【手続補正書】
【提出日】平成26年7月25日(2014.7.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２５】
実施例1：ESCからの原腸陥入前エピブラスト様細胞（EpiLC）
C57BL／6バックグラウンドで、Blimp1−mVenus and stella−ECFPレポーター（BVSC）（Reproduction 136, 503−514（2008））を有する雄のESCを得、MAPKシグナリング阻害剤（PD0325901、0.4μM）、GSK3阻害剤（CHIR99021、3μM）及びLIF（1000 U／ml）［2i＋LIF］を有するN2B27培地中（~E3.5〜E4.5 ICM／初期エピブラスト様状態（基底状態）にESCを保つ条件（Nature 453, 519−523, doi:nature06968 ［pii］ 10.1038／nature06968（2008）；Development 136, 3215−3222, doi:dev.038893 ［pii］ 10.1242／dev.038893（2009）））で維持した。検証した種々の条件のうち、フィブロネクチンでコートされたディッシュ上、アクチビンA（20 ng／ml）、bFGF（12 ng／ml）及びKnockout（商標）Serum Replacement（KSR）（1％）で刺激することにより、非常にコンパクトなESCコロニーが、エピブラストに類似したより扁平な上皮性構造に、3日にわたって均一に誘導されることを発見した（図1A、B）。刺激すると、細胞は、最初の2日間は比較的急速に増殖したが、その後、かなりの程度の細胞死を起こし、3日目の生存細胞数は2日目のものと類似した（図1C(a)）。3日目の細胞は、より伸長し突起のある形態を示した（図1B）。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２６】
3日の分化期間において、基底状態のESC又は誘導されたエピブラスト様細胞（以下、EpiLCと称する）においてBVSC発現は観察されなかった（図1B）。Prdm14レポーター（Prdm14−mVenus；P14V）（Nat Genet 40, 1016−1022（2008））を有する独立したESC株は、アクチビンA、bFGF及びKSRによる刺激時に類似した分化を示した：Prdm14はESCにで発現したが、EpiLCの誘導とともに急速に減少した（図1B）。キーとなる多能性タンパク質（Oct3／4、Sox2及びNanog）発現（概説についてはDevelopment 136, 2311−2322, doi:136／14／2311 ［pii］10.1242／dev.024398（2009）を参照されたい）の免疫蛍光分析により、EpiLC誘導の間に、Oct3／4は持続して発現したが、Sox2及びNanogは、それぞれ2日目及び1日目に減少したことが示された（図1B）。EpiLCの特性をより正確に検証するために、EpiLCと単離したE5.75エピブラストとの間で、多数のマーカーの発現を定量（Q）−PCRにより比較した。レポーター遺伝子発現及び免疫蛍光分析と十分一致して、EpiLC分化の過程で、Oct3／4は比較的一定のレベルで発現したが、ICM状態とより緊密に関連する遺伝子、例えば、Sox2、Nanog及びPrdm14、並びにZfp42（Rex1）、Tbx3、Tcl1、Esrrb、Klf2、Klf4及びKlf5などは、エピブラストのものと類似のレベルまで下方制御された（図1C(b)）。対照的に、エピブラストで上方制御される遺伝子、例えば、Wnt3、Fgf5及びDnmt3bなどの発現は（Nat Genet 22, 361−365（1999）, Dev Dyn 233, 1064−1075（2005）, Development 112, 397−406（1991）, Development 112, 407−415（1991）, Cell 99, 247−257（1999）, Gene Expr Patterns 9, 27−30, doi:S1567−133X（08）00108−7［pii］10.1016／j.gep.2008.09.002（2009））、実際に上昇した（図1C(b)）。特に、EpiSCとは相違して、Gata4、Gata6、Sox17などの内胚葉マーカーは下方制御されるか、非常に低く維持された（図1C(b)）。PGC以外では近位内胚葉及び胚体内胚葉で発現を示すBlimp1が、EpiLCでさらに下方制御されたことにも留意しなくてはならない（図1C(b)）。これらの発見は、基底状態で培養されたESCが、アクチビンA、bFGF及びKSRでの刺激により、一過性であるとはいえ、原腸陥入前エピブラスト様細胞に誘導されたことを示す。特に、2日目のEpiLC（day−2 EpiLC）は、その形態及び遺伝子発現に関して、原腸陥入前エピブラストと酷似する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２７】
実施例2：EpiLCを介した、ESCからのPGC様細胞の誘導
次に我々は、EpiLCが、in vivoにおける原腸陥入前エピブラストの場合と同様に、PGC様細胞に誘導されるかを検証した。このような誘導は、EpiLCが原腸陥入前エピブラストの機能的特性を有するか否かの重要な指標であると考えられた。我々は、BVSC ESC並びに1日目（day−1）、2日目（day−2）及び3日目（day−3）のEpiLCを、浮遊条件下（低細胞結合性U底96ウェルプレートのウェル当たり1,000細胞）、SFM単独、又はLIF（1000 U／ml）を有するSFM中、又はBMP4（500 ng／ml）を有するSFM中、又はBMP4及びLIFを有するSFM中で2日間培養した。図2Aに示すように、SFM単独又はLIFを有するSFM中で培養した集合体のいずれも、有意なBV誘導は観察されなかった。対照的に、BMP4を有するSFM、又はBMP4及びLIFを有するSFM中で培養した場合には、顕著且つ比較的均一なBV誘導が、day−2 EpiLC由来の集合体において明確に見られたが、ESC又はday−1 EpiLC由来の集合体では見られなかった（図2A）。day−3 EpiLC由来の集合体もBV誘導を呈したが、他の起源のものと比較して、非常に小さく、あまり組み込まれていないようであった（図2A）。SCは、2日の培養の間、いずれの条件下でも誘導されていないようであった。これらの発見は、E5.5〜E6.0エピブラストと同様に、EpiLC、特にday−2 EpiLCが、BMP4に応答して特異的にBlimp4を発現する能力を有することを示す。
【手続補正４】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多能性幹細胞からエピブラスト様細胞（EpiLC）を製造する方法であって、前記多能性幹細胞をアクチビンAの存在下で培養する、方法。
【請求項２】
EpiLCが、分化誘導前の多能性幹細胞に比して、Fgf5、Wnt3及びDnmt3bから選択される少なくとも1つの遺伝子発現の上昇を示す、請求項1記載の方法。
【請求項３】
EpiLCが、分化誘導前の多能性幹細胞に比して、Gata4、Gata6、Sox17及びBlimp1から選択される少なくとも1つの遺伝子発現の低下を示す、請求項1又は2記載の方法。
【請求項４】
さらに塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）及び／又はKnockOut（商標）Serum Replacement（KSR）の存在下で培養を実施する、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５】
無血清及び無フィーダー条件下で培養を実施する、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
【請求項６】
培養を3日未満実施する、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
【請求項７】
多能性幹細胞から始原生殖細胞様（PGC様）細胞を製造する方法であって、以下の工程I）及びII）を含む、方法：
I）請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法でEpiLCを製造する工程、
II）工程I）で得られたEpiLCをBMP4及びLIFの存在下で培養する工程。
【請求項８】
PGC様細胞が、分化誘導前のEpiLCに比して、Blimp1及び／又はStella（Dppa3）遺伝子発現の上昇を示す、請求項7記載の方法。
【請求項９】
PGC様細胞が、正常な精子形成に貢献できる、請求項7又は8記載の方法。
【請求項１０】
前記工程II）の培養をさらにSCF及び／又はBMP8b及び／又はEGFの存在下で実施する、請求項7〜9のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１１】
前記工程I）の培養をアクチビンA、bFGF及びKSRの存在下で実施し、前記工程II）の培養をBMP4、LIF、SCF、BMP8b及びEGFの存在下で実施する、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
前記工程II）の培養を無血清条件下で実施する、請求項8〜11のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１３】
さらに、
III）前記工程II）で得られた細胞からBlimp1陽性細胞を選択する工程
を含む、請求項7〜12のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１４】
さらに、
III）前記工程II）で得られた細胞からSSEA1−及びインテグリン−β3−二重陽性細胞を選択する工程
を含む、請求項7〜13のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１５】
多能性幹細胞が、人工多能性幹細胞（iPSC）又は胚性幹細胞（ESC）である、請求項1〜14のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１６】
アクチビンA、bFGF及びKSRを含む、多能性幹細胞からEpiLCへの分化誘導用試薬キット。
【請求項１７】
BMP4、LIF、SCF、BMP8b及びEGFを含む、EpiLCからPGC様細胞への分化誘導用試薬キット。