【手続補正書】
【提出日】平成25年12月6日(2013.12.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞が分泌する複数の蛋白を含み、複数の分化細胞型への分化能を有する成体幹細胞を液体細胞培地にて培養することで得られる、腫瘍の治療にて用いるための、訓化培地。
【請求項２】
それから訓化培地を得ることができる成体幹細胞からなる細胞フラクションを含む、請求項１記載の訓化培地。
【請求項３】
無細胞である、請求項１記載の訓化培地。
【請求項４】
（ｉ）複数の分化細胞型への分化能を有する成体幹細胞を液体細胞培地にて所定の時間培養する工程、および
（ｉｉ）細胞フラクションを該液体細胞培地から取り出し、それにより細胞が分泌する複数の蛋白を含む無細胞の訓化培地を得る工程
を含む方法により得ることができる、請求項３記載の訓化培地。
【請求項５】
細胞フラクションを液体細胞培地より遠心分離または濾過により取り出す、請求項４記載の訓化培地。
【請求項６】
液体細胞培地が付加的に、約２００００ないし３０００００ｇ、好ましくは約８００００ないし２０００００ｇのＧ力で、超遠心分離に供される、請求項５記載の訓化培地。
【請求項７】
方法がさらに、（ｉｉｉ）無細胞の訓化培地より、公称分子量が３ｋＤａより低い物質のフラクションを除去する、工程を含む、請求項４ないし６のいずれかに記載の訓化培地。
【請求項８】
公称分子量が３ｋＤａより低い物質のフラクションが無細胞の訓化培地より限外濾過により除去される、請求項７記載の訓化培地。
【請求項９】
方法がさらに工程（ｉｉ）にてまたは工程（ｉｉｉ）にて得られる無細胞の訓化培地をＲＮａｓｅで処理する工程を含む、請求項４ないし８のいずれかに記載の訓化培地。
【請求項１０】
複数の分化細胞型への分化能を有する成体幹細胞が、肝臓幹細胞、腎臓幹細胞、脂肪幹細胞、間葉細胞幹細胞、血管周囲多能性前駆細胞、歯髄幹細胞、上皮幹細胞、造血幹細胞、剥脱した脱落歯からの幹細胞および臍帯幹細胞からなる群より選択される、請求項１ないし９のいずれかに記載の訓化培地。
【請求項１１】
複数の分化細胞型への分化能を有する成体幹細胞が非楕円肝臓幹細胞である、請求項１０記載の訓化培地。
【請求項１２】
非楕円肝臓幹細胞が成熟肝細胞、インスリン産生細胞、骨形成原細胞および上皮細胞への分化能を有する、請求項１１記載の訓化培地。
【請求項１３】
複数の分化細胞型への分化能を有する成体幹細胞がヒト細胞である、請求項１ないし１２のいずれかに記載の訓化培地。
【請求項１４】
腫瘍の治療にて用いるための、複数の分化細胞型への分化能を有する成体幹細胞。
【請求項１５】
請求項１０ないし１３のいずれかに記載される、請求項１４に記載の成体幹細胞。
【請求項１６】
腫瘍が充実性腫瘍である、請求項１ないし１３のいずれかに記載の訓化培地または請求項１４もしくは１５に記載の成体幹細胞。
【請求項１７】
腫瘍が、肝腫瘍、上皮腫瘍、乳房の腫瘍、肺腫瘍、前立腺腫瘍、胃腫瘍および結腸腫瘍からなる群より選択される、請求項１６記載の訓化培地または成体幹細胞。
【請求項１８】
腫瘍が肝臓癌、カポシ肉腫および乳腺腺癌からなる群より選択される、請求項１７記載の訓化培地または成体幹細胞。
【請求項１９】
請求項１ないし１３のいずれかに記載の訓化培地または請求項１４または１５に記載の成体幹細胞の、腫瘍の治療にて用いるための医薬を製造するための使用。
【請求項２０】
腫瘍が請求項１６ないし１８のいずれかに記載されるとおりである、請求項１９記載の使用。
【請求項２１】
医薬が局所または全身投与用のものである、請求項１９または２０記載の使用。
【請求項２２】
医薬が注射により投与されるための、請求項２１記載の使用。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００２】
転移性癌細胞は、幹細胞と、その自己複製能および多様な子孫の産生能などの多くの特徴点を共有する。さらには、幹細胞と癌細胞の表現型は微小環境により大いに影響を受ける。同時に、胚微小環境は種々の癌細胞系の腫瘍原性を阻害することが判明した。嚢胚形成の前に、転移性黒色腫細胞の胚ゼブラフィッシュ微小環境への暴露が、その非腫瘍原性表現型への再プログラム化をもたらすことが証明された（Cucina Aら、(2006). Zebrafish embryo proteins induce apotosis in human colon cancer cells (Caco2). Apoptosis 11：1615-1628；Lee LMら (2005). The fate of human malignant melanoma cells transplanted into Zebrafish embryos: Assessment of migration and cell division in the absence of tumor formation. Dev Dyn 233：1560-1570）。加えて、成長過程にある鶏胚に移された転移性黒色腫細胞は、神経堤移動経路に沿って進み、腫瘍原性の喪失および神経堤様表現型の獲得をもたらしうる。最近の研究は、ヒト胚幹細胞（ｈＥＳＣ）微小環境が、具体的に、胚モルホゲンノダル（Nodal）の転移性黒色腫および乳癌細胞における発現を中和し、それらをあまり攻撃的でない表現型に再プログラム化することを示した（Postovit LMら（2008）. Human embryonic stem cell microenvironment suppresses the tumorigenic phenotype of aggressive cancer cells. PNAS 105: 4329-4334）。Postovit LMらは、Nodalシグナル伝達の阻害因子である、ｈＥＳＣにより分泌されるレフティ（Lefty）を、これら現象の重要な伝達物質の一つとして発見した。これらの研究は、胚幹細胞の微小環境が、攻撃的な腫瘍細胞にて異常に発現された胚性因子の制御のための、以前には言及されなかった治療的存在を提供することを立証する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００３】
Giuffrida D et al. Human embryonic stem cells secrete soluble factors that inhibit cancer cell growth. Cell Prolif. 2009 Sep 1 にて、ヒト上皮癌細胞株の増殖の阻害はｈＥＳＣにより産生される可溶性因子により媒介されることが示された。著者らはＧ（１）相の癌細胞の割合がｈＥＳＣ  ＣＭ治療により増加し、ＳおよびＧ（２）／Ｍ相における細胞の減少を伴うことを見いだし、これらの因子が細胞周期阻害により癌細胞の進行の速度を落とすことを示唆している。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００４】
しかしながら、かかる結果は、胚幹細胞を得るのに胚の破壊が必要とされる点において、獲得することが困難であり、倫理的および方法論的関心の両方を生じさせる、胚幹細胞により達成された。さらには、胚幹細胞はインビボでの移植において増殖が制御できないかもしれない。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００６】
ＷＯ２００６／１２６２１９にて、ＨＬＳＣは「多能性前駆細胞」と定義されたが、「前駆細胞」および「幹細胞」の語は共に、自己再生能および特殊化した（すなわち、分化した）細胞型への分化能を有する細胞をいう。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
さらには、「多能性」および「多分化能」なる語は、その両方が幹／前駆細胞の複数の特殊化した（分化した）細胞型に分化する能力をいう点で、本願明細書の中で相互変換可能であると考えられる。この文脈で、「複数」なる語は、少なくとも２種、好ましくは少なくとも３種の特殊化した（分化した）細胞型を意味する。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
かくして、本願発明の第一の態様は、細胞が分泌する複数の蛋白を含み、複数の分化細胞型への分化能を有する成体幹細胞を液体細胞培地にて培養することで得られる、腫瘍の治療にて用いるための、訓化培地である。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
本願発明のもう一つ別の態様は、細胞が分泌する複数の蛋白を含み、複数の分化細胞型への分化能を有する成体幹細胞を液体細胞培地にて培養することにより得ることができる訓化培地を、腫瘍の治療用医薬を製造するために用いることである。無細胞または細胞フラクション含有の訓化培地のいずれも腫瘍の治療に用いるのに適している。しかしながら、無細胞訓化培地が好ましい。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
本願発明の好ましい実施態様の腫瘍の治療に用いるのに適する無細胞訓化培地は、例えば、
（ｉ）複数の分化細胞型への分化能を有する成体幹細胞を液体細胞培地にて所定の時間培養し、および
（ｉｉ）細胞フラクションを該液体細胞培地から取り出し、それにより細胞が分泌する複数の蛋白を含む無細胞の訓化培地を得る
ことを含む、方法により得ることができる。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
しかしながら、哺乳動物の幹または前駆細胞、好ましくはヒト幹または前駆細胞を培養するのに適する液体細胞培地は、本願発明の細胞培地を得るのに用いることができると理解すべきである。以下に示す別の培地は、非限定的な例として挙げられる：Dulbecco's Modified Eagle Medium：Nutrient Mixture F-12（DMEM/F-12）、Roswell Park Memorial Institute medium（RPMI-1640）、Minimum Essential Medium（MEM）Alpha Medium（α-MEM）、Medium 199およびIscove's Modified Dulbecco's Medium（IMDM）。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
好ましい実施態様において、細胞フラクションは所定の期間培養され、ついでそれを遠心分離または濾過により液体細胞培地より取り出す。適当な所定の期間は、例えば、６ないし４８時間から、好ましくは１２ないし２４時間から構成される。非分化条件下での成体幹／前駆動物またはヒト細胞、好ましくは哺乳動物細胞の培養に適する培地は、液体細胞培地として使用するのに適する。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
胚幹細胞と対照的に、複数の分化細胞型に分化する能力を有し、成体組織より単離される幹細胞／前駆細胞は、本願発明の治療用途に有用な訓化培地を産生するのに適している。好ましい実施態様において、成体幹細胞は、肝臓幹細胞、腎臓幹細胞、脂肪幹細胞、間葉細胞幹細胞、血管周囲多能性前駆細胞、歯髄幹細胞、上皮幹細胞、造血幹細胞、剥脱した脱落歯からの幹細胞および臍帯幹細胞からなる群より選択される。成体幹細胞は動物幹細胞またはヒト幹細胞のいずれでもよい。ヒト幹細胞は、治療剤がヒト患者に投与されるべきである場合に好ましい。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２６】
好ましい実施態様において、成体幹細胞は非楕円幹細胞、好ましくはＷＯ２００６／１２６２３６に開示の非楕円ヒト肝臓多能性前駆細胞（ＨＬＳＣ）である。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２８】
本願明細書の実験セクションに記載の「比較例」は、ＨＬＳＣ−ＣＭおよびＭＳＣ−ＣＭは共にＨｅｐＧ２細胞のアポトーシスの増加に有効であるが、ＨＳＬＣ−ＣＭがＭＳＣ−ＣＭよりもより効果的であることを示す。比較例はまた、両方の訓化培地（ＨＳＬＣ−ＣＭおよびＭＳＣ−ＣＭ）の両方がＴＧＦ−β単独よりも効果的であることを示す。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３０】
好ましい実施態様において、ＨＬＳＣは、ＷＯ２００６／１２６２３６の第７頁の表Ｉに要約される特徴を有し（その中で該細胞は「ＨｕＨＥＰ」と称される）、そこでは、ＦＡＣＳおよび免疫蛍光分析による特徴付けを説明する。かかる分析の結果を本願明細書にて以下に説明する。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３２】
ＷＯ２００６／１２６２３６に開示の非楕円ヒト肝臓多能性前駆細胞より得られるＨＬＳＣ−ＣＭの組成物は、国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０５７２３２において特徴付けられ、開示されている。かかる特徴は出典明示により本願明細書の一部とする。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３５】
肝臓多能性前駆／幹細胞はＷＯ２００６／１２６２３６に開示される方法により単離され、その中で拡張工程は、前駆幹細胞をウシ胎仔血清（ＦＣＳ）（好ましくは約１０％の濃度で）、ｈＥＧＦ（ヒト上皮成長因子）およびｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞成長因子）の存在下で培養することで行われる。ＦＣＳ、ｂＦＧＦおよびｈＥＧＦは、好ましくは、ＧＭＰグレード、例えばInvitrogenにより製造されるものである。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４０】
【図１】ＨｅｐＧ２細胞を異なる用量の２５ｘ濃縮したＨＬＳＣ−ＣＭと一緒に４８時間インキュベートすることで実施されたインビトロ増殖アッセイの結果を示すグラフである。ＨｅｐＧ２の増殖はインキュベーションの４８時間後にＢｒｄＵ取り込みアッセイにより評価した。ＨｅｐＧ２を、ＤＭＥＭ単独で、または０．５；２；８または１６％の２５ｘ濃縮したＣＭを補足したＤＭＥＭ中で培養した。４８時間後、ＨｅｐＧ２の増殖をＢｒｄＵ取り込みアッセイを用いて定量した。該実験を四重重複して行った。図示されているデータは８回の実験の平均値±標準偏差である（Ｐ＜０．０５）。
【図２】ＨｅｐＧ２細胞を異なる用量の２５ｘ濃縮したＨＬＳＣ−ＣＭと一緒に４日間インキュベートすることで実施されたインビトロ増殖アッセイの結果を示すグラフである。ＨｅｐＧ２の増殖はインキュベーションの４日後にＢｒｄＵ取り込みアッセイにより評価した。ＨｅｐＧ２を、ＤＭＥＭ単独で、または１；８または１６％の２５ｘ濃縮したＨＬＳＣ−ＣＭを補足したＤＭＥＭ中で４日間培養した。該実験を四重重複して行った。図示されているデータは８回の実験の平均値±標準偏差である（Ｐ＜０．０５）。
【図３】ＨｅｐＧ２、ＭＣＦ−７およびカポシ細胞（ＫＳ）を２５ｘ濃縮したＨＬＳＣ−ＣＭの２種の異なる調製物と一緒にインキュベートすることにより実施されたインビトロ増殖アッセイの結果を示すグラフである。ＨｅｐＧ２、ＭＣＦ−７およびカポシ細胞（ＫＳ）の増殖は１６％の２５ｘ濃縮したＨＬＳＣ６ｂから、およびＨＬＳＣ２から由来のＣＭと一緒に４８時間インキュベートした後にＢｒｄＵ取り込みアッセイにより評価した。該実験を二重重複して行った。図示されているデータは４回の実験の平均値±標準偏差である（Ｐ＜０．０５）。
【図４】ＨｅｐＧ２細胞を２５ｘ濃縮したＨＬＳＣ−ＣＭと一緒にインキュベートすることにより実施されたインビトロアポトーシスアッセイの結果を示すグラフである。ＨｅｐＧ２のアポトーシスは、異なる用量のＣＭ（０．５；２；６および１６％の２５ｘ濃縮したＣＭ）と一緒に２４時間インキュベーションした後のアポトーシス細胞の割合としてＴＵＮＥＬアッセイにより評価した。アポトーシス誘発の陽性対照として、ビクリスチンおよびドキソルビシンを用い；陰性対照において、ＨｅｐＧ２をビヒクル単独で処理した。結果を３種の異なる実験の平均値±ＳＤとして表す。
【図５】ＨｅｐＧ２、ＭＣＦ−７およびＫＳ細胞を２５ｘ濃縮したＨＬＳＣ−ＣＭと一緒にインキュベートすることで実施されたインビトロアポトーシスアッセイの結果を示すグラフである。ＨｅｐＧ２、ＭＣＦ−７およびＫＳ細胞のアポトーシスは１６％の２５ｘ濃縮した２種の異なる細胞調製物（ＨＬＳＣ−６ｂおよびＨＬＳＣ−２）から由来のＣＭと一緒に７２時間インキュベートした後のアポトーシス細胞の割合としてＴＵＮＥＬアッセイにより評価した。アポトーシス誘発の陽性対照として、ビクリスチンを用い；陰性対照において、該細胞をビヒクル単独で処理した。結果を３種の異なる実験の平均値±ＳＤとして表す（Ｐ＜０．０５）。
【図６】ＨｅｐＧ２を移植されたＳＣＩＤマウスに腫瘍内（ｉ．ｔ．）投与されたＨＬＳＣ−ＣＭの抗腫瘍活性を示すグラフである。腫瘍の体積は、毎週、移植片の２本の直交した直径をキャリパーで測定することにより決定された。
【図７】ＣＭ−ＨＬＳＣ（ｎ＝６）またはビヒクル（ｎ＝６）で腫瘍内処理した後、マウスを殺す際に、回収されたＨｅｐＧ２腫瘍の腫瘍体積を測定することで得られたデータを示すグラフである。腫瘍の体積は、毎週、移植片の２本の直交した直径をキャリパーで測定することにより決定された。
【図８】ＣＭ−ＨＬＳＣ（ｎ＝６）またはビヒクル（ｎ＝６）で腫瘍内処理した後、マウスを殺す際に、回収されたＨｅｐＧ２腫瘍の腫瘍重量を測定することで得られたデータを示すグラフである。
【図９】ＨＬＳＣ−ＣＭ処理による腫瘍増殖のインビボ阻害および腫瘍内アポトーシスの誘発を示す顕微鏡写真である（Ａ）。ＣＭ処理したマウスおよび処理していないマウスから由来の、４週間後に回収されたＨｅｐＧ２腫瘍の代表的顕微鏡写真。Ｂ）ＣＭ−処理した、または処理していないＨｅｐＧ２腫瘍のヘマトキシリン−エオジン染色およびＰＣＮＡ染色（Ｃ）。Ｄ）回収されたビヒクル単独で処理したＨｅｐＧ２腫瘍、またはＨＬＳＣからのＣＭで処理したＨｅｐＧ２腫瘍のアポトーシスを示す代表的な顕微鏡写真。
【図１０】原文に記載なし
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５２】
細胞増殖
種々の濃度のＣＭを用い、ＦＣＳを与えないＤＭＥＭ（Sigma）中、９６−ウェルのプレートにてＨｅｐＧ２を８０００細胞／ウェルで播種した。ＨＬＳＣから由来のＣＭが異なる腫瘍からの細胞株においてもその抗腫瘍活性を発揮するかどうかを調査するために、ＭＣＦ−７乳腺腺癌およびカポジ肉腫を用い、その抗腫瘍作用をＨｅｐＧ２で観察される作用と比較した。培養して４８時間経過した後、５−ブロモ−２’−デオキシ−ウリジン（ＢｒｄＵ）の細胞ＤＮＡへの取り込みとして、ＤＮＡ合成が検出された。ついで、細胞を０．５Ｍのエタノール／ＨＣｌで固定し、ヌクレアーゼと一緒にインキュベートし、ＤＮＡを消化した。ＤＮＡに取り込まれたＢｒｄＵを、抗ＢｒｄＵペルオキシダーゼ結合モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を用いて検出し、可溶性発色基質で可視化した。光学密度をＥＬＩＳＡ読み取り装置を用いて４０５ｎｍで測定した。
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５３】
アポトーシスアッセイ
ＨｅｐＧ２、ＭＣＦ−７およびＫＳ細胞を、１０％ＦＣＳを補足した低グルコースＤＭＥＭ（Sigma）中、ドキソルビシン（１００ｎｇ／ｍｌ、Sigma）またはビンクリスチン（５０ｎｇ／ｍｌ、Sigma）あるいは異なる濃度のＣＭ（０．５；１；２；８；１６％の２５ｘ濃縮したＣＭ）の存在下にて、９６−ウェルプレートに、８０００細胞／ウェルで播種した。アポトーシスをＴＵＮＥＬアッセイ（ApopTag Oncor、Gaithersburg、MD、USA）で評価した。
【手続補正２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６４】
ＨＥＰＧ２腫瘍増殖に対するＣＭのインビボ生物学的作用
結果
ＳＣＩＤマウスでの肝細胞癌異種移植片実験にて、腫瘍成長および増殖がＨＬＳＣより由来のＣＭにより阻害された
【手続補正２２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７２】
結果
ＨｅｐＧ２のＨＬＳＣ−ＣＭとの２４時間にわたるインキュベーションは、ビヒクル単独でインキュベートされた対照と比べてアポトーシスを顕著に促進した。ＭＳＣ−ＣＭもまた、ＴＧＦ−βと同様に、ＨＬＳＣ−ＣＭに関するほど顕著ではないが、ＨｅｐＧ２のアポトーシスを促進した。