【手続補正書】
【提出日】平成25年11月22日(2013.11.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
巨核球（ＭＫ）を生成する方法であって、
血管芽細胞を準備すること、及び
前記血管芽細胞を培養して、巨核球へと分化させること
を含む方法。
【請求項２】
前記血管芽細胞が、生体外で多能性幹細胞から分化する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記多能性幹細胞が、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記多能性幹細胞が、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
多能性幹細胞の前記分化が、前記多能性幹細胞を解離すること、並びにＢＭＰ−４、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＴＰＯ、Ｆｌｔ３リガンド、ＳＣＦ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される成長因子又はサイトカインを含む培地で前記多能性幹細胞を培養して、胚様体（ＥＢ）を形成することを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記培地が、ＢＭＰ−４及びＶＥＧＦを含み、前記多能性幹細胞の培養が、前記ＥＢを形成するために約４８時間にわたる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ＢＭＰ−４の濃度が、５０ｎｇ／ｍｌであり、ＶＥＧＦが、５０ｎｇ／ｍｌである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記形成されたＥＢを、化学的に及び／又は機械的に解離し、前記培養培地の少なくとも一部を、ＢＭＰ−４、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＴＰＯ、Ｆｌｔ３リガンド、ＳＣＦ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される成長因子又はサイトカインを含む培地と交換して、前記血管芽細胞を生成する、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記ｂＦＧＦの濃度が、２０ｎｇ／ｍｌであり、ＴＰＯが、５０〜１００ｎｇ／ｍｌであり、Ｆｌｔ３リガンドが、５０ｎｇ／ｍｌであり、ＳＣＦが、５０ｎｇ／ｍｌである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記解離されたＥＢを、ｂＦＧＦを含む芽球コロニー増殖培地中で約３〜４日間培養して、前記血管芽細胞を生成する、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記培地が、ＩＬ６、エストラジオール、ビタミンＢ３、１つ又は複数の細胞外マトリックスタンパク質、又はそれらの組み合わせを更に含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記ｉＰＳＣが、ヒト由来の体細胞から誘導される、請求項４に記載の方法。
【請求項１３】
前記体細胞が、成体組織または胎児（仔）組織に由来する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記血管芽細胞の前記ＭＫへの分化が、ＴＰＯ、ＳＣＦ、ＩＬ１１、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される成長因子又はサイトカインを含む培地中で、約２〜８日間培養することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＴＰＯの濃度が、５０ｎｇ／ｍｌであり、ＳＣＦが、２０ｎｇ／ｍｌであり、ＩＬ１１が、２０ｎｇ／ｍｌである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記培養培地の少なくとも一部を、ＴＰＯ、ＳＣＦ、ＩＬ１１、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される成長因子又はサイトカインを含む培地と２〜３日毎に交換して、前記血管芽細胞を前記ＭＫへと分化させることを更に含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１〜１６に記載の方法のいずれかから生成される、ある量の巨核球。
【請求項１８】
血小板を生成する方法であって、
巨核球（ＭＫ）を準備すること、及び
前記ＭＫを培養して、血小板へと分化させることを含む方法。
【請求項１９】
前記ＭＫが、血管芽細胞から分化する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記血管芽細胞の前記ＭＫへの分化が、ＴＰＯ、ＳＣＦ、ＩＬ１１、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される成長因子又はサイトカインを含む培地中で、約２〜８日間培養することを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＴＰＯの濃度が、５０ｎｇ／ｍｌであり、ＳＣＦが、２０ｎｇ／ｍｌであり、ＩＬ１１が、２０ｎｇ／ｍｌである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記培養培地の少なくとも一部を、ＴＰＯ、ＳＣＦ、ＩＬ１１、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される成長因子又はサイトカインを含む培地と２〜３日毎に交換して、前記血管芽細胞を前記ＭＫへと分化させることを更に含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記血管芽細胞が、生体外で多能性幹細胞から分化する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
前記多能性幹細胞が、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記多能性幹細胞が、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記多能性幹細胞の分化が、前記多能性幹細胞を解離すること、並びにＢＭＰ−４、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＴＰＯ、Ｆｌｔ３リガンド、ＳＣＦ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される成長因子又はサイトカインを含む培地で前記多能性幹細胞を培養して、胚様体（ＥＢ）を形成することを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記培地が、ＢＭＰ−４及びＶＥＧＦを含み、前記多能性幹細胞の培養が、ＥＢを形成するために約４８時間にわたる、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＢＭＰ−４の濃度が、５０ｎｇ／ｍｌであり、ＶＥＧＦが、５０ｎｇ／ｍｌである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
形成された前記ＥＢを、化学的に及び／又は機械的に解離し、前記培養培地の少なくとも一部を、ＢＭＰ−４、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＴＰＯ、Ｆｌｔ３リガンド、ＳＣＦ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される成長因子又はサイトカインを含む培地と交換して、前記血管芽細胞を生成する、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記ｂＦＧＦの濃度が、２０ｎｇ／ｍｌであり、ＴＰＯが、５０〜１００ｎｇ／ｍｌであり、Ｆｌｔ３リガンドが、５０ｎｇ／ｍｌであり、ＳＣＦが、５０ｎｇ／ｍｌである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
解離された前記ＥＢを、ｂＦＧＦを含む芽球コロニー増殖培地中で約３〜４日間養殖して、前記血管芽細胞を生成する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記培地が、ＩＬ６、エストラジオール、ビタミンＢ３、１つ又は複数の細胞外マトリックスタンパク質、又はそれらの組み合わせを更に含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
前記ｉＰＳＣが、ヒト由来の体細胞から誘導される、請求項２５に記載の方法。
【請求項３４】
前記体細胞が、成体組織または胎児（仔）組織に由来する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記ＭＫを、ＴＰＯ、ＳＣＦ、ヘパリンナトリウム、ＩＬ１１、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される成長因子又はサイトカインを含む培地に再懸濁し、少なくとも４日間培養して、前記血小板へと分化させる、請求項１８に記載の方法。
【請求項３６】
前記ＴＰＯの濃度が、１００ｎｇ／ｍｌであり、ＳＣＦが、５０ｎｇ／ｍｌであり、ヘパリンナトリウムが、２５単位／ｍｌであり、ＩＬ１１が、２０ｎｇ／ｍｌである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記少なくとも４日間の前記ＭＫ培養後に、ＧＭ６００１又はＩＬ３を添加することを更に含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記培地の少なくとも一部を、ＴＰＯ、ＳＣＦ、ヘパリンナトリウム、ＩＬ１１、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される成長因子又はサイトカインを含む培地と、少なくとも２日毎に交換することを更に含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
前記ＭＫを解離し、ＴＰＯ、ＳＣＦ、ヘパリンナトリウム、ＩＬ１１、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される成長因子又はサイトカインを含む培地中の、有糸分裂的に停止されたフィーダー層上で少なくとも４日間培養して、前記血小板へと分化させる、請求項１８に記載の方法。
【請求項４０】
前記フィーダー層が、ＯＰ９細胞またはＣ３Ｈ  １０Ｔ１／２細胞を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記少なくとも４日間の前記ＭＫ培養後に、ＧＭ６００１又はＩＬ３を添加することを更に含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記培地の少なくとも一部を、ＴＰＯ、ＳＣＦ、ヘパリンナトリウム、ＩＬ１１、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される成長因子又はサイトカインを含む培地と、少なくとも２日毎に交換することを更に含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４３】
請求項１８〜４２に記載の方法のいずれかから生成される、ある量の血小板。
【請求項４４】
前記血小板が、前記血小板の対象体への投与の際に、前記対象体においてＨＬＡ同種免疫原性反応に寄与しない溶液中で保存される、請求項４３に記載の血小板。
【請求項４５】
前記血小板が、アピラーゼ及び／又はＥＤＴＡの存在下で活性化されない、請求項４３に記載の血小板。
【請求項４６】
細胞分化の修飾因子をスクリーニングする方法であって、
ある量の巨核球（ＭＫ）を準備すること、
前記ＭＫを試験化合物と接触させること、及び
前記ＭＫと前記試験化合物との接触に由来する機能的効果の存在又は非存在を決定することを含み、
前記機能的効果の存在が、前記試験化合物が、細胞分化を調節する巨核球形成因子、血小板新生因子、及び／又は造血因子であることを示し、前記機能的効果の非存在が、前記試験化合物が、細胞分化を調節する巨核球形成因子、血小板新生因子、及び／又は造血因子でないことを示す方法。
【請求項４７】
血小板輸血を必要とする対象体を治療するための組成物であって、前記組成物は、ある量の生体外で分化した血小板を含み、ここで、
ある量の血管芽細胞が培養されて、巨核球（ＭＫ）へと分化し、そして前記ＭＫは、生体外で培養されて、血小板へと分化する、組成物。
【請求項４８】
前記生体外で分化した血小板が前記対象体に適合されて、免疫媒介性宿主反応が低減又は排除される、請求項４７に記載の組成物。