【手続補正書】
【提出日】平成24年10月1日(2012.10.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数のポリヌクレオチドを含む核酸ライブラリーであって、該ポリヌクレオチドのそれぞれが、トリプルタグ配列に連結された関心対象のタンパク質をコードし、該トリプルタグ配列が、6×ヒスチジンタグ(SEQ ID NO: 1)、c-mycタグ(SEQ ID NO: 2)、およびV5タグ (SEQ ID NO: 3)を含み、該c-mycタグが、該6×ヒスチジンタグと該V5タグの間に位置し、かつこれらのタグが直接的に連結されるかまたはスペーサーを介して間接的に連結されている、核酸ライブラリー。
【請求項２】
複数のポリペプチドを提示する複数のファージを含むバクテリオファージライブラリーであって、各ポリペプチドが、トリプルタグ配列に連結された関心対象のタンパク質を含み、該トリプルタグ配列が、6×ヒスチジンタグ(SEQ ID NO: 1)、c-mycタグ(SEQ ID NO: 2)、およびV5タグ(SEQ ID NO: 3)を含み、該c-mycタグが、6×ヒスチジンタグとV5タグの間に位置し、かつこれらのタグが直接的に連結されるかまたはスペーサーを介して間接的に連結されている、バクテリオファージライブラリー。
【請求項３】
トリプルタグ配列に連結された関心対象のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターであって、該トリプルタグ配列が、6×ヒスチジンタグ(SEQ ID NO: 1)、c-mycタグ(SEQ ID NO: 2)、およびV5タグ(SEQ ID NO: 3)を含み、該c-mycタグが、6×ヒスチジンタグとV5タグの間に位置し、かつこれらのタグが直接的に連結されるかまたはスペーサーを介して間接的に連結されている、ベクター。
【請求項４】
6×ヒスチジンタグ(SEQ ID NO: 1)、c-mycタグ(SEQ ID NO: 2)、およびV5タグ(SEQ ID NO: 3)を含むトリプルタグ配列に連結された関心対象のタンパク質を含むタグ化タンパク質であって、該c-mycタグが、6×ヒスチジンタグとV5タグの間に位置し、かつこれらのタグが直接的に連結されるかまたはスペーサーを介して間接的に連結されており、該トリプルタグ配列がSEQ ID NO: 4またはSEQ ID NO: 5と任意で70％、80％、または90％同一である、タグ化タンパク質。
【請求項５】
6×ヒスチジンタグ(SEQ ID NO: 1)、c-mycタグ(SEQ ID NO: 2)、およびV5タグ(SEQ ID NO: 3)を含むトリプルタグ配列に連結された単鎖抗体またはFab断片のライブラリーであって、該c-mycタグが、6×ヒスチジンタグとV5タグの間に位置し、かつこれらのタグが直接的に連結されるかまたはスペーサーを介して間接的に連結されている、単鎖抗体またはFab断片のライブラリー。
【請求項６】
Fabライブラリーまたは単鎖抗体ライブラリーをコードする複数のポリヌクレオチドであって、
該Fabライブラリーが、複数のベクターを含み、該複数のベクターの各ベクターが、抗体重鎖可変領域、抗体重鎖定常領域、軽鎖可変領域、および軽鎖定常領域をコードする配列を含むポリヌクレオチドを含み、かつ該ポリヌクレオチドが、6×ヒスチジンタグ(SEQ ID NO: 1)、c-mycタグ(SEQ ID NO: 2)、およびV5タグ(SEQ ID NO: 3)を含むトリプルタグ配列をコードする配列をさらに含み、該c-mycタグが、6×ヒスチジンタグとV5タグの間に位置し、かつこれらのタグが直接的に連結されるかもしくはスペーサーを介して間接的に連結されている、および
該単鎖抗体ライブラリーが、複数のベクターを含み、該複数のベクターの各ベクターが、抗体重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードする配列を含むポリヌクレオチドを含み、かつ該ポリヌクレオチドが、6×ヒスチジンタグ(SEQ ID NO: 1)、c-mycタグ(SEQ ID NO: 2)、およびV5タグ(SEQ ID NO: 3)を含むトリプルタグ配列をコードする配列をさらに含み、該c-mycタグが、6×ヒスチジンタグとV5タグの間に位置し、かつこれらのタグが直接的に連結されるかもしくはスペーサーを介して間接的に連結されている、
Fabライブラリーまたは単鎖抗体ライブラリーをコードする複数のポリヌクレオチド。
【請求項７】
スペーサーが3〜7アミノ酸長でありかつ任意でGAAまたはKAAである、請求項1記載の核酸ライブラリー。
【請求項８】
スペーサーが3〜7アミノ酸長でありかつ任意でGAAまたはKAAである、請求項2記載のバクテリオファージライブラリー。
【請求項９】
スペーサーが3〜7アミノ酸長でありかつ任意でGAAまたはKAAである、請求項3記載の核酸のベクター。
【請求項１０】
スペーサーが3〜7アミノ酸長でありかつ任意でGAAまたはKAAである、請求項4記載のタグ化タンパク質。
【請求項１１】
スペーサーが3〜7アミノ酸長でありかつ任意でGAAまたはKAAである、請求項5記載の単鎖抗体またはFab断片のライブラリー。
【請求項１２】
スペーサーが3〜7アミノ酸長でありかつ任意でGAAまたはKAAである、請求項6記載のFabライブラリーまたは単鎖抗体ライブラリーをコードする複数のポリヌクレオチド。
【請求項１３】
トリプルタグ配列が、
HHHHHHEQKLISEEDLGKPIPNPLLGLDST (SEQ ID NO: 4)
によって表されるか、または
HHHHHHGAAEQKLISEEDLKAAGKPIPNPLLGLDST (SEQ ID NO: 5)
によって表される、請求項1記載の核酸ライブラリー。
【請求項１４】
トリプルタグ配列が、
HHHHHHEQKLISEEDLGKPIPNPLLGLDST (SEQ ID NO: 4)
によって表されるか、または
HHHHHHGAAEQKLISEEDLKAAGKPIPNPLLGLDST (SEQ ID NO: 5)
によって表される、請求項2記載のバクテリオファージライブラリー。
【請求項１５】
トリプルタグ配列が、
HHHHHHEQKLISEEDLGKPIPNPLLGLDST (SEQ ID NO: 4)
によって表されるか、または
HHHHHHGAAEQKLISEEDLKAAGKPIPNPLLGLDST (SEQ ID NO: 5)
によって表される、請求項3記載のベクター。
【請求項１６】
トリプルタグ配列が、
HHHHHHEQKLISEEDLGKPIPNPLLGLDST (SEQ ID NO: 4)
によって表されるか、または
HHHHHHGAAEQKLISEEDLKAAGKPIPNPLLGLDST (SEQ ID NO: 5)
によって表される、請求項4記載のタグ化タンパク質。
【請求項１７】
トリプルタグ配列が、
HHHHHHEQKLISEEDLGKPIPNPLLGLDST (SEQ ID NO: 4)
によって表されるか、または
HHHHHHGAAEQKLISEEDLKAAGKPIPNPLLGLDST (SEQ ID NO: 5)
によって表される、請求項5記載の単鎖抗体またはFab断片のライブラリー。
【請求項１８】
トリプルタグ配列が、
HHHHHHEQKLISEEDLGKPIPNPLLGLDST (SEQ ID NO: 4)
によって表されるか、または
HHHHHHGAAEQKLISEEDLKAAGKPIPNPLLGLDST (SEQ ID NO: 5)
によって表される、請求項6記載のFabライブラリーまたは単鎖抗体ライブラリーをコードする複数のポリヌクレオチド。
【請求項１９】
関心対象のタンパク質が結合分子またはその断片であり、該結合分子が任意で抗体またはその断片であり、さらに任意で、単鎖抗体、単一ドメイン抗体、もしくは抗体のFab断片であるか、またはFab、Fab'、Fab'-SH、Fv、scFv、およびF(ab')2からなる群より選択される、請求項1記載の核酸ライブラリー。
【請求項２０】
関心対象のタンパク質が結合分子またはその断片であり、該結合分子が任意で抗体またはその断片であり、さらに任意で、単鎖抗体、単一ドメイン抗体、もしくは抗体のFab断片であるか、またはFab、Fab'、Fab'-SH、Fv、scFv、およびF(ab')2からなる群より選択される、請求項2記載のバクテリオファージライブラリー。
【請求項２１】
関心対象のタンパク質が結合分子またはその断片であり、該結合分子が任意で抗体またはその断片であり、さらに任意で、単鎖抗体、単一ドメイン抗体、もしくは抗体のFab断片であるか、またはFab、Fab'、Fab'-SH、Fv、scFv、およびF(ab')2からなる群より選択される、請求項3記載のベクター。
【請求項２２】
請求項3、9、15または21のいずれか一項記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項２３】
トリプルタグ配列に連結された関心対象のタンパク質を製造する方法であって、
ポリヌクレオチド配列が発現され、かつトリプルタグ配列に連結された関心対象のタンパク質が産生される条件下で、請求項22記載の宿主細胞を培養する段階を含み、
以下の段階を含む方法を用いて宿主細胞培養物からタンパク質を回収する段階を任意でさらに含む、方法：
(a)請求項22記載の宿主細胞からペリプラズム抽出物を調製する段階；
(b)該ペリプラズム抽出物を、6×ヒスチジンタグ、c-mycタグ、またはV5タグに対する抗体と接触させる段階であって、タグ化タンパク質が、6×ヒスチジンタグ、c-mycタグ、またはV5タグに対する該抗体によって補足される段階；
(c)抗体に結合したタグ化タンパク質を溶出させる段階；および
(d)タグ化タンパク質を溶出液から回収する段階。
【請求項２４】
請求項3記載の複数のベクターを含む、関心対象のタンパク質のファージミドライブラリーをスクリーニングする方法であって、
(a)請求項3記載の複数のベクターから複数のポリヌクレオチドを発現させる段階；
(b)発現されたポリヌクレオチドを、V5タグ、c-mycタグ、または6×ヒスチジンタグに特異的な抗体への結合に基づいてスクリーニングする段階；および
(c)段階(b)で結合する発現されたポリヌクレオチドを回収する段階
を含む、方法。
【請求項２５】
請求項4、10または16のいずれか一項記載の複数のタグ化タンパク質を含むポリペプチドライブラリー。
【請求項２６】
請求項4、10または16のいずれか一項記載の複数のタグ化タンパク質を表面に提示するバクテリオファージのライブラリー
【請求項２７】
複数のポリペプチドから、抗原に結合するポリペプチドを選択するための方法であって、
(a)請求項25または26記載のポリペプチドライブラリーを抗原と接触させる段階；および
(b)該抗原に結合するポリペプチドを選択する段階
を含むか、または
(a)請求項1記載のライブラリーを発現させて複数のポリペプチドを産生させる段階；および
(b)発現させたポリペプチドを抗原と接触させる段階；および
(c)該抗原に結合するポリペプチドを選択する段階
を含む、方法。
【請求項２８】
6×ヒスチジンタグ(SEQ ID NO: 1)、c-mycタグ(SEQ ID NO: 2)、およびV5タグ(SEQ ID NO: 3)を含むトリプルタグ配列に連結された関心対象の複数のタンパク質を含む請求項26記載のバクテリオファージのライブラリーをスクリーニングするための方法であって、
該c-mycタグが、6×ヒスチジンタグとV5タグの間に位置し、かつこれらのタグが直接的に連結されるかまたはスペーサーを介して間接的に連結されており、
該方法が、
(a)ライブラリーの試料を6×ヒスチジンタグ、c-mycタグ、またはV5タグに特異的な第1の結合分子と接触させる段階;
(b)6×ヒスチジンタグ、c-mycタグ、またはV5タグに特異的な該結合分子を用いて、トリプルタグ配列に連結された関心対象のタンパク質を捕捉するまたは検出する段階;
(c)結合された関心対象のタンパク質を6×ヒスチジンタグ、c-mycタグ、またはV5タグに特異的な第2の結合分子と接触させる段階;および
(d)6×ヒスチジンタグ、c-mycタグ、またはV5タグに特異的な結合分子を用いて、関心対象のタンパク質を検出する段階
を含み、
該第1の結合分子の特異性は、該第2の結合分子の特異性と異なり、かつ
任意で、V5タグに特異的な結合分子が段階(a)で使用され、かつ6×ヒスチジンタグに特異的な結合分子が段階(c)で使用されるか、または、6×ヒスチジンタグに特異的な結合分子が段階(a)で使用され、かつV5タグに特異的な結合分子が段階(c)で使用される、方法。