【誤訳訂正書】
【提出日】平成26年10月16日(2014.10.16)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式（Ｉ）の構造を有するフルクトシル化プエラリン。
【化１】
2013540769.tif 000001
（Ｉ）
式中、Ｒ１とＲ２は水素であり、；Ｒはフルクトースモノグリコシルまたは２〜５のフルクトースが接続したオリゴサッカリルであり、その構造は式（ＩＩ）に示す通りである：
2013540769.tif 000002
（ＩＩ）
式中、ｎ＝０〜４である。
【請求項２】
フルクトシル化酵素活性を有する発酵液若しくは発酵液上澄み、または純化したフルクトシル化酵素若しくはその組換発現たんぱく質を使用して、プエラリンを含む変換液について生物変換反応を行い、プエラリンをフルクトシル化プエラリンに変換することを含む、請求項１記載のフルクトシル化プエラリンの調製方法。
【請求項３】
変換終了後、変換液の中の菌体細胞または菌体たんぱく質などの不純物を除去し、その後樹脂精製により得られた目標留分を回転蒸発または冷凍乾燥し、フルクトシル化プエラリン粉末または結晶体を得ることを含む、請求項２に記載の調製方法。
【請求項４】
前記発酵液または発酵液上澄みが、フルクトシル化プエラリン活性を有する微生物の発酵により得られる、請求項２または３に記載の調製方法。
【請求項５】
前記微生物が、アルスロバクタ・ニコチアナエ(Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ  ＸＭ６)（ＣＣＴＣＣ  Ｎｏ．：Ｍ２０１０１６４）である、請求項４に記載の調製方法。
【請求項６】
前記フルクトシル化酵素またはその組換発現たんぱく質がβ−Ｄ−フルクトフラノシダーゼまたはその組換発現たんぱく質である、請求項２〜５のいずれか１項に記載の調製方法。
【請求項７】
前記β−Ｄ−フルクトフラノシダーゼは関節胞子菌属細菌から由来し、その分子量は約６０ｋＤａ、Ｎ端前の５個のアミノ酸配列はそれぞれＡＴＥＰＶである、請求項６に記載の調製方法。
【請求項８】
微生物の発酵に用いられる発酵培養基は、サッカロース５〜８０ｇ／Ｌ、ペプトン５〜５０ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４０．４〜４ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ２０．５〜５ｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ４０．１〜２ｇ／Ｌを含み、ｐＨ６〜８である、請求項２〜７のいずれか１項に記載の調製方法。
【請求項９】
発酵条件が：２５〜４０℃、１０〜４００ｒｐｍ振とうフラスコで振盪または発酵槽で撹拌して通気し、回転速度通気量は１〜６ｖｖｍ、１０〜４００ｒｐｍ、発酵時間は６〜４８時間である、請求項２〜８のいずれか１項に記載の調製方法。
【請求項１０】
微生物の発酵に用いられる発酵培養基は、サッカロース１５ｇ／Ｌ、ペプトン２５ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４２ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ２２ｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ４０．２ｇ／Ｌを含み、ｐＨ７．５である、請求項２〜９のいずれか１項に記載の調製方法。
【請求項１１】
発酵条件が：３０℃、２４０ｒｐｍで振とうフラスコで１６時間振盪または発酵槽で撹拌して通気し、回転速度通気量は４ｖｖｍ、３００ｒｐｍで、６時間発酵することである、請求項２〜１０のいずれか１項に記載の調製方法。
【請求項１２】
前記生物変換反応が水相において行われ、前記水相変換が以下を含むことであり：１０〜４００ｒｐｍ振とうフラスコで振盪または発酵槽で撹拌し、プエラリン濃度は０．１ｇ／Ｌを上回る数値から飽和までであり、グリコシル供与体はフルクトースまたはサッカロースまたは２つの混合物であり、プエラリンとグリコシル供与体モル比は１：１〜１：２００であり、反応系の１０％〜５０％を占めるフルクトシル化酵素１０−１００Ｕ／ｍＬの発酵液または発酵液上澄みを加え、任意の１種類ｐＨ４〜８の緩衝溶液の中で行い、変換温度は２５〜４０℃、反応時間は６〜９６時間である、請求項２〜１１のいずれか１項に記載の調製方法。
【請求項１３】
１０ｇ／Ｌプエラリン、１００ｇ／Ｌサッカロースをグリコシル供与体とし、２０％のフルクトシル化酵素３０Ｕ／ｍＬを含む発酵液上澄みを、１／１５ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ６．８６のリン酸塩緩衝溶液の５Ｌ発酵槽の中に加え、３０℃、３００ｒｐｍで１２時間撹拌変換する、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記生物変換反応が非水相において行われ、前記非水相変換条件に以下を含むことであり：１０〜４００ｒｐｍ振とうフラスコで振盪または発酵槽で撹拌し、５〜５０％のジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、アセトニトリル、メタノール、アセトンまたはエタノールから選択した１種または数種の親水性有機溶剤を使い、プエラリン濃度は５〜２００ｇ／Ｌであり、プエラリン濃度は５〜１２０ｇ／Ｌ、グリコシル供与体はフルクトースまたはサッカロースまたは２つの混合物であり、プエラリンとグリコシル供与体のモル比は１：１〜１：２００であり、反応系の１０％〜５０％を占めるフルクトシル化酵素１０−１００Ｕ／ｍＬを含む発酵液または発酵液上澄みを加え、反応時間は６〜９６時間である、請求項２〜１１のいずれか１項に記載の調製方法。
【請求項１５】
２０％のフルクトシル化酵素３０Ｕ／ｍＬを含む発酵液上澄みを、１／１５ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ６．８６のリン酸塩緩衝溶液の５Ｌ発酵槽に加え、３０℃、３００ｒｐｍで７２時間撹拌変換する、請求項１４に記載の調製方法。
【請求項１６】
前記樹脂精製はフルクトシル化プエラリンを含む変換液をＡＢ−８マクロ孔質樹脂の吸着により、前記吸着は変換液における有機溶剤を低温蒸発して除去または有機溶剤を２％未満の体積比まで希釈した条件の下で行い；吸着後はまず溶離液で残りのグリコシル供与体を洗い落とし、また溶離液で勾配溶離または段階溶離してそれぞれフルクトシル化プエラリンを得て；さらに１０倍カラムベッド体積でｐＨ４〜４．５の蒸留水を使用して残りのグリコシル供与体を洗い落とし、その後５〜３０％のメタノールまたはエタノール溶液で勾配溶離または段階溶離してそれぞれフルクトシル化プエラリンを得る、請求項２〜１５のいずれか１項に記載の調製方法。
【請求項１７】
前記生物変換反応が非水相変換である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
溶離液を使用し残りのプエラリンを洗い落として回収する、請求項２〜１７のいずれか１項に記載の調製方法。
【請求項１９】
１００％のメタノールまたはエタノールを使用して残りのプエラリンを洗い落として回収する、請求項１８に記載の調製方法。
【請求項２０】
請求項１記載のフルクトシル化プエラリンの脳心血管関連疾病および／または腫瘍関連疾病の治療用薬物の製造における使用。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０００１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０００１】
本発明は生物製薬技術分野に属し、具体的にプエラリンの新規誘導体、生物変換反応およびその薬物応用に関する。
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０００７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０００７】
プエラリンは水溶性が比較的劣っていることから、生物変換法を使用してプエラリングリコシル化改変を行う時、変換前のプエラリン濃度はおしなべて比較的低く（いずれも１０ｇ／Ｌ以下）、生成物のモル転換率も比較的低く（いずれも７０％以下）、これらの限界性は得られた充分な生成物に脳心血管および腫瘍関連の疾病の薬理実験を行い、且つ後期の工業化生産にかなりの難易度をもたらした。
【誤訳訂正４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０００９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０００９】
本発明のもう１つの目的は、前記フルクトシル化プエラリンの調製方法であり、具体的に、アルスロバクタ・ニコチアナエ（ラテン語学名：Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ  ＸＭ６、分類名：アルスロバクタ・ニコチアナエ  ＸＭ６、２０１０年６月２９日に中国典型培養物保存センターに保存、住所：中国  武漢  武漢大学、郵便番号：４３００７２、保存番号：ＣＣＴＣＣ  ＮＯ：Ｍ２０１０１６４）で水相または非水相においてフルクトシル化プエラリンを生物変換する。
【誤訳訂正５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１７】
もう一方で、本発明は前記フルクトシル化プエラリンの調製に用いる方法を提供し、前記方法にはフルクトシル化酵素活性を有する発酵液または発酵液上澄みまたは純化したフルクトシル化酵素またはその組換発現たんぱく質を使用して、プエラリンを含む変換液について生物変換反応を行い、プエラリンをフルクトシル化プエラリンに変換することを含む。
【誤訳訂正６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２１】
好ましいのは、前記生物変換反応は水相または非水相において行うことで；そのうち、前記水相変換条件には以下を含む：１０〜４００ｒｐｍで振とうフラスコで振盪または発酵槽で撹拌し、プエラリン濃度は０．１ｇ／Ｌより上から飽和までとし、グリコシル供与体はフルクトースまたはサッカロースまたは２つの混合物とし、プエラリンとグリコシル供与体モル比は１：１〜１：２００、反応系の１０％〜５０％を占める発酵液または発酵液上澄み（フルクトシル化酵素１０〜１００Ｕ／ｍＬを含む）を加え、任意の一種類ｐＨ４〜８の緩衝溶液の中で行い、変換温度は２５〜４０℃であり、反応時間は６〜９６時間あり；好ましい条件は以下の通りである：１０ｇ／Ｌプエラリン、１００ｇ／Ｌサッカロースをグリコシル供与体とし、２０％の発酵液上澄み（フルクトシル化酵素３０Ｕ／ｍＬを含む）を、１／１５ｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝溶液（ｐＨ６．８６）の５Ｌ発酵槽の中に加え、３０℃、３００ｒｐｍで１２時間撹拌変換を行う。
【誤訳訂正７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３７】
本発明のもう１つの実施方法に基づき、本発明はフルクトシル化プエラリンを生物変換する方法を提供する。
【誤訳訂正８】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００４４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００４４】
前記生物変換法、変換反応は水相または非水相の中で行ってもよく、変換温度の範囲は２５〜４０℃で、１０〜４００ｒｐｍ振とうフラスコで振盪または５Ｌ発酵槽で撹拌し、反応時間は６〜９６時間である。（１）水相変換条件は以下の通り：プエラリン濃度は０．１ｇ／Ｌより上から飽和まで、グリコシル供与体はフルクトースまたはサッカロースまたは２つの混合物、プエラリンとグリコシル供与体のモル比は１：１〜１：２００、任意の１種のｐＨ４〜８の緩衝溶液における；（２）非水相変換条件は以下の通り：５〜５０％の親水性有機溶剤ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、アセトニトリル、メタノール、アセトン、エタノールを使用し、プエラリン濃度は５〜２００ｇ／Ｌ、好ましいプエラリン濃度は５〜１２０ｇ／Ｌ、グリコシル供与体はフルクトースまたはサッカロースまたは２つの混合物、プエラリンとグリコシル供与体のモル比は１：１〜１：２００、任意の１種のｐＨ４〜８の緩衝溶液における；
【誤訳訂正９】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００５４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００５４】
次に、プエラリンと比べて、この新型フルクトシル化プエラリンの溶解度はよりよく、薬理活性が高く、プエラリン製品の欠陥を補っており、薬の使用の安全性は向上し、治療効果が向上し、よりよい発展の見込みを有する新薬製品であり；さらに、本発明者は前記新型フルクトシル化プエラリンの生物変換法を提供している。従来の生物変換法を使用しプエラリングリコシル化の改変を行う時、プエラリンの水溶性が比較的劣っているため、プエラリン濃度はおしなべて比較的低く（いずれも１０ｇ／Ｌ以下）、製品のモル転換率も比較的低いが（いずれも７０％以下）、本発明の生物変換法を使用すると、得られるモノフルクトシル基−β（２，６）−プエラリン濃度は１１１．７ｇ／Ｌに達し、基質変換率は９０％以上に達し、従来の技術に存在する技術課題を解決し、前記生成物を使用して脳心血管および腫瘍関連の疾病の薬理試験および後期の工業化生産を行うことに有利である。
【誤訳訂正１０】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００５５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００５５】
添付図の要約説明
以下に、添付図と合わせて本発明の実施例を詳細に説明し、そのうち：
【図１】水相生物変換プエラリンのＨＰＬＣクロマトグラムを表し、前記図の中で：保持時間１４．９１０ｍｉｎのピークはプエラリンで、保持時間１０．１３１ｍｉｎのピークはモノフルクトシル基−β（２，６）−プエラリンで、保持時間６．１３０ｍｉｎのピークはジフルクトシル基−β（２，６）−プエラリンで、保持時間５．４０９ｍｉｎのピークはトリフルクトシル基−β（２，６）−プエラリンで、保持時間５．１４４ｍｉｎのピークはテトラフルクトシル基−β（２，６）−プエラリンで、保持時間４．９６８ｍｉｎのピークはペンタフルクトシル基−β（２，６）−プエラリンであり；
【図２】非水性生物変換プエラリンのＨＰＬＣクロマトグラムを表し、前記図の中で：保持時間１３．７３５ｍｉｎのピークはプエラリンで、保持時間７．４５０ｍｉｎのピークはモノフルクトシル基−β（２，６）−プエラリンで、保持時間４．６０３ｍｉｎのピークはジフルクトシル基−β（２，６）−プエラリンで、保持時間４．１９２ｍｉｎのピークはトリフルクトシル基−β（２，６）−プエラリンであり；
【図３】モノフルクトシル基−β（２，６）−プエラリンの１Ｈ  ＮＭＲクロマトグラムを表す；
【図４】モノフルクトシル基−β（２，６）−プエラリンの１３Ｃ  ＮＭＲクロマトグラムを表す；
【図５】モノフルクトシル基−β（２，６）−プエラリンのＨ−Ｈ  ＣＯＳＹクロマトグラムを表す；
【図６】モノフルクトシル基−β（２，６）−プエラリンのＣ−Ｈ  ＨＳＱＣクロマトグラムを表す；
【図７】モノフルクトシル基−β（２，６）−プエラリンの高分解能質量クロマトグラムを表す；
【図８】プエラリンの１Ｈ  ＮＭＲクロマトグラムを表す；
【図９】プエラリンの１３Ｃ  ＮＭＲクロマトグラムを表す；
【図１０】ジフルクトシル基−β（２，６）−プエラリンの１Ｈ  ＮＭＲクロマトグラムを表す；
【図１１】ジフルクトシル基−β（２，６）−プエラリンの１３Ｃ  ＮＭＲクロマトグラムを表す；
【図１２】ジフルクトシル基−β（２，６）−プエラリンのＨ−Ｈ  ＣＯＳＹクロマトグラムを表す；
【図１３】ジフルクトシル基−β（２，６）−プエラリンのＣ−Ｈ  ＨＳＱＣクロマトグラムを表す；
【図１４】ジフルクトシル基−β（２，６）−プエラリンの高分解能質量クロマトグラムを表す；
【図１５】トリフルクトシル基−β（２，６）−プエラリンのマススペクトラムを表す；
【図１６】テトラフルクトシル基−β（２，６）−プエラリンのマススペクトラムを表す；
【図１７】ペンタフルクトシル基−β（２，６）−プエラリンのマススペクトラムを表す；
【誤訳訂正１１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００５９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００５９】
実施例１：水相生物変換プエラリンを使用しフルクトシル化プエラリンを得た
４０ｍＬ発酵培養の培養基２（培養基の構成については表１を参照のこと）を２５０ｍＬの三角フラスコに入れ、１２１℃の高圧蒸気で２０分間滅菌後、アルスロバクタ・ニコチアナエ（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｎｉｃｏｎｉａｎａｅ  ＸＭ６）（ＣＣＴＣＣ  ＮＯ：Ｍ２０１０１６４。）に組み込み、３０℃、１８０ｒｐｍで１６時間振盪、発酵培養し植種液として５Ｌの発酵槽に接種し、接種量は５体積%、発酵槽に入れる液量は３Ｌ、発酵槽の滅菌方法は振とうフラスコと同様とした。３０℃、３００ｒｐｍで発酵培養し、通気量は３ｖｖｍで、６時間発酵培養（ＯＤは約１０前後）した後、８０００ｒｐｍで２０分間遠心し、上澄み酵素液を収集し、上澄み酵素液内に含まれているフルクトシル化酵素３０Ｕ／ｍＬを測定した。そのうち、酵素活性の測定には以下の方法を採用した：
【誤訳訂正１２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００７２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００７２】
実施例２：非水相生物変換プエラリンを使用しフルクトシル化プエラリンを得た
４０ｍＬの発酵培養した培養基２（培養基構成は表１を参照のこと）を２５０ｍＬの三角フラスコに入れ、１２１℃の高圧蒸気で２０分間滅菌した後、アルスロバクタ・ニコチアナエ（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ  ＸＭ６）（ＣＣＴＣＣ  ＮＯ：Ｍ２０１０１６４）に組み込み、３０℃、１８０ｒｐｍで１６時間振盪、発酵培養し植種液として５Ｌの発酵槽に接種し、接種量は５％、発酵槽に入れる液量は３Ｌとし、発酵槽の滅菌方法は振とうフラスコと同様の３０℃、３００ｒｐｍ発酵培養で、通気量３ｖｖｍで、6時間発酵培養をした（ＯＤは約１０前後）後、８０００ｒｐｍで２０分間遠心し、上澄み酵素液を収集して、上澄み酵素液に含まれるフルクトシル化酵素３０Ｕ／ｍＬを測定した。
【誤訳訂正１３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００７３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００７３】
６００ｍＬ上澄み酵素液を総体積３０００ｍＬに１０７．５ｇ／Ｌプエラリン、３５０ｇ／Ｌサッカロース、２０％ＤＭＳＯを含む１／１５ｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝溶液（ｐＨ６．８６）の５Ｌ発酵槽に加え、３０℃、３００ｒｐｍで振盪変換させ、７２時間後、４５℃で２時間加熱して変換反応を終止させた。変換液はＨＰＬＣにより検出され：モノフルクトシル基−β（２，６）−プエラリンは１１１．７ｇ／Ｌに達し、ジフルクトシル基−β（２，６）−プエラリンは２８．３ｇ／Ｌに達し、トリフルクトシル基−β（２，６）−プエラリンは２．３ｇ／Ｌに達し、フルクトシル化プエラリン誘導体の生物変換率は９０％に達した。結果参考図２。
【誤訳訂正１４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００７６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００７６】
実施例３：  非水相生物変換プエラリンを使用しフルクトシル化プエラリンを得た
４０ｍＬの発酵培養した培養基２（培養基構成は表１を参照のこと）を２５０ｍＬの三角フラスコに入れ、１２１℃の高圧蒸気で２０分間滅菌した後、アルスロバクタ・ニコチアナエ（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ  ＸＭ６）（ＣＣＴＣＣ  ＮＯ：Ｍ２０１０１６４）に組み込み、３０℃、１８０ｒｐｍで１６時間振盪して発酵培養後（ＯＤは約１０前後）、８０００ｒｐｍで２０分間遠心し、上澄み酵素液を収集して、上澄み酵素液に含まれるフルクトシル化酵素は３０Ｕ／ｍＬであった。