【手続補正書】
【提出日】平成24年4月6日(2012.4.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
本発明の新規の特徴は、添付の特許請求の範囲において具体的に示される。本発明の特徴および利点についてのより良い理解は、例示的な実施形態を示す以下の詳細な説明と添付の図面を参照することによって得られるであろう。以下の詳細な説明では、本発明の原理が利用される。
したがって、本発明は、以下の項目を提供する；
（項目１）
宿主細胞中で異種配列を発現させる方法であって、該異種配列が発現される培地中および条件下で該宿主細胞を培養する工程を含み、該異種配列が、ガラクトース誘導性調節エレメントに作動可能であるように連結され、そして該異種配列の発現が、該培地にガラクトースを直接補充することなく誘導される、方法。
（項目２）
上記異種配列の発現が、ガラクトースではない糖によって、ガラクトースが補充された培地中で上記宿主細胞を培養することによって得られるレベルと同等のレベルにまで誘導され、補充されたガラクトースの量とガラクトースではない糖の量は、モル数として測定すると同等である、項目１に記載の方法。
（項目３）
宿主細胞中で異種配列を発現させる方法であって、該異種配列が発現される培地中および条件下で該宿主細胞を培養する工程を含み、該異種配列が、ガラクトース誘導性調節エレメントに作動可能であるように連結され、そして該異種配列の発現が、該培地にラクトースが添加されると誘導される、方法。
（項目４）
上記異種配列の発現が、ラクトースが補充されると、ガラクトースが補充された培地中で上記宿主細胞を培養することによって得られるレベルと同等のレベルにまで誘導され、補充されたガラクトースの量とラクトースの量は、モル数として測定すると同等である、項目３に記載の方法。
（項目５）
上記異種配列がタンパク質性産物をコードする、項目３に記載の方法。
（項目６）
上記異種配列が、アンチセンス分子、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＥＧＳ、アプタマー、およびリボザイムからなる群より選択される産物を生産する、項目３に記載の方法。
（項目７）
宿主細胞中でイソプレノイドを生産させる方法であって、メバロン酸非依存性デオキシキシルロース５−リン酸（ＤＸＰ）経路またはメバロン酸（ＭＥＶ）経路の１種類またはそれ以上の酵素をコードする１種類またはそれ以上の異種配列を発現する宿主細胞を培養する工程を含み、該１種類またはそれ以上の異種配列は、ガラクトース誘導性調節エレメントに作動可能であるように連結され、そして該１種類またはそれ以上の異種配列の発現が、該培地にガラクトースを直接補充することなく誘導される、方法。
（項目８）
上記１種類またはそれ以上の異種配列の発現が、ラクトースの存在下で誘導される、項目１または７に記載の方法。
（項目９）
上記イソプレノイドが、Ｃ５〜Ｃ２０イソプレノイドである、項目１、３、または７に記載の方法。
（項目１０）
上記イソプレノイドがＣ２０＋イソプレノイドである、項目１、３、または７に記載の方法。
（項目１１）
上記宿主細胞に、プレニルトランスフェラーゼおよびイソプレノイドシンターゼをコードする外因性配列がさらに含まれる、項目１、３、または７に記載の方法。
（項目１２）
上記培地にラクトースとラクターゼとが含まれる、項目７に記載の方法。
（項目１３）
上記宿主細胞に、ガラクトーストランスポーターまたはその生物学的に活性な断片が含まれる、項目１、３、または７に記載の方法。
（項目１４）
上記宿主細胞に、ＧＡＬ２ガラクトーストランスポーターまたはその生物学的に活性な断片が含まれる、項目１、３、または７に記載の方法。
（項目１５）
上記宿主細胞に、ラクトーストランスポーターまたはその生物学的に活性な断片が含まれる、項目１、３、または７に記載の方法。
（項目１６）
上記宿主細胞に、ＧＡＬ２であるガラクトーストランスポーターが含まれる、項目１、３、または７に記載の方法。
（項目１７）
上記ガラクトース誘導性調節エレメントがエピソーム性である、項目１、３、または７に記載の方法。
（項目１８）
上記ガラクトース誘導性調節エレメントが、上記宿主細胞のゲノムに組み込まれる、項目１、３、または７に記載の方法。
（項目１９）
上記ガラクトース誘導性調節エレメントに、ＧＡＬ７プロモーター、ＧＡＬ２プロモーター、ＧＡＬ１プロモーター、ＧＡＬ１０プロモーター、ＧＡＬ３プロモーター、ＧＣＹ１プロモーター、ＧＡＬ８０プロモーターからなる群より選択されるガラクトース誘導性プロモーターが含まれる、項目１、３、または７に記載の方法。
（項目２０）
上記宿主細胞に、ラクターゼまたはその生物学的に活性な断片が含まれる、項目１、３、または７に記載の方法。
（項目２１）
上記宿主細胞に、ラクターゼ酵素をコードする外因性配列が含まれる、項目１、３、または７に記載の方法。
（項目２２）
上記宿主細胞に、分泌可能なラクターゼをコードする外因性配列が含まれる、項目１、３、または７に記載の方法。
（項目２３）
上記宿主細胞がガラクトースを異化する低減された能力を示す、項目１、３、または７に記載の方法。
（項目２４）
上記宿主細胞が、機能性のＧＡＬ１タンパク質、ＧＡＬ７タンパク質、および／またはＧＡＬ１０タンパク質を欠いている、項目１、３、または７に記載の方法。
（項目２５）
上記宿主細胞がＧＡＬ４タンパク質を発現する、項目１、３、または７に記載の方法。
（項目２６）
上記宿主細胞が、構成的なプロモーターの制御下でＧＡＬ４タンパク質を発現する、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
上記宿主細胞が原核生物細胞である、項目１、３、または７に記載の方法。
（項目２８）
上記宿主細胞が真核生物細胞である、項目１、３、または７に記載の方法。
（項目２９）
上記宿主細胞がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである、項目１、３、または７に記載の方法。
（項目３０）
培地中で培養すると、ガラクトース誘導性調節エレメントに作動可能であるように連結された異種配列を発現するように修飾された宿主細胞であって、該異種配列の発現が、該培地にガラクトースを直接補充することなく誘導される、宿主細胞。
（項目３１）
上記異種配列の発現が、ガラクトースではない糖によって、ガラクトースが補充された培地中で上記宿主細胞を培養することによって得られるレベルと同等のレベルにまで誘導され、補充されたガラクトースの量とガラクトースではない糖の量は、モル数として測定すると同等である、項目３０に記載の宿主細胞。
（項目３２）
培地中で培養すると、ガラクトース誘導性調節エレメントに作動可能であるように連結された異種配列を発現するように修飾された宿主細胞であって、該異種配列の発現が、ラクトースの存在下で誘導される、宿主細胞。
（項目３３）
上記異種配列の発現が、ラクトースが補充されると、ガラクトースが補充された培地中で上記宿主細胞を培養することによって得られるレベルと同等のレベルにまで誘導され、補充されたガラクトースの量とラクトースの量は、モル数として測定すると同等である、項目３１に記載の宿主細胞。
（項目３４）
上記宿主細胞に、ガラクトーストランスポーターまたはその生物学的に活性な断片が含まれる、項目３０または３２に記載の宿主細胞。
（項目３５）
上記宿主細胞に、ＧＡＬ２ガラクトーストランスポーターまたはその生物学的に活性な断片が含まれる、項目３０または３２に記載の宿主細胞。
（項目３６）
上記宿主細胞に、ラクトーストランスポーターまたはその生物学的に活性な断片が含まれる、項目３０または３２に記載の宿主細胞。
（項目３７）
上記ガラクトース誘導性調節エレメントが、１つまたは複数の染色体外プラスミドに含まれる、項目３０または３２に記載の宿主細胞。
（項目３８）
上記ガラクトース誘導性調節エレメントが上記宿主細胞のゲノムに組み込まれる、項目３０または３２に記載の宿主細胞。
（項目３９）
上記ガラクトース誘導性調節エレメントに、ＧＡＬ７プロモーター、ＧＡＬ２プロモーター、ＧＡＬ１プロモーター、ＧＡＬ１０プロモーター、ＧＡＬ３プロモーター、ＧＣＹ１プロモーター、およびＧＡＬ８０プロモーターからなる群より選択されるガラクトース誘導性プロモーターが含まれる、項目３０または３２に記載の宿主細胞。
（項目４０）
上記宿主細胞にラクターゼ酵素が含まれる、項目３０または３２に記載の宿主細胞。
（項目４１）
上記宿主細胞に、ラクターゼ酵素またはその生物学的に活性な断片をコードする外因性配列が含まれる、項目３０または３２に記載の宿主細胞。
（項目４２）
上記宿主細胞に、分泌可能なラクターゼをコードする外因性配列が含まれる、項目３０または３２に記載の宿主細胞。
（項目４３）
上記宿主細胞が、ガラクトースを異化する低減された能力を示す、項目３０または３２に記載の宿主細胞。
（項目４４）
上記宿主細胞が、機能的なＧＡＬ１タンパク質、ＧＡＬ７タンパク質、および／またはＧＡＬ１０タンパク質を欠いている、項目３０または３２に記載の宿主細胞。
（項目４５）
上記宿主細胞がＧＡＬ４タンパク質を発現する、項目３０または３２に記載の宿主細胞。
（項目４６）
上記宿主細胞が、構成的なプロモーターの制御下でＧＡＬ４タンパク質を発現する、項目３０または３２に記載の宿主細胞。
（項目４７）
上記宿主細胞が原核生物細胞である、項目３０または３２に記載の宿主細胞。
（項目４８）
上記宿主細胞が真核生物細胞である、項目３０または３２に記載の宿主細胞。
（項目４９）
上記宿主細胞がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである、項目３０または３２に記載の宿主細胞。
（項目５０）
上記異種配列がタンパク質様産物をコードする、項目３０または３２に記載の宿主細胞。
（項目５１）
上記異種配列が、アンチセンス分子、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アプタマー、およびリボザイムからなる群より選択される産物を生産する、項目３０または３２に記載の宿主細胞。
（項目５２）
デオキシキシルロース５−リン酸（ＤＸＰ）経路を通じてイソプレノイドを生産する、項目３０または３２に記載の宿主細胞であって、上記異種配列が、メバロン酸非依存性デオキシキシルロース５−リン酸（ＤＸＰ）経路の１種類またはそれ以上の酵素をコードする、宿主細胞。
（項目５３）
メバロン酸（ＭＥＶ）経路を通じてイソプレノイドを生産する、項目３０または３２に記載の宿主細胞であって、上記異種配列が、該ＭＥＶ経路の１種類またはそれ以上の酵素をコードする、宿主細胞。
（項目５４）
上記イソプレノイドが、Ｃ５〜Ｃ２０イソプレノイドである、項目５３または５４に記載の宿主細胞。
（項目５５）
上記イソプレノイドがＣ２０＋イソプレノイドである、項目５２または５３に記載の宿主細胞。
（項目５６）
上記イソプレノイドがカロテノイドである、項目５２または５３に記載の宿主細胞。
（項目５７）
ガラクトース誘導性調節エレメントに作動可能であるように連結された第１の異種配列と、ラクターゼまたはその生物学的に活性な断片をコードする第２の異種配列とを含む発現ベクターであって、宿主細胞に導入されると、該宿主細胞が該第１の異種配列の発現を誘導するのに十分な量のラクトースが補充された培地中で培養されたときに、該発現ベクターが、該宿主細胞中で該第１の異種配列の発現を生じる、発現ベクター。
（項目５８）
ラクターゼまたはその生物学的に活性な断片をコードする上記第２の異種配列が発現され、ラクトースをグルコースとガラクトースとに加水分解する、項目５７に記載の発現ベクター。
（項目５９）
ＤＸＰ経路の酵素またはその生物学的に活性な断片をコードする異種配列をさらに含む、項目５７に記載の発現ベクター。
（項目６０）
ＭＥＶ経路の酵素またはその生物学的に活性な断片をコードする異種配列をさらに含む、項目５７に記載の発現ベクター。
（項目６１）
ラクトーストランスポーターをコードする異種配列をさらに含む、項目５７に記載の発現ベクター。
（項目６２）
ガラクトーストランスポーターまたはその生物学的に活性な断片をコードする異種配列をさらに含む、項目５７に記載の発現ベクター。
（項目６３）
少なくとも１つの第１の発現ベクターと少なくとも１つの第２の発現ベクターとを含む発現ベクターのセットであって、該第１の発現ベクターには、ガラクトース誘導性調節エレメントに作動可能であるように連結された第１の異種配列が含まれ、そして第２の発現ベクターには、ラクターゼまたはその生物学的に活性な断片をコードする第２の異種配列が含まれ、宿主細胞に導入されると、該発現ベクターのカセットは、該宿主細胞を該第１の異種配列の発現を誘導するのに十分な量のラクトースが補充されている培地中で培養するとき、該宿主細胞中で該第１の異種配列の発現を生じる、発現ベクターのセット。
（項目６４）
ラクターゼまたはその生物学的に活性な断片をコードする上記第２の異種配列が発現され、ラクトースをグルコースとガラクトースとに加水分解する、項目６３に記載の発現ベクターのセット。
（項目６５）
ＤＸＰ経路の酵素またはその生物学的に活性な断片をコードする異種配列をさらに含む、項目６３に記載の発現ベクターのセット。
（項目６６）
ＭＥＶ経路の酵素またはその生物学的に活性な断片をコードする異種配列がさらに含まれる、項目６３に記載の発現ベクターのセット。
（項目６７）
ラクトーストランスポーターまたはその生物学的に活性な断片をコードする異種配列をさらに含む、項目６３に記載の発現ベクターのセット。
（項目６８）
ガラクトーストランスポーターまたはその生物学的に活性な断片をコードする異種配列をさらに含む、項目６３に記載の発現ベクターのセット。
（項目６９）
項目５７に記載の発現ベクターと、キットの使用説明書とを含む、キット。
（項目７０）
項目６３に記載の発現ベクターのカセットと、キットの使用説明書とを含む、キット。
（項目７１）
項目３０または３２に記載の宿主細胞を含む、細胞培養物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
宿主細胞中で異種配列を発現させる方法であって、該異種配列が発現される培地中および条件下で該宿主細胞を培養する工程を含み、該異種配列が、ガラクトース誘導性調節エレメントに作動可能であるように連結され、そして該異種配列の発現が、該培地にガラクトースを直接補充することなく誘導される、方法。
【請求項２】
前記異種配列が、前記培地にラクトースを添加したときに誘導される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記異種配列が、タンパク質性産物、またはアンチセンス分子、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＥＧＳ、アプタマー、およびリボザイムからなる群より選択される産物をコードする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記異種配列が、メバロン酸（ＭＥＶ）経路またはメバロン酸非依存性デオキシキシルロース５−リン酸（ＤＸＰ）経路の１種類またはそれ以上の酵素をコードし、そして前記宿主細胞がイソプレノイドを生産する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
前記イソプレノイドが、Ｃ５〜Ｃ２０イソプレノイドである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記宿主細胞に、プレニルトランスフェラーゼおよびイソプレノイドシンターゼをコードする外因性配列がさらに含まれる、請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
前記１種類またはそれ以上の異種配列の発現が、ラクトースの存在下で誘導される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記培地にラクトースとラクターゼとが含まれる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記宿主細胞に、ラクトーストランスポーターまたはその生物学的に活性な断片が含まれる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ガラクトース誘導性調節エレメントに、ＧＡＬ７プロモーター、ＧＡＬ２プロモーター、ＧＡＬ１プロモーター、ＧＡＬ１０プロモーター、ＧＡＬ３プロモーター、ＧＣＹ１プロモーター、ＧＡＬ８０プロモーターからなる群より選択されるガラクトース誘導性プロモーターが含まれる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記宿主細胞に、ラクターゼ酵素をコードする外因性配列が含まれる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記宿主細胞が真核生物細胞である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記宿主細胞がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
培地中で培養すると、ガラクトース誘導性調節エレメントに作動可能であるように連結された異種配列を発現するように修飾された宿主細胞であって、該宿主細胞は、請求項１〜１３のいずれか一項に記載されるものである、宿主細胞。
【請求項１５】
請求項１４に記載の宿主細胞を含む、細胞培養物。
【請求項１６】
ガラクトース誘導性調節エレメントに作動可能であるように連結された第１の異種配列と、ラクターゼまたはその生物学的に活性な断片をコードする第２の異種配列とを含む発現ベクターであって、宿主細胞に導入されると、該宿主細胞が該第１の異種配列の発現を誘導するのに十分な量のラクトースが補充された培地中で培養されたときに、該発現ベクターが、該宿主細胞中で該第１の異種配列の発現を生じる、発現ベクター。
【請求項１７】
ＭＥＶ経路の酵素またはその生物学的に活性な断片あるいはＤＸＰ経路の酵素またはその生物学的に活性な断片をコードする異種配列をさらに含む、請求項１６に記載の発現ベクター。
【請求項１８】
ラクトーストランスポーターをコードする異種配列をさらに含む、請求項１６または１７に記載の発現ベクター。
【請求項１９】
少なくとも１つの第１の発現ベクターと少なくとも１つの第２の発現ベクターとを含む発現ベクターのセットであって、該第１の発現ベクターには、ガラクトース誘導性調節エレメントに作動可能であるように連結された第１の異種配列が含まれ、そして第２の発現ベクターには、ラクターゼまたはその生物学的に活性な断片をコードする第２の異種配列が含まれ、宿主細胞に導入されると、該発現ベクターのカセットは、該宿主細胞を該第１の異種配列の発現を誘導するのに十分な量のラクトースが補充されている培地中で培養するとき、該宿主細胞中で該第１の異種配列の発現を生じる、発現ベクターのセット。