(57)【要約】      （修正有）【課題】オキシドレダクターゼ、その単離されたＤＮＡ配列、融合タンパク質およびＳ−２−ヒドロキシ酸エステルの製造方法の提供。【解決手段】Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓから得られたＮＡＤＰＨ依存性のオキシドレダクターゼ、２−オキソ酸エステルを相応するキラルのＳ−２−ヒドロキシ酸エステルに酵素によりエナンチオ選択的に還元する方法及び酵素と関連した補酵素再生を用いてＳ−２−ヒドロキシ酸エステルを酵素によりエナンチオ選択的に収得する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
２−オキソ酸エステルをＮＡＤＰＨ及び水の存在で相応するＳ−２−ヒドロキシ酸エステルに還元することを特徴とする、オキシドレダクターゼ。
【請求項２】
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  （Ｌ．）  ｒｅｕｔｅｒｉ，  Ｌ．  ｋｅｆｉｒｉ，  Ｌ．  ｋａｎｄｌｅｒｉ，  Ｌ．  ｐａｒａｂｕｃｈｎｅｒｉ，  Ｌ．  ｃｅｌｌｏｂｉｏｓｕｓ又はＬ．  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍから得ることができることを特徴とする、請求項１に記載のオキシドレダクターゼ。
【請求項３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８に記載のアミノ酸配列を示すことを特徴とする、請求項１又は２に記載のオキシドレダクターゼ。
【請求項４】
アミノ酸配列の７０％より多くがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８のアミノ酸配列と一致し、かつエチル−２−オキソ−４−フェニルブチレートをＳ−エチル−２−ヒドロキシ−４−フェニルブチレートへの反応に関して、１ｍｇあたり１μｍｏｌより大きい比活性を示すことを特徴とする、請求項１から３のいずれか一項に記載のオキシドレダクターゼ。
【請求項５】
アミノ酸配列の８０％〜９９．５％、特に９０〜９９．５％、特に有利に９９％〜９９．５％がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８のアミノ酸配列と一致することを特徴とする、請求項４に記載のオキシドレダクターゼ。
【請求項６】
アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８を有するオキシドレダクターゼよりも、１〜５０個のアミノ酸が付加されているか又は１〜５０個のアミノ酸が欠失していて、かつエチル−２−オキソ−４−フェニルブチレートからＳ−エチル−２−ヒドロキシ−４−フェニルブチレートへの反応に関して、１ｍｇあたり１μｍｏｌより大きい比活性を示すことを特徴とする、請求項１から５のいずれか一項に記載のオキシドレダクターゼ。
【請求項７】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８のアミノ酸配列において１〜２５個のアミノ酸、特に２〜２０個のアミノ酸、有利に３〜１０個のアミノ酸が付加されているか又は欠失していることを特徴とする、請求項４に記載のオキシドレダクターゼ。
【請求項８】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８のアミノ酸配列を有し、水溶性ポリマーによって１箇所、２箇所、３箇所、４箇所又は５箇所修飾されていて、かつエチル−２−オキソ−４−フェニルブチレートからＳ−エチル−２−ヒドロキシ−４−フェニルブチレートへの反応に関して、１ｍｇあたり１μｍｏｌより大きい比活性を示すことを特徴とする、請求項１から６のいずれか一項に記載のオキシドレダクターゼ。
【請求項９】
水溶性ポリマーがポリエチレングリコールであることを特徴とする、請求項８に記載のオキシドレダクターゼ。
【請求項１０】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８のアミノ酸配列のフラグメントであり、その際、このフラグメントは５〜３０個のアミノ酸を有することを特徴とする、オキシドレダクターゼのフラグメント。
【請求項１１】
６〜２５個のアミノ酸、特に８〜２０個のアミノ酸、有利に１０〜１８個のアミノ酸のアミノ酸鎖を有するＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８のフラグメントである、特に有利にアミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０１又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０２であることを特徴とする、請求項１０に記載のフラグメント。
【請求項１２】
アミノ酸配列のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８を有するオキシドレダクターゼ又はその５〜３０個のアミノ酸のフラグメントであり、かつこのオキシドレダクターゼ又はそのフラグメントが他のポリペプチドとＮ末端で又はカルボキシ末端でペプチド結合を介して結合していることを特徴とする、融合タンパク質。
【請求項１３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８によるオキシドレダクターゼに特異的に結合するか又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０１又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０２によるフラグメントに特異的に結合することを特徴とする、抗体。
【請求項１４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０１又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０２によるオキシドレダクターゼをコードする、単離された核酸配列。
【請求項１５】
請求項１から９の及び請求項１２のいずれか一項に記載の、２−オキソ酸エステルをＮＡＤＰＨ及び水の存在で相応するＳ−２−ヒドロキシ酸エステルへの還元を触媒するオキシドレダクターゼの単離されたＤＮＡ配列において、このＤＮＡ配列が次のグループ
ａ）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９に記載のヌクレオチド配列を有するＤＮＡ−配列又はそれぞれの相補的な鎖
ｂ）  ａ）に記載の１種又は数種のＤＮＡ配列又はその相補的な鎖とハイブリダイゼーションするＤＮＡ配列、その際、このハイブリダイゼーションはストリンジェントな条件下で行う、及び
ｃ）  遺伝コードの変性に基づいて、ａ）又はｂ）に記載の１種又は数種のＤＮＡ配列によりコードされている一つのタンパク質をコードするＤＮＡ配列
から選択されることを特徴とする、オキシドレダクターゼの単離されたＤＮＡ配列。
【請求項１６】
核酸塩基の７０％より多くがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９に記載されたＤＮＡ配列又はその相補的な鎖と一致し、かつエチル−２−オキソ−４−フェニル−ブチレートからＳ−エチル−２−ヒドロキシ−４−フェニルブチレートへの反応に関して、１ｍｇあたり１μｍｏｌより高い比活性を有するタンパク質をコードすることを特徴とする、単離されたＤＮＡ配列。
【請求項１７】
核酸塩基の８０％〜９９．５％、特に９０％〜９９．５％、有利に９９％〜９９．５％がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９に記載のＤＮＡ配列と一致していることを特徴とする、請求項１６に記載の単離されたＤＮＡ配列。
【請求項１８】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９のＤＮＡ配列又はその相補的な鎖の一部と一致する配列を有する、１０〜５０個の核酸塩基を有することを特徴とする、単離されたＤＮＡ配列。
【請求項１９】
１５〜４５個の核酸塩基、特に２０〜４０個の核酸塩基、特に有利に３０〜４０個の核酸塩基であることを特徴とする、請求項１８に記載の単離されたＤＮＡ配列。
【請求項２０】
請求項１４から１９のいずれか一項に記載の１つ又は複数のＤＮＡ配列を有することを特徴とする、クローニングベクター。
【請求項２１】
請求項１４から１９のいずれか一項に記載の１つ又は複数のＤＮＡ配列を有し、かつ適当な方法で発現コントロール配列と結合していることを特徴とする、発現ベクター。
【請求項２２】
細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞又は哺乳動物細胞であり、請求項２１に記載の発現ベクターで形質転換されたか又は形質移入された、宿主細胞。
【請求項２３】
２−オキソ酸エステルを、請求項１から９の及び請求項１２のいずれか一項に記載のオキシドレダクターゼ、ＮＡＤＰＨ及び水の存在で、相応するＳ−２−ヒドロキシ酸エステルに還元し、生成されたＳ−２−ヒドロキシ酸エステルを単離することを特徴とする、Ｓ−２−ヒドロキシ酸エステルをエナンチオ選択的に収得する方法。
【請求項２４】
２−オキソ酸エステルとして、次の式Ｉ
Ｒ２−Ｃ（Ｏ）−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｒ１    （Ｉ）
［式中、
Ｒ１は、
１．  −（Ｃ1〜Ｃ20）−アルキル、その際、アルキルは直鎖又は分枝鎖である、
２．  −（Ｃ2〜Ｃ20）−アルケニル、その際、アルケニルは直鎖又は分枝鎖であり、鎖長に応じて１個、２個、３個又は４個の二重結合を有する、
３．  −（Ｃ2〜Ｃ20）−アルキニル、その際、アルキニルは直鎖又は分枝鎖であり、場合により１個、２個、３個又は４個の三重結合を有する、
４．  −（Ｃ6〜Ｃ14）−アリール、
５．  −（Ｃ1〜Ｃ8）−アルキル−（Ｃ6〜Ｃ14）−アリール、
６．  −（Ｃ5〜Ｃ14）−複素環式基、これは非置換であるか又は１〜３個のハロゲン、ヒドロキシル、アミノ又はニトロにより置換されているか、又は
７．  −（Ｃ3〜Ｃ7）−シクロアルキルを表し、かつ
Ｒ２は、
１．  −（Ｃ1〜Ｃ20）−アルキル、その際、アルキルは直鎖又は分枝鎖である、
２．  −（Ｃ2〜Ｃ20）−アルケニル、その際、アルケニルは直鎖又は分枝鎖であり、鎖長に応じて１個、２個、３個又は４個の二重結合を有する、場合により１個、２個、３個又は４個の三重結合を有する、
４．  −（Ｃ6〜Ｃ14）−アリール、
５．  −（Ｃ1〜Ｃ8）−アルキル−（Ｃ6〜Ｃ14）−アリール、
６．  −（Ｃ5〜Ｃ14）−複素環式基、これは非置換であるか又は１〜３個のハロゲン、ヒドロキシ、アミノ又はニトロによって置換基されているか、又は
７．  −（Ｃ3〜Ｃ7）−シクロアルキルを表し、
前記式中、１．〜７．に記載した基は非置換であるか又は相互に無関係に次の１個〜３個の置換基により置換されている
ａ）  −ＯＨ、
ｂ）  ハロゲン、例えばフッ素、塩素、臭素又はヨウ素、
ｃ）  −ＮＯ2、
ｄ）  −Ｃ（Ｏ）−Ｏ−（Ｃ1〜Ｃ20）−アルキル、その際、アルキルは直鎖又は分枝鎖であり、かつ非置換であるか又は１個〜３個のハロゲン、ヒドロキシル、アミノ又はニトロにより置換されている、又は
ｅ）  −（Ｃ5〜Ｃ14）−複素環式基、これは非置換であるか又は１〜３個のハロゲン、ヒドロキシル、アミノ又はニトロにより置換されている］
の化合物を使用することを特徴とする、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
Ｓ−２−ヒドロキシ酸エステルをエナンチオ選択的に収得する方法において、次の工程
ａ）  ２−オキソ酸エステルを請求項１から９の及び請求項１２のいずれか一項に記載のオキシドレダクターゼ、ＮＡＤＰＨ及び水の存在で、相応するＳ−２−ヒドロキシ酸エステルに還元する工程、
ｂ）  オキシドレダクターゼにより形成されたＮＡＤＰをデヒドロゲナーゼ及び補基質を用いて同時にＮＡＤＰＨに還元する工程、及び
ｃ）  形成されたキラルのＳ−２−ヒドロキシ酸エステルを単離する工程
を特徴とする方法。
【請求項２６】
２−オキソ酸エステルとして、請求項２４に記載の式Ｉの化合物を使用することを特徴とする、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
デヒドロゲナーゼとして、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂｉｕｍ  ｂｒｏｃｋｉｉ，  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒ又はＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓからのアルコール−デヒドロゲナーゼを使用し、かつ補基質としてエタノール、２−プロパノール、２−ブタノール、２−ペンタノール又は２−オクタノールを使用することを特徴とする、請求項２５又は２６に記載の方法。
【請求項２８】
デヒドロゲナーゼとしてグルコース−デヒドロゲナーゼを使用し、補基質としてグルコースを使用するか、又はＮＡＤＰＨ依存性のホルメート−デヒドロゲナーゼを使用し、補基質としてギ酸の塩、例えばギ酸アンモニウム、ギ酸ナトリウム又はギ酸カルシウムを使用することを特徴とする、請求項２５又は２６に記載の方法。
【請求項２９】
次の工程
ａ）  ２−オキソ酸エステルを請求項１から９の及び請求項１２のいずれか一項に記載のオキシドレダクターゼ、ＮＡＤＰＨ及び水の存在で、相応するＳ−２−ヒドロキシ酸エステルに還元する工程、
ｂ）  オキシドレダクターゼにより形成されたＮＡＤＰをデヒドロゲナーゼ及び補基質を用いて同時にＮＡＤＰＨに還元する工程、及び
ｃ）  この反応を有機溶剤の存在で実施する工程、及び
ｄ）  形成されたキラルのＳ−２−ヒドロキシ酸エステルを単離する工程
を特徴とする、Ｓ−２−ヒドロキシ酸エステルをエナンチオ選択的に収得する方法。
【請求項３０】
２−オキソ酸エステルとして、請求項２４に記載の式Ｉの化合物を使用することを特徴とする、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
デヒドロゲナーゼとして、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂｉｕｍ  ｂｒｏｃｋｉｉ，  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒ又はＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓからのアルコール−デヒドロゲナーゼを使用し、かつ補基質としてエタノール、２−プロパノール、２−ブタノール、２−ペンタノール又は２−オクタノールを使用することを特徴とする、請求項２９又は３０に記載の方法。
【請求項３２】
デヒドロゲナーゼとしてグルコース−デヒドロゲナーゼを使用し、補基質としてグルコースを使用するか、又はＮＡＤＰＨ依存性のホルメート−デヒドロゲナーゼを使用し、補基質としてギ酸の塩、例えばギ酸アンモニウム、ギ酸ナトリウム又はギ酸カルシウムを使用することを特徴とする、請求項２９又は３０に記載の方法。
【請求項３３】
有機溶剤としてジエチルエーテル、ｔ−ブチルメチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジブチルエーテル、酢酸ブチル、ヘプタン、ヘキサン又はシクロヘキサンを使用することを特徴とする、請求項２９から３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
有機相が全体の反応体積の５％〜８０％、有利に１０％〜４０％であることを特徴とする、請求項２９から３２のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オキシドレダクターゼ、オキシドレダクターゼのフラグメント及びオキシドレダクターゼの単離されたＤＮＡ配列、オキシドレダクターゼ又はそのフラグメントをベースとする融合タンパク質及びＳ−２−ヒドロキシ酸エステルをエナンチオ選択的に収得する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
２−ヒドロキシ酸及びそのエステルは、重要なキラルの合成の構成単位であり、これから一連の化合物、例えばエポキシド、アルキルエステル、ヒドラジニルエステル、アルファ−Ｎ−アルコキシアミノエステル又はアルファアミノエステルをＣ２−原子にキラリティーを維持しながら得ることができる。
【０００３】
今までに多数の研究分野がエナンチオマー純粋の２−ヒドロキシ酸及びそのエステルの製造方法の開発を試みており、その際に多様な化学的手法及び生体触媒的手法が考察された。今までに、工業的規模でこの生産の要求を満たす方法を開発することには成功していない。特に、２−ヒドロキシ酸及びそのエステルの製造の場合には、キラル中心の酵素触媒を用いた導入が化学的触媒による合成より優れていると見られている。
【０００４】
酵素触媒を用いた方法の場合には、現在では３種の異なる方法が存在している。一つの方法は、キラルのシアノヒドリンのオキシニトリラーゼ触媒を用いた合成及び引き続くしばしば同様に酵素触媒を用いた加水分解である（Ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ．  ４th  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  （２０００），  Ｋ．  Ｆａｂｅｒ；  Ｃｙａｎｈｙｄｒｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）。この方法の欠点は毒性のＨＣＮの使用である。
【０００５】
もう一つの方法は、リパーゼ、例えばＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｏｕｒｅｓｃｅｎｓからのリパーゼを用いた２−ヒドロキシ酸エステルのラセミ分割である（Ｊ，  Ｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ．  ５５，  ８１２−８１５  （１９９１），  Ｋｉｎｅｔｉｃ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ２−ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ  Ｅｓｔｅｒｓ  ｃａｔａｌｙｓｅｄ  ｂｙ  ａ  Ｌｉｐａｓｅ  Ｅｘ．  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｏｕｒｅｓｚｅｎｓ，  Ｋａｌａｒｉｔｉｓ，  Ｐ．ら著）。この方法の欠点は理論収率が５０％にすぎないことである。
【０００６】
もう一つの方法は、プロキラルの２−オキソ酸又はそのエステルの還元によるキラルの２−ヒドロキシ酸及びそのエステルの合成である。全酵母細胞又はＰｒｏｔｅｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ又はＰｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓの細胞を用いた形質転換又は単離された酵素を用いた方法は公知である。全酵母細胞を用いた形質転換の場合には、２−オキソ酸の還元性酵素活性は、酵素のラクテート−デヒドロゲナーゼ又はマレエート−デヒドロゲナーゼに基づき（Ｒａｍｅｓｈ  Ｎ．  Ｐａｔｅｌ  Ｓｔｅｒｅｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｅ，  ＮＹ  （２０００），  １４．  Ｓｔｅｒｅｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｃｈｉｒａｌ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｗｈｏｌｅ−  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓ，  Ｐａｏｌａ  Ｄ´Ａｒｒ
ｉｇｏ，  Ｇｉｕｓｅｐｐｅ  Ｐｅｄｒｏｃｃｈｉ−Ｆａｎｔｏｎｉ及びＳｔｅｆａｎｏ  Ｓｅｒｖｉ著）、プロテウス属を用いて実施した還元の場合には、この反応のために膜に位置するモリブデン依存性の鉄−硫黄タンパク質が関与する（Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  （１９９４）；  ２２２（３）；  １０２５−３２  ，Ｔｈｅ  （２Ｒ）−ｈｙｄｒｏｘｙｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ−ｖｉｏｌｏｇｅｎ−ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ  ｉｓ  ａ  ｍｏｌｙｂｄｅｎｕｍ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｉｒｏｎ−ｓｕｌｐｈｕｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ，  Ｔｒａｕｔｗｅｉｎ  Ｔ，  Ｋｒａｕｓｓ  Ｆ，  Ｌｏｔｔｓｐｅｉｃｈ  Ｆ，  Ｓｉｍｏｎ  Ｈ．著）。
【０００７】
２−オキソ酸エステルを還元するための公知の方法の場合には、単離した酵素（Ｄ／Ｌ）−ラクテート−デヒドロゲナーゼ（ＵＳ  ５，６８６，２７５）、（Ｄ／Ｌ）−ジヒドロキシイソカプロエート−デヒドロゲナーゼ（ＵＳ  ６，０３３，８８２）又はＤ−マンデレート−デヒドロゲナーゼ（Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ２００２  Ｆｅｂ；６８（２）：９４７−５１，  Ｔｗｏ  ｆｏｒｍｓ  ｏｆ  ＮＡＤ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｄ−ｍａｎｄｅｌａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｉｎ  Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ  ＩＡＭ  １００７１，  Ｔａｍｕｒａ  Ｙ．ら  １０）が使用され、これらの酵素はクローニングされ、過剰発現されて、市販されている。これらの酵素はＮＡＰＨ−依存性であり、２−オキソ酸エステルを反応させない。さらに、２−オキソ酸又はそのエステルを還元する酵素は二級アルコールを反応させないことは公知である。
【０００８】
さらに、補酵素ＮＡＤを、ホルメート−デヒドロゲナーゼ、例えばＣａｎｄｉｄａ  ｂｏｉｄｉｎｉｉからのホルメート−デヒドロゲナーゼ又はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｏｕｒｅｓｚｅｎｓからのその組換体を用いて再生する方法は公知である（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ，  Ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ  Ｉ  （Ｒｅｈｍ  ａｎｄ  Ｒｅｅｄ）  ９．  Ａｌｃｏｈｏｌ  Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｓ−Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ，  Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ  Ｊ．  Ｐｅｔｅｒｓ著，  ＷＩＬＥＹ−ＶＣＨ  −Ｖｅｒｌａｇ．（１９９８））。例えば、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓからのＤ−ラクテート−デヒドロゲナーゼを用いたＲ−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸の酵素による製造方法が記載されている（Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ，  Ｌｉｅｓｅ，  Ｋ．  Ｓｅｅｌｂａｃｈ，  Ｃ．  Ｗａｎｄｒｅｙ．  ＷＩＬＥＹ−ＶＣＨ  −Ｖｅｒｌａｇ，  （２０００））。このホルメート−デヒドロゲナーゼを用いた補酵素再生の欠点は、ホルメート−デヒドロゲナーゼの比活性が少ないこと（４〜１０Ｕ／ｍｇ）及びこの酵素の製造コストが高いことにある。それにより、経済的観点から、この酵素は多数回使用する必要があり、比較的に基本的に複雑で、従って高価なプロセス管理を必要とする。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の課題は、オキシドレダクターゼによって、先行技術からの方法の前記の欠点を回避することであった。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
前記の課題は、本発明の場合に、２−オキソ酸エステルをＮＡＤＰＨ及び水の存在で相応するＳ−２−ヒドロキシ酸エステルに還元するオキシドレダクターゼによって解決される。
【００１１】
本発明は、特に、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  （Ｌ．）  ｒｅｕｔｅｒｉ，  Ｌ．  ｋｅｆｉｒｉ，  Ｌ．  ｋａｎｄｌｅｒｉ，  Ｌ．  ｐａｒａｂｕｃｈｎｅｒｉ，  Ｌ．  ｃｅｌｌｏｂｉｏｓｕｓ又はＬ．  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍから得ることができるオキシドレダクターゼに関する。
【００１２】
本発明は、さらに添付の配列表に記載されたようなＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９によるＤＮＡ配列を有するＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉからのオキシドレダクターゼ、及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８によるアミノ酸配列にも関する。
【００１３】
本発明は、さらに、アミノ酸の７０％より多くがアミノ酸配列のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８と同一であり、かつエチル−２−オキソ−４−フェニルブチレートからＳ−エチル−２−ヒドロキシ−４−フェニルブチレートへの反応に関して、１ｍｇあたり１μｍｏｌより大きい比活性を示すことを特徴とするオキシドレダクターゼに関する。アミノ酸の８０％〜９９．５％、特に９０％〜９９．５％、特に有利に９９％〜９９．５％が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８のアミノ酸配列と一致しているオキシドレダクターゼが有利である。このＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８によるオキシドレダクターゼ又はその誘導体又は類似体の比活性の測定は、実施例２に記載されたテストシステムで行う。
【００１４】
本発明は、さらに、アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８を有するオキシドレダクターゼよりも、１〜５０個のアミノ酸が付加されているか又は１〜５０個のアミノ酸が欠失していて、かつエチル−２−オキソ−４−フェニルブチレートからＳ−エチル−２−ヒドロキシ−４−フェニルブチレートへの反応に関して、１ｍｇあたり１μｍｏｌより大きい比活性を示すことを特徴とするオキシドレダクターゼに関する。アミノ酸配列のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８において１〜２５個のアミノ酸、特に２〜２０個のアミノ酸、有利に３〜１０個のアミノ酸が付加されているか又は欠失しているオキシドレダクターゼが有利である。
【００１５】
本発明は、さらに、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８のアミノ酸配列を有し、水溶性ポリマーによって１箇所、２箇所、３箇所、４箇所又は５箇所修飾されていて、かつエチル−２−オキソ−４−フェニルブチレートからＳ−エチル−２−ヒドロキシ−４−フェニルブチレートへの反応に関して、１ｍｇあたり１μｍｏｌより大きい比活性を示すことを特徴とするオキシドレダクターゼに関する。水溶性ポリマーの例はポリエチレングリコールである。ポリエチレングリコールとの結合は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８によるオキシドレダクターゼのＮ末端で行うのが有利である。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８によるオキシドレダクターゼは、固体、例えばポリエチレン、ポリスチレン、多糖、セルロース又はセルロース誘導体と結合されていてもよい。
【００１６】
本発明は、さらに、アミノ酸配列のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８のフラグメントであり、５〜３０個のアミノ酸の数を有することを特徴とする、オキシドレダクターゼのフラグメントに関する。６〜２５個のアミノ酸、特に８〜２０個のアミノ酸、有利に１０〜１８個のアミノ酸のアミノ酸鎖のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８のフラグメント、特に有利にアミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０１又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０２が有利である。このようなフラグメントは、例えばＬ．  ｒｅｕｔｅｒｉから又は任意の他の微生物から本発明によるオキシドレダクターゼを見つけ出すために使用することができる。
【００１７】
本発明は、さらに、アミノ酸配列のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８を有するオキシドレダクターゼ又はその５〜３０個のアミノ酸のフラグメントであり、かつこのオキシドレダクターゼ又はそのフラグメントが他のポリペプチドとＮ末端で又はカルボキシ末端でペプチド結合によって結合していることを特徴とする融合タンパク質に関する。この融合タンパク質は、例えば他のタンパク質から容易に分離できるか又は細胞中でより大量に発現できる。
【００１８】
本発明は、さらに、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８によるオキシドレダクターゼに特異的に結合するか又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０１又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０２によるフラグメントに特異的に結合する抗体に関する。この抗体の製造は、公知の方法により、適当な哺乳動物、例えばウマ、マウス、ラット又はブタを免疫化し、引き続きこの抗体を収得することにより行う。この抗体はモノクローナルであるか又はポリクローナルであることができる。
【００１９】
本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０１又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：０２によるオキシドレダクターゼをコードする単離された核酸配列にも関する。
【００２０】
本発明は、さらに、ＮＡＤＰＨ及び水の存在で２−オキソ酸エステルから相応するＳ−２−ヒドロキシ酸エステルへの還元を触媒するオキシドレダクターゼの単離されたデオキシリボ核酸配列（ＤＮＡ配列）に関し、その際、このＤＮＡ配列は次のグループから選択される：
ａ）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９に記載のヌクレオチド配列を有するＤＮＡ−配列又はそれぞれの相補的な鎖
ｂ）  ａ）に記載の１種又は数種のＤＮＡ配列又はその相補的な鎖とハイブリダイゼーションするＤＮＡ配列、その際、このハイブリダイゼーションはストリンジェントな条件下で行う、及び
ｃ）  遺伝コードの変性に基づいて、ａ）又はｂ）に記載の１種又は数種のＤＮＡ配列によりコードされている一つのタンパク質をコードするＤＮＡ配列。
【００２１】
このハイブリダイゼーションは、例えばＳａｍｂｒｏｋ及びＲｕｓｓｅｌ著、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第１巻、第１章、プロトコル３０−３２に記載されている。
【００２２】
本発明は、さらに、核酸塩基の７０％より多くがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９に記載されたＤＮＡ配列又はその相補的な鎖と一致し、かつエチル−２−オキソ−４−フェニル−ブチレートからＳ−エチル−２−ヒドロキシ−４−フェニルブチレートへの反応に関して、１ｍｇあたり１μｍｏｌより大きい比活性を有するタンパク質をコードすることを特徴とする、単離されたＤＮＡ配列に関する。核酸塩基の８０％〜９９．５％、特に９０％〜９９．５％、有利に９９％〜９９．５％がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９に記載のＤＮＡ配列と一致しているＤＮＡ配列が有利である。
【００２３】
本発明は、さらに、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９のＤＮＡ配列又はその相補的な鎖の一部と一致する配列を有する、１０〜５０個の核酸塩基を有する単離されたＤＮＡに関する。１５〜４５個の核酸塩基、特に２０〜４０個の核酸塩基、特に有利に３０〜４０個の核酸塩基を有する核酸配列が有利である。これらの前記した核酸配列は、ポリメラーゼ連鎖増幅反応（ＰＣＲ）用の分子プローブとしても又はプライマーとしても適している。
【００２４】
本発明は、さらに、前記した１種又は数種の核酸配列又はＤＮＡ配列を含有するクローニングベクターに関する。本発明は、さらに、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞又は哺乳動物細胞中に存在し、かつ前記した１種又は数種の核酸配列又はＤＮＡ配列を含有し、かつ適当な方法で発現コントロール配列と結合している発現ベクターに関する。
【００２５】
本発明は、さらに、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞又は哺乳動物細胞でありかつ前記した発現ベクターで形質転換されているか又はトランスフェクションされている宿主細胞に関する。
【００２６】
前記のＤＮＡ配列又はアミノ酸配列の同一性は、それぞれのタンパク質又はＤＮＡ配列の部分配列と一致するアミノ酸又は核酸塩基の数を合計し、アミノ酸又は核酸塩基の総数で割り、１００を掛けることにより計算される。
【００２７】
適当なクローニングベクターは、例えばｐｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ，  ｐＣＭＶ−Ｓｃｒｉｐｔ，  ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ），  ｐＤｒｉｖｅ  ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒ  （Ｑｕｉａｇｅｎ），  ｐＳ  Ｂｌｕｅ，  ｐＥＴ  Ｂｌｕｅ，  ｐＥＴ  ＬＩＣ−ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）ならびにＴＡ−ＰＣＲクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｅ）である。
【００２８】
適当な発現ベクターは、例えばｐＫＫ２２３−３，  ｐＴｒｃ９９ａ，  ｐＵＣ，  ｐＴＺ，  ｐＳＫ，  ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ，  ｐＧＥＭ，  ｐＱＥ，  ｐＥＴ，  ＰＨＵＢ，  ｐＰＬｃ，  ｐＫＣ３０，  ｐＲＭ１／ｐＲＭ９，  ｐＴｒｘＦｕｓ，  ｐＡＳ１，  ｐＧＥｘ，  ｐＭＡＬ，  ｐＴｒｘである。
【００２９】
適当な発現コントロール配列は、例えばｔｒｐ−ｌａｃ（ｔａｃ）−プロモーター、ｔｒｐ−ｌａｃ（ｔｒｃ）−プロモーター、ｌａｃ−プロモーター、Ｔ７−プロモーター、λｐＬ−プロモーターである。
【００３０】
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉからのオキシドレダクターゼは、ＳＤＳゲル中で測定した分子量３０〜３５ｋＤａ及びゲル透過クロマトグラフィーで測定した分子量６０〜６５ｋＤａを有するホモダイマーである。この最適温度は５５℃〜６０℃の範囲内にあり、最適ｐＨは６．５〜７．０である。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉからのこのオキシドレダクターゼは、良好な温度安定性及びｐＨ安定性を示し、４．５〜８．５のｐＨ領域でかつ１５℃〜５０℃の温度範囲で少なくとも５時間安定であり、さらに有機溶剤中で高い安定性を示す。
【００３１】
この酵素は、特にＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属の微生物から単離可能であり、分光光度試験でＮＡＤＰＨの減少に関して３４０ｎｍで相応する基質、例えばエチル−２−オキソ−４−フェニル酪酸又はエチル−２−オキソ吉草酸の存在で検出することができる。
【００３２】
本発明によるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉからのオキシドレダクターゼはクローニングされ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  （Ｅ．）  ｃｏｌｉ中で１００００Ｕ／ｇ〜３００００Ｕ／ｇ  Ｅ．  ｃｏｌｉ湿潤重量の活性で過剰発現することができる。この酵素は、従って安価であり、大量に供給可能である。データバンクには、類縁する配列は見られず、ヒドロキシアシル−ＣｏＡ−デヒドロゲナーゼのグループとの酵素との遠い類縁関係が想定できるにすぎなかった。
【００３３】
この発明は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉからオキシドレダクターゼを収得する方法にも関する。このために、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉからのオキシドレダクターゼをコードするＤＮＡを適当な原核生物又は真核生物中で発現させる。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉからのオキシドレダクターゼをＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ株中に形質転換し、特にＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１ｓｔａｒ  （ＤＥ３）細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  ｃａｔ  Ｎｏ．Ｃ６０１０−０３、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１から誘導され、ｌａｃＵＶ５−プロモーターの制御下でのＴ７  ＲＮＡ−ポリメラーゼ遺伝子の染色体のコピーを有し、ｏｍｐＴ及びＬｏｎ−プロテアーゼを有していない、Ｂｌ２１  ｓｔａｒはＲＮａｓｅＥ（ｒｎｅ１３１）中で突然変異を有する）中に形質転換し、発現させるのが有利である。
【００３４】
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉからのこのオキシドレダクターゼは、例えばこの組み換えＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ細胞を培養し、オキシドレダクターゼの発現を誘導し、引き続き１０〜１８時間（ｈ）後にこの細胞を超音波処理又はボールミル（Ｒｅｔｓｃｈ，  １０  ｍｉｎ，  ２４  Ｈｚ）中でのガラスビーズを用いる湿式粉砕により破壊することにより得られる。得られた細胞抽出物は直接使用できるか又はさらに精製される。このために、細胞抽出物は例えば遠心分離し、得られた上澄みを疎水性の相互作用クロマトグラフィー、例えばブチルセファロース（Ｂｕｔｙｌｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ  （Ｐｈａｒｍａｃｉａ））の疎水性の相互作用クロマトグラフィーにかけ、引き続きゲル浸透（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ＨＲ，  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にかける。
【００３５】
本発明は、さらに、２−オキソ酸エステルをオキシドレダクターゼ、ＮＡＤＰＨ及び水の存在で相応するＳ−２−ヒドロキシ酸エステルに還元し、生成された２−オキソ酸エステルを単離することを特徴とする、Ｓ−２−ヒドロキシ酸エステルをエナンチオ選択的に収得する方法に関する。
【００３６】
本発明による方法は、高い可使時間を示し、製造したキラルのＳ−２−ヒドロキシ酸エステルの９４％より高いエナンチオマー純度を示し、かつ２−オキソ酸エステルの使用量に対して高い収率を示す。
【００３７】
「ＮＡＤＰＨ」の概念は、還元されたニコチンアミド−アデニン−ジヌクレオチド−ホスフェートであると解釈される。「ＮＡＤＰ」の概念は、ニコチンアミド−アデニン−ジヌクレオチド−ホスフェートであると解釈される。
【００３８】
「２−オキソ酸エステル」の概念は例えば次の式Ｉの化合物
Ｒ２−Ｃ（Ｏ）−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｒ１    （Ｉ）
であると解釈される。
【００３９】
Ｒ１は次のものを表す
１．  −（Ｃ1〜Ｃ20）−アルキル、その際、アルキルは直鎖又は分枝鎖である、
２．  −（Ｃ2〜Ｃ20）−アルケニル、その際、アルケニルは直鎖又は分枝鎖であり、鎖長に応じて１個、２個、３個又は４個の二重結合を有する、
３．−（Ｃ2〜Ｃ20）−アルキニル、その際、アルキニルは直鎖又は分枝鎖であ    り、場合により１個、２個、３個又は４個の三重結合を有する、
４．  −（Ｃ6〜Ｃ14）−アリール、
５．  −（Ｃ1〜Ｃ8）−アルキル−（Ｃ6〜Ｃ14）−アリール、
６．  −（Ｃ5〜Ｃ14）−複素環式基、これは非置換であるか又は１〜３個のハロゲン、ヒドロキシ、アミノ又はニトロによる置換基を有するか、又は
７．  −（Ｃ3〜Ｃ7）−シクロアルキル、
Ｒ２次のものを表す
１．  −（Ｃ1〜Ｃ20）−アルキル、その際、アルキルは直鎖又は分枝鎖である、
２．  −（Ｃ2〜Ｃ20）−アルケニル、その際、アルケニルは直鎖又は分枝鎖であり、鎖長に応じて１個、２個、３個又は４個の二重結合を有する、
３．  −（Ｃ2〜Ｃ20）−アルキニル、その際、アルキニルは直鎖又は分枝鎖であり、場合により１個、２個、３個又は４個の三重結合を有する、
４．  −（Ｃ6〜Ｃ14）−アリール、
５．  −（Ｃ1〜Ｃ8）−アルキル−（Ｃ6〜Ｃ14）−アリール、
６．  −（Ｃ5〜Ｃ14）−複素環式基、これは非置換であるか又は１〜３個のハロゲン、ヒドロキシル、アミノ又はニトロにより置換されているか、又は
７．  −（Ｃ3〜Ｃ7）−シクロアルキル、
前記式中、１．〜７．に記載した基は非置換であるか又は相互に無関係に次の１個〜３個の置換基により置換されている
ａ）  −ＯＨ、
ｂ）  ハロゲン、例えばフッ素、塩素、臭素又はヨウ素、
ｃ）  −ＮＯ2、
ｄ）  −Ｃ（Ｏ）−Ｏ−（Ｃ1〜Ｃ20）−アルキル、その際、アルキルは直鎖又は分枝鎖であり、かつ非置換であるか又は１〜３個のハロゲン、ヒドロキシル、アミノ又はニトロにより置換されている、又は
ｅ）  −（Ｃ5〜Ｃ14）−複素環式基、これは非置換であるか又は１〜３個のハロゲン、ヒドロキシル、アミノ又はニトロにより置換されている。
【００４０】
「Ｓ−２−ヒドロキシ酸エステル」の概念は、次の式ＩＩ
Ｒ２−Ｃ（ＯＨ）−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｒ１    （ＩＩ）
の化合物であると解釈され、前記式中、−ＯＨ基は炭素原子に対してＳ−配置にあって、この炭素原子と結合していて、Ｒ１及びＲ２は式Ｉと同様の意味を有する。
【００４１】
アリールの概念は、環中で６〜１４個の炭素原子を有する芳香族炭化水素基であると解釈される。−（Ｃ6〜Ｃ14）−アリール基は、例えばフェニル、ナフチル、例えば１−ナフチル、２−ナフチル、ビフェニリル、例えば２−ビフェニリル、３−ビフェニリル及び４−ビフェニリル、アントリル又はフルオレニルである。ビフェニリル基、ナフチル基及び特にフェニル基が有利なアリール基である。「ハロゲン」の概念は、一連のフッ素、塩素、臭素又はヨウ素からの元素であると解釈される。「−（Ｃ1〜Ｃ20）−アルキル」の概念は、炭化水素基であると解釈され、この炭素鎖は直鎖又は分枝鎖であり、１〜２０個の炭素原子を含有し、例えばメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノネニル又はデカニルである。
【００４２】
「−（Ｃ3〜Ｃ7）−シクロアルキル」の概念は、環式炭化水素基、例えばシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル又はシクロヘプチルであると解釈される。
【００４３】
「−（Ｃ5〜Ｃ14）−複素環式基」の概念には、単環式又は二環式の５員〜１４員の複素環であると解釈され、この環は部分的に飽和又は完全に飽和されている。ヘテロ原子の例はＮ、Ｏ及びＳである。−（Ｃ5〜Ｃ14）−複素環式基の概念の例は、ピロール、フラン、チオフェン、イミダゾール、ピラゾール、オキサゾール、イソオキサゾール、チアゾール、イソチアゾール、テトラゾール、１，２，３，５−オキサチアジアゾール−２−オキシド、トリアゾロン、オキサジアゾロン、イソオキサゾロン、オキサジアゾリジンジオン、トリアゾール、（これらはＦ、−ＣＮ、−ＣＦ3又は−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−（Ｃ1〜Ｃ4）−アルキルにより置換されていてもよい）、３−ヒドロキシピロロ−２，４−ジオン、５−オキソ−１，２，４−チアジアゾール、ピリジン、ピラジン、ピリミジン、インドール、イソインドール、インダゾール、フタラジン、キノリン、イソキノリン、キノキサリン、キナゾリン、シンノリン、カルボリン及びベンゾ縮合した、シクロペンタ縮合した、シクロヘキサ縮合した又はシクロヘプタ縮合したこれらの複素環の誘導体から誘導される基である。特に有利な基は、２−又は３−ピロリル、フェニルピロリル、例えば４−又は５−フェニル−２−ピロリル、２−フリル、２−チエニル、４−イミダゾリル、メチル−イミダゾリル、例えば１−メチル−２−、−４−又は−５−イミダゾリル、１，３−チアゾール−２−イル、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２−、３−又は４−ピリジル−Ｎ−オキシド、２−ピラジニル、２−、４−又は５−ピリミジニル、２−、３−又は５−インドリル、置換された２−インドリル、例えば１−メチル−、５−メチル−、５−メトキシ−、５−ベンジルオキシ−、５−クロロ又は４，５−ジメチル−２−インドリル、１−ベンジル−２−又は−３−インドリル、４，５，６，７−テトラヒドロ−２−インドリル、シクロヘプタ［ｂ］−５−ピロリル、２−、３−又は４−キノリル、１−、３−又は４−イソキノリル、１−オキソ−１，２−ジヒドロ−３−イソキノリル、２−キノキサリニル、２−ベンゾフラニル、２−ベンゾチエニル、２−ベンゾオキサゾリル又はベンゾチアゾリル又はジヒドロピリジニル、ピロリジニル、例えば２−又は３−（Ｎ−メチルピロリジニル）、ピペラジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、テトラヒドロチエニル又はベンゾジオキソラニルである。
【００４４】
式Ｉの有利な化合物は、例えばエチル−２−オキソバレリアネート、エチル−２−オキソ−４−フェニルブチレート、エチルピルベート、エチルフェニルグリオキシレート、エチル−２−オキソ−３−フェニルプロピオン酸、エチル−８−クロロ−６−オキソオクタノエート、エチル−２−オキソブチレート、エチル−２−オキソヘキサノエート、メチルフェニルグリオキシレート、メチル−２−オキソバレリアネート、メチルピルベート、メチル−２−オキソ−４−フェニルブチレート、メチル−２−オキソ−３−フェニルプロピオン酸、メチル−８−クロロ−６−オキソ−オクタノエート、メチル−２−オキソブチレート又はメチル−２−オキソ−ヘキサノエートである。
【００４５】
相応して生成されたＳ−２−ヒドロキシ酸エステルは、例えばエチル−Ｓ−ヒドロキシバレリアネート、エチル−Ｓ−２−ヒドロキシ−４−フェニルブチレート、エチル−Ｌ−ラクテート又はエチル−Ｓ−マンデレートである。
【００４６】
適当なオキシドレダクターゼは例えばＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉから由来する。このオキシドレダクターゼは本発明による方法において、完全に精製して使用するか又は部分的に精製して使用するか又は細胞中に内包させて使用することができる。この使用した細胞は、この場合に天然の形で、透過性の形で又は溶菌させて存在することができる。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８に記載のクローニングされたオキシドレダクターゼを使用するのが有利である。
【００４７】
使用したオキシドレダクターゼの体積活性は、２５０ユニット／ｍｌ（Ｕ／ｍｌ）〜２００００Ｕ／ｍｌ、有利に約４０００Ｕ／ｍｌである。式Ｉの反応すべき化合物１ｋｇあたり、５０００から２５００００Ｕ、有利に約１００００Ｕ〜５００００Ｕのオキシドレダクターゼが使用される。酵素単位１Ｕはこの場合に、エチル−２−オキソ−フェニルブチレート１μｍｏｌを１分（ｍｉｎ）あたりＳ−エチル−２−ヒドロキシ−４−フェニルブチレートに変換するのに必要な酵素量に相当する。
【００４８】
本発明は、さらに次の工程を特徴とするＳ−２−ヒドロキシ酸エステルをエナンチオ選択的に収得する方法に関する：
ａ）  ２−オキソ酸エステルをオキシドレダクターゼ、ＮＡＤＰＨ及び水の存在で、相応するＳ−２−ヒドロキシ酸エステルに還元し、
ｂ）  オキシドレダクターゼにより形成されたＮＡＤＰをデヒドロゲナーゼ及び補基質を用いて同時にＮＡＤＰＨに還元し、かつ
ｃ）  形成されたキラルのＳ−２−ヒドロキシ酸エステルを単離する。
【００４９】
適当なデヒドロゲナーゼは例えばＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂｉｕｍ  ｂｒｏｃｋｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒ又はＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓからのアルコール−デヒドロゲナーゼであり、この場合にこのれらの酵素は補酵素としてＮＡＤＰＨを必要とする（ＤＥ  １９  ６１０  ９８４，  ＥＰ  ０  ４５６  １０７，  ＷＯ  ９７／３２０１２）。
【００５０】
使用したアルコール−デヒドロゲナーゼにとって適当な補基質は、アルコール、例えばエタノール、２−プロパノール（イソプロパノール）、２−ブタノール、２−ペンタノール又は２−オクタノールである。
【００５１】
さらに、ＮＡＤＰ−還元は公知のＮＡＤＰＨの再生のために使用する公知の酵素、例えばグルコース−デヒドロゲナーゼ又はＮＡＤＰＨ依存性ホルメート−デヒドロゲナーゼを用いても実施できる（Ｔｉｓｈｋｏｖら．著，  Ｊ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｅｎｇ．  ［１９９９］  ６４，  １８７−１９３，  Ｐｉｌｏｔ−ｓｃａｌｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＮＡＤ  ａｎｄ  ＮＡＤＰ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆｏｒｍａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）。
【００５２】
本発明による方法にとって適当な補基質は、グルコース−デヒドロゲナーゼの場合にグルコースである。ホルメート−デヒドロゲナーゼの適当な補基質は、例えばギ酸の塩、例えばギ酸アンモニウム、ギ酸ナトリウム又はギ酸カルシウムである。
【００５３】
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｉｎｏｒ  （ＤＥ  １０１  １９２７４）からのアルコール−デヒドロゲナーゼを使用するのが有利である。このアルコール−デヒドロゲナーゼは、本発明による方法の場合に、完全に精製してか又は部分的に精製して使用することができるか、又はアルコール−デヒドロゲナーゼを含有する全細胞を使用することができる。この使用した細胞は、この場合に天然の形で、透過性の形で又は溶菌させて存在することができる。使用すべき式Ｉの化合物１ｋｇ当たり、アルコール−デヒドロゲナーゼ１００００Ｕ〜２０００００Ｕ、有利に約２５０００Ｕ〜１０００００Ｕが使用される。酵素単位１Ｕは、この場合、補基質（例えば２−プロパノール）１μｍｏｌを１分（ｍｉｎ）あたり反応させるために必要な酵素量である。
【００５４】
この水に、緩衝剤、例えばリン酸カリウム緩衝剤、トリス／ＨＣｌ緩衝剤、トリエタノールアミン緩衝剤を、ｐＨ値５〜１０、有利にｐＨ値６〜９で添加するのが有利である。この緩衝剤濃度は１０ｍＭ〜１５０ｍＭ、有利に９０ｍＭ〜１１０ｍＭ、特に１００ｍＭである。この緩衝剤は、さらになお両方の酵素の安定化又は活性化のためにイオンを含有することができ、例えばＬａｃｔｏｂａｉｌｌｕｓ  ｍｉｎｏｒからのアルコール−デヒドロゲナーゼの安定化のためにマグネシウムイオンを含有することができる。
【００５５】
この温度は、本発明による方法の場合に、例えば約１０℃〜６０℃、有利に３０℃〜５５℃である。
【００５６】
本発明は、さらに次の工程を特徴とするＳ−２−ヒドロキシ酸エステルをエナンチオ選択的に収得する方法に関する：
ａ）  ２−オキソ酸エステルをオキシドレダクターゼ、ＮＡＤＰＨ及び水の存在で、相応するＳ−２−ヒドロキシ酸エステルに還元し、
ｂ）  オキシドレダクターゼにより形成されたＮＡＤＰをデヒドロゲナーゼ及び補基質を用いて同時にＮＡＤＰＨに還元し、かつ
ｃ）  この反応を有機溶剤の存在で実施し、かつ
ｄ）  形成されたキラルのＳ−２−ヒドロキシ酸エステルを単離する。
【００５７】
有利な有機溶剤は、例えばジエチルエーテル、ｔ−ブチルメチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジブチルエーテル、酢酸ブチル、ヘプタン、ヘキサン又はシクロヘキサンである。
【００５８】
この反応バッチは、付加的に溶剤を使用する際には、水相又は有機相からなる。この有機相は、基質が溶解して存在している適当な溶剤により形成されるか、又は非水溶性の基質自体によって形成される。この有機相は、この場合に、全体の反応物の体積の約５％〜８０％、有利に１０％〜４０％である。
【００５９】
この水は、第１の液相と有機溶剤とからなる本発明による二相系において、第２の液相を形成する。場合により、なお固相又は他の液相が存在することもでき、これは例えば完全に溶解しないオキシドレダクターゼ及び／又はアルコール−デヒドロゲナーゼによるか又は式Ｉの化合物により形成される。しかしながら第２の液相は固相を有していないのが有利である。この第２の液相は、有利に機械的に混合され、それによりこの２つの液相の間には大きな表面積が形成される。
【００６０】
補因子のＮＡＤＰＨの水相に対する濃度は、０．００１ｍＭ〜０．１ｍＭ、特に０．００５ｍＭ〜０．０２ｍＭである。
【００６１】
本発明による方法の場合に、アルコール−デヒドロゲナーゼの他の安定剤を使用するのも有利である。適当な安定剤は、例えばグリセリン、ソルビトール又はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）である。
【００６２】
式Ｉの化合物は、本発明による方法の場合に、全体の体積に対して１０％〜６０％の量で、有利に１５％〜５０％、特に２０％〜４０％の量で使用される。
【００６３】
ＮＡＤＰからＮＡＤＰＨへの再生のための補基質、例えばイソプロパノールの量は、全体の体積に対して約５％〜５０％、有利に１０％〜３０％、特に有利に１５％〜２５％である。
【００６４】
本発明による方法は、例えばガラス製又は金属製の密閉した反応容器中で実施される。このために、これらの成分は別個に反応容器内へ導入され、例えば窒素又は空気の雰囲気下で撹拌が行われる。基質及び使用した式Ｉの化合物に応じて、反応時間は１時間〜４８時間、特に２時間〜２４時間である。
【００６５】
引き続き、この反応混合物を後処理する。このために、水相を分離し、有機相を濾過する。この水相を場合によりなお１回抽出し、同様に有機相をさらに後処理する。その後、場合により溶剤を透明な有機相から蒸発させる。このようにして例えば生成物のＳ−エチル−２−ヒドロキシ−４−フェニルブチレートが、９４％より高いエナンチオマー純度で得られ、主に出発物質のエチル−２−オキソ−４−フェニルブチレートは不含であった。生成物の全収率は、生成物の蒸留後に、使用した出発物質の量に対して５０％〜９５％であった。
【実施例】
【００６６】
本発明を次の実施例によって詳説する。
【００６７】
実施例１：  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属の株中の２−オキソ酸エステルを還元するオキシドレダクターゼのスクリーニング
スクリーニングのために、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属の多様な株を次の培地（数値はそれぞれｇ／ｌ）：グルコース（２０）、酵母抽出物（５）、肉抽出物（１０）、クエン酸水素二アンモニウム（２）、酢酸ナトリウム（５）、硫酸マグネシウム（０．２）、硫酸マンガン（０．０５）、リン酸水素二カリウム（２）中で培養した。この培地を１２１℃で滅菌し、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属の株（以後、Ｌ．と省略する）をさらにｐＨ調整又は酸素供給せずに培養した。
【００６８】
引き続き細胞１２５ｍｇを溶解緩衝液（１００ｍＭトリエタノールアミン（ＴＥＡ）、ｐＨ７．０）８００μｌで再懸濁させ、ガラスパール１ｇと混合し、４℃で１０分間ボールミル中で溶解させた（Ｒｅｔｓｃｈ）。１分当たり１２０００回の回転数（ｒｐｍ）で２分（ｍｉｎ）間遠心分離した後に得られた上澄液を、活性スクリーニング及びエナンチオマー過剰率の測定のために使用した。基質としてエチル−２−オキソペンタノエート及びエチル−２−オキソ−４−フェニルブチレートを使用した。
【００６９】
活性スクリーニングのためのバッチ：
８６０μｌ      ０．１Ｍ  ＫＨ2ＰＯ4／Ｋ2ＰＯ4  ｐＨ＝７．０  １ｍＭ  ＭｇＣｌ2
２０μｌ      ＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＨ（１０ｍＭ）
２０μｌ      溶解産物
１００μｌ      基質（１００ｍＭ）
この反応を１分間３４０ｎｍで行った。
【００７０】
ｅｅ値の測定のためのバッチ：
２０μｌ      溶解産物
１００μｌ      ＮＡＤＨ／ＮＡＤＰＨ（５０ｍＭ）
６０μｌ      基質（エチル−２−オキソ−４−フェニルブチレート  １００ｍＭ）
ｅｅ値の測定のためのバッチを２４時間（ｈ）後にクロロホルムで抽出し、ＧＣを用いてエナンチオマー過剰率を分析した。
【００７１】
エナンチオマー過剰率は次のように計算した：
ｅｅ（％）＝（（Ｒ−アルコール  −  Ｓ−アルコール）／（Ｒ−アルコール  ＋  Ｓ−アルコール））×１００
【００７２】
【表１】
2004215666.tif 000002
ＤＳＭＺは、Ｄｅｕｔｓｃｈｅｎ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｆｕｅｒ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ，  Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ  Ｗｅｇ  １ｂ，  ３８１２４  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇを表す。
【００７３】
表１からは、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属中の複数の種が、エチル−２−オキソ−４−フェニルブチレート又はエチル−２−オキソペンタノエートを基質とするＮＡＤＰＨ依存性のオキシドレダクターゼを有することが明らかである。
【００７４】
酵素単位の定義：１Ｕは、１分あたり基質１μｍｏｌを変換するのに必要な酵素量に相当する。
【００７５】
実施例２：  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉからのＮＡＤＰＨ依存性オキシドレダクターゼの単離
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉからＮＡＤＰＨ依存性のオキシドレダクターゼを単離するために、実施例１に記載したようにこの微生物を培養した。定常期に達した後に、これらの細胞を収穫し、遠心分離によって培地から分離した。酵素放出は、ガラスパールを用いた湿式粉砕によって行ったが、他の溶解法により達成することもできた。このために、Ｌ．  ｒｕｔｅｒｉ  ２０ｇを分解緩衝液８０ｍｌ（トリエタノールアミン１００ｍＭ、ＭｇＣｌ2  １ｍＭ、ｐＨ＝７．０）で懸濁し、ガラスパール８０ｍｌを添加した後に、ボールミル（Ｒｅｔｓｃｈ、１０分、２４Ｈｚ）を用いて細胞溶解を行った。
【００７６】
遠心分離により得られた粗製抽出物を、次いで（ＮＨ4）2ＳＯ4  ２４２ｍｇの添加により５０％の硫酸アンモニウムの最終濃度に調節し、４℃で１ｈ撹拌した。引き続き、このペレットを１２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離により除去し、得られた上澄みをＦＰＬＣを用いてさらに精製した。この酵素を、Ｂｕｔｙｌｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）による疎水性相互作用クロマトグラフィーを用いて、引き続きゲル濾過（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ＨＲ，  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて精製した。このために、この上澄みをアンモニウムスルフェート沈殿の後に、ＴＥＡ１００ｍＭ、ｐＨ＝７．０及び（ＮＨ4）2ＳＯ4  １Ｍで平衡化したＢｕｔｙｌｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦカラム上に直接載せ、直線的に降下する塩勾配液で溶離した。この場合に、この酵素は（ＮＨ4）2ＳＯ4  ０Ｍで溶離した。この活性フラクションを合わせ、限外濾過（除外度１０ｋＤａ）を用いて適当な体積にまで濃縮した。このオキシドレダクターゼの酵素活性は実施例１に記載されたテストシステム（活性スクリーニングのためのバッチ）で測定し、タンパク質量の測定はＬｏｗｒｙら著，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  １９３  （１９５１）：  ２６５−２７５又はＰｅｔｅｒｓｏｎら著，  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  １００  （１９７９）：  ２０１−２２０）に従って行った。酵素活性とタンパク質量との商は比活性を表し、この場合に、１分あたり１μｍｏｌの反応は１ユニット（Ｕ）に相当する。
【００７７】
引き続きこの粗製酵素試料を、ゲル濾過（ＴＥＡ  １００ｍＭ、ｐＨ＝７．０、ＮａＣｌ  ０．１５Ｍ、ＭｇＣｌ2  １ｍＭ）でさらに精製し、同時にこの天然の酵素の分子量を測定した。分子量標準としてカタラーゼ（２３２ｋＤａ）、アルドース（１５８ｋＤａ）、アルブミン（６９．８ｋＤａ）及びオバルブミン（４９．４ｋＤａ）を使用した。
精製リスト
【００７８】
【表２】
2004215666.tif 000003
天然の状態でのこのタンパク質のゲル濾過を用いて測定した分子量は６０±５ｋＤａであった。
【００７９】
実施例３：  Ｎ末端配列の測定及びインゲル消化後の内部ペプチドの測定
この酵素試料を、１０％のナトリウムドデシルスルフェート（ＳＤＳ）ゲル中でのゲル濾過により分離し、ポリビニリデン−ジフルオリド−膜（ＰＶＤＦ−膜）上に移した。
【００８０】
約３０〜３５ｋＤａでの目立ったバンドを、エドマン分解によるＮ末端配列決定にかけた。次のＮ末端配列が得られた：
【００８１】
【数１】
2004215666.tif 000004
７つのタンパク質のこのＳＤＳ−ＰＡＧＥ−バンドをジチオトレイトールで還元し、カルボキシメチル化し、エンドプロテアーゼ  Ｌｙｓ−Ｃで消化した。得られたペプチドを３００μｍ×１５０ｍｍのキャピラリーＨＰＬＣ−カラム（Ｖｙｄａｃ  ＲＰ１８，  ＬＣ  Ｐａｃｋｉｎｇｓ）によって分離した。２５のフラクションを手動で捕集し、ＭＡＬＤＩ  ＭＳ（Ｖｏｙａｇｅｒ−ＤＥ  ＳＴＲ  （ＰＥ−Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））を用いて配列決定のために適したペプチドを調査した。ＭＨ＋＝１４９１．８を示すフラクション１２を、自動エドマン分解により配列決定し、次の配列が提供された：
【００８２】
【数２】
2004215666.tif 000005
実施例４：  酵素のクローニング
４．１  ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を用いたＬ．  ｒｅｕｔｅｒｉの特異的遺伝子フラグメントのクローニング
染色体ＤＮＡをＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉの細胞からＭａｎｎｉａｔｉｓ  ＆  Ｓａｍｂｒｏｏｋ著の "Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ"に記載の方法で抽出した。得られたゲノムＤＮＡを、変性プライマーを用いる直接ポリメラーゼ連鎖反応のための鋳型として使用した。この場合に、この変性５′−プライマーを、Ｎ末端アミノ酸配列（Ｓｅｑ  Ｎｏ：１）から、及び３′−プライマーを内部に存在するペプチド（Ｓｅｑ  Ｎｏ：２）のアミノ酸配列から、普遍的遺伝子コードと参照しながら誘導した（Ｓｅｑ  Ｎｏ：３，４，５及び６）。プライマー構築物を次に列挙する。
【００８３】
Ｎ＝Ａ、Ｔ、Ｃ又はＧ；Ｙ＝Ｔ又はＣ；Ｒ＝Ａ又はＧ
これらのプライマーは公知の方法により製造した
【００８４】
【数３】
2004215666.tif 000006
この増幅を、ＰＣＲ緩衝液［Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）１０ｍＭ、ＫＣｌ  ５０ｍＭ、ＭｇＣｌ2  ２．５ｍＭ、デオキシヌクレオチドトリホスフェートミックス（ｄＮＴＰ  Ｍｉｘ）  １ｍＭ、それぞれのプライマー３０ｐＭｏｌ及びＡｍｐｌｉＴａｇ  Ｇｏｌｄ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）２．５Ｕ］中で実施した。ＡｍｐｌｉＴａｇ  Ｇｏｌｄポリメラーゼを活性化（１０分、９４℃）し、次に３５サイクルのＰＣＲ（９４℃、６０秒、５３℃、４５秒；７２℃、６０秒）の後に、この反応物を４℃に冷却し、全ＰＣＲバッチを１％アガロースゲル上に分析のために載せた。
【００８５】
４．２  ＰＣＲ増幅産物のサブクローニング
２００ｂｐで同定された、Ｌ．  ｒｕｔｅｒｉ（Ｓ）−ＡＤＨ遺伝子の特異的断片を、ゲル精製（Ｑｉａｅｘ  Ａｇａｒｏｓｅ  ｅｘｔｒａｋｔｉｏｎ  ｋｉｔ）の後にＴＡ−クローニングベクターｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，ドイツ国）内にリゲーションした。リゲーションバッチ２μｌをＥ．  ｃｏｌｉ  Ｔｏｐ  １０Ｆ´細胞内に形質転換した後に、生じたクローンのＤＮＡを組み込まれた２００ｂｐＰＣＲフラグメントを有するプラスミドｐＣＲ２．１の存在に関してスクリーニングした。このためにＥｃｏ  ＲＩエンドヌクレアーゼを用いて制限分析を実施した。引き続き陽性のクローンを次のプライマー：
【００８６】
【数４】
2004215666.tif 000007
でＡＢＩ  ＤＮＡシークエンサーを用いて配列決定した。
【００８７】
１５９ｂｐの長さの遺伝子フラグメント（Ｓｅｑ．  Ｎｏ：７）の配列分析は、５３のアミノ酸のオープンリードフレームを示し、その中にＮ末端及び内部ペプチドの２つの配列フラグメントがさらに見られた。
【００８８】
４．３  Ｌ．  ｒｅｕｔｅｒｉ（Ｓ）−ＡＤＨをコードする完全な遺伝子セグメントのクローニング
実施例４．２からの１５９ｂｐの長さの遺伝子フラグメントのヌクレオチド配列に基づいて、インバースポリメラーゼ連鎖反応（ｉＰＣＲ）のための特別なプライマーペアを次のネスト−ＰＣＲを用いて構築した（Ｓｅｑ．  Ｎｏ：８、９、１０及び１１）。この場合に、プライマー８及び９は、見出された遺伝子配列の３′末端と相補的であり、及びプライマー１０及び１１は５′末端の付近の領域と相補的である。
【００８９】
【数５】
2004215666.tif 000008
Ｌ．  ｒｕｔｅｒｉの細胞からの染色体ＤＮＡを、Ｅｃｏ  ＲＩエンドヌクレアーゼで消化し、Ｔ４リガーゼで再リゲーションした。得られた環状の染色体ＤＮＡフラグメントはｉＰＣＲ用の鋳型として使用した。ポリメラーゼ連鎖反応の次の増幅サイクルを、ＰＣＲ緩衝液（実施例２参照）、ＭｇＣｌ2  １ｍＭ中で、プライマー８及び１０それぞれ３０μＭｏｌ、鋳型としての再リゲーション産物２５ｎｇ及びＰｍｐｌｉＴａｇＧｏｌｄＤＮＡポリメラーゼ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）２．５Ｕを用いて実施した。
サイクル１：  ９４℃、１０分
サイクル２×３０：  ９４℃、１分
５７℃、４５秒
７２℃、１分
サイクル３：  ７２℃、７分
４℃、∞
このＰＣＲシグナルを引き続きネストＰＣＲによって増強した。最適なＭｇＣｌ2濃度はこの反応中で２ｍＭであり及び鋳型としての最初のｉＰＣＲの２μｌを使用した。勾配ＰＣＲにより、プライマーペアの９及び１１についての最適温度が５７℃で測定された。次の増幅サイクルは、１２００ｂｐの長さの特異的なＰＣＲ産物を検出するためにＡｍｐｌｉＴａｇ  Ｇｏｌｄ  ＤＮＡポリメラーゼを用いることが必要であった。
サイクル１：  ９５℃、１０分
サイクル２×４０：９５℃、４５秒
５７℃、１分
７２℃、９０秒
サイクル３：  ７２℃、７分
４℃、∞
１２００ｂｐの長さを有する特異的なバンドは、１％アガロースゲル上でＱｉａｅｘ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｋｔｉｏｎｓｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎｅ，  Ｈｉｌｄｅｎ，ドイツ国）を用いて精製し、ＴＡ−ＰＣＲ−クローニングベクターｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いるリゲーション反応においてこれを使用した。
【００９０】
リゲーションバッチ２μｌをＥ．  ｃｏｌｉ  Ｔｏｐ  １０Ｆ´細胞内に形質転換した後に、生じたアンピシリン耐性のクローンのプラスミドＤＮＡを、組み込まれた２００ｂｐＰＣＲフラグメントを有するプラスミドｐＣＲ２．１の存在に関してスクリーニングした。このためにＥｃｏ  ＲＩエンドヌクレアーゼを用いて制限分析を実施した。引き続き陽性のクローンをプライマーＭ１３  ｒｅｖ及びＭ１３  ｕｎｉを用いて４．２に記載されたと同様に配列決定した。
【００９１】
１２４１ｂｐの長さのＤＮＡフラグメント（Ｓｅｑ  Ｎｏ：１２）の配列分析は、５′末端の領域内で１４８のアミノ酸のオープンリードフレームを示した。最初の１５のＮ末端アミノ酸の配列は、４．２からのＳｅｑ  Ｎｏ：７のＣ末端アミノ酸配列に一致していた。１２４１ｂｐの長さのＤＮＡ断片のＣ末端配列の分析は、Ｌ．  ｒｕｔｅｒｉの（Ｓ）−ＡＤＨ遺伝子のＮ末端に存在する調節ＤＮＡセグメントを示した。
【００９２】
Ｎ末端領域（４４７ｂｐ）がＬ．  ｒｕｔｅｒｉからのオキシドレダクターゼの他の遺伝子断片であるこの１２４１ｂｐの長さのＤＮＡフラグメントの配列に基づき、他のインバースポリメラーゼ連鎖反応（ｉＰＣＲ）のための特異的プライマーを次のネストＰＣＲを用いて構築した（Ｓｅｑ  ＮＯ：１３及び１４）。プライマー１３及び１４は見出された遺伝子フラグメントの３′延長部に対して相補的である。
【００９３】
【数６】
2004215666.tif 000009
Ｌ．  ｒｕｔｅｒｉの細胞からの染色体ＤＮＡを、Ａｆｌ  ＩＩＩエンドヌクレアーゼで消化し、Ｔ４リガーゼで再リゲーションした。得られた環状の染色体ＤＮＡフラグメントはｉＰＣＲ用の鋳型として使用した。ポリメラーゼ連鎖反応の次の増幅サイクルを、ＰＣＲ緩衝液（実施例４．１参照）、ＭｇＣｌ2  １ｍＭ中で、プライマー７ａ／９ａそれぞれ３０μＭｏｌ、鋳型としての再リゲーション産物２５ｎｇ及びＰｍｐｌｉＴａｇＧｏｌｄＤＮＡポリメラーゼ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）２．５Ｕを用いて実施した。
サイクル１：  ９４℃、１０分
サイクル２×３０：  ９５℃、１分
５６℃、４５秒
７２℃、１：４５分
サイクル３：  ７２℃、７分
４℃、∞
このＰＣＲシグナルを引き続きネストＰＣＲによって増強した。最適なＭｇＣｌ2濃度はこの反応中２ｍＭであり、最初のｉＰＣＲ  ２μｌをネストＰＣＲの鋳型として使用した。次の増幅サイクルは、９５０ｂｐの長さの特異的なＰＣＲ産物を検出するためにＡｍｐｌｉＴａｇ  Ｇｏｌｄ  ＤＮＡポリメラーゼを用いることが必要であった。
サイクル１：  ９４℃、１０分
サイクル２×４０：９４℃、４５秒
５６℃、１分
７２℃、１：４５分
サイクル３：  ７２℃、７分
４℃、∞
９５０ｂｐの長さを有する特異的なバンドは、１％アガロースゲル上でＱｉａｅｘ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｋｔｉｏｎｓｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎｅ）を用いて精製し、ＴＡ−ＰＣＲ−クローニングベクターｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いるリゲーション反応においてこれを使用した。
【００９４】
リゲーションバッチ２μｌをＥ．  ｃｏｌｉ  Ｔｏｐ  １０Ｆ´細胞内に形質転換した後に、生じたアンピシリン耐性のクローンのプラスミドＤＮＡを、組み込まれた９５０ｂｐＰＣＲフラグメントを有するプラスミドｐＣＲ２．１の存在に関してスクリーニングした。このために、Ｅｃｏ  ＲＩエンドヌクレアーゼを用いる制限分析を実施した。引き続き陽性のクローンをプライマーＭ１３  ｒｅｖ及びＭ１３  ｕｎｉを用いて例４．２に記載されたと同様に配列決定した。
【００９５】
このｐＣＲ２．１ベクター内にインサートされたＤＮＡフラグメントは８２２ｂｐの長さであり、かつＮ末端に１２６のアミノ酸のオープンリードフレームを有し、これは停止コドン及び終止ループで終わっている（Ｓｅｑ  Ｎｏ：１５）。１２のアミノ酸の５′ペプチドは、Ｓｅｑ  ＮＯ：１２のＣ末端と一致した。従ってｉＰＣＲにより精製された８２２ｂｐのＤＮＡフラグメントはＬ．  ｒｅｕｔｅｒｉのオキシドレダクターゼをコードする遺伝子セグメントのＣ末端を有していた。
【００９６】
４．４  ＰＣＲを用いてＬ．  ｒｅｕｔｅｒｉからのオキシドレダクターゼの完全な遺伝子の合成
Ｓｅｑ  Ｎｏ：７及びＮｏ：１５をベースとして、完全な長さの−遺伝子を適当な発現システム内へ引き続きクローニングするための特異的なプライマーを構築した。この場合に、５′プライマーをＮｄｅ  Ｉに対する認識配列で修飾し、３′プライマーをＨｉｎｄ  ＩＩＩに対する認識配列で修飾した（Ｓｅｑ  Ｎｏ：１６；Ｓｅｑ  Ｎｏ：１７）。
【００９７】
【数７】
2004215666.tif 000010
Ｌ．  ｒｅｕｔｅｒｉの細胞からのゲノムＤＮＡは、ポリメラーゼ連鎖反応のための鋳型として利用した。ＰＣＲ緩衝液［Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  １０ｍＭ；（ｐＨ  ８．０）、ＫＣｌ  ５０ｍＭ；ＭｇＳＯ4  １０ｍＭ；ｄＮＴＰ  Ｍｉｘ  １ｍＭ；プライマーそれぞれ３０ｐＭｏｌ及びＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｐｆｘ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｔｒｏｇｅｎ）２．５Ｕ］中で鋳型３００ｎｇを用いて次の温度サイクルで増幅した。
サイクル１：  ９４℃、２分
サイクル２×３０：９４℃、１５秒
５８℃、３０秒
６８℃、７５秒
サイクル３：６８℃、７分
４℃、∞
得られたＰＣＲ産物を、１％アガロースゲルにより精製後に、Ｎｄｅ  Ｉ及びＨｉｎｄ  ＩＩＩで消化し、同じエンドヌクレアーゼで処理したｐＥＴ２１ａベクター（Ｎｏｖｏｇｅｎｅ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＵＳＡ）のバックボーン中へリゲーションした。リゲーションバッチ２μｌをＥ．  ｃｏｌｉ  Ｔｏｐ  １０Ｆ´細胞中へ形質転換した後に、プラスミド−ＤＮＡのアンピシリン耐性クローンをエンドヌクレアーゼＮｄｅ  Ｉ及びＨｉｎｄ  ＩＩＩを用いる制限分析によって行われたリゲーションが正しいかについて調査した。この発現構築物ｐＥＴ２１−ｒｅｕｔ＃１０を配列決定した。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉからのこのオキシドレダクターゼは全部で８８２ｂｐのオープンリードフレーム（Ｓｅｑ  Ｎｏ：１９）を有し、これは２９４のアミノ酸のタンパク質に対応していた（Ｓｅｑ  Ｎｏ：１８）。
【００９８】
４．５  Ｅ．  ｃｏｌｉ中での組み換え（Ｓ）−ＡＤＨの産生
コンピテントＥｓｃｈｅｎｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＳｔａｒＢＬ２１（Ｄｅ３）細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、オキシドレダクターゼ遺伝子を含有する発現構築物ｐＥＴ２１−ｒｅｕｔ＃１０で形質転換した。この株を、５００ｎｍで測定して光学密度０．５が達成されるまで、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を有するＬＢ培地（トリプトン１％、酵母抽出物０．５％、ＮａＣｌ  １％）中で培養した。オキシドレダクターゼの発現を、１ｍＭの最終濃度のイソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）の添加により誘導した。２５℃及び２２０ｒｐｍで８時間誘導した後でこの細胞を収穫し、−２０℃で凍結した。
【００９９】
生化学的に特性決定する次の試験のために、細胞１００ｍｇを溶解緩衝液６００μｌとガラスパール６００μｌと混合し、１０ｍｉｎ間ボールミルで溶解した。得られた溶解産物を、次いで相応する測定のために希釈して使用した。この場合に、この溶解産物は、２０００〜４０００Ｕ／ｍｌのエチル−２−オキソ−４−フェニル−ブチレートの活性を有していた。
【０１００】
この酵素は、つまり１００００Ｕ／ｇ〜３００００Ｕ／ｇ湿潤重量Ｅ．  ｃｏｌｉの活性で発現することができた。従って、この酵素は安価であり、大量に供給することが可能である。
【０１０１】
実施例５：  Ｌ．  ｒｅｕｔｅｒｉからの組み換えオキシドレダクターゼの特性決定
５．１  最適ｐＨ値
次の測定緩衝液は全て５０ｍＭで、ＭｇＣｌ2  １ｍＭを有し、異なるｐＨ値を有する。
【０１０２】
【表３】
2004215666.tif 000011
酵素の希釈は必要に応じて（１：２０）
測定バッチ（３０℃）
８７０μｌ  多様なｐＨを有する測定緩衝液
２０μｌ  ＮＡＤＰＨ  １０ｍＭ（８．６ｍｇ／ｍｌ  Ｈ2Ｏ）
１０μｌ  酵素、希釈した
２〜３分  インキュベーション
＋  １００μｌ  基質溶液（１００ｍＭ  エチル−２−オキソ−４−フェニルブチレート）
最適ｐＨ値の測定のために、酵素反応を表３にそれぞれ記載した緩衝液中で測定した。この場合に、本発明による酵素に対して６．５〜７の最適ｐＨ値が測定された。４．５〜８のｐＨ領域でこの酵素はその最大活性の８０％を示し、４．０より低いか８．５より高いｐＨ値の場合にこの活性は急速に低下する。
【０１０３】
５．２  ｐＨ安定性
多様なｐＨ値を示す緩衝液中で貯蔵した場合の酵素の活性の依存性は、ｐＨ４〜１１の範囲内で試験した。このために、ｐＨ４〜１１の範囲内の多様な緩衝液（５０ｍＭ）を調製し、実施例４で試験した酵素をその中で１：２００に希釈し、３０分、６０分、３００分インキュベーションした。全ての緩衝液はＭｇＣｌ2  １ｍＭを有していた。引き続きその中から１０μｌを標準活性試験で使用した。開始値はこの場合、リン酸カリウム緩衝液５０ｍＭ  ｐＨ＝７．０中に酵素を希釈した直後に得られた測定値である。この値は、所定の条件下で０．７０／分の吸光度変化に相当し、１００％値としてプロットし、以後の全ての測定値をこの値に対する比率でプロットした。
【０１０４】
この場合に、Ｌ．  ｒｅｕｔｅｒｉからの組み換えオキシドレダクターゼが４．５〜８．０のｐＨ領域で少なくとも５時間活性の損失が無くインキュベーションできることが確認された。ｐＨ値４．０及び９．０の場合には５時間後に５０％もしくは４０％の残留活性が確認された。９．５を上回るｐＨ値では酵素は即座に失活した。
【０１０５】
５．３  最適温度
最適な試験温度を決定するために、酵素活性を１５℃〜７０℃の温度範囲で標準測定試験で測定した。表５から明らかなように、酵素は５５℃で最大活性を示し、引き続き活性は急激に低下する。
【０１０６】
【表４】
2004215666.tif 000012
５．４  温度安定性
５．２に記載したと同様の方法で、１５℃〜７０℃の範囲の温度安定性を測定した。このために適当な酵素の１：２００の希釈物を６０分間及び１８０分間それぞれの温度でインキュベーションし、引き続き３０℃で上記の試験バッチを用いて測定した。この場合でも、開始値として、酵素をリン酸カリウム緩衝液５０ｍＭ  ｐＨ＝７．０中に希釈直後に得られた測定値を用いた。この値を１００％値としてプロットした。
【０１０７】
この酵素はこの場合に１５℃〜５０℃の温度範囲で完全に安定性であり、３時間インキュベーションした後で活性損失は示さなかった。５５℃では既に３０分後に酵素活性はもはや検出できなかった。
【０１０８】
５．５  基質スペクトル／エナンチオマー過剰率
本発明によるオキシドレダクターゼの基質スペクトルは、一連のケトン、オキソ酸ならびのそのエステルを用いた酵素活性の測定によって決定した。このために、標準測定バッチ（実施例５．１）を異なる基質を用いて使用した。エチル−２−オキソ−４−フェニルブチレートの活性を１００％にプロットし、他の全ての基質はこれに対する割合でプロットした。この酵素は、（Ｒ）又は（Ｓ）エチル−２−ヒドロキシ−４−フェニルブチレート、（Ｒ）又は（Ｓ）４−クロロ−３−ヒドロキシブチレートもしくは（Ｄ）又は（Ｌ）エチルラクテートに対するＮＡＤＰ依存性のデヒドロゲナーゼ活性を示さなかった。
【０１０９】
ｅｅ値の測定のために、次の反応バッチの選択した基質について実施した。
【０１１０】
１００μｌ      ＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＰＨ（５０ｍＭ）
６０μｌ  基質（１００ｍＭ）
及び１〜２ユニット  オキシドレダクターゼ
ｅｅ値の測定のためのバッチを２４時間後にクロロホルムで抽出し、ＧＣを用いて生じたアルコールのエナンチオマー過剰率を分析した。
【０１１１】
【表５】
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表５から明らかなように、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉからの組み換えオキシドレダクターゼにより、特に２−オキソ酸エステルは位置選択的に相応する２−ヒドロキシ酸エステルに還元される。相応する２−オキソ酸は基質として受け入れられず、同様にメチルケトンもそれほど良好に還元されなかった。３−オキソ酸エステルは部分的に還元されるが、たいていは位置選択的ではない。
【０１１２】
５．６  溶剤安定性
有機溶剤と接触した場合の酵素安定性の試験のために、Ｌ．  ｒｅｕｔｅｒｉからのオキシドレダクターゼを記載した溶剤混合物と１：４００（水と混合可能な有機溶剤の場合）で希釈し、室温でインキュベーションした。引き続き酵素溶液１０μｌを標準試験バッチで使用した。この場合でも、緩衝液（リン酸カリウム緩衝液１００ｍＭ、ｐＨ＝７．０、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2）中に希釈した後の開始値を１００％としてプロットし、その他の全ての値をこれに対する割合でプロットした。水と混合できない有機溶剤の場合には、同様にリン酸カリウム緩衝液中で希釈を行い、同じ体積の有機溶剤をバッチに添加し、このバッチを室温でサーモミキサー中でｒｐｍ＝１７０でインキュベーションした。この活性測定は水相から行った。
【０１１３】
【表６】
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表６から明らかなように、Ｌ．  ｒｅｕｔｅｒｉからのオキシドレダクターゼは、有機溶剤に対して意想外に良好な安定性を示した。さらに、この酵素は、純粋な緩衝液中でのインキュベーションと比較して水と混合可能な有機溶剤でも、水と混合不可能な有機溶剤中でも安定であった。
【０１１４】
５．７  ＮＡＤＰＨ及びエチル−２−オキソペンタノエートに対するＫm及びＶmaxの測定
ＮＡＤＰＨ及びエチル−２−オキソペンタノエートのＫm及びＶmax値の測定のために次のバッチを選択した：
Ａ．  ＮＡＤＰＨは変化／基質濃度は一定
９７０μｌ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ＝７．０）中でのエチル−２−オキソペンタノエート溶液
２０μｌ  ＮＡＤＰＨ（濃度は２００〜５μＭの最終濃度）
１０μｌ  酵素溶液（１：３００）
Ｂ．  基質濃度は変化／ＮＡＤＰＨは一定
９７０μｌ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ＝７．０）中でのエチル−２−オキソペンタノエート溶液
（濃度は１０〜０．１ｍＭ）
２０μｌ  ＮＡＤＰＨ（０．２ｍＭ  最終濃度）
１０μｌ  酵素溶液（１：３００）
【０１１５】
【表７】
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酵素溶液として、組み換えＥ．  ｃｏｌｉ細胞０．１ｇから得られた溶解産物（６００μｌ）を１：３００で希釈して使用した。
【０１１６】
５．８  エチル−２−オキソ−４−フェニルブチレートの予備反応
Ａ．  Ｔｈｅｒｍｏａｎｅｒｏｂｉｕｍ  ｂｒｏｃｋｉｉからの２級アルコール−デヒドロゲナーゼを用いた補酵素再生
予備バッチのために、リン酸カリウム緩衝液４ｍｌ、１００ｍＭ、ｐＨ＝７．０、イソプロパノール２ｍｌ、エチル−２−オキソ−４−フェニルブチレート４ｍｌ、ＮＡＤＰ０．０６４ｍｇ、Ｌ．  ｒｅｕｔｅｒｉからのオキシドレダクターゼ１０００ユニット、及びＡＤＨ  Ｔｈｅｒｍｏａｎｅｒｏｂｉｕｍ  ｂｒｏｃｋｉｉ（Ｆｌｕｋａ，２−プロパノールの酸化に関して約１００Ｕ）１０ｍｇからなる混合物を室温で２４時間強力に撹拌しながらインキュベーションした。２４時間後に基質のエチル−２−オキソ−４−フェニルブチレートが完全にエチル−２−ヒドロキシ−４−フェニルブチレートに反応した。この場合相応するＳ−アルコールが９７％まで生成した。
【０１１７】
Ｂ．  ２級アルコール−デヒドロゲナーゼ（ＫＲＥＤ  １００４，  Ｂｉｏｃａｔａｌｙｔｉｃｓ  Ｉｎｃ，  Ｐａｓａｄｅｎａ）を用いた補酵素再生
予備バッチのために、リン酸カリウム緩衝液４ｍｌ、１００ｍＭ、ｐＨ＝７．０、イソプロパノール２ｍｌ、エチル−２−オキソ−４−フェニルブチレート４ｍｌ、ＮＡＤＰ０．０６４ｍｇ、Ｌ．  ｒｅｕｔｅｒｉからのオキシドレダクターゼ１０００ユニット、及びＫＲＥＤ１００４（Ｂｉｏｃａｔａｌｙｔｉｃｓ  Ｉｎｃ，  Ｐａｓａｄｅｎａ）１ｍｇからなる混合物を室温で２時間強力に撹拌しながらインキュベーションした。２時間後に基質のエチル−２−オキソ−４−フェニルブチレートが完全にエチル−２−ヒドロキシ−４−フェニルブチレートに反応した。この場合相応するＳ−アルコールが９８％まで生成した。