【手続補正書】
【提出日】平成26年7月30日(2014.7.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
胎児の遺伝的異常を決定するための、コンピュータにより実行される方法であって、前記遺伝的異常は染色体異数性であり、以下の工程a)〜e)を含む方法：
a) サンプルから複数のポリヌクレオチド断片の配列情報を得る工程であって、
前記サンプルは、妊娠女性に由来する末梢血サンプルであり母体DNAと胎児DNAとの両方を含有する工程、
b) 前記断片を各染色体における同じサイズの参照固有リードと比較することにより、前記断片を、前記配列情報に基づいて染色体に割り当てる工程であって、
前記参照固有リードは、参照ゲノム配列に基づいて単一の染色体上位置に明確に割り当てることができる、固有の配列を有する染色体断片である工程、
c) 工程b)において染色体の参照固有リードに割り当てられた断片の前記配列情報に基づいて、染色体のカバー深度およびGC含量を決定する工程であって、
前記カバー深度は、参照ヒトゲノム配列に基づいて、前記染色体に固有に割り当てられる断片の数と、前記染色体の同じ断片サイズの参照固有リードの数との間の比である工程、
d) 前記染色体の前記GC含量、および、異数性の不存在下における前記染色体のカバー深度とGC含量との間の確立された関係を使用して、前記染色体のあてはめられたカバー深度を決定する工程であって、
前記確立された関係は、次の工程(i)〜(iv)を含む方法により決定される工程：
(i) ゲノムDNAを含有する複数の正倍数体末梢血サンプルから、前記染色体をカバーする複数のポリヌクレオチド断片の配列情報を得る工程であって、その断片のサイズは、前記工程a)における複数のポリヌクレオチド断片の断片サイズと同じである工程、
(ii) 前記(i)の断片を、前記工程b)に従って、前記(i)の配列情報に基づいて染色体に割り当てる工程、
(iii) 各々の正倍数体サンプルについて、前記工程c)に従って、前記(i)の配列情報に基づいて前記染色体のカバー深度とGC含量とを決定すること、および、
(iv) 工程(iii)において各サンプルについて決定されたカバー深度とGC含量とを使用して、異数性の不存在下における前記染色体のカバー深度とGC含量との間の関係を決定する工程、
ならびに、
e) 前記あてはめられたカバー深度を、工程c)において決定された前記染色体の前記カバー深度と比較する工程であって、
それらの間の差異は胎児の染色体異数性を示す工程。
【請求項２】
前記工程a)は、複数の異なるサンプルから複数のポリヌクレオチド断片の配列情報を得ることをさらに含み、前記カバー深度は、異なるサンプルについて得られた配列リードの総数の違いについて調整するために正規化される、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記正規化は、別の1つの染色体の平均カバー深度に対して行われる、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
前記正規化は、他のすべての常染色体の平均カバー深度、または他のすべての染色体の平均カバー深度に対して行われる、請求項2に記載の方法。
【請求項５】
前記工程c)において、染色体のGC含量は、前記染色体に割り当てられるすべての断片の平均GC含量として決定される、請求項1〜4のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
胎児の性別を決定する工程をさらに含む、請求項2〜4のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
胎児の性別が以下の式に従って決定され、
【数６】
2014520509.tif 000001
式中、
【数７】
2014520509.tif 000002
および
【数８】
2014520509.tif 000003
は、それぞれ、サンプルiのX染色体およびY染色体の相対カバー深度である、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
胎児分割合を推定する工程をさらに含み、
胎児分割合が、前記工程c)に従って決定されたX染色体および／またはY染色体のカバー深度に基づいて、
（イ）以下の式に従って計算され、
【数９】
2014520509.tif 000004
ここで、
Cri,Yは、サンプルiのY染色体のカバー深度であり、
【数１０】
2014520509.tif 000005
は、女性胎児を身ごもった妊娠女性からのサンプルのY染色体カバー深度と対応するGC含量との関係から計算される、あてはめられたカバー深度であり、
【数１１】
2014520509.tif 000006
は、男性被検者のY染色体カバー深度と対応するGC含量との関係から計算される、あてはめられたカバー深度を表し、または、
（ロ）以下の式に従って計算され、
【数１２】
2014520509.tif 000007
ここで、
Cri,Xは、サンプルiのX染色体のカバー深度であり、
【数１３】
2014520509.tif 000008
は、女性胎児を身ごもった妊娠女性からのサンプルのX染色体カバー深度と対応するGC含量との関係から計算される、あてはめられたカバー深度であり、
【数１４】
2014520509.tif 000009
は、男性被検者からのサンプルのX染色体カバー深度と対応するGC含量との関係から計算される、あてはめられたカバー深度を表し、または、
（ハ）以下の式に従って計算され、
【数１５】
2014520509.tif 000010
ここで、
【数１６】
2014520509.tif 000011
は、女性胎児を身ごもった妊娠女性からのサンプルのX染色体カバー深度と対応するGC含量との関係から計算される、あてはめられたカバー深度であり、
【数１７】
2014520509.tif 000012
は、女性胎児を身ごもった妊娠女性からのサンプルのY染色体カバー深度と対応するGC含量との関係から計算される、あてはめられたカバー深度を表し、
【数１８】
2014520509.tif 000013
は、男性被検者からのサンプルのX染色体カバー深度と対応するGC含量との関係から計算される、あてはめられたカバー深度を表し、
【数１９】
2014520509.tif 000014
は、男性被検者のY染色体カバー深度と対応するGC含量との関係から計算される、あてはめられたカバー深度を表す、
請求項2〜4のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記あてはめられたカバー深度と前記工程c)において決定された染色体のカバー深度との比較は、統計学的仮説検定により実行され、
1つの仮説は胎児が正倍数体であること（H0）であり、もう1つの仮説は胎児が前記染色体について異数性を示すこと（H1）である、請求項2〜4のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
両方の仮説についてスチューデントのt統計量が計算される、請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
H0およびH1についてのスチューデントのt統計量が、それぞれ以下の式
【数２０】
2014520509.tif 000015
および
【数２１】
2014520509.tif 000016
に従って計算され、ここで
【数２２】
2014520509.tif 000017
は胎児分割合であり、
iはサンプル番号であり、
jは染色体番号であり、
以下の式
【数１】
2014520509.tif 000018
の関係が成立し、式中、
【数２】
2014520509.tif 000019
はサンプルi、染色体jの正規化されたカバー深度と対応するGC含量との間の関係についての関数を表し、εi,jはサンプルi、染色体jの残差を表し、
以下の式
【数３】
2014520509.tif 000020
の関係が成立し、この式はあてはめられたカバー深度を表し、
stdjは、以下の式
【数４】
2014520509.tif 000021
に従って計算される標準変動であり、ここでnsは参照サンプルの数を表す、
請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
t1およびt2の対数尤度比は以下の式に従って計算され、
【数２３】
2014520509.tif 000022
ここで、Li,jは対数尤度比であり、degreeはt分布の自由度を表し、Dは二倍性を表し、Tはトリソミーを表し、
【数２４】
2014520509.tif 000023
は、t分布自由度が与えられた場合の条件付き確率密度を表し、
前記比が1より大きい場合に、胎児が前記染色体についてトリソミーを示すと推量される、
請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
胎児の常染色体の異数性を決定することにおいて使用される、請求項1〜12のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記胎児異数性が、13トリソミー、18トリソミー、および21トリソミーからなる群から選択される、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
性染色体の異数性を決定することにおいて使用される、請求項6または7に記載の方法。
【請求項１６】
前記性染色体異数性が、XO、XXX、XXY、およびXYYからなる群から選択される、請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
請求項1〜16のいずれかに記載の方法を実行するための複数の指示を含むコンピュータ可読媒体であって、前記指示には、前記工程a)に従って得られる配列情報が補足される、コンピュータ可読媒体。
【請求項１８】
請求項1〜16のいずれかに記載の方法を実行するための手段を備えるシステム。