【手続補正書】
【提出日】平成24年7月2日(2012.7.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物中で活性のある調節領域に作動可能に連結された、配列番号２８と少なくとも７０％の配列同一性を有する、インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸であって、植物中で発現させた場合にウイルス様粒子（ＶＬＰ）を産生する前記核酸。
【請求項２】
前記ＨＡが、天然のシグナルペプチドまたは非天然のシグナルペプチドを含む、請求項１に記載の核酸。
【請求項３】
植物においてインフルエンザウイルス様粒子（ＶＬＰ）を産生する方法であって、
ａ）請求項１に記載の核酸を前記植物または前記植物の一部に導入する工程と、
ｂ）核酸の発現を可能にする条件下で、前記植物または前記植物の一部をインキュベーションして、それによってＶＬＰを産生する工程と
を含む方法。
【請求項４】
前記導入工程（工程ａ）において、前記核酸が一過性様式で植物中に導入されるか、又は前記核酸が安定的であるように植物中に導入される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ｃ）宿主を採取しＶＬＰを精製する工程
をさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記導入工程（工程ａ）において、１つまたは複数のシャペロンタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第２の核酸が植物に導入される、請求項３〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
植物においてインフルエンザウイルス様粒子（ＶＬＰ）を産生する方法であって、
ａ）請求項１に記載の核酸を含む植物または植物の一部を提供する工程と、
ｂ）核酸の発現を可能にする条件下で、前記植物または前記植物の一部をインキュベーションして、それによってＶＬＰを産生する工程と
を含む方法。
【請求項８】
請求項１に記載の核酸を含む植物。
【請求項９】
該植物中で活性のある調節領域に作動可能に連結された１つまたは複数のシャペロンタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第２の核酸をさらに含む、請求項８に記載の植物。
【請求項１０】
植物において産生されるウイルス様粒子（ＶＬＰ）であって、請求項１に記載の核酸によってコードされるインフルエンザウイルス赤血球凝集素（ＨＡ）と、植物に由来する１つまたは複数の脂質とを含む、前記ウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
【請求項１１】
免疫応答を誘導するための効果的な用量の請求項１０に記載のＶＬＰと、薬学的に許容される担体とを含む組成物。
【請求項１２】
インフルエンザウイルス感染に対する免疫の被験体においての誘導における使用のための、請求項１０に記載のウイルス様粒子（ＶＬＰ）又は請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
植物特異的Ｎ−グリカンまたは修飾されたＮ−グリカンを持つ、請求項１０に記載のウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
【請求項１４】
免疫応答を誘導するための効果的な用量の請求項１３に記載のＶＬＰと、薬学的に許容される担体とを含む組成物。
【請求項１５】
インフルエンザウイルス感染に対する免疫の被験体においての誘導における使用のための、請求項１３に記載のウイルス様粒子又は請求項１４に記載の組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６５】
【図１Ａ】本発明の実施形態に従う株Ａ／ニューカレドニア／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）からのＨ１の発現のために使用される、アルファルファのプラストシアニンベースの発現カセットの配列を示した図である（配列番号：８）。タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）シグナルペプチドに下線が引かれる。クローニングのために使用したＢｇｌＩＩ（ＡＧＡＴＣＴ）制限部位およびＳａｃＩ（ＧＡＧＣＴＣ）制限部位は、太字で示される。
【図１Ｂ】インフルエンザ赤血球凝集素の機能ドメインの概略図を示した図である。ＨＡ０の切断後に、ＨＡ１およびＨＡ２の断片は、ジスルフィド架橋によってともに結合されたままである。
【図２Ａ】株Ａ／ニューカレドニア／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）からのＨＡ亜型Ｈ１の発現のために組み立てられたプラスミド５４０の説明を示した図である。
【図２Ｂ】株Ａ／インドネシア／５／２００５（Ｈ５Ｎ１）からのＨＡ亜型Ｈ５の発現のために組み立てられたプラスミド６６０の説明を示した図である。
【図３Ａ】赤血球凝集素Ｈ１またはＨ５を産生する葉からのタンパク質抽出物のサイズ排除クロマトグラフィーを示した図である。ブルーデキストラン２０００（三角形）およびタンパク質（菱形）の溶出プロフィールを示す。
【図３Ｂ】サイズ排除クロマトグラフィー（Ｓ５００ＨＲビーズ）に続く、Ｈ１（Ａ／ニューカレドニア／２０／９９（Ｈ１Ｎ１））溶出画分の免疫検出（ウエスタンブロット；抗Ｈ１）を示した図である。
【図３Ｃ】赤血球凝集素Ｈ１またはＨ５を産生する葉からのタンパク質抽出物のサイズ排除クロマトグラフィーを示した図である。Ｈ５の溶出プロフィールを示し、ブルーデキストラン２０００（三角形）およびタンパク質（菱形）である。
【図３Ｄ】サイズ排除クロマトグラフィー（Ｓ５００ＨＲビーズ）に続く、Ｈ５（Ａ／インドネシア／５／２００５（Ｈ５Ｎ１））溶出画分の免疫検出（ウエスタンブロット；抗Ｈ５）を示した図である。
【図４Ａ】ＦＨ１（Ａ／ニューカレドニア／２０／９９（Ｈ１Ｎ１））のＮ末端断片をコードする配列を示した図である（配列番号：１）。
【図４Ｂ】Ｈ１（Ａ／ニューカレドニア／２０／９９（Ｈ１Ｎ１））のＣ末端断片をコードする配列を示した図である（配列番号：２）。
【図５】Ｈ１（Ａ／ニューカレドニア／２０／９９（Ｈ１Ｎ１））のＨＡ０をコードする完全な配列を示した図である（配列番号：２８）。
【図６】最初のＡＴＧのすぐ上流のＨｉｎｄＩＩＩ部位およびストップ（ＴＡＡ）コドンのすぐ下流のＳａｃＩ部位が隣接するＨ５（Ａ／インドネシア／５／２００５（Ｈ５Ｎ１））をコードする配列を示した図である（配列番号：３）
【図７Ａ】プライマーＰｌａｓｔｏ−４４３ｃの配列を示した図である（配列番号：４）。
【図７Ｂ】プライマーＳｐＨＡ（Ｉｎｄ）−Ｐｌａｓｔｏ．ｒの配列を示した図である（配列番号：５）。
【図７Ｃ】プライマーＳｐＨＡ（Ｉｎｄ）−Ｐｌａｓｔｏ．ｒの配列を示した図である（配列番号：６）。
【図７Ｄ】プライマーＨＡ（Ｉｎｄ）−Ｓａｃ．ｒの配列を示した図である（配列番号：７）。
【図８Ａ】Ｈ１（Ａ／ニューカレドニア／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）；配列番号：９）のアミノ酸配列を示した図である。
【図８Ｂ】Ｈ５（Ａ／インドネシア／５／２００５（Ｈ５Ｎ１）；配列番号：１０）のアミノ酸配列を示した図である。天然のシグナルペプチドは太字で示される。
【図９】インフルエンザＡ亜型Ｈ７のＨＡのヌクレオチド配列を示した図である（配列番号：１１）。
【図１０Ａ】インフルエンザＡ型ＨＡ亜型Ｈ２のヌクレオチド配列を示した図である（配列番号：１２）。
【図１０Ｂ】インフルエンザＡ型ＨＡ亜型Ｈ３のヌクレオチド配列を示した図である（配列番号：１３）。
【図１０Ｃ】インフルエンザＡ型ＨＡ亜型Ｈ４のヌクレオチド配列を示した図である（配列番号：１４）。
【図１０Ｄ】インフルエンザＡ型ＨＡ亜型Ｈ５のヌクレオチド配列を示した図である（配列番号：１５）。
【図１０Ｅ】インフルエンザＡ型ＨＡ亜型Ｈ６のヌクレオチド配列を示した図である（配列番号：１６）。
【図１０Ｆ】インフルエンザＡ型ＨＡ亜型Ｈ８のヌクレオチド配列を示した図である（配列番号：１７）。
【図１０Ｇ】インフルエンザＡ型ＨＡ亜型Ｈ９のヌクレオチド配列を示した図である（配列番号：１８）。
【図１０Ｈ】インフルエンザＡ型ＨＡ亜型Ｈ１０のヌクレオチド配列を示した図である（配列番号：１９）。
【図１０Ｉ】インフルエンザＡ型ＨＡ亜型Ｈ１１のヌクレオチド配列を示した図である（配列番号：２０）。
【図１０Ｊ】インフルエンザＡ型ＨＡ亜型Ｈ１２のヌクレオチド配列を示した図である（配列番号：２１）。
【図１０Ｋ】インフルエンザＡ型ＨＡ亜型Ｈ１３のヌクレオチド配列を示した図である（配列番号：２２）。
【図１０Ｌ】インフルエンザＡ型ＨＡ亜型Ｈ１４のヌクレオチド配列を示した図である（配列番号：２３）。
【図１０Ｍ】インフルエンザＡ型ＨＡ亜型Ｈ１５のヌクレオチド配列を示した図である（配列番号：２４）。
【図１０Ｎ】インフルエンザＡ型ＨＡ亜型Ｈ１６のヌクレオチド配列を示した図である（配列番号：２５）。
【図１０Ｏ】インフルエンザＢ型ＨＡのヌクレオチド配列を示した図である（配列番号：２６）。
【図１０Ｐ】インフルエンザＣ型ＨＡのヌクレオチド配列を示した図である（配列番号：２７）。
【図１０Ｑ】プライマーＸｍａＩ−ｐＰｌａｓ．ｃのヌクレオチド配列を示した図である（配列番号：２９）。
【図１０Ｒ】プライマーＳａｃＩ−ＡＴＧ−ｐＰｌａｓ．ｒのヌクレオチド配列を示した図である（配列番号：３０）。
【図１０Ｓ】プライマーＳａｃＩ−ＰｌａｓＴｅｒ．ｃのヌクレオチド配列を示した図である（配列番号：３１）。
【図１０Ｔ】プライマーＥｃｏＲＩ−ＰｌａｓＴｅｒ．ｒのヌクレオチド配列を示した図である（配列番号：３２）。
【図１１】本明細書において使用されるいくつかのコンストラクトの図式的説明を示した図である。コンストラクト６６０は、プラストシアニンプロモーター（ｐｌａｓｔｏ）およびプラストシアニンターミネーター（Ｐｔｅｒ）に作動可能に連結された、ＨＡ亜型Ｈ５（Ａ／インドネシア／５／２００５（Ｈ５Ｎ１））をコードするヌクレオチド配列を含み；コンストラクト５４０は、アルファルファタンパク質ジスルフィドイソメラーゼシグナルペプチド（ＳＰ  ＰＤＩ）と組み合わせたＨＡ亜型Ｈ１（Ａ／ニューカレドニア／２０／９９（Ｈ１Ｎ１））をコードするヌクレオチド配列を含み、プラストシアニンプロモーター（Ｐｌａｓｔｏ）およびプラストシアニンターミネーター（Ｐｔｅｒ）に作動可能に連結され；コンストラクト５４４は、ＨＡ亜型Ｈ１（Ａ／ニューカレドニア／２０／９９（Ｈ１Ｎ１））の発現のために組み立てられ、Ｈ１をコードするヌクレオチド配列は、アルファルファタンパク質ジスルフィドイソメラーゼシグナルペプチド（ＳＰ  ＰＤＩ）およびＧＣＮ４ｐＩＩロイシンジッパー（Ｈ１の膜貫通ドメインおよび細胞質尾部の代わりに）と組み合わせて、プラストシアニンプロモーター（Ｐｌａｓｔｏ）およびプラストシアニンターミネーター（Ｐｔｅｒ）に作動可能に連結され；ならびに、インフルエンザＡ型／ＰＲ／８／３４からのＭ１コード領域の発現のためのコンストラクト７５０は、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）５’ＵＴＲに組み合わせ、２つの３５ＳプロモーターおよびＮｏｓターミネーターと作動可能に連結された。
【図１２】コンストラクト６６０により形質転換されたＮ．ベンサミアナナ（Ｎ．  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）の葉からのタンパク質抽出物における、抗Ｈ５（ベトナム）抗体を使用したＨ５（Ａ／インドネシア／５／２００５（Ｈ５Ｎ１））の免疫検出を示した図である（レーン３）。市販のインフルエンザＡ型／ベトナム／１２０３／２００４からのＨ５を検出の陽性対照として使用し（レーン１）、空ベクターにより形質転換した葉からのタンパク質抽出物は陰性対照として使用した（レーン２）。
【図１３】サイズ排除クロマトグラフィーによる赤血球凝集素構造の特性評価を示した図である。Ｈ５（Ａ／インドネシア／５／２００５（Ｈ５Ｎ１））、Ｈ１（Ａ／ニューカレドニア／２０／９９（Ｈ１Ｎ１））、可溶性Ｈ１、またはＨ１とＭ１を産生する個別のバイオマスからのタンパク質抽出物を、Ｓ−５００  ＨＲ上にゲル濾過によって分離した。ロゼット形態の市販のＨ１（Ａ／ニューカレドニア／２０／９９（Ｈ１Ｎ１））も分画した（Ｈ１ロゼット）。図１３Ａは、相対的タンパク質含有量を分析した溶出画分を示す（相対的タンパク質レベル−バイオマス分画のスタンダードタンパク質溶出プロフィールが示される）。ブルーデキストラン２０００（２ＭＤａ参照スタンダード）の溶出ピークを示す。図１３Ｂは、抗Ｈ５（ベトナム）の抗体（Ｈ５に対する）によるイムノブロットによって赤血球凝集素の存在を分析した溶出画分を示す。図１３Ｃは、Ｈ１に対する抗インフルエンザＡ型の抗体で分析した溶出画分を示す。図１３Ｄは、可溶性Ｈ１に対する抗インフルエンザＡ型の抗体で分析した溶出画分を示す。図１３Ｅは、Ｈ１ロゼットに対する抗インフルエンザＡ型の抗体で分析した溶出画分を示す。図１３Ｆは、Ｈ１＋Ｍ１に対する抗インフルエンザＡ型の抗体で分析した溶出画分を示す。
【図１４Ａ】ショ糖勾配遠心によるインフルエンザＨ５（Ａ／インドネシア／５／２００５（Ｈ５Ｎ１））構造の濃縮を示した図である。ショ糖密度勾配遠心からの画分の特性評価を示す。各々の画分は、抗Ｈ５（ベトナム）の抗体を使用するイムノブロットによるＨ５の存在（上部パネル）、ならびにそれらの相対的タンパク質含有量および赤血球凝集能（グラフ）について分析した。
【図１４Ｂ】ショ糖勾配遠心による赤血球凝集素濃縮画分の電子顕微鏡検査を示した図である。ショ糖勾配遠心からプールした画分１７、１８および１９のネガティブ染色透過型電子顕微鏡検査を示す。バーは１００ｎｍに相当する。
【図１５Ａ】インフルエンザＨ５  ＶＬＰの精製を示した図である。清澄化工程におけるタンパク質含有物のクマシーブルー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を示す。−レーン１、粗抽出物；レーン２、ｐＨ６に調整した抽出物；レーン３、熱処理した抽出物；レーン４、ＤＥで濾過した抽出物；フェチュイン親和性精製工程：レーン５、ロードしたもの；レーン６、フロースルー；レーン７、溶出したもの（１０倍濃縮）。
【図１５Ｂ】インフルエンザＨ５  ＶＬＰの精製を示した図である。精製されたＨ５  ＶＬＰサンプルのネガティブ染色透過型電子顕微鏡検査を示す。バーは１００ｎｍに相当する。
【図１５Ｃ】インフルエンザＨ５  ＶＬＰの精製を示した図である。構造の詳細を示すために拡大した単離Ｈ５  ＶＬＰを示す。
【図１５Ｄ】インフルエンザＨ５  ＶＬＰの精製を示した図である。クマシー染色した還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（レーンＡ）および株Ａ／ベトナム／１２０３／２００４（Ｈ５Ｎ１）からのＨＡに対して作製されたウサギポリクローナル抗体を使用するウエスタンブロット（レーンＢ）上のＨ５  ＶＬＰ産物を示す。
【図１６】インフルエンザＡ型ウイルス（Ａ／ニューカレドニア／２０／９９（Ｈ１Ｎ１））赤血球凝集素（ＨＡ）遺伝子、完全ｃｄｓのヌクレオチド配列を示した図である。ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ２８９９２９（配列番号：３３）
【図１７】タンパク質ジスルフィドイソメラーゼのアルファルファ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａ）ｍＲＮＡのヌクレオチド配列を示した図である。ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｚ１１４９９（配列番号：３４）。
【図１８】インフルエンザＡ型ウイルス（Ａ／プエルトリコ／８／３４（Ｈ１Ｎ１））セグメント７、完全配列のヌクレオチド配列を示した図である。ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００２０１６．１（配列番号：３５）。
【図１９】Ｈ５産生組織のポジティブ染色透過型電子顕微鏡観察によるＶＬＰ蓄積の局在を示した図である。ＣＷ：細胞壁、ｃｈ：葉緑体、ｐｍ：原形質膜、ＶＬＰ：ウイルス様粒子。バーは１００ｎｍに相当する。
【図２０Ａ】植物で作製されたインフルエンザＨ５  ＶＬＰ（Ａ／インドネシア／５／２００５（Ｈ５Ｎ１））または組換え可溶性Ｈ５（Ａ／インドネシア／５／２００５（Ｈ５Ｎ１））でワクチン接種したＢａｌｂ／ｃマウスにおける追加接種１４日後の血清抗体応答の誘導を示した図である。筋肉内注射を介して免疫されたマウスの抗体応答を示す。抗体応答は不活性化Ｈ５Ｎ１全ウイルス（Ａ／インドネシア／５／０５）に対して測定した。ＧＭＴ：幾何平均力価。値は、１群あたり５匹のマウスの終了点力価の逆数（reciprocal end-point titer）のＧＭＴ（ｌｎ）である。バーは平均偏差を表わす。＊は組換え可溶性Ｈ５と比較して、ｐ＜０．０５。
【図２０Ｂ】植物で作製されたインフルエンザＨ５  ＶＬＰ（Ａ／インドネシア／５／２００５（Ｈ５Ｎ１））または組換え可溶性Ｈ５（Ａ／インドネシア／５／２００５（Ｈ５Ｎ１））でワクチン接種したＢａｌｂ／ｃマウスにおける追加接種１４日後の血清抗体応答の誘導を示した図である。鼻腔内投与を介して免疫されたマウスの抗体応答を示す。抗体応答は不活性化Ｈ５Ｎ１全ウイルス（Ａ／インドネシア／５／０５）に対して測定した。ＧＭＴ：幾何平均力価。値は、１群あたり５匹のマウスの終了点力価の逆数のＧＭＴ（ｌｎ）である。バーは平均偏差を表わす。＊は組換え可溶性Ｈ５と比較して、ｐ＜０．０５。
【図２１Ａ】植物で作製されたインフルエンザＨ５  ＶＬＰ（Ａ／インドネシア／５／２００５（Ｈ５Ｎ１））または組換え可溶性Ｈ５（Ａ／インドネシア／５／２００５（Ｈ５Ｎ１））でワクチン接種したＢａｌｂ／ｃマウスにおける追加接種１４日後の赤血球凝集阻害抗体応答（ＨＡＩ）を示した図である。筋肉内注射を介して免疫されたマウスの抗体応答を示す。ＨＡＩ抗体応答は不活性化Ｈ５Ｎ１全ウイルス（Ａ／インドネシア／５／０５）を使用して測定した。ＧＭＴ：幾何平均力価。値は、１群あたり５匹のマウスの終了点力価の逆数のＧＭＴ（ｌｎ）である。バーは平均偏差を表わす。＊および＊＊は、組換え可溶性Ｈ５と比較して、ｐ＜０．０５および  ｐ＜０．０１。
【図２１Ｂ】植物で作製されたインフルエンザＨ５  ＶＬＰ（Ａ／インドネシア／５／２００５（Ｈ５Ｎ１））または組換え可溶性Ｈ５（Ａ／インドネシア／５／２００５（Ｈ５Ｎ１））でワクチン接種したＢａｌｂ／ｃマウスにおける追加接種１４日後の赤血球凝集抑制抗体応答（ＨＡＩ）を示した図である。鼻腔内投与を介して免疫されたマウスの抗体応答を示す。ＨＡＩ抗体応答は不活性化Ｈ５Ｎ１全ウイルス（Ａ／インドネシア／５／０５）を使用して測定した。ＧＭＴ：幾何平均力価。値は、１群あたり５匹のマウスの終了点力価の逆数のＧＭＴ（ｌｎ）である。バーは平均偏差を表わす。＊および＊＊は、組換え可溶性Ｈ５と比較して、ｐ＜０．０５および  ｐ＜０．０１。
【図２２Ａ】Ｂａｌｂ／ｃマウスにおけるＶＬＰの免疫原性に対するアジュバントの効果を示した図である。筋肉内注射を介して免疫されたマウスに対するミョウバンの効果を示す。ＨＡＩ抗体応答は不活性化Ｈ５Ｎ１全ウイルス（Ａ／インドネシア／５／０５）を使用して測定した。ＧＭＴ：幾何平均力価。値は、１群あたり５匹のマウスの終了点力価の逆数のＧＭＴ（ｌｎ）である。バーは平均偏差を表わす。＊は対応する組換え可溶性Ｈ５と比較して、ｐ＜０．０５。
【図２２Ｂ】Ｂａｌｂ／ｃマウスにおけるＶＬＰの免疫原性に対するアジュバントの効果を示した図である。鼻腔内投与を介して免疫されたマウスに対するキトサンの効果を示す。ＨＡＩ抗体応答は不活性化Ｈ５Ｎ１全ウイルス（Ａ／インドネシア／５／０５）を使用して測定した。ＧＭＴ：幾何平均力価。値は、１群あたり５匹のマウスの終了点力価の逆数のＧＭＴ（ｌｎ）である。バーは平均偏差を表わす。＊は対応する組換え可溶性Ｈ５と比較して、ｐ＜０．０５。
【図２３Ａ】Ｈ５  ＶＬＰ（Ａ／インドネシア／５／２００５（Ｈ５Ｎ１））投与に対する抗体応答を示した図である。筋肉内投与を介して免疫されたマウスにおける追加接種３０日後の抗インドネシア／５／０５免疫グロブリンアイソタイプを示す。値は、１群あたり５匹のマウスの終了点力価の逆数のＧＭＴ（ｌｏｇ2）である。ＥＬＩＳＡは、コーティング剤として不活性化Ｈ５Ｎ１（Ａ／インドネシア／５／２００５）全ウイルスを使用して行われた。バーは平均偏差を表わす。＊および＊＊は、対応する組換え可溶性Ｈ５（Ａ／インドネシア／５／２００５（Ｈ５Ｎ１））と比較して、ｐ＜０．０５およびｐ＜０．００１。
【図２３Ｂ】Ｈ５  ＶＬＰ（Ａ／インドネシア／５／２００５（Ｈ５Ｎ１））投与に対する抗体応答を示した図である。非活性化全ウイルス（Ａ／インドネシア／５／２００５（Ｈ５Ｎ１）およびＡ／ベトナム／１１９４／０４（Ｈ５Ｎ１））に対する抗体力価。すべての群は陰性対照に対して統計的な有意差がある。
【図２４】第１の投薬１４日後（２週目）、追加接種１４日後（５週目）または追加接種３０日後（７週目）の、Ｈ５  ＶＬＰ（Ａ／インドネシア／５／２００５（Ｈ５Ｎ１））で免疫されたＢａｌｂ／ｃマウスからの、同種の非活性化全ウイルス（Ａ／インドネシア／５／０５）に対する抗体力価を示した図である。ＧＭＴ：幾何平均力価。値は、１群あたり５匹のマウスの終了点力価の逆数のＧＭＴ（ｌｎ）である。＊は組換え可溶性Ｈ５と比較して、ｐ＜０．０５。
【図２５Ａ】追加接種３０日後の、Ｈ５  ＶＬＰ（Ａ／インドネシア／５／２００５（Ｈ５Ｎ１））で免疫されたＢａｌｂ／ｃマウスからの血清抗体のインビトロ交差反応性を示した図である。非活性化全ウイルスに対する抗体力価を示す。値は、１群あたり５匹のマウスの終了点力価の逆数のＧＭＴ（ｌｎ）である。バーは平均偏差を表わす。すべての群は陰性対照に対して統計的な有意差がある。＊は対応する組換え可溶性Ｈ５と比較して、ｐ＜０．０５。１０よりも少ない値はすべて、５（ｌｎでは１．６）の任意の値を与えられ、陰性であると判断される。
【図２５Ｂ】追加接種３０日後の、Ｈ５  ＶＬＰ（Ａ／インドネシア／５／２００５（Ｈ５Ｎ１））で免疫されたＢａｌｂ／ｃマウスからの血清抗体のインビトロ交差反応性を示した図である。様々な非活性化全ウイルスに対する赤血球凝集阻害力価を示す。値は、１群あたり５匹のマウスの終了点力価の逆数のＧＭＴ（ｌｎ）である。バーは平均偏差を表わす。すべての群は陰性対照に対して統計的な有意差がある。＊は対応する組換え可溶性Ｈ５と比較して、ｐ＜０．０５。１０よりも少ない値はすべて、５（ｌｎでは１．６）の任意の値を与えられ、陰性であると判断される。
【図２６Ａ】植物で作製されたＨ５  ＶＬＰ（Ａ／インドネシア／５／２００５（Ｈ５Ｎ１））の有効性を示した図である。１０００ＬＤ50（４．０９×１０6ＣＣＩＤ50）のインフルエンザ株Ａ／トルコ／５８２／０６（Ｈ５Ｎ１）による攻撃感染後(after challenge)のマウスの生存率を示す。
【図２６Ｂ】植物で作製されたＨ５  ＶＬＰ（Ａ／インドネシア／５／２００５（Ｈ５Ｎ１））の有効性を示した図である。攻撃感染後の免疫されたマウスの体重を示す。値は生存マウスの平均体重である。
【図２７Ａ】植物に由来するインフルエンザＶＬＰの起原を示した図である。精製されたインフルエンザＶＬＰの極性脂質組成物を示す。４０μｇのタンパク質の相当物に含有される脂質を、記載されるようにＶＬＰから抽出し、ＨＰ−ＴＬＣによって分離し、高度に精製されたタバコ原形質膜（ＰＭ）から単離した脂質の移動プロフィールに対して比較した。脂質略称は以下のとおりである。ＤＧＤＧ、ジガラクトシルジアシルグリセロール；ｇｌｕＣＥＲ、グルコシルセラミド；ＰＡ、ホスファチン酸（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｃ  ａｃｉｄ）；ＰＣ、ホスファチジルコリン；ＰＥ、ホスファチジルエタノールアミン；ＰＧ、ホスファチジルグリセロール；ＰＩ、ホスファチジルイノシトール；ＰＳ、ホスファチジルセリン；ＳＧ、ステリルグリコシド。
【図２７Ｂ】植物に由来するインフルエンザＶＬＰの起原を示した図である。精製されたインフルエンザＶＬＰの中性脂質組成を示す。２０μｇのタンパク質の相当物に含有される脂質は、記載されるようにＶＬＰから抽出され、ＨＰ−ＴＬＣによって分離され、シトステロールの移動と比較された。
【図２７Ｃ】植物に由来するインフルエンザＶＬＰの起原を示した図である。精製されたＶＬＰならびにタバコ葉（ＰＭＬ）およびＢＹ２タバコ細胞（ＰＭＢＹ２）から高度に精製されたＰＭ中の原形質膜マーカーのプロトンポンプＡＴＰアーゼ（ＰＭＡ）の免疫検出を示す。１８マイクログラムのタンパク質を各々のレーン中にロードした。
【図２８】クローン７７４のＤｒａＩＩＩ部位からＳａｃＩ部位にわたる配列（Ａ／ブリズベーン／５９／２００７（Ｈ１Ｎ１）のヌクレオチド配列）を示した図である（配列番号：３６）。コード配列はプラストシアニン調節領域が隣接し、５’末端のＤｒａＩＩＩ制限部位で開始し、３’末端に終止コドンおよびＳａｃＩ部位がある。制限部位に下線が引かれ、ＡＴＧは太字で下線が引かれる。
【図２９】クローン７７５のＤｒａＩＩＩ部位からＳａｃＩ部位にわたる配列（Ａ／ソロモン諸島３／２００６（Ｈ１Ｎ１）のヌクレオチド配列）を示した図である（配列番号：３７）。コード配列はプラストシアニン調節領域が隣接し、５’末端のＤｒａＩＩＩ制限部位で開始し、３’末端に終止コドンおよびＳａｃＩ部位がある。制限部位に下線が引かれ、ＡＴＧは太字で下線が引かれる。
【図３０】クローン７７６のＤｒａＩＩＩからＳａｃＩ部位にわたる配列（Ａ／ブリズベーン１０／２００７（Ｈ３Ｎ２）のヌクレオチド配列）を示した図である（配列番号：３８）。コード配列はプラストシアニン調節領域が隣接し、５’末端のＤｒａＩＩＩ制限部位で開始し、３’末端に終止コドンおよびＳａｃＩ部位がある。制限部位に下線が引かれ、ＡＴＧは太字で下線が引かれる。
【図３１】クローン７７７のＤｒａＩＩＩ部位からＳａｃＩ部位にわたる配列（Ａ／ウィスコンシン／６７／２００５（Ｈ３Ｎ２）のヌクレオチド配列）を示した図である（配列番号：３９）。コード配列はプラストシアニン調節領域が隣接し、５’末端のＤｒａＩＩＩ制限部位で開始し、３’末端に終止コドンおよびＳａｃＩ部位がある。制限部位に下線が引かれ、ＡＴＧは太字で下線が引かれる。
【図３２】クローン７７８のＤｒａＩＩＩ部位からＳａｃＩ部位にわたる配列（Ｂ／マレーシア／２５０６／２００４のヌクレオチド配列）を示した図である（配列番号：４０）。コード配列はプラストシアニン調節領域が隣接し、５’末端のＤｒａＩＩＩ制限部位で開始し、３’末端に終止コドンおよびＳａｃＩ部位がある。制限部位に下線が引かれ、ＡＴＧは太字で下線が引かれる。
【図３３】クローン７７９のＤｒａＩＩＩ部位からＳａｃＩ部位にわたる配列（Ｂ／フロリダ／４／２００６のヌクレオチド配列）を示した図である（配列番号：４１）。コード配列はプラストシアニン調節領域が隣接し、５’末端のＤｒａＩＩＩ制限部位で開始し、３’末端に終止コドンおよびＳａｃＩ部位がある。制限部位に下線が引かれ、ＡＴＧは太字で下線が引かれる。
【図３４】クローン７８０のＤｒａＩＩＩ部位からＳａｃＩ部位にわたる配列（Ａ／シンガポール／１／５７（Ｈ２Ｎ２）のヌクレオチド配列）を示した図である（配列番号：４２）。コード配列はプラストシアニン調節領域が隣接し、５’末端のＤｒａＩＩＩ制限部位で開始し、３’末端に終止コドンおよびＳａｃＩ部位がある。制限部位に下線が引かれ、ＡＴＧは太字で下線が引かれる。
【図３５】クローン７８１のＤｒａＩＩＩ部位からＳａｃＩ部位にわたる配列（Ａ／アンホイ／１／２００５（Ｈ５Ｎ１）のヌクレオチド配列）を示した図である（配列番号：４３）。コード配列はプラストシアニン調節領域が隣接し、５’末端のＤｒａＩＩＩ制限部位で開始し、３’末端に終止コドンおよびＳａｃＩ部位がある。制限部位に下線が引かれ、ＡＴＧは太字で下線が引かれる。
【図３６】クローン７８２のＤｒａＩＩＩ部位からＳａｃＩ部位にわたる配列（Ａ／ベトナム／１１９４／２００４（Ｈ５Ｎ１）のヌクレオチド配列）を示した図である（配列番号：４４）。コード配列はプラストシアニン調節領域が隣接し、５’末端のＤｒａＩＩＩ制限部位で開始し、３’末端に終止コドンおよびＳａｃＩ部位がある。制限部位に下線が引かれ、ＡＴＧは太字で下線が引かれる。
【図３７】クローン７８３のＤｒａＩＩＩ部位からＳａｃＩ部位にわたる配列（Ａ／コガモ／香港／Ｗ３１２／９７（Ｈ６Ｎ１）のヌクレオチド配列）を示した図である（配列番号：４５）。コード配列はプラストシアニン調節領域が隣接し、５’末端のＤｒａＩＩＩ制限部位で開始し、３’末端に終止コドンおよびＳａｃＩ部位がある。制限部位に下線が引かれ、ＡＴＧは太字で下線が引かれる。
【図３８】クローン７８４のＤｒａＩＩＩ部位からＳａｃＩ部位にわたる配列（Ａ／ウマ／プラハのヌクレオチド配列／５６（Ｈ７Ｎ７））を示した図である（配列番号：４６）。コード配列はプラストシアニン調節領域が隣接し、５’末端のＤｒａＩＩＩ制限部位で開始し、３’末端に終止コドンおよびＳａｃＩ部位がある。制限部位に下線が引かれ、ＡＴＧは太字で下線が引かれる。
【図３９】クローン７８５のＤｒａＩＩＩ部位からＳａｃＩ部位にわたる配列（Ａ／香港／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２）のヌクレオチド配列）を示した図である（配列番号：４７）。コード配列はプラストシアニン調節領域が隣接し、５’末端のＤｒａＩＩＩ制限部位で開始し、３’末端に終止コドンおよびＳａｃＩ部位がある。制限部位に下線が引かれ、ＡＴＧは太字で下線が引かれる。
【図４０Ａ】クローン７７４（Ａ／ブリズベーン／５９／２００７（Ｈ１Ｎ１））から翻訳されたポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：４８）を示した図である。クローン７７４のオープンリーディングフレームは図２８中で示されたＡＴＧで開始する。
【図４０Ｂ】クローン７７５（Ａ／ソロモン諸島３／２００６（Ｈ１Ｎ１））から翻訳されたポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：４９）を示した図である。クローン７７５のオープンリーディングフレームは図２９中で示されたＡＴＧで開始する。
【図４１Ａ】クローン７７６（Ａ／ブリズベーン／１０／２００７（Ｈ３Ｎ２））から翻訳されたポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：５０）を示した図である。クローン７７６のオープンリーディングフレームは図３０中で示されたＡＴＧで開始する。
【図４１Ｂ】クローン７７７（Ａ／ウィスコンシン／６７／２００５（Ｈ３Ｎ２））から翻訳されたポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：５１）を示した図である。クローン７７７のオープンリーディングフレームは図３１中で示されたＡＴＧで開始する。
【図４２Ａ】クローン７７８（Ｂ／マレーシア／２５０６／２００４）から翻訳されたポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：５２）を示した図である。クローン７７８のオープンリーディングフレームは図３２中で示されたＡＴＧで開始する。
【図４２Ｂ】クローン７７９（Ｂ／フロリダ／４／２００６）から翻訳されたポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：５３）を示した図である。クローン７７９のオープンリーディングフレームは図３３中で示されたＡＴＧで開始する。
【図４３Ａ】クローン７８０（Ａ／シンガポール／１／５７（Ｈ２Ｎ２））から翻訳されたポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：５４）を示した図である。クローン７８０のオープンリーディングフレームは図３４中で示されたＡＴＧで開始する。
【図４３Ｂ】クローン７８１（Ａ／アンホイ／１／２００５（Ｈ５Ｎ１））から翻訳されたポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：５５）を示した図である。クローン７８１のオープンリーディングフレームは図３５中で示されたＡＴＧで開始する。
【図４４Ａ】クローン７８２（Ａ／ベトナム／１１９４／２００４（Ｈ５Ｎ１））から翻訳されたポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：５６）を示した図である。クローン７８２のオープンリーディングフレームは図３６中で示されたＡＴＧで開始する。
【図４４Ｂ】クローン７８３（Ａ／コガモ／香港／Ｗ３１２／９７（Ｈ６Ｎ１））から翻訳されたポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：５７）を示した図である。クローン７８３のオープンリーディングフレームは図３７中で示されたＡＴＧで開始する。
【図４５Ａ】クローン７８４（Ａ／ウマ／プラハ／５６（Ｈ７Ｎ７））から翻訳されたポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：５８）を示した図である。クローン７８４のオープンリーディングフレームは図３８中で示されたＡＴＧで開始する。
【図４５Ｂ】クローン７８５（Ａ／香港／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２））から翻訳されたポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：５９）を示した図である。クローン７８５のオープンリーディングフレームは図３９中で示されたＡＴＧで開始する。
【図４６】植物で産生されたＶＬＰのサイズ排除クロマトグラフィー後の溶出画分７〜１７の免疫検出（ウエスタンブロット）を示した図である。ブルーデキストランの溶出ピーク（画分１０）は矢印によって示される。赤血球凝集素亜型Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ６およびＨ９を示す。赤血球凝集素は画分７〜１４中で検出され、ＶＬＰの溶出に対応する。
【図４７】一連の各年の流行株からの赤血球凝集素の発現のイムノブロット分析を示した図である。様々なインフルエンザ株（イムノブロットの上部に示す）からのＨＡを発現する植物について、１０および２０マイクログラムの葉タンパク質抽出物を、それぞれレーン１および２中にロードした。
【図４８Ａ】一連の可能性のあるパンデミック株からの一連のＨ５赤血球凝集素の発現のイムノブロット分析を示した図である。１０および２０マイクログラムのタンパク質抽出物を、それぞれレーン１および２中にロードした。
【図４８Ｂ】選択されたインフルエンザ株からのＨ２、Ｈ７およびＨ９赤血球凝集素の発現のイムノブロット分析を示した図である。１０および２０マイクログラムのタンパク質抽出物を、それぞれレーン１および２中にロードした。
【図４９】ＡＧＬ１／６６０でアグロインフィルトレーションしたニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）葉からのタンパク質抽出物における株Ａ／インドネシア／５／２００５からのＨ５のイムノブロットを示した図である。２つの植物（植物１および植物２）をインフィルトレーションし、各々の植物から抽出した１０および２０μｇの可溶性タンパクをそれぞれレーン１および２中にロードした。
【図５０Ａ】血清抗体のインビトロ交差反応性を示した図である。植物で作製されたインフルエンザＨ５  ＶＬＰ（Ａ／インドネシア／５／２００５（Ｈ５Ｎ１））による第１の免疫１４日後のフェレット血清における赤血球凝集阻害（ＨＩ）力価。ＨＡＩ抗体応答は以下の不活性化Ｈ５Ｎ１全ウイルスを使用して測定された。Ａ／シチメンチョウ／トルコ／１／０５、Ａ／ベトナム／１１９４／０４、Ａ／アンホイ／５／０５およびＡ／インドネシア／５／０５と同種の株。値は、１群あたり５匹のフェレットの終了点力価の逆数のＧＭＴ（ｌｏｇ2）である。斜め縞−Ａ／インドネシア／６／０６（クレード２．１．３）；市松模様−Ａ／シチメンチョウ／トルコ／１／０５（クレード２．２）；白色の棒−Ａ／ベトナム／１１９４／０４（クレード１）；黒色の棒Ａ／アンホイ／５／０５。レスポンダーが示される。バーは平均偏差を表わす。
【図５０Ｂ】血清抗体のインビトロ交差反応性を示した図である。植物で作製されたインフルエンザＨ５  ＶＬＰ（Ａ／インドネシア／５／２００５（Ｈ５Ｎ１））による第２の追加接種の１４日後のフェレット血清における赤血球凝集阻害（ＨＩ）力価。ＨＡＩ抗体応答は以下の不活性化Ｈ５Ｎ１全ウイルスを使用して測定された。Ａ／シチメンチョウ／トルコ／１／０５、Ａ／ベトナム／１１９４／０４、Ａ／アンホイ／５／０５およびＡ／インドネシア／５／０５と同種の株。値は、１群あたり５匹のフェレットの終了点力価の逆数のＧＭＴ（ｌｏｇ2）である。斜め縞−Ａ／インドネシア／６／０６（クレード２．１．３）；市松模様−Ａ／シチメンチョウ／トルコ／１／０５（クレード２．２）；白色の棒−Ａ／ベトナム／１１９４／０４（クレード１）；黒色の棒Ａ／アンホイ／５／０５。レスポンダーが示される。バーは平均偏差を表わす。
【図５１】アルファルファのプラストシアニンプロモーターおよび５’ＵＴＲ、Ａ／インドネシア／５／２００５からのＨ５の赤血球凝集素コード配列（コンストラクト番号６６０）、アルファルファのプラストシアニン３’ＵＴＲおよびターミネーター配列を含むＨＡ発現カセットの核酸配列（配列番号：６０）を示した図である。
【図５２】アルファルファのプラストシアニンプロモーターおよび５’ＵＴＲ、Ａ／ニューカレドニア／２０／１９９９からのＨ１の赤血球凝集素コード配列（コンストラクト番号５４０）、アルファルファのプラストシアニン３’ＵＴＲおよびターミネーター配列を含むＨＡ発現カセットの核酸配列（配列番号：６１）を示した図である。
【図５３】アルファルファのプラストシアニンプロモーターおよび５’ＵＴＲ、Ａ／ブリズベーン／５９／２００７からのＨ１の赤血球凝集素コード配列（コンストラクト番号７７４）、アルファルファのプラストシアニン３’ＵＴＲおよびターミネーター配列を含むＨＡ発現カセットの核酸配列（配列番号：６２）を示した図である。
【図５４】アルファルファのプラストシアニンプロモーターおよび５’ＵＴＲ、Ａ／ソロモン諸島／３／２００６（Ｈ１Ｎ１）からのＨ１の赤血球凝集素コード配列（コンストラクト番号７７５）、アルファルファのプラストシアニン３’ＵＴＲおよびターミネーター配列を含むＨＡ発現カセットの核酸配列（配列番号：６３）を示した図である。
【図５５】アルファルファのプラストシアニンプロモーターおよび５’ＵＴＲ、Ａ／シンガポール／１／５７（Ｈ２Ｎ２）からのＨ２の赤血球凝集素コード配列（コンストラクト番号７８０）、アルファルファのプラストシアニン３’ＵＴＲおよびターミネーター配列を含むＨＡ発現カセットの核酸配列（配列番号：６４）を示した図である。
【図５６】アルファルファのプラストシアニンプロモーターおよび５’ＵＴＲ、Ａ／アンホイ／１／２００５（Ｈ５Ｎ１）からのＨ５の赤血球凝集素コード配列（コンストラクト番号７８１）、アルファルファのプラストシアニン３’ＵＴＲおよびターミネーター配列を含むＨＡ発現カセットの核酸配列（配列番号：６５）を示した図である。
【図５７】アルファルファのプラストシアニンプロモーターおよび５’ＵＴＲ、Ａ／ベトナム／１１９４／２００４（Ｈ５Ｎ１）からのＨ５の赤血球凝集素コード配列（コンストラクト番号７８２）、アルファルファのプラストシアニン３’ＵＴＲおよびターミネーター配列を含むＨＡ発現カセットの核酸配列（配列番号：６６）を示した図である。
【図５８】アルファルファのプラストシアニンプロモーターおよび５’ＵＴＲ、Ａ／コガモ／香港／Ｗ３１２／９７（Ｈ６Ｎ１）からのＨ６の赤血球凝集素コード配列（コンストラクト番号７８３）、アルファルファのプラストシアニン３’ＵＴＲおよびターミネーター配列を含むＨＡ発現カセットの核酸配列（配列番号：６７）を示した図である。
【図５９】アルファルファのプラストシアニンプロモーターおよび５’ＵＴＲ、Ａ／香港／１０７３／９９（Ｈ９Ｎ２）からのＨ９の赤血球凝集素コード配列（コンストラクト番号７８５）、アルファルファのプラストシアニン３’ＵＴＲおよびターミネーター配列を含むＨＡ発現カセットの核酸配列（配列番号：６８）を示した図である。
【図６０】アルファルファのプラストシアニンプロモーターおよび５’ＵＴＲ、Ａ／ブリズベーン／１０／２００７（Ｈ３Ｎ２）からのＨ３の赤血球凝集素コード配列、アルファルファのプラストシアニン３’ＵＴＲおよびターミネーター配列を含むＨＡ発現カセットの核酸配列（配列番号：６９）を示した図である。
【図６１】アルファルファのプラストシアニンプロモーターおよび５’ＵＴＲ、Ａ／ウィスコンシン／６７／２００５（Ｈ３Ｎ２）からのＨ３の赤血球凝集素コード配列、アルファルファのプラストシアニン３’ＵＴＲおよびターミネーター配列を含むＨＡ発現カセットの核酸配列（配列番号：７０）を示した図である。
【図６２】アルファルファのプラストシアニンプロモーターおよび５’ＵＴＲ、Ａ／ウマ／プラハからのＨ７の赤血球凝集素コード配列、／５６（Ｈ７Ｎ７）、アルファルファのプラストシアニン３’ＵＴＲおよびターミネーター配列を含むＨＡ発現カセットの核酸配列（配列番号：７１）を示した図である。
【図６３】アルファルファのプラストシアニンプロモーターおよび５’ＵＴＲ、Ｂ／マレーシア／２５０６／２００４からのＨＡの赤血球凝集素コード配列、アルファルファのプラストシアニン３’ＵＴＲおよびターミネーター配列を含むＨＡ発現カセットの核酸配列（配列番号：７２）を示した図である。
【図６４】アルファルファのプラストシアニンプロモーターおよび５’ＵＴＲ、Ｂ／フロリダ／４／２００６からのＨＡの赤血球凝集素コード配列、アルファルファのプラストシアニン３’ＵＴＲおよびターミネーター配列を含むＨＡ発現カセットの核酸配列（配列番号：７３）を示した図である。
【図６５】Ａ／ニューカレドニア／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）（配列番号：３３によってコードされる）、Ａ／ブリズベーン／５９／２００７（Ｈ１Ｎ１）（配列番号：４８）、Ａ／ソロモン諸島／３／２００６（Ｈ１Ｎ１）（配列番号：４９）および配列番号：９のＨＡのコンセンサスアミノ酸配列（配列番号：７４）を示した図である。Ｘ１（ポジション３）はＡまたはＶであり；Ｘ２（ポジション５２）はＤまたはＮでありＸ３（ポジション９０）はＫまたはＲであり；Ｘ４（ポジション９９）はＫまたはＴであり；Ｘ５（ポジション１１１）はＹまたはＨであり；Ｘ６（ポジション１４５）はＶまたはＴであり；Ｘ７（ポジション１５７）はＥまたはＫであり；Ｘ８（ポジション１６２）はＲまたはＫであり；Ｘ９（ポジション１８２）はＶまたはＡであり；Ｘ１０（ポジション２０３）はＤまたはＮであり；Ｘ１１（ポジション２０５）はＲまたはＫであり；Ｘ１２（ポジション２１０）はＴまたはＫであり；Ｘ１３（ポジション２２５）はＲまたはＫであり；Ｘ１４（ポジション２６８）はＷまたはＲであり；Ｘ１５（ポジション２８３）はＴまたはＮであり；Ｘ１６（ポジション２９０）はＥまたはＫであり；Ｘ１７（ポジション４３２）はＩまたはＬであり；Ｘ１８（ポジション４８９）はＮまたはＤである。
【図６６】配列番号：３３によってコードされるＨ１ニューカレドニア（ＡＡＰ３４３２４．１）のアミノ酸配列（配列番号：７５）を示した図である。
【図６７】配列番号：３５によってコードされるＨ１プエルトリコ（ＮＣ＿０４０９８７８．１）のアミノ酸配列（配列番号：７６）を示した図である。
【図６８】ＰａｃＩ（上流プロモーター）からＡｓｃＩ（ＮＯＳターミネーターのすぐ下流）の発現カセット番号８２８の一部の核酸配列を示した図である。変異させたＡＴＧを持つＣＰＭＶ  ＨＴ  ５’ＵＴＲ配列に下線が引かれる。ＡｐａＩ制限部位（発現されるタンパク質コード配列、この事例においてＣ５−１κ軽鎖のＡＴＧのすぐ上流）。
【図６９】ＨｉｎｄＩＩＩ（プラストシアニンのプロモーターの上流のマルチプルクローニング部位中の）からＥｃｏＲＩ（プラストシアニンのターミネーターのすぐ下流）までのコンストラクト番号６６３の一部の核酸配列を示した図である。ＰＤＩ  ＳＰと融合させたＨ５（Ａ／インドネシア／５／２００５からの）コード配列に下線が引かれる。
【図７０】ＨｉｎｄＩＩＩ（プラストシアニンのプロモーターの上流のマルチプルクローニング部位中の）からＥｃｏＲＩ（プラストシアニンのターミネーターのすぐ下流）のコンストラクト番号７８７の一部の核酸配列を示した図である。ＰＤＩ  ＳＰと融合させたＨ１（Ａ／ブリズベーン／５９／２００７からの）コード配列に下線が引かれる。
【図７１】ＨｉｎｄＩＩＩ（プラストシアニンのプロモーターの上流のマルチプルクローニング部位中の）からＥｃｏＲＩ（プラストシアニンのターミネーターのすぐ下流）のコンストラクト番号７９０の一部の核酸配列を示した図である。ＰＤＩ  ＳＰと融合させたＨ３（Ａ／ブリズベーン／１０／２００７からの）コード配列に下線が引かれる。
【図７２】ＨｉｎｄＩＩＩ（プラストシアニンのプロモーターの上流のマルチプルクローニング部位中の）からＥｃｏＲＩ（プラストシアニンのターミネーターのすぐ下流）のコンストラクト番号７９８の一部の核酸配列を示した図である。ＰＤＩ  ＳＰと融合させたＢ／フロリダ／４／２００６コード配列からのＨＡに下線が引かれる。
【図７３】ＰａｃＩ（３５Ｓプロモーターの上流）からＡｓｃＩ（ＮＯＳターミネーターのすぐ下流）のコンストラクト番号５８０の一部の核酸配列を示した図である。ＰＤＩ  ＳＰと融合させたＨ１（Ａ／ニューカレドニア／２０／１９９９からの）のコード配列に下線が引かれる。
【図７４】ＰａｃＩ（３５Ｓプロモーターの上流）からＡｓｃＩ（ＮＯＳターミネーターのすぐ下流）のコンストラクト番号６８５の一部の核酸配列を示した図である。Ａ／インドネシア／５／２００５からのＨ５のコード配列に下線が引かれる。
【図７５】ＰａｃＩ（３５Ｓプロモーターの上流）からＡｓｃＩ（ＮＯＳターミネーターのすぐ下流）のコンストラクト番号６８６の一部の核酸配列を示した図である。ＰＤＩ  ＳＰと融合させたＡ／インドネシア／５／２００５からのＨ５のコード配列に下線が引かれる。
【図７６】ＰａｃＩ（３５Ｓプロモーターの上流）からＡｓｃＩ（ＮＯＳターミネーターのすぐ下流）のコンストラクト番号７３２の一部の核酸配列を示した図である。Ａ／ブリズベーン／５９／２００７からのＨ１のコード配列に下線が引かれる。
【図７７】ＰａｃＩ（３５Ｓプロモーターの上流）からＡｓｃＩ（ＮＯＳターミネーターのすぐ下流）のコンストラクト番号７３３の一部の核酸配列を示した図である。ＰＤＩ  ＳＰと融合されたＡ／ブリズベーン／５９／２００７からのＨ１のコード配列に下線が引かれる。
【図７８】ＰａｃＩ（３５Ｓプロモーターの上流）からＡｓｃＩ（ＮＯＳターミネーターのすぐ下流）のコンストラクト番号７３５の一部の核酸配列を示した図である。Ａ／ブリズベーン／１０／２００７からのＨ３のコード配列に下線が引かれる。
【図７９】ＰａｃＩ（３５Ｓプロモーターの上流）からＡｓｃＩ（ＮＯＳターミネーターのすぐ下流）のコンストラクト番号７３６の一部の核酸配列を示した図である。ＰＤＩ  ＳＰと融合させたＡ／ブリズベーン／１０／２００７からのＨ３のコード配列に下線が引かれる。
【図８０】ＰａｃＩ（３５Ｓプロモーターの上流）からＡｓｃＩ（ＮＯＳターミネーターのすぐ下流）のコンストラクト番号７３８の一部の核酸配列を示した図である。Ｂ／フロリダ／４／２００６からのＨＡのコード配列に下線が引かれる。
【図８１】ＰａｃＩ（３５Ｓプロモーターの上流）からＡｓｃＩ（ＮＯＳターミネーターのすぐ下流）のコンストラクト番号７３９の一部の核酸配列を示した図である。ＰＤＩ  ＳＰと融合させたＢ／フロリダ／４／２００６からのＨＡのコード配列に下線が引かれる。
【図８２】Ｍｓｊ１をコードする核酸配列（配列番号：１１４）を示した図である。
【図８３】ＨｉｎｄＩＩＩ（プロモーターの上流のマルチプルクローニング部位中の）からＥｃｏＲＩ（ＮＯＳターミネーターのすぐ下流）のコンストラクト番号Ｒ８５０の一部の核酸配列を示した図である。ＨＳＰ４０コード配列に下線が引かれる。
【図８４】ＨｉｎｄＩＩＩ（プロモーターの上流のマルチプルクローニング部位中の）からＥｃｏＲＩ（ＮＯＳターミネーターのすぐ下流）のコンストラクト番号Ｒ８６０の一部の核酸配列を示した図である。ＨＳＰ７０コード配列に下線が引かれる。
【図８５Ａ】ＨｉｎｄＩＩＩ（プロモーターの上流のマルチプルクローニング部位中の）からＥｃｏＲＩ（ＮＯＳターミネーターのすぐ下流）のコンストラクト番号Ｒ８７０の一部の核酸配列を示した図である。ＨＳＰ４０コード配列は下線を引いたイタリック体であり、ＨＳＰ７０コード配列は下線が引かれる。ヌクレオチド１〜５００３を示す。
【図８５Ｂ】ＨｉｎｄＩＩＩ（プロモーターの上流のマルチプルクローニング部位中の）からＥｃｏＲＩ（ＮＯＳターミネーターのすぐ下流）のコンストラクト番号Ｒ８７０の一部の核酸配列を示した図である。ＨＳＰ４０コード配列は下線を引いたイタリック体であり、ＨＳＰ７０コード配列は下線が引かれる。ヌクレオチド５００４〜９４９３を示す。
【図８６】コンストラクトＲ４７２の図式的説明を示す。
【図８７】アルファルファのタンパク質ジスルフィドイソメラーゼからのシグナルペプチドを使用するＨＡの発現のイムノブロット分析を示した図である。５マイクログラムのＨ１（Ａ／ニューカレドニア／２０／９９（Ｈ１Ｎ１））が使用された以外は、３つの個別の植物から得られた２０マイクログラムの葉タンパク質抽出物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにロードした。示された対照（同種株の非活性化全ウイルス（ＷＩＶ））を、５又は２０マイクログラムのモックインフィルトレーションした植物にスパイク(spike)した。ａ）Ａ／ニューカレドニア／２０／９９からのＨ１の発現を示す。ｂ）Ａ／ブリズベーン／５９／２００７からのＨ１の発現を示す。ｃ）Ａ／ブリズベーン／１０／２００７からのＨ３の発現を示す。ｄ）Ａ／インドネシア／５／２００５からのＨ５の発現を示す。ｅ）Ｂ／フロリダ／４／２００６からのＨＡの発現を示す。矢印はＨＡ０に対応する免疫反応性バンドを示す。ＳＰ  ＷＴ：天然のシグナルペプチド、ＰＳ  ＰＤＩ：アルファルファのＰＤＩシグナルペプチド。
【図８８】葉タンパク質抽出物のイムノブロット分析によるＨＡ発現ストラテジーの比較を示す。ＨＡはプラストシアニンベースのカセットまたはＣＰＭＶ−ＨＴベースのカセットを使用して産生した。ＣＰＭＶ−ＨＴについては、野生型ＨＡシグナルペプチドおよびアルファルファのＰＤＩからのシグナルペプチドも比較した。Ｈ１ニューカレドニアについては５マイクログラムをロードした以外は、分析されるＨＡ亜型について２０マイクログラムのタンパク質抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにロードした。ａ）Ａ／ニューカレドニア／２０／１９９９からのＨ１の発現を示す。ｂ）Ａ／ブリズベーン／５９／２００７からのＨ１の発現を示す。ｃ）Ａ／ブリズベーン／１０／２００７からのＨ３の発現を示す。ｄ）Ａ／インドネシア／５／２００５からのＨ５の発現を示す。ｅ）Ｂ／フロリダ／４／２００６からのＢの発現を示す。矢印はＨＡ０に対応する免疫反応性バンドを示し、ＨＡ発現のために使用した特異的なベクターを含む特異的なアグロバクテリウム株をレーンのトップに示す。
【図８９】Ｈｓｐ  ４０およびＨｓｐ７０を共発現した場合のＨＡ蓄積のイムノブロットを示した図である。Ｈ１ニューカレドニア（ＡＧＬ１／５４０）およびＨ３ブリズベーン（ＡＧＬ１／７９０）を単独で発現させるかまたはＡＧＬ１／Ｒ８７０と共発現させた。ＨＡ蓄積レベルはインフィルトレーションした葉からのタンパク質抽出物のイムノブロット分析によって評価した。株Ａ／ニューカレドニア／２０／９９の非活性化全ウイルス（ＷＩＶ）またはブリズベーン／１０／２００７を対照として使用した。
【図９０】Ａ／カリフォルニア／０４／０９（コンストラクト番号５６０）からのＨ１についてのＣＰＭＶ−ＨＴベースの発現カセットを示した図である。
【図９１】インフィルトレーション２日後にアグロインフィルトレーションした植物からのタンパク質抽出物におけるＡ／カリフォルニア／０４／０９からのＨ１のウエスタンブロット解析を示した図である。各々のレーン中に泳動したサンプルを表２０中で示す。
【図９２Ａ】Ａ／カリフォルニア／０４／０９（カセット番号５６０）からのＨ１についてのＣＰＭＶ−ＨＴベースの発現カセットのヌクレオチド配列（配列番号：１２７）を示した図である。アルファルファのタンパク質ジスルフィドイソメラーゼシグナルペプチドのコード配列に下線が引かれ、成熟Ｈ１コード配列は太字で強調される。
【図９２Ｂ】Ａ／カリフォルニア／０４／０９（配列番号：１２７によってコードされる）からのＨ１のアミノ酸配列（配列番号：１２８）を示した図である。アルファルファのタンパク質ジスルフィドイソメラーゼシグナルペプチドに下線が引かれる。
【図９３】２×３５Ｓプロモーター（配列番号：１２９）のヌクレオチド配列を示した図である。
【図９４】ＰａｃＩ（上流プロモーター）からＡｓｃＩ（ＮＯＳターミネーターのすぐ下流）の中間発現カセット番号９７２（配列番号：１３４）のヌクレオチド配列を示した図である。２×３５Ｓプロモーター配列に下線が引かれる。変異させたＡＴＧは囲まれている。ＡｐａＩ制限部位（発現されるタンパク質コード配列、この事例においてＨ５  Ａ／インドネシアのＨＡ０についてのＡＴＧのすぐ下流）は網掛けされる。
【図９５】天然のＨ１  Ａ／カリフォルニア／４／２００９配列（配列番号：１３５）のヌクレオチド配列を示した図である。天然のＨ１  Ａ／カリフォルニア／４／２００９シグナルペプチドに下線が引かれる。ＳａｃＩ部位およびＳｔｕＩの制限部位は囲まれている。
【図９６】Ｈ１  Ａ／カリフォルニア／４／２００９配列を含有する合成の最終配列（配列番号：１３６）のヌクレオチド配列を示した図である。ＤｒａＩＩＩ制限部位からＡｐａＩ制限部位のＭタンパク質部分に下線が引かれる。ＰＤＩＳＰは太字である。変異させたＳａｃＩ制限部位およびＳｔｕＩ制限部位は囲まれている。
【図９７】ＰＣＲベースのライゲーションを使用してＨ１  Ａ／カリフォルニア／４／２００９配列を合成するために使用される断片１（配列番号：１３７）、断片２（配列番号：１３８）および断片３（配列番号：１３９）のヌクレオチド配列を示した図である。
【図９８】ＰａｃＩ（上流プロモーター）からＡｓｃＩ（ＮＯＳターミネーターのすぐ下流）の発現カセット番号５６０（配列番号：１４６）のヌクレオチド配列を示した図である。ＰＤＩＳＰ−ＨＡ０  Ｈ１  Ａ／カリフォルニア／４／２００９配列に下線が引かれる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０７】
エンベロープウイルスのＶＬＰは、一般的には出芽する膜からエンベロープを取得する。植物原形質膜は、免疫刺激効果がある植物性ステロール相補物を有している。この可能性を調査するために、植物で作製されたＨ５  ＶＬＰをアジュバントの存在下または非存在下において動物に投与し、ＨＡＩ（赤血球凝集阻害抗体応答）を決定した（図２２Ａ、２２Ｂ）。追加アジュバントが存在しなくても、植物で作製されたＨ５  ＶＬＰは有意なＨＡＩを実証し、抗原の投与に対する全身性免疫応答を表す。さらに、アジュバントの存在下または非存在下において投与されたＶＬＰの抗体アイソタイププロフィールは類似している（図２３Ａ）。
表５は、本発明の様々な実施形態において提供される配列をリストする。
表５：配列識別名のための配列記載。
【表５】
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