【手続補正書】
【提出日】平成26年1月10日(2014.1.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
非ヒト脊椎動物宿主において導入された免疫グロブリン領域を含むゲノムを有するトランスジェニック非ヒト脊椎動物であって、
前記導入された領域がヒト免疫グロブリン可変領域コード配列および非ヒト脊椎動物宿主の内在性免疫グロブリン可変領域遺伝子座に基づいた非コード配列を含む、トランスジェニック非ヒト脊椎動物。
【請求項２】
非ヒト脊椎動物宿主の免疫グロブリン可変領域遺伝子座における内在性可変遺伝子の一部または全部が除去される、
請求項１に記載のトランスジェニック非ヒト脊椎動物。
【請求項３】
導入される免疫グロブリン領域遺伝子座がヒトのＶＨ、ＤＨ、およびＪＨコード配列を含み、または、ＶＬおよびＪＬコード配列を含み前記Ｌはλまたはκに関連する
請求項１または２に記載のトランスジェニック非ヒト脊椎動物。
【請求項４】
前記非ヒト脊椎動物宿主が齧歯類である、
請求項１〜３のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト脊椎動物。
【請求項５】
前記非ヒト脊椎動物宿主がマウスである、
請求項１〜４のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト脊椎動物。
【請求項６】
請求項１に記載のトランスジェニック脊椎動物を産生する方法であって、
ａ）１以上の部位特異的リコンビナーゼのための２以上の標的部位を非ヒト脊椎動物細胞内に導入し、前記細胞のゲノムにおいて内在性免疫グロブリン可変遺伝子を含むゲノム領域の上流の少なくとも１つの部位と、内在性免疫グロブリン可変遺伝子を含むゲノム領域の下流の少なくとも１つの部位とを統合する導入ステップであって、前記内在性免疫グロブリン可変遺伝子セグメントは、Ｖ、Ｄ、およびＪ遺伝子セグメント、または、ＶおよびＪ遺伝子セグメントを含む、導入ステップ；
ｂ）部位特異的組換え部位に挟まれた、ヒトコード配列と、内在性免疫グロブリン可変領域遺伝子座に基づいた非コード配列とを含む部分的ヒト免疫グロブリン可変領域を含むベクターを提供する提供ステップであって、前記組換え部位は、前記ステップａ）におい
て脊椎動物細胞に導入された前記部位と組換え可能である、提供ステップ；
ｃ）前記ステップｂ）の前記ベクターと、その中のリコンビナーゼ部位を認識できる部位特異的リコンビナーゼとを導入するステップ；
ｄ）前記細胞のゲノムと前記部分的ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子座との間で組換え事象が起こることを可能にし、結果的に前記内在性免疫グロブリン可変領域遺伝子座と前記部分的ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子座との置換を生じさせるステップ；
ｅ）前記ステップｄ）において作成された、部分的ヒト免疫グロブリン領域を含む細胞を選択するステップ；および
ｆ）前記細胞を利用して、部分的ヒト免疫グロブリン領域を含むトランスジェニック動物を作り出すステップ；
を含む、方法。
【請求項７】
前記導入ステップの後且つ前記提供ステップの前に、第１組の部位特異的組換え部位を認識するリコンビナーゼの導入により内在性免疫グロブリン領域の一部を欠失するステップをさらに含み、前記ゲノムにおける前記欠失は、互いに組換えができない第２組の部位特異的組換え部位を残す、
請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞が哺乳類胚性幹（ＥＳ）細胞である、
請求項６または７に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９８】
形質移入クローンをＧ４１８選択にかけ、リコンビナーゼ−仲介カセット交換方法を受けた細胞のクローンをリッチ化する。リコンビナーゼ−仲介カセット交換方法により、部分的ヒトドナーＤＮＡ（８０９）が全体として、ｌｏｘＰ部位とｌｏｘ５１７１部位との間の欠失された免疫グロブリン重鎖遺伝子座に組込まれて、８１１に図示されたＤＮＡ領域が作り出される。５’ベクター（８０３）由来の残りの要素が、ＦＬＰ−仲介組換え（８０６）で除去されて、結果的に、８１３に示す最終的なヒト化遺伝子座が生じる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１４】
ＥＳ細胞クローンであって、それらの免疫グロブリンκ鎖遺伝子座の２つの相同コピーの一方における配列が欠失されたＥＳ細胞クローンに、Ｖ、ＤおよびＪ領域遺伝子セグメントを含む部分的ヒト免疫グロブリンκ遺伝子座を含むＤＮＡ片（９０９）と、Ｃｒｅリコンビナーゼ発現ベクターとを用いて、再形質移入する（９０４）。このＤＮＡ片（「Ｋ−Ｋ」と呼ばれる）の重要な特徴は以下の通りである：ｌｏｘ５１７１部位；ネオマイシン耐性遺伝子オープンリーディングフレーム（イニシエータメチオニンコドンを欠くが、インフレームでありｌｏｘ５１７１部位における連続したオープンリーディングフレームと隣接している）；転写終結／ポリアデニル化配列；ＦＲＴ部位；３９のヒトκ可変領域遺伝子セグメントのアレイであって、それぞれ、マウス非コード配列に組込まれたヒトコード配列から成る。；マウスκ鎖遺伝子座におけるＪκ領域遺伝子セグメントの集団のすぐ上流由来の１３．５ＫｂのゲノムＤＮＡ片；マウス非コードＤＮＡに組込まれた５つのヒトＪ領域遺伝子セグメントを含む２ＫｂのＤＮＡ片；ｌｏｘ５１７１部位と逆相対配向
のｌｏｘＰ部位。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１５】
第２の独立した実験では、Ｋ−Ｋ  ＤＮＡの代わりに部分的ヒトＤＮＡの代替片（９０９）を使用する。このＤＮＡ（「Ｌ−Ｋ」と呼ばれる）の重要な特徴は以下の通りである：ｌｏｘ５１７１部位；ネオマイシン耐性遺伝子オープンリーディングフレーム（イニシエータメチオニンコドンを欠くが、インフレームでありｌｏｘ５１７１部位における連続したオープンリーディングフレームと隣接している）；転写終結／ポリアデニル化配列；ＦＲＴ部位；３８のヒトλ可変領域遺伝子セグメントのアレイであって、それぞれ、マウス非コード配列に組込まれたヒトコード配列から成る。；マウスκ鎖遺伝子座におけるＪ領域遺伝子セグメントの集団のすぐ上流由来の１３．５ＫｂのゲノムＤＮＡ片；マウス非コードＤＮＡに組込まれた５つのヒトＪλ領域遺伝子セグメントを含む２ＫｂのＤＮＡ片；ｌｏｘ５１７１部位と逆相対配向のｌｏｘＰ部位。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１６】
Ｋ−ＫおよびＬ−Ｋ形質移入実験からの形質移入クローンをＧ４１８選択にかけ、リコンビナーゼ−仲介カセット交換方法を受けていた細胞のクローンをリッチ化する。リコンビナーゼ−仲介カセット交換方法により、部分的ヒトドナーＤＮＡが全体として、ｌｏｘＰ部位とｌｏｘ５１７１部位（それぞれ３’ベクター（９０５）および５’ベクター（９０３）によって配置された）との間の、欠失された免疫グロブリンκ鎖遺伝子座に組込まれる。Ｋ−Ｋ配列を使用して作り出されたＤＮＡ領域を図９の９１１に図示する。５’ベクター（９０３）由来の残りの要素を、ＦＬＰ−仲介組換え（９０６）で除去し、結果的に、９１３に示す最終的なヒト化遺伝子座を生じる。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２８】
免疫グロブリンλ鎖遺伝子座の２つの相同コピーの一方に欠失を有するＥＳ細胞クローンに、Ｖ、ＪおよびＣ領域遺伝子セグメントを含む部分的ヒト免疫グロブリンλ鎖遺伝子座を含むＤＮＡ片（１００７）と、Ｃｒｅリコンビナーゼ発現ベクターとを用いて、再形質移入する（１００４）。このＤＮＡ片（１００７）の重要な特徴は以下の通りである：ｌｏｘ５１７１部位；ネオマイシン耐性遺伝子オープンリーディングフレーム（イニシエータメチオニンコドンを欠くが、インフレームでありｌｏｘ５１７１部位における連続したオープンリーディングフレームと隣接している）；転写終結／ポリアデニル化配列；ＦＲＴ部位；３８のヒトλ可変領域遺伝子セグメントのアレイであって、それぞれ、マウスλ非コード配列に組込まれたヒトλコード配列から成る；Ｊ〜Ｃユニットのアレイであって、マウスλ遺伝子座由来の非コード配列内に組込まれたヒトＪλ領域遺伝子セグメントおよびマウスλ定常ドメイン遺伝子セグメントから成る（ヒトＪ領域遺伝子セグメントは、Ｊ１、Ｊ２、Ｊ６およびＪ７をコード化するものであるが、マウスλ定常ドメイン遺伝子セグメントは、Ｃ１および／またはＣ２および／またはＣ３である）；「Ｆ３」部位と
して知られるＦｌｐリコンビナーゼ用の変異型認識部位；ハイグロマイシン耐性を与えるオープンリーディングフレーム；そのオープンリーディングフレームは、構築物において、情報をコードしている免疫グロブリン遺伝子セグメントに関してアンチセンス鎖上に位置する；ｌｏｘ５１７１部位と逆相対配向のｌｏｘＰ部位。