【手続補正書】
【提出日】平成23年12月6日(2011.12.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト胚性幹細胞またはヒトの誘導された多分化能性（pluripotent）幹細胞をインビトロで懸濁培養において培養する方法であって、
（ｉ）ヒト胚性幹細胞またはヒトの誘導された多分化能性幹細胞を複数のマイクロキャリアに付着させてマイクロキャリア−幹細胞複合体を形成し、その際、当該マイクロキャリアの表面は細胞外マトリックス成分を含むマトリックス中にコートされており；
（ｉｉ）マイクロキャリア−幹細胞複合体を懸濁培養において培養し；
（ｉｉｉ）（ｉｉ）からの培養細胞を継代し；そして
（ｉｖ）工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を通して少なくとも７継代反復する；
ことを含み、その際、工程（ｉｖ）の後の培養物中の幹細胞が多分化能性である、前記方法。
【請求項２】
マイクロキャリアが、ロッド形であるかまたは実質的に球形の形状を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
マトリックスが、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ヒアルロン酸、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、コラーゲン、エラスチン、ヘパラン硫酸、デキストラン、デキストラン硫酸、コンドロイチン硫酸、または、ラミニン、Ｉ型コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン及びエンタクチン１の混合物、のうち１以上を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
幹細胞の数が、各継代間で拡張している、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
マイクロキャリアが、セルロース、デキストラン、ヒドロキシル化メタクリレート、コラーゲン、ゼラチン、ポリスチレン、プラスチック、ガラス、セラミック、シリコーンのうち１以上を含むか、もしくはそれらからなる、または、マイクロキャリアがマクロ多孔質もしくはミクロ多孔質のｃａｒｂｏｓｅｅｄマイクロキャリアである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
マイクロキャリアが、プロタミンまたはポリリジンとカップリングしている、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
マイクロキャリアが陽電荷を有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
工程（ｉｉ）において、培養物中の幹細胞の数を拡張させるのに十分な期間、幹細胞を培養する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
各反復サイクルにおいて、工程（ｉ）の幹細胞がその前の反復サイクルの工程（ｉｉｉ）の継代細胞から得られる、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
工程（ｉｖ）において、工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を通して、少なくとも８継代、少なくとも９継代、少なくとも１０継代、少なくとも１１継代、少なくとも１２継代、少なくとも１３継代、少なくとも１４継代、少なくとも１５継代、少なくとも１６継代、少なくとも１７継代、少なくとも１８継代、少なくとも１９継代、少なくとも２０継代、少なくとも２１継代、少なくとも２２継代、少なくとも２３継代、少なくとも２４継代、少なくとも２５継代、少なくとも３０継代、少なくとも４０継代、少なくとも５０継代、少なくとも６０継代、少なくとも７０継代、少なくとも８０継代、少なくとも９０継代、少なくとも１００継代、の一つで反復する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）のサイクルの少なくとも６０％について、マイクロキャリアがマトリックス中にコートされている、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）のサイクルにおいて、マイクロキャリアが同一マトリックス中にコートされている、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）の第１と第２の連続サイクルにおいて、マトリックスが異なるか、または存在しない、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
工程（ｉｖ）の後、培養物中の少なくとも６０％の幹細胞が多分化能性であるか、またはＯｃｔ４、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ−１−６０およびＭａｂ８４のうち１、２、３もしくはすべてを発現する、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
該方法が、幹細胞を無血清培地、または幹細胞用馴化培地、またはフィーダー細胞を含まない状態で培養することを含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
フィーダー細胞もマイクロキャリアに付着している、ここで場合により、培養はさらに、幹細胞が付着するマイクロキャリアとは異なるマイクロキャリアに付着したフィーダー細胞を含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
さらに、工程（ｉｖ）の後に得られる幹細胞の分化を誘導する工程を含むか、または幹細胞の分化を誘導する条件下にマイクロキャリア幹細胞複合体を置くことを含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
該方法が、工程（ｉｖ）の後に、幹細胞をマイクロキャリアから分離し、そして分離した幹細胞をマイクロキャリアの無い培養において、幹細胞の分化を誘導する条件下で培養する工程を含む、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
さらに、多分化能性幹細胞の分化を含む方法であって、
（ｖ）工程（ｉｖ）の後に得られる多分化能性幹細胞を複数の第２マイクロキャリアに付着させてマイクロキャリア幹細胞複合体を形成し、その際、第２マイクロキャリアの表面は第２マトリックス中にコートされているか、またはコートされておらず；そして
（ｖｉ）（ｖ）からのマイクロキャリア幹細胞複合体を懸濁培養において、幹細胞の分化を誘導する条件下で培養する；
ことを含み、ここで当該方法は、場合によりさらに以下：
（ｖｉｉ）工程（ｖｉ）から得られる分化した幹細胞を複数の第３マイクロキャリアに付着させてマイクロキャリア幹細胞複合体を形成し、その際、第３マイクロキャリアの表面は第３マトリックス中にコートされているか、またはコートされておらず；そして
（ｖｉｉｉ）（ｖｉｉ）からのマイクロキャリア幹細胞複合体を懸濁培養において、分化した幹細胞のさらなる分化を誘導する条件下で培養する；
ことを含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
分化した細胞を培養して胚様体を形成させる、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
幹細胞をインビトロで懸濁培養において培養する方法であって、
（ｉ）幹細胞を複数のマイクロキャリアに付着させてマイクロキャリア−幹細胞複合体を形成し、その際、マイクロキャリアの表面はＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）中にコートされており；
（ｉｉ）マイクロキャリア−幹細胞複合体を懸濁培養において培養し；
（ｉｉｉ）（ｉｉ）からの培養細胞を継代し；そして
（ｉｖ）工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を通して少なくとも７継代反復する
ことを含み、その際、工程（ｉｖ）の後の培養物中の幹細胞が多分化能性（pluripotent）であり、培養物がフィーダー細胞を含まず、各継代間で幹細胞の数が拡張し、幹細胞がヒトもしくは霊長類の胚性幹細胞またはヒトもしくは霊長類の誘導された多分化能性幹細胞である、前記方法。
【請求項２２】
多分化能性（pluripotent）状態を有する新たな細胞を生じるための、ヒト多分化能性細胞の培養におけるインビトロでのマイクロキャリアの使用であって、当該マイクロキャリアはセルロース、デキストラン、ヒドロキシル化メタクリレート、またはコラーゲンのうち１以上を含み、そしてここで当該マイクロキャリアは細長い形状を有し、約２０００μｍ未満の最長寸法および約１０μｍより大きい最短寸法、好ましくは５０μｍから４００μｍの間の最長寸法、を有し、そしてここで当該マイクロキャリアの表面が細胞外マトリックス成分を含むマトリックス中にコートされ、そしてここで１個または複数のヒト多分化能性細胞がマトリックスコーティングに付着し、当該マイクロキャリアは場合によりロッド形である、前記使用。
【請求項２３】
マトリックスコーティングが、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ヒアルロン酸、ラミニンまたはフィブロネクチンのうち１以上を含む、請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
多分化能性細胞が、ヒトの胚性幹細胞またはヒトの誘導された多分化能性幹細胞である、請求項２２または２３に記載の使用。
【請求項２５】
マイクロキャリアが陽電荷を有する、請求項２２〜２４のいずれか１項に記載の使用。