(57)【要約】【課題】Ｌ−メチオニンの発酵による製造。【解決手段】出発菌株から製造可能な、Ｌ−メチオニンの発酵による製造のために好適である微生物菌株において、出発菌株に対してｙｊｅＨ−遺伝子産物のまたはｙｊｅＨ−ホモログの遺伝子産物の上昇した活性を有することを特徴とする、微生物菌株。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
出発菌株から製造可能な、Ｌ−メチオニンの発酵による製造のために好適である微生物菌株において、出発菌株に対して上昇したｙｊｅＨ−遺伝子産物のまたはｙｊｅＨ−ホモログの遺伝子産物の活性を有することを特徴とする、微生物菌株。
【請求項２】
真菌、酵母または細菌であり、有利には腸内細菌科からの細菌、特に有利には種エシェリキア・コリである、請求項１記載の微生物菌株。
【請求項３】
微生物中のｙｊｅＨ−遺伝子のコピー数が上昇しているか、または好適なプロモータまたは翻訳シグナルの挿入によりｙｊｅＨ−遺伝子の発現が増大した、請求項１または２記載の微生物菌株。
【請求項４】
プロモータがｇａｐＡ−遺伝子の構成的なＧＡＰＤＨ−プロモータ、誘導可能なｌａｃ−、ｔａｃ−、ｔｒｃ−、ラムダ−、ａｒａおよびｔｅｔ−プロモータの群から選択されている、請求項３記載の微生物菌株。
【請求項５】
ｙｊｅＨ−遺伝子産物の上昇した活性がｐＡＣＹＣ−誘導体中のｙｊｅＨ−遺伝子のコピー数の増加に起因するエシェリキア・コリ菌株である、請求項１から４までのいずれか１項記載の微生物菌株。
【請求項６】
プロモータを有するｙｊｅＨ−遺伝子を含有することを特徴とする、プラスミド。
【請求項７】
メチオニン代謝の脱制御のための遺伝的要素を付加的に含有する、請求項６記載のプラスミド。
【請求項８】
出発菌株に請求項６または７記載のプラスミドを導入する、請求項１から５までのいずれか１項記載の微生物菌株の製法。
【請求項９】
請求項１から５までのいずれか１項記載の微生物菌株を発酵に使用し、Ｌ−メチオニンを発酵配合物から分離することを特徴とする、Ｌ−メチオニンの製法。
【請求項１０】
微生物菌株を、連続培養として、回分培養として、または有利に流加培養として発酵装置中で培養する、請求項９記載の製法。
【請求項１１】
Ｃ−源を発酵の間連続的に供給する、請求項９または１０記載の製法。
【請求項１２】
Ｃ−源として、糖、糖アルコールまたは有機酸を使用する、請求項９から１１までのいずれか１項記載の製法。
【請求項１３】
Ｃ−源の配量を、発酵装置中のＣ−源の含量が発酵の間０.１〜５０ｇ／ｌの範囲、特に有利には０.５〜１０ｇ／ｌの範囲に保持されることが保証されるような形で実施する、請求項９から１２までのいずれか１項記載の製法。
【請求項１４】
Ｎ−源として、アンモニア、アンモニウム塩または蛋白質加水分解物を使用する、請求項９から１３までのいずれか１項記載の製法。
【請求項１５】
発酵を好気増殖条件下に実施する、請求項９から１４までのいずれか１項記載の製法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は発酵によるＬ−メチオニンの製法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アミノ酸メチオニンは動物の飼料において重要な役割を果たす。メチオニンは脊椎動物の物質代謝において生物学的合成により製造することができない必須アミノ酸に属する。その結果、動物の飼育の際にメチオニンを十分な量で飼料と共に摂取することができることを確実にしなければならない。しかしながら、メチオニンは古来の飼料植物（例えば、大豆または穀物）中には、最適な動物飼育のために、特にブタおよび家禽のために、しばしば僅かすぎる量で存在するので、メチオニンを添加物として動物飼料に添加するのが有利である。動物飼育のためのメチオニンの高い重要性は、メチオニンがＬ−システイン（もしくはＬ−シスチン）と共に物質代謝において重要な硫黄源であるということに起因する。動物における物質代謝はメチオニンをシステインに変換することはできるが、逆はない。
【０００３】
公知技術においては、メチオニンを年間生産高＞１０００００トンの規模で化学合成により製造している。その際まずアクロレインとメチルメルカプタンとを反応させて３−メチルチオプロピオンアルデヒドにし、これを更にシアン化物、アンモニアおよび一酸化炭素と反応させてヒダントインにする。最終的にこれを加水分解し、両方の立体異性体Ｄ−もしくはＬ−メチオニンの当モル量の混合物であるラセミ体にする。Ｌ−型のみが分子の生物学的活性型を示すので、飼料中に含有されるＤ−型は物質代謝において脱アミノ化およびトランスアミノ化によりはじめて活性Ｌ−型に変換されなければならない。
【０００４】
エナンチオマー純粋なＬ−メチオニンの製造はラセミ分割によりまたはヒダントイナーゼにより可能であることは公知である。高い値段のためにこれらの方法は飼料産業において従来全く実施されていない。
【０００５】
メチオニンとは明らかに異なり、多くの他の天然の、蛋白質のアミノ酸の製造は今日主に微生物の発酵により行われる。その際、微生物が天然のアミノ酸の合成のための相応する生物学的合成経路を有することが利用される。更に、多くの発酵法は安価な出発物質、例えばグルコースおよび無機塩で非常に安価な製造費用を達成し、かつ更にそれぞれのアミノ酸の生物学的に活性なＬ−型を供給する。
【０００６】
しかしながら、野生型菌株においては、アミノ酸の生物学的合成経路はアミノ酸を細胞のそれ自体の要求のためにのみ製造することが達せられるような厳密な代謝制御下にある。従って、効果的な生産法のための重要な前提条件は、野生型有機体とは異なり、所望のアミノ酸の製造に関して著しく上昇した生産能力を有する好適な微生物を提供することができることである。
【０００７】
そのようなアミノ酸過剰生産微生物は従来の突然変異法／選択法により、および／または近代的な目標をしぼった組換え法（“metabolic engineering”）により生産することができる。最後の方法はその変更、活性化または不活性化によりアミノ酸過剰生産に作用する遺伝子またはアレルを最初に同定する。次いでこれらの遺伝子／アレルを分子生物学的方法により微生物菌株中に導入するかまたは不活性化し、こうして最適な過剰生産を達成する。しかしながら、しばしば多くの異なる処置の組合せが、実際に効率のよい生産に初めて導く。
【０００８】
微生物中でのＬ−メチオニンの生物学的合成は非常に複雑である。分子のこのアミノ酸体はＬ−アスパルテートから誘導され、これはアスパルチルセミアルデヒド／アスパルチル−リン酸を介してＬ−ホモセリンに変換される。次いで３つの酵素的工程で（Ｏ−スクシニルホモセリンおよびシスタチオニンを介して）、この分子においてヒドロキシ基がチオール基に交換され、その際これはシステイン分子から可動化され、ホモシステインが生じる。生物学的合成の最後の工程においては、最終的にチオール基のメチル化によりＬ−メチオニンが形成される。メチル基はセリン代謝から由来する。
【０００９】
形式的には、メチオニンは微生物による物質代謝において一方では、アミノ酸アスパルテート、セリンおよびシステインから合成され、こうして他のアミノ酸に比べて非常に複雑な生物学的合成を必要とする。合成のメインの工程（アスパルテート−ホモセリン−ホモシステイン）の他に、システイン生物学的合成、こうして無機硫黄の複雑な固定並びにＣｌ−物質代謝の最適化を決定しなければならない。
【００１０】
この理由から、Ｌ−メチオニンの発酵による製造は従来あまり熱心に研究されなかった。しかしながら、近年セリン−およびシステイン−代謝の最適化において決定的な前進がなされ、こうしてＬ−メチオニンの発酵による製造も今や現実的なものと思われるようになった。従って、この方向での最初の研究は従来技術において簡単に記載されている。
【００１１】
Ｌ−メチオニンの発酵による製造に関しては、その使用がＬ−メチオニン過剰生産に導くことのできる次の遺伝子／アレルが従来技術において公知である。
【００１２】
−  ｍｅｔＡ−アレル、これは同一出願人の２００２年１０月１１日付けの出願またはＪＰ２０００１３９４７１Ａ中に記載されている。このｍｅｔＡ−アレルは、Ｌ−メチオニンによるフィードバック阻害を減少する、Ｏ−ホモセリン−トランスサクシニラーゼをコードする。これによりＯ−サクシニルホモセリンの形成は細胞のメチオニン水準から十分に分離される。
【００１３】
−  ｍｅｔＪ−欠失、これはＪＰ２０００１３９４７１Ａに記載されている。ｍｅｔＪ−遺伝子はメチオニン代謝の中心的な遺伝子制御をコードし、これによりメチオニン生物学的合成遺伝子の発現制御において決定的な役割を果たす。
【００１４】
同様に公知技術から、改善されたＬ−セリンおよびＬ−システインを達成する公知の処置がＬ−メチオニンの生産に対してプラスの影響を有するということが容易に推考される。
【特許文献１】ＪＰ２０００１３９４７１Ａ
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明の課題は、Ｌ−メチオニンの過剰生産を可能とする微生物菌株を提供することにある。その他の課題は、本発明による微生物菌株によりＬ−メチオニンを製造する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
第１に挙げた課題は、出発菌株から製造可能であり、出発菌株に対してｙｊｅＨ−遺伝子産物のまたはｙｊｅＨ−ホモログの遺伝子産物の上昇した活性を有することを特徴とする微生物菌株により解決する。
【００１７】
本発明の意味においてｙｊｅＨ−遺伝子産物の活性の上昇とは、細胞中での遺伝子産物量の上昇により細胞中での上昇した全活性が達せられ、こうして遺伝子産物の特異的な活性は変化することなく保持されているが、細胞あたりのｙｊｅＨ−遺伝子生産物の活性が上昇されている場合も含む。
【００１８】
エシェリキア・コリのｙｊｅＨ−遺伝子はゲノム配列決定の分野において（Blattner et al. 1997, Science 277: 1453-1462）オープンリーディングフレームとして同定され、４１８個のアミノ酸を有する蛋白質をコードする。従来、ｙｊｅＨ−遺伝子に生理学的機能を記載することはできなかった。配列相同を有する蛋白質によるデータバンク調査（FASTA-Algorithmus von GCG Wisconsin Package, Genetics Computer Group (GCG) Madison, Wisconsin）からも、その機能が同様に未知である蛋白質に対してのみ明らかな類似性を示すため、あまり情報は得られなかった。
【００１９】
ｙｊｅＨ−遺伝子およびｙｊｅＨ−遺伝子産物（ｙｊｅＨ−蛋白質）をＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ  １もしくはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ  ２により特徴付ける。本発明の範囲においてはｙｊｅＨ−ホモログとしては、アルゴリズムＢＥＳＴＦＩＴ（GCG Wisconsin Package, Genetics Computer Group (GCG) Madison, Wisconsin）での分析において、配列同一性が３０％より大である、有利には５３％より大である遺伝子を包含する。特に有利であるのは７０％より大の配列同一性である。
【００２０】
同様に３０％より大、有利に５３％より大の配列同一性を有する蛋白質（アルゴリズムＢＥＳＴＦＩＴ（GCG Wisconsin Package, Genetics Computer Group (GCG) Madison, Wisconsin））もｙｊｅＨ−蛋白質として包含される。特に有利であるのは７０％より大の配列同一性である。
【００２１】
こうして、ｙｊｅＨ−遺伝子のアレル変異体もｙｊｅＨ−ホモログとして理解されるべきであり、特にヌクレオチドの欠失、挿入または置換によりＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ  １中に示した配列から誘導された機能的変異体もｙｊｅＨ−ホモログとして理解されるべきであり、その際それぞれの遺伝子産物の酵素活性は保持される。
【００２２】
出発菌株に対して上昇したｙｊｅＨ−遺伝子産物の活性を示す本発明による微生物は分子生物学の標準技術を用いて生成することができる。
【００２３】
出発菌株としては、原則的にＬ−メチオニンに関する生物学的合成経路を有し、組換え法を行うことができ、かつ発酵により培養可能である、全ての有機体が好適である。そのような微生物は真菌、酵母または細菌である。有利な細菌はユーバクテリウムの系統発生的な群の細菌である。特に有利であるのは腸内細菌科からの微生物、特に種エシェリキア・コリである。
【００２４】
本発明の微生物中でのｙｊｅＨ−遺伝子産物の活性の上昇は例えばｙｊｅＨ−遺伝子の発現の強化により達せられる。その際、微生物中のｙｊｅＨ−遺伝子のコピー数は上昇していてよいかおよび／または好適なプロモータによりｙｊｅＨ−遺伝子の発現が上昇していてよい。強化した発現とは、ｙｊｅＨ−遺伝子が出発菌株におけるより少なくとも２倍強く発現されるのが有利であると理解される。
【００２５】
微生物中でのｙｊｅＨ−遺伝子のコピー数の増加は当業者にとって公知の方法で行うことができる。こうして、例えば細胞あたり多くのコピー数を有するプラスミドベクター（例えば、エシェリキア・コリに関してはｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＡＣＹＣ１８４）中にｙｊｅＨ−遺伝子をクローニングし、微生物中に導入することができる。選択的に、ｙｊｅＨ−遺伝子を微生物の染色体中に複数組み込むこともできる。この組込法としてはテンペレートバクテリオファージ、インテグラティブプラスミド、またはホモログ組換えによる組込を用いる公知システムを使用することができる（例えば、Hamilton et al., 1989, J. Bacteriol. 171: 4617-4622）。
【００２６】
プロモータの制御下でのプラスミドベクター中へのｙｊｅＨ−遺伝子のクローニングによるコピー数の増加が有利である。ｐＡＣＹＣ−誘導体、例えばｐＡＣＹＣ１８４−ＬＨ（Deutschen Sammlung fuer Mikroorganismen und Zellkulturen, Braunschweig において９５年８月１８日に、ブタペスト条約に基づきＤＳＭ番号１０１７２として寄託）中でのｙｊｅＨ−遺伝子のクローニングによるエシェリキア・コリ中でのコピー数の増加は特に有利である。
【００２７】
プラスミドがコードしたｙｊｅＨ−遺伝子の発現に関する制御領域としては、遺伝子の天然のプロモータ領域およびオペレータ領域を使用する。
【００２８】
しかしながら、ｙｊｅＨ−遺伝子の強化した発現は特に他のプロモータによっても行うことができる。例えばエシェリキア・コリ中での相応するプロモータシステム、ｇａｐＡ−遺伝子の構成的なＧＡＰＤＨ−プロモータまたは誘導可能なｌａｃ−、ｔａｃ−、ｔｒｃ−、ラムダ−、ａｒａまたはｔｅｔ−プロモータは当業者に公知である（Makrides S. C.1996, Microbiol. Rev. 60: 512-538）。そのような構成体は公知法でプラスミドまたは染色体に使用することができる。
【００２９】
その他の強化した発現は、翻訳開始シグナル、例えばリボソーム結合位または遺伝子の開始コドンがそれぞれの構成体に最適化された配列で存在しているか、または“コドン使用頻度”により稀なコドンを頻度の高いコドンに交換することにより達成することができる。
【００３０】
前記変更を有する微生物菌株は本発明の有利な実施形である。
【００３１】
プラスミドベクター中へのｙｊｅＨ−遺伝子のクローニングは、例えば完全なｙｊｅＨ−遺伝子を包含する特別なプライマーを使用してポリメラーゼ連鎖反応による特別な増幅および引き続くベクターＤＮＡフラグメントとのライゲーションにより行われる。
【００３２】
ｙｊｅＨ−遺伝子のクローニングのための有利なベクターとしては、すでに強化した発現のためのプロモータ、例えばエシェリキア・コリのｇａｐＡ−遺伝子の構成的なＧＡＰＤＨ−プロモータ、を有するプラスミドを使用する。
【００３３】
こうして、本発明はプロモータを有するｙｊｅＨ−遺伝子を含有することを特徴とするプラスミドにも関する。
【００３４】
更に、その使用がＬ−メチオニン代謝の減少したフィードバック阻害に導く遺伝子／アレル、例えば突然変異ｍｅｔＡ−アレル（ＤＥ−Ａ１０２４７４３７出願明細書中に記載されている）をすでに有するベクターが特に有利である。そのようなベクターは任意の微生物菌株から高いアミノ酸過剰生産を有する本発明の微生物菌株を直接製造することを可能にする、それというのもそのようなプラスミドは微生物中でのメチオニン代謝のフィードバック阻害の減少にも作用するためである。
【００３５】
こうして、本発明はメチオニン代謝の脱制御のための遺伝的要素並びにプロモータを有するｙｊｅＨ−遺伝子を含有することを特徴とするプラスミドにも関する。
【００３６】
現行の形質転換法（例えば、エレクトロポレーション）により、ｙｊｅＨ−含有プラスミドを微生物中に導入し、例えば抗生物質耐性によりプラスミドを有するクローンを選択する。
【００３７】
こうして、本発明は、出発菌株中に本発明によるプラスミドを導入することを特徴とする、本発明による微生物菌株を製造するための方法にも関する。
【００３８】
本発明によるプラスミドで形質転換するための菌株としては、Ｌ−メチオニン生産に有利に作用する染色体のアレルをすでに有するものである、例えば
−  ｍｅｔＪ−欠失（例えば、ＪＰ２０００１３９４７１中に記載されている）または
−  改善されたセリン製造に作用する、例えばフィードバック耐性のｓｅｒＡ−変異体（例えば、ＥＰ０６２０８５３Ｂ１またはＥＰ０９３１８３３Ａ２）のようなアレル、または
−  改善されたシステイン製造に作用する、例えばフィードバック耐性のｃｙｓＥ−変異体（例えば、ＷＯ９７／１５６７３中に記載されている）遺伝子
を有するものである。
【００３９】
本発明による微生物菌株を用いるＬ−メチオニンの生産は公知法による発酵装置中で行われる。
【００４０】
こうして、本発明は本発明による微生物菌株を発酵に使用し、生産されたＬ−メチオニンを発酵配合物から分離することを特徴とする、Ｌ−メチオニンの製法にも関する。
【００４１】
発酵装置中での微生物菌株の培養を、連続培養として、回分培養として、または有利に流加培養（fed-batch-Kultur）として実施する。発酵の間、Ｃ−源を連続的に供給するのが特に有利である。
【００４２】
Ｃ−源として、有利に糖、糖アルコールまたは有機酸を使用する。本発明方法においてＣ−源として特に有利であるのは、グルコース、ラクトースまたはグリセリンである。
【００４３】
Ｃ−源の配量は、発酵装置中のＣ−源の含量が発酵の間０.１〜５０ｇ／ｌの範囲に保持されるような形が有利である。特に有利であるのは、０.５〜１０ｇ／ｌの範囲である。
【００４４】
本発明による方法においては、Ｎ−源として、有利にアンモニア、アンモニウム塩または蛋白質加水分解物を使用する。ｐＨ維持のための調整剤としてアンモニアを使用する際に、発酵の間このＮ−源を規則的に後配量する。
【００４５】
その他の医薬添加物としては元素の燐、塩素、ナトリウム、マグネシウム、窒素、カリウム、カルシウム、鉄の塩および元素モリブデン、ホウ素、コバルト、マンガン、亜鉛およびニッケルの塩の痕跡量（すなわちμＭ濃度）で添加することができる。
【００４６】
更に有機酸（例えばアセテート、シトレート）、アミノ酸（例えばロイシン）およびビタミン（例えばＢ１、Ｂ１２）を媒体に添加することができる。
【００４７】
複合的な栄養源としては、例えば酵母エキス、トウモロコシ膨潤水、大豆粉または麦芽エキスを使用することができる。
【００４８】
中温性微生物に関するインキュベーション温度は、有利に１５〜４５℃、特に有利に３０〜３７℃である。
【００４９】
発酵は有利に好気性培養条件下に実施する。発酵装置中への酸素導入は圧搾空気または純粋な酸素で実施する。
【００５０】
発酵媒体のｐＨ値は、発酵の間有利にｐＨ−範囲５.０〜８.５、特に有利にはｐＨ値７.０である。
【００５１】
Ｌ−メチオニンの製造のためには、発酵の間硫黄源を供給する。その際スルフェートまたはチオスルフェートの使用が有利である。
【００５２】
記載した方法により発酵される微生物は、バッチ法および供給バッチ法において増殖期の後に１０〜１５０時間の間、Ｌ−メチオニンを培地中に分泌する。
【００５３】
生産されたＬ−メチオニンは培養液からアミノ酸単離のための通常の処置により獲得することができる（例えば、イオン交換法、結晶化等）。
【実施例】
【００５４】
本発明を更に詳細に説明するために次の実施例を示す。Ｌ−メチオニンの本発明による製造に好適であるｙｊｅＨ−遺伝子を有する本発明によるプラスミドを有する菌株として、菌株Ｗ３１１０ΔＪ／ｐＫＰ４５０をＤＳＭＺ（Deutschen Sammlung fuer Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, D-38142 Braunschweig）において、ＤＳＭ番号１５４２１としてブタペスト条約に基づき寄託した。
【００５５】
例１：ベースベクターｐＫＰ２２８のクローニング
ｙｊｅＨ−遺伝子を構成的プロモータの制御下におくために、最初にベースベクターをエシェリキア・コリのグリセリンアルデヒド−３−デヒドロゲナーゼのためのｇａｐＡ−遺伝子の構成的ＧＡＰＤＨ−プロモータで構成する。このためには、プライマー：
【００５６】
【化１】
2004236660.tif 000002
およびＥ・コリ菌株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）の染色体ＤＮＡを用いてポリメラーゼ連鎖反応を実施した。生じたＤＮＡ−フラグメントをアガロースゲル電気泳動を用いて精製し、引き続き単離した（Qiaquick Gel Extraction Kit, Quiagen, Hilden, D）。その後、このフラグメントを制限酵素ＰａｃＩおよびＭｌｕＩで処理し、かつ同様にＰａｃＩ／ＭｌｕＩ切断ベクターｐＡＣＹＣ１８４−ＬＨ（Deutschen Sammlung fuer Mikroorganismen und Zellkulturen, Braunschweig において９５年８月１８日に、ブタペスト条約に基づきＤＳＭ番号１０１７２として寄託）中でクローニングした。新規な構成体をｐＫＰ２２８と命名した。
【００５７】
例２：ｙｊｅＨ−遺伝子のクローニング
エシェリキア・コリ菌株Ｗ３１１０からのｙｊｅＨ−遺伝子をポリメラーゼ連鎖反応を用いて増幅した。特別なポリマーとして次のオリゴヌクレオチド
【００５８】
【化２】
2004236660.tif 000003
を使用し、Ｅ．コリ菌株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）の染色体ＤＮＡをマトリックスとして使用した。生じたＤＮＡフラグメントはアガロースゲル電気泳動により精製し、単離した（Qiaquick Gel Extraction Kit, Quiagen, Hilden, ドイツ）。クローニングは、その５′−突出末端がクレノウ酵素により満たされた、ＢｇｌＩＩ切断ベクターｐＫＰ２２８を用いて平滑末端ライゲーションにより行った。前記の方法によりｙｊｅＨ−遺伝子をＧＡＰＤＨ−プロモータの後方に配置し、転写はそこから開始される。生じたベクターはｐＫＰ４５０という記号を有する。
【００５９】
例３：ｙｊｅＨ−遺伝子とフィードバック耐性ｍｅｔＡ−アレルとの組合せ
同一出願人の２００２年１０月１１日付の特許出願ＤＥ−Ａ１０２４７４３７中に記載された、フィードバック耐性Ｏ−ホモセリン−トランスサクシニラーゼをコードするｍｅｔＡ−アレルをポリメラーゼ連鎖反応により、テンプレートｐＫＰ４４６（同様に特許出願ＤＥ−Ａ１０２４７４３７中に記載されている）およびプライマー
【００６０】
【化３】
2004236660.tif 000004
を用いて増幅した。その際、制限エンドヌクレアーゼＮｃｏＩおよびＳａｃＩに関する末端切断位が生じた。得られたＤＮＡ−フラグメントを同様にこのエンドヌクレアーゼで消化し、精製し、ＮｃｏＩ／ＳａｃＩ−切断ベクターｐＫＰ４５０中でクローニングする。生じたプラスミドをｐＫＰ４５１と命名した。
【００６１】
ｍｅｔＡ−アレルを有するが、ｙｊｅＨ−遺伝子を有さない対照プラスミドを製造するために、ｐＫＰ４５１からｙｊｅＨ−遺伝子を欠失した。このためには、ｐＫＰ４５１をＥｃ１１３６ＩＩおよびＰａｃＩで切断し、突出する末端をクレノウ酵素で消化し、ベクターを再ライゲーションする。このようにして得られたプラスミドはｐＫＰ４４６ＡＣと命名される。
【００６２】
例４：染色体のｍｅｔＪ−突然変異の形成
遺伝子ｍｅｔＪ／Ｂをポリメラーゼ連鎖反応により、プライマー
【００６３】
【化４】
2004236660.tif 000005
およびエシェリキア・コリＷ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）からの染色体ＤＮＡを用いて増幅する。３.７３ｋｂを有するフラグメントを精製し、制限エンドヌクレアーゼＮｏｔＩで消化し、ＮｏｔＩ−切断ベクターｐＡＣＹＣ１８４−ＬＨ（例１参照）中でクローニングした。その後、ｍｅｔＪ−遺伝子中に内部ＡｆｌＩＩＩ−切断位にカナマイシン耐性カセットを挿入する。このためには、最初にＡｆｌＩＩＩで消化し、クレノウ酵素を用いて平滑末端を製造する。このカナマイシンカセットをＰｖｕＩＩ−制限により再びベクターｐＵＫ４Ｋ（Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, D）から獲得し、ライゲーションによりｍｅｔＪ−遺伝子中に挿入する。そのようにして製造したベクターｐＫＰ４４０からはｍｅｔＪ：：ｋａｎ−カセットがＮｏｔＩ−制限により線状フラグメントとして得られ、Ｗｉｎａｎｓ等の方法（J. Bacteriol. 1985, 161:1219-1221）によりｒｅｃＢＣ／ｓｂｃＢ−菌株ＪＣ７６２３（E.coli Genetic Stock Center CGSC5188）中に、染色体に組み込む。次いで最後の工程としてｍｅｔＪ：：ｋａｎ−突然変異体をＰ１−形質導入により（Miller, 1972, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, p201-205）野生型菌株Ｗ３１１０（ATCC27325）中に形質導入し、こうして菌株Ｗ３１１０ΔＪを製造する。
【００６４】
ｍｅｔＪ：：ｋａｎ−挿入体の移入により菌株Ｗ３１１０ΔＪはそれぞれｙｊｅＨを有するプラスミドもしくは対照プラスミドで形質転換され、相応する形質転換体をテトラサイクリンを用いて選択する。
【００６５】
例５：発酵のための生産菌株の前培養
発酵のための前培養として、テトラサイクリン１５ｍｇ／ｌを付加的に含有するＬＢ−培地（トリプトン１０ｇ／ｌ、酵母エキス５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ １０ｇ／ｌ）２０ｍｌに生産菌株を接種し、振盪器中で３０℃、１５０ｒｐｍでインキュベーションした。７時間後、グルコース５ｇ／ｌ；ビタミンＢ１ ０.５ｍｇ／ｌおよびテトラサイクリンを添加した、ＳＭ１−培地（Ｋ２ＨＰＯ４１２ｇ／ｌ；ＫＨ２ＰＯ４３ｇ／ｌ；（ＮＨ４）２ＳＯ４５ｇ／ｌ；ＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏ ０.３ｇ／ｌ；ＣａＣｌ２×２Ｈ２Ｏ ０.０１５ｇ／ｌ；ＦｅＳＯ４×７Ｈ２Ｏ ０.００２ｇ／ｌ；クエン酸Ｎａ３×２Ｈ２Ｏ １ｇ／ｌ；ＮａＣｌ ０.１ｇ／ｌ；以下の成分からなる微量元素溶液１ｍｌ／ｌ、Ｎａ２ＭｏＯ４×２Ｈ２Ｏ ０.１５；Ｎａ３ＢＯ３２.５ｇ／ｌ；ＣｏＣｌ２×６Ｈ２Ｏ ０.７ｇ／ｌ；ＣｕＳＯ４×５Ｈ２Ｏ ０．２５ｇ／ｌ；ＭｎＣｌ２×４Ｈ２Ｏ １.６ｇ／ｌ；ＺｎＳＯ４×７Ｈ２Ｏ ０.３ｇ／ｌ）１００ｍｌ中に全配合物を供給した。更なるインキュベーションを３０℃で、１５０ｒｐｍで１７時間実施した。
【００６６】
例６：Ｌ−メチオニンの発酵による製造
発酵装置としては、最大培養体積２ ｌのＢｉｏｓｔａｔ Ｂ装置（Braun Biotech社、Melsungen, D）を用いた。例５中に記載した前培養体（６００ｎｍでの光学密度約３）を発酵装置にグルコース１５ｇ／ｌ、トリプトン１０ｇ／ｌ、酵母エキス５ｇ／ｌ、Ｎａ２Ｓ２Ｏ３×５Ｈ２Ｏ３ｇ／ｌ、ビタミンＢ１ ０.５ｍｇ／ｌ、ビタミンＢ１２ ３０ｍｇ／ｌ、およびテトラサイクリン１５ｍｇ／ｌを添加したＳＭ１−培地９００ｍｌと共に接種した。発酵の間、温度を３２℃に調節し、ｐＨ値を２５％濃度のアンモニアを供給することにより７.０の値で一定に保持した。この培地に除菌した圧搾空気を、５体積／体積／分で通気し、回転数４００ｒｐｍで攪拌した。酸素飽和が５０％の値まで低下した後、回転数を制御装置を介して１５００ｒｐｍの値まで上昇させ、５０％酸素飽和を得る（ｐＯ２−ゾンデで測定し、９００ｒｐｍで１００％飽和に対して較正する）。最初１５ｇ／ｌの発酵装置中のグルコース含量が約５〜１０ｇ／ｌに低下すると同時に、５６％濃度のグルコース溶液の供給を行う。栄養供給は流速６〜１２ｍｌ／ｈで行い、その際発酵装置中のグルコース濃度は０.５〜１０ｇ／ｌに一定に保持した。グルコースの測定はグルコース分析装置（YSI 社、Yellow Springs, Ohio, USA）を用いて実施した。発酵時間は４８時間であった。この時間の後、試料を取出し、細胞を遠心分離により培地から分離する。生じた培養上澄みをＬＵＮＡ５μＣ１８（２）カラム（Phenomenex Aschaffenburg, Deutschland）を用いて、流速０.５ｍｌ／分で逆相ＨＰＬＣにより分析した。溶離剤としては希リン酸（濃リン酸０.１ｍｌ／ｌ）を使用する。第１表は培養上澄み中に達せられたＬ−メチオニンの含量を示す。
【００６７】
【表１】
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【配列表】
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