【手続補正書】
【提出日】平成24年9月5日(2012.9.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
1,4-ブタンジオール(BDO)経路を有する非天然微生物体であって、該微生物体は、BDOを生成するのに十分な量で発現されるBDO経路酵素をコードする外因性核酸を含み、該BDO経路酵素は、
（Ａ）3-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドロゲナーゼ、3-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドラターゼ、ビニルアセチル-CoAΔ-イソメラーゼ及び4-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドラターゼからなる群から選択される少なくとも１つのBDO経路酵素、
（Ｂ）グルタミン酸CoAトランスフェラーゼ、グルタミル-CoAヒドロラーゼ、グルタミル-CoAリガーゼ、グルタミン酸5-キナーゼ、グルタミン酸-5-セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ(リン酸化)、グルタミル-CoAレダクターゼ、グルタミン酸-5-セミアルデヒドレダクターゼ、グルタミル-CoAレダクターゼ(アルコール形成)、2-アミノ-5-ヒドロキシペンタン酸オキシドレダクターゼ(脱アミノ化)、2-アミノ-5-ヒドロキシペンタン酸トランスアミナーゼ、5-ヒドロキシ-2-オキソペンタン酸デカルボキシラーゼ、及び5-ヒドロキシ-2-オキソペンタン酸デヒドロゲナーゼ(脱カルボキシル化)からなる群から選択される少なくとも１つのBDO経路酵素、
（Ｃ）グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、4-アミノ酪酸オキシドレダクターゼ(脱アミノ化)、4-アミノ酪酸トランスアミナーゼ、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、4-ヒドロキシブチリル-CoAヒドロラーゼ、4-ヒドロキシブチリル-CoAリガーゼ及び4-ヒドロキシブタナールデヒドロゲナーゼ(リン酸化)からなる群から選択される少なくとも１つのBDO経路酵素、
（Ｄ）4-アミノ酪酸CoAトランスフェラーゼ、4-アミノブチリル-CoAヒドロラーゼ、4-アミノ酪酸-CoAリガーゼ、4-アミノブチリル-CoAオキシドレダクターゼ(脱アミノ化)、4-アミノブチリル-CoAトランスアミナーゼ及び4-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドロゲナーゼからなる群から選択される少なくとも１つのBDO経路酵素、
（Ｅ）4-アミノ酪酸CoAトランスフェラーゼ、4-アミノブチリル-CoAヒドロラーゼ、4-アミノ酪酸-CoAリガーゼ、4-アミノブチリル-CoAレダクターゼ(アルコール形成)、4-アミノブチリル-CoAレダクターゼ、4-アミノブタン-1-オールデヒドロゲナーゼ、4-アミノブタン-1-オールオキシドレダクターゼ(脱アミノ化)及び4-アミノブタン-1-オールトランスアミナーゼからなる群から選択される少なくとも１つのBDO経路酵素、
（Ｆ）4-アミノ酪酸キナーゼ、4-アミノブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ(リン酸化)、4-アミノブタン-1-オールデヒドロゲナーゼ、4-アミノブタン-1-オールオキシドレダクターゼ(脱アミノ化)、4-アミノブタン-1-オールトランスアミナーゼ、[(4-アミノブタノイル)オキシ]ホスホン酸オキシドレダクターゼ(脱アミノ化)、[(4-アミノブタノイル)オキシ]ホスホン酸トランスアミナーゼ、4-ヒドロキシブチリル-リン酸デヒドロゲナーゼ及び4-ヒドロキシブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ(リン酸化)からなる群から選択される少なくとも１つのBDO経路酵素、
（Ｇ）アルファ-ケトグルタル酸5-キナーゼ、2,5-ジオキソペンタン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ(リン酸化)、2,5-ジオキソペンタン酸レダクターゼ、アルファ-ケトグルタル酸CoAトランスフェラーゼ、アルファ-ケトグルタリル-CoAヒドロラーゼ、アルファ-ケトグルタリル-CoAリガーゼ、アルファ-ケトグルタリル-CoAレダクターゼ、5-ヒドロキシ-2-オキソペンタン酸デヒドロゲナーゼ、アルファ-ケトグルタリル-CoAレダクターゼ(アルコール形成)、5-ヒドロキシ-2-オキソペンタン酸デカルボキシラーゼ及び5-ヒドロキシ-2-オキソペンタン酸デヒドロゲナーゼ(脱カルボキシル化)からなる群から選択される少なくとも１つのBDO経路酵素、
（Ｈ）ホモセリンデアミナーゼ、ホモセリンCoAトランスフェラーゼ、ホモセリン-CoAヒドロラーゼ、ホモセリン-CoAリガーゼ、ホモセリン-CoAデアミナーゼ、4-ヒドロキシブタ-2-エノイル-CoAトランスフェラーゼ、4-ヒドロキシブタ-2-エノイル-CoAヒドロラーゼ、4-ヒドロキシブタ-2-エノイル-CoAリガーゼ、4-ヒドロキシブタ-2-エン酸レダクターゼ、4-ヒドロキシブチリル-CoAトランスフェラーゼ、4-ヒドロキシブチリル-CoAヒドロラーゼ、4-ヒドロキシブチリル-CoAリガーゼ及び4-ヒドロキシブタ-2-エノイル-CoAレダクターゼからなる群から選択される少なくとも１つのBDO経路酵素、又は、
（Ｉ）スクシニル-CoAレダクターゼ(アルコール形成)、4-ヒドロキシブチリル-CoAヒドロラーゼ、4-ヒドロキシブチリル-CoAリガーゼ及び4-ヒドロキシブタナールデヒドロゲナーゼ(リン酸化)からなる群から選択される少なくとも１つのBDO経路酵素、
を含む、前記非天然微生物体。
【請求項２】
選択肢（Ａ）、（Ｂ）、（Ｄ）、（Ｇ）又は（Ｈ）の前記BDO経路酵素が、4-ヒドロキシブチリル-CoAレダクターゼ(アルコール形成)、4-ヒドロキシブチリル-CoAレダクターゼ又は1,4-ブタンジオールデヒドロゲナーゼをさらに含む、請求項1記載の非天然微生物体。
【請求項３】
選択肢（Ｃ）の前記BDO経路酵素が、アルファ-ケトグルタル酸デカルボキシラーゼ、4-ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ、4-ヒドロキシブチリル-CoAトランスフェラーゼ、4-ヒドロキシ酪酸キナーゼ、ホスホトランス-4-ヒドロキシブチリラーゼ、4-ヒドロキシブチリル-CoAレダクターゼ、4-ヒドロキシブチリル-CoAレダクターゼ(アルコール形成)又は1,4-ブタンジオールデヒドロゲナーゼをさらに含む、請求項1記載の非天然微生物体。
【請求項４】
選択肢（Ｅ）又は（Ｆ）の前記BDO経路酵素が、1,4-ブタンジオールデヒドロゲナーゼをさらに含む、請求項1記載の非天然微生物体。
【請求項５】
選択肢（Ｉ）の前記BDO経路酵素が、スクシニル-CoAレダクターゼ、4-ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ、4-ヒドロキシブチリル-CoAトランスフェラーゼ、4-ヒドロキシ酪酸キナーゼ、ホスホトランス-4-ヒドロキシブチリラーゼ、4-ヒドロキシブチリル-CoAレダクターゼ、4-ヒドロキシブチリル-CoAレダクターゼ(アルコール形成)又は1,4-ブタンジオールデヒドロゲナーゼをさらに含む、請求項1記載の非天然微生物体。
【請求項６】
選択肢（Ｂ）、（Ｄ）、（Ｅ）、（Ｆ）、（Ｇ）及び（Ｈ）の前記微生物体が、それぞれがBDO経路酵素をコードする2つ又は3つの外因性核酸を含む、請求項1記載の非天然微生物体。
【請求項７】
選択肢（Ｂ）、（Ｅ）、（Ｆ）及び（Ｇ）の前記微生物体が、それぞれがBDO経路酵素をコードする4つの外因性核酸を含む、請求項1記載の非天然微生物体。
【請求項８】
選択肢（Ｂ）の前記微生物体が、それぞれがBDO経路酵素をコードする5つの外因性核酸を含む、請求項1記載の非天然微生物体。
【請求項９】
前記微生物体が、
（Ｊ）それぞれがBDO経路酵素をコードする4つの外因性核酸[a、b、c、d]（ここで、該4つの外因性核酸は、
（a）グルタミン酸CoAトランスフェラーゼ、グルタミル-CoAヒドロラーゼ又はグルタミル-CoAリガーゼ、
（b）グルタミル-CoAレダクターゼ(アルコール形成)、
（c）2-アミノ-5-ヒドロキシペンタン酸オキシドレダクターゼ(脱アミノ化)又は2-アミノ-5-ヒドロキシペンタン酸トランスアミナーゼ、及び、
（d）5-ヒドロキシ-2-オキソペンタン酸デカルボキシラーゼ又は5-ヒドロキシ-2-オキソペンタン酸デヒドロゲナーゼ(脱カルボキシル化)、
をコードする。）、又は、
（Ｋ）それぞれがBDO経路酵素をコードする4つの外因性核酸[a、b、c、d]（ここで、該4つの外因性核酸は、
（a）グルタミン酸5-キナーゼ、
（b）グルタミン酸-5-セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ(リン酸化)、
（c）2-アミノ-5-ヒドロキシペンタン酸オキシドレダクターゼ(脱アミノ化)又は2-アミノ-5-ヒドロキシペンタン酸トランスアミナーゼ、及び、
（d）5-ヒドロキシ-2-オキソペンタン酸デカルボキシラーゼ又は5-ヒドロキシ-2-オキソペンタン酸デヒドロゲナーゼ(脱カルボキシル化)、
をコードする。）、又は、
（Ｌ）それぞれがBDO経路酵素をコードする5つの外因性核酸[a、b、c、d、e]（ここで、該5つの外因性核酸は、
（a）グルタミン酸CoAトランスフェラーゼ、グルタミル-CoAヒドロラーゼ又はグルタミル-CoAリガーゼ、
（b）グルタミル-CoAレダクターゼ、
（c）グルタミン酸-5-セミアルデヒドレダクターゼ、
（d）2-アミノ-5-ヒドロキシペンタン酸オキシドレダクターゼ(脱アミノ化)又は2-アミノ-5-ヒドロキシペンタン酸トランスアミナーゼ、及び、
（e）5-ヒドロキシ-2-オキソペンタン酸デカルボキシラーゼ又は5-ヒドロキシ-2-オキソペンタン酸デヒドロゲナーゼ(脱カルボキシル化)、
をコードする。）、又は、
（Ｍ）それぞれがBDO経路酵素をコードする5つの外因性核酸[a、b、c、d、e]（ここで、該5つの外因性核酸は、
（a）グルタミン酸5-キナーゼ、
（b）グルタミン酸-5-セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ(リン酸化)、
（c）グルタミン酸-5-セミアルデヒドレダクターゼ、
（d）2-アミノ-5-ヒドロキシペンタン酸オキシドレダクターゼ(脱アミノ化)又は2-アミノ-5-ヒドロキシペンタン酸トランスアミナーゼ、及び、
（e）5-ヒドロキシ-2-オキソペンタン酸デカルボキシラーゼ又は5-ヒドロキシ-2-オキソペンタン酸デヒドロゲナーゼ(脱カルボキシル化)、
をコードする。）、又は、
（Ｎ）それぞれがBDO経路酵素をコードする3つの外因性核酸[a、b、c]（ここで、該3つの外因性核酸は、
（a）4-アミノ酪酸CoAトランスフェラーゼ、4-アミノブチリル-CoAヒドロラーゼ又は4-アミノ酪酸-CoAリガーゼ、
（b）4-アミノブチリル-CoAオキシドレダクターゼ(脱アミノ化)又は4-アミノブチリル-CoAトランスアミナーゼ、及び、
（c）4-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドロゲナーゼ、
をコードする。）、又は、
（Ｏ）それぞれがBDO経路酵素をコードする3つの外因性核酸[a、b、c]（ここで、該3つの外因性核酸は、
（a）4-アミノ酪酸CoAトランスフェラーゼ、4-アミノブチリル-CoAヒドロラーゼ又は4-アミノ酪酸-CoAリガーゼ、
（b）4-アミノブチリル-CoAレダクターゼ(アルコール形成)、及び、
（c）4-アミノブタン-1-オールオキシドレダクターゼ(脱アミノ化)又は4-アミノブタン-1-オールトランスアミナーゼ、
をコードする。）、又は、
（Ｐ）それぞれがBDO経路酵素をコードする4つの外因性核酸[a、b、c、d]（ここで、該4つの外因性核酸は、
（a）4-アミノ酪酸CoAトランスフェラーゼ、4-アミノブチリル-CoAヒドロラーゼ又は4-アミノ酪酸-CoAリガーゼ、
（b）4-アミノブチリル-CoAレダクターゼ、
（c）4-アミノブタン-1-オールデヒドロゲナーゼ、及び、
（d）4-アミノブタン-1-オールオキシドレダクターゼ(脱アミノ化)又は4-アミノブタン-1-オールトランスアミナーゼ、
をコードする。）、又は、
（Ｑ）それぞれがBDO経路酵素をコードする4つの外因性核酸[a、b、c、d]（ここで、該4つの外因性核酸は、
（a）4-アミノ酪酸キナーゼ、
（b）4-アミノブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ(リン酸化)、
（c）4-アミノブタン-1-オールデヒドロゲナーゼ、及び、
（d）4-アミノブタン-1-オールオキシドレダクターゼ(脱アミノ化)又は4-アミノブタン-1-オールトランスアミナーゼ、
をコードする。）、又は、
（Ｒ）それぞれがBDO経路酵素をコードする4つの外因性核酸[a、b、c、d]（ここで、該4つの外因性核酸は、
（a）4-アミノ酪酸キナーゼ、
（b）[(4-アミノブタノリル)オキシ]ホスホン酸オキシドレダクターゼ(脱アミノ化)又は[(4-アミノブタノイル)オキシ]ホスホン酸トランスアミナーゼ、
（c）4-ヒドロキシブチリル-リン酸デヒドロゲナーゼ、及び、
（d）4-ヒドロキシブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ(リン酸化)、
をコードする。）、又は、
（Ｓ）それぞれがBDO経路酵素をコードする3つの外因性核酸[a、b、c]（ここで、該3つの外因性核酸は、
（a）アルファ-ケトグルタル酸CoAトランスフェラーゼ、アルファ-ケトグルタリル-CoAヒドロラーゼ又はアルファ-ケトグルタリル-CoAリガーゼ、
（b）アルファ-ケトグルタリル-CoAレダクターゼ(アルコール形成)、及び、
（c）5-ヒドロキシ-2-オキソペンタン酸デカルボキシラーゼ、
をコードする。）、又は、
（Ｔ）それぞれがBDO経路酵素をコードする3つの外因性核酸[a、b、c]（ここで、該3つの外因性核酸は、
（a）アルファ-ケトグルタル酸CoAトランスフェラーゼ、アルファ-ケトグルタリル-CoAヒドロラーゼ又はアルファ-ケトグルタリル-CoAリガーゼ、
（b）アルファ-ケトグルタリル-CoAレダクターゼ(アルコール形成)、及び、
（c）5-ヒドロキシ-2-オキソペンタン酸デヒドロゲナーゼ(脱カルボキシル化)、
をコードする。）、又は、
（Ｕ）それぞれがBDO経路酵素をコードする4つの外因性核酸[a、b、c、d]（ここで、該4つの外因性核酸は、
（a）アルファ-ケトグルタル酸5-キナーゼ、
（b）2,5-ジオキソペンタン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ(リン酸化)、
（c）2,5-ジオキソペンタン酸レダクターゼ、及び、
（d）5-ヒドロキシ-2-オキソペンタン酸デカルボキシラーゼ、
をコードする。）、又は、
（Ｖ）それぞれがBDO経路酵素をコードする4つの外因性核酸[a、b、c、d]（ここで、該4つの外因性核酸は、
（a）アルファ-ケトグルタル酸5-キナーゼ、
（b）2,5-ジオキソペンタン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ(リン酸化)、
（c）2,5-ジオキソペンタン酸レダクターゼ、及び、
（d）5-ヒドロキシ-2-オキソペンタン酸デヒドロゲナーゼ(脱カルボキシル化)、
をコードする。）、又は、
（Ｗ）それぞれがBDO経路酵素をコードする4つの外因性核酸[a、b、c、d]（ここで、該4つの外因性核酸は、
（a）アルファ-ケトグルタル酸CoAトランスフェラーゼ、アルファ-ケトグルタリル-CoAヒドロラーゼ又はアルファ-ケトグルタリル-CoAリガーゼ、
（b）アルファ-ケトグルタリル-CoAレダクターゼ、
（c）5-ヒドロキシ-2-オキソペンタン酸デヒドロゲナーゼ、及び、
（d）5-ヒドロキシ-2-オキソペンタン酸デカルボキシラーゼ、
をコードする。）、又は、
（Ｘ）それぞれがBDO経路酵素をコードする4つの外因性核酸[a、b、c、d]（ここで、該4つの外因性核酸は、
（a）アルファ-ケトグルタル酸CoAトランスフェラーゼ、アルファ-ケトグルタリル-CoAヒドロラーゼ又はアルファ-ケトグルタリル-CoAリガーゼ、
（b）アルファ-ケトグルタリル-CoAレダクターゼ、
（c）5-ヒドロキシ-2-オキソペンタン酸デヒドロゲナーゼ、及び、
（d）5-ヒドロキシ-2-オキソペンタン酸デヒドロゲナーゼ(脱カルボキシル化)、
をコードする。）、又は、
（Ｙ）それぞれがBDO経路酵素をコードする3つの外因性核酸[a、b、c]（ここで、該3つの外因性核酸は、
（a）ホモセリンデアミナーゼ、
（b）4-ヒドロキシブタ-2-エノイル-CoAトランスフェラーゼ、4-ヒドロキシブタ-2-エノイル-CoAヒドロラーゼ、4-ヒドロキシブタ-2-エノイル-CoAリガーゼ、及び、
（c）4-ヒドロキシブタ-2-エノイル-CoAレダクターゼ、
をコードする。）、又は、
（Ｚ）それぞれがBDO経路酵素をコードする3つの外因性核酸[a、b、c]（ここで、該3つの外因性核酸は、
（a）ホモセリンCoAトランスフェラーゼ、ホモセリン-CoAヒドロラーゼ又はホモセリンCoAリガーゼ、
（b）ホモセリン-CoAデアミナーゼ、及び、
（c）4-ヒドロキシブタ-2-エノイル-CoAレダクターゼ、
をコードする。）、及び又は、
（ＡＡ）それぞれがBDO経路酵素をコードする3つの外因性核酸[a、b、c]（ここで、該3つの外因性核酸は、
（a）ホモセリンデアミナーゼ、
（b）4-ヒドロキシブタ-2-エン酸レダクターゼ、及び、
（c）4-ヒドロキシブチリル-CoAトランスフェラーゼ、4-ヒドロキシブチリル-CoAヒドロラーゼ又は4-ヒドロキシブチリル-CoAリガーゼ、
をコードする。）、
を含む、請求項1記載の非天然微生物体。
【請求項１０】
選択肢（Ｊ）、（Ｋ）、（Ｌ）、（Ｍ）、（Ｎ）、（Ｔ）、（Ｖ）、（Ｘ）、（Ｙ）、（Ｚ）又は（ＡＡ）の前記BDO経路が、4-ヒドロキシブチリル-CoAレダクターゼ(アルコール形成)、4-ヒドロキシブチリル-CoAレダクターゼ又は1,4-ブタンジオールデヒドロゲナーゼをさらに含む、請求項9記載の非天然微生物体。
【請求項１１】
選択肢（Ｏ）、（Ｐ）、（Ｑ）、（Ｒ）、（Ｓ）、（Ｕ）又は（Ｗ）の前記BDO経路が、1,4-ブタンジオールデヒドロゲナーゼをさらに含む、請求項9記載の非天然微生物体。
【請求項１２】
前記少なくとも1つの外因性核酸が異種核酸である、請求項1〜11のいずれか1項記載の非天然微生物体。
【請求項１３】
実質的に嫌気性の培地に存在する、請求項1〜12のいずれか1項記載の非天然微生物体。
【請求項１４】
1,4-ブタンジオール(BDO)経路を有する非天然微生物体であって、該微生物体は、BDOを生成するのに十分な量で発現されるBDO経路酵素をコードする外因性核酸を含み、該BDO経路酵素は、図1又は8〜13のいずれかに示されている若しくは明細書中に記載されている少なくとも1つのBDO経路酵素を含む、前記非天然微生物体。
【請求項１５】
請求項1〜14のいずれか1項記載の非天然微生物体を、BDOを生成するための条件下で、且つ十分な時間にわたって培養することを含む、BDOを生成するための方法。
【請求項１６】
前記非天然微生物体が実質的に嫌気性の培地に存在する、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
前記少なくとも1つの外因性核酸が異種核酸である、請求項15記載の方法。