(57)【要約】【課題】  DNAワクチンの有効性を高めるために、DNAワクチンの中和抗体誘導能を増強するための新たな方法を提供することが本発明の課題である。【解決手段】  本発明により、遺伝子導入型ワクチンとの投与と同時に蛋白質導入型ワクチンを生体に投与することを特徴とする、遺伝子導入型ワクチンの中和抗体誘導能を増強する方法が与えられた。また本発明により、遺伝子導入型ワクチン及び蛋白質導入型ワクチンを同時に生体に投与することにより、遺伝子導入型ワクチン又は蛋白質導入型ワクチンを単独で投与した時と比較して、生体におけるワクチンの中和抗体誘導能が相乗的に増強していることを特徴とするワクチンの投与方法も与えられた。本発明の方法は、抗体中和誘導能が低いDNAワクチンの有効性を高める目的に有用である。また本発明において針無注射器を用いて２種類のワクチンを混合投与することは好ましい態様である。【選択図】        なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子導入型ワクチンの投与と同時に蛋白質導入型ワクチンを生体に投与することを特徴とする、遺伝子導入型ワクチンの中和抗体誘導能を増強する方法。
【請求項２】
前記遺伝子導入型ワクチンがDNAワクチンであり、前記蛋白質導入型ワクチンがサブユニットワクチンであることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記DNAワクチンがコードする蛋白質と、前記サブユニットワクチン中に含まれる蛋白質が同じ免疫原性を有することを特徴とする、請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記遺伝子導入型と前記蛋白質導入型ワクチンが、ウイルス、細菌又は寄生虫に起因する感染症に対するワクチンであることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記遺伝子導入型ワクチンと前記蛋白質導入型ワクチンが、ウイルスに起因する感染症に対するワクチンであることを特徴とする、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記遺伝子導入型ワクチンと前記蛋白質導入型ワクチンが、日本脳炎に対するワクチンであることを特徴とする、請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記遺伝子導入型ワクチンがpcJEMEであり、かつ前記蛋白質導入型ワクチンがJEEPであることを特徴とする、請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記遺伝子導入型ワクチンと前記蛋白質導入型ワクチンが、デング熱、デング出血熱又はデングショック症候群に対するワクチンであることを特徴とする、請求項５記載の方法。
【請求項９】
前記遺伝子導入型ワクチンがpcD2MEであり、かつ前記蛋白質導入型ワクチンがD2EPであることを特徴とする、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記遺伝子導入型ワクチンと前記蛋白質導入型ワクチンを混合して針無注射器で投与することを特徴とする、請求項１ないし請求項９のいずれか１つの請求項記載の方法。
【請求項１１】
遺伝子導入型導入型ワクチン及び蛋白質導入型ワクチンを同時に生体に投与することにより、当該遺伝子導入型ワクチン又は当該蛋白質導入型ワクチンを単独で投与した時と比較して、生体におけるワクチンの中和抗体誘導能が相乗的に増強していることを特徴とする、ワクチンの投与方法。
【請求項１２】
前記遺伝子導入型ワクチンがDNAワクチンであり、前記蛋白質導入型ワクチンがサブユニットワクチンであることを特徴とする、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記DNAワクチンがコードする蛋白質と、前記サブユニットワクチン中に含まれる蛋白質が、同じ免疫原性を有することを特徴とする、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記中和抗体誘導能の相乗的な増強により、前記遺伝子導入型ワクチン又は前記蛋白質導入型ワクチンを単独で投与した時と比較して、生体において低容量でワクチンとしての有効性を発揮することを特徴とする、請求項１１記載の方法。
【請求項１５】
前記遺伝子導入型ワクチンと前記蛋白質導入型ワクチンが、ウイルス、細菌又は寄生虫に起因する感染症に対するワクチンであることを特徴とする、請求項１１記載の方法。
【請求項１６】
前記遺伝子導入型ワクチンと前記蛋白質導入型ワクチンが、ウイルスに起因する感染症に対するワクチンであることを特徴とする、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
前記遺伝子導入型ワクチンと前記蛋白質導入型ワクチンが、日本脳炎に対するワクチンであることを特徴とする、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
前記遺伝子導入型ワクチンがpcJEMEであり、かつ前記蛋白質導入型ワクチンがJEEPであることを特徴とする、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
前記遺伝子導入型ワクチンと前記蛋白質導入型ワクチンが、デング熱、デング出血熱又はデングショック症候群に対するワクチンであることを特徴とする、請求項１６記載の方法。
【請求項２０】
前記遺伝子導入型ワクチンがpcD2MEであり、かつ前記蛋白質導入型ワクチンがD2EPであることを特徴とする、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
前記遺伝子導入型ワクチンと前記蛋白質導入型ワクチンを混合して針無注射器で投与することを特徴とする、請求項１１ないし請求項２０のいずれか１つの請求項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子導入型ワクチンの投与と同時に蛋白質導入型ワクチンを生体に投与することを特徴とする、遺伝子導入型ワクチンの中和抗体誘導能を増強する方法に関する。更に本発明は、遺伝子導入型ワクチン及び蛋白質導入型ワクチンを同時に生体に投与することにより、遺伝子導入型ワクチン又は蛋白質導入型ワクチンを単独で投与した時と比較して、生体におけるワクチンの中和抗体誘導能が相乗的に増強していることを特徴とするワクチンの投与方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
DNAワクチンは遺伝子導入型ワクチン（gene-based vaccine）の一種であり、目的とする抗原の遺伝子（例えばウイルス遺伝子の断片）を発現プラスミドに組み込んで接種することにより、抗原に特異的な免疫応答を誘導することを特徴としている。DNAワクチンは被接種者の体内で抗原を産生させてそれに対する抗体を誘導するという特徴を有し、次世代のワクチンとして注目を集めている。DNAは安定な物質であり、遺伝子の複製技術を用いることにより大量に安価で提供することが可能であるので、DNAワクチンの実用性は高い。また従来の不活化ワクチンと異なり、DNAワクチンは本来の感染と類似する免疫応答を宿主に誘導することが可能であって、かつ作用が持続的である。更に、DNAワクチンは感染性がなく細胞内で複製しないので、従来の弱毒化ウイルスを用いた生ワクチンに比べて安全性が高いという利点がある。
【０００３】
しかしDNAワクチンは細胞性免疫の誘導には優れるが、液性免疫は効果的に誘導できないという問題があり、そのために中和抗体誘導能の増強が課題となっている。特に日本脳炎やデング熱などの、中和抗体による防御免疫が主体である感染症について、DNAワクチンの免疫原性を増強することが望まれてきた。
【０００４】
DNAワクチンの中和抗体誘導能を増強する試みの一つとして、時期を変えて異なった種類のワクチンを投与することによって免疫原性の増強を行う方法である、プライム・ブースト（prime-boost）法が試みられている。プライム・ブースト法は、まずDNAワクチンによりプライミングを行い、次に蛋白質導入型ワクチン（protein-based vaccine）のような他の型のワクチンを投与して効率的な中和抗体の誘導を行うことを特徴としている方法である。プライム・ブースト法は、例えばエイズの臨床試験などでも用いられており、DNAワクチンの有効性を高めるためのアプローチとして現在注目されている手法の一つである。
【０００５】
なお、上記の蛋白質導入型ワクチンには、殺したウイルスまたは病原細菌を用いる不活化ワクチン、不活化ワクチンの一部構成成分のみを用いる成分ワクチンや、ウイルスの抗原性部分のみを用いるサブユニットワクチンなどが含まれる。蛋白質導入型ワクチンは、上記のDNAワクチンの様に宿主による蛋白質の発現というプロセスを介することはなく、宿主の免疫応答を直接的に引き起こす。そのために、蛋白質導入型ワクチンは中和抗体誘導能が高いという利点を有するが、作用の持続性などではDNAワクチンの方が優れている。
【０００６】
プライム・ブースト法を試みた例として、DNAワクチンでプライミングを行った後に日本脳炎の組み換えウイルスワクチン又は弱毒ワクチンの投与を行ったNamらの報告（非特許文献１）や、デング熱に対するDNAワクチンと蛋白質ワクチンを組み合わせて投与を行ったSimmonnsらの報告（非特許文献２）があるが、これらの報告において明らかな中和抗体誘導の増強は認められなかった。
【０００７】
また異なった型のワクチンを時期を変えて投与を行うという、プライム・ブースト法とは異なったアプローチとして、２種類のワクチンを組み合わせて同時に投与行ったというBiswasらの報告（非特許文献３）もある。その報告の中で、Biswasらは狂犬病ウイルスの不活化ワクチンとDNAワクチンを組み合わせて同時投与を行っている。しかしBiswasらの報告においては、同時投与を２回から５回行っており、中和抗体誘導能は必ずしも満足のいくものではなかった。
【０００８】
【非特許文献１】Nam JH, et al., Immunogenecity of a recombinant MVA and a DNA vaccine for Japanese encephalitis virus in swaine, Microbiol Immunol 2002; 46:23-8
【非特許文献２】Simmons M, et al., Characterization of antibody respones to combinations of a dengue-2 DNA and dengue-2 recombinant subunit vaccine, Am J Trop Med Hyg 2001; 65:420-6
【非特許文献３】Biswas S, et al., Preexposure efficacy of a novel combination DNA and inactivated rabies virus vaccine, Hum Gene Ther 2001; 12:1917-22
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
そこで本発明の課題は、種々の利点を有するDNAワクチンにおいて、その中和抗体誘導能を増強するための新たな方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記の課題を解決するために、本発明者は、DNAワクチンと蛋白質導入型ワクチンを組み合わせて、同時に投与したときの効果を詳細に検討した。その結果、DNAワクチンと蛋白質導入ワクチンの同時投与は、高い中和抗体価を得る目的において有効であるという結果を得た。特に、蛋白質導入ワクチンとして、同時投与するDNAワクチンと同じ免疫原性を有するサブユニットワクチンを用いると、免疫応答を誘導する作用が相乗的に増加し、両者のワクチンの組み合わせによって非常に高い中和抗体価を得ることが可能であった。また本発明の方法においては、２種類のワクチンの同時投与を一回行うだけで十分な効果が認められた。更にDNAワクチンと蛋白質導入型ワクチンを混合して針無注射器で投与することにより、一箇所にワクチンを接種するだけで中和抗体を相乗的に誘導することが可能となった。
【００１１】
そこで本発明は、遺伝子導入型ワクチンの投与と同時に蛋白質導入型ワクチンを生体に投与することを特徴とする、遺伝子導入型ワクチンの中和抗体誘導能を増強する方法である。更に本発明は、遺伝子導入型ワクチン及び蛋白質導入型ワクチンを同時に生体に投与することにより、遺伝子導入型ワクチン又は蛋白質導入型ワクチンを単独で投与した時と比較して、生体におけるワクチンの中和抗体誘導能が相乗的に増強していることを特徴とするワクチンの投与方法である。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、遺伝子導入型ワクチンの投与と同時に蛋白質導入型ワクチンを生体に投与することを特徴とする、遺伝子導入型ワクチンの中和抗体誘導能を増強する方法が与えられた。また本発明により、遺伝子導入型ワクチン及び蛋白質導入型ワクチンを同時に生体に投与することにより、遺伝子導入型ワクチン又は蛋白質導入型ワクチンを単独で投与した時と比較して、生体におけるワクチンの中和抗体誘導能が相乗的に増強していることを特徴とするワクチンの投与方法も与えられた。本発明の方法は、抗体中和誘導能が低いDNAワクチンの有効性を高める目的に有用である。また本発明の方法により高い中和抗体価を得ることが可能であるために、接種するワクチンの量を大幅に減らすことが可能である。また本発明において針無注射器を用いて２種類のワクチンを混合投与することは好ましい態様である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
下記の実施例において、遺伝子導入型ワクチンとして日本脳炎ウイルス中山株の遺伝子を用いて作製したpcJEMEと、デングウイルスニューギニアＣ株から作製したpcD2MEを使用した。また蛋白質導入型ワクチンとして、日本脳炎ウイルス細胞外粒子（EP）であるJEEPと、デングウイルス細胞外粒子（EP）である蛋白質のD2EPを使用した。なお、JEEPとD2EPは本来の粒子と類似のエンベロープから構成されるサブユニットワクチンである。
【００１４】
pcJEMEとpcD2MEは、細胞内で発現したウイルス蛋白質が細胞外に分泌されるように設計されているDNAワクチンであり、分泌された蛋白質はビリオン類似の粒子構造を有しているために細胞外粒子と称される。なお細胞外粒子は精製が容易であるために取り扱いの際に有利である。また、同時投与する蛋白質導入型ワクチンであるJEEPとD2EPもインビトロで産生させた細胞外粒子であるために、DNAワクチンの投与により宿主体内で発現する蛋白質をサブユニットワクチンとして投与していることになる。本発明の態様において、同時投与する蛋白質導入型ワクチンは、DNAワクチンがコードしている蛋白質と同じ免疫原性を有するサブユニットワクチンであることが好ましく、それによって相乗的に中和抗体誘導能を増強するという効果を達成することが可能である。
【００１５】
なお、本願明細書において「中和抗体誘導能」とはワクチンが、ウイルス、細菌又は寄生虫などの抗原に対する免疫応答を引き起こすことにより、それらの抗原に対する防御抗体の産生を誘導する能力を意味する。そして、「中和抗体誘導能が相乗的に増強している」とは、遺伝子導入型ワクチンと蛋白質導入型ワクチンを同時投与した際の中和抗体誘導能が、両者のワクチンをそれぞれ単独に投与した時に得られる中和抗体誘導能の合計以上であることを意味する。
【００１６】
下記の実施例おいて、日本脳炎とデング熱に対するワクチンについて、遺伝子導入型ワクチンと蛋白質導入型ワクチンを組み合わせて同時投与することの有効性を検討したところ、中和抗体誘導作用が顕著に増強していることが確認された。この様な効果は、日本脳炎とデング熱に対するワクチンのみならず、他の疾患に対するワクチンにおいても達成されるものと思われる。
【００１７】
本発明のワクチン投与方法は、日本脳炎とデング熱に対するワクチンを投与するときに有用であるのみならず、種々のウイルスに起因する感染症に対するワクチンを投与するときに有用である。本発明のワクチン投与方法は、成人T細胞白血病ウイルス、EBウイルス、A型肝炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス、黄熱ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、RSウイルス、ポリオウイルス、ヒトコロナウイルス、ヒトエンテロウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、ヒトパピローマウイルス、ヒトパルボウイルス、ヒトレオウイルス、インフルエンザウイルス、ラッサウイルス、ヒトラチノウイルス、水痘−帯状疱疹ウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、ハンタウイルス、ロタウイルス、豚コレラウイルス、狂犬病ウイルスなどのウイルスに起因する感染症に対するワクチンを投与するときに有用である。なお、これらの列挙されたウイルスは単に例示したものであって、その他のウイルスに起因する感染症に対するワクチンを投与するときに本発明の方法を使用する、という態様を除外するものではない。
【００１８】
更にウイルスに起因する感染症に対するワクチンを投与するときだけでなく、細菌や寄生虫に起因する感染症に対するワクチンを投与するときにおいても本発明の方法は有用であると考えられる。本発明のワクチン投与方法は、髄膜炎菌、結核菌、肺炎マイコプラズマ、破傷風菌、ジフテリア菌、ボツリヌス菌、炭疽菌、枯草菌、百日咳菌、赤痢菌、腸炎ビブリオ、黄色ブドウ球菌、化膿連鎖球菌、肺炎球菌、淋菌、破傷風菌、梅毒トレポネーマ、ボレリアブルグドルフィー、チフス菌、レジオネラ菌などの細菌に起因する感染症に対するワクチンを投与するときにも有用である。また本発明のワクチン投与方法は、リーシュマニア、マラリア原虫、トキソプラズマ原虫、トリパノ−マ、赤痢アメーバなどの寄生虫に起因する感染症に対するワクチンを投与するときにも有用である。なお、これらの列挙された細菌と寄生虫は単に例示したものであって、その他の細菌と寄生虫に起因する感染症に対するワクチンを投与するときに本発明の方法を使用する、という態様を除外するものではない。
【００１９】
よって、種々のウイルス、細菌、寄生虫に起因する感染症に対する遺伝子導入型ワクチンを、蛋白質導入型ワクチンと同時に投与することにより、本発明の方法を実施することが可能である。本発明の方法は、広範囲の感染症に対するDNAワクチン等の遺伝子導入型ワクチンの防御抗体を顕著に増強させる新たな方法を与えるものであるので、遺伝子導入型ワクチンを用いた予防法の有効性を増加するための新たな可能性を与えるものであってその意義は大きい。更に本発明の方法は、予防のみならず、感染症に対する治療にも貢献するものと考えられる。
【００２０】
遺伝子導入型ワクチンは好ましくは筋肉内投与又は皮内投与の経路により投与され、一方、蛋白質導入型ワクチンは好ましくは皮下投与の経路により投与される。しかし、投与経路はこれらに限定されるものではなく、遺伝子導入型ワクチンと蛋白質導入型ワクチンがその効果を奏することができる限りにおいて、他の任意の投与経路を用いることも可能である。よって、ワクチンの効果を得ることができるならば、経口投与、経皮投与や経鼻投与等の投与経路も用いることができると考えられ、種々の投与経路を用いて本発明の方法を実施することができる。また、投与方法についても、通常の注射器を用いた方法、針無注射器を用いた方法、肌に塗布する方法、スプレーで噴霧する方法など種々の方法を用いることができる。遺伝子導入型ワクチンを希釈する希釈液の組成や、蛋白質導入型ワクチンに添加するアジュバントなどもワクチンの有効性に影響するが、当業者は本分野の技術常識に照らし合わせてそれらの因子についても種々の改変を行い、最も効果を奏するように工夫を行って本発明を実施することができる。
【００２１】
遺伝子導入型ワクチンの投与量と蛋白質導入型ワクチンの投与量の比率は特に限定されるものではなく、両者を同時投与することにより免疫応答を誘導するという本発明の効果を達成するために最も適切な比率を適宜設定することができる。下記の実施例において、日本脳炎ウイルスのワクチンであるpcJEME（DNAワクチン）50μgとJEEP（サブユニットワクチン）10μgを組み合わせて同時投与すると最も効果が高い、という知見が得られている。投与される２種のワクチンの比率はそれに限定されるものではなく、当業者は本分野の技術常識に基づいて最も有効な比率を決定することが可能である。
【００２２】
本発明の方法において、遺伝子導入型ワクチンと蛋白質導入型ワクチンの同時投与による効果は１回の投与でも十分に得ることができる。しかし、複数回に分けてワクチンの投与を行うことにより、更に顕著な効果を得ることが期待できる。複数回に分けてワクチンの投与を行う場合には、投与の間隔は一般的には1週間から5週間程度であるが、その間隔に限定されるものではなく、最も適切な投与回数と投与間隔を任意に設定することができる。そして、ワクチンを投与した後、一般的には３週間から１５週間程度で最も高い中和抗体価を得ることができる。
【００２３】
本発明において相乗的な効果が得られる背景には、抗原性を有する比較的多量の蛋白質導入型ワクチンによって起こる初期の免疫応答と、遺伝子導入型ワクチンの投与により宿主細胞から分泌される少量の蛋白質により起こる長期の免疫応答が存在すると推定される。これによって両者の中和抗体誘導能を相互促進し合い、１回の投与によっても所謂「ブースト」をかけた場合と同様の強い免疫応用が誘導される。蛋白質導入型ワクチンであるサブユニットワクチンと、遺伝子導入型ワクチンであるDNAワクチンが同じ免疫原性を有するものであるときに、このようなメカニズムが最も有効に働くために、顕著な中和抗体誘導能が得られると考えられる。上記のBiswasらの文献（非特許文献３）においては、DNAワクチンと共に投与したのは狂犬病ウイルスの不活化ワクチンであるために、投与された２種のワクチンの免疫原性は同一とは言えない。よって本発明は、DNAワクチンの中和抗体誘導能を効率的に誘導するための優れた方法を新たに与えるものである。
【００２４】
下記の実施例１においては、遺伝子導入型ワクチンについては筋肉内投与、蛋白質導入型ワクチンについては皮下投与という２つの投与ルートを組み合わせて同時投与を行っている。しかし接種部位を一箇所に減らすことができるならば、臨床への応用においてその意義は大きいと考えられる。なお現行のワクチン接種においては複数回の追加免疫が必要である。
【００２５】
近年、注射器先端部の突端に設けられたジェット噴射口から強い圧力で薬液をジェット噴射することにより、注射針を使わずに薬液を皮膚から体内に注入することが可能な、ジェット噴射式針無注射器が開発されてきている。このジェット噴射式針無注射器は、殆ど無痛で薬液を簡単に注射することができるので、例えば糖尿病患者が日常的にインスリンを自分で注射（自己注射）するのにも使われている。なお、針無注射器を用いてDNAワクチンを投与するとDNAの導入効率が高まるとも言われているが、それは通常の針付注射器より多くの細胞にワクチンDNAが導入されるためであると考えられる。
【００２６】
そのような針無注射器に注目し、投与のルートを減らす事とDNAの導入効率を高める事を目的として、本発明者らは、２種類のワクチンを混合して針無注射器で投与した（実施例２）。その結果、針無注射器を用いて遺伝子導入型ワクチンと蛋白質導入型ワクチンの混合投与を行うと中和抗体誘導能の相乗的な上昇が認められた。よって針無注射器を用いた混合投与により、１回の接種により長期持続的な中和抗体価を維持することが可能となった。
【００２７】
針無注射器を用いた混合投与の系でDNAワクチンを投与するとDNAが宿主動物細胞に導入される効率が高くなる。それに加えて、下記の実施例において示すように、DNAに含まれるCpGモチーフがアジュバント作用を有しており、これらの作用が針無注射器による混合投与時に免疫原性が相乗的に上昇する一因であると考えられる。
【００２８】
本発明において使用される針無注射器は、特に限定されるものではなく、医療目的などにおいて一般的に使用されているものを中心として、注入するDNAワクチンの量やDNAワクチンを注入する組織に合わせて種々のものを採用することができる。なおジェット噴射式針無注射器（needle-free jet injector）を使用することは本発明において特に好ましい態様である。本発明の目的における使用に適した針無注射器の例としては、島津製作所から提供されるシマジェット、バイオインジェクト社から提供されるバイオインジェクター2000、メディジェクト社から提供されるメディジェクターチョイス、アクティバブランドプロダクト社から提供されるアドバンタジェットアクティバ、マーダインターナショナル社から提供されるマーダジェットXLなどを挙げることができるが、それらに限定されるものではない。なお、外来遺伝子を導入する目的で遺伝子銃（ジーンガン）による投与方法が用いられているが、本発明の針無注射器は所謂「ジーンガン」とは異なっており、それを意味するものではない。
【００２９】
またDNAワクチンを針無注射器により投与する経路は特に限定されるものではない。DNAワクチンは一般的には筋肉内投与又は皮内投与の経路により投与されるので、かかる投与経路を採用することは本発明において好ましく、DNAワクチンを筋肉内投与することは特に好ましい。しかし、DNAワクチンとしての効果を得ることができるならば、必要に応じて他の経路により投与することも理論的には可能である。
下記の実施例や図面を用いて本発明を更に詳しく説明するが、その記載は本発明の範囲を何ら限定するものではない。
【実施例１】
【００３０】
（DNAワクチンとサブユニットワクチンの同時投与の検討）
DNAワクチンとして、日本脳炎ウイルスprM/E遺伝子をpcDNA3ベクターに組み込んで作製したpcJEMEと、DEN2ウイルスのニューギニアC（NGC）株prM/E遺伝子をpcDNA3ベクターに組み込んで作製したpcD2MEを用いた。サブユニットワクチンとしては、日本脳炎ウイルス細胞外粒子（EP）であるJEEPと、デングウイルス細胞外粒子（EP）であるD2EPを用いた。なお、JEEPのサブユニットワクチンを作製するために細胞をプラスミドpcJEEPトランスフェクトした。また、D2EPのサブユニットワクチンを作製するために細胞をプラスミドがpcD2EPでトランスフェクトした。細胞外粒子は、細胞外粒子連続発現株の培養上清から、ポリエチレングリコール沈殿及び蔗糖密度勾配遠心により精製することにより調製した。pcJEMEの塩基配列を配列表の配列番号１に、pcJEEPの塩基配列を配列表の配列番号２に、pcD2MEの塩基配列を配列表の配列番号３に、pcD2EPの塩基配列を配列表の配列番号４にそれぞれ示す。
【００３１】
４週齢のICRまたはddYマウス（各群５匹）にDNAワクチンとサブユニットワクチンを接種した。pcJEMEとpcD2MEについては筋肉内に50μg接種した。JEEPとD2EPについてはフロインドの完全アジュバントと調合して、皮下に0.1μgから10μgを接種した。これら２種の免疫原を単独あるいは２種同時に１回接種した後に、接種マウスから１５週にわたり３週毎に採血し、血清中の中和抗体価を測定した。
【００３２】
図１は、日本脳炎ウイルスに対するワクチンを同時投与した効果を検討した結果であって、50μgのpcJEME（□で示す）又は10μgのJEEP（▲で示す）を単独で１回、また両ワクチンを同時に投与した群（●で示す）のプール血清における中和抗体価の経時的変化を示す。50μgのpcJEME又は10μgのJEEPを投与した群は、1:10又は1:20の中和抗体価であったのに対して、両ワクチンを同時に投与した群の中和抗体価は最高で1:160であり、同時投与の効果は顕著であった。投与後９週目における各群内の個体による変動は、プール血清で得られた中和抗体価から２倍以内の範囲であり、同時に投与した群における中和抗体価の上昇は、統計的に有意であることが示された。
【００３３】
また、pcJEME及びJEEPの濃度を変えてICRマウスの免疫を行って誘導された中和抗体価の比較を行った。結果を下記の表１に示す。各群5匹の４週齢マウスに、記載した投与量（表１a）でpcJEME及びJEEPを接種した。また対照として50μgのpcDNA3及びアジュバントと調合したリン酸緩衝生理食塩水を投与した（表１b）。免疫原投与の後、3週目、６週目、９週目（表１c）の中和抗体価を測定した。表１において、1.7μgのpcJEMEと0.3μgのJEEPの同時投与は、50μgのpcJEMEまたは10μgのJEEPの単独投与と同等の中和抗体誘導能を示し、DNAワクチンまたはサブユニットワクチンの単独投与と比較して、少量のワクチンの投与によって高い中和抗体価を得ることができた。
【００３４】
【表１】
2004307477.tif 000002
【００３５】
図２はデングウイルスに対するワクチンの同時投与の効果を検討した結果であって、50μgのpcD2ME（□で示す）又は150ngのD2EP（▲で示す）を単独で１回、また両ワクチンを同時に投与した群（●で示す）のプール血清における中和抗体価の経時的変化を示す。対照として、50μgのpcDNA3及びアジュバントと調合したリン酸緩衝生理食塩水を投与した群を併せて示す（×で示す：control）。デングウイルスに対するワクチンにおいても、同時投与することにより、ICR（上段）及びddY（下段）の両系統のマウスにおいて、単独投与より4倍から16倍以上の高い中和抗体価が誘導され、相乗的に中和抗体が誘導されることが示された。
【実施例２】
【００３６】
（針無注射器を用いた投与の検討）
更にDNAワクチンであるpcJEMEとサブユニットワクチンであるJEEPを組み合わせて針無注射器で投与することを試みた。４週齢のddYマウスを、針無注射器を用いてpcJEMEとJEEPを混合投与し、pcJEMEまたはJEEPの単独で免疫したマウスと、中和抗体価を９週間比較した(図３)。pcJEMEのドーズは一定にし(1μg)、JEEPのドーズは0.001-1μgの間で変化させた。
【００３７】
1μgのpcJEMEと1μgのJEEPを組み合わせた場合には、誘導された中和抗体価は1:20から1:80であった（図３Ａ）。一方pcJEMEとJEEPの単独によって誘導された中和抗体は検出限界以下（1:10以下）であるか、あるいは低レベル（1:10）であった。同様に1μgのpcJEMEと0.1μgのJEEPを組み合わせた場合にも中和抗体が誘導された（図３Ｂ）。なお単独投与では中和抗体の誘導は認められなかった。DNAワクチンとサブユニットワクチンの混合物により誘導された中和抗体レベルは、JEEPのドーズに依存していた（図３Ｃ）。これらの結果は、pcJEMEとJEEPを組み合わせて針無注射器で免疫することにより中和抗体価が相乗的に上昇することを示している。
【００３８】
更にJEEPの代わりに、マウス脳由来の日本脳炎不活化ワクチンであるJEVAX（武田薬品工業株式会社から購入）を用いて試験した。針無注射器を用いてpcJEMEとJEVAXをマウスに混合投与した場合と単独投与した場合の中和抗体価を比較した（図４）。pcJEMEについては0.1μgから10μg、JEVAXについてはヒトに使用するドーズの1/1000から1/10を使用した。10μgのpcJEMEと1/10ドーズのJEVAXを組み合わせて混合投与した場合には、誘導された中和抗体価は1:80から1:160であった（図４Ａ）。一方、pcJEMEまたはJEVAXを単独投与した際の中和抗体価は、pcJEMEについては1:40であり、JEVAXについては1:10であった。なお10μgのpcJEMEと1/10ドーズのJEVAXを混合投与した群の中和抗体価を投与後２１週まで調べたところ、1:160の中和抗体価が維持されていた。
【００３９】
1μgのpcJEMEと1/100ドーズのJEVAXを組み合わせた時には、混合投与の効果はより顕著であった（図４Ｂ）。単独投与では中和抗体価は検出限界以下であったのに対して、pcJEMEとJEVAXの混合投与により1:20から1:80の中和抗体価の中和抗体が誘導された。pcJEMEとJEVAXの混合投与によって誘導される中和抗体レベルは、これらのワクチンのドーズが減少するにつれて低下した（図４Ｃ）。これらの結果は、pcJEMEとJEVAXを混合して針無注射器のシステムで投与すると、はやり相乗的な効果が得られることを示している。
【００４０】
更にDNAに含まれるCpGモチーフのアジュバント作用が、針無注射器を使用した混合投与時における相乗的な中和抗体価上昇に影響しているかについて調べた（図５）。1/10ドーズのJEVAXと、空のベクターであるpcDNA3（7.3μgまたは0.73μg）又はpcJEME（10μgまたは1μg）を針無注射器で投与を行った。なお分子量から換算すると、10μgと1μgのpcJEMEに含まれるCpGモチーフのモル数は、pcDNA3のそれぞれ7.3μgと0.73μgに含まれるCpGモチーフのモル数に相当する。
【００４１】
10μgのpcJEMEと1/10ドーズのJEVAXの混合投与により誘導された中和抗体価は、1/10ドーズのJEVAX単独（1:10以下または1:10、図５Ｃ、●で示す）と比較して４倍以上（1:40から1:80，図５Ａ、●で示す）であった。この条件下で、7.3μgのpcDNA3と1/10ドーズのJEVAXを混合投与すると中和抗体価は1:20（図５Ａ、○で示す）であった。この結果は、pcJEMEとJEVAXを混合投与した際の免疫原性の増強効果は、ある程度ベクターに由来するものであることを示唆している。また図５Ｂに、1μgのpcJEMEとJEVAX（1/10ドーズ）の混合投与（図５Ｂ●）と、0.73μgのpcDNA3とJEVAXの混合投与（図５Ｂ○）の結果を示す。この結果も、CpGモチーフの効果が部分的であることを示している。
【産業上の利用可能性】
【００４２】
遺伝子導入型ワクチンの投与と同時に蛋白質導入型ワクチンを生体に投与することにより、ワクチンの中和抗体誘導能を相乗的に増強することが可能となった。またそれら２種類のワクチンを針無注射器で混合投与することにより、一箇所に接種するのみで中和抗体能の増強を達成することが可能となった。従来の技術では複数回の投与が必要であり、且つ本発明の方法によりワクチンの摂取用量を減らすことができることを考えると、医薬分野において本発明の有用性は高いと考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】図１は、日本脳炎ウイルスに対するDNAワクチン（pcJEME）とサブユニットワクチン（JEEP）を同時投与した際の中和抗体価の経時的変化を示すグラフである。
【図２】図２は、デングウイルスに対するDNAワクチン（pcD2ME）とサブユニットワクチン（D2EP）を同時投与した際の中和抗体価の経時的変化を示すグラフである。
【図３】図３は、日本脳炎ウイルスに対するDNAワクチン（pcJEME）とサブユニットワクチン（JEEP）を混合して針無注射器で投与した際の中和抗体価の経時的変化を示すグラフである。
【図４】図４は、日本脳炎ウイルスに対するDNAワクチン（pcJEME）と市販の不活化ワクチン（JEVAX）を混合して針無注射器で投与した際の中和抗体価の経時的変化を示すグラフである。
【図５】図５は、針無注射器を用いて混合投与した際の相乗的な中和抗体価誘導に、空のベクターであるpcDNA3が及ぼす影響を示すグラフである。
【図１】
2004307477.tif 000003
【図２】
2004307477.tif 000004
【図３】
2004307477.tif 000005
【図４】
2004307477.tif 000006
【図５】
2004307477.tif 000007
【配列表】
2004307477000001.xml