【手続補正書】
【提出日】平成26年10月21日(2014.10.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における血小板減少を治療する方法であって、前記方法は、
ａ）ヒト多能性幹細胞におけるＧＡＴＡ−１の発現を減少させる工程であって、それにより、ＧＡＴＡ−１ノックアウトまたはノックダウン幹細胞を生成するものである、前記減少させる工程と、
ｂ）前記ＧＡＴＡ−１ノックアウトまたはノックダウン幹細胞をトロンボポエチンの存在下で培養する工程であって、それにより、自己複製する巨核球−赤血球前駆細胞（ＭＥＰ）様細胞株（Ｇ１ＭＥ）を生成するものである、前記培養する工程と、
ｃ）前記Ｇ１ＭＥ細胞においてＧＡＴＡ−１を発現させる工程であって、それにより、最終的な赤血球および巨核球に前記細胞を分化させるものである、前記発現させる工程と、
ｄ）工程ｃ）の前記細胞から巨核球を単離する工程と、
ｅ）前記単離した巨核球を前記対象に投与する工程であって、それにより、前記血小板減少を治療するものである、前記投与する工程と
を有する、方法。
【請求項２】
請求項１記載の方法において、前記ヒト多能性幹細胞はヒト胚性幹細胞または人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞である、方法。
【請求項３】
請求項１記載の方法において、この方法は、さらに、
工程ｅ）の前に、目的タンパク質をコードする核酸分子の前記細胞への送達を有するものである、方法。
【請求項４】
請求項３記載の方法において、この方法は、さらに、
目的タンパク質をコードする核酸分子の前記Ｇ１ＭＥ細胞への送達を有するものである、方法。
【請求項５】
請求項１記載の方法において、工程ａ）は、前記ヒト多能性幹細胞における遺伝子ターゲティングによってＧＡＴＡ−１ノックアウトを生成する工程を有するものである、方法。
【請求項６】
請求項１記載の方法において、工程ａ）は、ＧＡＴＡ−１  ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを前記ヒト多能性幹細胞に送達する工程を有するものである、方法。
【請求項７】
請求項１記載の方法において、工程ｃ）は、ＧＡＴＡ−１をコードする核酸分子を有するウイルスベクターに前記Ｇ１ＭＥ細胞を接触させる工程を有するものである、方法。
【請求項８】
請求項１記載の方法において、工程ｃ）はＧＡＴＡ−１発現の抑制の除去を有するものである、方法。
【請求項９】
請求項１記載の方法において、工程ｃ）は、ＧＡＴＡ−１を天然レベルに発現する工程を有するものである、方法。
【請求項１０】
請求項１記載の方法において、工程ｂ）はさらに、間質細胞を有するＧＡＴＡ−１ノックアウトまたはノックダウン幹細胞を培養する工程を有するものである、方法。
【請求項１１】
請求項１記載の方法において、工程ｄ）は、少なくとも約５０μｍの直径を有する細胞を単離する工程を有するものである、方法。
【請求項１２】
自己複製する巨核球−赤血球前駆細胞（ＭＥＰ）様細胞株を生成する方法であって、前記方法は、
ａ）ヒト多能性幹細胞におけるＧＡＴＡ−１の発現を減少させる工程であって、それにより、ＧＡＴＡ−１ノックアウトまたはノックダウン幹細胞を生成するものである、前記減少させる工程と、
ｂ）前記ＧＡＴＡ−１ノックアウトまたはノックダウン幹細胞をトロンボポエチンの存在下で培養する工程であって、それにより、自己複製する巨核球−赤血球前駆細胞（ＭＥＰ）様細胞株（Ｇ１ＭＥ）を生成するものである、前記培養する工程と、
を有する、方法。
【請求項１３】
請求項１２記載の方法において、この方法は、さらに、
目的タンパク質をコードする核酸分子を前記細胞に送達する工程を有するものである、方法。
【請求項１４】
請求項１２記載の方法によって生成された、単離された自己複製する巨核球−赤血球前駆細胞（ＭＥＰ）様細胞株。
【請求項１５】
血小板減少症の治療に使用するための単離巨核球であって、前記単離巨核球は、
ａ）ヒト多能性幹細胞におけるＧＡＴＡ−１の発現を減少させる工程であって、それによりＧＡＴＡ−１ノックアウトまたはノックダウン幹細胞を生成する、前記減少させる工程と、
ｂ）前記ＧＡＴＡ−１ノックアウトまたはノックダウン幹細胞をトロンボポエチンの存在下で培養する工程であって、それにより自己複製する巨核球−赤血球前駆細胞（ＭＥＰ）様細胞株（Ｇ１ＭＥ）を生成する、前記培養する工程と、
ｃ）前記Ｇ１ＭＥ細胞においてＧＡＴＡ−１を発現させる工程であって、それにより前記細胞を最終的な赤血球および巨核球に分化させる、前記発現させる工程と、
ｄ）工程ｃ）の前記細胞から巨核球を単離する工程と、
を有する方法によって取得される、単離巨核球。
【請求項１６】
請求項１５記載の血小板減少症の治療に使用するための単離巨核球であって、さらに、治療用タンパク質をコードする核酸分子を有する、単離巨核球。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
血小板産生、巨核球から循環血小板が生じることによる工程は、依然として不完全に理解されている。試験管内での研究は、血小板が血小板前駆体ストランドの先端でノードを形成することを示唆している（Ｉｔａｌｉａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）  Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１４７：１２９９−１３１２）。しかしながら、多光子生体内顕微鏡を使用する、生頭蓋冠髄の直接的な視覚化は、巨核球が大きな細胞質断片を血管系内に放出し（Ｊｕｎｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１７：１７６７−１７７０）、その後に、血小板内で再組織化を受けなければならないことを示唆している。肺静脈系の巨核球様倍数体の核の形態分析および定量化に基づく研究は、巨核球が肺に血小板を放出することを示唆する（Ｚｕｃｋｅｒ−Ｆｒａｎｋｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，１５７：６９−７４）。培養における巨核球からの血小板の派生は、報告されたが（Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｂｌｏｏｄ  ８５：４０２−４１３）、量的に平均水準以上になることは困難であった。血小板を生体外で発達させるための現在の努力は、非常に制限されているように見受けられ、臨床的に関連した結果ではない。現在まで、試験管内で生成された血小板の注入からの公開された最も良い結果は、低い血小板数（〜１０４／μｌ）を有する放射線処理されたマウスを使用したものである（Ｎｉｓｈｉｋｉｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，２０５：１９１７−１９２７）。ドナー血小板が計数するピークパーセントは、依然としてわずか１％〜２％であった。
この出願の発明に関連する先行技術文献情報としては、以下のものがある（国際出願日以降国際段階で引用された文献及び他国に国内移行した際に引用された文献を含む）。
（先行技術文献）
（特許文献）
（特許文献１）  米国特許出願公開第２００６／０１３４７８３号明細書
（特許文献２）  米国特許出願公開第２００８／０２７５０４９号明細書
（非特許文献）
（非特許文献１）  Ｓｔａｃｈｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．Ｅａｒｌｙ  ｂｌｏｃｋ  ｔｏ  ｅｒｙｔｈｒｏｍｅｇａｋａｒｙｏｔｉｃ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｃｏｎｆｅｒｒｅｄ  ｂｙ  ｌｏｓｓ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｆａｃｔｏｒ  ＧＡＴＡ−１．Ｂｌｏｏｄ  ２００６，１０７：８７−９７；ａｂｓｔｒａｃｔ，ｐｇ  ８９，ｃｏｌ  ２，ｐａｒａ  １−２，ｐｇ  ９０，ｃｏｌ  １，ｐａｒａ  ２，ｐｇ  ９０，ｃｏｌ  ２，ｐａｒａ  ２，ｐｇ  ９１，ｃｏｌ  １，ｐａｒａ  １，ｐｇ  ９１，ｃｏｌ  ２，ｐａｒａ  １，Ｆｉｇ．１Ｃ
（非特許文献２）  Ｓｈｉｖｄａｓｓａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｌｉｎｅａｇｅ−ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｓ  ｔｈｅ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ＧＡＴＡ−ｌ  ｉｎ  ｍｅｇａｋａｒｙｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １９９７，１６：３９６５−３９７３；ａｂｓｔｒａｃｔ