【手続補正書】
【提出日】平成26年10月9日(2014.10.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
方法の一態様において、Ciz1 b変異体ポリペプチドは、アミノ酸配列DEEEIEVRSRDIS（SEQ ID NO: 49）を含む。別の態様において、Ciz1 b変異体ポリペプチドは、SEQ ID NO:22のアミノ酸配列を含む。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４８】
別の局面において、本発明は、本発明の化合物を作製する方法を提供する。
[本発明1001]
対象においてガンを診断する方法であって、以下：
i）試験に供する単離された生物学的試料を提供する工程；
ii）Ciz1 b変異体ポリペプチドが該試料中に存在するか否かを検出する工程
を含み、該Ciz1 b変異体ポリペプチドの存在が、該対象がガンを有することを示す、方法。
[本発明1002]
ガンが、肺ガン、リンパ腫、腎臓ガン、乳ガン、肝臓ガン、膀胱ガン、および甲状腺ガンより選択される、本発明1001の方法。
[本発明1003]
対象における肺ガンの早期検出のための方法であって、以下：
i）試験に供する単離された生物学的試料を提供する工程；
ii）Ciz1 b変異体ポリペプチドが該試料中に存在するか否かを検出する工程
を含み、該試料中の該Ciz1 b変異体ポリペプチドの存在が、対象がガンを有することを示す、方法。
[本発明1004]
肺ガンに関して以前に処置された対象における肺ガン再発の検出のための方法であって、以下：
i）該対象由来の、試験に供する単離された生物学的試料を提供する工程；
ii）Ciz1 b変異体ポリペプチドが該試料中に存在するか否かを検出する工程
を含み、該試料中の該Ciz1 b変異体ポリペプチドの存在が、該対象における肺ガンの再発を示す、方法。
[本発明1005]
肺結節を伴う対象においてガンを診断する方法であって、以下：
i）試験に供する単離された生物学的試料を提供する工程；
ii）Ciz1 b変異体ポリペプチドが該試料中に存在するか否かを検出する工程
を含み、該試料中の該Ciz1 b変異体ポリペプチドの存在が、対象がガンを有することを示す、方法。
[本発明1006]
肺炎または肺ガンのいずれかを有することが疑われる対象において肺ガンを肺炎から鑑別診断する方法であって：
i）該対象由来の、試験に供する単離された生物学的試料を提供する工程；
ii）Ciz1 b変異体ポリペプチドが該試料中に存在するか否かを検出する工程
を含み、該試料中の該Ciz1 b変異体ポリペプチドの存在が、対象がガンを有することを示す、方法。
[本発明1007]
ガンが、非小細胞肺ガン（NSCLC）である、本発明1001〜1006のいずれかの方法。
[本発明1008]
肺ガンが、小細胞肺ガン（SCLC）である、本発明1001〜1006のいずれかの方法。
[本発明1009]
肺ガンが、ステージ0のNSCLCである、本発明1007の方法。
[本発明1010]
肺ガンが、ステージIAのNSCLCである、本発明1007の方法。
[本発明1011]
肺ガンが、ステージIBのNSCLCである、本発明1007の方法。
[本発明1012]
肺ガンが、限定されたステージのSCLCである、本発明1008の方法。
[本発明1013]
肺結節が、直径約20mm未満である、本発明1005の方法。
[本発明1014]
肺結節が、約15mm未満である、本発明1013の方法。
[本発明1015]
肺結節が、10mm未満または約10mmである、本発明1014の方法。
[本発明1016]
肺結節が、約7.5mm未満である、本発明1015の方法。
[本発明1017]
肺結節が、約5mm〜約10mmの間である、本発明1016の方法。
[本発明1018]
対象の肺を撮像する工程を含む、本発明1001〜1017のいずれかの方法。
[本発明1019]
撮像が、胸部X線、コンピューター断層撮影（CT）スキャン、磁気共鳴イメージング（MRI）スキャン、または陽電子放射断層撮影（PET）スキャンを実施する工程をさらに含み、該撮像が、単独ではガンの該診断のためには不十分である、本発明1018の方法。
[本発明1020]
撮像が、胸部X線を実施する工程を含む、本発明1019の方法。
[本発明1021]
撮像が、コンピューター断層撮影（CT）スキャンを実施する工程を含む、本発明1019の方法。
[本発明1022]
CTスキャンが、低線量ヘリカルコンピュータ断層撮影CTスキャンである、本発明1021の方法。
[本発明1023]
撮像が、MRIスキャンを実施する工程を含む、本発明1019の方法。
[本発明1024]
撮像が、PETスキャンを実施する工程を含む、本発明1019の方法。
[本発明1025]
肺ガンに関して処置された対象においてガン細胞死を示す方法であって、以下：
i）該処置の前後に、該対象由来の、試験に供する単離された生物学的試料を提供する工程；
ii）該処置の前後に、該生物学的試料中に存在する該Ciz1 b変異体ポリペプチドの量を測定する工程
を含み、処置後の該Ciz1 b変異体ポリペプチドの量の増加が、腫瘍細胞死を示す、方法。
[本発明1026]
Ciz1 b変異体ポリペプチドが、アミノ酸配列
DEEEIEVRSRDIS (SEQ ID NO: 49)
を含む、本発明1001〜1025のいずれかの方法。
[本発明1027]
Ciz1 b変異体ポリペプチドが、SEQ ID NO:22のアミノ酸配列を含む、本発明1026の方法。
[本発明1028]
生物学的試料が、組織、血液、血漿、喀痰、気管支肺胞洗浄液、気管支肺胞擦過物または尿である、本発明1001〜1027のいずれかの方法。
[本発明1029]
生物学的試料が、組織である、本発明1028の方法。
[本発明1030]
組織が、肺組織である、本発明1029の方法。
[本発明1031]
生物学的試料が、血液である、本発明1028の方法。
[本発明1032]
生物学的試料が、単離されたCTCである、本発明1031の方法。
[本発明1033]
生物学的試料が、血漿である、本発明1028の方法。
[本発明1034]
生物学的試料が、喀痰である、本発明1028の方法。
[本発明1035]
生物学的試料が、気管支肺胞洗浄液である、本発明1028の方法。
[本発明1036]
生物学的試料が、尿である、本発明1028の方法。
[本発明1037]
Ciz1 b変異体ポリペプチドが、細胞外にある、本発明1001〜1029および1033〜1036のいずれかの方法。
[本発明1038]
生物学的試料 100μL未満を、Ciz1 b変異体ポリペプチドの存在について試験する、本発明1033の方法。
[本発明1039]
生物学的試料 50μL未満を、Ciz1 b変異体ポリペプチドの存在について試験する、本発明1038の方法。
[本発明1040]
生物学的試料 25μL未満を、Ciz1 b変異体ポリペプチドの存在について試験する、本発明1039の方法。
[本発明1041]
生物学的試料 10μL未満を、Ciz1 b変異体ポリペプチドの存在について試験する、本発明1040の方法。
[本発明1042]
生物学的試料 5μL未満を、Ciz1 b変異体ポリペプチドの存在について試験する、本発明1040の方法。
[本発明1043]
生物学的試料 1μL未満を、Ciz1 b変異体ポリペプチドの存在について試験する、本発明1041の方法。
[本発明1044]
生物学的試料 0.5〜5μLを、Ciz1 b変異体ポリペプチドの存在について試験する、本発明1041の方法。
[本発明1045]
生物学的試料 0.25〜5μLを、Ciz1 b変異体ポリペプチドの存在について試験する、本発明1041の方法。
[本発明1046]
生物学的試料 0.25〜2μLを、Ciz1 b変異体ポリペプチドの存在について試験する、本発明1041の方法。
[本発明1047]
生物学的試料 0.5〜1.5μLを、Ciz1 b変異体ポリペプチドの存在について試験する、本発明1041の方法。
[本発明1048]
生物学的試料 約1μLを、Ciz1 b変異体ポリペプチドの存在について試験する、本発明1041の方法。
[本発明1049]
生物学的試料をCiz1 b変異体ポリペプチド結合剤と接触させる工程をさらに含む、本発明1001〜1048のいずれかの方法。
[本発明1050]
Ciz1 b変異体ポリペプチド結合剤が、抗体またはその抗原結合フラグメントである、本発明1049の方法。
[本発明1051]
抗体が、ポリクローナルである、本発明1050の方法。
[本発明1052]
抗体が、モノクローナルである、本発明1050の方法。
[本発明1053]
抗原結合フラグメントが、Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、またはsdAbより選択される、本発明1050の方法。
[本発明1054]
Ciz1 b変異体ポリペプチド結合剤が、核酸アプタマーである、本発明1049の方法。
[本発明1055]
Ciz1 b変異体ポリペプチド結合剤が、ペプチドアプタマーである、本発明1049の方法。
[本発明1056]
Ciz1 b変異体ポリペプチド結合剤が、ペプチド模倣体である、本発明1049の方法。
[本発明1057]
Ciz1 b変異体ポリペプチド結合剤が、アミノ酸配列 SEQ ID NO:22を含むCiz1 b変異体ポリペプチドに特異的に結合する、本発明1049〜1056のいずれかの方法。
[本発明1058]
Ciz1 b変異体ポリペプチド結合剤が、SEQ ID NO:8のアミノ酸配列を含むCiz1 b変異体ポリペプチドに特異的に結合する、本発明1057の方法。
[本発明1059]
Ciz1 b変異体ポリペプチド結合剤が、エクソン14bおよび15にまたがるエピトープに特異的に結合する、本発明1057の方法。
[本発明1060]
結合剤が、少なくとも100倍上回る親和性で、SEQ ID NO:23のアミノ酸配列を含むCiz1 ポリペプチドよりも、SEQ ID NO:8のアミノ酸配列を含むCiz1 b変異体ポリペプチドに特異的に結合する、本発明1058の方法。
[本発明1061]
結合剤が、少なくとも1,000倍上回る親和性で、Ciz1 ポリペプチドよりも、Ciz1 b変異体ポリペプチドに特異的に結合する、本発明1060の方法。
[本発明1062]
結合剤が、少なくとも10,000倍上回る親和性で、Ciz1 ポリペプチドよりも、Ciz1 b変異体ポリペプチドに特異的に結合する、本発明1060の方法。
[本発明1063]
結合剤が、SEQ ID NO:23のアミノ酸配列に特異的に結合しない、本発明1049〜1062のいずれかの方法。
[本発明1064]
生物学的試料を第2のCiz1 b変異体ポリペプチド結合剤と接触させる工程をさらに含み、該第2のCiz1 b変異体ポリペプチド結合剤が、エクソン14bおよび15にまたがるエピトープ以外のエピトープを認識する、本発明1049〜1063のいずれかの方法。
[本発明1065]
第2のCiz1 b変異体ポリペプチド結合剤が、抗体またはその抗原結合フラグメントである、本発明1064の方法。
[本発明1066]
抗体が、ポリクローナルである、本発明1065の方法。
[本発明1067]
抗体が、モノクローナルである、本発明1065の方法。
[本発明1068]
抗原結合フラグメントが、Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、またはsdAbより選択される、本発明1065の方法。
[本発明1069]
第2のCiz1 b変異体ポリペプチド結合剤が、核酸アプタマーである、本発明1064の方法。
[本発明1070]
第2のCiz1 b変異体ポリペプチド結合剤が、ペプチドアプタマーである、本発明1064の方法。
[本発明1071]
第2のCiz1 b変異体ポリペプチド結合剤が、ペプチド模倣体である、本発明1064の方法。
[本発明1072]
Ciz1 b変異体ポリペプチドを固体支持体上に固定化する工程をさらに含む、本発明1001〜1071のいずれかの方法。
[本発明1073]
固体支持体が、ビーズである、本発明1072の方法。
[本発明1074]
固体支持体が、マイクロタイタープレートである、本発明1072の方法。
[本発明1075]
第2のCiz1 b変異体ポリペプチド結合剤を固体支持体上に固定化する工程をさらに含む、本発明1064〜1074のいずれかの方法。
[本発明1076]
第2のCiz1 b変異体ポリペプチド結合剤の結合によって、それに結合する場合にCiz1 b変異体ポリペプチドを固体支持体上に固定化する、本発明1075の方法。
[本発明1077]
サンドイッチアッセイである、本発明1001〜1076のいずれかの方法。
[本発明1078]
サンドイッチイムノアッセイである、本発明1077の方法。
[本発明1079]
ELISAである、本発明1001〜1078のいずれかの方法。
[本発明1080]
Ciz1 b変異体ポリペプチドに特異的に結合する、単離されたCiz1 b変異体ポリペプチド結合剤。
[本発明1081]
Ciz1 b変異体ポリペプチド結合剤が、アミノ酸配列 SEQ ID NO:22を含むCiz1 b変異体ポリペプチドに特異的に結合する、本発明1080の結合剤。
[本発明1082]
Ciz1 b変異体ポリペプチド結合剤が、SEQ ID NO:8のアミノ酸配列を含むCiz1 b変異体ポリペプチドに特異的に結合する、本発明1081の結合剤。
[本発明1083]
Ciz1 b変異体ポリペプチド結合剤が、エクソン14bおよび15にまたがるエピトープに特異的に結合する、本発明1080の結合剤。
[本発明1084]
少なくとも100倍上回る親和性で、SEQ ID NO:23のアミノ酸配列を含むCiz1 ポリペプチドよりも、SEQ ID NO:8のアミノ酸配列を含むCiz1 b変異体ポリペプチドに特異的に結合する、本発明1082の結合剤。
[本発明1085]
少なくとも1,000倍上回る親和性で、Ciz1 ポリペプチドよりも、Ciz1 b変異体ポリペプチドに特異的に結合する、本発明1084の結合剤。
[本発明1086]
少なくとも10,000倍上回る親和性で、Ciz1 ポリペプチドよりも、Ciz1 b変異体ポリペプチドに特異的に結合する、本発明1084の結合剤。
[本発明1087]
SEQ ID NO:23のアミノ酸配列に特異的に結合しない、本発明1080〜1086のいずれかの結合剤。
[本発明1088]
結合剤が、単離された抗体またはその抗原結合フラグメントである、本発明1080〜1087のいずれかのCiz1 b変異体ポリペプチド結合剤。
[本発明1089]
ポリクローナルである、本発明1088の抗体。
[本発明1090]
モノクローナルである、本発明1088の抗体。
[本発明1091]
Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、またはsdAbより選択される、本発明1088の抗原結合フラグメント。
[本発明1092]
第2のCiz1 b変異体ポリペプチド結合剤が、核酸アプタマーである、本発明1080〜1087のいずれかのCiz1 b変異体ポリペプチド結合剤。
[本発明1093]
第2のCiz1 b変異体ポリペプチド結合剤が、ペプチドアプタマーである、本発明1080〜1087のいずれかのCiz1 b変異体ポリペプチド結合剤。
[本発明1094]
第2のCiz1 b変異体ポリペプチド結合剤が、ペプチド模倣体である、本発明1080〜1087のいずれかのCiz1 b変異体ポリペプチド結合剤。
[本発明1095]
本発明1080〜1091のいずれかのCiz1 b変異体ポリペプチド結合剤を発現する、単離された細胞。
[本発明1096]
Ciz1 b変異体ポリペプチドに特異的に結合する、単離されたヒト自己抗体。
[本発明1097]
対象においてガンを診断する方法であって、以下：
i）試験に供する単離された生物学的試料を提供する工程；
ii）Ciz1 b変異体転写物が該生物学的試料中に存在するか否かを決定する工程
を含み、該Ciz1 b変異体転写物の存在が、該生物学的試料中でのガン細胞の存在を示す、方法。
[本発明1098]
Ciz 1複製ドメインとCiz 1固定化ドメインの発現を比較することによって、対象においてガンを診断する方法であって、以下：
i）試験に供する単離された生物学的試料を提供する工程；
ii）Ciz 1複製ドメインをコードするヌクレオチド配列を含むmRNAを検出する工程；
iii）Ciz 1固定化ドメインをコードするヌクレオチド配列を含むmRNAを検出する工程；
iv）該Ciz 1固定化ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む該mRNAに対する該Ciz 1複製ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む該mRNAの相対的な発現レベルを比較する工程
を含み、相対的な発現における少なくとも2倍の差が、ガン細胞の存在を示す、方法。
[本発明1099]
Ciz 1複製ドメインを含むポリペプチドと、Ciz 1固定化ドメインを含むポリペプチドの発現を比較することによって、対象においてガンを診断する方法であって、以下：
i）試験に供する単離された生物学的試料を提供する工程；
ii）該Ciz 1複製ドメインおよび該Ciz 1固定化ドメインを検出する工程；
iii）該試料中に存在する該Ciz 1固定化ドメインに対する該Ciz 1複製ドメインの相対的レベルを比較する工程
を含み、Ciz 1複製ドメインと該Ciz 1固定化ドメインの相対的レベルにおける2倍超の差が、ガンの存在を示す、方法。
[本発明1100]
Ciz 1複製ドメインとCiz 1固定化ドメインの発現を比較することによって、ガン患者の予後を示すための方法であって、以下：
i）試験に供する単離された生物学的固形組織試料を提供する工程であって、該組織が固形腫瘍に隣接している、工程；
ii）Ciz 1複製ドメインをコードするヌクレオチド配列を含むmRNAを検出する工程；
iii）Ciz 1固定化ドメインをコードするヌクレオチド配列を含むmRNAを検出する工程；
iv）該Ciz 1複製ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む該mRNAと、該Ciz 1固定化ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む該mRNAの相対的な発現レベルを比較する工程
を含み、相対的レベルにおける少なくとも2倍の差が、より不良な予後を示す、方法。
[本発明1101]
Ciz 1複製ドメインを含むポリペプチドと、Ciz 1固定化ドメインを含むポリペプチドの発現を比較することによって、ガン患者の予後を示すための方法であって、以下：
i）試験に供する単離された生物学的固形組織試料を提供する工程であって、該組織が固形腫瘍に隣接している、工程；
ii）該組織試料中の該Ciz 1複製ドメインおよび該Ciz1固定化ドメインを検出する工程；
iii）該試料中に存在する該Ciz 1複製ドメインと該Ciz1固定化ドメインの相対的レベルを比較する工程
を含み、該Ciz 1固定化ドメインに対するCiz 1複製ドメインの相対的レベルにおける2倍超の差が、より不良な予後を示す、方法。
[本発明1102]
対象におけるガンの診断または予後判定のための方法であって、以下：
（a）対象に由来する生物学的試料中のCiz1タンパク質を定量的に検出する工程；および
（b）対象の試料中で検出された該Ciz1タンパク質のレベルと、対照試料中で検出されたタンパク質のレベルを比較する工程
を含み、対照試料と比較した、対象の試料中で検出されたCiz1タンパク質のレベルの増加が、ガンを伴う対象の指標である、方法。
[本発明1103]
生物学的試料中の抗Ciz1抗体を検出するための方法であって、以下：
（a）抗Ciz1抗体を含む試料を、Ciz1タンパク質抗原を含む試料と、免疫特異的な抗原-抗体結合反応が生じうるような条件下で接触させる工程；および
（b）試料中でのCiz1タンパク質への抗Ciz1抗体の免疫特異的な結合を検出する工程を含む、方法。
[本発明1104]
試料中の抗Ciz1抗体を検出する工程が、試料中の抗Ciz1抗体に対して特異的である抗体に結合しているシグナル生成成分を使用することを含む、本発明1103の方法。
[本発明1105]
試料中の抗Ciz1抗体の存在が、イムノアッセイによって測定され、以下：
（a）固体基質上に1つまたは複数のCiz1タンパク質を固定化する工程；
（b）固体基質と試料を接触させる工程；および
（c）試料中の、Ciz1タンパク質に対して特異的な抗Ciz1抗体の存在を検出する工程を含む、本発明1103の方法。
[本発明1106]
生物学的試料中のCiz1ポリペプチドの存在を検出するための成分を含む、対象におけるガンの診断および予後判定のためのキット。
[本発明1107]
Ciz1ポリペプチドの存在を検出するための成分が、Ciz1結合剤である、本発明1106のキット。
[本発明1108]
Ciz1ポリペプチドが、Ciz1 b変異体ポリペプチドである、本発明1106のキット。
[本発明1109]
Ciz1ポリペプチドを検出するための成分が、抗Ciz1抗体である、本発明1106〜1108のいずれかのキット。
[本発明1110]
抗Ciz1抗体が標識された、本発明1109のキット。
[本発明1111]
標識が、放射性、蛍光、比色、または酵素標識である、本発明1110のキット。
[本発明1112]
抗Ciz1抗体に免疫特異的に結合する標識二次抗体をさらに含む、本発明1109のキット。
[本発明1113]
生物学的試料中の抗Ciz1抗体の存在を検出するための成分を含む、生物学的試料中の該抗Ciz1自己抗体の存在を検出するためのキット。
[本発明1114]
成分が、Ciz1抗原である、本発明1113のキット。
[本発明1115]
Ciz1抗原が標識された、本発明1114のキット。
[本発明1116]
Ciz1抗原が固相に連結された、本発明1113または1114のキット。
[本発明1117]
Ciz1 b変異体mRNAを標的とする、単離されたアンチセンスオリゴヌクレオチド、siRNA、またはshRNA。
[本発明1118]
本発明1117のアンチセンスオリゴヌクレオチド、siRNAまたはshRNA、および薬学的に許容される賦形剤を含む、薬学的組成物。
[本発明1119]
アンチセンスオリゴヌクレオチド、siRNA、またはshRNAが、エクソン14b及び15の接合部にまたがるCiz1のヌクレオチド配列を介してCiz1 b変異体mRNAを標的とする、本発明1118の薬学的組成物。
[本発明1120]
細胞においてCiz1 b変異体mRNAの発現を低下させる方法であって、b変異体mRNAを発現する細胞を、b変異体mRNAを低下させる量の本発明1117のアンチセンスオリゴヌクレオチド、siRNA、またはshRNAと接触させる工程を含む、方法。
[本発明1121]
哺乳動物においてb変異体mRNAの発現を低下させる方法であって、哺乳動物に、b変異体mRNAを低下させる量の本発明1117のアンチセンスオリゴヌクレオチド、siRNA、またはshRNAを含む組成物を投与する工程を含む、方法。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５０】
【図１】エクソン構造を示す、Ciz1遺伝子の概略図を例示する。DNA複製3および核マトリクスへの付着1に関与する機能的ドメインをコードする領域を、上に黒色線で示す。点線は、ドメインの境界に関する不確実性を示す。ギャップは、インビトロでの完全な活性を伴う変異体からスプライシングされる配列を示す。PCRプライマーおよびプローブの位置を、公知の機能ドメインとの関係において示す。ピンクバー：エクソン5中のプローブT5、緑色バー：エクソン6と7の間の接合部でのプローブT7、黄色バー：エクソン14中のプローブT4、青色バー：エクソン16中のプローブT3。B）肺ガンおよび正常な隣接組織に由来する46のcDNA（Origene cDNAアレイHLRT504）にわたるA）に示すプローブを使用した、Ciz1発現の定量化（アクチンに対する標準化後のdCT値）。Ciz1複製ドメイン（RD）内の配列を増幅する両方の試薬セットは、アレイにわたって同様のプロファイルを生成する。逆に、核マトリクスアンカードメイン（AD）中の配列を増幅する試薬セットは、互いに非常に類似するプロファイルを生成するが、これは、RDと明確に異なっている。C）ステージIA、IB、IIA、IIB、IIIA、またはIIIB腫瘍を有する23人の患者由来の隣接する対照組織中での、およびD）腫瘍自体中でのCiz1発現の定量化（アクチンに対する標準化後のdCT値）。グラフは、線形回帰トレンド線を含む。E）マッチド対照と比較して、複製ドメインとアンカードメインの発現間の均衡が腫瘍において変化する範囲での単一の数値指標を開発するために、2つの複製ドメインプローブまたは2つのアンカードメインプローブに関するRQ（試料セット1/2中の対照組織に対して較正する）を平均化した。腫瘍試料に関する平均RQを、そのマッチド対照の平均RQによって割り、各々のドメインについての周囲組織と比べた、変化の個々の測定値を与えた。複製ドメインにおける変化をアンカードメインにおける変化で割ることによって値を組み合わせることで、例えば、アンカードメインの発現増加によって均衡されている複製ドメインの発現増加が、1に近い値をもたらしうるようになる。逆に、アンカードメインの発現減少によって悪化している複製ドメインの発現増加は、1よりも有意に大きい値をもたらすであろう。結果をログスケールで表現する。2倍未満である変化（灰色領域によって示される）は、有意ではないと考えられる。この分析は、Ciz1の均衡した過小発現または過剰発現ではなく、発現における周囲組織と比べた変化のみを明らかにする。RDとADの不均衡の程度は、腫瘍ステージとともに増加する。
【図２】様々な固形腫瘍におけるDNA複製ドメインおよび核マトリクスアンカードメインの非共役発現を示す。ヒストグラムは、cDNAアレイCSRT1において示される試料セットにおけるCiz1エクソン7（RD、白色バー）およびCiz1エクソン16（AD、黒色バー）の相対的な定量値（RQ）を示す。各々の組織型について、進行するステージ（左から右）の9つの独立した腫瘍の分析について、ガン患者由来の、見掛け上は正常な組織に由来する3つの非マッチド対照試料（対照として同定される）と並べて示す。2つのプローブについての結果は、RDについて、灰色に陰をつけた対照（C）の平均に対して標準化され、RQ＝2-（Ct試験したエクソン−Ct ex 7の平均対照）であった。肺腫瘍ステージI〜IIIについての結果は、図1において分析した試料セットと同等であり、灰色に陰をつけた。全ての腫瘍型について、ステージIV腫瘍の例も含まれる。これらの大半について、RDの発現は、RDと等しいかまたはそれを超える（*を用いて示す）。B）右側のパネルは、左から右へのステージ進行に伴う、ADおよびRD（比率＝エクソン16のCt/エクソン7のCt）の発現の比率を示す。最初のデータ点は平均化対照を、最後のデータ点はステージIV試料を表す。二次回帰トレンド線を、Excelを使用して生成した。肝臓を除く全ての腫瘍型について、対照と比較すると早期ステージ腫瘍ではRDと比べてADで比例してトレンドが増加し、かつ、より後期ステージではこのトレンドは逆転するため、大半のステージIV腫瘍について、RDはしばしばADを超える。
【図３】A）図2のように分析し、対照試料と比較した、40の悪性黒色腫におけるADの発現変化を示す。2セットの検出ツールについての結果を、最初の対照試料についての1に対して標準化する。右側のパネルは、アンカードメイン発現が複製ドメインのものを超えている試料の％を示す、ステージII、III、およびIV腫瘍についての結果の概要である。
【図４】A）Ciz1複製ドメイン（黒色線）および核マトリクスアンカードメイン（黄色円）の非共役発現が、Ciz1の固定化およびそのDNA複製活性の核内局在に影響を及ぼしうる方法。灰色のバレルは、複製起点で組み立てられたDNA複製タンパク質を表す。灰色の楕円は、Ciz1についての核マトリクスとのドッキング部位を表す。モデルは、核マトリクスとのドッキング部位が限定的であると仮定する。右側のパネルは、核マトリクスと会合する能力が損なわれたCiz1の変異体を示す。B）ヒト腫瘍において見られるCiz1誤発現の2つの型の概要：i）最も一般的に固形腫瘍において見られ、図1〜3に記載される非共役発現。ii）小細胞肺ガン、甲状腺ガン、およびリンパ腫において高い割合で見られるb変異体。
【図５−１】Ciz1複製ドメイン（RD）およびアンカードメイン（AD）抗体の生成および検証、ならびにRDおよびADタンパク質発現の分析。A）ポリクローナル抗体（上方のパネル）およびモノクローナル抗体（下方のパネル）のための免疫原として使用される領域を示す、Ciz1エクソンの模式図（陰をつけた四角形）。B）固定前の処理を行わず（「非抽出」）、0.1％トリトンX100の存在における可溶性タンパク質の抽出後（「界面活性剤耐性」）、およびDNAse 1を用いたインキュベーション後（「DNase耐性」）の、正常な胎児肺細胞（WI38）と2つの代表的な腫瘍細胞株とにおいてCiz1-RD抗体（赤色）を用いて検出された内在性Ciz1の代表的な免疫蛍光画像を示す。標準化された露出時間を伴う同一条件下で画像を収集したが、細胞株内および細胞株間で、Ciz1の強度およびDNAの強度は、異なる条件下で細胞中に残っているCiz1およびDNAのレベルを反映する。全DNAを、Hoechst 33258（青色）を用いて染色する。バーは10ミクロンである。同様の結果が、異なる由来の4つの他のガン細胞株について得られた。C）検出が、Ciz1-AD抗体（緑色）を用いていること以外はBと同じ。結果として、i）タンパク質レベルでのCiz1-RDおよびCiz1-ADの非共役および不均衡発現、ii）ガン細胞中で固定化されていないCiz1-RDタンパク質の増加、iii）Ciz1-ADタンパク質の大部分の固定化、が例示される。
【図５−２】Ciz1複製ドメイン（RD）およびアンカードメイン（AD）抗体の生成および検証、ならびにRDおよびADタンパク質発現の分析。D）内在性Ciz1の固定化に対する組換えADタンパク質の効果。マウスADタンパク質をコードする組換えGFP-C275（緑色）を発現しない（左側のパネル）または発現する（右側のパネル）、NIH3T3細胞中での内在性Ciz1-RD（赤色）のDNAse耐性画分の高倍率画像。全DNAを、Hoechst 33258（青色）を用いて染色する。GFP-C275を用いてトランスフェクトした細胞中での焦点染色低下に注目すること。E）画像は、界面活性剤を用いた抽出後の、GFP-Ciz1の焦点パターン、GFP-C275の非焦点パターンを伴うNIH3T3核、および両方のベクターを用いてコトランスフェクトした細胞を示す。緑色はGFPである。青色は、Hoechst 33258を用いて染色された核を示す。GFP-C275は、GFP-Ciz1核内フォーカスの形成に干渉する。
【図６】A）b型転写物接合部にまたがるプライマーを使用して生成された産物（赤色矢印）および接合部にまたがるtaqmanプローブの位置（赤色線）を示す模式図。B）SCLC細胞株由来のb変異体エクソンを伴うクローン産物および正常な細胞株由来の完全長産物において観察された移動度の変動。C）接合部にまたがるプライマーを、正常な転写物（クローン19）またはb型転写物（クローン20）を発現するレポータープラスミドを使用して検証した。ゲルは、選択的プライマー対P3/4、または非選択的Ciz1プライマー対P1/2を用いた場合のプラスミド由来PCR産物を示す。D）2つの神経内分泌肺ガン細胞株（L95、SBC5）および1つの正常な胎児肺細胞株（HFL1）より調製されたcDNAから、プライマーセットP11/P12（アクチン、下方のパネル）、プライマーセットP1/P2（Ciz1、上方のパネル）、またはb型転写物の接合部にまたがるプライマーP4/P3（中央のパネル）を使用して生成したPCR産物。産物の配列を検証した。noTは鋳型を用いない対照レーンである。E）可変領域のいずれかの側からのプライマー（P1/P2またはP6/P7）を、b型転写物中の固有の接合物にまたがる（T2）かまたは選択的にスプライシングされない領域を認識する（T4およびT3）taqmanプローブと共役させた。100、75、50、25、または0％のいずれかでクローン20を含む、プラスミドクローン19と20との混合物に対する適用により、b型の転写産物を選択的に検出できることを実証している。グラフは、閾値に達するために要求されるサイクル数が、非選択的検出ツールの場合一定であるが、変異体選択ツールの場合、プラスミド混合組成物によって影響を受けることを示す。
【図７】A）3つの「正常な」胎児肺細胞株および3つの神経内分泌肺腫瘍細胞株、加えて、1つの神経内分泌カルチノイドからの鋳型を使用した、図1〜3にあるような、b変異体の、RD（左側のパネル）またはAD（中央のパネル）についてのQPCR。結果を、アクチンに対して標準化し、IMR90 RDに対して較正する。D）ヒト肺ガン組織。同じ検出ツールを、3人のSCLC患者および同じ個人由来の3つの正常な隣接組織由来のcDNAに適用した。b型転写物の発現は、これらの神経内分泌腫瘍において劇的に増加する。
【図８】A）グレードI〜グレードIIIにある23人の肺ガン患者由来の、マッチド試料セット（図1と同じセット）におけるb型転写物（黒色バー）の発現（Origene cDNAアレイHLRT504）。発現はアクチンに対して標準化され、各組において、任意の値1が与えられる「正常」試料（白色バー）と比べて表現される。B）示したステージからの非小細胞肺腫瘍および非マッチド対照の別々のセットでの同様の分析（OrigeneアレイCSRT303）。ヒストグラムは、アクチンに対する標準化後のb変異体RQを示す。C）肝臓腫瘍およびD）CSRT303にも由来する腎臓腫瘍についての同等の結果。結果を、対照組織試料の平均に対して較正し、灰色のブロックによって示す。図8に示す全ての試料セットについて、b変異体が少数のランダムケースにおいて増加している。
【図９】リンパ腫、甲状腺ガン、膀胱ガン、肝臓ガン、および腎臓ガンについての分析（図8の通り）を例示する。
【図１０】エクソン14b変異体タンパク質検出ツールの生成および検証。A）16アミノ酸ペプチド内で固有のEEIEVRSR (SEQ ID NO: 85) 接合部を生成するための介在配列（灰色）を欠く免疫原性ペプチド（下方の列）(SEQ ID NO: 8)、および、接合部隣接エピトープと反応する抗体種を除去するために使用される完全長ペプチド（上方の列）(SEQ ID NO: 23)。ポリクローナル血清およびハイブリドーマを、固定化された完全長ペプチドに対してネガティブスクリーニングし、あるいは14b接合部含有ペプチドを使用して親和性精製し、親和性精製ポリクローナル抗体を生成した（抗体2B）。B）GFP-hCiz1またはGFP-hCiz1 b変異体を発現するNIH3T3細胞を使用した、抗b変異体抗体を用いた免疫蛍光（緑色）。組換え14bタンパク質を赤色で検出し、DNAを青色で染色する。C）エクソン14b接合部を持つ過剰発現GFP-Ciz1タンパク質の選択的検出を示すウエスタンブロット。抗b変異体血清、免疫前の血清、および抗Ciz1ポリクローナル抗体を用いた結果を示す。D）SCLC細胞および代表的な正常細胞中での、親和性精製した抗b変異体ポリクローナル抗体を用いた内在性14bタンパク質の免疫検出を示す。SCLC細胞は抗b変異体血清と反応するが、正常細胞は反応しない。E）同じ細胞中でのCiz1の検出を比較のために示す。F）サイズは同様であるが、DNA複製フォーカスよりも数がより少ない、核における離散フォーカスを明らかにする、SCLC細胞の高倍率（600×）画像D。
【図１１】b型転写物選択的RNA干渉ツールの開発。A）最上部のパネルは、固有のエクソン接合部にまたがるsiRNA配列のパネルを示す模式図。下方のパネルは、SCLC細胞中への一過性トランスフェクションの24時間後の、Ciz1 AD転写物レベルおよびb型転写物レベルに対するそれらの効果を示す。結果を、アクチンに対して標準化し、対照siRNA（Dcon）を用いてトランスフェクトした細胞由来の試料に対して較正する。B）結果は、ADとb型転写物の比率として表現され、ここで、対照siRNAは比率1を有する。最も有効で選択的なsiRNA配列を、さらなる試験のために選んだ（星印）。C）組換えCiz1タンパク質の発現に対する変異体選択的な効果。クローン19および20を、b型転写物に選択的なsiRNAまたは対照siRNAを用いてマウス3T3細胞中にコトランスフェクトした。b型転写物siRNAは、発現クローン20由来のタンパク質の発現を抑制するが、発現クローン19由来の内在性マウスCiz1またはヒトCiz1は抑制しない。
【図１２】培養中のSCLC細胞増殖に対するb変異体選択的shRNAの誘導性発現の効果。A）選んだb型選択的配列およびdox調節shRNAベクター（Clonetech）由来の対照配列（ルシフェラーゼに対する）の安定的な発現。結果は、4日間にわたる細胞数における増加を示す。試験試料にDoxを、0および3日目に加えた（黒色矢印）。対照細胞（ルシフェラーゼshRNAを発現するSCLC）は、誘導によっては大部分が影響を受けず、一方試験細胞（b型選択的配列を発現するSCLC）は、通常の速度で増殖することが妨げられる。B）ドキシサイクリンを0日目に加え、細胞数を4日目に3組で定量化した、独立した実験。エラーバーはSEMを示す。C）ゲル画像は、RT-PCR産物およびb型転写物対全Ciz1発現についての選ばれた配列の選択性を示す。誘導後26時間までに、b型転写物レベルが回復しており、試料を単離する1時間前に第2用量を与えたものでは、b型転写物の選択的抑制が明らかである。D）ドキシサイクリンを用いたshRNA発現の誘導から48時間後の、b変異体ポリクローナル抗体を用いて検出された、SBC5細胞中でのb変異体タンパク質の抑制。E）誘導を行わず、低tet血清中での培養1ヶ月後の、誘導性b変異体shRNAベクター細胞を持つSBC5。慢性的な漏出発現は、細胞に対して、可視的かつ進行性の効果を有する。
【図１３】インビボ試験（Southern Research Institute, USA）  A）15匹のNOD/SCIDマウスの2つのコホートに、0日目に、dox調節型のb型変異体選択的shRNAベクターを持つ1.5×107個の細胞を注射した。21日目に、100mg未満の腫瘍を有するマウスを間引き、等しい平均腫瘍重量および低い固有変動を有する群を作製した。Doxを、21日目に、群2（黒色丸）に飲料水で投与し、その後、腫瘍サイズを週に2回測定した。グラフは、平均腫瘍重量をSEMと共に示す。B）SCLC細胞を用いた注射の前に、追加で10匹のマウスを3日目からDoxで維持した。doxを与えられていない15匹のマウスの平均腫瘍重量と比較した、それらの平均腫瘍重量の結果をSEMと共に示す。C）群1の、腫瘍を伴う2匹のマウス（図13A中の白丸）、および群3の、腫瘍を伴わない2匹のマウス（図13A中の黒四角形）の、全血由来cDNA中でのb型転写物の相対的レベルを示す定量的RT-PCR。ヒストグラムは、マウスアクチンに対する標準化後の二度の分析（各々が三つ組み試料の平均である）およびサンプルSRI-3-8に対する較正を示す。4匹のマウスが有する皮下腫瘍の推定サイズも示す。
【図１４】A）エクソンを示すCiz1遺伝子（番号付き）およびsiRNAの位置（灰色の三角形）の概略図。B）Dharmaconスマートプール抗ヒトCiz1 siRNAを、個別に（A、B、C、D）または混合物として用いた、および、Dharmaconスマートプール対照siRNA用いた、ヒトSCLC細胞株SBC5の一過性トランスフェクション後のヒトCiz1転写物の抑制。ヒストグラムは、プライマーP1/P2およびプローブT4を用いて検出された、示された時間でのCiz1アンカードメイン転写物の相対的定量化（RQ）を示す。任意の値1が与えられる、アクチンに対して標準化され対照siRNAをトランスフェクトされた細胞の結果に対して、結果が較正される。C）トランスフェクションの24時間後に収集した、SBC5細胞由来の界面活性剤可溶性の上清（SN）および界面活性剤耐性ペレット（P）のタンパク質画分のウエスタンブロットにおける、Ciz1タンパク質に対するsiRNA Bおよび対照siRNAの効果。Ciz1タンパク質を、抗マウスCiz1 RDポリクローナル抗体1793を用いて検出した。複数のCiz1アイソフォームが、以前に報告された通り、NIH3T3細胞およびU20S細胞について検出される。D）単一の一過性トランスフェクションに続く5日間にわたる、抗ヒトCiz1 siRNA B（灰色の四角形）、およびCiz1 siRNA 1（灰色の丸）、Ciz1 siRNA 3（灰色の三角形）、および対照siRNA（白丸）の、SBC5細胞の増殖に対する効果。結果を、3つの独立した集団に由来する、1日あたりの細胞数における増加倍率としてSDと共に表現する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５１】
出願人は、固形腫瘍試料に加えて、Ciz1 b変異体ポリペプチドをガン患者の血漿中で検出することができることを発見した。この知見は注目すべきであり、予想外である。その理由は、Ciz1は核タンパク質であり、分泌されることは公知ではないからである。さらに、プロテアーゼが血液中に存在し、多くのタンパク質を分解する。さらにより予想外なことでは、出願人は、腫瘍負荷が低い場合での、早期ガン患者（ステージIのNSCLCおよび限定されたステージのSCLC）の血漿中で、Ciz1 b変異体ポリペプチドを発見している。Ciz1 b変異体バイオマーカーは、高程度の感度および特異度を両立してガンを検出する。
【図１５】肺ガン患者の血漿中のb変異体Ciz1タンパク質。A）エクソンを示すCiz1遺伝子（番号付き）、直下のエクソン14の一部を欠くCiz1 b変異体の提示を伴う、DNA複製ドメインおよび核マトリクスアンカードメイン(SEQ ID NO: 89)。B）抗体2Bを用いて検出された、SCLCおよびNSCLCを伴う患者由来の血漿、加えて、疾患と診断されなかった個人由来の5つの試料の1μl中でのb変異体タンパク質を示すウエスタンブロット。内在性免疫グロブリンを使用し、添加について標準化する（対照）。C）示した疾患の型およびステージを伴う肺ガン患者由来の合計119の前処理試料、加えて、疾患を伴わない個人、または、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、喘息、または貧血を伴う患者由来の51試料についての結果を示す、ウエスタンブロットのデンシトメトリーによって決定された平均b変異体タンパク質レベル（SEMを伴う）。ガンではない試料の平均値（＋1 SD）にて設定された閾値を使用し、試験によって、限定されたステージのSCLC患者およびステージIのNSCLC患者の93％を正確に分類した。D）連続分散データ（AUCは0.958である）のROC分析用のWebベース電卓を使用し、全ての170の試料について生成された95％信頼区間を伴う受信者動作特性曲線。http://www.jrocfit.orgで入手可能なWebベースの電卓（連続分布データ用のフォーマット5）を、計算のために使用した。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８４】
一態様において、本発明のsiRNAまたはshRNAのアンチセンス鎖は、以下より選択されるヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を含む：
5' AAGAAGAGAUCGAGGUGAGGU 3' (SEQ ID NO: 24);
5' AAGAGAUCGAGGUGAGGUCCA 3' (SEQ ID NO: 25);
5' AGAAGAGAUCGAGGUGAGGUC 3' (SEQ ID NO: 26);
5' GAAGAGAUCGAGGUGAGGUCC 3' (SEQ ID NO: 27); または
5' AGAGAUCGAGGUGAGGUCCAG 3' (SEQ ID NO: 28)。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４６】
一態様において、PTDは、3回反復するHIV-1 tatタンパク質（RKKRRQRRR） (SEQ ID NO: 29)の一部分である。一態様において、DRBDは、プロテインキナーゼRNA活性化、つまりPKRタンパク質（真核生物翻訳開始因子2-アルファキナーゼ2（EIF2AK2）およびPRKRとしても公知である）の65アミノ酸 
(FFMEELNTYRQKQGVVLKYQELPNSGPPHDRRFTFQVIIDG
REFPEGEGRSKKEAKNAAAKLAVEILNKE ) (SEQ ID NO: 30) 
部分を含む。他の態様において、PTDは、ヘルペスウイルスVP22タンパク質；ヒト免疫不全ウイルス（HIV）TATタンパク質を含むポリペプチド；アンテナペディアタンパク質のホメオドメイン（Antp HD）を含むポリペプチド、およびそれらの機能的フラグメントである。他の態様において、DRBDは、ヒストン、RDE-4タンパク質、プロタミンからなる群より選択される配列を含み、dsRNA結合タンパク質（カッコ中はアクセッション番号）は、PKR（AAA36409、AAA61926、Q03963）、TRBP（P97473、AAA36765）、PACT（AAC25672、AAA49947、NP609646）、Staufen（AAD17531、AAF98119、AAD17529、P25159）、NFAR1（AF167569）、NFAR2（AF167570、AAF31446、AAC71052、AAA19960、AAA19961、AAG22859）、SPNR（AAK20832、AAF59924、A57284）、RHA（CAA71668、AAC05725、AAF57297）、NREBP（AAK07692、AAF23120、AAF54409、T33856）、kanadaptin（AAK29177、AAB88191、AAF55582、NP499172、NP198700、BAB19354）、HYLL（NP563850）、hyponastic leaves（CAC05659、BAB00641）、ADAR1（AAB97118、P55266、AAK16102、AAB51687、AF051275）、ADAR2 P78563、P51400、AAK17102、AAF63702）、ADAR3（AAF78094、AAB41862、AAF76894）、TENR（XP059592、CAA59168）、RNaselll（AAF80558、AAF59169、Z81070Q02555/S55784、P05797）、およびDicer（BAA78691、AF408-401、AAF56056、S44849、AAF03534、Q9884）、RDE-4（AY071926）、FLJ20399（NP060273、BAB26260）、CG1434（AAF48360、EAA12065、CAA21662）、CG13139（XP059208、XP143416、XP110450、AAF52926、EEA14824）、DGCRK6（BAB83032、XP110167）、CG1800（AAF57175、EAA08039）、FLJ20036（AAH22270、XP134159）、MRP-L45（BAB14234、XP129893）、CG2109（AAF52025）、CG12493（NP647927）、CG10630（AAF50777）、CG17686（AAD50502）、T22A3.5（CAB03384）およびアクセッション番号EAA14308のものを含む。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７０】
一態様において、方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を使用し、Ciz1 b変異体転写物の存在を検出する。別の態様において、ヌクレオチドプライマーをPCRにおいて使用し、エクソン14bとエクソン15の間の接合部にまたがる核酸の部分を増幅する。別の態様において、PCRを使用して増幅された核酸産物は、ヌクレオチド配列
5' TGGACCTCACCTCGATCTCT 3' (SEQ ID NO: 31)
を含む。別の態様において、PCRを使用して増幅された核酸は、ヌクレオチド配列GATATATCTCTGGACCTCACCTCGATCTCTTCTTCATCCT 3' (SEQ ID NO: 32)
を含む。別の態様において、増幅された核酸産物は、通常の対応する対照を伴う。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７２】
一態様において、前記の増幅産物を、核酸配列
5'GAAGAAGAGATCGAGGTGAGGTCCAGAGA3' (SEQ ID NO: 33)
を切断しない制限エンドヌクレアーゼで消化する。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７４】
別の態様において、前記オリゴヌクレオチドプライマー対を適応し、核酸配列
GAAGAAGAGATCGAGGTGAGGTCCAGAGA (SEQ ID NO: 33)
を含む核酸分子を特異的に増幅する。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７５】
別の態様において、前記プライマー対中の前記オリゴヌクレオチドプライマーの1つは、核酸配列
5' GAAGAGATCGAGGTGAGGTC 3' (SEQ ID NO: 34)
を含むか、またはそれからなる。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７６】
別の態様において、前記オリゴヌクレオチドプライマー対は、核酸配列
5' GAAGAGATCGAGGTGAGGTC 3' (SEQ ID NO: 34); および
5' GAAGAAGAGATCGAGGTGAGGTCCAGAGA.3' (SEQ ID NO: 33)
を含むか、またはそれからなる。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７７】
別の態様において、配列
GAAGAAGAGATCGAGGTGAGGTCCAGAGA (SEQ ID NO: 33) 
を含む増幅産物は、ヌクレオチド配列
5' TGGACCTCACCTCGATCTCTTCTTCA 3' (SEQ ID NO: 35)
を含むか、またはそれからなるオリゴヌクレオチドプローブを用いて検出する。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９９】
一態様において、前記のb変異体ポリペプチドは、タンパク質分解的に切断されたCiz1 b変異体ポリペプチドフラグメントである。さらなる態様において、ポリペプチドフラグメントは、エクソン14bおよび15によってコードされるポリペプチド配列を含む。さらなる態様において、ポリペプチドフラグメントは、アミノ酸配列DEEEIEVRSRDIS(SEQ ID NO: 49)を含む。別の態様において、フラグメントは、分解の程度に依存して、8％ SDS-PAGE上で、約50〜60kDaの間の見掛けの分子量を伴って移動する。さらなる態様において、フラグメントは、8％ SDS-PAGE上で、約50kDaの見掛けの分子量を伴って移動する。一態様において、抗体は、エクソン14bおよびエクソン15の両方によってコードされるアミノ酸残基を含む連続エピトープに特異的に結合する。別の態様において、抗体は、Ciz1 b変異体ポリペプチドに特異的に結合するが、エクソン14aを含むmRNAから翻訳されたCiz1ポリペプチドには特異的に結合しない。別の態様において、抗体は、少なくとも10倍上回る親和性で、Ciz1 b変異体ポリペプチドよりもエクソン14aを含むmRNAから翻訳されたCiz1ポリペプチドに特異的に結合する。一態様において、抗体は、少なくとも100倍上回る親和性で、エクソン14aを含むmRNAから翻訳されたCiz1ポリペプチドと比較して、Ciz1 b変異体ポリペプチドに結合する。一態様において、前記の抗体は、少なくとも1,000倍上回る親和性で、エクソン14aを含むmRNAから翻訳されたCiz1ポリペプチドと比較して、Ciz1 b変異体ポリペプチドに結合する。一態様において、抗体は、少なくとも10,000倍上回る親和性で、エクソン14aを含むmRNAから翻訳されたCiz1ポリペプチドと比較して、Ciz1 b変異体ポリペプチドに結合する。一態様において、抗体は、少なくとも100,000倍上回る親和性で、エクソン14aを含むmRNAから翻訳されたCiz1ポリペプチドと比較して、Ciz1 b変異体ポリペプチドに結合する。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２００
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２００】
一態様において、抗体は、アミノ酸配列
DEEEIEVRSRDIS (SEQ ID NO: 49)
に特異的に結合する。一態様において、抗体は、アミノ酸配列
DEEEIEVRSRDIS (SEQ ID NO: 49)
に特異的に結合するが、アミノ酸配列
DEEEIE (SEQ ID NO: 36), VRSRDIS (SEQ ID NO: 37) またはDEEEIEVEEELCKQVRSRDIS (SEQ ID NO: 38)
のいずれにも特異的に結合しない。一態様において、抗体は、アミノ酸配列
EGDEEEEEDDEDEEEIEVRSRDISREEWKGSETY (SEQ ID NO: 39)
に特異的に結合するが、アミノ酸配列
EGDEEEEEDDEDEEEIEVEEELCKQVRSRDISREEWKGSETY (SEQ ID NO: 40)
には特異的に結合しない。別の態様において、抗体は、アミノ酸配列
DEEEEEDDEDEEEIEVRSRDISREEWKGSE (SEQ ID NO: 41)
に特異的に結合するが、アミノ酸配列
DEEEEEDDEDEEEIEVEEELCKQVRSRDISREEWKGSE (SEQ ID NO: 42)
には特異的に結合しない。別の態様において、抗体は、アミノ酸配列
DEEEEEDDEDEEEIEVRSRDISREEWKGSE (SEQ ID NO: 41)
に特異的に結合するが、アミノ酸配列
DEEEEEDDEDEEEIEVEEELCKQVRSRDISREEWKGSE (SEQ ID NO: 42)
には特異的に結合しない。別の態様において、抗体は、アミノ酸配列
EEEEDDEDEEEIEVRSRDISREEWKG (SEQ ID NO: 43)
に特異的に結合するが、アミノ酸配列
EEEEDDEDEEEIEVEEELCKQVRSRDISREEWKG (SEQ ID NO: 44)
には特異的に結合しない。別の態様において、抗体は、アミノ酸配列
EEDDEDEEEIEVRSRDISREEW (SEQ ID NO: 45)
に特異的に結合するが、アミノ酸配列
EEDDEDEEEIEVEEELCKQVRSRDISREEW (SEQ ID NO: 46)
には特異的に結合しない。別の態様において、抗体は、アミノ酸配列
DDEDEEEIEVRSRDISRE (SEQ ID NO: 47)
に特異的に結合するが、アミノ酸配列
DDEDEEEIEVEEELCKQVRSRDISRE (SEQ ID NO: 48)
には特異的に結合しない。別の態様において、抗体は、アミノ酸配列
DEDEEEIEVRSRDISR (SEQ ID NO: 8)
に特異的に結合するが、アミノ酸配列
DEDEEEIEVEEELCKQVRSRDISR (SEQ ID NO: 23)
には特異的に結合しない。別の態様において、抗体は、アミノ酸配列
EDEEEIEVRSRDIS (SEQ ID NO: 50)
に特異的に結合するが、アミノ酸配列
EDEEEIEVEEELCKQVRSRDIS (SEQ ID NO: 51)
には特異的に結合しない。別の態様において、抗体は、アミノ酸配列
DEEEIEVRSRDI (SEQ ID NO: 52)
に特異的に結合するが、アミノ酸配列
DEEEIEVEEELCKQVRSRDI (SEQ ID NO: 53)
には特異的に結合しない。別の態様において、抗体は、アミノ酸配列
EIEVRSR (SEQ ID NO: 54)
に特異的に結合するが、アミノ酸配列
EIEVEEELCKQVRSR (SEQ ID NO: 55)
には特異的に結合しない。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０１】
別の局面において、本発明は、Ciz1 b変異体ポリペプチドに特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。一態様において、抗体はモノクローナル抗体である。別の態様において、前記の抗体はポリクローナル抗体である。別の態様において、抗体は、Ciz1 b変異体ポリペプチドに特異的に結合するが、エクソン14aを含むmRNAから翻訳されたCiz1ポリペプチドには特異的に結合しない。別の態様において、抗体は、少なくとも10倍上回る親和性で、エクソン14aを含むmRNAから翻訳されたCiz1ポリペプチドよりもCiz1 b変異体ポリペプチドに特異的に結合する。一態様において、抗体は、少なくとも100倍上回る親和性で、エクソン14aを含むmRNAから翻訳されたCiz1ポリペプチドと比較して、Ciz1 b変異体ポリペプチドに結合する。一態様において、抗体は、少なくとも1000倍上回る親和性で、エクソン14aを含むmRNAから翻訳されたCiz1ポリペプチドと比較して、Ciz1 b変異体ポリペプチドに結合する。一態様において、抗体は、エクソン14bおよびエクソン15によってコードされるアミノ酸残基を含む連続エピトープに特異的に結合する。一態様において、抗体は、アミノ酸配列
EGDEEEEEDDEDEEEIEVRSRDISREEWKGSETY (SEQ ID NO: 39)
に特異的に結合するが、アミノ酸配列
EGDEEEEEDDEDEEEIEVEEELCKQVRSRDISREEWKGSETY (SEQ ID NO: 40)
には特異的に結合しない。別の態様において、抗体は、アミノ酸配列
DEEEEEDDEDEEEIEVRSRDISREEWKGSE (SEQ ID NO: 41)
に特異的に結合するが、アミノ酸配列
DEEEEEDDEDEEEIEVEEELCKQVRSRDISREEWKGSE (SEQ ID NO: 42)
には特異的に結合しない。別の態様において、抗体は、アミノ酸配列
DEEEEEDDEDEEEIEVRSRDISREEWKGSE (SEQ ID NO: 41)
に特異的に結合するが、アミノ酸配列
DEEEEEDDEDEEEIEVEEELCKQVRSRDISREEWKGSE (SEQ ID NO: 42)
には特異的に結合しない。別の態様において、抗体は、アミノ酸配列
EEEEDDEDEEEIEVRSRDISREEWKG (SEQ ID NO: 43)
に特異的に結合するが、アミノ酸配列
EEEEDDEDEEEIEVEEELCKQVRSRDISREEWKG (SEQ ID NO: 44)
には特異的に結合しない。別の態様において、抗体は、アミノ酸配列
EEDDEDEEEIEVRSRDISREEW (SEQ ID NO: 45)
に特異的に結合するが、アミノ酸配列
EEDDEDEEEIEVEEELCKQVRSRDISREEW (SEQ ID NO: 46)
には特異的に結合しない。別の態様において、抗体は、アミノ酸配列
DDEDEEEIEVRSRDISRE (SEQ ID NO: 47)
に特異的に結合するが、アミノ酸配列
DDEDEEEIEVEEELCKQVRSRDISRE (SEQ ID NO: 48)
には特異的に結合しない。別の態様において、抗体は、アミノ酸配列
DEDEEEIEVRSRDISR (SEQ ID NO: 8)
に特異的に結合するが、アミノ酸配列
DEDEEEIEVEEELCKQVRSRDISR (SEQ ID NO: 23)
には特異的に結合しない。別の態様において、抗体は、アミノ酸配列
EDEEEIEVRSRDIS (SEQ ID NO: 50)
に特異的に結合するが、アミノ酸配列
EDEEEIEVEEELCKQVRSRDIS (SEQ ID NO: 51)
には特異的に結合しない。別の態様において、抗体は、アミノ酸配列
DEEEIEVRSRDI (SEQ ID NO: 52)
に特異的に結合するが、アミノ酸配列
DEEEIEVEEELCKQVRSRDI (SEQ ID NO: 53)
には特異的に結合しない。別の態様において、抗体は、アミノ酸配列
EIEVRSR (SEQ ID NO: 54)
に特異的に結合するが、アミノ酸配列
EIEVEEELCKQVRSR (SEQ ID NO: 55)
には特異的に結合しない。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１９】
本発明のさらなる局面によれば、核酸配列
5' GAAGAAGAGAUCGAGGUGAGGUCCAGAGA 3' (SEQ ID NO: 56)
を含むmRNA分子を検出するためのオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブを含むキットを提供する。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２２０】
本発明の一態様において、前記キットは、核酸配列
5' GAAGAGATCGAGGTGAGGTC 3' (SEQ ID NO: 34) および
5' TGGACCTCACCTCGATCTCTTCTTCA 3' (SEQ ID NO: 35)
を含むか、またはそれからなるオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブを含む。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２２８】
一態様において、Ciz 1複製ドメインを増幅する前記オリゴヌクレオチドプライマー対は、
CACAACTGGCCACTCCAAAT (SEQ ID NO: 57) とCCTCTACCACCCCCAATCG (SEQ ID NO: 58); および
ACACACCAGAAGACCAAGATTTACC (SEQ ID NO: 59) とTGCTGGAGTGCGTTTTTCCT (SEQ ID NO: 60)
からなる群より選択される。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２２９】
別の態様において、前記の増幅された複製ドメインは、配列
CGCCAGTCCTTGCTGGGACC (SEQ ID NO: 61) またはCCCTGCCCAGAGGACATCGCC (SEQ ID NO: 62)
を含むオリゴヌクレオチドを用いて検出される。
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３０】
別の態様において、Ciz 1固定化ドメインを増幅する前記オリゴヌクレオチドプライマー対は、
CAGGGGCATAAGGACAAAG (SEQ ID NO: 63) とGGCTTCCTCAGACCCCTCTG (SEQ ID NO: 64); および
CGAGGGTGATGAAGAAGAGGA (SEQ ID NO: 65) とCCCCTGAGTTGCTGTGATA (SEQ ID NO: 66)
からなる群より選択される。
【手続補正２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３１】
別の態様において、増幅された固定化ドメインは、配列
TGGTCCTCATCTTGGCCAGCA (SEQ ID NO: 67), CACGGGCACCAGGAAGTCCA (SEQ ID NO: 68) または
CACTGCAAGTCCCTGGGCCA (SEQ ID NO: 69)
を含むオリゴヌクレオチドを用いて検出される。
【手続補正２２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２４１】
本発明の一態様において、複製ドメインを増幅するオリゴヌクレオチドプライマーは、
CACAACTGGCCACTCCAAAT (SEQ ID NO: 57) とCCTCTACCACCCCCAATCG (SEQ ID NO: 58); または
ACACACCAGAAGACCAAGATTTACC (SEQ ID NO: 59) とTGCTGGAGTGCGTTTTTCCT (SEQ ID NO: 60)
である。
【手続補正２３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２４２】
本発明の好ましい方法において、固定化ドメインを増幅するオリゴヌクレオチドプライマーは、
CAGGGGCATAAGGACAAAG (SEQ ID NO: 63) とGGCTTCCTCAGACCCCTCTG (SEQ ID NO: 64); または
CGAGGGTGATGAAGAAGAGGA (SEQ ID NO: 65) とCCCCTGAGTTGCTGTGATA (SEQ ID NO: 66)
である。
【手続補正２４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２４３】
本発明の好ましい態様において、前記キットは、増幅されたCiz 1複製ドメインを検出する、
CGCCAGTCCTTGCTGGGACC (SEQ ID NO: 61) またはCCCTGCCCAGAGGACATCGCC (SEQ ID NO: 62)
より選択されるオリゴヌクレオチドプローブを含む。
【手続補正２５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２４４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２４４】
本発明の好ましい態様において、キットは、増幅されたCiz 1固定化ドメインを検出する、
TGGTCCTCATCTTGGCCAGCA (SEQ ID NO: 67), CACGGGCACCAGGAAGTCCA (SEQ ID NO: 68) または
CACTGCAAGTCCCTGGGCCA (SEQ ID NO: 69)
より選択されるオリゴヌクレオチドプローブを含む。
【手続補正２６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２９０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２９０】
一態様において、自己抗体は、アミノ酸配列
DEEEIEVRSRDIS (SEQ ID NO: 49)
に特異的に結合する。一態様において、自己抗体は、アミノ酸配列
DEEEIEVRSRDIS (SEQ ID NO: 49)
に特異的に結合するが、アミノ酸配列
DEEEIE (SEQ ID NO: 36), VRSRDIS (SEQ ID NO: 37) またはDEEEIEVEEELCKQVRSRDIS (SEQ ID NO: 38)
のいずれにも特異的に結合しない。一態様において、自己抗体は、アミノ酸配列
EGDEEEEEDDEDEEEIEVRSRDISREEWKGSETY (SEQ ID NO: 39)
に特異的に結合するが、アミノ酸配列
EGDEEEEEDDEDEEEIEVEEELCKQVRSRDISREEWKGSETY (SEQ ID NO: 40)
には特異的に結合しない。別の態様において、自己抗体は、アミノ酸配列
DEEEEEDDEDEEEIEVRSRDISREEWKGSE (SEQ ID NO: 41)
に特異的に結合するが、アミノ酸配列
DEEEEEDDEDEEEIEVEEELCKQVRSRDISREEWKGSE (SEQ ID NO: 42)
には特異的に結合しない。別の態様において、自己抗体は、アミノ酸配列
DEEEEEDDEDEEEIEVRSRDISREEWKGSE (SEQ ID NO: 41)
に特異的に結合するが、アミノ酸配列
DEEEEEDDEDEEEIEVEEELCKQVRSRDISREEWKGSE (SEQ ID NO: 42)
には特異的に結合しない。別の態様において、自己抗体は、アミノ酸配列
EEEEDDEDEEEIEVRSRDISREEWKG (SEQ ID NO: 43)
に特異的に結合するが、アミノ酸配列
EEEEDDEDEEEIEVEEELCKQVRSRDISREEWKG (SEQ ID NO: 44)
には特異的に結合しない。別の態様において、前記の自己抗体は、アミノ酸配列
EEDDEDEEEIEVRSRDISREEW (SEQ ID NO: 45)
に特異的に結合するが、アミノ酸配列
EEDDEDEEEIEVEEELCKQVRSRDISREEW (SEQ ID NO: 46)
には特異的に結合しない。別の態様において、自己抗体は、アミノ酸配列
DDEDEEEIEVRSRDISRE (SEQ ID NO: 47)
に特異的に結合するが、アミノ酸配列
DDEDEEEIEVEEELCKQVRSRDISRE (SEQ ID NO: 48)
には特異的に結合しない。別の態様において、自己抗体は、アミノ酸配列
DEDEEEIEVRSRDISR (SEQ ID NO: 8)
に特異的に結合するが、アミノ酸配列
DEDEEEIEVEEELCKQVRSRDISR (SEQ ID NO: 23)
には特異的に結合しない。別の態様において、自己抗体は、アミノ酸配列
EDEEEIEVRSRDIS (SEQ ID NO: 50)
に特異的に結合するが、アミノ酸配列
EDEEEIEVEEELCKQVRSRDIS (SEQ ID NO: 51)
には特異的に結合しない。別の態様において、自己抗体は、アミノ酸配列
DEEEIEVRSRDI (SEQ ID NO: 52)
に特異的に結合するが、アミノ酸配列
DEEEIEVEEELCKQVRSRDI (SEQ ID NO: 53)
には特異的に結合しない。別の態様において、自己抗体は、アミノ酸配列
EIEVRSR (SEQ ID NO: 54)
に特異的に結合するが、アミノ酸配列
EIEVEEELCKQVRSR (SEQ ID NO: 55)
には特異的に結合しない。
【手続補正２７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３０３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３０３】
一態様において、Ciz1自己抗体を検出するために使用されるCiz1抗原は、アミノ酸配列
EGDEEEEEDDEDEEEIEVRSRDISREEWKGSETY (SEQ ID NO: 39)
を含む。一態様において、Ciz1自己抗体を検出するために使用されるポリペプチドまたはペプチドは、アミノ酸配列
EGDEEEEEDDEDEEEIEVRSRDISREEWKGSET (SEQ ID NO: 70)
を含む。一態様において、Ciz1自己抗体を検出するために使用されるポリペプチドまたはペプチドは、アミノ酸配列
DEEEEEDDEDEEEIEVRSRDISREEWKGSE (SEQ ID NO: 41)
を含む。一態様において、Ciz1自己抗体を検出するために使用されるポリペプチドまたはペプチドは、アミノ酸配列
EEEEDDEDEEEIEVRSRDISREEWKG (SEQ ID NO: 43)
を含む。一態様において、Ciz1自己抗体を検出するために使用されるポリペプチドまたはペプチドは、アミノ酸配列
EEDDEDEEEIEVRSRDISREEW (SEQ ID NO: 45)
を含む。一態様において、Ciz1自己抗体を検出するために使用されるポリペプチドまたはペプチドは、アミノ酸配列
DDEDEEEIEVRSRDISRE (SEQ ID NO: 47)
を含む。一態様において、Ciz1自己抗体を検出するために使用されるポリペプチドまたはペプチドは、アミノ酸配列
EDEEEIEVRSRDIS (SEQ ID NO: 50)
を含む。一態様において、Ciz1自己抗体を検出するために使用されるポリペプチドまたはペプチドは、アミノ酸配列
DEEEIEVRSRDI (SEQ ID NO: 52)
を含む。一態様において、Ciz1自己抗体を検出するために使用されるポリペプチドまたはペプチドは、アミノ酸配列
EEIEVRSR (SEQ ID NO: 85)
を含む。一態様において、Ciz1自己抗体を検出するために使用されるポリペプチドまたはペプチドは、アミノ酸配列IEVRS (SEQ ID NO: 86)を含む。一態様において、Ciz1自己抗体を検出するために使用されるポリペプチドまたはペプチドは、アミノ酸配列EVRS (SEQ ID NO: 87)を含む。
【手続補正２８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３０４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３０４】
一態様において、Ciz1自己抗体を検出するための方法において対照として使用されるポリペプチドまたはペプチドは、アミノ酸配列
EGDEEEEEDDEDEEEIEVEEELCKQVRSRDISREEWKGSETY (SEQ ID NO: 40)
を含む。一態様において、ポリペプチドまたはペプチド対照は、アミノ酸配列
EGDEEEEEDDEDEEEIEVEEELCKQVRSRDISREEWKGSET (SEQ ID NO: 71)
を含む。一態様において、ポリペプチドまたはペプチド対照は、アミノ酸配列
EGDEEEEEDDEDEEEIEVEEELCKQVRSRDISREEWKGSET (SEQ ID NO: 71)
を含む。一態様において、ポリペプチドまたはペプチド対照は、アミノ酸配列
DEEEEEDDEDEEEIEVEEELCKQVRSRDISREEWKGSE (SEQ ID NO: 42)
を含む。一態様において、ポリペプチドまたはペプチド対照は、アミノ酸配列
EEEEDDEDEEEIEVEEELCKQVRSRDISREEWKG (SEQ ID NO: 44)
を含む。一態様において、ポリペプチドまたはペプチド対照は、アミノ酸配列
EEDDEDEEEIEVEEELCKQVRSRDISREEW (SEQ ID NO: 46)
を含む。一態様において、ポリペプチドまたはペプチド対照は、アミノ酸配列
DDEDEEEIEVEEELCKQVRSRDISRE (SEQ ID NO: 48)
を含む。一態様において、ポリペプチドまたはペプチド対照は、アミノ酸配列
EDEEEIEVEEELCKQVRSRDIS (SEQ ID NO: 51)
を含む。Ciz1ポリペプチドまたはペプチドはまた、Ciz1自己抗体を検出するためのアッセイにおいて遮断剤として使用することができる。一態様において、Ciz1自己抗体を検出するための方法において対照として使用されるCiz1ポリペプチドまたはペプチドは、アミノ酸配列
DEEEIEVEEELCKQVRSRDI (SEQ ID NO: 53)
を含む。別の態様において、ポリペプチドまたはペプチド遮断剤は、アミノ酸配列
EGDEEEEEDDEDEEEIEVEEELCKQVRSRDISREEWKGSETY (SEQ ID NO: 40)
を含む。別の態様において、ポリペプチドまたはペプチド遮断剤は、アミノ酸配列
EGDEEEEEDDEDEEEIEVEE ELCKQVRSRDISREEWKGSET (SEQ ID NO: 71)
を含む。別の態様において、ポリペプチドまたはペプチド遮断剤は、アミノ酸配列
EGDEEEEEDDEDEEEIEVEEELCKQVRSRDISREEWKGSET (SEQ ID NO: 71)
を含む。別の態様において、ポリペプチドまたはペプチド遮断剤は、アミノ酸配列
DEEEEEDDEDEEEIEVEEELCKQVRSRDISREEWKGSE (SEQ ID NO: 42)
を含む。別の態様において、ポリペプチドまたはペプチド遮断剤は、アミノ酸配列
EEEEDDEDEEEIEVEEELCKQVRSRDISREEWKG (SEQ ID NO: 44)
を含む。別の態様において、ポリペプチドまたはペプチド遮断剤は、アミノ酸配列
EEDDEDEEEIEVEEELCKQVRSRDISREEW (SEQ ID NO: 46)
を含む。別の態様において、ポリペプチドまたはペプチド遮断剤は、アミノ酸配列
DDEDEEEIEVEEELCKQVRSRDISRE (SEQ ID NO: 48)
を含む。別の態様において、ポリペプチドまたはペプチド遮断剤は、アミノ酸配列
EDEEEIEVEEELCKQVRSRDIS (SEQ ID NO: 51)
を含む。別の態様において、ポリペプチドまたはペプチド遮断剤は、アミノ酸配列
DEEEIEVEEELCKQVRSRDI (SEQ ID NO: 53)
を含む。別の態様において、ポリペプチドまたはペプチド遮断剤は、アミノ酸配列
VEEELCKQV (SEQ ID NO: 72)
を含む。別の態様において、ポリペプチドまたはペプチド遮断剤は、アミノ酸配列
EEELCKQ (SEQ ID NO: 73)
を含む。
【手続補正２９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３０７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３０７】
（表１）オリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブの概要
2013539534.tif 000001
【手続補正３０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３０９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３０９】
ヒト組織由来RNA
IRBの承認プロトコール下で採取された組織由来の肺腫瘍／正常RNAの3ペアは、Cytomyx（http://www.cytomyx.com/cytomyx/cytomyx biorepository.asp）からのものであった。ドナーのインフォームドコンセントを得て採取したヒト肺組織の追加試料が、ILSbio（http://www.ilsbio.com/）から得られた。製造業者の指示に従って、TRIzolを使用して組織からRNAを単離した。組織の均質化をRNaseフリーの1.5mL Pellet Pestle（Anachem）を使用して行った。以下のように、ランダムプライマー、またはオリゴdTおよびランダムプライマーの混合物を用いてRNA試料を逆転写した。約1.6*mgの全RNAを、1μLの10mM dNTP、0.5μLの0.5μg/μLランダムプライマー（Promega）、および0.5μLの0.5μg/μLオリゴdT12-18プライマー (SEQ ID NO: 88) （Invitrogen）を用いて、DEPC水中、全体積12μLでインキュベートした。あるいは全RNAを、1μLの500μg/mLランダムプライマー、1μLの10mM dNTPを用いて、DEPC水中、全体積13μLでインキュベートした。試料を、65℃で10分間、PTC-200 Peltier Thermal Cycler（MJ Research）においてインキュベートし、氷上で5分間インキュベーションを続けた。ランダムプライム反応物に、以下を加え体積20μLとする：1×First-Strandバッファー、5mM DTT、200U SuperScript III、および40U RNaseOUT（全てInvitrogen）。反応物を、46℃で3時間、その後70℃で15分間インキュベートした。ランダムプライマー／オリゴdT反応物に、以下を加え最終体積20μLとした：1×M-MLV反応バッファー、10mM DTT、200U M-MLV逆転写酵素（全てがPromega）、および40U RNaseOUT（Invitrogen）。反応物を、42℃で52分間、その後70℃で15分間インキュベートした。
【手続補正３１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３１３】
免疫蛍光
カバースリップ上の固定細胞をPBSを用いて洗浄し、次に抗体バッファー（PBS中の10％プロテアーゼ不含有BSA、0.02％ SDS、0.1％ Triton X-100）を用いてブロックした。Ciz1-RDを、抗Ciz1ポリクローナル抗体1793を用いて、Ciz1-ADを、Ciz 1アンカードメインペプチド
DEDEEEIEVEEELCKQVRSRDISR (SEQ ID NO: 23)
を使用して、アフィニティー精製したポリクローナル抗体2Cを用いて検出した。DNAを、Hoechst 33258（Sigma）を用いて対比染色した。画像を、Zeiss Axiovert 200 MおよびOpenlab画像取得ソフトウェアを使用し、実験内で同一のパラメーター、典型的にはTRITC標識Ciz1については300ms、GFPについては400ms、Hoeschtについては15msを使用して収集した。画像をデジタル的に増強し、バックグラウンド蛍光を除去する、または、Adobe Photoshopを使用して明るさを増加させる場合、同一の操作を1つの実験内で画像に適用した。そのため、例えば抽出前後のCiz1染色の強度は、処理の効果を反映する。蛍光強度を、Openlab「Profile」ツールを使用して同一の撮像パラメーター下で取得した生画像から定量化した。
【手続補正３２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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