【手続補正書】
【提出日】平成23年12月14日(2011.12.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
イソプレンの産出能力が増加された組み換え細胞であって、
（ａ）イソプレンシンターゼポリペプチドであって、非相同核酸によりコードされるイソプレンシンターゼポリペプチド、
（ｂ）イソペンテニル-ジホスフェート デルタ-イソメラーゼ(IDI)ポリペプチド、及び
（ｃ）(i) 1-デオキシキシルロース-5-ホスフェートシンターゼ(DXS)ポリペプチド、及び／又は
(ii) メバロン酸塩 (MVA) 経路ポリペプチド
をコードする核酸の１以上を備え、
１）前記細胞が400ナノモル/gwcm/hrを超えるイソプレンを産出し、
２）前記細胞が細胞培養培地から消費する炭素の0.002モルパーセントを超える量をイソプレンに転換し
３） 前記細胞が0.1mg/Lbroth/hrを超えるイソプレンの平均容積生産性を有する、及び／又は
４）前記細胞が細胞乾燥質量(gdcm)当たり少なくとも0.0037グラムのイソプレンを産出する、細胞。
【請求項２】
前記細胞がイソプレンを少なくとも500, 600, 700, 800, 900, 1,000, 1,250, 1,500, 1,750, 2,000, 2,500, 3,000, 4,000, 5,000, 10,000, または12,500ナノモル/gwcm/hr産出する、請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
前記細胞が400 ナノモル/gwcm/hrから2.0×105 ナノモル/gwcm/hrのイソプレンを産出する、請求項１に記載の細胞。
【請求項４】
前記イソプレンシンターゼポリペプチドが、植物性イソプレンシンターゼポリペプチドである、請求項１に記載の細胞。
【請求項５】
前記植物性イソプレンシンターゼポリペプチドが、ポプラ（poplar）イソプレンシンターゼポリペプチドである、請求項４に記載の細胞。.
【請求項６】
前記ポプライソプレンシンターゼポリペプチドが、ポプラ・アルバ(Populus alba)、ポプラ・トレムロイデス(Populus tremuloides)、ポプラ・ニグラ(Populus nigra)、ポプラ・トリコカーパ(Populus trichocarpa)、及びポプラ・アルバ×ポプラ・トレムラ(Populus tremula)からなる群から選択されるポプラ種に由来する天然由来ポリペプチドである、請求項５に記載の細胞。
【請求項７】
前記植物性イソプレンシンターゼポリペプチドが、クズ（kudzu）イソプレンシンターゼポリペプチドである、請求項４に記載の細胞。
【請求項８】
前記クズ（kudzu）イソプレンシンターゼポリペプチドがプエラリア・モンタナ（Pueraria montana)由来の天然由来ポリペプチドである、請求項７に記載の細胞。
【請求項９】
前記（ｂ）におけるIDIポリペプチドをコードする核酸が非相同核酸である、請求項１に記載の細胞。
【請求項１０】
前記IDIポリペプチドが酵母IDIポリペプチドである、請求項９に記載の細胞。
【請求項１１】
前記（ｂ）におけるIDIポリペプチドをコードする非相同核酸が、IDIポリペプチドをコードする内因性核酸のコピーである、請求項９に記載の細胞。
【請求項１２】
前記（ｃ）におけるDXSポリペプチドをコードする核酸が非相同核酸である、請求項１に記載の細胞。
【請求項１３】
前記（ｃ）におけるDXSポリペプチドをコードする非相同核酸が、DXSポリペプチドをコードする内因性核酸のコピーである、請求項１２に記載の細胞。
【請求項１４】
前記（ｃ）における１以上のMVA経路ポリペプチドをコードする非相同核酸を１以上有する、請求項１に記載の細胞。
【請求項１５】
前記（ｃ）における１以上のMVA経路ポリペプチドをコードする核酸の少なくとも１が内因性核酸のコピーである、請求項１に記載の細胞。
【請求項１６】
１以上の核酸が、１，２，３，４またはそれ以上のMVA経路ポリペプチドをコードする、請求項１に記載の細胞。
【請求項１７】
前記１以上の核酸が全てのMVA経路のポリペプチドをコードする、請求項１に記載の細胞。
【請求項１８】
前記１以上の核酸が下流MVA経路のポリペプチドをコードする、請求項１に記載の細胞。
【請求項１９】
前記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）のいずれかのポリペプチドをコードする１以上の核酸の内の少なくとも１が過剰発現される、請求項１に記載の細胞。
【請求項２０】
前記過剰発現された核酸がマルチコピープラスミド中にクローン化される、請求項１９に記載の細胞。
【請求項２１】
前記過剰発現された核酸が、誘導プロモータまたは構築プロモータの下に置かれる、請求項１９に記載の細胞。
【請求項２２】
前記細胞が、植物性細胞、細菌細胞、藻類細胞、酵母細胞、及び菌類細胞から成る群から選択される、請求項１に記載の細胞。
【請求項２３】
前記細胞が、グラム陽性細菌細胞またはグラム陰性細菌細胞である、請求項２２に記載の細胞。
【請求項２４】
前記細菌細胞が、大腸菌(E. coli)、パントエア・シトレア（Pantoea citrea）、バシラス.スブチリス（Bacillus subtilis）、B. リケニホルミス（licheniformis)、B. レンタス(lentus)、B.ブレビス (brevis)、B. ステアロサーモフィラス (stearothermophilus)、B.アルカロフィラス (alkalophilus)、B. アミロリケファシエンス (amyloliquefaciens)、B.クラウシー (clausii)、B.ハロヂュランス (halodurans)、B.メガテリウム (megaterium)、B.コーギュランス (coagulans)、B.サーキュランス (circulans)、B.ロータス (lautus)、及び B.チューリンゲンシス (thuringiensis)、ストレプトミセス・アルバス(Streptomyces albus)、ストレプトミセス・リビダンス(lividans)、ストレプトミセス・コエリカラー(coelicolor)、またはストレプトミセス・グリセウス(griseus)、シュードモナス (Pseudomonas)属、及びシュードモナス・アルカリゲンス(alcaligenes)細胞から成る群から選択される、請求項２３に記載の細胞。
【請求項２５】
前記（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のポリペプチドをコードする１以上の核酸の内の少なくとも１がベクター上にある、請求項１に記載の細胞。
【請求項２６】
前記（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のポリペプチドをコードする１以上の核酸の内の少なくとも１が前記細胞の染色体に組み込まれている、請求項１に記載の細胞。
【請求項２７】
前記細胞が、
（ｃ）(i) DXSポリペプチド、及び 
(ii) １以上のMVA経路ポリペプチド
をコードする核酸を１以上備える、請求項１に記載の細胞。
【請求項２８】
前記細胞が、
（ｃ）(i) DXSポリペプチド、及び 
(ii) 全てのMVA経路のポリペプチド
をコードする核酸を１以上備える、請求項２７に記載の細胞。
【請求項２９】
前記細胞が、
（ｃ）(i) DXSポリペプチド、及び 
(ii) 下流MVA経路のポリペプチド
をコードする核酸を１以上備える、請求項２７に記載の細胞。
【請求項３０】
イソプレンを産出する方法であって、
（ａ）請求項１に記載の組み換え細胞を、イソプレン産出に適した培養条件下で培養する工程であって、前記細胞が
(i) 400 ナノモル/gwcm/hrを超えるイソプレンを産出し、
(ii) 前記細胞が細胞培養培地から消費する炭素の0.002モルパーセントを超える量をイソプレンに転換させ、
(iii) 0.1mg/Lbroth/hrを超えるイソプレンの平均容積生産性を有する、及び／又は
(iv) 前記細胞が細胞乾燥質量(gdcm)当たり少なくとも0.0037グラムのイソプレンを産出する、工程と、
（ｂ）イソプレンを産出する工程とを含む方法。
【請求項３１】
さらにイソプレンを回収する工程を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記細胞がイソプレンを少なくとも500, 600, 700, 800, 900, 1,000, 1,250, 1,500, 1,750, 2,000, 2,500, 3,000, 4,000, 5,000, 10,000, または12,500ナノモル/gwcm/hr産出する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記細胞が400 ナノモル/gwcm/hrから2.0×105 ナノモル/gwcm/hrのイソプレンを産出する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
前記細胞が植物性イソプレンシンターゼポリペプチドを備える、請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
前記植物性イソプレンシンターゼポリペプチドが、ポプライソプレンシンターゼポリペプチドである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記ポプライソプレンシンターゼポリペプチドが、ポプラ・アルバ(Populus alba)、ポプラ・トレムロイデス(Populus tremuloides)、ポプラ・ニグラ(Populus nigra)、ポプラ・トリコカーパ(Populus trichocarpa)、及びポプラ・アルバ×ポプラ・トレムラ(Populus tremula)からなる群から選択されるポプラ種に由来する天然由来ポリペプチドである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記植物性イソプレンシンターゼポリペプチドが、クズ（kudzu）イソプレンシンターゼポリペプチドである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
前記クズ（kudzu）イソプレンシンターゼポリペプチドがプエラリア・モンタナ（Pueraria montana)由来の天然由来ポリペプチドである、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記細胞がIDIポリペプチドをコードする非相同核酸を備える、請求項３０に記載の方法。
【請求項４０】
前記IDIポリペプチドが酵母IDIポリペプチドである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記IDIポリペプチドをコードする非相同核酸が、IDIポリペプチドをコードする内因性核酸のコピーである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記細胞がDXSポリペプチドをコードする非相同核酸を備える、請求項３０に記載の方法。
【請求項４３】
前記DXSポリペプチドをコードする非相同核酸が、DXSポリペプチドをコードする内因性核酸のコピーである、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記細胞が、１以上のMVA経路ポリペプチドをコードする非相同核酸を１、２、３、４またはそれ以上備える、請求項３０に記載の方法。
【請求項４５】
前記細胞が、全てのMVA経路のポリペプチドをコードする非相同核酸を１以上備える、請求項３０に記載の方法。
【請求項４６】
前記細胞が、１以上の下流MVA経路のポリペプチドをコードする非相同核酸を１以上備える、請求項３０に記載の方法。
【請求項４７】
前記細胞が、ポリペプチドをコードする核酸の少なくとも１を過剰発現する、請求項３０に記載の方法。
【請求項４８】
前記過剰発現された核酸がマルチコピープラスミド中にクローン化される、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記過剰発現された核酸が、誘導プロモータまたは構築プロモータの制御下に置かれる、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
前記細胞が、植物性細胞、細菌細胞、藻類細胞、酵母細胞、及び菌類細胞から成る群から選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項５１】
前記細胞が、グラム陽性細菌細胞またはグラム陰性細菌細胞である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記細菌細胞が、大腸菌(E. coli)、パントエア・シトレア（Pantoea citrea）、バシラス.スブチリス（Bacillus subtilis）、B. リケニホルミス（licheniformis)、B. レンタス(lentus)、B.ブレビス (brevis)、B. ステアロサーモフィラス (stearothermophilus)、B.アルカロフィラス (alkalophilus)、B. アミロリケファシエンス (amyloliquefaciens)、B.クラウシー (clausii)、B.ハロヂュランス (halodurans)、B.メガテリウム (megaterium)、B.コーギュランス (coagulans)、B.サーキュランス (circulans)、B.ロータス (lautus)、及び B.チューリンゲンシス (thuringiensis)、ストレプトミセス・アルバス(Streptomyces albus)、ストレプトミセス・リビダンス(lividans)、ストレプトミセス・コエリカラー(coelicolor)、またはストレプトミセス・グリセウス(griseus)、シュードモナス (Pseudomonas)属、及びシュードモナス・アルカリゲンス(alcaligenes)細胞から成る群から選択される、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記細胞が少なくとも１のポリペプチドをコードする核酸を備え、前記核酸がベクター上にある、請求項３０に記載の方法。
【請求項５４】
前記細胞がポリペプチドをコードする少なくとも１の核酸を備え、前記核酸が前記細胞の染色体に組み込まれている、請求項３０に記載の細胞方法。
【請求項５５】
前記細胞が、DXSポリペプチド、及び１以上のMVA経路ポリペプチドをコードする核酸を１以上備える、請求項３０に記載の方法。
【請求項５６】
前記細胞が、 DXSポリペプチド、及び 全てのMVA経路のポリペプチドをコードする核酸を１以上備える、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記細胞が、 DXSポリペプチド、及び 下流MVA経路のポリペプチドをコードする核酸を１以上備える、請求項５５に記載の方法。