(57)【要約】【課題】間接型ビリルビンの干渉を完全に回避し、廃液による環境汚染等の危険性の少ない直接型ビリルビンの測定方法及び測定試薬の提供をその目的とする。【解決手段】本発明は、試料にビリルビンオキシダーゼを作用させ、該試料の光学的変化により試料中の直接型ビリルビンを測定する方法において、１００ｍＭ〜８００ｍＭのカリウムイオンを共存させておくことを特徴とする直接型ビリルビンの測定方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ビリルビンを含む試料にビリルビンオキシダーゼを作用させ、該試料の光学的変化により試料中の直接型ビリルビンを測定する方法において、１００ｍＭ〜８００ｍＭのカリウムイオンである間接型ビリルビン反応抑制剤を共存させてビリルビンオキシダーゼを作用させることを特徴とする直接型ビリルビンの測定方法。
【請求項２】
ビリルビンオキシダーゼを作用させるときのｐＨが５．０〜６．０である請求項１の直接型ビリルビンの測定方法。
【請求項３】
必須成分として、i）ビリルビンオキシダーゼとii）１００ｍＭ〜８００ｍＭのカリウムイオンである間接型ビリルビン反応抑制剤とを含むことを特徴とする直接型ビリルビン測定用試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中に含まれる直接型ビリルビンの測定方法及びそれに用いる測定用試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
ビリルビンは老化赤血球由来のヘモグロビンの代謝産物で胆汁色素の主成分である。血液中には、側鎖のプロピオン酸基が肝臓で酵素的に主にグルクロン酸とエステル結合し水溶性が増加した画分（抱合型）と、プロピオン酸基が遊離の状態のままであり水溶性が低い画分（遊離型）が主に存在する。前者はジアゾ試薬と容易に反応するために直接型ビリルビンと称され、後者はアルコールなどの反応促進剤の存在下において初めてジアゾ試薬と反応するため、間接型ビリルビンとして捉らえられている。間接型ビリルビンは、反応促進剤の存在下全てのビリルビンをジアゾ発色して求められる総ビリルビンから直接型ビリルビンを差し引いて求めることができる。
これらの抱合型（直接型）および遊離型（間接型）の各ビリルビン濃度を分別定量することにより各種肝疾患、溶血性疾患などによる黄だんの鑑別および診断を行うことができるため、ビリルビンの測定は臨床検査における重要な項目となっている。
【０００３】
直接型ビリルビンの定量法としては、以下に示すように、ジアゾ試薬による方法、ビリルビンオキシダーゼによる方法、高速液体クロマトグラフィーによる方法、化学的酸化剤による方法などが報告されている。
【０００４】
Ａ）ジアゾ試薬による直接型ビリルビンの測定方法
ジアゾ試薬による方法は、ビリルビンがジアゾ試薬と反応してアゾビリルビンを生成し、その結果、ビリルビン本来の可視部極大吸収波長より長波長域にアゾビリルビンの極大吸収が発生するため、この波長における吸光度変化によりビリルビンを定量するものである。これらは、間接型ビリルビンの反応促進剤の種類、反応停止条件、アゾビリルビンの検出条件の違いにより種々のものが報告されている（非特許文献１、非特許文献２および非特許文献３）。
【０００５】
Ｂ）ビリルビンオキシダーゼによる直接型ビリルビンの測定方法
ビリルビンオキシダーゼによる方法は、ビリルビンを含む検体にビリルビンオキシダーゼを作用させて、ビリルビンをビリベルジンに酸化させ、この際、ビリルビンの極大吸収波長域の吸光度が消失するので、この吸光度の減少量により定量するものである。この測定法では、間接ビリルビンの反応抑制の方法に種々の工夫がなされており、下記のごとく多数の方法が報告されている。
【０００６】
Ｂ１）ｐＨ３．５〜４．５でビリルビンオキシダーゼを作用させることを特徴とする直接型ビリルビンの測定方法（特許文献１）。
Ｂ２）陰イオン界面活性剤を含有するｐＨ５〜６の酸性緩衝液中で、ビリルビンオキシダーゼを作用させることを特徴とする直接型ビリルビンの測定方法（非特許文献４および特許文献２）。
Ｂ３）ｐＨ９〜１０の緩衝液中でビリルビンオキシダーゼを作用させ生じた吸光度の変化を測定することを特徴とする抱合型ビリルビンの定量方法（特許文献３）。
Ｂ４）ｐＨ２．０〜３．３のフェロシアン化カリウムおよび／またはフェリシアン化カリウムを含む緩衝液中でビリルビンオキシダーゼを作用させ、生じた吸光度変化を測定することを特徴とする直接型ビリルビンの定量方法（特許文献４）。
Ｂ５）ビリルビンオキシダーゼとともに、フッ素化合物または還元剤を共存させることを特徴とする直接型ビリルビンの定量方法（特許文献５）ビリルビンオキシダーゼとともに、テトラピロール環化合物を共存させることを特徴とする直接型ビリルビンの定量方法（特許文献６）。
【０００７】
Ｃ）高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による直接型ビリルビンの測定方法
ＨＰＬＣによる直接型ビリルビンの測定法は、逆相カラムに有機溶剤の濃度勾配をかけビリルビンの画分を親水性／疎水性の序列により分画するものである。ＨＰＬＣによると血清中のビリルビンは主にα、β、γ、δの４画分に分離され、それぞれ、α画分は遊離型ビリルビン、β画分は１分子中に２つある側鎖のプロピオン酸基の１つのみがグルクロン酸とエステル結合をしているビリルビン（ビリルビンモノグルクロナイド）、γ画分はプロピオン酸基が２つともグルクロン酸とエステル結合をしているビリルビン（ビリルビンジグルクロナイド）、δ画分はアルブミンとビリルビンが共有結合をしているものと同定されている。また、δ画分はγ画分とアルブミンが非酵素的に反応した結果、生成したものと推定されている（非特許文献５）。なお、ＨＰＬＣでのα画分は上記Ａ）のジアゾ試薬による方法では間接型ビリルビンに相当し、一方、βとγおよびδ画分は直接型ビリルビンに相当するとされる（非特許文献６）。ＨＰＬＣ法は、煩雑な検体前処理工程を極力省略した形で改良が進められており、種々の報告がなされている（非特許文献７、非特許文献８および非特許文献９）。
【０００８】
Ｄ）化学的酸化剤による直接型ビリルビンの測定方法
化学的酸化剤によるものは、ビリルビンオキシダーゼの代わりに、低分子量の酸化剤を作用させて、ビリルビンをビリベルジンに酸化し、この際のビリルビンに基づく吸光度減少量により定量するものである。これらも、間接型ビリルビンの反応抑制の方法に種々の工夫がなされており、下記のごとく報告されている。
Ｄ１）銅イオンおよびチオ尿素もしくはその誘導体を被検液に作用させることを特徴とする直接型ビリルビンの定量方法（特許文献７）。
Ｄ２）バナジン酸イオンまたは３価のマンガンイオンを酸化剤として作用させ、試料の光学的変化を測定することを特徴とするビリルビンの定量方法（特許文献８）。この方法で直接型ビリルビンを測定するためには、間接型ビリルビンの反応抑制剤として、ヒドラジン類、ヒドロキシルアミン類、オキシム類、脂肪族多価アミン類、フェノール類、水溶性高分子およびＨＬＢが１５以上の非イオン型界面活性剤からなる群より選ばれた１種以上の化合物を使用する。
Ｄ３）亜硝酸を酸化剤として作用させ、試料の光学的変化を測定することを特徴とするビリルビンの定量方法（特許文献９）。この方法で直接型ビリルビンを測定するためには、間接型ビリルビンの反応抑制剤として、ＨＬＢが１２〜１５のポリオキシエチレン（ｎ−アルキルあるいはｉｓｏ−アルキル）エーテル、チオ尿素、ヒドラジン、ポリビニルピロリドン等を使用する。
【０００９】
上記Ａ）〜Ｄ）の各測定法にはそれぞれ一長一短があり、現在のところ、必ずしも、満足のいく測定方法は存在しない。以下に各測定法の問題点を列記する。
【００１０】
ジアゾ試薬による方法Ａ）は、反応促進剤が共存しない場合での反応をジアゾ直接反応と定義し、直接型ビリルビンの名称の由来ともなっている。しかしながら、このジアゾ直接反応は間接型ビリルビンの一部に対しても起こり得ることが多数報告がなされている（例えば、非特許文献１０、非特許文献１１、非特許文献１２、非特許文献１３、非特許文献１４および非特許文献１５）。従ってジアゾ直接反応により定義されたビリルビン測定値は、正確には“直接型ビリルビン”を測定しているとは言い切れない。
【００１１】
ビリルビンオキシダーゼによる方法Ｂ）は、ジアゾ直接反応により定義されたビリルビン測定値と近似し得るように測定系を開発した結果、間接型ビリルビンの一部に対しても酸化反応が認められ、一般的には“直接型ビリルビン”を測定しているとは言い切れない。その中で、ビリルビンオキシダーゼにフッ素化合物を共存させる方法（特許文献１０）やテトラピロール環化合物を共存させる方法（特許文献１１）は、間接型ビリルビンに対する反応を回避し得るものである。しかし、フッ素化合物を使用するため環境汚染に問題を有し、またテトラピロール環化合物を試薬中に存在させるため安定性に欠け、溶液状態で長時間使用することに問題を有する。
【００１２】
高速液体クロマトグラフィーによる方法Ｃ）は、高い分析性能を有するが１検体の処理に約１時間を要するので、多数の検体を処理するには不向きである。また高価で特殊な装置を必要とし汎用性に欠ける。
【００１３】
化学的酸化剤による方法Ｄ）は、ビリルビンオキシダーゼによるものと同様にジアゾ直接反応により定義された直接型ビリルビン測定値と近似し得るように測定系を開発した結果、間接型ビリルビンの一部に対しても酸化反応が認められ、やはり正確には“直接型ビリルビン”を測定しているとは言い切れない。
【００１４】
以上述べてきたように、間接型ビリルビンに対する反応を完全に回避し、安定かつ安全な直接型ビリルビンの測定方法は現在のところ必ずしも存在せず、この開発が待ち望まれている。
【特許文献１】特開昭５９−１２５８９９号公報
【特許文献２】特開昭６０−１５２９５５号公報
【特許文献３】特開昭６２−５８９９９号公報
【特許文献４】特開昭６４−５４９９号公報
【特許文献５】特開平５−２７６９９２号公報
【特許文献６】特開平７−２３１７９５号公報
【特許文献７】特開昭６３−１１８６６２号公報
【特許文献８】特開平５−１８９７８号公報
【特許文献９】国際公開第９６−１７２５１号パンフレット
【特許文献１０】特開平５−２７６９９２号公報
【特許文献１１】特開平７−２３１７９５号公報
【非特許文献１】Ｍａｌｌｏｙ，Ｈ．Ｔ．，Ｅｖｅｌｙｎ，Ｋ．Ａ．；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１１９，４８１（１９３７）；Ｔｈｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｌｉｒｕｂｉｎ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｐｈｏｔｏｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｅｒ
【非特許文献２】Ｊｅｎｄｒａｓｓｉｋ，Ｌ．，Ｇｒｏｆ，Ｐ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｚ．，２９７．８１（１９３８）：Ｖｅｒｅｉｎｆａｃｈｔｅ  Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｓｃｈｅ  Ｍｅｔｈｏｄｅｎ  ｚｕｒ  Ｂｅｓｔｉｍｍｕｎｇ  ｄｅｓ  Ｂｌｕｔｂｉｌｉｒｕｂｉｎｓ
【非特許文献３】Ｍｉｃｈａ  ｅｌｅｓｓｏｎ，Ｍ．，Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１２（Ｓｕｐｐ．５６），１〜８（１９３７）；Ｂｉｌｉｒｕｂｉｎ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｓｅｒｕｍ  ａｎｄｕｒｉｎｅ）
【非特許文献４】Ｓｈｏｇｏ  Ｏｔｓｕｊｉ：Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２１，３３〜３８（１９８８）
【非特許文献５】山本  俊夫：日内会誌７８（１１），３６〜４１（１９８９）
【非特許文献６】Ｊｏｈｎ  Ｊ．Ｌａｕｆｆ，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，２８（４）６２９〜６３７（１９８２）
【非特許文献７】Ｎａｋａｍｕｒａ  Ｈ．：Ｂｕｎｓｅｋｉ  ｋａｇａｋｕ，３６，３５２〜３５５（１９８７）
【非特許文献８】Ｙｕｋｉｈｉｋｏ  Ａｄａｃｈｉ：Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｉａ  Ｊａｐｏｎｉｃａ，２３（３），２６８〜２７２（１９８８）
【非特許文献９】加藤  裕子：近畿大医誌第１４巻１号９７〜１１２（１９８９）
【非特許文献１０】Ｋｉｌｌｅｎｂｅｒｇ，Ｐ．Ｇ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，７８，１０１１〜１０１５（１９８０）
【非特許文献１１】Ｂｌａｎｋａｅｒｔ，Ｎ．，Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．，９６，１９８〜２１２（１９８０）
【非特許文献１２】真鍋幸男：分析化学，３０，７３６〜７４０（１９８１）
【非特許文献１３】Ｃｈａｎ，Ｋ．Ｍ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，３１，１５６０〜１５６３（１９８５）
【非特許文献１４】高坂彰：検査と技術１４  ９７１〜９７５（１９８６）
【非特許文献１５】足立幸彦：生物試料分析  ９  ３３〜４２（１９８６）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明は上記した現状に鑑みなされたもので、間接型ビリルビンの干渉を完全に回避し、廃液による環境汚染等の危険性のない直接型ビリルビンの測定方法および測定用試薬の提供をその目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者らはビリルビンオキシダーゼの至適ｐＨ域において、間接型ビリルビンや直接型ビリルビンの反応性を鋭意検討した結果、ビリルビンにビリルビンオキシダーゼを作用させる際に、チオシアン酸イオン、ヒドラジド類、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）、または１００ｍＭ〜８００ｍＭのカリウムイオンを共存させた場合、間接型ビリルビンの酸化が完全に抑制されると共に、直接型ビリルビンの酸化が定量的に進行し直接型ビリルビンを正確に測定できることを見いだし本発明を完成するに至った。
【００１７】
すなわち、本発明は、試料にビリルビンオキシダーゼを作用させ、該試料の光学的変化により試料中の直接型ビリルビンを測定する方法において、チオシアン酸イオン、ヒドラジド類、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）及び１００ｍＭ〜８００ｍＭのカリウムイオンから選ばれる間接型ビリルビン反応抑制剤の１種以上を共存させてビリルビンオキシダーゼを作用させることを特徴とする直接型ビリルビンの測定方法である。
更に本発明は、必須構成成分として、ｉ）ビリルビンオキシダーゼとii）チオシアン酸イオン、ヒドラジド類、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸及び１００ｍＭ〜８００ｍＭのカリウムイオンから選ばれる間接型ビリルビン反応抑制剤の１種以上とを含むことを特徴とする直接型ビリルビン測定用試薬である。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、試料中の直接型ビリルビンを間接ビリルビンの影響なく選択的に測定することができ、臨床検査の分野において有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明では、試料は、直接型ビリルビンまたは間接型ビリルビンを含むものであれば特に限定しない。通常、試料は、血しょう、血清、尿等の生態体液試料、またはこれらのモデルサンプルである。
本発明の方法においては、間接型ビリルビン反応抑制剤として用いるチオシアン酸イオンとしては、特に限定されないが、チオシアン酸アルカリ金属、チオシアン酸アルカリ土類金属、チオシアン酸アンモニウム等が挙げられるが、チオシアン酸ナトリウム、チオシアン酸カリウム等が好ましい。
【００２０】
ヒドラジド類としては、アセチルヒドラジド、フタルヒドラジド、イソフタロイルジヒドラジド、テレフタリックジヒドラジド、ベンゼンスルフォニルヒドラジド等を例示できる。
【００２１】
還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）または還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）は、直接、反応試薬中に共存させてもよく、あるいはアルコールデヒドロゲナーゼ、グルコール−６−リン酸デヒドロゲナーゼ等の酵素反応により酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドから誘導したものを用いても本発明の目的を達することができる。
【００２２】
カリウムイオンとしては、塩化カリウム、臭化カリウム、酢酸カリウム、クエン酸カリウム、酒石酸カリウム、乳酸カリウム、フタル酸カリウム、硫酸カリウム等が限定されずに使用しうる。
【００２３】
本発明においては、試料中のビリルビンにビリルビンオキシダーゼを作用させる際、その酵素反応液中に共存させる間接型ビリルビン反応抑制剤は、低濃度に過ぎると間接型ビリルビンの反応抑制効果が充分に得にくく、また高濃度に過ぎるとビリルビンオキシダーゼの阻害性が昂進し直接型ビリルビンの酸化反応が妨害されやすい。従って、間接型ビリルビン反応抑制剤として、チオシアン酸イオン又はヒドラジド類を用いる場合には酵素反応液中において、０．１ｍＭ〜１００ｍＭの濃度が好ましく、０．２ｍＭ〜５０ｍＭの濃度がさらに好ましい。
ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを用いる場合には、０．１ｍＭ〜１０ｍＭ、好ましくは０．２ｍＭ〜５ｍＭの濃度範囲である。
【００２４】
カリウムイオンを用いる場合には、酵素反応液中で、カリウムイオン濃度は、１００ｍＭ〜８００ｍＭが好ましく、１１０ｍＭ〜６００ｍＭがさらに好ましく、１２０〜４００ｍＭが特に好ましい。カリウムイオン濃度が１００ｍＭを超えないと、間接型ビリルビンの反応抑制効果が弱くなる。カリウムイオン濃度が８００ｍＭを越えるビリルビンオキシダーゼの阻害性が昂進し直接型ビリルビンの酸化反応が妨害されやすい。
【００２５】
本発明の方法においては、間接型ビリルビン反応抑制剤は、２種以上を用いてもよい。例えば、チオシアン酸イオン、ヒドラジド類、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨから選ばれる２種以上の反応抑制剤を併用することができる。また、チオシアン酸イオン、ヒドラジド類、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨから選ばれる１種または２種以上の反応抑制剤とカリウムイオンとを併用することもできる。
【００２６】
本発明の方法において、ビリルビンオキシダーゼは、特に限定されないが、Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ  ｖｅｒｒｕｃａｒｉａ  由来のビリルビンオキシダーゼ（天野製薬（株）から入手可能）あるいはＴｒａｃｈｙｄｅｒｍａ  ｔｓｕｎｏｄａｅ  由来のビリルビンオキシダーゼ（宝酒造（株）から入手可能）あるいはＰｌｅｕｒｏｔｕｓ  属由来のビリルビンオキシダーゼ（株式会社盛進から入手可能）等が挙げられ、その必要量は最終反応液中において、それぞれ０．００１〜１０Ｕ／ｍｌの濃度にて使用するのが好ましい。より好ましくは０．０１〜１Ｕ／ｍｌ、特に好ましくは０．０２〜０．５Ｕ／ｍｌの濃度範囲である。
【００２７】
ビリルビンオキシダーゼを作用させる際、ｐＨ範囲は、酵素活性が至適状態で発現しうる範囲であれば限定されないが、ｐＨ４．５〜６．５が好ましく、ｐＨ５．０〜６．０が特に好ましい。使用する緩衝液はこのｐＨ範囲において緩衝能を有するものであれば特に限定されないが、フタル酸水素カリウム／水酸化ナトリウム緩衝液、クエン酸ナトリウム／水酸化ナトリウム緩衝液、リンゴ酸／水酸化ナトリウム緩衝液等を含むものが挙げられる。特に緩衝液の成分として、フタル酸水素カリウム等のカリウム塩を含む場合、カリウムイオンが、間接型ビリルビン反応抑制効果を有する点から好ましい。
【００２８】
本発明では、試料中の直接型ビリルビンを、例えば、ビリルビンオキシダーゼおよび間接型ビリルビン反応抑制剤の１種以上を含む直接型ビリルビン測定用試薬を用いて測定することができる。
【００２９】
直接型ビリルビン測定用試薬としては、例えば、チオシアン酸イオン又はヒドラジド類を含む液を第１試薬液とし、また、ビリルビンオキシダーゼを含む液を第２試薬液とし、これら２つの試薬から構成されるキットとすることが好ましい。第１試薬液には、さらにカリウムイオンを含むことが好ましい。
【００３０】
あるいは、例えば、ｐＨ４．５〜６．５の緩衝液、好ましくはｐＨ５．０〜６．０の緩衝液を第１試薬液とし、また、ビリルビンオキシダーゼとＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨまたはカリウムイオンとを含む液を第２試薬液とし、これら２つの試薬から構成されるキットとすることがＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨまたはビリルビンオキシダーゼの安定性から好ましい。ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを用いる場合、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの溶液状態での安定性から、第２試薬液のｐＨは、９以上が好ましく、９〜１１．０がさらに好ましい。さらにカリウムイオンを含むことが好ましい。
間接型ビリルビンオキシダーゼの反応抑制剤としてカリウムイオンを単独で用いる場合、ビリルビンオキシダーゼを含む第２試薬液のｐＨは、７〜１１がビリルビンオキシダーゼの安定性から好ましい。
緩衝液の組成としては、前記したように、フタル酸水素カリウム／水酸化ナトリウム緩衝液、クエン酸ナトリウム／水酸化ナトリウム緩衝液、リンゴ酸／水酸化ナトリウム緩衝液等を含むものを例示できる。
第１試薬液には、さらにカリウムイオンを含むことが好ましい。
【００３１】
本発明の方法は、例えば、上記したキットにより、以下のように実施できる。試料と上記の第１試薬液とを混合し、この混合液中のビリルビンに基づく波長域（４３０〜４６０ｎｍ）の特定の波長、好ましくは波長４５０ｎｍにおける吸光度を測定する（吸光度１）。ついで、得られる液にビリルビンオキシダーゼを含む第２試薬液を添加して２５〜４０℃で、３〜１５分間、ビリルビンの酸化反応を行った後、再度溶液中のビリルビンに基づく特定の波長における吸光度を測定する（吸光度２）。得られた吸光度１および吸光度２の値に液量補正等を処した後、酸化反応前後での吸光度変化量を求める。この値と、予め濃度既知の標準液を用いて上記と同様の操作により得られた吸光度変化量に基づいて作成した検量線から、試料中の直接型ビリルビン濃度を求めることができる。このようなキットによる直接型ビリルビンの測定方法は、日立７０７０型自動分析装置等の汎用型の自動分析装置に適用可能である。なお、試料は、０．００５〜２ｍｌが好ましい。
【００３２】
直接型ビリルビン測定用試薬に含まれるチオシアン酸イオン、ヒドラジド類、カリウムイオンは水溶液中でとくに不安定ではなく、またＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨおよびビリルビンオキシダーゼは、ｐＨ９以上では水溶液中でとくに不安定ではないので、この試薬は、水溶液の状態で液状試薬として使用することも可能である。また、直接型ビリルビン測定用試薬には、他の試薬類、例えば防腐剤、キレート化剤、界面活性剤等の通常の試薬やキットに使用し得るものであれば公知の方法に準じて適宜選択して使用することができる。
【００３３】
実施例１〜６および比較例１
間接型ビリルビンの抑制効果
ビリルビンオキシダーゼを作用させる際、１００ｍＭ〜８００ｍＭのカリウムイオン（実施例１）、チオシアン酸イオン（実施例２）、ヒドラジド類（実施例３及び実施例４）、ＮＡＤＨ（実施例５）、ＮＡＤＰＨ（実施例６）を共存させると、間接型ビリルビンの酸化反応が抑制されるかどうかを観察するため以下の実験を行った。なお、比較例１では、これらチオシアン酸イオン等を含まない条件で行った。それらの試薬、試料、測定、結果を以下に示す。
【００３４】
（１）第１及び第２試薬液
比較例１に用いた第１試薬液
：フタル酸                            １５０    ｍＭ
トリトンＸ−１００                      ０．０５％
ｐＨ５．５０（ＮａＯＨで調整）
実施例１に用いた第１試薬液
：フタル酸                            １５０    ｍＭ
塩化カリウム                        ２００    ｍＭ
トリトンＸ−１００                      ０．０５％
ｐＨ５．５０（ＮａＯＨで調整）
実施例２に用いた第１試薬液
：フタル酸水素カリウム                １５０    ｍＭ
チオシアン酸ナトリウム                １０    ｍＭ
トリトンＸ−１００                      ０．０５％
ｐＨ５．５０（ＮａＯＨで調整）
実施例３に用いた第１試薬液
：フタル酸水素カリウム                １５０    ｍＭ
ベンゼンスルフォニルヒドラジド        １０    ｍＭ
トリトンＸ−１００                      ０．０５％
ｐＨ５．５０（ＮａＯＨで調整）
実施例４に用いた第１試薬液
：フタル酸水素カリウム                １５０    ｍＭ
イソフタロイルジヒドラジド            １０    ｍＭ
トリトンＸ−１００                      ０．０５％
ｐＨ５．５０（ＮａＯＨで調整）
実施例５および実施例６に用いた第１試薬液
：フタル酸水素カリウム                １５０    ｍＭ
トリトンＸ−１００                      ０．０５％
ｐＨ５．５０
比較例１及び実施例１〜４に用いた第２試薬液
：トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン
１０    ｍＭ
ビリルビンオキシダーゼ                ０．２４Ｕ／ｍｌ
（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ属由来）
ｐＨ１０．２
実施例５に用いた第２試薬液
：トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン
１０    ｍＭ
ＮＡＤＨ                                ５    ｍＭ
ビリルビンオキシダーゼ                ０．２４Ｕ／ｍｌ
ｐＨ１０．２
実施例６に用いた第２試薬液
：トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン
１０    ｍＭ
ＮＡＤＰＨ                              ５    ｍＭ
ビリルビンオキシダーゼ                ０．２４Ｕ／ｍｌ
ｐＨ１０．２
【００３５】
（２）試料
試料は、間接型ビリルビン濃度５０ｍｇ／ｄｌでありかつヒト血清アルブミン濃度６．０ｇ／ｌのものを用いた。その試料は、以下のようにして調整した。
間接型ビリルビン５ｍｇを秤量し０．４ｍｌのジメチルスルホキシドに分散させる。この分散した液に、０．４ｍｌの１００ｍＭ炭酸ナトリウム溶液を加え間接型ビリルビンを溶解させた直後、ヒト血清アルブミンを含む１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．００）９．２ｍｌにて希釈して試料を調製した。
【００３６】
（３）比較例１及び実施例１〜６での測定
日立７０７０型自動分析装置において、試料１０μｌ、第１試薬液３００μｌ、第２試薬液７５μｌの条件で、主波長４５０ｎｍ、副波長５４６ｎｍにおける吸光度変化を２Ｐｏｉｎｔ  Ｅｎｄ法にて求めた。
即ち、自動分析装置上で第１試薬液と試料とを混合し、３７℃で５分間インキュベーションした後、この溶液中のビリルビンに基づく吸光度を主波長４５０ｎｍ、副波長５４６ｎｍにて測定する（吸光度１）。ついで、得られる溶液に、ビリルビンオキシダーゼを含む第２試薬液を添加して３７℃で、５分間ビリルビンの酸化反応を行った後、再度、溶液中のビリルビンに基づく吸光度を前記の波長で測定する（吸光度２）。得られた吸光度１及び吸光度２の値に液量補正等を処した後、酸化反応前後での吸光度減少量を求める。これらの測定及び計算は、自動分析装置で自動的に行われる。
【００３７】
（４）比較例１及び実施例１〜６の結果
比較例１及び実施例１〜６における間接型ビリルビンでの吸光度減少量の結果を表１に示す。また、比較例１及び実施例１〜６における自動分析装置上における反応経過過程（反応タイムコース）を図１〜６に示す。
【００３８】
【表１】
2004194670.tif 000002
【００３９】
表１及び図１〜図６から明らかなように、本発明に基づく方法（実施例１〜６）では、間接型ビリルビンの酸化に基づく吸光度減少量は、自動分析装置の測定誤差程度であり、反応タイムコースにおいても吸光度の減少は認められない。これに対して、比較例１では明らかな間接型ビリルビンの酸化に伴う吸光度の減少が認められる。
これにより、チオシアン酸イオン、ヒドラジド類、１００ｍＭ〜８００ｍＭのカリウムイオン、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ共存下では、いずれも、ビリルビンオキシダーゼによる間接型ビリルビンの反応が抑制されることが明らかにされた。
【００４０】
実施例７〜１２
直接型及び間接型ビリルビンとを含む試料中の直接型ビリルビンの測定
（１）試料の調製
１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．００）中に合成抱合型ビリルビンであるジタウロビリルビンを５ｍｇ／ｄｌ（ビリルビン相当濃度）とヒト血清アルブミンを６．０ｇ／ｌ含む溶液を直接型ビリルビン溶液として調整した。また、それとは別に、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．００）中に非抱合型ビリルビンを５ｍｇ／ｄｌとヒト血清アルブミンを６．０ｇ／ｌ含む溶液を間接型ビリルビン溶液として調製した。次いで、直接型ビリルビン溶液を間接型ビリルビン溶液にて希釈し、総ビリルビン濃度が同一（５ｍｇ／ｄｌ）でかつ直接型ビリルビン濃度が異なる種々の試料を調整した。なお、試料は、総ビリルビンに対する直接型ビリルビンの比が０．０、０．２、０．４、０．６、０．８、１．０の６種のものを調製した。
【００４１】
（２）測定条件
この試料を用いた以外は、実施例１〜６記載の測定試薬、測定条件で、吸光度減少量を測定し、それぞれ、実施例７（カリウムイオン使用）、実施例８（チオシアン酸イオン使用）、実施例９（ヒドラジド類使用）、実施例１０（ヒドラジド類使用）、実施例１１（ＮＡＤＨ）、実施例１２（ＮＡＤＰＨ）とした。
【００４２】
（３）結果
結果を図７〜１２に示す。図７〜１２では、横軸に総ビリルビンに対する直接ビリルビンの比、縦軸に吸光度減少量を表わしている。本発明の方法（実施例７〜１２）では、直接型ビリルビンの量に比例して吸光度が大きくなり、原点回帰の良好な希釈直線性が得られた。これは、実施例７〜１２では、間接型ビリルビンの干渉なく、直接型ビリルビンを選択的に測定していることを示している。
【００４３】
比較例２
従来法による直接型ビリルビンと間接型ビリルビンとを含む試料中の直接型ビリルビンの測定
一方、実施例７〜１２に用いた試料を用いて、従来法で直接型ビリルビンを測定した。従来法は、ｐＨ３．５〜４．５の条件でビリルビンオキシダーゼを作用させる測定法（特開昭５９−１２５８９９；Ｓｈｏｇｏ  ｏｔｓｕｊｉ，Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２１，３３〜３８（１９８８））で行った。即ち、以下の組成の試薬条件によるものである。
【００４４】
（１）第１及び第２試薬液
従来法の第１試薬液
クエン酸三ナトリウム・三水和物          １７．６５  ｇ／ｌ
乳酸                                    ３０．０    ｇ／ｌ
トリトンＸ−１００                        １．０    ｇ／ｌ
ＥＤＴＡ・２Ｎａ・２Ｈ２  Ｏ              １８．６  ｍｇ／ｌ
ｐＨ３．７０
従来法の第２試薬液
クエン酸三ナトリウム・三水和物            ３．０５  ｇ／ｌ
乳酸                                  １６０      ｍｇ／ｌ
トリトンＸ−１００                        １．０    ｇ／ｌ
ＣｕＳＯ４  ・５Ｈ２  Ｏ                      １．２５  ｇ／ｌ
ビリルビンオキシダーゼ                    ０．２    Ｕ／ｍｌ
ｐＨ６．５０
【００４５】
（２）測定法
従来法の測定条件は、試薬液以外は、実施例１記載の測定条件と同一とした。
【００４６】
（３）結果
結果を図７〜１２に示す。従来法（比較例２）では、試料中の直接型ビリルビン濃度と測定された吸光度との間に直線性が得られないことが判明した。従来法では、試料中の間接型ビリルビンの干渉を大きく受け、試料中の直接型ビリルビンを正確に測定していないことを示す。
【００４７】
実施例１３〜１８及び比較例３
本発明の測定方法条件下でビリルビン高値患者検体中の間接型ビリルビンが反応しないことをＨＰＬＣで確認した例
（１）試料
試料としてビリルビン高値の患者プール血清検体を用いた。血清検体に対しては、硫酸ナトリウムによる塩析を行わず、未処理のまま分析に処した。試料中のグロブリンがカラムに吸着し劣化を早める結果となるが、ビリルビン画分の変性を防止することを目的とした為である。
【００４８】
（２）試薬
実施例１３（カリウムイオン使用）、実施例１４（チオシアン酸イオン使用）、実施例１５（ヒドラジド類使用）、実施例１６（ヒドラジド類使用）、実施例１７（ＮＡＤＨ使用）、実施例１８（ＮＡＤＰＨ使用）では、それぞれ、実施例１〜６で用いた試薬を使用した。比較例３では、比較例２で用いた試薬を使用した。
【００４９】
（３）ビリルビンオキシダーゼによる試料中のビリルビンの酸化反応
試料１６μｌに対して第１試薬液４８０μｌを添加し、３７℃で５分間加温した。さらに、得られる液に、１２０μｌの第２試薬液を添加し、３７℃で５分間加温後、１２０μｌの２％アスコルビン酸水溶液を添加してビリルビンオキシダーゼの反応を停止させた。
【００５０】
（４）ＨＰＬＣによる分析
ＨＰＬＣの分析は、文献（Ｊｏｈｎ  Ｊ．  Ｌａｕｆｆ，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ，２８（４），６２９〜６３７（１９８２））記載の方法により行い、反応前後における間接型ビリルビンに基づくピーク面積の変化を調べた。反応前のデータは、第２試薬液として生理食塩水を用いた以外は、上記した酸化反応と同様の操作を行い、間接型ビリルビンに基づくピーク面積を求めた。
ＨＰＬＣは、日立ＨＰＬＣシステム（Ｃｏｌｕｍｎ  Ｏｖｅｎ  Ｌ−７３００、ＵＶ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ  Ｌ−７４００、Ｐｕｍｐ  Ｌ−７１００、Ｉｎｔｅｇｒａｔｏｒ  Ｄ−７５００）に関東化学（株）製の逆相系カラムＬｉｃｈｒｓｐｈｅｒ  １００  ＲＰ−１８（１０μｍ）を接続して使用した。
すなわち、上記の酸化反応で得られる液を、０．４５μｍのメンブランフィルターにてろ過し、ろ液１５０μｌをＨＰＬＣのカラムに注入して反応後の間接ビリルビンに基づくピーク面積を求めた。溶出は、ビリルビン画分を、Ａ液：（精製水９５０容／２−メトキシエタノール５０容／りん酸にてｐＨ２．１に調製）とＢ液：（イソプロパノール９５０容／２−メトキシエタノール５０容／りん酸２．５容）の２液間におけるイソプロパノールの直線勾配により行い、４５０ｎｍの波長により検出した。
【００５１】
（５）結果
反応前のデータを１００とし、そのデータと反応後の間接型ビリルビンに基づくピーク面積のデータとの比較により、間接型ビリルビンの残存比率を求めた。結果を表２に示す。反応前後で間接型ビリルビンに基づくピーク面積がほとんど変わらず、本発明の測定条件下では、間接型ビリルビンが反応しないことが確認された。一方、比較例３（従来法）では、間接型ビリルビンが１６．５％減少していた。従来法の条件下では、間接型ビリルビンの一部が反応したことを示している。
【００５２】
【表２】
2004194670.tif 000003
【００５３】
本発明によれば、試料中の直接型ビリルビンを間接ビリルビンの影響なく選択的に測定することができ、臨床検査の分野において有用である。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】実施例１及び比較例１での反応タイムコースを示す。横軸に測光ポイント（１ポイントは約２０秒）、縦軸には、吸光度×１００００を示す。
【図２】実施例２及び比較例１での反応タイムコースを示す。横軸に測光ポイント（１ポイントは約２０秒）、縦軸には、吸光度×１００００を示す。
【図３】実施例３及び比較例１での反応タイムコースを示す。横軸に測光ポイント（１ポイントは約２０秒）、縦軸には、吸光度×１００００を示す。
【図４】実施例４及び比較例１での反応タイムコースを示す。横軸に測光ポイント（１ポイントは約２０秒）、縦軸には、吸光度×１００００を示す。
【図５】実施例５及び比較例１でのビリルビンオキシダーゼによる間接型ビリルビンの反応タイムコースを示す。横軸に測光ポイント（１ポイントは約２０秒）、縦軸には、吸光度×１００００を示す。
【図６】実施例６及び比較例１でのビリルビンオキシダーゼによる間接型ビリルビンの反応タイムコースを示す。横軸に測光ポイント（１ポイントは約２０秒）、縦軸には、吸光度×１００００を示す。
【図７】実施例７及び比較例２での結果を示す。横軸に総ビリルビンに対する直接型ビリルビンの比、縦軸に吸光度減少量を示す。
【図８】実施例８及び比較例２での結果を示す。横軸に総ビリルビンに対する直接型ビリルビンの比、縦軸に吸光度減少量を示す。
【図９】実施例９及び比較例２での結果を示す。横軸に総ビリルビンに対する直接型ビリルビンの比、縦軸に吸光度減少量を示す。
【図１０】実施例１０及び比較例２での結果を示す。横軸に総ビリルビンに対する直接型ビリルビンの比、縦軸に吸光度減少量を示す。
【図１１】実施例１１及び比較例２での結果を示す。横軸に総ビリルビンに対する直接型ビリルビンの比、縦軸に吸光度減少量を示す。
【図１２】実施例１２及び比較例２での結果を示す。横軸に総ビリルビンに対する直接型ビリルビンの比、縦軸に吸光度減少量を示す。
【図１】
2004194670.tif 000004
【図２】
2004194670.tif 000005
【図３】
2004194670.tif 000006
【図４】
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【図５】
2004194670.tif 000008
【図６】
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【図７】
2004194670.tif 000010
【図８】
2004194670.tif 000011
【図９】
2004194670.tif 000012
【図１０】
2004194670.tif 000013
【図１１】
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【図１２】
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