(57)【要約】【課題】ウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIのコスト効果の高い代替供給源を提供すること。【解決手段】（a）ウシ膵臓タンパク質およびシグナルペプチドからなるプレタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むベクターを提供する工程、（b）ベクターでメチロトローフ酵母株を形質転換する工程、（c）栄養分およびメタノールを含有する増殖培地において形質転換メチロトローフ酵母株を培養する工程、ここでメチロトローフ酵母株は増殖培地にウシ膵臓タンパク質を発現し、分泌する、（d）増殖培地からウシ膵臓タンパク質を精製する工程を含む、工程（d）で精製された１mgのタンパク質当たり少なくとも6,000ユニットのデオキシリボヌクレアーゼ比活性を有するウシ膵臓タンパク質の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（a）ウシ膵臓タンパク質およびシグナルペプチドからなるプレタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むベクターを提供する工程、
（b）ベクターでメチロトローフ酵母株を形質転換する工程、
（c）栄養分およびメタノールを含有する増殖培地において形質転換メチロトローフ酵母株を培養する工程、ここでメチロトローフ酵母株は増殖培地にウシ膵臓タンパク質を発現し、分泌する、
（d）増殖培地からウシ膵臓タンパク質を精製する工程
を含む、工程（d）で精製された１mgのタンパク質当たり少なくとも6,000ユニットのデオキシリボヌクレアーゼ比活性を有するウシ膵臓タンパク質の製造方法。
【請求項２】
ウシ膵臓タンパク質のアミノ酸配列が配列番号：１であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
シグナルペプチドが、ウシ膵臓タンパク質の最初のアミノ酸のすぐ隣に位置するシグナルペプチダーゼ切断部位を含有してなることを特徴とする請求項１または２いずれか記載の方法。
【請求項４】
発現されたプレタンパク質のアミノ酸配列が、
（a）配列番号：２、
（b）配列番号：３、および
（c）配列番号：４
からなる群より選ばれることを特徴とする請求項１〜３いずれか記載の方法。
【請求項５】
ウシ膵臓タンパク質をコードするヌクレオチド配列が配列番号：５であることを特徴とする請求項１〜４いずれか記載の方法。
【請求項６】
プレタンパク質をコードするヌクレオチド配列が、ウシ膵臓タンパク質をコードするヌクレオチド配列に融合されたシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列からなることを特徴とする請求項１〜５いずれか記載の方法。
【請求項７】
シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列が、
（a）配列番号：６、
（b）配列番号：７、および
（c）配列番号：８
からなる群より選ばれることを特徴とする請求項１〜６いずれか記載の方法。
【請求項８】
プレタンパク質をコードするヌクレオチド配列が、プロモーターまたはプロモーターエレメントに作動可能に連結されることを特徴とする請求項１〜７いずれか記載の方法。
【請求項９】
ベクターが、メチロトローフ酵母株のエピソームとして複製可能なプラスミドであることを特徴とする請求項１〜８いずれか記載の方法。
【請求項１０】
メチロトローフ酵母株において複製可能である人工染色体が前記ベクターを含有してなることを特徴とする請求項１〜８いずれか記載の方法。
【請求項１１】
メチロトローフ酵母株の染色体が前記ベクターを含有してなることを特徴とする請求項１〜８いずれか記載の方法。
【請求項１２】
メチロトローフ酵母株が、Hansenula種、Pichia種、Candida種またはTorulopsis種であることを特徴とする請求項１〜１１いずれか記載の方法。
【請求項１３】
メチロトローフ酵母株が、Pichia pastoris、Hansenula polymorpha、Candida boidiniiおよびTorulopsis glabrataからなる群より選ばれることを特徴とする請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
メチロトローフ酵母株が、アメリカンタイプカルチャーコレクション登録番号76273のPichia pastoris株またはその派生体であることを特徴とする請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
配列番号：２９のPichia pastris AOX1プロモーターまたはそのプロモーターエレメントに作動可能に連結された、ウシ膵臓タンパク質およびシグナルペプチドからなるプレタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むベクターを含有する染色体を有してなるPichia pastris株であって、プレタンパク質をコードするヌクレオチド配列が配列番号：５に融合された配列番号：７または配列番号：８である、Pichia pastris株。
【請求項１６】
請求項１〜１４いずれか記載の方法により得ることができる、１mgのタンパク質当たり少なくとも6,000ユニットのデオキシリボヌクレアーゼI比活性を有するウシ膵臓タンパク質。
【請求項１７】
DNAの加水分解のための、１mgのタンパク質当たり少なくとも6,000ユニットのデオキシリボヌクレアーゼ比活性を有するウシ膵臓タンパク質の使用。
【請求項１８】
１mgのタンパク質当たり少なくとも6,000ユニットのデオキシリボヌクレアーゼ比活性を有するウシ膵臓タンパク質および二価カチオンを含有する反応緩衝液を含有してなるパーツのキット。
【請求項１９】
ウシ膵臓タンパク質が水、グリセロール、プロテアーゼインヒビター、および二価カチオンを含有する保存緩衝液に溶解され、反応緩衝液がMg2+、Ca2+およびMn2+からなる群より選ばれる二価カチオンを含有してなる請求項１８記載のパーツのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はメチロトローフ酵母での組換えウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIの生産に関する。特に、本発明はメチロトローフ酵母によって増殖培地中に分泌され、それから精製される、ウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIに関する。また、組換えウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIの使用およびキットも提供する。
【背景技術】
【０００２】
ウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIは広範囲で適用される工業製品である。例えば、細胞生物学の分野における適用では、ウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIを、細胞組織を解離させて単一細胞を単離する目的のための標準的な実験手順において利用する。このようなプロセスは、常に一部の細胞の破壊および溶解を伴う。結果として、DNAはこれらの細胞から細胞間空間および／または解離培地中に放出され、好ましくない細胞凝集を生じる。解離培地へのウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIの添加は、この酵素が1mg/mlまでの濃度では細胞傷害性ではないと示されているので、好ましくない細胞凝集を防ぐための好ましい方法である。従って、細胞凝集はDNAを加水分解することで防止される。組織培養の目的のためには、ウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIはまたコラゲナーゼまたはトリプシンなどの他の酵素と組み合わせて用いられる（例えば、非特許文献１を参照）。
【０００３】
分子生物学および核酸生化学の分野に関しては、いくつかを挙げると、ウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIはニックトランスレーション、ランダムDNA断片の作製、転写因子フットプリントなどのデオキシリボヌクレアーゼI保護アッセイ、インビトロでの転写後のDNA鋳型の除去、RT-PCRなどの適用の前のRNAサンプルからのDNAの除去、ならびに生物学的および／または生化学的手順によって作製された他の調製物からのDNAの除去のような適用に用いられる（例えば、非特許文献２を参照）。従って、DNAの除去はDNAを加水分解することで達成される。
【０００４】
DNaseIはまた肺分泌物の粘弾性を低下させることを目的として医療用に用いられる（例えば、非特許文献３を参照）。この特定の目的のためには、ヒト起源のデオキシリボヌクレアーゼIが好ましい酵素であるが、ウシ膵臓由来のデオキシリボヌクレアーゼIも前記で例示される種々の研究的な使用に好ましい。従って、ウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIは工業的規模で生産され、通常の工業製品として販売される酵素である（例えば、ウシ膵臓由来のデオキシリボヌクレアーゼI, EC 3.1.21.1、非特許文献４中の商品番号1284932）。
【０００５】
ウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIの分子量は約30,000ダルトンであり、酵素活性最適pHは7.8である。ウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIは、優先的にピリミジンヌクレオチドに隣接するDNAのホスホジエステル結合を加水分解して、3'位に遊離のヒドロキシル基および5'位にホスフェート基を有するDNA分子を生じさせる。限界消化の平均鎖長は4ヌクレオチドである。ウシ膵臓由来の4種のデオキシリボヌクレアーゼがあるが、これらは全て糖タンパク質である。それらは炭水化物側鎖またはポリペプチド成分のいずれかにおいて互いに異なっている。ウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIは一本鎖DNA、二本鎖DNAおよびクロマチンに作用する多様な化学活性を有する（例えば、非特許文献５を参照）。他のデオキシリボヌクレアーゼと同様に、ウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIはインビボで細胞インヒビターとして作用するアクチンによって調節されると考えられる（例えば、非特許文献６を参照）。さらに、他のデオキシリボヌクレアーゼ同様、ウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIは二価の金属イオンによって活性化される。最大活性化はMg2+およびCa2+で達成される。DNAのマグネシウム塩などの金属基質を必要とする。クエン酸塩は、マグネシウムによって活性化されるがマンガンによっては活性化されないデオキシリボヌクレアーゼIを完全に阻害する。デオキシリボヌクレアーゼIはEDTAなどのキレート剤によって、およびドデシル硫酸ナトリウムによって阻害される（例えば、非特許文献２を参照）。
【０００６】
目下のところ、ウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIの主要な供給源は屠殺したウシから得られる膵臓組織である。通常、酵素は組織原料から、例えば、非特許文献７、８または９によって記載されるものなどのクロマトグラフィー分離技術を用いて精製される。非特許文献８によって明確に報告されるように、研究室の条件下での精製プロセスにより400gの組織から得られた1mgのタンパク質当たり1,000ユニットの範囲の比活性が得られる。スケールアップされた工業的プロセスでは、ウシ膵臓組織からのウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIの単離により通常1mgのタンパク質当たり3,500ユニットの比活性を示す単離された酵素調製物が得られる（本発明者ら自身の未公開の知見）。ウシ膵臓から精製されたリサーチグレードのウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIの市販されている調製物の比活性は、カタログ番号1284932（2,000ユニット/mg）、104132（3,000ユニット/mg）、104159（2,000ユニット/mg）のロシュ製品（非特許文献１０の商品）,
およびカタログ番号D5025（2,000ユニット/mg）、D4263（2,000U/mg）、D4513（2,000ユニット/mg）、DN-25（400-800ユニット/mg）のSigma-Aldrich製品（非特許文献１１の商品）によって例示されるように、通常この値を下回る。一般に、ウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIの供給源としての膵臓組織は、この組織が高含量の他の消化酵素前駆体およびその活性型を含むので問題がある。従って、一方では、それから所望の酵素が精製される混合物は非常に複雑なものであり、複雑な分離技術が必要である。他方では、消化酵素の中のプロテアーゼは、所望のタンパク質を、特に、膵臓組織をホモジナイズする精製プロセスの第1の工程の間に破壊してしまう場合がある。膵臓組織ホモジネートがウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIの実質的な部分を不活性化する阻害性物質を含み、それによってこの供給源から精製され得る活性酵素の比活性を制限するということも推測される。
【０００７】
当技術分野では細菌宿主中で酵素的に活性なウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIタンパク質の組換え発現が可能であることも公知である。しかしながら、過剰発現が細菌細胞に対するエンドヌクレアーゼの内在性毒性による問題を引き起こす。毒性が細菌の細胞質中に存在する高レベルの活性なウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼI酵素での宿主細胞DNAの細胞内分解によって引き起こされることは明らかである。細菌細胞では、転写および翻訳は、これらのプロセスが別の区画、すなわち、核および細胞質で起こる真核生物細胞とは対照的に、密接に関連している。従って、ウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIを過剰発現する細菌クローンの選択は同時にこれらのクローンの不安定性（例えば、遺伝的不安定性）および／または産生される組換えデオキシリボヌクレアーゼタンパク質の不安定性を促進する。この問題を克服する試みは、主にしっかりと調節されており誘導可能である細菌の発現システムに基づいて行われていた。
【０００８】
Worrall, A.F.およびConnolly, B.A.（非特許文献１２）は宿主生物のコドン使用に適応させた合成コード配列を利用して大腸菌中で活性なウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIタンパク質を発現させた。転写発現はλpLプロモーターの制御下にあった。組換えタンパク質は細胞内で産生され、その後超音波処理によって可溶化された。組換えの活性なタンパク質は細菌宿主株にとって毒性であると認められた。従って、発現量は100g〜1mg/培養物1lの範囲とされた。大腸菌由来の組換えの活性なウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIの比活性は天然タンパク質の比活性と同一であると認められた。この文献に示された値（5×108ユニット/タンパク質1g）は調製物の真の値ではなく精製について補正されていた。その組換えウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIタンパク質は部分的にしか精製されておらず、その文献には実質的に純粋なおよび／またはリサーチグレードの製品のデオキシリボヌクレアーゼ比活性については全く記載されていない。
【０００９】
Chen, C.Y.ら（非特許文献１３）は大腸菌中で本来のウシ膵臓転写物を提示するcDNAを発現させた。この構築物をBL21（DE3）pLysE株中で発現させ、IPTG誘導性T7ポリメラーゼによって転写させた。しかしながら、活性なウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIの過剰発現は量が制限されていると認められ、産物は細菌宿主生物にとって毒性であると考えられた。誘導の際の細胞溶解のために、ウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼI活性は上清中に認められたが、培養物の細胞画分にも認められた。デオキシリボヌクレアーゼ酵素活性は、反応緩衝液中の二価の陽イオンおよびその濃度ならびにそのpHに関する変更が行われている点でKunitzアッセイとは異なる、酵素活性についてのアッセイを用いて測定された。しかしながら、一般に、このアッセイで検出されたユニットはKunitzアッセイのものに匹敵すると考えられている。この文献のアッセイによれば、誘導された培養物からのおよその収率は3,500ユニット/lであった。大腸菌中で産生された組換えウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIの酵素の比活性は908ユニット/mgであり、膵臓組織から平行して精製された天然のウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIの比活性（938ユニット/mg）と同じ範囲にあった。
【００１０】
真核生物起源の翻訳後プロセッシングされたタンパク質が原核生物の宿主システムで発現される場合に広く認められることであるが、大腸菌中での組換え発現によって得られたウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIは天然のタンパク質とは著しく異なっている。特に、天然の膵臓デオキシリボヌクレアーゼIタンパク質の特徴であるN-グリコシル化が原核生物発現システム由来の組換え産物には認められない。グリコシル化は大腸菌では起こらず、非特許文献１２および非特許文献１３の刊行物によって、組換えにより産生されたウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIタンパク質はグリコシル化されていなかったということが確認された。また、タンパク質の折り畳みおよびジスルフィド結合の形成も真核細胞では別々に制御されている（例えば、非特許文献１４を参照）。特に、組換えにより産生されたタンパク質中でのジスルフィド架橋の形成は、ひと度タンパク質のSH基が空気中の酸素と接触するとランダムに生じると推定され得る。
【００１１】
グリコシル化されたウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIはまた、培養哺乳類細胞中でも発現させられた。Nishikawa, Aら（非特許文献１５）は、COS-1細胞中でウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIならびにヒトデオキシリボヌクレアーゼIを産生させ、これらのタンパク質のマンノースリン酸化を研究した。しかしながら、この文献は産生された組換えデオキシリボヌクレアーゼIの収率または活性に関しては全く記載していない。ウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIのグリコシル化に関するさらなる研究が非特許文献１６によって公開されているが、これはウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIのN結合型グリコシル化効率を論じているものであった。この文献もまた、産生された組換えデオキシリボヌクレアーゼIの収率または活性に関しては全く記載されていない。
【００１２】
胚性腎臓293細胞中でのヒト膵臓デオキシリボヌクレアーゼIの組換え発現が非特許文献１７ならびに同じ著者による特許文献１に記載された。後者の文献では、293細胞由来の組換えヒト膵臓デオキシリボヌクレアーゼの比活性は、参照として用いられたウシデオキシリボヌクレアーゼ（Sigma製品D5025）の比活性に匹敵すると考えられると記載されている。業者（Sigma）のカタログによれば、この製品の比活性は2,000ユニット/mgであり、これは組換えによって発現されたヒト膵臓デオキシリボヌクレアーゼIタンパク質と同じ範囲と見なされる。さらに、特許文献１に記載されている発明によれば、組換えデオキシリボヌクレアーゼは好ましくは、哺乳類細胞中だけではなく、原核生物、真菌、酵母、pichia属酵母、昆虫などでも発現される。しかしながら、哺乳類細胞での発現は別として、この文献は真核生物の発現システムに関する他の例を全く開示していない。さらに、この文献は他の真核生物の発現システムにおいて産生される場合の組換えデオキシリボヌクレアーゼのグリコシル化、ジスルフィド架橋の形成および比活性に関して全く記載していない。さらに、この文献は所望のタンパク質の収率ならびにその活性に対する分泌の影響についても全く記載していない。
【００１３】
特許文献１のものと同様の発現システムを用いて、特許文献２は、アクチンに対して低い結合親和性を示すヒトデオキシリボヌクレアーゼI変異体の産生を記載している。特許文献３は、HeLa細胞中でのヒトデオキシリボヌクレアーゼIIの発現を開示している。
【００１４】
デオキシリボヌクレアーゼ活性を有するウシ膵臓タンパク質を得るための最先端の技術によって提供される方法にも、ある欠点がある。本発明は改良した方法を提供する。
【特許文献１】国際公開第90/07572号パンフレット
【特許文献２】国際公開第96/26278号パンフレット
【特許文献３】欧州特許第1122306号明細書
【非特許文献１】Kaighn, M.E., Tissue culture, methods and applications;Kruse, P.F. & Patterson, M.K.編, Academic press, New York & London, 1973, p.54-58
【非特許文献２】Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning, A Laboratory Manual,第3版, CSHL Press, 2001
【非特許文献３】Liao, T.H., J. Formos. Med. Assoc. 96 （1997） p.481-487
【非特許文献４】Roche Diagnostics GmbH、マンハイムの2002カタログ
【非特許文献５】Liao, T.H.著、Mol. Cell Biochem. 34 （1981） p.15-22
【非特許文献６】Lazarides, E.およびLindberg, U.著、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 71 （1974） p.4742
【非特許文献７】Funakoshi, A.ら著、J. Biochem. （東京） 88 （1980） p.1113-1138
【非特許文献８】Paudel, H. K.およびLiao, T .H.著、J. Biol Chem.  261 （1986） p.16006-16011
【非特許文献９】Nefsky, B.およびBretscher, A.著、Eur. J. Biochem. 179 （1989） p.215-219
【非特許文献１０】Roche Diagnostics GmbH、マンハイム、ドイツ;2002年11月のカタログ
【非特許文献１１】Sigma-Aldrich Chemie GmbH Taufkirchen, Germany；2002年11月のカタログ
【非特許文献１２】Worrall, A.F.およびConnolly, B.A.、J. Biol. Chem. 265 （1990） p.21889-21895
【非特許文献１３】Chen, C.Y.ら、Gene 206 （1998） p.181-184
【非特許文献１４】Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Walter, P.（編）, Molecular Biology of the Cell, 第4版, 2002, Garland Science Publishing
【非特許文献１５】Nishikawa, A.ら, J. Biol. Chem. 272 （1997） p.19408-19412
【非特許文献１６】Nishikawa, A.およびMizuno, S., Biochem. J 355 （2001） p.245-248
【非特許文献１７】Shak, S., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 （1990） p.9188-9192
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明の目的は、ウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIのコスト効果の高い代替供給源を提供することである。本発明のさらなる目的は動物以外の宿主生物によって合成された組換えタンパク質としてのウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIを精製することである。本発明の別の目的は、宿主生物が細菌よりも組換えウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIに対して寛容である発現システムを提供することである。本発明の別の目的は、細胞または培地成分からのウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIの分離を単純化しかつ促進し、従って他の方法によっては失われてしまう酵素活性を維持する発現システムを提供することである。本発明のさらに別の目的は、高い比活性を有する酵素調製物を生じる生産手順を提供することである。本発明のさらに別の目的は、生産手順がコスト効果の高い工業プロセスへのスケールアップを受け入れられることである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
驚くべきことに、ウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIがメチロトローフ酵母中でプレタンパク質の形態で組換え発現され、メチロトローフ酵母が成熟タンパク質を分泌する場合は、精製されたタンパク質は非常に高い比活性、すなわち、1mgのタンパク質当たり6,000ユニットに匹敵するか、またはそれより高い比活性を有することを見出した。
【００１７】
従って、本発明によれば、デオキシリボヌクレアーゼ活性を有するウシ膵臓タンパク質を生産する方法が提供される。この方法は、（a）ウシ膵臓タンパク質およびシグナルペプチドからなるプレタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むベクターを提供する工程、（b）メチロトローフ酵母株をこのベクターで形質転換する工程、（c）形質転換されたメチロトローフ酵母株を、メチロトローフ酵母株が増殖培地中でウシ膵臓タンパク質を発現しさらにそれを増殖培地中に分泌する、栄養分およびメタノールを含む増殖培地で培養する工程、ならびに、（d）ウシ膵臓タンパク質を増殖培地から精製する工程、ここでウシ膵臓タンパク質は、ウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIであり、デオキシリボヌクレアーゼ活性を有し、工程（d）で精製されたウシ膵臓タンパク質は1mgのタンパク質当たり少なくとも6,000ユニットのデオキシリボヌクレアーゼ比活性によって特徴づけられる、を含む。
【００１８】
従って、産物を、以下の方法によって得ることができるウシ膵臓タンパク質と定義する。この方法は、（a）ウシ膵臓タンパク質およびシグナルペプチドからなるプレタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むベクターを提供する工程、（b）メチロトローフ酵母株をこのベクターで形質転換する工程、（c）形質転換されたメチロトローフ酵母株を、メチロトローフ酵母株がウシ膵臓タンパク質を発現しさらにそれを増殖培地中に分泌する、栄養分およびメタノールを含む増殖培地で培養する工程、ならびに、（d）ウシ膵臓タンパク質を増殖培地から精製する工程、ここでウシ膵臓タンパク質はウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIであり、デオキシリボヌクレアーゼ活性を有し、ウシ膵臓タンパク質を、1mgのタンパク質当たり少なくとも6,000ユニットのデオキシリボヌクレアーゼ比活性によって特徴づけられる、を含む。
【００１９】
すなわち、本発明の要旨は、
［１］  （a）ウシ膵臓タンパク質およびシグナルペプチドからなるプレタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むベクターを提供する工程、
（b）ベクターでメチロトローフ酵母株を形質転換する工程、
（c）栄養分およびメタノールを含有する増殖培地において形質転換メチロトローフ酵母株を培養する工程、ここでメチロトローフ酵母株は増殖培地にウシ膵臓タンパク質を発現し、分泌する、
（d）増殖培地からウシ膵臓タンパク質を精製する工程
を含む、工程（d）で精製された１mgのタンパク質当たり少なくとも6,000ユニットのデオキシリボヌクレアーゼ比活性を有するウシ膵臓タンパク質の製造方法、
［２］  ウシ膵臓タンパク質のアミノ酸配列が配列番号：１であることを特徴とする前記［１］記載の方法、
［３］  シグナルペプチドが、ウシ膵臓タンパク質の最初のアミノ酸のすぐ隣に位置するシグナルペプチダーゼ切断部位を含有してなることを特徴とする前記［１］または［２］いずれか記載の方法、
［４］  発現されたプレタンパク質のアミノ酸配列が、
（a）配列番号：２、
（b）配列番号：３、および
（c）配列番号：４
からなる群より選ばれることを特徴とする前記［１］〜［３］いずれか記載の方法、
［５］  ウシ膵臓タンパク質をコードするヌクレオチド配列が配列番号：５であることを特徴とする前記［１］〜［４］いずれか記載の方法、
［６］  プレタンパク質をコードするヌクレオチド配列が、ウシ膵臓タンパク質をコードするヌクレオチド配列に融合されたシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列からなることを特徴とする前記［１］〜［５］いずれか記載の方法、
［７］  シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列が、
（a）配列番号：６、
（b）配列番号：７、および
（c）配列番号：８
からなる群より選ばれることを特徴とする前記［１］〜［６］いずれか記載の方法、
［８］  プレタンパク質をコードするヌクレオチド配列が、プロモーターまたはプロモーターエレメントに作動可能に連結されることを特徴とする前記［１］〜［７］いずれか記載の方法、
［９］  ベクターが、メチロトローフ酵母株のエピソームとして複製可能なプラスミドであることを特徴とする前記［１］〜［８］いずれか記載の方法、
［１０］  メチロトローフ酵母株において複製可能である人工染色体が前記ベクターを含有してなることを特徴とする前記［１］〜［８］いずれか記載の方法、
［１１］  メチロトローフ酵母株の染色体が前記ベクターを含有してなることを特徴とする前記［１］〜［８］いずれか記載の方法、
［１２］  メチロトローフ酵母株が、Hansenula種、Pichia種、Candida種またはTorulopsis種であることを特徴とする前記［１］〜［１１］いずれか記載の方法、
［１３］  メチロトローフ酵母株が、Pichia pastoris、Hansenula polymorpha、Candida boidiniiおよびTorulopsis glabrataからなる群より選ばれることを特徴とする前記［１２］記載の方法、
［１４］  メチロトローフ酵母株が、アメリカンタイプカルチャーコレクション登録番号76273のPichia pastoris株またはその派生体であることを特徴とする前記［１３］記載の方法、
［１５］  配列番号：２９のPichia pastris AOX1プロモーターまたはそのプロモーターエレメントに作動可能に連結された、ウシ膵臓タンパク質およびシグナルペプチドからなるプレタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むベクターを含有する染色体を有してなるPichia pastris株であって、プレタンパク質をコードするヌクレオチド配列が配列番号：５に融合された配列番号：７または配列番号：８である、Pichia pastris株、
［１６］  前記［１］〜［１４］いずれか記載の方法により得ることができる、１mgのタンパク質当たり少なくとも6,000ユニットのデオキシリボヌクレアーゼI比活性を有するウシ膵臓タンパク質、
［１７］  DNAの加水分解のための、１mgのタンパク質当たり少なくとも6,000ユニットのデオキシリボヌクレアーゼ比活性を有するウシ膵臓タンパク質の使用、
［１８］  １mgのタンパク質当たり少なくとも6,000ユニットのデオキシリボヌクレアーゼ比活性を有するウシ膵臓タンパク質および二価カチオンを含有する反応緩衝液を含有してなるパーツのキット、および
［１９］  ウシ膵臓タンパク質が水、グリセロール、プロテアーゼインヒビター、および二価カチオンを含有する保存緩衝液に溶解され、反応緩衝液がMg2+、Ca2+およびMn2+からなる群より選ばれる二価カチオンを含有してなる前記［１８］記載のパーツのキット
に関する。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、ウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIのコスト効果の高い代替供給源を提供される。また、本発明によれば、動物以外の宿主生物によって合成された組換えタンパク質としてのウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIを精製することができるという優れた効果が得られる。また本発明によれば、宿主生物が細菌よりも組換えウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIに対して寛容である発現システムが提供される。また本発明によれば、細胞または培地成分からのウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIの分離を単純化しかつ促進し、従って他の方法によっては失われてしまう酵素活性を維持する発現システムが提供される。また本発明によれば、高い比活性を有する酵素調製物を生じる生産手順が提供される。また本発明によれば、前記生産手順をコスト効果の高い工業プロセスにスケールアップできるという優れた効果が得られる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
デオキシリボヌクレアーゼ活性を定量する場合には、本明細書では「ユニット」という。従って、ウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIのヌクレオチド分解活性はKunitz, M（J. Gen. Physiol. 33 （1950） p.349-62および363）と同様の分光計によるアッセイを用いて定量する。任意の調製物の「デオキシリボヌクレアーゼ比活性」または「比活性」は実施例11に詳細に記載される方法によって測定される、調製物中の1mgのタンパク質当たりのユニット数と定義する。
【００２２】
「メチロトローフ酵母」とはメタノールをその炭素源として利用できる酵母と定義する。この用語はまたその研究室株も含む。メチロトローフ酵母株が栄養要求性である場合には、この要求が、十分な量のアミノ酸を合成することができないメチロトローフ酵母株の場合には例えばヒスチジンなどの補助的な炭素含有物質を補充する必要があるので、この補助物質は炭素源ではなく栄養分とみなされる。
【００２３】
「ベクター」とは本発明のDNA断片を含むことができる、すなわち、保有しかつ維持することができるDNAと定義し、例えば、ファージおよびプラスミドが挙げられる。これらの用語は遺伝子操作の当業者によって理解される。用語「発現カセット」とはプロモーターおよびターミネーターに対して作動可能に連結された、プレタンパク質をコードするヌクレオチド配列を意味する。発現カセットを含有しているベクターについては、用語「ベクター」と「発現ベクター」は同義語である。
【００２４】
用語「オリゴヌクレオチド」は100個未満のヌクレオチド長の核酸分子、DNA（またはRNA）について用いる。
【００２５】
「形質転換」は染色体外エレメントとして、または染色体への組み込みによるかのいずれで、DNAが複製可能であるように生物にDNAを導入することを意味する。
【００２６】
用語「発現」および動詞「発現させる」とは、プレタンパク質（すなわち、翻訳後プロセシングを含んでいない）を生じる宿主生物中でのDNA配列の転写および／または転写されたmRNAの翻訳を意味する。
【００２７】
ヌクレオチド配列は、核酸の少なくとも一部またはその相補物が直接翻訳されてペプチドまたはタンパク質のアミノ酸配列を提供することができる場合、または単離された核酸を、単独または発現ベクターの一部として使用して原核生物の宿主細胞中または真核生物の宿主細胞中でインビトロでペプチドまたはタンパク質を発現させることができる場合に、ペプチドまたはタンパク質を「コードしている」。
【００２８】
「プロモーター」は転写を刺激する調節ヌクレオチド配列である。これらの用語は遺伝子操作の当業者によって理解される。プロモーターと同様に、「プロモーターエレメント」も転写を刺激するが、これはより大きなプロモーター配列の細断片を構成する。
【００２９】
用語「作動可能に連結される」とは一方の機能が他方によって影響を受けるような単一のベクター上の2以上の核酸断片の連結を指す。例えば、プロモーターは、コード配列の発現に影響を及ぼすことができる（すなわち、コード配列がそのプロモーターの転写制御下にある）場合に、コード配列（すなわち、タンパク質またはプレタンパク質）をコードするヌクレオチド配列と作動可能に連結されている。
【００３０】
用語「ポリペプチド」または「タンパク質」とは、ペプチド結合によって結合された90個よりも多くのアミノ酸単量体からなるポリマーを意味する。用語「ペプチド」は、ペプチド結合によって結合された90個以下のアミノ酸単量体から構成されるオリゴマーを意味する。「ペプチド結合」は、一方のアミノ酸のα-アミノ基ともう一方のアミノ酸のα-カルボキシル基が結合している2個のアミノ酸間の共有結合である。
【００３１】
用語「プレタンパク質」とは、成熟タンパク質の前駆体である一次翻訳産物を意味する、すなわち、この場合にはタンパク質はプレタンパク質の翻訳後プロセッシングによって生じる。
【００３２】
用語「翻訳後プロセッシング」とは、細胞区画または細胞外区画において、成熟タンパク質を生じるために、プレタンパク質が供される修飾工程を意味する。
【００３３】
「シグナルペプチド」とは、分泌可能なタンパク質のプレタンパク質型として存在するアミノ酸の切断可能なシグナル配列である。細胞膜を通過して輸送される（すなわち「分泌される」）タンパク質は、典型的には約15〜30個のアミノ酸長の疎水性アミノ酸を多く含むN末端配列を有する。膜を通って通過するプロセスの間に、シグナルペプチダーゼによってシグナル配列が切断される場合もある（Alberts，B., Johnson，A., Lewis，J., Raff，M., Roberts，K., Walter, P.（編）Molecular Biology of the Cell, 第4版, 2002, Garland Science Publishing）。シグナルペプチドの多数の供給源が当業者には十分に公知であり、例えば、Saccharomyces cerevisiae由来のα因子シグナルペプチドのアミノ酸配列などを挙げることができる。別の例としては天然のウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIプレタンパク質のウシシグナルペプチドがある。一般に、本質的に全ての分泌タンパク質のプレタンパク質のＮ末端は、本発明における使用に好適なシグナルペプチドの供給源である可能性がある。シグナルペプチドはまたプレタンパク質を第1および第2の細胞区画に向かわせる２種のシグナルペプチドを含む二分性であってもよい。二分性シグナルペプチドは分泌経路の過程の間に段階的に切断される。従って、特定の例は、Saccharomyces cerevisiaeに由来するα因子のプレプロペプチドである（Watersら著、J. Biol. Chem. 263 （1988） p.6209-14）。
【００３４】
N末端シグナルペプチドを有するプレタンパク質は「分泌経路」に入るよう向けられる。分泌経路は翻訳後プロセッシングのプロセスを含み、最終的にタンパク質の分泌を生じる。グリコシル化およびジスルフィド結合の形成は、分泌前の分泌経路の一部であるプロセスである。本明細書では、メチロトローフ酵母株によって分泌されるタンパク質は分泌経路を通るということが理解される。
【００３５】
酵素ウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIを動物以外の宿主生物としてメチロトローフ酵母を用いて生産する。メチロトローフ酵母はメタノール利用に必要な生化学経路を有し、細胞形態および増殖特性に基づいて4つの属:Hansenula、Pichia、Candida、およびTorulopsisに分類される。最も高度に開発されたメチロトローフ宿主システムは、Pichia pastoris（Komagataella pastoris）およびHansenula polymorpha（Pichia angusta）を利用する。
【００３６】
酵母中での異種タンパク質の発現はUS5,618,676号、US5,854,018号、US5,856,123号およびUS5,919,651号に記載されている。
【００３７】
酵母という生物は細胞内で合成されるが細胞の外側で機能を有する多数のタンパク質を産生する。これらの細胞外タンパク質は分泌タンパク質と呼ばれる。最初に分泌タンパク質は細胞の内側で、発現産物を小胞体の膜を通過する細胞の分泌経路に確実に効率的に向かわせるN末端シグナルペプチドを含む前駆体またはプレタンパク質の形で発現される。一般に、シグナルペプチドは輸送の間に切断されて所望の産物となる。切断はシグナルペプチダーゼによってタンパク質分解的に行われる。シグナルペプチドのアミノ酸の特定のサブ配列がシグナルペプチダーゼによって認識されて切断される。このサブ配列はシグナルペプチダーゼ切断部位と呼ばれる。ひと度、分泌経路に入ると、タンパク質はゴルジ体に輸送される。タンパク質はゴルジ体から原形質膜、リソソームおよび分泌小胞へと分配される。
【００３８】
分泌タンパク質は細胞内タンパク質とは対照的に種々の環境条件に直面する。分泌経路のプロセスの一部は成熟しつつある細胞外タンパク質を安定化するためのものである。従って、酵母の分泌経路を通過するプレタンパク質は、特定の翻訳後プロセッシングを受ける。例えば、プロセッシングには、分子内架橋を形成するためのジスルフィド結合の生成が含まれ得る。さらに、タンパク質の特定のアミノ酸がグリコシル化されうる。
【００３９】
酵母にとって異種であるタンパク質の酵母中での発現および分泌については、いくつかのアプローチが示されている。EP0116201号は、酵母とは異種のタンパク質が、所望のタンパク質、シグナルペプチドおよびシグナルペプチダーゼ切断部位として作用するペプチドをコードするDNAを保有している発現ベクターによって形質転換されるプロセスを記載している。形質転換された生物の培養物を調製し増殖させ、培養培地からタンパク質を回収する。酵母細胞中での使用については、Saccharomyces cerevisiae由来のα因子シグナルペプチドが適切なシグナルペプチドであると認められている（US4,870,008号）。
【００４０】
本発明がなされたとき、驚くべきことに、天然のウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIプレタンパク質のウシシグナルペプチドもまた、プレタンパク質をメチロトローフ酵母の分泌経路に向けるために十分であることを見出した。従って、天然のウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIプレタンパク質のウシシグナルペプチドを、メチロトローフ酵母中で異種遺伝子産物を発現および分泌させるために使用することができる。
【００４１】
分泌の際には、酵母の酵素KEX-2はシグナルペプチダーゼであり、プレタンパク質中のその切断部位としてリジン-アルギニン配列を認識する。KEX-2は所望のタンパク質の配列の連結部を切断する。結果として、所望の遺伝子産物が放出され、そしてこれは、リーダー部分、すなわち、プレタンパク質のシグナルペプチドを含まない。KEX-2エンドプロテアーゼは最初にサッカロミセス酵母中で特徴づけられた。ここで、KEX-2エンドプロテアーゼは、接合型α因子の前駆体およびキラー因子を特異的にプロセッシングする（Julius, D.ら著、Cell 37（1984） p.1075-1089）。Pichia pastorisなどのメチロトローフ酵母種は、Saccharomyces cerevisiaeとKEX-2型プロテアーゼを共有する（同様の役割および機能）（Werten, M.W.ら著、Yeast 15 （1999） p.1087-1096）。
【００４２】
高レベル組換えタンパク質発現の宿主として例示的に記載される十分に確立されたメチロトローフ酵母種にはPichia pastorisがある（US4,683,293、US4,808,537、US4,812,405、US4,818,700、US4,837,148、US4,855,231、US4,857,467、US4,879,231、US4,882,279、US4,885,242、US4,895,800、US4,929,555、US5,002,876、US5,004,688、US5,032,516、US5,122,465、US5,135,868、US5,166,329、WO00/56903）。グルコースがない場合には、Pichia pastorisはメタノールを炭素源として用い、これは同時にメチロトローフ生物の特徴である。配列番号29で示されるアルコールオキシダーゼ（AOX1）プロモーターは、メタノール代謝の第1工程を触媒するアルコールオキシダーゼの発現を制御する。典型的に、メタノール誘導された細胞においては全可溶性タンパク質の30％がアルコールオキシダーゼである。いくつかのPichia発現ベクターはAOX1プロモーターを保有し、メタノールを用いて所望の異種タンパク質の高レベルでの発現を誘導する。また、発現構築物をPichia pastorisゲノムに組み込み、それにより形質転換された遺伝的に安定な宿主を作成する。
【００４３】
シグナルペプチドまたはシグナルペプチダーゼ切断部位を含むシグナルペプチドおよび所望のタンパク質を含む異種プレタンパク質をコードする発現ベクターを用いて、所望の産物を、分泌タンパク質を精製することができる増殖培地に分泌するようPichia pastoris株などのメチロトローフ酵母株を操作することができる。実質的に異なるコドン使用を有しているプレタンパク質をコードするヌクレオチド配列を得ることが有利であり得る。コドンは、特定のコドンが宿主によって利用される頻度に従って、特定の酵母発現宿主においてプレタンパク質の発現が生じる速度を高めるよう選択することができる。コードされるアミノ酸配列を変更せずにプレタンパク質をコードするヌクレオチド配列を実質的に変更する他の理由としては、自然界に存在している配列から産生される転写物よりも長い半減期のような、より望ましい特性を有するRNA転写物の産生が挙げられる。
【００４４】
発現に適格である、例えば、プロモーターまたはプロモーターエレメント、およびターミネーターまたはターミネーターエレメント、ならびに効率的な翻訳に必要とされる配列に対して作動可能に連結されたプレタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むベクターを用いて、宿主生物をベクターで形質転換し、形質転換体を選択する。次いで、形質転換体を増殖培地に分泌された組換えタンパク質の量に関して分析する。最も多量の酵素的に活性な組換えタンパク質を分泌する形質転換体を選択する。従って、最も高い比活性を有する活性なウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIを分泌する形質転換体を選択する。
【００４５】
一方では、発現量は、所望の産物の、例えば、Saccharomyces cerevisiae由来のα因子シグナルペプチドまたは天然のウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIプレタンパク質のウシシグナルペプチドなどのシグナルペプチドによる分泌経路への適切なターゲッティングに依存する。他方、発現量は所望の産物をコードする遺伝子の量を増大させこと、すなわち、宿主生物中の発現構築物のコピー数を増加させることによって増大させることができる。これを達成する1つの方法は、所望の産物をコードする発現ベクターの多重形質転換による。別の方法として第1および第2の発現ベクターを用いて所望の産物をコードする遺伝子を宿主生物に導入することであり、ここでは、第2の発現ベクターは第1の発現ベクターに用いられる選択マーカーとは異なる選択マーカーに基づいている。宿主生物がすでに第1の多コピーの発現ベクターを保有している場合にもなお、同一の所望される産物をコードする第2の発現ベクターを導入することができる（US5,324,639;Thill, G.P.ら著、Positive and Negative Effects of Multi-Copy Integrated Expression in Pichia pastoris, International Symposium on the Genentics of Microorganisms 2 （1990）, p.477-490）;Vedvick, T.ら著、（J. Ind. Microbiol. 7 （1991） p.197-201）;Werten, M.W.ら著,Yeast 15 （1999）p.1097-1096）。
【００４６】
発現されたウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIの増殖培地への分泌は、成熟組換えタンパク質を細胞質外空間へ向け、そこから増殖培地に拡散される。従って、液体培地中で増殖させたメチロトローフ酵母はウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIを液体増殖培地、すなわち、液体培養培地中に分泌する。これにより例えば、濾過技術を用いて組換えタンパク質からの酵母バイオマスの非常に効率的な分離が可能となる。結果として、この供給源から精製されたウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIは、RNaseまたはプロテアーゼ活性のような他の酵素活性から非常に効率的に取り除かれている。
【００４７】
高い酵素比活性はまた、ウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIの構造に依存している。真核生物のタンパク質構造の補正を成し遂げるには、タンパク質の折り畳み、分子内ジスルフィド結合の形成またはグリコシル化のようなプロセスが関与し得る。組換え発現のための真核宿主生物としてのメチロトローフ酵母が異種タンパク質をグリコシル化できることは公知である。メチロトローフ酵母によって分泌された組換えウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIはグリコシル化されていると推定される。さらに、加えて、メチロトローフ酵母の分泌経路の過程でジスルフィド結合が形成される可能性もあり得る。
【００４８】
驚くべきことに、ウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIがメチロトローフ酵母によって発現され、さらに増殖培地中に分泌される場合には、このことがデオキシリボヌクレアーゼ活性を有する膵臓タンパク質をもたらし、精製された膵臓タンパク質のデオキシリボヌクレアーゼ比活性は非常に高いということを見出した。
【００４９】
従って、本発明によれば、デオキシリボヌクレアーゼ活性を有するウシ膵臓タンパク質を生産する方法が提供される。この方法は、（a）ウシ膵臓タンパク質およびシグナルペプチドからなるプレタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むベクターを提供する工程、（b）メチロトローフ酵母株をこのベクターで形質転換する工程、（c）形質転換したメチロトローフ酵母株を、メチロトローフ酵母株がウシ膵臓タンパク質を発現しさらにそれを増殖培地中に分泌する、栄養分およびメタノールを含有する増殖培地で培養する工程、（ｄ）増殖培地からウシ膵臓タンパク質を精製する工程、ここでウシ膵臓タンパク質はウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIであり、デオキシリボヌクレアーゼ活性を有し、工程（d）で精製されたウシ膵臓タンパク質は1mgのタンパク質当たり少なくとも6,000ユニットのデオキシリボヌクレアーゼ比活性によって特徴づけられる、を含む。
【００５０】
従って、工程（d）で精製された1mgのタンパク質当たり少なくとも6,000ユニットのデオキシリボヌクレアーゼ比活性を有するウシ膵臓タンパク質を生産する方法が提供される。この方法は、（a）ウシ膵臓タンパク質およびシグナルペプチドからなるプレタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むベクターを提供する工程、（b）メチロトローフ酵母株をこのベクターで形質転換する工程、（c）形質転換したメチロトローフ酵母株を、栄養分およびメタノールを含有する増殖培地で培養する工程、ここでメチロトローフ酵母株がウシ膵臓タンパク質を発現し、さらにそれを増殖培地中に分泌する、および（ｄ）増殖培地からウシ膵臓タンパク質を精製する工程を含む。
【００５１】
従って、本方法はメチロトローフ酵母株中で異種プレタンパク質として発現され、成熟タンパク質として増殖培地中に分泌された、ウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIである精製されたウシ膵臓タンパク質を生じる。従って、本発明の非常に好ましい実施形態では、ウシ膵臓タンパク質のアミノ酸配列は配列番号１であり、これはメチロトローフ酵母の好ましいコドンを含むヌクレオチド配列である。
【００５２】
詳細に記載されるもの以外の酵母由来であるならびに酵母以外に由来する真核生物のシグナルペプチドを同じ目的のために使用することができる。シグナルペプチドがシグナルペプチダーゼによって切断可能ではない場合には、シグナルペプチダーゼ切断ペプチドを、シグナルペプチドのアミノ酸配列とウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIポリペプチドのアミノ酸配列の間であるプレタンパク質のアミノ酸配列中に挿入することができる。従って、本発明のさらに別の非常に好ましい実施形態では、シグナルペプチドはウシ膵臓タンパク質の最初のアミノ酸のすぐ隣りに位置するシグナルペプチダーゼ切断部位を含む。
【００５３】
非常に好ましいシグナルペプチドとしては配列番号2、配列番号3または配列番号4のプレタンパク質のシグナルペプチドがある。従って、本発明の別の非常に好ましい実施形態では、発現されるプレタンパク質のアミノ酸配列は（a）配列番号2、（b）配列番号3および（c）配列番号4からなる群から選択される。従って、ベクターはメチロトローフ酵母、特にPichia pastoris中で発現された場合に分泌経路に入るウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIプレタンパク質のアミノ酸配列をコードする。
【００５４】
異種タンパク質の翻訳効率は、異種タンパク質をコードするヌクレオチド配列のコドンを宿主生物に好ましいコドンに従って適応させることによって改善することができる。本発明のさらに別の非常に好ましい実施形態では、ウシ膵臓タンパク質をコードするヌクレオチド配列は配列番号5である。従って、配列番号5のヌクレオチド配列は、メチロトローフ酵母（特に、Pichia、さらにより詳しくはPichia pastoris）において好ましいコドンによって構成されている。
【００５５】
本発明の好ましい実施形態では、プレタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、ウシ膵臓タンパク質をコードするヌクレオチド配列に融合させられたシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列からなる。本発明の非常に好ましい実施形態では、シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列は、（a）配列番号6、（b）配列番号7および（c）配列番号8からなる群より選択される。配列番号6は天然のウシ膵臓DNアーゼIプレタンパク質のシグナルペプチドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列である。配列番号7は、天然のウシ膵臓DNアーゼIプレタンパク質のシグナルペプチドおよびさらなるシグナルペプチダーゼ切断部位のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列である。配列番号8は、Saccharomyces cerevisiae由来のα因子のシグナルペプチドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列である。このシグナルペプチドは、二分性シグナルペプチドである。従って、本発明のさらに別の非常に好ましい実施形態では、ヌクレオチド配列は（a）配列番号2、（b）配列番号3および（c）配列番号4からなる群から選択されるプレタンパク質をコードする。さらに、シグナルペプチドの多くの供給源は当業者には十分に公知である。一般に、本質的に全ての分泌タンパク質のプレタンパク質N末端をコードするヌクレオチド配列は、本発明のウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIプレタンパク質のシグナルペプチドをコードする好ましいヌクレオチド配列である可能性がある。
【００５６】
本発明のさらに好ましい実施形態では、プレタンパク質をコードするヌクレオチド配列が、プロモーターまたはプロモーターエレメントに作動可能に連結される。
【００５７】
また、プロモーターまたはプロモーターエレメントがメチロトローフ酵母株中で、プロモーターまたはプロモーターエレメントが作動可能に連結されているプレタンパク質をコードするヌクレオチド配列の転写を刺激することも好ましい。Pichia pastoris由来のプロモーターまたはプロモーターエレメントが非常に好ましく、配列番号29で示されるPichia pastoris AOX1プロモーターがさらにより好ましい。さらに、プレタンパク質をコードするヌクレオチド配列がメチロトローフ酵母株中で転写を終結させるターミネーター配列と作動可能に連結されることもまた好ましい。Pichia pastoris由来のターミネーターが非常に好ましく、Pichia pastoris AOX1ターミネーターがさらにより好ましい。
【００５８】
本発明のさらに好ましい実施形態では、ベクターはメチロトローフ酵母株中でエピソームとして複製され得るプラスミドである。従って、好ましいプラスミドは、メチロトローフ酵母株でエピソームの複製を指示する複製起点を含む環状核酸分子である。さらに、プラスミドはメチロトローフ酵母株中で発現される選択マーカーを含み、この選択マーカーによってメチロトローフ酵母株中でのプラスミドの存在についての選択が可能となる。非常に好ましい選択マーカーは、Streptoalloteichus hindustanus由来のSh ble遺伝子の天然型または遺伝子操作された変異体であるゼオシン（Zeosin）（登録商標）耐性遺伝子である（Drocourt, D.ら著、Nucleic Acids Res. 18 （1990） p.4009 ;Carmels, T.ら著、Curr. Genet. 20 （1991） p.309-314）。別の非常に好ましい選択マーカーはハイグロマイシンおよびG418のようなアミノ配糖体抗生物質に対する耐性を付与する（Southern, P.J.およびBerg, P.著、J. Mol. Appl. Genet. 1 （1982） p.327-341）。このような選択マーカーの例として、アミノ配糖体ホスホトランスフェラーゼ遺伝子が挙げられる。
【００５９】
本発明のさらに好ましい実施形態では、メチロトローフ酵母株中で複製され得る人工染色体がベクターを含む。従って、好ましい人工染色体は、それによってメチロトローフ酵母株における人工染色体の複製、完全性および有糸分裂／減数分裂分布を制御する、少なくとも1つの複製起点、セントロメアおよび末端テロメアを含む直鎖状核酸分子である。さらに、人工染色体に含まれるベクターはメチロトローフ酵母株中で発現され、メチロトローフ酵母株中で複製される人工染色体中のベクターの存在についての選択を可能にする選択マーカーを含む。非常に好ましい選択マーカーは、Streptoalloteichus hindustanus由来のSh ble遺伝子の天然型または人工的な変異体である、ゼオシン（登録商標）耐性遺伝子である。別の非常に好ましい選択マーカーはハイグロマイシンおよびG418のようなアミノ配糖体抗生物質に対する耐性を付与する。このような選択マーカーの例は、アミノ配糖体ホスホトランスフェラーゼ遺伝子である。
【００６０】
本発明のなおさらに好ましい実施形態では、メチロトローフ酵母株の染色体がベクターを含む。ベクターが染色体配列と同一のヌクレオチド配列を有することが非常に好ましく、これによって、部位特異的組換えによる宿主染色体中へのベクターの組み込みが可能となる。この目的には、Pichia pastoris AOX1遺伝子座が、部位特異的組換えによる宿主染色体への組み込み遺伝子座としていっそうより好ましい。また、ベクターがメチロトローフ酵母株中で発現され、メチロトローフ酵母株中でのベクターの存在についての選択を可能にする選択マーカーを含むことも非常に好ましい。非常に好ましい選択マーカーは、Streptoalloteichus hindustanus由来のSh ble遺伝子の天然型または人工的な変異体である、ゼオシン（登録商標）耐性遺伝子である。別の非常に好ましい選択マーカーは、ハイグロマイシンおよびG418などのアミノ配糖体抗生物質に対する耐性を付与する。このような選択マーカーの例は、アミノ配糖体ホスホトランスフェラーゼ遺伝子である。
【００６１】
当業者は、ウシ膵臓タンパク質が発現され分泌されるプレタンパク質をコードするヌクレオチド配列のコピー数を増大させると、液体増殖培地のような増殖培地から得ることができる分泌されたウシ膵臓タンパク質の収量を増大させることができるという事実を認識している。従って、メチロトローフ酵母株のゲノム中のベクターのコピー数を増加させれば、増殖培地から得られる分泌されたウシ膵臓タンパク質の収量を増大させることができる。例えば、ベクターのコピー数は、メチロトローフ酵母株をベクターの形質転換の繰り返し、およびベクターに含まれる選択マーカーがそれに対する耐性を付与する選択剤の漸増濃度を用いる選択ラウンドの繰り返しを行うことによって増大させることができる（US5,324,639;Thill, G.P.ら著、Positive and Negative Effects of Multi-Copy Integrated Expression in Pichia pastoris, International Symposium on the Genentics of Microorganisms 2 （1990）, p.477-490;Vedvick, T.ら著、J. Ind. Microbiol. 7 （1991） p.197-201）。
【００６２】
また、当業者は、形質転換の繰り返しを、1種よりも多いベクターを用いて行うことができるという事実を認識している。例えば、形質転換の繰り返しは、同一のプレタンパク質をコードし、第1および第2のベクター中においてプレタンパク質をコードするヌクレオチド配列がプロモーターまたはプロモーターエレメントと作動可能に連結されており、同一のウシ膵臓タンパク質が発現され、さらに分泌され、第1および第2の選択マーカーに対する耐性を付与する、第1および第2のベクターを用いて実施することができる。
【００６３】
第1の選択マーカーの例は、ゼオシン（登録商標）耐性遺伝子であるSh ble遺伝子である（Drocourt, D.ら著、Nucleic Acids Res. 18 （1990） p.4009; Carmels, T.ら著、Curr. Genet. 20 （1991） p.309-314）。Sh ble遺伝子によってコードされるタンパク質はゼオシン（登録商標）と化学量論的におよび強力な親和性で結合する。ゼオシン（登録商標）の結合はその毒性活性を阻害し、それによってSh ble遺伝子を含有する形質転換体を選択する。当業者には、培地中の選択剤としてのゼオシン（登録商標）の濃度を増大させることによって、Sh ble遺伝子を発現するベクターのコピー数の増大が選択されることが公知である。従って、形質転換の繰り返しによって、多コピーのベクターを含有する複数のメチロトローフ酵母株を作成するためには、選択マーカーとしてSh ble遺伝子を含むベクターを用いることが有利である。ゼオシン（登録商標）に対する耐性レベルをそれ以上は高めない形質転換メチロトローフ酵母株が得られるか、または選択培地中のゼオシン（登録商標）濃度をさらにそれ以上は高めることができなくなるまで、形質転換を繰り返し、さらにより耐性である形質転換体の選択を繰り返すことがさらに有利である。
【００６４】
第1および第2のベクターを用いる場合には、第2の選択マーカーの例は、G418のような、アミノ配糖体抗生物質に対する耐性である（Southern, P.J.およびBerg, P.著、J. Mol. Appl. Genet. 1 （1982） p.327-341）。従って、例示的な第2のベクターは、G418に対する耐性を付与する耐性遺伝子を発現する。例えば、アミノ配糖体抗生物質に対する耐性を付与するいくつかのアミノ配糖体ホスホトランスフェラーゼが、当技術分野で公知である（van Treeck, U.ら著、Antimicrob Agents Chemother. 19 （1981） p.371-381；Beck, E.ら著、Gene 19 （1982） p.327-336）。アミノ配糖体ホスホトランスフェラーゼI（APH-I）酵素は抗生物質G418を不活性化する能力を有し、酵母において確立された選択マーカーである（Chen, X.J.およびFukuhara, H.著、Gene （1988） p.181-192）。
【００６５】
従って、ウシ膵臓タンパク質が発現され、さらに分泌されるプレタンパク質をコードするヌクレオチド配列の量をさらに増大させる目的のために、形質転換および選択のさらなるラウンドのために第2のベクターを用いることが有利であり、この場合、好ましい選択剤はG418であり、形質転換には第1のベクターで形質転換されたメチロトローフ酵母株を用いる。
【００６６】
本発明のなおさらに好ましい実施形態では、メチロトローフ酵母株は、Hansenula、Pichia、Candida、またはTorulopsis種である。本発明の非常に好ましい実施形態では、メチロトローフ酵母株は、Pichia pastoris、Hansenula polymorpha、Candida boidinii、およびTorulopsis glabrataからなる群から選択される。
【００６７】
いっそうより好ましいPichia pastoris株は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ATCC）に登録番号201178、201949、204162、204163、204164、204165、204414、204415、204416、204417、20864、28485、34614、60372、66390、66391、66392、66393、66394、66395、76273、76274および90925で寄託されている。
【００６８】
さらに、いっそうより好ましいメチロトローフ酵母株は、アメリカンタイプカルチャーコレクション登録番号76273のPichia pastoris株またはその誘導体である。
【００６９】
いっそうより好ましいHansenula polymorpha株は、アメリカンタイプカルチャーコレクションに登録番号14754、200499、200500、200501、200502、200503、200504、200505、200506、200507、200508、200509、200510、200511、200512、200513、200838、200839、201322、204205、22023、26012、34438、36669、38626、44954、44955、46059、48180、58401、62809、64209、66057、76722、76723、76760、90438、96694、96695、MYA-335、MYA-336、MYA-337、MYA-338、MYA-339およびMYA-340で寄託されている。
【００７０】
いっそうより好ましいCandida boidinii株はアメリカンタイプカルチャーコレクションに登録番号18810、201209、20432、26175、32195、32929、36351、38256、38257、44637、46498、48180、56294、56507、56897、60364、62807、90439、90441、96315および96926で寄託されている。
【００７１】
いっそうより好ましいTorulopsis glabrata株はアメリカンタイプカルチャーコレクションに登録番号15126、15545、2001、22019、26512、28226、28290、32312、32554、32936、34147、34449、36909、38326、4135、46433、48435、58561、66032、750および90030で寄託されている。
【００７２】
当業者はウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIのクロマトグラフィーによる精製に関しては精通している（Funakoshi, A.ら著、J. Biochem. （Tokyo） 88 （1980） p.1113-1138；Paudel, H.K.およびLiao, T.H.著、J. Biol. Chem. 261 （1986） p.16006-16011；Nefsky, B.およびBretscher, A.著、Eur. J. Biochem. 179 （1989） p.215-219）。しかし、形質転換されたメチロトローフ酵母株によって増殖培地中に分泌されたウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIはイオン交換クロマトグラフィーを用いて精製すること好ましい。イオン交換クロマトグラフィーの固相としては、陽イオン交換体が非常に好ましいの。本発明の好ましい実施形態では、ウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIは伝導率の低い液相で二価の陽イオンおよびアセテートの存在下で（すなわち、伝導率の低い結合緩衝液中で）、陽イオン交換体に結合する。好ましい二価の陽イオンは、Mg2＋、Ca2+またはMn2+である。低伝導率として好ましいのは、0.5〜10mS/cmの範囲である。低伝導率として非常に好ましいのは、1〜5mS/cmの範囲である。低伝導率としていっそうより好ましいのは、2〜3mS/cmの範囲である。また、結合緩衝液がプロテアーゼインヒビターを含むことも好ましい。さらに、結合緩衝液が酸性pHを有することも好ましい。好ましいpHは4.5と6.9の間の範囲にある。いっそうより好ましいのはpH5.0である。他のタンパク質は、ウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIが固相（すなわち、陽イオン交換体）に結合させられたままである伝導率の低い結合緩衝液で固相を反復して洗浄することによって、ほぼ完全に除去することができる。本発明の別の好ましい実施形態では、ウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIの溶出は二価の陽イオンおよびアセテートの存在下で伝導率の高い溶出緩衝液を用いて達成され、この場合、小さい溶出容量が有利である。好ましい二価の陽イオンは、Mg2＋、Ca2+またはMn2+がある。また、溶出緩衝液中の0.3MのNaClの濃度も好ましい。溶出緩衝液がプロテアーゼインヒビターを含むこともさらに好ましい。さらに、溶出緩衝液が酸性のpHを有することも好ましい。好ましいpHは4.5と6.9の間の範囲にある。pH5.0がいっそうより好ましい。高伝導率として好ましいのは10〜60mS/cmの範囲である。高伝導率として非常に好ましいのは20〜50mS/cmの範囲である。高伝導率としていっそうより好ましいのは30〜40mS/cmの範囲である。さらに好ましいのは、結合緩衝液（すなわち、前記のような伝導率の低い緩衝液）で固層の洗浄を繰り返すことであり、これによって約95％よりも高い純度のウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIの溶出を達成する。純度はゲルをクマシー・ブルーを用いて染色するSDS PAGEによって調べられる。また、ヘパリンセファロースを用いるアフィニティークロマトグラフィーを含むさらなる精製工程も非常に好ましい。このさらなる工程を用いて、当業者は、ゲルをクマシーブルーを用いて染色するSDS PAGEによって調べられる、ウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIの約98％の純度を達成する。アフィニティー精製したウシ膵臓タンパク質のデオキシリボヌクレアーゼ比活性は1mgのタンパク質当たり少なくとも6,000ユニットである。
【００７３】
本発明のなお別の好ましい実施形態は、配列番号29のPichia pastoris AOX1プロモーターまたはそのプロモーターエレメントと作動可能に連結された、ウシ膵臓タンパク質およびシグナルペプチドからなるプレタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有しているベクターを含む染色体を含むPichia pastoris株である。ここでは、プレタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号5と融合された、配列番号7または配列番号8である。
【００７４】
本発明のなお別の好ましい実施形態は、以下の方法によって得られる、1mgのタンパク質当たりのデオキシリボヌクレアーゼ比活性が少なくとも6,000ユニットであるウシ膵臓タンパク質である。この方法は、（a）ウシ膵臓タンパク質およびシグナルペプチドからなるプレタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むベクターを提供する工程、（b）メチロトローフ酵母株をこのベクターで形質転換する工程、（c）形質転換したメチロトローフ酵母株を、メチロトローフ酵母株がウシ膵臓タンパク質を発現しさらにそれを増殖培地中に分泌する、栄養分およびメタノールを含む増殖培地で培養する工程、（ｄ）ウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIであり、デオキシリボヌクレアーゼ活性を有するウシ膵臓タンパク質を増殖培地から精製するという工程を含む。
【００７５】
本発明の別の非常に好ましい実施形態は、デオキシリボヌクレアーゼ比活性が1mgのタンパク質当たり少なくとも6,000ユニットであり、そのデオキシリボヌクレアーゼ比活性の少なくとも50％を75℃での60分間の熱インキュベーション後も保持する、ウシ膵臓タンパク質である。熱インキュベーションの間は、ウシ膵臓タンパク質は、20mMのTrisHCl、2mMのMgCl2、4mMのCaCl2、50％グリセロール、pH7.6を含有する貯蔵緩衝液中に溶解させられる。
【００７６】
本発明のなお別の好ましい実施形態は、DNAを加水分解するための、1mgのタンパク質当たり少なくとも6,000ユニットのデオキシリボヌクレアーゼ比活性を有するウシ膵臓タンパク質の使用である。
【００７７】
本発明のなお別の好ましい実施形態はデオキシリボヌクレアーゼ比活性が1mgのタンパク質当たり少なくとも6,000ユニットであるウシ膵臓タンパク質および二価の陽イオンを含む反応緩衝液を含む、パーツのキットである。本発明のなお別の非常に好ましい実施形態は、ウシ膵臓タンパク質が水、グリセロール、プロテアーゼインヒビターおよび二価の陽イオンを含有している貯蔵緩衝液に溶解させられ、反応緩衝液がMg2＋、Ca2+およびMn2+からなる群から選択される二価の陽イオン含む、パーツのキットである。
【００７８】
本発明の方法はウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIの精製の別の方法を示す。さらに、これにより、非常に高い比活性を有する活性なウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼI酵素の産生および精製が可能である。
【００７９】
以下の実施例、参照文献、配列表および図面は本発明の理解を助けるために提供されるもので、その真の範囲は添付の特許請求の範囲に示されている。本発明の精神から逸脱することなく、示される手順の改変が行われ得ることが理解される。
【実施例１】
【００８０】
成熟ウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIタンパク質をコードする酵母に適応させたヌクレオチド配列の合成
概ね、Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning, A Laboratory Manual,第3版, CSHL Press, 2001に記載されている分子生物学の標準的な方法を適用した。
【００８１】
各コドンを酵母における使用に最適化するために、コードベクターを新たに合成した。成熟ウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIタンパク質の配列は配列番号１に示し、これは260個のアミノ酸からなる。逆翻訳により停止コドンを含む783塩基対のヌクレオチド配列を得た。酵母に適応させたコード配列は配列番号５に示す。コード配列を、42ヌクレオチドから72ヌクレオチドの間の長さである18のDNAオリゴヌクレオチドに分割した。隣接する断片と相補的な5'および3'重複を有する別のコード鎖および非コード鎖の一連の断片として、一本鎖DNAオリゴヌクレオチドを設計した。このように用いるDNAオリゴヌクレオチドを、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25および配列番号26に示す。重複領域は、アニーリング反応の際の非特異的結合が大きく抑制されるように選択した。コード配列の上流および下流に位置する、配列番号1をコードする配列の5'末端および3'末端に相当するDNAオリゴヌクレオチドには、人工ヌクレオチド配列の発現ベクターへの挿入を容易にするために制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含めた。配列番号１をコードする配列の上流5'末端にXhoI切断部位とSaccharomyces cerevisiae由来のα因子シグナルペプチドのC末端の2個のアミノ酸のコドンを加えた。停止コドンの下流、すなわち、配列番号１をコードする配列の3'末端に、NotIおよびBglII切断部位を加えた。
【００８２】
DNAオリゴヌクレオチドからポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって3種の大きなDNA断片を個別に合成した。第1の反応は配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13および配列番号14で示されるDNAオリゴヌクレオチドを含んでなっていた。第2の反応は配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19および配列番号20で示されるDNAオリゴヌクレオチドを含んでなっていた。第3の反応は配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25および配列番号26で示されるDNAオリゴヌクレオチドを含んでなっていた。PCRの過程では、各サイクルにおいて重複している末端がアニーリングし、相補DNA鎖が合成された。従って、DNAオリゴヌクレオチドを断片の最終的な長さに到達するまで段階的に伸張させた。このためのアニーリング温度は重複領域の必要性に従って選択した。すなわち、最も低い融解温度を有する領域によりアニーリング温度を決定した。続くサイクルの間にこの最終断片を増幅した。
【００８３】
アガロースゲル電気泳動によって、3種の大きなDNA断片をいずれかの副生成物から分離した。所望の断片に相当するゲルバンドを切り出し、「QIAquick Gel Extraction Kit（Qiagen カタログ番号28704）」を用いてアガロースブロックからDNAを単離した。次いで、3種の大きなDNA断片を前記と同様の様式でさらなるPCRで結合させて、成熟ウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIタンパク質をコードする完全なベクターを合成した。第1回目の5回のPCRサイクルでは、3種の大きなDNA断片を用い、いずれのさらなるプライマーも加えなかった。再度、アニーリング温度は重複領域、すなわち、最も低い融解温度を有する領域の必要性に従って選択した。次いで、完全人工ヌクレオチド配列の末端に相当する2つのDNAオリゴヌクレオチドを加えた。アニーリング温度は加えたプライマーの必要性に従って上げた、すなわち、最も低い融解温度を有するプライマーがアニーリング温度を決定する。完全人工ヌクレオチド配列を25回のPCRサイクルの過程で増幅した。
【００８４】
次いで、成熟ウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIタンパク質をコードする完全DNA断片をクローニングベクターに挿入し、従来技術を用いて大腸菌で増殖させた（Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning, A Laboratory Manual,第3版, CSHL Press, 2001）。完全DNA断片のヌクレオチド配列を配列決定によって確認した。
【実施例２】
【００８５】
天然のウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIプレタンパク質のウシシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列のクローニング
概ね、Invitrogenマニュアル 「Pichia Expressiom Kit」 Version M 011102 25-0043、「pPICZ A、BおよびC」 Version D 110801 25-0148、「pPICZαA、BおよびC」 Version E 010302 25-0150および「pPIC9K」 Version E 030402 25-0106に示唆および記載される方法を適用した。そこに記載されているさらなるベクター、酵母株および培地も参考にした。Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 第3版, CSHL Press, 2001に記載されるような分子生物学の基本的な方法を適用した。
【００８６】
天然のウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIプレタンパク質のウシシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を提供するために、2つの相補的な一本鎖DNAオリゴヌクレオチドを合成した。実施例１と同様に、コドンはメチロトローフ酵母において好ましいコドン使用に従って設計した。用いたDNAオリゴヌクレオチドを、配列番号27、配列番号28に示す。DNAオリゴヌクレオチドの5'末端は、アニーリングした（すなわち、二本鎖の）核酸が、制限エンドヌクレアーゼSfuIおよびXhoIでの切断によって生じる突出と同一の末端突出を有するように設計した。突出の方向性は、コード鎖がその5'末端に配置されたSfuI部位を有し、かつその3'末端に配置されたXhoI部位を有するようにした。コード配列の上流には宿主生物中での効率的な翻訳開始を促進するように、最適Kosak配列を挿入した。
【００８７】
2つのDNAオリゴヌクレオチドの各々の5μgを、10mMのTrisHCl pH7.5、10mMのMgCl2、50mMのNaCl、1mMのジチオスレイトール中に溶解させ100℃で5分間加熱して、好ましくない二次構造および不ぞろいなハイブリダイゼーション産物を分解させた。次いで、混合物を室温までゆっくりと冷却させることによってハイブリダイゼーションを起こさせた。二本鎖の核酸をアガロースゲル中で分析し、SfuIおよびXhoIで予め直鎖状にした発現ベクターpPICZA（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）とのライゲーション反応に直接用いた。次いで、天然のウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIプレタンパク質のウシシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を保有している得られたベクターを、制限酵素消化およびアガロースゲル電気泳動によって、ならびに配列決定によって分析した。
【実施例３】
【００８８】
種々の発現ベクターにおける成熟ウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIをコードする人工ベクターのクローニング
概ね、Invitrogenマニュアル 「Pichia Expressiom Kit」 Version M 011102 25-0043、「pPICZ A、BおよびC」 Version D 110801 25-0148、「pPICZαA、BおよびC」 Version E 010302 25-0150および「pPIC9K」 Version E 030402 25-0106に示唆および記載される方法を適用した。そこに記載されているさらなるベクター、酵母株および培地も参考にした 。Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning, A Laboratory Manual,  第3版, CSHL Press, 2001に記載されるような分子生物学の基本的な方法を適用した。
【００８９】
PCR断片から作製した成熟ウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIをコードする人工DNA断片（実施例１参照）をXhoIおよびBglII（Roche Diagnostics GmbH）で切り出した。この断片を、「QIAquick Gel Extraction Kit」を製造業者の使用説明書に従って用いて単離した。
【００９０】
例1:断片をpPICZAベクターにライゲーションして、成熟ウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIをコードするヌクレオチド配列を天然のウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIプレタンパク質のウシシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列（実施例2参照）に融合させた。ライゲーションに先立って、ベクターを同様にXhoIおよびBglIIで切断して単離した。
【００９１】
例2:断片をpPICZαAベクターにライゲーションして、成熟ウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIをコードするヌクレオチド配列をSaccharomyces cerevisiae由来のα因子シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列に融合させた。ライゲーション反応に先立って、ベクターを同様にXhoIおよびBglIIで切断して単離した。
【００９２】
例1で行ったクローニング手順により、ロイシン-グルタミン酸-リジン-アルギニンをコードするリンカー配列を、天然のウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIタンパク質前駆体のウシシグナルペプチドと成熟タンパク質をコードする配列との間のリーディングフレームに挿入した。ロイシン-グルタミン酸配列はXhoI部位（CTCGAG）によって挿入した。リジン-アルギニン配列が分泌経路の過程におけるタンパク質前駆体からのシグナルペプチドの切断に必要な、KFX-2シグナルペプチダーゼ切断部位に相当することは公知である。リシン-アルギニン配列のヌクレオチド配列は配列番号7に含まれ、配列番号3のシグナルペプチドアミノ酸配列に相当する。例2で行ったクローニング手順により、成熟ウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIをコードするヌクレオチド配列を、Saccharomyces cerevisiae由来のα因子シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列のすぐ後ろにインフレームで挿入した。
【００９３】
両方の例において、組換えタンパク質前駆体をコードするヌクレオチド配列を、メタノールによって誘導可能なP. pastoris AOX-1プロモーター（配列番号29）の制御下においた。
【００９４】
構築は、総容量10μl中で、20ngの直鎖上にしたベクター断片（1μLの容量中）、100ngのPCR断片（3μl中）を混合し、T4 DNAリガーゼ（Roche Diagnostics GmbH）の存在下で製造業者の使用説明書に従って16℃にて一晩インキュベーションすることにより達成した。次いで、5μlのライゲーション調製物を用いて総容量205μl中でコンピテント（Hanahan, 1983）E. coli XL1 Blue細胞（Stratagene）を形質転換した。氷上で30分間インキュベーションした後、細胞を42℃で90秒間熱ショック処理した。次いで、細胞を1mlのLB培地に移し、37℃にて１時間インキュベートして選択マーカーを発現させた。その後、アリコートを100μg/mlのゼオシンを含有するLBプレートにプレーティングして37℃にて15時間インキュベートした。耐性クローンを選び取り、プラスミドを単離し（Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning, A Laboratory Manual,第３版、CSHL Press, 2001）、制限分析ならびに配列分析によって調べた。構築物クローンがエラーを含んでいないことを確認し、クローニング人工産物を選択した。ウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIをSaccharomyces cerevisiae由来のα因子シグナルペプチドとともに保有している発現ベクターをpDNASE-1とし、ウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIを天然のウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIタンパク質前駆体のウシシグナルペプチドとともに保有している発現ベクターをpDNASE-4とした。
【実施例４】
【００９５】
Pichia pastorisのpDNASE-1およびpDNASE-4での形質転換
概ね、Invitrogenマニュアル 「Pichia Expressiom Kit」 Version M 011102 25-0043、「pPICZ A、BおよびC」 Version D 110801 25-0148、「pPICZαA、BおよびC」 Version E 010302 25-0150および「pPIC9K」 Version E 030402 25-0106に示唆されるおよび記載される方法を適用した。そこに記載されているさらなるベクター、酵母株および培地も参考にした 。Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning, A Laboratory Manual,第3版, CSHL Press, 2001に記載されるような分子生物学の基本的な方法を適用した。
【００９６】
用いた宿主株はPichia pastoris X-33、GS115、KM71HおよびSMD 1168（Invitrogen）であった。好ましい株はX-33およびKM71Hであった。形質転換は宿主生物のゲノムに発現構築物を安定に組換えることを目的とした。
【００９７】
最初に、P. pastorisコロニーを、含む5mlのYPD培地（YPD=イースト・ペプトン・デキストロース;Invitrogen）に播種し、30℃にてシェーカーで一晩前培養した。形質転換コンピテント細胞を調製するために、100μlの前培養物を種菌として200mlの新しいYPD培地に加えて1.3と1.5の間のOD600nmに到達するまで増殖させた。細胞を1,500×gで5分間遠心分離して200mlの氷冷（０℃）滅菌水中に再懸濁させた。細胞を再び1,500×gで5分間遠心分離して100mlの氷冷滅菌水中に再懸濁させた。細胞をもう一度1,500×gで5分間遠心分離して10mlの氷冷1Mソルビトール（ICN）中に再懸濁させた。このように調製した細胞を氷上に維持し、直ちに形質転換に用いた。
【００９８】
形質転換に使用した発現ベクターpDNASE-1およびpDNASE-4は、SacI制限エンドヌクレアーゼ（Roche Diagnostics GmbH）を用いて直鎖状にし、沈殿させて水中に再懸濁させた。形質転換は、「Gene Pulser II（登録商標）」（BioRad）を用いてエレクトロポレーションによって達成した。形質転換のセッティングには、1Mのソルビトール溶液中の80μlのP. pastoris細胞を１μgの直鎖状にした発現ベクターDNAとゆっくりと混合させて氷冷したキュベット中に移し、次いでこれを氷上で5分間維持した。次いで、このキュベットをGene Pulserに移した。エレクトロポレーションのパラメーターは1kV、1kΩおよび25μFとした。エレクトロポレーション後、細胞懸濁液に1mlの1Mのソルビトール溶液を加え、次いで、100μg/mlのゼオシン（登録商標）（Invitrogen）を含有しているYPDSプレート（YPDS=イースト・ペプトン・デキストロース・ソルビトール;Invitrogen）上にプレーティングし、単一のプレートに100〜150μlの細胞懸濁液を拡げた。YPDSプレートを30℃にて2〜4日間インキュベートした。酵母クローンをグリッド入り最小デキストロースプレートに移した。これらのプレートからコロニーを選び取り、別々に滅菌水中に再懸濁した。細胞を17.5ユニットのリチカーゼ（Roche Diagnostics GmbH）で30℃にて1時間消化し、その後-80℃で10分間凍結させた。PCRによって、pDNASE-1およびpDNASE-4の発現カセットの存在を確認した。用語「発現カセット」とは、AOX1プロモーターおよびAOX1ターミネーターに対して作動可能に連結されたウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIプレタンパク質をコードするヌクレオチド配列を示し、ここで発現カセットを形質転換に用いるそれぞれのpDNASEベクターに由来する。発現カセットを含むベクターについては、用語「ベクター」と「発現ベクター」は同義語である。
【００９９】
陽性クローン、すなわち、ゲノム中に安定に組み込まれた完全な発現カセットの存在について陽性と調べられたクローンをウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼI発現のさらなる特性決定に用いた。
【０１００】
さらに、レシピエントであるPichia pastoris X33株でpPICZαAベクターを用いて対照形質転換を行った。陽性クローンを得、同様に確認した。
【実施例５】
【０１０１】
組換えウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIの発現および分泌、異なるシグナルペプチドを含むプレタンパク質の分析
概ね、Invitrogenマニュアル 「Pichia Expression Kit」 Version M 011102 25-0043、「pPICZ A、BおよびC」 Version D 110801 25-0148、「pPICZαA、BおよびC」 Version E 010302 25-0150および「pPIC9K」 Version E 030402 25-0106に示唆されるおよび記載される方法を適用した。そこに記載されているさらなるベクター、酵母株および培地も参考にした 。Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning, A Laboratory Manual,第3版, CSHL Press, 2001に記載されるような分子生物学の基本的な方法を適用した。
【０１０２】
pDNASE-1およびpDNASE-4で形質転換した1セットの陽性クローン（通常、20〜30個）（実施例4を参照）を、それぞれ3mlのBMGY培地（BMGY=緩衝グリセロール複合体培地;Invitrogen）中で振盪培養物として一晩増殖させた。その後、培養物のOD600nm値を測定し、次いで各々10mlのpH3のBMMY培地（Invitrogen）を含む振盪フラスコに継代した。種菌として前培養物を用い、それぞれ1のOD600nmとなるようにした。培養は30℃のシェーカー上で維持した。平行して、同一条件下で陽性対照クローンを培養した。
【０１０３】
BMMY（BMMY=緩衝メタノール複合体培地;）培地は、発現ベクターに挿入された組換えウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼI配列の転写を制御するAOX−1プロモーターの誘導因子であるメタノール（Mallinckrodt Baker B.V.）を含む。
【０１０４】
全72時間にわたって24時間間隔で振盪フラスコから500μlのサンプルを採取した。サンプルのアリコートを採取する時に、培養物に0.5％メタノールも与えた。上清増殖培地のサンプルをデオキシリボヌクレアーゼ酵素活性について調べた。
【実施例６】
【０１０５】
組換えウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIの発現の分析
実施例5に記載したように得たサンプルのアリコートについて、まずOD600nmを測定した。次いで、細胞を遠心分離によってペレットとし、上清を確保した。未希釈の上清で、ならびに1:10希釈で（実施例10）デオキシリボヌクレアーゼ活性を測定した。
【０１０６】
pPICZαAベクターで形質転換した対照クローンは培地にいずれの測定可能なデオキシリボヌクレアーゼ活性ももたらさなかったのに対し、pDNASE-1およびpDNASE-4で形質転換したPichia株は、増殖培地（すなわち、培養培地）中に分泌されたウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIによるデオキシリボヌクレアーゼ活性を示した。従って、Saccharomyces cerevisiae由来のα因子シグナルペプチドまたは天然のウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIプレタンパク質のウシシグナルペプチドのいずれかを含む組換えプレタンパク質の発現は、デオキシリボヌクレアーゼ活性を有する活性な酵素の分泌を可能にすると結論づけることができた。
【０１０７】
分泌された成熟タンパク質、すなわち、所望のウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIの収率に関しては、天然のウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIプレタンパク質のウシシグナルペプチドを含むプレタンパク質を発現する株と、Saccharomyces cerevisiae由来のα因子シグナルペプチドを含むプレタンパク質を発現する株との間には明らかな相異はなかった。
【実施例７】
【０１０８】
多重形質転換およびゼオシン（登録商標）濃度の増大による発現量の増加
概ね、Invitrogenマニュアル 「Pichia Expressiom Kit」 Version M 011102 25-0043、「pPICZ A、BおよびC」 Version D 110801 25-0148、「pPICZαA、BおよびC」 Version E 010302 25-0150および「pPIC9K」 Version E 030402 25-0106に示唆および記載される方法を適用した。そこに記載されているさらなるベクター、酵母株および培地も参考にした 。Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning, A Laboratory Manual,第3版, CSHL Press, 2001に記載されるような分子生物学の基本的な方法を適用した。
【０１０９】
上清培地において最も高いデオキシリボヌクレアーゼ活性を生じると見出された、発現ベクターpDNASE-1およびpDNASE-4で形質転換した酵母クローンを前と同一の発現ベクターを用いるエレクトロポレーションの繰り返しに供した。エレクトロポレーション条件は、YPDSプレートに1,000と2,000μg/mlの間である高濃度のゼオシン（登録商標）を含めたという点以外は実施例4に記載した条件と同じであった。抗生物質の濃度はそのゲノムにそれぞれの多コピーの発現ベクターが組み込まれている形質転換体を選択するために増大させた。抗生物質に対する耐性が高められた酵母クローンをグリッド入り最小デキストロースプレートに移した。実施例5ですでに記載したように、個々の酵母クローンから前培養物を作製し、実施例6に記載したように増殖培地中に分泌されたデオキシリボヌクレアーゼ酵素活性を測定することにより発現を評価した。デオキシリボヌクレアーゼ活性の産生量が増加した個々のクローンを見出した。これは、両タイプの組換えプレタンパク質、すなわち、Saccharomyces cerevisiae由来のα因子シグナルペプチドまたは天然のウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIプレタンパク質のウシシグナルペプチドのいずれかを含むプレタンパク質を発現する酵母形質転換体の場合であった。平均して、pDNASE-1またはpDNASE-4で繰り返し形質転換されたPichia株の上清中で測定したデオキシリボヌクレアーゼ活性は、形質転換を１回だけ受けたそれぞれの前駆体株と比較して2倍〜3倍高かった。
【０１１０】
分泌された成熟タンパク質の量に関しては、天然のウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIプレタンパク質のウシシグナルペプチドを含むプレタンパク質を発現する株と、Saccharomyces cerevisiae由来のα因子シグナルペプチドを含むプレタンパク質を発現する株との間では明らかな相異はなかった。
【実施例８】
【０１１１】
さらなる選択圧の適用を可能にする異なる発現ベクターを導入することによる発現量の増大
概ね、Invitrogenマニュアル 「Pichia Expressiom Kit」 Version M 011102 25-0043、「pPICZ A、BおよびC」 Version D 110801 25-0148、「pPICZαA、BおよびC」 Version E 010302 25-0150および「pPIC9K」 Version E 030402 25-0106に示唆されるおよび記載される方法を適用した。そこに記載されているさらなるベクター、酵母株および培地も参考にした 。Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning, A Laboratory Manual,第3版, CSHL Press, 2001に記載されるような分子生物学の基本的な方法を適用した。
【０１１２】
発現ベクターpDNASE-1およびpDNASE-4から、AOX-1プロモーターおよびそれぞれのプレタンパク質のリーディングフレームの一部からなる発現カセット（図X参照）を制限エンドヌクレアーゼSacIおよびXbaI（Roche Diagnostics GmbH）を用いて切り出した。得られた切断産物をアガロースゲル電気泳動によって分離した。pDNASE-1の場合には、1765bpの大きさの断片を切り出して「QIAquick Gel Extraction Kit」（Qiagen）を用いて単離した。pDNASE-4の場合には、1560bpの大きさの断片を切り出して「QIAquick Gel Extraction Kit」（Qiagen）を用いて単離した。両断片において、クレノー・ポリメラーゼ（Roche Diagnostics GmbH）を用いてXbaI突出を平滑末端へと転換させた。
【０１１３】
制限エンドヌクレアーゼSacIおよびNotI（Roche Diagnostics GmbH）を用いてベクターpPIC9K（Invitrogen）を切断した。得られた切断産物をアガロースゲル電気泳動によって分離した。8956bpの大きさの断片を切り出して「QIAquick Gel Extraction Kit」（Qiagen）を用いて単離した。クレノーポリメラーゼ（Roche Diagnostics GmbH）を用いてNotI突出を平滑末端へと転換した。pDNASE-1およびpDNASE-4から調製した発現カセットを別々に挿入した。形質転換した細菌クローンを100μg/mlの抗生物質アンピシリンを含有しているLBプレートで選択するという点以外は実施例3に記載のように、ライゲーション、細菌形質転換およびクローニング手順を実施した。クローンを、制限分析および配列決定によって確認した。ウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIをSaccharomyces cerevisiae由来のα因子シグナルペプチドとともに保有しているpPIC9K由来の発現ベクターをpDNASE-2とし、ウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIを天然のウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIプレタンパク質のウシシグナルペプチドとともに保有しているpPIC9K由来の発現ベクターをpDNASE-6とした。
【０１１４】
pPIC9K由来の発現ベクターを用いて、抗生物質G418に対する耐性を導入した。そのゲノムに多コピーのpDNASE-1およびpDNASE-4発現ベクターが組み込まれている、Pichia pastorisのゼオシン（登録商標）耐性形質転換体の中から、増殖培地中に最高量のデオキシリボヌクレアーゼ活性を分泌したものを選択した。多コピーのpDNASE-1を含有しているクローンをpDNASE-2で形質転換し、多コピーのpDNASE-4を含むクローンをpDNASE-6で形質転換した。用いた発現ベクターは、SalI制限エンドヌクレアーゼ（Roche Diagnostics GmbH）を用いて直鎖状にした。1μgのそれぞれの直鎖状にした発現ベクターを形質転換に用い、これを実施例4に記載したように実施した。エレクトロポレーション後、細胞を4℃にて１Mのソルビトール中で1〜3日の間維持し、細胞を抗生物質に対して耐性にさせた。細胞懸濁液を1、2および4mg/mlのG418（Roche Diagnostics GmbH）を含有しているYPDSプレート（Invitrogen）上にプレーティングし、100〜200μlの細胞懸濁液を単一のプレート上に拡げた。YPDSプレートを30℃にて3〜5日間インキュベートした。酵母クローンをグリッド入り最小デキストロースプレート上に移した。G418濃度が最も高いYPDSプレートから生じたクローンを優先的に移した。選択したクローンを、実施例4に記載したようにさらに特性決定した。
【０１１５】
ゼオシン（登録商標）耐性を付与する多コピーの発現ベクターとG418に対する耐性を付与する多コピーの発現ベクターとを保有している、多重形質転換され確認されたPichiaクローンを、増殖培地中に分泌されたデオキシリボヌクレアーゼ活性の量に関して特性決定した。アッセイは実施例5に記載されるように実施した。多コピーのpDNASE-1のみを含みpDNASE-2は含まない前駆体クローンよりもいっそう高レベルの分泌されたデオキシリボヌクレアーゼ酵素活性を生じる、pDNASE-1構築物とpDNASE-2構築物とを保有しているクローンを同定した。さらに、多コピーのpDNASE-4のみを含みpDNASE-6は含まない前駆体クローンよりもいっそう高いレベルの分泌されたデオキシリボヌクレアーゼ酵素活性を生じる、pDNASE-4およびpDNASE-6構築物を保有しているクローンを同定した。平均すると、pDNASE-2またはpDNASE-6で形質転換した、すなわち、pDNASE-1またはpDNASE-4での多重形質転換に加えて、培養物の上清中で測定したデオキシリボヌクレアーゼ活性は単一の形質転換のみを受けたそれぞれの前駆体株と比較すると、約4倍高いと認められた。
【０１１６】
分泌された成熟タンパク質の量に関しては、天然のウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIプレタンパク質のウシシグナルペプチドを含むプレタンパク質を発現する株と、Saccharomyces cerevisiae由来のα因子シグナルペプチドを含むプレタンパク質を発現する株との間には明らかな相異はなかった。
【実施例９】
【０１１７】
液体培養上清からの組換えウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIタンパク質の精製
濾過または遠心分離によって上清増殖培地からバイオマスを除去した。次いで、陽イオン交換体を用いるイオン交換クロマトグラフィーによってウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIを精製した。うまく用いられる陽イオン交換体としてはSPセファロースがあった。ウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIを、伝導率の低い液相中（すなわち、伝導率の低い結合緩衝液中）で陽イオン交換体に結合させた。低い伝導率とは2〜3mS/cmの間の伝導率値に当たる。結合緩衝液のpHは5.0であり、20mMのCa2+アセテートおよび1mMのペファブロック（登録商標）を含んでいた。他のタンパク質を結合緩衝液で固相を繰り返し洗浄することにより除去し、ここでウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIは陽イオン交換体である固相に結合させたままとした。ウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIの溶出を、伝導率の高い溶出緩衝液を用いて達成した。高い伝導率とは30〜40mS/cmの間の伝導率値に当たる。溶出緩衝液のpHは5.0であり、0.3MのNaCl、20mMのCa2＋アセテートおよび1mMのPefabloc（登録商標）を含んでいた。この工程の後に達成されたウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIの純度はゲルをクマシーブルーを用いて染色したSDS PAGEによって調べたところ約95％よりも高かった。続く精製工程は、RNase活性を除去するためのヘパリンセファロースを用いるアフィニティークロマトグラフィーとした。用いた緩衝液系は、2.1+/-0.1mS/cmの伝導率の2mMのTris/HCl pH6.5であった。ウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIは固相には結合しなかった。この工程後のウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIの純度はゲルをクマシーブルーを用いて染色したSDS PAGEによって調べたところ約98％よりも高かった。アフィニティー精製したウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIのデオキシリボヌクレアーゼ比活性は、1mgのタンパク質当たり6,000ユニット以上であった。
【実施例１０】
【０１１８】
増殖培養上清中の精製されたウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIのデオキシリボヌクレアーゼ比活性を測定するためのアッセイ
Kunitz, M.著、J. Gen. Physiol. 33 （1950） p.349-62および363に従って、サンプルのアリコート中のデオキシリボヌクレアーゼ活性について試験を行った。ウシ胸腺DNAを10mMのTrisHCl pH8.0、0.1mMのCaCl2、１mMのMgCl2を含有している緩衝液中に0.05mg/mlの濃度で溶解させた。培養上清のような精製したデオキシリボヌクレアーゼ活性を含有している増殖培地を加えて260nmでの消光の増大を25℃にて一晩光度測定した。1ユニット（1U）とは1分当たり0.001の消光増加（ΔE）に当たる。代表的な結果を表1に示す。
【０１１９】
【表１】
2004194657.tif 000002
【実施例１１】
【０１２０】
精製されたウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIのデオキシリボヌクレアーゼ比活性を測定するアッセイ
デオキシリボヌクレアーゼを含まない参照サンプルは、1部の1Mの酢酸ナトリウムpH5.0、1部の50mMのMgSO4および8部の二重滅菌水の混合物であるサンプル緩衝液とした。基質緩衝液には、ウシ胸腺DNAを5mMのMgSO4および100mMの酢酸ナトリウムpH5.0を含有している緩衝液中に溶解させて37℃の水浴中で24〜30時間インキュベートした。不溶性部分を13,000×gで10分間遠心分離することによって除去した。基質緩衝液はDNAを0.04mg/mlの濃度で含んでいた。上清のDNA含量を260nmで光度測定し、必要に応じて、0.8の消光値を示すよう基質緩衝液をサンプル緩衝液を用いて調節した。基質緩衝液は使用前に少なくとも3日間4℃で保存した。
【０１２１】
実施例9に従うウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIの精製によって得られる1ml当たりの容量活性が約10,000ユニットのDNaseを含有している溶液をデオキシリボヌクレアーゼ活性の測定に用いた。5μlのデオキシリボヌクレアーゼを含有している溶液を95μlの二重滅菌水で希釈した。まず、2.5mlの基質緩衝液を厚さ1cmの石英キュベットに入れた。基質緩衝液とキュベットの双方を25℃で維持し、測定は同一温度で行った。260nmの波長で測定を行った。光度計をゼロ消光（参照値）に設定した後、0.05mlの希釈したデオキシリボヌクレアーゼを含有している溶液を加えて混合した。消光の増加（ΔE/分）を経時測定した。1ユニット（１U）は前記の条件下で1分当たり0.001の消光の増加を生じる活性に当たる。
【０１２２】
規定の容量あたりの活性を以下のように算出した。
【数１】
2004194657.tif 000003
【０１２３】
未希釈のウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼI調製物の活性を、適用した希釈因子に従って算出した。本アッセイを用いて測定したユニットはKunitzアッセイのものに匹敵するということが概ね認められた。
【０１２４】
さらに、タンパク質含量を前記と同種のキュベットを用いて測定した。サンプル緩衝液中の精製されたウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIの測定値を、20と25℃の間の温度で、280nmの波長で、サンプル緩衝液を参照として使用しながら測定した。
【０１２５】
タンパク質含量を以下のように消光値（ΔE280）から算出した。
[タンパク質mg/ml]=ΔE280×0.796
【０１２６】
それぞれの測定を、三連で行った。次いで、規定用量のデオキシリボヌクレアーゼ比活性を1mgのタンパク質当たりのユニットとして算出した。代表的な結果を表2に示す。
【０１２７】
【表２】
2004194657.tif 000004
【実施例１２】
【０１２８】
精製された活性なウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIの熱安定性
20mMのTrisHCl、2mMのMgCl2、4mMのCaCl2、50%グリセロール、pH7.6を含有している貯蔵緩衝液中の精製されたウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIのアリコートを55℃、60℃、65℃、70℃、75℃および80℃で60分間インキュベートした。各アリコートの容量は500μlであり、かつ、1ml当たり少なくとも10,000ユニットを含んでいた。各アリコートをきっちりと制御される（0.5℃未満の変動限界）サーモスタットブロックヒーターにおいて加熱時間全体にわたって維持した。インキュベーション直後に、残っているデオキシリボヌクレアーゼ比活性を、0に記載したアッセイを用いて容量あたりの活性として測定した。
【０１２９】
代表的な結果を表3にまとめる。熱処理後の容量あたりの残っている活性は、未処理の対照のアリコートの活性を100%としてパーセンテージとして示す。熱安定性に関しては、形質転換に用いたPichia酵母株に関して（実施例4参照）、そしてそれぞれのプレタンパク質中に存在するシグナルペプチドの種類に関しても（実施例3、5、6、7、8）、相異は認められなかった。
【０１３０】
【表３】
2004194657.tif 000005
【０１３１】
参考文献のリスト
Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Walter, P. (eds), Molecular Biology of the Cell, fourth edition, 2002, Garland Science Publishing
Beck, E.,ら., Gene 19 (1982) 327-336
Carmels, T.,ら., Curr. Genet. 20 (1991) 309-314 
Chen, C.Y.,ら., Gene 206 (1998) 181-184
Chen, X.J., および Fukuhara, H., Gene (1988) 181-192
Drocourt, D.,ら., Nucleic Acids Res. 18 (1990) 4009
EP 0 116 201
EP 1 122 306
Funakoshi, A.,ら., J. Biochem. (Tokyo) 88 (1980) 1113-1138
Julius, D.,ら., Cell 37 (1984) 1075-1089
Kaighn, M.E., In: Tissue culture, methods and applications; Kruse, P. F. & Patterson, M. K., eds., Academic Press, New York & London, 1973, 54-58
Kunitz, M., J. Gen. Physiol. 33 (1950) 349-62 and 363
Lazarides, E., および Lindberg, U., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 71 (1974) 4742
Liao, T.H., J. Formos. Med. Assoc. 96 (1997)  481-487
Liao, T.H., Mol. Cell Biochem. 34 (1981) 15-22
Nefsky, B., および Bretscher, A., Eur. J. Biochem. 179 (1989) 215-219
Nishikawa, A., および Mizuno, S., Biochem. J. 355 (2001) 245-248
Nishikawa, A.,ら., J. Biol. Chem. 272 (1997) 19408-19412
Paudel, H.K., および Liao, T.H., J. Biol Chem. 261 (1986) 16006-16011
Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd edition, CSHL Press, 2001
Shak, S., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990) 9188-9192
Southern, P.J., および Berg, P., J. Mol. Appl. Genet. 1 (1982) 327-341
Thill, G.P.,ら., Positive and Negative Effects of Multi-Copy Integrated Expression in Pichia pastoris, International Symposium on the Genentics of Microorganisms 2 (1990), pp. 477-490
US 4,683,293
US 4,808,537
US 4,812,405
US 4,818,700
US 4,837,148
US 4,855,231
US 4,857,467
US 4,870,008
US 4,879,231
US 4,882,279
US 4,885,242
US 4,895,800
US 4,929,555
US 5,002,876
US 5,004,688
US 5,032,516
US 5,122,465
US 5,135,868
US 5,166,329
US 5,324,639
US 5,618,676
US 5,854,018
US 5,856,123
US 5,919,651
van Treeck, U.,ら., Antimicrob Agents Chemother. 19 (1981) 371-380
Vedvick, T.,ら., J. Ind. Microbiol. 7 (1991) 197-201
Watersら., J. Biol. Chem. 263 (1988) 6209-14
Werten, M.W.,ら., Yeast 15 (1999) 1087-1096
WO 00/56903
WO 90/07572
WO 96/26278
Worrall, A.F., および Connolly, B.A., J. Biol. Chem. 265 (1990) 21889-21895
【図面の簡単な説明】
【０１３２】
【図１】図１は、ゼオシン（登録商標）に対する耐性を付与する市販のプラスミドpPICZαA（Invitrogen）の誘導体であるプラスミドpDNASE-1のマップである。「DNAsel」と示されるインサートは、Saccharomyces cerevisiae由来のα因子シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列（配列番号8）に融合させた成熟ウシ分泌デオキシリボヌクレアーゼIタンパク質をコードする合成DNA配列（配列番号5）である。「AOX1-Prom」はPichia pastoris AOX1プロモーターを示し、「Term」はPichia pastoris AOX1ターミネーターを示す。
【図２】図２は、G418に対する耐性を付与する市販のプラスミドpPIC9K（Invitrogen）の誘導体であるプラスミドpDNASE-2のマップである。「DNAsel」と示されるインサートは、Saccharomyces cerevisiae由来のα因子シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列（配列番号8）に融合させた成熟ウシ分泌デオキシリボヌクレアーゼIタンパク質をコードする合成DNA配列（配列番号5）である。「AOX1-Prom」はPichia pastoris AOX1プロモーターを示し、「Term」はPichia pastoris AOX1ターミネーターを示す。
【図３】図３は、ゼオシン（登録商標）に対する耐性を付与する市販のプラスミドpPICZαA（Invitrogen）の誘導体であるプラスミドpDNASE-4のマップである。「Sig-DNAsel」と示されるインサートは成熟ウシ分泌デオキシリボヌクレアーゼIタンパク質をコードする合成DNA配列（配列番号5）と天然のウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIシグナルペプチド配列およびさらなるシグナルペプチダーゼ切断部位をコードするヌクレオチド配列（配列番号7）との融合物である。「AOX1-Prom」はPichia pastoris AOX1プロモーターを示し、「Term」はPichia pastoris AOX1ターミネーターを示す。
【図４】図４は、G418に対する耐性を付与する市販のプラスミドpPIC9K（Invitrogen）の誘導体であるプラスミドpDNASE-6のマップである。「Sig-DNAsel」と示されるインサートは成熟ウシ分泌デオキシリボヌクレアーゼIタンパク質をコードする合成DNA配列（配列番号5）と天然のウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼIシグナルペプチド配列およびさらなるシグナルペプチダーゼ切断部位をコードするヌクレオチド配列（配列番号7）との融合物である。「AOX1-Prom」はPichia pastoris AOX1プロモーターを示し、「Term」はPichia pastoris AOX1ターミネーターを示す。
【図１】
2004194657.tif 000006
【図２】
2004194657.tif 000007
【図３】
2004194657.tif 000008
【図４】
2004194657.tif 000009
【配列表】
2004194657000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成16年2月5日(2004.2.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（a ）ウシ膵臓タンパク質およびシグナルペプチドからなるプレタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むベクターを提供する工程、
（b ）ベクターでメチロトローフ酵母株を形質転換する工程、
（c ）栄養分およびメタノールを含有する増殖培地において形質転換メチロトローフ酵母株を培養する工程、ここでメチロトローフ酵母株は増殖培地にウシ膵臓タンパク質を発現し、分泌する、
（d ）増殖培地からウシ膵臓タンパク質を精製する工程
を含む、工程（d ）で精製された１mgのタンパク質当たり少なくとも6,000 ユニットのデオキシリボヌクレアーゼ比活性を有するウシ膵臓タンパク質の製造方法。
【請求項２】
ウシ膵臓タンパク質のアミノ酸配列が配列番号：１であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
シグナルペプチドが、ウシ膵臓タンパク質の最初のアミノ酸のすぐ隣に位置するシグナルペプチダーゼ切断部位を含有してなることを特徴とする請求項１または２いずれか記載の方法。
【請求項４】
発現されたプレタンパク質のアミノ酸配列が、
（a ）配列番号：２、
（b ）配列番号：３、および
（c ）配列番号：４
からなる群より選ばれることを特徴とする請求項１〜３いずれか記載の方法。
【請求項５】
ウシ膵臓タンパク質をコードするヌクレオチド配列が配列番号：５であることを特徴とする請求項１〜４いずれか記載の方法。
【請求項６】
プレタンパク質をコードするヌクレオチド配列が、ウシ膵臓タンパク質をコードするヌクレオチド配列に融合されたシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列からなることを特徴とする請求項１〜５いずれか記載の方法。
【請求項７】
シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列が、
（a ）配列番号：６、
（b ）配列番号：７、および
（c ）配列番号：８
からなる群より選ばれることを特徴とする請求項１〜６いずれか記載の方法。
【請求項８】
プレタンパク質をコードするヌクレオチド配列が、プロモーターまたはプロモーターエレメントに作動可能に連結されることを特徴とする請求項１〜７いずれか記載の方法。
【請求項９】
ベクターが、メチロトローフ酵母株のエピソームとして複製可能なプラスミドであることを特徴とする請求項１〜８いずれか記載の方法。 
【請求項１０】
配列番号：２９のPichia pastris AOX1プロモーターまたはそのプロモーターエレメントに作動可能に連結された、ウシ膵臓タンパク質およびシグナルペプチドからなるプレタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むベクターを含有する染色体を有してなるPichia pastris株であって、プレタンパク質をコードするヌクレオチド配列が配列番号：５に融合された配列番号：７または配列番号：８である、Pichia pastris株。
【請求項１１】
請求項１〜９いずれか記載の方法により得ることができる、１mgのタンパク質当たり少なくとも6,000 ユニットのデオキシリボヌクレアーゼI 比活性を有するウシ膵臓タンパク質。
【請求項１２】
DNA の加水分解のための、１mgのタンパク質当たり少なくとも6,000 ユニットのデオキシリボヌクレアーゼ比活性を有するウシ膵臓タンパク質の使用。
【請求項１３】
１mgのタンパク質当たり少なくとも6,000 ユニットのデオキシリボヌクレアーゼ比活性を有するウシ膵臓タンパク質および二価カチオンを含有する反応緩衝液を含有してなるパーツのキット。
【請求項１４】
ウシ膵臓タンパク質が水、グリセロール、プロテアーゼインヒビター、および二価カチオンを含有する保存緩衝液に溶解され、反応緩衝液がMg2+、Ca2+およびMn2+からなる群より選ばれる二価カチオンを含有してなる請求項１３記載のパーツのキット。