギの他の渦性系統でも、赤神力及びカシマムギで見出された渦遺伝子を共通して検出できるかどうかを試験した。用いた栽培品種は、「清源在来（Ｃｈｅｏｎｇｗｅｏｎ  Ｎａｔｉｖｅ）；皮性、秋播型、韓国」「青麦（Ａｏｍｕｇｉ）；裸性、春播型、韓国」「谷風（Ｔａｎｉｋａｚｅ）；皮性、春播型、日本」「関取（Ｓｅｋｉｔｏｒｉ）；皮性、秋播型、日本」「コビンカタギ（Ｋｏｂｉｎｋａｔａｇｉ）；裸性、秋播型、日本」のそれぞれの渦性系統である。これらの品種は、例えば、種子外皮のタイプ（皮性であるか裸性であるか）、春化処理の必要性の程度（秋播型であるか春播型であるか）及び採集地（日本であるか韓国であるか）の点で、それぞれがかなり異なる表現型を有している。
【００８０】
ｄＣＡＰＳマーカーを用いた渦遺伝子の検出は、実施例２に記載したのと同様の方法に従って行った。すなわち、各品種の種子胚から調製した鋳型ＤＮＡに対して、ｄＣＡＰＳプライマー１及び２を用いるＰＣＲ増幅を行って増幅断片を得た。次いでその試料を２つに分け、一方は制限酵素で無処理の対照試料とし、もう一方はＨｈａ  Ｉを用いて制限消化した検出試料とした。続いて、これらの試料をアガロースゲル電気泳動にかけた。このようにして得られた電気泳動の結果を図５に示す。図中、「Ｍ」は分子量マーカーφＸ１７４  Ｈａｅ  ＩＩＩ、「−」はＨｈａ  Ｉで無処理の対照試料、「＋」はＨｈａ  Ｉにより制限消化した検出試料をロードしたレーンであることを表す。
【００８１】
図５に示される通り、使用したどの品種においても、対照試料では２９４  ｂｐ、検出試料では２６５  ｂｐに相当するバンドが観察された。この結果から、これらのオオムギ品種由来の核酸試料について、ｄＣＡＰＳマーカーを用いてブラシノステロイド受容体相同遺伝子（ＨｖＢＲＩ１）変異体の２６１２Ａ→ＧのＳＮＰを検出することにより、渦遺伝子を直接検出し、それによりその核酸試料中に渦遺伝子が存在するかどうか（渦遺伝子の有無）を判定できることが示された。さらに、上記のように表現型が大きく異なる渦性系統間において、渦遺伝子が共通して検出されたことから、これらのオオムギ品種は、渦性の原因遺伝子として共通して渦遺伝子を保持していることが示された。すなわち、以上のような方法により、オオムギ由来の核酸試料中に渦遺伝子が存在するか否か（渦遺伝子の有無）を判定して、渦遺伝子がホモ接合体で存在すると判定されれば、そのオオムギを渦性品種として識別できることが示された。
【００８２】
【発明の効果】
本発明において、多収をもたらす矮性遺伝子としての渦遺伝子が、特定の１アミノ酸変異を有するブラシノステロイド受容体遺伝子変異体であることが明らかになった。本発明の渦遺伝子の有無を判定する方法、例えばｄＣＡＰＳマーカーを用いる方法を使用すれば、遺伝的にヘテロな植物体（Ｆ１植物など）における渦遺伝子の存在を確実に判定することができるため、その判定結果に基づいてヘテロ接合体植物を育種親として選択し、その育種親を自家交配することにより、渦性品種（ホモ接合体）を効率良く確実に作出することが可能となる。また、ホモ接合体植物においては、任意の植物試料について渦遺伝子の存在を確実に判定することができるため、任意の生長段階で渦性品種か否かを識別することが可能となる。このように、本発明の方法は、多収遺伝子としての渦遺伝子の導入を目的とした育種において、渦遺伝子系統の確実かつ簡便な選抜が可能となるため、育種工程の効率化が図れ、非常に有用である。また、本発明において提供する配列番号５で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド又はその部分配列を有するポリヌクレオチドは、上記の渦遺伝子の有無を判定する方法においてプローブ又はプライマーとして用いることにより、渦遺伝子を特異的に検出できる点で、大変有用である。特に、配列番号５で示される塩基配列の２６１１番目の塩基位置を３’末端とする部分配列について２６１０番目の位置の塩基をグアニンに変更した配列からなるポリヌクレオチドは、制限酵素Ｈｈａ  Ｉを使用した簡便な渦遺伝子の有無の判定方法において有効なプライマーとして用いることができる。さらに、本発明における渦遺伝子の有無を判定するためのキットは、渦性品種の識別方法及び渦性品種の育種方法を効率的に実施する上で、特に有用なツールとして使用することができる。
【００８３】
【配列表】
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【００８４】
【配列表フリーテキスト】
配列番号７〜１８の配列は、合成ＤＮＡである。
【００８５】
配列番号７〜９の配列中の「ｎ」は、イノシンである。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、シロイヌナズナ（ＡｔＢＲＩ１）、イネ（ＯｓＢＲＩ１）、オオムギ（ＨｖＢＲＩ１）のブラシノステロイド受容体のアミノ酸配列をアライメントした図である。Ｉ〜ＸＩまでのローマ数字は、タンパク質リン酸化酵素の各保存ドメインを示している。
【図２】図２は、オオムギのブラシノステロイド受容体のアミノ酸配列を、ミサトゴールデン（並性系統）並びに赤神力及びカシマムギ（渦性系統）の間でアライメントした図である。矢印は、渦性系統における変異（８５７Ｈｉｓ→Ａｒｇ）部位を示す。
【図３】図３は、ｄＣＡＰＳマーカーと２６１２Ａ→ＧのＳＮＰ部位の配列番号１で示される塩基配列上の位置関係を示す図である。「ｕｚｕ」は赤神力及びカシマムギ（渦性系統）から得られる渦遺伝子を、「ｎｏｒｍａｌ」はミサトゴールデン（並性系統）から得られる野生型遺伝子を表す。囲い枠は、８５７Ｈｉｓ→Ａｒｇの変異に対応するコドンを示す。枠の中に太字で示した「Ａ」及び「Ｇ」が変異部位の塩基を示している。
【図４】図４は、ｄＣＡＰＳマーカーを利用して並性系統と渦性系統を識別した電気泳動結果を示す図である。
【図５】図５は、ｄＣＡＰＳマーカーを利用して渦性系統５品種を識別した電気泳動結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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