(57)【要約】【課題】本発明は、細胞培養によって軟骨組織を再生する際に使用される培養用基材および、その製造法の提供に関し、取扱いの利便性、任意形状・大きさへの切断の容易性、縫合性、細胞の増殖効率等において優れるものである。【解決手段】架橋されたコラーゲンスポンジを構成素材としたこと、生体内分解吸収性の強化材と複合化されていることを特徴とする軟骨培養用基材。強化材を敷設した上からコラーゲンの水溶液、または、酢酸、もしくは、エタノールとの混合溶液、あるいは、これらの発泡液を注ぎ、次いで凍結乾燥することを特徴とする軟骨培養用基材の製造法。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
架橋されたコラーゲンスポンジを構成素材としたことを特徴とする軟骨培養用基材。
【請求項２】
１ミクロン〜５００ミクロンのポアサイズを有するコラーゲンスポンジである請求項１記載の軟骨培養用基材。
【請求項３】
厚さが1〜２０mmの範囲にある請求項1〜２に記載の軟骨培養用基材。
【請求項４】
生体内分解吸収性の強化材と複合化されていることを特徴とする請求項１〜３に記載の軟骨培養用基材。
【請求項５】
強化材が片面もしくは中心部に位置して一体化されている請求項４に記載の軟骨培養用基材。
【請求項６】
強化材が網目状に構成されたものである請求項４に記載の軟骨培養用基材。
【請求項７】
強化材が編、織地、不織布、フィルムから選択されたものである請求項６に記載の軟骨培養用基材。
【請求項８】
強化材が乳酸、グリコール酸、カプロラクトンの重合体およびこれらの共重合体、もしくは、重合体の混合物より選択されたものである請求項７に記載の軟骨培養用基材。
【請求項９】
強化材が親水化処理されたものである請求項８に記載の軟骨培養用基材。
【請求項１０】
架橋されたコラーゲンスポンジと強化材が生体内分解吸収性ポリマーによって接着されている請求項４に記載の軟骨培養用基材。
【請求項１１】
接着に用いられる生体内分解吸収性ポリマーが乳酸とカプロラクトンの共重合体である請求項１０記載の軟骨培養用基材。
【請求項１２】
強化材を敷設した上からコラーゲンの水溶液、または、酢酸、もしくは、エタノールとの混合溶液、あるいは、これらの発泡液を注ぎ、次いで凍結乾燥することを特徴とする軟骨培養用基材の製造法。
【請求項１３】
強化材を敷設した上から生体内分解吸収性ポリマー溶液を注ぎ、コラーゲンスポンジをのせ、凍結乾燥することにより、強化材とコラーゲンスポンジとを接着させることを特徴とする軟骨培養用基材の製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、細胞培養によって軟骨組織を再生させる際に使用される培養用基材および、その製造法の提供に関する。
【０００２】
【従来の技術】
手術、外傷、関節の変形性疾患等によって失われた軟骨組織を細胞培養によって再構築し、人体に移植することにより再生する手法が再生医療として実用化されつつある。
即ち、近年の細胞培養技術の進歩により、種々の細胞の培養が可能となり、例えば、桟敷らはコラーゲンスポンジに軟骨細胞を播種し、軟骨組織を再生させることに成功している（非特許文献１参照）。また、Vacantiらは生体内吸収性高分子であるグリコール酸と乳酸の共重合体からなる繊維を基材としてこれに軟骨細胞を播種することによって軟骨組織の再生を試みている（非特許文献２参照）。また、生体内分解性ポリマーやその多孔体を軟骨細胞の培養用基材として用いることも知られている（特許文献１、特許文献２参照）。さらに、本出願人において、乳酸、グリコール酸もしくはカプロラクトンのいずれかの重合体またはこれらの共重合体のいずれかからなり、細胞保持構造を有するスポンジ状成型物による軟骨組織再生用基材も提案している（特許文献３参照）。
【０００３】
【非特許文献１】
Biomaterials 17(1996)155-162
【非特許文献２】
Plast.Reconstr.Surg.88,753,1991
【特許文献１】
ＷＯ９０/２０９１号公報
【特許文献２】
ＷＯ９８/３１３４５号公報
【特許文献３】
特開平10−234844号公報
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
然しながら、上記構成によるものは、取扱い性、任意形状・大きさへの切断の容易性、縫合性、細胞の増殖効率等においてなお改善の余地があった。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明は上記課題を解決するために成されたもので、以下の構成に特徴を有する。
項１．架橋されたコラーゲンスポンジを構成素材としたことを特徴とする軟骨培養用基材。
項２．１ミクロン〜５００ミクロンのポアサイズを有するコラーゲンスポンジである項1記載の軟骨培養用基材。
項３．厚さが1〜２０mmの範囲にある項1〜２に記載の軟骨培養用基材。
項４．生体内分解吸収性の強化材と複合化されていることを特徴とする項１〜３に記載の軟骨培養用基材。
項５．強化材が片面もしくは中心部に位置して一体化されている項４に記載の軟骨培養用基材。
項６．強化材が網目状に構成されたものである項４に記載の軟骨培養用基材。
項７．強化材が編、織地、不織布、フィルムから選択されたものである項６に記載の軟骨培養用基材。
項８．強化材が乳酸、グリコール酸、カプロラクトン、の重合体およびこれらの共重合体、もしくは、重合体の混合物より選択されたものである項７に記載の軟骨培養用基材。
項９．強化材が親水化処理されたものである項８に記載の軟骨培養用基材。
項10．架橋されたコラーゲンスポンジと強化材が生体内分解吸収性ポリマーによって接着されている項４に記載の軟骨培養用基材。
項11．接着に用いられる生体内分解吸収性ポリマーが乳酸とカプロラクトンの共重合体である項10に記載の軟骨培養用基材。
項12．強化材を敷設した上からコラーゲンの水溶液、または、酢酸、もしくは、エタノールとの混合溶液、あるいは、これらの発泡液を注ぎ、次いで凍結乾燥することを特徴とする軟骨培養用基材の製造法。
項13．強化材を敷設した上から生体内分解吸収性ポリマー溶液を注ぎ、コラーゲンスポンジをのせ、凍結乾燥することにより、強化材とコラーゲンスポンジとを接着させることを特徴とする軟骨培養用基材の製造法。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明は特に、多孔体足場（スポンジ）として適度に架橋されたコラーゲンを使用し、生体内分解性素材による強化材により補強されていることに特徴を有し、これにより、取扱い性の向上、任意形状・大きさへの切断の容易性、縫合性、細胞の増殖効率等の改善がなされたものである。
以下、かかる構成について詳細に説明する。
【０００７】
（架橋コラーゲンスポンジ）
本発明に使用されるコラーゲンは、皮膚、骨、腱、或いは、動物、ヒト等の由来を問わず、変性コラーゲン、線維化コラーゲン等、その構造に関わらず目的を達することができるが、特に、抗原性を低下させる目的で末端のテロぺプタイドを酵素的に除去したアテロコラーゲンの使用が好ましい。
また、架橋処理は生体内での分解のコントロールと培養液につけた際、膨潤しすぎて取扱い難くなる欠点を解消することを主目的として行う。その方法としては、熱架橋、紫外線架橋、或いは、グルタルアルデヒド、ヘキサメチレンジイソシアネート、カルボジイミド等を用いた化学架橋を用いることができる。架橋度の調整は、これらの条件を適宜選択して行えばよいが、通常５日〜数ヶ月の範囲、望ましくは、数週間〜３ヶ月程度で分解するよう調整するのが好ましい。具体的には含水率が６０％〜９５％の範囲への調整が目安となる。
一方、スポンジ化は、例えば、コラーゲン水溶液、または、酢酸、もしくは、エタノールとの混合溶液、あるいは、これらの発泡液を凍結乾燥することにより行う。この際、コラーゲンの水溶液にクロロホルムを加えたり、酢酸を加えたり、エタノールを加えることにより、ポーラスの安定性や均一性を向上させることができる。また、溶液の濃度、攪拌の程度、溶媒、溶媒への添加物、凍結乾燥条件を適宜変えることにより、ポアサイズを数ミクロン〜数百ミクロン、具体的には１ミクロン〜５００ミクロン、厚さ1〜２０mmとすることが望まれる。何れもこの範囲内であることは、軟骨細胞の増殖性において、また、強度、取扱いの利便性等において好適な範囲である。さらに、かかる構成においては、乳酸−カプロラクトン共重合体のスポンジ体と複合化、例えば、貼り合わせたり、重ねたりした構成としてもよい。
【０００８】
（強化材）
生体内分解吸収性高分子であるポリ乳酸、乳酸―カプロラクトン共重合体、ポリグリコール酸、乳酸―グリコール酸共重合体、乳酸−エチレングリコール共重合体、ポリジオキサノン、グリコール酸−カプロラクトン共重合体、グリコール酸−トリメチレンカーボネート共重合体が例示できるが、本発明においては、分解性の制御、柔軟性において、乳酸、グリコール酸、カプロラクトン、の重合体およびこれらの共重合体、もしくは、重合体の混合物より選択されたものであることが好ましい。
本発明においては、これらの高分子を公知の方法により紡糸、延伸した糸を用いて編成、織成、不織布化、平組紐化等して得た布状体、或いは、押出し、キャスティング等して得たフィルムを強化材として用いる。なお、不織布化の方法としては、ニードルパンチング方式のほか、メルトブロー方式により得たものを用いることもできる。
なお、これらの強化材は、培養される細胞への栄養補給を考慮し、網目状（メッシュ状）で、特にその目付けを５〜２００ｇ/ｍ２の範囲とすることが好ましい。従って、フィルムに関しては、適宜の方法により、微細な孔を設けることが望ましい。さらに、コラーゲンスポンジとの接着性を向上させる目的において、予め親水化処理が施されることが望ましい。
かかる親水化の方法としては、例えば、プラズマ処理、グロー放電処理、コロナ放電処理、オゾン処理、表面グラフト処理、コーティング処理、薬品処理等が挙げられるが、操作性、効果の面からプラズマによる処理が望ましい。
【０００９】
（複合化の方法）
本発明においては、その複合化の形態は、コラーゲンスポンジの片面に強化材を一体化させるもの、或いは、強化材を中心にその両面をコラーゲンスポンジによりサンドイッチ状に挟んだ形態とするものが例示できる。また、強化材はその全面に配置することも、一部に配置することも任意であるが、取扱いの利便性の面より全面に配置させることが好ましい。さらに、一体化のために生体内分解吸収性ポリマー溶液を接着剤として用いてもよい。かかる接着剤としては、乳酸−カプロラクトン共重合体溶液が好ましい例として例示できる。
以下に複合化の方法について具体的に例示するが、これに限定されない。
（Ａ法）
適宜の容器に強化材を敷く⇒ホモジナイズしたコラーゲン水溶液、または、酢酸、もしくは、エタノールを加えた水溶液を注ぐ⇒凍結乾燥する⇒架橋処理する（２層構造）
（Ｂ法）
適宜の容器に強化材を敷く⇒接着剤としての乳酸−カプロラクトン共重合体溶液を注ぐ⇒架橋したコラーゲンスポンジをその上に貼り付ける⇒凍結乾燥する（接着層を介した２層構造）
（Ｃ法）
適宜の容器にホモジナイズしたコラーゲン溶液を注ぐ⇒強化材を載せる⇒ホモジナイズしたコラーゲン水溶液、または、酢酸、もしくは、エタノールを加えた水溶液を注ぐ⇒凍結乾燥・架橋する（サンドイッチ状の３層構造）
以下、具体的に実施例を挙げて説明する。
【００１０】
【実施例１】
１．コラーゲンスポンジの作製
・アテロコラーゲン（新田ゼラチン（株）製）を原料とし、３ｍｇ／ｍｌ、pH3.0のコラーゲン水溶液を調整する。
・この溶液50gにクロロホルム0.5gを添加し、ホモジナイザーを用いて、6000rpmで１分間、激しく撹拌する。
・得られたクリーム状の発泡液をアルミ製型枠（11cm×8.5cm）に流し込む。
・−40℃の冷凍庫内で１時間静置し、凍結させる。
・真空減圧下（0.01mmHg）で−40°Ｃから40°Ｃまで12時間かけて一定速度で加温し、さらに真空減圧下40°Ｃで12時間乾燥させコラーゲンスポンジを得る。
２．熱架橋コラーゲンスポンジの作製
・上記のコラーゲンスポンジに真空減圧下105°Ｃで24時間加熱乾燥を行い、熱架橋コラーゲンスポンジを得る。
３．化学架橋コラーゲンスポンジの作製
・上記の熱架橋コラーゲンスポンジを５°Ｃの0.2wt%のグルタルアルデヒド／酢酸溶液中に、２４時間浸漬させ、化学架橋させる。
・得られたスポンジをイオン交換水で十分洗浄する。
・洗浄後、１５％エタノール水溶液に浸漬させる。
・-135°Ｃの冷凍庫内で12時間静置し、凍結させる。
真空減圧下（0.01mmHg）で−40°Ｃから40°Ｃまで12時間かけて一定速度で加温し、さらに真空減圧下40℃で12時間乾燥させ化学架橋複合化コラーゲンスポンジを得る。
４．ポリ−Ｌ乳酸繊維（布）との複合化
・ ポリ−Ｌ乳酸繊維（PLLA繊維）から補強用布を作製する。
（組織：フライス編生地、両面編生地、ツインニット生地、平織生地、天竺編生地、不織布の７種類）
・乳酸−カプロラクトン共重合体（P(LA/CL) ；重合比５０：５０）の４％ジオキサン溶液を作製する。
・20cm×20cmのガラス型枠に前記のPLLA布を敷き、そこへP(LA/CL)溶液を流し込む。
・その上に前記３で得たスポンジをのせ、速やかに−80°Ｃの冷凍庫に移し、凍結させる。
・ 真空減圧下（0.01mmHg）で−40°Ｃから40°Ｃまで12時間かけて一定速度で加温し、さらに真空減圧下40°Ｃで６時間乾燥させ、さらに真空減圧下70°Ｃで12時間乾燥させ、コラーゲンスポンジとPLLA布およびP(LA/CL)スポンジの複合体を得る。
【００１１】
【実施例２】
１．乳酸−カプロラクトン補強材（布）の調整
・乳酸−カプロラクトン共重合体（P(LA/CL)；重合比７５：２５）繊維から布を作製する。（組織：フライス編生地、両面編生地、ツインニット生地、平織生地、天竺編生地、不織布の７種類）
・ P(LA/CL)布をプラズマ処理（酸素、100W、0.5torr、30秒）し、親水化する。２．コラーゲンスポンジとの複合化
・アテロコラーゲン（新田ゼラチン）を原料とし、３ｍｇ／ｍｌ、pH3.0のコラーゲン水溶液を調整する。
・この溶液50gにクロロホルム0.5gを添加し、ホモジナイザーを用いて、6000rpmで１分間、激しく撹拌する。
・アルミ製型枠（11cm×8.5cm）に前記親水化したP(LA/CL)布を敷き、得られたクリーム状のコラーゲン発泡液を流し込む。
・−40°Ｃの冷凍庫内で１時間静置し、凍結させる。
・真空減圧下（0.01mmHg）で−40°Ｃから40°Ｃまで12時間かけて一定速度で加温し、さらに真空減圧下40°Ｃで12時間乾燥させ、P(LA/CL)補強布と複合化したコラーゲンスポンジを得る。
３．熱架橋
上記の複合体に真空減圧下105°Ｃで24時間加熱乾燥を行い、熱架橋させる。
４．化学架橋
・前記の複合化物を５°Ｃの0.2wt%のグルタルアルデヒド／酢酸溶液中に、２４時間浸漬させ、化学架橋させる。
・得られたスポンジをイオン交換水で十分洗浄する。
・洗浄後、１５％エタノール水溶液に浸漬させる。
・-135°Ｃの冷凍庫内で12時間静置し、凍結させる。
・ 真空減圧下（0.01mmHg）で−40°Ｃから40°Ｃまで12時間かけて一定速度で加温し、さらに真空減圧下40℃で12時間乾燥させ化学架橋複合化コラーゲンスポンジを得る。
【００１２】
（動物への移植）
ウサギの骨髄を採取し、１５％ウシ胎児血清を含むDMEM培地と混和し、約１週間培養した。さらに約１週間継代培養し、10６程度に増殖させた。この細胞を直径4mm、厚さ3mmの円柱状に切り出した上記実施例２で得たフライス編生地と架橋コラーゲンスポンジとの複合体に播種した。ウサギの膝関節を露出させ、ドリルを用いて直径4mm深さ4mmの骨軟骨欠損を作製し、細胞を播種したサンプルを欠損部に挿入した。手術後１，２，４週間でウサギを犠牲死させ、移植部位の組織切片を作製した。術後、時間の経過とともに、関節面での軟骨組織の再生および骨欠損部での骨組織の再生が認められた。
【００１３】
【発明の効果】
本発明は、コラーゲンの架橋、強化材による補強効果により、取扱い利便性の向上、自由な形状、大きさへの切断が可能、十分な縫合強度が付加されること、補強材が吸収されること、補強材が多孔体（適度に目が開いている）であるので栄養透過すること等、多大な特徴、効果を有するものである。
よって、軟骨再生用としては勿論のこと、他の器官の再生用基材として、例えば、培養皮膚用基材としても用いることができる。特に、サンドイッチ構造による３層タイプのものは培養皮膚基材として好適に用いることができるものである。