【手続補正書】
【提出日】平成26年5月12日(2014.5.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼ及び前記熱安定性ルシフェラーゼのＮ末端部分に前記熱安定性ルシフェラーゼのＣ末端部分を連結するリンカーを含むバイオセンサーポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、前記修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼは親の円順列熱安定性ルシフェラーゼに比較して修飾され、前記リンカーは細胞中の標的分子と相互反応できるセンサー領域を含み、ここで前記修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼは、ｉ）前記標的分子の存在下での前記親の円順列熱安定性ルシフェラーゼ、又はｉｉ）前記標的分子の不在下での前記修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼの少なくとも１つに比較して、標的分子とバイオセンサーとの相互反応の後、増強された応答を有する、ポリヌクレオチド。
【請求項２】
前記修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼが、配列番号２の位置５０７に対応するアミノ酸で置換を含む、請求項１記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
前記修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼが、配列番号２の位置５０３に対応するアミノ酸で置換を含む、請求項１又は２記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
前記修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼが、配列番号２の位置４７１に対応するアミノ酸で置換を含む、請求項１〜３のいずれか１項記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
前記修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼが、配列番号２の位置１９３に対応するアミノ酸で置換を含む、請求項１〜４のいずれか１項記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
前記修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼが、配列番号２のＩ４７１Ｔ、Ｓ５０３Ｇ、Ｔ５０７Ｉ及びＳ１９３Ｐに対応するアミノ酸置換を含む、請求項１〜５のいずれか１項記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
前記修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼが、配列番号２のＩ４７１Ｔ、Ｓ５０３Ｇ及びＴ５０７Ｉに対応するアミノ酸置換を含む、請求項１〜６のいずれか１項記載のポリヌクレオチド。
【請求項８】
前記修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼが、配列番号２のＳ５０３Ｇ、Ｔ５０７Ｉ及びＳ１９３Ｐに対応するアミノ酸置換を含む、請求項１〜７のいずれか１項記載のポリヌクレオチド。
【請求項９】
前記修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼが、配列番号２のＴ５０７Ｉに対応するアミノ酸置換を含む、請求項１〜８のいずれか１項記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０】
前記修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼが、配列番号２の位置５、１７、２１、２３、２６、３９、４４、５１、８１、１０１、１０３、１１０、１１４、１１５、１１９、１２３、１２６、１２８、１３３、１３７、１８６、１９１、１９２、１９３、１９６、２０８、２１１、２１４、２２６、２２８、２３０、２３３、２６４、２７３、２７５、２８６、２８７、２９４、２９５、２９７、３０２、３０３、３０４、３０６、３０８、３０９、３１３、３２４、３２９、３３１、３４３、３４８、３５３、３６４、３７４、３８５、３８９、４０９、４２０、４２６、４２７、４２８、４３１、４４９、４５６、４６０、４６１、４６５、４６６、４６８、４７１、４７３、４８２、４８４、４８５、４８９、４９３、４９４、４９７、５０３、５０７、５０９、５１０、５１３、５１６、５１７、５２１、５２２、５２３、５２６、５３０、５３３、５３６、５３７、５４２又は５４３、又はそれらの組合せに対応する少なくとも１つのアミノ酸の置換を含む、請求項１〜９のいずれか１項記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１】
前記熱安定性ルシフェラーゼが、ホタルルシフェラーゼの残基２−１２、残基３２−５３、残基７０−８８、残基１０２−１２６、残基１３９−１６５、残基１８３−２０３、残基２２０−２４７、残基２６２−２７３、残基３０３−３１３、残基３５３−４０８、残基４８５−４９５又は残基５３５−５４６に対応する領域で円順列される、請求項１〜１０のいずれか１項記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２】
前記バイオセンサーが、プロテアーゼ認識部位、キナーゼ認識部位、抗体結合部位、金属結合部位、イオン結合部位、環状ヌクレオチド結合部位又はヌクレオチド結合部位を含む、請求項１〜１１のいずれか１項記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３】
前記バイオセンサーがプロテアーゼ認識部位を含む、請求項１〜１２のいずれか１項記載のポリヌクレオチド。
【請求項１４】
前記プロテアーゼ認識部位が、カスパーゼ３認識部位、カスパーゼ８認識部位、エンテロキナーゼ認識部位、前立腺血清抗原認識部位、ＳＡＲＳウィルスプロテアーゼ認識部位、ＴＥＶプロテアーゼ認識部位、グランザイムＢ認識部位、ＭＭＰ認識部位及びライノウィルスプロテアーゼ認識部位から成る群から選択される、請求項１３記載のポリヌクレオチド。
【請求項１５】
前記熱安定性ルシフェラーゼが、ルキオラ・クルキアタ（Luciola cruciata）、ルキオラ・ラテラリス（Luciola lateralis）、ピロコエリア・ミヤコ（pyrocoelia miyako）、ラムピリス・ノクチルカ（Lampyris noctiluca）、フォツリス・ペンシルバニカ（Photuris pennsylvanica）、フェンゴデスsp.（Phengodes sp.）、ルキオラ・ミングレリカ（Luciola mingrelica）及びフォチナス・ピラリス（photinus pyralis）から成る群から選択された種からの野生型ルシフェラーゼから変性される、請求項１〜１４のいずれか１項記載のポリヌクレオチド。
【請求項１６】
前記熱安定性ルシフェラーゼが、ホタルルシフェラーゼである、請求項１〜１５のいずれか１項記載のポリヌクレオチド。
【請求項１７】
前記熱安定性ルシフェラーゼが、配列番号２に対して少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有する、請求項１６記載のポリヌクレオチド。
【請求項１８】
前記熱安定性ルシフェラーゼが、配列番号４に対して少なくとも９０％のアミノ酸同一性を有する、請求項１６記載のポリヌクレオチド。
【請求項１９】
前記熱安定性ルシフェラーゼが、配列番号４に対して少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有する、請求項１６記載のポリヌクレオチド。
【請求項２０】
前記リンカーが前記センサー領域ＤＥＶＤを含む、請求項１〜１９のいずれか１項記載のポリヌクレオチド。
【請求項２１】
前記リンカーが、ＳＳＤＥＶＤＧＳＳＧ(配列番号52)、ＳＳＧＳＤＥＶＤＧＳＬＳＳＧ(配列番号53)、ＳＤＥＶＤＧＳＬ(配列番号54)又はＤＥＶＤＧ(配列番号55)である、請求項１〜２０のいずれか１項記載のポリヌクレオチド。
【請求項２２】
配列番号６のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項２３】
請求項１〜２２のいずれか１項記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項２４】
請求項１〜２２のいずれか１項記載のポリヌクレオチド、又は請求項２３記載のベクターを含む細胞。
【請求項２５】
請求項２４記載の細胞を含む非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項２６】
請求項１〜２２のいずれか１項記載のポリヌクレオチド又は請求項２３記載のベクターを含むキット。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８７】
従って、本発明は、中でも、標的分子に対する増強された応答を有する、修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーを提供する。本発明の種々の特徴及び利点が次のクレームに示される。
本発明の態様として、例えば以下のものがある。
〔１〕修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼ及び前記熱安定性ルシフェラーゼのＮ末端部分に前記熱安定性ルシフェラーゼのＣ末端部分を連結するリンカーを含むバイオセンサーポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、前記修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼは親の円順列熱安定性ルシフェラーゼに関連して修飾され、前記リンカーは細胞中の標的分子と相互反応できるセンサー領域を含み、ここで前記修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼは、ｉ）前記標的分子の存在下での前記親の円順列熱安定性ルシフェラーゼ、又はｉｉ）前記標的分子の不在下での前記修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼの少なくとも１つに関し、標的分子とバイオセンサーとの相互反応の後、増強された応答を有する、ポリヌクレオチド。
〔２〕前記修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼが、配列番号２の位置５０７に対応するアミノ酸で置換を含む、前記〔１〕記載のポリヌクレオチド。
〔３〕前記位置５０７でのアミノ酸がＩである、前記〔２〕記載のポリヌクレオチド。
〔４〕前記修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼが、配列番号２の位置５０３に対応するアミノ酸で置換を含む、前記〔１〕〜〔３〕のいずれか１項記載のポリヌクレオチド。
〔５〕前記位置５０３でのアミノ酸がＧである、前記〔４〕記載のポリヌクレオチド。
〔６〕前記修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼが、配列番号２の位置４７１に対応するアミノ酸で置換を含む、前記〔１〕〜〔５〕のいずれか１項記載のポリヌクレオチド。
〔７〕前記位置４７１でのアミノ酸がＴである、前記〔６〕記載のポリヌクレオチド。
〔８〕前記修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼが、配列番号２の位置１９３に対応するアミノ酸で置換を含む、前記〔１〕〜〔７〕のいずれか１項記載のポリヌクレオチド。
〔９〕前記位置１９３でのアミノ酸がＰである、前記〔８〕記載のポリヌクレオチド。
〔１０〕前記修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼが、配列番号２のＩ４７１Ｔ、 Ｓ５０３Ｇ、Ｔ５０７Ｉ及びＳ１９３Ｐに対応するアミノ酸置換を含む、前記〔１〕〜〔９〕のいずれか１項記載のポリヌクレオチド。
〔１１〕前記修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼが、配列番号２のＩ４７１Ｔ、Ｓ５０３Ｇ及びＴ５０７Ｉに対応するアミノ酸置換を含む、前記〔１〕〜〔１０〕のいずれか１項記載のポリヌクレオチド。
〔１２〕前記修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼが、配列番号２のＳ５０３Ｇ、Ｔ５０７Ｉ及びＳ１９３Ｐに対応するアミノ酸置換を含む、前記〔１〕〜〔１１〕のいずれか１項記載のポリヌクレオチド。
〔１３〕前記修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼが、配列番号２のＴ５０７Ｉに対応するアミノ酸置換を含む、前記〔１〕〜〔１２〕のいずれか１項記載のポリヌクレオチド。
〔１４〕前記修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼが、配列番号２の位置５、１７、２１、２３、２６、３９、４４、５１、８１、１０１、１０３、１１０、１１４、１１５、１１９、１２３、１２６、１２８、１３３、１３７、１８６、１９１、１９２、１９３、１９６、２０８、２１１、２１４、２２６、２２８、２３０、２３３、２６４、２７３、２７５、２８６、２８７、２９４、２９５、２９７、３０２、３０３、３０４、３０６、３０８、３０９、３１３、３２４、３２９、３３１、３４３、３４８、３５３、３６４、３７４、３８５、３８９、４０９、４２０、４２６、４２７、４２８、４３１、４４９、４５６、４６０、４６１、４６５、４６６、４６８、４７１、４７３、４８２、４８４、４８５、４８９、４９３、４９４、４９７、５０３、５０７、５０９、５１０、５１３、５１６、５１７、５２１、５２２、５２３、５２６、５３０、５３３、５３６、５３７、５４２又は５４３、又はそれらの組合せに対応する少なくとも１つのアミノ酸の置換を含む、前記〔１〕〜〔１３〕のいずれか１項記載のポリヌクレオチド。
〔１５〕前記熱安定性ルシフェラーゼが、ホタルルシフェラーゼの残基２−１２、残基３２−５３、残基７０−８８、残基１０２−１２６、残基１３９−１６５、残基１８３−２０３、残基２２０−２４７、残基２６２−２７３、残基３０３−３１３、残基３５３−４０８、残基４８５−４９５又は残基５３５−５４６に対応する領域で円順列される、前記〔１〕〜〔１４〕のいずれか１項記載のポリヌクレオチド。
〔１６〕前記バイオセンサーが、プロテアーゼ認識部位、キナーゼ認識部位、抗体結合部位、金属結合部位、イオン結合部位、環状ヌクレオチド結合部位又はヌクレオチド結合部位を含む、前記〔１〕〜〔１５〕のいずれか１項記載のポリヌクレオチド。
〔１７〕前記バイオセンサーがプロテアーゼ認識部位を含む、前記〔１〕〜〔１６〕のいずれか１項記載のポリヌクレオチド。
〔１８〕前記プロテアーゼ認識部位が、カスパーゼ３認識部位、カスパーゼ８認識部位、エンテロキナーゼ認識部位、前立腺血清抗原認識部位、ＳＡＲＳウィルスプロテアーゼ認識部位、ＴＥＶプロテアーゼ認識部位、グランザイムＢ認識部位、ＭＭＰ認識部位及びライノウィルスプロテアーゼ認識部位から成る群から選択される、前記〔１７〕記載のポリヌクレオチド。
〔１９〕前記熱安定性ルシフェラーゼが、ルキオラ・クルキアタ（Luciola cruciata）、ルキオラ・ラテラリス（Luciola lateralis）、ピロコエリア・ミヤコ（pyrocoelia miyako）、ラムピリス・ノクチルカ（Lampyris noctiluca）、フォツリス・ペンシルバニカ（Photuris pennsylvanica）、フェンゴデスsp.（Phengodes sp.）、ルキオラ・ミングレリカ（Luciola mingrelica）及びフォチナス・ピラリス（photinus pyralis）から成る群から選択された種からの野生型ルシフェラーゼから変性される、前記〔１〕〜〔１８〕のいずれか１項記載のポリヌクレオチド。
〔２０〕前記熱安定性ルシフェラーゼが、ホタルルシフェラーゼである、前記〔１〕〜〔１９〕のいずれか１項記載のポリヌクレオチド。
〔２１〕前記熱安定性ルシフェラーゼが、配列番号２に対して少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有する、前記〔２０〕記載のポリヌクレオチド。
〔２２〕前記熱安定性ルシフェラーゼが、配列番号４に対して少なくとも９０％のアミノ酸同一性を有する、前記〔２０〕記載のポリヌクレオチド。
〔２３〕前記熱安定性ルシフェラーゼが、配列番号４に対して少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有する、前記〔２０〕記載のポリヌクレオチド。
〔２４〕前記リンカーが前記センサー領域ＤＥＶＤを含む、前記〔１〕〜〔２３〕のいずれか１項記載のポリヌクレオチド。
〔２５〕前記リンカーが、ＳＳＤＥＶＤＧＳＳＧ(配列番号52)、ＳＳＧＳＤＥＶＤＧＳＬＳＳＧ(配列番号53)、ＳＤＥＶＤＧＳＬ(配列番号54)又はＤＥＶＤＧ(配列番号55)である、前記〔１〕〜〔２４〕のいずれか１項記載のポリヌクレオチド。
〔２６〕配列番号６のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
〔２７〕前記〔１〕〜〔２６〕のいずれか１項記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
〔２８〕前記ポリヌクレオチドがプロモーターに操作可能に結合される、前記〔２７〕記載のポリヌクレオチド。
〔２９〕前記〔１〕〜〔２６〕のいずれか１項記載のポリヌクレオチド、又は前記〔２７〕又は〔２８〕記載のベクターを含む細胞。
〔３０〕前記〔２９〕記載の細胞を含む非ヒトトランスジェニック動物。
〔３１〕前記〔１〕〜〔２６〕のいずれか１項記載のポリヌクレオチドによりコードされる修飾された熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサー。
〔３２〕修飾された熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーの発現を可能にする条件下で前記〔２９〕記載の細胞を増殖することを含む、修飾された熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーの製造方法。
〔３３〕修飾された熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーの発現を可能にする条件下で前記〔２７〕又は〔２８〕記載のベクターを細胞中に導入することを含む、修飾された熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーの製造方法。
〔３４〕前記〔１〕〜〔２６〕のいずれか１項記載のポリヌクレオチド又は前記〔２７〕又は〔２８〕記載のベクターを含むキット。
〔３５〕細胞中の標的分子の存在の検出方法であって、
ａ）前記細胞と、前記〔１〕〜〔２６〕のいずれか１項記載のポリヌクレオチド又は前記〔２７〕又は〔２８〕記載のベクター及び修飾された熱安定性ルシフェラーゼのための基質とを接触させ；そして
ｂ）前記細胞中のルミネッセンスを検出することを含み、この際、前記標的分子が前記修飾された熱安定性ルシフェラーゼと相互反応できる、方法。
〔３６〕細胞中の標的分子の存在の検出方法であって、
ａ）前記細胞と、前記〔３１〕記載の修飾された熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサー及び前記修飾された熱安定性ルシフェラーゼのための基質とを接触させ；そして
ｂ）前記細胞中のルミネッセンスを検出することを含み、この際、前記標的分子が前記修飾された熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーと相互反応できる、方法。
〔３７〕サンプル中の標的分子の存在又は活性の検出方法であって、
ａ）標的分子のためのセンサー領域を含む修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーをコードするポリヌクレオチド及び前記修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼのための基質と前記サンプルとを接触させ；そして
ｂ）前記サンプル中のルミネッセンスを検出することを含む方法。
〔３８〕前記サンプルが、細胞、動物、細胞溶解物、又はin vitro転写／翻訳混合物である、前記〔３７〕記載の方法。
〔３９〕前記標的分子がプロテアーゼである、前記〔３５〕〜〔３８〕のいずれか１項記載の方法。
〔４０〕前記プロテアーゼが、カスパーゼ３、カスパーゼ８、ＴＥＶプロテアーゼ又はＭＭＰ−２である、前記〔３９〕記載の方法。
〔４１〕前記標的分子の活性を変更できる試験化合物をさらに添加することを含む、前記〔３５〕〜〔４０〕のいずれか１項記載の方法。
〔４２〕ルミネッセンスがin vivoイメージングにより検出される、前記〔３５〕〜〔４１〕のいずれか１項記載の方法。
〔４３〕前記修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーが細胞において発現される、前記〔３７〕〜〔４２〕のいずれか１項記載の方法。
〔４４〕前記修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーを発現する細胞が、動物中に注入されるか又は移植される、前記〔４３〕記載の方法。
〔４５〕細胞中の標的分子の存在又は活性の検出方法であって、
ａ）標的分子のためのセンサー領域を含む修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサー及び前記修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼのための基質と細胞とを接触させ；そして
ｂ）前記細胞中のルミネセンスを検出することを含む方法。
〔４６〕前記標的分子がプロテアーゼである、前記〔４５〕記載の方法。
〔４７〕前記プロテアーゼが、カスパーゼ３、カスパーゼ８、ＴＥＶプロテアーゼ又はＭＭＰ−２である、前記〔４６〕記載の方法。
〔４８〕前記標的分子の活性を変更できる試験化合物をさらに添加することを含む、前記〔４５〕〜〔４７〕のいずれか１項記載の方法。
〔４９〕動物中の標的分子の存在又は活性の検出方法であって、
ａ）前記標的分子のためのセンサー領域を含む修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサー及び前記修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼのための基質と前記動物とを接触させ；そして
ｂ）前記動物中のルミネッセンスを検出することを含む方法。
〔５０〕前記修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーが細胞において発現される、前記〔４９〕記載の方法。
〔５１〕前記細胞が、前記動物中に注入されるか又は移植される、前記〔５０〕記載の方法。
〔５２〕前記ルシフェラーゼのための基質が前記動物中に注入される、前記〔４９〕〜〔５１〕のいずれか１項記載の方法。
〔５３〕前記動物がマウスである、前記〔４９〕〜〔５２〕のいずれか１項記載の方法。
〔５４〕前記標的分子の活性を変更できる試験化合物をさらに添加することを含む、前記〔４９〕〜〔５３〕のいずれか１項記載の方法。
〔５５〕ルミネッセンスがイメージングにより検出される、前記〔４９〕〜〔５４〕のいずれか１項記載の方法。
〔５６〕サンプル中の標的分子の存在又は活性の検出方法であって、
ａ）前記標的分子のためのセンサー領域を含む修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーを、固体支持体上の固定し；
ｂ）前記標的分子を含むサンプルを、前記固定されたバイオセンサーに添加し；
ｃ）前記修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼのための基質を添加し、そして
ｄ）ルミネッセンスを検出することを含む方法。
〔５７〕前記固体支持体が、粒子、樹脂、カラム、ウェルボトム、プレート又はスライドである、前記〔５６〕記載の方法。
〔５８〕前記標的分子がプロテアーゼである、前記〔５６〕又は〔５７〕記載の方法。
〔５９〕前記プロテアーゼが、カスパーゼ３、カスパーゼ８、ＴＥＶプロテアーゼ又はＭＭＰ−２である、前記〔５８〕記載の方法。
〔６０〕前記修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーが、精製されるか、又は細胞溶解物において発現される、前記〔５６〕〜〔５９〕のいずれか１項記載の方法。
〔６１〕前記標的分子が精製されるか、又は細胞溶解物において発現される、前記〔５６〕〜〔６０〕のいずれか１項記載の方法。
〔６２〕サンプル中のアポトーシスの検出方法であって、
ａ）アポトーシスに関与する分子のためのセンサー領域を含む修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーをコードするポリヌクレオチド及び前記修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼのための基質と前記サンプルとを接触させ；そして
ｂ）前記サンプル中のルミネッセンスを検出することを含む方法。
〔６３〕前記サンプルが、細胞、動物、細胞溶解物、又はin vitro転写／翻訳混合物である、前記〔６２〕記載の方法。
〔６４〕前記標的分子がプロテアーゼである、前記〔６２〕又は〔６３〕記載の方法。
〔６５〕前記プロテアーゼが、カスパーゼ３又はカスパーゼ８である、前記〔６４〕記載の方法。
〔６６〕前記標的分子の活性を変更できる試験化合物をさらに添加することを含む、前記〔６２〕〜〔６５〕のいずれか１項記載の方法。
〔６７〕ルミネッセンスがin vivoイメージングにより検出される、前記〔６２〕〜〔６６〕のいずれか１項記載の方法。
〔６８〕前記修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーが細胞において発現される、前記〔６２〕〜〔６７〕のいずれか１項記載の方法。
〔６９〕前記修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーを発現する細胞が、動物中に注入されるか又は移植される、前記〔６８〕記載の方法。
〔７０〕前記修飾された円順列熱安定性ルシフェラーゼバイオセンサーが、前記〔１〕〜〔２６〕のいずれか１項記載のポリヌクレオチドによりコードされる、前記〔３７〕〜〔６９〕のいずれか１項記載の方法。