【手続補正書】
【提出日】平成26年8月29日(2014.8.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的の免疫原をコードするＲＮＡ分子を中に被包しているリポソームであって、ここで該リポソームは、ポリエチレングリコールが該リポソームの外側に存在するように、ポリエチレングリコール部分に結合した少なくとも１種の脂質を含み、ここで該ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分の平均分子量は、１ｋＤａ〜３ｋＤａである、リポソーム。
【請求項２】
目的の免疫原をコードするＲＮＡ分子を中に被包しているリポソームであって、ここで該リポソームは、ＰＥＧ−ＤＭＧ（１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）］）および／もしくは式（Ｘ）：
【化４】
2013536803.tif 000001
のポリマー改変脂質を含み、
ここで：
［Ｚ］ｎは、ポリ（オキサゾリン）、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（グリセロール）、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリ［Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド］およびポリ（アミノ酸）からなる群より選択される親水性ポリマー部分であり、［Ｚ］ｎは、直鎖状または分枝状であり；
各Ｚは、独立して、必要に応じて置換されてもよく；
ｎは、Ｚの１０〜２００ユニットの数平均重合度であり（そして種々のＺ基に関して最適化され得る）；
Ｌ１は、エーテル（例えば、−Ｏ−）、エステル（例えば、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−）、スクシネート（例えば、−Ｏ（Ｏ）Ｃ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）Ｏ−）、カルバメート（例えば、−ＯＣ（Ｏ）−ＮＲ’−）、カーボネート（例えば、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−）、ウレア（例えば、−ＮＲＣ（Ｏ）ＮＲ’−）、アミン（例えば、−ＮＲ’−）、アミド（例えば、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’−）、イミン（例えば、−Ｃ（ＮＲ’）−）、チオエーテル（例えば、−Ｓ−）、キサンテート（例えば、−ＯＣ（Ｓ）Ｓ−）、およびホスホジエステル（例えば、−ＯＰ（Ｏ）２Ｏ−）のうちの０個、１個もしくは２個を含む、必要に応じて置換された、Ｃ１−１０アルキレンもしくはＣ１−１０ヘテロアルキレンリンカーであり、ここでＲ’は、独立して、−Ｈ、−ＮＨ−、−ＮＨ２、−Ｏ−、−Ｓ−、ホスフェート、もしくは必要に応じて置換されたＣ１−１０アルキレンから選択され；
Ｘ１およびＸ２は、炭素、または−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−もしくはホスフェートから選択されるヘテロ原子から独立して選択され；
Ａ１およびＡ２は、いずれも、Ｃ６−３０アルキル、Ｃ６−３０アルケニル、およびＣ６−３０アルキニルから独立して選択され、ここでＡ１およびＡ２は、同じであっても異なっていてもよく、またはＡ１およびＡ２は、Ａ１およびＡ２が結合する炭素原子と一緒になって、必要に応じて置換されたステロイドを形成する、リポソーム。
【請求項３】
請求項１または２のいずれか１項に記載のリポソームであって、８０ｎｍ〜１６０ｎｍの範囲の直径を有する、リポソーム。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のリポソームであって、カチオン性頭部を有する脂質を含む、リポソーム。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のリポソームであって、両性イオン性頭部を有する脂質を含む、リポソーム。
【請求項６】
前記ＲＮＡ分子は、自己複製ＲＮＡ分子である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のリポソーム。
【請求項７】
前記自己複製ＲＮＡ分子は、
（ｉ）ＲＮＡを該自己複製ＲＮＡ分子から転写し得るＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、および
（ｉｉ）免疫原
をコードする、請求項６に記載のリポソーム。
【請求項８】
前記ＲＮＡ分子は、２個のオープンリーディングフレームを有し、該２個のオープンリーディングフレームのうちの第１のものは、アルファウイルスレプリカーゼをコードし、該２個のオープンリーディングフレームのうちの第２のものは、前記免疫原をコードする、請求項７に記載のリポソーム。
【請求項９】
前記ＲＮＡ分子は、９０００〜１２０００ヌクレオチド長である、請求項１〜８のいずれか１項に記載のリポソーム。
【請求項１０】
前記免疫原は、細菌、ウイルス、真菌もしくは寄生生物に対してインビボで免疫応答を誘発し得る、請求項１〜９のいずれか１項に記載のリポソーム。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載のリポソームであって、ＤｌｉｎＤＭＡ（１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン）、ＤＳＰＣ（１，２−ジアステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）、ＤＰｙＰＥ（１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、コレステロール、ＰＥＧ化脂質、またはこれらの組合せを含む、リポソーム。
【請求項１２】
前記ポリエチレングリコール部分が前記脂質の頭部に結合している、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のリポソーム。
【請求項１３】
前記リポソームは、大きな単層小胞（ＬＵＶ）である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のリポソーム。
【請求項１４】
リポソームの集団および免疫原をコードするＲＮＡ分子の集団を含む薬学的組成物であって、ここで該リポソームは脂質の集団を含み、ここで、該脂質の一部は、ポリエチレングリコール部分が該リポソームの外側に存在するように、ポリエチレングリコール部分に結合しており、ここで、該ポリエチレングリコール部分の平均分子量は、１ｋＤａ〜３ｋＤａであり、そして該ＲＮＡ分子の集団のうちの少なくとも半分がリポソーム中に被包されている、薬学的組成物。
【請求項１５】
前記リポソームの集団の平均直径は、６０ｎｍ〜１８０ｎｍの範囲にある、請求項１４に記載の薬学的組成物。
【請求項１６】
ポリエチレングリコール部分に結合した脂質分子の部分は、該組成物中の脂質の全量の１０％未満である、請求項１４または１５に記載の薬学的組成物。
【請求項１７】
前記リポソームの集団の多分散性指数は０．２未満である、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項１８】
脊椎動物における防御免疫応答を惹起するための、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のリポソームを含む組成物または請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
本発明はまた、ＲＮＡ含有リポソームを調製するためのプロセスを提供し、上記プロセスは、ＲＮＡと、１種以上の脂質とを、上記脂質が上記ＲＮＡを中に被包するリポソームを形成するような条件下で、混合する工程を包含し、ここで少なくとも１種の脂質は、上記プロセス中に上記リポソームの外側に位置するようになるポリエチレングリコール部分を含み、そして上記ポリエチレングリコールの平均分子量は、１ｋＤａ〜３ｋＤａである。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
目的の免疫原をコードするＲＮＡを中に被包しているリポソームであって、ここで該リポソームは、ポリエチレングリコールが該リポソームの外側に存在するように、ポリエチレングリコール部分を含む少なくとも１種の脂質を含み、ここで該ポリエチレングリコールの平均分子量は、１ｋＤａ〜３ｋＤａである、リポソーム。
（項目２）
ＰＥＧ−ＤＭＧおよび／もしくは式（Ｘ）の脂質を含む、項目１に記載のリポソーム。
（項目３）
前述の項目のいずれかに記載のリポソームであって、８０ｎｍ〜１６０ｎｍの範囲の直径を有する、リポソーム。
（項目４）
前述の項目のいずれかに記載のリポソームであって、カチオン性頭部を有する脂質を含む、リポソーム。
（項目５）
前述の項目のいずれかに記載のリポソームであって、両性イオン性頭部を有する脂質を含む、リポソーム。
（項目６）
前記ＲＮＡは、自己複製ＲＮＡである、前述の項目のいずれかに記載のリポソーム。
（項目７）
前記自己複製ＲＮＡ分子は、
（ｉ）ＲＮＡを該自己複製ＲＮＡ分子から転写し得るＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、および
（ｉｉ）免疫原
をコードする、項目６に記載のリポソーム。
（項目８）
前記ＲＮＡ分子は、２個のオープンリーディングフレームを有し、該２個のオープンリーディングフレームのうちの第１のものは、アルファウイルスレプリカーゼをコードし、該２個のオープンリーディングフレームのうちの第２のものは、前記免疫原をコードする、項目７に記載のリポソーム。
（項目９）
前記ＲＮＡ分子は、９０００〜１２０００ヌクレオチド長である、前述の項目のいずれかに記載のリポソーム。
（項目１０）
前記免疫原は、細菌、ウイルス、真菌もしくは寄生生物に対してインビボで免疫応答を誘発し得る、前述の項目のいずれかに記載のリポソーム。
（項目１１）
前述の項目のいずれかに記載のリポソームを含む、薬学的組成物。
（項目１２）
脊椎動物における防御免疫応答を惹起するための方法であって、該方法は、該脊椎動物に、項目１〜１０に記載のリポソームまたは項目１１に記載の薬学的組成物の有効量を投与する工程を包含する、方法。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
本発明での使用のための１つの適切なＰＥＧ化脂質は、実施例において使用されるとおり、ＰＥＧ−ＤＭＧである。図１７Ａ〜１７Ｅは、さらなる有用なＰＥＧ化脂質を示す。ＰＥＧ化コレステロールもまた、使用され得る。他のポリマー改変脂質、例えば、式（Ｘ）のポリマー改変脂質が使用され得る：
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２４】
ここで：
［Ｚ］ｎは、ＰＥＧ、ならびにポリ（オキサゾリン）、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（グリセロール）、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリ［Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド］およびポリ（アミノ酸）に基づくポリマーから選択される親水性頭部成分であり、ここで上記ポリマーは、直鎖状であっても分枝状であってもよく、そして上記ポリマーは、必要に応じて置換されていてもよく；
Ｚは、ｎサブユニットで重合され；
ｎは、Ｚの１０〜２００ユニットの数平均重合度であり（そして種々のＺ基に関して最適化され得る）；
Ｌ１は、エーテル（例えば、−Ｏ−）、エステル（例えば、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−）、スクシネート（例えば、−Ｏ（Ｏ）Ｃ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）Ｏ−）、カルバメート（例えば、−ＯＣ（Ｏ）−ＮＲ’−）、カーボネート（例えば、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−）、ウレア（例えば、−ＮＲＣ（Ｏ）ＮＲ’−）、アミン（例えば、−ＮＲ’−）、アミド（例えば、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’−）、イミン（例えば、−Ｃ（ＮＲ’）−）、チオエーテル（例えば、−Ｓ−）、キサンテート（例えば、−ＯＣ（Ｓ）Ｓ−）、およびホスホジエステル（例えば、−ＯＰ（Ｏ）２Ｏ−）のうちの０個、１個もしくは２個を含む、必要に応じて置換された、Ｃ１−１０アルキレンもしくはＣ１−１０ヘテロアルキレンリンカーであり、ここでＲ’は、独立して、−Ｈ、−ＮＨ−、−ＮＨ２、−Ｏ−、−Ｓ−、ホスフェート、もしくは必要に応じて置換されたＣ１−１０アルキレンから選択され；
Ｘ１およびＸ２は、炭素、または−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−もしくはホスフェートから選択されるヘテロ原子から独立して選択され；
Ａ１およびＡ２は、いずれも、Ｃ６−３０アルキル、Ｃ６−３０アルケニル、およびＣ６−３０アルキニルから独立して選択され、ここでＡ１およびＡ２は、同じであっても異なっていてもよく、またはＡ１およびＡ２は、Ａ１およびＡ２が結合する炭素原子と一緒になって、必要に応じて置換されたステロイドを形成する。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３１】
ここで：
［Ｚ］ｎは、ＰＥＧ、ならびにポリ（オキサゾリン）、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（グリセロール）、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリ［Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド］およびポリ（アミノ酸）に基づくポリマーから選択される親水性頭部成分であり、ここで上記ポリマーは、直鎖状であっても分枝状であってもよく、そして上記ポリマーは、必要に応じて置換されていてもよく；
ここでＺは、ｎサブユニットで重合され；
ｎは、Ｚの１０〜２００ユニットの数平均重合度であり、ここでｎは、種々のポリマータイプに関して最適化され；
Ｌ１は、エーテル（例えば、−Ｏ−）、エステル（例えば、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−）、スクシネート（例えば、−Ｏ（Ｏ）Ｃ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）Ｏ−））、カルバメート（例えば、−ＯＣ（Ｏ）−ＮＲ’−）、カーボネート（例えば、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−）、ウレア（例えば、−ＮＲＣ（Ｏ）ＮＲ’−）、アミン（例えば、−ＮＲ’−）、アミド（例えば、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’−）、イミン（例えば、−Ｃ（ＮＲ’）−）、チオエーテル（例えば、−Ｓ−）、キサンテート（例えば、−ＯＣ（Ｓ）Ｓ−）、およびホスホジエステル（例えば、−ＯＰ（Ｏ）２Ｏ−）のうちの０個、１個もしくは２個を含む、必要に応じて置換された、Ｃ１−１０アルキレンもしくはＣ１−１０ヘテロアルキレンリンカーであり、
ここでＲ’は、−Ｈ、−ＮＨ−、−ＮＨ２、−Ｏ−、−Ｓ−、ホスフェートもしくは必要に応じて置換されたＣ１−１０アルキレンから独立して選択され；
Ｘ１およびＸ２は、炭素、または−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−もしくはホスフェートから選択されるヘテロ原子から独立して選択され；
Ａ１およびＡ２は、Ｃ６−３０アルキル、Ｃ６−３０アルケニル、およびＣ６−３０アルキニルから独立して選択され、ここでＡ１およびＡ２は、同じであっても異なっていてもよく、またはＡ１およびＡ２は、Ａ１およびＡ２が結合する炭素原子と一緒になって、必要に応じて置換されたステロイドを形成する。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３３】
【化１１】
2013536803.tif 000002
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３４】
ここで
ＰＥＧは、ポリ（エチレングリコール）であり、ここで上記ＰＥＧは、直鎖状であっても分枝状であってもよく；
ｎは、エチレンオキシドの１０〜２００ユニット、好ましくは、約４５ユニットの数平均重合度であり；
Ｌ１は、エーテル、エステル、スクシネート、カルバメート、カーボネート、ウレア、アミン、アミド、イミン、チオエーテル、キサンテート、およびホスホジエステルのうちの１個もしくは２個を含む、必要に応じて置換されたＣ１−１０ヘテロアルキレンリンカーであり；
Ｘ１およびＸ２は、酸素で有り；
Ａ１およびＡ２は、Ｃ６−３０アルキル、Ｃ６−３０アルケニル、およびＣ６−３０アルキニルから独立して選択され、ここでＡ１およびＡ２は、同じであっても異なっていてもよく、またはここでＡ１およびＡ２は、Ａ１およびＡ２が結合する炭素原子と一緒になって、必要に応じて置換されたステロイドを形成する。