(57)【要約】【課題】豆類由来の安全性の高い新規なアポトーシス誘導剤、並びにこれを含有する飲食品及び薬品を提供する。ここでいう豆類とは、大豆（黄色種・黒色種）・インゲンマメ・ベニバナインゲン等を指す。【解決手段】本発明のアポトーシス誘導剤は、豆類、特に種皮の抽出物を有効成分とすることを特徴とする。前記抽出物の抽出溶媒はエタノール濃度２０〜８５％（ｗ／ｗ）のエタノール／水であるとよい。本発明のアポトーシス誘導剤は豆類由来の成分を含有することを特徴とする。本発明の飲食品は、前記アポトーシス誘導剤を含有していることを特徴とする。本発明の薬品は、前記アポトーシス誘導剤を含有していることを特徴とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
豆類の抽出物を有効成分とするアポトーシス誘導剤。
【請求項２】
前記豆類が、豆類特に大豆（黄色種・黒色種）・インゲンマメ・ベニバナインゲンの種皮である請求項１記載のアポトーシス誘導剤。
【請求項３】
前記豆類が、脱脂豆類種皮である請求項１記載のアポトーシス誘導剤。
【請求項４】
前記抽出物の抽出溶媒がエタノール濃度２０〜８５％（ｗ／ｗ）のエタノール／水である請求項１〜３のいずれか一項記載のアポトーシス誘導剤。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項記載のアポトーシス誘導剤を含有して成る薬品。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、細胞死の一つのタイプであるアポトーシスを誘導するアポトーシス誘導剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ガンは生活習慣病と並んで死亡原因の上位を占める病気であり、その予防に対する人々の関心は非常に高い。ガンを予防するために、食品等により日常的に有効成分を取り入れる方法が数多く提案されている。
【０００３】
近年、ガン研究の分野ではアポトーシス、すなわちガン細胞自滅に関する研究が盛んになりつつある。アポトーシスは生物個体発生における組織、臓器の形成、また生体の恒常性維持や防御に重要な働きをしている。さらには多くの病気の発生に深い関係があることが解明されつつある。
【０００４】
細胞のアポトーシスによる制御作用の異常は、ガン形成における一つの原因であると考えられている。本来死滅すべき細胞がアポトーシスを起こすことなく生き残ると、その細胞が様々な刺激を受けて染色体上に変異を重ね、最終的にガン細胞になるとされている。ガン細胞は、アポトーシスの耐性機構を獲得して初めて増殖を可能にするのである。つまり、種々の遺伝子変異を伴う細胞のガン化はアポトーシスに対する耐性獲得と関連がある。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
このような背景の下、本発明では、豆類由来の安全性の高い新規なアポトーシス誘導剤、並びにこれを含有する飲食品および薬品を提供することを目的として研究を行った。
本発明者らは豆類の抽出成分について実験を行い、生化学的・医学的な見地から鋭意研究に努めた結果、豆類抽出物、特に大豆（黄色種・黒色種）・インゲンマメ・ベニバナインゲンの種皮の抽出物がガン細胞に対して顕著なアポトーシス誘導作用を示すことを見出した。
【０００６】
これまで、黒豆の抽出物にがん細胞の増殖を抑える作用（特許文献１、非特許文献１）や、大豆中の成分であるイソフラボンの抗がん作用（非特許文献２）が知られている。本発明では、これまで、報告されていないインゲンやベニバナインゲンに新規のアポトーシス誘導作用を見出し、さらにこれまであまり検討されておらず、イソフラボンが含まれていない大豆や黒豆の種皮にもアポトーシス誘導作用があることを見出した。
【０００７】
【特許文献１】特願平１１−１９３２４１
【０００８】
【非特許文献１】小宮孝志・大脇進治・勝崎裕隆・今井邦雄・伊達久美子・木村幸信・樋廻博重、「クロマメ種皮に含まれる抗腫瘍活性物質の探索とその作用機作」、日本食品科学工学会大会講演集、２００１年  Ｖｏｌ．４８、１４３頁
【０００９】
【非特許文献２】Ｓｈａｏ  Ｚ−Ｎ，  Ｗｕ  Ｊ，  Ｓｈｅｎ  Ｚ−Ｚ，  Ｂａｒｓｋｙ  Ｓ  Ｈ，  Ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ  ｅｘｅｒｔｓ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｎ  ｈｕｍａｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌｓ，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，  １９９８  Ｖｏｌ．５８  Ｎｏ．２１，  ｐａｇｅ  ４８５１−４８５７
【００１０】
【課題を解決するための手段】
前記課題を解決するための本発明のアポトーシス誘導剤は、下記の特徴を有する構成とした。
【００１１】
１．豆類の抽出物を有効成分とすることを特徴とする。
２．前記豆類が豆類種皮であることを特徴とする。
３．前記抽出物の抽出溶媒がアルコール濃度２０〜８５％（ｗ／ｗ）のエタノール／水であることを特徴とする。
【００１２】
本発明の飲食品は、前記アポトーシス誘導剤を含有して成ることを特徴とする。
【００１３】
【発明実施の形態】
世界のマメ科植物は６００属１３，０００種におよび、種子が食用とされる、一般的に豆類と呼ばれるもののうち、国内で栽培されているものには、大豆、小豆、インゲンマメ、ベニバナインゲン、エンドウがある。大豆の中には、黄色種・緑色種・黒色種・鞍掛がある。インゲンマメの代表的な品種としては、手亡類・金時類などがあり、ベニバナインゲンの代表的な品種は白花豆・紫花豆である。
【００１４】
豆類の中でも最も重要な品種は大豆であり、１９９９年の世界の大豆生産量は１億５４３２万ｔであった。主要な生産国はアメリカであり、全生産量のうち４６．６％を占める。次いでブラジル２０．０％、アルゼンチン１１．７％、中国８．９％と続く。国内での大豆の需要量は２０００年では５０６万２千ｔであり、自給率は５．３％であった。国内での用途は、製油７７．６％、食品・醸造２０．４％、飼料２．０％である。
【００１５】
大豆の栄養成分の特徴としては、タンパク質、脂質を多く含むことである。ビタミン類ではＢ１・Ｂ２含量がかなり高く、有効な供給源となっている。ほかにビタミンＥ、レシチン、サポニンも特記すべき大豆の栄養成分である。
【００１６】
このような栄養機能のほかに注目される三次機能として、大豆には様々な生理活性があることが研究されてきた。なかでも大豆タンパク質には、コレステロール低下作用、血圧降下作用があることが知られている。また、大豆の糖質の主な成分であるオリゴ糖にはビフィズス菌増殖作用があり、腸内環境改善に有用である。そして近年盛んに研究が行われているのは抗ガン作用である。抗ガン作用を持つ大豆の成分としては、イソフラボン、プロテアーゼインヒビター、フィチン酸、フェノール酸、サポニンなどがある。これまで明らかにされてきた抗ガン作用機構は、抗酸化、ガン細胞の増殖抑制、免疫活性の亢進であるが、そのメカニズムには未だ解明されていないものが多い。黒大豆のＥＢＶ−ＥＡ誘導抑制作用は（特許文献１）に記載されている。
【００１７】
本発明で使用する豆類の抽出物は、豆、もしくは豆の種皮より既知の方法で得ることができる。例えば豆を乾燥、粉砕し、水または有機溶媒で抽出し、乾燥させる。豆類の抽出に使用する溶媒はとくには限定されず、例えば抽出溶媒として水、メタノール、エタノール等の１級アルコール、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール等の液状高価アルコール、酢酸エチルエステルなどの低級アルキルエステル、ベンゼン、ヘキサン等の炭化水素、エチルエーテル、アセトン、塩化メチレン、二酸化炭素等の公知の溶媒などが挙げられる。またこれらの溶媒は、一種または二種以上を組み合わせて使用することができる。そのうちで、好ましい抽出溶媒としては、水と混和する溶媒の水溶液、例えばエタノール、メタノール、アセトンなどの水溶液が挙げられる。
【００１８】
特に含水エタノールを抽出溶媒とするのが望ましい。含水エタノールによれば、効率よく有効成分を抽出することができるためである。含水エタノールは、エタノール濃度２０〜８５％（ｗ／ｗ）のエタノール／水であるとよい。エタノール濃度２０〜８５％（ｗ／ｗ）としたのは、２０％（ｗ／ｗ）未満であると、抽出収量が減少し、また８５％（ｗ／ｗ）を超えると、有効成分の抽出量が不十分になるからである。
【００１９】
本発明の「飲食品」には、飲料および固形食品が含まれる。飲食品の形態としては、例えば特定の保健効果が認められる食品、あるいは生体調整成分の機能を生かして作られる機能性食品とすることができる。本発明のアポトーシス誘導剤を飲食品に適用する場合、豆の抽出物をそのまま製剤の形態にしてもよいが、所要量のアポトーシス誘導剤を食品原料に加えて、一般の製造法により加工製造することができる。例えばアポトーシス誘導剤を飲料に添加物として直接添加するか、あるいはビスケットのような固形食品に添加してガン予防の食品、健康食品あるいは機能性食品等として提供することができる。
【００２０】
また、本発明のアポトーシス誘導剤を、例えば油脂、エタノール、プロピレングリコール、グリセリン、あるいはこれらの混合物に溶解して液状にし、飲料に添加するか、固形食品に添加することが可能である。
【００２１】
さらに、必要に応じてアラビアガム、デキストリン等のバインダーと混合して粉末状あるいは顆粒状にし、飲料や固形食品に添加することも可能である。本発明のアポトーシス誘導剤を添加する飲食品の種類は特に限定されない。飲食品に豆類抽出物を添加する場合、豆類抽出物の使用量に特に制限はないが、健康食品、機能性食品としての摂取は、病気予防、健康維持に用いられるので、含有する飲食品に対して豆類抽出物が合計０．０５〜２０％（ｗ／ｗ）であるのが好ましい。
【００２２】
本発明の「薬品」は、医薬品および医薬部外品を含む。豆類抽出物のアポトーシス誘導能を利用することによりガン治療薬とすることができる。
【００２３】
本発明による薬品の投与方法は、経口投与とすることが望ましい。一般的には錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤等の形態とすることができる。
【００２４】
本発明による薬品を非経口剤として投与してもよい。非経口剤として投与する場合、溶液の状態、または分散剤、懸濁剤、安定剤などを添加した状態で、注射剤、坐剤などに調整することができる。
【００２５】
有効成分の投与量は、年齢、体重、症状、治療効果、投与方法、処理時間等により異なるが、通常成人一人当り、１回に１ｍｇ〜１０００ｍｇの範囲で１日１回から数回経口投与されるか、または１回に１００μｇ〜１００ｍｇの範囲で１日１回から数回非経口投与される。なお、投与量は種々の条件で変動するので、上記投与量より少ない量で十分な場合もあるし、また、範囲を超えて投与する必要のある場合もある。
【００２６】
本発明の有効成分である抽出物は、従来から食品として供されている食材から見出した抽出物であり、安全性の面からも優れているのは明らかである。
【００２７】
〔アポトーシス阻害剤の製造〕
原料として準備した豆類は、丹波黒（大豆黒色種）、光黒（大豆黒色種）、タマホマレ（大豆黄色種）、金時豆（インゲンマメ）、紫花豆（ベニバナインゲン）である。アポトーシス阻害剤として、これらの豆類の熱水抽出エキスと、これらの豆類および豆類の種皮のエタノール抽出エキスを用意した。熱水抽出エキスは、豆類を一晩水に浸漬させた後、１時間加熱することによって得た熱水抽出液を濃縮し、この濃縮液の固形分と同量のデキストリンを加え、乾燥粉末として得た。エタノール抽出エキスは、豆類および豆類の種皮に、４０、５０、６０、８０％（ｗ／ｗ）含水エタノールでそれぞれ還流し、得られたエタノール抽出液について、上記の熱水抽出エキス製造方法と同様にして、乾燥粉末として得た。用意したアポトーシス阻害剤の一覧を表１に示す。
【００２８】
【表１】
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【００２９】
〔試験例１：豆類のヒト胃ガン細胞に対するアポトーシス誘導作用〕
細胞にアポトーシスが誘導されるとＤＮＡの断片化が生じる。試験例１では、実施例１〜１７を添加した細胞からＤＮＡを抽出して電気泳動を行い、ＤＮＡの断片化を観察した。
【００３０】
ヒト胃ガン細胞を１０％牛胎児血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地で培養した。５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調整したヒト胃ガン細胞に所定濃度のサンプルを添加した。これらを３７℃、９５％ａｉｒ−５％ＣＯ２の条件下で３日間培養し、遠心分離して上清を除き、細胞をＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ）で洗浄した。細胞ペレットにｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ  を加え、細胞膜を破壊させた。ここにＲＮａｓｅを加え、５０℃で２．５時間反応させてからプロテアーゼＫ溶液を加え、５０℃で２．５時間反応させた。ＤＮＡ断片を抽出し、ＤＮＡ抽出液とゲルローディング液を混合して２％アガロースゲル板のウェルに添加し、１００Ｖで電気泳動を行った。
【００３１】
ゲルを水に浸し、ＵＶトランスイルミネーターでエチジウムブロマイド蛍光を発したＤＮＡを検出した。
【００３２】
なお、対照として、溶媒（蒸留水）のみを添加したものについて同様な条件でＤＮＡ断片化の様子を観察した。結果を図１に示す。
【００３３】
図１において、「Ｍ」はＤＮＡマーカー、「（１）」は対照（無添加）、「（２）」は実施例１、「（３）」は実施例２、「（４）」は実施例３、「（５）」は実施例４、「（６）」は実施例５、「（７）」は実施例６、「（８）」は実施例７、「（９）」は実施例８、「（８）」は実施例７、「（９）」は実施例８、「（１０）」は実施例９、「（１１）」は実施例１０、「（１２）」は実施例１１、「（１３）」は実施例１２、「（１４）」は実施例１３、「（１５）」は実施例１４、「（１６）」は実施例１５、「（１７）」は実施例１６、「（１８）」は実施例１７を示す。
【００３４】
図１「（１）」の対照群と比較すると、すべてのサンプルについてＤＮＡの断片化が見られ、アポトーシス誘導能を有することがわかった。特に、大豆黒色種である丹波黒・光黒種皮のエタノール抽出エキスではＤＮＡの断片化が著しく、より強いアポトーシス誘導能を有することがわかる。
【００３５】
〔試験例２：ヒト胃ガン細胞に対するアポトーシス誘導作用〕
試験例１で特に効果の認められた実施例４（丹波黒種皮４０％エタノール抽出エキス）について、ヒト胃ガン細胞に対するアポトーシス誘導作用を確認するために、細胞が形態変化する様子を観察した。
【００３６】
ヒト胃ガン細胞を１０％牛胎児血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地で培養した。５×１０５  ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調整したヒト胃ガン細胞に、サンプル５ｍｇ／ｍｌを添加した。これらを３７℃、９５％ａｉｒ−５％ＣＯ２の条件下で３日間培養し、遠心分離により細胞を集めた。集めた細胞の核を染色し、蛍光顕微鏡で形態を観察した。なお、対照として溶媒のみを添加したものについて同様な条件で細胞の形態を観察した。
【００３７】
図２（Ａ）に示すように、無添加の対照には細胞の形態変化が見られないのに対し、実施例４（丹波黒種皮４０％エタノール抽出エキス）を添加したものは、アポトーシス誘導の特徴であるアポトーシス小体が認められた（図２（Ｂ）参照）。
【００３８】
〔試験例３：ＤＮＡ断片化の解析〕
試験例３では、実施例４（丹波黒種皮４０％エタノール抽出エキス）についてアポトーシス誘導能の濃度依存性および経時的変化を確認するため、試験例１と同様にしてＤＮＡ抽出、電気泳動を行い、ＤＮＡの断片化を観察した。
【００３９】
ヒト胃ガン細胞の培養、ＤＮＡ抽出、および電気泳動の方法は試験例１に準ずる。ヒト胃ガン細胞に添加するサンプルは、実施例４（丹波黒種皮４０％エタノール抽出エキス）をそれぞれ所定濃度に調整して用いた。また、対照として、溶媒（蒸留水）を用いた。結果を図３に示す。
【００４０】
図３において、「Ｍ」はＤＮＡマーカー、「（１）」は対照（無添加）、「（２）」は実施例４（丹波黒種皮４０％エタノール抽出エキス）を１ｍｇ／ｍｌ添加したもの、「（３）」は実施例４（丹波黒種皮４０％エタノール抽出エキス）を２ｍｇ／ｍｌ添加したもの、「（４）」は実施例４（丹波黒種皮４０％エタノール抽出エキス）を３ｍｇ／ｍｌ添加したものである。実施例４（丹波黒種皮４０％エタノール抽出エキス）を１ｍｇ添加したものからＤＮＡの断片化が見られ、濃度が大きくなるに従い、ＤＮＡの断片化の程度が大きくなることがわかる。
【００４１】
図４において、「Ｍ」はＤＮＡマーカー、「（１）」は対照（無添加）、「（２）」、「（３）」および「（４）」は実施例４（丹波黒種皮４０％エタノール抽出エキス）を３ｍｇ／ｍｌ添加したものについて、培養１日目、２日目、および３日目のＤＮＡの断片化の様子を観察したものである。実施例４（丹波黒種皮４０％エタノール抽出エキス）を添加したは、培養日数の経過に伴い、ＤＮＡの断片化の程度が大きくなることがわかる。
【００４２】
〔製造例：飲食品への適用〕
例えば、次の処方によりガン予防に有効な飲食品を製造することができる。
【００４３】
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【００４４】
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【００４５】
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【００４６】
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【００４７】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明によれば、次のように優れた効果を奏する。
ａ．豆類由来の安全性の高いアポトーシス誘導剤を得ることができる。
ｂ．副作用のないガン予防食品やガン治療薬を容易に製造することができる。  ｃ．ガン予防の有効成分を飲食品または薬品として日常的に摂取しやすくなる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ヒト胃ガン細胞のＤＮＡ断片化の様子を示す電気泳動写真である。
【図２】ヒト胃ガン細胞の形態変化の様子を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図３】ヒト胃ガン細胞のＤＮＡ断片化の様子を示す電気泳動写真である。
【図４】ヒト胃ガン細胞のＤＮＡ断片化の様子を示す電気泳動写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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