(57)【要約】【課題】特定の細胞系統、特に造血細胞に対して優れた遺伝子導入活性を示す。【解決手段】少なくとも、３５型アデノウィルスゲノムのＥ１領域を欠損させてなるＥ１欠損領域を有する３５型アデノウィルスゲノムを含み、当該Ｅ１欠損領域を、外来ペプチドをコードする塩基配列の挿入部位とすることを特徴とするアデノウィルスベクター。【選択図】　図１
2004008047.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも、３５型アデノウィルスゲノムのＥ１領域を欠損させてなるＥ１欠損領域を有する３５型アデノウィルスゲノムを含み、当該Ｅ１欠損領域を、外来塩基配列の挿入部位とすることを特徴とするアデノウィルスベクター。
【請求項２】
少なくとも３５型アデノウィルスゲノムのＥ１領域を欠損させてなるＥ１欠損領域を含むアデノウィルスベクターを準備する工程と
上記３５型アデノウィルスゲノムのＥ１欠損領域に、外来塩基配列を挿入する工程と
を含む組換えアデノウィルスベクターの作製方法。
【請求項３】
上記アデノウィルスベクターを準備する工程では、上記Ｅ１欠損領域を含む３５型アデノウィルスゲノムの一部を準備し、
上記外来塩基配列を挿入する工程では、上記３５型アデノウィルスゲノムの一部に上記外来塩基配列を挿入し、
その後、上記外来塩基配列を挿入した上記３５型アデノウィルスゲノムの一部を、３５型アデノウィルスゲノムの残りの領域と連結することを特徴とする請求項２記載の組換えアデノウィルスベクターの作製方法。
【請求項４】
少なくとも３５型アデノウィルスゲノムのＥ１領域を欠損させてなるＥ１欠損領域を含むアデノウィルスベクターを準備する工程と
上記３５型アデノウィルスゲノムのＥ１欠損領域に、外来塩基配列を挿入し、組換え３５型アデノウィルスベクターを調製する工程と、
上記組換え３５型アデノウィルスベクターを、導入対象の細胞に感染させる工程と
を含む遺伝子導入方法。
【請求項５】
上記導入対象の細胞は、造血細胞であることを特徴とする請求項４記載の遺伝子導入方法。
【請求項６】
上記導入対象の細胞は、ＣＤ３４＋細胞であることを特徴とする請求項４記載の遺伝子導入方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、例えば、対象の細胞に対して目的の遺伝子を導入する際に使用されるアデノウィルスベクターに関する。
【０００２】
【従来技術】
アデノウィルスは、１９５３年、小児の扁桃腺やアデノイド組織培養液中から分離され、現在までにヒト、トリ、ウシ、サル、イヌ、マウス或いはブタを宿主とする８０以上の血清型の存在が明らかにされている。ヒトを宿主とするアデノウィルスについては、これまで５０種類以上の血清型が発見されており、その中でも２型と５型とが遺伝子治療用ベクターとして用いられている。
【０００３】
５型アデノウィルスはエンベロープを持たず、２５２個のカプソメアよりなる正２０面体構造をしている。そのうち頂点にある１２個のカプソメアは突起構造を持ったペントン（ペントンベースとファイバーから成る）と呼ばれ、他の２４０個はヘキソンと呼ばれる。ウィルスの細胞内への侵入（感染）は、ファイバーが受容体のＣＡＲに結合し（詳細については、Ｂｅｒｇｅｌｓｏｎ　Ｊ　Ｍら、Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｃｏｍｍｏｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｆｏｒ　Ｃｏｘｓａｃｋｉｅ　Ｂ　ｖｉｒｕｓｅｓ　ａｎｄ　ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ　２　ａｎｄ　５．　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２７５：１３２０−１３２３，　１９９７を参照されたい）、その後ペントンベースのＲＧＤモチーフが細胞表面上のインテグリンに結合することによって起こる（Ｂａｉ　Ｍ，　Ｈａｒｆｅ　Ｂ，　Ｆｒｅｉｍｕｔｈ　Ｐ、Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ　ｔｈａｔ　ａｌｔｅｒ　ａｎ　Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ　（ＲＧＤ）　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ　ｔｙｐｅ　２ｐｅｎｔｏｎ　ｂａｓｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ａｂｏｌｉｓｈ　ｉｔｓ　ｃｅｌｌ−ｒｏｕｎｄｉｎｇ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ａｎｄ　ｄｅｌａｙ　ｖｉｒｕｓ　ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｉｎ　ｆｌａｔ　ｃｅｌｌｓ．　Ｊ．　Ｖｉｒｏｌ．　６７：　５１９８−５２０５，　１９９３；Ｗｉｃｋｈａｍ　Ｔ　Ｊら、Ｉｎｔｅｇｒｉｎｓαｖβ３　ａｎｄαｖβ５　ｐｒｏｍｏｔｅ　ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ　ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ　ｂｕｔ　ｎｏｔｖｉｒｕｓ　ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ．　Ｃｅｌｌ　７３：３０９−３１９，　１９９３）。エンドソームに達したウィルスは酸性条件下でカプシド蛋白質の構造変化を起こし、エンドソームを破壊して、細胞質内に侵入する。従って、細胞表面上の受容体であるＣＡＲに、ウィルスのファイバーが結合するのが感染の第一ステップであり、ファイバーを修飾することにより、ベクターの感染域を変えることができると考えられる（Ｐａｉｌｌａｒｄ，　Ｆ．，Ｄｒｅｓｓｉｎｇ　ｕｐ　ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ　ｔｏ　ｍｏｄｉｆｙ　ｔｈｅｉｒ　ｔｒｏｐｉｓｍ．　Ｈｕｍ．　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒ．　１０：２５７５−２５７６，　１９９９）。
一方、３５型のアデノウィルスは、当初、腎臓移植患者、骨髄移植患者、ＡＩＤＳ患者等の尿中から発見され、その感染により急性出血性膀胱炎を引き起こし、腎臓に感染すると言われている。３５型アデノウィルスの感染受容体は現在のところ不明である。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
ところで、外来遺伝子を目的の細胞に導入する際に用いられるベクターとしては、ヒトを宿主とする２型、５型及び７型アデノウィルス、ヒト以外を宿主とするアデノウィルスでは、サルアデノウィルス、マウスアデノウィルス、イヌアデノウィルス、ヒツジアデノウィルス及びトリアデノウィルス等が知られている。
【０００５】
ところが、上述したようなアデノウィルスを用いたベクターには、目的とする細胞の種類によっては感染力が十分でなく、或いは遺伝子導入効率が十分でないため、所期の目的を達成することができないといった問題があった。
そこで本発明は、特定の細胞系統、特に造血細胞に対して優れた遺伝子導入活性を示すアデノウィルスベクターを提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
上述した目的を達成した本発明は、以下を包含する。
（１）　少なくとも、３５型アデノウィルスゲノムのＥ１領域を欠損させてなるＥ１欠損領域を有する３５型アデノウィルスゲノムを含み、当該Ｅ１欠損領域を、外来塩基配列の挿入部位とすることを特徴とするアデノウィルスベクター。
【０００７】
（２）　少なくとも３５型アデノウィルスゲノムのＥ１領域を欠損させてなるＥ１欠損領域を含むアデノウィルスベクターを準備する工程と、上記３５型アデノウィルスゲノムのＥ１欠損領域に、外来塩基配列を挿入する工程とを含む組換えアデノウィルスベクターの作製方法。
【０００８】
（３）　上記アデノウィルスベクターを準備する工程では、上記Ｅ１欠損領域を含む３５型アデノウィルスゲノムの一部を準備し、上記外来塩基配列を挿入する工程では、上記３５型アデノウィルスゲノムの一部に上記外来塩基配列を挿入し、その後、上記外来塩基配列を挿入した上記３５型アデノウィルスゲノムの一部を、３５型アデノウィルスゲノムの残りの領域と連結することを特徴とする（２）記載の組換えアデノウィルスベクターの作製方法。
【０００９】
（４）　少なくとも３５型アデノウィルスゲノムのＥ１領域を欠損させてなるＥ１欠損領域を含むアデノウィルスベクターを準備する工程と、上記３５型アデノウィルスゲノムのＥ１欠損領域に、外来塩基配列を挿入し、組換え３５型アデノウィルスベクターを調製する工程と、上記組換え３５型アデノウィルスベクターを、導入対象の細胞に感染させる工程とを含む遺伝子導入方法。
【００１０】
（５）　上記導入対象の細胞は、造血細胞であることを特徴とする（４）記載の遺伝子導入方法。
（６）　上記導入対象の細胞は、ＣＤ３４＋細胞であることを特徴とする（４）記載の遺伝子導入方法。
【００１１】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のアデノウィルスベクターは、少なくとも、３５型アデノウィルスゲノムのＥ１領域を欠損させてなるＥ１欠損領域を有する３５型アデノウィルスゲノムを含むものである。すなわち、本発明のアデノウィルスベクターは、Ｅ１欠損領域を有するものであれば、３５型アデノウィルスゲノムの一部からなるものであっても良い。また、本発明のアデノウィルスベクターは、Ｅ１欠損領域を有する３５型アデノウィルスゲノムの全部からなるものであっても良い。
【００１２】
Ｅ１欠損領域を有し、３５型アデノウィルスゲノムの一部からなるアデノウィルスベクターは、例えば、３５型アデノウィルスゲノムのＥ１領域を含む断片を制限酵素で切り出し、当該断片におけるＥ１領域を欠損させて得たＥ１欠損領域を所定のベクターに連結することによって得ることができる。具体的には、例えば、３５型アデノウィルスゲノムの一部からなるアデノウィルスベクターは、３５型アデノウィルスゲノムの塩基配列における４００〜２９００番目を欠損し（Ｅ１欠損領域）、３５型アデノウィルスゲノムの塩基配列における１〜８４００番目からなるものが挙げられる。
【００１３】
ここで、３５型アデノウィルスゲノムのＥ１領域とは、一般に知られているアデノウィルスの増殖に必須なタンパク質であるＥ１タンパク質をコードする領域を意味する。具体的に、３５型アデノウィルスゲノムのＥ１領域とは、３５型アデノウィルスゲノムの塩基配列における４００〜２９００番目に相当し、制限酵素ＡｃｃＩとＰａｃＩとで３５型アデノウィルスゲノムを処理したときに生ずる約２．５ｋｂｐの断片に存在する。また、Ｅ１領域は、３５型アデノウィルスゲノムの塩基配列における４００〜３４００番目に相当し、３５型アデノウィルスゲノムを制限酵素ＡｃｃＩとＢａｍＨＩとで処理したときに生ずる約３．０ｋｂｐの断片に存在する。
【００１４】
特に、Ｅ１欠損領域とは、Ｅ１タンパク質をコードする領域を機能的に欠損させた領域を意味する。機能的に欠損させるとは、例えば、宿主細胞内で機能するかたちでＥ１タンパク質を発現させないことを意味する。したがって、本発明に係るアデノウィルスベクターは、Ｅ１領域の全体を欠失している必要はなく、Ｅ１領域の一部を有するものであっても良い。すなわち、本発明に係るアデノウィルスベクターは、宿主細胞内で機能するＥ１タンパク質を発現しなければ、３５型アデノウィルスゲノムＥ１領域の一部を有するものであってもよい。
【００１５】
なお、本発明に係るアデノウィルスベクターは、Ｅ１欠損領域の他に、Ｅ３領域を欠損させた３５型アデノウィルスゲノムの一部又は全部であっても良い。３５型アデノウィルスゲノムにおけるＥ３領域は、３５型アデノウィルスゲノムをＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで処理し、２８３００〜３０３００番目に相当する部位を除くことで欠損させることができる。Ｅ１欠損領域の他に、Ｅ３領域を欠損させた３５型アデノウィルスゲノムを用いることで、サイズが大きい外来塩基配列をＥ１欠損領域に挿入することができる。
【００１６】
さらに、本発明に係るアデノウィルスベクターは、Ｅ１欠損領域を有し、３５型アデノウィルスゲノムに存在する遺伝子の一部を欠損させることにより免疫反応を減弱させたものであってもよい。言い換えると、本発明に係るアデノウィルスベクターは、Ｅ１欠損領域を有し、３５型アデノウィルスゲノムの一部からなる、いわゆるｇｕｔｔｅｄ（ｇｕｔｌｅｓｓ）アデノウィルスベクターであってもよい。
【００１７】
また、本発明の組換えアデノウィルスベクターは、Ｅ１欠損領域に外来塩基配列を有し、且つ、Ｅ１欠損領域を除く３５型アデノウィルスゲノムの全部を含むベクターである。この組換えアデノウィルスベクターは、本発明のアデノウィルスベクターを用いて作製することができる。すなわち、Ｅ１欠損領域を有し、３５型アデノウィルスゲノムの一部を有するアデノウィルスベクター、或いは、Ｅ１欠損領域を有し、３５型アデノウィルスゲノムの全部を有するアデノウィルスベクターいずれからも作製することができる。
【００１８】
Ｅ１欠損領域を有し、３５型アデノウィルスゲノムの一部を有するアデノウィルスベクターを用いて本発明の組換えアデノウィルスベクターを作製する際には、先ず、アデノウィルスベクターにおけるＥ１欠損領域に外来塩基配列を挿入した後、３５型アデノウィルスゲノムの残りの部分と連結する。これによって、上記外来塩基配列を有する組換えアデノウィルスベクターを作製することができる。また、Ｅ１欠損領域を有する３５型アデノウィルスゲノムの全部からなるアデノウィルスベクターの場合は、Ｅ１欠損領域に外来塩基配列を挿入することによって、上記塩基配列を有する組換えアデノウィルスベクターとすることができる。
【００１９】
一般に、アデノウィルスにおいてＥ１領域を欠損させると、Ｅ１タンパク質を発現している細胞（例えば、２９３細胞）以外で増殖することができない。例えば、遺伝子導入ベクターとして使用されている５型アデノウィルスのＥ１領域欠損型は、２９３細胞では増殖することができるが、遺伝子導入標的細胞では増殖できない。
【００２０】
３５型アデノウィルスにおいてＥ１領域を欠損させると、５型アデノウィルスのＥ１タンパク質及びＥ４タンパク質を発現する細胞において増殖することができるが、Ｅ１タンパク質を発現し、Ｅ４タンパク質を発現しない細胞では増殖することができない。すなわち、５型アデノウィルスのＥ１領域欠損型と、Ｅ１領域を欠損させてなる３５型アデノウィルスとは、増殖の特性が異なっている。
【００２１】
Ｅ１欠損領域に挿入する外来塩基配列としては、何ら限定されないが、例えば、タンパク質或いはペプチドをコードする塩基配列、所定の遺伝子の制御領域に存在する塩基配列、所定のタンパク質が結合できる塩基配列等、如何なる塩基配列であってもよい。特に、外来塩基配列としては、いわゆる遺伝子治療に効果が認められる、或いは効果があるとされる遺伝子を使用することが好ましい。更に好ましくは、遺伝子治療としては、造血細胞に関する疾患或いは疾病の治療或いは予防、及び、造血細胞に起因する症状の改善を目的とした遺伝子治療を挙げることができる。
【００２２】
また、外来塩基配列として、発現を制御するプロモーター配列、ルシフェラーゼをコードする遺伝子及びポリＡ配列をこの順で有する塩基配列とした場合、遺伝子導入標的細胞における導入効率を、ルシフェラーゼ活性を測定して評価できる。また、ルシフェラーゼをコードする遺伝子に代えて、グリーン蛍光タンパク質（いわゆるＧＦＰ）をコードする遺伝子を用いた場合には、遺伝子導入標的細胞におけるグリーン蛍光を測定することで、遺伝子導入標的細胞における導入効率を評価できる。
【００２３】
ここで、遺伝子導入標的細胞としては、ＣＤ３４＋細胞或いは造血幹細胞等の造血細胞を使用することが好ましい。造血細胞において、３５型アデノウィルスに対する感染受容体は未知である。ルシフェラーゼ遺伝子やＧＦＰ遺伝子等の外来塩基配列を有する組換えアデノウィルスベクターは、外来塩基配列の導入量を測定できるため、造血細胞における感染受容体を探求する際に有用なものとなる。
【００２４】
なお、３５型アデノウィルスがヒトＣＤ３４＋細胞に対して高い親和性を示し、５型アデノウィルスのキャプシドに３５型アデノウィルスのファイバー領域の一部を含むキメラベクター（Ａｄ５／Ｆ３５）がヒトＣＤ３４＋細胞に対して高い効率で遺伝子を導入することが知られている（Ｓｈａｙａｋｈｍｅｔｏｖ，　Ｄ．　Ｍ．，　Ｐａｐａｙａｎｎｏｐｏｕｌｏｕ，　Ｔ．，　Ｓｔａｍａｔｏｙａｎｎｏｐｏｕｌｏｓ，　Ｇ．　＆　Ｌｉｅｂｅｒ，　Ａ．　（２０００）．　Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　ｇｅｎｅ　ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｉｎｔｏ　ｈｕｍａｎ　ＣＤ３４（＋）　ｃｅｌｌｓ　ｂｙ　ａ　ｒｅｔａｒｇｅｔｅｄ　ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ　ｖｅｃｔｏｒ．　Ｊ．　Ｖｉｒｏｌ．　７４，　２５６７−２５８３．）。
【００２５】
これに対して、本発明の組換えアデノウィルスベクターは、ヒトＣＤ３４＋細胞等の造血細胞に対して高い親和性を持って感染することができるだけでなく、造血細胞に外来ペプチドをコードする塩基配列を効率よく導入することができる。
また、本発明の組換えアデノウィルスベクターは、繰り返し投与時に有用である。一般に用いられている５型アデノウィルスベクターで対象動物に繰り返し投与を行った場合には、対象動物内における抗原抗体反応の結果、投与回数を重ねるに従って遺伝子導入効率が低下してしまうことが知られている。
【００２６】
したがって、例えば、一般に用いられている５型アデノウィルスベクターで対象動物に単回投与を行った後、本発明の組換えアデノウィルスベクターで当該対象動物に複数回目の投与を行うことによって、優れた効率で複数回目の投与による遺伝子導入を行うことができる。
【００２７】
【実施例】
以下に実施例を示して本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。
〔実施例１〕
３５型アデノウィルスベクターの作製
・プラスミドの作製
先ず、３５型アデノウィルスゲノムの両末端に、ＳｂｆＩ認識配列及びＮｏｔＩ認識配列を付加したプラスミド（ｐＡｄＭＳ１）を作製した。作製手順を図１に示す。
ｐＡｄＭＳ１を作製する際には、先ず、３５型アデノウィルスをＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から入手した（ＡＴＣＣ番号：ＶＲ−７１８）。入手した３５型アデノウィルスをＨｅＬａ細胞で増殖させ、ＣｓＣｌ２密度勾配法で精製した。次に３５型アデノウィルスをプロテイナーゼＫで処理して、３５型アデノウィルスのゲノムＤＮＡを単離した。次に、単離したゲノムＤＮＡの５’末端にＳｂｆＩ部位を付加した後、ゲノムＤＮＡをＰａｃＩで処理し、生じた約２．９〜３ｋｂの断片をｐＦＳ２ベクターのＳｂｆＩ／ＰａｃＩ部位にクローニングした。約２．９〜３ｋｂの断片をクローニングしたｐＦＳ２ベクターをｐＦＳ２−Ａｄ３５−５とした。クローニングした約２．９〜３ｋｂの断片は３５型アデノウィルスゲノムの５’側のＩＴＲを含んでいた。また、単離したゲノムＤＮＡの３’末端にＮｏｔＩ部位を付加した後、ゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩで処理し、生じた約７ｋｂの断片をｐＨＭ１５ベクターのＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩ部位にクローニングした。約７ｋｂの断片をクローニングしたｐＨＭ１５ベクターをｐＨＭ１５−Ａｄ３５−１とした。クローニングした約７ｋｂの断片は３５型アデノウィルスゲノムの３’側のＩＴＲを含んでいた。
【００２８】
なお、ｐＦＳ２ベクターは、ｐＧＥＭ７Ｚｆ（＋）（プロメガ社製）のＸｂａＩ／ＸｈｏＩ／ＥｃｏＲＩ／ＫｐｎＩ／ＳｍａＩ／Ｃｓｐ４５Ｉ／ＣｌａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩ／ＳａｃＩ部位をＳｂｆＩ／ＳｗａＩ／ＰａｃＩ／ＡｓｃＩ／ＳｇｆＩ／ＮｏｔＩ部位に変えたベクターである。ｐＨＭ１５ベクターは、ｐＨＭ５　（Ｍｉｚｕｇｕｃｈｉ，　Ｈ．　ａｎｄ　Ｋａｙ，　Ｍ．Ａ．　Ａ　ｓｉｍｐｌｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ　Ｅ１　ａｎｄ　Ｅ１／Ｅ４　ｄｅｌｅｔｅｄ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ　ｖｅｃｔｏｒ．　Ｈｕｍ．　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒ．，　１０，　２０１３−２０１７　（１９９９））のＩ−ＣｅｕＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ／ＳｐｈＩ部位をＸｂａＩ／ＡｖｒＩＩ／ＮｈｅＩ／ＳｐｅＩ／ＮｏｔＩ部位に、ＰＩ−ＳｃｅＩ部位をＰｖｕＩＩ／ＡｐａＩ／ＳｐｅＩ／ＮｈｅＩ／ＡｖｒＩＩ／ＸｂａＩ部位に変えたベクターである。
【００２９】
次に、これらｐＦＳ２−Ａｄ３５−５及びｐＨＭ１５−Ａｄ３５−１をそれぞれ、ＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩで消化した。これによりｐＦＳ２−Ａｄ３５−５は、ゲノムＤＮＡ由来の領域に存在するＢａｍＨＩ認識部位で切断されて直鎖状となった。一方、定法に従ってｐＨＭ１５−Ａｄ３５−１からは、ゲノムＤＮＡ由来の領域を含むＢａｍＨＩ−ＮｏｔＩ断片を切り出した。直鎖状となったｐＦＳ２−Ａｄ３５−５と切り出されたＢａｍＨＩ−ＮｏｔＩ断片とを連結することによって得られたベクターをｐＦＳ２−Ａｄ３５−６とした。
【００３０】
次に、得られたｐＦＳ２−Ａｄ３５−６をＢａｍＨＩで消化して直鎖状とした。直鎖状としたｐＦＳ２−Ａｄ３５−６と３５型アデノウィルスゲノムのゲノムＤＮＡとを用いて大腸菌ＢＪ５１８３株に形質転換した。これにより、大腸菌ＢＪ５１８３株内でｐＦＳ２−Ａｄ３５−６と３５型アデノウィルスゲノムのゲノムＤＮＡとの間で相同組換えが起こる。その後、定法に従って大腸菌ＢＪ５１８３株からプラスミドを抽出することによりプラスミドｐＡｄＭＳ１を作製した。
【００３１】
次に、プラスミドｐＡｄＭＳ１を用いてＧＦＰを発現する組換えアデノウィルスベクターを作製した。作製手順を図２に示す。先ず、３５型アデノウィルスのゲノムＤＮＡをＰａｃＩ及びＡｓｃＩで消化して当該ゲノムＤＮＡの約２９００〜８４００番目に相当するＰａｃＩ／ＡｓｃＩ断片を切り出した。次に、ｐＦＳ２−Ａｄ３５−５をＡｃｃＩ及びＰａｃＩで消化して３５型アデノウィルスのゲノムＤＮＡにおける約４００〜２９００番目に相当するＡｃｃＩ／ＰａｃＩ断片を除去するとともにＡｃｃＩ認識部位をＰａｃＩ認識部位に変換した。これを、さらにＰａｃＩ及びＡｓｃＩで消化した後、３５型アデノウィルスのゲノムＤＮＡの約２９００〜８４００番目に相当するＰａｃＩ／ＡｓｃＩ断片を連結することにより、当該ゲノムＤＮＡの約１〜８４００番目の塩基配列における約４００〜２９００番目が欠失するとともにＡｃｃＩ認識部位がＰａｃＩ認識部位に変換された塩基配列を有するプラスミドを構築した。このプラスミドをｐＦＳ２−Ａｄ３５−７とした。
【００３２】
次に、サイトメガロウィルスプロモーター（ＣＭＶ）、ＧＦＰ遺伝子及びウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリＡ配列がこの順で連結されてなるＧＦＰ発現カセットを、ｐＦＳ２−Ａｄ３５−７のＰａｃＩ認識部位に組み込みクローニングした。このプラスミドをｐＦＳ２−Ａｄ３５−７−ＧＦＰ１とした。次に、このｐＦＳ２−Ａｄ３５−７−ＧＦＰ１及びｐＡｄＭＳ１（図１）を、それぞれＳｂｆＩ及びＡｓｃＩで消化し、ｐＦＳ２−Ａｄ３５−７−ＧＦＰ１におけるＧＦＰ発現カセットを含む断片と、ｐＡｄＭＳ１におけるＳｂｆＩ／ＡｓｃＩ断片（ゲノムＤＮＡにおける約１〜８４００番目に相当）を除いた断片とを連結した。その結果、Ｅ１欠損領域にＧＦＰ発現カセットを組み込んだ３５型アデノウィルスのゲノムＤＮＡを有するプラスミドｐＡｄＭＳ１−ＧＦＰ１を構築できた。
一方、Ｅ１欠損領域にルシフェラーゼ発現カセットを組み込んだ３５型アデノウィルスのゲノムＤＮＡを有するプラスミドｐＡｄＭＳ１−Ｌ２は、ｐＡｄＭＳ１−ＧＦＰ１と同様にして構築した。
【００３３】
・組換えアデノウィルスベクターの構築
得られたｐＡｄＭＳ１−ＧＦＰ１及びｐＡｄＭＳ１−Ｌ２は、以下のように組換えアデノウィルスベクターとして構築した。すなわち、先ず、これらｐＡｄＭＳ１−ＧＦＰ１及びｐＡｄＭＳ１−Ｌ２を、それぞれＳｂｆＩ及びＮｏｔＩで消化し、Ｅ１遺伝子とともにＥ４遺伝子を発現する２９３細胞（ＶＫ１０−９）へトランスフェクトした。トランスフェクト後、１０〜１４日で細胞変性効果が観測され、各プラスミド由来のウィルスが増幅していることを確認した。各プラスミド由来のウィルスは、定法（Ｌｉｅｂｅｒ，　Ａ．ら、Ｊ．　Ｖｉｒｏｌ．　７０，　８９４４−８９６０（１９９６））に従って精製した。
【００３４】
その結果、ｐＡｄＭＳ１−ＧＦＰ１由来のウィルス（Ａｄ３５ＧＦＰ）の収量は、１０１１ウィルス粒子／ｍｌの濃度で約１．５ｍｌ得られた。これは、５型アデノウィルスの場合とほぼ同等又はやや低い収量であった。なお、ｐＡｄＭＳ１−Ｌ２由来のウィルス（Ａｄ３５Ｌ）も同様に精製した。以上により、ＧＦＰ発現カセットが組み込まれた３５型アデノウィルスベクター及びルシフェラーゼ発現カセットが組み込まれた３５型アデノウィルスベクターを構築することができた。
【００３５】
なお、比較のために、通常の５型アデノウィルスベクター（Ａｄ５）及びファイバー領域を３５型のファイバーに置換した５型アデノウィルスベクター（Ａｄ５Ｆ３５）を用いて、ＧＦＰ発現カセット又はルシフェラーゼ発現カセットを組み込んだベクター（Ａｄ５ＧＦＰ及びＡｄ５Ｆ３５ＧＦＰ）を構築した。
【００３６】
Ａｄ３５ＧＦＰに関してプラーク形成単位（ＰＦＵ）とウィルス粒子力価との比率は１：１３３であり、Ａｄ５Ｆ３５ＧＦＰに関して当該比率は１：２４であり、Ａｄ５ＧＦＰに関して当該比率は１：５６であり、Ａｄ３５Ｌに関して当該比率は１：２２５であり、Ａｄ５Ｆ３５Ｌに関して当該比率は１：１３であり、Ａｄ５Ｌに関して当該比率は１：１３であった。なお、ＰＦＵの測定は、Ｋａｎｅｇａｅ　Ｙ　ｅｔ　ａｌ　Ｊｐｎ．　Ｊ．　Ｍｅｄ．　Ｓｃｉ．　Ｂｉｏｌ．　１９９４；４７：１５７−１６６に記載された方法に準じて行った。ウィルス粒子力価の測定は、Ｍａｉｚｅｌ　Ｊｖ　ｅｔ　ａｌ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．　１９６８；３６：１１５−１２５に記載された方法に準じて行った。
【００３７】
・血球細胞に対する遺伝子導入実験
上記で構築された組換えアデノウィルスベクター（Ａｄ３５ＧＦＰ及びＡｄ３５Ｌ）を用いて血球細胞への遺伝子導入を行った。血球細胞としては、ヒトＣＤ３４＋細胞（バイオホイッタカー社より入手）を用いた。製造元の取扱説明書によれば、９５％以上の細胞がＣＤ３４陽性であった。
【００３８】
遺伝子導入実験開始１６〜２０時間前に、ヒトＣＤ３４＋細胞を凍結保存状態から回復させ、ＳｔｅｍＳｐａｎ（商標）２０００（ステム・セル・テクノロジー社より入手）に溶解した。なお、ＳｔｅｍＳｐａｎ（商標）２０００にサイトカインカクテルＳｔｅｍＳｐａｎ（商標）ＣＣ１００（ヒトｆｌｔ−３リガンド（１００ｎｇ／ｍｌ）、ヒト幹細胞因子（１００ｎｇ／ｍｌ）、ヒトインターロイキン−３（２０ｎｇ／ｍｌ）及びヒトインターロイキン−６（１００ｎｇ／ｍｌ））を加えて実験に用いた。その後、ヒトＣＤ３４＋細胞を、２４ウェルプレートに１×１０５ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌとなるように播種した。そして、Ａｄ３５ＧＦＰ、Ａｄ５ＧＦＰ及びＡｄ５Ｆ３５ＧＦＰをそれぞれ３、３０及び３００ＰＦＵ／ｃｅｌｌの濃度となるように希釈し、各濃度でＡｄ３５ＧＦＰ、Ａｄ５ＧＦＰ及びＡｄ５Ｆ３５ＧＦＰを用いてヒトＣＤ３４＋細胞に対して遺伝子導入を行った。
４８時間後、ヒトＣＤ３４＋細胞内におけるＧＦＰ遺伝子の発現を、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトフェア（ベクトン・ディキンソン社製）を用いたＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒフローサイトメータでフローサイトメトリーによって解析した。結果を図３に示す。
【００３９】
また、Ａｄ３５Ｌ、Ａｄ５Ｌ及びＡｄ５Ｆ３５Ｌを用いる場合には、ヒトＣＤ３４＋細胞を９６ウェルプレートに１×１０４ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌとなるように播種し、Ａｄ３５Ｌ、Ａｄ５Ｌ及びＡｄ５Ｆ３５Ｌそれぞれ３、３０、１００及び３００ＰＦＵ／ｃｅｌｌの濃度、並びに３００、３０００、６０００及び９０００ベクター粒子／ｃｅｌｌの濃度となるように希釈し、各濃度でＡｄ３５Ｌ、Ａｄ５Ｌ及びＡｄ５Ｆ３５Ｌを用いてヒトＣＤ３４＋細胞に対して遺伝子導入を行った。４８時間後、ヒトＣＤ３４＋細胞内におけるルシフェラーゼ遺伝子の発現を、ルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｉｃａｇｅｎｅ　ＬＴ２．０、東洋インキ社製）を用いて評価した。結果を図４に示す。なお、図４において「Ｂ−１」は各ウィルスを３、３０、１００及び３００ＰＦＵ／ｃｅｌｌの濃度で用いたときの結果を示し、「Ｂ−２」は各ウィルスを３００、３０００、６０００及び９０００ベクター粒子／ｃｅｌｌの濃度で用いたときの結果を示している。
【００４０】
・各ウィルスによる血球細胞に対する遺伝子導入実験の評価
図３に示した結果から、Ａｄ３５ＧＦＰを用いた場合には、Ａｄ５ＧＦＰ及びＡｄ５Ｆ３５ＧＦＰを用いた場合と比較して、最も高い効率でＧＦＰ遺伝子を導入できることが判った。特に、Ａｄ３５ＧＦＰを３００ＰＦＵ／ｃｅｌｌ濃度で用いた場合には、５９％のヒトＣＤ３４＋細胞でＧＦＰ遺伝子を発現していた。同濃度でＡｄ５ＧＦＰを用いた場合には５％のヒトＣＤ３４＋細胞でＧＦＰ遺伝子を発現しており、同濃度でＡｄ５Ｆ３５ＧＦＰを用いた場合には５２％のヒトＣＤ３４＋細胞でＧＦＰ遺伝子を発現していた。Ａｄ３５ＧＦＰを用いた場合の蛍光強度平均値（ＭＦＩ）は、Ａｄ５ＧＦＰを用いた場合と比較して１０〜７０倍、Ａｄ５Ｆ３５ＧＦＰを用いた場合と比較して２〜３倍であった。
【００４１】
また図４「Ｂ−１」に示した結果から、Ａｄ３５Ｌを用いた場合のルシフェラーゼ発現量は、Ａｄ５Ｌを用いた場合と比較して１０００〜３０００倍、Ａｄ５Ｆ３５Ｌを用いた場合と比較して１５〜１００倍であった。なお、Ｅ４遺伝子産物を発現する２９３細胞は、５型アデノウィルスの場合とは異なり、３５型アデノウィルスを完全に産生しないと考えられたため、図４「Ｂ−１」に示したように、ＰＦＵ価による遺伝子導入効率は、Ａｄ３５Ｌについては過小評価される可能性がある。そこで、３００、３０００、６０００及び９０００ベクター粒子／ｃｅｌｌの各濃度で遺伝子導入効率を評価した。その結果、Ａｄ３５Ｌは、図４「Ｂ−２」に示したように、３０００ベクター粒子／ｃｅｌｌ以上の濃度でＡｄ５Ｌ及びＡｄ５Ｆ３５Ｌと比較して、高い遺伝子導入効率を示した。
【００４２】
以上の結果から、Ａｄ３５を用いたヒトＣＤ３４＋細胞に対する遺伝子導入は、Ａｄ５或いはＡｄ５Ｆ３５を用いた遺伝子導入と比較して、非常に優れた効率を達成することができた。このことから、Ａｄ３５を用いた遺伝子導入は、特に、造血幹細胞等の血球細胞に対して有効であることが示された。
【００４３】
・Ａｄ３５を用いたｉｎ　ｖｉｖｏ繰り返し投与実験
本例では、１回目の投与としてＡｄ５を用いた遺伝子導入及び続く２回目の投与としてＡｄ３５を用いた遺伝子導入からなるｉｎ　ｖｉｖｏ繰り返し投与実験を行い、Ａｄ３５の有用性を検討した。
実験動物としては、マウス（Ｃ５７Ｂ６、日本ＳＬＣより入手）を用いた。また１回目の投与にはＡｄ５Ｌを用いた。２回目の投与には、上述した手法に準じ、ヒト分泌性アルカリフォスファターゼ（ＳＥＡＰ）発現カセット（ＲＳＶＳＥＡＰ１）を組み込んだＡｄ３５（Ａｄ３５ＲＳＶＳＥＡＰ１）を用いた。ＲＳＶＳＥＡＰ１は、ラウス肉腫ウィルス（ＲＳＶ）プロモーター、ＳＥＡＰ遺伝子及びＢＧＨポリＡ配列がこの順で連結されてなる。また、比較としては、２回目の投与にＲＳＶＳＥＡＰ１を組み込んだＡｄ５（Ａｄ５ＲＳＶＳＥＡＰ１）を用いた。ｉｎ　ｖｉｖｏ繰り返し投与実験は以下の手順で行った。
【００４４】
先ず、１回目の投与としてＡｄ５Ｌを１．５×１０１０ベクター粒子／Ｍｉｃｅの投与量で尾静脈内投与した。一回目投与より１４日後、Ａｄ５ＲＳＶＳＥＡＰ１もしくはＡｄ３５ＲＳＶＳＥＡＰ１を１．５×１０１０ベクター粒子／Ｍｉｃｅの投与量で筋肉内投与した。二回目の投与より二日後、眼より採血し、血清中のヒト分泌性アルカリフォスファターゼ量（ＳＥＡＰ量）を測定した。ＳＥＡＰ量は、Ｇｒｅａｔ　ＥｓｃＡＰｅ　ＳＥＡＰ　Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　（クロンテック社より入手）を用いて測定した。またコントロール群としては、一回目投与時には何も投与せず二回目投与時にＡｄ５ＲＳＶＳＥＡＰ１もしくはＡｄ３５ＲＳＶＳＥＡＰ１を筋肉内投与した。
【００４５】
結果を図５に示す。なお、図５の各データは、４回ずつ行った試験の平均値±Ｓ．Ｄ．として示している。縦軸に示すＳＥＡＰ量はコントロール群のＳＥＡＰ量を１００％としたときの相対値である。図５に示すように、１回目投与及び２回目投与においてＡｄ５を用いた場合には、１回目未投与群（コントロール群）と比較して、２回目の投与に起因するＳＥＡＰ量が５％以下に低下している。これに対して、１回目投与においてＡｄ５を用い、２回目投与においてＡｄ３５を用いた場合には、１回目未投与群（コントロール群）と比較して、２回目の投与に起因するＳＥＡＰ量がほぼ同等であった。このように、１回目の投与による遺伝子導入を一般に用いられているＡｄ５等のアデノウィルスベクターを用い、複数回目の投与による遺伝子導入をＡｄ３５を用いることによって、投与回数を重ねるに従って遺伝子導入効率が低下してしまう不都合を回避でき、優れた効率で複数回目の投与による遺伝子導入を行うことができることが示された。
【００４６】
【発明の効果】
以上、詳細に説明したように、本発明によれば、特定の細胞系統、特に造血細胞に対して優れた遺伝子導入活性を示すアデノウィルスベクター、その作製方法及び遺伝子導入方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】３５型アデノウィルスゲノムを有するプラスミドｐＡｄＭＳ１の構築過程を示す図である。
【図２】ＧＦＰ発現カセットを有するＡｄ３５ＧＦＰの構築過程を示す図である。
【図３】Ａｄ５ＧＦＰ、Ａｄ５Ｆ３５ＧＦＰ及びＡｄ３５ＧＦＰを用いた遺伝子導入の結果の蛍光強度を示す特性図である。
【図４】Ａｄ５Ｌ、Ａｄ５Ｆ３５Ｌ及びＡｄ３５Ｌを用いた遺伝子導入の結果のルシフェラーゼ活性を示す特性図である。
【図５】Ａｄ３５を用いたｉｎ　ｖｉｖｏ繰り返し投与実験の結果を示す特性図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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