【誤訳訂正書】
【提出日】平成23年3月9日(2011.3.9)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
全血サンプル中の循環癌細胞上におけるＨｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質の発現を検出する方法であって、該方法は、癌細胞関連Ｈｅｒ−２／ｎｅｕの検出が可能な免疫測定を該血液サンプルに対して実施する工程であって、免疫測定の陽性の結果は該癌細胞上のＨｅｒ−２／ｎｅｕの存在を示す、工程を包含し、
該免疫測定の実施前に該全血から該循環癌細胞を分離せず、
前記免疫アッセイは、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕに対する第１の抗体、および該第１の抗体またはＨｅｒ−２／ｎｅｕのいずれかに対する第２の抗体であって磁性ビーズに付着された第２の抗体を用い、
該免疫測定は、検出のために電気化学発光を用い、
該免疫測定は、
ａ）血液１ミリリットルあたりＳＫ−ＢＲ−３細胞１００個以下の濃度で血液中に加えた場合、ＳＫ−ＢＲ−３乳癌細胞からＨｅｒ−２／ｎｅｕを検出することが可能であり、
ｂ）少なくとも１００万個のヒト末梢血単核細胞の存在下でアッセイを行った場合、１０個のＳＫ−ＢＲ−３乳癌細胞からＨｅｒ−２／ｎｅｕを検出することが可能である、方法。
【請求項２】
血液サンプル中の循環癌細胞上におけるＨｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質の発現を検出する方法であって、該方法は、癌細胞関連Ｈｅｒ−２／ｎｅｕの検出が可能な免疫測定を該血液サンプルに対して実施する工程であって、免疫測定の陽性の結果は該癌細胞上のＨｅｒ−２／ｎｅｕの存在を示す、工程を包含し、
該免疫測定の実施前に末梢血単核細胞から該循環癌細胞を分離せず、
前記免疫アッセイは、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕに対する第１の抗体、および該第１の抗体またはＨｅｒ−２／ｎｅｕのいずれかに対する第２の抗体であって磁性ビーズに付着された第２の抗体を用い、
該免疫測定は、検出のために電気化学発光を用い、
該免疫測定は、
ａ）血液１ミリリットルあたりＳＫ−ＢＲ−３細胞１００個以下の濃度で血液中に加えた場合、ＳＫ−ＢＲ−３乳癌細胞からＨｅｒ−２／ｎｅｕを検出することが可能であり、
少なくとも１００万個のヒト末梢血単核細胞の存在下でアッセイを行った場合、１０個のＳＫ−ＢＲ−３乳癌細胞からＨｅｒ−２／ｎｅｕを検出することが可能である、方法。
【請求項３】
前記免疫測定は溶液に基づく免疫測定である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記免疫測定はサンドイッチ免疫測定である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
前記免疫測定は前記血液サンプル中の癌細胞関連Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ分子の数に比例したシグナルを生成する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
前記免疫測定はＨｅｒ−２／ｎｅｕの細胞質領域と選択的に結合する１つまたは２つの抗体を用いる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項７】
前記免疫測定はＨｅｒ−２／ｎｅｕの細胞質領域と選択的に結合する２つの抗体を用いる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記免疫測定はＨｅｒ−２／ｎｅｕに対するポリクローナル抗体を用いる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項９】
前記免疫測定は前記ポリクローナル抗体に対する二次抗体を用いる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記免疫測定はＨｅｒ−２／ｎｅｕに対するモノクローナル抗体を用いる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１１】
前記免疫測定は前記モノクローナル抗体に対する二次抗体を用いる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記モノクローナル抗体はヒト化マウスモノクローナル抗体である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記モノクローナル抗体はトラスツズマブである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
Ｈｅｒ−２／ｎｅｕを標的とする抗癌剤での治療から利益を得る可能性が高い癌患者を同定するのを補助する方法であって、請求項１に記載の方法を包含し、該癌細胞を含有する血液サンプルが該患者から採取されている、方法。
【請求項１５】
前記患者の腫瘍生検組織は、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕの組織アッセイによりＨｅｒ−２／ｎｅｕ発現に関して陰性であると予め決定されている、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記組織アッセイは免疫組織化学法およびＦＩＳＨ解析からなるリストから選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
治療から利益を得る可能性が高い癌患者を治療するための組成物であって、該患者は、請求項１４〜１６のいずれか１つに記載の方法により同定されており、該組成物は、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕを標的とする抗癌剤を含む、組成物。
【請求項１８】
前記抗癌剤はトラスツズマブ；ラパチニブ；ＣＰ−７２４，７１４；ＨＫＩ−２７２；およびＢＭＳ−５９９６２６からなるリストから選択される、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
Ｈｅｒ−２／ｎｅｕを標的とする抗癌剤での治療から利益を得る可能性が高い癌患者を同定するのを補助する方法であって、請求項２に記載の方法を包含し、該癌細胞を含有する血液サンプルは該患者から採取されている、方法。
【請求項２０】
前記患者の腫瘍生検組織は、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕの組織アッセイによりＨｅｒ−２／ｎｅｕ発現に関して陰性であると予め決定されている、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記組織アッセイは免疫組織化学法およびＦＩＳＨ解析からなるリストから選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
治療から利益を得る可能性が高い癌患者を治療するための組成物であって、該患者は、請求項１９〜２１のいずれか１つに記載の方法により同定されており、該組成物は、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕを標的とする抗癌剤を含む、組成物。
【請求項２３】
前記抗癌剤はトラスツズマブ；ラパチニブ；ＣＰ−７２４，７１４；ＨＫＩ−２７２；およびＢＭＳ−５９９６２６からなるリストから選択される、請求項２２に記載の組成物。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【発明の詳細な説明】
【発明の名称】分離されていない循環癌細胞由来のＨｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質の上昇したレベルの検出および治療
【背景技術】
【０００１】
Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ；ＨＥＲ２；ｃ−ｅｒｂＢ−２、およびｅｒｂＢ２とも呼ばれる）タンパク質または関連遺伝子を癌細胞から検出するために現在市販されているテストは煩雑で、多大な時間を要するものである。さらに、乳癌患者の２５〜３０％のみが、自身の原発腫瘍の生検材料中のＨｅｒ−２／ｎｅｕ（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ；ＨＥＲ２；ｃ−ｅｒｂＢ−２、およびｅｒｂＢ２とも呼ばれる）タンパク質または遺伝子レベルが上昇しているという所見に基づいてＨｅｒ−２／ｎｅｕに関する治療を受ける。文献中のデータは、原発腫瘍の生検においてＨｅｒ２／ｎｅｕに関して陰性の結果が出た女性の多く（被検者２６人中１１人）は、その後、循環癌細胞がＨｅｒ２／ｎｅｕ陽性となることを示唆している（非特許文献１；非特許文献２）。また、かなりの数の女性乳癌患者は、Ｈｅｒ−２−ｎｅｕの状態をテストするために容易に利用できる生検材料を有さない。Ｈａｙｅｓら、およびＭｅｎｇらによる論文で用いられたアプローチは煩雑で、時間を要するものであり、迅速でより便利なテストが必要とされており、特に、診療所で行うことができるものが必要である。Ｈａｙｅｓらの方法はフローサイトメトリー解析を必要とし、Ｍｅｎｇらの方法は、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を必要としており、これらは、本発明で説明するような直接的な（例えば、ＥＣＬによる）Ｈｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質の検出よりも複雑で、より多くの時間を要する。さらに、Ｍｅｎｇら、およびＨａｙｅｓらの方法は、腫瘍細胞を濃縮するために免疫磁気ビーズを必要とした。対称的に（ｉｎ  ｃｏｎｓｔａｓｔ）、本発明と同様に、そのような分離工程を必要とすることなく行うことができる迅速な方法は、全血または末梢血単核細胞のいずれかから癌細胞を分離するために用いられる工程に見られる損失を回避することで、感度の改善に関するさらなる利点を提供する。
【０００２】
Ｈｅｒ２／ｎｅｕおよびＨｅｒ−２／ｎｅｕを標的とした治療：女性乳癌患者の生検サンプルのおよそ２５％においてＨｅｒ２／ｎｅｕ癌遺伝子の過剰発現が観察されており、これは予後不良に関連する。トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ）は、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ受容体の細胞外領域（ＥＣＤ）に対するヒト化モノクローナル抗体であり、この受容体を過剰に発現するヒト乳癌細胞の増殖を阻害する（最近の総説に関しては、非特許文献３を参照されたい）。乳癌細胞上でのＨｅｒ−２／ｎｅｕのタンパク質発現は、ＳＫ−ＢＲ−３と呼ばれるヒト乳癌細胞株を過剰に発現するＨｅｒ−２／ｎｅｕの場合と同様に、１つの細胞あたり分子５００，０００個以上のレベルに容易に達し得る。Ｈｅｒ２／ｎｅｕに関する現在のテストは、タンパク質過剰発現または遺伝子増幅に関する患者の生検組織切片のテストに依存する。遺伝子増幅、または当該タンパク質に対する少なくとも２＋の免疫染色を有する女性においては、トラスツズマブ単剤またはトラスツズマブとパクリタキセル等の化学療法薬との組み合わせで有意な反応が示された。最近では、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ陽性の女性乳癌患者の治療に関して、ラパチニブ（ＧＷ−５７２０１６とも呼ばれる）が米国食品医薬品局（ＦＤＡ）により承認された。Ｈｅｒ−２／ｎｅｕは、乳癌以外に、卵巣癌を含む他の癌細胞上でも過剰発現する。
【０００３】
医療の現場では、循環乳癌細胞上でＨｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質が過剰発現したためＨｅｒ−２／ｎｅｕを標的とした療法、例えば、トラスツズマブ、ラパチニブ、または他の抗Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ関連療法が有効である可能性が高い女性乳癌患者を同定するために十分な感度および特異性を有する全血またはＰＢＭＣサンプルから迅速かつ直接的に行うことが可能な便利なアッセイに対する要望が大きい。現在トラスツズマブまたはラパチニブ治療の対象外である数千人の女性乳癌患者がＨｅｒ−２／ｎｅｕが過剰発現した循環腫瘍細胞を有し、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕに対して陰性と見なされた原発腫瘍を有することを示す証拠が文献として存在するため、これはさらに重要である。そのような女性は、最初に同定された場合には、抗Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ標的剤が有効であり得る。
【０００４】
分離した循環癌細胞上のＨｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質の発現を検出する方法が特許文献１（Ｗｅｌｌｓｔａｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  Ｃｏｒｐ．）に記載されている。最初に循環癌細胞を分離する必要性をなくすことは、テストの簡便さ、アッセイの迅速さ、および、最も重要である、広範囲にわたるサンプル操作の低減による癌細胞の喪失の予防に関して大きな利点となる。しかしながら、当該分野では、全血サンプル中の低レベルの循環乳癌細胞から、またはヒト末梢血単核細胞のサンプルからＨｅｒ−２／ｎｅｕを検出するために十分な感度および特異性を有する免疫測定の獲得には大きな障害が存在すると考えられている。
【０００５】
非特許文献４および非特許文献２はともに、それらの循環癌細胞のＨｅｒ−２／ｎｅｕに関するアッセイにおいて濃縮の使用を必要としていた。フローサイトメトリーを用いて循環癌細胞上のＨｅｒ−２／ｎｅｕを検出すること（Ｈａｙｅｓら）は、そのような濃縮が必要な感度を得るために「必要」かつ「不可欠」であることを示す（１１１２ページ、最終文、および１１１３ページ、１文目参照）。さらに、非特許文献５は、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ転写物およびタンパク質がともに正常な末梢血単核細胞（ＰＭＢＣ）中において低レベルで発現することを示す。Ｌｅｏｎｅらにより示されるそのようなＨｅｒ−２／ｎｅｕの発現は、ＰＢＭＣ数が高い場合には、循環癌細胞中におけるＨｅｒ−２／ｎｅｕの発現の検査を困難にすることが予期される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２００６／０４１９５９号パンフレット
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｈａｙｅｓ  ＤＦら、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｎｃｏｌ  ２１：１１１１−７
【非特許文献２】Ｍｅｎｇ  Ｓら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（２００４）１０１：９３９３−９８
【非特許文献３】Ｅｓｔｅｖｅ  ＦＪ、Ｔｈｅ  Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ（２００４）９（Ｓｕｐｐｌ３）：４〜９ページ
【非特許文献４】Ｈａｙｅｓら、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｎｃｏｌ（２００２）２１：１１１１−７
【非特許文献５】Ｌｅｏｎｅら、Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｂｉｏｌ（２００３）７４：５９３−６０１
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、全血サンプル中の循環癌細胞上におけるＨｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質の発現を検出する方法であって、該方法は、癌細胞関連Ｈｅｒ−２／ｎｅｕの検出が可能な免疫測定を上記血液サンプルに対して実施する工程であって、免疫測定の陽性の結果は上記癌細胞上のＨｅｒ−２／ｎｅｕの存在を示す、工程を包含し、上記免疫測定の実施前に上記全血から上記循環癌細胞を分離せず、上記免疫測定は、ａ）血液１ミリリットルあたりＳＫ−ＢＲ−３細胞１００個以下の濃度で血液中に加えた場合、ＳＫ−ＢＲ−３乳癌細胞からＨｅｒ−２／ｎｅｕを検出することが可能であり、ｂ）少なくとも１００万個のヒト末梢血単核細胞の存在下でアッセイを行った場合、１０個のＳＫ−ＢＲ−３乳癌細胞からＨｅｒ−２／ｎｅｕを検出することが可能である、方法を提供する。
【０００９】
本発明は、血液サンプル中の循環癌細胞上におけるＨｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質の発現を検出する方法であって、該方法は、癌細胞関連Ｈｅｒ−２／ｎｅｕの検出が可能な免疫測定を上記血液サンプルに対して実施する工程であって、免疫測定の陽性の結果は上記癌細胞上のＨｅｒ−２／ｎｅｕの存在を示す、工程を包含し、上記免疫測定の実施前に末梢血単核細胞から上記循環癌細胞を分離せず、上記免疫測定は、ａ）血液１ミリリットルあたりＳＫ−ＢＲ−３細胞１００個以下の濃度で血液中に加えた場合、ＳＫ−ＢＲ−３乳癌細胞からＨｅｒ−２／ｎｅｕを検出することが可能であり、少なくとも１００万個のヒト末梢血単核細胞の存在下でアッセイを行った場合、１０個のＳＫ−ＢＲ−３乳癌細胞からＨｅｒ−２／ｎｅｕを検出することが可能である、方法を提供する。
【００１０】
本発明は、循環癌細胞上のＨｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質の発現を検出するためにそのような細胞を分離する必要がないという知見に基づく。最初に循環癌細胞を分離する必要性をなくすことは、テストの簡便さ、アッセイの迅速さ、および、最も重要である、広範囲にわたるサンプル操作の低減による癌細胞の喪失の予防に関して大きな利点である。工程数を少なくすることで本発明の方法をより速く、安価に行うことができる。また、工程数を少なくすることで本発明の方法をより容易に自動化することができる。さらに、本発明の改良されたアッセイは、血液サンプル中の循環癌細胞からのＨｅｒ−２／ｎｅｕの検出感度に深刻な悪影響を及ぼし得る分離工程をなくすことにより癌細胞の喪失を防ぐ。
【００１１】
本発明は、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕを標的とする抗癌剤での治療から利益を得る可能性が高い癌患者を同定する方法であって、上記の検出法を包含する、方法を提供する。そのような患者の同定に用いる場合、上記癌細胞を含有する血液サンプルを上記患者から採取する。本発明は、このようにして同定した癌患者を治療する方法であって、上記Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ標的抗癌剤を上記患者に投与する工程を包含する、方法を提供する。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
全血サンプル中の循環癌細胞上におけるＨｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質の発現を検出する方法であって、該方法は、癌細胞関連Ｈｅｒ−２／ｎｅｕの検出が可能な免疫測定を該血液サンプルに対して実施する工程であって、免疫測定の陽性の結果は該癌細胞上のＨｅｒ−２／ｎｅｕの存在を示す、工程を包含し、
該免疫測定の実施前に該全血から該循環癌細胞を分離せず、
該免疫測定は、
ａ）血液１ミリリットルあたりＳＫ−ＢＲ−３細胞１００個以下の濃度で血液中に加えた場合、ＳＫ−ＢＲ−３乳癌細胞からＨｅｒ−２／ｎｅｕを検出することが可能であり、
ｂ）少なくとも１００万個のヒト末梢血単核細胞の存在下でアッセイを行った場合、１０個のＳＫ−ＢＲ−３乳癌細胞からＨｅｒ−２／ｎｅｕを検出することが可能である、方法。
（項目２）
血液サンプル中の循環癌細胞上におけるＨｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質の発現を検出する方法であって、該方法は、癌細胞関連Ｈｅｒ−２／ｎｅｕの検出が可能な免疫測定を該血液サンプルに対して実施する工程であって、免疫測定の陽性の結果は該癌細胞上のＨｅｒ−２／ｎｅｕの存在を示す、工程を包含し、
該免疫測定の実施前に末梢血単核細胞から該循環癌細胞を分離せず、
該免疫測定は、
ａ）血液１ミリリットルあたりＳＫ−ＢＲ−３細胞１００個以下の濃度で血液中に加えた場合、ＳＫ−ＢＲ−３乳癌細胞からＨｅｒ−２／ｎｅｕを検出することが可能であり、
少なくとも１００万個のヒト末梢血単核細胞の存在下でアッセイを行った場合、１０個のＳＫ−ＢＲ−３乳癌細胞からＨｅｒ−２／ｎｅｕを検出することが可能である、方法。
（項目３）
前記免疫測定は溶液に基づく免疫測定である、項目１または２に記載の方法。
（項目４）
前記免疫測定は、電気化学発光、化学発光、蛍光発生化学発光、蛍光偏光、および時間分解蛍光からなる群より選択される検出技術を用いる、項目３に記載の方法。
（項目５）
前記免疫測定はサンドイッチ免疫測定である、項目１または２に記載の方法。
（項目６）
前記免疫測定は、電気化学発光、化学発光、および蛍光発生化学発光からなる群より選択される検出技術を用いる、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記免疫測定は前記血液サンプル中の癌細胞関連Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ分子の数に比例したシグナルを生成する、項目１または２に記載の方法。
（項目８）
前記免疫測定はＨｅｒ−２／ｎｅｕの細胞質領域と選択的に結合する１つまたは２つの抗体を用いる、項目１または２に記載の方法。
（項目９）
前記免疫測定はＨｅｒ−２／ｎｅｕの細胞質領域と選択的に結合する２つの抗体を用いる、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記免疫測定はＨｅｒ−２／ｎｅｕに対するポリクローナル抗体を用いる、項目１または２に記載の方法。
（項目１１）
前記免疫測定は前記ポリクローナル抗体に対する二次抗体を用いる、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記免疫測定はＨｅｒ−２／ｎｅｕに対するモノクローナル抗体を用いる、項目１または２に記載の方法。
（項目１３）
前記免疫測定は前記モノクローナル抗体に対する二次抗体を用いる、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記モノクローナル抗体はヒト化マウスモノクローナル抗体である、項目１２に記載の方法。
（項目１５）
前記モノクローナル抗体はトラスツズマブである、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
Ｈｅｒ−２／ｎｅｕを標的とする抗癌剤での治療から利益を得る可能性が高い癌患者を同定する方法であって、項目１に記載の方法を包含し、該癌細胞を含有する血液サンプルを該患者から採取する、方法。
（項目１７）
前記患者の腫瘍生検組織は、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕの組織アッセイによりＨｅｒ−２／ｎｅｕ発現に関して陰性であると予め決定されている、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記組織アッセイは免疫組織化学法およびＦＩＳＨ解析からなるリストから選択される、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
Ｈｅｒ−２／ｎｅｕを標的とする抗癌剤での治療から利益を得る可能性が高い癌患者を治療する方法であって、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ標的抗癌剤を項目１６〜１８のいずれか１つに記載の方法により同定される患者に投与する工程を包含する、方法。
（項目２０）
前記抗癌剤はトラスツズマブ；ラパチニブ；ＣＰ−７２４，７１４；ＨＫＩ−２７２；およびＢＭＳ−５９９６２６からなるリストから選択される、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
Ｈｅｒ−２／ｎｅｕを標的とする抗癌剤での治療から利益を得る可能性が高い癌患者を同定する方法であって、項目２に記載の方法を包含し、該癌細胞を含有する血液サンプルを該患者から採取する、方法。
（項目２２）
前記患者の腫瘍生検組織は、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕの組織アッセイによりＨｅｒ−２／ｎｅｕ発現に関して陰性であると予め決定されている、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記組織アッセイは免疫組織化学法およびＦＩＳＨ解析からなるリストから選択される、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
Ｈｅｒ−２／ｎｅｕを標的とする抗癌剤での治療から利益を得る可能性が高い癌患者を治療する方法であって、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ標的抗癌剤を項目２１〜２３のいずれか１つに記載の方法により同定される患者に投与する工程を包含する、方法。
（項目２５）
前記抗癌剤はトラスツズマブ；ラパチニブ；ＣＰ−７２４，７１４；ＨＫＩ−２７２；およびＢＭＳ−５９９６２６からなるリストから選択される、項目２４に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】溶解物中のＨｅｒ−２／ｎｅｕの免疫測定検出のためのＥＣＬシグナルに関するＳＫ−ＢＲ−３乳癌細胞（Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ過剰発現に関する陽性対照）とＭＤＡ−ＭＢ−４６８（Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ過剰発現に関する陰性対照）の比較。１個のウェルあたり１、２、および１０個の細胞の溶解物を用いたデータを示す。
【図２】溶解物中のＨｅｒ−２／ｎｅｕの免疫測定検出のためのＥＣＬシグナルに関するＳＫ−ＢＲ−３乳癌細胞（Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ過剰発現に関する陽性対照）とＭＤＡ−ＭＢ−４６８（Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ過剰発現に関する陰性対照）のさらなる比較。この図では図１に示すものと同じ実験データを用いているが、Ｘ軸の値の増加を示すために、このグラフには１個のウェルあたり５０個および２５０個の細胞の溶解物材料から得たデータも含まれている。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本明細書で用いる「包含する」という移行句は非制限的用語である。この用語を用いる請求項は、そのような請求項に記載される以外の構成要件を含むようにすることができる。よって、例えば、請求の範囲には、記載する構成要件またはそれらの同等物が存在する限り、特に明記していない他の工程も含む方法が含まれ得る。
【００１４】
「非分離癌細胞」または「分離されていない癌細胞」という用語：本明細書で用いる「非分離癌細胞」または「分離されていない癌細胞」という用語は、アッセイによるテストのための抗原を有する癌細胞について言及する場合、サンプル１ｍｌあたり少なくとも１００，０００個の非癌細胞の存在下で、より好ましくは、サンプル１ｍｌあたり少なくとも５００，０００個の非癌細胞の存在下で、さらにより好ましくは、サンプル１ｍｌあたり少なくとも１００万個の非癌細胞の存在下で、最も好ましくは、サンプル１ｍｌあたり少なくとも２００万個の非癌細胞の存在下で抗原に関してテストされる癌細胞を指す。例えば、循環ヒト癌細胞上に見られる抗原に関してアッセイを行う場合、および１ｍｌあたり５００，０００個のヒト末梢血単核細胞が存在するアッセイサンプル中に循環ヒト癌細胞がある場合、サンプル中の循環ヒト癌細胞は、分離されていない癌細胞であり、非分離癌細胞である。
【００１５】
本発明の１つの実施形態では、上記免疫測定は溶液に基づく免疫測定である。溶液に基づく免疫測定：本明細書で用いる「溶液に基づく免疫測定」という用語は、抗原に対する少なくとも１つの抗体を用いた抗原溶液の免疫測定を指す。溶液に基づく免疫測定に適した検出技術は、電気化学発光、化学発光、蛍光発生化学発光、蛍光偏光、および時間分解蛍（ｔｉｍｅ−ｒｅｓｏｌｖｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｎ）を含む。
【００１６】
本発明の他の実施形態では、上記免疫測定はサンドイッチ免疫測定である。本明細書で用いる「サンドイッチ免疫測定」という用語は、それぞれ抗原または当該抗原の一部に対する一対の抗体（例えば、抗体“Ａ”および抗体“Ｂ”）を用いて抗原を検出するアッセイを指す。一対の抗体については、抗体“Ａ”には、レポーター分子（例えば、電気化学発光を可能にする分子、または蛍光を可能にする分子）との共有結合または非共有結合のいずれかにより標識を付す。抗体“Ａ”の非共有結合標識の例としては、抗体“Ａ”に対する二次標識抗体を抗体“Ａ”に結合させることが挙げられる。抗体“Ｂ”は、アッセイプレート、磁石、または電極のような固体支持体相（ｓｏｌｉｄ  ｓｕｐｐｏｒｔ  ｐｈａｓｅ）に直接付着させる（または間接的に付着させることができる）。サンドイッチ免疫測定に適した検出技術は、電気化学発光、化学発光、および蛍光発生化学発光を含む。
【００１７】
本発明は、血液サンプル中の循環乳癌細胞上のＨｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質のレベルの定量化に十分な感度を有する方法を提供するとともに、トラスツズマブ、ラパチニブ、またはＨｅｒ−２／ｎｅｕを標的とした他の薬剤を用いた治療から利益を得る可能性が高い女性乳癌患者を同定する方法を提供する。Ｈｅｒ−２／ｎｅｕを標的とすることが可能な他の薬剤が開発中であり、本発明に対してトラスツズマブまたはラパチニブと同様に適用可能である。これらは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈが開発中のＯＭＮＩＴＡＲＧ（ペルツズマブ）、Ｐｆｉｚｅｒが開発中のＣＰ−７２４，７１４、およびＣＰ−６５４５７７（Ｍｕｎｓｔｅｒら、２００７，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ１３：１２３８−４５；Ｂａｒｂａｃｃｉら、２００３，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ６３：４４５０−４４５９）、Ｗｙｅｔｈが開発中のＨＫＩ−２７２（Ｗｏｎｇら、２００６，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ２４（Ｊｕｎｅ２０  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）：３０１８；Ｒａｂｉｎｄｒａｎら、２００４，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ２００４、６４：３９５８−６５）、およびＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ−Ｓｑｕｉｂｂが開発中のＢＭＳ−５９９６２６を含むがそれらに限定されない。それらの特異性にＨｅｒ−２／ｎｅｕを含む他の抗癌剤がＳｐｅｃｔｏｒら、２００７（Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ９，２０５ページから）、ならびＪａｎｍａａｔおよびＧｉａｃｃｏｎｅ，２００３（Ｔｈｅ  Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ８：５７６−８６）に記載されている。Ｈｅｒ−２／ｎｅｕを標的とするさらなる抗癌剤としては、Ｈｅｒ２標的ナノ粒子バイオコンジュゲート（Ａｌｅｘｉｓ  Ｆら、２００７；Ａｂｓｔｒａｃｔ＃４１８１，２００７  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ参照）、および化学療法薬を含有する抗Ｈｅｒ２イムノリポソーム（Ｎｏｂｌｅ  ＣＯら、２００４，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｔｈｅｒ  Ｔａｒｇｅｔｓ８：３３５−５３参照）が挙げられる。
【００１８】
本発明に従って用いられる免疫測定は、血液１ミリリットルごとに加えた少なくとも１００個のＳＫ−ＢＲ−３乳癌細胞からＨｅｒ−２／ｎｅｕを検出するに十分な感度、好ましくは、血液１ミリリットルごとに加えた少なくとも３０個のＳＫ−ＢＲ−３乳癌細胞の検出に十分な感度、より好ましくは、血液１ミリリットルごとに加えた少なくとも１０個のＳＫ−ＢＲ−３乳癌細胞の検出に十分な感度、より好ましくは、血液１ミリリットルごとに加えた少なくとも３個のＳＫ−ＢＲ−３乳癌細胞の検出に十分な感度、および最も好ましくは、血液１ミリリットルごとに加えた少なくとも１個のＳＫ−ＢＲ−３乳癌細胞の検出に十分な感度を有する。本発明に従って用いられる免疫測定は、少なくとも１００万個のヒト末梢血単核細胞の存在下で測定した場合、１０個のＳＫ−ＢＲ−３乳癌細胞からＨｅｒ−２／ｎｅｕを検出できるような耐干渉性を有する。
【００１９】
好適な実施形態では、上記免疫測定は上記血液サンプル中の癌細胞関連Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ分子の数に比例したシグナルを生成する。
【００２０】
癌患者、特に、乳癌患者の血液サンプル（通常、およそ８〜２０ｍｌの範囲）を採取する。工程の詳細は下記の通りである：
１．赤血球および好中球の選択的減少。好適な実施形態にはこの工程が含まれる。
【００２１】
２．循環カルシノーマ細胞中のＨｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質の検出および定量化
１．赤血球および好中球の選択的減少。好適な方法では、抗凝血剤（ＥＤＴＡまたはクエン酸塩）を入れたＢＤ  Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ  ＣＰＴチューブを用いる。これらのチューブには、正確な遠心分離（１，１００ｘｇ、１０分間、スイング型ローター）時に、赤色血液細胞および好中球の除去を可能にする材料が入っている。遠心分離の後、チューブの底には赤血球（赤色血液細胞）および好中球の細胞ペレットが含まれる。細胞ペレットの上にはゲルバリアがあり、ゲルバリアの上には単核細胞（腫瘍細胞、リンパ球、および単球）が血漿の下のバンドとして存在する。そして、腫瘍細胞、リンパ球、および単球は、ゲルバリアより上の上部から容易に回収することができる。この方法は、赤色血液細胞だけでなく好中球も取り除くため好ましい。
【００２２】
２．循環カルシノーマ細胞のＨｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質の検出および定量化
次いで、検出分子と直接または間接的に結合したＨＥＲＣＥＰＴＩＮ等のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）またはＨｅｒ−２／ｎｅｕに対するポリクローナル抗体（例えば、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓのヤギポリクローナル抗体商品番号ＡＦ１１２９）の使用によりＨｅｒ−２／ｎｅｕの検出を行うことができる。電気化学発光（ＥＣＬ）の場合、上記検出分子はルテニウムである。トリプロピルアミンを含有する溶液中の磁性ビーズ上における抗原のＥＣＬ検出の後にルテニウムと抗体を結合するために十分に有用な方法を提供する公知文献が多く存在する（例えば、Ｌｅｅら、Ａｍ  Ｊ  Ｔｒｏｐ  Ｍｅｄ  Ｈｙｇ２００１，６５：１−９）。電位差を与えることにより、ルテニウム標識を励起し、発光させ、その光をＥＣＬ検出器（ＯＲＩＧＥＮ分析器、またはＢＩＯＶＥＲＩＳ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤのＭ−Ｓｅｒｉｅｓ（登録商標）３８４等の市販器具など）を用いて検出する。
【００２３】
本発明に従って用いる免疫測定は、少なくとも１つの抗体、好ましくは、２セットの抗体からなる。これらの抗体は、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕに対するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれかとすることができる。好ましくは、上記モノクローナル抗体は、ヒト化マウスモノクローナル抗体、例えば、トラスツズマブである。トラスツズマブは、本発明による免疫測定および治療法の好適な実施形態である。
【００２４】
本発明のさらなる実施形態では、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕを標的とする上記抗体の１つに対する二次抗体を用いる。本発明の好適な実施形態では、上記二次抗体には、レポーター分子（例えば、電気化学発光を可能にする分子、または蛍光を可能にする分子）との共有結合または非共有結合のいずれかにより標識を付す。本発明の他の好適な実施形態では、ＥＣＬを用いるとともに、上記二次抗体をビオチン化し、ストレプトアビジン被覆磁性ビーズに対する二次抗体の付着を可能にする。
【００２５】
Ｈｅｒ−２／ｎｅｕの検出のために、細胞外領域および細胞質領域に対する抗体を含むＨｅｒ−２／ｎｅｕに対する各種のモノクローナルおよびポリクローナル抗体がＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ  Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ（Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ）、およびＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）等の供給業者より市販されている。ウサギポリクローナル抗体もＬＡＢＶＩＳＩＯＮ  Ｃｏｒｐ，Ｆｒｅｍｏｎｔ．ＣＡ；ｎｅｕ  Ａｂ−２１等）、およびＵＰＳＴＡＴＥ  ＣＥＬＬ  ＳＩＧＮＡＬＩＮＧ  ＳＯＬＵＴＩＯＮＳ（Ｌａｋｅ  Ｐｌａｃｉｄ，ＮＹ；商品番号０６−５６２等）から入手可能である。Ｈｅｒ−２／ｎｅｕの細胞外領域に対するヤギポリクローナル抗体は、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ（商品番号ＡＦ１１２９）から入手可能である。完全長組み換え体Ｈｅｒ−２／ｎｅｕに対するヤギポリクローナル抗体は、ＥＸＡＬＰＨＡ  ＢＩＯＬＯＧＩＣＳ（Ｒｏｓｅｄａｌｅ，ＭＡ；商品番号Ｍ１００Ｐ）から入手可能である。そのような完全長Ｈｅｒ−２／ｎｅｕに対するポリクローナル抗体は、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕの細胞外および細胞質領域に結合可能であり、細胞外領域に対して特異的ではないと予想される；そのような抗体はなおも有用であるが、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕに対してより特異的な抗体と組み合わせることが好ましい。モノクローナル抗体は、細胞外領域（例えば、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ商品番号ＭＡＢ１１２９）、およびＣ末端ペプチド（例えば、ＬＡＢＶＩＳＩＯＮ  ｎｅｕＡＢ−１５）を含む細胞質領域（例えば、ＬＡＢＶＩＳＩＯＮ  ｎｅｕＡＢ−８）の両方に対して利用可能である。Ｈｅｒ−２／ｎｅｕに対するモノクローナル抗体はまた、Ｈｕｄｚｉａｋら（１９９７、米国特許第５，６７７，１７１号）に開示されている。１つの改良された実施形態ではＨＥＲＣＥＰＴＩＮを用いるが、これは、この抗体との結合により、患者の治療のためのＨＥＲＣＥＰＴＩＮの結合を最もよく予測できるためである。他の有利な実施形態では、ポリクローナル抗体、またはＨｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質上の多数のエピトープと結合する抗体の混合物を用いることでより高い感度を可能にする。
【００２６】
本発明の１つの実施形態では、上記サンプルが細胞溶解する前に上記Ｈｅｒ−２／ｎｅｕに対する抗体の１つを癌細胞と結合させることにより上記免疫測定の一工程を無傷の癌細胞に対して行う。無傷の癌細胞との結合に用いられるそのような抗体は、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕの細胞外領域に対するものでなければならない。代替的には、上記癌細胞を溶液に基づく免疫測定の全工程の前に溶解させることができ、当該免疫測定を細胞溶解物に対して行う。この場合、上記免疫測定は、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕの細胞外または細胞質領域のいずれかに選択的に結合する抗体を利用することができる。本発明のより具体的な実施形態では、上記免疫測定はＨｅｒ−２／ｎｅｕの細胞質領域と選択的に結合する１つまたは２つの抗体を用いる。
【００２７】
本発明の溶液に基づく免疫測定の好適な実施形態では、上記抗原に対する抗体を用いて上記溶液中の抗原を磁石、電極、またはアッセイプレート等の固体支持体に間接的に付着させる。溶液に基づく免疫測定の一例としては、電気化学発光（ＥＣＬ）により抗原に対する２つの抗体を用いて当該抗原を検出する例があり、上記抗体の一方にルテニウムで標識を付し、他方を電極と付着可能な磁性ビーズに付着させる。本用途に必要な高い感受性を得ることが可能な他の溶液に基づく免疫測定は、電気化学発光以外に、
ａ）Ｌｉｕ  Ｙら、２００３（Ｊ  Ｆｏｏｄ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ６６：５１２−７）に記載されるような化学発光、
ｂ）Ｙｕ  Ｈら、２０００（Ｂｉｏｓｅｎｓ  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ１４：８２９−４０）に記載されるような蛍光発生化学発光（ＦＣＬ）、
ｃ）蛍光偏光免疫測定（Ｈｏｗａｎｉｔｚ  ＪＨ，１９８８  Ａｒｃｈ  Ｐａｔｈｏｌ  Ｌａｂ  Ｍｅｄ１１２：７７５−９参照）、
ｄ）時間分解蛍光免疫測定（Ｂｕｔｃｈｅｒ  Ｈら、２００３、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ２７２：２４７−５６；Ｓｏｕｋｋａら、２００１，Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ４７：１２６９−７８；Ｈｏｗａｎｉｔｚ  ＪＨ，１９８８  Ａｒｃｈ  Ｐａｔｈｏｌ  Ｌａｂ  Ｍｅｄ１１２：７７５−９）を含むがこれらに限定されない。
【００２８】
本発明のサンドイッチ免疫測定の好適な実施形態では、上記抗体の一方にルテニウムで標識を付し、他方の抗体を電極に付着可能な磁性ビーズに付着させる電気化学発光（ＥＣＬ）を用いる。
【００２９】
本発明によるＨｅｒ−２／ｎｅｕを標的とする抗癌剤での治療から利益を得る可能性が高い患者を同定する方法は、その感度のために、腫瘍生検組織がＨｅｒ−２／ｎｅｕの組織アッセイによりＨｅｒ−２／ｎｅｕ発現に関して陰性であると（例えば、免疫組織化学法またはＦＩＳＨ解析により）予め判定された患者に効果的に適用することができる。
【００３０】
本発明は以下の実施例を参照することにより容易に理解できるが、それらの実施例は本明細書に記載の発明を例示するものであり、なんら限定するものではない。
【実施例】
【００３１】
（実施例１）
転移性乳癌患者は診察室に入り、血液サンプル（８〜４０ｍＬ）をクエン酸塩等の抗凝血剤を入れたＢＤ  Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ  ＣＰＴチューブ内に直接採血される。この材料を２０分間、１５００〜１８００ＲＣＦ（相対遠心力）で遠心分離機にかける。ゲルバリアの上の細胞層を取り出し、すでにＨｅｒ−２／ｎｅｕに対する抗体（例えば、ポリクローナル抗体またはＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（トラスツズマブ））を入れた異なる容器（例えば、チューブ）内に入れる。そのような抗体には予めルテニウム標識を付している。抗体にルテニウム標識する常法は当該分野ではＬｅｅら、Ａｍ  Ｊ  Ｔｒｏｐ  Ｍｅｄ  Ｈｙｇ２００１，６５：１−９などに記載されている。次いで、サンプル中の細胞を溶解させる。溶解は当該分野で記載される任意の数の細胞溶解試薬（例えば、溶解緩衝液Ａ［１％ＮＰ−４０、２０ｍＭトリス（ｐＨ８.０）、１３７ｍＭのＮａＣｌ、１０％グリセロール、２ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭオルトバナジウム酸ナトリウム、１０ｕｇ／ｍＬアプロチニン、１０Ｕｇ／ｍＬロイペプチン］が挙げられるがこれら限定されない）を用いて行うことができる。この溶解物に、ビオチン化したＨｅｒ−２／ｎｅｕに対する第２の抗体を加える。例えば、この第２の抗体は、例えば、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ製のＨｅｒ−２／ｎｅｕに対するビオチン化ポリクローナル抗体（商品番号ＢＡＦ１１２９）である。次に、上記２つの抗体の各々と結合抗原を電極に近づけるストレプトアビジン被覆磁性ビーズとともに、トリプロピルアミン溶液をその細胞溶解物に加える。電流を印加し、市販されるようなＥＣＬ検出装置（ＢＩＯＶＥＲＩＳ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて電気化学発光（ＥＣＬ）を検出する。これらの器具内では、効率的な光捕捉のために光電子増倍管（ＰＭＴ）が作用電極のすぐ上に配置される。作用電極の下には、標的抗原で覆われたビーズを回収する磁石が配置される。シグナルは、循環腫瘍細胞の表面に結合して見出されるＨｅｒ−２／ｎｅｕの量に比例する。
【００３２】
（実施例２）
Ｈｅｒ−２／ｎｅｕに対する２つのポリクローナル抗体を検出に用いる以外は実施例１で用いたものと同じ方法を提供する。
【００３３】
（実施例３）
上記一対の抗体の各々を加える前にＰＢＭＣサンプルを溶解させる以外は実施例１および２で用いた方法と同じである。
【００３４】
（実施例４）
ＰＢＭＣサンプルの代わりに全血サンプルを直接用いる以外は実施例１および３と同じ方法である。
【００３５】
（実施例５）
患者の原発腫瘍の分析に基づいて当該患者に対して事前にＨｅｒ−２／ｎｅｕに関する陰性の結果が出ているか、または患者が分析に容易に利用できる腫瘍組織を有さないこと以外は実施例１〜４で用いたものと同じ方法を提供する。
【００３６】
（実施例６）
実施例１〜５に示すような対照サンプルよりもＨｅｒ−２／ｎｅｕのレベルが高い患者は、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ陽性の腫瘍細胞を有するものとみなし、トラスツズマブ等のＨｅｒ−２／ｎｅｕに対するモノクローナル抗体を含むレジメンを用いて治療する。好適な治療は、初期負荷用量４ｍｇ／ｋｇ、９０分間注入、および週間維持用量２ｍｇ／ｋｇ、３０分間注入でトラスツズマブを投与することからなる。
【００３７】
（実施例７）
実施例１〜５に示すような対照サンプルよりもＨｅｒ−２／ｎｅｕのレベルが高い患者は、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ陽性の腫瘍細胞を有するものとみなし、ラパチニブを含むレジメンを用いて治療する。ラパチニブを用いた投与レジメンの一例では、この薬剤を１〜２１日目には１日に１回、１，２５００ｍｇ（各々２５０ｍｇを５錠）経口投与するとともに、１日あたりカペシタビン２０００ｍｇ／ｍ２を投与する（２１日周期における１〜１４日目におよそ１２時間間隔で２回経口投与）。
【００３８】
（実施例８）
実施例１〜５に示すような対照サンプルよりもＨｅｒ−２／ｎｅｕのレベルが高い患者は、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ陽性の腫瘍細胞を有するものとみなし、ＣＰ−７２４，７１４を含むレジメンを用いて治療する。ＣＰ−７２４，７１４を用いた投与レジメンの一例では、この薬剤を１日に２回、２５０ｍｇで経口投与する。
【００３９】
（実施例９）
実施例１〜５に示すような対照サンプルよりもＨｅｒ−２／ｎｅｕのレベルが高い患者は、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ陽性の腫瘍細胞を有するものとみなし、ＨＫＩ−２７２を含むレジメンを用いて治療する。ＨＫＩ−２７２を用いた投与レジメンの一例では、この薬剤２４０〜３２０ｍｇを１日目に１回経口投与するとともに、８日目から１日１回経口投与する。
【００４０】
（実施例１０）
本実施例では、精製組み換え体Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ（細胞外領域）を標準として用いて電気化学発光を用いる溶液に基づく免疫測定の感度を調べた。この標準を１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水；ｐＨ＝７.２）に希釈した。
【００４１】
１つのアッセイ緩衝液を調製した：
●アッセイ緩衝液１：０.５％Ｔｗｅｅｎ−２０および０.５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）のＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）溶液
Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ標準（組み換えＨｅｒ−２／ｎｅｕ細胞外領域）をＯｎｃｏｇｅｎｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ；製品番号ＥＬ５４１）から入手した。ヤギ抗ヒトＨｅｒ−２／ｎｅｕポリクローナル抗体をＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ５５４１３  ＵＳＡ）からビオチン化および非ビオチン化形態（それぞれ、商品番号ＢＡＦ１１２９およびＡＦ１１２９）の両方で入手した。ポリクローナル抗体ＡＦ１１２９に、Ｌｏｒｅｎｃｅ＆Ｌｕ（ＰＣＴ国際公開第ＷＯ２００６／０４１９５９Ａ２号）に示される手順を用いてルテニウム標識（「ＴＡＧ標識」）を付した。
【００４２】
これ以降、本実施例および以下の実施例では、ルテニウム標識ポリクローナル抗体ＡＦ１１２９およびビオチン化ポリクローナル抗体ＢＡＦ１１２９を「ＴＡＧ−ｐＡｂ」および「ビオチン−ｐＡｂ」と呼ぶ。
【００４３】
電気化学発光アッセイを以下のように行った：
●Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ標準を２５μｌ／ウェルで、ＴＡＧ−Ａｂとビオチン−Ａｂの混合物［２セットの濃度の一方：（Ａ）５０μｌにそれぞれ１μｇ／ｍｌ（最終濃度０.２μｇ／ｍｌ、最終アッセイ容量２５０μｌ／ウェル）；および（Ｂ）５０μｌ中、ビオチン−ｐＡｂ０.７μｇ／ｍｌ（最終濃度０.１４μｇ／ｍｌ、最終アッセイ容量２５０μｌ／ウェル）；および５０μｌ中、ＴＡＧ−ｐＡｂ１.２μｇ／ｍｌ（最終濃度０.２４μｇ／ｍｌ、最終アッセイ容量２５０μｌ／ウェル）］を５０μｌ／ウェルで順に４つのＰＢＳアッセイ緩衝液に希釈し）、９６ウェルＵ底ポリプロピレンプレートのウェルに加え、常時振盪しながら室温でインキュベートした（例えば、２時間）。
【００４４】
●１０μｇの磁性ストレプトアビジンビーズ（例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−２８０ストレプトアビジン、ＢｉｏＶｅｒｉｓ，Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を含む２５μｌ溶液を各ウェルに加え、常時振盪しながらインキュベートした（例えば、３０分間）。
【００４５】
●アッセイ緩衝液１を各ウェルに加えて、最終容量２５０μｌ／ウェルにした。このアッセイにおける検体（組み換えＨｅｒ−２／ｎｅｕ細胞外領域）の量は、１６〜１６０、〜１６００ｐｇ／ウェルの範囲とした。検体を含まない対照ウェルも含めた。全ての条件について少なくとも二重に重複させたウェルにおいてテストを行った。次いで、Ｍ−Ｓｅｒｉｅｓ（登録商標）３８４分析器（ＢｉｏＶｅｒｉｓ，Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を用いて９６ウェルプレートの電気化学発光について分析した。
【００４６】
その結果、溶液に基づく免疫測定とＴＡＧ−ｐＡｂおよびビオチン−ｐＡｂとを両方の使用条件で用いてテストを行った全てのレベルの組み換えＨｅｒ−２／ｎｅｕ細胞外領域（１６、１６０、および１６００ｐｇ／ウェル）が検出可能であるとともに、ベースラインよりも上であることが示された（表１）。
【００４７】
【表１】
2010525326.tif 000001
（実施例１１）
●ＳＫ−ＢＲ−３乳癌細胞（Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ過剰発現に関して陽性の対照細胞）およびＭＤＡ−ＭＢ−４６８乳癌細胞（Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ過剰発現に関して陰性）からの細胞抽出物を分析したこと以外は、実施例１０で用いたものと同じ方法を用いた。
【００４８】
ＳＫ−ＢＲ−３およびＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞（ＡＴＣＣ製、Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）を６ウェル組織培養プレートでＡＴＣＣが推奨する条件どおりに増殖させ、ＰＢＳで２回洗浄し、血球計を用いてアリコートを計数した。（Ｌｏｒｅｎｃｅ＆Ｌｕ［ＰＣＴ国際公開第ＷＯ２００６／０４１９５９Ａ２号］に記載されるようなＰｉｅｒｃｅ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒを用いてＳＫ−ＢＲ−３細胞を溶解し、上清を得た。ウェルごとの溶解上清量は１〜２５０個の範囲のＳＫ−ＢＲ−３またはＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞から抽出したものと異なり、最終アッセイ濃度０.２μｇ／ｍｌのＴＡＧ−ｐＡｂおよび０.２μｇ／ｍｌのビオチン−ｐＡｂを用いて実験１０に記載の免疫測定によりＨｅｒ−２／ｎｅｕの分析を行った。
【００４９】
この実験の結果を図１および図２に示す。図１は、このアッセイの低細胞数におけるＨｅｒ−２／ｎｅｕ検出能力が最も分かりやすくなるようにデータセットの低い側をグラフに示す。図１は、１つのウェルにつき細胞数が最大で１０個までの細胞範囲のデータのみを含んでいる。図２は、データセット全体（１つのウェルにつき細胞数が最大で２５０個）をグラフで示す。
【００５０】
本実験において最低量のＳＫ−ＢＲ−３溶解物を用いるウェルを含む本実験のＳＫ−ＢＲ−３細胞の溶解物（ウェルごとに細胞１個ずつ増やした場合の溶解物；図１）では、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕを検出可能であり、ベースラインの上にあった。さらに、１つのウェルにつき細胞数が１〜２５０個のテスト範囲全体において、このＳＫ−ＢＲ−３細胞（Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ過剰発現に関して陽性の対照）の溶解物は、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕに関する免疫測定において、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞（Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ過剰発現に関して陰性）の溶解物よりも著しく高いシグナルを発生しており、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕの検出結果（図１および図２）の特異性が高いことを示している。
【００５１】
（実施例１２）
本実験では、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を商業製品供給業者（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｔｄ．；Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，Ｏｈｉｏ；製品番号ＣＴＬ−ＵＰ１）から入手し、実施例１１の乳癌細胞と同じ方法で溶解物を調製したこと以外は実施例１０と同じ免疫測定法を用いた。
【００５２】
各ウェルに下記を加えてテストサンプルを調製した：
●１０ＳＫ−ＢＲ−３細胞または対照ＰＢＳアッセイ緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ＝７．２、０．５％ＢＳＡ、および０．５％Ｔｗｅｅｎ２０）の細胞溶解物
●６２５，０００個のヒトＰＢＭＣまたは対照ＰＢＳアッセイ緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ＝７．２、０．５％ＢＳＡ、および０．５％Ｔｗｅｅｎ２０）の細胞溶解物
これらの複合溶解物に下記を加えた：
●各ウェルにＴＡＧ−ｐＡｂおよびビオチン−ｐＡｂ（各抗体の最終アッセイ濃度０.２μｇ／ｍｌ）を加え、９６ウェルプレートを常時振盪しながら２時間室温でインキュベートした。
【００５３】
●１０μｇの磁性ストレプトアビジンビーズ（例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−２８０ストレプトアビジン、商品番号１１００２８、ＢｉｏＶｅｒｉｓ、Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）の２５μｌ溶液を各ウェルに加え、常時振盪しながら３０分間インキュベートした。
【００５４】
●ＰＢＳアッセイ緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ＝７.２、０.５％ＢＳＡ、および０.５％Ｔｗｅｅｎ２０）を各ウェルに加え、各ウェルの最終容量を２５０μｌにした。次いで、９６ウェルプレートを実施例１０に示すように電気化学発光に関して分析した。
【００５５】
この実験結果を表２に示す。６２５，０００個のヒトＰＢＭＣからはＨｅｒ−２／ｎｅｕは検出できなかった（表２）。対照的に、ＳＫ−ＢＲ−３乳癌細胞溶解物に関しては、使用量が最小（１つのウェルにつきＳＫ−ＢＲ−３細胞数が１０個の場合の溶解物；表６参照）の場合でもＨｅｒ−２／ｎｅｕを検出することができた。さらに、６２５，０００個のヒトＰＢＭＣの細胞溶解物を加えても乳癌細胞中のＨｅｒ−２／ｎｅｕの検出に影響はなかった（表２）。
【００５６】
【表２】
2010525326.tif 000002
（実施例１３）
これら２つの実験では、実施例１０と同様のＨｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質標準、および実施例１１と同様のＳＫ−ＢＲ−３溶解物を用いて免疫測定を行ったが、ビオチン−ｐＡｂの代わりにヒト化モノクローナル抗体トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）を用いたこと、および下記の４つのＥＣＬ免疫測定条件のうちの１つについてテストを行ったことが異なる：
●条件＃１：トラスツズマブにルテニウムを用いて直接標識を付した。実施例１０に示すような最終アッセイ濃度が０.２μｇ／ｍｌのビオチン化ポリクローナル抗体を用いた。
【００５７】
●条件＃２：トラスツズマブにビオチンを用いて直接標識を付した。実施例１０に示すような最終アッセイ濃度が０.２μｇ／ｍｌのルテニウム標識ポリクローナル抗体を用いた。
【００５８】
●条件＃３および＃４：これらの２つの条件に関しては、トラスツズマブに直接標識を付さない代わりに、二次抗体（ビオチン標識抗ヒトＩｇＧ）を代用した。
【００５９】
○条件＃３：まず、トラスツズマブ（２５０μｌ／ウェルでＥＣＬを行う場合の最終濃度０.２μｇ／ｍｌ）を細胞溶解物を直接用いて５０分間インキュベートした。次いで、この工程の後に、ビオチン標識抗ヒトＩｇＧ（最終濃度０.２μｇ／ｍｌ；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；商品番号１３−４９９８、ヒトＩｇＧに対するビオチン標識ヤギ抗体）およびＴＡＧ−ｐＡｂ（最終濃度０.２μｇ／ｍｌ）を加え、これらのアッセイ構成成分を１時間室温でインキュベートした後、（前述の実施例１０で使用したような）ストレプトアビジンビーズを加えた。
【００６０】
○条件＃４：濃度は条件＃３と同様であるが、試薬の添加順序を変更した。条件＃４では、まず、トラスツズマブおよびルテニウム標識ｐＡｂ（ＴＡＧ−ｐＡｂ）を細胞溶解物を用いて５０分間培養した。次いで、この工程の後に、ビオチン標識抗ヒトＩｇＧを加え、これらのアッセイ構成成分を１時間室温でインキュベートした後、（前述の実施例１０で使用したような）ストレプトアビジンビーズを加えた。
【００６１】
トラスツズマブを用いた最初の実験では、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ陽性対照サンプルのアッセイにおいて条件＃１および＃２に関してテストを行った。この実験では、条件＃１に関して、１６００ｐｇ／ウェルのＨｅｒ−２／ｎｅｕを用いてバックグラウンドを越えるシグナルウェルが得られ、条件＃２よりも感度が高かった。
【００６２】
【表３−１】
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トラスツズマブを用いた次の実験では、条件＃１および＃２に対して感度を向上させるために条件＃３および＃４を考案し、ＳＫ−ＢＲ−３細胞溶解物のＨｅｒ−２／ｎｅｕのアッセイに用いた。その結果、条件＃３および＃４では、溶液に基づくアッセイにおいてトラスツズマブをポリクローナル抗体とともに用いて、１つのウェルにつき少なくとも１個のＳＫ−ＢＲ−３細胞溶解物のＨｅｒ−２／ｎｅｕを検出できることが分かった（表３Ｂ）。条件＃４は、少数のＳＫ−ＢＲ−３細胞の検出感度が条件＃３Ａよりも高かった。
【００６３】
【表３−２】
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本例の結果では、トラスツズマブを用いてテストを行った４つの条件のうち、トラスツズマブに対する二次抗体を用いた条件＃３および＃４については、トラスツズマブを直接標識するとともに、二次抗体を用いなかった条件＃１および＃２に対して有利な結果が得られた。
【００６４】
（実施例１４）
本実験では、ＴＡＧ−ｐＡｂおよびビオチン−ｐＡｂを用いる免疫測定法は実施例１２で用いたものと同じであり、トラスツズマブを用いる免疫測定法は実施例１３の条件＃４のものと同様である。さらに６人のドナーのヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をＣｅｌｌｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｔｄ．；Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，Ｏｈｉｏ；製品番号ＣＴＬ−ＵＰ１）から入手し、実施例１２と同様にして溶解物を調製した。本例では、ＰＢＭＣの溶解物について、１つのウェルにつき５００，０００〜１，０００，０００個の細胞に対するテストを、ＳＫ−ＢＲ−３細胞溶解物（１つのウェルにつき１０個の細胞をテスト）をそれらのＰＢＭＣ溶解物中に加えた場合と、加えない場合に関して行った。
【００６５】
ＴＡＧ−ｐＡｂおよびビオチン−ｐＡｂを用いた場合の結果を個々のＰＢＭＣドナーについては表４〜表９に示し、全てのドナーの平均については表１０に示す。表４〜表９に示すとともに、表１０に要約するように、全てのドナーＰＢＭＣに関して非常に一貫した結果が得られた。１，０００，０００個という多量のＰＭＢＣの場合でも、溶解物は全て、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕについて、わずか１０個のＳＫ−ＢＲ−３細胞の場合の溶解物よりも著しく低いシグナルを発した。１０個のＳＫ−ＢＲ−３細胞溶解物では、１，０００，０００個という多量のＰＢＭＣ溶解物が存在する場合でも高いシグナルが得られた。これらの結果は、ヒトＰＢＭＣがこの免疫測定のＨｅｒ−２／ｎｅｕを過剰に発現する少数の乳癌細胞からＨｅｒ−２／ｎｅｕを検出する能力に影響しなかったことを示す。
【００６６】
トラスツズマブ、ビオチン標識抗ヒトＩｇＧ、およびＴＡＧ−ｐＡｂを用いた場合の結果を個々のＰＢＭＣドナーについては表１１〜表１６に示し、全てのドナーの平均については表１７に示す。これらの抗体を用いた溶液に基づく免疫測定を用いた場合、ポリクローナル抗体をＴＡＧ標識およびビオチン標識の両方に用いた場合に得られる結果と非常に類似した結果が得られた。同様に、これらの結果は、用いた全てのドナーＰＢＭＣに関して非常に一貫していた。全てのドナーについて、ＰＭＢＣが１，０００，０００個の場合の溶解物は、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕについてベースラインを越えるシグナルを発しなかったが、対照的に、ＳＫ−ＢＲ−３細胞がわずかに１０個の場合の溶解物からは高いシグナルが得られた。これらの結果は、同様に、ヒトＰＢＭＣが本アプローチのＨｅｒ−２／ｎｅｕを過剰に発現する少数の乳癌細胞からＨｅｒ−２／ｎｅｕを検出する能力に影響しなかったことを示す。
【００６７】
【表４】
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【００６８】
【表５】
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【００６９】
【表６】
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【００７０】
【表７】
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【００７１】
【表８】
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【００７２】
【表９】
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【００７３】
【表１０】
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【００７４】
【表１１】
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【００７５】
【表１２】
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【００７６】
【表１３】
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【００７７】
【表１４】
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【００７８】
【表１５】
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【００７９】
【表１６】
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【００８０】
【表１７】
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