【手続補正書】
【提出日】平成23年12月13日(2011.12.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３１】
好ましい態様において、顕微鏡対物レンズ１４０は開口数を有する。本明細書において用いる場合、「高開口数のレンズ」には、開口数が０．６に等しい又はそれより大きいレンズが含まれる。開口数は、対物レンズによって捕捉される高度に回折された像形成光の数の尺度である。開口数が高いほど、傾きのより大きい光線が対物レンズに入ることが可能になり、それによって、より解像度の高い像が形成される。像の輝度もまた、開口数が高くなるにつれて増加する。高開口数のレンズは様々な製造業者から商業的に入手可能であり、開口数が約０．６に等しい又はそれより大きいレンズであれば分析器システムに用いることができる。いくつかの態様において、レンズは約０．６〜約１．３の開口数を有する。いくつかの態様において、レンズは約０．６〜約１．０の開口数を有する。いくつかの態様において、レンズは約０．７〜約１．２の開口数を有する。いくつかの態様において、レンズは約０．７〜約１．０の開口数を有する。いくつかの態様において、レンズは約０．７〜約０．９の開口数を有する。いくつかの態様において、レンズは約０．８〜約１．３の開口数を有する。いくつかの態様において、レンズは約０．８〜約１．２の開口数を有する。いくつかの態様において、レンズは約０．８〜約１．０の開口数を有する。いくつかの態様において、レンズは少なくとも約０．６の開口数を有する。いくつかの態様において、レンズは少なくとも約０．７の開口数を有する。いくつかの態様において、レンズは少なくとも約０．８の開口数を有する。いくつかの態様において、レンズは少なくとも約０．９の開口数を有する。いくつかの態様において、レンズは少なくとも約１．０の開口数を有する。いくつかの態様において、顕微鏡対物レンズ１４０の開口数は約１．２５である。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３４】
単一分子分析器システム１００において、インタロゲーション・スペースがラベリングされた単一分子を通過する際に、インタロゲーション・スペースに向けられる電磁放射線源のビーム１２６は、ラベルを励起状態にする。粒子がその励起状態から緩和すると、検出可能な光の爆発が放射される。インタロゲーション・スペースが粒子を通過するのに要する長さの時間において、各粒子によって励起−放射サイクルが何度も繰り返される。これにより、インタロゲーション・スペースが粒子を通過する際に、分析器システム１００は各粒子に対して数十〜数千の光子を検出し得る。蛍光性粒子によって放出される光子は、インタロゲーション・スペースがラベリングされた粒子を通過する時間を表す時間遅延と共に検出器１８４によって記録される。光子の強度は検出器１８４によって記録され、サンプリング時間はビン（ｂｉｎ）へと分割され、ビンは、自由に選択可能な時間チャンネル幅を有する均一で任意の時間セグメントである。各ビンに含まれる信号の数が評価される。様々な統計分析方法の一つ又はそれより多くが、粒子が存在する場合を決定するために用いられる。これらの方法には、検出器からの偽陽性信号を軽減するための、分析器システムのベースラインノイズの測定、およびベースラインノイズより大きい統計的レベルにおける蛍光ラベルの信号強度の測定が含まれる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５１】
いくつかの態様において、走査レンズ（図１Ａおよび１Ｂに示す１３０）は、走査光路を対物レンズの瞳（ｐｕｐｉｌ）へと向け直し得る。走査レンズは、走査鏡における光軸の像の焦点を対物レンズの射出瞳に合わせる。走査レンズは、走査鏡と顕微鏡対物レンズとの間の距離に関わらず、走査ビームを対物レンズに集中させたままであることを確保し、従って、走査ビームの像および光収集効率が改良される。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５６】
［４．試料プレート］
本明細書に記載の発明のいくつかの態様において、件の単一分子に関して検出される試料を保持するための試料プレート１７０が使用される。いくつかの態様において、試料プレートはマイクロタイタープレートである。マイクロタイタープレートは、基部１７２および上面１７４からなる。いくつかの態様において、マイクロタイタープレートの上面１７４は、件の試料を入れるための少なくとも一つのウェルを有する。いくつかの態様において、マイクロタイタープレートは、複数の試料を入れるための複数のウェルを有する。本明細書に記載のシステムは十分に高感度であるので、小さい試料寸法のみが必要とされる。いくつかの態様において、試料は約１００μｌより小さい寸法であり得る。いくつかの態様において、試料は約１０μｌより小さい寸法であり得る。いくつかの態様において、試料は約１μｌより小さい寸法であり得る。いくつかの態様において、試料は約０．１μｌより小さい寸法であり得る。いくつかの態様において、試料は約０．００１μｌより小さい寸法であり得る。いくつかの態様において、マイクロタイタープレートは微細加工技術を用いて作製されるものであり得る。いくつかの態様において、プレートの上面は平坦であり得る。試料は、試料が試料自体の表面張力によって内蔵（または収容）されるように大きさが決められ得る。そのような態様において、試料はプレート表面において滴を形成する。いくつかの態様において、試料はその後、件の分子に関して走査され得る。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６５】
いくつかの態様において、分析器システムは少なくとも一つの検出器を有し得る。他の態様において、分析器システムは少なくとも二つの検出器を有し得、各検出器は、特定の波長範囲の光エネルギーを検出するように選択および構成され得る。例えば、二つの別々の検出器は、ＥＭ源による励起において異なるスペクトルのエネルギーを有する光子を放出する異なるラベルで標識された粒子を検出するのに使用され得る。一の態様において、分析器システムは、緑色色素（例えばＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６）によって放射される蛍光エネルギー等の、４５０〜７００ｎｍの範囲の蛍光エネルギーを検出し得る第１検出器、および遠赤色色素（例えばＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７）によって放射される蛍光エネルギー等の、６２０〜７８０ｎｍの範囲の蛍光エネルギーを検出し得る第２検出器を有し得る。他の態様において、青色色素（例えばＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２）によって放射される蛍光エネルギー等の、４００〜６００ｎｍの範囲の蛍光エネルギーを検出し、かつ赤色色素（例えばＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６およびＣｙ３）によって放射されるエネルギー等の、５６０〜７００ｎｍの範囲のエネルギーを検出する検出器が用いられる。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８０】
現在、その同調調節または非調和（ｄｉｓｃｏｒｄａｎｔ）調節が臨床的に注目されている１００を超えるサイトカイン／ケモカインが存在する。特定の疾患の経過をサイトカインレベルの変化と関連付けるために、理想的なアプローチは、試料を、所定のサイトカインまたは複数のサイトカインに対して高感度で分析することを必要とする。現在マーカーパネルに用いられており、かつ本発明の方法および組成物に使用され得る例示的サイトカインには以下のものが含まれるが、それらに限定されるものではない。ＢＤＮＦ、ＣＲＥＢ  ｐＳ１３３、ＣＲＥＢ  Ｔｏｔａｌ、ＤＲ−５、ＥＧＦ、ＥＮＡ−７８、エオタキシン、脂肪酸結合タンパク質、塩基性ＦＧＦ、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、ＧＣＰ−２、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子ＧＭ−ＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）、成長関連癌遺伝子ケラチノサイト（ＧＲＯ−ＫＣ）、ＨＧＦ、ＩＣＡＭ−１、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、インターロイキンＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−１２ｐ４０／ｐ７０、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−１ｒａ／ＩＬ−１Ｆ３、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、インターフェロン誘導性タンパク質（１０  ＩＰ−１０）、ＪＥ／ＭＣＰ−１、ケラチノサイト（ＫＣ）、ＫＣ／ＧＲＯａ、ＬＩＦ、リンホタクチン、Ｍ−ＣＳＦ、単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）、ＭＣＰ−１（ＭＣＡＦ）、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−５、ＭＤＣ、ＭＩＧ、マクロファージ炎症（ＭＩＰ−１α）、ＭＩＰ−１β、ＭＩＰ−１γ、ＭＩＰ−２、ＭＩＰ−３β、ＯＳＭ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、活性化に応じて調節され、発現および分泌された正常Ｔ細胞（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｕｐｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，ｎｏｒｍａｌ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ａｎｄ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ）（ＲＡＮＴＥＳ）、Ｒｂ（ｐＴ８２１）、Ｒｂ（ｔｏｔａｌ）、Ｒｂ  ｐＳｐＴ２４９／２５２、タウ（ｐＳ２１４）、タウ（ｐＳ３９６）、タウ（ｔｏｔａｌ）、組織因子、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、ＴＮＦ−β、ＴＮＦ−ＲＩ、ＴＮＦ−ＲＩＩ、ＶＣＡＭ−１およびＶＥＧＦ。いくつかの態様において、サイトカインはＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−１０、ＩＬ−１α、ＩＬ−３、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−１２、ＩＬ−６、ＩＬ−４、ＩＬ−１８、ＩＬ−１０、ＩＬ−５、エオタキシン、ＩＬ−１６、ＭＩＧ、ＩＬ−８、ＩＬ−１７、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−１３、ＩＬ−２Ｒ（可溶性）、ＩＬ−２、ＬＩＦ／ＨＩＬＤＡ、ＩＬ−１β、Ｆａｓ／ＣＤ９５／Ａｐｏ−１およびＭＣＰ−１である。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９１】
［生物学的状態のマーカー］
マーカーは、件の特定の表現型の状態の存在を示し得る。表現型の状態の例として、１種類の生物または生物の綱もしくは亜綱の環境変化、薬物治療、遺伝子操作もしくは遺伝子変異、損傷、食物の変化、老化、または他の何らかの特性によって生じる表現型が挙げられる。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９２】
いくつかの態様において、件の表現型の状態は、臨床学的に診断された疾患の状態である。そのような疾患の状態には、例えば、癌、循環器疾患、炎症性疾患、自己免疫疾患、神経系疾患、感染症および妊娠関連障害が含まれる。別法として、健康状態はマーカーを用いて検出され得る。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９４】
循環器疾患は本発明の他の応用に含まれ得る。本発明における循環器疾患の例として以下のものが挙げられるが、これらに限定されない。鬱血性心不全、高血圧、不整脈、アテローム性動脈硬化症、コレステロール、ウォルフ・パーキンソン・ホワイト症候群、ＱＴ延長症候群、狭心症、頻脈、徐脈、心房細動、心室細動、心筋虚血、心筋梗塞、心タンポナーデ、心筋炎、心膜炎、不整脈原性右室異形成、肥大型心筋症、ウィリアムズ症候群、心臓弁膜症、心内膜炎、細菌性疾患、肺動脈閉鎖、大動脈弁狭窄、レイノー病、コレステロール塞栓症、ワレンベルグ症候群、ヒッペル・リンダウ病および毛細血管拡張症。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９５】
炎症性疾患および自己免疫疾患は本発明の他の態様に含まれ得る。炎症性疾患および自己免疫疾患の例として以下のものが挙げられるが、これらに限定されない。関節リウマチ、非特異的関節炎、喉頭の炎症性疾患、炎症性腸疾患、乾癬、甲状腺機能低下（例えば橋本病甲状腺炎）、大腸炎、１型糖尿病、骨盤内炎症性疾患、中枢神経系の炎症性疾患、側頭動脈炎、リウマチ性多発筋痛、強直性脊椎炎、結節性多発動脈炎、ライター症候群、強皮症、全身性紅斑性狼瘡およびエリテマトーデス。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０１】
いくつかの態様において、本発明はマーカーを検出するためのラベルを提供し、ラベルは、マーカーに対する結合パートナーおよび蛍光部分を有し、蛍光部分は、蛍光部分の励起波長で光を放射するレーザーによって刺激される場合に少なくとも約２００個の光子を放出することができ、レーザーは、蛍光部分を含む直径が約５ミクロン以上のスポットに焦点が合わされ、レーザーによってスポットに向けられる全エネルギーは約３マイクロジュール以下である。いくつかの態様において、蛍光部分は蛍光分子を有する。いくつかの態様において、蛍光部分は複数の蛍光分子、例えば、約２〜１０、２〜８、２〜６、２〜４、３〜１０、３〜８または３〜６の蛍光分子を有する。いくつかの態様において、ラベルは、約２〜４の蛍光分子を有する。いくつかの態様において、蛍光色素分子は、少なくとも一つの置換インドリウム環系を有し、その置換インドリウム環系において、インドリウム環の３位の炭素における置換基は化学反応性基または共役物質を有する。いくつかの態様において、蛍光分子は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０またはＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７００からなる群から選択される。いくつかの態様において、蛍光分子は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０またはＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７００からなる群から選択される。いくつかの態様において、蛍光分子はＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７分子である。いくつかの態様において、結合パートナーには抗体が含まれる。いくつかの態様において、抗体はモノクローナル抗体である。他の態様において、抗体はポリクローナル抗体である。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２１】
［１．抗体］
いくつかの態様において、結合パートナーは、検出すべき分子に対して特異的な抗体である。用語「抗体」は、本明細書において用いる場合、広い意味を有する用語であり、その通常の意味で用いられ、その意味には、自然に存在する抗体および自然に存在しない抗体を指すことが含まれるがそれに限定されず、その抗体には、例えば、１本鎖抗体、キメラ抗体、二機能性抗体およびヒト化抗体、並びにそれらの抗原結合フラグメントが含まれる。抗体が引き寄せられる（または結合する）分子の領域またはエピトープの選択により、例えば分子が存在する場合にその分子の様々な形態に対して、または全体（例えば、全ての分子または実質的に全ての分子）に対してその特異性が決定されることが理解されるだろう。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２５】
いくつかの態様において、様々な種と交差反応する抗体を、捕捉抗体、検出抗体、またはその両方として用いることが有用である。そのような態様には、例えば心臓障害のマーカーとして血中に放出される心筋トロポニンを測定することによる、薬物毒性の測定が含まれる。交差反応抗体によって、一の種、例えばヒト以外の種において毒性の研究を行うこと、および、分析試薬中の同じ抗体または抗体ペアを用いてその結果を他の種、例えばヒトの研究または臨床的観察に直接応用すること、従って分析間のばらつきを減少させることが可能となる。従って、いくつかの態様において、件の分子（例えば心筋トロポニンＩ等の心筋トロポニン）のマーカーに対する結合パートナーとして使用するための一またはそれより多くの抗体は、交差反応抗体であり得る。いくつかの態様において、抗体は、ヒト、サル、イヌおよびネズミからなる群から選択される少なくとも二つの種からのマーカー（例えば心筋トロポニン）と交差反応する。いくつかの態様において、抗体は、ヒト、サル、イヌおよびネズミからなる群全体からのマーカー（例えば心筋トロポニン）と交差反応する。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２７】
「蛍光部分」は、この用語が本明細書において用いられる場合、一またはそれより多くの蛍光性要素を含有し、その蛍光の総量は、その蛍光部分を本明細書に記載の単一分子検出器において検出し得るようなものである。従って、蛍光部分は単一の要素（例えば量子ドットまたは蛍光分子）または複数の要素（例えば複数の蛍光分子）を含有し得る。「部分」が、この用語が本明細書において用いられる際に、蛍光性要素の群（例えば複数の蛍光色素分子）を指す場合、個々の要素が結合パートナーに対して別々に結合し得、または、群としての要素が検出するのに十分な蛍光を与える限りにおいては、それらの要素が一緒に結合し得ることが理解されるだろう。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３２】
いくつかの態様において、蛍光部分は平均で少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の蛍光性要素、例えば蛍光分子を有する。いくつかの態様において、蛍光部分は平均で約２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１１以下の蛍光性要素、例えば蛍光分子を有する。いくつかの態様において、蛍光部分は平均で約１〜１１、または約２〜１０、または約２〜８、または約２〜６、または約２〜５、または約２〜４、または約３〜１０、または約３〜８、または約３〜６、または約３〜５、または約４〜１０、または約４〜８、または約４〜６、または約２、３、４、５、６、または約６より多くの蛍光性要素を有する。いくつかの態様において、蛍光部分は、平均で約２〜８の結合された蛍光部分を含む。いくつかの態様において、蛍光部分は平均で約２〜６の蛍光性要素を有する。いくつかの態様において、蛍光部分は平均で約２〜４の蛍光性要素を有する。いくつかの態様において、蛍光部分は平均で約３〜１０の蛍光性要素を有する。いくつかの態様において、蛍光部分は平均で約３〜８の蛍光性要素を有する。いくつかの態様において、蛍光部分は平均で約３〜６の蛍光性要素を含む。「平均」は、本発明のラベル群を代表する任意の試料であって、試料が複数の結合パートナー−蛍光部分ユニットを含有する試料において、標準的な分析方法によって測定された、結合パートナーに対する特定の蛍光性要素のモル比が、規定の数または数の範囲に一致することを意味する。例えば、ラベルが、結合パートナー（即ち抗体）および特定の吸光度を有する複数の蛍光色素分子を含有する蛍光部分を含む態様において、分光光度分析が用いられ得、この分光光度分析において、ラベル溶液が適切なレベルに希釈され、タンパク質（抗体）のモル濃度を決定するために２８０ｎｍにおける吸光度が取得され、蛍光色素分子のモル濃度を決定するために、例えば６５０ｎｍ（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７の場合）における吸光度が取得される。前者に対する後者のモル濃度比は、各抗体に結合された蛍光部分における蛍光性要素（色素分子）の平均数を表す。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４０】
［２．量子ドット］
いくつかの態様において、本発明の分析器システムを用いて試料中の分子を検出するのに用いられる蛍光ラベル部分は量子ドットである。量子ドット（ＱＤ）は、半導体ナノ結晶または人工原子としても知られており、１００〜１，０００の電子および２〜１０ｎｍの範囲を有する半導体結晶である。いくつかのＱＤは直径が１０〜２０ｎｍであり得る。ＱＤは高い量子収率を有し、それにより、ＱＤは光学的用途に対して特に有用である。ＱＤは、励起子を形成することによって蛍光を発するフルオロフォアであり、このフルオロフォアは、従来のフルオロフォアの励起状態と似ているが、２００ナノ秒までのより一層長い寿命を有する。この特徴により、ＱＤに低い光退色性が与えられる。ＱＤのエネルギー準位は、ＱＤの寸法および形状、並びにＱＤのポテンシャルの深さを変化させることによって制御し得る。小さい励起子ＱＤの一の光学的特徴は着色性であり、これはドットの寸法によって決まる。ドットが大きいほど、蛍光は赤くなり、またはスペクトルの赤色端へ更に向かう。ドットが小さいほど、蛍光は青くなり、またはスペクトルの青色端へ更に向かう。発生する蛍光のエネルギー、従って色を決定するバンドギャップエネルギーは、ＱＤ寸法の２乗に反比例する。ＱＤが大きいほど、より間隔の狭いより高いエネルギー準位を有し、従って、ＱＤが、より小さいエネルギーを有する光子、即ち、スペクトルの赤色端により近い光子を吸収することが可能となる。ドットの放射振動数がバンドギャップに依存するので、ドットの出力波長を非常に正確に制御し得る。いくつかの態様において、単一分子分析器システムによって検出されるタンパク質は、ＱＤによってラベリングされる。いくつかの態様において、単一分子分析器は、一つのＱＤによってラベリングされたタンパク質を検出するのに用いられ、フィルターを用いることにより、異なるタンパク質を異なる波長で検出することが可能となる。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４５】
免疫測定において、同じ分子（例えばマーカー）に対する結合パートナーのペア（例えば抗体）が用いられるサンドウィッチ型構成がしばしば採用されることが理解されるだろう。本発明は、結合パートナーのペア、例えば抗体であって、両方の抗体が同じ分子、例えば同じマーカーに対して特異的であり、そのペアの少なくとも一方の構成要素が本明細書に記載のラベルであるペアも包含する。従って、結合パートナーおよび蛍光部分を有するいずれのラベルに関しても、本発明は、結合パートナーのペアであって、第１結合パートナー（例えば抗体）がラベルの一部であり、第２結合パートナー（例えば抗体）が通常ラベリングされておらず、捕捉結合パートナーとして機能するペアも包含する。更に、結合パートナーのペアは、ＦＲＥＴ分析において頻繁に用いられる。本発明において有用なＦＲＥＴ分析は、米国特許出願第１１／０４８，６６０号に開示されており、これは、その全体を引用することにより本明細書に組み込まれる。本発明は、結合パートナーペアであって、その各々がＦＲＥＴラベルを有する結合パートナーペアも包含する。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５３】
いくつかの態様において、不均一分析形式が用いられ、非結合ラベルを取り除くための工程が通常採用される。そのような分析形式は、当該技術分野においてよく知られている。一の特に有用な分析形式は、サンドウィッチ分析、例えばサンドウィッチ免疫測定である。この形式において、件の分子、例えば生物学的状態のマーカーは、捕捉結合パートナーを用いて、例えば固体支持物において捕捉される。望ましくない分子および他の物質は、その後、場合により洗い流され、次いで検出結合パートナーおよび検出可能ラベル、例えば蛍光部分を含むラベルと結合する。更に洗浄して非結合ラベルを除去し、その後、検出可能なラベルが放出されるが、通常は検出結合パートナーと未だ結合しているとは限らない。別の態様において、試料およびラベルは、間に洗浄されることなく、例えば同時に捕捉結合パートナーに加えられる。他の変形は当業者に明らかであるだろう。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５５】
捕捉結合パートナーは、固体支持物、例えばマイクロタイタープレートまたは常磁性ビーズに結合され得る。いくつかの態様において、本発明は、常磁性ビーズに結合された、件の分子（例えば生物学的状態のマーカー）に対する結合パートナーを提供する。捕捉することが望まれる分子に対して特異的ないずれの適切な結合パートナーも用いることができる。結合パートナーは、抗体、例えばモノクローナル抗体であり得る。抗体の製造および製造元は、本明細書の他の場所に記載されている。捕捉抗体と同じくらい有用であると本明細書において認められる抗体は、検出抗体としても有用であり得、逆もまた同様であることが理解されるだろう。
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５８】
固体支持物に対する抗体の配向性結合に関する例示的プロトコルは以下の通りである。ＩｇＧを０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）に、最終濃度が１ｍｇ／ｍｌになるまで溶解させる。等体積の氷冷した０．１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）中の２０ｍＭ過ヨウ素酸ナトリウムを加える。ＩｇＧを１／２時間氷上で酸化させる。過剰なヨウ素酸化物試薬を、体積０．１５の１Ｍグリセロールを加えることによって急冷する。酸化反応の低分子量の副生成物を限外ろ過によって取り除く。酸化されたＩｇＧフラクションを適切な濃度（通常は０．５ｍｇ／ｍｌ  ＩｇＧ）に希釈し、ヒドラジドで活性化されたマルチウェルプレートと室温で少なくとも２時間反応させる。マルチウェルプレートをホウ酸緩衝生理食塩水または他の適切な緩衝液で洗浄することによって、非結合ＩｇＧを取り除く。プレートは、所望であれば保管のために乾燥させ得る。マイクロビーズの材料がそのような結合に適している場合、抗体をマイクロビーズに結合させるために同様のプロトコルに従い得る。
【手続補正２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６３】
件の分子を測定するのに用いられる捕捉および信号抗体を含む、いくつかの免疫測定の診断試薬は、動物の血清から得ることができる（または動物の血清に由来し得る）。他の種の免疫グロブリンと結合する能力を有する内因性ヒト異好性抗体またはヒト抗動物抗体は、１０％より多くの患者の血清または血漿中に存在する。これらの循環する異好性抗体は、免疫測定の計測を妨げ得る。サンドウィッチ免疫測定において、これらの異好性抗体は（診断用）捕捉および検出抗体を架橋し得、それによって偽陽性信号が発生し、あるいはこれらの異好性抗体は診断用抗体の結合を妨げ得、それによって偽陰性信号が発生する。競合的免疫測定において、異好性抗体は分析に関わる抗体と結合し得、その抗体の件の分子との結合を妨げ得る。特に抗種（ａｎｔｉｓｐｅｃｉｅｓ）抗体が分離システムにおいて用いられる場合、これらは、遊離している件の分子からの抗体−件の分子錯体の分離も阻害または増加し得る。従って、これらの異好性抗体の妨害の影響力は予測困難であり、異好性抗体の結合を阻害することが好都合であり得る。本発明のいくつかの態様において、免疫測定は、一つ又はそれより多くの異好性抗体ブロッカーを用いて試料中の異好性抗体を激減させる工程を含む。免疫測定において試験すべき試料から異好性抗体を取り除く方法は公知であり、以下のものを含む：酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）中の試料を９０℃で１５分間加熱し、１２００ｇで１０分間遠心分離すること；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いて異好性免疫グロブリンを沈殿させること；タンパク質Ａもしくはタンパク質Ｇを用いて試料から妨害異好性免疫グロブリンを免疫抽出（ｉｍｍｕｎｏｅｘｔｒａｃｔ）すること；または非免疫マウスＩｇＧを加えること。本発明の方法の態様は、単一分子検出器で分析する前に試料を調製することを意図している。前処理の方法の妥当性が決定され得る。異好性抗体によって引き起こされる免疫測定の妨害を最小にするための生化学物質が市販されている。例えば、ＭＡＫ３３と呼ばれる製品（これはｈ−ＣＫ−ＭＭに対するＩｇＧ１モノクローナル抗体である）は、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍから入手できる。ＭＡＫ３３プラス製品は、ＩｇＧ１とＩｇＧ１−Ｆａｂとの組み合わせを含有する。ｐｏｌｙＭＡＫ３３はＩｇＧ１と共に重合されたＩｇＧ１−Ｆａｂを含有し、ｐｏｌｙＭＡＣ  ２ｂ／２ａはＩｇＧ２ｂと共に重合されたＩｇＧ２ａ−Ｆａｂを含有する。Ｂｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ  Ｉｎｃ．（ニューヨーク州イーストメドウ）は、免疫グロブリン抑制試薬として知られている異好性抗体を無効にするための生化学物質の二次的な商業的供給源を市販している。この製品は、複数の種（主にＢａｌｂ／ｃマウスからのマウスＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ３）の免疫グロブリン（ＩｇＧおよびＩｇＭ）の調製品である。いくつかの態様において、異好性抗体は、当該技術分野において公知の方法（例えば、妨害する抗体をタンパク質Ａまたはタンパク質Ｇと結合させることによって試料中の異好性抗体を激減させる方法）を用いて試料から免疫抽出され得る。いくつかの態様において、異好性抗体は、一つ又はそれより多くの異好性抗体ブロッカーを用いて無効化され得る。異好性ブロッカーは、抗アイソタイプ異好性抗体ブロッカー、抗イディオタイプ異好性抗体ブロッカー、および抗抗イディオタイプ異好性抗体ブロッカーからなる群から選択され得る。いくつかの態様において、異好性抗体ブロッカーの組み合わせが使用され得る。
【手続補正２２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６６】
もう一つの態様において、固相結合分析は、競合的結合分析であり得る。一のそのような方法は以下の通りである。まず、結合表面上に固定化された捕捉抗体を、ｉ）試料中の件の分子、例えば生物学的状態のマーカー、およびｉｉ）検出可能なラベルを有する分子のラベリングされた類似物（検出試薬）によって競合的に結合させる。次に、単一分子分析器を用いてラベルの量を測定する。もう一つのそのような方法は以下の通りである。まず、検出可能なラベルを有する抗体（検出試薬）を、ｉ）試料中の件の分子、例えば生物学的状態のマーカー、およびｉｉ）結合表面上で固定化された分子の類似物（捕捉試薬）と競合的に結合させる。次に、単一分子分析器において用いられるラベルの量を測定する。本明細書において、「分子の類似物」は、捕捉抗体と結合する分子と競合する種を指す。競合的免疫測定の例は、米国特許第４，２３５，６０１号（Ｄｅｕｔｓｃｈら）、米国特許第４，４４２，２０４号（Ｌｉｏｔｔａ）、および米国特許第５，２０８，５３５号（Ｂｕｅｃｈｌｅｒら）に開示されており、それらの全ては、引用することによって本明細書に組み込まれる。
【手続補正２３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７０】
いくつかの態様において、本発明の方法で用いられる単一分子検出器において、試料プレート、試料が入っている試料プレートに向けられる連続波レーザー、インタロゲーション・スペースが試料を通って移動させられる際に試料から放射される光を集光する高開口数の顕微鏡対物レンズ（レンズは少なくとも約０．８の開口数を有する）、インタロゲーション・スペースから放射される放射線を検出するためのアヴァランシェ・フォトダイオード検出器、および試料を通ってインタロゲーション・スペースを移動させるための可動鏡を備えた走査モーターが使用され、インタロゲーション・スペースは約１μｍ３〜約１００００μｍ３である。いくつかの態様において、本発明の方法で用いられる単一分子検出器において、試料プレート、試料中に設けられるインタロゲーション・スペースに向けられる連続波レーザー、インタロゲーション・スペースが試料を通って移動させられる際に試料から放射される光を集光する高開口数の顕微鏡対物レンズ（レンズは少なくとも約０．８の開口数を有する）、インタロゲーション・スペースから放射される放射線を検出するためのアヴァランシェ・フォトダイオード検出器、および試料を通ってインタロゲーション・スペースを移動させるための走査モーターが使用され、インタロゲーション・スペースは約１μｍ３〜約１０００μｍ３である。いくつかの態様において、本発明の方法で用いられる単一分子検出器において、試料プレート、試料中に設けられるインタロゲーション・スペースに向けられる連続波レーザー、インタロゲーション・スペースが試料を通って移動させられる際に試料から放射される光を集光する高開口数の顕微鏡対物レンズ（レンズは少なくとも約０．８の開口数を有する）、インタロゲーション・スペースから放射される放射線を検出するためのアヴァランシェ・フォトダイオード検出器、および試料を通ってインタロゲーション・スペースを移動させるための走査モーターが使用され、インタロゲーション・スペースは約１μｍ３〜約１００μｍ３である。いくつかの態様において、本発明の方法で用いられる単一分子検出器において、試料プレート、試料中に設けられるインタロゲーション・スペースに向けられる連続波レーザー、インタロゲーション・スペースが試料を通って移動させられる際に試料から放射される光を集光する高開口数の顕微鏡対物レンズ（レンズは少なくとも約０．８の開口数を有する）、インタロゲーション・スペースから放射される放射線を検出するためのアヴァランシェ・フォトダイオード検出器、および試料を通ってインタロゲーション・スペースを移動させるための走査モーターが使用され、インタロゲーション・スペースは約１μｍ３〜約１０μｍ３である。いくつかの態様において、本発明の方法で用いられる単一分子検出器において、試料プレート、試料中に設けられるインタロゲーション・スペースに向けられる連続波レーザー、インタロゲーション・スペースが試料を通って移動させられる際に試料から放射される光を集光する高開口数の顕微鏡対物レンズ（レンズは少なくとも約０．８の開口数を有する）、インタロゲーション・スペースから放射される放射線を検出するためのアヴァランシェ・フォトダイ��ード検出器、および試料を通ってインタロゲーション・スペースを移動させるための走査モーターが使用され、インタロゲーション・スペースは約２μｍ３〜約１０μｍ３である。いくつかの態様において、本発明の方法で用いられる単一分子検出器において、試料プレート、試料中に設けられるインタロゲーション・スペースに向けられる連続波レーザー、インタロゲーション・スペースが試料を通って移動させられる際に試料から放射される光を集光する高開口数の顕微鏡対物レンズ（レンズは少なくとも約０．８の開口数を有する）、インタロゲーション・スペースから放射される放射線を検出するためのアヴァランシェ・フォトダイオード検出器、および試料を通ってインタロゲーション・スペースを移動させるための走査モーターが使用され、インタロゲーション・スペースは約２μｍ３〜約８μｍ３である。いくつかの態様において、本発明の方法で用いられる単一分子検出器において、試料プレート、試料中に設けられるインタロゲーション・スペースに向けられる連続波レーザー、インタロゲーション・スペースが試料を通って移動させられる際に試料から放射される光を集光する高開口数の顕微鏡対物レンズ（レンズは少なくとも約０．８の開口数を有する）、インタロゲーション・スペースから放射される放射線を検出するためのアヴァランシェ・フォトダイオード検出器、および試料を通ってインタロゲーション・スペースを移動させるための走査モーターが使用され、インタロゲーション・スペースは約３μｍ３〜約７μｍ３である。これらのいずれの態様においても、分析器はたった一つのインタロゲーション・スペースを含み得る。
【手続補正２４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７４】
本発明の機器および方法の極めて高い感度に寄与する特徴は、ラベルを検出および計数する方法であり、これらのラベルは、いくつかの態様において、検出すべき単一分子と結合され、または、より一般的には、検出すべき単一分子に一致する。簡潔に言うと、試料プレートに入っている試料は、試料プレートを通ってインタロゲーション・スペースを移動させることによって一連の検出イベントへと有効に分割され、ラベルにおいて用いられる蛍光部分に適した励起波長のレーザーからのＥＭ放射が所定の時間、当該波長に向けられ（または合わせられ）、その間に放出される光子が検出される。各々の所定の期間は「ビン（ｂｉｎ）」である。特定のビンにおいて検出される光子の総数が所定の閾値レベルを上回る場合、検出イベントはそのビンに対して記録される（即ち、ラベルは検出された）。光子の総数が所定の閾値レベルにない場合、検出イベントは記録されない。いくつかの態様において、処理試料の濃度は十分薄く、その結果、大部分の検出イベントに関して、検出イベントは、一つのラベルのみが窓を通過することを表し、これは原試料中の件の単一分子に対応する。従って、一つのビンにおいて一つより多くのラベルを表す検出イベントは僅かである。いくつかの態様において、処理試料中のより高濃度（即ち、２またはそれより多くのラベルが単一の検出イベントとして検出される可能性がもはや僅かでない濃度）のラベルの精確な検出を可能にするために、更なる改良が適用される。
【手続補正２５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８１】
測定に影響を及ぼす他の要因は、蛍光部分の輝度または暗さ（ｄｉｍｎｅｓｓ）、レーザービームの横方向範囲または開口像の寸法、インタロゲーション・スペースが試料を通って移動させられる速度、およびレーザー出力である。ラベルの検出を可能にする関連要因の種々の組み合わせは当業者に明らかだろう。いくつかの態様において、ビン時間は、走査速度を変化させることなく調節される。当業者は、ビン時間が減少するにつれて、インタロゲーション・スペースに向けられるレーザー出力は、ビン時間の間にインタロゲーション・スペースに適用される総エネルギーを一定に保持するために増加させなければならないことを理解するだろう。例えば、ビン時間が１０００マイクロ秒から２５０マイクロ秒に減少する場合、第１近似として、レーザー出力は約４倍増加しなければならない。これらの設定により、前の設定を仮定して１０００マイクロ秒の間に計数される光子の数と同じ数の光子を２５０マイクロ秒の間に検出することが可能となり、バックグラウンドがより小さく感度がより高い、より高速の試料分析が可能となる。更に、インタロゲーション・スペースが試料を通って移動する速度は、試料の処理を加速させるために調節され得る。これらの数は単に例示的なものであり、当業者は、所望の結果を得るために必要に応じてパラメーターを調節し得る。
【手続補正２６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８５】
他の態様において、各ビンにおいて存在する複数の粒子によって発せられる全光子信号が検出される。これらの態様によって、ダイナミックレンジが少なくとも３ｌｏｇ、３．５ｌｏｇ、４ｌｏｇ、４．５ｌｏｇ、５．５ｌｏｇ、６ｌｏｇ、６．５ｌｏｇ、７ｌｏｇ、７．５ｌｏｇ、８ｌｏｇである、または８ｌｏｇより大きい本発明の単一分子検出器が可能となる。
【手続補正２７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９１】
［ＶＩ．試料のキャリーオーバー］
キャリーオーバーは診断において望ましくない。一の試料中の件の分子の検出は、その後試験される試料中の件の分子の検出精度を落とし得ない。本明細書に記載の単一分子分析器は、一の試料中の単一分子の有無を検出することができ、その後、試料間のキャリーオーバーがゼロの状態で、次の試料中の単一分子の有無を検出し得る。本明細書に記載の発明は、連続して、第１試料中の特定の種類の単一分子の有無を検出することができ、第２試料中の当該種類の単一分子の有無を検出し得る機器であって、第１試料と第２試料との間でキャリーオーバーが存在しないように適合させられ且つ構成される機器を提供する。連続して、第１試料中の特定の種類の単一分子の有無を検出し、第２試料中の当該種類の単一分子の有無を検出する方法であって、第１試料と第２試料との間でキャリーオーバーが存在しない方法が、本明細書において更に提供される。
【手続補正２８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９５】
［ＶＩＩ．単一分子分析器の使用方法］
試料中の単一分子の有無を検出する方法をここで更に提供し、その方法は以下の工程を含む：（ａ）電磁放射線源からの電磁放射線を、試料におけるインタロゲーション・スペースに向ける工程；（ｂ）試料の第１の位置に設けられるインタロゲーション・スペース中の第１の単一分子の有無を検出する工程；（ｃ）インタロゲーション・スペースを、試料を通って試料の次の位置に移動させる工程；（ｄ）試料の次の位置において次の単一分子の有無を検出する工程；並びに（ｅ）試料の一つより多くの位置において単一分子の有無を検出するのに必要なだけ、工程（ｃ）および（ｄ）を繰り返す工程。いくつかの態様において、インタロゲーション・スペースは、約１μｍ３より大きい、約２μｍ３より大きい、約３μｍ３より大きい、約４μｍ３より大きい、約５μｍ３より大きい、約１０μｍ３より大きい、約１５μｍ３より大きい、約３０μｍ３より大きい、約５０μｍ３より大きい、約７５μｍ３より大きい、約１００μｍ３より大きい、約１５０μｍ３より大きい、約２００μｍ３より大きい、約２５０μｍ３より大きい、約３００μｍ３より大きい、約４００μｍ３より大きい、約５００μｍ３より大きい、約５５０μｍ３より大きい、約６００μｍ３より大きい、約７５０μｍ３より大きい、約１０００μｍ３より大きい、約２０００μｍ３より大きい、約４０００μｍ３より大きい、約６０００μｍ３より大きい、約８０００μｍ３より大きい、約１００００μｍ３より大きい、約１２０００μｍ３より大きい、約１３０００μｍ３より大きい、約１４０００μｍ３より大きい、約１５０００μｍ３より大きい、約２００００μｍ３より大きい、約３００００μｍ３より大きい、約４００００μｍ３より大きい、または約５００００μｍ３より大きい体積を有する。いくつかの態様において、インタロゲーション・スペースの体積は、約５００００μｍ３より小さく、約４００００μｍ３より小さく、約３００００μｍ３より小さく、約２００００μｍ３より小さく、約１５０００μｍ３より小さく、約１４０００μｍ３より小さく、約１３０００μｍ３より小さく、約１２０００μｍ３より小さく、約１１０００μｍ３より小さく、約９５００μｍ３より小さく、約８０００μｍ３より小さく、約６５００μｍ３より小さく、約６０００μｍ３より小さく、約５０００μｍ３より小さく、約４０００μｍ３より小さく、約３０００μｍ３より小さく、約２５００μｍ３より小さく、約２０００μｍ３より小さく、約１５００μｍ３より小さく、約１０００μｍ３より小さく、約８００μｍ３より小さく、約６００μｍ３より小さく、約４００μｍ３より小さく、約２００μｍ３より小さく、約１００μｍ３より小さく、約７５μｍ３より小さく、約５０μｍ３より小さく、約２５μｍ３より小さく、約２０μｍ３より小さく、約１５μｍ３より小さく、約１４μｍ３より小さく、約１３μｍ３より小さく、約１２μｍ３より小さく、約１１μｍ３より小さく、約１０μｍ３より小さく、約５μｍ３より小さく、約４μｍ３より小さく、約３μｍ３より小さく、約２μｍ３より小さく、または約１μｍ３より小さい。いくつかの態様において、インタロゲーション・スペースの体積は、約１μｍ３〜約１００００μｍ３である。いくつかの態様において、インタロゲー���ョン・スペースは約１μｍ３〜約１０００μｍ３である。いくつかの態様において、インタロゲーション・スペースは約１μｍ３〜約１００μｍ３である。いくつかの態様において、インタロゲーション・スペースは約１μｍ３〜約５０μｍ３である。いくつかの態様において、インタロゲーション・スペースは約１μｍ３〜約１０μｍ３である。いくつかの態様において、インタロゲーション・スペースは約２μｍ３〜約１０μｍ３である。いくつかの態様において、インタロゲーション・スペースは約３μｍ３〜約７μｍ３である。
【手続補正２９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０１】
（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７でラベリングされた抗体の調製）
検出抗体Ｇ−１２９−Ｃを、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７と結合（または共役）させることによって調製する。１００μｇのＧ−１２９−Ｃを４００μｌのカップリング緩衝液に溶解させる。抗体溶液をＹＭ−３０フィルターの中に移して溶液およびフィルターを遠心分離にかけることによって、抗体溶液を５０μｌに濃縮する。ＹＭ−３０フィルターおよび抗体を、４００μｌのカップリング緩衝液を加えることによって３回洗浄する。５０μｌのカップリング緩衝液をフィルターに加え、フィルターを反転させ、そして５，０００ｘｇで１分間遠心分離することによって抗体を回収する。得られる抗体溶液の濃度は約１〜２μｇ／μｌである。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７  ＮＨＳエステル原液（または貯蔵液）は、２０μｌ  ＤＭＳＯ中の１バイアルの再構成されたＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７によって作製される。この溶液は、−２０℃で１ヶ月まで保管可能である。３μｌのＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７原液を暗所で１時間、抗体溶液と混合する。その後、１Ｍトリス７．５μｌを抗体Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７溶液に加え、混合する。溶液をＹＭ−３０で限外ろ過し、低分子量成分を除去する。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７と結合（または共役）した抗体を含有する保持物の体積を、ＰＢＳを加えることによって２００〜４００μｌに調節する。３μｌの１０％ＮａＮ３を溶液に加える。得られる溶液を、Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ０．２２遠心分離器ユニットに移し、１２，０００ｘｇで２分間遠心分離する。結合された（または共役された）抗体を含有するろ液を回収し、分析において用いる。
【手続補正３０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０５】
［実施例３：ＴｎＩに関するサンドウィッチビーズベース分析］
上述の分析は、ターゲット分子を固定するためにプラスチック表面が用いられるマイクロタイタープレート方式を用いる。単一粒子分析器システムは、結合要素および非結合要素を分離するために微小粒子またはビーズを用いて溶液中で行われる分析にも対応する。
【手続補正３１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単一分子分析器であって、
（ａ）試料を含む試料容器に電磁放射線を与えるための電磁放射線源；
（ｂ）電磁放射線源からの電磁放射線を、試料中のインタロゲーション・スペースに向けるためのシステム；
（ｃ）インタロゲーション・スペースを試料の少なくとも一部を通って移動させ、それによって可動インタロゲーション・スペースを形成するための移動システム；および
（ｄ）分子が存在する場合に、インタロゲーション・スペースにおける単一分子から放射される電磁放射線を検出するための検出器であって、検出器が操作可能であるようにインタロゲーション・スペースに接続される検出器
を含む、単一分子分析器。
【請求項２】
移動システムが、直線状経路および非直線状経路の一つ又はそれより多くにおいてインタロゲーション・スペースを移動させ得る、請求項１に記載の単一分子分析器。
【請求項３】
非直線状経路が、実質的に円状の経路を含む請求項２に記載の単一分子分析器。
【請求項４】
非直線状経路が螺旋状経路を含む、請求項２に記載の単一分子分析器。
【請求項５】
非直線状経路がラスターパターンを含む、請求項２に記載の単一分子分析器。
【請求項６】
表面において少なくとも一つの試料を収容し且つ閉じこめるための表面を有する容器を更に含む、請求項１に記載の単一分子分析器。
【請求項７】
試料容器がプレートである、請求項１に記載の単一分子分析器。
【請求項８】
プレートがマイクロタイタープレートである、請求項７に記載のプレート。
【請求項９】
インタロゲーション・スペースの体積が約１５μｍ３〜約１１０００μｍ３である、請求項１に記載の単一分子分析器。
【請求項１０】
インタロゲーション・スペースの体積が約２００μｍ３〜約３０００μｍ３である、請求項１に記載の単一分子分析器。
【請求項１１】
インタロゲーション・スペースの体積が約５００μｍ３〜約６００μｍ３である、請求項１に記載の単一分子分析器。
【請求項１２】
分子が容器表面に結合される、請求項６に記載の単一分子分析器。
【請求項１３】
非共有結合によって分子が容器表面に結合される、請求項１２に記載の単一分子分析器。
【請求項１４】
非共有結合が、分子と、容器表面に共有結合または非共有結合する一つ又はそれより多くの抗体との間に形成される、請求項１３に記載の単一分子分析器。
【請求項１５】
顕微鏡対物レンズを更に含み、顕微鏡対物レンズの被写界深度および顕微鏡対物レンズに結像される開口部の直径が共にインタロゲーション・スペースを規定する、請求項１に記載の単一分子分析器。
【請求項１６】
顕微鏡対物レンズを更に含み、顕微鏡対物レンズの被写界深度および電磁放射ビームの横方向範囲が共にインタロゲーション・スペースを規定する、請求項１に記載の単一分子分析器。
【請求項１７】
移動システムが、インタロゲーション・スペースを試料の一部を通って１回より多い回数、移動させるように構成および配置される、請求項１に記載の単一分子分析器。
【請求項１８】
移動システムが、１回目および２回目に試料の同じ部分を通って、件の分子が存在する場合、１回目にインタロゲーション・スペースが試料の当該部分を通って移動する際に検出される件の分子が、１回目に試料の当該部分がインタロゲーション・スペースによってインタロゲートされた後に試料の当該部分から実質的に拡散することを可能とし、更に、次の件の分子が存在する場合、２回目に試料の当該部分がインタロゲーション・スペースによってインタロゲートされる際に、次の件の分子が試料の当該部分の中に実質的に拡散することを可能とする十分に遅い速度で移動するように構成および配置される、請求項１７に記載の単一分子分析器。
【請求項１９】
移動システムが、インタロゲーション・スペースを実質的に円状のパターンで移動させるように構成および配置され、システムは、約１００〜約１０００ＲＰＭの速度でインタロゲーション・スペースを移動させることができる、請求項１８に記載の分析器。
【請求項２０】
移動システムが、１回目の通過において検出された分子が前記部分から拡散し得、かつ他の分子が前記部分の中に拡散し得るように十分な時間が経過した後に、検出スポットが試料の前記部分に戻るように、インタロゲーション・スペースを移動させるように構成および配置される、請求項１７に記載の単一分子分析器。
【請求項２１】
分析器が、第１試料中の特定の種類の単一分子の有無を連続して検出し、第２試料中の当該種類の単一分子の有無を検出するように適合させられ且つ構成され、第１試料と第２試料との間でキャリーオーバーが存在しない、請求項１に記載の単一分子分析器。
【請求項２２】
（ａ）５５０ｎｍ〜８００ｎｍの波長の光に対して実質的に透明である材料からなり、かつ一つ又はそれより多くの部分を含む基部であって、当該部分が、当該部分の第２の側に配置される高開口数のレンズによって当該部分の第１の側において像が形成され得るような厚さであり、像のどの部分も基部内に形成されない基部；および
（ｂ）少なくとも一つの流体試料を表面に収容し且つ閉じこめるように適合させられ且つ構成される表面
を含むマイクロタイタープレート。
【請求項２３】
基部が６００ｎｍ〜７５０ｎｍの波長の光に対して透明である、請求項２２に記載のマイクロタイタープレート。
【請求項２４】
基部が６３０ｎｍ〜７４０ｎｍの波長の光に対して透明である、請求項２２に記載のマイクロタイタープレート。
【請求項２５】
基部が６３０ｎｍ〜６４０ｎｍの波長の光に対して透明である、請求項２２に記載のマイクロタイタープレート。
【請求項２６】
表面がマイクロウェルを有する、請求項２２に記載のマイクロタイタープレート。
【請求項２７】
プレートが、ポリスチレンより小さい蛍光を放射する材料を含む、請求項２２に記載のマイクロタイタープレート。
【請求項２８】
試料中の単一分子の有無を検出する方法であって、
（ａ）電磁放射線源からの電磁放射線を試料中のインタロゲーション・スペースに向ける工程；
（ｂ）試料の第１位置に設けられるインタロゲーション・スペースにおける第１の単一分子の有無を検出する工程；
（ｃ）インタロゲーション・スペースを、試料を通って試料の次の位置に移動させる工程；
（ｄ）試料の次の位置において次の単一分子の有無を検出する工程；および
（ｅ）試料の一つより多くの位置において単一分子の有無を検出するのに必要なだけ、工程（ｃ）および（ｄ）を繰り返す工程
を含む方法。
【請求項２９】
インタロゲーション・スペースの体積が約１５μｍ３〜約１１０００μｍ３である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
インタロゲーション・スペースの体積が約２００μｍ３〜約３０００μｍ３である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
インタロゲーション・スペースの体積が約５００μｍ３〜約６００μｍ３である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
インタロゲーション・スペースが、非直線状経路で移動させられる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
非直線状経路が実質的に円状の経路を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
非直線状経路が螺旋状経路を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
試料が、試料中に配置されたインタロゲーション・スペースに向けられる電磁放射線に対して実質的に静止したままである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３６】
インタロゲーション・スペースが、１回より多い回数、試料の第１位置を通って移動させられる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３７】
インタロゲーション・スペースが、次の回において、試料の第１位置を通って、件の分子が存在する場合、１回目にインタロゲーション・スペースが試料の当該位置を通って移動させられる際に検出される件の分子が、１回目に試料の当該位置がインタロゲーション・スペースによってインタロゲートされた後に、試料の当該位置から実質的に拡散することを可能とし、更に、次の件の分子が存在する場合、２回目に試料の当該位置がインタロゲーション・スペースによってインタロゲートされる際に、次の件の分子が試料の当該位置の中に実質的に拡散することを可能とする十分に遅い速度で移動する、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
インタロゲーション・スペースが、１回目の通過において検出された分子が前記部分から拡散し得、別の分子が前記部分の中に拡散し得るように十分な時間が経過した後に、検出スポットが試料の第１位置に戻るように移動させられる、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
試料中の特定の種類の単一分子の有無を連続して検出し、次に、第２試料中の同じ種類の単一分子の有無を検出する工程であって、第１試料と第２試料との間でキャリーオーバーが存在しない工程を更に含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項４０】
第１試料および第２試料が、使い捨てでない装置内に収容され且つ閉じこめられる、請求項３９に記載の方法。