【手続補正書】
【提出日】平成24年10月25日(2012.10.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５または９６によってコードされる配列を含む、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）に対する単離した遺伝子マーカーを含む組成物。
【請求項２】
配列番号：６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５または９６の相補的配列を含む組成物。
【請求項３】
配列番号：６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、または８５によってコードされる配列を含む、高リスクのヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）に対する単離した遺伝子マーカーを含む組成物。
【請求項４】
配列番号：１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５による配列によってコードされるオリゴヌクレオチドを含む組成物。
【請求項５】
配列番号：１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５の相補的配列を含む組成物。
【請求項６】
ＨＰＶのＥ１遺伝子に対して相同な配列を含む、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）に対する単離した遺伝子マーカーを含む組成物。
【請求項７】
前記配列がＨＰＶのＥ１遺伝子のヌクレオチド９８７〜１１３５を含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記配列が配列番号：６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５または９６によってコードされる、請求項６に記載の組成物。
【請求項９】
前記配列がＨＰＶのＥ１遺伝子に対して少なくとも７０％同一である、請求項６または７に記載の組成物。
【請求項１０】
前記配列がＨＰＶのＥ１遺伝子に対して少なくとも７０％相同である、請求項６または７に記載の組成物。
【請求項１１】
患者からの尿サンプルにおけるＨＰＶのＥ１遺伝子の１つ以上の配列を、該患者におけるヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）感染の指標とする方法であって、
該尿サンプルにおいてＨＰＶのＥ１遺伝子の１つ以上の配列を検出する工程
を含み、ＨＰＶのＥ１遺伝子の１つ以上の配列を検出することが、少なくとも１つのヒトパピローマウイルスの存在を示し、それによって該患者におけるＨＰＶ感染を示す、方法。
【請求項１２】
前記核酸がＤＮＡである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＤＮＡが経腎臓性ＤＮＡである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記検出工程が、ハイブリダイゼーション；ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）；ネステッ
ドプライマーＰＣＲ；リアルタイムＰＣＲ；ＮＡハイブリダイゼーション；サイクリックプローブ反応；一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）；鎖置換増幅（ＳＴＡ）；および制限断片長多型（ＲＦＬＰ）からなる群から選択される技術を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記検出工程が、ＨＰＶのＥ１遺伝子中の配列とハイブリダイズするのに十分に相補的なプライマーの対を使用するポリメラーゼ連鎖反応を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記検出工程が、配列番号：６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５または９６によってコードされる配列とハイブリダイズするのに十分に相補的なプライマーの対を使用するポリメラーゼ連鎖反応を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
前記ポリメラーゼ連鎖反応が、配列番号：４１および４２のプライマーの対を使用する、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ポリメラーゼ連鎖反応が、以下の配列番号：４３と５５、４４と５６、４５と３０、４６と５７、４７と５８、４８と３３、４９と３４、５０と３６、５１と５９、５２と３８、５３と３９、または５４と４０によってコードされるプライマーの対の少なくとも１つを使用する、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ポリメラーゼ連鎖反応が、配列番号：４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、および５４からなる群から選択される少なくとも１つの正方向プライマー、ならびに配列番号：５５、５６、３０、５７、５８、３３、３４、３５、３６、５９、３８、３９、および４０からなる群から選択される少なくとも１つの逆方向プライマーを使用する、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記ポリメラーゼ連鎖反応が、以下の配列番号：４３と５５、４４と５６、４５と３０、４６と５７、４８と３３、５０と３６、５１と５９、および５２と３８によってコードされるプライマーの対の少なくとも１つを使用する、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記ポリメラーゼ連鎖反応が、配列番号：４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、および５４からなる群から選択される少なくとも１つの正方向プライマー、ならびに配列番号：５５、５６、３０、５７、５８、３３、３５、３６、５９、３８、および３９からなる群から選択される少なくとも１つの逆方向プライマーを使用する、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項２２】
前記尿サンプルにおける核酸分解を減少させる、請求項１１に記載の方法。
【請求項２３】
核酸分解を減少させることが、上昇させたｐＨ、増大させた塩濃度、熱不活性化によって、または前記尿サンプルを、エチレンジアミン四酢酸、グアニジンＨＣＩ、グアニジンイソチオシアネート、Ｎ−ラウロイルサルコシン、およびドデシル硫酸ナトリウムからなる群から選択される化合物で処理することによって、ヌクレアーゼ活性を阻害することを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記検出工程が、前記尿サンプル中の前記核酸を実質的に単離する工程を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項２５】
前記単離が、沈降によるまたは固形吸着物質を用いることによるものである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
夾雑物を除去するために前記尿サンプルを濾過する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記濾過によって、約１０００超のヌクレオチドを含む核酸が除去される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記濾過によって、約３００超のヌクレオチドを含む核酸が除去される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記核酸を定量化する工程をさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
具体的には、本発明は、配列番号：６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５または９６によってコードされる配列を含むヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）に対する単離した遺伝子マーカーを含む組成物を提供する。あるいは、または加えて、本発明は、配列番号：６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５または９６の相補的配列を含む組成物を提供する。好ましい態様において、本発明は、配列番号：６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、または８５によってコードされる配列を含有する高リスクのヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）に対する単離した遺伝子マーカーを含む組成物を提供する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００９】
さらに本発明は、ＨＰＶのＥ１遺伝子に対して相同な配列を含むヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）に対する単離した遺伝子マーカーを含む組成物を提供する。一態様において、当該配列はＨＰＶのＥ１遺伝子のヌクレオチド９８７〜１１３５を含む。別の態様において、当該配列は配列番号：６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５または９６によってコードされる。本発明は、ＨＰＶのＥ１遺伝子に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％同一である、またはその間の任意のパーセンテージポイントである配列を包含する。好ましい実施形態において、当該配列はＨＰＶのＥ１遺伝子に対して少なくとも７０％同一である。本発明は、ＨＰＶのＥ１遺伝子に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％相同である、またはその間の任意のパーセンテージポイントである配列を包含する。好ましい実施形態において、当該配列はＨＰＶのＥ１遺伝子に対して少なくとも７０％相同である。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
当該検出工程は、ＨＰＶのＥ１遺伝子中の配列とハイブリダイズするのに十分に相補的なプライマーの対を使用するポリメラーゼ連鎖反応を含む。さらに、当該検出工程は、配列番号：６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５または９６によってコードされる配列とハイブリダイズするのに十分に相補的なプライマーの対を使用するポリメラーゼ連鎖反応を含む。あるいは、または加えて、当該検出工程は、配列番号：１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５によってコードされる配列、あるいはその相補的な配列とハイブリダイズするのに十分に相補的なプライマーの対を使用するポリメラーゼ連鎖反応を含む。本明細書に記載される方法がポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づく方法を用いてＨＰＶを検出する場合、当該ポリメラーゼ連鎖反応は配列番号：４１および４２のプライマーの対を使用する。配列番号：４１および４２のプライマーの対は、高リスク形態のＨＰＶを分別して検出する。あるいは、当該ポリメラーゼ連鎖反応は、以下の配列番号：４３と５５、４４と５６、４５と３０、４６と５７、４７と５８、４８と３３、４９と３４、５０と３６、５１と５９、５２と３８、５３と３９、または５４と４０によってコードされるプライマーの対の少なくとも１つを使用する。ある実施形態において、当該ポリメラーゼ連鎖反応は、配列番号：４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、および５４からなる群から選択される少なくとも１つの正方向プライマー、ならびに配列番号：５５、５６、３０、５７、５８、３３、３４、３５、３６、５９、３８、３９、および４０からなる群から選択される少なくとも１つの逆方向プライマーを使用する。当該ポリメラーゼ連鎖反応は、さらに、以下の配列番号：４３と５５、４４と５６、４５と３０、４６と５７、４８と３３、５０と３６、５１と５９、および５２と３８によってコードされるプライマーの対の少なくとも１つを使用する。ある態様において、当該ポリメラーゼ連鎖反応は、配列番号：４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、および５４からなる群から選択される少なくとも１つの正方向プライマー、ならびに配列番号：５５、５６、３０、５７、５８、３３、３５、３６、５９、３８、および３９からなる群から選択される少なくとも１つの逆方向プライマーを使用する。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
またこの方法は、前記核酸を定量化する工程をさらに含めている。定量化は、当該技術分野において既知の方法によって達成される。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
配列番号：６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、または９７によってコードされる配列を含む、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）に対する単離した遺伝子マーカーを含む組成物。
（項目２）
配列番号：６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、または９７の相補的配列を含む組成物。
（項目３）
配列番号：６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、または８５によってコードされる配列を含む、高リスクのヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）に対する単離した遺伝子マーカーを含む組成物。
（項目４）
配列番号：１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５による配列によってコードされるオリゴヌクレオチドを含む組成物。
（項目５）
配列番号：１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５の相補的配列を含む組成物。
（項目６）
ＨＰＶのＥ１遺伝子に対して相同な配列を含む、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）に対する単離した遺伝子マーカーを含む組成物。
（項目７）
前記配列がＨＰＶのＥ１遺伝子のヌクレオチド９８７〜１１３５を含む、項目６に記載の組成物。
（項目８）
前記配列が配列番号：６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、または９７によってコードされる、項目６に記載の組成物。
（項目９）
前記配列がＨＰＶのＥ１遺伝子に対して少なくとも７０％同一である、項目６または７に記載の組成物。
（項目１０）
前記配列がＨＰＶのＥ１遺伝子に対して少なくとも７０％相同である、項目６または７に記載の組成物。
（項目１１）
患者におけるヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）感染を診断する方法であって、
（ａ）該患者から尿サンプルを入手する工程；および
（ｂ）該尿サンプルにおいてＨＰＶのＥ１遺伝子の１つ以上の配列を検出する工程；
を含み、ＨＰＶのＥ１遺伝子の１つ以上の配列を検出することが、少なくとも１つのヒトパピローマウイルスの存在を示し、それによって患者におけるＨＰＶ感染を診断する、方法。
（項目１２）
前記核酸がＤＮＡである、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記ＤＮＡが経腎臓性ＤＮＡである、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記検出工程が、ハイブリダイゼーション；ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）；ネステッ
ドプライマーＰＣＲ；リアルタイムＰＣＲ；ＮＡハイブリダイゼーション；サイクリックプローブ反応；一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）；鎖置換増幅（ＳＴＡ）；および制限断片長多型（ＲＦＬＰ）からなる群から選択される技術を含む、項目１１に記載の方法。
（項目１５）
前記検出工程が、ＨＰＶのＥ１遺伝子中の配列とハイブリダイズするのに十分に相補的なプライマーの対を使用するポリメラーゼ連鎖反応を含む、項目１１に記載の方法。
（項目１６）
前記検出工程が、配列番号：６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、または９７によってコードされる配列とハイブリダイズするのに十分に相補的なプライマーの対を使用するポリメラーゼ連鎖反応を含む、項目１１に記載の方法。
（項目１７）
前記ポリメラーゼ連鎖反応が、配列番号：４１および４２のプライマーの対を使用する、項目１５または１６に記載の方法。
（項目１８）
前記ポリメラーゼ連鎖反応が、以下の配列番号：４３と５５、４４と５６、４５と３０、４６と５７、４７と５８、４８と３３、４９と３４、５０と３６、５１と５９、５２と３８、５３と３９、または５４と４０によってコードされるプライマーの対の少なくとも１つを使用する、項目１６または１７に記載の方法。
（項目１９）
前記ポリメラーゼ連鎖反応が、配列番号：４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、および５４からなる群から選択される少なくとも１つの正方向プライマー、ならびに配列番号：５５、５６、３０、５７、５８、３３、３４、３５、３６、５９、３８、３９、および４０からなる群から選択される少なくとも１つの逆方向プライマーを使用する、項目１６または１７に記載の方法。
（項目２０）
前記ポリメラーゼ連鎖反応が、以下の配列番号：４３と５５、４４と５６、４５と３０、４６と５７、４８と３３、５０と３６、５１と５９、および５２と３８によってコードされるプライマーの対の少なくとも１つを使用する、項目１６または１７に記載の方法。
（項目２１）
前記ポリメラーゼ連鎖反応が、配列番号：４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、および５４からなる群から選択される少なくとも１つの正方向プライマー、ならびに配列番号：５５、５６、３０、５７、５８、３３、３５、３６、５９、３８、および３９からなる群から選択される少なくとも１つの逆方向プライマーを使用する、項目１６または１７に記載の方法。
（項目２２）
前記尿サンプルにおける核酸分解を減少させる、項目１１に記載の方法。
（項目２３）
核酸分解を減少させることが、上昇させたｐＨ、増大させた塩濃度、熱不活性化によって、または前記尿サンプルを、エチレンジアミン四酢酸、グアニジンＨＣＩ、グアニジンイソチオシアネート、Ｎ−ラウロイルサルコシン、およびドデシル硫酸ナトリウムからなる群から選択される化合物で処理することによって、ヌクレアーゼ活性を阻害することを含む、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
工程（ｂ）が、前記尿サンプル中の前記核酸を実質的に単離する工程を含む、項目１１に記載の方法。
（項目２５）
前記単離が、沈降によるまたは固形吸着物質を用いることによるものである、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
夾雑物を除去するために前記尿サンプルを濾過する工程をさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目２７）
前記濾過によって、約１０００超のヌクレオチドを含む核酸が除去される、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
前記濾過によって、約３００超のヌクレオチドを含む核酸が除去される、項目２６に記載の方法。
（項目２９）
前記核酸を定量化する工程をさらに含む、項目１１に記載の方法。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３２】
【表１】
2012507293.tif 000001
本発明の実施に有用な核酸操作のための技術には、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｖｏｌ．１−３，ｅｄｓ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）；およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄｓ．Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８７）、ならびに定期的に更新したものが含まれるが、これに制限されない様々な参考
文献に記載されている。特定の記載は、本発明の範囲を制限することを意図するものではないが、本発明のある態様を実施する際に指針を提供する。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２３】
【表６】
2012507293.tif 000002
結果
計３２０の尿サンプルを、対応する子宮頸部試料のｈｃ２アッセイおよび細胞診検査の結果と比較するために、ＸｅｎｏｍｉｃｓのＣＥアッセイによって分析した。ｈｃ２に関する比較の結果を表７に示す。一致率は２４８／３２０（７７．５％）であった。３２０の尿サンプルのうち、７２は適合させた子宮頸部試料のｈｃ２アッセイと不一致の結果を出し、ＤＮＡシークエンシングによってさらに検証された。