【手続補正書】
【提出日】平成24年6月19日(2012.6.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
特異的PPARγ受容体アゴニストによるhMADS細胞の刺激を含む、ヒト脂肪組織からの多能性成人幹細胞（hMADS細胞）集団を機能的ヒト褐色脂肪細胞集団に分化させるための方法であって、該刺激が、
−  10〜30日を含む持続期間、または
−  （i）2〜9日を含む持続期間のhMADS細胞から白色脂肪細胞への第一の分化期間、（ii）第一の期間の後に、2〜10日を含む持続期間の、その間に刺激を停止させる、第二の期間、（iii）第二の期間の後に、1〜10日を含む持続期間の第三の刺激期間
行われ、それによって、以下の遺伝子を同時に発現する機能的ヒト褐色脂肪細胞集団を得る、前記方法：
−  UCP1、CIDEA、CPT1B、およびBcl-2タンパク質をコードする遺伝子、
これらの遺伝子の発現はヒト白色脂肪細胞集団の発現より高い、
−  Baxタンパク質をコードする遺伝子、
この遺伝子の発現は、ヒト白色脂肪細胞集団の発現より低い、ならびに、
−  PPARα、PGC-1α、PGC-1β、およびPRDM16タンパク質をコードする遺伝子、
これらの遺伝子の発現は、ヒト白色脂肪細胞集団の発現と類似である。
【請求項２】
特異的PPARγ受容体アゴニストがチアゾリジンジオンであり、該チアゾリジンジオンが、有利にはロシグリタゾン、シグリタゾン、ピオグリタゾン、ダルグリタゾン、およびトログリタゾンを含む群から選択される、請求項1記載の分化させる方法。
【請求項３】
特異的PPARγ受容体アゴニストの濃度が、アゴニストがロシグリタゾンである場合、5 nM〜1,000 nMを含み、アゴニストがピオグリタゾンである場合、0.2μM〜10μMを含み、アゴニストがシグリタゾンである場合、0.5μM〜20μMを含み、アゴニストがダルグリタゾンである場合、0.2μM〜20μMを含み、およびアゴニストがトログリタゾンである場合、0.2μM〜10μMを含む、請求項2記載の分化させる方法。
【請求項４】
hMADS細胞集団を分化させた後に得られるヒト褐色脂肪細胞集団の機能性を証明する段階をさらに含み、証明する段階が以下の連続段階を含む、請求項1〜3のいずれか一項記載の分化させる方法：
−  特異的β-アドレナリン受容体アゴニストによって該ヒト褐色脂肪細胞集団の呼吸活性を刺激する段階、
−  UCP1をコードする遺伝子の発現および／または酸素消費を定量する段階、ならびに
−  特異的β-アドレナリン受容体アゴニストによる刺激の非存在下で得られたものと比較して、UCP1をコードする遺伝子の発現および／または酸素消費が増加すれば、集団が機能的であると証明される段階。
【請求項５】
特異的β-アドレナリン受容体アゴニストが、イソプレナリン、ノルアドレナリン、アドレナリン、ドブタミン、テルブタリン、および化合物CL316243から選択され、有利にはイソプロテレノールである、請求項4記載の分化させる方法。
【請求項６】
特異的β-アドレナリン受容体アゴニストの濃度が1 nM〜1,000 nMを含む、請求項4または5記載の分化させる方法。
【請求項７】
1〜10日を含む持続期間、特異的PPARγアゴニストによってヒト白色脂肪細胞集団を刺激する段階を含む、請求項1において定義された機能的ヒト褐色脂肪細胞集団にヒト白色細胞集団を変換させる方法。
【請求項８】
特異的PPARγ受容体アゴニストがチアゾリジンジオンであって、該チアゾリジンジオンが、有利にはロシグリタゾン、シグリタゾン、ピオグリタゾン、ダルグリタゾン、およびトログリタゾンを含む群から選択される、請求項7記載の変換させる方法。
【請求項９】
特異的PPARγ受容体アゴニストの濃度が、アゴニストがロシグリタゾンである場合、5 nM〜1,000 nMを含み、アゴニストがピオグリタゾンである場合、0.2μM〜10μMを含み、アゴニストがシグリタゾンである場合、0.5μM〜20μMを含み、アゴニストがダルグリタゾンである場合、0.2μM〜20μMを含み、およびアゴニストがトログリタゾンである場合、0.2μM〜10μMを含む、請求項8記載の変換させる方法。
【請求項１０】
ヒト白色脂肪細胞集団を変換させた後に得られるヒト褐色脂肪細胞集団の機能性を証明する段階をさらに含み、証明する段階が以下の連続段階を含む、請求項7〜9のいずれか一項記載の変換させる方法：
−  特異的β-アドレナリン受容体アゴニストによって該ヒト褐色脂肪細胞集団の呼吸活性を刺激する段階、
−  UCP1をコードする遺伝子の発現および／または酸素消費を定量する段階、ならびに
−  特異的β-アドレナリン受容体アゴニストによる刺激の非存在下で得られたものと比較して、UCP1をコードする遺伝子の発現および／または酸素消費が増加すれば、集団が機能的であると証明される段階。
【請求項１１】
特異的β-アドレナリン受容体アゴニストが、イソプロテレノール、ノルアドレナリン、アドレナリン、ドブタミン、テルブタリン、および化合物CL316243から選択され、有利にはイソプロテレノールである、請求項10記載の変換させる方法。
【請求項１２】
特異的β-アドレナリン受容体アゴニストの濃度が1 nM〜1,000 nMを含む、請求項10または11記載の変換させる方法。
【請求項１３】
請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法によって得ることができる、ヒト褐色脂肪細胞集団。
【請求項１４】
個体における体重を調整することができる分子または分子の組み合わせを同定するための、有利には、個体における過剰な体重および／または肥満を処置することができる分子または分子の組み合わせを同定するためのモデルとしての、請求項1において定義された機能的ヒト褐色脂肪細胞集団の使用。
【請求項１５】
以下の連続段階を含む、褐色脂肪細胞集団の呼吸活性および／もしくはアンカップリング活性に作用することができる、ならびに／または個体における体重を調整することができる分子または分子の組み合わせを同定するための方法：
−  請求項1において定義された機能的ヒト褐色脂肪細胞集団を分子または分子の組み合わせの存在下に置く段階、
−  該ヒト褐色脂肪細胞集団のUCP1をコードする遺伝子の発現、および／または酸素消費、および／またはアンカップリング活性を定量する段階、ならびに
−  UCP1をコードする遺伝子の発現および／または酸素消費および／またはアンカップリング活性が、上記分子の非存在下で得られるものとは有意に異なる場合に、上記分子または分子の組み合わせを、褐色脂肪細胞集団の呼吸活性および／もしくはアンカップリング活性に作用することができる、ならびに／または個体における体重を調整することができると同定する段階。
【請求項１６】
UCP1をコードする遺伝子の発現および／または酸素消費および／またはアンカップリング活性が、分子または分子の組み合わせの非存在下で得られるものより高い場合に、該分子または分子の組み合わせが、褐色脂肪細胞集団の呼吸活性を増加させることができ、ならびに／または個体における過剰な体重および／もしくは肥満を処置することができる、請求項15記載の同定する方法。
【請求項１７】
以下の連続段階を含む、ヒト褐色脂肪細胞の形成を促進することができる、ならびに／または個体における過剰な体重および／もしくは肥満を処置することができる、分子または分子の組み合わせを同定する方法：
−  hMADS細胞集団を分子または分子の組み合わせの存在下に置く段階、
−  hMADS細胞集団が、請求項1において定義された機能的ヒト褐色脂肪細胞集団の表現型を発現する場合、上記分子または分子の組み合わせを、ヒト褐色脂肪細胞の形成を促進することができる、ならびに／または個体における過剰な体重および／もしくは肥満を処置することができると同定する段階。
【請求項１８】
以下の連続段階を含む、ヒト褐色脂肪細胞の形成を促進することができる、ならびに／または個体における過剰な体重および／もしくは肥満を処置することができる、分子または分子の組み合わせを同定する方法：
−  ヒト白色脂肪細胞集団を分子または分子の組み合わせの存在下に置く段階、
−  ヒト白色脂肪細胞集団が、請求項1において定義されたヒト褐色脂肪細胞集団の表現型を発現する場合、上記分子または分子の組み合わせを、ヒト褐色脂肪細胞の形成を促進することができる、ならびに／または個体における過剰な体重および／もしくは肥満を処置することができると同定する段階。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５３】
以下の実施例および図面は、本発明を例証し、本発明の範囲をいかなるようにも制限しない。
[本発明1001]
以下の遺伝子を同時に発現する機能的なヒト褐色脂肪細胞集団：
−  UCP1、CIDEA、CPT1B、およびBcl-2タンパク質をコードする遺伝子、
これらの遺伝子の発現はヒト白色脂肪細胞集団の発現より高い、
−  Baxタンパク質をコードする遺伝子、
この遺伝子の発現は、ヒト白色脂肪細胞集団の発現より低い、ならびに、
−  PPARα、PGC-1α、PGC-1β、およびPRDM16タンパク質をコードする遺伝子、
これらの遺伝子の発現は、ヒト白色脂肪細胞集団の発現と類似である。
[本発明1002]
UCP1をコードする遺伝子の発現が、β-アドレナリン受容体アゴニストによる刺激後、有利にはβ3-アドレナリン受容体アゴニストによる刺激後に増加する、本発明1001のヒト褐色脂肪細胞集団。
[本発明1003]
特異的PPARγ受容体アゴニストによるhMADS細胞の刺激を含む、ヒト脂肪組織からの多能性成人幹細胞（hMADS細胞）集団を本発明1001または1002において定義される集団などの機能的ヒト褐色脂肪細胞集団に分化させるための方法であって、刺激が以下のあいだ行われる、方法：
−  10〜30日を含む持続期間、または
−  （i）2〜9日を含む持続期間の、hMADS細胞を白色脂肪細胞へと分化させる第一の期間、（ii）第一の期間の後、2〜10日を含む持続期間の第二の期間が続き、そのあいだに刺激を停止させ、（iii）第二の期間の後に続く、1〜10日を含む持続期間の第三の刺激期間。
[本発明1004]
特異的PPARγ受容体アゴニストがチアゾリジンジオンであり、該チアゾリジンジオンが、有利にはロシグリタゾン、シグリタゾン、ピオグリタゾン、ダルグリタゾン、およびトログリタゾンを含む群から選択される、本発明1003の分化させる方法。
[本発明1005]
特異的PPARγ受容体アゴニストの濃度が、アゴニストがロシグリタゾンである場合、5 nM〜1,000 nMを含み、アゴニストがピオグリタゾンである場合、0.2μM〜10μMを含み、アゴニストがシグリタゾンである場合、0.5μM〜20μMを含み、アゴニストがダルグリタゾンである場合、0.2μM〜20μMを含み、およびアゴニストがトログリタゾンである場合、0.2μM〜10μMを含む、本発明1004の分化させる方法。
[本発明1006]
hMADS細胞集団を分化させた後に得られるヒト褐色脂肪細胞集団の機能性を証明する段階をさらに含み、証明する段階が以下の連続段階を含む、本発明1003〜1005のいずれかの分化させる方法：
−  特異的β-アドレナリン受容体アゴニストによってヒト褐色脂肪細胞集団の呼吸活性を刺激する段階、
−  UCP1をコードする遺伝子の発現および／または酸素消費を定量する段階、ならびに
−  特異的β-アドレナリン受容体アゴニストによる刺激の非存在下で得られたものと比較して、UCP1をコードする遺伝子の発現および／または酸素消費が増加すれば、集団が機能的であると証明される段階。
[本発明1007]
特異的β-アドレナリン受容体アゴニストが、イソプレナリン、ノルアドレナリン、アドレナリン、ドブタミン、テルブタリン、および化合物CL316243から選択され、有利にはイソプロテレノールである、本発明1006の分化させる方法。
[本発明1008]
特異的β-アドレナリン受容体アゴニストの濃度が1 nM〜1,000 nMを含む、本発明1006または1007の分化させる方法。
[本発明1009]
1〜10日を含む持続期間、特異的PPARγアゴニストによってヒト白色脂肪細胞集団を刺激する段階を含む、本発明1001または1002において定義された集団などの機能的ヒト褐色細胞集団にヒト白色細胞集団を変換させる方法。
[本発明1010]
特異的PPARγ受容体アゴニストがチアゾリジンジオンであって、該チアゾリジンジオンが、有利にはロシグリタゾン、シグリタゾン、ピオグリタゾン、ダルグリタゾン、およびトログリタゾンを含む群から選択される、本発明1009の変換させる方法。
[本発明1011]
特異的PPARγ受容体アゴニストの濃度が、アゴニストがロシグリタゾンである場合、5 nM〜1,000 nMを含み、アゴニストがピオグリタゾンである場合、0.2μM〜10μMを含み、アゴニストがシグリタゾンである場合、0.5μM〜20μMを含み、アゴニストがダルグリタゾンである場合、0.2μM〜20μMを含み、およびアゴニストがトログリタゾンである場合、0.2μM〜10μMを含む、本発明1010の変換させる方法。
[本発明1012]
ヒト白色脂肪細胞集団を変換させた後に得られるヒト褐色脂肪細胞集団の機能性を証明する段階をさらに含み、証明する段階が以下の連続段階を含む、本発明1009〜1011のいずれかの変換させる方法：
−  特異的β-アドレナリン受容体アゴニストによってヒト褐色脂肪細胞集団の呼吸活性を刺激する段階、
−  UCP1をコードする遺伝子の発現および／または酸素消費を定量する段階、ならびに
−  特異的β-アドレナリン受容体アゴニストによる刺激の非存在下で得られたものと比較して、UCP1をコードする遺伝子の発現および／または酸素消費が増加すれば、集団が機能的であると証明される段階。
[本発明1013]
特異的β-アドレナリン受容体アゴニストが、イソプロテレノール、ノルアドレナリン、アドレナリン、ドブタミン、テルブタリン、および化合物CL316243から選択され、有利にはイソプロテレノールである、本発明1012の変換させる方法。
[本発明1014]
特異的β-アドレナリン受容体アゴニストの濃度が1 nM〜1,000 nMを含む、本発明1012または1013の変換させる方法。
[本発明1015]
個体における体重を調整することができる分子または分子の組み合わせを同定するための、有利には、個体における過剰な体重および／または肥満を処置することができる分子または分子の組み合わせを同定するためのモデルとしての、本発明1001または1002の機能的ヒト褐色脂肪細胞集団の使用。
[本発明1016]
以下の連続段階を含む、褐色脂肪細胞集団の呼吸活性および／もしくはアンカップリング活性に作用することができる、ならびに／または個体における体重を調整することができる分子または分子の組み合わせを同定するための方法：
−  本発明1001または1002の機能的ヒト褐色脂肪細胞集団を分子または分子の組み合わせの存在下に置く段階、
−  ヒト褐色脂肪細胞集団のUCP1をコードする遺伝子の発現、および／または酸素消費、および／またはアンカップリング活性を定量する段階、ならびに
−  UCP1をコードする遺伝子の発現および／または酸素消費および／またはアンカップリング活性が、上記分子の非存在下で得られるものとは有意に異なる場合に、上記分子または分子の組み合わせを、褐色脂肪細胞集団の呼吸活性および／もしくはアンカップリング活性に作用することができる、ならびに／または個体における体重を調整することができると同定する段階。
[本発明1017]
UCP1をコードする遺伝子の発現および／または酸素消費および／またはアンカップリング活性が、分子または分子の組み合わせの非存在下で得られるものより高い場合に、該分子または分子の組み合わせが、褐色脂肪細胞集団の呼吸活性を増加させることができ、ならびに／または個体における過剰な体重および／もしくは肥満を処置することができる、本発明1016の同定する方法。
[本発明1018]
以下の連続段階を含む、ヒト褐色脂肪細胞の形成を促進することができる、ならびに／または個体における過剰な体重および／もしくは肥満を処置することができる、分子または分子の組み合わせを同定する方法：
−  hMADS細胞集団を分子または分子の組み合わせの存在下に置く段階、
−  hMADS細胞集団が、本発明1001または1002の機能的ヒト褐色脂肪細胞集団の表現型を発現する場合、上記分子または分子の組み合わせを、ヒト褐色脂肪細胞の形成を促進することができる、ならびに／または個体における過剰な体重および／もしくは肥満を処置することができると同定する段階。
[本発明1019]
以下の連続段階を含む、ヒト褐色脂肪細胞の形成を促進することができる、ならびに／または個体における過剰な体重および／もしくは肥満を処置することができる、分子または分子の組み合わせを同定する方法：
−  ヒト白色脂肪細胞集団を分子または分子の組み合わせの存在下に置く段階、
−  ヒト白色脂肪細胞集団が、本発明1001または1002のヒト褐色脂肪細胞集団の表現型を発現する場合、上記分子または分子の組み合わせを、ヒト褐色脂肪細胞の形成を促進することができる、ならびに／または個体における過剰な体重および／もしくは肥満を処置することができると同定する段階。