(57)【要約】【課題】大腸菌を用いた遺伝子組換えによるＳ−ヒドロキシニトリルリアーゼの効率的な製造方法を提供する。【解決手段】キャッサバ（Manihot esculenta）由来Ｓ−ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子中のコドンを、そのアミノ酸配列を変化させることなく、大腸菌におけるアミノ酸ごとのコドンの使用頻度が５％以上となるように改変した遺伝子である。また、当該遺伝子を使用したＳ−ヒドロキシニトリルリアーゼの製造方法によれば、極めて効率よく、大量のＳ−ヒドロキシニトリルリアーゼを製造することができる。【選択図】            なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
キャッサバ（cassava, Manihot esculenta Crantz）由来Ｓ−ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子中のコドンを、そのアミノ酸配列を変化させることなく、大腸菌におけるアミノ酸ごとのコドンの使用頻度が５％以上となるように改変した遺伝子。
【請求項２】
配列番号２の塩基配列からなるＤＮＡ  。
【請求項３】
請求項１または２に記載の遺伝子を含有する組換えベクタープラスミド遺伝子。
【請求項４】
ｐＥＴベクターに請求項１または２に記載の遺伝子を挿入した組換えベクタープラスミド遺伝子。
【請求項５】
請求項３または４に記載の組換えベクタープラスミド遺伝子を含む大腸菌。
【請求項６】
請求項５に記載の大腸菌を温度０〜３５℃で培養し、得られた培養物からＳ−ヒドロキシニトリルリアーゼを採取する、当該酵素の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、Ｓ−ヒドロキシニトリルリアーゼをコードするＤＮＡを含有する遺伝子、該遺伝子を有する組換えベクタープラスミド遺伝子、およびこの組換えベクタープラスミド遺伝子を含む大腸菌に関する。さらに、本発明は、上記遺伝子を組み込んだ組換え大腸菌によるＳ−ヒドロキシニトリルリアーゼの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
キャッサバ由来のＳ−ヒドロキシニトリルリアーゼ（ＥＣ  ４．１．２．３７）は、芳香族または脂肪族のカルボニル化合物とシアン化水素から光学活性なＳ−シアノヒドリンを合成するために有効な酵素である。本酵素を用いた光学活性シアノヒドリンの合成は、種々の光学活性中間体を合成する上できわめて有用である。しかしながら、本酵素はキャッサバ（Manihot esculenta）、バラゴムノキ（Hevea brasiliensis）などの組織に微量含まれるに過ぎず、工業的に利用することは困難であった。
【０００３】
この課題を解決するため、従来、キャッサバ由来のＳ−ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする遺伝子を組み込んだ組換え大腸菌を培養することによって、該酵素を製造した例が知られている（例えば、非特許文献１参照。）。しかし、この方法では、ｍａｌＥ遺伝子とＨＮＬ遺伝子とをポリリンカーで結合したベクターを用い、大腸菌内で得られた融合タンパク質を単離した後、ポリリンカーのＦａｃｔｏｒＸａ部位で切断し、ＨＮＬタンパク質を得るため、本来のキャッサバ由来Ｓ−ヒドロキシニトリルリアーゼのＮ末端に数個のアミノ酸が付加した組換えタンパク質となり、タンパク質の折りたたみがうまく起こらず、本来のタンパク質とは異なる性質を示す結果となっていた。また、真核生物由来の遺伝子を原核生物である大腸菌に組み込んでいるため、得られた組換えタンパク質の比活性も十分ではなかった。
【０００４】
このため、真核細胞である酵母（サッカロマイセス属もしくはピキア属）を宿主として、バラゴムノキ由来のＳ−ヒドロキシニトリルリアーゼを同様に遺伝子組換えにより製造した例が知られている（例えば、特許文献１参照。）。しかし、この方法では、培養時間が長期に及ぶうえ、酵母は細胞壁が堅く、細胞破砕による組換えタンパク質の回収が困難であるという問題点があった。
【０００５】
また同様に、酵母（サッカロマイセス属もしくはピキア属）を宿主として、酵母エピソーム型発現ベクターを用いることにより、キャッサバ由来のＳ−ヒドロキシニトリルリアーゼを組換えにより製造した例が知られている（例えば、特許文献２および３参照。）。しかし、この方法においても、比活性は十分ではなかった。
【０００６】
【特許文献１】
特表平１１−５０８７７５号公報
【特許文献２】
特開２０００−１８９１５９号公報
【特許文献３】
特開２０００−１８９１６０号公報
【非特許文献１】
Biotechnol. Bioeng. 53, 332-338, 1997
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
このような現状のもと、大量培養が容易で目的とする遺伝子やタンパク質を大量に製造できること、酵母に比べ細胞壁が薄く細胞破砕により容易に組換えタンパク質が得られること、および目的とする遺伝子やタンパク質の精製方法がよく確立されていることなどを考慮すると、大腸菌を用いた遺伝子組換えによるＳ−ヒドロキシニトリルリアーゼの効率的な製造方法の開発が望まれる。
【０００８】
また、単にＳ−ヒドロキシニトリルリアーゼの発現量を増加させたとしても、大腸菌などの宿主内で外来タンパク質を大量に生産する際には、分子シャペロンなどによる翻訳産物の折りたたみが正常に機能しないため、外来タンパク質の不活性体の塊、いわゆる封入体が形成されることが多い。封入体は、目的物の三次元構造が変化したものであり、目的物本来の活性に影響が現れる。このため、リフォールディング処理などを行う必要が生じる。したがって、このような封入体の形成されない製造方法が望まれる。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ここで、キャッサバ由来のＳ−ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする遺伝子を、大腸菌において、該タンパク質の翻訳の際にそのアミノ酸配列を変化させることなく、より使用頻度の高いコドンが使用されるように改変することにより、大腸菌において高い翻訳効率を有する遺伝子を作製して、これを大腸菌に組み込むことにより、従来よりも大量にＳ−ヒドロキシニトリルリアーゼを製造することに成功し、本発明を完成させるに至った。また、該大腸菌を温度０〜３５℃で培養することで、発現量を高め、かつ封入体の形成を抑制して、効率的にＳ−ヒドロキシニトリルリアーゼが製造できることを見出し、本発明を完成させた。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１１】
本発明の第一は、下記配列番号１で示すキャッサバ由来Ｓ−ヒドロキシニトリルリアーゼ（以下、「ＳＨＮＬ」とも称する）遺伝子中のコドンを、そのアミノ酸配列を変化させることなく、大腸菌におけるアミノ酸ごとのコドンの使用頻度が５％以上となるように改変した遺伝子である。
【００１２】
【配列番号１】
2004194550.tif 000002
アミノ酸は、コドンと称される３つの塩基の組み合わせによって特定されるが、一つのアミノ酸に対応するコドンは一つに限定されず、通常複数存在する。例えば、ＡｒｇはＣＧＵ、ＣＧＣ、ＣＧＡ、ＣＧＧ、ＡＧＡ、ＡＧＧの６種のコドンに対応し、ＬｙｓはＡＡＡ、ＡＡＧの２種のコドンにのみ対応する。遺伝子の翻訳の際に使用されるコドンの使用頻度は種によって異なることが知られており、一般に、使用頻度の著しく低いコドンが存在すると、翻訳速度が低下し、発現量も低下する。
【００１３】
ＳＨＮＬはキャッサバ由来であり、キャッサバにおけるコドン使用頻度に応じたコドンが使用されるため、従来、これを大腸菌の遺伝子組換えにより製造する際、原核生物と真核生物との遺伝子の翻訳の際に使用されるコドンの使用頻度に大きな差があり、翻訳効率を低下させる原因となっていた。
【００１４】
しかしながら、本発明の遺伝子は、上記配列番号１で示されるＳＨＮＬをコードする遺伝子（以下、「Ｏｒｉ遺伝子」とも称する）の塩基配列をもとに、そのアミノ酸配列を変化させることなく、大腸菌におけるアミノ酸ごとのコドンの使用頻度が５％以上となるように改変することで、ＳＨＮＬの発現量を増加させることができ、また、コードするアミノ酸が変化しないことから、得られるタンパク質は本来のＳＨＮＬとアミノ酸配列が全く同じである。
【００１５】
本発明において、使用頻度とは、大腸菌体内で発現する全ての遺伝子に含まれる全コドン中の、同種アミノ酸をコードするコドンの使用回数に対する１つのコドンの使用回数の百分率をいう。
【００１６】
ここで、改変した遺伝子のコドンのうち、大腸菌における使用頻度が最も低いコドンの使用割合が５％以上、より好ましくは７％以上となるようにする。５％を下回ると発現量の増加が少ない場合があるためである。ここで、本発明におけるコドンの使用頻度としては、表１に示すように、コドンの使用頻度がデータベース化されている大腸菌株、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  Ｃｏｌｉ  Ｋ−１２  ＭＧ１６５５（ＸａｎａＧｅｎｏｍｅ（Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ）参照）のコドン使用頻度データを利用するものとする。しかしながら、表１のデータにおける使用頻度とは、発現する全ての遺伝子がもつコドンの平均である。したがって通常ほとんど使用されない遺伝子も頻度算出に用いられているため、このデータに従って遺伝子を改変しても、高発現に充分でない場合がある。そこで、これに加えて、表２に示す、大腸菌由来の高発現遺伝子の一つであるＬ−アスパルターゼ構造遺伝子のコドン使用回数に従って、さらに使用回数の多いコドンへと改変を行ってもよい。この表は大腸菌のＬ−アスパルターゼ遺伝子の塩基配列（Nucleic Acids Research, 13(6), 2063-2074）をもとに、その翻訳領域におけるコドンの使用回数を計数し、Ｌ−アスパルターゼ遺伝子の全コドンに対する各コドンの百分率を算出し、対応するアミノ酸とともに示したものである。ここで、表２において、例えば「ＴＴＴ−Ｐｈｅ  ２（０．４２）」とあるのは、大腸菌由来のＬ−アスパルターゼ遺伝子においてＰｈｅをコードするコドンのうち、ＴＴＴによるものは２つあり、該遺伝子の全コドンの０．４２％に相当するということを示している。
【００１７】
より具体的には、本発明では例えば、Ｏｒｉ遺伝子において、表１に従いＡｒｇをコードする使用頻度が２．２３％であるコドンＡＧＧを、使用頻度が３７．８９％であるコドンＣＧＵへ改変し、上記５％以上の範囲内で、さらに表２に従って、例えば使用回数が２回であるＰｈｅをコードするコドンＴＴＴを、使用回数が１１回であるコドンＴＴＣへ改変し、上記のコドン使用頻度を調整することができる。
【００１８】
【表１】
2004194550.tif 000003
【００１９】
【表２】
2004194550.tif 000004
【００２０】
また一般に、組換えタンパク質が生産されると、その毒性などにより細胞が悪影響を受け、結果として最終的な細胞密度が低くなるが、後記実施例に示すように、本発明の遺伝子を低温培養下で発現させると、細胞密度の低下が起こらないばかりか、組換えタンパク質の生産されない非組換え株よりも高い細胞密度を達成することができることを発見した。
【００２１】
さらに、本発明の最も好ましい形態は、以下の配列番号２で示されるＤＮＡである。該遺伝子によれば、活性型ＳＨＮＬの収率に優れる。
【００２２】
【配列番号２】
2004194550.tif 000005
本発明の第二は、上記した本発明の遺伝子を含有する組換えベクタープラスミド遺伝子である。
【００２３】
本発明において、組換えベクタープラスミド遺伝子は、上記本発明の遺伝子を、適当な制限酵素で切断した発現用ベクター中に連結することによって調製できる。
【００２４】
また、本発明における組換えベクタープラスミド遺伝子の形態としては、プラスミド、コスミド、人工染色体、またはファージなどが挙げられる。さらに、本発明における組換えベクタープラスミド遺伝子は、本発明の遺伝子で形質転換された大腸菌を選択できるような一以上の選択マーカーを含むものであってもよい。このような選択マーカーの例としては、カナマイシン、アンピシリン、テトラサイクリン、クロラムフェニコールなどの抗生物質が挙げられるがこれに限定されない。
【００２５】
また、本発明において、組換えベクターは、本発明の遺伝子を発現させるプロモーターまたは他の制御配列、例えば、細菌発現用のリボソーム結合部位、ポリアデニル化シグナル、転写終止配列、上流制御領域、エンハンサー、オペレーターやシグナル配列等が本発明の遺伝子に連結されるものであることが好ましい。このようなプロモーターまたは他の制御配列は、本発明の遺伝子を発現できるものであれば特に制限されることなく、当該分野において既知のものが使用される。具体的には、Ｔ７プロモーター、Ｌａｃプロモーター、Ｔａｃプロモーターなどが挙げられる。組換えベクターは、上記制御配列に加えて、タンパク質の発現を調節できる調節配列を含むものであってもよい。
【００２６】
さらに、本発明のより好ましい形態は、本発明の遺伝子を含む組換えベクターとして、ベクターｐＥＴ、ベクターｐＫＫ２２３−３を用いるものであり、最も好ましくはベクターｐＥＴを用いるものである。これは、本発明の遺伝子の効果は組換えタンパク質の翻訳速度を向上させることにあり、したがってＤＮＡからｍＲＮＡへの転写速度が律速段階となれば、本発明の遺伝子による生産性向上効果は期待されなくなってしまうため、より強力なプロモーターを有するベクターを探索した結果である。
【００２７】
ＳＨＮＬ遺伝子が挿入されたプラスミドの調製方法としては周知の方法を利用することができる。例えば本発明の遺伝子は、通常知られている方法により合成することができ、ベクターに組み込むため、適当な制限酵素の切断部位を両末端に含むように、プライマーを用いてＰＣＲ法により増幅してもよい。ＰＣＲ反応の条件は、当業者が適宜決定することができるが、例えば９８℃で３０秒間の変性、５７℃で１５秒間のアニーリング、７４℃で３０秒間の重合を１サイクルとして３０サイクル反応させ、増幅された遺伝子を得ることができる。
【００２８】
本発明の遺伝子を含むＤＮＡ断片を組換えベクターに挿入するために、上記のベクターに適当な制限酵素を作用させればよく、当該制限酵素は、挿入されるＤＮＡ断片とライゲーションし得るような末端を生じるものであれば、いずれのものを用いてもよい。制限酵素による消化反応の反応温度、反応時間などの反応条件は、選択した酵素に応じて適宜条件設定することができる。また、これらのベクターを、必要とあればボイル法、アルカリＳＤＳ法などの精製手段により精製し、さらにたとえばエタノール沈殿法、ポリエチレングリコール沈殿法などの濃縮手段により濃縮することができる。
【００２９】
前記処理工程において、挿入ＤＮＡ断片とベクターを消化するための制限酵素の組み合わせとしては、この技術分野でそれ自体公知の組み合わせを適宜使用することができる。
【００３０】
次いで、増幅された本発明の遺伝子と前記のベクターを混合し、これにリガーゼ、たとえばＴ４ＤＮＡリガーゼ、大腸菌由来ＤＮＡリガーゼを作用させて組換えベクタープラスミド遺伝子を得ることができる。好ましくは市販のライゲーションキット、たとえばライゲーションｈｉｇｈ（東洋紡株式会社製）を用いて、規定の条件にてライゲーション反応を行なうことにより組換えベクタープラスミド遺伝子を得ることができる。
【００３１】
次いで、本発明の遺伝子を発現させるため、得られた遺伝子を含む組換えベクタープラスミド遺伝子を用いてコンピテントセルを形質転換させる。本発明におけるコンピテントセルとしては、ｐＥＴシステムによるタンパク質発現が行えない菌株であって、形質転換効率の高いものであれば制限なく使用することができるが、例えば大腸菌ＤＨ５αコンピテントセルを用いることができる。大腸菌ＤＨ５αは、毒性を考慮せず菌株構築ができ、また形質転換効率も高いため、本発明において好ましく使用される。本発明の遺伝子を含む組換えベクタープラスミド遺伝子によるコンピテントセルの形質転換には、通常用いられるケミカルコンピテントセル法、エレクトロポレーション法などを用いることができる。
【００３２】
本発明の遺伝子により形質転換した大腸菌は、そのベクタープラスミド遺伝子が有するマーカー遺伝子により、例えば、アンピシリン、カナマイシンなどの抗生物質を含むＬＢ培地寒天プレート上でコロニーを形成することにより選抜することができるが、クローニングされた大腸菌が本発明の遺伝子により形質転換されたものかどうかを確認するため、一部を用いて、ＰＣＲ法によるインサートの増幅確認、またはシーケンサーを用いたダイデオキシ法による配列解析をしてもよい。
【００３３】
上記方法で得られた、本発明の遺伝子により形質転換された大腸菌は、適当な培地で培養し、組換えベクタープラスミド遺伝子を大量に得ることができる。培地としては、通常用いられるＬＢ液体培地、Ｍ９培地などを用いることができる。また、周知の方法を用いて組換えベクタープラスミド遺伝子を回収することができるが、好ましくは、プラスミド回収キット、例えばQIAprep（登録商標）Spin Mini prep kit（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、規定の条件で組換えベクタープラスミド遺伝子を得ることができる。
【００３４】
本発明の第三は、上記した本発明の組換えベクタープラスミド遺伝子を含む大腸菌である。
【００３５】
本発明における大腸菌は、本発明の組換えベクタープラスミド遺伝子により、大腸菌を形質転換することによって調製される。使用する大腸菌は、本発明の遺伝子を含むベクタープラスミド遺伝子により形質転換でき、本発明の遺伝子を発現させることができるものであれば、特に制限されることはない。
【００３６】
さらに、本発明のより好ましい形態は、本発明の組換えベクタープラスミド遺伝子を含む大腸菌として、ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞、ＢＬ２１ｐｌｕｓＳ細胞、ＯｒｉｇａｍｉＢ２等を用いるものであり、中でも生産性に優れる点でＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を用いるものが最も好ましい。
【００３７】
本発明の第四は、本発明の遺伝子を組み込んだ大腸菌を、通常大腸菌の培養に用いられる３７℃よりも低い０〜３５℃で培養することを特徴とする、Ｓ−ヒドロキシニトリルリアーゼの製造方法である。
【００３８】
本発明において、本発明の遺伝子を含む組換えベクタープラスミド遺伝子を、大腸菌に形質転換により導入し、温度０〜３５℃で培養することで、活性型ＳＨＮＬを収率よく、しかも効率的に製造することができる。
【００３９】
形質転換体である大腸菌の培養形態は、大腸菌の栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すればよく、多くの場合は液体培養で行うことができる。工業的にはジャーファーメンターなどによる通気攪拌培養を行うのが有利である。
【００４０】
培地の栄養源としては、大腸菌の培養に通常用いられるものを広く使用することができる。炭素源としては資化可能な炭素化合物であればよく、例えば、グリセリンなどのポリオール類、またはピルビン酸、コハク酸もしくはクエン酸等の有機酸類を使用することができる。また、窒素源としては利用可能な窒素化合物であればよく、例えば、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物、大豆粕アルカリ抽出物、またはアンモニアもしくはその塩などを使用することができる。その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミン、消泡剤なども必要に応じて使用してもよい。また、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドなどのタンパク質発現誘導剤を必要に応じて培地に添加してもよい。
【００４１】
培養温度は菌が成育し、ＳＨＮＬを生産する範囲で適宜変更してもよいが、本発明では０〜３５℃、より好ましくは１０〜２７℃、特に好ましくは１０〜１９℃である。一般に、大腸菌は３７℃にて培養を行うのが通例であるが、３５℃を超えると、封入体、すなわち不活性型ＳＨＮＬが増加するため、効率的なＳＨＮＬの製造が困難となる。一方、０℃を下回ると、菌の増殖速度が著しく低下し、ＳＨＮＬ全量の生産量が低下する。これは、０〜３５℃という低温で培養することにより、大腸菌の増殖が抑制され、ＳＨＮＬの翻訳スピードが低下し、ＳＨＮＬが本来の三次元構造を形成する時間が確保でき、その結果不活性なＳＨＮＬの封入体の形成を抑制して、可溶性の活性ＳＨＮＬが効率よく得られると考えられるからである。また、低温培養によれば、培養液中の飽和溶存酸素濃度が相対的に高まるばかりではなく、菌体の増殖速度が抑えられることによる酸素消費速度の低下により、溶存酸素濃度が急激に低下せずにエネルギー効率のよい好気的環境が維持される。すなわち、培養液中の溶存酸素濃度は、発現系として使用される宿主の性質に合わせて適宜変更することができるが、本発明のように大腸菌を宿主とする場合、培養液中の溶存酸素濃度を０ｐｐｍ超に維持するとエネルギー効率を向上させ、少ない栄養源で大量のＳＨＮＬを製造することができる。本発明では低温培養により、大腸菌の急激な増殖を抑制することで併せて好気的環境を維持することができ、栄養源利用の効率を向上し、ＳＨＮＬを高収率で製造することができる。
【００４２】
培養時間は条件によって多少異なるが、通常、ＳＨＮＬ活性は、細胞増殖が定常期に入った後に最高値を取り、その後急速に減少する。したがって細胞の増殖が定常に達した時点で細胞回収を行うのが最も好ましく、通常は４８〜６６時間程度である。また、培地のｐＨは菌の発育が可能で、生産されたＳＨＮＬの活性が損なわれない範囲で適宜変更することができるが、好ましくはｐＨ４〜８程度の範囲である。
【００４３】
培養物中のＳＨＮＬを回収する方法としては、常法に従って、得られた培養物からろ過、遠心分離などの手段により菌体を採取し、次いで、この菌体を機械的方法、リゾチームなどを用いた酵素的方法または界面活性剤などを用いた化学的処理によって破壊し、また、必要に応じて、ＥＤＴＡ等のキレート剤、界面活性剤などを添加してＳＨＮＬを可溶化し、水溶液として分離採取することができる。
【００４４】
上記の粗酵素液から、ＳＨＮＬをさらに精製するには、通常のタンパク質精製法を用いることができる。具体的には、硫安分画法、有機溶媒沈殿法、イオン交換体などによる吸着処理法、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動法などを、単独または適宜組み合わせて用いることができる。
【００４５】
【実施例】
以下、本発明を実施例をあげて説明するが、本発明は下記実施例に制限されるものではない。
【００４６】
〔実施例１〕
上記配列番号２で示される本発明の遺伝子（以下、「Ｓｅｍｂａ遺伝子」とも称する）を組換えベクターに組み込むために、下記ＰＣＲプライマーを合成し、Ｓｅｍｂａ遺伝子をテンプレートとしてＰＣＲ反応を行った。ここで、テンプレートとして用いた遺伝子は、Ｓｅｍｂａ遺伝子をいくつかのオリゴマーに分け、エスペックオリゴサービス株式会社によりそのオリゴマーごとに作成し、ＰＣＲ法により連結することによって作製した。下記プライマーには制限酵素ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩの切断部位を含ませており、制限酵素ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩを用いることで、Ｓｅｍｂａ遺伝子と組換えベクターとの連結を可能とした。
【００４７】
＜Ｓｅｍｂａ遺伝子用プライマー＞
【００４８】
【配列番号３】
2004194550.tif 000006
【００４９】
【配列番号４】
2004194550.tif 000007
この際のＰＣＲ反応は、９８℃で５分間インキュベートした後、サイクル（９８℃で３０秒間、５７℃で１５秒間、７４℃で３０秒間）で３０回インキュベートし、最後に４℃で５分〜１時間インキュベートした。
【００５０】
上記ＰＣＲ産物を通常知られている電気泳動法により解析した結果、Ｓｅｍｂａ遺伝子に相当する遺伝子が含まれていることを確認した。
【００５１】
上記Ｓｅｍｂａ遺伝子を大腸菌において発現させるために、強力な遺伝子発現能力を持つＴ７プロモーターを有するｐＥＴ２１ａベクター（Novagen社製）にサブクローニングした。
【００５２】
サブクローニングの方法としては、ｐＥＴ２１ａベクターおよびＳｅｍｂａ遺伝子を制限酵素ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで処理した後、ライゲーションｈｉｇｈキット（東洋紡株式会社製）を用いて、規定の方法によりライゲーションを行った。
【００５３】
上記で得られた、Ｓｅｍｂａ遺伝子を組み込んだｐＥＴ２１ａ混合液を用いて、大腸菌ＤＨ５αコンピテントセルをトランスフォーメーションした。その後ＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で１２〜１６時間インキュベートした。
【００５４】
上記ＬＢ寒天培地上で生育したそれぞれの形質転換大腸菌のコロニーから任意に１０個を選別し、コロニーＰＣＲ法によるコロニーの確認を行った。
【００５５】
上記においてインサートが挿入されていることが確認されたコロニーをＬＢ液体培地で３７℃で８時間培養し、上記と同様にプラスミドを回収した。また、このプラスミドを、pET21a/Sembaと称する。
【００５６】
上記で得られたpET21a/Sembaを、大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）（Novagen社製）に形質転換により導入した。また、ここで得られた遺伝子組換え大腸菌を、BL21/pET21a/Sembaと称する。
【００５７】
上記で構築された組換え大腸菌株（BL21/pET21a/Semba）を以下の方法により培養し、組換えタンパク質を得た。
【００５８】
まず、１５ｍＬ試験管中でＬＢ培地５ｍＬに菌株１コロニー分を植菌し、培養温度３７℃、振盪速度１７０ｒｐｍで１２時間、前培養を行った。続いて、５００ｍＬ坂口フラスコ中でＬＢ培地１００ｍＬにそれぞれの前培養液２ｍＬを植菌し、タンパク質発現誘導剤イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を最終濃度が１ｍＭになるように添加後、培養温度３７℃、振盪速度１３０ｒｐｍで１２時間、本培養を行った。
【００５９】
上記培養後、培養液の最終細胞密度の測定を、６６０ｎｍにおける吸光度を測定することにより行った。その後培養液を回収し、遠心分離（１５０００ｒｐｍ、５分間）して菌体細胞を得た。得られた細胞はクエン酸Ｎａバッファー中で超音波処理により破砕した。破砕処理液は遠心分離（１５０００ｒｐｍ、５分間）により、可溶性上清と不溶性沈殿に分離した。
【００６０】
上記で得られた可溶性上清を用いて、文献（特開２０００−１８９１６０）の方法によりＳＨＮＬの活性測定を行った。
【００６１】
〔比較例１〕
上記配列番号１で示すＯｒｉ遺伝子を、文献(Arch. Biochem. Biophys. 311, 496-502, 1994)にしたがって入手した。
【００６２】
次いで、該Ｏｒｉ遺伝子のクローニングを文献（特開２０００−１８９１６０）の方法で行った。
【００６３】
Ｏｒｉ遺伝子について、上記実施例１と同様の方法により遺伝子組換え大腸菌株の構築、培養、最終細胞密度の測定およびＳＨＮＬの活性測定を行った。なお、実施例の場合と制限酵素が異なるが、発現ベクターｐＥＴ２１ａのプロモーター活性などの性質に影響を及ぼすものではない。ここで得られた組換え大腸菌を、BL21/pET21a/Originalと称する。
【００６４】
また、インサートを含まないｐＥＴ２１ａベクターを組み込んだＢＬ２１（ＤＥ３）を調製した。これをBL21/pET21a/Controlと称する。該細胞も実施例１と同じ条件で培養して最終細胞密度の測定および活性測定を行った。これらの結果を表３に示す。
【００６５】
＜Ｏｒｉ遺伝子用プライマー＞
【００６６】
【配列番号５】
2004194550.tif 000008
【００６７】
【配列番号６】
2004194550.tif 000009
【００６８】
【表３】
2004194550.tif 000010
【００６９】
〔実施例２〕
実施例１で構築した遺伝子組換え大腸菌BL21/pET21a/Sembaを用い、以下の方法でさらに低温培養(２７℃、２２℃、１９℃、１７℃）を行った。
【００７０】
まず、１５ｍＬ試験管中でＬＢ培地５ｍＬにそれぞれの菌株１コロニー分を植菌し、培養温度３７℃、振盪速度１７０ｒｐｍで１２時間、前培養を行った。続いて、５００ｍＬ坂口フラスコ中で栄養培地（培地組成：蒸留水１Ｌ中、グリセロール４０ｇ、硫酸アンモニウム（(ＮＨ4)2ＳＯ4）１０ｇ、リン酸二水素カリウム（ＫＨ2ＰＯ4）２ｇ、リン酸水素二カリウム（Ｋ2ＨＰＯ4）６ｇ、酵母抽出物４０ｇ、硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ4）１ｇ、アデカノール２０滴、ｐＨ６）１００ｍＬにそれぞれの前培養液２ｍＬを植菌し、タンパク質発現誘導剤イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を最終濃度が１ｍＭになるように添加後、振盪速度１３０ｒｐｍ、培養温度２７℃、２２℃、１９℃および１７℃で、培養が定常に達するまで本培養を行った。
【００７１】
上記培養後、培養液の最終細胞密度を実施例１と同様の方法により測定した。また、培養液を回収し、遠心分離後、破砕により、可溶性上清と不溶性沈殿に分離した。
【００７２】
ここで得られた可溶性上清を用いて、実施例１と同様の方法によりＳＨＮＬの活性測定を行った。この結果を表４に示す。
【００７３】
〔比較例２〕
実施例２の比較例として、実施例２と同様の遺伝子組換え大腸菌BL21/pET21a/Sembaを用いて、培養温度を３７℃で行った以外は上記実施例２と同様の方法により、培養、最終細胞密度の測定およびＳＨＮＬの活性測定を行った。これらの結果を表４に示す。
【００７４】
【表４】
2004194550.tif 000011
【００７５】
また、上記で得られた可溶性上清および不溶性沈殿について、周知の方法によりＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行い、タンパク質の解析を行った。ここでＳＤＳ−ＰＡＧＥは、１ウェルあたり２０μＬで、ＯＤ値が一定となるように希釈してアプライした。この結果を図１に示す。
【００７６】
〔実施例３〕
培養温度によって、培養液中の溶存酸素濃度にどのような影響が現れるのかを解析するために、BL21/pET21a/Sembaを用いて、以下の方法で培養を行った。
【００７７】
まず、５００ｍＬ坂口フラスコ中で実施例２に記載の栄養培地１００ｍＬに、実施例１で構築した形質転換大腸菌BL21/pET21a/Semba２ｍＬを植菌し、培養温度３７℃、振盪速度１３０ｒｐｍで１２時間、前培養を行った。続いて、２Ｌジャーファーメンター中で実施例２に記載の栄養培地１２００ｍＬにそれぞれの前培養液２５ｍＬを植菌し、タンパク質発現誘導剤イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を最終濃度が１ｍＭになるように添加後、振盪速度６８０ｒｐｍ、通気量１ｖｖｍ、培養温度１７℃で本培養を行った。ここで培養時間は、培養が定常に達するまでとした。
【００７８】
また、上記培養中、６時間ごとに培養液を回収し、遠心分離後、破砕により、可溶性上清と不溶性沈殿に分離した。
【００７９】
上記の培養中、６時間ごとに得られた培養液について、細胞密度および溶存酸素濃度（ＤＯ）の測定を行った。この結果を図２に示す。
【００８０】
〔比較例３〕
実施例３と同様の遺伝子組換え大腸菌BL21/pET21a/Sembaを用いて、培養温度を３７℃で行った以外は上記実施例３と同様の方法により培養し、最終細胞密度を測定した。また、酸素電極（丸菱バイオエンジ社製）を有する溶存酸素計を用いて溶存酸素濃度の測定を行った。これらの結果を図２に示す。
【００８１】
結果：
表１からわかる通り、インサートの違いにより最終細胞密度およびＳＨＮＬ活性値に大きな差が見られた。活性はインサートのある２株で確認され、細胞単位あたりの酵素生産能力を示す比活性値は、Ｓｅｍｂａ遺伝子をインサートに持つ株のほうがＯｒｉ遺伝子をインサートに持つ株よりも２倍以上高かった。したがって、コドン改変の効果により、Ｓｅｍｂａ遺伝子では組換えＳＨＮＬの生産能力が上昇することが示された。
【００８２】
また、表４からわかる通り、培養温度を低温で行う事により活性値および比活性値は大きく上昇した。培養を３７℃で行った場合の比活性は僅かに０．１７u/mg-proteinである。しかし培養温度を１７℃に設定する事で比活性は２９．０８u/mg-proteinと、３７℃の１７０倍に増加した。また、３７〜２７℃で培養した場合には、比較的早い段階で比活性増加は停滞し、次いで減少が始まった。低温で培養した場合長時間に渡り比活性の増加が継続した。
【００８３】
図１からわかる通り、温度の違いにより、生産されたＳＨＮＬの可溶性画分と不溶性画分の割合が変化している事が分かった。３７℃では、ほぼ１００％不溶性にバンドが出現しているが、２２℃、１９℃においては可溶性、不溶性の割合がほぼ半々となり、１７℃では可溶性の割合が著しく増加した。また、低温で培養することで、ＳＨＮＬの総生産量も飛躍的に増加した。これらの結果から、低温で培養することによって、不溶性の封入体の形成が抑制され、活性の可溶性ＳＨＮＬタンパク質が大量に生産されることが示された。
【００８４】
図２からもわかる通り、最終細胞濃度は３７℃でＯＤ値３０に対し、１７℃ではＯＤ値５４と、２倍近い値であった。また、３７℃培養と比較して１７℃における比増殖速度は８分の１程度であった。また、培養液中の溶存酸素濃度は、３７℃では培養５時間めには０になるのに対し、１７℃では培養終了まで０にはならなかった。この結果より、低温培養においては系が好気環境に維持され、細胞のエネルギー効率が低下せず、ＳＨＮＬが効率よく生産されるということが示された。
【００８５】
【発明の効果】
本発明によれば、キャッサバ由来のＳＨＮＬ遺伝子を改変することにより、組換え大腸菌での生産が容易になる遺伝子が提供される。また、本発明における、当該遺伝子を用いたＳＨＮＬの製造方法によれば、組換えＳＨＮＬの封入体形成を抑制できることから、大腸菌を用いて可溶性の活性型ＳＨＮＬを大量に生産させることができ、しかも組換え大腸菌を高密度で培養することが可能となる。また、培養中の溶存酸素を枯渇させることなく培養できることから、本発明はエネルギー効率の面からも有用である。
【００８６】
上記ＳＨＮＬの製造方法により、極めて効率よく、大量のＳＨＮＬを製造することができるため、光学活性シアノヒドリンの合成、および種々の光学活性中間体の合成への応用が期待される。
【００８７】
【配列表】
2004194550.tif 000012
2004194550.tif 000013
2004194550.tif 000014
2004194550.tif 000015
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例２で得られた可溶性上清および不溶性沈殿について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法を用いてタンパク質の発現を解析した図である。
【図２】実施例３の細胞密度および溶存酸素濃度の測定の結果得られた、ジャーファーメンター培養における培養温度と細胞密度および溶存酸素濃度の関係を示す図である。
【図１】
2004194550.tif 000016
【図２】
2004194550.tif 000017