【手続補正書】
【提出日】平成24年2月9日(2012.2.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
以下の配列は、米国特許法施行規則第１．８２１〜１．８２５条（「ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列の開示を含む特許出願の要件−配列規則」）に従い、そして世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）標準ＳＴ．２５（１９９８年）ならびにＥＰＯおよびＰＣＴの配列表の要件（規則５．２および４９．５（ａの２）、ならびに実施細則第２０８号および付属書Ｃ）に一致する。ヌクレオチドおよびアミノ酸の配列データに使用した記号および形式は米国特許法施行規則第１．８２２条に記載の規則に従う。
配列番号１は、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）のＣＰ４株由来のＺｍＰｇａｐのヌクレオチド配列である。
配列番号２は、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）のＺＭ４株由来のＺｍＰｇａｐのヌクレオチド配列である。
配列番号３は、ｐＺＢ４由来のＺｍＰｇａｐのヌクレオチド配列であり、これはまた、株ＺＷ６４１および８ＸＬ４のＰｇａｐｘｙｌＡＢオペロンにもある。
配列番号４は、株ＺＷ６５８由来の改善されたＰｇａｐのヌクレオチド配列である。
配列番号５は、株８ｂ由来の改善されたＰｇａｐのヌクレオチド配列である。
配列番号６は、ＰｇａｐのｐＺＢ４変種において−１９０（ＺＷ６５８）および−８９（８ｂ）変異の両方を伴う改善されたＰｇａｐのヌクレオチド配列である。
配列番号７は、ＰｇａｐのＣＰ４変種においてＺＷ６５８由来の−１９０変異を伴う改善されたＰｇａｐのヌクレオチド配列である。
配列番号８は、ＰｇａｐのＣＰ４変種において８ｂ由来の−８９変異を伴う改善されたＰｇａｐのヌクレオチド配列である。
配列番号９は、ＰｇａｐのＣＰ４変種において−１９０（ＺＷ６５８）および−８９（８ｂ）変異の両方を伴う改善されたＰｇａｐのヌクレオチド配列である。
配列番号１０は、ＰｇａｐのＺＭ４変種においてＺＷ６５８由来の−１９０変異を伴う改善されたＰｇａｐのヌクレオチド配列である。
配列番号１１は、ＰｇａｐのＺＭ４変種において８ｂ由来の−８９変異を伴う改善されたＰｇａｐのヌクレオチド配列である。
配列番号１２は、ＰｇａｐのＺＭ４変種において−１９０（ＺＷ６５８）および−８９（８ｂ）変異の両方を伴う改善されたＰｇａｐのヌクレオチド配列である。
配列番号１３および１４は、ｐＺＢ４由来のグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター（Ｐｇａｐ）を含有するＤＮＡフラグメントの増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号１５および１６は、ｐＺＢ４由来のｔａｌコード領域を含有するＤＮＡフラグメントの増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号１７および１８は、Ｐｇａｐおよびｔａｌフラグメント由来のＰｇａｐｔａｌを含有するＤＮＡフラグメントの増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号１９および２０は、ｐＺＢ１８６由来のｌｏｘＰ：：Ｃｍを含有するＤＮＡフラグメントの増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号２１は、ｐＭＯＤＰｇａｐｔａｌｔｋｔＣｍプラスミドの完全なヌクレオチド配列である。
配列番号２２および２３は、ｐＭＯＤＰｇａｐｔａｌｔｋｔＣｍを収容する形質転換体におけるｔａｌおよびｔｋｔコード領域を含有する３ｋｂのＤＮＡフラグメントの増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号２４は、ｐＭＯＤＰｇａｐｘｙｌＡＢＣｍプラスミドの完全なヌクレオチド配列である。
配列番号２５および２６は、ｐＭＯＤＰｇａｐｘｙｌＡＢＣｍを伴うＴ２Ｃ、Ｔ３Ｃ、Ｔ４ＣおよびＴ５Ｃ組み込み体由来の１．６ｋｂのＰｇａｐｘｙｌＡ  ＤＮＡフラグメントの増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号２７および２８は、ＺＷ６４１およびＺＷ６５８由来のＰｇａｐを含有するＤＮＡフラグメントの増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号２９〜３１は、ＺＷ６４１およびＺＷ６５８由来のＰｇａｐを配列決定するためのプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号３２および３３は、Ｓｐｅｃr−カセットを含有するＤＮＡフラグメントの増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号３４は、キシロースイソメラーゼ発現カセットＰｇａｐＸｙｌＡの完全ヌクレオチド配列である。
配列番号３５および３６は、ｐＭＯＤ２−＜ＭＣＳ＞の異なるマルチクローニング部位を置換するために使用されるオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列である。
配列番号３７および３８は、それぞれ、プラスミドｐＭＯＤ−リンカー−Ｓｐｅｃ−８０１ＧａｐＸｙｌＡおよびｐＭＯＤ−リンカー−Ｓｐｅｃ−６４１ＧａｐＸｙｌＡを得るため、ｐＭＯＤ−リンカー−Ｓｐｅｃに挿入するための株ＺＷ８０１−４およびＺＷ６４１由来のＰｇａｐｘｙｌＡ領域の増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号３９および４０は、ｐＺＢ１８８／ａａｄＡ−６４１ＧａｐＸｙｌＡ由来のＰｇａｐの増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列であり、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＲＰＩオープンリーディングフレームの最初の１５ｂｐを含む。
配列番号４１および４２は、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＲＰＩオープンリーディングフレームの増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号４３は、プラスミドｐＺＢ１８８ａａｄＡ／Ｇａｐ／ＺｙｍｏＲＰＩ／ＥｃｏｌｉＳＬに存在するＲＰＩ発現カセットの完全ヌクレオチド配列である。
配列番号４４および４５は、８ＸＬ４および８ｂ由来のＰｇａｐを含有するＤＮＡフラグメントの増幅のためのプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号４６は、８ＸＬ４および８ｂ由来のＰｇａｐを配列決定するためのプライマーの完全ヌクレオチド配列である。
配列番号４７は、それぞれ配列番号１、２および３の配列である、ＣＰ４、ＺＭ４およびｐＺＢ４のＺｍＰｇａｐ部分の−１９０位を含むヌクレオチド配列である。
配列番号４８は、それぞれ配列番号１、２および３の配列である、ＣＰ４、ＺＭ４およびｐＺＢ４のＺｍＰｇａｐ部分の−８９位を含むヌクレオチド配列である。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３６】
−１９０位置は、配列構成：
2011515106.tif 000001
（配列番号４７）における位置である。この配列は、それぞれ配列番号１、２および３の配列である、ＣＰ４、ＺＭ４およびｐＺＢ４のＺｍＰｇａｐ部分の−１９０位を含むヌクレオチド配列である。
太字および下線を付したＧは、変異によってＴに変化する塩基である。この位置は、ＣＰ４株およびＺＭ４株のＺｍＰｇａｐ配列においては−１９０位であるが、ｐＺＢ４中のプロモーター配列では−２１位のＴが欠失しているため、ｐＺＢ４においては−１８９位である。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３７】
−８９位置は、配列構成：
2011515106.tif 000002
における位置である。この配列は、それぞれ配列番号１、２および３の配列である、ＣＰ４、ＺＭ４およびｐＺＢ４のＺｍＰｇａｐ部分の−８９位を含むヌクレオチド配列である。
太字および下線を付したＣは、変異によってＴに変化する塩基である。この位置は、ＣＰ４株およびＺＭ４株のＺｍＰｇａｐ配列においては−８９位であるが、ｐＺＢ４中のプロモーター配列では−２１位のＴが欠失しているため、ｐＺＢ４においては−８８位である。本発明のプロモーターは、−１９０位、−８９位、またはこれらの位置の両方においてＺｍＰｇａｐのヌクレオチド変化を有する。好ましくは、変化は、−１９０位におけるＧからＴへの変化であり、そして−８９位におけるＣからＴへの変化である。これらの改変を含む本発明のプロモーターは、改善されたＰｇａｐｓである。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４２】
−１８９位および／または−８８位において記載の変異を伴う改善されたＰｇａｐ変異配列の例として、株ＺＷ６５８由来のプロモーター配列（配列番号４）、株８ｂ由来のプロモーター配列（配列番号５）、およびｐＺＢ４由来である同じＺｍＰｇａｐ変異体の二重変異（配列番号６）が挙げられる。改善されたＰｇａｐ配列のさらなる例には、ＣＰ４由来のＺｍＰｇａｐ変種における−１９０位の変異、−８９位の変異、または二重変異（それぞれ、配列番号７、８、および９）ならびにＺＭ４由来のＺｍＰｇａｐ変種における−１９０位の変異、−８９位の変異、または二重変異（それぞれ、配列番号１０、１１、および１２）がある。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２３】
株ＺＷ６５８のＰｇａｐｘｙｌＡＢオペロンのプロモーター配列の場合と同様に、新規の配列の制御下でのコード領域からのタンパク質の産生が、部分的に適応された株由来の同じプロモーターの配列よりも多く産生されることを可能にする新規の配列への適応中に、株８ｂのＰｇａｐｘｙｌＡＢオペロンのプロモーター配列が変化した。
更に本発明の具体的実施態様を以下に列挙する。
（１）116位、217位、並びに、116位および217位の両方、からなる群から選択される位置において塩基置換を含むＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターを含む単離された核酸分子であって、前記位置番号は配列番号１における番号であり、前記プロモーターが改善されたプロモーターである、前記核酸分子。
（２）塩基置換が、
ａ）116位におけるＧからＴへの置き換え；および
ｂ）217位におけるＣからＴへの置き換え
である、（１）に記載の単離された核酸分子。
（３）配列番号４、５、６、７、８、９、１０、１１、および１２からなる群から選択される配列を含む、（２）に記載の単離された核酸分子。
（４）異種核酸分子に作動可能に連結された（１）に記載の単離された核酸分子を含む、キメラ遺伝子。
（５）異種核酸分子がタンパク質またはペプチドをコードする、（４）に記載のキメラ遺伝子。
（６）異種核酸分子が、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、および干渉ＲＮＡからなる群から選択される調節ＲＮＡ分子をコードする、（４）に記載のキメラ遺伝子。
（７）（１）に記載の単離された核酸分子を含むベクター。
（８）（２）に記載の単離された核酸分子を含むベクター。
（９）（３）に記載の単離された核酸分子を含むベクター。
（１０）（１）に記載の単離された核酸分子を細胞に導入する工程を含む、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞およびザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）細胞からなる群から選択される細菌細胞を形質転換する方法。
（１１）（２）に記載の単離された核酸分子を細胞に導入する工程を含む、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞およびザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）細胞からなる群から選択される細菌細胞を形質転換する方法。
（１２）（３）に記載の単離された核酸分子を細胞に導入する工程を含む、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞およびザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）細胞からなる群から選択される細菌細胞を形質転換する方法。
（１３）導入する工程が、（１）に記載の単離された核酸分子を細胞のゲノムに組み込むか、または細胞内の安定に複製するプラスミド上で維持する工程を含む、（１０）に記載の方法。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2011515106000001.app
【手続補正７】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
116位、217位、並びに、116位および217位の両方、からなる群から選択される位置において塩基置換を含むＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーターを含む単離された核酸分子であって、前記位置番号は配列番号１における番号であり、前記プロモーターが改善されたプロモーターである、前記核酸分子。
【請求項２】
異種核酸分子に作動可能に連結された請求項１に記載の単離された核酸分子を含む、キメラ遺伝子。
【請求項３】
請求項１に記載の単離された核酸分子を含むベクター。
【請求項４】
請求項１に記載の単離された核酸分子を細胞に導入する工程を含む、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）細胞およびザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）細胞からなる群から選択される細菌細胞を形質転換する方法。