【手続補正書】
【提出日】平成24年4月12日(2012.4.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの甘味料または甘味増強剤と結合可能なＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質であって、配列番号２または配列番号２０と少なくとも９０％の配列同一性を有するＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２ポリペプチド、および配列番号４または配列番号２２と少なくとも９０％の配列同一性を有するＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３ポリペプチドからなる群から選択される１または２以上のＣＳＲ：：Ｔ１Ｒポリペプチドを含む、前記ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質。
【請求項２】
ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２／ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３ヘテロダイマーキメラタンパク質、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２／Ｔ１Ｒ３ヘテロダイマーキメラタンパク質、およびＴ１Ｒ２／ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３ヘテロダイマーキメラタンパク質からなる群から選択されるヘテロダイマータンパク質を形成する２つのポリペプチドサブユニットを含み、ヘテロダイマーのＴ１Ｒ２サブユニットが配列番号８と少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドを含有し、ヘテロダイマーのＴ１Ｒ３サブユニットが配列番号１０と少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む、請求項１に記載のＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質。
【請求項３】
ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２−ａ／ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３−ａヘテロダイマータンパク質、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２−ｂ／ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３−ｂヘテロダイマータンパク質、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２−ａ／ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３−ｂヘテロダイマータンパク質、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２−ｂ／ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３−ａヘテロダイマータンパク質または少なくとも９０％の配列同一性を有するヘテロダイマータンパク質からなる群から選択されるＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２／ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３ヘテロダイマーキメラタンパク質を含む、請求項２に記載の２つのポリペプチドサブユニットを含むＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質であって、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２−ａが配列番号２に相当し、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２−ｂが配列番号２０に相当し、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３−ａが配列番号４に相当しおよびＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３−ｂが配列番号２２に相当する、前記ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質。
【請求項４】
少なくとも１つの甘味料または甘味増強剤と結合することができる請求項１に記載のＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質をコードする核酸であって、５０％のホルムアルデヒド、５×ＳＳＣ、および０．１％のＳＤＳからなる溶液中で４２℃の温度、および０．２×ＳＳＣおよび０．１％のＳＤＳからなる溶液中で６５℃で洗浄されるというストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でのハイブリダイゼーションによって決定された、配列番号１（ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２−ａ）、配列番号１９（ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２−ｂ）、配列番号３（ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３−ａ）および配列番号２１（ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３−ｂ）からなる群から選択される核酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸、配列番号２または配列番号２０と少なくとも９０％以上の配列同一性を有するＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ２ポリペプチドをコードする核酸、および配列番号４または配列番号２２と少なくとも９０％以上の配列同一性を有するＣＳＲ：：Ｔ１Ｒ３ポリペプチドをコードする核酸の１種または２種以上を含む、前記核酸。
【請求項５】
配列番号６（ＨＳＶタグ）をその対応するタンパク質のＣ末端またはその付近に含む、請求項４に記載の核酸。
【請求項６】
請求項４または５で定義された核酸を含む、発現ベクター。
【請求項７】
請求項６で定義された発現ベクターを形質転換された、宿主細胞。
【請求項８】
安定的に請求項１で定義されたＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質およびＧタンパク質、任意にＧａｑ−ガストデューシンと少なくとも９０％の配列同一性を有するＧタンパク質を発現する、宿主細胞。
【請求項９】
一時的に請求項１で定義されたＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質およびＧタンパク質、任意にＧａｑ−ガストデューシンと少なくとも９０％の配列同一性を有するＧタンパク質を発現する、宿主細胞。
【請求項１０】
請求項１〜３のいずれかで定義されたＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質を産生する方法であって、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質をコードする発現ベクターを含む真核細胞、酵母細胞、昆虫細胞、哺乳類細胞、両生類細胞、およびぜん虫細胞からなる群より選択された宿主細胞を、発現に十分な条件下で培養し、それによってＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質を形成し、任意にそれを細胞から回収するステップを含む、前記方法。
【請求項１１】
味覚細胞における甘味シグナルを調節する剤を同定する方法であって、
（ｉ）任意に他の剤の存在下で、剤の、甘味刺激およびカルシウム刺激から選択される刺激に応答して機能的応答を提供するＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質を発現する細胞への接触、および
（ｉｉ）少なくとも１つの剤が、前記細胞中の少なくとも１つの機能応答によって、前記細胞中の前記ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質の機能応答に影響するかどうかの決定、
を含み、
前記ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質が請求項１〜３のいずれかに定義されたものである、前記方法。
【請求項１２】
細胞が、Ｇタンパク質もまた発現する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
Ｇタンパク質が、Ｇａｑ−ガストデューシンと少なくとも９０％の配列同一性を有するキメラＧタンパク質である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
Ｇタンパク質が、キメラＧタンパク質Ｇアルファ１６−ガストデューシン４４である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ステップ（ｉｉ）が、細胞内メッセンジャーのまたはそれに起因する変化を計測することによって実施される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
機能応答が、ＩＰ３およびカルシウム２＋から選択される細胞内メッセンジャーの変化を計測することによって決定される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
細胞が、真核細胞、酵母細胞、昆虫細胞、哺乳類細胞、両生類細胞、およびぜん虫細胞からなる群より選択された細胞である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
細胞が、哺乳類細胞である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
哺乳類細胞が、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬａおよびＨＥＫ−２９３細胞からなる群より選択された哺乳類細胞である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ステップ（ｉ）が、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質と試験剤をカルシウムの存在下で接触させることをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項２１】
カルシウムが、塩化カルシウムの形態で提供される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
（ｉ）請求項１〜３のいずれかで定義されたＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質を発現する遺伝子組換え細胞、および
（ｉｉ）ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質のアゴニスト
を、ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質の調節剤としての試験剤の同定のために組み合わせて利用することを含む、キット。
【請求項２３】
（ｉ）ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質を発現する遺伝子組換え細胞を成長させること、
（ｉｉ）適切な濃度のアゴニストの存在下で試験剤を添加すること、および
（ｉｉｉ）試験剤の存在下および非存在下における応答の比較により、細胞の機能的応答における変化を決定すること、ならびにその結果、試験剤が請求項１〜３のいずれかで定義されたＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質の調節剤であることが同定されること
を含む、請求項２２に記載のキットの利用方法。
【請求項２４】
請求項１〜３のいずれかで定義されたＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質を調節する剤の同定方法であって、
（ｉ）ＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質へのリガンド結合に応答して変化するパラメータを計測すること、および
（ｉｉ）任意にリガンドの存在下で、試験剤に応答して変化するパラメータの、ネガティブコントロールと比較した変化を決定すること、およびそれによって調節剤またはリガンドを同定すること
を含む、前記方法。
【請求項２５】
リガンドが、カルシウム、カルシウムイオンおよび塩化カルシウムからなる群から選択されたリガンドである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
ステップ（ｉ）が、蛍光分光法、ＮＭＲ分光法、１または２以上の吸収、屈折率の計測、流体力学法、クロマトグラフィ、溶解度計測、生物化学的方法からなる群より選択される方法で行われ、これらの方法は、溶液、二重膜、固相への連結、単脂質膜中、膜上への結合、および小胞内からなる群より選択された適切な環境においてＣＳＲ：：Ｔ１Ｒキメラタンパク質の特性を計測する、請求項２４または２５に記載の方法。