(57)【要約】【課題】工業的に利用可能な、効率的な（Ｒ）−マンデル酸アミド誘導体の製造方法を提供する。【解決手段】本発明に係る（Ｒ）−マンデル酸アミド誘導体の製造方法は、特定のベンゾイルホルムアミド誘導体（Ａ）にサッカロマイセス属酵母を作用させ、特定の（Ｒ）−マンデル酸アミド誘導体を得ることを特徴としている。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ｒ）−２−クロロマンデル酸アミドの原料となる、下記式（Ｉ）で表される２−クロロベンゾイルホルムアミド。
【化１】
2004075561.tif 000016
【請求項２】
下記一般式（ＩＩ）（Ｘ１、Ｘ２は、水素、ハロゲン原子、低級アルキル基、保護基で保護されていてもよいヒドロキシル基、ニトロ基、及びスルホニル基からなる群から選ばれる基を示し、Ｘ１、Ｘ２は、互いに同一であっても異なってもよいが同時に水素であることはない。Ｒは、ハロゲン原子、低級アルキル基、保護基で保護されていてもよいヒドロキシル基、ニトロ基、及びスルホニル基からなる群から選ばれる少なくとも１種であり、式（ＩＩ）中のベンゼン環上の３位、４位、５位が、ｎ個　（０から３の整数）のＲにより置換されていることを意味する。）で表されるベンゾイルホルムアミド誘導体（Ａ）にサッカロマイセス属酵母を作用させ、下記一般式（ＩＩＩ）（Ｘ１、　Ｘ２、　Ｒ、　ｎは、前記一般式（ＩＩ）中のＸ１、　Ｘ２、　Ｒ、　ｎと同じである。）　で表される（Ｒ）−マンデル酸アミド誘導体を得る、（Ｒ）−マンデル酸アミド誘導体の製造方法。
【化２】
2004075561.tif 000017
【化３】
2004075561.tif 000018
【請求項３】
前記一般式（ＩＩ）で表されるベンゾイルホルムアミド誘導体（Ａ）が、２−クロロベンゾイルホルムアミドであることを特徴とする請求項２に記載の（Ｒ）−マンデル酸アミド誘導体の製造方法。
【請求項４】
前記サッカロマイセス属酵母が、パン酵母であることを特徴とする請求項２または３に記載の（Ｒ）−マンデル酸アミド誘導体の製造方法。
【請求項５】
下記一般式（ＩＶ）（Ｒは、ハロゲン原子、低級アルキル基、保護基で保護されていても良いヒドロキシル基、ニトロ基、及びスルホニル基からなる群から選ばれ少なくとも１種を示し、ｎは０から５の整数を示す。）で表されるベンゾイルホルムアミド誘導体（Ｂ）に、トロピノン還元酵素−Ｉ活性を有する酵素活性物質を作用させ、下記一般式（Ｖ）（Ｒは、ハロゲン原子、低級アルキル基、保護基で保護されていても良いヒドロキシル基、ニトロ基、及びスルホニル基からなる群から選ばれる少なくとも１種を示し、式（ＩＶ）中のベンゼン環上の２位、３位、４位、５位および／または６位が、ｎ個（ｎは０から５の整数）のＲにより置換されていることを意味する。）で表される（Ｒ）−マンデル酸アミド誘導体を得る、（Ｒ）−マンデル酸アミド誘導体の製造方法。
【化４】
2004075561.tif 000019
【化５】
2004075561.tif 000020
【請求項６】
前記一般式（ＩＶ）で表されるベンゾイルホルムアミド誘導体（Ｂ）が、式（ＩＶ）中のベンゼン環上の２位および／または６位に置換基Ｒを有することを特徴とする請求項５に記載の（Ｒ）−マンデル酸アミド誘導体の製造方法。
【請求項７】
前記酵素活性物質が、Ｄａｔｕｒａ属、またはＨｙｏｓｃｙａｍｕｓ属に属する植物に由来する酵素活性物質であることを特徴とする請求項５または６に記載の（Ｒ）−マンデル酸アミド誘導体の製造方法。
【請求項８】
前記Ｄａｔｕｒａ属に属する植物が、Ｄａｔｕｒａ　ｓｔｒａｍｏｎｉｕｍであることを特徴とする請求項７に記載の（Ｒ）−マンデル酸アミド誘導体の製造方法。
【請求項９】
前記Ｈｙｏｓｃｙａｍｕｓ属に属する植物が、Ｈｙｏｓｃｙａｍｕｓ　ｎｉｇｅｒであることを特徴とする請求項７に記載の（Ｒ）−マンデル酸アミド誘導体の製造方法。
【請求項１０】
前記酵素活性物質が、トロピノン還元酵素−ＩをコードするＤＮＡを含むベクターにより形質転換された形質転換体、またはその処理物であることを特徴とする請求項５〜９のいずれかに記載の（Ｒ）−マンデル酸アミド誘導体の製造方法。
【請求項１１】
前記ベクターが、更に酸化型補酵素を還元型補酵素に再生する酵素をコードするＤＮＡを共に含むことを特徴とする請求項１０に記載の（Ｒ）−マンデル酸アミド誘導体の製造方法。
【請求項１２】
前記酸化型補酵素を還元型補酵素に再生する酵素が、グルコース脱水素酵素であることを特徴とする請求項１１に記載の（Ｒ）−マンデル酸アミド誘導体の製造方法。
【請求項１３】
前記グルコース脱水素酵素が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来であることを特徴とする請求項１２に記載の（Ｒ）−マンデル酸アミド誘導体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、医薬品合成の原料として有用な、（Ｒ）−マンデル酸アミド誘導体の製造方法に関し、たとえば（Ｒ）−マンデル酸アミド誘導体として（Ｒ）−２−クロロマンデル酸アミドを含む。
【０００２】
【従来の技術】
ベンゼン環上にハロゲン置換を有する（Ｒ）−マンデル酸アミド誘導体の製造方法はこれまでに報告されていない。
【０００３】
ベンゼン環上にハロゲン置換を有しない　（Ｒ）−マンデル酸アミド誘導体の製造方法としては、
・（Ｒ）−マンデル酸に塩化チオニルなどを作用させて、酸クロライドに変換した後、アンモニアと反応させる方法　　（Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　３４，　４３３−４３６　（１９９３）。
・（Ｒ）−マンデル酸をメチルエステルなどに変換した後に、アンモニアと反応させる方法　（Ａｇｒｉ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　５３，　１６５−１７４　（１９８９）　）
・ラセミ体マンデル酸アミドからカラム分割により（Ｒ）−マンデル酸アミドを製造する方法　（Ｃｈｅｍ．　Ｂｅｒ．　１１６，　３６１１−３６１７　（１９８３）　）
・ベンゾイルホルムアミドをパン酵母により不斉還元し、（Ｒ）−マンデル酸アミドを製造する方法　（Ａｕｓｔ．　Ｊ．　Ｃｈｅｍ．　２９，　２４５９−２４６７　（１９７６）　）　、などが知られている。
【０００４】
しかしながら、（Ｒ）−マンデル酸を原料として、ベンゼン環上にハロゲン原子を有する（Ｒ）−マンデル酸に変えることができたとしても、その原料が高価であり、また、反応中に光学純度の低下が起こりうることから工業的な製造方法としては適さない。
【０００５】
また、カラム分割を用いた（Ｒ）−マンデル酸アミドの入手方法と同様な手法により、ベンゼン環上にハロゲン原子を有するラセミ体マンデル酸アミド誘導体から、ベンゼン環上にハロゲン原子を有する（Ｒ）−マンデル酸アミド誘導体を分離する方法も考えられるが、（Ｓ）体は不要となり収率は最大５０％に留まるなど工業上有効な製造方法とはいえない。
【０００６】
このため、工業的な製造方法として、ベンゼン環上にハロゲン原子を置換基として有する（Ｒ）−マンデル酸アミド誘導体を含め、効率の高い（Ｒ）−マンデル酸アミド誘導体の製造方法の出現が望まれていた。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、工業的に利用可能な（Ｒ）−マンデル酸アミド誘導体の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
安価に合成可能な、ベンゼン環上にハロゲン原子を置換基として有するベンゾイルホルムアミド誘導体を原料とし、微生物や酵素を利用した不斉還元反応により、ベンゼン環上にハロゲン原子などを置換基として有する（Ｒ）−マンデル酸アミド誘導体を合成する方法は、理論収率１００％が可能であり、工業的な（Ｒ）−マンデル酸アミド誘導体の製造方法として適している。特に医薬品原料として有用な　（Ｒ）−２−クロロマンデル酸アミドの原料となる２−クロロベンゾイルホルムアミドは文献記載ない新規な化合物であった。
【０００９】
しかし、これまではベンゼン環上に置換基を有しないベンゾイルホルムアミドに対してパン酵母を用いた不斉還元が報告されているのみで、ベンゼン環上に置換基を有する基質に対する反応は知られていない。
【００１０】
一般に、微生物や酵素を用いた反応に於いては、反応点に近い部位に立体障害となるような置換基が導入された場合に、その反応性、立体選択性が著しい影響を受ける場合がある。
【００１１】
例えば、置換基を持たないフェニルグリオキシル酸誘導体を不斉還元することが報告されているキャンディダ・ファマータ　ＩＦＯ　０８５６（特開平６−７１７９号公報）は、オルト位にクロロ置換を有するオルトクロロフェニルグリオキシル酸には還元活性を有しないことが報告されている　（特願２００２−３１５４４）　。また、本願発明者らがロイコノストック・メセンテロイデス・サブスピーシーズ・デキストラニカムより生成させたα−ケト酸還元酵素は、２−クロロベンゾイルギ酸に対する酵素活性を１００％とすると、３−クロロベンゾイルギ酸に対する酵素活性は４．５％、ベンゾイルギ酸に対する活性は１２．９％に過ぎず、ベンゼン環上の置換基が活性に大きな影響を及ぼすことが示されている（特願２００２−２０７５０７）　。
【００１２】
また、本件発明者らは、オルト位に塩素原子を置換基として有するベンゾイルホルムアミド（２−クロロベンゾイルホルムアミド）にパン酵母を作用させた結果、極めて意外なことに、効率よく還元反応が進むことを確認した。また、生成した２−クロロマンデル酸アミドの光学純度を光学分割カラムを用いて測定した結果、９５．３％ｅｅ（Ｒ）という高い純度を有することが明らかとなり、本発明を完成するに至った。
【００１３】
尚、従来報告されているパン酵母を用いて合成した（Ｒ）−マンデル酸アミドは、［α］Ｄは報告されているものの、その光学純度は不明であった。
【００１４】
更に本件発明者らは、種々の酵素を用いて２−クロロベンゾイルホルムアミドに対する還元活性を測定した結果、トロピノン還元酵素−Ｉが還元活性を有し、しかも、９９％ｅｅ以上の（Ｒ）−２−クロロベンゾイルホルムアミドを極めて効率よく生成することを見いだした。
【００１５】
なお、トロピノン還元酵素−Ｉは、植物中のアルカロイド合成に重要な役割を有する酵素であり、生理的にはトロピノンを還元し、トロピンを生成する。また、本酵素は、３−キヌクリジノンを還元し、（Ｒ）−３−キヌクリジノンを生成することが本件発明者らにより報告されているが　（特願２００２−１５２９５５）　、トロピン、３−キヌクリジノンのいずれの構造からも本酵素が２−クロロベンゾイルホルムアミドを始めとしたベンゾイルホルムアミド誘導体に作用し、しかも、９９％以上の高い立体選択性を有することは予想できなかった。
【００１６】
すなわち本発明は、（Ｒ）−２−クロロマンデル酸アミドの原料となる、下記式（Ｉ）で表される２−クロロベンゾイルホルムアミドを提供する。
【化６】
2004075561.tif 000002
本発明に係る（Ｒ）−マンデル酸アミド誘導体の製造方法は、下記一般式（ＩＩ）（Ｘ１、Ｘ２は、水素、ハロゲン原子、低級アルキル基、保護基で保護されていてもよいヒドロキシル基、ニトロ基、及びスルホニル基からなる群から選ばれる基を示し、Ｘ１、Ｘ２は、互いに同一であっても異なってもよいが同時に水素であることはない。Ｒは、ハロゲン原子、低級アルキル基、保護基で保護されていてもよいヒドロキシル基、ニトロ基、及びスルホニル基からなる群から選ばれる少なくとも１種であり、式（ＩＩ）中のベンゼン環上の３位、４位、５位が、ｎ個　（０から３の整数）　のＲにより置換されていることを意味する。）で表されるベンゾイルホルムアミド誘導体（Ａ）にサッカロマイセス属酵母を作用させ、下記一般式（ＩＩＩ）（Ｘ１、　Ｘ２、　Ｒ、　ｎは、前記一般式（ＩＩ）中のＸ１、　Ｘ２、　Ｒ、　ｎと同じである。）　で表される（Ｒ）−マンデル酸アミド誘導体を得ることを特徴とする。
【化７】
2004075561.tif 000003
【化８】
2004075561.tif 000004
前記一般式（ＩＩ）で表されるベンゾイルホルムアミド誘導体（Ａ）は、２−クロロベンゾイルホルムアミドであることが好ましい。
前記サッカロマイセス属酵母は、パン酵母であることが好ましい。
本発明に係る（Ｒ）−マンデル酸アミド誘導体の製造方法は、下記一般式（ＩＶ）（Ｒは、ハロゲン原子、低級アルキル基、保護基で保護されていても良いヒドロキシル基、ニトロ基、及びスルホニル基からなる群から選ばれ少なくとも１種を示し、ｎは０から５の整数を示す。）で表されるベンゾイルホルムアミド誘導体（Ｂ）に、トロピノン還元酵素−Ｉ活性を有する酵素活性物質を作用させ、下記一般式（Ｖ）（Ｒは、ハロゲン原子、低級アルキル基、保護基で保護されていても良いヒドロキシル基、ニトロ基、及びスルホニル基からなる群から選ばれる少なくとも１種を示し、式（ＩＶ）中のベンゼン環上の２位、３位、４位、５位および／または６位が、ｎ個（ｎは０から５の整数）　のＲにより置換されていることを意味する。）で表される（Ｒ）−マンデル酸アミド誘導体を得ることを特徴とする。
【化９】
2004075561.tif 000005
【化１０】
2004075561.tif 000006
前記一般式（ＩＶ）で表されるベンゾイルホルムアミド誘導体（Ｂ）は、式（ＩＶ）中のベンゼン環上の２位および／または６位に置換基Ｒを有することが好ましい。前記酵素活性物質は、Ｄａｔｕｒａ属、またはＨｙｏｓｃｙａｍｕｓ属に属する植物に由来する酵素活性物質であることが好ましい。
前記Ｄａｔｕｒａ属に属する植物は、Ｄａｔｕｒａ　ｓｔｒａｍｏｎｉｕｍであることが好ましい。
前記Ｈｙｏｓｃｙａｍｕｓ属に属する植物は、Ｈｙｏｓｃｙａｍｕｓ　ｎｉｇｅｒであることが好ましい。前記酵素活性物質は、トロピノン還元酵素−ＩをコードするＤＮＡを含むベクターにより形質転換された形質転換体、またはその処理物であってもよい。
前記ベクターは、更に酸化型補酵素を還元型補酵素に再生する酵素をコードするＤＮＡを共に含むことが好ましい。
前記酸化型補酵素を還元型補酵素に再生する酵素は、グルコース脱水素酵素であることが好ましい。
前記グルコース脱水素酵素は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来であることが好ましい。
【発明の実施の形態】
２−クロロベンゾイルホルムアミド
【００１７】
本発明は、（Ｒ）−２−クロロマンデル酸アミドの原料となる、下記式（Ｉ）で表される２−クロロベンゾイルホルムアミドを提供する。
【化１１】
2004075561.tif 000007
【００１８】
このようなベンゼン環上にハロゲン原子を置換基として有するベンゾイルホルムアミド誘導体は、例えば、以下のような方法により製造することができる。
【００１９】
トルエン、アセトニトリルなどの溶媒中にシアン化第１銅を懸濁させておき、ベンゾイルクロライド誘導体を攪拌下に滴下し、加熱還流後、室温まで冷却した後に濾過により不溶物を濾別し、溶媒を減圧蒸留することにより残渣として、ベンゾイルシアナイド誘導体を得ることができる。
【００２０】
また、ベンゾイルシアナイド誘導体を濃塩酸に懸濁後、室温で一晩攪拌し、更に、反応液全体を水中に投入して攪拌し、生成する結晶を濾別後、洗浄、乾燥することにより、ベンゼン環上に置換基を有するベンゾイルホルムアミド誘導体を合成することができる。
【００２１】
さらに、２−クロロベンゾイルギ酸を原料として、塩化チオニルなどによるカルボニルの塩素化、もしくは、短鎖アルコールとのエステル化を経て、アンモニアと作用させることにより、ベンゼン環上にハロゲン置換を有するベンゾイルホルムアミド誘導体を合成することができる。
サッカロマイセス属酵母を用いる（Ｒ）−マンデル酸アミドの合成
【００２２】
本発明は、ベンゼン環上の２位および／または６位（オルト位）に置換基を有する一般式　（ＩＩ）　で表されるベンゾイルホルムアミド誘導体（Ａ）（以下「基質」ということがある。）にサッカロマイセス属酵母を作用させ、一般式　（ＩＩＩ）　　で表される　（Ｒ）−マンデル酸アミド誘導体を製造する方法を提供するものである。
【化１２】
2004075561.tif 000008
【化１３】
2004075561.tif 000009
【００２３】
前記式（ＩＩ）中、Ｘ１、Ｘ２は、水素、ハロゲン原子、低級アルキル基、保護基で保護されていてもよいヒドロキシル基、ニトロ基、及びスルホニル基からなる群から選ばれることを示す。
【００２４】
Ｘ１、Ｘ２は互いに同一であっても異なっていてもよく、Ｘ１とＸ２とが同時に水素であることはない。Ｒは、ハロゲン原子、低級アルキル基、保護基で保護されていてもよいヒドロキシル基、ニトロ基、及びスルホニル基からなる群から選ばれる少なくとも１種であり、前記式（ＩＩ）中のベンゼン環上の３位、４位、５位（ホルムアミドカルボニル基に対してメタ位及び／又はパラ位）が、ｎ個　（ただし、ｎは０から３の整数、好ましくは０または１、さらに好ましくは０である）　のＲで置換されていることを意味する。
【００２５】
前記Ｘ１、Ｘ２において、前記ハロゲン原子としては、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子などが挙げられ、このうちでは、塩素原子が好ましい。前記低級アルキル基としては、炭素原子数が好ましくは１〜４、さらに好ましくは１または２のアルキル基が挙げられ、たとえば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基などが挙げられる。前記保護基で保護されていてもよいヒドロキシル基の保護基としては、メチル基、エチル基、イソプロピル基、ｔ−ブチル基などが挙げられる。
【００２６】
これらのうち、Ｘ１、Ｘ２としては、ハロゲン原子、低級アルキル基が好ましく、Ｘ１、Ｘ２の一方がハロゲン原子であることがより好ましい。
【００２７】
前記式（ＩＩ）中のＲにおいて、ハロゲン原子としては、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子などが挙げられ、このうちでは、塩素原子が好ましい。前記低級アルキル基としては、炭素原子数が好ましくは１〜４、さらに好ましくは１または２のアルキル基が挙げられ、たとえば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基などが挙げられる。前記保護基で保護されていてもよいヒドロキシル基の保護基としては、メチル基、エチル基、イソプロピル基、ｔ−ブチル基などが挙げられる。
【００２８】
これらのうち、Ｒとしては、ハロゲン原子、低級アルキル基が好ましく、ハロゲン原子がより好ましい。
【００２９】
前記式（ＩＩＩ）中、Ｘ１、Ｘ２、Ｒ、ｎは、それぞれ、前記一般式（ＩＩ）中のＸ１、Ｘ２、Ｒ、ｎと同様である。
【００３０】
このような前記一般式　（ＩＩ）　で表されるベンゾイルホルムアミド誘導体（Ａ）の製造方法は限定されず、公知の方法を用いることができる。たとえば、前記ベンゼン環上にハロゲン原子を置換基として有するベンゾイルホルムアミド誘導体の製造方法は前述のとおりである。
【００３１】
これらの反応に用いられるサッカロマイセス属酵母としては、例えば、サッカロマイセス・セレビジアエ　（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）　が挙げられる。サッカロマイセス・セレビジアエの中でもパン酵母は安価に、大量に生菌体もしくは乾燥菌体が容易に入手可能であるため、好適に用いられる。パン酵母の中でも、オリエンタル酵母製のパン酵母を特に好適に用いることができる。
【００３２】
本発明に係るサッカロマイセス属酵母を用いた前記式（ＩＩ）で表されるベンゾイルホルムアミド誘導体の不斉還元反応は、例えば以下のようにして行うことができる。
【００３３】
基質濃度（溶媒に対する基質の重量割合）：好ましくは０．０１重量％〜５０重量％、　さらに好ましくは０．１重量％〜２０重量％、　特に好ましくは０．５〜５重量％
【００３４】
溶媒：水道水、ｐＨが好ましくは３〜９、さらに好ましくは５〜７に調整した緩衝液など
【００３５】
添加物：還元反応のエネルギー源として、グルコース、スクロース、エタノール、イソプロパノール、アミノ酸などを単独で、又は任意の組み合わせで、それぞれ好ましくは０．０１重量％〜５０重量％を、一括、又は分割、連続して添加することもできる。
【００３６】
サッカロマイセス酵母：培養したサッカロマイセス酵母をそのまま添加、遠心分離などによる集菌の後に反応液に添加、反応開始時及び反応中に分割投与などが可能である。市販されている生パン酵母や乾燥パン酵母を用いることも可能である。また、界面活性剤や有機溶媒などにより膜の透過性を変化させた菌体の処理物、無細胞抽出液なども利用できる。更に、反応液に、ＮＡＤＨもしくはＮＡＤＰＨを再生するための微生物、その処理物、酵素、例えば、グルコース脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、アミノ酸脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素、有機酸脱水素酵素などを対応する基質と共に添加することにより反応速度を上げることも可能である。サッカロマイセス酵母の濃度は、酵母の湿重量に換算して、溶媒に対して、好ましくは１〜５０重量％、さらに好ましくは５〜２０重量％であることが好ましい。
【００３７】
基質の添加方法：基質の添加方法は特に限定されないが、特に、市販の乾燥パン酵母や生パン酵母を利用する場合には、基質を添加する前にパン酵母を水に懸濁し、グルコース、スクロースなどの糖を添加した状態で数時間放置し、呼吸に伴う泡の生成を確認した後に基質を添加するのが望ましい。基質となる前記一般式　（ＩＩ）　の化合物は水に対する溶解度が低いため、固体　（粉体）　を、または、基質が溶解するジメチルスルホキシド、エタノールなどの溶媒に高濃度に溶解したものを、反応開始時に一括、分割、または連続して添加することができる。
【００３８】
反応時間は、好ましくは６〜９６時間程度であればよい。反応温度は、好ましくは１５〜４０℃、さらに好ましくは２５〜３５℃程度であればよい。
【００３９】
このようにして得られる（Ｒ）−マンデル酸アミド誘導体の精製は、菌体、タンパク質の遠心分離、膜処理等による分離、溶媒抽出、蒸留、結晶化等を適当に組み合わせることにより行うことができる。
【００４０】
例えば、（Ｒ）−２−クロロマンデル酸アミドを含む反応液を遠心分離することにより菌体を除去し、限外濾過などにより除蛋白したのちに、酢酸エチルなどを用いて（Ｒ）−２−クロロマンデル酸アミドを抽出し、溶媒を減圧下に留去することにより精製することができる。
【００４１】
このようにして、得られる（Ｒ）−マンデル酸アミド誘導体の光学純度（ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｉｃ　ｅｘｃｅｓｓ；ｅｅ）は、好ましくは８０％ｅｅ以上、さらに好ましくは９０％ｅｅ以上、特に好ましくは９５％ｅｅ以上を有する。
【００４２】
光学活性な（Ｒ）−マンデル酸アミド誘導体の光学純度は、たとえば、光学分割カラムなどを用いて確認することができる。
トロピノン還元酵素−Ｉ活性を有する酵素活性物質を用いる（Ｒ）−マンデル酸アミドの合成
【００４３】
本発明は、光学活性マンデル酸アミド誘導体の原料となる、下記一般式（ＩＶ）、で表されるベンゾイルホルムアミド誘導体（Ｂ）に、トロピノン還元酵素−Ｉ活性を有する酵素活性物質を作用させ、下記一般式（Ｖ）で表される（Ｒ）−マンデル酸アミド誘導体を製造する方法を提供するものである。
【化１４】
2004075561.tif 000010
【化１５】
2004075561.tif 000011
【００４４】
上記式（ＩＶ）中、Ｒは、ハロゲン原子、低級アルキル基、保護基で保護されていても良いヒドロキシル基、ニトロ基、及びスルホニル基からなる群から選ばれ少なくとも１種を示し、ｎは好ましくは０から５の整数、さらに好ましくは１〜３の整数、特に好ましくは１である。置換基Ｒが２以上存在する場合は、置換基Ｒは互いに同一であっても、異なっていてもよい。これらの置換基のベンゼン環上の位置は、２〜６位（ホルムアミドカルボニル基に対して、オルト位、メタ位、またはパラ位）のいずれも採ることができるが、好ましくは、２位および／または６位（オルト位）に置換基が存在することが望ましい。
【００４５】
前記式（ＩＶ）中、ハロゲン原子としては、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子などが挙げられ、このうちでは、塩素原子が好ましい。前記低級アルキル基としては、炭素原子数が好ましくは１〜４、さらに好ましくは１または２のアルキル基が挙げられ、たとえば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基などが挙げられる。前記保護基で保護されていてもよいヒドロキシル基の保護基としては、メチル基、エチル基、イソプロピル基、ｔ−ブチル基などが挙げられる。
【００４６】
これらのうち、Ｒとしては、ハロゲン原子、低級アルキル基が好ましく、ハロゲン原子がより好ましい。
【００４７】
前記式（Ｖ）中、Ｒ、ｎは、それぞれ前記一般式（ＩＶ）中のＲ、ｎと同様である。
【００４８】
このような前記一般式（ＩＶ）で表されるベンゾイルホルムアミド誘導体（Ｂ）の製造方法は特に限定されず、公知の方法を用いることができる。たとえば、前記ベンゼン環上にハロゲン原子を置換基として有するベンゾイルホルムアミド誘導体は、前述の方法により製造することができる。
【００４９】
前記一般式（ＩＶ）で表されるベンゾイルホルムアミド誘導体（Ｂ）の不斉還元反応に用いることができる酵素活性物質は、トロピノン還元酵素−Ｉ活性を有し、かつケトンを不斉還元して光学活性アルコールを生成しうるものであれば、任意の酵素を用いることができる。
【００５０】
なお、本発明において、トロピノン還元酵素−Ｉ活性とは、トロピノンに作用してトロピンを生成する活性をいう。トロピノン還元酵素には、トロピノンから互いに逆の立体配置を持つトロピンとシュードトロピンを生成する二種類の還元酵素が報告されている。これらの酵素は、それぞれトロピノン還元酵素−Ｉ（ＥＣ．１．１．１．２０６）（トロピン生成）、およびトロピノン還元酵素−ＩＩ（ＥＣ１．１．１．２３６）（シュードトロピン生成）と名づけられている。これらの酵素は、ヒヨスチアミンやスコポラミンなどのトロパンアルカロイド生合成経路の分岐点に位置する反応を触媒する。すなわちトロピノン還元酵素−Ｉとは、トロピノンに作用してトロピンを生成する活性を有する酵素（ＥＣ．１．１．１．２０６）を指す。
【００５１】
トロピノン還元酵素−Ｉの酵素活性は、以下のような方法によって測定することができる。すなわち、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ　６．５）、０．２ｍＭＮＡＤＰＨ、４ｍＭ　トロピノンおよび酵素を含む反応液中で、３７℃で反応させ、ＮＡＤＰＨの減少による３４０ｎｍの吸収の減少を測定することにより、トロピノン還元活性を測定することができる。また、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液　（ｐＨ　６．５）　、０．２ｍＭ　ＮＡＤＰＨ、１ｍＭ　２−クロロベンゾイルホルムアミド及び酵素を含む反応液中で、３７℃で反応させ、ＮＡＤＰＨの減少による３４０ｎｍの吸収の減少を測定することにより、２−クロロベンゾイルホルムアミド還元活性を測定することができる。それぞれ、１Ｕは、１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＰＨの減少を触媒する酵素量とした。
【００５２】
前記本発明に用いるトロピノン還元酵素−Ｉの由来に特に制限はない。本発明における好ましい酵素活性物質は、ベンゾイルホルムアミド誘導体（Ｂ）を基質として、少なくとも８０％ｅｅ（Ｒ）以上、好ましくは９０％ｅｅ（Ｒ）以上、更に好ましくは９５％ｅｅ（Ｒ）以上の光学純度の光学活性マンデル酸アミド誘導体を生成することができる酵素活性物質である。生成物の光学純度は、反応生成物の光学分割カラム、例えば、ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ　ＡＳ−Ｈ　（ダイセル化学製）　を用い、ｎ−ヘキサン／エタノール　（７５／２５）の溶離液を用いた解析によって確認できる。
【００５３】
本発明における好ましいトロピノン還元酵素−Ｉ活性を有する酵素活性物質は、たとえばＤａｔｕｒａ属、あるいはＨｙｏｓｃｙａｍｕｓ属に属する植物から得ることができる。より具体的には、Ｄａｔｕｒａ　ｓｔｒａｍｏｎｉｕｍ　由来のトロピノン還元酵素−Ｉ（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　Ｕ．　Ｓ．　Ａ．，９０，９５９１−９５９５（１９９３））、あるいはＨｙｏｓｃｙａｍｕｓ　ｎｉｇｅｒ由来のトロピノン還元酵素−Ｉ（Ｂｉｏｓｃｉ．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６３（１０），１８１９−１８２２（１９９９））などが挙げられる。
【００５４】
その他、種々の生物に由来するトロピノン還元酵素−Ｉも、前記式（ＩＶ）で表されるベンゾイルホルムアミド誘導体（Ｂ）を還元して　（Ｒ）−マンデル酸アミド誘導体を生成する活性を有する限り利用することができる。他の生物由来のトロピノン還元酵素−Ｉ活性を有する酵素としては、例えばＢｒｕｇｍａｎｓｉａ　ｃａｎｄｉｄａ　ｘａｕｒｅａ　ｈｙｂｒｉｄ　（Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，　５２，　８７１−８７８　（１９９９））、Ａｔｒｏｐａ　ｂｅｌｌａｄｏｎｎａ　（Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．，　１００，　８３６−８４５　（１９９２））、Ｐｈｙｓａｌｉｓｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉｃａ　（Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．，　１００，　８３６−８４５　（１９９２））、Ｓｏｌａｎｕｍ　ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ　（ＤＮＡ　Ｄａｔａｂａｎｋ　ｏｆ　ＪＡＰＡＮ　（ＤＤＢＪ））　由来のトロピノン還元酵素−Ｉなどが挙げられる。
【００５５】
なお、本発明において、酵素活性物質とは、精製酵素のみならず、トロピノン還元酵素−Ｉを含む微生物菌体、植物、その培養細胞、形質転換体、または、その処理物が含まれる。ここで処理物とは、生物細胞に対して、物理処理、生化学的処理、あるいは化学的処理等を行った産物を指す。また生物細胞には、上記酵素を含む植物細胞に加え、当該酵素の遺伝子を発現可能に保持する形質転換体も含まれる。また処理物を得るための物理処理には、凍結融解処理、超音波処理、加圧処理、浸透圧差処理、あるいは磨砕処理等が含まれる。また生化学的処理としては、具体的には、たとえばリゾチームなどの細胞壁溶解酵素処理などが挙げられる。更に、化学的処理としては、たとえば、界面活性剤、トルエン、キシレン、またはアセトンなどの有機溶媒との接触処理などが挙げられる。このような処理によって細胞膜の透過性を変化させた微生物、あるいはガラスビーズや酵素処理によって菌体を破砕した無細胞抽出液やそれを部分精製したものなどは処理物に含まれる。
【００５６】
前記本発明で用いるトロピノン還元酵素−Ｉ活性を有する酵素活性物質として利用できる精製酵素は、例えばＤａｔｕｒａ　ｓｔｒａｍｏｎｉｕｍ　（Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，　３７（２），　３９１−４００　（１９９４））や、Ｈｙｏｓｃｙａｍｕｓ　ｎｉｇｅｒ　（Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．，　１００，　８３６−８４５　（１９９２））等の植物体から公知の方法によって単離することができる。
【００５７】
あるいは酵素活性物質として形質転換体を利用することもできる。まずトロピノン還元酵素−Ｉをコードする遺伝子を取得し、これを遺伝子組換え技術を用いて同種もしくは異種の宿主中で発現可能に保持させた形質転換体を得ることができる。この形質転換体は、そのままで、あるいは処理物として酵素活性物質とすることができる。更にこの形質転換体を培養して、トロピノン還元酵素−Ｉを取得することもできる。
【００５８】
本発明に用いることができるトロピノン還元酵素−Ｉをコードする遺伝子としては、例えばＤａｔｕｒａ　ｓｔｒａｍｏｎｉｕｍ　（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　Ｕ．　Ｓ．　Ａ．　，９０　，　９５９１−９５９５　（１９９３））　やＨｙｏｓｃｙａｍｕｓｎｉｇｅｒ　（Ｂｉｏｓｃｉ．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６３（１０），１８１９−１８２２（１９９９））　の遺伝子が挙げられる。
【００５９】
これらトロピノン還元酵素−Ｉをコードする遺伝子の塩基配列情報は、ＤＮＡ　Ｄａｔａｂａｎｋ　ｏｆ　ＪＡＰＡＮ（ＤＤＢＪ）、ＥＭＢＬ、Ｇｅｎｅ−ＢａｎｋなどのＤＮＡに関するデータベースに登録されている。これらの塩基配列情報に基いて、目的とする遺伝子を当該生物から取得することができる。遺伝子の取得には、ＰＣＲやハイブリダイズスクリーニングが用いられる。また、ＤＮＡ合成によって遺伝子の全長を化学的に合成することもできる。
【００６０】
更に上記塩基配列情報に基づいて、上記以外の生物に由来するトロピノン還元酵素−Ｉの遺伝子を取得することもできる。たとえば、上記塩基配列もしくはその一部の配列をプローブとして他の生物から調製したＤＮＡに対しストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションを行うことにより、種々の生物由来のトロピノン還元酵素−Ｉを単離することができる。ストリンジェントな条件でハイブリダイズできるポリヌクレオチドとは、配列番号：１または配列番号：２に記載された塩基配列から選択された塩基配列を有するＤＮＡをプローブＤＮＡとし、たとえばＥＣＬ　ｄｉｒｅｃｔ　ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ　ｌａｂｅｌｉｎｇ　ａｎｄ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ　（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｉｃａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用いたマニュアルに記載の条件（ｗａｓｈ：４２℃、０．５ｘＳＳＣを含むｐｒｉｍａｒｙ　ｗａｓｈ　ｂｕｆｆｅｒ）や０．２ｘＳＳＣ　（１ｘＳＳＣ：１５ｍＭ　クエン酸３ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム）、０．１％ＳＤＳ溶液中で６０℃、１５分間洗浄する条件において、ハイブリダイズするポリヌクレオチドを指す。プローブＤＮＡを構成する塩基配列は、前記塩基配列から任意の少なくとも２０個、好ましくは少なくとも３０個、たとえば４０、６０または１００個の連続した配列を一つまたは複数選択することができる。
【００６１】
また、上記塩基配列情報に基づいて、ホモロジーの高い領域からＰＣＲ用のプライマーをデザインすることができる。このようなプライマーを用い、染色体ＤＮＡもしくはｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行えば、トロピノン還元酵素−Ｉをコードする遺伝子を種々の生物から単離することもできる。
【００６２】
本発明の（Ｒ）−マンデル酸アミド誘導体の製造方法においては、天然型のトロピノン還元酵素−Ｉ活性を有する酵素のみならず、ベンゾイルホルムアミド誘導体を還元して（Ｒ）−マンデル酸アミド誘導体を生成する活性を有する限り、天然型酵素のアミノ酸配列に対して１または複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入したアミノ酸配列からなるトロピノン還元酵素−Ｉ活性を有する酵素を用いることも可能である。当業者であれば、例えば、部位特異的変異導入法（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ．１０，ｐｐ．６４８７　（１９８２）　，　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００，ｐｐ．４４８　（１９８３），　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　２ｎｄＥｄｔ．，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ　（１９８９）　，　ＰＣＲ　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ　ｐｐ．２００（１９９１）　）などを用いて、適宜、欠失、置換、挿入、および／または付加変異を導入することにより、蛋白質の構造を改変することができる。また、アミノ酸の変異は自然界において生じることもあり、人工的にアミノ酸を変異した酵素のみならず、自然界においてアミノ酸が変異した酵素も本発明の（Ｒ）−マンデル酸アミド誘導体の製造方法において用いることができる。
【００６３】
また、本発明の（Ｒ）−マンデル酸アミド誘導体の製造方法においては、トロピノン還元酵素−Ｉのアミノ酸配列にホモロジーを有する蛋白質をコードする遺伝子も、その産物である酵素がベンゾイルホルムアミド誘導体を還元して（Ｒ）−マンデル酸アミド誘導体を生成する活性を有する限り、本発明に利用することができる。これら遺伝子は、蛋白質のホモロジー検索を利用して得ることができる。ホモロジー検索には、たとえば以下に示すデータベースを用いることができる。
【００６４】
ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ、ＰＩＲなどの蛋白質のアミノ酸配列に関するデータベース
ＤＮＡ　Ｄａｔａｂａｎｋ　ｏｆ　ＪＡＰＡＮ（ＤＤＢＪ）、ＥＭＢＬ、Ｇｅｎｅ−ＢａｎｋなどのＤＮＡに関するデータベース
ＤＮＡ配列を元にした予想アミノ酸配列に関するデータベース
ＦＡＳＴＡ　ｐｒｏｇｒａｍやＢＬＡＳＴ　ｐｒｏｇｒａｍなどのホモロジー検索用のプログラムも公知である。
【００６５】
更に、上記データベースをこれらのプログラムを用いて検索するサービスも、インターネット上で提供されている。この種のサービスを利用して、本発明に用いることのできるトロピノン還元酵素−Ｉ活性を有する酵素を見出すこともできる。
【００６６】
Ｄａｔｕｒａ　ｓｔｒａｍｏｎｉｕｍ、Ｈｙｏｓｃｙａｍｕｓ　ｎｉｇｅｒ　由来のトロピノン還元酵素−Ｉのアミノ酸配列と、少なくとも８５％、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上のホモロジーを有する蛋白質は、本発明の本発明に用いるトロピノン還元酵素−Ｉとして好ましい。Ｄａｔｕｒａ　ｓｔｒａｍｏｎｉｕｍ、Ｈｙｏｓｃｙａｍｕｓ　ｎｉｇｅｒ　由来のトロピノン還元酵素−Ｉは、いずれも本発明に利用することができる酵素活性を有していた。両者のホモロジーは９４％である。ここでいうホモロジーとは、たとえば、ＢＬＡＳＴ　ｐｒｏｇｒａｍを用いたＩｄｅｎｔｉｔｉｅｓの相同性の値を示す。
【００６７】
本発明におけるトロピノン還元酵素−Ｉ活性を有する好ましい酵素活性物質として、トロピノン還元酵素−Ｉをコードする遺伝子を遺伝子組換え技術を用いて同種もしくは異種の宿主中で発現させた形質転換体、もしくはその処理物を挙げることができる。
【００６８】
本発明においてトロピノン還元酵素−Ｉ遺伝子を発現させるために、形質転換の対象となる生物は、トロピノン還元酵素−Ｉ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含む組換えベクターにより形質転換され、トロピノン還元酵素−Ｉ活性を発現することができる生物であれば特に制限はない。
【００６９】
形質転換体の作製のための手順および宿主に適合した組み換えベクターの構築は、分子生物学、生物工学、遺伝子工学の分野において慣用されている技術に準じて行うことができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、モレキュラー・クローニング、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。微生物中などにおいて、本発明のＮＡＤＰ＋を補酵素とするトロピノン還元酵素−Ｉ遺伝子を発現させるためには、まず微生物中において安定に存在するプラスミドベクターやファージベクター中にこのＤＮＡを導入し、その遺伝情報を転写・翻訳させる必要がある。そのためには、転写・翻訳を制御するユニットにあたるプロモーターを本発明のＤＮＡ鎖の５’−側上流に、より好ましくはターミネーターを３’−側下流に、それぞれ組み込めばよい。このプロモーター、ターミネーターとしては、宿主として利用する微生物中において機能することが知られているプロモーター、ターミネーターを用いる必要がある。これら各種微生物において利用可能なベクター、プロモーター、ターミネータ−などに関して「微生物学基礎講座８遺伝子工学・共立出版」、特に酵母に関しては、Ａｄｖ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｅｎｇ．　４３，　７５−１０２　（１９９０）、Ｙｅａｓｔ　８，　４２３−４８８　（１９９２）、などに詳細に記述されている。
【００７０】
また、微生物以外でも、植物、動物において様々な宿主・ベクター系が開発されており、特に蚕を用いた昆虫（Ｎａｔｕｒｅ　３１５，　５９２−５９４　（１９８５））や菜種、トウモロコシ、ジャガイモなどの植物中に大量に異種蛋白質を発現させる系が開発されており、好適に利用できる。形質転換体の培養、および形質転換体からのトロピノン還元酵素−Ｉの精製は、当業者に公知の方法により行うことができる。
【００７１】
本発明による（Ｒ）−マンデル酸アミド誘導体の製造方法においては、補酵素の再生系を組み合わせることができる。ケトンを還元してアルコールを生成する過程で、トロピノン還元酵素−Ｉは還元型補酵素を要求する。還元型補酵素としては、ＮＡＤＰＨやＮＡＤＨを利用することができる。たとえばＮＡＤＰＨを還元型補酵素に用いた場合、トロピノン還元酵素−Ｉによる還元反応に付随して、ＮＡＤＰＨからＮＡＤＰ＋が生成する。ＮＡＤＰ＋は、適当な基質の酸化反応を利用することによって、再び還元型であるＮＡＤＰＨに再生することができる。ＮＡＤＰ＋からＮＡＤＰＨへの再生は、植物、微生物、形質転換体の含有するＮＡＤＰ＋からＮＡＤＰＨを再生する酵素によって行うことができる。ＮＡＤＰＨの再生反応を触媒する酵素は、単一であってもよいし、複数の酵素で構成される多段階反応であってもよい。複数の酵素によって目的とする酵素反応が支えられているとき、一連の酵素反応を構成する酵素の集合を酵素系と呼ぶ。
【００７２】
これらＮＡＤＰ＋還元能は、反応系にグルコース、スクロースなどの糖、有機酸、またはエタノール、イソプロパノールなどのアルコールを添加することにより、増強することができる。また、ＮＡＤＰ＋からＮＡＤＰＨを生成する能力を有する酵素を用いてＮＡＤＰＨの再生を行うことができる。ＮＡＤＰＨの生成に有用な酵素を以下に示す。これらの酵素は、精製酵素のみならず、当該酵素を有する微生物、その処理物、あるいは部分精製酵素として用いることができる。たとえばグルコース脱水素酵素の場合には、グルコースからδ−グルコノラクトンへの酸化に伴ってＮＡＤＰ＋からＮＡＤＰＨへの再生が行われる。
【００７３】
グルコース脱水素酵素
グルタミン酸脱水素酵素
ギ酸脱水素酵素
リンゴ酸脱水素酵素
グルコース−６−リン酸脱水素酵素
ホスホグルコン酸脱水素酵素
アルコール脱水素酵素
グリセロール脱水素酵素
【００７４】
これらのＮＡＤＰＨ再生に必要な反応を構成する成分は、本発明を構成する還元酵素反応系に添加、もしくは固定化したものを添加することができる。あるいはＮＡＤＰＨの交換が可能な膜を介して前記反応系に接触させることができる。
【００７５】
また、トロピノン還元酵素−ＩをコードするＤＮＡを含む組換えベクターで形質転換した形質転換体を、本発明の（Ｒ）−マンデル酸アミド誘導体の製造方法に利用する場合には、ＮＡＤＰＨ再生のための付加的な反応系を不要とできる場合がある。すなわち、ＮＡＤＰＨ再生活性の高い生物を宿主として用いることにより、形質転換体を用いた還元反応において、ＮＡＤＰＨ再生用の酵素（酸化型補酵素を還元型補酵素に再生する酵素）を添加することなく効率的な反応を行える。
【００７６】
あるいは前記ＮＡＤＰＨ再生に利用可能な酵素の遺伝子を、トロピノン還元酵素−ＩをコードするＤＮＡと同時に導入した宿主を利用することもできる。このような形質転換体の利用によって、ＮＡＤＰＨ再生酵素とトロピノン還元酵素−Ｉの発現、および基質の還元反応を、より効率的に行うこともできる。これらの２つ、もしくは、それ以上の遺伝子の宿主への導入には、不和合性をさけるために複製起源の異なる複数のベクターに別々に遺伝子を導入した組み換えベクターにより宿主を形質転換する方法や、単一のベクターに両遺伝子を導入する方法、片方、もしくは、両方の遺伝子を染色体中に導入する方法などを利用することができる。
【００７７】
本発明におけるＮＡＤＰＨ再生に利用可能なグルコース脱水素酵素として、バシラス・サブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に由来するグルコース脱水素酵素や、サーモプラズマ・アシドフィラム（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ　ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）　に由来するグルコース脱水素酵素を示すことができる。これら酵素をコードする遺伝子は既に単離されている（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　Ｕ．Ｓ．Ａ．，８０，７８５−７８９（１９８３）；　Ｅｕｒ．　Ｊ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２１１，５４９−５５４（１９９３））　。あるいは既に明らかにされているその塩基配列に基づいて、ＰＣＲやハイブリダイズスクリーニングによって、当該微生物から取得することもできる。
【００７８】
単一のベクター中に複数の遺伝子を導入する場合には、プロモーター、ターミネーターなど発現制御に関わる領域をそれぞれの遺伝子に連結する方法やラクトースオペロンのような複数のシストロンを含むオペロンとして発現させることも可能である。
【００７９】
単一のベクターにトロピノン還元酵素−Ｉとグルコース脱水素酵素を導入したプラスミドは、例えばｐＳＥ４２０Ｄ（特開２０００−１８９１７０号公報）に各遺伝子をタンデムに連結して取得することができる。Ｄａｔｕｒａ　ｓｔｒａｍｏｎｉｕｍ　由来のトロピノン還元酵素−ＩとＢａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のグルコース脱水素酵素を導入されたプラスミドｐＳＧ−ＤＳＲ１（ＦＥＲＭ　Ｐ−１８３９５）、Ｈｙｏｓｃｙａｍｕｓ　ｎｉｇｅｒ　由来のトロピノン還元酵素−ＩとＢａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のグルコース脱水素酵素を導入されたプラスミドｐＳＧ−ＨＮＲ１（ＦＥＲＭ　Ｐ−１８３９６）は、それぞれ以下のとおり特許生物寄託センターに寄託されている。
【００８０】
プラスミドｐＳＧ−ＤＳＲ１、またはｐＳＧ−ＨＮＲ１の寄託：
（ａ）寄託機関の名称・あて名
名称：独立行政法人　産業技術総合研究所　特許生物寄託センター
（旧名称：通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所）
あて名：日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号中央第６（郵便番号３０５−８５６６）
（ｂ）寄託日　　平成１３年６月２２日
（ｃ）受託番号　ＦＥＲＭ　Ｐ−１８３９５　（ｐＳＧ−ＤＳＲ１）
受託番号　ＦＥＲＭ　Ｐ−１８３９６　（ｐＳＧ−ＨＮＲ１）
【００８１】
本発明による（Ｒ）−マンデル酸アミド誘導体の製造方法を構成する酵素反応は、前記トロピノン還元酵素−Ｉ活性を有する酵素活性物質と、基質であるベンゾイルホルムアミド誘導体（Ｂ）とを反応溶液中で接触させることにより、実施することができる。具体的には、水性媒体中、水性媒体と水可溶性の有機溶媒との混合系、あるいは水不溶性の溶媒との２相系中において行うことができる。水性媒体としては、リン酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液などの中性付近に緩衝能を有する緩衝液が挙げられる。あるいは酸とアルカリを用いて反応中のｐＨ変化を好ましい範囲にとどめることが可能であれば、緩衝液を特に使う必要はない。水に溶解しにくい有機溶媒としては、例えば、酢酸エチル、酢酸ブチル、トルエン、クロロホルム、ｎ−ヘキサン、イソオクタン、メチル　イソブチル　ケトン、メチルｔ−ブチル　エーテルなどを用いることができる。あるいは、エタノール、アセトン、ジメチルスルホキシド、アセトニトリル等の有機溶媒と水性媒体との混合系中で行うこともできる。
【００８２】
２相系では、酵素活性物質は、そのまま、あるいは水や緩衝液の溶液として供給される。基質化合物を水、緩衝液またはエタノール等の水溶性溶媒に溶解させて反応系に供給することもできる。この場合は、酵素活性物質とともに単一相の反応系を構成することになる。その他、本発明の反応は、固定化酵素、膜リアクターなどを利用して行うことも可能である。なお、酵素活性物質と反応溶液の接触形態はこれらの具体例に限定されない。反応溶液とは、基質を酵素活性の発現に望ましい環境を与える適当な溶媒に溶解したものである。
このようなトロピノン還元酵素−Ｉ活性を有する酵素活性物質による酵素反応は、以下の条件で行うことができる。
・基質濃度（反応溶液に対する重量割合）：好ましくは０．０１〜５０重量％、さらに好ましくは、０．１〜３０重量％
・反応温度：好ましくは４〜６０℃、さらに好ましくは２５〜４０℃
・ｐＨ：好ましくは４〜９、さらに好ましくは６．５〜８．５
【００８３】
反応系には必要に応じて補酵素ＮＡＤＰ＋またはＮＡＤＰＨを０．００１ｍＭ〜１００ｍＭ、好ましくは、０．０１〜１０ｍＭ添加することができる。また、基質は反応開始時に一括して添加するか、または連続的もしくは非連続的に添加することができる。
【００８４】
ＮＡＤＰＨの再生反応用の化合物は、基質であるベンゾイルホルムアミド誘導体（Ｂ）に対して、モル比でたとえば、好ましくは０．１〜２０倍、さらに好ましくは０．５〜５倍の量を添加することができる。またＮＡＤＰＨ再生反応用の酵素は、トロピノン還元酵素−Ｉに比較して酵素活性で好ましくは０．１〜１００倍、さらに好ましくは０．５〜２０倍程度添加することができる。以下にＮＡＤＰＨの再生反応用の化合物と、当該化合物を利用してＮＡＤＰＨを再生する酵素の組み合せの一例を示す。
【００８５】
グルコース（グルコース脱水素酵素）
ギ酸（ギ酸脱水素酵素）
エタノールまたは２−プロパノール（アルコール脱水素酵素）
Ｌ−グルタミン酸（グルタミン酸脱水素酵素）
Ｌ−リンゴ酸（リンゴ酸脱水素酵素、または有機酸脱水素酵素）
【００８６】
ベンゾイルホルムアミド誘導体（Ｂ）の還元により生成する、（Ｒ）−マンデル酸アミド誘導体の精製は、菌体、タンパク質の遠心分離、膜処理等による分離、溶媒抽出、蒸留、結晶化等を適当に組み合わせることにより行うことができる。例えば、（Ｒ）−２−クロロマンデル酸アミドを含む反応液を遠心分離することにより菌体を除去し、限外濾過などにより除蛋白したのちに、酢酸エチルなどを用いて（Ｒ）−２−クロロマンデル酸アミドを抽出し、溶媒を減圧下に留去することにより精製することができる。
【実施例】
以下、実施例により本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
［実施例１］
（２−クロロベンゾイルホルムアミドの合成）
【００８７】
シアン化第一銅１１６．６ｇ　（１．３　ｍｏｌ）、アセトニトリル　８０ｍＬ、トルエン１５０ｍＬを、１Ｌ四つ口フラスコに加え、懸濁した。２−クロロベンゾイルクロライド１７５．０ｇ（１．０　ｍｏｌ）　を、攪拌下に１０分かけて滴下し、滴下終了後、攪拌しながら８８〜９０℃で３時間加熱還流した。
【００８８】
反応液を室温まで冷却後、濾過により不溶物を除き、濾液を減圧濃縮した。濃縮液を減圧蒸留　（３０　ｍｍＨｇ，　１３８−１４０℃）　して、薄黄色結晶として２−クロロベンゾイルシアナイドを９８．５ｇ得た。
【００８９】
５００ｍＬの４つ口フラスコに２−クロロベンゾイルシアナイド２５．０ｇ（０．１５　ｍｏｌ）、濃塩酸１６５ｍＬを添加し懸濁した。この懸濁液を室温で２４時間攪拌した。反応終了後、５Ｌの水中に投入し攪拌し、生成した白色結晶を濾過し、洗浄後、乾燥して、２−クロロベンゾイルホルムアミド　１５．３ｇを得た。得られた２−クロロベンゾイルホルムアミドの１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲ、ＩＲおよび元素分析の測定結果を以下に示す。
【００９０】
１Ｈ−ＮＭＲ　（５００　ＭＨｚ，　ＣＤＣｌ３）　δ　６．１６　（ｂｒｓ，　１Ｈ）　，　６．８１　（ｂｒｓ，　１Ｈ）　，　７．３６−７．６８　（ｍ，　４Ｈ）
【００９１】
１３Ｃ−ＮＭＲ　（１２５　ＭＨｚ，　ＣＤＣｌ３）　δ　１２６．６，　１３０．４，　１３１．１，　１３３．１，　１３３．２，　１３３．７，　１６２．７，　１８９．６
【００９２】
ＩＲ　（ＫＢｒ）　１７００，　１６６０，　１６１０，　１５９０　ｃｍ−１
【００９３】
元素分析：　Ｃ　５２．２８％　（５２．３４％）　，　Ｈ３．３１％　（３．２９％）　，　Ｎ　７．４６％　（７．６３％）　（理論値）
［実施例２］
（パン酵母による２−クロロベンゾイルホルムアミドの還元）
【００９４】
生パン酵母　（オリエンタル酵母製）１０ｇ、水道水６０ｍＬ、スクロース１０ｇを２００ｍＬのメジュームビンに入れ、混合後、細かい泡が発生するまで室温で放置した。
【００９５】
上記混合液に２−クロロベンゾイルホルムアミド０．８１４ｇを添加し、懸濁させた後、２５℃で終夜放置した。翌日、さらにスクロースを５ｇ添加し、混合後、さらに１日反応させ、２−クロロマンデル酸アミドを得た。
［実施例３］
（２−クロロマンデル酸アミドの定量）
【００９６】
既存の２−クロロマンデル酸アミド、原料の２−クロロベンゾイルホルムアミドの定量は、ＨＰＬＣにより行った。イナートシル　ＯＤＳ−２カラム　（ＧＬサイエンス製，　０．４６　ｘ　１５　ｃｍ）　を用いて、１５％　アセトニトリルを溶離液とし、流速１ｍＬ／ｍｉｎ．、カラム温度は室温、検出は２５４ｎｍにおける吸光度、の条件で分析した結果、２−クロロマンデル酸アミドは５．３分に、２−クロロベンゾイルホルムアミドは１４．３分に溶出した。
【００９７】
実施例２における反応終了液の分析は、反応液を遠心分離して上清を回収し、その上清を０．２２μｍ膜により濾過した濾液を分析した。その結果、６５％の反応収率で２−クロロマンデル酸アミドが生成していることを確認できた。
［実施例４］
（２−クロロマンデル酸アミドの抽出）
【００９８】
実施例２により得られた反応終了液を全量遠心分離し、洗浄液を含め、９５ｇの上清を得た。この上清に１００ｍＬの酢酸エチルを添加し、２−クロロマンデル酸アミドを抽出した。上相の酢酸エチル相と下相の水相を分液し、水相に更に酢酸エチル１００ｍＬを添加して再度、２−クロロマンデル酸アミドを抽出し、酢酸エチル相と水相を分液した。酢酸エチル相を混合し、飽和の塩化ナトリウム水で洗浄後、硫酸ナトリウムによる脱水の後、溶媒を減圧留去し、粗２−クロロマンデル酸アミド１．０４ｇを得た。
［実施例５］
（２−クロロマンデル酸アミドの光学純度の測定）
【００９９】
光学純度の測定は、ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ　ＡＳ−Ｈ　（ダイセル化学製）　を用いたＨＰＬＣにより行った。ｎ−ヘキサン：エタノール＝８５：１５を溶離液とし、流速１．０ｍＬ／ｍｉｎ．、カラム温度２５℃、ピーク検出は２５４ｎｍにおけるＵＶ吸収の測定により行った。
【０１００】
上記条件に於いて、２−クロロマンデル酸アミドは、７．５分　（前成分）　と１０．１分　（後成分）　に溶出した。実施例４により得られた２−クロロマンデル酸アミドの光学純度は９５．３％ｅｅ　（前成分）　であった。また、得られた２−クロロマンデル酸アミドは、下記参考例１〜３の方法により、（Ｒ）体であることを確認した。
［参考例１］
（ラセミ体２−クロロマンデル酸アミドの合成）
【０１０１】
２−クロロベンズアルデヒド２８ｇ（０．２　ｍｏｌ）、シアン化ナトリウム１０ｇ（０．２　ｍｏｌ）　及び水４０ｍＬを加え、室温にて攪拌しながら亜硫酸水素ナトリウムの飽和水溶液６０ｍＬを徐々に加え、室温で２時間反応させた。反応混合物を酢酸エチルで抽出し、酢酸エチル相を５％炭酸水素ナトリウム、水、飽和食塩水で洗浄後、硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を減圧濃縮して、２−クロロマンデロニトリル３０ｇを得た。
【０１０２】
２−クロロマンデロニトリル１６．７ｇ（０．１　ｍｏｌ）　を濃塩酸５０ｍＬに添加し、室温で攪拌して溶解した。室温で７日間攪拌した後に、水２００ｍＬを加え、酢酸エチル２００ｍＬで抽出した。酢酸エチル相を飽和食塩水で洗浄した後、硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮した。濃縮して得られたカルボン酸をアセトン４０ｍＬに溶解し、１０ｇの濃硫酸を−１０℃以下にコントロールしながら徐々に滴下して、５分間反応させた。反応後、炭酸ナトリウム１０％水溶液２００ｍＬ中に注ぎ、析出した結晶を濾別した。濾過した結晶を冷水にてよく洗浄後、乾燥し、２００ｍＬの液体アンモニアに添加し、一晩反応後、室温にてアンモニアを除き、析出した結晶をシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し、ラセミ体２−クロロマンデル酸アミド５．５ｇを得た。
［参考例２］
（（Ｒ）−２−クロロマンデル酸の合成）
【０１０３】
ロイコノストック・メセンテロイデス・サブスピーシーズ・デキストラニカム（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ　ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｓｕｂｓｐ．　ｄｅｘｔｒａｎｉｃｕｍ）を１ＬのＭＲＳ培地（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ　ＭＲＳ　ｂｒｏｔｈ、ＤｉｆｃｏＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）を用いて培養し、菌体を調製した。１％の２−クロロフェニルグリオキシル酸および１％グルコースを含む１００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ　７．０）１Ｌを加え、３０℃、４８時間振とう反応した。
【０１０４】
反応液を遠心分離することによって除菌し、得られた上清に酸を添加し、ｐＨを２以下にしたのち、酢酸エチルにより反応液中の（Ｒ）−２−クロロマンデル酸を抽出した。
【０１０５】
酢酸エチルをエバポレーターにより濃縮し、低温に放置することによりは、（Ｒ）−２−クロロマンデル酸を結晶として分離した。
【０１０６】
得られれた（Ｒ）−２−クロロマンデル酸の光学純度を、ダイセル化学工業株式会社製キラルセル　ＯＪ−Ｈ（ＣＨＩＲＡＬＣＥＬ　ＯＪ−Ｈ　４．６ｍｍ　ｘ　１５０ｍｍ）を用い、ｎ−ヘキサン：イソプロパノール：トリフルオロ酢酸　＝８５：１５：０．１の溶離液、流速１．５ｍＬ／ｍｉｎ、２５４ｎｍにおけるＵＶ吸収を検出して測定した結果、９９％ｅｅ以上のＲ体であった。
［参考例３］
（（Ｒ）−２−クロロマンデル酸アミドの合成）
【０１０７】
（Ｒ）−２−クロロマンデル酸１５．０ｇ　（８０．４　ｍｍｏｌ）をメタノール１００ｍＬに溶解し、硫酸０．７８ｇを加え、７５℃のオイルバス中で２．５時間還流させた。反応液を冷却後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液１４．４ｍＬを入れたナスフラスコに、反応液を一気に移液した。反応液中のメタノールをエバポレーターで留去し、酢酸エチル１４０ｍＬで（Ｒ）−２−クロロマンデル酸メチルを抽出した。酢酸エチル相を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、エバポレーターで減圧濃縮し、粗（Ｒ）−２−クロロマンデル酸メチルを得た。
【０１０８】
得られた粗（Ｒ）−２−クロロマンデル酸メチル１５．０ｇに、２８％−アンモニア水１００ｍＬを添加し、室温下で撹拌しながら、均一溶液になるまでメタノールを添加した。４０℃で（Ｒ）−２−クロロマンデル酸メチルが消失するまで撹拌し、エバポレーターでメタノールを留去後、生成した（Ｒ）−２−クロロマンデル酸アミドを酢酸エチルで抽出した。抽出液を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、エバポレーターで減圧濃縮し、粗（Ｒ）−２−クロロマンデル酸アミドを得た。
【０１０９】
粗（Ｒ）−２−クロロマンデル酸アミド１０．８ｇをトルエンとメタノールを加えて、加熱して均一溶液にし、室温まで冷却後、終夜撹拌し、析出した結晶を濾別し、精製（Ｒ）−２−クロロマンデル酸アミド６．４６ｇを得た。得られた（Ｒ）−２−クロロマンデル酸アミドを実施例５の方法により分析した結果、９９％ｅｅ以上の前成分であったことから、実施例４で得られた２−クロロマンデル酸アミドが（Ｒ）体であることが確認できた。また、得られた（Ｒ）−２−クロロマンデル酸アミドの比旋光度は、［α］Ｄ２０　＝　−９１．４　（ｃ＝１．１２，　ＥｔＯＨ）　であった。
［実施例６］
（トロピノン還元酵素の大腸菌による生産）
【０１１０】
トロピノン還元酵素を発現するプラスミドｐＳＧ−ＤＳＲ１、あるいは、ｐＳＧ−ＨＮＲ１（特願２００２−１５２９５５）　で形質転換された大腸菌ＪＭ１０９株をアンピシリンを含む液体ＬＢ培地で終夜３０℃培養し、０．１ｍＭ　ＩＰＴＧを加え、さらに４時間培養を行った。
【０１１１】
菌体を遠心分離により集菌した後、０．０２％　２−メルカプトエタノール、２ｍＭ　ＰＭＳＦ、１０％グリセリンを含む５０ｍＭ　トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）に懸濁し、密閉式超音波破砕装置ＵＣＤ−２００ＴＭ（コスモバイオ製）を用いて３分間処理することで、菌体を破砕した。菌体破砕液を遠心分離し、その上清を菌体抽出液中として回収した。
［実施例７］
（２−クロロベンゾイルギ酸アミドの還元活性測定）
【０１１２】
実施例６で調製したトロピノン還元酵素（ＤｓＴＲ１およびＨｎＴＲ１）にトロピノンおよび２−クロロベンゾイルギ酸アミドを作用させ、その還元活性を測定した。還元活性の測定は、次のようにして確認した。
【０１１３】
還元活性測定法；５０ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ　６．５）、０．２ｍＭ　ＮＡＤＰＨ及び酵素を含む反応液中に、基質（１ｍＭ　２−クロロベンゾイルギ酸アミドあるいは４ｍＭ　トロピノン）を加えて３０℃で反応させ、ＮＡＤＰＨの減少にともなう３４０　ｎｍの吸光度の減少を測定する。１Ｕは、１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＰＨの減少を触媒する酵素量とした。その還元反応の活性をトロピノンの還元を１００とした相対活性で表し、表１に示した。
【表１】
2004075561.tif 000012
【０１１４】
［実施例８］
（トロピノン還元酵素による（Ｒ）−２−クロロマンデルアミドの生産）
２００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ　６．５）、１ｍＭ　ＮＡＤＰ＋、１Ｕトロピノン還元酵素（ＤｓＴＲ１あるいはＨｎＴＲ１）、１００ｍＭ　グルコース、２Ｕ　グルコース脱水素酵素（和光純薬製）、５０ｍＭ　２−クロロベンゾイルギ酸アミドを含む反応液中で、３０℃で終夜反応させた。生成した２−クロロマンデル酸アミドは、実施例３及び５にしたがって定量および光学純度の測定を行なった。その結果、ＤｓＴＲ１、ＨｎＴＲ１何れにおいても生成した２−クロロマンデル酸アミドは、９９％ｅｅ以上のＲ体であった。また、反応収率は１００％であった。
【０１１５】
［実施例９］
（ｐＳＧ−ＤＳＲ１で形質転換した大腸菌ＨＢ１０１による（Ｒ）−２−クロロマンデル酸アミドの製造）
ｐＳＧ−ＤＳＲ１で形質転換された大腸菌ＨＢ１０１株をアンピシリンを含む２０ｍＬの液体ＬＢ培地で終夜３０℃培養し、０．１ｍＭ　ＩＰＴＧを加え、さらに４時間培養を行った。菌体を遠心分離により集菌した後、１０９ｍＭ　２−クロロベンゾイルギ酸アミド、１６４ｍＭグルコースを含む５００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ　７．５）５ｍＬに懸濁し、終夜３０℃で振とう反応を行った。その結果、生成した（Ｒ）−２−クロロマンデル酸アミドの光学純度は９９％ｅｅ以上で、反応収率は１００％であった。
【０１１６】
【発明の効果】
本発明に係る（Ｒ）−マンデル酸アミド誘導体の製造方法によれば、工業的に利用可能な方法で、高い光学純度で（Ｒ）−マンデル酸アミド誘導体を得ることができる。特に、本発明に係る（Ｒ）−マンデル酸アミド誘導体の製造方法は、（Ｒ）−２−クロロマンデル酸アミドを生産する方法として有用である。また本発明は、（Ｒ）−２−クロロマンデル酸アミドの原料となる２−クロロベンゾイルホルムアミドを提供するものである。
【０１１７】
【配列表】
2004075561.tif 000013
2004075561.tif 000014
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