【誤訳訂正書】
【提出日】平成24年1月10日(2012.1.10)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
脳梗塞を治療するための静脈内適用可能な薬物を製造するための、Ｄｅｓｍｏｄｕｓ  ｒｏｔｕｎｄｕｓのプラスミノーゲン活性化因子（ＤＳＰＡ）またはその薬学的に受容可能な塩の使用であって、該プラスミノーゲン活性化因子は６２．５〜２３０μｇ／ｋｇの投薬量で投与され、かつ、脳梗塞発症の少なくとも３時間後に投与される、プラスミノーゲン活性化因子の使用。
【請求項２】
前記投薬量が、６２．５〜９０μｇ／ｋｇである、請求項１に記載のプラスミノーゲン活性化因子の使用。
【請求項３】
点滴を特徴とする、請求項１〜２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項４】
ボーラス注射を特徴とする、請求項１〜２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５】
単回ボーラス注射を特徴とする、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
脳梗塞発症の少なくとも６時間後に、ヒトにおいて脳梗塞を治療的処置するための、請求項１〜５の少なくとも一項に記載のプラスミノーゲン活性化因子の使用。
【請求項７】
脳梗塞発症の少なくとも９時間後に、ヒトにおいて脳梗塞を治療的処置するための、請求項１〜６の少なくとも一項に記載のプラスミノーゲン活性化因子の使用。
【請求項８】
前記脳梗塞の発症が時間的には正確に決められない脳梗塞患者を治療的処置するための、請求項１〜７の少なくとも一項に記載のプラスミノーゲン活性化因子の使用。
【請求項９】
野生型ｔ−ＰＡの神経毒性を回避しつつ脳梗塞を治療するための、請求項１〜８の少なくとも一項に記載のプラスミノーゲン活性化因子の使用。
【請求項１０】
請求項１〜９の少なくとも一項に記載のプラスミノーゲン活性化因子、および少なくとも１つのさらなる薬学的活性成分またはその薬学的に受容可能な塩を含有する薬学的組成物。
【請求項１１】
神経保護剤を特徴とする、請求項１０に記載の薬学的組成物。
【請求項１２】
グルタミン酸レセプターアンタゴニストを特徴とする、請求項１１に記載の薬学的組成物。
【請求項１３】
競合的アンタゴニストまたは非競合的アンタゴニストを特徴とする、請求項１２に記載の薬学的組成物。
【請求項１４】
以下の物質：トロンボモジュリン、トロンボモジュリンアナログ、トリアビン、パリジピン、またはソルリンの群から優先的に選択される、少なくとも１つのトロンビンインヒビターを特徴とする、請求項１０に記載の薬学的組成物。
【請求項１５】
以下の抗凝血剤：ヒルジン、ヘパリン、アセチルサリチル酸またはアンクロドの群から優先的に選択される、少なくとも１つの抗凝血剤を特徴とする、請求項１０に記載の薬学的組成物。
【請求項１６】
抗炎症物質を特徴とする、請求項１０に記載の薬学的組成物。
【請求項１７】
抗生剤を特徴とする、請求項１０に記載の薬学的組成物。
【請求項１８】
シチコリンを特徴とする、請求項１０に記載の薬学的組成物。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【発明の詳細な説明】
【発明の名称】脳梗塞の処置のための非神経毒性プラスミノーゲン活性剤の静脈内注射
【技術分野】
【０００１】
本願発明は、非神経毒性プラスミノーゲン活性化因子、特に、遺伝子改変されたプラスミノーゲン活性化因子およびＤｅｓｍｏｄｕｓ  ｒｏｔｕｎｄｕｓの唾液由来のプラスミノーゲン活性化因子（ＤＳＰＡ）を、ヒトの脳梗塞を治療するために静脈内適用することに関する。これらのプラスミノーゲン活性化因子による脳梗塞の治療は、国際特許出願第ＰＣＴ／ＥＰ０２／１２２０４によって知られており、その開示内容はすべて、参照に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
（脳梗塞の臨床学的特徴および生化学）
さまざまな臨床像が、臨床症状に関連した「脳梗塞」という用語にまとめられている。それぞれの病因によって、まず、これらの臨床像は、いわゆる虚血発作と出血性発作に区別することが可能である。
【０００３】
虚血性発作（虚血）は、動脈血の供給がなくなるために、脳における血液循環が低下または阻害されることを特徴とする。これは、しばしば、動脈硬化性の狭窄した血管の血栓によって、または、動脈・動脈性の個々の心臓塞栓症によって生じる。
【０００４】
出血性発作は、とりわけ、動脈性の筋緊張亢進によって損傷された脳供給動脈の穿孔による。しかしながら、すべての脳の発作のうち約２０％が出血性発作に起因するに過ぎない。したがって、血栓症による発作の方がずっと関連性が高い。
【０００５】
他の組織の虚血と比較すると、神経組織の虚血は、影響を受ける細胞の壊死を広範に伴う。神経組織において壊死の発生率が高くなることは、新しく解明された「興奮毒性」という、複数の反応段階を含む複合的カスケードによって説明することができる。このカスケードは、酸素欠乏に見舞われると、即座にＡＴＰを失って脱分極する虚血ニューロンによって開始される。その結果、カチオンチャンネルを制御している膜結合型グルタミン酸レセプターを活性化する神経伝達物質であるグルタミン酸の後シナプス放出が増加する。しかし、グルタミン酸の放出の増加によって、グルタミン酸レセプターが過活性化される。
【０００６】
グルタミン酸レセプターは、グルタミン酸がレセプターに結合することによって開く電圧依存型カチオンチャンネルを調節する。その結果、Ｎａ＋とＣａ２＋の細胞への流入が起こり、Ｃａ２＋依存型の細胞代謝の大規模な阻害が生じる。特に、Ｃａ２＋依存型異化酵素の活性化は、その後の細胞死の原因となりうる（Ｌｅｅ，Ｊｉｎ−Ｍｏ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｔｈｅ  ｃｈａｎｇｉｎｇ  ｌａｎｄｓｃａｐｅ  ｏｆ  ｉｓｃｈａｅｍｉｃ  ｂｒａｉｎ  ｉｎｊｕｒｙ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ”；Ｄｅｎｎｉｓ  Ｗ．Ｚｈｏｌ”Ｇｌｕｔａｍａｔｅ  ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ”）。
【０００７】
グルタミン酸媒介型神経毒性のメカニズムは、まだ完全に解明されていないが、脳虚血後の神経細胞死にかなりの程度寄与していることについては見解が一致している（Ｊｉｎ−Ｍｏ  Ｌｅｅ，ｅｔ  ａｌ．）。
【０００８】
（脳梗塞の治療法）
急性脳虚血の治療においては、生体機能の保全と生理的なパラメータを安定させること以外に、閉じた血管を再開させることが優先される。この再開は、さまざまな手段で行なうことができる。例えば、心臓発作後のＰＴＣＡなどのように、単なる機械的な再開は、今までのところ、満足の行く結果には至っていない。線維素溶解に成功することによってのみ、患者の健康状態を許容できるまで改善することができる。これは、カテーテルを用いる局所適用によって行うことができる（ＰＲＯＣＡＴ、プロウロキナーゼを用いた研究）。しかしながら、最初に良好な結果が得られたにもかかわらず、この方法は薬品治療としてまだ公式には承認されていない。
【０００９】
自然な線維素溶解は、セリンプロテアーゼであって、その不活性型前駆体プラスミノゲンから触媒作用（活性化）によって生じるプラスミンの蛋白質分解活性によるものである。プラスミノーゲンの自然での活性化は、生体内で天然に存在するプラスミノーゲン活性化因子であるｕ−ＰＡ（ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子）およびｔ−ＰＡ（組織プラスミノーゲン活性化因子）によって触媒される。ｕ−ＰＡとは対照的に、ｔ−ＰＡは、フィブリンおよびプラスミノーゲンと一緒にいわゆる活性化因子複合体を形成する。したがって、ｔ−ＰＡの触媒活性はフィブリン依存的であり、それが存在すると約５５０倍に増強される。フィブリン以外にフィブリノーゲンも、程度は低いものの、プラスミノーゲンからプラスミンへのｔ−ＰＡによる触媒を促進することができる。フィブリノーゲンが存在する場合には、ｔ−ＰＡ活性は２５倍増強するにすぎない。また、フィブリンの切断産物（フィブリン分解産物（ＦＤＰ））はｔ−ＰＡを促進させる。
【００１０】
（既知の治療法）
（ａ）ストレプトキナーゼ）
急性脳梗塞を血栓溶解治療しようとした初期の試みは１９５０年代に遡る。β溶連菌由来の線維素溶解因子であるストレプトキナーゼを用いた最初の広範な臨床試験は１９９５年に始められたばかりである。ストレプトキナーゼは、プラスミノーゲンと一緒に、他のプラスミノーゲン分子をプラスミンに触媒する複合体を形成する。
【００１１】
ストレプトキナーゼはバクテリアのプロテアーゼであって、生体のアレルギー反応を誘発しうることから、ストレプトキナーゼによる治療には重大な不利益が伴う。さらに、以前、連鎖球菌に感染して抗体の産生などがあると、患者は、いわゆるストレプトキナーゼ耐性を示すことがあり、治療がより困難になる。これに加えて、ヨーロッパにおける臨床試験（ヨーロッパ多施設急性脳梗塞治験（ＭＡＳＴ−Ｅ）、イタリア多施設急性脳梗塞治験（ＭＡＳＴ−Ｉ）およびオーストラリア（オーストラリアストレプトキナーゼ治験（ＡＳＴ））は、ストレプトキナーゼで患者を治療した後に死亡リスクが高まり、脳出血（大脳内の出血、ＩＣＨ）のリスクがより高くなることを示した。これらの治験は早期に終了しなければならなかった。
【００１２】
（ｂ）ウロキナーゼ）
あるいは、古典的な線維素溶解因子でもあるウロキナーゼを適用することもできる。ストレプトキナーゼとは対照的に、これは、様々な身体組織の中に天然に存在する酵素であるため、抗原特性は示さない。それはプラスミノーゲンの活性化因子であって、補助因子には依存しない。ウロキナーゼは腎臓培養細胞において産生される。
【００１３】
（ｃ）組換えｔ−ＰＡ（ｒｔ−ＰＡ））
血栓溶解療法に関する広範囲な実験結果が、組織型プラスミノーゲン活性化因子であって、組換えハムスター細胞で産生される、いわゆるｒｔ−ＰＡ（欧州特許第００９３６１９号、米国特許第４，７６６，０７５号）について利用可能である。１９９０年代に、急性心筋梗塞を主な適応症として、ｔ−ＰＡを用いた世界規模の臨床試験がいくつか行なわれたが、一部理解できない矛盾した結果がもたらされた。いわゆる欧州急性脳梗塞試験（ＥＣＡＳＳ）では、脳梗塞の症状が発生した後６時間という時間枠内でｒｔ−ＰＡを静脈内に投与して患者を治療した。９０日後に、患者の身体障害と治療とは無関係な生存率に関する指数として死亡率およびバーテル（Ｂａｒｔｈｅｌ）指数を調べた。生存率の有意な改善は報告されなかっただけでなく、有意とはいえなかったが、死亡率の増加が報告された。したがって、脳梗塞を発症した直後に各自の病歴によって個別に選抜された患者をｒｔ−ＰＡによって血栓溶解治療することが有利でありえると結論づけることができよう。しかし、脳梗塞を発症した後６時間という時間枠内でｒｔ−ＰＡを一般的に使用することは推奨されなかった。なぜなら、この時間内における適用が脳内出血（ＩＣＨ）の危険を増加させるからである（Ｃ．Ｌｅｗａｎｄｏｗｓｋｉ  Ｃ  ａｎｄ  Ｗｉｌｉａｍ  Ｂａｒｓａｎ，２００１：Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｃｕｔｅ  Ｓｔｒｏｋｅ；ｉｎ：Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｅｍｅｒｇｅｎｃｙ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３７：２；  Ｓ．２０２ｆｆ．）。
【００１４】
脳梗塞の血栓溶解治療も、米国における米国国立神経疾患・脳卒中研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒ  ａｎｄ
Ｓｔｒｏｋｅ）によって行われた臨床試験（いわゆるＮＩＮＤＳ  ｒｔＰＡ脳梗塞試験）の課題であった。この試験は、症状が始まってから３時間以内のときにだけ静脈内からｒｔ−ＰＡ治療を行った場合の効果に集中した。治療後３ヶ月後に患者を調査した。この治療法が患者の生存率に対して陽性の効果をもつことが観察されたため、著者らは、ＩＣＨの危険性がより高いことに気づいたにもかかわらず、この３時間という限られた時間枠内でのｒｔ−ＰＡ治療が推奨された。
【００１５】
さらに２つの研究（ＥＣＡＳＳ  ＩＩ試験：虚血性脳梗塞における急性非介入治療のためのアルテプラーゼ血栓溶解法（ＡＴＬＡＮＴＩＳ））で、脳梗塞発症後３時間以内にｒｔ−ＰＡ治療をしたときのプラスの効果が、６時間以内に治療したときにも繰り返されるか否かが調べられた。しかしながら、臨床症状の改善や死亡率のいくらかの減少が観察されなかったため、この問題に対する答えは肯定的とはいえない。ＩＣＨに対するリスクは依然そのままである。
【００１６】
１９９７年に初めて出版され、２００１年３月に改訂された、すべての脳梗塞試験の概説によれば、血栓溶解剤（ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、ｒｔ−ＰＡ、または組換えウロキナーゼ）による治療はすべて、脳梗塞発症後６時間以内に血栓溶解剤を使用した場合には、死亡したか身体障害になった患者の総数は減少する一方で、脳梗塞後最初の１０日以内の死亡率を有意に高める結果となった。この効果は、主にＩＣＨによるものであった。したがって、脳梗塞を治療するため広範に血栓溶解剤を使用することは推奨されなかった。
【００１７】
それ以前から、脳梗塞患者は死ぬか身体障害になって生き残るか選択するという単なる皮肉が言われていたのは、このような結果があったからである（ＳＣＲＩＰ  １９９７：２２６５，２６）。
【００１８】
それにもかかわらず、今までのところ、ｒｔ−ＰＡによる治療が、米国において食品医薬品局（ＦＤＡ）によって承認された唯一の急性脳虚血治療法である。しかし、それは、脳梗塞発症後３時間以内にｒｔ−ＰＡを適用する場合に限られている。
【００１９】
組換えプラスミノーゲン活性化因子は、現在、類似した薬品にアルテプラーゼまたはレテプラーゼ（ｒｅｔｅｐｌａｓｅ）という名前が付けられて市販されている。後者は、半減期の短い、治療薬として活性をもつｔ−ＰＡ断片である。アルテプラーゼの薬用量は約７０〜１００ｍｇであり、レテプラーゼでは２×５６０ｍｇであるが、これらの場合、アルテプラーゼは主に点滴で適用され、レテプラーゼは、約３０分間隔でボーラス注射を２回繰り返して適用される（Ｍｕｔｓｃｈｌｅｒ：”Ａｒｚｎｅｉｍｉｔｔｅｌｗｉｒｋｕｎｇｅｎ”，８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐａｇｅｓ  ５１２−５１３）。
【００２０】
（ｔ−ＰＡの副作用）
（神経毒性および興奮毒性）
ｒｔ−ＰＡの承認は１９９６年に得られた。その前の１９９５年に、ｔ−ＰＡのマイナスの副作用に関する最初の発表が知られるようになり、それらが、３時間という時間枠を外れて脳梗塞の治療に適用されたときの劇的効果に対する説明の根拠となっている。従って、海馬の小グリア細胞およびニューロン細胞が、グルタミン酸塩を介する興奮毒性に寄与するｔ−ＰＡを生産する。このことは、ｔ−ＰＡ欠乏マウスと野生型マウスのそれぞれの海馬にグルタミン酸アゴニストを注入したときのｔ−ＰＡ欠乏マウスと野生型マウスの比較実験から結論されている。ｔ−ＰＡ欠乏マウスは、外部から（くも膜下）に適用されたグルタミン酸に対して有意に高い抵抗性を示した（Ｔｓｉｒｋａ  ＳＥ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｖｏｌ．３７７，１９９５，”Ｅｘｃｉｔｏｘｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｅｉｚｕｒｅ  ａｒｅ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ｔｉｓｓｕｅ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ”）。これらの結果は、１９９８年になって、ｔ−ＰＡを静脈内注射するとｔ−ＰＡ欠乏マウスの壊死神経組織の量がほぼ２倍になることをＷａｎｇらが証明できたときに確認された。野生型マウスに対する外部ｔ−ＰＡのこのマイナスの効果は、約３３％にすぎなかった（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ，”Ｔｉｓｓｕｅ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ（ｔ−ＰＡ）ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｄａｍａｇｅ  ａｆｔｅｒ  ｆｏｃａｌ
ｃｅｒｅｂｒａｌ  ｉｓｃｈａｅｍｉａ  ｉｎ  ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅ  ａｎｄ  ｔ−ＰＡ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｉｃｅ”）。
【００２１】
さらに、ｔ−ＰＡによる興奮毒性の促進に関するさらなる結果が、２００１年の初頭にＮｉｃｏｌｅらによって発表された（Ｎｉｃｏｌｅ  Ｏ．，Ｄｏｃａｇｎｅ  Ｆ  Ａｌｉ
Ｃ；Ｍａｒｇａｉｌｌ  Ｉ；Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ  Ｐ；ＭａｃＫｅｎｚｉｅ  Ｅ  Ｔ，Ｖｉｖｉｅｎ  Ｄ  ａｎｄ  Ｂｕｉｓｓｏｎ  Ａ，２００１：Ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｔｉｓｓｕｅ−ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ＮＭＤＡ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ；ｉｎ：  Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ７，５９−６４）。彼らは、脱分極した皮質ニューロンによって放出されているｔ−ＰＡが、ＮＲ１の切断をもたらすＮＭＤＡ型グルタミン酸レセプターのいわゆるＮＲ１サブユニットと相互作用しうることを証明することができた。これは、グルタミン酸アゴニストであるＮＭＤＡを適用すると、より高い組織損害を生じさせるレセプター活性を増加させる。ＮＭＤＡアゴニストは興奮毒性を誘発した。したがって、ｔ−ＰＡは、ＮＭＤＡ型のグルタミン酸レセプターを活性化させることによって、神経毒性作用を示す。脳梗塞の間、罹患組織領域において血液脳関門が破壊されるため、フィブリノーゲンのような可溶性血漿蛋白質および治療的に適用されたｔ−ＰＡが、神経組織と接触できるようになり、ｔ−ＰＡはフィブリノーゲンによる刺激を受けて、グルタミン酸レセプターの活性化を介して神経毒作用を示す。
【００２２】
神経毒副作用と死亡率を高める効果があるにもかかわらず、ｔ−ＰＡはＦＤＡによって承認された。これは、それ以外に無害で有効な代替物がないということによってしか説明できない、すなわち、非常に実際的な費用便益分析によるものである。したがって、安全な治療法に対する需要が依然としてある。しかし、それらが依然として血栓溶解剤に基づくものであったなら、すなわち、血栓溶解に代わるものを発見することが可能でなければ、神経毒性の問題を考慮しなければならない（例えば、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．ａ．ａ．Ｏ．；Ｌｅｗａｎｄｏｗｓｋｉ  ａｎｄ  Ｂａｒｓｏｎ  ２００１  ａ．ａ．Ｏ参照）。
【００２３】
したがって、基本的には、すべての血栓溶解剤は適合的である可能性を秘めていたが、ＤＳＰＡ（Ｄｅｓｍｏｄｕｓ  ｒｏｔｕｎｄｕｓのプラスミノーゲン活性化因子）など、既知の血栓溶解剤を、脳梗塞用の新薬を開発するためにさらに検討することは終わった。
特に、ＤＳＰＡの場合には、この医療適用に適合する可能性が以前から指摘されていた（Ｍｅｄａｎ  Ｐ；Ｔａｔｌｉｓｕｍａｋ  Ｔ；Ｔａｋａｎｏ  Ｋ；Ｃａｒａｎｏ  ＲＡＤ；Ｈａｄｌｅｙ  ＳＪ；Ｆｉｓｈｅｒ  Ｍ：Ｔｈｒｏｍｂｏｌｙｓｉｓ  ｗｉｔｈ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｄｅｓｍｏｄｕｓ  ｓａｌｉｖａ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ（ｒＤＳＰＡ）ｉｎ  ａ  ｒａｔ  ｅｍｂｏｌｉｃ  ｓｔｒｏｋｅ  ｍｏｄｅｌ；ｉｎ：Ｃｅｒｅｂｒｏｖａｓｃ  Ｄｉｓ  １９９６：６；１７５−１９４（４ｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｏｎ  Ｔｈｒｏｍｂｏｌｉｃ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  Ａｃｕｔｅ  Ｉｓｃｈａｅｍｉｃ  Ｓｔｒｏｋｅ）。ＤＳＰＡはｔ−ＰＡに高い相同性（類似性）を有するプラスミノーゲン活性化因子である。したがって、（ｔ−ＰＡの神経毒性の副作用による失望に加えて、）ＤＳＰＡが脳梗塞を治療するのに適した薬剤であるという期待はもうなかった。
【００２４】
（代替的治療法）
代替的な治療法の検討は、現在、例えば、ヘパリン、アスピリン、または、マレーマムシ（Ｍａｌａｙａｎ  ｐｉｔ  ｖｉｐｅｒ）の毒から得られる活性物質であるアンクロド（ａｎｃｒｏｄ）などの抗凝血剤に集中している。ヘパリンの効果を検討する、さらに２つの臨床試験（国際脳梗塞試験（ＩＳＴ）および急性脳梗塞治療（ＴＯＡＳＴ）におけるＯＲＧ  １０１７２の試験）が行われているが、有意な死亡率の改善または脳梗塞の予防を示していない。
【００２５】
さらに新しい治療法は、血栓にも血液の低粘稠化または抗凝血にも注目することなく、血液供給の遮断によって損傷された細胞の活力を上げようと試みている（ＷＯ  ０１／５１６１３Ａ１号およびＷＯ  ０１／５１６１４Ａ１号）。このことを実現するために、キノン、アミノグリコシド、またはクロラムフェニコールの群から選んだ抗生物質を適用する。同様の理由で、脳梗塞を発症した直後にまずシチコリンを適用させることが勧められている。身体の中で、シチコリンはシチジンとコリンに切断される。この切断産物は、神経細胞の膜の一部を形成して、損傷された組織の再生を助ける（米国特許第５，８２７，８３２号）。
【００２６】
安全な治療法に関する最近の研究は、脳梗塞が致命的な結果となることの一部は、血液供給の阻害によっては間接的に引き起こされるにすぎず、直接的には、過剰活性化されたグルタミン酸レセプターを含む興奮毒性または神経毒性によるという新しい知見に基づいている。この作用は、ｔ−ＰＡによって増強される（上記参照）。したがって、興奮毒性を低下させようと考えることは、いわゆる神経保護剤を採用しようとすることである。それらは、神経毒作用を最小限に抑えるために線維素溶解剤とは別に、または併用して用いることができる。それらは、例えば、グルタミン酸レセプター・アンタゴニストとして直接的に、または、電圧依存的なナトリウムチャンネルまたはカルシウムチャンネルを阻害することによって間接的に興奮毒性を低下させることができる（Ｊｉｎ−Ｍｏ  Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．  ａ．ａ．Ｏ．）。
【００２７】
ＮＭＤＡ型のグルタミン酸レセプターの競合的阻害（アンタゴニスト作用）は、例えば、２−アミノ−５−ホスホノ吉草酸（ＡＰＶ）または２−アミノ−５−ホスホノヘプタン酸（ＡＰＨ）によって可能となる。非競合的阻害は、例えば、チャンネルのフェンシクリジン側に結合する物質によって行うことができる。このような物質としては、フェンシクリジン、ＭＫ−８０１、デキストロルファン（ｄｅｘｔｒｏｒｐｈａｎ）またはケタミン（ｋｅｔａｍｉｎ）などがありうる。
【００２８】
これまでのところ、神経保護剤による治療は、保護的作用を示すためには血栓溶解剤と併用しなければならず、期待された成功を収めていない。これは、他の物質についても同様である（図１０参照）。
【００２９】
ｔ−ＰＡと神経保護剤を併用しても、損傷を限定的なものにできるのみで、線維素溶解剤の神経毒性という短所などは避けることができない。
【００３０】
（非神経毒性プラスミノーゲン活性化因子）
脳梗塞を治療するためのプラスミノーゲン活性化因子は、その酵素活性がフィブリンによって、非常に選択的に何倍にも、すなわち、６５０倍超に増加し、国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ０２／１２２０４から知られている。なお、この文献の開示内容は、完全に参考文献に組み込まれる。
【００３１】
これらプラスミノーゲン活性化因子の性質と投与は、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）の神経毒性が、主に、脳梗塞によって脳内で起こる組織破壊の結果、血液脳関門が機能障害を起こすか破壊されて、血液中を循環しているフィブリノーゲンが脳の神経組織に浸透できるようになるという事実によるものであるとの知識に基づいている。そこでフィブリノーゲンがｔ−ＰＡを活性化し、それが、グルタミン酸レセプターを活性化させたり、プラスミノーゲンを活性化させたりすることによって、間接的にさらなる組織損傷をもたらすのである（上記参照）。
【００３２】
この作用を防ぐためには、フィブリンに対して高い選択性を示し、その逆の結果として、フィブリノーゲンによって活性化される可能性が低いプラスミノーゲン活性化因子を適用する。それによって、これらのプラスミノーゲン活性化因子は活性化されないか、または、ｔ−ＰＡに較べれば、血液脳関門が損傷された結果神経組織内への血液からのフィブリノーゲンが浸透してきても、大きさと不溶性によって活性化因子であるフィブリンが神経組織に入り込むことはできないため、プラスミノーゲン活性化因子は非常に低度にしか活性化されないはずである。したがって、これらプラスミノーゲン活性化因子は非神経毒性である。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００３３】
（ａ）遺伝子改変されたプラスミノーゲン活性化因子）
本発明の好ましい実施形態によれば、非毒性のプラスミノーゲン活性化因子であって、いわゆるチモーゲントライアド（ｚｙｍｏｇｅｎ  ｔｒｉａｄｅ）の成分の少なくとも１つを含むものが用いられる。同等のトライアドは、アスパラギン酸１９４、ヒスチジン４０およびセリン３２の３つの相互作用するアミノ酸からなるキモトリプシンファミリーのセリンプロテアーゼの触媒活性中心から知られている。しかし、このトライアドは、キモトリプシン様セリンプロテアーゼファミリーに属するｔ−ＰＡには存在しない。それにもかかわらず、上記アミノ酸の少なくとも一つを適当な位置に導入する目的で、天然型ｔ−ＰＡを部位特異的に変異誘発すると、フィブリン存在下でプロ酵素（一本鎖ｔ−ＰＡ）の活性が低下し、成熟酵素（二本鎖ｔ−ＰＡ）の活性が上昇することが知られている。したがって、トライアドの少なくとも一つのアミノ酸、または、トライアド中でそれぞれの機能をもつアミノ酸を導入すれば、ｔ−ＰＡのチモーゲン性（すなわち、成熟酵素とプロ酵素の活性の比率）を上昇させることができる。その結果、フィブリン特異性が顕著に高まる。これは、導入されたアミノ酸残基および／または野生型配列のアミノ酸残基との立体構造的な相互作用によるものである。
【００３４】
Ｐｈｅ３０５をＨｉｓで置換し（Ｆ３０５Ｈ）、Ａｌａ２９２をＳｅｒで置換（Ａ２９２Ｓ）することによって天然型ｔ−ＰＡを変異誘発すると、Ｆ３０５Ｈ変異体のみではすでに５倍高いチモーゲン性が導かれるのに対して、チモーゲン性が２０倍高くなることが知られている（ＥＬ  Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｋｏｂｅ  Ａ，Ｇｅｔｈｉｎｇ  Ｍ−Ｊ；  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ＪＦ，Ｇｏｌｄｓｍｉｔｈ  ＥＪ  １９９３：Ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｔｏ  ａ  Ｚｙｍｏｇｅｎ：Ａ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔｒｉａｄ  ｏｆ  Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ；Ｓｃｉｅｎｃｅ：２６２，４１９−４２１）。フィブリン存在下で、これらのｔ−ＰＡ変異体は、それぞれ、３０，０００倍（Ｆ３０５Ｈ）および１３０，０００倍（Ｆ３０５Ｈ，Ａ２９２Ｓ）の活性増加を示す。また、これらの変異体は、プラスミンによってＡｒｇ２７５−Ｉｌｅ２７６の切断部位で切断されるを防げるためにＡｒｇ２７５からＲ２７５Ｅへの置換を含み、それによって、一本鎖ｔ−ＰＡは二本鎖型へと変化する。変異部位Ｒ２７５Ｅだけで、ｔ−ＰＡのフィブリン特異性は６，９００倍増加する（Ｋ  Ｔａｃｈｉａｓ，Ｍａｄｉｓｏｎ  Ｅ  Ｌ  １９９５：Ｖａｒｉａｎｔｓ  ｏｆ  Ｔｉｓｓｕｅ−ｔｙｐｅ  Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  Ｗｈｉｃｈ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｆｉｂｒｉｎ，ｉｎ：Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７０，３１：１８３１９−１８３２２）。
【００３５】
ｔ−ＰＡの３０５位および２９２位は、キモトリプシン性セリンプロテアーゼの既知のトライアドのＨｉｓ４０およびＳｅｒ３２と相同である。ヒスチジンまたはそれぞれにセリンを導入する対応する置換によって、これらのアミノ酸は、ｔ−ＰＡのアスパラギン酸４７７と相互作用できるようになり、ｔ−ＰＡ変異体中に機能的なトライアドを生じさせる（Ｍａｄｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）。
【００３６】
これらのｔ−ＰＡ変異体は、フィブリン特異性が高くなるため、神経毒性を全く示さないか、野生型ｔ−ＰＡに較べて有意に低い神経毒性を示すので、本発明により脳梗塞の治療に用いることができる。上記ｔ−ＰＡ変異体Ｆ３０５Ｈ；Ｆ３０５Ｈ；Ａ２９２Ｓを、単独またはＲ２７５Ｅと組み合わせて開示する目的で、本発明者らは、Ｍａｄｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）およびＴａｃｈｉａｓ  ａｎｄ  Ｍａｄｉｓｏｎ  （１９９５）という刊行物を全体的に参照して本明細書に組み入れる。
【００３７】
プラスミノーゲン活性化因子のフィブリン特異性を高めることは、あるいはＡｓｐ１９４（または、相同位置でのアスパラギン酸）における点変異によっても実現させることができる。プラスミノーゲン活性化因子は、キモトリプシンファミリーのセリンプロテアーゼ群に属しているため、成熟プロテアーゼの触媒活性立体構造の安定性に関与する保存アミノ酸であるＡｓｐ１９４を含む。Ａｓｐ１９４は、セリンプロテアーゼのチモーゲン型におけるＨｉｓ４０と相互作用することが知られている。切断によってチモーゲンが活性化されると、この特異的相互作用が阻害され、Ａｓｐ１９４の側鎖が、Ｉｌｅ１６と新たな塩橋を形成するために約１７０°回転する。この塩橋は、成熟セリンプロテアーゼの触媒中心のオキシアニオン（ｏｘｙａｎｉｏｎ）ポケットの安定性に必須に寄与する。これは、ｔ−ＰＡにも存在する。
【００３８】
Ａｓｐ１９４を置換する点変異の導入が、セリンプロテアーゼの触媒立体構造の形成または安定性をそれぞれ阻害することは明白である。それにもかかわらず、変異型プラスミノーゲン活性化因子が、それらの補助因子であるフィブリン存在下で、特に、成熟した野生型のものと比較しても有意に活性を上昇させることを示すが、これは、フィブリンとの相互作用によって触媒活性を促進させる立体構造上の変化が可能になるというふうにしか説明できない（Ｌ  Ｓｔｒａｎｄｂｅｒｇ，Ｍａｄｉｓｏｎ  ＥＬ，１９９５：Ｖａｒｉａｎｔｓ  ｏｆ  Ｔｉｓｓｕｅ−ｔｙｐｅ  Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｗｉｔｈ  Ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ａｎｄ  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ  ｔｏｗａｒｄｓ  Ｆｉｂｒｉｎ  ｃｏ−ｆａｃｔｏｒｓ，ｉｎ：Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７０，４０：２３４４−２３４９）。
【００３９】
要するに、プラスミノーゲン活性化因子のＡｓｐ１９４変異体は、フィブリン存在下で高い活性上昇を示し、それにより、本発明によって利用することができる。
【００４０】
本発明の好ましい実施形態において、Ａｓｐ１９４が、グルタミン酸によって（Ｄ１９４Ｅ）、またはアスパラギンによって（Ｄ１９４Ｎ）置換された変異型ｔ−ＰＡが使用される。これらの変異体では、フィブリンが存在しないとｔ−ＰＡの活性が１から２０００倍低下するが、フィブリンが存在すると、４９８，０００から１，０５０，０００倍の活性上昇を達成することができる。さらに、これらの変異体は、Ａｒｇ１５からＲ１５Ｅへの置換を含むため、プラスミンによってペプチド結合Ａｒｇ１５−Ｉｌｅ１６において一本鎖ｔ−ＰＡが切断されるのが防止されるが、そのため、ｔ−ＰＡの二本鎖型になる。この変異のみでも、フィブリンによるｔ−ＰＡの活性化が１２，０００倍に増強される。１９４位および１５位におけるｔ−ＰＡ変異を開示するという理由で、Ｓｔｒａｎｄｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｍａｄｉｓｏｎ（１９９５）という刊行物を全面的に参照して組み入れる。
【００４１】
プラスミノーゲン活性化因子のフィブリン依存性の増加も、いわゆる「自己分解ループ」に点変異を導入することによって実現することができる。この要素は、トリプシンから知られており、セリンプロテアーゼの相同部分においても見つけることでき、特に、３個の疎水性アミノ酸（Ｌｅｕ、ＰｒｏおよびＰｈｅ）によって特徴づけられている。プラスミノーゲン活性化因子における自己分解ループは、プラスミノーゲンとの相互作用に関与する。この領域の点変異は、プラスミノーゲンおよびプラスミノーゲン活性化因子の間の蛋白質−蛋白質相互作用がそれ以上有効に形成されないという効果を持ちうる。これらの変異は、フィブリンが存在しないときにのみ機能的に関係する。これに対し、フィブリン存在下では、それらは、プラスミノーゲン活性化因子の活性上昇に関与する（Ｋ  Ｓｏｎｇ−Ｈｕａ，Ｔａｃｈｉａｓ  Ｋ，Ｌａｍｂａ  Ｄ，Ｂｏｄｅ  Ｗ，Ｍａｄｉｓｏｎ  ＥＬ，１９９７：Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｅｘｏｃｉｔｅ  ｏｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｔｙｐｅ  Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  Ｔｈａｔ  Ｍｏｄｕｌａｔｅｓ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｆｏｒ  Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ，  ｉｎ：  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７２；３，１８１１−１８１６）。
【００４２】
好ましい実施形態において、４２０位から４２３位に点変異を示すｔ−ＰＡが使用される。これらの残基が、部位特異的変異誘発によって置換されると、ｔ−ＰＡのフィブリン依存性が、６１，０００倍まで増加する（Ｋ  Ｓｏｎｇ−Ｈｕａ  ｅｔ  ａｌ．）。Ｓｏｎｇ−Ｈｕａらは、Ｌ４２０Ａ、Ｌ４２０Ｅ、Ｓ４２１Ｇ、Ｓ４２１Ｅ、Ｐ４２２Ａ、Ｐ４２２Ｇ、Ｐ４２２Ｅ、Ｆ４２３ＡおよびＦ４２３Ｅという点変異を調べた。これらの刊行物は、本発明に係る使用を開示するために参照として全面的に組み込まれる。
【００４３】
さらに有利な実施形態によれば、配列番号１（図１４）に記載されたアミノ酸配列をもつ、改変された組織プラスミノーゲン活性化因子が使用される。この改変されたｔ−ＰＡは、以下のような自己分解ルーブ中の４２０位から４２３位の疎水性アミノ酸を交換しているという点で野生型のｔ−ＰＡと異なる：Ｈｉｓ４２０、Ａｓｐ４２１、Ａｌａ４２２およびＣｙｓ４２３。このｔ−ＰＡは、優先的に、１９４位にフェニルアラニンを含む。さらに、２７５位はグルタミン酸によって占められていることがある。好適には、１９４位がフェニルアラニンによって占められている。
【００４４】
さらに、改変されたウロキナーゼを本発明によって使用することができる。本発明に係るウロキナーゼは、自己分解ループの疎水性アミノ酸がＶａｌ４２０、Ｔｈｒ４２１、Ａｓｐ４２２およびＳｅｒ４２３で置換されている配列番号２（図１３）に記載されたアミノ酸配列を含むことができる。好適には、ウロキナーゼはＩｌｅ２７５およびＧｌｕ１９４をもっている。この変異体は、野生型のウロキナーゼと比較して、５００倍高いフィブリン特異性を示す。
【００４５】
変異型ウロキナーゼおよび変異型ｔ−ＰＡは、ともに半定量試験で分析され、野生型ｔ−ＰＡに較べて高いフィブリン特異性を示した。
【００４６】
（ｂ）Ｄｅｓｍｏｄｕｓ  ｒｏｔｕｎｄｕｓ由来のプラスミノーゲン活性化因子（ＤＳＰＡ））
吸血コウモリ（Ｄｅｓｍｏｄｕｓ  ｒｏｔｕｎｄｕｓ）の唾液由来のプラスミノーゲン活性化因子（ＤＳＰＡ）も、フィブリン存在下で、非常に高い活性、具体的には１００，０００倍の増加を示す。したがって、ＤＳＰＡを本発明によって優先的に使用することができる。ＤＳＰＡという用語は、４種類の異なったプロテアーゼであって、Ｄｅｓｍｏｄｕｓ  ｒｏｔｕｎｄｕｓに必要な機能を充足させるもの、すなわち、獲物の傷口からの出血を長引かせるプロテアーゼを含む（Ｃａｒｔｗｒｉｇｈｔ，１９７４）。これら４つのプロテアーゼ（ＤＳＰＡα１、ＤＳＰＡα２、ＤＳＰＡβ、ＤＳＰＡγ）は、互いに、およびヒトｔ−ＰＡに高い類似性（相同性）を示す。また、それらは、類似した生理活性を示し、総称であるＤＳＰＡに一般的に分類される。ＤＳＰＡは、欧州特許第０３５２１１９Ａ１号ならびに米国特許第６，００８，０１９号および第５，８３０，８４９号に開示されているので、開示の目的で、その全文を本明細書に参照して組み込む。
【００４７】
今までのところ、ＤＳＰＡα１がこの群で一番よく解析されているプロテアーゼである。それは、既知のヒトｔ−ＰＡのアミノ酸配列に対して７２％よりも高い相同性をもつアミノ酸配列を有する（Ｋｒａｅｔｚｓｃｈｍａｒ  ｅｔ  ａｌ，１９９１）。しかし、ｔ−ＰＡとＤＳＰＡには２つの主要な相違点がある。第一に、ＤＳＰＡはすべて、ｔ−ＰＡとは対照的に、二本鎖型に変わることはないので、一本鎖分子で完全なプロテアーゼ活性を有する（Ｇａｒｄｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９；Ｋｒａｅｔｚｓｃｈｍａｒ  ｅｔ  ａｌ，１９９１）。第二に、ＤＳＰＡの触媒活性は、ほぼ完全にフィブリンに依存する（Ｇａｒｄｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９；Ｂｒｉｎｇｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５；Ｔｏｓｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。例えば、ＤＳＰＡα１の活性は、フィブリン存在下で、１００，０００倍に上昇するが、それに対し、ｔ−ＰＡ活性は５５０倍上昇するにすぎない。これに対して、ＤＳＰＡ活性は、フィブリノーゲンによっては、それほど強く誘導されることはない、なぜなら、ＤＳＰＡ活性は、７から９倍の上昇しか示さないからである（Ｂｒｉｎｇｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。要するに、ＤＳＰＡは、より強くフィブリンに依存し、フィブリンによっては５５０倍しか活性化されない野生型ｔ−ＰＡよりもフィブリン特異性がずっと強い。
【００４８】
線維素溶解特性およびｔ−ＰＡへの高い類似性があるため、ＤＳＰＡは、血栓溶解剤を開発するための興味深い候補物質となっている。それにもかかわらず、ＤＳＰＡを血栓溶解剤として治療に使用できるのは、過去、心筋梗塞の治療に制限されていた。なぜなら、ｔ−ＰＡがグルタミン酸に誘発される神経毒性に寄与するため、ｔ−ＰＡに関係するプラスミノーゲン活性化因子が急性脳梗塞の治療に当然に使用できるとの合理的な希望が存在しなかったからである。
【００４９】
驚くべきことに、ＤＳＰＡは、ｔ−ＰＡに高い類似性（相同性）を示すにもかかわらず、また、その分子の生理学的作用もかなりの程度同じであるにもかかわらず、神経毒性作用をもたないことが示された。上記の結論によって、結局のところ、ＤＳＰＡを、神経組織損傷という重大なリスクを引き起こすことなく、血栓溶解剤として脳梗塞の治療にうまく使用できるかもしれないというアイデアがもたらされた。特に興味深いのは、ＤＳＰＡは、脳梗塞症状を発症してから３時間以上たってからでも使用できるという事実である。
【００５０】
（ＤＳＰＡに神経毒性がないことの実験的証拠）
この新しい教示は、いわゆるカイニン酸モデルおよび線条体のＮＭＤＡ誘導による損傷実験用モデルを用いて行われる、一方ではｔ−ＰＡの、他方ではＤＳＰＡの神経変性作用のインビボにおける比較実験に基づいている。
【００５１】
カイニン酸モデル（またはカイニン酸損傷モデル）は、カイニン酸型（ＫＡ型）グルタミン酸レセプター、ならびにＮＭＤＡおよびＡＭＰＡのグルタミン酸レセプターのアゴニストとしてカイニン酸（ＫＡ）を外部から適用することによって、神経毒性グルタミン酸カスケードを刺激することに基づいている。ｔ−ＰＡ欠乏型マウスの系統（ｓｔｅｍ）を実験モデルに用いて、実験動物のカイニン酸に対する感受性が、外部ｔ−ＰＡを補助的に適用した後にやっと野生型マウスのレベルに到達することを示すことができた。これに対して、同じ実験条件下でＤＳＰＡの等モル濃度液を注入しても、カイニン酸（ＫＡ）に対する感受性を回復しない。ｔ−ＰＡの神経毒性作用は、ＤＳＰＡによって誘導されるものではないと結論された。これらの結果の要約を図１５（表１）に示す。
【００５２】
このモデルに基づいた定量的実験によって、ＤＳＰＡの濃度を１０倍増加させても、ＫＡ処理に対するｔ−ＰＡ欠乏マウスの感受性を回復できなかったのに、１０倍低いｔ−ＰＡ濃度では、ＫＡ誘導による組織損傷をすでにもたらしていたことが明らかになった。これによって、ＫＡ処理後の神経変性の促進に関して、ＤＳＰＡは、ｔ−ＰＡよりも少なくとも１００倍低い神経毒性能力を有するという結論が得られる（図１１および１２も参照）。
【００５３】
神経変性の二番目のモデルでは、ＮＭＤＡ依存性神経変性の促進に対するｔ−ＰＡおよびＤＳＰＡの作用と考えられるものを野生型マウスと比較した。この目的のために、ＮＭＤＡ（ＮＤＭＡ型のグルタミン酸レセプターのアゴニストとして）を、単独またはｔ−ＰＡまたはＤＳＰＡのいずれかと併用して野生型マウスに注射した。このモデルによって、神経変性、および血液脳関門の崩壊による血漿蛋白質の流入を必ずもたらす条件下でこれらのプロテアーゼの効果を比較することができる（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。
【００５４】
このモデルで研究している最中に、ＮＭＤＡを注射すると、マウスの線条体に再現可能な損傷がもたらされた。ｔ−ＰＡとＮＭＤＡを併用して注射すると、損傷部位の体積が少なくとも５０％増加した。これに対して、ＤＳＰＡα１を同時に注射したときには、ＮＭＤＡ注射によって起こる損傷の増加および拡大はもたらされなかった。ＮＭＤＡによって誘発される損傷領域に自由に拡散することができる血漿蛋白質が存在していても、ＤＳＰＡは神経変性の増加をもたらさなかった。これらの結果をまとめたものを図１６に示す（表２）。
【００５５】
臨床試験の最初の結果は、ヒトの脳梗塞治療にもこれらの結果を移しうることを示している。有意な改善が、灌流に成功した後に患者の中で達成されうることが発見された（８ポイントＮＩＨＳＳまたはＮＩＨＳＳスコアで０から１の改善）。これを図１７に示す（表３）。
【００５６】
さらなる実験で、静脈注射されたとき、ｔ−ＰＡおよびＤＳＰＡが損傷された血液脳関門を透過できるか否か、また、その結果、脳における組織損傷が増加するか否かが調べられた。この問題に取り組むため、線条体に組織損傷を生じさせるためにマウスにＮＭＤＡを定位注射した後、ＮＭＤＡ注射後６時間または２４時間してからｔ−ＰＡまたはＤＳＰＡを静脈から適用した。陰性対照と比較すると、ＮＭＤＡ注射後２４時間してから、注入液としてｔ−ＰＡを投与したとき、実験動物では、ＮＭＤＡ注射に誘導された損傷組織領域の約３０％の増加が示された。これに対して、ＤＳＰＡで同様に処理すると、抗体染色の方法によって損傷組織領域へのＤＳＰＡの浸透が検出されたが、組織損傷のこのような増加は生じなかった（図１８、１９参照）。ＮＭＤＡ注射してから６時間後に同様の方法でｔ−ＰＡまたはＤＳＰＡを静脈内に適用したところ、損傷された組織領域の増加はまだ検出されなかった。それによって、血液脳関門が、ｔ−ＰＡまたはＤＳＰＡを注射した時点では、まだ充分な関門として機能していたことを説明できる。
【００５７】
これらの結果は、ＤＳＰＡが、哺乳動物の（したがって、ヒトの）中枢神経系においてはほとんど不活性のプロテアーゼを構成し、ｔ−ＰＡとは対照的に、ＫＡまたはＮＭＤＡによって誘発される神経毒性の増強作用を生じさせないことを示している。この神経毒がないことが、一般の予想に反して、ＤＳＰＡをして、急性脳梗塞の治療に適した血栓溶解剤とならしめている。
【００５８】
（非神経毒性プラスミノーゲン活性化因子の治療能力）
ＤＳＰＡ、およびその他の非神経毒性プラスミノーゲン活性化因子に神経毒性がないこと（上記参照）は、これらのプラスミノーゲン活性化因子の使用が、野生型のｔ−ＰＡとは対照的に、脳梗塞発症後最長でも３時間という短い時間に制限されないという、脳梗塞の治療における特別の利点を提供する。それどころか、興奮毒性反応を刺激するリスクがほとんどないため、遅くなっても、例えば、６時間以上経過した後でも治療を開始することができる。ＤＳＰＡによる最初の臨床試験で、脳梗塞症状が発現してから６から９時間にわたる時間的範囲でも、患者を安全に治療できることが証明される。
【００５９】
非神経毒性活性化因子によって、時間的な制限なしに治療できるという選択肢が特に重要である。なぜなら、それによって、急性脳梗塞症状のある患者を、診断が遅れた場合や、充分な確実性をもって脳梗塞の発症時期を判定できない場合でも安全に治療することが初めて可能になるからである。先行技術において、この患者群は、不利なリスク評価であったため、プラスミノーゲン活性化因子による血栓溶解療法から排除されていた。したがって、脳梗塞に対する血栓溶解剤の認可された用法に対する必須の禁忌が解消される。
【００６０】
（プラスミノーゲン活性化因子の適用）
すでに確立されている脳梗塞治療剤ｒｔ−ＰＡとは対照的に、非神経毒性プラスミノーゲン活性化因子による脳梗塞治療についての可能な適用方式に関して利用可能な有効な情報はまだない。
【００６１】
したがって、これらの非神経毒性プラスミノーゲン活性化因子に対して有利な適用方式を提供することが本発明の目的である。
【００６２】
本発明によれば、フィブリン存在下でその活性が６５０倍よりも高くなるプラスミノーゲン活性化因子は、脳梗塞を治療するために静脈内に適用される。
【００６３】
これら非神経毒性プラスミノーゲン活性化因子を、脳梗塞を治療するために静脈投与することは、すでに臨床試験で評価されているが、この臨床試験では、ＤＳＰＡが、この群の線維素溶解剤の一例として、これらの患者に静脈内に適用され、それによって、些細な副作用だけが生じた。
【００６４】
臨床試験のこれらの結果は、ｔ−ＰＡおよび他の通常の線維素溶解剤を静脈内適用することは、脳出血という重大なリスクを伴うということが充分に知られていたため予想外のものであった（上記参照）。
【００６５】
脳内出血を軽減させるために、最近では、これらの物質を、静脈内ではなく、動脈内経路によって、カテーテルを用いて血管内血栓のすぐ近くに適用する方法を開発しようと努力が払われた。組換え製造されたウロキナーゼ（プロ−ウロキナーゼによる研究としてＰＲＯＫＡＴ）については、実用経験がすでに可能になっている。この適用方式は、投薬総量をかなり少なくできるため、用量依存的な副作用を軽減させることができ、したがって、脳出血を抑えることも分かっている。
【００６６】
しかし、動脈内適用のこれら重要な利点も、考えられる２つの欠点によって打ち消される。まず、この治療は、時間をかけて患者に準備させる必要があるが、脳梗塞治療において、わずか３時間という所定の枠のなかでそれを実現させることは可能でない。他方で、この治療は、より低い総投薬量を確実に達成することができる。しかしながら、薬剤濃度を高くすれば、末端の動脈血管に局所的に到達する。脳梗塞の場合には、血管内皮が障壁機能に障害を起こす結果、医薬物質も局所的に高い濃度で周囲の組織に到達する。すると、望ましくない副作用が生じうる。
【００６７】
それに対して、静脈内適用の場合には、静脈の血流によって医薬物質の濃度が希釈される。したがって、ｔ−ＰＡのように組織を破壊できる薬剤の場合には、動脈内注射は問題が多い（Ｆｏｒｔｈ，Ｈｅｎｓｃｈｌｅｒ，Ｒｕｍｍｅｌ，Ｓｔａｒｋｅ：”Ｐｈａｒｍａｋｏｌｏｇｉｅ  ｕｎｄ  Ｔｏｘｉｋｏｌｏｇｉｅ”，６ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９２，ｐａｇｅ  ２９）。
【００６８】
しかし、動脈内適用を面倒にするこれらの制約、すなわち、狭い時間枠および組織損傷副作用は、本発明によって適用されるプラスミノーゲン活性化因子には当てはまらない。したがって、否定できない利点（上記参照）があることから、動脈内適用が、原則として、非神経毒性プラスミノーゲン活性化因子にとって非常に有望な適用方式を構成する。したがって、これらの薬剤を適用する好ましい方式をさがす場合には、この経路に従うべきことは明らかであったろう。
【００６９】
それにもかかわらず、非神経毒性プラスミノーゲン活性化因子を適用する者も、かえって問題の多い静脈内適用に依存することを選択してきたが、意外にも、それが有利であることを証明したのである。
【００７０】
さらに、本発明に係る適用方式も、高い免疫原能力をもつ蛋白質を投与するために、アレルギー・ショックのリスクを低減させる目的で、通常の治療行為に反して、主に、筋肉内注射または静脈点滴を利用する（Ｍｅｂｓ：”Ｇｉｆｔｔｉｅｒｅ”，２ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，２０００）。
【００７１】
天然の体内物質であるｔ−ＰＡとは対照的に、本発明に係り適用されるプラスミノーゲン活性化因子は、動物由来の外来蛋白質（例えば、ＤＳＰＡのように）か、または、その構造的な違いによって新しいエピトープを提示する遺伝子改変された体内蛋白質のいずれかである。アレルギー反応という随伴する問題、特に、静脈内適用の場合に一般的に必要とされるような、高い治療投薬量を適用するときに伴う問題が、例えばストレプトキナーゼのような外来蛋白質からなる別の線維素溶解剤にも適用される。
【００７２】
特に有用な実施形態において、本発明によって適用されるプラスミノーゲン活性化因子は、ボーラス注射（静脈内への迅速な注射）という方法で投与され、全治療量を含む単回静脈内迅速注射として投与することもできる。
【００７３】
臨床実験を検討する中で、驚くほど低い治療量を静脈内適用しても、有利な結果が得られることが発見された。好ましい治療結果が、例えば、９０μｇ／ｋｇから２３０μｇ／ｋｇの用量で得られた。ここでの特に好ましい治療結果は、６２．５μｇ／ｋｇから９０μｇ／ｋｇの用量で得られた。調査した患者において、脳梗塞から薬剤適用までにかかった時間は３〜９時間であった。適当な検査方法を用いて、治療効果の開始を決定することができた（図２０および２９参照）。
【００７４】
他の非神経毒性プラスミノーゲン活性化因子同様、ＤＳＰＡは組織損傷副作用を示さない。しかし、人体に自然に存在するグルタミン酸によって誘導される組織損傷を制限するために、脳梗塞を治療するための神経保護剤と併用してそれらを適用するのが好適であり得る。競合的または非競合的にグルタミン酸レセプターを阻害する神経保護剤を使用することもできる。有用な組み合わせは、例えば、ＡＰＶ、ＡＰＨ、フェンシクリジン、ＭＫ−８０１、デキストロルファンまたはケタミンなどのような、ＮＭＤＡ型、カイニン酸型、またはキスカル酸型のグルタミン酸レセプターに対する既知の阻害剤との組み合わせである。
【００７５】
さらに、カチオン、特にＺｎ−イオンは、グルタミン酸レセプターによって調節されるカチオン・チャンネルを遮断し、それゆえ神経毒作用を抑制することができるため、カチオンと組み合わせることも好適であり得る。
【００７６】
さらに好ましい実施形態では、非神経毒性のプラスミノーゲン活性化因子を、少なくとも一種類のさらに別の治療薬または薬学的に許容できる担体と組み合わせることもできる。細胞を活性化させることによって組織損傷の抑制を補助する治療薬と併用するのが、既に損傷された組織の再生に寄与し、または、さらなる脳梗塞が発生するのを防げるのに役立つため特に好適である。好ましい例は、キノンのような抗生物質、ヘパリンまたはヒルジンなどの抗凝血剤、また、シチコリンまたはアセチルサリチル酸との併用である。
【００７７】
少なくとも一種類のトロンビン阻害剤と併用することも好適であろう。優先的には、トロンボモジュリン、および、例えばソルリン（ｓｏｌｕｌｉｎ）、トリアビン（ｔｒｉａｂｉｎ）またはパリジピン（ｐａｌｌｉｄｉｐｉｎ）のようなトロンボモジュリン類似化合物を使用することもできる。さらに、抗炎症物質と併用することも、白血球による浸潤に影響を与えるため好適である。
【００７８】
以下に、特徴的な治療例によって本発明に係る適用方式および処方を概説する。
【実施例】
【００７９】
（ｔ−ＰＡとＤＳＰＡの比較試験）
（Ａ．方法）
（１．動物）
野生型マウス（ｃ５７／Ｂｌａｃｋ６）およびｔ−ＰＡ欠乏マウス（ｔ−ＰＡ−／−マウス）（ｃ５７／Ｂｌａｃｋ６）（Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）をベルギー国ルーバン（Ｌｅｕｖｅｎ，  Ｂｅｌｇｉｕｍ）のＰｅｔｅｒ  Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ博士から入手した。
【００８０】
（２．脳組織からの蛋白質抽出）
ｔ−ＰＡまたはＤＳＰＡα１のいずれかを注入した後の脳組織における蛋白質分解活性の評価をザイモグラフ解析によって行った（Ｇｒａｎｅｌｌｉ−Ｐｉｐｅｒｎｏ  ａｎｄ  Ｒｅｉｃｈ，１９７４）。７日間にわたって海馬に注入した後、マウスを麻酔してから、ＰＢＳで経心臓的に灌流してから脳を切除した。海馬領域を取り出して、エッペンドルフチューブに移して、プロテアーゼインヒビターを含まない０．５％ＮＰ−４０溶解用バッファーの等量液（ｗ／ｖ）（約３０−５０μｌ）（０．５％ＮＰ−４０，１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．４，１０ｍＭ  ＮａＣＬ，３ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１ｍＭ  ＥＤＴＡ）中でインキュベートした。手動式のガラス製ホモジナイザーで脳抽出物をホモジナイズし、氷上に３０分間放置した。そして、サンプルを遠心分離して、上清を取り出した。存在する蛋白質の量を測定した（Ｂｉｏ−Ｒａｄ−ｒｅａｇｅｎｔ）。
【００８１】
（３．プロテアーゼのザイモグラフ解析）
Ｇｒａｎｅｌｌｉ−Ｐｉｐｅｒｎｏ  ａｎｄ  Ｒｅｉｃｈ（１９７４）の方法に従い、ザイモグラフ解析によってサンプルおよび脳組織抽出物における蛋白質分解活性を測定した。組換え蛋白質（最大１００ｎｍｏｌ）または脳組織抽出物（２０μｇ）を含むサンプルに、非還元条件下で（１０％）ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。ゲルをプレートから取り出して、１％トリトン×１００で２時間洗浄してから、重合されたフィブリノーゲンおよびプラスミノーゲンを含むアガロースゲルの上に重ねた（Ｇｒａｎｅｌｌｉ−Ｐｉｐｅｒｎｏ  ａｎｄ  Ｒｅｉｃｈ，１９７４）。このゲルを、蛋白質分解ゾーンが現れるまで加湿チャンバーにおいて３７℃でインキュベートした。
【００８２】
（４．ｔ−ＰＡ、ＤＳＰＡの海馬内注入およびその後のカイニン酸注射）
カイニン酸損傷モデルは、Ｔｓｉｒｋａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）の研究に基づいていた。動物にアトロピン（４  ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した後、ペントバルビタール・ナトリウム（７０  ｍｇ／ｋｇ）のｉ．ｐ．注射によって麻酔した。その後、マウスを定位固定式の枠に置いて、１００μｌのＰＢＳまたは組換えヒトｔ−ＰＡ（０．１２ｍｇ／ｍｌ，１．８５μＭ）またはＤＳＰＡα１（１．８５μＭ）のいずれかを含む小型浸透圧ポンプ（Ａｌｚｅｔ  ｍｏｄｅｌ  １００７Ｄ，Ａｌｚｅｔ  ＣＡ．ＵＳＡ）を肩胛骨の間の皮下に埋め込んだ。このポンプを、無菌チューブを経由して脳カニューレに接続してから、正中部付近にその液体を導入するため、ブレグマ方向に−２．５ｍｍ、内外方向に０．５ｍｍ、また背腹方向に１．６ｍｍという座標で頭蓋骨に作ったギザギザの開口部を通して挿入した。カニューレを所望の位置に固定して、ポンプからそれぞれの溶液を１時間あたり０．５μｌという速度で、全部で７日間注入した。
【００８３】
プロテアーゼを注入してから２日後にマウスを再度麻酔して、再び固定枠に置いた。その後、０．３μｌのＰＢＳ中１．５ｎｍｏｌのカイニン酸を海馬に片側的に注射した。座標は、ブレグマ方向に２．５ｍｍ、内外方向に１．７ｍｍ、また背腹方向に１．６ｍｍであった。興奮毒（ＫＡ）を３０秒間送達した。カイニン酸処理の後、注射針をこれらの座標にさらに２分間残して、液体が逆流するのを防いだ。
【００８４】
（５．脳の処理法）
ＫＡ注射から５日後に、動物を麻酔して、３０ｍｌのＰＢＳで、その後７０ｍｌの４％パラホルムアルデヒド溶液で経心臓的に灌流して、２４時間、同じ固定液で後固定した後、３０％ショ糖液でさらに２４時間インキュベートした。そして、凍結ミクロトーム上で脳の冠状断面（４０μｍ）を切り出し、チオニン（ＢＤＨ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）で対比染色するか、後述するような免疫組織化学的検査を行うために処理した。
【００８５】
（６．海馬内における神経細胞脱落の定量）
ＣＡ１〜ＣＡ３の海馬亜領域における神経細胞脱落の定量を既述されている通りに行った（Ｔｓｉｒｋａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５；Ｔｓｉｒｋａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）。すべての処理群から背側海馬の連続した５つの部分を、その部位が、ＣＡ注射した場所と損傷領域を実際に含むように注意しながら調製した。これらの切片の海馬亜領域（ＣＡ１〜ＣＡ３）を、海馬のカメラルシーダ画像法によってトレースした。これら亜領域の全長を、同じ倍率下でトレースした１ｍｍ基準と比較して測定した。生きた錐体神経細胞（正常な形態を有する）をもつ組織の長さと、神経細胞のない（細胞がなく、チオニン染色されない）組織の長さを測定した。各海馬亜領域にわたる完全な神経細胞および神経細胞脱落を示す長さを、切片の全域について平均して、標準偏差を決定した。
【００８６】
（７．ｔ−ＰＡまたはＤＳＰＡの有無による線条体内ＮＭＤＡ興奮毒性損傷）
野生型マウス（ｃ５７／Ｂｌａｃｋ６）を麻酔して、定位固定式の枠に入れた（上記参照）。そして、マウスの左側の線条体に５０ｎｍｏｌのＮＭＤＡを片側的に、単独、または４６μＭのｒｔ−ＰＡまたは４６μＭのＤＳＰＡα１と併用して注射した。対照として、ｔ−ＰＡおよびＤＳＰＡα１も単独で注射した（どちらも濃度４６μＭ）。注射した座標は、ブレグマ方向に−０．４ｍｍ、内外方向に２．０ｍｍ、また背腹方向に２．５ｍｍであった。溶液（すべての処置につき全体積で１μｌ）を５分間にわたって０．２μｌ／分の速度で移動させ、注射後さらに２分間、針をそのままにして、液体が逆流するのを抑えた。２４時間後、マウスに麻酔をかけ、３０ｍｌのＰＢＳ、その後７０ｍｌの４％パラホルムアルデヒド溶液で経心臓的に灌流して、同じ固定液で２４時間後固定した後、３０％ショ糖液でさらに２４時間インキュベートした。そして、凍結ミクロトーム上で脳を切り出し（４０μｍ）、ゼラチンコートしたスライドガラスにマウントした。
【００８７】
（８．ＮＭＤＡ注射後の損傷体積の定量）
Ｃａｌｌａｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）によって記載された方法を用いて、線条体損傷体積の定量を行った。損傷された領域にまたがる１０個の連続した冠状切片を調製した。Ｃａｌｌａｗａｙ法を用いて、損傷された領域を可視化し、マイクロコンピュータ画像化装置（ＭＣＩＤ，Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．，Ｂｒｏｃｋ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）によって損傷体積を定量した。
【００８８】
（９．免疫組織化学法）
標準的な方法を用いて免疫組織化学法を行った。冠状切片を３％Ｈ２Ｏ２／１０％メタノールの溶液に５分間浸した後、５％の正常なヤギ血清中で６０分間インキュベートした。切片を、星状細胞を検出するための抗ＧＦＡＰ抗体（１：１，０００；Ｄａｋｏ，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ．，ＵＳＡ）、小グリア細胞を検出するための抗ＭＡＣ−１抗体（１：１，０００；Ｓｅｒｏｔｅｃ，Ｒａｌｅｉｇｈ，Ｎ．Ｃ．，ＵＳＡ）、または、ポリクローナル抗体である抗ＤＳＰＡ抗体（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  ＡＧ，Ｂｅｒｌｉｎ）のいずれかとともに一晩インキュベートした。洗浄した後、切片を、適当なビオチン化二次抗体（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ．，ＵＳＡ）とともにインキュベートした。その後、３，３’−ジアミノベブシジン（ｄｉａｍｉｎｏｂｅｂｚｉｄｉｎ）／０．０３％Ｈ２Ｏ２で可視化するまえに、最後にアビジン／ビオチン複合体とともに６０分間インキュベートした。そして、切片をゼラチンコートしたスライドにマウントして、乾燥、脱水し、パーマウントでカバーガラスをのせた。
【００８９】
（１０．ｔ−ＰＡまたはＤＳＰＡの静脈内投与による、ＮＭＤＡ注射によって誘発される組織損傷の促進）
線条体内に組織損傷を生じさせるために、マウスを定位固定してＮＭＤＡを注射した。ＮＭＤＡを注射してから６時間後、ｔ−ＰＡまたはＤＳＰＡ（１００μｌ；１０ｍｇ／ｋｇ）を尾静脈から注射した。対照として、１００μｌの０．９％ＮａＣｌを注射した後、ＰＢＳを注入した。２４時間後、動物を殺して損傷体積を測定した。
【００９０】
２回目の実験では、同様に、ＮＭＤＡ注射の２４時間後にｔ−ＰＡまたはＤＳＰＡの注射液で１５匹までのマウスを含む動物群に注射し、その後組織損傷を測定した。脳内にＤＳＰＡが存在することの証拠として、常法にしたがって冠状切片を抗ＤＳＰＡ抗体で染色した。
【００９１】
（Ｂ．結果）
（１．ｔ−ＰＡまたはＤＳＰＡを注入すると、ｔ−ＰＡ−／−マウスの海馬に分散し、蛋白質分解活性を保持する）
ｔ−ＰＡおよびＤＳＰＡがともに、７日間の注入期間の間蛋白質分解活性を保持することを確認するために最初の実験を設計した。この目的で、ｔ−ＰＡおよびＤＳＰＡの等量液（１００ｎｍｏｌ）を湯浴槽中３７℃および３０℃で７日間インキュベートした。蛋白質分解活性を測定するために、プローブの５倍段階希釈液について、非還元的条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行って、ザイモグラフ解析によって蛋白質分解活性を測定した。７日間凍結しておいたｔ−ＰＡおよびＤＳＰＡの等量液を対照として評価した。図１から分かるように、この時間内では、２５℃でインキュベートしても、３７℃でインキュベートしても、ｔ−ＰＡまたはＤＳＰＡの活性はわずかに失われただけであった。
【００９２】
（２．注入後ｔ−ＰＡ−／−マウスから調製された海馬抽出物においてｔ−ＰＡまたはＤＳＰＡの活性は回復される）
まず、注入を受けた動物の脳の中に注入されたプロテアーゼが存在していて、また、このコンパートメントに存在する間、蛋白質分解活性を保持していることを確認する必要があった。この点を扱うために、ｔ−ＰＡ−／−にｔ−ＰＡまたはＤＳＰＡのいずれかを７日間注入した（上記参照）。そして、マウスを、ＰＢＳで経心臓的に灌流し、脳を取り出した。同側および対側にある海馬領域と、小脳の一領域（陰性対照として）とを単離した。方法の部の記載に従って、組織サンプル（２０μｇ）に対してＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびザイモグラフ解析を行った。図２から分かるように、ｔ−ＰＡおよびＤＳＰＡの活性は両方とも、海馬の同側領域で検出され、一方、対側でもいくらかの活性が検出された。このことは、注入されたプロテアーゼが、脳の中で活性を保持しただけでなく、海馬領域内にさらに分散したことを示している。対照として、小脳から調製された抽出物では活性を検出できなかった。
【００９３】
（３．ＤＳＰＡの免疫組織化学評価）
ＤＳＰＡが海馬領域に確かに分散したことをさらに確認するために、ＤＳＰＡ注入後、ｔ−ＰＡ−／−マウスの脳の冠状切片を免疫組織化学的に解析した。ＤＳＰＡ抗原が、海馬領域において、注入部位領域で最も顕著な染色を示して検出された。この結果は、注入されたＤＳＰＡが可溶性であり、実際に海馬に存在することが確認するものである。
【００９４】
（４．ＤＳＰＡの注入によって、カイニン酸によるインビボでの神経変性は回復されない）
特徴的なことに、ｔ−ＰＡ−／−マウスは、カイニン酸（ＫＡ）が介在する神経変性に耐性である。しかし、ｒｔ−ＰＡの海馬内注入によって、ＫＡ介在型損傷に対する感受性が完全に回復される。このモデルにおいて、ＤＳＰＡがｔ−ＰＡに代用しうるか否かを判定するために、ミニ浸透圧ポンプを用いて、ｔ−ＰＡ−／−マウスの海馬内にｔ−ＰＡまたはＤＳＰＡを注入した。両群につき１２匹のマウスをテストした。２日後、動物にカイニン酸を注射して、回復させた。５日後、動物を殺して、脳を取り出して調製した（上記参照）。対照として、ｔ−ＰＡ−／−マウスに、ＫＡ処理する前にＰＢＳを注入した（Ｎ＝３）。
【００９５】
脳の冠状切片を調製して、Ｎｉｓｓｌ染色によって神経細胞を検出した。図４ａおよび４ｂに示すように、ＰＢＳを注入されたｔ−ＰＡ−／−マウスは、その後のＫＡによる誘発に対して耐性であった。しかし、組換えｔ−ＰＡを注入すると、ＫＡ処理に対する感受性が回復された。それに対して、同じ濃度のＤＳＰＡを海馬領域に注入しても、ＫＡに対する動物の感受性は変化しなかった。
【００９６】
これらの結果の定量は、各群中の１２匹のマウスから得たデータに基づいていた。ＤＳＰＡを注入された１２匹のマウスのうち２匹では、軽度の神経変性が見られた。その理由は明確でないが、おそらく、ＤＳＰＡが存在したこととは無関係であったろう。まとめられたデータは、これら２匹の動物の症例で見られた些細な作用も考慮している。ｔ−ＰＡで処理された１２匹のマウスはすべて、ＫＡ処理に対して感受性であった。これらの結果は、ｔ−ＰＡまたはＤＳＰＡα１を等モル濃度で注入した場合には、ｔ−ＰＡを投与した場合にだけ、ＫＡ誘導による神経変性に対する感受性が回復する結果となることを示している。
【００９７】
（５．ＤＳＰＡ注入は、小グリア細胞の活性化をもたらさない）
ｔ−ＰＡ注入によってもたらされた、ｔ−ＰＡ−／−マウスのＫＡ感受性の回復は、小グリア活性化ももたらす（Ｒｏｇｏｖｅ  ｅｔ  ａｌ，１９９９）。ｔ−ＰＡまたはＤＳＰＡの注入、およびその後ＫＡ処理した後の小グリア活性化の程度を評価するために、Ｍａｃ−１抗体を用いて、マウスの冠状切片に対し、活性化小グリア細胞のため免疫組織化学染色を行った。ｔ−ＰＡ注入後にＫＡ感受性を回復した結果、Ｍａｃ−１陽性細胞が明らかに増加した。これは、ＤＳＰＡを注入されたマウスでは観察されなかった。したがって、ＤＳＰＡが存在しても、ＫＡ処理の後に小グリア細胞を活性化させる結果とはならない。
【００９８】
（６．マウスの海馬領域におけるＤＳＰＡおよびｔ−ＰＡの滴定）
注入に使用したｔ−ＰＡの濃度は、Ｔｓｉｒｋａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）に記載されている濃度（０．１２ｍｇ／ｍｌを１００μｌ［１．８５μＭ］）に基づいた．１０倍低いｔ−ＰＡ（０．１８５μＭ）および１０倍高いＤＳＰＡ量（１８．５μＭ）を用いて、ＫＡ損傷実験を反復した。より低いｔ−ＰＡ濃度でも、なお、ＫＡ処理に対する感受性を回復することができた（ｎ＝３）。特に興味があるのは、１０倍高いＤＳＰＡ濃度を注入すると、ＫＡ処理後わずかな神経細胞脱落が起きるという発見であった。これらのデータは、ＤＳＰＡが、ＫＡに対する感受性を増強させないことを強く示している。
【００９９】
（７．野生型マウスにおけるＮＭＤＡ依存型神経変性に対するｔ−ＰＡおよびＤＳＰＡの効果）
ｔ−ＰＡおよびＤＳＰＡの効果も、野生型マウスにおける神経変性のモデルにおいて調べた。これらマウスの線条体にｔ−ＰＡを注入すると、グルタミン酸の類似化合物であるＮＭＤＡによって引き起こされる神経変性作用の増加が明らかにもたらされた（Ｎｉｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。
【０１００】
野生型マウスの線条体領域に、ｔ−ＰＡまたはＤＳＰＡ存在下（それぞれ４６μＭ）、総体積１μｌでＮＭＤＡを注射した。２４時間後、脳を取り出して、Ｃａｌｌａｗａｙ法（Ｃａｌｌａｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）（上記参照）によって損傷のサイズを定量した。図７から分かるように、ＮＭＤＡを単独で注射すると、すべての処置マウスで再現可能な損傷が生じた（Ｎ＝４）。ｔ−ＰＡおよびＮＭＤＡを一緒に適用すると、損傷のサイズが約５０％（Ｐ＜０．０１、ｎ＝４）増加した。これとは明らかに対照的に、ＮＭＤＡ、および同じ濃度のＤＳＰＡを同時に注射すると、ＮＭＤＡ単独の場合と較べて損傷のサイズが増加しなかった。
【０１０１】
ｔ−ＰＡまたはＤＳＰＡ単独の注射では、検出可能な神経変性に至らなかった。単独で投与されたときにｔ−ＰＡの作用がないことは、Ｎｉｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）の結果と一致している。これらのデータは、ＤＳＰＡが存在すると、たとえ神経変性が起きている最中であっても、神経変性を促進させないことを示している。
【０１０２】
ＤＳＰＡの注射液が海馬領域の中に実際に拡散したことを確認するために、ＤＳＰＡ抗体を使用して、冠状切片上で免疫組織化学法を行った。試験の結果、ＤＳＰＡは、実際に線条体領域に入ったことが示された。
【０１０３】
（間接的色原体試験によるプラスミノーゲン活性化の動態解析）
ｔ−ＰＡ活性の間接的な色原体テストを、Ｍａｄｉｓａｎ  Ｅ．Ｌ．，Ｇｏｌｄｓｍｉｔｈ  Ｅ．  Ｊ．，  Ｇｅｒａｒｄ  Ｒ．  Ｄ．，  Ｇｅｔｈｉｎｇ  Ｍ．−Ｊ．，  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．Ｆ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３３９  ７２１−７２４；Ｍａｄｉｓｏｎ  Ｅ．ＬＯ．，Ｇｏｌｄｓｍｉｔｈ  Ｅ．Ｊ．，Ｇｅｔｈｉｎｇ  Ｍ．Ｊ．，Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．Ｆ．ａｎｄ  Ｂａｓｓｅｌ−Ｄｕｂｙ  Ｒ．Ｓ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ  ８７，３５３０−３５３３、また、Ｍａｄｉｓｏｎ  Ｅ．Ｌ．，Ｇｏｌｄｓｍｉｔｈ  Ｅ．Ｊ．，Ｇｅｔｈｉｎｇ  Ｍ．Ｊ．，Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．Ｆ．ａｎｄ  Ｇｅｒａｒｄ  Ｒ．Ｄ．（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ  ２６５，２１４２３−２１４２６に記載されている基質であるＬｙｓ−プラスミノーゲン（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ）およびスペクトロザイム（ｓｐｅｃｔｒｏｃｙｍｅ）ＰＬ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ）を用いて行った。試験は、補助因子であるＤＥＳＡＦＩＢ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ）の存在下および非存在下で行った。ＤＥＳＡＦＩＢは、非常に純度の高いヒトフィブリノーゲンをプロテアーゼであるバトロキソビンで切断して得られる可溶性フィブリンモノマー製剤である。バトロキソビンは、フィブリノーゲンのＡα−鎖中のＡｒｇ１６−Ｇｌｙ１７結合を切断して、フィブリノペプチドＡを放出する。その結果得られる、フィブリンＩモノマーを代表するｄｅｓ−ＡＡ−フィブリノーゲンは、ペプチドＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏがなければ可溶性である。Ｌｙｓ−プラスミノーゲンの濃度は、ＤＥＳＡＦＩＢ存在下では、０．０１２５から０．２μＭまで変化させ、補助因子の非存在下では、０．９から１６μＭまで変化させた。
【０１０４】
（さまざまな刺激物質存在下における間接的色原体試験）
上記引用した刊行物に従って、間接的色原体標準試験を行った。０．２５〜１ｎｇの酵素、０．２μＭのＬｙｓ−プラスミノーゲン、および０．６２ｍＭのスペクトロザイムＰＬを含む全量で１００μｌのプローブを用いた。試験は、バッファー、２５μｇ／ｍｌのＤＥＳＡＦＩＢ、１００μｇ／ｍｌのフィブリノーゲンの臭化シアンフラグメント（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ）、または１００μｇ／ｍｌの刺激性１３アミノ酸ペプチドＰ３６８のいずれかの存在下で行った。解析は、マイクロタイタープレートの中で行い、光学密度を、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｔｈｅｒｍｏｍａｘ」において、４０５ｎｍの波長で３０秒ごと、１時間測定した。反応温度は３７℃であった。
【０１０５】
（８．静脈内適用の場合にも、ＤＳＰＡは神経組織損傷の増加を起こさない）
マウスの線条体では、ＮＭＤＡを注射してから、６時間または２４時間後にｔ−ＰＡまたはＤＳＰＡを静脈内適用して、組織損傷を誘導した。陰性対照と比較して、ＮＭＤＡを注射してから２４時間後にｔ−ＰＡを静脈内注入液として投与すると、実験動物は、ＮＭＤＡ注射によって生じた、約３０％の損傷組織面積の増加を示したが、これは、組織損傷をそのようには増加させなかったＤＳＰＡとは対照的であった（図１８参照）。抗ＤＳＰＡ抗体を用いた冠状切片の染色により、ＮＭＤＡを注射してから２４時間後に静脈内投与されたＤＳＰＡが、損傷組織の面積内へ浸透したことを検出することは、可能であった（図１９参照）。同じように、ＮＭＤＡを注射してから６時間後にｔ−ＰＡまたはＤＳＰＡを静脈内適用した場合には、損傷組織の面積の増加はまだ検出されなかった。これは、ｔ−ＰＡまたはＤＳＰＡを適用した時点では、血液脳関門が、まだ十分な障壁機能を提供していたというのが理由かもしれない。このように、静脈内適用する場合にも、ＤＳＰＡは神経毒副作用を示さない。
【０１０６】
【表１】
2006525270.tif 000001
【０１０７】
【表２】
2006525270.tif 000002
【０１０８】
【表３】
2006525270.tif 000003
【０１０９】
【表４】
2006525270.tif 000004
【図面の簡単な説明】
【０１１０】
【図１】記載なし。
【図２】記載なし。
【図４ａ】記載なし。
【図４ｂ】記載なし。
【図７】記載なし。
【図９】記載なし。
【図１０】記載なし。
【図１１】記載なし。
【図１２】記載なし。
【図１３】記載なし。
【図１４】記載なし。
【図１５】記載なし。
【図１６】記載なし。
【図１７】記載なし。
【図１８】記載なし。
【図１９】記載なし。
【図２０】記載なし。
【図２１】記載なし。
【図２２】記載なし。
【図２３】記載なし。
【図２４】記載なし。
【図２５】記載なし。
【図２６】記載なし。
【図２７】記載なし。
【図２８】記載なし。
【図２９】記載なし。
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】図面
【訂正対象項目名】全図
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図１】
2006525270.tif 000005
【図２】
2006525270.tif 000006
【図４ａ】
2006525270.tif 000007
【図４ｂ】
2006525270.tif 000008
【図７】
2006525270.tif 000009
【図９】
2006525270.tif 000010
【図１０】
2006525270.tif 000011
【図１１】
2006525270.tif 000012
【図１２】
2006525270.tif 000013
【図１３】
2006525270.tif 000014
【図１４】
2006525270.tif 000015
【図１６】
2006525270.tif 000016
【図１７】
2006525270.tif 000017
【図１８】
2006525270.tif 000018
【図１９】
2006525270.tif 000019
【図２０】
2006525270.tif 000020
【図２１】
2006525270.tif 000021
【図２２】
2006525270.tif 000022
【図２３】
2006525270.tif 000023
【図２４】
2006525270.tif 000024
【図２５】
2006525270.tif 000025
【図２６】
2006525270.tif 000026
【図２７】
2006525270.tif 000027
【図２８】
2006525270.tif 000028
【図２９】
2006525270.tif 000029
【図１５】
2006525270.tif 000030