(57)【要約】      （修正有）【課題】植物増殖を制御する受容体遺伝子を提供すると共に、その遺伝子発現を制御することによって、植物増殖効率を制御する技術を提供する。【解決手段】以下の（a）または（b）のタンパク質および該タンパク質をコードする遺伝子を提供する。（a）特定のアミノ酸配列からなるタンパク質、（b）上記に示されるアミノ酸配列において、1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ植物増殖因子PSK応答性であるタンパク質。【選択図】    図２
2004215650.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質。
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ植物増殖因子ＰＳＫ応答性であるタンパク質。
【請求項２】
以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子。
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ植物増殖因子ＰＳＫ応答性であるタンパク質。
【請求項３】
以下の（ｃ）または（ｄ）のＤＮＡを含む遺伝子。
（ｃ）配列番号２に示される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）配列番号２に示される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ植物増殖因子ＰＳＫ応答性であるＤＮＡ。
【請求項４】
請求項２または３に記載の遺伝子と相補的な配列からなる核酸であって、前記植物増殖因子ＰＳＫ応答性を低下させる核酸。
【請求項５】
請求項２〜４のいずれか一項に記載の遺伝子を含む組換えベクター。
【請求項６】
請求項２〜４のいずれか一項に記載の遺伝子を含む形質転換体。
【請求項７】
請求項２〜４のいずれか一項に記載の遺伝子を含むトランスジェニック植物。
【請求項８】
以下の工程：（１）請求項２〜３記載の遺伝子を植物細胞に導入する工程と、および
（２）工程（１）で得られる植物細胞を培養し、再分化個体を得る工程と、
を含むことを特徴とする分裂・増殖が向上された植物の作製方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、植物細胞増殖因子の受容体をコードする遺伝子、該遺伝子を含有する組換えベクター、該組換えベクターを含む形質転換体、該遺伝子を含有するトランスジェニック植物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
１９９０年代以降，高等植物の細胞間情報伝達物質としてペプチド性の分子が機能している例がいくつか報告され，オーキシンやサイトカイニン等に代表される従来型の植物ホルモンとは異なる物質が，植物の生活環の様々な局面において重要な機能を担っていることが明らかになってきた。また、シロイヌナズナの全ゲノム解析結果からは、少なくとも３４０の受容体型キナーゼの存在が予測されており、それぞれの受容体に対するリガンド探しがポストゲノム時代の重要なテーマのひとつになりつつある。
【０００３】
このような状況の中、特異的受容体を介して植物細胞の増殖や分化を制御していると考えられている細胞外分泌型ペプチドやタンパク質が、現在までに２種類知られている。ひとつはファイトスルフォカイン（ｐｈｙｔｏｓｕｌｆｏｋｉｎｅ：ＰＳＫ）であり、もうひとつは、ＣＬＡＶＡＴＡ３（ＣＬＶ３）である（特許文献１、２および非特許文献１を参照）。これらのペプチドは、いずれもシグナル配列を持つ前駆体として翻訳された後、プロセシングを経て細胞外に分泌される。これらのペプチドによって生理活性を発現することが明らかにされている植物細胞では、各種の機能を持った細胞に分化した後でも、それらの細胞を適切な条件下に置くことにより再分化を行い、最終的に完全な植物体を再生することができる。この分化全能性（Ｔｏｔｉｐｏｔｅｎｃｙ）と呼ばれる植物特有の性質を利用して、親と全く同一の遺伝子を持つクローン植物を作製する技術が、すでに多くの植物種において確立されている。付加価値の高い品種の大量生産が可能になるなど、産業的にも重要な地位を占めるにいたっている。植物が潜在的に有しているこのような能力を十分に引き出すために、通常、無菌的に取り出した植物組織を各種の無機塩類やビタミン、糖類などの有機成分に加え、植物ホルモンであるオーキシンとサイトカイニンを含む培地に移して培養することが必要である。また、これら２種類の植物ホルモンの濃度や比率を変化させることにより、培養組織の再分化の方向性、すなわち芽や根のいずれに優先的に分化するかを決定づけることもできる。
【０００４】
このように，植物細胞の増殖および分化の過程は，かなりの部分を人為的にコントロールすることが可能になってきている。しかし、研究者たちを長年悩ませてきた問題のひとつに、細胞増殖の密度依存性がある。これは、組織培養のように細胞集団として培養すると活発に分裂、増殖することができる植物細胞が、その細胞を酵素処理または機械的な方法で遊離させて単細胞として培養すると、一般的に１０４  ｃｅｌｌｓ／ｍｌ程度以下の細胞密度になると著しく増殖が抑制されてしまう現象である。そのため、遺伝子導入実験などのように対象となる細胞（ｔａｒｇｅｔ  ｃｅｌｌｓ）が少量の場合，適当な細胞（ｎｕｒｓｅ  ｃｅｌｌｓ）を用いて全体の密度を高めるナースカルチャーというテクニックが用いられる場合がある。なぜ植物細胞は低密度では増殖できなくなってしまうのであろうか、という問いに対して、いくつかの実験的事実から次のようなモデルが考えられてきた。すなわち、培養系に移された植物細胞は細胞外に未知の増殖因子を分泌し、その因子の細胞外濃度がある一定値を越えると細胞分裂を開始することができるという概念である。したがって、細胞が低密度の場合は、増殖因子が必要濃度に達するのに時間がかかり、培地中で分解される速度の方が速くなってしまうために細胞増殖が抑制されることになる。実際、一度細胞培養に使った培地、すなわちｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ  ｍｅｄｉｕｍ（ＣＭ）中には細胞増殖を促進する因子が含まれていることが示されており、この本体を明らかにしようとする研究がいくつか試みられてきた。植物は動物のように高度に分化した器官を持たないこと、オーキシンやサイトカイニンなどの植物ホルモンが細胞増殖、分化の広い範囲にわたって多くの生理活性を持つことなどが理由となって、これまで植物には動物ホルモンのようなペプチド性増殖因子の存在を想定する研究者は少なかった。しかし、１９９０年代後半におけるＰＳＫやＣＬＡＶＡＴＡなどの発見により、最近ではペプチド性増殖因子の存在を前提とした概念が定着しつつある。上述のような状況において、ペプチド性増殖因子受容体の解析を進展が望まれていた。この受容体の解析によって生理学的機能を解明することで、植物細胞の増殖制御機構について新たな知見を得ることが期待されている。
【０００５】
上述のように、植物の細胞増殖における密度効果という現象の確認から始まり、生物検定系の確立、増殖因子の単離と構造決定、遺伝子のクローニング、そしてその特異的受容体の解析までが望まれていた。しかし、ＰＳＫがインタクトの植物体内でどのような生理的役割を担っているかについては、未だ未解明の部分が多く、その機能の解明は重要なテーマのひとつとして残されていた。また、植物細胞（特に培養細胞株）の増殖に関与するリガンドと受容体のペアが同定された例はこれまでになく、特にＰＳＫの受容体については、その同定が望まれていた。
【０００６】
【特許文献１】
特開平１１−７９６１２
【０００７】
【特許文献２】
特開平１０−４５７９７
【０００８】
【非特許文献１】
Ａ．Ｅ．  Ｔｒｏｔｏｃｈａｕｄ，  Ｓ．  Ｊｅｏｎｇ，  ａｎｄ  Ｓ．Ｅ．  Ｃｌａｒｋ、ＣＬＡＶＡＴＡ３，  ａ  ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｃ  ｌｉｇａｎｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ＣＬＡＶＡＴＡ１  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｋｉｎａｓｅ．、“Ｓｃｉｅｎｃｅ”、（ＵＳＡ）、２０００年、２８９巻、ｐ．６１３−６１７
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、植物増殖を制御する受容体遺伝子を提供すると共に、その遺伝子発現を制御することによって、植物増殖効率を制御する技術を提供することである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
上記問題を解決すべく鋭意研究を行った結果、ニンジン細胞からＰＳＫ受容体をコードする遺伝子を単離することに成功し、本発明を完成するに至った。詳細には、可溶化した植物細胞タンパク質中から、ＰＳＫと特異的に相互作用するタンパク質を探索し、その結果ＰＳＫ受容体タンパク質を発見し、その遺伝子のクローニングに成功した。また、ＰＳＫ受容体とＰＳＫの相互作用によって分化および増殖の調節が行われていることを見出し、人為的にこれらの量を変化させることによって植物細胞の増殖速度を制御することに成功し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は、以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質を提供する。
【００１２】
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ植物増殖因子ＰＳＫ応答性であるタンパク質。
【００１３】
また、本発明は、以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子を提供する。
【００１４】
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ植物増殖因子ＰＳＫ応答性であるタンパク質。
【００１５】
さらに、本発明は、以下の（ｃ）または（ｄ）のＤＮＡを含む遺伝子を提供する。
【００１６】
（ｃ）配列番号２に示される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）配列番号２に示される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ植物増殖因子ＰＳＫ応答性であるＤＮＡ。
【００１７】
さらに、本発明は、上記記載の遺伝子と相補的な配列からなる核酸であって、植物の植物増殖因子ＰＳＫ応答性を低下させる核酸を提供する。
【００１８】
また、上記記載の遺伝子を含む組換えベクター、形質転換体およびトランスジェニック植物を提供する。
【００１９】
特に、本発明は、以下の工程：（１）上記記載の遺伝子を植物細胞に導入する工程と、および
（２）工程（１）で得られる植物細胞を培養し、再分化個体を得る工程と、
を含むことを特徴とする分裂・増殖が向上された植物の作製方法を提供する。
【００２０】
【発明の実施の形態】
１，本発明の遺伝子の単離
本発明のＰＳＫ受容体をコードする遺伝子配列（配列番号２）は、後述の実施例に詳述したように常法に従って単離することができる。簡単には、ＰＳＫ固定化アフィニティーカラムを使用して、ニンジン細胞のミクロソーム膜からＰＳＫ結合タンパク質をアフィニティー精製する。アフィニティー精製したタンパク質をトリプシン消化して、逆相ＨＰＬＣによってペプチド断片を分取する。各ピークのペプチド断片のタンパク質配列をタンパク質シーケンサーおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳを使用して解析し、タンパク質の部分アミノ酸配列を得る。得られたペプチド配列に基づいて縮重プライマーを設計し、ニンジン細胞から調整したｃＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲ反応を行う。このＰＣＲ産物をハイブリダイゼーションブロー部として使用し、ニンジン細胞ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって全長ｃＤＮＡを得ることができる。
【００２１】
また、この配列（配列番号２）を基にしてプライマーを設計し、通常のＰＣＲ法を使用することによって得ることができる。さらに、化学合成することによって、または該塩基配列を有するＤＮＡ断片をプローブとしてハイブリダイズさせることによって本発明のＰＳＫ受容体をコードする遺伝子を得ることができる。具体的には、ＰＣＲ法を使用するのであれば、テンプレートとしてのｃＤＮＡを以下のようにして得て、以下に記載した配列のプライマーを使用して、ＰＣＲを行うことによって増幅できる。
【００２２】
テンプレートとしてのｃＤＮＡの作製するために、まずｍＲＮＡの調製を行う。たとえば、通常行われる手法によって行うことができる。たとえば、植物体または植物細胞（たとえば、ニンジンＮＣ細胞を使用）を超音波処理または乳鉢などで摩砕した後、得られた摩砕物からグリオキザール法、グアニジンチオシナネート−塩化セシウム法、塩化リチウム−尿素法、プロテイナーゼＫ−デオキシリボヌクレアーゼ法などによりにより粗ＲＮＡ画分を抽出調製する。次いで、この粗ＲＮＡ画分から、オリゴｄＴ−セルロースやセファロース２Ｂを担体とするポリ  Ｕ−セファロースなどを用いたアフィニティーカラム法あるいはバッチ法によってポリ（Ａ）＋ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を得ることができる。さらに、ショ糖密度勾配遠心法などによりｍＲＮＡをさらに画分してもよい。このようにして得られたｍＲＮＡを鋳型として、市販のキット（たとえば、ＺＡＰ−ｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製））を用い、オリゴｄＴ２０及び逆転写酵素によって一本鎖ｃＤＮＡを合成した後、該一本鎖ｃＤＮＡから二本鎖ｃＤＮＡを合成する。次いで、得られた二本鎖ｃＤＮＡに適切なアダプターを付加後、適切なプラスミド内に連結することにより、ｃＤＮＡライブラリーを作製することができる。このようなｃＤＮＡライブラリーをテンプレートとして使用すればよい。
【００２３】
ＰＣＲプライマーとしては、本発明の遺伝子のクローニングに使用したＥ１、Ｅ２およびＦプライマー（後述の実施例参照）を使用すればよい。ニンジン以外の植物ｃＤＮＡから増幅するのであれば、該配列を基に縮重プライマーを作製してもよい。
【００２４】
これらのテンプレートおよびプライマーを使用して通常の条件においてＰＣＲを行うことによってＰＳＫ受容体をコードする遺伝子を得ることができる。
【００２５】
増幅された配列は、たとえば制限酵素で切断した後に、市販のプラスミドにクローニングすることができる。このプラスミドを公知の方法（たとえば、Ｊ．ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  ２ｎｄ  Ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ｐｐ．１．２１−１．５２）に従って単離精製する。また、サンガー法やマクサム・ギルバート法等の公知の方法および自動塩基配列決定装置（ＡＢＩ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  ３１０）用いて塩基配列を確認してもよい。
【００２６】
配列番号２に本発明のＰＳＫ受容体遺伝子の塩基配列を、配列番号１に本発明のＰＳＫ受容体遺伝子によりコードされるアミノ酸配列を例示するが、このアミノ酸配列を含むタンパク質（ＰＳＫ受容体タンパク質ともいう）が植物に発現された場合に、該植物がＰＳＫ応答性である限り、当該アミノ酸配列において複数個、好ましくは１若しくは数個のアミノ酸に欠失、置換、付加等の変異が生じてもよい。たとえば、配列番号１に示されるアミノ酸配列の１〜１０個、好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失してもよく（たとえば配列番号１に示されるアミノ酸配列のうち第１番目のメチオニンが欠失したもの）、配列番号１に示されるアミノ酸配列に１〜１０個、好ましくは１〜５個のアミノ酸が付加してもよく、あるいは、配列番号２に示されるアミノ酸配列の１〜１０個、好ましくは１〜５個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換してもよい。
【００２７】
本発明において、「植物増殖因子ＰＳＫ応答性」とは、ＰＳＫによる生理活性が発現されることをいう。すなわちＰＳＫを作用させることによって、分化・増殖が向上されることを意味する。「植物増殖因子ＰＳＫ応答性」であるタンパク質またはＤＮＡとは、植物に導入または発現させた場合に、上記植物増殖因子ＰＳＫ応答性を有するタンパク質またはＤＮＡをいう。また、「植物増殖因子ＰＳＫ応答性が向上される」とは、本発明の遺伝子を発現させた植物におけるＰＳＫ結合量が、野生型植物におけるＰＳＫ結合量よりも１０％以上、好ましくは１００〜１０００％増加され、野生型植物におけるＰＳＫ応答性と比較して分化・増殖が向上されることを意味する。逆に、「植物増殖因子ＰＳＫ応答性が低下される」とは、ＰＳＫ結合量が、野生型植物におけるＰＳＫ結合量よりも１０％以上、好ましくは１００％低下され、野生型植物におけるＰＳＫ応答性と比較して分化・増殖が低下されることを意味する。
【００２８】
また、本発明の遺伝子には、ＰＳＫ受容体遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるＤＮＡであって、該ＤＮＡを発現させた植物におけるＰＳＫ結合量を増加させるものも含まれる。ストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成される条件をいう。たとえば、相同性が高い核酸同士、すなわち９０％以上、好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡであって、植物におけるＰＳＫ結合量を増加又は減少させることができるタンパク質をコードするＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低い核酸同士がハイブリダイズしない条件が挙げられる。より具体的には、ナトリウム濃度が１５〜３００ｍＭ、好ましくは１５〜７５ｍＭであり、温度が５０〜６０℃、好ましくは５５〜６０℃の条件をいう。
【００２９】
本発明の遺伝子と相補的な配列からなる核酸は、たとえばアンチセンス法において使用される。本発明の遺伝子の全塩基配列またはその一部の配列と相補的な配列を持った核酸（たとえばアンチセンスＲＮＡ）が、成体あるいは細胞に外来的に投与される。投与された核酸（アンチセンスＲＮＡ）は、ｍＲＮＡとハイブリッドを形成することにより、ｍＲＮＡの遺伝情報がタンパク質に翻訳される過程を阻害する。このようなアンチセンス核酸は、そのＤＮＡ情報を発現ベクターに組み込んで細胞内でアンチセンスＲＮＡとして発現させることも可能である。アンチセンスＲＮＡが、アンチセンス効果を発揮するためには、標的ＲＮＡと１００％相補的である必要はない。本発明のタンパク質の発現を抑制することが可能であればよい。アンチセンス核酸は、本発明の遺伝子と好ましくは９０％、さらに好ましくは９５％の相補性を有する。また、アンチセンス効果を発揮するためには、相補的なＲＮＡは、少なくとも１５ｂｐ、好ましくは１００ｂｐ以上、さらに好ましくは５００ｂｐ以上の鎖長を有する。
【００３０】
また、本発明の「遺伝子」には、ＤＮＡおよびＲＮＡからなるものも含まれる。
【００３１】
さらに、本発明の「核酸」には、ＤＮＡおよびＲＮＡも含まれる。
【００３２】
遺伝子に変異を導入するには、Ｋｕｎｋｅｌ法、Ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ法等の公知の手法又はこれに準ずる方法を採用することができる。例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばＭｕｔａｎｔ−Ｋ（ＴＡＫＡＲＡ社製）やＭｕｔａｎｔ−Ｇ（ＴＡＫＡＲＡ社製））などを用いて、あるいは、ＴＡＫＡＲＡ社のＬＡ  ＰＣＲ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  シリーズキットを用いて変異の導入が行う。
【００３３】
その他、得られたニンジン由来ＰＳＫ受容体のアミノ酸配列を用いてデータベース検索し、種々の植物のＥＳＴ配列から相同性を持つ遺伝子を同定し、上述した工程によって配列番号２の遺伝子に変異を伴った遺伝子（すなわち相同体）を単離することもできる。このような相同体遺伝子は、たとえば、既知であるニンジン由来ＰＳＫ受容体の内部アミノ酸配列に基づいてｄｅｇｅｎｅｒａｔｅプライマーを設計し、上述のように所望の植物からテンプレートｃＤＮＡを作製し、これらを使用してｄｅｇｅｎｅｒａｔｅＰＣＲを行うことによって容易に単離することができる。推定アミノ酸配列の相同性から、このような遺伝子もニンジン由来ＰＳＫ受容体と同様の機能を持つことが推測されるであろう。
【００３４】
２，本発明の遺伝子を含む組換えベクターの作製
本発明の組換えベクターは、適切なベクターに本発明の遺伝子を挿入することによって得ることができる。本発明の遺伝子を挿入するためのベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、たとえば、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡなどが挙げられる。プラスミドＤＮＡとしては、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９などの大腸菌宿主用プラスミド、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５などの枯草菌用プラスミド、ＹＥｐ１３，  ＹＥｐ２４、ＹＣｐ５０などの酵母宿主用プラスミド、ｐＢＩ２２１、ｐＢＩ１２１などの植物細胞宿主用プラスミドなどが挙げられ、ファージＤＮＡとしてはλファージなどが挙げられる。さらに、レトロウイルス又はワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、バキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクター並びに植物ウイルスベクターを用いることもできる。ベクターに本発明の遺伝子を挿入するには、精製したＤＮＡを適切な制限酵素で切断し、適切なベクターＤＮＡの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。本発明の遺伝子は、その遺伝子の機能が発揮されるようにベクターに組み込まれることが必要である。そこで、本発明のベクターには、プロモーター、本発明の遺伝子のほか、所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）などを含有するものを連結することができる。なお、選択マーカーとしては、たとえばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子などが挙げられる。
【００３５】
具体的には、後述の実施例に記載したとおり、本発明のニンジン由来ＰＳＫ受容体遺伝子を、バイナリーベクターｐＢｌ１２１内に組み込まれた恒常的カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターの制御下にセンスまたはアンチセンス配向で挿入することによって作製することができる。
【００３６】
３，本発明の遺伝子を導入した形質転換体（トランスジェニック植物）の作製本発明において形質転換の対象となる植物は、植物体全体、植物器官（たとえば葉、花弁、茎、根、種子等）、植物組織（たとえば表皮、師部、柔組織、木部、維管束等）又は植物培養細胞のいずれであってもよい。形質転換に用いられる植物としては、すべての植物が含まれるが、特にイネ、トウモロコシ、アスパラガス、コムギ等の単子葉植物、シロイヌナズナ、タバコ、ニンジン、ダイズ、トマト、ジャガイモ等の双子葉植物が好ましい。
【００３７】
形質転換体の作製方法としては、本技術分野において知られている通常の方法を用いる事ができる。たとえば上記組換えベクターを、通常の形質転換方法、たとえばエレクトロポレーション法、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法、ＰＥＧ法等によって植物中に導入することができる。
【００３８】
アグロバクテリウム法を用いる場合は、構築した植物用発現ベクターを適当なアグロバクテリウム、たとえばアグロバクテリウム・チュメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）に導入し、この株をバキュームインフィルトレーション法（Ｂｅｃｈｔｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  Ｃ．  Ｒ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｓｅｒ．  ＩＩＩ  Ｓｃｉ．  Ｖｉｅ，  ３１６，  １１９４−１１９９）等に従って宿主の無菌培養葉片に感染させ、形質転換植物を得ることができる。
【００３９】
また、パーティクルガン法を用いる場合は、植物体、植物器官、植物組織自体をそのまま使用してもよく、切片を調製した後に使用してもよく、プロトプラストを調製して使用してもよい。このように調製した試料を遺伝子導入装置（たとえばＢＩＯＬＩＳＴＩＣ  ＰＯＳ  １０００／Ｈｅ；  ＢｉｏＲａｄ等）を用いて処理することができる。処理条件は植物又は試料により異なるが、通常は１０００〜１１００ｐｓｉ程度の圧力、５〜１０ｃｍ程度の距離で行う。
【００４０】
形質転換の結果得られる腫瘍組織やシュート、毛状根などは、そのまま細胞培養、組織培養又は器官培養に用いることが可能であり、また従来知られている植物組織培養法を用い、適切な濃度の植物ホルモン（オーキシン、サイトカイニン、ジベレリン、アブシジン酸、エチレン、ブラシノライド等）を投与することによって植物体に再生させることができる。
【００４１】
形質転換体が植物細胞又は植物組織である場合は、培養は、通常の植物培養用培地、たとえばＭＳ基本培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ，  Ｔ．  ＆  Ｓｋｏｏｇ，  Ｆ．  （１９６２）  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  Ｐｌａｎｔ．１５：  ４７３）、ＬＳ基本培地（Ｌｉｎｓｍａｉｅｒ，  Ｅ．  Ｍ．  ＆  Ｓｋｏｏｇ，  Ｆ．  （１９６５）  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  Ｐｌａｎｔ．１８：  １００）、プロトプラスト培養培地（ＬＳ培地を改変したもの）等を用いることにより行うことができる。培養方法は、通常の固体培養法、液体培養法のいずれをも採用することができる。上記培地に、細胞、組織又は器官を０．１〜１０ｇ新鮮重／Ｌ接種し、必要によりＮＡＡ、２，４−Ｄ、ＢＡ、カイネチン等を適宜添加して培養する。培養開始時の培地のｐＨ  は５．０〜６．０に調節し、培養は通常２０〜３０℃、好ましくは２５℃前後で、また、１０〜１２０ｒｐｍ攪拌で２日〜４週間培養する。形質転換体が植物体である場合は、圃場やガラスハウスなどで栽培又は水耕培養する。
【００４２】
具体的には、たとえば上述のニンジン由来ＰＳＫ受容体遺伝子が組み込まれたバイナリーベクターｐＢｌ１２１を導入する場合、Ｍ．Ｈａｒｄｅｇｇｅｒ，  Ａ．  Ａｔｕｒｍ，  Ｍｏｌ．  Ｂｒｅｅｄ．  ４，  １１９（１９９８）に記載のプロトコールにしたがって植物を処理することによって遺伝子を宿主に導入し、植物を再生することができる。
【００４３】
本発明の受容体遺伝子は、上記植物宿主に導入するのみならず、大腸菌等の細菌、酵母、動物細胞、あるいは昆虫細胞などに導入して形質転換体を得ることもできるが、これらに限定されるものではない。大腸菌、酵母等の細菌を宿主とする場合は、本発明の組換えベクターが該細菌中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、本発明の遺伝子、転写終結配列から構成されていることが好ましい。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
【００４４】
本発明のＰＳＫ受容体遺伝子が宿主に組み込まれたか否かの確認は、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法等により行うことができる。たとえば、形質転換体からＤＮＡを調製し、ＰＳＫ受容体遺伝子特異的プライマーを設計してＰＣＲを行う。ＰＣＲは、前記プラスミドを調製するために使用した条件と同様の条件で行われる。その後、増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又はキャピラリー電気泳動等を行い、臭化エチジウム、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ液等により染色し、増幅産物を１本のバンドとして検出することによって形質転換されたことを確認できる。また、予め蛍光色素等により標識したプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を検出することもできる。さらに、マイクロプレート等の固相に増幅産物を結合させ、蛍光又は酵素反応等により増幅産物を確認する方法も採用してもよい。
【００４５】
４，本発明のタンパク質の精製
培養後、本発明のタンパク質が菌体内又は細胞内に生産される場合には、超音波処理、凍結融解の繰り返し、ホモジナイザー処理などを施して菌体又は細胞を破砕することにより目的のタンパク質採取する。また、本発明のタンパク質が菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体又は細胞を除去する。その後、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、たとえば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、前記培養物中から本発明のタンパク質を単離精製することができる。
【００４６】
培養細胞又は培養組織からＰＳＫ受容体タンパク質を精製するには、まず、セルラーゼ、ペクチナーゼ等の酵素を用いた細胞溶解処理、超音波破砕処理、磨砕処理等により細胞を破壊する。次いで、濾過又は遠心分離等を用いて不溶物を除去し、粗タンパク質溶液を得る。上記粗溶液から本発明のＰＳＫ受容体タンパク質を精製するには、塩析、各種クロマトグラフィー（たとえばゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等）、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動等を単独で又は適宜組み合わせて実施する。
【００４７】
５，本発明の分裂・増殖が向上された植物の作製
上述の遺伝子の単離に示したように遺伝子を単離（好ましくは組換えベクターに組み込み）し、上述の形質転換体（トランスジェニック植物）の作製に示したように単離した遺伝子を植物細胞に導入して、得られた植物細胞を上述の通り培養して再分化個体を得ることにより、分裂・増殖が向上された植物を作製することができる。
【００４８】
【実施例】
方法
（ＰＳＫ固定化アフィニティーカラムの調整）
固相合成によって作製した２１０ｍｇ（０．２ｍｍｏｌ）のＦｍｏｃ−Ｔｙｒ（ＳＯ３Ｈ）−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ（ＳＯ３Ｈ）−Ｔｈｒ−Ｌｙｓを、５ｍｌの５０％アセトニトリル溶液中において、１．０ｍｍｏｌのＮａＣＯ３の存在下で１．０ｍｍｏｌのＢｏｃ−（Ａｈｘ）２−ＯＳｕと、室温１時間反応させて、［Ｌｙｓ５］ＰＳＫ−セファロースを調整した。Ｂｏｃ−Ａｈｘ２末端を含むペプチドを逆相ＨＰＬＣで精製して、凍結乾燥し、６．０ｍｌの９５％トリフルオロ酢酸により室温で１２分間処理してＢｏｃ基を脱保護した。脱保護したペプチドを、直ちに逆相ＨＰＬＣで精製し、凍結乾燥してＦｍｏｃ−Ｔｙｒ（ＳＯ３Ｈ）−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ（ＳＯ３Ｈ）−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ（εＮ−（Ａｈｘ）２）を１８０ｍｇ（０．１４ｍｍｏｌ、７０％）収率で得た。製造者のプロトコルにしたがって、１２９ｍｇ（０．１ｍｍｏｌ）のこのペプチドを２．０ｍｍｏｌのＮａＣＯ３を含む１０ｍｌの９５％アセトニトリルに溶解して、５．０ｍｌのプレパックＨｉ−Ｔｒａｐ  ＮＨＳ活性化セファロース（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）と結合させた。０．２ＭのエタノールアミンでＮＨＳ基を不活性化した後、リガンドが結合したセファロースをピペリジン：アセトニトリル：水（２：１：１）で１０分間処理し、Ｆｍｏｃ基を脱保護した。３０１ｎｍにおける蛍光誘導体の発光の吸光度を測定することによって結合効率を決定し、１０．８μｍｏｌリガンド／５．０ｍｌセファロースであった。このカラムをジメチルホルムアミド、５０％アセトニトリルおよび水でよく洗浄した。Ｈｉ−Ｔｒａｐ  ＮＨＳ活性化セファロースは、セファロースとＮＨＳ基の間にＡｈｘリンカーを含むため、このアフィニティーマトリクスは、［Ｌｙｓ５］ＰＳＫ部分とセファロース間に三つのＡｈｘスペーサーを含むことになる。
【００４９】
（ＰＳＫ結合タンパク質のアフィニティー精製）
ニンジンのミクロソーム膜（１２００ｍｇタンパク質相当）を、２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ７．５）、５０ｍＭ  ＫＣｌおよび１．０％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含むバッファー（バッファーＡ）３２０ｍｌに可溶化した。可溶化物を４℃において３０分間、１００，０００ｇで遠心して、上清を、流速０．５ｍｌ／ｍｉｎのＡＫＴＡ  Ｐｒｉｍｅ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用した［Ｌｙｓ５］ＰＳＫ−セファロースカラム（５．０ｍｌ）にかけた。２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ７．５）、５０ｍＭ  ＫＣｌおよび０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含むバッファー（バッファーＢ）５０ｍｌで洗浄した後、カラムを、１５ｍｌの１．０ｍｇ／ｍｌ  ＰＳＫを含むバッファーＢ溶液で溶出した。溶出液を１．０ｍｌのＭａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ  Ｃｅｒａｍｉｃ  Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ  Ｔｙｐｅ  Ｉ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）カラムに、４℃において流速０．５ｍｌ／ｍｉｎで添加した。カラムを２０ｍｌのバッファーＢで洗浄して、１８ｍｌのＫＨ２ＰＯ４（０〜４００ｍＭ）勾配バッファーＢ溶液で溶出した。［３Ｈ］ＰＳＫ結合アッセイで活性画分（１２ｍｌ）を測定し、ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ（Ｂｉｏｍａｘ−１０膜を備えたＵｌｔｒａｆｒｅｅ−１５  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ，  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）によって濃縮し、７．５％ゲルを使用してＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析した。
【００５０】
（１２０ｋＤタンパク質のトリプシン消化）
アフィニティー精製タンパク質をアセトン沈殿し、ジチオスレイトールで還元し、ピリジルエチル化して電気泳動した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った後、Ｎｉｌｅ  ｒｅｄ染色を行い、各バンドを切断し、ｉｎ  ｓｉｔｕでＴＰＣＫ−トリプシン（Ｓｉｇｍａ）で消化した。生じたペプチドをゲルから抽出して真空中で濃縮し、１４０Ａ  ｓｏｌｖｅｎｔ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、１００μｌ／ｍｉｎの流速で、１０〜５０％アセトニトリルの０．１％トリフルオロ酢酸溶液を１４０分の勾配で溶出して、ＴＳＫｇｅｌ  ＯＤＳ−８０Ｔｓ（２．０×１５０ｍｍ，  Ｔｏｓｏｈ，  Ｊａｐａｎ）上で分離した。
【００５１】
（縮重プライマーを使用したｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ）
上記消化タンパク質から得られたｅおよびｆピークのペプチド配列に基づいて、縮重プライマーＥ１（配列番号３  ：  ５’−ＧＧＹＴＣＹＴＣＮＡＣＮＧＣＲＴＴＹＴＣ−３’）、Ｅ２（配列番号４：  ５’−ＴＴＲＡＡＲＡＡＮＧＧＲＡＡＲＴＣＮＧＧ−３’）およびＦ（配列番号５：  ５’−ＧＴＮＴＡＹＧＡＲＡＡＹＴＣＮＴＴＹＣＡ−３’）を合成した。第一のＰＣＲは、ＮＣ細胞から調製したｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡをテンプレートと使用してプライマーＥ２およびｆで行った。温度条件は、９５℃  ６０秒、４５℃  ６０秒、７２℃  １２０秒で行ない、増幅サイクルを４０回繰り返した。ＰＣＲ産物をｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲのテンプレートとし、プライマーＥ１およびｆを用いて同温度条件にてｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲを行った。このＰＣＲ産物をｐＢＳ  ＳＫベクターのＥｃｏＲ  Ｖサイトにサブクローン化して、ｃＤＮＡの単離に使用した。
【００５２】
（全長ｃＤＮＡの単離）
ｐＢＳ  ＳＫベクターにサブクローン化された上記ＰＣＲ産物をＥｃｏＲ  Ｖで切り出し、アマシャム・ファルマシア社のＡｌｋＰｈｏｓ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｋｉｔを用いて標識プローブを作製した。ＺＡＰ−ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）を用いて作製したニンジンＮＣ細胞由来のｃＤＮＡライブラリー・ファージをＬＢ培地上に１００，０００プラーク生育させ、これをナイロンメンブレンに転写・固定した。このメンブレンをＡｌｋＰｈｏｓ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｋｉｔ添付の試薬を用いてプロトコル通りに標識プローブでハイブリダイゼーション後、同社のＤｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔで陽性プラークを検出した。得られた陽性ファージから、キット添付のヘルパーファージを用いてインサート部分をｐＢＳベクターにサブクローニングし、全長シークエンスをＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社の３１０型シークエンスアナライザを用いて解析した。
【００５３】
（ニンジン細胞の遺伝的形質転換）
バイナリーベクターｐＢｌ１２１内の恒常的カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターの制御下に、ＰＳＫ受容体のＯＲＦをセンスまたはアンチセンス向きで挿入し、キメラ遺伝子を構築した。ニンジン胚軸分節の形質転換および植物再生は、Ｍ．  Ｈａｒｄｅｇｇｅｒ，  Ａ，  Ｍｏｌ．  Ｂｒｅｅｄ．  ４，  １１９  （１９９８）に記載のプロトコルにしたがって行った。バイナリーベクターのみで形質転換したニンジン細胞をコントロールとして使用した。生育データの分散解析は、Ｐｒｉｓｍ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）のスチューデントｔ分布法を使用して行った。
【００５４】
（光親和性ラベルされたタンパク質の免疫沈降）
１２０ｋＤ受容体タンパク質細胞外領域（シグナルペプチドを持たない）をｐＥＴ−２４ｂ発現ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）を使用してＨｉｓ６融合タンパク質として大腸菌に発現させ、精製した。この組換えタンパク質を抗原として使用してウサギで抗体を作製（ＭＢＬ，  Ｎａｇｏｙａ，  Ｊａｐａｎ）し、抗原を固定化したＨｉ−Ｔｒａｐ  ＮＨＳ活性化セファロース（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して抗体をアフィニティー精製した。製造者のプロトコルにしたがって、ＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用したウエスタンブロッティングを行った。ラベルした膜タンパク質（５０μｇ）を５０μｌのバッファーＡで溶解して、精製抗体およびｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  セファロース（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して免疫沈降した。免疫前のＩｇＧ画分をコントロールとして使用した。セファロースビーズを電気泳動サンプルバッファー中で煮沸して、上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析した。
【００５５】
結果および考察
（ＰＳＫ結合タンパク質の光親和性ラベルおよびＰＮＧａｓｅ処理）
光活性化可能なＰＳＫ類似体を、ＮＣ細胞の膜タンパク質と光親和性ラベルさせてＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を行うと、約１２０ｋＤのタンパク質と約１５０ｋＤのタンパク質がＰＳＫと特異的に相互作用していることが示された（図１）。これらのタンパク質は、Ｎ−グリコシダーゼＦ（ＰＮＧａｓｅ  Ｆ）で処理すると切断可能な、約１０ｋＤのＮ結合オリゴ糖を含むことが示された。
【００５６】
（アフィニティー精製したタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析）
［Ｌｙｓ５］ＰＳＫ−セファロースカラムを使用してＰＳＫ結合タンパク質を精製した。精製したタンパク質をさらにハイドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィーで精製し、濃縮してＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＮｉｌｅ  ｒｅｄ染色を行うと、１２０ｋＤの主要タンパク質と微量の１５０ｋＤのタンパク質が特異的に回収されることが示された（図２）。これらのタンパク質は、Ｎ−グリコシダーゼＦ（ＰＮＧａｓｅ  Ｆ）で処理すると切断可能な、約１０ｋＤのＮ結合オリゴ糖を含むことが示された。
【００５７】
（トリプシン消化した精製１２０ｋＤタンパク質の逆相ＨＰＬＣプロフィール）
４回の独立した精製を行い、４８００ｍｇのミクロソームタンパク質から５０μｇの１２０ｋＤタンパク質を、４０％の収率で得た。このタンパク質をＴＰＣＫ−トリプシンで消化してペプチド断片を生じさせ、逆相ＨＰＬＣで分離した（図３）。そのうちの独立した１５個のピークについて、タンパク質シーケンサーおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ（ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｌａｓｅｒ  ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）を使用して解析し、６個のピークから内部ペプチドの完全なアミノ酸配列が得られた（図３のａ〜ｆ）。
【００５８】
（１２０ｋＤタンパク質のクローニング）
１２０ｋＤタンパク質の７つの内部アミノ酸配列のうち３つのアミノ酸配列（Ｃ１、ｅおよびｆ）に基づいて、ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅオリゴヌクレオチドを合成した。これを、ニンジンＮＣ細胞ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡをテンプレートとして使用したｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲのプライマーに使用した。ペプチドｅおよびｆに基づいたプライマーセットを使用した場合にのみ、特異的ＰＣＲ産物が得られた。このＰＣＲ産物をハイブリダイゼーションプローブとして使用し、ニンジンＮＣ  ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって３．５ｋｂのｃＤＮＡクローンを得た。ＯＲＦの解析により、このｃＤＮＡは、推定分子量１１２ｋＤ１０２１アミノ酸タンパク質をコードすることが明らかとなった（図４Ａ）。このタンパク質は、Ｎ末端疎水性シグナル配列、細胞外ロイシンリッチリピート（ＬＲＲｓ）、膜貫通領域および細胞内リン酸化酵素領域を有していた（図４Ｂ）。
【００５９】
（１２０ｋＤ受容体タンパク質ｍＲＮＡのノーザンブロット解析）
対応する遺伝子の発現パターンを調べるために、ノーザンブロット解析を行った（図５）。ＮＣ細胞、二週齢ニンジン種子の種々の部位および形質転換細胞から、総ＲＮＡを単離して解析した結果、ニンジン種子の、葉、頂端分裂組織、胚軸および根において恒常的に発現していたが、培養ＮＣ細胞よりは低い発現であった。図中、ｒＲＮＡはリボソームＲＮＡを示し、ｂｐは塩基対を示す。
【００６０】
（受容体タンパク質の過剰発現）
このタンパク質のｃＤＮＡを、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターの制御下で、センス配向でニンジン細胞に過剰発現させた。その結果、ＰＳＫ応答性が促進されることが明らかとなった（図６）。逆に、アンチセンス鎖を発現させると、ガル巣の成長が実質的に阻害された。これらの知見は、この受容体タンパク質の過剰発現およびアンチセンス阻害が、ニンジン細胞のＰＳＫに対する応答性を変化させるという仮説と一致している。図６は、１０ｎＭ  ＰＳＫにさらした形質転換細胞（センスおよびアンチセンス）並びにコントロール細胞の成長を示す。形質転換細胞およびコントロール細胞は、ナフタレン酢酸（ＮＡＡ、１．０ｍｇ／ｌ）、６−ベンジルアミノプリン（６−ＢＡ、０．５ｍｇ／ｌ）および１０ｎＭ  ＰＳＫを含むＢ５培地において３週間培養した。図には、三回の独立した実験のうち一つを示した。
【００６１】
（ＰＳＫ結合活性の増加）
図７Ａは、センス形質転換体およびコントロール細胞に対するＰＳＫの特異的結合を示した図である。また、図７Ｃは、コントロール細胞およびセンス形質転換体に由来する膜タンパク質の光親和性ラベルを行った結果を示す図である。センス形質転換体の膜画分に対するＰＳＫの結合が、増加していることが示される（図７ＡおよびＣ）。図７Ｂは、図７Ａの結合データのスキャッチャードプロットを示した図である。この結果から、結合の増加は、結合部位が増加したためであることがわかる（センス形質転換体Ｂｍａｘ＝５７０±１８ｆｍｏｌ／ｍｇ膜タンパク質；コントロールＢｍａｘ＝３４±ｆｍｏｌ／ｍｇ膜タンパク質（Ｂｍａｘは、結合部位の最大数）であり、センス形質転換体Ｋｄ＝４．１±０．５ｎＭ；コントロールＫｄ＝４．８±１．１ｎＭを示す）。また、センス形質転換体由来の光親和性ラベル解析および免疫沈降解析から１５０ｋＤタンパク質と１２０ｋＤタンパク質が単一の遺伝子によってコードされていることが明らかとなった。
【００６２】
（ＰＳＫ結合活性の特異性）
数種のＰＳＫ類似体に対する結合親和性を比較することによって、ＰＳＫ結合活性の特異性を特徴づけた。図８は、センス形質転換体の膜画分に対する［３Ｈ］ＰＳＫの結合を、競合分子としてラベルのないＰＳＫ、［１−４］ＰＳＫおよび［２−５］ＰＳＫによって阻害したときの結合親和性比を示した図である（図中、エラーバーは、三回の独立した実験の±ＳＥを示す）。膜タンパク質を６．３ｎＭの［３Ｈ］ＰＳＫおよび３．２μＭ競合分子を含む結合バッファー中で培養した。ラベルのないＰＳＫによって強力に阻害され、活性の低い類似体である［１−４］ＰＳＫによって少し阻害され、および不活性な類似体である［２−５］ＰＳＫによって全く阻害されなかった。このように高い特異性および親和性を有することから、この受容体はＰＳＫと直接相互作用しており、機能的ＰＳＫ受容体の構成成分であることが示唆される。
【００６３】
（形質転換体の増殖）
図９には、この受容体のセンスｍＲＮＡを高レベルで発現する形質転換細胞を示す。植物再分化を誘導するために、植物ホルモンを含まないＢ５培地中で形質転換ニンジン細胞およびコントロール細胞を４週間培養した。形質転換細胞では増殖が加速されているが、根およびシュートに再分化することはできなかった。
【００６４】
【発明の効果】
ＰＳＫ受容体を過剰発現することによって植物増殖が促進される。この効果は、細胞自身が生産するＰＳＫ刺激によって半永久的に継続される。たとえば、植物細胞にＰＳＫ受容体を過剰発現させると、その増殖速度を上昇させることができる。逆に、ＰＳＫ受容体アンチセンスｍＲＮＡを発現させることにより、植物の増殖速度を低下させることができる。
【００６５】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】光親和性ラベルによるＰＳＫ結合タンパク質の検出を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析写真。
【図２】アフィニティー精製したタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析写真。
【図３】トリプシン消化ペプチドの逆相ＨＰＬＣプロフィールを示す図。
【図４】（Ａ）１２０ｋＤタンパク質をコードするｃＤＮＡの核酸配列を示す図および（Ｂ）模式図。
【図５】１２０ｋＤ受容体ｍＲＮＡを示すノーザンブロット解析を示す写真。
【図６】形質転換体の増殖を示す写真。
【図７】ＰＳＫの特異的結合を示す図。
【図８】競合分子ＰＳＫによる結合阻害を示す図。
【図９】センス形質転換体の再分可能の欠失を示す写真。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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