【誤訳訂正書】
【提出日】平成26年10月24日(2014.10.24)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組織が、破壊性凍結が起こりにくい必要な細胞と、破壊性凍結が起こりやすい不要な細胞とを有するようにする前処理工程、
組織を凍結する工程、
組織をバラバラに分散させる工程、
組織を加温する工程、及び
細胞生成物を得るために、不要な細胞物質から必要な細胞を分離する工程を有し、
前記前処理工程が、必要な細胞に凍結保護剤を含む凍結保護剤溶液を注入する工程と、不要な細胞に腺管系を通じて水性溶液を注入する工程とを有する、細胞生成物を単離する方法。（但し、ヒトから組織を取得する工程を含まない。）
【請求項２】
前記組織が膵臓組織であり、前記細胞生成物が膵島である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
膵臓組織の前処理が：
膵島に、凍結保護剤を含む凍結保護剤溶液を血管系を通じて注入する工程、及び
腺房組織に、腺管系を通じて水性溶液を注入する工程を有する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
さらに、膵島を消化酵素で処理する工程を有する、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
前記凍結保護剤が、ジメチルスルホキシド、グリセロール、エチレングリコール、プロピレングリコール、ショ糖、及びトレハロースからなる群より選択される、請求項２〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記水性溶液が、水または等張性食塩水である、請求項２〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
組織の前処理工程が、必要な細胞が熱力学的に凍結保護剤と平衡になるまで、凍結保護剤溶液を組織に注入する工程を有する、請求項２〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
膵島に凍結保護剤溶液を注入する工程が、２℃〜３５℃の温度で、２０分間〜７０分間実施される、請求項２〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
膵臓組織が目にみえて膨張するまで、腺房組織に水性溶液が注入される、請求項２〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
凍結保護剤溶液中に０．５モル〜３．０モルの濃度の凍結保護剤が存在する、請求項２〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
膵臓組織の凍結が、−１０℃〜−２００℃で膵臓を凍結する工程を有する、請求項２〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
膵臓組織の凍結が、１℃／分〜２０℃／分の冷却速度で行われる、請求項２〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
膵臓組織の加温が、１２℃／分以上の加温速度で行われる、請求項２〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
膵臓組織の加温が、温かい浸透緩衝培地への組織の浸漬によってなされる、請求項２〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
膵臓組織の分散が、機械的ストレス、多様な膨張に起因する熱機械的ストレス、急勾配の温度変化に起因する熱機械的ストレス、及び凍結による体積変化に起因する熱機械的ストレス、並びにこれらの組み合わせよりなる群より選択される技術によりなされる、請求項２〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
膵臓組織の分散が、膵臓が凍結した状態、または膵臓が解凍された状態でなされる、請求項２〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
さらに、膵島からの凍結保護剤の溶出、及び膵島からの凍結保護剤の溶出の間の膵臓組織への浸透圧緩衝の適用を有する、請求項２〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
さらに、１．４ｍｇ／ｍＬ未満の濃度のコラゲナーゼの膵臓組織への添加を有する、請求項２〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
移植資源として有用な、機能的完全性を十分に保持する膵島組織を単離する方法であって、
血管及び腺管への挿管のために、生体外の膵臓を外科的に調製する工程、
前記膵臓を２℃〜３５℃に冷却する工程、
膵島組織を凍結保護剤で平衡化させる工程、
腺管への流入により、蒸留水または生理的食塩水を膵臓に注入し、凍結時の広範な氷形成を促進する工程、
膵臓を−１０℃〜−２００℃に凍結する工程、
膵臓を凍結させたまま、機械的に膵臓をバラバラに分散させる工程、
膵臓を培地に浸漬させて解凍し、凍結保護剤を溶出する工程、
膵臓をろ過する工程、
プロテアーゼ阻害剤及びデオキシリボヌクレアーゼを含む培地で膵臓を洗浄する工程、及び
膵島を勾配精製または培養する工程を有する、方法。（但し、ヒトから組織を取得する工程を含まない。）
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】発明の名称
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【発明の名称】凍結保護により細胞生成物を単離する方法
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０００４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０００４】
細胞生成物の酵素消化の必要性をなくし、または減じ、代わりに、細胞の凍結傷害への脆弱性を利用し、凍結保護性の差異を促進する技術によって、不要な組織から必要な組織を分離する、細胞生成物の分離方法を開示する。
【誤訳訂正４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０００５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０００５】
実施形態において、破壊性凍結が起こりにくい必要な細胞と、破壊性凍結が起こりやすい不要な細胞とを有する組織を提供する工程、組織を凍結する工程、組織をバラバラに分散する工程、組織を加温する工程、及び、細胞生成物を得るために、不要な細胞材料から必要な細胞を分離し、細胞生成物を取得する工程を有する方法により、細胞生成物が単離される。
【誤訳訂正５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０００６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０００６】
実施形態において、必要な細胞を破壊性凍結が起こりにくくなるように、不要な細胞を破壊性凍結が起こりやすくなるようにする組織の前処理工程、組織をバラバラに分散させる工程、組織を加温する工程、及び、細胞生成物を得るために、不要な細胞材料から必要な細胞を分離し、細胞生成物を取得する工程を有する方法により、細胞生成物が単離される。
【誤訳訂正６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０００７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０００７】
実施形態において、血管系を通して膵島組織に凍結保護剤（CPA）を含む凍結保護剤溶液を注入する工程、膵管系を通して腺房組織に水性溶液を注入する工程、膵臓を凍結する工程、膵臓をバラバラに分散させる工程、膵臓を加温する工程、及び膵島を分離する工程を有する方法によって、膵島が単離される。
【誤訳訂正７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０００８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０００８】
実施形態において、移植資源として有用な機能的完全性を保持する膵島組織は、血管及び腺管への挿管のために、生体外の膵臓を外科的に調製する工程、膵臓を約−4℃〜約−7℃まで冷却する工程、膵島組織を凍結保護剤で平衡化させる工程、膵管への流入によって膵臓に水性溶液を注入し、凍結時の広範な氷形成を促進する工程、膵臓を約−10℃〜約−200℃の温度に凍結する工程、膵臓が凍結した状態のまま、機械的に膵臓をバラバラに分散させる工程、CPAを希釈する溶媒に膵臓を浸漬させ膵臓を解凍する工程、膵臓をろ過する工程、膵臓を洗浄する工程、及び膵島細胞を勾配精製または培養する工程を有する方法で単離される。
【誤訳訂正８】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１３】
実施形態において、細胞生成物は、破壊性凍結が起こりにくい必要な細胞と、破壊性凍結が起こりやすい不要な細胞とを有する組織の提供により単離される。組織は、先天的に多様な凍結反応性を有していてもよく、その場合、破壊性凍結の際に一部の細胞が破壊されるが、残りの細胞は保護される。例えば、組織が多様な凍結時核形成温度を有する細胞を含んでいてもよく、必要な細胞が、不要な細胞より低い凝固点を有するようにしてもよい。
【誤訳訂正９】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１４】
実施形態において、細胞生成物は、必要な細胞で破壊性凍結が起こりにくく、不要な細胞で破壊性凍結が起こりやすいように、組織の前処理をする工程を用いて単離される。例えば、必要な細胞に凍結保護剤（CPA）を注入して、破壊性凍結が起こりにくくなるようにしてもよく、また、不要な細胞にCPAを含まない溶液を注入することで、より破壊性凍結を起こしやすくしてもよい。その後、組織が凍結され、バラバラに分散することで、必要な細胞が不要な細胞物質から分離され、細胞生成物を得ることができる。組織を加温し、必要な細胞を不要な細胞から分離することで、必要な細胞を有する細胞生成物を得ることができる。
【誤訳訂正１０】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１５】
実施形態において、凍結保護は、必要な細胞を選択的に保存して、不要な細胞を破壊するために用いる。凍結保護工程は、結合熱及び物質移動を組み合わせた工程であり、一般に非平衡状態で行われる。細胞または組織の単純な凍結を行うと、一般に、細胞または組織は、死んで機能しなくなってしまう。
【誤訳訂正１１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２０】
細胞の凍結保護状態からの加温は、温度が凍結レベルから溶液の融点まで上がるときに生じる、小さな氷粒からの氷の再結晶化を防止するために、通常は最大限の加温速度で実施される。再加温の間の再結晶化は、細胞に悪影響を及ぼし、細胞の生存率を低くしてしまうが、その傷害のメカニズムは完全には分かっていない。しかしながら、一般的に、細胞を急速に加温して、再結晶化が起こりやすい条件を通過してしまえば、生存度は大きくなる。
【誤訳訂正１２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２４】
実施形態において、方法は、図1A、図1B及び図1Cに示すように、膵島組織16が破壊性凍結を受けにくく、腺房組織18が破壊性凍結を受けやすいように、膵臓10を前処理する工程を有する。膵臓10は複数条件の潅流によって、膵島組織16が保存され、腺房組織18が最大限に破壊されるよう前処理される。例えば、膵島組織16には、腹腔動脈12及び上腸間膜動脈14を通るような、脈管系を通して、CPAを含む凍結保護剤溶液が注入される。膵島組織16の十分な平衡化の後、腺房組織18に膵管20を通して水性溶液が注入される。
【誤訳訂正１３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２５】
実施形態において、膵臓の前処理は、膵島組織が膵腺内で平衡化されるよう制御された条件下で行われるのが好ましい。例えば、脈管注入は約2℃〜約35°Cまでの温度で行うことができる。さらに、潅流は、CPAの浸透を伴い、膵島細胞が十分に平衡化される程度に維持されなくてはならないが、腺全体が平衡化されないようにしなくてはならない。潅流は、例えば約20分〜約70分間、例えば約25分〜約35分、また、例えば約30分維持され得る。この工程は、十分なCPAを膵島組織に到達させ、続く膵臓の凍結工程における凍結傷害から膵島組織を保護するために実施される。
【誤訳訂正１４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２６】
実施形態において、凍結保護剤溶液は、生物学的緩衝培地のような水性溶液にCPAを含有させてもよい。CPAは、例えば、DMSO、グリセロール、エチレングリコール、プロピレングリコール、ショ糖及びトレハロースからなる群より選択することができる。DMSOはグリセロールより良好なCPAであることが判明しており、約0.5〜3.0モル濃度のCPAが、低冷却速度で凍結される生物学的系の細胞傷害を最小化させる際に、多くの場合、特に効果的である。
【誤訳訂正１５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２７】
実施形態において、腺房組織に、水または等張性食塩水のような水性溶液を注入することができる。膵管への水性溶液の逆流的な注入は、上記の膵島組織への脈管注入の終了後、すぐに開始可能である。この工程は、腺房細胞を水性溶液に含浸させ、冷却及び凍結工程時の非凍結保護性腺房細胞における広範囲の破壊性の氷の形成を促進するために実施される。
【誤訳訂正１６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２９】
実施形態において、次の方法は、膵臓の凍結工程を有する。膵臓は、凍結するまで零下温度まで冷却される。この工程は、続く凍結保護性の膵島組織を切り離す膵腺分散工程のために、非保護組織における氷の形成を最大限として、組織破壊を促進するために実施される。
【誤訳訂正１７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３４】
実施形態において、凍結保護性の膵島をバラバラに分散した組織から切り離す際において、凍結と破砕が完全には効果的でない場合は、追加的に低用量の消化酵素を、最終的な結合組織の分散を補助するために有利に使用できる。低温条件下で凍結膵臓を瞬時的に剥脱させた方が有益な場合には、プローブを瞬時的に加熱して、プローブの周囲の膵臓の薄層のみを瞬時的に解凍し、プローブの膵臓への吸着等を減じてもよい。
【誤訳訂正１８】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３５】
実施形態において、膵臓はバラバラに分散し、破壊された腺房組織から凍結保護性の膵島組織が切り離される。膵臓が凍結している間、または膵臓が加温されている間に、膵臓はバラバラに分散される。実施形態において、分散は、機械的なストレス、多様な膨張から起こる熱−機械的ストレス、急な温度勾配によって起こる熱−機械的ストレス、及び凍結による体積変化によって起こる熱―機械的ストレス、またはこれらの組み合わせによって生じる。
【誤訳訂正１９】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００４１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００４１】
他の実施形態において、膵臓の分散を、凍結組織を機械的に破断させることによって行ってもよい。これは、例えば2つの段階を経て実施できる。第1の段階は、例えばハンマーやのみを用いて、凍結された膵臓を物理的に破断して小片にすることである。第2の段階は、例えば電気的氷圧搾機やブレンダーを用いて、温水または等張性培地に浸漬した凍結組織小片を破砕することである。これは、機械的な組織破砕と同時に、急速加温及び凍結保護剤の希釈をも実現するものである。
【誤訳訂正２０】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００４２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００４２】
実施形態における方法は、不要な膵臓物質から膵島を切り離す工程を更に有する。膵島組織の分離は、例えば、ろ過、密度勾配分離、組織培養、またはこれらの組み合わせによって行われる。ろ過は、ステンレス鋼メッシュ（茶こし）のようなろ過器具を用いて行われる。分離は、プロテアーゼ阻害剤（例えばPEFABLOC（登録商標））及びデオキシリボヌクレアーゼ（例えばPULMOZYMER（登録商標））を含む培地を用いてろ過された膵臓を洗う工程を包含し、傷害性を有する内因性プロテアーゼ、及び溶解した外分泌組織由来のDNAを取り除く。実施形態において、ろ過された膵臓をジチゾンのような膵島を識別するための指示薬で染色し、顕微鏡下で、完全体の膵島組織の存在の有無を観察する。
【誤訳訂正２１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００５２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００５２】
膵島の凍結保護のために広く使用される、2モルのDMSOをCPAとして使用する。CPAの脈管注入時においては、腹腔／SMAを、シールリングカニューレとペリスタポンプを用いて、4℃〜7℃の温度で30分間潅流させる。水の膵管注入時においては、膵臓が目にみえて膨張するまで、注射器を使用して膵管を通して膵臓に水を注射する。凍結工程の間、膵臓は、熱電対を埋め込んだ状態で、−196℃で沸騰する液体窒素の表面より上方に固定されたステンレス鋼トレイの上に置く。ステンレス鋼トレイは、大きな表面積を有し、フィルターを通らなかった大きな腺を冷やすのに必要な熱伝導性を有するものとする。膵臓組織の粉砕時に関して、凍結した組織を直接温かい培地に浸漬することで熱ショックを起こさせ、組織を破断する。または、温かい培地を入れた電動氷粉砕機において、機械的に組織を切断する。この方法によれば、急速な加温と希釈が促進される。
【誤訳訂正２２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００５５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００５５】
上記の結果より、周囲の腺房組織の破壊を促進するとともに、完全な膵島の組織内（in situ）凍結保護を可能とする、単一の膵臓に適用可能な多様な凍結条件の概念が示された。
【誤訳訂正２３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００５６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００５６】
実施例２：膵臓の凍結破壊の間、膵島を組織内（in situ）で選択的に保護し、腺を破砕して生存する膵島を切り離すために多条件凍結技術を使用する。特に、最初に生体外（ex vivo）の膵臓を外科的に準備し、血管及び膵管の挿管に供する。動物個体間差を生じないため、また実験に要するブタの数を限定するため、葉を分割する方法を使用する。この方法においては、ブタ膵臓は、下記のように頭部と尾部とで、それぞれ独立した潅流ができるように、外科的に準備される。比較例群（従来の酵素法）及び実施例群（凍結単離）として、それぞれ6サンプルについて試験を行った。