【手続補正書】
【提出日】平成23年4月15日(2011.4.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４３】
この試験システムを用いると、代表的な化合物は、野生型Ablが触媒となったリン酸化反応の阻害について、< 5 nMのIC50値を示す（例えば化合物の例1、5、7、8、10、11、19）。本発明の化合物はまた、T315Iの変異型Ablが触媒となったリン酸化反応を阻害し、代表的化合物が47〜49 nM（実施例6）、36〜57 nM（実施例15）および65〜68 nM（実施例25）のIC50値を示す。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４６】
細胞は、構成的に活性なAblキナーゼとの融合Bcr-Ablタンパク質を発現し、そして成長因子と無関係に増殖する。細胞をRPMI 1640（AMIMED）、10%胎児ウシ血清（FCS）、2 mM グルタミン（Gibco）（「完全培地」）中で増殖させ、そして作業株を凍結培地（95% FCS、5% DMSO（SIGMA））中、バイアルあたり2 x 106個の細胞の凍結アリコートによって製造する。解凍後、細胞を実験のために最大10〜12継代の間で使用する。ELISAには、抗体抗Abl SH3ドメイン（カタログ番号06-466、Upstate Biotechnology製）が使用される。Bcr-Ablリン酸化反応を検知するために、ZYMED（カタログ番号03-7722）からアルカリホスファターゼ（PY10（AP））と標識された抗ホスホシロシン抗体Ab PY20が使用される。比較および対照化合物として、メタンスルホン酸（モノメシラート）塩（STI571）の型の中にある（N-{5-[4-（4-メチル-ピペラジノ-メチル）-ベンゾイルアミド]-2-メチルフェニル}-4-（3-ピリジル）-2-ピリミジン-アミン（イマチニブのGleevec(商標)またはGlivec(登録商標)、Novartis Pharmaceuticals）を用いる。10 mMの貯蓄液がDMSOで製造され、-20℃にて貯蔵される。細胞アッセイ用に、貯蔵液を完全培地で以下の2段階で希釈する。（1：100および1：10）出発濃度10 μMを得てその後、完全培地中で連続3倍希釈物を製造する。溶解度の問題はこの工程を用いる上では一切生じない。試験化合物は類例として扱われる。アッセイ用に、ウェルあたり、50 μL中200’000個の32D-Bcr／Abl細胞を、96ウェル丸底組織培養プレート中に播種する。ウェルあたり50μLの試験化合物の連続3倍希釈物を3連で、細胞へと加える。試験化合物の最終濃度は、例えば5 μMから下は0.01 μMまでの範囲である。未処置細胞を対照として使用する。化合物を細胞と一緒に、37℃、5%のCO2で90分間培養し、その後組織培養プレートを1300 rpmで遠心分離し（Beckman GPR遠心分離器）、ペレット化した細胞を除去しないように注意深く吸引して、上清を除去する。細胞ペレットを150μLの溶解バッファー（50mM トリス／HCI、pH7．4、150mMの塩化ナトリウム、5mMのEDTA、1mMのEGTA、1%NP-40（非イオン性界面活性剤、Roche Diagnostics GmbH、ドイツ、マンハイム）、2mMのオルトバナジウム酸ナトリウム、1mMのPMSF、50μg／mLのアプロチニンおよび80μg／mLのロイペプチン）を加えて溶解させ、そしてすぐにELISAに使用するか、または使用するまで-20℃にてプレート中で凍結保存する。抗-abl SH3ドメイン抗体を50μL PBS中200 ng／ウェルで、黒色ELISAプレート（Packard HTRF-96黒色プレート）に、4℃で一晩コーティングする。0.05%のTween20（PBST）および0.5%のTopBlock（Juro、カタログ番号TB 232010）を含む200μL／ウェルのPBSで3回洗浄した後、残りのタンパク質結合部位を200μL／ウェルのPBST、3%のTopBlockで、室温にて4時間ブロックし、その後未処置または化合物処置細胞（ウェルあたり20μgの全タンパク質）の50μL溶解物と、4℃にて3〜4時間培養する。3回の洗浄後、ブロックバッファーで0.5 μg/mLに希釈した50μL／ウェルのPY20（AP）を加え、一晩培養する（4℃）。全培養工程について、プレートをプレートシーラー（Costar、カタログ番号3095）で覆う。最後に、プレートをさらに3回洗浄バッファーで、そして脱イオン水で1回洗浄し、その後90μL／ウェルのAP基質CPDStar RTUを、Emerald IIと加える。ここで、Packard Top Seal(商標)-Aプレートシーラー（カタログ番号6005185）で封入したプレートを、室温にて暗所で45分��培養し、蛍光をPackard Top Count Microplate Scintillation Counter（Top Count）で、カウント毎秒（CPS）を測定して定量する。最適化された最終版のELISA用に、50 μLの培養、処理した細胞溶解と96ウェル組織培養プレートの中の溶解を、これらのプレートから直接、50ng／ウェルのUpstate製のウサギポリクローナル抗-Abl-SH3ドメインAB 06-466でプレコートされたELISAプレートに移す。抗ホスホチロシン抗体AB PY20（AP）の濃度は、0.2 μg/mLに減少させてよい。蛍光基質での洗浄、ブロック、培養は上記の通りである。定量化は以下のように達成する。未処理32D-Bcr／Abl細胞の溶解物で得られたELISA読み取り値（CPS）と、アッセイ-バックグラウンド（全成分を含むが細胞溶解物なし）の読み取り値の間の差を計算し、そしてこれらの細胞に存在する構成的にリン酸化されたBcr-Ablタンパク質を100%とする。化合物のBcr-Ablキナーゼ活性に対する活性を、Bcr-Ablリン酸化の減少の割合として発現する。IC50についての値を、図の内挿または外挿による用量応答曲線から決定する。本発明の化合物で見出すことができるIC50値は、好ましくは1 nM〜10 μM、より好ましくは1nM〜1000 nMの範囲である。例えば、実施例2、10および12の化合物で見出すことができるIC50値は、各々21〜179 nM, 101〜370 nMおよび39〜157 nMの範囲である。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５５】
腫瘍は、各細胞（最低2 x 106細胞／100 mLリン酸塩緩衝化生理的食塩水）をキャリアマウス（例： 4〜8匹のマウス／細胞株）に皮下注射をした後に得る。結果として得られた腫瘍を、治療を開始する前に連続的に少なくとも三回の順次移植を通じて挿入する。腫瘍の断片（各25 mg）を、13-ゲージのトロカール針を使用し、Forene麻酔（Abbott、スイス）で動物の左脇腹に皮下注射して移植する。エストロゲン依存性腫瘍を移植されたマウスに、さらにエストロゲンペレット（1.0 cmの管に医薬的目的の上で適切な数量（Dow Chemicals製）、および5 mgエストラジオール（Sigma製））を与える。腫瘍が平均100 mm3の大きさに到達したら、治療を定期的に（すなわち全身腫瘍組織量が低度または中程度であるとき）開始する。腫瘍成長を週に1回、2回または3回（細胞株の腫瘍成長に応じて）、および垂直直径の測定による最後の治療から24時間後に測定する。腫瘍の場合は、腫瘍容積を式L x D x p/6（Evans, B.D., Smith, I.E., Shorthouse, A.J. and Millar, J.J., Brit. J. Cancer, 1982:45:466-468を参照）によって測定する。抗腫瘍活性はT/C%（処理動物の腫瘍容積の平均増加を対象動物の腫瘍容積で割り、100を掛ける）で発現する。腫瘍の退行（%）は治療開始時の平均腫瘍容積に比較して最小平均腫瘍容積を表す。腫瘍の直径が1,5〜2 cm3以上に達した動物各々を殺す。白血病の腫瘍組織量は末梢白血球数と脾臓の重量の両方、および白血病細胞株の腫瘍のある動物の胸腺を検査することにより評価する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５６】
模範となる（ただし限定的ではない）化学式Iの化合物またはその塩の投与計画は毎日投与であり、好ましくは長期間にわたり、日に1〜3回投与し、できれば病気が治癒するまで、または緩和治療しか達成できないならば、必要である限り投与する；あるいは、例えば、5日間の治療、および／または1、4、9日目の投与と一定期間の休薬後の最終的な反復が可能である。あるいは、一日数回（例：2〜5回）の治療、または連続投与（例：点滴）による治療（例：直前の文で示した時点で）が可能である。一般に、投与は経口的または非経口的に行うが、好ましくは経口的に行う。試験化合物は好ましくは、水または0.9%の無菌生理食塩水で希釈する。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５９】
適切な臨床研究は、例えば、上記に記載された腫瘍疾患の1つを患う患者に関する非無作為化オープンラベル、投与量漸増試験である。増殖疾患の有益な効果は、直接これらの研究の結果により、またはそれ自体当業者に知られる研究デザインの変更によって判断できる。治療の効用は、以下のような研究、例えば、18または24週間後の腫瘍の場合、6週間ごとの腫瘍の放射線学的評価、白血病の場合、例えば異常白血球細胞数の測定、単核細胞の染色、および／または微小残存病変（MRD）の、例えばFACS-LPC MRDまたはPCRによる判定により判断できる。あるいは、プラシーボを対照とした二重盲検試験を用いて、本明細書に記載した発明により有効な化学式Iによる化合物の効用を実証することができる。