【手続補正書】
【提出日】平成24年5月25日(2012.5.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
広範囲にわたって防御するために遺伝子改変された少なくとも２つの髄膜炎菌株から得た未変性の外膜小胞を含むワクチンであって、前記未変性の外膜小胞が、ＰｏｒＡ、ＬＯＳ、および保存外膜タンパク質に基づいた３つの異なる抗原組を含み、前記遺伝子改変菌株が、ｌｐｘＬ１遺伝子、ｓｙｎＸ遺伝子、およびｌｇｔＡ遺伝子の不活化に基づいて安全性が強化されるように改変されており、前記遺伝子改変菌株のうちの少なくとも１つが、少なくとも２つの異なるＰｏｒＡ亜型タンパク質または亜型エピトープを発現する、ワクチン。
【請求項２】
各菌株によって発現された前記ＬＯＳが異なるＬＯＳコア構造を有し、グルコースおよびガラクトースからなるα鎖を有する、請求項１に記載のワクチン。
【請求項３】
各菌株がＢ群分離菌のうちで最も一般的なＰｏｒＡ亜型に基づいて選択される少なくとも２つの異なるＰｏｒＡ亜型タンパク質または亜型エピトープを発現する、請求項１に記載のワクチン。
【請求項４】
殺菌抗体を誘導する能力が証明された異なる保存表面タンパク質が各菌株で過剰発現され、ＦＨＢＰ（ＧＮＡ１８７０）バリアント１、ＦＨＢＰバリアント２、およびＦＨＢＰバリアント３、ＮａｄＡ、Ａｐｐ、ＮｓｐＡ、ＴｂｐＡおよびＴｂｐＢからなる群から選択される、請求項１に記載のワクチン。
【請求項５】
３つの遺伝子改変された抗原性が多様な髄膜炎菌株由来のＮＯＭＶの組み合わせ物であって、少なくとも１つの菌株が、以下：
（１）以下の遺伝子改変または特徴を有するＨ４４／７６  ＨＯＰＳ−ＤＬ：
ｓｙｎＸ遺伝子、ｌｐｘＬ１遺伝子、およびｌｇｔＡ遺伝子の不活化、
ｏｐａＤの代わりの第２のｐｏｒＡ遺伝子（亜型Ｐ１．７−１，１）の挿入、
ＮａｄＡ発現の増加、および
ＯｐｃおよびＰｏｒＡの安定化された高発現、
（２）以下の遺伝子改変または特徴を有する８５７０  ＨＯＰＳ−ＧＡＬ：
ｓｙｎＸ遺伝子、ｌｐｘＬ１遺伝子、およびｌｇｔＡ遺伝子の不活化、
ｏｐａＤの代わりの第２のｐｏｒＡ遺伝子の挿入、
Ｈ因子結合タンパク質バリアント１発現の増加、および
ＰｏｒＡおよびＯｐｃの安定化された高発現、および
（３）以下の遺伝子改変または特徴を有するＢ１６Ｂ６  ＨＰＳ−Ｇ２Ａ：
ｓｙｎＸ遺伝子、ｌｐｘＬ１遺伝子、およびｌｇｔＡ遺伝子の不活化、
ｏｐａＤの代わりの第２のｐｏｒＡ遺伝子の挿入、
Ｈ因子結合タンパク質バリアント２発現の増加、および
ＰｏｒＡおよびＯｐｃの安定化された高発現
から選択される、組み合わせ物。
【請求項６】
菌株Ｈ４４／７６  ＨＯＰＳ−ＤＬがＥＴ−５野生型菌株Ｈ４４／７６（Ｂ：１５：Ｐ１．７，１６：Ｌ，３，７：Ｐ５．５，Ｃ）に由来した、請求項５に記載のワクチン菌株の組み合わせ物。
【請求項７】
菌株８５７０  ＨＯＰＳ−ＧＩＬがＥＴ−５野生型菌株８５７０（Ｂ：４：Ｐ  １．１９，１５：Ｌ３，７ｖ：Ｐ５．５，１１，Ｃ）に由来した、請求項５に記載のワクチン菌株の組み合わせ物。
【請求項８】
菌株Ｂ１６Ｂ６  ＨＰＳ−Ｇ２ＬがＥＴ−３７野生型菌株Ｂ１６Ｂ６（Ｂ：２ａ：Ｐ  １．５，２：Ｌ２：Ｐ５．１，２，５）に由来する、請求項５に記載のワクチン菌株の組み合わせ物。
【請求項９】
前記ＮＯＭＶを界面活性剤または変性溶媒へ曝露することなく充填細胞または消費した培養培地から調製する、請求項１に記載のワクチン。
【請求項１０】
前記ワクチンを賦形剤としての５％グルコースに懸濁する、請求項１に記載のワクチン。
【請求項１１】
前記ＮＯＭＶを、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、ＭＦ５９、ＣＰＧ−ＯＤＮ、またはＭＰＬＡを含む１つまたは複数のアジュバントと組み合わせる、請求項１に記載のワクチン。
【請求項１２】
髄膜炎菌性疾患に対する免疫のための組成物であって、請求項１に記載のワクチンを含み、前記組成物は、筋肉内および／または鼻腔内に投与されるものであることを特徴とする、組成物。
【請求項１３】
Ｂ群髄膜炎菌性疾患に対する免疫のための組成物であって、請求項１に記載のワクチンを含み、前記組成物は、筋肉内および／または鼻腔内に投与されるものであることを特徴とする、組成物。
【請求項１４】
髄膜炎菌の１つまたは複数の遺伝子改変菌株由来の未変性の外膜小胞（ＮＯＭＶ）を含む髄膜炎菌性疾患に対するワクチン組成物であって、前記１つまたは複数の遺伝子改変菌株が、
ｉ．ｓｙｎＸ遺伝子の不活化，
ｉｉ．ｌｐｘＬ１遺伝子の不活化、
ｉｉｉ．ラクト−Ｎ−ネオテトラオーステトラサッカリドを欠く短縮されたかまたは切り詰められたリポオリゴサッカリド（ＬＯＳ）が発現される各菌株中でのｌｇｔＡ遺伝子の不活化、および
ｉｖ．ｏｐａ遺伝子の代わりの少なくとも１つの第２の抗原性が異なるｐｏｒＡ遺伝子の挿入
によって改変された、ワクチン組成物。
【請求項１５】
前記遺伝子改変菌株が少なくとも１つの微量保存外膜タンパク質の増加または安定した発現をさらに含む、請求項１４に記載のワクチン組成物。
【請求項１６】
前記遺伝子改変菌株が少なくとも１つの外膜タンパク質の安定化された発現をさらに含み、前記外膜タンパク質がＯｐｃおよびＰｏｒＡを含む群から選択される、請求項１４から１５のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
【請求項１７】
前記少なくとも１つの第２の抗原性が異なるｐｏｒＡ遺伝子が髄膜炎Ｂ群分離菌の最も一般的なＰｏｒＡ亜型から選択される少なくとも１つのＰｏｒＡ亜型タンパク質または亜型エピトープを発現する、請求項１４から１６のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
【請求項１８】
前記少なくとも１つの微量保存外膜タンパク質が、ＦＨＢＰ（ＧＮＡ１８７０）バリアント１、ＦＨＢＰバリアント２、ＦＨＢＰバリアント３、ＮａｄＡ、Ａｐｐ、ＮｓｐＡ、ＴｂｐＡ、およびＢからなる群から選択される、請求項１５から１７のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
【請求項１９】
菌株Ｈ４４／７６  ＨＯＰＳ−Ｄを含む髄膜炎菌亜型Ｂ菌株からの遺伝子改変されたワクチン菌株。
【請求項２０】
以下：
ｉ）ｓｙｎＸ遺伝子の不活化、
ｉｉ）ｌｐｘＬ１遺伝子の不活化、
ｉｉｉ）ｌｇｔＡ遺伝子の不活化、
ｉｖ）ｏｐａＤ遺伝子の代わりの第２のｐｏｒＡ遺伝子の挿入、
ｖ）未変性菌株と比較して増加したＮａｄＡ発現、および
ｖｉ）Ｏｐｃタンパク質およびＰｏｒＡタンパク質発現の安定化された増加
の遺伝子改変を含む菌株Ｈ４４／７６由来の髄膜炎菌亜型Ｂの遺伝子改変されたワクチン菌株。
【請求項２１】
菌株Ｈ４４／７６  ＨＯＰＳ−ＤＬがＥＴ−５野生型菌株Ｈ４４／７６（Ｂ：１５：Ｐ１．７，１６：Ｌ，３，７：Ｐ５．５，Ｃ）に由来した、請求項１９または２０に記載の遺伝子改変菌株。
【請求項２２】
菌株８５７０  ＨＯＳ−Ｇ１を含む髄膜炎菌亜型Ｂの遺伝子改変されたワクチン菌株。
【請求項２３】
以下：
ｉ）ｓｙｎＸ遺伝子の不活化、
ｉｉ）ｌｐｘＬ１遺伝子の不活化、
ｉｉｉ）ｌｇｔＡ遺伝子の不活化、
ｉｖ）ｏｐａＤの代わりの第２のｐｏｒＡ遺伝子の挿入、
ｖ）Ｈ因子結合タンパク質バリアント１発現の増加、および
ｖｉ）ＰｏｒＡタンパク質およびＯｐｃタンパク質発現の安定化された増加
の遺伝子改変を含む８５７０由来の髄膜炎菌亜型Ｂ菌株の遺伝子改変されたワクチン菌株。
【請求項２４】
前記遺伝子改変菌株がＥＴ−５野生型菌株８５７０（Ｂ：４：Ｐ  １．１９，１５：Ｌ３，７ｖ：Ｐ５．５，１１，Ｃ）に由来した、請求項２２または２３に記載の遺伝子改変菌株。
【請求項２５】
菌株Ｂ１６Ｂ６  ＨＰＳ−Ｇ２Ａを含む髄膜炎菌亜型Ｂの遺伝子改変されたワクチン菌株。
【請求項２６】
以下：
ｉ）ｓｙｎＸ遺伝子の不活化、
ｉｉ）ｌｐｘＬ１遺伝子の不活化、
ｉｉｉ）ｌｇｔＡ遺伝子の不活化、
ｉｖ）ｏｐａＤの代わりの第２のｐｏｒＡ遺伝子（亜型Ｐ１．２２−１，４）の挿入、
ｖ）  Ｈ因子結合タンパク質バリアント２発現の増加、および
ｖｉ）ＰｏｒＡタンパク質およびＯｐｃタンパク質発現の安定化された増加
の遺伝子改変を含むＢ１６Ｂ６由来の髄膜炎菌亜型Ｂの遺伝子改変されたワクチン菌株。
【請求項２７】
前記遺伝子改変菌株がＥＴ−３７野生型菌株Ｂ１６Ｂ６（Ｂ：２ａ：Ｐ  １．５，２：Ｌ２：Ｐ５．１，２，５）に由来する、請求項２５または２６に記載の遺伝子改変菌株。
【請求項２８】
前記菌株を鉄欠損培地で生育させる、請求項１９から２７のいずれか１項に記載の遺伝子改変菌株。
【請求項２９】
ｓｙｎＸ遺伝子、ｌｐｘＬ１遺伝子、またはｌｇｔＡ遺伝子の不活化が不活化遺伝子配列内の薬物耐性遺伝子の挿入による、請求項１９から２８のいずれか１項に記載の遺伝子改変菌株。
【請求項３０】
請求項２０から２９のいずれか１項に記載の１つまたは複数の遺伝子改変菌株由来のＮＯＭＶを含むワクチン組成物。
【請求項３１】
前記ワクチン組成物が２つ以上の遺伝子改変菌株由来のＮＯＭＶを含む、請求項３０に記載のワクチン組成物。
【請求項３２】
前記ワクチン組成物が３つ以上の遺伝子改変菌株由来のＮＯＭＶを含む、請求項３０に記載のワクチン組成物。
【請求項３３】
前記ＮＯＭＶを界面活性剤または変性溶媒へ曝露することなく充填細胞または消費した培養培地から調製する、請求項１から４および９から１１のいずれか１項に記載のワクチン、または請求項５から８のいずれか１項に記載の組み合わせ物、または請求項１２から１３のいずれか１項に記載の組成物、または請求項１４から１８および３０から３２のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
【請求項３４】
前記ワクチン組成物を賦形剤としての５％グルコースに懸濁する、請求項１４から１８および３０から３２のいずれか１項に記載のワクチン組成物、または請求項５から８のいずれか１項に記載の組み合わせ物、または請求項１２から１３のいずれか１項に記載の組成物、または請求項１から４および９から１１のいずれか１項に記載のワクチン。
【請求項３５】
前記ＮＯＭＶを１つまたは複数のアジュバントと組み合わせる、請求項１４から１８および３０から３２のいずれか１項に記載のワクチン組成物、または請求項５から８のいずれか１項に記載の組み合わせ物、または請求項１２から１３のいずれか１項に記載の組成物、または請求項１から４および９から１１のいずれか１項に記載のワクチン。
【請求項３６】
前記遺伝子改変した菌株を鉄取り込みタンパク質を発現するように変化させる、請求項１４から１８および３０から３２のいずれか１項に記載のワクチン組成物、または請求項５から８のいずれか１項に記載の組み合わせ物、または請求項１２から１３のいずれか１項に記載の組成物、または請求項１から４および９から１１のいずれか１項に記載のワクチン。
【請求項３７】
種々の未変性の外膜小胞（ＮＯＭＶ）を含む髄膜炎菌性疾患に対するワクチンであって、少なくともいくつかのＮＯＭＶがリポオリゴサッカリド（ＬＯＳ）の発現またはシアル酸化を本質的に含まず、ペンタ−アシル構造を有する脂質Ａを含むＬＯＳを含み、発現レベルの増加した少なくとも１つの微量保存外膜タンパク質を含み、前記微量保存外膜タンパク質が殺菌抗体を誘導するタンパク質から選択される、ワクチン。
【請求項３８】
前記微量保存外膜タンパク質が、ＮａｄＡ、Ｈ因子結合タンパク質（ＦＨＢＰ）バリアント１、およびＦＨＢＰバリアント２からなる群から選択される、請求項３７に記載のワクチン。
【請求項３９】
前記ＮＯＭＶのうちの少なくともいくつかがラクト−Ｎ−ネオテトラオース（ＬＮｎＴ）テトラサッカリドを本質的に含まない短縮されたか、または切り詰められたＬＯＳを含む、請求項３７に記載のワクチン。
【請求項４０】
前記ＮＯＭＶのうちの少なくともいくつかが２つ以上の異なるＰｏｒＡタンパク質を含む、請求項３７に記載のワクチン。
【請求項４１】
前記少なくとも２つ以上の異なるＰｏｒＡタンパク質が、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）亜群Ｂ菌株の最も一般的な菌株から選択される、請求項４０に記載のワクチン。
【請求項４２】
請求項１４から１８および３０から３２のいずれか１項に記載のワクチン組成物、または請求項５から８のいずれか１項に記載の組み合わせ物、または請求項１２から１３のいずれか１項に記載の組成物、または請求項１から４および９から１１のいずれか１項に記載のワクチンを含む、髄膜炎菌性疾患に対する免疫のために動物またはヒトにおいて髄膜炎菌性疾患に対する免疫応答を誘発するための組成物。
【請求項４３】
前記ワクチンをＢ群髄膜炎菌性疾患に対する免疫のために使用する、請求項４２に記載の組成物。
【請求項４４】
髄膜炎菌性疾患に対するワクチンで用いる髄膜炎菌の遺伝子改変菌株を調製する方法であって、
ａ）遺伝子改変することができる髄膜炎菌Ｂ型菌株を選択する工程、
ｂ）ｓｙｎＸ遺伝子の不活化によって前記菌株を遺伝子改変する工程，
ｃ）ｌｐｘＬ１遺伝子の不活化によって前記菌株を遺伝子改変する工程、
ｄ）ｌｇｔＡ遺伝子の不活化によって前記菌株を遺伝子改変する工程、および
ｅ）１つまたは複数の微量保存外膜タンパク質の発現の増加によって前記菌株を遺伝子改変する工程
を含む、方法。
【請求項４５】
ｏｐａ遺伝子の読み取り枠への少なくとも１つの第２の抗原性が異なるｐｏｒＡ遺伝子の挿入によって前記菌株を遺伝子改変する工程をさらに含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
少なくとも１つの外膜タンパク質のプロモーターまたは読み取り枠内のポリ−Ｃ配列をＧヌクレオチドおよびＣヌクレオチドを含む配列で置換することによって前記菌株を遺伝子改変して少なくとも１つの外膜タンパク質を安定的に発現させるか、または過剰発現させる工程をさらに含む、請求項４４または４５に記載の方法。
【請求項４７】
髄膜炎菌性疾患に対するワクチンを調製する方法であって、
ａ）以下：
ｉ．ｓｙｎＸ遺伝子の不活化，
ｉｉ．ｌｐｘＬ１遺伝子の不活化、
ｉｉｉ．ＩｇｔＡ遺伝子の不活化、
ｉｖ．ｏｐａ遺伝子の代わりの少なくとも１つの第２の抗原性が異なるｐｏｒＡ遺伝子の挿入、
ｖ．少なくとも１つの微量保存外膜タンパク質の増加した発現または安定した発現、および
ｖｉ．少なくとも１つの外膜タンパク質の安定化させた発現
からなる群から選択される１つまたは複数の改変を含む髄膜炎菌の遺伝子改変菌株を培養する工程、
ｂ）前記ａ）の培養菌株を使用して発酵槽内の培地に植菌して発酵することによって前記培養物を拡大する工程、
ｃ）前記発酵培養物を不活化する工程、
ｄ）連続フロー型遠心分離によって髄膜炎菌培養細胞を採取し、そして細胞ペーストを回収する工程、
ｅ）前記細胞ペーストからＮＯＭＶを単離する工程、および
ｆ）ワクチン投与に適切な緩衝液またはキャリアにＮＯＭＶを再懸濁する工程
を含む、方法。
【請求項４８】
Ｂ群単離菌のうちで最も一般的な菌株のＰｏｒＡ亜型が、それぞれＰ１．７−１，１、Ｐ１．２２，１４およびＰ１．２２−１，４からなる群から選択される、請求項３に記載のワクチンまたは請求項１７に記載のワクチン組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
さらに別の態様では、本発明のテクノロジーは、ａ）ｓｙｎＸ遺伝子の不活化、ｌｐｘＬ１遺伝子の不活化、ＩｇｔＡ遺伝子の不活化、ｏｐａ遺伝子の代わりの少なくとも１つの第２の抗原性が異なるｐｏｒＡ遺伝子の挿入、少なくとも１つの微量保存外膜タンパク質の増加または安定した発現、および／または少なくとも１つの外膜タンパク質の安定化させた発現からなる群から選択される１つまたは複数の改変を含む髄膜炎菌の遺伝子改変菌株を培養する工程、ｂ）ａ）の培養菌株を使用して発酵槽内の培地に植菌して発酵することによって前記培養物を拡大する工程、ｃ）発酵培養物を不活化する工程、ｄ）連続フロー型遠心分離および細胞ペーストの回収によって髄膜炎菌培養細胞を採取する工程、ｅ）細胞ペーストからＮＯＭＶを単離する工程、およびｆ）ワクチン投与に適切な緩衝液またはキャリアにＮＯＭＶを再懸濁する工程を含む、髄膜炎菌性疾患に対するワクチンを調製する方法を提供する。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
広範囲にわたって防御するために遺伝子改変された少なくとも２つの髄膜炎菌株から得た未変性の外膜小胞を含むワクチンであって、前記未変性の外膜小胞が、ＰｏｒＡ、ＬＯＳ、および保存外膜タンパク質に基づいた３つの異なる抗原組を含み、前記遺伝子改変菌株が、ｌｐｘＬ１遺伝子、ｓｙｎＸ遺伝子、およびｌｇｔＡ遺伝子の不活化に基づいて安全性が強化されるように改変されている、ワクチン。
（項目２）
各菌株によって発現された前記ＬＯＳが異なるＬＯＳコア構造を有し、グルコースおよびガラクトースからなるα鎖を有する、項目１に記載のワクチン。
（項目３）
各菌株がＢ群分離菌のうちで最も一般的なＰｏｒＡ亜型に基づいて選択される少なくとも２つの異なるＰｏｒＡ亜型タンパク質または亜型エピトープを発現する、項目１に記載のワクチン。
（項目４）
殺菌抗体を誘導する能力が証明された異なる保存表面タンパク質が各菌株で過剰発現され、ＦＨＢＰ（ＧＮＡ１８７０）バリアント１、ＦＨＢＰバリアント２、およびＦＨＢＰバリアント３、ＮａｄＡ、Ａｐｐ、ＮｓｐＡ、ＴｂｐＡおよびＴｂｐＢからなる群から選択される、項目１に記載のワクチン。
（項目５）
３つの遺伝子改変された抗原性が多様な髄膜炎菌株由来のＮＯＭＶの組み合わせであって、少なくとも１つの菌株が、以下：
（１）以下の遺伝子改変または特徴を有するＨ４４／７６  ＨＯＰＳ−ＤＬ：
ｓｙｎＸ遺伝子、ｌｐｘＬ１遺伝子、およびｌｇｔＡ遺伝子の不活化、
ｏｐａＤの代わりの第２のｐｏｒＡ遺伝子（亜型Ｐ１．７−１，１）の挿入、
ＮａｄＡ発現の増加、および
ＯｐｃおよびＰｏｒＡの安定化された高発現、
（２）以下の遺伝子改変または特徴を有する８５７０  ＨＯＰＳ−ＧＡＬ：
ｓｙｎＸ遺伝子、ｌｐｘＬ１遺伝子、およびｌｇｔＡ遺伝子の不活化、
ｏｐａＤの代わりの第２のｐｏｒＡ遺伝子の挿入、
Ｈ因子結合タンパク質バリアント１発現の増加、および
ＰｏｒＡおよびＯｐｃの安定化された高発現、および
（３）以下の遺伝子改変または特徴を有するＢ１６Ｂ６  ＨＰＳ−Ｇ２Ａ：
ｓｙｎＸ遺伝子、ｌｐｘＬ１遺伝子、およびｌｇｔＡ遺伝子の不活化、
ｏｐａＤの代わりの第２のｐｏｒＡ遺伝子の挿入、
Ｈ因子結合タンパク質バリアント２発現の増加、および
ＰｏｒＡおよびＯｐｃの安定化された高発現
から選択される、組み合わせ。
（項目６）
菌株Ｈ４４／７６  ＨＯＰＳ−ＤＬがＥＴ−５野生型菌株Ｈ４４／７６（Ｂ：１５：Ｐ１．７，１６：Ｌ，３，７：Ｐ５．５，Ｃ）に由来した、項目５に記載のワクチン菌株の組み合わせ。
（項目７）
菌株８５７０  ＨＯＰＳ−ＧＩＬがＥＴ−５野生型菌株８５７０（Ｂ：４：Ｐ  １．１９，１５：Ｌ３，７ｖ：Ｐ５．５，１１，Ｃ）に由来した、項目５に記載のワクチン菌株の組み合わせ。
（項目８）
菌株Ｂ１６Ｂ６  ＨＰＳ−Ｇ２ＬがＥＴ−３７野生型菌株Ｂ１６Ｂ６（Ｂ：２ａ：Ｐ  １．５，２：Ｌ２：Ｐ５．１，２，５）に由来する、項目５に記載のワクチン菌株の組み合わせ。
（項目９）
前記ＮＯＭＶを界面活性剤または変性溶媒へ曝露することなく充填細胞または消費した培養培地から調製する、項目１に記載のワクチン。
（項目１０）
前記ワクチンを賦形剤としての５％グルコースに懸濁する、項目１に記載のワクチン。
（項目１１）
前記ＮＯＭＶを、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、ＭＦ５９、ＣＰＧ−ＯＤＮ、またはＭＰＬＡを含む１つまたは複数のアジュバントと組み合わせる、項目１に記載のワクチン。
（項目１２）
髄膜炎菌性疾患に対する免疫のために筋肉内および／または鼻腔内に投与する項目１に記載のワクチンの使用方法。
（項目１３）
Ｂ群髄膜炎菌性疾患に対する免疫のために筋肉内および／または鼻腔内に投与する項目１に記載のワクチンの使用方法。
（項目１４）
髄膜炎菌の１つまたは複数の遺伝子改変菌株由来の未変性の外膜小胞（ＮＯＭＶ）を含む髄膜炎菌性疾患に対するワクチン組成物であって、前記１つまたは複数の遺伝子改変菌株が、
ｉ．ｓｙｎＸ遺伝子の不活化，
ｉｉ．ｌｐｘＬ１遺伝子の不活化、
ｉｉｉ．ラクト−Ｎ−ネオテトラオーステトラサッカリドを欠く短縮されたかまたは切り詰められたリポオリゴサッカリド（ＬＯＳ）が発現される各菌株中でのｌｇｔＡ遺伝子の不活化、および
ｉｖ．ｏｐａ遺伝子の代わりの少なくとも１つの第２の抗原性が異なるｐｏｒＡ遺伝子の挿入
によって改変された、ワクチン組成物。
（項目１５）
前記遺伝子改変菌株が少なくとも１つの微量保存外膜タンパク質の増加または安定した発現をさらに含む、項目１４に記載のワクチン組成物。
（項目１６）
前記遺伝子改変菌株が少なくとも１つの外膜タンパク質の安定化された発現をさらに含み、前記外膜タンパク質がＯｐｃおよびＰｏｒＡを含む群から選択される、項目１４から１５のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
（項目１７）
前記少なくとも１つの第２の抗原性が異なるｐｏｒＡ遺伝子が髄膜炎Ｂ群分離菌の最も一般的なＰｏｒＡ亜型から選択される少なくとも１つのＰｏｒＡ亜型タンパク質または亜型エピトープを発現する、項目１４から１６のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
（項目１８）
前記少なくとも１つの微量保存外膜タンパク質が、ＦＨＢＰ（ＧＮＡ１８７０）バリアント１、ＦＨＢＰバリアント２、ＦＨＢＰバリアント３、ＮａｄＡ、Ａｐｐ、ＮｓｐＡ、ＴｂｐＡ、およびＢからなる群から選択される、項目１５から１７に記載のワクチン組成物。
（項目１９）
菌株Ｈ４４／７６  ＨＯＰＳ−Ｄを含む髄膜炎菌亜型Ｂ菌株からの遺伝子改変されたワクチン菌株。
（項目２０）
以下：
ｉ）ｓｙｎＸ遺伝子の不活化、
ｉｉ）ｌｐｘＬ１遺伝子の不活化、
ｉｉｉ）ｌｇｔＡ遺伝子の不活化、
ｉｖ）ｏｐａＤ遺伝子の代わりの第２のｐｏｒＡ遺伝子の挿入、
ｖ）未変性菌株Ｈ４４／７６と比較して増加したＮａｄＡ発現、および
ｖｉ）Ｏｐｃタンパク質およびＰｏｒＡタンパク質発現の安定化された増加
の遺伝子改変を含む菌株Ｈ４４／７６由来の髄膜炎菌亜型Ｂからの遺伝子改変されたワクチン菌株。
（項目２１）
菌株Ｈ４４／７６  ＨＯＰＳ−ＤＬがＥＴ−５野生型菌株Ｈ４４／７６（Ｂ：１５：Ｐ１．７，１６：Ｌ，３，７：Ｐ５．５，Ｃ）に由来した、項目１９または２０に記載の遺伝子改変菌株。
（項目２２）
菌株８５７０  ＨＯＳ−Ｇ１を含む髄膜炎菌亜型Ｂからの遺伝子改変されたワクチン菌株。
（項目２３）
以下：
ｉ）ｓｙｎＸ遺伝子の不活化、
ｉｉ）ｌｐｘＬ１遺伝子の不活化、
ｉｉｉ）ｌｇｔＡ遺伝子の不活化、
ｉｖ）ｏｐａＤの代わりの第２のｐｏｒＡ遺伝子の挿入、
ｖ）Ｈ因子結合タンパク質バリアント１発現の増加、および
ｖｉ）ＰｏｒＡタンパク質およびＯｐｃタンパク質発現の安定化された増加
の遺伝子改変を含む８５７０由来の髄膜炎菌亜型Ｂ菌株からの遺伝子改変されたワクチン菌株。
（項目２４）
前記遺伝子改変菌株がＥＴ−５野生型菌株８５７０（Ｂ：４：Ｐ  １．１９，１５：Ｌ３，７ｖ：Ｐ５．５，１１，Ｃ）に由来した、項目２２または２３に記載の遺伝子改変菌株。
（項目２５）
菌株Ｂ１６Ｂ６  ＨＰＳ−Ｇ２Ａを含む髄膜炎菌亜型Ｂからの遺伝子改変されたワクチン菌株。
（項目２６）
以下：
ｉ）ｓｙｎＸ遺伝子の不活化、
ｉｉ）ｌｐｘＬ１遺伝子の不活化、
ｉｉｉ）ｌｇｔＡ遺伝子の不活化、
ｉｖ）ｏｐａＤの代わりの第２のｐｏｒＡ遺伝子（亜型Ｐ１．２２−１，４）の挿入、
ｖ）  Ｈ因子結合タンパク質バリアント２発現の増加、および
ｖｉ）ＰｏｒＡタンパク質およびＯｐｃタンパク質発現の安定化された増加
の遺伝子改変を含むＢ１６Ｂ６由来の髄膜炎菌亜型Ｂからの遺伝子改変されたワクチン菌株。
（項目２７）
前記遺伝子改変菌株がＥＴ−３７野生型菌株Ｂ１６Ｂ６（Ｂ：２ａ：Ｐ  １．５，２：Ｌ２：Ｐ５．１，２，５）に由来する、項目２５または２６に記載の遺伝子改変菌株。
（項目２８）
前記菌株を鉄欠損培地で生育させる、項目１９から２７のいずれか１項に記載の遺伝子改変菌株。
（項目２９）
ｓｙｎＸ遺伝子、ｌｐｘＬ１遺伝子、またはｌｇｔＡ遺伝子の不活化が不活化遺伝子配列内の薬物耐性遺伝子の挿入による、項目１９から２８のいずれか１項に記載の遺伝子改変菌株。
（項目３０）
項目２０から２９のいずれか１項に記載の１つまたは複数の遺伝子改変菌株由来のＮＯＭＶを含むワクチン組成物。
（項目３１）
前記ワクチン組成物が２つ以上の遺伝子改変菌株由来のＮＯＭＶを含む、項目３０に記載のワクチン組成物。
（項目３３）
前記ワクチン組成物が３つ以上の遺伝子改変菌株由来のＮＯＭＶを含む、項目３０に記載のワクチン組成物。
（項目３４）
前記ＮＯＭＶを界面活性剤または変性溶媒へ曝露することなく充填細胞または消費した培養培地から調製する、項目１から１８および３０から３３のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
（項目３５）
前記ワクチン組成物を賦形剤としての５％グルコースに懸濁する、項目１から１８および３０から３３のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
（項目３６）
前記ＮＯＭＶを１つまたは複数のアジュバントと組み合わせる、項目１から１８および３０から３３のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
（項目３７）
前記遺伝子改変した菌株を鉄取り込みタンパク質を発現するように変化させる、項目１から１８および３０から３３のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
（項目３８）
種々の未変性の外膜小胞（ＮＯＭＶ）を含む髄膜炎菌性疾患に対するワクチンであって、少なくともいくつかのＮＯＭＶがリポオリゴサッカリド（ＬＯＳ）の発現またはシアル酸化を本質的に含まず、ペンタ−アシル構造を有する脂質Ａを含むＬＯＳを含み、発現レベルの増加した少なくとも１つの微量保存外膜タンパク質を含み、前記微量保存外膜タンパク質が殺菌抗体を誘導するタンパク質から選択される、ワクチン。
（項目３９）
前記微量保存外膜タンパク質が、ＮａｄＡ、Ｈ因子結合タンパク質（ＦＨＢＰ）バリアント１、およびＦＨＢＰバリアント２からなる群から選択される、項目３８に記載のワクチン。
（項目４０）
少なくともいくつかのＮＯＭＶがラクト−Ｎ−ネオテトラオース（ＬＮｎＴ）テトラサッカリドを本質的に含まない短縮されたか、または切り詰められたＬＯＳを含む、項目３８に記載のワクチン。
（項目４１）
少なくともいくつかのＮＯＭＶが２つ以上の異なるＰｏｒＡタンパク質を含む、項目３８に記載のワクチン。
（項目４２）
前記少なくとも２つ以上の異なるＰｏｒＡタンパク質が、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）亜群Ｂ菌株の最も一般的な菌株から選択される、項目４３に記載のワクチン。
（項目４３）
髄膜炎菌性疾患に対する免疫のために項目１から１８および３０から３３のいずれか１項に記載の組成物を動物またはヒトに投与する工程を含む該動物または該ヒトにおいて髄膜炎菌性疾患に対する免疫応答を誘発する方法。
（項目４４）
前記ワクチンをＢ群髄膜炎菌性疾患に対する免疫のために使用する、項目４３に記載の方法。
（項目４５）
髄膜炎菌性疾患に対するワクチンで用いる髄膜炎菌の遺伝子改変菌株を調製する方法であって、
ａ）遺伝子改変することができる髄膜炎菌Ｂ型菌株を選択する工程、
ｂ）ｓｙｎＸ遺伝子の不活化によって前記菌株を遺伝子改変する工程，
ｃ）ｌｐｘＬ１遺伝子の不活化によって前記菌株を遺伝子改変する工程、
ｄ）ｌｇｔＡ遺伝子の不活化によって前記菌株を遺伝子改変する工程、および
ｅ）１つまたは複数の微量保存外膜タンパク質の発現の増加によって前記菌株を遺伝子改変する工程
を含む、方法。
（項目４６）
ｏｐａ遺伝子の読み取り枠への少なくとも１つの第２の抗原性が異なるｐｏｒＡ遺伝子の挿入によって前記菌株を遺伝子改変する工程をさらに含む、項目４５に記載の方法。
（項目４７）
少なくとも１つの外膜タンパク質のプロモーターまたは読み取り枠内のポリ−Ｃ配列をＧヌクレオチドおよびＣヌクレオチドを含む配列で置換することによって前記菌株を遺伝子改変して少なくとも１つの外膜タンパク質を安定的に発現させるか、または過剰発現させる工程をさらに含む、項目４５または４６に記載の方法。
（項目４８）
髄膜炎菌性疾患に対するワクチンを調製する方法であって、
ａ）以下：
ｉ．ｓｙｎＸ遺伝子の不活化，
ｉｉ．ｌｐｘＬ１遺伝子の不活化、
ｉｉｉ．ＩｇｔＡ遺伝子の不活化、
ｉｖ．ｏｐａ遺伝子の代わりの少なくとも１つの第２の抗原性が異なるｐｏｒＡ遺伝子の挿入、
ｖ．少なくとも１つの微量保存外膜タンパク質の増加した発現または安定した発現、および
ｖｉ．少なくとも１つの外膜タンパク質の安定化させた発現
からなる群から選択される１つまたは複数の改変を含む髄膜炎菌の遺伝子改変菌株を培養する工程、
ｂ）前記ａ）の培養菌株を使用して発酵槽内の培地に植菌して発酵することによって前記培養物を拡大する工程、
ｃ）前記発酵培養物を不活化する工程、
ｄ）連続フロー型遠心分離によって髄膜炎菌培養細胞を採取し、そして細胞ペーストを回収する工程、
ｅ）前記細胞ペーストからＮＯＭＶを単離する工程、および
ｆ）ワクチン投与に適切な緩衝液またはキャリアにＮＯＭＶを再懸濁する工程
を含む、方法。