【手続補正書】
【提出日】平成26年2月28日(2014.2.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
シュードモナス菌宿主細胞における組み換え型毒素タンパク質を生成する方法であって、前記方法は：
発現ベクターへ、毒素タンパク質をコード化するヌクレオチド配列を連結する工程；
発現ベクターによりシュードモナス菌宿主細胞を形質転換する工程；及び
組み換え型毒素タンパク質の発現に適している培地において、形質転換されたシュードモナス菌宿主細胞を培養する工程を含み；
前記組み換え型毒素タンパク質は、ＣＲＭ１９７、クロストリジウムディフィシレ毒素Ｂ、破傷風毒素フラグメントＣ、緑膿菌外毒素Ａ、コレラ毒素Ｂ、ジフテリア毒素、コレラホロトキシン、および、百日咳毒素から選択される、ことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記組換え型タンパク質は、１リットル当たり０．２グラム乃至１リットル当たり約１２グラムの可溶性の及び／又は活性な毒素タンパク質の収量で生成されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
１リットル当たり約０．２グラム乃至１リットル当たり約１２グラムの可溶性の及び／又は活性な毒素タンパク質の収量は、約０．２ｇ／Ｌ、約０．３ｇ／Ｌ、約０．４ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ、約０．６ｇ／Ｌ、約０．７ｇ／Ｌ、約０．８ｇ／Ｌ、約０．９ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ、約１．５ｇ／Ｌ、約２ｇ／Ｌ、約２．５ｇ／Ｌ、約３ｇ／Ｌ、約３．５ｇ／Ｌ、約４ｇ／Ｌ、約４．５ｇ／Ｌ、約５ｇ／Ｌ、約５．５ｇ／Ｌ、約６ｇ／Ｌ、約６．５ｇ／Ｌ、約７ｇ／Ｌ、約７．５ｇ／Ｌ、約８ｇ／Ｌ、約８．５ｇ／Ｌ、約９ｇ／Ｌ、約９．５ｇ／Ｌ、約１０ｇ／Ｌ、約１０．５ｇ／Ｌ、約１１ｇ／Ｌ、約１２ｇ／Ｌ、約０．２ｇ／Ｌ乃至約０．５ｇ／Ｌ、約０．２ｇ／Ｌ乃至約１ｇ／Ｌ、約０．２乃至約２ｇ／Ｌ、約０．３ｇ／Ｌ乃至約０．６ｇ／Ｌ、約０．３ｇ／Ｌ乃至約１ｇ／Ｌ、約０．３乃至約２ｇ／Ｌ、約０．４乃至約０．７ｇ／Ｌ、約０．４乃至約１ｇ／Ｌ、約０．４乃至約２ｇ／Ｌ、約０．４乃至約３ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ乃至約１ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ乃至約２ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ乃至約３ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ乃至約４ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ乃至約５ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ乃至約６ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ乃至約７ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ乃至約８ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ乃至約９ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ乃至約１０ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ乃至約１１ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ乃至約１２ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ乃至約２ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ乃至約３ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ乃至約４ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ乃至約５ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ乃至約６ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ乃至約７ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ乃至約８ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ乃至約９ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ乃至約１０ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ乃至約１１ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ乃至約１２ｇ／Ｌ、約２ｇ／Ｌ乃至約３ｇ／Ｌ、約２ｇ／Ｌ乃至約４ｇ／Ｌ、約２ｇ／Ｌ乃至約５ｇ／Ｌ、約２ｇ／Ｌ乃至約６ｇ／Ｌ、約２ｇ／Ｌ乃至約７ｇ／Ｌ、約２ｇ／Ｌ乃至約８ｇ／Ｌ、約２ｇ／Ｌ乃至約９ｇ／Ｌ、約２ｇ／Ｌ乃至約１０ｇ／Ｌ、約２ｇ／Ｌ乃至約１１ｇ／Ｌ、約２ｇ／Ｌ乃至約１２ｇ／Ｌ、約３ｇ／Ｌ乃至約４ｇ／Ｌ、約３ｇ／Ｌ乃至約５ｇ／Ｌ、約３ｇ／Ｌ乃至約６ｇ／Ｌ、約３ｇ／Ｌ乃至約７ｇ／Ｌ、約３ｇ／Ｌ乃至約８ｇ／Ｌ、約３ｇ／Ｌ乃至約９ｇ／Ｌ、約３ｇ／Ｌ乃至約１０ｇ／Ｌ、約３ｇ／Ｌ乃至約１１ｇ／Ｌ、約３ｇ／Ｌ乃至約１２ｇ／Ｌ、約４ｇ／Ｌ乃至約５ｇ／Ｌ、約４ｇ／Ｌ乃至約６ｇ／Ｌ、約４ｇ／Ｌ乃至約７ｇ／Ｌ、約４ｇ／Ｌ乃至約８ｇ／Ｌ、約４ｇ／Ｌ乃至約９ｇ／Ｌ、約４ｇ／Ｌ乃至約１０ｇ／Ｌ、約４ｇ／Ｌ乃至約１１ｇ／Ｌ、約４ｇ／Ｌ乃至約１２ｇ／Ｌ、約５ｇ／Ｌ乃至約６ｇ／Ｌ、約５ｇ／Ｌ乃至約７ｇ／Ｌ、約５ｇ／Ｌ乃至約８ｇ／Ｌ、約５ｇ／Ｌ乃至約９ｇ／Ｌ、約５ｇ／Ｌ乃至約１０ｇ／Ｌ、約５ｇ／Ｌ乃至約１１ｇ／Ｌ、約５ｇ／Ｌ乃至約１２ｇ／Ｌ、約６ｇ／Ｌ乃至約７ｇ／Ｌ、約６ｇ／Ｌ乃至約８ｇ／Ｌ、約６ｇ／Ｌ乃至約９ｇ／Ｌ、約６ｇ／Ｌ乃至約１０ｇ／Ｌ、約６ｇ／Ｌ乃至約１１ｇ／Ｌ、約６ｇ／Ｌ乃至約１２ｇ／Ｌ、約７ｇ／Ｌ乃至約８ｇ／Ｌ、約７ｇ／Ｌ乃至約９ｇ／Ｌ、約７ｇ／Ｌ乃至約１０ｇ／Ｌ、約７ｇ／Ｌ乃至約１１ｇ／Ｌ、約７ｇ／Ｌ乃至約１２ｇ／Ｌ、約８ｇ／Ｌ乃至約９ｇ／Ｌ、約８ｇ／Ｌ乃至約１０ｇ／Ｌ、約８ｇ／Ｌ乃至約１１ｇ／Ｌ、約８ｇ／Ｌ乃至約１２ｇ／Ｌ、約９ｇ／Ｌ乃至約１０ｇ／Ｌ、約９ｇ／Ｌ乃至約１１ｇ／Ｌ、約９ｇ／Ｌ乃至約１２ｇ／Ｌ、約１０ｇ／Ｌ乃至約１１ｇ／Ｌ、約１０ｇ／Ｌ乃至約１２ｇ／Ｌ、又は約１１ｇ／Ｌ乃至約１２ｇ／Ｌであることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記毒素タンパク質をコード化する前記ヌクレオチド配列が、発現される時に毒素タンパク質のペリプラズムへの輸送を誘導する分泌シグナルコード配列に融合されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記宿主細胞は、少なくとも１つのプロテアーゼの発現を欠き、又は前記宿主細胞は、少なくとも１つのフォールディングモジュレータ、又はその組み合わせを過剰発現させることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記組み換え型毒素タンパク質はＣＲＭ１９７であり、前記宿主細胞は、ＨｓｌＵ、ＨｓｌＶ、Ｐｒｃ１、ＤｅｇＰ１、ＤｅｇＰ２、及びＡｐｒＡの発現を欠くことを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記組み換え型毒素タンパク質はＣＲＭ１９７であり、前記組み換え型毒素タンパク質は、Ａｚｕ、ＩｂｐＳ３１Ａ、ＣｕｐＡ２、ＰｂｐＡ２０Ｖ、又はＰｂｐである分泌リーダーに融合されることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記組み換え型毒素タンパク質がＣＲＭ１９７であり、宿主細胞が、セラリシン、ＨｓｌＵ、ＨｓｌＶ、Ｐｒｃ１、ＤｅｇＰ１、ＤｅｇＰ２、ＡｐｒＡ、又はそれらの任意の組み合わせの発現を欠き、又は宿主細胞が、ＤｓｂＡ、ＤｓｂＢ、ＤｓｂＣ、及びＤｓｂＤを過剰発現し、及び更に、前記組み換え型毒素タンパク質がＡｚｕ、Ｐｂｐ、又は自然の分泌リーダーに融合されることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記宿主細胞がＤｓｂＡ、ＤｓｂＢ、ＤｓｂＣ、及びＤｓｂＤを過剰発現し、前記組み換え型毒素タンパク質は分泌リーダーＡｚｕに融合されることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記宿主細胞がセラリシンの発現を欠き、前記組み換え型毒素タンパク質が分泌リーダーＰｂｐ又はＡｚｕに融合されることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記宿主細胞がＨｓｌＵ及びＨｓｌＶの発現を欠き、前記組み換え型毒素タンパク質が分泌リーダーＰｂｐ又はＡｚｕに融合されることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記組み換え型毒素タンパク質がＣＲＭ１９７であり、前記宿主細胞が野生型であり、前記組み換え型毒素タンパク質が分泌リーダーＰｂｐ又はＡｚｕに融合されることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項１３】
前記組み換え型毒素タンパク質がその自然の分泌リーダーに融合されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
活性アッセイにおける前記組み換え型毒素タンパク質の活性を測定する工程をさらに含み、生成された可溶性毒素タンパク質の約４０％乃至約１００％が活性であると決定されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記活性アッセイが、免疫学アッセイ、受容体結合アッセイ、又は酵素アッセイであることを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記発現ベクターが、タンパク質コード配列に操作可能に連結されたｌａｃ誘導体プロモータを含み、前記培養する工程が、約０．０２乃至約１．０ｍＭの濃度でＩＰＴＧを使用するプロモータの誘発を含み、誘発時の細胞密度が、約４０乃至約２００の吸光度単位（ＡＵ）の光電密度であり、培養のｐＨが約６乃至約７．５であり、成長温度が約２０乃至約３５℃であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記宿主細胞が、シュードモナス菌細胞であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記宿主細胞が緑膿菌であることを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ヌクレオチド配列がシュードモナス菌宿主細胞における発現のために最適化されたことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記発現ベクターが分泌シグナルのためのコード配列に隣接しているタグ配列をさらに含むことを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項２１】
前記発現ベクターが、毒素タンパク質のためのコード配列に隣接しているタグ配列をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。