【手続補正書】
【提出日】平成26年11月7日(2014.11.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
予め定義された配列を有する少なくとも１種のポリヌクレオチドを製造する方法であって、
ａ．少なくとも第１および第２の複数の支持体結合一本鎖オリゴヌクレオチドを提供すること、ここで、第１および第２の複数のオリゴヌクレオチドの各々が、予め定義された配列を有し、支持体の別個の機構と結合しており、第１の複数のオリゴヌクレオチドの各々が、その３’末端に、第２の複数のオリゴヌクレオチドの３’末端の配列領域と相補的である配列領域を含む；
ｂ．鎖伸長反応において、第１および第２の複数の支持体結合オリゴヌクレオチドと相補的である少なくとも第１および第２の複数の構築オリゴヌクレオチドを作製すること；
ｃ．選択された機構で、複数の支持体結合アンカー一本鎖オリゴヌクレオチドを提供すること、ここで、複数の第１のアンカーオリゴヌクレオチドの５’末端が、第１の複数の支持体結合オリゴヌクレオチドの配列領域と同一である；
ｄ．少なくとも第１および第２の複数の構築オリゴヌクレオチドを、複数のアンカーオリゴヌクレオチドとハイブリダイズすること；
ｅ．少なくとも第１および第２の複数の構築オリゴヌクレオチドをライゲーションし、それによって少なくとも１種のポリヌクレオチドを作製すること；および
ｆ．任意に、少なくとも第３の複数のオリゴヌクレオチドを使用して、ステップｂからｅをさらに逐次反復し、複数のオリゴヌクレオチドの各々が、その３’末端に、次の複数のオリゴヌクレオチドの３’末端の配列領域と相補的である配列領域を含み、それによって、少なくとも１種のポリヌクレオチドを製造すること、
を含む、方法。
【請求項２】
少なくとも第１および第２の複数の構築オリゴヌクレオチドが、少なくとも第１および第２の複数の支持体結合オリゴヌクレオチドから解離され、
第１の複数の構築オリゴヌクレオチドを、第１の機構から選択された機構へ移すことおよび第２の複数の構築オリゴヌクレオチドを、第２の機構から選択された機構へ移すことをさらに含み、ここで、選択された機構が、複数の支持体結合アンカー一本鎖オリゴヌクレオチドを含み、選択された機構が、第１および第２の機構と同一支持体上にあるか、または選択された機構が、第１および第２の機構と異なる支持体上にある、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
さらに、
第３の複数の支持体結合一本鎖オリゴヌクレオチドを提供すること、ここで、第３の複数のオリゴヌクレオチドの各々が、予め定義された配列を有し、支持体の第３の別個の機構と結合しており、第３の複数のオリゴヌクレオチドの各々が、その３’末端に、第２の複数のオリゴヌクレオチドの３’末端の配列領域と相補的である配列領域を含む；
鎖伸長反応において、第３の複数の支持体結合オリゴヌクレオチドと相補的である第３の複数の構築オリゴヌクレオチドを作製すること；
選択された機構で、少なくとも第１、第２および第３の複数の構築オリゴヌクレオチドを、複数のアンカーオリゴヌクレオチドとハイブリダイズすること；および
少なくとも第１、第２および第３の複数の構築オリゴヌクレオチドをライゲーションし、それによって、少なくとも１種のポリヌクレオチドを製造すること、
を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
複数の支持体結合オリゴヌクレオチドの各々が、その３’末端にプライマー結合部位を有し、
プライマーの伸長を促進する条件下で、プライマーを、少なくとも第１および第２の複数の支持体結合オリゴヌクレオチドとアニーリングし、それによって伸長生成物二本鎖を形成することをさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
複数の支持体結合オリゴヌクレオチドが、固体支持体上で合成されるか、
複数の支持体結合オリゴヌクレオチドが、固体支持体上にスポットされるか、または
複数の支持体結合オリゴヌクレオチドが、その３’末端によって支持体上に固定化される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
支持体が、マイクロアレイデバイスである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
Ｎ個の複数の予め定義された支持体結合一本鎖オリゴヌクレオチドを提供すること、ここで、第１の複数のオリゴヌクレオチドが、その３’末端に、第２のオリゴヌクレオチドの３’末端の配列領域と相補的である配列領域を含み、複数のオリゴヌクレオチドＮが、その３’末端に、複数のオリゴヌクレオチド（Ｎ−１）の配列領域と相補的である配列領域を含む；および
その５’末端に、第１の複数の支持体結合オリゴヌクレオチドの配列領域と同一である配列を含む複数のアンカーオリゴヌクレオチドを提供すること、
を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
支持体結合一本鎖オリゴヌクレオチドと相補的であるＮ個の複数の構築オリゴヌクレオチドが作製され、Ｎ個の複数の構築オリゴヌクレオチドが、ポリヌクレオチドの全配列にまたがり、ギャップを含まない、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
第１の複数の支持体結合オリゴヌクレオチドの３’末端配列領域が、アンカーオリゴヌクレオチドの５’末端領域と同一である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
伸長二本鎖をさらに解離し、それによって、少なくとも第１および第２の複数の構築オリゴヌクレオチドを放出する、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
プライマー配列が、少なくとも１個のウラシルを含み、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）およびＤＮＡグリコシラーゼ−リアーゼエンドヌクレアーゼＶＩＩＩの混合物を使用して、プライマーを除去することをさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
予め定義された配列を有するポリヌクレオチドを作製する方法であって、
ａ．遊離一本鎖オーバーハングを含む複数の支持体結合二本鎖ポリヌクレオチドを合成し、複数のポリヌクレオチド配列が予め定義されたポリヌクレオチド配列を含むこと、ここで、一本鎖オーバーハングが、末端構築オリゴヌクレオチドの配列Ｎを含む；
ｂ．一本鎖オーバーハングを含むステム−ループオリゴヌクレオチドを提供すること、ここで、一本鎖オーバーハングが、末端構築オリゴヌクレオチド配列Ｎと相補的である；
ｃ．ステム−ループオリゴヌクレオチドを、予め定義された配列を有するポリヌクレオチドの遊離オーバーハングとハイブリダイズすること；
ｄ．ステム−ループオリゴヌクレオチドを、予め定義された配列を有するポリヌクレオチドの遊離オーバーハングとライゲーションすること；および
ｅ．末端構築オリゴヌクレオチド配列Ｎを含まないポリヌクレオチド配列を分解すること、
を含む、方法。
【請求項１３】
予め定義された配列を有するポリヌクレオチドを合成する方法であって、
ａ．（ｉ）５’末端が第１の複数のオリゴヌクレオチドの５’末端と相補的である、第１の複数の支持体結合アンカーオリゴヌクレオチドを有し、かつ（ｉｉ）５’末端が末端構築オリゴヌクレオチドＮと相補的である、第２の複数の支持体結合アンカーオリゴヌクレオチドを有する、支持体を提供すること；
ｂ．５’一本鎖オーバーハングを含む複数の支持体結合二本鎖ポリヌクレオチドを合成すること、ここで、複数のポリヌクレオチド配列が予め定義されたポリヌクレオチド配列を含み、予め定義されたポリヌクレオチド配列の一本鎖５’オーバーハングが、末端構築オリゴヌクレオチドＮ配列を含み、ポリヌクレオチド配列の一本鎖３’末端が、第１のオリゴヌクレオチド配列を含む；
ｃ．複数の合成されたポリヌクレオチドを、第１のアンカーオリゴヌクレオチドとハイブリダイズすること；および
ｄ．合成されたポリヌクレオチドをハイブリダイゼーション条件に付し、それによって、末端構築オリゴヌクレオチドＮを有するポリヌクレオチドの５’オーバーハングを、第２の複数のアンカーオリゴヌクレオチドの５’末端とハイブリダイズし、それによって、予め定義された配列を有するポリヌクレオチドを選択すること、
を含む、方法。
【請求項１４】
遊離３’または５’末端を有するポリヌクレオチド配列をさらに分解すること；
支持体から予め定義された配列を有するポリヌクレオチドをさらに放出すること；の一つ以上をさらに含み、
ポリヌクレオチドが、ＩＩ型エンドヌクレアーゼを使用して放出されるか、またはポリヌクレオチドが、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）およびＤＮＡグリコシラーゼ−リアーゼエンドヌクレアーゼＶＩＩＩの混合物を使用して放出される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
第１の複数のアンカーオリゴヌクレオチドが、第２の複数のアンカーオリゴヌクレオチドから、予め定義されたポリヌクレオチドの長さに対応する距離だけ離れている、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
支持体が、第１および第２のアンカーオリゴヌクレオチド間の距離を設定する支持体結合スペーサー一本鎖オリゴヌクレオチドをさらに含み、第１および第２のアンカーオリゴヌクレオチド間の距離が、第１および第２のアンカーオリゴヌクレオチドの濃度およびスペーサーオリゴヌクレオチドの濃度の関数である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
複数の支持体結合二本鎖ポリヌクレオチドが、複数の支持体結合一本鎖オリゴヌクレオチドを鋳型として使用するポリメラーゼ鎖伸長によって合成される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
ａ．固体支持体；
ｂ．固体支持体と関連している複数の別個の機構であって、各機構が、予め定義された配列を有する複数の支持体結合オリゴヌクレオチドを含み、第１の複数のオリゴヌクレオチドが、その５’末端に、第２のオリゴヌクレオチドの５’末端の配列領域と相補的である配列領域を含み、複数のオリゴヌクレオチドＮが、その５’末端に、複数のオリゴヌクレオチド（Ｎ−１）の５’末端配列領域と相補的である配列を含む機構；および
ｃ．その５’末端に、第１の複数の支持体結合オリゴヌクレオチドの配列領域と同一である配列を含む、少なくとも第１の複数のアンカーオリゴヌクレオチド、
を含む、核酸アレイ。
【請求項１９】
第２の複数の支持体結合アンカーオリゴヌクレオチドをさらに含み、第２のアンカーオリゴヌクレオチドの５’末端が、複数のオリゴヌクレオチドＮの５’末端と同一である、請求項１８に記載の核酸アレイ。
【請求項２０】
予め定義された配列を有する複数のポリヌクレオチドを製造する方法であって、
ａ．複数の機構を有する第１および第２の支持体を提供すること、ここで、各機構は、異なる予め定義された配列を有する複数の異なる支持体結合オリゴヌクレオチドを含む；
ｂ．複数の支持体結合オリゴヌクレオチドを鋳型として使用して、異なる予め定義された配列を有する第１および第２の複数の異なる構築オリゴヌクレオチドを作製すること、ここで、第１および第２の複数の構築オリゴヌクレオチドは、３’末端相補配列を有する；
ｃ．複数の機構を含む支持体を提供すること、ここで、各機構が、複数の支持体結合アンカー一本鎖オリゴヌクレオチドを含み、複数のアンカーオリゴヌクレオチド各々の５’末端が、第１の複数の構築オリゴヌクレオチドの５’末端と相補的である；
ｄ．第１の複数の構築オリゴヌクレオチドを、アンカーオリゴヌクレオチドとハイブリダイズすること；
ｅ．第２の複数の構築オリゴヌクレオチドを、第１の複数の構築オリゴヌクレオチドとハイブリダイズすること；
ｆ．任意に、第３の複数の構築オリゴヌクレオチドを、第２の複数の構築オリゴヌクレオチドと逐次ハイブリダイズすること；
ｇ．複数の構築オリゴヌクレオチドをライゲーションすること、
を含む、方法。
【請求項２１】
予め定義されたポリヌクレオチドの各々を定義する複数の構築オリゴヌクレオチドの各々が、異なる支持体上で合成されること；
複数の異なるポリヌクレオチドが、支持体結合アンカーオリゴヌクレオチドを含む支持体の異なる機構でアセンブルされること；
複数の第１の構築オリゴヌクレオチドを作製するステップが、プライマーの伸長を促進する条件下で、少なくとも１個のウラシルを有するプライマー配列を、第１の複数の支持体結合オリゴヌクレオチドとアニーリングすること、およびウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）およびＤＮＡグリコシラーゼ−リアーゼエンドヌクレアーゼＶＩＩＩの混合物を使用して、プライマーを除去すること、
のいずれか１つ以上が適用される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
予め定義された配列を有する複数のポリヌクレオチドを合成する方法であって、
ａ．複数の機構を含む第１の支持体を提供すること、ここで、各機構は、複数の支持体結合アンカー一本鎖オリゴヌクレオチドを含み、複数のアンカーオリゴヌクレオチド各々の５’末端が、第１の複数の構築オリゴヌクレオチドの５’末端と相補的である；
ｂ．複数の機構を有する第２の支持体を提供すること、ここで、各機構は、複数の一本鎖支持体結合鋳型オリゴヌクレオチドを含み、複数の支持体結合オリゴヌクレオチドは各々、異なる予め定義された配列を有する；
ｃ．複数の支持体結合オリゴヌクレオチドを鋳型として使用するポリメラーゼ伸長によって、第１の複数の構築オリゴヌクレオチドを作製すること；
ｄ．第２の支持体の各機構が、第１の支持体の対応する機構に対してアラインされるように、第１および第２の支持体を配置すること；
ｅ．第１の複数のオリゴヌクレオチドの複数の対応するアンカーオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを促進する条件下で、第１の複数の構築オリゴヌクレオチドを溶液中に放出すること；および
ｆ．任意に、第２の複数の構築オリゴヌクレオチドを含む第３の支持体を用いてステップｂ〜ｅを反復すること、ここで、第２および第３の複数の構築オリゴヌクレオチドは３’末端相補配列を有する、
を含む方法。
【請求項２３】
複数の第１の構築オリゴヌクレオチドを作製するステップが、プライマーの伸長を促進する条件下で、少なくとも１個のウラシルを有するプライマー配列を、第１の複数の支持体結合オリゴヌクレオチドとアニーリングすること、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）およびＤＮＡグリコシラーゼ−リアーゼエンドヌクレアーゼＶＩＩＩの混合物を使用してプライマーを除去すること；
第２の支持体の各機構が、複数のオリゴヌクレオチドを含み、複数のオリゴヌクレオチドが、異なる予め定義された配列を有するオリゴヌクレオチドの少なくとも２つの集団を含み、オリゴヌクレオチドの少なくとも２つの集団が相補配列を有すること；
第２の支持体が、第１の支持体の上部に向かい合って配置されること；
第１の複数の構築オリゴヌクレオチドを溶液中に放出するステップによって、アンカーオリゴヌクレオチドに向けた第１の複数のオリゴヌクレオチドの拡散が可能になること；
のいずれか１つ以上が適用され、
第１の複数の構築オリゴヌクレオチドの化学量論が、アンカーオリゴヌクレオチドの化学量論よりも高い；および／または
第３の支持体が、複数のアンカーオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションによって固定化された複数のポリヌクレオチドを含む、
請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
アンカーオリゴヌクレオチドおよび第２の複数の構築オリゴヌクレオチドをライゲーションすること、および／または複数のポリヌクレオチドを、ミスマッチヌクレオチドを含有する二本鎖ポリヌクレオチドの切断に適した条件下で、ミスマッチを認識し、切断する成分に曝露すること、をさらに含む、請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２５】
第１の複数の構築オリゴヌクレオチドを溶液中に放出するステップが、アンカーオリゴヌクレオチドに向けた構築オリゴヌクレオチドの実質的な垂直拡散を可能にする多孔性膜の存在下にあり、多孔性膜が、構築オリゴヌクレオチドの側方拡散を低減する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
オリゴヌクレオチドの２つの集団を溶液中に放出するステップによって、構築オリゴヌクレオチドの第１の集団の構築オリゴヌクレオチドの第２の集団とのハイブリダイゼーションおよびオリゴヌクレオチドの第１の集団のアンカーオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションが可能となる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
溶液が、リガーゼを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
複数のポリヌクレオチドが、支持体上に固定化されているか、または溶液中にある、請求項２２〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
ミスマッチを認識し、切断する成分が、ミスマッチエンドヌクレアーゼを含む、および／またはミスマッチ特異的エンドヌクレアーゼが、ＣＥＬ  Ｉ酵素である、請求項２４に記載の方法。