【手続補正書】
【提出日】平成23年3月18日(2011.3.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
本発明はさらに、例えば、重要な治療的応用を有する所望の結合特性および／または結合親和性を有する抗体様分子を設計または選択するための、そのようなポリペプチドおよびそのようなポリペプチドを含むライブラリーの様々な使用に関する。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下を提供する：
（項目１）
異種アミノ酸配列にコンジュゲートされたＶｐｒｅＢ配列および／またはλ５配列を含むポリペプチドであって、前記ポリペプチドが、標的に結合することができる、ポリペプチド。
（項目２）
ＶｐｒｅＢ配列を含む、項目１に記載のポリペプチド。
（項目３）
前記ＶｐｒｅＢ配列が、未変性ＶｐｒｅＢ１配列、未変性ＶｐｒｅＢ２配列、未変性ＶｐｒｅＢ３配列ならびにそれらの断片および変異体からなる群より選択される、項目２に記載のポリペプチド。
（項目４）
前記未変性ＶｐｒｅＢ配列が、配列番号１のヒトＶｐｒｅＢ１、配列番号２および３のマウスＶｐｒｅＢ２、配列番号４のヒトＶｐｒｅＢ３、ならびにそれらの断片および変異体からなる群より選択される、項目３に記載のポリペプチド。
（項目５）
前記異種アミノ酸配列が、λ５配列を含む、項目２に記載のポリペプチド。
（項目６）
前記異種アミノ酸配列が、配列番号５のヒトλ５または配列番号６のヒトλ５様ポリペプチドの全部または一部を含む、項目５に記載のポリペプチド。
（項目７）
前記λ５配列が、前記ＶｐｒｅＢ配列に融合される、項目５に記載のポリペプチド。
（項目８）
異種アミノ酸配列へのＶｐｒｅＢ配列の融合物を含む、項目２に記載のポリペプチド。
（項目９）
前記異種アミノ酸配列が、λ５配列である、項目８に記載のポリペプチド。
（項目１０）
前記ＶｐｒｅＢ配列が、配列番号１のヒトＶｐｒｅＢｌ、配列番号２および３のマウスＶｐｒｅＢ２、および配列番号４のヒトＶｐｒｅＢ３、ならびにそれらの断片および変異体からなる群より選択される、項目９に記載のポリペプチド。
（項目１１）
前記λ５配列が、配列番号５のヒトλ５の配列、配列番号６のヒトλ５様ポリペプチド、またはそれらの断片もしくは変異体である、項目１０に記載のポリペプチド。
（項目１２）
前記融合が、それぞれ、前記ＶｐｒｅＢ配列およびλ５のＣＤＲ３類似領域においてまたはそのまわりで起きる、項目９に記載のポリペプチド。
（項目１３）
前記異種アミノ酸配列が、抗体軽鎖可変領域配列を含む、項目８に記載のポリペプチド。
（項目１４）
前記抗体軽鎖可変領域配列が、抗体軽鎖ＣＤＲ３領域に類似する部位において前記ＶｐｒｅＢ配列に融合される、項目１３に記載のポリペプチド。
（項目１５）
前記抗体軽鎖可変領域配列の前記ＣＤＲ３領域が、前記ＣＤＲ３領域に類似する部位において前記ＶｐｒｅＢ配列に融合される、項目１３に記載のポリペプチド。
（項目１６）
前記抗体軽鎖が、λ鎖である、項目１５に記載のポリペプチド。
（項目１７）
前記抗体軽鎖が、κ鎖である、項目１５に記載のポリペプチド。
（項目１８）
前記異種アミノ酸配列が、抗体軽鎖定常領域配列をさらに含む、項目１３に記載のポリペプチド。
（項目１９）
前記定常領域配列が、抗体軽鎖の定常領域全体である、項目１８に記載のポリペプチド。
（項目２０）
λ５配列を含む、項目１に記載のポリペプチド。
（項目２１）
前記λ５配列が、配列番号５のヒトλ５の配列、または配列番号６のヒトλ５様ポリペプチド、あるいはそれらの断片または変異体である、項目２０に記載のポリペプチド。
（項目２２）
前記異種アミノ酸配列が、前記λ５配列にコンジュゲートされたＶｐｒｅＢ配列である、項目２１に記載のポリペプチド。
（項目２３）
前記コンジュゲーションが、前記λ５およびＶｐｒｅＢ配列の融合である、項目２２に記載のポリペプチド。
（項目２４）
前記コンジュゲーションが、前記λ５とＶｐｒｅＢ配列との間の共有結合である、項目２２に記載のポリペプチド。
（項目２５）
前記共有結合が、接続ペプチドまたはポリペプチド配列により形成される、項目２４に記載のポリペプチド。
（項目２６）
ＶｐｒｅＢ配列およびλ５配列を含み、前記コンジュゲーションが、非共有結合性会合であり、前記ＶｐｒｅＢおよびλ５配列の少なくとも一方が、それぞれ、完全長未変性ＶｐｒｅＢおよびλ５配列以外である、項目１に記載のポリペプチド。
（項目２７）
前記ＶｐｒｅＢおよびλ５配列の少なくとも一方が、それぞれ、未変性ＶｐｒｅＢおよびλ５配列の断片または変異体である、項目２６に記載のポリペプチド。
（項目２８）
前記ポリペプチドが、第２の異種アミノ酸配列にさらにコンジュゲートされる、項目１に記載のポリペプチド。
（項目２９）
前記第２の異種アミノ酸配列と共有結合的に会合させられた、λ５配列へのＶｐｒｅＢ配列の融合物を含む、項目２８に記載のポリペプチド。
（項目３０）
前記第２の異種ポリペプチド配列が、可変領域を含む抗体重鎖配列である、項目２９に記載のポリペプチド。
（項目３１）
前記抗体重鎖配列が、前記ＶｐｒｅＢ配列と前記λ５配列との融合物にペプチドリンカーによってコンジュゲートされる、項目３０に記載のポリペプチド。
（項目３２）
前記抗体重鎖配列が、前記ＶｐｒｅＢ配列と前記λ５配列との融合物に非共有結合性の会合によってコンジュゲートされ、二量体複合体を形成する、項目３０に記載のポリペプチド。
（項目３３）
前記抗体重鎖可変領域配列が、前記ポリペプチドと同じ標的に結合する、項目３２に記載のポリペプチド。
（項目３４）
前記抗体重鎖可変領域配列が、前記ポリペプチドが結合する標的と異なる標的に結合する、項目３２に記載のポリペプチド。
（項目３５）
前記ポリペプチドが腫瘍抗原に結合し、前記抗体可変領域配列がエフェクター細胞に結合する、項目３４に記載のポリペプチド。
（項目３６）
非共有結合的に会合させられたＶｐｒｅＢ配列およびλ５配列と非共有結合的に会合させられて三量体複合体を形成する可変領域を含む抗体重鎖配列をさらに含む、項目２６に記載のポリペプチド。
（項目３７）
前記抗体重鎖が、前記ポリペプチドと同じ標的に結合する可変領域配列を含む、項目３６に記載のポリペプチド。
（項目３８）
前記抗体重鎖が、前記ポリペプチドが結合する標的と異なる標的に結合する可変領域配列を含む、項目３６に記載のポリペプチド。
（項目３９）
前記ポリペプチドが腫瘍抗原に結合し、前記可変領域配列がエフェクター細胞に結合する、項目３８に記載のポリペプチド。
（項目４０）
前記ＶｐｒｅＢ配列および／または前記λ５配列のＣＤＲ類似領域が、治療抗体由来の対応するＣＤＲ配列をグラフトすることにより設計される、項目１に記載のポリペプチド。
（項目４１）
前記標的が、抗原である、項目１に記載のポリペプチド。
（項目４２）
前記標的が、ウイルス抗原である、項目１に記載のポリペプチド。
（項目４３）
前記標的が、インフルエンザＡウイルスである、項目４２に記載のポリペプチド。
（項目４４）
前記ポリペプチドが、前記インフルエンザＡウイルスを無力化する、項目４３に記載のポリペプチド。
（項目４５）
項目１〜４４のいずれか１項に記載のポリペプチドを含むライブラリー。
（項目４６）
抗体重鎖と会合させられたＶｐｒｅＢ配列とλ５配列とのコンジュゲートを含むライブラリー。
（項目４７）
前記コンジュゲートが、前記ＶｐｒｅＢとλ５配列との融合物である、項目４６に記載のライブラリー。
（項目４８）
前記コンジュゲートが、前記ＶｐｒｅＢとλ５配列との非共有結合性会合である、項目４６に記載のライブラリー。
（項目４９）
前記コンジュゲートが、ペプチドリンカーを介した前記ＶｐｒｅＢとλ５配列との共有結合である、項目４６に記載のライブラリー。
（項目５０）
前記抗体重鎖可変領域配列が、前記コンジュゲートと非共有結合的に会合される、項目４６に記載のライブラリー。
（項目５１）
前記抗体重鎖可変領域配列が、前記コンジュゲートと共有結合的に会合させられる、請求項４６に記載のライブラリー。
（項目５２）
前記抗体重鎖が、前記コンジュゲートと同じ標的に結合する可変領域配列を含む、項目４６に記載のライブラリー。
（項目５３）
前記抗体重鎖が、前記コンジュゲートが結合する標的と異なる標的に結合する可変領域配列を含む、項目４６に記載のライブラリー。
（項目５４）
前記コンジュゲートが腫瘍抗原に結合し、前記可変領域配列がエフェクター細胞に結合する、項目５３に記載のライブラリー。
（項目５５）
ディスプレイの形態である、項目４５に記載のライブラリー。
（項目５６）
前記ディスプレイが、ファージディスプレイ、細菌ディスプレイ、酵母ディスプレイ、リボソームディスプレイ、ｍＲＮＡディスプレイ、ＤＮＡディスプレイ、哺乳動物細胞上のディスプレイ、胞子ディスプレイ、ウイルスディスプレイ、タンパク質−ＤＮＡ結合に基づくディスプレイ、およびミクロビーズディスプレイからなる群より選択される、項目５５に記載のライブラリー。
（項目５７）
ディスプレイの形態である、項目４６に記載のライブラリー。
（項目５８）
前記ディスプレイが、ファージディスプレイ、細菌ディスプレイ、酵母ディスプレイ、リボソームディスプレイ、ｍＲＮＡディスプレイ、ＤＮＡディスプレイ、哺乳動物細胞上のディスプレイ、胞子ディスプレイ、ウイルスディスプレイ、タンパク質−ＤＮＡ結合に基づくディスプレイ、およびミクロビーズディスプレイからなる群より選択される、項目５７に記載のライブラリー。
（項目５９）
代替軽鎖配列を含むライブラリー。
（項目６０）
ディスプレイの形態である、項目５９に記載のライブラリー。
（項目６１）
前記ディスプレイが、ファージディスプレイ、細菌ディスプレイ、酵母ディスプレイ、リボソームディスプレイ、ｍＲＮＡディスプレイ、ＤＮＡディスプレイ、哺乳動物細胞上のディスプレイ、胞子ディスプレイ、ウイルスディスプレイ、タンパク質−ＤＮＡ結合に基づくディスプレイ、およびミクロビーズディスプレイからなる群より選択される、項目５９に記載のライブラリー。
（項目６２）
前記ライブラリーのメンバーに付加されたまたは埋め込まれた少なくとも１つの付加的な機能性をさらに含む、項目４５、４６または５９に記載のライブラリー。
（項目６３）
前記付加的な機能性が、抗体、ペプチド、またはポリペプチド配列により提供される、項目６２に記載のライブラリー。
（項目６４）
前記ポリペプチド配列が、受容体またはリガンド配列である、項目６３に記載のライブラリー。
（項目６５）
前記抗体、ペプチド、またはポリペプチド配列が、抗体、ペプチド、またはポリペプチドライブラリーのメンバーである、項目６３に記載のライブラリー。
（項目６６）
前記ペプチドライブラリーが、ランダムペプチド配列のライブラリーである、項目６５に記載のライブラリー。
（項目６７）
前記ペプチド配列の少なくともいくつかが、標的抗原への結合特異性を有する、項目６６に記載のライブラリー。
（項目６８）
ディスプレイの形態である、項目６２に記載のライブラリー。
（項目６９）
前記ディスプレイが、ファージディスプレイ、細菌ディスプレイ、酵母ディスプレイ、リボソームディスプレイ、ｍＲＮＡディスプレイ、ＤＮＡディスプレイ、哺乳動物細胞上のディスプレイ、胞子ディスプレイ、ウイルスディスプレイ、タンパク質−ＤＮＡ結合に基づくディスプレイ、およびミクロビーズディスプレイからなる群より選択される、項目６８に記載のライブラリー。
（項目７０）
抗体重鎖可変領域配列と会合させられた代替軽鎖配列のコレクションを含む、ライブラリー。
（項目７１）
前記代替軽鎖配列が、１つ以上の標的に対する結合特異性を有する、項目７０に記載のライブラリー。
（項目７２）
前記代替軽鎖配列が、同じ標的に対する結合特異性を有する、項目７１に記載のライブラリー。
（項目７３）
前記代替軽鎖配列が、少なくとも２つの異なる標的に対する結合特異性を有する、項目７１に記載のライブラリー。
（項目７４）
前記代替軽鎖配列が、複数の標的に対する結合特異性を有する、項目７１に記載のライブラリー。
（項目７５）
前記代替軽鎖配列が、ＶｐｒｅＢ配列および／またはλ５配列を含む、項目７０に記載のライブラリー。
（項目７６）
前記ＶｐｒｅＢ配列が、ヒトＶｐｒｅＢ１（配列番号１）、マウスＶｐｒｅＢ２（配列番号２および３）、およびヒトＶｐｒｅＢ３（配列番号４）配列、ならびにそれらの断片および変異体からなる群より選択される、項目７５に記載のライブラリー。
（項目７７）
前記λ５配列が、配列番号５のヒトλ５、配列番号６のヒトλ５様ポリペプチド、ならびにそれらの断片および変異体からなる群より選択される、項目７５に記載のライブラリー。
（項目７８）
前記ＶｐｒｅＢおよびλ５配列が、互いに非共有結合的に会合させられる、項目７５に記載のライブラリー。
（項目７９）
前記ＶｐｒｅＢおよびλ５配列が、互いに共有結合的に接続される、項目７５に記載のライブラリー。
（項目８０）
前記ＶｐｒｅＢおよびλ５配列が、互いに直接的に融合される、項目７９に記載のライブラリー。
（項目８１）
前記ライブラリーのメンバーに付加されたまたは埋め込まれた少なくとも１つの付加的な機能性をさらに含む、項目７５に記載のライブラリー。
（項目８２）
前記付加的な機能性が、抗体、ペプチド、またはポリペプチド配列により提供される、項目８１に記載のライブラリー。
（項目８３）
前記ポリペプチド配列が、受容体またはリガンド配列である、項目８２に記載のライブラリー。
（項目８４）
前記抗体、ペプチド、またはポリペプチド配列が、抗体、ペプチド、またはポリペプチドライブラリーのメンバーである、項目８２に記載のライブラリー。
（項目８５）
前記ペプチドライブラリーが、ランダムペプチド配列のライブラリーである、項目８４に記載のライブラリー。
（項目８６）
前記ペプチド配列の少なくともいくつかが、標的抗原への結合特異性を有する、項目８５に記載のライブラリー。
（項目８７）
ディスプレイの形態である、項目７０に記載のライブラリー。
（項目８８）
前記ディスプレイが、ファージディスプレイ、細菌ディスプレイ、酵母ディスプレイ、リボソームディスプレイ、ｍＲＮＡディスプレイ、ＤＮＡディスプレイ、哺乳動物細胞上のディスプレイ、胞子ディスプレイ、ウイルスディスプレイ、タンパク質−ＤＮＡ結合に基づくディスプレイ、およびミクロビーズディスプレイからなる群より選択される、項目８７に記載のライブラリー。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２６】
【図１】ヒトＶｐｒｅＢｌ（配列番号１）およびヒトλ５（配列番号５）と、抗体λ鎖可変（配列番号２７）および定常領域（配列番号２８）との配列比較を示す。ＶｐｒｅＢｌが抗体λ鎖可変領域といくらかの配列類似性を共有する一方、λ５は、抗体λ鎖定常領域およびフレームワーク領域４といくらかの類似性を共有する。四角で囲んだ領域は、抗体λ鎖ＣＤＲｌ、ＣＤＲ２および各ＣＤＲ３領域とそれぞれ類似するＶｐｒｅＢ１およびλ５配列を特定する。
【図２】ＶｐｒｅＢおよびλ５配列により形成された代替軽鎖、代替軽鎖配列を含む例示的な融合ポリペプチド、およびＶ−Ｊ接合由来の抗体軽鎖構造の概略図である。
【図３】様々な代替軽鎖欠失および単鎖構築物の概略図である。
【図４】代替軽鎖構築物内への組み合せ機能多様性の組み込みを概略的に例示する。
【図５】様々な例示的な代替軽鎖構築物の遺伝子およびタンパク質構造を示す。（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３リンカーを配列番号３５として開示した。
【図６】ＶｐｒｅＢｌ配列（配列番号１）と抗体λ５軽鎖可変領域配列（それぞれ、記載される順に配列番号２９〜３１）との配列比較である。最も高い配列類似度を有する領域が四角で囲んである。図に示されるように、ＶｐｒｅＢｌは、λ５軽鎖可変領域生殖系列に対し５６％〜６２％（アミノ酸２〜９７）配列同一性しか示さない。
【図７】ＶｐｒｅＢｌ配列と抗体λ５軽鎖定常領域配列との配列比較である。図に示されるように、整列されたＶｐｒｅＢｌ配列は、対応する抗体λ５軽鎖定常領域配列に対し６２％（アミノ酸９７〜２０９）配列同一性しか示さない。図７は、それぞれ、記載される順に配列番号５および３２を開示する。
【図８】ＶｐｒｅＢｌ配列と抗体κ軽鎖定常領域配列との配列比較である。図に示されるように、整列されたＶｐｒｅＢｌ配列は、対応する抗体κ軽鎖定常領域配列に対し３５％（アミノ酸１０５〜２０９）配列同一性しか示さない。図８は、配列番号５の残基１〜２０８および配列番号３３を開示する。
【図９】代替軽鎖（ＳＬＣ）コンポーネントに機能性を付加する様々な代表的方法を例示する。
【図１０−１】配列番号１のヒトＶｐｒｅＢｌ配列、配列番号２および３のマウスＶｐｒｅＢ２配列；配列番号４のヒトＶｐｒｅＢ３配列、配列番号５のヒトλ５配列および配列番号６のヒトλ５様タンパク質配列、ならびに実施例において用いられた様々な構築物の配列を示す。
【図１０−２】配列番号１のヒトＶｐｒｅＢｌ配列、配列番号２および３のマウスＶｐｒｅＢ２配列；配列番号４のヒトＶｐｒｅＢ３配列、配列番号５のヒトλ５配列および配列番号６のヒトλ５様タンパク質配列、ならびに実施例において用いられた様々な構築物の配列を示す。
【図１０−３】配列番号１のヒトＶｐｒｅＢｌ配列、配列番号２および３のマウスＶｐｒｅＢ２配列；配列番号４のヒトＶｐｒｅＢ３配列、配列番号５のヒトλ５配列および配列番号６のヒトλ５様タンパク質配列、ならびに実施例において用いられた様々な構築物の配列を示す。
【図１０−４】配列番号１のヒトＶｐｒｅＢｌ配列、配列番号２および３のマウスＶｐｒｅＢ２配列；配列番号４のヒトＶｐｒｅＢ３配列、配列番号５のヒトλ５配列および配列番号６のヒトλ５様タンパク質配列、ならびに実施例において用いられた様々な構築物の配列を示す。
【図１１】本発明の様々な三量体および二量体代替軽鎖構築物を例示する。
【図１２】代替軽鎖およびコンジュゲートされた重鎖の検出。レーン１：完全長、レーン２：λ５  ｄＴ、レーン３：ＶｐｒｅＢ  ｄｔ、レーン４：ショート、レーン５：ＳＣＬ融合１、レーン６：ＳＬＣ融合２、レーン７：抗体。
【図１３】ＳＬＣ融合タンパク質が、Ｅ．ｃｏｌｉのペリプラズム中で発現および十分に分泌し、ＩｇＭではなくＩｇＧｌ由来の重鎖ＣＨｌと最もうまくパートナーにされる。パネルＡ：Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＳＣＬ融合タンパク質発現。パネルＢ：ＩｇＧｌγ鎖は、ＩｇＭμ鎖よりもうまくＳＬＣ融合とパートナーになり精製する。
【図１４】抗ファージ検出を介したファージ代替軽鎖構築物捕獲ＥＬＩＳＡ。
【図１５】哺乳動物細胞中で発現された精製代替軽鎖構築物がウイルス標的と結合する。
【図１６】哺乳動物細胞中で発現された精製代替軽鎖構築物が、ウイルス抗原と結合する安定な複合体を含む。
【図１７】Ｅ．ｃｏｌｉペリプラズムライゼートと結合する抗原。
【図１８】無力化重鎖と対にされた代替軽鎖融合構築物ファージがＨ５  ＨＡ抗原と容易に結合する。
【図１９】無力化重鎖と対にされた代替軽鎖構築物ファージが抗原と結合する。
【図２０】ファージディスプレイ実験の結果の概要を示す表。
【図２１】代替軽鎖融合１および２のラウンド１のクローン分析の結果。
【図２２】代替軽鎖融合１および２のラウンド２のクローン分析の結果。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３０】
４つの組合せ代替軽鎖可能性の各々を、Ｃ末端ヘキサヒスチジン（Ｈｉｓ６）タグ（配列番号９）（Ｈｉｓ６タグを配列番号３４として開示した）を含有する既知のヒト抗インフルエンザ重鎖で同時形質移入し、製造業者（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ  ＣＡ）の提案に従って低血清培地中で発現させた。３日後、上清を採集し、濾過し、ニッケルキレートクロマトグラフィー（Ｑｉａｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により精製した。次に、精製タンパク質を、抗ペプチドウサギ血清（ＶｐｒｅＢおよびλ５）か、あるいは抗ヒスチジン抗体（Ｓｅｒｏｔｅｃ，Ｒａｌｅｉｇｈ  ＮＣ）のいずれかによるウェスタンブロット分析により試験し。タンパク質の検出は、抗ウサギＨＲＰ（ＶｐｒｅＢおよびλ５）または抗マウスＨＲＰ（重鎖）およびＴＭＢ基質による比色発色の後に視覚化した。（図１２、レーン１〜４）
加えて、代替軽鎖融合物（図１１参照）を、ＶｐｒｅＢｌ遺伝子とλ５遺伝子か軽鎖定常ラムダドメインとで構成されたキメラタンパク質を設計することにより作り出した。具体的には、ＶｐｒｅＢ（配列番号１）からλ５タンパク質アミノ酸１２１−２０９（配列番号５）（配列番号１０）までのアミノ酸１−８７を含む組み換え的に融合されたタンパク質を産生した。加えて、ＶｐｒｅＢ（配列番号１）から抗体λ軽鎖定常（配列番号１１）のＣ末端１２１アミノ酸までのアミノ酸１−８７を含む第２の融合物を作成した。各代替軽鎖融合物を、基本的には上記で記載されたように、一時的に発現させ、収集し、精製し、ウェスタンブロット分析により試験した。特に、両方の融合物が、抗ＶｐｒｅＢ１抗ペプチド血清に対するエピトープを含んでいたので、これはウェスタンブロット分析に用いた。（図１２、レーン５−６）
（実施例７）
Ｅ．ｃｏｌｉにおける代替軽鎖構築物（ＳＵＲＲＯＢＯＤＹ（商標））の発現
組み換えタンパク質は、細菌中でしばしば有用に発現させられるので、原核生物系において可溶性代替軽鎖構築物を産生する能力を試験した。これに対処するため、図１１において「二量体」と呼ばれる代替軽鎖融合を、Ｅ．ｃｏｌｉ発現／分泌系中でクローニングした。ｐｌａｃ抑制発現系が用いられ、成熟哺乳動物タンパク質、原核生物リーダー配列への組み換え融合によりペリプラズムに発現および分泌された。具体的には、代替軽鎖融合物は、ｍ１３  ｇＩＩＩリーダーコード配列（配列番号１２および１３）のＣ末端へ成熟タンパク質のコード配列を融合させることにより、ペリプラズムへ誘導した。重鎖は、ＩｇＧｌ重鎖可変領域および抗インフルエンザ抗体の重鎖定常領域ドメインを、ｐｅｌＢリーダー配列（配列番号１４）のＣ末端に融合させることにより発現させた。両方のタンパク質を発現させるプラスミドを、ＨＢ２１５１  Ｅ．ｃｏｌｉ細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に形質変換し、１００ｍｃｇ／ｍｌアンピシリンおよび２００ミクロモルＩＰＴＧを含有するＬＢ培地中で、３０度で一晩発現させた。細胞を収集し、当該技術分野において知られている方法に従い、ペリプラズムライゼートを調製した。このペリプラズムライゼートを、ウェスタンブロット分析により直接試験、または上述のように精製した（図１３、パネルＡ）。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３２】
（実施例８）
代替軽鎖構築物（ＳＵＲＲＯＢＯＤＹ（商標））ｍ１３ファージミドの発現
組み換えタンパク質は、細菌においてだけでなく、個別におよび細菌ウイルス粒子の表面上の多様なライブラリーコレクションにおいて有用に発現されるので、本発明者らは、ｍ１３ファージミドの表面上に可溶性代替軽鎖構築物を産生したいと考えた。これに対処するため、代替軽鎖融合物（図１１の「二量体」）を、Ｅ．ｃｏｌｉ発現／分泌系にクローニングした。すべての系について、上述のｐＬａｃ抑制発現系を用いた。しかしながら、この場合、本発明者らは、Ｅ−タグエピトープ（ＧＡＰＶＰＹＰＤＰＬＥＰＲ）（配列番号１６）を代替軽鎖融合物、ならびに軽鎖制御タンパク質にも付加した。遺伝子ＩＩＩ  ＶｐｒｅＢｌ−ラムダ５−Ｅ−タグ融合物（融合物１）および遺伝子ＩＩＩ  ＶｐｒｅＢｌ−ＣＩ−Ｅタグ融合物（融合物２）の配列が、それぞれ配列番号１２および１３として示してある。重鎖構築物をｍ１３ファージミドに固着するため、重鎖構築物を、可変重鎖およびガンマ定常重ドメイン１領域とインフレームでｍ１３遺伝子ＩＩＩ生成物により組み換え的にクローニングした。具体的には、組み換えタンパク質は、介在性のヘキサヒスチジンペプチド（配列番号３４）、抗ｃ−ｍｙｃ抗体（ＧＥＱＫＬＩＳＬＥＥＤＬ）（配列番号１７）のためのペプチドエピトープ、およびアンバー終止コドンを含んでいた。本発明者らは、抗ヒスチジンおよび抗Ｅ−捕獲ＥＬＩＳＡにより、タンパク質発現および複合体形成の忠実度をそれぞれ調べた。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３６】
（実施例１０）
Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現された代替軽鎖構築物の抗原結合
代替軽鎖融合物が安定な複合体を形成すると思われたので、本発明者らは、抗インフルエンザ抗体からの重鎖と対にされたそのような融合物が抗体の同族ウイルスと結合するかどうかを確かめたいと考えた。結合について試験するため、ペリプラズムライゼートを、上述の通りに調製した。ライゼートを次に、本質的には上述の通りにＥＬＩＳＡ抗原結合に供したが、重鎖のＣ末端の付加されたヘキサヒスチジン（配列番号３４）エピトープか、あるいは代替軽鎖融合物のＣ末端の付加されたＥ−タグかのどちらか一方に対するモノクロナール抗体を用いてポリクロナール親和性精製抗体を介して結合を検出した点が異なる。エピトープ検出は、抗マウスペルオキシダーゼコンジュゲート抗体か抗ウサギペルオキシダーゼコンジュゲート抗体のどちらか一方により達成した。最後に、結合を、ＴＭＢ基質発色により比色的に視覚化し、定量した。結果は、図１７に示してある。
【手続補正６】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１０−１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１０−１】
2010522566.tif 000001