【誤訳訂正書】
【提出日】平成26年11月7日(2014.11.7)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
霊長類の体細胞を再プログラムする方法であって、以下の工程、
（１）ＳＶ４０Ｔ抗原および１つまたは複数個の能力決定因子をコードする少なくとも１種の非ウイルスエピソームベクターを、霊長類体細胞を再プログラムするのに充分な条件の下で、該霊長類体細胞に導入する工程であって、前記少なくとも１種の非ウイルスエピソームベクターが、単一の形質導入を使用して、前記霊長類体細胞に導入され、前記霊長類体細胞が、胎児または出生後の個体から得られたものである工程、
（２）前記細胞を培養して、前記霊長類体細胞より高い能力レベルを有する再プログラムされた細胞を得る工程であって、該再プログラムされた細胞が、前記胎児または出生後の個体と遺伝的に同一であり、かつ１つまたは複数個の能力決定因子をコードする少なくとも１種の非ウイルスエピソームベクターを前記体細胞に曝露することに関連するどのような構成要素も含まない工程、
を含むことを特徴とする再プログラム方法。
【請求項２】
前記霊長類が、ヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記１つまたは複数個の能力決定因子が、ヒトＯＣＴ−４、ヒトＳＯＸ２、ヒトＬＩＮ２８、ヒトＮＡＮＯＧ、ヒトｃ−Ｍｙｃ、およびヒトＫＬＦ４を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記少なくとも１つのベクターが、単一ベクターである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記単一ベクターが、少なくとも１つの配列内リボソーム進入部位を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記単一ベクターが、順番に、第一のプロモータ、ＯＣＴ４、ＩＲＥＳ２、ＳＯＸ２、第二のプロモータ、ＳＶ４０Ｔ抗原、ＩＲＥＳ２、およびＫＬＦ４を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記ベクターが、順番に、第一のプロモータ、ＯＣＴ４、ＩＲＥＳ２、ＳＯＸ２、第二のプロモータ、ｃ−Ｍｙｃ、ＩＲＥＳ２、ＫＬＦ４、第三のプロモータ、ＮＡＮＯＧ、ＩＲＥＳ２、およびＬＩＮ２８を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
第一のベクターが、順番に、第一のプロモータ、ＯＣＴ４、ＩＲＥＳ２、ＳＯＸ２、第二のプロモータ、ＳＶ４０Ｔ抗原、ＩＲＥＳ２、およびＫＬＦ４を含み、第二のベクターが、順番に、第三のプロモータ、ＯＣＴ４、ＩＲＥＳ２、ＳＯＸ２、第四のプロモータ、ＮＡＮＯＧ、ＩＲＥＳ２、およびＫＬＦ４を含み、第三のベクターが、順番に、第五のプロモータ、ｃ−Ｍｙｃ、ＩＲＥＳ２、ＬＩＮ２８を含み、前記プロモータが、同一である必要がない、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記第一の、第二の、第三の、第四の、および第５の各プロモータが、伸長因子１α（ＥＦ１α）遺伝子プロモータである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
第一のベクターが、順番に、第一のプロモータ、ＯＣＴ４、ＩＲＥＳ２、ＳＯＸ２、第二のプロモータ、ＫＬＦ４、ＩＲＥＳ２、ｃ−Ｍｙｃ、第三のプロモータ、ＮＡＮＯＧ、ＩＲＥＳ２、およびＬＩＮ２８を含み、第二のベクターが、順番に、第四のプロモータ、ＯＣＴ４、ＩＲＥＳ２、ＳＯＸ２、第五のプロモータ、ＳＶ４０Ｔ抗原、ＩＲＥＳ２、およびＫＬＦ４を含み、前記プロモータが、同一である必要がない、請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
前記第一の、第三の、第四の、および第五の、各プロモータが、ＥＦ１α遺伝子プロモータであり、また第二のプロモータが、サイトメガロウイルス・前初期遺伝子（ＣＭＶ）プロモータである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
第一のベクターが、順番に、第一のプロモータ、ＯＣＴ４、ＩＲＥＳ２、ＳＯＸ２、第二のプロモータ、ＮＡＮＯＧ、ＩＲＥＳ２、およびＬＩＮ２８を含み、第二のベクターが、順番に、第三のプロモータ、ＯＣＴ４、ＩＲＥＳ２、ＳＯＸ２、第四のプロモータ、ＳＶ４０Ｔ抗原、ＩＲＥＳ２、およびＫＬＦ４を含み、ならびに、第三のベクターが、順番に、第五のプロモータ、ＯＣＴ４、ＩＲＥＳ２、ＳＯＸ２、第六のプロモータ、ｃ−Ｍｙｃ、ＩＲＥＳ２、およびＫＬＦ４を含み、前記プロモータが、同一である必要がない、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
霊長類多能性細胞の濃縮された集団であって、以下の工程、
ＳＶ４０Ｔ抗原および１つまたは複数個の能力決定因子をコードする少なくとも１種の非ウイルスエピソームベクターを、能力決定因子を発現するのに充分な条件の下で、霊長類体細胞に導入する工程であって、前記霊長類体細胞が、胎児または出生後の個体から得られ、もって、前記体細胞を再プログラムして、前記霊長類多能性細胞を産生する工程を含む方法により産生され、
前記細胞が、前記胎児または出生後の個体と遺伝的に同一であり、かつ前記能力決定因子を前記体細胞に曝露することに関連するどのような構成要素も含まないことを特徴とする、集団。
【請求項１４】
前記霊長類が、ヒトである、請求項１３に記載の前記集団。
【請求項１５】
前記１つまたは複数個の能力決定因子が、ヒトＯＣＴ−４、ヒトＳＯＸ２、ヒトＬＩＮ２８、ヒトＮＡＮＯＧ、およびヒトｃ−Ｍｙｃを含む、請求項１３に記載の集団。
【請求項１６】
多能性の誘導に関連するどのような構成要素も実質的に含まない霊長類誘導多能性細胞。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２７】
ＯＲＦ上流または下流の発現に関して、様々なプロモータ、ＩＲＥＳ配列、および、導入遺伝子の配置の相対的効果を、以前に記述（Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，上記参照）したように、形質導入後ヒト体細胞を再プログラムできるかをテストするために、様々な導入遺伝子発現カセットをｐＳｉｎ４、修飾したレンチウイルス・ベースのベクターへと別々にクローニングして評価した。２９３ＦＴ細胞に、下記に示すようにＳｕｐｅｒＦｅｃｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使いＩＲＥＳ１またはＩＲＥＳ２で連結されたＯＣＴ４とＳＯＸ２を発現するレンチウイルスのプラスミドベクターで形質導入した。細胞は、形質導入２日後に収集した。図１Ａは、２９３ＦＴ細胞内のＯＣＴ−４とＳＯＸ２のウエスタンブロット法による解析を示す。レーン１、ｐＳＩＮ４−ＥＦ２−ＯＣＴ４−ＩＲＥＳ１−ＳＯＸ２、レーン２,ｐＳＩＮ４−ＥＦ２−ＯＣＴ４−ＩＲＥＳ２−ＳＯＸ２、レーン３,ｐＳＩＮ４−ＥＦ２−ＯＣＴ４−Ｆ２Ａ−ＳＯＸ２、レーン４、ｐＳＩＮ４−ＥＦ２−ＯＣＴ４−ＩＲＥＳ１−ＰＵＲＯ、レーン５、ｐＳＩＮ４−ＥＦ２−ＳＯＸ２−ＩＲＥＳ１−ＰＵＲＯ、レーン６、プラスミド無し(コントロール)。マウス抗ヒトＯＣＴ４モノクローナル抗体（１：５００，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ，ｓｃ−５２７９）とヤギ抗ヒトＳＯＸ２ポリクローナル抗体（１：５００，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ ＡＦ２０１８）を使用して、ＯＣＴ４とＳＯＸ２それぞれの相対的発現を検出した。
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２９】
実施例２
レンチウイルス・コンストラクトを使用したヒト新生児包皮線維芽細胞の再プログラム化  予備的再プログラムの実験は、レンチウイルスベクターをヒト新生児の包皮線維芽細胞に導入することによって行った。図２Ａは、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＬＩＮ２８、および、さらにｃ−ＭＹＣを導入する場合、ＮＡＮＯＧが再プログラム効率にかなりのプラス効果をもたらすことを示し、 また、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、および、ＬＩＮ２８との組み合わせでは、ｃ−ＭＹＣまたはＫＬＦ４が無い場合でもＮＡＮＯＧが再プログラムを補助できることを示す。使用したレンチウイルスのコンストラクトは、ｐＳＩＮ４−ＥＦ２−ＯＣＴ４−ＩＲＥＳ２−ＳＯＸ２（Ｏ２Ｓ）、ｐＳＩＮ４−ＥＦ２−ＮＡＮＯＧ−ＩＲＥＳ２−ＬＩＮ２８ （Ｎ２Ｌ）、ｐＳＩＮ４−ＥＦ２−ＬＩＮ２８−ＩＲＥＳ１−ＰＵＲＯ（Ｌ）、ｐＳＩＮ４−ＣＭＶ−ｃ−Ｍｙｃ−ＩＲＥＳ１−ＰＵＲＯ（Ｍ）、ｐＳＩＮ４−ＥＦ２−ＫＬＦ４−ＩＲＥＳ１−ＰＵＲＯ（Ｋ）であった。形質導入２０日後、アルカリ・ホスファターゼ-陽性ヒトｉＰＳ細胞コロニーを計数した。ｉＰＳ細胞コロニーの数は、２．５×１０4個のヒト新生児包皮線維芽細胞（継代数９）の入力由来であった。薄灰色の棒は、再プログラムされて形成した、代表的なヒトＥＳ細胞形態を有するコロニーの合計数を表し、濃い灰色棒は、分化が最も少なかった大型コロニーの数を表す。
【誤訳訂正４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３５】
製造元の指示に従い、ヒト真皮線維芽細胞キット（Ｎｏｒｍａｌ Ｈｕｍａｎ Ｄｅｒｍａｌ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ，Ａｍａｘａ，Ｉｎｃ．Ｃａｔ．Ｎｏ．ＶＰＤ−１００１）を使用して、単一のヌクレオフェクション・イベント経由で線維芽細胞にベクターを導入した。ヌクレオフェクション後、照射を受けたマウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）が播種された３個の１０ｃｍの皿の上に形質導入した線維芽細胞(それぞれ〜０．８から１．０×１０6細胞)を直ちにプレートした。包皮線維芽細胞培地は一日おきに交換した。４日後、包皮線維芽細胞培地をヒト胚性幹細胞培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に以下を補充、２０％ノックアウト血清リプレーサー、０．１ｍＭの非必須アミノ酸（全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．製）、１ｍＭのグルタマックス、０．１ｍＭのβメルカプトエタノール、および、前記した１００ｎｇ／ｍｌのゼブラフィッシュタンパク・塩基性線維芽細胞増殖因子（ｚｂＦＧＦ）（Ａｍｉｔ ｅｔ ａｌ．， Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２２７：２７１−２７８ （２００６）； Ｌｕｄｗｉｇ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ３：６３７−６４６（２００６）、ここで、それぞれは、参照により全体を説明したものとしてここに組み入れる）と交換した。プレーティング８〜１０日後、播種されたＭＥＦが、再プログラム培地を維持出来なくなったとき、照射されたＭＥＦで馴化したヒト胚性幹細胞培地を代わりに使用した。適切な時期（形質導入２〜３週間後）に、ヒトｉＰＳコロニー発生の徴候としてアルカリ・ホスファターゼにより培養物を着色した。
【誤訳訂正５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３７】
ヒト新生児包皮線維芽細胞生存物について、導入された導入遺伝子コンストラクトの量の効果も、予備的実験で評価した。図３Ｃは、ヌクレオフェクション後翌日の細胞コンフルエンスから推定した、ヌクレオフェクションの効率性とヒト新生児包皮線維芽細胞の生存物について、使用されたｐＣＥＰ４−ＥＧＦＰのエピソームのベクターの量の効果を示す。ヌクレオフェクションされた約１×１０6個の包皮線維芽細胞を６ウェル・プレートの各ウェルにプレートした。灰色線は形質導入されなかった対照の線維芽細胞を表し、黒色線は形質導入された線維芽細胞を表す。
【誤訳訂正６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３９】
図４Ｂは、エピソームのベクターの形質導入１８日後に観察した形態変化をもつ典型的なコロニーの明視野顕微鏡のイメージを示す。図４Ｃは、エピソームのベクターの形質導入１８日後のアルカリホスファターゼ−陽性コロニーの明視野顕微鏡イメージを示す。 
【誤訳訂正７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００４０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００４０】
形質導入２５〜３０日後、ヒトｉＰＳ細胞コロニーに形態的に類似した多くの非ｉＰＳ 細胞コロニーがある故に、再プログラム培養物を一度新鮮な１０ｃｍのＭＥＦ皿（１：３比）に移した。そして、その後の解析のためにコロニーを選択した。図４Ｄは、形質導入再プログラム培養後２８日目の第一継代６日後のヒトｉＰＳ細胞コロニーの明視野顕微鏡イメージを示す。スケールバーは、０．１ｍｍを表す。再プログラムされた細胞は、後の解析のために、前述した馴化培地（Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：９７１（２００１）、参照により全体を説明したものとして本明細書に組み込む)を用い、マトリゲル（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）のフィーダ・フリー培養で維持した。
【誤訳訂正８】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００４２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００４２】
本開示に記述した本発明のいくつかの改作は当業者においては通常の最適化事項であり、本発明の精神もしくは添付の請求項の範囲を逸脱することなく実施できることを理解されたい。明細書で上述した出版物と特許は、参照により本明細書に組み込まれる。本発明の記述した方法とシステムの様々な改変と変形は、本発明の範囲と精神を逸脱することなく、当業者には明らかである。しかし、上記した本発明の実施例と実施形態は、例証的であり、本発明を限定するわけではない。本発明は、下記の請求項の範囲に付随する実施例と実施形態の全ての改変体を含む。
【表１】
2012506702.tif 000001
【表２】
2012506702.tif 000002
【表３】
2012506702.tif 000003
2012506702.tif 000004
2012506702.tif 000005
2012506702.tif 000006