【誤訳訂正書】
【提出日】平成24年7月13日(2012.7.13)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸配列の特定位置の塩基の種類の存在を検出する方法であって、
ａ）検出すべきヌクレオチドと相補的な以下の式の末端リン酸標識ヌクレオチド及び残りの３種類のヌクレオチドであってホスファターゼと非反応性のヌクレオチドの反応を含む核酸ポリメラーゼ反応を実施して、標識ポリリン酸を生じさせる工程と
【化１】
2005501567.tif 000001
（式中、Ｐはリン酸（ＰＯ3）又はその誘導体であり、ｎは２以上であり、Ｙは酸素又は硫黄原子であり、Ｂは窒素含有の複素環式塩基であり、Ｓは非環式部分、炭素環式部分又は糖部分であり、Ｌは、天然又は修飾ヌクレオチドの末端リン酸でのリン酸エステル、チオエステル又はホスホロアミデート結合の形成に適したヒドロキシル基、スルフヒドリル基又はアミノ基を含むホスファターゼで活性化可能な標識であり、Ｐ−Ｌは、リン酸が除去されたときに独立に検出可能となるリン酸化標識である。）、
ｂ）上記標識ポリリン酸をホスファターゼと反応させて、検出可能な種を生じさせる工程、及び
ｃ）上記検出可能な種の存在を検出する工程
を含む方法。
【請求項２】
工程（ａ）がホスファターゼの存在下で前記ポリメラーゼ反応を実施することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記核酸配列がＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ｎが３以上である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記核酸配列を定量する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記検出可能な種が核酸配列の量に比例する量で生成する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記核酸配列が天然又は合成オリゴヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記核酸配列が染色体ＤＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記核酸配列がＤＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ポリメラーゼ反応が１種以上のＤＮＡ又はＲＮＡポリメラーゼの存在下で核酸配列をインキュベートする工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記ポリメラーゼ反応において１種以上の追加の検出試薬を添加する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記追加の検出試薬が、前記検出可能な種とは異なる応答によって検出できる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記追加の検出試薬が抗体である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ホスファターゼで活性化可能な標識が化学発光化合物、蛍光原色素、発色性色素、質量タグ、電気化学的タグ及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記検出可能な種が色、蛍光発光、化学発光、質量変化、還元／酸化電位又はそれらの組合せからなる群から選択される性質により検出可能である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記リン酸化標識が、２−（５’−クロロ−２’−ホスホリルオキシフェニル）−６−クロロ−４−（３Ｈ）−キナゾリノン、フルオレセイン二リン酸、フルオレセイン３’（６’）−Ｏ−アルキル−６’（３’）−リン酸、９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン−７−イル）リン酸、４−メチルウンベリフェリルリン酸、レゾルフィンリン酸、４−トリフルオロメチルウンベリフェリルリン酸、ウンベリフェリルリン酸、３−シアノウンベリフェリルリン酸、９，９−ジメチルアクリジン−２−オン−７−イルリン酸、６，８−ジフルオロ−４−メチルウンベリフェリルリン酸及びそれらの誘導体からなる群から選択される蛍光原部分である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記リン酸化標識が、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸、３−インドリルリン酸、ｐ−ニトロフェニルリン酸及びそれらの誘導体からなる群から選択される発色性部分である、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記化学発光化合物がホスファターゼで活性化された１，２−ジオキセタン化合物である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記１，２−ジオキセタン化合物が、２−クロロ−５−（４−メトキシスピロ［１，２−ジオキセタン−３，２’−（５−クロロ−）トリシクロ［３，３，１−１3,7］−デカン］−１−イル）−１−フェニルリン酸、クロロアダマント−２’−イリデンメトキシフェノキシリン酸化ジオキセタン、３−（２’−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４−（３”−ホスホリルオキシ）フェニル−１，２−ジオキセタン及びそれらの誘導体からなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記糖部分がリボシル、２’−デオキシリボシル、３’−デオキシリボシル、２’，３’−ジデオキシリボシル、２’，３’−ジデヒドロジデオキシリボシル、２’−アルコキシリボシル、２’−アジドリボシル、２’−アミノリボシル、２’−フルオロリボシル、２’−メルカプトリボシル、２’−アルキルチオリボシル、炭素環式、非環式及び他の修飾糖からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記塩基がウラシル、チミン、シトシン、５−メチルシトシン、グアニン、７−デアザグアニン、ヒポキサンチン、７−デアザヒポキサンチン、アデニン、７−デアザアデニン、２，６−ジアミノプリン又はそれらの類似体からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記検出可能な種で得られたスペクトルと既知のスペクトルとの比較により前記核酸配列を定量する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
核酸検出キットであって、
（ａ）次式の１種以上の末端リン酸標識ヌクレオチド
【化２】
2005501567.tif 000002
（式中、Ｐはリン酸（ＰＯ3）又はその誘導体であり、ｎは２以上であり、Ｙは酸素又は硫黄原子であり、Ｂは窒素含有の複素環式塩基であり、Ｓは非環式部分、炭素環式部分又は糖部分であり、Ｌは、天然又は修飾ヌクレオチドの末端リン酸でのリン酸エステル、チオエステル又はホスホロアミデート結合の形成に適したヒドロキシル基、スルフヒドリル基又はアミノ基を含むホスファターゼで活性化可能な標識であり、Ｐ−Ｌは、リン酸が除去されたときに独立に検出可能となるリン酸化標識である。）、
（ｂ）ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ及び逆転写酵素からなる群から選択される１種以上の酵素、及び
（ｃ）ホスファターゼ
を含む、キット。
【請求項２４】
ｎが３以上である、請求項２３に記載のキット。
【請求項２５】
前記糖部分がリボシル、２’−デオキシリボシル、３’−デオキシリボシル、２’，３’−ジデオキシリボシル、２’，３’−ジデヒドロジデオキシリボシル、２’−アルコキシリボシル、２’−アジドリボシル、２’−アミノリボシル、２’−フルオロリボシル、２’−メルカプトリボシル、２’−アルキルチオリボシル、炭素環式、非環式及び他の修飾糖からなる群から選択される、請求項２３に記載のキット。
【請求項２６】
前記塩基がウラシル、チミン、シトシン、５−メチルシトシン、グアニン、７−デアザグアニン、ヒポキサンチン、７−デアザヒポキサンチン、アデニン、７−デアザアデニン、２，６−ジアミノプリン又はそれらの類似体からなる群から選択される、請求項２３に記載のキット。
【請求項２７】
前記ホスファターゼで活性化可能な標識が化学発光化合物、蛍光原色素、発色性色素、質量タグ、電気化学的タグ及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項２３に記載のキット。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【書類名】  明細書
【発明の名称】  末端リン酸標識ヌクレオチド及び使用方法
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の規定に基づいて、２００１年８月２９日に出願した、米国仮出願第６０／３１５，７９８号の優先権を主張する。
【０００２】
【技術分野】
本発明は、一般に、核酸ポリメラーゼの基質として３個以上のリン酸を含む末端リン酸標識ヌクレオチドの使用に基づいて、試料中のポリヌクレオチドを検出する方法に関する。使用される標識は、酵素で活性化できるものであって、化学発光性、蛍光性、電気化学的及び発色性部分並びに質量タグを含む。
【０００３】
【背景技術】
高い特異性及び感度で試料中の特異的核酸又は分析物を検出する方法は公知である。かかる方法では一般に特異的な標的配列又は分析物の存在に基づいて最初に核酸配列を増幅する必要がある。増幅後に、増幅された配列を検出し、定量する。従来の核酸検出系には、蛍光標識の検出、蛍光性酵素連結検出系、抗体媒介標識検出及び放射性標識の検出が含まれる。
【０００４】
現在広く使用される検出方法の一つの短所は、最終標識生成物又は副生物から標識出発材料を分離する必要があることである。かかる分離は一般に検出のためにゲル電気泳動又はメンブラン上での標的配列の固定化を必要とする。さらに、検出には数多くの試薬及び／又はインキュベーション工程が必要とされることが多い。
【０００５】
ＤＮＡ及びＲＮＡポリメラーゼは、三リン酸部分のγ位に又はその代わりに修飾を有するヌクレオシドを認識及び利用することができることが知られている。さらに、様々なポリメラーゼがγ−修飾ヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）を認識及び利用する能力は、γリン酸に結合した部分に応じて変動することが知られている。一般に、ＲＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼよりも交雑性が高い。
【０００６】
γリン酸修飾ヌクレオチドの存在下でＲＮＡポリメラーゼからＲＮＡ合成をモニターするための比色アッセイは以前に報告されている。この以前の報告では、ＲＮＡポリメラーゼ反応は、γリン酸位がジニトロフェニル基で修飾されたγ修飾アルカリホスファターゼ耐性ヌクレオチド三リン酸の存在下で実施されている。ＲＮＡポリメラーゼ反応を、唯一のヌクレオチド三リン酸としてのこのγ修飾ＮＴＰ及びホモポリマー鋳型の存在下で行うと、ＲＮＡポリメラーゼは修飾ＮＴＰを認識及び利用することができることが判明している。さらに、ポリメラーゼ反応を、ホスホリル転移のｐ−ニトロフェニルピロリン酸のアルド生成物を消化して発色性ｐ−ニトロフェニレートを生じるアルカリホスファターゼの存在下で実施すると、吸光度が増大することが報告されている。この検出方法の短所は、アルカリホスファターゼの存在下で実施されるリアルタイム比色アッセイは、ホモポリマー鋳型でしか機能しないことである。
【０００７】
したがって、ヘテロポリマー鋳型の存在下でＲＮＡを検出する方法であって、アルカリホスファターゼと実質的に非反応性の唯一のヌクレオチドとして、１種類の末端リン酸修飾ヌクレオチドを使用することに限定されない方法を提供することができれば、有益であろう。これにより、ヘテロポリマー鋳型を用いたＲＮＡ合成のリアルタイムモニタリングのための単一試験管アッセイが可能となる。
【０００８】
末端リン酸の標識の種類を変えて、ＲＮＡポリメラーゼによる認識性及び利用性を高めることができる同様のＲＮＡアッセイを提供することができればさらに有益であろう。さらに、化学発光及び蛍光検出、質量又は還元電位による分析が可能で、しかも比色による検出性が向上し、検出に簡単な慣用機器操作しか必要とされないように、末端リン酸基の標識を変えることができれば望ましい。
【０００９】
末端修飾ヌクレオチドの認識及び利用に関してＲＮＡポリメラーゼよりもＤＮＡポリメラーゼの方が交雑性が低く、末端位置の基の種類がヌクレオチドに対するＤＮＡポリメラーゼの特異性に大きく影響し得ることが当技術分野で公知であることに鑑みれば、ＤＮＡポリメラーゼ活性をモニターすることによる非放射性のＤＮＡ検出法を提供することができれば極めて望ましい。さらに、ＤＮＡの合成及び検出をリアルタイムモニタリング用の単一試験管アッセイで達成することができ、ヌクレオチド基質の末端リン酸位の標識が、化学発光、蛍光及び比色検出並びに質量又は還元電位による分析を包含することができれば望ましいであろう。
【００１０】
【発明の概要】
本発明は、核酸配列の存在を検出する方法であって、ａ）ホスファターゼと実質的に非反応性の１種以上のヌクレオチド及び１種以上の末端リン酸標識ヌクレオチドの反応を含む核酸ポリメラーゼ反応を実施して、標識ポリリン酸を生じさせる工程、ｂ）標識ポリリン酸をホスファターゼと反応させて、検出可能な種を生じさせる工程、及びｃ）検出可能な種の存在を検出する工程を含む方法を提供する。本発明におけるホスファターゼの定義には、リン酸モノエステル、ポリリン酸及びヌクレオチドを開裂して無機リン酸を放出する任意の酵素が包含される。本発明の文脈で、この酵素は、末端標識ヌクレオシドリン酸を開裂しない（即ち、末端リン酸標識ヌクレオチドはホスファターゼと実質的に非反応性である）。本明細書中で提供されるホスファターゼの定義には、具体的には、限定するものではないが、アルカリホスファターゼ（ＥＣ３.１.３.１）及び酸性ホスファターゼ（ＥＣ３.１.３.２）が含まれる。本発明におけるヌクレオチドの定義には、天然又は修飾ヌクレオシドリン酸が含まれる。
【００１１】
本発明は、ＤＮＡ配列の存在を検出する方法であって、ａ）末端リン酸標識ヌクレオチドの存在下で、ＤＮＡポリメラーゼ反応を実施して、標識ポリリン酸を生じさせる工程、ｂ）標識ポリリン酸をホスファターゼと反応させて、検出可能な種を生じさせる工程、及びｃ）検出可能な種の存在を検出する工程を含む方法をさらに提供する。
【００１２】
また、核酸配列の存在を検出する方法であって、（ａ）ポリリン酸鎖中に４個以上のリン酸基を有する１種以上の末端リン酸標識ヌクレオチドの存在下で、核酸ポリメラーゼ反応を実施して、標識ポリリン酸を生じさせる工程、及び（ｂ）標識ポリリン酸を検出する工程を含む方法も提供する。
【００１３】
加えて、本発明は、核酸配列の存在を検出する方法であって、（ａ）ポリリン酸鎖中に４個以上のリン酸基を有する１種以上の末端リン酸標識ヌクレオチドの存在下で、核酸ポリメラーゼ反応を実施して、標識ポリリン酸を生じさせる工程、（ｂ）標識ポリリン酸をホスファターゼと反応させて、検出可能な種を生じさせる工程、及び（ｃ）検出可能な種の存在を検出する工程を含む方法に関する。
【００１４】
本発明のさらなる態様は、核酸を定量する方法であって、（ａ） ホスファターゼと実質的に非反応性のヌクレオチド及び１種以上の末端リン酸標識ヌクレオチドの反応を含む核酸ポリメラーゼ反応を実施して、標識ポリリン酸を生じさせる工程、（ｂ）標識ポリリン酸をホスファターゼと反応させて、検出可能な副生物種を核酸の量に実質的に比例した量で生じさせる工程、（ｃ）検出可能な種を測定する工程、及び（ｄ）測定値を既知の標準と比較して核酸の量を求める工程を含む方法に関する。
【００１５】
本発明は、さらに、ＤＮＡ配列を定量する方法であって、（ａ）末端リン酸標識ヌクレオチドの存在下で、ＤＮＡポリメラーゼ反応を実施して、標識ポリリン酸を生じさせる工程、（ｂ）標識ポリリン酸をホスファターゼと反応させて、検出可能な副生物種をＤＮＡ配列の量に実質的に比例した量で生じさせる工程、（ｃ）検出可能な種を測定する工程、及び（ｄ）測定値を既知の標準と比較してＤＮＡの量を求める工程を含む方法に関する。
【００１６】
本発明のもう一つの態様は、核酸配列中の単一のヌクレオチドを同定する方法であって、（ａ）１種以上の末端リン酸標識ヌクレオチドの存在下で、核酸ポリメラーゼ反応を実施して、標識ポリリン酸を生じさせる工程、（ｂ）標識ポリリン酸をホスファターゼと反応させて、検出可能な種を生じさせる工程、（ｃ）検出可能な種の存在を検出する工程、及び（ｄ）組み込まれたヌクレオシドを同定する工程を含む方法に関する。
【００１７】
また、核酸配列中の単一のヌクレオチドを同定する方法であって、（ａ）ポリリン酸鎖中に４個以上のリン酸基を有する１種以上の末端リン酸標識ヌクレオチドの存在下で、核酸ポリメラーゼ反応を実施して、標識ポリリン酸を生じさせる工程、（ｂ）標識ポリリン酸をホスファターゼと反応させて、検出可能な種を生じさせる工程、（ｃ）当該検出可能な種の存在を検出する工程、及び（ｄ）組み込まれたヌクレオシドを同定する工程を含む方法も提供する。
【００１８】
本発明はさらに、核酸検出キットであって、
（ａ）次の式Ｉの１種以上の末端リン酸標識ヌクレオチド
【化１】
2005501567.tif 000003
（式中、Ｐはリン酸（ＰＯ3）又はその誘導体であり、ｎは２以上であり、Ｙは酸素又は硫黄原子であり、Ｂは窒素含有の複素環式塩基であり、Ｓは非環式部分、炭素環式部分又は糖部分であり、Ｌは、天然又は修飾ヌクレオチドの末端リン酸でのリン酸エステル、チオエステル又はホスホロアミデート結合の形成に適したヒドロキシル基、スルフヒドリル基又はアミノ基を含む酵素で活性化可能な標識であり、Ｐ−Ｌは、リン酸が除去されたときに、好ましくは独立に検出可能となるリン酸化標識である。）、
（ｂ）１種以上のＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ又は逆転転写酵素、及び
（ｃ）ホスファターゼ
を含む、キットを包含する。
【００１９】
【発明を実施するための形態】
本明細書中で定義される「ヌクレオシド」という用語は、糖又は炭素環式もしくは非環式基のような糖代替物に１’位又は同等の位置で結合したプリン、デアザプリン、ピリミジン又は修飾塩基を含む化合物であり、２’−デオキシ及び２’−ヒドロキシル及び２’，３’−ジデオキシ形並びに他の置換基を含む。
【００２０】
本明細書中で用いる「ヌクレオチド」という用語は、ヌクレオシドのリン酸エステルをいい、エステル化部位は典型的には、ペントース糖のＣ−５位置に結合したヒドロキシル基に対応する。
【００２１】
「オリゴヌクレオチド」という用語には、デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシドなどを始めとする、ヌクレオチドの線状オリゴマー又はそれらの誘導体が包含される。本明細書を通して、オリゴヌクレオチドを文字列で表す場合には、常に、ヌクレオチドは、左から右に５’→３’の順序であり、別途記載しない限り、Ａはデオキシアデノシンを意味し、Ｃはデオキシシチジンを意味し、Ｇはデオキシグアノシンを意味し、Ｔはチミジンを意味する。
【００２２】
「プライマー」という用語は、ユニークな核酸配列に特異的にアニールして、そのユニークな配列の増幅を可能にする線状オリゴヌクレオチドを指す。
【００２３】
「標的核酸配列」などの用語は、本発明の１つ以上の方法によって、その配列の同一性又はヌクレオシドの順番もしくは位置を決定する核酸をいう。
【００２４】
本発明は、試料中のポリヌクレオチドを検出する方法に関するものであり、核酸ポリメラーゼ活性によってＲＮＡ又はＤＮＡ合成をモニターするための簡便なアッセイが用いられる。ＲＮＡ及びＤＮＡポリメラーゼは、ヌクレシド三リン酸（ＮＴＰ）又はデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）から、成長中のオリゴヌクレオチド鎖の３’ヒドロキシルへのヌクレオシド一リン酸の転移によってオリゴヌクレオチドを合成する。この反応を駆動する力は、酸無水物結合の開裂とそれに伴う無機ピロリン酸の形成である。本発明は、ヌクレオチドの末端リン酸の構造的修飾は、ポリメラーゼ反応におけるその機能を損なわないという知見を利用する。オリゴヌクレオチドの合成反応は、ヌクレオチドのα−及びβ−ホスホリル基のみでの直接な変化を伴い、末端リン酸位で修飾したヌクレオチドを核酸ポリメラーゼ反応の基質として役立てることができる。
【００２５】
特定の実施形態では、ポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼＩ、ＩＩもしくはＩＩＩ、又はＤＮＡポリメラーゼα、β、γなどのＤＮＡポリメラーゼ、又は末端デオキシヌクレオチジル転移酵素又はテロメラーゼである。他の実施形態では、適当なポリメラーゼには、限定するものではないが、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、プライマーゼ、又はＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（逆転転写酵素）が含まれる。
【００２６】
本発明で提供する方法は、末端リン酸に結合した電気化学的標識、質量タグ、又は比色性色素、化学発光性又は蛍光性標識を伴うデオキシヌクレオシドポリリン酸、ジデオキシヌクレオシドポリリン酸、炭素環式ヌクレオシドポリリン酸、又は非環式ヌクレオシドポリリン酸類似体のような、ヌクレオシドポリリン酸を利用する。核酸ポリメラーゼが基質としてこの類似体を用いる場合、酵素で活性化可能な標識は、ホスホリル転移の無機ポリリン酸副生物上に存在する。ホスファターゼによるホスホリル転移のポリリン酸生成物の開裂は、それに結合した標識に検出可能な変化を生じる。なお、ＲＮＡ及びＤＮＡポリメラーゼは、修飾末端ホスホリル基を有するヌクレオチドを認識することができるが、本発明者等はこの出発材料はホスファターゼの鋳型ではないと決定した。以下の反応式は、本発明の方法に最も関連した分子、つまり末端リン酸標識ヌクレオチド、標識ポリリン酸副生物及び酵素活性化標識を示す。
【化２】
2005501567.tif 000004
【００２７】
上記の反応式において、ｎは１以上であり、Ｒ1及びＲ2は独立にＨ、ＯＨ、ＳＨ、ＳＲ、ＯＲ、Ｆ、Ｂｒ、Ｃｌ、Ｉ、Ｎ3、ＮＨＲ又はＮＨ2であり、Ｂはヌクレオチド塩基又は修飾複素環式塩基であり、ＸはＯ、Ｓ又はＮＨであり、ＹはＯ、Ｓ又はＢＨ3であり、Ｌはホスファターゼで活性化可能な標識であって、発色性、蛍光原、化学発光分子、質量タグ、電気化学的タグとすることができる。質量タグは質量分析に適した低分子量の部分であり、質量の差によって他の成分から容易に識別できる。電気化学的タグは、容易に酸化又は還元できる種である。ｎが２以上である場合、このヌクレオチドは、ｎが１のときよりもポリメラーゼの格段に優れた基質であることが判明した。従って、好ましい実施形態では、ｎは２、３又は４であり、Ｒ1及びＲ2は独立にＨ又はＯＨであり、Ｘ及びＹはＯであり、Ｂはヌクレオチド塩基であり、Ｌは発色性、蛍光原又は化学発光分子である。
【００２８】
本明細書中で提供される核酸配列の存在を検出する方法の一実施形態では、本方法は、（ａ）１種類の末端リン酸標識ヌクレオチドに加えて、ホスファターゼと実質的に非反応性の１種以上のヌクレオチドの反応を含む核酸ポリメラーゼ反応を実施して、標識ポリリン酸を生じさせる工程、ｂ）標識ポリリン酸を、リン酸エステルの加水分解に適したホスファターゼと反応させて、検出可能な種を生じさせる工程、及びｃ）検出可能な種の存在を適当な手段で検出する工程を含む。この実施形態では、核酸ポリメラーゼ反応に用いられる鋳型は、ヘテロポリマー鋳型でもホモポリマー鋳型でもよい。末端リン酸標識ヌクレオチドとは、本明細書を通して、成長中のヌクレオチド鎖へのヌクレオシド一リン酸の組み込みに伴って放出された標識ポリリン酸が、ホスファターゼと反応して、検出可能な種を生成できることを意味する。反応に含まれる他のヌクレオチドはホスファターゼと実質的に非反応性であり、例えば、末端リン酸の位置で、検出可能な種の生成をもたらさない部分でブロックされていてもよい。この特別な実施形態における検出用の核酸としては、ＲＮＡ、天然又は合成オリゴヌクレオチド、ミトコンドリア又は染色体ＤＮＡが挙げられる。
【００２９】
本発明は、ＤＮＡ配列の存在を検出する方法であって、（ａ）末端リン酸標識ヌクレオチドの存在下で、ＤＮＡポリメラーゼ反応を実施して、標識ポリリン酸を生じさせる工程、（ｂ）標識ポリリン酸をホスファターゼと反応させて、検出可能な種を生じさせる工程、及び（ｃ）当該検出可能な種の存在を検出する工程を含む方法をさらに提供する。検出のためのＤＮＡ配列としては、細胞から単離されたＤＮＡ、重亜硫酸塩で処理されたメチル化ＤＮＡのような化学処理されたＤＮＡ、或いは当技術分野で公知の方法によって化学合成又は酵素的に合成したＤＮＡが挙げられる。かかる方法としては、DNA Structure Part A: Synthesis and Physical analysis of DNA, Lilley, D.M.J. and Dahlberg, J.E. (Eds.), Methods Enzymol., 211, Academic Press, Inc., New York (1992)に記載されたものが挙げられ、その記載内容は援用によって本明細書の内容の一部をなす。ＤＮＡ配列としては、さらに、染色体ＤＮＡ及び天然又は合成オリゴヌクレオチドが挙げられる。ＤＮＡは二本鎖又は一本鎖のいずれでもよい。
【００３０】
本発明の方法はさらに、ポリメラーゼ反応で１種以上の追加の検出試薬を含む工程を含んでいてもよい。追加の検出試薬は、検出可能な種とは異なる応答によって検出できるものであってもよい。例えば、追加の検出試薬は抗体であってもよい。
【００３１】
ポリメラーゼ反応における基質として添加するのに適したヌクレオチドとしては、デオキシリボヌクレオシドポリリン酸、リボヌクレオシドポリリン酸、ジデオキシヌクレオシドポリリン酸、炭素環式ヌクレオシドポリリン酸、及び非環式ヌクレオシドポリリン酸並びにそれらの類似体を始めとする、ヌクレオシドポリリン酸が挙げられる。特に望ましいのは、ポリリン酸鎖中に３、４又は５個のリン酸基を含むヌクレオチドであって末端リン酸が標識されたものである。
【００３２】
ポリリン酸鎖中に４個以上のリン酸を有する末端リン酸標識ヌクレオチドを含む実施形態では、ホスホリル転移の標識ポリリン酸副生物を、ホスファターゼ処理を使用せずに、検出し得ることも本発明の想定内にある。例えば、天然又は修飾ヌクレオシド塩基（特にグアニン）は蛍光マーカーの消光を引き起こすことが知られている。そのため、末端リン酸標識ヌクレオチドでは、標識が、塩基によって部分的に消光する。ヌクレオシド一リン酸が組み込まれると、標識ポリリン酸副生物は、その蛍光の増大によって検出し得る。或いは、蛍光、色、化学発光又は電気化学的検出による同定の前に、クロマトグラフィー分離法で標識ポリリン酸生成物を物理的に分離しておくことも可能である。加えて、質量分析を用いて、質量の差によって生成物を検出することもできる。
【００３３】
本発明の方法は、１種以上のＤＮＡ又はＲＮＡポリメラーゼの存在下でポリメラーゼ反応を実施することを含んでいてもよい。適当な核酸ポリメラーゼとしては、プライマーゼ、テロメラーゼ、末端デオキシヌクレオチジル転移酵素及び逆転転写酵素も挙げられる。ポリメラーゼ反応を起こすために核酸鋳型が必要とされることもあり、核酸鋳型をポリメラーゼ反応溶液に添加してもよい。本発明の検出方法における工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の全ては、単一の均一な反応混合液を用いて同時に行ってもよいし、或いは順次行ってもよい。
【００３４】
核酸ポリメラーゼ反応が、ポリメラーゼを利用した増幅方法を含んでいてもよいことは、本発明の十分な想定内である。かかる方法の例としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）及び核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）が挙げられる。例えば、標的分子がＤＮＡのような核酸ポリマーである場合には、それは、アデニン、チミン、シトシン、グアニン又は他の窒素複素環式塩基のようなγリン酸標識ヌクレオチド塩基のＤＮＡ分子へのＰＣＲ組み込みによって検出し得る。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）方法は、Saiki et al in Science Vol. 239, page 487, 1988, Mullis et al、米国特許第４，６８３，１９５号、Sambrook, J. et al. (Eds.), Molecular Cloning, second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1980)、 Ausubel, F.M. et al. (Eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY (1999)及びWu, R. (Ed.), Recombinant DNA Methodology II, Methods in Zumulogy, Academic Press, Inc., NY, (1995)に記載されている。ＰＣＲを用いると、ＤＮＡのような検出のための標的核酸は、それをＰＣＲ試薬及び適切なプライマーを含有する反応容器中に直接入れることによって増幅される。典型的には、標的核酸の少なくとも一部と配列が相補的なプライマーが選択される。
【００３５】
本発明の方法の工程（ａ）を実施するのに適した核酸ポリメラーゼ反応は、核酸配列を増幅する種々のＲＣＡ方法をさらに含んでいてもよい。例えば、Lizardi, Paul Mの米国特許第５，８５４，０３３号（その開示内容は援用によって本明細書の内容の一部をなす。）に開示されたものが有用である。ポリメラーゼ反応は、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）をさらに含んでいてもよく、その場合、系は、ＤＮＡでなく、ＲＮＡの増幅を伴い、増幅は等温性であり、一つの温度（４１℃）で起こる。標的ＲＮＡのＮＡＳＢＡによる増幅は、試料の標的ＲＮＡに対するオリゴヌクレオチドプライマーと共に、逆転転写酵素、Ｒｎａｓｅ  Ｈ及びＴ７ＲＮＡポリメラーゼの３種類の酵素の調和した活性を伴う。これらの酵素は、伸張、分解、ＤＮＡ合成及び環状ＲＮＡ増幅の４つの工程で標的一本鎖ＲＮＡの指数的増幅を触媒する。
【００３６】
ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＣＡ及びＮＡＳＢＡの方法では、概して、増幅生成物の定量によって標的核酸の初期量を間接的に測定する必要がある。増幅生成物は、典型的には、まずアガロースゲルでの電気泳動によって出発材料から分離して、増幅の成功を確認し、次いで、蛍光標識の検出、酵素結合検出系、抗体媒介標識検出及び放射性標識の検出のような、従来の核酸検出系を用いて定量する。対照的に、本方法では、ポリメラーゼ反応の生成物を検出するのに、出発材料からポリメラーゼ反応の生成物を分離しておく必要性はない。例えば、本発明では、レポーター分子（蛍光性、化学発光性又は発色性）又は他の有用な分子を、リン酸結合でマスクされている一定の条件下では検出できないように、ヌクレオチドに結合させる。ただし、成長オリゴヌクレオチド鎖にヌクレオチドが組み込まれかつ反応液をホスファターゼ処理した後は、標識はこれらの条件下で検出可能となる。例えば、１，３−ジクロロ−９，９−ジメチル−アクリジン−２−オン（ＤＤＡＯ）の三環式構造の側鎖のヒドロキシル基がヌクレオチドの末端リン酸位に結合している場合には、ＤＤＡＯは６５９ｎｍで蛍光発光しない。ＤＮＡにヌクレオシド一リン酸が組み込まれると、他方の生成物であるＤＤＡＯポリリン酸（これも６５９ｎｍで蛍光発光しない）はホスファターゼの基質である。いったん脱リン酸化して、ＤＤＡＯが生じると、色素部分は６５９ｎｍで蛍光性となり、検出可能となる。ポリリン酸生成物の特異的分析はポリメラーゼ反応溶液中で実施することができるので、出発材料から反応生成物を分離する必要性がなくなる。このスキームによって、分光光度計のような慣用機器を用いて、ポリメラーゼ反応で生成した核酸の検出及び任意には定量が可能となる。
【００３７】
上述の方法で、ポリメラーゼ反応工程はさらに、標識ポリリン酸副生物を検出可能な標識へと転化させるホスファターゼの存在下でポリメラーゼ反応を実施することを含んでいてもよい。こうして、核酸配列の存在を検出するための簡便なアッセイが確立され、検出可能な種の形成を連続的に監視することができる。これは、単一の試験管内で実施できる均一アッセイフォーマットを表す。
【００３８】
上述のアッセイ方法の一つのフォーマットとしては、限定するものではないが、検出可能な種（例えば末端リン酸修飾ＡＴＰ）を生成することのできる１種類の末端リン酸標識ヌクレオチドの存在下でポリメラーゼ反応を実施することがあり、他の全てのヌクレオチドはホスファターゼと実質的に非反応性であるが、検出不能な種を生成する。
【００３９】
別のアッセイフォーマットでは、各々独自に検出可能な種を生成することのできる２種以上の末端リン酸標識ヌクレオチドの存在下でポリメラーゼ反応を実施してもよい。例えば、アッセイは、ホスホリル転移の無機ポリリン酸副生物から酵素で遊離させたときに第一の波長で発光する第一の標識を伴う第一のヌクレオチド（例えば、アデニンポリリン酸）と、第二の波長で発光する第二の標識を伴う第二のヌクレオチド（例えば、グアノシンポリリン酸）とを含んでいてもよい。望ましくは、第一及び第二の波長での発光は、実質的にほとんど或いは全く重なり合わない。従って、ヌクレオシド配列情報に基づく多重の同時アッセイを、ポリリン酸から放出される特定の標識に基づいて導き出すことができることは本発明の想定内である。
【００４０】
上述の核酸配列の存在を検出する方法の一つの態様では、末端リン酸標識ヌクレオチドは、以下の構造（式Ｉ）で表すことができる。
【化３】
2005501567.tif 000005
（式中、Ｐはリン酸（ＰＯ3）又はその誘導体であり、ｎは２以上であり、Ｙは酸素又は硫黄原子であり、Ｂは窒素含有の複素環式塩基であり、Ｓは非環式部分、炭素環式部分又は糖部分であり、Ｌは、天然又は修飾ヌクレオチドの末端リン酸でのリン酸エステル、チオエステル又はホスホロアミデート結合の形成に適したヒドロキシル基、スルフヒドリル基又はアミノ基を含む酵素で活性化可能な標識であり、Ｐ−Ｌは、リン酸が除去されたときに、好ましくは独立に検出可能となるリン酸化標識である。）。
【００４１】
本発明の方法の目的には、有用な炭素環式部分は、Ferraro, M. and Gotor, V. in Chem Rev. 2000, volume 100, 4319-48に記載されている。適当な糖部分は、Joeng, L.S. et al., in J Med. Chem. 1993, vol. 356, 2627-38、Kim H.O. et al., in J Med. Chem. 193, vol. 36, 30-7; and by Eschenmosser A., in Science 1999, vol. 284, 2118-2124に記載されている。さらに、有用な非環式部分は、Martinez, C.I., et al., in Nucleic Acids Research 1999, vol. 27, 1271-1274、Martinez, C.I., et al., in Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 1997, vol. 7, 3013-3016及びTrainer, G.Lへの米国特許第５，５５８，９１号に記載されている。これらの部分の構造を以下に示すが、すべての部分についてＲはＨ、ＯＨ、ＮＨＲ、Ｆ、Ｎ3、ＳＨ、ＳＲ、ＯＲ、低級アルキル及びアリ−ルであり、糖部分ではＸ及びＹは独立にＯ、Ｓ又はＮＨであり、非環式部分ではＸ＝Ｏ、Ｓ、ＮＨ、ＮＲである。
【化４】
2005501567.tif 000006
【００４２】
特定の実施形態では、式Ｉにおける糖部分は、リボシル、２’−デオキシリボシル、３’−デオキシリボシル、２’，３’−ジデヒドロジデオキシリボシル、２’，３’−ジデオキシリボシル、２’−又は３’−アルコキシリボシル、２’−又は３’−アミノリボシル、２’−又は３’−フルオロリボシル、２’−又は３’−メルカプトリボシル、２’−又は３’−アルキルチオリボシル、非環式、炭素環式及び他の修飾糖から選択し得る。
【００４３】
さらに、式Ｉで、塩基としては、ウラシル、チミン、シトシン、５−メチルシトシン、グアニン、７−デアザグアニン、ヒポキサンチン、７−デアザヒポキサンチン、アデニン、７−デアザアデニン、２，６−ジアミノプリン又はそれらの類似体が挙げられる。
【００４４】
末端リン酸標識ヌクレオチドにおいて末端リン酸位で結合する標識は、１，２−ジオキセタン化学発光化合物、蛍光原色素、発色性色素、質量タグ及び電気化学的タグからなる群から選択し得る。こうして、検出可能な種は、色、蛍光発光、化学発光、質量変化、電気化学的検出又はこれらの組合せのいずれかの存在によって検出可能となる。
【００４５】
式Ｉのリン酸化標識が蛍光原部分である場合には、それは、望ましくは以下のもの（全てモノリン酸エステルとして示す）：ＥＬＦ９７という商品名（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社）で市販されている２−（５’−クロロ−２’−ホスホリルオキシフェニル）−６−クロロ−４−（３Ｈ）−キナゾリノン、フルオレセイン二リン酸（四アンモニウム塩）、フルオレセイン３’（６’）−Ｏ−アルキル−６’（３’）−リン酸、９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン−７−イル）リン酸（二アンモニウム塩）、４−メチルウンベリフェリルリン酸（遊離酸）、レゾルフィンリン酸、４−トリフルオロメチルウンベリフェリルリン酸、ウンベリフェリルリン酸、３−シアノウンベリフェリルリン酸、９，９−ジメチルアクリジン−２−オン−７−イルリン酸、６，８−ジフルオロ−４−メチルウンベリフェリルリン酸及びそれらの誘導体から選択される。これらの色素の構造を以下に示す。
【化５】
2005501567.tif 000007
【化６】
2005501567.tif 000008
【化７】
2005501567.tif 000009
【００４６】
上記の式Ｉのリン酸化標識部分が発色性部分である場合には、それは、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸、３−インドリルリン酸、ｐ−ニトロフェニルリン酸及びそれらの誘導体から選択される。これらの発色性色素の構造を、以下にモノリン酸エステルとして示す。
【化８】
2005501567.tif 000010
【００４７】
末端リン酸位の部分はさらに化学発光物質であってもよく、その場合、ホスファターゼ−活性化１，２−ジオキセタン化合物であるのが望ましい。１，２−ジオキセタン化合物としては、限定するものではないが、ＣＤＰ−Ｓｔａｒという商品名（Ｔｒｏｐｉｘ社（米国マサチューセッツ州ベッドフォード））で市販されている２−クロロ−５−（４−メトキシスピロ［１，２−ジオキセタン−３，２’−（５−クロロ−）トリシクロ［３，３，１−１3,7］−デカン］−１−イル）−１−フェニルリン酸二ナトリウム、ＣＳＰＤという商品名（Ｔｒｏｐｉｘ社）で市販されているクロロアダマント−２’−イリデンメトキシフェノキシリン酸化ジオキセタン、ＡＭＰＰＤという商品名（Ｔｒｏｐｉｘ社）で市販されている３−（２’−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４−（３”−ホスホリルオキシ）フェニル−１，２−ジオキセタンが挙げられる。これらの市販ジオキセタン化合物の構造は、米国特許第５，５８２，９８０号、第５，１１２，９６０号及び第４，９７８，６１４号（その開示内容は援用によって本明細書の内容の一部をなす。）に、それぞれ、開示されている。
【００４８】
上記で説明した方法はさらに、核酸配列を定量する工程を含んでいてもよい。これに関連する態様では、検出可能な種は、増幅された核酸配列の量に実質的に比例した量で生成する。核酸配列の定量工程は、検出可能な種で得られたスペクトルと既知のスペクトルとの比較によって行うのが望ましい。
【００４９】
一実施形態では、本発明は、核酸の定量方法であって、（ａ）１種類以上の末端リン酸標識ヌクレオチドに加えて、ホスファターゼと実質的に非反応性の１種以上のヌクレオチドの反応を含む核酸ポリメラーゼ反応を実施して、標識ポリリン酸を生じさせる工程、（ｂ）標識ポリリン酸をホスファターゼと反応させて、検出可能な副生物種を、定量すべき核酸の量に実質的に比例した量で生じさせる工程、（ｃ）検出可能な種を測定する工程、及び（ｄ）測定値を既知の標準と比較して核酸の量を求める工程を含む方法を提供する。この実施形態の核酸の定量方法では、定量すべき核酸はＲＮＡとすることができる。核酸はさらに、天然又は合成オリゴヌクレオチド、染色体ＤＮＡ、又はＤＮＡであってもよい。
【００５０】
本発明はさらに、核酸の定量方法であって、（ａ）末端リン酸標識ヌクレオチドの存在下で核酸ポリメラーゼ反応を実施して、標識ポリリン酸を生じさせる工程、（ｂ）標識ポリリン酸をホスファターゼと反応させて、検出可能な副生物種を、定量すべき核酸配列の量に実質的に比例した量で生じさせる工程、（ｃ）検出可能な種を測定する工程、及び（ｄ）測定値を既知の標準と比較して核酸の量を求める工程を含む方法を提供する。この実施形態では、定量のための核酸配列には、天然又は合成オリゴヌクレオチド、又は染色体ＤＮＡを始めとする細胞から単離されたＤＮＡが挙げられる。
【００５１】
上記で説明した核酸配列の各定量方法において、ポリメラーゼ反応工程はさらに、ホスファターゼの存在下でポリメラーゼ反応を実施することを含んでいてもよい。この明細書の前半で説明した通り、これによって、核酸ポリメラーゼ活性のリアルタイムモニタリング、及び定量のための標的核酸配列のリアルタイム検出が可能となる。
【００５２】
本明細書中で提供する核酸配列の定量方法に有用な末端リン酸標識ヌクレオチドは、上述の式Ｉで表すことができる。酵素で活性化可能な標識はホスファターゼの酵素活性によって検出可能となり、ホスファターゼは、標識と天然又は修飾ヌクレオチドの末端リン酸との間のリン酸エステル結合を変化させて検出可能な種を生じさせる。検出可能な種は、色、蛍光発光、化学発光、質量変化、電気化学的電位のいずれか又はそれらの組合せの存在によって検出できる。上記で既に説明した通り、酵素で活性化可能な標識は、１，２−ジオキセタン化学発光化合物、蛍光原色素、発色性色素、質量タグ及び電気化学的タグ又はそれらの組合せとし得る。適当な標識は上記で説明した通りである。
【００５３】
実施例の項でさらに詳細に説明する通り、本発明は、標的核酸配列における単一のヌクレオチドの同一性を決定する方法を提供する。これらの方法は、（ａ）１種以上の末端リン酸標識ヌクレオチドの存在下で、核酸ポリメラーゼ反応を実施して、標識ポリリン酸を生じさせる工程、（ｂ）標識ポリリン酸をホスファターゼと反応させて、検出可能な種を生じさせる工程、（ｃ）検出可能な種の存在を検出する工程、及び（ｄ）組み込まれたヌクレオシドを同定する工程を含む。望ましい実施形態では、末端リン酸標識ヌクレオチドは、ポリリン酸鎖の中に４個以上のリン酸を含む。
【００５４】
本発明のもう一つの態様は、核酸検出キットであって、
（ａ）次の式Ｉの１種以上の末端リン酸標識ヌクレオチド
【化９】
2005501567.tif 000011
（式中、Ｐはリン酸（ＰＯ3）又はその誘導体であり、ｎは２以上であり、Ｙは酸素又は硫黄原子であり、Ｂは窒素含有の複素環式塩基であり、Ｓは非環式部分、炭素環式部分又は糖部分であり、Ｌは、天然又は修飾ヌクレオチドの末端リン酸でのリン酸エステル、チオエステル又はホスホロアミデート結合の形成に適したヒドロキシル基、スルフヒドリル基又はアミノ基を含む酵素で活性化可能な標識であり、Ｐ−Ｌは、リン酸が除去されたときに、好ましくは独立に検出可能となるリン酸化標識である。）、
（ｂ）１種以上のＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ又は逆転転写酵素、及び
（ｃ）ホスファターゼ
を含む、キットに関する。
【００５５】
キットに含まれる末端リン酸標識ヌクレオチド中の糖部分には、限定するものではないが、リボシル、２’−デオキシリボシル、３’−デオキシリボシル、２’，３’−ジデヒドロジデオキシリボシル、２’，３’−ジデオキシリボシル、２’−又は３’−アルコキシリボシル、２’−又は３’−アミノリボシル、２’−又は３’−フルオロリボシル、２’−又は３’−メルカプトリボシル、２’−又は３’−アルキルチオリボシル、非環式、炭素環式及び他の修飾糖が含まれる。
【００５６】
塩基は、限定するものではないが、ウラシル、チミン、シトシン、５−メチルシトシン、グアニン、７−デアザグアニン、ヒポキサンチン、７−デアザヒポキサンチン、アデニン、７−デアザアデニン、及び２，６−ジアミノプリン並びにそれらの類似体とし得る。
【００５７】
さらに、上記で説明したように、酵素で活性化可能な標識は、１，２−ジオキセタン化学発光化合物、蛍光原色素、発色性色素、質量タグ及び電気化学的タグ又はそれらの組合せとし得る。ヌクレオチドの末端リン酸位で結合に適当な化合物は、上記で説明した通りである。
【００５８】
【実施例】
実施例１
γ−（４−トリフルオロメチルクマリニル）ｄｄＧＴＰ（γＣＦ3クマリン−ｄｄＧＴＰ）の調製
ｄｄＧＴＰ（４６.４ｍＭ溶液２００μｌ、＞９６％純度）を無水ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、２×０.５ｍｌ）と共蒸発させた。これに、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ、９.６ｍｇ、５当量）を加えて、混合液を再び無水ＤＭＦ（０.５ｍｌ）と共蒸発させた。残渣を無水ＤＭＦ（０.５ｍｌ）中に取って、混合液を一晩攪拌した。未環化三リン酸が依然として約２０％存在していた（カラム上での環化トリメタリン酸の加水分解に起因する可能性がある）。混合液にさらに２当量のＤＣＣを加えて、２時間攪拌後に、７−ヒドロキシ−４−トリフルオロメチルクマリン（４−トリフルオロメチルウンベリフェロン、４２.７ｍｇ，２０当量）及びトリエチルアミン（２０μｌ、２０当量）を加えて、混合液を室温で攪拌した。２日後に、ＨＰＬＣ（１５分間で０.１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＡ）中の０〜３０％アセトニトリル、５分間で３０〜５０％アセトニトリル、１０分間で５０〜１００％アセトニトリル、Ｃ１８ ３.９×１５０ｍｍカラム、流速１ｍｌ／分）によって、９.７分に新規生成物及び出発環状三リン酸を示した（２５４ｎｍで７７対５の比率）が認められた。混合液をもう１日間攪拌した。Ｐ−３１ ＮＭＲによって、反応混合液の主要成分としてγ標識ヌクレオチド−三リン酸が認められた。反応混合液をロータリーエバポレーター上で濃縮した。残渣を水（５×１ｍｌ）で抽出した。ＨＰＬＣは、２５４ｎｍで８２％及び３３５ｎｍで８１％の純度を示した。一つにまとめた水溶液をロータリーエバポレーター上で濃縮して、水（１ｍｌ）中に再溶解した。それを、Ｃ１８ １インチ×３００ｍｍカラム上で、３０分間で０.１Ｍ重炭酸トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＢ、ｐＨ８.３）中の０〜３０％アセトニトリル、１０分間で３０〜５０％アセトニトリル、流速１５ｍｌ／分を用いて精製した。生成物のピークを３つのフラクションに採取した。フラクション１を、ＣＯ2を吹き込んでＴＥＡＢ緩衝液のｐＨを６.７に下げた点以外は、上記と同じ分取ＨＰＬＣ法を用いて再精製した。生成物のピークを濃縮して、ＭｅＯＨ（２回）及び水（１回）と共蒸発させた。試料を水１ｍｌ中に溶解した。ＨＰＬＣは、２５４及び３３５ｎｍで＞９９％の純度を示した。ＵＶは、３２２ｎｍで１１，０００の吸光係数（７−ヒドロキシ−４−トリフルオロメチルクマリンのβガラクトシド誘導体、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社のカタログに記載）を仮定して、２.２ｍＭの濃度を示した。ＭＳ：Ｍ-＝７０２.１８（計算値７０２.３１）、ＵＶλA＝２５３、２７６及び３２２ｎｍ。ｄｄＧＴＰのγリン酸に結合したトリフルオロクマリン色素は、３２２ｎｍの励起極大及び約４１５ｎｍの発光極大をもって蛍光性である。遊離のクマリン色素を放出するリン酸エステルの加水分解で、スペクトルは約３８５ｎｍの励起極大及び約５０２ｎｍの発光極大に変化する。この変化は、簡単な蛍光測定又は色の変化により容易に検出される。γヌクレオチドの合成は、Arzumanov, A. et al. in J Biol Chem (1996) Oct 4; 271 (40): 24389-94に概説されている。
【化１０】
2005501567.tif 000012
【００５９】
実施例２
γ−（３−シアノクマリニル）ｄｄＡＴＰ（γＣＮクマリン−ｄｄＡＴＰ）の調製
ｄｄＡＴＰ（８９ｍＭ溶液１００μｌ、＞９６％）を無水ＤＭＦ（２×１ｍｌ）と共蒸発させた。これに、ＤＣＣ（９.２ｍｇ、５当量）を加えて、混合液を再び無水ＤＭＦ（１ｍｌ）と共蒸発させた。残渣を無水ＤＭＦ（０.５ｍｌ）中に取って、反応液を室温で攪拌した。一晩後、７−ヒドロキシ−３−シアノクマリン（３３.３ｍｇ，２０当量）及びＴＥＡ（２５μｌ、２０当量）を加えて、混合液を室温で攪拌した。１日後に、８．１分に主要生成物（２５４ｎｍで５５％）が、１０分の別の副次的生成物（約１０％）と共に観察された。さらに１日経過しても顕著な変化は起きなかった。反応混合液をロータリーエバポレーター上で濃縮し、残渣を水３×２ｍｌで抽出してろ過した。水溶液を濃縮して、Ｃ１８上で、３０分間で０.１ＭＴＥＡＢ（ｐＨ６.７）中の０〜３０％アセトニトリル及び１０分間で３０〜５０％アセトニトリル、流速１５ｍｌ／分を用いて精製した。主要ピークを３つのフラクションに採取した。主要ピークのＨＰＬＣ（フラクション２）は、２５４ｎｍで９５.６％及び３３５ｎｍで９８.１％の純度を示した。それをロータリーエバポレーター上で濃縮して（室温で）、ＭｅＯＨ（２回）及び水（１回）と共蒸発させた。残渣を水０.５ｍｌ中に溶解した。試料５μｌをＵＶ分析のために１ｍｌに希釈した。Ａ３４６ｎｍ＝０.７８４。２０，０００の吸光係数（７−エトキキシ−３−シアノクマリン、Molecular Probesカタログ、について報告された）を仮定して、濃度＝７.８４ｍＭ。収量＝３.９２μｍｏｌ、４４％。試料をＣ−１８カラム上で上記と同じ方法を用いて再精製した。試料ピークを３つのフラクションに採取した。２５４ｎｍで＞９８％及び３４０ｎｍで＞９９.５％の純度を有するフラクション２及び３を一つにまとめた。濃縮後に、残渣を、ＭｅＯＨ（２回）及び水（１回）と共蒸発させた。試料を水（１ｍｌ）中に溶解すると、２.７７ｍＭ溶液を与えた。ＭＳ：Ｍ-＝６４２.９８ａｕ（計算値６４３.００ａｕ）、ＵＶλA＝２６３及び３４６ｎｍ。ｄｄＡＴＰのγリン酸に結合したシアノクマリン色素は、約３４６ｎｍの励起極大及び約４１１ｎｍの発光極大をもって蛍光性である。遊離のクマリン色素を放出するリン酸エステルの加水分解で、スペクトルは約４０８ｎｍの励起極大及び約４５０ｎｍの発光極大に変化する。この変化は、簡単な蛍光測定又は色の変化により容易に検出される。γヌクレオチドの合成は、Arzumanov, A. et al. in J Biol Chem (1996) Oct 4; 271 (40): 24389-94に概説されている。
【化１１】
2005501567.tif 000013
【００６０】
実施例３
δ−９Ｈ（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン−７−イル）−ジデオキシチミジン−５’−テトラリン酸（ｄｄＴ４Ｐ−ＤＤＡＯ）の調製
ｄｄＴＴＰ（８０ｍＭ溶液１００μｌ）を無水ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、２×１ｍｌ）と共蒸発させた。これに、ジシクロヘキシルカルボジイミド（８.３ｍｇ、５当量）を加えて、混合液を再び無水ＤＭＦ（１ｍｌ）と共蒸発させた。残渣を無水ＤＭＦ（１ｍｌ）中に取って、反応液を一晩室温で攪拌した。ＨＰＬＣでほとんど環化した三リン酸（約８２％）が認められた。反応混合液を濃縮して、残渣を無水ジエチルエーテルで３回洗浄した。それを無水ＤＭＦ中に再溶解して、ロータリーエバポレーター上で濃縮乾固した。残渣をＤＤＡＯ−一リン酸、アンモニウム塩（５ｍｇ、１.５当量）と共に無水ＤＭＦ２００μｌに入れ、４０℃で週末中攪拌した。ＨＰＬＣによって、１１.９６分に所望のＵＶ特性を有する新規生成物の形成が認められた。（ＨＰＬＣ方法：１５分間で０.１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム（ｐＨ７）中の０〜３０％アセトニトリル、５分間で３０〜５０％アセトニトリル、Ｎｏｖａｐａｋ  Ｃ−１８ ３.９×１５０ｍｍカラム、１ｍｌ／分）。ＬＣＭＳ（ＥＳ−）はまた、Ｍ−１として主要質量ピーク８３４を示した。反応混合液を濃縮して、Ｄｅｌｔａｐａｋ  Ｃ１８ １９×１５０ｍｍカラム上で０.１Ｍ ＴＥＡＢ（ｐＨ６.７）及びアセトニトリルを用いて精製した。生成物を含むフラクションを上記と同一の方法を用いるＨＰＬＣにより再精製した。純粋な生成物を含むフラクションを濃縮して、ＭｅＯＨ（２回）及び水（１回）と共蒸発させた。残渣を水（１.２ｍｌ）中に溶解すると、１.２３ｍＭの溶液を与えた。ＨＰＬＣ純度２５４ｎｍで＞９７.５％、４５５ｎｍで＞９６％；ＵＶλA＝２６７及び４５５ｎｍ；ＭＳ：Ｍ−１＝８３４.０４（計算値８３３.９５）。
【００６１】
δ−９Ｈ（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン−７−イル）−ジデオキシシチジン−５’−テトラリン酸（ｄｄＣ４Ｐ−ＤＤＡＯ）、δ−９Ｈ（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン−７−イル）−ジデオキシアデノシン−５’−テトラリン酸（ｄｄＡ４Ｐ−ＤＤＡＯ）及びδ−９Ｈ（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン−７−イル）−ジデオキシグアノシン−５’−テトラリン酸（ｄｄＧ４Ｐ−ＤＤＡＯ）を、同様に合成して精製した。これらの精製化合物は以下のデータを与えた：ｄｄＣ４Ｐ−ＤＤＡＯ：ＵＶλA＝２６８ｎｍ及び４５４ｎｍ；ＭＳ：Ｍ−１＝８１９.３２（計算値８１８.９６）；ｄｄＡ４Ｐ−ＤＤＡＯ：ＵＶλA＝２６３ｎｍ及び４５７ｎｍ；ＭＳ：Ｍ−１＝８４３.３０（計算値８４２.９７）；ｄｄＧ４Ｐ−ＤＤＡＯ：ＵＶλA＝２５７ｎｍ及び４５７ｎｍ；ＭＳ：Ｍ−１＝８５９.４０（計算値８５８.９７）。
【化１２】
2005501567.tif 000014
【００６２】
実施例４
ε−９Ｈ（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン−７−イル）−ジデオキシチミジン−５’−ペンタリン酸ＤＤＡＯ−ｄｄＴ−ペンタリン酸（ｄｄＴ５Ｐ−ＤＤＡＯ）の調製
Ａ．ＤＤＡＯ−ピロリン酸の調製
ＤＤＡＯリン酸二アンモニウム塩（１１.８μｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（３×０.２５ｍｌ）と共蒸発させて、ＤＭＦ（０.５ｍｌ）中に溶解した。これに、カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ、９.６ｍｇ、５当量）を加えて、混合液を一晩室温で攪拌した。過剰のＣＤＩをＭｅＯＨ（５μｌ）の添加により分解して、３０分間攪拌した。混合液に、リン酸二水素トリブチルアンモニウム（１０当量、ＤＭＦ中の０.５Ｍ溶液２３６ｍｌ）を加えて、混合液を室温で４日間攪拌した。反応混合液をロータリーエバポレーター上で濃縮した。残渣をＨｉＰｒｅｐ  １６.１０ ＱＸＬカラム上で、０.１Ｍ ＴＥＡＢ／アセトニトリル（３：１）を緩衝液Ａとし、１Ｍ ＴＥＡＢ／アセトニトリル（３：１）を緩衝液Ｂとして用いる０〜１００％Ｂを使用して、精製した。主要ピーク（９８％ＨＰＬＣ純度）を採取して、濃縮して、メタノール（２回）と共蒸発させた。残渣を水１ｍｌ中に溶解すると、５.９ｍＭの溶液を与えた。ＵＶ／ＶＩＳ λmax＝４５６ｎｍ。
【００６３】
Ｂ．ｄｄＴ５Ｐ−ＤＤＡＯの調製
ｄｄＴＴＰ（４７.５ｍＭ水溶液１００μｌ）を無水ＤＭＦ（２×１ｍｌ）と共蒸発させた。これに、ＤＣＣ（５当量、４.９ｍｇ）を加えて、混合液を無水ＤＭＦ（１×１ｍｌ）と共蒸発させた。残渣を無水ＤＭＦ（０.５ｍｌ）中に取って、室温で３時間攪拌した。これに、別に無水ＤＭＦ（２×１ｍｌ）と共蒸発させたＤＤＡＯ−ピロリン酸１.０３当量をＤＭＦ溶液として加えた。混合液を濃縮乾固して、次いで無水ＤＭＦ２００μｌ中に取った。混合液を３８℃で２日間加熱した。反応混合液を濃縮し、水で希釈し、ろ過して、HiTrap ５ｍｌイオン交換カラム上で、二段階勾配を用いる０〜１００％Ａ−Ｂを使用して精製した。溶媒Ａ＝０.１Ｍ ＴＥＡＢ／アセトニトリル（３：１）及び溶媒Ｂ＝１Ｍ ＴＥＡＢ／アセトニトリル（３：１）。生成物の大部分を含有するフラクション１２×１３を一つにまとめ、濃縮して、メタノール（２回）と共蒸発させた。残渣をＸｔｅｒｒａ  ＲＰ Ｃ−１８ ３０〜１００ｍｍカラム上で、０.１Ｍ ＴＥＡＢ中の０〜３０％アセトニトリルを５倍のカラム容積でそして３０〜５０％アセトニトリルを２倍のカラム容積で、流速１０ｍｌ／分を使用して再精製した。純粋な生成物を含有するフラクションを濃縮して、ＭｅＯＨ（２回）及び水（１回）と共蒸発させた。４５５ｎｍにおけるＨＰＬＣ純度＞９９％。ＵＶ／ＶＩＳ＝２６８ｎｍ及び４５５ｎｍ。ＭＳ：Ｍ−１＝９１４.０３（計算値９１３.９３）。
【００６４】
これらのポリリン酸のγリン酸に結合したＤＤＡＯ色素は、４５５ｎｍの励起極大及び約６０８ｎｍの発光極大をもって蛍光性である。遊離の色素を放出するリン酸エステルの加水分解で、スペクトルは約６４５ｎｍの励起極大及び約６５９ｎｍの発光極大に変化する。この変化は、簡単な蛍光測定又は色の変化により容易に検出される。
【化１３】
2005501567.tif 000015
【００６５】
末端リン酸に結合した色素又は他の検出可能な部分を有する同様なヌクレオチド化合物はまた、上の実施例１〜４に説明したものと同様の方法を用いて作られるかもしれないということが注目される。これらには、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、ヌクレオシド−テトラリン酸、天然起源の塩基（アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ヒポキサンチン及びウラシル）並びに修飾塩基又は修飾糖のいずれかを有するヌクレオチドが含まれる。
【００６６】
下の実施例５及び６は、末端リン酸に結合した色素誘導体を有するジデオキシヌクレオチドが、核酸の検出のための鋳型−指向方法で核酸ポリメラーゼにより成長する核酸鎖の中に基質として効果的に組み込まれ得ることを実証する。
【００６７】
実施例５
γリン酸−標識ｄｄＧＴＰのポリメラーゼ組み込みを用いる核酸配列の検出
実施例（１）のジデオキシヌクレオチドを用いて、反応液を室温（２３℃）で調製した。反応液は、プライマーの３’末端に隣接した次の鋳型ヌクレオチドとしてｄＣ又はｄＴを有する２種類の異なるオリゴヌクレオチド鋳型（それぞれ、配列番号２及び配列番号３に対応）の一方にアニールした単一のオリゴヌクレオチドプライマー（配列番号１で表される）を有するプライマー：鋳型の組合せを含んでいた。
【００６８】
ここで図１を参照すると、本実施例における鋳型１（配列番号２）では、ＤＮＡポリメラーゼは標識ｄｄＧＴＰでプライマーを伸張すると予測される。同様に、図１における鋳型２（配列番号３）では、ＤＮＡポリメラーゼはｄｄＡＴＰではプライマーを伸張するが、標識ｄｄＧＴＰでは伸長しないと予測される。
【００６９】
反応条件：２５ｍＭトリス、ｐＨ８.０、５％グリセロール、５ｍＭ ＭｇＣｌ2、０.５ｍＭβ−メルカプトエタノール、０.０１％ｔｗｅｅｎ−２０、エビアルカリホスファターゼ０.２５単位、鋳型（次の鋳型は、上述の通り、ｄＣＭＰ又はｄＴＭＰのいずれかである）にアニールした１００ｎＭプライマー及び２μＭ ｄｄＧＴＰ−ＣＦ3−クマリンを含有する反応液７０μｌを、時間ドライブモードで運転される、ＬＳ−５５ルミネセンス分光計（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）の中で石英蛍光ウルトラマイクロキュベット中に調製した。励起及び発光波長は、それぞれ、３９０ｎｍ及び５００ｎｍである。スリット幅は、励起スリットについて５ｎｍ、発光スリットについて１５ｎｍであった。遺伝子操作によって３’−５’エキソヌクレアーゼ活性、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性及びジデオキシヌクレオチド識別性をなくしたクローン化ＤＮＡポリメラーゼＩの０.３５μｌ（１１単位）並びに０.２５ｍＭ ＭｎＣｌ2の添加により、反応を開始した。
【００７０】
図１に示すように、γ標識ｄｄＧＴＰを含有する反応液では、色素発光は、プライマー：鋳型１（鋳型中の次のヌクレオチドはｄＣである。）でのみ検出された。エビアルカリホスファターゼによるホスホリル転移のピロリン酸生成物の開裂によって、ＣＦ3−クマリン標識に検出可能な変化が起こり、核酸を検出できるようになる。プライマー：鋳型２では、検出可能な色素発光は全く得られなかった。
【００７１】
実施例６
γリン酸−標識ｄｄＡＴＰのポリメラーゼ組み込みを用いる核酸配列の検出
実施例（２）のジデオキシヌクレオチドを用いて、反応液を室温（２３℃）で調製した。反応液は、プライマーの３’末端に隣接した鋳型ヌクレオチドとしてｄＣ又はｄＴを有する２種類の異なるオリゴヌクレオチド鋳型（それぞれ、配列番号２及び配列番号３に対応）の一方にアニールした単一のオリゴヌクレオチドプライマー（配列番号１）を有するプライマー：鋳型の組合せを含んでいた。
【００７２】
ここで図２を参照すると、本実施例における鋳型２（配列番号３）では、ＤＮＡポリメラーゼは標識ｄｄＡＴＰでプライマーを伸張すると予測される。同様に、図２における鋳型１（配列番号３）では、ＤＮＡポリメラーゼはｄｄＧＴＰではプライマーを伸張するが、標識ｄｄＡＴＰでは伸長しないと予測される。
【００７３】
反応条件：２５ｍＭトリス、ｐＨ８.０、５％グリセロール、５ｍＭ ＭｇＣｌ2、０.５ｍＭβ−メルカプトエタノール、０.０１％ｔｗｅｅｎ−２０、エビアルカリホスファターゼ０.２５単位、鋳型にアニールした１００ｎＭプライマー及び２μＭ ｄｄＡＴＰ−ＣＮ−クマリンを含有する反応液７０μｌを、時間ドライブモードで運転される、ＬＳ−５５ルミネセンス分光計（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）の中で石英蛍光ウルトラマイクロキュベット中に調製した。励起及び発光波長は、それぞれ、４１０ｎｍ及び４５０ｎｍである。スリット幅は、励起スリットについて５ｎｍ、発光スリットについて１５ｎｍであった。遺伝子操作によって３’−５’エキソヌクレアーゼ活性、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性及びジデオキシヌクレオチド識別性をなくしたクローン化ＤＮＡポリメラーゼＩの０.３５μｌ（１１単位）並びに０.２５ｍＭ ＭｎＣｌ2の添加により、反応を開始した。
【００７４】
図２に示すように、γ標識ｄｄＡＴＰを含有する反応液では、色素発光は、プライマー：鋳型２（鋳型中の次のヌクレオチドはｄＴである。）でのみ検出された。エビアルカリホスファターゼによるホスホリル転移のピロリン酸生成物の開裂によって、ＣＮ−クマリン標識に検出可能な変化が起こり、核酸を検出できるようになる。プライマー：鋳型１では、検出可能な色素発光は全く得られなかった。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】  図１は、ホスファターゼの存在下で鋳型特異的方法でγリン酸標識ｄｄＧＴＰをポリメラーゼで利用することにより得られた蛍光を示すグラフである。
【図２】  図２は、ホスファターゼの存在下で鋳型特異的方法でγリン酸標識ｄｄＡＴＰをポリメラーゼで利用するこにより得られた蛍光を示すグラフである。