(57)【要約】【課題】高精度なピロリン酸の検知・定量方法を提供すること、また、該ピロリン酸の検知・定量方法を利用した各種核酸増幅法による核酸の検知・定量方法及び該方法に有用な試薬キットを提供すること。【解決手段】ピロリン酸を含む溶液に、キサンチンデヒドロゲナーゼ／オキシダーゼを作用させ、前記溶液に予め含有されているヒポキサンチンおよび／またはキサンチンを除去する工程と、イノシン酸および／またはキサンチル酸およびヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼを作用させ、ピロリン酸をヒポキサンチンおよび／またはキサンチンに変換する工程と、テトラゾリウム塩およびキサンチンデヒドロゲナーゼ／オキシダーゼを作用させ、生成するヒポキサンチンおよび／またはキサンチンをホルマザンに変換する工程と、生成するホルマザンを検知・定量する工程とを具備することを特徴とする、ピロリン酸の検知・定量方法。【選択図】    図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ピロリン酸を含む溶液に、キサンチンデヒドロゲナーゼ／オキシダーゼを作用させ、前記溶液に予め含有されているヒポキサンチンおよび／またはキサンチンを除去する工程と、イノシン酸および／またはキサンチル酸およびヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼを作用させ、ピロリン酸をヒポキサンチンおよび／またはキサンチンに変換する工程と、テトラゾリウム塩およびキサンチンデヒドロゲナーゼ／オキシダーゼを作用させ、生成するヒポキサンチンおよび／またはキサンチンをホルマザンに変換する工程と、生成するホルマザンを検知・定量する工程とを具備することを特徴とする、ピロリン酸の検知・定量方法。
【請求項２】
ピロリン酸を含む溶液に、イノシン酸および／またはキサンチル酸とキサンチンデヒドロゲナーゼ／オキシダーゼとを添加する工程と、テトラゾリウム塩およびヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼを添加する工程とを具備することを特徴とする、ピロリン酸の検知・定量方法。
【請求項３】
ピロリン酸を含む溶液に、キサンチンデヒドロゲナーゼ／オキシダーゼを作用させ、前記溶液に予め含有されているヒポキサンチンおよび／またはキサンチンを除去する工程と、イノシン酸および／またはキサンチル酸およびヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼを作用させ、ピロリン酸をヒポキサンチンおよび／またはキサンチンに変換する工程と、スーパーオキシドアニオンを検出する化学発光試薬およびキサンチンデヒドロゲナーゼ／オキシダーゼを作用させ、生成するヒポキサンチンおよび／またはキサンチンから発光を生じさせる工程と、生成する発光を検知・定量する工程とを具備することを特徴とする、ピロリン酸の検知・定量方法。
【請求項４】
ピロリン酸を含む溶液に、イノシン酸および／またはキサンチル酸、とキサンチンデヒドロゲナーゼ／オキシダーゼとを添加する工程と、スーパーオキシドアニオンを検出する化学発光試薬およびヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼを添加する工程とを具備することを特徴とする、ピロリン酸の検知・定量方法。
【請求項５】
ピロリン酸を含む溶液に、キサンチンデヒドロゲナーゼ／オキシダーゼを作用させ、前記溶液に予め含有されているヒポキサンチンおよび／またはキサンチンを除去する工程と、イノシン酸および／またはキサンチル酸およびヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼを作用させ、ピロリン酸をヒポキサンチンおよび／またはキサンチンに変換する工程と、スーパーオキシドアニオンを検出する蛍光試薬およびキサンチンデヒドロゲナーゼ／オキシダーゼを作用させ、生成するヒポキサンチンおよび／またはキサンチンから蛍光物質を生じさせる工程と、生成する蛍光物質を検知・定量する工程とを具備することを特徴とする、ピロリン酸の検知・定量方法。
【請求項６】
ピロリン酸を含む溶液に、イノシン酸および／またはキサンチル酸およびキサンチンデヒドロゲナーゼ／オキシダーゼを添加する工程と、スーパーオキシドアニオンを検出する蛍光試薬およびヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼを添加する工程とを具備することを特徴とする、ピロリン酸の検知・定量方法。
【請求項７】
核酸の検知・定量方法であって、試料溶液中の核酸を増幅する工程と、前記増幅後の試料溶液に含有されるピロリン酸を請求項１乃至６のいずれか１項に記載の方法を用いて検知・定量する工程とを含むことを特徴とする、核酸の検知・定量方法。
【請求項８】
９５℃以上の温度を加えても酵素活性を失わないヒポキサンチングアニンホスホリボシルおよび／またはキサンチンデヒドロゲナーゼ／オキシダーゼを使用することを特徴とする、請求項１乃至６のいずれか１項に記載のピロリン酸の検知・定量方法。
【請求項９】
９５℃以上の温度を加えても酵素活性を失わないヒポキサンチングアニンホスホリボシルおよび／またはキサンチンデヒドロゲナーゼ／オキシダーゼを使用することを特徴とする、請求項７に記載の核酸の検知・定量方法。
【請求項１０】
請求項１または２に記載のピロリン酸の検知・定量方法に有用な試薬キットであって、ピロリン酸とイノシン酸および／またはキサンチル酸とテトラゾリウム塩とヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼとキサンチンデヒドロゲナーゼ／オキシダーゼとを、各々単独で含有する試薬として、またはいずれか２種以上の混合試薬として含む試薬キット。
【請求項１１】
請求項３または４に記載のピロリン酸の検知・定量方法に有用な試薬キットであって、ピロリン酸とイノシン酸および／またはキサンチル酸とスーパーオキサイドアニオンを検出する化学発光試薬とヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼとキサンチンデヒドロゲナーゼ／オキシダーゼとを、各々単独で含有する試薬として、またはいずれか２種以上の混合試薬として含む試薬キット。
【請求項１２】
請求項５または６に記載のピロリン酸の検知・定量方法に有用な試薬キットであって、ピロリン酸とイノシン酸および／またはキサンチル酸とスーパーオキサイドアニオンを検出する蛍光試薬とヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼとキサンチンデヒドロゲナーゼ／オキシダーゼとを、各々単独で含有する試薬として、またはいずれか２種以上の混合試薬として含む試薬キット。
【請求項１３】
標的とする核酸の検知・定量に有用な試薬キットであって、請求項１０乃至１２のいずれか一項記載の試薬キットに加え、さらに核酸を増幅するために必要な試薬を含む試薬キット。
【請求項１４】
請求項１または２に記載のピロリン酸の検知・定量方法に有用な試薬キットであって、ピロリン酸とイノシン酸および／またはキサンチル酸とテトラゾリウム塩とヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼとキサンチンデヒドロゲナーゼ／オキシダーゼとが固定された試薬支持体を含む試薬キット。
【請求項１５】
請求項３または４に記載のピロリン酸の検知・定量方法に有用な試薬キットであって、ピロリン酸とイノシン酸および／またはキサンチル酸とスーパーオキサイドアニオンを検出する化学発光試薬とヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼとキサンチンデヒドロゲナーゼ／オキシダーゼとが固定された試薬支持体を含む試薬キット。
【請求項１６】
請求項５または６に記載のピロリン酸の検知・定量方法に有用な試薬キットであって、ピロリン酸とイノシン酸および／またはキサンチル酸とスーパーオキサイドアニオンを検出する蛍光試薬とヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼとキサンチンデヒドロゲナーゼ／オキシダーゼとが固定された試薬支持体を含む試薬キット。
【請求項１７】
前記試薬支持体にさらに核酸を増幅するために必要な試薬が固定されている請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ピロリン酸の検知・定量方法に関するものである。本発明はまた、該ピロリン酸の検知・定量方法を利用した核酸の検知・定量方法であって、詳しくはポリメラーゼ連鎖反応を含む種々の核酸増幅方法を用いて特定核酸領域を増幅したときに生成するピロリン酸を検知・定量することにより核酸を検知・定量する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ピロリン酸は生体内に存在する種々の酵素反応により遊離する物質である。そのため、ピロリン酸の各種測定方法が開発されている。そのうち、より簡便な方法として、ピロリン酸をアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）スルフリラーゼでＡＴＰに変換し、生成したＡＴＰを測定する方法や（例えば、非特許文献１参照。）、ピロリン酸を無機ピロフォスファターゼでリン酸に分解し、生成したリン酸を測定する方法（例えば、非特許文献２参照。）が汎用されている。更に、これら以外にもピロリン酸の測定方法に関しては様々な技術が報告されている（例えば、非特許文献３−５参照。）。
【０００３】
ピロリン酸を遊離する酵素反応の１つである核酸ポリメラーゼは、特定塩基配列を連続的に増幅させることにより、微量の核酸を検出する核酸増幅技術に利用されている。例えば、ポリメラーゼチェーンリアクション法（ＰＣＲ法）は、核酸分子中の特定核酸領域を試験管内で数百万倍にも増幅するものであり、該ＰＣＲ法に関しては様々な技術が開示されている（例えば、特許文献１−３参照。）。このＰＣＲ法を利用することにより、標的核酸の特定核酸領域を増幅された状態で検出することが可能となっている。
【０００４】
そして、この増幅された特定核酸領域の一般的な検出方法として、ＰＣＲ終了後の反応溶液をアガロース電気泳動により、分離した後染色し、バンドの大きさ（分子量）で判別する方法や、前記反応溶液をドットハイブリダイゼーション法により検出する方法が行われている。この検出方法は、試料中のＤＮＡを直接増幅して検出できるため、検査時間が短くかつ遺伝子の同定が容易であるという特徴を有する。しかし複雑でかつ時間のかかる電気泳動工程は、現場での利用については不便な点が多い。
【０００５】
電気泳動を行うことなく、ＰＣＲ生成物を検出および定量する方法として、ＰＣＲ開始前の反応液に予め、ＤＮＡとインターカレートしたときのみ蛍光を発する試薬を添加し、蛍光分光光度計を使用して蛍光強度を測定することにより、増幅ＤＮＡ量を測定する方法などがある（例えば、特許文献４参照。）。標的核酸の初期鋳型量は、インターカレーター性蛍光色素の存在下でＰＣＲを行い、反応液の蛍光を各ＰＣＲサイクル毎に測定してその変化から求めることができる。しかしこのような目的のために設計された蛍光強度を各サイクル毎に測定するための装置は高価であるという欠点を有する。またＤＮＡとインターカレートする試薬は生体にとって有害である。
【０００６】
ＤＮＡとのインターカレート試薬を用いない方法としては、例えば、ＰＣＲによる核酸増幅過程で生成する副生成物のピロリン酸を、ＡＴＰスルフリラーゼの作用でＡＴＰに導き、該ＡＴＰをさらにルシフェリン−ルシフェラーゼ法で発光させ、検出することによりピロリン酸を検出する方法が報告されている（例えば、特許文献５、非特許文献６、７参照。）。
【０００７】
また、ピロリン酸を無機ピロフォスファターゼを用いて分解した生成物であるリン酸を検出することにより標的とする遺伝子核酸を検出する方法が報告されている（例えば、特許文献６、非特許文献８、９参照。）。
【０００８】
さらに、ピロリン酸をヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼを用いてヒポキサンチンに変換し、該ヒポキサンチンをキサンチンデヒドロゲナーゼ／オキシダーゼを用いて、ホルマザン、過酸化水素もしくはスーパーオキサイドアニオンに変換しこれらを検出する方法が報告されている（例えば、特許文献７、非特許文献１０参照。）。
【０００９】
【特許文献１】
米国特許第４，６８３，１９５号明細書
【００１０】
【特許文献２】
米国特許第４，６８３，２０２号明細書
【００１１】
【特許文献３】
米国特許第４，９６５，１８８号明細書
【００１２】
【特許文献４】
特開平５−２３７０００号公報
【００１３】
【特許文献５】
国際公開第９２／１６６５４号パンフレット
【００１４】
【特許文献６】
特開平７−５９６００号公報
【００１５】
【特許文献７】
特願２００１−３７７２２９号公報
【００１６】
【非特許文献１】
「アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌｙｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、１９８５年、第１５１巻、ｐ．５０４−５０９
【００１７】
【非特許文献２】
「アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌｙｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、１９９７年、第２５４巻、ｐ．１８−２２
【００１８】
【非特許文献３】
「アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌｙｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、１９７９年、第９４巻、ｐ．１１７−１２０
【００１９】
【非特許文献４】
「バイオケミカル・ジャーナル（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ）」、１９８５年、第２３０巻、ｐ．２５５−２６０
【００２０】
【非特許文献５】
「アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌｙｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、１９９６年、第２４３巻、ｐ．４１−４５
【００２１】
【非特許文献６】
「ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッド（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ）」、１９９２年、第１５６巻、ｐ．５５−６０
【００２２】
【非特許文献７】
「アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌｙｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、２００１年、第２８８巻、ｐ．２８−３８
【００２３】
【非特許文献８】
「アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌｙｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、１９９７年、第２５４巻、ｐ．１８−２２
【００２４】
【非特許文献９】
「バイオ・テクニクス（Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）」、１９９８年、第２５巻、ｐ．６０８−６１４
【００２５】
【非特許文献１０】
「日本食品科学工学会第４９回大会講演集」、２００２年８月２９日発行、ｐ．１１９
【００２６】
【発明が解決しようとする課題】
上述した従来のピロリン酸の測定方法は、いずれもピロリン酸をＡＴＰ、リン酸もしくはヒポキサンチンに誘導して検出するため、生体内に存在するそれらの物質がバックグラウンドとして検出される可能性が高い。リン酸は食品、培地、酵素抽出用緩衝液などに多く利用され、ＡＴＰは、細菌などの生体に常に存在し、除去することが困難な物質である。更にＡＴＰはアセチルコエンザイムＡシンテターゼのような多くの酵素反応の基質となるため、ある種の酵素反応の活性測定には利用することができない。また、ヒポキサンチンは鮮度の悪い魚介類などに存在する場合がある。
【００２７】
本発明は以上のような問題点に鑑み創案されたものであり、高精度なピロリン酸の検知・定量方法を提供すること、また、該ピロリン酸の検知・定量方法を利用した各種核酸増幅法による核酸の検知・定量方法及び該方法に有用な試薬キットを提供することを目的とする。
【００２８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼおよびキサンチンデヒドロゲナーゼ／オキシダーゼを用いたピロリン酸の検知・定量方法において、その酵素および試薬類の添加順序を変えることで、バックグラウンド物質の影響を受けることなく、ピロリン酸量を測定できることが可能になることを新たに見出した。この方法を用いてピロリン酸を検知・定量することにより、安定且つ高精度にピロリン酸を検知・定量し得、更に該ピロリン酸の検知・定量方法が各種核酸増幅法による核酸の検知・定量に極めて有用であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００２９】
すなわち、本発明は下記構成を有するものである。
【００３０】
（１）  ピロリン酸を含む溶液に、キサンチンデヒドロゲナーゼ／オキシダーゼを作用させ、前記溶液に予め含有されているヒポキサンチンおよび／またはキサンチンを除去する工程と、イノシン酸および／またはキサンチル酸およびヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼを作用させ、ピロリン酸をヒポキサンチンおよび／またはキサンチンに変換する工程と、テトラゾリウム塩およびキサンチンデヒドロゲナーゼ／オキシダーゼを作用させ、生成するヒポキサンチンおよび／またはキサンチンをホルマザンに変換する工程と、生成するホルマザンを検知・定量する工程とを具備することを特徴とする、ピロリン酸の検知・定量方法。
【００３１】
（２）  ピロリン酸を含む溶液に、イノシン酸および／またはキサンチル酸とキサンチンデヒドロゲナーゼ／オキシダーゼとを添加する工程と、テトラゾリウム塩およびヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼを添加する工程とを具備することを特徴とする、ピロリン酸の検知・定量方法。
【００３２】
（３）  ピロリン酸を含む溶液に、キサンチンデヒドロゲナーゼ／オキシダーゼを作用させ、前記溶液に予め含有されているヒポキサンチンおよび／またはキサンチンを除去する工程と、イノシン酸および／またはキサンチル酸およびヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼを作用させ、ピロリン酸をヒポキサンチンおよび／またはキサンチンに変換する工程と、スーパーオキシドアニオンを検出する化学発光試薬およびキサンチンデヒドロゲナーゼ／オキシダーゼを作用させ、生成するヒポキサンチンおよび／またはキサンチンから発光を生じさせる工程と、生成する発光を検知・定量する工程とを具備することを特徴とする、ピロリン酸の検知・定量方法。
【００３３】
（４）  ピロリン酸を含む溶液に、イノシン酸および／またはキサンチル酸、とキサンチンデヒドロゲナーゼ／オキシダーゼとを添加する工程と、スーパーオキシドアニオンを検出する化学発光試薬およびヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼを添加する工程とを具備することを特徴とする、ピロリン酸の検知・定量方法。
【００３４】
（５）  ピロリン酸を含む溶液に、キサンチンデヒドロゲナーゼ／オキシダーゼを作用させ、前記溶液に予め含有されているヒポキサンチンおよび／またはキサンチンを除去する工程と、イノシン酸および／またはキサンチル酸およびヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼを作用させ、ピロリン酸をヒポキサンチンおよび／またはキサンチンに変換する工程と、スーパーオキシドアニオンを検出する蛍光試薬およびキサンチンデヒドロゲナーゼ／オキシダーゼを作用させ、生成するヒポキサンチンおよび／またはキサンチンから蛍光物質を生じさせる工程と、生成する蛍光物質を検知・定量する工程とを具備することを特徴とする、ピロリン酸の検知・定量方法。
【００３５】
（６）  ピロリン酸を含む溶液に、イノシン酸および／またはキサンチル酸およびキサンチンデヒドロゲナーゼ／オキシダーゼを添加する工程と、スーパーオキシドアニオンを検出する蛍光試薬およびヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼを添加する工程とを具備することを特徴とする、ピロリン酸の検知・定量方法。
【００３６】
（７）  核酸の検知・定量方法であって、試料溶液中の核酸を増幅する工程と、前記増幅後の試料溶液に含有されるピロリン酸を（１）乃至（６）のいずれか１項に記載の方法を用いて検知・定量する工程とを含むことを特徴とする、核酸の検知・定量方法。
【００３７】
（８）  ９５℃以上の温度を加えても酵素活性を失わないヒポキサンチングアニンホスホリボシルおよび／またはキサンチンデヒドロゲナーゼ／オキシダーゼを使用することを特徴とする、（１）乃至（６）のいずれか１項に記載のピロリン酸の検知・定量方法。
【００３８】
（９）  ９５℃以上の温度を加えても酵素活性を失わないヒポキサンチングアニンホスホリボシルおよび／またはキサンチンデヒドロゲナーゼ／オキシダーゼを使用することを特徴とする、（７）に記載の核酸の検知・定量方法。
【００３９】
（１０）  （１）または（２）に記載のピロリン酸の検知・定量方法に有用な試薬キットであって、ピロリン酸とイノシン酸および／またはキサンチル酸とテトラゾリウム塩とヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼとキサンチンデヒドロゲナーゼ／オキシダーゼとを、各々単独で含有する試薬として、またはいずれか２種以上の混合試薬として含む試薬キット。
【００４０】
（１１）  （３）または（４）に記載のピロリン酸の検知・定量方法に有用な試薬キットであって、ピロリン酸とイノシン酸および／またはキサンチル酸とスーパーオキサイドアニオンを検出する化学発光試薬とヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼとキサンチンデヒドロゲナーゼ／オキシダーゼとを、各々単独で含有する試薬として、またはいずれか２種以上の混合試薬として含む試薬キット。
【００４１】
（１２）  （５）または（６）に記載のピロリン酸の検知・定量方法に有用な試薬キットであって、ピロリン酸とイノシン酸および／またはキサンチル酸とスーパーオキサイドアニオンを検出する蛍光試薬とヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼとキサンチンデヒドロゲナーゼ／オキシダーゼとを、各々単独で含有する試薬として、またはいずれか２種以上の混合試薬として含む試薬キット。
【００４２】
（１３）  標的とする核酸の検知・定量に有用な試薬キットであって、請求項１０乃至１２のいずれか一項記載の試薬キットに加え、さらに核酸を増幅するために必要な試薬を含む試薬キット。
【００４３】
（１４）  （１）または（２）に記載のピロリン酸の検知・定量方法に有用な試薬キットであって、ピロリン酸とイノシン酸および／またはキサンチル酸とテトラゾリウム塩とヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼとキサンチンデヒドロゲナーゼ／オキシダーゼとが固定された試薬支持体を含む試薬キット。
【００４４】
（１５）  （３）または（４）に記載のピロリン酸の検知・定量方法に有用な試薬キットであって、ピロリン酸とイノシン酸および／またはキサンチル酸とスーパーオキサイドアニオンを検出する化学発光試薬とヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼとキサンチンデヒドロゲナーゼ／オキシダーゼとが固定された試薬支持体を含む試薬キット。
【００４５】
（１６）  （５）または（６）に記載のピロリン酸の検知・定量方法に有用な試薬キットであって、ピロリン酸とイノシン酸および／またはキサンチル酸とスーパーオキサイドアニオンを検出する蛍光試薬とヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼとキサンチンデヒドロゲナーゼ／オキシダーゼとが固定された試薬支持体を含む試薬キット。
【００４６】
（１７）  前記試薬支持体にさらに核酸を増幅するために必要な試薬が固定されている（１４）〜（１６）のいずれか１項に記載の試薬キット。
【００４７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００４８】
本発明の測定対象はピロリン酸である。本発明の方法は、本発明者らが、各種核酸増幅手法で生成するピロリン酸の測定方法を開発する一環として開発されたものである。従って、ＰＣＲ法、Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｎｄ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｐｒｉｍｅｒ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ法（ＩＣＡＮ法）、ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ法（ＬＡＭＰ法）などの各種手法を用いて増幅する核酸量の変化を、ピロリン酸量から推定しようする場合のピロリン酸の測定方法として好適である。
【００４９】
また、本発明のピロリン酸測定方法は、食品添加物として食品に添加される各種ピロリン酸塩の測定方法としても有効である。
【００５０】
上述したように、ピロリン酸は従来、たとえば、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼおよびキサンチンデヒドロゲナーゼ／オキシダーゼを用いた方法などによって測定されてきた。しかし、この測定系における中間生成物のヒポキサンチンは肉や魚中に存在するため、この方法を食品中の核酸の検出に応用する場合、バックグラウンドが上昇するという欠点があった。
【００５１】
本発明者等は、その酵素および試薬類の添加順序を変えることで、バックグラウンド物質の影響を受けることなく、ピロリン酸量を測定できることが可能になることを新たに見出し、以下に詳述する本発明を完成するに至った。
【００５２】
本発明により新規に提供されるピロリン酸を測定するための第１の方法は、ピロリン酸を含む測定試料に必要量のキサンチンデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．１．１．２０４）／キサンチンオキシダーゼ（ＥＣ  １．１．３．２２）を添加して、試料中に予め混在していたヒポキサンチンおよび／またはキサンチンを除去する工程を具備する。次いで必要量のイノシン酸（キサンチル酸が含まれていても、キサンチル酸のみでも良い）と、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．４．２．８）を添加して、試料中のピロリン酸をヒポキサンチンおよび／またはキサンチンに変化させる。次いで、キサンチンデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．１．１．２０４）／キサンチンオキシダーゼ（ＥＣ  １．１．３．２２）およびテトラゾリウム塩を添加して、ピロリン酸由来のヒポキサンチンおよび／またはキサンチンをホルマザンに変換する。この一連の反応は以下のように示される。
【００５３】
【化１】
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【００５４】
以上のような方法で生成したホルマザンを定量することにより、ピロリン酸を定量することが可能となる。なお、ホルマザンの定量は公知の方法を用いて容易に行うことができる。
【００５５】
キサンチンデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．１．１．２０４）およびキサンチンオキシダーゼ（ＥＣ  １．１．３．２２）は同一の酵素であり、テトラゾリウム塩が存在する場合にはデヒドロゲナーゼとして作用し、水と酸素が存在するとオキシダーゼとして作用し、酸素が一旦スーパーオキサイドアニオン（Ｏ２−）になった後、速やかに水と反応して過酸化水素を発生する。
【００５６】
ピロリン酸定量操作として最も好ましい操作手順としては、ピロリン酸を含む試料に、キサンチンデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．１．１．２０４）／キサンチンオキシダーゼ（ＥＣ  １．１．３．２２）およびイノシン酸（キサンチル酸が含まれていても、キサンチル酸のみでも良い）を同時に添加して、試料中に混在するヒポキサンチンおよび／またはキサンチンを除去し、次いでヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．４．２．８）およびテトラゾリウム塩を同時に添加して、ピロリン酸をヒポキサンチンおよび／またはキサンチンに変換し、さらにホルマザンと尿酸にまで変換する方法である。この操作方法であれは、試薬類の添加工程は２回で済み効率的である。
【００５７】
本方法に用いるテトラゾリウム塩は特に制限されるものではなく、例えばパラヨードニトロテトラゾリウムバイオレット、チアゾイルブルー、ネオテトラゾリウムクロライド、ニトロブルーテトラゾリウム、テトラニトロブルーテトラゾリウム、テトラゾリウムブルー、テトラゾリウムレッド、テトラゾリウムバイオレット、チオカルバモイルニトロブルーテトラゾリウム、トリフェニルテトラゾリウムクロライド、ＷＳＴ−１、ＷＳＴ−３等を挙げることができる。
【００５８】
例えば、パラヨードニトロテトラゾリウムバイオレットを用いて、ピロリン酸を測定する場合には、通常は１〜１００ｍＭ程度のイノシン酸、１〜１００ｍＭ程度の塩化マグネシウム、１〜１００  ｕｎｉｔ／Ｌ程度のキサンチンデヒドロゲナーゼ／オキシダーゼを含む５〜５００ｍＭ程度のトリス塩酸緩衝液（ｐＨ  ６．５〜８．５程度）２０μＬをピロリン酸を含む試料１００μＬに添加し、２７〜６５℃で１〜１０分程度反応させた後、０．１〜１００ｍＭ程度のパラヨードニトロテトラゾリウムバイオレット、１〜１００ｍＭ程度の塩化マグネシウム、１０〜１０００  ｕｎｉｔ／ｍＬ程度のヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼを含む５〜５００ｍＭ程度のトリス塩酸緩衝液（ｐＨ  ６．５〜８．５程度）８０μＬ  を加え、２７〜６５度で１０〜１２０分程度反応させた後、４００−５５０ｎｍ程度の波長で比色定量すれば良い。
【００５９】
次に本発明により提供される第２のピロリン酸測定方法について説明する。
第２の方法は、上記第１の方法と同様、ピロリン酸を含む測定試料に必要量のキサンチンデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．１．１．２０４）／キサンチンオキシダーゼ（ＥＣ  １．１．３．２２）を添加して、試料中に予め混在していたヒポキサンチンおよび／またはキサンチンを除去する工程を具備する。次いで必要量のイノシン酸（キサンチル酸が含まれていても、キサンチル酸のみでも良い）およびヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．４．２．８）を添加して、試料中のピロリン酸をヒポキサンチンおよび／またはキサンチンに変化させる。次いで、キサンチンデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．１．１．２０４）／キサンチンオキシダーゼ（ＥＣ  １．１．３．２２）およびスーパーオキサイドアニオン（Ｏ２−）と反応して化学発光性を示す化学発光試薬を添加して、ピロリン酸由来のヒポキサンチンおよび／またはキサンチンを光と尿酸に変換する。この一連の反応は以下のように示される。
【００６０】
【化２】
2004236575.tif 000004
【００６１】
ヒポキサンチンにキサンチンオキシダーゼが作用すると、酸素が一旦スーパーオキサイドアニオン（Ｏ２−）になった後、速やかに水と反応して過酸化水素を発生する。しかし、化学発光試薬が存在する場合は、スーパーオキサイドアニオン（Ｏ２−）は化学発光試薬と反応し、発光を示す。化学発光試薬としては、スーパーオキサイドアニオン（Ｏ２−）に対して特異的に発光を示す化合物が好ましく、特に過酸化水素と反応しないことが重要である。この目的のために好適な化学発光試薬としては、特開平５−６０６９７号公報に開示されたウミホタルルシフェリン誘導体や特開平１１−２０９３７９号公報に開示されたイミダゾヒラジノン誘導体などを挙げることができる。
【００６２】
ピロリン酸定量操作として最も好ましい操作手順としては、ピロリン酸を含む試料に、キサンチンデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．１．１．２０４）／キサンチンオキシダーゼ（ＥＣ  １．１．３．２２）およびイノシン酸（キサンチル酸が含まれていても、キサンチル酸のみでも良い）を同時に添加して、試料中に混在するヒポキサンチンおよび／またはキサンチンを除去し、次いでヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．４．２．８）および化学発光試薬を同時に添加して、ピロリン酸をヒポキサンチンおよび／またはキサンチンに変換し、さらに光と尿酸にまで変換する方法である。この操作方法であれは、試薬類の添加工程は２回で済み効率的である。
【００６３】
例えば、ウミホタルルシフェリン誘導体の一種である２−メチル−６−（４−メトキシフェニル）−３，７−ジヒドロイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３−オン  ハイドロクロライド（ＭＣＬＡ）を用いて、ピロリン酸を測定する場合には、通常は１〜１００ｍＭ程度のイノシン酸、１〜１００ｍＭ程度の塩化マグネシウム、１〜１００  ｕｎｉｔ／Ｌ程度のキサンチンデヒドロゲナーゼ／オキシダーゼを含む５〜５００ｍＭ程度のトリス塩酸緩衝液（ｐＨ  ６．５〜８．５程度）２０μＬをピロリン酸を含む試料１００μＬに添加し、２７〜６５℃で１〜１０分程度反応させた後、０．１〜１００μＭ程度のＭＣＬＡ、１〜１００ｍＭ程度の塩化マグネシウム、１０〜１０００  ｕｎｉｔ／ｍＬ程度のヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼを含む５〜５００ｍＭ程度のトリス塩酸緩衝液（ｐＨ  ６．５〜８．５程度）８０μＬ  を加え、２７〜６５度で１０〜１２０分程度反応させた後、反応液の化学発光強度測定すれば良い。
【００６４】
この方法はホルマザンでの呈色反応を利用したピロリン酸測定方法の検出限界が高いことから、検出限界の低い場合に化学発光検出を用いることによりピロリン酸の検出感度を上昇させることを目的として案出した。
【００６５】
次に本発明に係る第３の方法について説明する。第３の方法は、前記第１及び第２の方法と同様、ピロリン酸を含む測定試料に必要量のキサンチンデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．１．１．２０４）／キサンチンオキシダーゼ（ＥＣ  １．１．３．２２）を添加して、試料中に予め混在していたヒポキサンチンおよび／またはキサンチンを除去する。次いで必要量のイノシン酸（キサンチル酸が含まれていても、キサンチル酸のみでも良い）およびヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．４．２．８）を添加して、試料中のピロリン酸をヒポキサンチンおよび／またはキサンチンに変化させる。次いで、キサンチンデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．１．１．２０４）／キサンチンオキシダーゼ（ＥＣ  １．１．３．２２）およびスーパーオキサイドアニオン（Ｏ２−）と反応して蛍光を示す蛍光試薬を添加して、ピロリン酸由来のヒポキサンチンおよび／またはキサンチンを蛍光物質と尿酸に変換する。この一連の反応は以下のように示される。
【００６６】
【化３】
2004236575.tif 000005
【００６７】
ヒポキサンチンにキサンチンオキシダーゼが作用すると、酸素が一旦スーパーオキサイドアニオン（Ｏ２−）になった後、速やかに水と反応して過酸化水素を発生する。しかし、スーパーオキサイドアニオン（Ｏ２−）検出用の蛍光試薬が存在する場合は、スーパーオキサイドアニオン（Ｏ２−）は蛍光試薬と反応し、蛍光を示す。蛍光試薬としては、スーパーオキサイドアニオン（Ｏ２−）に対して特異的に発光を示す化合物が好ましく、特に過酸化水素と反応しないことが重要である。この目的のために好適な蛍光試薬としては、ＡｍｐｌｅｘＴＭ  Ｒｅｄ（Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ２５３，  １６２−１６８  （１９９７）もしくはＪ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０２，  １３３−１４１  （１９９７））に開示された蛍光試薬などを挙げることができる。
【００６８】
ピロリン酸定量操作として最も好ましい操作手順としては、ピロリン酸を含む試料に、キサンチンデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．１．１．２０４）／キサンチンオキシダーゼ（ＥＣ  １．１．３．２２）およびイノシン酸（キサンチル酸が含まれていても、キサンチル酸のみでも良い）を同時に添加して、試料中に混在するヒポキサンチンおよび／またはキサンチンを除去し、次いでヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．４．２．８）および蛍光試薬を同時に添加して、ピロリン酸をヒポキサンチンおよび／またはキサンチンに変換し、さらに蛍光化合物と尿酸にまで変換する方法である。この操作方法であれは、試薬類の添加工程は２回で済み効率的である。
【００６９】
例えば、ＡｍｐｌｅｘＴＭ  Ｒｅｄを用いて、ピロリン酸を測定する場合には、通常は１〜１００ｍＭ程度のイノシン酸、１〜１００ｍＭ程度の塩化マグネシウム、１〜１００  ｕｎｉｔ／Ｌ程度のキサンチンデヒドロゲナーゼ／オキシダーゼを含む５〜５００ｍＭ程度のトリス塩酸緩衝液（ｐＨ  ６．５〜８．５程度）２０μＬをピロリン酸を含む試料１００μＬに添加し、２７〜６５℃で１〜１０分程度反応させた後、０．１〜１０００μＭ程度のＡｍｐｌｅｘＴＭ  Ｒｅｄ、１〜１００ｍＭ程度の塩化マグネシウム、１０〜１０００  ｕｎｉｔ／ｍＬ程度のヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼを含む５〜５００ｍＭ程度のトリス塩酸緩衝液（ｐＨ  ６．５〜８．５程度）８０μＬ  を加え、２７〜６５度で１０〜１２０分程度反応させた後、反応液の蛍光強度（励起波長５５０〜５７０ｎｍ、蛍光波長５８０〜６１０ｎｍ）を測定すれば良い。
【００７０】
この方法はホルマザンでの呈色反応を利用したピロリン酸測定方法の検出限界が高いことから、検出限界の低いに蛍光検出を用いることによりピロリン酸の検出感度を上昇させることを目的として案出した。
【００７１】
本発明のピロリン酸測定方法は、ばらばらの供給源から得られる必要な試薬及び材料を用いて実施することは可能であるが、本発明の測定方法に有用な試薬及び酵素等が試薬キットの一部として供給されることが有利である。本発明での測定に使用される酵素類、コファクター類、緩衝液類、塩類の最低量、および各々の適当な範囲は当該技術分野で周知であり、本発明により提供される試薬キットに含まれる構成品は、所定の方法に適するいずれかの濃度で提供および使用され、予め蓋付き容器に分注されていることが望ましい。本発明の試薬キットに含まれる構成品は、測定試料及び測定方法等に応じて必要とされる試薬及び酵素各々を単独で含有するもの、あるいは２種以上の試薬又は酵素等の混合物であり得る。また、本発明の試薬キットに含まれる構成品は、試料に対して別個に添加または混合してから添加することができる。これらの材料は、必要な安定性、安全性及び取り扱いの簡便さの目的で適宜包装（乾式又は湿式）することができる。もしくは、必要な試薬類が固定された濾紙などの試薬支持体を構成品として含む試薬キットも本発明の測定方法において有意に用いることができ、該試薬支持体上で上記反応を行わせることも可能である。本試薬キットを用いて、ピロリン酸を検知する手段としては、紫外可視分光光度計、蛍光分光光度計、化学発光検出器などの高度な光学機器を用いた精密定量の他に、ピロリン酸の有無を確認するための簡易判定として、肉眼による色見本との濃淡比較もしくは写真やＣＣＤカメラ等による呈色または蛍光、発光の濃淡によっておおよその濃度を知ることも可能である。
【００７２】
また、本発明のピロリン酸測定方法を用いて、核酸の有無の検出または定量を行おうとする場合に用いられる試薬及び酵素は、試薬キットの構成品として供給されることが有利である。このような試薬キットの構成品としては、上記ピロリン酸測定用の試薬キットに含まれる構成品の他に、更に核酸を増幅するために必要な試薬を含む。核酸を増幅するために必要な試薬としては、プライマー類、コファクター類、ヌクレオチド−３−リン酸類等を挙げることができる。核酸増幅に使用されるプライマー類、コファクター類、ヌクレオチド−３−リン酸類の最低量、および各々の適当な範囲は当該技術分野で周知であり、これらは所定の方法に適するいずれかの濃度で提供および使用される。
【００７３】
核酸増幅法として、ＰＣＲ反応の他に、ＬＡＭＰ法やＩＣＡＮ法など幾つかの手法があるが、核酸増幅に伴い、ピロリン酸が同時に生成される場合は、本発明の手法は、ＰＣＲ以外の方法にも同様に適用できる。色素生成による判定では、特別に検出装置を使わず、既存の核酸増幅試薬に本発明のピロリン酸測定方法に有用な上記試薬を添加すれば、特定の核酸の存在の有無が目視で判定できる。
【００７４】
エンドポイント分析によって、核酸増幅反応の有無を検知したい場合は、試料中に予め含有されているヒポキサンチンおよび／またはキサンチンを除去する工程（最も好ましい測定方法として上述した操作手順においては２工程にわたる試薬類の添加工程のうち１回目の添加工程）は、上述のいずれかの核酸増幅反応の開始前、開始後のどちらでもよい。その場合核酸増幅反応において９５℃以上の温度を加えても酵素活性を失わない耐熱性のキサンチンデヒドロゲナーゼ／オキシダーゼを用いることで、ピロリン酸検出のための前記除去工程後の工程（２工程にわたる添加工程にあっては２回目の添加工程）において再度キサンチンデヒドロゲナーゼ／オキシダーゼを添加する必要はない。リアルタイム分析によって、核酸増幅反応の有無を検知したい場合は、ピロリン酸検出試薬のうち、キサンチンデヒドロゲナーゼ／オキシダーゼおよびヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼの両方の酵素が耐熱性であることが必要である。
【００７５】
ＰＣＲ反応は以下の様に反応しピロリン酸を副生成物として遊離する。従って、ピロリン酸（ＰＰｉ）生成量は増幅ＤＮＡ量に比例する。
【００７６】
【化４】
2004236575.tif 000006
【００７７】
本発明によりウイルス等の初期鋳型核酸量を定量する場合は、ＰＣＲによって指数関数的にピロリン酸が生成することを利用する。ＰＣＲ反応生成物は、反応初期にはほぼ指数関数的増加を示し、十分なサイクル数ＰＣＲを行った場合は、初期鋳型核酸量に関係なくほぼ同じ量のＰＣＲ反応生成物が得られる。従ってＰＣＲ反応生成物がある一定量に達するサイクル数（ＣＴ）は初期鋳型核酸量と逆相関の関係にある。またこの関係が成り立つためには初期鋳型核酸量が異なっていても指数増幅期の増幅率が等しくなければならない。標的配列が同じ場合はこの関係が成立しているため、ＣＴから初期鋳型核酸量を推定することが可能である。本発明ではサイクル数を変化させてＰＣＲ反応を行い、各サイクル数におけるピロリン酸の生成量から初期鋳型核酸量を定量する方法を用いる。例えばパソコンによる色データの時間変化解析などにより、おおよそのピロリン濃度とその時間変化から、初期鋳型核酸量を定量することができる。
【００７８】
【実施例】
次に本発明を実施例により更に詳細に説明するが、実施例は例示のために提示するものであって、本発明を限定することを意図するものではない。
【００７９】
（実施例１）
初めに次の２種類の試薬を予め調製しておく。
【００８０】
（１）２０ｍＭイノシン酸、１０ｍＭ塩化マグネシウム、０．４ｕｎｉｔｓ／ｍＬキサンチンデヒドロゲナーゼ／オキシダーゼを含む１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ  ７．６）
（２）４ｍＭパラヨードニトロテトラゾリウムバイオレット、１０ｍＭ塩化マグネシウム、１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼを含む１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ  ７．６）
既知濃度のピロリン酸溶液１００μｌに（１）を２０μｌ加え、６０℃で１分間反応させた後、（２）を８０μｌ加え、６０℃で１０分間反応させた。この反応液９０μｌを９６穴のマイクロプレートに取り、マイクロプレートリーダー「Ｂｉｏ−Ｔｅｋ  Ｅｌｘ  ８００」（Ｂｉｏ−Ｔｅｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ製）を用いて、５１５ｎｍと６３０ｎｍの吸光度を測定した。
そのときのピロリン酸の検量線を図１に示す。尚、図１における吸光度は５１５ｎｍにおける吸光度から６３０ｎｍにおける吸光度を引くことによって求めた。本実施例の結果から、本発明の方法を用いて精度良くピロリン酸を測定できることがわかる。
【００８１】
（実施例２）
実施例１と同様の試薬を調製し、１０％および５０％の牛血清または１〜１０  ｍＭのリン酸カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）、１〜１０  ｍＭのＡＴＰ、５０〜５００  ｍＭのヒポキサンチン、５０〜５００  ｍＭのキサンチンを含む５００μＭのピロリン酸を含む１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ溶液（ｐＨ７．８）１００μｌに（１）を２０μｌ加え、６０℃で１分間反応させた後、（２）を８０μｌ加え、６０℃で１０分間反応させた。この反応液９０μｌを９６穴のマイクロプレートに取り、マイクロプレートリーダー「Ｂｉｏ−Ｔｅｋ  Ｅｌｘ  ８００」（Ｂｉｏ−Ｔｅｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ製）を用いて、５１５ｎｍと６３０ｎｍの吸光度を測定した。そのときの吸光度を表１に示す。尚、表１における吸光度は５１５ｎｍにおける吸光度から６３０ｎｍにおける吸光度を引くことによって求めた。本実施例の結果から、本発明の方法を用いた場合、生体サンプルおよび各種生体サンプル中に存在するリン酸やＡＴＰに影響されることなく、ピロリン酸を測定できることがわかる。また、バックグラウンド原因物質のヒポキサンチンとキサンチンは、試料中に５０〜１００  ｍＭ程度存在しても測定値に影響を与えなかった。もし１００  ｍＭ以上のヒポキサンチンやキサンチンが存在する試料を測定する場合には、（１）液中のキサンチンデヒドロゲナーゼ／オキシダーゼの濃度を多くしたり、（１）液を加えた後の反応時間を長くすればよいことは明らかである。
【００８２】
【表１】
2004236575.tif 000007
【００８３】
（実施例３）
アマシャムファルマシアバイオテク（株）のＲｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ  ＰＣＲ  Ｂｒｅａｄｓを用いて、ＰＣＲ法による核酸の増幅を行った。ＰＣＲを行う反応溶液はキット添付のＣｏｎｔｒｏｌ  Ｌａｍｂｄａ  ＤＮＡ  および１組のプライマーを用いて、キット添付のプロトコールに従って調製した。そして、変性（９５℃、１分）、アニーリング（５５℃、１分）、ＤＮＡ伸長反応（７２℃、１分）のサイクルを、０、１０、２０、２５、２７、３０、３５サイクル行った。反応溶液の組成は以下のとおりである。
【００８４】
反応溶液の組成（ＰＣＲ  Ｂｒｅａｄｓ  １ビーズ中）
Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｌａｍｂｄａ  ＤＮＡ        １μｌ（０または１ｎｇ／μｌのもの）
Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｐｒｉｍｅｒ  １            １μｌ
Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｐｒｉｍｅｒ  ２            １μｌ
滅菌蒸留水                ２２μｌ
ＰＣＲ終了後、５０μｌの反応溶液に対して、実施例１と同様の方法を用いて比色定量した。そのときの吸光度とサイクル数の関係を図２に示す。この図から、サイクル数の増加に伴って吸光度が上昇するため、本測定方法を用いて目的核酸の有無の判断が可能となることがわかる。
【００８５】
（実施例４）
初めに次の２種類の試薬を予め調製しておく。
【００８６】
（１）２０ｍＭイノシン酸、１０ｍＭ塩化マグネシウム、０．４ｕｎｉｔｓ／ｍＬキサンチンデヒドロゲナーゼ／オキシダーゼを含む１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ  ７．６）
（２）３２μＭのＭＣＬＡ、１０ｍＭ塩化マグネシウム、１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼを含む１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ  ７．６）既知濃度のピロリン酸溶液５０μｌをマイクロチューブに取り、そこに（１）を１０μｌ加え、６０℃で１分間反応させた後、（２）を４０μｌ加え、６０℃で反応させながら１０分間、化学発光強度（化学発光検出器・浜松ホトニクス）を測定した。そのときのピロリン酸の検量線を図３に示す。本実施例の結果から、本発明の方法を用いて精度良くピロリン酸を測定できることがわかる。
【００８７】
（実施例５）
アマシャムファルマシアバイオテク（株）のＲｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ  ＰＣＲ  Ｂｒｅａｄｓを用いて、ＰＣＲ法による核酸の増幅を行った。ＰＣＲを行う反応溶液はキット添付のＣｏｎｔｒｏｌ  Ｌａｍｂｄａ  ＤＮＡ（０、０．１、１、１０  ｎｇ／μｌに調製して使用した。）  および１組のプライマーを用いて、キット添付のプロトコールに従って調製した。そして、変性（９５℃、１分）、アニーリング（５５℃、１分）、ＤＮＡ伸長反応（７２℃、１分）のサイクルを、０、１０、１５、２０、２５、２７サイクル行った。反応溶液の組成は以下のとおりである。
【００８８】
反応溶液の組成（ＰＣＲ  Ｂｒｅａｄｓ  １ビーズ中）
Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｌａｍｂｄａ  ＤＮＡ        １μｌ（４種類の濃度に調製）
Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｐｒｉｍｅｒ  １            １μｌ
Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｐｒｉｍｅｒ  ２            １μｌ
滅菌蒸留水                ２２μｌ
ＰＣＲ終了後、２５μｌの反応溶液に対して、実施例４と同様の方法を用いて化学発光強度を測定した。そのときの化学発光強度とサイクル数の関係を図４に示す。この図から、サイクル数の増加に伴って化学発光強度が上昇するため、本測定方法を用いて目的核酸の有無の判断および初期鋳型核酸量の推定が可能となることがわかる。
【００８９】
（実施例６）
初めに次の２種類の試薬を予め調製しておく。
【００９０】
（１）２０ｍＭイノシン酸、１０ｍＭ塩化マグネシウム、０．４ｕｎｉｔｓ／ｍＬキサンチンデヒドロゲナーゼ／オキシダーゼを含む１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ  ７．６）
（２）２００μＭのＡｍｐｌｅｘＴＭ  Ｒｅｄ、１０ｍＭ塩化マグネシウム、１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼを含む１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ  ７．６）
既知濃度のピロリン酸溶液５０μｌをマイクロチューブに取り、そこに（１）を１０μｌ加え、６０℃で１分間反応させた後、（２）を４０μｌ加え、６０℃で１０分間反応させた後、蛍光強度（蛍光分光光度計・日本分光）を測定した。そのときのピロリン酸の検量線を図５に示す。本実施例の結果から、本発明の方法を用いて精度良くピロリン酸を測定できることがわかる。
【００９１】
（実施例７）
培養したＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｔｏｎｐｓｏｎ，  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ，  大腸菌Ｏ６及びＯ１４８を熱水抽出後、サルモネラｉｎｖＡ遺伝子検出用プライマー（タカラバイオ）を用いてＰＣＲ反応を行い、反応終了後、実施例３と同様な方法でピロリン酸検出を行った結果、Ｓ．  Ｔｏｎｐｓｏｎ，  Ｓ．  Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓのみ呈色した（表２）。アガロースゲル電気泳動でＰＣＲ反応物の生成が確認された反応液中のピロリン酸量は、２００−４００μＭ程度であった。このように本法を利用することで、毒性のない試薬を用いかつ目視簡易判定により、細菌の同定を行うことができた。
【００９２】
【表２】
2004236575.tif 000008
【００９３】
【発明の効果】
以上詳述したように、本発明は従来のピロリン酸定量法の欠点であるバックグラウンドの上昇などを克服した簡便かつ精度の高いピロリン酸定量方法及び該定量方法に有用な試薬キットであり、本発明により特定核酸の有無の判別が正確かつ簡便に行うことが可能となった。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のピロリン酸定量方法を用いて得られたピロリン酸濃度と吸光度との関係を示す図。
【図２】本発明のピロリン酸定量方法を用いて得られたサイクル数と吸光度との関係を示す図。
【図３】本発明のピロリン酸定量方法を用いて得られたピロリン酸濃度と化学発光強度の関係を示す図。
【図４】本発明のピロリン酸定量方法を用いて得られたサイクル数と化学発光強度の関係を示す図。
【図５】本発明のピロリン酸定量方法を用いて得られたピロリン酸濃度と蛍光強度の関係を示す図。
【図１】
2004236575.tif 000009
【図２】
2004236575.tif 000010
【図３】
2004236575.tif 000011
【図４】
2004236575.tif 000012
【図５】
2004236575.tif 000013