(57)【要約】      （修正有）【課題】微生物由来の新規なヌクレアーゼ若しくは新規なホスファターゼ又はこれらの両者を含む新規なＤＮＡ分解酵素として見出すとともに、当該新規なＤＮＡ分解酵素の製造方法と、この新規なＤＮＡ分解酵素を用いてデオキシヌクレオシド類を製造する方法の提供。【解決手段】ぺニシリウム  ジアストリボラスに属する微生物、その変種又は変異体により産生されたヌクレアーゼおよび／またはホスファターゼを含む新規なＤＮＡ分解酵素の具現化と、これを製造する方法と、当該新規なＤＮＡ分解酵素を、ＤＮＡに反応させることを特徴とするＤＮＡからデオキシヌクレオシドやデオキシヌクレオチドを製造する方法である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ぺニシリウム  ジアストリボラスに属する菌体、その変種又は変異体により産生されたヌクレアーゼおよび／またはホスファターゼであることを特徴とする新規なＤＮＡ分解酵素。
【請求項２】
ぺニシリウム  ジアストリボラスに属する菌体、その変種又は変異体を培養し、その培地よりヌクレアーゼおよび／またははホスファターゼを含む新規なＤＮＡ分解酵素を、抽出若しくは濃縮・回収又は精製するなどの手段により得るようにしたことを特徴とする新規なＤＮＡ分解酵素の製造方法。
【請求項３】
ぺニシリウム  ジアストリボラスに属する菌体、その変種又は変異体により産生されたヌクレアーゼおよび／またはホスファターゼを含む新規なＤＮＡ分解酵素を、ＤＮＡに反応させることを特徴とするＤＮＡからデオキシヌクレオシド類を製造する方法。
【請求項４】
ぺニシリウム  ジアストリボラスに属する菌体、その変種又は変異体の培地抽出液および／または培養液を、ＤＮＡに反応させることを特徴とするＤＮＡからデオキシヌクレオチドを製造する方法。
【請求項５】
ぺニシリウム  ジアストリボラスに属する菌体、その変種又は変異体の培地抽出液又は培養液を熱処理して、ホスファターゼを失活させた後、ＤＮＡに反応させることを特徴とするＤＮＡからデオキシヌクレオチドを製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、微生物由来の新規なヌクレアーゼ若しくは新規なホスファターゼ又はこれらの両者を含む新規なＤＮＡ分解酵素として見出すとともに、当該新規なＤＮＡ分解酵素の製造方法と、この新規なＤＮＡ分解酵素を用いてデオキシヌクレオシド類を製造する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来よりデオキシヌクレオシド類は、遺伝子解析用試薬、アンチセンス医薬等の種々の医薬品原料として用いられている。一般的に、デオキシヌクレオシドは、魚介類精巣から抽出されるＤＮＡをヌクレアーゼで分解してデオキシヌクレオチドとし、ホスファターゼでリン酸基を除くことにより得られることが知られている。
【０００３】
これに対して、近年ＤＮＡ分解酵素を用いてデオキシヌクレオシドを製造する方法が開発された。具体的には、魚類精巣をアルカリ処理することによりＤＮＡを加水分解するなどして抽出し、ヌクレアーゼとホスファターゼを順または同時に酵素処理し、反応液からクロマトグラフィー法にてデオキシヌクレオシドを分離、取得する方法である（特願平１１−５４８０６４号「精巣からのデオキシヌクレオシドの直接製造法」）。
【０００４】
しかし、当該デオキシヌクレオシドの直接製造法は、異種微生物により産生されたヌクレアーゼとホスファターゼなどの精製酵素を用意し、これを利用する方法である。そのために異種微生物を培養し、それからヌクレアーゼやホスファターゼなどの酵素を個別に抽出したり精製したりする必要がある。
【０００５】
具体的には、例えば、ヌクレア−ゼＰ１の一般的な製造法は、ぺニシリウム  シトリナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｉｔｒｉｎｕｍ）をふすま培養し、培地より水抽出等で酵素を抽出した後、これをＵＦ膜、アセトン沈殿、硫酸アンモニウム沈殿等で酵素を濃縮・回収する。そのうえで陰イオン交換クロマトグラフィー等で精製する方法である。また、酸性ホスファターゼの一般的な製造法は、小麦胚芽から抽出した後、ＵＦ膜、アセトン沈殿、硫酸アンモニウム沈殿等で酵素を濃縮・回収する。そのうえで陰イオン交換クロマトグラフィー等で精製する方法である。更に、アルカリホスファターゼの一般的製造法は、アルカリホスファターゼ高生産性大腸菌を培養し、菌体を破砕し、酵素を抽出した後、ＵＦ膜、アセトン沈殿、硫酸アンモニウム沈殿等で酵素を濃縮・回収する。そのうえで陰イオン交換クロマトグラフィー等で精製する方法である。上記のように、ヌクレアーゼやホスファターゼを製造する方法は、その手間が煩雑で大変であり、コスト的に満足できるものではなかった。
【０００６】
また、ヌクレオシドをデオキシ化したり、デオキシヌクレオシドの塩基部分を置き換える等の酵素的製造法（特開平７−１５７４９６号、特開２００１−４６０９７号、特開２００２−１７３９３号、特開２００２−５１７８１号）が報告されている。これらも酵素を菌体内から抽出したり精製するなどの工程が必要であり、その操作が煩雑であった。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
前述のように、近年開発されたＤＮＡ分解酵素を用いてデオキシヌクレオシド類を製造する方法は、いずれもコスト的に高かったり、製造工程が煩雑であったりして、必ずしも満足できるものでなかった。
【０００８】
本発明者は、このような従来技術の課題を解決せんとして高効率でＤＮＡをデオキシヌクレオシドに分解することのできるヌクレア−ゼやホスファターゼを産生する微生物を探索する研究をした。その結果、先ず、微生物の培地抽出液又は培養液をＤＮＡに反応させると高効率でデオキシヌクレオシドが生産されるぺニシリウム  ジアストリボラス（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｇｅａｓｔｒｉｖｏｒｕｓ）に属する微生物を見出し、当該ぺニシリウム属の微生物を単離することに成功した。そこで、この新たに発見されたぺニシリウム属の微生物については、本特許出願人によって独立行政法人産業技術総合総合研究所  特許生物寄託センターに寄託した。
【０００９】
その上で、更に、新たに見出されたぺニシリウム属の微生物の培地抽出液又は培養液を、魚介類精巣、牛胸腺又は微生物菌体から抽出されたＤＮＡに反応させると、デオキシヌクレオシドを得ることが出来ることや、当該微生物（菌）の培地抽出液又は培養液を、加熱処理したうえでＤＮＡに反応させると、簡単にデオキシヌクレオチドを得ることができるなどの新たな技術的知見を得た。
【００１０】
本発明者は、このような新たな技術的知見に基づいて、本件発明を完成した。本件発明の目的は、第１に、一種の微生物により産生される新規なヌクレアーゼ若しくは新規なホスファターゼ又はこれらの両者を含む新規で有効なＤＮＡ分解酵素を提供することであり、第２に、その新規なＤＮＡ分解酵素を製造する方法を開発せんとするものであり、第３は、この新規なＤＮＡ分解酵素を用いてデオキシヌクレオシド類を簡便で且つ安価に製造する方法を具体化することである。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
特許を受けようとする第１発明は、ぺニシリウム  ジアストリボラスに属する菌体、その変種又は変異体により産生されたヌクレアーゼおよび／またはホスファターゼであることを特徴とする新規なＤＮＡ分解酵素である。
【００１２】
本件発明に係る微生物由来の新規なＤＮＡ分解酵素であるヌクレア−ゼやホスファターゼの性質は、次の通りである。
【００１３】
＜粗酵素液中のヌクレア−ゼの理化学的性質＞
至適ｐＨ：  ３．０〜４．０（３７℃で酵素活性測定）
ｐＨ安定性：  ｐＨ６〜７．５で８０％以上活性保持（５０℃で３０分加温後、ｐＨ４、３７℃で酵素活性測定）
至適温度：  ６５〜８０℃（ｐＨ４で酵素活性測定）
温度安定性：  ６０℃以下で９０％以上活性保持（ｐＨ７で３０分加温後、ｐＨ４、３７℃で酵素活性測定）
金属イオン要求性：  亜鉛イオンが必須
基質特異性：  ＲＮＡ（１３）＞一本鎖ＤＮＡ（１）＞二本鎖ＤＮＡ（０．０８）（カッコ内は活性比率）
生成物：  モノデオキシヌクレオチド−５‘−リン酸（５’−ホスホジエステラーゼ活性による）
分子量：  約４４，４００（４４．４ｋＤａ）（ゲル濾過法（ＳｅｐＨａｃｒｙｌ  Ｓ２００）による）
【００１４】
＜ホスファターゼの理化学的性質＞
至適ｐＨ：  ９（３７℃で酵素活性測定）
ｐＨ安定性：  ｐＨ７．５〜８で８０％以上活性保持（５０℃で３０分加温後、３７℃で酵素活性測定）
至適温度：  ４０〜５５℃（ｐＨ９で酵素活性測定）
温度安定性：  ５０℃以下で９０％以上活性保持（ｐＨ７で３０分加温後、ｐＨ９、３７℃で酵素活性測定）
金属イオン要求性：  特に無し
基質特異性：  モノデオキシヌクレオチド−５‘−リン酸、パラニトロフェノールのリン酸基を加水分解
分子量：  試験未実施
【００１５】
本発明に係るヌクレアーゼおよびホスファターゼは、生産菌ぺニシリウム  ジアストリボラスに属する菌体によって産生されるが、それは上記のような理化学的性質を有しているが、このようにして得たＤＮＡ分解酵素の特性を調べたところ、従来のヌクレアーゼやホスファターゼよりも高効率にＤＮＡを分解・精製する特性を有するものであり、微生物由来の新規なヌクレア−ゼや新規なホスファターゼである
【００１６】
また、本件発明の対象となるＤＮＡとは、魚介類精巣だけではなく、牛胸腺又は微生物菌体から抽出されたものでよいことは勿論である。
【００１７】
特許を受けようとする第２発明は、ぺニシリウム  ジアストリボラスに属する菌体、その変種または変異体を培養し、その培地よりヌクレアーゼおよび／またはホスファターゼを含む新規なＤＮＡ分解酵素を、抽出若しくは濃縮・回収又は精製するなどの手段により得るようにしたことを特徴とする新規なＤＮＡ分解酵素の製造方法である。
【００１８】
当該第２発明は、ＤＮＡ分解酵素であるヌクレアーゼおよびホスファターゼの製造方法である。当該ヌクレアーゼおよびホスファターゼは、ぺニシリウム  ジアストリボラスに属する微生物によって生産されるのである。その生産用微生物である菌体は、本発明者が土壌中より新規に単離した菌株である。本菌株について、形態観察及びｒＤＮＡ解析を行った結果、以下の根拠により帰属分類群をペニシリン  ジアストリボラス（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｇｅａｓｔｒｉｖｏｒｕｓ）に属すると同定された。即ち、本菌株の２８ＳｒＤＮＡ（Ｄ１，Ｄ２）塩基配列（５７１ベース）をクエリー配列としてＧｅｎＢａｎｋに対してＢＬＡＳＴ検索を行ったところ、ぺニシリウム  ジアストリポラス（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｇｅａｓｔｒｉｖｏｒｕｓ）の２８ＳｒＤＮＡの当該部分と完全に一致したことにより、当該菌分類群に含まれる可能性が推定された。そこで、本発明者は、本菌株について、工業技術院生命工学工業技術研究所に、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１８９９５として寄託した。尚、本発明に用いることができる微生物は、本菌体とその変種、及び変異体でもよい。
【００１９】
特許を受けようとする第３発明は、ぺニシリウム  ジアストリボラスに属する菌体、その変種又は変異体により産生されたヌクレアーゼおよび／またはホスファターゼを含む新規なＤＮＡ分解酵素を、ＤＮＡに反応させることを特徴とするＤＮＡからデオキシヌクレオシド類を製造する方法である。
【００２０】
当該第３発明は、発明者が単離したぺニシリウム  ジアストリボラスに属する単一微生物が産生する新規なヌクレアーゼや新規なホスファターゼなる酵素を用いてＤＮＡからデオキシヌクレオシド類を製造する方法である。本発明に係る新規なＤＮＡ分解酵素を用いたデオキシヌクレオシド類の製造法は、従来の異種微生物が産生したヌクレアーゼやホスファターゼを用いた場合より高効率に製造することが出来た。
【００２１】
特許を受けようとする第４発明は、ぺニシリウム  ジアストリボラスに属する菌体、その変種又は変異体の培地抽出液および／または培養液を、ＤＮＡに反応させることを特徴とするＤＮＡからデオキシヌクレオシドを製造する方法である。
【００２２】
当該第４発明は、ぺニシリウム  ジアストリボラスに属する微生物の培地抽出液または培養液を直接ＤＮＡに反応させるだけで、簡単にＤＮＡからデオキシヌクレオシドを製造する方法である。
【００２３】
ぺニシリウム  ジアストリボラスに属する微生物の培養方法には、固体培養、液体培養などがある。固体培地を使用する場合、水抽出、熱水抽出、界面活性剤による抽出等により培地抽出液が得られる。液体培養の場合には、遠心分離、ろ過等により培養液を得ることが出来る。この培地抽出液又は培養液をそのまま酵素溶液として使用しても良いし、ＵＦ膜、硫安沈殿、陰イオン交換樹脂等により濃縮・回収したものを酵素溶液として使用しても良い。このように回収した酵素溶液を、微生物や牛胸腺や魚介類精巣から酸、アルカリ、界面活性剤、プロテアーゼ等により抽出したＤＮＡに作用させると、デオキシヌクレオシドが生成され、公知の技術により４種のデオキシヌクレオシドに分離することにより、デオキシヌクレオシドが得られる。
【００２４】
特許を受けようとする第５発明は、ぺニシリウム  ジアストリボラスに属する菌体、その変種又は変異体の培地抽出液又は培養液を熱処理してホスファターゼを失活させた後、ＤＮＡに反応させることを特徴とするＤＮＡからデオキシヌクレオチドを製造する方法である。
【００２５】
第５発明は、ぺニシリウム  ジアストリボラスに属する微生物の培地抽出液または培養液を直接ＤＮＡに反応させるだけで、ＤＮＡからデオキシヌクレオチドを製造する方法である。
【００２６】
本発明は、前記第４発明と同様に、ぺニシリウム  ジアストリボラスに属する微生物を固体培養または液体培養するが、固体培養をした場合、水抽出、熱水抽出、界面活性剤による抽出等により培地抽出液が得られるのに対し、液体培養した場合は、遠心分離、ろ過等により培養液を得ることが出来る。この培地抽出液又は培養液をそのまま酵素溶液として使用しても良いが、ＵＦ膜、硫安沈殿、陰イオン交換樹脂等により濃縮・回収したものを酵素溶液として使用しても良い。本発明は、このようにして得た酵素溶液を６０〜８０℃で熱処理することによりホスファターゼを失活させ、微生物、牛胸腺または魚介類精巣から酸、アルカリ、界面活性剤、プロテアーゼ等により抽出したＤＮＡに作用させるとデオキシヌクレオチドが生成され、公知の技術により４種類のデオキシヌクレオチドに分離することにより、デオキシヌクレオチドを単離して得られる。
【００２７】
【実施例】
以下本件発明を実施例に基づいて詳細に説明する。
先ず、本件発明に係るペニシリウム  ジアストリボラス（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｇｅａｓｔｒｉｖｏｒｕｓ）に属する微生物の培養方法について具体的に述べる。
【００２８】
前培養：  グルコース、ペプトン、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシウムを組成物とする平地培地（ｐＨ６．５）に白金耳で菌を接種し、２５℃で５〜８日間静置培養する。
【００２９】
固体培養：  三角フラスコに入ったふすま培地（小麦ふすま：水（バッファー）＝７：４）に平板培地に形成された分生子を接種する。ふすま培地１０ｇに対し、平板培地１ｃｍ２分を接種する。２５℃で５〜８日間静置培養する。ふすま培地が１００ｇ以下であればこの方法でよいが、１００ｇより多い場合は、１００ｇに対しふすま培養物を約１５ｇ接種する。
【００３０】
液体培養：  グルコース、ペプトン、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシウムを組成物とする液体培地（ｐＨ６．５）１００ｍｌを５００ｍｌ容坂口フラスコに入れ、滅菌する。そこに平地培地に形成された分生子を接種する（１ｃｍ２）。２５℃で３〜５日間培養する。同培地のグルコースの替わりに１０％（ｗ／ｖ）の小麦ふすまを添加しても良い。
【００３１】
＜実施例１＞  デオキシヌクレオシドの製造法
ペニシリウム  ジアストリボラス（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｇｅａｓｔｒｉｖｏｒｕｓ）に属する微生物を１００ｇのふすま培地（ふすま：水＝７：４）に接種し、２５℃で６日間培養した。その培地より水抽出により酵素溶液５００ｍｌを得た。当該酵素溶液５００ｍｌ、鮭精巣から酸及びアルカリで抽出したＤＮＡ２ｇ、バッファー（ｐＨ４．５）、０．３ｍＭ亜鉛を混合して２リットルとし、５０℃で３時間加熱した。その結果、０．７ｇのデオキシヌクレオシドが得られた。
【００３２】
＜実施例２＞  デオキシヌクレオチドの製造法
ペニシリウム  ジアストリボラス（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｇｅａｓｔｒｉｖｏｒｕｓ）に属する微生物（菌体）を１００ｇのふすま培地（ふすま：水＝７：４）に接種し、２５℃で６日間培養した。その培地より水抽出により酵素溶液５００ｍｌを得た。当該酵素溶液に最終１ｍＭの亜鉛を添加し、６５℃で１時間熱した。ＵＦ膜で４倍に濃縮した酵素溶液５００ｍｌ、鮭精巣から酸及びアルカリで抽出したＤＮＡ２ｇ、バッファー（ｐＨ４．５）、０．３ｍＭ亜鉛イオンを混合して２リットルとし、５０℃で３時間加熱した。その結果、１．１ｇのデオキシヌクレオチドが得られた。