【手続補正書】
【提出日】平成24年6月1日(2012.6.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ベータカロテンをアスタキサンチンに変換する酵素アスタキサンチンシンターゼにより触媒される反応における電子供与体の役目を果たす、シトクロムＰ４５０レダクターゼ活性を有する酵素をコードしていることを特徴とするＤＮＡであって、
以下のヌクレオチド配列：
ａ）ＳＥＱ１により表される配列、または
ｂ）ヌクレオチド配列であって、その遺伝子コードが縮重しているため、ａ）において記述されたヌクレオチド配列によりコードされるものと同じアミノ酸配列を有するシトクロムＰ４５０レダクターゼをコードするヌクレオチド配列、あるいは
ｃ）ａ）および／またはｂ）において記述されたヌクレオチド配列の相補鎖に標準的なストリンジェントな条件の下でハイブリダイズするヌクレオチド配列；
から選択されるヌクレオチド配列を含む、前記ＤＮＡ。
【請求項２】
ベータカロテンをアスタキサンチンに変換する酵素アスタキサンチンシンターゼにより触媒される反応における電子供与体の役目を果たす、シトクロムＰ４５０レダクターゼ活性を有する酵素をコードしていることを特徴とするＤＮＡであって、
以下のヌクレオチド配列：
ａ）ＳＥＱ２により表される配列、または
ｂ）ヌクレオチド配列であって、その遺伝子コードが縮重しているため、ａ）において記述されたヌクレオチド配列によりコードされるものと同じアミノ酸配列を有するシトクロムＰ４５０レダクターゼをコードするヌクレオチド配列、あるいは
ｃ）ａ）および／またはｂ）において記述されたヌクレオチド配列の相補鎖に標準的なストリンジェントな条件の下でハイブリダイズするヌクレオチド配列；
から選択されるヌクレオチド配列を含む、前記ＤＮＡ。
【請求項３】
シトクロムＰ４５０レダクターゼ活性を有し、そして、請求項１および２に記載のＤＮＡのヌクレオチド配列によりコードされることを特徴とする、ポリペプチド。
【請求項４】
ａ）ＳＥＱ３により表されるアミノ酸配列、または
ｂ）アミノ酸の１個以上の変化を有し、記述されたシトクロムＰ４５０レダクターゼの活性を維持している、ＳＥＱ３に類似のアミノ酸配列、あるいは
ｃ）化学合成または生合成により合成される、ａ）および／またはｂ）において記述されたアミノ酸配列；
を有することを特徴とする、請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項５】
ＳＥＱ４〜ＳＥＱ１０６で構成されるグループから選択され、そして、請求項１又は２に記載のヌクレオチド配列とハイブリダイズすることを特徴とする、オリゴヌクレオチド。
【請求項６】
ＰＣＲまたは他の分子生物学の技法によりＤＮＡを増幅するのに役立つことを特徴とする、請求項５に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
請求項１又は２に記載のＤＮＡを含むことを特徴とする、ベクターまたはプラスミド。
【請求項８】
請求項１又は２に記載のＤＮＡにより形質転換またはトランスフェクションされていることを特徴とする、宿主生物。
【請求項９】
請求項７に記載のベクターまたはプラスミドにより形質転換またはトランスフェクションされていることを特徴とする、宿主生物。
【請求項１０】
シトクロムＰ４５０レダクターゼ活性を有するポリペプチドを生成するためのプロセスであって、それが請求項８又は９に記載の宿主生物を、この酵素の産生の助けになる条件下で培養することを含むことを特徴とするプロセス。
【請求項１１】
アスタキサンチンの生物学的生産のためのプロセスであって、それが請求項１又は２に記載の１種類以上のＤＮＡを適切な宿主生物へ導入し、アスタキサンチンの産生の助けになる条件下で増殖させ、その培養物からアスタキサンチンを回収することを含むことを特徴とするプロセス。
【請求項１２】
ベータカロテンからのアスタキサンチンの製造のためのプロセスであって、それが適切な再構成された膜を含む適切な反応混合物中でのアスタキサンチンシンターゼにより触媒される反応のために、請求項３又は４記載のポリペプチドからの電子の供与を提供することを特徴とする、前記プロセス。
【請求項１３】
請求項１２に記載のベータカロテンからのアスタキサンチンの製造のプロセスであって、前記ポリペプチドが、ミクロソームまたはミトコンドリア膜のような生物学的な膜から調製された再構成された膜の形で存在することを特徴とする、前記プロセス。
【請求項１４】
請求項１２に記載のベータカロテンからのアスタキサンチンの製造のプロセスであって、前記ポリペプチドが、リポソームのような再構成された人工的な膜の形で存在することを特徴とする、前記プロセス。
【請求項１５】
請求項１また２に記載のＤＮＡを含むことを特徴とする、ベータカロテンからのアスタキサンチンの製造のための組成物。
【請求項１６】
請求項３又は４に記載のポリペプチドを含むことを特徴とする、ベータカロテンからのアスタキサンチンの製造のための組成物。
【請求項１７】
請求項５又は６に記載のオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする、ベータカロテンからのアスタキサンチンの製造のための組成物。
【請求項１８】
請求項７に記載のベクターを含むことを特徴とする、ベータカロテンからのアスタキサンチンの製造のための組成物。
【請求項１９】
請求項１５〜１８に記載の組成物の使用であって、それがベータカロテンから始まるアスタキサンチンの製造に有用であることを特徴とする使用。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
基質中への酸素の挿入に関して、シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ型の酵素は真核生物では電子供与系を必要とし、タンパク質シトクロムＰ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ）である（ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｒｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８）。加えて、Ｏｊｉｍａら（２００６）は、大腸菌を互いに共存できる３種類のプラスミドで形質転換し、そのプラスミドの内の１種類はベータカロテンの合成に必要な遺伝子を含み、別のプラスミドはＸ．デンドロロウスの遺伝子ｃｒｔＳを含み、３番目は出芽酵母のＰ４５０レダクターゼを含み、この系はベータカロテンの酸化型誘導体を得ることのみ可能であり、アスタキサンチンは得られなかったという研究を記述した。これらの結果から、我々はその系における生合成経路を補完するのに適したシトクロムＰ４５０レダクターゼの配列が必要であると推論することができる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２４】
本発明は、Ｘ．デンドロロウスのｃｒｔＲ遺伝子のＤＮＡ配列に関し、その好ましい態様において、ゲノムおよび相補的ＤＮＡの配列、ならびにその遺伝子の断片、ならびにこれらの半縮重（ｓｅｍｉ−ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）またはそうでないものに関する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５２】
実施例１：Ｘ．デンドロロウスからｃｒｔＲ遺伝子のゲノムＤＮＡ配列を得る。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５３】
Ｘ．デンドロロウスのｃｒｔＲ遺伝子を単離および特性付けするため、オリゴヌクレオチドを設計してＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）の技法によりｃｒｔＲ遺伝子の一部を増幅した。この目的のため、我々は酵母クンニンハメラ・エキヌラタ、出芽酵母、およびロドトルラ・ミヌタの酵素ＣＰＲ類の遺伝子のヌクレオチド配列をＣｌｕｓｔａｌ  Ｗプログラムにより比較し、保存された領域を同定し、これらに基づいて表１において記述した半縮重オリゴヌクレオチド（ＳＥＱ４〜ＳＥＱ９）を設計し、比較した配列内でのそれらの位置を図３において示す。プライマーＳＥＱ８およびＳＥＱ４のペアを用いて、Ｘ．デンドロロウスの野生株ＵＣＤ６７−３８５のゲノムＤＮＡから、次の条件下でのＰＣＲプロトコルを用いてｃｒｔＲ遺伝子を増幅した：９５℃で３分間の最初の変性、３５サイクルの：９４℃において３０秒間の変性、５５℃において３０秒間のアニーリング、７２℃において３分間の伸長。最後の伸長の後、７２℃において１０分間。得られた増幅産物を０．８％アガロースゲルで泳動し、それから精製し、次いで配列決定した。この技法を用いて、１６４９塩基対の増幅産物を得ることができた。得られた配列をＢＬＡＳＴＸプログラムを用いて国際データベースと比較する（得られたヌクレオチド配列をアミノ酸に翻訳したものを用いてタンパク質データベースを検索する）ことにより、得られた増幅産物が他の酵母のＣＰＲ類と高い百分率の類似性を有することが分かり、カワラタケ（Ｔｒａｍｅｔｅｓ  ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）ＢＡＢ８３５８８．１（一致：６１％およびＥの値：３×１０−１４２）およびファネロキーテ・クリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）ＡＡＧ３１３５１．１（一致：５９％およびＥの値：１×１０−１３７）との一致が最大であった。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５４】
得られた配列から、それらの保存されたコーディングセグメントを分析し（ＢｌａｓｔＰプログラムを用いた）、それらに基づいてＸ．デンドロロウスのｃｒｔＲ遺伝子に特異的な新しいプライマーを設計した（ＳＥＱ１０〜ＳＥＱ１３、表１）。これらのプライマーを用いてＸ．デンドロロウスのゲノムライブラリーにおいてクローンを見つけ、コンストラクションしてプラスミドＹＩｐ５のＢａｍＨＩ部位の中に入れ、これをｃｒｔＲ遺伝子をコードするゲノムＤＮＡ断片を含むＥ．ｃｏｌｉのＤＨ５α株へのゲストとして用いた。これらのクローンの研究は、そのゲノムライブラリーのクローンの挿入断片のＰＣＲによる増幅により行われた。ｃｒｔＲ遺伝子はそれらの配列の中にＢａｍＨＩ部位を含み、従って用いたゲノムライブラリーから完全なｃｒｔＲ遺伝子を含むクローンを得ることはできなかった。しかし、我々はその遺伝子の一部を含む２種類のクローンを得た。１２８２０ｂｐの挿入断片を有する一方を完全に配列決定し、それはｃｒｔＲ遺伝子をエキソン１のヌクレオチド番号８２の塩基からその遺伝子の終わりまで含んでおり、おおよそ６５００ｂｐの挿入断片を含む他方のクローンを完全に配列決定し、それはｃｒｔＲ遺伝子のプロモーター領域およびエキソン１の８８ｂｐであった。制限酵素による消化およびプライマーＳＥＱ８およびＳＥＱ４により増幅された断片をプローブとして用いたゲノムＤＮＡのハイブリダイゼーション試験により、ｃｒｔＲ遺伝子は配列中にＳａｌＩ部位を含まず、おおよそ４９００ｂｐのＳａｌＩ断片はその遺伝子を丸ごと含むことが決定された。基本的に、この実験に関して用いられたプロトコルは次のものであった：Ｘ．デンドロロウスのＵＣＤ６７−３８５のゲノムＤＮＡを異なる制限酵素で消化し、０．８％アガロースゲル上で電気泳動した。次いでそのＤＮＡを変性させ、ナイロン膜に移し、ｃｒｔＲ遺伝子の一部に相当するＤＮＡ断片をプローブとして用いてハイブリダイゼーションを行った。膜の準備およびハイブリダイゼーションは、Ｓａｍｂｒｏｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１の標準的な方法に従って行った。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５６】
実施例２：Ｘ．デンドロロウスからのｃｒｔＲ遺伝子の相補的ＤＮＡの配列の獲得。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６２】
酵母Ｘ．デンドロロウスにおけるアスタキサンチンの生合成経路におけるｃｒｔＲ遺伝子の重要性を示すため、野性型のＸ．デンドロロウスの株におけるｃｒｔＲ遺伝子の欠失変異体を構築し、その変異体の表現型および遺伝型を元の株と比較した。この目的のため、それを形質転換ベクターの中に挿入し、ｃｒｔＲ遺伝子を含むＤＮＡ断片をハイグロマイシンＢ抗生物質に対する耐性モジュールに置き換えるようなコンストラクションを行った。このモジュールは、ＴＥＦ遺伝子（翻訳伸長因子ＥＦ−１αをコードする）のプロモーターの制御下のハイグロマイシンＢに対する抗生物質耐性遺伝子（ｈｐｈ）およびＸ．デンドロロウスのＧＰＤ遺伝子のターミネーター領域で構成されている。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６４】
ＵＣＤ６７−３８５株を、ｃｒｔＲ遺伝子の欠失およびハイグロマイシンに対する耐性のモジュールを含む線状ＤＮＡ断片を用いて形質転換した。この断片は、クローンＣＰＲ１．３ΔＢｓｉＷＩ＋ｈｙｇのエンドヌクレアーゼＳｍａＩおよびＳｐｅＩによる消化から得られた。二重の相同組換えの事象により、ＵＣＤ６７−３８５株のｃｒｔＲ遺伝子の対立遺伝子が欠失部分により置き換えられ、その結果Ｔ１３株が得られた。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６８】
上記の株のゲノムレベルでの形質転換を確認するため、我々はそれらの挿入断片により影響を受けた遺伝子座をＰＣＲにより、鋳型として形質転換体および野生株からのゲノムＤＮＡを用いて調べた。形質転換株Ｔ１３の分析に関して、次のプライマーのペア：ｇｄｐ  ｒｅｖ  ＋  ＳＥＱ５０、ＳＥＱ１４  ＋  Ｐｅｆ  ｆｗｄ、ＳＥＱ１４  ＋  ＳＥＱ５０を用いてＰＣＲ反応を行い、鋳型として野生株ＵＣＤ６７−３８５、形質転換株Ｔ１３および陰性対照として蒸留水を用いた。形質転換株ＣＢＳＴｒの分析に関して、次のプライマーのペア：Ｐｅｆ  ｆｗｄ  ＋  ＳＥＱ３５、ｇｐｄ  ｒｅｖ  ＋  ＳＥＱ３０を用いてＰＣＲ反応を行い、鋳型として野生株ＣＢＳ６９３８、形質転換株ＣＢＳＴｒおよび陰性対照として蒸留水を用い、また、プライマーペア：ＳＥＱ７５  ＋  ｈｙｇＳｅｃＲ、ＨＦ  ＋  ＳＥＱ３５、ＨｙｇＳｅｃＦ  ＋  Ｍ１３Ｆ、Ｍ１３Ｒ  ＋  ＳＥＱ１５、ＳＥＱ２０  ＋  ＳＥＱ５０およびＳＥＱ３０  ＋  ＳＥＱ５０も用い、鋳型として形質転換株ＣＢＳＴｒを用いた。これらのプライマーのいくつかはｃｒｔＲの配列とハイブリダイズせず、それらの配列を表２において詳細に述べ、それらの相対的な位置を図７において示す。ＰＣＲ反応は次のプロトコルに従って行った：９５℃において３分間の最初の変性、３５サイクルの：９４℃において３０秒間の変性、５５℃において３０秒間のアニーリング、７２℃において３分間の伸長。最後の伸長の後、７２℃において１０分間、およびそれを０．８％アガロースゲル上にロードした。得られた結果を図１０において示し、予想される増幅産物の大きさおよび得られた増幅産物の大きさの間の比較を表３において示す。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６９】
表２：形質転換株のゲノムの分析において用いた、ｃｒｔＲの配列に相補的で無いプライマー