(57)【要約】【課題】ドラッグデリバリーシステムなどの医用材料や、環境適合性材料などに用いられ、温度変化に対応して膨潤／収縮の変化を示し、良好な生分解性を有する温度応答性生分解性ゲル及びその構成化合物（架橋体）を提供することである。【解決手段】Ｎ−イソプロピルアクリルアミドとアクリル酸及び／又はメタクリル酸との共重合体と安全で生分解性を有するポリ酸性アミノ酸又はこの混合物、及び／又はその塩とを両者のカルボキシ同士をエポキシ化合物などの架橋剤によって架橋した架橋体及びこれを水に浸漬し温度応答性生分解性ゲルを得る。【選択図】なし。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ−イソプロピルアクリルアミドとアクリル酸及び／又はメタクリル酸との共重合体のカルボキシル基と分子量１０，０００乃至３００，０００のポリ酸性アミノ酸のカルボキシル基とが架橋された架橋体に水分及び／又は有効成分を含有し、かつ３次元網目構造を有する温度応答性生分解性ゲル。
【請求項２】
ポリ酸性アミノ酸がポリ−α−グルタミン酸、ポリ−γ−グルタミン酸、ポリ−α―アスパラギン酸、ポリ−β―アスパラギン酸及びこれらの混合物から選ばれた少なくとも一つである請求項１記載の温度応答性生分解性ゲル。
【請求項３】
架橋体がエポキシ化合物又はイソシアネート化合物から選ばれた少なくとも一つの架橋剤により架橋されている請求項１乃至２記載の温度応答性生分解性ゲル。
【請求項４】
架橋体中のＮ−イソプロピルアクリルアミドとアクリル酸及び／又はメタクリル酸との共重合体のカルボキシル基／ポリ酸性アミノ酸のカルボキシル基の比の値が１／１５〜１／８０である請求項１乃至３記載の温度応答性生分解性ゲル。
【請求項５】
有効物質が医薬、農薬、無機物、植物成長促進剤または肥料である請求項１乃至４記載の温度応答性生分解性ゲル。
【請求項６】
Ｎ−イソプロピルアクリルアミドとアクリル酸及び／又はメタクリル酸との共重合体のカルボキシル基と分子量１０，０００乃至３００，０００のポリ酸性アミノ酸のカルボキシル基とが架橋された架橋体。
【請求項７】
ポリ酸性アミノ酸がポリ−α−グルタミン酸、ポリ−γ−グルタミン酸、ポリ−α―アスパラギン酸、ポリ−β―アスパラギン酸及びこれらの混合物から選ばれた少なくとも一つである請求項６記載の架橋体。
【請求項８】
架橋がエポキシ化合物又はイソシアネート化合物から選ばれた少なくとも一つの架橋剤による架橋である請求項６乃至７記載の架橋体。
【請求項９】
架橋体中のＮ−イソプロピルアクリルアミドとアクリル酸及び／又はメタクリル酸との共重合体のカルボキシル基／ポリ酸性アミノ酸のカルボキシル基の比の値が１／１５〜１／８０である請求項６乃至８記載の架橋体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ドラッグデリバリーシステムなどの医用材料や、環境適合性材料などに用いられる温度応答性生分解性ゲルに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
医療分野で行なわれている薬物治療は、経口からの服用や静脈注射するのみならず様々な薬物投与方法が行なわれている。その中の一つとして薬物送達法（ドラッグデリバリーシステム：ＤＤＳ）があげられる。この分野においては物理的あるいは化学的な変化による信号に応答してシステムが構造、機能を変化させ、薬物の放出や透過性を変化させ、薬物濃度の制御を行うなどの技術が各種知られている。特開平３−３２７２９号公報は、ＤＤＳに用いるポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）が温度応答性高分子であり、この物質は下限臨界溶液温度とよばれる相分離温度を示すことを開示している。即ち、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）から構成されるゲルは下限臨界溶液温度以下の温度では水和し膨潤状態となるが、下限臨界溶液温度以上では水を吐き出し収縮する。この挙動を利用して薬物をゲル内に埋包させ、温度変化させたときの薬物の放出制御などに応用している。Ｎ−イソプロピルアクリルアミドは単独では温度応答性ではないが、これを重合した高分子が温度応答性を有する。ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）で構成されるゲルは生分解性を有しておらず、膨潤／収縮の変化も小さく、温度変化に対する応答速度が遅いなどの問題が指摘されている。機能性高分子ゲルと最新の応用動向を窺う一つとして、第３０回医用高分子シンポジウム講演要旨集（３５ページ）にはポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）ゲルの架橋剤としてペプチド鎖を用いることで温度応答性ゲルを合成する方法が記載されているものの、そのゲルは通常のゲルよりも柔らかく形状保持能力の点で劣り、かつ酵素による分解性は悪く、生分解性は不十分であった。バイオミメティックスハンドブック（（株）エヌティエス）には温度応答性と生分解性を有するゲルの研究例が紹介されている。タンパク質で構成されるゲルが温度変化に伴いゾル−ゲル転移する例が示されているが、ゾル−ゲル転移の現象が記載されているのみで、性能に関する具体的記載はなされていない。
【０００３】
特開平１１−３２２９４１号公報は水溶性高分子であり、３次元網目構造であって、生体内分解性高分子あるいは分子中に生体内分解部位を有する高分子を開示し、これには温度応答性高分子がグラフト鎖として導入されている。該高分子としてはポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）やポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）とポリエチレングリコールとのブロック共重合体が開示されている。一方、３次元網目を構成している生体内分解高分子は両末端などの一部がオリゴペプチドあるいはオリゴ糖であり、グルタミン酸を含む各種アミノ酸が単独あるいは複数からなるオリゴペプチドも含むことが開示されているもののポリ−α−グルタミン酸、ポリ−γ−グルタミン酸、ポリ−α−アスパラギン酸、ポリ−β−アスパラギン酸単独やこれらの混合物で使用することの具体的な記載はない。物性については図２に膨潤度と温度との関係が開示されておるが、図２で見る限り膨潤度は１０〜４５℃の範囲は一定であり温度応答性が見られない。化学大辞典（昭和３５年３月３０日発行  共立出版（株）によれば２〜１０個のアミノ酸からなるペプチドをオリゴペプチド、１０〜１００個のアミノ酸から成るものをポリペプチド、それ以上長いペプチドをマクロペプチドと３大別することが記載されている。化学大辞典にはポリ−Ｄ−グルタミン酸（ポリ−γ―グルタミン酸）の分子量に関して分子量は菌種により差があり、約６０００から１０万〜１８万のものまで知られていると記載がある。
又、ポリ−γ―グルタミン酸は納豆菌から生産される粘性のある物質であり、その用途はトイレタリー、化粧料、食品等幅広く用いられ、以下のことも知られている。ポリ−γ―グルタミン酸は化学合成、酵素合成の他、納豆菌等のバチルス属の菌体を用いた培養により製造することができる。納豆菌等を用いた場合には、納豆の粘質物中に含まれるポリ−γ−グルタミン酸を抽出することや、菌体が菌体外に分泌するポリ−γ−グルタミン酸を用いることができる。一般に納豆粘質物中のポリ−γ−グルタミン酸やバチルス属が通常の培養条件で分泌するポリ−γ−グルタミン酸は、高分子量体であり非常に粘性が高いため、用途に応じて、酸や酵素による低分子化処理をすることができる。
【０００４】
【特許文献１】
特開平３−３２７２９号公報
【０００５】
【特許文献２】
特開平１１−３２２９４１号公報
【０００６】
【非特許文献１】
岡野光夫（Ｏｋａｎｏ  Ｔｅｒｕｏ）ら、第３０回医用高分子シンポジウム講演要旨集（３５ページ）
【０００７】
【非特許文献２】
編集代表  長田義仁（Ｏｓａｄａ  ｙｏｓｈｉｈｉｔｏ）、バイオミメティックスハンドブック（８２０ページ）  （株）エヌティエス）
【０００８】
【非特許文献３】
化学大辞典  昭和３５年３月３０日発行  共立出版（株）
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の解決する課題は、ドラッグデリバリーシステムなどの医用材料や、環境適合性材料などに用いられる温度変化に対応し膨潤／収縮の変化を示し、優れた生分解性を有する温度応答性生分解性ゲル及びゲルを構成する高分子架橋体を提供することである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らはＮ−イソプロピルアクリルアミドとアクリル酸及び／又はメタクリル酸との共重合体のカルボキシル基とポリ酸性アミノ酸のカルボキシル基とを架橋剤により架橋した架橋体が温度応答性生分解性であること、さらにこれを主成分とするゲルが温度応答性生分解性良好であることを見出し、本発明を完成させた。すなわち本発明の第１は請求項１記載のＮ−イソプロピルアクリルアミドとアクリル酸及び／又はメタクリル酸との共重合体のカルボキシル基と分子量１０，０００乃至３００，０００のポリ酸性アミノ酸のカルボキシル基とが架橋された架橋体に水分及び／又は有効成分を含有し、かつ３次元網目構造を有する温度応答性生分解性ゲル、本発明の第２は請求項２記載のポリ酸性アミノ酸がポリ−α−グルタミン酸、ポリ−γ−グルタミン酸、ポリ−α―アスパラギン酸、ポリ−β―アスパラギン酸及びこれらの混合物から選ばれた少なくとも一つである請求項１記載の温度応答性生分解性ゲル、本発明の第３は請求項３記載の架橋体がエポキシ化合物又はイソシアネート化合物から選ばれた少なくとも一つの架橋剤により架橋されている請求項１乃至２記載の温度応答性生分解性ゲル、本発明の第４は請求項４記載の架橋体中のＮ−イソプロピルアクリルアミドとアクリル酸及び／又はメタクリル酸との共重合体のカルボキシル基／ポリ酸性アミノ酸のカルボキシル基の比の値が１／１５〜１／８０である請求項１乃至３記載の温度応答性生分解性ゲル、本発明の第５は請求項５記載の有効物質が医薬、農薬、無機物、植物成長促進剤または肥料である請求項１乃至４記載の温度応答性生分解性ゲル、本発明の第６は請求項６記載のＮ−イソプロピルアクリルアミドとアクリル酸及び／又はメタクリル酸との共重合体のカルボキシル基と分子量１０，０００乃至３００，０００のポリ酸性アミノ酸のカルボキシル基とが架橋された架橋体、本発明の第７は請求項７記載のポリ酸性アミノ酸がポリ−α−グルタミン酸、ポリ−γ−グルタミン酸、ポリ−α―アスパラギン酸、ポリ−β―アスパラギン酸及びこれらの混合物から選ばれた少なくとも一つである請求項６記載の架橋体、本発明の第８は請求項８記載の架橋がエポキシ化合物又はイソシアネート化合物から選ばれた少なくとも一つの架橋剤による架橋である請求項６乃至７記載の架橋体及び本発明の第９は請求項９記載の架橋体中のＮ−イソプロピルアクリルアミドとアクリル酸及び／又はメタクリル酸との共重合体のカルボキシル基／ポリ酸性アミノ酸のカルボキシル基の比の値が１／１５〜１／８０である請求項６乃至８記載の架橋体である。
【００１１】
【発明の実施の形態】
以下本発明を具体的に説明する。本発明の温度応答性生分解性ゲルはＮ−イソプロピルアクリルアミドとアクリル酸及び／又はメタクリル酸との共重合体のカルボキシル基とポリ酸性アミノ酸のカルボキシル基とを架橋剤で架橋して得られる。これは従来その性質が知られていたポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）と比較しても温度応答の温度幅があり、これらを用いたゲルの吐水量を比較すると本願発明の温度応答性生分解性ゲルがはるかに優れている。
【００１２】
本発明の温度応答性生分解性ゲルに用いるＮ−イソプロピルアクリルアミドとアクリル酸及び／又はメタクリル酸との共重合体（「ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド／メタクリル酸）」と記すこともある）は以下の通り合成することができる。  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  （Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ４７３−４９３，  ２０００）  に記載された公知の方法に従い、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドとメタクリル酸をペルオキソ二硫酸アンモニウムなどの過酸化物をラジカル重合開始剤として重合反応を行い、透析による精製を行った後、凍結乾燥してポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド／メタクリル酸）を合成する。Ｎ−イソプロピルアクリルアミドとメタクリル酸の構成比率は生成するポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド／メタクリル酸）が温度応答性を示す範囲であれば任意に設定することができるが、温度応答性の観点から９９／１〜５０／５０、好ましくは９５／５〜８０／２０である。
【００１３】
本発明で使用するポリ酸性アミノ酸及び／又はその塩は酸性アミノ酸が重合したものであれば特に制限はない。ポリ酸性アミノ酸を例示するならばポリ−α−グルタミン酸、ポリ−γ−グルタミン酸、ポリ−α―アスパラギン酸、ポリ−β―アスパラギン酸である。本発明に用いるポリ酸性アミノ酸は遊離であっても塩を形成してもよい。ポリ酸性アミノ酸塩はポリ酸性アミノ酸と塩基性化合物を反応させることによって製造することができる。このとき、塩基性化合物としては生体適合性があれば問題なく使用できるが、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどのアルカリ金属など用いることが好ましい。ポリ酸性アミノ酸は分子量が１０，０００乃至３００，０００、好ましくは１０，０００乃至５０，０００、さらに好ましい範囲は２０，０００乃至５０，０００である。ポリグルタミン酸の分子量が大きくなればそれだけ保水量を増加させることができるので、これを用いて得られた温度応答性生分解性ゲルに有効成分をより多く含有させることができる。この観点からポリグルタミン酸の分子量は少なくとも１０，０００は必要である。一方、製造上の観点から見れば分子量を大きくするとゲルを製造する際、水溶液の粘度が上昇するので攪拌操作等の作業性が落ちる。従ってポリグルタミン酸の分子量の上限は３００，０００程度が望ましい。  またポリ酸性アミノ酸を構成するアミノ酸はＤ体、Ｌ体またはＤＬ体の混合物であってもよい。ポリ酸性アミノ酸は上記のポリアミノ酸単独であっても，又これらの混合物で構成されていても良い。具体例で示すならポリ−α，β―アスパラギン酸でも良いし、又ポリ−α−グルタミン酸とポリ−α，β―アスパラギン酸との混合物で構成されていても良い。
【００１４】
ポリ−α−グルタミン酸はカップリング法、ＮＣＡ法など化学合成法や酵素法等によって製造することができる。工業的製造方法としてはＮＣＡ法が広く知られている。ポリ−γ―グルタミン酸は化学合成、酵素合成の他、納豆菌等のバチルス属の菌体を用いた培養により製造することができる。納豆菌等を用いた場合には、納豆の粘質物中に含まれるポリ−γ−グルタミン酸を抽出することや、菌体が菌体外に分泌するポリ−γ−グルタミン酸を用いることができる。一般に納豆粘質物中のポリ−γ−グルタミン酸やバチルス属が通常の培養条件で分泌するポリ−γ−グルタミン酸は、高分子量体であり非常に粘性が高いため、用途に応じて、酸や酵素による低分子化処理をすることができる。
【００１５】
一方、ポリアスパラギン酸はポリ−α―アスパラギン酸又はポリ−β―アスパラギン酸を単独で得ることは通常の生産方法では得られない。通常ではポリ−α，β―アスパラギン酸が得られる。これはアスパラギン酸を加熱脱水縮合した後、加水分解することにより製造する方法や、無水マレイン酸とアンモニアを加熱反応させマレイミドを経て得られる重合物を加水分解することにより製造することができる。ポリ−α，β―アスパラギン酸及び／又はそれらの塩は水溶性でもあり、分子量も１０，０００〜３００，０００を得ることができ、物性はポリグルタミン酸とも良く似ている。アスパラギン酸のα位又はβ位のカルボキシル基はポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）とアクリル酸及び／又はメタクリル酸のカルボキシル基とで架橋剤により架橋することができる。この架橋体は水を含みゲルを形成する。得られたゲルは温度応答性生分解性を有する。
【００１６】
本発明で使用する架橋剤としてはエポキシ化合物、イソシアネートから選ばれた少なくとも一種を用いることができる。具体的には、エチレングリコールジグリシジルエーテル、プロピレングリコールジグリシジルエーテル、ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル、ポリプロピレングリコールジグリシジルエーテルなどのポリエポキシ化合物、ヘキサメチレンジイソシアネート、イソホロンジイソシアネートなどのポリイソシアネートなどが使用できる。反応性の観点ではポリエポキシ化合物が好ましく、生分解性または、分解後の安全性の観点では、グリセリン誘導体、エチレングリコール誘導体、ポリエチレングリコール誘導体が好ましい。
【００１７】
本発明の温度応答性生分解性ゲルのゲルを構成する架橋体はＮ−イソプロピルアクリルアミドとアクリル酸及び／又はメタクリル酸との共重合体のカルボキシル基とポリ酸性アミノ酸のカルボキシル基を前述の架橋剤で架橋して得られる。架橋後は未反応のカルボキシル基がない状態の架橋体を得ることもできる。しかしながらこのようにして得られた架橋体は必ずしも温度応答性が良いわけではない。通常前者と後者の各々の重合体は重合度、反応比率が異なるのでカルボキシル基は両者で通常１対１では対応しない。また前者の共重合体を得る場合には、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（Ａ）／アクリル酸又はメタクリル酸（Ｂ）の反応比は、モル比でＡ／Ｂが９９／１〜５０／５０、好ましくは９５／５〜８０／２０である。この場合アクリル酸及びメタクリル酸を混合して用いても差し支えなく、この時のＡ／Ｂも同様な値となる。架橋体を得るには、前者の共重合体と後者のポリ酸性アミノ酸との反応比率は、比の値で前者の共重合体のカルボキシル基／ポリ酸性アミノ酸のカルボキシル基が１／１５〜１／８０の範囲内が好ましい。１／１５より大きいと柔らかいゲルとなり有効成分を保有し難くなる。又１／８０より小さいと硬いゲルとなり温度応答性が不十分になる。架橋剤を反応させる比率としては架橋剤とＮ−イソプロピルアクリルアミドとアクリル酸及び／又はメタクリル酸との共重合体のカルボキシル基とポリ酸性アミノ酸のカルボキシル基の合計との比が１／４〜３／５の範囲であることが好ましい。１／４より小さい場合には柔らかいゲルとなり有効成分を保有し難くなる。３／５より大きい場合には硬いゲルとなり温度応答性が不十分になる。又未反応のカルボキシル基がそのまま又は塩として部分的に残留することは本願発明に何ら影響を与えない。反応溶媒は原料の溶解性、反応を妨げない範囲で選択することができるが、水を用いることが好ましい。反応容器に関しては温度応答性生分解性ゲルを使用する目的に応じて選択することができる。例えばゴムシートで隔てた２枚のガラス板の間に注入するなどの方法を用いてゲルを得ることができる。架橋反応温度については、室温〜１００℃の範囲で設定できるが、好ましくは３０〜６０℃の範囲である。反応時間についてはゲル強度が一定になる時点で反応を終了とすればよい。反応温度によって異なるが１２時間から７２時間の間で設定することができる。また、未反応の原料および低分子不純物については蒸留水中に浸漬することで除去することができる。
【００１８】
温度応答性生分解性ゲルから放出される薬剤としては水に可溶であれば特に制限されない。例えば医薬ではテトラサイクリン、ペニシリン等の抗生物質、塩化ベンザルコニウム等の抗菌剤、インドメタシン等の消炎鎮痛剤、アミノアセトフェノン等の感冒薬、ニトログリセリン等の抗狭心剤、抗高血圧剤、抗癌剤、農薬では殺虫剤、植物生育調整剤、防腐剤、無機イオンを含む植物栄養剤等が挙げられる。これらの有効成分を本願発明のゲルに収納する際、水に加え、使用目的を損なわない範囲内で有効成分を溶解するアルコール等の溶解補助剤を存在させることは一向に差し支えない。
【００１９】
温度応答性並びに生分解性の評価方法について説明する。温度応答性については本発明の温度応答性生分解性ゲルの膨潤／収縮率Ｗ／Ｗｏを算出することで評価した。具体的には本発明の温度応答性生分解性ゲルを、１０℃において重量が一定となるまで蒸留水中に浸漬した。ゲルの重量（Ｗ）は、ゲルを水から分離した後にゲル表面の余分な水分をウエスでふき取った後の秤量値。重量測定後、再びゲルを異なる温度の蒸留水中に浸漬し、重量が一定となるまで放置した。この手順を繰り返し、ゲル重量の平衡値を約１０℃間隔で昇温しながら１０℃から６０℃までの範囲で測定した。すべての重量測定が終了した後に乾燥し、ゲルの乾燥重量（Ｗｏ）を測定した。生分解性は、生体内条件を考慮して  ０．０３  Ｍ  ＮａＨＣＯ３，  ０．００２  Ｍ  Ｋ２ＨＰＯ４，  ０．１２  Ｍ  ＮａＣｌ  及び０．００３  Ｍ  ＫＣｌの水溶液の組成の模擬体液を使用し３７℃の条件下での  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  における酵素分解性として検査した。具体的には、タンパク質加水分解酵素を用いて本発明の温度応答性生分解性ゲルの分解試験を行う。炎症部位で産生されるペプチド分解酵素には、ｃａｔｈｅｐｓｉｎ  Ｂなどのエンドペプチダーゼとｃａｒｂｏｘｙｐｅｐｔｉｄａｓｅなどのエキソペプチダーゼに分類される。本発明では、ｃａｔｈｅｐｓｉｎ  Ｂと類似のポリアミノ酸加水分解挙動を示すエンドペプチダーゼの例としてパパインを用いて、０．０１  Ｍ  Ｌ−システイン及び０．０２  Ｍ  エチレンジアミン四酢酸を含む模擬体液中で生体条件下（３７℃，  ｐＨ７．４）で試験を行った。まずはじめにゲルを凍結乾燥し乾燥重量（Ｗｏ）を測定した。このゲル（乾燥重量約４０ｍｇ）をパパイン（４０  ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）を含む模擬体液  ５ｍｌに浸漬し攪拌した。一定時間後に、この反応容器内の残存物をＮｏ．５Ｃろ紙を用いてろ過し、固形分乾燥重量（Ｗ）をろ紙を乾燥して求めた。ゲルの存在重量をＷ／Ｗｏとして算出した。酵素溶液への浸漬時間を変えて同様の測定を繰り返した。更に、酵素未添加での分解挙動、０．０１Ｍ  ＮａＯＨ水溶液にゲルを浸漬した場合のアルカリ加水分解によるゲルの分解挙動を検査した。
【００２０】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。分子量の測定はゲルろ過―光散乱法（ＧＰＣ−ＭＡＬＬＳ法：Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製  ＤａｗｎＤＰＳ）で測定した重量平均分子量である。
【００２１】
【実施例１】
Ｎ−イソプロピルアクリルアミド１．０２ｇ、メタクリル酸  ０．０８７ｇを蒸留水に溶解し２０ｍｌの溶液を調製した。１０分間窒素曝気した後に、氷浴中で  ５０  ｇ／ｌ  ペルオキソ二硫酸アンモニウム水溶液、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン溶液を各０．２  ｍｌ加え、３０℃で２４時間重合しポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド／メタクリル酸）を重合し、共重合体を得た。このポリマーを透析膜（三光純薬製セルロースチューブ）を用いて蒸留水中で透析した。透析後、ポリマーを凍結乾燥し、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド／メタクリル酸）共重合体の粉末を得た。
バチルス属の納豆菌の培養液から単離精製したポリ−γ−グルタミン酸（平均分子量２２，０００）４００ｍｇと上記ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド／メタクリル酸）粉末  ９０  ｍｇ  を蒸留水  ４ｍｌに室温で溶解した。そこに架橋剤としてポリエチレングリコールジグリシジルエーテル（アルドリッチ製、平均分子量５２６）を０．４  ｍｌ加えた。この溶液を厚さ１．５  ｍｍのゴムシートで隔てた２枚のガラス板の間に注入した。３０℃で４８時間架橋反応を行い、ポリ−γ−グルタミン酸と、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドとメタクリル酸との共重合体とにより得られた架橋体のゲル（ポリ−γ−グルタミン酸とポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド／メタクリル酸）の架橋ゲルと記すこともある。）を得た。前者の共重合体のカルボキシル基／ポリ酸性アミノ酸のカルボキシル基の比の値は１／３３であった。得られた水分を含んだゲルの物性はやや硬いゲルであった。ゲルを蒸留水中に浸漬することで残留する不純物を除去した。
【００２２】
【実施例２】
Ｎ−イソプロピルアクリルアミドとメタクリル酸  を用い、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド／メタクリル酸）共重合体の粉末を製造し、この共重合体６０ｍｇ（カルボキシル基０．０５５ｍｍｏｌ）とポリ酸性アミノ酸としてポリ−γ−グルタミン酸（平均分子量２２，０００）５００ｍｇ（カルボキシ基３．４６ｍｍｏｌ）を用い、そこに架橋剤としてポリエチレングリコールジグリシジルエーテル（アルドリッチ製、平均分子量５２６）を０．８  ｍｌを加え、ポリ−γ−グルタミン酸とポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド／メタクリル酸）の架橋ゲルを実施例１に準拠し製造し、得られたゲルの物性を評価した。前者の共重合体のカルボキシル基／ポリ酸性アミノ酸のカルボキシル基の比の値は１／６３であった。得られた水分を含んだゲルの物性はやや硬いゲルであった。
【００２３】
【実施例３】
Ｎ−イソプロピルアクリルアミドとメタクリル酸  を用い、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド／メタクリル酸）共重合体の粉末を製造し、この共重合体９０ｍｇ（カルボキシル基０．０８３ｍｍｏｌ）とポリ酸性アミノ酸としてポリ−γ−グルタミン酸（平均分子量２２，０００）４００ｍｇ（カルボキシ基２．７７ｍｍｏｌ）を用い、そこに架橋剤としてポリエチレングリコールジグリシジルエーテル（アルドリッチ製、平均分子量５２６）を０．６  ｍｌを加え、ポリ−γ−グルタミン酸とポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド／メタクリル酸）の架橋ゲルを実施例１に準拠し製造し、得られたゲルの物性を評価した。前者の共重合体のカルボキシル基／ポリ酸性アミノ酸のカルボキシル基の比の値は１／３３であった。得られた水分を含んだゲルの物性は程よく硬いゲルであった。
【００２４】
【実施例４】
Ｎ−イソプロピルアクリルアミドとメタクリル酸  を用い、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド／メタクリル酸）共重合体の粉末を製造し、この共重合体１２０ｍｇ（カルボキシル基０．１１１ｍｍｏｌ）とポリ酸性アミノ酸としてポリ−γ−グルタミン酸（平均分子量２２，０００）４００ｍｇ（カルボキシ基２．７７ｍｍｏｌ）を用い、そこに架橋剤としてポリエチレングリコールジグリシジルエーテル（アルドリッチ製、平均分子量５２６）を０．４  ｍｌを加え、ポリ−γ−グルタミン酸とポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド／メタクリル酸）の架橋ゲルを実施例１に準拠し製造し、得られたゲルの物性を評価した。前者の共重合体のカルボキシル基／ポリ酸性アミノ酸のカルボキシル基の比の値は１／２５であった。得られた水分を含んだゲルの物性は柔らかいゲルであった。
【００２５】
【比較例１】
＜ポリ−γ−グルタミン酸単独ゲルの合成＞  以下の方法で合成した。バチルス属の納豆菌の培養液から単離精製したポリ−γ−グルタミン酸（平均分子量２２，０００）４００ｍｇを蒸留水４  ｍｌに溶解した。そこに架橋剤としてポリエチレングリコールジグリシジルエーテル（アルドリッチ製、平均分子量５２６）を１  ｍｌ加えた。この溶液を厚さ１．５  ｍｍのゴムシートで隔てた２枚のガラス板の間に注入した。３０℃で４８時間重合反応を行い、ポリ−γ−グルタミン酸単独ゲルを得た。蒸留水に浸漬することでゲル内に残留する不純物を除去した。
【００２６】
【比較例２】
＜ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）単独ゲルの合成＞  以下の方法で合成した。Ｎ−イソプロピルアクリルアミド  １．１３ｇ、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド  ６２  ｍｇを蒸留水に溶解し１０  ｍｌの水溶液を調製した。１０分間窒素曝気した後に、氷浴中で  ５０  ｇ／ｌ  ペルオキソ二硫酸アンモニウム水溶液、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン溶液を各０．１  ｍｌ加え、厚さ１．５  ｍｍのゴムシートで隔てた２枚のガラス板の間に注入した。２２℃で２４時間重合しポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）単独ゲルを合成した。蒸留水に浸漬することでゲル内に残留する不純物を除去した。
【００２７】
【比較例３】
Ｎ−イソプロピルアクリルアミドとメタクリル酸  を用い、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド／メタクリル酸）共重合体の粉末を製造し、この共重合体２００ｍｇ（カルボキシル基０．１８４ｍｍｏｌ）とポリ酸性アミノ酸としてポリ−γ−グルタミン酸（平均分子量２２，０００）２００ｍｇ（カルボキシ基１．３８ｍｍｏｌ）を用い、そこに架橋剤としてポリエチレングリコールジグリシジルエーテル（アルドリッチ製、平均分子量５２６）を０．２ｍｌを加え、ポリ−γ−グルタミン酸とポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド／メタクリル酸）の架橋ゲルを実施例１に準拠し製造し、得られたゲルの物性を評価した。前者の共重合体のカルボキシル基／ポリ酸性アミノ酸のカルボキシル基の比の値は１／８であった。ゲルは形成できなかった。
【００２８】
【実施例５】
＜温度応答性試験＞  実施例１で合成したポリ−γ−グルタミン酸とポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド／メタクリル酸）の架橋ゲルを、１０℃において重量が一定となるま蒸留水中に浸漬した。ゲルの重量（Ｗ）は、ゲルを水から分離した後にゲル表面の余分な水分をキムワイプ（クレシア製実験用ティッシュペーパ）でふき取った後に電子天秤を用いて測定した。重量測定後、再びゲルを異なる温度の蒸留水中に浸漬し、重量が一定となるまで放置した。この手順を繰り返し、ゲル重量の平衡値を約１０℃間隔で昇温しながら１０℃から６０℃までの範囲で測定した。すべての重量測定が終了した後に乾燥し、ゲルの乾燥重量（Ｗｏ）を測定した。ゲル重量の温度依存性は膨潤／収縮率Ｗ／Ｗｏを算出することで評価した。同様に比較例１、２のゲルについても膨潤／収縮率を算出した。結果を図１に示す。図中、曲線Ｉ（黒丸）はポリ−γ−グルタミン酸と、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドとメタクリル酸との共重合体とにより得られた架橋体のゲル、曲線ＩＩ（白抜き丸）はポリ−γ−グルタミン酸単独のゲル、曲線ＩＩＩ（白抜き三角）はポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）単独のゲルを示す。実施例１で合成したゲル（曲線Ｉ）は温度応答性があり、加熱によりゲルは脱水し重量減少することが示された。１０℃から６０℃の範囲で比較すると、比較例２で合成したポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）ゲルでは膨潤／収縮率変化（Ｗ／Ｗｏ）が約１０であるのに対し、実施例１のポリ−γ−グルタミン酸とポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド／メタクリル酸）の架橋体で構成される温度応答性生分解性ゲルでは膨潤／収縮率変化（Ｗ／Ｗｏ）が約２５となり膨潤／収縮の変化が大きい。一方、温度応答性高分子を含まないポリ−γ−グルタミン酸単独ゲル（曲線ＩＩ／比較例１）では、１０−６０℃の温度範囲では温度応答性を示さない。
【００２９】
【実施例６】
＜生分解性試験＞実施例１で合成したポリ−γ−グルタミン酸とポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド／メタクリル酸）の架橋ゲルの分解試験を行った。  架橋ゲルの生分解性試験は、生体内条件を考慮して  ０．０３  Ｍ  ＮａＨＣＯ３，  ０．００２  Ｍ  Ｋ２ＨＰＯ４，  ０．１２  Ｍ  ＮａＣｌ  及び０．００３  Ｍ  ＫＣｌの水溶液の組成の模擬体液を使用し３７℃の条件下での  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  における酵素分解性として検査した。炎症部位で産生されるペプチド分解酵素には、ｃａｔｈｅｐｓｉｎ  Ｂなどのエンドペプチダーゼとｃａｒｂｏｘｙｐｅｐｔｉｄａｓｅなどのエキソペプチダーゼに分類される。本実施例では、ｃａｔｈｅｐｓｉｎ  Ｂと類似のポリアミノ酸加水分解挙動を示すエンドペプチダーゼの例としてパパインを用いて、０．０１  Ｍ  Ｌ−システイン及び０．０２  Ｍ  エチレンジアミン四酢酸を含む模擬体液中で生体条件下（３７℃，  ｐＨ７．４）で試験を行った。ゲルを凍結乾燥し乾燥重量（Ｗｏ）を測定した。このゲル（乾燥重量約４０ｍｇ）をパパイン（４０  ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）を含む模擬体液  ５ｍｌに浸漬し攪拌した。一定時間後に、この反応容器内の残存物をＮｏ．５Ｃろ紙を用いてろ過し、固形分乾燥重量（Ｗ）をろ紙を乾燥して求めた。ゲルの存在重量をＷ／Ｗｏとして算出した。酵素溶液への浸漬時間を変えて同様の測定を繰り返した。更に、酵素未添加での分解挙動、０．０１Ｍ  ＮａＯＨ水溶液にゲルを浸漬した場合のアルカリ加水分解によるゲルの分解挙動を検査した。結果を図２に示す。図２中パパインが共存する（曲線Ｉ／白抜き丸）場合には、時間経過と共にゲルの残存量は減少し、約４０時間でゲルは消失した。それに対し、パパイン未添加でのゲル（曲線ＩＩ／黒丸）の重量減少は遅く４０時間後でも９０％以上の重量が残った。また、ＮａＯＨ水溶液中（黒三角）ではゲルの架橋点であるエステル結合がアルカリ加水分解を受けるために、酵素での分解よりも速い。
【００３０】
【実施例７】
＜円筒状ポリ−γ−グルタミン酸とポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド／メタクリル酸）の架橋ゲルと凍結乾燥物及びこれの膨潤ゲル化物の製造＞
実施例１と準拠し、ポリ−γ−グルタミン酸とポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド／メタクリル酸）の架橋ゲルを直径２ｍｍ、長さ２０ｍｍのガラス管中で製造した。この架橋ゲルをガラス管中より取り出し、ナス型フラスコに入れ、−２０℃にて２時間凍結させた。その後東京理化（株）製凍結乾燥機ＦＤ−１を用い２４時間凍結乾燥を行ったところ、棒状の架橋ゲルの乾燥物が得られ、その一部を写真模式図の図３のａに示した。このものをそのまま立てても折り曲がったりせず、指で押しても形状を維持できる程度の硬度を有していた。さらにこの凍結乾燥品を２２℃の水に浸漬し、１０分経過したところ円柱形を維持したまま再びゲルとなり、その直径約４ｍｍに膨潤した。これを写真模式図の図３のｂに示した。さらに浸漬を続けると１０時間後には直径１０ｍｍにさらに膨潤し、この写真模式図の図３のｃに示した。このときの膨潤ゲル化物の重量は凍結乾燥品の約１００倍の重量であった。
【００３１】
【実施例８】
＜赤外吸収スペクトル測定によるエステル化合物生成の確認＞
実施例１で合成したポリ−γ−グルタミン酸とポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド／メタクリル酸）の架橋ゲル（以下「ＰＧＡ−  ｐｏｌｙ（ＮＩＰＡ／ＭＡ）架橋ゲル」と記すこともある）を１０５℃の乾燥機中で４時間乾燥し、更に室温で真空乾燥を４８時間行った。乾燥したＰＧＡ−  ｐｏｌｙ（ＮＩＰＡ／ＭＡ）架橋ゲルを粉砕し、ＫＢｒ錠剤法を用いて日本分光（株）製  ＦＴ−ＩＲ−４３０型赤外スペクトル測定装置で赤外スペクトルを測定した。結果を図４に示した。同様に、比較例１で得たポリ−γ−グルタミン酸単独ゲル（以下「ＰＧＡ単独架橋ゲル」と記すこともある）を実施例１と同様の方法で乾燥した。乾燥したＰＧＡ単独架橋ゲルを粉砕し、ＫＢｒ錠剤法を用いてそれぞれの赤外スペクトルを測定した。結果を図５に示した。図４に示すように実施例１で得たＰＧＡ−  ｐｏｌｙ（ＮＩＰＡ／ＭＡ）架橋ゲルのＩＲ吸収は３４６５  ｃｍ−１  −ＣＯＮＨ−  アミド、１７３４，１７４２，１７４８  ｃｍ−１  −ＣＯＯＲ  エステル、１６５３，  １６４０  ｃｍ−１  アミドＩ  （−ＣＯＮＨ−  単量体）、１５５８及び１５４０  ｃｍ−１  アミドＩＩ（−ＣＯＮＨ−  二量体）であり、数種類のエステル結合を有する化合物である。図５に示すように比較例１で得たＰＧＡ単独架橋ゲルの乾燥物のＩＲ吸収スペクトルは３４１６  ｃｍ−１  −ＣＯＮＨ−  アミド、１７４１  ｃｍ−１  −ＣＯＯＲ  エステル、１６５０  ｃｍ−１  アミドＩ  （−ＣＯＮＨ−  単量体）及び１５４０  ｃｍ−１  アミドＩＩ  （−ＣＯＮＨ−二量体）が観測され、エステルの吸収は１７４１  ｃｍ−１  の単一吸収であった。以上のようにＰＧＡ−  ｐｏｌｙ（ＮＩＰＡ／ＭＡ）架橋ゲルの乾燥物のＩＲ吸収には、ＰＧＡ単独架橋ゲルの乾燥物のＩＲ吸収とは異なる吸収の存在がエステル領域に確認されたことは、ポリ−γ−グルタミン酸とポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド／メタクリル酸）との間に新規な架橋が生成したことを裏付けるものである。
【００３２】
【発明の効果】
本発明はＮ−イソプロピルアクリルアミドとアクリル酸及び／又はメタクリル酸との共重合体と安全で生分解性を有するポリグルタミン酸及び／又はポリアスパラギン酸、並びにこれらの塩を含むこともできる物質をエポキシ化合物などの架橋剤によって架橋することにより得られる温度応答性生分解性ゲルである。本発明によりドラッグデリバリーシステムなどの医用材料や、環境適合性材料などに用いられる温度変化に対応して膨潤／収縮の変化を示し、良好な生分解性を有する温度応答性生分解性ゲル材料を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】は本願発明の温度応答性生分解性ゲルの温度依存性を示す図である。
【図２】は温度応答性生分解性ゲルの生分解性を示す図である。
【図３】のａはＰＧＡ−  ｐｏｌｙ（ＮＩＰＡ／ＭＡ）架橋ゲル乾燥物、ｂはこの乾燥物を１０分間水に浸漬し得られたゲル、ｃは該乾燥物を水に浸漬して１０時間後に得られたゲルの写真の模式図である。
【図４】はＰＧＡ−  ｐｏｌｙ（ＮＩＰＡ／ＭＡ）架橋ゲル乾燥物のＩＲ吸収スペクトルである。
【図５】はポリ−γ−グルタミン酸単独ゲルの乾燥物のＩＲ吸収スペクトルである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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