(57)【要約】【課題】ラットチトクロムＰ４５０分子種をコードするｍＲＮＡを分別して定量する測定技術およびそのためのプライマー対およびプローブを提供。【解決手段】ラットチトクロムＰ４５０分子種をコードするｍＲＮＡの測定に用いられるプローブであって、例えばＣｙｐ１ａ１遺伝子の６２４−６５０の領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなるプローブ；例えば上記プローブと、Ｃｙｐ１ａ１遺伝子の６０１−６２２領域および６７５−６５２領域にそれぞれハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーおよびリバースプライマーであるプライマー対との組合せを含むラットチトクロムＰ４５０分子種の測定キット；並びに該測定キットを用いてラットチトクロムＰ４５０分子種を測定する方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラットチトクロムＰ４５０分子種をコードするｍＲＮＡの測定に用いられるプローブであって、下記（１）−（１４）に示す各遺伝子の所定領域にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドからなる群から選ばれるオリゴヌクレオチドであることを特徴とするプローブ。
（１）　Ｃｙｐ１ａ１遺伝子の６２４−６５０の領域
（２）　Ｃｙｐ１ａ２遺伝子の１２００−１２２７の領域
（３）　Ｃｙｐ２ａ２遺伝子の３５６−３８２の領域
（４）　Ｃｙｐ２ｂ１遺伝子の９８９−１０１３の領域または１２０４−１２３２の領域
（５）　Ｃｙｐ２ｂ２遺伝子の９８９−１０１３の領域または１２０４−１２３２の領域
（６）　Ｃｙｐ２ｃ１１遺伝子の１０１０−１０３５の領域
（７）　Ｃｙｐ２ｃ１２遺伝子の４６９−４９７の領域
（８）　Ｃｙｐ２ｄ１遺伝子の１１５８−１１８１の領域
（９）　Ｃｙｐ２ｄ２遺伝子の３９−６９の領域
（１０）　Ｃｙｐ２ｄ３遺伝子の６８３−７０８の領域
（１１）　Ｃｙｐ２ｅ１遺伝子の２００−２２５の領域
（１２）　Ｃｙｐ３ａ１遺伝子の１２２３−１２４８の領域
（１３）　Ｃｙｐ３ａ２遺伝子の６８−９１の領域
（１４）　Ｃｙｐ４ａ１遺伝子の１３５−１６０の領域
【請求項２】
オリゴヌクレオチドが、更にリポーター色素とクエンチャー色素とを結合させたものである請求項１に記載のプローブ。
【請求項３】
オリゴヌクレオチドが、２０−４０の塩基長を有するものである請求項１に記載のプローブ。
【請求項４】
オリゴヌクレオチドが、配列番号１−配列番号１６のいずれかに示される配列を含むものである請求項１−３のいずれかに記載のプローブ。
【請求項５】
オリゴヌクレオチドが、配列番号１−配列番号１６のいずれかに示される配列からなるものである請求項１−３のいずれかに記載のプローブ。
【請求項６】
フォワードプライマーとリバースプライマーとのプライマー対とプローブとのセットの少なくともひとつを含むラットチトクロムＰ４５０分子種をコードするｍＲＮＡの測定キットであって、上記プライマー対とプローブとが下記（１）−（１４）に示されるラットチトクロムＰ４５０分子種をコードする遺伝子の各領域にそれぞれハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドである上記キット。
（１）プライマー対；Ｃｙｐ１ａ１遺伝子の６０１−６２２領域および６７５−６５２領域、プローブ；６２４−６５０領域
（２）プライマー対；Ｃｙｐ１ａ２遺伝子の１１７５−１１９５領域および１２４９−１２２９領域、プローブ；１２００−１２２７領域
（３）プライマー対；Ｃｙｐ２ａ２遺伝子の３００−３１８領域および４２５−４０７領域、プローブ；３５６−３８２領域
（４）プライマー対；Ｃｙｐ２ｂ１遺伝子の９６１−９８２領域および１０３７−１０１６領域、プローブ；９８９−１０１３領域またはプライマー対；Ｃｙｐ２ｂ１遺伝子の１１７９−１２０２領域および１２３７−１２５８領域、プローブ；１２０４−１２３２領域
（５）プライマー対；Ｃｙｐ２ｂ２遺伝子の９６１−９８２領域および１０３７−１０１６領域、プローブ；９８９−１０１３領域またはプライマー対；Ｃｙｐ２ｂ２遺伝子の１１７９−１２０２領域および１２３７−１２５８領域、プローブ；１２０４−１２３２領域
（６）プライマー対；Ｃｙｐ２ｃ１１遺伝子の９８９−１００８領域および１０５８−１０３７領域、プローブ；１０１０−１０３５領域
（７）プライマー対；Ｃｙｐ２ｃ１２遺伝子の４４５−４６５領域および５３５−５１６領域、プローブ；４６９−４９７領域
（８）プライマー対；Ｃｙｐ２ｄ１遺伝子の１１３５−１１５４領域および１２０５−１１８５領域、プローブ；１１５８−１１８１領域
（９）プライマー対；Ｃｙｐ２ｄ２遺伝子の６−２６領域および９７−７９領域、プローブ；３９−６９領域
（１０）プライマー対；Ｃｙｐ２ｄ３遺伝子の６６１−６８１領域および７４８−７２９領域、プローブ；６８３−７０８領域
（１１）プライマー対；Ｃｙｐ２ｅ１遺伝子の１７２−１９０領域および２５１−２３３領域、プローブ；２００−２２５領域
（１２）プライマー対；Ｃｙｐ３ａ１遺伝子の１１９９−１２１７領域および１２７６−１２５８領域、プローブ；１２２３−１２４８領域
（１３）プライマー対；Ｃｙｐ３ａ２遺伝子の４７−６５領域および１２７−１１０領域、プローブ；６８−９１領域
（１４）プライマー対；Ｃｙｐ４ａ１遺伝子の１０８−１２９領域および１８５−１６６領域、プローブ；１３５−１６０領域
【請求項７】
プローブが、更にリポーター色素とクエンチャー色素とを結合させたものである請求項６に記載の測定キット。
【請求項８】
プライマー対とプローブとが、下記（１）−（１４）に示される各配列番号の配列を含むオリゴヌクレオチドである請求項７に記載の測定キット。
（１）プライマー対；配列番号１７および１８、プローブ；配列番号１
（２）プライマー対；配列番号１９および２０、プローブ；配列番号２
（３）プライマー対；配列番号２１および２２、プローブ；配列番号３
（４）プライマー対；配列番号２３および２４、プローブ；配列番号４またはプライマー対；配列番号２５および２６、プローブ；配列番号５
（５）プライマー対；配列番号２７および２８、プローブ；配列番号６またはプライマー対；配列番号２９および３０、プローブ；配列番号７
（６）プライマー対；配列番号３１および３２、プローブ；配列番号８
（７）プライマー対；配列番号３３および３４、プローブ；配列番号９
（８）プライマー対；配列番号３５および３６、プローブ；配列番号１０
（９）プライマー対；配列番号３７および３８、プローブ；配列番号１１
（１０）プライマー対；配列番号３９および４０、プローブ；配列番号１２
（１１）プライマー対；配列番号４１および４２、プローブ；配列番号１３
（１２）プライマー対；配列番号４３および４４、プローブ；配列番号１４
（１３）プライマー対；配列番号４５および４６、プローブ；配列番号１５
（１４）プライマー対；配列番号４７および４８、プローブ；配列番号１６
【請求項９】
請求項８に記載の測定キットであって、（１）のセットがＣｙｐ１ａ１の測定用で、（２）のセットがＣｙｐ１ａ２の測定用で、（３）のセットがＣｙｐ２ａ２の測定用で、（４）のセットがＣｙｐ２ｂ１の測定用で、（５）のセットがＣｙｐ２ｂ２の測定用で、（６）のセットがＣｙｐ２ｃ１１の測定用で、（７）のセットがＣｙｐ２ｃ１２の測定用で、（８）のセットがＣｙｐ２ｄ１の測定用で、（９）のセットがＣｙｐ２ｄ２の測定用で、（１０）のセットがＣｙｐ２ｄ３の測定用で、（１１）のセットがＣｙｐ２ｅ１の測定用で、（１２）のセットがＣｙｐ３ａ１の測定用で、（１３）のセットがＣｙｐ３ａ２の測定用で、（１４）のセットがＣｙｐ４ａ１の測定用である測定キット。
【請求項１０】
プライマー対とプローブとが、請求項８の（１）−（１４）に記載の各配列番号の配列からなるオリゴヌクレオチドである、請求項９に記載の測定キット。
【請求項１１】
ラットチトクロムＰ４５０分子種をコードするｍＲＮＡを含む検体を調製し、該検体について、請求項６−１０のいずれかに記載の測定キットを用いてポリメラーゼ連鎖反応を行い、該ポリメラーゼ連鎖反応の間に加水分解されるプローブを測定することを特徴とするラットチトクロムＰ４５０分子種をコードするｍＲＮＡの測定方法。
【請求項１２】
加水分解されるプローブの測定が、励起光照射による蛍光の発色測定によりなされる請求項１１に記載の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ラットチトクロムＰ４５０分子種をコードするｍＲＮＡの測定方法およびそのためのプローブおよびキットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
チトクロムＰ４５０には、多数の分子種があり、これらの各分子種はそれぞれ薬物代謝の第Ｉ相反応に関与する主な酵素としてよく知られている。
【０００３】
新薬を開発する上で、該新薬（候補化合物）を投与した際のチトクロムＰ４５０の働き（発現量の増減）を把握することは重要である。何故なら、チトクロムＰ４５０の変動が判らないと、該新薬と併用される併用薬剤の効力や副作用の増減或いは併用薬剤や他の摂取物による新薬の効力や副作用の増減が予測できず、該新薬の安全性を確認することができないからである。
【０００４】
上記新薬の安全性試験のためには、ヒトにおけるチトクロムＰ４５０の変動を調べる必要があるが、医薬品業界では、ヒトにおける試験の前段階としてラットなどの動物を用いた試験が行われる。この動物試験では、ヒトのチトクロムＰ４５０に対応する各動物種のチトクロムＰ４５０の働きを調べる必要がある。特に、上記供試動物としてのラットの利用が公的に要求されつつある。
【０００５】
従って、ラットチトクロムＰ４５０に関する情報、特にヒトチトクロムｐ４５０の各分子種に対応するラットチトクロムＰ４５０の各分子種をコードするｍＲＮＡに関する情報およびこれらラットチトクロムＰ４５０の各分子種をコードするｍＲＮＡを区別して測定する技術の開発が、当業界で要望されてきている。このような測定技術が開発できれば、ヒトへの投与に先だって、新薬の他剤との相互作用や特殊病態時における影響などが予測できる。即ち、該新薬の副作用などに関する有用な情報を、臨床試験の前に得ることができ、かくして該新薬のヒトへの投与の安全性を確保することができる。
【０００６】
一方、ポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）は、核酸の増幅法として広く知られており、例えばＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ＰＣＲ）、コンペティティブＲＴ−ＰＣＲなどが、微量のｍＲＮＡの検出、定量に威力を発揮している。
【０００７】
近年、ＰＣＲを利用したリアルタイム定量検出法が確立された（Ｔａｑ　Ｍａｎ　ＰＣＲ，　Ｇｅｎｏｍｅ　Ｒｅｓ．，　６（１０），　９８６　（１９９６）：　ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭＴＭ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ　（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社））。該検出法は、特定の蛍光標識プローブ（ＴａｑＭａｎ　ｐｒｏｂｅ）を用いて核酸を測定する方法である。より詳しくは、例えば５’末端にリポーター色素および３’末端にクエンチャー色素を付加して蛍光標識したプローブをターゲットＤＮＡにアニールさせた状態で、通常のＰＣＲ反応を行わせると、伸長反応の進行に伴って、ＤＮＡポリメラーゼの有する５’−３’エキソヌクレアーゼ活性により、上記プローブが５’末端から加水分解される。その結果、５’末端のリポーター色素が３’末端のクエンチャー色素から離れ、これにより、当初一定の空間的距離を保っていたことによるＦＲＥＴ（Ｆｌｕｏｒｅｓｅｎｃｅ　Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ　Ｅｎｅｒｇｙ　Ｔｒａｎｓｆｅｒ，両蛍光色素の共鳴によるリポーター色素のエネルギー順位の低下に基づく蛍光強度の低下現象）効果がなくなり、クエンチャー色素により制御されていたリポーター色素の蛍光強度が増加する。かくして、該蛍光強度の増加を測定することによって、ターゲット核酸をリアルタイムに選択的に定量検出できるのである。この方法によれば、ＰＣＲ反応後に増幅物を例えばアガロースゲル電気泳動して、泳動パターンを解析するなどの複雑な工程が不要となり、短時間で且つ同時に多種のサンプルを定量できる利点がある。
【０００８】
一般に、新薬の候補化合物を選別する場合などは、非常に多数の検体について限られた時間内に定量検出を行うことが望ましく、このような定量検出を効率良く行い得る手法として、上記リアルタイム定量検出法は期待されている。
【０００９】
本発明者らは、上記ＰＣＲを利用するリアルタイム定量検出法に着目し、これがラットチトクロムＰ４５０分子種をコードするｍＲＮＡの検出に利用できれば、同じ装置を用いて同時に同一のＰＣＲ条件で上記各分子種のｍＲＮＡを区別して測定、検出できるとの着想から、鋭意研究を重ねた。
【００１０】
しかるに、ラットチトクロムＰ４５０の各分子種をコードするｍＲＮＡの配列は、それぞれ知られているが、これらの各配列をターゲット遺伝子として、同一ＰＣＲ条件でそれぞれ充分に増幅し得、更に、各々のターゲット遺伝子の特定位置にのみハイブリダイズし得るプライマー対としてのオリゴヌクレオチドを検索することは困難であると考えられた。また、かかるプライマー対に挟まれた特定領域に、同一ＰＣＲ条件下にこれらのプライマーよりも早くハイブリダイズし得、しかも各分子種に対して特異的なプローブの構築もまた、同様に困難であると考えられた。特に、ヌクレオチド配列が既知の２つの核酸のハイブリダイズのし易さは、融点（Ｔｍ）の計算によりある程度推定することはできるものの、この推定によって選択したプライマーとプローブとの組合せが、必ずしもＤＮＡ測定において好結果をもたらすわけではないことが知られている。このことより、現在知られているラットチトクロムＰ４５０分子種をコードする各ｍＲＮＡについて、これらを同時に区別して測定可能な、上記ＰＣＲによるリアルタイム定量検出用の各プライマー対とプローブとの組合せの選択は、熟練者の試行錯誤による多大な実験などが必要となると予想された。
【００１１】
本発明者らは、鋭意研究の結果、先に２９種のヒトチトクロムＰ４５０分子種をコードするｍＲＮＡに対して、これらを区別して定量測定することができるＰＣＲによる定量検出用のプライマー対およびプローブの組合せ（セット）を提供することに成功した（ＷＯ２００１／９２５３８）。しかしながら、これらはヒトチトクロムＰ４５０分子種の定量検出用であり、該ヒトチトクロムＰ４５０分子種とはそれぞれ異なる配列を有するラットＰ４５０の各分子種の定量検出には利用できないものであった。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、ラットチトクロムＰ４５０分子種をコードするｍＲＮＡのＰＣＲによる測定法、特にリアルタイム定量検出法の確立と、そのためのプローブおよびプライマー対のセットを提供することにある。
【００１３】
本発明者らは、上記目的よりラットチトクロムＰ４５０分子種をコードするｍＲＮＡについて、更に、多大な実験、研究を繰返し行った結果、ラットチトクロムＰ４５０をコードするｍＲＮＡの１４種の分子種に対して、目的のプライマー対およびプローブのセットを提供することに成功し、ここに本発明を完成するに至った。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
本発明は、下記項１−１２に記載のラットチトクロムＰ４５０分子種のｍＲＮＡ測定用プローブ、測定キットおよびこれらを用いた測定方法を提供する。
【００１５】
項１．ラットチトクロムＰ４５０分子種をコードするｍＲＮＡの測定に用いられるプローブであって、下記（１）−（１４）に示す各遺伝子の所定領域にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドからなる群から選ばれるオリゴヌクレオチドであることを特徴とするプローブ；
（１）　Ｃｙｐ１ａ１遺伝子の６２４−６５０の領域
（２）　Ｃｙｐ１ａ２遺伝子の１２００−１２２７の領域
（３）　Ｃｙｐ２ａ２遺伝子の３５６−３８２の領域
（４）　Ｃｙｐ２ｂ１遺伝子の９８９−１０１３の領域または１２０４−１２３２の領域
（５）　Ｃｙｐ２ｂ２遺伝子の９８９−１０１３の領域または１２０４−１２３２の領域
（６）　Ｃｙｐ２ｃ１１遺伝子の１０１０−１０３５の領域
（７）　Ｃｙｐ２ｃ１２遺伝子の４６９−４９７の領域
（８）　Ｃｙｐ２ｄ１遺伝子の１１５８−１１８１の領域
（９）　Ｃｙｐ２ｄ２遺伝子の３９−６９の領域
（１０）　Ｃｙｐ２ｄ３遺伝子の６８３−７０８の領域
（１１）　Ｃｙｐ２ｅ１遺伝子の２００−２２５の領域
（１２）　Ｃｙｐ３ａ１遺伝子の１２２３−１２４８の領域
（１３）　Ｃｙｐ３ａ２遺伝子の６８−９１の領域
（１４）　Ｃｙｐ４ａ１遺伝子の１３５−１６０の領域。
【００１６】
項２．オリゴヌクレオチドが、更にリポーター色素とクエンチャー色素とを結合させたものである項１に記載のプローブ。
【００１７】
項３．オリゴヌクレオチドが、２０−４０の塩基長を有するものである項１に記載のプローブ。
【００１８】
項４．オリゴヌクレオチドが、配列番号１−配列番号１６のいずれかに示される配列を含むものである項１−３のいずれかに記載のプローブ。
【００１９】
項５．オリゴヌクレオチドが、配列番号１−配列番号１６のいずれかに示される配列からなるものである項１−３のいずれかに記載のプローブ。
【００２０】
項６．フォワードプライマーとリバースプライマーとのプライマー対とプローブとのセットの少なくともひとつを含むラットチトクロムＰ４５０分子種をコードするｍＲＮＡの測定キットであって、上記プライマー対とプローブとが下記（１）−（１４）に示されるラットチトクロムＰ４５０分子種をコードする遺伝子の各領域にそれぞれハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドである上記キット；
（１）プライマー対；Ｃｙｐ１ａ１遺伝子の６０１−６２２領域および６７５−６５２領域、プローブ；６２４−６５０領域
（２）プライマー対；Ｃｙｐ１ａ２遺伝子の１１７５−１１９５領域および１２４９−１２２９領域、プローブ；１２００−１２２７領域
（３）プライマー対；Ｃｙｐ２ａ２遺伝子の３００−３１８領域および４２５−４０７領域、プローブ；３５６−３８２領域
（４）プライマー対；Ｃｙｐ２ｂ１遺伝子の９６１−９８２領域および１０３７−１０１６領域、プローブ；９８９−１０１３領域またはプライマー対；Ｃｙｐ２ｂ１遺伝子の１１７９−１２０２領域および１２３７−１２５８領域、プローブ；１２０４−１２３２領域
（５）プライマー対；Ｃｙｐ２ｂ２遺伝子の９６１−９８２領域および１０３７−１０１６領域、プローブ；９８９−１０１３領域またはプライマー対；Ｃｙｐ２ｂ２遺伝子の１１７９−１２０２領域および１２３７−１２５８領域、プローブ；１２０４−１２３２領域
（６）プライマー対；Ｃｙｐ２ｃ１１遺伝子の９８９−１００８領域および１０５８−１０３７領域、プローブ；１０１０−１０３５領域
（７）プライマー対；Ｃｙｐ２ｃ１２遺伝子の４４５−４６５領域および５３５−５１６領域、プローブ；４６９−４９７領域
（８）プライマー対；Ｃｙｐ２ｄ１遺伝子の１１３５−１１５４領域および１２０５−１１８５領域、プローブ；１１５８−１１８１領域
（９）プライマー対；Ｃｙｐ２ｄ２遺伝子の６−２６領域および９７−７９領域、プローブ；３９−６９領域
（１０）プライマー対；Ｃｙｐ２ｄ３遺伝子の６６１−６８１領域および７４８−７２９領域、プローブ；６８３−７０８領域
（１１）プライマー対；Ｃｙｐ２ｅ１遺伝子の１７２−１９０領域および２５１−２３３領域、プローブ；２００−２２５領域
（１２）プライマー対；Ｃｙｐ３ａ１遺伝子の１１９９−１２１７領域および１２７６−１２５８領域、プローブ；１２２３−１２４８領域
（１３）プライマー対；Ｃｙｐ３ａ２遺伝子の４７−６５領域および１２７−１１０領域、プローブ；６８−９１領域
（１４）プライマー対；Ｃｙｐ４ａ１遺伝子の１０８−１２９領域および１８５−１６６領域、プローブ；１３５−１６０領域。
【００２１】
項７．プローブが、更にリポーター色素とクエンチャー色素とを結合させたものである項６に記載の測定キット。
【００２２】
項８．プライマー対とプローブとが、下記（１）−（１４）に示される各配列番号の配列を含むオリゴヌクレオチドである項７に記載の測定キット；
（１）プライマー対；配列番号１７および１８、プローブ；配列番号１
（２）プライマー対；配列番号１９および２０、プローブ；配列番号２
（３）プライマー対；配列番号２１および２２、プローブ；配列番号３
（４）プライマー対；配列番号２３および２４、プローブ；配列番号４またはプライマー対；配列番号２５および２６、プローブ；配列番号５
（５）プライマー対；配列番号２７および２８、プローブ；配列番号６またはプライマー対；配列番号２９および３０、プローブ；配列番号７
（６）プライマー対；配列番号３１および３２、プローブ；配列番号８
（７）プライマー対；配列番号３３および３４、プローブ；配列番号９
（８）プライマー対；配列番号３５および３６、プローブ；配列番号１０
（９）プライマー対；配列番号３７および３８、プローブ；配列番号１１
（１０）プライマー対；配列番号３９および４０、プローブ；配列番号１２
（１１）プライマー対；配列番号４１および４２、プローブ；配列番号１３
（１２）プライマー対；配列番号４３および４４、プローブ；配列番号１４
（１３）プライマー対；配列番号４５および４６、プローブ；配列番号１５
（１４）プライマー対；配列番号４７および４８、プローブ；配列番号１６。
【００２３】
項９．項８に記載の測定キットであって、（１）のセットがＣｙｐ１ａ１の測定用で、（２）のセットがＣｙｐ１ａ２の測定用で、（３）のセットがＣｙｐ２ａ２の測定用で、（４）のセットがＣｙｐ２ｂ１の測定用で、（５）のセットがＣｙｐ２ｂ２の測定用で、（６）のセットがＣｙｐ２ｃ１１の測定用で、（７）のセットがＣｙｐ２ｃ１２の測定用で、（８）のセットがＣｙｐ２ｄ１の測定用で、（９）のセットがＣｙｐ２ｄ２の測定用で、（１０）のセットがＣｙｐ２ｄ３の測定用で、（１１）のセットがＣｙｐ２ｅ１の測定用で、（１２）のセットがＣｙｐ３ａ１の測定用で、（１３）のセットがＣｙｐ３ａ２の測定用で、（１４）のセットがＣｙｐ４ａ１の測定用である測定キット。
【００２４】
項１０．プライマー対とプローブとが、項８の（１）−（１４）に記載の各配列番号の配列からなるオリゴヌクレオチドである、項９に記載の測定キット。
【００２５】
項１１．ラットチトクロムＰ４５０分子種をコードするｍＲＮＡを含む検体を調製し、該検体について、請求項６−１０のいずれかに記載の測定キットを用いてポリメラーゼ連鎖反応を行い、該ポリメラーゼ連鎖反応の間に加水分解されるプローブを測定することを特徴とするラットチトクロムＰ４５０分子種をコードするｍＲＮＡの測定方法。
【００２６】
項１２．加水分解されるプローブの測定が、励起光照射による蛍光の発色測定によりなされる項１１に記載の測定方法。
【００２７】
本発明方法は、より詳しくは、フォーワードプライマーおよびリバースプライマーのプライマー対並びにレポーター色素とクエンチャー色素を有し上記両プライマーに挟まれた領域内で鋳型核酸とハイブリダイズするプローブを用いて、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼによりポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行い、該ＰＣＲの間に加水分解されるプローブを測定することによって、ラットチトクロムＰ４５０分子種をコードするｍＲＮＡを測定するリアルタイム定量検出方法を提供する。
【００２８】
本発明のリアルタイム定量検出方法は、同一ＰＣＲ乃至ＲＴ−ＰＣＲ反応条件下にリアルタイムで簡便且つ迅速に、ラットチトクロムＰ４５０分子種をコードする各ｍＲＮＡを検出および定量できるものであり、その確立は、医薬品分野において非常に有益である。特に、本発明のリアルタイム定量検出法は、迅速に且つ多種のサンプルを処理できるものであり、例えば摘出した組織や培養細胞などから抽出した僅かなＲＮＡサンプルを利用して、正確に、該サンプル中のラットチトクロムＰ４５０分子種をコードするｍＲＮＡを定量、検出することができる利点がある。
【００２９】
更に、特定のラットチトクロムＰ４５０分子種をコードするｍＲＮＡは、肝臓、腎臓などでの発現量の変化が血液中（血液に含まれる核を有する細胞）の値の変化と相関する可能性が考えられるが、この血液中の値は小さく、測定には多くの血液を必要とする。しかるに、本発明プライマーとプローブとのセットを用いれば、かかる血液を検体としても、少ないサンプル量で、特別の機器を利用することなく、該血液中のｍＲＮＡ量を正確に測定することができる。
【００３０】
以下、本発明方法に利用するプローブおよびプライマー対につき詳述すれば、これら各プローブおよびプライマー対は、上述した通り、ラットチトクロムＰ４５０分子種をコードするｍＲＮＡの特定領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドから選択される。
【００３１】
ここで「ハイブリダイズする」とは、後述するＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）の条件でハイブリダイズすることをいう。
【００３２】
本発明に係わるプローブおよびプライマーに共通する要件としては、増幅生成物が５０−４００塩基対の長さであること、プライマーとプローブができる限り近接していること、配列に含まれるＧ（グアニン）およびＣ（シトシン）の割合がなるべく５０％前後であること、Ｇ（グアニン）が４つ以上連続していないことなどを挙げることができる。また、その他の本発明プローブの有する好ましい要件としては、Ｔｍ値が７０℃前後であることを挙げることができる。同様に、プライマーは、Ｔｍ値が６０℃前後であることを好ましい要件として挙げることができる。
【００３３】
ラットチトクロムＰ４５０分子種をコードする各ｍＲＮＡ配列は公知であり、それぞれジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）に以下の登録番号で登録されている。
（１）Ｃｙｐ１ａ１遺伝子；ＮＭ＿０１２５４０
（２）Ｃｙｐ１ａ２遺伝子；ＮＭ＿０１２５４１
（３）Ｃｙｐ２ａ２遺伝子；ＮＭ＿０１２６９３
（４）Ｃｙｐ２ｂ１遺伝子；ＡＨ００２１６１
（５）Ｃｙｐ２ｂ２遺伝子；ＡＨ００２１６２
（６）Ｃｙｐ２ｃ１１遺伝子；Ｕ３３１７３
（７）Ｃｙｐ２ｃ１２遺伝子；ＮＭ＿０３１５７２
（８）Ｃｙｐ２ｄ１遺伝子；ＡＢ００８４２２
（９）Ｃｙｐ２ｄ２遺伝子；ＮＭ＿０１２７３０
（１０）Ｃｙｐ２ｄ３遺伝子；ＡＢ００８４２４
（１１）Ｃｙｐ２ｅ１遺伝子；ＡＦ０６１４４２
（１２）Ｃｙｐ３ａ１遺伝子；Ｌ２４２０７
（１３）Ｃｙｐ３ａ２遺伝子；Ｕ０９７４２
（１４）Ｃｙｐ４ａ１遺伝子；Ｍ５７７１８
本明細書において、ラットチトクロムＰ４５０分子種をコードするｍＲＮＡの特定領域の表示は、いずれも上記各登録番号で登録された遺伝子の配列（開始コドンを１とする）に従うものである。
【００３４】
これら各プライマーおよびプローブ用のオリゴヌクレオチドのヌクレオチド数は、少なくとも１５個、通常１５−５０個、好ましくは２０−４０個の範囲にあるのがよい。これらプライマーおよびプローブのヌクレオチド数が上記よりあまりに多くなりすぎると、１本鎖ＤＮＡにハイブリダイズしにくくなり、逆にあまりに小さすぎると、ハイブリダイゼーションの特異性が低下する。
【００３５】
プライマーおよびプローブのヌクレオチド配列の好ましい具体例は、前述した項８に示すとおりであり、各分子種に応じて、それぞれ配列番号１−１６（プローブの場合）並びに配列番号１７−４８（プライマーの場合）に示される。
【００３６】
尚、例えば２０ヌクレオチドからなるプライマーまたはプローブは、鋳型鎖との間に少数、通常１−２個、のミスマッチが存在しても鋳型鎖とハイブリダイズし得、従ってＰＣＲのプライマーとしてまたは検出用プローブとして機能し得ることが知られている。本発明プライマーおよびプローブもまた、上記特定のヌクレオチド配列を有するものに限定されず、該配列をその一部として含むものや、この配列中の例えば２個以下のヌクレオチドの置換、欠失および／または付加による修飾のなされた配列を有するものであってもよい。
【００３７】
本発明プローブおよびプライマーとしての各オリゴヌクレオチドは、常法に従い、自動合成機、例えばＤＮＡシンセサイザー（パーキンエルマー社）などを用いて容易に合成することができる。得られるオリゴヌクレオチドは、必要に応じて、市販の精製用カートリッジなどを用いて更に精製することもできる。
【００３８】
以下、リアルタイム定量検出用の本発明プローブにつき詳述すれば、該プローブは、その一端、例えば５’−末端、にレポーター色素を結合しており、他端、例えば３’−末端、にクエンチャー色素を結合している。レポーター色素は、例えば励起光の照射によって蛍光を発する物質であり、クエンチャーは、該レポーター色素に距離的に接近して存在する場合に該レポーター色素に作用してその蛍光の発生を消去する作用を有するものである。該レポーター色素の例としては、例えば６−カルボキシ−フルオレッセイン（ＦＡＭ）、テトラクロロ−６−カルボキシフルオレッセイン（ＴＥＴ）、２，７−ジメトキシ−４，５−ジクロロ−６−カルボキシフルオレッセイン（ＪＯＥ）、ヘキサクロロ−６−カルボキシフルオレッセイン（ＨＥＸ）などが挙げられる。クエンチャー色素の例としては、例えば６−カルボキシ−テトラメチル−ローダミン（ＴＡＭＲＡ）などが挙げられる。
【００３９】
本発明プローブは、前記特定配列のプローブ用オリゴヌクレオチドにレポーター色素およびクエンチャー色素を結合させることにより調製できる。例えばプローブの５’側には、通常数個のメチレン鎖をリンカーとし、末端のリン酸基にＦＡＭ分子をリン酸エステルの形で結合させることができる。また、その場合、３’側には、下に示す構造単位を介してアミド結合によりＴＡＭＲＡ分子を結合させる。
【００４０】
【化１】
2004008072.tif 000002
【００４１】
本発明プライマー対およびプローブを利用してラットチトクロムＰ４５０分子種をコードするｍＲＮＡを測定する方法は、本発明プライマー対およびプローブを利用することを必須として、通常のｍＲＮＡの測定技術に従うことができる。該技術としては、ＰＣＲ法（例えば、Ｓｃｉｅｎｃｅ，　２３０，　１３５０　（１９８５）参照）、ＲＴ−ＰＣＲ（Ｇｅｎｏｍｅ　Ｒｅｓ．，　６（１０），　９８６　（１９９６）参照）など、特にリアルタイム定量検出法（例えばＴａｑＭａｎ　ＰＣＲ，　ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭＴＭ　７７００　ＳＥＱＵＥＮＣＥ　ＤＥＴＥＣＴＩＯＮ　ＳＹＳＴＥＭ，　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，　Ｖｅｒ１，　Ｊｕｎｅ　１９９６参照）などを挙げることができる。
【００４２】
即ち本発明方法は、ラットチトクロムＰ４５０分子種をコードするｍＲＮＡを含む検体を調製し、該検体について前述した（１）−（１４）に示される少なくともひとつの本発明プライマー対とプローブとのセットを含む測定キットを用いてＰＣＲを行い、該ＰＣＲの間に加水分解されるプローブを測定することにより実施される。具体的には、ラットチトクロムＰ４５０分子種をコードするｍＲＮＡを発現している生体組織を採取し、該組織より常法に従って全ＲＮＡを抽出し、次にそれに対して相補性のｃＤＮＡを常法に従って合成した後、本発明プライマー対とプローブとのセットを含む測定キットを用いてＰＣＲを行えばよい。また、常法に従って全ＲＮＡを抽出後、本発明プライマーとプローブとを含む測定キットを用いて直接ＲＴ−ＰＣＲを行うこともできる。
【００４３】
ＰＣＲ反応およびＲＴ−ＰＣＲ反応は、基本的には公知の方法に従うことができる。それらの反応条件も公知の方法に準じて適宜決定することができる。より具体的には、後記実施例に示す条件を採用して実施することができる。
【００４４】
加水分解されたプローブの測定、検出は、基本的には常法に従って実施することができる。例えば、リアルタイム定量検出法の場合は、アルゴンレーザ光をＰＣＲ反応液に照射し、放射される蛍光をＣＣＤカメラを用いて測定、検出することによって実施することができる。
【００４５】
かくして、本発明方法の実施によって、所期のラットチトクロムＰ４５０分子種をコードするｍＲＮＡを容易且つ迅速に、しかも各分子種をコードするｍＲＮＡ毎に測定、検出することができる。
【００４６】
本発明は、上記方法の実施のための測定キットをも提供する。このキットは前記項６に示す（１）−（１４）のプライマー対とプローブとのセットからなる群から選ばれる少なくともひとつを含んでいる。また、本発明キットは、対照として使用することができる既知の核酸や、該核酸を測定するためのプライマー対とプローブとのセットを更に含んでいてもよい。
【００４７】
本発明方法によれば、ラットチトクロムＰ４５０分子種をコードする各ｍＲＮＡを、当該ｍＲＮＡ毎に測定、検出でき、しかも各ｍＲＮＡの測定、検出を迅速に且つ精度よく行うことができる。
【００４８】
【実施例】
以下、本発明を更に詳しく説明するため試験例および実施例を挙げる。
【００４９】
【試験例１】リアルタイム定量検出法による検量線の作成
（１）試験方法
本試験で採用したリアルタイムワンステップＲＴ−ＰＣＲ法は、９６ウェルを用いて、最大９６の異なった反応を同時に実施して、一度に最大９６の検体を測定できるものである。また、１チューブ内でＲＴ反応とＰＣＲ反応とを行い得るものである。更に、３８４ウェルでの測定も可能である。
【００５０】
本法の原理は、隣接した２種類の蛍光色素を用いて、一方の色素（リポーター色素）の蛍光波長と他方の色素（クエンチャー色素）の励起光波長との間で、波長領域が重なる場合に生じるＦＲＥＴを利用している。ＦＲＥＴを生じる２種の蛍光色素を両末端に結合させたプローブ（ＴａｑＭａｎ　ｐｒｏｂｅ）がＰＣＲで増幅した特定のラットチトクロムＰ４５０をコードするｍＲＮＡ種に由来するｃＤＮＡにハイブリダイゼーションし、この状態でＰＣＲの伸長反応が始まり、Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼの有する５’−３’エンドヌクレアーゼ活性によってＴａｑＭａｎプローブが加水分解され、リポーター色素が脱離し、クエンチャー色素との間の物理的距離が生じ、ＦＲＥＴによって抑制されていたリポーター色素の蛍光強度が増加し、この蛍光強度の増加はＰＣＲの増幅産物の増加量に比例するため、この増加をＰＣＲ反応毎に測定することによって、所望の定量が可能となる。
【００５１】
本試験では、プローブの５’末端側にリポーター色素としてＦＡＭを、３’末端側にクエンチャー色素としてＴＡＭＲＡを使用した。これら各色素の結合およびこれによるＴａｑＭａｎプローブの作成は、文献記載の方法（Ｇｅｎｏｍｅ　Ｒｅｓ．，　６（１０），　９８６　（１９９６））に従って行った。
【００５２】
また、各プライマーおよびプローブとしてのオリゴヌクレオチドは、自動シンセサイザーとしてＡＢＩ社製のＤＮＡ／ＲＮＡ合成機を利用して、基質（ｄＮＴＰ）および規定の試薬を用いて合成した。
【００５３】
検体ＲＮＡとしては、ラットの肝臓プールより精製した全ＲＮＡを用いた。
【００５４】
ラットの肝臓プールより精製した全ＲＮＡは、ＲＮａｓｅフリーの水で希釈して２０μｇ／ｍＬとした（検量線作成用）。また、このものを５０μｇ／ｍＬのイーストｔＲＮＡ（Ｙｅａｓｔ　ｔＲＮＡ，　ＧＩＢＣＯ社製）を用いて、５倍公比で希釈した。測定には５μＬを使用した。
【００５５】
ＲＴ−ＰＣＲ反応は、３００ｎＭフォーワードプライマー、９００ｎＭリバースプライマーおよび２００ｎＭ　ＴａｑＭａｎプローブを含むＴａｑＭａｎ　Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ　ＲＴ−ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ　Ｒｅａｇｅｎｔｓ　Ｋｉｔ　（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、５０μＬ／チューブの系で、ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭＴＭ７７００　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ　（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を利用して実施した。
【００５６】
温度条件は、４８℃で３０分間、９５℃で１０分間保温した後、９５℃で１５秒間、６０℃で１分間のサイクルを５０回行い、各サイクルごとに蛍光強度を測定した。
【００５７】
下記表１に示す各ラットチトクロムＰ４５０分子種（酵素種）に対して各配列番号のオリゴヌクレオチドからなるプライマー対およびプローブを用いて、上記試験を行った結果（検量線）を表２に示す。
【００５８】
【表１】
2004008072.tif 000003
【００５９】
【表２】
2004008072.tif 000004
【００６０】
表２に示す結果より、１０００００ｐｇ全ＲＮＡ／５０μＬ反応液量から５倍公比で希釈された検量線を作成したところ、Ｃｙｐ２ａ２分子種については、１．２８ｐｇ全ＲＮＡ／５０μＬ反応液量まで定量性を有しており、他の各分子種においても１．２８−４０００ｐｇ全ＲＮＡ／５０μＬ反応液量を定量限界とした検量線の相関係数（ｒ）は０．９９以上（ただし、Ｃｙｐ２ｄ３分子種においては０．９７）であった。
【００６１】
【配列表】
ＳＥＱＵＥＮＣＥ　ＬＩＳＴＩＮＧ
＜１１０＞　Ｏｔｓｕｋａ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｆａｃｔｏｒｙ　Ｉｎｃ．
＜１２０＞　Ａ　ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　ｍｅａｓｕｒｉｎｇ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｓｐｅｃｉｅｓ　ｏｆ　ｒａｔ　Ｐ４５０　ｍＲＮＡｓ　ａｎｄ　ａ　ｐｒｏｂｅ　ａｎｄ　ｋｉｔ　ｔｈｅｒｅｆｏｒ
＜１３０＞　３６００２ＪＰ
＜１６０＞　４８
＜１７０＞　ＰａｔｅｎｔＩｎ　Ｖｅｒ．　２．１
＜２１０＞　１
＜２１１＞　２７
＜２１２＞　ＤＮＡ
＜２１３＞　Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ
＜２２３＞　ｐｒｏｂｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　Ｃｙｐ１ａ１
＜４００＞　１
ｃａｇａｃｇｔｔａｔ　ｇａｃｃａｃｇａｔｇ　ａｃｃａａｇａ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２７
＜２１０＞　２
＜２１１＞　２８
＜２１２＞　ＤＮＡ
＜２１３＞　Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ
＜２２３＞　ｐｒｏｂｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　Ｃｙｐ１ａ２
＜４００＞　２
ｃａａｇｇａｇｃｇｃ　ｔｇｃａｔｃｔｔｃａ　ｔａａａｃｃａｇ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２８
＜２１０＞　３
＜２１１＞　２７
＜２１２＞　ＤＮＡ
＜２１３＞　Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ
＜２２３＞　ｐｒｏｂｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　Ｃｙｐ２ａ２
＜４００＞　３
ａｔｇｔｇｇａａｃａ　ｇｇｃｃａａｇｃｇｔ　ａｔｃａｇｇｃ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２７
＜２１０＞　４
＜２１１＞　２５
＜２１２＞　ＤＮＡ
＜２１３＞　Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ
＜２２３＞　ｐｒｏｂｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　Ｃｙｐ２ｂ１
＜４００＞　４
ｔｔｃａｃａｃｃｇｇ　ｃｔａｃｃａａｃｃｃ　ｔｔｇａｔ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２５
＜２１０＞　５
＜２１１＞　２９
＜２１２＞　ＤＮＡ
＜２１３＞　Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ
＜２２３＞　ｐｒｏｂｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　Ｃｙｐ２ｂ１
＜４００＞　５
ｃａｇａｃａｇｃｔｔ　ｃａａｔｃｃｔｇａａ　ｃａｃｔｔｃｃｔｇ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２９
＜２１０＞　６
＜２１１＞　２５
＜２１２＞　ＤＮＡ
＜２１３＞　Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ
＜２２３＞　ｐｒｏｂｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　Ｃｙｐ２ｂ２
＜４００＞　６
ｃｔｃｔｃａｃａｇｇ　ｃｃａｃｃａｔｃｃｃ　ｔｔｇａｔ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２５
＜２１０＞　７
＜２１１＞　２９
＜２１２＞　ＤＮＡ
＜２１３＞　Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ
＜２２３＞　ｐｒｏｂｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　Ｃｙｐ２ｂ２
＜４００＞　７
ｃａｇａｃａｃｃｔｔ　ｃａａｔｃｃｔｇａｇ　ｃａｃｔｔｃｃｔｇ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２９
＜２１０＞　８
＜２１１＞　２６
＜２１２＞　ＤＮＡ
＜２１３＞　Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ
＜２２３＞　ｐｒｏｂｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　Ｃｙｐ２ｃ１１
＜４００＞　８
ｃｃｔｇｃａｔｇａａ　ａｇａｃａｇｇａｇｃ　ｃａｇａｔｇ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２６
＜２１０＞　９
＜２１１＞　２９
＜２１２＞　ＤＮＡ
＜２１３＞　Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ
＜２２３＞　ｐｒｏｂｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　Ｃｙｐ２ｃ１２
＜４００＞　９
ａａｇａａａａｃｃａ　ａａｇｇｃｔｃａｃｃ　ｃｔｇｔｇａｔｃｃ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２９
＜２１０＞　１０
＜２１１＞　２４
＜２１２＞　ＤＮＡ
＜２１３＞　Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ
＜２２３＞　ｐｒｏｂｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　Ｃｙｐ２ｄ１
＜４００＞　１０
ａｇｔｃｃａｇｇａｃ　ｔｔｃｇｔｃａｔｃｃ　ｃｃａａ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２４
＜２１０＞　１１
＜２１１＞　３１
＜２１２＞　ＤＮＡ
＜２１３＞　Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ
＜２２３＞　ｐｒｏｂｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　Ｃｙｐ２ｄ２
＜４００＞　１１
ｃａｔａｔｔｃａｃａ　ｇｃｃａｔｃｔｔｃｔ　ｔｇｃｔｔｃｔｇｇｔ　ｇ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　３１
＜２１０＞　１２
＜２１１＞　２６
＜２１２＞　ＤＮＡ
＜２１３＞　Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ
＜２２３＞　ｐｒｏｂｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　Ｃｙｐ２ｄ３
＜４００＞　１２
ａｃａｔｇｔｔｃｃｃ　ａｇｔｔｃｔｃｃｔｇ　ｃｇｃａｔｃ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２６
＜２１０＞　１３
＜２１１＞　２６
＜２１２＞　ＤＮＡ
＜２１３＞　Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ
＜２２３＞　ｐｒｏｂｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　Ｃｙｐ２ｅ１
＜４００＞　１３
ｔｇｔｔｃａｃａｃｔ　ｇｃａｃｃｔｔｇｇｃ　ｔｃａａｇｇ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２６
＜２１０＞　１４
＜２１１＞　２６
＜２１２＞　ＤＮＡ
＜２１３＞　Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ
＜２２３＞　ｐｒｏｂｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　Ｃｙｐ３ａ１
＜４００＞　１４
ｃａｇａｇｃｃｔｇａ　ｇｇａａｔｔｔｃｇｃ　ｃｃａｇａａ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２６
＜２１０＞　１５
＜２１１＞　２４
＜２１２＞　ＤＮＡ
＜２１３＞　Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ
＜２２３＞　ｐｒｏｂｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　Ｃｙｐ３ａ２
＜４００＞　１５
ａｃｃｇａｃｔｔｇｇ　ａａｃｃｃａｔａｇａ　ｃａｔｇ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２４
＜２１０＞　１６
＜２１１＞　２６
＜２１２＞　ＤＮＡ
＜２１３＞　Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ
＜２２３＞　ｐｒｏｂｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　Ｃｙｐ４ａ１
＜４００＞　１６
ｃａａｇｇｃｔｔｔｃ　ｃａｇｃａｇｔｔｃｃ　ｃａｔｃａｃ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２６
＜２１０＞　１７
＜２１１＞　２２
＜２１２＞　ＤＮＡ
＜２１３＞　Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ
＜２２３＞　ｐｒｉｍｅｒ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　（ｆｏｒｗａｒｄ）　ｏｆ　Ｃｙｐ１ａ１
＜４００＞　１７
ｇｔｃａｔｃｔｇｔｇ　ｃｃａｔａｔｇｃｔｔ　ｔｇ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２２
＜２１０＞　１８
＜２１１＞　２４
＜２１２＞　ＤＮＡ
＜２１３＞　Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ
＜２２３＞　ｐｒｉｍｅｒ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　（ｒｅｖｅｒｓｅ）　ｏｆ　Ｃｙｐ１ａ１
＜４００＞　１８
ｇｃｔｔａｇａｔｔｇ　ａｃｔａｔｇｃｔｇａ　ｇｃａｇ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２４
＜２１０＞　１９
＜２１１＞　２１
＜２１２＞　ＤＮＡ
＜２１３＞　Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ
＜２２３＞　ｐｒｉｍｅｒ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　（ｆｏｒｗａｒｄ）　ｏｆ　Ｃｙｐ１ａ２
＜４００＞　１９
ｃｃｔｃａｃｔｇａａ　ｔｇｇｃｔｔｃｃａｃ　ａ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２１
＜２１０＞　２０
＜２１１＞　２１
＜２１２＞　ＤＮＡ
＜２１３＞　Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ
＜２２３＞　ｐｒｉｍｅｒ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　（ｒｅｖｅｒｓｅ）　ｏｆ　Ｃｙｐ１ａ２
＜４００＞　２０
ｔｃｔｃａｔｃａｔｇ　ｇｔｔｇａｃｃｔｇｃ　ｃ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２１
＜２１０＞　２１
＜２１１＞　１９
＜２１２＞　ＤＮＡ
＜２１３＞　Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ
＜２２３＞　ｐｒｉｍｅｒ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　（ｆｏｒｗａｒｄ）　ｏｆ　Ｃｙｐ２ａ２
＜４００＞　２１
ｔｇｇｃｇａａｃｔｇ　ｃｃｔａｃｃｔｔｔ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１９
＜２１０＞　２２
＜２１１＞　１９
＜２１２＞　ＤＮＡ
＜２１３＞　Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ
＜２２３＞　ｐｒｉｍｅｒ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　（ｒｅｖｅｒｓｅ）　ｏｆ　Ｃｙｐ２ａ２
＜４００＞　２２
ｃｇｃｔｔｇｃｃｃａ　ｃａｃｃａａａａｔ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１９
＜２１０＞　２３
＜２１１＞　２２
＜２１２＞　ＤＮＡ
＜２１３＞　Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ
＜２２３＞　ｐｒｉｍｅｒ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　（ｆｏｒｗａｒｄ）　ｏｆ　Ｃｙｐ２ｂ１
＜４００＞　２３
ｇｃａｇａａａｇｇａ　ｇｇｔｔｇａｔｃａｇ　ｇｔ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２２
＜２１０＞　２４
＜２１１＞　２２
＜２１２＞　ＤＮＡ
＜２１３＞　Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ
＜２２３＞　ｐｒｉｍｅｒ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　（ｒｅｖｅｒｓｅ）　ｏｆ　Ｃｙｐ２ｂ１
＜４００＞　２４
ａｇｔｇｔａｔｇｇｃ　ａｔｔｔｔａｃｔｇｃ　ｇｇ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２２
＜２１０＞　２５
＜２１１＞　２４
＜２１２＞　ＤＮＡ
＜２１３＞　Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ
＜２２３＞　ｐｒｉｍｅｒ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　（ｆｏｒｗａｒｄ）　ｏｆ　Ｃｙｐ２ｂ１
＜４００＞　２５
ｃａｔｇａｃｃｃａｃ　ａｇｔａｃｔｔｔｇａ　ｃｃａｃ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２４
＜２１０＞　２６
＜２１１＞　２２
＜２１２＞　ＤＮＡ
＜２１３＞　Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ
＜２２３＞　ｐｒｉｍｅｒ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　（ｒｅｖｅｒｓｅ）　ｏｆ　Ｃｙｐ２ｂ１
＜４００＞　２６
ｃｔｃｔｔｔｔｔｃａ　ｇｔｇｃｃｃｃｇｔｔ　ａａ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２２
＜２１０＞　２７
＜２１１＞　２２
＜２１２＞　ＤＮＡ
＜２１３＞　Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ
＜２２３＞　ｐｒｉｍｅｒ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　（ｆｏｒｗａｒｄ）　ｏｆ　Ｃｙｐ２ｂ２
＜４００＞　２７
ａｃａｇａａａｇｇａ　ｇａｔｔｇａｔｃａｇ　ｇｔ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２２
＜２１０＞　２８
＜２１１＞　２２
＜２１２＞　ＤＮＡ
＜２１３＞　Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ
＜２２３＞　ｐｒｉｍｅｒ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　（ｒｅｖｅｒｓｅ）　ｏｆ　Ｃｙｐ２ｂ２
＜４００＞　２８
ａｇｔｇｔａｔｇｇｃ　ａｔｔｔｔｇｇｔａｃ　ｇａ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２２
＜２１０＞　２９
＜２１１＞　２４
＜２１２＞　ＤＮＡ
＜２１３＞　Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ
＜２２３＞　ｐｒｉｍｅｒ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　（ｆｏｒｗａｒｄ）　ｏｆ　Ｃｙｐ２ｂ２
＜４００＞　２９
ｃａｔｇａｃｃｃａｃ　ａｇｔａｃｔｔｔｇａ　ｃｃａｔ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２４
＜２１０＞　３０
＜２１１＞　２２
＜２１２＞　ＤＮＡ
＜２１３＞　Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ
＜２２３＞　ｐｒｉｍｅｒ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　（ｒｅｖｅｒｓｅ）　ｏｆ　Ｃｙｐ２ｂ２
＜４００＞　３０
ｃｔｃｔｔｔｔｔｃａ　ｇｔｇｔｃｃｃａｔｃ　ｇｇ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２２
＜２１０＞　３１
＜２１１＞　２０
＜２１２＞　ＤＮＡ
＜２１３＞　Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ
＜２２３＞　ｐｒｉｍｅｒ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　（ｆｏｒｗａｒｄ）　ｏｆ　Ｃｙｐ２ｃ１１
＜４００＞　３１
ｔａａｔｔｇｇｃａｇ　ａａａｃｃｇｇａｇｃ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０
＜２１０＞　３２
＜２１１＞　２２
＜２１２＞　ＤＮＡ
＜２１３＞　Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ
＜２２３＞　ｐｒｉｍｅｒ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　（ｒｅｖｅｒｓｅ）　ｏｆ　Ｃｙｐ２ｃ１１
＜４００＞　３２
ｔｇｃａｃｔａｃａｇ　ｃａｔｃｃｇｔｇｔａ　ｇｇ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２２
＜２１０＞　３３
＜２１１＞　２１
＜２１２＞　ＤＮＡ
＜２１３＞　Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ
＜２２３＞　ｐｒｉｍｅｒ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　（ｆｏｒｗａｒｄ）　ｏｆ　Ｃｙｐ２ｃ１２
＜４００＞　３３
ｇｃａｇａｇｔｇｇｃ　ｔａｇｔｇａｔｇｇａ　ａ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２１
＜２１０＞　３４
＜２１１＞　２０
＜２１２＞　ＤＮＡ
＜２１３＞　Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ
＜２２３＞　ｐｒｉｍｅｒ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　（ｒｅｖｅｒｓｅ）　ｏｆ　Ｃｙｐ２ｃ１２
＜４００＞　３４
ａｇａｔｇａｃａｔｔ　ｇｃａｇｇｇａｇｃａ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０
＜２１０＞　３５
＜２１１＞　２０
＜２１２＞　ＤＮＡ
＜２１３＞　Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ
＜２２３＞　ｐｒｉｍｅｒ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　（ｆｏｒｗａｒｄ）　ｏｆ　Ｃｙｐ２ｄ１
＜４００＞　３５
ｃｇｃａｔｃａｃｇａ　ｇｔｔｇｔｇａｃａｔ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０
＜２１０＞　３６
＜２１１＞　２１
＜２１２＞　ＤＮＡ
＜２１３＞　Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ
＜２２３＞　ｐｒｉｍｅｒ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　（ｒｅｖｅｒｓｅ）　ｏｆ　Ｃｙｐ２ｄ１
＜４００＞　３６
ａｇｇｔｔｇａｔｇａ　ｔｇａｇｇｇｔｃｇｔ　ｃ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２１
＜２１０＞　３７
＜２１１＞　２１
＜２１２＞　ＤＮＡ
＜２１３＞　Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ
＜２２３＞　ｐｒｉｍｅｒ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　（ｆｏｒｗａｒｄ）　ｏｆ　Ｃｙｐ２ｄ２
＜４００＞　３７
ｇｃｔｇｃｔｇａｔｔ　ｇｇａｇａｔｇａｃｃ　ｔ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２１
＜２１０＞　３８
＜２１１＞　１９
＜２１２＞　ＤＮＡ
＜２１３＞　Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ
＜２２３＞　ｐｒｉｍｅｒ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　（ｒｅｖｅｒｓｅ）　ｏｆ　Ｃｙｐ２ｄ２
＜４００＞　３８
ｔｃｃａｇａａｔｔｔ　ｇｔｇｃｃｇｇｔｇ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１９
＜２１０＞　３９
＜２１１＞　２１
＜２１２＞　ＤＮＡ
＜２１３＞　Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ
＜２２３＞　ｐｒｉｍｅｒ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　（ｆｏｒｗａｒｄ）　ｏｆ　Ｃｙｐ２ｄ３
＜４００＞　３９
ｇｇｃｔｔｇｔｔｔｃ　ｃｔｇａｇｇｔｔｔｔ　ｇ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２１
＜２１０＞　４０
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＜２１２＞　ＤＮＡ
＜２１３＞　Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ
＜２２３＞　ｐｒｉｍｅｒ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　（ｒｅｖｅｒｓｅ）　ｏｆ　Ｃｙｐ２ｄ３
＜４００＞　４０
ａｔｇｔｃｔｔｔｔｇ　ｃｃｃａｇｇｇａａｇ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０
＜２１０＞　４１
＜２１１＞　１９
＜２１２＞　ＤＮＡ
＜２１３＞　Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ
＜２２３＞　ｐｒｉｍｅｒ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　（ｆｏｒｗａｒｄ）　ｏｆ　Ｃｙｐ２ｅ１
＜４００＞　４１
ａｃｃａａｇｔｔｇｇ　ｃａａａｇｃｇｃｔ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１９
＜２１０＞　４２
＜２１１＞　１９
＜２１２＞　ＤＮＡ
＜２１３＞　Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ
＜２２３＞　ｐｒｉｍｅｒ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　（ｒｅｖｅｒｓｅ）　ｏｆ　Ｃｙｐ２ｅ１
＜４００＞　４２
ｔｔｇｔａｇｃｃａｔ　ｇｃａｇｇａｃｃａ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１９
＜２１０＞　４３
＜２１１＞　１９
＜２１２＞　ＤＮＡ
＜２１３＞　Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ
＜２２３＞　ｐｒｉｍｅｒ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　（ｆｏｒｗａｒｄ）　ｏｆ　Ｃｙｐ３ａ１
＜４００＞　４３
ｔｔｃａｃｃｇｔｇａ　ｔｃｃａｃａｇｃａ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１９
＜２１０＞　４４
＜２１１＞　１９
＜２１２＞　ＤＮＡ
＜２１３＞　Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ
＜２２３＞　ｐｒｉｍｅｒ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　（ｒｅｖｅｒｓｅ）　ｏｆ　Ｃｙｐ３ａ１
＜４００＞　４４
ｔｇｃｔｇｃｃｃｔｔ　ｇｔｔｃｔｃｃｔｔ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１９
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＜２１１＞　１９
＜２１２＞　ＤＮＡ
＜２１３＞　Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ
＜２２３＞　ｐｒｉｍｅｒ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　（ｆｏｒｗａｒｄ）　ｏｆ　Ｃｙｐ３ａ２
＜４００＞　４５
ｃａｇｔｃａｔｃｃｔ　ｇｇｔｇｃｔｔｃｔ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１９
＜２１０＞　４６
＜２１１＞　１８
＜２１２＞　ＤＮＡ
＜２１３＞　Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ
＜２２３＞　ｐｒｉｍｅｒ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　（ｒｅｖｅｒｓｅ）　ｏｆ　Ｃｙｐ３ａ２
＜４００＞　４６
ｇｔｔｔｔｇｇｃｃｃ　ａｇｇａａｔｔｃ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１８
＜２１０＞　４７
＜２１１＞　２２
＜２１２＞　ＤＮＡ
＜２１３＞　Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ
＜２２３＞　ｐｒｉｍｅｒ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　（ｆｏｒｗａｒｄ）　ｏｆ　Ｃｙｐ４ａ１
＜４００＞　４７
ｇｔｔｃｔａｃｃｔｇ　ｃａａａｇｇｃａａｔ　ｇｇ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２２
＜２１０＞　４８
＜２１１＞　２０
＜２１２＞　ＤＮＡ
＜２１３＞　Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ
＜２２３＞　ｐｒｉｍｅｒ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　（ｒｅｖｅｒｓｅ）　ｏｆ　Ｃｙｐ４ａ１
＜４００＞　４８
ｔｇｃｃｃａａａｇａ　ａｃｃａｇｔｇｇａａ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０