【手続補正書】
【提出日】平成26年6月6日(2014.6.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００４】
不運にも、今日入手可能なほとんどの生体材料は、高荷重要求用途（例えば、骨、靱帯、腱、筋肉）の機械的完全性または適切な生物学的機能性を有さず；ほとんどの生体材料は、分解が速すぎるか（例えば、コラーゲン、ＰＬＡ、ＰＧＡ、または関連コポリマー）または非分解性（例えば、ポリエステル、金属）であり、いずれにしても、機能的な自己組織は発生することができず患者は能力障害に苦しむ。場合によっては、生体材料は組織分化および発生を間違う可能性があり（例えば、自然骨形成、腫瘍）、というのも周囲の細胞および組織との生体適合性を欠くからである。その上、典型的に分解できない生体材料は、慢性炎症と関連し、ここで、そのような応答は実際には周囲の組織にとって有害である（すなわち、衰弱させる）。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
典型的には、文献で「絹」というと、その発言は、何世紀もの間、織物および医薬において使用されている天然由来およびそれでしか入手できない「絹」（すなわち、セリシンコートフィブロイン繊維）に焦点が合わせられていることが推測される。医療グレードカイコ絹は、伝統的に２つの形態でのみ使用される：（ｉ）バージンシルク縫合糸、この場合セリシンは除去されている、および（ｉｉ）従来のより一般的な絹縫合糸、または一般に黒編組絹縫合糸と呼ばれる、この場合、セリシンは完全に除去されているが、ワックスまたはシリコーンコーティングで置換され絹フィブロインと体組織および細胞の間でバリアが提供される。現在、絹が依然として使用される唯一の医学的応用は、縫合糸結紮においてであり、これは特に、絹が手術における機械的特性（例えば、結び目の強さおよび操作性）のために依然として価値があるからである。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
絹フィブロインの追加の制限としては、カイコ絹から抽出され、溶解され、再建され、またはカイコ以外のクモまたは昆虫から生成されたかに関係なく、下記が挙げられる：（ｉ）絹の疎水性、絹にその強度を提供するコアフィブロインタンパク質のβシート結晶立体構造の直接的な結果、（ｉｉ）哺乳類細胞外マトリクスタンパク質中で典型的には見いだされる細胞結合ドメインの欠乏（例えば、ペプチド配列ＲＧＤ）、および（ｉｉｉ）絹フィブロインの滑らかな表面。結果として炎症性および宿主組織応答と関連する細胞（例えば、マクロファージ、好中球）は分解可能な材料として絹フィブロインを認識することができない。よって、これらの細胞は、異物を封入し、遮断することを選び（図１８Ａを参照されたい）、よって（ｉ）絹フィブロイン分解、（ｉｉ）組織内殖、および（ｉｉｉ）組織リモデリングが制限される。よって、絹フィブロインフィラメントはしばしば、慢性炎症、末梢肉芽腫および瘢痕封入と関連する強い異物応答（ＦＢＲ）を誘発する（図１８Ａ）。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
絹の生物学的不利益に加えて、絹のマルチフィラメント性質（例えば、縫合糸として）ならびにフィブロインフィラメントの小さなサイズは、密接に充填された構造につながる可能性がある。そのようなものとして、絹はあまりに速く分解する可能性がある。末梢封入内で見られる刺激された細胞から生成されるプロテアーゼ（酵素）は、移植構造に浸透することができる（図１１Ａおよび図１１Ｂを参照されたい）が、正常な組織リモデリング中に装置（この場合、黒編組縫合糸）を強化し得る新規組織沈着細胞（例えば、線維芽細胞）は可能ではない。よって、非処理または非修正フィブロイン装置の内部は、宿主異物応答および組織（線維芽細胞により導かれ、生成される）と接触せず、結果として、装置が組織リモデリングに向かわせる能力が制限される。宿主細胞および組織増殖は制限され、分解は通常可能ではない。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３６】
他の態様では、織糸またはより大きな織糸のコンストラクトの形態のカイコフィブロイン繊維は、ここでは装置と呼ばれ、セリシンが取り去られ、ファブリックとされ（例えば、織り、編み、不織ウェットレイド、編組、ステッチ貼り合わせ、など）、滅菌され、制御可能な寿命（すなわち、分解速度）および制御可能なコラーゲンおよび／または細胞外マトリクス沈着の程度を提供する移植可能なサポートまたは修復材料として使用される。サポートまたは修復材料は、任意のそのような目的のために体内で使用することができ、特にヘルニア修復、特に胸部および腹腔内の体壁の再建、および内臓、例えば、限定はされないが、膀胱、子宮、腸、尿道、および尿管のサポート、位置決めまたは固定化のために使用することができる。また、カイコフィブロイン繊維はセリシンが取り去られ、組織化され不織ファブリックにされ得る。そのような不織ファブリックは上記のような移植可能なサポートまたは修復材料として使用することができるが、より特定的には、スポンジ形成が有用である用途のために使用することができる。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４４】
【図１Ａ】図１Ａ−図１Ｇは写真およびグラフ表示を含む。図１Ａはセリシンコーティングを有する単一の天然の、精錬され、撚られた２０／２２デニール絹繊維の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像である。
【図１Ｂ】図１Ｂは６０分間３７℃で抽出された図１Ａの絹繊維のＳＥＭを示す。
【図１Ｃ】図１Ｃは、６０分９０℃で抽出された図１Ａの絹繊維のＳＥＭを示し、セリシンコーティングの完全な除去が示される。
【図１Ｄ】図１Ｄは、最大引張強度（ＵＴＳ）および剛性（３ｃｍ長さのマトリクスに対するＮ／ｍｍ）を抽出条件の関数として示すチャートである。
【図１Ｅ】図１Ｅは、生絹フィブロインのＳＥＭを示す。
【図１Ｆ】図１Ｆは、９０°で６０分の第１の抽出を示す。
【図１Ｇ】図１Ｇは同一の条件下での第２の抽出を示す。これらの図は、第２の抽出後、典型的な３％質量損失となるフィラメントに対する機械的損傷を示す。よって、％質量損失が第１から第２の抽出まで３％を超えて変化しない限り（９０℃、１時間、標準の洗剤および塩）、完全抽出が達成されたと仮定される。総質量損失の３％損失の有用性は、測定、アッセイおよび第２の抽出後の織糸の質量損失となる機械的損傷の変動性から反映されている。
【図２Ａ】図２Ａ−図２Ｄは写真および描画を含む。図２Ａは、（ケーブルまたはツイストされた）織糸の代表的な３−Ｄモデルであり、その５レベルの階層が示される（単一繊維レベルは図示せず）。各レベルで使用される繊維の数によって、コードは、ヘルニア修復メッシュを編むための織糸またはＡＣＬマトリクスを形成するために他のコードと並列で使用されるコードとして機能することができる。
【図２Ｂ】図２Ｂは、３６繊維を含む２レベル階層ツイストまたはケーブル化織糸の作成の概略図であり、その後、並列で撚られＡＣＬマトリクスを形成し、または組織工学および組織修復のための織りまたは編みファブリック（例えば、ヘルニアメッシュ）を作成するために使用される。略図は視覚的に２つの非常に一般的なファブリック形成形態を規定する：「織り」および「編み」。
【図２Ｃ】図２Ｃは中心軸についてらせん状に組織化され、２レベルのツイスト階層から構成されるジオメトリを有する織糸の単一コードを示す。６つのコードが並列で使用された場合（例えば、マトリクス１）、織糸は天然靱帯と同様の機械的特性を有する。
【図２Ｄ】図２Ｄは、中心軸についてらせん状に組織化され、３レベルのツイスト階層から構成されるジオメトリを有する織糸の単一コードを示す。６つのコードが並列で使用された場合（例えば、マトリクス２）、マトリクスは天然靱帯と同様の機械的特性を有する。
【図３Ａ】図３Ａ−図３Ｄは一連のグラフである。図３Ａは、図２Ａで示される６つの並列絹フィブロインコードから形成されたマトリクス１の５つの試料（ｎ＝５）に対する荷重−伸長曲線を示す。
【図３Ｂ】図３ＢはＵＴＳ、１６８０Ｎ、および１２００Ｎ荷重での不全までのサイクルのチャートであり（各荷重に対しｎ＝５）、マトリクス１の疲労データを示す。インビボでの不全までのサイクル数を予測するために生理的荷重レベル（４００Ｎ）まで外挿させた場合のマトリクス１疲労データの回帰分析は、３３０万サイクルのマトリクス寿命を示す。
【図３Ｃ】図３Ｃは図２Ｂで示される６つの並列絹フィブロインコードから形成されたマトリクス２（ｎ＝３）の３つの試料（ｎ＝３）に対する荷重−伸長曲線を示す。
【図３Ｄ】図３ＤはＵＴＳ、２２８０Ｎ、２１００Ｎおよび１８００Ｎ荷重での不全までのサイクルのチャートであり（各荷重に対しｎ＝３）、マトリクス２の疲労データを示す。インビボでの不全までのサイクル数を予測するために生理的荷重レベル（４００Ｎ）まで外挿させた場合のマトリクス２疲労データの回帰分析は、１０００万サイクルを超えるマトリクス寿命を示す。
【図４Ａ】図４Ａ−図４Ｃは写真およびグラフである。図４Ａは、我々の研究所で作成された複数の織糸およびファブリック形態の画像を示す。いくつかの異なる織糸構造、例えば様々な型の編組（ｉ、ｉｉ、ｉｖ）、平編組（ｉｉｉ）、変動直径またはテーパ編組（ｖ）、より大きな（約２５０繊維）ケーブル化された２レベル束（ｖｉ）、２４−１２繊維で織られた織糸から構成される並列撚りおよび貼り合わせ（スエージ加工）織糸（ｖｉｉ）、様々なツイスト織糸（ｖｉｉｉ−ｘｉ）、および２４−１２繊維２レベルケーブル化織糸から構成される並列撚りおよび貼り合わせ（スエージ加工）織糸（ｘｉｉ）。
【図４Ｂ】図４Ｂは、下記に対する荷重−伸長曲線のチャートである：（Ｉ）編組（４８繊維、ツイストされ抽出された１２繊維織糸を使用する４キャリアブレーダー）および織られた織糸（総４８繊維）および（ＩＩ）ツイスト織糸とケーブル化織糸の比較、総１２繊維−試料は全て３ｃｍの長さとした。
【図４Ｃ】図４Ｃは、（Ｉ）３６繊維の小ケーブルおよび（ＩＩ）６０繊維の小さな織られた織糸に対する、３Ｂおよび３Ｄと比較される、小さな織糸、長さ３ｃｍに対する疲労データのチャートである。
【図５Ａ】図５Ａ−図５Ｂは表およびグラフである。図５Ａは、３６繊維織糸に対する強度および剛性データを試験した６つの異なるひずみ速度の関数として提供する（Ｎ＝５／群）。
【図５Ｂ】図５Ｂは６つの異なるひずみ速度のうちの２つで試験した３６−繊維織糸、３ｃｍ長に対する荷重−伸長曲線を示す。データは、試験手順（ここでは、具体的にはひずみ速度）の織糸構造の報告された機械的特性（例えば、ＵＴＳ）に対する影響を表す。
【図６Ａ】図６Ａ−図６Ｂはグラフである。図６Ａは、ツイスト／インチ（ＴＰＩ）の関数としてのＵＴＳのチャートであり；傾向線を作成して、データを４次多項式まで外挿した０−１５のＴＰＩを示す。個々のフィラメントが調和して働く秩序構造を示す最大が観察された。
【図６Ｂ】図６Ｂは剛性の（３ｃｍ長の試料に対する）ツイスト／インチ（ＴＰＩ）の関数としてのチャートであり；傾向線を作成して、データを５次多項式まで外挿した０−１５のＴＰＩを示す。最大が観察され、ＴＰＩは、特定のＵＴＳまたは剛性のために設計するツールとして使用することができるであろうことが示される。
【図７Ａ】図７Ａ−図７Ｄは写真である。図７Ａは細胞を播種する前の抽出された絹フィブロインのＳＥＭを示す。
【図７Ｂ】図７Ｂは、播種直後の絹フィブロインに播種され、接着された骨髄間質細胞のＳＥＭを示す。
【図７Ｃ】図７Ｃは、播種後１日の絹フィブロインに接着され、拡散された骨髄細胞のＳＥＭを示す。
【図７Ｄ】図７Ｄは、播種後１４日の、無傷の細胞−細胞外マトリクスシートを形成する絹フィブロインに播種された骨髄間質細胞のＳＥＭを示す。
【図８Ａ】図８Ａ−図８Ｂは写真である。図８Ａは、図２Ｃで示され、骨髄間質細胞が播種され、１４日間静的環境で培養され、ＭＴＴで染色された３ｃｍの長さの絹フィブロインコードを示し、増殖期間後のマトリクスの均一な細胞被覆が示される。
【図８Ｂ】図８Ｂは、ＭＴＴで染色された３ｃｍの長さの絹フィブロインコードの対照ストランドを示す。
【図９Ａ】図９Ａ−図９Ｂはデータのグラフである。図９Ａは２１日の培養期間にわたる総細胞ＤＮＡにより決定される絹フィブロインマトリクス１上での骨髄間質細胞増殖を示すチャートであり、２１日の培養後、細胞増殖が著しく増加することが示されている。
【図９Ｂ】図９Ｂは１４日の培養期間にわたる総細胞ＤＮＡにより決定される絹フィブロインマトリクス２上での骨髄間質細胞増殖を示す棒グラフであり、１４日の培養後、細胞増殖が著しく増加することが示されている。
【図１０】図１０は生理的増殖条件での２１日の培養にわたる、骨髄間質細胞が播種された、または播種されていない、３０絹繊維抽出コンストラクトの最大引張強度を示す。
【図１１Ａ】図１１Ａ−図１１Ｂはデータのグラフである。図１１Ａはインビトロ酵素分解の関数としてのＵＴＳのチャートである；陰性対照、ＰＢＳでは強度損失は観察されなかった。絹は、２１日の培養後、その強度の５０％を失った。Ｓｉｇｍａ製のプロテアーゼＸＩＶの１ｍｇ／ｍｌ溶液を使用した。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、インビトロ酵素分解の関数としての質量損失のチャートである；陰性対照、ＰＢＳでは強度損失は観察されなかった。４１日の培養後、５０％質量損失が観察された。
【図１２】図１２は１０、２０および３０日間の非荷重皮下ラットモデルへのＲＧＤ修飾マトリクス移植後のインビボ分解の関数としてのＵＴＳ損失のチャートである。５０％強度損失がインビボで、非荷重環境で約１０日後に観察された。
【図１３Ａ】図１３Ａ−図１３Ｅは写真、グラフおよび表である。図１３Ａは、Ｌｅｗｉｓラットに皮下移植した後３０日の、１２（０）ｘ３（８）非修飾およびＲＧＤ修飾のセリシンを含まない絹フィブロインマトリクスの組織切片を示す。列Ｉは４０ＸでのＨ＆Ｅ染色であり、列ＩＩは１２８ＸでのＨ＆Ｅ染色であり、列ＩＩＩは１２８Ｘでのコラーゲントリクローム染色であり、列ＩＶは列ＩＩＩ画像から取り消されたコラーゲンであり、コラーゲン内殖定量が可能であり、列Ｖは取り消された残りの絹フィブロインの断面と関連する画素であり分解の定量が可能になる。定性的評価では、皮下環境において、非処理群および修飾群のどちらも、マトリクス自体内での細胞内殖およびコラーゲン沈着をサポートし、末梢封入は制限された。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、定量的に３０日の皮下移植後のＲＧＤ修飾絹断面積の３６％の減少を表し、非処理対照に比べて、表面修飾絹フィブロインマトリクスを分解する宿主の能力の著しい改善が示される。
【図１３Ｃ】図１３Ｃは定量的に非処理対照に比べて、ＲＧＤ修飾フィブロインマトリクス内のコラーゲン沈着の著しい６３％の増加を示し、再び、修飾絹マトリクスの宿主細胞および組織内殖をサポートする能力が証明される。
【図１３Ｄ】図１３ＤはＬｅｗｉｓラットの腹腔内で筋肉内に移植された、抽出された３６繊維フィブロイン織糸のＨ＆Ｅ染色を示す。画像は、非修飾およびＲＧＤ修飾マトリクスの両方に対し４０Ｘおよび１２８Ｘで示される。結果は、定性的に、ＲＧＤ修飾が３０日以内にインビボで細胞および組織浸潤を劇的に増加させたことを示す。黒編組絹縫合糸またはバージンシルク縫合糸とは異なり、末梢封入またはプラズマ細胞は観察されなかった。皮下インプラントに比べ、細胞浸潤およびコラーゲン沈着が非処理対照ではほぼ〜全く観察されず、表面修飾に加えて移植部位の効果が示される。
【図１３Ｅ】図１３Ｅは、非処理対照と比較した２つの異なる修飾群由来のインビボ質量損失の数値表示である。ＲＧＤ修飾、続いて気体プラズマ修飾は、９０日の筋肉内移植後の分解の程度を著しく（ｐ＜０．０５）増加させた。しかしながら、予測されたように、分解は筋肉内環境に比べ皮下環境でより積極的であったと考えられる。
【図１４】図１４は時間経過に伴う選択されたマーカーのＲＴ−ＰＣＲ増幅のゲル電気泳動分析を示す。ゲルは、１４日の培養にわたりマトリクス２上で増殖した骨髄間質細胞によりハウスキーピング遺伝子、ＧＡＰＤＨに対して正規化された、コラーゲンＩおよびＩＩＩ型発現レベルの両方における上方制御を示す。コラーゲンＩＩ型（軟骨に対するマーカーとして）および骨シアロタンパク質（骨組織形成のマーカーとして）は検出されず、マトリクス２と培養させた場合、ＢＭＳＣによる靱帯特異的分化応答が示される。
【図１５Ａ】図１５Ａ−図１５Ｂはウサギモデルにおいて内側側副靱帯（ＭＣＬ）を再建するために使用された、６週間のインビボ移植後のマトリクス１の単一コード（移植時には播種されず）を示す。図１５Ａはヘマトキシリンおよびエオシン染色により可視化された、前駆宿主細胞により囲まれたマトリクス１フィブロイン繊維およびマトリクス中および個々のフィブロイン繊維の周囲への組織内殖を示す。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、トリクローム染色により可視化されたマトリクス中および個々のフィブロイン繊維の周囲へのコラーゲン組織内殖を示す。
【図１６Ａ】図１６Ａ−図１６Ｃはコラーゲン繊維上で播種され、１日（図１６Ａ）および２１日（図１６Ｂ）間に増殖した骨髄間質細胞を示す；ＲＴ−ＰＣＲ（図１６Ｃ）およびコラーゲンＩおよびＩＩＩ発現対ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨのゲル電気泳動分析：ａ＝コラーゲンＩ、１４日；ｂ＝コラーゲンＩ、１８日；ｃ＝コラーゲンＩＩＩ、１４日；ｄ＝コラーゲンＩＩＩ、１８日；ｅ＝ＧＡＰＤＨ、１４日；ｆ＝ＧＡＰＤＨ、１８日。コラーゲンＩＩ型（軟骨のためのマーカーとして）および骨シアロタンパク質（骨組織形成のマーカーとして）は検出されず、靱帯特異的分化応答が示される。
【図１６Ｂ】図１６Ａ−図１６Ｃはコラーゲン繊維上で播種され、１日（図１６Ａ）および２１日（図１６Ｂ）間に増殖した骨髄間質細胞を示す；ＲＴ−ＰＣＲ（図１６Ｃ）およびコラーゲンＩおよびＩＩＩ発現対ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨのゲル電気泳動分析：ａ＝コラーゲンＩ、１４日；ｂ＝コラーゲンＩ、１８日；ｃ＝コラーゲンＩＩＩ、１４日；ｄ＝コラーゲンＩＩＩ、１８日；ｅ＝ＧＡＰＤＨ、１４日；ｆ＝ＧＡＰＤＨ、１８日。コラーゲンＩＩ型（軟骨のためのマーカーとして）および骨シアロタンパク質（骨組織形成のマーカーとして）は検出されず、靱帯特異的分化応答が示される。
【図１６Ｃ】図１６Ａ−図１６Ｃはコラーゲン繊維上で播種され、１日（図１６Ａ）および２１日（図１６Ｂ）間に増殖した骨髄間質細胞を示す；ＲＴ−ＰＣＲ（図１６Ｃ）およびコラーゲンＩおよびＩＩＩ発現対ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨのゲル電気泳動分析：ａ＝コラーゲンＩ、１４日；ｂ＝コラーゲンＩ、１８日；ｃ＝コラーゲンＩＩＩ、１４日；ｄ＝コラーゲンＩＩＩ、１８日；ｅ＝ＧＡＰＤＨ、１４日；ｆ＝ＧＡＰＤＨ、１８日。コラーゲンＩＩ型（軟骨のためのマーカーとして）および骨シアロタンパク質（骨組織形成のマーカーとして）は検出されず、靱帯特異的分化応答が示される。
【図１７】図１７は８．９：１のコラーゲンＩ対コラーゲンＩＩＩ（ＧＡＰＤＨに対し正規化）の転写比が得られた、１４日での実時間定量的ＲＴ−ＰＣＲを示す。
【図１８Ａ】図１８Ａ−図１８Ｃは写真である。図１８Ａおよび図１８Ｂはそれぞれ、筋肉内移植後３０日の、６束の（Ａ）２−０黒編組絹縫合糸および（Ｂ）ＲＧＤ−表面修飾絹（３６繊維／束）のＨ＆Ｅ染色断面である。図１８Ｃは、移植前４週間ＢＭＳＣを前播種させたＲＧＤ修飾絹である。図１８Ａは、市販（Ｅｔｈｉｃｏｎ、Ｉｎｃ．）の黒編組絹縫合糸に対する典型的および広範な異物反応を示し、ここでは内殖または細胞浸潤は観察されない。図１８Ｂは、操作された絹の、細胞および組織内殖を促進する能力を示す。図１８Ａ、１８Ｂおよび１８Ｃはワックス中でコートされた（図１８Ａ）、セリシンが取り去られ、ＲＧＤでコートされた（図１８Ｂ）、およびセリシンが取り去られ前駆成体幹細胞が播種された（図１８Ｃ）、絹繊維コンストラクトに対する組織応答を示す。
【図１８Ｂ】図１８Ａ−図１８Ｃは写真である。図１８Ａおよび図１８Ｂはそれぞれ、筋肉内移植後３０日の、６束の（Ａ）２−０黒編組絹縫合糸および（Ｂ）ＲＧＤ−表面修飾絹（３６繊維／束）のＨ＆Ｅ染色断面である。図１８Ｃは、移植前４週間ＢＭＳＣを前播種させたＲＧＤ修飾絹である。図１８Ａは、市販（Ｅｔｈｉｃｏｎ、Ｉｎｃ．）の黒編組絹縫合糸に対する典型的および広範な異物反応を示し、ここでは内殖または細胞浸潤は観察されない。図１８Ｂは、操作された絹の、細胞および組織内殖を促進する能力を示す。図１８Ａ、１８Ｂおよび１８Ｃはワックス中でコートされた（図１８Ａ）、セリシンが取り去られ、ＲＧＤでコートされた（図１８Ｂ）、およびセリシンが取り去られ前駆成体幹細胞が播種された（図１８Ｃ）、絹繊維コンストラクトに対する組織応答を示す。
【図１８Ｃ】図１８Ａ−図１８Ｃは写真である。図１８Ａおよび図１８Ｂはそれぞれ、筋肉内移植後３０日の、６束の（Ａ）２−０黒編組絹縫合糸および（Ｂ）ＲＧＤ−表面修飾絹（３６繊維／束）のＨ＆Ｅ染色断面である。図１８Ｃは、移植前４週間ＢＭＳＣを前播種させたＲＧＤ修飾絹である。図１８Ａは、市販（Ｅｔｈｉｃｏｎ、Ｉｎｃ．）の黒編組絹縫合糸に対する典型的および広範な異物反応を示し、ここでは内殖または細胞浸潤は観察されない。図１８Ｂは、操作された絹の、細胞および組織内殖を促進する能力を示す。図１８Ａ、１８Ｂおよび１８Ｃはワックス中でコートされた（図１８Ａ）、セリシンが取り去られ、ＲＧＤでコートされた（図１８Ｂ）、およびセリシンが取り去られ前駆成体幹細胞が播種された（図１８Ｃ）、絹繊維コンストラクトに対する組織応答を示す。
【図１９Ａ】図１９Ａ−図１９Ｄはラットモデルに３０日間移植した後の、２つの織糸（４ｘ３ｘ３および１２ｘ３）の４０Ｘ（上列、図１９Ａ＆図１９Ｂ）および１２８Ｘ（底列、図１９Ｃおよび１９Ｄ）でのＨ＆Ｅ染色断面画像を示し、それぞれ、同じ繊維数を含むが、特定の階層により異なって組織化されている。結果から、織糸設計および構造は、細胞および組織内殖の程度に影響を与えることができることが示され、１２ｘ３織糸コンストラクトは内殖を可能にしたが、４ｘ３ｘ３は阻止したようである。
【図１９Ｂ】図１９Ａ−図１９Ｄはラットモデルに３０日間移植した後の、２つの織糸（４ｘ３ｘ３および１２ｘ３）の４０Ｘ（上列、図１９Ａ＆図１９Ｂ）および１２８Ｘ（底列、図１９Ｃおよび１９Ｄ）でのＨ＆Ｅ染色断面画像を示し、それぞれ、同じ繊維数を含むが、特定の階層により異なって組織化されている。結果から、織糸設計および構造は、細胞および組織内殖の程度に影響を与えることができることが示され、１２ｘ３織糸コンストラクトは内殖を可能にしたが、４ｘ３ｘ３は阻止したようである。
【図１９Ｃ】図１９Ａ−図１９Ｄはラットモデルに３０日間移植した後の、２つの織糸（４ｘ３ｘ３および１２ｘ３）の４０Ｘ（上列、図１９Ａ＆図１９Ｂ）および１２８Ｘ（底列、図１９Ｃおよび１９Ｄ）でのＨ＆Ｅ染色断面画像を示し、それぞれ、同じ繊維数を含むが、特定の階層により異なって組織化されている。結果から、織糸設計および構造は、細胞および組織内殖の程度に影響を与えることができることが示され、１２ｘ３織糸コンストラクトは内殖を可能にしたが、４ｘ３ｘ３は阻止したようである。
【図１９Ｄ】図１９Ａ−図１９Ｄはラットモデルに３０日間移植した後の、２つの織糸（４ｘ３ｘ３および１２ｘ３）の４０Ｘ（上列、図１９Ａ＆図１９Ｂ）および１２８Ｘ（底列、図１９Ｃおよび１９Ｄ）でのＨ＆Ｅ染色断面画像を示し、それぞれ、同じ繊維数を含むが、特定の階層により異なって組織化されている。結果から、織糸設計および構造は、細胞および組織内殖の程度に影響を与えることができることが示され、１２ｘ３織糸コンストラクトは内殖を可能にしたが、４ｘ３ｘ３は阻止したようである。
【図２０Ａ】図２０Ａ−図２０Ｃは（Ａ）ファブリック形成後に抽出された、単一繊維がウェットレイドされた不織ファブリック（繊維は最初に抽出され、不織に形成することができる−データ図示せず）、（Ｂ）ファブリック形成後に抽出された１２繊維織糸を用いたチェーンステッチの形態から生成された編みファブリック、（Ｃ）ウエフト方向に走る３６繊維の前抽出された織糸を有する前抽出された１２繊維織糸から生成された織ファブリックの写真である。
【図２０Ｂ】図２０Ａ−図２０Ｃは（Ａ）ファブリック形成後に抽出された、単一繊維がウェットレイドされた不織ファブリック（繊維は最初に抽出され、不織に形成することができる−データ図示せず）、（Ｂ）ファブリック形成後に抽出された１２繊維織糸を用いたチェーンステッチの形態から生成された編みファブリック、（Ｃ）ウエフト方向に走る３６繊維の前抽出された織糸を有する前抽出された１２繊維織糸から生成された織ファブリックの写真である。
【図２０Ｃ】図２０Ａ−図２０Ｃは（Ａ）ファブリック形成後に抽出された、単一繊維がウェットレイドされた不織ファブリック（繊維は最初に抽出され、不織に形成することができる−データ図示せず）、（Ｂ）ファブリック形成後に抽出された１２繊維織糸を用いたチェーンステッチの形態から生成された編みファブリック、（Ｃ）ウエフト方向に走る３６繊維の前抽出された織糸を有する前抽出された１２繊維織糸から生成された織ファブリックの写真である。
【図２１】図２１は生体適合性および生分解性絹フィブロインマトリクスを生成するために使用することができる様々な方法および配列のフローチャートである。例えば、単一繊維を抽出し、ツイストして織糸とし、編んでファブリックとし、または織糸を撚り、撚られた織糸をツイストし、ファブリックを形成させ、その後抽出する。ほとんど無限の組み合わせが存在するが、全て、表４、６、７、および８に示されるように、織糸の階層、１レベルあたりの繊維数および１レベルあたりのＴＰＩに依存する。
【図２２Ａ】図２２Ａ−図２２Ｂは本発明による、豊胸または再建手順のための移植可能なプロステーシスの線図を示す。
【図２２Ｂ】図２２Ａ−図２２Ｂは本発明による、豊胸または再建手順のための移植可能なプロステーシスの線図を示す。
【図２３Ａ】図２３Ａ−図２３Ｂは描画である。図２３Ａは、本発明の１つの実施形態による、垂直サポートを提供する移植位置での、図２２Ａおよび２２Ｂの移植可能なプロステーシスの線図を示す。
【図２３Ｂ】図２３Ｂは、本発明の別の実施形態による、内側または外側サポートを提供する移植位置での、図２２Ａおよび２２Ｂの移植可能なプロステーシスの線図を示す。
【図２４】図２４は本発明の１つの実施形態による、三日月形状を有する、豊胸または再建手順のための移植可能なプロステーシスの線図を示す。
【図２５】図２５は本発明の１つの実施形態による、細長いまたは楕円形状を有する、豊胸または再建手順のための移植可能なプロステーシスの線図を示す。
【図２６】図２６は本発明の１つの実施形態による、スリング形態の、豊胸または再建手順のための移植可能なプロステーシスの線図を示す。
【図２７】図２７は本発明の１つの実施形態による、移植可能なストリップまたはテープの形態の、豊胸または再建手順のための移植可能なプロステーシスの線図を示す。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６０】
他の用途では、材料はほとんど弾性を有さず、大きな強度を有するべきである。そのようなファブリックでは、太い織糸の高密度織りが適切であり、標準の織ファブリック（図２０Ｃ）と同様の材料が生成される。そのような材料は任意でコーティング処理または熱処理により補完することができ、織糸セグメントの重複部分が貼り合わせられ、よってほぐれおよびストレッチの両方が防止される。熱処理は絹タンパク質を完全に変性させてはならない。ファブリックは任意で、ポリプロピレンメッシュで現在実施されているように、所定の位置に縫いつけられ、糊付けされまたはステープルでとめることができる。インプラントは、記載される他の型のいずれかのように、局所治癒および組織内殖過程を増強させる様々な材料で、および／または修復部位の内蔵への癒着を防止するコーティングでコートすることができる。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６６】
多くの場合、医療機器またはプロステーシスの形成には単一のファブリック型のみが使用されるが、場合によっては、２つ以上の型のファブリックを単一の装置において使用するのが有用であり得る。例えば、ヘルニア修復では、修復ファブリックの組織に面する側は細胞を誘引することが望ましく、腹膜面は細胞を忌避し、癒着を防止するべきである。この効果は、細胞を誘引しない絹の１つの層、および誘引する別の層（例えば、下記実施例におけるように、非処理層およびＲＧＤ含有層）を有することにより達成することができる。別の例は、膀胱スリングの形成を含む。基本的なスリングは適合し、幾分弾力があり、長い推定寿命を有するべきである。しかしながら、膀胱に最も近いスリングの面は、実現可能限り少ないテクスチャーを有するべきである。これは、本発明の、小さな直径を有する織糸（例えば、単一繊維）から作製された、薄いが堅く織られた、不織または編まれたファブリックの層を、スリング内の、膀胱と接触する場所に配置することにより達成することができる。不織ファブリックは、実現可能な限り小さなゲージ（デニール）を有するべきである。２つ以上の型のファブリックを必要とする多くの他の状況がありうる。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６８】
別の例では、精製された絹フィブロイン原繊維を細胞誘引剤（表９）で処理した。最初に、織糸を、絹フィブロインの精製された繊維を共にツイストすることにより生成させた。いくらかの織糸は、Sofia et al, J. Biomed. Mater. Res. 54: 139-148, 2001において記載される手順を使用して、細胞を誘引するためにペプチドＲＧＤで誘導体化されたフィラメントから作製した。処理済みおよび非処理（黒編組絹縫合糸）織糸の切片をラットの腹腔壁に移植した（図１８Ａ−Ｃ）。３０日の移植後、黒編組縫合糸は緻密な原繊維束を含み、原繊維束間で細胞浸潤があったが、その内部にはなかった。対照的に、ＲＧＤ処理原繊維束は、宿主細胞により広範に浸潤され、膨潤し、緻密ではなくなった（図１３Ａ−Ｅ、１８Ｂ）が、依然として有意に分解されなかった（図１３Ａ−Ｅ）。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５９】
幹細胞源として使用される場合、脂肪組織は、当業者に知られている任意の方法により得ることができる。例えば、脂肪組織は、吸引による脂肪組織除去、超音波による脂肪組織除去、および切除脂肪吸引により患者から除去することができる。さらに、手順は、そのような手順の組み合わせを含むことができる。吸引による脂肪組織除去は、脂肪組織を患者から除去するのに望ましい。というのも、幹細胞損傷の可能性が最初に抑えられ、他の技術、例えば超音波による脂肪組織除去と組み合わせることができる、組織を収集する低侵襲方法を提供するからである。脂肪組織は、細胞構成要素の生存率を保存し、潜在的な感染性生物、例えば細菌および／またはウイルスによる組織の汚染の可能性を最小に抑えるように収集されるべきである。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６０】
いくつかの用途では、活性細胞集団の調製は、脂肪組織の成熟脂肪蓄積脂肪細胞構成要素の欠乏が要求され得る。これは、典型的には、一連の洗浄および脱凝集工程により達成され、これらの工程では、組織を最初にすすぎ、遊離脂質（破裂した脂肪細胞から放出）および末梢血液要素（組織収集中に切断された血管から放出）の存在を減少させ、その後、脱凝集させ、無傷脂肪細胞および他の細胞集団を結合組織マトリクスから取り除く。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２４４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２４４】
【表９】
2013533761.tif 000001
【手続補正１３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１３Ａ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１３Ａ】
2013533761.tif 000002
【手続補正１４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１３Ｂ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１３Ｂ】
2013533761.tif 000003
【手続補正１５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１３Ｃ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１３Ｃ】
2013533761.tif 000004
【手続補正１６】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１３Ｄ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１３Ｄ】
2013533761.tif 000005
【手続補正１７】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１３Ｅ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１３Ｅ】
2013533761.tif 000006
【手続補正１８】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２１】
2013533761.tif 000007