(57)【要約】【課題】従来、専門的知識と熟練を要す方法しか確立していなかった細菌性膣症の診断において、熟練を要さずとも、迅速かつ簡易簡便に客観的な診断結果を得ることができる液体培地を提供する。【解決手段】乳酸菌用培地にｐＨ指示薬としてクロロフェノールレッドを添加し、特に、初期ｐＨが厳密に規定された液体培地を開示する。当該液体培地に膣検体を植付けて一定時間培養すれば、膣検体に含まれる乳酸菌の初期菌数に依存して赤色〜黄色の明瞭な色変化が生じるため、容易に客観的な細菌性膣症の診断をすることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細菌性膣症を診断するために使用される培地であって、炭素／窒素栄養源，酵母エキス，必須微量金属，および選択的菌類抑制物質を含む乳酸菌用培地において、ｐＨ指示薬としてクロロフェノールレッドを含有し、液体であり、且つそのｐＨが５．７０〜５．９５であることを特徴とする細菌性膣症診断用培地。
【請求項２】
約２４時間以内に診断結果を得ることができる請求項１に記載の細菌性膣症診断用培地。
【請求項３】
ｐＨが５．７５〜５．９０である請求項１または２に記載の細菌性膣症診断用培地。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、細菌性膣症を診断するために使用される液体培地に関するものであり、この液体培地によれば、培地の色変化を見ることにより極めて簡便かつ容易に細菌性膣症の診断結果を得ることができる上に、定量的な判断も可能である。
【０００２】
【従来の技術】
膣内は、常在菌である乳酸菌の作用により酸性条件に保たれることで自己防御作用や自浄作用を備えているが、これら作用が低下することで膣炎を発症する場合がある。斯かる膣炎は、特異性膣炎（カンジダ膣炎およびトリコモナス膣炎）とは別に、非特異的膣炎（細菌性膣炎，老人性膣炎，小児膣炎など）に分類され、外見上の炎症の他におりものの増加や悪臭，痒み等を伴う。特に細菌性膣炎に関しては、実にＳＴＤ外来受診女性の約３割にみられるという海外のデータも提示されている。
【０００３】
また、雑菌に感染しているにも拘わらず炎症を伴わない場合は「細菌性膣症」と称される場合があるが、斯かる「細菌性膣症」は、特に妊婦の場合に大きな問題となる。即ち、症状の自覚があれば診断・治療を受けることにより完治し得るものの、自覚症状が無い状態で放置すると菌が膣内から上行感染し、絨毛羊膜炎（ＣＡＭ）やひいては早産に至ることが最近の研究で明らかとされている。よって、速やかに診断結果が得られなければ感染部位が拡大する結果になりかねない故、細菌性膣症の迅速な診断は、特に産科領域で重要である。
【０００４】
尚、上記の「細菌性膣炎」と「細菌性膣症」には様々な定義があるが、本発明では、原虫や真菌によらない膣の細菌感染症として、「細菌性膣炎」と「細菌性膣症」を合わせて「細菌性膣症」と定義する。
【０００５】
膣炎のうち、特異的膣炎であるカンジダ膣炎とトリコモナス膣炎は原因菌（原虫）が特定されていることから、その診断方法も既に確立されている。一方、細菌性膣症では、以前はガードネレラ・バギナリス（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ）が原因菌として有力であったが、最近ではバクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ），ペプトストレプトコッカス（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）等の嫌気生菌やモビルンカス（Ｍｏｂｉｌｕｎｃｕｓ）の病原的意義が指摘されるようになっており、更に細菌性膣症の症状があるにも拘わらずこれら細菌が検出されない場合もあり、いまだに原因菌が特定されていないのが現状である。
【０００６】
斯かる事情によって、産婦人科領域における細菌性膣症の診断方法としては、原因菌の特定を必要としない２つの方法が確立されている。一つはＡｍｓｅｌ法（ＷＨＯ基準）であり、▲１▼肉眼的所見（灰色帯下），▲２▼アミン臭，▲３▼ｐＨ４．５以上（５．０以上の場合もある），▲４▼クルーセル（Ｃｌｕｅ  ｃｅｌｌ，剥がれた膣上皮細胞に無数の細菌が付着しているもの）のうち３項目を満たす場合は、陽性と判定するものである。もう一つはＳｐｉｅｇｅｌ法と呼ばれる方法であり、「細菌性膣症は、膣内乳酸菌が減少して他の菌に置き換わった状態である」との知見の下、乾燥固定した膣のスメアをグラム染色し、これを顕微鏡観察して一視野内の膣内乳酸菌数から判断するものである。
【０００７】
しかし、いずれの方法も操作が煩雑で熟練を要し、実地臨床では殆ど使われていない。
【０００８】
ところで、上記Ｓｐｉｅｇｅｌ法における知見により、膣内防御作用等に関係する乳酸菌の存在状況を知るべくこれを培養することは、原因菌が特定されていない細菌性膣症の診断において有用であると考えられる。
【０００９】
乳酸菌を培養するための培地としては、Ｂａｃｔｏ  Ｓｎｙｄｅｒ  Ｔｅｓｔ  Ａｇａｒが日本ベクトン・デッキンソン社から市販されている。当該培地は指示薬としてブロモクレゾールグリーンを含み、色変化（青緑色→緑色→黄色）によって乳酸菌を検出することができる。しかし、結果を得るまでに７２時間かかり迅速な診断ができない上、粉末寒天培地である故に、検体接種前に用時加温溶解しなければならず面倒である。
【００１０】
また、同じく日本ベクトン・デッキンソン社より、Ｂａｃｔｏ  Ｒｏｇｏｓａ  ＳＬ  Ｂｒｏｔｈが市販されている。当該培地は、前者（Ｂａｃｔｏ  Ｓｎｙｄｅｒ  Ｔｅｓｔ  Ａｇａｒ）とは異なり液体培地ではあるものの指示薬を含んでおらず、その使用説明書にも指示薬に関する示唆は何らされていない。つまり、単に口、糞便、膣内からの乳酸菌を分離培養し、その生育状況を観察できるものに過ぎない。
【００１１】
そして何よりも、前者の培地は迅速性に欠け、後者の培地は単に乳酸菌等を分離培養するためのものであるため、何れも細菌性膣症の診断に応用することはできない。例えば、Ｂａｃｔｏ  Ｓｎｙｄｅｒ  Ｔｅｓｔ  ＡｇａｒのｐＨは４．８±０．２であるが、この様な低ｐＨでは乳酸菌が短時間で充分に生育できず迅速な診断結果が得られないのみならず、乳酸菌の生育に応じた培地の色変化を明瞭に観察することができないため、細菌性膣症の診断に応用するには限界がある。この様に迅速な診断結果が得られない場合には、特に妊婦の診断においては取り返しのつかない結果に繋がる可能性がある。斯かる状況は、そのｐＨが５．４±０．２のＢａｃｔｏ  Ｒｏｇｏｓａ  ＳＬ  Ｂｒｏｔｈでも同様である。以上のことより、これら従来培地は迅速性と操作性に問題があり、膣内常在菌である乳酸菌の存在量を判断の指標とする細菌性症の迅速診断に応用することは困難である。
【００１２】
更に、下記非特許文献１には、乳酸菌の糖分解試験培地が記載されている。当該培地は指示薬としてクロロフェノールレッドを含むものの、やはり寒天培地であって正確な色判別ができないだけでなく、７日或いは１０日の培養が必要である。
【００１３】
その上、この糖分解試験培地のｐＨは６．５であり、初期ｐＨがこの様に高い場合は、前記Ｂａｃｔｏ  Ｓｎｙｄｅｒ  Ｔｅｓｔ  Ａｇａｒと同様に培地の色変化を明瞭に観察できないのみならず、乳酸菌以外の雑菌が繁殖するという問題がある。従って、膣検体を培地に植付した場合には、乳酸菌の生育が抑制されて培地の診断感度が極端に低下するので、この糖分解試験培地を細菌性膣症の診断に用いることはできない。
【００１４】
また、下記非特許文献２にもクロロフェノールレッドを含む乳酸菌用液体培地が記載されているが、培養に７日も必要とされている。そして、やはりその初期ｐＨが６．６であることから細菌性膣症の診断に応用できるものではなく、勿論、クロロフェノールレッドを含む乳酸菌用培地が細菌性膣症の診断に極めて有用であることに関しては、何ら記載も示唆もされていない。
【００１５】
【非特許文献１】
光岡知足，「乳酸菌の細菌学」，臨床検査，１９７４年１１月，第１８巻，第１１号，ｐ．１１６３−１１７２
【非特許文献２】
デイヴィッド・ビー・サビン（Ｄａｖｉｄ  Ｂ．  Ｓａｂｉｎｅ）ら，「ラクトバシラスアシドフィラスの微量元素要求（Ｔｒａｃｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔ  Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｏｆ  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）」，ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），１９６７年４月２９日，第２１４巻，ｐ．５２０
【００１６】
【発明が解決しようとする課題】
上述した様に乳酸菌用の培地自体は知られているが、そのほとんどが菌発育用か分離用である。また、ｐＨ指示薬であるクロロフェノールレッドの従来培地への添加例はこれまでにも知られてはいるが、乳酸菌の生物学的性状の研究（糖分解試験や微量元素要求試験）が目的であり、当該培地のように細菌性膣症の診断に応用することなど誰も考えなかった。
【００１７】
本発明は上記のような事情に鑑みてなされたものであって、その目的は、細菌性膣症の診断を簡易簡便に行なうことができ、且つ診断結果を迅速に得ることができる上に、結果を定量的に得ることも可能であり、検体中に存在する初発菌数までも推定し得る様な液体培地を提供することにある。
【００１８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決すべく、その原因菌が特定されていない細菌性膣症の診断では、膣の防御作用等に関係している常在乳酸菌の存在状況を測定すれば、間接的に診断が可能であるとの知見に基づいて鋭意研究を重ねたところ、本発明の構成を採用すれば操作が簡易簡便であるだけでなく、従来技術に比して迅速に正確な診断結果を得ることができることを見出して、本発明を完成するに至った。
【００１９】
つまり、ｐＨ指示薬を含む従来の培地や既存の培地にｐＨ指示薬を添加して細菌性膣症の診断に応用しても、迅速に診断結果を得ることができないばかりか、定性的な結果しか得られないことから感染状況を正確に把握することができず、実際の臨床に応用できるものではなかった。
【００２０】
この様な状況下、本発明者らは、適切なｐＨ指示薬を選択し培地を液体とした上で、初期の培地ｐＨを厳密に規定すれば、細菌性膣症の診断において雑菌の生育を抑制できるだけでなく、正常な状態（感染無し）から重篤な感染状態まで培地色が段階的で且つ明瞭に変化するため、簡易簡便にほぼ定量的な結果を迅速に得ることができ、初発菌数をも推定し得ることを見出して本発明を完成した。
【００２１】
即ち、本発明の細菌性膣症診断用培地は、細菌性膣症を診断するために使用される培地であって、炭素／窒素栄養源，酵母エキス，必須微量金属，および選択的菌類抑制物質を含む乳酸菌用培地において、ｐＨ指示薬としてクロロフェノールレッドを含有し、液体であり、且つそのｐＨが５．７０〜５．９５であることを特徴とする。
【００２２】
上記細菌性膣症診断用培地は、約２４時間以内に診断結果を得ることができるものが好ましい。妊婦の細菌性膣症診断では、特に迅速な結果を得ることが重要であり、また、上記の構成を採用すれば、約２４時間以内に診断結果を得ることは充分に可能である。
【００２３】
上記ｐＨとしては、５．７５〜５．９０の範囲が特に好ましい。乳酸菌の生育に応じた色変化がより明瞭であり、更に正確な診断結果を得ることができるからである。
【００２４】
【発明の実施の形態】
本発明に係る細菌性膣症診断用液体培地が享有する最大の特長は、細菌性膣症の診断を簡易簡便にできるのみならず迅速に結果が得られ、また、得られる結果も従来技術に比して顕著に正確な点にある。
【００２５】
即ち、膣内には常在菌として防御作用等を担う乳酸菌が存在しているが、非常在細菌に感染した場合には相対的に乳酸菌の存在量が減ることになる。また、乳酸菌は増殖に伴って乳酸を生成し、環境を酸性にするという特徴を示す。本発明はこれら知見に基づいて完成されたものであり、乳酸菌を選択的に培養できる培地に含有せしめるべき適切なｐＨ指示薬等の探索や培地初期ｐＨに関する厳密な実験の結果により、上記特徴の全てを満たすに至ったものである。
【００２６】
以下に、斯かる特徴を発揮する本発明の実施形態、及びその効果について説明する。
【００２７】
本発明の液体培地は、細菌性膣症の診断のために使用されるものである。つまり、従来においても乳酸菌を選択的に培養するための培地は知られていたが、本発明では、その構成を更に工夫することによって、これまで簡易簡便な診断方法が確立されていなかった細菌性膣症の診断への応用を初めて可能にした。
【００２８】
本発明に係る液体培地の構成成分である「炭素／窒素栄養源」は、乳酸菌の生育に必須の炭素源と窒素源となるものであれば特に制限なく使用できるが、例えば、「炭素栄養源」としてはデキストロース，アラビノース，サッカロース等の糖類、「窒素栄養源」としてはペプトン，トリプトン，カザアミノ酸等の総合アミノ酸やペプチドを好適に用いることができる。これら「炭素／窒素栄養源」は、１〜１０質量％添加することが好ましい。１質量％未満であると菌体増殖が不十分となり、また、１０質量％を超えると却って増殖が阻害されるからである。
【００２９】
「酵母エキス」も乳酸菌の栄養源となるものであるが、特に上記「炭素／窒素栄養源」に含まれないビタミン等の微量元素であって、乳酸菌の生育に欠かせないものを供給する役割を有する。その好適な添加量は、１質量％以下（０質量％を含まない）とする。
【００３０】
「必須微量金属」は乳酸菌の充分な生育に必要な金属元素をいい、例えばマグネシウム，マンガン，鉄等を挙げることができる。これらは金属塩の形態、例えば硫酸マグネシウム，硫酸マンガン，硫酸第一鉄等として添加することができる。これらの好適な添加量は、硫酸マグネシウム０．０１〜０．０６質量％，硫酸マンガン０．０１〜０．０５質量％，硫酸第一鉄０．０２〜０．０３質量％である。
【００３１】
「選択的菌類抑制物質」とは、乳酸菌の生育に対する影響が少ないにも拘わらず、真菌や原虫、乳酸菌以外の細菌に対して有効な抑制物質をいい、検体中に混在する雑菌の増殖を抑制できるものをいう。このような「選択的菌類抑制物質」としては、例えば酢酸ナトリウム，クエン酸アンモニウム，オレイン酸ナトリウム，プロピオン酸ナトリウム等の選択的乳酸菌用培地に使用されている選択的菌類抑制物質；アムホテリシンＢ等の抗真菌剤；メトロニダゾール等の抗トリコモナス原虫剤；ノルフロキサシン，シプロフロキサシン等の抗病原細菌剤を挙げることができ、これらを乳酸菌の生育を阻害しない範囲で添加する。これら「選択的菌類抑制物質」の中では、酢酸ナトリウムおよび／またはクエン酸アンモニウムを好適に用いることができる。作用が穏やかであり、乳酸菌の生育を阻害することなく雑菌の増殖を抑制できる上に、適度な緩衝作用を有することから、乳酸菌の発育が旺盛になり、結果として培地の色変化がシャープになるからである。これら「選択的菌類抑制物質」の好適な添加量は、酢酸ナトリウム１〜３質量％，クエン酸アンモニウム０．１〜０．５質量％であり、その他の抗真菌剤等の場合は、乳酸菌の生育を阻害しないために０．００１〜０．００５質量％と極微量にする。
【００３２】
ｐＨ指示薬としては、「クロロフェノールレッド」を使用する。本発明者らは、細菌性膣症の診断用培地に使用できるｐＨ指示薬について種々検討したところ、クロロフェノールレッドが乳酸菌の生育に応じた培地のｐＨ変化に対応して赤色から黄色まで明瞭に変色し、初発菌数に応じた定量的な診断結果が得られることを見出し、添加すべきｐＨ指示薬として定めたものである。また、クロロフェノールレッド以外のｐＨ指示薬であるブロモクレゾールグリーンやブロムクレゾールパープル等は、菌体表面に吸着して沈殿することにより培地の脱色が生じることがあるため、細菌性膣症の診断には使用することができない。
【００３３】
また、本発明の細菌性膣症診断用培地を「液体」としたのは、寒天培地等の固体培地と異なり、ｐＨ指示薬による変色を容易に把握することができ、簡易で且つ迅速な診断が可能となるからである。
【００３４】
本発明に係る細菌性膣症診断用培地は、その初期ｐＨが５．７０〜５．９５であることを必須要件としているが、斯かる範囲を規定した理由は以下の二点にある。
【００３５】
一つは、クロロフェノールレッドの色はｐＨ＜４．８において黄色，ｐＨ＞６．４において赤紫色であり、且つ乳酸菌の生育に伴って培地ｐＨは酸性側に傾くことを前提として、本発明に斯かる培地の初期ｐＨが５．９５を超えている場合には発育初期段階（赤色領域）の色変化を把握し難く、特に５．７０未満である場合には既に黄色が混入していることから各発育段階における色変化に乏しくなり、簡易簡便な診断結果が得られ難くなるからである。一方、初期ｐＨが５．７０〜５．９５の範囲にあれば、乳酸菌の生育に伴って、赤色から黄色に至る色変化が明瞭に現われる。
【００３６】
初期ｐＨを規定したもう一つの理由は、初期ｐＨが５．９５を超えると乳酸菌以外の雑菌が繁殖し易くなることによる。この点に関しては、従来の乳酸菌用培地では乳酸菌の生育しか考慮していなかったため、初期ｐＨが高いものが多く、そのまま細菌性膣症の診断に用いると雑菌が繁殖するために、正確な診断結果を得ることは不可能であった。しかし、本発明では、選択的菌類抑制物質を培地の構成成分とする他に初期ｐＨを規定し、細菌性膣症の診断への応用を可能としている。
【００３７】
以上の効果をより一層有効に発揮させるには、培地ｐＨを５．７５〜５．９０の範囲とすることが好ましい。
【００３８】
この培地初期ｐＨの調節は、ｐＨが高すぎる場合には乳酸を適量加え、ｐＨが低すぎる場合には、水酸化ナトリウム水溶液を加えることにより行なう。
【００３９】
本発明に係る細菌性膣症診断用液体培地を製造するには、上記構成成分を水に加えた後、十分攪拌して均一溶液とするのが好ましい。また、「水」としては、超純水や蒸留水等、液体培地の構成成分として一般的に用いられるものを特に制限なく使用することができる。
【００４０】
一般的には、均一溶液とした後に滅菌処理を行なう。この場合、後述する実施例で実証されたことであるが、高温で長時間という厳格な滅菌処理を行なえば菌の発育が抑えられるものの、保存安定性が低下する傾向にある。逆に、緩和な条件下のオートクレーブ処理やメンブランろ過では、菌の発育がかなり旺盛になり、結果として一部の雑菌で培地の脱色が起きたりするものの、保存時における培地の変色は少ない。従って、滅菌処理の条件は、使用時期や検体中の雑菌の種類により決定すべきであるが、一般的には、１０５〜１１０℃における１〜３分間のオートクレーブ処理や、０．４５μｍ、続いて０．２２μｍの２段階のメンブランろ過を行なう。
【００４１】
本発明に係る細菌性膣症診断用液体培地を使用する診断方法は、簡単にいえば、被験者の膣検体を培地に投入し、一定時間培養した後の色変化によって、細菌性膣症の診断を行なうものである。
【００４２】
しかし、本発明培地は、乳酸菌の生育に伴って鋭敏に色変化を起こすため、本発明の目的を達成できる範囲で使用する培地の量や検体量を決定し、複数被験者を診断する場合には、培地量や検体量は統一すべきである。培地の量や検体量によって、診断結果が異なることを防ぐためである。培地量としては、試験管等に５．０〜５．５ｍｌずつ分注するのが一般的であり、また、検体の採取方法は、膣内に綿棒を挿入してこれを培地中で数秒間浸漬するのが一般的である。しかし、当該培地では綿棒を培地中に入れたままでも培養でき、この場合には検体量にはそれ程注意を払う必要はないが、当然、綿棒の大きさや種類は同一のものを用いるべきである。
【００４３】
また、培養時間は約２４時間以内が望ましい。特に妊婦の細菌性膣症診断では迅速に結果を得ることが求められている上に、約２４時間以内の培養であれば初発菌数と培地ｐＨ（培地の色変化）がほぼ比例関係になるため、培地色変化から膣検体内の乳酸菌初発菌数を推定できるからである。また、約２４時間を超えて培養すると、膣検体に含まれる雑菌の中には乳酸菌の生育を抑制する程度まで増殖するものがあり、培地の色変化に影響を与える等によって、正確な診断が困難となる場合があるからである。逆をいえば、本発明培地による約２４時間以内の培養ならば、乳酸菌の影響のみで培地色が変化する。この点は、２４時間以内の測定が困難であった従来の培地に対するメリットでもある。尚、ここで「約２４時間」とは、上記効果を示す範囲として判断されるが、好ましくは「２４±３時間」をいうものとする。
【００４４】
本発明に係る細菌性膣症診断用液体培地は以上の様に構成されており、本発明培地を使用すれば、細菌性膣症の診断方法として一般的なＡｍｓｅｌ法の様に専門的な知識や技術を要せず、簡易簡便に診断を行なうことができる上に、迅速で客観的な結果を得ることができる。
【００４５】
【実施例】
以下に、製造例および試験例を示し、本発明を更に詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。
【００４６】
（製造例１）本発明に係る培地の調製
本発明に係る細菌性膣症診断用液体培地として、１Ｌ中に下表１の組成成分を含む培地を調製した。即ち、市販のＢａｃｔｏ  Ｒｏｇｏｓａ  ＳＬ  Ｂｒｏｔｈを蒸留水に加えて溶解し、さらにクロロフェノールレッド等の添加成分を加えた後、十分攪拌する。そして１Ｎ−水酸化ナトリウムや１Ｎ−乳酸を加えてｐＨを５．８８に調整して表１の構成にした。
【００４７】
【表１】
2004236574.tif 000002
【００４８】
（試験例１）ｐＨ指示薬の選択
製造例１において、Ｂａｃｔｏ  Ｒｏｇｏｓａ  ＳＬ  Ｂｒｏｔｈにクロロフェノールレッドを加え、次いでｐＨ調節して表２の培地を作成した。また、クロロフェノールレッドの代わりにブロモクレゾールグリーン、またはブロモクレゾールグリーン／ブロモクレゾールパープルを含有する下表２の培地を作成し、各培地に乳酸菌（Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  ＩＦＯ１３９５１）を１×１０６個／ｍｌ（培地）の割合で植付し、３５℃で２４時間インキュベートした後の培地変化を測定した。結果を表２に示す。
【００４９】
【表２】
2004236574.tif 000003
【００５０】
表中、クロロフェノールレッドをＣＰＲと、ブロモクレゾールグリーンをＢＣＧと、ブロモクレゾールパープルをＢＣＰとして示す。
【００５１】
当該結果によれば、ＣＰＲは乳酸菌の生育を阻害することなく、明確な色変化（赤色から黄色）を示すことが明らかにされた。
【００５２】
一方、ＢＣＧ含有培地では、変色域を考えて初期ｐＨを５．４０に設定した。ＢＣＧはｐＨ５．４において青色のはずであるが、培地に混入すると淡緑色になった。また、乳酸菌の発育に従って色素が菌体表面に吸着し、菌の生育が阻害されると共に、試験管底に沈殿して培地の脱色が生じた。この様な現象は、ＢＣＧ／ＢＣＰ混合ｐＨ指示薬においても同様であった。
【００５３】
従って、細菌性膣症診断用培地のｐＨ指示薬としては、クロロフェノールレッドが最適であることが実証された。
【００５４】
（試験例２）各種菌の生育状況
製造例１に示した培地をｐＨ５．９０に調節し、膣内で一般的に観察される各種乳酸菌，他の細菌，真菌，トリコモナス原虫を植付けて３５℃で２４時間培養し、ｐＨを測定し、色変化を観察した。植付量は、乳酸菌で１×１０６個／ｍｌ（培地），他の細菌で１×１０５個／ｍｌ（培地），真菌（カンジダ菌）で１×１０６個／ｍｌ（培地），トリコモナス原虫で１×１０５個／ｍｌ（培地）とした。
【００５５】
尚、日本人女性の膣内乳酸菌組成は、Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓが５０％，Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉが２４％，Ｌ．ｖａｇｉｎａｌｉｓが１０％である。また、乳酸産生能の強さは、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ＞Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ＞Ｌ．ｖａｇｉｎａｌｉｓの順である。
【００５６】
結果を下表３に示す。
【００５７】
【表３】
2004236574.tif 000004
【００５８】
当該結果より、本発明の培地は、実質的に乳酸菌の生育のみで色変化を生じ、乳酸菌以外の細菌等によって色変化は生じないことが明らかにされた。これは、酢酸ナトリウムとクエン酸アンモニウムの添加および初期ｐＨ５．９０という低い初期ｐＨにより他の細菌等が十分に増殖できなかったか、或いは僅かに増殖しても培地の緩衝作用のため培地ｐＨを低下するほどの酸は産生されなかったことが、その理由であると考えられる。
【００５９】
従って、本発明の細菌性膣症診断用液体培地は、実質的に、膣内検体に含まれる乳酸菌のみの生育に応じて色変化を生じるため、色変化によって乳酸菌による膣内の防御機能を試験することができ、ひいては細菌性膣症の診断に使用できることが解かった。
【００６０】
（試験例３）判定基準
製造例１で製造した培地に、日本人女性の一般的な膣内常在乳酸菌（Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ  ＪＣＭ１１３１）を様々な初発菌数で植付け、３５℃で２４時間インキュベートした後の色変化を観察した。結果を下表４と図１に示す。
【００６１】
【表４】
2004236574.tif 000005
【００６２】
表４に示す結果の通り、本発明の細菌性膣症診断用培地を使用すれば乳酸菌を２４時間で培養することができ、また、図１の通り、乳酸菌の生育に伴うｐＨ変化に応じて、赤から黄色まで段階的な色変化を明瞭に観察できることが明らかにされた。従って、膣検体を本発明培地に植付けて培養すれば、検体中の初発菌数に応じて明瞭な色変化が現われるため、培地色変化によって、容易に細菌性膣症の診断ができる。但し、より正確な判断をしたい場合には、培養後の培地ｐＨを測定すればよい。
【００６３】
また、当該結果により、２４時間後の培地色変化によって、膣内の乳酸菌による防御能を判断できることが分かる。即ち、２４時間後の培地色が黄橙色または黄色（ｐＨ約４．６５以下）であれば膣検体中に充分量の乳酸菌が存在したと推定でき、細菌性膣症の判定は陰性であるといえる。逆に赤色または赤橙色（ｐＨ約５．５０以上）であれば、充分量の乳酸菌は存在せず、膣内は雑菌に侵されていると考えられ、細菌性膣症の判定は陽性であると判断できる。その中間である橙色の場合には培地色のみで判断すべきでなく、臨床所見や症状などを含めて総合的に判定すべきである。
【００６４】
本発明に係る液体培地を使用した細菌性膣症の診断では、図１に示す様に、乳酸菌の生育に伴って培地色が赤色から黄色まで段階的に変化する特性を有することから、上記表に示した通り、２４時間培養後の色変化やｐＨに応じて、便宜上スコアを設けた。但し、本発明培地における乳酸菌の生育に対する色変化の鋭敏さから、判断が難しい場合がある。従って、色変化がスコア＋３とスコア＋２のいずれにも属さない場合には＋２．５とし、同様にスコア＋１．７５、スコア＋１．２５、スコア＋０．５を設ける場合もある。
【００６５】
また、上記結果より、膣内に存在する乳酸菌を特定できれば、その乳酸産生能を考慮して、色変化から膣内検体に含まれるおおよその初発乳酸菌数を推定できることも分かる。
【００６６】
（試験例４）オレイン酸ナトリウムとプロピオン酸ナトリウムの添加効果
製造例１で製造した培地を１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌し、更にオレイン酸ナトリウム（以下、「ＯＡＮａ」と表わす）とプロピオン酸ナトリウム（以下、「ＰＡＮａ」と表わす）を下表５の濃度（ｍｃｇ／ｍｌ）で加えてメンブラン濾過した。
【００６７】
この培地（ｐＨ５．８０）に乳酸菌（ＪＣＭ１１３１）を植付け３５℃で２４時間インキュベートし、ＯＡＮａとＰＡＮａが菌の生育に与える影響を調べた。結果を表５に示す。
【００６８】
【表５】
2004236574.tif 000006
【００６９】
当該結果より、ＯＡＮａとＰＡＮａを過剰に加えると、乳酸菌の生育が抑えられて感度が低下することが明らかとなった。
【００７０】
また、乳酸菌以外の雑菌に関しても、同様の実験を行なった。但し、培養状況は菌数を指標として評価した。培地のみの培養結果を表６に、ＯＡＮａ（４００ｍｃｇ／ｍｌ）とＰＡＮａ（５０ｍｃｇ／ｍｌ）を添加した培地での培養結果を表７に示す。
【００７１】
【表６】
2004236574.tif 000007
【００７２】
【表７】
2004236574.tif 000008
【００７３】
表中の略号は、ＳＡ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ），ＧＢＳ（Ｇｒｏｕｐ  Ｂ  ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ），ＳＦ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ），ＥＣ（Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ），ＣＡ（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ），ＳＥ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ），ＰＡ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ），ＫＰ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ），ＰＶ（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｖｕｒｇａｌｉｓ），ＣＧ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ），Ｐａ（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ  ＪＣＭ８１４３），Ｆｎ（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ  ＪＣＭ６３２８）である。
【００７４】
尚、２×１０５個／ｍｌ  ｍｅｄｉａは、膣分泌物量当たりに換算すると１０７個／ｍｌとなり、通常、常在菌として考えられる最大濃度である。
【００７５】
当該結果より、培地のみで培養した場合およびＯＡＮａとＰＡＮａを添加した場合共に、若干増殖している菌があるものの、全体として雑菌の発育は抑制されているといえ、嫌気性菌（ＰａとＦｎ）については、完全に淘汰されていることが分かった。また、雑菌の増殖が多少みられる場合であっても、２４時間程度の培養時間であれば、培地の色変化に影響を与えないことも明らかとされた。その理由は、雑菌の酸産生能が乳酸菌に比べて劣るため、雑菌の数が多少増えても、培地が有する緩衝能を超えることができないことによると考えられる。
【００７６】
以上の結果より、細菌性膣症を診断するための培地感度（乳酸菌の生育）を向上させるためにはＯＡＮａとＰＡＮａを添加することが好ましく、その添加量は、感度と特異性とのバランスを考慮して、それぞれ２００〜４００ｍｃｇ／ｍｌ，５０〜１００ｍｃｇ／ｍｌが好適であることが証明された。
【００７７】
（試験例５）培地の滅菌条件
上記試験例４において、培地の滅菌条件を１０５℃で１分にして、同様の実験を行なった。結果を表８に示す。
【００７８】
【表８】
2004236574.tif 000009
【００７９】
表８によれば、乳酸菌（ＪＣＭ１１３１）の生育が明らかに抑制されている。また、ＯＡＮａとＰＡＮａの存在に拘わらずＧＢＳが生育しており、ＳＦの場合にはｐＨ指示薬の吸着が生じて培地の脱色が起こったが、脱色度合いは小さくなっていた。従って、滅菌条件も培地の診断感度に重要であることが明らかとなった。
【００８０】
（試験例６）選択的菌類抑制物質の効果
試験例４と同様の条件（但し、培地ｐＨ５．８）によって、その他の選択的菌類抑制物質の効果を調べた。選択的菌類抑制物質としては、アジ化ナトリウム（ＮａＮ３，２００μｇ／ｍｌ  ｍｅｄｉａ），ノルフロキサシン（ＮＦＸ，１０μｇ／ｍｌ  ｍｅｄｉａ），メトロニダゾール（ＭＴＺ，１０μｇ／ｍｌ  ｍｅｄｉａ），アムホテリシンＢ（ＡｍＢ，１２．５μｇ／ｍｌ  ｍｅｄｉａ），シプロフロキサシン（ＣＦＸ，１０μｇ／ｍｌ  ｍｅｄｉａ）を用いた。乳酸菌を培養した結果を表９に、その他の雑菌を培養した結果を表１０〜１２示す。
【００８１】
【表９】
2004236574.tif 000010
【００８２】
【表１０】
2004236574.tif 000011
【００８３】
【表１１】
2004236574.tif 000012
【００８４】
【表１２】
2004236574.tif 000013
【００８５】
当該結果より、選択的菌類抑制物質としてアジ化ナトリウムを添加すると乳酸菌の生育も抑制され、培地感度が著しく低下することが明らかにされた。一方、それ以外の上記選択的菌類抑制物質は、乳酸菌の生育を阻害することなく病原菌の生育を抑制でき、特にシプロフロキサシンは特異性に効果を示すことが証明された。
【００８６】
尚、培地中２×１０５個／ｍｌ  ｍｅｄｉａ（ＣＡ，ＣＧ，Ｐａ，Ｆｎは除く）は、膣分泌物１ｍｌ当たりに換算すると１０７個／ｍｌとなり、通常、常在菌として考えられる最大濃度である。ＣＡ，ＣＧ１０５個／ｍｌ  ｍｅｄｉａは、膣分泌物１ｍｌ当たり１０７個／ｍｌとなり、カンジダ膣炎患者の最大濃度である。また、Ｐａ，Ｆｎ１〜２×１０７個／ｍｌ  ｍｅｄｉａについては、膣分泌物１ｍｌ当たり１０９個／ｍｌとなり、ＢＶ患者の最大濃度である。
【００８７】
（試験例７）雑菌共存下における乳酸菌培養実験
上記試験例４〜６によって、本発明培地を使用して乳酸菌以外の雑菌を培養しても、２４時間程度の培養時間であれば問題となる程の雑菌増殖は観察されず、また、培地の色変化は殆ど見られないことが明らかにされた。
【００８８】
しかし、これら雑菌は、たとえ培地色に影響を与えなくても乳酸菌の生育を抑制し、正確な細菌性膣症の診断結果を得られない原因となるおそれがある。
【００８９】
そこで、乳酸菌と雑菌を混合培養し、培地色変化に与える影響を調べた。培地は製造例１で製造したものを使用し、３５℃で２４時間インキュベートした後の培地色を観察した。結果を表１３に示す。
【００９０】
【表１３】
2004236574.tif 000014
【００９１】
表中、ＴｖはＴｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ  ｖａｇｉｎａｌｉｓを示す。
【００９２】
上記結果より、乳酸菌と雑菌が共存していても、細菌性膣症診断に対する本発明培地の色変化には殆ど影響が見られず、感度に問題はないことが明らかになった。
【００９３】
雑菌が存在していても感度に影響がないことの理由は、培地ｐＨが低い場合には雑菌の拮抗作用が抑制され、乳酸菌が排除され難くなることや（牛島彊，医学と生物，第１２１巻，第４号，第１９３〜１９７頁（１９９０年）を参照）、乳酸菌の生育に伴う▲１▼培地ｐＨの低下，▲２▼殺菌作用のあるＨ２Ｏ２の産生，▲３▼幅広い抗菌活性をもつバクテリオシンの産生（Ａｌｌａ  Ａｒｏｕｔｃｈｅｖａ，  ＭＤら，アメリカン・ジャーナル・オブ・オブステトリシアン・アンド・ガイニコロジスツ（Ａｍ．  Ｊ．  Ｏｂｓｔｅｔ．  Ｇｙｎｅｃｏｌ．），第１８５巻，第２号，第３７５〜３７９頁（２００１年）を参照）にあると考えられる。また、培養時間が長期に亘れば、雑菌の増殖による診断結果への悪影響が生じることも考えられるが、２４時間の培養であるならば、診断結果に影響は無い。
【００９４】
以上より、乳酸菌以外の雑菌が存在する膣検体を、本発明培地に植付けても、乳酸菌の発育による培地色変化に影響は無く、細菌性膣症の診断を行なえることが明確にされた。
【００９５】
（試験例８）培地ｐＨの影響
製造例１の培地を使用し、そのｐＨを変更して各菌を植付け、その生育状況を観察し、感度や特異性に与える影響を調べた。結果を表１４に示す。
【００９６】
【表１４】
2004236574.tif 000015
【００９７】
培養前の培地では、ｐＨ５．６で赤橙色であり、既に黄色がかっている。また、ｐＨ６．２で赤紫色であり、徐々にｐＨが低下しても赤色領域での色変化が続くことから、乳酸菌の生育に伴う色変化を明瞭に把握するには、初期ｐＨは５．７０〜５．９５であることが必要である。
【００９８】
また、表１４の結果によれば、初期ｐＨが５．４では乳酸菌の生育も抑えられて感度が低下し、また、ｐＨ５．９を超えると雑菌の繁殖が生じ、特にｐＨ６．２以上では、１０５個／ｍｌで植付けた場合であってもＧＢＳやＳＦ等の乳酸菌以外の雑菌が生育してくる。従って、斯かる結果によっても初期ｐＨは５．７０〜５．９５の範囲であることが必要であることが実証された。
【００９９】
（試験例９）滅菌方法の効果
製造例１の培地を使用し、様々な条件で滅菌した上で菌を植付け３５℃で２４時間培養し、それぞれの条件下における診断感度，特異性，安定性について試験した。結果を表１５に示す。
【０１００】
【表１５】
2004236574.tif 000016
【０１０１】
上記の滅菌条件下における乳酸菌の生育結果によれば、より厳しい条件ほど生育が抑えられる傾向にあるが、細菌性膣症の診断が困難になる程度ではなかった。しかし、滅菌条件が緩和なほど呈色度が強く、また、変色域付近での呈色の切れが良かった。
【０１０２】
特異性に関しては、やはり滅菌条件が緩和であれば乳酸菌以外の雑菌も増殖し、菌種によっては培地の脱色が生じている。
【０１０３】
遮光、冷所保存での安定性に関しては、１２１℃で１５分間オートクレーブした培地は、１ヶ月で外観が赤褐色化し、培養後の色変化も鮮明でなくなった。
【０１０４】
以上より、滅菌法の相違が診断感度や安定性等に影響することから、診断状況，膣検体に含まれる雑菌の種類，滅菌後直に使用するか或いは一定期間保存するのか等によって、滅菌条件を変更するのが望ましいことが明らかになった。
【０１０５】
（試験例１０）水質と安定性との関係
超純水と蒸留水を用い製造例１の成分構成で培地を作成し、種々の条件にて滅菌した上で、室温，遮光なしの保存で安定性を試験した。結果を表１６に示す。
【０１０６】
【表１６】
2004236574.tif 000017
【０１０７】
当該結果より、水の種類は培地安定性には関係なく、滅菌条件が過酷なほど安定性が悪いのが分かった。
【０１０８】
（試験例１１）初発菌数とｐＨとの相関性
製造例１の培地を用い、種々の乳酸菌につき初発菌数を変化させて植付け、３５℃で２４時間インキュベートし培養した後のｐＨを測定した。結果を表１７に示す。
【０１０９】
【表１７】
2004236574.tif 000018
【０１１０】
上記結果に基づき、菌液濃度（初発菌数）をＹ，ｐＨをＸとして回帰式を求め表１８に示した。
【０１１１】
【表１８】
2004236574.tif 000019
【０１１２】
ＪＣＭ１１３１ではｌｏｇＹ＝７．０７７−０．１８２８Ｘであり、相関係数ｒ２＝０．８５８９の負の相関を有することが分かった。同様に、他の菌でもｒ２＝０．９２〜０．９８の負の相関を有している。
【０１１３】
従って、これら式より２４時間培養後のｐＨによって、臨床試験における１綿棒当たりの大凡の菌数が分かることが証明された。
【０１１４】
また、各菌種ごとの初発菌数とｐＨの関係を、図２〜図６に示した。
【０１１５】
（試験例１２）臨床試験
製造例１の培地を用いて下記の通り滅菌処理を行なってＡ培地，Ｂ培地とし、被験者６２名（妊婦４０名，ＳＴＤ（性感染症）外来患者２２名）を対象にして臨床試験を行なった。同様にＣ培地について、被験者４３名（妊婦２１名，ＳＴＤ外来患者２２名）を対象に臨床試験を行なった。
【０１１６】
Ａ培地：１０５℃で１分間オートクレーブ滅菌
Ｂ培地：１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌
Ｃ培地：メンブランろ過（０．４５μｍ→０．２２μｍ）。
【０１１７】
即ち、被験者の膣分泌物（約５０μｌ）を綿棒（γ線滅菌した天然綿棒）
で採取し上記培地５ｍｌに投入後、３５℃で２４時間静置培養し、色変化を観察した。
【０１１８】
判定は、表４に示す判定基準に従ったが、Ｃ培地を使用した例では、スコア＋１．５をＢＶ（細菌性膣症）陽性とした場合とＢＶ陰性とした場合の両方を示し、考察した。
【０１１９】
尚、Ａｍｓｅｌ法（ＷＨＯ基準）は、膣性状のうち、▲１▼灰色帯下，▲２▼膣内ｐＨ＞５．０，▲３▼アミン臭の検出（検体に１０％ＫＯＨを加えると、アミン臭を生じる場合），▲４▼クルーセルの検出（上皮細胞の２０％以上）の４つのうち３つが陽性であればＢＶ陽性であると判断することにより行なった。結果を表１９と表２０に示す。
【０１２０】
【表１９】
2004236574.tif 000020
【０１２１】
【表２０】
2004236574.tif 000021
【０１２２】
上記結果によれば、本発明に係る培地を使用した診断方法（表中では、「本発明法」と表わしている）とＡｍｓｅｌ法にはかなり高い相関性があった。
【０１２３】
しかし、Ａｍｓｅｌ法（ＷＨＯ基準）は、臨床症状や所見により行なわれることから正確であるといわれているものの、実際には評価者の主観により結果が異なる場合がある。
【０１２４】
従って、本発明法とＡｍｓｅｌ法の全体一致率は必ずしも１００％ではないものの、本発明法は、細菌性膣症の診断方法として正確なものであるといえる。また、Ａｍｓｅｌ法のように主観的なものではなく、客観的な評価が可能であることから、細菌性膣症の診断方法として極めて優れている。
【０１２５】
因みに、表中の「特異性」は、Ａｍｓｅｌ法では陰性とされた患者のうち本発明法で陰性とされた患者の割合である。つまり、「特異性」が低いということは、ＢＶではないにも拘わらず本発明法で「ＢＶ陽性」と判断してしまう可能性があることを示す。例えば、膣乳酸菌数が正常（スコア＋２以上）であっても、切迫流産等によって膣検体に血液が混入すると、その混入量にもよるが、培地色は黄色から橙色（スコア＋１．５）まで戻され、「ＢＶ陽性」と判断される場合があり得る。
【０１２６】
この点につき、Ｃ培地を使用した場合の結果によれば、スコア＋１．５をＢＶ陽性とすれば当然に特異性は多少低下することとなる。しかし、スコア＋１．５を陽性としておけば、Ａｍｓｅｌ法でＢＶ陽性の患者であれば本発明法でもＢＶ陽性とできることから、見逃しができない妊婦等の診断では、スコア＋１．５を陽性とすることが好ましいと思われる。
【０１２７】
【発明の効果】
本発明の細菌性膣症診断用液体培地により、細菌性膣症の診断を迅速且つ簡易簡便に行なうことができる。特に、本発明培地により膣検体を培養すれば、一定時間後における赤色から黄色までの明瞭な培地色変化によって膣検体に含まれる初発乳酸菌数を推定できるため、膣内乳酸菌が減少して他の菌（但し、原因菌は特定されていない）に置き換わった状態である細菌性膣症の客観的な診断を、熟練者でなくとも簡便に行なうことができる点に特徴を有する。
【０１２８】
従って、婦人科での積極的な細菌性膣症診断のみならず、産科で行なわれる妊婦スクリーニングにおいても、自覚症状の乏しい細菌性膣症につき迅速に診断することが可能であり、当該疾患を原因とする早産を防止できる点で、非常に有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】培養後における培地の色変化を示す写真
【図２】乳酸菌（ＪＣＭ１１３１）の初発菌数と培地ｐＨとの関係を示す図
【図３】乳酸菌（ＪＣＭ１１３２）の初発菌数と培地ｐＨとの関係を示す図
【図４】乳酸菌（ＪＣＭ１１４６）の初発菌数と培地ｐＨとの関係を示す図
【図５】乳酸菌（ＪＣＭ８７７８）の初発菌数と培地ｐＨとの関係を示す図
【図６】乳酸菌（ＪＣＭ９５０５）の初発菌数と培地ｐＨとの関係を示す図
【図１】
2004236574.tif 000022
【図２】
2004236574.tif 000023
【図３】
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【図４】
2004236574.tif 000025
【図５】
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【図６】
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