【手続補正書】
【提出日】平成26年4月30日(2014.4.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｒ型の高分子量（ｈｍｗ）バクテリオシンをコードする単離された核酸分子であって、ここで、前記核酸分子は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのある株のあるゲノム由来であり、かつここで、前記Ｒ型のｈｍｗバクテリオシンは、配列番号４〜１６、１８、１９、および６６〜８０からなる群より選択されるポリペプチドと少なくとも８０％同一であるポリペプチドを含み、かつ前記Ｒ型のｈｍｗバクテリオシンは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの少なくとも１つの他の株のレセプターに結合するレセプター結合ドメイン（ＲＢＤ）を有し、かつＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの少なくとも１つの他の株に対する殺菌活性を有する、核酸分子。
【請求項２】
前記核酸分子が、Ｃｄ４、Ｃｄ１６、Ｃｄ１９１０８、Ｃｄ１９１２３、Ｃｄ１９１２６、Ｃｄ１９１４５、およびＡＴＣＣアクセッション番号４３５９３からなる群より選択されるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのある株のあるゲノム由来であり、任意で当該株がCd16であり前記核酸分子が配列番号１のポリヌクレオチドを有し、又は当該株がCd4であり前記核酸分子が配列番号6１のポリヌクレオチドを有する、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項３】
前記Ｒ型のｈｍｗバクテリオシンが、配列番号１６または７８のポリペプチドを含み、又は当該Ｒ型のｈｍｗバクテリオシンが、配列番号４〜１６、１８及び１９のポリペプチド；又は配列番号６６〜８０のポリペプチドを含む、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項４】
請求項１に記載の核酸分子であって、
（ａ）前記ＲＢＤが、配列番号１７および４９〜５３からなる群より選択されるポリペプチドに対して少なくとも８０％同一であるか、または配列番号５４〜５６からなる群より選択されるポリペプチドのレセプター結合ドメイン（ＲＢＤ）領域を含むポリペプチドに対して少なくとも８０％同一であるポリペプチドを含み；
（ｂ）前記レセプター結合ドメイン（ＲＢＤ）領域が、配列番号５４、５５、または５６のカルボキシル末端残基に対するアミノ酸残基５１を含む；
核酸分子。
【請求項５】
前記Ｒ型のｈｍｗバクテリオシンが、配列番号１６または７８のポリペプチドを含み、前記核酸分子がさらに、Ｒ型のｈｍｗバクテリオシンのレセプター結合ドメイン（ＲＢＤ）、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに感染するバクテリオファージのレセプター結合ドメイン（ＲＢＤ）、またはそれらの改変型のレセプター結合ドメイン（ＲＢＤ）をコードする異種配列を含み、ここで前記改変型が、未改変のＲＢＤとは異なる殺菌スペクトルを有し、任意で前記ＲＢＤが、配列番号１７および４９〜５３からなる群より選択される天然のＲＢＤの改変型、または配列番号５４〜５６からなる群より選択されるポリペプチドのレセプター結合ドメイン（ＲＢＤ）領域であり、前記改変型が、天然のＲＢＤと少なくとも８０％同一である、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の核酸分子によってコードされる単離されたＲ型のｈｍｗバクテリオシン。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の核酸分子を含む発現カセット。
【請求項８】
前記核酸分子が、異種プロモーターに対して作動可能に連結され、任意で当該プロモーターが、誘導性または抑制性であり、任意で当該プロモーターが、低分子のインデューサーまたはデ−リプレッサーによって誘導され、又は任意で構成的に活性なＲｅｃＡタンパク質をコードするｒｅｃＡ遺伝子をさらに含んでおり、かつ低分子のインデューサーまたはデ−リプレッサーに応答性である異種プロモーターの制御下である、請求項７に記載の発現カセット。
【請求項９】
請求項７〜８のいずれか１項に記載の発現カセットを含む、又はその染色体内に請求項１〜５のいずれか１項に記載の核酸分子を含む、プロデューサー細胞。
【請求項１０】
前記細胞が、非病原性でかつ非偏性嫌気性の細菌であり、任意で、当該非病原性でかつ非偏性嫌気性の細菌が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、およびＬｉｓｔｅｒｉａからなる群より選択される細菌の属由来の種であり、好ましくは当該種が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓであり、任意で当該Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓが、ＰＢＳＸ遺伝子クラスターを欠く、請求項９に記載のプロデューサー細胞。
【請求項１１】
殺菌活性を有する、単離されたＲ型の高分子量（ｈｍｗ）バクテリオシンであって、前記Ｒ型のｈｍｗバクテリオシンが、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属の細菌の第一の種の第一の株のベースプレートアタッチメント領域（ＢＰＡＲ）、およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属の前記第一の種の第二の株の、もしくは第二の種の、またはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種に感染するバクテリオファージのレセプター結合ドメイン（ＲＢＤ）を含み、ここで前記バクテリオシンが、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの少なくとも１つの株に対する殺菌活性を有する、Ｒ型の高分子量（ｈｍｗ）バクテリオシン。
【請求項１２】
請求項１１に記載のＲ型のｈｍｗバクテリオシンであって、
（ａ）前記ＢＰＡＲが、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの第一の株由来であり、かつ前記ＲＢＤが、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの第二の株由来、またはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに感染するバクテリオファージ由来であり；
（ｂ）前記ＢＰＡＲが、配列番号１６もしくは７８の５０個以上連続するアミノ酸から構成されるか、または配列番号５４〜５６の５０個以上連続するアミノ酸から構成される、ポリペプチドに対して少なくとも８０％同一であり；又は
（ｃ）前記ＲＢＤが、配列番号１７および４９〜５３からなる群より選択されるポリペプチドに対して少なくとも８０％同一であるか、または配列番号５４〜５６からなる群より選択されるポリペプチドのレセプター結合ドメイン（ＲＢＤ）領域を含むポリペプチドに対して少なくとも８０％同一である；
Ｒ型のｈｍｗバクテリオシン。
【請求項１３】
Ｒ型のｈｍｗバクテリオシンを産生する方法であって、
誘導性プロモーターに対して作動可能に連結される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の核酸分子を含むプロデューサー細胞を、誘導剤に対して、Ｒ型のｈｍｗバクテリオシンの発現を誘導するのに有効な濃度で暴露することと、
この発現されたＲ型のバクテリオシンを精製することと、
を包含し、任意で当該Ｒ型のバクテリオシンをコードする前記核酸分子が、前記プロデューサー細胞の前記ゲノムに対して異種であり、かつ前記核酸分子が、プロデューサー細胞の染色体内に含まれるか、または前記プロデューサー細胞内の染色体外発現ベクターに含まれる、産生方法。
【請求項１４】
前記プロデューサー細胞が、非病原性でかつ非偏性嫌気性の細菌であり、任意で当該非病原性でかつ非偏性嫌気性の細菌が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、およびＬｉｓｔｅｒｉａからなる群より選択される細菌の属由来の種であり、好ましくは当該種が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓであり、任意で当該Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓが、Ｒ型のバクテリオシンを産生するように誘導されるとき、溶解しないものであり、任意で当該Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓがＰＢＳＸ遺伝子クラスターを欠く、請求項１３に記載の産生方法。
【請求項１５】
前記病原性細菌と、請求項６または請求項１１に記載のＲ型バクテリオシンとを接触させ、それによって前記Ｒ型のバクテリオシンが、病原性細菌に結合しかつ殺傷することを包含する、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅを殺傷する方法。
【請求項１６】
請求項６若しくは請求項１１に記載のＲ型バクテリオシン、又は請求項９若しくは請求項１０に記載のプロデューサー細胞の、動物におけるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの感染を処置する方法における使用。