【手続補正書】
【提出日】平成24年4月11日(2012.4.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸が少なくとも２つの変異体で生じる可能性がある場合に、試料中の標的核酸変異体の存在又は非存在を検出する方法であって、
（ａ）第１の標識を含む少なくとも１つの標識オリゴヌクレオチドを準備すること、ここで前記第１の標識が、少なくとも１つの発光部分を含み、前記標識オリゴヌクレオチドの少なくともサブ配列が、前記標的核酸の少なくともサブ配列と十分に相補的であり、そのため、選択された条件下で前記標識オリゴヌクレオチドが前記標的核酸とハイブリダイズし、
（ｂ）少なくとも１つの可溶性発光変更物質を準備すること、ここで前記変更物質が、前記標識オリゴヌクレオチドが組み込まれている二本鎖ＤＮＡと非共有結合で結合する際に前記第１の標識からの発光を消光し、前記標識オリゴヌクレオチドが一本鎖である時に前記可溶性発光変更物質の存在下で前記第１の標識の発光を著しくは消光しない、
（ｃ）選択された条件下での増幅反応において前記標識オリゴヌクレオチド及び前記可溶性発光変更物質の存在下で前記試料中の前記標的核酸を増幅すること、そのため、前記標識オリゴヌクレオチドが伸長されて、前記標識オリゴヌクレオチドが組み込まれている第１の二本鎖標識増幅産物が産生され、前記第１の標識増幅産物が、少なくとも２つの標的核酸変異体のうちどれが増幅されるか応じて、異なる融解温度を有し、
（ｄ）温度を変化させながら前記標識のシグナルをモニターすることにより、２つの一本鎖に解離された二本鎖標識増幅産物の融解温度を検出すること、及び
（ｅ）前記二本鎖標識増幅産物の融解温度を、少なくとも２つの標的変異体のうちの１つの存在と相関させ、それにより試料中の標的核酸変異体の存在又は非存在を検出することを含む方法。
【請求項２】
第２の標識を含む第２の標識オリゴヌクレオチドを準備することを更に含み、前記第２の標識が、少なくとも１つの発光部分を含み、前記第２の標識オリゴヌクレオチドの少なくともサブ配列が、少なくとも２つの変異体で生じる可能性がある前記標的核酸の少なくとも第２のサブ配列と十分に相補的であり、そのため、選択された条件下で前記第２の標識オリゴヌクレオチドが前記第２の標的核酸とハイブリダイズし、前記第２の標識からのシグナルを、前記第１の標識のシグナルと区別することができ、
前記少なくとも１つの可溶性発光変更物質が、前記第２の標識オリゴヌクレオチドが組み込まれている二本鎖ＤＮＡにインターカレートした際に、前記第２の標識からの発光を消光し、前記第２の標識オリゴヌクレオチドが、前記可溶性発光変更物質の存在下で一本鎖である時に前記第２の標識の発光を著しくは消光しない、
前記試料が、前記標的核酸の少なくとも１つの変異体を含み、前記増幅ステップ（ｃ）が、前記増幅反応において前記第２の標識オリゴヌクレオチドの存在下で前記試料中の核酸を増幅することを更に含み、そのため前記第２の標識オリゴヌクレオチドが伸長されて、前記第２の標識オリゴヌクレオチドが組み込まれている第２の標識増幅産物が産生され、前記第２の標識増幅産物が、少なくとも２つの標的核酸変異体のうちどれが増幅されるかに応じて、異なる融解温度を有し、
前記検出ステップ（ｄ）が、温度を変化させながら前記第２の標識のシグナルをモニターすることにより、前記第２の標識増幅産物の融解温度を検出することを更に含み、
前記相関ステップ（ｅ）が、前記第２の標識増幅産物の融解温度を、第２の標的核酸変異体の存在と相関させることを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記変更物質が、ジアジン染料、チアジン染料、アゾカルミン染料、フェナジン染料、オキサジン染料、ジエチルサフラニンアゾジメチルアニリンクロリド、メチレンブルー、メチレングリーン、チオニン、１，９−ジメチルメチレンブルー、ｓｙｍ−ジメチルチオニン、トルイジンブルーＯ、ニューメチレンブルー、メチレンバイオレットベルントゼン（bernthsen）、アズールＡ、アズールＢ、及びアズールＣからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記第１の標識及び／又は前記第２の標識が、ローダミン染料、フルオレッセイン染料、及びシアニン染料からなる群から選択される、請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記少なくとも２つの変異体の増幅産物の融解温度が、少なくとも５℃異なる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
標的核酸；
第１の標識を含む少なくとも１つの標識オリゴヌクレオチド、
ここで、前記第１の標識が少なくとも１つの発光部分を含み、前記標識オリゴヌクレオチドの少なくともサブ配列が、前記標的核酸の少なくともサブ配列と十分に相補的であり、そのため、選択された条件下で前記標識オリゴヌクレオチドが前記標的核酸とハイブリダイズする；
少なくとも１つの可溶性発光変更物質、
ここで、前記変更物質が、前記標識オリゴヌクレオチドが組み込まれている二本鎖ＤＮＡと結合する際に前記第１の標識からの発光を消光し、前記標識オリゴヌクレオチドが一本鎖である時に前記可溶性発光変更物質の存在下で前記第１の標識の発光を著しくは消光しない；
一本鎖又は二本鎖の第１の増幅産物ポリヌクレオチドであり、前記第１の増幅産物ポリヌクレオチドが、前記標識オリゴヌクレオチドの標識及び配列を含む第１の増幅産物ポリヌクレオチド
含む反応混合物。
【請求項７】
前記反応混合物が、緩衝液、塩、金属イオン、ヌクレオチド組み込み生体触媒、又はデオキシリボヌクレオチド三リン酸の１つ又は複数を更に含む、請求項６に記載の反応混合物。
【請求項８】
前記変更物質が、ジアジン染料、チアジン染料、アゾカルミン染料、フェナジン染料、オキサジン染料、ジエチルサフラニンアゾジメチルアニリンクロリド、メチレンブルー、メチレングリーン、チオニン、１，９−ジメチルメチレンブルー、ｓｙｍ−ジメチルチオニン、トルイジンブルーＯ、ニューメチレンブルー、メチレンバイオレットベルントゼン（bernthsen）、アズールＡ、アズールＢ、及びアズールＣからなる群から選択される、請求項６に記載の反応混合物。
【請求項９】
前記第１の標識が、ローダミン染料、フルオレッセイン染料、及びシアニン染料からなる群から選択される、請求項６に記載の反応混合物。
【請求項１０】
第２の標識を含む第２の標識オリゴヌクレオチド、ここで、前記第２の標識が、少なくとも１つの発光部分を含み、前記第２の標識オリゴヌクレオチドの少なくともサブ配列は、少なくとも２つの変異体で生じる可能性がある前記標的核酸の少なくとも第２のサブ配列と十分に相補的であり、そのため、選択された条件下で前記第２の標識オリゴヌクレオチドが前記第２の標的核酸とハイブリダイズし、前記第２の標識からのシグナルを、前記第１の標識のシグナルと区別することができ、
少なくとも１つの可溶性発光変更物質が、前記第２の標識オリゴヌクレオチドが組み込まれている二本鎖ＤＮＡにインターカレートした際に前記第２の標識からの発光を消光しし、前記第２の標識オリゴヌクレオチドが、前記可溶性発光変更物質の存在下で一本鎖である時に前記第２の標識の発光を著しくは消光しない；及び
一本鎖又は二本鎖の第２の増幅産物ポリヌクレオチド、ここで、前記第２の増幅産物ポリヌクレオチドが、前記標識オリゴヌクレオチドの標識及び配列を含む第２の増幅産物ポリヌクレオチドを
更に含む、請求項６に記載の反応混合物。
【請求項１１】
請求項１又は２に記載の方法により試料中の標的核酸変異体の存在又は非存在を検出するためのキットであって、
第１の標識を含む少なくとも１つの標識オリゴヌクレオチド、ここで、前記第１の標識が少なくとも１つの発光部分を含み、前記標識オリゴヌクレオチドの少なくともサブ配列が、前記標的核酸の少なくともサブ配列と十分に相補的であり、そのため、選択された条件下で前記標識オリゴヌクレオチドが前記標的核酸とハイブリダイズする；
少なくとも１つの可溶性発光変更物質、ここで、前記変更物質が、前記標識オリゴヌクレオチドが組み込まれている二本鎖ＤＮＡと結合する際に前記第１からの標識の発光を消光し、前記可溶性発光変更物質の存在下で前記標識オリゴヌクレオチドが一本鎖である時の前記第１の標識の発光を著しくは消光しない；及び
一本鎖又は二本鎖の第１の増幅産物ポリヌクレオチド、ここで、前記第１の増幅産物ポリヌクレオチドが、前記標識オリゴヌクレオチドの標識及び配列を含む
を含む、キット。