【手続補正書】
【提出日】平成23年6月30日(2011.6.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
規定の培地条件下における多能性幹細胞の自動化増殖のための方法であって：
（ａ）規定の増殖培地において多能性細胞の第一の集団を得る工程と；
（ｂ）自動化分離システムによって該多能性細胞を分離する工程と；
（ｃ）新鮮な規定の増殖培地中に該分離された細胞を懸濁して多能性細胞の増殖した集団を得る工程と、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記多能性細胞がＥＳ細胞または人工多能性細胞（ｉＰＳ）であるかまたは好ましくはヒトＥＳ細胞である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記培養された増殖した多能性ＥＳ細胞のうち少なくとも９７％で分化が全く生じないか、または本質的に生じない、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記増殖培地がＴｅＳＲ培地を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
多能性細胞の前記第一の集団が細胞分離の時点で約５０％コンフルエントと約９９％コンフルエントとの間であり、好ましくは細胞分離の時点で約６０％、７０％、８０％または９０％コンフルエントである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
新鮮増殖培地中の前記分離された細胞を懸濁する工程が、１つ以上の新規な細胞培養プレート（単数または複数）中に該細胞を播種する工程を包含し、好ましくはここで該新規な細胞培養プレート（単数または複数）の表面積がＥＳ細胞の前記第一の集団を含んでいる該プレートの表面積よりも約５倍と約３５倍との間または好ましくは約１０倍と約３５倍との間大きい、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記自動化分離プロトコールが、多能性細胞の前記第一の集団とタンパク質分解酵素とを接触させる工程を包含し、好ましくはここで該タンパク質分解酵素がトリプシン、組み換えトリプシン、トリプシン様プロテイナーゼ、またはＴＲＹＰＬＥである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記新鮮増殖培地がタンパク質分解酵素のインヒビターを、好ましくは細胞分離のために用いられる該タンパク質分解酵素のインヒビターを含み、より好ましくは、ここで該タンパク質分解酵素のインヒビターがトリプシンインヒビターまたはダイズトリプシンインヒビターである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記分離システムがリキッド・ハンドラー・ロボットによって自動化され、好ましくはここで該自動化分離システムが：
（ｉ）前記第一の多能性細胞集団から前記培地を除去する工程と；
（ｉｉ）該多能性細胞とタンパク質分解酵素とを接触させる工程と；
（ｉｉｉ）該細胞とタンパク質分解酵素とをインキュベートして細胞集合を分離する工程と、
を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
タンパク質分解酵素インヒビターとＲｈｏ関連キナーゼ（ＲＯＣＫ）インヒビターとを含む規定の培地が工程（ｉｉｉ）の後に溶液に添加される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記自動化分離システムがさらに：
（ｉｖ）前記インキュベートされた細胞を機械的攪拌に供して、細胞集合をさらに分離する工程、
を包含する、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
多能性細胞の前記集団が非多能性細胞を含まないか、または実質的に含まず、好ましくはここで多能性細胞の該集団がヒトＥＳ細胞であり、ヒトＥＳ細胞の集団が非ヒト細胞を含まないか、または実質的に含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
胚性幹（ＥＳ）細胞の自動化連続増殖のための方法としてさらに規定され：
（ａ）増殖培地においてＥＳ細胞の第一の集団を得る工程と；
（ｂ）自動化分離システムによって該ＥＳ細胞を分離する工程と；
（ｃ）新鮮な増殖培地中に該分離された細胞を懸濁してＥＳ細胞の増殖した集団を得る工程と、
（ｄ）細胞増殖を支持する条件下で該増殖したＥＳ細胞集団をインキュベートする工程と、
（ｅ）工程ｂ〜ｄを１回以上反復してＥＳ細胞の連続増殖した集団を得る工程と、
を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記増殖培地がＲｈｏ関連キナーゼ（ＲＯＣＫ）インヒビターの有効量を含み、好ましくはここで該Ｒｈｏ関連キナーゼ（ＲＯＣＫ）インヒビターがＨＡ−１００またはＨ−１１３５である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
多能性細胞の自動化した維持および増殖のための装置であって：
（ａ）インキュベーター；
（ｂ）リキッド・ハンドラー・ユニット；
（ｃ）１つ以上のリザーバであって、（ｉ）多能性細胞の生きている集団と、（ｉｉ）規定の培地であって、多能性細胞が未分化状態で培養および維持され得る培地である、規定の培地と、（ｉｉｉ）プロテアーゼ、プロテアーゼインヒビターおよびＲｈｏ関連キナーゼ（ＲＯＣＫ）インヒビターのうちの１つ以上とを含むリザーバ；ならびに
（ｄ）該リキッド・ハンドラー・ユニットと連絡したコントローラであって、該多能性細胞の自動化された増殖および維持を達成するように該リキッド・ハンドラー・ユニットに仕向けるように構成されている、コントローラ；
を備える、装置。
【請求項１６】
前記コントローラが操作プログラムを含むコンピューター読み取り可能な媒体を備えるか、またはここで該コントローラがコンピュータ中に含まれる、請求項１５に記載の装置。
【請求項１７】
前記コントローラが：前記リキッド・ハンドラー・ユニット、１つ以上の前記リザーバ、および前記インキュベーターのうちの少なくとも１つを（ｉ）多能性細胞集団から培地を除去するように；多能性細胞とタンパク質分解酵素とを接触させるように；および多能性細胞とタンパク質分解酵素とをインキュベートさせて細胞集合を分離するように仕向けるか、または（ｉｉ）インキュベートされた多能性細胞がプロテアーゼインヒビター、好ましくはＲｈｏ関連キナーゼ（ＲＯＣＫ）インヒビターと接触するように仕向ける、請求項１５に記載の装置。
【請求項１８】
前記装置がさらに機械的攪拌装置および吸引装置を備え、かつ前記コントローラがさらに：前記リキッド・ハンドラー・ユニット、１つ以上の前記リザーバ、および前記インキュベーターのうちの少なくとも１つを、該多能性細胞が機械的攪拌または吸引に供されるように仕向けて、細胞集合をさらに分離する、請求項１５に記載の装置。
【請求項１９】
前記リキッド・ハンドラー・ユニットが少なくとも第一のリザーバおよび第二のリザーバを備え、該第一のリザーバがＴｅＳＲ培地を含み、かつ該第二のリザーバがＴｅＳＲ培地、Ｒｈｏ関連キナーゼ（ＲＯＣＫ）インヒビター、およびプロテアーゼインヒビターを含む、請求項１５に記載の装置。
【請求項２０】
前記リキッド・ハンドラーが、グリッパー・ツールおよびリキッド・ハンドリング・ツールを備える、請求項１５に記載の装置。
【請求項２１】
前記リキッド・ハンドラー・ユニットと前記インキュベーターとの間の流体連絡を容易にするように構成されたロボット様デバイスをさらに備える、請求項１５に記載の装置。
【請求項２２】
前記リキッド・ハンドラー・ユニットと連絡した第二のまたはそれ以上のリザーバをさらに備え、ここで、該第二のリザーバが細胞培養プレート、細胞増殖培地、またはタンパク質分解酵素溶液を好ましくは備え、好ましくはここで該リキッド・ハンドラーが少なくとも第一のリザーバおよび第二のリザーバと連絡しており、該第一のリザーバがＴｅＳＲ培地を含み、かつ該第二のリザーバがＴｅＳＲ培地を含み、該培地がさらに、Ｒｈｏ関連キナーゼ（ＲＯＣＫ）インヒビターおよびプロテアーゼインヒビターを含む、請求項１５に記載の装置。
【請求項２３】
前記インキュベーターが前記多能性細胞の一部を含み、前記装置が該増殖された多能性細胞のうち少なくとも９７％で該細胞のさらなる分化を伴わないかまたは本質的に伴わずに、前記多能性細胞の増殖をもたらすように構成されているか、またはここで前記多能性細胞がヒトＥＳ細胞である、請求項１５に記載の装置。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
本発明の他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかになる。しかし、詳細な説明および特定の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示しているが、例示のために示されているに過ぎないことが理解されるべきである。なぜならこの詳細な説明から当業者には本発明の趣旨および範囲内の種々の変化および改変が明らかになるからである。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
規定の培地条件下における多能性幹細胞の自動化増殖のための方法であって：
（ａ）規定の増殖培地において多能性細胞の第一の集団を得る工程と；
（ｂ）自動化分離システムによって該多能性細胞を分離する工程と；
（ｃ）新鮮な規定の増殖培地中に該分離された細胞を懸濁して多能性細胞の増殖した集団を得る工程と、
を包含する、方法。
（項目２）
前記多能性細胞がＥＳ細胞または人工多能性細胞（ｉＰＳ）である項目１に記載の方法。
（項目３）
前記細胞がヒトＥＳ細胞である、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記培養された増殖した多能性ＥＳ細胞のうち少なくとも９７％で分化が全く生じないか、または本質的に生じない、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記増殖培地がＴｅＳＲ培地を含む、項目１に記載の方法。
（項目６）
多能性細胞の前記第一の集団が細胞培養プレート上に含まれる、項目１に記載の方法。
（項目７）
前記細胞培養プレートがゲル・マトリックスを含む、項目６に記載の方法。
（項目８）
多能性細胞の前記第一の集団が細胞分離の時点で約５０％コンフルエントと約９９％コンフルエントとの間である、項目６に記載の方法。
（項目９）
多能性細胞の前記第一の集団が細胞分離の時点で約６０％、７０％、８０％または９０％コンフルエントである、項目８に記載の方法。
（項目１０）
新鮮増殖培地中の前記分離された細胞を懸濁する工程が、１つ以上の新規な細胞培養プレート（単数または複数）中に該細胞を播種する工程を包含する、項目６に記載の方法。
（項目１１）
前記新規な細胞培養プレート（単数または複数）の表面積がＥＳ細胞の前記第一の集団を含んでいる該プレートの該表面積よりも約５倍と約３５倍との間大きい、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記新規な細胞培養プレート（単数または複数）の前記表面積がＥＳ細胞の前記第一の集団を含んでいる該プレートの該表面積よりも約１０と約３５倍との間大きい、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記自動化分離プロトコールが、多能性細胞の前記第一の集団とタンパク質分解酵素とを接触させる工程を包含する、項目１に記載の方法。
（項目１４）
前記タンパク質分解酵素がトリプシンである、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記タンパク質分解酵素が、組み換えトリプシン、トリプシン様プロテイナーゼ、またはＴＲＹＰＬＥである、項目１３に記載の方法。
（項目１６）
前記タンパク質分解酵素が、組み換え酵素である、項目１３に記載の方法。
（項目１７）
前記新鮮増殖培地がタンパク質分解酵素のインヒビターを含む、項目１に記載の方法。
（項目１８）
前記新鮮増殖培地が細胞分離のために用いられる前記タンパク質分解酵素のインヒビターを含む、項目１３に記載の方法。
（項目１９）
前記タンパク質分解酵素インヒビターがトリプシンインヒビターである、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記タンパク質分解酵素インヒビターがダイズトリプシンインヒビターである、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記新鮮増殖培地が約０．５ｍｇ／ｍｌのダイズトリプシンインヒビターを含む、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
前記分離システムがリキッド・ハンドラー・ロボットによって自動化される、項目１に記載の方法。
（項目２３）
前記自動化分離システムが：
（ｉ）前記第一の多能性細胞集団から前記培地を除去する工程と；
（ｉｉ）該多能性細胞とタンパク質分解酵素とを接触させる工程と；
（ｉｉｉ）該細胞とタンパク質分解酵素とをインキュベートして細胞集合を分離する工程と、
を包含する、項目１３に記載の方法。
（項目２４）
タンパク質分解酵素インヒビターとＲｈｏ関連キナーゼ（ＲＯＣＫ）インヒビターとを含む規定の培地が工程（ｉｉｉ）の後に溶液に添加される、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
前記ＥＳ細胞が、約２〜約１０分の間前記タンパク質分解酵素とともにインキュベートされる、項目２３に記載の方法。
（項目２６）
前記ＥＳ細胞が、約２５℃と約４０℃との間で前記タンパク質分解酵素とともにインキュベートされる、項目２３に記載の方法。
（項目２７）
前記ＥＳ細胞が、約３７℃で前記タンパク質分解酵素とともにインキュベートされる、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
前記自動化分離システムがさらに：
（ｉｖ）前記インキュベートされた細胞を機械的攪拌に供して、細胞集合をさらに分離する工程、
を包含する、項目２３に記載の方法。
（項目２９）
前記機械的攪拌が、前記ＥＳ細胞を剪断力または吸引に供する工程を包含する、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
前記タンパク質分解酵素インヒビターを含む前記増殖培地を、該インヒビターを実質的に含まない増殖培地で置き換える工程をさらに包含する、項目１７に記載の方法。
（項目３１）
多能性細胞の前記集団が非多能性細胞を含まないか、または実質的に含まない、項目１に記載の方法。
（項目３２）
多能性細胞の前記集団がヒトＥＳ細胞であり、ヒトＥＳ細胞の集団が非ヒト細胞を含まないか、または実質的に含まない、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
胚性幹（ＥＳ）細胞の自動化連続増殖のための方法としてさらに規定され：
（ａ）増殖培地においてＥＳ細胞の第一の集団を得る工程と；
（ｂ）自動化分離システムによって該ＥＳ細胞を分離する工程と；
（ｃ）新鮮な増殖培地中に該分離された細胞を懸濁してＥＳ細胞の増殖した集団を得る工程と、
（ｄ）細胞増殖を支持する条件下で該増殖したＥＳ細胞集団をインキュベートする工程と、
（ｅ）工程ｂ〜ｄを１回以上反復してＥＳ細胞の連続増殖した集団を得る工程と、
を包含する、項目１に記載の方法。
（項目３４）
（ｄ）細胞増殖を支持する条件下で前記増殖したＥＳ細胞集団をインキュベートする工程が、培地灌流培養で該細胞をインキュベートする工程を包含する、項目３３に記載の方法。
（項目３５）
前記増殖培地がＲｈｏ関連キナーゼ（ＲＯＣＫ）インヒビターの有効量を含む、項目１に記載の方法。
（項目３６）
前記Ｒｈｏ関連キナーゼ（ＲＯＣＫ）インヒビターがＨＡ−１００である、項目３５に記載の方法。
（項目３７）
前記ＨＡ−１００が約１０μＭの濃度で存在する、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
前記Ｒｈｏ関連キナーゼ（ＲＯＣＫ）インヒビターがＨ−１１３５である、項目３５に記載の方法。
（項目３９）
前記Ｈ−１１３５が約１〜３μＭの濃度で存在する、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
多能性細胞の自動化した維持および増殖のための装置であって：
ａ）インキュベーター；
ｂ）リキッド・ハンドラー・ユニット；
ｃ）１つ以上のリザーバであって、ｉ）多能性細胞の生きている集団と、ｉｉ）規定の培地であって、多能性細胞が未分化状態で培養および維持され得る培地である、規定の培地と、ｉｉｉ）プロテアーゼ、プロテアーゼインヒビターおよびＲｈｏ関連キナーゼ（ＲＯＣＫ）インヒビターのうちの１つ以上とを含むリザーバ；ならびに
ｄ）該リキッド・ハンドラー・ユニットと連絡したコントローラであって、該多能性細胞の自動化された増殖および維持を達成するように該リキッド・ハンドラー・ユニットに仕向けるように構成されている、コントローラ；
を備える、装置。
（項目４１）
前記コントローラが操作プログラムを含むコンピューター読み取り可能な媒体を備える、項目４０に記載の装置。
（項目４２）
前記コントローラが：前記リキッド・ハンドラー・ユニット、１つ以上の前記リザーバ、および前記インキュベーターのうちの少なくとも１つをｉ）多能性細胞集団から培地を除去するように；ｉｉ）多能性細胞とタンパク質分解酵素とを接触させるように；およびｉｉｉ）多能性細胞とタンパク質分解酵素とをインキュベートさせて細胞集合を分離するように仕向ける、項目４０に記載の装置。
（項目４３）
前記装置がさらに機械的攪拌装置および吸引装置を備え、かつ前記コントローラがさらに：前記リキッド・ハンドラー・ユニット、１つ以上の前記リザーバ、および前記インキュベーターのうちの少なくとも１つを、該多能性細胞が機械的攪拌または吸引に供されるように仕向けて、細胞集合をさらに分離する、項目４０に記載の装置。
（項目４４）
前記コントローラがさらに：前記リキッド・ハンドラー・ユニット、１つ以上の前記リザーバ、および前記インキュベーターのうちの少なくとも１つを、インキュベートされた多能性細胞がプロテアーゼインヒビターと接触するように仕向ける、項目４０に記載の装置。
（項目４５）
前記コントローラがさらに：前記リキッド・ハンドラー・ユニット、１つ以上の前記リザーバ、および前記インキュベーターのうちの少なくとも１つを、インキュベートされた多能性細胞がＲｈｏ関連キナーゼ（ＲＯＣＫ）インヒビターと接触するように仕向ける、項目４４に記載の装置。
（項目４６）
前記リキッド・ハンドラー・ユニットが少なくとも第一のリザーバおよび第二のリザーバを備え、該第一のリザーバがＴｅＳＲ培地を含み、かつ該第二のリザーバがＴｅＳＲ培地、Ｒｈｏ関連キナーゼ（ＲＯＣＫ）インヒビター、およびプロテアーゼインヒビターを含む、項目４０に記載の装置。
（項目４７）
前記Ｒｈｏ関連キナーゼ（ＲＯＣＫ）インヒビターがＨ−１１５２またはＨ−１００である、項目４０に記載の装置。
（項目４８）
前記多能性細胞がＥＳ細胞または人工多能性細胞（ｉＰＳ）である、項目４０に記載の装置。
（項目４９）
前記リキッド・ハンドラーが、グリッパー・ツールおよびリキッド・ハンドリング・ツールを備える、項目４０に記載の装置。
（項目５０）
前記多能性細胞がヒトＥＳ細胞である、項目４０に記載の装置。
（項目５１）
前記リキッド・ハンドラー・ユニットと前記インキュベーターとの間の流体連絡を容易にするように構成されたロボット様デバイスをさらに備える、項目４０に記載の装置。
（項目５２）
前記リキッド・ハンドラー・ユニットと連絡した第二のまたはそれ以上のリザーバをさらに備える、項目４０に記載の装置。
（項目５３）
前記第二のリザーバが細胞培養プレート、細胞増殖培地、またはタンパク質分解酵素溶液を備える、項目５２に記載の装置。
（項目５４）
前記リキッド・ハンドラーが少なくとも第一のリザーバおよび第二のリザーバと連絡しており、該第一のリザーバがＴｅＳＲ培地を含み、かつ該第二のリザーバがＴｅＳＲ培地を含み、該培地がさらに、Ｒｈｏ関連キナーゼ（ＲＯＣＫ）インヒビター、およびプロテアーゼインヒビターを含む、項目４０に記載の装置。
（項目５５）
前記コントローラがコンピューター中に含まれる、項目４０に記載の装置。
（項目５６）
前記インキュベーターが前記多能性細胞の一部を含み、前記装置が該増殖された多能性細胞のうち少なくとも９７％で該細胞のさらなる分化を伴わないかまたは本質的に伴わずに、前記多能性細胞の増殖をもたらすように構成されている、項目４０に記載の装置。
（項目５７）
前記インキュベーターが前記多能性細胞の一部を含み、かつ前記多能性細胞がヒトＥＳ細胞である、項目４０に記載の装置。