【手続補正書】
【提出日】平成26年8月13日(2014.8.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２９５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２９５】
上で示されるように、全Δ９エロンガーゼ変換効率がＹ９５０２株で８３．３％と判定された一方、Ｚ１９７８株では効率が改善された（すなわち８５．３％）。このΔ９エロンガーゼ活性の改善に基づいて、ＥｇＤ９ｅＳ−Ｌ３５Ｇは、ＰＵＦＡの生合成のための機能的Δ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路で使用される有用な変異遺伝子と見なされる。
本実施例で実証されるように、本明細書の発明の変異Δ９エロンガーゼのいずれも、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の好ましい株の発現のために、適切なベクターに同様に導入し得る。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２９６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２９６】
以上、本発明を要約すると下記のとおりである。
１．（ａ）Δ９エロンガーゼ活性を有する変異ポリペプチドをコードし、
ｉ）Ｌ３５Ｆ変異；
ｉｉ）Ｌ３５Ｍ変異；
ｉｉｉ）Ｌ３５Ｇ変異；
ｉｖ）Ｌ３５Ｇ変異と、Ｓ９Ａ、Ｓ９Ｄ、Ｓ９Ｇ、Ｓ９Ｉ、Ｓ９Ｋ、Ｓ９Ｑ、Ｑ１２Ｋ、Ａ２１Ｄ、Ａ２１Ｔ、Ａ２１Ｖ、Ｖ３２Ｆ、Ｙ８４Ｃ、Ｑ１０７Ｅ、Ｌ１０８Ｇ、Ｇ１２７Ｌ、Ｗ１３２Ｔ、Ｍ１４３Ｎ、Ｍ１４３Ｗ、Ｌ１６１Ｔ、Ｌ１６１Ｙ、Ｗ１６８Ｇ、Ｉ１７９Ｍ、Ｉ１７９Ｒ、Ｃ２３６Ｎ、Ｑ２４４Ｎ、Ａ２５４Ｗ、およびＡ２５４Ｙからなる群から選択される、少なくとも１つのその他の変異；
ｖ）Ｌ３５Ｇ、Ａ２１Ｖ、Ｌ１０８Ｇ、およびＩ１７９Ｒ変異；
ｖｉ）Ｌ３５Ｇ、Ｗ１３２Ｔ、およびＩ１７９変異；
ｖｉｉ）Ｌ３５Ｇ、Ｓ９Ｄ、Ｙ８４Ｃ、およびＩ１７９Ｒ変異；
ｖｉｉｉ）Ｌ３５Ｇ、Ｙ８４Ｃ、Ｉ１７９Ｒ、およびＱ２４４Ｎ変異；
ｉｘ）Ｌ３５Ｇ、Ａ２１Ｖ、Ｗ１３２Ｔ、Ｉ１７９Ｒ、およびＱ２４４Ｎ変異；
ｘ）Ｋ５８ＲおよびＩ２５７Ｔ変異；
ｘｉ）Ｄ９８Ｇ変異；
ｘｉｉ）Ｌ１３０ＭおよびＶ２４３Ａ変異；および
ｉ）Ｋ５８Ｒ、Ｌ３５Ｆ、Ｌ３５Ｇ、Ｌ３５Ｍ、Ｓ９Ａ、Ｓ９Ｄ、Ｓ９Ｇ、Ｓ９Ｉ、Ｓ９Ｋ、Ｓ９Ｑ、Ｑ１２Ｋ、Ａ２１Ｄ、Ａ２１Ｔ、Ａ２１Ｖ、Ｖ３２Ｆ、Ｙ８４Ｃ、Ｄ９８Ｇ、Ｑ１０７Ｅ、Ｌ１０８Ｇ、Ｇ１２７Ｌ、Ｌ１３０Ｍ、Ｗ１３２Ｔ、Ｍ１４３Ｎ、Ｍ１４３Ｗ、Ｌ１６１Ｔ、Ｌ１６１Ｙ、Ｗ１６８Ｇ、Ｉ１７９Ｍ、Ｉ１７９Ｒ、Ｃ２３６Ｎ、Ｖ２４３Ａ、Ｑ２４４Ｎ、Ａ２５４Ｗ、Ａ２５４Ｙ、およびＩ２５７Ｔからなる群から選択される、少なくとも２つの変異を含んでなる任意の組み合わせ
からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸変異によって配列番号１０と異なる、配列番号２２に記載のアミノ酸配列を有するヌクレオチド配列；
（ｂ）（ａ）部分のヌクレオチド配列と同数のヌクレオチドからなり１００％相補的である、（ａ）部分のヌクレオチド配列の相補体
を含んでなる、単離ポリヌクレオチド。
２．ヌクレオチド配列が、配列番号２８、配列番号３１、配列番号３４、配列番号３７、配列番号４０、配列番号５８、配列番号６１、配列番号８６、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号１００、配列番号１０３、配列番号１０６、および配列番号１０９からなる群から選択される、上記１に記載の単離ポリヌクレオチド。
３．上記１に記載の単離ポリヌクレオチドによってコードされる、Δ９エロンガーゼ活性を有する変異ポリペプチド。
４．タンパク質配列が、配列番号２９、配列番号３２、配列番号３５、配列番号３８、配列番号４１、配列番号５９、配列番号６２、配列番号８７、配列番号１０１、配列番号１０４、配列番号１０７、および配列番号１１０からなる群から選択される、上記３に記載の変異ポリペプチド。
５．Δ９エロンガーゼ活性が、配列番号１０に記載のポリペプチドのΔ９エロンガーゼ活性と少なくとも機能的にほぼ同等である、上記３または４に記載の変異ポリペプチド。
６．リノール酸からエイコサジエン酸への％基質変換が、配列番号１０に記載のポリペプチドのリノール酸からエイコサジエン酸への％基質変換と比べて、少なくとも１１０％である、上記５に記載の変異ポリペプチド。
７．リノール酸からエイコサジエン酸への％基質変換が、配列番号１０に記載のポリペプチドのリノール酸からエイコサジエン酸への％基質変換と比べて、少なくとも１２０％である、上記６に記載の変異ポリペプチド。
８．少なくとも１つの調節制御配列に作動可能に連結された、上記１に記載の単離ポリヌクレオチドを含んでなる組換えコンストラクト。
９．上記１に記載の単離ポリヌクレオチドを含んでなる、形質転換細胞。
１０．前記細胞が、植物、細菌、酵母、藻類、ユーグレナ属、ストラメノパイル、卵菌綱、および真菌からなる群から選択される、上記９に記載の形質転換細胞。
１１．細胞がその乾燥細胞質量の少なくとも約２５％を油として産生する油性酵母である、上記１０に記載の形質転換細胞。
１２．油性酵母が、少なくとも１つの調節配列に作動可能に連結された単離ポリヌクレオチドを含んでなる、少なくとも１つの組換えＤＮＡコンストラクトをさらに含んでなり、組換えＤＮＡコンストラクトが、Δ４デサチュラーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ８デサチュラーゼ、Δ６デサチュラーゼ、Δ９デサチュラーゼ、Δ１２デサチュラーゼ、Δ１５デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、Ｃ１４／１６エロンガーゼ、Ｃ１６／１８エロンガーゼ、Ｃ１８／２０エロンガーゼ、およびＣ２０／２２エロンガーゼからなる群から選択されるポリペプチドをコードする、上記１１に記載の形質転換細胞。
１３．油性酵母によって産生される油が、アラキドン酸、エイコサジエン酸、エイコサペンタエン酸、エイコサテトラエン酸、エイコサトリエン酸、ジホモ−γ−リノレン酸、ドコサテトラエン酸、ドコサペンタエン酸、およびドコサヘキサエン酸からなる群から選択される長鎖多価不飽和脂肪酸を含んでなる、上記１２に記載の形質転換細胞。
１４．油性酵母が、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ロ
ドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）、およびリポマイセス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）からなる群から選択される、上記１０または１１に記載の形質転換細胞。
１５．細胞がヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）である、上記１４に記載の形質転換細胞。
１６．ａ）ｉ）少なくとも１つの調節配列に作動可能に連結され、Δ９エロンガーゼ活性を有する変異ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを含んでなり、
（ａ）Ｌ３５Ｆ変異；
（ｂ）Ｌ３５Ｍ変異；
（ｃ）Ｌ３５Ｇ変異；
（ｄ）Ｌ３５Ｇ変異と、Ｓ９Ａ、Ｓ９Ｄ、Ｓ９Ｇ、Ｓ９Ｉ、Ｓ９Ｋ、Ｓ９Ｑ、Ｑ１２Ｋ、Ａ２１Ｄ、Ａ２１Ｔ、Ａ２１Ｖ、Ｖ３２Ｆ、Ｙ８４Ｃ、Ｑ１０７Ｅ、Ｌ１０８Ｇ、Ｇ１２７Ｌ、Ｗ１３２Ｔ、Ｍ１４３Ｎ、Ｍ１４３Ｗ、Ｌ１６１Ｔ、Ｌ１６１Ｙ、Ｗ１６８Ｇ、Ｉ１７９Ｍ、Ｉ１７９Ｒ、Ｃ２３６Ｎ、Ｑ２４４Ｎ、Ａ２５４Ｗ、およびＡ２５４Ｙからなる群から選択される、少なくとも１つのその他の変異；
（ｅ）Ｌ３５Ｇ、Ａ２１Ｖ、Ｌ１０８Ｇ、およびＩ１７９Ｒ変異；
（ｆ）Ｌ３５Ｇ、Ｗ１３２Ｔ、およびＩ１７９変異；
（ｇ）Ｌ３５Ｇ、Ｓ９Ｄ、Ｙ８４Ｃ、およびＩ１７９Ｒ変異；
（ｈ）Ｌ３５Ｇ、Ｙ８４Ｃ、Ｉ１７９Ｒ、およびＱ２４４Ｎ変異；
（ｉ）Ｌ３５Ｇ、Ａ２１Ｖ、Ｗ１３２Ｔ、Ｉ１７９Ｒ、およびＱ２４４Ｎ変異；
（ｊ）Ｋ５８ＲおよびＩ２５７Ｔ変異；
（ｋ）Ｄ９８Ｇ変異；
（ｌ）Ｌ１３０ＭおよびＶ２４３Ａ変異；および
（ｍ）Ｋ５８Ｒ、Ｌ３５Ｆ、Ｌ３５Ｇ、Ｌ３５Ｍ、Ｓ９Ａ、Ｓ９Ｄ、Ｓ９Ｇ、Ｓ９Ｉ、Ｓ９Ｋ、Ｓ９Ｑ、Ｑ１２Ｋ、Ａ２１Ｄ、Ａ２１Ｔ、Ａ２１Ｖ、Ｖ３２Ｆ、Ｙ８４Ｃ、Ｄ９８Ｇ、Ｑ１０７Ｅ、Ｌ１０８Ｇ、Ｇ１２７Ｌ、Ｌ１３０Ｍ、Ｗ１３２Ｔ、Ｍ１４３Ｎ、Ｍ１４３Ｗ、Ｌ１６１Ｔ、Ｌ１６１Ｙ、Ｗ１６８Ｇ、Ｉ１７９Ｍ、Ｉ１７９Ｒ、Ｃ２３６Ｎ、Ｖ２４３Ａ、Ｑ２４４Ｎ、Ａ２５４Ｗ、Ａ２５４Ｙ、およびＩ２５７Ｔからなる群から選択される少なくとも２つの変異を含んでなる任意の組み合わせ
からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸変異によって、配列番号１０と異なる、配列番号２２に記載のアミノ酸配列を有する組換えコンストラクト；および
ｉｉ）リノール酸およびα−リノレン酸からなる群から選択される基質脂肪酸源
を含んでなる、油性酵母を備えるステップと；
ｂ）Δ９エロンガーゼ活性を有する変異ポリペプチドをコードする組換えコンストラクトが発現され、基質脂肪酸が生産物脂肪酸に変換される条件下で、ステップ（ａ）の酵母を培養するステップで、ここでリノール酸がエイコサジエン酸に変換され、α−リノレン酸がエイコサトリエン酸に変換される、該ステップと；
ｃ）任意選択的に、ステップ（ｂ）の生産物脂肪酸を回収するステップと
を含んでなる多価不飽和脂肪酸を生産する方法。
１７．上記９に記載の油性酵母から得られる微生物油。
１８．乾燥細胞質量の質量％として測定して少なくとも２２．５質量％のエイコサペンタエン酸を含んでなる油を産生し、配列番号５９に記載のアミノ酸配列を含んでなる少なくとも１つの変異Δ９エロンガーゼポリペプチドを含んでなる、組換え微生物宿主細胞。
【手続補正３】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）Δ９エロンガーゼ活性を有する変異ポリペプチドをコードし、
ｉ）Ｌ３５Ｆ変異；
ii）Ｌ３５Ｍ変異；
iii）Ｌ３５Ｇ変異；
iv）Ｌ３５Ｇ変異と、Ｓ９Ａ、Ｓ９Ｄ、Ｓ９Ｇ、Ｓ９Ｉ、Ｓ９Ｋ、Ｓ９Ｑ、Ｑ１２Ｋ、Ａ２１Ｄ、Ａ２１Ｔ、Ａ２１Ｖ、Ｖ３２Ｆ、Ｙ８４Ｃ、Ｑ１０７Ｅ、Ｌ１０８Ｇ、Ｇ１２７Ｌ、Ｗ１３２Ｔ、Ｍ１４３Ｎ、Ｍ１４３Ｗ、Ｌ１６１Ｔ、Ｌ１６１Ｙ、Ｗ１６８Ｇ、Ｉ１７９Ｍ、Ｉ１７９Ｒ、Ｃ２３６Ｎ、Ｑ２４４Ｎ、Ａ２５４Ｗ、およびＡ２５４Ｙからなる群から選択される、少なくとも１つのその他の変異；
ｖ）Ｌ３５Ｇ、Ａ２１Ｖ、Ｌ１０８Ｇ、およびＩ１７９Ｒ変異；
vi）Ｌ３５Ｇ、Ｗ１３２Ｔ、およびＩ１７９変異；
vii）Ｌ３５Ｇ、Ｓ９Ｄ、Ｙ８４Ｃ、およびＩ１７９Ｒ変異；
viii）Ｌ３５Ｇ、Ｙ８４Ｃ、Ｉ１７９Ｒ、およびＱ２４４Ｎ変異；
ix）Ｌ３５Ｇ、Ａ２１Ｖ、Ｗ１３２Ｔ、Ｉ１７９Ｒ、およびＱ２４４Ｎ変異；
ｘ）Ｋ５８ＲおよびＩ２５７Ｔ変異；
xi）Ｄ９８Ｇ変異；
xii）Ｌ１３０ＭおよびＶ２４３Ａ変異；および
ｉ）Ｋ５８Ｒ、Ｌ３５Ｆ、Ｌ３５Ｇ、Ｌ３５Ｍ、Ｓ９Ａ、Ｓ９Ｄ、Ｓ９Ｇ、Ｓ９Ｉ、Ｓ９Ｋ、Ｓ９Ｑ、Ｑ１２Ｋ、Ａ２１Ｄ、Ａ２１Ｔ、Ａ２１Ｖ、Ｖ３２Ｆ、Ｙ８４Ｃ、Ｄ９８Ｇ、Ｑ１０７Ｅ、Ｌ１０８Ｇ、Ｇ１２７Ｌ、Ｌ１３０Ｍ、Ｗ１３２Ｔ、Ｍ１４３Ｎ、Ｍ１４３Ｗ、Ｌ１６１Ｔ、Ｌ１６１Ｙ、Ｗ１６８Ｇ、Ｉ１７９Ｍ、Ｉ１７９Ｒ、Ｃ２３６Ｎ、Ｖ２４３Ａ、Ｑ２４４Ｎ、Ａ２５４Ｗ、Ａ２５４Ｙ、およびＩ２５７Ｔからなる群から選択される、少なくとも２つの変異を含んでなる任意の組み合わせ
からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸変異によって配列番号１０と異なる、配列番号２２に記載のアミノ酸配列を有するヌクレオチド配列；
（ｂ）（ａ）部分のヌクレオチド配列と同数のヌクレオチドからなり１００％相補的である、（ａ）部分のヌクレオチド配列の相補体
を含んでなる、単離ポリヌクレオチド。
【請求項２】
請求項１に記載の単離ポリヌクレオチドによってコードされる、Δ９エロンガーゼ活性を有する変異ポリペプチド。
【請求項３】
少なくとも１つの調節制御配列に作動可能に連結された、請求項１に記載の単離ポリヌクレオチドを含んでなる組換えコンストラクト。
【請求項４】
請求項１に記載の単離ポリヌクレオチドを含んでなる、形質転換細胞。
【請求項５】
ａ）ｉ）少なくとも１つの調節配列に作動可能に連結され、Δ９エロンガーゼ活性を有する変異ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを含んでなり、
（ａ）Ｌ３５Ｆ変異；
（ｂ）Ｌ３５Ｍ変異；
（ｃ）Ｌ３５Ｇ変異；
（ｄ）Ｌ３５Ｇ変異と、Ｓ９Ａ、Ｓ９Ｄ、Ｓ９Ｇ、Ｓ９Ｉ、Ｓ９Ｋ、Ｓ９Ｑ、Ｑ１２Ｋ、Ａ２１Ｄ、Ａ２１Ｔ、Ａ２１Ｖ、Ｖ３２Ｆ、Ｙ８４Ｃ、Ｑ１０７Ｅ、Ｌ１０８Ｇ、Ｇ１２７Ｌ、Ｗ１３２Ｔ、Ｍ１４３Ｎ、Ｍ１４３Ｗ、Ｌ１６１Ｔ、Ｌ１６１Ｙ、Ｗ１６８Ｇ、Ｉ１７９Ｍ、Ｉ１７９Ｒ、Ｃ２３６Ｎ、Ｑ２４４Ｎ、Ａ２５４Ｗ、およびＡ２５４Ｙからなる群から選択される、少なくとも１つのその他の変異；
（ｅ）Ｌ３５Ｇ、Ａ２１Ｖ、Ｌ１０８Ｇ、およびＩ１７９Ｒ変異；
（ｆ）Ｌ３５Ｇ、Ｗ１３２Ｔ、およびＩ１７９変異；
（ｇ）Ｌ３５Ｇ、Ｓ９Ｄ、Ｙ８４Ｃ、およびＩ１７９Ｒ変異；
（ｈ）Ｌ３５Ｇ、Ｙ８４Ｃ、Ｉ１７９Ｒ、およびＱ２４４Ｎ変異；
（ｉ）Ｌ３５Ｇ、Ａ２１Ｖ、Ｗ１３２Ｔ、Ｉ１７９Ｒ、およびＱ２４４Ｎ変異；
（ｊ）Ｋ５８ＲおよびＩ２５７Ｔ変異；
（ｋ）Ｄ９８Ｇ変異；
（ｌ）Ｌ１３０ＭおよびＶ２４３Ａ変異；および
（ｍ）Ｋ５８Ｒ、Ｌ３５Ｆ、Ｌ３５Ｇ、Ｌ３５Ｍ、Ｓ９Ａ、Ｓ９Ｄ、Ｓ９Ｇ、Ｓ９Ｉ、Ｓ９Ｋ、Ｓ９Ｑ、Ｑ１２Ｋ、Ａ２１Ｄ、Ａ２１Ｔ、Ａ２１Ｖ、Ｖ３２Ｆ、Ｙ８４Ｃ、Ｄ９８Ｇ、Ｑ１０７Ｅ、Ｌ１０８Ｇ、Ｇ１２７Ｌ、Ｌ１３０Ｍ、Ｗ１３２Ｔ、Ｍ１４３Ｎ、Ｍ１４３Ｗ、Ｌ１６１Ｔ、Ｌ１６１Ｙ、Ｗ１６８Ｇ、Ｉ１７９Ｍ、Ｉ１７９Ｒ、Ｃ２３６Ｎ、Ｖ２４３Ａ、Ｑ２４４Ｎ、Ａ２５４Ｗ、Ａ２５４Ｙ、およびＩ２５７Ｔからなる群から選択される少なくとも２つの変異を含んでなる任意の組み合わせ
からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸変異によって、配列番号１０と異なる、配列番号２２に記載のアミノ酸配列を有する組換えコンストラクト；および
ii）リノール酸およびα−リノレン酸からなる群から選択される基質脂肪酸源
を含んでなる、油性酵母を備えるステップと；
ｂ）Δ９エロンガーゼ活性を有する変異ポリペプチドをコードする組換えコンストラクトが発現され、基質脂肪酸が生産物脂肪酸に変換される条件下で、ステップ（ａ）の酵母を培養するステップで、ここでリノール酸がエイコサジエン酸に変換され、α−リノレン酸がエイコサトリエン酸に変換される、該ステップと；
ｃ）任意選択的に、ステップ（ｂ）の生産物脂肪酸を回収するステップと
を含んでなる多価不飽和脂肪酸を生産する方法。
【請求項６】
請求項４に記載の油性酵母から得られる微生物油。
【請求項７】
乾燥細胞質量の質量％として測定して少なくとも２２．５質量％のエイコサペンタエン酸を含んでなる油を産生し、配列番号５９に記載のアミノ酸配列を含んでなる少なくとも１つの変異Δ９エロンガーゼポリペプチドを含んでなる、組換え微生物宿主細胞。