【手続補正書】
【提出日】平成23年5月30日(2011.5.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、ヒドロゲルを形成する方法であって、架橋可能なフェノール基を含むポリマー、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）、および過酸化水素（H2O2）を溶液中で混合して、該ポリマーを架橋しヒドロゲルを形成する、方法：
HRP濃度の閾値およびH2O2モル濃度の範囲を決定する工程であって、溶液中のH2O2モル濃度を該範囲内に限定し、かつ、該溶液中のHRP濃度を該閾値超に限定した場合、
該溶液におけるゲル化速度が、該範囲内での該H2O2モル濃度の変化によって実質的に影響されず、かつ
ヒドロゲルにおける架橋密度が、該閾値超での該HRP濃度の変化によって実質的に影響されないように、
該範囲の上限が約1 mM未満である、工程；
HRPの量およびH2O2の量を選択する工程；ならびに
該ポリマー、該量のHRPおよび該量のH2O2を溶液中で混合して、該ポリマーを架橋しヒドロゲルを形成する、工程であって、
該溶液中の該H2O2モル濃度を該範囲内に限定し、かつ、該溶液中の該HRP濃度を該閾値超に限定するように、該HRPおよびH2O2の量が選択される、工程。
【請求項２】
前記溶液から形成される前記ヒドロゲルが所定の貯蔵弾性率（storage modulus）を有するように、前記H2O2モル濃度が選択される、請求項1記載の方法。
【請求項３】
前記溶液から形成される前記ヒドロゲルが、約10〜約4000 Paの貯蔵弾性率を有する、請求項1または2記載の方法。
【請求項４】
前記範囲が約0.146〜約1.092 mMである、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
前記決定する工程が以下の段階を含む、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法：
複数の溶液から複数のヒドロゲルを形成する段階であって、該溶液の各々が、前記ポリマー、HRP、およびH2O2を含み、該複数の溶液が同一濃度の該ポリマーを有し、いくつかの該溶液が同一のH2O2モル濃度を有するが異なるHRP濃度を有し、かつ、いくつかの該溶液が同一のHRP濃度を有するが異なるH2O2モル濃度を有し、該溶液中のH2O2モル濃度が約1 mM未満である、段階；
該形成する段階の間の該溶液の各々におけるゲル化速度を示す第1計測値（metric）、および該ヒドロゲルの各々における架橋密度を示す第2計測値を測定する段階；
（1）該第1計測値が、前記閾値超の同一のHRP濃度を有するが前記範囲内の異なるH2O2モル濃度を各々有する溶液について実質的に一定であること、および
（2）該第2計測値が、前記範囲内の同一のH2O2モル濃度を有するが前記閾値超の異なるHRP濃度を各々有する溶液について実質的に一定であること
を必要とすることで、H2O2モル濃度の前記範囲およびHRP濃度の前記閾値を決定する段階。
【請求項６】
前記第1計測値がゲル化点に達するのに要する時間であり、かつ前記第2計測値が貯蔵弾性率である、請求項5記載の方法。
【請求項７】
前記ポリマーが、ヒアルロン酸およびチラミンの結合体（HA-Tyr）である、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
以下の工程を含む、方法：
複数の溶液から複数のヒドロゲルを形成する工程であって、該溶液の各々が、ポリマー、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）、および過酸化水素（H2O2）を含み、該ポリマーが架橋可能なフェノール基を含み、該複数の溶液が同一濃度の該ポリマーを有し、いくつかの該溶液が同一のH2O2モル濃度を有するが異なるHRP濃度を有し、かつ、いくつかの該溶液が同一のHRP濃度を有するが異なるH2O2モル濃度を有し、該溶液中のH2O2モル濃度が約1 mM未満である、工程；
該形成する工程の間の該溶液の各々におけるゲル化速度を示す第1計測値、および該ヒドロゲルの各々における架橋密度を示す第2計測値を測定する工程；
（1）該第1計測値が、閾値超の同一のHRP濃度を有するが範囲内の異なるH2O2モル濃度を各々有する溶液について実質的に一定であること、および
（2）該第2計測値が、該範囲内の同一のH2O2モル濃度を有するが該閾値超の異なるHRP濃度を各々有する溶液について実質的に一定であること
を必要とすることで、H2O2モル濃度の範囲およびHRP濃度の閾値を決定する工程。
【請求項９】
前記第1計測値がゲル化点に達するのに要する時間であり、かつ前記第2計測値が貯蔵弾性率である、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
架橋可能なフェノール基を含むポリマー、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）、および過酸化水素（H2O2）を複数の溶液の各々において混合して、該各溶液において該ポリマーを架橋しそれぞれのヒドロゲルを形成する、工程であって、該溶液が、予め選択されたゲル化速度を達成するように選択されたHRP濃度、およびそれぞれの溶液から形成される異なるヒドロゲルにおいて異なる架橋密度を達成するように選択された異なるH2O2モル濃度を有する、工程；
約1mM未満の上限を有する所定の範囲内に該H2O2モル濃度を限定する工程；ならびに
所定の閾値超に該HRP濃度を限定する工程
を含む、架橋可能なフェノール基を含むポリマーから異なる架橋密度を有するヒドロゲルを形成する方法であって、
該溶液中のH2O2モル濃度を該所定の範囲内に限定し、かつ該溶液中のHRP濃度を該所定の閾値超に限定した場合、
該溶液におけるゲル化速度が、該範囲内での該H2O2モル濃度の選択の変化によって実質的に影響されないこと、および
該ヒドロゲルにおける架橋密度が、該閾値超での該HRP濃度の選択の変化によって実質的に影響されないこと
に基づいて、該所定の範囲および該所定の閾値が決定されている、方法。
【請求項１１】
前記ポリマーが、ヒアルロン酸およびチラミンの結合体である、請求項10記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００４】
本発明の別の局面によれば、ヒドロゲルを形成する方法であって、架橋可能なフェノール基を含むポリマー、HRP、およびH2O2を溶液中で混合してヒドロゲルを形成する工程を含み、H2O2が約1 mM以下のモル濃度を有する、方法が提供される。前記溶液は、前段落に記載された通りであり得る。
［０００４ａ］
本発明の別の局面によれば、以下の工程を含む、ヒドロゲルを形成する方法であって、架橋可能なフェノール基を含むポリマー、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）、および過酸化水素（H2O2）を溶液中で混合して、該ポリマーを架橋しヒドロゲルを形成する、方法が提供される：HRP濃度の閾値およびH2O2モル濃度の範囲を決定する工程であって、溶液中のH2O2モル濃度を該範囲内に限定し、かつ、該溶液中のHRP濃度を該閾値超に限定した場合、該溶液におけるゲル化速度が、該範囲内での該H2O2モル濃度の変化によって実質的に影響されず、かつヒドロゲルにおける架橋密度が、該閾値超での該HRP濃度の変化によって実質的に影響されないように、該範囲の上限が約1 mM未満である、工程；HRPの量およびH2O2の量を選択する工程；ならびに、該ポリマー、該量のHRPおよび該量のH2O2を溶液中で混合して、該ポリマーを架橋しヒドロゲルを形成する、工程であって、該溶液中の該H2O2モル濃度を該範囲内に限定し、かつ、該溶液中の該HRP濃度を該閾値超に限定するように、該HRPおよびH2O2の量が選択される、工程。H2O2モル濃度は、前記溶液から形成される前記ヒドロゲルが所定の貯蔵弾性率を有するように、選択されてもよい。前記溶液から形成される前記ヒドロゲルは、約10〜約4000 Paの貯蔵弾性率を有してもよい。前記範囲は約0.146〜約1.092 mMであってもよい。H2O2モル濃度は約0.16〜約0.728 mMであってもよい。前記閾値は約0.032単位／mlであってもよい。HRP濃度は約0.032〜約0.124単位／ml、例えば約0.062単位／mlであってもよい。前記ポリマーは、ヒアルロン酸およびチラミンの結合体（HA-Tyr）であってもよい。前記溶液中のチラミンに対するH2O2のモル比は、約0.4以下であってもよい。前記溶液は、前記HA-Tyr結合体を約0.1〜約20 w/v%含んでもよい。前記溶液は、前記HA-Tyr結合体を約1.75 w/v%含んでもよい。前記ヒアルロン酸は、約90,000 Daの分子量を有してもよい。前記溶液中のチラミンは、約0.42〜約21 mMのモル濃度、例えば約2.57 mMのモル濃度を有してもよい。前記溶液は、約4〜約8のpHを有してもよい。前記溶液は、約293〜約313 Kの温度にあってもよい。前記溶液は薬物を含んでもよい。前記溶液はタンパク質を含んでもよい。前記溶液は水を含んでもよい。前記溶液はリン酸緩衝生理食塩水を含んでもよい。前記決定する工程は、以下の段階を含んでもよい：複数の溶液から複数のヒドロゲルを形成する段階であって、該溶液の各々が、前記ポリマー、HRP、およびH2O2を含み、該複数の溶液が同一濃度の該ポリマーを有し、いくつかの該溶液が同一のH2O2モル濃度を有するが異なるHRP濃度を有し、かつ、いくつかの該溶液が同一のHRP濃度を有するが異なるH2O2モル濃度を有し、該溶液中のH2O2モル濃度が約1 mM未満である、段階；該形成する段階の間の該溶液の各々におけるゲル化速度を示す第1計測値（metric）、および該ヒドロゲルの各々における架橋密度を示す第2計測値を測定する段階；該第1計測値が、前記閾値超の同一のHRP濃度を有するが前記範囲内の異なるH2O2モル濃度を各々有する溶液について実質的に一定であること、および該第2計測値が、前記範囲内の同一のH2O2モル濃度を有するが前記閾値超の異なるHRP濃度を各々有する溶液について実質的に一定であることを必要とすることで、H2O2モル濃度の前記範囲およびHRP濃度の前記閾値を決定す���段階。第1計測値はゲル化点に達するのに要する時間であってもよく、第2計測値は貯蔵弾性率であってもよい。
［０００４ｂ］
本発明の別の局面によれば、以下の工程を含む方法が提供される：複数の溶液から複数のヒドロゲルを形成する工程であって、該溶液の各々が、ポリマー、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）、および過酸化水素（H2O2）を含み、該ポリマーが架橋可能なフェノール基を含み、該複数の溶液が同一濃度の該ポリマーを有し、いくつかの該溶液が同一のH2O2モル濃度を有するが異なるHRP濃度を有し、かつ、いくつかの該溶液が同一のHRP濃度を有するが異なるH2O2モル濃度を有し、該溶液中のH2O2モル濃度が約1 mM未満である、工程；該形成する工程の間の該溶液の各々におけるゲル化速度を示す第1計測値、および該ヒドロゲルの各々における架橋密度を示す第2計測値を測定する工程；該第1計測値が、閾値超の同一のHRP濃度を有するが範囲内の異なるH2O2モル濃度を各々有する溶液について実質的に一定であること、および該第2計測値が、該範囲内の同一のH2O2モル濃度を有するが該閾値超の異なるHRP濃度を各々有する溶液について実質的に一定であることを必要とすることで、H2O2モル濃度の範囲およびHRP濃度の閾値を決定する工程。第1計測値はゲル化点に達するのに要する時間であってもよく、第2計測値は貯蔵弾性率であってもよい。
［０００４ｃ］
本発明の別の局面によれば、以下の工程を含む、架橋可能なフェノール基を含むポリマーから異なる架橋密度を有するヒドロゲルを形成する方法が提供される：該ポリマー、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）、および過酸化水素（H2O2）を複数の溶液の各々において混合して、該各溶液において該ポリマーを架橋しそれぞれのヒドロゲルを形成する、工程であって、該溶液が、予め選択されたゲル化速度を達成するように選択されたHRP濃度、およびそれぞれの溶液から形成される異なるヒドロゲルにおいて異なる架橋密度を達成するように選択された異なるH2O2モル濃度を有する、工程；約1 mM未満の上限を有する所定の範囲内に該H2O2モル濃度を限定する工程；ならびに所定の閾値超に該HRP濃度を限定する工程。ここで、該溶液中のH2O2モル濃度を該所定の範囲内に限定し、かつ該溶液中のHRP濃度を該所定の閾値超に限定した場合、該溶液におけるゲル化速度が、該範囲内での該H2O2モル濃度の選択の変化によって実質的に影響されないこと、および該ヒドロゲルにおける架橋密度が、該閾値超での該HRP濃度の選択の変化によって実質的に影響されないことに基づいて、該所定の範囲および該所定の閾値が決定されている。前記ポリマーは、ヒアルロン酸およびチラミンの結合体であってもよい。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００５】
本発明の他の局面および特徴は、添付の図面と併せて本発明の具体的な態様についての以下の説明を検討すると、当業者に対して明らかとなる。
[請求項1001]
以下の工程を含む、ヒドロゲルを形成する方法であって、架橋可能なフェノール基を含むポリマー、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）、および過酸化水素（H2O2）を溶液中で混合して、該ポリマーを架橋しヒドロゲルを形成する、方法：
HRP濃度の閾値およびH2O2モル濃度の範囲を決定する工程であって、溶液中のH2O2モル濃度を該範囲内に限定し、かつ、該溶液中のHRP濃度を該閾値超に限定した場合、
該溶液におけるゲル化速度が、該範囲内での該H2O2モル濃度の変化によって実質的に影響されず、かつ
ヒドロゲルにおける架橋密度が、該閾値超での該HRP濃度の変化によって実質的に影響されないように、
該範囲の上限が約1 mM未満である、工程；
HRPの量およびH2O2の量を選択する工程；ならびに
該ポリマー、該量のHRPおよび該量のH2O2を溶液中で混合して、該ポリマーを架橋しヒドロゲルを形成する、工程であって、
該溶液中の該H2O2モル濃度を該範囲内に限定し、かつ、該溶液中の該HRP濃度を該閾値超に限定するように、該HRPおよびH2O2の量が選択される、工程。
[請求項1002]
前記溶液から形成される前記ヒドロゲルが所定の貯蔵弾性率（storage modulus）を有するように、前記H2O2モル濃度が選択される、請求項1001記載の方法。
[請求項1003]
前記溶液から形成される前記ヒドロゲルが、約10〜約4000 Paの貯蔵弾性率を有する、請求項1001または1002記載の方法。
[請求項1004]
前記範囲が約0.146〜約1.092 mMである、請求項1001〜1003のいずれか一項記載の方法。
[請求項1005]
前記H2O2モル濃度が約0.16〜約0.728 mMである、請求項1004記載の方法。
[請求項1006]
前記閾値が約0.032単位／mlである、請求項1001〜1005のいずれか一項記載の方法。
[請求項1007]
前記HRP濃度が約0.032〜約0.124単位／mlである、請求項1006記載の方法。
[請求項1008]
前記HRP濃度が約0.062単位／mlである、請求項1007記載の方法。
[請求項1009]
前記ポリマーが、ヒアルロン酸およびチラミンの結合体（HA-Tyr）である、請求項1001〜1008のいずれか一項記載の方法。
[請求項1010]
前記溶液中のチラミンに対するH2O2のモル比が、約0.4以下である、請求項1009記載の方法。
[請求項1011]
前記溶液が、前記HA-Tyr結合体を約0.1〜約20 w/v%含む、請求項1009または請求項1010記載の方法。
[請求項1012]
前記溶液が、前記HA-Tyr結合体を約1.75 w/v%含む、請求項1011記載の方法。
[請求項1013]
前記ヒアルロン酸が、約90,000 Daの分子量を有する、請求項1009〜1012のいずれか一項記載の方法。
[請求項1014]
前記溶液中のチラミンが、約0.42〜約21 mMのモル濃度を有する、請求項1009〜1013のいずれか一項記載の方法。
[請求項1015]
前記溶液中のチラミンが、約2.57 mMのモル濃度を有する、請求項1014記載の方法。
[請求項1016]
前記溶液が、約4〜約8のpHを有する、請求項1001〜1015のいずれか一項記載の方法。
[請求項1017]
前記溶液が、約293〜約313 Kの温度にある、請求項1001〜1016のいずれか一項記載の方法。
[請求項1018]
前記溶液が薬物を含む、請求項1001〜1017のいずれか一項記載の方法。
[請求項1019]
前記溶液がタンパク質を含む、請求項1001〜1018のいずれか一項記載の方法。
[請求項1020]
前記溶液が水を含む、請求項1001〜1019のいずれか一項記載の方法。
[請求項1021]
前記溶液がリン酸緩衝生理食塩水を含む、請求項1001〜1020のいずれか一項記載の方法。
[請求項1022]
前記決定する工程が以下の段階を含む、請求項1001〜1003のいずれか一項記載の方法：
複数の溶液から複数のヒドロゲルを形成する段階であって、該溶液の各々が、前記ポリマー、HRP、およびH2O2を含み、該複数の溶液が同一濃度の該ポリマーを有し、いくつかの該溶液が同一のH2O2モル濃度を有するが異なるHRP濃度を有し、かつ、いくつかの該溶液が同一のHRP濃度を有するが異なるH2O2モル濃度を有し、該溶液中のH2O2モル濃度が約1 mM未満である、段階；
該形成する段階の間の該溶液の各々におけるゲル化速度を示す第1計測値（metric）、および該ヒドロゲルの各々における架橋密度を示す第2計測値を測定する段階；
（1）該第1計測値が、前記閾値超の同一のHRP濃度を有するが前記範囲内の異なるH2O2モル濃度を各々有する溶液について実質的に一定であること、および
（2）該第2計測値が、前記範囲内の同一のH2O2モル濃度を有するが前記閾値超の異なるHRP濃度を各々有する溶液について実質的に一定であること
を必要とすることで、H2O2モル濃度の前記範囲およびHRP濃度の前記閾値を決定する段階。
[請求項1023]
前記第1計測値がゲル化点に達するのに要する時間であり、かつ前記第2計測値が貯蔵弾性率である、請求項1022記載の方法。
[請求項1024]
以下の工程を含む、方法：
複数の溶液から複数のヒドロゲルを形成する工程であって、該溶液の各々が、ポリマー、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）、および過酸化水素（H2O2）を含み、該ポリマーが架橋可能なフェノール基を含み、該複数の溶液が同一濃度の該ポリマーを有し、いくつかの該溶液が同一のH2O2モル濃度を有するが異なるHRP濃度を有し、かつ、いくつかの該溶液が同一のHRP濃度を有するが異なるH2O2モル濃度を有し、該溶液中のH2O2モル濃度が約1 mM未満である、工程；
該形成する工程の間の該溶液の各々におけるゲル化速度を示す第1計測値、および該ヒドロゲルの各々における架橋密度を示す第2計測値を測定する工程；
（1）該第1計測値が、閾値超の同一のHRP濃度を有するが範囲内の異なるH2O2モル濃度を各々有する溶液について実質的に一定であること、および
（2）該第2計測値が、該範囲内の同一のH2O2モル濃度を有するが該閾値超の異なるHRP濃度を各々有する溶液について実質的に一定であること
を必要とすることで、H2O2モル濃度の範囲およびHRP濃度の閾値を決定する工程。
[請求項1025]
前記第1計測値がゲル化点に達するのに要する時間であり、かつ前記第2計測値が貯蔵弾性率である、請求項1024記載の方法。
[請求項1026]
以下の工程を含む、架橋可能なフェノール基を含むポリマーから異なる架橋密度を有するヒドロゲルを形成する方法：
該ポリマー、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）、および過酸化水素（H2O2）を複数の溶液の各々において混合して、該各溶液において該ポリマーを架橋しそれぞれのヒドロゲルを形成する、工程であって、該溶液が、予め選択されたゲル化速度を達成するように選択されたHRP濃度、およびそれぞれの溶液から形成される異なるヒドロゲルにおいて異なる架橋密度を達成するように選択された異なるH2O2モル濃度を有する、工程；
該ゲル化速度が該溶液において実質的に一定となるように、約1 mM未満の上限を有する所定の範囲内に該H2O2モル濃度を限定する工程；ならびに
該ヒドロゲルの該架橋密度が該HRP濃度の値によって実質的に影響されないように、所定の閾値超に該HRP濃度を限定する工程。
[請求項1027]
前記ポリマーが、ヒアルロン酸およびチラミンの結合体である、請求項1026記載の方法。