【手続補正書】
【提出日】平成26年4月23日(2014.4.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）生物学的試料の導入のために構成された、添加ポート；
ｂ）前記添加ポートに作動可能に連結した細胞溶解サブサーキットであって、
ｉ）溶解チャンバー、および
ｉｉ）溶解緩衝液
を含み、前記溶解チャンバー中の前記生物学的試料を前記溶解緩衝液で溶解して溶解試料を生成するように構成された、細胞溶解サブサーキット；
ｃ）前記溶解サブサーキットに作動可能に連結した核酸抽出サブサーキットであって、
ｉ）前記溶解試料中に存在する核酸に結合するように構成された核酸抽出構成要素、
ｉｉ）洗浄緩衝液、および
ｉｉｉ）溶出緩衝液
を含み、抽出核酸の混合物を生成する、核酸抽出サブサーキット；
ｄ）前記核酸抽出サブサーキットに作動可能に連結した増幅サブサーキットであって、
前記抽出核酸の混合物について増幅を実施して増幅核酸を生成するのに有用である、少なくとも１つの増幅関連酵素を含む安定化酵素混合物
を含む、増幅サブサーキット；
ｅ）前記増幅サブサーキットに作動可能に連結した断片化サブサーキットであって、
ｉ）前記増幅核酸を消化して、断片化核酸を生成するように構成された試薬混合物、および／または
ｉｉ）前記増幅核酸を機械的に断片化して、断片化核酸を生成するように構成された断片化構成要素
を含む、断片化サブサーキット；並びに
ｆ）前記断片化サブサーキットに作動可能に連結したリンカー連結サブサーキットであって、
ｉ）配列決定方法における使用のために構成された核酸アダプター、および
ｉｉ）前記核酸アダプターを前記断片化核酸に連結して、核酸配列決定ライブラリーを生成するように構成された連結酵素混合物
を含む、リンカー連結サブサーキット；
を含む、マイクロフリューディックカード。
【請求項２】
前記核酸配列決定ライブラリー上の前記リンカーにハイブリダイズするように構成されたアンカー核酸配列を含む核酸精製構成要素を含む、前記リンカー連結構成要素に作動可能に連結した精製サブサーキット
をさらに含む、請求項１に記載のマイクロフリューディックカード。
【請求項３】
前記核酸配列決定ライブラリーの少なくとも一部分を使用者が回収できるように構成された出口ポートをさらに含む、請求項１に記載のマイクロフリューディックカード。
【請求項４】
前記溶解サブサーキット、前記核酸抽出サブサーキット、前記増幅サブサーキット、前記断片化サブサーキット、および／またはアダプター連結サブサーキットの１つ以上に作動可能に連結した廃棄物チャンバーをさらに含む、請求項１に記載のマイクロフリューディックカード。
【請求項５】
前記安定化酵素混合物がｉ）ＢＳＡ、ｉｉ）糖，ｉｉｉ）無機塩、ｉｖ）二価金属カチオン、ｖ）緩衝剤、ｖｉ）乳化剤、およびｖｉｉ）還元剤をさらに含む、請求項１に記載のマイクロフリューディックカード。
【請求項６】
前記安定化酵素混合物中において、前記ＢＳＡが０．０５％−３．０％の濃度で存在し、糖が５−３５％の濃度で存在し、前記無機塩が１ｍＭ−２５ｍＭの濃度で存在し、前記二価金属カチオンが１ｍＭ−３０ｍＭの濃度で存在し、前記緩衝剤が１０ｍＭ−１００ｍＭの濃度で存在し、前記乳化剤が０．０１％−０．１５％の濃度で存在し、前記還元剤が１ｍＭ−１０ｍＭの濃度で存在する、請求項１から５の一項に記載のマイクロフリューディックカード。
【請求項７】
緩衝液および試料を通過させるように構成された処理構成要素をさらに含む、請求項１から６の一項に記載のマイクロフリューディックカード。
【請求項８】
溶解緩衝液、洗浄緩衝液、溶出緩衝液、安定化酵素混合物、前記増幅核酸を消化するように構成された試薬混合物、および前記連結酵素混合物の１つ以上を含む１つ以上の密封容器をさらに含む、請求項１から７の一項に記載のマイクロフリューディックカード。
【請求項９】
（ａ）請求項１から８の一項に記載のマイクロフリューディックカード；および
（ｂ）次世代核酸シークエンサー；および
（ｃ）前記マイクロフリューディックカードおよび前記次世代核酸シークエンサーが統合された処理機器
を含む、試料調製および配列決定システム。
【請求項１０】
前記次世代核酸シークエンサーが、ゼロモード導波路、前記核酸アダプターに相補的なオリゴヌクレオチドが固定化されているフローセル、ＤＮＡが通過するナノポア、および前記核酸アダプターに相補的なオリゴヌクレオチドを保持しているビーズの１つ以上を含む、請求項９に記載の試料調製および配列決定システム。
【請求項１１】
（ａ）生物学的試料を請求項１から８の一項に記載のマイクロフリューディックカードに導入するステップ；
（ｂ）前記生物学的試料の細胞を溶解して、溶解試料を生成するステップ；
（ｃ）前記溶解試料から核酸を抽出して、抽出核酸の混合物を生成するステップ；
（ｄ）抽出核酸の前記混合物について増幅を実施して、増幅核酸を生成するステップ；
（ｅ）前記増幅核酸を断片化して、断片化核酸を生成するステップ；
（ｆ）核酸アダプターを前記断片化核酸に連結して、核酸配列決定ライブラリーを生成するステップ；
（ｇ）前記マイクロフリューディックカードから前記核酸配列決定ライブラリーの少なくとも一部を回収するステップ；および
（ｈ）前記核酸配列決定ライブラリー由来の１つ以上の核酸を配列決定するステップ
を含む、生物学的試料由来の核酸を配列決定する方法。
【請求項１２】
（ｉ）前記核酸アダプターに相補的なオリゴヌクレオチドを保持しているビーズで前記核酸配列決定ライブラリーから単一分子を捕獲するステップ；
（ｉｉ）前記ビーズを水−油微小胞中に個々に区画化するステップ；
（ｉｉｉ）エマルジョンＰＣＲによって前記単一分子上でクローン性増幅を実施するステップ；
（ｉｖ）ビーズを個々のウエルに入れるステップ；
（ｖ）適切なｄＮＴＰが前記単一分子に付加される際に検出可能な発光が産生されるように、配列決定酵素および発光レポーターの存在下でｄＮＴＰの反復的導入を実施するステップ；および
（ｖｉ）前記単一分子の配列を読み取るためにｄＮＴＰの前記反復的導入によって産生された前記発光を検出するステップ；
を含む、請求項１１に記載の生物学的試料由来の核酸を配列決定する方法。
【請求項１３】
（ｉ）前記核酸アダプターに相補的なオリゴヌクレオチドアンカーで覆われたフローセルの表面上に前記核酸配列決定ライブラリーからの核酸分子を捕獲するステップ；
（ｉｉ）増幅分子と隣接アンカーとのハイブリッド形成が生じる条件下で前記アンカーをプライマーとして使用して前記核酸分子をＰＣＲ増幅して、前記フローセルの前記表面上に架橋構造を形成するステップ；
（ｉｉｉ）前記架橋構造を変性および切断するステップ；
（ｉｖ）色素標識転写ターミネーターヌクレオチドを、切断された架橋構造中に可逆的に取り込むステップ；
（ｖ）取り込み後にヌクレオチド蛍光を検出するステップ；
（ｖｉ）色素およびターミネーターを除去するステップ；および
（ｖｉｉ）ステップ（ｉｖ）から（ｖｉ）を反復して、前記核酸分子を配列決定するステップ
を含む、請求項１１に記載の生物学的試料由来の核酸を配列決定する方法。
【請求項１４】
（ｉ）前記核酸アダプターに相補的なオリゴヌクレオチドを保持しているビーズで前記核酸配列決定ライブラリーから単一分子を捕獲するステップ；
（ｉｉ）前記ビーズを水−油微小胞中に個々に区画化するステップ；
（ｉｉｉ）エマルジョンＰＣＲによって前記単一分子上でクローン性増幅を実施して、鋳型を生成するステップ；
（ｉｖ）前記ビーズをフローセルの誘導体化表面上に固定化するステップ；
（ｖ）前記アダプターに相補的なプライマーをアニーリングするステップ；
（ｖｉ）１つの照合プローブが前記鋳型に結合する条件下で前記鋳型を標識された照合プローブに暴露するステップ；
（ｖｉｉ）蛍光を検出するステップ；
（ｖｉｉｉ）前記鋳型由来の前記照合プローブを変性するステップ；および
（ｉｘ）ステップ（ｖ）から（ｖｉｉｉ）を反復し、これにより前記単一分子を配列決定するステップ
を含む、請求項１１に記載の生物学的試料由来の核酸を配列決定する方法。
【請求項１５】
（ｉ）前記核酸配列決定ライブラリーから単一分子を捕獲するステップ；
（ｉｉ）電導性液中に浸漬したナノポアを通して前記単一分子を通過させるステップであって、前記ナノポアの端から端まで電圧がかけられているステップ；および
（ｉｉｉ）前記単一分子が前記ナノポアを通して通過する際に産生される電流を検出するステップ
を含む、請求項１１に記載の生物学的試料由来の核酸を配列決定する方法。
【請求項１６】
（ｉ）フローセルの表面上のオリゴヌクレオチドに前記核酸配列決定ライブラリー由来の核酸分子のアダプターを連結するステップ；
（ｉｉ）相補的ｄＮＴＰが前記核酸に付加される条件下で、前記核酸分子に蛍光標識されたｄＮＴＰを連続的に付加するステップ；
（ｉｉｉ）取り込まれたｄＮＴＰに関連する蛍光を検出するステップ
を含む、請求項１１に記載の生物学的試料由来の核酸を配列決定する方法。
【請求項１７】
（ｉ）前記核酸配列決定ライブラリー由来の核酸分子を反応溶液中に入れるステップ；
（ｉｉ）ゼロモード導波路（ＺＭＷ）を前記反応溶液に暴露するステップであって、前記ＺＭＷがその底表面に付着したＤＮＡポリメラーゼを含むステップ；
（ｉｉｉ）明確に標識されたリン酸結合ヌクレオチドを前記反応溶液に添加するステップ；および
（ｉｖ）標識されたｄＮＴＰ残基がＺＭＷ中にある時間量に基づいてｄＮＴＰの取り込みを検出するステップ
を含む、請求項１１に記載の生物学的試料由来の核酸を配列決定する方法。