【手続補正書】
【提出日】平成24年9月11日(2012.9.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中の胎児核酸の量を決定するための方法であって、該方法は：
ａ）妊婦からのサンプル中に存在する核酸を、複数の遺伝子座でメチル化されていない母体核酸を特異的に消化する作用物質と接触させることにより、該胎児核酸を濃縮する工程であって、該サンプルは、差次的にメチル化された胎児核酸および母体核酸を含み、該胎児核酸と該母体核酸との組み合わせは、該サンプル中の総核酸を構成する、工程；および
ｂ）（ａ）における胎児核酸の量を決定する工程
を包含する、方法。
【請求項２】
メチル化されていない母体核酸を特異的に消化する前記作用物質が、メチル化感受性制限酵素である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記サンプル中に存在する核酸の総量を決定する工程を包含する、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記サンプル中の胎児核酸の量を決定する工程が、（ｂ）における胎児核酸の量を前記核酸の総量と比較することを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
（ａ）の後に、既知濃度の１つ以上の競合物質を導入する工程を包含する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記サンプル中の胎児核酸の絶対量を決定する工程を包含する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記複数の遺伝子座が、配列番号１〜８９の遺伝子座から選択される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記複数の遺伝子座が、配列番号１〜５９および配列番号８６〜８９の遺伝子座から選択される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記複数の遺伝子座が、配列番号１〜５９の遺伝子座から選択される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記複数の遺伝子座が、配列番号４２の遺伝子座を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記複数の遺伝子座が、配列番号５２の遺伝子座を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
胎児核酸の前記濃度が、胎児の形質を示す方法とともに用いられる、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記胎児の形質が、胎児の異数性である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記方法が、ある特定の臨床的感度または臨床的特異性の必要条件を満たす濃度の胎児核酸を必要とする、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記胎児核酸の量を決定する工程が、質量分析法、ＲＴ−ＰＣＲ、デジタルＰＣＲ、アレイに基づく方法、配列決定法、ナノポアに基づく方法、核酸に結合したビーズに基づくカウント方法および競合物質に基づく方法およびメチル化の状態に基づいて核酸に結合する作用物質を用いて核酸を分離するための方法から選択される１以上のプロセスの使用を含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記胎児核酸の量を決定する工程が、質量分析法の使用を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記胎児核酸の量を決定する工程が、配列決定法の使用を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記配列決定法は、合成により配列決定することを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記メチル化感受性制限酵素の消化効率が、決定される、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
妊婦からのサンプル中のＹ染色体核酸の有無を判定する工程を包含する、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
妊婦からのサンプル中に存在するＹ染色体核酸の量が、男の胎児に対して決定される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記胎児核酸の量が、前記Ｙ染色体核酸の量と比較される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
１０以上の遺伝子座における胎児核酸の量が決定される、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記男の胎児に対するＹ染色体核酸の量、および前記メチル化感受性制限酵素の消化効率が、決定される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
２つ以上のアッセイが、核酸の総量を決定するために用いられ、１つ以上のアッセイが、男の胎児に対するＹ染色体核酸の量を決定するために用いられ、そして１つ以上のアッセイが、前記メチル化感受性制限酵素の消化効率を決定するために用いられる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
３以上の遺伝子座における胎児核酸の量が決定される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記胎児核酸の量が、前記消化された母体核酸の平均長より大きいアンプリコンを生成する増幅反応により、該胎児核酸がさらに濃縮されることによって決定される、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
標的染色体由来の胎児核酸の量が決定され、そして参照染色体由来の胎児核酸の量が決定される、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記標的染色体由来の胎児核酸の量と前記参照染色体由来の胎児核酸の量とを比較することにより、胎児異数性の有無を決定する工程をさらに包含する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
サンプル中の胎児の割合を決定するための方法であって、
（ａ）１以上の多型核酸標的についてサンプル核酸を濃縮する工程であって、該サンプル核酸は、胎児核酸および母体核酸を含む、工程；
（ｂ）配列決定プロセスによって該核酸標的の一部または全てについてのヌクレオチド配列を得る工程；
（ｃ）（ｂ）のヌクレオチド配列を分析する工程；および
（ｄ）（ｃ）における分析に基づいて胎児の割合を決定する工程
を包含する、方法。
【請求項３１】
前記濃縮する工程が、複数の多型核酸標的を増幅することを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記濃縮する工程が、増幅反応において増幅生成物を生成することを含む、請求項３０または３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記増幅が単一反応において多重化される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記多型核酸標的が各々少なくとも１つの単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を含む、請求項３０〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記多型核酸標的が各々少なくとも１つの短いタンデム反復（ＳＴＲ）を含む、請求項３０〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
前記胎児の割合を決定する工程が、（ｉ）（ｂ）における前記ヌクレオチド配列から少なくとも１つの情報的に有益な多型部位を同定すること、および胎児多型部位および母体多型部位の量から該胎児の割合を計算することを含む、請求項３０〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
１以上の多型核酸標的での前記母体遺伝子型が（ａ）の前には知られていない、請求項３０〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
１０以上の多型核酸標的が濃縮される、請求項３０〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
１００以上の多型核酸標的が濃縮される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記配列決定プロセスが、合成法によって配列決定することを含む、請求項３０〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
（ｃ）における分析に基づいて胎児の異数性の有無を判定することをさらに含む、請求項３０〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
胎児の異数性の有無を判定することが、（ｃ）において得られたヌクレオチド配列に基づく、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
胎児の異数性の有無を判定することが、（ｉ）標的染色体由来の胎児核酸の量と参照染色体由来の胎児核酸の量を決定すること、および（ｉｉ）該標的染色体由来の胎児核酸の量を該参照染色体由来の胎児核酸の量と比較することにより、胎児の異数性の有無を判定することを含む、請求項４１または４２に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４５】
ＣｐＧアイランドは、いくつかの場合においてＣｐＧ含有ゲノム配列として使用され得る一方、他の場合では、ＣｐＧ含有ゲノム配列は、ＣｐＧアイランドでないかもしれない。いくつかの実施形態において、本技術は、本技術の方法を行うためのキットを提供する。そのキットの１つの構成要素は、メチル化感受性結合剤である。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
胎児核酸を調製するための方法であって、該方法は：
ａ）妊婦からサンプルを得る工程；
ｂ）胎児核酸と母体核酸対応物との間の異なるメチル化状態に従って、該妊婦のサンプル由来の該母体核酸から該胎児核酸を分離する工程であって、ここで、該胎児核酸は、配列番号１〜８９のポリヌクレオチド配列の１つ以上からの１つ以上のＣｐＧ部位を含む、工程；および
ｃ）パート（ｂ）において分離された胎児核酸を鋳型として利用するプロセスによって、胎児核酸を含む核酸を調製する工程
を包含する、方法。
（項目２）
前記胎児核酸が、メチル化ヌクレオチドに特異的に結合する作用物質によって前記母体核酸から分離される、項目１に記載の方法。
（項目３）
メチル化ヌクレオチドに結合する前記作用物質が、メチル−ＣｐＧ結合タンパク質（ＭＢＤ）またはそのフラグメントである、項目２に記載の方法。
（項目４）
メチル化ヌクレオチドに結合する前記作用物質が、メチル化された胎児核酸に結合する、項目２に記載の方法。
（項目５）
メチル化ヌクレオチドに結合する前記作用物質が、メチル化された母体核酸に結合する、項目２に記載の方法。
（項目６）
前記胎児核酸が、非メチル化ヌクレオチドに特異的に結合する作用物質によって前記母体核酸から分離される、項目２に記載の方法。
（項目７）
前記胎児核酸が、メチル化されていない母体核酸を特異的に消化する作用物質によって前記母体核酸から分離される、項目１に記載の方法。
（項目８）
メチル化されていない母体核酸を特異的に消化する前記作用物質が、メチル化（ｍｅｔｈｙａｌｔｉｏｎ）感受性制限酵素である、項目７に記載の方法。
（項目９）
２つ以上のメチル化感受性制限酵素が、同じ反応において使用される、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記工程ｃ）のプロセスが、増幅反応である、項目１に記載の方法。
（項目１１）
前記工程ｃ）のプロセスが、胎児核酸の絶対量を測定するための方法である、項目１に記載の方法。
（項目１２）
配列番号１〜８９のポリヌクレオチド配列のうちの３つ以上が、調製される、項目１に記載の方法。
（項目１３）
母体サンプル中の胎児核酸の絶対量を測定するための方法であって、ここで、該母体サンプルは、差次的にメチル化された母体核酸および胎児核酸を含み、該方法は：
ａ）１つ以上のメチル化感受性制限酵素を用いて母体サンプル中の該母体核酸を消化することにより、該胎児核酸を濃縮する工程；および
ｂ）多型に基づかない定量方法および亜硫酸水素塩に基づかない定量方法を用いて工程ａ）からの胎児核酸の絶対量を測定する工程
を包含する、方法。
（項目１４）
胎児核酸の前記絶対量または濃度が、胎児の形質を判定する診断法とともに用いられ、ここで、該診断法は、ある特定の臨床的感度または臨床的特異性の必要条件を満たす所与の絶対量または濃度の胎児核酸を必要とする、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
母体サンプル中の胎児核酸の濃度を測定するための方法であって、ここで、該母体サンプルは、差次的にメチル化された母体核酸および胎児核酸を含み、該方法は：
ａ）該母体サンプル中に存在する核酸の総量を測定する工程；
ｂ）メチル化感受性制限酵素を用いて母体サンプル中の該母体核酸を消化することにより、該胎児核酸を濃縮する工程；
ｃ）多型に基づかない定量方法および亜硫酸水素塩に基づかない定量方法を用いて工程ｂ）からの胎児核酸の量を測定する工程；および
ｄ）工程ｃ）からの胎児核酸の量を工程ａ）からの核酸の総量と比較することにより、該母体サンプル中の胎児核酸の濃度を測定する工程
を包含する、方法。
（項目１６）
胎児核酸の前記絶対量または濃度が、胎児の形質を判定する診断法とともに用いられ、ここで、該診断法は、ある特定の臨床的感度または臨床的特異性の必要条件を満たす所与の絶対量または濃度の胎児核酸を必要とする、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
母体サンプル由来の胎児核酸を用いて胎児の異数性の有無を判定するための方法であって、ここで、該母体サンプルは、差次的にメチル化された母体核酸および胎児核酸を含み、該方法は：
ａ）メチル化感受性制限酵素を用いて母体サンプル中の該母体核酸を消化することにより、該胎児核酸を濃縮する工程；
ｂ）多型に基づかない定量方法および亜硫酸水素塩に基づかない定量方法を用いて標的染色体由来の胎児核酸の量を測定する工程；
ｃ）多型に基づかない定量方法および亜硫酸水素塩に基づかない定量方法を用いて参照染色体由来の胎児核酸の量を測定する工程；
ｄ）工程ｂ）からの胎児核酸の量を工程ｃ）からの胎児核酸の量と比較する工程であって、ここで、標的の胎児核酸の量と参照の胎児核酸の量との間の統計学的有意差は、胎児の異数性の存在を示す、工程
を包含する、方法。
（項目１８）
前記標的染色体および参照染色体の各々における３から１５遺伝子座における胎児核酸の量が、測定される、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
前記メチル化感受性制限酵素の消化効率が、測定される、項目１３、１５または１７に記載の方法。
（項目２０）
前記定量を行うための、多型に基づかない方法および亜硫酸水素塩に基づかない方法は、胎児核酸の量を測定するために競合物質に基づく方法を用いる、項目１３、１５または１７に記載の方法。
（項目２１）
前記方法が、母体サンプル中に存在するＹ染色体核酸の有無を判定する工程をさらに包含する、項目１３、１５または１７に記載の方法。
（項目２２）
母体サンプル中に存在する前記Ｙ染色体核酸の量が、男の胎児に対して測定される、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記胎児核酸の量が、前記Ｙ染色体核酸の量と比較される、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０またはそれ以上の遺伝子座における胎児核酸の量が測定される、項目１３または１５に記載の方法。
（項目２５）
母体サンプル中に存在する核酸の総量が測定される、項目１３または１７に記載の方法。
（項目２６）
前記核酸の総量および男の胎児に対するＹ染色体核酸の量が、測定される、項目１３、１５または１７に記載の方法。
（項目２７）
前記核酸の総量、男の胎児に対するＹ染色体核酸の量、および前記メチル化感受性制限酵素の消化効率のすべてが、測定される、項目１３、１５または１７に記載の方法。
（項目２８）
２つ以上のアッセイが、核酸の総量を測定するために用いられ、１つ以上のアッセイが、男の胎児に対するＹ染色体核酸の量を測定するために用いられ、そして１つ以上のアッセイが、前記メチル化感受性制限酵素の消化効率を測定するために用いられる、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
３またはそれ以上の遺伝子座における胎児核酸の量が測定される、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
前記胎児核酸の量が、消化された母体核酸の平均長より大きいアンプリコンを生成する増幅反応によって測定され、それにより、該胎児核酸がさらに濃縮される、項目１３、１５または１７に記載の方法。