【手続補正書】
【提出日】平成15年7月25日(2003.7.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１）２本鎖ＤＮＡ試料を複数の制限酵素により切断して２本鎖ＤＮＡ断片を得る工程と
２）前記２本鎖ＤＮＡ断片の両３’末端の塩基配列の違いを少なくとも２種類のＤＮＡプライマーの３’末端の１塩基〜４塩基の塩基配列により識別して、前記２本鎖ＤＮＡ断片の両３’末端の塩基配列が所定の塩基配列をもつ前記２本鎖ＤＮＡ断片を、前記２種類のＤＮＡプライマーを用いた相補鎖合成反応を用いて、選択的に分離する工程と、
３）前記相補鎖合成反応の生成物の長さを計測する工程とを有し、
前記ＤＮＡプライマーの１塩基〜４塩基の塩基配列は、アデニン、チミン、グアニン、およびシトシンからの全ての組合せに対応して設けられることを特徴とする核酸分析方法。
【請求項２】
１）２本鎖ＤＮＡ試料を複数の制限酵素により切断して２本鎖ＤＮＡ断片を得る工程と、
２）前記２本鎖ＤＮＡ断片の両末端にオリゴヌクレオチドを結合する工程と、
３）前記オリゴヌクレオチドの塩基配列、及び前記オリゴヌクレオチドの塩基配列に続く、前記制限酵素が認識する塩基配列の一部又は全部と相補な塩基配列と、３’末端に１塩基〜４塩基からなる選択塩基配列をもつ、標識されたＤＮＡプライマーの複数からなるＤＮＡプライマーセットの複数セットを用いて、異なる前記制限酵素が認識する塩基配列に挟まれた、前記２本鎖ＤＮＡ断片の領域の相補鎖合成反応を行なう工程と、
４）前記相補鎖合成反応の生成物を電気泳動分離する工程とを有し、前記選択塩基配列は、アデニン、チミン、グアニン、およびシトシンからの全ての組合せに対応して設けられることを特徴とする核酸分析方法。
【請求項３】
１）２本鎖ＤＮＡ試料を第１の制限酵素により切断して２本鎖ＤＮＡ断片を得る工程と、
２）前記２本鎖ＤＮＡ断片の両末端に第１のオリゴヌクレオチドを結合する工程と、
３）工程２）の生成物を第２の制限酵素により切断して２本鎖ＤＮＡ断片を得る工程と、
４）工程３）で得た前記２本鎖ＤＮＡ断片の末端に第２のオリゴヌクレオチドを結合する工程と、
５）前記第１、第２のオリゴヌクレオチドをそれぞれ両末端に有する前記２本鎖ＤＮＡ断片を捕捉する工程と、
６）工程５）で捕捉された前記２本鎖ＤＮＡ断片を１本鎖ＤＮＡ断片にした後、前記１本鎖ＤＮＡ断片を含む液を複数の容器に分画する工程と、
７）前記第１のオリゴヌクレオチドの塩基配列、及び前記第１のオリゴヌクレオチドの塩基配列に続く、前記第１の制限酵素が認識する塩基配列の一部又は全部と相補な塩基配列と、３’末端に１塩基〜４塩基からなる第１の選択塩基配列をもつ、標識された第１のＤＮＡプライマーの複数からなる第１のＤＮＡプライマーセットと、前記第２のオリゴヌクレオチドの塩基配列、及び前記第２のオリゴヌクレオチドの塩基配列に続く、前記第２の制限酵素が認識する塩基配列の一部又は全部と相補な塩基配列と、３’末端に１塩基〜４塩基からなる第２の選択塩基配列をもつ、標識された第２のＤＮＡプライマーの複数からなる第２のＤＮＡプライマーセットとから、前記第１のＤＮＡプライマーと前記第２のＤＮＡプライマーとの組合わせからなるＤＮＡプライマーを、前記各組合わせに対応させて前記各容器に添加して、前記第１、第２の制限酵素が認識する塩基配列に挟まれた、前記２本鎖ＤＮＡ断片の領域の相補鎖合成反応を、前記各容器で行なう工程と、
８）前記各容器での前記相補鎖合成反応の生成物を電気泳動分離する工程とを有し、前記第１の選択塩基配列と前記第２の選択塩基配列は、アデニン、チミン、グアニン、およびシトシンからの全ての組合せに対応して各々設けられることを特徴とする核酸分析方法。
【請求項４】
ビーズ固定
１ａ）２本鎖ＤＮＡ試料を第１の制限酵素により切断して２本鎖ＤＮＡ断片を担体に保持する工程と、
２ａ）前記２本鎖ＤＮＡ断片の末端に第１のオリゴヌクレオチドを結合する工程と、
３ａ）工程２ａ）の生成物を第２の制限酵素により切断して２本鎖ＤＮＡ断片を得る工程と、
４ａ）工程３ａ）で得た前記２本鎖ＤＮＡ断片の末端に第２のオリゴヌクレオチドを結合する工程と、
１ｂ）前記２本鎖ＤＮＡ試料を前記第２の制限酵素により切断して２本鎖ＤＮＡ断片を担体に保持する工程と、
２ｂ）工程１ｂ）で得た前記２本鎖ＤＮＡ断片の末端に前記第２のオリゴヌクレオチドを結合する工程と、
３ｂ）工程２ｂ）の生成物を前記第１の制限酵素により切断して２本鎖ＤＮＡ断片を得る工程と、
４ｂ）工程３ｂ）で得た前記２本鎖ＤＮＡ断片の末端に前記第１のオリゴヌクレオチドを結合する工程と、
５）工程４ａ）及び工程４ｂ）の生成物を混合して、前記担体に保持された２本鎖ＤＮＡ断片を除去した後に、前記２本鎖ＤＮＡ断片を１本鎖ＤＮＡ断片にした後、前記１本鎖ＤＮＡ断片を含む液を複数の容器に分画する工程と、
６）前記第１のオリゴヌクレオチドの塩基配列、及び前記第１のオリゴヌクレオチドの塩基配列に続く、前記第１の制限酵素が認識する塩基配列の一部又は全部と相補な塩基配列と、３’末端に１塩基〜４塩基からなる第１の選択塩基配列をもつ、標識された第１のＤＮＡプライマーの複数からなる第１のＤＮＡプライマーセットと、前記第２のオリゴヌクレオチドの塩基配列、及び前記第２のオリゴヌクレオチドの塩基配列に続く、前記第２の制限酵素が認識する塩基配列の一部又は全部と相補な塩基配列と、３’末端に１塩基〜４塩基からなる第２の選択塩基配列をもつ、標識された第２のＤＮＡプライマーの複数からなる第２のＤＮＡプライマーセットとから、前記第１のＤＮＡプライマーと前記第２のＤＮＡプライマーとの組合わせからなるＤＮＡプライマーを、前記各組合わせに対応させて前記各容器に添加して、前記第１、第２の制限酵素が認識する塩基配列に挟まれた、前記２本鎖ＤＮＡ断片の領域の相補鎖合成反応を、前記各容器で行なう工程と、
７）前記各容器での前記相補鎖合成反応の生成物を電気泳動分離する工程とを有し、前記第１の選択塩基配列と前記第２の選択塩基配列は、アデニン、チミン、グアニン、およびシトシンからの全ての組合せに対応して各々設けられることを特徴とする核酸分析方法。
【請求項５】
１）２本鎖ＤＮＡ試料を複数種類の制限酵素により切断して２本鎖ＤＮＡ断片を得る工程と、
２）前記２本鎖ＤＮＡ断片の両末端に複数種類のオリゴヌクレオチドを結合する工程と、
３）前記２本鎖ＤＮＡ断片を含む液を複数の容器に分画する工程と、
４）前記オリゴヌクレオチドの塩基配列、及び前記オリゴヌクレオチドの塩基配列に続く、前記制限酵素が認識する塩基配列の一部又は全部と相補な塩基配列と、３’末端に１塩基〜４塩基からなる選択塩基配列をもつ、標識された第ＤＮＡプライマーの複数からなるＤＮＡプライマーセットの複数セットの、それぞれのセットからの前記ＤＮＡプライマーの組合わせからなるＤＮＡプライマーを、前記各組合わせに対応させて前記各容器に添加して、２種類の前記制限酵素が認識する塩基配列に挟まれた、前記２本鎖ＤＮＡ断片の領域の相補鎖合成反応を、前記各容器で行なう工程と、
５）前記各容器での前記相補鎖合成反応の生成物を電気泳動分離する工程とを有し、前記選択塩基配列は、アデニン、チミン、グアニン、およびシトシンからの全ての組合せに対応して各々設けられることを特徴とする核酸分析方法。
【請求項６】
請求項２、３、４、５のいずれかに記載の核酸分析方法に用いるＤＮＡプライマーセットであり、ＤＮＡプライマーセットは複数のＤＮＡプライマーからなり、各ＤＮＡプライマーは、５’Ｎ１Ｎ２…ＮｎＸ１Ｘ２…ＸｍＺ１Ｚ２…ＺｈＹ１Ｙ２…Ｙｋ３’の構造を有し、Ｎ１Ｎ２…Ｎｎ（５≦ｎ≦２７）は、２本鎖ＤＮＡ断片の末端に結合したオリゴヌクレオチドと実質相補な塩基配列であり、Ｎ１Ｎ２…Ｎｎを構成する何れかのヌクレオチドが標識されており、Ｘ１Ｘ２…Ｘｍ（１≦ｍ≦６）は、制限酵素が認識する塩基配列の一部又は全部と相補な塩基配列であり、Ｚ１Ｚ２…Ｚｈ（０≦ｈ≦３）は、複数種類のヌクレオチドとハイブリダイズし得るヌクレオチドアナログであり、Ｙ１Ｙ２…Ｙｋ（１≦ｋ≦４）は、Ａ、Ｃ、Ｇ及びＴの組合わせの（４のｋ乗）の種類からなることを特徴とするＤＮＡプライマーセット。