(57)【要約】【課題】  調製が容易であり、かつ従来よりもタンパク質合成量の高い無細胞系タンパク質合成用昆虫細胞抽出液の調製方法、および該昆虫細胞抽出液、ならびにこの昆虫細胞抽出液を用いた無細胞系のタンパク質合成方法を提供する。【解決手段】  昆虫細胞から抽出を行って無細胞系タンパク質合成用昆虫細胞抽出液を調製する方法であって、抽出用液中に懸濁した昆虫細胞を急激に凍結させる工程を少なくとも含有する無細胞系タンパク質合成用昆虫細胞抽出液の調製方法、および該昆虫細胞抽出液、ならびにこの昆虫細胞抽出液を用いた無細胞系のタンパク質合成方法。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
昆虫細胞から抽出を行って無細胞系タンパク質合成用昆虫細胞抽出液を調製する方法であって、抽出用液中に懸濁した昆虫細胞を急激に凍結させる工程を少なくとも含有する、無細胞系タンパク質合成用昆虫細胞抽出液の調製方法。
【請求項２】
上記昆虫細胞を急激に凍結させた後、解凍し、遠心分離することによって昆虫細胞からの抽出を行う、請求項１に記載の調製方法。
【請求項３】
昆虫細胞が、液体窒素によって凍結されたものである、請求項１または２に記載の調製方法。
【請求項４】
昆虫細胞が、−１０℃〜２０℃の水浴または氷水浴中で解凍されたものである、請求項２または３に記載の調製方法。
【請求項５】
抽出用液がプロテアーゼインヒビターを含有するものである、請求項１〜４のいずれかに記載の調製方法。
【請求項６】
ヌクレアーゼ処理を施すことを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の調製方法。
【請求項７】
昆虫細胞がＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ卵細胞由来および／またはＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｌｐｅｒｄａ卵巣細胞由来の培養細胞である、請求項１〜６のいずれかに記載の調製方法。
【請求項８】
請求項１〜７のうちのいずれかに記載の方法で調製された、無細胞系タンパク質合成用昆虫細胞抽出液。
【請求項９】
請求項８に記載の昆虫細胞抽出液を用いた無細胞系タンパク質合成方法。
【請求項１０】
キャップ構造を有する外来ｍＲＮＡを使用することを特徴とする、請求項９に記載の合成方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、無細胞系のタンパク質合成に使用できる昆虫細胞抽出液の調製方法、および昆虫細胞抽出液、ならびに該昆虫細胞抽出液を使用した無細胞系タンパク質合成方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ヒトゲノムを始め多くの生物の遺伝情報が解読されてきている。このような中、ポストゲノム研究として、これらの遺伝情報に対応するタンパク質の機能解析やゲノム創薬が注目を集めている。これらの遺伝情報に対応するタンパク質を医薬品などに応用、利用するには、莫大な種類のタンパク質を短時間で簡単に合成することが必要となってくる。
【０００３】
現在、タンパク質の生産方法には、遺伝子組換え技術によって酵母や昆虫細胞などの生細胞を用いる発現系（以下、「細胞系」ということがある）が広く利用されている。しかし、生細胞は自己機能を維持するために外来タンパク質を排除する傾向があり、また生細胞で細胞毒タンパク質を発現すると細胞が生育しないなど発現が困難なタンパク質も多い。
【０００４】
一方、細胞系を使用しないタンパク質の生産方法として、細胞破砕液や抽出液に基質や酵素などを加えるなどして生物の遺伝情報翻訳系を試験管内に取り揃え、目的のタンパク質をコードするｍＲＮＡを用いて、アミノ酸を望みの順番に必要な残基数結合させることのできる合成系を再構築する、無細胞系のタンパク質合成が知られている。このような無細胞系タンパク質合成では、上記細胞系のタンパク質合成のような制約を受けにくく、生物の命を断つことなくタンパク質の合成を行うことができ、またタンパク質の生産に培養などの操作を伴わないため細胞系と比較して短時間にタンパク質の合成を行うことができる。さらに無細胞系タンパク質合成では、生命体が利用していないアミノ酸配列からなるタンパク質の大量生産も可能となることから、有望な発現方法であると期待されている。このような無細胞系のタンパク質合成に供する細胞破砕液や抽出液として、種々の生物由来のものを使用することが検討され、研究が進められている。この中で、昆虫細胞は、多くの哺乳類系の培養細胞と異なり二酸化炭素雰囲気下での培養を必要とせず、無血清培地においても培養が可能で、また細胞系においては翻訳後修飾により、本来の生物活性を保持しつつ大量発現が可能であることから、様々なタンパク質の発現に用いられている。このような昆虫細胞を無細胞系において利用することが可能となれば、糖鎖付加などの翻訳後修飾も充分に期待できるため、その開発が注目されている。
【０００５】
従来、無細胞系タンパク質合成用の抽出液を調製すべく昆虫細胞から抽出を行う方法としては、不活性ガスの雰囲気中、加圧下の昆虫細胞を減圧させることによって、昆虫細胞を破砕して抽出する方法が知られている（たとえば、特許文献１を参照。）。しかし、この方法では昆虫細胞からの抽出に際し特別な装置や器具が必要であり、また操作も煩雑である。さらに、抽出液調製時の細胞数や窒素ガス圧、加圧時間によって無細胞系でのタンパク質合成能が大きく影響されるため、条件設定に煩雑な操作を要する。また、かかる方法によって得られた抽出液では、合成できるタンパク質の量は極めて少なく、放射能標識を行ったアミノ酸の取り込みによってのみ、そのタンパク質合成活性を測定できるという程度である。
このため、その調製が容易でありかつタンパク質合成量の高い昆虫細胞由来抽出液およびその調製方法の開発が望まれている。
【特許文献１】特開２０００−３２５０７６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、上記課題を解決するためになされたものであって、その目的とするところは、調製が容易であり、かつ従来よりもタンパク質合成量の高い無細胞系タンパク質合成用昆虫細胞抽出液の調製方法、および該昆虫細胞抽出液、ならびにこの昆虫細胞抽出液を用いた無細胞系のタンパク質合成方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、本発明を完成するに至った。即ち、本発明は以下のとおりである。
（１）昆虫細胞から抽出を行って無細胞系タンパク質合成用昆虫細胞抽出液を調製する方法であって、抽出用液中に懸濁した昆虫細胞を急激に凍結させる工程を少なくとも含有する、無細胞系タンパク質合成用昆虫細胞抽出液の調製方法。
（２）上記昆虫細胞を急激に凍結させた後、解凍し、遠心分離することによって昆虫細胞からの抽出を行う、上記（１）に記載の調製方法。
（３）昆虫細胞が、液体窒素によって凍結されたものである、上記（１）または（２）に記載の調製方法。
（４）昆虫細胞が、−１０℃〜２０℃の水浴または氷水浴中で解凍されたものである、上記（２）または（３）に記載の調製方法。
（５）抽出用液がプロテアーゼインヒビターを含有するものである、上記（１）〜（４）のいずれかに記載の調製方法。
（６）ヌクレアーゼ処理を施すことを特徴とする、上記（１）〜（５）のいずれかに記載の調製方法。
（７）昆虫細胞がＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ卵細胞由来および／またはＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｌｐｅｒｄａ卵巣細胞由来の培養細胞である、上記（１）〜（６）のいずれかに記載の調製方法。
（８）上記（１）〜（７）のうちのいずれかに記載の方法で調製された、無細胞系タンパク質合成用昆虫細胞抽出液。
（９）上記（８）に記載の昆虫細胞抽出液を用いた無細胞系タンパク質合成方法。
（１０）キャップ構造を有する外来ｍＲＮＡを使用することを特徴とする、上記（９）に記載の合成方法。
【０００８】
本明細書における「無細胞系タンパク質合成」は、外来ｍＲＮＡの情報を読み取ってタンパク質を合成する無細胞翻訳系によるタンパク質合成を指すものとする。ここで、本発明の合成方法によって無細胞系で合成される「タンパク質」は、複数のアミノ酸残基から構成される任意の分子量のペプチド、すなわち低分子量のペプチドから高分子量のいずれをも包含するものとする。また本明細書でいう「タンパク質」は、糖鎖修飾されてなる糖タンパク質も含む。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、調製が容易であり、かつ従来よりもタンパク質合成量の高い無細胞系タンパク質合成用昆虫細胞抽出液の調製方法、および該昆虫細胞抽出液、ならびにこの昆虫細胞抽出液を用いた無細胞系のタンパク質合成方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、昆虫細胞から抽出を行って無細胞系タンパク質合成用昆虫細胞抽出液を調製する方法であって、抽出用液中に懸濁した昆虫細胞を急激に凍結させる工程を少なくとも含有することをその大きな特徴とするものである。このような昆虫細胞抽出液を調製することで、上記特許文献１に記載の従来の手法と比較して、より緩和な状態で細胞の破砕を行うことができ、無細胞系タンパク質合成に必須な成分を破壊することなく細胞外に取り出すことができるので、従来よりも無細胞系にてタンパク質の合成量の高い抽出液を容易に調製することができる。さらに本発明の方法によれば、使用器具などからのＲＮａｓｅなどの混入も防ぐことができ、また、界面活性剤などの試薬を用いた細胞破砕法の場合に懸念される翻訳反応を阻害するような物質の持込みもない。
【００１１】
本発明の調製方法では、抽出用液中に懸濁した昆虫細胞を急激に凍結させることを要する。本発明の調製方法において、「急激に凍結」とは、凍結処理に付した後、１０秒以下、好ましくは２秒以下で昆虫細胞を凍結させることを指す。本発明において、昆虫細胞の凍結を急激に行わなかった場合には、タンパク質合成に必須な成分が不活化する虞があるため、本発明の上記効果を達成することができない。
上記のように昆虫細胞を急激に凍結させる温度としては、通常−８０℃以下であり、好ましくは−１５０℃以下である。−８０℃を越える温度で急激に凍結させると、タンパク質合成に必須な成分が失活してタンパク質合成能が低下してしまう傾向にあるためである。
【００１２】
上記昆虫細胞の急激な凍結は、たとえば、液体窒素や液体ヘリウムなどの不活性ガスを使用することなどによって実現できるが、入手が容易であり安価な液体窒素を用いて行うのが好ましい。
【００１３】
本発明の調製方法においては、昆虫細胞からの抽出に際して、抽出用液中に懸濁した昆虫細胞を急激に凍結させる工程を少なくとも含有しているならば、その他の工程について特に制限はない。たとえば、乳鉢中で乳棒を用いてすり潰す方法、ダウンスホモジナイザーを用いる方法、ガラスビーズを用いる方法など、大腸菌や小麦胚芽などから無細胞系タンパク質合成用の抽出液を得る際に従来より行われていた種々の手法にて昆虫細胞を破砕し、抽出を行えばよいが、昆虫細胞は、大腸菌や小麦胚芽などから無細胞系タンパク質合成用の抽出液を得る場合と比較して細胞の破砕が容易であり、さらには、この凍結・解凍によるだけの破砕法により得られた抽出液にはタンパク質合成に必須な成分が活性を保持した状態で含まれているという理由によりタンパク質合成能の高い抽出液を得ることができるという利点もあることから、上記昆虫細胞を急激に凍結させた後、解凍し、遠心分離することによって昆虫細胞を破砕するのが好ましい。
【００１４】
上記急激に凍結した昆虫細胞を、解凍した後、遠心分離する場合、解凍は、たとえば−１０℃〜２０℃の水浴または氷水浴中での解凍、室温（２５℃）にての放置などによって実現できるが、タンパク質合成に必須な成分の失活を防止し、タンパク質合成能の低下を確実に防ぐことから、０℃〜２０℃（特には、４℃〜１０℃）の水浴または氷水浴中で解凍を行うのが好ましい。解凍した昆虫細胞の遠心分離は、当分野において通常行われている条件（１０，０００×ｇ〜５０，０００×ｇ、０℃〜１０℃、１０分間〜６０分間）で行えばよい。かかる遠心分離後の上清には、目的とする昆虫細胞の抽出物が含有される。
【００１５】
本発明に用いる昆虫細胞としては、特に制限はなく、たとえば、鱗翅目、直翅目、双翅目、膜翅目、鞘翅目、甲虫目、脈翅目、半翅目などの昆虫由来の細胞を使用することができる。中でも、培養細胞株が多く樹立されていることから鱗翅目、半翅目などの昆虫由来の細胞が好ましい。また、本発明における昆虫細胞としては、いかなる組織由来の細胞であってもよく、たとえば、血球細胞、生殖巣由来細胞、脂肪体由来細胞、胚由来細胞、孵化幼虫由来細胞などを特に制限なく使用することができる。中でも、タンパク質生産能が高いと考えられる生殖巣由来細胞を使用するのが好ましい。特に、細胞系においてタンパク質合成能が高く、また無血清培地にて培養が可能であることから、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉの卵細胞由来の細胞であるＨｉｇｈ  Ｆｉｖｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）やＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｌｐｅｒｄａ卵巣細胞由来の細胞であるＳｆ２１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を昆虫細胞として用いるのが好ましい。
なお本発明においては、単一種の昆虫における単一の組織由来の昆虫細胞に限らず、単一種の昆虫における複数種の組織由来であってよく、複数種の昆虫における単一の組織由来であってもよく、無論、複数種の昆虫における複数種の組織由来であってもよい。
【００１６】
本発明の調製方法に用いられる抽出用液は、特に制限されるものではないが、プロテアーゼインヒビターを少なくとも含有するのが好ましい。プロテアーゼインヒビターを含有する抽出用液を用いると、昆虫細胞由来の抽出物に含有されるプロテアーゼの活性が阻害され、当該プロテアーゼによる抽出物中の活性タンパクの不所望な分解を防止でき、結果として昆虫細胞由来の抽出物が有するタンパク質合成能を有効に引き出すことができるようになるという利点がある。
【００１７】
上記プロテアーゼインヒビターとしては、プロテアーゼの活性を阻害し得るものであるならば特に制限はなく、たとえば、フェニルメタンスルホニルフルオリド（以下、「ＰＭＳＦ」ということがある。）、アプロチニン、ベスタチン、ロイペプチン、ペプスタチンＡ、Ｅ−６４（Ｌ−ｔｒａｎｓ−エポキシスクシニルロイシルアミド−４−グアニジノブタン）、エチレンジアミン四酢酸、ホスホラミドンなどを使用することができるが、昆虫細胞由来の抽出液にはセリンプロテアーゼが含まれることから、上記中でもセリンプロテアーゼに対して特異性の高いインヒビターとして働くＰＭＳＦを使用するのが好ましい。また、１種類のプロテアーゼインヒビターのみならず、数種類の混合物（プロテアーゼインヒビターカクテル）を用いてもよい。
【００１８】
当該抽出用液中におけるプロテアーゼインヒビターの含有量に特に制限はないが、本発明の作用に必須な酵素類の分解阻害能を好適に発揮できる観点から、１μＭ〜５０ｍＭ含有されることが好ましく、０．０１ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。プロテアーゼインヒビターが１μＭ未満であると、プロテアーゼの分解活性を充分抑えることができない傾向にあるためであり、またプロテアーゼインヒビターが５０ｍＭを越えると、タンパク質合成反応を阻害する傾向にあるためである。
【００１９】
また本発明に用いる抽出用液は、上記プロテアーゼインヒビターに加えて、カリウム塩、マグネシウム塩、ジチオトレイトールおよび緩衝剤を少なくとも含有するのが好ましい。
上記カリウム塩としては、本発明の作用を阻害するようなものでなければ特に制限はなく、たとえば酢酸カリウム、炭酸カリウム、炭酸水素カリウム、塩化カリウム、リン酸水素二カリウム、クエン酸水素二カリウム、硫酸カリウム、リン酸二水素カリウム、ヨウ化カリウム、フタル酸カリウムなど一般的な形態で使用することができ、中でも酢酸カリウムを使用するのが好ましい。カリウム塩は、タンパク質合成反応における補助因子として作用する。
【００２０】
当該抽出用液中におけるカリウム塩の含有量に特に制限はないが、保存安定性の観点から、たとえば酢酸カリウムなど１価のカリウム塩である場合、１０ｍＭ〜５００ｍＭ含有されることが好ましく、５０ｍＭ〜３００ｍＭ含有されることがより好ましい。カリウム塩が１０ｍＭ未満または５００ｍＭを越えると、タンパク質合成に必須な成分が不安定になる傾向にあるためである。
【００２１】
上記マグネシウム塩としては、本発明の作用を阻害するようなものでなければ特に制限はなく、たとえば酢酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、クエン酸マグネシウム、リン酸水素マグネシウム、ヨウ化マグネシウム、乳酸マグネシウム、硝酸マグネシウム、シュウ酸マグネシウムなど一般的な形態で使用することができ、中でも酢酸マグネシウムを使用するのが好ましい。マグネシウム塩も、タンパク質合成反応における補助因子として作用する。
【００２２】
当該抽出液中におけるマグネシウム塩の含有量に特に制限はないが、保存安定性の観点から、たとえば酢酸マグネシウムなど２価の塩である場合、０．１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．５ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。マグネシウム塩が０．１ｍＭ未満または１０ｍＭを越えると、タンパク質の合成に必須な成分が不安定になる傾向にあるためである。
【００２３】
上記ジチオトレイトール（以下、「ＤＴＴ」ということがある。）は、酸化防止の目的で配合されるものであり、当該抽出液中において０．１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．５ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。ＤＴＴが０．１ｍＭ未満または１０ｍＭを越えると、タンパク質の合成に必須な成分が不安定になる傾向にあるためである。
【００２４】
上記緩衝剤は、抽出液に緩衝能を付与し、たとえば酸性または塩基性物質の添加などによって起こる抽出液のｐＨの急激な変化による抽出物の変性を防止する目的で配合される。このような緩衝剤としては、特に制限はなく、たとえば、ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、酢酸−酢酸ナトリウム、クエン酸−クエン酸ナトリウム、リン酸、ホウ酸、ＭＥＳ、ＰＩＰＥＳなどを使用することができる。
緩衝剤は、当該抽出液のｐＨが４〜１０に保持されるようなものを使用するのが好ましく、ｐＨが６．５〜８．５に保持されるようなものを使用するのがより好ましい。抽出液のｐＨが４未満またはｐＨが１０を越えると、本発明の反応に必須な成分が変性する虞があるためである。このような観点より、上記中でもＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ６．５〜８．５）を使用するのが特に好ましい。
【００２５】
当該抽出液中における緩衝剤の含有量に特に制限はないが、好適な緩衝能を保持する観点から、５ｍＭ〜２００ｍＭ含有されることが好ましく、１０ｍＭ〜１００ｍＭ含有されることがより好ましい。緩衝剤が５ｍＭ未満であると、酸性または塩基性物質の添加によりｐＨの急激な変動を引き起こし、抽出物が変性する傾向にあるためであり、また緩衝剤が２００ｍＭを越えると、塩濃度が高くなり過ぎ、タンパク質合成に必須な成分が不安定になる傾向にあるためである。
【００２６】
また、上記組成に加えて、塩化カルシウムおよびグリセロールをさらに含有してなる抽出用液を用いると、タンパク質合成能がより向上された昆虫細胞抽出液を得ることができるため好ましい。
この場合、塩化カルシウムの含有量は特に制限されないが、上記タンパク質合成能の向上の効果を有効に発揮し得る観点より、０．１ｍＭ〜１０ｍＭであるのが好ましく、０．５ｍＭ〜５ｍＭであるのがより好ましい。また、グリセロールの添加量についても特に制限されるものではないが、上記タンパク質合成能の向上の効果を有効に発揮し得る観点より、５（ｖ／ｖ）％〜８０（ｖ／ｖ）％となるように添加されるのが好ましく、１０（ｖ／ｖ）％〜５０（ｖ／ｖ）％となるように添加されるのがより好ましい。
【００２７】
本発明の昆虫細胞抽出液の調製方法において、細胞破砕後から、無細胞系タンパク質合成用昆虫細胞抽出液を得るまでの手順等については特に制限されるものではない。図１は、本発明の好ましい調製方法１〜３を簡略化して示すフローチャートである。図１に示す各調製方法１〜３においては、上述したように急激な凍結後、解凍して遠心分離を行う方法によって細胞破砕を行う例を示している。
図１に示すように、本発明の調製方法においては、細胞破砕後、上記遠心分離後の上清（上清１Ａ）をそのまま抽出液としてもよいし、また上清１Ａをさらに遠心分離（１０，０００×ｇ〜１００，０００×ｇ、０℃〜１０℃、１０分間〜１２０分間）にかけて、得られた上清（上清１Ｂ）を抽出液（上清１）としてもよい（以下「調製方法１」と呼ぶ）。さらに、上記上清１（上清１Ａまたは１Ｂ）をゲル濾過し、ゲル濾過後の濾液より２８０ｎｍにおける吸光度が１０以上の画分（吸収の大きな画分）を分取して、これを抽出液としてもよい（以下「調製方法２」と呼ぶ）。この場合、具体的には以下の手順にて行う。
【００２８】
まず、上清１Ａまたは上清１Ｂについてゲル濾過を行うが、ゲル濾過は、たとえば脱塩カラム  ＰＤ−１０（アマシャム  バイオサイエンス社製）を好適に使用することができ、常法にしたがって、ゲル濾過用緩衝液にてカラムを平衡化した後、試料を供給し、上記ゲル濾過用緩衝液にて溶出する、というような条件にて行えばよい。上記ゲル濾過用緩衝液としては、従来公知の適宜の組成のものを特に制限なく使用することができ、たとえば、１０ｍＭ〜１００ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ６．５〜８．５）、５０ｍＭ〜３００ｍＭの酢酸カリウム、０．５ｍＭ〜５ｍＭの酢酸マグネシウム、０．５ｍＭ〜５ｍＭのＤＴＴ、０．０１ｍＭ〜５ｍＭのＰＭＳＦを含有するゲル濾過用緩衝液を用いることができる。ゲル濾過して得られる濾液は、通常のゲル濾過で行われているように、０．１ｍＬ〜１ｍＬを１画分とすればよく、高いタンパク質合成能を有する画分を効率よく分取するという観点より、０．４ｍＬ〜０．６ｍＬを１画分とするのが好ましい。
続いて、たとえばＵｌｔｒｏｓｐｅｃ３３００ｐｒｏ（アマシャム  バイオサイエンス社製）などの機器を用いて、２８０ｎｍにおける吸光度が３０以上の画分（吸収の大きな画分）をゲル濾過後の濾液より分取して、これを抽出液とする。
【００２９】
また上記調製方法２で得られた吸収の大きな画分を、さらに遠心分離にかけて、得られた上清（上清２）を抽出液とするようにしてもよい（以下、「調製方法３」と呼ぶ）。このゲル濾過後の遠心分離は、翻訳反応を阻害する不溶性の成分を除去するという理由から、３０，０００×ｇ〜１００，０００×ｇ、０℃〜１０℃、１０分間〜６０分間の条件で行うのが、好ましい。
【００３０】
なお、本発明の調製方法に供する昆虫細胞は、培養に用いる培地の翻訳反応液への持込みを避けるため、上記急激な凍結を行う前に、プロテアーゼインヒビターおよびグリセロールを含有しない以外は、上述した昆虫細胞用の好適な抽出用液と同じ組成の洗浄液にて予め洗浄しておくのが好ましい。洗浄液での洗浄は、昆虫細胞に洗浄液を添加し、これを遠心分離（たとえば、７００×ｇ、１０分間、４℃という条件）することによって行う。洗浄に用いる洗浄液の量は、培地を完全に洗い流すという理由から、湿重量１ｇの昆虫細胞に対し５ｍＬ〜１００ｍＬであるのが好ましく、１０ｍＬ〜５０ｍＬであるのがより好ましい。洗浄回数は、１回〜５回行うのが好ましく、２回〜４回行うのがより好ましい。
【００３１】
また本発明の調製方法に供する昆虫細胞の量は、特に制限されるものではないが、抽出効率を最適に保つため、抽出液１ｍＬに対して０．１ｇ〜５ｇであるのが好ましく、０．５ｇ〜２ｇであるのがより好ましい。
【００３２】
本発明の方法にて調製された無細胞系タンパク質合成用の昆虫細胞抽出液は、昆虫細胞由来の抽出物をタンパク質濃度で１ｍｇ／ｍＬ〜２００ｍｇ／ｍＬ含有することが好ましく、１０ｍｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬ含有することがより好ましい。当該抽出物の含有量がタンパク質濃度で１ｍｇ／ｍＬ未満であると、本発明の作用に必須な成分の濃度が低くなり、充分な合成反応が行えなくなる虞があるためであり、また当該抽出物の含有量がタンパク質濃度で２００ｍｇ／ｍＬを越えると、抽出液自体が高い粘性を有し、操作しづらい虞があるためである。
該抽出液中の昆虫細胞由来の抽出物の含有量は、タンパク質濃度を測定することで決定され、たとえば、ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（ＰＩＥＲＣＥ社製）を使用し、タンパク質濃度を測定することによって決定される。具体的には、反応試薬２ｍＬに対してサンプルを０．１ｍＬ加え、３７℃で３０分間反応させ、分光光度計（Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ３３００ｐｒｏ、アマシャムバイオサイエンス社製）を用いて、５６２ｎｍにおける吸光度を測定する。コントロールとしては、通常、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を使用し、検量線を作成する。このような手法により測定することができる。
【００３３】
また抽出液中に含有される抽出物が昆虫細胞由来のものであるか否かは、たとえば、抽出液中のリボソームＲＮＡの塩基配列解析を行うことによって判別することができる。
【００３４】
本発明の抽出液は、昆虫細胞由来の抽出物をタンパク質濃度で１０ｍｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬ含有するとともに、５０ｍＭ〜３００ｍＭの酢酸カリウム、０．５ｍＭ〜５ｍＭの酢酸マグネシウム、０．５ｍＭ〜５ｍＭのＤＴＴ、０．０１ｍＭ〜５ｍＭのＰＭＳＦ、１０ｍＭ〜１００ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ６．５〜８．５）を含有するように実現されるのが好ましい。
【００３５】
本発明の昆虫細胞抽出液は、無細胞系タンパク質合成に供する前に、ヌクレアーゼ処理を施されたものであることが好ましい。ヌクレアーゼ処理の施された昆虫細胞抽出液を無細胞系タンパク質合成に供することで、ヌクレアーゼ処理を施さなかった昆虫細胞抽出液を用いた場合と比較して、より多くの量の目的タンパク質を合成することができる。これは、以下のような理由による。
無細胞系において目的タンパク質を合成する際、細胞抽出液由来の内在性ｍＲＮＡが含まれると、この内在性ｍＲＮＡがコードするタンパク質も合成されてしまう。たとえば、無細胞系において目的タンパク質を標識したいときに、この内在性ｍＲＮＡより合成されたタンパク質についても同時に標識されてしまい、その後の目的タンパク質の解析に支障をきたすことがある。また内在性ｍＲＮＡ存在下では目的のタンパク質の合成量も低下してしまう可能性が高い。よって、無細胞系タンパク質合成に用いられる細胞抽出液中には内在性ｍＲＮＡは含まれないことが望ましい。
【００３６】
ヌクレアーゼ処理は、従来公知の適宜の手法を特に制限なく用いることができるが、内在性のＲＮＡの中で、ｍＲＮＡのみに対し選択的に消化を行うことから、ｍＲＮＡをカルシウム存在下で選択的に分解するミクロコッカルヌクレアーゼを用いて昆虫細胞抽出液を処理することが好ましい。
具体的には、昆虫細胞抽出液に、ミクロコッカルヌクレアーゼ（ロシュ・ダイアグノスティクス社製）及び塩化カルシウムを添加し、１５℃〜２５℃で５分間〜６０分間反応させる。ミクロコッカルヌクレアーゼは、翻訳反応開始後に外来ｍＲＮＡを分解または抽出液中のタンパク質合成に必須な成分を分解する虞があるため、終濃度が１０μｇ／ｍＬ〜１００μｇ／ｍＬとなるように添加するのが好ましく、３０μｇ／ｍＬ〜６０μｇ／ｍＬとなるように添加するのがより好ましい。また塩化カルシウムはカルシウムがミクロコッカルヌクレアーゼの活性化に必須であるが、翻訳反応を阻害する虞があるため、終濃度が０．０５ｍＭ〜５０ｍＭとなるように添加するのが好ましく、０．１ｍＭ〜１ｍＭとなるように添加するのがより好ましい。上記反応後、ミクロコッカルヌクレアーゼがカルシウム依存性であるため、カルシウムイオンをキレートし、ミクロコッカルヌクレアーゼを失活させることを目的として、エチレングリコールビス（２−アミノエチルエーテル）四酢酸（以下、「ＥＧＴＡ」ということがある。）を添加する。ＥＧＴＡは、カルシウムイオンを充分にキレートできるように、終濃度が０．１ｍＭ〜１００ｍＭとなるように添加するのが好ましく、１ｍＭ〜２０ｍＭとなるように添加するのがより好ましい。
【００３７】
本発明はまた、上記抽出液を用いた無細胞系のタンパク質合成方法を提供するものである。かかる合成反応においては、通常、上記抽出液に無細胞系でのタンパク質合成に要する添加物を添加した反応液として調製する。上記添加物に特に制限はなく、無細胞系のタンパク質合成の分野において従来より一般に使用されているものであれば特に制限はない。
なお上記反応液は、本発明の抽出液が１０（ｖ／ｖ）％〜８０（ｖ／ｖ）％、特には３０（ｖ／ｖ）％〜６０（ｖ／ｖ）％含有されるように調製されるのが好ましい。
すなわち、上記反応液の全体において、昆虫細胞由来の抽出物の含有量が、タンパク質濃度で０．１ｍｇ／ｍＬ〜１６０ｍｇ／ｍＬとなるように調製されるのが好ましく、３ｍｇ／ｍＬ〜６０ｍｇ／ｍＬとなるように調製されるのがより好ましい。当該抽出物の含有量がタンパク質濃度で０．１ｍｇ／ｍＬ未満または１６０ｍｇ／ｍＬを越えると、目的のタンパク質の合成速度が低下する虞があるためである。
【００３８】
通常、上記反応液としては、上記抽出液を除く成分として、カリウム塩、マグネシウム塩、ＤＴＴ、アデノシン三リン酸、グアノシン三リン酸、クレアチンリン酸、クレアチンキナーゼ、アミノ酸成分、ＲＮａｓｅインヒビター、ｔＲＮＡ、外来ｍＲＮＡ、緩衝剤を少なくとも含有するものを用いる。これにより、短時間で大量のタンパク質の合成が可能であるというような利点をさらに有する無細胞系タンパク質合成用の反応液を実現できる。
【００３９】
当該反応液中におけるカリウム塩としては、抽出用液の成分として上述した各種のカリウム塩、好適には酢酸カリウム、を好ましく使用できる。カリウム塩は、上述した抽出用液におけるカリウム塩の場合と同様の観点から、当該反応液中において、１０ｍＭ〜５００ｍＭ含有されることが好ましく、５０ｍＭ〜１５０ｍＭ含有されることがより好ましい。
【００４０】
当該反応液中におけるマグネシウム塩としては、抽出用液の成分として上述した各種のマグネシウム塩、好適には酢酸マグネシウム、を好ましく使用できる。マグネシウム塩は、上述した抽出液におけるマグネシウム塩の場合と同様の観点から、当該反応液中において、０．１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．５ｍＭ〜３ｍＭ含有されることがより好ましい。
【００４１】
当該反応液中におけるＤＴＴは、上述した抽出用液におけるＤＴＴの場合と同様の観点から、０．１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．２ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。
【００４２】
当該反応液中におけるアデノシン三リン酸（以下、「ＡＴＰ」ということがある。）は、タンパク質合成の速度の観点から、当該反応液中において０．０１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．１ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。ＡＴＰが０．０１ｍＭ未満または１０ｍＭを越えると、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。
【００４３】
当該反応液中におけるグアノシン三リン酸（以下、「ＧＴＰ」ということがある。）は、タンパク質合成の速度の観点から、当該反応液中において０．０１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることが好ましく、０．０５ｍＭ〜５ｍＭ含有されることがより好ましい。ＧＴＰが０．０１ｍＭ未満または１０ｍＭを越えると、タンパク質合成の速度が低下する傾向にあるためである。
【００４４】
当該反応液中におけるクレアチンリン酸は、タンパク質を継続的に合成するための成分であって、ＡＴＰとＧＴＰを再生する目的で配合される。クレアチンリン酸は、タンパク質合成の速度の観点から、当該反応液中において１ｍＭ〜２００ｍＭ含有されることが好ましく、１０ｍＭ〜１００ｍＭ含有されることがより好ましい。クレアチンリン酸が１ｍＭ未満であると、充分な量のＡＴＰとＧＴＰが再生されにくく、結果としてタンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためであり、またクレアチンリン酸が２００ｍＭを越えると、阻害物質として働き、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。
【００４５】
当該反応液中におけるクレアチンキナーゼは、タンパク質を継続的に合成するための成分であって、クレアチンリン酸と共にＡＴＰとＧＴＰを再生する目的で配合される。クレアチンキナーゼは、タンパク質合成の速度の観点から、当該反応液中において１μｇ／ｍＬ〜１０００μｇ／ｍＬ含有されることが好ましく、１０μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬ含有されることがより好ましい。クレアチンキナーゼが１μｇ／ｍＬ未満であると、充分な量のＡＴＰとＧＴＰが再生されにくく、結果としてタンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためであり、またクレアチンキナーゼが１０００μｇ／ｍＬを越えると、阻害物質として働き、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。
【００４６】
当該反応液中におけるアミノ酸成分は、２０種類のアミノ酸、すなわち、バリン、メチオニン、グルタミン酸、アラニン、ロイシン、フェニルアラニン、グリシン、プロリン、イソロイシン、トリプトファン、アスパラギン、セリン、トレオニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、チロシン、リシン、グルタミン、シスチン、アルギニン、の２０種類のアミノ酸を少なくとも含有する。このアミノ酸には、ラジオアイソトープ標識されたアミノ酸も含まれる。さらに、必要に応じて、修飾アミノ酸を含有していてもよい。当該アミノ酸成分は、通常、各種類のアミノ酸を概ね等量ずつ含有してなる。
本発明においては、タンパク質合成の速度の観点から、当該反応液中において上記のアミノ酸成分が１μＭ〜１０００μＭ含有されることが好ましく、１０μＭ〜２００μＭ含有されることがより好ましい。アミノ酸成分が１μＭ未満または１０００μＭを越えると、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあるためである。
【００４７】
当該反応液中におけるＲＮａｓｅインヒビターは、抽出液に混在する昆虫細胞由来のＲＮａｓｅによって、本発明の無細胞系タンパク質合成の際にｍＲＮＡやｔＲＮＡが不所望に消化されて、タンパク質の合成を妨げるのを防ぐ目的で配合されるものであり、当該反応液中において０．１Ｕ／μＬ〜１００Ｕ／μＬ含有されることが好ましく、１Ｕ／μＬ〜１０Ｕ／μＬ含有されることがより好ましい。ＲＮａｓｅインヒビターが０．１Ｕ／μＬ未満であると、ＲＮａｓｅの分解活性を充分抑えることができない傾向にあるためであり、またＲＮａｓｅインヒビターが１００Ｕ／μＬを越えると、タンパク質合成反応を阻害する傾向にあるためである。
【００４８】
当該反応液中における外来ｍＲＮＡにおいては、昆虫細胞に由来しないｍＲＮＡであるならば、コードするタンパク質（ペプチドを含む）に特に制限はなく、毒性を有するタンパク質をコードするものであってもよいし、また糖タンパク質をコードするものであってもよい。反応液に含有されるｍＲＮＡが外来ｍＲＮＡであるか昆虫細胞に由来するｍＲＮＡであるかは、まず、抽出液中より、ｍＲＮＡを単離精製後、逆転写酵素によりｃＤＮＡを合成し、得られたｃＤＮＡの塩基配列を解析し、既知の外来ｍＲＮＡの塩基配列と比較することで判別することができる。
【００４９】
なお用いる外来ｍＲＮＡは、塩基数に特に制限はなく、目的とするタンパク質を合成し得るならば外来ｍＲＮＡ全てが同じ塩基数でなくともよい。また、目的とするタンパク質を合成し得る程度に相同な配列であれば、各外来ｍＲＮＡは、複数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加されたものであってよい。
本発明に用いる外来ｍＲＮＡは、市販のものでもよいし、目的とするタンパク質のＯＲＦ（Ｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ）を市販のベクター、たとえば、ｐＴＮＴ  Ｖｅｃｔｏｒ（プロメガ社製）の５’−βグロビンリーダー配列の下流に挿入し、これを用いて転写反応で得られたｍＲＮＡを用いても構わない。また、転写反応の際にメチル化されたリボヌクレオチドなどを加えることにより付加されたキャップ構造を有する外来ｍＲＮＡを用いてもよい。
【００５０】
当該反応液中において、外来ｍＲＮＡは、タンパク質合成の速度の観点から、５μｇ／ｍＬ〜２０００μｇ／ｍＬ含有されることが好ましく、２０μｇ／ｍＬ〜１０００μｇ／ｍＬ含有されることがより好ましい。外来ｍＲＮＡが５μｇ／ｍＬ未満または２０００μｇ／ｍＬを越えると、タンパク質合成の速度が低下する傾向にあるためである。
【００５１】
当該反応液中におけるｔＲＮＡは、上記２０種類のアミノ酸に対応した種類のｔＲＮＡを概ね等量ずつ含有してなる。本発明においては、タンパク質合成の速度の観点から、当該反応液中において１μｇ／ｍＬ〜１０００μｇ／ｍＬ含有されることが好ましく、１０μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬ含有されることがより好ましい。ｔＲＮＡが１μｇ／ｍＬ未満または１０００μｇ／ｍＬを越えると、タンパク質合成の速度が低下する傾向にあるためである。
【００５２】
反応液に含有される緩衝剤としては、上述した本発明の抽出液と同様のものが好適に使用でき、同様の理由から、ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ６．５〜８．５）を使用するのが好ましい。また、緩衝剤は、上述した抽出液における緩衝剤の場合と同様の観点から、５ｍＭ〜２００ｍＭ含有されることが好ましく、１０ｍＭ〜５０ｍＭ含有されることがより好ましい。
【００５３】
また上記反応液は、ＥＧＴＡを含有するのが好ましい。ＥＧＴＡを含有すると、ＥＧＴＡが抽出液中の金属イオンとキレートを形成することでリボヌクレアーゼ、プロテアーゼ等が不活化することにより、本発明のタンパク質合成に必須な成分の分解を阻害することができるためである。また上記のように抽出液にヌクレアーゼ処理を施した場合であっても、反応液がＥＧＴＡを含有することにより、ヌクレアーゼが無細胞系タンパク質合成に悪影響を及ぼすことを確実に防止することができる。該ＥＧＴＡは、上記反応液中において、上記分解阻害能を好適に発揮し得る観点から０．０１ｍＭ〜５０ｍＭ含有されることが好ましく、０．１ｍＭ〜１０ｍＭ含有されることがより好ましい。ＥＧＴＡが０．０１ｍＭ未満であると必須な成分の分解活性を充分に抑えることができない傾向にあるためであり、また、５０ｍＭを越えるとタンパク質合成反応を阻害する傾向にあるためである。
【００５４】
すなわち、本発明の無細胞系タンパク質合成方法に用いる反応液は、上記抽出液を３０（ｖ／ｖ）％〜６０（ｖ／ｖ）％含有するとともに、５０ｍＭ〜１５０ｍＭの酢酸カリウム、０．５ｍＭ〜３ｍＭの酢酸マグネシウム、０．２ｍＭ〜５ｍＭのＤＴＴ、０．１ｍＭ〜５ｍＭのＡＴＰ、０．０５ｍＭ〜５ｍＭのＧＴＰ、１０ｍＭ〜１００ｍＭのクレアチンリン酸、１０μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬのクレアチンキナーゼ、１０μＭ〜２００μＭのアミノ酸成分、１Ｕ／μＬ〜１０Ｕ／μＬのＲＮａｓｅインヒビター、１０μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬのｔＲＮＡ、２０μｇ／ｍＬ〜１０００μｇ／ｍＬの外来ｍＲＮＡ、１０ｍＭ〜５０ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ６．５〜８．５）を含有するように実現されるのが好ましい。また、上記に加えてさらに０．１ｍＭ〜１０ｍＭのＥＧＴＡを含有するように実現されるのがより好ましい。
【００５５】
本発明の無細胞系タンパク質合成方法は、上記のような本発明の抽出液を用いて、従来公知のたとえば低温恒温槽にて行う。反応に際しては、通常、上記抽出液を含有する反応液を調製して、これを用いて行う。
【００５６】
また反応温度は、通常、１０℃〜４０℃、好ましくは１５℃〜３０℃の範囲内である。反応温度が１０℃未満であると、タンパク質の合成速度が低下する傾向にあり、また反応温度が４０℃を越えると、必須な成分が変性する傾向にあるためである。
反応の時間は、通常、１時間〜７２時間、好ましくは３時間〜２４時間である。
【００５７】
本発明の無細胞系タンパク質合成方法にて合成されたタンパク質の量は、酵素の活性の測定、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、免疫検定法などによって測定できる。
【００５８】
本発明の無細胞系のタンパク質合成方法にて合成できるタンパク質に特に制限はない。
【実施例】
【００５９】
以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に制限されるものではない。
参考例１
：昆虫細胞の培養
細胞数２．１×１０７個の昆虫細胞Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を、Ｌ−グルタミンを添加したＥｘｐｒｅｓｓ  Ｆｉｖｅ無血清培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を入れた培養フラスコ（６００ｃｍ２）内で２７℃で６日間培養した。結果、細胞数１．０×１０８個、湿重量１．２１ｇとなった。
【００６０】
実施例１
：昆虫細胞抽出液の調製
まず、上記参考例１で培養した昆虫細胞を集菌し、下記組成の抽出用液で３回洗浄（７００×ｇ、４℃、１０分間の条件で遠心分離）した後、１ｍＬの抽出用液中に懸濁した。
〔抽出用液の組成〕
・６０ｍＭ          ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．９）
・２００ｍＭ        酢酸カリウム
・４ｍＭ            酢酸マグネシウム
・４ｍＭ            ＤＴＴ
・０．５ｍＭ        ＰＭＳＦ
この懸濁液を液体窒素中にて急速（１０秒以内）に凍結させた。充分に凍結させた後、約１０℃の水浴中で解凍した。完全に解凍した後、１５０００×ｇ、４℃で１５分間遠心分離（ｈｉｍａｃＣＲ２０Ｂ３、日立工機社製）し、上清を回収した。回収した上清１．５ｍＬを下記組成のゲル濾過用緩衝液で平衡化したＰＤ−１０脱塩カラム（アマシャム  バイオサイエンス社製）にアプライした。
〔ゲル濾過用緩衝液の組成〕
・４０ｍＭ          ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．９）
・１００ｍＭ        酢酸カリウム
・２ｍＭ            酢酸マグネシウム
・１ｍＭ            ＤＴＴ
・０．５ｍＭ        ＰＭＳＦ
アプライした後、ゲル濾過用緩衝液４ｍＬにて溶出し、分光光度計（Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ３３００ｐｒｏ、アマシャム  バイオサイエンス社製）を用いて、２８０ｎｍにおける吸光度が３０以上の画分を回収した。回収した濾液をさらに４５，０００×ｇ、４℃で３０分間遠心分離し、その上清を昆虫細胞抽出液とした。
【００６１】
参考例２
：外来ｍＲＮＡの作製
（１）ベクターＤＮＡの構築
ｐＧＥＭ−ｌｕｃ  Ｖｅｃｔｏｒ（プロメガ社製）５ｎｇを鋳型とし、配列表配列番号１に示す塩基配列を有するプライマー（Ｌｕｃ  Ｔ７−Ｆ３−Ｋｐｎ）と、配列表配列番号２に示す塩基配列を有するプライマー（Ｌｕｃ  Ｔ７−Ｒ４−Ｋｐｎ）と、ＫＯＤ  ｐｌｕｓ（東洋紡績社製）を用いて、９７℃１５秒、５５℃３０秒、６８℃１２０秒、３０サイクルのＰＣＲを行った。エタノール沈殿によりＤＮＡ断片を精製した後、ＫｐｎＩで消化した。
これとは別に、ｐＴＮＴ  Ｖｅｃｔｏｒ（プロメガ社製）をＫｐｎＩで消化した。これらの反応液をアガロースゲル電気泳動で分離した後、Ｇｅｎ  Ｅｌｕｔｅ  Ｇｅｌ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（シグマ社製）を用いてＤＮＡ断片を精製した。Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ（東洋紡績社製）を用いて、これらのＤＮＡ断片をライゲーションした後、大腸菌ＤＨ５α（東洋紡績社製）を形質転換した。形質転換した大腸菌からアルカリ−ＳＤＳ法により調製したプラスミドＤＮＡを、配列表配列番号３に示す塩基配列を有するプライマー（Ｔ７  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）およびＢｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｃｉｎｇ  ＦＳ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いてシークエンシング反応（９６℃１０秒、５０℃５秒、６０℃４分、３０サイクル）を行った。この反応液をＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（アプライドバイオシステムズ社製）に供し、塩基配列解析を行った。ｐＴＮＴ  Ｖｅｃｔｏｒ由来の５’−βグロビンリーダー配列の下流にルシフェラーゼ遺伝子の開始コドンが挿入されたプラスミドをｐＴＮＴ−Ｌｕｃと命名した。
【００６２】
（２）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応
上記（１）で作製したｐＴＮＴ−ＬｕｃをＢａｍＨＩで消化した後、フェノール−クロロホルム抽出、エタノール沈殿により精製した。これを鋳型とし、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応を行った。転写反応液としては、以下の組成のものを用いた。
〔転写反応液の組成〕
・８０ｍＭ          ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．４）
・２４ｍＭ          酢酸マグネシウム
・４０ｍＭ          ＤＴＴ
・７．５ｍＭ        ＮＴＰｓ（ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ、ＣＴＰ）
・２ｍＭ            スペルミジン
・１Ｕ／μＬ        ＲＮａｓｅインヒビター（ヒト胎盤由来）
・１Ｕ／μＬ        Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ
・５０μｇ／ｍＬ    ｐＴＮＴ−Ｌｕｃ／ＢａｍＨＩ
ＮＴＰｓ（シグマ社製）、ＲＮａｓｅインヒビター（宝酒造社製）、Ｔ７  ＲＮＡ  ポリメラーゼ（プロメガ社製）をそれぞれ用いた。反応装置として低温アルミブロック恒温槽ＭＧ−１０００（東京理化器械社製）を用いた。転写反応は３７℃、４時間で行い、反応液量は２０μＬとした。
【００６３】
（３）外来ｍＲＮＡの精製
転写反応終了後、上記（２）の反応液２０μＬに１ＵのＲＱ１  ＲＮａｓｅ  ｆｒｅｅ  ＤＮａｓｅ（プロメガ社製）を添加し、３７℃、１５分間インキュベートし、鋳型ＤＮＡを消化した。フェノール−クロロホルム抽出によりタンパク質を除去した後、酢酸カリウムを終濃度０．３Ｍとなるように添加し、エタノール沈殿を行った。得られた沈殿を１００μＬの滅菌水に溶解し、Ｎｉｃｋ  Ｃｏｌｕｍｎ（アマシャム  バイオサイエンス社製）にアプライした。滅菌水４００μＬで溶出を行った。溶出画分を回収し、酢酸カリウムを終濃度０．３Ｍとなるように添加し、エタノール沈殿を行った。合成された外来ｍＲＮＡの定量は、２６０ｎｍの吸光度を測定して行った。その結果、２０μＬスケールの反応で約６０μｇの外来ｍＲＮＡが合成された。
【００６４】
実験例１
：実施例１の昆虫細胞抽出液および参考例２の外来ｍＲＮＡを用いた無細胞系タンパク質合成
実施例１で調製した昆虫細胞抽出液、および参考例２で合成した外来ｍＲＮＡを用いて、下記組成の反応液を調製し、無細胞系でのタンパク質合成を行った。
〔反応液の組成〕
・５０（ｖ／ｖ）％  昆虫細胞抽出液
・４０ｍＭ          ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．９）
・１００ｍＭ        酢酸カリウム
・２ｍＭ            酢酸マグネシウム
・２ｍＭ            ＤＴＴ
・０．５ｍＭ        ＡＴＰ
・０．２５ｍＭ      ＧＴＰ
・２０ｍＭ          クレアチンリン酸
・２００μｇ／ｍＬ  クレアチンキナーゼ
・８０μＭ          アミノ酸（２０種）
・０．２５ｍＭ      ＥＧＴＡ
・１Ｕ／μＬ        ＲＮａｓｅインヒビター（ヒト胎盤由来）
・２００μｇ／ｍＬ  ｔＲＮＡ
・３２０μｇ／ｍＬ  外来ｍＲＮＡ
ＡＴＰ（シグマ社製）、ＧＴＰ（シグマ社製）、アミノ酸（２０種）（シグマ社製）、ＲＮａｓｅインヒビター（宝酒造社製）、ｔＲＮＡ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）をそれぞれ用いた。反応装置として低温アルミブロック恒温槽ＭＧ−１０００を用いた。反応液量は２５μＬ、反応温度は２５℃とし、反応時間ごとにサンプリングを行い、合成されたルシフェラーゼ量を測定した。合成されたルシフェラーゼはルシフェラーゼアッセイキット（Ｅ−１５００、プロメガ社製）を用いて定量した。ルシフェラーゼアッセイ試薬５０μＬに反応液２．５μＬを添加し、ルミノメーター（Ｔｕｎｅｒ  Ｄｅｓｉｇｎｓ  ＴＤ−２０／２０、プロメガ社製）を用いて、ルシフェラーゼによる発光を測定した。
図２は、実施例１の昆虫細胞抽出液を用いた各反応時間におけるルシフェラーゼの合成量を示すグラフである。図２において縦軸はルシフェラーゼ合成量（μｇ／ｍＬ）、横軸は反応時間（ｈ）を示す。図２に示すように、タンパク質合成反応は反応開始後８時間まで継続し、２４．７μｇ／ｍＬのルシフェラーゼが合成された。
【００６５】
実施例２
：実施例１の昆虫細胞抽出液のヌクレアーゼ処理
実施例１の抽出液に対し、ミクロコッカルヌクレアーゼ（ロシュ・ダイアグノスティクス社製）終濃度３６μｇ／ｍＬ、塩化カルシウム終濃度０．３６ｍＭで添加し、２０℃で１５分間反応させた。反応後、ＥＧＴＡを終濃度６ｍＭで添加し、これを昆虫細胞抽出液とした。
【００６６】
実験例２
：実施例２の昆虫細胞抽出液および参考例２の外来ｍＲＮＡを用いた無細胞系タンパク質合成
実施例２で調製した昆虫細胞抽出液、および参考例２で合成した外来ｍＲＮＡを用いた以外は実験例１で用いたのと同様の組成の反応液を調製し、無細胞系でのタンパク質合成を行った。
図３は、実験例１、２の昆虫細胞抽出液を用いた合成反応開始から５時間のルシフェラーゼの合成量の変化を示すグラフである。図３において、縦軸はヌクレアーゼ未処理の抽出液を用いた反応液において、５時間後のルシフェラーゼ合成量を１００％とした相対合成量（％）を示し、横軸は反応時間（ｈ）を示す。図３に示すように、ヌクレアーゼ処理を施した実施例２の昆虫細胞抽出液を用いると、タンパク質の合成量が増加することが判った。
【００６７】
参考例３
：キャップ構造の付加
多くの真核細胞由来のｍＲＮＡにみられる７−メチルグアノシン５’キャップ構造は、ｍＲＮＡの安定化、リボソームとの親和性の向上といった働きがあることが知られている。転写反応の際にメチル化されたリボヌクレオチドを加えると、転写産物の５’末端にキャップ構造を組み込むことができる。具体的には、以下の手順にて、キャップ構造を有する外来ｍＲＮＡを合成した。
参考例２（１）と同様にして作製したｐＴＮＴ−ＬｕｃをＢａｍＨＩで消化した後、フェノール−クロロホルム抽出、エタノール沈殿により精製した。これを鋳型とし、メチル化されたリボヌクレオチドとしてＲｉｂｏ  ｍ７  Ｃａｐ  Ａｎａｌｏｇ（プロメガ社製）を用い、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応を行った。転写反応液の組成を以下に示す。
〔転写反応液の組成〕
・８０ｍＭ          ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．９）
・２４ｍＭ          酢酸マグネシウム
・４０ｍＭ          ＤＴＴ
・７．５ｍＭ        ＡＴＰ
・７．５ｍＭ        ＵＴＰ
・７．５ｍＭ        ＣＴＰ
・０．６ｍＭ        ＧＴＰ
・３ｍＭ            Ｒｉｂｏ  ｍ７  Ｃａｐ  Ａｎａｌｏｇ
・２ｍＭ            スペルミジン
・１Ｕ／μＬ        ＲＮａｓｅインヒビター（ヒト胎盤由来）
・１Ｕ／μＬ        Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ
・５０μｇ／ｍＬ    ｐＴＮＴ−Ｌｕｃ／ＢａｍＨＩ
【００６８】
実験例３
実施例１で調製した昆虫細胞抽出液、および参考例３で合成したキャップ構造を有する外来ｍＲＮＡを用いた以外は実験例１で用いたのと同様の組成の反応液を調製し、無細胞系でのタンパク質合成を行った。結果、反応時間１０時間で、キャップ構造を有しない外来ｍＲＮＡを用いた場合（実験例１）の約２．６倍のルシフェラーゼが合成された。
図４は、実施例１の昆虫細胞抽出液と参考例３のｍＲＮＡを用いた合成反応開始から１０時間のルシフェラーゼ合成量の変化を示すグラフである。図４において、縦軸は実施例１の昆虫細胞抽出液とキャップ構造を有しない外来ｍＲＮＡ（参考例２）を用いた翻訳反応において１０時間後のルシフェラーゼ合成量を１００％とした相対合成量（％）を示し、横軸は反応時間（ｈ）を示す。
【００６９】
比較例１
参考例１と同様にして培養した昆虫細胞Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を、冷却した昆虫細胞を懸濁後、５分間激しく攪拌して抽出を行った以外は、実施例１および実験例１と同様にして、無細胞系でのタンパク質合成を行った。
結果、反応は２時間で停止し、ルシフェラーゼの合成量も２０ｎｇ／ｍＬと、実験例１の約１０００分の１程度であった。
【００７０】
比較例２
参考例１と同様にして培養した昆虫細胞Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を、細胞溶解用試薬（Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｌｙｓｉｓ  Ｒｅａｇｅｎｔ、プロメガ社製）に溶解した後、抽出を行った以外は、実施例１および実験例１と同様にして、無細胞系でのタンパク質合成を行った。
結果、反応は２時間で停止し、ルシフェラーゼの合成量も２００ｎｇ／ｍＬと、実験例１の約１００分の１程度であった。
【００７１】
参考例４
：昆虫細胞の培養
昆虫細胞Ｓｆ２１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）をＳｆ９００−ＩＩ無血清培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）中にて２７℃で培養した。培地１ｍＬあたりの細胞数６.０×１０５個のＳｆ２１を１２５ｍＬ三角フラスコ内の培地５０ｍＬ中で２７℃・１３０ｒｐｍ・５日間懸濁培養を行った。結果、培地１ｍＬあたりの細胞数１.０×１０８個、湿重量３ｇとなった。この細胞を用いて細胞抽出液を調製した。
【００７２】
実施例３
：昆虫細胞抽出液の調製
まず、上記参考例４で培養した昆虫細胞を集菌し、下記組成の洗浄液にて３回洗浄（７００×ｇ、４℃、１０分間の条件で遠心分離）した後、３ｍＬの下記組成の抽出用液中に懸濁した。
〔洗浄液の組成〕
・４０ｍＭ          ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．９）
・１００ｍＭ        酢酸カリウム
・２ｍＭ            酢酸マグネシウム
・２ｍＭ            塩化カルシウム
・１ｍＭ            ＤＴＴ
〔抽出用液の組成〕
・４０ｍＭ          ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．９）
・１００ｍＭ        酢酸カリウム
・２ｍＭ            酢酸マグネシウム
・２ｍＭ            塩化カルシウム
・２０％（ｖ／ｖ）  グリセロール
・１ｍＭ            ＤＴＴ
・０．５ｍＭ        ＰＭＳＦ
この細胞懸濁液を液体窒素中にて急速（１０秒以内）に凍結させた。充分に凍結させた後、約４℃の氷水浴中で解凍した。完全に解凍した後、３００００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離（ｈｉｍａｃＣＲ２０Ｂ３、日立工機社製）し、上清１Ａを回収した。回収した上清１Ａをさらに４５０００×ｇ、４℃で３０分間遠心分離（ｈｉｍａｃＣＲ２０Ｂ３、日立工機社製）して上清１Ｂを回収した。回収した上清１Ｂを下記組成のゲル濾過用緩衝液で平衡化したＰＤ−１０脱塩カラム（アマシャム  バイオサイエンス社製）に２.５ｍＬアプライした。
〔ゲル濾過用緩衝液の組成〕
・４０ｍＭ          ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．９）
・１００ｍＭ        酢酸カリウム
・２ｍＭ            酢酸マグネシウム
・１ｍＭ            ＤＴＴ
・０．５ｍＭ        ＰＭＳＦ
アプライした後、ゲル濾過用緩衝液３ｍＬにて溶出し、分光光度計（Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ３３００ｐｒｏ、アマシャム  バイオサイエンス社製）を用いて、２８０ｎｍにおける吸光度が３０以上の画分を回収し、これを昆虫細胞抽出液とした。
【００７３】
実験例４
：実施例３の昆虫細胞抽出液および参考例２の外来ｍＲＮＡを用いた無細胞系タンパク質合成
実施例３で調製した昆虫細胞抽出液、および参考例２で合成した外来ｍＲＮＡを用いて、下記組成の反応液を調製し、無細胞系でのタンパク質合成を行った。
〔反応液の組成〕
・５０（ｖ／ｖ）％  昆虫細胞抽出液
・４０ｍＭ          ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．９）
・１００ｍＭ        酢酸カリウム
・１．５ｍＭ        酢酸マグネシウム
・２ｍＭ            ＤＴＴ
・０．２５ｍＭ      ＡＴＰ
・０．１ｍＭ        ＧＴＰ
・２０ｍＭ          クレアチンリン酸
・２００μｇ／ｍＬ  クレアチンキナーゼ
・８０μＭ          アミノ酸（２０種）
・０．１ｍＭ        ＥＧＴＡ
・１Ｕ／μＬ        ＲＮａｓｅインヒビター
・２００μｇ／ｍＬ  ｔＲＮＡ
・３２０μｇ／ｍＬ  外来ｍＲＮＡ（ルシフェラーゼ遺伝子をコード）
ＡＴＰ（シグマ社製）、ＧＴＰ（シグマ社製）、アミノ酸（２０種）（シグマ社製）、ＲＮａｓｅインヒビター（宝酒造社製）、ｔＲＮＡ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）をそれぞれ用いた。反応装置として低温アルミブロック恒温槽ＭＧ−１０００を用いた。反応液量は２５μＬ、反応温度は２５℃、反応時間は６時間で実施した。実験例１と同様にして合成されたルシフェラーゼ量を経時的に測定した結果、１６．３μｇ／ｍＬのルシフェラーゼが合成された（図５）。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】本発明の好ましい調製方法１〜３を簡略化して示すフローチャートである。
【図２】実施例１の昆虫細胞抽出液を用いた各反応時間におけるルシフェラーゼの合成量を示すグラフであり、縦軸はルシフェラーゼ合成量（μｇ／ｍＬ）、横軸は反応時間（ｈ）を示す。
【図３】実験例１、２の昆虫細胞抽出液を用いた合成反応開始から５時間のルシフェラーゼの合成量の変化を示すグラフであり、縦軸はヌクレアーゼ未処理の抽出液を用いた反応液において、５時間後のルシフェラーゼ含有量を１００％とした相対合成量（％）を示し、横軸は反応時間（ｈ）を示す。
【図４】実施例１の昆虫細胞抽出液と参考例３のｍＲＮＡを用いた合成反応開始から１０時間のルシフェラーゼ合成量の変化を示すグラフである。
【図５】実施例３の昆虫細胞抽出液を用いた各反応時間におけるルシフェラーゼの合成量を示すグラフであり、縦軸はルシフェラーゼ合成量（μｇ／ｍＬ）、横軸は反応時間（ｈ）を示す。
【配列表フリーテキスト】
【００７５】
配列番号１：プライマー  Ｌｕｃ  Ｔ７−Ｆ３−Ｋｐｎ
配列番号２：プライマー  Ｌｕｃ  Ｔ７−Ｒ４−Ｋｐｎ
配列番号３：プライマー  Ｔ７  ｐｒｏｍｏｔｅｒ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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