【手続補正書】
【提出日】平成24年3月23日(2012.3.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単一の組織サンプルにおける２以上の標的分子のクロモゲン検出法において、
組織サンプルと、第一標的分子に特異的に結合する第一特異的結合部位とを接触させる工程と、
組織サンプルにおける第一標的分子を、不溶性で電子豊富な芳香族クロモゲン生成物を沈殿させることによって検出する工程と、
組織サンプルと、第二標的分子に特異的に結合する第二のハプテン標識された特異的結合部位とを接触する工程であって、第二のハプテン標識された特異的結合部位のハプテンが、電子欠損芳香族化合物を含有する工程と、
第二のハプテン標識された特異的結合部位と、組織サンプルとを接触させる前またはそれと同時に、組織サンプルを、可溶性で電子豊富な芳香族化合物を含有する溶液で処理する工程と、
第一標的分子を検出するために沈殿させた不溶性で電子豊富な芳香族化合物から区別することができる第二の不溶性クロモゲン生成物を沈殿させることによって、第二標的分子を検出する工程であって、組織サンプルを、可溶性で電子豊富な芳香族化合物を含有する溶液で処理する工程が、ハプテン標識された特異的結合部位と、第一標的分子の付近に沈殿した不溶性で電子豊富な化合物との非特異的結合により、バックグラウンドを減少させうる工程とを
含有する方法。
【請求項２】
可溶性で電子豊富な芳香族化合物は、以下の一般式を有する請求項１に記載の方法：
【化１】
2012500973.tif 000001
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３の少なくとも１つは、電子供与基であり、−ＯＲ４、−ＮＲ６Ｒ７、−ＯＰＯ３２−から独立して選択され、Ｒ６およびＲ７は、独立してＨもしくは低級アルキルであり、あるいはＲ１、Ｒ２、Ｒ３の２つは、結合した芳香環を共に形成し、任意に１、２または３の電子供与置換基と置換され、
特に、Ｒ２およびＲ３は結合した芳香環を共に形成し、電子豊富な芳香族化合物は以下の一般式を有する。
【化２】
2012500973.tif 000002
Ｒ８、Ｒ９およびＲ１０は、独立してＨ、−ＯＲ１１、−ＮＲ１２Ｒ１３、−ＯＰＯ３２−または低級アルキルから選択され；Ｒ１１、Ｒ１２およびＲ１３は、独立してＨおよび低級アルキルから選択される。
【請求項３】
可溶性で電子豊富な芳香族化合物は、ナフトールを含有し、特に、ナフトール濃度は、ハプテン標識された特異的結合部位と、第一標的分子付近に沈殿した不溶性で電子豊富な化合物のハプテン標識された特異的結合部位との非特異的結合により、バックグラウンドを減少させ、１ｍｇ／ｍＬ〜３０ｍｇ／ｍＬの範囲であり、特に、ナフトール濃度は、１ｍｇ／ｍＬ〜７ｍｇ／ｍＬの範囲であり、またはナフトール濃度は、０．３ｍｇ／ｍＬ〜１ｍｇ／ｍＬの範囲である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
第二のハプテン標識された特異的結合部位は、ハプテン標識された核酸プローブであり、特に、ハプテン標識された核酸プローブは、ＤＮＡプローブであり、特に、ハプテン標識された核酸プローブのハプテンは、ニトロアリール化合物であり、特に、ニトロアリール化合物は、ジニトロフェノールであり、特に、ジニトロフェノール核酸標識されたプローブの濃度は、少なくとも５μｇ／ｍＬであり、特に、ジニトロフェノール核酸標識されたプローブの濃度は、１０μｇ／ｍＬ〜１５μｇ／ｍＬの範囲である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
第二のハプテン標識されたプローブのハプテンは、ニトロアリール化合物であり、特に、ニトロアリール化合物は、ジニトロフェノールである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
第一標的分子はタンパク質であり、第二標的分子は核酸配列であり、または第一標的分子はタンパク質であり、第二標的分子は、第一標的分子のタンパク質をエンコードする核酸配列であり、特に、タンパク質は、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｃ−Ｍｙｃ、ｎ−Ｍｙｃ、Ａｂｌ、ＥＧＦＲタンパク質、ＴＯＰ２Ａ、Ｂｃｌ２、Ｂｃｌ６、Ｒｂ１、ｐ５３もしくはｃ−Ｍｅｔであり、
あるいは第一標的分子および第二標的分子は、第一タンパク質および第二タンパク質であり、または第一標的分子および第二標的分子は、第一核酸配列および第二核酸配列である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
第二標的分子は、核酸配列であり、特に、核酸配列は、ＨＥＲ２、ｃ−Ｍｙｃ、ｎ−Ｍｙｃ、Ａｂｌ、ＥＧＦＲ、ＴＯＰ２Ａ、Ｂｃｌ２、Ｂｃｌ６、Ｒｂ１、ｐ５３、ｃ−Ｍｅｔをエンコードする核酸配列である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
可溶性で電子豊富な芳香族化合物を含有する溶液で組織サンプルを処理する工程は、第二のハプテン標識された特異的結合部位と組織サンプルとを接触させる前に、可溶性で電子豊富な芳香族化合物を含有する溶液で組織サンプルを処理する工程を含有し、
あるいは可溶性で電子豊富な芳香族化合物を含有する溶液と組織サンプルを処理する工程は、第二のハプテン標識された特異的結合部位と組織サンプルとを接触させると同時に、可溶性で電子豊富な芳香族化合物を含有する溶液で組織サンプルを処理する工程を含有する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
第一特異的結合部位は、１次抗体であり、特に、１次抗体は、ＨＥＲ２、ｃ−Ｍｙｃ、ｎＭｙｃ、Ａｂｌ、ＥＧＦＲタンパク質、Ｃ−Ｍｅｔ、ＴＯＰ２Ａ、Ｂｃｌ２、Ｂｃｌ６、Ｒｂ１、ｐ５３またはｃ−Ｍｅｔペプチドと結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
不溶性で電子豊富な芳香族化合物は、アゾ染料を含有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
クロモゲン沈殿は、基質と触媒とを反応させて、不溶性で電子豊富な芳香族化合物を直接
的または間接的に形成することを含み、特に、触媒は酵素であり、特に、酵素は、アルカリホスファターゼまたはセイヨウセイワサビペルオキシダーゼであり、特に、基質は、３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、３−アミノ−９−エチルカルバゾール（ＡＥＣ）、４−クロロ−１−ナフトール（４−ＣＮ）、ナフトールＡＳ−ＴＲリン酸、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸塩（ＢＣＩＰ）またはニトロフェニルフォスフェート（ＰＮＮＰ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
第一標的分子の検出は、免疫染色（ＩＨＣ）を実行する工程を含み、第二標的分子の検出は、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成（ＩＳＨ）を実行する工程を含み、ＩＨＣの実行は、アルカリホスファターゼレッドクロモゲン検出法またはセイヨウセイワサビペルオキシダーゼ−ＤＡＢクロモゲン検出法によって、第一標的分子を検出する工程を含み、ＩＳＨの実行は、セイヨウセイワサビペルオキシダーゼ銀ＩＳＨ検出またはアルカリホスファターゼ赤銀検出法によって、第二標的分子を検出する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
方法は自動化されており、特に、
組織サンプル中で、１次抗体が第一標的分子と特異的に結合するのに十分な条件下にて、組織サンプルに１次抗体を自動的に分配する工程と、
組織サンプル中の第一標的分子を１次抗体とともにＩＨＣによって検出する工程と、
ハプテン標識された核酸プローブが第二標的分子と特異的に結合するのに十分な条件下にて、組織サンプルにハプテン標識された核酸プローブを自動的に分配する工程であって、ハプテン標識された核酸プローブは、電子欠損の芳香族化合物を含む工程と、
第二のハプテン標識された核酸プローブを組織サンプルに自動的に分配する前またはそれと同時に、電子豊富な芳香族化合物を含有する溶液で組織サンプルを処理する工程と、
第二標的分子をｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成（ＩＳＨ）によって検出し、二重核酸
およびタンパク質の検出を同じ組織サンプルにおいて単一の自動実行で可能とする工程で
あって、電子豊富な芳香族化合物は以下の一般式を有する工程とを含み、
【化３】
2012500973.tif 000003
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３の少なくとも１つは、電子供与基であり、独立して−ＯＲ４、−ＮＲ６Ｒ７から選択され、Ｒ６およびＲ７は、独立してＨまたは低級アルキルであり、あるいはＲ１、Ｒ２およびＲ３の２つは結合した芳香族環を共に形成し、任意に１、２または３つの電子供与置換基で置換され、特に、ＩＨＣをＩＳＨの前に実行し、またはＩＳＨをＩＨＣの前に実行する、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
ＩＳＨは、セイヨウセイワサビペルオキシダーゼ銀染色ＩＳＨまたはアルカリホスファターゼ赤銀染色によって、または標的核酸を検出する工程、
あるいはＩＨＣは、アルカリホスファターゼレッドクロモゲンまたはセイヨウセイワサビペルオキシダーゼ―ＤＡＢクロモゲンによって標的タンパク質を検出する工程を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
単一の組織サンプルにおける２以上の標的分子のクロモゲン検出用のキットにおいて、
第一標的分子に特異的に結合する第一特異的結合部位を含有する溶液と；第二標的分子に特異的に結合する第二のハプテン標識された特異的結合部位を含有する溶液と；可溶性で電子豊富な芳香族化合物を含有する溶液とを備え、可溶性で電子豊富な芳香族化合物はナフトールであり、第二のハプテン標識された特異的結合部位はＤＮＰ標識された核酸プローブであり、特に、可溶性で電子豊富な芳香族化合物を含有する溶液は、さらにハプテン標識された核酸プローブを含むキット。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
一実施形態の方法において、Ｒ２およびＲ３は共に結合芳香族環を形成し、電子豊富な
芳香族環は、以下の一般式を有し、
【化２】
2012500973.tif 000004
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３７】
自動核酸およびタンパク質の検出法の一の実施形態において、Ｒ２およびＲ３が結合した芳香族化合物を共に形成する電子豊富な芳香族化合物であり、電子豊富な芳香族化合物は以下の一般式を有する
【化４】
2012500973.tif 000005
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０６】
置換基Ｒ１〜Ｒ６の２以上はまた、環系、例えばナフタレン（以下に示す）またはアントラセン誘導体における、原子、通常炭素原子であることができる。６員環系以外の環系を、例えば結合された６〜５環系で形成することができる。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４０】
【化１３】
2012500973.tif 000006
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８０】
【化１５】
2012500973.tif 000007
2012500973.tif 000008