【手続補正書】
【提出日】平成24年7月27日(2012.7.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも約70℃の融解温度または少なくとも約20%のGC含量を有する第一のプローブが標的細胞内のそのmRNA標的に特異的にハイブリダイズし、かつ、第二のプローブが標的細胞内のその染色体DNA標的に特異的にハイブリダイズすることが可能な条件下で、一つまたは複数の標的細胞を含む生物学的試料に、第一のプローブおよび第二のプローブをインサイチューでハイブリダイズする段階を含む、細胞内のmRNAおよび染色体DNAを検出するための方法。
【請求項２】
第一のプローブが標的細胞のmRNAマーカー用のプローブである、請求項1記載の方法。
【請求項３】
標的細胞が胎児細胞である、請求項1記載の方法。
【請求項４】
第一のプローブが胎児細胞のmRNAマーカー用のプローブである、請求項1記載の方法。
【請求項５】
第一のプローブが、イプシロン-ヘモグロビンmRNA、ゼータ-ヘモグロビンmRNA、ガンマ-ヘモグロビンmRNA、Y-染色体特異的ジンクフィンガータンパク質mRNA(ZFY-mRNA)、胎児アルファ-フェトプロテイン(AFP)mRNA、ガンマ-グルタミル-トランスペプチダーゼ(GGT)mRNA、ヒト胎盤性ラクトゲン1、2、3、および4(hPL、PLAC-1-4としても知られる)mRNA、妊娠関連血漿タンパク質-A(PAPP-A)mRNA、副腎皮質刺激ホルモン放出因子(CRH)mRNA、組織因子経路阻害因子2(TFPI-2)mRNA、KISS-1転移-抑制因子mRNA、およびPLAC-1 mRNA、妊娠特異的ベータ-1-グリコプロテイン-2、3、4、5、6、7、および9 mRNA、絨毛性ソマトマンモトロピンホルモン2および変異体(v1、v2、v3、v4、v5)mRNA、成長ホルモン変異体mRNA、アルファ-ディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼドメイン変異体mRNA、ジペプチジルペプチダーゼ7 mRNA、フィビュリンmRNA、s100カルシウム結合タンパク質mRNA、前立腺分化因子mRNA、ならびにシトクロムP450、サブファミリーxix mRNAからなる群より選択される胎児細胞のmRNAマーカー用のプローブである、請求項1記載の方法。
【請求項６】
第一のプローブが一つまたは複数の修飾されたヌクレオチドを含む、請求項1記載の方法。
【請求項７】
第一のプローブが少なくとも約30%の修飾されたヌクレオチドを含む、請求項1記載の方法。
【請求項８】
第一のプローブが、ロックド核酸(LNA)、ペプチド核酸(PNA)、2'-OMeヌクレオチドを含む核酸、メチルホスホネートを含む核酸、ホスホロチオエートを含む核酸、モルホリノを含む核酸、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される一つまたは複数の修飾されたヌクレオチドを含む、請求項1記載の方法。
【請求項９】
第一のプローブが約20から約50ヌクレオチドを含む、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
第一のプローブが、検出可能な物質で標識されている、請求項1記載の方法。
【請求項１１】
第一のプローブがビオチンで標識されている、請求項1記載の方法。
【請求項１２】
第二のプローブが、インサイチューハイブリダイゼーションのために蛍光標識されたプローブである、請求項1記載の方法。
【請求項１３】
生物学的試料が血液または子宮頚管粘液試料である、請求項1記載の方法。
【請求項１４】
標的細胞が胎児由来の胎児細胞であり、生物学的試料が胎児の母性宿主由来の血液試料である、請求項1記載の方法。
【請求項１５】
標的細胞が胎児由来の胎児細胞であり、生物学的試料が胎児の母性宿主の血液試料から得られる胎児細胞濃縮試料である、請求項1記載の方法。
【請求項１６】
標的細胞が腫瘍性細胞である、請求項1記載の方法。
【請求項１７】
生物学的試料内の細胞がインサイチューハイブリダイゼーションに適するように処理される、請求項1記載の方法。
【請求項１８】
生物学的試料内の細胞が、少なくとも30分間、室温にてPBS中の約4%パラホルムアルデヒドで処理されている、請求項1記載の方法。
【請求項１９】
第一のプローブおよび第二のプローブが、ハイブリダイゼーション前に変性条件下で生物学的試料とインキュベートされる、請求項1記載の方法。
【請求項２０】
条件が、約4時間から約14時間、約37℃から約45℃でハイブリダイズすることを含む、請求項1記載の方法。
【請求項２１】
室温から80℃までの様々な温度での洗浄を含む洗浄工程が、第一のプローブおよび第二のプローブのハイブリダイゼーション後に行われる、請求項1記載の方法。
【請求項２２】
洗浄溶液が、1XSSC、ホルムアミド、および任意で一つまたは複数の界面活性剤を含む、請求項1記載の方法。
【請求項２３】
第一のプローブのそのmRNA標的へのハイブリダイゼーションおよび第二のプローブのその染色体DNA標的へのハイブリダイゼーションを検出する前に、一つまたは複数のブロッキング剤が添加される、請求項1記載の方法。
【請求項２４】
標的細胞が胎児細胞であり、第一のプローブがSEQ ID NO：1〜SEQ ID NO：40からなる群より選択される核酸配列を含む、請求項1記載の方法。
【請求項２５】
第一のプローブのそのmRNA標的へのハイブリダイゼーションおよび第二のプローブのその染色体DNA標的へのハイブリダイゼーションが同時に行われる、請求項1記載の方法。
【請求項２６】
第一のプローブのそのmRNA標的へのハイブリダイゼーションおよび第二のプローブのその染色体DNA標的へのハイブリダイゼーションが同時に検出される、請求項1記載の方法。
【請求項２７】
少なくとも約80℃の融解温度または少なくとも約40%のGC含量を有する第一のプローブが胎児細胞内のそのmRNA標的に特異的にハイブリダイズし、かつ、第二のプローブが胎児細胞内のその染色体DNA標的に特異的にハイブリダイズすることが可能な条件下で、胎児由来の一つまたは複数の胎児細胞を含む生物学的試料に、第一のプローブおよび第二のプローブをインサイチューでハイブリダイズすることを含む方法であって、第一のプローブのそのmRNA標的へのハイブリダイゼーションおよび第二のプローブのその染色体DNA標的へのハイブリダイゼーションが、胎児の遺伝的障害の指標である、胎児の遺伝的障害を検出するための方法。
【請求項２８】
遺伝的障害が、嚢胞性線維症、鎌状赤血球貧血、フェニルケトン尿症、テイ-サックス病、副腎過形成、ファンコーニ貧血、脊髄性筋萎縮症、デュシェーヌ筋ジストロフィ、ハンチントン病、ベータサラセミア、筋緊張性ジストロフィ、ぜい弱X症候群、ダウン症候群、エドワーズ症候群、パトー症候群、クラインフェルター症候群、3倍性X染色体症候群、XYY症候群、8トリソミー、16トリソミー、ターナー症候群、ロバートソン転座、エンジェルマン症候群、ディ・ジョージ症候群、ウォルフ‐ヒルシュホーン症候群、およびRhD症候群からなる群より選択される、請求項27記載の方法。
【請求項２９】
生物学的試料が胎児の母性宿主由来の血液試料である、請求項27記載の方法。
【請求項３０】
生物学的試料が、胎児の母性宿主の生物学的試料から得られる胎児細胞濃縮試料である、請求項27記載の方法。
【請求項３１】
染色体DNA標的が、嚢胞性線維症、鎌状赤血球貧血、フェニルケトン尿症、テイ-サックス病、副腎過形成、ファンコーニ貧血、脊髄性筋萎縮症、デュシェーヌ筋ジストロフィ、ハンチントン病、ベータサラセミア、筋緊張性ジストロフィ、ぜい弱X症候群、ダウン症候群、エドワーズ症候群、パトー症候群、クラインフェルター症候群、3倍性X染色体症候群、XYY症候群、8トリソミー、16トリソミー、ターナー症候群、ロバートソン転座、エンジェルマン症候群、ディ・ジョージ症候群、ウォルフ‐ヒルシュホーン症候群、およびRhD症候群からなる群より選択される遺伝的障害と関連している、請求項27記載の方法。
【請求項３２】
mRNA標的が胎児細胞のmRNAマーカーである、請求項27記載の方法。
【請求項３３】
胎児が少なくとも7週齢である、請求項27記載の方法。
【請求項３４】
SEQ ID NO：1〜40からなる群より選択される核酸配列を含むプローブ。
【請求項３５】
一つまたは複数の修飾されたヌクレオチドを含む、請求項34記載のプローブ。
【請求項３６】
少なくとも約30%の修飾されたヌクレオチドを含む、請求項34記載のプローブ。
【請求項３７】
ロックド核酸(LNA)、ペプチド核酸(PNA)、2'-OMeヌクレオチドを含む核酸、メチルホスホネートを含む核酸、ホスホロチオエートを含む核酸、モルホリノ類似体を含む核酸、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される一つまたは複数の修飾されたヌクレオチドを含む、請求項34記載のプローブ。
【請求項３８】
約20から約50ヌクレオチドを含む、請求項34記載のプローブ。
【請求項３９】
検出可能な物質で標識されている、請求項34記載のプローブ。
【請求項４０】
励起‐発光メカニズムまたは化学発光メカニズムにより発光する直接的または間接的に検出可能な物質で標識されている、請求項34記載のプローブ。
【請求項４１】
フルオレセイン、Cy3、Cy5、Cy7、テキサスレッド、スターブライトグリーン、スターブライトオレンジ、ローダミングリーン、オレゴングリーン、ボディピィ(bodipy)蛍光体、350〜750nmの発光を有するアレクサフルオル(Alexa Fluor)色素、ならびにそれらの組み合わせからなる群より選択される直接標識で標識されている、請求項34記載のプローブ。
【請求項４２】
ジゴキシゲニン、ビオチン、ルシファーイエロー、ジニトロフェニル(DNP)、ダンシル、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される間接標識で標識されている、請求項34記載のプローブ。
【請求項４３】
請求項34記載のプローブを含むキット。
【請求項４４】
胎児細胞内の染色体DNA標的に対する第二のプローブをさらに含む、請求項43記載のキット。
【請求項４５】
胎児における遺伝的障害に関連した染色体DNA標的に対する第二のプローブをさらに含む、請求項43記載のキット。
【請求項４６】
プローブのそのmRNA標的へのハイブリダイゼーションに適した緩衝剤をさらに含む、請求項43記載のキット。
【請求項４７】
胎児細胞内の染色体DNA標的に対する第二のプローブと、プローブのそのmRNA標的へのハイブリダイゼーションおよび第二のプローブのその染色体DNA標的へのハイブリダイゼーションに適した緩衝剤とをさらに含む、請求項43記載のキット。
【請求項４８】
洗浄緩衝剤およびブロッキング剤をさらに含む、請求項47記載のキット。
【請求項４９】
インサイチューハイブリダイゼーションに適したものとなるように細胞試料を処理するための試薬をさらに含む、請求項48記載のキット。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００９】
本発明のさらに別の態様において、本発明は、本発明のプローブを含むキットを提供する。
[本発明1001]
少なくとも約80℃の融解温度または少なくとも約40%のGC含量を有する第一のプローブが標的細胞内のそのmRNA標的に特異的にハイブリダイズし、かつ、第二のプローブが標的細胞内のその染色体DNA標的に特異的にハイブリダイズすることが可能な条件下で、一つまたは複数の標的細胞を含む生物学的試料に、第一のプローブおよび第二のプローブをインサイチューでハイブリダイズする段階を含む、細胞内のmRNAおよび染色体DNAを検出するための方法。
[本発明1002]
第一のプローブが標的細胞のmRNAマーカー用のプローブである、本発明1001の方法。
[本発明1003]
標的細胞が胎児細胞である、本発明1001の方法。
[本発明1004]
第一のプローブが胎児細胞のmRNAマーカー用のプローブである、本発明1001の方法。
[本発明1005]
第一のプローブが、イプシロン-ヘモグロビンmRNA、ゼータ-ヘモグロビンmRNA、ガンマ-ヘモグロビンmRNA、Y-染色体特異的ジンクフィンガータンパク質mRNA(ZFY-mRNA)、胎児アルファ-フェトプロテイン(AFP)mRNA、ガンマ-グルタミル-トランスペプチダーゼ(GGT)mRNA、ヒト胎盤性ラクトゲン1、2、3、および4(hPL、PLAC-1-4としても知られる)mRNA、妊娠関連血漿タンパク質-A(PAPP-A)mRNA、副腎皮質刺激ホルモン放出因子(CRH)mRNA、組織因子経路阻害因子2(TFPI-2)mRNA、KISS-1転移-抑制因子mRNA、およびPLAC-1 mRNA、妊娠特異的ベータ-1-グリコプロテイン-2、3、4、5、6、7、および9 mRNA、絨毛性ソマトマンモトロピンホルモン2および変異体(v1、v2、v3、v4、v5)mRNA、成長ホルモン変異体mRNA、アルファ-ディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼドメイン変異体mRNA、ジペプチジルペプチダーゼ7 mRNA、フィビュリンmRNA、s100カルシウム結合タンパク質mRNA、前立腺分化因子mRNA、ならびにシトクロムP450、サブファミリーxix mRNAからなる群より選択される胎児細胞のmRNAマーカー用のプローブである、本発明1001の方法。
[本発明1006]
第一のプローブが一つまたは複数の修飾されたヌクレオチドを含む、本発明1001の方法。
[本発明1007]
第一のプローブが少なくとも約30%の修飾されたヌクレオチドを含む、本発明1001の方法。
[本発明1008]
第一のプローブが、ロックド核酸(LNA)、ペプチド核酸(PNA)、2'-OMeヌクレオチドを含む核酸、メチルホスホネートを含む核酸、ホスホロチオエートを含む核酸、モルホリノを含む核酸、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される一つまたは複数の修飾されたヌクレオチドを含む、本発明1001の方法。
[本発明1009]
第一のプローブが約20から約50ヌクレオチドを含む、本発明1001の方法。
[本発明1010]
第一のプローブが、検出可能な物質で標識されている、本発明1001の方法。
[本発明1011]
第一のプローブがビオチンで標識されている、本発明1001の方法。
[本発明1012]
第二のプローブが、インサイチューハイブリダイゼーションのために蛍光標識されたプローブである、本発明1001の方法。
[本発明1013]
生物学的試料が血液または子宮頚管粘液試料である、本発明1001の方法。
[本発明1014]
標的細胞が胎児由来の胎児細胞であり、生物学的試料が胎児の母性宿主由来の血液試料である、本発明1001の方法。
[本発明1015]
標的細胞が胎児由来の胎児細胞であり、生物学的試料が胎児の母性宿主の血液試料から得られる胎児細胞濃縮試料である、本発明1001の方法。
[本発明1016]
標的細胞が腫瘍性細胞である、本発明1001の方法。
[本発明1017]
生物学的試料内の細胞がインサイチューハイブリダイゼーションに適するように処理される、本発明1001の方法。
[本発明1018]
生物学的試料内の細胞が、少なくとも30分間、室温にてPBS中の約4%パラホルムアルデヒドで処理されている、本発明1001の方法。
[本発明1019]
第一のプローブおよび第二のプローブが、ハイブリダイゼーション前に変性条件下で生物学的試料とインキュベートされる、本発明1001の方法。
[本発明1020]
条件が、約4時間から約14時間、約37℃から約45℃でハイブリダイズすることを含む、本発明1001の方法。
[本発明1021]
室温から80℃までの様々な温度での洗浄を含む洗浄工程が、第一のプローブおよび第二のプローブのハイブリダイゼーション後に行われる、本発明1001の方法。
[本発明1022]
洗浄溶液が、1XSSC、ホルムアミド、および任意で一つまたは複数の界面活性剤を含む、本発明1001の方法。
[本発明1023]
第一のプローブのそのmRNA標的へのハイブリダイゼーションおよび第二のプローブのその染色体DNA標的へのハイブリダイゼーションを検出する前に、一つまたは複数のブロッキング剤が添加される、本発明1001の方法。
[本発明1024]
標的細胞が胎児細胞であり、第一のプローブがSEQ ID NO：1〜SEQ ID NO：40からなる群より選択される核酸配列を含む、本発明1001の方法。
[本発明1025]
第一のプローブのそのmRNA標的へのハイブリダイゼーションおよび第二のプローブのその染色体DNA標的へのハイブリダイゼーションが同時に行われる、本発明1001の方法。
[本発明1026]
第一のプローブのそのmRNA標的へのハイブリダイゼーションおよび第二のプローブのその染色体DNA標的へのハイブリダイゼーションが同時に検出される、本発明1001の方法。
[本発明1027]
少なくとも約80℃の融解温度または少なくとも約40%のGC含量を有する第一のプローブが胎児細胞内のそのmRNA標的に特異的にハイブリダイズし、かつ、第二のプローブが胎児細胞内のその染色体DNA標的に特異的にハイブリダイズすることが可能な条件下で、胎児由来の一つまたは複数の胎児細胞を含む生物学的試料に、第一のプローブおよび第二のプローブをインサイチューでハイブリダイズすることを含む方法であって、第一のプローブのそのmRNA標的へのハイブリダイゼーションおよび第二のプローブのその染色体DNA標的へのハイブリダイゼーションが、胎児の遺伝的障害の指標である、胎児の遺伝的障害を検出するための方法。
[本発明1028]
遺伝的障害が、嚢胞性線維症、鎌状赤血球貧血、フェニルケトン尿症、テイ-サックス病、副腎過形成、ファンコーニ貧血、脊髄性筋萎縮症、デュシェーヌ筋ジストロフィ、ハンチントン病、ベータサラセミア、筋緊張性ジストロフィ、ぜい弱X症候群、ダウン症候群、エドワーズ症候群、パトー症候群、クラインフェルター症候群、3倍性X染色体症候群、XYY症候群、8トリソミー、16トリソミー、ターナー症候群、ロバートソン転座、エンジェルマン症候群、ディ・ジョージ症候群、ウォルフ‐ヒルシュホーン症候群、およびRhD症候群からなる群より選択される、本発明1027の方法。
[本発明1029]
生物学的試料が胎児の母性宿主由来の血液試料である、本発明1027の方法。
[本発明1030]
生物学的試料が、胎児の母性宿主の生物学的試料から得られる胎児細胞濃縮試料である、本発明1027の方法。
[本発明1031]
染色体DNA標的が、嚢胞性線維症、鎌状赤血球貧血、フェニルケトン尿症、テイ-サックス病、副腎過形成、ファンコーニ貧血、脊髄性筋萎縮症、デュシェーヌ筋ジストロフィ、ハンチントン病、ベータサラセミア、筋緊張性ジストロフィ、ぜい弱X症候群、ダウン症候群、エドワーズ症候群、パトー症候群、クラインフェルター症候群、3倍性X染色体症候群、XYY症候群、8トリソミー、16トリソミー、ターナー症候群、ロバートソン転座、エンジェルマン症候群、ディ・ジョージ症候群、ウォルフ‐ヒルシュホーン症候群、およびRhD症候群からなる群より選択される遺伝的障害と関連している本発明1027の方法。
[本発明1032]
mRNA標的が胎児細胞のmRNAマーカーである、本発明1027の方法。
[本発明1033]
胎児が少なくとも7週齢である、本発明1027の方法。
[本発明1034]
SEQ ID NO：1〜40からなる群より選択される核酸配列を含むプローブ。
[本発明1035]
一つまたは複数の修飾されたヌクレオチドを含む、本発明1034のプローブ。
[本発明1036]
少なくとも約30%の修飾されたヌクレオチドを含む、本発明1034のプローブ。
[本発明1037]
ロックド核酸(LNA)、ペプチド核酸(PNA)、2'-OMeヌクレオチドを含む核酸、メチルホスホネートを含む核酸、ホスホロチオエートを含む核酸、モルホリノ類似体を含む核酸、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される一つまたは複数の修飾されたヌクレオチドを含む、本発明1034のプローブ。
[本発明1038]
約20から約50ヌクレオチドを含む、本発明1034のプローブ。
[本発明1039]
検出可能な物質で標識されている、本発明1034のプローブ。
[本発明1040]
励起‐発光メカニズムまたは化学発光メカニズムにより発光する直接的または間接的に検出可能な物質で標識されている、本発明1034のプローブ。
[本発明1041]
フルオレセイン、Cy3、Cy5、Cy7、テキサスレッド、スターブライトグリーン、スターブライトオレンジ、ローダミングリーン、オレゴングリーン、ボディピィ(bodipy)蛍光体、350〜750nmの発光を有するアレクサフルオル(Alexa Fluor)色素、ならびにそれらの組み合わせからなる群より選択される直接標識で標識されている、本発明1034のプローブ。
[本発明1042]
ジゴキシゲニン、ビオチン、ルシファーイエロー、ジニトロフェニル(DNP)、ダンシル、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される間接標識で標識されている、本発明1034のプローブ。
[本発明1043]
本発明1034のプローブを含むキット。
[本発明1044]
胎児細胞内の染色体DNA標的に対する第二のプローブをさらに含む、本発明1043のキット。
[本発明1045]
胎児における遺伝的障害に関連した染色体DNA標的に対する第二のプローブをさらに含む、本発明1043のキット。
[本発明1046]
プローブのそのmRNA標的へのハイブリダイゼーションに適した緩衝剤をさらに含む、本発明1043のキット。
[本発明1047]
胎児細胞内の染色体DNA標的に対する第二のプローブと、プローブのそのmRNA標的へのハイブリダイゼーションおよび第二のプローブのその染色体DNA標的へのハイブリダイゼーションに適した緩衝剤とをさらに含む、本発明1043のキット。
[本発明1048]
洗浄緩衝剤およびブロッキング剤をさらに含む、本発明1047のキット。
[本発明1049]
インサイチューハイブリダイゼーションに適したものとなるように細胞試料を処理するための試薬をさらに含む、本発明1048のキット。