【手続補正書】
【提出日】平成25年11月26日(2013.11.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞培養培地中のマイコプラズマを検出する方法であって、
細胞培養培地のアリコートを得るステップと、
前記アリコート中のマイコプラズマ核酸を、存在する場合に増幅するために熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを用いてリアルタイム核酸増幅反応を実施するステップであって、
前記アリコート中の核酸がさらに精製されることがなく、
前記増幅反応が、二本鎖ＤＮＡの存在下で蛍光シグナルを生成する、インターカレートする蛍光色素を含むステップと、
前記増幅反応の増幅産物の融解温度を検出するステップであって、前記増幅産物の存在が、前記細胞培養中のマイコプラズマの存在を示すステップと
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法において、前記実施ステップが、以下の縮重プライマー：
ＧＡＡＧＡＷＡＴＧＣＣＷＴＡＴＴＴＡＧＡＡＧＡＴＧＧ（配列番号１）、および
ＣＣＲＴＴＴＴＧＡＣＴＹＴＴＷＣＣＡＣＣＭＡＧＴＧＧＴＴＧＴＴＧ（配列番号２）、
を用いて、前記部分を増幅することを含み、
ここで、ＷはＡまたはＴを表し、ＹはＣまたはＴを表し、ＲはＡまたはＧを表し、ＭはＡまたはＣを表わすことを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法において、前記反応が、１つの順方向プライマーおよび１つの逆方向プライマー以外のプライマーを含有しないことを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法において、前記増幅反応がマイコプラズマ・アルギニニ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｒｇｉｎｉｎｉ）、Ｍ．ピルム（Ｍ．ｐｉｒｕｍ）、Ｍ．ホミニス（Ｍ．ｈｏｍｉｎｉｓ）、Ｍ．ファーメンタンス（Ｍ．ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、Ｍ．サルバリウム（Ｍ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｍ）、Ｍ．オラーレ（Ｍ．ｏｒａｌｅ）、Ｍ．ヒオリニス（Ｍ．ｈｙｏｒｈｉｎｉｓ）、およびアコレプラズマ・ライドラウィー（Ａｃｈｏｌｅｐｌａｓｍａ  ｌａｉｄｌａｗｉｉ）のいずれでも、前記アリコート中に存在する場合に増幅することができることを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法において、前記マイコプラズマ核酸が、少なくとも５０ヌクレオチドのｒｐｏＢ遺伝子部分を含むことを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法において、前記検出ステップが、前記増幅産物をヌクレオチドシークエンシングするステップと、決定したヌクレオチド配列を様々なマイコプラズマ種のヌクレオチド配列と関連づけることにより、前記マイコプラズマを同定するステップとをさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項１に記載の方法において、前記増幅反応が、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを含まないことを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法において、前記ポリメラーゼが、配列非特異的ＤＮＡ結合ドメインに連結されることを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法において、前記配列非特異的ＤＮＡ結合ドメインが、Ｓｓｏ７ＤＮＡ結合ドメインであることを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項１に記載の方法において、前記アリコートが、Ｔａｑポリメラーゼの活性を少なくとも１０％阻害するために十分量の増幅阻害物質を含むことを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法において、前記阻害物質が、細胞片、細胞老廃物（例えば多糖またはタンパク質）、およびウシ胎児血清またはその増幅阻害物質成分からなる群から選択されることを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項１に記載の方法において、前記増幅反応が、前記増幅反応の効率を改善するために十分量のオスモライトおよび／またはヘパリンを含むことを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法において、前記オスモライトが、サルコシン、トリメチルアミンＮ−オキシド（ＴＭＡＯ）、ジメチルスルホニオプロピオナート、およびトリメチルグリシンからなる群から選択されることを特徴とする方法。
【請求項１４】
細胞培養培地中のマイコプラズマを検出する方法であって、
細胞培養培地のアリコートを得るステップと、
前記アリコート中のマイコプラズマ核酸を、存在する場合に増幅するためにＤＮＡポリメラーゼを用いて核酸増幅反応を実施するステップであって、
（ａ）前記実施ステップが第１および第２のプライマーを用いて前記部分を増幅することを含み、前記第１のプライマーが次の縮重配列：
ＧＡＡＧＡＷＡＴＧＣＣＷＴＡＴＴＴＡＧＡＡＧＡＴＧＧ（配列番号１）
を含み、かつ前記第２のプライマーが次の縮重配列：
ＣＣＲＴＴＴＴＧＡＣＴＹＴＴＷＣＣＡＣＣＭＡＧＴＧＧＴＴＧＴＴＧ（配列番号２
）
を含み、
ここで、ＷはＡまたはＴを表し、ＹはＣまたはＴを表し、ＲはＡまたはＧを表し、ＭはＡまたはＣを表し、
（ｂ）前記増幅反応の増幅産物の有無を検出し、増幅産物の存在が細胞培養物中のマイコプラズマの存在を示すステップと
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法において、前記増幅反応が、リアルタイムでモニターされることを特徴とする方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法において、前記増幅反応が、二本鎖ＤＮＡの存在下で、一本鎖ＤＮＡのみの存在下で生成する蛍光シグナルの少なくとも２倍の蛍光シグナルを生成するインターカレートする蛍光色素を含むことを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項１４に記載の方法において、前記第１および第２のプライマーが、それぞれ以下の縮重配列：
ＧＡＡＧＡＷＡＴＧＣＣＷＴＡＴＴＴＡＧＡＡＧＡＴＧＧ（配列番号１）、および
ＣＣＲＴＴＴＴＧＡＣＴＹＴＴＷＣＣＡＣＣＭＡＧＴＧＧＴＴＧＴＴＧ（配列番号２）
からなることを特徴とする方法。
【請求項１８】
請求項１４に記載の方法において、前記アリコート中の核酸がさらに精製されないことを特徴とする方法。
【請求項１９】
請求項１４に記載の方法において、前記反応が、ｒｐｏＢ遺伝子にハイブリダイズするように設計された、１つの順方向プライマーおよび１つの逆方向プライマー以外のプライマーを含有しないことを特徴とする方法。
【請求項２０】
請求項１４に記載の方法において、前記検出ステップが、前記増幅産物をヌクレオチドシークエンシングするステップと、決定したヌクレオチド配列を様々なマイコプラズマ種のヌクレオチド配列と関連づけることにより、前記マイコプラズマを同定するステップとをさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項２１】
請求項１４に記載の方法において、前記増幅反応が、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを含まないことを特徴とする方法。
【請求項２２】
請求項１４に記載の方法において、前記ポリメラーゼが、配列非特異的ＤＮＡ結合ドメインに連結されることを特徴とする方法。
【請求項２３】
請求項２２に記載の方法において、配列非特異的ＤＮＡ結合ドメインが、Ｓｓｏ７ＤＮＡ結合ドメインであることを特徴とする方法。
【請求項２４】
請求項１４に記載の方法において、前記増幅反応が、前記増幅反応の効率を改善するために十分量のオスモライトおよび／またはヘパリンを含むことを特徴とする方法。
【請求項２５】
請求項２４に記載の方法において、前記オスモライトが、サルコシン、トリメチルアミンＮ−オキシド（ＴＭＡＯ）、ジメチルスルホニオプロピオナート、およびトリメチルグリシンからなる群から選択されることを特徴とする方法。
【請求項２６】
細胞培養培地からのマイコプラズマＤＮＡを、存在する場合に増幅するためのキットであって、
ＧＡＡＧＡＷＡＴＧＣＣＷＴＡＴＴＴＡＧＡＡＧＡＴＧＧ（配列番号１）を含む第１の縮重プライマー、および
ＣＣＲＴＴＴＴＧＡＣＴＹＴＴＷＣＣＡＣＣＭＡＧＴＧＧＴＴＧＴＴＧ（配列番号２）を含む第２の縮重プライマー
を含み、
ここで、ＷはＡまたはＴを表し、ＹはＣまたはＴを表し、ＲはＡまたはＧを表し、ＭはＡまたはＣを表す
ことを特徴とするキット。
【請求項２７】
請求項２６に記載のキットにおいて、前記第１のプライマーが、
ＧＡＡＧＡＷＡＴＧＣＣＷＴＡＴＴＴＡＧＡＡＧＡＴＧＧ（配列番号１）からなり、
前記第２のプライマーが、
ＣＣＲＴＴＴＴＧＡＣＴＹＴＴＷＣＣＡＣＣＭＡＧＴＧＧＴＴＧＴＴＧ（配列番号２）からなることを特徴とするキット。
【請求項２８】
請求項２６に記載のキットにおいて、
ポリメラーゼ；
インターカレートする蛍光色素；
配列番号１または配列番号２によりプライムされる、ポリメラーゼにより増幅可能なポリヌクレオチドを含む陽性対照ポリヌクレオチド
の少なくとも１つまたは複数をさらに含むことを特徴とするキット。
【請求項２９】
請求項２６〜２８のいずれか１項に記載のキットにおいて、前記キットが、マイコプラズマｒｐｏＢ遺伝子の少なくとも５０の連続したヌクレオチドを含む核酸を含む陽性対照試料をさらに含むことを特徴とするキット。
【請求項３０】
請求項２６に記載のキットにおいて、オスモライトおよび／またはヘパリンをさらに含むことを特徴とするキット。
【請求項３１】
請求項３０に記載のキットにおいて、前記オスモライトが、サルコシン、トリメチルアミンＮ−オキシド（ＴＭＡＯ）、ジメチルスルホニオプロピオナート、およびトリメチルグリシンからなる群から選択されることを特徴とするキット。
【請求項３２】
請求項２８に記載のキットにおいて、前記ポリメラーゼが、配列非特異的ＤＮＡ結合ドメインに連結されることを特徴とするキット。
【請求項３３】
請求項３２に記載のキットにおいて、前記配列非特異的ＤＮＡ結合ドメインが、Ｓｓｏ７ＤＮＡ結合ドメインであることを特徴とするキット。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３８】
「耐熱性」ポリメラーゼは、当技術分野で一般に使用されるように使用され、例えば複数サイクルのＰＣＲ反応で使用するのに有効となるように、高温（例えば９０℃）で活性を実質的に保持するポリメラーゼを指す。
[本発明1001]
細胞培養培地中のマイコプラズマを検出する方法であって、
細胞培養培地のアリコートを得るステップと、
前記アリコート中のマイコプラズマ核酸を、存在する場合に増幅するために熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを用いてリアルタイム核酸増幅反応を実施するステップであって、
前記アリコート中の核酸がさらに精製されることがなく、
前記増幅反応が、二本鎖ＤＮＡの存在下で蛍光シグナルを生成する、
インターカレートする蛍光色素を含むステップと、
前記増幅反応の増幅産物の融解温度を検出するステップであって、前記増幅産物の存在が、前記細胞培養中のマイコプラズマの存在を示すステップと
を含むことを特徴とする方法。
[本発明1002]
本発明1001の方法において、前記増幅反応がマイコプラズマ・アルギニニ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｒｇｉｎｉｎｉ）、Ｍ．ピルム（Ｍ．ｐｉｒｕｍ）、Ｍ．ホミニス（Ｍ．ｈｏｍｉｎｉｓ）、Ｍ．ファーメンタンス（Ｍ．ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、Ｍ．サルバリウム（Ｍ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｍ）、Ｍ．オラーレ（Ｍ．ｏｒａｌｅ）、Ｍ．ヒオリニス（Ｍ．ｈｙｏｒｈｉｎｉｓ）、およびアコレプラズマ・ライドラウィー（Ａｃｈｏｌｅｐｌａｓｍａ  ｌａｉｄｌａｗｉｉ）のいずれでも、前記アリコート中に存在する場合に増幅することができることを特徴とする方法。
[本発明1003]
本発明1001の方法において、前記マイコプラズマ核酸が、少なくとも50ヌクレオチドのｒｐｏＢ遺伝子部分を含むことを特徴とする方法。
[本発明1004]
本発明1001の方法において、前記実施ステップが、以下の縮重プライマー：
ＧＡＡＧＡＷＡＴＧＣＣＷＴＡＴＴＴＡＧＡＡＧＡＴＧＧ（配列番号1）、および
ＣＣＲＴＴＴＴＧＡＣＴＹＴＴＷＣＣＡＣＣＭＡＧＴＧＧＴＴＧＴＴＧ（配列番号2）、
を用いて、前記部分を増幅することを含み、
ここで、ＷはＡまたはＴを表し、ＹはＣまたはＴを表し、ＲはＡまたはＧを表し、ＭはＡまたはＣを表わす
ことを特徴とする方法。
[本発明1005]
本発明1004の方法において、前記反応が、1つの順方向プライマーおよび1つの逆方向プライマー以外のプライマーを含有しないことを特徴とする方法。
[本発明1006]
本発明1001の方法において、前記検出ステップが、前記増幅産物をヌクレオチドシークエンシングするステップと、決定したヌクレオチド配列を様々なマイコプラズマ種のヌクレオチド配列と関連づけることにより、前記マイコプラズマを同定するステップとをさらに含むことを特徴とする方法。
[本発明1007]
本発明1001の方法において、前記増幅反応が、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを含まないことを特徴とする方法。
[本発明1008]
本発明1001の方法において、前記ポリメラーゼが、配列非特異的ＤＮＡ結合ドメインに連結されることを特徴とする方法。
[本発明1009]
本発明1008の方法において、前記配列非特異的ＤＮＡ結合ドメインが、Ｓｓｏ7ＤＮＡ結合ドメインであることを特徴とする方法。
[本発明1010]
本発明1001の方法において、前記アリコートが、Ｔａｑポリメラーゼの活性を少なくとも10％阻害するために十分量の増幅阻害物質を含むことを特徴とする方法。
[本発明1011]
本発明1010の方法において、前記阻害物質が、細胞片、細胞老廃物（例えば多糖またはタンパク質）、およびウシ胎児血清またはその増幅阻害物質成分からなる群から選択されることを特徴とする方法。
[本発明1012]
本発明1001の方法において、前記増幅反応が、前記増幅反応の効率を改善するために十分量のオスモライトおよび／またはヘパリンを含むことを特徴とする方法。
[本発明1013]
本発明1012の方法において、前記オスモライトが、サルコシン、トリメチルアミンＮ−オキシド（ＴＭＡＯ）、ジメチルスルホニオプロピオナート、およびトリメチルグリシンからなる群から選択されることを特徴とする方法。
[本発明1014]
細胞培養培地中のマイコプラズマを検出する方法であって、
細胞培養培地のアリコートを得るステップと、
前記アリコート中のマイコプラズマ核酸を、存在する場合に増幅するためにＤＮＡポリメラーゼを用いて核酸増幅反応を実施するステップであって、
（ａ）前記実施ステップが第1および第2のプライマーを用いて前記部分を増幅することを含み、前記第1のプライマーが次の縮重配列：
ＧＡＡＧＡＷＡＴＧＣＣＷＴＡＴＴＴＡＧＡＡＧＡＴＧＧ（配列番号1）
を含み、かつ前記第2のプライマーが次の縮重配列：
ＣＣＲＴＴＴＴＧＡＣＴＹＴＴＷＣＣＡＣＣＭＡＧＴＧＧＴＴＧＴＴＧ（配列番号2）
を含み、
ここで、ＷはＡまたはＴを表し、ＹはＣまたはＴを表し、ＲはＡまたはＧを表し、ＭはＡまたはＣを表し、
（ｂ）前記増幅反応の増幅産物の有無を検出し、増幅産物の存在が細胞培養物中のマイコプラズマの存在を示すステップと
を含むことを特徴とする方法。
[本発明1015]
本発明1014の方法において、前記増幅反応が、リアルタイムでモニターされることを特徴とする方法。
[本発明1016]
本発明1015の方法において、前記増幅反応が、二本鎖ＤＮＡの存在下で、一本鎖ＤＮＡのみの存在下で生成する蛍光シグナルの少なくとも2倍の蛍光シグナルを生成するインターカレートする蛍光色素を含むことを特徴とする方法。
[本発明1017]
本発明1014の方法において、前記第1および第2のプライマーが、それぞれ以下の縮重配列：
ＧＡＡＧＡＷＡＴＧＣＣＷＴＡＴＴＴＡＧＡＡＧＡＴＧＧ（配列番号1）、および
ＣＣＲＴＴＴＴＧＡＣＴＹＴＴＷＣＣＡＣＣＭＡＧＴＧＧＴＴＧＴＴＧ（配列番号2）からなることを特徴とする方法。
[本発明1018]
本発明1014の方法において、前記アリコート中の核酸がさらに精製されないことを特徴とする方法。
[本発明1019]
本発明1014の方法において、前記反応が、ｒｐｏＢ遺伝子にハイブリダイズするように設計された、1つの順方向プライマーおよび1つの逆方向プライマー以外のプライマーを含有しないことを特徴とする方法。
[本発明1020]
本発明1014の方法において、前記検出ステップが、前記増幅産物をヌクレオチドシークエンシングするステップと、決定したヌクレオチド配列を様々なマイコプラズマ種のヌクレオチド配列と関連づけることにより、前記マイコプラズマを同定するステップとをさらに含むことを特徴とする方法。
[本発明1021]
本発明1014の方法において、前記増幅反応が、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを含まないことを特徴とする方法。
[本発明1022]
本発明1014の方法において、前記ポリメラーゼが、配列非特異的ＤＮＡ結合ドメインに連結されることを特徴とする方法。
[本発明1023]
本発明1022の方法において、配列非特異的ＤＮＡ結合ドメインが、ＳｓｏＤＮＡ結合ドメインであることを特徴とする方法。
[本発明1024]
本発明1014の方法において、前記増幅反応が、前記増幅反応の効率を改善するために十分量のオスモライトおよび／またはヘパリンを含むことを特徴とする方法。
[本発明1025]
本発明1024の方法において、前記オスモライトが、サルコシン、トリメチルアミンＮ−オキシド（ＴＭＡＯ）、ジメチルスルホニオプロピオナート、およびトリメチルグリシンからなる群から選択されることを特徴とする方法。
[本発明1026]
細胞培養培地からのマイコプラズマＤＮＡを、存在する場合に増幅するためのキットであって、
ＧＡＡＧＡＷＡＴＧＣＣＷＴＡＴＴＴＡＧＡＡＧＡＴＧＧ（配列番号1）を含む第1の縮重プライマー、および
ＣＣＲＴＴＴＴＧＡＣＴＹＴＴＷＣＣＡＣＣＭＡＧＴＧＧＴＴＧＴＴＧ（配列番号2）を含む第2の縮重プライマー
を含み、
ここで、ＷはＡまたはＴを表し、ＹはＣまたはＴを表し、ＲはＡまたはＧを表し、ＭはＡまたはＣを表す
ことを特徴とするキット。
[本発明1027]
本発明1026のキットにおいて、前記第1のプライマーが、
ＧＡＡＧＡＷＡＴＧＣＣＷＴＡＴＴＴＡＧＡＡＧＡＴＧＧ（配列番号1）からなり、
前記第2のプライマーが、
ＣＣＲＴＴＴＴＧＡＣＴＹＴＴＷＣＣＡＣＣＭＡＧＴＧＧＴＴＧＴＴＧ（配列番号2）からなることを特徴とするキット。
[本発明1028]
本発明1026のキットにおいて、
ポリメラーゼ；
インターカレートする蛍光色素；
配列番号1または配列番号2によりプライムされる、ポリメラーゼにより増幅可能なポリヌクレオチドを含む陽性対照ポリヌクレオチド
の少なくとも1つまたは複数をさらに含むことを特徴とするキット。
[本発明1029]
本発明1026〜1028のいずれかのキットにおいて、前記キットが、マイコプラズマｒｐｏＢ遺伝子の少なくとも50の連続したヌクレオチドを含む核酸を含む陽性対照試料をさらに含むことを特徴とするキット。
[本発明1030]
本発明1026のキットにおいて、オスモライトおよび／またはヘパリンをさらに含むことを特徴とするキット。
[本発明1031]
本発明1030のキットにおいて、前記オスモライトが、サルコシン、トリメチルアミンＮ−オキシド（ＴＭＡＯ）、ジメチルスルホニオプロピオナート、およびトリメチルグリシンからなる群から選択されることを特徴とするキット。
[本発明1032]
本発明1028のキットにおいて、前記ポリメラーゼが、配列非特異的ＤＮＡ結合ドメインに連結されることを特徴とするキット。
[本発明1033]
本発明1032のキットにおいて、前記配列非特異的ＤＮＡ結合ドメインが、Ｓｓｏ7ＤＮＡ結合ドメインであることを特徴とするキット。