【手続補正書】
【提出日】平成23年8月19日(2011.8.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離二本鎖分子であって、細胞に導入されると、ＣＤＣＡ５、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１及びＷＤＨＤ１から成る群から選択される遺伝子のｉｎ  ｖｉｖｏ発現及び細胞増殖を阻害し、該二本鎖分子は、ＳＴＫ３１では配列番号３８（配列番号５の１７１３〜１７３２ｎｔ位で）及び配列番号３９（配列番号５の２２８９〜２３０８ｎｔ位で）と、ＣＤＣＡ５では配列番号４０（配列番号１の８０８〜８２７ｎｔ位で）及び配列番号４１（配列番号１の４７０〜４８８ｎｔ位で）と、ＥＰＨＡ７では配列番号４２（配列番号３の２１８２〜２２００ｎｔ位で）及び配列番号４３（配列番号３の１９６８〜１９８７ｎｔ位で）と、ＷＤＨＤ１では配列番号４４（配列番号７の５７７〜５９６ｎｔ位で）及び配列番号４５（配列番号７の２０４１〜２０６０ｎｔ位で）とから成る群から選択される標的配列に一致するｍＲＮＡで作用する、二本鎖分子。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２６】
さらなる実施の形態において、本発明は、ＣＸ遺伝子、ＣＤＣＡ５、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１及びＷＤＨＤ１に対する二本鎖分子、例えばｓｉＲＮＡを提供し、これは本方法によってスクリーニングされた。本発明の二本鎖分子は、ＣＸ遺伝子によって媒介される癌又はＣＸ遺伝子の過剰発現をもたらす癌（例えば肺癌及び／又は食道癌）を治療又は予防するのに有用である。そのため本発明はさらに、癌性細胞を、本方法によってスクリーニングされる作用物質、例えばｓｉＲＮＡに接触させることを含む、癌を治療する方法に関する。
[請求項1001]
単離二本鎖分子であって、細胞に導入されると、ＣＤＣＡ5、ＥＰＨＡ7、ＳＴＫ31及びＷＤＨＤ1から成る群から選択される遺伝子のｉｎ  ｖｉｖｏ発現及び細胞増殖を阻害し、該二本鎖分子は、ＳＴＫ31では配列番号38（配列番号5の1713〜1732ｎｔ位で）及び配列番号39（配列番号5の2289〜2308ｎｔ位で）と、ＣＤＣＡ5では配列番号40（配列番号1の808〜827ｎｔ位で）及び配列番号41（配列番号1の470〜488ｎｔ位で）と、ＥＰＨＡ7では配列番号42（配列番号3の2182〜2200ｎｔ位で）及び配列番号43（配列番号3の1968〜1987ｎｔ位で）と、ＷＤＨＤ1では配列番号44（配列番号7の577〜596ｎｔ位で）及び配列番号45（配列番号7の2041〜2060ｎｔ位で）とから成る群から選択される標的配列に一致するｍＲＮＡで作用する、二本鎖分子。
[請求項1002]
二本鎖を形成するように互いにハイブリダイズする、センス鎖とそれに対して相補的なアンチセンス鎖とを含み、該センス鎖が、ＣＤＣＡ5では配列番号40及び配列番号41と、ＥＰＨＡ7では配列番号42及び配列番号43と、ＳＴＫ31では配列番号38及び配列番号39と、ＷＤＨＤ1では配列番号44及び配列番号45とから成る群から選択される配列に対応するオリゴヌクレオチドを含む、請求項1001に記載の二本鎖分子。
[請求項1003]
介在一本鎖によって連結した前記センス鎖と前記アンチセンス鎖との両方を含む単一オリゴヌクレオチドから成る、請求項1002に記載の二本鎖分子。
[請求項1004]
一般式5’−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ’］−3’
を有する二本鎖であって、式中、
［Ａ］は、ＣＤＣＡ5では配列番号40及び配列番号41と、ＥＰＨＡ7では配列番号42及び配列番号43と、ＳＴＫ31では配列番号38及び配列番号39と、ＷＤＨＤ1では配列番号44及び配列番号45とから成る群から選択される配列に対応するオリゴヌクレオチドを含むセンス鎖であり、
［Ｂ］は前記介在一本鎖であり、かつ、
［Ａ’］は［Ａ］で選択される配列に相補的な配列に対応するオリゴヌクレオチドを含む前記アンチセンス鎖である、請求項1003に記載の二本鎖分子。
[請求項1005]
3’オーバーハングを含有する、請求項1001に記載の二本鎖分子。
[請求項1006]
請求項1001に記載の二本鎖分子を発現するベクター。
[請求項1007]
ＣＤＣＡ5、ＥＰＨＡ7、ＳＴＫ31及びＷＤＨＤ1から成る群から選択される遺伝子を発現する細胞の成長を阻害又は低減する方法であって、該方法は、少なくとも1つの二本鎖分子又は少なくとも1つの二本鎖分子を発現するベクターを与える工程を含み、該二本鎖分子又は該ベクターが細胞に導入され、該遺伝子のｉｎ  ｖｉｖｏ発現を阻害又は低減する、方法。
[請求項1008]
前記二本鎖分子が請求項1001に記載される二本鎖分子である、請求項1007に記載の方法。
[請求項1009]
ＣＤＣＡ5、ＥＰＨＡ7、ＳＴＫ31及びＷＤＨＤ1から成る群から選択される遺伝子を発現する癌を治療又は予防する方法であって、該方法は、少なくとも1つの二本鎖分子又は少なくとも1つの二本鎖分子を発現するベクターを投与する工程を含み、該二本鎖分子又は該ベクターが細胞に導入され、該遺伝子のｉｎ  ｖｉｖｏ発現を阻害又は低減する、方法。
[請求項1010]
前記二本鎖分子が請求項1001に記載される二本鎖分子である、請求項1009に記載の方法。
[請求項1011]
前記癌が肺癌及び／又は食道癌である、請求項1009に記載の方法。
[請求項1012]
ＣＤＣＡ5、ＥＰＨＡ7、ＳＴＫ31及びＷＤＨＤ1から成る群から選択される遺伝子を発現する細胞の成長を阻害又は低減する組成物であって、少なくとも1つの二本鎖分子又は少なくとも1つの二本鎖分子を発現するベクターを含み、該二本鎖分子又は該ベクターが細胞に導入され、該遺伝子のｉｎ  ｖｉｖｏ発現を阻害又は低減する、組成物。
[請求項1013]
前記二本鎖分子が請求項1001に記載される二本鎖分子である、請求項1012に記載の組成物。
[請求項1014]
ＣＤＣＡ5、ＥＰＨＡ7、ＳＴＫ31及びＷＤＨＤ1から成る群から選択される遺伝子を発現する癌を治療又は予防する組成物であって、前記方法が少なくとも1つの二本鎖分子又は少なくとも1つの二本鎖分子を発現するベクターを投与する工程を含み、該二本鎖分子又は該ベクターが細胞に導入され、該遺伝子のｉｎ  ｖｉｖｏ発現及び細胞増殖を阻害又は低減する、組成物。
[請求項1015]
前記二本鎖分子が請求項1001に記載される二本鎖分子である、請求項1014に記載の組成物。
[請求項1016]
肺癌及び／又は食道癌を診断する方法であって、
（ａ）生体試料において、ＣＤＣＡ5、ＥＰＨＡ7、ＳＴＫ31及びＷＤＨＤ1から成る群から選択される遺伝子の発現レベルを検出する工程と、
（ｂ）前記遺伝子の正常対照レベルに対する前記発現レベルの増大を前記疾患と関連付ける工程とを含む、方法。
[請求項1017]
前記発現レベルが正常対照レベルよりも少なくとも10％大きい、請求項1016に記載の方法。
[請求項1018]
前記発現レベルが、
（ａ）ＣＤＣＡ5、ＥＰＨＡ7、ＳＴＫ31及びＷＤＨＤ1から成る群から選択されるポリペプチドをコードするｍＲＮＡを検出すること、
（ｂ）ＣＤＣＡ5、ＥＰＨＡ7、ＳＴＫ31及びＷＤＨＤ1から成る群から選択されるポリペプチドを検出すること、及び
（ｃ）ＣＤＣＡ5、ＥＰＨＡ7、ＳＴＫ31及びＷＤＨＤ1から成る群から選択されるポリペプチドの生物活性を検出することから成る群から選択される方法のいずれか1つによって検出される、請求項1016に記載の方法。
[請求項1019]
前記肺癌が非小細胞肺癌又は小細胞肺癌である、請求項1016に記載の方法。
[請求項1020]
肺癌及び／又は食道癌の患者の予後を判定する方法であって、
（ａ）生体試料において、ＥＰＨＡ7、ＳＴＫ31及びＷＤＨＤ1から成る群から選択される遺伝子の発現レベルを検出する工程と、
（ｂ）前記検出された発現レベルを対照レベルと比較する工程と、
（ｃ）（ｂ）の比較に基づいて、前記患者の予後を決定する工程とを含む、方法。
[請求項1021]
前記対照レベルが良好な予後対照レベルであり、該対照レベルに対する前記発現レベルの増大が予後不良と決定される、請求項1020に記載の方法。
[請求項1022]
前記増大が前記対照レベルよりも少なくとも10％大きい、請求項1021に記載の方法。
[請求項1023]
前記発現レベルが、
（ａ）ＥＰＨＡ7、ＳＴＫ31及びＷＤＨＤ1から成る群から選択されるポリペプチドをコードするｍＲＮＡを検出すること、
（ｂ）ＥＰＨＡ7、ＳＴＫ31及びＷＤＨＤ1から成る群から選択されるポリペプチドを検出すること、並びに
（ｃ）ＣＤＣＡ5、ＥＰＨＡ7、ＳＴＫ31及びＷＤＨＤ1から成る群から選択されるポリペプチドの生物活性を検出することから成る群から選択される方法のいずれか1つによって求められる、請求項1020に記載の方法。
[請求項1024]
前記肺癌が非小細胞肺癌又は小細胞肺癌である、請求項1023に記載の方法。
[請求項1025]
被験体においてＥＰＨＡ7ポリペプチドを検出する方法であって、
（ａ）診断すべき被験体から体液を採取する工程と、
（ｂ）イムノアッセイによって前記体液中のＥＰＨＡ7ポリペプチド又はその断片のレベルを求める工程とを含む、方法。
[請求項1026]
前記体液が全血、血清及び血漿から成る群から選択される、請求項1025に記載の方法。
[請求項1027]
前記イムノアッセイがＥＬＩＳＡである、請求項1025に記載の方法。
[請求項1028]
さらに
（ｄ）前記血液試料においてｐｒｏ−ＧＲＰのレベルを測定する工程と、
（ｅ）工程（ｅ）で測定された前記ｐｒｏ−ＧＲＰのレベルを、正常対照のレベルと比較する工程とを含み、前記血液試料において、該正常対照のレベルに比べて高いＥＰＨＡ7及び高いｐｒｏ−ＧＲＰのレベルのいずれか又は両方が、前記被験体が肺癌を患っていることを示す、請求項1025に記載の方法。
[請求項1029]
さらに
（ｄ）前記血液試料においてＣＥＡのレベルを測定する工程と、
（ｅ）工程（ｅ）で測定された前記ＣＥＡのレベルを、正常対照のレベルと比較する工程とを含み、前記血液試料において、該正常対照のレベルに比べて高いＥＰＨＡ7及び高いＣＥＡのレベルのいずれか又は両方が、前記被験体が肺癌を患っていることを示す、請求項1025に記載の方法。
[請求項1030]
肺癌及び／又は食道癌を検出するキットであって、
（ａ）血液試料においてＥＰＨＡ7のレベルを測定する、イムノアッセイ試薬と、
（ｂ）ＥＰＨＡ7で陽性の対照試料とを含む、キット。
[請求項1031]
ＣＥＡ及び／又はｐｒｏ−ＧＲＰを検出する試薬をさらに含む、請求項1030に記載のキット。
[請求項1032]
ＣＤＣＡ5、ＥＰＨＡ7、ＳＴＫ31又はＷＤＨＤ1遺伝子から成る群から選択される少なくとも1つの遺伝子を発現する癌を診断、治療又は予防するのに有用な作用物質をスクリーニングする方法であって、
（ａ）試験作用物質を前記遺伝子でコードされるポリペプチド又はその断片に接触させる工程と、
（ｂ）前記ポリペプチドと前記試験作用物質との結合を検出する工程と、
（ｃ）工程（ａ）の前記ポリペプチドと結合する前記試験作用物質を選択する工程とを含む、方法。
[請求項1033]
ＣＤＣＡ5、ＥＰＨＡ7、ＳＴＫ31又はＷＤＨＤ1遺伝子を発現する癌を治療又は予防するのに有用な作用物質をスクリーニングする方法であって、
（ａ）試験作用物質を、ＣＤＣＡ5、ＥＰＨＡ7、ＳＴＫ31及びＷＤＨＤ1ポリペプチドから成る群から選択されるポリペプチド又はその機能的等価物をコードするポリヌクレオチドを発現する細胞に接触させる工程と、
（ｂ）工程（ａ）の前記ポリヌクレオチド又は前記ポリペプチドの発現レベルを検出する工程と、
（ｃ）前記工程（ｂ）で検出された前記レベルを、前記試験作用物質の非存在下で検出されたレベルと比較する工程と、
（ｄ）工程（ｃ）において前記試験作用物質の非存在下で検出されたレベルに比べて前記レベルを低減又は阻害する該試験作用物質を選択する工程とを含む、方法。
[請求項1034]
ＣＤＣＡ5、ＥＰＨＡ7、ＳＴＫ31又はＷＤＨＤ1遺伝子を発現する癌を治療又は予防するのに有用な作用物質をスクリーニングする方法であって、
（ａ）試験作用物質を、ＣＤＣＡ5、ＥＰＨＡ7、ＳＴＫ31及びＷＤＨＤ1ポリペプチドから成る群から選択されるポリペプチド又はその機能的等価物をコードするポリヌクレオチドを発現する細胞に接触させる工程と、
（ｂ）工程（ａ）の前記ポリヌクレオチド又は前記ポリペプチドの生物活性を検出する工程と、
（ｃ）前記工程（ｂ）で検出された前記生物活性を、前記試験作用物質の非存在下で検出されたレベルと比較する工程と、
（ｄ）工程（ｃ）において前記試験作用物質の非存在下で検出されたレベルに比べて前記生物活性を低減する該試験作用物質を選択する工程とを含む、方法。
[請求項1035]
前記生物活性が、
（ａ）増殖活性、
（ｂ）浸潤活性、及び
（ｃ）キナーゼ活性から成る群から選択される活性のいずれか1つである、請求項1034に記載の方法。
[請求項1036]
前記キナーゼ活性が、ＥＧＦＲ、ＰＬＣγ、ＣＤＣ25、ＭＥＴ、Ｓｈｃ、ＥＲＫ1／2（ｐ44／42  ＭＡＰＫ）、Ａｋｔ、ＳＴＡＴ3及びＭＥＫ1／2から成る群から選択される遺伝子のリン酸化レベルによって検出される、請求項1035に記載の方法。
[請求項1037]
前記リン酸化レベルが、
（ａ）ＥＧＦＲのＹ845、Ｙ1068、Ｙ1086、Ｙ1173、Ｓ1046又はＳ1047、
（ｂ）ＰＬＣγのＹ783、
（ｃ）ＣＤＣ25のＳ216、
（ｄ）ＭＥＴのＹ1230、Ｙ1234、Ｙ1235、Ｙ1349又はＹ1365、
（ｅ）ＳｈｃのＹ317、Ｙ239、Ｙ240、
（ｆ）ＥＲＫ1／2（ｐ44／42  ＭＡＰＫ）のＴ202又はＹ204、
（ｇ）ＡｋｔのＳ473、
（ｈ）ＳＴＡＴ3のＹ705、及び
（ｉ）ＭＥＫ1／2のＳ217又はＳ221から成る群から選択される残基で検出される、請求項1036に記載の方法。
[請求項1038]
ＥＰＨＡ7遺伝子を発現する癌を治療又は予防するのに有用な作用物質をスクリーニングする方法であって、
（ａ）ＥＰＨＡ7ポリペプチド又はその機能的等価物を、ＥＧＦＲ、ＰＬＣγ、ＣＤＣ25、ＭＥＴ、Ｓｈｃ、ＥＲＫ1／2（ｐ44／42  ＭＡＰＫ）、Ａｋｔ、ＳＴＡＴ3及びその機能的等価物から成る群から選択される基質に、該基質をリン酸化させる条件下で試験化合物の存在下において接触させる工程と、
（ｂ）基質のリン酸化レベルを検出する工程と、
（ｃ）前記工程（ｂ）で検出された前記レベルを、前記試験作用物質の非存在下で検出されたレベルと比較する工程と、
（ｄ）工程（ｃ）において前記試験作用物質の非存在下で検出されたレベルに比べて該レベルを低減又は阻害する該試験作用物質を選択する工程とを含む、方法。
[請求項1039]
前記基質のリン酸化レベルが、ＥＧＦＲのＹ845、Ｙ1068、Ｙ1086及び／又はＹ1173、ＰＬＣγのＹ783、ＣＤＣ25のＳ216、ＭＥＴのＹ1230、Ｙ1234、Ｙ1235、Ｙ1313、Ｙ1349及び／又はＹ1365、ＳｈｃのＹ317、Ｙ239及び／又はＹ240、ＥＲＫ1／2（ｐ44／42  ＭＡＰＫ）のＴ202及び／又はＹ204、ＡｋｔのＳ473、及びＳＴＡＴ3のＹ705から成る群から選択される残基で検出される、請求項1038に記載の方法。
[請求項1040]
ＥＧＦＲの前記機能的等価物が配列番号75のアミノ酸配列を含むポリペプチド断片である、請求項1039に記載の方法。
[請求項1041]
ＭＥＴの前記機能的等価物が配列番号76のアミノ酸配列を含むポリペプチド断片である、請求項1038に記載の方法。
[請求項1042]
前記癌が肺癌及び／又は食道癌である、請求項1038に記載の方法。
[請求項1043]
ＥＰＨＡ7ポリペプチドとＥＧＦＲポリペプチド又はＭＥＴとの結合を妨げる作用物質をスクリーニングする方法であって、
（ａ）ＥＰＨＡ7ポリペプチド又はその機能的等価物を、試験作用物質の存在下で、ＥＧＦＲ若しくはＭＥＴポリペプチド又はその機能的等価物に接触させる工程と、
（ｂ）前記ポリペプチド間の結合を検出する工程と、
（ｃ）前記工程（ｂ）で検出された前記結合レベルを、前記試験作用物質の非存在下で検出されたレベルと比較する工程と、
（ｄ）工程（ｃ）において前記試験作用物質の非存在下で検出されたレベルに比べて前記結合レベルを低減又は阻害する該試験作用物質を選択する工程とを含む、方法。
[請求項1044]
ＥＰＨＡ7の前記機能的等価物が前記ＥＧＦＲ結合ドメインを含む、請求項1038に記載の方法。
[請求項1045]
ＥＧＦＲの前記機能的等価物が配列番号75のアミノ酸配列を含むポリペプチド断片である、請求項1038に記載の方法。
[請求項1046]
ＭＥＴの前記機能的等価物が配列番号76のアミノ酸配列を含むポリペプチド断片である、請求項1038に記載の方法。
[請求項1047]
ＳＴＫ31遺伝子を発現する癌を治療又は予防するのに有用な作用物質をスクリーニングする方法であって、
（ａ）ＳＴＫ31ポリペプチド又はその機能的等価物を、ＥＲＫ1／2（ｐ44／42  ＭＡＰＫ）、ＥＧＦＲ及びＭＥＫ1／2から成る群から選択される基質に、該基質をリン酸化させる条件下で試験化合物の存在下において接触させる工程と、
（ｂ）基質のリン酸化レベルを検出する工程と、
（ｃ）前記工程（ｂ）で検出された前記レベルを、前記試験作用物質の非存在下で検出されたレベルと比較する工程と、
（ｄ）工程（ｃ）において前記試験作用物質の非存在下で検出されたレベルに比べて該レベルを低減又は阻害する該試験作用物質を選択する工程とを含む、方法。
[請求項1048]
前記基質のリン酸化レベルが、ＥＲＫ1／2（ｐ44／42  ＭＡＰＫ）のＴ202及び／又はＹ204、ＥＧＦＲのＳ1046及び／又はＳ1047、及びＭＥＫ1／2のＳ217及び／又はＳ221から成る群から選択される残基で検出される、請求項1047に記載の方法。
[請求項1049]
前記癌が肺癌及び食道癌から成る群から選択される、請求項1047に記載の方法。
[請求項1050]
ＳＴＫ31ポリペプチドとｃ−ｒａｆ、ＭＥＫ又はＥＲＫ（ｐ44／42  ＭＡＰＫ）ポリペプチドとの結合を妨げる作用物質をスクリーニングする方法であって、
（ａ）ＳＴＫ31ポリペプチド又はその機能的等価物を、試験作用物質の存在下で、ｃ−ｒａｆ、ＭＥＫ若しくはＥＲＫ（ｐ44／42  ＭＡＰＫ）ポリペプチド又はその機能的等価物に接触させる工程と、
（ｂ）前記ポリペプチド間の結合を検出する工程と、
（ｃ）前記工程（ｂ）で検出された前記結合レベルを、前記試験作用物質の非存在下で検出されたレベルと比較する工程と、
（ｄ）工程（ｃ）において前記試験作用物質の非存在下で検出されたレベルに比べて前記結合レベルを低減又は阻害する該試験作用物質を選択する工程とを含む、方法。
[請求項1051]
ＳＴＫ31の前記機能的等価物が、前記ｃ−ｒａｆ、ＭＥＫ又はＥＲＫ（ｐ44／42  ＭＡＰＫ）結合ドメインを含む、請求項1050に記載の方法。
[請求項1052]
ｃ−ｒａｆ、ＭＥＫ又はＥＲＫ（ｐ44／42  ＭＡＰＫ）の前記機能的等価物が、前記ＳＴＫ31結合ドメインを含む、請求項1051に記載の方法。
[請求項1053]
癌を治療又は予防する作用物質をスクリーニングする方法であって、
（ａ）試験作用物質を、ＷＤＨＤ1ポリペプチド又はその機能的等価物をコードする遺伝子を発現する細胞に接触させる工程と、
（ｂ）工程（ａ）の前記ポリペプチドをリン酸化させる条件下で培養する工程と、
（ｃ）工程（ａ）の前記ポリペプチドのホスホセリン又はホスホチロシンレベルを検出する工程と、
（ｄ）前記工程（ｃ）で検出された前記リン酸化レベルを、前記試験作用物質の非存在下で検出されたリン酸化レベルと比較する工程と、
（ｅ）前記リン酸化レベルを阻害又は低減する前記試験作用物質を選択する工程とを含む、方法。
[請求項1054]
前記癌が肺癌及び食道癌から成る群から選択される、請求項1053に記載の方法。
[請求項1055]
ＷＤＨＤ1のホスホセリン（phosphor-serine）がＳ374である、請求項1054に記載の方法。
[請求項1056]
前記癌が肺癌及び食道癌から成る群から選択される、請求項1053に記載の方法。
[請求項1057]
ＷＤＨＤ1遺伝子を発現する癌を治療又は予防するのに有用な作用物質をスクリーニングする方法であって、
（ａ）ＷＤＨＤ1をリン酸化させる条件下で試験化合物の存在下において、Ａｋｔポリペプチド又はその機能的等価物をＷＤＨＤ1又はその機能的等価物に接触させる工程と、
（ｂ）ＷＤＨＤ1のリン酸化レベルを検出する工程と、
（ｃ）前記工程（ｂ）で検出された前記レベルを、前記試験作用物質の非存在下で検出されたレベルと比較する工程と、
（ｄ）工程（ｃ）において前記試験作用物質の非存在下で検出されたレベルに比べて前記レベルを低減又は阻害する該試験作用物質を選択する工程とを含む、方法。
[請求項1058]
リン酸化の前記レベルがＷＤＨＤ1のＳ374の残基で検出される、請求項1057に記載の方法。
[請求項1059]
ＣＤＣＡ5ポリペプチドと、ＣＤＣ2又はＥＲＫポリペプチドとの間の相互作用又は結合を妨げる作用物質をスクリーニングする方法であって、
（ａ）試験作用物質の存在下で、以下の（ｉ）ＣＤＣＡ5ポリペプチド又はその機能的等価物、及び（ｉｉ）ＣＤＣ2若しくはＥＲＫポリペプチド又はその機能的等価物のポリペプチドを接触させる工程と、
（ｂ）前記ポリペプチド間の前記相互作用又は前記結合のレベルを検出する工程と、
（ｃ）前記工程（ｂ）で検出された前記レベルを、前記試験作用物質の非存在下で検出されたレベルと比較する工程と、
（ｄ）前記レベルを低減又は阻害する該試験作用物質を選択する工程とを含む、方法。
[請求項1060]
ＣＤＣＡ5の前記機能的等価物が前記ＣＤＣ2相互作用ドメイン又は前記ＥＲＫ相互作用ドメインを含む、請求項1059に記載の方法。
[請求項1061]
ＣＤＣ2又はＥＲＫの前記機能的等価物が前記ＣＤＣＡ5相互作用ドメインを含む、請求項1059に記載の方法。
[請求項1062]
ＣＤＣＡ5のＣＤＣ2媒介性リン酸化又はＥＲＫ媒介性リン酸化を調整する作用物質をスクリーニングする方法であって、
（ａ）試験作用物質の存在下で、（ｉ）ＣＤＣＡ5ポリペプチド又はその機能的等価物、及び（ｉｉ）ＣＤＣ2若しくはＥＲＫポリペプチド又はその機能的等価物のポリペプチドを接触させる工程と、
（ｂ）（ａ）（ｉ）のポリペプチドのリン酸化レベルを検出する工程と、
（ｃ）前記工程（ｂ）で検出された前記リン酸化レベルを、前記試験作用物質の非存在下で検出されたレベルと比較する工程と、
（ｄ）阻害剤として前記リン酸化レベルを阻害又は低減する前記試験作用物質を選択する工程、又は促進剤として前記リン酸化レベルを促進する又は高める前記試験作用物質を選択する工程とを含む、方法。
[請求項1063]
ＣＤＣＡ5ポリペプチドの前記機能的等価物が、該ＣＤＣＡ5ポリペプチドの少なくとも1つのＣＤＣ2媒介性リン酸化部位又はＥＲＫ媒介性リン酸化部位を含む、請求項1062に記載の方法。
[請求項1064]
前記ＣＤＣ2媒介性リン酸化部位が、配列番号2（ＣＤＣＡ5）のセリン−21、セリン−75又はスレオニン−159であり、前記ＥＲＫ媒介性リン酸化部位が、セリン−21、スレオニン−48、セリン−75、セリン−79、スレオニン−111、スレオニン−115、スレオニン−159又はセリン−209である、請求項1062に記載の方法。
[請求項1065]
ＣＤＣＡ5を発現する癌を予防又は治療するのに有用な作用物質をスクリーニングする方法であって、
（ａ）試験作用物質を、ＣＤＣＡ5ポリペプチド又はその機能的等価物をコードする遺伝子を発現する細胞に接触させる工程と、
（ｂ）工程（ａ）の前記ポリペプチドをリン酸化させる条件下で培養する工程と、
（ｃ）工程（ａ）の前記ポリペプチドのリン酸化レベルを検出する工程と、
（ｄ）前記工程（ｃ）で検出された前記リン酸化レベルを、前記試験作用物質の非存在下で検出されたリン酸化レベルと比較する工程と、
（ｅ）工程（ｃ）において前記試験作用物質の非存在下で検出されたレベルに比べて前記リン酸化レベルを低減又は阻害する該試験作用物質を選択する工程とを含む、方法。
[請求項1066]
前記作用物質が、ＣＤＣＡ5のＣＤＣ2媒介性リン酸化活性又はＥＲＫ媒介性リン酸化活性を阻害又は低減する、請求項1065に記載の方法。
[請求項1067]
前記リン酸化レベルがホスホセリン又はホスホスレオニンのレベルである、請求項1065に記載の方法。
[請求項1068]
ＣＤＣＡ5のホスホセリンが配列番号2（ＣＤＣＡ5）のセリン−21、セリン−75、セリン−79又はセリン−209である、請求項1067に記載の方法。
[請求項1069]
ＣＤＣＡ5のホスホスレオニンが配列番号2（ＣＤＣＡ5）のスレオニン−48、スレオニン−111又はスレオニン−115である、請求項1068に記載の方法。
[請求項1070]
前記癌が肺癌及び食道癌から成る群から選択される、請求項1065に記載の方法。
[請求項1071]
ＣＤＣＡ5、ＥＰＨＡ7、ＳＴＫ31又はＷＤＨＤ1遺伝子を発現する癌を治療又は予防するのに有用な作用物質をスクリーニングする方法であって、
（ａ）試験作用物質を、ＣＤＣＡ5、ＥＰＨＡ7、ＳＴＫ31及び／又はＷＤＨＤ1遺伝子の転写調節領域を含むベクターと、該転写調節領域の制御下で発現するレポーター遺伝子とが導入された細胞に接触させる工程と、
（ｂ）前記レポーター遺伝子の活性の発現を測定する工程と、
（ｃ）前記試験化合物の非存在下でのレベルに比べて前記レポーター遺伝子の活性レベルの発現を低減する化合物を選択する工程とを含む、方法。
[請求項1072]
前記癌が肺癌及び食道癌から成る群から選択される、請求項1071に記載の方法。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８２】
（ｉ）ポリクローナル抗体：
ポリクローナル抗体は、動物において関連抗原及びアジュバントの頻回皮下（ｓｃ）又は腹腔内（ｉｐ）注射により生じさせるのが好ましい。二官能性物質又は誘導体化剤、例えばマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を介する共役）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リシン残基を介する）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣ１２、又はＲ’Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ（式中、Ｒ’及びＲは異なるアルキル基である）を用いて、免疫化される種において免疫原性のあるタンパク質、例えばキーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、又はダイズトリプシン阻害因子と関連抗原とを共役させることが有用であり得る。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９２】
所望の特異性、親和性、及び／又は活性を有する抗体を産生するハイブリドーマ細胞を同定した後、そのクローンを限界希釈法によってサブクローニングし、標準的な方法（Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)）によって成長させてもよい。この目的に適した培養培地には、例えばＤ−ＭＥＭ培地又はＲＰＭＩ−１６４０培地が含まれる。また、ハイブリドーマ細胞を動物において腹水腫瘍として、ｉｎ  ｖｉｖｏで成長させてもよい。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５１】
具体的に、本発明は、上述の標的配列を標的とする以下の二本鎖分子を提供し、これらをそれぞれ標的遺伝子を発現する細胞の成長を阻害又は低減する能力に関して調べた。ＣＸ遺伝子（複数可）を発現する癌細胞の成長は、本発明の二本鎖分子によって阻害又は低減され、ＣＤＣＡ５発現細胞、例えば肺癌細胞株Ａ５４９及び肺癌細胞株ＬＣ３１９の成長は、２つの二本鎖分子によって阻害され（図２Ａ及び図２Ｂ、中央及び下部のパネル）、ＥＰＨＡ７発現細胞、例えば肺癌細胞株ＮＣＩ−Ｈ５２０及び肺癌細胞株ＳＢＣ−５の成長は、２つの二本鎖分子によって阻害され（図６Ａ、中央及び下部のパネル）、ＳＴＫ３１発現細胞、例えば肺癌細胞株ＬＣ３１９及び肺癌細胞株ＮＣＩ−Ｈ２１７０の成長は、２つの二本鎖分子によって阻害され（図１１Ｂ及び図１１Ｃ）、ＷＤＨＤ１発現細胞、例えば肺癌細胞株ＬＣ３１９及び肺癌細胞株ＴＥ９の成長は、２つの二本鎖分子によって阻害された（図１５Ａ、中央及び下部のパネル）。したがって、本発明は以下の群から選択される配列のいずれかを標的とする二本鎖分子を提供する。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７９】
（ｉｉｉ）癌細胞の成長を阻害若しくは低減する、又は二本鎖分子を用いて癌を治療若しくは予防する方法
本発明において、上述の標的配列を標的とする二本鎖分子をそれぞれ、標的遺伝子を（過剰）発現する細胞の成長を阻害又は低減する能力に関して試験した。ＣＸ遺伝子（複数可）を（過剰）発現する癌細胞の成長は、本発明の二本鎖分子によって阻害又は低減され、ＣＤＣＡ５（過剰）発現細胞、例えば肺癌細胞株Ａ５４９及び肺癌細胞株ＬＣ３１９の成長は２つの二本鎖分子によって阻害され（図２Ａ及び図２Ｂ、中央及び下部のパネル）、ＥＰＨＡ７発現細胞、例えば肺癌細胞株ＮＣＩ−Ｈ５２０及び肺癌細胞株ＳＢＣ−５の成長は２つの二本鎖分子によって阻害され（図６Ａ、中央及び下部のパネル）、ＳＴＫ３１発現細胞、例えば肺癌細胞株ＬＣ３１９及び肺癌細胞株ＮＣＩ−Ｈ２１７０の成長は２つの二本鎖分子によって阻害された（図１１Ｂ及び図１１Ｃ）。ＷＤＨＤ１発現細胞、例えば肺癌細胞株ＬＣ３１９及び肺癌細胞株ＴＥ９の成長は２つの二本鎖分子によって阻害された（図１５Ａ、中央及び下部のパネル）。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２８２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２８２】
ＥＰＨＡ７とＣＥＡ及び／又はｐｒｏＧＲＰとの間の組合せによって、肺癌、即ちＮＳＣＬＣ及び／又はＳＣＬＣの検出に対する感度が有意に改善され得る。例えば、後述の実施例において解析される群では、ＮＳＣＬＣに対するＣＥＡの感度が３７．９％（８８／２３２）であり、特異度が８９．８％（１１４／１２７）である（図５Ｃ、上部パネル）。一方、ＥＰＨＡ７とＣＥＡとの組合せは、ＮＳＣＬＣの検出に対する感度全体を７６．７％（１７８／２３２）に改善する。本発明では、「ＥＰＨＡ７とＣＥＡとの組合せ」は、ＥＰＨＡ７及びＣＥＡのレベルのいずれか又は両方がマーカーとして用いられることを表す。幾つかの実施形態では、ＥＰＨＡ７及びＣＥＡのいずれかに関して陽性であると試験された患者は、ＮＳＣＬＣを患っていると判断することができる。ＮＳＣＬＣのための血清学的マーカーとしてのＥＰＨＡ７とＣＥＡとの組合せの使用は、当該技術分野で開示されていない。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４２２】
（ｖｉ）指標としてＥＰＨＡ７媒介性のリン酸化を用いるスクリーニング
本発明の別の態様によれば、ＥＧＦＲ、ＰＬＣ−γ（配列番号５２、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００２６６０）、ＣＤＣ２５（配列番号５４、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００１７９０）、ＭＥＴ（配列番号５６、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿０００２４５）、Ｓｈｃ（配列番号５８、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００１１３００４１）、ＥＲＫ（ｐ４４／４２  ＭＡＰＫ）（配列番号５０、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００１０４００５６）、Ａｋｔ（配列番号６０、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００１０１４４３１）又はＳＴＡＴ３（配列番号６２、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿１３９２７６）のＥＰＨＡ７媒介性のリン酸化を阻害又は低減する作用物質は、ＥＰＨＡ７を発現する癌細胞、例えば肺癌細胞又は食道癌細胞の成長を阻害又は低減するために使用することができ、またＥＰＨＡ７を発現する癌、例えば肺癌又は食道癌を治療又は予防するために使用することができ、指標としてＥＰＨＡ７媒介性のリン酸化レベルを用いてスクリーニングされる。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４３１】
（ｖｉｉ）指標としてＳＴＫ３１キナーゼ活性を用いるスクリーニング
本発明において、ＳＴＫ３１タンパク質の存在下でのＥＧＦＲ（Ｓｅｒ１０４６／１０４７）、ＥＲＫ（Ｐ４４／４２  ＭＡＰＫ）（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）及びＭＥＫ（Ｓ２１７／２２１）（図１２Ｂ、図１２Ｃ、図１２Ｄ）のリン酸化の促進も確認された。ＳＴＫ３１タンパク質は、７４５ａａ〜９７２ａａにおいてＳＴＹＫｃドメインのコンセンサス配列を有することが知られている。これにより本発明者らは、ＳＴＫ３１の下流の標的としてＥＧＦＲ、ＥＲＫ（Ｐ４４／４２  ＭＡＰＫ）及びＭＥＫを同定した。ＥＧＦＲのＳｅｒ１０４６／１０４７はＣａ２＋／カルモジュリン依存性キナーゼＩＩ（ＣａＭキナーゼＩＩ）によってリン酸化され、そのリン酸化がＥＧＦＲキナーゼ活性を減衰させたことが示された。ＣａＭキナーゼＩＩは、細胞成長を調節したＥＲＫ（Ｐ４４／４２  ＭＡＰＫ）活性化を引き起こすことも報告された。これにより、ＳＴＫ３１キナーゼ活性を阻害又は低減する化合物は、ＳＴＫ３１を発現する癌細胞、例えば肺癌細胞及び／又は食道癌細胞を阻害又は低減するのに有用であり、ＳＴＫ３１を発現する癌、例えば肺癌及び／又は食道癌を治療又は予防するのに有用であり得る。さらに本発明者らは、基質としてＭＢＰを使用してＳＴＫ３１キナーゼ活性を確認した。これにより、ＳＴＫ３１キナーゼ活性を阻害する化合物は、ＭＢＰのリン酸化レベルを用いてスクリーニングすることができる。したがって本発明は、指標としてかかるＳＴＫ３１キナーゼ活性を用いて、癌細胞の成長を阻害又は低減する化合物をスクリーニングする方法も提供する。さらに本発明は、ＥＰＨＡ７を発現する癌細胞、例えば肺癌細胞及び／又は食道癌細胞を阻害又は低減する化合物をスクリーニングする方法も提供する。この方法は、ＥＰＨＡ７を発現する癌、例えば肺癌及び／又は食道癌で使用することができる作用物質をスクリーニングするのに特に適している。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４３９】
（ｖｉｉｉ）指標としてＳＴＫ３１と、ｃ−ｒａｆ、ＭＥＫ又はＥＲＫ（ｐ４４／４２  ＭＡＰＫ）との結合を用いるスクリーニング
本発明において、ＳＴＫ３１タンパク質がｃ−ｒａｆ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００２８８０、配列番号６４）、ＭＥＫ又はＥＲＫタンパク質と相互作用し（図１２Ｆ）、またＥＧＦＲタンパク質のＳｅｒ−１０４６／１０４７、ＥＲＫ（ｐ４４／４２  ＭＡＰＫ）及びＭＥＫのＴｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４でリン酸化することが確認された（図１２Ｂ、図１２Ｄ）。ＳＴＫ３１タンパク質と、ｃ−ｒａｆ、ＭＥＫ又はＥＲＫ（ｐ４４／４２  ＭＡＰＫ）タンパク質との結合を阻害する化合物は、指標としてＳＴＫ３１タンパク質と、ｃ−ｒａｆ、ＭＥＫ又はＥＲＫ（ｐ４４／４２  ＭＡＰＫ）タンパク質とのかかる結合を用いてスクリーニングすることができる。それにより本発明は、ＳＴＫ３１タンパク質とｃ−ｒａｆ、ＭＥＫ、又はＥＲＫ（ｐ４４／４２  ＭＡＰＫ）との結合を阻害する化合物をスクリーニングする方法も提供し、この化合物はＳＴＫ３１タンパク質とｃ−ｒａｆ、ＭＥＫ、又はＥＲＫ（ｐ４４／４２  ＭＡＰＫ）とのかかる結合を用いてスクリーニングすることができる。さらに本発明は、ＳＴＫ３１を発現する癌細胞（例えば肺癌細胞及び／又は食道癌細胞）の成長を阻害又は低減する化合物と、癌（例えば肺癌及び／又は食道癌）を治療又は予防する化合物とをスクリーニングする方法も提供する。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４４７】
（ｉｘ）指標としてＷＤＨＤ１のリン酸化レベルを用いるスクリーニング
さらに、本発明において、ＷＤＨＤ１タンパク質がリン酸化によって修飾されたことが確認された。またＷＤＨＤ１のリン酸化領域の１つが、ＡＫＴキナーゼに対するコンセンサスリン酸化部位（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００１０１４４３１）（Ｒ−Ｘ−Ｒ−Ｘ−Ｘ−Ｓ３７４、ｒｅｆ．３３）を有する。ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達は、細胞増殖及び生存に重要である。そして、ＬＹ２９４００２を用いたＰＩ３Ｋ活性の阻害は、総ＷＤＨＤ１とリン酸化ＷＤＨＤ１との発現レベルを低減した（図１６Ｃ）。この結果は、ＷＤＨＤ１がＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路の構成要素の１つであり、リン酸化によって安定化されることを示している。さらに、ＷＤＨＤ１発現の阻害は、細胞成長の阻害に関与し、その結果アポトーシスを誘導させた（図１５Ｃ）。このため、ＷＤＨＤ１タンパク質のリン酸化を阻害する化合物は、指標としてかかる修飾を用いてスクリーニングして、ＷＤＨＤ１を発現する癌細胞の成長を阻害又は低減するのに有用であり得るか、癌細胞にアポトーシスを誘導するのに有用であり得るか、又はＷＤＨＤ１を発現する癌を治療又は予防するのに有用であり得る。癌は、肺癌、例えば非小細胞肺癌及び／又は小細胞肺癌、又は食道癌であり得る。したがって本発明は、ＷＤＨＤ１タンパク質のリン酸化を阻害する化合物をスクリーニングする方法も提供する。さらに本発明は、ＷＤＨＤ１を発現する癌細胞の成長を阻害又は低減する化合物と、ＷＤＨＤ１を発現する癌細胞にアポトーシスを誘導する化合物とをスクリーニングする方法も提供する。この方法は特に、ＷＤＨＤ１を発現する癌を治療又は阻害する際に使用することができる作用物質をスクリーニングするのに適している。癌は、肺癌、例えば非小細胞肺癌若しくは小細胞肺癌、又は食道癌である。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４４８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４４８】
特に本発明は、以下の［１］〜［５］の方法を提供する：
［１］癌を予防又は治療する作用物質をスクリーニングする方法であって、
（ａ）試験作用物質を、ＷＤＨＤ１ポリペプチド又はその機能的等価物をコードする遺伝子を発現する細胞に接触させる工程と、
（ｂ）工程（ａ）の上記ポリペプチドをリン酸化させる条件下で培養する工程と、
（ｃ）工程（ａ）の上記ポリペプチドのホスホセリン又はホスホチロシンレベルを検出する工程と、
（ｄ）工程（ｃ）で検出されたリン酸化レベルを、試験作用物質の非存在下で検出されたリン酸化レベルと比較する工程と、
（ｅ）リン酸化レベルを阻害又は低減する試験作用物質を選択する工程とを含む、方法。
［２］癌が肺癌及び食道癌から成る群から選択される、［１］に記載の方法。
［３］ＷＤＨＤ１のホスホセリンがＳ３７４である、［１］に記載の方法。
［４］試験作用物質が、ＷＤＨＤ１ポリペプチド又はその機能的等価物と結合する、［１］に記載の方法。
［５］作用物質が、ＷＤＨＤ１の部位でＡＫＴのリン酸化活性を阻害又は低減する、［１］に記載の方法。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４５４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４５４】
（ｘ）指標として、ＣＤＣＡ５とＣＤＣ２との相互作用、又はＣＤＣＡ５とＥＲＫとの相互作用を用いるスクリーニング
本発明において、ＣＤＣＡ５ポリペプチドがＣＤＣ２ポリペプチド及びＥＲＫポリペプチドと相互作用し、またＣＤＣＡ５ポリペプチドが、ＣＤＣ２ポリペプチド及びＥＲＫポリペプチドによってリン酸化されることが確認された（図２）。さらに、ＣＤＣＡ５ポリペプチドは、アミノ酸残基６８〜８２（Ｓ／Ｔ−Ｐ−ｘ−Ｒ／Ｋ）でＣＤＣ２に対するコンセンサスリン酸化モチーフを有し、配列番号２のセリン−７５はリン酸化された領域又は部位である（図１）。ＣＤＣＡ５ポリペプチドは、アミノ酸残基７６〜８６及びアミノ酸残基１０９〜１２２（ｘ−ｘ−Ｓ／Ｔ−Ｐ）でＥＲＫに対するコンセンサスリン酸化モチーフを有し、配列番号２のセリン−７９及びスレオニン−１１５はリン酸化された領域又は部位である（図１）。これらのデータは、ＣＤＣＡ５ポリペプチドがＥＲＫポリペプチド及びＣＤＣ２ポリペプチドによってリン酸化されたという結論に一致している。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４６６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４６６】
（ｘｉ）指標としてＣＤＣＡ５のリン酸化を用いるスクリーニング
本発明の別の態様によれば、ＣＤＣＡ５のＣＤＣ２媒介性のリン酸化又はＣＤＣＡ５のＥＲＫ媒介性のリン酸化を阻害又は低減する作用物質は、ＣＤＣＡ５を発現する癌細胞、例えばＣＸ遺伝子の過剰発現から生じる、又はＣＸ遺伝子によって媒介される癌（例えば肺癌細胞又は食道癌細胞）由来の細胞の周期の進行を阻害又は低減するのに使用することができ、且つＣＤＣＡ５を発現する癌（例えば肺癌又は食道癌）を治療又は予防するのに使用することができ、またこれは指標として、ＣＤＣＡ５のＣＤＣ２媒介性のリン酸化レベル又はＣＤＣＡ５のＥＲＫ媒介性のリン酸化レベルを用いてスクリーニングされる。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４７４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４７４】
本発明において、上述のように、ＣＤＣＡ５タンパク質の生物活性としてはリン酸化活性が挙げられる。当業者は、上述のようにリン酸化レベルを推測することができる（（ｉ）一般的なスクリーニング方法を参照されたい）。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４８０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４８０】
単離化合物及び医薬組成物
上記のスクリーニングによって単離された化合物は、本発明のＣＸポリペプチドの活性を阻害する薬剤に対する候補物質であり、ＣＸ遺伝子の過剰発現から生じる、又はＣＸ遺伝子によって媒介される癌、例えば肺癌及び／又は食道癌の治療における用途を見出す。より具体的には、指標としてＣＸタンパク質の生物活性を用いる場合、本方法によってスクリーニングされる化合物は、ＣＸ遺伝子を発現する癌、例えば肺癌及び／又は食道癌の治療のための薬剤に対する候補物質として有用である。例えば本発明は、癌細胞の成長を阻害又は低減する組成物、癌細胞にアポトーシスを誘導する化合物、及び癌を治療又は予防する化合物を提供し、該組成物は、
（ａ）ＣＤＣＡ５、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１及びＷＤＨＤ１ポリペプチドから成る群から選択されるポリペプチド、又はその機能的等価物の発現レベルを阻害すること、
（ｂ）ＣＤＣＡ５、ＥＰＨＡ７、ＳＴＫ３１及びＷＤＨＤ１ポリペプチドから成る群から選択されるポリペプチド、又はその機能的等価物を発現する細胞の増殖活性を阻害すること、
（ｃ）ＷＤＨＤ１ポリペプチド又はその機能的等価物を発現する細胞にアポトーシスを誘導すること、
（ｄ）ＥＰＨＡ７ポリペプチド又はその機能的等価物を発現する細胞の浸潤活性を阻害すること、
（ｅ）ＥＰＨＡ７ポリペプチドとＥＧＦＲポリペプチド（又はその機能的等価物）との結合活性を阻害すること、
（ｆ）ＥＰＨＡ７及びＳＴＫ３１ポリペプチドから成る群から選択されるポリペプチド、又はその機能的等価物のキナーゼ活性を阻害すること、並びに
（ｇ）ＷＤＨＤ１タンパク質又はその機能的等価物のリン酸化レベルを阻害すること、
（ｈ）ＣＤＣＡ５ポリペプチド又はその機能的等価物を発現する細胞の細胞周期を阻害すること、並びに
（ｉ）ＣＤＣＡ５ポリペプチドとＣＤＣ２ポリペプチド（又はその機能的等価物）との相互作用又は結合を阻害すること、
（ｊ）ＣＤＣＡ５ポリペプチドとＥＲＫポリペプチド（又はその機能的等価物）との相互作用又は結合を阻害すること、
（ｋ）ＣＤＣＡ５ポリペプチド又はその機能的等価物のリン酸化レベルを阻害することから成る群から選択される機能を少なくとも１つ有する阻害剤を薬学的に有効な量含む。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０５１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０５１４】
［４］癌を予防又は治療する作用物質をスクリーニングするキットであって、
（ａ）ＷＤＨＤ１ポリペプチド又はその機能的等価物をコードする遺伝子を発現する細胞と、
（ｂ）（ａ）のポリペプチドのリン酸化レベルを検出する手段とを含む、キット。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０５１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０５１６】
［５］ＣＤＣＡ５ポリペプチドとＣＤＣ２ポリペプチドとの相互作用又は結合を妨げる作用物質をスクリーニングするキットであって、
（ａ）ＣＤＣＡ５ポリペプチドのＣＤＣ２相互作用ドメインを含むポリペプチドと、
（ｂ）ＣＤＣ２ポリペプチドのＣＤＣＡ５相互作用ドメインを含むポリペプチドと、
（ｃ）ポリペプチド間の相互作用又は結合を検出する手段とを含む、キット。
［６］ＣＤＣＡ５のＣＤＣ２媒介性のリン酸化を調整する作用物質をスクリーニングするキットであって、
（ａ）ＣＤＣ２ポリペプチドのタンパク質キナーゼドメインを含むポリペプチドと、
（ｂ）ＣＤＣＡ５ポリペプチドのＣＤＣ２媒介性のリン酸化部位を含むポリペプチド、又はその機能的等価物と、
（ｃ）（ｂ）のポリペプチドのリン酸化レベルを検出する手段とを含む、キット。
［７］ＣＤＣＡ５を発現する癌を予防又は治療する作用物質をスクリーニングするキットであって、
（ａ）ＣＤＣ２ポリペプチドのタンパク質キナーゼドメインを含むポリペプチド、又はその機能的等価物と、
（ｂ）ＣＤＣＡ５ポリペプチドのＣＤＣ２媒介性のリン酸化部位を含むポリペプチド、又はその機能的等価物と、
（ｃ）（ｂ）のポリペプチドのリン酸化レベルを検出する手段とを含む、キット。
［８］癌を予防又は治療する作用物質をスクリーニングするキットであって、
（ａ）ＣＤＣＡ５ポリペプチド又はその機能的等価物をコードする遺伝子を発現する細胞と、
（ｂ）（ａ）のポリペプチドのリン酸化レベルを検出する手段とを含む、キット。
［９］ＣＤＣＡ５ポリペプチドとＥＲＫポリペプチドとの相互作用又は結合を妨げる作用物質をスクリーニングするキットであって、
（ａ）ＣＤＣＡ５ポリペプチドのＥＲＫ相互作用ドメインを含むポリペプチドと、
（ｂ）ＥＲＫポリペプチドのＣＤＣＡ５相互作用ドメインを含むポリペプチドと、
（ｃ）ポリペプチド間の相互作用又は結合を検出する手段とを含む、キット。
［１０］ＣＤＣＡ５のＥＲＫ媒介性のリン酸化を調整する作用物質をスクリーニングするキットであって、
（ａ）ＥＲＫポリペプチドのタンパク質キナーゼドメインを含むポリペプチドと、
（ｂ）ＣＤＣＡ５ポリペプチドのＥＲＫ媒介性のリン酸化部位を含むポリペプチド、又はその機能的等価物と、
（ｃ）（ｂ）のポリペプチドのリン酸化レベルを検出する手段とを含む、キット。
［１１］ＣＤＣＡ５を発現する癌を予防又は治療する作用物質をスクリーニングするキットであって、
（ａ）ＥＲＫポリペプチドのタンパク質キナーゼドメインを含むポリペプチド、又はその機能的等価物と、
（ｂ）ＣＤＣＡ５ポリペプチドのＥＲＫ媒介性のリン酸化部位を含むポリペプチド、又はその機能的等価物と、
（ｃ）（ｂ）のポリペプチドのリン酸化レベルを検出する手段とを含む、キット。
［１２］癌を予防又は治療する作用物質をスクリーニングするキットであって、
（ａ）ＣＤＣＡ５ポリペプチド又はその機能的等価物をコードする遺伝子を発現する細胞と、
（ｂ）（ａ）のポリペプチドのリン酸化レベルを検出する手段とを含む、キット。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０５５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０５５８】
（１９）有糸分裂での細胞同期化及びＥＧＦ刺激アッセイ
培養されたＡ５４９及びＬＣ３１９肺癌細胞及び頸部扁平上皮癌Ｈｅｌａ細胞を、１６時間のインキュベーションの間、２μｇ／ｍｌのアフィジコリンによって、Ｇ１／Ｓ期で同期させた。有糸分裂同期のために、細胞を０時間で、Ｇ１／Ｓ期から開放させた。ノコダゾールを５時間目に添加し、有糸分裂が止まるのを防いだ。この時点で、ＣＤＣ２阻害剤又はＰＢＳを細胞培養液に添加した。ＥＧＦ刺激アッセイのために、Ｈｅｌａ細胞を２０時間、ＦＢＳ無含有培地中で培養した。それから、１０μＭのＭＥＫ阻害剤Ｕ０１２６（Promega）を用いて又は用いずに、３０分間、５０μｇ／ｍｌのＥＧＦによって細胞を刺激した。
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０５８０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０５８０】
プローブとしてＥＰＨＡ７のｃＤＮＡを使用したノーザンブロット解析によって、２７個の成人ヒト組織及び胎児ヒト組織の中で胎児脳と胎児腎臓のみで非常に低レベルの６．８ｋｂの転写産物が同定された（図３Ｃ）。同じプローブを使用した付加的なノーザンブロット法によって、肺癌細胞株ＳＢＣ−３で、胎児脳及び胎児腎臓よりもかなり豊富に、ＥＰＨＡ７転写産物のみが検出された（図３Ｄ）。さらに本発明者らは、免疫組織化学解析によって、抗ＥＰＨＡ７ポリクローナル抗体を使用して、５つの正常組織（心臓、肺、肝臓、腎臓及び睾丸）でのＥＰＨＡ７タンパク質発現を、肺癌でのＥＰＨＡ７タンパク質発現と比較した。ＥＰＨＡ７は主に、肺癌細胞の細胞質及び／又は細胞膜で豊富に発現したが、その発現は、残りの４つの正常組織ではほとんど検出することができなかった（図３Ｅ）。
【手続補正２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０６０２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０６０２】
（８）考察
過去１０年で、療法剤及び放射線療法、並びに腫瘍の画像化における日進月歩の（daily）発展にもかかららず、肺癌患者の予後及び生活の質（quality of life）における改善はほとんど達成されていない。腫瘍の早期検出が、肺癌治療における最も有効な需要の１つであるため、強力な診断戦略及び診断ツール、例えば肺癌に対する腫瘍バイオマーカーが依然として世界中で望まれている。現在、癌特異的な膜貫通／分泌タンパク質を検出する利用可能な腫瘍特異的バイオマーカーはほんのわずかしかない（例えばＣＹＦＲＡ又はＰｒｏ−ＧＲＰ）（Pujol JL, et al., Cancer Res. 1993 Jan 1;53（1）: 61-6、Miyake Y, et al., Cancer Res. 1994 Apr 15;54（8）: 2136-40）。腫瘍特異的な膜貫通／分泌タンパク質は、細胞表面上又は細胞外空間のいずれかで提示されるため、分子標的としての用途が見出され、このことがこれらを分子療法標的として容易に接近可能にさせる。ＣＤ２０陽性リンパ腫に対するヒト化モノクローナル抗体であるリツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ）によって、特異的細胞表面タンパク質の標的化が有意な臨床的利点をもたらし得るという裏付けが与えられる（Hennessy BT, et al., Lancet Oncol. 2004 Jun;5（6）:341-53）。したがって本発明者らは、癌細胞で過剰発現する腫瘍特異的な膜貫通／分泌タンパク質をコードするかかる遺伝子を選択するために、全ゲノムｃＤＮＡマイクロアレイ解析能を利用して、肺癌の診断及び治療に効果的なツールの開発のための標的としてＥＰＨＡ７を同定した。
【手続補正２２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０６１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０６１３】
（２）ＳＴＫ３１発現と予後不良との関連性
肺癌形成におけるＳＴＫ３１の生物学的及び臨床病理学的な有意性を研究するために、本発明者らは、根治性の外科的切除を受けたＮＳＣＬＣの３６８症例由来の組織切片を含有する組織マイクロアレイで、免疫組織化学染色を実施した。ＳＴＫ３１に特異的なポリクローナル抗体によるＳＴＫ３１染色は主に、腫瘍細胞の核及び細胞質で観察されたが、正常細胞では検出されなかった（図１０Ｂ）。３６８個のＮＳＣＬＣの中で、ＳＴＫ３１は、２３５症例（６３．９％）で陽性染色され（スコア１＋）、１３３症例（３６．１％）で染色されなかった（スコア０）。それから本発明者らは、ＳＴＫ３１発現（陽性対陰性）と様々な臨床病理学的パラメータとの相関関係を調べ、組織型（非ＡＤＣでより高い、Ｐ＝０．００３３、フィッシャーの直接確率検定）及び喫煙歴（喫煙者でより高い、Ｐ＝０．０４４６、フィッシャーの直接確率検定）との有意な相関関係を見出した（表５Ａ）。ＮＳＣＬＣ患者の生存期間中央値が、ＳＴＫ３１の発現に応じて有意に短くなった（Ｐ＝０．０１７８、ログランク検定、図１０Ｃ）。また本発明者らは、患者の予後と、年齢（６５歳未満対６５歳以上）、性別（男性対女性）、病理的腫瘍段階（腫瘍サイズ、Ｔ１＋Ｔ２対Ｔ３＋Ｔ４）、病理的節段階（節の状況、Ｎ０＋Ｎ１対Ｎ２）、組織型（ＡＤＣ対非ＡＤＣ）、及び喫煙歴（非喫煙者対喫煙者）を含む他の因子との関連性を評価するために、単変量解析を適用した。これらのパラメータの中で、ＳＴＫ３１状況（Ｐ＝０．０１７８）、男性（Ｐ＝０．０００５）、進行性ｐＴ段階（Ｐ＝０．０００５）、進行性ｐＮ段階（Ｐ＜０．０００１）、非ＡＤＣ組織分類（Ｐ＝０．０１１５）、及び喫煙歴（Ｐ＝０．０２９７）が、予後不良に有意に関連していた（表５Ｂ）。予後因子の多変量解析では、ＳＴＫ３１状況は、この試験で登録された外科的治療を受けたＮＳＣＬＣ患者に対する独立予後因子として統計的に有意なレベルに達していなかったが（Ｐ＝０．０８２９）、ｐＴ及びｐＮ段階、並びに性別は統計的に有意なレベルに達しており（それぞれ、Ｐ＝０．００１７、Ｐ＜０．００９０、及びＰ＜０．０００１）、このことは、肺癌におけるＳＴＫ３１発現とこれらの臨床病理学的因子との関連性を実証していた（表５Ｂ）。
【手続補正２３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０６１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０６１９】
（６）ＭＡＰＫ経路におけるＳＴＫ３１の関与
ＳＴＫ３１によるＥＲＫ（ＥＲＫ１／２）（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）のリン酸化機構を求めるために、ＳＴＫ３１発現ベクターをトランスフェクトした細胞でのＥＲＫの上流経路の活性化を調べようとした。ＳＴＫ３１の発現が、ＣＯＳ−７細胞及びＳＢＣ−５細胞でのＭＥＫ（ＭＥＫ１／２）のリン酸化を増大させた（図１２Ｄ）。さらに、ＳＢＣ−５細胞におけるＥＲＫ１／２及びＭＥＫの両方のリン酸化は、ＳＴＫ３１に対するｓｉＲＮＡによるＳＴＫ３１発現の抑制に応じて低減した（図１２Ｅ）。さらに本発明者らは、ＳＴＫ３１発現ベクターをトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞由来の溶解物を用いた免疫沈降によって、外因性ＳＴＫ３１が内因性ｃ−ｒａｆ、ＭＥＫ及びＥＲＫ１／２と結合することができることが確認され、このことは、ＳＴＫ３１過剰発現によってＭＡＰＫシグナルが活性化する可能性があることを示唆していた。