(57)【要約】【課題】ＲＡＮＫＬ拮抗作用を有する低分子化合物、その製造方法ならびにその用途を提供する。【解決手段】下記一般式〔Ｉ〕【化１】2004075625.tif 000023〔式中、Ｒ１及びＲ２は各々同一又は異なってメチル基又はメトキシ基を表し、【化２】2004075625.tif 000024は、単結合または二重結合を表す。〕で示される化合物又はその薬理的に許容しうる塩。シューソスポラ（Ｃｅｕｔｈｏｓｐｏｒａ）属に属する微生物を培養し、その培養物又は培養物の処理物から当該化合物を採取することを特徴とする当該化合物の製造方法。当該化合物を有効成分とする医薬組成物。また、当該化合物のＲＡＮＫＬ拮抗薬としての使用。【選択図】　　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式〔Ｉ〕
【化１】
2004075625.tif 000017
〔式中、Ｒ１及びＲ２は各々同一又は異なってメチル基又はメトキシ基を表し、
【化２】
2004075625.tif 000018
は、単結合または二重結合を表す。〕
で示される化合物又はその薬理的に許容しうる塩。
【請求項２】
シューソスポラ属に属する微生物の培養物中から取得できるものである請求項１記載の化合物又はその薬理的に許容しうる塩。
【請求項３】
下式〔Ａ１〕
【化３】
2004075625.tif 000019
で示される化合物（ＴＭＣ−３１５Ａ１）又はその薬理的に許容しうる塩。
【請求項４】
下式〔Ａ２〕
【化４】
2004075625.tif 000020
で示される化合物（ＴＭＣ−３１５Ａ２）又はその薬理的に許容しうる塩。
【請求項５】
下式〔Ｂ１〕
【化５】
2004075625.tif 000021
で示される化合物（ＴＭＣ−３１５Ｂ１）又はその薬理的に許容しうる塩。
【請求項６】
下式〔Ｂ２〕
【化６】
2004075625.tif 000022
で示される化合物（ＴＭＣ−３１５Ｂ２）又はその薬理的に許容しうる塩。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項記載の化合物又はその薬理的に許容しうる塩の製造方法であって、シューソスポラ属に属する微生物を培養し、その培養物又は培養物の処理物から当該化合物を採取する工程を含むことを特徴とする製造方法。
【請求項８】
シューソスポラ属に属する微生物が、Ｃｅｕｔｈｏｓｐｏｒａ　ｓｐ．ＴＣ１６７８（ＦＥＲＭ　Ｐ−１８８７９）である請求項７記載の製造方法。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の化合物又はその薬理的に許容しうる塩の、ＲＡＮＫＬ拮抗薬としての使用。
【請求項１０】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の化合物又はその薬理的に許容しうる塩を用いて、ＲＡＮＫＬの機能を抑制する方法。
【請求項１１】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の化合物又はその薬理的に許容しうる塩を有効成分とする医薬組成物。
【請求項１２】
ＲＡＮＫＬ拮抗薬である請求項１１記載の医薬組成物。
【請求項１３】
ＲＡＮＫＬの機能を抑制することにより病態改善が見込まれる疾患の治療又は予防のための医薬である請求項１１記載の医薬組成物。
【請求項１４】
骨そしょう症の治療又は予防のための医薬である請求項１１記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＲＡＮＫＬ（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ａｃｔｉｖａｔｏｒ　ｏｆ　ＮＦ−κＢ　ｌｉｇａｎｄ）に対する拮抗作用を有する低分子化合物（ＴＭＣ−３１５Ａ１、ＴＭＣ−３１５Ａ２、ＴＭＣ−３１５Ｂ１およびＴＭＣ−３１５Ｂ２、又はそれらの薬理的に許容しうる塩）およびその製造法ならびにその用途（該化合物を有効成分とする医薬組成物など）に関する。
【０００２】
【従来の技術】
骨組織においては、破骨細胞による骨吸収と骨芽細胞による骨形成が絶え間なく繰り返されている。正常時には、骨吸収と骨形成の両過程が機能的平衡を保っており骨量は一定に保たれるが、この平衡状態が破綻し骨代謝異常が生じると疾患の原因となる。
【０００３】
例えば、骨粗鬆症は、骨吸収が骨形成を上回るような骨代謝異常により発生する代表的な疾患である。骨粗鬆症は「骨の減少と骨組織の微細構造の劣化を特徴とし、その結果骨の脆弱化が増大し、骨折の危険性をきたす疾患」と定義されている。
原発性のものと続発性のものとに大きく分類され、前者には閉経後骨粗鬆症や老人性骨粗鬆症が含まれ、後者には副腎皮質ホルモン過剰、甲状腺機能亢進症、慢性関節リウマチ等に伴う骨粗鬆症が含まれる。
【０００４】
骨粗鬆症患者の多くは原発性であり、なかでも閉経後骨粗鬆症が圧倒的多数を占めている。閉経後骨粗鬆症では、女性ホルモンの欠乏が引金となって骨の吸収と形成の双方が促進されるが、骨形成が骨吸収に追い付かず骨塩量が低下して脊椎などの海綿骨組織の脆弱化が進むとされている。
【０００５】
老人性骨粗鬆症は、加齢による骨形成不全やビタミンＤ作用の低下、腸からのカルシウム吸収能の低下などの原因が重なることによって起こり、脊椎のほか、大腿骨などの長管骨の皮質骨も弱くなって大腿骨骨折を起こしやすいとされている。
また、骨粗鬆症は、寝たきり老人の原因疾患のうち二番目に多い疾患であることから、高リスク患者の早期診断、有効な予防方法や治療方法の開発は、社会的にも大きな課題となっている。
【０００６】
骨粗鬆症の治療薬としては、過剰な骨吸収を抑えたり、カルシウム代謝を改善する薬剤が現在主に使用されている。例えば、活性型ビタミンＤ３製剤は腸管からのカルシウム吸収を促進する。また、エストロゲン製剤などを用いたホルモン療法は、閉経後に低下した女性ホルモンを補うものである。また、組織選択的なエストロゲン作用薬（ＳＥＲＭ；ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ　ｅｓｔｒｏｇｅｎ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｍｏｄｉｆｉｅｒ）は、骨と脂質代謝にはエストロゲン様に働く一方、子宮内膜癌と乳癌に対しては抗エストロゲン作用を発揮するため副作用が少ないという点で注目を集めている。また、ビスフォスフォネートは骨に選択的に取り込まれ破骨細胞による骨吸収を強力に抑制する。
【０００７】
しかしながら、これらの薬物はいずれも副作用等の問題があったり、ターゲット分子が明確ではない等の問題もあり、メカニズムベースの新しい治療薬開発が望まれていた。
【０００８】
一方、最近、骨代謝のメカニズムに関する研究の進展の中で、骨芽細胞（ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ）と破骨細胞（ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ）の分化や活性化を制御する生理活性蛋白質や受容体について、関心が高まり精力的な研究が進められている。
【０００９】
骨芽細胞の増殖や分化に関与するサイトカインとしては、繊維芽細胞増殖因子ファミリー（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ；　ＦＧＦ）、インシュリン様増殖因子‐Ｉ（Ｉｎｓｕｌｉｎ　ｌｉｋｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ−Ｉ；　ＩＧＦ−Ｉ）、インシュリン様増殖因子−ＩＩ（Ｉｎｓｕｌｉｎ　ｌｉｋｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ−ＩＩ；　ＩＧＦ−ＩＩ）、アクチビンＡ（ＡｃｔｉｖｉｎＡ）、トランスフォーミング増殖因子−β　（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｍｎｇ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ−β；　ＴＧＦ−β）、異所骨形成因子ファミリー（Ｂｏｎｅ　ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎ；　ＢＭＰ）に属するもの（ＢＭＰ−２、ＯＰ−１等）などが報告されている。
【００１０】
一方、破骨細胞の分化（又は成熟）を抑制するサイトカインとしては、トランスフォーミング増殖因子−β　（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｍｎｇ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ−β；　ＴＧＦ−β）、インターロイキン−４（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−４；　ＩＬ−４）、インターフェロン−γ（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｇａｍｍａ；　ＩＦＮ−γ）、オステオプロテゲリン（Ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ：　ＯＰＧ）が報告されている。また、破骨細胞による骨吸収を抑制する因子としてカルシトニン（Ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ　ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ　ｆａｃｔｏｒ；　Ｍ−ＣＳＦ）、ＩＬ−４、ＩＦＮ−γ、ＯＰＧが報告されている。
【００１１】
また、骨芽細胞の細胞表面に存在するＲＡＮＫＬ（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ａｃｔｉｖａｔｏｒ　ｏｆ　ＮＦ−κＢ　ｌｉｇａｎｄ）は、構造上ＴＮＦファミリーに属し、破骨細胞分化誘導因子（Ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ；　ＯＤＦ）あるいはＴＲＡＮＣＥ（ＴＮＦ−ｒｅｌａｔｅｄ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ　ｃｙｔｏｋｉｎｅ）とも呼ばれるが、破骨細胞活性化に関与する因子として大きな注目を集めている。ＲＡＮＫＬは、破骨細胞およびその前駆細胞の細胞表面に発現するＲＡＮＫ（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ａｃｔｉｖａｔｏｒ　ｏｆ　ＮＦ−κＢ）と結合して破骨細胞およびその前駆細胞を活性化し、それら細胞の分化・成熟、寿命延長、骨吸収亢進を誘導することが報告されている。
〔Ｍａｎｏｌａｇａｓら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ　Ｒｅｖ．、２１巻、１１５頁、２０００年；
（ＯＤＦ）Ｙａｓｕｄａら、Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ、９５巻、３５９７頁、１９９８年；
（ＯＤＦ）Ｌａｃｅｙら、Ｃｅｌｌ、９３巻、１６５頁、１９９８年；
（ＲＡＮＫＬ）　Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３９０巻、１７５−１７９頁、１９９７年；
（ＴＲＡＮＣＥ）Ｗｏｎｇら、　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．、２７２巻、２５１９０頁、１９９７年〕
さらに、破骨細胞の分化抑制因子として同定された前記のＯｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ（ＯＰＧ）は、ＲＡＮＫの細胞外ドメインと類似の構造を有しており、デコイ受容体として機能することによりＲＡＮＫＬ（ＯＤＦ、ＴＲＡＮＣＥ）とＲＡＮＫの結合を阻害して破骨細胞の分化を抑制することが知られている。このような機能から、ＯＰＧは新規なメカニズムを持った骨粗鬆症治療薬として期待され開発が進められている（Ｂｅｋｋｅｒら、Ｂｏｎｅ　Ｍｉｎｅｒ．　Ｒｅｓ．、１６巻、３４８頁、２００１年）。しかし、ＯＰＧは蛋白質製剤であるため、投与方法が限定されるといった問題やコストの問題などがある。
【００１２】
上記のような、ＲＡＮＫＬ（ＯＤＦ、ＴＲＡＮＣＥ）、ＲＡＮＫ及びＯＰＧに関する知見から、ＲＡＮＫＬ（ＯＤＦ、ＴＲＡＮＣＥ）とＲＡＮＫとの結合を選択的に阻害する作用を持った低分子化合物が得られれば、新しい骨粗鬆症治療薬の開発につながるかもしれないと期待される。しかしながら、このような選択的阻害作用を持った低分子化合物はいまだに見つかっていない。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、優れたＲＡＮＫＬ拮抗作用を有する低分子化合物（特にＲＡＮＫＬとＲＡＮＫとの結合を選択的に阻害する作用を持った低分子化合物）を提供することにある。また、その製造方法ならびにその用途（該化合物を有効成分とする医薬組成物など）を提供することにある。
【００１４】
また、本発明の他の目的は、ＲＡＮＫＬ拮抗作用を有する低分子化合物のスクリーニング、同定、又は特徴付けを行う方法を提供することにある。また、上記以外の目的については以下の記載より明らかである。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、種々の微生物の培養物を検討したところ、シューソスポラ（Ｃｅｕｔｈｏｓｐｏｒａ）属に属する微生物の培養物中にＲＡＮＫＬ拮抗作用を示す化合物群を見出した。さらに、この化合物群を培養物から分離し、それらの物理化学的性質を検討して化学構造を決定した。その結果、この化合物群には、共通の基本骨格を有する４つの新規化合物が含まれることを見出し、それぞれＴＭＣ−３１５Ａ１、ＴＭＣ−３１５Ａ２、ＴＭＣ−３１５Ｂ１及びＴＭＣ−３１５Ｂ２と命名した。
【００１６】
すなわち、本発明は、下記一般式〔Ｉ〕
【００１７】
【化７】
2004075625.tif 000002
【００１８】
〔式中、Ｒ１及びＲ２は各々同一又は異なってメチル基又はメトキシ基を表し、
【００１９】
【化８】
2004075625.tif 000003
【００２０】
は、単結合または二重結合を表す。〕
で示される化合物又はその薬理的に許容しうる塩である。
【００２１】
本発明は、より詳細には、シューソスポラ属に属する微生物の培養物中から取得でき、一般式〔Ｉ〕で示される化合物又はその薬理的に許容しうる塩である。
【００２２】
本発明の化合物としては、以下の（１）〜（４）の化合物が含まれる。
（１）下式〔Ａ１〕
【００２３】
【化９】
2004075625.tif 000004
【００２４】
で示される化合物（ＴＭＣ−３１５Ａ１と称する）又はその薬理的に許容しうる塩。
（２）下式〔Ａ２〕
【００２５】
【化１０】
2004075625.tif 000005
【００２６】
で示される化合物（ＴＭＣ−３１５Ａ２と称する）又はその薬理的に許容しうる塩。
（３）下式〔Ｂ１〕
【００２７】
【化１１】
2004075625.tif 000006
【００２８】
で示される化合物（ＴＭＣ−３１５Ｂ１と称する）又はその薬理的に許容しうる塩。
（４）下式〔Ｂ２〕
【００２９】
【化１２】
2004075625.tif 000007
【００３０】
で示される化合物（ＴＭＣ−３１５Ｂ２と称する）又はその薬理的に許容しうる塩。
【００３１】
また、本発明は、シューソスポラ（Ｃｅｕｔｈｏｓｐｏｒａ）属に属する微生物を培養し、その培養物又は培養物の処理物から当該化合物を採取することを特徴とする当該化合物の製造法である。
【００３２】
さらに、本発明は、上記化合物またはそれらの薬理的に許容しうる塩を有効成分とする医薬組成物〔ＲＡＮＫＬの機能を抑制することにより病態改善が見込まれる疾患（骨そしょう症等）の治療又は予防のための医薬等〕である。
【００３３】
さらに、本発明は、上記化合物またはそれらの薬理的に許容しうる塩についてのＲＡＮＫＬ拮抗薬としての使用、及び、上記化合物またはそれらの薬理的に許容しうる塩を用いてＲＡＮＫＬの機能を抑制する方法を含む。
【００３４】
【発明の実施の形態】
本発明の化合物（ＴＭＣ−３１５Ａ１、ＴＭＣ−３１５Ａ２、ＴＭＣ−３１５Ｂ１およびＴＭＣ−３１５Ｂ２等）は、例えば、それらを生産する能力を有する微生物を培養し、その培養物又は培養処理物から本発明の化合物を採取することにより製造することができる。
【００３５】
本発明の化合物（ＴＭＣ−３１５Ａ１、ＴＭＣ−３１５Ａ２、ＴＭＣ−３１５Ｂ１およびＴＭＣ−３１５Ｂ２等）を生産する能力を有する微生物としては、カビ等の微生物が挙げられ、より詳細には、例えば、シューソスポラ（Ｃｅｕｔｈｏｓｐｏｒａ）属に属する微生物が挙げられる。かかるシューソスポラ（Ｃｅｕｔｈｏｓｐｏｒａ）属に属する微生物としては、具体的には例えば、本願発明者らが土壌から分離した菌株「Ｃｅｕｔｈｏｓｐｏｒａ　ｓｐ．ＴＣ１６７８」（以下、ＴＣ１６７８株とも称する）が挙げられる。このＴＣ１６７８株は、独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センターに寄託され、平成１４（２００２）年６月１０日、受託番号ＦＥＲＭ　Ｐ−１８８７９として受託された。
【００３６】
ＴＣ１６７８株の菌学的性質は下記の通りである。
オートミール寒天上でのコロニーは、よく成育し、ロゼット状をなし、２５℃、７日で６０ｍｍとなり、綿毛状ないし縄状を呈し、淡オリーブ色（マンセル　５Ｙ７／４）、裏面も類似色を呈する。分生子殻はコロニーの中心部に散在し、表在性または寒天中に形成され、単生または数個が群生しストローマ状となる。
【００３７】
麦芽エキス寒天上でのコロニーは、良く成育し、２５℃、７日で７０ｍｍ以上となり、黒色の菌糸が表面から寒天中まで網目状をなし、表面には無色の菌糸束が綿毛状に立ち上がる。オリーブ色から暗オリーブ色（５Ｙ３／２）。裏面はほとんど黒色である。
【００３８】
じゃがいもブドウ糖寒天（ＰＤＡ）上で、コロニーは良く生育し、２５℃、７日で７０ｍｍ以上となり、オリーブ色（５Ｙ４／４）を呈する。
【００３９】
三浦培地上では、コロニーの生育は、より貧弱で、菌糸は薄く這い、ほとんど無色。分生子殻は表面に散在し、単褐色で菌糸に覆われ、稀に個生、通常は数個が群生しストローマとなる。
【００４０】
生育温度範囲は、５℃から３０℃で、適温は１０〜２５℃である。生育ｐＨ範囲は、２．０〜８．０で、至適ｐＨは３．０〜６．０である。
【００４１】
分生子殻はフラスコ型で、密に絡まった菌糸で覆われ、基部は球形で単褐色、直径１００−２００μｍ　（平均　１５０μｍ）で、上端に明瞭な暗褐色のビークを生じ、特にオートミール寒天状では顕著、ビークの長さは４５−５８μｍ、孔口は直径３５−４５μｍ、フィアライドは、６．５−１１．０　ｘ　２．５−３．０μｍ　（平均　８．０　ｘ　３．０μｍ）で、分生子殻内部の基部の円筒形細胞から層状に平行に立ち上がり、数回分岐し、その先端に分生子を次々と着生し、無色塊状となる。
【００４２】
分生子は無色、１細胞、平滑、円筒形で両端が少し尖り、時に基部が肥大し、先端にゼラチン質の付属物を有することがあり、本体は１０．０〜１８．０ｘ２．５〜４．０μｍ　　（平均１１．５ｘ３．０μｍ）で、付属物はうすい布状で帚星状をなし、長さ３．０〜４．５ｘ２．５〜３．５μｍ　（平均３．５ｘ３．０μｍ）である。
【００４３】
丸底フラスコ型の特徴的な分生子殻を形成し、複数個が集合し、しばしばストローマ状となる。個々の分生子殻上部に暗褐色の明瞭なビークを１個生じる。分生子形成細胞は数回分岐した分生子柄先端にフィアライドとして形成、分生子は円筒形で先端にゼラチン質の付属部を有する。
【００４４】
以上の特徴から、サットン（Ｓｕｔｔｏｎ，Ｂ．Ｃ．，１９８０　Ｔｈｅ　Ｃｏｅｌｏｍｙｃｅｔｅｓ．　ＣＡＢ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，　Ｅｇｈａｍ．　６９６ｐｐ．）およびナグ・ラジＮａｇ．Ｒａｊ，　Ｔ．Ｒ．，１９９３Ｃｏｅｌｏｍｙｃｅｔｏｕｓ　ａｎａｍｏｒｐｈｓ　ｗｉｔｈ　ａｐｐｅｎｄａｇｅ−ｂｅａｒｉｎｇ　ｃｏｎｉｄｉａ．　Ｍｙｃｏｌｏｇｕｅ　Ｐｕｂ．，Ｗａｔｅｒｌｏｏ．　１６０〜１８８ｐｐ．）の成書に従えば、本菌は分生子果不完全菌の、Ｃｅｕｔｈｏｓｐｏｒａ　Ｇｒｅｖｉｌｌｅに属することが明らかであり、本菌をＣｅｕｔｈｏｓｐｏｒａ　ｓｐ．と同定した。
【００４５】
ＴＣ１６７８株は、一般の糸状菌同様、変異しやすい性質を有している。例えば、ＴＣ１６７８株又は由来の突然変異株、形質接合株、遺伝子組換え体であっても、本発明の化合物（ＴＭＣ−３１５Ａ１、ＴＭＣ−３１５Ａ２、ＴＭＣ−３１５Ｂ１およびＴＭＣ−３１５Ｂ２等）を生産する能力を有するを有するものであれば、本発明の化合物の製造のために使用することができる。
【００４６】
本発明の化合物を生産する能力を有する微生物の培養は、かかる微生物の菌株を栄養源を含む培地に接種して生育させることにより実施できる。
【００４７】
本発明において、微生物の培養は、使用する微生物の性質に応じて、この分野において慣用的に用いる培養条件を適宜選択して行うことができる。通常、例えば、慣用の炭素源、窒素源および無機塩類含有培地中、ｐＨ３〜９で、常温ないし加温下で実施できる。また、培地は固体培地又は液体培地が好ましく、通常、培養は好気的に行われる。
【００４８】
培地中に含有せしめる栄養源としては、微生物が栄養源として使用しうる通常の炭素源と窒素源を使用することができる。このような窒素源としては、例えば、ペプトン、肉エキス、コーン・スティープ・リカー、綿実粉、落花生粉、大豆粉、酵母エキス、ＮＺ−アミン、カゼイン水解物、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム等が挙げられる。また、炭素源としては、例えば、デンプン、グリセリン、シュークロース、グルコース、ガラクトース、マンノース、糖蜜、脂肪などが挙げられる。また、培地には、これら炭素源及び窒素源に加えて、食塩、炭酸カルシウム、リン酸塩、硫酸マグネシウムなどを添加してもよい。
【００４９】
培養温度は、通常、２０〜４０℃で実施できる。ＴＣ１６７８株等、シューソスポラ属微生物の場合は、２０〜３５℃、より好ましくは約２７℃付近で実施することが好ましい。
【００５０】
培養物としては、培養液、菌体（生菌体又は洗浄菌体）などが挙げられる。また、かかる培養物の処理物としては、例えば、培養上清、乾燥菌体、菌体破砕物、菌体抽出物などが挙げられる。
【００５１】
例えば、生菌体もしくは培養上清は、培養液から遠心分離及び／又はろ過等の操作により得ることができる。また、生菌体を生理食塩水等で洗浄することにより洗浄菌体を得ることができ、生菌体や洗浄菌体等を凍結乾燥またはアセトン乾燥することによる乾燥菌体を得ることができる。また、生菌体、洗浄菌体等を種々の物理化学的方法（例えば、超音波、フレンチプレス、浸透圧、凍結融解、アルミナ破壊、溶菌酵素、界面活性剤または有機溶媒等での処理）で処理することにより、菌体破砕物を得ることができる。また、これら菌体破砕物をろ過または遠心分離などに供した後固形物を除去することにより菌体抽出物を得ることができる。
【００５２】
本発明の化合物は、前記のような培養物もしくはその処理物から、遊離のままあるいはその塩として、単離精製することができる。単離精製は、抽出、濃縮、結晶化、ろ過、再結晶、各種クロマトグラフィーなど通常の化学的操作を適用して実施できる。また各種の塩は、通常用いられる造塩処理に付すことにより製造できる。
【００５３】
本発明の化合物は、遊離の形でも、薬理的に許容し得る塩の形でも使用することができる。薬理的に許容しうる塩としては、慣用の無毒性塩であればよく、例えば塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩又は臭化水素酸塩の如き無機酸塩、酢酸塩、フマル酸塩、シュウ酸塩、クエン酸塩、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、トシル酸塩又はマレイン酸塩の如き有機酸塩等が挙げられる。
【００５４】
本発明の化合物又はその薬理的に許容しうる塩は、その分子内塩や付加物、それらの溶媒和物或いは水和物等をいずれも含むものである。
【００５５】
さらに、本発明の化合物又はその薬理的に許容しうる塩は、骨格中に不斉炭素を持つため光学異性体が存在しうるが、それらの各異性体、およびそれらの混合物のいずれをも含むものである。
【００５６】
本発明の化合物又はその薬理的に許容しうる塩は、ＲＡＮＫＬの機能に対しこれを抑制する作用を有する。より詳細に述べれば、本発明の化合物又はその薬理的に許容しうる塩は、ＲＡＮＫＬに対して拮抗作用（以下、ＲＡＮＫＬ拮抗作用）を有する。本発明の化合物（とりわけＴＭＣ−３１５Ｂ２）が有するＲＡＮＫＬ拮抗作用は選択性が高い。ＴＭＣ−３１５Ｂ２は、ＲＡＮＫＬ類似蛋白質であるＴＮＦに対しては全くもしくはほとんど拮抗作用を示さず、ＴＭＣ−３１５Ｂ２のＲＡＮＫＬに対する拮抗作用は、ＴＮＦに対する作用の１００倍以上である。
【００５７】
また、本発明の化合物又はその薬理的に許容しうる塩は、ＲＡＮＫＬ拮抗作用に基づいて、ＲＡＮＫＬの機能を抑制し、破骨細胞の分化を抑制する。
【００５８】
従って、本発明の化合物又はその薬理的に許容しうる塩は、ＲＡＮＫＬにより介在される疾患（すなわち、ＲＡＮＫＬの機能を抑制することにより病態の改善が見込まれる疾患）の予防又は治療薬としての効果を発揮することが期待される。かかる疾患としては、骨代謝（例えば破骨細胞の分化等）に関連する疾患が挙げられ、具体的には、例えば、骨粗鬆症、大理石病、骨軟化症、高カルシウム血症などが挙げられる。
【００５９】
化合物のＲＡＮＫＬ拮抗作用（ＲＡＮＫＬとＲＡＮＫとの結合を阻害する作用）は、例えば、被験化合物の存在下もしくは非存在下にＲＡＮＫＬとＲＡＮＫとの結合を検出することによりアッセイできる。かかるアッセイは、例えば、後記実施例２記載の方法に準じて実施できるが、これに限定されるものではない。
【００６０】
化合物がＲＡＮＫＬの機能を抑制する作用は、例えば、レポータアッセイ法などを用い、被験化合物の存在下もしくは非存在下で、「ＲＡＮＫＬによって誘導されるＮＦ−κＢ活性化」を検出することによりアッセイできる。かかるアッセイは、例えば、後記実施例３記載の方法や文献（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３９０巻、１７５−１７９頁、１９９７年；　Ｗｏｎｇら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７３巻、２８３５５−２８３５９頁、１９９８年など）に記載の方法に準じて実施できるが、これに限定されるものではない。かかるアッセイのための細胞としては、ＮＦ−κＢ結合配列がレポータ遺伝子の上流に連結されたＤＮＡ構成を含む細胞株、ＨＥＫ２９３　９−１株などが好適に使用できる。
【００６１】
破骨細胞の分化に対する抑制作用は、例えば、骨髄細胞との共存培養系を用い、被験化合物の存在下もしくは非存在下で、破骨細胞の分化の度合いを検出することによりアッセイできる。かかるアッセイは、例えば、後記実施例４記載の方法や文献（Ｈｓｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９６巻、３５４０−３５４５頁、１９９９年など）に記載の方法に準じて実施できるが、これに限定されるものではない。
【００６２】
また、骨代謝に関連する疾患（例えば、骨粗鬆症、大理石病、骨軟化症、高カルシウム血症など）に対する薬効の評価方法としては、例えば、頭頂骨器官培養系における骨吸収を調べる方法や、ＴＰＴＸラットを用いた高カルシウム血症モデルにおける作用（血中カルシウム濃度上昇の抑制作用）を調べる方法等が適用できる。これら方法は、例えば後記実施例５及び実施例６記載に記載の方法等に準じて実施できるが、これに限定されるものではない。
【００６３】
ＲＡＮＫＬ拮抗作用、ＲＡＮＫＬの機能及びそれを抑制する作用等をアッセイする方法、もしくは、骨代謝に関連する疾患に対する薬効を評価する方法としては、上記のほか、例えば以下の文献及び成書に記載された方法を適宜適用することができる。
・Ｍａｎｏｌａｇａｓ　Ｅ．Ｃ．，　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ　Ｒｅｖｉｅｗｓ，　２１巻、１１５−１３７頁，　２０００年
・「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ｏｆ　Ｂｏｎｅ　Ｂｉｏｌｏｇｙ」
（Ｊ．Ｐ．　Ｂｉｌｅｚｉｋａｎ，　Ｌ．Ｇ．　Ｒａｉｓｚ，　Ｇ．Ａ．　Ｒｏｄａｎ，　ｅｄｓ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　Ｉｎｃ．，　Ｕ．Ｓ．Ａ．
（ｐｐ．１２５３−１２６５，　Ｃｈａｐｔｅｒ　９１，　Ｇｒｏｎｏｗｉｃｚ　ａｎｄ　Ｌ．Ｇ．Ｒａｉｓｚ，”Ｂｏｎｅ　Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ　Ａｓｓａｙｓ”他）
ＲＡＮＫＬ（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ａｃｔｉｖａｔｏｒ　ｏｆ　ＮＦ−κＢ　ｌｉｇａｎｄ）（ＯＤＦ，　ＴＲＡＮＣＥとも称する）のｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列はすでに報告されている
（Ｇｅｎｂａｎｋ／ＥＭＢＬ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＡＦ０１９０４７；Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３９０巻、１７５−１７９頁、１９９７年；Ｗｏｎｇら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７２巻、２５１９０−２５１９４頁、１９９７年）。
また、ＲＡＮＫ（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ａｃｔｉｖａｔｏｒ　ｏｆ　ＮＦ−κＢ）（ＲＡＮＫＬ（ＯＤＦ，　ＴＲＡＮＣＥ）の受容体）のｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列もすでに報告されている
（Ｇｅｎｂａｎｋ／ＥＭＢＬ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＡＦ０１８２５３；Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３９０巻、１７５−１７９頁、１９９７年）。従って、ＲＡＮＫＬもしくはＲＡＮＫは、例えば前記既知配列情報に基づいて、通常の遺伝子工学的手法により、ｃＤＮＡを単離し、組換え型蛋白質を適当な宿主細胞内で発現させることにより調製して取得することができる。
【００６４】
本発明の化合物又はその薬理的に許容しうる塩は、医薬として用いる際、投与方法は特に限定されず、経口的にも非経口的にも投与することができる。また、錠剤、顆粒剤、カプセル剤、散剤、注射剤、吸入剤等の慣用の医薬製剤として用いることができる。例えば、本発明の化合物を、一般的な医薬において許容される結合剤、崩壊剤、増量剤、充填剤、滑沢剤などの賦活剤あるいは希釈剤とともに用い、通常の方法により、製剤化して用いることができる。
【００６５】
本発明の化合物又はその薬理的に許容し得る塩の投与量は、投与方法、患者の年令、体重、状態によっても異なるが、通常、１日当り約０．０１〜３００ｍｇ／ｋｇ、とりわけ約０．１〜３０ｍｇ／ｋｇ程度とするのが好ましい。
【００６６】
以下、実施例をもって本発明をさらに詳しく説明するが、これらの実施例は本発明を制限するものではない。
【００６７】
なお、下記実施例において、各操作は特に明示がない限り、「モレキュラークローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）」（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，　Ｊ．，　Ｆｒｉｔｓｃｈ，　Ｅ．Ｆ．及びＭａｎｉａｔｉｓ，　Ｔ．　著、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓより１９８９年に発刊）に記載の方法により行うか、または、市販の試薬やキットを用いる場合には市販品の指示書に従って使用した。
【００６８】
【実施例】
実施例１
（１）ＴＣ１６７８株の培養
ＴＣ１６７８株（Ｃｅｕｔｈｏｓｐｏｒａ　ｓｐ．ＴＣ　１６７８）の分生子を７０ｍＬの種培地〔脱イオン水１０００ｍＬにグルコース１０ｇ、ポリペプトン５ｇ、乾燥酵母５ｇ、Ｖ−８ジュース（キャンベルジャパン社製）２００ｍＬ、アップルジュース（キリントロピカーナインク社製）２００ｍＬ及び炭酸カルシウム５ｇを添加したもの〕を含む５００ｍＬ容の三角フラスコに植菌して、２７℃、２２０ｒｐｍにて４日間振とう培養した。
【００６９】
前記で得られた種培養液を１ｍＬずつ本培養固体培地〔脱イオン水２０ｍＬに押し麦２０ｇ、酵母エキス０．０４ｇ、シュウ酸ナトリウム０．０２ｇ及びリン酸二水素カリウム０．０２ｇを添加したもの〕を含む５００ｍＬ容の三角フラスコ３０本に植菌して、２７℃にて１２日間静置培養した。
【００７０】
（２）培養物からの化合物単離
前記（１）で得られた培養物に、ｎ−ブタノール（各三角フラスコ当たり６０ｍＬ）を加え、ロータリー・シェーカー（２２０回転／分）上２７℃で３０分間振とうした後、菌体を濾過した。得られたｎ−ブタノール抽出液１．５Ｌを減圧濃縮した後、これに水１００ｍＬを加え等量の酢酸エチルで２回抽出した。得られた抽出液を減圧濃縮後、これに９０％含水メタノール１５０ｍＬを加え等量のｎ−ヘキサンで１回洗浄した後、含水メタノール層を減圧濃縮して緑黄色の固体５．２５ｇを得た。
【００７１】
得られた緑黄色の固体を少量の塩化メチレンとメタノールの混液（１：１）に溶解後、あらかじめ塩化メチレンとメタノールの混液（１：１）で平衡化したセファデックスＬＨ−２０（ファルマシア社製、４０ｍｍＸ４４０ｍｍ）のカラムにかけ、同溶剤でゲル濾過した。溶出液の各フラクションについて、ＲＡＮＫＬ拮抗作用を指標として測定し、化合物ＴＭＣ−３１５Ａ１、ＴＭＣ−３１５Ａ２、ＴＭＣ−３１５Ｂ１及びＴＭＣ−３１５Ｂ２を含むフラクションを回収した。これを減圧濃縮して黄色の粉末２．７９ｇを得た。
【００７２】
前記で得られた黄色の粉末を、少量のジメチルスルホキシドに溶解した。次いで、３０％アセトニトリル含有０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ３．５）に懸濁した逆相系シリカゲル（ＹＭＣ社製ＹＭＣ−ＧＥＬ　ＯＤＳ（Ａ６０））を充填したカラム塔（４０ｍｍＸ４００ｍｍ）に、前記の溶解液を負荷した。
【００７３】
カラム塔を、同溶剤０．５Ｌ、次いで５５％アセトニトリル含有０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ３．５）３．９Ｌで展開溶出した。溶出液は、分析用逆相系高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）でモニターして、化合物ＴＭＣ−３１５Ａ１、ＴＭＣ−３１５Ａ２、ＴＭＣ−３１５Ｂ１及びＴＭＣ−３１５Ｂ２の各々を含むフラクションを分取した。各フラクションについて、減圧下でアセトニトリルを除去後、ｎ−ブタノール１００ｍＬで抽出し、５０ｍＬの水で２回洗浄して減圧下濃縮することにより粉末状の粗画分を得た。
〔ＴＭＣ−３１５Ａ２、ＴＭＣ−３１５Ｂ１及びＴＭＣ−３１５Ｂ２の粗画分として、それぞれ１５７９．２ｍｇ（淡黄色粉末）、４４０．６ｍｇ（淡黄色粉末）、２７５．１ｍｇ（黄色粉末）及び２４３．４ｍｇ（黄色粉末）を得た。〕
（３）精製
化合物ＴＭＣ−３１５Ａ１を含む粗画分１００ｍｇを、少量のジメチルスルホキシドに溶解後、分取用高速液体クロマトグラフィー〔カラム：ＹＭＣ社製ＹＭＣＰａｃｋ　Ｄ−ＯＤＳ−５−Ｂ（３０ｍｍＸ２５０ｍｍ）、溶媒：５５％アセトニトリルを含有する０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ３．５）、流速：２５ｍＬ／分〕を使用して分画した。活性画分を分取し、減圧濃縮によりアセトニトリルを除去した後、残渣をｎ−ブタノールで抽出した。ｎ−ブタノール層を水洗後、濃縮乾固した。ＴＭＣ−３１５Ａ１を含む粉末を少量の塩化メチレンとメタノールの混液（１：１）に溶解後、あらかじめ塩化メチレンとメタノールの混液（１：１）で平衡化したセファデックスカラム（ファルマシア社製、ＬＨ−２０、２２ｍｍＸ４２０ｍｍ）のカラムにかけ、同一溶剤でゲル濾過し、活性画分を減圧濃縮し、ＴＭＣ−３１５Ａ１　４７．２ｍｇ（淡黄色粉末）を精製物として得た。
【００７４】
化合物ＴＭＣ−３１５Ａ２、ＴＭＣ−３１５Ｂ１及びＴＭＣ−３１５Ｂ２の各々を含む粗画分（各１００ｍｇ）についても、前記と同様にして精製を行った。〔但し、ＴＭＣ−３１５Ａ２、ＴＭＣ−３１５Ｂ１及びＴＭＣ−３１５Ｂ２についての分取用高速液体クロマトグラフィーにおいては、５０％アセトニトリル、６０％アセトニトリル及び５５％アセトニトリルを含有する０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ３．５）を各々溶媒として用いた。〕
かくして、ＴＭＣ−３１５Ａ２　４６．２ｍｇ（淡黄色粉末）、ＴＭＣ−３１５Ｂ１　４４．７ｍｇ（黄色粉末）およびＴＭＣ−３１５Ｂ２　４６．３ｍｇ（黄色粉末）を各々精製物として得た。
【００７５】
（４）化合物の物理化学的性状
これら化合物の物理化学的性状は以下の通りであった。
【００７６】
（４−１）ＴＭＣ−３１５Ａ１
１）物質の性状：　淡黄色粉末
２）分子量：　ｍ／ｚ　６１１（Ｍ＋Ｈ，ＥＳＩマスのスペクトルによる）
３）分子式：　Ｃ３２Ｈ３４Ｏ１２
４）比旋光度：　［α］Ｄ３０＝＋２３３°（ｃ＝０．１９、メタノール）
５）紫外部吸収スペクトル（メタノール溶液）　λｍａｘ，ｎｍ　（ｌｏｇε）：
２１０（４．５６）、２７４（３．９２）、３４５（４．６８）（図１参照）
６）赤外部吸収スペクトル（ＫＢｒ打錠）ｃｍ−１　：
１６００、１５７５、１４５０、１４２０、１３７０、１３５０、１２９５、１２３０、１２００、１１６５、１１３０、１１０５、１０３５、９９５（図２参照）
７）１Ｈ核磁気共鳴スペクトル（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６、内部標準；テトラメチルシラン）δ　ｐｐｍ：
１．１８（３Ｈ，ｄ）、１．５４（３Ｈ，ｓ）、１．５５（３Ｈ，ｓ）、２．０３（３Ｈ，ｄ）、２．２９（１Ｈ，ｍ）、２．３〜２．４（２Ｈ，ｍ）、２．６８（１Ｈ，ｍ）、２．７３（１Ｈ，ｍ）、３．４４（３Ｈ，ｓ）、　３．７８（３Ｈ，ｓ）、３．８５（１Ｈ，ｍ）、３．８７（１Ｈ，ｍ）、４．１８（１Ｈ，ｍ）、４．２２（１Ｈ，ｄ）、４．３１（１Ｈ，ｍ）、６．１７（１Ｈ，ｓ）、６．３６（１Ｈ，ｄ）、１１．６２（１Ｈ，ｓ）、１１．８５（１Ｈ，ｓ）、１３．７２（１Ｈ，ｂｒｓ）、１３．８０（１Ｈ，ｂｒｓ）（図３参照）
８）１３Ｃ核磁気共鳴スペクトル（１００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６、内部標準；テトラメチルシラン）δ　ｐｐｍ：
１８．３（ｑ）、２１．０（ｑ）、２６．１（ｑ）、２６．３（ｑ）、２９．８（ｄ）、３２．７（ｔ）、３３．６（ｔ）、５６．１（ｑ）、５６．５（ｑ）、７１．６（ｄ）、７４．９（ｄ）、７５．１（ｄ）、８２．０（ｓ）、８３．４（ｓ）、９３．１（ｄ）、１０１．７（ｓ）、１０４．７（ｓ）、１０５．１（ｓ）、１０５．３（ｓ）、１０５．８（ｓ）、１１０．０（ｄ）、１１４．７（ｓ）、１５１．１（ｓ）、１５８．３（ｓ）、１６１．２（ｓ）、１６１．４（ｓ）、１６１．６（ｓ）、１６６．５（ｓ）、１７５．７（ｓ）、１７６．９（ｓ）、１８７．９（ｓ）、１８８．７（ｓ）（図４参照）
９）溶解度：
メタノール、アセトニトリル、アセトン、酢酸エチル、クロロホルム、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシドに易溶。エタノール、ｎ−ブタノールに可溶。ｎ−ヘキサン、水に不溶。
１０）呈色反応：　ヨウ素、硫酸に陽性。ニンヒドリンに陰性。
【００７７】
（４−２）ＴＭＣ−３１５Ａ２
１）物質の性状：　淡黄色粉末
２）分子量：　ｍ／ｚ　６１１（Ｍ＋Ｈ，ＥＳＩマスのスペクトルによる）
３）分子式：　Ｃ３２Ｈ３４Ｏ１２
４）比旋光度：　［α］Ｄ３０＝＋２２８°（ｃ＝０．１５、メタノール）
５）紫外部吸収スペクトル（メタノール溶液）　λｍａｘ，ｎｍ　（ｌｏｇε）：
２１０（４．５４）、２８０（３．８８）、３４１（４．６５）（図５参照）
６）赤外部吸収スペクトル（ＫＢｒ打錠）ｃｍ−１　：
１６１０、１５８０、１４５０、１４２０、１３７５、１３５０、１３００、１２８０、１２３０、１１７５、１１２０、１０９５、１０７５、１０５５、１０３５、９８５（図６参照）
７）１Ｈ核磁気共鳴スペクトル（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６、内部標準；テトラメチルシラン）δ　ｐｐｍ：
１．５５（３Ｈ，ｓ）、２．０２（３Ｈ，ｍ）、２．６８（１Ｈ，ｍ），２．７３（１Ｈ，ｍ）、３．４４（３Ｈ，ｓ）、３．８９（１Ｈ，ｄｄｄ）、４．２７（１Ｈ，ｄ）、４．３２（１Ｈ，ｍ）、６．４２（１Ｈ，ｄ）、１１．６７（１Ｈ，ｓ）、１３．７７（１Ｈ，ｂｒｓ）（図７参照）
８）１３Ｃ核磁気共鳴スペクトル（１００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６、内部標準；テトラメチルシラン）δ　ｐｐｍ：
２０．９（ｑ）、２６．３（ｑ）、３２．７（ｔ）、５６．１（ｑ）、７１．５（ｄ）、７４．９（ｄ）、８２．１（ｓ）、１０５．３（ｓ）、１０５．４（ｓ）、１１０．４（ｄ）、１１７．１（ｓ）、１５０．７（ｓ）、１５８．５（ｓ）、１６０．５（ｓ）、１７５．９（ｓ）、１８８．７（ｓ）（図８参照）
９）溶解度：　クロロホルム、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシドに易溶。メタノール、アセトニトリル、アセトン、酢酸エチル、に可溶。エタノール、ｎ−ブタノール、ｎ−ヘキサン、水に不溶。
１０）呈色反応：　ヨウ素、硫酸に陽性。ニンヒドリンに陰性。
【００７８】
（４−３）　ＴＭＣ−３１５Ｂ１
１）物質の性状：　黄色粉末
２）分子量：　ｍ／ｚ　６０９（Ｍ＋Ｈ，ＥＳＩマスのスペクトルによる）
３）分子式：　Ｃ３２Ｈ３２Ｏ１２
４）比旋光度：　［α］Ｄ３０＝−２８°（ｃ＝０．３８、メタノール）
５）紫外部吸収スペクトル（メタノール溶液）　λｍａｘ，ｎｍ　（ｌｏｇε）：
２０４（４．６０）、２３５（肩４．４０）、２７９（４．０７）、３５６（４．５０）、３８５（４．４７）、４０８（肩４．３５）（図９参照）
６）赤外部吸収スペクトル（ＫＢｒ打錠）ｃｍ−１　：
１７２５、１６０５、１５８０、１５６０、１４５５、１４２５、１３７０、１３３０、１２９５、１２３５、１２０５、１１６５、１１０５、１０６０、１０３５、１０００（図１０参照）
７）１Ｈ核磁気共鳴スペクトル（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６、内部標準；テトラメチルシラン）δ　ｐｐｍ：
１．１７（３Ｈ，ｄ）、１．４８（３Ｈ，ｓ）、１．５５（３Ｈ，ｓ）、２．０２（３Ｈ，ｄ）、２．２９（１Ｈ，ｍ）、２．３〜２．４（２Ｈ，ｍ）、３．７９（３Ｈ，ｓ）、３．８５（１Ｈ，ｍ）、３．９２（３Ｈ，ｓ）、４．０２（１Ｈ，ｄｄ）、４．１９（１Ｈ，ｂｒｓ）、４．９９（１Ｈ，ｄ）、５．３９（１Ｈ，ｄ）、６．１７（１Ｈ，ｓ）、６．３４（１Ｈ，ｄ）、１１．７６（１Ｈ，ｂｒｓ）、１１．８４（１Ｈ，ｓ）、１３．７３（１Ｈ，ｂｒｓ）、１４．５２（１Ｈ，ｂｒｓ）（図１１参照）
８）１３Ｃ核磁気共鳴スペクトル（１００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６、内部標準；テトラメチルシラン）δ　ｐｐｍ：
１８．３（ｑ）、２０．９（ｑ）、２３．３（ｑ）、２６．１（ｑ）、２９．７（ｄ）、３３．６（ｔ）、５６．５（ｑ）、５７．５（ｑ）、７４．４（ｄ）、７５．１（ｄ）、８０．７（ｓ）、８３．４（ｓ）、９３．１（ｄ）、９４．８（ｄ）、９９．５（ｓ）、１０１．７（ｓ）、１０４．７（ｓ）、１０４．７（ｓ）、１０６．０（ｓ）、１０９．７（ｄ）、１１４．７（ｓ）、１４９．６（ｓ）、１５７．７（ｓ）、１６０．５（ｓ）、１６１．３（ｓ）、１６１．６（ｓ）、１６６．５（ｓ）、１７３．７（ｓ）、１７４．４（ｓ）、１７６．８（ｓ）、１８４．６（ｓ）、１８８．０（ｓ）（図１２参照）
９）溶解度：　メタノール、エタノール、アセトニトリル、アセトン、酢酸エチル、クロロホルム、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシドに易溶。ｎ−ブタノールに可溶。ｎ−ヘキサン、水に不溶。
１０）呈色反応：　ヨウ素、硫酸に陽性。ニンヒドリンに陰性。
【００７９】
（４−４）　ＴＭＣ−３１５Ｂ２
１）物質の性状：　黄色粉末
２）分子量：　ｍ／ｚ　６０９（Ｍ＋Ｈ，ＥＳＩマスのスペクトルによる）
３）分子式：　Ｃ３２Ｈ３２Ｏ１２
４）比旋光度：　［α］Ｄ３０＝−３６°（ｃ＝０．４６、メタノール）
５）紫外部吸収スペクトル（メタノール溶液）　λｍａｘ，ｎｍ　（ｌｏｇε）：
２０９（４．５６）、２２８（肩４．４４）、２７９（４．０４）、３４６（４．４０）、３８７（４．４６）、４０８（肩４．３５）（図１３参照）
６）赤外部吸収スペクトル（ＫＢｒ打錠）ｃｍ−１　：
１７２５、１６１０、１５８０、１５６０、１４５０、１３６５、１３５０、１３００、１２７５、１２３０、１２０５、１１６０、１１３０、１０９５、１０５５、１０４５、１０００（図１４参照）
７）１Ｈ核磁気共鳴スペクトル（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６、内部標準；テトラメチルシラン）δ　ｐｐｍ：
１．４９（３Ｈ，ｓ）、１．５５（３Ｈ，ｓ）、２．０１（３Ｈ，ｄ）、２．０３（３Ｈ，ｄ）、２．６８（１Ｈ，ｍ）、２．７３（１Ｈ，ｍ）、３．４４（３Ｈ，ｓ）、３．８８（１Ｈ，ｄｄｄ）、３．９３（３Ｈ，ｓ）、４．０４（１Ｈ，ｂｒｓ）、４．２６（１Ｈ，ｂｒｓ）、４．３２（１Ｈ，ｂｒｓ）、４．９９（１Ｈ，ｂｒｄ）、５．４１（１Ｈ，ｂｒｓ）、６．３９（１Ｈ，ｄ）、６．４２（１Ｈ，ｄ）、１１．６６（１Ｈ，ｓ）、１１．８２（１Ｈ，ｓ）、１３．７８（１Ｈ，ｂｒｓ）、１４．４９（１Ｈ，ｂｒｓ）（図１５参照）
８）１３Ｃ核磁気共鳴スペクトル（１００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６、内部標準；テトラメチルシラン）δ　ｐｐｍ：
２０．８（ｑ）、２０．９（ｑ）、２３．３（ｑ）、２６．３（ｑ）、３２．７（ｔ）、５６．１（ｑ）、５７．５（ｑ）、７１．５（ｄ）、７４．４（ｄ）、７４．９（ｄ）、８０．８（ｓ）、８２．０（ｓ）、９４．８（ｄ）、９９．６（ｓ）、１０４．９（ｓ）、１０５．３（ｓ）、１０５．４（ｓ）、１１０．０（ｄ）、１１０．３（ｄ）、１１７．２（ｓ）、１１７．４（ｓ）、１４９．２（ｓ）、１５０．７（ｓ）、１５７．９（ｓ）、１５８．５（ｓ）、１５９．８（ｓ）、１６０．５（ｓ）、１７３．８（ｓ）、１７４．６（ｓ）、１７５．９（ｓ）、１８４．６（ｓ）、１８８．７（ｓ）（図１６参照）
９）溶解度：　メタノール、アセトニトリル、アセトン、酢酸エチル、クロロホルム、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシドに易溶。エタノール、ｎ−ブタノールに可溶。ｎ−ヘキサン、水に不溶。
１０）呈色反応：　ヨウ素、硫酸に陽性。ニンヒドリンに陰性。
【００８０】
実施例２　ＲＡＮＫＬ−ＲＡＮＫ結合に対する阻害作用（ＲＡＮＫＬ拮抗作用）
（１）ＲＡＮＫＬ（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ　ＲＡＮＫＬ）の発現と調製
報告されたヒトのＲＡＮＫＬ（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ａｃｔｉｖａｔｏｒ　ｏｆ　ＮＦ−κＢ　ｌｉｇａｎｄ）（ＯＤＦ，　ＴＲＡＮＣＥとも称する）の遺伝子配列情報（Ｇｅｎｂａｎｋ／ＥＭＢＬ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＡＦ０１９０４７；Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３９０巻、１７５−１７９頁、１９９７年）を利用して、以下のようにヒトＲＡＮＫＬをコードするｃＤＮＡを取得した。
【００８１】
まず、ヒト白血球（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ）のｃＤＮＡライブラリーを鋳型にし、後記配列表の配列番号３及び４に示した核酸配列を有する合成オリゴヌクレオチドを各々、センスプライマー及びアンチセンスプライマーとして用い、ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ）を行った。〔ＰＣＲは、９４℃　１分　→　５５℃　２分→　７２℃　３分の条件で３０サイクル行った。〕
得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動に供し、バンドを切り出して、
増幅したＤＮＡ断片（約８００ｂｐ）（天然型ヒトＲＡＮＫＬの第７１番目のアミノ酸残基Ａｒｇから第３１７番目のアミノ酸残基Ａｓｐまでの領域をコードする配列を含み両端に制限酵素認識部位を含むリンカー配列が付加されたＤＮＡ断片）を得た。これをベクタープラスミドｐＧＥＭＴ−ｅａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）にサブクローニングし、プラスミド（ｐＧＥＭＴ−ｈＯＤＦ）を得た。
【００８２】
次いで、これを制限酵素ＸｈｏＩ−ＸｂａＩで消化し、ＸｈｏＩ−ＸｂａＩ断片をベクタープラスミドｐＴｈｉｏＨｉｓＣ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）のＸｈｏＩ−ＸｂａＩ切断部位に連結してプラスミド（ｐＨＰ−ｈＯＤＦ５）を得た。さらに、これをＸｈｏＩ−ＳｔｕＩで切断後、末端を平滑化してライゲーションすることにより、ＸｈｏＩ−ＳｔｕＩ断片を除去して、プラスミド（ｐＴＨ−ΔｈＯＤＦ）を得た。
【００８３】
このプラスミド（ｐＴＨ−ΔｈＯＤＦ）は、天然型ヒトＲＡＮＫＬ（配列番号１）の中の第１２２番目のアミノ酸残基Ａｌａから第３１７番目のアミノ酸残基Ａｓｐまでのアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするｃＤＮＡが、ｌａｃオペレータ制御下にあるＴｒｃプロモータの下流に連結されており、前記ポリペプチドを発現させるための発現ベクターである。
【００８４】
全長ＲＡＮＫＬは大腸菌中で発現させた場合に不溶化するという問題があるが、Ｎ末端側を欠失させた前記ポリペプチド（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ　ＲＡＮＫＬ）は、大腸菌中でも不溶化することなく発現させることができる。
【００８５】
前記で得た発現ベクター（ｐＴＨ−ΔｈＯＤＦ）を大腸菌ＪＭ１０９株に導入した。この菌株を、３７℃で一晩振盪培養した後、新たなＬＢ培地中に３％植菌し、これを３０℃で培養した。ＯＤ６６０が約２．０になった時点で、ＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）（ｌａｃオペレータ脱抑制物質）を最終濃度０．１ｍＭになるように添加し、さらに一晩培養した。培養液から菌を回収し、１／１０量の緩衝液Ｉ〔２０ｍＭリン酸ｂｕｆｆｅｒ　（ｐＨ７．８），　０．５Ｍ　ＮａＣｌ〕に懸濁後、超音波破砕した。これを遠心分離（１００００ｘｇ，２０分）し、上清を分取した。
【００８６】
これをアフィニティカラムクロマトグラフィー用カラム（ＨｉＴｒａｐ　Ｃｈｅｌａｔｉｎｇカラム、アマシャム・ファルマシア製）にアプライし、緩衝液Ｉ〔２０ｍＭリン酸ｂｕｆｆｅｒ　（ｐＨ７．８），　０．５Ｍ　ＮａＣｌ〕（５カラム用量）で洗浄した後、さらに２０ｍＭイミダゾール（５カラム用量）で洗浄した。次いで、２０−５０ｍＭイミダゾールの直線勾配（２０カラム用量）によって溶出（溶出緩衝液：５００ｍＭ　イミダゾールを含む緩衝液Ｉ）し、５ｍｌ毎分画した。各画分につき、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動及びウェスタンブロッティングに供し、ＲＡＮＫＬを含む画分を回収した。
【００８７】
前記で回収した画分を２００倍量の０．１ｍＭＰＭＳＦ（Ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ　ｆｌｕｏｒｉｄｅ）を含む緩衝液ＩＩ〔２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ＨＣｌ（ｐＨ７．５）〕に対して透析し、これを陰イオン交換クロマトグラフィー用カラム（ＨｉＴｒａｐ　Ｑ、アマシャム・ファルマシア製）にアプライした。緩衝液ＩＩ（５カラム用量）で洗浄後、０−１Ｍ　ＮａＣｌの直線勾配（４０カラム用量）で５ｍｌ毎分画した。各画分につき、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動及びウェスタンブロッティングに供し、ＲＡＮＫＬを含む画分を回収した。
【００８８】
かくして、精製されたＲＡＮＫＬ（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ　ＲＡＮＫＬ）（天然型ヒトＲＡＮＫＬ（配列番号１）の中の第１２２番目のアミノ酸残基Ａｌａから第３１７番目のアミノ酸残基Ａｓｐまでに相当するアミノ酸配列からなるポリペプチド）を得た。
【００８９】
（２）ＲＡＮＫ−Ｆｃ融合蛋白質の発現と調製
報告されたヒトのＲＡＮＫ（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ａｃｔｉｖａｔｏｒ　ｏｆ　ＮＦ−κＢ）（ＲＡＮＫＬ受容体）の遺伝子配列情報　（Ｇｅｎｂａｎｋ／ＥＭＢＬ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＡＦ０１８２５３；Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３９０巻、１７５−１７９頁、１９９７年）を利用し、ＰＣＲ法により、ヒトＲＡＮＫをコードするｃＤＮＡを取得した。ＰＣＲの際、鋳型としてはヒト白血球（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ）のｃＤＮＡライブラリーを用いた。取得したＤＮＡ断片は、ヒトＲＡＮＫのシグナルペプチドおよび細胞外ドメインを含む領域（天然型ヒトＲＡＮＫの中の第１番目のアミノ酸残基Ｍｅｔから第１７１番目のアミノ酸残基Ｐｒｏまでに相当する領域）をコードする。このＤＮＡ断片を、バキュロウイルストランスファーベクター（以下、ウイルスベクター）ｐＶＬ１３９２（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）のポリヘドリンプロモータの下流に連結してウイルスベクターを得た。
【００９０】
得られたウイルスベクターを、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域をコードするｃＤＮＡと連結させ、融合蛋白質発現用ウイルスベクター（ｐＶＬ−ＲＡＮＫ−Ｆｃ）を得た。ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域をコードするｃＤＮＡは、文献（Ｎａｔｕｒｅ、３４４巻、６６７−６７０頁、１９９０年）記載の方法に準じて取得したものであり、ヒトＩｇＧ１のＣ末端から２２７番目のアスパラギン酸残基までをコードしている。
【００９１】
かくして得られた融合蛋白質発現用ベクター（ｐＶＬ−ＲＡＮＫ−Ｆｃ）は、ＲＡＮＫ（天然型ヒトＲＡＮＫの中の第１番目のアミノ酸残基Ｍｅｔから第１７１番目のアミノ酸残基Ｐｒｏまでに相当する領域）のＣ末端側にヒトＩｇＧ１のＦｃ領域が融合した蛋白質を発現させるためのウイルスベクターである。
【００９２】
この融合蛋白質発現用ベクター（ｐＶＬ−ＲＡＮＫ−Ｆｃ）を、昆虫細胞Ｓｆ９（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に導入し、形質転換細胞（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔ　ｃｅｌｌ）を得た。形質転換細胞の培養上清４ｍｌを、昆虫細胞Ｓｆ９（２ｘ１０７ｃｅｌｌｓ／１５０ｃｍ２／２５ｍｌ）の培養液中に添加し、４日間培養することで１ｓｔ　ｖｉｒｕｓ溶液を得た。１ｓｔ　ｖｉｒｕｓ溶液５ｍｌを用いて同様に増幅を行い２ｎｄ　ｖｉｒｕｓ溶液を得た。同様の操作を繰り返し、４ｔｈ　ｖｉｒｕｓ溶液を得た。４ｔｈ　ｖｉｒｕｓ溶液１００μｌをＳｆ２１細胞（２ｘ１０７ｃｅｌｌｓ）の培養液中に添加して５日間培養し、培養上清（５０ｍｌ）を得た。
【００９３】
アフィニティカラムクロマトグラフィー用カラム（ＨｉＴｒａｐ　Ｃｈｅｌａｔｉｎｇカラム、アマシャム・ファルマシア製）をＰＢＳで平衡化した後、これに前記で得た培養上清５０ｍｌをアプライした。これをＰＢＳ（８ｍｌ）で洗浄した後、Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙｓｉｎ緩衝液（ｐＨ２．７）で溶出し１ｍｌ毎分画した。溶出と同時に各分画には１Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を０．１ｍｌずつ添加した。抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃポリクローナル抗体を用いたウエスタンブロッティングを各画分について行い、陽性のものをＲＡＮＫ−Ｆｃ融合蛋白質を含む画分として選択・回収した。
【００９４】
かくして、精製されたＲＡＮＫ−Ｆｃ融合蛋白質（天然型ヒトＲＡＮＫ（配列番号２）の中の第１番目のアミノ酸残基Ｍｅｔから第２１２番目のアミノ酸残基Ｐｒｏまでに相当する領域のＣ末端側にヒトＩｇＧ１のＦｃ領域を融合させた蛋白質）を得た。
【００９５】
（３）ＲＡＮＫＬ−ＲＡＮＫ結合に対する阻害作用のアッセイ
前記（２）で得た精製ＲＡＮＫ−Ｆｃ融合蛋白質（１００ｎｇ／ｍｌ、２０ｍＭＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液ｐＨ７．５中）をイムノプレート（Ｎｕｎｃ社製）に添加（１００μｌ／ｗｅｌｌ）して固相化した。３０℃で３時間放置後、ブロックエース（雪印社製）を１５０μｌ／ｗｅｌｌ加え、４℃で一晩インキュベートした。
【００９６】
次いで、これに前記（１）で得た精製ＲＡＮＫＬ（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ　ＲＡＮＫＬ）を、細胞培養用培地（ダルベッコＭＥＭ；以下Ｄ−ＭＥＭ）（１００μｌ／ｗｅｌｌ）中、終濃度１００ｎｇ／ｍｌとなるように調製して加え、さらにこれに被験化合物（ＴＭＣ３１５−Ｂ２等）を添加して２時間インキュベートした。
これを０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を添加した　ＴＢＳ（Ｔｒｉｓ　Ｂｕｆｆｅｒ　Ｓａｌｉｎｅ）（０．９％ＮａＣｌを含む２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．５）（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を添加した　ＴＢＳを以下ＴＢＳ−Ｔと称する）で洗浄後、抗チオレドキシンモノクローナル抗体（フナコシ社製）（ＴＢＳ−Ｔで５０００倍希釈したもの）を１００μｌ／ｗｅｌｌ添加し、１．５時間静置した。ＴＢＳ−Ｔで洗浄後、アルカリフォスファターゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体（プロメガ社製）（ＴＢＳ−Ｔで２０００倍希釈したもの）を１００ｕｌ／ｗｅｌｌで添加し、１．５時間静置した。ＴＢＳ−Ｔで洗浄後、アルカリフォスファターゼ活性測定用キット（Ｋｉｒｋｅｇａａｄ　ａｎｄ　Ｐｅｒｒｙ　Ｌａｂ社製）でアルカリフォスファターゼ活性を測定した。酵素反応の停止は等量の５％ＥＤＴＡを加えることにより行った。
【００９７】
被験化合物としてＴＭＣ３１５−Ｂ２を用いて、前記のようにしてＲＡＮＫＬ−ＲＡＮＫ結合に対する阻害作用を調べた結果、化合物ＴＭＣ３１５−Ｂ２はＲＡＮＫＬ−ＲＡＮＫ結合を濃度依存的に阻害することがわかった。本阻害のＩＣ５０値は０．６１μＭであった。
【００９８】
実施例３　ＲＡＮＫＬ誘導ＮＦ−κＢ活性化に対する抑制作用
（１）アッセイに用いる細胞株の取得
ＲＡＮＫＬにより誘導されるＮＦ−κＢ活性化に対する抑制作用を調べるため、アッセイに用いる細胞株を、以下のようにして得た。
【００９９】
ｐＮＦκＢ−Ｌｕｃは、ＮＦ−κＢ　結合配列　（ＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣ）を含むオリゴヌクレオチドが、ホタルルシフェラーゼ遺伝子　（Ｌｕｃ）　の上流に連結されたＤＮＡ構成を含むレポータープラスミドである。このプラスミドと薬剤耐性遺伝子（Ｇ４１８耐性遺伝子）を含むベクタープラスミドとを同時にヒト胎児腎細胞由来細胞株　ＨＥＫ２９３に共トランスフェクトし、薬剤耐性（Ｇ４１８耐性）を安定に発現する細胞株（すなわち、２種のプラスミド由来のＤＮＡが染色体上に組み込まれた可能性の高い細胞株）を単離した。
【０１００】
次いで、これら単離した細胞株の中から、ＲＡＮＫＬに対し良好な反応性を示す株を選択し、これをＨＥＫ２９３　９−１株と名づけた。細胞株ＨＥＫ２９３　９−１は、ＮＦ−κＢ　結合配列がレポーター遺伝子（ルシフェラーゼ遺伝子）の上流に連結されたＤＮＡ構成を染色体上に含む。また、細胞株ＨＥＫ２９３　９−１は、ＲＡＮＫＬによる刺激に対して良好なＮＦ−κＢ活性化を示し、ＲＡＮＫＬ刺激時には非刺激時に比べて約１０〜３０倍のレポータ活性（ルシフェラーゼ活性）の上昇が認められた。
【０１０１】
（２）ＲＡＮＫＬ誘導ＮＦ−κＢ活性化に対する抑制作用のアッセイ
（レポータアッセイ（ルシフェラーゼアッセイ））
前記（１）で得たＨＥＫ２９３　９−１細胞を用い、レポータアッセイ（ルシフェラーゼアッセイ）を以下のように実施することにより、ＲＡＮＫＬ（又はＴＮＦ−α）刺激により誘導されるＮＦ−κＢ活性化及びこれに対する各被験化合物の抑制作用を測定した。
【０１０２】
すなわち、前記で得たＨＥＫ２９３　９−１株を、９６穴プレートに８×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ（８０μｌ／ｗｅｌｌ）播種した。３７℃、５％ＣＯ２下で２４時間培養後、ＲＡＮＫＬ（最終濃度２００ｎｇ／ｍｌ）〔またはＴＮＦ−α（最終濃度５ｎｇ／ｍｌ）〕及び被験化合物（ｉｎ０．１％ＤＭＳＯ）を添加（もしくは非添加）した培地を加え（２０μｌ／ｗｅｌｌ）、さらに５時間培養した。
培養後の細胞に、ルシフェラーゼアッセイ用の基質溶液〔Ｓｔｅａｄｙ−ＧｌｏＴＭ　Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ　Ａｓｓａｙ　Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）またはＢｒｉｇｈｔ−　ＧｌｏＴＭ　Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ　Ａｓｓａｙ　Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）〕　５０μｌ／ｗｅｌｌを加え、室温で１５分間（Ｂｒｉｇｈｔ−　Ｇｌｏの場合は５分間）静置した後ｍｉｘｉｎｇし、１秒間の発光度値を測定・積算した。被験化合物の代わりに０．１％ＤＭＳＯのみを添加した場合の測定値をＦｕｌｌ活性値とし、また、ＲＡＮＫＬ（またはＴＮＦ−α）非添加時の測定値をブランクとして差し引いた。
【０１０３】
かくしてＲＡＮＫＬ（又はＴＮＦ−α）刺激により誘導されるＮＦ−κＢ活性化及びこれに対する各被験化合物の抑制作用を、ルシフェラーゼ活性を指標として測定した。その結果、化合物ＴＭＣ３１５−Ｂ２は、ＲＡＮＫＬ刺激によるＮＦ−κＢ活性化（ルシフェラーゼ活性上昇を濃度依存的に抑制した（ＩＣ５０値＝０．０８６ｕＭ）。一方、ＴＮＦ刺激によるＮＦ−κＢ活性化（ルシフェラーゼ活性上昇）に対しては、化合物ＴＭＣ３１５−Ｂ２は、ほとんど抑制作用を示さなかった（ＩＣ５０値＞１６μＭ）。
【０１０４】
実施例４　破骨細胞の分化に対する抑制作用
骨髄細胞との共存培養系を用い、破骨細胞の分化に対する被験化合物の作用を以下のようにして調べた。
【０１０５】
骨髄細胞と破骨細胞との共存培養は、宇田川らの文献（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１２５巻、１８０５−１８１３頁、１９８９年）記載の方法に準じて行った。まず、新生仔ＢＤＦ１マウスの頭頂骨をコラーゲナーゼ処理して初代培養骨芽細胞を調製した（２ｘ１０７　ｃｅｌｌｓ　／ｍｌで保存）。また、６週齢ＢＤＦ１マウスの脛骨から骨髄細胞を採取した。
【０１０６】
得られた初代培養骨芽細胞及び骨髄細胞を、各々２．５ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ及び２．５ｘ１０６ｃｅｌｌｓ　／ｍｌになるように４８穴プレートに播種し（０．４ｍｌ／ｗｅｌｌ）、被験化合物の存在下もしくは非存在下に共培養した。培地としては、ビタミンＤ３（１ｘ１０−８　Ｍ）、ＰＧＥ２（１ｘ１０−６　Ｍ）及び１０％ウシ胎児血清を含むα−ＭＥＭ培地を用い、これに被験化合物を添加（もしくは非添加）した。培養３日後、０．３ｍｌを同培地で培地交換しさらに３日間培養した。培養後の細胞をＴＲＡＰ染色に供し、３核以上のＴＲＡＰ陽性細胞を、分化した破骨細胞として計数した。
【０１０７】
その結果、化合物ＴＭＣ３１５−Ｂ２は、破骨細胞の分化を抑制する作用を有することがわかった（ＩＣ５０値＝２．７μＭ）。
【０１０８】
実施例５　頭頂骨器官培養系における骨吸収に対する抑制作用
頭頂骨器官培養系を用い、頭頂骨における骨吸収に対する被験化合物の作用を以下のようにして調べた。手順はＨａｒａらの方法（Ｈａｒａら、　Ｂｏｎｅ　、１６巻，　１７９−１８４頁，　１９９５年）に準じ、一部改良して行った。
【０１０９】
まず、７日齢の新生児ＩＣＲマウスから頭頂骨を採取し、これをＰＢＳ（−）−ＳＰ（＋）　（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ　Ｇ　１００　Ｕ／ｍｌ及び　ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ　ｓｕｌｆａｔｅ　１００　μｇ／ｍｌを含むｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒｅｄ　ｓａｌｉｎｅ）で洗浄した。次に鳩目抜きを用い、冠状・ラムダ状・矢状縫合を含まない様に、左右の頭頂骨から一枚ずつ円状（直径約４．５　ｍｍ）に二枚切り抜き、ＰＢＳ（−）−ＳＰ（＋）中で保存した。切り出した頭頂骨を一枚ずつ２４穴プレートにとり、０．１％　ウシ血清アルブミン含有　ダルベッコＭＥＭ培地　１．５ｍｌ中で一日間前培養した。前培養後、これを４８穴プレートに移し、ＰＧＥ２（１μＭ）及び被験化合物を添加（もしくは非添加）した培地中（０．７５　ｍｌ　／　ｗｅｌｌ）で培養した。５日間培養後、カルシウム測定キット（カルシウム　Ｃ−テストワコー、和光純薬製）を用いて培養上清中のＣａ濃度を測定することにより、ＰＧＥ２による骨吸収に対する被験化合物の作用（ＰＧＥ２による骨吸収に対する阻害率）を評価した。ＰＧＥ２により促進された骨吸収（ＰＧＥ２添加群のＣａ濃度からＰＧＥ２非添加群のＣａ濃度差し引いた値）を１００％とし、阻害率を算出した。
【０１１０】
その結果、ＰＧＥ２による骨吸収に対し、化合物ＴＭＣ３１５−Ｂ２は、１０μｇ／ｍｌで８６％これを抑制した。
【０１１１】
実施例６　高カルシウム血症モデルにおける作用
（血中カルシウム濃度上昇の抑制作用）
高カルシウム血症モデルとしてＴＰＴＸラットを用い、以下のようにして被験化合物の作用を調べた。高カルシウム血症モデル（ＴＰＴラット）は、Ｙａｍａｍｏｔｏらの方法（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１３９巻、４０１２−４０１５頁、１９９８年）に準じて作製した。
【０１１２】
まず、７週齢の雄性ラットの甲状腺および副甲状腺を摘除して内因性のＰＴＨ（ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ　ｈｏｒｍｏｎｅ；　副甲状腺ホルモン）を欠失させ、血清カルシウム濃度が低下したラットを作製した。甲状腺および副甲状腺の摘除はエーテル麻酔下でラットの喉の筋層を切開して行い、摘除後は筋肉層及び皮膚を縫合し、その後実験終了まで絶食でラットを飼育した。摘除翌日、血清カルシウム濃度を測定し血清カルシウム濃度が７．５ｍｇ／ｄｌ以下に低下したラットを手術成功例として選別した。
【０１１３】
次いで、これらラットにヒトＰＴＨｒＰ（ＰＴＨ　ｒｅｌａｔｅｄ　ｐｅｐｔｉｄｅ）を浸透圧ポンプで持続投与して血清カルシウム濃度を増加させ、高カルシウム血症モデルとした。ＰＴＨｒＰ投与は、３７℃にプレインキュベーションしたＰＴＨｒＰ溶液（４０μＭ、２％システインを含む生理食塩水中）１００μｌを含む浸透圧ポンプをラットの肩甲骨付近の皮下に挿入して行った。
【０１１４】
この高カルシウム血症モデルに被験化合物を投与し、被験化合物の作用を評価した。被験化合物は、ＰＴＨｒＰの投与と同時に、尾静脈から投与した（投与量３又は１０ｍｇ／ｋｇ）。被験化合物の投与後２、４、６、８及び２４時間後に頸静脈から経時採血し、血清Ｃａ濃度を測定した。
【０１１５】
その結果、化合物ＴＭＣ３１５−Ｂ２は、ＰＴＨｒＰ投与から８時間目以降の血中カルシウム濃度上昇を濃度依存的に抑制した。
【０１１６】
「配列表フリーテキスト」
配列番号３〜４のフリーテキスト
＜２２３＞　人工的に合成されたプライマーの配列（Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌｌｙ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ　ｐｒｉｍｅｒ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ）
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ＴＭＣ−３１５Ａ１の紫外部吸収スペクトルを示す。
【図２】ＴＭＣ−３１５Ａ１の赤外部吸収スペクトルを示す。
【図３】ＴＭＣ−３１５Ａ１の１Ｈ核磁気共鳴スペクトル（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６中で測定）を示す。
【図４】ＴＭＣ−３１５Ａ１の１３Ｃ核磁気共鳴スペクトル（１００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６中で測定）を示す。
【図５】ＴＭＣ−３１５Ａ２の紫外部吸収スペクトルを示す。
【図６】ＴＭＣ−３１５Ａ２の赤外部吸収スペクトルを示す。
【図７】ＴＭＣ−３１５Ａ２の１Ｈ核磁気共鳴スペクトル（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６中で測定）を示す。
【図８】ＴＭＣ−３１５Ａ２の１３Ｃ核磁気共鳴スペクトル（１００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６中で測定）を示す。
【図９】ＴＭＣ−３１５Ｂ１の紫外部吸収スペクトルを示す。
【図１０】ＴＭＣ−３１５Ｂ１の赤外部吸収スペクトルを示す。
【図１１】ＴＭＣ−３１５Ｂ１の１Ｈ核磁気共鳴スペクトル（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６中で測定）を示す。
【図１２】ＴＭＣ−３１５Ｂ１の１３Ｃ核磁気共鳴スペクトル（１００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６中で測定）を示す。
【図１３】ＴＭＣ−３１５Ｂ２の紫外部吸収スペクトルを示す。
【図１４】ＴＭＣ−３１５Ｂ２の赤外部吸収スペクトルを示す。
【図１５】ＴＭＣ−３１５Ｂ２の１Ｈ核磁気共鳴スペクトル（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６中で測定）を示す。
【図１６】ＴＭＣ−３１５Ｂ２の１３Ｃ核磁気共鳴スペクトル（１００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６中で測定）を示す。
【図１】
2004075625.tif 000025
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2004075625.tif 000031
【図８】
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【図９】
2004075625.tif 000033
【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
2004075625.tif 000037
【図１４】
2004075625.tif 000038
【図１５】
2004075625.tif 000039
【図１６】
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