(57)【要約】【課題】リパーゼを細胞表層に提示する酵母を酵素としてを用いて効率よく光学分割を行うこと。【解決手段】リパーゼを細胞表層に提示する組換え細胞を、１−ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロピルコハク酸モノエステルと反応させ、光学活性な１−ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロピルコハク酸モノエステルを回収する。酵素活性を高める処理を行った組換え酵母では、リパーゼ活性が処理前の１０倍以上に高められ、光学分割反応における立体選択性も向上する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
リパーゼを細胞表層に提示する組換え酵母と、（±）１−置換または未置換ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロピルコハク酸モノエステルとを接触させる工程を含む、光学活性な１−置換または未置換ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロピルコハク酸モノエステルの製造方法。
【請求項２】
前記リパーゼのＮ末端側が、酵母の糖鎖結合タンパク質ドメインのＣ末端側と連結されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
光学活性な１−置換または未置換ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロピルコハク酸モノエステルが、（Ｓ）−１−置換または未置換ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロピルコハク酸モノエステルである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記リパーゼが、リゾプス・オリゼ由来である、請求項１から３のいずれかの項に記載の方法。
【請求項５】
前記リパーゼを細胞表層に提示する組換え酵母が、酵素活性を高める処理をされた酵母である、請求項１から４のいずれかの項に記載の方法。
【請求項６】
リパーゼを細胞表層に提示する組換え酵母であって、該酵母が室温にて、４〜８日間の放置処理を施され、リパーゼ活性が該処理前のリパーゼ活性に比べて１０倍以上に高められた組換え酵母。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、細胞表層提示酵素を用いる、光学活性な１−ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロピルコハク酸モノエステルの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
（Ｓ）−１−ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロピルコハク酸モノエステルは、（Ｓ）−Ｏ−ベンジルグリシドールの前駆体である。この（Ｓ）−Ｏ−ベンジルグリシドールは、メバロノラクロン、フィソスチグミン、trans−４−ヒドロキシプロリン、（−）−メセンブリンをはじめとする、種々の医薬品、およびそれらの中間体のキラルビルディングブロックとして有用である。そのため、（Ｓ）−１−ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロピルコハク酸モノエステルの製造方法が、種々検討されている。例えば、（±）−１−ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロピルコハク酸モノエステルとリパーゼとを反応させて、光学活性体の一方を優先的に加水分解し、他方の光学活性な１−ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロピルコハク酸モノエステルを効率的に製造する方法が知られている（特許文献１）。しかし、この方法では、酵素反応に時間がかかること、酵素が反復使用できないことなどの問題がある。
【０００３】
【特許文献１】
特開平９−１４０３９４号公報
【非特許文献１】
植田ら、蛋白質・核酸・酵素  vol.46, No.11(2001), 1480-1487
【非特許文献２】
Matumoto, T. ら、Applied and Environmental Microbiology, (2002) 4517-4522
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、効率的な１−ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロピルコハク酸モノエステルの光学分割法を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、リパーゼを細胞表層に提示する組換え酵母と、（±）１−置換または未置換ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロピルコハク酸モノエステルとを接触させる工程を含む、光学活性な１−置換または未置換ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロピルコハク酸モノエステルの製造方法を提供する。
【０００６】
好ましい実施態様においては、前記リパーゼのＮ末端側が、酵母の糖鎖結合タンパク質ドメインのＣ末端側と連結されている。
【０００７】
別の好ましい実施態様においては、前記光学活性な１−置換または未置換ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロピルコハク酸モノエステルが、（Ｓ）−１−置換または未置換ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロピルコハク酸モノエステルである。
【０００８】
好ましい実施態様においては、前記リパーゼが、リゾプス・オリゼ由来である。
【０００９】
さらに別の好ましい実施態様においては、前記リパーゼを細胞表層に提示する組換え酵母が、酵素活性を高める処理をされた酵母である。
【００１０】
さらに、本発明は、リパーゼを細胞表層に提示する組換え酵母であって、該酵母が室温にて、４〜８日間の放置処理を施され、リパーゼ活性が該処理前のリパーゼ活性に比べて１０倍以上に高められた組換え酵母を提供する。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明においては、リパーゼを細胞表層に提示する組換え酵母を酵素（リパーゼ）として用いる。細胞表層に提示されるリパーゼには、特に制限はなく、微生物由来のリパーゼ、動物由来のリパーゼなどが好ましく利用される。用いるリパーゼによって、一方の光学活性体が選択的にあるいは優先的に分解され、他方の光学活性な１−ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロピルコハク酸モノエステルが残る。
【００１２】
例えば、セラチア属、シュードモナス属、スタフィロコッカス属、リゾプス属、ムコール属、アスペルギルス属、キャンディダ属に属する微生物に由来するリパーゼは、（Ｒ）−１−ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロピルコハク酸モノエステルを優先的に分解するので、（Ｓ）−１−ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロピルコハク酸モノエステルの製造に好適である。具体的には、セラチア・マルセッセンス、シュードモナス・フラジー、スタフィロコッカス・キシローサス、リゾプス・ジャポニカス、リゾプス・オリゼ、ムコール・ミエヘイ、アスペルギルス・オクラセウス、キャンディダ・リポリティカなどのリパーゼが用いられる。この中でも、構造遺伝子配列が知られているリゾプス・オリゼのリパーゼが好適に使用される。
【００１３】
他方、例えば、バシラス属に属する微生物に由来するリパーゼは、ほとんどの場合、（Ｓ）−１−ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロピルコハク酸モノエステルを優先的に分解するので、（Ｒ）−１−ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロピルコハク酸モノエステルの製造に好適である。
【００１４】
これらのリパーゼは、その構造遺伝子配列が知られているものは、その構造遺伝子配列を用いればよく、構造遺伝子配列が不明なものは、配列を決定して使用すればよい。
【００１５】
リパーゼを細胞表層に提示するには、（ａ）細胞表層局在タンパク質のＧＰＩアンカーを利用する方法（非特許文献１参照）、および（ｂ）細胞表層局在タンパク質の糖鎖結合タンパク質ドメインを利用する方法がある（非特許文献２参照）。これらの（ａ）および（ｂ）の両方の方法に用いられる細胞表層局在タンパク質としては、酵母の性凝集タンパク質であるα−またはａ−アグルチニン、ＦＬＯタンパク質（例えば、ＦＬＯ１、ＦＬＯ２、ＦＬＯ４、ＦＬＯ５、ＦＬＯ９、ＦＬＯ１０、およびＦＬＯ１１）、アルカリホスファターゼなどが挙げられる。
【００１６】
（ａ）ＧＰＩアンカーを利用する方法（非特許文献１参照）
ＧＰＩアンカーによって、異種遺伝子を発現する方法は、分泌シグナル配列をコードするＤＮＡ−細胞表層局在タンパク質をコードする構造遺伝子−ＧＰＩアンカー付着認識シグナルをコードするＤＮＡ配列から発現され、細胞膜外に分泌された細胞表層局在タンパク質がＧＰＩアンカー付着認識シグナルを介して細胞膜のＧＰＩアンカーと結合することを利用する。すなわち、この細胞表層局在タンパク質をコードする構造遺伝子の全部または一部の配列を、リパーゼの構造遺伝子の配列に置換することにより、リパーゼが細胞表層に提示される。ＧＰＩアンカー付着認識シグナル配列としては、例えば、酵母のα−アグルチニンのＣ末端から数えて３２０アミノ酸の配列中に存在するＧＰＩアンカー付着認識シグナル配列が利用される。
【００１７】
（ｂ）糖鎖結合タンパク質ドメインを利用する方法
細胞表層局在タンパク質が糖鎖結合タンパク質である場合、その糖鎖結合タンパク質ドメインは、複数の糖鎖を有し、この糖鎖が細胞壁中の糖鎖と相互作用を行う、または絡み合うことによって、細胞表層に留まることが可能である。例えば、レクチン、レクチン様タンパク質などの糖鎖結合部位などが挙げられる。代表的には、ＧＰＩアンカータンパク質の凝集機能ドメインが挙げられる。ＧＰＩアンカータンパク質の凝集機能ドメインとは、ＧＰＩアンカリングドメインよりもＮ末端側にあり、複数の糖鎖を有し、凝集に関与していると考えられているドメインをいう。
【００１８】
この細胞表層局在タンパク質（凝集機能ドメイン）とリパーゼとの融合蛋白質を発現させることにより、細胞表層にリパーゼが提示される。リパーゼを、細胞表層局在タンパク質（凝集機能ドメイン）の（１）Ｎ末端側に結合させる、（２）Ｃ末端側に結合させる、および（３）Ｎ末端側およびＣ末端側の両方に結合させることができる。高いリパーゼ活性を維持する観点からは、（２）の糖鎖結合タンパク質ドメインのＣ末端側とリパーゼのＮ末端側とが連結された融合タンパク質として細胞表層に提示されることが望ましい。
【００１９】
したがって、例えば、
（１）分泌シグナル配列をコードするＤＮＡ−リパーゼの構造遺伝子−細胞表層局在タンパク質（凝集機能ドメイン）をコードする構造遺伝子、
（２）分泌シグナル配列をコードするＤＮＡ−細胞表層局在タンパク質（凝集機能ドメイン）をコードする構造遺伝子−リパーゼの構造遺伝子、
（３）分泌シグナル配列をコードするＤＮＡ−リパーゼの構造遺伝子−細胞表層局在タンパク質（凝集機能ドメイン）をコードする構造遺伝子−リパーゼの構造遺伝子、などのＤＮＡ配列を作成し、酵母に導入することにより、細胞表層にリパーゼを提示する酵母が得られる。上記の通り、（２）のＤＮＡ配列が、最も好ましく利用できる。
【００２０】
上記（ａ）および（ｂ）の方法において、組換えＤＮＡに用いられる分泌シグナル配列は、細胞表層局在タンパク質の分泌シグナル配列でもよいし、発現した酵素を細胞外へ導くことができる他の分泌シグナル配列でもよい。例えば、グルコアミラーゼの分泌シグナル配列、酵母のα−またはａ−アグルチニンの分泌シグナル配列、リパーゼの分泌シグナル配列が好適に用いられる。酵素活性に影響を及ぼさなければ、細胞表層提示後に分泌シグナル配列およびプロ配列の一部または全部がＮ末端に残ってもよい。
【００２１】
上記の各種配列を含むＤＮＡの合成および結合は、当業者が通常用い得る技術で行われ得る。
【００２２】
上記ＤＮＡはプラスミドの形態であることが望ましい。このＤＮＡの出発材料は、例えば、酵母の２μｍプラスミドの複製起点（Ori）とColE1の複製起点とを有しており、また、酵母選択マーカー（例えば、薬剤耐性遺伝子、TRP、LEU2など）および大腸菌の選択マーカー（薬剤耐性遺伝子など）を有することが好ましい。また、酵素の構造遺伝子を発現させるために、この遺伝子の発現を調節するオペレーター、プロモーター、ターミネーター、エンハンサーなどのいわゆる調節配列をも含んでいることが望ましい。例えば、GAPDH（グリセルアルデヒド３’-リン酸デヒドロゲナーゼ）プロモーターおよびGAPDHターミネーターが挙げられる。このような出発材料のプラスミドの例としては、GAPDHプロモーター配列およびGAPDHターミネーター配列を含むプラスミドpYGA2270またはpYE22m、あるいはUPR-ICL（イソクエン酸リアーゼ上流領域）配列とTerm-ICL（イソクエン酸リアーゼのターミネーター領域）配列とを含むプラスミドpWI3などが挙げられる。
【００２３】
好適には、プラスミドpYGA2270またはpYE22mのGAPDHプロモーター配列とGAPDHターミネーター配列との間、あるいはプラスミドpWI3のUPR-ICLの配列とTerm-ICLの配列との間に、上記リパーゼを細胞表層に提示するためのＤＮＡを挿入すれば、目的のプラスミドが製造される。
【００２４】
宿主の酵母としては、どのような酵母を用いてもよいが、凝集性の酵母が、反応後の分離が簡単である点で、あるいは簡単に多孔質担体に固定できるため連続反応を行い得る点で好ましい。糖鎖結合タンパク質ドメインとして、凝集機能ドメインを使用する場合は、どのような酵母にも強い凝集性を付与することができる。
【００２５】
導入されるＤＮＡは、前述のようなプラスミドの形態であってもよく、あるいは宿主の遺伝子に挿入して、または宿主の遺伝子と相同組換えを起こして染色体に取り込まれてもよい。
【００２６】
ＤＮＡが導入された細胞は、選択マーカー（例えば、TRP）で選択され、発現されたリパーゼの活性を測定することにより選択される。リパーゼが細胞表層に固定されていることは、リパーゼに対する抗タンパク質抗体とFITC標識抗IgG抗体とを用いる免疫抗体法によって確認できる。
【００２７】
上記のようにして得られたリパーゼを細胞表層に提示する組換え酵母は、培地を含む懸濁液あるいは蒸留水中で低温保存または凍結保存され得るか、あるいは低温乾燥または凍結乾燥して保存され得る。好ましくは、培養終了後、蒸留水に懸濁し、室温で４〜８日、最も好ましくは、２０℃で１週間程度放置する。この放置処理により、リパーゼ活性が処理前の活性に比べて、１０倍〜２０倍以上、好ましくは１５〜２０倍に向上し得る。以下、この処理を、酵素活性を高める処理ということがある。また、このような酵素活性を高める処理をされた酵母は、繰返し使用が可能である。
【００２８】
本発明の（Ｓ）−１−置換または未置換ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロピルコハク酸モノエステルの製造方法は、上記のようにして得られたリパーゼを細胞表層に提示する組換え酵母と、（±）１−置換または未置換ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロピルコハク酸モノエステルとを接触させる工程を含む。
【００２９】
本発明の方法を模式的に表すと、以下のようになる。
【００３０】
【化１】
2004194559.tif 000002
【００３１】
上記反応式において、＊は不斉炭素の位置を示し、Ｒは、水素またはアルキル基を表す。Ｒがアルキル基の場合、炭素数は１〜２０が好ましく、炭素数１〜１０の直鎖または分岐を有するアルキル基がより好ましい。さらに好ましくは、Ｒは炭素数１〜４の低級アルキル基（例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基）である。置換基は、ｏ−、ｍ−またはｐ−のどの位置に結合していてもよい。
【００３２】
この式では、（±）１−置換または未置換ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロピルコハク酸モノエステルに、リパーゼを細胞表層に提示する組換え酵母を酵素（リパーゼ）として作用させることによって、一方の１−置換または未置換ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロピルコハク酸モノエステルを選択的にあるいは優先的に分解して、光学活性な１−置換または未置換ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロピルコハク酸モノエステルと、光学活性な１−置換または未置換ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロパノールとを得ることを示す。
【００３３】
反応は、基質である（±）１−置換または未置換ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロピルコハク酸モノエステルを水あるいは緩衝液に溶解し、これにリパーゼを細胞表層に提示する組換え酵母、好ましくは、酵素活性を高める処理した組換え酵母を添加して、攪拌することにより行われる。反応液のｐＨは、３〜９が好ましく、４〜８がより好ましい。反応温度は、５℃〜５０℃、好ましくは１０〜３０℃である。
【００３４】
反応終了後、１−置換または未置換ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロピルコハク酸モノエステルと、１−置換または未置換ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロパノールとを分離する。分離は、溶媒抽出法、結晶析出法、カラムクロマトグラフ法などの、当業者が適宜使用する方法が適用される。
【００３５】
溶媒抽出法では、例えば、以下のように行われる：酸性条件下、適切な溶媒（例えば、酢酸エチル）を用いて、１−置換または未置換ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロピルコハク酸モノエステルおよび１−置換または未置換ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロパノールを反応液から抽出する；ついで、アルカリ性の水溶液（例えば、ｐＨ８のリン酸カリウム緩衝液）を加えて、１−置換または未置換ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロピルコハク酸モノエステルのみを水層に抽出する。なお、この抽出法で得られる抽出物には、（Ｓ）−１−置換または未置換ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロピルコハク酸モノエステルの他に、分解されなかった（Ｒ）−１−置換または未置換ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロピルコハク酸モノエステルも含有される。従って、溶媒抽出法を用いる場合、基質を選択的にかつ効率良く分解することが望ましい。
【００３６】
なお、本発明の基質となる１−置換または未置換ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロピルコハク酸モノエステルは、公知の方法で合成することができる。例えば、トルエン中、ＢＦ３・Ｅｔ２Ｏの存在下、ラセミ体のエピクロルヒドリンを置換または未置換ベンジルアルコールと反応させ、１−置換または未置換ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロパノールを合成する。次いで、得られた１−置換または未置換ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロパノールを無水コハク酸でエステル化することにより、目的の１−置換または未置換ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロピルコハク酸モノエステルが得られる。
【００３７】
【実施例】
以下、実施例をあげて本発明を説明する。
【００３８】
［調製例１］リパーゼを細胞表層に提示する酵母ＦＳ株（S. cerevisiae MT8-1/pWIFSproROL）の調製
Ａ：ＦＬＯ１の５’領域（シグナル配列および凝集機能ドメイン）の遺伝子の取得
次のようにしてＦＬＯ１の遺伝子を取得した。まず、S. cerevisiae ATCC60715から染色体DNAを抽出した。次いでこれをテンプレートとし、プライマーとして配列番号１および配列番号２に記載のヌクレオチド配列を用いてPCR増幅し、BamHIおよびBglIIで切断して、約3300bpの長さのBamHI-BglII断片（BamHI-BglII FLO1 3300bp断片）を得た。この3300bp断片は、ＦＬＯ１の５’側の配列（分泌シグナル配列およびＦＬＯ１凝集機能ドメイン）を有していると思われる。
【００３９】
Ｂ：リパーゼ遺伝子の取得
次のようにして、Rhizopus oryzaeのリパーゼの遺伝子を取得した。簡単に述べると、まず、R. oryzae IFO4697から染色体DNAを抽出した。次いで、これをテンプレートとし、プライマーとして配列番号３および配列番号４に記載のヌクレオチド配列を用いてPCR増幅を行い、BamHIおよびSalIで切断して、約1100bpの長さのBamHI-SalI断片（BamHI-SalIリパーゼ断片）を得た。このリパーゼ断片は、リパーゼのプロ配列および成熟タンパク質配列を有しており、Beerらの報告（Biochim Biophys Acta, 1399: 173-180, 1998）に記載の配列とほぼ一致するものであった。
【００４０】
Ｃ：ＦＬＯ１の５’領域およびプロリパーゼの構造遺伝子をこの順で有するプラスミドの作成
目的のＤＮＡを有するプラスミドは、上記Ａで得られたＦＬＯ１の５’領域遺伝子と上記Ｂで得られたプロリパーゼ遺伝子とを接続することにより得られる。ＦＬＯ１誘導体とリパーゼとの融合タンパク質を作成するために、以下の操作を行った。作成の模式図を、図１に示す。
【００４１】
まず、マルチコピー型プラスミドpWI3を、BglIIで切断し、脱リン酸化後、上記Ａで得られたBamHI-BglII FLO1 3300bp断片を挿入して、プラスミドpWIFSを得た。次いで、このプラスミドpWIFSを、BglIIおよびXhoIで切断し、上記Ｂで得られたBamHI-SalIリパーゼ断片を挿入して、pWIFSpmROLを得た。
【００４２】
Ｄ：形質転換酵母の調製
得られたプラスミドpWIFSpmROLを、Yeast Maker（Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA）を用いた酢酸リチウム法によって非凝集性酵母S. cerevisiae MT8-1（MATa ade his3 leu2 trp1 ura3）（Tajimaら、Yeast, 1:67-77, 1985）に導入した。これを、L-トリプトファンを含まない適切なアミノ酸および塩基を補充したSD-W寒天選択培地（6.7％ Yeast nitrogen base w/o amino acids (Difco Laboratories製)、２％グルコース、２％寒天末）を用いて培養した。生育した酵母を選択し、S. cerevisiae MT8-1/pWIFSproROLと命名した。以下、この株をＦＳ株という。
【００４３】
［調製例２］リパーゼを細胞表層に提示する酵母ＦＬ株（S. cerevisiae MT8-1/pWIFLpmROL）の調製
Ａ：ＦＬＯ１の５’領域（シグナル配列および凝集機能ドメイン）の遺伝子の取得
上記調製例１と同様にして、ＦＬＯ１の染色体DNAを抽出した。これをテンプレートとし、プライマーとして配列番号５および配列番号６に記載のヌクレオチド配列を用いてPCR増幅し、BamHIおよびBglIIで切断して、約4500bpの長さのBamHI-BglII断片（BamHI-BglII FLO1 4500bp断片）を得た。この4500bp断片は、ＦＬＯ１の５’側の配列（分泌シグナル配列およびＦＬＯ１凝集機能ドメイン）を有していると思われる。
【００４４】
Ｂ：リパーゼ遺伝子
リパーゼ遺伝子は、上記調製例１で得られた遺伝子を用いた。
【００４５】
Ｃ：ＦＬＯ１の５’領域およびプロリパーゼの構造遺伝子をこの順で有するプラスミドの作成
Ａで得られたBamHI-BglII FLO1 4500bp断片を用いて、調製例１と同様の操作を行った。すなわち、調製例１のBamHI-BglII FLO1 3300bp断片の代わりに、この4500bp断片をpWI3に挿入し、プラスミドpWIFLを得た。次いで、このプラスミドpWIFLに、調製例１のＢで得られたBamHI-SalIリパーゼ断片を挿入して、プラスミドpWIFLpmROLを得た。
【００４６】
Ｄ：形質転換酵母の調製
得られたプラスミドpWIFLpmROLを用いて、調製例１のＤに記載された方法と同様の方法を行い、生育した酵母を選択し、S. cerevisiae MT8-1/ pWIFLpmROLと命名した。以下、この株をＦＬ株という。
【００４７】
得られたＦＳ株とＦＬ株は、ＦＬＯ１の長さが異なり、ＦＳ株のＦＬＯ１の長さがＦＬ株のＦＬＯ１の長さよりも短い。従って、細胞表層において、ＦＬ株の方が、酵母の表層部のより外側にリパーゼを提示していると考えられる。
【００４８】
[実施例１]
リパーゼを細胞表層に提示する組換え酵母のリパーゼ活性を高める処理
ＦＳ株およびＦＬ株をそれぞれ、500mLのＳＤＣ液体培地(0.67％ 酵母ニトロゲンベース、2.0％カザミノ酸、0.5％グルコース、0.01％ロイシン、0.002％アデニン、0.02％ウラシル、0.02％ヒスチジン)で150時間培養し、遠心分離して培地と菌体とに分離した。洗浄後、菌体を蒸留水で容量が37mLとなるように懸濁し、使用まで、４℃で保存した。
【００４９】
粉末酵素、ＦＳ株およびＦＬ株のリパーゼ活性は、以下のように測定した。すなわち、0.5mMのｐ−ニトロフエニルブチレート水溶液(1.5mL)にpH7.0の20mMリン酸緩衝液(0.4mL)、および酵素液（酵母懸濁液）(0.1mL)を加え、25℃で10分間インキュベートした。次いで、300mMトリクロロ酢酸(0.1mL)を添加することにより反応を停止した後、遠心分離(3,000rpm、10分)することにより、不溶物を除去した。得られた上清(1.5mL)にpH7.0の200mMリン酸緩衝液(2.0mL)を加えて400nmの吸光度を測定し、加水分解により生成したｐ−ニトロフェノールを定量した。１Ｕは、１分間に１μmolのｐ−ニトロフェノールを生成する酵素量として定義した。結果を表１に示す。
【００５０】
【表１】
2004194559.tif 000003
【００５１】
表１からわかるように、ＦＳ株およびＦＬ株ともにリパーゼ活性を示した。
【００５２】
次に、酵母懸濁液を−８０℃で１６時間凍結後融解する凍結融解処理により、あるいは超音波破砕処理により酵母細胞壁および細胞膜を破損させ、リパーゼ活性を測定した。また、酵母懸濁液を２０℃で８日間放置して保存した後、リパーゼ活性を測定した。コントロールとして、無処理の酵母懸濁液のリパーゼ活性を測定した。結果を表２に示す。
【００５３】
【表２】
2004194559.tif 000004
【００５４】
この結果、凍結融解処理および超音波破砕処理により、ＦＳ株では約３倍に、ＦＬ株では約１．５倍に増加した。このことは、菌体内部にもリパーゼが存在することを示している。一方、２０℃で８日間放置保存した酵母は、ＦＳ株およびＦＬ株ともに１５倍以上にリパーゼ活性が高くなっていた。このことから、酵母を２０℃で、１週間以上保存することにより酵素活性が劇的に高くなることが判明した。
【００５５】
[実施例２]
ＦＳ株およびＦＬ株を上記と同じ条件で500mLのＳＤＣ液体培地で培養し、遠心分離して３７ｍｌとなるように蒸留水に懸濁して、２０℃で７日間放置保存し、この懸濁液を同容積のｐＨ５．０の５００ｍＭリン酸緩衝液で希釈して、酵母懸濁液とした。コントロールとして粉末酵素リパーゼＦ−ＡＰ１５（天野エンザイム（株）より購入）を用いた。いずれのリパーゼもリゾプス・オリゼ（Rhizopus oryzae）由来のリパーゼである。他方、メチル−ｔ-ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）２００μｌに１−ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロピルコハク酸モノエステル４０ｍｇを溶解し、基質溶液を調製した。この基質溶液を全量、酵母懸濁液１０ｍｌに添加し、２５℃で２４時間振盪した。反応終了後、溶媒抽出法で１−ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロピルコハク酸モノエステルを抽出し、反応率と純度を求めた。結果を表３に示す。
【００５６】
【表３】
2004194559.tif 000005
【００５７】
リパーゼＦ−ＡＰ１５を用いた場合には立体選択性が低く、Ｅ値は４であったが、リパーゼを表層に提示する酵母ＦＳ株およびＦＬ株ともにＥ値は170以上であり、立体選択性が飛躍的に向上した。これは、細胞表層に提示されたリパーゼが融合タンパク質として発現されているため、分泌型のリパーセとは立体構造が異なり、立体選択性が変化したことによると考えられる。また、２４時間以内に、１−ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロピルコハク酸モノエステルの光学分割をほぼ完全に終了し得ることが判明した。
【００５８】
なお、Ｅ値は、以下の様にして求められる。
Ｅ＝ln[1-c{1+ee(P)}]/ln[1-c{1-ee(P)}]
ここで、ｃは反応率を表し、ee(P)は、反応生成物である１−ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロパノールの光学純度を表す。この計算方法は、J. Am. Chem. Soc. 1982, 104, 7294-7299に記載されている。
【００５９】
さらに、上記反応終了後のＦＳ株およびＦＬ株を遠心分離して水洗後、光学分割反応に繰り返し使用した結果を図２に示す。ＦＳ株を用いた場合には、４回目使用しても反応率の著しい低下は見られなかった。一方、ＦＬ株を用いた場合には、２回目の使用時、１回目と比較して反応率が半分以下となったが、３回目の以降の反応では、反応率の著しい低下はみられなかった。
【００６０】
以上により、リパーゼを表層に提示する組換え酵母を菌体触媒として用いる光学分割を行う場合、菌体は回収、再利用が可能であることを確認した。
【００６１】
【発明の効果】
本発明の方法によれば、リパーゼを細胞表層に提示する酵母を用いると、立体選択性が向上し、１−ベンジルオキシ−３−クロロ−２−プロピルコハク酸モノエステルの光学分割をほぼ完全に行うことができる。さらに、酵素活性を高める処理を行うことによって、リパーゼ活性が高められ、光学分割反応速度が増加し、反応完了までの時間が大幅に短縮される。さらに、酵素活性を高める処理をされた組換え酵母は、繰り返し使用が可能である。
【００６２】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ＦＬＯ１の５’領域およびプロリパーゼの構造遺伝子をこの順で有するプラスミドの構築の模式図である。
【図２】リパーゼを表層に提示する組換え酵母を用いて、光学分割を繰り返して行った場合の反応率の経持変化を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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