(57)【要約】【課題】昆虫細胞への遺伝子導入にピギーバックトランスポゼースタンパク質を用いることで、組換え効率の向上、活性のあるトランスポゾンが自然界へ拡散する危険性を排除する。【解決手段】以下の２つを細胞に導入する工程を含む、昆虫細胞に外来ＤＮＡを導入するための方法。（ａ）  ピギーバック（ｐｉｇｇｙＢａｃ）トランスポゾンの逆位反復配列間に外来ＤＮＡの付与されたＤＮＡ（ｂ）  逆位反復配列に対し活性のある、大腸菌により生産されたピギーバックトランスポゼースタンパク質この方法により、組換え効率の向上、活性のあるトランスポゾンが自然界へ拡散する危険性を排除することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）および（ｂ）を細胞に導入することを特徴とする、昆虫細胞に外来ＤＮＡを導入するための方法。
（ａ）  ピギーバック（ｐｉｇｇｙＢａｃ）トランスポゾンの逆位反復配列間に外来ＤＮＡが付与されたＤＮＡ
（ｂ）  逆位反復配列に対し活性のある、大腸菌により生産されたピギーバックトランスポゼースタンパク質
【請求項２】
昆虫細胞が鱗翅目昆虫由来であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
昆虫細胞がカイコガ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）由来であることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
昆虫細胞がカイコガ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）由来の卵中に存在することを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
細胞への導入方法がマイクロインジェクションによることを特徴とする請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
ピギーバックトランスポゼースタンパク質が単離精製されたものであることを特徴とする請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
昆虫細胞に導入する（ｂ）  逆位反復配列に対し活性のある、大腸菌により生産されたピギーバックトランスポゼースタンパク質が、配列番号１に記載したアミノ酸配列を持つピギーバックトランスポゼースタンパク質に１〜３０個のアミノ酸を付与した組み換えピギーバックトランスポゼースタンパク質であることを特徴とする請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
昆虫細胞に導入する（ｂ）  逆位反復配列に対し活性のある、大腸菌により生産されたピギーバックトランスポゼースタンパク質が、末端に６〜１２個のヒスチジン残基を付与した組み換えピギーバックトランスポゼースタンパク質であることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
１〜３０個のアミノ酸を付与した組み換えピギーバックトランスポゼースタンパク質。
【請求項１０】
６〜１２個のヒスチジン残基を付与した請求項９記載の組み換えピギーバックトランスポゼースタンパク質。
【請求項１１】
配列番号２に記載したアミノ酸配列を有する請求項１０に記載の組み換えピギーバックトランスポゼースタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はトランスポゼースの機能を利用した、昆虫細胞に外来ＤＮＡを付与するための方法に属する。
【０００２】
【従来の技術】
真核・原核生物由来のある種のＤＮＡ因子は、別の遺伝子座へと転移することができる。一般にこうした転移因子はトランスポゾンと呼ばれている。トランスポゾンは転移の機構により二つのクラスに分類されている。ＲＮＡを介し逆転写酵素を用いて転移するクラス１と、その他のトランスポゾンが分類されるクラス２である。現在昆虫において知られている主なクラス２トランスポゾンとしてＰ因子、ミノス（Ｍｉｎｏｓ）、マリナー（ｍａｒｉｎｅｒ）、ピギーバック（ｐｉｇｇｙＢａｃ）などがあり、こうしたクラス２トランスポゾンの持つ転移能力を利用して、ゲノムに外来のＤＮＡ物質を導入するための研究が進められてきた（非特許文献１）。
【０００３】
１９９７年、米国農務省らによりＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ由来トランスポゾンであるピギーバックを利用した、２種類のＤＮＡを用いる遺伝子導入システムに関する特許が登録された（特許文献１）。
【０００４】
２０００年、この技術を用いて産業上重要な昆虫であるカイコガ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）ゲノムにクラゲ緑色蛍光タンパク質遺伝子を、効率約２％で導入した報告がなされた（非特許文献２）。
【０００５】
【特許文献１】
米国特許６２１８１８５号公報
【非特許文献１】
インセクト  バイオケミストリー  アンド  モレキュラー  バイオロジー（Ｉｎｓｅｃｔ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）  ３１，１１１−１２８，２００１
【非特許文献２】
ネイチャー  バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）  １８，８１−８４，２０００
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
米国農務省らによる特許（米国特許６２１８１８５号公報）ではピギーバックトランスポゾンの逆位反復配列に対して活性のあるトランスポゼースをコードするＤＮＡを用いる必要がある。ここでの問題点として、活性のあるトランスポゼース遺伝子が自然界に広がる危険性が指摘されている（バイオサイエンスとインダストリー５９，８５３−８５６，２００１）。ショウジョウバエの場合、自然突然変異の大半はトランスポゾンによる遺伝子の変化により引き起こされると考えられており、こうした変異原性ゆえに、活性のあるトランスポゾンを持つ個体は淘汰されていく方向に選択圧がかかる。例えば昆虫の代表的なトランスポゾンであるマリナー様因子は、ヒトをはじめとした動物や植物にも見出され、真核生物すべてに分布していることが分かってきたが、自然界で実際に活性を有していたものはたった一つであった（ジェネティックス（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）  １２８，３１１−３１８，１９９１）。このことは活性のあるマリナー様因子が生物に何らかの害を及ぼす存在であったことを示唆している。すなわち従来の米国農務省らによる遺伝子導入技術では、自然界にはほとんど存在しない活性のあるトランスポゾンをコードする遺伝子がゲノムに組み込まれ、自然界へと広がる危険性があった。なおカイコ卵に導入した外来遺伝子がゲノムに組み込まれた例としては、１９９６年の報告（Ａｐｐｌ．  Ｅｎｔｏｍｏｌ．  Ｚｏｏｌ．  ３１，５８７−５９６，１９９６）がある。
【０００７】
２０００年に報告されたカイコガ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）ゲノムへのクラゲ緑色蛍光タンパク質遺伝子の導入技術では（ネイチャー  バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）１８，８１−８４，２０００）、遺伝子組換え個体が得られる頻度が約２％と低いといった問題点があった。これは遺伝子組換え効率の鍵となる細胞内でのトランスポゼースタンパク質の発現量をコントロールすることができないことが一因と考えられる。この効率の低さのため、従来は遺伝子組換え個体を得るために１０００個以上のカイコ卵へマイクロインジェクションを行うといった労力が必要であった。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは前記課題すなわち低組換え効率、活性のあるトランスポゾンをコードする遺伝子が染色体に組み込まれて自然界へと広がる危険性を共に解決できる手法を鋭意検討した結果、大腸菌より発現させたピギーバックトランスポゼースタンパク質を用いる手法により、課題を解決できることを見出し本発明に至った。
【０００９】
すなわち本発明は、以下の２つ、「（ａ）  ピギーバック（ｐｉｇｇｙＢａｃ）トランスポゾンの逆位反復配列間に外来ＤＮＡの付与されたＤＮＡ    （ｂ）  逆位反復配列に対し活性のある、大腸菌により生産されたピギーバックトランスポゼースタンパク質」を細胞に導入することを特徴とする、昆虫細胞に外来ＤＮＡを導入するための方法、および１〜３０個のアミノ酸を付与した組み換えピギーバックトランスポゼースタンパク質に関する。
【００１０】
【発明の実施の形態】
まず本発明における昆虫とは特に限定されるものではないが、好ましくは鱗翅目昆虫、より好ましくはカイコガ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）由来細胞、さらに好ましくはカイコガ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）の卵に含まれる細胞である。
【００１１】
ピギーバックトランスポゾンとは両端に１３塩基対の逆位配列と、内部に約２．１ｋ塩基対のＯＲＦを有する転位因子である。本発明において使用されるピギーバックトランスポゾンをクローニングする方法に特に制限はない。既知の遺伝子情報に基づき、ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）法を用いて必要な遺伝領域を増幅取得する方法、既知の遺伝子情報に基づきゲノムライブラリーやｃＤＮＡライブラリーより相同性や酵素活性を指標としてクローニングする方法などが挙げられる。本発明においては、これらの遺伝子は、遺伝的多形性などによる変異型も含む。なお、遺伝的多形性とは、遺伝子上の自然突然変異により遺伝子の塩基配列が一部変化しているものをいう。好ましくはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ＴＮ−３６８、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  ＮＰＶ（ＡｃＮＰＶ）、Ｇａｌｌｅｒｉａ  ｍｅｌｌｏｎｅａ  ＮＰＶ（ＧｍＭＮＰＶ）由来のピギーバックトランスポゾンを用いることができる。更に好ましくはＧｍＭＮＰＶ由来ピギーバックの一部を持つプラスミドｐＨＡ３ＰＩＧやｐ３Ｅ１．２（Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １８，８１−８４，２０００）が用いられる。
【００１２】
また本発明で昆虫細胞に導入する外来ＤＮＡとしては特に限定されるものではなく、外来遺伝子配列のいかなるものでも良く、タンパク質をコードしていない領域であっても良い。好ましくはタンパク質をコードする領域である。また外来遺伝子はその発現を制御できるように設計されており、通常は昆虫細胞内で発現するプロモーターを上流に、任意のポリＡ付加配列を下流に連結した構造を持つ。さらにプロモーターとの間に任意の遺伝子由来シグナル配列などを連結しても良く、ポリＡ付加配列との間にも任意の遺伝子配列を連結しても良い。また人工的に設計、合成された遺伝子配列を連結することもできる。プロモーターについて、特に限定されるものではなく、どのような生物由来であっても昆虫細胞内で発現するプロモーターであればよい。また人工的に合成、変化させたものであっても構わない。好ましくは３ｘＰ３プロモーター（Ｉｎｓｅｃｔ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ  ３１，１１３７−１１４３，２００１）やアクチンプロモーター、転写因子プロモーター、コリオンプロモーター、キューティクルタンパクプロモーター、抗菌タンパク・ペプチドプロモーター、貯蔵タンパクプロモーター、ビテロジェニンプロモーター、バキュロウイルスのポリヘドリンプロモーターなどが挙げられる。またカイコ絹糸腺で特異的にタンパク質の発現を誘導するように工夫されたプロモーターを用いても良い。例えば、フィブロインＨ鎖プロモーター、フィブロインＬ鎖プロモーター、ｐ２５プロモーター、セリシンプロモーターなどのカイコ絹糸腺タンパク質のプロモーターが挙げられる。更に好ましくはアクチンプロモーターが用いられる。
【００１３】
そのほかプロモーター以外に用いられる遺伝子配列については、シグナル配列、ポリＡ配列や、その他遺伝子の発現を制御する配列などが挙げられる。これらは特定のものに限定されず、目的タンパク質の発現に適したものを選択することができる。例えば、目的タンパク質のシグナル配列やポリＡ配列など目的タンパク質由来のもの、宿主となるカイコなど昆虫タンパク質のシグナル配列、ポリＡ配列が挙げられる。または、ＳＶ４０ポリＡやウシ成長ホルモンポリＡなどの一般的にタンパク質の発現に実績のあるものなどが挙げられる。好ましくはＳＶ４０ポリＡが用いられる。
【００１４】
本発明において使用されるピギーバックトランスポゼースタンパク質を得る方法に特に制限はないが、例えば、ピギーバックトランスポゼースタンパク質の細胞内での量が上昇した組換え細胞などを適当な培地で培養し、増殖した菌体を回収し、当該菌体を破砕すればよい。
【００１５】
組換え細胞としては、微生物、動物、植物、または昆虫由来のものが好ましく使用できる。例えば動物を用いる場合、マウス、ラットやそれらの培養細胞などが用いられる。植物を用いる場合、例えばシロイヌナズナ、タバコやそれらの培養細胞が用いられる。また、昆虫を用いる場合、例えばカイコやその培養細胞などが用いられる。また、微生物を用いる場合、例えば、大腸菌などが用いられる。
【００１６】
また、ピギーバックトランスポゼースタンパク質を複数種組み合わせて使用しても良い。
【００１７】
ピギーバックトランスポゼースタンパク質を得るために、組換え細胞を培養する方法に特に制限はないが、例えば微生物を培養する場合、使用する培地は、炭素源、窒素源、無機イオンおよび必要に応じその他有機成分を含有する培地が用いられる。例えば、大腸菌の場合しばしばＬＢ培地が用いられる。炭素源としては、グルコース、ラクトース、ガラクトース、フラクトース、アラビノース、マルトース、キシロース、トレハロース、リボースや澱粉の加水分解物などの糖類、グリセロール、マンニトールやソルビトールなどのアルコール類、グルコン酸、フマール酸、クエン酸やコハク酸等の有機酸類を用いることができる。窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガス、アンモニア水等を用いることができる。有機微量栄養素としては、各種アミノ酸、ビタミンＢ１等のビタミン類、ＲＮＡ等の核酸類などの要求物質または酵母エキス等を適量含有させることが望ましい。それらの他に、必要に応じて、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添加される。
【００１８】
培養条件にも特に制限はなく、例えば大腸菌の場合、好気条件下で１６〜７２時間程度実施するのが良く、培養温度は２５℃〜４５℃に、特に好ましくは３７℃に、培養ｐＨは５〜８に、特に好ましくはｐＨ７に制御するのがよい。なおｐＨ調整には無機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、さらにアンモニアガス等を使用することができる。
【００１９】
増殖した組換え細胞は、遠心分離等により培養液から回収することができる。回収した組換え細胞から細胞破砕液を調製するには、通常の方法が用いられる。すなわち、組換え細胞を超音波処理、ダイノミル、フレンチプレス等の方法にて破砕し、遠心分離により細胞残渣を除去することにより細胞破砕液が得られる。
【００２０】
細胞破砕液からピギーバックトランスポゼースタンパク質を精製するには、硫安分画、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、等電点沈殿、熱処理、ｐＨ処理、等酵素の精製に通常用いられる手法が適宜組み合わされて用いられる。また封入体など不溶性画分からの精製には尿素やグアニジン、界面活性剤のような変性剤で封入体をアンフォールディングした後、透析あるい  は希釈により変性剤を除去し、リフォールディング（再生）させる方法を用いることができる。
【００２１】
本発明では、ピギーバックトランスポゼースタンパク質はピギーバックトランスポゼースタンパク質の細胞内での量が上昇した組換え細胞から調製されたものが好ましく使用できる。細胞内でピギーバックトランスポゼースタンパク質の量を上昇させる方法に特に制限はない。具体的には、遺伝子の転写調節領域の改良、遺伝子のコピー数の増加、蛋白への翻訳の効率化などが挙げられる。
【００２２】
転写調節領域の改良とは、遺伝子の転写量を増加させる改変を加えることをいう。例えば、プロモーターに変異を導入することによってプロモーター強化を行い、下流にある遺伝子の転写量を増加させることができる。プロモーターに変異を導入する以外にも、宿主内で強力に発現するプロモーターを導入しても良い。例えば大腸菌においては、ｌａｃ、ｔａｃ、ｔｒｐなどのプロモーターが挙げられる。また、エンハンサーを新たに導入することによって遺伝子の転写量を増加させることができる。染色体ＤＮＡのプロモーター等の遺伝子導入については、例えば特開平１−２１５２８０号公報に記載されている。
【００２３】
遺伝子のコピー数の上昇は、具体的には、遺伝子を多コピー型のベクターに接続して組換えＤＮＡを作製し、該組換えＤＮＡを宿主細胞に保持させることにより達成することができる。ここでベクターとは、プラスミドやファージ等広く用いられているものを含むが、これら以外にも、トランソポゾン（Ｂｅｒｇ，Ｄ．Ｅ  ａｎｄ  Ｂｅｒｇ．Ｃ．Ｍ．，  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．，ｖｏｌ．１，Ｐ．４１７（１９８３））やＭｕファージ（特開平２−１０９９８５号公報）も含む。遺伝子を相同組換え用プラスミド等を用いた方法で染色体に組み込んでコピー数を上昇させることも可能である。
【００２４】
タンパク質の翻訳効率を上昇させる方法としては、例えば原核生物においてはＳＤ配列（Ｓｈｉｎｅ，  Ｊ．  ａｎｄ  Ｄａｌｇａｒｎｏ，  Ｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ７１，  １３４２−１３４６  （１９７４））、真核生物では  Ｋｏｚａｋ  のコンセンサス配列（Ｋｏｚａｋ，  Ｍ．，  Ｎｕｃ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  Ｖｏｌ．１５，ｐ．８１２５−８１４８（１９８７））を導入、改変することや、使用コドンの最適化（特開昭５９−１２５８９５）などが挙げられる。
【００２５】
ピギーバックトランスポゼースタンパク質の活性を上昇させる手段としては、酵素の構造遺伝子自体に変異を導入して、酵素そのものの活性を上昇させることも挙げられる。
【００２６】
遺伝子に変異を生じさせるには、部位特異的変異法（Ｋｒａｍｅｒ，Ｗ．  ａｎｄ  ｆｒｉｔａ，Ｈ．Ｊ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１５４，Ｐ．３５０（１９８７））リコンビナントＰＣＲ法（ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９））、特定の部分のＤＮＡを化学合成する方法、または当該遺伝子をヒドロキシアミン処理する方法や当該遺伝子を保有する菌株を紫外線照射処理、もしくはニトロソグアニジンや亜硝酸などの化学薬剤で処理する方法がある。
【００２７】
上記の方法を用い、ピギーバックトランスポゼースタンパク質の量もしくは活性が上昇した組換え細胞の培養およびそれからのピギーバックトランスポゼースタンパク質の調製法は、上記にピギーバックトランスポゼースタンパク質の取得について説明したようにして行うことができる。ピギーバックトランスポゼースタンパク質の細胞内での量が上昇した組換え細胞を用いることによって、容易かつ有利にピギーバックトランスポゼースタンパク質を調製することができる。
【００２８】
本発明において使用されるピギーバックトランスポゼースタンパク質は、ピギーバックトランスポゼースタンパク質を有する休止細胞、その細胞破砕液などが使用できるが、細胞破砕液が好ましい。
【００２９】
さらに、部分的に精製したピギーバックトランスポゼースタンパク質を作用させることにより昆虫細胞への負荷を抑制することができ、より高効率で遺伝子組換え個体が得られる。さらに好ましくは単離精製したピギーバックトランスポゼースタンパク質を作用させることである。ピギーバックトランスポゼースタンパク質を部分的に精製、または単離精製することで、昆虫細胞への負荷を抑制することができる。
【００３０】
一般的に酵素というものは本来あるべきアミノ酸配列で自然界に存在するため、人工的にアミノ酸配列を付与もしくは欠如させると酵素の活性を失うことが多い。しかし本発明においてピギーバックトランスポゼースタンパク質に１から３０個のアミノ酸配列を付与したタンパク質が好ましく使用できる。ここで、付与するものはＮ末端の６から１０個のヒスチジン残基が好ましい。このように、アミノ酸を付与することで、ピギーバックトランスポゼースタンパク質の精製を簡便にできるようにすることができる。１から３０個のアミノ酸を付与する方法に特に制限はない。例えばピギーバックトランスポゼースタンパク質遺伝子に付与したいアミノ酸配列に相当する塩基配列を遺伝子工学的手法を用い、組み換えればよい。用いる遺伝子工学的手法に特に制限はないが。好ましくはＰＣＲ法やＤＮＡ断片同士の連結による方法がある。また精製された１から３０個のアミノ酸配列が付与されたピギーバックトランスポゼースタンパク質を、トロンビンやファクターＸａなどのプロテアーゼで処理し、付与したアミノ酸の一部を除去しても良い。
【００３１】
本発明における昆虫細胞へのＤＮＡ・ピギーバックトランスポゼースタンパク質導入方法に関しては、安定にゲノムに組み込まれ、発現し、交配により子孫にも安定に伝わる導入方法であれば良い。細胞への導入方法としては昆虫の細胞にマイクロインジェクションする方法、遺伝子銃を用いる方法、エレクトロポレーションによる方法、リポソームを用いる方法などを用いることができるが、好ましくは昆虫卵にマイクロインジェクションする方法が、更に好ましくはカイコガ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）卵にマイクロインジェクションする方法が用いられる。ここで卵にマイクロインジェクションを行う場合、卵中の細胞に直接導入する必要はなく、卵中に導入しさえすればよい。
【００３２】
またインジェクションを行う卵についてはＤＮＡ・ピギーバックトランスポゼースタンパク質導入後、発生・分化が進めば良く、導入の時期については特に制限はないが、好ましくは細胞数の少ない状態にある産卵後１時間以上から８時間以内の卵が望ましい。
【００３３】
昆虫細胞へ導入するＤＮＡ・ピギーバックトランスポゼースタンパク質濃度について、安定にゲノムに組み込まれ、発現し、交配により子孫にも安定に伝わればよいが、ＤＮＡ濃度を約１００〜３００μｇ／ｍｌ、ピギーバックトランスポゼースタンパク質濃度を約１．３〜４．１μｇ／ｍｌとすることにより良好な形質転換結果が得られる。この時、導入するＤＮＡに対して、ピギーバックトランスポゼースタンパク質をモル比で２〜２０倍とすることが好ましい。
【００３４】
さらに、昆虫細胞へ導入するＤＮＡ・ピギーバックトランスポゼースタンパク質溶液には、細胞の生育、発生、分化に悪影響を及ぼすことがなければ、含有する成分に特に制限はないが、好ましくはＤＮＡやタンパク質を安定させるために緩衝液が用いられる。またＤＮＡやタンパク質の安定化、転移活性増大のために、グリセロールやＢＳＡ、プロテアーゼ阻害剤、ＧＴＰ等のｄＮＴＰ、マグネシウムイオンやマンガンなど金属イオン、ナトリウムイオンやカリウムイオンなどが適宜組み合わせて用いられる。
【００３５】
【実施例】
以下に実施例を示し、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例の記載に限定されるものではない。
【００３６】
実施例１  ピギーバックトランスポゼースタンパク質の調製
（１）ピギーバックトランスポゼース遺伝子のクローニングおよび発現ベクターの作製
米国農務省らによる特許（米国特許６２１８１８５号公報）で開示されているピギーバックトランスポゼース遺伝子の塩基配列を参考に、オリゴヌクレオチドプライマーを合成した。プライマーの端には後の遺伝子操作のために制限酵素切断部位を付加した。
【００３７】
プライマー１（配列番号３）ｃｃａｔｇｇｇｃｃａｔｃａｔｃａｔｃａｔｃａｔｃａｔｃａｔｃａｔｃａｔｃａｃａｇｃａｇｃｇｇｃｃａｔａｔｃｇａａｇｇｔｃｇｔｃａｔａｔｇｇｇａｔｇｔｔｃｔｔｔａｇａｃｇａｔｇａｇとプライマー２（配列番号４）ｇｇａｔｃｃｔｔａｇｔｃａｇｔｃｃａｇａａａｃａａｃｔｔｔｇｇｃの２種類のプライマーを用い、プラスミドｐＨＡ３ＰＩＧ（Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １８，８１−８４，２０００）をテンプレートとして用いたＰＣＲにより取得した。ＰＣＲは０．２ｍｌのミクロ遠心チューブを用い、テンプレートＤＮＡを１０ｎｇ、各プライマーを２０ｐｍｏｌ、２０ｍＭ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、２．５ｍＭ  ＫＣｌ、１００μｇ／ｍｌゼラチン、５０μＭ各ｄＮＴＰ、２単位  ＬＡＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造（株）製）となるように各試薬を加え、全量を５０μｌとした。ＤＮＡの変性条件を９４℃、３０秒、プライマーのアニーリング条件を５５℃、３０秒、ＤＮＡプライマーの伸長反応条件を７２℃、３分の各条件でＢｉｏＲａｄ社のサーマルサイクラーを用い、３０サイクル反応させた。これらの反応液を１％アガロースゲルにて電気泳動し、約１．８ｋｂｐのＤＮＡ断片を常法に従って抽出、調整した。これらのＤＮＡ断片をポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造（株）製）によりリン酸化した後、ＨｉｎｃＩＩで切断後脱リン酸化処理したｐＵＣ１９ベクターに宝酒造（株）のＤＮＡライゲーションキットＶｅｒ．２を用いて１６℃、終夜反応を行い、連結した。これらを用いて常法に従い大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体にＰＣＲ断片が挿入されていることを、得られたコロニーを前述と同じ条件でＰＣＲすることによって確認し、ＰＣＲ断片の挿入されたプラスミドを常法によって調整した。これらのプラスミドをシークエンスすることにより、得られた断片がそれぞれの遺伝子の塩基配列であることを確認した。
【００３８】
この大腸菌からプラスミドを回収し、ＮｃｏＩ、及びＢａｍＨＩで消化し、得られた２．１ｋｂのＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩ断片を、予めＮｃｏＩ、及びＢａｍＨＩで消化しておいたｐＴＶ１１８Ｎ（宝酒造（株）製）のＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩ間隙に常法に従ったライゲーション反応により挿入し、得られたプラスミドをｐＴＶ−ｐｉｇｇｙと命名した（図１）。このプラスミドを導入した大腸菌を培養することで、ピギーバックトランスポゼースタンパク質のＮ末端アミノ酸配列に１０個のヒスジチン残基が付加された分子量約６９ｋＤａの組み換えピギーバックトランスポゼースタンパク質を生産することができる。
【００３９】
（２）組み換えピギーバックトランスポゼースタンパク質の産生
ｐＴＶ−ｐｉｇｇｙでＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１株をアンピシリン耐性に形質転換し、得られた形質転換体をＢＬ２１−ｐｉｇｇｙ株と命名した。
【００４０】
次にＢＬ２１−ｐｉｇｇｙ株で組み換えピギーバックトランスポゼースタンパク質を産生させた。まず、ＢＬ２１−ｐｉｇｇｙ株をそれぞれ５０μｇ／ｍｌのアンピシリンナトリウムを含んだ滅菌ＬＢ培地（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ    ３ｒｄ．  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．  Ｐｒｅｓｓ）（ＬＢ−ａｍｐ培地）５ｍｌに１白金耳植菌し、３７℃で２４時間振とうして前培養を行った。
【００４１】
この前培養液をＬＢ−ａｍｐ培地５０ｍｌに全量植菌し、３７℃、振幅３０ｃｍで、１８０ｒｐｍの条件下で３時間培養した後に１ｍＭ  ＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−１−ｔｈｉｏ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ）添加し、更に４時間培養した。対照実験として、ＢＬ２１をｐＴＶ１１８Ｎで形質転換した形質転換体を対照として用い同様の培養を行った。こうして得られた菌体を集め、５ｍｌのＴＢＳ緩衝液（宝酒造製）に再懸濁後、超音波破砕および遠心分離により細胞破砕液を調製した。この細胞破砕液をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分画し、Ｐｅｎｔａ−Ｈｉｓ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ抗体（ＱＩＡＧＥＮ社製）でウエスタンブロッティングを行った結果、ＢＬ２１−ｐｉｇｇｙ株由来の細胞破砕液のみから、分子量約６９ｋＤａの組み換えピギーバックトランスポゼースタンパク質を検出した。
【００４２】
（３）組み換えピギーバックトランスポゼースタンパク質の精製
この組み換えピギーバックトランスポゼースタンパク質は、Ｎ末端アミノ酸配列に１０個のヒスチジン残基があることこから、ニッケルイオンとの相互作用を利用した精製を行った。
【００４３】
まず、１０ｍｌのキレーティング  セファロース  ファースト  フロー（Ｃｈｉｌａｔｉｎｇ    Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ）担体（アマシャム  バイオサイエンス社製）を充填したカラムシステムを構築した。このカラムに５０ｍｌの５０ｍＭ  硫酸ニッケル水溶液、５０ｍｌのＴＢＳ緩衝液の順で流した後、（２）と同様の方法で得られたＢＬ２１−ｐｉｇｇｙ株の５００ｍｌ培溶液由来の５０ｍｌ細胞破砕液を流した。その後、１００ｍｌの５ｍＭ    イミダゾールを含むＴＢＳ緩衝液、１００ｍｌの５０ｍＭ  イミダゾールを含むＴＢＳ緩衝液をこの順序で流した。更に５０ｍｌの６００ｍＭ    イミダゾールを含むＴＢＳ緩衝液を流した。カラムに流した各々の緩衝液を（２）と同様の方法でウエスタンブロッティングを行ったところ、６００ｍＭ    イミダゾールを含むＴＢＳ緩衝液のみに約６９ｋＤａタンパク質を検出した。また、カラムに流した各々の緩衝液をＳＤＳ−ＰＡＧＥし、クマシーブリリアントブルーで染色たところ、６００ｍＭ    イミダゾールを含むＴＢＳ緩衝液から、約６９ｋＤａの単一バンドを検出し、この精製タンパク質は組換えピギーバックトランスポゼースタンパク質であることを確認した。
【００４４】
実施例２遺伝子導入用プラスミドの作製
遺伝子導入用プラスミドには、トランスポゾンｐｉｇｇｙＢａｃの一対の逆向き反復配列の間に，カイコアクチンプロモーター（Ａ３プロモーター）制御下に発現するＣｙｃｌｅ３  ＧＦＰ遺伝子構造を含むプラスミドｐｉｇＡ３Ｃｙ３ＧＦＰを用いた。
【００４５】
すなわち、米国特許第６２１８１８５号に開示されるプラスミドｐ３Ｅ１．２よりｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅをコードする領域を取り除き、その部分にＡ３プロモーターおよびアクチン遺伝子の一部（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ４９８５４の塩基番号１７６４〜２５９５番目）さらにその下流にタンパク質翻訳フレームを合わせたかたちでＣＴ−ＧＦＰ  Ｆｕｓｉｏｎ  ＴＯＰＯ  ＴＡ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）由来のＣｙｃｌｅ３  ＧＦＰ遺伝子およびＢＧＨポリＡ配列を連結した遺伝子構造を挿入したベクターがｐｉｇＡ３Ｃｙ３ＧＦＰである。
【００４６】
ｐｉｇＡ３Ｃｙ３ＧＦＰの作製は以下の手法により行った。まず、Ａ３プロモーターおよびアクチン遺伝子の一部（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ４９８５４の塩基番号１７６４〜２５９５番目）をＢｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡを鋳型に、プライマー５（配列番号５）とプライマー６（配列番号６）の２種類のプライマーを用いたＰＣＲにより取得した。ＰＣＲはＬＡ−ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造（株））を用いて、添付の方法に従い、９４℃、１５秒、５５℃、３０秒、７２℃、６０秒の条件で３０サイクル行った。約８００ｂｐの遺伝子断片を抽出、精製した後、ｐｃＤＮＡ３．１／ＣＴ−ＧＦＰ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に宝酒造（株）のＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２を用いて１６℃、終夜反応を行い、連結した。これらを用いて常法に従い大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体にＰＣＲ断片が挿入されていることを、得られたコロニーを前述と同じ条件でＰＣＲすることによって確認し、ＰＣＲ断片の挿入されたプラスミドを常法によって調整した。これらのプラスミドをシークエンスすることにより、挿入された断片がそれぞれの遺伝子の塩基配列であることを確認した。
【００４７】
そのプラスミドを鋳型にさらに、プライマー７（配列番号７）とプライマー８（配列番号８）の２種類のプライマーを用いて、ＰＣＲを行った。ＰＣＲはＬＡ−Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造（株））を用いて、添付の方法に従い、９４℃、１５秒、５５℃、３０秒、７２℃、１２０秒の条件で３０サイクル行い、約１．８ｋｂｐの遺伝子断片を抽出、精製した。この遺伝子断片（配列番号９）をＢｇｌ  ＩＩ、Ｈｐａ  Ｉ処理したものと、Ｂｇｌ  ＩＩ、Ｈｐａ  Ｉで切断したｐ３Ｅ１．２とを上記と同様の方法で、連結し、ｐｉｇＡ３Ｃｙ３ＧＦＰを得た。
【００４８】
実施例３  遺伝子組換えカイコの作製
ｐｉｇＡ３Ｃｙ３ＧＦＰとピギーバックトランスポゼースタンパク質を、ＤＮＡ濃度を約２００μｇ／ｍｌ、ピギーバックトランスポゼースタンパク質濃度を約２．７μｇ／ｍｌ（モル比１：１０）含んだ０．５ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．０）−５ｍＭ  ＫＣｌ溶液を調整し、３〜２０ｎｌを産卵後４時間以内のカイコ卵５００個に対してマイクロインジェクションした。なお、対照実験としてピギーバックトランスポゼースタンパク質を含まない溶液を導入した。
【００４９】
そのカイコ卵より孵化した幼虫を飼育し、得られた成虫（Ｇ０）を群内で掛け合わせ得られた次世代（Ｇ１）をＣｙｃｌｅ３  ＧＦＰタンパク質の蛍光を観察することにより、Ｃｙｃｌｅ３  ＧＦＰ遺伝子が染色体へ導入されたカイコをスクリーニングした。その結果、ピギーバックトランスポゾンを導入した時にのみ、遺伝子組換えカイコが得られた。またその効率（蛍光を発する個体を生じた蛾数／交配蛾数）は約６％であった。
【００５０】
本実験を再度行ったところ、再現性良く約６％の効率で遺伝子組換えカイコが得られた。これらの結果を表１に示す。
【００５１】
【表１】
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【００５２】
実施例４  遺伝子組換えカイコの解析
導入した遺伝子が確実にカイコ染色体に組み込まれていることをサザンブロッティング法により解析した。カイコ染色体は以下の手法により調製した。Ｃｙｃｌｅ３ＧＦＰタンパク質の蛍光が観察されたカイコを５齢３日目に解剖し、後部絹糸腺組織を取り出した。１×ＳＳＣで洗浄した後、ＤＮＡ  抽出バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０，  １ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．０，  １００ｍＭ  ＮａＣｌ）２００μｌを加えた。プロテイネース  Ｋ（ｆｉｎａｌ  ２００μｇ／ｍｌ）を加えて組織をグラインダーで充分すりつぶし、更にＤＮＡ  抽出バッファーを３５０μｌ、１０％ＳＤＳ  ６０μｌを加え混合後、５０℃  ２時間保温した。Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ飽和フェノール  ｐＨ８．０  ５００μｌを加え１０ｍｉｎ混合後、１０，０００ｒｐｍ  ５分  ４℃にて遠心分離し上清を回収した。上清に等量のフェノール・クロロホルム・イソアミルアルコール（２５：２４：１）を加え混合後、遠心分離した。再度フェノール・クロロホルム・イソアミルアルコールを加え、遠心分離後上清を回収した。等量のクロロホルム・イソアミルアルコール（２４：１）を加え混合後、遠心分離した上清に再度クロロホルム・イソアミルアルコールを加え、遠心分離後上清を回収した。得られた上清に１／１０量の３Ｍ  酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５．２）を加え混合し、更に２．５倍量の冷エタノールを加え−８０℃にて３０分静置後、１５，０００ｒｐｍ  １０分  ４℃にて遠心分離し染色体ＤＮＡを沈殿させた。７０％エタノールでＤＮＡの沈殿を洗浄した後、風乾させた。ＲＮａｓｅ入り滅菌水で１００μｇ／ｍｌとなるように溶解、希釈し染色体  ＤＮＡ溶液を調製した。
【００５３】
カイコ染色体ＤＮＡ約１０μｇを制限酵素処理したサンプルを１％アガロースゲルを用いて電気泳動後、ＤＮＡをメンブレンに転写させた。プローブとしてＣｙｃｌｅ３  ＧＦＰ遺伝子を用い、Ｇｅｎｅ  Ｉｍａｇｅｓ  ＣＤＰ−Ｓｔａｒ  ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  （アマシャムファルマシア）による化学発光により検出した。その結果調べた５頭のカイコ全てでＣｙｃｌｅ３  ＧＦＰ遺伝子が染色体に組み込まれていることが確認された。
【００５４】
【発明の効果】
ピギーバックトランスポゼースタンパク質を用いる手法により、外来ＤＮＡを昆虫細胞のゲノムに導入することが可能となった。この新手法により、従来の低組換え効率、活性のあるトランスポゾンをコードする遺伝子が染色体に組み込まれて自然界へと広がる危険性といった課題を解決することができる。
【００５５】
【配列表】
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