(57)【要約】【課題】ヒト口腔内バイオフィルムに類似し、口腔疾患等に対する有効成分の探索・評価および口腔疾患予防剤等の開発に有効なインビトロバイオフィルムを提供すること。【解決手段】少なくとも１種の生細菌を連続培養して作成したインビトロバイオフィルムであって、該連続培養で用いられる培養液を異種培養液に一定時間置換することで作成したインビトロバイオフィルム。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１種の生細菌を連続培養して作成されたインビトロバイオフィルムであって、
該連続培養で用いられる培養液を異種培養液に一定時間置換することで作成されたことを特徴とするインビトロバイオフィルム。
【請求項２】
前記異種培養液に含まれる栄養源が前記連続培養で用いられる培養液に含まれる栄養源と異なることを特徴とする請求項１記載のインビトロバイオフィルム。
【請求項３】
前記連続培養に用いられる培養液が糖分を含有しないとともに、前記異種培養液が糖分を含有することを特徴とする請求項１または２記載のインビトロバイオフィルム。
【請求項４】
前記異種培養液が薬剤であることを特徴とする請求項１，２または３記載のインビトロバイオフィルム。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、連続培養で作成されたインビトロバイオフィルムに関し、さらに詳述すると、ヒト口腔内バイオフィルムに類似し、口腔疾患等に対する有効成分の探索・評価および口腔疾患予防剤等の開発に有用なインビトロバイオフィルムに関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】
従来から、細菌が形成するバイオフィルムは、医学および歯学分野における各種疾病や、環境問題等を引き起こすことが知られている。
上記バイオフィルムを構成している細菌は、同一細菌の浮遊性状態とは異なる性質を持ち、その薬剤耐性や表現型が異なることが指摘されており、このような性状を実験上再現させるため、連続培養やシェアフォースをかける培養法などによりバイオフィルムを作成する工夫がなされている。
しかしながら、自然環境下では、時間によってバイオフィルムへの栄養供給量が異なる場合があり、実験室において単一培地で連続培養しても、形成されるバイオフィルムの性状が環境中のバイオフィルムとは異なるという欠点がある。
【０００３】
また、バイオフィルム（プラーク）は、口腔内におけるう蝕や歯周病の病原因子として捉えられ、これらの疾患予防のための有効成分探索・評価にインビトロバイオフィルムが用いられるケースも多い。
このインビトロバイオフィルムを作成する手段として、最も高頻度で用いられているものは、ミュータンス連鎖球菌にショ糖を加えた培地で一日間バッチ培養する方法である。しかしながら、この方法では、う蝕についてしか評価できない上、系が単純すぎるため、該方法では有効性を持つ薬剤でも、ヒトの口腔内では有効性を示さない例が多いという欠点がある。
【０００４】
一方、混合菌を用いた低栄養培地による連続培養や、この連続培養中に糖類を添加する等の方法も検討されているが、前者の方法では、栄養源が単一であり、後者の方法では、糖類が連続培養の希釈にまかされてしまうため、いずれも実際の口腔内環境とは異なり、その結果実際のバイオフィルムとは細菌学的または生化学的性状が異なるという欠点があった。
【０００５】
本発明は上記事情に鑑みなされたものであり、ヒト口腔内バイオフィルムに類似し、口腔疾患等に対する有効成分の探索・評価および口腔疾患予防剤等の開発に有効なインビトロバイオフィルムを提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段および発明の実施の形態】
本発明者らは、上記目的を達成するため、細菌の栄養源という観点からヒト口腔内の性状、すなわち、通常時は唾液が流れているのみで、遊離の糖分などは含まれておらず、唾液中の細菌栄養成分としては一定濃度のタンパク、ペプチド、糖タンパクなどが考えられ、一方、飲食時には高濃度のタンパク、糖類、ビタミン、ミネラルが供給されるという性状に着目して鋭意検討を重ねた結果、連続培養中に培養液を、これとは異なる種類の培養液に所定時間置換することで、この場合、特に、置換される培養液に連続培養に用いられる培養液と異なる栄養源を含ませることで、よりヒト口腔内と類似性の高いバイオフィルムが得られることを見いだし、本発明を完成した。
【０００７】
すなわち、本発明は、
１．少なくとも１種の生細菌を連続培養して作成されたインビトロバイオフィルムであって、該連続培養で用いられる培養液を異種培養液に一定時間置換することで作成されたことを特徴とするインビトロバイオフィルム、
２．前記異種培養液に含まれる栄養源が前記連続培養で用いられる培養液に含まれる栄養源と異なることを特徴とする１のインビトロバイオフィルム、
３．前記連続培養に用いられる培養液が糖分を含有しないものであるとともに、前記異種培養液が糖分を含有することを特徴とする１または２のインビトロバイオフィルム、
４．前記異種培養液が薬剤であることを特徴とする１，２または３のインビトロバイオフィルム
を提供する。
【０００８】
以下、本発明についてさらに詳しく説明する。
本発明に係るインビトロバイオフィルムは、上述のように、少なくとも１種の生細菌を連続培養して作成されたインビトロバイオフィルムであって、連続培養で用いられる培養液を異種培養液に一定時間置換することで作成されたものである。
ここで、連続培養に用いられる培養液としては、インビトロバイオフィルムの作成に一般的に用いられるものであれば、特に限定はなく、一般細菌用培地、ペプトン類、糖タンパク類、アミノ酸類、またはこれらの混合物等を適宜用いることができ、必要に応じて無機塩類などを添加することもできるが、後に詳述するように、糖分を含まないものであることが好ましい。一方、異種培養液としては、連続培養に用いられる培養液と異なる種類の培養液であればよいが、特に、連続培養で用いられる培養液と異なる栄養源を含有するものを用いることが好ましく、このような培養液で置換することで、得られるインビトロバイオフィルムをよりヒト口腔内のバイオフィルムに近づけることができる。
【０００９】
また、本発明では特に、連続培養に用いられる培養液には、糖分を含まないものを用いるとともに、異種培養液には、糖分を含むものを用いることが好ましい。このように、通常は遊離糖分を含まない培養液を用いて連続培養を行った後にこれを排出し、続いて、糖分を含む培養液を加えて一定時間培養し、さらに再び遊離糖分を含まない培養液に戻すという連続培養を行うことで、ヒト口腔内バイオフィルムと類似性の高いインビトロバイオフィルムを簡便かつ効率的に得ることができる。
【００１０】
ここで、連続培養に用いられる糖分を含まない培養液としては、上述した培養液において糖分を含まないものを用いればよい。一方、糖分を含む異種培養液としては、糖含有一般細菌用培地、糖含有水溶液、またはこれらの混合物等を用いることができる。なお、使用可能な糖としては、ブドウ糖、果糖、ショ糖、その他の水溶性の単糖、オリゴ糖、多糖類などを単独または混合して用いることができる。
【００１１】
また、異種培養液として薬剤を用いることもでき、薬剤を用いることで、（１）バイオフィルムの量および病原性をコントロールする、（２）口腔疾患予防剤を評価、探索することができる。
この場合、使用可能な薬剤としては、特に限定されるものではなく、例えば、フッ素、トリクロサン、クロルヘキシジン、ＣＰＣ、天然または植物抽出物、界面活性剤等、あるいは組成物として歯磨き希釈液、洗口剤、ガム、タブレットの溶解物等が挙げられる。
【００１２】
上記生細菌としては、通常、インビトロバイオフィルムの作成に用いられる生細菌であれば特に限定はなく、例えば、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、アクチノマイセス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）属、ベイヨネラ（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ）属，フソバクテリウム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属，ラクトバシリス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属，ポルフィロモナス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ）属，ナイセシア（Ｎｅｉｓｓｅｓｉａ）属等が挙げられる。
【００１３】
上記ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属としては、特に限定されるものではなく、例えば、ストレプトコッカス　アシドミニマス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（以下、Ｓと略記する。）　ａｃｉｄｏｍｉｎｉｍｕｓ），ストレプトコッカス　アガラクティー（Ｓ．　ａｇａｌａｃｔｉａｅ），ストレプトコッカス　アラクトリティカス（Ｓ．　ａｌａｃｔｏｌｙｔｉｃｕｓ），ストレプトコッカス　アンギノサス（Ｓ．　ａｎｇｉｎｏｓｕｓ），ストレプトコッカス　ボビス（Ｓ．　ｂｏｖｉｓ），ストレプトコッカス　カニス（Ｓ．　ｃａｎｉｓ），ストレプトコッカス　カプリナス（Ｓ．　ｃａｐｒｉｎｕｓ），ストレプトコッカス　コンスティラタス亜種コンスティラタス（Ｓ．　ｃｏｎｓｔｅｌｌａｔｕｓ　ｓｕｂｓｐ．　ｃｏｎｓｔｅｌｌａｔｕｓ），ストレプトコッカス　コンスティラタス亜種ファリンギス（Ｓ．　ｃｏｎｓｔｅｌｌａｔｕｓｓｕｂｓｐ．　ｐｈａｒｙｎｇｉｓ），ストレプトコッカス　クリセティ（Ｓ．　ｃｒｉｃｅｔｉ），ストレプトコッカス　クリスタタス（Ｓ．　ｃｒｉｓｔａｔｕｓ），ストレプトコッカス　ディデェルフィス（Ｓ．　ｄｉｄｅｌｐｈｉｓ），ストレプトコッカス　ディフィシリス（Ｓ．　ｄｉｆｆｉｃｉｌｉｓ），ストレプトコッカス　ドゥネイ（Ｓ．　ｄｏｗｎｅｉ），ストレプトコッカス　ディサガラクティアエ亜種ディサガラクティアエ（Ｓ．　ｄｙｓａｇａｌａｃｔｉａｅ　ｓｕｂｓｐ．　ｄｙｓａｇａｌａｃｔｉａｅ），ストレプトコッカス　ディサガラクティアエ亜種エクイシミリス（Ｓ．　ｄｙｓａｇａｌａｃｔｉａｅｓｕｂｓｐ．　ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｉｓ），ストレプトコッカス　エクイ亜種エクイ（Ｓ．　ｅｑｕｉ　ｓｕｂｓｐ．　ｅｑｕｉ），ストレプトコッカス　エクイ亜種ゾエピデミカス（Ｓ．　ｅｑｕｉ　ｓｕｂｓｐ．　ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ），ストレプトコッカス　エクイニィス（Ｓ．　ｅｑｕｉｎｕｓ），ストレプトコッカス　フェラス（Ｓ．　ｆｅｒｕｓ），ストレプトコッカス　ガロリティカス（Ｓ．　ｇａｌｌｏｌｙｔｉｃｕｓ），ストレプトコッカス　ゴルドニー（Ｓ．　ｇｏｒｄｏｎｉｉ），ストレプトコッカス　ヒョインテスティナリス（Ｓ．　ｈｙｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ），ストレプトコッカス　ヒョヴァギナリス（Ｓ．　ｈｙｏｖａｇｉｎａｌｉｓ），ストレプトコッカス　インファンタリウス亜種インファンタリウス（Ｓ．　ｉｎｆａｎｔａｒｉｕｓ　ｓｕｂｓｐ．　ｉｎｆａｎｔａｒｉｕｓ），ストレプトコッカス　インファンタリウス亜種コリィ（Ｓ．　ｉｎｆａｎｔａｒｉｕｓ　ｓｕｂｓｐ．　ｃｏｌｉ），ストレプトコッカス　インファンティス（Ｓ．　ｉｎｆａｎｔｉｓ），ストレプトコッカス　インアエ（Ｓ．　ｉｎｉａｅ），ストレプトコッカス　インターミディウス（Ｓ．　ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ），ストレプトコッカス　インテスティナリス（Ｓ．　ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ），ストレプトコッカス　マカカエ（Ｓ．ｍａｃａｃａｅ），ストレプトコッカス　マセドニカス（Ｓ．　ｍａｃｅｄｏｎｉｃｕｓ），ストレプトコッカス　ミティス（Ｓ．　ｍｉｔｔｓ），ストレプトコッカス　ミュータンス（Ｓ．　ｍｕｔａｎｓ），ストレプトコッカス　オラーリス（Ｓ．　ｏｒａｌｉｓ），ストレプトコッカス　オリスラティ（Ｓ．　ｏｒｉｓｒａｔｔｉ），ストレプトコッカス　パラサングイニス（Ｓ．　ｐａｒａｓａｎｇｕｉｎｉｓ），ストレプトコッカス　パラウベリス（Ｓ．　ｐａｒａｕｂｅｒｉｓ），ストレプトコッカス　ペロリス（Ｓ．　ｐｅｒｏｒｉｓ），ストレプトコッカス　フォカエ（Ｓ．ｐｈｏｃａｅ），ストレプトコッカス　プレオモルファス（Ｓ．　ｐｌｅｏｍｏｒｐｈｕｓ），ストレプトコッカス　プルラニマリウム（Ｓ．　ｐｌｕｒａｎｉｍａｌｉｕｍ），ストレプトコッカス　ニューモニエ（Ｓ．　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ），ストレプトコッカス　ポルシナス（Ｓ．　ｐｏｒｃｉｎｕｓ），ストレプトコッカス　ピオジェネス（Ｓ．　ｐｙｏｇｅｎｅｓ），ストレプトコッカス　ラティ（Ｓ．　ｒａｔｔｉ），ストレプトコッカス　サリバリウス亜種サリバリウス（Ｓ．　ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ　ｓｕｂｓｐ．　ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ），ストレプトコッカス　サリバリウス亜種サーモフィラス（Ｓ．　ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ　ｓｕｂｓｐ．　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ），ストレプトコッカス　サングイニイス（Ｓ．　ｓａｎｇｕｉｎｉｓ），ストレプトコッカス　ソブリナス（Ｓ．　ｓｏｂｒｉｎｕｓ），ストレプトコッカス　スイス（Ｓ．　ｓｕｉｓ），ストレプトコッカス　サーモフィラス（Ｓ．　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ），ストレプトコッカス　ソラリテンシス（Ｓ．ｔｈｏｒａｌｔｅｎｓｉｓ），ストレプトコッカス　ウベリス（Ｓ．　ｕｂｅｒｉｓ），ストレプトコッカス　ウリナリス（Ｓ．　ｕｒｉｎａｌｉｓ），ストレプトコッカス　ヴェスティブラリス（Ｓ．　ｖｅｓｔｉｂｕｌａｒｉｓ），ストレプトコッカス　ワイウス（Ｓ．　ｗａｉｕｓ）等が挙げられ、これらを２種以上組み合わせて使用することができる。また、旧名および通称名でストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）と命名される細菌も用いることができる。
【００１４】
上記アクチノマイセス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）属としては、特に限定されるものではなく、例えば、アクチノマイセス　ボビス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ（以下、Ａと略記する。）　ｂｏｖｉｓ），アクチノマイセス　カニス（Ａ．　ｃａｎｉｓ），アクチノマイセス　キャトゥリ（Ａ．　ｃａｔｕｌｉ），アクチノマイセス　デンティコレンス（Ａ．　ｄｅｎｔｉｃｏｌｅｎｓ），アクチノマイセス　ジオルジアエ（Ａ．　ｇｅｏｒｇｉａｅ），アクチノマイセス　ジェレンシェリアエ（Ａ．　ｇｅｒｅｎｃｓｅｒｉａｅ），アクチノマイセス　ホルデオヴルネリス（Ａ．　ｈｏｒｄｅｏｖｕｌｎｅｒｉｓ），アクチノマイセス　ホウレィー（Ａ．　ｈｏｗｅｌｌｉｉ），アクチノマイセス　フミフェラス（Ａ．ｈｕｍｉｆｅｒｕｓ），アクチノマイセス　ヒョヴァギナリス（Ａ．　ｈｙｏｖａｇｉｎａｌｉｓ），アクチノマイセス　イスラエリィ（Ａ．　ｉｓｒａｅｌｉｉ），アクチノマイセス　マリママリウム（Ａ．　ｍａｒｉｍａｍｍａｌｉｕｍ），アクチノマイセス　メエリ（Ａ．　ｍｅｙｅｒｉ），アクチノマイセス　ネスランディイ（Ａ．　ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉ），アクチノマイセス　ニュウィー亜種アニトラタス（Ａ．　ｎｅｕｉｉ　ｓｕｂｓｐ．　ａｎｉｔｒａｔｕｓ），アクチノマイセス　ニュウィー亜種ニュウィー（Ａ．　ｎｅｕｉｉ　ｓｕｂｓｐ．　ｎｅｕｉｉ），アクチノマイセス　オドントリティカス（Ａ．　ｏｄｏｎｔｏｌｙｔｉｃｕｓ），アクチノマイセス　ラデンガエ（Ａ．　ｒａｄｉｎｇａｅ），アクチノマイセス　ラディシデンティス（Ａ．　ｒａｄｉｃｉｄｅｎｔｉｓ），アクチノマイセス　スラッキィ（Ａ．　ｓｌａｃｋｉｉ），アクチノマイセス　スイス（Ａ．　ｓｕｉｓ），アクチノマイセス　トゥリセンシス（Ａ．　ｔｕｒｉｃｅｎｓｉｓ），アクチノマイセス　ユロジェニタリス（Ａ．　ｕｒｏｇｅｎｉｔａｌｉｓ），アクチノマイセス　ビスコーサス（Ａ．　ｖｉｓｃｏｓｕｓ）等が挙げられ、これらを１種単独でまたは２種以上を組み合わせて使用することができる。また旧名および通称名でアクチノマイセス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）と命名される細菌も用いることができる。
【００１５】
本発明のバイオフィルムは、例えば、以下のように製造することができる。
まず、予めＴＨＢ等の液体培地を用いて別々に培養したストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属等の細菌を含む細菌懸濁液を、ＢＭＭ（Ｂａｓａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ　Ｍｕｃｉｎ）等の培養液を入れた培養槽に各々所定量を加えて混合し、０〜４８時間、３７℃、嫌気的条件（例えば、９５％Ｎ２、５％ＣＯ２）下で培養を行う。
その後、培養に使用したものと同じ培養液を０．０１〜５００ｍＬ／ｈｒの所定速度で連続的に供給するとともに、同速度で培養液を排出しながら、３７℃、嫌気的条件（例えば、９５％Ｎ２、５％ＣＯ２）下で０．１〜３０日の所定期間連続培養を行う。
【００１６】
この際、栄養源をヒト食餌パターンに近づけるため、一日に１〜６回、特に２〜５回ほぼ全量の培養液を排出し、直ちに好ましくは糖分を含む異種培養液を添加し、０．５〜１２０分間、特に１〜８０分間のインキュベート後、異種培養液を排出し、再び連続培養に使用する培養液を添加することを繰り返す。異種培養液を添加した後０〜２時間を除き、培養液には酸やアルカリなどを添加して、所定のｐＨに調整することもできる。
培養槽内の回転板（回転速度１〜３００ｒｐｍ）に唾液コートを施したヒトエナメル切片およびハイドロキシアパタイト（以下、ＨＡＰと記す。）板を装着し、バイオフィルムを形成させる。
【００１７】
上記連続培養に用いられる培養装置としては、特に限定されるものではないが、培養槽の底部に排出口を設けたり、培養槽に吸出管を備え付ける等により、培養液の排出を簡便に行えるドレインを設けたものを用いることが好適である。ここで、培養液の排出は、ドレインの弁の開閉や、ポンプによる吸出によって行うことができ、この場合に、電磁弁を用いたり、ポンプとタイマーとを併用することで、自動的かつ定期的に培養液の排出を行えるようにすることが好ましい。また、液体培養液を連続供給する供給口および異種培養液の供給口等を有する培養装置であることが好ましい。さらに、ｐＨ調整が必要な場合は、ｐＨ測定装置とｐＨスタットを接続してもよい。
【００１８】
【実施例】
以下、実施例および比較例を挙げて、本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００１９】
インビトロバイオフィルムの作製
［実施例１］
ストレプトコッカス　サングイニス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓａｎｇｕｉｎｉｓ）　ＡＴＣＣ１０５５６，ストレプトコッカス　ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｍｕｔａｎｓ）　ＡＴＣＣ２５１７５，アクチノマイセス　ネスランディ（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ　ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉ）　ＡＴＣＣ５１６５５，ベイヨネラ　パルビュラ（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ　ｐａｒｖｕｌａ）　ＡＴＣＣ１７７４５，フソバクテリウム　ヌクレアタム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）　ＡＴＣＣ１０９５を、ラクトバシラス　カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃａｓｅｉ）　ＡＴＣＣ４６４６、ポルフィロモナス　ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）　ＡＴＣＣ３３２７７を、ＴＨＢまたはＢＨＩ液体培地で嫌気的に定常状態に達するまで培養し、７×１０８個／ｍＬになるようにＢＭＭ培地中で調整した。
【００２０】
調整した細菌懸濁液を、予めＢＭＭ７００ｍＬを入れた培養槽に、各々１０ｍＬずつ加えて混合し、３７℃、嫌気的条件（９５％Ｎ２、５％ＣＯ２）下で一晩培養を行った。
その後、ＢＭＭ培地を７０ｍＬ／ｈｒの速度で連続的に供給するとともに、同速度で培養液を排出しながら、３７℃、嫌気的条件（９５％Ｎ２、５％ＣＯ２）下で２０日間の連続培養を行った。
【００２１】
この場合、栄養源をヒト食餌パターンに近づけるため、１２時間ごとに全量の培養液を排出し、直ちに異種培養液である１％ショ糖を含むＢＭＭ培地を添加し、３０分間のインキュベート後、同液を排出してからＢＭＭ培地を７００ｍｌ添加し、再度同培地を添加してからの１時間を除いて培養液に１ＭのＮａＯＨを添加することで培養液中のｐＨを約７．０に調整した。
培養槽内の回転板（８０ｒｐｍで回転）に唾液コートを施したヒトエナメル切片およびヒドロキシアパタイト（ＨＡＰ）板を装着し、バイオフィルムを形成させた。
【００２２】
上記培養に用いたＢＭＭ培地の組成を以下に示す。
ＢＭＭ（Ｂａｓａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ　Ｍｕｃｉｎ）組成
プロテオースペプトン　：０．２％
イーストエキス　　　　：０．１％
トリプチケースペプトン：０．１％
ブタ胃ムチン　　　　　：０．２５％
ヘミン　　　　　　　　：１ｍｇ／Ｌ
メナジオン　　　　　　：０．２ｍｇ／Ｌ
ＫＣｌ　　　　　　　　：０．２５％
【００２３】
［比較例１］
実施例１と同様のＢＭＭ培地を用い、実施例１と同様の手法で２０日間連続培養を行って、ヒドロキシアパタイト（ＨＡＰ）板上にバイオフィルムを形成させた。
【００２４】
細菌数測定
上記実施例１および比較例１で得られたＨＡＰ板上のバイオフィルムをサンプリングし、超音波で分散後、選択培地に塗沫、培養し、常法によりＨＡＰ１枚あたりの総菌数および各構成細菌数を求めた。結果を下記表１に示す。
【００２５】
【表１】
2004008046.tif 000002
【００２６】
表１に示されるように、ショ糖の間欠投与を行う連続培養で得られた実施例１のインビトロバイオフィルムの菌叢は、これを行わない連続培養で得られた比較例１のインビトロバイオフィルムのそれと大きく異なっているだけでなく、実施例１のインビトロバイオフィルムの方が、各構成細菌の菌数がヒトバイオフィルムに近いものであることがわかる。
【００２７】
【発明の効果】
本発明のインビトロバイオフィルムによれば、連続培養で用いられる培養液を異種培養液に一定時間置換することで作成した、ヒト口腔内と類似性の高いバイオフィルムであるから、口腔疾患等に対する有効成分の探索・評価および口腔疾患予防剤等の開発に有効に利用することができる。