【手続補正書】
【提出日】平成24年6月15日(2012.6.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
レバウジオシドＡ、モグロシドＶ、ステビオシド、ルブソシド、ナリンジンジヒドロカルコン（ＮａｒＤＨＣ）、ペリラルチン、ｐ−エトキシベンズアルデヒド、シンナモニトリル、サイクラミン酸塩、およびネオヘスペリジンジヒドロカルコン（ＮＤＨＣ）からなる群から選択される化合物を含む剤であって、甘味閾値以上の濃度の、知られたまたは事前に決定された甘味物質と、甘味閾値の近傍または僅かに下の濃度で混合された場合に、前記剤と前記知られたまたは事前に決定された甘味物質との混合物の甘味を、前記甘味物質のみまたは前記剤のみ含有する混合物の甘味と比較して相加的以上に増強する
、前記剤。
【請求項２】
化合物または化合物群を同定する方法であって、前記化合物または化合物群が、甘味閾値以上の濃度の、知られたまたは事前に決定された甘味物質と、甘味閾値の近傍または僅かに下の濃度で混合された場合に、前記化合物または化合物群と前記知られたまたは事前に決定された甘味物質との混合物の甘味を、前記甘味物質のみまたは前記化合物または化合物群のみ含有する混合物の甘味と比較して相加的以上に増強するものであり、
前記化合物または化合物群が、前記化合物または化合物群の存在下での味覚受容体の活性アッセイによって生成されるシグナルと前記化合物または化合物群の非存在下での味覚受容体の活性アッセイによって生成されるシグナルとを比較して同定可能であり、
前記味覚受容体の活性アッセイは、細胞表面受容体の細胞外ドメインと連結した味覚受容体の膜貫通ドメインを含有するタンパク質を利用することにより、味覚受容体のビーナスフライトラップドメインに結合する化合物または化合物群を除外しながら、味覚受容体の膜貫通ドメインに結合する化合物または化合物群を同定することを含む、前記方法。
【請求項３】
化合物または化合物群を同定する方法であって、前記化合物または化合物群が、甘味閾値以上の濃度の、知られたまたは事前に決定された甘味物質と、甘味閾値の近傍または僅かに下の濃度で混合された場合に、前記化合物または化合物群と前記知られたまたは事前に決定された甘味物質との混合物の甘味を、前記甘味物質のみまたは前記化合物または化合物群のみ含有する混合物の甘味と比較して相加的以上に増強するものであり、
前記化合物または化合物群が、前記化合物または化合物群の存在下での味覚受容体の活性アッセイによって生成されるシグナルと前記化合物または化合物群の非存在下での味覚受容体の活性アッセイによって生成されるシグナルとを比較して同定可能であり、
前記味覚受容体の活性アッセイが、味覚受容体のビーナスフライトラップドメインを切断して除去した味覚受容体を含むタンパク質を利用することにより、味覚受容体のビーナスフライトラップドメインに結合する化合物または化合物群を除外しながら、味覚受容体の膜貫通ドメインに結合する化合物または化合物群を同定することを含む、前記方法。
【請求項４】
化合物または化合物群を同定する方法であって、前記化合物または化合物群が、甘味閾値以上の濃度の、知られたまたは事前に決定された甘味物質と、甘味閾値の近傍または僅かに下の濃度で混合された場合に、前記化合物または化合物群と前記知られたまたは事前に決定された甘味物質との混合物の甘味を、前記甘味物質のみまたは前記化合物または化合物群のみ含有する混合物の甘味と比較して相加的以上に増強するものであり、
前記化合物または化合物群が、前記化合物または化合物群の存在下での味覚受容体の活性アッセイによって生成されるシグナルと前記剤の非存在下での味覚受容体の活性アッセイによって生成されるシグナルとを比較して同定可能であり、
前記味覚受容体の活性アッセイが、味覚受容体のビーナスフライトラップドメインを切断して除去した味覚受容体を含むタンパク質を利用することにより、味覚受容体のビーナスフライトラップドメインに結合する化合物または化合物群を除外しながら、ＴＡＳ１Ｒ味覚受容体のＴ１Ｒ２サブユニットの膜貫通ドメインに結合する化合物または化合物群を同定することを含む、前記方法。
【請求項５】
化合物または化合物群を同定する方法であって、前記化合物または化合物群が、甘味閾値以上の濃度の、知られたまたは事前に決定された甘味物質と、甘味閾値の近傍または僅かに下の濃度で混合された場合に、前記化合物または化合物群と前記知られたまたは事前に決定された甘味物質との混合物の甘味を、前記甘味物質のみまたは前記化合物または化合物群のみ含有する混合物の甘味と比較して相加的以上に増強するものであり、
前記化合物または化合物群が、前記化合物または化合物群の存在下での味覚受容体の活性アッセイによって生成されるシグナルと前記化合物または化合物群の非存在下での味覚受容体の活性アッセイによって生成されるシグナルとを比較して同定可能であり、
前記アッセイが、野生型ビーナスフライトラップドメインが代替的なクラスＣ  ＧＰＣＲビーナスフライトラップドメインに置き換えられたキメラ味覚受容体のサブユニットと野生型味覚受容体のサブユニットとを組み合わせることを含み、
前記アッセイが、前記化合物または化合物群の存在下での組み合わされたキメラ受容体／野生型味覚受容体ダイマーの活性のアッセイによって生成されたシグナルおよび前記化合物または化合物群の非存在下での組み合わされたキメラ受容体／野生型味覚受容体ダイマーの活性のアッセイによって生成されたシグナルを計測し、２つの計測値を比較することを含む、前記方法。
【請求項６】
味覚受容体のビーナスフライトラップドメインの外部で味覚受容体と結合および／またはそれを活性化する化合物または化合物群を同定する方法であって、改変された味覚受容体と化合物または化合物群とを接触させること、および当該化合物または化合物群が改変された受容体と結合し、かつ／またはそれを活性化するかどうかを決定することを含み、
改変された受容体が：
ａ）自身のビーナスフライトラップドメインを欠損したＴ１Ｒ２および／または自身のビーナスフライトラップドメインを欠損したＴ１Ｒ３、
ｂ）Ｔ１Ｒ２−ＴＭＤ、ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ、Ｔ１Ｒ３−ＴＭＤ、Ｔ１Ｒ２−ＴＭＤおよびＴ１Ｒ３−ＴＭＤの両方、ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ２、ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ３、ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ２およびＴ１Ｒ３−ＴＭＤの両方、Ｔ１Ｒ２−ＴＭＤおよびＣＳＲ：Ｔ１Ｒ３の両方、ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ２およびＣＳＲ：Ｔ１Ｒ３の両方、
ｃ）クラスＣ  Ｇタンパク質共役受容体由来のビーナスフライトラップドメインと、自身のビーナスフライトラップドメインを欠損したＴ１Ｒ２とを含むキメラタンパク質および／またはクラスＣ  Ｇタンパク質共役受容体由来のビーナスフライトラップドメインと、自身のビーナスフライトラップドメインを欠損したＴ１Ｒ３とを含むキメラタンパク質、
ｄ）ａ）〜ｃ）に列挙されたいずれかのタンパク質とアミノ酸レベルで少なくとも９５％同一である任意のタンパク質、
ｅ）ａ）〜ｃ）に列挙されたいずれかのタンパク質と実質的に相同である任意のタンパク質、
ｆ）配列番号１、１３、１５または２７によってコードされる任意のタンパク質、
ｇ）ストリンジェントな条件で配列番号１、１３、１５または２７とハイブリダイズする核酸によってコードされる任意のタンパク質、
からなる群から選択されたポリペプチドを含み、
改変された味覚受容体が任意にシグナル配列および抗体エピトープから選択される１または２以上の配列タグをさらに含み、ただし、改変された受容体の少なくとも１つのサブユニットがＴ１Ｒ２ビーナスフライトラップドメインまたはＴ１Ｒ３ビーナスフライトラップドメインを含まない、前記方法。
【請求項７】
甘味を増強する化合物または化合物群を同定する方法であって、
ａ）改変された味覚受容体と化合物または化合物群とを接触させること、および、化合物または化合物群が改変された受容体に結合および／またはそれを活性化するかどうかを決定することを含む、化合物または化合物群が味覚受容体にそのビーナスフライトラップドメインの外部で結合し、かつ／またはそれを活性化するかどうかを決定する工程、ならびに
ｂ）改変された受容体に結合するおよび／またはそれを活性化する化合物または化合物群が甘味を増強するかどうかを、
ｉ）化合物または化合物群が、その受容体に対するリガンドによるキメラ受容体との結合および／またはその活性化を増強するかどうかを決定すること、または
ｉｉ）化合物または化合物群が甘味料の甘味を増強するかどうかを、甘味料が２％またはそれを超える濃度のスクロース溶液と等甘味度の濃度で存在し、化合物が２％未満の濃度のスクロース溶液と等甘味度の濃度で存在する状態で決定すること
により決定する工程
を含み、
キメラ受容体が、１）クラスＣ  Ｇタンパク質共役受容体由来のビーナスフライトラップドメイン、および２）自身のビーナスフライトラップドメインを欠損したＴ１Ｒ２を含むサブユニット、および任意に、１）クラスＣ  Ｇタンパク質共役受容体由来のビーナスフライトラップドメイン、および２）自身のビーナスフライトラップドメインを欠損したＴ１Ｒ３を含むサブユニットを含み、少なくとも１つのサブユニットがＴ１Ｒ２ビーナスフライトラップドメインまたはＴ１Ｒ３ビーナスフライトラップドメインを含有せず、および
改変された受容体が
ａ）自身のビーナスフライトラップドメインを欠損したＴ１Ｒ２および／または自身のビーナスフライトラップドメインを欠損したＴ１Ｒ３、
ｂ）Ｔ１Ｒ２−ＴＭＤ、ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ、Ｔ１Ｒ３−ＴＭＤ、Ｔ１Ｒ２−ＴＭＤおよびＴ１Ｒ３−ＴＭＤの両方、ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ２、ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ３、ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ２およびＴ１Ｒ３−ＴＭＤの両方、Ｔ１Ｒ２−ＴＭＤおよびＣＳＲ：Ｔ１Ｒ３の両方、ＣＳＲ：Ｔ１Ｒ２およびＣＳＲ：Ｔ１Ｒ３の両方、
ｃ）クラスＣ  Ｇタンパク質共役受容体由来のビーナスフライトラップドメインと、自身のビーナスフライトラップドメインを欠損したＴ１Ｒ２とを含むキメラタンパク質、および／またはクラスＣ  Ｇタンパク質共役受容体由来のビーナスフライトラップドメインと、自身のビーナスフライトラップドメインを欠損したＴ１Ｒ３とを含むキメラタンパク質、
ｄ）ａ）〜ｃ）に列挙されたいずれかのタンパク質とアミノ酸レベルで少なくとも９５％同一である任意のタンパク質、
ｅ）配列番号１、１３、１５または２７によってコードされる任意のタンパク質、
ｆ）ストリンジェントな条件で配列番号１、１３、１５または２７とハイブリダイズする核酸によってコードされる任意のタンパク質、
からなる群から選択されるポリペプチドを含み、
改変された受容体が任意に、シグナル配列および抗体エピトープから選択される１または２以上の配列タグをさらに含み、ただし、改変された受容体の少なくとも１つのサブユニットがＴ１Ｒ２ビーナスフライトラップドメインまたはＴ１Ｒ３ビーナスフライトラップドメインを含有しない、
請求項２に記載の方法。
【請求項８】
アッセイが、Ｇタンパク質をも発現している細胞を用いる、請求項２〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
Ｇタンパク質がＧαｑ−ガストデューシンに基づくキメラＧタンパク質である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
Ｇタンパク質がキメラＧタンパク質であるＧアルファ１６−ガストデューシン４４である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
アッセイが、Ｔ１Ｒ２および／またはＴ１Ｒ３の膜貫通ドメインを含むタンパク質をコードする１または２以上の核酸を、一過性または安定的にトランスフェクトした細胞を用いる、請求項２〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
少なくとも１つの化合物または化合物群が細胞における味覚受容体の機能活性に作用するかどうかの、細胞における少なくとも１つの機能的応答による決定がなされ、この決定が細胞内メッセンジャーの変化または細胞内メッセンジャーに起因する変化の計測によって行われる、請求項２〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
機能的応答が、ＩＰ３およびカルシウム２＋から選択される細胞内メッセンジャーの変化を計測することで決定される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
アッセイが、細菌細胞、真核細胞、酵母細胞、昆虫細胞、哺乳類細胞、両生類細胞、およびぜん虫細胞からなる群より選択される細胞を用いる、請求項２〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
細胞が非ヒト哺乳類細胞である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
哺乳類細胞が、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬａおよびＨＥＫ−２９３細胞からなる群より選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
甘味料の存在下でＴ１Ｒ２甘味受容体を試験化合物または化合物群に接触させることをさらに含む、請求項２〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
混合物を製造する方法であって、レバウジオシドＡ、モグロシドＶ、ステビオシド、ルブソシド、ナリンジンジヒドロカルコン（ＮａｒＤＨＣ）、ペリラルチン、ｐ−エトキシベンズアルデヒド、シンナモニトリル、サイクラミン酸塩、およびネオヘスペリジンジヒドロカルコン（ＮＤＨＣ）からなる群から選択される化合物と甘味料とを混合する工程を含み、甘味料がスクロースの甘味度の少なくとも２％となる濃度で存在し、化合物が少なくとも１ｐｐｂから１００，０００ｐｐｍの濃度で存在し、化合物が甘味料である場合、その甘味検出閾値に近い濃度で、２％（ｗ／ｗ）スクロース未満のスクロースと等甘味度で存在する、前記方法。
【請求項１９】
試験化合物または化合物群をＴ１Ｒ２−ＴＭＤの調節物質として同定するために組み合わせて利用される、
（ｉ）（ａ）Ｔ１Ｒ２−ＴＭＤ甘味受容体、または（ｂ）Ｔ１Ｒ２−ＴＭＤ甘味受容体とアミノ酸レベルで少なくとも９５％同一である任意のタンパク質、または（ｃ）ストリンジェントな条件で配列番号１とハイブリダイズする核酸によってコードされる任意のタンパク質を発現するが、Ｔ１Ｒ３受容体は発現しない組換え細胞、および
（ｉｉ）Ｔ１Ｒ２−ＴＭＤ甘味受容体のアゴニスト
を含むキット。
【請求項２０】
請求項１９に記載のキットを使用する方法であって、
（ｉ）固体支持体上で組換え細胞を成長させること、
（ｉｉ）定義されたプレートまたはウェルの培養培地へ、適切な濃度のアゴニストの存在下、試験化合物または化合物群を添加すること、および
（ｉｉｉ）試験化合物または化合物群の存在下および非存在下での応答を比較することにより、細胞の機能的応答の変化を決定し、その結果、試験化合物または化合物群がＴ１Ｒ２甘味受容体またはその実質的に類似するホモログの調節物質であることが同定されること
を含む、前記方法。
【請求項２１】
（ｉ）リガンドのＴ１Ｒ２−ＴＭＤへの結合に応答して変化するパラメータを計測すること、
（ｉｉ）任意にリガンドの存在下で、試験化合物または化合物群に応答したパラメータの、ネガティブコントロールと比較した変化を決定し、それにより調節物質またはリガンドを同定すること
を含む、Ｔ１Ｒ２−ＴＭＤを調節する化合物または化合物群を同定する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
リガンドがペリラルチン、ｐ−エトキシベンズアルデヒド、シンナモニトリル、ステビオシド、ルブソシド、レバウジオシドＡおよびネオヘスペリジンジヒドロカルコンからなる群から選択される、請求項７または２１に記載の方法。
【請求項２３】
リガンドの受容体への結合に応答した変化が、蛍光分光法、ＮＭＲ分光法、１または２以上の吸収、屈折率の計測、流体力学法、クロマトグラフィ、溶解度計測、生物化学的方法からなる群より選択される方法で決定され、これらの方法は、溶液、二重膜、固相への連結、単脂質膜中、膜上への結合、および小胞内からなる群より選択された適切な環境において受容体ポリペプチドの特性を計測する、請求項２〜１７および２０〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
（ｉ）が、蛍光分光法、ＮＭＲ分光法、１または２以上の吸収、屈折率の計測、流体力学法、クロマトグラフィ、溶解度計測、生物化学的方法からなる群より選択される方法で行われ、これらの方法は、溶液、二重膜、固相への連結、単脂質膜中、膜上への結合、および小胞内からなる群より選択された適切な環境においてＴ１Ｒ２−ＴＭＤポリペプチドの特性を計測する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
全長野生型Ｔ１Ｒ２および全長野生型Ｔ１Ｒ３タンパク質の両方を採用する方法を包含しない、請求項２〜１７および２０〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
消費材において甘味を増強する方法であって、消費材に、甘味増強化合物を、その甘味検出閾値未満またはその近傍の、濃度２％未満のスクロース溶液と等甘味度の濃度で含ませることを含み、ここで、前記甘味増強化合物はレバウジオシドＡ、モグロシドＶ、ステビオシド、ルブソシド、ナリンジンジヒドロカルコン（ＮａｒＤＨＣ）、ペリラルチン、ｐ−エトキシベンズアルデヒド、シンナモニトリル、サイクラミン酸塩、およびネオヘスペリジンジヒドロカルコン（ＮＤＨＣ）からなる群から選択される化合物を含み、その消費材は甘味料をその甘味検出閾値以上の濃度で含有している、前記方法。
【請求項２７】
レバウジオシドＡを含む剤であって、甘味閾値以上の濃度の、知られたまたは事前に決定された甘味物質と、甘味閾値の近傍または僅かに下の濃度で混合された場合に、レバウジオシドＡと前記知られたまたは事前に決定された甘味物質との混合物の甘味を、前記甘味物質のみまたはレバウジオシドＡのみ含有する混合物の甘味と比較して相加的以上に増強する、前記剤。
【請求項２８】
混合物を製造する方法であって、レバウジオシドＡと甘味料とを混合する工程を含み、甘味料がスクロースの甘味度の少なくとも２％となる濃度で存在し、レバウジオシドＡが少なくとも１ｐｐｂから１００，０００ｐｐｍの、その甘味検出閾値に近い濃度で、２％（ｗ／ｗ）スクロース未満のスクロースと等甘味度で存在する、前記方法。
【請求項２９】
モグロシドＶを含む剤であって、甘味閾値以上の濃度の、知られたまたは事前に決定された甘味物質と、甘味閾値の近傍または僅かに下の濃度で混合された場合に、モグロシドＶと前記知られたまたは事前に決定された甘味物質との混合物の甘味を、前記甘味物質のみまたはモグロシドＶのみ含有する混合物の甘味と比較して相加的以上に増強する、前記剤。
【請求項３０】
混合物を製造する方法であって、モグロシドＶと甘味料とを混合する工程を含み、甘味料がスクロースの甘味度の少なくとも２％となる濃度で存在し、モグロシドＶが少なくとも１ｐｐｂから１００，０００ｐｐｍの、その甘味検出閾値に近い濃度で、２％（ｗ／ｗ）スクロース未満のスクロースと等甘味度で存在する、前記方法。
【請求項３１】
甘味閾値の近傍または僅かに下の濃度のレバウジオシドＡと、甘味閾値以上の濃度の、知られたまたは事前に決定された甘味物質との、レバウジオシドＡと前記知られたまたは事前に決定された甘味物質との混合物の甘味を、前記甘味物質のみまたはレバウジオシドＡのみ含有する混合物の甘味と比較して相加的以上に増強するための使用。
【請求項３２】
甘味料との混合物を製造するためのレバウジオシドＡの使用であって、甘味料がスクロースの甘味度の少なくとも２％となる濃度で存在し、レバウジオシドＡが少なくとも１ｐｐｂから１００，０００ｐｐｍの、その甘味検出閾値に近い濃度で、２％（ｗ／ｗ）スクロース未満のスクロースと等甘味度で存在する、前記使用。
【請求項３３】
甘味閾値の近傍または僅かに下の濃度のモグロシドＶと、甘味閾値以上の濃度の、知られたまたは事前に決定された甘味物質との、モグロシドＶと前記知られたまたは事前に決定された甘味物質との混合物の甘味を、前記甘味物質のみまたはモグロシドＶのみ含有する混合物の甘味と比較して相加的以上に増強するための使用。
【請求項３４】
甘味料との混合物を製造するためのモグロシドＶの使用であって、甘味料がスクロースの甘味度の少なくとも２％となる濃度で存在し、モグロシドＶが少なくとも１ｐｐｂから１００，０００ｐｐｍの、その甘味検出閾値に近い濃度で、２％（ｗ／ｗ）スクロース未満のスクロースと等甘味度で存在する、前記使用。
【請求項３５】
甘味閾値の近傍または僅かに下の濃度の、レバウジオシドＡ、モグロシドＶ、ステビオシド、ルブソシド、ナリンジンジヒドロカルコン（ＮａｒＤＨＣ）、ペリラルチン、ｐ−エトキシベンズアルデヒド、シンナモニトリル、サイクラミン酸塩、およびネオヘスペリジンジヒドロカルコン（ＮＤＨＣ）からなる群から選択される化合物と、甘味閾値以上の濃度の、知られたまたは事前に決定された甘味物質との、前記化合物と前記知られたまたは事前に決定された甘味物質との混合物の甘味を、前記甘味物質のみまたは前記化合物のみ含有する混合物の甘味と比較して相加的以上に増強するための使用。
【請求項３６】
レバウジオシドＡ、モグロシドＶ、ステビオシド、ルブソシド、ナリンジンジヒドロカルコン（ＮａｒＤＨＣ）、ペリラルチン、ｐ−エトキシベンズアルデヒド、シンナモニトリル、サイクラミン酸塩、およびネオヘスペリジンジヒドロカルコン（ＮＤＨＣ）からなる群から選択される化合物を含む、甘味増強剤。