(57)【要約】【課題】迅速かつ簡便に結核菌に含まれる薬剤耐性遺伝子を検出する方法、並びに該方法において好適に用いることができるＰＣＲ用プライマーペアセット、塩基配列決定用プライマーセット、及び薬剤耐性結核の診断用試薬キットを提供すること。【解決手段】結核菌由来のＤＮＡと、該結核菌に含まれる特定の遺伝子群から選ばれる２種以上の遺伝子が有する２以上の特定領域に対応する、特定のＰＣＲ用プライマーペアとを用いて、該２以上の特定領域を１台のＰＣＲ増幅用機器によって一度にＰＣＲ増幅し、次いで、増幅した２以上の特定領域に含まれる２以上の標的領域を直接塩基配列決定することにより、結核菌に含まれる薬剤耐性遺伝子を検出する方法、並びに特定のＰＣＲ用プライマーペアセット、特定の塩基配列決定用プライマーセット、及び特定の薬剤耐性結核の診断用試薬キット。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
結核菌由来のＤＮＡと、該結核菌に含まれる遺伝子であるｒｐｏＢ、ｋａｔＧ、ｍａｂＡ−ｉｎｈＡ、ｅｍｂＢ、ｐｎｃＡ、ｒｐｓＬ、ｒｒｓ、及びｇｙｒＡからなる遺伝子群から選ばれる２種以上の遺伝子が有する２以上の特定領域に対応する、２種以上のＰＣＲ用プライマーペアとを用いて、該２以上の特定領域を１台のＰＣＲ増幅用機器によって一度にＰＣＲ増幅し、次いで、増幅した２以上の特定領域に含まれる２以上の標的領域に対応する２種以上の塩基配列決定用プライマーを用いて、該２以上の標的領域を直接塩基配列決定することにより、結核菌に含まれる薬剤耐性遺伝子を検出する方法。
【請求項２】
結核菌由来のＤＮＡと、該結核菌に含まれる遺伝子であるｒｐｏＢ、ｋａｔＧ、ｍａｂＡ−ｉｎｈＡ、ｅｍｂＢ、ｐｎｃＡ、ｒｐｓＬ、ｒｒｓ、及びｇｙｒＡからなる遺伝子群から選ばれる２種以上の遺伝子が有する２以上の特定領域に対応する、２種以上のＰＣＲ用プライマーペアとを用いて、該２以上の特定領域を１台のＰＣＲ増幅用機器によって一度にＰＣＲ増幅し、次いで、増幅した２以上の特定領域に含まれる２以上の標的領域に対応する２種以上の塩基配列決定用プライマーを用いて、該２以上の標的領域をシークエンス反応し、得られたシークエンス反応物を用いて１台の塩基配列決定用機器によって一度に塩基配列決定することにより、結核菌に含まれる薬剤耐性遺伝子を検出する方法。
【請求項３】
前記２種以上のＰＣＲ用プライマーペアが、配列番号１の塩基配列を含有するプライマー及び配列番号２の塩基配列を含有するプライマーによるプライマーペア、配列番号３の塩基配列を含有するプライマー及び配列番号４の塩基配列を含有するプライマーによるプライマーペア、配列番号５の塩基配列を含有するプライマー及び配列番号６の塩基配列を含有するプライマーによるプライマーペア、配列番号７の塩基配列を含有するプライマー及び配列番号８の塩基配列を含有するプライマーによるプライマーペア、配列番号９の塩基配列を含有するプライマー及び配列番号１０の塩基配列を含有するプライマーによるプライマーペア、配列番号１１の塩基配列を含有するプライマー及び配列番号１２の塩基配列を含有するプライマーによるプライマーペア、配列番号１３の塩基配列を含有するプライマー及び配列番号１４の塩基配列を含有するプライマーによるプライマーペア、並びに配列番号１５の塩基配列を含有するプライマー及び配列番号１６の塩基配列を含有するプライマーによるプライマーペアからなるプライマーペア群より選ばれる２種以上のプライマーペアであることを特徴とする請求項１または２に記載の結核菌に含まれる薬剤耐性遺伝子を検出する方法。
【請求項４】
前記２種以上のＰＣＲ用プライマーペアが、配列番号１のオリゴヌクレオチド及び配列番号２のオリゴヌクレオチドよりなるオリゴヌクレオチドペア、配列番号３のオリゴヌクレオチド及び配列番号４のオリゴヌクレオチドよりなるオリゴヌクレオチドペア、配列番号５のオリゴヌクレオチド及び配列番号６のオリゴヌクレオチドよりなるオリゴヌクレオチドペア、配列番号７のオリゴヌクレオチド及び配列番号８のオリゴヌクレオチドよりなるオリゴヌクレオチドペア、配列番号９のオリゴヌクレオチド及び配列番号１０のオリゴヌクレオチドよりなるオリゴヌクレオチドペア、配列番号１１のオリゴヌクレオチド及び配列番号１２のオリゴヌクレオチドよりなるオリゴヌクレオチドペア、配列番号１３のオリゴヌクレオチド及び配列番号１４のオリゴヌクレオチドよりなるオリゴヌクレオチドペア、並びに配列番号１５のオリゴヌクレオチド及び配列番号１６のオリゴヌクレオチドよりなるオリゴヌクレオチドペアからなるオリゴヌクレオチドペア群より選ばれる２種以上のオリゴヌクレオチドペアであることを特徴とする請求項１または２に記載の結核菌に含まれる薬剤耐性遺伝子を検出する方法。
【請求項５】
前記ＰＣＲ増幅が、シャトルＰＣＲ増幅であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の結核菌に含まれる薬剤耐性遺伝子を検出する方法。
【請求項６】
前記２種以上の塩基配列決定用プライマーが、配列番号１７の塩基配列を含有するプライマー〜配列番号３２の塩基配列を含有するプライマーの１６のプライマーからなるプライマー群より選ばれる２種以上のプライマーであることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の結核菌に含まれる薬剤耐性遺伝子を検出する方法。
【請求項７】
２種以上の塩基配列決定用プライマーが、配列番号１７のオリゴヌクレオチド〜配列番号３２のオリゴヌクレオチドの１６のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド群より選ばれる２種以上のオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の結核菌に含まれる薬剤耐性遺伝子を検出する方法。
【請求項８】
前記直接塩基配列決定を、ダイターミネーター法により行うことを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の結核菌に含まれる薬剤耐性遺伝子を検出する方法。
【請求項９】
配列番号１のオリゴヌクレオチド及び配列番号２のオリゴヌクレオチドよりなるオリゴヌクレオチドペア、配列番号３のオリゴヌクレオチド及び配列番号４のオリゴヌクレオチドよりなるオリゴヌクレオチドペア、配列番号５のオリゴヌクレオチド及び配列番号６のオリゴヌクレオチドよりなるオリゴヌクレオチドペア、配列番号７のオリゴヌクレオチド及び配列番号８のオリゴヌクレオチドよりなるオリゴヌクレオチドペア、配列番号９のオリゴヌクレオチド及び配列番号１０のオリゴヌクレオチドよりなるオリゴヌクレオチドペア、配列番号１１のオリゴヌクレオチド及び配列番号１２のオリゴヌクレオチドよりなるオリゴヌクレオチドペア、配列番号１３のオリゴヌクレオチド及び配列番号１４のオリゴヌクレオチドよりなるオリゴヌクレオチドペア、並びに配列番号１５のオリゴヌクレオチド及び配列番号１６のオリゴヌクレオチドよりなるオリゴヌクレオチドペアからなるオリゴヌクレオチドペア群より選ばれる１種以上のオリゴヌクレオチドペアであることを特徴とするＰＣＲ用プライマーペアセット。
【請求項１０】
配列番号１の塩基配列を含有するプライマー及び配列番号２の塩基配列を含有するプライマーによるプライマーペア、配列番号３の塩基配列を含有するプライマー及び配列番号４の塩基配列を含有するプライマーによるプライマーペア、配列番号５の塩基配列を含有するプライマー及び配列番号６の塩基配列を含有するプライマーによるプライマーペア、配列番号７の塩基配列を含有するプライマー及び配列番号８の塩基配列を含有するプライマーによるプライマーペア、配列番号９の塩基配列を含有するプライマー及び配列番号１０の塩基配列を含有するプライマーによるプライマーペア、配列番号１１の塩基配列を含有するプライマー及び配列番号１２の塩基配列を含有するプライマーによるプライマーペア、配列番号１３の塩基配列を含有するプライマー及び配列番号１４の塩基配列を含有するプライマーによるプライマーペア、並びに配列番号１５の塩基配列を含有するプライマー及び配列番号１６の塩基配列を含有するプライマーによるプライマーペアからなるプライマーペア群より選ばれる１種以上のプライマーペアであることを特徴とするＰＣＲ用プライマーペアセット。
【請求項１１】
配列番号１のオリゴヌクレオチド〜配列番号１６のオリゴヌクレオチドの１６のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド群より選ばれる１種以上のオリゴヌクレオチドをプライマーとして有することを特徴とするＰＣＲ用プライマーペアセット。
【請求項１２】
配列番号１の塩基配列を含有するプライマー〜配列番号１６の塩基配列を含有するプライマーの１６のプライマーからなるプライマー群より選ばれる１種以上のプライマーを有することを特徴とするＰＣＲ用プライマーペアセット。
【請求項１３】
配列番号１７のオリゴヌクレオチド〜配列番号３２のオリゴヌクレオチドの１６のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド群より選ばれる１種以上のオリゴヌクレオチドであることを特徴とする塩基配列決定用プライマーセット。
【請求項１４】
配列番号１７の塩基配列を含有するプライマー〜配列番号３２の塩基配列を含有するプライマーの１６のプライマーからなるプライマー群より選ばれる１種以上のプライマーであることを特徴とする塩基配列決定用プライマーセット。
【請求項１５】
請求項９〜１２のいずれか１項に記載のＰＣＲ用プライマーペアセットと請求項１３または１４に記載の塩基配列決定用プライマーセットとを有することを特徴とする薬剤耐性結核の診断用試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、結核菌に含まれる薬剤耐性遺伝子を検出する方法、ＰＣＲ用プライマーペアセット、塩基配列決定用プライマーセット、及び薬剤耐性結核の診断用試薬キットに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
現在、日本では年間約３０００人が、地球規模では年間３００万人が結核により死亡している。結核治療の薬剤としては、多くの種類の薬剤が知られているが、薬剤を患者に投与した場合、突然変異によりある出現頻度で、投与した薬剤に対する耐性を有する耐性菌が生じることがわかっている。このような耐性菌の出現頻度は、薬剤により異なるが、例えば、イソニアジド（ＩＮＨ）が１０−６のオーダー、リファンピシン（ＲＦＰ）が１０−７のオーダー、ストレプトマイシン（ＳＭ）が１０−６のオーダー、エタンブトール（ＥＢ）１０−４のオーダーである。１９９６年に使用されたピラジナミド（ＰＺＡ）、カナマイシン（ＫＭ）、ビオマイシン（ＶＭ）、アミカシン（ＡＫ）及び、抗結核薬としては国内で認可されていないフルオロキノロン（ＦＱ）については耐性菌の出現頻度のデータはない。これらの薬剤に対する耐性を有する耐性菌に関して、特定遺伝子の突然変異によって生じる耐性菌について報告がなされている。
【０００３】
ＲＦＰに対する耐性を有する耐性菌に関しては、ＲＮＡポリメラーゼのβサブユニットをコードするｒｐｏＢ遺伝子上の狭い領域に野生型結核菌では見られない点突然変異が存在することが明らかにされている。ＩＮＨに対する耐性を有する耐性菌に関しては、カタラーゼペロキシダーゼ（Ｃａｔａｌａｓｅ−ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）をコードする遺伝子であるｋａｔＧ遺伝子、ｍａｂＡ−ｉｎｈＡ遺伝子上の変異が耐性に関与していることが明らかにされている。ＥＢに対する耐性を有する耐性菌に関しては、アラビノシルトランスフェラーゼ（Ａｒａｂｉｎｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）をコードするｅｍｂＢ遺伝子上の変異が耐性に関与していることが明らかにされている。ＰＺＡに対する耐性を有する耐性菌に関しては、ピラジナミダーゼ（ｐｉｒａｚｉｎａｍｉｄａｓｅ）をコードするｐｎｃＡ遺伝子上の変異が耐性に関与していることが明らかにされている。ＳＭに対する耐性を有する耐性菌に関しては、リボソーム蛋白Ｓ１２（ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓ１２）をコードするｒｐｓＬ遺伝子上の変異、並びに１６ＳリボソームＲＮＡ（１６Ｓ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ＲＮＡ）をコードするｒｒｓ遺伝子上のクラスターＡ領域及びクラスターＢ領域における変異が、耐性に関与していることが明らかにされている。ＫＭ、ＶＭ、またはＡＫに対する耐性を有する耐性菌に関しては、１６ＳリボソームＲＮＡ（１６Ｓ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ＲＮＡ）をコードするｒｒｓ遺伝子上のクラスターＣ領域における変異が耐性に関与していることが明らかにされている。ＦＱに対する耐性を有する耐性菌に関しては、ＤＮＡギラーゼＡサブユニット（ＤＮＡ  ｇｙｒａｚｅ  Ａ  ｓｕｂｕｎｉｔ）をコードするｇｙｒＡ遺伝子上の変異が耐性に関与していることが明らかとなっている。これらの耐性に関与する遺伝子の結核菌遺伝子上の位置を図２に示す。
【０００４】
結核空洞内には、通常１０８オーダーの数の結核菌が存在するとされる。仮に１０９個の結核菌を保有する結核患者に対してＩＮＨを単剤で投与したとすると、平均して、１０３個以上の菌がＩＮＨに対する耐性を有するＩＮＨ耐性菌として生き残る。この結核患者は、ＩＮＨの投与により、一旦回復したかに見えるが、生き残ったＩＮＨ耐性菌が増殖することにより再び発症する。発症した患者の治療に引き続きＲＦＰを用いれば、このＩＮＨ耐性菌は、同様の機序によりＲＦＰに対する耐性を獲得するために、ＩＮＨ及びＲＦＰの２剤に対して耐性を獲得することになる。この繰返しにより、多くの薬剤に対する耐性を有する難治性の多剤耐性結核菌が出現することになる。この多剤耐性結核菌は、患者の治療を遅延させるばかりでなく、院内感染や市中への結核感染の拡散の原因となっており、結核治療上の大きな問題となっている。
【０００５】
そこで、耐性菌の出現を防ぐために、結核治療は、２種の薬剤あるいは３種の薬剤を投与する２剤併用療法、または３剤併用療法が結核治療の主流となっている。結核患者に対して、初回治療の段階から２種の薬剤あるいは３種の薬剤を投与すると、耐性菌の出現頻度はほとんど無視してよいレベルにまで下がる。ＩＮＨ及びＲＦＰを投与すると、耐性菌の出現頻度は、１０−６×１０−７＝１０−１３オーダーであり、通常の結核患者においてはほとんど耐性菌が出現しないと考えて良い。しかしながら、結核患者の保有する結核菌が、投与する２種の薬剤あるいは３種の薬剤のうち、１種以上の薬剤に対してすでに耐性を有している場合は、２種の薬剤あるいは３種の薬剤を投与しても耐性菌が出現する可能性がある。
【０００６】
このような理由により、結核患者が保有する結核菌の薬剤に対する耐性について情報があれば、結核患者が保有する結核菌が耐性を有しない薬剤を２剤あるいは３剤選択して投与することができるため、新たな耐性菌の出現がほとんどなくなる。
【０００７】
そこで、結核患者が保有する結核菌の薬剤に対する耐性について情報を得るために、結核菌の薬剤感受性試験が行われている。薬剤感受性試験は、所定の薬剤を含有させた薬剤感受性培地における菌体の増殖の有無により、該所定の薬剤に対する耐性の有無を検査する方法が一般的である。かかる薬剤感受性試験における薬剤感受性培地としては、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｉｎｄｉｃａｔｏｒ  ｔｕｂｅ  「ＭＧＩＴ」（日本ベクトン・ディッキンソン株式会社製）、ＢＡＣＴＥＣ  ４６０ＴＢ（日本ベクトン・ディッキンソン株式会社製）、結核感受性ＰＺＡ液体培地（極東製薬株式会社製）、ビットスペクトルＳＲ（極東製薬株式会社製）、ブロスミック  ＭＴＢ−Ｉ（極東製薬株式会社製）、ウエルパック培地Ｐ（日本ＢＣＧ株式会社製）、ウエルパック培地  Ａ，Ｂ（日本ＢＣＧ株式会社製）、耐性培地（日水製薬株式会社製）、感受性培地（日水製薬株式会社製）を挙げることができる。しかし、結核菌は増殖が遅く、結核菌の増殖の有無を確かめて耐性の有無を判断するまでに数週間を要するという問題がある。
【０００８】
また、最近、ＤＮＡハイブリダイゼーション技術を用いた診断法が開発されている。特開２００１−１０３９８１号公報（特許文献１）には、結核治療に用いられる薬剤に対して感受性である野生型結核菌およびいずれかの薬剤に対して耐性を有する変異型結核菌のそれぞれから得られる、結核治療に用いられる薬剤に対する耐性に関わる結核菌ゲノム上の遺伝子の塩基配列をもとに合成されたオリゴヌクレオチドが、共有結合により固定化された基板を含む結核菌診断キットであって、被検結核菌に由来する核酸とのハイブリダイゼーションにより結核菌の薬剤耐性鑑別または結核菌感染の判定を行うための診断用キットが開示されている。該診断用キットを用いたＤＮＡハイブリダイゼーション技術は、ＤＮＡチップによって、薬剤耐性遺伝子の変異を見出そうとするものであるが、多量のＤＮＡを必要とすること、検査時間は７時間だが培養のための時間が数週間かかること、特定の遺伝子配列の変異しか検出できないこと、現在開発されている製品（ＤＮＡマイクロアレイキット「ＯｌｉｇｏＡｒｒａｙ」：日清紡績株式会社製）ではＩＮＨ、ＲＦＰ、ＳＭ、ＫＭ、ＥＢの５薬剤に対する耐性に関与する遺伝子にかかる変異しか検出できないことなどの問題点がある。どちらの結核薬剤感受性試験でも、検査しようとする菌を数週間ないし数ヶ月かけて培養して、分離する必要がある。
【０００９】
さらに、喀痰などにより得られる結核菌から遺伝子を抽出して、ＰＣＲ増幅した産物を直接塩基配列決定することにより、薬剤に対する耐性に関わる遺伝子を検出する方法があり、この方法によると結核菌の培養を数週間かけて行う必要はない。しかし、耐性に関わる遺伝子ごとにＰＣＲ増幅及び直接塩基配列決定の実験を行っており、大きな労力が必要となるため、検査室での日常業務での使用に適していない。
【００１０】
【特許文献１】
特開２００１−１０３９８１号公報
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、本発明は、迅速かつ簡便に結核菌に含まれる薬剤耐性遺伝子を検出する方法、並びに該方法において好適に用いることができるＰＣＲ用プライマーペアセット、塩基配列決定用プライマーセット、及び薬剤耐性結核の診断用試薬キットを提供することをその課題とする。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
かかる実情において、本発明者は鋭意検討を行った結果、結核菌に含まれる遺伝子であるｒｐｏＢ、ｋａｔＧ、ｍａｂＡ−ｉｎｈＡ、ｅｍｂＢ、ｐｎｃＡ、ｒｐｓＬ、ｒｒｓ、及びｇｙｒＡからなる遺伝子群から選ばれる２種以上の遺伝子が有する２以上の特定領域を、該２以上の特定領域に対応する２種以上のＰＣＲ用プライマーペアを用いて、１台のＰＣＲ増幅用機器によって一度にＰＣＲ増幅し、次いで、増幅した２以上の特定領域を直接塩基配列決定することにより、迅速かつ簡便に結核菌に含まれる薬剤耐性遺伝子を検出することができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
すなわち、本発明（１）は、結核菌由来のＤＮＡと、該結核菌に含まれる遺伝子であるｒｐｏＢ、ｋａｔＧ、ｍａｂＡ−ｉｎｈＡ、ｅｍｂＢ、ｐｎｃＡ、ｒｐｓＬ、ｒｒｓ、及びｇｙｒＡからなる遺伝子群から選ばれる２種以上の遺伝子が有する２以上の特定領域に対応する、２種以上のＰＣＲ用プライマーペアとを用いて、該２以上の特定領域を１台のＰＣＲ増幅用機器によって一度にＰＣＲ増幅し、次いで、増幅した２以上の特定領域に含まれる２以上の標的領域に対応する２種以上の塩基配列決定用プライマーを用いて、該２以上の標的領域を直接塩基配列決定することにより、結核菌に含まれる薬剤耐性遺伝子を検出する方法を提供するものである。かかる構成を採用することにより、結核菌に含まれる遺伝子であるｒｐｏＢ、ｋａｔＧ、ｍａｂＡ−ｉｎｈＡ、ｅｍｂＢ、ｐｎｃＡ、ｒｐｓＬ、ｒｒｓ、及びｇｙｒＡからなる遺伝子群から選ばれる２種以上の遺伝子が有する２以上の特定領域を簡便かつ迅速にＰＣＲ増幅できるため、迅速かつ簡便な結核菌に含まれる薬剤耐性遺伝子を検出する方法とすることができる。
【００１４】
また、本発明（２）は、結核菌由来のＤＮＡと、該結核菌に含まれる遺伝子であるｒｐｏＢ、ｋａｔＧ、ｍａｂＡ−ｉｎｈＡ、ｅｍｂＢ、ｐｎｃＡ、ｒｐｓＬ、ｒｒｓ、及びｇｙｒＡからなる遺伝子群から選ばれる２種以上の遺伝子が有する２以上の特定領域に対応する、２種以上のＰＣＲ用プライマーペアとを用いて、該２以上の特定領域を１台のＰＣＲ増幅用機器によって一度にＰＣＲ増幅し、次いで、増幅した２以上の特定領域に含まれる２以上の標的領域に対応する２種以上の塩基配列決定用プライマーを用いて、該２以上の標的領域をシークエンス反応し、得られたシークエンス反応物を用いて１台の塩基配列決定用機器によって一度に塩基配列決定することにより、結核菌に含まれる薬剤耐性遺伝子を検出する方法を提供するものである。かかる構成を採用することにより、結核菌に含まれる遺伝子であるｒｐｏＢ、ｋａｔＧ、ｍａｂＡ−ｉｎｈＡ、ｅｍｂＢ、ｐｎｃＡ、ｒｐｓＬ、ｒｒｓ、及びｇｙｒＡからなる遺伝子群から選ばれる２種以上の遺伝子が有する２以上の特定領域を簡便かつ迅速にＰＣＲ増幅および直接塩基配列決定できるため、迅速かつ簡便な結核菌に含まれる薬剤耐性遺伝子を検出する方法とすることができる。
【００１５】
また、本発明（３）は、前記２種以上のＰＣＲ用プライマーペアが、配列番号１の塩基配列を含有するプライマー及び配列番号２の塩基配列を含有するプライマーによるプライマーペア、配列番号３の塩基配列を含有するプライマー及び配列番号４の塩基配列を含有するプライマーによるプライマーペア、配列番号５の塩基配列を含有するプライマー及び配列番号６の塩基配列を含有するプライマーによるプライマーペア、配列番号７の塩基配列を含有するプライマー及び配列番号８の塩基配列を含有するプライマーによるプライマーペア、配列番号９の塩基配列を含有するプライマー及び配列番号１０の塩基配列を含有するプライマーによるプライマーペア、配列番号１１の塩基配列を含有するプライマー及び配列番号１２の塩基配列を含有するプライマーによるプライマーペア、配列番号１３の塩基配列を含有するプライマー及び配列番号１４の塩基配列を含有するプライマーによるプライマーペア、並びに配列番号１５の塩基配列を含有するプライマー及び配列番号１６の塩基配列を含有するプライマーによるプライマーペアからなるプライマーペア群より選ばれる２種以上のプライマーペアである前記発明（１）または（２）に記載の結核菌に含まれる薬剤耐性遺伝子を検出する方法を提供するものである。かかる構成を採用することにより、前記発明（１）または（２）の奏する効果に加えて、結核菌に含まれる遺伝子であるｒｐｏＢ、ｋａｔＧ、ｍａｂＡ−ｉｎｈＡ、ｅｍｂＢ、ｐｎｃＡ、ｒｐｓＬ、ｒｒｓ、ｇｙｒＡからなる遺伝子群から選ばれる２種以上の遺伝子が有する２以上の特定領域を、結核菌の前記遺伝子群より選ばれる遺伝子において従来の直接塩基配列決定法により塩基配列決定される領域よりも、広範な領域として増幅することができるという効果を奏するものである。
【００１６】
また、本発明（４）は、前記２種以上のＰＣＲ用プライマーペアが、配列番号１のオリゴヌクレオチド及び配列番号２のオリゴヌクレオチドよりなるオリゴヌクレオチドペア、配列番号３のオリゴヌクレオチド及び配列番号４のオリゴヌクレオチドよりなるオリゴヌクレオチドペア、配列番号５のオリゴヌクレオチド及び配列番号６のオリゴヌクレオチドよりなるオリゴヌクレオチドペア、配列番号７のオリゴヌクレオチド及び配列番号８のオリゴヌクレオチドよりなるオリゴヌクレオチドペア、配列番号９のオリゴヌクレオチド及び配列番号１０のオリゴヌクレオチドよりなるオリゴヌクレオチドペア、配列番号１１のオリゴヌクレオチド及び配列番号１２のオリゴヌクレオチドよりなるオリゴヌクレオチドペア、配列番号１３のオリゴヌクレオチド及び配列番号１４のオリゴヌクレオチドよりなるオリゴヌクレオチドペア、並びに配列番号１５のオリゴヌクレオチド及び配列番号１６のオリゴヌクレオチドよりなるオリゴヌクレオチドペアからなるオリゴヌクレオチドペア群より選ばれる２種以上のオリゴヌクレオチドペアである前記発明（１）または（２）に記載される結核菌に含まれる薬剤耐性遺伝子を検出する方法を提供するものである。かかる構成を採用することにより、前記発明（３）と同様の効果を奏するものである。
【００１７】
また、本発明（５）は、前記ＰＣＲ増幅が、シャトルＰＣＲ増幅である前記発明（１）〜（４）のいずれかに記載される結核菌に含まれる薬剤耐性遺伝子を検出する方法を提供するものである。かかる構成を採用することにより、前記発明（１）〜（４）のいずれかの発明と同様の効果を奏するのに加えて、ＰＣＲ増幅におけるＰＣＲ用プライマーとのアニーリング、及びＤＮＡポリメラーゼによる相補鎖の伸長反応を同一の温度条件で実施できるため、結核菌に含まれる遺伝子であるｒｐｏＢ、ｋａｔＧ、ｍａｂＡ−ｉｎｈＡ、ｅｍｂＢ、ｐｎｃＡ、ｒｐｓＬ、ｒｒｓ、ｇｙｒＡからなる遺伝子群から選ばれる２種以上の遺伝子が有する２以上の特定領域を、より一層簡便にＰＣＲ増幅できるという効果を奏する。
【００１８】
また、本発明（６）は、前記２種以上の塩基配列決定用プライマーが、配列番号１７の塩基配列を含有するプライマー〜配列番号３２の塩基配列を含有するプライマーの１６のプライマーからなるプライマー群より選ばれる２種以上のプライマーである前記発明（１）〜（５）のいずれかに記載される結核菌に含まれる薬剤耐性遺伝子を検出する方法を提供するものである。かかる構成を採用することにより、前記発明（１）〜（５）のいずれかの発明の奏する効果に加えて、結核菌に含まれる遺伝子であるｒｐｏＢ、ｋａｔＧ、ｍａｂＡ−ｉｎｈＡ、ｅｍｂＢ、ｐｎｃＡ、ｒｐｓＬ、ｒｒｓ、ｇｙｒＡからなる遺伝子群から選ばれる２種以上の遺伝子が有する２以上の特定領域を、結核菌の前記遺伝子群より選ばれる遺伝子において従来の直接塩基配列決定法により塩基配列決定される領域よりも、広範な領域として増幅することができ、従来の直接塩基配列決定法において見落としていた新規な変異を見出すことが可能となるという効果を奏するものである。
【００１９】
また、本発明（７）は、２種以上の塩基配列決定用プライマーが、配列番号１７のオリゴヌクレオチド〜配列番号３２のオリゴヌクレオチドの１６のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド群より選ばれる２種以上のオリゴヌクレオチドである前記発明（１）〜（５）のいずれかに記載される結核菌に含まれる薬剤耐性遺伝子を検出する方法を提供するものである。かかる構成を採用することにより、前記発明（６）と同様の効果を奏するものである。
【００２０】
また、本発明（８）は、前記直接塩基配列決定を、ダイターミネーター法により行う前記発明（１）〜（７）のいずれかに記載される結核菌に含まれる薬剤耐性遺伝子を検出する方法を提供するものである。かかる構成を採用することにより、前記発明（１）〜（７）のいずれかの発明の奏する効果に加えて、直接塩基配列決定に際して１本のチューブにおいて１つの標的領域のシークエンス反応を行うことが可能となるという効果を奏するものである。
【００２１】
また、本発明（９）は、配列番号１のオリゴヌクレオチド及び配列番号２のオリゴヌクレオチドよりなるオリゴヌクレオチドペア、配列番号３のオリゴヌクレオチド及び配列番号４のオリゴヌクレオチドよりなるオリゴヌクレオチドペア、配列番号５のオリゴヌクレオチド及び配列番号６のオリゴヌクレオチドよりなるオリゴヌクレオチドペア、配列番号７のオリゴヌクレオチド及び配列番号８のオリゴヌクレオチドよりなるオリゴヌクレオチドペア、配列番号９のオリゴヌクレオチド及び配列番号１０のオリゴヌクレオチドよりなるオリゴヌクレオチドペア、配列番号１１のオリゴヌクレオチド及び配列番号１２のオリゴヌクレオチドよりなるオリゴヌクレオチドペア、配列番号１３のオリゴヌクレオチド及び配列番号１４のオリゴヌクレオチドよりなるオリゴヌクレオチドペア、並びに配列番号１５のオリゴヌクレオチド及び配列番号１６のオリゴヌクレオチドよりなるオリゴヌクレオチドペアからなるオリゴヌクレオチドペア群より選ばれる１種以上のオリゴヌクレオチドペアであるＰＣＲ用プライマーペアセットを提供するものである。
【００２２】
また、本発明（１０）は、配列番号１の塩基配列を含有するプライマー及び配列番号２の塩基配列を含有するプライマーによるプライマーペア、配列番号３の塩基配列を含有するプライマー及び配列番号４の塩基配列を含有するプライマーによるプライマーペア、配列番号５の塩基配列を含有するプライマー及び配列番号６の塩基配列を含有するプライマーによるプライマーペア、配列番号７の塩基配列を含有するプライマー及び配列番号８の塩基配列を含有するプライマーによるプライマーペア、配列番号９の塩基配列を含有するプライマー及び配列番号１０の塩基配列を含有するプライマーによるプライマーペア、配列番号１１の塩基配列を含有するプライマー及び配列番号１２の塩基配列を含有するプライマーによるプライマーペア、配列番号１３の塩基配列を含有するプライマー及び配列番号１４の塩基配列を含有するプライマーによるプライマーペア、並びに配列番号１５の塩基配列を含有するプライマー及び配列番号１６の塩基配列を含有するプライマーによるプライマーペアからなるプライマーペア群より選ばれる１種以上のプライマーペアであるＰＣＲ用プライマーペアセットを提供するものである。
【００２３】
また、本発明（１１）は、配列番号１のオリゴヌクレオチド〜配列番号１６のオリゴヌクレオチドの１６のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド群より選ばれる１種以上のオリゴヌクレオチドをプライマーとして有するＰＣＲ用プライマーペアセットを提供するものである。
【００２４】
また、本発明（１２）は、配列番号１の塩基配列を含有するプライマー〜配列番号１６の塩基配列を含有するプライマーの１６のプライマーからなるプライマー群より選ばれる１種以上のプライマーを有するＰＣＲ用プライマーペアセットを提供するものである。
【００２５】
また、本発明（１３）は、配列番号１７のオリゴヌクレオチド〜配列番号３２のオリゴヌクレオチドの１６のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド群より選ばれる１種以上のオリゴヌクレオチドである塩基配列決定用プライマーセットを提供するものである。
【００２６】
また、本発明（１４）は、配列番号１７の塩基配列を含有するプライマー〜配列番号３２の塩基配列を含有するプライマーの１６のプライマーからなるプライマー群より選ばれる１種以上のプライマーである塩基配列決定用プライマーセットを提供するものである。
【００２７】
また、本発明（１５）は、前記発明（９）〜（１２）のいずれかに記載のＰＣＲ用プライマーペアセットと前記発明（１３）または（１４）に記載の塩基配列決定用プライマーセットとを有することを特徴とする薬剤耐性結核の診断用試薬キットを提供するものである。
【００２８】
【発明の実施の形態】
以下に、本発明の実施の形態を述べるが、本発明はこれら実施の形態により制限されない。
【００２９】
＜結核菌由来のＤＮＡの調製＞
以下に本発明の結核菌に含まれる薬剤耐性遺伝子を検出する第１の方法を記載する。結核菌由来のＤＮＡの調製は、喀痰、髄液、胃液、糞便、リンパ節等の組織抽出液などからの結核菌からＤＮＡを抽出することによって得ることができる。例えば、喀痰中の結核菌からＤＮＡを抽出する方法は、常法を用いることができるが、Ｊ．ＢＥＩＧＥらの方法（Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，  ３３：  ９０−９５．  １９９５）に従って行うことが好ましい。
【００３０】
＜２種以上の遺伝子及び２以上の特定領域の選定＞
また、結核菌に含まれる遺伝子であるｒｐｏＢ、ｋａｔＧ、ｍａｂＡ−ｉｎｈＡ、ｅｍｂＢ、ｐｎｃＡ、ｒｐｓＬ、ｒｒｓ、及びｇｙｒＡからなる遺伝子群から２種以上の遺伝子を選ぶ。  そして、選んだ２種以上の遺伝子のそれぞれについて、ＰＣＲ増幅するための特定領域を選定し、２以上の特定領域を選定する。
【００３１】
Ｍｙｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの全ゲノム配列は、Ｃｏｌｅ，Ｓ．Ｔら（Ｎａｔｕｒｅ  ３９３（６６８５），ｐ５３７−５４４（１９９８））により報告され、ＧｅｎｅＢａｎｋ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．：ＮＣ  ０００９６２）上に開示されている。ｒｐｏＢ遺伝子についてはゲノム配列上の第７５９８０５塩基対〜第７６３３２３塩基対に相当し、ｋａｔＧ遺伝子についてはゲノム配列上の第２１５３８８７塩基対〜第２１５６１０９塩基対に相当し、ｍａｂＡ−ｉｎｈＡ遺伝子についてはゲノム配列上の第１６７３４３８塩基対〜第１６７５００９塩基対相当し、ｅｍｂＢ遺伝子についてはゲノム配列上の第４２４６５１１塩基対〜第４２４９８０７塩基対に相当し、ｐｎｃＡ遺伝子についてはゲノム配列上の第２２８８６７９塩基対〜第２２８９２３９塩基対に相当し、ｒｐｓＬ遺伝子についてはゲノム配列上の第７５１５５８塩基対〜第７８１９３２塩基対に相当し、ｒｒｓ遺伝子についてはゲノム配列上の第１４７１８４４塩基対〜第１４７３３８０塩基対に相当し、ｇｙｒＡ遺伝子についてはゲノム配列上の第７３０２塩基対〜第９８１８塩基対に相当する。ＰＣＲ増幅するために選定される特定領域は、遺伝子ごとに異なっている。以下に記載する各遺伝子の特定領域における塩基対の番号は、センスコドンの開始コドンの１番目の塩基対を１番目の塩基対として定めたものである。ｒｐｏＢ遺伝子については、前記特定領域が第１２７６塩基対〜第１３５６塩基対を含有する領域であると好ましく、第１１９９塩基対〜第１９０３塩基対を含有する領域であると最も好ましい。ｋａｔＧ遺伝子については、前記特定領域が第１塩基対〜第２２０５塩基対を含有する領域であると好ましく、第１塩基対〜第２２２３塩基対からなる領域であると最も好ましい。ｍａｂＡ−ｉｎｈＡ遺伝子については、前記特定領域が第−８１塩基対〜第１０４４塩基対を含有する領域であると好ましく、第−２１７塩基対〜第１１４５塩基対からなる領域であると最も好ましい。ｅｍｂＢ遺伝子については、前記特定領域が第８５５塩基対〜第３０７２塩基対を含有する領域であると好ましく、第６４６塩基対〜第３３８２塩基対からなる領域であると最も好ましい。ｐｎｃＡ遺伝子については、前記特定領域が第−１２塩基対〜第５４６塩基対を含有する領域であると好ましく、第−８０塩基対〜第５９０塩基対からなる領域であると最も好ましい。ｒｐｓＬ遺伝子については、前記特定領域が第１１５塩基対〜第２７３塩基対を含有する領域であると好ましく、第４塩基対〜第５７５塩基対からなる領域であると最も好ましい。ｒｒｓ遺伝子については、前記特定領域が第５１２塩基対〜第１４０２塩基対を含有する領域であると好ましく、第４２８塩基対〜第１７５６塩基対からなる領域であると最も好ましい。ｇｙｒＡ遺伝子については、前記特定領域が第２６２塩基対〜第２８５塩基対を含有する領域であると好ましく、第−１塩基対〜第３９７塩基対からなる領域であると最も好ましい。
【００３２】
遺伝子、及び遺伝子に対応する特定領域を選ぶに際しては、３種以上の遺伝子及び３以上の特定領域を選ぶと好ましく、４種以上の遺伝子及び４以上の特定領域を選ぶとさらに好ましく、５種以上の遺伝子及び５以上の特定領域を選ぶとさらに好ましく、６種以上の遺伝子及び６以上の特定領域を選ぶとさらに好ましく、７種以上の遺伝子及び７以上の特定領域を選ぶとさらに好ましく、８種全ての遺伝子及び８つの特定領域を選ぶと最も好ましい。
【００３３】
従来の研究において、結核菌の上記した８遺伝子における薬剤耐性を獲得する機構は、ゲノムの遺伝子内の比較的限定されたコドンにおける塩基の置換（変異）に耐性遺伝子の生成による機構であることが明らかにされており、これまで、これら生成した耐性遺伝子上のゲノムの遺伝子内の比較的限定されたコドンにおける塩基の置換（変異）に着目した研究がなされてきた。例えば、ｒｐｏＢ遺伝子においては、５１３番目のコドンＣＡＡ周辺の限定された領域、及び５３１番目のコドンＴＣＧ周辺の限定された領域について、ＰＣＲ増幅及び直接塩基配列決定がなされてきた。ｋａｔＧにおいては、３１５番目のコドンＡＧＣ周辺の限定された領域について、ＰＣＲ増幅及び直接塩基配列決定がなされてきた。ｍａｂＡ−ｉｎｈＡにおいては、開始コドンのＧ塩基より１５塩基上流のＣ塩基周辺の限定された領域について、ＰＣＲ増幅及び直接塩基配列決定がなされてきた。ｅｍｂＢにおいては、４９７番目のコドンＣＡＧ周辺の限定された領域について、ＰＣＲ増幅及び直接塩基配列決定がなされてきた。ｐｎｃＡにおいては、５１番目のコドンＣＡＣ周辺の限定された領域について、ＰＣＲ増幅及び直接塩基配列決定がなされてきた。ｒｐｓＬにおいては、４３番目のコドンＡＡＧ周辺の限定された領域、及び８８番目のコドンＡＡＧ周辺の限定された領域について、ＰＣＲ増幅及び直接塩基配列決定がなされてきた。ｒｒｓにおいては、５１２番目の塩基Ｃ〜５１６番目の塩基Ｃの周辺における限定された領域（ストレプトマイシンに対する耐性に関するＣｌｕｓｔｅｒＡ中の領域）、９０３番目の塩基Ｔ〜９０６番目の塩基Ａの周辺における限定された領域（ストレプトマイシンに対する耐性に関するＣｌｕｓｔｅｒＢ中の領域）、及び１３９９番目の塩基Ｃ〜１４０２番目の塩基Ｇの周辺における限定された領域（カナマイシン、ビオマイシン、及びアミカシンに対する耐性に関するＣｌｕｓｔｅｒＣ中の領域）について、ＰＣＲ増幅及び直接塩基配列決定がなされてきた。ｇｙｒＡにおいては、９５番目のコドンＡＧＣ周辺の限定された領域について、ＰＣＲ増幅及び直接塩基配列決定がなされてきた。
【００３４】
本発明も上記した８遺伝子に着目し、これらの８遺伝子から選ばれた２種以上の遺伝子における上記したコドンまたは塩基を網羅した範囲を特定領域としてＰＣＲ増幅しているが、該特定領域は、上記した従来のＰＣＲ増幅及び直接塩基配列決定のような限られたコドンのみではなく、耐性の機構から考えて、耐性に関与している変異が生じる可能性のある領域を含有する、広範な領域である。結果、直接塩基配列決定の条件を工夫すれば、新規な変異を見出すことが可能となった。従って、これまで見落としていた恐れのある変異の同定も可能となった。
【００３５】
＜２種以上のＰＣＲ用プライマーペアの決定＞
次いで、選んだ２種以上の遺伝子のそれぞれについて、選定した特定領域を増幅することができるＰＣＲ用プライマーペアを決定し、２種以上の遺伝子が有する２以上の特定領域に対応する２種以上のＰＣＲ用プライマーペアを用意する。２種以上のＰＣＲ用プライマーペアは、２以上の特定領域を増幅することができ、且つ同一の温度条件でＰＣＲ増幅できるように設計されていることが好ましい。ｒｐｏＢ遺伝子については、ＰＣＲ用プライマーペアが配列番号１の塩基配列を含有するプライマー及び配列番号２の塩基配列を含有するプライマーによるプライマーペアであると特に好ましく、ＰＣＲ用プライマーペアが配列番号１のオリゴヌクレオチド及び配列番号２のオリゴヌクレオチドよりなるオリゴヌクレオチドペアであると、最も好ましい領域である第１１９９塩基対〜第１９０３塩基対を増幅することができ、且つシャトルＰＣＲ増幅に適しているため最も好ましい。ｋａｔＧ遺伝子については、ＰＣＲ用プライマーペアが配列番号３の塩基配列を含有するプライマー及び配列番号４の塩基配列を含有するプライマーによるプライマーペアであると特に好ましく、ＰＣＲ用プライマーペアが配列番号３のオリゴヌクレオチド及び配列番号４のオリゴヌクレオチドよりなるオリゴヌクレオチドペアであると、最も好ましい領域である第１塩基対〜第２２２３塩基対を増幅することができ、且つシャトルＰＣＲ増幅に適しているため最も好ましい。ｍａｂＡ−ｉｎｈＡ遺伝子については、ＰＣＲ用プライマーペアが配列番号５の塩基配列を含有するプライマー及び配列番号６の塩基配列を含有するプライマーによるプライマーペアであると特に好ましく、ＰＣＲ用プライマーペアが配列番号５のオリゴヌクレオチド及び配列番号６のオリゴヌクレオチドよりなるオリゴヌクレオチドペアであると、最も好ましい領域である第−２１７塩基対〜第１１４５塩基対を増幅することができ、且つシャトルＰＣＲ増幅に適しているため最も好ましい。ｅｍｂＢ遺伝子については、ＰＣＲ用プライマーペアが配列番号７の塩基配列を含有するプライマー及び配列番号８の塩基配列を含有するプライマーによるプライマーペアであると特に好ましく、ＰＣＲ用プライマーペアが配列番号７のオリゴヌクレオチド及び配列番号８のオリゴヌクレオチドよりなるオリゴヌクレオチドペアであると、最も好ましい領域である第６４６塩基対〜第３３８２塩基対を増幅することができ、且つシャトルＰＣＲ増幅に適しているため最も好ましい。ｐｎｃＡ遺伝子については、ＰＣＲ用プライマーペアが配列番号９の塩基配列を含有するプライマー及び配列番号１０の塩基配列を含有するプライマーによるプライマーペアであると特に好ましく、ＰＣＲ用プライマーペアが配列番号９のオリゴヌクレオチド及び配列番号１０のオリゴヌクレオチドよりなるオリゴヌクレオチドペアであると、最も好ましい領域である第−８０塩基対〜第５９０塩基対を増幅することができ、且つシャトルＰＣＲ増幅に適しているため最も好ましい。ｒｐｓＬ遺伝子については、ＰＣＲ用プライマーペアが配列番号１１の塩基配列を含有するプライマー及び配列番号１２の塩基配列を含有するプライマーによるプライマーペアであると特に好ましく、ＰＣＲ用プライマーペアが配列番号１１のオリゴヌクレオチド及び配列番号１２のオリゴヌクレオチドよりなるオリゴヌクレオチドペアであると、最も好ましい領域である第４塩基対〜第５７５塩基対を増幅することができ、且つシャトルＰＣＲ増幅に適しているため最も好ましい。ｒｒｓ遺伝子については、ＰＣＲ用プライマーペアが配列番号１３の塩基配列を含有するプライマー及び配列番号１４の塩基配列を含有するプライマーによるプライマーペアであると特に好ましく、ＰＣＲ用プライマーペアが配列番号１３のオリゴヌクレオチド及び配列番号１４のオリゴヌクレオチドよりなるオリゴヌクレオチドペアであると、最も好ましい領域である第４２８塩基対〜第１７５６塩基対を増幅することができ、且つシャトルＰＣＲ増幅に適しているため最も好ましい。ｇｙｒＡ遺伝子については、ＰＣＲ用プライマーペアが配列番号１５の塩基配列を含有するプライマー及び配列番号１６の塩基配列を含有するプライマーによるプライマーペアであると特に好ましく、ＰＣＲ用プライマーペアが配列番号１５のオリゴヌクレオチド及び配列番号１６のオリゴヌクレオチドよりなるオリゴヌクレオチドペアであると、最も好ましい領域である第−１塩基対〜第３９７塩基対を増幅することができ、且つシャトルＰＣＲ増幅に適しているため最も好ましい。
【００３６】
なお、配列番号１のオリゴヌクレオチドは、ｒｐｏＢ遺伝子の第１１９９塩基対〜第１２２６塩基対に対応するセンスプライマーであり、配列番号２のオリゴヌクレオチドは、ｒｐｏＢ遺伝子の第１９０３塩基対〜第１８８０塩基対に対応するアンチセンスプライマーである。配列番号３のオリゴヌクレオチドは、ｋａｔＧ遺伝子の第１塩基対〜第２８塩基対に対応するセンスプライマーであり、配列番号４のオリゴヌクレオチドは、ｋａｔＧ遺伝子の第２２２３塩基対〜第２２００塩基対に対応するアンチセンスプライマーである。配列番号５のオリゴヌクレオチドは、ｍａｂＡ−ｉｎｈＡ遺伝子の第−２１７塩基対〜第−１９８塩基対に対応するセンスプライマーであり、配列番号６のオリゴヌクレオチドは、ｍａｂＡ−ｉｎｈＡ遺伝子の第１１４５塩基対〜第１１２６塩基対に対応するアンチセンスプライマーである。配列番号７のオリゴヌクレオチドは、ｅｍｂＢ遺伝子の第６４６塩基対〜第６６５塩基対に対応するセンスプライマーであり、配列番号８のオリゴヌクレオチドは、ｅｍｂＢ遺伝子の第３３８２塩基対〜第３３６３塩基対に対応するアンチセンスプライマーである。配列番号９のオリゴヌクレオチドは、ｐｎｃＡ遺伝子の第−８０塩基対〜第−６１塩基対に対応するセンスプライマーであり、配列番号１０のオリゴヌクレオチドは、ｐｎｃＡ遺伝子の第５９０塩基対〜第５７２塩基対に対応するアンチセンスプライマーである。配列番号１１のオリゴヌクレオチドは、ｒｐｓＬ遺伝子の第４塩基対〜第２３塩基対に対応するセンスプライマーであり、配列番号１２のオリゴヌクレオチドは、ｒｐｓＬ遺伝子の第５７５塩基対〜第５５６塩基対に対応するアンチセンスプライマーである。配列番号１３のオリゴヌクレオチドは、ｒｒｓ遺伝子の第４２８塩基対〜第４４７塩基対に対応するセンスプライマーであり、配列番号１４のオリゴヌクレオチドは、ｒｒｓ遺伝子の第１７５６塩基対〜第１７３７塩基対に対応するアンチセンスプライマーである。配列番号１５のオリゴヌクレオチドは、ｇｙｒＡ遺伝子の第−１塩基対〜第１９塩基対に対応するセンスプライマーであり、配列番号１６のオリゴヌクレオチドは、ｇｙｒＡ遺伝子の第３９７塩基対〜第３７９塩基対に対応するアンチセンスプライマーである。ここで、塩基対の番号は、鋳型鎖の開始コドンの開始塩基を１番目の塩基として定めたものである。
【００３７】
＜２以上の特定領域のＰＣＲ増幅＞
次いで、結核菌から抽出したＤＮＡと、２以上の特定領域に対応する２種以上のＰＣＲ用プライマーペアとを用いて、１台のＰＣＲ増幅用機器によって、２以上の特定領域をＰＣＲ増幅する。ＰＣＲ増幅においては、耐熱性ポリメラーゼの触媒作用により鋳型であるＤＮＡを基にしてプライマーに挟まれた領域を増幅する。ＰＣＲ増幅の方法としては、鋳型ＤＮＡを一本鎖にする（変性）、この一本鎖とプライマーが結合する（アニーリング）、最後に耐熱性ポリメラーゼの触媒作用により相補鎖を延長する（伸長反応）の３段階からなる通常のＰＣＲ増幅でも、シャトルＰＣＲ増幅でもよい。
【００３８】
通常、２種以上のプライマーペアにおいて、アニーリング温度はプライマーごとにその最適温度が異なり、また、伸長反応時間は、増幅したい産物の長さに比例してその長さが異なる。本発明において通常のＰＣＲ増幅を行うに際しては、２以上の特定領域に対応する２種以上のＰＣＲ用プライマーペアを構成するプライマーのアニーリング温度を全て一定にしなければならない。本発明の場合、２以上の特定領域、それもＰＣＲ産物の長さが異なる領域を、１台のＰＣＲ用機器で一度に増幅するためには、シャトルＰＣＲ増幅の方が実用的であるので好ましい。
【００３９】
シャトルＰＣＲ増幅であると、ＰＣＲ増幅におけるＰＣＲ用プライマーとのアニーリング、及びＤＮＡポリメラーゼによる相補鎖の伸長反応を同一の温度条件で実施できるため好ましい。シャトルＰＣＲ増幅は公知の方法であり、シャトルＰＣＲ増幅を行うためのキットとしては、Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｒ  ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（インビトロジエン株式会社製）、ＴａｋａＲａ  Ｚ−ｔａｑＴＭ（タカラバイオ株式会社製）、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  Ｒ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ株式会社製）が市販されており、ＰＣＲ用機器としては、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  ＳＹＳＴＥＭ  ９７００  ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  社製）、ｉ−Ｃｙｃｌｅｒ（タカラバイオ株式会社製）、ＴａｋａＲａ  ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＧＰ（タカラバイオ株式会社製）が市販されている。
【００４０】
なお、シャトルＰＣＲ増幅に際して、２種以上のＰＣＲ用プライマーペアが、上記した８種のオリゴヌクレオチドペアからなるオリゴヌクレオチドペア群より選ばれる２種以上のオリゴヌクレオチドペアあるいは、上記した８種のプライマーペアからなるプライマーペア群より選ばれる２種以上のプライマーペアであると、１台のＰＣＲ増幅用機器によって、同一の温度条件で好適にシャトルＰＣＲ増幅することが可能となる。前記２種以上のオリゴヌクレオチドペアあるいは前記２種以上のプライマーペアを、２種以上のＰＣＲ用プライマーペアとして用いると、同一の温度条件で好適にシャトルＰＣＲ増幅できる理由については、以下のように考えられる。シャトルＰＣＲにおいては、厳密なアニーリング温度を必要としないため、前記２種以上のオリゴヌクレオチドペアあるいは前記２種以上のプライマーペアのそれぞれのオリゴヌクレオチドあるいはプライマーに最適な温度にアニーリング温度を設定する必要が無く、アニーリングと伸長反応を同時に行う同一の温度条件にて、一度に増幅することができる。
【００４１】
なお、シャトルＰＣＲ法においては、逆に非特異的な反応が起こりやすくなることが懸念され、産物の長さが異なる。しかし、上記２種以上のオリゴヌクレオチドペアあるいは前記２種以上のプライマーペアにおいては、シャトルＰＣＲ増幅において同一の伸長反応時間にし、再現良く且つ非特異的反応を起こさせない為の条件設定が行われている。また、上記２種以上のオリゴヌクレオチドペアあるいは前記２種以上のプライマーペアは、シャトルＰＣＲに適したポリメラーゼ（Ｚ−ｔａｑ；ＴＡＫＡＲＡ、宝酒造社製）の温度条件を満たしている。さらに、上記２種以上のオリゴヌクレオチドペアあるいは前記２種以上のプライマーペアは、通常のＰＣＲプライマーと同様、プライマー同士の結合（プライマーダイマー形成）が起こりにくい設計になっている。加えて、上記２種以上のオリゴヌクレオチドペアあるいは前記２種以上のプライマーペアは、アニーリングに際して上記２以上の特定領域に結合する部位が、変異高発部位でないように設計されているため、菌株の変異の有無によってアニーリングに際しての結合部位に差異が生じないため、菌株によって増殖の程度に差が生じることがない。
【００４２】
２種以上のＰＣＲ用プライマーペアが、上記した８種のオリゴヌクレオチドペアより選ばれる３種以上のオリゴヌクレオチドペアあるいは上記した８種のプライマーペアより選ばれる３種以上のプライマーペアであるとさらに好ましい。２種以上のＰＣＲ用プライマーペアが、前記８種のオリゴヌクレオチドペアより選ばれる４種以上のオリゴヌクレオチドペアあるいは前記８種のプライマーペアより選ばれる４種以上のプライマーペアであるとさらに好ましい。２種以上のＰＣＲ用プライマーペアが、前記８種のオリゴヌクレオチドペア群より選ばれる５種以上のオリゴヌクレオチドペアあるいは前記８種のプライマーペア群より選ばれる５種以上のプライマーペアであるとさらに好ましい。２種以上のＰＣＲ用プライマーペアが、前記８種のオリゴヌクレオチドペア群より選ばれる６種以上のオリゴヌクレオチドペアあるいは前記８種のプライマーペアより選ばれる６種以上のプライマーペアであるとさらに好ましい。２種以上のＰＣＲ用プライマーペアが、前記８種のオリゴヌクレオチドペアより選ばれる７種以上のオリゴヌクレオチドペアあるいは前記８種のプライマーペアより選ばれる７種以上のプライマーペアであるとさらに好ましい。
【００４３】
２種以上のＰＣＲ用プライマーペアが、上記した８種のオリゴヌクレオチドペアあるいは上記した８種のプライマーペアであると、ＰＣＲ増幅するサンプルが８種となるため最も好ましい。その理由を以下に述べる。現在市場で流通しているＰＣＲ用機器は、８×１２ｗｅｌｌの構造を採り、８種のサンプルを同時にＰＣＲ増幅できる構造となっており、８種のサンプルを扱うために８練チューブも市販されている。よって８種よりサンプルが少ないと空のチューブが生じて費用の損失となり、９種以上のサンプルであると、ＰＣＲ増幅を２度に分けて行う必要があり、反応時間が２倍となってしまい時間及び費用のロスになる。さらには、８種のサンプルを用いると一度に１２検体のＰＣＲ増幅が可能であり、検体の取り違い防止にもつながる。
【００４４】
＜ＰＣＲ産物の分離及び標的領域の選定＞
ＰＣＲ増幅した２以上の特定領域の産物は、ＭｉｃｒｏＳｐｉｎＴＭ  Ｃｏｌｕｍｎｓ（アマシャムバイオサイエンス株式会社製）などにより過剰プライマーの除去、精製を行う。２以上の特定領域に含まれる２以上の標的領域を適宜選定する。各遺伝子の塩基配列は、上記したようにＣｏｌｅ，Ｓ．Ｔら（Ｎａｔｕｒｅ  ３９３（６６８５），ｐ５３７−５４４（１９９８））により報告され、ＧｅｎｅＢａｎｋ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．：ＮＣ  ０００９６２）上に開示されている。直接塩基配列決定するために選定される標的領域の好ましい領域は、遺伝子ごとに異なっている。以下に記載する各遺伝子の標的領域における塩基対の番号は、上記各遺伝子の鋳型鎖の開始コドンの開始塩基を１番目の塩基とするものである。ｒｐｏＢ遺伝子については、前記標的領域が、相補鎖の第１５２９塩基対〜上述したｒｐｏＢ遺伝子の特定領域の鋳型鎖の５’末端に位置する塩基対を含有する領域であると好ましく、相補鎖の第１５２９塩基対〜第１１９９塩基対を含有する領域であると最も好ましい。ｋａｔＧ遺伝子については、前記標的領域が、相補鎖の第６８９塩基対〜上述したｋａｔＧ遺伝子の特定領域の鋳型鎖の５’末端に位置する塩基対を含有する領域、鋳型鎖の第５７４塩基対〜上述したｋａｔＧ遺伝子の特定領域の鋳型鎖の３’末端に位置する塩基対を含有する領域、鋳型鎖の第１１６２塩基対〜上述したｋａｔＧ遺伝子の特定領域の鋳型鎖の３’末端に位置する塩基対を含有する領域、及び鋳型鎖の第１７２９塩基対〜上述したｋａｔＧ遺伝子の特定領域の鋳型鎖の３’末端に位置する塩基対を含有する領域からなる１種以上の領域であると好ましい。前記標的領域が、相補鎖の第６８９塩基対〜第１塩基対を含有する領域、鋳型鎖の第５７４塩基対〜第１３２４塩基対を含有する領域、第１１６２塩基対〜第１９１２塩基対を含有する領域、及び鋳型鎖の第１７２９塩基対〜第２２２３塩基対を含有する領域からなる領域群より選ばれる１種以上の領域であるとさらに好ましい。ｋａｔＧ遺伝子については、前記標的領域が、前記した領域群より選ばれる２種以上の領域であるとさらに好ましく、前記標的領域が、前記した領域群より選ばれる３種以上の領域であるとさらに好ましく、前記標的領域が、前記した領域群に含まれる４種全ての領域であると最も好ましい。ｍａｂＡ−ｉｎｈＡ遺伝子については、前記標的領域が、鋳型鎖の第−２１７塩基対〜上述したｍａｂＡ−ｉｎｈＡ遺伝子の特定領域の鋳型鎖の３’末端に位置する塩基対を含有する領域であると好ましく、鋳型鎖の第−２１７塩基対〜第９０３塩基対を含有する領域であると最も好ましい。ｅｍｂＢ遺伝子については、前記標的領域が、鋳型鎖の第６４６塩基対〜上述したｅｍｂＢ遺伝子の特定領域の鋳型鎖の３’末端に位置する塩基対を含有する領域、鋳型鎖の第１４６２塩基対〜上述したｅｍｂＢ遺伝子の特定領域の鋳型鎖の３’末端に位置する塩基対を含有する領域、相補鎖の第１５９６塩基対〜上述したｅｍｂＢ遺伝子の特定領域の鋳型鎖の５’末端に位置する塩基対を含有する領域、鋳型鎖の第２００７塩基対〜上述したｅｍｂＢ遺伝子の特定領域の鋳型鎖の３’末端に位置する塩基対を含有する領域、及び鋳型鎖の第２５８１塩���対〜上述したｅｍｂＢ遺伝子の特定領域の鋳型鎖の３’末端に位置する塩基対を含有する領域からなる領域群より選ばれる１種以上の領域であると好ましい。前記標的領域が、鋳型鎖の第６４６塩基対〜第１３９６塩基対を含有する領域、鋳型鎖の第１４６２塩基対〜第２２１２塩基対を含有する領域、相補鎖の第１５９６塩基対〜第８４６塩基対を含有する領域、鋳型鎖の第２００７塩基対〜第２７５７塩基対を含有する領域、及び鋳型鎖の第２５８１塩基対〜第３３３１塩基対を含有する領域からなる領域群より選ばれる１種以上の領域であるとさらに好ましい。ｅｍｂＢ遺伝子については、前記標的領域が、前記した領域群より選ばれる２種以上の領域であるとさらに好ましく、前記標的領域が、前記した領域群より選ばれる３種以上の領域であるとさらに好ましく、前記標的領域が、前記した領域群に含まれる４種以上の領域であるとさらに好ましく、前記標的領域が、前記した領域群に含まれる５種全ての領域であると最も好ましい。ｐｎｃＡ遺伝子については、前記標的領域が、鋳型鎖の第−８０塩基対〜上述したｐｎｃＡ遺伝子の特定領域の鋳型鎖の３’末端に位置する塩基対を含有する領域であると好ましく、鋳型鎖の第−８０塩基対〜第５９０塩基対を含有する領域であると最も好ましい。ｒｐｓＬ遺伝子については、前記標的領域が、鋳型鎖の第４塩基対〜上述したｒｐｓＬ遺伝子の特定領域の鋳型鎖の３’末端に位置する塩基対であると好ましく、鋳型鎖の第４塩基対〜第５７５塩基対を含有する領域であると最も好ましい。ｒｒｓ遺伝子については、標的領域が、相補鎖の第９７９塩基対〜上述したｒｒｓ遺伝子の特定領域の鋳型鎖の５’末端に位置する塩基対を含有する領域、鋳型鎖の第１２９１塩基対〜上述したｒｒｓ遺伝子の特定領域の鋳型鎖の５’末端に位置する塩基対を含有する領域からなる領域群より選ばれる１以上の領域であると好ましく、相補鎖の第９７９塩基対〜第４２８塩基対を含有する領域、及び鋳型鎖の第１２９１塩基対〜第１７５６塩基対を含有する領域の２つの領域からなる領域群より選ばれる１以上の領域であるとさらに好ましい。また、標的領域を、上記した２つの領域とするとさらに好ましい。ｇｙｒＡ遺伝子については、鋳型鎖の第１塩基対〜上述したｇｙｒＡ遺伝子の特定領域の鋳型鎖の３’末端に位置する塩基対であると好ましく、鋳型鎖の第−１塩基対〜第３９７塩基対からなる領域であると最も好ましい。なお、この段落で、なお、鋳型鎖とは、遺伝子がＲＮＡに転写される時に直接鋳型として使われる鎖を示し、相補鎖とは、鋳型鎖と２本鎖を形成するもう一方の鎖を示している。
【００４５】
標的領域を選ぶに際しては、３種以上の遺伝子に対応する標的領域全てを選ぶと好ましく、４種以上の遺伝子に対応する標的領域全てを選ぶとさらに好ましく、５種以上の遺伝子に対応する標的領域全てを選ぶとさらに好ましく、６種以上の遺伝子に対応する標的領域全てを選ぶとさらに好ましく、７種以上の遺伝子に対応する標的領域全てを選ぶとさらに好ましく、８種全ての遺伝子に対応する１６の標的領域を選ぶと最も好ましい。なお、遺伝子に対応する標的領域全てとは、例えば、ｅｍｂＢ遺伝子においては、上記した５種の標的領域全てを指す。
【００４６】
＜塩基配列決定用プライマーの選定＞
選定した２以上の標的領域に対応する２種以上の塩基配列決定用プライマーを用いて、該２以上の標的領域を直接塩基配列決定する。２種以上の塩基配列決定用プライマーとしては、公知のプライマーを用いることができる。
【００４７】
塩基配列決定用プライマーの好ましいプライマーは遺伝子ごとに異なる。遺伝子ｒｐｏＢ遺伝子については、配列番号１７のオリゴヌクレオチドあるいは配列番号１７の塩基配列を含有するプライマーが特に好ましい。ｋａｔＧ遺伝子については、配列番号１８〜２１の４つのオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド群の１種以上のオリゴヌクレオチド、あるいは配列番号１８の塩基配列を含有するプライマー〜配列番号２１の塩基配列を含有するプライマーの４つのプライマーからなるプライマー群の１種以上のプライマーが特に好ましく、塩基配列決定用プライマーが、上記オリゴヌクレオチド群またはプライマー群の２種以上がさらに好ましく、３種以上がさらに好ましく、４種全てであると最も好ましい。ｍａｂＡ−ｉｎｈＡ遺伝子については、配列番号２２のオリゴヌクレオチドあるいは配列番号２２の塩基配列を含有するプライマーが特に好ましい。ｅｍｂＢ遺伝子については、配列番号２３〜２７の５つのオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド群より選ばれる１種以上のオリゴヌクレオチド、あるいは配列番号２３の塩基配列を含有するプライマー〜配列番号２７の塩基配列を含有するプライマーの５つのプライマーからなるプライマー群より選ばれる１種以上のプライマーが特に好ましく、塩基配列決定用プライマーが、上記オリゴヌクレオチド群またはプライマー群の２種以上がさらに好ましく、３種以上がさらに好ましく、４種以上がさらに好ましく、５種全てであると最も好ましい。ｐｎｃＡ遺伝子については、配列番号２８のオリゴヌクレオチドあるいは配列番号２８の塩基配列を含有するプライマーが特に好ましい。ｒｐｓＬ遺伝子については、配列番号２９のオリゴヌクレオチドあるいは配列番号２９の塩基配列を含有するプライマーが特に好ましい。ｒｒｓ遺伝子については、配列番号３０、３１の２つのオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド群より選ばれる１種以上のオリゴヌクレオチド、あるいは配列番号３０の塩基配列を含有するプライマー及び配列番号３１の塩基配列を含有するプライマーからなるプライマー群より選ばれる１種以上のプライマーが特に好ましく、塩基配列決定用プライマーが、上記オリゴヌクレオチド群またはプライマー群の２種であると最も好ましい。ｇｙｒＡ遺伝子については、配列番号３２のオリゴヌクレオチド、及び配列番号３２の塩基配列を含有するプライマーが特に好ましい。
【００４８】
なお、配列番号１７のオリゴヌクレオチドは、ｒｐｏＢ遺伝子の相補鎖の第１５２９塩基対〜第１５１２塩基対に対応する塩基配列決定用プライマーである。配列番号１８のオリゴヌクレオチドは、ｋａｔＧ遺伝子の相補鎖の第６８９塩基対〜第６７０塩基対に対応する塩基配列決定用プライマーであり、配列番号１９のオリゴヌクレオチドは、ｋａｔＧ遺伝子の鋳型鎖の第５７４塩基対〜第５９３塩基対に対応する塩基配列決定用プライマーであり、配列番号２０のオリゴヌクレオチドは、ｋａｔＧ遺伝子の鋳型鎖の第１１６２塩基対〜第１１８１塩基対に対応する塩基配列決定用プライマーであり、配列番号２１のオリゴヌクレオチドは、ｋａｔＧ遺伝子の鋳型鎖の第１７２９塩基対〜第１７４８塩基対に対応する塩基配列決定用プライマーであり、配列番号２２のオリゴヌクレオチドは、ｍａｂＡ−ｉｎｈＡ遺伝子の鋳型鎖の第−２１７塩基対〜第−１９８塩基対に対応するアンチセンスプライマーである。配列番号２３のオリゴヌクレオチドは、ｅｍｂＢ遺伝子の鋳型鎖の第６４６塩基対〜第６６５塩基対に対応する塩基配列決定用プライマーであり、配列番号２４のオリゴヌクレオチドは、ｅｍｂＢ遺伝子の鋳型鎖の第１４６２塩基対〜第１４８１塩基対に対応する塩基配列決定用プライマーである。配列番号２５のオリゴヌクレオチドは、ｅｍｂＢ遺伝子の相補鎖の第１５９６塩基対〜第１５７７塩基対に対応する塩基配列決定用プライマーであり、配列番号２６のオリゴヌクレオチドは、ｅｍｂＢ遺伝子の鋳型鎖の第２００７塩基対〜第２０２６塩基対に対応する塩基配列決定用プライマーであり、配列番号２７のオリゴヌクレオチドは、ｅｍｂＢ遺伝子の鋳型鎖の第２５８１塩基対〜第２６０１塩基対に対応するセンスプライマーである。配列番号２８のオリゴヌクレオチドは、ｐｎｃＡ遺伝子の鋳型鎖の第−８０塩基対〜第−６１塩基対に対応するアンチセンスプライマーである。配列番号２９のオリゴヌクレオチドは、ｒｐｓＬ遺伝子の鋳型鎖の第４塩基対〜第２３塩基対に対応する塩基配列決定用プライマーである。配列番号３０のオリゴヌクレオチドは、ｒｒｓ遺伝子の相補鎖の第９７９塩基対〜第９５９塩基対に対応する塩基配列決定用プライマーであり、配列番号３１のオリゴヌクレオチドは、ｒｒｓ遺伝子の鋳型鎖の第１２９１塩基対〜第１３１０塩基対に対応する塩基配列決定用プライマーである。配列番号３２のオリゴヌクレオチドは、ｇｙｒＡ遺伝子の鋳型鎖の第−１塩基対〜第１９塩基対に対応する塩基配列決定用プライマーである。ここで、塩基対の番号は、鋳型鎖の開始コドンの開始塩基を１番目の塩基として定めたものである。
【００４９】
＜直接塩基配列決定＞
直接塩基配列決定の方法としては、２以上の標的領域を、２種以上の塩基配列決定用プライマーを用いて１台のシークエンス反応用機器で１度でシークエンス反応し、次いでシークエンス反応により得られるシークエンス反応物を、１台の塩基配列決定用機器（オートシークエンサー）により１度に泳動して、ソフトウェアにより塩基配列の解析及び編集を行う方法を好適な方法として挙げることができる。２種以上の塩基配列決定用プライマーを用いて１台のシークエンス反応用機器で２度以上に分けてシークエンス反応するシークエンス反応の方法、及び１台の塩基配列決定用機器（オートシークエンサー）により２度以上に分けて泳動して、ソフトウェアにより塩基配列の解析及び編集を行う方法も本発明に包含されるものである。シークエンス反応を行うためのシークエンス反応用機器（サーマルサイクラー）としては、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  ＳＹＳＴＥＭ  ９７００  ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  社製）、ｉ  Ｃｙｃｌｅｒ  サーマルサイクラー（日本バイオラッドラボラトリーズ株式会社製）、ＴａｋａＲａ  ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＧＰ（タカラバイオ株式会社製）を挙げることができ、直接塩基配列決定に際してシークエンス反応の産物の泳動を行う塩基配列決定用機器としては、１６本キャピラリー式ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１００  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ、４８本式キャピラリー式  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３７３０  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒ、９６本キャピラリー式  ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７００  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒなどの機器を挙げることができ、塩基配列の解析及び編集を行うソフトウェアとしてはＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＡｎａｌｙｓｉｓＳｏｆｔｗａｒｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  社製）、Ｇｅｎｅｔｙｘ（ゼネティックス株式会社製）、ＤＮＡＳＩＳ  Ｐｒｏ（日立ソフトウェア株式会社製）を挙げることができる。
【００５０】
以下に本発明の結核菌に含まれる薬剤耐性遺伝子を検出する第２の方法を記載する。＜結核菌由来のＤＮＡの調製＞、＜２種以上の遺伝子及び２以上の特定領域の選定＞、＜２種以上のＰＣＲ用プライマーペアの決定＞、＜２以上の特定領域のＰＣＲ増幅＞、＜ＰＣＲ産物の分離及び標的領域の選定＞は第１の方法と同様に行われる。また、直接塩基配列決定に用いられるシークエンス反応用キット、泳動を行う機器、並びに塩基配列の決定及び編集用ソフトウェアは前記したものと同様である。第２の方法が第１の方法と異なるのは、前記した２以上の標的領域を、１台の塩基配列決定用機器によって一度に直接塩基配列決定する点である。以下この点について詳述する。
【００５１】
通常、２種以上の塩基配列決定用プライマーによるシークエンス反応において、アニーリング温度はプライマーごとにその最適温度が異なり、また、伸長反応時間は、シークエンス反応したい産物の長さに比例してその長さが異なる。第２の方法において、１台のシークエンス反応用機器によって、２以上の標的領域を１度にシークエンス反応するためには、プライマー毎に分けて最適なアニーリング温度にてシークエンス反応を行うか、２以上の標的領域に対応する２種以上の塩基配列決定用プライマーを構成するプライマーのアニーリング温度を全て一定にしなければならない。本発明の場合、２以上の標的領域、それもシークエンス反応による産物の長さが異なる領域を、１台のシークエンス反応用機器で一度にシークエンス反応するためには、反応の際にアニーリング温度を全て一定にして行う方法が実用的であるので好ましい。
【００５２】
塩基配列決定用プライマーは、３種以上の遺伝子に対応する標的領域全てをシークエンスできる、上記した１６のオリゴヌクレオチドから選ばれるオリゴヌクレオチド群あるいは上記した１６のプライマーから選ばれるプライマー群であると好ましい。４種以上の遺伝子に対応する標的領域全てをシークエンスできる、上記した１６のオリゴヌクレオチドから選ばれるオリゴヌクレオチド群あるいは上記した１６のプライマーから選ばれるプライマー群であるとさらに好ましい。５種以上の遺伝子に対応する標的領域全てをシークエンスできる、上記した１６のオリゴヌクレオチドより選ばれるオリゴヌクレオチド群あるいは上記した１６のプライマーから選ばれるプライマー群であるとさらに好ましい。６種以上の遺伝子に対応する標的領域全てをシークエンスできる、上記した１６のオリゴヌクレオチドから選ばれるオリゴヌクレオチド群あるいは上記した１６のプライマーから選ばれるプライマー群であるとさらに好ましい。７種以上の遺伝子に対応する標的領域全てをシークエンスできる、上記した１６のオリゴヌクレオチドから選ばれるオリゴヌクレオチド群あるいは上記した１６のプライマーから選ばれるプライマー群であるとさらに好ましい。なお、３種の遺伝子に対応する標的領域全てをシークエンスできる、上記した１６のオリゴヌクレオチドから選ばれるオリゴヌクレオチド群あるいは上記した１６のプライマーから選ばれるプライマー群とは、例えば、ｒｐｏＢ遺伝子、ｋａｔＧ遺伝子、及びｍａｂＡ−ｉｎｈＡ遺伝子の上記した合計６つの標的領域を全てシークエンスできる上記した６つのプライマーまたは上記した６つのオリゴヌクレオチドからなるプライマー群を示す。
【００５３】
８種全ての遺伝子に対応する１６の標的領域をシークエンスできる、上記した１６のオリゴヌクレオチドあるいは上記した１６のプライマーであると、シークエンス反応物としてのサンプルが１６種となるため、最も好ましい。その理由を以下に述べる。直接塩基配列決定用の機器、例えば、ＡＢＩ３１００シークエンサーは、１６サンプルが１回の反応の基準となっている。そこで、１６より少ないサンプル数では費用の損失となり、サンプル数が１７以上となると２度に分けてシークエンス反応する必要があるため、反応時間が２倍となってしまい時間及び費用のロスとなる。また、上記した１６のオリゴヌクレオチドあるいは１６のプライマーは、前述の如く、最も好ましい標的領域を１度でシークエンス反応して、直接塩基配列決定できるように設計されている。
【００５４】
次に本発明のＰＣＲ用プライマーペアセットについて述べる。本発明のＰＣＲ用プライマーペアセットは、上記した発明（９）〜発明（１２）に記載されるものであるが、これらのプライマーペアセットを構成するプライマーは、全自動のオリゴヌクレオチド合成装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製３８０Ｂ）により容易に合成して調製することができる。本発明のＰＣＲ用プライマーペアセットは、上記した本発明の結核菌に含まれる薬剤耐性遺伝子を検出する第１の方法または第２の方法におけるＰＣＲ増幅する際、特に２種以上のＰＣＲ用プライマーペアとを用いて、前記２以上の特定領域を１台のＰＣＲ増幅用機器によって一度にシャトルＰＣＲ増幅する際に好適に用いることができる。
【００５５】
次に本発明の塩基配列決定用プライマーセットについて述べる。本発明の塩基配列決定用プライマーセットは、上記した発明（１３）〜発明（１４）に記載されるものであるが、これらのプライマーセットを構成するプライマーは、全自動のオリゴヌクレオチド合成装置により容易に合成して調製することができる。本発明の塩基配列決定用プライマーセットは、上記した本発明の結核菌に含まれる薬剤耐性遺伝子を検出する第１の方法または第２の方法における直接塩基配列決定、特に反応の際に、アニーリング温度を一定にして、２種以上の塩基配列決定用プライマーを用いて行うシークエンス反応を経て、該２以上の標的領域を、１台の塩基配列決定用機器によって一度に直接塩基配列決定する際において好適に用いることができる。
【００５６】
次に本発明の薬剤耐性結核の診断用試薬キットについて述べる。本発明の薬剤耐性結核の診断用試薬キットは、上記した発明（１５）に記載したものであるが、該薬剤耐性結核の診断用試薬キットを構成するプライマーは、全自動のオリゴヌクレオチド合成装置により容易に合成して調製することができる。本発明の薬剤耐性結核の診断用試薬キットは、上記した本発明の結核菌に含まれる薬剤耐性遺伝子を検出する第１の方法または第２の方法において好適に用いることができる。
【００５７】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、これは単に例示であって、本発明を制限するものではない。
【００５８】
実施例１
＜喀痰の前処理と結核菌のＤＮＡの抽出＞
３４人の患者から、３４株の喀痰検体を取り出した。３４株の喀痰検体の前処理とＤＮＡ抽出は、Ｊ．ＢＥＩＧＥらの方法（Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，  ３３：  ９０−９５．  １９９５）に従って、菌株ごとに行った。
【００５９】
＜８種の遺伝子における８つの特定領域の選定＞
上記の方法に従って、菌株ごとに抽出したＤＮＡにおいて、ｒｐｏＢ、ｋａｔＧ、ｍａｂＡ−ｉｎｈＡ、ｅｍｂＢ、ｐｎｃＡ、ｒｐｓＬ、ｒｒｓ、及びｇｙｒＡの８遺伝子を選定し、遺伝子ごとに１つの特定領域、合計８つの特定領域を選定した。ｒｐｏＢ遺伝子としては、全ての菌株で、特定領域を、第１１９９塩基対〜第１９０３塩基対の７０５塩基対からなる領域とした。ｋａｔＧ遺伝子としては、全ての菌株で、特定領域を、第１塩基対〜第２２２３塩基対の２２２３塩基対からなる領域とした。ｍａｂＡ−ｉｎｈＡ遺伝子としては、全ての菌株で、特定領域を、第−２１７塩基対〜第１１４５塩基対の１３６２塩基対からなる領域とした。ｅｍｂＢ遺伝子としては、全ての菌株で、特定領域を、第６４６塩基対〜第３３８２塩基対の２７３７塩基対からなる領域とした。ｐｎｃＡ遺伝子としては、全ての菌株で、特定領域を、第−８０塩基対〜第５９０塩基対の６７０塩基対からなる領域とした。ｒｐｓＬ遺伝子としては、全ての菌株で、特定領域を、第４塩基対〜第５７５塩基対の５７２塩基対からなる領域とした。ｒｒｓ遺伝子としては、全ての菌株で、特定領域を、第４２８塩基対〜第１７５６塩基対の１３２９塩基対からなる領域とした。ｇｙｒＡ遺伝子としては、全ての菌株で、特定領域を、第−１塩基対〜第３９７塩基対の３９８塩基対からなる領域とした。
【００６０】
＜８種のＰＣＲ用プライマーペア＞
上記した８種の遺伝子に対応する８つの特定領域のそれぞれに対して１組のプライマーペアを用意した。ｒｐｏＢ遺伝子に対応する上記特定領域に対して、配列番号１及び２のオリゴヌクレオチドペアをプライマーペアとして用いた。ｋａｔＧ遺伝子に対応する上記特定領域に対して、配列番号３及び４のオリゴヌクレオチドペアをプライマーペアとして用いた。ｍａｂＡ−ｉｎｈＡ遺伝子に対応する上記特定領域に対して、配列番号５及び６のオリゴヌクレオチドペアをプライマーペアとして用いた。ｅｍｂＢ遺伝子に対応する上記特定領域に対して、配列番号７及び８のオリゴヌクレオチドペアをプライマーペアとして用いた。ｐｎｃＡ遺伝子に対応する上記特定領域に対して、配列番号９及び１０のオリゴヌクレオチドペアをプライマーペアとして用いた。ｒｐｓＬ遺伝子に対応する上記特定領域に対して、配列番号１１及び１２のオリゴヌクレオチドペアをプライマーペアとして用いた。ｒｒｓ遺伝子に対応する上記特定領域に対して、配列番号１３及び１４のオリゴヌクレオチドペアをプライマーペアとして用いた。ｇｙｒＡ遺伝子に対応する上記特定領域に対して、配列番号１５及び１６のオリゴヌクレオチドペアをプライマーペアとして用いた。
【００６１】
＜シャトルＰＣＲ増幅＞
上記の方法にて抽出したＤＮＡを鋳型とし、上記した８つの特定領域を上記した８組のプライマーペアから選ばれるプライマーペアを、ＰＣＲチューブ１本ごとに１種ずつ投入してなる８本のＰＣＲチューブを用いて、菌株ごとに、１台のＰＣＲ増幅用機器を用いて１度にシャトルＰＣＲ増幅した。シャトルＰＣＲ増幅の手順を以下に示す。
【００６２】
ＰＣＲチューブ１本ごとの組成を、鋳型ＤＮＡ１．０μｌ、Ｚ−Ｔａｑポリメラーゼ１．２５Ｕ（タカラバイオ株式会社製）、ｄＮＴＰ２００μｌ（タカラバイオ株式会社製）、上記８組のプライマーペアから選ばれるプライマーペア１種を２００ｎＭずつとし、さらに１０×Ｚ  ｔａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ  ５μｌ（タカラバイオ株式会社製）を加え、滅菌蒸留水にて全量を５０μｌとした。用いたＰＣＲチューブは番号１〜８の８本のチューブである。１番のＰＣＲチューブには配列番号１及び２のオリゴヌクレオチドペアを、２番のＰＣＲチューブには配列番号３及び４のオリゴヌクレオチドペアを、３番のＰＣＲチューブには配列番号５及び６のオリゴヌクレオチドペアを、４番のＰＣＲチューブには配列番号７及び８のオリゴヌクレオチドペアを、５番のＰＣＲチューブには配列番号９及び１０のオリゴヌクレオチドペアを、６番のＰＣＲチューブには配列番号１１及び１２のオリゴヌクレオチドペアを、７番のＰＣＲチューブには配列番号１３及び１４のオリゴヌクレオチドペアを、８番のＰＣＲチューブには配列番号１５及び１６のオリゴヌクレオチドペアを、ＰＣＲ用プライマーペアとして投入した。このように準備したＰＣＲチューブ８本に含まれる前記８つの特定領域を、ＰＣＲ増幅用機器としてＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  ＳＹＳＴＥＭ  ９７００  ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  社製）を用いて、全て同じ温度プロファイルでシャトルＰＣＲ増幅した。温度プロファイルは、変性９５℃で１秒、アニ−リング及び伸長反応６８℃で３０秒とした。該温度プロファイルを３０サイクル繰り返した。その後、８本のＰＣＲ用チューブの１本ごとに、それぞれＭｉｃｒｏＳｐｉｎＴＭＣｏｌｕｍｎｓ（アマシャムバイオサイエンス社製）を用いてアガロースゲル電気泳動により、精製し、上記した８つの特定領域の特定領域ごとの８種のＰＣＲ産物を取り出した。アガロースゲル電気泳動の結果を図１に示す。図１において、１番はｒｐｏＢ遺伝子についての上記特定領域のＰＣＲ産物の示すバンドを、２番はｋａｔＧ遺伝子についての上記特定領域のＰＣＲ産物の示すバンドを、３番はｍａｂＡ−ｉｎｈＡ遺伝子についての上記特定領域のＰＣＲ産物の示すバンドを、４番はｅｍｂＢ遺伝子についての上記特定領域のＰＣＲ産物の示すバンドを、５番はｐｎｃＡ遺伝子についての上記特定領域のＰＣＲ産物の示すバンドを、６番はｒｐｓＬ遺伝子についての上記特定領域のＰＣＲ産物の示すバンドを、７番はｒｒｓ遺伝子についての上記特定領域のＰＣＲ産物の示すバンドを、８番はｇｙｒＡ遺伝子についての上記特定領域のＰＣＲ産物の示すバンドを、それぞれ示すものである。
【００６３】
＜８種の遺伝子における１６の標的領域の選定＞
ｒｐｏＢ遺伝子については、標的領域を、相補鎖の第１５２９塩基対〜第１１９９塩基対からなる領域とした。ｋａｔＧ遺伝子については、第一の標的領域が相補鎖の第６８９塩基対〜第１塩基対からなる領域であり、第二の標的領域が鋳型鎖の第５７４塩基対〜第１３２４塩基対からなる領域であり、第三の標的領域が第１１６２塩基対〜第１９１２塩基対からなる領域であり、第四の標的領域が鋳型鎖の第１７２９塩基対〜第２２２３塩基対からなる領域とした。ｍａｂＡ−ｉｎｈＡ遺伝子については、標的領域を、鋳型鎖の第−２１７塩基対〜第９０３塩基対からなる領域とした。ｅｍｂＢ遺伝子については、第一標的領域が鋳型鎖の第６４６塩基対〜第１３９６塩基対からなる領域、第二標的領域が鋳型鎖の第１４６２塩基対〜第２２１２塩基対からなる領域、第三標的領域が相補鎖の第１５９６塩基対〜第８４６塩基対からなる領域、第四標的領域が鋳型鎖の第２００７塩基対〜第２７５７塩基対からなる領域、及び第五標的領域が鋳型鎖の第２５８１塩基対〜第３３３１塩基対からなる領域とした。ｐｎｃＡ遺伝子については、標的領域を、鋳型鎖の第−８０塩基対〜第５９０塩基対からなる領域とした。ｒｐｓＬ遺伝子については、標的領域を、鋳型鎖の第４塩基対〜第５７５塩基対を含有する領域とした。ｒｒｓ遺伝子については、第一標的領域を相補鎖の第９７９塩基対〜第４２８塩基対からなる領域、第二標的領域を鋳型鎖の第１２９１塩基対〜第１７５６塩基対からなる領域とした。ｇｙｒＡ遺伝子については、標的領域を、鋳型鎖の第−１塩基対〜第３９７塩基対からなる領域とした。
【００６４】
＜塩基配列決定用プライマー＞
上記した８種の遺伝子に対応する１６の標的領域のそれぞれに対して１つのプライマーを用意した。ｒｐｏＢ遺伝子に対応する上記標的領域に対して、配列番号１７のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いた。ｋａｔＧ遺伝子の第一標的領域に対して、配列番号１８のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いた。ｋａｔＧ遺伝子の第二標的領域に対して、配列番号１９のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いた。ｋａｔＧ遺伝子の第三標的領域に対して、配列番号２０のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いた。ｋａｔＧ遺伝子の第四標的領域に対して、配列番号２１のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いた。ｍａｂＡ−ｉｎｈＡ遺伝子の上記標的領域に対して、配列番号２２のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いた。ｅｍｂＢ遺伝子の第一標的領域に対して、配列番号２３のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いた。ｅｍｂＢ遺伝子の第二標的領域に対して、配列番号２４のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いた。ｅｍｂＢ遺伝子の第三標的領域に対して、配列番号２５のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いた。ｅｍｂＢ遺伝子の第四特定領域に対して、配列番号２６のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いた。ｅｍｂＢ遺伝子の第五特定領域に対して、配列番号２７のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いた。ｐｎｃＡ遺伝子に対応する上記標的領域に対して、配列番号２８のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いた。ｒｐｓＬ遺伝子に対応する上記標的領域に対して、配列番号２９のオリゴヌクレオチドペアをプライマーペアとして用いた。ｒｒｓ遺伝子の第一標的領域に対して、配列番号３０のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いた。ｒｒｓ遺伝子の第二標的領域に対して、配列番号３１のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いた。ｇｙｒＡ遺伝子に対応する上記標的領域に対して、配列番号３２のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いた。
【００６５】
＜シークエンス反応＞
Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：シークエンス反応（Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ反応）は、ＢｉｇＤｙｅ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｃｙｃｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ  Ｖ  ３．０（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，社製）を用いたダイターミネーター法にて行った。シークエンス反応用チューブの組成は以下の通りとした。プレミックス（シークエンス用緩衝液；５×Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ  ４μｌ、デオキシリボヌクレオチド３リン酸；ｄＮＴＰ  ｍｉｘ  １μｌ、ダイデオキシターミネーター；ＤｙｅＤｅｏｘｙ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｓ  ０．５μｌ、ＤＮＡ  ポリメラーゼであるＡｍｐｌｉＴａｑ，ＦＳ  ４μｌ；合計８μｌ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  社製））、１つのチューブにつき１種のＰＣＲ産物１μｌ、耐性遺伝子の上記標的領域の塩基配列決定に適したプライマー３．２ｐｍｏｌを加え、滅菌蒸留水にて全量を２０μｌとした。
【００６６】
用いたシークエンス反応用チューブは番号１〜１６の１６本であった。１番のシークエンス反応用チューブには、上記した１番のＰＣＲ用チューブにより得られたＰＣＲ産物と配列番号１７のオリゴヌクレオチドとを、２番のシークエンス反応用チューブには、２番のＰＣＲ用チューブにより得られたＰＣＲ産物と配列番号１８のオリゴヌクレオチドとを、３番のシークエンス反応用チューブには、２番のＰＣＲ用チューブにより得られたＰＣＲ産物と配列番号１９のオリゴヌクレオチドとを、４番のシークエンス反応用チューブには、２番のＰＣＲ用チューブにより得られたＰＣＲ産物と配列番号２０のオリゴヌクレオチドとを、５番のシークエンス反応用チューブには、２番のＰＣＲ用チューブにより得られたＰＣＲ産物と配列番号２１のオリゴヌクレオチドとを、６番のシークエンス反応用チューブには、３番のＰＣＲ用チューブにより得られたＰＣＲ産物と配列番号２２のオリゴヌクレオチドとを、７番のシークエンス反応用チューブには、４番のＰＣＲ用チューブにより得られたＰＣＲ産物と配列番号２３のオリゴヌクレオチドとを、８番のシークエンス反応用チューブには、４番のＰＣＲ用チューブにより得られたＰＣＲ産物と配列番号２４のオリゴヌクレオチドとを、９番のシークエンス反応用チューブには、４番のＰＣＲ用チューブにより得られたＰＣＲ産物と配列番号２５のオリゴヌクレオチドとを、１０番のシークエンス反応用チューブには、４番のＰＣＲ用チューブにより得られたＰＣＲ産物と配列番号２６のオリゴヌクレオチドとを、１１番のシークエンス反応用チューブには、４番のＰＣＲ用チューブにより得られたＰＣＲ産物と配列番号２７のオリゴヌクレオチドとを、１２番のシークエンス反応用チューブには、５番のＰＣＲ用チューブにより得られたＰＣＲ産物と配列番号２８のオリゴヌクレオチドとを、１３番のシークエンス反応用チューブには、６番のＰＣＲ用チューブにより得られたＰＣＲ産物と配列番号２９のオリゴヌクレオチドとを、１４番のシークエンス反応用チューブには、７番のＰＣＲ用チューブにより得られたＰＣＲ産物と配列番号３０のオリゴヌクレオチドとを、１５番のシークエンス反応用チューブには、７番のＰＣＲ用チューブにより得られたＰＣＲ産物と配列番号３１のオリゴヌクレオチドとを、１６番のシークエンス反応用チューブには、８番のＰＣＲ用チューブにより得られたＰＣＲ産物と配列番号３２のオリゴヌクレオチドとを、投入した。シークエンス反応の温度プロファイルは以下の通りである。変性９６℃１０秒、アニーリング５０℃５秒、伸長反応６０℃４分を２５サイクル繰り返した。シークエンス反応は、上記した１６本のチューブとシークエンス反応用機器として上記したＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  ＳＹＳＴＥＭ  ９７００  ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  社製）を用いて１６サンプル全て１度に行った。
【００６７】
増幅反応後、カラムとしてＣｅｎｔｒｉ−ｓｅｐ  ｓｐｉｎ  ｃｏｌｕｍｎｓ（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ社製）を用いて、未反応Ｄｙｅ及び過剰プライマーを除去して、シークエンス反応物を精製した。次いで、カラム溶出液を濃縮遠心機（トミー工業株式会社製）を用いて５０℃で１７００ｒｐｍで１５分遠心して乾燥させ、ｌｏａｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ、すなわちＨｉ−Ｄｉホルムアミド（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）１５μｌを加え、９５℃２分加熱後、急冷した。さらに、１つのウェルに対して１本のチューブから得られたシークエンス反応物を入れることにより、１６チューブのシークエンス反応物を９６ウエルプレート（８ウェル×１２レーン中の２レーン）に入れ、１６本キャピラリー式ＡＢＩ３１００オートシークエンサーを用いることによりウェルを無駄にすることなく泳動した。泳動は、菌株ごとに行った。
【００６８】
＜塩基配列の解析＞
塩基配列の解析及び編集用のソフトウェアとしては、Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用い、これらの既知の薬剤感受性Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓＨ３７Ｒｖ株の塩基配列と比較することにより、変異の有無を、菌株ごとに解析した。各遺伝子ごとに、見つかった変異の位置及び変異、変異が見つかった菌株数を以下に詳述する。
【００６９】
＜塩基配列の解析の結果＞
以下に示すセンスコドンの番号については、センスコドンの開始コドンを第１番目のコドンとして、番号を付した。また、塩基対の番号は、センスコドンの開始コドンの第１番目の塩基対を第１番目の塩基対として塩基対の番号を付した。
【００７０】
ｒｐｏＢ遺伝子については、３４株中１株が、第５１３番目のセンスコドンＣＡＡ（グルタミン、Ｇｌｎに翻訳される）がコドンＣＴＡ（ロイシン、Ｌｅｕに翻訳される）に変異しており、３４株中６株が、第５３１番目のセンスコドンＴＣＧ（セリン、Ｓｅｒに翻訳される）がコドンＴＴＧ（ロイシン、Ｌｅｕに翻訳される）に変異しており、３４株中１株が、第５２６番目のセンスコドンＣＡＣ（ヒスチジン、Ｈｉｓに翻訳される）がＡＣＣ（チロシン、Ｔｈｒに翻訳される）に変異しており、変異が確認された菌株は３４株中、合計８株であった。遺伝子の変異のうち、第５２６番目のセンスコドンの変異は新規な発見である。
【００７１】
ｋａｔＧ遺伝子については、３４株中１株が、第２９５番目のセンスコドンＣＡＧ（グルタミン、Ｇｌｎに翻訳される）がＣＣＧ（プロリン、Ｐｒｏに翻訳される）に変異しており、３４株中１株が、第２９７番目のセンスコドンＧＧＣ（グリシン、Ｇｌｙに翻訳される）がＧＴＣ（バリン、Ｖａｌに翻訳される）に変異しており、３４株中４株が、第３１５番目のセンスコドンＡＧＣ（セリン、Ｓｅｒに翻訳される）がＡＣＣ（トレオニン、Ｔｈｒに翻訳される）に変異しており、さらに３４株中２株が、第３２４番目のセンスコドンＡＣＣ（トレオニン、Ｔｈｒに翻訳される）がＣＣＣ（プロリン、Ｐｒｏに翻訳される）に変異しており、変異が確認された菌株は３４株中、合計８株であった。遺伝子の変異のうち、第２９５番目のセンスコドン、第２９７番目のセンスコドン及び第３２４番目のセンスコドンの変異は新規な発見である。
【００７２】
ｍａｂＡ−ｉｎｈＡ遺伝子については、３４株中４株が、第−１５番目の塩基対にあるＣ塩基がＴ塩基に変異しており、変異が確認された菌株は３４株中、合計４株であった。
【００７３】
ｅｍｂＢ遺伝子については、３４株中１株が、第４９７番目のセンスコドンＣＡＧ（グルタミン、Ｇｌｎに翻訳される）がＣＧＧ（アルギニン、Ａｒｇに翻訳される）に変異しており、さらに３４株中３株が、第３０６番目のセンスコドンＡＴＧ（メチオニン、Ｍｅｔに翻訳される）がＡＴＡ（イソロイシン、Ｉｌｅに翻訳される）に変異しており、変異が確認された菌株は３４株中、合計４株であった。
【００７４】
ｐｎｃＡ遺伝子については、３４株中１株が、第４番目のセンスコドンＧＣＧ（アラニン、Ａｌａに翻訳される）がＧＡＧ（グルタミン、Ｇｌｕに翻訳される）に変異しており、３４株中１株が、第１０番目のセンスコドンＣＡＧ（グルタミン、Ｇｌｎに翻訳される）がＣＣＧ（プロリン、Ｐｒｏに翻訳される）に変異しており、３４株中１株が、第５１番目のセンスコドンＣＡＣ（ヒスチジン、Ｈｉｓに翻訳される）がＣＡＧ（グルタミン、Ｇｌｎに翻訳される）に変異しており、さらに３４株中１株が、第１４８番目のセンスコドンＣＧＣ（アルギニン、Ａｒｇに翻訳される）がＡＧＣ（セリン、Ｓｅｒに翻訳される）に変異しており、変異が確認された菌株は３４株中、合計４株であった。遺伝子の変異のうち、第４番目のセンスコドンの変異、第１０番目のセンスコドンの変異及び第１４８番目のセンスコドンの変異は新規な発見である。
【００７５】
ｒｐｓＬ遺伝子については、３４株中、変異を生じた菌株はなかった。
【００７６】
ｒｒｓ遺伝子については、３４株中１株が、第１４００番目の塩基対にあるＡ塩基がＴ塩基に変異しており、変異が確認された菌株は３４株中、合計１株であった。第１４００番目の塩基対の変異は新規な発見である。
【００７７】
ｇｙｒＡ遺伝子については、３４株中１株が、第９０番目のセンスコドンＧＣＧ（アラニン、Ａｌａに翻訳される）がＧＴＧ（バリン、Ｖａｌに翻訳される）に変異しており、変異が確認された菌株は３４株中、合計１株であった。
【００７８】
以上をまとめると、結核菌ＤＮＡ抽出後から、塩基配列の解析が終了するまでに要した時間は、約６．５時間であり、従来の薬剤感受性試験が２週間以上要したのに対して、さらに、従来のＰＣＲ増幅及び直接塩基配列決定により上記８種の遺伝子の塩基配列決定する際に要する時間に対して、耐性遺伝子を有する菌株を検出するために必要な時間を大幅に短縮できた。また、本方法は遺伝子変異を特定できるので、疫学情報としても使用できることがわかった。なお、ｒｐｏＢ遺伝子に変異を有する菌株８株中１株、ｋａｔＧ遺伝子に変異を有する菌株８株中４株、ｐｎｃＡ遺伝子に変異を有する菌株４株中３株、ｒｒｓ遺伝子に変異を有する１株について、これまで報告のない新規の変異を有する菌株を発見した。
【００７９】
実施例２
以下のように従来の薬剤感受性試験と実施例１の＜塩基配列の解析の結果＞とを比較検討した。
【００８０】
＜薬剤感受性試験＞
従来の薬剤感受性試験を実施した。＜喀痰の前処理と結核菌のＤＮＡの抽出＞における３４人の患者からの結核菌の菌株３４株を、菌株ごとに、ＳＡＢＩＮＥらの方法（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ３７（１），ｐ４５〜４８，１９９９）に従って、４週間かけて増殖させた。増殖させた菌株を用いて、菌株ごとに、薬剤感受性試験を行った。ＩＮＨ、ＲＦＰ、ＥＭＢについては、ＳＡＢＩＮＥら（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ３７（１），ｐ４５〜４８，１９９９）の方法に従って、薬剤感受性試験を行った。また、ＰＺＡについては、Ａ．Ｐ．ＤＡＶＩＥＳら（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，３８（１０），ｐ３６８６〜３６８８，２０００）の方法に従って、薬剤感受性試験を行った。結果、調べた臨床分離株３４株中、１９株は全ての薬剤に感受性であった。３４株中１０株が、ＲＦＰに対する耐性を有することがわかった。３４株中１５株がＩＮＨに対する耐性を有することがわかった。３３株中４株がＥＭＢに対する耐性を有することがわかった。３３株中４株がＰＺＡに対する耐性を有することがわかった。
【００８１】
＜実施例１の塩基配列の解析結果と薬剤感受性試験の結果との比較検討＞
薬剤感受性試験において全ての薬剤に感受性であった１９株については、実施例１の塩基配列の解析結果においては、全１９株とも、耐性遺伝子の変異は認められなかった。薬剤感受性試験において、ＲＦＰに対する耐性を有する１０株については、実施例１の塩基配列の解析結果において、該１０株中８株で、ＲＦＰに対する耐性に関与する変異である、ｒｐｏＢ遺伝子の変異が検出された。薬剤感受性試験において、ＩＮＨに対する耐性を有する１５株については、実施例１の塩基配列の解析結果において、該１５株中９株で、ＩＮＨに対する耐性に関与する変異である、ｋａｔＧ遺伝子の変異が検出され、且つ該１５株中４株で、ＩＮＨに対する耐性に関与する変異である、ｍａｂＡ−ｉｎｈＡ遺伝子の変異が検出された。ＩＮＨに対する耐性を有する１５株中１３株において、耐性に関与する遺伝子に変異が確認されたこととなる。薬剤感受性試験において、ＥＭＢに対する耐性を有する４株については、実施例１の塩基配列の解析結果において、該４株中４株で、ＥＭＢに対する耐性に関与する変異である、ｅｍｂＢ遺伝子の変異が検出された。薬剤感受性試験において、ＰＺＡに対する耐性を有する４株については、実施例１の塩基配列の解析結果において、該４株中４株で、ＰＺＡに対する耐性に関与する変異である、ｐｎｃＡ遺伝子の変異が検出された。
【００８２】
以上の結果をまとめると、実施例１の塩基配列の解析結果では、薬剤感受性試験によるＲＦＰ耐性株１０株中８株（８０％）、薬剤感受性試験によるＩＮＨ耐性株１５株中１３株（８７％）、薬剤感受性試験によるＥＭＢ耐性株４株中４株（１００％）、薬剤感受性試験によるＰＺＡ耐性株４株中４株（１００％）において、耐性に関与する遺伝子の変異を検出でき、結果として、薬剤感受性試験における耐性菌を、検出することができた。
【００８３】
本実施例の薬剤耐性遺伝子を検出する方法は、ＰＣＲ増幅により行われるので、比較的少量のＤＮＡ量、菌量で十分である。従って、患者喀痰検体から直接検査することが可能である。また、塩基配列を直接解読するので、配列の違いによる見逃しがない。さらに、株間の疫学情報としても利用できる（同じ株なのかどうか比較的正確にわかる）。加えて、実施例１に用いた８種のＰＣＲ用プライマー並びに１６種の塩基配列決定用プライマーは、シークエンサー（ＡＢＩ３１００）とＰＣＲ増幅器があれば、簡単なキット化が可能である。
【００８４】
【発明の効果】
本発明により、迅速かつ簡便に結核菌に含まれる薬剤耐性遺伝子を検出する方法、並びに該方法において好適に用いることができるＰＣＲ用プライマーペアセット、塩基配列決定用プライマーセット、及び薬剤耐性結核の診断用試薬キットを提供することができる。本発明の薬剤耐性遺伝子を検出する方法は、結核の迅速薬剤感受性試験として、医療施設の細菌検査部門、保健所、地方衛生研究所、細菌検査センターなどで簡便に利用できる。
【００８５】
【配列表】
【００８６】
配列番号：１  配列の長さ：２８  配列の型：核酸  鎖の数：一本鎖  トポロジー：直鎖状  配列の種類  他の核酸  合成ＤＮＡ  配列  ５’−ＣＣＣ  ＡＧＧ  ＡＣＧＴＧＧ  ＡＧＧ  ＣＧＡ  ＴＣＡ  ＣＡＣ  ＣＧＣ  Ａ−３’
【００８７】
配列番号：２  配列の長さ：２３  配列の型：核酸  鎖の数：一本鎖  トポロジー：直鎖状  配列の種類  他の核酸  合成ＤＮＡ  配列  ５’−ＣＧＴ  ＣＧＣ  ＣＧＧＣＧＴ  ＣＧＡ  ＴＣＧ  ＣＣＧ  ＣＧ−３’
【００８８】
配列番号：３  配列の長さ：３２  配列の型：核酸  鎖の数：一本鎖  トポロジー：直鎖状  配列の種類  他の核酸  合成ＤＮＡ  配列  ５’−ＧＴＧ  ＣＣＣ  ＧＡＧＣＡＡ  ＣＡＣ  ＣＣＡ  ＣＣＣ  ＡＴＴ  ＡＣＡ  ＧＡＡ  ＡＣ−３’
【００８９】
配列番号：４  配列の長さ：２４  配列の型：核酸  鎖の数：一本鎖  トポロジー：直鎖状  配列の種類  他の核酸  合成ＤＮＡ  配列  ５’−ＴＣＡ  ＧＣＧ  ＣＡＣＧＴＣ  ＧＡＡ  ＣＣＴ  ＧＴＣ  ＧＡＧ−３’
【００９０】
配列番号：５  配列の長さ：２０  配列の型：核酸  鎖の数：一本鎖  トポロジー：直鎖状  配列の種類  他の核酸  合成ＤＮＡ  配列  ５’−ＡＣＡ  ＴＡＣ  ＣＴＧＣＴＧ  ＣＧＣ  ＡＡＴ  ＴＣ−３’
【００９１】
配列番号：６  配列の長さ：２０  配列の型：核酸  鎖の数：一本鎖  トポロジー：直鎖状  配列の種類  他の核酸  合成ＤＮＡ  配列  ５’−ＧＣＡ  ＴＡＣ  ＧＡＡＴＡＣ  ＧＣＣ  ＧＡＧ  ＡＴ−３’
【００９２】
配列番号：７  配列の長さ：２０  配列の型：核酸  鎖の数：一本鎖  トポロジー：直鎖状  配列の種類  他の核酸  合成ＤＮＡ  配列  ５’−ＡＣＧ  ＣＴＧ  ＡＡＡＣＴＧ  ＣＴＧ  ＧＣＡ  ＡＴ−３’
【００９３】
配列番号：８  配列の長さ：２０  配列の型：核酸  鎖の数：一本鎖  トポロジー：直鎖状  配列の種類  他の核酸  合成ＤＮＡ  配列  ５’−ＧＴＧ  ＣＡＴ  ＡＣＣＧＡＧ  ＣＡＧ  ＣＡＴ  ＡＧ−３’
【００９４】
配列番号：９  配列の長さ：２０  配列の型：核酸  鎖の数：一本鎖  トポロジー：直鎖状  配列の種類  他の核酸  合成ＤＮＡ  配列  ５’−ＧＧＣ  ＧＴＣ  ＡＴＧＧＡＣ  ＣＣＴ  ＡＴＡ  ＴＣ−３’
【００９５】
配列番号：１０  配列の長さ：１９  配列の型：核酸  鎖の数：一本鎖  トポロジー：直鎖状  配列の種類  他の核酸  合成ＤＮＡ  配列  ５’−ＣＡＡ  ＣＡＧ  ＴＴＣ  ＡＴＣ  ＣＣＧ  ＧＴＴ  Ｃ−３’
【００９６】
配列番号：１１  配列の長さ：２０  配列の型：核酸  鎖の数：一本鎖  トポロジー：直鎖状  配列の種類  他の核酸  合成ＤＮＡ  配列  ５’−ＣＣＡ  ＡＣＣ  ＡＴＣ  ＣＡＧ  ＣＡＧ  ＣＴＧ  ＧＴ−３’
【００９７】
配列番号：１２  配列の長さ：２０  配列の型：核酸  鎖の数：一本鎖  トポロジー：直鎖状  配列の種類  他の核酸  合成ＤＮＡ  配列  ５’−ＧＴＣ  ＧＡＧ  ＡＧＣ  ＣＣＧ  ＣＴＴ  ＧＡＧ  ＧＧ−３’
【００９８】
配列番号：１３  配列の長さ：２０  配列の型：核酸  鎖の数：一本鎖  トポロジー：直鎖状  配列の種類  他の核酸  合成ＤＮＡ  配列  ５’−ＡＡＡ  ＣＣＴ  ＣＴＴ  ＴＣＡ  ＣＣＡ  ＴＣＧ  ＡＣ−３’
【００９９】
配列番号：１４  配列の長さ：２０  配列の型：核酸  鎖の数：一本鎖  トポロジー：直鎖状  配列の種類  他の核酸  合成ＤＮＡ  配列  ５’−ＧＴＡ  ＴＣＣ  ＡＴＴ  ＧＡＴ  ＧＣＴ  ＣＧＣ  ＡＡ−３’
【０１００】
配列番号：１５  配列の長さ：２０  配列の型：核酸  鎖の数：一本鎖  トポロジー：直鎖状  配列の種類  他の核酸  合成ＤＮＡ  配列  ５’−ＧＡＴ  ＧＡＣ  ＡＧＡ  ＣＡＣ  ＧＡＣ  ＧＴＴ  ＧＣ−３’
【０１０１】
配列番号：１６  配列の長さ：１９  配列の型：核酸  鎖の数：一本鎖  トポロジー：直鎖状  配列の種類  他の核酸  合成ＤＮＡ  配列  ５’−ＧＧＧ  ＣＴＴ  ＣＧＧ  ＴＧＴ  ＡＣＣ  ＴＣＡ  Ｔ−３’
【０１０２】
配列番号：１７  配列の長さ：１８  配列の型：核酸  鎖の数：一本鎖  トポロジー：直鎖状  配列の種類  他の核酸  合成ＤＮＡ  配列  ５’−  ＴＡＣ  ＧＧＣ  ＧＴＴ  ＴＣＧ  ＡＴＧ  ＡＡＣ−３’
【０１０３】
配列番号：１８  配列の長さ：２０  配列の型：核酸  鎖の数：一本鎖  トポロジー：直鎖状  配列の種列  他の核酸  合成ＤＮＡ  配列  ５’−ＡＣＧ  ＴＡＧ  ＡＴＣ  ＡＧＣ  ＣＣＣ  ＡＴＣ  ＴＧ−３’
【０１０４】
配列番号：１９  配列の長さ：２０  配列の型：核酸  鎖の数：一本鎖  トポロジー：直鎖状  配列の種類  他の核酸  合成ＤＮＡ    配列  ５’−ＧＡＧ  ＣＣＣ  ＧＡＴ  ＧＡＧ  ＧＴＣ  ＴＡＴ  ＴＧ−３’
【０１０５】
配列番号：２０  配列の長さ：２０  配列の型：核酸  鎖の数：一本鎖  トポロジー：直鎖状  配列の種類  他の核酸  合成ＤＮＡ  配列  ５’−ＣＣＧ  ＡＴＣ  ＴＡＴ  ＧＡＧ  ＣＧＧ  ＡＴＣ  ＡＣ−３’
【０１０６】
配列番号：２１  配列の長さ：２０  配列の型：核酸  鎖の数：一本鎖  トポロジー：直鎖状  配列の種類  他の核酸  合成ＤＮＡ  配列  ５’−ＧＡＡ  ＣＡＡ  ＡＣＣ  ＧＡＣ  ＧＴＧ  ＧＡＡ  ＴＣ−３’
【０１０７】
配列番号：２２  配列の長さ：２０  配列の型：核酸  鎖の数：一本鎖  トポロジー：直鎖状  配列の種類  他の核酸  合成ＤＮＡ  配列  ５’−ＡＣＡ  ＴＡＣ  ＣＴＧ  ＣＴＧ  ＣＧＣ  ＡＡＴ  ＴＣ−３’
【０１０８】
配列番号：２３  配列の長さ：２０  配列の型：核酸  鎖の数：一本鎖  トポロジー：直鎖状  配列の種類  他の核酸  合成ＤＮＡ  配列  ５’−ＡＣＧ  ＣＴＧ  ＡＡＡ  ＣＴＧ  ＣＴＧ  ＧＣＧ  ＡＴ−３’
【０１０９】
配列番号：２４  配列の長さ：２０  配列の型：核酸  鎖の数：一本鎖  トポロジー：直鎖状  配列の種類  他の核酸  合成ＤＮＡ  配列  ５’−ＧＴＣ  ＡＴＣ  ＣＴＧ  ＡＣＣ  ＧＴＧ  ＧＴＧ  ＴＴ−３’
【０１１０】
配列番号：２５  配列の長さ：２０  配列の型：核酸  鎖の数：一本鎖  トポロジー：直鎖状  配列の種類  他の核酸  合成ＤＮＡ  配列  ５’−ＧＧＴ  ＧＧＧ  ＣＡＧ  ＧＡＴ  ＧＡＧ  ＧＴＡ  ＧＴ−３’
【０１１１】
配列番号：２６  配列の長さ：２０  配列の型：核酸  鎖の数：一本鎖  トポロジー：直鎖状  配列の種類  他の核酸  合成ＤＮＡ  配列  ５’−ＣＡＣ  ＡＡＴ  ＣＴＴ  ＴＴＴ  ＣＧＣ  ＣＣＴ  ＧＴ−３’
【０１１２】
配列番号：２７  配列の長さ：２１  配列の型：核酸  鎖の数：一本鎖  トポロジー：直鎖状  配列の種類  他の核酸  合成ＤＮＡ  配列  ５’−ＧＣＧ  ＴＧＧ  ＴＡＴ  ＣＴＣ  ＣＴＧ  ＣＣＴ  ＡＡＧ−３’
【０１１３】
配列番号：２８  配列の長さ：２０  配列の型：核酸  鎖の数：一本鎖  トポロジー：直鎖状  配列の種類  他の核酸  合成ＤＮＡ  配列  ５’−ＧＧＣ  ＧＴＣ  ＡＴＧ  ＧＡＣ  ＣＣＴ  ＡＴＡ  ＴＣ−３’
【０１１４】
配列番号：２９  配列の長さ：２０  配列の型：核酸  鎖の数：一本鎖  トポロジー：直鎖状  配列の種類  他の核酸  合成ＤＮＡ  配列  ５’−ＣＣＡ  ＡＣＣ  ＡＴＣ  ＣＡＧ  ＣＡＧ  ＣＴＧ  ＧＴ−３’
【０１１５】
配列番号：３０  配列の長さ：２１  配列の型：核酸  鎖の数：一本鎖  トポロジー：直鎖状  配列の種類  他の核酸  合成ＤＮＡ  配列  ５’−ＣＡＧ  ＧＴＡ  ＡＧＧ  ＴＴＣ  ＴＴＣ  ＧＣＧ  ＴＴＧ−３’
【０１１６】
配列番号：３１  配列の長さ：２０  配列の型：核酸  鎖の数：一本鎖  トポロジー：直鎖状  配列の種類  他の核酸  合成ＤＮＡ  配列  ５’−  ＧＴＴ  ＣＧＧ  ＡＴＣ  ＧＧＧ  ＧＴＣ  ＴＧＣ  ＡＡ  −３’
【０１１７】
配列番号：３２  配列の長さ：２０  配列の型：核酸  鎖の数：一本鎖  トポロジー：直鎖状  配列の種類  他の核酸  合成ＤＮＡ  配列  ５’−ＧＡＴ  ＧＡＣ  ＡＧＡ  ＣＡＣ  ＧＡＣ  ＧＴＴ  ＧＣ−３’
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、アガロースゲル電気泳動の結果得られた８種のＰＣＲ産物を示す図である。
【図２】図２は、薬剤耐性に関与する遺伝子の結核菌遺伝子上の位置を示す図である。
【図１】
2004215542.tif 000002
【図２】
2004215542.tif 000003