(57)【要約】【課題】  天然ＶＥＧＦよりも低い親和性をもってヘパリンと結合する特定を持つ新たな天然の血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）の変異体およびそれをコードする核酸分子を提供する。【解決手段】  本発明は、Ｃ末端ヘパリン結合ドメインに特定の構造変化を含むヘパリン結合性ＶＥＧＦ変異体であり、天然ＶＥＧＦよりも低い親和性をもってヘパリンと結合する特定を持つ。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
天然の血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）のＣ末端ヘパリン結合ドメインにおける構造変化を含む、天然ＶＥＧＦよりも低い親和性をもってヘパリンと結合するヘパリン結合性ＶＥＧＦ変異体であって、
a)  １つまたはそれ以上の正に荷電したアミノ酸が負に荷電したアミノ酸または電気的に中性のアミノ酸に置換されていること、
b)  １つまたはそれ以上の正に荷電したアミノ酸が欠失していること、
c)  １つまたはそれ以上のジスルフィド結合が破壊されていること、または
d)  それらの組合わせ
を含む変異体、をコードする配列を含む単離された核酸分子。
【請求項２】
１つまたはそれ以上のアルギニンまたはリジン残基が置換されている、請求項１記載の単離された核酸分子。
【請求項３】
１つまたはそれ以上のアルギニンまたはリジン残基が欠失している、請求項１記載の単離された核酸分子。
【請求項４】
１つまたはそれ以上のジスルフィド結合がタンパク質分解的開裂によって破壊されている、請求項１記載の単離された核酸分子。
【請求項５】
１つまたはそれ以上のジスルフィド結合が１つまたはそれ以上のシステイン残基の欠失によって破壊されている、請求項１記載の単離された核酸分子。
【請求項６】
１つまたはそれ以上のジスルフィド結合が１つまたはそれ以上のシステイン残基の置換によって破壊されている、請求項１記載の単離された核酸分子。
【請求項７】
ＶＥＧＦ変異体が、天然ＶＥＧＦと比較して低下したクリアランス速度を持つ、請求項１から６までのいずれか記載の単離された核酸分子。
【請求項８】
天然の血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）のＣ末端ヘパリン結合ドメインにおける構造変化を含む、天然ＶＥＧＦよりも低い親和性をもってヘパリンと結合する精製されたヘパリン結合性ＶＥＧＦ変異体であって、
a)  １つまたはそれ以上の正に荷電したアミノ酸が負に荷電したアミノ酸または電気的に中性のアミノ酸に置換されていること、
b)  １つまたはそれ以上の正に荷電したアミノ酸が欠失していること、
c)  １つまたはそれ以上のジスルフィド結合が破壊されていること、または
d)  それらの組合わせ
を含む変異体。
【請求項９】
１つまたはそれ以上のアルギニンまたはリジン残基が置換されている、請求項８記載のＶＥＧＦ変異体。
【請求項１０】
１つまたはそれ以上のアルギニンまたはリジン残基が欠失している、請求項８記載のＶＥＧＦ変異体。
【請求項１１】
１つまたはそれ以上のジスルフィド結合がタンパク質分解的開裂によって破壊されている、請求項８記載のＶＥＧＦ変異体。
【請求項１２】
１つまたはそれ以上のジスルフィド結合が１つまたはそれ以上のシステイン残基の欠失によって破壊されている、請求項８記載のＶＥＧＦ変異体。
【請求項１３】
１つまたはそれ以上のジスルフィド結合が１つまたはそれ以上のシステイン残基の置換によって破壊されている、請求項８記載のＶＥＧＦ変異体。
【請求項１４】
天然ＶＥＧＦと比較して低下したクリアランス速度を持つ、請求項８から１３までのいずれか記載のＶＥＧＦ変異体。
【請求項１５】
請求項８から１４までのいずれか記載のＶＥＧＦ変異体、および製薬上許容できる担体を含む組成物。
【請求項１６】
請求項８から１４までのいずれか記載のＶＥＧＦ変異体を含む、脈管形成または血管新生を促進させる必要のある患者を処置するための医薬品。
【請求項１７】
請求項８から１４までのいずれか記載のＶＥＧＦ変異体を含む、内皮細胞増殖を促進させるための医薬品。
【請求項１８】
請求項８から１４までのいずれか記載のＶＥＧＦ変異体を含む、血管網への外傷を処置するための医薬品。
【請求項１９】
外傷が創傷、潰瘍または外科的切開である、請求項１８記載の医薬品。
【請求項２０】
創傷が血管の裂傷、切開または貫通である、請求項１９記載の医薬品。
【請求項２１】
潰瘍が糖尿病性潰瘍、血友病性潰瘍または静脈瘤潰瘍である、請求項１９記載の医薬品。
【請求項２２】
外科的切開が心臓に関するものである、請求項１９記載の医薬品。
【請求項２３】
請求項８から１４までのいずれか記載のＶＥＧＦ変異体を含む、ＶＥＧＦの生体内クリアランス速度を低下させるための医薬品であって、製薬上許容できる担体にＶＥＧＦ変異体を調合することにより調製され、該ＶＥＧＦ変異体がヘパリンおよび／またはヘパリン様化合物と共に全身投与される医薬品。
【請求項２４】
請求項８から１４までのいずれか記載のＶＥＧＦ変異体を含む、ＶＥＧＦの血漿濃度を増大させるための医薬品であって、製薬上許容できる担体にＶＥＧＦ変異体を調合することにより調製され、該ＶＥＧＦ変異体がヘパリンおよび／またはヘパリン様化合物と共に全身投与される医薬品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は次の特許出願に関連する内容を含む：米国出願第08/691791号（1996年8月2日出願）、米国出願第08/567200号（1995年12月5日出願）、米国出願第60/002827号（1995年8月25日出願）、米国出願第07/389722号（1989年8月4日出願；現在は米国特許第5332671号）、米国出願第07/369424号（1989年6月21日出願）、米国出願第07/351117号（1989年5月12日出願）、米国出願第08/734443号（1996年10月17日出願）および米国出願第08/643839号（1996年5月7日出願）。
本願は1997年2月14日に出願された米国出願第08/802,052号の35 U.S.C.120/121に基づく継続出願である。
【０００２】
本発明は1）血管内皮細胞増殖因子（以下VEGFという場合もある）と2）血管内細胞鎖増殖因子特定変異体のクリアランス速度を低下させる方法に向けられ、またそれら変異体に関して、それらの製造法と、それら変異体を、その親化合物VEGFと少なくとも実質上本質的には異ならない治療特性を持つが、親化合物VEGFとは異なる薬理学的特性を持つ医薬活性物質の生産に使用するための方法、組成物および測定法に関する。具体的に述べると、上記変異体を用いる測定法は、VEGFに対してアゴニスト特性またはアンタゴニスト特性を持つ新規物質の発見に使用できる。
【０００３】
VEGFと本発明VEGF変異体を使用する方法は、天然物質と比較して明らかに遅いクリアランス速度を示し、そのような低下したクリアランス速度ゆえに低用量で使用できることから、全身投与にとって有用でおそらくはより安全な代替法となり、それゆえVEGFとVEGF変異体による治療法は、より持続的な治療効果を与えうる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、上に概論したように、一側面として、C末端ヘパリン結合ドメインに修飾を持つ血管内皮細胞増殖因子（VEGF）変異体の提供によって達成され、該変異体は一般に天然VEGFより低い用量での全身投与で低下したクリアランス速度を示すため、より長く治療効果を与えうる変異体になる。
【０００５】
好ましい態様として、そのような修飾は、アミノ酸121付近からアミノ酸165付近にまたがるC末端ヘパリン結合ドメインの領域内、より好ましくは位置125と147のプロテアーゼ感受性部位付近、および/または、構造変化が機能的結合特性を変化させる上記ドメイン内の他の部位（例えば正に荷電したアミノ酸の位置など）で起こる構造変化をもたらす。
【０００６】
本発明変異体は、DNAの組換え発現がVEGF変異体（そのC末端ヘパリン結合ドメインは欠失を含有し、その結果、治療結果に影響を及ぼす変化した薬理学的特性を持つ）を与えるように、利用できる手段と技術を使ってC末端ドメインに欠失をもつDNAを用意することにより、組換えDNA技術で製造できる。また、そのような変異体は、C末端部（主として塩基性アミノ酸を含有するドメイン）での蛋白質分解的切断を引き起こしてC末端ヘパリン結合ドメイン欠失変異体をもたらす組換え系からも単離できる。また、そのようなC末端欠失変異体は、例えばカルボキシペプチダーゼB処理の産物でもある。
他の側面として、本発明は、上述した様々な変異体をコードするDNA配列、形質転換宿主細胞へのDNAの導入によって該DNA配列を発現させうる複製可能な発現ベクターならびに該ベクターで形質転換された微生物および細胞培養に関する。
【０００７】
本発明は、そのさらなる側面として、上述したDNAの組換え発現に有用な方法（回収の一部としての単離および精製法を含む）に向けられる。
さらなる側面として、本発明は、根底にある疾患状態の治療にとって脈管形成または血管形成が望しい適応症の治療に有用な、製薬上許容できる担体と混合された治療有効量の本発明VEGF変異体を含む組成物（有利なことに、これは本発明の変異体が低下したクリアランス速度を示すため、一般に低用量型である）に向けられる。したがって本発明はVEGFの変異体を提供し、それらが示す低下したクリアランス速度は、結果として、より低い用量でより長く治療効果をもたらしうる、より安全な代替的全身投与を提供するという効果を与える。また、ヘパリンドメイン修飾変異体の非標的組織への非特異的結合の減少により、潜在的毒性副作用の減少が予想される。
【０００８】
このように本発明は、VEGF変異体分子のヘパリン結合特性の機能的変化をもたらす構造変化を持つVEGF C末端ヘパリン結合ドメイン変異体に向けられる。そのような構造変化は、例えば種々の蛋白質分解部位での内部切断および/または種々の突然変異によって付与されうる。例えば構造変化は、負に荷電したまたは電気的に中性のアミノ酸による主として正に荷電したアミノ酸の置換により、および/または、例えばアミノ酸の欠失、置換などによって誘導体をもたらす他の突然変異により、そのドメインのイオン性電荷の変化を指示することがあり、またおそらくはそうするだろう。
【０００９】
このような構造変化はすべて、結果として、ヘパリン結合特性に影響を及ぼす変化したコンフォメーション構造を持つ分子をもたらすと考えられる。ヘパリン結合ドメインは著しく正に荷電したドメインであるので、ヘパリンとの結合特性はイオン相互作用であると考えられる。したがってイオン相互作用に影響を及ぼすであろう構造変化は結果として結合に影響するだろう。したがって、ヘパリン結合への影響をもたらすこのような構造変化は、いずれも本発明の範囲に含まれる。すなわち、そのような本発明VEGF変異体は機能的効果を示す。本発明のこの側面の主な指令の一つは、VEGFのヘパリン結合ドメインにおける総正電荷発現を減少させることである。ヘパリン硫酸プロテオグリカンは総負電荷を示し、それらの先祖血管細胞と結合する。このように、これらプロテオグリカンのVEGFとのイオン結合は、ヘパリン包含複合体を介して、それらを上記血管細胞または赤血球と結合させる。したがって本発明VEGF変異体が示すヘパリン結合ドメインの総正電荷の減少は上述の結合を抑制し、それら変異体を循環血漿中に残留させ、生物学的クリアランス機構から排除する。
【００１０】
VEGFのC末端ヘパリン結合ドメイン欠失変異体の発見に基づく本発明の基本的前提の下に発展して、本発明は、例えばそれら変異体を製造するための組換えDNA物質と方法、それら変異体を医薬として加工された形態に調合するための材料と情報、それら変異体を使った種々の測定法など、そこから派生する全ての関連態様に向けられる。
さらに本発明は、ヘパリンが（ヘパリンをVEGFと同時投与した場合は特に）生体内でVEGFの薬物動態を有意に変化させるという発見に基づいている。
【００１１】
ヘパリンは、高度に脈管化された器官（例えば周知のクリアランス器官である肝臓）へのVEGFの分布を、VEGFのヘパリン硫酸プロテオグリカンとのイオン結合相互作用を遮断することによって妨害することが見出された。したがって、本発明VEGF変異体に関して上に議論したように、ヘパリンはVEGFの血管細胞または赤血球との結合を減少させる働きをして、VEGFを循環血漿中に留めて、生物学的クリアランス機構から排除する。
このように生体内でのヘパリンのVEGFとの同時投与または少なくとも同時存在は、血漿中のVEGF濃度を上昇させる。したがって、VEGFは血漿中で持続的な高濃度を示し、クリアランス速度の低下をもたらす。
【００１２】
したがって本発明のこの側面は、VEGFをヘパリンおよび/またはヘパリン様化合物と実質的上同時に全身投与することからなる生体内でのVEGFのクリアランス速度を低下させる方法に向けられる。
このように、本発明の主な側面のそれぞれでは、VEGFおよび/またはVEGF変異体による治療法の全身投与における利点が明白であり、例えばヘパリン硫酸プロテオグリカンによって媒介されるようなVEGF分子の血管細胞との（本来の）結合への干渉は、循環血漿におけるVEGF分子の分布を増加させ、その結果、低下したクリアランス速度によって表される持続的治療効果をもたらす。
包括的に繰り返すと、本発明は、VEGFの生体内でのクリアランス速度を低下させる方法であってVEGFをヘパリンおよび/またはヘパリン様化合物と実質上同時に全身投与することからなる方法と、本発明VEGF変異体の生体内でのクリアランス速度を低下させる方法であって該VEGF変異体を全身投与することからなる方法に向けられる。
【００１３】
発明の詳しい説明
A．定義
本明細書において「血管内皮細胞増殖因子」または「VEGF」とは、米国特許5,332,671に定義される哺乳類増殖因子を指し、図1のヒトアミノ酸配列を含む。天然VEGFの生物学的活性は、血管内皮細胞の選択的増殖を促進できるがウシ角膜内皮細胞、水晶体上皮細胞、副腎皮質細胞、BHK-21繊維芽細胞またはケラチン生成細胞の増殖を促進できないその任意の類似体または変異体、もしくは対応する天然VEGFの少なくとも1つのエピトープに対して生じた抗体と免疫学的に交差反応する免疫エピトープを持つその類似体または変異体のいずれにも共通する。
【００１４】
「変異体」という用語は、C末端ヘパリン結合ドメインに薬理動態特性の機能的修飾（すなわち天然物と比較して低下したクリアランス速度を持つ分子の生成）をもたらす修飾を含有するVEGF分子を指す。そのような修飾は得られた変異体のコンフォメーション構造に影響を及ぼすと考えられるので、そのような「修飾」に関して「構造変化」という用語を使用する。これらの修飾は、天然物に見出されるものとは異なるアミノ酸を持つ分子が生成するようなDNA突然変異誘発の結果でありうる。具体的に述べると、C末端ヘパリン結合ドメインは比較的多数の正に荷電したアミノ酸を含有するので、このドメインのヘパリンとの結合はイオン相互作用に基づくと考えられる。したがって好ましい態様では、正に荷電したアミノ酸が、負に荷電したアミノ酸または電気的に中性なアミノ酸で置換されるだろう。また、この分子はC末端ヘパリン結合ドメインの一部を欠失させることによって修飾されうる。さらにまた、C末端ヘパリン結合ドメインの様々な切断部位での蛋白質分解的切断は、クリアランス速度の低下をもたらす修飾を持つVEGF変異体を与える。したがって本発明の一側面は、影響を受けた薬物動態特性を持つ分子をもたらす、VEGFのC末端ヘパリン結合ドメインへの任意の修飾（すなわち機能的定義）に向けられる。
【００１５】
VEGFとヘパリンおよび/またはヘパリン様化合物の同時全身投与に向けられる本発明の側面に関して「実質上」という用語は、上述したように、ヘパリンがVEGFのプロテオグリカンとの結合を妨害するのに利用されうるようにそれらの生体内での同時存在をもたらす、これら2つの主要成分の投与法を指す。ヘパリン様化合物とはヘパリンに似た生物学的挙動を示す化合物を指し、例えばデキストラン硫酸はヘパリンと同様に挙動してイオン相互作用を遮断する。
【００１６】
「トランスフェクション」とは、何らかのコード配列が実際に発現されるか否かにかかわらず、宿主細胞による発現ベクターの取り込みを指す。当業者には、例えばCaPO4やエレクトロレーションなど、数多くのトランスフェクション法が知られている。トランスフェクションの成功は、一般に、そのベクターの作用の何らかのしるしが、その宿主細胞内で起こるときに認識される。
【００１７】
「形質転換」とは、DNAを、そのDNAが染色体外要素としてまたは染色体組込みによって複製できるように、ある生物に導入することをいう。形質転換は、使用する宿主細胞に応じて、その細胞に適した標準的技術を用いて行われる。Cohen,S.N. Proc.Natl.Acad.Sci.（USA）69,2110（1972）やMandelら,J.Mol.Biol.53,154（1970）に記述されているような塩化カルシウムを用いるカルシウム処理は、原核生物または堅固な細胞壁境界を含む他の細胞に広く使用されている。そのような細胞壁を持たない哺乳類細胞には、Graham,Fおよびvan der Eb,A.,Virology,52,456-457（1978）のリン酸カルシウム沈澱法が好ましい。哺乳類細胞宿主系形質転換の一般的側面については、Axelが米国特許第4,399,216号（1983年8月16日発行）に記述している。酵母への導入（形質転換）は、通例、Van Solingen,P.ら,J.Bact.,130,946（1977）とHsiao,C.L.ら,Proc.Natl.Acad.Sci.（USA）76,3829（1979）の方法に従って行われる。ただし、DNAを細胞に導入する他の方法、例えば核注入やプロトプラスト融合などによる方法も使用できる。
【００１８】
「部位特異的突然変異誘発」は、当技術分野では標準的な技術であり、突然変異させようとする一本鎖ファージDNAに対して目的の突然変異に相当する限定されたミスマッチ以外は相補的な合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いて行われる。簡単に述べると、合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして、ファージに相補的な鎖の合成を行い、得られた二本鎖DNAをファージ維持宿主細菌に導入する。形質転換された細菌の培養を上層寒天に播種し、ファージを保持する単一細胞からプラークを形成させる。理論的には、新しいプラークの50%が突然変異型を一本鎖として有するファージを含有し、50%が元の配列を持つだろう。それらのプラークを、キナーゼ処理した合成プライマーと、正確な対合のハイブリダイゼーションは可能であるが元の鎖とのミスマッチがハイブリダイゼーションを妨害するのに十分であるような温度で、ハイブリダイズさせる。次に、そのプローブとハイブリダイズするプラークを選択し、培養して、そのDNAを回収する。
【００１９】
「作動可能に連結された（operably liked）」とは、構成要素の正常な機能が行われうるような並置を指す。したがって、制御配列に「作動可能に連結された」コード配列とは、そのコード配列がそれら配列の制御下に発現されうるような、また連結されたDNA配列が連続的であるような（分泌リーダーの場合は連続的かつ解読相が一致するような）配置を指す。例えばプレ配列または分泌リーダーのDNAは、それがあるポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現されるのであれば、そのポリペプチドのDNAに作動可能に連結されている。プロモーターまたはエンハンサーは、それがあるコード配列の転写に影響を及ぼすのであれば、そのコード配列に作動可能に連結されている。また、リボソーム結合部位は、それが翻訳を促進するような位置にあるのであれば、コード配列に作動可能に連結されている。連結は都合のよい制限部位での連結（ライゲーション）によって達成される。そのような部位が存在しない場合は、常法に従って合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを使用する。
【００２０】
「制御配列」とは、特定の宿主生物における作動可能に連結されたコード配列の発現に必要なDNA配列を指す。原核生物に適した制御配列には、例えばプロモーター、随意にオペレーター配列、リボソーム結合部位、そしてもしかするとまだよく理解されていない他の配列が含まれる。真核細胞はプロモーター、ポリアデニル化シグナルおよびエンハンサーを利用することがわかっている。
【００２１】
「発現系」とは、目的のコード配列と制御配列を含むDNA配列であって、そのコード配列と制御配列が、それらの配列で形質転換された宿主がコードされているそのタンパク質を生産することができるように作動可能に連結されているものを指す。形質転換を達成するには発現系をベクターに含めうるが、関連DNAが続いて宿主染色体に組込まれてもよい。
【００２２】
本明細書において「細胞」「細胞系」および「細胞培養」という用語は互換的に使用され、このような用語はいずれも子孫を含む。したがって「形質転換体」または「形質転換細胞」という用語は、初代対象細胞とそこから得られる培養を、その継代数にかかわらず包含する。また、すべての子孫は、意図的な突然変異または偶然の突然変異により、そのDNA内容が正確には同一でない場合もあると解される。元の形質転換細胞中で選択の対象としたものと同じ機能性を持つ突然変異体子孫は包含される。別個の指定が意図される部分は、その文脈から明らかになるだろう。
【００２３】
「プラスミド」は小文字pとその前後に添えた大文字および/または数字によって指定される。ここに記載する出発プラスミドは市販されているか、公的に無制限に入手できるか、またはそれら入手可能なプラスミドから公表された方法に従って構築できる。また、他の等価なプラスミドも当技術分野では知られており、それらは当業者には容易にわかるだろう。
【００２４】
DNAの「消化」とは、そのDNAの一定の位置でのみ作用する酵素によるDNAの触媒的切断をいう。そのような酵素は制限酵素と呼ばれており、各制限酵素が特異性を示す部位は制限部位と呼ばれる。ここで使用される種々の制限酵素は市販されており、それらの反応条件、補因子および他の必要条件は、その酵素の供給者によって確立されたものを使用する。制限酵素は通常、各制限酵素が最初に得られた微生物を表わす大文字とそれに続く他の文字、次いでその酵素を指定する数字からなる略号によって指定される。一般的には、約1mgのプラスミドまたはDNA断片を、約1〜2単位の酵素と共に、約20mlの緩衝液中で使用する。特定の制限酵素に適した緩衝液と基質量は、その製造者によって指定される。通常は、37℃で約1時間のインキュベーションを使用するが、これは供給者の指示に従って変動しうる。インキュベーション後、フェノールとクロロホルムを用いた抽出によってタンパク質を除去し、消化された核酸をエタノールでの沈澱によって水性画分から回収する。DNA断片の2つの制限切断末端が「環化」または閉環を形成してその制限部位への別のDNA断片の挿入を妨害するのを防止するために、制限酵素による消化後に、まれに、その末端5'リン酸基を細菌アルカリ性ホスファターゼで加水分解することもある。特に断らない限り、プラスミドの消化後に5'末端脱リン酸化を行なわない。脱リン酸化の方法と試薬は従来のものである（T.Maniatisら,1982,Molecular Cloning:A Laboratory Manual（ニューヨーク：コールドプスリングハーバー研究所,1982）の133-134頁ページ）。
【００２５】
所定のDNA断片の制限消化物からの「回収」または「単離」とは、その消化物のポリアクリルアミドまたはアガロースゲルにおける電気泳動による分離、既知の分子量を持つマーカーDNA断片と移動度を比較することによる目的の断片の同定、所望の断片を含有するゲル切片の切り出し、およびDNAからのゲルの分離を意味する。この方法は広く知られている。例えば、R.Lawnら,Nucleic Acids Res.9,6103-6114（1981）やD.Goeddelら,Nucleic Acids Res.8,4057（1980）を参照されたい。
【００２６】
「サザン分析」は、消化物またはDNA含有組成物中のDNA配列の存在を、既知の標識オリゴヌクレオチドまたはDNA断片へのハイブリダイゼーションによって確認する方法である。本明細書では、特に断わらない限り、サザン分析とはE.Southern,J. Mol. Biol.98,503-517（1975）の方法による1%アガロースでの消化物の分離、変性およびニトロセルロースへの転写、ならびにT.Maniatisら,Cell 15,687-701（1978）に記述されているようなハイブリッダイゼーションを意味するものとする。
【００２７】
「連結（ライゲーション）」とは、2つの二本鎖核酸断片間にリン酸ジエステル結合を形成させる過程をいう（T.Maniatisら,1982,前掲,146頁）。特に断わらない限り、連結は、ほぼ等量の連結しようとするDNA断片0.5mgあたり10単位のT4 DNAリガーゼ（「リガーゼ」）を用いて、既知の緩衝液と条件で行ないうる。
形質転換体からのDNAの「調製」とは、微生物培養からプラスミドDNAを単離することを意味する。特に断わらない限り、Maniatisら,1982,前掲,90頁のアルカリ/SDS法を使用できる。
【００２８】
「オリゴヌクレオチド」は、既知の方法（例えばEP特許公開第266,032号（1988年5月4日公開）に記述されているような固相法を用いるリン酸トリエステル、ホスファイトまたはホスホルアミダイト化学法や、Froehlerら,Nucl.Acids Res.14,5399-5407 [1986]に記述されているようなデオキシヌクレオシドH-ホスホネート中間体を経由する方法など）によって化学的に合成される短い一本鎖または二本鎖ポリデオキシヌクレオチドである。これらは合成に続いてポリアクリルアミドゲルで精製される。
【００２９】
B．一般的方法論
1．糖鎖付加
VEGFアミノ酸配列変異体は、N結合によって糖鎖付加される可能性があって、しかも天然分子では本来糖鎖付加されていない少なくとも1つのアミノ酸配列を含有しうる。
【００３０】
2．アミノ酸配列変異体
a．付加的突然変異
ここに記述するVEGF変異体を手短に指定するために、番号は推定成熟VEGFのアミノ酸配列に沿ったアミノ酸残基/位置を指すことを強調しておく。アミノ酸の指定には、アミノ酸の一文字アルファベット、すなわち、
【表１】
2004194665.tif 000002
を使用する。
【００３１】
本発明はVEGFのC末端ヘパリン結合ドメイン変異体に向けられる。本発明の属性を形成するこれらの変異体は、VEGF分子の主鎖に、そのVEGF基準変異体の生物学的性質に本質的に影響を及ぼさない追加の変異を含有してもよい。
【００３２】
C末端ヘパリン結合ドメイン欠失変異体に関して、本発明の思想から逸脱することなく、そのVEGF分子中の他の位置で一定の他の変異を形成させうることは理解されるだろう。したがって、やはりC末端欠失に関してその基準変異体の総合的な特性に影響を及ぼすことなく興味深い特性を付与するべく、点突然変異または他のより広範な変異を、その分子の他の全ての部分に形成させうる。これら後者の変異は、等技術分野で広く知られている手段で形成させうる。例えば、種々のアミノ酸残基に共有結合修飾を施しうる。
【００３３】
システイニル残基は、最も一般的には、クロロ酢酸やクロロアセトアミドなどのα-ハロ酢酸類（および対応するアミン）と反応させて、カルボキシメチルまたはカルボキシアミドメチル誘導体にする。システイニル残基はブロモトリフルオロアセトン、α-ブロモ-β-(5-イミドゾイル)ピロピオン酸、リン酸クロロアセチル、N-アルキルマレイミド、3-ニトロ-2-ピリジルジスルフィド、メチル2-ピリジルジスルフィド、p-クロロメルクリベンゾエート、2-クロロメルクリ-4-ニトロフェノールまたはクロロ-7-ニトロベンゾ-2-オキサ-1,3-ジアゾールとの反応によっても誘導体化される。
【００３４】
ジエチルピロカーボネートはヒスチジル側鎖に対して比較的特異的なので、ヒスチジル残基はpH5.5〜7.0におけるこの試薬との反応によって誘導体化される。p-ブロモフェナシルブロミドも有用であり、その反応はpH6.0の0.1Mカコジル酸ナトリウム中で行なうことが好ましい。
リジニル残基とアミノ末端残基は無水コハク酸または他のカルボン酸無水物と反応させる。これらの試薬による誘導体化は、リジニル残基の電荷を反転させるという効果を持つ。α-アミノ含有残基の誘導体化に適した他の試薬には、ピコリンイミド酸メチルなどのイミドエステル；ピリドキサルリン酸；ピリドキサル；クロロボロヒドリド；トリニトロベンゼンスルホン酸；O-メチルイソ尿素；2,4-ペンタンジオン；およびグリオキシレートを用いるトランスアミナーゼ触媒反応がある。
【００３５】
アルギニル残基は1種類または数種類の従来試薬（例えばフェニルグリオキサール、2,3-ブタンジオン、1,2-シクロヘキサンジオン、ニンヒドリンなどがある）との反応によって修飾される。グアニジン官能基のpKaは高いので、アルギニン残基を誘導体化するには、その反応をアルカリ条件下で行なう必要がある。さらにまた、これらの試薬はリジンまたはアルギニンの原子団およびε-アミノ基とも反応しうる。
チロシル残基の特異的修飾自体は、芳香族ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンとの反応によってチロシル残基に光学標識を導入するという特別な関心を持って、広範に研究されている。最も一般的には、N-アセチルイミジゾールとテトラニトロメタンを使って、それぞれO-アセチルチロシル種と3-ニトロ誘導体を形成させる。ラジオイムノアッセイで使用される標識タンパク質を調製するには、125Iまたは131Iを使ってチロシル残基をヨウ素化する。この場合、上述のクロラミンT法が好適である。
【００３６】
カルボキシル側鎖基（アスパルチルまたはグルタミル）は、1-シクロヘキシル-3-(2-モルホリニル-(4-エチル)カルボジイミドや1-エチル-3-(4-アゾニア-4,4-ジメチルペンチル)カルボジイミドなどのカルボジイミド（R'-N-C-N-R'）との反応によって選択的に修飾される。さらにまた、アスパルチル残基とグルタミル残基はアンモニウムイオンとの反応により、アスパラギニル残基およびグルタミニル残基に変換される。
【００３７】
二官能性試薬による誘導体化は、抗VEGF抗体の精製法に使用される水不溶性支持マトリックスまたは水不溶性支持表面にVEGFを架橋するのに役立つ。一般的に使用される架橋剤には、例えば1,1-ビス(ジアゾアセチル)-2-フェニルエタン、グルタルアルデヒド、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば4-アジドサリチル酸とのエステル、3,3'-ジチオビス(スクシンイミジルピロピオネート)などのジスクシンイミジルエステルを含むホモ二官能性イミドエステル、ビス-N-マレイミド-1,8-オクタンなどの二官能性マレイミドがある。メチル-3-[(p-アジドフェニル)ジチオ]プロピオイミデートなどの誘導体化試薬は、光の存在下で架橋を形成する能力を持つ光活性化可能な中間体を与える。あるいは、臭化シアン活性化炭水化物などの反応性水不溶性マトリックスと、米国特許第3,969,287号、同第3,691,016号、同第4,195,128号、同第4,247,642号、同第4,229,537号および同第4,330,440号に記載の反応性基質が、タンパク質の固定化に使用される。
【００３８】
グルタミニル残基とアスパラギニル残基はしばしば対応するグルタミル残基およびアスパルチル残基に脱アミド化される。あるいは、これらの残基は温和な塩基性条件下で脱アミド化される。これら残基のいずれの形態も本発明の範囲に包含される。
その他の修飾には、プロリンとリジンのヒドロキシル化、セリルまたはスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニンおよびヒスチジン側鎖のα-アミノ基のメチル化（T.E.Creighton,Proteins:Structure and Molecular Properties,W.H.Freeman & Co.,サンフランシスコ,79-86頁[1983]）、N末端アミンのアセチル化、また場合によっては、C末端カルボキシル基のアミド化がある。
【００３９】
b．DNA突然変異
VEGFのアミノ酸配列変異体は、DNAの突然変異によって調製することもできる。そのような変異体には、例えば、図1に示すアミノ酸配列内での残基の欠失、挿入または置換がある。最終コンストラクトが目的の活性を有する限り、最終コンストラクトを得るために欠失、挿入および置換をどのように組み合わせてもよい。変異体をコードするDNAに作られる突然変異がその配列を読み枠外に置いてはならないことは明白であり、また二次mRNA構造を生成しうる相補領域を生み出さないことが好ましい（EP 75,444A参照）。
【００４０】
遺伝子レベルでは、これらの変異体は通常、VEGFをコードするDNA中のヌクレオチドの部位特異的突然変異誘発によって変異体をコードするDNAを作成し、次にそのDNAを組換え細胞培養中で発現させることによって調製される。変異体は通例、天然に存在する類似体と定性的に同じ生物学的活性を示す。
【００４１】
アミノ酸配列変異を導入する部位は前もって決定されるが、突然変異そのものを前もって決定しておく必要はない。例えば、所定の部位における突然変異の成果を最適化するために、標的コドンまたは標的領域で無作為突然変異誘発を行い、発現したVEGF変異体を望ましい活性の最適な組み合わせについてスクリーニングできる。既知の配列を持つDNA中の前もって決定された部位に置換突然変異を作成するための、例えば部位特異的突然変異誘発法などの技術は、よく知られている。
【００４２】
本発明のVEGF変異体の調製は、先に調製された変異体または非変異体型タンパク質をコードするDNAの部位特異的突然変異誘発によって達成されることが好ましい。部位特異的突然変異誘発は、目的の突然変異のDNA配列と、横断される欠失接合部の両側に安定な二本鎖を形成するのに足りるサイズと配列複雑性とを持つプライマー配列を与えるのに足りる数の隣接ヌクレオチドとをコードする、特定のオリゴヌクレオチド配列を使用することによるVEGF変異体の作成を可能にする。通例、約20〜25ヌクレオチド長であって、変更する配列の接合部の両側に約5〜10残基を持つプライマーが好ましい。Adelmanら,DNA 2,183（1983）（その明細は参考文献として本明細書の一部を構成する）などの刊行物によって例示されるように、一般に、部位特異的突然変異誘発の技術は当技術分野でよく知られている。
【００４３】
部位特異的突然変異誘発技術が、通例、一本鎖型と二本鎖型の両方で存在するファージベクターを使用することは理解されるだろう。部位特異的突然変異誘発に有用な典型的ベクターには、例えばMessingら,Third Cleveland Symposium on Macromolecules and Recombinant DNA,A.Walton編,Elsevier,アムステルダム（1981）（これは参考文献として本明細書の一部を構成する）に開示されているようなM13ファージなどのベクターがある。これらのファージは市販されており、それらの使用法は一般に当業者にはよく知られている。また、一本鎖ファージ複製起点を含有するプラスミドベクター（Veiraら,Meth.Enzymol.,153,3[1987]）を使用して、一本鎖DNAを得ることもできる。
【００４４】
一般に、ここでの部位特異的突然変異誘発は、まず関連タンパク質をコードするDNA配列をその配列内に含む一本鎖ベクターを得ることによって行われる。目的の突然変異配列を保持するオリゴヌクレオチドプライマーは、一般に合成的に、例えばCreaら,Proc.Natl.Acad.Sci.（USA）,75,5765（1978）の方法によって調製される。次に、そのプライマーを一本鎖タンパク質配列含有ベクターとアニールさせ、大腸菌ポリメラーゼIクレノウ断片などのDNA重合酵素にさらして、突然変異保持鎖の合成を完了する。このようにして一方の鎖が元の非突然変異配列をコードし、もう一方の鎖が目的の突然変異を保持するヘテロ二本鎖が形成される。次にそのヘテロ二本鎖ベクターを用いてJM101細胞などの適当な細胞を形質転換し、突然変異した配列を持つ組換えベクターを含むクローンを選択する。
そのようなクローンを選択した後、突然変異させたタンパク質領域を取り出し、タンパク質生産に適したベクター（一般的には、適当な宿主の形質転換に使用しうるタイプの発現ベクター）に入れる。
【００４５】
c.  突然変異のタイプ
アミノ酸配列欠失は、一般的には約1〜30残基、より好ましくは1〜10残基に及び、通例、連続的である。
アミノ酸配列挿入には、1残基から本質的に無制限な長さのポリペプチドに至るアミノ末端融合および/またはカルボキシル末端融合、ならびに1または複数のアミノ酸残基の配列内挿入がある。配列内挿入（すなわち成熟VEGF配列内での挿入）は一般的には約1〜10残基、より好ましくは1〜5残基に及びうる。末端挿入の例には、成熟VEGFの組換え宿主からの分泌を促進するために行なう、シグナル配列（宿主細胞と同種であるか異種であるかを問わない）のVEGF分子のN末端への融合がある。
変異体の第3のグループは、VEGF分子中の少なくとも1つのアミノ酸残基（好ましくは1つだけ）が除去され、その場所に異なる残基が挿入されているものである。VEGF分子の特徴を細かく調節したい場合は、そのような置換を次の表1に従って行なうことが好ましい。
【００４６】
【表２】
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【００４７】
機能的または免疫学的同一性の本質的な変化は、表1に記載した置換よりも保存性の低い置換を選択することによって、すなわち（a）置換領域のポリペプチド主鎖の構造（例えばシートまたはらせんコンフォメーション）、（b）標的部位における分子の電荷または疎水性、もしくは（c）側鎖の嵩高さ、の維持に対する効果がより大きく異なる残基を選択することによって起こる。VEGFの特徴に最も大きな変化をもたらすと一般的に予想される置換は、（a）グリシンおよび/またはプロリン（P）を別のアミノ酸で置換するか、これらの残基を欠失または挿入するもの、（b）親水性残基（例えばセリルまたはスレオニル）で（を）疎水性残基（例えばロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリルまたはアラニル）を（で）置換するもの、（c）システイン残基で（を）他の任意の残基を（で）置換するもの、（d）電気陽性側鎖を持つ残基（例えばリジル、アルギニルまたはヒスチジル）で（を）負電荷を持つ残基（例えばグルタミルまたはアスパルチル）を（で）置換するもの、（e）電気陰性側鎖を持つ残基で（を）正電荷を持つ残基を（で）置換するもの、または（f）嵩高い側鎖を持つ残基（例えばフェニルアラニン）で（を）そのような側鎖を持たない残基（例えばグリシン）を（で）置換するものだろう。
【００４８】
ほとんどの欠失と挿入、そして特に置換は、VEGF分子の特徴に著しい変化をもたらさないと予想される。しかし、置換、欠失または挿入の正確な効果を前もって予測することが困難な場合、その効果が常套的なスクリーニングアッセイで評価されることは、当業者には理解されるだろう。例えば、変異体は通例、天然VEGFコード核酸の部位特異的突然変異誘発、その変異体核酸の組換え細胞培養における発現、および任意に例えばウサギポリクローナル抗VEGFカラムへの免疫アフィニティー吸着（残存する免疫エピトープの少なくとも1つにそれを結合させることにより変異体を吸収するため）などによるその細胞培養からの精製によって作られる。
【００４９】
VEGFは二量体に会合する傾向があるので、一方のサブユニットまたは両方のサブユニットが変異体であるヘテロ二量体およびホモ二量体を提供することは、本発明の範囲に包含される。両方のサブユニットが変異体である場合、アミノ酸配列中の変化は各サブユニット鎖で同じであっても異なってもよい。ヘテロ二量体は、両方のサブユニットをコードするDNAで宿主細胞を同時形質転換し、必要であれば目的のヘテロ二量体を精製することによって、または各サブユニットを個別に合成し、それらサブユニットを（例えば、尿素、グアニジン塩酸塩などのカオトロピック剤による処理で）解離し、解離したサブユニットを混合した後、カオトロピック剤を透析除去してそれらサブユニットを再会合させることによって、容易に製造される。
【００５０】
いわゆるグリコスキャン（glyco-scan）突然変異体も、ここでいう突然変異体に包含される。この態様ではいわゆる糖鎖付加部位の知識を利用する。例えば、それが適切な場合には、そのような糖鎖付加化部位を導入することにより、その位置に糖鎖付加部分を含有する分子種を生成させうる。また、突然変異によって現存する糖鎖付加部位を除去することにより、その部位で糖鎖付加されない分子種を生成させることもできる。それらが本発明の基本的前提に従っていわゆるKDRおよび/またはFLT-1ドメイン内に導入されること、また、その最終産物が上記2つの結合ドメインの一方または両方に導入された突然変異の性質と全体として本質的に異ならない限り、同分子の全範囲でこれらのドメイン外にある他の位置にそれらを導入できることは、本発明に包含される他の突然変異の場合と同様にやはり理解されるだろう。
【００５１】
次に、細胞溶解物または精製VEGF変異体の活性を、目的の特徴に適したスクリーニングアッセイでスクリーニングする。例えば、VEGF分子の免疫学的特徴（与えられた抗体に対する親和性など）の変化は、競争型免疫検定法で測定される。候補突然変異体による血管内皮増殖の促進または抑制の変化は、適当な検定法で測定される。酸化還元安定性や熱安定性、疎水性、蛋白質分解的減成に対する感受性、担体との会合傾向、多量体への会合傾向などといったタンパク質特性の修飾は、当業者によく知られている方法で分析される。
【００５２】
3．組換え発現
目的のVEGF分子は、組換え法を含む任意の技術で製造できる。また本明細書において、単離DNAとは、3'-および/または5'-隣接領域を伴うまたは伴わない化学的に合成されたDNA、cDNA、染色体DNAまたは染色体外DNAを意味すると解される。ここでの目的のVEGFは、組換え細胞培養での合成によって製造されることが好ましい。
【００５３】
そのような合成には、まず、VEGFをコードする核酸を確保する必要がある。VEGF分子をコードするDNAは、ウシ下垂体濾胞細胞から、（a）それらの細胞からcDNAライブラリーを調製し、（b）VEGFまたはその断片（長さが100塩基対まで、またはそれ以上のもの）をコードする標識DNAを用いてハイブリダイゼーション分析を行って、相同配列を含有するライブラリー中のクローンを検出し、（c）そのクローンを制限酵素分析と核酸配列決定で分析して全長クローンを同定することにより、得ることができる。低ストリンジェンシー条件下でVEGFコードDNAにハイブリダイズできるDNAは、VEGFをコードするDNAの同定に役立つ。高および低ストリンジェンシー条件については下に定義する。全長クローンがcDNAライブラリー中に存在しない場合は、本明細書に初めて開示される核酸配列情報を用いて種々のクローンから適当な断片を回収し、それらクローンに共通する制限部位で連結することにより、VEGFをコードする全長クローンを組み立てることができる。もう一つの選択肢として、ゲノムライブラリーから目的のDNAが得られるだろう。ヒト白血病細胞株を詳査することによって最終的に決定されたヒトVEGFをコードするDNAの配列を図1に示す。
【００５４】
このDNAをライブラリーから同定し、単離したら、それをさらなるクローニングまたは発現のために複製可能なベクターに連結する。
組換え発現系の一例として、VEGFをコードするDNAを含む発現ベクターを用いた形質転換により、VEGFコード遺伝子を哺乳類細胞中で発現させる。培養培地中または宿主細胞の周辺腔中にVEGFが得られる（すなわち分泌分子が得られる）ようなプロセシングを果たしうる宿主細胞を形質転換することが好ましい。
【００５５】
a．有用な宿主細胞とベクター
ここに開示するベクターと方法は、広範な原核生物および真核性物を宿主細胞とする使用に適している。
一般的に、DNA配列の最初のクローニングと本発明で有用なベクターの構築には、当然ながら、原核生物が好ましい。例えば大腸菌K12 MM294株（ATCC番号31,446）はとりわけ有用である。使用しうる他の微生物株には、大腸菌Bや大腸菌X1776（ATCC番号31,537）などの大腸菌株がある。これらの例はもちろん限定ではなく例示を意図している。
【００５６】
原核生物は発現にも使用できる。上述の株だけでなく、大腸菌W3110（F-、ラムダ-、原栄様株、ATCC番号27,325）、K5772（ATCC番号53,635）およびSR101、枯草菌などのバチルス、ネズミチフス菌や霊菌（セラチア・マルセサンス）などといった他の腸内細菌、および様々なシュードモナス種も使用できる。
【００５７】
一般にこれらの宿主には、その宿主細胞と適合する種に由来するレプリコンと制御配列を含有するプラスミドベクターが使用される。それらのベクターは通常、複製部位と、形質転換された細胞の表現型による選択を可能にする標識配列とを保持する。例えば大腸菌は通例、大腸菌種に由来するベクターpBR322を用いて形質転換される（例えばBolivaraら,Gene 2,95[1977]を参照されたい）。pBR322はアンピシリン耐性遺伝子とテトラサイクリン耐性遺伝子を含有するので、形質転換細胞を同定する簡単な手段になる。pBR322プラスミドや他の微生物プラスミドまたはファージは、その微生物がそれ自身のタンパク質の発現に使用しうるプロモーターをも含有するか、またはそれを含有するように修飾されなければならない。
【００５８】
組換えDNA構築に最も一般的に使用されるプロモーターには、β-ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトースプロモーター系（Changら, Nature,375,615[1978]；Itakuraら,Science,198,1056[1977]；Goeddelら,Nature,281,544[1979]）と、トリプトファン（trp）プロモーター系（Goeddelら,Nucleic Acids Res.,8,4057[1980]；EPO出願公開第0036,776号）がある。最も一般的に使用されるプロモーターはこれらであるが、他の微生物プロモーターも発見され、使用されている。また、それらのヌクレオチド配列に関する詳細は公表されているので、当業者はそれらをプラスミドベクターと作動可能に連結できる（例えばSiebenlistら,Cell,20,269[1980]を参照されたい）。
【００５９】
原核宿主細胞に加えて、酵母培養などの真核微生物も使用できる。一般的なパン酵母サッカロミセス・セレビシェは、なかでも最も広く使用されている真核微生物である（ただし他にもいくつかの株が一般に利用できる）。サッカロミセスでの発現には、例えばプラスミドYRp7（Stinchcombら,Nature 282,39[1979]；Kingsmanら,Gene 7,141[1979]；Tschemperら,Gene 10,157[1980]）などがよく使用される。このプラスミドは既にtrp1遺伝子を含有しており、それがトリプトファン中で生育する能力を欠く酵母の突然変異株、例えばATCC番号44,076やPEP4-1（Jones,Genetics 85,12[1977]）に選択マーカーを提供する。つまり酵母宿主細胞ゲノムの特徴としてtrp1損傷が存在することは、トリプトファン不在下での生育によって形質転換を検出するための効果的な環境を提供する。
【００６０】
酵母ベクター中の好適な促進配列には、3-ホスホグリセリン酸キナーゼ（Hitzemanら,J.Biol.Chem.255,2073[1980]）または他の解糖系酵素（Hessら,J.Adv.Enzyme Reg.7,149[1968]；Hollandら,Biochemistry 17,4900[1978]）、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸脱炭酸酵素、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース-6-リン酸イソメラーゼ、3-ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼおよびグルコキナーゼなどのプロモーターがある。また、好適な発現プラスミドを構築するには、これらの遺伝子に付随する終結配列を、その発現ベクター中の発現させようとする配列の3'側に連結することにより、mRNAのポリアデニル化と終結に備える。生育条件によって転写を制御できるというさらなる利点を持つ他のプロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ2、イソシトクロムC、酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関係する分解酵素、上述のグリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ、およびマルトースとガラクトースの資化を担う酵素のプロモーター領域である。酵母に適合するプロモーター、複製起点および終結配列を含有するプラスミドベクターはいずれも好適である。
【００６１】
微生物に加えて、多細胞生物に由来する細胞の培養も宿主として使用できる。原則として、脊椎動物由来の培養であるか無脊椎動物由来の培養であるかにかかわらず、それらの細胞培養はいずれも使用できる。しかし脊椎動物細胞に最も大きな関心が持たれており、培養された脊椎動物細胞（組織培養）の増殖は近年、常套手段になっている［Tissue Culture,Academic Press,KruseおよびPatterson編（1973）］。それら有用な宿主細胞株の例はVERO細胞、HeLa細胞、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞株、W138、BHK、COS-7、293およびMDCK細胞株である。これらの細胞用の発現ベクターは通常、（必要であれば）複製起点、発現させる遺伝子の前に位置するプロモーターを、必要なリボソーム結合部位、RNAスプライス部位、ポリアデニル化部位および転写終結配列と共に含む。
【００６２】
哺乳類細胞で使用については、発現ベクター上の制御機能がウイルス物質によって提供されることが多い。例えば一般的に使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス2、そして最も多くの場合シミアンウイルス40（SV40）に由来する。SV40ウイルスの初期および後期プロモーターは、共にSV40ウイルス複製起点をも含む断片としてウイルスから容易に得られるので、とりわけ有用である［Fiersら,Nature,273,113（1978）］。これより小さいSV40断片やこれより大きいSV40断片も、HindIII部位からウイルス複製起点中に位置するBglI部位に向かって伸びる約250bpの配列が含まれている限り使用できる。さらに、目的の遺伝子配列に通常付随するプロモーターまたは制御配列が宿主細胞系に適合するのであれば、それらを使用することもでき、またそうすることがしばしば望ましい。
【００６３】
複製起点は、SV40または他のウイルス（例えばポリオーマ、アデノ、VSV、BPV）供給源から得られるような外来の起点を含むようにベクターを構築することによって、または宿主細胞染色体複製機構によって提供されうる。ベクターが宿主細胞染色体に組み込まれる場合は、しばしば後者で十分である。
【００６４】
細胞培養によって十分な量のタンパク質が生産されるが、二次コード配列を用いて改良すると、生産レベルがさらに向上する。二次コード配列の一つはジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）からなる。これはメトトレキセート（MTX）などの外部から制御されるパラメーターによる影響を受けるので、メトトレキセート濃度の制御による発現の制御を可能にする。
【００６５】
VEGFとDHFRタンパク質の両方をコードするDNA配列を含む本発明ベクターによるトランスフェクションに好ましい宿主細胞を選択する場合、使用するDHFRタンパク質のタイプに従って宿主を選択することが適切である。野生型DHFRタンパク質を使用する場合は、DHFR欠損性の宿主細胞を選択して、そのDHFRコード配列をヒポキサンチン、グリシンおよびチミジンを欠く選択培地中で成功したトランスフェクションのマーカーとして使用できるようにすることが好ましい。この場合、適当な宿主細胞は、UrlaubおよびChasin,Proc.Natl.Acad.Sci.（USA）,77,4216（1980）に記述されているように調製、増殖されるDHFR活性欠損性チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞株である。
【００６６】
これに対し、MTXに対する結合親和性が低いDHFRタンパク質を制御配列として使用する場合は、DHFR欠損細胞を使用する必要はない。この突然変異型DHFRはメトトレキセートに対して耐性を示すので、宿主細胞自体がメトトレキセート感受性であれば、MTX含有培地を選択手段として使用できる。MTXを吸収できる真核細胞のほとんどはメトトレキセート感受性であると思われる。そのような有用な細胞株の一つはCHO細胞株CHO-K1（ATCC番号CCL61）である。
【００６７】
b．利用できる典型的方法論
目的のコード配列と制御配列とを含有する好適なベクターの構築には、標準的な連結技術を使用する。単離されたプラスミドまたはDNA断片を切断し、加工処理し、望ましい形態に再連結することにより、必要なプラスミドを調製する。
平滑末端が必要なら、調製物を10単位のポリメラーゼI（クレノウ）を用いて15℃で15分間処理し、フェノール-クロロホルム抽出し、エタノール沈澱できる。
切断した断片のサイズ分離は、Goeddelら,Nucleic Acids Res.8,4057（1980）に記載の6%ポリアクリルアミドゲルを用いて行ないうる。
【００６８】
構築したプラスミド中の正しい配列を確認するための分析には、通例、連結混合物を使って大腸菌K12 294株（ATCC31,446）または他の適当な大腸菌株を形質転換し、成功した形質転換体を適宜アンピシリンまたはテトラサイクリン耐性によって選択する。それらの形質転換体からプラスミドを調製し、制限マッピングおよび/またはMessingら,Nucleic Acids Res.9,309（1981）の方法もしくはMaxamら,Methods of Enzymology 65,499（1980）の方法によるDNA配列決定によって分析する。
【００６９】
そのDNAを哺乳類細胞宿主に導入し、安定なトランスフェクタントを培地中で選択した後、約20,000-500,000nM濃度のメトトレキセート（DHFR活性の競争的阻害剤）の存在下に宿主細胞培養を生育することにより、DHFRタンパク質コード配列の増幅を果たす。当然、有効濃度範囲はDHFR遺伝子の性質と宿主の特徴に強く依存する。普遍的に限定された上限と下限を確認し得ないことは明らかである。DHFRを阻害する他の葉酸類似体や他の化合物も適当な濃度で使用できるだろう。しかしMTX自体は便利で、容易に入手でき、効果的である。
使用しうる他の技術については、実施例の直前の項で説明する。
【００７０】
4．有用性と製剤
ここに記載するVEGF分子は、血管内皮に関係するいくつかの治療用途を持つ。それらの用途には、外傷を取り巻く血管内皮細胞の増殖をVEGFが迅速に促進することが立証されていることから、血管網への外傷の処置が含まれる。そのように処置できる外傷の例には、外科的切開、とりわけ心臓に関するものや、血管の裂傷、切開および貫通を含む創傷、糖尿病性潰瘍、血友病性潰瘍、静脈瘤潰瘍などの血管内皮に関係する表面潰瘍が含まれるが、これらに限るわけではない。VEGFの選択的有糸分裂促進特性に基づいて改善されうる他の生理学的状態もここに含まれる。
【００７１】
上に挙げた外傷性適応症には、治療しようとする特定の障害、個々の患者の状態、VEGFの送達部位、投与法または医師に知られている他の要因を考慮して、適正な医療行為と合致するようにVEGF分子が製剤化され、投与されるだろう。したがって、本明細書においてVEGFの「治療有効量」とは、処置される状態の緩和または治癒、もしくはその悪化の予防または軽減に有効な量であり、具体的には、血管内皮の増殖を生体内で促進するに足りる量である。
天然VEGFに対して生成した抗体と免疫学的に交差反応するVEGFアミノ酸配列変異体および誘導体は、VEGFの免疫測定法における標品として、また標識した場合は競争試薬として有用である。
【００７２】
VEGFは、望ましい純度を持つVEGFを生理学的に許容できる担体、添加剤または安定化剤と混合することにより、貯蔵または投与のために調剤される。そのような物質は使用する用量と濃度で受容者に対して非毒性である。そのVEGFが水溶性である場合は、リン酸塩や他の有機酸塩などの緩衝液（好ましくはpH約7〜8）中に製剤化できる。VEGF変異体が水に部分的にしか溶解しない場合は、その溶解性を上げるために、それを0.04〜0.05%（w/v）量の非イオン界面活性剤（例えばツウィーン（Tween）、プルロニック（Pluronic）またはPEGなど（例：Tween 80））と調合することにより、マイクロエマルジョンとして調製できる。
【００７３】
随意に、抗酸化剤（例えばアスコルビン酸）；低分子量（約10残基未満の）ポリペプチド（例えばポリアルギニンまたはトリペプチド）；血清アルブミン、ゼラチン、免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸またはアルギニンなどのアミノ酸；セルロースまたはその誘導体、グルコース、マンノースまたはデキストリンを含む単糖類、二糖類および他の炭水化物；EDTAなどのキレート剤；マンニトールやソルビトールといった糖アルコールなどの他の成分を加えうる。
【００７４】
治療的投与に使用されるVEGFは滅菌状態でなければならない。滅菌状態は滅菌濾過膜（例えば0.2ミクロン膜）による濾過で容易に達成される。VEGFは通常、凍結乾燥型で保存されるか、熱的変性と酸化的変性に対して高度に安定な場合は水溶液として保存されるだろう。VEGF調製品のpHは通例約6〜8だろう。ただし、より高いまたはより低いpH値が適当である場合もありうる。上述の添加剤、担体または安定化剤のうち一定のものを使用することにより、VEGFの塩が生成することは理解されるだろう。
【００７５】
VEGFを非経口的に使用する場合は、一般的には、VEGFを含有する治療組成物を滅菌注入口の付いた容器（例えば静注用溶液バッグや皮下注射針で突き刺せる栓が付いたバイアル）に入れる。
一般に、その障害が許す場合は、VEGFを部位特異的送達用に製剤化し、投与すべきである。これは創傷や潰瘍の場合に便利である。
【００７６】
徐放性製剤も調製でき、これにはマイクロカプセル状粒子と植込可能品の形成が含まれる。徐放性VEGF組成物を調製するには、VEGFを生分解性のマトリックスまたはマイクロカプセルに組み込むことが好ましい。この目的に適した素材はポリラクチドであるが、ポリ-D-(-)-3-ヒドロキシ酪酸（EP 133,988A）などの他のポリ-(α-ヒドロキシカルボン酸)のポリマーも使用できる。他の生分解性ポリマーには、ポリ(ラクトン)、ポリ(アセタール)、ポリ(オルトエステル)またはポリ(オルトカーボネート)がある。ここでまず考慮しなければならないことは、その担体そのものまたはその分解産物が標的組識内で非毒性であることと、その状態をさらに悪化させないことである。これは、標的とする障害の動物モデル（そのようなモデルが利用できない場合は正常な動物）における常套的スクリーニングによって決定できる。そのような動物モデルは、数多くの科学刊行物に詳述されている。
徐放性組成物の例については、米国特許第3,773,919号、EP 58,481A、米国特許第3,887,699号、EP 158,277A、カナダ特許第1176565号、U.Sidmanら,Biopolymers 22,547[1983]およびR.Langerら,Chem.Tech.12,98[1982]を参照されたい。
【００７７】
局所的に適用する場合は、VEGFを担体および/またはアジュバントなどの他の成分と適宜混合される。そのような他の成分の性質については、それらが製薬上許容でき、意図する投与に有効でなければならないこと、およびその組成物中の活性成分の活性を分解できないこと以外に制限はない。好適な賦形剤の例には、精製コラーゲンを含むまたは含むない軟膏、クリーム、ゲルまたは懸濁剤がある。これらの組成物は、好ましくは液状または半液状で、経皮吸収用貼付剤、硬膏剤および包帯に含浸させてもよい。
【００７８】
ゲル製剤を得るために、液体組成物中に調合したVEGFを有効量の水溶性多糖または合成ポリマー（ポリエチレングリコールなど）と混合して、局所投与に適した粘度のゲルを形成させうる。使用できる多糖には、例えば、アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロースおよびアルキルヒドロキシアルキルセルロース（メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースおよびヒドロキシプロピルセルロースなど）を含むエーテル化セルロース誘導体などのセルロース誘導体；澱粉と分別澱粉（fractionated starch）；寒天；アルギン酸とアルギナート；アラビアゴム；プルラン；アガロース；カラギーナン；デキストラン；デキストリン；フルクタン；イヌリン；マンナン；キシラン；アラビナン；キトサン；グリコーゲン；グルカン；合成生体高分子；キサンタンゴム、グアーゴム、ローカストビーンゴム、アラビアゴム、トラガカントゴム、カラヤゴムなどのゴム；およびそれらの誘導体と混合物がある。ここで好ましいゲル化剤は、生物学的系に対して不活性、非毒性であり、調製が簡単で、流動性が高すぎたり粘度が高すぎたりせず、その中に保持されたVEGFを不安定化しないものである。
【００７９】
多糖はエーテル化セルロース誘導体であることが好ましく、明確で、精製されていて、USP（米国薬局方）に挙げられているもの（例えばメチルセルロースや、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースなどのヒドロキシアルキルセルロース誘導体）がより好ましい。ここで最も好ましいものはメチルセルロースである。
【００８０】
ゲル化に有用なポリエチレングリコールは、通例、適切な粘度を持つように混合された低分子量および高分子量ポリエチレングリコールの混合物である。例えば、分子量400〜600のポリエチレングリコールと分子量1500のものとの混合物は、ペーストが得られるように適切な比率で混合されている場合は、この目的に有効だろう。
【００８１】
多糖類とポリエチレングリコールに適用される「水溶性」という用語は、コロイド溶液と分散液を包含するものとする。一般に、セルロース誘導体の溶解度はエーテル基の置換度によって決まり、ここで有用な安定化誘導体は、その誘導体を水溶性にするのに足りる量のそのようなエーテル基をセルロース鎖の一無水グルコース単位あたりに持つべきである。一般的には、一無水グルコース単位あたり少なくとも0.35エーテル基のエーテル置換度であれば十分である。またセルロース誘導体は、Li、Na、KまたはCs塩などのアルカリ金属塩の形態であってもよい。
【００８２】
ゲル中にメチルセルロースを使用する場合は、それがゲルの約2〜5%（より好ましくは約3%）を占めることが好ましく、VEGFはゲル1mlにつき約300〜1000mgの量で存在することが好ましい。
使用すべき用量は上述の要因に依存する。おおまかな案として、約0.1ng/ccから有効であるが不当に毒性ではない最大用量までのVEGFレベルを組織内に樹立しうる用量でVEGFを製剤化し、標的部位または標的組識に送達する。この組織内濃度は、可能であれば持続注入、持続的放出、局所適用または実験的に決定した頻度での注射によって維持されるべきである。
【００８３】
細胞の増殖と修復を促進する増殖因子類（VEGFを含む）の活性を高めるために、VEGF治療法を他の新規治療法または従来療法（例えばaFGF、bFGF、PDGF、IGF、NGF、アナボリックステロイド、EGFまたはTGF-α）と組み合わせることは、本発明の範囲に包含される。このような補助治療剤はそれ自体が本発明組成物に含まれる必要はないが、それらの薬剤がタンパク質である場合はそうすることが便利だろう。そのような混合物はVEGFを単独で使用する場合と同じ方法と目的で適宜投与される。このような二次増殖因子に対するVEGFの有効なモル比は通例、1:0.1〜10であり、約等モル量であることが好ましい。
【００８４】
5．医薬組成物
本発明化合物は、医薬的に有用な組成物を製造するための既知の方法に従い、本発明VEGF変異体を製薬上許容できる担体賦形剤と混合することによって製剤化できる。好適な担体賦形剤とそれらの製剤は、ヒト血清アルブミンなどの他のヒトタンパク質を含めて、例えばRemington's Pharmaceutical Sciences,第16版,1980,Mack Publishing社,Osloら編（その内容は参考文献として本明細書の一部を構成する）などに記述されている。ここに記載のVEGF変異体は心血管疾患または心血管異常を持つ対象に非経口的に、またはそれを有効な形態で確実に血流に送達する他の方法によって投与できる。
【００８５】
本発明の実施に使用される本発明VEGF変異体の臨床的投与にとりわけ適した組成物には、例えば滅菌水溶液、または凍結乾燥タンパク質などの滅菌された水和可能粉末がある。製剤には、さらに適当量の製薬上許容できる塩が、一般的にはその製剤を等張にするのに足りる量で含まれることが、一般に望ましい。アルギニン塩基やリン酸などのpH調節剤も通例、適当なpH（一般的には5.5〜7.5）を維持するのに足りる量で含まれる。さらに、貯蔵寿命や水性製剤の安定性を改善するために、グリコールなどの薬剤をさらに含むことも望ましいだろう。変異型t-PA製剤は、このようにして、非経口投与、特に静脈内投与に適した製剤にされる。
【００８６】
本発明医薬組成物の用量と望ましい薬物濃度は、想定したその用途に依存して変わりうる。例えば、深静脈血栓や末梢血管疾患の処置には、一般的には「ボーラス」投与が好ましく、その後、好ましくは約3μg/ml程度のほぼ一定の血中レベルを維持するための投与が行われる。
しかし、救急医療施設に関係する用途では、一般に注入法を利用できず、また根底にある疾患（例えば塞栓症や梗塞）が一般に重篤であるため、静脈内ボーラスのように多少高い初期用量を与えることが一般に望ましいだろう。
【００８７】
本発明化合物に関して言及した種々の治療適応症には、治療しようとする特定の障害、個々の患者の状態、送達部位、投与法および各分野の医師に知られている他の要因を考慮して、適正な医療行為と合致するようにVEGF分子が製剤化され、投与される。したがって本明細書において本発明VEGF分子の「治療有効量」とは、処置される状態の緩和または治癒、もしくはその悪化の予防または軽減に有効な量であり、具体的には血管内皮の増殖を生体内で促進するのに足りる量である。一般的には、処置される治療適応症の標的である組識中で、約0.1ng/cm3から有効であるが不当に毒性ではない最大用量までの本発明VEGF突然変異体レベルを樹立できる用量が使用される。本発明化合物に関する治療適応症のうち一定のものには、組織内投与が選択肢になりうると考えられる。
【００８８】
下記の実施例は、単に現在知られている本発明を実施するための最良の形態を例示することを意図しているだけで、本発明がこのような実施例の詳細に限定されると見なしてはならない。
【００８９】
実施例
血管内増殖因子（VEGF）は虚血組織の脈管再生に臨床上の利益をもたらしうるヘパリン結合性増殖因子である。チャイニーズハムスター卵巣（CHO）由来のVEGFと大腸菌由来のVEGFの薬理学的特性に有意な相違が観察された（図6）。この研究の目的は、CHO VEGFと大腸菌VEGFの薬理学的相違の分子的根拠を決定することであった。摘出ラット肝灌流試験と全身動物薬物動態試験をヘパリンカラムクロマトグラフィーおよび質量分析と共に使用して、クリアランス決定因子の相違を特徴づけた。大腸菌VEGFはCHO VEGFと比較して大きな初回通過肝抽出と高い分布容積を持っていた（図7および8）。
【表３】
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【００９０】
大腸菌VEGFのヘパリンとの予備インキュベーションは肝抽出を減少させたことから、ヘパリン硫酸プロテオグリカンの結合が迅速な肝取り込みの一因であることが示唆された（図8）。ヘパリンカラムクロマトグラフィーを用いて、CHO VEGFと大腸菌VEGFの結合親和力の相違に注目した。CHO VEGFは不均質であると思われ、より早く溶出した。還元カルボキシメチル化CHO VEGFの質量分析により、C末端ヘパリン結合ドメイン内での内部蛋白質分解的切断が明らかになった。大腸菌VEGFは制限蛋白質分解後に試験管内と生体内でCHO VEGFと同様に挙動した（図10および11）。これらの結果は、CHO VEGFがそのC末端ヘパリン結合領域で蛋白質加水分解的に切断され、そのことがヘパリン結合の減少をもたらし（図9）、またそれゆえに生体内で遅いクリアランスと低い分布容積をもたらした（図14）ことを証明している。
【００９１】
CHO VEGFと大腸菌VEGFのヘパリン結合特性の比較
3ロットのCHO由来VEGFと2ロットの大腸菌由来VEGFをヘパリンカラム（Pharmacia製）クロマトグラフィーを使って分析した。直線的NaCl勾配（150mMから2.0mM NaCl、10mM NaP pH7.4、0.01% T-20）を0.5〜1ml/分の流速で溶出に使用した。CHOロットは大腸菌中で生産されたVEGFと比較して不均質であるように見えた。CHO由来のVEGFは520mM NaClで溶出する総ピーク面積の約40%（ピーク1）と約720mM NaClで溶出する総ピーク面積の約60%（ピーク2）の二重線として現れた。使用する勾配を浅くすると、ピーク1と同時溶出する複数の追加ピークが現れた。これに対し、大腸菌VEGFはわずかに長い保持時間を持ち、溶出に約745ｍM NaClを要した（図9）。
【００９２】
ヘパリン結合の相違はシアル酸含量には関係しない
糖鎖付加の不均質性がヘパリンクロマトグラフィー後のCHO-VEGFのクロマトグラムに見られる多重ピークを生じさせた可能性を検討するために試験を行った。第一の試験ではシアル酸を除去するためにCHO VEGFをノイラミニダーゼで処理した。シアル酸の定量的除去はDionexによって確認された。ヘパリン上でのCHO VEGFの保持時間はシアル酸除去後も変化しなかったことから、ピーク1とピーク2の相違はシアル酸含量の相違によるのではないことが示唆された。
【００９３】
第二の試験ではピーク1とピーク2を個別に集め、等電点分離法で未分画のCHOと比較した。すべてのピークで酸性バンドが示されたが、より早く溶出するピーク1では、より塩基性のバンドの不在が顕著だった。これらのデータはヘパリンカラムクロマトグラフィー後に観察される多重ピークがシアル酸含量の相違によるのではないことをさらに証明している。むしろピーク1はピーク2と比較して余分な酸性バンドを持つのではなく塩基性バンドを欠いているようだった。VEGFのC末端領域は高度に塩基性であり、ヘパリン結合にとって重要であることが知られているので、VEGFのヘパリン結合親和力に関する明らかな不均質性はヘパリン結合ドメイン内の塩基性アミノ酸のC末端除去またはヘパリン結合ドメインでの蛋白質分解的プロセシングによるものだろうと推論された（図2）。
【００９４】
CHO VEGFのC末端分解
ヘパリンから溶離するピーク1とピーク2をヘパリンカラムクロマトグラフィーに続いて個別に収集し、SDS-PAGEとLC-MSで分析した。SDS-PAGE分析については、様々な分子型のVEGFの検出感度を向上させるために、種々の画分を放射性ヨウ素化した。ピーク1とピーク2を還元条件と非還元条件で泳動した。どちらのピークも非還元条件では対照と同様に見え、全画分が予想される分子量（43kDA）に移動した。しかし還元条件では不均質性が明らかだった（図15）。ピーク1画分では15kDAから20kDAまでの分子量にわたる複数のバンドがはっきりと見えたが、ピーク2にはVEGFモノマーの予想分子量より低い小バンドが１つあるだけだった。
【００９５】
N-グリカナーゼ還元カルボキシメチル化VEGFの質量分析は、主要ピークであるピーク2がVEGF 164/164へテロダイマーに相当することを示した。ピーク1はさらにアミノ酸110、125および147のC末端側のジスルフィド結合内で切断されているVEGFに相当した（図2）。これらのデータはCHO VEGFにおける明らかな不均質性が、ヘパリン結合ドメイン内でのC末端プロセシングの結果であることを示している。最後に、カルボキシペプチダーゼBによる大腸菌VEGFの制限消化は、CHOピーク2と同時溶出するピークをもたらした（図11）。このピークの質量分析は、このピークがVEGF163/164ヘテロダイマーに相当することを明らかにした。ピーク1と類似する保持時間を持つピークが、カルボキシペプチダーゼBでの長時間にわたる処置（24時間）後に観察された。このように大腸菌VEGFは、CPBによるC末端消化後に、ヘパリン結合に関してCHO VEGFのように振舞わせることができる。
【００９６】
rhVEGF165ロットD9837Aの各1mgアリコート（200μl）を0.2M NH4HCO3で1mLに希釈した。それらのrhVEGF165溶液にWorthington製PMSF処理CpBを1：50の酵素：基質比で加えた。それらの試料を周囲温度で18時間消化した。それらのCpB消化rhVEGF165試料をヘパリンクロマトグラフィーで精製した。調製用に収集した画分をプールし、次にAmicon製Centricon-10濃縮器で濃縮した。それらの濃縮画分をCentricon-10濃縮器で5mMコハク酸塩、275mMトレハロースに再配合した。それらの画分を濃縮した後、0.1%Tween-20をそれらの溶液に加えた。各画分のタンパク質濃度をヘパリンクロマトグラフィーで決定し、rhVEGF165 D9837Aの標準溶液のピーク面積と比較した。
【００９７】
ヘパリンクロマトグラフィー条件
カラム：TosoHass製ヘパリン-5PWカラム7.5mm×7.5cm
流速：10mL/分
検出：214nmでのUV吸光度
移動相：
A：10mM NaH2PO4、150mM NaCl、pH7.4
B：10mM NaH2PO4、2M NaCl、pH7.4
勾配：30分間で0%Bから80%Bへの直線
【００９８】
大量実験
大量実験は4バイアルのバッチで行った。Centricon-10濃縮器を用いて、4バイアルのM3RD587を濃縮し0.2M NH4HCO3に再配合して、約1.5mL（7.7mg/mL）にした。それらのrhVEGF165溶液にWorthington製PMSF処理CpBを1：50の酵素：基質比で加えた。それらの試料を37℃で30〜40分消化した。それらのCpB消化rhVEGF165試料をヘパリンクロマトグラフィーで精製した（図10）。調製用に収集したそれらの画分をプールし、次にAmicon製Centriprep-10濃縮器を使って濃縮した。それら濃縮画分を同じCentriprep-10濃縮器で5mMコハク酸塩、275mMトレハロースに再配合した。それらの画分を濃縮した後、0.1%Tween-20をそれらの溶液に加えた。タンパク質濃度を276nmでの吸光度とアミノ酸分析によって決定した。
【００９９】
ヘパリンクロマトグラフィー条件
カラム：Pharmacia製5mLハイトラップ・ヘパリンカラム
流速：2.0mL/分
検出：214nmでのUV吸光度
移動相：
A：10mM NaH2PO4、150mM NaCl、pH7.4
B：10mM NaH2PO4、2M NaCl、pH7.4
勾配：30分間で0%Bから80%Bへの直線
【０１００】
ACE細胞増殖に対するVEGF変異体の効果
ウシ副腎皮質内皮（ACE）細胞を6ウェルプレートに6000細胞/ウェルの密度で播種し、10%ウシ胎仔血清を含む培養した。培養第一日にその培地に1nMの濃度でVEGFを加えた。ACE細胞を第5日にトリプシン処理し、Casy-1細胞計数器で計数した。対照培養にはVEGFの代わりに希釈緩衝液を加えた。データは5つの複製試料の平均（n＝5）である。これらのデータは、ヘパリン結合ドメインが修飾されているVEGFが、なお生物学的活性（すなわち培養内皮細胞を刺激して増殖させる能力）を保っていることを示す（図16）。
【０１０１】
ラットおよびウサギにおける血球へのVEGF結合に対するヘパリンの効果
図17は放射性ヨウ素化大腸菌VEGFがCHO VEGFより高程度にウサギおよびラット中の血球に結合することを明らかにしている。大腸菌由来VEGFを制限タンパク質分解（EC1+2参照）で修飾すると、この相互作用は減少する。110/110型のVEGFが血球ペレットに結合しないという事実は、RBCへのVEGF結合がヘパリン結合ドメインによって媒介されることのさらなる証拠になる。さらにこれらのデータは、VEGFをヘパリンと同時投与すると、ヘパリン結合ドメインの修飾により、様々な組織（この場合、その例は血球である）での非特異的結合によるrhVEGFの損失が制限されうることを証明している。
【０１０２】
VEGFの処理に対するヘパリンの全身動物生体内効果
下記のデータは上述のデータ（とりわけ図8の結果とそれらの結果を与えた関連する実験材料/方法を参照されたい）を全身動物生体内環境で確認するものであり、ヘパリンとの同時投与時の生体内でのVEGFに関する薬物動態効果を証明するものである（図18参照）。
【０１０３】
目的
VEGF（血管内皮増殖因子）はヘパリンと、おそらくは細胞表面ヘパリン硫酸プロテオグリカンとに結合する血管由来因子である。大腸菌由来のVEGF（rhVEGF165）は現在虚血性心疾患患者で試験されている。これらの患者では、カテーテルの開通性を維持するために、ヘパリンがしばしば低用量で投与され、このような治療では、単に、投与VEGFの冠動脈注入部位で、ヘパリンの既知の抗凝固剤特性から利益を得るために、ヘパリンが投与される。この研究の目的は、外因性ヘパリンがrhVEGF165の薬物動態に影響を及ぼすかどうかを決定することと、ヘパリン抗凝固剤活性に関してrhVEGFの考えうる干渉を調べることであった。
【０１０４】
方法
ウサギを次の3群（n＝4匹/群）に割り当てた：グループ1（ヘパリンのみ）、グループ2（ヘパリンとrhVEGF）およびグループ3（rhVEGFのみ）。ヘパリンを、50U/kgの静脈内（IV）ボーラス投与とそれに続く50U/kg/時で9時間にわたる持続注入として投与した（第1群と第2群）。このヘパリン投与法は、その試験期間中に一定した抗凝固反応をすばやく（＜1時間）もたらすことが既に示されている。rhVEGFを、ヘパリン投与（第2群）または賦形剤投与（第3群）の開始1時間後に、IVボーラス（0.3mg/k）として与えた。rhVEGFの血漿濃度はELISAによって定量し、ヘパリン活性は生体外活性化部分トロンボプラスチン時間（aPTT）測定法を使って決定した。薬物動態パラメーターはモデル非依存的分析法で計算した。
【０１０５】
結果
ヘパリンの存在下では、aPTTはベースラインの1.5〜2倍延長され、抗凝固反応はrhVEGFの同時投与による影響を受けなかった。これに対し、ヘパリンはrhVEGFの薬物動態特性に初期分布期と末期の両方で影響した。rhVEGF血漿濃度は、IVボーラス投与に続いて、最初の2分以内に急激に低下した後、回復した。この迅速な低下はヘパリンの存在下にrhVEGFを投与した動物では観察されなかった。ヘパリンの存在下では、VEGF投与の2分後に採取したrhVEGF血漿濃度は645±94ng/mlから1018±57ng/mlに増加し、これはより小さい初期分布容積に反映された。ヘパリンの存在下では定常状態におけるrhVEGFの分布容積が485±90ml/kgから201±27ml/kgに減少した。分布容積は血漿容積よりはるかに大きく、rhVEGFの広範な組織結合が示唆される。また、それぞれヘパリンの存在下と不在下で、rhVEGFの末期半減期はより短く（46.9±1.7分と64.9±6.7分）、総血漿クリアランスはより遅かった（5.98±0.6ng/ml/分と3.98±0.6ng/ml/分）。ヘパリン存在下でのrhVEGFの薬物動態パラメーターとヘパリン不在下での薬物動態パラメーターとのこれらの相違はすべて統計的に有意だった（p＜0.05）。
【０１０６】
結論
この試験は、rhVEGFのヘパリンとの同時投与がaPTTに影響を及ぼさないことを示している。対照的に、ヘパリンはrhVEGFの薬物動態を有意に変化させる。ヘパリンは、rhVEGFの細胞表面ヘパリン硫酸プロテオグリカンとの相互作用を遮断することによって、rhVEGF分布の初期を妨害するようである。rhVEGFの赤血球とのヘパリン依存的相互作用は、ヘパリン存在下での概して短い末期半減期にも寄与したかもしれない。
【表４】
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１投与2分後のVEGFの血漿濃度
２全身クリアランス
【０１０７】
結語
上記は本発明の実施に使用できる特定の方法を詳述したものである。これら特定の方法を詳述したので、当業者には、本発明の成果を利用するにあたり、同じ情報に到達して信頼できる代替法を考案する方法が十分にわかるだろう。したがって、上に詳細を記述したが、それがその全体的な範囲を制限するとみなしてはならず、むしろ本発明の境界線は下記請求の範囲の法的な構成によってのみ決定されるべきである。本明細書で引用した全ての文書は参考文献として本明細書の一部を構成する。
【図面の簡単な説明】
【０１０８】
【図１Ａ】165アミノ酸を有するVEGFのアミノ酸配列とDNA配列の両方を表す。このタンパク質の予想アミノ酸をDNA配列の下に示し、そのタンパク質配列のN末端の最初の残基から番号を付けている。負のアミノ酸番号は推定されるリーダーシグナル配列またはプレタンパク質を表し、正の番号は推定上の成熟タンパク質を表す。
【図１Ｂ】165アミノ酸を有するVEGFのアミノ酸配列とDNA配列の両方を表す。このタンパク質の予想アミノ酸をDNA配列の下に示し、そのタンパク質配列のN末端の最初の残基から番号を付けている。負のアミノ酸番号は推定されるリーダーシグナル配列またはプレタンパク質を表し、正の番号は推定上の成熟タンパク質を表す。
【図２】VEGFのC末端ヘパリン結合ドメインを表す。ヘパリン結合ドメインは一般にアミノ酸121付近から全長分子のC末端までに位置すると考えられる。アミノ酸110、125および147は、C末端ヘパリン結合ドメイン内の「クリッピング（切断）」部位である。
【図３】プラスミドpSDVF165の構造をその様々な配列と共に表している。
【図４】プラスミドpRK5の構造をその様々な配列と共に表している。
【図５】本発明の様々な生成物の製造に応じた突然変異を含有するDNAを保持する最終発現ベクターを製造する際に従った構築図を表す。
【図６】ラットにおける大腸菌VEGFとCHO VEGFとの比較薬物動態（PK）試験を表す。大腸菌から得られたVEGFは、ヘパリンまたは内因性ヘパリン硫酸プロテオグリカンへの結合が増大しているため、より迅速に清掃されることがわかる。
【図７Ａ】図6に示すCHO VEGFと大腸菌VEGFに関する薬物動態パラメーターの計算値を表す。
【図７Ｂ】図8に示すPKパラメーターの計算値を表す。
【図８】摘出ラット肝灌流実験での[125I]-VEGFを表す。これらのデータは大腸菌VEGF（VEGF165/165）が肝臓を初回通過するときに、より多量に（約80%）抽出され、次いでCHO VEGF（C末端部内で切断されたVEGF）であることを示唆している。ヘパリン結合ドメインの正電荷を中和するために大腸菌VEGFをまずヘパリンと共に予備インキュベートすると、初回通過抽出が減少しうる。
【図９】大腸菌VEGFとCHO VEGFのヘパリンカラムクロマトグラフィーによる比較を表す。
【図１０】種々のVEGF試料のヘパリンクロマトグラフィーを表す。
【図１１】カルボキシペプチダーゼ処理後の大腸菌由来VEGFをCHO由来VEGFと比較した結果を表す。
【図１２】肝灌流によるCHO由来VEGFピーク1および2を表す。
【図１３】大腸菌由来VEGF（対照、ピーク1およびピーク2）の生体内薬理動態を示す。
【図１４】CHO由来VEGFと大腸菌由来VEGF（対照、ピーク1およびピーク2）の生体内薬物動態を示す.
【図１５】様々なヨウ素化VEGF試料のSDS-PAGEゲル結果を表す。
【図１６】ACE細胞増殖に対するVEGF変異体の効果を示す。
【図１７Ａ】様々な哺乳動物種の赤血球に対するVEGF結合を表す。
【図１７Ｂ】様々な哺乳動物種の赤血球に対するVEGF結合を表す。
【図１７Ｃ】様々な哺乳動物種の赤血球に対するVEGF結合を表す。
【図１８】覚醒したウサギにおけるrhVEGFの血漿動態に対するヘパリンの効果を示す。
【図１９−１】配列表を表す。
【図１９−２】配列表を表す。
【図１９−３】配列表を表す。
【図１９−４】配列表を表す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１８】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図１９−３】
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【図１９−４】
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