【手続補正書】
【提出日】平成24年5月15日(2012.5.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
エリスロポイエチンを産生する真核細胞が灌流リアクター中で細胞の滞留下に培養される際に、エリスロポイエチンを連続的に発酵により製造する方法において、リアクター中でのグルコース濃度を培地の灌流速度により、およびリアクター中での細胞数を細胞滞留率により、予め定めた範囲内に調節することを特徴とする、エリスロポイエチンを連続的に発酵により製造する方法。
【請求項２】
ａ）培地の灌流速度をリアクター中でのグルコース濃度に依存して、予め定めた範囲内に調節し、および
ｂ）細胞滞留装置の細胞滞留率をリアクター中での細胞密度に依存して、予め定めた範囲内に調節しおよび／またはリアクター中で一定の細胞密度に調節するために時間間隔で定義された量の細胞含有培地をリアクターから排出する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
エリスロポイエチンを産生する真核細胞を使用しながらの連続的で発酵による製造の場合には、有利にアミノ酸交換体、アミノ酸欠失またはアミノ酸付加物最大１０個、特に有利に最大５個を有する野生型ヒトエリスロポイエチンの変形、特に有利にアミノ酸交換体、アミノ酸欠失またはアミノ酸付加物最大１個を有する変形であるエリスロポイエチンが得られる、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
培養上澄液中でのグルコース濃度を０．０５〜１．５ｇ／ｌの範囲内に調節し、細胞数を１ｍｌ当たり細胞０．５×１０7〜５．０×１０7個の範囲内に調節する、請求項１から３までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
エリスロポイエチンを産生する真核細胞は、哺乳動物細胞、有利にヒト細胞、特に有利にチャイニーズハムスター卵巣細胞である、請求項１から４までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
超音波細胞滞留システムを使用しながら細胞を滞留させる、請求項１から５までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
発酵溶液は、なお指数増殖期で存在する、高められた相対的割合の細胞を有する細胞集団を含有する、請求項１から６までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
プロセスパラメーターのｐＨ値、温度、酸素分圧、攪拌速度および供給された培地の組成を、発酵の全時間に亘って一定に維持する、請求項１から７までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
産生能は、発酵上澄液１  ｌ当たりエリスロポイエチン少なくとも１０ｍｇ、有利に少なくとも２０ｍｇ、さらに有利に少なくとも２５ｍｇ、殊に有利に少なくとも３０ｍｇである、請求項１から８までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
細胞１個当たり毎日の平均的な比産生能は、エリスロポイエチン少なくとも０．５ｐｇ、有利に少なくとも１．０ｐｇ、特に有利に少なくとも１．２ｐｇ、殊に有利に少なくとも１．４ｐｇである、請求項１から９までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
細胞の平均活力は、少なくとも７０％、特に少なくとも７５％、特に有利に少なくとも８０％、さらに有利に少なくとも９０％、殊に有利に少なくとも９５％である、請求項１から１０までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
発酵中の灌流速度は、０．５〜３、有利に１〜２．５、特に有利に１．５〜２．０である、請求項１から１１までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
本方法を少なくとも１０日間、有利に少なくとも２０日間、特に有利に少なくとも３０日間、殊に有利に少なくとも４０日間の期間に亘って実施する、請求項１から１２までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
培養上澄液中のグルコース濃度を０．２５〜１．２５ｇ／ｌの範囲内、有利に０．５〜１．０ｇ／ｌの範囲内に調節する、請求項１から１３までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
発酵リアクター内での細胞数を発酵培地１ｍｌ当たり細胞１．０×１０7〜４．０×１０7個、有利に細胞１．５×１０7〜３．０×１０7個の範囲内に調節する、請求項１から１４までのいずれか１項に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３０】
記載された方法は、新たにエリスロポイエチンの産生収量ならびに産生品質を高めるための種々の手段を組み合わせている：
（１）灌流により、絶えず細胞毒性の代謝産生物が排出され、ならびに新しい栄養物質が供給され、したがってバイオリアクター中で極めて高い細胞密度が達成され、細胞は、極めて長時間に亘って産生する。
（２）灌流プロセスの場合に典型的に極めて高い消費量の高価な培地を減少させ、経済的に改善された産生プロセスを可能にするために、さらに、灌流速度は、培養上澄液中でのグルコース含量が実際に一面で効率的な細胞成長に必要な下限を下廻らないが、しかし、他面、細胞代謝で"代謝シフト"が生じ、毒性の代謝産物のラクテートおよびアンモニウムがなお減少された範囲でのみ産生され、それによって灌流の際になお微少量の新しい培地だけが排出されなければならないような形式に制限されているように選択される。
（３）その上、調整可能な細胞滞留システムの細胞滞留率を適当に調節すること、または定義された量の細胞含有培地を繰り返し排出することにより、発酵溶液中で、なお成長プラトーが達成されずに、なお指数増殖期が存在し、特に公式標準に相当する高い価値のＥＰＯを産生する能力を有する、高められた相対的割合の細胞での細胞集結を生じることができる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３７】
本発明による方法の特に好ましい実施態様において、産生能は、発酵上澄液１  ｌ当たりエリスロポイエチン少なくとも１０ｍｇ、特に少なくとも２０ｍｇ、さらに有利に少なくとも２５ｍｇ、殊に有利に少なくとも３０ｍｇである。特に、平均的な産生能は、発酵上澄液１  ｌ当たりエリスロポイエチン少なくとも１０ｍｇ、特に少なくとも１５ｍｇである。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３８】
更に、細胞１個当たり毎日の平均的な比産生能は、エリスロポイエチン少なくとも０．５ｐｇ、さらに有利に少なくとも１．０ｐｇ、特に有利に少なくとも１．２ｐｇ、殊に有利に少なくとも１．４ｐｇである。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４４】
【図１】図１は、本発明による方法で得られる、グルコース濃度または培養上澄液中でのＥＰＯ産生能（ＥＰＯ  μｇ／ｍｌ）の時間的経過を示す線図である。
【図２】図２は、培養上澄液中での生体細胞数（ｖｉｔ．ＺＺ）およびＥＰＯ産生能の時間的経過ならびに本発明方法による灌流の時間的経過を示す線図である。
【図３】図３は、培養上澄液中の細胞の全体数に対する生体細胞の百分率での割合の時間的経過および本発明方法による百分率での細胞滞留率の時間的経過を示す線図である。
【図４】図４は、本発明方法により得られる、培養上澄液中でのラクテート濃度またはグルタメート濃度の時間的経過を示す線図である。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４６】
本発明によれば、段階なしに調節可能な超音波細胞滞留システムを備えた灌流リアクター中で、特にＣＨＯ細胞を用いてエリスロポイエチンを連続的に発酵により製造する方法で
ａ）一面で、培地の灌流速度（調整パラメーターとして）は、発酵リアクター中でのグルコース濃度（測定パラメーターとして）に依存して調節され、
ｂ）他面、細胞滞留装置の細胞滞留率（調整パラメーターとして）は、発酵リアクター中での細胞密度（測定パラメーターとして）に依存して適当な方法で互いに予め定められた範囲内で調節されることにより、
発酵溶液中で、なお成長プラトーが達成されずに、なお指数増殖期が存在する、高められた相対的割合の細胞での細胞集結が得られる。このような細胞は、特に公式標準に相当する高い価値のＥＰＯを産生する能力を有する。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５７】
発酵の進行中に粗製ＥＰＯ１２ｇの全体量と一緒に７７６  ；を取得した。産生能は、１ｍｌ当たり細胞１．６×１０7個の平均細胞数の際に平均で１５μｇ／ｍｌであり、最大細胞数は、３０μｇ／ｍｌを超える最大産生能の際に１ｍｌ当たり細胞２．６×１０7個であった。細胞１個当たりの毎日の比産生能は、１．４ｐｇであり、平均灌流速度は、１．９であった。細胞活力は、７６〜９８％であった。Ｂｉｏｓｅｐシステムを用いての平均細胞滞留率は、８５％であった（７〜９７％）。