【手続補正書】
【提出日】平成26年1月7日(2014.1.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４１】
【図１】図１は、サーモトーガ・マリチマ（Thermotoga maritima）由来のTM1643遺伝子のクローニングを示す。
【図２】図２は、pET-MT1643-Allプラスミド又は対照であるpET-22bを保持するBL21(DE3)株の不溶性及び可溶性画分についてのPAAG電気泳動パターンの写真である。  レーン１、２、３、４：不溶性画分  レーン５、６、７、８：可溶性画分  Ｍ：タンパク質マーカー。  レーン１：pET-22bプラスミド + IPTG  レーン２：pET-22bプラスミド  レーン３：pET-TM1643-All + IPTG  レーン４：pET-TM1643-All  レーン５：pET-TM1643-All + IPTG  レーン６：pET-TM1643-All  レーン７：pET-22bプラスミド+ IPTG  レーン８：pET-22bプラスミド。
【図３】図３は、T. maritima由来のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ（配列番号２のヌクレオチド１〜233）及びポラロモナス属の一種（Polaromonas sp. ）JS666由来のホモログ（配列番号４のヌクレオチド2〜260）のアラインメントを示す。
【図４】図４は、pMW-intxis-catプラスミドベクターの構築を示す。
【図５】図５は、phMIV-1ヘルパープラスミドの構築を示す。
【図６】図６は、pMIVK620Sプラスミドの構築を示す。
【図７】図７は、Polaromonas sp. JS666由来のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼの幾つかのホモログのアラインメントを示す。  Polaromonas sp. JS666（配列番号４）  デルフチア・アシドボランス（Delftia acidovorans）（配列番号１００）  コマモナス・テストステローニ（Comamonas testosteroni）（配列番号１０２）  ラルストニア・ユートロファ（Ralstonia eutropha）（配列番号１０４）  シュードモナス・エルジノーサ（Pseudomonas aeruginosa）（配列番号１０６）  バークホルデリア・セノセパシア（Burkholderia cenocepacia）（配列番号１０８）  ロドシュードモナス・パルストリス（Rhodopseudomonas palustris） RPB_3108（配列番号１１０）  ロドシュードモナス・パルストリス（Rhodopseudomonas palustris） RPB_0147（配列番号１１２）  コンセンサス（配列番号１１３）。
【図８】図８は、Polaromonas sp. JS666由来のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼの幾つかのホモログのアラインメントを示す（続き）。
【図９】図９は、Polaromonas sp.のADHの精製のSDS-PAGE（10％）による分析について示す写真である。  Ｍ：分子量タンパク質マーカー；  レーン１：BL21(DE3)/pET-ADH-P(S)の粗細胞抽出物（crude cell extract）の可溶性画分（30μg）  レーン２：硫酸アンモニウム溶液中での沈殿後の画分（30μg）  レーン３：陰イオン交換クロマトグラフィ後の画分（4.6μg）  レーン４、５：アフィニティクロマトグラフィ後の画分（6.6μg及び3.3μg）。
【図１０】図１０は、ADHの正反応及び逆反応の触媒作用に対するpHの効果を示す。
【図１１】図１１は、Polaromonas sp.のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼの安定性に対する温度の効果を示す。
【図１２】図１２は、Polaromonas sp.のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼの調節特性（regulatory properties）を示す。
【図１３】図１３は、ADHのオキサロ酢酸のアミノ化反応の触媒作用に対するアスパラギン酸の効果を示す。
【図１４】図１４は、pET-ADH-P(S)プラスミドの構築を示す。
【図１５】図１５は、Rhodopseudomonas palustris HaA2由来の推定上のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子RPB_0147を含むpET-15-ADH1-Rpプラスミドの構築のスキームを示す。
【図１６】図１６は、pET-15-ADH1-Rpプラスミドを保持するBL21(DE3)株の粗抽出物から調製した可溶性及び不溶性画分のSDS/PAAG（10％）電気泳動の写真である。  Ｋ：BL21(DE3)/pET15b  Ｍ：タンパク質マーカーSM0431  レーン７、８：BL21(DE3)/pET15-ADH1-Rp、クローン７及び８。
【図１７】図１７は、精製したRhodopseudomonas palustrisのアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ（ADH1-Rp）のSDS-PAGEの写真である。
【図１８】図１８は、Rhodopseudomonas palustrisのADH1-Rpの触媒作用に対するpHの効果を示す。
【図１９】図１９は、Polaromonas sp.由来のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼの完全長ホモログの系統樹（distance tree）である。
【図２０】図２０は、Polaromonas sp.由来のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼの完全長ホモログの系統樹である（続き）。
【図２１】図２１は、E. coli MG1655株の染色体への、Bradyrhizobium japonicum由来のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の組込みを示す。
【図２２】図２２は、Ralstonia eutropha H16由来の推定上のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子h16_B0736を含むpET15-ADH-Reプラスミドの構築を示す。
【図２３】図２３は、pET15-ADH-Reプラスミドを保持するBL21(DE3)株の粗抽出物から調製した可溶性及び不溶性画分のSDS/PAAG（10％）電気泳動の写真である。  Ｋ：pET15b  Ｍ：タンパク質マーカーSM0431  レーン２：pET15-ADH-Re、クローン２  レーン３：pET15-ADH-Re、クローン３  レーン４：pET15-ADH-Re、クローン４  レーン５：pET15-ADH-Re、クローン５。
【図２４】図２４は、精製したRalstonia eutropha ADH-ReのSDS-PAGEの写真である。  左のレーン：精製した酵素（1 mkg）；右のレーン：タンパク質マーカー。
【図２５】図２５は、Ralstonia eutropha ADH-Reのアミノ化反応及び脱アミノ化反応の触媒作用に対するpHの効果を示す。
【図２６】図２６は、pET15-ADH-Bjプラスミドを保有するBL21(DE3)株の粗抽出物から調製した可溶性及び不溶性画分のSDA/PAAG（10％）電気泳動の写真である。  Ｍ：SM0431マーカー  レーン１：BL21(DE3)/pET15bの可溶性画分  レーン２、３：BL21(DE3)/pET15-ADH-Bjの可溶性画分、クローン１、２  レーン４：BL21(DE3)/pET15bの不溶性画分  レーン５、６：BL21(DE3)/pET15-ADH-Bjの不溶性画分、クローン１、２
【図２７】図２７は、精製したブラディリゾビウム・ジャポニカム（Bradyrhizobium japonicum ）ADH-BjのSDS-PAGE（12％）の写真である。  左のレーン：精製した酵素（2 mkg）；右のレーン：タンパク質マーカー。
【図２８】図２８は、Bradyrhizobium japonicum ADH-Bjのアミノ化反応及び脱アミノ化反応の触媒作用に対するpHの効果を示す。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１４】
RBSΦ10に接続した遺伝子を、組込みベクターpMIV5-JS（ロシア連邦特許出願第2006132818号、EP1942183）にサブクローニングし、Ptacプロモーターの制御下に置いた。この結果得られたプラスミドpMIV-TM1643（図１）を、P. ananatis 5ΔP2-36S株に導入した。P.
ananatis 5ΔP2-36S及び5ΔP2-36S/pMIV-TM1643株のそれぞれを、保持するプラスミド用に50 mg/Lのクロラムフェニコールを添加したLB-M91/2培地中で７時間生育させ、試験管
発酵用の標準的な培地を用いて30倍に希釈し、フラスコ（750 mlのフラスコ中の30 mlの
培地）中で通気しながら15時間培養した。6 mlの培養物から細胞を遠心分離により回収し、50 mM TRIS, pH 7.5で洗浄して凍結した。ペレットを50 mM TRIS, pH 7.4及び2 mM DTTの緩衝液に再懸濁し、超音波によって細胞を破砕した。反応混合物は、100 mM TRIS, pH 9.8、1 mM NADP、5 mM アスパラギン酸、及び2.5μgの全タンパク質を含むものとした。
プローブは、+70℃で30分間インキュベートした。インキュベートしていないプローブ及
びアスパラギン酸なしのプローブを対照として使用した。5ΔP2-36S/pMIV-TM1643の粗抽
出物中のアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ活性の測定により、６つの独立した形質転換体において、E. coli BL21(DE3)/pET-TM1643-All株で測定された比活性と同等の高いレベルのアスパラギン酸デヒドロゲナーゼ活性が示された（表２）。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１２】
5ΔP2RMG-S株を、5ΔP2RM株から取得した。このために、5ΔP2RM株において、グルコースデヒドロゲナーゼをコードするgcd遺伝子を、オリゴヌクレオチドgcd-attR（配列番号
９５）及びgcd-attL（配列番号９６）を組込み用DNA断片の生成のためのプライマーとし
て使用した上記λRed依存性手順に従って欠失させた。オリゴヌクレオチドgcd-test1（配列番号９７）及びgcd-test2（配列番号９８）を、得られた組込み体のPCR検証に使用した。この結果得られた株5ΔP2RMGから、上記λInt/Xis依存性手順を使用してカナマイシン
耐性マーカーをキュアリングし、5ΔP2RMG-Sと命名した。
【手続補正４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２３】
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