【誤訳訂正書】
【提出日】平成23年12月27日(2011.12.27)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【書類名】  明細書
【発明の名称】  樹状細胞ハイブリッドによって活性化される細胞傷害性Ｔリンパ球
【特許請求の範囲】
【請求項１】  抗原活性についてペプチドを試験する方法であって、該方法が、以下の工程：
（ａ）ヒト樹状細胞およびヒト腫瘍または癌細胞の融合産物を含むハイブリッド細胞を提供する工程であって、ここでヒト腫瘍または癌細胞は、原発性または転移性の腫瘍細胞であり、ここで該ハイブリッド細胞が、（ｉ）ＭＨＣクラスＩＩ分子、（ｉｉ）Ｂ７、および（ｉｉｉ）該ヒト腫瘍または癌細胞の細胞表面の抗原を発現する、工程；
（ｂ）該ハイブリッド細胞とヒト免疫エフェクター細胞とを接触させることによって、ヒト活性化免疫エフェクター細胞を生成する工程；および
（ｃ）該ヒト活性化免疫エフェクター細胞を、該ペプチドの存在下で標的細胞と接触させる工程であって、ここで該標的細胞の溶解は、該ペプチドを抗原ペプチドとして同定する、工程、
を包含する、方法。
【請求項２】  請求項１に記載の方法であって、該方法が、以下の工程：
（ａ）細胞の集団を提供する工程であって、ここで該集団の少なくとも５％の細胞が、少なくとも１種のヒト樹状細胞と細胞表面の抗原を発現する少なくとも１種のヒト腫瘍または癌細胞との間の融合によって産生される融合細胞であり、ここでヒト腫瘍または癌細胞は、原発性または転移性の腫瘍細胞であり、ここで該融合細胞が、免疫応答を刺激するのに効果的な量における、（ｉ）ＭＨＣクラスＩＩ分子、（ｉｉ）Ｂ７、および（ｉｉｉ）該細胞表面の抗原を発現する、工程；ならびに、
（ｂ）工程（ａ）からの細胞の集団に、ヒトＴリンパ球の集団を接触させる工程であって、該接触は、該Ｔリンパ球の集団内のエフェクター細胞前駆細胞の、細胞傷害性Ｔリンパ球を含むエフェクター細胞への分化を生じる、工程；および
（ｃ）前記ペプチドの存在下で該エフェクター細胞と複数の標的細胞を接触させる工程、
を包含する、方法であって、
ここで、該複数の標的細胞または該複数の標的細胞の一部分の溶解によって、該ペプチドを細胞傷害性Ｔリンパ球によって認識される抗原ペプチドとして同定する、方法。
【請求項３】  前記ペプチドが、前記癌細胞によって発現されるタンパク質のフラグメントである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】  請求項１に記載の抗原性活性について１つ以上のペプチドを試験する工程、該ペプチドの少なくとも１つを抗原性ペプチドとして同定する工程；および該抗原性ペプチド、または該抗原性ペプチドを含むポリペプチドを薬学的に受容可能なキャリアと合わせる工程を包含する、方法。
【請求項５】  前記ペプチドは、癌胎児抗原、前立腺特異的抗原、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＣＡ−１２５およびムチン−１（ＭＵＣ１）からなる群より選択されるポリペプチドに由来するものである、請求項４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本明細書中に記載される研究は、米国国立衛生院のＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｓｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅからの助成金第ＣＡ３８４９３号によって部分的に援助された。米国政府は、本発明において特定の権利を有し得る。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、細胞性免疫に関する。
【０００３】
（発明の背景）
樹状細胞（ＤＣ）は、免疫系における、有力な抗原提示細胞（ＡＰＣ）である。ＤＣは、Ｔ細胞の活性化および増殖に必要な全てのシグナルを提供する。これらのシグナルは、２つの型に分類され得る。第１の型は、免疫応答に特異性を与え、Ｔ細胞レセプター／ＣＤ３（ＴＣＲ／ＣＤ３）複合体と、ＡＰＣの表面において主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩまたはＩＩタンパク質により提示される抗原性ペプチドとの間の相互作用を通して、媒介される。この相互作用は、Ｔ細胞活性化が生じるために必要であるが、十分なものではない。実際に、第２の型のシグナルがなくとも、第１の型のシグナルは、Ｔ細胞アレルギーを生じ得る。第２の型のシグナルは、同時刺激シグナルと呼ばれ、抗原特異性もなくＭＨＣに制限されることもなく、第１の型のシグナルの存在下において、Ｔ細胞の十分な増殖応答およびＴ細胞のエフェクター機能の十分な誘導を導く。
【０００４】
同時刺激シグナルは、ＡＰＣおよびＴ細胞表面に発現されたレセプター−リガンド対の間の相互作用によって生じる。特定の例示的なレセプター−リガンド対は、ＤＣ表面上のＢ７同時刺激分子うちの１つと、Ｔ細胞上のその対応するレセプターＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４のである（Ｆｒｅｅｍａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６２：９０９〜９１１、１９９３；Ｙｏｕｎｇら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９０：２２９、１９９２；Ｎａｂａｖｉら、Ｎａｔｕｒｅ  ３６０：２６６、１９９２）。
【０００５】
ＤＣは、種々の免疫組織（例えば、脾臓、胸腺、リンパ節、表皮、および末梢血）の少数成分である。例えば、ＤＣは、調製していない脾臓（Ｓｔｅｉｎｍａｎら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１４９：１、１９７９）または表皮細胞懸濁物（Ｓｃｈｕｌｅｒら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６１：５２６、１９８５；およびＲｏｍａｎｉら、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．９３：６００、１９８９）のたった約１％、および末梢血中の単核球細胞の０．１〜１％である（Ｆｒｅｕｄｅｎｔｈａｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ。Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：７６９８、１９９０）。末梢血または骨髄前駆体から樹状細胞を生成する方法は、記載される（Ｉｎａｂａら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５：１１５７、１９９２；Ｉｎａｂａら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６：１６９３〜１７０２、１９９２；Ｒｏｍａｎｉら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８０：８３〜９３；およびＳａｌｌｕｓｔｏら、Ｉ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７９：１１０９〜１１１８、１９９４）。
【０００６】
（発明の要旨）
本発明の特徴は、エフェクターＴリンパ球（例えば、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）またはヘルパーＴ細胞（ＨＴＬ））を生成する方法であり、ここでＴリンパ球が、以下に記載のように、哺乳動物（例えば、ヒト）樹状細胞と非樹状細胞細胞（例えば、癌細胞）の間の融合によって生成した融合細胞によって活性化される。例えば、Ｔリンパ球は、癌（例えば、乳癌）または、感染症（例えば、ＡＩＤＳのようなウィルス感染症）を有する哺乳動物（例えば、ヒト）に由来する。融合細胞は、以下に記載される特性を有する。ＭＨＣに制限される機構によって、この方法によって生成されるＣＴＬは、標的細胞（例えば、自己腫瘍細胞、病原体感染細胞）を溶解する。ＭＨＣ分子に結合した抗原ペプチドによる活性化の後、ＣＴＬおよびＢリンパ球応答を増強する分泌ヘルパーサイトカインが出される。本発明は、この様式で生成されるＣＴＬおよびＨＴＬを含む。さらに、本発明は、これらＣＴＬおよびＨＴＬによって認識されるペプチドを同定する方法を特徴とする。これらのペプチドの特徴は、免疫応答の標的となる抗原（例えば、腫瘍親和性抗原）の同定を可能にする。
【０００７】
免疫系を刺激する組成物は、融合細胞を含む複数の細胞を含み、ここで、各融合細胞は、少なくとも１種の哺乳動物樹状細胞（例えば、骨髄培養物または末梢血細胞培養物に由来するＤＣ）と細部表面抗原（例えば、癌抗原）を発現する少なくとも１種の哺乳動物非樹状細胞（例えば、癌細胞またはトランスフェクト細胞）の間の融合により生成される。組成物において、複数の細胞の少なくとも５％は、融合細胞であり得る。「癌抗原」によって、癌を有する個体において、主に、または全体的に、癌細胞（正常細胞と異なる）によって発現される抗原分子が意味される。組成物における融合細胞は、免疫系（例えば、Ｔ細胞を活性化する）、ＭＨＣクラスＩＩ分子、Ｂ７、および細胞表面抗原を刺激するために効果的な量で、発現する。「Ｂ７」によって、同時刺激分子のＢ７ファミリーの任意のメンバー（例えば、Ｂ７−１またはＢ７−２）が意味される。
【０００８】
融合細胞を生成するために使用される親細胞は、単独の個体（例えば、ヒト、マウス、またはラット）から得られ得る。これらはまた、ＭＨＣ分子が適合または非適合であっても、同じ種（例えば、ヒト）の異なる個体から得られ得る。例えば、樹状細胞は、自己または同種異系である。
【０００９】
哺乳動物樹状細胞は、融合因子（例えば、電気、ポリエチレングリコールまたはセンダイウィルス）の存在下で細胞表面抗原を発現する哺乳動物非樹状細胞と融合される。必要に応じて培地（必要に応じてヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む）中で融合された細胞混合物をある時間培養した後、培養された融合細胞は、２つの細胞群の異なる接着特性に基づいて、融合されなかった親非樹状細胞から分離される。非融合親樹状細胞は、増殖せず、そして死ぬ。これらが、治療組成物に存在する場合でも、これらは、融合細胞の効果を阻害しない。単離された細胞は、（ａ）ＭＨＣクラスＩＩタンパク質、（ｂ）Ｂ７、および（ｃ）非樹状親細胞上の細胞表面抗原を典型的に発現し、免疫系を刺激するのに有用である。融合またはインビトロ培養工程の後に、細胞は、スクリーニング方法または治療方法において、直接使用される。
【００１０】
融合細胞のＤＣ表現型は、少なくとも１種のさらなる哺乳動物樹状細胞と再融合によって維持される。再融合細胞は、ＭＨＣクラスＩＩ分子、Ｂ７、および樹状親細胞の細胞表面抗原を発現し、そして免疫系を刺激するために有用である。
【００１１】
本発明の組成物は、個体（例えば、ヒト）に投与され得て、個体の免疫系を刺激し得る。この個体は、細胞内抗原；癌；または癌発達の素因について、感染または感染に対する感受性に帰因する免疫刺激が必要になる。融合細胞を生成するために使用されるＤＣは、この個体から得られ得る。この個体が癌を有する場合、個体の有する癌細胞は、この個体のＤＣとの融合に使用され得て、融合細胞が生成され、次いでこれが個体に投与される。融合細胞の親非樹状細胞のパートナー上に存在する細胞表面抗原の異常な発現によって特徴付けられる疾患状態に対して、ＤＣ融合細胞を用いた免疫系の刺激は、個体の免疫を増大させる。異常な発現は、細胞表面抗原が、（ｉ）正常組織に発現しない、（ｉｉ）所定の型の正常組織より、同じ組織型の疾患細胞において非常に高いレベルで発現される、または（ｉｉｉ）所定の型の正常細胞より、同じ組織型の疾患細胞において異なる修飾（例えば、リン酸化）されることを意味する。免疫の増大は、免疫系の細胞媒介機能または体液性機能、または両方の増大を必然的に伴う。
【００１２】
本発明は、ＣＴＬまたはＨＴＬを含む細胞集団を作製する方法を具体化する。本方法は、以下の工程を含む；（ａ）融合細胞を含む複数の細胞を提供し、各融合細胞は、少なくとも１種の哺乳動物樹状細胞と、細胞表面抗原を発現する少なくとも１種の哺乳動物非樹状細胞（例えば、ヒト乳癌細胞のような癌細胞）の間の融合により生成され、ここで少なくとも５％の融合タンパク質が、免疫応答（（ｉ）ＭＨＣクラスＩＩ分子、（ｉｉ）Ｂ７、および（ｉｉｉ）細胞表面抗原）を刺激するために効果的な量で発現する工程；および（ｂ）複数の細胞とＴリンパ球の集団を接触し、ここでこの接触が、（ｉ）ＣＴＬへのＴリンパ球の集団におけるＣＴＬ前駆体細胞；または（ｉｉ）ＨＴＬへのＴリンパ球の集団におけるＨＴＬ前駆体細胞である工程。提供される複数の細胞において、少なくとも５％の細胞が融合細胞である。本発明はまた、上記の手順および以下の工程を含む方法によって作られるＣＴＬまたはＨＴＬを含む細胞の集団を含む：（ａ）ＣＴＬおよび／またはＨＴＬの作用によって減じられ得る症状を伴う疾患（例えば、ヒト乳癌のような癌）を有する被験体を同定する工程；および（ｂ）ＣＴＬおよび／またはＨＴＬを含む上記の細胞集団を被験体に投与する工程。ＣＴＬまたはＨＴＬを含む上記の細胞集団を被験体に投与して、被験者内のＣＴＬまたはＨＴＬを増大させる方法が本発明によって含まれる。
【００１３】
以下の工程を含む抗原活性についてペプチドを試験する方法が、本発明に含まれる：（ａ）ＣＴＬを含む上記の細胞集団を提供する工程；および（ｂ）ペプチドの存在下で複数の標的細胞を細胞の集団と接触させる工程。複数の標的細胞または複数の標的細胞の一部の融解液は、ペプチドを細胞の集団内でＣＴＬによって認識される抗原ペプチドとして認める。代替的に、この方法は、以下の工程を含む：（ａ）ＨＴＬを含む上記細胞集団を提供する工程；および（ｂ）ペプチドの存在下で複数の抗原提示細胞を細胞の集団と接触させる工程。ＨＴＬの応答（例えば、増殖応答またはサイトカイン生成応答）は、ペプチドを細胞の集団内でＨＴＬによって認識される抗原ペプチドとして認める。融合細胞を生成するために使用される哺乳動物非樹状細胞は、癌細胞であり得る（例えば、ヒト乳癌細胞）。被験者（例えば、ヒト乳癌患者のような患者）において免疫応答を誘導する方法において、本方法によって同定されるペプチド、またはこのペプチドがフラグメントであるポリペプチドは、患者に投与され得る。
【００１４】
本発明は、免疫系を刺激するための組成物を特徴とする。したがって、本発明は、ハイブリッド細胞（またはこれらの子孫）を含み、これは、樹状細胞の融合産物（例えば、樹状細胞と非樹状細胞）である。ハイブリッド細胞は、その表面にＢ７を発現する。ハイブリッド細胞はまた、ＭＨＣクラスＩ分子、ＭＨＣクラスＩＩ分子、同時刺激分子、および／または接着分子を発現する。好ましくは、樹状細胞融合パートナーおよび非樹状細胞は、同じ種に由来する。例としては、非樹状細胞融合パートナーは、疾患関連抗原（例えば、腫瘍、細菌、またはウィルスに由来するもの）を発現する。代替的に非樹状細胞は腫瘍細胞である。樹状細胞および非樹状細胞は、好ましくは同じ個体（例えば、ヒト患者）に由来する。ハイブリッド細胞は、２つ以上の細胞由来の細胞質および／または膜成分を含む細胞である。
【００１５】
本発明はまた、活性化された免疫エフェクター細胞の集団を含む。例えば、細胞は、エキソビボで活性化される。この集団は、Ｔ細胞およびハイブリッド細胞を含む。実質的にピュアな、活性化された抗原特異的免疫エフェクター細胞の集団はまた、本発明に含まれる。細胞は、患者由来の免疫細胞およびハイブリッド細胞の共培養物に由来する。エフェクター細胞は、自己腫瘍細胞を特異的に殺す。
【００１６】
抗原特異的免疫エフェクター細胞を生成する方法は、Ｔ細胞を上に記載のハイブリッド細胞と接触させることによって実施される。Ｔ細胞は、種々の供給源（例えば、末梢血または腫瘍部位に由来）に由来する。接触する工程は、インビボまたはエキソビボにおいて生じる。例えば、標的抗原に特異的な、単離された活性化免疫エフェクター細胞の集団を生成する方法は、Ｔ細胞を活性化するのに十分な時間において、Ｔ細胞をハイブリッド細胞と接触させ、Ｔ細胞からハイブリッド細胞を分離し、抗原特異的免疫エフェクター細胞の集団を得ることによって実施される。
【００１７】
本発明に、ワクチンが含まれ、これはハイブリッド細胞および薬学的に許容されるキャリアーを含む。代替的に、ワクチン組成物は、活性化抗原特異的エフェクター細胞（例えば、エフェクター細胞）が含まれ、これは患者由来の免疫細胞（例えば、Ｔ細胞およびハイブリッド抗原提示細胞）の共培養物に由来する。
【００１８】
本発明はまた、樹状細胞および非樹状細胞の種内ハイブリッドを含む。このハイブリッドは、非樹状細胞由来の既知および未知の細胞抗原、ＭＨＣクラスＩおよびＩＩ分子、および、Ｂ７同時刺激分子を、非樹状細胞抗原に対して細胞傷害性免疫応答を刺激するのに十分な量において発現する。
【００１９】
本発明はまた、複数の細胞（融合細胞が、細胞表面抗原を発現する少なくとも１種の哺乳動物非樹状細胞の少なくとも５％）の提供を含む活性化Ｔ細胞を含む細胞集団を作製する方法を提供する。この方法において、少なくとも５％の融合細胞が、免疫応答、ＭＨＣクラスＩＩ分子、Ｂ７、および細胞表面抗原を刺激するのに効果的な量において発現する。次いで、Ｔ細胞の集団は、この複数の細胞と接触し、Ｔ細胞の活性化を生じる。
【００２０】
他に規定されない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および化学用語は、本発明が属する分野の当業者において一般に理解されるものと同様の意味を持つ。例示的方法および材料は、以下に記載されるが、本明細書に記載される、これらと同様または等価な方法および材料が本発明の実施または試験において使用され得る。本明細書に記載される全ての刊行物および他の参考文献は、その全体が参考として援用される。矛盾がある場合、本発明の明細書（定義を含む）が統制する。材料、方法、および実施例は、例示であって、限定を意図するものではない。
【００２１】
本発明のほかの特徴および利点は、以下の図面、詳細な説明、および請求の範囲から明らかである。
【００２２】
（発明の詳細な説明）
本発明は以下を特徴とする：（１）ＤＣと非樹状細胞との間の融合によって形成される融合細胞を使用して、ＣＴＬおよびＨｉｔを活性化させる方法；（２）これらの方法によって産生されるＣＴＬおよびＨＴＬ；（３）ＣＴＬおよび／またはＨＴＬ作用によって減少され得る症状を伴う疾患を有する被験体への、これらＣＴＬおよび／またはＨＴＬの投与を含む処置方法；（４）ＣＴＬおよび／またはＨＴＬによって認識される抗原性ペプチドを同定する方法；ならびに（５）（４）のように同定された抗原性ペプチド、またはこのようなペプチドがフラグメントあるポリペプチド抗原のいずれかを哺乳動物（例えば、ヒト患者）に投与することによって、哺乳動物における免疫応答を誘導する方法。
【００２３】
ＤＣは、当該分野で公知のプロトコルを使用して、骨髄培養物、末梢血、脾臓または哺乳動物の他の適切な組織から得られ得る。骨髄は、ＤＣ前駆体を含み、このＤＣ前駆体は、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）およびインターロイキン４（「ＩＬ−４」）のようなサイトカインを用いる処置の際に、ＤＣ内に増殖しそして分化する。腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）はまた、ＤＣの成熟を促進するために使用され得る。そのようにして得られたＤＣは、（例えば、脾臓ＤＣと比較されると）比較的未成熟である。ＤＣを刺激されたＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４は、ＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ分子、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＩＣＡＭ、ＣＤ４０ならびにＣＤ８３の変異レベルを発現する。出願者によって知見されたように、これらの未成熟ＤＣは、脾臓において見出されたさらなる成熟ＤＣよりも融合を受け入れやすい。末梢血はまた、比較的未成熟なＤＣまたはＤＣ前駆体を含み、これらは、ＧＭ−ＣＳＦのような適切なサイトカインの存在下において増殖かつ分化し得、そして融合の際にもまた使用され得る。
【００２４】
本発明で用いられる非樹状細胞は、任意の組織または癌（例えば、乳癌、肺癌、膵臓癌、前立腺癌、膀胱癌、神経癌、尿生殖器癌、血液癌、黒色腫および他の皮膚癌、ならびに胃腸癌）から周知の方法によってもたらされ得、そして不朽化され得る。目的の細胞表面抗原を発現する非樹状細胞は、その抗原を含むポリペプチドをコードする核酸分子を用いて所望の型の非樹状細胞にトランスフェクトすることによって生成され得る。例示的な細胞表面抗原としては、ＭＵＣ１、α−フェトプロテイン、γ−フェトプロテイン、癌胎児抗原、胎児スルホ糖タンパク質抗原、鉄タンパク質、胎盤アルカリホスファターゼ、および白血病関連膜抗原である。トランスフェクション方法および抗原を同定する方法は、当該分野で周知である。
【００２５】
ＤＣと非樹状細胞との融合は、周知の方法（ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）センダイウイルスを用いる方法、または電気融合）を用いて実施され得る。融合におけるＤＣの非樹状細胞に対する比率は、１：１００〜１０００：１に変化し得、非樹状細胞が培養中に濃密に増殖する場合、１：１の比率よりも高いことが好ましい。融合後、融合されなかったＤＶは、培養中に数日で、通常、死滅し、そして融合細胞は、以下の２つの方法によって、融合されなかった親の非樹状細胞から分離され得る。これら方法の両方は、約５０％以上の純度の融合細胞を得る（すなわち、融合細胞の調製物は、非融合細胞を５０％より少なく含み、大抵３０％より少なく含む）。
【００２６】
非樹状細胞が、死ぬかまたは少なくとも所定の試薬の存在下で増殖をせず、そしてこの感受性がＤＣとの融合によって克服され得る場合、融合細胞およびその親細胞を含む融合後の細胞混合物は、非融合細胞のほとんどを除去するために十分な時間の間、この試薬を含む培地中でインキュベートされ得る。例えば、多数の腫瘍細胞株は、機能的ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（「ＨＧＰＲＴ」）の欠損に起因してＨＡＴに対して感受性である。ＤＣとこれらの腫瘍細胞株とで形成された融合細胞は、ＤＣが機能的ＨＧＰＲＴに寄与して、ＨＡＴに耐性となる。従って、ＨＡＴ選択は、融合されなかった親細胞を除去するために、融合後実施され得る。標準的なＨＡＴ選択技術に反して、出願人等は、長い培養がこれらの融合細胞においてＭＨＣクラスＩＩタンパク質および／またはＢ７共刺激分子の欠損を引き起こすことを見出したため、ＨＡＴ選択は、通常、１２日間よりも長く続けるべきではない。
【００２７】
非融合細胞を融合細胞から分離する第２の方法は、融合細胞と非樹状親細胞との間の異なる接着性に基づく。融合細胞は、一般に、組織培養容器に軽く接着することが見出されている。従って、非樹状親細胞は、より強い接着性がある（例えば、癌細胞の場合、融合後の細胞混合物は、適切な培地（ＨＡＴは、必要でないが、非融合細胞の増殖を低下させる場合、添加され得る）中で短期間培養され得る）。続いて、融合細胞は、穏やかに取り除かれて吸引除去され、一方、非融合細胞は組織培養容器にしっかりと接着して増殖する。逆に、非樹状細胞親細胞が懸濁液中に増殖する場合、この培養期間の後、その容器にゆるく接着した融合細胞を残しながら、それらは穏やかに吸引除去され得る。上記の方法によって得られた融合細胞は、代表的にＤＣの表現型を保持する。例えば、これらの融合細胞は、Ｔ細胞刺激分子（例えば、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質、Ｂ７−１、Ｂ７−２）、およびＡＰＣの特性を示す接着分子（ＩＣＡＭ−１）を発現する。融合細胞はまた、親の非樹状細胞の細胞表面抗原を発現し続け、そしてそれ故、細胞表面抗原に対する免疫を誘導するのに有用である。とりわけ、非樹状細胞の融合パートナーが腫瘍細胞である場合、融合細胞の腫瘍形成能は、しばしば親の腫瘍細胞と比較して減弱されることが見出される。
【００２８】
融合細胞が特定のＤＣの特性（例えば、ＡＰＣ特異的Ｔ細胞刺激分子の発現）を欠損する場合、それら（すなわち、一次融合細胞）は、ＤＣ表現型を回復するように樹状細胞と再融合され得る。この再融合細胞（すなわち、二次融合細胞）は、非常に強力なＡＰＣであり、そしていくつかの場合において、一次融合細胞よりもなお一層少ない腫瘍形成能を有することが見出される。融合細胞は、樹状親細胞または非樹状親細胞を用いて、所望であれば多数回、再融合され得る。
【００２９】
ＭＨＣクラスＩＩ分子、Ｂ７、または他の所望のＴ細胞刺激分子を発現する融合細胞はまた、これらの分子に対する抗体を用いてパニングまたは蛍光活性化細胞ソーティングによっても選択され得る。
【００３０】
本発明の融合細胞を用いて、疾患の処置または予防のために哺乳動物の免疫系を刺激し得る。例えば、ヒトにおける腫瘍（原発性または転移性）を処置するために、患者自身のＤＣと腫瘍細胞とで形成された融合細胞を含む組成物は、患者（例えば、リンパ組織近接部位）に投与される。この組成物は、複数回（例えば３回〜５回）、適切な間隔（例えば、２〜３週間毎）にて、投薬量（例えば、１投与あたりの融合細胞、約１０５〜１０８個（例えば、約０．５×１０６〜１×１０６個））で投与され得る。癌に対する予防（例えば予防接種）のために、非同系の融合細胞（例えば、同系ＤＣと同種癌細胞または異種癌細胞とで形成された融合細胞、あるいは同種ＤＣと同種癌細胞とで形成された融合細胞）は、投与され得る。予防接種の効果をモニターするために、処置された個体から得られた細胞傷害性Ｔリンパ球は、細胞傷害性アッセイにおいて癌細胞に対するそれらの効力について試験され得る。複数ブーストは、細胞傷害性Ｔリンパ球の効力を増強するために必要とされ得る。以下の実施例Ｉでは、腫瘍細胞と同系ＤＣとで形成された融合細胞が、哺乳動物モデルにおいて腫瘍を抑制および処置し得ることが実証される。実施例ＩＩでは、このような融合細胞が腫瘍抗原に対して特異的な不応答Ｔ細胞を活性化し得ることがさらに実証される。
【００３１】
細胞内病原体で感染された細胞はまた、この病原体によって引き起こされる疾患の処置のために、この融合の非樹状パートナーとしても用いられ得る。病原体の例としては、以下に挙げられるが、これらに限定される：ウイルス（例えば、ヒト免疫不全（ｉｉｎｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスもしくはＣ型肝炎ウイルス、パピローマウイルス、ヘルペスウイルス、または麻疹ウイルス）、細菌（例えば、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｔｕｓｓｉｓ）、および細胞内真核生物寄生生物（例えば、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｓｐｐ．、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｓｐｐ．、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｓｐｐ．、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ．ｓｐｐ．、またはＭｙｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｉｎ  ｌｅｐｒａｅ）。適切な融合細胞を含む組成物は、個体（例えば、ヒト）に、当業者によって適切に決定されたレジメンで投与される。例えば、この組成物は、複数回（例えば３回〜５回）、適切な間隔（例えば、２〜３週間毎）にて、投薬量（例えば、１投与あたりの融合細胞、約１０５〜１０８個、そして好ましくは、１０７個）で投与され得る。
【００３２】
あるいは、１つ以上の核酸構築物（これらの各々は、同定された癌抗原または病原体由来の抗原を１つ以上コードする）でトランスフェクトされた非樹状細胞は、融合における非樹状パートナーとして用いられ得る。抗原は、抗原が融合細胞においてＭＨＣクラスＩ分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子によって提示され得る限り、癌細胞の表面または病原体の表面上に発現される必要はない。ＤＣとこれらのトランスフェクトされた細胞とで作製された融合細胞は、この病原体によって引き起こされた癌または疾患の処置および予防の両方のために用いられ得る。例えば、ＭＵＣ１を発現する融合細胞は、乳癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、肺癌、および黒色腫を処置または予防し得；フェトプロテインを発現する融合細胞を用いて、ヘパトームまたは慢性肝炎を処置または予防し得（ここで、フェトプロテインは、しばしば漸増したレベルで発現される）；そして、前立腺特異的抗原を発現する融合細胞を用いて、前立腺癌を処置し得る。
【００３３】
トランスフェクション方法および抗原を同定する方法は、当該分野で周知である。このように生成された融合細胞を含む組成物の投与は、上記に記載されるとおりである。
【００３４】
（エフェクター細胞（ＣＴＬおよびＨＴＬ）の生成方法）
本発明のエフェクター細胞（ＣＴＬおよびＨＴＬ）は、多数の方法で生成され得る。基本的には、リンパ球（ＣＴＬ前駆細胞およびＨＴＬ前駆細胞を含む）（例えば、末梢血液中の単核細胞（ＰＢＭＣ））、脾臓細胞、またはリンパ節細胞は、記載される本発明の融合細胞のいずれかを含む組成物に接触させる。この接触は、インビボ（例えば、被験体中にこれらの融合細胞を注射することによって）、インビトロ（例えば、リンパ球を含む細胞を融合細胞と一緒に培養することによって）、またはインビボとインビトロの方法論の組合せ（例えば、融合細胞を注射された被験体由来の細胞のインビトロでの活性化によって）によってであり得る。融合細胞によって活性化されるリンパ球は、「バージン」Ｔ細胞（すなわち、融合細胞と接触させる前に、融合細胞によって発現される抗原を活性化するように曝露されていないＴ細胞）であり得るか、またはこれらは、先にこのように曝露されていることが可能である。例えば、リンパ球が腫瘍または感染性疾患を有する患者中にあるかまたはこのような患者由来である場合、これらのリンパ球は、融合細胞への曝露の前に被験体中の腫瘍または感染細胞によって発現される抗原に曝露されている。
【００３５】
融合細胞と接触することは、単回または複数回（例えば、必要に応じて、１回以上のインビボでの曝露後、インビトロでの単回の曝露またはインビトロでの複数回の曝露）であり得る。エフェクター細胞の生成のために用いられる融合細胞は、未処理で用いられ得るか、またはそれらは、それらの増殖能を抑止する薬剤（例えば、電離放射線もしくはマイトマイシンＣのような薬剤）で前処理され得る。一般に、インビトロでの活性化のために用いられる融合細胞は、このような薬剤で前処理されている。この接触は、以下に例証されるサイトカインのいずれかの外生供給源の添加を用いるかまたは用いずに実施され得る。前駆細胞の接触は、ＣＴＬおよび／またはＨＴＬの活性化を生じ得る。これらの活性化細胞をＣＴＬ活性およびＨＴＬ活性について試験することは、以下に記載される方法のいずれかを用いて実施され得る。
【００３６】
ほとんどのＣＴＬは、ＭＨＣクラスＩ分子によって拘束されたＣＤ８＋Ｔ細胞であり、そして大部分のＨＴＬは、ＭＨＣクラスＩＩ分子によって拘束されたＣＤ４＋Ｔ細胞である。しかし、ＭＨＣクラスＩＩ分子によって拘束されたＣＤ４＋ＣＴＬおよびＭＨＣクラスＩ分子によって拘束されたＣＤ８＋ＨＴＬもまた、記載されている。さらに、ＭＨＣクラスＩＩ分子によって拘束されたＣＤ４＋ＣＴＬおよびＭＨＣクラスＩ分子によって拘束されたＣＤ４＋ＨＴＬの報告もまた存在する。ＣＤ８＋Ｔ細胞はまた、例えＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞よりも低いレベルであるとしても、広範なサイトカインを産生する。全てのこれらのエフェクター細胞集団（それらがＴリンパ球を本発明の融合細胞と接触させることによって生じることが提供される）は、本発明に含まれる。本発明のＣＴＬおよびＨＴＬは、ポリクローナルまたはモノクローナルであり得る。ＣＴＬおよびＨＴＬをクローニングする方法は、当該分野で公知である。
【００３７】
（抗原性活性について候補ポリペプチドおよび候補ペプチドをスクリーニングする方法）
上記のＣＴＬおよびＨＴＬ（「エフェクター細胞」）を用いて、当該分野で用いられる多数の方法によって本発明のエフェクター細胞を作製するために用いられる融合細胞の非樹状細胞パートナーで発現される抗原を同定し得る。簡潔には、エフェクター細胞含有細胞集団は、候補ペプチドおよび候補ポリペプチドと、適切な標的細胞（細胞傷害性がアッセイされる細胞）または抗原提示細胞（ＡＰＣ）（細胞増殖またはサイトカイン産生がアッセイされる細胞）のいずれかとを一緒に培養し、そしてその関連活性が決定される。エフェクター活性を誘導するペプチドは、これらのエフェクター分子によって認識される抗原性ペプチドである。エフェクター活性を誘導するポリペプチドは、エフェクター細胞によって認識される抗原性ポリペプチド、ペプチドフラグメントである。
【００３８】
細胞傷害性活性は、当該分野で公知の種々の方法（例えば、実施例Ｉおよび実施例ＩＩＩ〜Ｖに記載される、５１Ｃｒまたは乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）放出アッセイ）によって試験され得る。標的細胞は、種々の細胞型（例えば、線維芽細胞、リンパ球、レクチン（例えば、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）、もしくはリポ多糖類（ＬＰＳ））活性化リンパ球芽細胞、マクロファージ、単球、または腫瘍細胞株）のいずれかであり得る。標的細胞は、抗原性活性について試験される候補抗原を天然に発現するべきでないが、これらの細胞は、それらの抗原を組換え的に発現し得る。しかし、標的細胞は、ＣＴＬと同様に、ＭＨＣ（ＭＥＣ）クラスＩ分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子（関連ＣＵの拘束に依存する）の少なくとも１つの型を発現するべきである。これらの標的細胞は、適切なＭＨＣ分子を内在的に発現し得るか、またはそれらが、トランスフェクトされたポリヌクレオチド（このような分子をコードする）を発現し得る。選択された標的細胞集団は、このアッセイの前に候補ペプチドまたは候補ポリペプチドとともにパルスされ得るか、またはこの候補ペプチドまたは候補ポリペプチドがアッセイの容器（マイクロタイタープレートウェルもしくは培養チューブ）にＣＴＬおよび標的細胞とともに添加され得る。あるいは、候補ペプチドまたは候補ポリペプチドをコードする配列を含む発現ベクターでトランスフェクトされたかまたは形質転換された標的細胞が、用いられ得る。ＣＴＬ含有細胞集団、標的細胞、および候補ペプチドまたは候補ポリペプチドは、約４時間から約２４時間、一緒に培養される。標的細胞の溶解は、例えば、標的細胞からの５１ＣｒまたはＬＤＨの放出によって測定される。ＣＴＬによって標的細胞の溶解を誘導するペプチドは、ＣＴＬによって認識される抗原性ペプチドである。ＣＴＬによって標的細胞の溶解を誘導するポリペプチドは、ＣＴＬによって認識される抗原性ポリペプチド、ペプチドフラグメントである。
【００３９】
候補ペプチドまたは候補ポリペプチドは、ＣＵおよびＨＴＬの両方において増殖性応答を誘導するそれらの能力について試験され得る。これらのエフェクター細胞は、適切なＭＨＣクラスＩ分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子を発現するＡＰＣの存在下で候補ペプチドまたは候補ポリペプチドとともに培養される。このようなＡＰＣは、Ｂリンパ球、単球、マクロファージ、または樹状細胞、あるいはＰＢＭＣ全体であり得る。ＡＰＣはまた、Ｂリンパ球、単球、マクロファージ、または樹状細胞由来の不朽化細胞株であり得る。ＡＰＣはまた、適切なＭＨＣ（ＭＥＣ）分子を内在的に発現し得るか、またはそれらは、トランスフェクトされた発現ベクター（このような分子をコードする）を発現し得る。全ての場合において、ＡＰＣは、このアッセイの前に、例えば、電離放射線またはマイトマイシンＣを用いた処理によって非増殖性になされ得る。エフェクター細胞含有集団は、候補ペプチドまたは候補ポリペプチドとともにかまたは非存在下で培養され、そして細胞の増殖性応答が、例えば、［３Ｈ］−チミジンのそれらのＤＮＡへの組み込みによって測定される。
【００４０】
細胞の増殖を測定する代わりに、エフェクター細胞によるサイトカイン産生が、当業者に公知の手順によって測定され得る。サイトカインとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：インターロイキン−２（ＩＬ−２）、ＩＦＮ−、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＴＮＦ−、インターロイキン−３（ＩＬ−３）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−１０（ＩＬ−ｂ）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）およびトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）。これらのサイトカインを測定するためのアッセイは、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＥＬＩＳＡ、およびバイオアッセイ（ここで、関連サイトカインに対する細胞の応答性は、試験サンプルの存在下で、応答性（例えば、増殖）について試験される）。あるいは、エフェクター細胞によるサイトカイン産生は、細胞内の免疫蛍光染色法およびフローサイトメトリーによって直接的に可視化され得る。
【００４１】
抗原性について試験される候補ペプチドおよび候補ポリペプチドの選択は、融合細胞を作製するために用いられた非樹状細胞に依存する。非樹状細胞が腫瘍細胞である場合、候補ポリペプチドは、関連腫瘍細胞によって発現されるポリペプチドである。これらのポリペプチドは、好ましくは、腫瘍細胞と等価の正常細胞におけるよりも腫瘍細胞において有意に高く発現されるポリペプチドが好ましい。候補ペプチドは、このようなポリペプチドのフラグメントである。したがって、例えば、候補ポリペプチドは、黒色腫細胞については、チロシナーゼ（すなわち、ＭＡＲＴファミリーのメンバーの分子）であり得るか；結腸癌については、癌胎児性抗原であり得るか；前立腺癌については、前立腺特異的抗原であり得るか；乳癌または卵巣癌については、ＨＥＲ２／ｎｅｕであり得るか；卵巣癌については、ＣＡ−１２５であり得るか；または、ほとんどの癌については、ｍｕｃｉｎ−１（ＭＵＣ１）であり得る。
【００４２】
他方では、融合細胞を作製するために用いられた非樹状細胞が、感染した細胞または病原体由来ポリペプチドを発現するように遺伝的に操作された細胞であった場合、候補ポリペプチドは、各々、適切な感染性微生物によって発現されるポリペプチドであるかまたはトランスフェクトされた細胞によって発現されるポリペプチドである。このようなポリペプチドの例としては、以下が挙げられる：レトロウイルス（例えば、ＨＩＶまたはＨＴＬＶ）の膜糖タンパク質（例えば、ｇｐ１６０）もしくはｇａｇタンパク質、インフルエンザウイルスノイラミニダーゼ（ｎｅｕｒａｉｍｉｎｉｄａｓｅ）またはヘマグルチニン、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓもしくはｌｅｐｒａｅタンパク質、または原生動物（例えば、ＰｌａｓｍｏｄｉｕｍもしくはＴｒｙｐａｎｓｏｍａ）タンパク質。ポリペプチドはまた、本明細書中に列挙される他の微生物由来であり得る。試験されるペプチドは、例えば、一連のペプチド（目的の全長ポリペプチドの種々のセグメントを表す）（例えば、配列全体を従えてカバーする重複配列を有するペプチド）であり得る。試験されるペプチドは、任意の長さであり得る。エフェクター細胞のＭＨＣクラスＩ拘束応答を試験する場合、これらのペプチドは、好ましくは、７〜２０（例えば、８〜１２）アミノ酸長である。他方では、ＭＨＣクラスＩＩ拘束応答において、これらのペプチドは、好ましくは、１０〜３０（例えば、１２〜２５）アミノ酸長である。
【００４３】
あるいは、ペプチドのランダムライブラリーが試験され得る。適切なエフェクター細胞における陽性応答を誘導するこれらのペプチドの配列をタンパク質配列データベースと比較することによって、このペプチド配列を含むポリペプチドが同定され得る。関連ポリペプチドまたは同定されたペプチド自体は、対応する疾患のための候補治療剤または候補ワクチン剤となる（以下を参照のこと）。
【００４４】
ポリペプチドおよびペプチドは、当該分野で公知の種々の手段によって生成され得る。より小さなペプチド（５０アミノ酸長よりも少ない）は、標準的な化学的手段によって慣用的に合成され得る。さらに、ポリペプチドおよびペプチドの両方は、適切なポリペプチドまたはペプチドをコードするヌクレオチド配列を用いる、標準的なインビトロでの組換えＤＮＡ技術、およびインビボでの遺伝的組換え（トランスジェネシス（ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓｉｓ））によって生成され得る。当業者に周知の方法を用いて、関連コード配列および適切な転写／翻訳制御シグナルを含む発現ベクターを構築し得る。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら，Ｍｏｌｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ［Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）、およびＡｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，［Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ
Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．，１９８９を参照のこと。
【００４５】
種々の宿主発現ベクター系を使用して、ペプチドおよびポリペプチドを発現し得る。このような宿主発現系は、目的のポリペプチドが産生され、そして続いて精製され得るビヒクルを表し、しかしまた、適切なヌクレオチドコード配列で形質転換またはトランスフェクトされた場合、インサイチュで関連のペプチドもしくはポリペプチドを産生し得る細胞を表す。これらには、組換えバクテリオファージＤＮＡで形質転換した細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉまたはＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のような微生物、配列をコードするペプチドまたはポリペプチドを含むプラスミドＤＮＡ発現ベクターまたはコスミドＤＮＡ発現ベクター；適切なコード配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換した酵母（例えば、ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓまたはＰｉｃｈｉａ）；組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）で感染させた昆虫細胞系；組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）もしくはタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ））で感染させた植物細胞系、または組換えプラスミド発現ベクター（例えば、適切なコード配列を含むＴｉプラスミド）で形質転換した植物細胞系；あるいは、哺乳動物細胞（例えば、メタロチオネインプロモーター）のゲノム由来、または哺乳動物ウイルス（例えば、アデノウイルス後期プロモーターもしくはワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）由来のプロモーターを含む組換え発現構築物を保持する哺乳動物細胞系（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３または３Ｔ３）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４６】
本発明のペプチドは、上記に記載されるものを含むが、しかしアミノ末端およびカルボキシル末端のいずれかまたは両方での、関連ペプチドのインビボでの生存性を促進するためのブロッキング剤の付加によって、インビボ使用について改変されるものを含む。これは、ペプチド末端が、細胞またはミトコンドリアの取り込みの前にプロテアーゼによって分解される傾向がある状況において有用であり得る。このようなブロッキング剤には、限定されないが、投与されるべきペプチドのアミノ末端残基および／またはカルボキシル末端残基に結合され得る、さらなる関連もしくは非関連のペプチド配列が挙げられる。これは、このペプチドの合成の間に化学的にか、または標準的な技術の当業者に知られた方法による組換えＤＮＡ技術のいずれかで実行され得る。あるいは、ピログルタミン酸または当該分野で公知の他の分子のようなブロッキング剤が、アミノ末端残基および／もしくはカルボキシル末端残基に結合され得るか、またはアミノ末端のアミノ基もしくはカルボキシル末端のカルボキシル基が異なる部分と置き換わる。同様に、このペプチドは、投与の前に薬学的に受容可能な「キャリア」タンパク質と共有結合または非共有結合され得る。
【００４７】
このペプチドまたはポリペプチドのアミノ酸配列に基づいて設計されるペプチド模倣化合物もまた重要である。ペプチド模倣化合物は、選択されたペプチドの３次元構造と実質的に同じである３次元構造（すなわち、「ペプチドモチーフ」）を有する合成化合物である。このペプチドモチーフは、このペプチド模倣物が由来するペプチドもしくはポリペプチドの様式と、質的に同一な様式でＴ細胞を活性化する能力を有するペプチド模倣化合物を提供する。ペプチド模倣化合物は、その治療的な有用性（例えば、細胞の透過性の増加および生物学的半減期の延長）を増強するさらなる特徴を有し得る。
【００４８】
代表的に、このペプチド模倣物は、部分的もしくは完全に非ペプチドであるが、このペプチド模倣物が基になったペプチドにおいて生じるアミノ酸残基の側鎖と同一の側鎖を有する骨格を有する。化学結合のいくつかの型（例えば、エステル結合、チオエステル結合、チオアミド結合、レトロアミド結合、還元型カルボキシル結合、ジメチレン結合およびケトメチレン結合）は当該分野で公知であり、プロテアーゼ耐性ペプチド模倣物の構築におけるペプチド結合のための、一般に有用である置換をする。
【００４９】
（本発明のエフェクター細胞、ポリペプチドおよびペプチドを使用する方法）
本発明のエフェクター細胞（ＣＴＬおよびＨＴＬ）、ポリペプチドおよびペプチドは、腫瘍および感染免疫学の基礎調査研究において使用され得る。これらは、例えばＣＴＬおよびＨＴＬ、ならびにＨＴＬ−ＣＴＬ相互作用における抗原プロセシング機構、抗原提示機構、抗原認識機構、シグナル伝達機構をさらに明らかにするための研究において使用され得る。他の使用に加えて、これらは適切なアッセイにおけるポジティブコントロールまたはネガティブコントロールとして使用され得る。これらはまた、診断のために使用され得る。例えば、試験被検体由来のＴ細胞の、本発明のポリペプチドもしくはペプチドに応答する能力は、この試験被検体が、関連ペプチドもしくはポリペプチドの発現に関連する疾患を有するかまたは疑われる指標である。本発明のＣＴＬおよびＨＴＬは、適切な診断アッセイについての役立つ「ポジティブコントロール」である。さらに、このエフェクター細胞、ポリペプチドおよびペプチドは、治療および予防接種の方法において使用され得る。本発明のこれらの方法は、２つの基本クラス（すなわち、インビボアプローチにおける使用およびエキソビボアプローチにおける使用）に分類される。
【００５０】
（インビボアプローチ）
１つのインビボアプローチにおいて、ポリペプチド、ペプチドまたはペプチド模倣物は、上記に列挙される任意の経路によって被検体に投与される。適切なリンパ組織（例えば、脾臓、リンパ節、または粘膜関連リンパ組織（ＭＡＬＴ））に直接送達されるのが好ましい。この被検体は、本明細書中に開示される任意の疾患を有するかまたは有することが疑われ得る。この被検体における、このポリペプチド、ペプチドもしくはペプチド模倣物の投与によって産生されるこの免疫応答は、この疾患の症状が完全に抑止するか、または（ｏｆ）減少するかのいずれかである。あるいは、このポリペプチド、ペプチドまたはペプチド模倣物は、ワクチンとして（すなわち、関連疾患の発症を阻害または遅延する対象物と共に）被検体に投与され得る。
【００５１】
要求される投与量は、ポリペプチド、ペプチドもしくはペプチド模倣物の選択、投与の経路、処方物の性質、患者の病気の性質および担当医の判断に依存する。適切な投与量は、０．１〜１００．０ｇ／ｋｇの範囲である。必要とされる投薬量における広範な変異は、利用可能な種々の本発明のポリペプチド、ペプチドもしくはペプチド模倣物および投与の経路の種々の異なる有効性を考慮して予期され得る。例えば、経口投与が、静脈注射による投与よりも高い投薬量を必要とされることが予期される。これらの投与レベルにおける変異は、当該分野でよく理解されるように、最適化するための標準的な経験的な作業を使用して調整される。
【００５２】
（エキソビボアプローチ）
１つのエキソビボアプローチにおいて、エフェクター細胞（本発明の融合細胞を使用して上記に記載されるように産生されたＣＴＬおよび／またはＨＴＬ）を含む細胞の集団は、本明細書中に記載される任意の疾患を有するか、または有すると疑われる被検体に投与され得る。このエフェクター細胞を産生するために使用されるこのリンパ細胞は、被検体または第２被検体（好ましくは同じ種であり、より好ましくは第１被検体と不適合なＭＨＣ遺伝子座（クラスＩもしくはクラスＩＩ）を有さないか１つ有する）から得られる。例えば、Ｔリンパ球を含む同種異系細胞（例えば、ＰＢＭＣ）が被検体の中に注入されるドナーリンパ球注入（ＤＬＩ）は、腫瘍ロードの減少を示すか、または種々の癌における完全な寛解でさえ生じる。この治療活性は、レシピエント被検体のＭＨＣおよび／または非ＭＨＣ同種異系によって活性化されるドナーＴ細胞の移植片対腫瘍活性に起因する。ＤＬＩに使用されるこの細胞のこのエフェクター機能は、レシピエント被検体中への注入前に、それら（１つずつまたは複数で）（例えば、インビトロで）によって本発明の適切な融合細胞に曝露されることによって増強され得る。好ましくは、しかし必ずしも必要ではないが、この融合細胞は、レシピエント被検体由来の樹状細胞および非樹状細胞から産生される。ＤＬＩは通常、しかし必ずしも必要ではないが、非脊髄切除脊髄移植の後に実行される。ＤＬＩおよび非脊髄切除脊髄移植は、当該分野で公知である。
【００５３】
第２のエキソビボアプローチにおいて、リンパ細胞がこの被検体または別の被検体から単離され；そして適切なＡＰＣの存在において本発明の方法によって同定されたポリペプチドまたはペプチドに（例えば、インビトロで）曝露される。このリンパ細胞は、１または複数回（例えば、２、３、４、６、８、または１０回）曝露され得る。刺激されたリンパ細胞のこの細胞溶解性、増殖性またはサイトカイン産生能力は、１回以上の曝露の後でモニターされ得る。一旦、エフェクター活性の所望のレベルが達成されると、この細胞は、本明細書中に列挙される任意の経路を介して被検体中に導入され得る。自然に、ＤＬＩ（上記を参照のこと）のために使用された細胞は、本発明の融合細胞によって活性化されることを除いて、上記に記載されるように同定されるペプチドまたはポリペプチドによって活性化される。
【００５４】
本発明の任意の治療方法もしくは予防方法において、細胞、ポリペプチド、ペプチドの投与は、本明細書中に記載される任意の免疫調節性サイトカイン（例えば、ＩＬ−２）の投与によって達成され得る。
【００５５】
本発明の治療方法もしくは予防方法は、本明細書中に列挙される任意の疾患および種に適用され得る。ペプチドまたはポリペプチドが特定の疾患に対して治療的または予防的であるかどうかを試験するための方法は、当該分野で公知である。治療効果が試験される場合、この疾患の症状を提示する試験集団（例えば、癌患者または癌である実験動物）は、試験エフェクター細胞含有細胞集団、ペプチドまたはポリペプチドで、上記に列挙される任意のストラテジーを使用して処理される。コントロール集団（これもまた疾患の症状を提示する）は、同じ方法論を使用して、プラセボで処理される。
【００５６】
試験被検体における疾患症状の消失または減少は、このポリペプチドまたはペプチドが効果的な治療剤であったという指標である。
【００５７】
同じストラテジーを、疾患症状の発症の前に被検体に適用して（例えば、その疾患に対する遺伝的素因を有するヒトまたは実験動物）、本発明のエフェクター細胞含有細胞集団、ポリペプチドまたはペプチドは、免疫応答の誘導における効力、または予防剤（すなわち、ワクチン）としての効力について試験され得る。この状況において、疾患症状の発症における予防または遅延が試験される。あるいは、実験的に乾燥したコントロール群において誘導される免疫応答のレベルが比較され得る。
【００５８】
以下の実施例は、本発明の例示のためであって、限定するためではない。
【００５９】
（実施例Ｉ．マウス樹状細胞およびマウス非樹状細胞の融合）
（材料および方法）
（細胞培養および融合）
マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）ＭＣ３８腺癌細胞を、安定にＤＦ３／ＭＵＣ１  ｃＤＮＡにトランスフェクトし、ＭＣ３８／ＭＵＣ１細胞系を産生した（Ｓｉｄｄｉｑｕｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２３２０〜２３２３、１９８８；Ａｋａｇｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２０：３８〜４７、１９９７）。ＭＣ３Ｓ、ＭＣ３８／ＭＵＣ１および同系のＭＢ４９膀胱癌細胞を、１０％の加熱非働化した仔ウシ胎児血清（「ＦＣＳ」）、２ｍＭグルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００：ｇ／ｍｌストレプトマイシン添加ＤＭＥＭ中で維持した。
【００６０】
ＤＣを、Ｉｎａｂａら（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６：１６９３〜１７０２、１９９２）によって記載される方法を改変して使用して、骨髄培養物から得た。簡単には、骨髄を、長骨から流して、そして赤血球を塩化アンモニウムで溶解した。リンパ球、顆粒球、およびＩａ＋細胞を、以下のモノクローナル抗体（「ｍＡｂ」）：
（１）  ２．４３、抗ＣＤ８［ＴＩＢ  ２１０；Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ
Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、Ｒｏｃｋｖｉｌｌ、ＭＤ］；
（２）  ＧＫ１．５、抗ＣＤ４（ＴＩＢ  ２０７、ＡＴＣＣ）；
（３）  ＲＡ３−３Ａ１／６．１、抗Ｂ２２０／ＣＤ４５Ｒ（ＴＩＢ  １４６、ＡＴＣＣ）；
（４）  Ｂ２１−２、抗Ｉａ（ＴＩＢ  ２２９、ＡＴＣＣ）；および
（５）  ＲＢ６−８Ｃ５、抗Ｇｒ−１（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）；
そして次いで補体とのインキュベーションによって骨髄細胞から枯渇させた。この溶解しない細胞を、５％加熱非働化ＦＣＳ、５０：Ｍ  ２−メルカプトエタノール、１ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、２ｍＭ  グルタミン（ｇｌｕｔａｎｉｎｅ）、１０Ｕ／ｍｌペニシリン、１０：ｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび５００Ｕ／ｍｌ組換えマウスＧＭ−ＣＳＦ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｉｎｄｉａｎａ）添加ＲＰＭＩ  １６４０培地中、６ウェル培養プレートに配置した。培養７日目に、付着しない細胞およびゆるく付着した細胞を収集し、１００ｍｍペトリ皿に再配置した（１０６細胞／ｍｌ；８ｍｌ／皿）。この付着しない細胞を、インキュベーションの３０ｍｍ後に洗い流し、そしてＪＭ−ＣＳＦ含有ＲＰＭＩ培地を付着細胞に添加した。培養１８時間後、この付着しない細胞集団を、ＭＣ３８ＩＭＴＪＣＩ細胞またはＭＣ３８との融合のために除去した。
【００６１】
融合を、Ｃａ２＋もＭｇ２＋も含有しないＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓリン酸緩衝化生理食塩水（「ＰＢＳ」）（ｐＨ７．４）中の５０％ＰＥＧと細胞とをインキュベートすることによって実行した。融合におけるＤＣの腫瘍細胞に対する比は、１５：１〜２０：１であった。融合後、この細胞をＨＡＴ（Ｓｉｇｍａ）含有培地中の２４ウェル培養プレートに１０〜１４日間配置した。ＭＣ３８細胞はＨＡＴにあまり敏感ではないので、ＨＡＴを、ＭＣ３８／ＭＵＣ１細胞およびＭＣ３８細胞を殺すよりはむしろ、増殖を遅くするために使用した。ＭＣ３８／ＭＵＣ１細胞およびＭＣ３８細胞は、組織培養フラスコにしっかり付着して成長するが、一方この融合細胞は、穏やかなピペッティングによってはがれた。
【００６２】
（フローサイトメトリー）
細胞を、ＰＢＳで洗浄し、そしてｍＡｂ  ＤＦ３（抗ＭＵＣＩ）、ｍＡｂ  Ｍｌ／４２／３．９．８（抗ＭＨＣクラスＩ）、ｍＡｂ  Ｍ５／１１４（抗ＭＨＣクラスＩＩ）、ｍＡｂ  １６−１０Ａ１（抗Ｂ７−１）、ｍＡｂ  ＧＬ１（抗Ｂ７−２）およびＭＡｂ  ３Ｅ２（抗ＩＣＡ．Ｍ−１）で３０分間（ｍｍ）氷上でインキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、フルオレセインイソチオシアネート（「ＦＩＴＣ」）−結合抗ハムスター、抗ラット、抗マウスＩｇＧを添加しさらに３０分間氷上でインキュベートした。次いでサンプルを洗浄し、固定し、そしてＦＡＣＳＣＡＮ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｍｏｕｎｔ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）によって分析した。
【００６３】
（細胞傷害性Ｔ細胞活性）
細胞傷害性Ｔ細胞（「ＣＴＬ」）活性を、ラクターゼジヒドロゲナーゼ（「ＬＤＨ」）（ＣｙｔｏＴｏｘ、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）の放出によって決定した。
【００６４】
（混合白血球反応）
ＤＣ、ＭＣ３８／ＭＵＣ１細胞およびＦＣ／ＭＵＣ１細胞を、５日間、イオン化した放射線（３０Ｇｙ）に曝露し、そして１×１０５の同系または同種異系Ｔ細胞を、９６ウェル平底培養プレートに添加した。このＴ細胞を、脾臓懸濁液をナイロンウールを通すことによって調製し、残りのＡＰＣを枯渇して１００ｍｍ組織培養皿中の９０ｍｍに配置した。３［Ｈ］−チミジンの付着しない細胞への取り込みを、１：Ｃｉ／ウェルのパルス（ＧＢｑ／ｍｍｏｌ；Ｄｕ  Ｐｏｎｔ−Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｍｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ）の６時間後に測定した。それぞれの反応を３回実行した。
【００６５】
（免疫細胞サブセットのインビトロ枯渇）
マウスに、静脈内および腹腔内の両方に、４日間のＦＣ／ＭＵＣＩでの２回の免疫化のうちの１回目の４日前まで、ｍＡｂ  ＧＫ１．５（抗ＣＤ４）、ｍＡｂ  ２．４３（抗ＣＤ８）またはラットＩｇＧを１日置きに注射し、その後ＭＣ３８／ＭＵＣ１細胞でチャレンジした。この脾臓細胞を、フローサイトメトリーのために収集しＣＴＬ活性を分析した。
【００６６】
（結果）
マウスＭＣ３８腺癌細胞を、骨髄由来ＤＣに融合した。首尾よく融合を実施するために、ＤＦ３／ＭＵＣ１腫瘍関連抗原を安定して発現するＭＣ３８細胞を最初に使用した（Ｓｉｄｄｉｑｕｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７５：５１３２−５１３６，１９７８）。融合細胞（ＦＣ／ＭＵＣＩ）は、ＭＨＣクラスＩおよびＩＩ、Ｂ７−１、Ｂ７−２およびＩＣＡＭ−１と同様にＤＦ３／ＭＵＣＩを発現した。
【００６７】
さらに、融合細胞の多くは、突起および樹状突起が見られないＤＣの形態を示した。ＤＣとのＭＣ３８細胞の融合（ＦＣ／ＭＣ３８）は、検出不可能なＤＦ３／ＭＵＣ１抗原を除いて細胞表面抗原発現の類似のパターンを生じた。マウスへのＭＣ３８／ＭＵＣ１細胞の注射は、皮下腫瘍の形成を生じた。同様の知見が、ＤＣと混合されたＭＣ３８／ＭＵＣ１またはＤＣとＭＣ３８細胞とを混合した後に得られた。
【００６８】
しかし、ＦＣ／ＭＵＣＩを注射されたマウスにおいて腫瘍が形成されなかったという知見は、融合細胞が、発癌性ではないことを示した。
【００６９】
樹状細胞が、初代ＭＬＲの強力な刺激物質であり；Ｓｔｅｉｎｍａｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７５：５１３２−５１３６，１９７８；ｖａｎ  Ｖｏｏｒｈｉｓら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５８：１７４−１９１，１９８３）、そしてインビボで同種異系ＣＤ８＊Ｔ細胞の増殖を誘導する（Ｉｎａｂａら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６：１８２１９４，１９８７；Ｙｏｕｎｇら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７１：１３１５−１３３２，１９９０）。ＦＣ／ＭＵＣＩ細胞の機能の一部分を特徴付けるために、初代同種異系ＭＬＲにおけるこれらの効果を、ＤＣおよびＭＣ３８／ＭＵＣ１細胞の効果と比較した。この結果は、ＤＣのように、ＦＣ／ＭＵＣ１細胞が、同種異系のＭＬＲにおける刺激性の機能を示すことを実証する。反対に、ＭＣ３８／ＭＵＣ１細胞は、Ｔ細胞増殖にわずかな効果を有する。
【００７０】
マウスを、ＦＣ／ＭＵＣＩ細胞で２回免疫化し、インビボ機能を評価した。腫瘍は、１０６個の照射されたＭＣ３８／ＭＵＣ１細胞で２回免疫され、続いて、ＭＣ３８／ＭＵＣ１細胞でチャレンジしたマウスにおいて発生した（表１）。反対に、２．５×１０５のＦＣ／ＭＵＣＩ細胞を免疫した後、すべての動物は、ＭＣ３８／ＭＵＣＩでのチャレンジ後、腫瘍のないままであった（表１）。しかし、ＤＣ単独またはＰＢＳを免疫され、次いで、２．５×１０５のＭＣ３８細胞またはＭＣ３８／ＭＵＣ１細胞を皮下にチャレンジされたコントロール動物は、１０〜２０日の内に腫瘍の増殖を示した。
【００７１】
さらに、ＦＣ／ＭＵＣＩまたはＦＣ／ＭＣ３Ｓでの免疫は、関連のない同系のＭＢ４９膀胱癌腫の増殖に対して検出可能な効果を有さなかった（表１）。ＦＣ／ＭＵＣＩで免疫されたマウス由来のＣＴＬは、ＭＣ３８／ＭＵＣＩの溶解を誘導したが、ＭＢ４９細胞では誘導しなかった。反対に、ＤＣまたはＰＢＳで免疫されたマウス由来のＣＴＬは、ＭＣ３８／ＭＵＣＩ標的の検出可能な溶解を示さなかった。
【００７２】
抗腫瘍活性に起因するエフェクター細胞をさらに規定するために、ＦＣ／ＭＵＣ１での免疫の前後にＣＤ４＋またはＣＤ８＋に対する抗体をマウスの腹腔内に注射した。８０〜９０％までのそれぞれの集団の欠乏を、脾細胞のスローサイトメトリー分析によって確認した。抗ＣＤ−４抗体および抗ＣＤ−８抗体の注射が、腫瘍発生率を増大したという知見は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の両方が抗腫瘍活性に寄与することを示した（図２Ｃ）。
【００７３】
さらに、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の欠乏は、インビトロでのＭＣ３８／ＭＵＣＩの溶解の減少に関連した（図２Ｄ）。
【００７４】
ＦＣ／ＭＵＣ１細胞での免疫が、汎発する疾患の防止に効果的かどうかを決定するために、ＭＣ３８／ＭＵＣＩ肺転移のモデルを使用した。静脈内または皮下内でのＦＣ／ＭＵＣ１の免疫は、ＭＣ３８／ＭＵＣ１細胞での静脈内のチャレンジを完全に防止した。反対に、ＭＣ３８／ＭＵＣ１細胞で同様にチャレンジした、すべての免疫されていないマウスは、２５０を越える肺転移を発生させた。
【００７５】
処置のモデルにおいて、ＭＣ３８／ＭＵＣ１肺転移を、ＦＣ／ＭＵＣ１を免疫する４日前に確立した。ビヒクルで処理したコントロールマウスは、２５０を超える転移を発生させたが、ＦＣ／ＭＵＣ１細胞で処理された１０匹のマウスのうち９匹が、検出可能な転移を有さず、そして１匹のマウスが、１０未満の小結節を有した。ＦＣ／ＭＵＣ３Ｓ細胞で処理したマウスは、同様にＭＣ３８胚転移が検出不可能であった。これらの知見は、ＦＣ／ＭＵＣ１免疫が、転移性の疾患の予防と処置の両方に使用され得ることを示した。
【００７６】
（実施例ＩＩ．ヒトＤＣおよび骨髄腫細胞の融合）
（材料および方法）
白血球除去法によって得られた軟膜（またはルウコパック（ｌｅｕｋｏｐａｃｋｓ））中の白血球を、Ｆｉｃｏｌｌ中での遠心分離によって分画した。（末梢血液の）単核細胞を含む画分を、１０％ウシ胎仔血清（「ＦＣＳ」）を添加したＲＰＭＩ１６４０を含むフラスコ中で、３０分間、３０℃でインキュベートした。非接着細胞（そのうちのいくらかは樹状細胞であった）を、保持された接着細胞から穏やかに分離した。非接着集団からＤＣを回収するために、非接着細胞を、２０％ＦＣＳを添加したＲＰＭＩ  １６４０中で、３０分間〜１時間、インキュベートし、その後、浮遊している細胞を除去し、廃棄した。両方の接着細胞サンプルを、次いで、２０％ＦＣＳを添加したＲＰＭＩ１６４０中で、２〜３日間インキュベートし、緩く接着した細胞（ＤＣ）の剥離を可能にした。これらの緩い接着細胞を除去し、そして保持した。残余接着細胞は、比較的低密度の緩い接着ＤＣを含有しており、これを１０％ウシ胎仔血清を添加したＲＰＭＩ１６４０中で、一晩インキュベートし、緩い接着ＤＣの剥離を可能にした。これらを残余接着細胞から分離した。緩い接着ＤＣの２つのサンプルを、次いでプールし、ＧＭ−ＣＳＦ（１０００Ｕ／ｍｌ）およびＩＬ−４（１００Ｕ／ｍｌ）を含有した培地中で、１０６細胞／ｍｌの密度で５〜６日間培養した。これらの培養物から回収した細胞は、融合実験で使用されたＤＣであった。
【００７７】
ＤＣをまた、骨髄幹細胞培養から得た。簡潔には、幹細胞を、１０％ＦＣＳを添加したＲＰＭＩ１６４０を含むフラスコ中に静置した。３７℃で３０分間のインキュベーション後、非接着細を洗い流した。１０％ＦＣＳを添加した新鮮なＲＰＭＩ１６４０を、残余物、つまり、接着細胞に加えた。一晩のインキュベーション後、緩く接着している細胞を、回収し、ＧＭ−ＣＳＦ（１０００Ｕ／ｍｌ）およびＩＬ−４（１００Ｕ／ｍｌ）を含有したＲＰＭＩ  １６４０／ＦＣＳ培地中で、５〜６日間インキュベートした。得られた細胞を、融合の用途ために準備した。
【００７８】
細胞融合を、ＤＣとヒト骨髄腫細胞ＭＹ５の間で実施し、融合細胞ＤＣ／ＭＹ５を作成した。融合後、この細胞をＨＡＴ選択中に１０〜１４日間静置した。ＩＬ−６をまた、この培地に２０〜５０：ｇ／ｍｌで加え、ＤＣ／ＭＹ５細胞の生存を促進した。融合の手順は、融合細胞が、融合細胞が提示する高い程度の表面接着性に基いて、融合していない骨髄腫細胞から分離される点を除いて、本質的には前出の実施例１に記載したものと同じである。
【００７９】
（結果）
フローサイトメトリーで示したように、ＤＣ／ＭＹ５細胞は、これらの親細胞の表現型の特徴を保持していた：ＤＣ／ＭＹ５は、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ３８（骨髄腫細胞表面マーカ）、ＤＦ３（腫瘍細胞表面マーカ）、ＣＤ８３（ＣＤ細胞表面マーカ）、Ｂ７−１およびＢ７−２についてのｍＡｂｓにより明確に染色される。リンパ球混合反応（ＭＬＲ）アッセイによって、これらの融合細胞がまた、Ｔ細胞の強力な刺激物質であることを示した。
【００８０】
（実施例ＩＩＩ．ヒトＨＵＣＩに対する寛容の逆転）
（融合細胞で免疫したＭＵＣ１トランスジェニックマウスにおける抗原）
（材料および方法）
（ＭＵＣ１トランスジェニックマウス）
ヒトＭＵＣＩについてトランスジェニックであるＣ５７Ｂ１／６マウス系統が、Ｒｏｗｓｅら（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８：３１５〜３２１、１９９８年）の記述により確立された。５００ｎｇのテイル（ｔａｉｌ）ＤＮＡを、７４５〜７６２のヌクレオチドおよび１０８６〜１０６５のヌクレオチドにそれぞれ対応するＭＵＣＩプライマーを使用したＰＣＲで増幅し、ＭＵＣＩ配列の存在を確認した。
【００８１】
ＰＣＲ産物は１％アガロースゲル（Ｒｏｗｓｅら、前出）中の電気泳動によって検出した。
【００８２】
（細胞培養および細胞融合）
マウス（Ｃ５７Ｂ１／６）ＭＣ３８およびＭＢ４９癌細胞を、ＭＵＣ１  ｃＤＮＡ（Ｓｉｄｄｉｑｕｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２３２０〜２３２３、１９８８；Ａｋａｇｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ２０：３８〜４７、１９９７；Ｃｈｅｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：３５１〜３５９、１９９７）を用いて、安定してトランスフェクトした。細胞を、１０％加熱非働化ＦＣＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン，１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００ｇ／ｍｌのストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ中で維持した。ＤＣを、骨髄培養物から得て、そして前出の実施例Ｉで記載したように、癌細胞に融合した。
【００８３】
（インビボＴ細胞増殖）
脾臓およびリンパ節の単一細胞の調製物を、１０％加熱非働化ＦＣＳ、５０Ｍ−メルカプトエタノール、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、および１００ｇ／ｍｌストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ培地中に懸濁した。細胞を５Ｕ／ｍｌの精製したＭＵＣ１抗原（Ｓｅｋｉｎｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３５：３６１０〜３６１６、１９８５）を用いて刺激（ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ）した。培養の１、３、および５日目に、この細胞を、１ウェル当たり１Ｃｉ［３Ｈ］チミジンを用いて１２時間パルスし、そして半自動化細胞回収機を用いてフィルター上に回収した。放射能を液体シンチレーションによって定量した。
【００８４】
（ＣＤ８＋Ｔ細胞系（Ｔｉｎｅｓ）の生成）
リンパ節細胞（「ＬＮＣ」）を、５Ｕ／ｍｌＭＵＣ１抗原を含む完全ＲＰＭＩ培地中に懸濁した。１０Ｕ／ｍｌのマウスＩＬ−２を、培養５日後に加えた。
第１０日目および１５日目において、細胞を、５Ｕ／ｍｌ  ＭＵＣＩ抗原および１：５照射（３０  Ｇｙ）同系脾臓細胞をＡＰＣとして用いて、再刺激した。Ｆｉｃｏｌｌ遠心分離によって死滅細胞を除去し、そしてナイロンウールを通過させることにより残余ＡＰＣの除去した後、Ｔ細胞培養物を分析した。Ｔ細胞を、ＣＤ３ｅ（１４５−２Ｃ１１）、ＣＤ４（Ｈ１２９，１９）、ＣＤ８（５３−６．７）、ＴｃＲ（Ｈ５７−５９７）およびＴｃＲ（ＵＣ７−１３Ｄ５）（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）に対するＦＩＴＣ−結合抗体用いて染色した。氷上で１時間のインキュベーション後、この細胞を洗浄し、固定し、そしてＦＡＣＳＣＡＮ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）により分析した。
【００８５】
（細胞毒性アッセイ）
インビトロ細胞毒性を、標準的な５ｌＣｒ−放出アッセイで測定した。簡潔には、細胞を、５ｌＣｒを用いて、６０分間、３７℃で標識し、そして洗浄して取込まれなかった同位体を除去した。標的細胞（ｌ×１０４）を、９６ウェルｖ底プレートのウェルに添加し、エフェクター細胞とともに、３７℃で５時間インキュベートした。上清を５１、Ｃｒについて、ガンマカウンターでアッセイした。５１Ｃｒの自然放出を、エフェクターの非存在下で、標的細胞のインキュベーションによって評価し、その一方で、５ｌＣｒの最大または全ての放出を０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００中の標的のインキュベーションによって決定した。特定の５１Ｃｒ放出のパーセンテージを、以下の式で決定した：特定の放出％＝［（実験値−自然放出）／（最大放出−自然放出））］×ｌ００。
【００８６】
（体液性免疫応答）
マイクロタイタープレートを、５Ｕ／ウェルの精製ＭＵＣＩ抗原を用いて、４℃で一晩かけて被覆した。このウェルを５％ウマ血清アルブミン含有ＰＢＳを用いて洗浄して、そしてマウス血清の４倍希釈液と共に１時間インキュベートした。洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合したヤギ抗マウスＩｇＧ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてインキュベートした後、抗体複合体をｏ−フェニレンジアミン（ｏ−ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｉｎｉｎｅ）（Ｓｉｇｍａ）を用いた発色およびＯＤを４９０ｎｍとするＥＬＩＳＡマイクロプレート自動読取り機ＥＬ３１０によって検出した。
【００８７】
（免疫組織学）
新鮮な除去した組織を、液体窒素で凍結した。幅において５ｍの組織切片を、低温槽で調製し、そして１０分間、アセトン中で固定した。この切片を、次に、モノクローナル抗体ＤＦ３（抗ＭＤＣ１）、抗−ＣＤ４（Ｈ１２９，１９）またはＣＤ８（５３−６．７）とともに室温で３０分間インキュベートし、そして、ＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ  ＡＢＣキット（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用して、間接免疫ペルオキシダーゼ染色（ｉｎｄｉｒｅｃｔ  ｉｍｍｕｎｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ｓｔａｉｎｉｎｇ）に供した。
【００８８】
（結果）
実施例１に示されているように、ＤＣおよびＭＣ３８／ＭＵＣＩ癌細胞（ＦＣ／ＭＵＣＩ）の融合に由来するワクチンは、強力な抗腫瘍免疫を誘導する。ＭＵＣ１トランスジェニックマウスのＦＣ／ＭＵＣ１を用いたワクチン接種の効果を評価するために，このマウスを、５×１０５ＦＣ／ＭＵＣ１を用いて２回免疫して、コントロールとして、１０６照射ＭＣ３８／ＭＵＣ１細胞またはＰＢＳを用いて免疫した。１０６ＭＣ３８またはＭＣ３８／ＭＵＣ１でチャレンジした後、照射ＭＣ３８／ＭＵＣ１細胞またはＰＢＳを用いて免疫した全てのマウスは、腫瘍を発生させた。それに比べて、ＦＣ／ＭＵＣＩで免疫化したマウスにおいて、腫瘍の増殖は観察されなかった。ＦＣ／ＭＵＣ１を用いたＭＵＣ１トランスジェニックマウスの免疫化は、関連のないＭＢ４９膀胱癌の成長には影響を与えなかった（Ｃｈｅｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：３５１〜３５９、１９９７）。しかし、ＭＵＣＩ（ＭＢ４９／ＭＵＪＣＩ）を発現するＭＢ４９細胞は、ＦＣ／ＭＵＣ１で免疫されたマウスはにおいて成長しなかった。
【００８９】
これらの結果を拡張して、ＦＣ／ＭＵＣ１−免疫化マウス由来のＣＴＬを標的細胞の溶解についてアッセイした。照射ＭＣ３８／ＭＵＣＩ細胞またはＰＢＳを用いて免疫したＭＵＣ１トランスジェニックマウス由来のＣＴＬは、たとえあるとしても、ＭＣ３８／ＭＵＣＩ細胞に対する反応性を殆ど提示しない。これとは対照的に、ＦＣ／ＭＵＣＩを用いて免疫化されたマウス由来のＣＴＬは、ＭＣ３８細胞、ＭＣ３８／ＭＵＣ１細胞およびＭＢ４９／ＭＵＣ１細胞の溶解を誘導したが、ＭＢ４９細胞の溶解は誘導しなかった。野生型マウスで示したように（実施例Ｉ、前出）、ＦＣ／ＭＵＣＩを使用した免疫化は、ＭＵＣＩおよびＭＣ３８細胞上の他の未知の抗原に対する免疫性を誘導する。従って、ＣＴＬによってＭＢ４９／ＭＵＣ１細胞が溶解し、ＭＢ４９細胞が溶解しないという実証は，ＦＣ／ＭＵＣＩが、ＭＵＣ１−特異的応答を誘導することを確認する。さらに、照射ＭＣ３８／ＭＵＣ１またはＰＢＳではなく、ＦＣ／ＭＵＣＩを用いるＭＵＣＩトランスジェニックマウスの免疫化が、ＭＵＣ１に対する特異的な抗体の応答を誘導する。
【００９０】
ＭＵＣＩトランスジェニック由来のＴ細胞がプライムされて、抗ＭＵＣＩ応答を誘導し得るか否かを決定するために、排出ＬＮＣが、照射ＭＣ３８／ＭＵＣ１細胞またはＦＣ／ＭＵＣ１を用いて免疫化されたマウスから単離された。このＬＮＣを、インビトロのＭＵＣＩ抗原を使用して刺激した。この結果は、ＰＢＳまたは照射ＭＣ３８／ＭＵＣ１細胞を使用して免疫化されたマウス由来のＬＮＣが、ＭＵＣＩ抗原の存在下で増殖しないことを実証する。対照的に、ＦＣ／ＭＵＣ１で免疫化したマウス由来のＬＮＣは、増殖を伴ってＭＵＣ１に応答する。ＭＵＣ１に対するＣＴＬ誘導を確認するために、排出ＬＮＣを、ＦＣ／ＭＵＣ１を用いて免疫化したＭＵＣＩトランスジェニックマウスから単離し、そしてＭＵＣＩ抗原および照射脾細胞の存在下で培養した。細胞を、培養の始まり、および第１０日目から１５日目に、ＦＡＣＳＣＡＮを用いて分析した。この結果は、ＭＵＣＩ抗原を用いたインキュベーション後の優勢なＣＤ８＋Ｔ細胞集団の選択を実証する。免疫化してないＭＵＣ１トランスジェニックマウス由来の天然のＴ細胞とは違って、これらのＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＭＣ３８／ＭＵＣ１およびＭＢ４９／ＭＵＣＩ標的に対する特異的なＣＴＬ活性を提示した。集合的に，これらの結果は、ＦＣ／ＭＵＣ１を用いた免疫化は、ＭＵＣＩトランスジェニックマウス内のＭＵＣＩに対する非応答性を逆転することを示唆する。
【００９１】
ＭＵＣＩに対する非応答性が、ＦＣ／ＭＵＣＩを用いた免疫化により逆転され得るという知見は、このワクチンを、正常な上皮によるＭＵＣ１発現のバックグラウンドにおける播種性の疾患を処置するために使用し得ることを示唆した。処置モデルにおいて、ＭＣ３８／ＭＵＣ１肺転移が、ＭＵＣ１トランスジェニックマウスへのＭＣ３８／ＭＵＣ１細胞の尾静脈注射より達成された。ビヒクルによって処置されたコントロールマウスが肺転移を発生させた一方、第２日目または第４日目にＦＣ／ＭＵＣＩで免疫化したマウスは、検出可能な転移を有さなかった。これらの知見は、ＰＣ／ＭＵＣＩ免疫化を、ＭＵＣ１トランスジェニックマウスにおける転移性疾患を処置するために使用し得ることを示唆する。重要なことには、ＭＣ３８／ＭＵＣＩ腫瘍に対して防御されるマウスは、正常な気管支上皮およびこの導入遺伝子を発現する他の組織におけるＭＵＣＩ抗原の持続的な発現を提示する（Ｒｏｗｓｅら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８：３１５〜３２１、１９９８）。また、抗ＣＤ４および抗ＣＤ８抗体を用いるＭＵＣＩ陽性組織の染色は、Ｔ細胞浸潤のいずれも示さない。
【００９２】
成体マウスでの自己抗原に対する非応答性の逆転は、抗腫瘍免疫学の分野で潜在的な重要性を有する。本実施例は、ＤＣ−腫瘍融合細胞を用いた免疫化は、確立された転移状態（ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ）を拒絶することを獲得するのに十分な免疫応答を誘導することを実証する。特に、抗腫瘍免疫を与える抗ＭＵＣＩ応答の誘導は、あったとしても、腺管に沿って先端周辺でＭＵＣＩを発現する正常な腺上皮に対する影響を殆ど有さない。これらの知見は、抗ＭＵＣＩ免疫性が、ＭＵＣＩ陽性のヒト腫瘍の処置についての有効なストラテジーを表していることを実証する。
【００９３】
（実施例ＩＶ．ヒト樹状細胞および乳癌細胞の融合による腫瘍特異的ＣＴＬの活性化）
（材料および方法）
（乳癌細胞培養）
ヒトＭＣＦ−７乳癌細胞（ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を、１０％加熱非働化ＦＣＳ、２ｍＬ  Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００ｇ／ｍｌストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ培養培地中で増殖した。ヒト乳癌細胞は、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄの認可を得て、原発性腫瘍および皮膚、肺および骨髄の転移性病変の生検材料から得た。この細胞を、１ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼ、０．１ｍｇ／ｍｌのヒアルロニダーゼおよび１ｍｇ／ｍｌのＤＮａｓｅを含み、Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋を含まないハンクス平衡塩類溶液中でインキュベーションすることにより分離した。乳癌細胞をまた、遠心分離および夾雑する赤血球の溶解により、悪性胸水から単離した。乳癌細胞を、１０％加熱非働化自己−ヒト血清、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００：ｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび：ｇ／ｍｌインシュリン（Ｓｉｇｍａ）を添加したＲＰＭＩ  １６４０培地中で維持した。
【００９４】
（ＤＣ、単球およびＴ細胞の調製）
末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離によって、転移性乳癌に罹患した患者から単離した。このＰＢＭＣを、１０％ヒト血清（Ｓｉｇｍａ）を添加したＲＰＭＩ  １６４０培養培地中に、１時間懸濁した。非接着細胞を除去し、そしてＴ細胞をナイロンウール分離によって単離した。接着細胞を、１０００Ｕ／ｍｌ  ＧＭ−ＣＳＦ（Ｇｅｎｚｙｍｅ）および５００Ｕ／ｍｌ  ＩＬ−４（Ｇｅｎｚｙｍｅ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地／１０％ヒト血清中で、１週間培養した。ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４刺激されたＤＣは、ＭＨＣクラスＩおよびＩＩ，Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＩＣＡＭ、ＣＤ４０ならびに可変量のＣＤ８３を発現させたが、ＣＤ１４、ＣＤ１９、サイトケラチンまたはＭＵＣ１は発現しなかった。非接着細胞および緩く接着する細胞を、ＤＣ集団を生成するように繰返し洗浄することにより回収した。しっかりと接着する単球を、トリプシンを用いてこのプレートから解放した。
【００９５】
（細胞融合）
ＤＣを、ＭＣＦ−７または原発性乳癌細胞と、１０：１の割合で混合し、そして、５０％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む無血清ＲＰＭＩ  １６４０培地で、５分間インキュベートした。無血清ＲＰＭＩ  １６４０培地を用いて徐々に希釈した後、細胞を洗浄し、１０％自己ヒト血清および５００Ｕ／ｍｌＧＭ−ＣＳＦを添加したＲＰＭＩ  １６４０培地に再懸濁し、そして、３７℃で、７〜１４日間インキュベートした。
【００９６】
（フローサイトメトリー）
細胞を、ＰＢＳを用いて洗浄し、そして、ＭＵＣＩ  （ＤＦ３）  （Ｋｕｆｅｒａら、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ３：２２３〜２３２、１９８４）、ＭＨＣクラスＩ（Ｗ６／３２）、ＭＨＣクラスＩＩ（ＨＬＡ−ＤＲ）、Ｂ７−１（ＣＤ８０）、Ｂ７−２  （ＣＤ８６）またはＩＣＡＭ（ＣＤ５４）（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）に対するマウス抗体と共に、氷上で、１時間インキュベートした。ＰＢＳによる洗浄後、この細胞を、フルオレセイン結合ヤギ抗マウスＩｇＧとともに、氷上で３０ｍｍインキュベートした。この細胞を再度洗浄し、続いて、ＰＥを結合した抗ＭＨＣクラスＩＩまたは抗Ｂ７．１と共に、４℃で、１時間インキュベートした。続いて、サンプルを洗浄し、２％  パラホルムアルデヒドを用いて洗浄し、そしてＦＡＣＳｃａｎ  （Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，  Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，  ＣＡ）によって、２次元分析（ｂｉ−ｄｉｍｅｎｔｉｏｎａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ）に供した。
【００９７】
（免疫組織化学）
この細胞集団のサイトスピン（Ｃｙｔｏｓｐｉｎ）調製を、アセトンで１０分間、固定した。このスライドを、ＭＡｂ  ＤＦ３（抗−ＭＵＣｌ）または抗サイトケラチン抗体（ＡＥ１／ＡＥ３，  Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，  ＩＮ）と共に、室温で３０分間インキュベートし、そして、ビオチン化ウマ抗マウスＩｇとともに、さらに３０分間インキュベートした。反応性を、ＡＢＣ溶液（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）を用いて検出した。この細胞を、マウス抗−ＭＨＣクラスＩＩと共に３０分間インキュベートし、そしてアルカリホスファターゼで標識した抗マウスＩｇと共に、さらに３０分間インキュベートした。ＡＰ−ＡＢＣ溶液（Ｖｅｃｔｏｒ）を使用して、青の対比染色を行った。
【００９８】
（自己Ｔ細胞刺激）
ＤＣ、乳房腫瘍細胞および融合細胞を、３０Ｇｙイオン化照射に曝露し、そして９６ウェルプレートの平底培養プレートに自己Ｔ細胞に５日間添加した。Ｔ細胞による［３Ｈ］−チミジンの取り込みを、ＩＣｉ／ウェル（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）のパルス後１２時間に測定した。
【００９９】
（ＣＴＬアッセイ）
ＰＢＭＣを、２０Ｕ／ｍｌのヒトインターロイキン−２（ＨｕＩＬ−２）の存在下で自己乳房腫瘍細胞または融合細胞と共に１０日間共培養した。この刺激されたＴ細胞を、ナイロンウール分離によって回収し、そして細胞標的を使用するＣＴＬアッセイにおいてエフェクター細胞として使用した。原発性乳房腫瘍細胞、単球、ＭＣＦ−７細胞、原発性卵巣癌細胞（ＯＶＣＡ）およびＫ５６２細胞を、３７℃で５１Ｃｒを用いて６０分間標識化した。洗浄して取り込まれなかったアイソトープを除去した後、この標的（２×１０４）を、３７℃でエフェクター細胞と共に５時間共培養した。望まれる実験において、エフェクター細胞に添加する前に、標識化標的細胞を３７℃で３０分間ＭＡｂ  Ｗｂ／３２（抗ＭＨＣクラスＩ）と共にインキュベーションした。この上清を、ガンマカウンターにおいて５１Ｃｒ放出についてアッセイした。５１Ｃｒの自発的な放出を、エフェクターの非存在下での標的のインキュベーションによってアッセイし、一方で、総５１Ｃｒ放出の最大値を、０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００における標的のインキュベーションによって決定した。特異的な５１Ｃｒ放出のパーセントを以下の式によって決定した：特異的な放出のパーセント＝［（実験での放出値−自発的な放出値）／（最大値−自発的な放出値）］×１００。
【０１００】
（結果）
（ヒト乳房腫瘍／ＤＣ融合の表現型）
ヒトＤＣが、腫瘍細胞と共にヘテロカリオンの産生に使用され得るかどうかを決定するために、転移性乳癌を患う患者のＰＢＭＣ由来のＤＣを調製した。ＤＣを、ヒトＭＣＦ−７乳癌腫細胞に最初に融合した。二次元フローサイトメトリーは、ＭＨＣクラスＩＩ、Ｂ７−１、Ｂ７−２またはＩＣＡＭではなく、ＭＵＣ１癌腫関連抗原およびＭＨＣクラスＩを発現することを実証した。反対に、ＤＣは、ＭＵＣ１ではなく、ＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩならびに同時刺激分子を発現した。ＭＣＦ−７細胞およびＤＣの融合後、得られたヘトロカリオンは、ＭＵＣ１およびＭＨＣクラスＩＩを同時発現した。Ｂ７−１、Ｂ７−２およびＩＣＡＭを伴うＭＵＣ１の同時発現の類似の発現パターンは、融合細胞において観察された。これらの知見は、乳癌細胞／ＤＣ融合細胞の産生の可能性があることを示すので、ヒト乳癌細胞を、これらとのＤＣ融合細胞を作製する目的のために原発性腫瘍または転移性腫瘍を患う患者から単離した。短期間培養物の免疫染色は、乳癌細胞がＭＵＣ１およびサイトケラチン（ＣＴ）を発現することを実証した。乳房腫瘍細胞は、ＭＨＣクラスＩＩ、同時刺激分子または接着分子の検出可能な発現を有しなかった。７日間の培養後、腫瘍細胞を、自己ＤＣと融合した。自己ＤＣと腫瘍細胞との融合は、ＭＵＣ１およびＭＨＣクラスＩＩの両方またはサイトケラチンおよびＭＨＣクラスＩＩの両方を発現したヘテロカリオンの産生を生じた。二次元フローサイトメトリーによる分析は、乳房腫瘍細胞（ＢＴ）が、ＭＨＣクラスＩＩではなく、ＭＵＣ１を発現し、一方で自己ＤＣが、ＭＵＣ１ではなくＭＨＣクラスＩＩを発現するということを実証した。反対に、４０％を超える融合細胞（ＤＣ／ＢＴ）が、ＭＵＣ１とＭＨＣクラスＩＩの両方を発現した。組織化学染色および二次元フローサイトメトリーによる同様の結果は、凝集せずに融合細胞が存在することをさらに示した。両方の方法による評価として、６人の別々の乳癌患者から調製された自己融合の効率は、３０〜５０％の腫瘍細胞集団の範囲にあった。
【０１０１】
（乳房腫瘍／ＤＣ融合の機能）
自己融合細胞が、自己Ｔ細胞の刺激において効果的かどうかを決定するために、ヘトロカリオンを、非接着ＰＢＭＣから単離されたＴ細胞と共培養した。コントロールとして、Ｔ細胞をまた、自己腫瘍細胞と共に共培養した。自己腫瘍に対するＴ細胞応答の証拠はなかったが、融合細胞は、Ｔ細胞増殖およびＴ細胞／融合細胞クラスターの形成を刺激した。この応答の特異性を評価するために、自己Ｔ細胞を、ＤＣ、照射された腫瘍融合細胞、非融合ＤＣおよび乳房腫瘍細胞の混合物、またはＤＣ−腫瘍融合細胞と共にインキュベーションした。自己ＤＣ、腫瘍または２つの細胞型によるＴ細胞刺激はたとえあったとしてもわずかであった。さらなるコントロールとして、自己Ｔ細胞は、ＤＣ／腫瘍融合細胞で得られた応答と比較して、ＰＲＧ処置ＤＣまたは単球に融合されたＤＣに対する応答はたとえあったとしてもわずかであることを示した。これらの知見は、乳房腫瘍細胞およびＤＣの融合が、特異的なＴ細胞の刺激を生じることを実証する。
【０１０２】
（ヒト乳房腫瘍に対するＣＴＬの産生）
腫瘍特異的ＣＴＬの誘導を評価するために、Ｔ細胞を１０日間刺激し、次いで、自己腫瘍細胞の溶解を評価するために単離した。自己ＤＣと共にインキュベーションされたＴ細胞、照射された乳房腫瘍細胞または両方の非融合混合物は、低いレベルの自己乳房腫瘍細胞溶解を示した。有意に、融合細胞で刺激されたＴ細胞は、自己腫瘍の細胞傷害性の誘導に効果的であった。同様の結果を、自己ＤＣ／乳房腫瘍細胞融合で刺激された３人の乳癌の患者由来のＴ細胞によって得た。さらに、自己乳房腫瘍細胞と共培養した非刺激Ｔ細胞は、有意な腫瘍細胞の死滅の媒介に失敗した。融合細胞とのインキュベーションによって産生されたＣＴＬの特異性を規定するために、発明者らは、自己腫瘍と他の細胞型を溶解する能力を比較した。図７Ａにおける２つのグラフは、２人の個々の患者由来の細胞から得られたデータを示す。自己乳房腫瘍細胞または単球との融合刺激Ｔ細胞のインキュベーションは、腫瘍細胞の溶解の選択性を実証した。さらに、自己融合細胞で刺激されたＴ細胞は、自己乳房腫瘍細胞の有意な溶解を実証したが、ＭＣＦ−７細胞、原発性卵巣癌細胞およびＮＫ−感受性Ｋ５６２の溶解は、自己単球から得られた結果と同様であった。ＭＨＣクラスＩに対して特異的な抗体と標的のプレインキュベーションが、自己乳房腫瘍細胞溶解の抑止を生じるという知見は、死滅が、ＭＨＣクラスＩによって制限されたことを示した。反対に、ＭＨＣクラスＩに対して特異的な抗体は、たとえ他の細胞型の溶解に効果があってもわずかであった。ヒト樹状細胞および卵巣癌細胞の融合によって腫瘍特異的ＣＴＬは、活性化された。
【０１０３】
（材料および方法）
（末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の単離）
単核細胞を、卵巣癌患者および正常ドナーの末梢血からＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心によって単離した。ＰＢＭＣを１％の自己血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地で１時間培養した。非接着細胞を除去し、そしてＴ細胞をナイロンウール分離によって精製した。接着細胞を、１％の自己血清、１０００Ｕ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦ（Ｇｅｎｚｙｍｅ）および５００Ｕ／ｍｌのＩＬ−４（Ｇｅｎｚｙｍｅ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地中で１週間培養した。ＤＣを非接着細胞および緩く接着している細胞から回収した。固く接着している単球をトリプシンで処理した後に回収した。
【０１０４】
（卵巣癌細胞の調製および融合）
卵巣癌（ＯＶＣＡ）細胞を原発性腫瘍から入手し、そして悪性腹水を１ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼ、０．１ｍｇ／ｍｌのヒアルロニダーゼおよび１ｍｇ／ｍｌのＤＮａｓｅを含むＨａｎｋの平衡塩類溶液（Ｃａ＋＋／Ｍｇ＋＋を含まない）中の他の細胞と非細胞性成分とを分離した。この細胞を、融合するまで１０％の非動化自己ヒト血清、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１００ｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充されたＲＰＭＩ１６４０培養培地中で培養した。自己ＤＣまたは同種異系ＤＣを、５０％のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む無血清ＲＰＭＩ１６４０培地に１０：１の比でＯＶＣＡと共に５分間インキュベーションした。次いで、ＲＰＭＩ１６４０培養培地を、ゆっくり添加してＰＥＧを希釈した。洗浄後、この細胞を１０％の自己血清および５００Ｕ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦを補充されたＲＰＭＩ１６４０培地中に７−１４日間懸濁した。
【０１０５】
（表現型分析）
細胞を、ヒトＤＦ３／ＭＵＣ１（ＭＡｂ  ＤＦ３）（Ｋｕｆｅら，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ３：２２３−２３２，１９８４），ヒトＣＡ−１２５（ＭＡｂ  ＯＣ−１２５）（Ｂａｓｔら，Ｎ  Ｅｎｇｌ．Ｊ  Ｍｅｄ  ３０９（１５）：８８３−８８７，１９８３），ヒトＭＨＣクラスＩ（Ｗ６／３２），ヒトＭＨＣクラスＩＩ（ＲＬＡ−ＤＲ），クラスＢ７−１（ＣＤ８０），ヒトＢ７−２（ＣＤ８６），ヒトＩＣＡＭ（ＣＤ５４；Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）およびヒトＣＤ８３  （Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）に対して指向するマウスモノクローナル抗体（Ｍａｂ）と共に氷上で１時間インキュベーションした。ＰＢＳで洗浄した後、この細胞を、マウスＩｇＧに特異的なフルオレッセイン結合化ヤギ抗体と共に３０分間インキュベーションした。二重発現分析として、細胞をＭａｂ  ＯＣ−１２５と共にインキュベーションし、洗浄し、次いでＭＨＣクラスＩＩ、Ｂ７−２またはＣＤ８３に特異的なフィコエリトリン結合化抗体と共に４℃で１時間インキュベーションした。サンプルを洗浄し、２％のパラホルムアルデヒドで固定し、そしてＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）によって分析した。
【０１０６】
（免疫組織化学染色）
サイトスピン細胞調製物を、アセトンで固定し、そしてＭａｂ  ＯＣ−１２５と共に室温で３０分間インキュベーションした。このスライドを、マウスＩｇＧに対して特異的なビオチン化ウマ抗体と共にさらに３０分間インキュベーションした。染色（赤色）をＡＢＣ溶液（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）によって達成した。次いで、このスライドを、ヒトＭＨＣクラスＩＩに特異的なマウス抗体と共に３０分間インキュベーションし、その後アルカリホスファターゼ標識化抗マウスＩｇＯとインキュベーションした。ＡＰ−ＡＢＣ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用して、青色の対比染色をした。
【０１０７】
（Ｔ細胞増殖アッセイ）
細胞を３０Ｇｙイオン化照射に曝露し、そして５日間９６ウェルの平底プレートに加えた。Ｔ細胞による［３Ｈ］−チミジンの取り込みを、１Ｃｉ／ウェルの存在下で１２時間のインキュベーション後に測定した。
【０１０８】
（細胞傷害性アッセイ）
Ｔ細胞を、２０Ｕ／ｍｌのＨｕＬＬ−２の存在下において望ましい細胞調製物で１週間刺激した。このＴ細胞を、ナイロンウール分離によって回収し、そしてＣＴＬアッセイにおいてエフェクター細胞を使用した。自己ＯＶＣＡ細胞、同種異系ＯＶＣＡ細胞、自己単球、ＭＣＦ−７乳癌細胞およびＫ５６２細胞を、５１Ｃｒを用いて３７℃で６０分間標識化した。洗浄後、標的（２×１０４）をＴ細胞と共に３７℃で５時間培養した。特定の実験において、標識化標的細胞を、エフェクター細胞を添加する前に、ＭＡｂ  Ｗ６／３２（抗ＭＨＣクラスＩ）と共に３７℃で３０分間インキュベーションした。上清をガンマカウンターにおいて５１Ｃｒの放出をアッセイした。５１Ｃｒの自発的な放出をエフェクターの非存在下で標的のインキュベーションによってアッセイした。総５１Ｃｒ放出の最大値を０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００中の標的のインキュベーションによって決定した。特異的な５１Ｃｒ放出のパーセントを以下の式によって決定した：特異的な放出のパーセント＝［（実験での放出値−自発的な放出値）／（最大値−自発的な放出値）］×１００。
【０１０９】
（結果）
（自己ＤＣおよび同種異系ＤＣと融合した卵巣癌腫（ＯＶＣＡ）の特徴付け）
ＤＣを転移性の卵巣癌の患者および正常なボランティアから産生した。接着細胞をＰＢＭＣから単離し、そしてＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４の存在下で１週間培養した。この得られた集団について、ＦＡＣＳ分析を行なった。このＤＣは、ＤＦ３／ＭＵＣ１またはＣＡ−１２５癌腫関連抗原ではなく、ＭＨＣクラスＩクラスＩＩ、同時刺激性分子、ＣＤ８３およびＩＣＡＭの発現を伴う特徴的な表現型を示した。反対に、転移性の卵巣癌を有する患者から単離されたＯＶＣＡ５細胞は、ＭＨＣクラスＩＩ、Ｂ７−１、Ｂ７−２、またはＣＤ８３ではなく、ＭＵＣ１、ＣＡ−１２５、ＭＨＣクラスＩおよびＩＣＡＭを発現した。同様の結果を、原発性卵巣腫瘍からおよび悪性腹水から得られたＯＶＣＡ細胞から得た。自己ＤＣ（ＯＶＣＡ／ＦＣ）とＯＶＣＡ細胞との融合は、ＣＡ−１２５およびＭＵＣ１抗原、ＭＨＣクラスＩＩ、Ｂ７−１、Ｂ７−２ならびにＣＤ８３を発現するヘトロカリオン（ＯＶＣＡ／ＦＣ）の産生を生じる。
【０１１０】
さらに、抗原発現のパターンは、ＯＶＣＡ細胞が自己ＤＣと融合した場合と類似していた。免疫染色は、ＭＨＣクラスＩＩを発現したＤＣおよびＣＡ−１２５を発現しないＤＣとで一致した。反対に、ＯＶＣＡ細胞はＭＨＣクラスＩＩを発現せずにＣＡ−１２５を発現した。融合細胞（ＯＶＣＡ／ＦＣ）の分析は、両方の抗原の発現を実証した。
【０１１１】
２次元フローサイトメトリーを使用して、融合の効率を評価した。ＤＣと反対に、ＯＶＣＡ細胞は、ＭＨＣクラスＩＩ、Ｂ７−２またはＣＤ８３ではなく、ＣＡ−１２５を発現した。自己ＤＣと融合したＯＶＣＡ細胞の分析は、３２．６％の集団が、ＣＡ−１２５とＭＨＣクラスＩＩの両方を発現したことを実証した。ＣＡ−１２５およびＢ７−２発現の評価は、３０％の自己ＯＶＣＡ／ＦＣが、両方の抗原を発現したことを実証した。さらに、１０．８％の自己ＯＶＣＡ／ＦＣ集団が、ＣＡ−１２５およびＣＤ８３を発現した。ＯＶＣＡ細胞および自己ＤＣの融合はまた、ＣＡ−１２５およびＭＢＣクラスＩＩ、Ｂ７−２またはＣＤ８３を同時発現する細胞を生じた。これらの知見は、ＯＶＣＡ細胞と自己ＤＣまたは同種異系ＤＣとの融合によるヘトロカリオンの形成を実証する。
【０１１２】
（自己ＯＶＣＡ／ＦＣによる抗腫瘍ＣＴＬの刺激）
ＯＶＣＡ／ＦＣの機能を評価するために、融合細胞を、自己ＰＢＭＣと共培養した。この実験を、３人の個々の患者由来の細胞で実施し、そして図１０Ｂにおけるそれぞれの３つのグラフは、患者の１人由来の細胞から得られたデータを示す。コントロールとして、ＰＢＭＣはまた、自己ＯＶＣＡ細胞と共に培養した。この融合細胞（腫瘍細胞ではなく）は、Ｔ細胞クラスターの形成を刺激した。１０日間の刺激の後、このＴ細胞を、細胞傷害性活性の評価のために単離した。標的として自己ＯＶＣＡ細胞を使用し、自己ＤＣ、同種異系腫瘍または非融合ＤＣおよび腫瘍の混合物と共にインキュベーションしたＴ細胞をアッセイした場合、低いレベルの溶解であった。反対に、ＯＶＣＡ／ＦＣで刺激したＴ細胞は、自己腫瘍標的の溶解を誘導において効果的であった。同様の結果を、卵巣癌の３人の患者由来のＴ細胞から得た。コントロールとして、自己単球（ＯＶＣＡ／ＭＣ）に融合したＯＶＣＡ細胞または単球に融合したＤＣ（ＤＣ／ＭＣ）で刺激したＴ細胞は、抗腫瘍ＣＴＬ活性の刺激にわずかに効果を有した。
【０１１３】
（自己ＤＣに融合したＯＶＣＡ細胞による抗腫瘍ＣＴＬの産生）
融合を自己ＤＣと実施した場合のＯＶＣＡ／ＦＣ機能を評価するために、自己ＰＢＭＣを、自己ＤＣまたは同種異系ＤＣに融合したＯＶＣＡで刺激した。図１１Ａおよび図１１Ｂにおけるそれぞれの２つのグラフは、個々の患者由来の細胞から得られたデータを示す。コントロールとして、自己ＰＢＭＣをまた、非融合ＤＣまたはＯＶＣＡ細胞で刺激した。同種異系ＤＣとのＴ細胞のインキュベーションは、自己ＤＣで得られた刺激よりも大きな刺激と関連した。この結果はまた、Ｔ細胞増殖が、自己ＤＣと比較して、同種異系ＤＣに融合したＯＶＣＡによってより大きな程度で刺激されることを実証する。同様の知見が、２人の患者から得られたＴ細胞から得られた。１０日間の刺激の後、Ｔ細胞を単離しそして自己腫瘍の溶解を評価した。非融合同種異系ＤＣまたは自己ＤＣでの刺激は、たとえＯＶＣＡ細胞の存在下で刺激されたＴ細胞で得られた溶解機能と比較して溶解機能においてわずかな効果であった。反対に、同種異系ＤＣに融合したＯＶＣＡ細胞で刺激されたＴ細胞は、自己腫瘍の溶解を誘導した。さらに、両方の患者について、自己ＤＣまたは同種異系ＤＣに融合したＯＶＣＡ細胞で刺激したＴ細胞は、ＣＴＬ活性の誘導を示した。これらの知見は、自己ＣＴＬの抗腫瘍活性が、自己ＤＣまたは同種異系ＤＣと腫瘍細胞との融合によって刺激されることを実証する。
【０１１４】
（ＯＶＣＡ／ＦＣ刺激されたＣＴＬの特異性）
融合細胞によって誘導されたＣＴＬの特異性を評価するために、自己ＤＣに融合したＯＶＣＡ細胞で刺激したＴ細胞を、自己腫瘍、自己単球、ＭＣＦ−７乳癌細胞、同種異系ＯＶＣＡ細胞およびＮＫ−感受性Ｋ５６２細胞と共にインキュベーションした。図１２Ａおよび図１２Ｂに示されるデータを、ヒトＭＨＣクラスＩ分子に対するＭＡｂの非存在下（無地棒）または存在下（斜線棒）で実施されたＣＴＬアッセイ培養から得られた。自己腫瘍およびまたは単球を使用してＯＶＣＡ／ＦＣ刺激されたＴ細胞のインキュベーションは、腫瘍の選択的な溶解を実証した。さらに、これらのＣＴＬによるＭＣＦ−７、同種異系ＯＶＣＡまたはＫ５６２細胞の溶解は、有意ではなかった。抗ＭＨＣクラスＩ抗体との標的のプレインキュベーションは、自己ＯＶＣＡ細胞の溶解をブロックし、そして抗体の非存在下で他の細胞型について得られた溶解に対してわずかな効果を有した。同種異系ＤＣに融合された自己ＯＶＣＡ細胞で刺激されたＴ細胞はまた、自己腫瘍の選択的な溶解を実証した。さらに、自己腫瘍の溶解を、抗ＭＨＣクラスＩと標的のプレインキュベーションによって抑止され、それによってＣＴＬによる腫瘍の認識は、ＭＨＣクラスＩ分子によって制限されることを示した。
【０１１５】
（他の実施形態）
本発明は、本発明の詳細な記述の組み合わせにおいて記載されるが、前述の記述は、例示を意図し、添付される請求項の範囲によって規定される、本発明の範囲を限定しないことが理解される。他の局面、利点および改変は、以下の請求項の範囲内にある。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】
図１Ａは、ＤＣ、ＭＣ３８細胞（ＭＣ３８／ＭＵＣ１）、およびＤＣ細胞とＭＣ３８／ＭＵＣ１細胞との間の融合によって生成された融合細胞（ＦＣ／ＭＵＣ１）の表面上の示された抗原のフローサイトメトリー分析の結果を示すグラフである。
【図１Ｂ】
図１Ｂは、雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（１群あたり１０匹）における腫瘍発生率を示すグラフである。この雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、２×１０５ＭＣ３８／ＭＵＣ１細胞（白三角）、２×１０５ＭＣ３８／ＭＵＣ１細胞と混合された２×１０６ＤＣ（白丸）、２×１０５ＦＣ／ＭＵＣ１細胞（影付き丸）または５×１０５ＦＣ／ＭＵＣ１細胞（影付き四角）を用いて皮下注射された。腫瘍発生率（直径３ｍｍより大きい）は、注射後、示した日にモニタリングされた。同様の結果が３つの別々の実験において得られた。
【図１Ｃ】
図１Ｃは、混合された白血球反応における［３Ｈ］−チミジン取込み反応を示すグラフである。ＤＣ（白丸）、ＭＣ３８／ＭＵＣ１細胞（影付き丸）およびＦＣ／ＭＵＣ１細胞（白三角）は照射され（３０Ｇｙ）、そして１×１０５同種異系Ｂａｌｂ／ｃ  Ｔ細胞に示した割合において添加された。６時間のインキュベーションにおける［３Ｈ］−チミジン取り込みは、３つの測定の平均±ｓ．ｅ．ｍとして示される。同様の結果が３つの別々の実験において得られた。
【図２Ａ】
図２Ａは、腫瘍発生率パーセントの形式でＦＣ／ＭＵＣ１による抗腫瘍活性の誘導を示すグラフである。１０匹のマウスの群は、１４日ごとに２回、３×１０５ＤＣ（白丸）、３×１０５ＦＣ／ＭＵＣ１細胞（影付き丸）またはＰＢＳ（白四角）を皮下注射された。１４日後、このマウスは、２．５×１０５ＭＣ３８／ＭＵＣ１細胞で皮下チャレンジされた。直径が３ｍｍより大きな腫瘍は、ポジティブとしてスコア付けされた。同様の結果が３つの別々の実験において得られた。
【図２Ｂ】
図２Ｂは、細胞傷害性の形式でＦＣ／ＭＵＣ１による抗腫瘍活性の誘導を示すグラフである。マウスは、ＤＣ（白丸）で２回注射された。ＦＣ／ＭＵＣ１（影付き丸）またはＰＢＳ（白四角）は、２．５×１０５ＭＣ３８／ＭＵＣ１腫瘍細胞を用いてチャレンジされた。脾細胞はチャレンジから２０日後に単離され、そしてＭＣ３８／ＭＵＣ１標的細胞との示したエフェクター：標的比においてインキュベートされた。細胞傷害性Ｔリンパ球（「ＣＴＬ」）活性（平均＝ｓ．ｅ．ｍ．）は、４時間のＬＤＨ放出アッセイによって決定された。同様の結果が３つの別々の実験において得られた。
【図２Ｃ】
図２Ｃは、腫瘍発生率パーセントの形式でＦＣ／ＭＵＣ１による抗腫瘍活性の誘導を示すグラフである。マウス（１群あたり８匹）は、ＣＤ４＋（白四角）およびＣＤ８＋（影付き丸）細胞に対してｍＡｂｓを用いて１日おきに静脈内および腹腔内に注射され、ＦＣ／ＭＵＣ１を用いた２回の免疫化の初めの４日前に開始し、かつ５×１０５ＭＣ３８／ＭＵＣ１細胞でチャレンジする４日前まで続けた。ラットＩｇＧ（白丸）は、コントロールとして注射された。３ｍｍより大きい腫瘍はポジティブとしてスコア付けされた。同様の結果が３つの別々の実験において得られた。
【図２Ｄ】
図２Ｄは、細胞傷害性の形式でＦＣ／ＭＵＣ１による抗腫瘍活性の誘導を示すグラフである。マウスは、上記のように、ＦＣ／ＭＵＣ１で免疫化されたＣＤ４＋（白四角）およびＣＤ８＋（影付き丸）またはラットＩｇＧ（白丸）に対してｍＡｂｓを用いて処置され、次いでＭＣ３８／ＭＵＣ１細胞でチャレンジされた。脾細胞は、腫瘍チャレンジの２０日後に収集され、そしてＭＣ３８／ＭＵＣ１細胞でインキュベートされた。ＣＴＬ活性（平均±ｓ．ｅ．ｍ．）は、４時間のＬＤＨ放出アッセイによって決定された。同様の結果が３つの別々の実験において得られた。
【図３Ａ】
図３Ａは、ＦＣ／ＭＵＣ１での免疫化の後、ＭＣ３８／ＭＵＣ１肺転移の予防を示すグラフである。１０匹のマウスの群は、ＦＣ／ＭＵＣ１細胞またはＰＢＳで２回注射され、次いで１４日後に、１×１０６ＭＣ３８／ＭＵＣ１細胞の静脈内投与でチャレンジされた。これらのマウスは、チャレンジの２８日後に屠殺された。肺転移は、インドインク（Ｉｎｄｉａ  ｉｎｋ）を用いて肺を染色した後、数えられた（Ｗｅｘｌｅｒ，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．３６：６４１〜６４３，１９６６）。
【図３Ｂ】
図３Ｂは、ＦＣ／ＭＵＣ１での免疫化後の、ＭＣ３８／ＭＵＣ１肺転移の処置を示すグラフである。１０匹のマウスの群は、１×１０６ＭＣ３８／ＭＵＣ１細胞またはＭＣ３８細胞を用いて静脈内注射された。これらのマウスは、腫瘍チャレンジの４日および１８日後に１×１０６ＦＣ／ＭＵＣ１またはＦＣ／ＭＣ３８で免疫化され、次いでさらに１０日後屠殺された。肺転移は、各マウスについて数えられた。同様の結果が２つの別々の実験において得られた（ＦＣ／ＭＵＣ１を用いて処置した１０／１０マウスは、第二実験において肺転移を有さなかった）。
【図４Ａ】
図４Ａは、ＭＣＦ−７乳癌細胞、ヒト樹状細胞および融合ＤＣ／ＭＣＦ−７細胞のＭＵＣ１およびＭＨＣクラスＩＩの発現を示す一連の二次元フローサイトメトリーヒストグラムである。
【図４Ｂ】
図４Ｂは、一次ヒト乳癌細胞におけるＭＵＣ１（左上）およびサイトケラチン（ＣＴ）（左下）の発現、ならびにＭＵＣ１およびＭＥＣクラスＩＩ（右上）ならびにヒトＤＣ／一次乳癌融合細胞におけるサイトケラチンおよびＭＨＣクラスＩＩ（右下）の発現を示す一連の顕微鏡写真である。
【図４Ｃ】
図４Ｃは、一次ヒト乳癌細胞（ＢＴ）、自己ヒト樹状細胞（ＤＣ）およびＢＴ／ＤＣ融合細胞におけるＭＨＣクラスＩＩおよびＭＵＣ１の発現を示す一連の二次元フローサイトメトリーヒストグラムである。
【図５Ａ】
図５Ａは、ＢＴ細胞（左）のみでなくＢＴ／ＤＣ融合細胞周囲の自己Ｔ細胞（右）のクラスター形成を示す１対の顕微鏡写真である。
【図５Ｂ】
図５Ｂは、ＤＣ（白丸）、自己ＢＴ細胞（白四角）、自己ＤＣと混合された自己ＢＴ細胞（影付き四角）または刺激性細胞に対するＴ細胞の示した割合における自己ＢＴ／ＤＣ融合細胞（影付き丸）での刺激に対するＴ細胞の増殖を示す線グラフである。
【図５Ｃ】
図５Ｃは、ＰＥＧ処置自己ＤＣ（白三角）、単球に融合された自己ＤＣ（影付き三角）または自己ＢＴ／ＤＣ融合細胞（白丸）による刺激に対するＴ細胞の増殖を示す線グラフである。
【図６Ａ】
図６Ａは、ヒトＩＬ−２の存在下で、自己ＤＣ，自己ＢＴ細胞、自己ＢＴ細胞と混合された自己ＤＣ（ＤＣ＋ＢＴ）または自己ＤＣ／ＢＴ融合細胞を用いて刺激されたＴ細胞による、自己ＢＴ標的細胞の細胞融解を示す棒グラフである。
【図６Ｂ】
図６Ｂは、３人の異なる乳癌患者由来の細胞を用いて得られたデータを示す３つの線グラフのセットである。このグラフは、自己ＢＴ細胞（白丸）またはＤＣ／ＢＴ融合細胞（影付き丸）のいずれかを用いて刺激されたＴ細胞による、自己ＢＴ標的細胞の細胞融解を示す。
【図７Ａ】
図７Ａは、２人の異なる乳癌患者由来の細胞を用いて得られたデータを示す１対の棒グラフである。このグラフは、自己ＢＴ細胞または自己ＤＣ／ＢＴ融合細胞を用いて刺激されたＴ細胞による自己単球（ＭＶ）の細胞融解を示す。
【図７Ｂ】
図７Ｂは、ヒトＭＨＣクラスＩ分子に対して特異的な抗体、自己ＢＴ細胞、自己ＭＣ、ＭＣＦ−７乳癌細胞、卵巣癌細胞（ＯＶＣＡ）および自己ＤＣ／ＢＴ融合細胞を用いて刺激されたＴ細胞によるＫ５６２細胞の非存在下（ベタ塗り棒）および存在下（斜線棒）での細胞融解を示す棒グラフである。
【図８Ａ】
図８Ａは、ヒトＤＣ、卵巣癌細胞（ＯＶＣＡ）およびＯＶＣＡ／ＤＣ融合細胞（ＯＶＣＡ／ＦＣ）上の種々の細胞表面分子の発現を示す一連のフローサイトメトリーヒストグラムである。
【図８Ｂ】
図８Ｂは、ＤＣ．ＯＶＣＡおよびＯＶＣＡ／ＤＣ融合細胞（ＯＶＣＡ／ＦＣ）におけるＨＬＡ−ＤＲ（ＭＨＣクラスＩＩ）の発現を示す一連の顕微鏡写真である。
【図９】
図９は、ＣＡ−１２５（ＯＣ−１２５）、ＭＨＣクラスＩＩ（ＭＨＣ  ＩＩ）、Ｂ７−２およびＤＣ．ＯＶＣＡ上のＣＤ３８、ＯＶＣＡ細胞、自己ＯＶＣＡ／ＤＣ融合細胞（自己ＯＶＣＡ／ＦＣ）ならびに同種異系ＯＶＣＡ／ＤＣ融合細胞（同種異系ＯＶＣＡ／ＦＣ）の発現を示す一連の二次元フローサイトメトリーヒストグラムである。
【図１０Ａ】
図１０Ａは、ＯＶＣＡ細胞（左）のみならずＯＶＣＡ／Ｄ融合細胞Ｃ（ＯＶＣＡ／ＦＣ）（右）の周囲の自己Ｔ細胞のクラスター形成を示す、１対の顕微鏡写真である。
【図１０Ｂ】
図１０Ｂは、３人の異なる卵巣癌患者由来の細胞を用いて得られたデータを示す３つの線グラフのセットである。このグラフは、自己ＤＣ（白丸）、自己ＯＶＣＡ細胞（白四角）、ＤＣと混合されたＯＶＣＡ細胞（白三角）、またはＯＶＣＡ／ＤＣ細胞（影付き丸）のいずれかを用いて刺激されたＴ細胞による自己ＯＶＣＡ標的細胞の細胞融解を示す。
【図１０Ｃ】
図１０Ｃは、自己ＤＣ（白丸）、自己ＯＶＣＡ細胞、自己ＯＶＣＡ／ＤＣ融合細胞（ＯＶＣＡ／ＦＣ）、自己単球（ＭＣ）、自己ＤＣに融合された自己単球（ＤＣ／ＭＣ）または自己単球に融合された自己ＯＶＣＡ細胞のいずれかを用いて刺激されたＴ細胞による自己ＯＶＣＡ標的細胞の細胞融解を示す棒グラフである。
【図１１Ａ】
図１１Ａは、２人の異なる乳癌患者由来の細胞を用いて得られたデータを示す１対の棒グラフである。このグラフは、自己または同種異系ＤＣ（ベタ塗り棒）、あるいは自己または同種異系ＤＣを用いて自己ＯＶＣＡ細胞を融合することによって産生されるＯＶＡＣ／ＤＣ融合細胞（斜線棒）を用いて刺激されたＴ細胞の増殖性応答を示す。
【図１１Ｂ】
図１１Ｂは、２人の異なる乳癌患者由来の細胞を用いて得られたデータを示す１対の棒グラフである。このグラフは、自己または同種異系ＤＣ（ベタ塗り棒）、自己または同種異系ＤＣを有する自己ＯＶＣＡ細胞の融合によって産生されたＯＶＡＣ／ＤＣ融合細胞（斜線棒）または自己ＯＶＣＡ細胞を用いて刺激されたＴ細胞による自己ＯＶＣＡ細胞の細胞融解を示す。
【図１２Ａ】
図１２Ａは、ヒトＭＨＣクラスＩ分子に対して特異的な抗体、自己ＯＶＣＡ細胞、自己単球（ＭＣ）、ＭＣＦ−７乳癌細胞、同種異系卵巣癌細胞（Ａｌｌｏ−ＯＶＣＡ）および自己ＯＶＣＡ／ＤＣ融合細胞を用いて刺激されたＴ細胞によるＫ５６２細胞の非存在下（ベタ塗り棒）および存在下（斜線棒）における、細胞融解を示す棒グラフである。
【図１２Ｂ】
図１２Ｂは、ヒトＭＨＣクラスＩ分子に対して特異的な抗体、自己ＯＶＣＡ細胞、自己単球（ＭＣ）、ＭＣＦ−７乳癌細胞、同種異系卵巣癌細胞（Ａｌｌｏ−ＯＶＣＡ）および同種異系ＯＶＣＡ／ＤＣ融合細胞を用いて刺激されたＴ細胞によるＫ５６２細胞の非存在下（ベタ塗り棒）および存在下（斜線棒）における、細胞融解を示す棒グラフである。