【誤訳訂正書】
【提出日】平成24年5月2日(2012.5.2)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
最高でも長さが１００ヌクレオチドである、短い長さのＲＮＡの定量測定のための方法であって、
ａ）前記の短い長さのＲＮＡを含むサンプルから、１）前記の短い長さのＲＮＡの配列からなる一本鎖標的配列、および２）５’および／または３’隣接ヌクレオチド配列からなる鋳型ポリヌクレオチドを調製すること、ここで、該５’および／または３’隣接ヌクレオチド配列は、単一のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドである、
ｂ）逆転写またはヌクレオチド重合において前記鋳型ポリヌクレオチドを使用して、ｃＤＮＡの鎖を得ること、および
ｃ）鋳型として前記ｃＤＮＡを含み、鋳型ポリヌクレオチドを含んでいてもよい、定量リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を実施すること、
を含み、
ここで、
1)ステップ（ｃ）においてｑＰＣＲのために使用されるプライマーが、
−少なくとも２つのオリゴヌクレオチド、ここで、前記オリゴヌクレオチドの少なくとも１つは、５’または３’隣接ヌクレオチド配列中の配列に相当する、あるいはこの配列と相補的である、および、
−少なくとも２つのオリゴヌクレオチド、ここで、前記オリゴヌクレオチドの少なくとも１つは、一本鎖標的配列の部分と、隣接する５’または３’ヌクレオチド配列の部分とによって構成される、鋳型ポリヌクレオチド中の連続する配列に相当する、あるいは、この配列と相補的である、
から選択される、 
または、
2)ステップ（ｂ）における反応が、一本鎖標的配列の部分と、隣接する５’または３’ヌクレオチド配列の部分とによって構成される、鋳型ポリヌクレオチド内の連続する配列に相当するあるいはこの配列に相補的である、逆転写プライマーまたはＤＮＡ重合プライマーを利用する、
短い長さのＲＮＡの定量測定のための方法。
【請求項２】
ステップ (c)においてｑＰＣＲのために使用されるプライマーが、
−少なくとも２つのオリゴヌクレオチド、ここで、前記オリゴヌクレオチドの少なくとも１つは、５’または３’隣接ヌクレオチド配列中の配列に相当する、あるいはこの配列と相補的である、
−少なくとも２つのオリゴヌクレオチド、ここで、前記オリゴヌクレオチドの少なくとも１つは、一本鎖標的配列の部分と、隣接する５’または３’ヌクレオチド配列の部分とによって構成される、鋳型ポリヌクレオチド中の連続する配列に相当する、あるいは、この配列と相補的である、および、
-少なくとも２つのオリゴヌクレオチド、ここで、１つは、一本鎖標的配列内の第１のヌクレオチド配列に相当し、もう１つは、一本鎖標的配列内の第２のヌクレオチド配列と相補的である、
から選択され、ｑＰＣＲのために使用される前記プライマーが、それぞれ独立に、検出可能な標識を含んでいてもよい、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップ（ｂ）における反応が、一本鎖標的配列に相当するあるいはこの配列に相補的である、あるいは、一本鎖標的配列の部分と、隣接する５’または３’ヌクレオチド配列の部分とによって構成される、鋳型ポリヌクレオチド内の連続する配列に相当するあるいはこの配列に相補的である、逆転写プライマーまたはＤＮＡ重合プライマーを利用する、請求項１または２の方法。
【請求項４】
前記逆転写プライマーまたはヌクレオチド重合プライマーが、少なくとも１つの短い長さのＲＮＡに対して特異的である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
一本鎖標的配列と、５’および／または３’隣接ヌクレオチド配列とが、共有結合的に結合される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
一本鎖標的配列と、５’および／または３’隣接ヌクレオチド配列とが、非共有結合的に結合される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
５’および／または３’隣接ヌクレオチド配列が、検出可能な標識を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
５’および／または３’隣接ヌクレオチド配列が、酵素反応によって一本鎖標的配列に結合される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
５’および／または３’隣接ヌクレオチド配列が、非酵素的な反応によって一本鎖標的配列に結合される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
５’および／または３’隣接ヌクレオチド配列が、サンプルＲＮＡが得られる生物中に天然には存在しない、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
５’および／または３’隣接ヌクレオチド配列が、非哺乳類のものである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
ステップ（ａ）が、５’および／または３’隣接ヌクレオチド配列の、短い長さのＲＮＡへの連結による鋳型ポリヌクレオチドの調製を含む、あるいはステップ（ａ）が、５’および／または３’隣接ヌクレオチド配列を、ターミナルトランスフェラーゼ反応において、短い長さのＲＮＡに連結することによる鋳型ポリヌクレオチドの調製を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
ターミナルトランスフェラーゼ反応がポリ−Ａトランスフェラーゼ反応である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
連結が、オーバーハングライゲーションおよび平滑末端ライゲーションから選択される、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
連結が、オーバーハングライゲーションである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
小さいＲＮＡ分子のリガーゼ反応性の末端に直接隣接する５’または３’隣接ヌクレオチド配列のリガーゼ反応性の末端が、オーバーハングライゲーションを可能にするように配置されるように、５’または３’隣接ヌクレオチド配列のリガーゼ反応性の末端と部分的に相補的であり、短い長さのＲＮＡ分子のリガーゼ反応性の末端と部分的に相補的であるオリゴヌクレオチドの、短い長さのＲＮＡへのアニーリングを含む、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
サンプル中のすべてのＲＮＡが、連結またはターミナルトランスフェラーゼ反応にかけられる、請求項１２〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
連結またはターミナルトランスフェラーゼ反応が、標的配列の３’末端のみで実施される、請求項１２〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
標的配列の５’末端への連結が、連結反応の前に、標的配列の５’末端をリン酸化することによって実施される、請求項１２〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
連結の前に、５’隣接ヌクレオチド配列が、その５’末端でブロックされ、３’隣接ヌクレオチド配列が、その３’末端でブロックされる、請求項１２〜１９のいずれか一項の方法。
【請求項２１】
５’および／または３’隣接ヌクレオチド配列が、規定されたプロセッシング状態の、ステップ（ａ）における前記短い長さのＲＮＡと優先的または独占的に結合される、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＲＮＡの規定されたプロセッシング状態が、成熟した状態である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
ステップ（ｂ）が、ｃＤＮＡを得るための鋳型ポリヌクレオチドの逆転写を含む、請求項１２〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
ステップ（ａ）が、隣接するヌクレオチド配列を付着するためのヌクレオチド重合のステップを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
重合が、鋳型に依存しないポリメラーゼおよび鋳型に依存するポリメラーゼからなる群から選択されるポリメラーゼによって達成される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
ポリメラーゼがＤＮＡポリメラーゼである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
重合が、標的配列の３’末端へのポリ−Ａ、ポリ−Ｇ、ポリ−Ｔ、またはポリ−Ｃテールの付加にある、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
ステップ（ａ）が、以下のステップ
−その５’末端が短い長さのＲＮＡの３’末端と相補的であるオリゴヌクレオチド捕捉プローブに、短い長さのＲＮＡの３’末端をアニーリングするステップと、
−鋳型ポリヌクレオチドを構成する伸長された短い長さのＲＮＡ分子を得るために、鋳型としてオリゴヌクレオチド捕捉プローブを使用するヌクレオチド重合によって、短い長さのＲＮＡを伸長するステップと、
による鋳型ポリヌクレオチドの調製を含む、請求項２４〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
ヌクレオチド重合が、鋳型ポリヌクレオチドを構成するＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを得るためにＤＮＡ重合を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
ステップ（ｂ）が、（Ｉ）ｃＤＮＡを得るために、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド鎖を逆転写させることを含む、請求項２８または２９に記載の方法。
【請求項３１】
（Ｉ）ｃＤＮＡを得るために、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド鎖を逆転写させることが、オリゴヌクレオチド捕捉プローブにアニーリングしていない材料の除去の後に行われる請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
逆転写におけるプライマーが、オリゴヌクレオチド捕捉プローブまたは別の逆転写プライマーである、請求項３０または３１に記載の方法。
【請求項３３】
ステップ（ａ）が、
−その３’末端が短い長さのＲＮＡの５’と相補的でありその５’末端が５’隣接ヌクレオチド配列を含む、オリゴヌクレオチド捕捉プローブに、短い長さのＲＮＡの５’末端をアニーリングするステップと、
−鋳型ポリヌクレオチドを構成する伸長された捕捉プローブを得るために、鋳型として短い長さのＲＮＡを使用する逆転写によって捕捉プローブを伸長するステップと、
による鋳型ポリヌクレオチドの調製を含む、請求項２４〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
ステップ（ｂ）が、短い長さのＲＮＡが、伸長された捕捉プローブから除去され、捕捉プローブが、３’隣接ヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を含むヘルパーオリゴヌクレオチドに、その３’末端でアニーリング可能にされ、捕捉プローブが、ｃＤＮＡを得るために、鋳型としてヘルパーオリゴヌクレオチドを使用するＤＮＡ重合によって、５’→３’方向にさらに伸長されることを含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
捕捉オリゴヌクレオチドが、固体支持体上への固定化を可能にする部分を含有する、請求項２８〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
非アニーリング材料の除去を可能にするために、捕捉プローブが、アニーリングの後に固定される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
ステップ（ａ）におけるサンプルが、短い長さのＲＮＡについて富化される、請求項１〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
ステップ（ｃ）が、改変されたヌクレオチドを含む検出プローブの使用を含む、請求項１〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
改変されたヌクレオチドが、ＬＮＡヌクレオチドである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
ＬＮＡヌクレオチドが、オキシ-ＬＮＡ、アルファ-ＬＮＡおよび/またはキシロＬＮＡヌクレオチドから選択される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
検出プローブが、短い長さのＲＮＡ内の配列に相当する、あるいはこの配列に相補的である、請求項３８または３９に記載の方法。
【請求項４２】
６〜３０ヌクレオチドの検出プローブが１〜８のＬＮＡヌクレオチドを含む請求項３８〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
検出プローブが少なくとも２つのＬＮＡヌクレオチドを含み、それらが連続的であっても、１以上の非ＬＮＡヌクレオチドによって分離されていてもよい、請求項３８〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
検出プローブの長さが２０ヌクレオチド未満である、請求項３８〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
検出プローブの長さが１５ヌクレオチド未満である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
検出プローブの長さが７〜１１ヌクレオチドである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
検出プローブが、検出プローブの標的配列へのハイブリダイゼーションが起こった場合に、シグナルを生成する、あるいは、シグナルの変化を生成する、互いに相互作用する標識の対を含んでいる、請求項３８〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
ヌクレオチドからの蛍光シグナルの上昇により、ハイブリダイズした状態のプローブがハイブリダイズしていない状態のプローブから識別できるように配置した、フルオロフォア部分およびクエンチャー部分を検出プローブが含んでいる、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
逆転写あるいはＤＮＡ重合に使用されるプライマーが、改変されたヌクレオチドを含む、請求項１〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
改変されたヌクレオチドが、ＬＮＡヌクレオチドである、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
ステップ（ｃ）におけるｑＰＣＲで使用される少なくとも１つのプライマーが、ステップ（ｂ）の逆転写またはヌクレオチド重合で使用されるプライマーによって構成される、請求項１〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
標的ヌクレオチド配列が、マイクロRNA配列である、請求項１〜５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
標的ヌクレオチド配列が、成熟したマイクロRNA配列である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
-すべてのマイクロRNA標的分子にポリＡヌクレオチドテイルが付加されるように、サイズが２００ヌクレオチド未満のRNAのみを含むトータルRNAサンプルまたはRNAサンプル画分がポリAポリメラーゼに供され、
-ポリT プライマーが次いで前記RNAサンプルをcDNAに変換する逆転写(RT)反応におけるプライマーとして使用され、ここで、前記RT反応は、 RT-プライマー配列を特定のマイクロRNAまたはマイクロRNAの群またはファミリーに特異的なマイクロＲＮＡ配列に部分的にオーバーラップさせることにより、配列特異的にされてもよく、そして
- 該cDNAを、特定のマイクロRNA標的に特異的なｑＰＣＲ プライマーを使用し、標識された検出プローブを使用してもよい、リアルタイムｑＰＣＲ増幅に供する、
請求項 1の方法であって、該ｑＰＣＲ プライマーが完全にまたは部分的に前記付加された配列とオーバーラップしてもよい、方法。