【手続補正書】
【提出日】平成26年4月16日(2014.4.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の段階を含む、ヘテロ二量体タンパク質を作出するためのインビトロの方法:
a) Fc領域が第1のCH3領域を含む、免疫グロブリンのFc領域を含む第1のホモ二量体タンパク質を提供する段階、
b) Fc領域が第2のCH3領域を含む、免疫グロブリンのFc領域を含む第2のホモ二量体タンパク質を提供する段階、
ここで該第1のCH3領域および第2のCH3領域の配列は異なり、かつ該第1のCH3領域と第2のCH3領域との間のヘテロ二量体相互作用が該第1のCH3領域および第2のCH3領域のホモ二量体相互作用の各々よりも強いようなものであり、
c) ヒンジ領域内のシステインがジスルフィド結合の異性化を起こすことを可能にするのに十分な還元条件の下で、該第1のタンパク質を該第2のタンパク質とともにインキュベートする段階、ならびに
d) 該ヘテロ二量体タンパク質を得る段階。
【請求項２】
第1のホモ二量体タンパク質および第2のホモ二量体タンパク質が、(i) Fc領域、(ii) 抗体、(iii) Fc領域を含む融合タンパク質、および(iv) プロドラッグ、ペプチド、薬物もしくは毒素に結合されたFc領域からなる群より選択される、請求項1記載のインビトロの方法。
【請求項３】
第1および/または第2のホモ二量体タンパク質が全長抗体である、請求項1記載のインビトロの方法。
【請求項４】
第1および第2のホモ二量体タンパク質がともに抗体であり、異なるエピトープに結合する、前記請求項のいずれか一項記載のインビトロの方法。
【請求項５】
第1のホモ二量体タンパク質のFc領域が、IgG1、IgG2、IgG3およびIgG4からなる群より選択されるアイソタイプのものであり、かつ第2のホモ二量体タンパク質のFc領域が、IgG1、IgG2、IgG3およびIgG4からなる群より選択されるアイソタイプのものである、前記請求項のいずれか一項記載のインビトロの方法。
【請求項６】
第1のホモ二量体タンパク質および第2のホモ二量体タンパク質の両方のFc領域がIgG1アイソタイプのものである、前記請求項のいずれか一項記載のインビトロの方法。
【請求項７】
ホモ二量体タンパク質のFc領域の一方がIgG1アイソタイプのものであり、もう一方がIgG4アイソタイプのものである、前記請求項のいずれか一項記載のインビトロの方法。
【請求項８】
ホモ二量体相互作用の各々と比較したヘテロ二量体相互作用の強度の増大が、共有結合、システイン残基または荷電残基の導入以外のCH3改変によるものである、前記請求項のいずれか一項記載のインビトロの方法。
【請求項９】
結果として得られるヘテロ二量体タンパク質における第1のタンパク質と第2のタンパク質との間のヘテロ二量体相互作用が、
a) 実施例13に記述した条件の下、0.5 mM GSHでFabアーム交換が起こりえないようなものであり、および/または
b) 実施例14に記述した条件の下、マウスにおいてインビボでFabアーム交換が起こらないようなものである、
前記請求項のいずれか一項記載のインビトロの方法。
【請求項１０】
結果として得られるヘテロ二量体タンパク質における第1のタンパク質と第2のタンパク質との間のヘテロ二量体相互作用が、例えば実施例30に記述のように決定した場合、2つのホモ二量体相互作用のうちで最も強いものよりも2倍を超えて強い、例えば3倍を超えて強い、例えば5倍を超えて強い、前記請求項のいずれか一項記載のインビトロの方法。
【請求項１１】
第1のCH3領域および第2のCH3領域の配列が、
a) 実施例30に記述のようにアッセイした場合、結果として得られるヘテロ二量体タンパク質における第1のタンパク質と第2のタンパク質との間のヘテロ二量体相互作用の解離定数が0.05マイクロモル未満であるようなものであり、および/または
b) 両方のホモ二量体相互作用の解離定数が0.01マイクロモルを超える、例えば0.05マイクロモルを超える、好ましくは0.01〜10マイクロモル、例えば0.05〜10マイクロモル、より好ましくは0.01〜5マイクロモル、例えば0.05〜5マイクロモル、さらにより好ましくは0.01〜1マイクロモル、例えば0.05〜1マイクロモル、0.01〜0.5マイクロモルまたは0.01〜0.1マイクロモルであるようなものである、前記請求項のいずれか一項記載のインビトロの方法。
【請求項１２】
第1のCH3領域および第2のCH3領域の配列が、同一でない位置にアミノ酸置換を含む、前記請求項のいずれか一項記載のインビトロの方法。
【請求項１３】
アミノ酸置換が天然アミノ酸または非天然アミノ酸である、請求項12記載のインビトロの方法。
【請求項１４】
野生型CH3領域と比較して、第1のホモ二量体タンパク質がCH3領域中に1つのみアミノ酸置換を有し、第2のホモ二量体タンパク質がCH3領域中に1つのみアミノ酸置換を有する、前記請求項のいずれか一項記載のインビトロの方法。
【請求項１５】
第1のホモ二量体タンパク質が、366、368、370、399、405、407および409からなる群より選択される位置にアミノ酸置換を有し、かつ第2のホモ二量体タンパク質が、366、368、370、399、405、407および409からなる群より選択される位置にアミノ酸置換を有し、ここで該第1のホモ二量体タンパク質および該第2のホモ二量体タンパク質は同じ位置では置換されない、前記請求項1〜13のいずれか一項記載のインビトロの方法。
【請求項１６】
a) 第1のホモ二量体タンパク質が位置409にLys、LeuまたはMet以外のアミノ酸を有し、かつ第2のホモ二量体タンパク質が、366、368、370、399、405および407からなる群より選択される位置にアミノ酸置換を有するか、
b) 第1のホモ二量体タンパク質が位置409にLys、LeuまたはMet以外のアミノ酸を有し、かつ第2のホモ二量体タンパク質が位置405にPhe以外のアミノ酸を有するか、
c) 第1のホモ二量体タンパク質が位置409にLys、LeuまたはMet以外のアミノ酸を有し、かつ第2のホモ二量体タンパク質が位置405にPhe、ArgまたはGly以外のアミノ酸を有するか、
d) 第1のホモ二量体タンパク質が位置405にPheを、および位置409にLys、LeuまたはMet以外のアミノ酸を含み、かつ第2のホモ二量体タンパク質が位置405にPhe以外のアミノ酸および位置409にLysを含むか、
e) 第1のホモ二量体タンパク質が位置405にPheを、および位置409にLys、LeuまたはMet以外のアミノ酸を含み、かつ第2のホモ二量体タンパク質が位置405にPhe、ArgまたはGly以外のアミノ酸および位置409にLysを含むか、
f) 第1のホモ二量体タンパク質が位置405にPheを、および位置409にLys、LeuまたはMet以外のアミノ酸を含み、かつ第2のホモ二量体タンパク質が位置405にLeuおよび位置409にLysを含むか、
g) 第1のホモ二量体タンパク質が位置405にPheおよび位置409にArgを含み、かつ第2のホモ二量体タンパク質が位置405にPhe、ArgまたはGly以外のアミノ酸および位置409にLysを含むか、
h) 第1のホモ二量体タンパク質が位置405にPheおよび位置409にArgを含み、かつ第2のホモ二量体タンパク質が位置405にLeuおよび位置409にLysを含む、
i) 第1のホモ二量体タンパク質が位置409にLys、LeuまたはMet以外のアミノ酸を含み、かつ第2のホモ二量体タンパク質が位置409にLys、位置370にThrおよび位置405にLeuを含むか、
j) 第1のホモ二量体タンパク質が位置409にArgを含み、かつ第2のホモ二量体タンパク質が位置409にLys、位置370にThrおよび位置405にLeuを含む、
k) 第1のホモ二量体タンパク質が位置370にLys、位置405にPheおよび位置409にArgを含み、かつ第2のホモ二量体タンパク質が位置409にLys、位置370にThrおよび位置405にLeuを含むか、
l) 第1のホモ二量体タンパク質が位置409にLys、LeuまたはMet以外のアミノ酸を有し、かつ第2のホモ二量体タンパク質が位置407にTyr、Asp、Glu、Phe、Lys、Gln、Arg、SerまたはThr以外のアミノ酸を有するか、
m) 第1のホモ二量体タンパク質が位置409にLys、LeuまたはMet以外のアミノ酸を有し、かつ第2のホモ二量体タンパク質が位置407にAla、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、ValまたはTrpを有するか、
n) 第1のホモ二量体タンパク質が位置409にLys、LeuまたはMet以外のアミノ酸を有し、かつ第2のホモ二量体タンパク質が位置407にGly、Leu、Met、AsnまたはTrpを有するか、
o) 第1のホモ二量体タンパク質が位置407にTyrを、および位置409にLys、LeuまたはMet以外のアミノ酸を有し、かつ第2のホモ二量体タンパク質が位置407にTyr、Asp、Glu、Phe、Lys、Gln、Arg、SerまたはThr以外のアミノ酸および位置409にLysを有するか、
p) 第1のホモ二量体タンパク質が位置407にTyrを、および位置409にLys、LeuまたはMet以外のアミノ酸を有し、かつ第2のホモ二量体タンパク質が位置407にAla、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、ValまたはTrpおよび位置409にLysを有するか、
q) 第1のホモ二量体タンパク質が位置407にTyrを、および位置409にLys、LeuまたはMet以外のアミノ酸を有し、かつ第2のホモ二量体タンパク質が位置407にGly、Leu、Met、AsnまたはTrpおよび位置409にLysを有するか、
r) 第1のホモ二量体タンパク質が位置407にTyrおよび位置409にArgを有し、かつ第2のホモ二量体タンパク質が位置407にTyr、Asp、Glu、Phe、Lys、Gln、Arg、SerまたはThr以外のアミノ酸および位置409にLysを有するか、
s) 第1のホモ二量体タンパク質が位置407にTyrおよび位置409にArgを有し、かつ第2のホモ二量体タンパク質が位置407にAla、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、ValまたはTrpおよび位置409にLysを有するか、
t) 第1のホモ二量体タンパク質が位置407にTyrおよび位置409にArgを有し、かつ第2のホモ二量体タンパク質が位置407にGly、Leu、Met、AsnまたはTrpおよび位置409にLysを有するか、
u) 第1のホモ二量体タンパク質が位置409にLys、LeuまたはMet以外のアミノ酸を有し、かつ第2のホモ二量体タンパク質が
(i) 位置368にPhe、LeuおよびMet以外のアミノ酸、または
(ii) 位置370にTrp、または
(iii) 位置399にAsp、Cys、Pro、GluもしくはGln以外のアミノ酸
を有するか、
v) 第1のホモ二量体タンパク質が位置409にArg、Ala、HisまたはGlyを有し、かつ第2のホモ二量体タンパク質が
(i) 位置368にLys、Gln、Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Asn、Arg、Ser、Thr、ValもしくはTrp、または
(ii) 位置370にTrp、または
(iii) 位置399にAla、Gly、Ile、Leu、Met、Asn、Ser、Thr、Trp、Phe、His、Lys、ArgもしくはTyr
を有するか；あるいは
w) 第1のホモ二量体タンパク質が位置409にArgを有し、かつ第2のホモ二量体タンパク質が
(i) 位置368にAsp、Glu、Gly、Asn、Arg、Ser、Thr、ValもしくはTrp、または
(ii) 位置370にTrp、または
(iii) 位置399にPhe、His、Lys、ArgもしくはTyr
を有する、
前記請求項1〜15のいずれか一項記載のインビトロの方法。
【請求項１７】
第1および第2のCH3領域が、指定した変異を除いて、SEQ ID NO:1に記載される配列を含む、前記請求項のいずれか一項記載のインビトロの方法。
【請求項１８】
a) 第1のホモ二量体タンパク質と第2のホモ二量体タンパク質のどちらもヒンジ領域の中にCys-Pro-Ser-Cys配列を含まないか、または
b) 第1のホモ二量体タンパク質と第2のホモ二量体タンパク質のどちらもヒンジ領域の中にCys-Pro-Pro-Cys配列を含む、
前記請求項のいずれか一項記載のインビトロの方法。
【請求項１９】
第1のホモ二量体タンパク質および第2のホモ二量体タンパク質が、指定した任意の変異を除いて、ヒト抗体である、前記請求項のいずれか一項記載のインビトロの方法。
【請求項２０】
第1のホモ二量体タンパク質および第2のホモ二量体タンパク質が重鎖抗体である、前記請求項のいずれか一項記載のインビトロの方法。
【請求項２１】
第1のホモ二量体タンパク質と第2のホモ二量体タンパク質のどちらも軽鎖をさらに含み；場合により軽鎖が異なる、前記請求項1〜20のいずれか一項記載のインビトロの方法。
【請求項２２】
第1および/または第2のホモ二量体タンパク質が、Asn結合型グリコシル化のアクセプタ部位を取り除く変異を含む、前記請求項のいずれか一項記載のインビトロの方法。
【請求項２３】
段階a)およびb)において提供される第1および第2のホモ二量体タンパク質が精製される、前記請求項のいずれか一項記載のインビトロの方法。
【請求項２４】
第1および/または第2のホモ二量体タンパク質が薬物、プロドラッグもしくは毒素に結合されるか、またはそれらに対するアクセプタ基を含む、前記請求項のいずれか一項記載のインビトロの方法。
【請求項２５】
a) ホモ二量体タンパク質がともに抗体であり、かつ第1の抗体および第2の抗体が同じ腫瘍細胞上の異なるエピトープに結合するか、または
b) ホモ二量体タンパク質がともに抗体であり、かつ第1の抗体が腫瘍細胞上のエピトープに結合し、かつ他方の抗体が、意図した用途に関連するいかなるインビボ結合活性もない無関係なまたは不活性な抗体である、
前記請求項1〜24のいずれか一項記載のインビトロの方法。
【請求項２６】
段階c)における還元条件に、還元剤、例えば2-メルカプトエチルアミン、ジチオスレイトールおよびトリス(2-カルボキシエチル)ホスフィンまたはその化学的誘導体からなる群より選択される還元剤の添加が含まれる、前記請求項のいずれか一項記載のインビトロの方法。
【請求項２７】
段階c)が、
a) -150〜-600 mV、例えば-250〜-400 mVの酸化還元電位による還元条件の下で行われる、および/または
b) 少なくとも25 mMの2-メルカプトエチルアミンの存在下にてまたは少なくとも0.5 mMのジチオスレイトールの存在下にて少なくとも20℃の温度で少なくとも90分間のインキュベーションを含む、
前記請求項のいずれか一項記載のインビトロの方法。
【請求項２８】
段階d)が、例えば脱塩による、還元剤の除去を含む、前記請求項のいずれか一項記載のインビトロの方法。
【請求項２９】
以下の段階を含む、所望の特性を有する二重特異性抗体の選択のための方法:
a) 第1セットの抗体が同一の第1のCH3領域を含む、異なる可変領域を有する抗体を含んだホモ二量体抗体の第1セットを提供する段階、
b) 第2セットの抗体が同一の第2のCH3領域を含む、異なる可変領域または同一の可変領域を有する抗体を含んだホモ二量体抗体の第2セットを提供する段階、
ここで該第1および第2のCH3領域の配列は異なり、かつ該第1のCH3領域と第2のCH3領域との間のヘテロ二量体相互作用が該第1のCH3領域および第2のCH3領域のホモ二量体相互作用の各々よりも強いようなものであり、
c) ヒンジ領域内のシステインがジスルフィド結合の異性化を起こすことを可能にするのに十分な還元条件の下で、該第1セットのおよび該第2セットの抗体の組み合わせをインキュベートする段階であって、かくして二重特異性抗体のセットを作出する、段階、
d) 任意で条件を非還元条件に戻す段階、
e) 得られた二重特異性抗体のセットを所与の所望の特性についてアッセイする段階、ならびに
f) 所望の特性を有する二重特異性抗体を選択する段階。
【請求項３０】
a) 第2セットのホモ二量体抗体が異なる可変領域を有するか、または
b) 第2セットのホモ二量体抗体は同一の可変領域を有するが、抗原結合領域外に異なるアミノ酸または構造変化を有する、
請求項29記載の方法。
【請求項３１】
以下の段階を含む、ヘテロ二量体タンパク質を産生するための方法:
a) 第1のFc領域が第1のCH3領域を含む、免疫グロブリンの第1のFc領域を含む第1のポリペプチドをコードする第1の核酸構築体を提供する段階、
b) 第2のFc領域が第1のCH3領域を含む、免疫グロブリンの第2のFc領域を含む第2のポリペプチドをコードする第2の核酸構築体を提供する段階、
ここで該第1および第2のCH3領域の配列は異なり、かつ該第1のCH3領域と第2のCH3領域との間のヘテロ二量体相互作用が該第1のCH3領域および第2のCH3領域のホモ二量体相互作用の各々よりも強いようなものであり、かつ
ここで該第1のホモ二量体タンパク質は位置409にLys、LeuもしくはMet以外のアミノ酸を有し、かつ該第2のホモ二量体タンパク質は、366、368、370、399、405および407からなる群より選択される位置にアミノ酸置換を有し、
かつ/または
ここで該第1および第2のCH3領域の配列は、CH3領域の各々のホモ二量体相互作用の解離定数が、実施例21に記述のようにアッセイした場合、0.01〜10マイクロモル、例えば0.05〜10マイクロモル、より好ましくは0.01〜5マイクロモル、例えば0.05〜5マイクロモル、さらにより好ましくは0.01〜1マイクロモル、例えば0.05〜1マイクロモル、0.01〜0.5マイクロモルまたは0.01〜0.1マイクロモルであるようなものであり、
c) 宿主細胞において該第1および第2の核酸構築体を共発現させる段階、ならびに
d) 細胞培養物から該ヘテロ二量体タンパク質を得る段階。
【請求項３２】
第1のCH3領域が位置409にLys、LeuもしくはMet以外のアミノ酸を有し、かつ第2のCH3領域が位置405にPhe、ArgもしくはGly以外などの、位置405にPhe以外のアミノ酸を有し、
または
第1のCH3領域が位置409にLys、LeuもしくはMet以外のアミノ酸を有し、かつ第2のCH3領域が位置407にTyr、Asp、Glu、Phe、Lys、Gln、Arg、SerもしくはThr以外のアミノ酸を有する、
請求項31記載の方法。
【請求項３３】
段階c)が、宿主細胞において軽鎖をコードする1つまたは複数の核酸構築体を共発現させる段階をさらに含む、前記請求項31〜32のいずれか一項記載の方法。
【請求項３４】
請求項2〜25のいずれか一項または複数項の特徴をさらに含む、前記請求項31〜33のいずれか記載の方法。
【請求項３５】
請求項31〜34のいずれか一項に特定されている核酸構築体を含む発現ベクター。
【請求項３６】
請求項31〜34のいずれか一項に特定されている核酸構築体を含む宿主細胞。
【請求項３７】
前記請求項1〜36のいずれか一項記載の方法によって得られたまたは得ることができるヘテロ二量体タンパク質。
【請求項３８】
第1のFc領域が第1のCH3領域を含む、免疫グロブリンの第1のFc領域を含む第1のポリペプチドと、第2のFc領域が第2のCH3領域を含む、免疫グロブリンの第2のFc領域を含む第2のポリペプチドとを含むヘテロ二量体タンパク質であって、ここで該第1および第2のCH3領域の配列は異なり、かつ該第1のCH3領域と第2のCH3領域との間のヘテロ二量体相互作用が該第1のCH3領域および第2のCH3領域のホモ二量体相互作用の各々よりも強いようなものであり、かつ
ここで該第1のホモ二量体タンパク質は位置409にLys、LeuもしくはMet以外のアミノ酸を有し、かつ該第2のホモ二量体タンパク質は、366、368、370、399、405および407からなる群より選択される位置にアミノ酸置換を有し、
かつ/または
ここで該第1および第2のCH3領域の配列は、CH3領域の各々のホモ二量体相互作用の解離定数が、実施例21に記述のようにアッセイした場合、0.01〜10マイクロモル、例えば0.05〜10マイクロモル、より好ましくは0.01〜5マイクロモル、例えば0.05〜5マイクロモル、さらにより好ましくは0.01〜1マイクロモル、例えば0.05〜1マイクロモル、0.01〜0.5マイクロモルまたは0.01〜0.1マイクロモルであるようなものである、
前記ヘテロ二量体タンパク質。
【請求項３９】
第1のCH3領域が位置409にLys、LeuもしくはMet以外のアミノ酸を有し、かつ第2のCH3領域が位置405にPhe、ArgもしくはGly以外のような、位置405にPhe以外のアミノ酸を有し、
または
第1のCH3領域が位置409にLys、LeuもしくはMet以外のアミノ酸を有し、かつ第2のCH3領域が位置407にTyr、Asp、Glu、Phe、Lys、Gln、Arg、SerもしくはThr以外のアミノ酸を有する、
請求項37記載のヘテロ二量体タンパク質。
【請求項４０】
請求項2〜25のいずれか一項または複数の項の特徴をさらに含む、前記請求項37〜39のいずれか一項記載のヘテロ二量体タンパク質。
【請求項４１】
医薬として用いるための、請求項38〜40のいずれか一項記載のヘテロ二量体タンパク質。
【請求項４２】
がんの処置で用いるための、請求項41記載のヘテロ二量体タンパク質。
【請求項４３】
請求項38〜40のいずれか一項記載のヘテロ二量体タンパク質と薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物。
【請求項４４】
請求項38〜40のいずれか一項記載のヘテロ二量体タンパク質の、それを必要としている個体への投与を含む、腫瘍細胞の成長および/もしくは増殖を阻害するための、ならびに/または腫瘍細胞の死滅化のための方法。