【手続補正書】
【提出日】平成24年9月26日(2012.9.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
レトロウイルスGAGタンパク質;
レトロウイルスPOLタンパク質;
レトロウイルスエンベロープ;
レトロウイルスポリヌクレオチドであって、前記レトロウイルスポリヌクレオチド配列の3'末端に長末端反復(LTR)配列、前記レトロウイルスポリヌクレオチドの5'末端に哺乳動物細胞での発現に適するプロモーター配列、gag核酸ドメイン、pol核酸ドメイン及びenv核酸ドメインを含むレトロウイルスポリヌクレオチド;
異種ポリヌクレオチドに作動可能に連結された内部リボソーム侵入部位(IRES)を含むカセットであって、3'LTRの5'側、及びレトロウイルスエンベロープをコードするenv核酸ドメインの3'側に位置するカセット;並びに
標的細胞での逆転写、パッケージング及び組込みのために必要なシス作用性配列を含み、6継代培養後に、配列番号21を含むベクター(pACE)と比較してより高い複製能力を維持する、組換え複製適合性レトロウイルス(RCR)。
【請求項２】
前記レトロウイルスポリヌクレオチド配列が、マウス白血病ウイルス(MLV)、モロニーマウス白血病ウイルス(MoMLV)、ネコ白血病ウイルス(FeLV)又はテナガザル白血病ウイルス(GALV)に由来する、請求項1に記載のレトロウイルス。
【請求項３】
前記MLVが両種性MLVである、請求項1又は2に記載のレトロウイルス。
【請求項４】
前記レトロウイルスがガンマレトロウイルスである、請求項1に記載のレトロウイルス。
【請求項５】
前記標的細胞が、細胞増殖性障害を有する細胞である、請求項1に記載のレトロウイルス。
【請求項６】
前記標的細胞が新生物細胞である、請求項1に記載のレトロウイルス。
【請求項７】
前記細胞増殖性障害が、肺癌、結腸直腸癌、乳癌、前立腺癌、尿路癌、子宮癌、脳腫瘍、頭頚部癌、膵臓癌、黒色腫、胃癌及び卵巣癌、関節リウマチ又は他の自己免疫疾患からなる群から選択される、請求項5に記載のレトロウイルス。
【請求項８】
前記プロモーター配列が増殖調節遺伝子に関連する、請求項1に記載のレトロウイルス。
【請求項９】
前記プロモーター配列が組織特異プロモーター配列を含む、請求項1に記載のレトロウイルス。
【請求項１０】
前記組織特異プロモーター配列が少なくとも一つのアンドロゲン応答エレメント(ARE)を含む、請求項9に記載のレトロウイルス。
【請求項１１】
前記アンドロゲン応答エレメントがプロバシンプロモーターに由来する、請求項10に記載のレトロウイルス。
【請求項１２】
前記組織特異プロモーター配列がプロバシンプロモーターを含む、請求項9に記載のレトロウイルス。
【請求項１３】
前記プロモーターが、配列番号19、20又は22のヌクレオチド1位からヌクレオチド約582位までに記載の配列を有するCMVプロモーターを含み、一つ又は複数の核酸塩基に対する改変を含んでもよく、転写を誘導し開始することができる、請求項1に記載のレトロウイルス。
【請求項１４】
前記プロモーターが、配列番号19、20又は22のヌクレオチド1位からヌクレオチド約582位までに記載の配列を含む、請求項1に記載のレトロウイルス。
【請求項１５】
前記プロモーターがCMV-R-U5ドメインポリヌクレオチドを含む、請求項1に記載のレトロウイルス。
【請求項１６】
前記CMV-R-U5ドメインが、MLV R-U5領域に連結されたヒトサイトメガロウイルス由来の前初期プロモーターを含む、請求項15に記載のレトロウイルス。
【請求項１７】
前記CMV-R-U5ドメインポリヌクレオチドが、配列番号19、20若しくは22のヌクレオチド約1位からヌクレオチド約1202位までに記載の配列、又は配列番号19、20若しくは22に記載の配列に対し少なくとも95%同一である配列を含み、前記ポリヌクレオチドが、作動可能にそれに連結された核酸分子の転写を促進する、請求項16に記載のレトロウイルス。
【請求項１８】
前記gagポリヌクレオチドがガンマレトロウイルスに由来する、請求項1に記載のレトロウイルス。
【請求項１９】
前記gag核酸ドメインが、配列番号19若しくは22のヌクレオチド番号約1203からヌクレオチド約2819までの配列、又はそれに対して少なくとも95%、98%、99%若しくは99.8%の同一性を有する配列を含む、請求項18に記載のレトロウイルス。
【請求項２０】
前記ポリヌクレオチドのpolドメインがガンマレトロウイルスに由来する、請求項1に記載のレトロウイルス。
【請求項２１】
前記polドメインが、配列番号19若しくは22のヌクレオチド番号約2820からヌクレオチド約6358までの配列、又はそれに対して少なくとも95%、98%、99%若しくは99.9%の同一性を有する配列を含む、請求項20に記載のレトロウイルス。
【請求項２２】
前記envドメインが、配列番号19若しくは22のヌクレオチド番号約6359からヌクレオチド約8323までの配列、又はそれに対して少なくとも95%、98%、99%若しくは99.8%の同一性
を有する配列を含む、請求項1に記載のレトロウイルス。
【請求項２３】
前記IRESが脳心筋炎ウイルスに由来する、請求項1に記載のレトロウイルス。
【請求項２４】
前記IRESが、配列番号19若しくは22のヌクレオチド番号約8327からヌクレオチド約8876までの配列、又はそれに対して少なくとも95%、98%又は99%の同一性を有する配列を含む、請求項23に記載のレトロウイルス。
【請求項２５】
前記3'LTRがガンマレトロウイルスに由来する、請求項1に記載のレトロウイルス。
【請求項２６】
前記3'LTRがU3-R-U5ドメインを含む、請求項25に記載のレトロウイルス。
【請求項２７】
前記3'LTRが、配列番号19若しくは22のヌクレオチド約9405位から約9998位までに記載の配列、又はそれに対して少なくとも95%、98%又は99.5%同一である配列を含む、請求項25に記載のレトロウイルス。
【請求項２８】
前記異種核酸配列が生体応答調節因子をコードする、請求項1に記載のレトロウイルス。
【請求項２９】
前記生体応答調節因子が免疫増強サイトカインを含む、請求項28に記載のレトロウイルス。
【請求項３０】
前記免疫増強サイトカインが、インターロイキン1〜15、インターフェロン、腫瘍壊死因子(TNF)及び顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)からなる群から選択される、請求項29に記載のレトロウイルス。
【請求項３１】
前記免疫増強サイトカインがインターフェロンである、請求項29に記載のレトロウイルス。
【請求項３２】
前記インターフェロンがガンマインターフェロンである、請求項31に記載のレトロウイルス。
【請求項３３】
前記異種核酸が、無毒性プロドラッグを毒性薬物に変換するポリペプチドをコードする、請求項1に記載のレトロウイルス。
【請求項３４】
無毒性プロドラッグを毒性薬物に変換する前記ポリペプチドが、チミジンキナーゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ(PNP)又はシトシンデアミナーゼである、請求項33に記載のレトロウイルス。
【請求項３５】
前記異種核酸配列がターゲッティング部分をコードする、請求項1に記載のレトロウイルス。
【請求項３６】
前記ターゲッティング部分が癌抗原を含む、請求項35に記載のレトロウイルス。
【請求項３７】
前記異種核酸配列が結合ドメインをコードする、請求項1に記載のレトロウイルス。
【請求項３８】
前記結合ドメインが受容体ドメイン、抗体又は抗体断片を含む、請求項37に記載のレトロウイルス。
【請求項３９】
前記異種核酸配列が抑制性ポリヌクレオチドを含む、請求項1に記載のレトロウイルス。
【請求項４０】
前記抑制性ポリヌクレオチドがRNAi又はsiRNA配列を含む、請求項39に記載のレトロウイルス。
【請求項４１】
5'から3'方向に、
ヒトサイトメガロウイルス由来の前初期プロモーターとMLV R-U5領域とのCMV-R-U5融合体;
逆転写酵素のプライマー結合部位PBS;
5'スプライス部位;
Ψパッケージングシグナル;
MLV群特異的抗原をコードするgagコード配列;
MLVポリメラーゼポリプロテインをコードするpolコード配列;
3'スプライス部位;
MLV株4070Aのエンベロープタンパク質をコードする4070A envコード配列;
脳心筋炎ウイルス由来の内部リボソーム侵入部位(IRES);
異種核酸配列;
ポリプリン領域;及び
U3-R-U5 MLV長末端反復を含む単離されたポリヌクレオチドであって、前記4070A envコード配列及びIRESが、配列番号19若しくは22のヌクレオチド番号約6359からヌクレオチド約8876までの配列、又はそれに対して少なくとも95%、98%又は99%の同一性を有する配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４２】
レトロウイルスポリヌクレオチド配列が、マウス白血病ウイルス(MLV)、モロニーマウス白血病ウイルス(MoMLV)、ネコ白血病ウイルス(FeLV)又はテナガザル白血病ウイルス(GALV)に由来する、請求項41に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４３】
前記MoMLVが両種性MoMLVである、請求項42に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４４】
細胞増殖性障害を有する被験体を治療する方法であって、前記被験体を、請求項41に記載のポリヌクレオチドと、前記ポリヌクレオチドが発現されるような条件下で接触させるステップを含む方法。
【請求項４５】
前記ポリヌクレオチドが前記被験体の細胞に組み込まれる、請求項44に記載の方法。
【請求項４６】
前記ポリヌクレオチドがレトロウイルスベクターによって送達される、請求項44に記載の方法。
【請求項４７】
前記細胞増殖性障害が多形神経膠芽腫である、請求項44に記載の方法。
【請求項４８】
前記細胞増殖性障害が、肺癌、結腸直腸癌、乳癌、前立腺癌、尿路癌、子宮癌、脳腫瘍、頭頚部癌、膵臓癌、黒色腫、胃癌及び卵巣癌からなる群から選択される、請求項44に記載の方法。
【請求項４９】
被験体における細胞増殖性障害を治療する方法であって、前記被験体を請求項1に記載のレトロウイルスと接触させるステップを含み、前記異種核酸配列は新生物細胞の増殖を阻害する治療的タンパク質をコードする、方法。
【請求項５０】
前記治療的タンパク質が、非細胞毒性薬物を細胞毒性薬物に変換するポリペプチドを含む、請求項49に記載の方法。
【請求項５１】
前記ポリペプチドがシトシンデアミナーゼ活性を有する、請求項50に記載の方法。
【請求項５２】
前記非細胞毒性薬物が5-フルオロシトシンである、請求項50に記載の方法。
【請求項５３】
細胞増殖性障害を治療する方法であって、請求項41に記載のポリヌクレオチドを含むレトロウイルスを、細胞増殖性障害を有する被験体に、前記障害を有する細胞にレトロウイルスが感染するような条件下で投与するステップ、及び前記被験体を抗癌剤又は化学療法剤と接触させるステップを含む方法。
【請求項５４】
前記抗癌剤が、ベバシズマブ、ペガプタニブ、ラニビズマブ、ソラフェニブ、スニチニブ、AE-941、VEGF Trap、パゾパニブ、バンデタニブ、バタラニブ、セジラニブ、フェンレチニド、スクアラミン、INGN-241、経口テトラチオモリブデート、テトラチオモリブデート、Panzem NCD、2-メトキシエストラジオール、AEE-788、AG-013958、ベバシラニブナトリウム、AMG-706、アクシチニブ、BIBF-1120、CDP-791、CP-547632、PI-88、SU-14813、SU-6668、XL-647、XL-999、IMC-1121B、ABT-869、BAY-57-9352、BAY-73-4506、BMS-582664、CEP-7055、CHIR-265、CT-322、CX-3542、E-7080、ENMD-1198、OSI-930、PTC-299、Sirna-027、TKI-258、Veglin、XL-184又はZK-304709からなる群から選択される、請求項53に記載の方法。
【請求項５５】
異種核酸配列が、配列番号4の最適化シトシンデアミナーゼのコード配列に連結されたHER2の細胞外ドメイン(ECD)及び膜貫通(TM)ドメインを含むポリペプチドをコードする配列を含む、請求項41に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５６】
異種核酸配列が、配列番号4を含む最適化シトシンデアミナーゼに連結されたHER2の細胞外ドメインのHerceptin結合ドメインIV (ECDIV)及び膜貫通(TM)ドメインを含むポリペプチドをコードする、請求項41に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５７】
異種核酸配列が、配列番号4を含む最適化シトシンデアミナーゼに連結されたHER2の細胞外ドメインのHerceptin結合ドメインIV (ECDIV)及び膜貫通(TM)ドメインに作動可能に融合したHER2のシグナルペプチド(S)を含むポリペプチドをコードする、請求項41に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５８】
IRESに作動可能に連結され、かつENV配列の3'側に連結された、請求項55、56又は57に記載のポリヌクレオチドを含む組換え複製適合性レトロウイルス。
【請求項５９】
前記異種ポリペプチドが、HER2又は末端切断HER2(HER2 ECDTM)又はHER2 SECDIVTMである、請求項1に記載の組換えレトロウイルス。
【請求項６０】
脳重量1gあたり10-3〜10-7 TUの用量で投与される、請求項1に記載の組換えレトロウイルス。
【請求項６１】
前記レトロウイルスが脳重量1gあたり約10-3〜10-7 TUで投与される、請求項44〜47のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
前記レトロウイルスが脳重量1gあたり約10-4〜10-6 TUで投与される、請求項61に記載の方法。
【請求項６３】
レトロウイルスGAGタンパク質;
レトロウイルスPOLタンパク質;
レトロウイルスエンベロープ;
レトロウイルスポリヌクレオチドであって、前記レトロウイルスポリヌクレオチド配列の3'末端に長末端反復(LTR)配列、前記レトロウイルスポリヌクレオチドの5'末端に哺乳動物細胞での発現に適するプロモーター配列、gag核酸ドメイン、pol核酸ドメイン及びenv核酸ドメインを含むレトロウイルスポリヌクレオチド;
miRNA又はsiRNA配列のための一次前駆体miRNA(pri-miRNA)を含むカセット、
標的細胞での逆転写、パッケージング及び組込みのために必要なシス作用性配列、
を含む、組換え複製適合性レトロウイルス(RCR)。
【請求項６４】
レトロウイルスGAGタンパク質;
レトロウイルスPOLタンパク質;
レトロウイルスエンベロープ;
レトロウイルスポリヌクレオチドであって、前記レトロウイルスポリヌクレオチド配列の3'末端に長末端反復(LTR)配列、前記レトロウイルスポリヌクレオチドの5'末端に哺乳動物細胞での発現に適するプロモーター配列、gag核酸ドメイン、pol核酸ドメイン及びenv核酸ドメインを含むレトロウイルスポリヌクレオチド;
miRNA又はsiRNA配列のための前駆体miRNA(pre-miRNA)を含むカセット、
標的細胞での逆転写、パッケージング及び組込みのために必要なシス作用性配列、
を含む、組換え複製適合性レトロウイルス(RCR)。
【請求項６５】
レトロウイルスGAGタンパク質;
レトロウイルスPOLタンパク質;
レトロウイルスエンベロープ;
レトロウイルスポリヌクレオチドであって、前記レトロウイルスポリヌクレオチド配列の3'末端に長末端反復(LTR)配列、前記レトロウイルスポリヌクレオチドの5'末端に哺乳動物細胞での発現に適するプロモーター配列、gag核酸ドメイン、pol核酸ドメイン及びenv核酸ドメインを含むレトロウイルスポリヌクレオチド;
polIIIプロモーター及びsiRNA又はshRNAを含むカセット、
標的細胞での逆転写、パッケージング及び組込みのために必要なシス作用性配列、
を含み、該ベクターは、細胞中で少なくとも6継代の間少なくとも90%安定である、組換え複製適合性レトロウイルス(RCR)。
【請求項６６】
miRNAが、miR 128-1及びmiR 128-2からなる群から選択される、請求項63、64又は65のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項６７】
前記ベクターが、異種ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたIRESカセットをさらに含む、請求項63、64又は65のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項６８】
前記IRESカセットがenv遺伝子のすぐ3'側に位置する、請求項67に記載のベクター。
【請求項６９】
レトロウイルスGAGタンパク質;
レトロウイルスPOLタンパク質;
レトロウイルスエンベロープ;
レトロウイルスポリヌクレオチドであって、前記レトロウイルスポリヌクレオチド配列の3'末端に長末端反復(LTR)配列、前記レトロウイルスポリヌクレオチドの5'末端に哺乳動物細胞での発現に適するプロモーター配列、gag核酸ドメイン、pol核酸ドメイン及びenv核酸ドメインを含むレトロウイルスポリヌクレオチド;
天然に存在するmiRNAの標的配列を含むカセット;並びに
標的細胞での逆転写、パッケージング及び組込みのために必要なシス作用性配列、
を含む、組換え複製適合性レトロウイルス(RCR)。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
【図１−１】図1A〜Cは野生型酵母シトシンデアミナーゼ(配列番号2)及び本開示のシトシンデアミナーゼ(配列番号4)のアライメント並びに本開示の他の配列（配列番号31〜40）を示す図である。
【図１−２】図1A〜Cは野生型酵母シトシンデアミナーゼ(配列番号2)及び本開示のシトシンデアミナーゼ(配列番号4)のアライメント並びに本開示の他の配列を示す図である。
【図１−３】図1A〜Cは野生型酵母シトシンデアミナーゼ(配列番号2)及び本開示のシトシンデアミナーゼ(配列番号4)のアライメント並びに本開示の他の配列を示す図である。
【図２】元の野生型CDと比較して、改変ベクターがより効果的であることを示す細胞死滅データのグラフである。新しい改変骨格(T5.0007)が古い骨格(pACE-CD)よりも死滅においてより効果的であることもグラフは示している。様々なベクター構築物及びそれらの名前をまとめた表も示す。
【図３−１】図3A〜Fは、(A)本開示の組換えレトロウイルスベクターの概略図;(B)本開示のポリヌクレオチドのプラスミド地図;(C及びD)本開示のポリヌクレオチドの配列(配列番号19);種々のフォーマットでのpAC-yCD2のベクターコード領域;(E)pACE-emdGFP及びpAC3-emdGFP間の変化を示す図;（F)pAC3-yCD2の図及び配列を示す図である。
【図３−２】図3A〜Fは、(A)本開示の組換えレトロウイルスベクターの概略図;(B)本開示のポリヌクレオチドのプラスミド地図;(C及びD)本開示のポリヌクレオチドの配列(配列番号19);種々のフォーマットでのpAC-yCD2のベクターコード領域;(E)pACE-emdGFP及びpAC3-emdGFP間の変化を示す図;（F)pAC3-yCD2の図及び配列を示す図である。
【図３−３】図3A〜Fは、(A)本開示の組換えレトロウイルスベクターの概略図;(B)本開示のポリヌクレオチドのプラスミド地図;(C及びD)本開示のポリヌクレオチドの配列(配列番号19);種々のフォーマットでのpAC-yCD2のベクターコード領域;(E)pACE-emdGFP及びpAC3-emdGFP間の変化を示す図;（F)pAC3-yCD2の図及び配列を示す図である。
【図３−４】図3A〜Fは、(A)本開示の組換えレトロウイルスベクターの概略図;(B)本開示のポリヌクレオチドのプラスミド地図;(C及びD)本開示のポリヌクレオチドの配列(配列番号19);種々のフォーマットでのpAC-yCD2のベクターコード領域;(E)pACE-emdGFP及びpAC3-emdGFP間の変化を示す図;（F)pAC3-yCD2の図及び配列を示す図である。
【図３−５】図3A〜Fは、(A)本開示の組換えレトロウイルスベクターの概略図;(B)本開示のポリヌクレオチドのプラスミド地図;(C及びD)本開示のポリヌクレオチドの配列(配列番号19);種々のフォーマットでのpAC-yCD2のベクターコード領域;(E)pACE-emdGFP及びpAC3-emdGFP間の変化を示す図;（F)pAC3-yCD2の図及び配列を示す図である。
【図３−６】図3A〜Fは、(A)本開示の組換えレトロウイルスベクターの概略図;(B)本開示のポリヌクレオチドのプラスミド地図;(C及びD)本開示のポリヌクレオチドの配列(配列番号19);種々のフォーマットでのpAC-yCD2のベクターコード領域;(E)pACE-emdGFP及びpAC3-emdGFP間の変化を示す図;（F)pAC3-yCD2の図及び配列を示す図である。
【図３−７】図3A〜Fは、(A)本開示の組換えレトロウイルスベクターの概略図;(B)本開示のポリヌクレオチドのプラスミド地図;(C及びD)本開示のポリヌクレオチドの配列(配列番号19);種々のフォーマットでのpAC-yCD2のベクターコード領域;(E)pACE-emdGFP及びpAC3-emdGFP間の変化を示す図;（F)pAC3-yCD2の図及び配列を示す図である。
【図３−８】図3A〜Fは、(A)本開示の組換えレトロウイルスベクターの概略図;(B)本開示のポリヌクレオチドのプラスミド地図;(C及びD)本開示のポリヌクレオチドの配列(配列番号19);種々のフォーマットでのpAC-yCD2のベクターコード領域;(E)pACE-emdGFP及びpAC3-emdGFP間の変化を示す図;（F)pAC3-yCD2の図及び配列を示す図である。
【図３−９】図3A〜Fは、(A)本開示の組換えレトロウイルスベクターの概略図;(B)本開示のポリヌクレオチドのプラスミド地図;(C及びD)本開示のポリヌクレオチドの配列(配列番号19);種々のフォーマットでのpAC-yCD2のベクターコード領域;(E)pACE-emdGFP及びpAC3-emdGFP間の変化を示す図;（F)pAC3-yCD2の図及び配列を示す図である。
【図３−１０】図3A〜Fは、(A)本開示の組換えレトロウイルスベクターの概略図;(B)本開示のポリヌクレオチドのプラスミド地図;(C及びD)本開示のポリヌクレオチドの配列(配列番号19);種々のフォーマットでのpAC-yCD2のベクターコード領域;(E)pACE-emdGFP及びpAC3-emdGFP間の変化を示す図;（F)pAC3-yCD2の図及び配列を示す図である。
【図３−１１】図3A〜Fは、(A)本開示の組換えレトロウイルスベクターの概略図;(B)本開示のポリヌクレオチドのプラスミド地図;(C及びD)本開示のポリヌクレオチドの配列(配列番号19);種々のフォーマットでのpAC-yCD2のベクターコード領域;(E)pACE-emdGFP及びpAC3-emdGFP間の変化を示す図;（F)pAC3-yCD2の図及び配列を示す図である。
【図３−１２】図3A〜Fは、(A)本開示の組換えレトロウイルスベクターの概略図;(B)本開示のポリヌクレオチドのプラスミド地図;(C及びD)本開示のポリヌクレオチドの配列(配列番号19);種々のフォーマットでのpAC-yCD2のベクターコード領域;(E)pACE-emdGFP及びpAC3-emdGFP間の変化を示す図;（F)pAC3-yCD2の図及び配列を示す図である。
【図３−１３】図3A〜Fは、(A)本開示の組換えレトロウイルスベクターの概略図;(B)本開示のポリヌクレオチドのプラスミド地図;(C及びD)本開示のポリヌクレオチドの配列(配列番号19);種々のフォーマットでのpAC-yCD2のベクターコード領域;(E)pACE-emdGFP及びpAC3-emdGFP間の変化を示す図;（F)pAC3-yCD2の図及び配列を示す図である。
【図３−１４】図3A〜Fは、(A)本開示の組換えレトロウイルスベクターの概略図;(B)本開示のポリヌクレオチドのプラスミド地図;(C及びD)本開示のポリヌクレオチドの配列(配列番号19);種々のフォーマットでのpAC-yCD2のベクターコード領域;(E)pACE-emdGFP及びpAC3-emdGFP間の変化を示す図;（F)pAC3-yCD2の図及び配列を示す図である。
【図３−１５】図3A〜Fは、(A)本開示の組換えレトロウイルスベクターの概略図;(B)本開示のポリヌクレオチドのプラスミド地図;(C及びD)本開示のポリヌクレオチドの配列(配列番号19);種々のフォーマットでのpAC-yCD2のベクターコード領域;(E)pACE-emdGFP及びpAC3-emdGFP間の変化を示す図;（F)pAC3-yCD2の図及び配列を示す図である。
【図３−１６】図3A〜Fは、(A)本開示の組換えレトロウイルスベクターの概略図;(B)本開示のポリヌクレオチドのプラスミド地図;(C及びD)本開示のポリヌクレオチドの配列(配列番号19);種々のフォーマットでのpAC-yCD2のベクターコード領域;(E)pACE-emdGFP及びpAC3-emdGFP間の変化を示す図;（F)pAC3-yCD2の図及び配列を示す図である。
【図３−１７】図3A〜Fは、(A)本開示の組換えレトロウイルスベクターの概略図;(B)本開示のポリヌクレオチドのプラスミド地図;(C及びD)本開示のポリヌクレオチドの配列(配列番号19);種々のフォーマットでのpAC-yCD2のベクターコード領域;(E)pACE-emdGFP及びpAC3-emdGFP間の変化を示す図;（F)pAC3-yCD2の図及び配列を示す図である。
【図３−１８】図3A〜Fは、(A)本開示の組換えレトロウイルスベクターの概略図;(B)本開示のポリヌクレオチドのプラスミド地図;(C及びD)本開示のポリヌクレオチドの配列(配列番号19);種々のフォーマットでのpAC-yCD2のベクターコード領域;(E)pACE-emdGFP及びpAC3-emdGFP間の変化を示す図;（F)pAC3-yCD2の図及び配列を示す図である。
【図３−１９】図3A〜Fは、(A)本開示の組換えレトロウイルスベクターの概略図;(B)本開示のポリヌクレオチドのプラスミド地図;(C及びD)本開示のポリヌクレオチドの配列(配列番号19);種々のフォーマットでのpAC-yCD2のベクターコード領域;(E)pACE-emdGFP及びpAC3-emdGFP間の変化を示す図;（F)pAC3-yCD2の図及び配列を示す図である。
【図３−２０】図3A〜Fは、(A)本開示の組換えレトロウイルスベクターの概略図;(B)本開示のポリヌクレオチドのプラスミド地図;(C及びD)本開示のポリヌクレオチドの配列(配列番号19);種々のフォーマットでのpAC-yCD2のベクターコード領域;(E)pACE-emdGFP及びpAC3-emdGFP間の変化を示す図;（F)pAC3-yCD2の図及び配列を示す図である。
【図３−２１】図3A〜Fは、(A)本開示の組換えレトロウイルスベクターの概略図;(B)本開示のポリヌクレオチドのプラスミド地図;(C及びD)本開示のポリヌクレオチドの配列(配列番号19);種々のフォーマットでのpAC-yCD2のベクターコード領域;(E)pACE-emdGFP及びpAC3-emdGFP間の変化を示す図;（F)pAC3-yCD2の図及び配列を示す図である。
【図３−２２】図3A〜Fは、(A)本開示の組換えレトロウイルスベクターの概略図;(B)本開示のポリヌクレオチドのプラスミド地図;(C及びD)本開示のポリヌクレオチドの配列(配列番号19);種々のフォーマットでのpAC-yCD2のベクターコード領域;(E)pACE-emdGFP及びpAC3-emdGFP間の変化を示す図;（F)pAC3-yCD2の図及び配列を示す図である。
【図３−２３】図3A〜Fは、(A)本開示の組換えレトロウイルスベクターの概略図;(B)本開示のポリヌクレオチドのプラスミド地図;(C及びD)本開示のポリヌクレオチドの配列(配列番号19);種々のフォーマットでのpAC-yCD2のベクターコード領域;(E)pACE-emdGFP及びpAC3-emdGFP間の変化を示す図;（F)pAC3-yCD2の図及び配列を示す図である。
【図３−２４】図3A〜Fは、(A)本開示の組換えレトロウイルスベクターの概略図;(B)本開示のポリヌクレオチドのプラスミド地図;(C及びD)本開示のポリヌクレオチドの配列(配列番号19);種々のフォーマットでのpAC-yCD2のベクターコード領域;(E)pACE-emdGFP及びpAC3-emdGFP間の変化を示す図;（F)pAC3-yCD2の図及び配列を示す図である。
【図３−２５】図3A〜Fは、(A)本開示の組換えレトロウイルスベクターの概略図;(B)本開示のポリヌクレオチドのプラスミド地図;(C及びD)本開示のポリヌクレオチドの配列(配列番号19);種々のフォーマットでのpAC-yCD2のベクターコード領域;(E)pACE-emdGFP及びpAC3-emdGFP間の変化を示す図;（F)pAC3-yCD2の図及び配列を示す図である。
【図３−２６】図3A〜Fは、(A)本開示の組換えレトロウイルスベクターの概略図;(B)本開示のポリヌクレオチドのプラスミド地図;(C及びD)本開示のポリヌクレオチドの配列(配列番号19);種々のフォーマットでのpAC-yCD2のベクターコード領域;(E)pACE-emdGFP及びpAC3-emdGFP間の変化を示す図;（F)pAC3-yCD2の図及び配列を示す図である。
【図３−２７】図3A〜Fは、(A)本開示の組換えレトロウイルスベクターの概略図;(B)本開示のポリヌクレオチドのプラスミド地図;(C及びD)本開示のポリヌクレオチドの配列(配列番号19);種々のフォーマットでのpAC-yCD2のベクターコード領域;(E)pACE-emdGFP及びpAC3-emdGFP間の変化を示す図;（F)pAC3-yCD2の図及び配列を示す図である。
【図３−２８】図3A〜Fは、(A)本開示の組換えレトロウイルスベクターの概略図;(B)本開示のポリヌクレオチドのプラスミド地図;(C及びD)本開示のポリヌクレオチドの配列(配列番号19);種々のフォーマットでのpAC-yCD2のベクターコード領域;(E)pACE-emdGFP及びpAC3-emdGFP間の変化を示す図;（F)pAC3-yCD2の図及び配列を示す図である。
【図３−２９】図3A〜Fは、(A)本開示の組換えレトロウイルスベクターの概略図;(B)本開示のポリヌクレオチドのプラスミド地図;(C及びD)本開示のポリヌクレオチドの配列(配列番号19);種々のフォーマットでのpAC-yCD2のベクターコード領域;(E)pACE-emdGFP及びpAC3-emdGFP間の変化を示す図;（F)pAC3-yCD2の図及び配列を示す図である。
【図３−３０】図3A〜Fは、(A)本開示の組換えレトロウイルスベクターの概略図;(B)本開示のポリヌクレオチドのプラスミド地図;(C及びD)本開示のポリヌクレオチドの配列(配列番号19);種々のフォーマットでのpAC-yCD2のベクターコード領域;(E)pACE-emdGFP及びpAC3-emdGFP間の変化を示す図;（F)pAC3-yCD2の図及び配列を示す図である。
【図３−３１】図3A〜Fは、(A)本開示の組換えレトロウイルスベクターの概略図;(B)本開示のポリヌクレオチドのプラスミド地図;(C及びD)本開示のポリヌクレオチドの配列(配列番号19);種々のフォーマットでのpAC-yCD2のベクターコード領域;(E)pACE-emdGFP及びpAC3-emdGFP間の変化を示す図;（F)pAC3-yCD2の図及び配列を示す図である。
【図３−３２】図3A〜Fは、(A)本開示の組換えレトロウイルスベクターの概略図;(B)本開示のポリヌクレオチドのプラスミド地図;(C及びD)本開示のポリヌクレオチドの配列(配列番号19);種々のフォーマットでのpAC-yCD2のベクターコード領域;(E)pACE-emdGFP及びpAC3-emdGFP間の変化を示す図;（F)pAC3-yCD2の図及び配列を示す図である。
【図３−３３】図3A〜Fは、(A)本開示の組換えレトロウイルスベクターの概略図;(B)本開示のポリヌクレオチドのプラスミド地図;(C及びD)本開示のポリヌクレオチドの配列(配列番号19);種々のフォーマットでのpAC-yCD2のベクターコード領域;(E)pACE-emdGFP及びpAC3-emdGFP間の変化を示す図;（F)pAC3-yCD2の図及び配列を示す図である。
【図３−３４】図3A〜Fは、(A)本開示の組換えレトロウイルスベクターの概略図;(B)本開示のポリヌクレオチドのプラスミド地図;(C及びD)本開示のポリヌクレオチドの配列(配列番号19);種々のフォーマットでのpAC-yCD2のベクターコード領域;(E)pACE-emdGFP及びpAC3-emdGFP間の変化を示す図;（F)pAC3-yCD2の図及び配列を示す図である。
【図３−３５】図3A〜Fは、(A)本開示の組換えレトロウイルスベクターの概略図;(B)本開示のポリヌクレオチドのプラスミド地図;(C及びD)本開示のポリヌクレオチドの配列(配列番号19);種々のフォーマットでのpAC-yCD2のベクターコード領域;(E)pACE-emdGFP及びpAC3-emdGFP間の変化を示す図;（F)pAC3-yCD2の図及び配列を示す図である。
【図３−３６】図3A〜Fは、(A)本開示の組換えレトロウイルスベクターの概略図;(B)本開示のポリヌクレオチドのプラスミド地図;(C及びD)本開示のポリヌクレオチドの配列(配列番号19);種々のフォーマットでのpAC-yCD2のベクターコード領域;(E)pACE-emdGFP及びpAC3-emdGFP間の変化を示す図;（F)pAC3-yCD2の図及び配列を示す図である。
【図４】野生型yCDタンパク質と比較して、感染U-87細胞において、より高レベルのyCD2タンパク質が観察されることを示す図である。
【図５】PCR増幅を使用した評価で、12サイクルのウイルス継代後に本開示のベクターが遺伝的に安定であることを示す図である。pACE-CDベクター(Kasahara et al.)と比較して、本開示のベクターがより長期の継代後により安定であることも図は示す。特に、pAC3-CDがpACE-CDよりも安定であり、これは、変更した骨格がベクターをより安定にしたことを示す。さらに、pACE-yCD1(T5.0001)及び-yCD2(T5-0002)がpAC-yCDよりもはるかに安定であり、これは、導入遺伝子のコード配列へのわずかなサイレントな変更が安定性に対して非常に大きな影響を与え、優れた特性をもたらすことができることを示す。T5.0003は安定性が最も低く、T5.0004及びT5.0005は、マウス腫瘍において有効性を示したpACE-CD(W.Wang et al.Hum Gene Ther 14:117 2003,Tai et al.Mol Ther 12:842 2005)とほとんど同等であるように思われる。
【図６−１】(A)細胞死滅アッセイ;及び(B)異なるベクターを感染させた細胞のシトシンデアミナーゼの比活性を示す。(A)は、漸増レベルの5-FCにU87感染細胞を曝露した場合、シトシンデアミナーゼ及び本開示のベクターが元のpACE-CDと少なくとも同等に感染細胞を死滅させ、おそらく元のpACE-CDよりも感染細胞をより死滅させることを示す。
【図６−２】(A)細胞死滅アッセイ;及び(B)異なるベクターを感染させた細胞のシトシンデアミナーゼの比活性を示す。(B)は、pACE-CD(T5.0000)と比較して、本開示のCD(T5.0007、T5.0001及びT5.0002)の比活性が全て増加し、T5.0000<T5.0007<T5.0001<T5.0002の順であることを示す。
【図７】本開示のCDベクターでin vivo処理し、4サイクルの5-FCで処理したマウスから移植したU-87腫瘍が薬物に対してなお感受性があることを示す。
【図８】脳腫瘍のマウスモデルに対するカプラン-マイヤー生存分析の投薬情報及び治療効果を示す。
【図９】同系のマウスモデルにおけるカプラン-マイヤー生存分析での投薬情報及び治療効果を示す。
【図１０−１】図10A〜Dは、CD、OPRT及びUPRT活性を有するポリペプチドを含む本開示の様々な実施形態を作製するためのスキームである。
【図１０−２】図10A〜Dは、CD、OPRT及びUPRT活性を有するポリペプチドを含む本開示の様々な実施形態を作製するためのスキームである。
【図１０−３】図10A〜Dは、CD、OPRT及びUPRT活性を有するポリペプチドを含む本開示の様々な実施形態を作製するためのスキームである。
【図１０−４】図10A〜Dは、CD、OPRT及びUPRT活性を有するポリペプチドを含む本開示の様々な実施形態を作製するためのスキームである。
【図１１】Aは、pAC3-miR128-1、pAC3-miR-128-2、及びpAC3-H1-shRNAmiR128と各々命名されたヒト一次前駆体miR-128-1、ヒト一次前駆体miR-128-2及びヒトH1プロモーターに連結したヒト前駆体miR-128のポリヌクレオチド配列を含むMLVレトロウイルスベクターpAC3骨格の概略ベクター地図である。Bは、pAC3-yCD2-H1-shRNAmiR128と命名された、ヒトH1プロモーターに連結したヒト前駆体miR-128のポリヌクレオチド配列を含むMLVレトロウイルスベクターpAC3-yCD2骨格の概略ベクター地図である。
【図１２】Aは、qPCRによって解析した、ヒト線維肉腫細胞HT1080におけるmiR-128含有ベクター(pAC3-miR-128-1、pAC3-miR-128-2、及び、pAC3-H1-shRNAmiR128)の複製速度の比較を示す。ウイルス複製中に、qPCRから得られた1/C(t)値 対 様々な時点をプロットすることによってグラフを作成した。Bは、qPCRによって解析した、ヒト神経膠腫細胞U87-MGにおけるmiR-128含有ベクター(pAC3-miR-128-1、pAC3-miR-128-2、及び、pAC3-H1-shRNAmiR128)の複製速度の比較を示す。ウイルス複製中に、qPCRから得られた1/C(t)値 対 様々な時点をプロットすることによってグラフを作成した。
【図１３】miR-128含有ベクターで形質導入した細胞の成熟型miR-128発現の相対定量化を示す
【図１４】miR-128含有ベクターで形質導入した細胞のBmi-1遺伝子発現の相対定量化を示す。
【図１５】pAC3-emd-142-3pTと命名され、1コピーの142-3pT標的配列を含むMLVレトロウイルスベクターpAC3-emd、及びpAC3-emd-142-3pT4Xと命名され、142-3pTの四つのタンデムリピートを含むMLVレトロウイルスベクターpAC3-emdの概略ベクター地図である。
【図１６】pAC3-yCD2-142-3pTと命名され、1コピーの142-3pT標的配列を含むMLVレトロウイルスベクターpAC3-yCD2、及びpAC3-yCD2-142-3pT4Xと命名され、142-3pTの四つのタンデムリピートを含むMLVレトロウイルスベクターpAC3-yCD2の概略ベクター地図である。
【図１７】Aは、qPCRによって解析した、ヒト線維肉腫細胞HT1080における142-3pT含有ベクター(pAC3-emd-142-3pT、pAC3-emd-142-3pT4X、pAC3-yCD2-142-3pT及びpAC3-yCD2-142-3pT4X)並びにそれらの親ベクター(pAC3-emd及びpAC3-yCD2)の複製速度の比較を示す。ウイルス複製中に、qPCRから得られた1/C(t)値 対 様々な時点をプロットすることによってグラフを作成した。Bは、ベクター拡散中の様々な時点でGFP発現についてフローサイトメトリー解析によって解析した、ヒト線維肉腫細胞HT1080におけるGFP含有ベクター(pAC3-emd、pAC3-emd-142-3pT及びpAC3-emd-142-3pT4X)の複製速度の比較を示す。
【図１８】Aは、qPCRによって解析した、ヒト神経膠腫細胞U87-MGにおける142-3pT含有ベクター(pAC3-emd-142-3pT、pAC3-emd-142-3pT4X、pAC3-yCD2-142-3pT及びpAC3-yCD2-142-3pT4X)並びにそれらの親ベクター(pAC3-emd及びpAC3-yCD2)の複製速度の比較を示す。ウイルス複製中に、qPCRから得られた1/C(t)値 対 様々な時点をプロットすることによってグラフを作成した。Bは、ベクター拡散中の様々な時点でGFP発現についてフローサイトメトリー解析によって解析した、ヒト神経膠腫細胞U87-MGにおけるGFP含有ベクター(pAC3-emd、pAC3-emd-142-3pT及びpAC3-emd-142-3pT4X)の複製速度の比較を示す。
【図１９】ベクター拡散の際の様々な時点でGFP発現についてフローサイトメトリー解析によって解析した、マウス及びヒト造血細胞におけるGFP含有ベクター(pAC3-emd)の複製速度を示す。
【図２０】複製速度の比較を示し、Aは、ベクター拡散中の様々な時点でGFP発現についてフローサイトメトリー法によって解析した、マウスT-リンパ球EL4におけるGFP含有ベクター(pAC3-emd、pAC3-emd-142-3pT及びpAC3-emd-142-3pT4X)の複製速度の比較を示す。Bは、ベクター拡散中の様々な時点でGFP発現についてフローサイトメトリー解析によって解析した、ヒトT-リンパ球SUP-T1におけるGFP含有ベクター(pAC3-emd、pAC3-emd-142-3pT及びpAC3-emd-142-3pT4X)の複製速度の比較を示す。Cは、ベクター拡散中の様々な時点でGFP発現についてフローサイトメトリー解析によって解析した、ヒト単球U937におけるGFP含有ベクター(pAC3-emd、pAC3-emd-142-3pT及びpAC3-emd-142-3pT4X)の複製速度の比較を示す。
【図２１】21A及び21Bは、Toca 511及びガドリニウムの腫瘍内CED注射の間に、患犬から得られたMRI画像の静止画像である。画像の左側にある大きな腫瘍が脳の両側を圧迫し、正中線構造を右側に移動させていることに注意されたい。白い領域は、ガドリニウム-Toca 511注射である。図21Bは、腫瘍内の二つのカテーテルの留置を示す。
【図２２】pAC3骨格内に、各々ヒトIFN-γ(hIFNg)及びマウスIFN-γ(mIFNg)をコードするMLVレトロウイルスベクターの概略ベクター地図である。
【図２３】pAC3-mIFNgベクターで感染させたヒト線維肉腫細胞株HT1080のRNAレベルにおけるmIFN-γ発現を示す図である。発現をRT-PCRによって検出している。
【図２４】pAC3-hIFNgベクターで感染させたヒト線維肉腫細胞株HT1080から分泌したhIFN-γタンパク質の発現を示すグラフである。
【図２５】pAC3-mIFNgベクターで感染させたヒト線維肉腫細胞株HT1080から分泌したmIFN-γタンパク質の発現を示すグラフである。
【図２６】ヌードマウスモデルへのAC3-GFPベクターの腫瘍内又は静脈内送達後のU87細胞におけるGFP発現のフローサイトメトリー解析を示す。GFP陽性パーセントについて、細胞をフローサイトメトリーにより測定する。未処理のヌードマウス脳から単離した細胞、組織培養由来のU87細胞、又はAC3-GFP(V)を用いて感染多重度1でin vitroで形質導入したU87細胞を対照とする。実施例27(GFPベクターのiv注射)より。
【図２７】U87単離細胞におけるGFPシグナルの分布を測定するために、実施例27(GFPベクターのiv注射)の第一、第三、及び第五群においてヒストグラム解析も行った結果のグラフを示す。GFP発現は、ベクター処理14日後のマウス脳から単離したU87腫瘍細胞に由来する。
【図２８】pAC3骨格内にヒトIL-2をコードするMLVレトロウイルスベクターの概略ベクター地図である。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１４】
近年では、ガンマレトロウイルス、XMRVがヒトの前立腺癌に関連付けられ、そのウイルスは前立腺組織での複製に強い好みを示す(R.Schlabergら、PNAS 106巻:16351〜16356頁2009年)。ウイルスは、異種指向性MLVに非常に類似して見える。本発明の一実施形態では、治療的遺伝子(シトシンデアミナーゼ、チミジンキナーゼ、他のプロドラッグ活性化遺伝子、インターフェロン、IL-2、IL-12、他のサイトカイン、p53、他の癌抑制遺伝子、抗癌性miRNAなど)、並びにXMRV gag及びgag-pol機能によって相補することができるエンベロープ遺伝子、例えば両種性エンベロープ、GALVエンベロープ、VSVgタンパク質エンベロープ又は当業者に公知である他のエンベロープの両方を運ぶ複製不能レトロウイルスベクターが提供される。複製不能ベクターポリヌクレオチドは、非ウイルス性若しくは物理的送達系;アデノウイルスベクターなどの異種ウイルス性送達系の一つを用いてDNA又はRNA分子として、又は製造されたレトロウイルス粒子として、患者又は動物の前立腺癌に送達される。送達されると、複製不能ベクターは、XMRVによる相補によって拡散され、XMRV相補が利用できない場合には、XMRV感染の境界に到達するまで、隣接細胞の感染が起こる。その後、治療的遺伝子は、XMRV感染領域だけでその影響を及ぼすことができる(例えばプロドラッグの投与後)。本発明の複製可能なレトロウイルスベクターを用いて、同じ救出効果を達成することができる。この戦略(治療的遺伝子を有する相補的複製不能ベクター)は、任意のレトロウイルス疾患(HIV感染、HTLV1感染、他の癌関連レトロウイルス)で、又は任意のウイルス性若しくはウイルス関連の疾患(子宮頸癌でのHPV感染並びにHPV E6及びE7の発現、EBV関連のリンパ腫又は癌腫など)で用いることができる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２９】
例えば、HSV-TKコード配列は、一部の状況では望ましいほど安定ではない。大きなベクター安定性を有する組換えベクターを選択するために、HSV-TKの変質されたコード配列のプールを含む組換えレトロウイルスベクターの分子育種が実施される。ランダムに突然変異を起こすヘルペスチミジンキナーゼ(TK)が、化学的に合成される(Bio Basic Inc、Markham, Canada)。合成配列は、配列番号19のyCD2配列の3'側に挿入されるか、又はCD2遺伝子の切除後にpAC3-yCD2ベクター骨格に単独で挿入される。レトロウイルスベクター混合物は、前述の通りにパッケージングされる。マウス線維芽細胞LMTK細胞又はヒト143Tk細胞にベクターを感染させ、HAT培地中でTK活性について選択する(Hillerら、Mol. Cell Biol. 8巻(8号):3298〜3302頁(1988年)。HAT培地で同じく選択される新しいLMTK細胞/143Tk細胞への抵抗性細胞の上清の連続継代は、TKを発現する安定ベクターの選択をもたらす。突然変異分析のための標準のPCRに基づく技術によってTK+抵抗性細胞を単離し、TK配列を回収することができる(Cowellら、CDNA Library Protocols、Humana Press発行、1996年)。この方法では、レトロウイルスベクター構築物の機能的タンパク質の発現及びゲノム安定性の両方について配列が選択される。類似した戦略は、UPRT(配列番号11、13)、OPRT(配列番号15、17)(Olahら、Cancer Res. 40巻:2869〜2875頁、1980年及びSuttle、Somatic Cell & Mol. Genet.、15巻(5号):435〜443頁、1989年)及び関心の他の遺伝子のために使用されてもよい。さらに、連続継代をIRES-挿入断片遺伝子全域にわたってPCRによって完全長挿入断片についてスクリーニングした後、選択不能遺伝子及びゲノムDNAのために連続継代戦略を用いることができる(図5を参照)。完全長挿入断片を精製し、クローニングでウイルスベクターに戻し、次に再試験することができる。最も安定な遺伝子を選択するために、この手順を数サイクル実施することができる。この戦略は、腫瘍の有無に関係なく動物で、さらに患者組織でも継代のために用いることもできる。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３０】
或いは、OPRT、UPRT、TK又は他のPAEは、異なるenv遺伝子又は他の適当な表面糖タンパク質を含む別々のベクターで発現させることができる。このベクターは、目的のエンベロープ及び遺伝子をコードする、複製適合性(Loggら、J.Mol Biol. 369巻:1214頁2007年)又は複製不能な「第一世代の」レトロウイルスベクターであることができる(Emiら、J.Virol 65巻:1202頁1991年)。後者の場合、既存のウイルス感染は、任意の既感染細胞からの「複製不能」ベクターの感染性拡散を可能にする、相補的gag及びpolを提供する。代わりのENV及び糖タンパク質には、ヒト細胞に感染することができる異種指向性及び多種指向性のENV並びに糖タンパク質、例えばMLVのNZB株由来のENV配列並びにMCF、VSV、GALV及び他のウイルス由来の糖タンパク質が含まれる(Palu 2000年、Baum 2006年、上記)。例えば、ポリヌクレオチドは、GAG及びPOL遺伝子が欠失し、ENVはNZB MLV又はVSV-g由来の異種指向性ENVドメインに対応し、IRES又はRSVなどのプロモーターはOPRT、UPRT、TK又は他のPAE遺伝子に作動可能に直接連結された配列を含むことができる。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４６】
免疫系の細胞間の相互作用のブロッキングは、活性化又は抑制のかなりの免疫学的影響を及ぼすことが示されている(Waldmann Annu Rev Med. 57巻:65頁2006年)。例えば、T細胞の活性化を調節する、CTLA-4(CD 152)及びB7.1(CD80)の相互作用の遮断は、おそらくこの抑制性相互作用をブロックすることによって、免疫刺激を引き起こすことが示されている(PeggsらCurr. Opin. Immunol. 18巻:206頁、2006年)。この遮断は、CTLA-4に対する抗体によって、又は溶解性のB7.1によって潜在的に達成することができる。この種の分子の全身投与は、最低でも有害な副作用、又は一CD28アゴニストの場合は死さえもたらすことがある、望ましくない全体的影響を及ぼすことができる(Suntharalingamら、NEJM 355巻1018頁2006年)。Pfizerは抗癌試薬としてそのような抗CTLA-4遮断抗体の一つ(CP-675,206)を開発しているが、重大な副作用のために開発を最近中止した。細胞外空間に放出されるそのような分子をコードする複製適合性ベクターに感染した後の腫瘍からの、局所環境に放出される遮断分子の局所送達は、局所的に免疫調節を提供し、これらの重大な副作用を回避し得る。遮断分子は、抗体、単鎖抗体、天然リガンドの溶解性バージョン、又はそのような受容体に結合する他のペプチドである。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６２】
実施例１：  pACE-GFPemdからpAC3-GFPemdへのベクター骨格の改変、及びGFPに代わるシトシンデアミナーゼ遺伝子配列の挿入
pACE-GFPemdプラスミドの以前の骨格(米国特許第6,899,871号、Wang et al. Hum Gene Ther 14:117 2003)を、図3Eに示す三つの方法で改変した。改変を、PCRによるオリゴヌクレオチド指定突然変異誘発(Logg et al.,J.Mol Biol 369:1214,2007;“Molecular Biology and Biotechnology" Eds. J M. Walker,R.Rapley,Royal Society of Chemistry,London UK,2000も参照されたい)によって行った。以下の改変を行った。1)両種性env遺伝子の3'末端のp15領域の核酸配列は、元は同種指向性エンベロープに由来した  -この配列を、4070A両種性エンベロープ由来の対応する配列に置換した。;二つの構築物におけるコード化エンベロープアミノ酸は同一である。2)PstI1部位の挿入により、選択した導入遺伝子の挿入がより容易になるようにIRES配列の3'末端を改変し、またIRES導入遺伝子部位の一方の末端にある小さな不完全反復配列を除去した。3)3'LTRの下流にある残りのウイルス配列を除去した。得られたプラスミドはpACE-emdGFP(別名pACE-GFP、pACE-eGFP及びT5.0006)であり、シトシンデアミナーゼ及び変異体をコードするベクターの基礎として使用した。最初に、コード配列カセットを挿入するための二つの方法を使用した。第一の方法は、ATG開始コドンのすぐ上流に配列5'TTATAAT3'（配列番号７３）をもたらし、第二の方法は配列5'TTATAA3'（配列番号７４）をもたらした。第二の方法はより単純であり、ベクター並びに合成シトシンデアミナーゼ遺伝子中でシンプルにPstI1及びNot1で酵素切断し、その後再びライゲーションを行う。シトシンデアミナーゼ挿入断片を有するベクターを、CDopt(CD1)及びCDopt+3pt(CD2)(図2参照)コード配列を用いる両方の方法により作製し、実施例3に記載したように、293T細胞の一過性トランスフェクションによって感染性ウイルス調製物を作製した。その後、MOI 0.1で、U87細胞を培養液中で感染させ、これらの細胞を100%感染するまで増殖させた。100%感染した細胞の細胞抽出物を、実施例6に記載したようにしてシトシンデアミナーゼ活性についてアッセイしたところ、この酵素の比活性は、いずれか一方の上流配列を有する点以外は同一である構築物と同等であることが判明した。したがって、図2の表において、pACE-eGFP(T5.0006)及びpACE-yCD(T5.0007)は第一の上流配列を有するが、さらに試験した他の全ての構築物は第二の上流配列を有する。その後、異なる遺伝子挿入断片を有するベクターを、単純なPStI1及びNot 1切断を用いて通常法で構築した。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６８】
酵母シトシンデアミナーゼを含む以下の配列を、クローニング、最適化及び突然変異のために用いた(ボックス中の核酸は、その後のクローニング法において使用する制限部位-Psi1及びNot1を含む)：
2012503987.tif 000001
（配列番号４３）
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７３】
全ては同等のGC含量を有し、同じアミノ酸をコードする。上記の天然の酵母遺伝子配列を別々にコドン最適化し、以下のCD遺伝子(CD1)を得、IRESを有する複製適合性レトロウイルス(RCR)をコードするpAC3プラスミドベクターに挿入した場合はそれをT5.0001と呼んだ：
2012503987.tif 000002
（配列番号４４）
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７６】
部位特異的突然変異誘発プライマー:センスプライマー:5'-tcgaggatatcggcgagtgaaacccgt
tattctttttggc-3'(配列番号45):
アンチセンスプライマー:5'-gccaaaaagaataacgggtttcactcgccgatatcctcga-3'(配列番号46)
センスプライマー:5'tcggcgagtgatccggcggcggcgcctccggcggcggcgcctccggcggcggcgcctccgg
cggcggcgccaacccgttatt-3'(配列番号47)
アンチセンスプライマー:5'-aataacgggttggcgccgccgccggaggcgccgccgccggaggcgccgccgccg
gaggcgccgccgccggatcactcgccga-3'(配列番号48)
天然酵母CDタンパク質の安定性を増加させるために、このタンパク質に三つのアミノ酸置換を遺伝子工学処理で行った。これらの置換は単独で行うか、あるいはヒトコドン最適化と組み合わせて行った。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７７】
三つのアミノ酸置換は、A23L、V108I、I140Lである。これらの置換をコードする配列を以下に示す：
2012503987.tif 000003
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７９】
優先コドンを利用する三つのアミノ酸置換A23L/V108I/I140Lを組み込み、配列全体に対
して優先ヒトコドン使用を利用する最終構築物設計(この遺伝子をCDopt+3pt[別名CD2](配列番号49):
2012503987.tif 000004
並びに、IRESを有するRCRをコードするpAC3プラスミドベクターに挿入した時のT5.0002。下線のコドンは、アミノ酸置換に対する優先コドンを示す。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８１】
CD最適化配列設計(ヒトコドンの優先+3つのアミノ酸置換)
2012503987.tif 000005
（配列番号50）
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８２】
C.CD-UPRT融合遺伝子(pAC3プラスミドRCRベクター中のCDopt+3pt-UPRT、[別名CDopt-UPRT及びCD2-UPRT]、T5.0003)の構築  図10Aで説明するスキームIを使用してCD最適化-UPRT配列を作製するため、UPRTポリペプチドに連結した上記のCDポリペプチドを含む融合構築物も作製した。以下のプライマーを用いて、CDとUPRTとの間の終止-開始コドンを除去した。
【表３】
2012503987.tif 000006
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８３】
得られた融合ポリヌクレオチドは1296bpを有し、直下に示す配列を含む：
2012503987.tif 000007
（配列番号５５）
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８４】
D.CD-リンカーUPRT融合遺伝子(CDopt+3pt-LINK-UPRT [別名CDopt-LINKER-UPRT及びCD2-L-UPRT]の構築
図10Bに示すスキームIIを使用してCD最適化-リンカー-UPRT配列を作製するために、CDポリペプチドとUPRTポリペプチドとの間にインフレームでリンカー(Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)4（配列番号５６）ドメインをクローニングすることによって、融合構築物も作製した。以下のプライマーを用いて、リンカーを挿入した。
【表４】
2012503987.tif 000008
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８５】
得られた構築物はサイズ:1356bp及び直下の配列を有する：
2012503987.tif 000009
（配列番号５９）
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８７】
得られた構築物は1269塩基対のサイズ及び直下の配列を含む：
2012503987.tif 000010
（配列番号６０）
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８８】
F.CD-リンカー-OPRT融合遺伝子(CDopt+3pt-LINK-OPRT、[別名CDopt-LINKER-OPRT及びCD2-L-OPRT]、pAC3プラスミドRCRベクター中ではT5.0005)の構築
図10Dに示すスキームIVを用いてCD最適化-リンカー-OPRT配列を作製するために、CDポリペプチドとOPRTポリペプチドとの間にインフレームでリンカー(Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)4（配列番号５６）ドメインをクローニングすることによって、融合構築物も作製した。
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８９】
得られた構築物は1329塩基対のサイズ及び直下の配列を含む：
2012503987.tif 000011
（配列番号６１）
【手続補正２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９９】
細胞死滅実験
Cell Titer 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay(MTS)は、増殖アッセイにおいて生存可能な細胞数を決定する比色法である。細胞増殖の速度を決定するため、並びに5-フルオロシトシン(5-FC)及び5-フルオロウラシル(5-FU)に対する様々な細胞株の用量反応を測定するために、このアッセイを使用した。
【手続補正２２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０１】
AC3-yCD2(ベクター)又はAC3-yCD(ベクター)のいずれかを感染させたU-87細胞に5-FC力価測定を行うことにより、yCD2タンパク質を発現する細胞内のシトシンデアミナーゼが、野生型yCDタンパク質を発現する細胞のシトシンデアミナーゼと少なくとも同程度の活性があることを証明する実験結果を図6Aは示す。簡単に説明すると、AC3-yCD(野生型CD)ベクター又はAC3-yCD2(熱安定化及びコドン最適化)ベクターのいずれかを用いた感染多重度0.1(すなわち100%感染)の感染の5日後のU-87細胞を、8日間、漸増量の5-FCに曝露し、又は陽性対照では0.1mMの5-FUに曝露した。8日目に、MTSアッセイ(プロメガ社のCell Titer 96 AQUEOUS One Solution Proliferation Assay)を用いて、細胞培養物を生存能力について評価した。漸増投与量での5-FC処理において、二つのレトロウイルスベクターのデータは同程度の死滅を示す。
【手続補正２３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３８】
リン酸カルシウム法を用いて、ベクターコード化プラスミドDNAを293T細胞に一過性にトランスフェクションすることにより、ベクターストックを作製した。トランスフェクション18時間後、培養液を新鮮培地と交換した。培地交換24時間後、ベクターを含む上清を回収し、0.45μmフィルターで濾過し、すぐに使用するか又は後の使用のために-80℃で、一定分量で保存した。20μLの回収したベクターストックを用いて、ヒト前立腺ガン細胞PC3に感染させた。感染24時間後、AZTを細胞に加え、さらなるウイルス複製を阻害した。感染48時間後、感染させたPC3細胞のゲノムDNAを力価アッセイのために抽出した。ベクターストックの力価を、既知のコピー数の標準物を用いたqPCRにより決定した。
【手続補正２４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２４６】
リン酸カルシウム法を用いて、ベクターコード化プラスミドDNAを293T細胞に一過性にトランスフェクションすることにより、ベクターストックを作製する。トランスフェクション18時間後、培養液を新鮮培地と交換する。培地交換24時間後、ベクターを含む上清を回収し、0.45μmフィルターで濾過し、すぐに使用するか又は後の使用のために-80℃で、一定分量で保存する。20μLの回収したベクターストックを用いて、ヒト前立腺ガン細胞PC3に感染させる。感染24時間後、AZTを細胞に加え、さらなるウイルス複製を阻害する。感染48時間後、感染させたPC3細胞のゲノムDNAを力価アッセイのために抽出する。ベクターストックの力価を、既知のコピー数の標準物を用いたqPCRにより決定する。
【手続補正２５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２６７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２６７】
リン酸カルシウム法を用いて、ベクターコード化プラスミドDNAを293T細胞に一過性にトランスフェクションすることにより、ベクターストックを作製した。トランスフェクション18時間後、培養液を新鮮培地と交換した。培地交換24時間後、ベクターを含む上清を回収し、0.45μmフィルターで濾過し、すぐに使用するか又は後の使用のために-80℃で、一定分量で保存した。20μLの回収したベクターストックを用いて、ヒト前立腺ガン細胞PC3に感染させた。感染24時間後、AZTを細胞に加え、さらなるウイルス複製を阻害した。感染48時間後、感染させたPC3細胞のゲノムDNAを力価アッセイのために抽出した。ベクターストックの力価を、既知のコピー数の標準物を用いたqPCRにより決定した。
【手続補正２６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２６９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２６９】
リン酸カルシウム法を用いて、ベクターコード化プラスミドDNAを293T細胞に一過性にトランスフェクションすることにより、ベクターストックを作製した。トランスフェクション18時間後、培養液を新鮮培地と交換した。培地交換24時間後、ベクターを含む上清を回収し、0.45μmフィルターで濾過し、すぐに使用するか又は後の使用のために-80℃で、一定分量で保存した。20μLの回収したベクターストックを用いて、ヒト前立腺ガン細胞PC3に感染させた。感染24時間後、AZTを細胞に加え、さらなるウイルス複製を阻害した。感染48時間後、感染させたPC3細胞のゲノムDNAを力価アッセイのために抽出した。ベクターストックの力価を、既知のコピー数の標準物を用いたqPCRにより決定した。
【手続補正２７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２７１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２７１】
リン酸カルシウム法を用いて、ベクターコード化プラスミドDNAを293T細胞に一過性にトランスフェクションすることにより、ベクターストックを作製した。トランスフェクション18時間後、培養液を新鮮培地と交換した。培地交換24時間後、ベクターを含む上清を回収し、0.45μmフィルターで濾過し、すぐに使用するか又は後の使用のために-80℃で、一定分量で保存した。20μLの回収したベクターストックを用いて、ヒト前立腺ガン細胞PC3に感染させた。感染24時間後、AZTを細胞に加え、さらなるウイルス複製を阻害した。感染48時間後、感染させたPC3細胞のゲノムDNAを力価アッセイのために抽出した。ベクターストックの力価を、既知のコピー数の標準物を用いたqPCRにより決定した。
【手続補正２８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２７３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２７３】
リン酸カルシウム法を用いて、ベクターコード化プラスミドDNAを293T細胞に一過性にトランスフェクションすることにより、ベクターストックを作製した。トランスフェクション18時間後、培養液を新鮮培地と交換した。培地交換24時間後、ベクターを含む上清を回収し、0.45μmフィルターで濾過し、すぐに使用するか又は後の使用のために-80℃で、一定分量で保存した。20μLの回収したベクターストックを使用して、ヒト前立腺ガン細胞PC3に感染させた。感染24時間後、AZTを細胞に加え、さらなるウイルス複製を阻害した。感染48時間後、感染させたPC3細胞のゲノムDNAを力価アッセイのために抽出した。ベクターストックの力価を、既知のコピー数の標準物を用いたqPCRにより決定した。
【手続補正２９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２７６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２７６】
1/C(t)値 対 複数の時点をプロットすることによって、各ベクターの複製速度を作成した。試験した全ベクターが、それらの親ベクター(pAC3-emd及びpAC3-yCD2)と比較して、同様の速度で複製したことを図17A及び図18Aは示す。GFPタンパク質を発現するベクター(pAC3-emd、pAC3-emd-142-3pT及びpAC3-emd-142-3pT4X)の複製速度も、フローサイトメトリー解析により評価した。pAC3-emd-142-3pT及びpAC3-emd-142-3pT4Xベクターが、それらの親ベクターpAC3-emdと同様の速度で複製したことを図17及び18は示す。
【手続補正３０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２７９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２７９】
実施例１９：  ウイルスRNAゲノム試験
上記のGFP発現抑制に対するmiR-142-3pTの機能的効果は、翻訳レベルにおけるGFP発現の直接的抑性に起因するのか、あるいは転写後レベルのウイルスゲノムの分解に起因するのかは不明である。実験の最後の時点において、標準的な分子生物学的方法を用いる全RNA抽出のために、一部の細胞を回収する。逆転写ウイルスRNAに由来するcDNAに特異的なプライマー(例えば、polプライマーセット及びenv2プライマーセット)を用いてqRT-PCRを行い、形質導入細胞のウイルス量を評価する。各々pAC3-emd-142-3pT及びpAC3-emd-142-3pT4Xで形質導入した細胞のウイルス量は、pAC3-emdベクターで形質導入した細胞よりも顕著に低いことを結果は示す。マウス及びヒト造血細胞におけるmiR-142-3pは、転写後レベルにおいてウイルスRNAゲノムを効果的に分解し、したがって、マウス及びヒト造血細胞におけるベクター拡散を制限するという考えを結果は支持する。
【手続補正３１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２８１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２８１】
実施例２１：  142-3pTを含む組換えレトロウイルスベクターの培養中のベクター安定性試験
142-3pTを含む組換えレトロウイルスベクターの多重連続感染サイクルを試験し、ベクターの安定性を評価する。最初に、HT1080及びU87-MG細胞を低いMOIにおいてベクターに感染させ、培養液中に拡散させる。各感染サイクルのベクターストックを回収、濾過、及び希釈し、新鮮な細胞に感染させる。env遺伝子の3'及びIRESに連結した異種ポリヌクレオチド配列のベクター下流にある非翻訳領域の3'に結合するプライマーを用いる標準的なPCRによって導入遺伝子安定性を評価するために、各感染サイクルの最後に細胞を回収し、ゲノムDNAを抽出する。1コピーの142-3pTを含むベクター(pAC3-emd-142-3pT及びpAC3-yCD2-142-3pT)は少なくとも10〜20サイクルにわたって安定な状態であるが、142-3pTの四つのタンデムリピートを含むベクター(pAC3-emd-142-3pT4X及びpAC3-yCD2-142-3pT4X)は、初期の感染サイクルにおいて、142-3pT配列の欠損を示し得る。
【手続補正３２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２８８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２８８】
FUGENE HDトランスフェクション試薬を用いて、ベクターコード化プラスミドDNAをHT1080細胞に一過性にトランスフェクションすることにより、ベクターストックを作製した。トランスフェクション48時間後、ベクターを含む上清を回収し、0.45μmフィルターで濾過し、すぐに使用するか又は後の使用のために-80℃で、一定分量で保存した。未希釈ベクターストックの特定量を用いて、75%集密度の新鮮なHT1080に感染させた。感染4日及び5日後に、ベクターを含む上清を回収し、0.45μmフィルターで濾過し、すぐに使用するか又は後の使用のために-80℃で、一定分量で保存した。20μLの回収したベクターストックを使用して、ヒト前立腺ガン細胞PC3に感染させた。感染24時間後、AZTを細胞に加え、さらなるウイルス複製を阻害した。感染48時間後、感染させたPC3細胞のゲノムDNAを力価アッセイのために抽出した。ベクターストックの力価を、既知のコピー数の標準物を用いたqPCRにより決定した。
【手続補正３３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２８９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２８９】
最初に、ヒトIFN-γの発現をRNAレベルで試験した。標準的なRNA抽出法を用いて、二次感染の感染5日後のHT1080形質導入細胞から全RNAを抽出した。RT-PCRを行い、ヒトIFN-γの発現を検出した。cDNAを作製するためにRT反応で50ngの全RNAを使用した。その後に、RT反応物の1/10体積を、ヒトIFN-γに特異的なPCRプライマーセットを用いるPCRに使用した。ヒトIFN-γがpAC3-hIFNgベクターで感染させたHT1080細胞内で発現することをRT-PCRの結果は示した。
【手続補正３４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２９０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２９０】
ヒトIFN-γ分泌タンパク質の発現を、標準的なELISAにより試験した。タンパク質濃度及び希釈係数間で直線的な範囲を得るために、感染4日及び5日後に回収したベクターストックをELISAアッセイにおいて段階希釈した。ヒトIFN-γタンパク質が、感染4日後の細胞よりも感染5日後のHT1080細胞により、より高い濃度で分泌されることを結果は示した(図24)。感染5日後の細胞は、約325〜355pg/mLのヒトIFN-γタンパク質を分泌した。
【手続補正３５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２９１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２９１】
B.マウスIFN-γ遺伝子をコードする複製適合性レトロウイルスベクターの構築及び試験
マウスIFN-γ遺伝子をコードする複製適合性レトロウイルスベクターpAC3-mIFNgは、上記のpAC3-yCD2骨格に由来した。pAC3-mIFNgベクターのpAC3骨格を、pAC3-yCD2プラスミドDNAのPsi I及びNot Iでのエンドヌクレアーゼ消化により単離した。マウスIFN-γ遺伝子のcDNA配列を同定し、異なるアクセッション番号(BC119063、BC119065及びNM008337)から得た三つの配列間で確かめた。配列アラインメントがこの三つの間で同一配列を示した。DNA断片の各末端に存在するPsi I及びNot I制限酵素部位を有するマウスIFN-γのオープンリーディングフレーム(配列番号39)を合成し、pAC3骨格内の対応する部位に挿入した。得られた構築物pAC3-mIFNgは、四つの遺伝子:gag、pol、env、及びマウスIFN-γをコードする(図22)。
【手続補正３６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２９４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２９４】
ヒトIFN-γ分泌タンパク質の発現を、標準的なELISAにより試験した。タンパク質濃度及び希釈係数間で線形の範囲を得るために、感染4日及び5日後に回収したベクターストックをELISAアッセイにおいて段階希釈した。マウスIFN-γタンパク質が、感染4日後の細胞よりも感染5日後のHT1080細胞により、より高い濃度で分泌されることを結果は示した(図25)。感染5日後の細胞は、約33〜42ng/mLのマウスIFN-γタンパク質を分泌した。
【手続補正３７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２９５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２９５】
実施例２５：  マウス皮下腫瘍モデルにおける、γインターフェロンを発現するベクターを用いる抗腫瘍有効性試験
目的
皮下結腸ガンを保有するBALB/cマウス(CT26.WT)に腫瘍内(IT)注射により送達する場合
の、マウスγインターフェロン配列(pAC3-mIFNg)を保有する新規MLVに基づく複製適合性
レトロウイルスベクターの腫瘍増殖に対する効果を評価することが本研究の目的である。
【手続補正３８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３０２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３０２】
実施例２６：  マウス皮下腫瘍モデルにおける、γインターフェロンを発現するベクターを用いる抗腫瘍有効性試験
目的
皮下結腸ガンを保有するBALB/cマウス(CT26.WT)における腫瘍内(IT)注射により送達する場合の、マウスγインターフェロン配列(pAC3-mIFNg)を保有する新規MLVに基づく複製適合性レトロウイルスベクターの腫瘍増殖における効果を評価することが本研究の目的である。
【手続補正３９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2012503987000001.app