(57)【要約】      （修正有）【課題】メタノール資化性細菌の多糖類生成に関与する遺伝子、及びその利用法を提供する。【解決手段】下記の（Ａ）〜（Ｄ）のいずれかに記載のタンパク質をコードするＤＮＡを用いて、メタノール資化性細菌の多糖類生成能を、向上又は低減させる。（Ａ）特定のアミノ酸配列を有するタンパク質。（Ｂ）（Ａ）のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、多糖類生成活性を有するタンパク質。（Ｃ）他の特定のアミノ酸配列を有するタンパク質。（Ｄ）（Ｃ）のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、多糖類生成活性を有するタンパク質。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の（Ａ）〜（Ｄ）のいずれかに記載のタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、多糖類生成活性を有するタンパク質。
（Ｃ）配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｄ）配列番号４に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、多糖類生成活性を有するタンパク質。
【請求項２】
下記の（ａ）〜（ｄ）に示すＤＮＡである請求項１に記載のＤＮＡ。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡ。
（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡまたは同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
（ｃ）配列番号３に記載の塩基配列を有するＤＮＡ。
（ｄ）配列番号３に記載の塩基配列を有するＤＮＡまたは同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
【請求項３】
メチロフィラス属細菌の染色体に由来することを特徴とする請求項１又は２に記載のＤＮＡ。
【請求項４】
請求項１に記載の遺伝子が導入され、多糖類生成能が向上したメタノール資化性細菌。
【請求項５】
メチロフィラス属細菌である請求項４に記載の細菌。
【請求項６】
請求項４又は５に記載の細菌をメタノールを主要炭素源とする培地に培養し、同培地又は細菌細胞中に多糖類を生成、蓄積させ、同培地又は細胞から多糖類を採取することを特徴とする多糖類の製造方法。
【請求項７】
染色体上の遺伝子であって、かつ、請求項１又は２に記載のＤＮＡと同一の塩基配列を有する遺伝子、又は同ＤＮＡと相同組換えが起こり得る程度の相同性を有する遺伝子が破壊されたことにより、該遺伝子の発現が抑えられ、多糖類生成能が低下したメタノール資化性細菌。
【請求項８】
メチロフィラス属細菌である請求項７に記載の細菌。
【請求項９】
請求項７又は８に記載の細菌であって、かつ、多糖類以外の目的物質を産生する細菌をメタノールを主要炭素源とする培地に培養し、同培地又は細菌細胞中に目的物質を生成、蓄積させ、同培地又は細胞から目的物質を採取することを特徴とする、目的物質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、微生物工業に関連したものであり、微生物の多糖類生成に関与する遺伝子とその利用法に関するものである。その遺伝子の利用は、一方で、微生物による有用多糖類の生産性を向上させ、他方で、微生物が副生する不要な多糖類合成を抑制し、その微生物が産生する目的物質の生産性を向上させ、目的物質の取得を容易にさせる。
【０００２】
上記製造法は、特に、Ｃ１化合物、即ち、メタノールなどの炭素原子１個を有する化合物を資化する微生物での利用が有用である。
【０００３】
【従来の技術】
メチロフィラス属細菌での多糖類生成に関しては、Ｂ．  Ｓｏｕｔｈｇａｔｅらは、メタノール資化性細菌メチロフィラス・メチロトロファス（Ｍｅｔｈｙｌｏｐｈｉｌｕｓ  ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｕｓ）が菌体外に多糖を生産することを報告している（非特許文献１）。しかしながら、メチロフィラス属細菌の多糖類生成に関与する遺伝子の構造については全く知られていない。
【０００４】
【非特許文献１】
Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，  １３５，  ｐｐ．  ２８５９−２８６７  （１９８９）
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、メチロフィラス属細菌の多糖類生成に関与する遺伝子を取得し、その遺伝子を利用してＣ１化合物からの多糖類の生産性を向上させる手段、あるいは、不要となる多糖類生成を抑制し、目的物質の生成収率を向上させる手段を提供することを課題とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、メチロフィラス・メチロトロファスの遺伝子群を解析する過程で、そのゲノム内に、多糖生成に関与する遺伝子群、即ち、「ｇｔｆＡ」遺伝子、及び「ｍａｎＣ」遺伝子を見出した。そして、当該遺伝子を破壊することで、宿主のメチロフィラス・メチロトロファスの産生する多糖類の量が減少することを確認し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち本発明は、以下のとおりである。
（１）下記の（Ａ）〜（Ｄ）のいずれかに記載のタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、多糖類生成活性を有するタンパク質。
（Ｃ）配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｄ）配列番号４に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、多糖類生成活性を有するタンパク質。
（２）下記の（ａ）〜（ｄ）に示すＤＮＡである（１）に記載のＤＮＡ。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡ。
（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡまたは同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
（ｃ）配列番号３に記載の塩基配列を有するＤＮＡ。
（ｄ）配列番号３に記載の塩基配列を有するＤＮＡまたは同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
（３）メチロフィラス属細菌の染色体に由来することを特徴とする（１）又は（２）に記載のＤＮＡ。
（４）（１）に記載の遺伝子が導入され、多糖類生成能が向上したメタノール資化性細菌。
（５）メチロフィラス属細菌である（４）に記載の細菌。
（６）（４）又は（５）に記載の細菌をメタノールを主要炭素源とする培地に培養し、同培地又は細菌細胞中に多糖類を生成、蓄積させ、同培地又は細胞から多糖類を採取することを特徴とする多糖類の製造方法。
（７）染色体上の遺伝子であって、かつ、（１）又は（２）に記載のＤＮＡと同一の塩基配列を有する遺伝子、又は同ＤＮＡと相同組換えが起こり得る程度の相同性を有する遺伝子が破壊されたことにより、該遺伝子の発現が抑えられ、多糖類生成能が低下したメタノール資化性細菌。
（８）メチロフィラス属細菌である（７）に記載の細菌。
（９）（７）又は（８）に記載の細菌であって、かつ、多糖類以外の目的物質を産生する細菌をメタノールを主要炭素源とする培地に培養し、同培地又は細菌細胞中に目的物質を生成、蓄積させ、同培地又は細胞から目的物質を採取することを特徴とする、目的物質の製造方法。
【０００７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
【０００８】
＜１＞    本発明のＤＮＡ
本発明のＤＮＡは、下記の（Ａ）〜（Ｄ）のいずれかに記載のタンパク質をコードするＤＮＡである。
（Ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、多糖類生成活性を有するタンパク質。
（Ｃ）配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｄ）配列番号４に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、多糖類生成活性を有するタンパク質。
【０００９】
以下、上記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質をＧｔｆＡ、同タンパク質をコードするＤＮＡをｇｔｆＡということがある。また、上記（Ｃ）又は（Ｄ）のタンパク質をＭａｎＣ、同タンパク質をコードするＤＮＡをｍａｎＣということがある。
本発明のＤＮＡは、ＧｔｆＡ及びＭａｎＣの両方をコードしていてもよい。
【００１０】
本発明のＤＮＡは、メチロフィラス属細菌、例えば、メチロフィラス・メチロトロファスの染色体ＤＮＡから単離、取得することができる。メチロフィラス・メチロトロファスの野生株ＡＳ１株（ＮＣＩＭＢ  Ｎｏ．１０５１５）は、ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・アンド・マリン・バクテリア（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  ａｎｄ  Ｍａｒｉｎｅ  Ｂａｃｔｅｒｉａ、住所ＮＣＩＭＢ  Ｌｔｓ．，  Ｔｏｒｒｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｔａｔｉｏｎ  １３５，  Ａｂｂｅｙ  Ｒｏａｄ，  Ａｂｅｒｄｅｅｎ  ＡＢ９  ８ＤＧ，  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）から入手可能である。そしてこの株の一般的な培養方法は、ＮＣＩＭＢのカタログに記載されているが、また実施例に記載したＳＥＩＩ培地でも生育させることができる。
【００１１】
ＡＳ１株のゲノムＤＮＡは公知の方法により調製できるが、市販のゲノム調製用キットを使用してもよい。
本発明のＤＮＡは、本発明によってそれらの塩基配列が明らかになったので、それらの塩基配列に基づいてプライマーを合成し、メチロフィラス属細菌等の細菌の染色体ＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ（ポリメラーゼ・チェーン・リアクション）により増幅することによって、取得することができる。また、前記塩基配列に基づいて調製したプローブ、又はＰＣＲにより増幅した部分断片をプローブに用いたコロニーハイブリダイゼーションによっても、本発明のＤＮＡは取得され得る。
【００１２】
本発明のＤＮＡのクローニングに用いるゲノムＤＮＡライブラリーの作製、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲ、プラスミドＤＮＡの調製、ＤＮＡの切断および連結、形質転換等の方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．，  Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  （２００１）に記載されている。
【００１３】
上記ＰＣＲに用いるプライマーとしては、ｇｔｆＡについては  配列番号５及び６、ｍａｎＣについては配列番号１０及び１１に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【００１４】
上記のようにして取得されたメチロフィラス・メチロトロファスのゲノムから単離されたｇｔｆＡ及びｍａｎＣの塩基配列を配列番号１及び３に示す。また、それらによってコードされるＧｔｆＡ及びＭａｎＣのアミノ酸配列を配列番号２及び４に示す。
【００１５】
上記ＧｔｆＡ及びＭａｎＣのアミノ酸配列について、既知のデータベースの相同性検索を行った。その結果、ＧｔｆＡは、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）のグリコシルトランスフェラーゼをコードすると思われる遺伝子産物（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＤＢ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  Ｄ２１２４２中のｏｒｆ−１４）と４３％の相同性が認められた。尚、この相同性は、ＧｔｆＡは８１〜４６７位、ｏｒｆ−１４は８４〜４６７位の領域間で比較した。また、ＭａｎＣは、エシェリヒア・コリのｃｐｓＢ（ｍａｎＣ）遺伝子産物と５６％の相同性が認められた。この相同性は、ＭａｎＣは１〜４７３位、ｃｓｐＢ産物は１〜４７８位の領域間で比較した。相同性は、比較に用いた領域の全アミノ酸残基数に対する同一アミノ酸残基の個数の割合として算出した。
【００１６】
本発明のＤＮＡは、コードされるＧｔｆＡ又はＭａｎＣの活性が損なわれない限り、１若しくは複数の位置での１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入または付加を含んでいてもよい。ここで、数個とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、例えば、ＧｔｆＡ又はＭａｎＣを構成するアミノ酸配列全体に対して、７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上の相同性を有し、ＧｔｆＡ又はＭａｎＣの活性を有するものであってもよい。具体的には、前記「数個」は、好ましくは２〜２０個、より好ましくは  ２〜１０個である。前記ＧｔｆＡ又はＭａｎＣの活性とは、具体的には多糖類を生成する活性であり、特に、ＧｔｆＡ活性は、ＧＤＰ−ガラクトースのガラクトシル−１−リン酸部分を、ウンデカプレニルリン酸へ転移させるガラクトシル−１−リン酸トランスフェラーゼ（ガラクトシル−Ｐ−Ｐ−ウンデカプレニル合成酵素）活性であり、ＭａｎＣ活性は、マンノース−１−リン酸をＧＤＰ−マンノースに変化するマンノース−１−リン酸グアノシルトランスフェラーゼの活性をいう。
【００１７】
上記のようなＧｔｆＡ又はＭａｎＣと実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡは、例えば、部位特異的変異法によって、特定の部位のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入または付加を含むように配列番号１又は４に示す塩基配列を改変することによって取得することができる。また、上記のような改変されたＤＮＡは、従来知られている変異処理によっても取得され得る。変異処理としては、ｇｔｆＡ又はｍａｎＣをヒドロキシルアミン等でインビトロ処理する方法、およびｇｔｆＡ又はｍａｎＣを保持する微生物、例えばエシェリヒア属細菌を、紫外線またはＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）もしくはＥＭＳ等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理する方法が挙げられる。
【００１８】
また、上記のような塩基の置換、欠失、挿入、付加、または逆位等には、ｇｔｆＡ又はｍａｎＣを保持する微生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（ｍｕｔａｎｔ又はｖａｒｉａｎｔ）も含まれる。
【００１９】
上記のような変異を有するＤＮＡを、適当な細胞で発現させ、発現されたＧｔｆＡ又はＭａｎＣの活性を調べることにより、ＧｔｆＡ又はＭａｎＣと実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡが得られる。また、変異を有するｇｔｆＡ又はｍａｎＣを保持する細胞から、例えば、ｇｔｆＡの場合は、配列番号１の塩基番号４〜１４０１からなる塩基配列を有するＤＮＡ、または同塩基配列から調製され得るプローブと、ｍａｎＣの場合は、配列番号３の塩基番号４〜４１０からなる塩基配列を有するＤＮＡ、または同塩基配列から調製され得るプローブと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＧｔｆＡ又はＭａｎＣのそれぞれの活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを単離することによっても、ＧｔｆＡ又はＭａｎＣと実質的に同一のタンパク質を、それぞれコードするＤＮＡが得られる。
【００２０】
ここでいう「ストリンジェントな条件」とはいわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましく９０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ，  ０．１％ＳＤＳ、好ましくは０．１×ＳＳＣ，  ０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。
【００２１】
プローブとしては、ｇｔｆＡの場合はｇｔｆＡの一部の配列、ｍａｎＣの場合はｍａｎＣの一部の配列を用いることもできる。そのようなプローブは、当業者によく知られた方法により、各遺伝子の塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、各遺伝子を含むＤＮＡ断片を鋳型とするＰＣＲ反応により作製することができる。プローブとして、３００ｂｐ程度の長さのＤＮＡ断片を用いる場合には、ハイブリダイゼーションの洗いの条件は５０℃、２×ＳＳＣ，  ０．１％ＳＤＳが挙げられる。
【００２２】
なお、ＧｔｆＡの活性は、Ｊｉａｎｇ，Ｘ．−Ｍ．ら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  ｖｏｌ．５，  ｐ６９５−７１３に記載）の方法により測定できると考えられる。一方、ＭａｎＣの活性の測定方法としては、例えば、Ｃａｂｉｂ，Ｅ．  ＆  Ｌｅｌｏｉｒ，Ｌ．Ｆ．（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ｖｏｌ．２３１，  ｐ２５９−２７５参照）の方法が挙げられる。
【００２３】
＜２＞本発明のメタノール資化性細菌
本発明の第一の細菌は、ｇｔｆＡ又はｍａｎＣが導入され、多糖類生成能が向上したメタノール資化性細菌である。ｇｔｆＡ及びｍａｎＣの両方が導入された細菌も、本発明の細菌に含まれる。
【００２４】
また、本発明の第二の細菌は、ｇｔｆＡもしくはｍａｎＣ、又はこれらと相同組換えが起こり得る程度の相同性を有する遺伝子が破壊されたことにより、該遺伝子の発現が抑えられ、多糖類生成能が低下し、かつ、多糖類以外の目的物質の生産能を有するメタノール資化性細菌である。ｇｔｆ及びｍａｎＣ、又はｇｔｆ及びｍａｎＣのホモログの両方が破壊された細菌は、本発明の細菌に含まれる。
【００２５】
本発明が適用されるメタノール資化性細菌としては、メタノールを主たる炭素源として生育することができる細菌であって、ｇｔｆＡ又はｍａｎＣが機能し得るか、あるいはｇｔｆＡもしくはｍａｎＣ又はそれらのホモログを保持している細菌であれば、特に制限されない。具体的には、メチロフィラス・メチロトロファス（Ｍｅｔｈｙｌｏｐｈｉｌｕｓ  ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｕｓ）等のメチロフィラス属細菌、及び、メチロバチラス・グリコゲネス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｌｙｃｏｇｅｎｅｓ）、メチロバチラス・フラゲラタム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｌａｇｅｌｌａｔｕｍ）等のメチロバチラス属細菌、メチロバクテリウム・イクストーケンス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ）等のメチロバクテリウム属細菌が挙げられる。これらの中では、メチロフィラス属細菌が好ましく、メチロフィラス・メチロトロファスが特に好ましい。
【００２６】
本発明の第一の細菌は、ｇｔｆＡ又はｍａｎＣを、これらがコードするＧｔｆＡ又はＭａｎＣが発現可能な形態でメタノール資化性細菌に導入することによって、構築することができる。メタノール資化性細菌にｇｔｆＡ又はｍａｎＣを導入するには、メタノール資化性細菌細胞内で自律複製可能なベクター、好ましくはマルチコピー型ベクターにｇｔｆＡ又はｍａｎＣを連結して組換えＤＮＡを作製し、それでメタノール資化性細菌メチロフィラス属細菌の宿主に導入して形質転換すればよい。組換えＤＮＡをメタノール資化性細菌へ導入するには、十分な形質転換効率が得られる方法ならば、いかなる方法を用いてもよいが、例えば、エレクトロポレーション法（ＣａｎａｄｉａｎＪｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  ４３，  １９７，  （１９９７））が挙げられる。また、トランスダクション、トランスポゾン（Ｂｅｒｇ，Ｄ．Ｅ．ａｎｄ  Ｂｅｒｇ，Ｃ．Ｍ．，  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．１，４１７，（１９８３））、Ｍｕファージ（特開平２−１０９９８５号）または相同組換え（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．（１９７２））を用いた方法で、ｇｔｆＡ又はｍａｎＣを宿主染色体に組み込むこともできる。尚、必要に応じて、メタノール資化性細菌内で機能するプロモーターを、ｇｔｆＡ又はｍａｎＣの上流に連結させてもよい。
【００２７】
前記ベクターとして具体的には、宿主として使用するメタノール資化性細菌、例えばメチロフィラス・メチロトロファス中で増殖できるプラスミドが使用される。例えば、広宿主域ベクターであるＲＳＦ１０１０及びその誘導体、例えば、ｐＡＹＣ３２（Ｃｈｉｓｔｏｓｅｒｄｏｖ，Ａ．Ｙ．，  Ｔｓｙｇａｎｋｏｖ，Ｙ．Ｄ．，  Ｐｌａｓｍｉｄ，  １９８６，  １６，  １６１−１６７）、あるいはｐＭＦＹ４２（Ｇｅｎｅ，  ４４，  ５３  （１９９０））や、ｐＢＢＲ１及びその誘導体に由来するもの（Ｋｏｖａｃｈ，Ｍ．Ｅ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ，  １６６，  １７５−１７６  （１９９５））、さらにはｐＲＫ３１０及びその誘導体に由来のもの（Ｅｄｔｓ．  Ｍｕｒｒｅｌｌ，  Ｊ．Ｃ．，  ａｎｄ  Ｄａｌｔｏｎ，  Ｈ．，  Ｍｅｔｈａｎｅ  ａｎｄ  ｍｅｔｈａｎｏｌ  ｕｔｉｌｉｚｅｒｓ，  Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，  １８３−２０６  （１９９２））等が利用できる。
【００２８】
本発明の第二の細菌は、染色体上のｇｔｆＡ又はｍａｎＣ、又はこれらと相同組換えが起こり得る程度の相同性を有するホモログ（以下、単に「ｇｔｆＡ又はｍａｎＣ」と記載することがある）を、これらの遺伝子産物が正常に機能しないように破壊することによって、構築することができる。前記相同組換えが起こり得る程度の相同性は、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、特に好ましくは９９％以上である。
【００２９】
ｇｔｆＡ又はｍａｎＣが破壊されたメタノール資化性細菌は、例えば、メタノール資化性細菌を紫外線照射またはＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）もしくはＥＭＳ等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理し、ＧｔｆＡ又はＭａｎＣの活性が低下した変異株を選択する方法が挙げられる。
【００３０】
また、実施例に示したように、相同性組換えを利用した遺伝子置換による方法（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒ１ｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｐｒｅｓｓ（１９７２）；  Ｍａｔｓｕｙａｍａ，Ｓ．ａｎｄ  Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ，Ｓ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６２，１１９６（１９８５））によっても、染色体上のｇｔｆＡ又はｍａｎＣを破壊することができる。相同性組換えは、細菌が一般的に持つ能力であり、メチロフィラス属細菌も、相同組換えによる遺伝子置換が可能なことを、本発明者らは見出している。具体的には、正常な機能を有するＧｔｆＡ又はＭａｎＣを産生しないように改変したｇｆｔＡ又はｍａｎＣ（欠失型遺伝子）を含むＤＮＡでメタノール資化性細菌を形質転換し、欠失型遺伝子と染色体上のｇｆｔＡ又はｍａｎＣとの間で組換えを起こさせる。この後、染色体上のプラスミドが組み込まれた部位で再び組換えが起こると、プラスミドが染色体上から抜け落ちる。その際、組換えが起きる位置によって、欠失型遺伝子の方が染色体上に固定され、元の正常な遺伝子がプラスミドと一緒に染色体上から抜け落ちる場合と、正常な遺伝子が染色体上に固定され、欠失型遺伝子がプラスミドと一緒に染色体上から抜け落ちる場合がある。前者のような菌株を選択することにより、染色体上の正常な遺伝子が欠失型遺伝子で置換された菌株を取得することができる。
【００３１】
前記欠失型遺伝子としては、コーディング領域の中の塩基配列中に１つまたは複数個の塩基の置換、欠失、挿入、付加または逆位を起こさせることによってコードされるタンパク質の比活性が低下又は消失した遺伝子が挙げられる。また、コーディング領域の内部又は末端を欠失させた遺伝子、あるいは、コード領域に、他の配列を挿入した遺伝子等が挙げられる。他の配列としては、カナマイシン耐性遺伝子等のマーカー遺伝子が挙げられる。
【００３２】
染色体上のｇｔｆＡ又はｍａｎＣの発現を低下又は消失させることは、これらの遺伝子のプロモーター配列中に、１つまたは複数個の塩基の置換、欠失、挿入、付加または逆位を起こさせ、プロモーター活性を低下させることによって、転写レベルで遺伝子の発現を抑えること（Ｍ．Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｄ．  Ｃｏｕｒｔ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １３（１９７９）ｐ．３１９、Ｐ．Ｙｏｕｄｅｒｉａｎ，Ｓ．Ｂｏｕｖｉｅｒ  ａｎｄ  Ｍ．  Ｓｕｓｓｋｉｎｄ，Ｃｅｌｌ  ３０（１９８２）Ｐ．８４３−８５３参照）によっても行うことができる。
【００３３】
また、これらの遺伝子の発現は、ＳＤ配列と開始コドンとの間の領域中に１つまたは複数個の塩基の置換、欠失、挿入、付加または逆位を起こさせることによって、翻訳レベルで抑えることができる（Ｊ．Ｊ．Ｄｕｎｎ，Ｅ．Ｂｕｚａｓｈ−Ｐｏｌｌｅｒｔ  ａｎｄ  Ｆ．Ｗ．Ｓｔｕｄｉｅｒ，Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，  ７５（１９７８）ｐ．２７４３参照）。
【００３４】
上記のようなプロモーターやＳＤ配列と開始コドンとの間の領域の改変は、前記の遺伝子置換と同様にして行うことができる。
遺伝子中に塩基の置換、欠失、挿入、付加または逆位を起こさせるには、具体的には、部位特異的変異法（Ｋｒａｍｅｒ，Ｗ．ａｎｄ  Ｆｒｉｔｓ，Ｈ．Ｊ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  １５４，  ３５０（１９８７））や、次亜硫酸ナトリウム、ヒドロキシルアミン等の化学薬剤により処理する方法（Ｓｈｏｒｔｌｅ，Ｄ．ａｎｄ  Ｎａｔｈａｎｓ，Ｄ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７５，２７０（１９７８））が挙げられる。
【００３５】
部位特異的変異法は、合成オリゴヌクレオチドを用いる方法であり、任意の限定された塩基対だけに、任意の置換、欠失、挿入、付加または逆位を導入できる手法である。この方法を利用するには、まず、クローン化され、ＤＮＡ塩基配列が決定されている目的遺伝子を持つプラスミドを変性させて１本鎖を調製する。次に、変異を起こさせたい部分に相補的な合成オリゴヌクレオチドを合成するが、この時合成オリゴヌクレオチドを完全に相補的な配列にせず、任意の塩基置換、欠失、挿入、付加または逆位を持つようにしておく。この後１本鎖ＤＮＡと任意の塩基置換、欠失、挿入、付加または逆位を持つ合成オリゴヌクレオチドをアニールさせ、さらにＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントとＴ４リガーゼを用いて完全な２本鎖プラスミドを合成し、これをエシェリヒア・コリのコンピテントセルに導入する。このようにして得られた形質転換体の幾つかは、任意の塩基置換、欠失、挿入、付加または逆位が固定された遺伝子を含むプラスミドを持っている。遺伝子に変異を導入し、改変または破壊することができる同様な手法には、リコンビナントＰＣＲ法（ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  ｐｒｅｓｓ（１９８９））がある。
【００３６】
本発明の第二の細菌は、Ｌ−リジン等のアミノ酸や、核酸、ビタミン類、酵素等のタンパク質等のような、多糖類以外の目的物質の生産能を有する細菌であることが好ましい。
上記のような細菌として、Ｌ−リジン生産能を有するメチロフィラス属細菌、例えばメチロフィラス・メチロトロファス菌株は、Ｌ−リジン生産能を有しない株に変異処理を施し、Ｓ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン（以下、ＡＥＣと記す）等のリジンアナログに対する耐性を付与することにより取得することができる。変異処理の方法としては、エシェリヒア・コリの菌体にＮＴＧやＥＭＳ等の化学薬剤による処理、あるいは紫外線、放射線照射等の処理を施す方法がある。このような菌株の具体例としては、メチロフィラス・メチロトロファス  ＡＪ１３６０８が挙げられる。本菌株は、メチロフィラス・メチロトロファスＡＳ１株にＡＥＣ耐性を付与することによって育種されたものである。尚、メチロフィラス・メチロトロファスＡＪ１３６０８は、１９９９年６月１０日付で工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号３０５  日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）に受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１７４１６として寄託され、２０００年３月３１日付にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７１１２が付与されている。
【００３７】
また、Ｌ−リジン生産能を有するメチロフィラス・メチロトロファス菌株は、Ｌ−リジンの生合成に関与する遺伝情報を担うＤＮＡを遺伝子組換え技術により導入、増強することによっても育種することができる。導入される遺伝子は、ジヒドロジピコリン酸合成酵素、スクシニルジアミノピメリン酸トランスアミナーゼ等、Ｌ−リジンの生合成経路上の酵素をコードする遺伝子であり、ジヒドロジピコリン酸合成酵素のようにＬ−リジンによるフィードバック阻害を受ける酵素遺伝子の場合には、かかる阻害が解除された酵素をコードする変異型遺伝子を用いることが望ましい。また、一方で、Ｌ−リジンの排出担体、例えば、コリネバクテリウム・グルタミカムでのｌｙｓＥ遺伝子の導入も有効と思われる。
【００３８】
目的遺伝子のメタノール資化性菌への導入は、前述のｇｔｆＡ又はｍａｎＣの導入と同様にして行うことができる。
目的物質生産能を有し、かつ、ｇｔｆＡ又はｍａｎＣが破壊されたメタノール資化性細菌は、ｇｔｆＡ又はｍａｎＣが破壊されたメタノール資化性細菌に目的物質生産能を付与することによって取得することができる。また、上記細菌は、目的物質生産能を有するメチロフィラス属細菌のｇｔｆＡ又はｍａｎＣを破壊することによっても、取得することができる。
【００３９】
＜３＞多糖類又は目的物質の製造方法
本発明の第一の細菌は、ｇｔｆＡ又はｍａｎＣが導入され、ＧｔｆＡ又はＭａｎＣの活性が高められている。したがって、同細菌をメタノールを主要炭素源とする培地に培養し、同培地又は細菌細胞中に多糖類を生成、蓄積させ、同培地又は細胞から多糖類を採取することにより、多糖類を効率よく製造することができる。
【００４０】
また、本発明の第二の細菌は、ｇｔｆＡ又はｍａｎＣが破壊され、多糖類、特に菌体外に分泌される多糖類の生成能が低下している。したがって、同細菌を培地に培養し、同培地又は細菌細胞中に目的物質を生成、蓄積させる際に、培地又は細胞中に生成する多糖成分量を低減させることができる。
【００４１】
多糖類は、ゲル化剤や増粘安定剤などの産業応用があり、その安価製造法は期待されている。この観点から、本発明の第一の細菌は有用である。
一方で、メタノール資化性菌にて、例えばアミノ酸、核酸、ビタミン類、酵素類、タンパク質などの有用物質を目的物質として生産させる場合は、同細菌が副生する多糖類は不要産物となる。従って、副生多糖類を削減することは、その副生物の生産のために浪費されたエネルギーや炭素が、本来の目的産物の為に有効に利用でき、目的産物の生産性や収量が向上することが考えられ、産業的な応用において重要となる。また、培養液から菌体を遠心により除去する際などは、多糖を大量に生産している菌の場合、多糖が邪魔になり、菌体を沈めることが困難な場合がある。しかし、多糖生成量を減ずることで、遠心操作により、菌体を迅速に沈めることが可能となり、培養液からの菌体分離や培養液中から目的物質を取得する際に、本発明の第二の細菌は有用である。
【００４２】
上記多糖類としては、キサンタンガムなどが挙げられる。
メタノール資化性細菌の培養のために使用される培地は、炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じその他の有機微量栄養源を含有する通常の培地である。主要炭素源としては、メタノールであるが、グルコース、ラクトース、ガラクトース、フラクトース、でんぷん加水分解物などの糖類、グリセロール、ソルビトールなどのアルコール類、フマール酸、クエン酸、コハク酸、ピルビン酸等の有機酸類を併用して用いることができる。「メタノールを主要炭素源とする」とは、全炭素源のうち、メタノールを５０％（ｗ／ｗ）以上、好ましくは８０％（ｗ／ｗ）以上であることをいう。メタノールを炭素源として用いる場合の濃度は、通常は０．００１％から４％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．１％から２％（ｗ／ｖ）である。また、グルコース等を添加する場合の濃度は、通常、０．１％から３％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．１％から１％（ｗ／ｖ）である。
【００４３】
窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素源、アンモニアガス、アンモニア水等を用いることができる。
【００４４】
無機イオンとしては、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添加される。これらの他に、有機微量栄養源として、ビタミンＢ１、または酵母エキス等を適量含有させることが望ましい場合もある。
【００４５】
培養は、好気的条件下で１６〜７２時間程度実施するのがよく、培養温度は２５℃〜４５℃に、培養中ｐＨは５〜８に制御する。尚、ｐＨ調整には無機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、あるいはアンモニアガス等を使用することができる。
【００４６】
培養終了後、発酵液中の多糖成分量は、公知の方法、例えばフェノール硫酸法（Ｈｏｄｇｅ，Ｊ．Ｅ．，  Ｈｏｆｒｅｉｔｅｒ，Ｂ．Ｔ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ｅｄ．  ｂｙ  Ｗｈｉｓｔｌｅｒ，Ｒ．Ｌ．，  Ｗｏｌｆｒｏｍ，Ｍ．Ｌ．，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ｖｏｌ．１，  ｐ．３８８  （１９６２））により測定することができる。
【００４７】
培地又は菌体からの多糖類又は目的物質の採取は、公知の方法によって行うことができる。例えば、Ｌ−リジン等のアミノ酸の採取は、通常のイオン交換樹脂法、沈澱法等を組み合わせることにより適宜実施できる。
【００４８】
【実施例】
以下、本発明を実施例により更に具体的に説明する。
【００４９】
【実施例１】ｇｔｆＡ（グリコシルトランスフェラーゼ）遺伝子の取得
メチロフィラス・メチロトロファス（Ｍｅｔｈｙｌｏｐｈｉｌｕｓ  ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｕｓ）ＡＳ１株（ＮＣＩＭＢ  Ｎｏ．１０５１５）を、５０  ｍＬのＳＥＩＩ  培地（組成：Ｋ２ＨＰＯ４，  １．９ｇ／Ｌ；  （ＮＨ４）２ＳＯ４，５．０ｇ／Ｌ；  ＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ，  １．５６ｇ／Ｌ；  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ，  ０．２ｇ／Ｌ；  ＣａＣｌ２・６Ｈ２Ｏ，  ０．７２ｍｇ／Ｌ；ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ，  ５μｇ／Ｌ；  ＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ，  ２５μｇ／Ｌ；  ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ，  ２３μｇ／Ｌ；  ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ，  ９．７ｍｇ／Ｌ；  メタノール，  １％（ｖ／ｖ））に植菌し、培養温度３７℃にて一晩振とう培養した。その後、培養液を遠心し、菌体を回収した。得られた菌体から、市販のキット（Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  （Ｅｄｇｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製））を用いて、染色体ＤＮＡを精製した。
【００５０】
次に、取得したゲノムＤＮＡ（０．０５μｇ）を鋳型にして、ＤＮＡプライマーＭｇｔｆＡ−Ｆ１（配列番号５）とＭｇｔｆＡ−Ｒ１（配列番号６）を用いてＰＣＲを行った。その条件は、変性９４℃−１０秒、アニーリング５０℃−３０秒、伸長反応７０℃−４分であった（２８サイクル）。ＰＣＲは、市販のキットＰｙｒｏｂｅｓｔ  ｔａｑ（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ  Ｉｎｃ．社製）を、添付のプロトコールに従って使用した。その結果、約３．８ｋｂｐのＤＮＡ断片が増幅できた。そして、これを制限酵素ＰｓｔＩで消化し、２．２ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。
【００５１】
一方、プラスミドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ−（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を制限酵素ＰｓｔＩで消化し、ＤＮＡ断片を調製した。以上の両ＤＮＡ断片を、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ  Ｉｎｃ．）を用いて連結し、ｐＢＳ−ｍＧｔｆＡ１を作製した。なお、このプラスミド上でｇｔｆＡ遺伝子の向きは、ｌａｃプロモーターからの転写の向きと同じ方向になっている。
【００５２】
こうしてクローニングされたＤＮＡ断片の塩基配列を、常法に従って決定した。その配列を配列表配列番号１に、そして、それがコードするアミノ酸配列を配列表配列番号２に示した。このアミノ酸配列に相同な配列を、既存のアミノ酸配列データベースに対して検索したところ、クレブシエラ・ニューモニエのグリコシルトランスフェラーゼが見出されたため、この配列番号１の遺伝子をｇｔｆＡと命名した。
【００５３】
【実施例２】メチロフィラス・メチロトロファスにおけるｇｔｆＡ遺伝子の破壊とその効果
まず、プラスミドｐＵＣ４Ｋ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）のＫｍＲ（カナマイシン耐性）遺伝子領域の両側に存在する制限酵素切断認識部位を一部改変した。すなわち、ｐＵＣ４Ｋを制限酵素ＥｃｏＲＩとＳａｌＩで切断し切断面を平滑化した後、ＫｍＲ遺伝子ＤＮＡ断片と複製開始領域（０ｒｉ）が搭載されるＤＮＡ断片とを、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（宝酒造社製）により連結し、ｐＵＣ４Ｋ２を作製した。つまり、ｐＵＣ４Ｋ２は、ｐＵＣ４Ｋから制限酵素部位ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、ＳａｌＩが欠如させたものである。
【００５４】
ＰＣＲ用のＤＮＡプライマーとして、Ｋｍ４−Ｆ２（配列番号７）とＫｍ４−Ｒ２（配列番号８）を作製し、鋳型ＤＮＡとしてｐＵＣ４Ｋ２を用いてＰＣＲ（条件：変性９４℃−１０秒、アニーリング５０℃−３０秒、伸長反応７０℃−１．５分、２８サイクル）を行い、ＫｍＲ遺伝子が搭載されているＤＮＡ断片を増幅し、更に増幅されたＤＮＡの両端をＢＫＬ  ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ  Ｉｎｃ．）で平滑端化した。
【００５５】
次に、実施例１で取得したｐＢＳ−ｍＧｔｆＡ１を制限酵素ＥｃｏＴ１４ＩとＭｌｕＩとで消化した後、平滑末端化処理を行い、ＤＮＡ断片を調製した。そして、このＤＮＡ断片と上記のＫｍＲ遺伝子ＤＮＡ断片とをＬｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔにより連結し、ｐＢＳ−ＭｇｔｆＡ−Δを作製した。
【００５６】
プラスミドｐＢＳ−ＭｇｔｆＡ−Δを制限酵素ＢａｍＨＩとＳａｌＩとで切断し、カナマイシン耐性遺伝子で分断されたｇｔｆＡ遺伝子（ｇｔｆＡ：：ＫｍＲ）を含む領域を断片化した。この断片をエタノール沈殿法にて濃縮し、更に脱塩処理を行い、これをエレクトロポレーションの導入ＤＮＡ断片標品とした。
【００５７】
一方、メチロフィラス・メチロトロファスＡＳ１株をＳＥＩＩ液体培地（但しメタノール濃度は０．５％（ｖ／ｖ））で、３７℃で１６時間振とう培養し、その培養液２０  ｍｌを１０，０００ｒｐｍ×１０分間の遠心にかけ、菌体を集菌した。これに１ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）緩衝液（２０  ｍｌ）を加えて懸濁した後、遠心するという操作を２回行い、最後に菌体に１ｍｌの同溶液を加え、菌体懸濁液を調製し、エレクトロポレーション用のエレクトロセルとした。そして、上記のカナマイシン耐性遺伝子で分断されたｇｔｆＡ遺伝子（ｇｔｆＡ：：ＫｍＲ）を含むＤＮＡ断片の約１μｇ分を、エレクトロセル１００μｌに加え、１８．５ｋＶ／ｃｍ，  ２５μＦ，  ２００Ωの条件で電気パルスを与え、エレクトロポレーション処理を行い、ＤＮＡ断片を細胞内へ導入した。
【００５８】
この菌懸濁液に直ちにＳＥＩＩ液体培地を加え、３７℃で３時間培養した。その後、この培養液をＳＥＩＩ＋Ｋｍ寒天培地（２０μ／ｍｌのカナマイシンと１．５％（ｗ／ｖ）の寒天を含むＳＥＩＩ培地）に塗布し、３７℃で３日間培養することで、ＫｍＲ株として約１００株を得た。その中から６株を選び、ゲノムＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲ（反応条件は、変性９４℃−１０秒、アニーリング５０℃−３０秒、伸長反応  ７２℃−４分、３０サイクル）を行い、各候補株のｇｔｆＡ遺伝子領域の構造を調べた。なお、ＰＣＲに使用したＤＮＡプライマーは、ＭｇｔｆＡ−Ｆ１（配列番号５）、ＭｇｔｆＡ−Ｒ１（配列番号６）とＫｍ４−Ｒ１（配列番号９）である。その結果、予想どおり、ＭｇｔｆＡ−Ｆ１とＭｇｔｆＡ−Ｒ２の組み合わせでは４１００  ｂｐの大きさのＤＮＡ断片、及びＭｇｔｆＡ−Ｆ１とＫｍ４−Ｒ１の組み合わせでは２９００  ｂｐの大きさのＤＮＡ断片がそれぞれ増幅でき、破壊の標的遺伝子であるｇｔｆＡ遺伝子の欠損株を取得できた。
【００５９】
次に、この遺伝子欠損によって、菌体が産生する多糖成分の生成量が変化するかどうかを調べた。ＡＳ１株とｇｔｆＡ遺伝子欠損候補株を、ＳＥＩＩ寒天培地へ塗り広げ、３７℃で１晩培養したのち、培地表面約３ｃｍ２の菌体をかきとって、ＳＥＩＩ生産培地（２０ｍｌ）に植菌し、３７℃で３５時間振盪培養した。培養終了後、菌体を遠心分離により除去し、その上清を菌体外多糖量測定のための試料とした。
【００６０】
菌体外多糖量の測定は、中性糖、特にヘキソースに適用される比色定量法の一つであるフェノール硫酸法（参考文献：Ｄｕｂｏｉｓ，Ｍ．，  Ｋ．Ａ．Ｇｉｌｅｓ，  Ｊ．Ｋ．Ｈａｍｉｌｔｏｎ，  Ｐ．Ａ．Ｒｅｂｅｒｓ  ａｎｄ  Ｆ．Ｓｍｉｔｈ．  １９５６．  Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｕｇａｒｓ  ａｎｄ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ．  Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２８：３５０−３５６）を用いた。具体的には、試料０．２  ｍＬに対し、５  ％フェノール溶液を０．２  ｍＬ加えて混合した。次いで、濃硫酸１  ｍＬを液面に直接滴下するように速やかに添加し、１０分間放置した。その後、再び混合し、２５℃の水浴中で２０分間放置した後、４９０  ｎｍの吸光度を吸光光度計（日立製Ｕ−２０００）をで測定した。
【００６１】
その結果、ＡＳ１株の菌体外多糖量は２２６  ｍｇ／Ｌであったのに対し、ｇｔｆＡ遺伝子欠損候補株では９８  ｍｇ／Ｌであり、約半分にまで菌体外多糖量が減っていることが判明し、取得した株が、表現型としても多糖類生成の抑制株であることが解った。
【００６２】
【実施例３】ｍａｎＣ（ｃｐｓＢ）（ホスホマンノース  イソメラーゼ  ／  マンノース−１−リン酸グアニリルトランスフェラーゼ）遺伝子の取得
メチロフィラス・メチロトロファスＡＳ１株のゲノムＤＮＡ（０．０５μｇ）を鋳型にして、ＤＮＡプライマーｍＭａｎＣ−Ｆ１（配列番号１０）とｍＭａｎＣ−Ｒ１（配列番号１１）を用いて、ＰＣＲを行った。その条件は、変性９４℃−１０秒、アニーリング５０℃−３０秒、伸長反応７０℃−４分であった（２８サイクル）。ＰＣＲは、市販のキットＰｙｒｏｂｅｓｔ  ｔａｑ  （Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ  Ｉｎｃ．社製）を、添付のプロトコールに従って使用した。その結果、約１，４６０ｂｐのＤＮＡ断片が増幅できた。そして、これを制限酵素ＢａｍＨＩで消化し、約１．４６ｋｂのＤＮＡ断片を取得した。
【００６３】
一方、プラスミドベクターｐＢＲ３２２（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ  Ｉｎｃ．）を制限酵素ＢａｍＨＩで消化した後、切断端の５’リン酸を脱リン酸化した。これら２つのＤＮＡ断片をＬｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ  Ｉｎｃ．）を用いて連結し、ｐＢＲ−ＭｍａｎＣを構築した。なお、このプラスミド中のｍａｎＣ遺伝子の向きは、プラスミド中のＡｍｐ（アンピシリン）耐性遺伝子の転写の向きと同方向である。
【００６４】
この取得できたＤＮＡ断片の塩基配列を常法により決定した。その塩基配列を配列表配列番号３に、また、それがコードするアミノ酸配列を配列表配列番号４に示した。このアミノ酸配列に相同な配列を、既存のアミノ酸配列データベースに対して検索したところ、エシェリヒア・コリのｍａｎＣ（ｃｐｓＢ）が見出されたため、この配列番号４の遺伝子をｍａｎＣと命名した。
【００６５】
【実施例４】ｍａｎＣ遺伝子の破壊とその効果
ＰＣＲ用のＤＮＡプライマーとして、Ｋｍ４−Ｆ２（配列番号７）とＫｍ４−Ｒ２（配列番号８）を用い、鋳型ＤＮＡとしてｐＵＣ４Ｋ２を用いて、ＰＣＲ（条件：変性９４℃−１０秒、アニーリング５０℃−３０秒、伸長反応７０℃−１．５分、２８サイクル）を行い、ＫｍＲ遺伝子が搭載されているＤＮＡ断片を増幅した。増幅されたＤＮＡの両端をＢＫＬ  ｋｉｔ  （Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ  Ｉｎｃ．）で平滑端化して、ＫｍＲ遺伝子を搭載したＤＮＡ断片（１．３  ｋｂ）を調製した。
【００６６】
次に、実施例３で取得したｐＢＲ−ＭｍａｎＣを制限酵素ＫｐｎＩで消化し、平滑末端化処理を行い、切断端の５’リン酸を脱リン酸化した。このＤＮＡ断片と、上記のＫｍＲ遺伝子を搭載したＤＮＡ断片とをＬｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔにより連結し、ｐＢＳ−ＭｍａｎＣ−Δを作製した。
【００６７】
プラスミドｐＢＳ−ＭｍａｎＣ−Δを制限酵素ＢａｍＨＩで切断し、カナマイシン耐性遺伝子で分断されたｍａｎＣ遺伝子（ｍａｎＣ：：ＫｍＲ）を含む領域を断片化した。この断片をエタノール沈殿法にて濃縮し、更に脱塩処理を行い、これをエレクトロポレーションの導入ＤＮＡ断片標品とした。
【００６８】
次に、実施例１、２と同様にして、ＡＳ１株に上記ＤＮＡサンプルをエレクトロポレーションし、形質転換体を取得した。ＫｍＲ株として約１００株が取得できた。その中から６株を選び、ゲノムＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲ（反応条件は変性９４℃−１０秒、アニーリング５０℃−３０秒、伸長反応  ７２℃−４分、３０サイクル）を行い、各候補株のｍａｎＣ遺伝子領域の構造を調べた。なお、ＰＣＲに使用したＤＮＡプライマーは、ＭｍａｎＣ−Ｆ２（配列番号１２）とＭｍａｎＣ−Ｒ２（配列番号１３）である。その結果、予想どおりＭｍａｎＣ−Ｆ２とＭｍａｎＣ−Ｒ２の組み合わせでは３９００  ｂｐの大きさのＤＮＡ断片が増幅でき、破壊の標的遺伝子であるｍａｎＣ遺伝子の欠損株を取得できた。
【００６９】
次に、この遺伝子欠損によって菌体が産生する多糖成分の生成量が変化するかどうかを調べた。実施例２と同様にフェノール硫酸法を用いた。
ＡＳ１株とｍａｎＣ遺伝子の欠損候補株をＳＥＩＩ寒天培地に塗り広げ、３７℃で１晩培養した後、培地表面約３ｃｍ２の菌体をかきとって、ＳＥＩＩ生産培地（２０ｍｌ）に植菌し、３７℃で４５時間振盪培養した。培養終了後、菌体を遠心分離により除去し、その上清を菌体外多糖量測定のための試料とした。
【００７０】
その結果、ＡＳ１株の菌体外多糖量は４７５ｍｇ／Ｌであったのに対し、ｍａｎＣ遺伝子欠損候補株では３０８ｍｇ／Ｌで、菌体外多糖量が減っていることが判明し、取得した株が、表現型としてもｍａｎＣ破壊株であることが示唆された。
【００７１】
以上のように、直鎖状ＤＮＡによる、メチロフィラス・メチロトロファスのｍａｎＣ遺伝子破壊が確認された。
【００７２】
【発明の効果】
本発明により、メチロフィラス属細菌の菌体外多糖生成に関わる遺伝子が提供される。この遺伝子を用いることで、菌体の多糖生成量を増加又は減少させることができる。
【００７３】
【配列表】
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