【手続補正書】
【提出日】平成26年6月18日(2014.6.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）（ｉ）配列番号２、３、及び４のアミノ酸配列をそれぞれ含むＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号８、９、及び１０のアミノ酸配列をそれぞれ含むＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
（ｉｉ）配列番号２０、２１、及び２２のアミノ酸配列をそれぞれ含むＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号２６、２７、及び２８のアミノ酸配列をそれぞれ含むＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
（ｉｉｉ）配列番号３８、３９、及び４０のアミノ酸配列をそれぞれ含むＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号４４、４５、及び４６から選択されるアミノ酸配列をそれぞれ含むＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
（ｉｖ）配列番号５６、５７、及び５８のアミノ酸配列をそれぞれ含むＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号６２、６３、及び６４のアミノ酸配列をそれぞれ含むＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
（ｖ）配列番号７４、７５、及び７６のアミノ酸配列をそれぞれ含むＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号８０、８１、及び８２のアミノ酸配列をそれぞれ含むＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；若しくは
（ｖｉ）配列番号９２、９３、及び９４のアミノ酸配列をそれぞれ含むＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号９８、９９、及び１００のアミノ酸配列をそれぞれ含むＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；又は
（Ｂ）配列番号１４及び１６、３２及び３４、５０及び５２、６８及び７０、８６及び８８、並びに１０４及び１０６から選択される第一及び第二アミノ酸配列を含むＶＨ及びＶＬ；又は
（Ｃ）配列番号１８、３６、５４、７２、９０、及び１０８から選択されるアミノ酸配列
のうちの１を含む単離された抗体、若しくはその抗原結合性断片。
【請求項２】
（Ａ）（ｉ）配列番号２、３、及び４；（ｉｉ）２０、２１、及び２２；（ｉｉｉ）３８、３９、及び４０；（ｉｖ）５６、５７、及び５８；（ｖ）７４、７５、及び７６；並びに（ｖｉ）９２、９３、及び９４から選択されるアミノ酸配列をそれぞれ含むＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；及び
（Ｂ）（ｉ）配列番号８、９、及び１０；（ｉｉ）２６、２７、及び２８；（ｉｉｉ）４４、４５、及び４６；（ｉｖ）６２、６３、及び６４；（ｖ）８０、８１、及び８２；並びに（ｖｉ）９８、９９、及び１００から選択されるアミノ酸配列をそれぞれ含むＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域
を含む単離された抗体、若しくはその抗原結合性断片。
【請求項３】
（ｉ）配列番号１４及び１６；（ｉｉ）３２及び３４；（ｉｉｉ）５０及び５２；（ｉｖ）６８及び７０；（ｖ）８６及び８８；並びに（ｖｉ）１０４及び１０６から選択される第一及び第二アミノ酸配列をそれぞれ含むＶＨ及びＶＬ
を含む単離された抗体、若しくはその抗原結合性断片。
【請求項４】
配列番号１８、３６、５４、７２、９０、及び１０８から選択されるアミノ酸配列
を含む単離された抗体、若しくはその抗原結合性断片。
【請求項５】
抗体が、ヒト可変領域フレームワーク領域を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項６】
抗体が、完全ヒト抗体である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項７】
抗体が、ＨＬＡ−Ａ２に結合したＷＴ１ペプチドに特異的に結合する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項８】
ＷＴ１が、アミノ酸配列ＲＭＦＰＮＡＰＹＬを有する、請求項７に記載の抗体。
【請求項９】
ＨＬＡ−Ａ２が、ＨＬＡ−Ａ０２０１である、請求項７に記載の抗体。
【請求項１０】
抗体の抗原結合性領域が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、又は単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１１】
治療薬に結合した、請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１２】
治療薬が、薬剤、毒素、放射性同位体、タンパク質、又はペプチドである、請求項１１に記載の抗体。
【請求項１３】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体をコードしている単離された核酸。
【請求項１４】
（Ａ）（ｉ）配列番号５、６、及び７；２３、２４、及び２５；４１、４２、及び４３；５８、５９、及び６０；７７、７８、及び７９；並びに９５、９６、及び９７からなる群から選択される第一、第二、及び第三ヌクレオチド配列；及び
（ｉｉ）配列番号１１、１２、及び１３；２９、３０、及び３１；４７、４８、及び４９；６５、６６、及び６７；８３、８４、及び８５；並びに１０１、１０２、及び１０３からなる群から選択される第四、第五、及び第六ヌクレオチド配列；又は
（Ｂ）配列番号１５及び１７、３３及び３５、５１及び５３、６９及び７１、８７及び８９、並びに１０５及び１０７からなる群から選択される第一及び第二ヌクレオチド配列；又は
（Ｃ）配列番号１９、３７、５５、７３、９１、及び１０９からなる群から選択されるヌクレオチド配列
を含む単離された核酸。
【請求項１５】
（Ａ）配列番号（ｉ）５、６、及び７；（ｉｉ）２３、２４、及び２５；（ｉｉｉ）４１、４２、及び４３；（ｉｖ）５８、５９、及び６０；（ｖ）７７、７８、及び７９；並びに（ｖｉ）９５、９６、及び９７からなる群から選択される第一、第二、及び第三ヌクレオチド配列；及び
（Ｂ）配列番号（ｖｉｉ）１１、１２、及び１３；（ｖｉｉｉ）２９、３０、及び３１；（ｉｘ）４７、４８、及び４９；（ｘ）６５、６６、及び６７；（ｘｉ）８３、８４、及び８５；並びに（ｘｉｉ）１０１、１０２、及び１０３からなる群から選択される第四、第五、及び第六ヌクレオチド配列
を含む単離された核酸。
【請求項１６】
第一、第二、及び第三ヌクレオチド配列が、抗体のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３をそれぞれコードし、第四、第五、及び第六ヌクレオチド配列が、抗体のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３をそれぞれコードする、請求項１５に記載の核酸。
【請求項１７】
配列番号（ｉ）１５及び１７；（ｉｉ）３３及び３５；（ｉｉｉ）５１及び５３；（ｉｖ）６９及び７１；（ｖ）８７及び８９；並びに（ｖｉ）１０５及び１０７からなる群から選択される第一及び第二ヌクレオチド配列をそれぞれ含む単離された核酸。
【請求項１８】
第一ヌクレオチド配列が、抗体のＶＨをコードし、第二ヌクレオチド配列が抗体のＶＬをコードする、請求項１７に記載の核酸。
【請求項１９】
配列番号１９、３７、５５、７３、９１、及び１０９からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項２０】
核酸が、ｓｃＦｖをコードする、請求項１９に記載の核酸。
【請求項２１】
請求項１３〜２０のいずれか１項に記載の核酸を含むベクター。
【請求項２２】
請求項１３〜２０のいずれか１項に記載の核酸を含む細胞。
【請求項２３】
その表面に請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体を発現させる、請求項２２に記載の細胞。
【請求項２４】
全細胞又は組織中のＷＴ１を探知する方法であって、
（Ａ）細胞又は組織に、ＨＬＡ−Ａ２に結合するＷＴ１ペプチドに特異的に結合する、探知可能な標識を含む抗体又はその抗原結合性断片と接触させ；
（Ｂ）抗体に結合した量が、細胞又は組織中のＷＴ１の量を示し、細胞又は組織に関連した探知可能な標識の量を測定することにより、細胞又は組織に結合した抗体の量を決定すること
を含む方法。
【請求項２５】
抗体が、アミノ酸配列ＲＭＦＰＮＡＰＹＬ（配列番号１）を有するＨＬＡ−Ａ２に結合したＷＴ１ペプチドに特異的に結合する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
ＷＴ１ペプチドが、ＨＬＡ−Ａ０２０１に結合する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
請求項２４に記載の方法であって、抗体が、
（Ａ）（ｉ）配列番号２、３、及び４のアミノ酸配列をそれぞれ含むＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；並びに配列番号８、９、及び１０のアミノ酸配列をそれぞれ含むＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
（ｉｉ）配列番号２０、２１、及び２２のアミノ酸配列をそれぞれ含むＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；並びに配列番号２６、２７、及び２８のアミノ酸配列をそれぞれ含むＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
（ｉｉｉ）配列番号３８、３９、及び４０のアミノ酸配列をそれぞれ含むＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；並びに配列番号４４、４５、及び４６から選択されるアミノ酸配列をそれぞれ含むＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
（ｉｖ）配列番号５６、５７、及び５８のアミノ酸配列をそれぞれ含むＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；並びに配列番号６２、６３、及び６４のアミノ酸配列をそれぞれ含むＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
（ｖ）配列番号７４、７５、及び７６のアミノ酸配列をそれぞれ含むＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２及びＨＣ−ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；並びに配列番号８０、８１、及び８２のアミノ酸配列をそれぞれ含むＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；若しくは
（ｖｉ）配列番号９２、９３、及び９４のアミノ酸配列をそれぞれ含むＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；並びに配列番号９８、９９、及び１００のアミノ酸配列をそれぞれ含むＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；又は
（Ｂ）配列番号１４及び１６；３２及び３４；５０及び５２；６８及び７０；８６及び８８；並びに１０４及び１０６から選択される第一及び第二アミノ酸配列を含むＶＨ及びＶＬ、又は
（Ｃ）配列番号１８、３６、５４、７２、９０及び１０８から選択されるアミノ酸配列
のうちの１を含む単離された抗体又はその抗原結合性断片。
【請求項２８】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体を含むキット。
【請求項２９】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体を含む、ＷＴ１陽性疾患治療用の医薬組成物。
【請求項３０】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体及び薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物。
【請求項３１】
治療的に効果のある量の請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合性断片を含むＷＴ１陽性疾患患者治療用の医薬組成物。
【請求項３２】
ＷＴ１陽性疾患が、慢性白血病、急性白血病、又はＷＴ１＋腫瘍である、請求項３１に記載の医薬組成物。
【請求項３３】
ＷＴ１陽性疾患が、慢性骨髄性白血病、多発性骨髄腫（ＭＭ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄／骨髄性白血病（ＡＭＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、中皮腫、卵巣癌、消化管癌、乳癌、前立腺癌、及びグリア芽腫からなる群から選択される、請求項３１に記載の医薬組成物。
【請求項３４】
抗体が、抗体に結合する細胞傷害性部分を有する結合体である、請求項３１に記載の医薬組成物。
【請求項３５】
治療的に効果のある量の請求項１３〜２０のいずれか１項に記載の核酸を含む、ＷＴ１陽性疾患患者治療用の医薬組成物。
【請求項３６】
ＷＴ１陽性疾患が、慢性白血病、急性白血病、又はＷＴ１＋腫瘍である、請求項３５に記載の医薬組成物。
【請求項３７】
ＷＴ１陽性疾患が、慢性骨髄性白血病、多発性骨髄腫（ＭＭ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄／骨髄性白血病（ＡＭＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、中皮腫、卵巣癌、消化管癌、乳癌、前立腺癌、及びグリア芽腫からなる群から選択される、請求項３６に記載の医薬組成物。
【請求項３８】
請求項１３〜２０のいずれか１項に記載の核酸を含む、ＷＴ１陽性疾患治療用の医薬組成物。
【請求項３９】
請求項１３〜２０のいずれか１項に記載の核酸を含む、医薬組成物。
【請求項４０】
ＨＬＡ−Ａ２に結合したＷＴ１ペプチドに特異的に結合する抗体又はその抗原結合性断片を含む、ＷＴ１＋細胞を死滅させるための医薬組成物。
【請求項４１】
抗体又はその抗原結合性断片が、それらに結合する細胞傷害性部分を有する、請求項４０に記載の医薬組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１２】
その他の実施態様においては、抗体又は抗原結合性タンパク質は、抗ＷＴ１−ｓｃＦｖであるか、又はＨＬＡ−Ａ０２０１と連結してアミノ酸配列ＲＭＦＰＮＡＰＹＬ（配列番号１）を有するペプチドに特異的に結合する、配列番号３６のアミノ酸配列を含む抗原結合性領域を有するその抗原結合性断片である。他の実施態様においては、抗ＷＴ１抗体は、ｓｃＦｖ−Ｆｃ融合タンパク質、又はＶＨ及びＶＬ領域若しくは表２から選択されるＣＤＲを有する完全長ヒトＩｇＧである。
【表２】
2014512812.tif 000001
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１３】
その他の実施態様においては、抗体又は抗原結合性タンパク質は、抗ＷＴ１−ｓｃＦｖであるか、又はＨＬＡ−Ａ０２０１と連結してアミノ酸配列ＲＭＦＰＮＡＰＹＬ（配列番号１）を有するペプチドに特異的に結合する、配列番号５４のアミノ酸配列を含む抗原結合性領域を有するその抗原結合性断片である。他の実施態様においては、抗ＷＴ１抗体は、ｓｃＦｖ−Ｆｃ融合タンパク質、又はＶＨ及びＶＬ領域若しくは表３から選択されるＣＤＲを有する完全長ヒトＩｇＧである。
【表３】
2014512812.tif 000002
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１４】
その他の実施態様においては、抗体又は抗原結合性タンパク質は、抗ＷＴ１−ｓｃＦｖであるか、又はＨＬＡ−Ａ０２０１と連結してアミノ酸配列ＲＭＦＰＮＡＰＹＬ（配列番号１）を有するペプチドに特異的に結合する、配列番号７２のアミノ酸配列を含む抗原結合性領域を有するその抗原結合性断片である。他の実施態様においては、抗ＷＴ１抗体は、ｓｃＦｖ−Ｆｃ融合タンパク質、又はＶＨ及びＶＬ領域若しくは表４から選択されるＣＤＲを有する完全長ヒトＩｇＧである。
【表４】
2014512812.tif 000003
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１５】
その他の実施態様においては、抗体又は抗原結合性タンパク質は、抗ＷＴ１−ｓｃＦｖであるか、又はＨＬＡ−Ａ０２０１と連結してアミノ酸配列ＲＭＦＰＮＡＰＹＬ（配列番号１）を有するペプチドに特異的に結合する、配列番号９０のアミノ酸配列を含む抗原結合性領域を有するその抗原結合性断片である。他の実施態様においては、抗ＷＴ１抗体は、ｓｃＦｖ−Ｆｃ融合タンパク質、又はＶＨ及びＶＬ領域若しくは表５から選択されるＣＤＲを有する完全長ヒトＩｇＧである。
【表５】
2014512812.tif 000004
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１６】
その他の実施態様においては、抗体又は抗原結合性タンパク質は、抗ＷＴ１−ｓｃＦｖであるか、又はＨＬＡ−Ａ０２０１と連結してアミノ酸配列ＲＭＦＰＮＡＰＹＬ（配列番号１）を有するペプチドに特異的に結合する、配列番号１０８のアミノ酸配列を含む抗原結合性領域を有するその抗原結合性断片である。他の実施態様においては、抗ＷＴ１抗体は、ｓｃＦｖ−Ｆｃ融合タンパク質、又はＶＨ及びＶＬ領域若しくは表６から選択されるＣＤＲを有する完全長ヒトＩｇＧである。
【表６】
2014512812.tif 000005
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２０】
ある実施態様では、定常領域／フレームワーク領域は、例えば、アミノ酸の置換により抗体の特性を修正するために改変される（例えば、１又はそれ以上の、抗原結合親和性、Ｆｃ受容体結合、例えば、グリコシル化、フコシル化などの抗体の炭水化物、システイン残基の数、エフェクター細胞の機能、補完機能、又は結合部位の導入を増加又は減少させるため）。さらに、薬物、毒素、放射性同位体、サイトカイン、炎症性ペプチド、又は細胞傷害性剤に対する抗体の結合も考えられる。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３９】
一旦選択すると、陽性のｓｃＦｖクローンを、間接的なフローサイトメトリーによって、Ｔ２生細胞表面上のＨＬＡ−Ａ２／ペプチド複合体へのそれらの結合について試験する。簡潔には、ファージクローンを、ＷＴ１−Ａペプチド又は無関係なペプチド（コントロール）でパルスしたＴ２細胞とともにインキュベートする。細胞を、次いで、マウス抗Ｍ１３コートタンパク質モノクローナル抗体とともに洗浄する。細胞を再び洗浄し、フローサイトメトリーに先立って、ＦＩＴＣ−ヤギ（Ｆａｂ）２抗マウスＩｇで標識する。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５５】
《材料》
細胞サンプル、細胞株、及び抗体
メモリアルスローンケタリングがんセンター治験審査委員会のインフォームドコンセントにプロトコルが承認された後、ＨＬＡ型の健康ドナー及び患者からの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、フィコール密度遠心分離によって得た。ヒト中皮腫細胞株を得るためのソースは、前述されている（２９）。細胞株は、Ｈ−Ｍｅｓｏ１Ａ、ＪＭＮ、ＶＡＭＴ、Ｈ２４５２、Ｈ２３７３、Ｈ２８、ＭＳＴＯ、Ｍｅｓｏ１１、Ｍｅｓｏ３４、Ｍｅｓｏ３７、Ｍｅｓｏ４７、及びＭｅｓｏ５６を含む。すべての細胞は、メモリアルスローンケタリングがんセンターの細胞免疫学教室によってＨＬＡ型とされた。白血病細胞株ＬＡＭＡ８１、ＢＶ１７３、及び６９７、（ＷＴ１＋、Ａ０２０１＋）は、ＨＪ  Ｓｔａｕｓｓ博士（ロンドン大学、ロンドン、イギリス）によって，親切にも提供された。メラノーマ細胞株ＭｅＷｏ（ＷＴ１−、Ａ２０１＋）、ＳＫＬＹ１６（Ｂ細胞リンパ腫、ＷＴ１‐、Ａ０２０１＋）、Ｋ５６２、ＲｗＬｅｕ４、及びＨＬ６０、全てのＷＴ１＋白血病、及びＴＡＰ欠損Ｔ２細胞株を、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから得た。細胞株を、５％ＦＣＳ、ペニシリン、ストレプトマイシン、グルタミン２ｍｍｏｌ／Ｌ、及び２−メルカプトエタノールを補充したＲＰＭＩ１６４０中で、３７℃、５％のＣＯ２で培養した。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６６】
造血細胞株、付着細胞株［非酵素的細胞ストリッパー（ｎａｍｅ）を用いて回収］、正常なドナー及びＡＭＬ患者由来の末梢血単核細胞を、前述のように得た。細胞をＰＢＳで一度洗浄し、ＰＢＳ中の２％ヒト血清中において、０℃で１０７細胞／ｍＬで再懸濁した。細胞（１０６チューブで２回実施）を、氷上で４５分間、１２５−Ｉ標識ＷＴ１ＡＢ１（１μｇ／ｍＬ）とともにインキュベートし、次に、ＰＢＳ内の１％ウシ血清アルブミンを用いて、０℃で広範囲に洗浄した。特異的結合を決定するために、５０過剰量非標識ＷＴ１ＡＢ１存在下で、氷上で２０分間プレインキュベーションした後に、細胞の２つのセットを評価した。結合放射線を、ガンマカウンターによって測定し、特異的結合を決定し、細胞辺りの結合した抗体の数を、比放射能から計算した。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８５】
次の重要な問題は、ＷＴ１ａｂ１が細胞表面上のＨＬＡ−Ａ０２０１分子によって提示され、自然に処理されたＷＴ１エピトープＲＭＦを認識できたかどうかであった。細胞株のパネルは、ＷＴ１ｍＲＮＡ及びＨＬＡ遺伝子型（表１３）の発現に基づいて選択された。
【表１３】
2014512812.tif 000006
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８９】
予想されたように、ＷＴ１ＡＢ１の結合の強さも、中皮腫細胞Ｈ２３７３、白血病細胞株６９７とＬＡＭＡ、及び骨髄腫細胞株Ｕ２６６に示すように、直接ＨＬＡ−Ａ０２０１分子の発現レベルと関連付けられているように思われた。これらの細胞株は、ＷＴ１転写物及びＨＬＡ−Ａ２の両方に陽性であり、ＨＬＡ−Ａ２の発現レベルは低く（表１３）、モノクローナル抗体は結合を示さなかった。一方、Ｔ２細胞を用いて得られた結果は、ＨＬＡ−Ａ２分子を高レベルで発現させたＴ２細胞として単独でＨＬＡ−Ａ０２０１へ結合する、ＷＴ１ａｂ１の可能性に反論する。特に、ＷＴ１ａｂ１は単独では、又はＲ３及びＥｗｉｎｇ肉腫由来のような他のＨＬＡ−Ａ０２０１結合ペプチド、又はＲＭＦペプチドのヘテロクリティックペプチドであるＷＴ１−Ａ１でパルスしても、Ｔ２細胞に結合しない。これら２種のペプチドは、Ｔ２安定化アッセイ（２８）において、ＨＬＡ−Ａ０２０１分子に対する高い親和性が示されている。これらの結果は、ＷＴ１ａｂ１認識が、複合体においてＲＭＦペプチドとＡ０２０１分子の共同で構成されるエピトープに特異的であったという強い証拠を提供した。ＷＴ１ａｂ３及びＷＴ１ａｂ５の２つの他のモノクローナル抗体の、ＢＶ１７３及びＪＭＮ細胞に対する結合もまた、ＷＴ１ａｂ１より弱かった。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９０】
《実施例５》
細胞上のＷＴ１ａｂ１結合部位の定量化
１２５Ｉ標識ＷＴ１ａｂ１を用いた放射免疫測定を、抗体のＷＴ１＋ＨＬＡ−Ａ０２０１＋細胞株に対する特異性を確認するため、親和定数を決定するため、かつ細胞株のパネル上の細胞当たりの抗体結合部位の数を評価するために、用いた。ＪＭＮ細胞への結合に基づくスキャッチャード分析は、約０．２ｎＭの親和定数を示した（図２３）。この数値は、Ｆｏｒｔｅ  Ｂｉｏ装置を用いて、干渉分光法により確認した。１２５Ｉ標識ＷＴ１ａｂ１を、抗体のＷＴ１＋  ＨＬＡ−Ａ０２０１＋細胞株に対する特異性を確認するため、及び細胞株のパネル上の抗体結合部位の数を評価するために用いた（図２４）。二価のモノクローナル抗体が表面上の１又は２の複合体に結合しているかどうかを、我々は判断できないため、細胞当たりのエピトープの合計は、モノクローナル抗体結合部位の数の二倍になることがある。再度、ＷＴ１ａｂ１は、ＨＬＡ−Ａ０２０１及びＷＴ１ｍＲＮＡの両方に陽性である、ＪＭＮ、ＡＬＬ−３、ＢＡ２５、ＢＶ１７３に結合したが、ＨＬＡ−Ａ０２０１陰性（ＨＬ６０）又はＷＴ１ｍＲＮＡ陰性（ＳＫＬＹ−１６）には結合しなかった。ＷＴ１ａｂ１は、ＨＬＡ−Ａ０２０１及びＷＴ１の両方に陽性の６９７細胞には結合しなったが、低レベルのＨＬＡ−Ａ０２０１（表１３）を含んでおり、あるレベルのＭＨＣ複合体の総数が、ＷＴ１ａｂ１結合のための十分なＷＴ１ペプチドが存在するために必要であると確認した。ＲＭＦでパルスしたＴ２は最も多い数のモノクローナル抗体と結合し（５００００／細胞）、次いで、細胞辺り〜６×１０３ＷＴ１ａｂ１分子と結合したＪＭＮ細胞であり、これは、それぞれが一価又は二価抗体結合だと想定して、１細胞辺り、６×１０３及び１．２×１０４ＲＭＦペプチド／Ａ２複合体を翻訳したこととなる。３個の白血病陽性細胞株は、１×１０３及び２×１０３ＷＴ１ａｂ１分子、又は２×１０３及び４×１０３の結合部位と結合した（図２４）。これらの結果を、定量的フローサイトメトリーによって確認した。