(57)【要約】【課題】有機物固定化基体及びその製造方法を提供する。【解決手段】部材１１と、該部材表面に該部材とは材料が異なるカーボン層１２を有する基体、及び前記カ−ボン層１２と親和性を有する結合ドメイン１５を含み、該カ−ボン層１２の少なくとも一部に固定されている有機物とを有する有機物固定化基体。部材と、該部材表面に該部材とは材料が異なるカーボン層を有する基体を用意する工程、及び前記カ−ボン層と親和性を有する結合ドメインを含む有機物を、該カ−ボン層の少なくとも一部に固定する工程とを有する有機物固定化基体の製造方法。【選択図】図１
2004215514.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
部材と、該部材表面に該部材とは材料が異なるカーボン層を有する基体、及び前記カ−ボン層と親和性を有する結合ドメインを含み、該カ−ボン層の少なくとも一部に固定されている有機物とを有することを特徴とする有機物固定化基体。
【請求項２】
前記有機物は、前記結合ドメインと機能ドメインを有する有機高分子である請求項１記載の有機物固定化基体。
【請求項３】
前記有機高分子は、生体高分子である請求項２記載の有機物固定化基体。
【請求項４】
部材と、該部材表面にカーボン層を有する基体、及び前記カ−ボン層と親和性を有する結合ドメインを含み、該カ−ボン層の少なくとも一部に固定されている有機物とを有する有機物固定化基体を備えている検出装置。
【請求項５】
部材と、該部材表面にカーボン層を有する基体、及び前記カ−ボン層と親和性を有する結合ドメインを含み、該カ−ボン層の少なくとも一部に固定されている有機物とを有する有機物固定化基体を備えているバイオリアクター。
【請求項６】
部材と、該部材表面に該部材とは材料が異なるカーボン層を有する基体を用意する工程、及び前記カ−ボン層と親和性を有する結合ドメインを含む有機物を、該カ−ボン層の少なくとも一部に固定する工程とを有することを特徴とする有機物固定化基体の製造方法。
【請求項７】
前記有機高分子がタンパク質からなり、少なくとも前記機能ドメインと前記結合ドメインから構成される融合タンパク質であることを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載の有機物固定化基体。
【請求項８】
前記結合ドメインが一以上のアミノ酸からなることを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載の有機物固定化基体。
【請求項９】
前記結合ドメインの少なくとも一部のアミノ酸配列が
Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒ（配列番号：１０）、
Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ（配列番号：１１）、
Ｔｒｐ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ（配列番号：１２）、
Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ（配列番号：１３）、
Ｔｒｐ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ（配列番号：１４）、
Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ（配列番号：１５）、
Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−ＡｌＡａｌａ−Ｖａｌ（配列番号：１６）、
Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ（配列番号：１７）、
Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ（配列番号：１８）、
Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ（配列番号：１９）、
Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ（配列番号：２０）、
Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ（配列番号：２１）、
Ｔｒｐ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ（配列番号：２２）、
Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ（配列番号：２３）、
Ｔｒｐ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ（配列番号：２４）、
Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ（配列番号：２５）、
Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ（配列番号：２６）、
Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ（配列番号：２７）、
Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ（配列番号：２８）、
Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（配列番号：２９）、
Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｐｒｏ（配列番号：３０）、
Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ａｌａ（配列番号：３１）、
Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ（配列番号：３２）、
Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｓｅｒ（配列番号：３３）、
Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ（配列番号：３４）、
からなる群より選ばれた少なくとも１つの全部または一部である請求項１乃至８のいずれかに記載の有機物固定化基体。
【請求項１０】
前記結合ドメインのアミノ酸配列がＴｒｐ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒ（配列番号：１０）の全部または一部である請求項１乃至９のいずれかに記載の有機物固定化基体。
【請求項１１】
前記結合ドメインのアミノ酸配列がＡｓｎ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ（配列番号：１１）の全部または一部である請求項１乃至１０のいずれかに記載の有機物固定化基体。
【請求項１２】
前記部材の少なくとも一部に多孔体を備え、該多孔体の孔の少なくとも一部の孔表面にカ−ボン層が形成されていることを特徴とする請求項１乃至１１記載の有機物固定化基体。
【請求項１３】
前記多孔体の孔径が１０乃至１０００ｎｍであることを特徴とする請求項１２記載される有機物固定化基体。
【請求項１４】
前記部材と前記カ−ボン層が電気的に接続していることを特徴とする請求項１乃至１３のいずれかに記載の有機物固定化基体。
【請求項１５】
表面にカ−ボン層を有する基体において、前記カ−ボン層上の少なくとも一部に有機高分子が担持され、前記有機高分子が少なくとも機能ドメインと前記カ−ボン層と親和性を有する結合ドメインから構成されることを特徴とする有機高分子固定化基板をモジュ−ルとして含むバイオセンサ−。
【請求項１６】
一つの面の少なくとも一部にカ−ボン層を有する基板において、前記カ−ボン層上の少なくとも一部に有機高分子が担持され、前記有機高分子が少なくとも機能ドメインと前記カ−ボン層と親和性を有する結合ドメインから構成されることを特徴とする有機高分子固定化基板をモジュ−ルとして含むバイオリアクタ−。
【請求項１７】
前記基板の少なくとも一部に多孔体が配され、前記多孔体の細孔の少なくとも一部の細孔表面にカ−ボン層を配され、前記孔表面の少なくとも一部に有機高分子が担持され、前記有機高分子が少なくとも機能ドメインと前記カ−ボン層と親和性を有する結合ドメインから構成されることを特徴とする有機高分子固定化基板をモジュ−ルとして含むバイオセンサ−。
【請求項１８】
前記基板と前記カ−ボン層の間の少なくとも一部に多孔体が配され、前記多孔体の細孔の少なくとも一部の細孔表面にカ−ボン層を配され、前記孔表面の少なくとも一部に有機高分子が担持され、前記有機高分子が少なくとも機能ドメインと前記カ−ボン層と親和性を有する結合ドメインから構成されることを特徴とする有機高分子固定化基板をモジュ−ルとして含むバイオリアクタ−。
【請求項１９】
孔を備え、該孔表面にカ−ボン層が形成されている部材を用意する工程、及び該カ−ボン層と親和性を有する結合ドメインを有する有機物を該孔表面に固定する工程を有することを特徴とする有機物固定化基体の製造方法。
【請求項２０】
前記有機物がタンパク質を含む有機高分子であって、少なくとも機能ドメインと前記結合ドメインから構成される融合タンパク質であることを特徴とする請求項１１９記載の有機物固定化基体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、有機物が基体に固定化されている有機物固定化基体、その製造方法、及びそれらを用いた検出装置やバイオリアクターに関する。
【０００２】
【従来技術】
近年、環境ホルモン、生体高分子などに代表される有機高分子を検出する装置開発が盛んに行われている。核酸やタンパク質等の生体高分子の場合、分子が有する分子認識の選択性を産業的に利用した検出装置の開発が行われている。なかでも、デオキシリボ核酸（以下ＤＮＡと記す）の塩基配列依存の相補的水素結合を利用したＤＮＡセンサ−チップ、抗原抗体反応に代表されるタンパク質分子と低分子またはタンパク質分子同士など抗体の特異的な分子認識能を利用して血液中に溶出する疾病マ−カ−等を検出する抗体センサ−、糖尿病患者のためのグルコ−スセンサ−に代表される酸化還元酵素や加水分解酵素を用いた酵素センサ−等のバイオセンサ−の研究開発が進められている。
【０００３】
これら生体高分子を応用したバイオセンサ−の製品群は、基板にＤＮＡなどの核酸分子や抗体・酵素等のタンパク質を基板または担体に固定化して使用されるのが一般的である。
【０００４】
基板に対して有機高分子、特にタンパク質等の生体高分子の固定化方法としては、基板をタンパク質溶液に浸漬または塗布した後に乾燥することでタンパク質を基板上に固定化する物理吸着法や、基板またはタンパク質分子を化学修飾した後に双方を化学結合により固定化する化学結合法、ゲル等の網目状組織を有するポリマ−構造体中にタンパク質を包括し固定化する方法等が知られている。
【０００５】
物理吸着法の一例としては、特開平０６−００３３１７号公報には、導電性基板上に有機電荷移動錯体層を形成し、さらに前記有機電荷移動層上にタンパク質溶液を塗布した後に乾燥させることでタンパク質を固定化する物理的吸着法による酵素電極作製方法が開示されている。
【０００６】
化学結合法の一例としては、Ｓｅｎｓｏｒ  ａｎｄ  Ａｃｔｕａｔｏｒｓ  Ｂ１５−１６  ｐ１２７（１９９３）には白金蒸着したシリコン基板表面をアミン系シランカップリング剤処理した後にグルタルアルデヒド等架橋剤を用いて化学的結合による固定化する方法が開示されている。
【０００７】
ゲルポリマ−などによる包括法の一例としては、特表２００１−５１８３１５号公報において、酵素をポリ（ヒドロキシエチルメタクリレ−ト）のような網状組織を有するポリマ−の「ゲル」に包括する技術を開示している。
【０００８】
しかしながら、前記のような物理吸着や架橋反応による化学的結合による生体高分子の固定化は、特に酵素や抗体等のタンパク質の場合、基板との結合に関与するタンパク質側の結合部位に対しての選択性が極めて低い。つまり、基板との結合に関与するタンパク質の部位が無作為に選択される為、目的の化合物の結合や酵素活性等に関わるの直接的な部位もしく間接的に関わる部位が基板との結合部位となり、活性が著しく低下することが懸念される。
【０００９】
また、包括法な場合、例えばゲル包括されたタンパク質は常にあらゆる角度からゲル分子と種々の相互作用を受けており、その結果、タンパク質の分子認識能に必要な高次構造の柔軟性を損ったり、結合時の結合部位の構造変化の速度が低下することによる分子認識能を十分に発揮することができず、バイオセンサ−の感度を低下させることが懸念される。
【００１０】
また、昨今のバイオセンサ−の要求品質のひとつに、μ−ＴＡＳに代表される“高感度且つ小型化“が挙げられる。限られた面積の中で分子認識能を有する活性な生体高分子を固定化する高配向・高集積できる技術が必要となっている。
【００１１】
生体高分子を高集積化する方法としては、基板を生体高分子を比表面積が大きいナノレベルでの規則的な細孔構造を有する多孔体を採用すること一般的に知られている。
【００１２】
ナノオ−ダ−スケ−ルでの規則性を有する細孔構造形成の従来法としては、ポリマ−加工したメンブレンフィルタ−や、ポ−ラスガラス等が知られている。しかし、これらは直行する細孔がほぼ等間隔に平行して形成されるハニカム構造の形成や、細孔径、細孔間隔、細孔深さを制御することが極めて難しい。その為、微量物質を対象とした生体高分子固定化基板とした場合には定量性において十分とは言い難い。しかし、アルミニウムを陽極酸化して得られる陽極酸化アルミナ層は、電解することである程度制御されたハニカム構造を作製する事が知られている。また、この細孔は陽極酸化時の電圧によって孔間隔、時間によって孔の深さ、さらに得られる孔径は浴組成、浴温、電圧などに制御できることが知られている。このような多孔体の孔特性を制御できる陽極酸化アルミナ層は、微量物質を対象とした生体高分子固定化基板としては利用することが期待される。
【００１３】
このような多孔性基板に生体高分子を固定化して得られた基板を利用して生体試料の微量物質を検出する方法の具体例として、前記基板を電極のひとつとして電気化学反応を用いた電極電子移動に伴なう電流値を測定する方法がある。
【００１４】
しかしながら、前記陽極酸化アルミナ層に直接固定化したのでは電極として十分な特性を得ることが難しい。前記陽極酸化アルミナ層をセンサ−電極として使用する方法として、特開２０００−３１４７１４号公報に基板上に導電性層、多孔体、カ−ボン層を順次設け、前記カ−ボン層を前記導電性基板と電気的に接続する方法が開示されている。これによれば、電位窓を従来の電極より大きくするとともにバックグランド電流と残余電流を抑制することができる技術が開示されている。
【００１５】
このようなカ−ボン層等の導電層を表面に有する多孔体基板に分子認識能を十分に発揮できる活性なタンパク質を固定化方法を確立することで、バイオセンサ−の要求品質のひとつである“高感度且つ小型化“が達成できる可能性がある。
【００１６】
【発明が解決しようとする課題】
このような分子認識能を十分に発揮できる活性な生体高分子を固定化できる効率が低い場合、要求品質である“高感度且つ小型化“を実現するには問題が多い。例えば、感度を維持する為には活性型の生体高分子の数量を確保しなければならず、タンパク質をはじめとする生体高分子を固定する領域の面積を増やさなければならず装置小型化の妨げになる。さらに、高価な生体高分子材料を大量に使用しならずコストの面においても製品化する上で大きな問題となる。活性なタンパク質を固定化できる高配向技術が求められている。
【００１７】
【課題を解決するための手段】
本発明は上記課題を解決すべくなされた本発明の構成を以下の通りである。
本発明に係る有機物固定化基体は、部材と、該部材表面に該部材とは材料が異なるカーボン層を有する基体、及び前記カ−ボン層と親和性を有する結合ドメインを含み、該カ−ボン層の少なくとも一部に固定されている有機物とを有することを特徴とする。
【００１８】
前記有機物は、例えば前記結合ドメインと機能ドメインを有する有機高分子である。
前記有機高分子は、例えば生体高分子である。
【００１９】
また、本発明に係る検出装置は、部材と、該部材表面にカーボン層を有する基体、及び前記カ−ボン層と親和性を有する結合ドメインを含み、該カ−ボン層の少なくとも一部に固定されている有機物とを有する有機物固定化基体を備えていることを特徴とする。
【００２０】
また、本発明に係るバイオリアクターは、部材と、該部材表面にカーボン層を有する基体、及び前記カ−ボン層と親和性を有する結合ドメインを含み、該カ−ボン層の少なくとも一部に固定されている有機物とを有する有機物固定化基体を備えていることを特徴とする。
【００２１】
また、本発明に係る有機物固定化基体の製造方法は、部材と、該部材表面に該部材とは材料が異なるカーボン層を有する基体を用意する工程、及び前記カ−ボン層と親和性を有する結合ドメインを含む有機物を、該カ−ボン層の少なくとも一部に固定する工程とを有することを特徴とする。
【００２２】
前記結合ドメインの少なくとも一部のアミノ酸配列は、例えば
Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒ（配列番号：１０）、
Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ（配列番号：１１）、
Ｔｒｐ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ（配列番号：１２）、
Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ（配列番号：１３）、
Ｔｒｐ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ（配列番号：１４）、
Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ（配列番号：１５）、
Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−ＡｌＡａｌａ−Ｖａｌ（配列番号：１６）、
Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ（配列番号：１７）、
Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ（配列番号：１８）、
Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ（配列番号：１９）、
Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ（配列番号：２０）、
Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ（配列番号：２１）、
Ｔｒｐ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ（配列番号：２２）、
Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ（配列番号：２３）、
Ｔｒｐ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ（配列番号：２４）、
Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ（配列番号：２５）、
Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ（配列番号：２６）、
Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ（配列番号：２７）、
Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ（配列番号：２８）、
Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（配列番号：２９）、
Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｐｒｏ（配列番号：３０）、
Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ａｌａ（配列番号：３１）、
Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ（配列番号：３２）、
Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｓｅｒ（配列番号：３３）、
Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ（配列番号：３４）、
からなる群より選ばれた少なくとも１つの全部または一部である。
【００２３】
前記結合ドメインのアミノ酸配列がＴｒｐ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒ（配列番号：１０）の全部または一部であってもよい。
【００２４】
前記結合ドメインのアミノ酸配列がＡｓｎ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ（配列番号：１１）の全部または一部であってもよい。
前記部材の少なくとも一部に多孔体を備え、該多孔体の孔の少なくとも一部の孔表面にカ−ボン層が形成されていてもよい。
【００２５】
前記多孔体の孔径は、例えば１０乃至１０００ｎｍである。
前記部材と前記カ−ボン層が電気的に接続していてもよい。
【００２６】
また、本発明に係る有機物固定化基体の製造方法は、孔を備え、該孔表面にカ−ボン層が形成されている部材を用意する工程、及び該カ−ボン層と親和性を有する結合ドメインを有する有機物を該孔表面に固定する工程を有することを特徴とする。
【００２７】
また本発明は、少なくとも一つの面の少なくとも一部にカ−ボン層を有する基板において、前記カ−ボン層上の少なくとも一部に有機高分子が担持され、前記有機高分子が少なくとも一以上の化合物を結合または変換する機能ドメインと前記カ−ボン層と親和性を有する結合ドメインから構成されることを特徴とする有機高分子固定化基板を含む。
【００２８】
これにより、有機高分子の目的の化合物の結合部位または変換部位と異なる、独立した部位を選択的に基板に固定化することが可能となる。従来問題であった固定化による有機高分子の所望の機能における活性低下を抑制することができる。また、電位窓が広く、且つ水素過電圧が小さい為、生体高分子を始めとする有機高分子等の化合物の計測に適した装置とすることができる。
【００２９】
更に、前記有機高分子がタンパク質からなり、少なくとも前記機能ドメインと前記結合ドメインから構成される融合タンパク質であることを特徴とする。
更に、前記結合ドメインが一以上のアミノ酸分子またはそれらの複合体から成ることを特徴とする。
【００３０】
これらにより、前記機能ドメインと前記結合ドメインを有する有機高分子を遺伝工学的な操作により測定条件や種々の阻害因子の影響を踏まえた最適設計することが可能となり、化合物結合部位の活性を損なうことなく、結合ドメインを融合したタンパク質を得ることができる。
【００３１】
更に、前記基板と前記カ−ボン層の間の少なくとも一部に多孔体が配され、前記多孔体の細孔の少なくとも一部の細孔表面にカ−ボン層を配され、前記孔表面の少なくとも一部に有機高分子が担持され、前記有機高分子が少なくとも一以上の化合物を結合または変換する結合ドメインと前記カ−ボン層と結合するドメインから構成されることを特徴とする。
更に、前記多孔体が孔径が１０乃至１０００ｎｍで形成されることを特徴とする。
【００３２】
これにより、比表面積を大幅に増加することができ、単位面積あたりの固定化される有機高分子数を多くすることができる。また、有機高分子が固定化された孔内部の分子認識反応場に侵入する分子を大きさにより選択することができ、更には、平板に有機高分子を固定した場合に比べ、一つ一つの反応場の体積が縮小される。これにより、反応場内での化合物が有機高分子と結合するために必要な平均移動距離を大幅に短縮でき、分子認識反応効率を向上することが期待できる。
【００３３】
更に、前記基板と前記カ−ボン層が電気的に接続していることを特徴とする。
これにより基板を介して、化合物結合前後での固定化された有機高分子の電気特性を測定することが可能となり、装置設計を比較的簡素化することができる。
更には、多孔体内部のみにカ−ボン層を設け、その上に有機高分子を設け、分子認識反応場を孔内の環境に限定することにより感度を更に向上させることが可能である。
【００３４】
【発明の実施の形態】
なお、以下では有機物として有機高分子を例に挙げ説明するがこれに限定されるものではない。
【００３５】
本発明に係る有機物固定化基体は、部材（例えば以下に示す基板。）と、該部材表面に該部材とは材料が異なるカーボン層を有する基体、及び前記カ−ボン層と親和性を有する結合ドメインを含み、該カ−ボン層の少なくとも一部に固定されている有機物とを有することを特徴とする。ここで、結合ドメインとは、カーボン層と選択的にくっつく（固定化される）機能を有する部位のことである。
【００３６】
図１は、本発明の基板表面上の少なくとも一部にカ−ボン層を有するカーボン被覆基板の一実施形態を示す断面図である。
図中、１１は基板、１２はカ−ボン層、１３は有機高分子、１４は前記機能ドメイン、１５は結合ドメインである。
【００３７】
基板１１としては、従来公知の種々の材料から選択して用いることができるが。基板１１を電極として使用したり、基板１１上に設けるカ−ボン層１２をＣＶＤで蒸着して設ける場合、基板１１は導電性基板が好ましい。具体的には、ＳｉやＰｔ、Ａｕ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ａｇ、Ｎｂ、Ａｌ等の金属類を少なくとも１種から選ばれる金属またはそれらの合金及びこれらの材料からなる積層基板からなる導電性基板や非導電性基板上に上記金属材料層を設けた積層基板をから適宜選択して用いることができる。
【００３８】
また、本発明の一形態として基板表面上の少なくとも一部に多孔体を配した基板を使用してもよい。多孔体を配した基板としては、従来既知の種々の多孔体を基板上に配することができる。より好ましくは、陽極酸化法を用いて形成されるアルミナナノホ−ルである。陽極酸化法によって得られたアルミナ多孔体の細孔はナノオ−ダ−で作製することが可能で有り、細孔の凹凸による有機高分子を固定化するための比表面積増大させことができ、さらには細孔作製条件により細孔径の制御することが容易であり固定化する有機高分子の外径および検出の対象となる固定化された有機高分子を介した結合または変換反応の反応効率に応じた設計を可能とする。尚、本発明における多孔体は上記した陽極酸化法に限られるものではない。
【００３９】
カ−ボン層１２は、カ−ボンブラックをメタノ−ル等の揮発性溶媒に分散させたカ−ボンブラック溶液を基板上に従来既知の方法によりコ−トし、溶剤を乾燥することで形成することができる。より好ましくはＣＶＤ法等炭化水素を気相炭化させる方法を用いることができる。炭化水素としては、メタン、エタン、プロパン、エチレン、アセチレン、ベンゼン等の常温で気体であるものがより適している。ＣＶＤで形成する場合、高温での熱膨張率および溶解を考慮して基板材料を適時選択することが好ましい。カ−ボン層２の厚みについては、基板が平板の場合、所望の導電性等本発明に求める特性を考慮し設計することが好ましい。前記のような基板の少なくとも一部に多孔体部分を含む場合、多孔体の細孔内に有機高分子が導入できるように細孔の内径と固定化する有機高分子の直径を更に考慮に加えカ−ボン層厚を設計することが好ましい、この場合のようにナノオ−ダ−の層厚を形成する場合はＣＶＤ法などで行うことが好ましい。また、カ−ボン層を導電層とすることにより酵素電極等に使用される金や白金に比べ材料コストを削減できる。
【００４０】
有機高分子１３は、少なくとも一以上の目的の化合物を結合する結合能や一以上の化合物を目的の物質に変換する変換能等の機能を発揮する機能ドメインと前記カーボン層と親和性を有する結合ドメインから構成される。
【００４１】
有機分子１３は、従来既知の化合物から選択して用いることが可能ではあるが、塩基、核酸分子、アミノ酸またはタンパク質、糖鎖および糖鎖−タンパク質複合体から少なくとも一種類以上選択されることが望ましく。本発明においては、タンパク質もしくはタンパク質を含む複合体であることがより望ましい。
【００４２】
核酸分子としては、デオキシリボ核酸分子、リボ核酸分子等が挙げられる。これの核酸分子に捕捉される化合物としては、核酸物質とそれ以外の物質に大別できる。化合物が核酸である場合、ＤＮＡチップに代表されるように各々の塩基配列に由来する塩基間の相補的な結合によって捕捉される。
【００４３】
一方、核酸分子の立体構造に由来する分子認識能も最近は注目されている。これらの核酸分子はアプタマ−と総称され、ＳＥＬＥＸ法に代表される分子進化工学的手法により得ることが可能である。このようにして得られた化合物の認識能を有する核酸分子を固定することも可能である。
【００４４】
このようなＤＮＡを始めとする核酸分子の優れた分子認識能を本発明に利用して、少なくとも一以上の化合物を結合または変換する結合ドメインと前記カ−ボン層と結合するドメインから構成される分子認識分子として本発明に利用することもできる。
【００４５】
本発明に利用するタンパク質分子としては、酵素、抗体、レセプタ−分子、または足場タンパク質分子が挙げられる。
本発明の有機高分子１３がタンパク質である場合、有機高分子１３は少なくとも前記機能ドメイン１４と前記結合ドメイン１５ａから構成される融合タンパク質が好ましい。
【００４６】
機能ドメイン１４としては、従来既知の酵素分子、抗体分子および抗体断片分子、レセプタ−分子等から目的の化合物との親和性や環境安定性などを考慮して選択して用いることができる。
【００４７】
抗体分子としては、抗原物質を被検体動物に導入し、その免疫反応の結果産出される免疫抗体や前記免疫抗体の構造を部分的もしくは全体的に遺伝工学的に改変された組換え抗体から適宜選択される免疫グロブリンから用いることができる。これら抗体は、モノクロ−ナルまたはポリクロ−ナルであってもよい。これら抗体は、任意の免疫グロブリンクラスに含まれ、以下のヒトＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥから選択できる。中でも、ＩｇＧクラス誘導体が、より好ましい。
【００４８】
抗体断片分子としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２等が挙げられる。
例えば、Ｆａｂ断片分子は、抗体グロブリンのパパイン分解によって得られる抗体断片分子とほぼ同じな断片分子である。Ｆ（ａｂ’）２は、抗体グロブリンのペプシン分解によって得られる抗体断片分子とほぼ同じな断片分子である。
【００４９】
このような抗体断片分子は、抗体グロブリンを前述のように酵素的または化学的分解する方法や、遺伝子工学的に産出する方法がある。好適に選択して用いることが可能である。本件で記した細孔内においては、これらの抗体断片分子中でも抗体が抗原を認識する為に最小必要単位である可変領域部（Ｆｖ）を構成する重鎖部（ＶＨ）、軽鎖部（ＶＬ）を互いにペプチド等をリンカ−にして結合して作製したｓｃＦｖ（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  Ｆｖ）を用いてもよい。
【００５０】
結合ドメイン１５としては、足場タンパクやカ−ボン層１２と特異的に結合するタンパク質もしくはアミノ酸配列から選択して使用することができる。本発明の結合ドメイン１５として、好ましい一形態はカ−ボン層２に親和性を有する一以上のアミノ酸である。前記一以上のアミノ酸は、ランダムペプチドライブラリのスクリ−ニングによって決定されたアミノ酸配列もしくはカ−ボン層の化学的性質により合理的に設計されたアミノ酸配列である。
【００５１】
本発明に用いられるランダムペプチドライブラリとしては、ランダムペプチドを可溶性の形で化学的に合成したランダム合成ペプチドライブラリ−や、樹脂ビ−ズ上で合成した固相固定化ペプチドライブラリ−、化学合成されたランダム配列のＤＮＡをリボソ−ム無細胞系で生合成したペプチドライブラリ、例えばＭ１３  系ファ−ジの表面蛋白質（例えばｇｅｎｅＩＩＩ  蛋白質）のＮ末端側遺伝子にランダム合成遺伝子を連結して調製されたファ−ジディスプレイペプチドライブラリ−、同様の手法で細菌の層タンパク質、Ｏｍｐ  Ａ（Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ  ら、１９９３、ＰＮＡＳ、９０、１０４４４−１０４４８あるいはＰｉｓｔｏｒ  と  Ｈｏｂｏｒｎ、１９８９、Ｋｌｉｎ．Ｗｏｃｈｅｎｓｃｈｒ．、６６、１１０−１１６）、ＰＡＬ（Ｆｕｃｈｓ  ら、１９９１、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９、１３６９−１３７２）、Ｌａｍｂ（Ｃｈａｒｂｉｔ  ら、１９８８、Ｇｅｎｅ、７０、１８１−１８９  及び  Ｂｒａｄｂｕｒｙ  ら、１９９３、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１５６５−１５６８）、フィンブリン（ＨｅｄｅｇＡａｒｄ  と  ＫｌｅｍＭ、１９８９、Ｇｅｎｅ、８５、１１５−１２４  及び  Ｈｏｆｎｕｎｇ、１９９１、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ＣｅｌＬＢｉｏｌ．、３４、７７−１０５）、およびＩｇＡプロテア−ゼβ領域（Ｋｌａｕｓｅｒ  ら、１９９０、ＥＭＢＯ  Ｊ．、９、１９９１−１９９９）に融合して提示したランダムペプチドライブラリ、などを挙げることができる。
【００５２】
これらのランダムペプチドライブラリを用いてカ−ボン層に対して親和性を有するアミノ酸配列をスクリ−ニング手法としては、化学合成ペプチドライブラリを用いる場合には、ペプチドライブラリとカ−ボン層２と同じ材料からなるカ−ボン被覆したカラムやプレ−ト等担体または基板とを接触させ、カ−ボン層に対して親和性を有しないペプチドを除き、しかる後にカ−ボン層に結合しているペプチドを回収しエドマン分解等を用いてそのアミノ酸配列を決定する。
【００５３】
一方、ファ−ジディスプレイペプチドライブラリ−を用いる場合には、前記カ−ボン被覆担体や前記カ−ボン被覆基板表面に、上記のライブラリ−を添加することによって接触させ結合ファ−ジを残し非結合ファ−ジは洗浄で洗い流す。洗浄後残ったファ−ジを酸などにより溶出し緩衝液で中和した後大腸菌に感染させファ−ジを増幅する。この選別を複数回繰り返すと目的のカ−ボン層に親和性のある複数のクロ−ンが濃縮される。ここで単一なクロ−ンを得るため再度大腸菌に感染させた状態で培地プレ−ト上にコロニ−を作らせる。それぞれの単一コロニ−を液体培地で培養した後、培地上清中に存在するファ−ジをポリエチレングリコ−ル等で沈殿精製し、その塩基配列を解析すればペプチドの構造を知ることができる。
【００５４】
ファ−ジディスプレイペプチドライブラリを用いたカ−ボン層に対して親和性を有するペプチドのスクリ−ニングは、カ−ボン層に対してより強く結合するファ−ジを濃縮する、いわゆるパンニング操作を含んでいるために、より信頼性のあるペプチド候補を選別できるので本発明に好適に用いることができる。ファ−ジランダムペプチドライブラリ−を構築する方法としては、例えばＭ１３  系ファ−ジの表面蛋白質（例えばｇｅｎｅＩＩＩ  蛋白質）のＮ末端側遺伝子にランダム合成遺伝子を連結し作製すれば良い。その方法としてはＳｃｏｔｔ、ＪＫ．ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ、ＧＰ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｖｏｌ．２４９、３８６、１９９０、やＣｗｉｒｌａ、ＳＥ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  Ｖｏｌ．８７、６３７８、１９９０等の報告がある。挿入する遺伝子の大きさはペプチドが安定に発現できれば特に制限はないが、作製したライブラリ−がすべてのランダム配列を網羅し、しかも親和性を有するためには６から４０アミノ酸に相当する長さ（分子量約６００から４０００に相当）が適当で、中でも７から１８アミノ酸が好ましい。
【００５５】
ファ−ジディスプレイペプチドライブラリのスクリ−ニングによって、カ−ボン層に対して親和性を有するペプチドが、二種類以上得られた場合には、これらのペプチドからなる群より選ばれた少なくとも１つのペプチドの、全部または一部分のアミノ酸配列を適当な組合せで直列に繋いだ配列を、カ−ボン層に対して親和性を有するペプチドとして用いても良い。この際、二種類のアミノ酸配列の間には適当なスペ−サ−配列を設けることが望ましい。スペ−サ−配列としては、約３〜約４００アミノ酸が好ましく、また、スペ−サ−配列はいかなるアミノ酸を含んでもよい。最も好ましくは、スペ−サ−配列は、前記機能ドメインの機能を妨害せず、また、有機高分子がカ−ボン層に結合するのを妨害しないものである。
【００５６】
本発明のカ−ボン層に対する親和性を有するアミノ酸配列は、ランダムペプチドライブラリのスクリ−ニングによって決定されたアミノ酸配列の他、カ−ボン層の化学的性質により合理的に設計されたアミノ酸配列とすることもできる。
カ−ボン層に対する有機高分子の固定化は、前記機能ドメインに融合され提示された前記結合ドメイン１５中の前記操作により得られたカ−ボン層に対する親和性を有するアミノ酸配列（以下、カ−ボン層親和性部位１５ａ）を介して成される。
【００５７】
主に表面が非極性であるカ−ボン層２、例えば前記グラファイトなどの炭素結晶からなる無機材料として用いる場合には、前記機能ドメイン１４に融合され提示される前記カ−ボン層親和性部位１５ａとしては、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、トリプトファン、フェニルアラニン、プロリンなどの遊離の疎水性基を有するアミノ酸を多く含んだ配列を選ぶことによって、疎水吸着によって前記機能ドメイン１４をカ−ボン層２に固定化することができる。
【００５８】
上記方法により得られた前記カ−ボン層親和性部位１５ａは、通常の遺伝子工学的手法を用いて、前記機能ドメイン１４に融合して利用される。前記カ−ボン層親和性部位は前記機能ドメイン１４のＮ末端あるいはＣ末端に連結して発現することができる。また適当なスペ−サ−配列を挿入した結合ドメインとして発現することもできる。
【００５９】
スペ−サ−配列としては、約３〜約４００アミノ酸が好ましく、また、スペ−サ−配列はいかなるアミノ酸を含んでもよい。最も好ましくは、スペ−サ−配列は、前記機能ドメイン１４が機能するのを妨害せず、また、前記機能ドメイン１４がカ−ボン層１２に結合するのを妨害しないものである。
【００６０】
前記ファ−ジディスプレイペプチドライブラリのスクリ−ニングなどの操作によって、カ−ボン層に対して親和性を有するペプチドが、二種類以上決定された場合には、これらのペプチドをそれぞれ個別に前記機能ドメインに融合した、複数種類の前記機能ドメインを、混合物として本発明に用いることができる。
【００６１】
前記機能ドメイン１４と前記結合ドメインに含まれるカ−ボン層親和性部位１５から構成される融合タンパク質の分離・精製方法は、前記前記機能ドメインの酵素活性が保持される方法であればいかなる方法をも用いることができる。
【００６２】
前記カ−ボン層２に前記有機高分子１３を結合ドメインに含まれるカ−ボン層親和性部位１５ａを介して固定化する工程は、前記有機高分子１３を水性媒体中でカ−ボン層２と接触させることにより達成される。
【００６３】
本工程の固定化用水性媒体の組成は、有機高分子１３が行う目的化合物の結合または変換反応を妨げないものであればよいが、後の工程の省略化を図るために、前記結合または変換反応活性を発揮させ得る組成としておくこともできる。ここで、活性を発揮させ得る組成として、例えば緩衝液を用いることができる。緩衝液としては、生化学的反応に用いられる一般的な緩衝液、例えば、酢酸バッファ−、リン酸バッファ−、リン酸カリウムバッファ−、３−（Ｎ−モルフォリノ）プロパンスルフォン酸（ＭＯＰＳ）バッファ−、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルフォン酸（ＴＡＰＳ）バッファ−、トリス塩酸バッファ−、グリシンバッファ−、２−（シクロヘキシルアミノ）エタンスルフォン酸（ＣＨＥＳ）バッファ−などが好適に用いられる。ＰＨＡ合成酵素の活性を発揮させ得る緩衝液の濃度は、一般的な濃度、即ち５ｍＭから１０Ｍの範囲で使用することができるが、望ましくは１０〜２００ｍＭで行うことが好ましい。また、ｐＨは５．５から９．０、好ましくは７．０から  ８．５となるように調製する。
【００６４】
有機高分子１３のカ−ボン層２への固定化は、カ−ボン層２と有機高分子１３を所定の水性媒体中で所定の濃度となるように混合することによって達成される。このとき、有機高分子１３のカ−ボン層親和性部位１５ａがカ−ボン層の表面に均等に吸着されるよう、反応容器を適当な強度で振盪あるいは攪拌することが望ましい。
【００６５】
上記固定化処理において、水性媒体の組成としては、水性媒体のｐＨや塩濃度によってカ−ボン層およびカ−ボン層親和性部位１５ａの表面電荷の電荷量、疎水性が変化するので、それを考慮した組成とするのが望ましい。例えば、塩濃度を上げることによって両者の疎水性を増やすことができる。
【００６６】
また、予め電気泳動やぬれ角等を測定し、カ−ボン層２やカ−ボン層親和性部位１５ａの疎水性を調べることで、吸着に適した組成を設定することもできる。さらに、カ−ボン層２とカ−ボン層親和性部位１５ａとの吸着量を直接測定して組成を求めることもできる。吸着量の測定は、例えば、ある一定面積のカ−ボン層に濃度既知の有機高分子１３を添加し、吸着処理を行った後、溶液中の有機高分子１３の濃度を測定し、差し引き法により吸着量を求める等の方法を用いればよい。
【００６７】
上記方法により作製された固定化有機高分子基板は、そのままでも用いることができるが、さらに凍結乾燥等を施した上で使用することもできる。有機高分子の固定化処理を行う時間は１分から４８時間が望ましく、より望ましくは１０分から３時間である。過剰な静置あるいは放置は有機高分子の所望の機能活性低下を招くので好ましくない。
【００６８】
【実施例】
以下、本発明の有機高分子固定化基板の構成について、実施例によって具体的に説明する。
【００６９】
本実施例では、本発明の有機高分子の機能ドメインとしてＰＨＡ合成酵素、結合ドメインとしてカーボン層親和性ペプチドとしたカ−ボン層親和性ペプチドを融合したポリヒドロキシアルカネ−ト（ＰＨＡ）合成酵素により作製した有機高分子固定基板及びその製造方法の例を示す。
【００７０】
まず、（参照）にて本発明のカ−ボン層親和性ペプチドを融合したＰＨＡ合成酵素の比較を行う為のＰＨＡ合成酵素の調整方法及びその酵素活性測定方法について示す。
【００７１】
次に、実施例１乃至７において、本発明のカ−ボン層親和性ペプチドとその取得方法、更にはカ−ボン層親和性ペプチドを融合したポリヒドロキシアルカネ−ト（ＰＨＡ）合成酵素により作製した有機高分子固定基板及びその製造方法の例を示す。
なお、本発明はこれらの実施例の内容に限定されるものではない。
（参照）ＰＨＡ合成酵素生産能を有する形質転換体の作製、及びＰＨＡ合成酵素の生産
【００７２】
ＰＨＡ合成酵素生産能を有する形質転換体を以下の方法で作製した。即ちＹＮ２株を１００  ｍｌのＬＢ培地（１％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム、ｐＨ７．４）で３０℃、一晩培養後、マ−マ−らの方法により染色体ＤＮＡを分離回収した。得られた染色体ＤＮＡを制限酵素Ｈｉｎｄ  ＩＩＩで完全分解した。ベクタ−にはｐＵＣ１８を使用し、制限酵素Ｈｉｎｄ  ＩＩＩで切断した。末端の脱リン酸処理（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、１、５７２、（１９８９）；  Ｃｏｌｄ  ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ出版）ののち、ＤＮＡライゲ−ションキットＶｅｒ．  ＩＩ（宝酒造）を用いて、ベクタ−の切断部位（クロ−ニングサイト）と染色体ＤＮＡのＨｉｎｄ  ＩＩＩ完全分解断片とを連結した。この染色体ＤＮＡ断片を組み込んだプラスミドベクタ−を用いて、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＨＢ１０１株を形質転換し、ＹＮ２株のＤＮＡライブラリ−を作製した。
【００７３】
次に、ＹＮ２株のＰＨＡ合成酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片を選択するため、コロニ−・ハイブリダイズ用のプロ−ブ調製を行った。配列番号：５および配列番号：６の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを合成し（アマシャムファルマシア・バイオテク）、このオリゴヌクレオチドをプライマ−に用いて、染色体ＤＮＡをテンプレ−トとしてＰＣＲを行った。ＰＣＲ増幅されてきたＤＮＡ断片をプロ−ブとして用いた。プロ−ブの標識化は、市販の標識酵素系ＡｌｋＰｈｏｓＤｉｒｅｃｔ（アマシャムファルマシア・バイオテク）を利用して行った。得られた標識化プロ−ブを用いて、ＹＮ２株の染色体ＤＮＡライブラリ−からコロニ−ハイブリダイゼ−ション法によってＰＨＡ合成酵素遺伝子を含む組換えプラスミドを有する大腸菌菌株を選抜した。選抜した菌株から、アルカリ法によってプラスミドを回収することで、ＰＨＡ合成酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片を得ることができた。
【００７４】
ここで取得した遺伝子ＤＮＡ断片を、不和合性グル−プであるＩｎｃＰ、ＩｎｃＱ、あるいはＩｎｃＷの何れにも属さない広宿主域複製領域を含むベクタ−ｐＢＢＲ１２２（ＭｏＢｉ  Ｔｅｃ）に組み換えた。この組み換えプラスミドをシュ−ドモナス・チコリアイＹＮ２ｍｌ株（ＰＨＡ合成能欠損株）にエレクトロポレ−ション法により形質転換したところ、ＹＮ２ｍｌ株のＰＨＡ合成能が復帰し、相補性を示した。従って、選抜された遺伝子ＤＮＡ断片は、シュ−ドモナス・チコリアイＹＮ２ｍｌ株内において、ＰＨＡ合成酵素に翻訳可能な、ＰＨＡ合成酵素遺伝子領域を含むことが確認される。
【００７５】
このＰＨＡ合成酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片について、サンガ−法により塩基配列を決定した。その結果、決定された塩基配列中には、それぞれペプチド鎖をコ−ドする、配列番号：２および配列番号：４で示される塩基配列が存在することが確認された。下で述べるように、個々のペプチド鎖からなる蛋白質は、ともに酵素活性を有しており、配列番号：２および配列番号：４で示される塩基配列はそれぞれＰＨＡ合成酵素遺伝子であることを確認することができた。すなわち、配列番号：１に示すアミノ酸配列を配列番号：２の塩基配列はコ−ドしており、配列番号：３に示すアミノ酸配列を配列番号：４の塩基配列はコ−ドしており、この何れか一方のアミノ酸配列を有する蛋白質のみで、ＰＨＡ合成能が発揮されることを確認した。
【００７６】
配列番号：２で示される塩基配列のＰＨＡ合成酵素遺伝子について、染色体ＤＮＡをテンプレ−トとしてＰＣＲを行い、ＰＨＡ合成酵素遺伝子の完全長を再調製した。
【００７７】
配列番号：２で示される塩基配列に対して、上流側プライマ−となる、その開始コドンよりも上流の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（配列番号：７）および下流側プライマ−となる、終止コドンよりも下流の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（配列番号：８）をそれぞれ設計・合成した（アマシャムファルマシア・バイオテク）。このオリゴヌクレオチドをプライマ−として、染色体ＤＮＡをテンプレ−トとしてＰＣＲを行い、ＰＨＡ合成酵素遺伝子の完全長を増幅した（ＬＡ−ＰＣＲキット；宝酒造）。
【００７８】
同様に、配列番号：４で示される塩基配列のＰＨＡ合成酵素遺伝子についても、染色体ＤＮＡをテンプレ−トとしてＰＣＲを行い、ＰＨＡ合成酵素遺伝子の完全長を再調製した。配列番号：４で示される塩基配列に対して、上流側プライマ−となる、その開始コドンよりも上流の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（配列番号：３８）および下流側プライマ−となる、終止コドンよりも下流の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（配列番号：３９）をそれぞれ設計・合成した（アマシャムファルマシア・バイオテク）。このオリゴヌクレオチドをプライマ−として、ＰＣＲを行い、ＰＨＡ合成酵素遺伝子の完全長を増幅した（ＬＡ−ＰＣＲキット；宝酒造）。
【００７９】
次に、得られたＰＨＡ合成酵素遺伝子の完全長を含むＰＣＲ増幅断片を、それぞれについて制限酵素Ｈｉｎｄ  ＩＩＩを用いて完全分解した。また、発現ベクタ−ｐＴｒｃ９９Ａも制限酵素Ｈｉｎｄ  ＩＩＩで切断し、脱リン酸化処理（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、１巻、５７２頁、１９８９年；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ出版）した。この発現ベクタ−ｐＴｒｃ９９Ａの切断部位に、両末端の不用な塩基配列を除いたＰＨＡ合成酵素遺伝子の完全長を含むＤＮＡ断片を、ＤＮＡライゲ−ションキットＶｅｒ．ＩＩ（宝酒造）を用いて連結した。
【００８０】
得られた組換えプラスミドで大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１：宝酒造）を塩化カルシウム法により形質転換した。得られた組換え体を培養し、組換えプラスミドの増幅を行い、組換えプラスミドをそれぞれ回収した。配列番号：２の遺伝子ＤＮＡを保持する組換えプラスミドをｐＹＮ２−Ｃ１（配列番号２由来）、配列番号：４の遺伝子ＤＮＡを保持する組換えプラスミドをｐＹＮ２−Ｃ２（配列番号４由来）とした。
【００８１】
ｐＹＮ２−Ｃ１、ｐＹＮ２−Ｃ２で大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１ｆＢ  ｆａｄＢ欠損株）を塩化カルシウム法により形質転換し、それぞれの組換えプラスミドを保持する組換え大腸菌株、ｐＹＮ２−Ｃ１組換え株、ｐＹＮ２−Ｃ２組換え株を得た。
【００８２】
ｐＹＮ２−Ｃ１組換え株、ｐＹＮ２−Ｃ２組換え株それぞれを酵母エキス０．５％、オクタン酸０．１％とを含むＭ９培地２００ｍｌに植菌して、３７℃、１２５ストロ−ク／分で振盪培養した。２４時間後、菌体を遠心分離によって回収し、常法によりプラスミドＤＮＡを回収した。
【００８３】
ｐＹＮ２−Ｃ１に対して、上流側プライマ−となる、オリゴヌクレオチド（配列番号：５）および下流側プライマ−となる、オリゴヌクレオチド（配列番号：６）をそれぞれ設計・合成した（アマシャムファルマシア・バイオテク）。このオリゴヌクレオチドをプライマ−として、ｐＹＮ２−Ｃ１をテンプレ−トとしてＰＣＲを行い、上流にＢａｍＨＩおよびＳａｃＩ制限部位、下流にＳｐｅＩおよびＸｈｏＩ制限部位を有するＰＨＡ合成酵素遺伝子の完全長を増幅した（ＬＡ−ＰＣＲキット；宝酒造）。
【００８４】
同様にｐＹＮ２−Ｃ２に対して、上流側プライマ−となる、オリゴヌクレオチド（配列番号：９）および下流側プライマ−となる、オリゴヌクレオチド（配列番号：８）をそれぞれ設計・合成した（アマシャムファルマシア・バイオテク）。
このオリゴヌクレオチドをプライマ−として、ｐＹＮ２−Ｃ２をテンプレ−トとしてＰＣＲを行い、上流にＢａｍＨＩ制限部位、下流にＸｈｏＩ制限部位を有するＰＨＡ合成酵素遺伝子の完全長を増幅した（ＬＡ−ＰＣＲキット；宝酒造）。
【００８５】
精製したそれぞれのＰＣＲ増幅産物をＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩにより消化し、プラスミドｐＧＥＸ−６Ｐ−１（アマシャムファルマシア・バイオテク社製）の対応する部位に挿入した。これらのベクタ−（ｐＧＥＸ−Ｃ１およびｐＧＥＸ−Ｃ２）を用いて大腸菌（ＪＭ１０９）を形質転換し、発現用菌株を得た。菌株の確認は、Ｍｉｎｉｐｒｅｐ（Ｗｉｚａｒｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＰＲＯＭＥＧＡ社製）を用いて大量に調製したプラスミドＤＮＡをＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩで処理して得られるＤＮＡ断片により行った。得られた菌株をＬＢ−Ａｍｐ培地１０ｍｌで一晩プレ・カルチャ−した後、その０．１ｍｌを、１０ｍｌのＬＢ−Ａｍｐ培地に添加し、３７℃、１７０ｒｐｍで３時間振とう培養した。その後ＩＰＴＧを添加  （終濃度  １ｍＭ）  し、３７℃で４￣１２時間培養を続けた。
【００８６】
ＩＰＴＧ  誘導した大腸菌を集菌  （８０００×ｇ、  ２分、４℃）  し、１／１０  量の  ４℃  ＰＢＳに再懸濁した。凍結融解およびソニケ−ションにより菌体を破砕し、遠心  （８０００×ｇ、  １０分、４℃）して固形夾雑物を取り除いた。目的の発現タンパク質が上清に存在することをＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した後、誘導され発現されたＧＳＴ融合タンパク質をグルタチオン・セファロ−ス４Ｂ（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎ  ＳｅＰＨＡｒｏｓｅ  ４Ｂ  ｂｅａｄｓ：  アマシャムファルマシア・バイオテク社製）で精製した。
【００８７】
使用したグルタチオンセファロ−スは、予め非特異的吸着を抑える処理を行った。すなわち、グルタチオンセファロ−スを同量のＰＢＳで３回洗浄（８０００×ｇ、１分、４℃）  した後、４％ＢＳＡ含有ＰＢＳを同量加えて４℃で１時間処理した。処理後同量のＰＢＳで２回洗浄し、１／２量のＰＢＳに再懸濁した。
前処理したグルタチオンセファロ−ス  ４０μＬを、無細胞抽出液１ｍｌ  に添加し、４℃で静かに攪拌した。これにより、融合タンパク質ＧＳＴ−ＹＮ２−Ｃ１およびＧＳＴ−ＹＮ２−Ｃ２をグルタチオンセファロ−スに吸着させた。
【００８８】
吸着後、遠心  （８０００×ｇ、  １分、４℃）してグルタチオンセファロ−スを回収し、４００μＬのＰＢＳで３回洗浄した。その後、１０  ｍＭグルタチオン４０μＬを添加し、４℃で１時間攪拌して、吸着した融合タンパク質を溶出した。遠心  （８０００×ｇ、２分、４℃）して上清を回収した後ＰＢＳに対して透析し、ＧＳＴ融合タンパク質を精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、シングルバンドを示すことを確認した。
【００８９】
各ＧＳＴ融合タンパク質５００μｇをＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテア−ゼ（アマシャムファルマシア・バイオテク、５Ｕ）で消化した後、グルタチオン・セファロ−スに通してプロテア−ゼとＧＳＴを除去した。フロ−スル−分画をさらに、ＰＢＳで平衡化したセファデックスＧ２００カラムにかけ、発現タンパク質ＹＮ２−Ｃ１およびＹＮ２−Ｃ２の最終精製物を得た。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりそれぞれ６０．８ｋＤａ、および６１．５ｋＤａのシングルバンドを示すことを確認した。
【００９０】
各精製酵素活性は以下の方法で測定した。
ＰＨＡ合成酵素の活性測定は、３−ヒドロキシアシルＣｏＡがＰＨＡ合成酵素の触媒作用により重合してＰＨＡになる過程で放出されるＣｏＡを、５、５’−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）で発色させて測定することを測定原理とする、以下に示す方法によって測定した。
【００９１】
試薬１：ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ社製）を０．１  Ｍ  トリス塩酸バッファー（ｐＨ８．０）  に３．０  ｍｇ／ｍｌ溶解、試薬２：３−ヒドロキシオクタノイルＣｏＡを０．１  Ｍ  トリス塩酸バッファー（ｐＨ８．０）  に３．０  ｍＭ溶解、試薬３：トリクロロ酢酸を０．１  Ｍ  トリス塩酸バッファー（ｐＨ８．０）  に１０  ｍｇ／ｍｌ溶解、試薬４：５、５’−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）を０．１  Ｍ  トリス塩酸バッファー（ｐＨ８．０）  に２．０  ｍＭ溶解。第１反応（ＰＨＡ合成反応）：試料（酵素）溶液１００μｌに試薬１を１００μｌ添加して混合し、３０℃で１分間プレインキュベートする。ここに、試薬２を１００μｌ添加して混合し、３０℃で１〜３０分間インキュベートしたのち、試薬３を添加して反応を停止させる。第２反応（遊離ＣｏＡの発色反応）：反応停止した第１反応液を遠心分離（１５、０００×ｇ、１０分間）し、この上清５００μｌに試薬４を５００μｌ添加し、３０℃で１０分間インキュベートしたのち、４１２  ｎｍの吸光度を測定した。
【００９２】
酵素活性の算出：１分間に１μｍｏｌのＣｏＡを放出させる酵素量を１単位（Ｕ）とする。
【００９３】
また、試料中のタンパク質濃度は、マイクロＢＣＡタンパク質定量試薬キット（ピアスケミカル社製）によって測定した。各精製酵素の活性測定の結果を表１に示した。
【００９４】
【表１】
2004215514.tif 000003
【００９５】
前記酵素を生体溶液試料濃縮剤（みずぶとりくんＡＢ−１１００、アト−（株）製）を用いて濃縮し、１０  Ｕ／ｍｌの精製酵素溶液を得た。
【００９６】
以下、実施例では比活性の高いＹＮ−Ｃ１を用いる。
（実施例１）
カーボンブラックに対する親和性を有するアミノ酸配列の取得
本発明のカーボン層作製に用いる材料の一例として示したカーボンブラックに対して親和性を有する複数のアミノ酸を以下の方法により取得する。
▲１▼カーボンブラック  （シグマ  アルドリッチ  ジャパン社製）を０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＴＢＳバッファー（５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ  ７．５、  １５０  ｍＭ  ＮａＣｌ）に５  ｍｇ／ｍｌの濃度に成るように懸濁した。この１０μｌをエッペンドルフチューブに加え、９９０μｌ  ＴＢＳＴバッファー（ＴＢＳバッファー  ＋  ０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０）を加えて希釈した。
▲２▼Ｐｈ．Ｄ．−１２ファージディスプレイペプチドライブラリ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ社製）の４  ｘ  １０１０ｐｆｕ相当をチューブに添加し、２５℃で１０分間静置した。
▲３▼チューブを遠心分離（２０，６３０×ｇ、５分間）した後、上清を捨て沈殿として顔料を回収した。回収した顔料を再びＴＢＳＴバッファーに懸濁し遠心分離を繰返すことによって、顔料をＴＢＳＴバッファーで１０回洗浄した。
▲４▼１００μｌの溶出バッファー（０．２Ｍ  Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ（ｐＨ２．２）、  １ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ）を加えて１分間静置した後、遠心分離（２０，６３０×ｇ、５分間）し、上清を別のエッペンドルフチューブに移し、１５ｍｌの１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．１）を加えて中和し、溶出されたファージを得た。
▲５▼溶出されたファージを対数増殖初期の大腸菌ＥＲ２５３７（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ社製）に感染させ増幅した。３７℃で４．５時間培養した。次にファージを遠心分離により細胞から分離し、ポリエチレングリコールの沈殿により精製した。精製、増幅されたファージはＴＢＳバッファーに懸濁され、適当な希釈系列を大腸菌に感染させることによって力価（ｔｉｔｅｒ）を測定した。
▲６▼増幅されたファージを用いて、前記▲１▼から▲５▼をあと４回繰返した。ただし用いるＴＢＳＴバッファー中のＴｗｅｅｎ−２０の濃度を０．５％に上げることによって、洗浄の条件を厳しくした。
【００９７】
２回目からは、エッペンドルフチューブに対しても同様の操作を行い、コントロールとした。各サイクルにおいて溶出されたファージの力価（ｔｉｔｅｒ）を表１７に示す。
【００９８】
【表２】
2004215514.tif 000004
【００９９】
最終的に溶出されたファージを大過剰の大腸菌に感染させることによってクローン化した。各クローンを大腸菌に感染させ増幅した後、ｓｓＤＮＡを調製し、ランダム領域の塩基配列を解読することによって、カーボンブラックに対して親和性を有するアミノ酸配列を取得した。結果のアミノ酸配列と頻度を表に示す。
【０１００】
【表３】
2004215514.tif 000005
2004215514.tif 000006
【０１０１】
（実施例２）
以下のようにカーボンブラックに対する親和性を有するＰＨＡ合成酵素を調製した。
【０１０２】
実施例４にて得られたアミノ酸配列（配列番号：１０から配列番号：３４）に対して、スペーサー配列ＧＳを介して、ＰＨＡ合成酵素のＮ末端に融合して発現する大腸菌発現ベクターを次のようにして構築した。これらのアミノ酸配列をコードするＤＮＡは二本鎖ＤＮＡとして作製するために、次に挙げる合成オリゴヌクレオチドのセットを用意した。
【０１０３】
【表４】
2004215514.tif 000007
2004215514.tif 000008
【０１０４】
表に挙げたそれぞれのアミノ酸配列に対する２種の合成ＤＮＡを夫々製造業者の説明に従いＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｇｉｂｃｏ製）を用いてリン酸化した。
続いて２種の合成ＤＮＡを等モル混合し、８０℃で５分間加熱し、その後室温までゆっくり冷却させることによって二本鎖ＤＮＡ断片を形成させた。形成された二本鎖ＤＮＡ断片は、その後のクローニングに直接用いた。
【０１０５】
プラスミドｐＧＥＸ‐Ｃ１をＢａｍＨＩおよびＳａｃＩにより消化し、前記二本鎖ＤＮＡ断片を挿入した。このベクターを用いて大腸菌（ＪＭ１０９）を形質転換し、発現用菌株を得た。菌株の確認は、Ｍｉｎｉｐｒｅｐ（Ｗｉｚａｒｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＰＲＯＭＥＧＡ社製）を用いて調製したプラスミドＤＮＡをテンプレートとしてｐＧＥＸ  ５’  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｐｒｉｍｅｒ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）を用いたシークエンシングによってインサートの塩基配列を決定することにより行った。得られた菌株をＬＢ−Ａｍｐ培地１０ｍＬで一晩プレ・カルチャーした後、その０．１ｍＬを、１０ｍＬのＬＢ−Ａｍｐ培地に添加し、３７℃、１７０ｒｐｍで３時間振とう培養した。
その後ＩＰＴＧを添加  （終濃度  １ｍＭ）  し、３７℃で４￣１２時間培養を続けた。
【０１０６】
ＩＰＴＧ  誘導した大腸菌を集菌  （８０００×ｇ、  ２分、４℃）  し、１／１０  量の  ４℃  ＰＢＳに再懸濁した。凍結融解およびソニケーションにより菌体を破砕し、遠心  （８０００×ｇ、１０分、４℃）して固形夾雑物を取り除いた。目的の発現タンパク質が上清に存在することをＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した後、誘導され発現されたＧＳＴ融合タンパク質をグルタチオン・セファロース４Ｂ（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ  ｂｅａｄｓ：  アマシャムファルマシア・バイオテク社製）で精製した。
【０１０７】
使用したグルタチオンセファロースは、予め非特異的吸着を抑える処理を行った。すなわち、グルタチオンセファロースを同量のＰＢＳで３回洗浄（８０００×ｇ、１分、４℃）  した後、４％ＢＳＡ含有ＰＢＳを同量加えて４℃で１時間処理した。処理後同量のＰＢＳで２回洗浄し、１／２量のＰＢＳに再懸濁した。前処理したグルタチオンセファロース  ４０μＬを、無細胞抽出液１ｍＬ  に添加し、４℃で静かに攪拌した。これにより、融合タンパク質ＧＳＴ−Ａａ１０−ＹＮ２−Ｃ１〜ＧＳＴ−Ａａ３４−ＹＮ２−Ｃ１をグルタチオンセファロースに吸着させた。［融合タンパク質ＧＳＴ−Ａａ△△−ＹＮ２−Ｃ１におけるＡａ△△は、配列番号△△のアミノ酸配列からなるポリペプチドをＰＨＡ合成酵素とＧＳＴの間に融合して発現していることを意味する。］
【０１０８】
吸着後、遠心  （８０００×ｇ、  １分、４℃）してグルタチオンセファロースを回収し、４００μＬのＰＢＳで３回洗浄した。その後、１０  ｍＭグルタチオン４０μＬを添加し、４℃で１時間攪拌して、吸着した融合タンパク質を溶出した。遠心  （８０００×ｇ、２分、４℃）して上清を回収した後ＰＢＳに対して透析し、ＧＳＴ融合タンパク質を精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、シングルバンドを示すことを確認した。
【０１０９】
各ＧＳＴ融合タンパク質５００μｇをＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ（アマシャムファルマシア・バイオテク、５Ｕ）で消化した後、グルタチオン・セファロースに通してプロテアーゼとＧＳＴを除去した。フロースルー分画をさらに、ＰＢＳで平衡化したセファデックスＧ２００カラムにかけ、それぞれの発現タンパク質Ａａ１０−ＹＮ２−Ｃ１（ｃｂ）〜Ａａ３４−ＹＮ２−Ｃ１（ｃｂ）の最終精製物を得た。［発現タンパク質Ａａ△△−ＹＮ２−Ｃ１（ｃｂ）におけるＡａ△△は配列番号△△のアミノ酸配列からなるポリペプチドをＰＨＡ酵素のＮ末端に融合して発現していることを意味する。］
【０１１０】
それぞれの精製酵素の活性は前述の方法で測定した。また、試料中のタンパク質濃度は、マイクロＢＣＡタンパク質定量試薬キット（ピアスケミカル社製）によって測定した。酵素濃度は１．９  Ｕ／ｍｌまた比活性は  ４．０  Ｕ／ｍｇタンパク質であった。精製酵素を生体溶液試料濃縮剤（みずぶとりくんＡＢ−１１００、アトー（株）製）を用いて濃縮し、１０  Ｕ／ｍｌの精製酵素溶液を得た。
【０１１１】
（実施例３）
カーボンブラックに対する親和性の評価
カーボンブラックを、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＴＢＳバッファーに０．５％（ｗ／ｖ）になるように懸濁した。この１０ｍｌをテフロン（登録商標）製遠沈管にとり、ここに、実施例２０で調整したＰＨＡ合成酵素Ａａ３９−ＹＮ２−Ｃ１（ｃｂ）〜Ａａ６３−ＹＮ２−Ｃ１（ｃｂ）、および参考例１で調整したＹＮ２−Ｃ１の０．５Ｕ相当を加え、室温で３０分間振とうした。遠心分離操作（１０、０００  ｘ  ｇ、４℃、１０分間）によってカーボンブラック粒子を沈殿として回収し、カーボンブラックに結合しなかった酵素を含む上清と分離した。カーボンブラックを再び０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＴＢＳバッファーに懸濁し、遠心操作を繰返すことによって、カーボンブラックを洗浄した。洗浄したカーボンブラックの懸濁液の酵素活性を測定した結果を示す。
【０１１２】
【表５】
2004215514.tif 000009
2004215514.tif 000010
【０１１３】
コントロールの酵素ＹＮ２−Ｃ１に比べて、カーボンブラック結合配列を融合した酵素Ａａ１０−ＹＮ２−Ｃ１（ｃｂ）〜Ａａ３４−ＹＮ２−Ｃ１（ｃｂ）の方が、酵素活性が高く、酵素を有効に基材表面に固定化できることが確かめられた。
【０１１４】
（実施例４）
カーボンブラックに対する親和性を有する以下の二種類のアミノ酸配列、Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒ（配列番号：１０）およびＡｓｎ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ（配列番号：１１）の全部を、スペーサー配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒを介してこの順番に直列に繋いだ配列、
Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ（配列番号：３５）を、さらにスペーサー配列ＧＳを介して、ＰＨＡ合成酵素のＮ末端に融合して発現する大腸菌発現ベクターを次のようにして構築した。このアミノ酸配列をコードするＤＮＡは、二種類の合成オリゴヌクレオチド、
５’−ＧＡＴＣＣＴＧＧＣＣＧＣＡＴＧＣＧＴＧＧＡＡＡＧＴＧＴＧＧＴＧＧＣＣＧＧＣＧＡＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＡＧＣＡＡＣＴＧＧＴＧＧＴＧＧＣＣＧＣＣＧＴＡＴＡＴＴＣＧＴＣＡＴＣＡＧＣＣＧＧＡＧＣＴ−３’（配列番号：３６）および５’−ＣＣＧＧＣＴＧＡＴＧＡＣＧＡＡＴＡＴＡＣＧＧＣＧＧＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＴＴＧＣＴＧＣＣＧＣＣＧＣＣＧＣＴＧＣＣＧＣＣＧＣＣＧＣＴＣＧＣＣＧＧＣＣＡＣＣＡＣＡＣＴＴＴＣＣＡＣＧＣＡＴＧＣＧＧＣＣＡＧ−３’（配列番号：３７）をそれぞれＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｇｉｂｃｏ製）を用いてリン酸化した後、等モル混合し、８０℃で５分間加熱し、その後室温までゆっくり冷却させることによって二本鎖ＤＮＡ断片として形成させた。形成された二本鎖ＤＮＡ断片は、実施例２０と同様にして、プラスミドｐＧＥＸ‐Ｃ１のＢａｍＨＩ／ＳａｃＩサイトに挿入し、このベクターを用いて大腸菌（ＪＭ１０９）を形質転換し、発現用菌株を得た。実施例２と同様にして、配列番号：３５のアミノ酸配列をＮ末端に融合した発現タンパク質Ａａ３５−ＹＮ２−Ｃ１（ｃｂ）を精製し、１０  Ｕ／ｍｌの精製酵素溶液を得た。実施例３と同様にして精製酵素のカーボンブラックに対する親和性を評価した。結果を表２１に示す。
【０１１５】
【表６】
2004215514.tif 000011
【０１１６】
コントロールの酵素ＹＮ２−Ｃ１に比べて、カーボンブラック結合配列を融合した酵素Ａａ３５−ＹＮ２−Ｃ１（ｃｂ）の方が、酵素活性が高く、酵素を有効に基材表面に固定化できることが確かめられた。
【０１１７】
（実施例５）
以下、カ−ボン被覆したポリスチレン基板上にカ−ボン層親和性ペプチドを融合したポリヒドロキシアルカネ−ト（ＰＨＡ）合成酵素を固定して得られる有機高分子固定基板及びその製造方法の一例である。図１は、実施例１の概略断面図である。
【０１１８】
（１）カ−ボン被覆ポリスチレン基板の作製
本実施例の基板１１としては、ポリスチレン基板を用いる。
カ−ボンブラック  （シグマ  アルドリッチ  ジャパン社製）をメタノ−ルに５ｍｇ／ｍｌの濃度に攪拌し、十分に分散した。ポリスチレン基板上にこの懸濁液を塗布し、メタノ−ルを蒸発させて除くことによって、ポリスチレン基板上にカ−ボンブラックの皮層を固着させる。固着したカ−ボン層は０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＴＢＳバッファ−（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍｌＮａＣｌ）で洗浄しても脱離しないことの確認を行い、ポリスチレン基板１１表面上にカ−ボン層２が被覆され、カ−ボン被覆ポリスチレン基板（以下、実施例１では基板と称する）を得た。
【０１１９】
（２）基板に対する親和性の評価
本実施例３の方法により得られた配列番号：１０のアミノ酸配列をＮ末端に有するＰＨＡ合成酵素を用いて以下の評価を行った。
【０１２０】
基板を３０ｍｌＴＢＳバッファ−が入ったシャ−レに浸漬しする。次に、上記（３）で調整したＰＨＡ合成酵素Ａａ３５−ＹＮ２−Ｃ１（ｃｂ）および参照で調整したＹＮ２−Ｃ１  ２．５Ｕ相当を加え、室温でゆっくりと１時間間振とうする。基板を取り出した後、基板表面をＴＢＳバッファ−に１０回洗浄した。洗浄した基板の浸漬液のＰＨＡ合成酵素活性を前記方法においての測定値は下表になる。
【０１２１】
【表７】
2004215514.tif 000012
【０１２２】
コントロ−ルの酵素ＹＮ２−Ｃ１に比べて、カ−ボン層結合配列を融合した酵素Ａａ３５−ＹＮ２−Ｃ１（ｃｂ）の方が、酵素活性が高く、酵素を有効に基材表面に固定化されてることが示され、バイオリアクターとして利用できることが示唆される。
【０１２３】
（実施例６）
本実施例６は、Ｓｉ基板上にＮｂ、Ａｌを順にスパッタし、そのサンプルを陽極酸化し、カ−ボンを被覆した後に有機高分子を固定化することにより得られる図２に示す生体分子固定化基板及びその製造方法の例である。
【０１２４】
（１）多孔性基板の作製
本実施例のＳｉ基板２１としては、１０−２Ωｃｍの抵抗値を有する鏡面研磨されたｎ型の単結晶Ｓｉ基板を用いた。ｎ型はリンド−プである。このＳｉ基板２１上に、ＲＦスパッタ法によりに厚さ１００ｎｍのＮｂ層２２を成層する。その後、Ａｌ層２３を５００ｎｍ成層した。（ここで得られたＡｌ層２３／Ｎｂ層２２／Ｓｉ基板２１を積層基板と称する。）
【０１２５】
次に、前記積層基板に対して陽極酸化を行なう。陽極酸化反応溶液は０．３Ｍのシュウ酸水溶液とし、恒温水槽により溶液を１７℃に保持する。ここで陽極酸化電圧はＤＣ４０Ｖであり、電極は均一に陽極酸化が進行するように積層基板のＳｉ基板２１の裏側全面からとった。陽極酸化工程途中、陽極酸化がＡｌ層２３表面から進行しＮｂ層２２まで到達したことを示す電流を検知するため、陽極酸化電流をモニタ−する。反応が進行するに連れてＡｌが酸化され、絶縁層のアルミナになっていくのと同時に、細孔がＡｌ層２３表面からＡｌ層２３の厚み方向（Ｓｉ基板側へ向って）成長していく。最終的にはＡｌ層２３の下地であるＮｂ層２２が細孔内部と部分的に導通させる。この陽極酸化処理により、図２ａで示すＡｌ層２３を図２ｂで示す細孔２４を有するアルミナ多孔体２３となる。陽極酸化処理後、純水、およびイソプロピルアルコ−ルによる洗浄を行った。その後、サンプルを５ｗｔ％リン酸溶液中に２０〜４５分間浸してポアワイドニング処理を行い、適宜、細孔の孔径を広げる。
【０１２６】
（２）カーボン層の作製
ポアワイドニング処理後の前記積層基板を管状炉内に入れ、設定温度まで毎分５℃ずつ上昇させる。熱処理中は、常に２％Ｈ２  ／９８％Ｈｅを３３ｓｃｃｍで流し、炭化水素ガスとして１％Ｃ２  Ｈ２  ／９９％Ｈｅ、１％Ｃ２  Ｈ４  ／９９％Ｈｅを６６ｓｃｃｍで流して使用した。炭化水素熱分解時は、合計１００ｓｃｃｍのガスが流れ、混合比はＣ２  Ｈ４  ：Ｈ２  ：Ｈｅ＝１：１：１×１０２  である。２％Ｈ２  ／９８％Ｈｅ雰囲気で１０００℃まで３時間２０分かけて加熱し、１０分間１０００℃で保持し、その後１％Ｃ２  Ｈ２  ／９９％Ｈｅを１０分間流した。その後、１０００℃で１時間保持した後、３時間２０分かけて冷却させる。その結果、図２ｃに示すように、アルミナ多孔体２３上及び細孔２４表面にカ−ボン層２５を被覆する。
【０１２７】
取り出した試料の表面、断面をＦＥ−ＳＥＭ（Ｆｉｅｌｄ    Ｅｍｉｓｓｉｏｎ−Ｓｃａｎｎｉｎｇ    Ｅｌｅｃｔｒｏｎ    Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ：電界放出走査型電子顕微鏡）にて観察した。その結果、図２ｃに示したようにＮｂ層２２が細孔表面を被覆しているカ−ボン層２５と接触している。（以下、ここで得られたカーボン層により被覆されたアルミナ多孔層／Ｎｂ層／Ｓｉの積層基板を実施例２で多孔体基板と称する。）
【０１２８】
（３）カーボン層親和性ペプチド融合したＰＨＡ合成酵素の調製
本実施例６の有機高分子として、実施例５と同じ調整方法により得られた配列番号：１０のアミノ酸配列をＮ末端に結合したＰＨＡ合成酵素を用いる。
（４）多孔体基板に対する親和性の評価
多孔体基板を３０ｍｌＴＢＳバッファ−が入ったシャ−レに浸漬する。次に、上記（２）で調整したＰＨＡ合成酵素Ａａ３５−ＹＮ２−Ｃ２（ｃｂ）および参照で調整したＹＮ２−Ｃ２  ２．５Ｕ相当を加え、室温でゆっくりと３０分間振とうした。基板を取り出した後、多孔性基板をＴＢＳバッファ−に５分浸漬し、ＴＢＳバッファ−で洗浄する固定を１０回を行う。洗浄した多孔性基板の懸濁液の酵素活性を実施例１と同様にして測定した結果を下表に示す。
【０１２９】
【表８】
2004215514.tif 000013
【０１３０】
コントロ−ルの酵素ＹＮ２−Ｃ１に比べて、カ−ボン層結合配列を融合した酵素Ａａ３５−ＹＮ２−Ｃ１（ｃｂ）の方が、酵素活性が高く、ＰＨＡ合成酵素が有効に多孔体基板表面に固定化されてることが示唆される。実施例５の平坦な基板と比較して、酵素活性が高いことから多孔性基板の方が固定化されたＰＨＡ合成酵素量が多いことが示され、バイオリアクターとして利用できることが示唆される。
【０１３１】
また、ＰＨＡ合成酵素の活性測定において、前記測定方法において試薬２を試薬２−１；３‘−ヒドロキシオクタノイルＣｏＡ／０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）溶液の濃度を１．５ｍＭ溶解、試薬２−２；３‘−ヒドロキシオクタノイルＣｏＡ／０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）溶液の濃度を６．０ｍＭ溶解したものにそれぞれ変更し、ＰＨＡ合成酵素活性を測定する。
【０１３２】
【表９】
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【０１３３】
３‘−ヒドロキシオクタノイルＣｏＡの濃度依存的に活性の変化が確認できる。このことからバイオセンサーとして応用できることが示唆される。
【０１３４】
【発明の効果】
本発明によれば、有機高分子を固定化した基板において、固定化される有機高分子が少なくとも機能ドメインと前記カ−ボン層と結合する結合ドメインから構成されることにより、有機高分子を機能ドメインと独立した部位をカーボン結合ドメインとして選択的に基板に固定化する製造方法および有機高分子固定化基板を得ることできる。これにより得られた有機高分子固定化基板は、機能ドメインの所望の機能に影響を最小限に抑え、効率的かつ高配向に有機高分子を基板上に固定されたものである。
【０１３５】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の有機高分子固定化基板の一例を示す概略図である。
【図２】実施例６のＡｌ層／Ｎｂ層／Ｓｉ積層基板の一例を示す概略図であり、図２ａは実施例６のＡｌ層／Ｎｂ層／Ｓｉ積層基板の一例を示す概略断面図、図２ｂは実施例６のＡｌ層／Ｎｂ層／Ｓｉ積層基板を陽極酸化して得られるアルミナ多孔体基板の概略断面図、図２ｃは実施例６で得られるアルミナ多孔体基板にカーボン層を設けた多孔性基板の概略断面図である。
【符号の説明】
１１  ポリスチレン基板
１２  カーボン層
１３  有機高分子
１４  機能ドメイン
１５  結合ドメイン
１５ａ  カーボン層親和性部位
１５ｂ  スペーサ−配列
２１  シリコン基板
２２  Ｎｂ層
２３  Ａｌ層
２４  細孔
２５  カーボン層
【図１】
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【図２】
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