【手続補正書】
【提出日】平成23年3月25日(2011.3.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００４】
本発明の局面は、人工タンパク質を宿主細胞表面にディスプレイするための組成物および方法に関する。ある態様において、宿主細胞から分泌された時、修飾タンパク質が表面に固定化された結合パートナーに結合するようにタンパク質が修飾される結果をもたらす条件下で人工タンパク質を宿主細胞内で発現させる。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
人工タンパク質を宿主細胞にディスプレイするための方法であって、以下の工程を含む方法：
宿主細胞が第１の結合パートナーをその表面にディスプレイすることを特徴とし、
人工タンパク質が修飾モチーフを含み、人工タンパク質が発現する時に第２の結合パートナーが修飾モチーフに共役されることを特徴とし、かつ
発現される人工タンパク質が宿主細胞から分泌され、第２の結合パートナーの第１の結合パートナーへの結合を介して細胞表面にディスプレイされることを特徴とする、
第１の核酸を含む宿主細胞を第１の核酸によってコードされる人工タンパク質を発現するのに十分な条件下でインキュベートする工程。
（項目２）
各々の異なる人工タンパク質が異なる宿主細胞内の異なる第１の核酸にコードされることを特徴とする、複数の異なる人工タンパク質をディスプレイする工程をさらに含む、項目１記載の方法。
（項目３）
異なる人工タンパク質が互いの配列変異体であることを特徴とする、項目２記載の方法。
（項目４）
人工タンパク質が分泌ペプチドを含むことを特徴とする、項目１記載の方法。
（項目５）
宿主細胞が酵母細胞であることを特徴とする、項目１記載の方法。
（項目６）
修飾モチーフがビオチン受容体ペプチドであることを特徴とする、項目１記載の方法。
（項目７）
第１の結合パートナーが、細胞表面に付着したさらなる第２の結合パートナーとの相互作用を介してディスプレイされることを特徴とする、項目１記載の方法。
（項目８）
第１の結合パートナーがアビジン様タンパク質であることを特徴とする、項目１記載の方法。
（項目９）
第２の結合パートナーがビオチンであることを特徴とする、項目１記載の方法。
（項目１０）
第２の結合パートナーの修飾モチーフへの共役が共役酵素によって触媒されることを特徴とする、項目１記載の方法。
（項目１１）
共役酵素が第２の核酸にコードされていることを特徴とし、第２の核酸がベクターまたは宿主細胞のゲノムに組み込まれた組換え核酸であることを特徴とする、項目１０記載の方法。
（項目１２）
共役酵素がビオチンリガーゼであることを特徴とする、項目１記載の方法。
（項目１３）
シャペロンタンパク質を宿主細胞内で発現させる工程をさらに含むことを特徴とする、項目１記載の方法。
（項目１４）
人工タンパク質を細胞表面にディスプレイするための方法であって、以下の工程を含む方法：
宿主細胞が第１の結合パートナーをその表面に含むことを特徴とし、かつ第１の結合パートナーに特異的に結合する第２の結合パートナーを含む細胞壁タンパク質に結合することによって第１の結合パートナーが細胞表面に付着することを特徴とする、第１の核酸によってコードされる人工タンパク質を発現するのに十分な条件下で第１の核酸を含む宿主細胞をインキュベートする工程、
第２の結合パートナーの第１の結合パートナーへの結合を介して標的分子を宿主細胞の表面に固定化するのに十分な条件下で第２の結合パートナーをも含む宿主細胞を標的分子と接触させる工程、
人工タンパク質が標的分子に結合することを特徴とする、人工タンパク質の分泌をもたらす条件下で細胞をインキュベートし、それにより人工タンパク質を宿主細胞表面にディスプレイする工程。
（項目１５）
人工タンパク質が、抗体、単鎖抗体、スキャフォールドタンパク質、またはその断片であることを特徴とする、項目１４記載の方法。
（項目１６）
第２の結合パートナーが発現した人工タンパク質に共役されることを特徴とし、かつ
発現した人工タンパク質が分泌され、第２の結合パートナーの第１の結合パートナーへの結合を介して細胞表面にディスプレイされることを特徴とする、
第１の結合パートナーを含む細胞表面を有する宿主細胞内で修飾モチーフを含む人工タンパク質を発現させる工程；および
細胞表面にディスプレイされた人工タンパク質の特性を評価する工程
を含むタンパク質スクリーニング法。
（項目１７）
評価する工程が、活性のレベルをアッセイする工程、人工タンパク質が所定の機能を有するかどうかを決定する工程、人工タンパク質の特性を参照タンパク質の特性と比較する工程、細胞表面にディスプレイされた人工タンパク質の量を決定する工程、またはその任意の組み合わせを含むことを特徴とする、項目１６記載の方法。
（項目１８）
人工タンパク質が、抗体、単鎖抗体、スキャフォールドタンパク質、またはその断片で、評価されているタンパク質の機能がタンパク質の標的分子への結合親和性であることを特徴とし、標的分子が抗原および／またはエピトープを含むことを特徴とする、項目１６記載の方法。
（項目１９）
宿主細胞が、ディスプレイされた人工タンパク質の第１の所定の特性に基づいて選択されることを特徴とする、項目１６記載の方法。
（項目２０）
ディスプレイされた人工タンパク質の第２の所定の特性に基づいて宿主細胞を選択する工程をさらに含む、項目１９記載の方法。
（項目２１）
少なくとも所定のレベルの人工タンパク質をディスプレイする選択された宿主細胞から人工タンパク質を放出する工程をさらに含む、項目１９記載の方法。
（項目２２）
活性のレベルをアッセイする工程が、人工タンパク質が基質を処理することができるかどうかをアッセイする工程を含むことを特徴とする、項目１７記載の方法。
（項目２３）
基質が表面に共役されることを特徴とする、項目２２記載の方法。
（項目２４）
基質が、ポリペプチド、核酸、脂質、多糖、合成ポリマー、または合成化合物であることを特徴とする、項目２２記載の方法。
（項目２５）
基質を処理する工程が、基質に結合する工程、基質を解離する工程、基質にニックを入れる工程、基質を切断する工程、基質を活性化する工程、基質を失活させる工程、基質に電荷を与える工程、基質から電荷を奪う工程、基質の立体構造を変化させる工程、基質をコピーする工程、基質を複製する工程、分子を基質にコンジュゲートする工程、ペプチドを基質にコンジュゲートする工程、または基質を修飾する工程を含むことを特徴とする、項目２２記載の方法。
（項目２６）
人工タンパク質が基質を処理することができるかどうかを評価するための方法であって、以下の工程を含む方法：
ａ）人工タンパク質が分泌され、かつ
ｂ）基質が宿主細胞表面に共役されることを特徴とする、
宿主細胞内での人工タンパク質の発現を誘導する工程、および
基質を処理する人工タンパク質によって生み出された検出可能なシグナルのレベルを測定する工程。
（項目２７）
基質が、ポリペプチド、核酸、脂質、多糖、合成ポリマー、または合成化合物であることを特徴とする、項目２６記載の方法。
（項目２８）
基質を処理する工程が、基質に結合する工程、基質を解離する工程、基質にニックを入れる工程、基質を切断する工程、基質を活性化する工程、基質を失活させる工程、基質に電荷を与える工程、基質から電荷を奪う工程、基質の立体構造を変化させる工程、基質をコピーする工程、基質を複製する工程、基質に分子をコンジュゲートする工程、基質にペプチドをコンジュゲートする工程、または基質を修飾する工程を含むことを特徴とする、項目２６記載の方法。
（項目２９）
宿主細胞がその細胞表面に共役した第１の結合パートナーを有することができることを特徴とし、
人工タンパク質が修飾モチーフを含むことを特徴とし、かつそれが第２の結合パートナーの第１の結合パートナーへの相互作用結合を介して細胞表面にディスプレイされることができるように、人工タンパク質の発現が第２の結合パートナーの修飾モチーフへの共役および人工タンパク質の分泌をもたらすことを特徴とする、
人工タンパク質をコードする第１の核酸を含む宿主細胞。
（項目３０）
宿主細胞が少なくとも１０４個の人工タンパク質をディスプレイすることを特徴とする、項目２９記載の宿主細胞。
（項目３１）
項目２９記載の宿主細胞のライブラリー。
（項目３２）
ライブラリーが少なくとも１０８個の異なるメンバーを有することを特徴とする、項目３１記載のライブラリー。
（項目３３）
各々の核酸が人工タンパク質の異なる変異体をコードすることを特徴とし、かつ各々の変異体が結合パートナーを共役することができる同一の修飾モチーフを含むことを特徴とする、複数の核酸を含む、核酸のライブラリー。
（項目３４）
修飾モチーフがビオチン化モチーフであることを特徴とする、項目３３記載のライブラリー。
（項目３５）
ライブラリーが少なくとも１０８個の異なるメンバーを有することを特徴とする、項目３３記載のライブラリー。
（項目３６）
それが所定の機能または所定のレベルの活性を有する場合に人工タンパク質を単離する工程をさらに含む、項目１７記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
人工タンパク質を宿主細胞にディスプレイするための方法であって、以下の工程：
宿主細胞が第１の結合パートナーをその表面にディスプレイすることを特徴とし、
人工タンパク質が修飾モチーフを含み、人工タンパク質が発現する時に第２の結合パートナーが修飾モチーフに共役されることを特徴とし、かつ
発現される人工タンパク質が宿主細胞から分泌され、第２の結合パートナーの第１の結合パートナーへの結合を介して細胞表面にディスプレイされることを特徴とする、
第１の核酸を含む宿主細胞を第１の核酸によってコードされる人工タンパク質を発現するのに十分な条件下でインキュベートする工程、
を含み、該方法はヒト体内では行われない、方法。
【請求項２】
各々の異なる人工タンパク質が異なる宿主細胞内の異なる第１の核酸にコードされることを特徴とする、複数の異なる人工タンパク質をディスプレイする工程をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
異なる人工タンパク質が互いの配列変異体であることを特徴とする、請求項２記載の方法。
【請求項４】
人工タンパク質が分泌ペプチドを含むことを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項５】
宿主細胞が酵母細胞であることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項６】
修飾モチーフがビオチン受容体ペプチドであることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項７】
第１の結合パートナーが、細胞表面に付着したさらなる第２の結合パートナーとの相互作用を介してディスプレイされることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項８】
第１の結合パートナーがアビジン様タンパク質であることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項９】
第２の結合パートナーがビオチンであることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
第２の結合パートナーの修飾モチーフへの共役が共役酵素によって触媒されることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
共役酵素が第２の核酸にコードされていることを特徴とし、第２の核酸がベクターまたは宿主細胞のゲノムに組み込まれた組換え核酸であることを特徴とする、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
共役酵素がビオチンリガーゼであることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
シャペロンタンパク質を宿主細胞内で発現させる工程をさらに含むことを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
人工タンパク質を細胞表面にディスプレイするための方法であって、以下の工程：
宿主細胞が第１の結合パートナーをその表面に含むことを特徴とし、かつ第１の結合パートナーに特異的に結合する第２の結合パートナーを含む細胞壁タンパク質に結合することによって第１の結合パートナーが細胞表面に付着することを特徴とする、
第１の核酸によってコードされる人工タンパク質を発現するのに十分な条件下で第１の核酸を含む宿主細胞をインキュベートする工程、
第２の結合パートナーの第１の結合パートナーへの結合を介して標的分子を宿主細胞の表面に固定化するのに十分な条件下で第２の結合パートナーをも含む宿主細胞を標的分子と接触させる工程、
人工タンパク質が標的分子に結合することを特徴とする、人工タンパク質の分泌をもたらす条件下で細胞をインキュベートし、それにより人工タンパク質を宿主細胞表面にディスプレイする工程、
を含み、該方法はヒト体内では行われない、方法。
【請求項１５】
人工タンパク質が、抗体、単鎖抗体、スキャフォールドタンパク質、またはその断片であることを特徴とする、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
第２の結合パートナーが発現した人工タンパク質に共役されることを特徴とし、かつ
発現した人工タンパク質が分泌され、第２の結合パートナーの第１の結合パートナーへの結合を介して細胞表面にディスプレイされることを特徴とする、
第１の結合パートナーを含む細胞表面を有する宿主細胞内で修飾モチーフを含む人工タンパク質を発現させる工程；および
細胞表面にディスプレイされた人工タンパク質の特性を評価する工程
を含むタンパク質スクリーニング法であって、該方法はヒト体内では行われない、方法。
【請求項１７】
評価する工程が、活性のレベルをアッセイする工程、人工タンパク質が所定の機能を有するかどうかを決定する工程、人工タンパク質の特性を参照タンパク質の特性と比較する工程、細胞表面にディスプレイされた人工タンパク質の量を決定する工程、またはその任意の組み合わせを含むことを特徴とする、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
人工タンパク質が、抗体、単鎖抗体、スキャフォールドタンパク質、またはその断片で、評価されているタンパク質の機能がタンパク質の標的分子への結合親和性であることを特徴とし、標的分子が抗原および／またはエピトープを含むことを特徴とする、請求項１６記載の方法。
【請求項１９】
宿主細胞が、ディスプレイされた人工タンパク質の第１の所定の特性に基づいて選択されることを特徴とする、請求項１６記載の方法。
【請求項２０】
ディスプレイされた人工タンパク質の第２の所定の特性に基づいて宿主細胞を選択する工程をさらに含む、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
少なくとも所定のレベルの人工タンパク質をディスプレイする選択された宿主細胞から人工タンパク質を放出する工程をさらに含む、請求項１９記載の方法。
【請求項２２】
活性のレベルをアッセイする工程が、人工タンパク質が基質を処理することができるかどうかをアッセイする工程を含むことを特徴とする、請求項１７記載の方法。
【請求項２３】
基質が表面に共役されることを特徴とする、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
基質が、ポリペプチド、核酸、脂質、多糖、合成ポリマー、または合成化合物であることを特徴とする、請求項２２記載の方法。
【請求項２５】
基質を処理する工程が、基質に結合する工程、基質を解離する工程、基質にニックを入れる工程、基質を切断する工程、基質を活性化する工程、基質を失活させる工程、基質に電荷を与える工程、基質から電荷を奪う工程、基質の立体構造を変化させる工程、基質をコピーする工程、基質を複製する工程、分子を基質にコンジュゲートする工程、ペプチドを基質にコンジュゲートする工程、または基質を修飾する工程を含むことを特徴とする、請求項２２記載の方法。
【請求項２６】
人工タンパク質が基質を処理することができるかどうかを評価するための方法であって、以下の工程：
ａ）人工タンパク質が分泌され、かつ
ｂ）基質が宿主細胞表面に共役されることを特徴とする、
宿主細胞内での人工タンパク質の発現を誘導する工程、および
基質を処理する人工タンパク質によって生み出された検出可能なシグナルのレベルを測定する工程、
を含み、該方法はヒト体内では行われない、方法。
【請求項２７】
基質が、ポリペプチド、核酸、脂質、多糖、合成ポリマー、または合成化合物であることを特徴とする、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
基質を処理する工程が、基質に結合する工程、基質を解離する工程、基質にニックを入れる工程、基質を切断する工程、基質を活性化する工程、基質を失活させる工程、基質に電荷を与える工程、基質から電荷を奪う工程、基質の立体構造を変化させる工程、基質をコピーする工程、基質を複製する工程、基質に分子をコンジュゲートする工程、基質にペプチドをコンジュゲートする工程、または基質を修飾する工程を含むことを特徴とする、請求項２６記載の方法。
【請求項２９】
宿主細胞がその細胞表面に共役した第１の結合パートナーを有することができることを特徴とし、
人工タンパク質が修飾モチーフを含むことを特徴とし、かつそれが第２の結合パートナーの第１の結合パートナーへの相互作用結合を介して細胞表面にディスプレイされることができるように、人工タンパク質の発現が第２の結合パートナーの修飾モチーフへの共役および人工タンパク質の分泌をもたらすことを特徴とする、
人工タンパク質をコードする第１の核酸を含む宿主細胞。
【請求項３０】
宿主細胞が少なくとも１０４個の人工タンパク質をディスプレイすることを特徴とする、請求項２９記載の宿主細胞。
【請求項３１】
請求項２９記載の宿主細胞のライブラリー。
【請求項３２】
ライブラリーが少なくとも１０８個の異なるメンバーを有することを特徴とする、請求項３１記載のライブラリー。
【請求項３３】
各々の核酸が人工タンパク質の異なる変異体をコードすることを特徴とし、かつ各々の変異体が結合パートナーを共役することができる同一の修飾モチーフを含むことを特徴とする、複数の核酸を含む、核酸のライブラリー。
【請求項３４】
修飾モチーフがビオチン化モチーフであることを特徴とする、請求項３３記載のライブラリー。
【請求項３５】
ライブラリーが少なくとも１０８個の異なるメンバーを有することを特徴とする、請求項３３記載のライブラリー。
【請求項３６】
それが所定の機能または所定のレベルの活性を有する場合に人工タンパク質を単離する工程をさらに含む、請求項１７記載の方法。