【誤訳訂正書】
【提出日】平成23年6月7日(2011.6.7)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療有効量のＣｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．抽出物を含む、ＣＯＸ−２を阻害するための組成物。
【請求項２】
前記抽出物が、メタノール抽出物を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記抽出物が、水性抽出物を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
治療有効量のＣｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．抽出物を含む、炎症を治療するための組成物。
【請求項５】
前記抽出物が、メタノール抽出物を含む、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記抽出物が、水性抽出物を含む、請求項４に記載の組成物。
【請求項７】
治療有効量のＣｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．抽出物を含む、癌を治療するための組成物。
【請求項８】
前記抽出物が、メタノール抽出物を含む、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記抽出物が、水性抽出物を含む、請求項７に記載の組成物。
【請求項１０】
医薬的に許容されるビヒクル；および前記ビヒクル中に懸濁された治療有効量のＣｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．抽出物を含む医薬。
【請求項１１】
極性溶媒；非極性溶媒；中程度の極性の溶媒；および水性溶媒からなる群から選択される溶媒を用いて抽出された成分を含むＣｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．抽出物。
【請求項１２】
抽出器および溶媒によってＣｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．原料を処理して成分溶液を作製すること；ならびに前記成分溶液から液体を少なくとも部分的に除去して抽出物を製造することを含む、Ｃｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．抽出物の製造方法。
【請求項１３】
前記溶媒が、極性溶媒；非極性溶媒；中程度の極性の溶媒；および水性溶媒からなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記溶媒が、メタノール；酢酸エチル；ヘキサン；および水からなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記抽出物を分画することにより前記抽出物の少なくとも１つの画分を得ることをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記抽出物をセミ分取カラム上で分画することにより前記抽出物の少なくとも１つの画分を得ることをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記溶媒がメタノールを含み、前記少なくとも１つの画分が、１、２、４、６、７、８、９、１０、１３および１４からなる群から選択される分単位の溶出時間を有する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
Ｃｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．原料を乾燥すること；前記原料を砕くこと；抽出器および溶媒によって前記原料を処理して成分溶液を作製すること；ならびに前記成分溶液から液体を少なくとも部分的に除去して抽出物を製造することを含む、Ｃｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．抽出物の製造方法。
【請求項１９】
治療有効量のＣｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．抽出物を含む、乳癌を治療するための組成物。
【請求項２０】
前記抽出物が、メタノール抽出物；酢酸エチル抽出物；ヘキサン抽出物；および水性抽出物からなる群から選択される、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
前記治療有効量の前記Ｃｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．抽出物は、医薬的に許容されるビヒクル中で非経口投与のために製剤されている、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
治療有効量のＣｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．抽出物を含む、ＮＦ−κＢの活性化を阻害するための組成物。
【請求項２３】
前記抽出物が、メタノール抽出物；酢酸エチル抽出物；ヘキサン抽出物；および水性抽出物からなる群から選択される、請求項２２に記載の組成物。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【発明の詳細な説明】
【発明の名称】Ｃｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．の抽出物および抽出の方法およびそのような抽出物の使用
【技術分野】
【０００１】
関連する出願への相互参照
本願は、２００７年９月１８日に出願された米国仮特許出願第６０／９７３，４００号および２００８年２月１８日に出願された米国特許出願第１２／０３２，９８４号に対する優先権を主張し、これらの出願の開示は、本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
本出願は、炎症および癌を治療するための植物抽出物に一般的に関する。
【背景技術】
【０００３】
関節リウマチは、複数の組織に影響を及ぼすが、典型的には関節で最も顕著な症状をもたらす慢性の炎症性疾患である。関節リウマチは、進行性であり、変性的であり、そして最終的には消耗性である。関節の慢性的炎症は、軟部組織、滑膜および軟骨の破壊のみならず、骨の関節表面の侵食につながる。この疾患は、アメリカ合衆国、ヨーロッパおよび日本で３２０万を超える人々に影響を及ぼすと推定される。関節リウマチは、女性でより一般的であり、その症例の大部分を占めると推定される。
【０００４】
炎症は異物または傷害から保護するための体の自然な防御であるが、それは特定の疾患では問題を引き起こすことがある。不適切な炎症は、糖質コルチコイドであるコルチゾールのような伝統的なステロイド、組み換えＤＮＡ技術により産生される治療的なタンパク質、および／または非ステロイド性の抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）で治療することができる。
【０００５】
プロスタグランジン類は、体細胞によって産生される化学物質のファミリーであり、疼痛、炎症および発熱の促進を含む多くの必須な機能を果たす。さらに、ある種のプロスタグランジン類は、血液凝固に必要な血小板の機能をサポートし、そして酸による傷害の影響から胃壁を保護する。プロスタグランジン類は、酵素シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）により体細胞内で産生される。
【０００６】
ＣＯＸ−２は、多くの機能（疼痛を誘導することを含むがこれに限らない）に関係する酵素である。ＣＯＸ−２は、炎症の原因となる体の領域に特に存在するが、胃の中には存在しない。ＣＯＸ−２は、我々の体の中で、理想的には限定的に活性である；しかし、ダイエット、ストレスおよび傷害などの要因は、ＣＯＸ−２活性を増大する可能性がある。ＣＯＸ−２が継続的に活性な場合、恒常的な疼痛が起こる。
【０００７】
具体的な作用メカニズムが完全に分からないとしても、ＣＯＸ−２の阻害は、癌細胞のアポトーシスをもたらすことが分かっている。非特許文献１および非特許文献２を参照のこと。
【０００８】
したがって、ＣＯＸ−２を阻害し得る植物抽出物は、様々な疾患を治療することができ、それらは限定されるものではないが、炎症、関節炎、筋肉痛、および癌を含む。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｊｏｈｎｓｅｎらの「Ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ−２  Ｉｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ，ａｎｄ  Ｎｏｎｓｔｅｒｏｉｄａｌ  Ａｎｔｉ−Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｄｒｕｇｓ  Ｉｎｄｕｃｅ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｉｎｈｉｂｉｔ  Ｔｕｍｏｒ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｉｎ  Ｖｉｖｏ，」Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ；Ｖｏｌ．６４，ｐａｇｅｓ  ７２１０−７２１５（２００４年１０月１５日）
【非特許文献２】Ｌａｕらの「Ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｍｏｄｕｌａｔｅ  ｔｈｅ  ｐ５３／ｈｄｍ２  ｐａｔｈｗａｙ  ａｎｄ  ｅｎｈａｎｃｅ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎ  ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ，」Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，Ｖｏｌ．２６，ｐａｇｅｓ  １９２０−１９３１（２００７）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
ＣＯＸ−２を阻害する、ＮＦ−κＢの活性化を阻害する、炎症を治療する、または癌を治療する方法は、治療有効量のＣｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．抽出物を患者に投与することを含むことができる。本明細書に記載の医薬は、医薬的に許容されるビヒクルおよび該ビヒクル中に懸濁された治療有効量のＣｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．抽出物を含むことができる。Ｃｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．抽出物の製造方法は、抽出器および溶媒によってＣｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．原料を処理して成分溶液を作製すること、ならびに該成分溶液から液体を少なくとも部分的に除去して抽出物を製造することを含むことができる。Ｃｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．抽出物は、種々の溶媒を用いて抽出された成分を含むことができる。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
治療有効量のＣｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．抽出物を患者に投与することを含む、ＣＯＸ−２を阻害する方法。
（項目２）
前記抽出物が、メタノール抽出物を含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記抽出物が、水性抽出物を含む、項目１に記載の方法。
（項目４）
治療有効量のＣｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．抽出物を患者に投与することを含む、炎症を治療する方法。
（項目５）
前記抽出物が、メタノール抽出物を含む、項目４に記載の方法。
（項目６）
前記抽出物が、水性抽出物を含む、項目４に記載の方法。
（項目７）
治療有効量のＣｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．抽出物を患者に投与することを含む、癌を治療する方法。
（項目８）
前記抽出物が、メタノール抽出物を含む、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記抽出物が、水性抽出物を含む、項目７に記載の方法。
（項目１０）
医薬的に許容されるビヒクル；および前記ビヒクル中に懸濁された治療有効量のＣｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．抽出物を含む医薬。
（項目１１）
極性溶媒；非極性溶媒；中程度の極性の溶媒；および水性溶媒からなる群から選択される溶媒を用いて抽出された成分を含むＣｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．抽出物。
（項目１２）
抽出器および溶媒によってＣｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．原料を処理して成分溶液を作製すること；ならびに前記成分溶液から液体を少なくとも部分的に除去して抽出物を製造することを含む、Ｃｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．抽出物の製造方法。
（項目１３）
前記溶媒が、極性溶媒；非極性溶媒；中程度の極性の溶媒；および水性溶媒からなる群から選択される、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記溶媒が、メタノール；酢酸エチル；ヘキサン；および水からなる群から選択される、項目１２に記載の方法。
（項目１５）
前記抽出物を分画することにより前記抽出物の少なくとも１つの画分を得ることをさらに含む、項目１２に記載の方法。
（項目１６）
前記抽出物をセミ分取カラム上で分画することにより前記抽出物の少なくとも１つの画分を得ることをさらに含む、項目１２に記載の方法。
（項目１７）
前記溶媒がメタノールを含み、前記少なくとも１つの画分が、１、２、４、６、７、８、９、１０、１３および１４からなる群から選択される分単位の溶出時間を有する、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
Ｃｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．原料を乾燥すること；前記原料を砕くこと；抽出器および溶媒によって前記原料を処理して成分溶液を作製すること；ならびに前記成分溶液から液体を少なくとも部分的に除去して抽出物を製造することを含む、Ｃｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．抽出物の製造方法。
（項目１９）
治療有効量のＣｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．抽出物を患者に投与することを含む、乳癌を治療する方法。
（項目２０）
前記抽出物が、メタノール抽出物；酢酸エチル抽出物；ヘキサン抽出物；および水性抽出物からなる群から選択される、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記治療有効量の前記Ｃｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．抽出物を医薬的に許容されるビヒクル中で非経口的に投与する、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
治療有効量のＣｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．抽出物を患者に投与することを含む、ＮＦ−κＢの活性化を阻害する方法。
（項目２３）
前記抽出物が、メタノール抽出物；酢酸エチル抽出物；ヘキサン抽出物；および水性抽出物からなる群から選択される、項目２２に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、４つの異なる溶媒を用いて抽出された９μｇ／ｍｌの濃度のＣｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．抽出物によるインビトロでのＣＯＸ−２阻害試験の実験結果を示すグラフである。図１のグラフは、ヒト組み換え型ＣＯＸ−２のパーセント阻害をｙ軸に、およびＣｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．原料から成分を抽出するために使用された溶媒をｘ軸に含む。
【図２】図２は、図１の実験の再現結果を示すグラフである。図２のグラフは、ヒト組み換え型ＣＯＸ−２のパーセント阻害をｙ軸に、およびＣｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．原料から成分を抽出するために使用された溶媒をｘ軸に含む。
【図３】図３は、図１の実験の別の再現結果を示すグラフである。図３のグラフは、ヒト組み換え型ＣＯＸ−２のパーセント阻害をｙ軸に、およびＣｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．原料から成分を抽出するために使用された溶媒をｘ軸に含む。
【図４】図４は、図１の実験のさらに別の再現結果を示すグラフである。図４のグラフは、ヒト組み換え型ＣＯＸ−２のパーセント阻害をｙ軸に、およびＣｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．原料から成分を抽出するために使用された溶媒をｘ軸に含む。
【図５】図５は、Ｃｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．のメタノール抽出物による種々の濃度におけるインビトロでのＣＯＸ−２阻害試験の実験結果を示すグラフである。図５のグラフは、ヒト組み換え型ＣＯＸ−２のパーセント阻害をｙ軸に、およびＣｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．のメタノール抽出物の濃度をｘ軸に含む。
【図６】図６は、図５の実験の再現結果を示すグラフである。図６のグラフは、ヒト組み換え型ＣＯＸ−２のパーセント阻害をｙ軸に、およびＣｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．のメタノール抽出物の濃度をｘ軸に含む。
【図７】図７は、種々の濃度でのＣｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．のメタノール抽出物に起因する、血清含有培地で培養されたＳＫ−Ｍｅｌ２８ヒト黒色腫細胞の細胞増殖の減少試験の実験結果を示すグラフである。図７のグラフは、細胞増殖のパーセント減少をｙ軸に、およびＣｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．のメタノール抽出物の濃度をｘ軸に含む。
【図８】図８は、ＳＫ−Ｍｅｌ２８ヒト黒色腫細胞を血清無添加培地で培養した以外は、図７の実験と同様の実験の結果を示すグラフである。図８のグラフは、細胞増殖のパーセント減少をｙ軸に、およびＣｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．のメタノール抽出物の濃度をｘ軸に含む。
【図９】図９は、１０μｇ／ｍｌの濃度におけるＣｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．のメタノール抽出物の画分によるインビトロでのＣＯＸ−２阻害試験の実験結果を示すグラフであり、ｙ軸はヒト組み換え型ＣＯＸ−２のパーセント阻害であり、ｘ軸は分単位の溶出時間で確認された画分である。
【図１０−１】図１０Ａ〜１０Ｅは、Ｃｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．のメタノール抽出物の図９における画分１および２に係る液体クロマトグラフィ質量分析および質量検出に基づく高圧液体クロマトグラフィのプロファイルである。
【図１０−２】図１０Ａ〜１０Ｅは、Ｃｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．のメタノール抽出物の図９における画分１および２に係る液体クロマトグラフィ質量分析および質量検出に基づく高圧液体クロマトグラフィのプロファイルである。
【図１１】図１１は、Ｃｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．のメタノール抽出物を投与した３つの乳癌細胞株の細胞コロニー数を試験した実験結果を示すグラフである。図１１のグラフは、ｘ軸に細胞株、およびｙ軸に対照（１００％）で標準化されたパーセント細胞コロニー数を含む。
【図１２】図１２は、Ｃｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．のヘキサン抽出物を投与した３つの乳癌細胞株の細胞コロニー数を試験した実験結果を示すグラフである。図１２のグラフは、ｘ軸に細胞株、およびｙ軸に対照（１００％）で標準化されたパーセント細胞コロニー数を含む。
【図１３】図１３は、８ｍｇ／ｍｌの濃度でＣｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．のメタノール抽出物を腹腔内投与したヌードマウスにおける腫瘍成長の抑制を試験した実験結果を示すグラフである。図１３のグラフは、ｙ軸に標準化腫瘍体積、およびｘ軸にＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の注入後の日数を含む。
【図１４】図１４は、８ｍｇ／ｍｌの濃度でＣｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．のメタノール抽出物を腹腔内投与したヌードマウスにおける腫瘍成長の抑制を試験した実験結果を示すグラフである。図１３のグラフは、ｙ軸に標準化腫瘍体積、およびｘ軸にＭＣＦ−７細胞の注入後の日数を含む。
【図１５】図１５は、種々の濃度のＣｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．の水性抽出物およびＮＦ−κＢの公知の活性剤、すなわち、ＴＮＦに曝されたヒト胚腎臓２９３細胞におけるＮＦ−κＢの活性化を試験した実験結果を示すグラフである。図１５のグラフは、ｘ軸に処置群、および対照（水性抽出物を含まない）１００％に対して標準化されたＮＦ−κＢの活性化を含む。
【図１６】図１６は、種々の濃度のＣｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．の水性抽出物およびＮＦ−κＢの公知の活性剤、すなわち、ＰＭＡに曝されたヒト胚腎臓２９３細胞におけるＮＦ−κＢの活性化を試験した実験結果を示すグラフである。図１６のグラフは、ｘ軸に処置群、および対照（水性抽出物を含まない）１００％に対して標準化されたＮＦ−κＢの活性化を含む。
【図１７】図１７は、種々の濃度のＣｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．のメタノール抽出物およびＮＦ−κＢの公知の活性剤、すなわち、ＴＮＦに曝されたヒト胚腎臓２９３細胞におけるＮＦ−κＢの活性化を試験した実験結果を示すグラフである。図１７のグラフは、ｘ軸に処置群、および対照（メタノール抽出物を含まない）１００％に対して標準化されたＮＦ−κＢの活性化を含む。
【図１８】図１８は、種々の濃度のＣｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．のメタノール抽出物およびＮＦ−κＢの公知の活性剤、すなわち、ＰＭＡに曝されたヒト胚腎臓２９３細胞におけるＮＦ−κＢの活性化を試験した実験結果を示すグラフである。図１８のグラフは、ｘ軸に処置群、および対照（メタノール抽出物を含まない）１００％に対して標準化されたＮＦ−κＢの活性化を含む。
【図１９】図１９は、図１７の実験の再現、すなわち、種々の濃度のＣｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．のメタノール抽出物およびＮＦ−κＢの公知の活性剤、すなわち、ＴＮＦに曝されたヒト胚腎臓２９３細胞におけるＮＦ−κＢの活性化を試験した実験結果を示すグラフである。図１９のグラフは、ｘ軸に処置群、および対照（メタノール抽出物を含まない）１００％に対して標準化されたＮＦ−κＢの活性化を含む。
【図２０】図２０は、図１８の実験の再現、すなわち、種々の濃度のＣｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．のメタノール抽出物およびＮＦ−κＢの公知の活性剤、すなわち、ＰＭＡに曝露されたヒト胚腎臓２９３細胞におけるＮＦ−κＢの活性化を試験した実験結果を示すグラフである。図２０のグラフは、ｘ軸に処置群、および対照（メタノール抽出物を含まない）１００％に対して標準化されたＮＦ−κＢの活性化を含む。
【図２１】図２１は、図１６の実験の再現、すなわち、種々の濃度のＣｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．の水性抽出物およびＮＦ−κＢの公知の活性剤、すなわち、ＰＭＡに曝されたヒト胚腎臓２９３細胞におけるＮＦ−κＢの活性化を試験した実験結果を示すグラフである。図２１のグラフは、ｘ軸に処置群、および対照（水性抽出物を含まない）１００％に対して標準化されたＮＦ−κＢの活性化を含む。
【図２２】図２２は、種々の濃度のＣｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．のヘキサン抽出物およびＮＦ−κＢの公知の活性剤、すなわち、ＰＭＡに曝されたヒト胚腎臓２９３細胞におけるＮＦ−κＢの活性化を試験した実験結果を示すグラフである。図２２のグラフは、ｘ軸に処置群、および対照（ヘキサン抽出物を含まない）１００％に対して標準化されたＮＦ−κＢの活性化を含む。
【図２３】図２３は、種々の濃度のＣｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．の酢酸エチル抽出物およびＮＦ−κＢの公知の活性剤、すなわち、ＰＭＡに曝されたヒト胚腎臓２９３細胞におけるＮＦ−κＢの活性化を試験した実験結果を示すグラフである。図２３のグラフは、ｘ軸に処置群、および対照（酢酸エチル抽出物を含まない）１００％に対して標準化されたＮＦ−κＢの活性化を含む。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
詳細な説明
本明細書で使用されるとき、以下の用語は、示された意味を有するものと理解すべきである：
項目が「ａ（１つ）」または「ａｎ（１つ）」によって導かれる場合、それは項目の１つ以上を意味するものと理解すべきである。
【００１３】
「成分」は、分子、化学物質、高分子、化合物、もしくは元素の任意の気体、液体もしくは固体の単独もしくは組み合わせを意味する。
【００１４】
「成分溶液」は、液体、固体もしくは気体中に含有、懸濁、保持、または分散された１つ以上の成分の混合物を意味する。
【００１５】
「含む」は、非限定的に含むことを意味する。
【００１６】
「含むこと」は、非限定的に含むことを意味する。
【００１７】
「状態」は、健康の特定の状態を意味し、例えば、限定されるものではないが、障害を受けた、もしくは不適切に機能している体の器官、部分、構造または系の、病気（ｉｌｌｎｅｓｓ）、疾病、疾患、病気（ｄｉｓｅａｓｅ）、身体的もしくは精神的な苦痛、身体的もしくは精神的な苦悩、身体的もしくは精神的な感覚、身体的もしくは精神的な苦しみ、または身体的もしくは精神的な疼痛が挙げられる。「状態」は、癌または炎症を含むことができる。
【００１８】
「ＣＯＸ−２」は、シクロオキシゲナーゼ−２を意味する。
【００１９】
「抽出器」は、溶媒または溶液を含むのに適合可能な少なくとも１つのフラスコ、原料を含むのに適合可能な少なくとも１つのチャンバ、ならびにチャンバおよびフラスコに流体連通した少なくとも１つのコンデンサを有する、装置、機械、器具、道具またはその組み合わせを意味する。抽出器は、抽出プロセスの過程のいくつかの時点で溶媒を回収するのに適合可能な漏斗を有してもよい。シンブルを抽出器と接続して使用してもよい。フィルタを抽出器と接続して使用してもよい。抽出器は、抽出器その完全性を損なわずに加熱に付されるのに適合可能であってよい。抽出器は、限定されるものではないが、１８７９年頃にＦｒａｎｚ  ｖｏｎ  Ｓｏｘｈｌｅｔによって発明されたソクスレー抽出器、ならびにいくつかの市販の抽出器、例えば、限定されるものではないが、Ｇｅｒｈａｒｄｔ  ＧｍｂＨのＳｏｘｔｈｅｒｍ（商標）抽出器およびＦＯＳＳによって製造された自動または半自動抽出器であるＳｏｘｔｅｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（商標）が挙げられる。
【００２０】
「砕く」は、対象物を粉末にするか、粉々にするか、切断するか、粉砕するか、すりつぶすか、激しくこするか、刻むか、鋸で切るか、削るか、もしくは溶解するか、またはそれらを組み合わせるかによって、比較的により小さな粒子または小片に縮小または減少させることを意味する。
【００２１】
「有すること」は、限定されるものではないが、含むことを意味する。
【００２２】
「ＩＣ５０」は、化合物または製剤に関して、ＣＯＸ−２の５０％阻害を生じる化合物または製剤の濃度を意味する。
【００２３】
「阻害する」は、酵素の活性を少なくとも部分的に減少させることを意味する。
【００２４】
「原料」は、植物の任意の部分を意味し、限定されるものではないが、皮（ｂａｒｋ）、茎（ｓｔｅｍ）、葉、芽、軸（ｓｔａｌｋ）、根、花、花粉、枝、シュート、果実、接ぎ穂・挿し穂（ｓｌｉｐ）、野菜（ｖｅｇｅｔａｂｌｅ）、種子、またはその組み合わせを含む。
【００２５】
「非経口的」は、成分の患者への投与経路の種類を意味し、ここで、望ましい効果は全身的である。「非経口的」は、限定されるものではないが、成分を患者に注射または注入によって投与することを含み、そのような注射または注入は、静脈内、動脈内、筋肉内、心臓内、皮下、骨内、皮内、腹腔内、経皮、経粘膜、吸入、またはそれらの組み合わせが挙げられる。
【００２６】
「患者」は、ヒトまたは任意の他の哺乳動物を意味する。
【００２７】
「医薬的に許容されるビヒクル」は、担体、希釈剤、アジュバント、もしくは賦形剤、またはその組み合わせを意味し、それと共に成分が患者に投与される。医薬的に許容されるビヒクルは、限定されるものではないが、ポリエチレングリコール；ワックス；ラクトース；グルコース；スクロース；ステアリン酸マグネシウム；ケイ酸誘導体；硫酸カルシウム；リン酸二カルシウム；デンプン；セルロース誘導体；ゼラチン；天然および合成ゴム（例えば、限定されるものではないが、アルギン酸ナトリウム、ポリエチレングリコールおよびワックス）；適切な油；食塩水；糖溶液（例えば、限定されるものではないが、デキストロース水溶液またはグルコース水溶液）；ＤＭＳＯ；グリコール類（例えば、限定されるものではないが、ポリエチレングリコールまたはポリプロピレングリコール）；滑沢剤（例えば、限定されるものではないが、オレイン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、安息香酸ナトリウム、タルク、およびステアリン酸マグネシウム）；崩壊剤（炭酸カルシウム、重炭酸ナトリウム、寒天、デンプン、およびキサンタンガムを含む）、ならびに吸収性担体（例えば、限定されるものではないが、ベントナイトおよびクロニン（ｋｌｏｎｉｎ）が挙げられ得る。
【００２８】
「溶媒」は、１つまたは複数の成分を懸濁するか、取り出すか、引き出すか、分離するか、または引きつけて溶液を形成する能力を有する液体または気体を意味する。
【００２９】
「治療有効量」は、患者に投与した際に、状態の治療を少なくとも部分的にもたらすために十分な成分の量を意味する。治療有効量は、状態、成分の投与経路、および治療される患者の年齢、体重などに応じて変動する。
【００３０】
「治療する」は、状態に関して、患者によって認識できないとしても、状態のいずれの症状も少なくとも部分的に低減するか、軽減するか、または緩和すること、状態または状態の症状の開始を遅らせること、状態の何らかの症状を少なくとも部分的に治すこと、あるいは、状態もしくは状態の症状を少なくとも部分的に予防もしくは抑制すること、またはそれらの組み合わせを意味する。
【００３１】
Ｃｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．は、限定されるものではないが、ブラジル、ペルー、コロンビア、ベネズエラ、エクアドル、ボリビア、ガイアナ、スリナムおよび仏領ギアナを含むアマゾン地域で一般的に生育するシクンシ科の植物である。ＣＯＸ−２を阻害するＣｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．抽出物は、本明細書に記述される方法を使用して製造することができる。抽出方法は、少なくとも部分的にＣＯＸ−２を阻害するＣｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．の成分を抽出するための溶媒の使用を含む。本明細書に記述される抽出物は、患者の炎症を治療するのに用いることができる。あるいはまた、本明細書に記述される抽出物は、患者の癌を治療するのに用いることができる。ＣＯＸ−２を阻害することは、炎症を減少させて、ヒトでの癌細胞のアポトーシスまたは増殖の減少に寄与することが当業者によく理解されている。
【００３２】
Ｃｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．抽出物は、以下の通りに製造できる。Ｃｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．からの原料を得て、乾燥し、砕くことができる。あるいはまた、Ｃｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．からの原料を小片に砕き、次いで乾燥することができる。原料は、限定されるものではないが、乾燥オーブンなどのオーブンで、約４５℃、または４６〜６５℃の範囲の温度で乾燥して、原料から液体の残りの大部分を除去することができる。乾燥原料は、抽出プロセスにおける次の工程の前に、約−２０℃、または約４℃、あるいは−７０〜−８０℃で保存することができる。あるいはまた、抽出プロセスにおける次の工程は、直ちに開始してもよい。もちろん、他の適当な乾燥温度を使用してもよい。
【００３３】
乾燥の前または後のいずれかで、Ｃｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．からの原料は、砕かれてより小粒径とすることができる。約２０〜５０ミクロン粒径を得るために、Ｃｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．からの原料は、例えば適切なグラインダまたは粉砕機（例えばＷｉｌｅｙミルロータリー粉砕機）を使用して砕かれてよい。さらに、約２０〜５０ミクロン粒径を分離して得るためにフィルタを使用することができる。抽出プロセスの工程の後および間で、Ｃｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．からの原料は、−２０℃、もしくは約４℃、もしくは−７０〜−８０℃または他の適切な温度で、実質的に気密のプラスチック袋または他の容器中に保存することができる。
【００３４】
Ｃｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．からの約１０〜１００グラムの原料は、抽出器を用いて抽出にかけることができる。様々な極性の溶媒が、成分の極性または溶解度に基づき、Ｃｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．原料から種々の成分を抽出して分離するために、抽出器と関連して使用することができる。初めに、Ｃｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．からの原料は、濾紙製「シンブル」の内側に配置することができる。シンブルは、任意の適切な浸透性材料からできていてよい。シンブルは、Ｃｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．からの原料とともに抽出器に入れることができる。抽出器は、溶媒およびコンデンサを含むフラスコを有することができる。溶媒は加熱されてよく、それにより溶媒を蒸発させる。熱い溶媒蒸気はコンデンサまで移動し、そこで、冷却されてチャンバ中に、またＣｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．からの原料の上に滴り落ちる。抽出器内では、Ｃｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．からの原料を含むチャンバは、温かい溶媒でゆっくりと満たされる。その時点で、原料の成分は、原料から抽出されて、溶媒を有する成分溶液を形成する。チャンバがほとんど満たされたとき、成分溶液はフラスコ内へのサイホン作用で空にされる。それぞれのサイクルの間、Ｃｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．原料からの成分は、溶媒中に抽出されて成分溶液をもたらす。このサイクルは何回も各溶媒で繰り返してもよい。この抽出プロセスの間、きれいな温かい溶媒は、Ｃｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．の原料から成分を抽出するのにシンブル中で使用され得る。
【００３５】
抽出器に関連して使用することができる溶媒に関して、非極性溶媒（例えば、ヘキサン−１（「ヘキサン」））または他の非極性溶媒（例えば、限定されるものではないが、ペンタン、シクロヘキサン、ヘプタン、トリクロロエチレン、四塩化炭素、ジイソプロピルエーテル、またはトルエン）が使用され得る。中程度の極性溶媒（例えば、酢酸エチル−２（「酢酸エチル」））または他の中程度の極性溶媒（例えば、限定されるものではないが、キシレン、メチルブチルエーテル、ジエチルエーテル、ジクロロメタン、ジクロロエタン、ｎ−ブタノール、イソプロパノール、テトラヒドロフラン、酢酸ブチル、クロロホルム、ｎ−プロパノール、またはメチルエチルケトン）を使用することができる。極性溶媒（例えば、メタノール−３（「メタノール」））または他の極性溶媒（例えば、限定されるものではないが、アセトン、エタノール、アセトニトリル、酢酸、ジメチルホルムアミド、またはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ））を使用することができる。非極性溶媒、中程度の極性溶媒、および極性溶媒による抽出は、４５℃または他の適切な温度（限定されるものではないが、約２６℃から約６０℃までを含む）で行うことができる。比較的純粋な水（「水性溶媒」）は、Ｃｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．からの原料を約１２時間、もしくは約４時間から１２時間の間、または他の適切な時間、浸すことにより成分を抽出するために使用することができ、そしてそれは極性溶媒、中程度の極性溶媒、または非極性溶媒のいずれかを使用して固形の原料を濾去した後に残存し、成分溶液をもたらす。あるいはまた、Ｃｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．からの原料は、抽出方法の過程の任意の時点で、または任意の溶媒によって原料を処理することから独立して、比較的純粋な水に浸すことができる。抽出に対する曝露時間の効果を評価するためにサンプルを対照として定期的に抜き取り、分析することができる。
【００３６】
上記のプロセスの後で、Ｃｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．の種々の成分を含む溶媒、すなわち成分溶液は、抽出器のフラスコ中に存在する。液体は、ロータリーエバポレータまたは他の適切なエバポレータ（限定されるものではないが、真空ドライヤ、真空オーブン、窒素ガス、熱燃料濃縮器、遠心分離機および噴霧乾燥器または他の適切な乾燥プロセスを含む）を使用して成分溶液を乾燥させることによって、少なくとも部分的に除去することができる。この乾燥プロセスは、成分溶液から液体を実質的に全て取り除くことが可能である。得られた抽出物は、凍結または凍結乾燥され得る。抽出物は、少なくとも部分的に乾燥粉末の形態で保存され得る。抽出物は、シンチレーションバイアルに移され得るが、該バイアルは、予め計量され、−２０℃で、または冷蔵庫に約４℃で、または−７０〜−８０℃で、あるいは他の適切な温度で保存され得る。
【００３７】
ヘキサン、酢酸エチル、メタノールおよび水が使用される場合、上記の方法の結果は、Ｃｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．の４つの抽出物であり、各抽出物は、使用される溶媒によって抽出された成分を含む。これらの抽出物は、ヘキサン抽出物、酢酸エチル抽出物、メタノール抽出物および水性抽出物（総称して、「４つの抽出物」）と呼ばれる。
【実施例】
【００３８】
実験結果
実験結果は、Ｃｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．抽出物が、ＣＯＸ−２を阻害するのに用いることができることを証明している。本明細書に記述された結果は、Ｃｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．抽出物が、ＮＦ−κＢの活性化を阻害することを証明している。また、本明細書に記述された結果は、Ｃｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．抽出物が、ＳＫ−Ｍｅｌ２８細胞（ヒトの黒色腫細胞株）の増殖を減少させ、ヒト乳癌細胞株における細胞コロニー数を減少させることを証明している。そのうえ、Ｃｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．抽出物は、ＭＣＦ−７およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳癌細胞由来の腫瘍を有するヌードマウスで、腫瘍体積が減少した成長をもたらす。
【００３９】
ＣＯＸ−２阻害およびＣｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．抽出物
Ｃｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．抽出物がＣＯＸ−２を少なくとも部分的に阻害したかどうかを確認した実験は、ヒト組換え型ＣＯＸ−２（「ＣＯＸ−２阻害アッセイ」）のペルオキシダーゼ活性をアッセイした。このＣＯＸ−２阻害アッセイは、４つの抽出物のそれぞれについて行われた。
【００４０】
ＣＯＸ−２阻害アッセイは、水浴を使用して、約３７℃に維持して行った。簡潔に言うと、反応緩衝液（５ｍＭのＥＤＴＡと２ｍＭのフェノールとを含む０．１Ｍのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０））中のヒト組み換え型ＣＯＸ−２、ヘム、およびアラキドン酸を、４つの抽出物の各々と２分間、インキュベーションした。酸化型テトラメチル−ｐ−フェニルジアミンの出現は、比色分析によりペルオキシダーゼ活性の存在を示した。
【００４１】
ＣＯＸ−２阻害アッセイの調製において、乾燥抽出物をメタノール、ジメチルスルホキシド（「ＤＭＳＯ」）、またはエタノールに溶解し、次いで反応緩衝液に希釈した。抽出物の最終濃度は、９μｇ／ｍｌであった。２分間のインキュベーションの後に、１Ｍ塩酸を加えてＣＯＸ−２活性を止めた。ＤＵＰ−６９７（既知のＣＯＸ−２阻害剤）を内部対照として使用し、予想されたように、約２００ｎＭのＩＣ５０でＣＯＸ−２を阻害した。ＣＯＸ−２のパーセント阻害は、抽出物ありの反応の定量されたＣＯＸ−２活性を、ＣＯＸ−２阻害剤が全くない反応の定量されたＣＯＸ−２活性から引いて、その結果を抽出物なしでの反応の定量されたＣＯＸ−２活性で割ることによって算出した。抽出物によるＣＯＸ−２のパーセント阻害は、５％から６７％の範囲であった。この結果は、メタノール抽出物が、酢酸エチル抽出物、ヘキサン抽出物および水性抽出物よりもこの濃度でＣＯＸ−２を阻害するのにより効果的であり得ることを証明した。酢酸エチル抽出物、ヘキサン抽出物または水性抽出物は、異なる濃度ではＣＯＸ−２を阻害するのにより効果的であり得る可能性がある。ＣＯＸ−２阻害アッセイは、同じ変数で少なくとも４回、行った。上記のＣＯＸ−２阻害アッセイの結果は、図１〜４に示される。ＣＯＸ−２の相対的な阻害は、ＩＣ５０値の生成と関係し得る。
【００４２】
さらに、メタノール抽出物を、１．５６μｇ／ｍｌから１００μｇ／ｍｌの範囲の異なる濃度で、ＣＯＸ−２阻害アッセイに用いた。２つの同一の実験からの結果は、図５および図６に示される。メタノール抽出物は、図５で２．２μｇ／ｍｌのＩＣ５０および図６で７．９μ／ｍｌのＩＣ５０を示した。ＣＯＸ−２のより大きな阻害は、メタノール抽出物のより高濃度と相関している場合がある。
【００４３】
さらなるアッセイを、ヒト癌細胞の増殖に対するメタノール抽出物の効果を決定するために行った。ヒト黒色腫細胞株（ＳＫ−Ｍｅｌ２８）を、２つの独立した実験で用いた。メタノール抽出物を、１．６μｇ／ｍｌから１００μｇ／ｍｌの範囲の異なる濃度で、ＳＫ−Ｍｅｌ２８細胞に投与した。血清（通常、種々の成長因子を含む）が、ＳＫ−Ｍｅｌ２８細胞の増殖の阻害に干渉する場合があるので、メタノール抽出物を、ヒト成長血清の存在下および非存在下に培養されたＳＫ−Ｍｅｌ２８細胞に投与した。細胞増殖は、テトラゾリウム化合物［３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム、分子内塩、または「ＭＴＳ」］を電子結合試薬（フェナジンエトサルフェート、すなわち「ＰＥＳ」）と併用するＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６  Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）により測定し、細胞増殖を示す比色変化を生じた。このアッセイは、４９０ｎｍでの吸光度を記録することによって、メタノール抽出物によるＳＫ−Ｍｅｌ２８の増殖における減少を測定した。アッセイの結果は、図７および８に示される。図７は、１００μｇ／ｍｌでのメタノール抽出物が、血清添加した成長培地でのヒト黒色腫細胞株ＳＫ−Ｍｅｌ２８の増殖を約３０％減少させることを示し、ＩＣ５０は、１００μｇ／ｍｌを超えるものであった。ＳＫ−Ｍｅｌ２８の増殖のメタノール抽出物による減少はまた、血清なしの成長培地のＳＫ−Ｍｅｌ２８細胞でもアッセイされ、その結果が図８に示される。８４μｇ／ｍｌのＩＣ５０を有するメタノール抽出物による、ＳＫ−Ｍｅｌ２８細胞の増殖の顕著な減少が、図８に示すように観察された。また、図７〜８は、メタノール抽出物が用量依存的にＳＫ−Ｍｅｌ２８の増殖を減少させたことを示す結果を表す。
【００４４】
ＣＯＸ−２の阻害を担うメタノール抽出物の成分を特定するために、Ｃｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．からのメタノール抽出物を、半分取カラム上で分画した。メタノール抽出物をＣＴＣ  Ａｎａｌｙｔｉｃｓ（商標）ＰＡＬ（商標）インジェクタ（液体クロマトグラフィ自動化インジェクタ）を用いて５０μｌの注入容量で、Ａｇｉｌｅｎｔ（商標）Ｚｏｒｂａｘ（商標）ＸＤＢ  Ｃ１８  ２１．２×１００ｍｍカラム上に負荷した。メタノール抽出物を、Ｓｈｉｍａｄｚｕ（商標）ＬＣ−６（商標）の２成分系高圧システムを使用して溶出した。第１移動相は、０．０５％トリフルオロ酢酸（「ＴＦＡ」）を含むＨ２Ｏであり、そして、第２移動相は、０．０５％ＴＦＡを含むメタノールであった。長さ１５ｃｍの制限キャピラリーおよび約５００：１のスプリット比による３０μｍの内径（「ｉｄ」）を有する２つのＶａｌｃｏ  Ｙ−フィッティングを備えるポストカラムスプリットを使用した。フラクションコレクタは、Ａｄｖａｎｔｅｃ製であり、０．８分での分画開始および０．２０分の回収工程に基づいて時間をセットした。もちろん、同じまたは類似した分画を達成するために、他の変数を用いることができる。異なる時間での溶出画分を回収し、窒素下で乾燥するかまたは凍結乾燥して比較的純粋な画分を得ることができた。乾燥画分は、ＣＯＸ−２を阻害することにより治療が可能である任意の病気または疾患（限定されるものではないが、炎症または癌に関連した病気を含む）を治療するために当該分野で公知の方法に従って医薬に配合され得る。
【００４５】
Ｃｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．メタノール抽出物からの画分によるＣＯＸ−２の阻害を、ＣＯＸ−２阻害アッセイによって調べた。ＣＯＸ−２阻害アッセイの乾燥画分を調製するために、乾燥画分を１００％のＤＭＳＯおよび水に懸濁して０．５％ＤＭＳＯ溶液とした。０．５％ＤＭＳＯのみによる対照を、ＣＯＸ−２阻害アッセイに含ませることができる。画分を、種々の濃度、例えば、限定されるものではないが、１．５６〜１００μｇ／ｍｌで試験した。Ｃｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．メタノール抽出物からの画分を１０μｇ／ｍｌの濃度で使用したＣＯＸ−２阻害アッセイの結果は、図９に示される。図９は、ｘ軸に分単位による溶出時間での画分番号（以下、各々の画分の識別番号である分単位の溶出時間を有する）と、ｙ軸にヒト組み換え型ＣＯＸ−２のパーセント阻害を示す。図９で分かるように、画分１および２（１分および２分でそれぞれ溶出した）は、最大のＣＯＸ−２阻害を示したが、画分６、７および１３も顕著なＣＯＸ−２阻害を示した。いくらかの阻害が、画分４、８、９、１０および１４により示された。
【００４６】
最大のＣＯＸ−２阻害を示した画分、特に画分１および２は、ｈｙｐｅｒｓｉｌ  Ｃ１８逆相カラム（１００×２．１ｍｍ、５ｍｍ）上での分析用液体クロマトグラフィ質量分析（「ＬＣ−ＭＳ」）を用いて構造についてプロファイルされ、０．６ｍｌ／分の流量で、水−アセトニトリル勾配により溶出した。図１０Ａ〜１０Ｅは、画分１および２からの質量スペクトルを示す。図１０Ａ〜１０Ｅで示されるように、画分１および２に存在し得る成分としては、２０−エピ−イソイグエステリノール、サラソールＡ、イソグエステリン、ノル−イソグエステリン、およびサラシノールが挙げられる。
【００４７】
ＮＦ−κＢの活性化の阻害およびＣｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．抽出物
ＮＦ−κＢアッセイは、Ｃｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．の水性抽出物、Ｃｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．のメタノール抽出物、Ｃｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．の酢酸エチル抽出物、およびＣｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．のヘキサン抽出物が、ヒト胚腎臓２９３細胞においてインビトロで炎症反応を減少させ得ることを証明した。ＮＦ−κＢは、転写因子である。ＮＦ−κＢの活性化／発現が、多くの初期の炎症反応のうちの１つであり、炎症の指標であることは、当業者に理解されている。ＮＦ−κＢの活性化の阻害は、炎症の対応する阻害を含み得る。このように、ＮＦ−κＢの活性化を阻害する抽出物は、患者の炎症を治療することができる。図１５〜２３は、ＮＦ−κＢの活性化への、Ｃｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．の水性抽出物、メタノール抽出物、ヘキサン抽出物、および酢酸エチル抽出物の効果を試験するためのＮＦ−κＢレポータ遺伝子アッセイの結果を示す。ヒト胚腎臓２９３細胞は、ホタルルシフェラーゼ遺伝子の上流にＮＦ−κＢ反応要素を含むＤＮＡプラスミドでトランスフェクションした。ＮＦ−κＢが活性化されると、ルシフェラーゼの発現が増加する。ルシフェラーゼの発現は、ルシフェラーゼが光を生じる酵素反応により測定される。より大きな光度は、増加したＮＦ−κＢの活性化と符合する。
【００４８】
ＴＮＦ（腫瘍壊死因子）およびＰＭＡ（ホルボールエステル）の両方は、ＮＦ−κＢの公知の強力な活性剤である。ＮＦ−κＢアッセイに関して、ヒト胚腎臓２９３細胞は、活性炭処理済み培地で一晩、プレート化した。ヒト胚腎臓２９３細胞を別々にＤＭＳＯのみ、および２０ｎｇ／ｍｌの濃度のＰＭＡで、そして第２の実験では、ＤＭＳＯのみおよび５０ｎｇ／ｍｌの濃度のＴＮＦに曝らし、そして前記の処置群の各々は、Ｃｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．の水性抽出物、メタノール抽出物、ヘキサン抽出物、または酢酸エチル抽出物をＤＭＳＯ中に２０μｇ／ｍｌ、２．０μｇ／ｍｌ、または０．２μｇ／ｍｌに溶解した用量範囲の投与を受けた。細胞を採取し、ルシフェラーゼアッセイのために翌日に溶解した。各々の処置群のＮＦ−κＢのパーセント活性化を観察した。ＮＦ−κＢの活性化は、ＤＭＳＯと公知の活性剤（ＴＮＦまたはＰＭＡ）とを含有する対照に関して１００％に標準化された。
【００４９】
Ｃｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．の水性抽出物を用いたＮＦ−κＢアッセイの結果は、図１５、１６および２１に示される。図１５は、５０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦとＣｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．の水性抽出物とを投与した細胞でのＮＦ−κＢの活性化を試験した実験結果を示すグラフである。図１５に示されるように、５０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ処置群では、結果はＮＦ−κＢの活性化に関して結論がでなかった。図１６および２１は、２０ｎｇ／ｍｌのＰＭＡとＣｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．の水性抽出物とを投与した細胞でのＮＦ−κＢの活性化を試験した２つの別々の実験からの結果を示すグラフである。図１６に示されるように、２０ｎｇ／ｍｌのＰＭＡ処置群では、ＮＦ−κＢの活性化は、Ｃｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．の水性抽出物２０μｇ／ｍｌを投与された細胞で約６３％であり、Ｃｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．の水性抽出物２μｇ／ｍｌを投与された細胞で約６５％であった。図２１に示されるように、２０ｎｇ／ｍｌのＰＭＡ処置群では、ＮＦ−κＢの活性化は、Ｃｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．の水性抽出物２０μｇ／ｍｌを投与された細胞で約３３％であり、Ｃｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．の水性抽出物０．２μｇ／ｍｌを投与された細胞で約９１％であった。
【００５０】
図１７および１９は、ＴＮＦ５０ｎｇ／ｍｌとＣｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．のメタノール抽出物とを投与した細胞でのＮＦ−κＢの活性化を試験した２つの別々の実験からの結果を示すグラフである。図１７は、５０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦとＣｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．のメタノール抽出物とを投与した細胞でのＮＦ−κＢの活性化を試験した実験結果を示すグラフである。図１７に図示されるように、５０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ処置群では、ＮＦ−κＢの活性化は、Ｃｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．のメタノール抽出物２０μｇ／ｍｌを投与された細胞で約９６％であり、Ｃｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．のメタノール抽出物２μｇ／ｍｌを投与された細胞で約９３％であった。図１９に示されるように、５０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ処置群では、ＮＦ−κＢの活性化は、Ｃｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．のメタノール抽出物２０μｇ／ｍｌを投与された細胞で約７５％であり、Ｃｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．のメタノール抽出物２μｇ／ｍｌを投与された細胞で約８４％であり、Ｃｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．のメタノール抽出物０．２μｇ／ｍｌを投与された細胞で約９８％であった。図１８および２０は、２０ｎｇ／ｍｌのＰＭＡとＣｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．のメタノール抽出物とを投与した細胞でのＮＦ−κＢの活性化を試験した２つの別々の実験からの結果を示すグラフである。図１８に図示されるように、２０ｎｇ／ｍｌのＰＭＡ処置群では、ＮＦ−κＢの活性化は、Ｃｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．のメタノール抽出物２０μｇ／ｍｌを投与された細胞で約６２％であり、Ｃｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．のメタノール抽出物２μｇ／ｍｌを投与された細胞で約９６％であり、Ｃｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．のメタノール抽出物０．２μｇ／ｍｌを投与された細胞で約８３％であった。図２０に示されるように、２０ｎｇ／ｍｌのＰＭＡ処置群では、ＮＦ−κＢの活性化は、Ｃｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．のメタノール抽出物２０μｇ／ｍｌを投与された細胞で約５６％であり、Ｃｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．のメタノール抽出物２μｇ／ｍｌを投与された細胞で約４０％であり、Ｃｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．のメタノール抽出物０．２μｇ／ｍｌを投与された細胞で約５４％であった。
【００５１】
Ｃｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．のヘキサン抽出物を用いたＮＦ−κＢアッセイの結果は、図２２に示される。図２２は、２０ｎｇ／ｍｌのＰＭＡとＣｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．のヘキサン抽出物とを投与した細胞でのＮＦ−κＢの活性化を試験した実験結果を示すグラフである。図２２に示されるように、２０ｎｇ／ｍｌのＰＭＡ処置群では、ＮＦ−κＢの活性化は、Ｃｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．のヘキサン抽出物２０μｇ／ｍｌを投与された細胞で約３９％であり、Ｃｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．のヘキサン抽出物２μｇ／ｍｌを投与された細胞で約９２％であった。Ｃｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．のヘキサン抽出物と５０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦとを用いたＮＦ−κＢアッセイの結果は、結論がでなかった。
【００５２】
Ｃｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．の酢酸エチル抽出物を用いたＮＦ−κＢアッセイの結果は、図２３に示される。図２３は、２０ｎｇ／ｍｌのＰＭＡとＣｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．の酢酸エチル抽出物とを投与した細胞でのＮＦ−κＢの活性化を試験した実験結果を示すグラフである。図２３に示されるように、２０ｎｇ／ｍｌのＰＭＡ処置群では、ＮＦ−κＢの活性化は、Ｃｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．の酢酸エチル抽出物２０μｇ／ｍｌを投与された細胞で約９１％であり、Ｃｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．の酢酸エチル抽出物２μｇ／ｍｌを投与された細胞で約８４％であり、そしてＣｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．の酢酸エチル抽出物０．２μｇ／ｍｌを投与された細胞で約６６％であった。Ｃｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．の酢酸エチル抽出物と５０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦとを用いたＮＦ−κＢアッセイの結果は、結論がでなかった。
【００５３】
Ｃｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．抽出物および癌成長の減少
インビトロでの細胞培養アッセイは、Ｃｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．のメタノール抽出物およびＣｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．のヘキサン抽出物が、癌細胞株で細胞コロニー形成の成長を減少させることを証明した。Ｃｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．の水性抽出物およびＣｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．の酢酸エチル抽出物を用いたインビトロでの細胞培養アッセイの結果は、結論がでなかった。図１１および図１２は、３つの乳癌細胞株：ＭＣＦ−７（エストロゲン受容体陽性ヒト乳癌細胞株）、ヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ヒト転移性乳管癌サンプル由来のエストロゲン非依存性癌細胞株）、およびＭＤＡ−ＭＢ−３６１（脳転移組織由来のエストロゲン受容体陽性ヒト乳癌細胞株）ならびにＣｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．のメタノール抽出物またはＣｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．のヘキサン抽出物を用いた結果を表す。
【００５４】
ヒト乳癌細胞株ＭＣＦ−７、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１の細胞を血清添加培地中で培養プレートに播種した。ＤＭＳＯ中１０μｇ／ｍｌの濃度に溶解したＣｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．のメタノール抽出物またはＣｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．のヘキサン抽出物に細胞を曝らした。７〜１０日間の増殖成長アッセイを実施した。コロニーを染色して、手動で計数（５０個の細胞が１つのコロニーに等しい）して細胞コロニーを計数することにより細胞の増殖をモニターした。図１１のグラフでは、結果はＣｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．のメタノール抽出物への早期の曝露に耐えて、増殖して目に見えるコロニーを形成する細胞の数を表す。図１２のグラフでは、結果はＣｏｍｂｒｅｔｕｍ
ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．のヘキサン抽出物への早期の曝露に耐えて、増殖して目に見えるコロニーを形成する細胞の数を表す。各細胞株に対する生のコロニーのカウント（コロニーの数）は、処置群について対照（１００％）を用いて標準化した。Ｃｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．のメタノール抽出物に曝された各細胞株に対する標準化された細胞コロニー数が図１１に示され、そこでは、各棒は、特定の細胞株がＣｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．のメタノール抽出物に曝された重複サンプルの平均である。図１１のグラフは、ｘ軸に細胞株、ｙ軸に対照（１００％）で標準化された細胞コロニー数を含む。図１１に示されるように、Ｃｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．のメタノール抽出物は、他の細胞株に比べて、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１の増殖を最大限に阻害し、約６９．３％の標準化細胞コロニー数を示し、ＭＣＦ−７の増殖は、約７８．２％の標準化された細胞コロニー数を有し、そしてＭＤＡ−ＭＢ−２３１は、約９５．７％の標準化された細胞コロニー数を有した。Ｃｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．のヘキサン抽出物に曝された各細胞株に対する標準化細胞コロニー数は、図１２に示され、そこでは、各棒は、特定の細胞株がＣｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．のヘキサン抽出物に曝された重複サンプルの平均である。図１２のグラフは、ｘ軸に細胞株およびｙ軸に対照（１００％）で標準化された細胞コロニー数を含む。図１２に示されるように、Ｃｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．のヘキサン抽出物は、他の細胞株に比べて、ＭＣＦ−７の増殖を最大限に阻害し、約７２．６％の標準化細胞コロニー数を示し、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１の増殖は、約８２．１％の標準化された細胞コロニー数を有し、そしてＭＤＡ−ＭＢ−２３１は、約１０２．１％の標準化された細胞コロニー数を有した。
【００５５】
実験結果は、Ｃｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．のメタノール抽出物が、インビボでの乳癌の腫瘍の増殖を抑制することができることを証明している。ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（商標）からのＲｅｄｕｃｅｄ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｍａｔｒｉｇｅｌを１００μｌ、および皮下背部の２つの部位への５×１０６個のＭＣＦ−７細胞（エストロゲン受容体陽性ヒト乳癌細胞）または乳房脂肪体への５×１０６個のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、全て５０μｌのリン酸緩衝生理食塩水（「ＰＢＳ」）に懸濁して雌ヌードマウスにそれぞれ注入した。腫瘍形成後（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を注入されたマウスに関しては注入後およそ１２日で、ＭＣＦ−７細胞を注入されたマウスに関しては注入後およそ１０日で発生）、ヌードマウスを処置群に無作為化した。ヌードマウスの１群に、５０μｌのＤＭＳＯ：ＰＢＳ（１：５）溶液に懸濁したＣｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．のメタノール抽出物を毎日、腹腔内（「ＩＰ」）注入した。ＤＭＳＯ：ＰＢＳ溶液に懸濁する前に、乾燥メタノール抽出物を純粋エタノールに再懸濁し、分注し、エタノールを蒸発させ、乾燥粉末とした。ヌードマウスの対照群は、ＤＭＳＯ：ＰＢＳ（１：５）溶液（「対照」）のみで処置した。ヌードマウスに、対照またはＣｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．のメタノール抽出物のいずれかを投与した。腫瘍は１日おきに測定した。腫瘍体積を、カリパスを用いてミリメートル単位で腫瘍の短軸および長軸を測定することによって算出し、式：４．１９×（長軸／２）×（短軸／２）２を用いて、立方ミリメートル（ｍｍ３）単位で腫瘍体積を得た。腫瘍体積値は標準化された。
【００５６】
上記の方法を用いた２つの実験の結果は、図１３および１４に示され、ｙ軸上に標準化された腫瘍体積を立方ミリメートル（ｍｍ３）で、ｘ軸上にＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞またはＭＣＦ−７細胞の注入後の日数を示す。マウスに、図１３に示される実験において乳房脂肪体にＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を注入したが、対照群では８匹のマウス、およびＣｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．のメタノール抽出物（最終濃度：０．８ｍｇ／ｍｌ）投与群では８匹のマウスをそれぞれ９日間連続して用いた。注入後２１日目から始めて、Ｃｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．のメタノール抽出物の最終濃度をメタノール抽出物で処置されるマウス群では８ｍｇ／ｍｌに増量した。腫瘍は、注入後１３日目から始めて１日おきに測定された。プロット線１０は、Ｃｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．のメタノール抽出物を投与した８匹のヌードマウスからの結果を表し、そしてプロット線１２は、対照を投与した８匹のヌードマウスからの結果を表す。図１４に示された実験では、１０匹の雌ヌードマウスに、彼らの耳の後ろの肩甲下に配置された０．７２ｍｇ−６０日間放出エストロゲンペレットに加えて、ＭＣＦ−７細胞を背部皮下の２つの部位に注入した。プロット線１４は、Ｃｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．のメタノール抽出物を８ｍｇ／ｍｌ濃度で投与した５匹のヌードマウスからの結果を表し、プロット線１６は、対照を投与した５匹のヌードマウスからの結果を表し、各々注入後１０日目から開始した。図１３〜１４に示されるように、対照と比べて、Ｃｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．のメタノール抽出物は、腫瘍成長を抑制した。
【００５７】
腹腔内注射により状態を治療する成分は、非経口投与された場合、状態を治療するようであると当業者に理解される。Ｃｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．抽出物は、乳癌を治療するために患者に非経口的に投与することができる。
【００５８】
Ｃｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．抽出物は、本明細書に記載された方法を用いて作製することができる。メタノールまたは他のいずれかの溶媒、例えば、限定されるものではないが、極性溶媒、非極性溶媒、中程度の極性溶媒、または水性溶媒を、ＣＯＸ−２を少なくとも部分的に阻害するＣｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．の成分の抽出に使用することができる。ＣＯＸ−２は、一般的に炎症と呼ばれる免疫反応に寄与する酵素であるので、ＣＯＸ−２の阻害は炎症の減少をもたらすことが当業者には理解される。また、ＣＯＸ−２の阻害は、癌細胞のアポトーシスまたは癌細胞の増殖の減少をもたらすことが当業者には理解されている。このように、Ｃｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．抽出物は、医薬に配合されることができ、癌細胞の増殖を減少させること、または癌細胞のアポトーシスを誘導することによって癌を治療することが期待される。このような抽出物は、また、濃縮または乾燥されて、医薬に配合することができる。あるいはまた、このような抽出物は、ＣＯＸ−２を阻害する特定の画分をさらに単離するために分画されてもよい。例えば、制限されることなく、画分１〜２および画分６、７、１３は、任意の組み合わせまたは個別で、医薬に配合して患者のＣＯＸ−２を少なくとも部分的に阻害することができる。
【００５９】
Ｃｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．抽出物を含む医薬は、炎症または癌を治療するために患者に治療有効量で投与され得ることが期待される。Ｃｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．抽出物を含む医薬を調製し、製剤化して当業者に公知の手順によって患者に投与することができる。
【００６０】
Ｃｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．抽出物を含む医薬は、化合物をブレンドし混合するための当業者に公知の従来の手順により調製され得る。例えば、Ｃｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．のメタノール抽出物、またはＣｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．のメタノール抽出物からの画分（例えば、画分１〜２または画分６、７および１３など）を単独または組み合わせて、患者を治療するための抽出物の経口投与または経腸的投与を容易にするための医薬的に許容されるビヒクルを用いて、治療有効量で溶液、懸濁液、粉末、カプセル、錠剤、または液体に製剤化することができる。あるいはまた、Ｃｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．抽出物またはＣｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．抽出物の特定の画分は、医薬的に許容されるビヒクルに配合されて、非経口投与（静脈内投与、皮内投与、筋肉内投与、および皮下投与を含む）を容易にすることができる。代替的な実施形態では、Ｃｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．抽出物またはＣｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｌａｕｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｍａｒｔ．抽出物からの画分は、単独または組み合わされて、局所投与または経皮投与のための医薬的に許容されるビヒクルを用いて、溶液、クリーム、またはゲルに配合されてよい。
【００６１】
上記の具体的な詳細は、本発明の特定の実施形態を記載するが、当業者は、様々な変更が、添付の請求項で定義された発明の精神および範囲から逸脱することなく、均等論を考慮して、本発明の詳細においてなされ得ることを認識するであろう。従って、本発明は、本明細書に示され、記載された具体的な詳細に制限されるものではないと理解すべきである。