(57)【要約】【課題】酸素運搬効率が高く、かつ必要な膠漆浸透圧を有し、適度な昌質浸透圧、ｐＨおよび電解質バランスを有する、人工酸素運搬体を含む医薬組成物を提供すること。【解決手段】リポソームにヘモグロビンを内包させたヘモグロビン小胞体製剤またはポルフィリン鉄錯体とアルブミンの複合体製剤に、膠質浸透圧を付与しうる化合物、電解質、糖質、アミノ酸、抗酸化剤、ｐＨ調整剤および等張化剤からなる群から選ばれる１種以上を適度に添加調製して得られる医薬組成物。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体内で酸素を可逆的に吸脱着できる人工酸素運搬体ならびに、膠質浸透圧を付与しうる化合物、電解質、糖類、アミノ酸、抗酸化剤、ｐＨ調整剤および等張化剤からなる群から選ばれる１種以上の化合物をさらに含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項２】
生体内で酸素を可逆的に吸脱着できる人工酸素運搬体ならびに膠質浸透圧を付与しうる化合物を含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項３】
人工酸素運搬体が、ヘモグロビン内包リポソームからなる、請求項１または２記載の医薬組成物。
【請求項４】
人工酸素運搬体が、ポルフィリン構造を有する金属錯体と蛋白質の複合体からなる、請求項１または２記載の医薬組成物。
【請求項５】
人工酸素運搬体が、ポルフィリン構造を有する金属錯体と蛋白質との複合体およびヘモグロビン内包リポソームからなる、請求項１または２記載の医薬組成物。
【請求項６】
リポソームが、非リン脂質型脂質とポリアルキレングリコール類との複合体を含む、請求項３または５記載の医薬組成物。
【請求項７】
ヘモグロビンが遺伝子組み換え型である、請求項３または５記載の医薬組成物。
【請求項８】
金属錯体が鉄（ＩＩ）錯体であり、かつ蛋白質がアルブミンである、請求項４または５記載の医薬組成物。
【請求項９】
蛋白質が遺伝子組み換え型である、請求項４または５記載の医薬組成物。
【請求項１０】
膠質浸透圧が約１〜５０ｍｍＨｇ、晶質浸透圧が約５０〜５００ｍＯｓｍ、Ｐ５０が約１〜５０Ｔｏｒｒ、ｐＨが約５．６〜８．０の液体である、請求項１または２記載の医薬組成物。
【請求項１１】
虚血部位または腫瘍組織に酸素を供給する、請求項１または２記載の医薬組成物。
【請求項１２】
出血時の輸血に使用する、請求項１または２記載の医薬組成物。
【請求項１３】
臓器保存灌流液、体外循環液または細胞培養液に使用する、請求項１または２記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は、生体内で酸素を可逆的に吸脱着できる人工酸素運搬体を含む医薬組成物に関する。
さらに詳細には、医療分野において、虚血部位や腫瘍組織への酸素供給用、大量出血患者の輸血用、臓器保存灌流液、体外循環液、細胞培養液として使用され、酸素運搬効率が高く、かつ必要な膠質浸透圧と、適度な晶質浸透圧、ｐＨおよび電解質バランスを有する、ポルフィリン構造を有する金属錯体を含む医薬組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生体の血管内における血液量の維持には、血漿コロイドである血漿蛋白質が重要な役割を果たしていることが知られている。このため、従来より、患者の出血性ショックを回復させるために、生体の血液とほぼ等しい膠質浸透圧を有する血漿増量剤を補液する手法が採られてきた。しかしながら、循環血液量の３０％以上の出血を伴う場合には、末梢組織への酸素供給が不十分となり、血漿増量剤の投与に加えて、さらに酸素運搬体の投与が必要となる。
【０００３】
従来、このような酸素運搬体としては、天然赤血球を含有する天然血液あるいは赤血球濃厚液が用いられてきた。しかし、抗原抗体反応による凝血を回避するために、供血者と受血者の血液型を一致させ、使用時には交差適性試験を行う必要があり、また、このような天然血液あるいは赤血球濃厚液は、その有効保存期間が３週間（４℃）と短く、凍結保存によって長期保存可能な凍結血液は、コスト高や使用の際の浸透圧ショックによって溶血しやすいという問題があった。さらに、肝炎やエイズ等の感染症の発生も懸念されていた。
【０００４】
このような問題を解決するため、フルオロカーボン乳化製剤からなる人工酸素運搬体（特許文献１）や、ポリエチレングリコール（以下、ＰＥＧと略す）等を、酸素の可逆的結合と解離の機能を有するヘムタンパク質であるヘモグロビン（ヒトヘモグロビン、ウシヘモグロビン、および組換えヘモグロビン等。以下、Ｈｂと略す。）と結合させて修飾し、循環血流中におけるヘモグロビンの滞留時間を延長させた代用血液（特許文献２）等の研究が既に開示されている。
しかし、フルオロカーボン乳化製剤からなる人工酸素運搬体は、その酸素運搬能をフルオロカーボンへの酸素の物理的溶解現象のみに依存しているため、酸素運搬能力が不十分であり、また、ＰＥＧ等をＨｂと結合させた代用血液においても、ヘモグロビンの滞留時間は十分ではないといった問題があった。
【０００５】
Ｈｂを用いた、分子内架橋Ｈｂ、水溶性高分子結合Ｈｂ、分子間架橋重合Ｈｂなどの酸素輸液剤の開発も進められているが、非細胞型構造に起因する各種の副作用が明らかにされている。
【０００６】
Ｈｂが本来赤血球膜に包まれている理由として、下記の事項が考えられる：
１）Ｈｂ溶液は、５％以上のＨｂ濃度にて膠質浸透圧は生理的な値を超えてしまうので、赤血球膜に包まれることにより膠質浸透圧の制御を可能とすること：
２）生理活性の高いヘモグロビンを膜内に封じ込めることにより、その副作用を抑制すること；
３）酸素親和度や酸素錯体の安定度などＨｂ機能を維持するための各種リン酸化合物、解糖・還元酵素系を同一系内に保持すること；および
４）血球分散系は非ニュートン性流体であり、体内（特に末梢血管）循環において特色ある流動形式により生理作用を示す利点があること。
このような赤血球構造の本来の役割を考慮すれば、酸素輸液剤としては、Ｈｂをカプセル封入した粒子の分散系が適切であることは明らかである。
【０００７】
一方、生体成分であるリン脂質が単独で小胞構造を形成することが発見され、ＤｊｏｒｄｊｅｖｉｃｈとＭｉｌｌｅｒがリン脂質／コレステロール／脂肪酸から成るリポソームを利用したヘモグロビン小胞体の検討を開始して以来、多くの機関でヘモグロビン小胞体の研究が進められてきた。ヘモグロビン小胞体の使用には、１）天然のヘモグロビンがそのまま使えること、２）ヘモグロビン由来の副作用を抑制できること、３）粘度や膠質浸透圧、酸素親和度を任意の値に調節できること、４）体内血中滞留時間を延長できること等の利点がある。
【０００８】
脂質２分子膜からなるリポソームの内層にヘモグロビンを内包したヘモグロビン内包リポソームについては様々な検討が行われている（特許文献３、特許文献４、特許文献５）。しかし、このようなヘモグロビン内包リポソームの懸濁液は、膠質浸透圧が極端に低いため、これらを生体の血管に投与しても循環血液量の維持あるいは増量効果は充分には期待できなかった。
【０００９】
上記の欠点を克服するものとして、ヘモグロビン内包リポソームを血漿増量剤の水溶液中に懸濁させることにより、酸素運搬能と血漿増量効果の両方を兼ね備えた人工血液が開示されている（特許文献６、特許文献７）。
しかしながら、特許文献６の人工血液においては、ヘモグロビン内包リポソームが血漿増量剤の水溶液中で凝集する傾向があり、懸濁液の粘度が高くなるために静注投与しにくく、また、リポソームの凝集塊が血管内で栓塞する危険性もあった。
特許文献７の人工血液は、ヘモグロビン小胞体と血中蛋白質との相互作用を抑制させることを目的として、ヘモグロビン小胞体の表面（すなわちリン脂質）にＰＥＧを結合させた酸素運搬体（特許文献８、特許文献９）を用いることによって、ヘモグロビン小胞体と血漿増量剤との相互作用を抑制している。
しかしながら、ＰＥＧ（ポリオキシエチレンと同義）のような水溶性高分子を、一般的な生物の細胞膜成分に多いであるホスファチジルエタノールアミン等のジアシル型リン脂質に結合させると、リン脂質二分子膜小胞体から脱離することが知られている（非特許文献１、特許文献１０）
【００１０】
これら人工酸素酸素運搬体を含む医薬組成物は、膠質浸透圧の付与を行わずに生体に投与すると、ショック症状を引き起こす。また、電解質バランスが生理的電解質バランスと異なる場合には、生体投与時の血管痛や晶質浸透圧の差に起因する溶血、血管炎が生じる。さらに。人工酸素輸液のｐＨが生理的ｐＨより高ければアルカローシスを、生理的ｐＨより低ければアシドーシスを引き起こすという問題があった。
【００１１】
【特許文献１】
特公昭６０−３３３６７号公報
【特許文献２】
特公平２−６３３７号公報
【特許文献３】
特開昭５２−１５１７１８号公報
【特許文献４】
特開昭５８−１８３６２５号公報
【特許文献５】
特開昭６１−３７７３５号公報
【特許文献６】
米国特許４，１３３，８７４号公報
【特許文献７】
特開平４−５２４２号公報
【特許文献８】
特開平２−１４９５１２号公報
【特許文献９】
特開平３−２１８３０９号公報
【特許文献１０】
特開２００１−６４３８３号公報  段落０００４
【非特許文献１】
Ｊ．Ｒ．Ｓｉｌｖｉｕｓ  ａｎｄ  Ｍ．Ｊ．Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ３２，  ３１５３，  １９９３
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、酸素運搬効率が高く、かつ必要な膠質浸透圧を有し、適度な晶質質浸透圧、ｐＨおよび電解質バランスを有する、人工酸素運搬体を含む医薬組成物を提供することを課題とする。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、リポソームにヘモグロビンを内包させたヘモグロビン内包リポソーム製剤に、膠質浸透圧を付与しうる化合物、電解質、糖質、アミノ酸、抗酸化剤、ｐＨ調整剤および等張化剤からなる群から選ばれる１種以上を適度に添加調製して得られる医薬組成物によって、上記課題が解決されることを見いだし本発明に到達した。また、ポルフィリン構造を有する金属錯体とアルブミンの複合体製剤はその溶液が膠質浸透圧を持つことにも着目し、本発明の一部の構成となった。
【００１５】
すなわち、本発明は、
（１）  生体内で酸素を可逆的に吸脱着できる人工酸素運搬体ならびに、膠質浸透圧を付与しうる化合物、電解質、糖類、アミノ酸、抗酸化剤、ｐＨ調整剤および等張化剤からなる群から選ばれる１種以上の化合物をさらに含むことを特徴とする医薬組成物、
（２）  生体内で酸素を可逆的に吸脱着できる人工酸素運搬体ならびに膠質浸透圧を付与しうる化合物を含むことを特徴とする医薬組成物、
（３）  人工酸素運搬体が、ヘモグロビン内包リポソームからなる、上記１または２記載の医薬組成物、
（４）  人工酸素運搬体が、ポルフィリン構造を有する金属錯体と蛋白質の複合体からなる、上記１または２記載の医薬組成物、
（５）  人工酸素運搬体が、ポルフィリン構造を有する金属錯体と蛋白質との複合体およびヘモグロビン内包リポソームからなる、上記１または２記載の医薬組成物、
（６）  リポソームが、非リン脂質型脂質とポリアルキレングリコール類との複合体を含む、上記３または５記載の医薬組成物、
（７）  ヘモグロビンが遺伝子組み換え型である、上記３または５記載の医薬組成物、
（８）  金属錯体が鉄（ＩＩ）錯体であり、かつ蛋白質がアルブミンである、上記４または５記載の医薬組成物、
（９）  蛋白質が遺伝子組み換え型である、上記４または５記載の医薬組成物、
（１０）  膠質浸透圧が約１〜５０ｍｍＨｇ、晶質浸透圧が約５０〜５００ｍＯｓｍ、Ｐ５０が約１〜５０Ｔｏｒｒ、ｐＨが約５．６〜８．０の液体である、上記１または２記載の医薬組成物。
（１１）  虚血部位または腫瘍組織に酸素を供給する、上記１または２記載の医薬組成物、
（１２）  出血時の輸血に使用する、上記１または２記載の医薬組成物、および
（１３）  臓器保存灌流液、体外循環液または細胞培養液に使用する、上記１または２記載の医薬組成物
である。
【００１６】
【発明の実施の形態】
本発明の医薬組成物は、液体、固体、ゲル状体等の組成物等特に限定されないが、好ましくは液体である。
具体的な人工酸素運搬体としては、例えば、ヘモグロビン内包リポソームや、ポルフィリン構造を有する金属錯体とアルブミンの複合体、あるいはそれらの混合物や複合体等が挙げられる。
本発明のポルフィリン構造を有する金属錯体とは、ポルフィリン環に中心金属が配位した金属錯体を指し、酸素との可逆的な結合能を有するもの全てを包含する。これらの金属錯体の中心金属としては、鉄、コバルト、クロムなどが好ましく、さらに好ましくは鉄（ＩＩ）、コバルト（ＩＩ）である。
【００１７】
ヘモグロビン内包リポソーム（以下ＨｂＶと略す）とは、リポソーム内部にヘモグロビンを包含した化合物である。
通常、「リポソーム」とは、膜状に集合した脂質および内部の水相から構成される閉塞小胞を意味するが、本発明においては、特に内水相を有しているか否かに関わらず、脂質が集合した微粒子全体を意味する。また、本発明のリポソームの構造も特に限定されず、多重層リポソームであってもよいし、一枚膜リポソームであってもよい。
本発明のリポソームの大きさは特に限定されないが、体積平均粒子径が約１０〜５０００ｎｍ程度、好ましくは約３０〜５００ｎｍ程度である。リポソームの体積平均粒子径は、動的光散乱法等の原理に基づき求めることができる。
【００１８】
本発明のリポソームを構成する脂質も特に限定されず、公知の脂質であってよい。前記脂質としては、例えば糖脂質、ステロール類、脂肪酸、リン脂質、両親媒性アルキルアミノ酸誘導体、ジアルキルジメチルアンモニウム、ポリグリセロールアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル等（Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  ｖｏｌ．１，１４１，１９９３）、アルキルグリコシド、アルキルメチルグルカミド、アルキルシュークロースエステル等（Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｔｈｅｃｎｏｌｏｇｙ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，ｖｏｌ．１，１４１，１９９３）、ポリオキシエチレン−ポリ乳酸等の両親媒性ブロック共重合体（特表平６―５０８８３１号公報）、長鎖アルキルアミン類（テトラデシルアミン、ヘキサデシルアミン、ステアリルアミン等）、または長鎖脂肪酸ヒドラジド類（ミリスチン酸ヒドラジド、パルミチン酸ヒドラジドもしくはステアリン酸ヒドラジド等）などを挙げることができる。
【００１９】
前記糖脂質としては、例えばグリセロ糖脂質、スフィンゴ糖脂質等が挙げられる。前期グリセロ糖脂質としては、ジガラクトシルジグリセリド類（ジガラクトシルジラウロイルグリセリド、ジガラクトシルジミリストイルグリセリド、ジガラクトシルジパルミトイルグリセリドもしくはジガラクトシルジステアロイルグリセリド等）、またはガラクトシルジグリセリド類（ガラクトシルジラウロイルグリセリド、ガラクトシルジミリストイルグリセリド、ガラクトシルジパルミトイルグリセリドもしくはガラクトシルジステアロイルグリセリド等）が挙げられる。前期スフィンゴ糖脂質としては、例えばガラクトシルセレブロシド、ラクトシルセレブロシドまたはガングリオシド等が挙げられる。
前期ステロール類としては、例えば、コレステロール、コレステロールヘミサクシネート、３β−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール、エルゴステロールまたはラノステロール等が挙げられる。
本発明においては、これらの脂質は単独で、または２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００２０】
前記リン脂質としては、例えばホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、リゾホスファチジルコリン、スフィンゴミエリン、卵黄レシチン、大豆レシチンまたは水素添加リン脂質等の天然または合成のリン脂質等が挙げられる。
【００２１】
本発明のリポソームは、特に、非リン脂質型の脂質とポリアルキレングリコール類が結合した複合体から構成されるのが好ましい。
ポリアルキレングリコール類としては、特に限定されないが、アルキレン鎖が炭素数１〜６程度のものが好ましい。また、アルキレン鎖は、本発明に支障のない置換基、例えば水酸基、カルボキシル基、アミノ基、アルコキシ基などで置換されていてもよい。具体的には、例えば、ＰＥＧ、ポリプロピレングリコールなどを用いることができる。中でも、特にＰＥＧを用いることが好ましい。ポリアルキレングリコール類の分子量は特に限定されないが、分子量が約２００〜４００万程度のもの、好ましくは約１，０００〜５０，０００程度のものを用いることができる。ＰＥＧを用いる場合には、特に上記分子量のものが好ましい。
本発明において、ポリアルキレングリコール類の含有量は特に限定されないが、リポソームを構成する総脂質量に対して約０．１〜３０モル％程度が好ましい。
【００２２】
本発明に用いるヘモグロビンは特に限定されず、種々の生体由来のヘモグロビンおよび遺伝子組み換え型のヘモグロビンのいずれも利用できるが、好ましくは、遺伝子組み換え型のヘモグロビンである。
【００２３】
ポルフィリン構造を有する金属錯体とアルブミンの複合体としては、一例として、テトラフェニルポルフィリン鉄誘導体である２−［８−｛Ｎ−（２−メチルイミダゾリル）｝オクタノイロキシメチル］−５，１０，１５，２０−テトラキス（α，α，α，α−ｏ−ピバロイルアミノ）フェニルポルフィナト鉄（ＩＩ）（２−［８−｛Ｎ−（２−ｍｅｔｈｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｙｌ）｝  ｏｃｔａｎｏｙｌｏｘｙｍｅｔｈｙｌ］−５，１０，１５，２０−ｔｅｔｒａｋｉｓ（α，α，α，α−ｏ−ｐｉｖａｌｏｙｌａｍｉｎｏ）ｐｈｅｎｙｌ−ｐｏｒｐｈｉｎａｔｏｉｒｏｎ（ＩＩ））等を、ヒト由来アルブミンまたは組換えアルブミンの疎水ポケットに包接させた酸素輸液剤（アルブミン−ヘムと称する）（Ｅ．Ｔｓｕｃｈｉｄａ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ｖｏｌ．８，  ５３４−５３８，  １９９７）などが挙げられる。
特開２００１−７２５９５
【００２４】
【００２５】
本発明に用いるポルフィリン構造を有する金属錯体は、特に限定されず、テトラフェニルポルフィリン、プロトポルフィリン、オクタアルキルポルフィリン、およびそれらの誘導体等のいずれも利用できるが、好ましくは、プロトポルフィリン誘導体である。
本発明に用いるアルブミンは特に限定されず、ヒト血清アルブミン、動物由来血清アルブミン、遺伝子組換え型動物、ヒト血清アルブミン（ｒＨＳＡ）、およびそれらの多量体等、のいずれも利用できる。感染防止等の観点から、特にｒＨＳＡが好ましい。
【００２６】
本発明において、Ｐ５０とは、ヘモグロビンと酸素との結合率が５０％となるときの酸素分圧である。Ｐ５０を１〜５０Ｔｏｒｒに調整することによって、生体内での正常な酸素吸脱着能を有する酸素運搬体を得ることができる。
また本発明は、膠質浸透圧を付与しうる化合物を含まない場合は膠質浸透圧が約０ｍｍＨｇであるが、膠質浸透圧を付与しうる化合物（ポルフィリン構造を有する金属錯体と蛋白質の複合体を含む）を含む場合は、膠質浸透圧を約１〜５０ｍｍＨｇとすることによって、生体への悪影響を防ぐことができる。また、本発明の医薬組成物の晶質浸透圧は約５０〜５０００  ｍＯｓｍであり、好ましくは約５０〜５００  ｍＯｓｍである。また、本発明の医薬組成物はｐＨが約５．６〜８．０であることが好ましい。
【００２７】
本発明の膠質浸透圧を付与しうる化合物としては、膠質浸透圧を有するものであれば医薬用に用いられる種々の高分子を使用することができるが、一例として、デキストラン（例えば、低分子デキストラン）、デキストラン誘導体（例えば、カルボキシメチルデキストラン、カルボキシデキストラン、カチオン化デキストラン、デキストラン硫酸）、ヒドロキシエチルデンプン、ヒドロキシプロピルデンプン、ゼラチン（例えば、修飾ゼラチン）、アルブミン（例えば、ヒト生血漿、ヒト血清アルブミン、加熱ヒト血漿蛋白、遺伝子組み換え型ヒト血清アルブミン）、ＰＥＧ、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロース、アカシアゴム、グルコース、デキストロース（例えば、Ｄ−ブドウ糖一水化物）、少糖類（例えば、オリゴ糖）、多糖類分解物、アミノ酸、蛋白分解物等が挙げられる。この中でも特に低分子デキストラン、ヒドロキシエチルデンプン、修飾ゼラチン、遺伝子組み換え型アルブミンが好ましい。
【００２８】
本発明に用いられる電解質としては、通常、医薬用に用いられる種々の電解質を使用することができるが、一例として、ナトリウム塩（例えば、塩化ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、クエン酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、酢酸ナトリウム、グリセロリン酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、アミノ酸ナトリウム塩、プロピオン酸ナトリウム、β−ヒドロキシ酪酸ナトリウム、グルコン酸ナトリウム）、カリウム塩（例えば、塩化カリウム、酢酸カリウム、グルコン酸カリウム、炭酸水素カリウム、グリセロリン酸カリウム、硫酸カリウム、乳酸カリウム、ヨウ化カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、クエン酸カリウム、アミノ酸カリウム塩、プロピオン酸カリウム、β−ヒドロキシ酪酸カリウム）、カルシウム塩（例えば、塩化カルシウム、グルコン酸カルシウム、乳酸カルシウム、グリセロリン酸カルシウム、パントテン酸カルシウム、酢酸カルシウム）、マグネシウム塩（例えば、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、グリセロリン酸マグネシウム、酢酸マグネシウム、乳酸マグネシウム、アミノ酸マグネシウム塩）、アンモニウム塩（例えば、塩化アンモニウム）、亜鉛塩（例えば、硫酸亜鉛、塩化亜鉛、グルコン酸亜鉛、乳酸亜鉛、酢酸亜鉛）、鉄塩（例えば、硫酸鉄、塩化第一鉄、グルコン酸鉄）、銅塩（例えば、硫酸銅）、マンガン塩（例えば、硫酸マンガン）等が挙げられる。この中でも、特に塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸二水素カリウム、乳酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、酢酸カリウム、グリセロリン酸カリウム、グルコン酸カルシウム、塩化カルシウム、硫酸マグネシウム、硫酸亜鉛が好ましい。
【００２９】
本発明に用いられる糖類としては、通常、医薬用に用いられる種々の糖類を使用することができるが、一例として、グルコース、フルクトース、キシリトール、ソルビトール、マンニトール、デキストリン、グリセリン、シュクロース、トレハロース、グリセロール、マルトース、ラクトース、エリスリトール、等が挙げられる。この中、特にグルコース、フルクトース、キシリトール、ソルビトール、マンニトール、デキストリン、グリセリン、およびシュクロースが好ましい。
【００３０】
本発明に用いられるアミノ酸としては、通常、医薬用に用いられる種々のアミノ酸およびその塩を使用することができる。一例として、リジン、塩酸リジン、酢酸リジン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、トレオニン、チロシン、メチオニン、シスチン、システイン、塩酸システイン、リンゴ酸システイン、ホモシステイン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、トリプトファン、バリン、アルギニン、塩酸アルギニン、ヒスチジン、塩酸ヒスチジン、アラニン、プロリン、アミノ酢酸等およびそれらの塩等が挙げられる。この中、特にリジン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、トレオニン、チロシン、メチオニン、シスチン、システイン、ホモシステイン、アミノ酢酸が好ましい。
【００３１】
本発明の抗酸化剤としては、通常、医薬用に用いられる種々の抗酸化剤を使用することができるが、一例として、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、ピロ亜硫酸ナトリウム（例えば、メタ重亜硫酸ナトリウム）、ロンガリット（ＣＨ２ＯＨＳＯ２Ｎａ）、アスコルビン酸、アスコルビン酸ナトリウム、エリソルビン酸、エリソルビン酸ナトリウム、システイン、塩酸システイン、ホモシステイン、グルタチオン、チオグリセロール、アルファチオグリセリン、エデト酸ナトリウム、クエン酸、クエン酸イソプロピル、ジクロルイソシアヌール酸カリウム、チオグリコール酸ナトリウム、チオリンゴ酸ナトリウム、ピロ亜硫酸ナトリウム１、３−ブチレングリコール、エチレンジアミン四酢酸Ｃａ二Ｎａ、エチレンジアミン四酢酸二Ｎａ、アミノ酸亜硫酸塩（例えば、Ｌ−リジン亜硫酸塩）、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ジブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、没食子酸プロピル、アスコルビン酸パルミテート、ビタミンＥおよびその誘導体（例えばｄｌ−α−トコフェロール、酢酸トコフェロール、天然ビタミンＥ、ｄ−δ−トコフェロール、濃縮混合トコフェロール、ｔｒｏｌｏｘ）、グアヤク脂、ノルジヒドログアヤレト酸（ＮＤＧＡ）、Ｌ−アスコルビン酸ステアリン酸エステル、大豆レシチン、パルミチン酸アスコルビン酸、ベンゾトリアゾール、ペンタエリスリチル−テトラキス［３−（３、５−ジ−ｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）プロピオネート］２−メルカプトベンズイミダゾール等が挙げられる。このうち、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、アスコルビン酸、ホモシステイン、ｄｌ−α−トコフェロール、酢酸トコフェロール、グルタチオン、ｔｒｏｌｏｘが好ましい。
【００３２】
本発明において、ｐＨ調整剤としては、通常、医薬用に用いられる種々のｐＨ調整剤を使用することができる。例えば、酸としては、アジピン酸、カゼインナトリウム、塩酸、希塩酸、硫酸、硫酸アルミニウムカリウム、クエン酸、クエン酸二水素ナトリウム、グリシン、グルコノ−δ−ラクトン、グルコン酸、グルコン酸ナトリウム、結晶リン酸二水素ナトリウム、コハク酸、酢酸、酢酸アンモニウム、酒石酸、Ｄ−酒石酸、乳酸、氷酢酸、フマル酸一ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、ホウ酸、ホウ酸アンモニウム、マレイン酸、マロン酸、リンゴ酸、無水リン酸二ナトリウム、メタンスルホン酸、、リン酸、リン酸二水素塩（例えば、リン酸二水素カリウム、リン酸二水素ナトリウム）、等が挙げられる。この中、塩酸、クエン酸、コハク酸、酢酸、乳酸、氷酢酸、リン酸、リン酸二水素カリウム、リン酸二水素ナトリウムが好ましい。
アルカリとしては、アンモニア水、乾燥炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、ジイソプロパノールアミン、Ｌ−酒石酸ナトリウム、乳酸塩（例えば、乳酸カルシウム、乳酸ナトリウム）、ホウ砂、マレイン酸ナトリウム、マロン酸ナトリウム、リンゴ酸ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化ナトリウム、水酸化マグネシウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウム、トリイソプロパノールアミン、モノエタノールアミン、トリエタノールアミン、無水酢酸ナトリウム、無水リン酸一水素ナトリウム、メグルミン、リン酸塩（例えば、リン酸三ナトリウム）、バルビタールのナトリウム塩、リン酸水素塩（例えば、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素二カリウム）等が挙げられる。この中、特に酢酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウム、リン酸三ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素二カリウムが好ましい。
本発明の医薬組成物は炭酸ガスのバブリングによってｐＨが調製されていてもよい。
【００３３】
本発明に用いられる等張化剤としては、通常、医薬用に用いられる種々の等張化剤を使用することができるが、一例として、アミノエチルスルホン酸、亜硫酸水素ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化ナトリウム、塩化ベンザルコニウム、塩化マグネシウム、糖類（例えば、乳糖、濃グリセリン、ブドウ糖、果糖、キシリトール、グリセリン）、糖アルコール（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール）、クエン酸、クエン酸ナトリウム、結晶リン酸二水素ナトリウム、臭化カルシウム、臭化ナトリウム、水酸化ナトリウム、生理食塩液、酒石酸ナトリウム・二水和物、炭酸水素ナトリウム、ニコチン酸アミド、乳酸ナトリウム液、プロピレングリコール、ベンジルアルコール、ホウ酸、ホウ砂、無水ピロリン酸ナトリウム、リン酸、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸二水素ナトリウム、マクロゴール４０００、等が挙げられる。この中でも特に塩化カリウム、塩化ナトリウム、濃グリセリン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素カリウムが好ましい。
【００３４】
本発明の医薬組成物の製造方法としては、種々公知の方法を用いることができる。
ヘモグロビン内包リポソームの調製方法は、既知の方法、例えば逆相蒸発法、高圧押し出し法、マイクロフルイダイザー法などいずれも利用できる。ヘモグロビン内包リポソームの調製は、ヘモグロビンの変性を防止するために、１０℃以下の低温で行うのが望ましい。
また、ポルフィリン構造を有する金属錯体と蛋白質との複合体の調製方法は、種々公知の方法を用いることができる。一例としては、Ｅ．Ｔｓｕｃｈｉｄａ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ｖｏｌ．８，  ５３４−５３８，  １９９７に記載されたアルブミン−ヘムの調製方法等が挙げられる。
【００３５】
本発明に用いるリポソームは、種々公知の手法に従って製造することができる。ポリアルキレングリコール類と脂質の複合体を含むリポソームを製造する場合、ポリアルキレングリコール類と脂質との結合は、通常、スペーサー分子を介して行われる。スペーサー分子はポリアルキレングリコール類と脂質の両者に結合できるものであれば特に限定されないが、例えば、アミノ酸やコハク酸が挙げられる。アミノ酸としては、コア部に１つの反応性官能基を有し、２つの分岐末端にそれぞれ反応性官能基を有する三官能性アミノ酸が特に好ましく、その例を挙げると、リシン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、トレオニン、チロシン等である。その中でも、コア部に第１の反応性官能基を、２つの分岐末端に同じ第２の官能基を有する三官能性アミノ酸（１つの末端カルボキシル基と２つの末端アミノ基を有するリシン、グルタミン、アスパラギン等、あるいは１つの末端アミノ基と２つの末端カルボキシル基を有するアスパラギン酸、グルタミン酸等）がより好ましい。
【００３６】
本発明に用いるヘモグロビンは、ヒト赤血球からストローマを除去し、ヘモグロビン溶液のｐＨを７．０〜７．５に調整したものが望ましい。ヘモグロビン溶液のｐＨの調整には、水酸化ナトリウムまたは炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウムの水溶液などが用いられる。ヘモグロビン溶液に緩衝液を添加することによってｐＨの調整もできる。緩衝液として例えばＴｒｉｓ、ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＨＥＰＥＳ  、無機リン酸等の緩衝液が利用できる。遺伝子組み換え型のヘモグロビンも同様に製造することができる。
【００３７】
本発明の医薬組成物は、酸素運搬体を必要とするあらゆる分野に利用できる。例えば、虚血部位や腫瘍組織への酸素の供給、出血時の輸血のために生体内へ投与されるか、あるいは臓器保存灌流液、体外循環液または細胞培養液として使用することができる。
【００３８】
【実施例】
次に本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００３９】
［実施例１］
Ｈｂ溶液（［Ｈｂ］：４０ｇ／ｄＬ）にＨｂと３倍モル量のピリドキサール５’リン酸（以下、ＰＬＰと略す）溶液（溶媒：ＮａＯＨ水溶液）及びホモシステイン（以下、Ｈｃｙと略す）を添加した後、ｐＨ７．４に調節し、４℃下で終夜撹拌した後、０．２２μｍフィルターでろ過した（終濃度：Ｈｂ；５．９ｍｍｏｌ／Ｌ、ＰＬＰ；１７．３ｍｍｏｌ／Ｌ、Ｈｃｙ；５ｍｍｏｌ／Ｌ）。この液を脱気及びＣＯガスフローを３回繰り返すことによって、液中のＨｂをＣＯ化し、ＣＯ化Ｈｂ溶液を得た。
一方、ＤＰＰＣ／コレステロール／１，５−ジパルミトイル−Ｌ−グルタメート−Ｎ−コハク酸＝１０／１０／２（モル比率）の混合物を計２０ｇ秤量してベンゼンに溶解させた後ＰＥＧがジステアリルグルタリルエステルに結合した複合体（以下、ＰＥＧ−ＤＳＧＥと略す）を生理食塩水に溶解させ、全脂質量に対してＰＥＧ−ＤＳＧＥ濃度比率が０．３ｍｏｌ％となるように混合し、凍結乾燥し、均一に分散した脂質混合粉末を得た。この脂質混合粉末をＣＯ化Ｈｂ溶液に少量ずつ添加し、４℃下で水和し終夜撹拌した。その後、エクストルーダー（ＬＩＰＥＸ  ＢＩＯＭＥＭＢＲＡＮＥＳ，ＩＮＣ製）で０．２２μｍ粒径調整し、ＨｂＶ分散液を得た。
上記ＨｂＶ分散液に４倍量の生理食塩水を添加し、ペリコンホルダー（ミリポア社製）にて限外濾過（分子量１，０００，０００）を数回繰り返して行い、外水相中のＨｂを除去した。この時、外水相の色が透明になったことを確認した。その後、生理食塩水にて脂質濃度が２．０ｇ／ｄＬになるように濃度調節をした。ＨｂＶ分散液にＰＥＧ−ＤＳＧＥ水溶液を少量ずつ滴下した。この混合物をＣＯ雰囲気下で２時間撹拌混合（３７℃、４００ｒｐｍ）した後、４℃で終夜撹拌混合した。
撹拌後、Ｈｂ濃度が２．０ｇ／ｄＬになるように生理食塩水にて濃度調節した後、酸素フロー及び可視光照射を行い、ＨｂからＣＯを脱離させた。この液を超遠心分離にて濃縮し、下層のＨｂＶペレット層を得た。
ＨｂＶペレット層にＰｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ  ｓａｌｉｎｅ（以下、ＰＢＳと略す）を添加し、超遠心分離して洗浄した。組換え型ヒト血清アルブミン（以下、ｒＨＳＡと略す）濃度が５％になるようにｒＨＳＡを溶解したＰＢＳを下層に添加してＨｂＶ溶液２００ｍＬ（［Ｈｂ］：１０ｇ／ｄＬ、ｐＨ約７．４）を得た。
本品の膠質浸透圧は約２０ｍｍＨｇ、晶質浸透圧は約３００ｍＯｓｍであった。
また、本品の最大吸収スペクトル（Ｑ帯）は約５７５ｎｍ付近を示した。この分散液に窒素ガスを通気すると、最大吸収スペクトル（Ｑ帯）はデオキシ体に相当する約５５５ｎｍ付近を示し、酸素の可逆的吸脱着を確認した。更に、デオキシ体に酸素分圧が段階的に異なる混合ガスを通気し、３７℃における酸素親和性を測定した結果、Ｐ５０は約３２Ｔｏｒｒを示した。
【００４０】
［実施例２］
Ｈｂ溶液（［Ｈｂ］：４０ｇ／ｄＬ）にＨｂと等モル量のＰＬＰ溶液（溶媒：ＮａＯＨ水溶液）及びＨｃｙを添加した後、ｐＨ７．４に調節し、４℃下で終夜撹拌した後、０．２２μｍフィルターでろ過した（終濃度：Ｈｂ；５．９ｍｍｏｌ／Ｌ、ＰＬＰ；５．９ｍｍｏｌ／Ｌ、Ｈｃｙ；５ｍｍｏｌ／Ｌ）。この液を脱気及びＣＯガスフローを３回繰り返すことによって、液中のＨｂをＣＯ化し、ＣＯ化Ｈｂ溶液を得た。
一方、ジパルミトイルホスファチジルコリン（以下、ＤＰＰＣと略す）／コレステロール／ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（以下、ＤＰＰＧと略す）＝１０／１０／２（モル比率）の混合物を計２０ｇ秤量してベンゼンに溶解させた後、凍結乾燥し、均一に分散した脂質混合粉末を得た。この脂質混合粉末をＣＯ化Ｈｂ溶液に少量ずつ添加し、４℃下で水和し終夜撹拌した。その後、エクストルーダー（ＬＩＰＥＸ  ＢＩＯＭＥＭＢＲＡＮＥＳ，ＩＮＣ製）で０．２２μｍ粒径調整し、ＨｂＶ分散液を得た。
上記ＨｂＶ分散液に４倍量の生理食塩水を添加し、ペリコンホルダー（ミリポア社製）にて限外濾過（分子量１，０００，０００）を数回繰り返して行い、小胞体に内封されなかった外水相中のＨｂを除去した。この時、外水相の色が透明になったことを確認した。その後、生理食塩水にて脂質濃度が２．０ｇ／ｄＬになるように濃度調節をした。一方、コハク酸を介して結合したＰＥＧとジステアロイルホスファチジルエタノールアミンの複合体（ＰＥＧ−ＤＳＰＥ）を生理食塩水に溶解させ、全脂質量に対してＰＥＧ−ＤＳＰＥ濃度比率が０．３ｍｏｌ％になるように調製し、ＨｂＶ分散液にＰＥＧ−ＤＳＰＥ水溶液を少量ずつ滴下した。この混合物をＣＯ雰囲気下で２時間撹拌混合（３７℃、４００ｒｐｍ）し、４℃で終夜撹拌混合した。
撹拌後、Ｈｂ濃度が２．０ｇ／ｄＬになるように生理食塩水にて濃度調節した後、酸素フロー及び可視光照射を行い、ＨｂからＣＯを脱離させた。この液を超遠心分離にて濃縮した後、下層のＨｂＶペレット層を得た。
ＨｂＶペレット層にＰＢＳを添加し、超遠心分離して洗浄した。ｒＨＳＡ濃度が５％になるようにｒＨＳＡを溶解したＰＢＳを下層に添加してＨｂＶ溶液２００ｍＬ（［Ｈｂ］：１０ｇ／ｄＬ、ｐＨ約７．４）を得た。
本品の膠質浸透圧は約２０ｍｍＨｇ、晶質浸透圧は約３００ｍＯｓｍであった。
また、本品の最大吸収スペクトル（Ｑ帯）は約５７５ｎｍ付近を示した。この分散液に窒素ガスを通気すると、最大吸収スペクトル（Ｑ帯）はデオキシ体に相当する約５５５ｎｍ付近を示し、酸素の可逆的吸脱着を確認した。更に、デオキシ体に酸素分圧が段階的に異なる混合ガスを通気し、３７℃における酸素親和性を測定した結果、Ｐ５０は約１８Ｔｏｒｒを示した。
【００４１】
［実施例３］
Ｈｂ溶液（［Ｈｂ］：４０ｇ／ｄＬ）にＨｂの３倍モル量のＰＬＰ溶液（溶媒：ＮａＯＨ水溶液）を添加した後、ｐＨ７．４に調節し、４℃下で終夜撹拌した後、０．２２μｍフィルターでろ過した（終濃度：Ｈｂ；５．９ｍｍｏｌ／Ｌ、ＰＬＰ；１７．３ｍｍｏｌ／Ｌ、Ｈｃｙ；５ｍｍｏｌ／Ｌ）。この液を脱気及びＣＯガスフローを３回繰り返すことによって、液中のＨｂをＣＯ化し、ＣＯ化Ｈｂ溶液を得た。
一方、ＤＰＰＣ／コレステロール／１，５−ジパルミトイル−Ｌ−グルタメート−Ｎ−コハク酸＝１０／１０／２（モル比率）の混合物を計２０ｇ秤量してベンゼンに溶解させた後ＰＥＧがジステアリルグルタリルエステルに結合した複合体（以下、ＰＥＧ−ＤＳＧＥと略す）を生理食塩水に溶解させ、全脂質量に対してＰＥＧ−ＤＳＧＥ濃度比率が０．３ｍｏｌ％となるように混合し、凍結乾燥し、均一に分散した脂質混合粉末を得た。この脂質混合粉末をＣＯ化Ｈｂ溶液に少量ずつ添加し、４℃下で水和し終夜撹拌した。その後、エクストルーダー（ＬＩＰＥＸ  ＢＩＯＭＥＭＢＲＡＮＥＳ，ＩＮＣ製）で０．２２μｍ粒径調整し、ＨｂＶ分散液を得た。
上記ＨｂＶ分散液に４倍量の生理食塩水を添加し、ペリコンホルダー（ミリポア社製）にて限外濾過（分子量１，０００，０００）を数回繰り返して行い、外水相中のＨｂを除去した。この時、外水相の色が透明になったことを確認した。その後、生理食塩水にて脂質濃度が２．０ｇ／ｄＬになるように濃度調節をした。ＨｂＶ分散液にＰＥＧ−ＤＳＧＥ水溶液を少量ずつ滴下した。この混合物をＣＯ雰囲気下で２時間撹拌混合（３７℃、４００ｒｐｍ）した後、４℃で終夜撹拌混合した。
撹拌後、Ｈｂ濃度が２．０ｇ／ｄＬになるように生理食塩水にて濃度調節した後、酸素フロー及び可視光照射を行い、ＨｂからＣＯを脱離させた。この液を超遠心分離にて濃縮し、下層のＨｂＶペレット層を得た。
ＨｂＶペレット層に生理食塩水を添加し、超遠心分離して洗浄した。ｒＨＳＡ濃度が５％になるようにｒＨＳＡを溶解した生理食塩水を下層に添加してＨｂＶ溶液２００ｍＬ（［Ｈｂ］：８．６ｇ／ｄＬ、ｐＨ約７．４）を得た。
本品の膠質浸透圧は約２０ｍｍＨｇ、晶質浸透圧は約３００ｍＯｓｍであった。
また、本品の最大吸収スペクトル（Ｑ帯）は約５７５ｎｍ付近を示した。この分散液に窒素ガスを通気すると、最大吸収スペクトル（Ｑ帯）はデオキシ体に相当する約５５５ｎｍ付近を示し、酸素の可逆的吸脱着を確認した。更に、デオキシ体に酸素分圧が段階的に異なる混合ガスを通気し、３７℃における酸素親和性を測定した結果、Ｐ５０は約３２Ｔｏｒｒを示した。
【００４２】
［実施例４］
Ｈｂ溶液（［Ｈｂ］：４０ｇ／ｄＬ）にＨｂと等モル量のＰＬＰ溶液（溶媒：ＮａＯＨ水溶液）及びＨｃｙを添加した後、ｐＨ７．４に調節し、４℃下で終夜撹拌した後、０．２２μｍフィルターでろ過した（終濃度：Ｈｂ；５．９ｍｍｏｌ／Ｌ、ＰＬＰ；５．９ｍｍｏｌ／Ｌ、Ｈｃｙ；５ｍｍｏｌ／Ｌ）。この液を脱気及びＣＯガスフローを３回繰り返すことによって、液中のＨｂをＣＯ化し、ＣＯ化Ｈｂ溶液を得た。
一方、ＤＰＰＣ／コレステロール／ＤＰＰＧ＝１０／１０／２（モル比率）の混合物を計２０ｇ秤量してベンゼンに溶解させた後、凍結乾燥し、均一に分散した脂質混合粉末を得た。この脂質混合粉末をＣＯ化Ｈｂ溶液に少量ずつ添加し、４℃下で水和し終夜撹拌した。その後、エクストルーダー（ＬＩＰＥＸ  ＢＩＯＭＥＭＢＲＡＮＥＳ，ＩＮＣ製）で０．２２μｍ粒径調整し、ＨｂＶ分散液を得た。
上記ＨｂＶ分散液に４倍量の生理食塩水を添加し、ペリコンホルダー（ミリポア社製）にて限外濾過（分子量１，０００，０００）を数回繰り返して行い、小胞体に内封されなかった外水相中のＨｂを除去した。この時、外水相の色が透明になったことを確認した。その後、生理食塩水にて脂質濃度が２．０ｇ／ｄＬになるように濃度調節をした。一方、コハク酸を介して結合したＰＥＧとジステアロイルホスファチジルエタノールアミンの複合体（ＰＥＧ−ＤＳＰＥ）を生理食塩水に溶解させ、全脂質量に対してＰＥＧ−ＤＳＰＥ濃度比率が０．３ｍｏｌ％になるように調製し、ＨｂＶ分散液にＰＥＧ−ＤＳＰＥ水溶液を少量ずつ滴下した。この混合物をＣＯ雰囲気下で２時間撹拌混合（３７℃、４００ｒｐｍ）し、４℃で終夜撹拌混合した。
撹拌後、Ｈｂ濃度が２．０ｇ／ｄＬになるように生理食塩水にて濃度調節した後、酸素フロー及び可視光照射を行い、ＨｂからＣＯを脱離させた。この液を超遠心分離にて濃縮した後、下層のＨｂＶペレット層を得た。
ＨｂＶペレット層に生理食塩水を添加し、超遠心分離して洗浄した。組換え型ヒト血清アルブミン（以下、ｒＨＳＡと略す）濃度が５％になるようにｒＨＳＡを溶解した生理食塩水を下層に添加してＨｂＶ溶液２００ｍＬ（［Ｈｂ］：８．６ｇ／ｄＬ、ｐＨ約７．４）を得た。
本品の膠質浸透圧は約２０ｍｍＨｇ、晶質浸透圧は約３００ｍＯｓｍであった。
また、本品の最大吸収スペクトル（Ｑ帯）は約５７５ｎｍ付近を示した。この分散液に窒素ガスを通気すると、最大吸収スペクトル（Ｑ帯）はデオキシ体に相当する約５５５ｎｍ付近を示し、酸素の可逆的吸脱着を確認した。更に、デオキシ体に酸素分圧が段階的に異なる混合ガスを通気し、３７℃における酸素親和性を測定した結果、Ｐ５０は約１８Ｔｏｒｒを示した。
【００４３】
［実験例１］
実施例３で製造されたＨｂＶ溶液を用いて出血性ショックからの蘇生試験を行い、血圧、血液ガス組成から酸素運搬機能を有する輸液としての効果を評価した。Ｗｉｓｔａｒ系ラット（雄，約２５０ｇ）に対し、セボフルレン吸入麻酔自発呼吸下、頸動静脈に挿管、頸動脈より循環血液量の５０％を脱血した。１５分間放置した後、頸静脈より蘇生液を投与し、６時間観察した。蘇生液としては、実施例３で得られたＨｂＶを５％ｒＨＳＡ水溶液に分散させた溶液（以下、ＨｂＶ／ｒＨＳＡ）、実施例３と同様にして得られるＨｂＶを生理食塩水に分散させた溶液（以下、ＨｂＶ／ｓａｌｉｎｅ）、あるいは、へパリン加脱血液をそのまま用いた。
脱血前約１００ｍｍＨｇの血圧は脱血後３０ｍｍＨｇに低下し（図１）、動脈血酸素分圧（以下、ＰａＯ２）は７９Ｔｏｒｒから１０３Ｔｏｒｒに上昇（図２）、乳酸は１．９ｍＭから７．２ｍＭへの顕著な上昇（図３）が認められた。ＨｂＶ／ｒＨＳＡ投与群では血圧が投与直後に９５ｍｍＨｇにまで回復し、これは脱血液投与群と同等であり、６時間保持された（図１）。血液ガス組成も同様に回復し、ＰａＯ２７３Ｔｏｒｒ（図２）、乳酸値１．８ｍＭ（図３）となった。一方、ＨｂＶ／ｓａｌｉｎｅでは、血圧は８８ｍｍＨｇにまで回復した（図１）が乳酸値は３．１ｍＭに留まり（図３）回復せず、二匹とも６時間経過を待たずに死亡した。
ＨｂＶ／ｒＨＳＡの膠質浸透圧は２０Ｔｏｒｒであるのに対し、ＨｂＶ／ｓａｌｉｎｅの膠質浸透圧は０Ｔｏｒｒであった。
以上の結果から、特に出血ショック蘇生のように循環血液量の回復が重要な場合は、血漿増量剤の併用が必須であることが明らかとなった。
【００４４】
［実施例５］
ポルフィリン鉄錯体（２−［８−｛Ｎ−（２−メチルイミダゾリル）｝オクタノイロキシメチル］−５，１０，１５，２０−テトラキス（α，α，α，α−ｏ−ピバロイルアミノ）フェニルポルフィナト鉄（ＩＩ））をエタノールに溶解し、Ｌ−アスコルビン酸溶液を添加し、中心鉄を還元させた後、一酸化炭素ガスを通気してポルフィリン鉄錯体を一酸化炭素錯体に転化させた．これを、リン酸緩衝液で希釈した遺伝子組換ヒト血清アルブミンに加えて混合し、ポルフィリン鉄錯体をアルブミンに包接させた。これを、リン酸緩衝液を用いて定容量限外ろ過透析を行い、混合液中のエタノールを除去し、濃縮を行った。得られた液に塩化ナトリウムを加え、塩濃度を１４０ｍＭになるように調整し、ポルフィリン鉄錯体−アルブミン包接化合物の分散液（ｐＨ７．３、アルブミン濃度５ｗ／ｖ％）を得た。この分散液の膠質浸透圧は約２０ｍｍＨｇ、晶質浸透圧は約３００ｍＯｓｍであった。
この分散液を酸素置換しながら氷浴中で光照射すると、オキシ体が得られ、最大吸収スペクトルは４２１ｎｍを示した。この分散液に窒素ガスを通気すると、最大吸収スペクトルはデオキシ体に相当する４４１ｎｍを示し、酸素の可逆的吸脱着を確認した。更に、デオキシ体に酸素分圧が段階的に異なる混合ガスを通気し、３７℃における酸素親和性を測定した結果、Ｐ５０は３３Ｔｏｒｒを示した。
【００４５】
［実施例６］
ポルフィリン鉄錯体（２−［８−｛Ｎ−（２−メチルイミダゾリル）｝オクタノイロキシメチル］−５，１０，１５，２０−テトラキス｛α，α，α，α−ｏ−（１−メチルシクロヘキサノイル）アミノ｝フェニルポルフィナト鉄（ＩＩ））をエタノールに溶解し、Ｌ−アスコルビン酸溶液を添加し、中心鉄を還元させた後、一酸化炭素ガスを通気してポルフィリン鉄錯体を一酸化炭素錯体に転化させた。これを、リン酸緩衝液で希釈した遺伝子組換ヒト血清アルブミンに加え、混合し、ポルフィリン鉄錯体をアルブミンに包接させた。これを、リン酸緩衝液（ｐＨ７．３）を用いて定容量限外ろ過透析を行い、混合液中のエタノールを除去し、濃縮を行った。得られた液に塩化ナトリウムを加え、塩濃度を１４０ｍＭになるように調整し、ポルフィリン鉄錯体−アルブミン包接化合物の分散液（ｐＨ７．３、アルブミン濃度５ｗ／ｖ％）を得た。この分散液の膠質浸透圧は約２０ｍｍＨｇ、晶質浸透圧は約３００ｍＯｓｍであった。
この分散液を酸素置換しながら、氷浴中で光照射すると、オキシ体が得られ、最大吸収スペクトルは４２４ｎｍを示した。この分散液に窒素ガスを通気すると、最大吸収スペクトルはデオキシ体に相当する４４３ｎｍを示し、酸素の可逆的吸脱着を確認した。更に、デオキシ体に酸素分圧が段階的に異なる混合ガスを通気し、３７℃における酸素親和性を測定した結果、Ｐ５０は３５Ｔｏｒｒを示した。
【００４６】
［実験例２］
実施例５及び６のポルフィリン鉄錯体−アルブミン包接化合物について、低酸素状態の細胞及び組織に対する酸素供給能を動物実験により評価した。Ｗｉｓｔｅｒ  ＩＧＳ系雄性ラット（体重２７５〜３１５ｇ）をセボフルラン麻酔下、右総頸動脈内にカテーテルを挿入し、脱血及び動脈血採血のルートとした。左大腿部を切開し、左大腿動脈内にカテーテルを挿入し、血圧の測定ルートとした。右大腿部を切開し、右大腿動脈内にカテーテルを挿入し、被験物質あるいは対照物質の投与及び静脈血採血のルートとした。腹部を切開し、腎皮質に酸素電極（インターメディカル（株）製、ＰＯＥ−４０ＰＳ）を刺入した。このラットの血液交換を行い、全血液量の７０％を５％ｒＨＳＡ溶液に交換した。血液交換終了後、右総頸動脈より推定総血液量（５６ｍＬ／ｋｇ体重として換算）の３０％に相当する量の脱血を行った。脱血後、直ちに脱血量と等量の被験物質（実施例５及び６のポルフィリン鉄錯体−アルブミン包接化合物の分散液）あるいは対照物質（５％ｒＨＳＡ溶液、脱血液の返血）を投与し、投与２時間後までの経過観察及び生死判定を行った。平均血圧は、圧用アンプを介しポリグラフシステム（日本光電工業（株）製、ＬＥＧ−１０００、Ｖｅｒ．０１−０２）を用いて測定した。組織酸素分圧は、組織酸素分圧測定装置（インターメディカル（株）製、ＰＯ２−１００ＤＷ）を用い、腎皮質に刺入した酸素電極より静脈血酸素分圧を測定した。平均血圧測定結果を図４に示す。平均血圧は、アルブミン群、返血群、実施例５のポルフィリン鉄錯体−アルブミン包接化合物の分散液（以下、ｐｉｖ群）及び実施例６のポルフィリン鉄錯体−アルブミン包接化合物の分散液（以下、ｃｙｃ群）それぞれについて測定を行った。まず、７０％血液を５％ｒＨＳＡに交換することにより平均血圧は初期値の約８０％まで低下した。さらに、３０％の脱血により約２５％まで低下した。その後、アルブミン群では、アルブミンを投与しても血圧上昇は認められなかったが、返血群では、返血により脱血直前の約１１０％まで血圧が上昇した。ｃｙｃ群及びｐｉｖ群では、被験物質の投与により脱血直前の約８５％まで血圧が上昇した。
静脈血酸素分圧測定結果を図５に示す。静脈血酸素分圧は、アルブミン群、返血群、ｃｙｃ群及びｐｉｖ群それぞれについて測定を行った。まず、７０％血液交換により静脈血酸素分圧は初期値の約９０％まで低下した。さらに、３０％の脱血により約６０％まで低下した。その後、アルブミン群では、アルブミンを投与しても酸素分圧上昇は認められなかったが、返血群、ｃｙｃ群及びｐｉｖ群では、被験物質投与により脱血直前の約１１０％まで酸素分圧が上昇した。
【００４７】
【発明の効果】
上述のように、本発明の人工血液は、酸素運搬能と膠質浸透圧（血漿増量効果）の両方を兼ね備え、特に大量出血患者の救命等に有効である。
また、本発明の人工血液では、晶質浸透圧、電解質バランス、ｐＨを生体が許容しうる範囲に調整してなるため、溶血毒性等を回避することができる。
本発明において、ヘモグロビン内包リポソームまたはポルフィリン構造を有する金属錯体とアルブミンとの複合体からなる酸素運搬体を用いることによって、赤血球と同等もしくはそれ以上の酸素運搬効率を有する医薬組成物を調製できる。
また、非リン脂質型脂質とポリアルキレングリコール類との複合体を含むリポソームを用いることによって、分子間相互作用を利用して、水溶性高分子を安定にリポソーム表面に固定でき、かつその機能を損なうことなく担持できる。
さらに、遺伝子組み換え型アルブミンあるいはヘモグロビンを用いることによって、生体由来の感染症などの恐れがない安全な医薬組成物を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の血圧降下に対する改善作用を示すグラフである。
【図２】本発明の動脈血酸素分圧増加に対する改善作用を示すグラフである。
【図３】本発明の乳酸値に対する改善作用を示すグラフである。
【図４】本発明の血圧降下に対する改善作用を示すグラフである。
【図５】本発明の静脈血酸素分圧低下に対する改善作用を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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