(57)【要約】      （修正有）【課題】免疫優性Ｃ型肝炎ウィルスＴ細胞エピトープおよびそれを含むワクチンの提供。【解決手段】ＨＣＶポリタンパク質のコア、および／またはＥ１、および／またはＥ２、および／またはＮＳ３領域から選択される少なくとも８個の連続するアミノ酸を含むかまたはそれよりなり、上記連続するアミノ酸がＴ細胞刺激性エピトープを含む、約８個〜約１００個のアミノ酸のポリペプチドに関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記領域：
−ＨＣＶのＥ１領域のアミノ酸３０１〜３２０の間に含まれる領域：
ＴＱＧＣＮＣＳＩＹＰＧＨＩＴＧＨＲＭＡＷ（配列番号２４）、
−ＨＣＶのＥ１領域のアミノ酸３１３〜３３２の間に含まれる領域：
ＩＴＧＨＲＭＡＷＤＭＭＭＮＷＳＰＴＡＡＬ（配列番号２５）、
−ＨＣＶのＥ１領域のアミノ酸アミノ酸３２６〜３４４の間に含まれる領域：
ＮＷＳＰＴＡＡＬＶＭＡＱＬＬＲＩＰＱＡＩ（配列番号２６）、又は
図４に示すとおりのＨＣＶの別の型に由来することができるようなこれらの配列のいずれかに対する変異体
のいずれかから選択される少なくとも８個の連続するアミノ酸を含むかまたはそれよりなり、かつ、
上記連続するアミノ酸が、Ｔ細胞刺激性エピトープを含む、
８個〜２０個のアミノ酸のポリペプチドの、ＨＣＶ免疫原性組成物の調製のための使用。
【請求項２】
下記：
ＶＶＬＬＬＦＡＧＶＤＡＥＴＩＶＳＧＧＱＡ（配列番号２９）
のＨＣＶのＥ１領域のアミノ酸３７３〜３９２の間に含まれる領域から選択される少なくとも８個の連続するアミノ酸を含むかまたはそれよりなり、かつ、
上記連続するアミノ酸が、Ｔ細胞刺激性エピトープを含む、
８個〜２０個のアミノ酸のポリペプチドの、ＨＣＶ免疫原性組成物の調製のための使用。
【請求項３】
下記領域：
−ＨＣＶのＥ１領域のアミノ酸１９２〜２３４の間に含まれる領域：
ＹＱＶＲＮＳＴＧＬＹＨＶＴＮＤＣＰＮＳＳＩＶＹＥＡＨＤＡＩＬＨＴＰＧＣＶＰＣＶＲＥＧＮ（配列番号１６４）、
−ＨＣＶのＥ１領域のアミノ酸２５３〜３３２の間に含まれる領域：
ＬＰＡＴＱＬＲＲＨＩＤＬＬＶＧＳＡＴＬＣＳＡＬＹＶＧＤＬＣＧＳＶＱＬＦＴＦＳＰＲＲＨＷＴＴＱＧＣＮＣＳＩＹＰＧＨＩＴＧＨＲＭＡＷＤＭＭＭＮＷＳＰＴＡＡＬ（配列番号１０６）、
−ＨＣＶのＥ１領域のアミノ酸アミノ酸３２５〜３９２の間に含まれる領域：
ＭＮＷＳＰＴＡＡＬＶＭＡＱＬＬＲＩＰＱＡＩＬＤＭＩＡＧＡＨＷＧＶＬＡＧＩＡＹＦＳＭＶＧＮＷＡＫＶＬＶＶＬＬＬＦＡＧＶＤＡＥＴＩＶＳＧＧＱＡ（配列番号１０７）、
−ＨＣＶのＥ１領域のアミノ酸アミノ酸２４３〜３９２の間に含まれる領域：
ＴＰＴＶＡＴＴＲＤＧＫＬＰＡＴＱＬＲＲＨＩＤＬＬＶＧＳＡＴＬＣＳＡＬＹＶＧＤＬＣＧＳＶＱＬＦＴＦＳＰＲＲＨＷＴＴＱＧＣＮＣＳＩＹＰＧＨＩＴＧＨＲＭＡＷＤＭＭＭＮＷＳＰＴＡＡＬＶＭＡＱＬＬＲＩＰＱＡＩＬＤＭＩＡＧＡＨＷＧＶＬＡＧＩＡＹＦＳＭＶＧＮＷＡＫＶＬＶＶＬＬＬＦＡＧＶＤＡＥＴＩＶＳＧＧＱＡ（配列番号１０４）、又は
図４に示すとおりのＨＣＶの別の型に由来することができるようなこれらの配列のいずれかに対する変異体
のいずれかから選択される少なくとも８個の連続するアミノ酸を含むかまたはそれよりなり、かつ、
上記連続するアミノ酸が、Ｔ細胞刺激性エピトープを含む、
８個〜２０個のアミノ酸のポリペプチドの、ＨＣＶ免疫原性組成物の調製のための使用。
【請求項４】
下記領域：
−ＨＣＶのＥ１領域のアミノ酸１９３〜２１２の間に含まれる領域：
ＱＶＲＮＳＴＧＬＹＨＶＴＮＤＣＰＮＳＳＩ（配列番号１６）、
−ＨＣＶのＥ１領域のアミノ酸２０５〜２２４の間に含まれる領域：
ＮＤＣＰＮＳＳＩＶＹＥＡＨＤＡＩＬＨＴＰ（配列番号１７）、
−ＨＣＶのＥ１領域のアミノ酸アミノ酸２１７〜２３６の間に含まれる領域：
ＨＤＡＩＬＨＴＰＧＣＶＰＣＶＲＥＧＮＶＳ（配列番号１８）、
−ＨＣＶのＥ１領域のアミノ酸アミノ酸２５３〜２７２の間に含まれる領域：
ＬＰＡＴＱＬＲＲＨＩＤＬＬＶＧＳＡＴＬＣ（配列番号２１）、
−ＨＣＶのＥ１領域のアミノ酸アミノ酸２６５〜２８４の間に含まれる領域：
ＬＶＧＳＡＴＬＣＳＡＬＹＶＧＤＬＣＧＳＶ（配列番号２２）、
−ＨＣＶのＥ１領域のアミノ酸アミノ酸２８９〜３０８の間に含まれる領域：
ＱＬＦＴＦＳＰＲＲＨＷＴＴＱＧＣＮＣＳＩ（配列番号２３）、
−ＨＣＶのＥ１領域のアミノ酸アミノ酸３３７〜３５６の間に含まれる領域：
ＬＬＲＩＰＱＡＩＬＤＭＩＡＧＡＨＷＧＶＬ（配列番号２７）、
−ＨＣＶのＥ１領域のアミノ酸アミノ酸３４９〜３６８の間に含まれる領域：
ＡＧＡＨＷＧＶＬＡＧＩＡＹＦＳＭＶＧＮＷ（配列番号２８）、又は
図４に示すとおりのＨＣＶの別の型に由来することができるようなこれらの配列のいずれかに対する変異体
のいずれかから選択される少なくとも８個の連続するアミノ酸を含むかまたはそれよりなり、かつ、
上記連続するアミノ酸が、Ｔ細胞刺激性エピトープを含む、
８個〜２０個のアミノ酸のポリペプチドの、ＨＣＶ免疫原性組成物の調製のための使用。
【請求項５】
下記領域：
−ＨＣＶのＥ１領域のアミノ酸２４３〜２６０の間に含まれる領域：
ＴＰＴＶＡＴＴＲＤＧＫＬＰＡＴＱＬＲ（配列番号１０５）、又は
図４に示すとおりのＨＣＶの別の型に由来することができるようなこれらの配列のいずれかに対する変異体から選択される少なくとも８個の連続するアミノ酸を含むかまたはそれよりなり、かつ、
上記連続するアミノ酸が、Ｔ細胞刺激性エピトープを含む、
８個〜２０個のアミノ酸のポリペプチドの、ＨＣＶ免疫原性組成物の調製のための使用。
【請求項６】
該Ｔ細胞刺激性エピトープが、Ｔ細胞ヘルパーエピトープである、請求項１〜５のいずれか１項記載のポリペプチドの使用。
【請求項７】
該Ｔ細胞刺激性エピトープが、ＣＴＬエピトープである、請求項１〜５のいずれか１項記載のポリペプチドの使用。
【請求項８】
該ポリペプチドが、予防ワクチン組成物に組み込まれている、請求項１〜７のいずれか１項記載のポリペプチドの使用。
【請求項９】
該ポリペプチドが、治療ワクチン組成物に組み込まれている、請求項１〜７のいずれか１項記載のポリペプチドの使用。
【請求項１０】
請求項１〜７のいずれか１項記載のＴ細胞刺激性エピトープを含むように選択された任意の連続するアミノ酸配列の複数のリピート、組合せ又はミモトープからなるポリペプチドであって、該組合せは、単一の構造につなげられた２以上のペプチドを含み、該ミモトープは、その後にＴ細胞が少なくとも１つの株のＨＣＶと反応性である限り、該ペプチドと比較して１個以上のアミノ酸変異を有する、ポリペプチド。
【請求項１１】
請求項１〜７のいずれか１項記載のポリペプチドをコードする核酸インサートを含む発現ベクターにより発現された組換えポリペプチドである、請求項１〜７のいずれか１項記載のポリペプチドの使用。
【請求項１２】
ＨＣＶエンベロープタンパク質Ｅ１およびＥ２、またはＨＣＶのＮＳ３、ＮＳ４またはＮＳ５免疫原、またはＢ細胞刺激性エピトープを含むＨＣＶペプチドのような、病原因子関連免疫原に作動可能に連結されている、請求項１〜７のいずれか１項記載のポリペプチドの使用。
【請求項１３】
下記ペプチド：
ａ）ＱＶＲＮＳＴＧＬＹＨＶＴＮＤＣＰＮＳＳＩ（配列番号１６）又は図４に示すとおりのＨＣＶの別の型に由来することができるようなこの配列に対する変異体
ｂ）ＣＶＲＥＧＮＶＳＲＣＷＶＡＭＴＰＴＶＡＴ（配列番号１９）、
ｃ）ＬＶＧＳＡＴＬＣＳＡＬＹＶＧＤＬＣＧＳＶ（配列番号２２）又は図４に示すとおりのＨＣＶの別の型に由来することができるようなこの配列に対する変異体、
ｄ）ＴＱＧＣＮＣＳＩＹＰＧＨＩＴＧＨＲＭＡＷ（配列番号２４）又は図４に示すとおりのＨＣＶの別の型に由来することができるようなこの配列に対する変異体、
ｅ）ＮＷＳＰＴＡＡＬＶＭＡＱＬＬＲＩＰＱＡＩ（配列番号２６）又は図４に示すとおりのＨＣＶの別の型に由来することができるようなこの配列に対する変異体、
ｆ）ＶＶＬＬＬＦＡＧＶＤＡＥＴＩＶＳＧＧＱＡ（配列番号２９）又は図４に示すとおりのＨＣＶの別の型に由来することができるようなこの配列に対する変異体、
のいずれかの配列の少なくとも８個の連続するアミノ酸からなるペプチドであって、該ペプチドが、Ｔ細胞エピトープを含む、ペプチド。
【請求項１４】
下記ペプチド：
ａ）ＮＤＣＰＮＳＳＩＶＹＥＡＨＤＡＩＬＨＴＰ（配列番号１７）、
ｂ）ＨＤＡＩＬＨＴＰＧＣＶＰＣＶＲＥＧＮＶＳ（配列番号１８）、
ｃ）ＡＭＴＰＴＶＡＴＲＤＧＫＬＰＰＡＴＱＬＲＲ（配列番号２０）、
ｄ）ＬＰＡＴＱＬＲＲＨＩＤＬＬＶＧＳＡＴＬＣ（配列番号２１）、
ｅ）ＱＬＦＴＦＳＰＲＲＨＷＴＴＱＧＣＮＣＳＩ（配列番号２３）、
ｆ）ＩＴＧＨＲＭＡＷＤＭＭＭＮＷＳＰＴＡＡＬ（配列番号２５）、
ｇ）ＬＬＲＩＰＱＡＩＬＤＭＩＡＧＡＨＷＧＶＬ（配列番号２７）、
ｈ）ＡＧＡＨＷＧＶＬＡＧＩＡＹＦＳＭＶＧＮＷ（配列番号２８）、
ｉ）ＹＱＶＲＮＳＴＧＬＹＨＶＴＮＤＣＰＮＳＳＩＶＹＥＡＨＤＡＩＬＨＴＰＧＣＶＰＣＶＲＥＧＮ（配列番号１６４）、
ｊ）ＴＰＴＶＡＴＴＲＤＧＫＬＰＡＴＱＬＲ（配列番号１０５）、
ｋ）ＬＰＡＴＱＬＲＲＨＩＤＬＬＶＧＳＡＴＬＣＳＡＬＹＶＧＤＬＣＧＳＶＱＬＦＴＦＳＰＲＲＨＷＴＴＱＧＣＮＣＳＩＹＰＧＨＩＴＧＨＲＭＡＷＤＭＭＭＮＷＳＰＴＡＡＬ（配列番号１０６）、
ｌ）ＭＮＷＳＰＴＡＡＬＶＭＡＱＬＬＲＩＰＱＡＩＬＤＭＩＡＧＡＨＷＧＶＬＡＧＩＡＹＦＳＭＶＧＮＷＡＫＶＬＶＶＬＬＬＦＡＧＶＤＡＥＴＩＶＳＧＧＱＡ（配列番号１０７）、
ｍ）ＴＰＴＶＡＴＴＲＤＧＫＬＰＡＴＱＬＲＲＨＩＤＬＬＶＧＳＡＴＬＣＳＡＬＹＶＧＤＬＣＧＳＶＱＬＦＴＦＳＰＲＲＨＷＴＴＱＧＣＮＣＳＩＹＰＧＨＩＴＧＨＲＭＡＷＤＭＭＭＮＷＳＰＴＡＡＬＶＭＡＱＬＬＲＩＰＱＡＩＬＤＭＩＡＧＡＨＷＧＶＬＡＧＩＡＹＦＳＭＶＧＮＷＡＫＶＬＶＶＬＬＬＦＡＧＶＤＡＥＴＩＶＳＧＧＱＡ（配列番号１０４）、
又は図４に示すとおりのＨＣＶの別の型に由来することができるような上記の配列のいずれかに対する変異体から選択されるペプチドであって、該ペプチドが、Ｔ細胞エピトープを含む、ペプチド。
【請求項１５】
医薬的に許容可能な賦形剤と混合された請求項１３又は１４記載のペプチドまたはポリペプチドの少なくとも１つからなるかまたはそれを含む、免疫原性組成物。
【請求項１６】
ワクチン組成物である、請求項１５記載の組成物。
【請求項１７】
予防ワクチン組成物である、請求項１６記載の組成物。
【請求項１８】
治療ワクチン組成物である、請求項１６記載の組成物。
【請求項１９】
該組成物が、請求項１３又は１４記載のいずれかのポリペプチドに加えて、少なくとも１つのＨＣＶのＢ細胞刺激性エピトープを含むペプチドまたはポリペプチド、および／またはＨＣＶ構造ポリペプチド、および／またはＨＣＶ非構造ポリペプチドを含む、請求項１５〜１８のいずれか１項記載の組成物。
【請求項２０】
請求項１３又は１４記載の上記ポリペプチドが、ＨＢｓＡｇまたはＨＢｃＡｇ粒子、ＨＢＶ免疫原、ＨＩＶ免疫原および／またはＨＴＬＶ免疫原と混合されている、請求項１５〜１８のいずれか１項記載の組成物。
【請求項２１】
ＨＣＶ免疫原性組成物の調製のための請求項１〜７のいずれか１項記載のポリペプチドをコードする核酸インサートを含む組換え発現ベクターの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＨＣＶのコア、Ｅ１、Ｅ２およびＮＳ３タンパク質から由来する、Ｃ型肝炎予防および治療ワクチンに有用な免疫優性Ｃ型肝炎ウイルスＴ細胞エピトープを記載する。
【０００２】
発明の技術分野
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルスのコア、Ｅ１、Ｅ２およびＮＳ３領域に関連する新規な合成免疫原の製造、およびワクチン、治療剤などの製造におけるその用途に関する。より詳細には、本発明は、ＨＣＶのコア、Ｅ１、Ｅ２およびＮＳ３のＴ細胞決定基を含むポリペプチド組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は、その発見から数年のうちに、急性および慢性肝疾患の主要な原因であることがわかった。ＨＣＶは、およそ９，４００ヌクレオチドのゲノムを有する一本鎖ＲＮＡウイルスであり、このゲノムは、約３，０１０アミノ酸の前駆体ポリタンパク質をコードする単一の大きいオープンリーディングフレームと、その前にある３４１ヌクレオチドの５′非翻訳領域（５′ＵＲ）からなる(Kato et al., 1990) 。このウイルスゲノムの遺伝子構成は、フラビウイルスおよびペスチウイルスのそれと関連しており、推定構造タンパク質がそのＮ末端領域に位置し、種々の非構造タンパク質がポリタンパク質のＣ末端に位置している。構造タンパク質は、コアタンパク質（Ｃ、アミノ酸１〜１９１）、それに続いている推定エンベロープタンパク質であるＥ１（アミノ酸１９２〜３８３）およびＥ２／ＮＳ１（アミノ酸３８４〜７４６）である。Ｅ２およびＮＳ１という用語は、しばしば互換的に使用される。別の形態のＥ２は、アミノ酸３８４〜８０９から構成され、第三の形態は、ＮＳ２と関連している。非構造タンパク質は、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４およびＮＳ５であり、このうち、少なくともＮＳ４およびＮＳ５は、さらにＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５ＡおよびＮＳ５Ｂにプロセシングされることが示されている。
【０００４】
ＨＣＶゲノムの構造解析から、異なるゲノタイプ（遺伝子型）の存在が明らかにされ、それらは、タイプ（型）およびサブタイプ（亜型）に分類されている(Stuyver et al., 1993)。配列の多様性は、５′非翻訳領域を含め、ゲノム全体にわたって分布している。最も高い配列の可変性は、ＮＳ２および３′非翻訳領域、およびＥ１およびＥ２タンパク質をコードする推定エンベロープ領域において観察されている。コア、ＮＳ３、およびＮＳ４タンパク質のある領域は、著しく多様性が低いことが示された(Okamoto et al., 1992)。
【０００５】
ＨＣＶ体液性応答
ＨＣＶの発見後まもなく、ＨＣＶタンパク質に対する循環（流血中）抗体の検出のためのイムノアッセイが広く利用可能になった。これらの手段は、異なる条件下でのＨＣＶに対するヒトの体液性免疫応答の分野の知見を爆発的に増大させた。いったんＨＣＶが輸血後非Ａ非Ｂ肝炎の主要原因であることが明らかになると、ＨＣＶに対する抗体の探索は、血液製品の安全性スクリーニングパネルに加えられた。この手順は、輸血の安全性を高めたばかりでなく、ウイルスの疫学の知見を増強した。ＨＣＶが、輸血または非経口接種が除外されている慢性肝感染のかなりの割合に関与しているという事実は、さらなる疫学的研究の主要な課題として残されている。ＨＣＶに対する抗体の検出のためのアッセイの広く行きわたった使用により、ウイルスの体液性抗原性を有する領域の認識ももたらされた。ＨＣＶの異なるタンパク質に対する体液性免疫応答の動態および程度と、疾患の経過および結果との間の関係は、まだ確立されていない。
【０００６】
ＨＣＶのＴ細胞エピトープ
ウイルス抗原に対する免疫応答は、ほとんど完全にＴ細胞依存性である。Ｔ細胞は、抗体産生およびある種の細胞傷害性反応の両方に必要とされる。ＨＣＶにコードされるタンパク質は、Ｂ細胞レベルでのみでなく、Ｔ細胞レベルでも免疫原性である。
【０００７】
ＨＣＶに対する細胞性免疫応答を記載している研究は少ない。Lin et al. (1993) は、コンピュータ検索により得られたＨＣＶ遺伝子の完全に保存された領域内のＴ細胞エピトープ候補を記載し、多数の潜在的Ｔ細胞エピトープを明らかにした。ＨＣＶ感染個体からの末梢血単球（ＰＢＭＣ）が、ＨＣＶ組換えタンパクに応答して増殖すること、およびコアタンパク質に対する末梢応答が、良性の（軽度の）感染経過と相関するということも、報告されている(Botarelli et al., 1993)。慢性的にＨＣＶに感染している患者の肝臓において、Ｅ１およびＮＳ２タンパク質中のエピトープを認識する、ＨＣＶ特異的、ＨＬＡクラスI限定細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）が同定され、クローニングされた。これらの研究者は、個々の患者からのＴ細胞クローンを得ること、および単一のＣＴＬクローンについての免疫反応性ドメインの局在化とを、主に焦点としていた。このような研究により、Ｅ１タンパク質のアミノ末端部分のエピトープＡＳＲＣＷＶＡＭ（アミノ酸２３５〜２４２）、およびＮＳ２領域からのエピトープＬＭＡＬＴＬＳＰＹＹＫＲＹ（アミノ酸８２６〜８３８）の発見がもたらされた(Koziel et al., 1992) 。慢性ＨＣＶ肝炎の患者において、ＨＣＶのＮＳ４タンパク質を特異的に認識する肝臓内ＣＤ４+ Ｔ細胞が観察された。これらのＴリンパ球のクロノタイプ（クローン型）は、これらの個体のＰＢＭＣにおいては検出されなかった(Minutello et al., 1993)。これらの研究により、ＨＣＶ肝炎患者においては、ＨＣＶ特異的Ｔリンパ球が感染肝臓および末梢血から単離されうることが明らかになっている。ＨＣＶ肝炎における肝臓損傷の病因論におけるそれらの役割、およびウイルスのクリアランスまたは存続についての関連は、まだ確立されていない。
【０００８】
あるウイルス感染の中和は、体液性免疫のみにより可能であるが、ほとんどの微生物学的因子は、細胞性免疫の助けを借りてのみ宿主から除去されうる。循環抗体の中和能がある種の感染において確立されている場合であっても、感染性因子の中和およびクリアランスの達成のためには、ヘルパーＴ細胞活性は、Ｂ細胞が必要なレベルの循環抗体を産生することを可能にするために、一般に必要とされる。しかし、ある種の感染性因子は、細胞性免疫によってのみ中和されうる。
【０００９】
ＨＣＶの場合には、Ｔ細胞免疫がウイルスのクリアランスに必要とされうると予期することができる。これは、ほとんどの患者が疾患の慢性経過をたどること、そして、特許出願ＥＰ−Ａ−０，３１８，２１６、ＥＰ−Ａ−０，３８８，２３２、ＥＰ−Ａ−０，４４２，３９４、ＥＰ−Ａ−０，４８４，７８７、ＥＰ−Ａ−０，４８９，９６８に記載されたように、ＨＣＶに感染したほとんどの患者が、ＨＣＶ抗原のほとんどに対する体液性免疫を形成したこと（ＨＣＶ感染の診断に利用しうる）、のためである。しかしながら、抗体陽性患者のほとんどは、ＨＣＶ−ＰＣＲ陽性のままであることから、循環系からウイルスを除去することができず、結果として、検出された抗体は、防御作用を有するものでも、ウイルスを中和するのに充分なものでもなかった。おそらく、現在ＨＣＶ診断アッセイに含まれていない他のエピトープに対する抗体が、ＨＣＶ感染を中和することができる可能性がある。このようなエピトープは、ウイルス膜タンパク質であるＥ１およびＥ２に位置している可能性があるが、異なるＨＣＶ種の広い範囲に対する防御には、ＨＣＶエンベロープ領域の高度可変性が障害となる可能性がある。
【００１０】
本発明の目的は、ＨＣＶ構造領域およびＮＳ３領域由来のＴ細胞刺激性ポリペプチドおよびペプチドを提供することである。
【００１１】
本発明の別の目的は、ＨＣＶ免疫原性組成物の調製における用途のための、上述のＴ細胞刺激性ポリペプチドおよびペプチドを提供することである。
【００１２】
本発明の別の目的は、ＨＣＶのコア領域、Ｅ１領域、Ｅ２領域またはＮＳ３領域由来のＴ細胞刺激性ペプチドおよびポリペプチドを提供することである。
【００１３】
本発明の別の目的は、ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４+)エピトープおよび／またはＣＴＬ（ＣＤ８+)エピトープを含む上述のとおりのＨＣＶからのＴ細胞刺激性ペプチドまたはポリペプチドを提供することである。
【００１４】
本発明の別の目的は、上記のものを含有する組換えポリペプチドを提供することである。
【００１５】
本発明の別の目的は、上記のものを含有する予防組成物ならびに治療組成物を提供することである。
【００１６】
本発明の別の目的は、上記のポリペプチドを含む予防または治療組成物を提供することである。
【００１７】
本発明の別の目的は、上記のものに基づいたＨＣＶ感染の防止または治療方法を提供することである。
【００１８】
発明の詳細な説明
より詳細には、本発明は、ＨＣＶポリタンパク質のコアおよび／またはＥ１および／またはＥ２および／またはＮＳ３領域から選択される少なくとも８個の連続するアミノ酸を含むかまたはそれよりなり、上記連続するアミノ酸がＴ細胞刺激性エピトープを含む、約８個〜約１００個のアミノ酸のポリペプチドであって、上記の領域のいずれかからの既知のＴ細胞エピトープを含むＨＣＶペプチドまたはポリペプチドとは異なるポリペプチドを記載する。後者の既知のＨＣＶポリペプチドおよびペプチドは、Ｂ細胞エピトープのスクリーニングについて記載されている。このようなポリペプチドおよびペプチドは、例えば、ＥＰ−Ａ−０，３１８，２１６、ＥＰ−Ａ−０，３８８，２３２、ＥＰ−Ａ−０，４４２，３９４、ＥＰ−Ａ−０，４８４，７８７、ＥＰ−Ａ−０，４８９，９６８、ＷＯ  ９２／２２５７１、Lesniewski et al., 1993; Weiner et al., 1993などにおいて言及されている。これらの出願などの内容は、参照によりここに包含される。
【００１９】
更により詳細には、本発明は、ＨＣＶ免疫原性組成物の調製のための上述のポリペプチドの用途に関する。
【００２０】
「ＨＣＶ免疫原性組成物」という表現は、ＨＣＶ感染の防止または治療に関する。
【００２１】
好ましくは、上記のポリペプチドは、ＲＡＬＡＨＧＶＲＶＬＥＤＧ、ＲＭＡＷＤＭＭ、ＰＴＤＣＦＲＫＨＰ、ＹＰＹＲＬＷＨ、ＧＫＳＴＫＶＰ、ＰＳＶＡＡＴ、ＩＧＴＶＬＤＱＡＥ、ＡＶＡＹＹＲ、ＡＳＲＣＷＶＡＭおよびＴＧＤＦＤＳＶＩＤとは異なる。
【００２２】
「ＨＣＶポリタンパク質」という用語は、当業界において開示されたあらゆるＨＣＶポリタンパク質に関するものである。これは、Okamoto et al., 1992により論評されており、例えば、ＨＣ−Ｊ１単離株の１ａ型ＨＣＶポリタンパク質、ＨＣ−Ｊ６単離株２ａ型のＨＣＶポリタンパク質(Okamoto et al., 1991)、ＨＣ−Ｊ８単離株２ｂ型(Okamoto et al., 1992)などがある。この定義によれば、ＨＣＶのあらゆる記載された領域内において既に観察されたあらゆる変異は、ＨＣＶポリタンパク質の定義の一部であると考えられる。例えば、Bukh et al., 1993, Bukh et al., 1994, Stuyver et al., 1993a, Stuyver et al., 1993b, Stuyver et al., 1994a, Stuyver et al., 1994cには、多数のタイプおよびサブタイプが開示されている。更に、本発明にしたがえば、これらのＨＣＶポリタンパク質には保存的置換が導入されてもよい。「保存的置換」という用語は、ここで用いる場合、あるアミノ酸残基が、別の生物学的に同様の残基で置き換えられていることを意味する。保存的置換の例としては、イソロイシン、バリン、ロイシンまたはメチオニンのような１つの疎水性残基によるもう１つの残基の置換、あるいは１つの極性残基によるもう１つの残基の置換、例えば、アルギニンとリジン間、グルタミン酸とアスパラギン酸間、またはグルタミンとアスパラギン間などが挙げられる。「保存的置換」という用語には、置換されていない親アミノ酸の代わりに置換されたアミノ酸を使用することをも、このようなポリペプチドに対して生成された抗体が、置換されていないアミノ酸を有する対応するポリペプチドとも免疫反応性である場合には、含む。
【００２３】
「抗体」という用語は、免疫グロブリンと呼ばれるグリコシル化されたタンパク質のファミリーのメンバーであり、抗原と特異的に結合しうる分子に関する。
【００２４】
「抗原」という用語は、歴史的には、抗体によって結合されるものを指すため、また、抗体の産生を誘導するものを指すためにも使用されてきた。より最近の使用では、抗原の意味を、抗体により結合されるものに制限し、一方、「免疫原」という言葉を、抗体産生を誘導するものに対して使用している。ここで考察するものが、免疫原性であり、かつ抗原性である場合には、その意図されている利用性にしたがって、免疫原または抗原のどちらかを典型的に用いる。
【００２５】
ペプチド配列に関して用いられる「対応する」という用語（種々の文法的形態をとる）は、記載されたペプチドに、そのアミノ末端とカルボキシ末端の一方または両方に３つまでのアミノ酸残基が加えられたまたは減らされたものであって、そのポリペプチド配列に沿って特定のアミノ酸残基に保存的置換のみを含むものを意味する。
【００２６】
「エピトープ」は、Ｔ細胞抗原レセプターにより特異的に結合される分子のその部分または抗体結合部位に関する。
【００２７】
「免疫反応する」という用語（種々の形態をとる）は、リガンドとしての抗原と、全抗体のＦａｂ部分のような抗体の結合部位を含む分子との間の結合を意味する。
【００２８】
本発明にしたがった「Ｔ細胞刺激性エピトープ」またはＴ細胞エピトープという表現は、Ｔ細胞を刺激することができるエピトープに関する。Ｔ細胞刺激性エピトープは、本発明にしたがって、（実施例のセクションに詳述したように）いずれかのＨＣＶポリタンパク質のコア、および／またはＥ１、および／またはＥ２、および／またはＮＳ３領域由来の少なくとも８個の連続するアミノ酸をそのアミノ酸配列中に含むポリペプチドに対するリンパ球増殖性応答を監視することにより選択してもよい。上記のリンパ球増殖性応答は、Ｔ細胞刺激活性について試験すべき種々の濃度のペプチドを用いてＣ型肝炎感染患者からのＰＭＢＣをインビトロで刺激す
ること、および放射性標識チミジンの取り込み量をカウントすることを含む、ヘルパーＴアッセイにより測定することができる。上記リンパ球増殖性応答は、51Ｃｒ放出を用いて細胞傷害性細胞の溶解活性を測定するＣＴＬアッセイにより測定することもできる。増殖は、刺激インデックス（抗原刺激培養の平均cpm ／対照培養の平均cpm)が１を越える（好ましくは２を越え、最も好ましくは３を越える）場合、陽性と考えられる。Ｔ細胞刺激性エピトープを含むペプチドを選択するために、これらのリンパ球増殖性アッセイの結果を比較し、免疫優性Ｔ細胞エピトープ含有ポリペプチドまたはペプチドを選択する。あるペプチドに対するリンパ球増殖性アッセイの結果は、インターフェロンα治療に対する臨床的無応答者（ノンレスポンダー）と応答者（レスポンダー）との間で比較することもできる。ＨＣＶのコア、Ｅ１およびＥ２／ＮＳ１配列を表す重複する一連の合成ペプチドおよび組換えＮＳ３タンパク質に対するリンパ球増殖性応答を、本発明の実施例のセクションにおいて開示したように、３２人の慢性ＨＣＶ肝炎患者で監視した。
【００２９】
結果として、本発明は、コア、Ｅ１、Ｅ２およびＮＳ３領域をカバーする一連の抗原からの免疫優性Ｔ細胞エピトープの選択物を表す。実施例のセクションから、ペプチドプール２および３ならびにペプチドＮＳ１−５* およびＮＳ１−７* ばかりでなく、プール４、５、６および９ならびにＮＳ３も、Ｃ型肝炎患者と高頻度に反応したが（表４）、一方、同じポリペプチドを用いて、正常対照においては稀にしか反応性が観察され得ない（表５）ことは、明らかである。表４に示したデータから、ＨＣＶ構造領域の広いエリア、例えば、プール１（アミノ酸５〜７２）およびプール７および８（アミノ酸４２７〜５７８）が、感染患者（ＩＦＮ−α治療に対して応答する患者についても）のＴ細胞と、ほとんど反応性を示さないことは明白である。しかしながら、最も顕著なことには、一般にＣ型肝炎に対する優性Ｂ細胞応答がコアのアミノ末端に位置している（表３も参照されたい）のに対し、優性Ｔ細胞応答はコアのカルボキシ末端領域に対するものであることが見出された（表４を参照されたい）。文献には、コアのカルボキシ末端側の半分には、Ｂ細胞反応性エピトープが、わずかしか、または全く含まれていない、という充分な証拠を見出すことができる。本発明に基づけば、それでもなお、例えばコアのカルボキシ末端領域の部分（アミノ酸７３〜１７６にわたる）を予防または治療ワクチン組成物に含ませることが望ましい可能性がある。
【００３０】
「ポリペプチド」および「ペプチド」という言葉は、明細書を通じて互換可能に用いられており、隣接するアミノ酸のαアミノ基とカルボキシ基との間のペプチド結合により一方から他方につながれているアミノ酸の直鎖状のシリーズをいう。ポリペプチドは、さまざまな長さであることができ、天然の（非荷電）形態または塩の形態であることができ、そして、グリコシル化、側鎖酸化もしくはリン酸化のような修飾を含まない状態またはこれらの修飾を含む状態であることができる。当業界においては、アミノ酸配列は酸性基および塩基性基を含むこと、およびペプチドが示す特定のイオン化状態は、タンパク質が溶液中にある場合には周囲の媒体のpHに依存し、あるいはタンパク質が固体形態の場合にはそれが得られたもとの媒体のpHに依存することは、よく理解されている。この定義には、グリコシル単位、脂質、またはホスフェートのような無機イオンなどの、アミノ酸側鎖に着いている付加的な置換基により修飾されたタンパク質、ならびにスルフヒドリル基の酸化などの、鎖の化学的変換に関する修飾も含まれる。したがって、「ポリペプチド」またはその等価の用語は、言及される適切なアミノ酸配列、その機能性を破壊しない前に述べたような修飾にかかるもの、を含むことを意図している。
【００３１】
本発明のポリペプチド、特にその中でも短いペプチドは、古典的な化学合成により調製することができる。合成は、均質な溶液中または固相において実施することができる。
【００３２】
例えば、用いることができる均質溶液中での合成技術は、E. Wunsh編の『Methode der organishen chemie （有機化学の方法）』と題された本の１５−IおよびII巻、THIEME, Stuttgart 1974中の、Houbenweylにより記載されたものがある。
【００３３】
本発明のポリペプチドは、Atherton and Shepardの『Solid phase peptide synthesis （固相ペプチド合成）』と題された本（IRS Press, Oxford, 1989)の、彼らにより記載された方法にしたがって、固相で調製することもできる。
【００３４】
本発明にしたがったポリペプチドはまた、以下に証明するように組換えＤＮＡ技術によって調製することもできる。
【００３５】
本発明にしたがったポリペプチドまたはペプチドは、上に特定したように、長さが変化してもよい。本発明にしたがったペプチドは、少なくとも３個、好ましくは少なくとも４、５、６、７個、しかし最も好ましくは少なくとも８個の連続するＨＣＶアミノ酸を含む。ペプチドの好ましい長さは、６、７、８、９、１０、またはそれ以上（例えば、１５、２０、２５、３０など）のアミノ酸残基である。本発明のポリペプチドは、１５０〜２００アミノ酸までの長さであってもよいが、好ましくは１００未満のアミノ酸である。
【００３６】
本発明にしたがって更に企図されているのは、ＨＣＶのコア領域のアミノ酸７３〜１７６の間、ＨＣＶのＥ１領域のアミノ酸１９２〜２３４および２４３〜３９２の間、ＨＣＶのＥ２領域のアミノ酸３９７と４２８およびアミノ酸５７１〜６３８の間、またはＨＣＶのＮＳ３領域のアミノ酸１１８８〜１４６３の間に含まれる領域から選択される少なくとも８個の連続するアミノ酸を含むかまたはそれよりなり、前記連続するアミノ酸がＴ細胞刺激性エピトープを含む、上記で定義したポリペプチドであって、前記ポリペプチドが上記の領域のいずれかからのあらゆる既知のＴ細胞エピトープを含有するＨＣＶペプチドまたはポリペプチドとは異なるポリペプチドである。後者の既知のＨＣＶポリペプチドおよびペプチドは、Ｂ細胞エピトープのスクリーニングについて記載されている。
【００３７】
より詳細には、本発明は、ＨＣＶ免疫原性組成物の調製のための上述のポリペプチドの用途に関する。
【００３８】
「アミノ酸Ｘ〜Ｙの間に含まれる」という表現は、アミノ酸Ｘおよびアミノ酸Ｙを含む。
【００３９】
本発明において用いられているＨＣＶポリタンパク質の番号付けは、Kato et al., 1990 にしたがったＨＣＶ−Ｊ単離株について用いられている番号付けをいう。当業界で公知の他の全てのＨＣＶ単離株は、この配列と整列させて、各々の個別のＨＣＶ単離株について引用されるＨＣＶポリタンパク質の番号付けを得ることができる。例えば、２型の単離株は、そのＥ２配列中に４つの余分のコドン／アミノ酸を含みうることが知られており、一方、３型の配列は、１型の配列と比較して２つのアミノ酸の挿入を有していることが知られている。
【００４０】
本発明の実施例のセクションには、Ｔ細胞エピトープが記載されており、ＨＣＶ構造領域の他の領域のなかでも、コアタンパク質のカルボキシ末端領域（アミノ酸（ａａ）７３〜１７６）、Ｅ１領域のアミノ酸１９２〜３８３、Ｅ２領域のアミノ酸３９７と４２８およびアミノ酸５７１〜６３８、ＮＳ３領域のアミノ酸１１８８〜１４６３のＴ細胞エピトープが記載されている。構造タンパク質コアおよびＥ２の部分をカバーするペプチドのグループ、完全Ｅ１タンパク質をカバーするペプチドのグループ、ならびに組換えＮＳ３タンパク質を研究した。ペプチドは、表１に示すように、グループ１（ａａ  ５〜８０）、グループ２（ａａ  ７３〜１４０）、グループ３（ａａ  １３３〜２００）、グループ４（ａａ  １９３〜２６０）、グループ５（ａａ  ２５３〜３３２）、グループ６（ａａ  ３２５〜３９２）、グループ７（ａａ  ４２７〜４９４）、グループ８（ａａ  ４８７〜５７８）、およびグループ９（ａａ  ５７１〜６３８）として試験した。組換えＮＳ３は、ＨＣＶの１ｂ亜型群に属する単離株ＩＧ８３０９のアミノ酸１１８８〜１４６３にわたるものであった。
【００４１】
グループ３ペプチドならびに個別のペプチドＮＳ１−７* およびＮＳ１−５* に対するＴ細胞応答は、一般に、より良性の疾患の経過を示すと受け取られているアラニンアミノトランフェラーゼ（ＡＬＴ）およびウイルスＲＮＡレベルの減少と、統計学的に適切な相関を示す。「組換えＨＣＶコアタンパク質」とより良性の疾患の経過との間の相関は、Botarelli et al., 1993に記載されている。しかしながら、Botarelli et al., 1993においては、エピトープは全くマッピングされておらず、組換えコアタンパク質の配列および正確な位置も記載されていない。本発明においては、ＩＦＮ−αに対して応答する患者とこれに対して無応答の患者の両方で、グループ２ペプチド（ａａ  ７３〜１４０）に関して同様のＴ細胞応答が観察された。これに対して、グループ３ペプチド（ａａ  １３３〜２００）に対するＴ細胞反応性は、インターフェロンαに対する応答者において観察され、ＩＦＮ−α治療に対する無応答者でのこの領域に対して観察されたＴ細胞反応性とは異なっていた。更に、グループ２および３からの個々のペプチドの反応性を調べた後、ＨＣＶ感染のより良性の経過と相関するこの特異的な応答は、ＣＯＲＥ２３、ＣＯＲＥ２５およびＣＯＲＥ２７と名付けられた特異的な個々のペプチドに更にマッピングすることができた。グループ２のペプチドに属するペプチドＣＯＲＥ１９もまた、一部のＩＦＮ−α治療応答者により認識された（図１を参照されたい）。
【００４２】
したがって、本発明は、以下の配列：
【００４３】
【表１】
2004194668.tif 000002
【００４４】
（配列番号５８、７３位〜１７６位にわたる）
〔式中、Ｘ1 はＲまたはＫを表し、Ｘ2 はＡ、ＳまたはＴを表し、Ｘ3 はＡまたはＧを表し、Ｘ4 はＱ、ＫまたはＲを表し、Ｘ5 はＹまたはＨを表し、Ｘ6 はＧまたはＡを表し、Ｘ7 はＥまたはＫを表し、Ｘ8 はＣ、ＭまたはＬを表し、Ｘ9 はＷまたはＬを表し、Ｘ10はＳ、Ｎ、Ｔ、ＤまたはＨを表し、Ｘ11はＰまたはＱを表し、Ｘ12はＮまたはＴを表し、Ｘ13はＲまたはＨを表し、Ｘ14はＲまたはＫを表し、Ｘ15はＬまたはＶまたはＦを表し、Ｘ16はＫまたはＲを表し、Ｘ17はＬまたはＩを表し、Ｘ18はＦまたはＬを表し、Ｘ19はＭまたはＩを表し、Ｘ20はＧまたはＥを表し、Ｘ21はＬまたはＶまたはＩを表し、Ｘ22はＶまたはＬを表し、Ｘ23はＡまたはＧを表し、Ｘ24はＬ、ＶまたはＩを表し、Ｘ25はＡまたはＶを表し、Ｘ26はＡまたはＳを表し、Ｘ27はＲまたはＡを表し、Ｘ28はＡまたはＴまたはＥを表し、Ｘ29はＡまたはＥを表し、Ｘ30はＶまたはＡまたはＬを表し、Ｘ31はＬまたはＶまたはＩを表し、Ｘ32はＥまたはＧを表し、Ｘ33はＶまたはＩを表し、Ｘ34はＦまたはＹを表し、Ｘ35はＡまたはＰを表し、Ｘ36はＬまたはＩを表す〕、および
【００４５】
【表２】
2004194668.tif 000003
【００４６】
（配列番号４８、１０９位〜１７６位にわたる）
を特徴とする、アミノ酸７３〜１７６の間に含まれる領域から選択される少なくとも８個〜約１０４個の連続するアミノ酸を含むかまたはそれよりなる、より詳細には、ＨＣＶのコア領域のアミノ酸１０９〜１７６の間に含まれる領域から選択される８個〜約６８個の連続するアミノ酸を含むかまたはそれよりなり、上記連続するアミノ酸はＴ細胞刺激性エピトープを含むポリペプチドであって、上記の領域のいずれかからのあらゆる既知のＴ細胞エピトープ含有ＨＣＶペプチドまたはポリペプチドとは異なるポリペプチドをも企図する。後者の既知のＨＣＶポリペプチドおよびペプチドは、Ｂ細胞エピトープのスクリーニングについて記載されており、Ｘ11〜Ｘ36は上記と同じ意味を有する。
【００４７】
本明細書においては、Ｘ1 、Ｘ2 、Ｘ3 、Ｘ4 、Ｘ5 、Ｘ6 、Ｘ7 、Ｘ8 、Ｘ9 、Ｘ10、Ｘ11、Ｘ12、Ｘ13、Ｘ14、Ｘ15、Ｘ16、Ｘ17、Ｘ18、Ｘ19、Ｘ20、Ｘ21、Ｘ22、Ｘ23、Ｘ24、Ｘ25、Ｘ26、Ｘ27、Ｘ28、Ｘ29、Ｘ30、Ｘ31、Ｘ32、Ｘ33、Ｘ34、Ｘ35、Ｘ36は、配列番号５８に関して定義したものと常に同じ意味であることは強調されるべきである。
【００４８】
好ましくは、上記のポリペプチドは、ＨＣＶのコア領域の１４９位〜１６１位にわたるＲＡＬＡＨＧＶＲＶＬＥＤＧとは異なる。
【００４９】
より詳細には、本発明は、以下の配列：
【００５０】
【表３】
2004194668.tif 000004
【００５１】
（配列番号５９、７３位〜１４８位にわたる）、
【００５２】
【表４】
2004194668.tif 000005
【００５３】
（配列番号６０、１６２位〜１７６位にわたる）、および
【００５４】
【表５】
2004194668.tif 000006
【００５５】
（配列番号６１、１２９位〜１４９位にわたる）
を特徴とする、アミノ酸７３〜１４８の間に含まれる領域から選択される少なくとも８個〜約７６個の連続するアミノ酸を含むかまたはそれよりなる、またはアミノ酸１６２〜１７６の間に含まれる領域から選択される８個〜約１５個の連続するアミノ酸を含むかまたはそれよりなる、またはＨＣＶのコア領域のアミノ酸１２９〜１４４の間に含まれる領域から選択される８個〜約１６個の連続するアミノ酸を含むかまたはそれよりなる、上記で定義したポリペプチドに関する。特に好ましいのは、ペプチドＡＬＭＧＹＩＰＬＶ（配列番号１６３）である。
【００５６】
更により詳細には、本発明は、ＨＣＶ免疫原性組成物の調製のための上述のポリペプチドの用途に関する。
【００５７】
したがって、本発明は、ＨＣＶのコア領域のアミノ酸１３３位〜１７６位の間に含まれる領域：
【００５８】
【表６】
2004194668.tif 000007
【００５９】
から選択される、より詳細にはペプチド
【００６０】
【表７】
2004194668.tif 000008
【００６１】
から選択される、少なくとも８個〜約４４個の連続するアミノ酸を含むかまたはそれよりなり、上記連続するアミノ酸はＴ細胞刺激性エピトープを含む、上記で定義したポリペプチドであって、上記の領域のいずれかからのあらゆる既知のＴ細胞エピトープ含有ＨＣＶペプチドまたはポリペプチドとは異なるポリペプチドをも企図する。後者の既知のＨＣＶポリペプチドおよびペプチドは、Ｂ細胞エピトープのスクリーニングについて記載されている。
【００６２】
更により詳細には、本発明は、ＨＣＶ免疫原性組成物の調製のための上述のポリペプチドの用途に関する。
【００６３】
したがって、本発明は、ＨＣＶのコア領域のアミノ酸１５７位〜１７６位の間に含まれる領域：
【００６４】
【表８】
2004194668.tif 000009
【００６５】
から選択される、より詳細には
【００６６】
【表９】
2004194668.tif 000010
【００６７】
（配列番号１３＝ペプチドＣＯＲＥ２７）または
【００６８】
【表１０】
2004194668.tif 000011
【００６９】
から選択される、少なくとも８個〜約２０個の連続するアミノ酸を含むかまたはそれよりなり、上記連続するアミノ酸はＴ細胞刺激性エピトープを含む、上記で定義したポリペプチドであって、上記の領域のいずれかからのあらゆる既知のＴ細胞エピトープ含有ＨＣＶペプチドまたはポリペプチドとは異なるポリペプチドをも企図する。後者の既知のＨＣＶポリペプチドおよびペプチドは、Ｂ細胞エピトープのスクリーニングについて記載されている。好ましくは、上記ペプチドは、以下のペプチドのリストから更に選ばれる：
【００７０】
【表１１】
2004194668.tif 000012
【００７１】
特に好ましいペプチドとしては、以下のものが挙げられる：
ＧＶＮＹＡＴＧＮＬ（配列番号７８）、ＧＶＮＹＡＴＧＮＬ（配列番号７９）、ＮＬＰＧＣＳＦＳＩ（配列番号８０）およびＬＰＧＣＳＦＳＩ（配列番号８１）。
【００７２】
更により詳細には、本発明は、ＨＣＶ免疫原性組成物の調製のための上述のポリペプチドの用途に関する。
【００７３】
したがって、本発明は、ＨＣＶのコア領域のアミノ酸１４５位〜１６４位の間に含まれる領域：
【００７４】
【表１２】
2004194668.tif 000013
【００７５】
から選択される、より詳細には
【００７６】
【表１３】
2004194668.tif 000014
【００７７】
（配列番号１２＝ペプチドＣＯＲＥ２５）または
【００７８】
【表１４】
2004194668.tif 000015
【００７９】
から選択される、少なくとも８個〜約２０個の連続するアミノ酸を含むかまたはそれよりなり、上記連続するアミノ酸はＴ細胞刺激性エピトープを含む、上記で定義したポリペプチドであって、上記の領域のいずれかからのあらゆる既知のＴ細胞エピトープ含有ＨＣＶペプチドまたはポリペプチドとは異なるポリペプチドをも企図する。後者の既知のＨＣＶポリペプチドおよびペプチドは、Ｂ細胞エピトープのスクリーニングについて記載されている。好ましくは、本発明にしたがった上記ペプチドは、以下のペプチドのリストから選ばれる：
【００８０】
【表１５】
2004194668.tif 000016
【００８１】
特に好ましいペプチドとしては、以下のものが挙げられる：
ＡＬＡＨＧＶＲＶＬ（配列番号８８）、ＬＡＨＧＶＲＶＬ（配列番号８９）、ＶＲＶＬＥＤＧＶ（配列番号９０）、ＲＶＬＥＤＧＶ（配列番号９１）、ＶＬＥＤＧＶＮＹ（配列番号９２）、およびＬＥＤＧＶＮＹ（配列番号９３）。
【００８２】
更により詳細には、本発明は、ＨＣＶ免疫原性組成物の調製のための上述のポリペプチドの用途に関する。
【００８３】
したがって、本発明は、ＨＣＶのコア領域のアミノ酸１３３位〜１５２位の間に含まれる領域：
【００８４】
【表１６】
2004194668.tif 000017
【００８５】
から選択される、より詳細には
【００８６】
【表１７】
2004194668.tif 000018
【００８７】
から選択される、少なくとも８個〜約２０個の連続するアミノ酸を含むかまたはそれよりなる、上記で定義したポリペプチドであって、上記の領域のいずれかからのあらゆる既知のＴ細胞エピトープ含有ＨＣＶペプチドまたはポリペプチドとは異なるポリペプチドをも企図する。後者の既知のＨＣＶポリペプチドおよびペプチドは、Ｂ細胞エピトープのスクリーニングについて記載されている。好ましくは、本発明にしたがった上記ペプチドは、以下のペプチドのリストから選ばれる：
【００８８】
【表１８】
2004194668.tif 000019
【００８９】
このリストから選ばれる好ましいペプチドとしては、以下のものが挙げられる：ＬＭＧＹＩＰＬＶ（配列番号６９）、ＭＧＹＩＰＬＶ（配列番号７０）、ＹＩＰＬＶＧＡＰＬ（配列番号７１）、ＩＰＬＶＧＡＰＬ（配列番号７２）、ＬＶＧＡＰＬＧＧＡ（配列番号９４）、およびＶＧＡＰＬＧＧＡ（配列番号９５）。
【００９０】
更により詳細には、本発明は、ＨＣＶ免疫原性組成物の調製のための上述のポリペプチドの用途に関する。
【００９１】
したがって、本発明は、ＨＣＶのコア領域のアミノ酸１０９位〜１２８位の間に含まれる領域：
【００９２】
【表１９】
2004194668.tif 000020
【００９３】
から選択される、より詳細には
【００９４】
【表２０】
2004194668.tif 000021
【００９５】
から選択される、少なくとも８個〜約２０個の連続するアミノ酸を含むかまたはそれよりなる、上記で定義したポリペプチドであって、上記の領域のいずれかからのあらゆる既知のＴ細胞エピトープ含有ＨＣＶペプチドまたはポリペプチドとは異なるポリペプチドをも企図する。後者の既知のＨＣＶポリペプチドおよびペプチドは、Ｂ細胞エピトープのスクリーニングについて記載されている。好ましくは、本発明にしたがった上記ペプチドは、以下のペプチドから選ばれる：
【００９６】
【表２１】
2004194668.tif 000022
【００９７】
好ましいペプチドは、例えば、ＮＬＧＫＶＩＤＴＬ（配列番号９８）およびＬＧＫＶＩＤＴＬ（配列番号１１７）である。
【００９８】
更により詳細には、本発明は、ＨＣＶ免疫原性組成物の調製のための上述のポリペプチドの用途に関する。
【００９９】
したがって、本発明は、ＨＣＶのコア領域のアミノ酸７３位〜９２位の間に含まれる領域：
【０１００】
【表２２】
2004194668.tif 000023
【０１０１】
から選択される、より詳細には
【０１０２】
【表２３】
2004194668.tif 000024
【０１０３】
から選択される、少なくとも８個〜約２０個の連続するアミノ酸を含むかまたはそれよりなる、上記で定義したポリペプチドであって、上記の領域のいずれかからのあらゆる既知のＴ細胞エピトープ含有ＨＣＶペプチドまたはポリペプチドとは異なるポリペプチドをも企図する。後者の既知のＨＣＶポリペプチドおよびペプチドは、Ｂ細胞エピトープのスクリーニングについて記載されている。本発明にしたがった好ましいペプチドとしては、例えば、
【０１０４】
【表２４】
2004194668.tif 000025
【０１０５】
から更に選択されるペプチドが挙げられ、例えば、ＴＷＡＱＰＧＹＰＷ（配列番号１０２）およびＷＡＱＰＧＹＰＷ（配列番号１０３）のようなペプチドがある。
【０１０６】
更により詳細には、本発明は、ＨＣＶ免疫原性組成物の調製のための上述のポリペプチドの用途に関する。
【０１０７】
したがって、本発明は、ＨＣＶのアミノ酸１９２〜２３４と２４３〜３９２の間に含まれる領域から選択される、より詳細には以下の配列：
【０１０８】
【表２５】
2004194668.tif 000026
【０１０９】
（配列番号１６４、１９２位〜２３４位にわたる）、および
【０１１０】
【表２６】
2004194668.tif 000027
【０１１１】
（配列番号１０４、２４３位〜３９２位にわたる）
を特徴とするＨＣＶのＥ１領域のアミノ酸１９２〜２３４と２４３〜３８３の間に含まれる領域または図４に示すようにＨＣＶの別の型に由来するこの配列のあらゆる変異体から選択される、少なくとも８個の連続するアミノ酸を含むかまたはそれよりなり、上記連続する配列はＴ細胞刺激性エピトープを含む、上記で定義したポリペプチドであって、上記の領域のいずれかからのあらゆる既知のＴ細胞エピトープ含有ＨＣＶペプチドまたはポリペプチドとは異なるポリペプチドをも企図する。後者の既知のＨＣＶポリペプチドおよびペプチドは、Ｂ細胞エピトープのスクリーニングについて記載されている。
【０１１２】
上記ペプチドは、好ましくは、３１７位〜３２３位にわたるＲＭＡＷＤＭＭおよび２３５位〜２４２位にわたるＡＳＲＣＷＶＡＭとは異なる。
【０１１３】
更により詳細には、本発明は、ＨＣＶ免疫原性組成物の調製のための上述のポリペプチドの用途に関する。
【０１１４】
したがって、本発明は、以下の配列：
【０１１５】
【表２７】
2004194668.tif 000028
【０１１６】
（配列番号１６５、１９３位〜２３４位にわたる）、および
【０１１７】
【表２８】
2004194668.tif 000029
【０１１８】
を特徴とするＨＣＶのＥ１領域のアミノ酸１９３〜２３４と２４３〜２６０の間に含まれる領域または図４に示すようにＨＣＶの別の型に由来するこの配列のあらゆる変異体から選択される、少なくとも８個〜約６８個の連続するアミノ酸を含むかまたはそれよりなり、上記連続する配列はＴ細胞刺激性エピトープを含む、上記で定義したポリペプチドであって、上記の領域のいずれかからのあらゆる既知のＴ細胞エピトープ含有ＨＣＶペプチドまたはポリペプチドとは異なるポリペプチドをも企図する。後者の既知のＨＣＶポリペプチドおよびペプチドは、Ｂ細胞エピトープのスクリーニングについて記載されている。
【０１１９】
本発明にしたがった特に好ましいペプチドとしては、以下のものが挙げられる：
【０１２０】
【表２９】
2004194668.tif 000030
【０１２１】
更により詳細には、本発明は、ＨＣＶ免疫原性組成物の調製のための上述のポリペプチドの用途に関する。
【０１２２】
したがって、本発明は、以下の配列：
【０１２３】
【表３０】
2004194668.tif 000031
【０１２４】
を特徴とするＨＣＶのＥ１領域のアミノ酸２５３〜３３２の間に含まれる領域または図４に示すようにＨＣＶの別の型に由来するこの配列のあらゆる変異体から選択される、少なくとも８個〜約８０個の連続するアミノ酸を含むかまたはそれよりなり、上記連続する配列はＴ細胞刺激性エピトープを含む、上記で定義したポリペプチドであって、上記の領域のいずれかからのあらゆる既知のＴ細胞エピトープ含有ＨＣＶペプチドまたはポリペプチドとは異なるポリペプチドをも企図する。後者の既知のＨＣＶポリペプチドおよびペプチドは、Ｂ細胞エピトープのスクリーニングについて記載されている。
【０１２５】
本発明にしたがった特に好ましいペプチドとしては、以下のものが挙げられる：
【０１２６】
【表３１】
2004194668.tif 000032
【０１２７】
更により詳細には、本発明は、ＨＣＶ免疫原性組成物の調製のための上述のポリペプチドの用途に関する。
【０１２８】
したがって、本発明は、以下の配列：
【０１２９】
【表３２】
2004194668.tif 000033
【０１３０】
を特徴とするＨＣＶのＥ１領域のアミノ酸３２５〜３９２の間に含まれる領域または図４に示すようにＨＣＶの別の型に由来するこの配列のあらゆる変異体から選択される、少なくとも８個〜約６８個の連続するアミノ酸を含むかまたはそれよりなり、上記連続する配列はＴ細胞刺激性エピトープを含む、上記で定義したポリペプチドであって、上記の領域のいずれかからのあらゆる既知のＴ細胞エピトープ含有ＨＣＶペプチドまたはポリペプチドとは異なるポリペプチドをも企図する。後者の既知のＨＣＶポリペプチドおよびペプチドは、Ｂ細胞エピトープのスクリーニングについて記載されている。
【０１３１】
本発明にしたがった特に好ましいペプチドとしては、以下のものが挙げられる：
【０１３２】
【表３３】
2004194668.tif 000034
【０１３３】
更により詳細には、本発明は、ＨＣＶ免疫原性組成物の調製のための上述のポリペプチドの用途に関する。
【０１３４】
したがって、本発明は、以下の配列：
【０１３５】
【表３４】
2004194668.tif 000035
【０１３６】
（配列番号４９、３９７位〜４２８位にわたる。図４を参照されたい）、
および
【０１３７】
【表３５】
2004194668.tif 000036
【０１３８】
（配列番号１０８、５７１位〜６３８位にわたる。図５を参照されたい）
を特徴とする、ＨＣＶのＥ２領域のアミノ酸３９７〜４２８の間の領域から選択される少なくとも８個〜約３２個の連続するアミノ酸を含むかまたはそれよりなる、またはアミノ酸５７１〜６３８の間の領域から選択される少なくとも８個〜約６８個の連続するアミノ酸を含むかまたはそれよりなる、上記で定義したポリペプチドをも企図する。
【０１３９】
上記式中、Ｘ37はＳ、Ａ、Ｑ、Ｌ、Ｎ、Ｙ、Ｒ、ＹまたはＨを表し、Ｘ38はＧ、Ｓ、Ｔ、ＡまたはＲを表し、Ｘ39はＦ、Ｉ、ＬまたはＶを表し、Ｘ40はＶ、ＡまたはＴを表し、Ｘ41はＳ、ＤまたはＧを表し、Ｘ42はＬ、Ｉ、Ｗ、ＦまたはＭを表し、Ｘ43はＬ、ＩまたはＦを表し、Ｘ44はＡ、Ｔ、ＤまたはＳを表し、Ｘ45はＰ、Ｑ、Ｓ、Ｒ、Ｌ、ＩまたはＴを表し、Ｘ46はＡ、ＰまたはＳを表し、Ｘ47はＫ、Ｓ、Ｑ、ＡまたはＲを表し、Ｘ48はＮ、Ｋ、ＤまたはＲを表し、Ｘ49はＶ、ＩまたはＬを表し、Ｘ50はＱ、ＳまたはＹを表し、Ｘ51はＩまたはＶを表し、Ｘ52はＬまたはＩを表し、Ｘ53はＳまたはＲを表し、Ｘ54はＴまたはＳを表し、Ｘ55はＧまたはＲを表し、Ｘ56はＧ、ＡまたはＫを表し、Ｘ57はＡ、Ｖ、Ｇ、ＳまたはＤを表し、Ｘ58はＧ、ＦまたはＹを表し、Ｘ59はＮ、Ｈ、Ｒ、Ｌ、ＡまたはＳを表し、Ｘ60はＴまたはＳを表し、Ｚ1 はＭまたはＩを表し、Ｚ2 はＤを表し、Ｘ61はＨ、Ｌ、Ｖ、ＴまたはＩを表し、Ｘ62はＨまたはＹを表し、Ｘ63はＤまたはＥを表し、Ｘ64はＡまたはＴを表し、Ｘ65はＳ、Ｔ、ＩまたはＬを表し、Ｘ66はＲまたはＫを表し、Ｘ67はＳまたはＡを表し、Ｘ68はＷまたはＬを表し、Ｘ69はＩまたはＬを表し、Ｘ70はＬ、ＭまたはＩを表し、Ｘ71はＶまたはＩを表し、Ｘ72はＩ、Ｖ、ＦまたはＬを表し、Ｘ73はＹまたはＦを表し、Ｘ74はＴ、ＳまたはＡを表し、Ｘ75はＩまたはＶを表し、Ｘ76はＩ、ＶまたはＡを表し、Ｘ77はＹまたはＦを表す。
【０１４０】
ここで、上記連続する配列はＴ細胞刺激性エピトープを含み、上記ポリペプチドは上記の領域のいずれかからのあらゆる既知のＴ細胞エピトープ含有ＨＣＶペプチドまたはポリペプチドとは異なる。後者の既知のＨＣＶポリペプチドおよびペプチドは、Ｂ細胞エピトープのスクリーニングについて記載されている。
【０１４１】
更により詳細には、本発明は、ＨＣＶ免疫原性組成物の調製のための上述のポリペプチドの用途に関する。
【０１４２】
したがって、本発明は、ＨＣＶのＥ２領域のアミノ酸３９７位〜４１６位の間に含まれる領域：
【０１４３】
【表３６】
2004194668.tif 000037
【０１４４】
（配列番号５５）
から選択される、より詳細には
【０１４５】
【表３７】
2004194668.tif 000038
【０１４６】
から選択される、少なくとも８個〜約２０個の連続するアミノ酸を含むかまたはそれよりなる、上記で定義したポリペプチドであって、上記の領域のいずれかからのあらゆる既知のＴ細胞エピトープ含有ＨＣＶペプチドまたはポリペプチドとは異なるポリペプチドをも企図する。後者の既知のＨＣＶポリペプチドおよびペプチドは、Ｂ細胞エピトープのスクリーニングについて記載されている。
【０１４７】
更により詳細には、本発明は、ＨＣＶ免疫原性組成物の調製のための上述のポリペプチドの用途に関する。
【０１４８】
したがって、本発明は、ＨＣＶのＥ２領域のアミノ酸４０９位〜４２８位の間に含まれる領域：
【０１４９】
【表３８】
2004194668.tif 000039
【０１５０】
から選択される、より詳細には
【０１５１】
【表３９】
2004194668.tif 000040
【０１５２】
から選択される、少なくとも８個〜約２０個の連続するアミノ酸を含むかまたはそれよりなり、上記連続するアミノ酸はＴ細胞刺激性エピトープを含む、上記で定義したポリペプチドであって、上記の領域のいずれかからのあらゆる既知のＴ細胞エピトープ含有ＨＣＶペプチドまたはポリペプチドとは異なるポリペプチドをも企図する。後者の既知のＨＣＶポリペプチドおよびペプチドは、Ｂ細胞エピトープのスクリーニングについて記載されている。好ましくは、本発明にしたがったペプチドは、以下のペプチドのリストから選択される：
【０１５３】
【表４０】
2004194668.tif 000041
【０１５４】
好ましいペプチドとしては、例えば、ＱＬＩＮＴＮＧＳＷ（配列番号１１３）、ＬＩＮＴＮＧＳＷ（配列番号１１４）、ＳＷＨＩＮＳＴＡＬ（配列番号１１５）およびＷＨＩＮＳＴＡＬ（配列番号１１６）が挙げられる。
【０１５５】
更により詳細には、本発明は、ＨＣＶ免疫原性組成物の調製のための上述のポリペプチドの用途に関する。
【０１５６】
したがって、本発明は、ＨＣＶのＥ２領域のアミノ酸５７１位〜６３８位の間に含まれる領域：
【０１５７】
【表４１】
2004194668.tif 000042
【０１５８】
（配列番号１０８）
から選択される少なくとも８個〜約２０個の連続するアミノ酸を含むかまたはそれよりなり、上記連続するアミノ酸はＴ細胞刺激性エピトープを含む、上記で定義したポリペプチドであって、上記の領域のいずれかからのあらゆる既知のＴ細胞エピトープ含有ＨＣＶペプチドまたはポリペプチドとは異なるポリペプチドをも企図する。後者の既知のＨＣＶポリペプチドおよびペプチドは、Ｂ細胞エピトープのスクリーニングについて記載されている。
【０１５９】
本発明にしたがった好ましいペプチドは、以下のペプチドのリストから選択される：
【０１６０】
【表４２】
2004194668.tif 000043
【０１６１】
より好ましくは、本発明にしたがったペプチドは、以下のペプチドのリストから選択される：
【０１６２】
【表４３】
2004194668.tif 000044
【０１６３】
上記ペプチドは、好ましくは、５８２位〜５９０位にわたるＰＤＣＦＲＫＨＰおよび６１１位〜６１７位にわたるＹＰＹＲＬＷＨとは異なる。
【０１６４】
更により詳細には、本発明は、ＨＣＶ免疫原性組成物の調製のための上述のポリペプチドの用途に関する。
【０１６５】
したがって、本発明は、以下の配列：
【０１６６】
【表４４】
2004194668.tif 000045
【０１６７】
（配列番号５７）
を特徴とするＨＣＶのＮＳ３領域のアミノ酸１１８８位〜１４６３位の間に含まれる領域または図６から演繹されうる上記の配列のあらゆる変異体から選択される少なくとも８個〜約２０個の連続するアミノ酸を含むかまたはそれよりなり、上記連続する配列はＴ細胞刺激性エピトープを含む、上記で定義したポリペプチドであって、上記の領域のいずれかからのあらゆる既知のＴ細胞エピトープ含有ＨＣＶペプチドまたはポリペプチドとは異なるポリペプチドをも企図する。後者の既知のＨＣＶポリペプチドおよびペプチドは、Ｂ細胞エピトープのスクリーニングについて記載されている。
【０１６８】
好ましくは、上記のペプチドは、以下のペプチドのリスト：
【０１６９】
【表４５】
2004194668.tif 000046
【０１７０】
または図６から演繹されうる上記配列のあらゆる変異体から選ばれる。
【０１７１】
上記ペプチドは、好ましくは、ＧＫＳＴＫＶＰ、ＰＳＶＡＡＴ、ＩＧＴＶＬＤＱＡＥ、ＡＶＡＹＹＲおよびＴＧＤＦＤＳＶＩＤとは異なる。
【０１７２】
本発明は、より詳細には、上記Ｔ細胞刺激性エピトープがヘルパーＴ細胞エピトープである上述のあらゆるポリペプチドに関する。
【０１７３】
本発明の別の態様にしたがえば、本発明は、上記Ｔ細胞刺激性エピトープがＣＴＬエピトープである上述のあらゆるポリペプチドに関する。
【０１７４】
本発明は、予防ワクチン組成物への上述のいずれかのポリペプチドの包含にも関する。
【０１７５】
別の態様にしたがえば、本発明は、治療ワクチン組成物への上述のいずれかのポリペプチドの包含に関する。
【０１７６】
更に、本発明は、上記で定義したいずれかのポリペプチドの複数のリピートを含むかまたはそれよりなるポリペプチド、上述のいずれかのポリペプチドの組合せ、または上述のペプチドのミモトープ(mimotopes) をも企図する。
【０１７７】
「ミモトープ」という用語は、免疫学的に上述のポリペプチドを擬態する(mimic) ペプチドに関する。ＨＣＶについては配列の可変性が観察されているので、異なる株のエピトープをよりよく擬態するように、１つ以上のアミノ酸を変えることが望ましい可能性がある。このようなミモトープは、対象化合物が免疫学的刺激を与えることができ、その後にＴ細胞が少なくとも１つの株のＨＣＶと反応性である限り、いずれかの特定のＨＣＶ配列と同一である必要がないことは、理解されるべきである。したがって、上述のポリペプチドは、挿入、欠失、および保存的アミノ酸置換および非保存的アミノ酸置換を有していてもよく、そのような場合、このような変化はその用途においてある利点を提供する可能性がある。ペプチドは、好ましくは、なるべく短く、それでもより長い配列の感度の全てをなお維持している。ある場合には、２つ以上のペプチドを単一の構造につなげることが望ましい可能性がある。このような混成物(composite）の形成には、共有結合または非共有結合による連結が関与する。
【０１７８】
本発明は、上記で定義したポリペプチドをコードする核酸インサート（挿入物）を含む発現ベクターにより発現された組換えポリペプチドである、上記で定義したポリペプチドをも企図する。
【０１７９】
本発明のＴ細胞エピトープ含有ポリペプチドの発現を、E. coli のような細菌またはS. cerevisiae のような真核細胞、あるいは昆虫細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＯＳ１細胞、ＢＨＫ細胞およびＭＤＣＫ細胞のような培養された脊椎動物または無脊椎動物宿主で実施するためには、以下の工程を実施する：
【０１８０】
−  適切な細胞宿主を、本発明のポリペプチドの１つをコードするヌクレオチド配列が、適切な調節要素、具体的には細胞宿主または生存キャリア系のポリメラーゼにより認識されるプロモーターと、原核生物宿主の場合には適切なリボソーム結合部位（ＲＢＳ）、の制御下に挿入されていて、前記ヌクレオチド配列の前記細胞宿主中での発現を可能にする、組換えベクターあるいはアデノウイルス、インフルエンザウイルス、ＢＣＧおよび他のいずれかの生存キャリア系を用いて、形質転換する工程、
【０１８１】
−  上記の形質転換された細胞宿主を、前記インサートの発現を可能にする条件下で培養する工程。
【０１８２】
組換えウイルスまたは生存キャリアベクターはまた、ヒトにおける生ワクチンとして直接使用してもよい。
【０１８３】
好ましい態様にしたがえば、本発明は、ＨＣＶコアタンパク質、ＨＣＶエンベロープタンパク質Ｅ１およびＥ２、またはＨＣＶのＮＳ３、ＮＳ４またはＮＳ５免疫原、またはＢ細胞エピトープ含有ＨＣＶペプチドのような病原因子関連免疫原に作動可能に連結された上述のポリペプチドを企図する。
【０１８４】
ここで用いる「作動可能に連結された」という句は、その連結が、連結されたグループのいずれかが記載されたとおりに機能する（例えば、ＴまたはＢ細胞決定基として機能する）能力に干渉しないことを意味する。したがって、作動可能な連結は、共有結合による連結のみでなく、Ｔ細胞機能を誘導しうる連結をも含む。
【０１８５】
ここで用いる「病原因子関連」という句は、ネイティブな形態の病原因子と免疫反応するＴ細胞機能を誘導しうるポリペプチドを指す。
【０１８６】
定義されたポリペプチドは、そのままでも、またはＨＣＶのＢ細胞エピトープ、ＨＢｓＡｇまたはＨＢｃＡｇ粒子、ＨＩＶ免疫原、ＨＴＬＶ免疫原と組合せても、使用することができる。好ましいＢ細胞エピトープを含むＨＣＶポリペプチドは、例えば、ＥＰ−Ａ−０，４８９，９６８およびＷＯ  ９３／１８０５４に詳述されている。
【０１８７】
アミノ酸残基側鎖を通じて個々のポリペプチドを作動可能に連結し、免疫原性コンジュゲート（すなわち、分枝鎖ポリペプチドポリマー）を形成させる方法は、当業界で周知である。これらの方法は、種々の側鎖上の１つ以上のタイプの官能基を通じて連結することを含み、それぞれのポリペプチド骨格が共有結合により連結（カップリング）されているが、少なくとも１つの側鎖で分離されているものを生じる。
【０１８８】
有用な側鎖官能基としては、エプシロン−アミノ基、ベータ−またはガンマ−カルボキシル基、チオール（−ＳＨ）基および芳香環（例えば、チロシンおよびヒスチジン）が挙げられる。上記の官能基の各々を用いてポリペプチドを連結する方法は、Erlanger(1980)、Aurameas et al. (1978)、および Nestor et al.に対する米国特許第４，４９３，７９５号に記載されている。更に、Rodwell et al. (1985) に記載されたような部位特異的カップリング反応は、ポリペプチドの生物学的活性が実質的に減少しないように実施することができる。
【０１８９】
更に、当業界では周知のように、ＨＢｃＡｇタンパク質およびポリペプチド免疫原は、そのネイティブな形態で使用することができ、あるいは、その官能基含量を、リジン残基のスクシニル化またはシステイン−チオラクトンとの反応により改変してもよい。スルフヒドリル基を、２−イミノチオランまたは３−（３−ジチオピリジル）プロピオネートのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを用いてアミノ官能基の反応によりどちらかのポリペプチドに包含させてもよい。ポリペプチドは、ヘキサメチレンジアミンまたは同様のサイズの他の二官能性分子のようなスペーサーアームを包含するよう改変して、連結を容易にすることもできる。
【０１９０】
抗体を産生させたいあらゆるポリペプチド免疫原を、本発明のポリペプチドに連結させ、本発明の免疫原性コンジュゲートを形成することができる。好ましい態様においては、ポリペプチド免疫原は、病原因子関連免疫原であり、コンジュゲートは、有効量で動物に注入された場合、その病原因子と免疫反応する抗体の産生を誘導する能力を有する。特に重要な免疫原の例は、B. pertussis、 S. typosa、 S. paratyphoid A およびB 、C. diptheriae 、C. tetani 、C. botulinum、 C. perfringens 、B. anthracis、 P. pestis、P. multocida、 V. cholerae、 N. meningitides、 N. gonorrhea 、H. influenzae 、T. palladiumなどの細菌由来のもの；ウイルス由来の免疫原、例えば、ポリオウイルス、アデノウイルス、パラインフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、レスピラトリーシンシチカル（ＲＳ）ウイルス、インフルエンザウイルス、ウマ脳脊髄炎ウイルス、ブタコレラウイルス、ニューカッスルウイルス、鶏痘ウイルス、狂犬病ウイルス、ネコおよびイヌジステンパーウイルス、口蹄疫ウイルス、ヒトおよびサル免疫不全症ウイルスなど；流行性および風土病性チフス、および斑点熱グループなどのリケッチア免疫原である。免疫原は、多数の文献、例えば、米国特許第３，１４９，０３６号、第３，９８３，２２８号および第４，０６９，３１３号；「Essential Immunology」、第３版、Roit著、 Blackwell Scientific Publications刊；「Fundamentals of Clinical Immunology」、Alexander and Good著、 W.B. Saunders刊; および「Immunology」、Bellanti著、 W.B. Saunders刊などにおいて従来周知である。特に好ましい病原因子関連免疫原は、米国特許第４，６２５，０１５号、第４，５４４，５００号、第４，５４５，９３１号、第４，６６３，４３６号、第４，６３１，１９１号、第４，６２９，７８３号および特許協力条約国際公開ＷＯ  ８７／０２７７５、ＷＯ  ８７／０２８９２に記載されているものであり、これらの開示の全ては参照によりここに包含される。
【０１９１】
本発明は、特に、以下のペプチドのいずれか、または以下のペプチドのいずれかの配列に包含されるいずれかのペプチドであって、Ｔ細胞エピトープを含むものに関する：
【０１９２】
【表４６】
2004194668.tif 000047
【０１９３】
【表４７】
2004194668.tif 000048
【０１９４】
【表４８】
2004194668.tif 000049
【０１９５】
【表４９】
2004194668.tif 000050
【０１９６】
更に、本発明は、医薬的に許容可能な賦形剤と混合された上記で定義したポリペプチドの少なくとも１つを含むまたはそれよりなる免疫原性組成物を企図する。
【０１９７】
患者に投与する前に、本発明のポリペプチドまたはペプチドに賦形剤を加えてもよい。液体の製剤が好ましい。例えば、これらの賦形剤としては、油類、ポリマー類、ビタミン類、炭水化物、アミノ酸、塩類、緩衝剤、アルブミン、界面活性剤または増量剤を含んでいてもよい。好ましくは、炭水化物としては、糖または糖アルコール、例えば、モノ、ジまたはポリサッカリド、または水溶性グルカンが挙げられる。サッカリドまたはグルカンとしては、フルクトース、デキストロース、ラクトース、グルコース、マンノース、ソルボース、キシロース、マルトース、スクロース、デキストラン、プルラン、デキストリン、アルファおよびベータシクロデキストリン、可溶性デンプン、ヒドロキシエチルデンプンおよびカルボキシメチルセルロース、またはこれらの混合物を挙げることができる。スクロースが最も好ましい。「糖アルコール」は、−ＯＨ基を有するＣ４〜Ｃ８炭化水素と定義され、ガラクチトール、イノシトール、マンニトール、キシリトール、ソルビトール、グリセロール、およびアラビトールなどがある。マンニトールが最も好ましい。上述のこれらの糖類または糖アルコールは、個別に用いてもよく、組合せて用いてもよい。その糖または糖アルコールが水性調製物中で可溶性である限りにおいて、用いる量について固定された制限はない。好ましくは、糖または糖アルコール濃度は、１．０w/v ％〜７．０w/v ％の間であり、より好ましくは２．０〜６．０w/v ％の間である。好ましくは、アミノ酸は左旋性（Ｌ）形態のカルニチン、アルギニン、およびベタインを含む。しかし、他のアミノ酸を加えてもよい。好ましいポリマーとしては、平均分子量２，０００〜３，０００のポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、または平均分子量３，０００〜５，０００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。凍結乾燥前または再構成後の溶液中のpH変化を最小限にするために、組成物に緩衝剤を用いることも好ましい。ほとんどあらゆる生理学的緩衝剤を用いることができるが、好ましいのは、サイトレート、ホスフェート、スクシネートおよびグルタメート緩衝剤またはそれらの混合物である。最も好ましいのはサイトレート（クエン酸）緩衝剤である。好ましくは、濃度は０．０１〜０．３molar である。製剤に添加することができる界面活性剤は、ＥＰ特許出願ＥＰ−０，２７０，７９９およびＥＰ−０，２６８，１１０に示されている。
【０１９８】
更に、ポリペプチドは、例えば、循環半減期を延ばすために、共有結合によるポリマーへのコンジュゲーションによって、化学的に修飾することができる。好ましいポリマー、およびそれらをペプチドに付着させる方法は、米国特許第４，７６６，１０６号；第４，１７９，３３７号；第４，４９５，２８５号；および第４，６０９，５４６号に示されている。好ましいポリマーは、ポリオキシエチル化ポリオール類およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。ＰＥＧは、室温で水に可溶性であり、一般式：Ｒ（Ｏ−ＣＨ2 −ＣＨ2)n Ｏ−Ｒ〔式中、Ｒは水素、またはアルキルもしくはアルカノール基のような保護基であることができる〕を有する。好ましくは、保護基は１個〜８個の炭素を有し、より好ましくはメチルである。記号ｎは正の整数であり、好ましくは１〜１，０００の間であり、より好ましくは２〜５００の間である。ＰＥＧは、好ましい平均分子量が１，０００〜４０，０００の間であり、これは、より好ましくは２，０００〜２０，０００の間であり、最も好ましくは３，０００〜１２，０００の間である。好ましくは、ＰＥＧは、少なくとも１つのヒドロキシ基を有し、より好ましくは、それは末端ヒドロキシ基である。このヒドロキシ基が、好ましくは活性化される。しかしながら、反応性基のタイプおよび量は、本発明の共有結合によりコンジュゲート化されたＰＥＧ／ポリペプチドを達成するためには変化させてもよいことは理解されるであろう。
【０１９９】
水溶性ポリオキシエチル化ポリオール類も、本発明において有用である。これらとしては、ポリオキシエチル化ソルビトール、ポリオキシエチル化グルコース、ポリオキシエチル化グリセロール（ＰＯＧ）などが挙げられる。ＰＯＧが好ましい。１つの理由は、ポリオキシエチル化グリセロールのグリセロール骨格が、例えば、動物およびヒトでのモノ−、ジ−、トリグリセリドの天然の骨格と同じであるからである。したがって、この分岐は、体内で必ずしも外来物として見られないであろう。ＰＯＧの好ましい分子量は、ＰＥＧと同じ範囲である。ＰＯＧの構造は、Knauf et al., 1988に示されており、ＰＯＧ／ＩＬ−２コンジュゲートの考察は、米国特許第４，７６６，１０６号に見出せる。
【０２００】
循環半減期を増加するための別のドラッグデリバリーシステムは、リポソームである。リポソームデリバリーシステムの調製方法は、Gabizon et al., 1982; およびSzoka, 1980 で考察されている。他のドラッグデリバリーシステムは当業界で公知であり、例えば、Poznansky, 1984 に記載されている。
【０２０１】
液体医薬組成物を調製した後、分解を防ぎ、無菌性を保つために、凍結乾燥することが好ましい。液体組成物の凍結乾燥法は、当業界の通常の技術者に公知である。使用の直前に、組成物を、無菌的希釈剤（例えば、リンガー液、蒸留水または無菌的生理食塩水）（付加的な成分を含んでいてもよい）で再構成することができる。再構成し、当業者に公知の方法を用いて、組成物を、好ましくは対象に投与する。
【０２０２】
上述のように、本発明の組成物およびポリペプチドは、前記の疾患状態のいずれかを防止または治療するためにヒト患者を処置するのに用いることができる。好ましい投与ルートは、非経口的ルートである。非経口投与においては、本発明の組成物は、単位容量の注射可能形態、例えば、溶液、懸濁液または乳化液に、医薬的に許容可能な非経口賦形剤と共に、製剤化する。このような賦形剤は、本質的に非毒性であり、非治療的である。このような賦形剤の例としては、生理食塩水、リンガー液、デキストロース溶液およびハンクス液がある。非水性賦形剤、例えば、オイルおよびエチルオレエートを用いてもよい。好ましい賦形剤は、５％デキストロースを含む生理食塩水である。賦形剤は、少量の添加剤、例えば、緩衝剤および保存剤などの等張性および化学的安定性を強化する物質を含有していてもよい。
【０２０３】
投与の用量およびモードは、個体に依存する。
【０２０４】
より詳細には、本発明は、場合により医薬的に許容可能なアジュバントと共に、免疫応答を生じさせるのに充分な量の上記で定義した少なくとも１つのポリペプチドを投与することを含む、ＨＣＶに対して免疫する方法に用いるための、上記で定義した組成物を企図する。
【０２０５】
より詳細には、上記免疫原性組成物はワクチン組成物である。更により詳細には、上記ワクチン組成物は、予防ワクチン組成物である。あるいは、上記ワクチン組成物は治療ワクチン組成物であってもよい。
【０２０６】
予防ワクチン組成物は、ＨＣＶ感染の防止を目的とし、ＨＣＶに未だ感染していない正常個体に投与されるべきワクチン組成物をいう。
【０２０７】
治療ワクチン組成物は、ＨＣＶ感染の治療を目的とし、ＨＣＶに感染した患者に投与されるべきワクチン組成物をいう。
【０２０８】
本発明に記載されたポリペプチドは、その免疫原性を高めるために、脂質で修飾することができ（リポペプチド、例えば、ＰＡＭ3 Ｃｙｓ）、ミョウバン、モノホスフォリルリピドＡ、プルロニック（界面活性剤）、ＳＡＦ１、Ｒｉｂｉ、トレハロース−６，６−ジミコレートまたは当業者に公知の他の免疫刺激性化合物を用いて製剤化することができる。
【０２０９】
また、本発明は、好ましい態様にしたがえば、上記で定義したＴ細胞刺激性ポリペプチドのいずれかに加えて、少なくとも１つのＨＣＶのＢ細胞エピトープを含むペプチドまたはポリペプチド、および／または構造ＨＣＶポリペプチド、および／または非構造ＨＣＶポリペプチドを含む、上記で定義した組成物をも企図する。
【０２１０】
更に別の好ましい態様にしたがえば、本発明は、場合により医薬的に許容可能なアジュバントと共に、ＨＣＶ感染の治療を可能にするのに充分な量の少なくとも１つの上記で定義したポリペプチドを投与することを含む、ＨＣＶ疾患の治療方法に用いるための、上記で定義した組成物を企図する。この場合、本発明のポリペプチドは、Ｃ型肝炎ウイルス感染のクリアランスのために充分なレベルのＴ細胞機能を誘導することを目的として、治療ワクチンの形態で使用することができる。
【０２１１】
更に別の好ましい態様にしたがえば、本発明は、上記で定義したポリペプチドのいずれかに加えて、少なくとも１つのＨＣＶのＢ細胞エピトープを含むペプチドまたはポリペプチド、および／または構造ＨＣＶポリペプチド、および／または非構造ＨＣＶポリペプチドを含む、上記で定義した組成物を企図する。
【０２１２】
更に別の態様にしたがえば、本発明は、上記で定義したポリペプチドが、ＨＢｓＡｇまたはＨＢｃＡｇ粒子、ＨＢＶ免疫原、ＨＩＶ免疫原、および／またはＨＴＬＶ免疫原と混合されている組成物を企図する。
【実施例】
【０２１３】
例１：研究した患者
研究した患者の構成は、２７歳〜７１歳の男性１９人および女性１３人（平均年齢：４９．９歳）であった。慢性ＨＣＶ肝炎の診断は、（ａ）少なくとも６か月間の、正常の上限の２倍のアラニンアミノトランスフェラーゼの証明された上昇；（ｂ）２つの第二世代酵素イムノアッセイ試験（ＵＢＩテストおよびインノテスト(Innotest)ＨＣＶ  ＡｂII、Innogenetics, Antwerp Belgium)により検出されるＨＣＶ特異的血清抗体の存在、および（ｃ）他のウイルス性、毒性、代謝性、遺伝性または自己免疫性肝炎の、臨床的、組織学的または血清学的徴候の欠如、に基づいていた。患者は、２４週間の間、週３回、３００万単位のインターフェロンα−２ｂ（INTRON A）を与える標準的治療、または８週間の間、週３回、６００万単位のインターフェロンα−２ｂの誘導相と、その後の、生化学的およびウイルス学的緩解（アラニンアミノトランスフェラーゼ活性が正常、血漿Ｃ型肝炎ウイルスＲＮＡが検出不能）が達成されるまで、週３回の６００万〜１００万単位の滴定した用量のインターフェロンの維持相とからなる実験的治療のいずれかを、ランダムに受けた。患者は、少なくとも１か月の間隔での治療中の少なくとも２回の連続する訪問において、アラニンアミノトランスフェラーゼ活性の正常化が観察された場合、臨床的応答者と考えられた。
【０２１４】
リンパ球増殖性応答の特異性に関する対照として、２５〜５８歳（平均３８．６歳）の健康な個人１８人、男性１０人および女性８人を選択した。これらの被験者は、ＨＣＶ抗体およびＨＣＶ−ＲＮＡについて陰性であった。１人の被験者は、過去にＢ型肝炎ウイルス感染の経歴があり、７人は、予防接種の結果としてＨＢｓＡｇに対する抗体を有していた。
【０２１５】
インターフェロンα療法の開始に先立って、全ての患者で肝臓の生検を実施した。組織学的状態は、従来の組織学的分類にしたがって定義した(Knodell et al., 1981)。
【０２１６】
上記に与えた臨床的応答者の定義に基づいて、１８人の被験者をインターフェロンαに対する臨床的応答者と考えることができた。両方のグループの最も適切な臨床的、病理学的およびウイルス学的データを、表２にまとめて示す。理論上予期されたよりも、応答者グループには女性が多く、無応答者グループには男性が多かったが、観察された不均衡は有意ではなかった（Ｘ2 テスト）。各被験者における疾患の持続期間は、既往歴データ（複数の輸血を伴う外科手術、静脈による薬物乱用、針刺し事故による職業的接触など）または慢性的に変動する上昇したトランスアミナーゼレベルを示す患者のファイルデータに基づいて概算した。疾患の持続期間は、１〜３２年の幅があった。平均疾患持続期間は、応答者では９．２±９．２年、および無応答者では６．８±５．４年であった。応答者グループには、実験的プロトコールで治療を受けた被験者が多く、無応答者には標準的プロトコールで治療を受けた被験者が多く含まれていたが、この不均衡は有意ではなかった（Ｘ2 テスト）。３２人の患者のうち２６人（８１％）は、１ｂ遺伝子型のＨＣＶに感染していた。遺伝子型３ａ、４ａおよび５ａは、それぞれ４人、１人および１人の被験者で見出された。既往歴データにより、感染源を導き出すことができた。１４人の被験者においては、輸血がＨＣＶ感染源の可能性があり、３人の患者はＩＶ薬物乱用および他の３人は針刺し事故であった。１２人の被験者については、感染源を追跡することはできなかった。ほとんどの患者（３２人のうち２０人）は、軽度、中程度または重度の形態の慢性活性肝炎に一致する病理学的損傷を示した。７人の患者は、慢性持続性肝炎の徴候を示した。２人の被験者については、生検により非特異的損傷のみが示され、他の２人では肝硬変の徴候が観察された。
【０２１７】
例２：体液性免疫応答の解析
ＩＮＮＯ−ＬＩＡ  ＨＣＶ  ＡｂII（Innogenetics, Belgium)を、コア、ＮＳ４ａ＋ｂおよびＮＳ５ａ領域からのペプチドエピトープに対する抗体を検出するために使用した。各患者から、インターフェロン療法の開始前に得た血清試料を調べ、ときどき付加的なフォローアップ試料をも試験した。研究した３２人の全ての患者は、２つの市販されている酵素イムノアッセイにより明らかにされるＨＣＶに対する循環抗体を有していた。ペプチドベースのイムノブロットアッセイ（ＩＮＮＯ−ＬＩＡ  ＨＣＶ  ＡｂII）を用いて、これらの抗体の特異性を部分的に定義することができた。３１人の患者からの血清を、このアッセイを用いて少なくとも１回調べ、２０人の被験者については、４週（患者第６３５番）〜１２４週（患者第６０６番）の間隔で採取した２つの血清に、このアッセイを行った。表３に、このサーベイの結果を示す。用いた抗原（４つの個々にスポットされたコアペプチド、５番目のラインをなすＮＳ４ペプチドの混合物、および６番目のラインをつくる選択されたＮＳ５ペプチド）との反応性パターンとは別に、表３には、ＨＣＶ遺伝子型、およびインターフェロン療法の開始に関して血清を採取した時点も示す。これらのデータは、個々の患者の抗体認識パターンは経時的にほとんど変化しないことを明らかに示す。２０対の試料において観察された唯一の差異は、反応の強度における単一ステップの変化であった。インターフェロンに対する無応答者におけるのと同様に応答者においても、血清学的反応パターンの同じヒエラルキーが観察された。判別しにくいまたは弱い反応を考慮に入れない場合、以下のようなヒエラルキーが見られる：コア２＞ＮＳ４＞ＮＳ５＞コア１＞コア４＞コア３。
【０２１８】
例３：ＨＣＶ  ＲＮＡおよびＨＣＶ遺伝子型の検出
逆転写およびＰＣＲは、以前記載されたように実施した(Stuyver et al., 1993)。ＰＣＲ産物は、ＩＮＮＯ−ＬｉＰＡゲノタイピングアッセイによるゲノタイピングのために更に処理した(Stuyver et al., 1993)。ゲノタイピングアッセイの結果を、表３に示す。
【０２１９】
例４：細胞性免疫応答の解析
４．１．ＨＣＶ抗原の合成
コア、Ｅ１およびＥ２／ＮＳ１配列に対応するペプチドの９つのグループ（プール）、Ｅ２／ＮＳ１に対応するこれらのプールに含まれていない２つの単一ペプチド、およびＮＳ３−ＨＣＶ遺伝子型１ｂの中央部分を表す組換えタンパク質を、ＰＢＭＣのインビトロ刺激に用いた。各グループには、８アミノ酸が重複する４〜６種の異なる２０mer （２０量体）ペプチドをプールした。グループ１、２および３には、主に、各々アミノ酸５位〜８０位、７３位〜１４０位および１３３位〜２００位のコアペプチドが含まれていた（表１）。グループ４、５および６は、主に、各々アミノ酸１９３位〜２６０位、２５３位〜３３２位および３２５位〜３９２位のＥ１ペプチドを含んでいた。グループ７、８および９には、各々アミノ酸４２７位〜４９４位、４８７位〜５７８位および５７１位〜６３８位のＥ２／ＮＳ１ペプチドが含まれていた。付加的な２つの単一ペプチド（ＮＳ１−７* およびＮＳ１−５*)は、Ｅ２配列の３９７〜４２８のアミノ酸をカバーしていた（表１）。ＮＳ３配列を含む融合タンパク質は、E. coli で発現させたものであり、ベルギーの単離株ＩＧ８３０９のＨＣＶアミノ酸１１８８〜１４６３をカバーしていた。
【０２２０】
ペプチドは、表１に示す緩衝液に溶解し、最終濃度１０μg/mlで培養に添加した。このペプチド濃度で、細胞培養中の溶解緩衝液の濃度は、毒性でも阻害性でもなかった。このことを確認するために予備的な実験を実施した。ＮＳ３タンパク質を、最終濃度１．５μg/mlで用いた。破傷風トキソイド（WHO, Copenhagen, Denmark）を陽性対照抗原として使用し、最終濃度１０μg/mlで培養液に添加した。
【０２２１】
全てのペプチドは、酸不安定性リンカーの４−（ａ−Ｆｍｏｃ−アミノ−２′，４′−ジメトキシベンジル）フェノキシ酢酸で官能化(functionalized)したＰｅｐＳｙｎ  Ｋ樹脂（Millipore)、または同じリンカーで官能化したＴｅｎｔａＧｅｌ  Ｓ−ＲＡＭ樹脂（Rapp Polymere)（切断によりペプチドアミドを生じる）のどちらかの上で合成した。ｔ−ブチルベースの側鎖保護およびＦｍｏｃ−ａ−アミノ保護アミノ酸誘導体を用いた。アルギニンのグアニジノ基は、２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルフォニルで保護した。ヒスチジンのイミダゾール基は、ｔ−Ｂｏｃまたはトリチルで保護し、システインのスルフヒドリル基は、トリチル基で保護した。カップリングは、予め形成したｏ−ペンタフルオロフェニルエステルを用いて実施した。例外として、アルギニンの場合には、ＴＢＴＵ（ｏ−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチルウロニウム  テトラフルオロボレート、Novabiochem)を、活性化剤として、２当量の塩基Ｎ−メチルモルフォリンおよび１当量の１−ヒドロキシベンゾトリアゾールの存在下で用いた。場合により、グルタミン、アスパラギンおよびトリプトファンも、ＴＢＴＵ活性化を用いてカップリングした。これらの場合には、トリチルで保護したグルタミンおよびアスパラギンの誘導体(Millipore) 、そしてｔ−Ｂｏｃで保護したトリプトファンの誘導体(Novabiochem) を使用した。合成は全て、連続フロー操作法を用いてMilligen 9050 PepSynthesizer (Millipore)で実施した。適切なスカベンジャーの存在下でのトリフルオロ酢酸によるペプチドの切断およびジエチルエーテルによる沈殿に続いて、全てのペプチドをＣ18逆相クロマトグラフィにより解析した。
【０２２２】
ウイルスヌクレオキャプシド（コア）およびＥ１タンパク質に対応するＨＣＶアミノ酸配列は、Okamoto et al. (1990) (Japan. J. Exp. Med. (1990) 60:167-177) に記載されたＨＣ−Ｊ１配列に基づいていた。アミノ酸残基Ｇｌｙ451 で始まるＨＣＶ配列は、Choo et al.(1991) (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1991) 88:2451-2455)により報告された配列から採用した。ほとんどのペプチド配列は、互いに８アミノ酸残基ずつ重複するように選択した。
【０２２３】
４．２．Ｔ細胞増殖アッセイ
全ての細胞培養に用いた培地は、ＲＰＭＩ１６４０に、２５mMＨＥＰＥＳ、２mMＬ−グルタミン、５０U/mlペニシリンおよび５０μg/mlストレプトマイシン（全てGibco Europe, Gent, Belgium より入手）、５×１０-5M ２−メルカプトエタノール（Sigma, St. Louis, MO) および１０％熱非働化ヒトＡＢ血清（プール）を加えたものからなっていた。このＡＢ血清は、血液群ＡＢ+ の健康な供血者から得たものであり、ＨＣＶに対する抗体およびＨＣＶ−ＲＮＡが欠如している場合のみ使用した。この「補完された(complemented)」ＲＰＭＩ１６４０培地は、これ以降、「完全培地」と呼ぶこととする。
【０２２４】
ＰＢＭＣは、フィコールHypaque (Lymphoprep, Nyegaard, Denmark) 上での等密度遠心分離法によりヘパリン処理した静脈血から単離し、完全培地中に懸濁した。完全培地２００μl 中４×１０5 個のＰＢＭＣを、種々の濃度の抗原の存在下または非存在下で、５％ＣＯ2 を含む大気中、３７℃で５日間、９６ウェル丸底マイクロプレート（Falcon Plastics)で培養した。次いで、各ウェルに０．５μCi(3Ｈ）−チミジンを添加し、１６〜２０時間後、マルチチャンネル細胞収穫器(PHD, Cambridge, MA)を用いてグラスファイバーフィルター上に培養を収穫して、ＬＫＢ−Wallac 8100 カウンター(LKB, Bromma, Sweden) 中で液体シンチレーションカウントによる(3Ｈ) −チミジンの取り込みを測定した。結果は、刺激インデックス（ＳＩ；抗原により刺激した培養の平均cpm ／対照培養の平均cpm)として表す。増殖は、刺激インデックスが＞３の場合に陽性とした。いくつかの図においては、結果をcpm として表す（抗原により刺激した培養の平均cpm −対照培養の平均cpm)。３つ１組の培養の平均cpm の標準偏差は、一貫して１０％未満であった。
【０２２５】
インビボでプライミングしたＨＣＶ特異的メモリーＴリンパ球の出現は、リンパ球増殖アッセイを用いて調べた。慢性ＨＣＶ患者３２人のＰＢＭＣを、１ａ型ＨＣＶのコア、Ｅ１およびＥ２／ＮＳ１領域を表す４〜６の部分的に重複する合成ペプチドのプール、１ａ型ＨＣＶのアミノ末端からの２つの重複する単一ペプチド、および１ｂ型のＨＣＶのＮＳ３配列を含む組換え融合タンパク質で、インビトロで刺激した。２人（＃６１０および＃６３６）を除く全ての患者において、少なくとも２回、最高１１回（＃６３３）までのアッセイを実施した。例えば、患者＃６３２は、インターフェロン療法の開始（第０週）の後、第４週〜第５４週の間の８回の異なる機会に検査した。図１には、療法に対する生化学的応答（ＡＬＴ／ＡＳＴ）と相関するこれらのアッセイの結果を示す。Intron-A (Schering Plough)の開始４週間後に、トランスアミナーゼレベルの正常化が観察された。この患者からのＰＢＭＣは、ペプチドプール２および３での刺激により一貫して活発に増殖する。他の抗原調製物に対する応答は、それに比べると活発でなく、再現性も低く、これらのエピトープを認識するメモリー細胞の数が少ないことが示唆された。常に刺激インデックス（ＳＩ）が３で増殖性応答を誘導しなかった抗原は、グラフに示していない。
【０２２６】
３２人の患者について実施した１３５回のアッセイの結果を解析し、要約するために、特定の抗原調製物（ペプチドプール１〜９、ＮＳ１−５* 、ＮＳ１−７* またはＮＳ３タンパク質）に対する個別の患者の応答を、実施したアッセイの少なくとも半分においてＳＩ  ３で誘導された場合に、有意であるとすることにした。表４に示した結果は、この採点方法を用いて得たものである。この表は、標準的に用いた１２の抗原調製物に対する慢性ＨＣＶ患者の抗原認識パターンを示す。個々の患者番号および各被験者からのＰＢＭＣを用いて実施したアッセイの数とは別に、表４には、これらのアッセイを実行した時間枠も示す。インターフェロン療法の開始を基準点、第０週として用いる。全ての抗原に応答した患者は一人もいなかった。１８人の臨床的応答者のうち１３人（７２％）からのＰＢＭＣ、および１４人の無応答者のうち１２人（８５％）が、少なくとも１つの抗原調製物に応答して増殖した。１つの抗原調製物（ペプチドプール８）を除いて全てが、少なくとも１人の被験者で増殖応答を誘導した。ペプチドプール２および３に対する応答が最も高頻度であった。インターフェロン応答者および無応答者の両方が、ペプチドプール２に対して等しく良好に増殖した（それぞれ５６％および５７％）が、ペプチドプール３に対しては、無応答者（２９％、すなわち、１４人中４人）は、応答者（４４％、すなわち、１８人中８人）に比べて反応が劣っていた。同様の不均衡は、ペプチドプール５および９に対する反応についても観察された。これらは、応答者（それぞれ１７％および１１％）に比べて無応答者でより高頻度で認識された（それぞれ４３％および４３％）。インターフェロン療法に対する臨床的無応答者は、ＮＳ３タンパク質で刺激した場合にも、応答者（２４％、すなわち、１７人中４人）よりも高頻度で反応した（５７％、すなわち、１４人中８人）。しかしながら、ペプチドプール３、５および９、またはＮＳ３タンパク質に対する増殖応答率におけるこれらの差異は、どれも統計学的有意性（Χ2 テストでｐ＜０．０５）に達しなかった。顕著でありかつ有意な差異（Χ2 テストでｐ＝０．０１）は、ペプチドＮＳ１−５* およびＮＳ１−７* に対する応答者および無応答者の応答率について観察された。実際、１７人中８人の応答者が一方または両方のペプチドを認識したのに対し、無応答者は１人も認識しなかった。これらの増殖アッセイ全ての結果の要約を、図２に、１２の抗原調製物に対するＨＣＶ患者ならびに１８人の健康な対照被験者の応答率で示す。実際、ＨＣＶ患者において観察される増殖応答の関連を確立するために、１８人の健康な対照被験者からのＰＢＭＣを、同じ抗原調製物で刺激した。全体で、２７回のアッセイ（すなわち、１０人の被験者で１回のアッセイ、７人のボランティアで２回、および１人については３回）を実施した。１２人の対照被験者については、どの抗原も増殖応答を誘導しなかった。６人の被験者については、１つ以上の抗原が増殖応答を誘導し、単独のアッセイまたは実施したアッセイの少なくとも半分でＳＩ  ３であった。表５に、これらの被験者で増殖応答を誘導した抗原を示す。図２は、増殖応答が、健康な対照者よりもＨＣＶ患者で、より���頻度で起こることを示唆するが、これらの差異は必ずしも統計学的有意性（ｐ＜０．０５）に達しない。ペプチドプール２および３、およびＮＳ３タンパク質は、明らかに（ｐ＜０．０５）、健康な対照者よりもＨＣＶ患者のグループ全体で、より高頻度で増殖応答を誘導する。これらの差異のほとんどは、インターフェロン応答者および無応答者を各々健康な対照者グループと比較した場合にも有意である。インターフェロン応答者のＮＳ３に対する増殖応答についてのみ、このことはもはや有効ではない。健康な対照者およびＨＣＶ患者におけるペプチドプール５に対する増殖応答の頻度は、有意に異ならなかったが、これらは、無応答者のみを対照被験者と比較した場合には有意となった（ｐ＜０．０３）。その他の差異は全て、ｐ＜０．０５レベルに達しなかった。
【０２２７】
例５：臨床的応答者からのＰＢＭＣによるＨＣＶコア領域の認識の精密な特異性：コアのカルボキシ末端領域中のＴ細胞エピトープの局在
ペプチドプール２および３は、ＨＣＶ患者の大部分において増殖応答を惹起したので、これらのプールのどのペプチドがこれらの応答を誘導していたのかを調べた。健康な対照被験者からのＰＢＭＣに対する単一ペプチドの刺激能力も、同様に試験した。１７人の対照被験者からのＰＢＭＣを用いて、２３回の増殖アッセイを実施した。ペプチドコアＣ１７、コアＣ２１およびコアＣ３１は、それぞれ２人（１２％）、１人（６％）および１人（６％）の被験者により認識された。インターフェロン療法に応答した１１人のＨＣＶ患者からＰＢＭＣを調製した。８人の被験者はペプチドプール２および３の一方または両方に対して増殖応答を示したが、３人の患者は示さなかった。１９回のアッセイを実施した。陽性の反応についての採点システムは、例４に記載のとおりであった。表６に、これらの１９回のアッセイの結果を要約し、アッセイ結果の一貫性を明らかにする。実際、これらのペプチドプールに反応しなかった患者からのＰＢＭＣは、個々のペプチドのいずれを用いて刺激しても、増殖しなかった。以前増殖応答を示した患者からのＰＢＭＣは、これらのプールからの１つまたはいくつかのペプチドを用いての刺激により反応した。少なくとも１つ〜最高５つのこれらのペプチドが、これらの患者により認識された。ＨＣＶコア配列の最も免疫原性の高い領域は、アミノ酸１０９と１７６の間に位置しているようである。ペプチドＣ２７（アミノ酸１５７〜１７６）は、８人の増殖応答者のうち６人により認識され、最も免疫優性なものであることがわかった。続いて、５人の患者により認識されたＣ２５、３人の患者により認識されたＣ２３およびＣ１９の順である。
【０２２８】
例６
リンパ球増殖性応答の精密な特異性を、新規試料を用いて再度試験した。それらの大部分は、例５で解析した患者とは異なる患者から得られた。５人の患者（ＩＦＮα応答者２人およびＩＦＮα無応答者３人）および１６人の正常対照者を調べた。表７に、慢性Ｃ型肝炎患者において実施したアッセイの結果を示す。試験した両ＩＦＮα応答者で観察された最も高いＬＰＲは、以下のアミノ酸位置に対するものであった：７３〜９２（Ｃ１３）；１０９〜１２８（Ｃ１９）；１２１〜１４０（Ｃ２１）；１４５〜１６４（Ｃ２５）；１５７〜１７６（Ｃ２７）。アミノ酸残基１２１〜１４０（Ｃ２１）および１３３〜１５２（Ｃ２３）のみが、２人のＩＦＮα無応答者で高いＬＰＲを惹起した。したがって、予防または治療ワクチン組成物におけるペプチドＣ１３、Ｃ１９、Ｃ２５および／またはＣ２７の使用は、特に有利である可能性がある。
【０２２９】
【表５０】
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【０２３０】
【表５１】
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【０２３１】
【表５２】
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【０２３２】
【表５３】
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【０２３３】
【表５４】
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【０２３４】
【表５５】
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【０２３５】
【表５６】
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【０２３６】
【表５７】
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【０２３７】
【表５８】
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【０２３８】
【表５９】
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【０２３９】
【表６０】
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【０２４０】
【表６１】
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【０２４１】
【表６２】
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【図面の簡単な説明】
【０２４２】
【図１】ＨＣＶ患者第６３２番におけるリンパ球増殖性応答およびトランスアミナーゼ活性の変化。ＡＳＴは、アスパルテートアミノトランスフェラーゼを表し、ＡＬＴは、アラニンアミノトランスフェラーゼを表す；ＳＩ：刺激インデックス；Ｐ１〜Ｐ６は、表１に開示したペプチド１〜６のグループを指す。
【図２】健康な対照、インターフェロン（ＩＦＮ）応答者およびＩＦＮ無応答者における、ペプチドプール１〜９、単一ペプチドＮＳ１−７* 、ＮＳ１−５* および組換えＮＳ３タンパク質に対するリンパ球増殖性応答の頻度。
【図３】試験した単離株ＩＧ８３０９の配列の一部を表す。この部分は、４１位のＧｌｙから３１８位のＳｅｒまで広がっている（配列番号５７）。
【図４Ａ】ＨＣＶ構造領域のアラインメント（整列図）を示す。
【図４Ｂ】ＨＣＶ構造領域のアラインメント（整列図）を示す。
【図４Ｃ】ＨＣＶ構造領域のアラインメント（整列図）を示す。
【図４Ｄ】ＨＣＶ構造領域のアラインメント（整列図）を示す。
【図４Ｅ】ＨＣＶ構造領域のアラインメント（整列図）を示す。
【図４Ｆ】ＨＣＶ構造領域のアラインメント（整列図）を示す。
【図４Ｇ】ＨＣＶ構造領域のアラインメント（整列図）を示す。
【図４Ｈ】ＨＣＶ構造領域のアラインメント（整列図）を示す。
【図４Ｉ】ＨＣＶ構造領域のアラインメント（整列図）を示す。
【図４Ｊ】ＨＣＶ構造領域のアラインメント（整列図）を示す。
【図４Ｋ】ＨＣＶ構造領域のアラインメント（整列図）を示す。
【図４Ｌ】ＨＣＶ構造領域のアラインメント（整列図）を示す。
【図４Ｍ】ＨＣＶ構造領域のアラインメント（整列図）を示す。
【図４Ｎ】ＨＣＶ構造領域のアラインメント（整列図）を示す。
【図４Ｏ】ＨＣＶ構造領域のアラインメント（整列図）を示す。
【図４Ｐ】ＨＣＶ構造領域のアラインメント（整列図）を示す。
【図４Ｑ】ＨＣＶ構造領域のアラインメント（整列図）を示す。
【図４Ｒ】ＨＣＶ構造領域のアラインメント（整列図）を示す。
【図４Ｓ】ＨＣＶ構造領域のアラインメント（整列図）を示す。
【図４Ｔ】ＨＣＶ構造領域のアラインメント（整列図）を示す。
【図４Ｕ】ＨＣＶ構造領域のアラインメント（整列図）を示す。
【図４Ｖ】ＨＣＶ構造領域のアラインメント（整列図）を示す。
【図４Ｗ】ＨＣＶ構造領域のアラインメント（整列図）を示す。
【図５Ａ】アミノ酸５７１位〜６３８位にわたるＥ２領域のアラインメント。
【図５Ｂ】アミノ酸５７１位〜６３８位にわたるＥ２領域のアラインメント。
【図６Ａ】アミノ酸１１８８位〜１４６５位にわたるＮＳ３配列のアラインメント。
【図６Ｂ】アミノ酸１１８８位〜１４６５位にわたるＮＳ３配列のアラインメント。
【図６Ｃ】アミノ酸１１８８位〜１４６５位にわたるＮＳ３配列のアラインメント。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図４Ｇ】
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【図４Ｈ】
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【図４Ｉ】
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【図４Ｊ】
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【図４Ｋ】
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【図４Ｌ】
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【図４Ｍ】
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【図４Ｎ】
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【図４Ｏ】
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【図４Ｐ】
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【図４Ｑ】
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【図４Ｒ】
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【図４Ｓ】
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【図４Ｔ】
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【図４Ｕ】
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【図４Ｖ】
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【図４Ｗ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【配列表】
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