【手続補正書】
【提出日】平成24年2月20日(2012.2.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第一級アルコールを生産するために十分な量で発現されるマロニル−ＣｏＡ非依存性ＦＡＳ経路酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む、マロニル−ＣｏＡ非依存性脂肪酸合成（ＦＡＳ）経路とアシル還元経路とを有する微生物を含む、天然に存在しない微生物であって、前記マロニル−ＣｏＡ非依存性ＦＡＳ経路が、ケトアシル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼまたはケトアシル−ＣｏＡチオラーゼ、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼおよびエノイル−ＣｏＡレダクターゼを含み、前記アシル還元経路が、アシル−ＣｏＡレダクターゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼを含む、天然に存在しない微生物。
【請求項２】
マロニル−ＣｏＡ非依存性ＦＡＳ経路酵素をそれぞれがコードする２つ、３つまたは４つの外因性核酸を含む、請求項１に記載の天然に存在しない微生物。
【請求項３】
アシル還元経路酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含み、前記アシル還元経路酵素がアシル−ＣｏＡレダクターゼまたはアルコールデヒドロゲナーゼから選択される、請求項１に記載の天然に存在しない微生物。
【請求項４】
前記第一級アルコールが、４〜２４個の間の炭素原子を有するアルコールを含む、請求項１に記載の天然に存在しない微生物。
【請求項５】
第一級アルコールを生産するための方法であって、請求項１〜４のいずれか１項に記載の天然に存在しない微生物を、実質的に嫌気性の条件下で、前記第一級アルコールを生産するために十分な期間にわたって培養することを含む、方法。
【請求項６】
前記第一級アルコールを単離することをさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
１つ以上の遺伝子破壊を含む天然に存在しない微生物であって、前記１つ以上の遺伝子破壊が、酵素（前記酵素は、前記遺伝子破壊が前記酵素の活性を低下させたときに、前記天然に存在しない微生物の増殖に長鎖アルコール（ＬＣＡ）生産を連動させるものである）をコードする遺伝子において生じ、それによって前記１つ以上の遺伝子破壊が、前記天然に存在しない微生物にＬＣＡの生産を付与するものである、天然に存在しない微生物。
【請求項８】
前記１つ以上の遺伝子破壊が、前記１つ以上の遺伝子の欠失を含む、請求項７に記載の天然に存在しない微生物。
【請求項９】
前記１つ以上の遺伝子破壊が、
表Ｉの設計Ｉ〜ＸＸＩによって与えられるか；または
アセトアルデヒド−ＣｏＡデヒドロゲナーゼおよび乳酸デヒドロゲナーゼからなる群より選択される酵素をコードする、
請求項７に記載の天然に存在しない微生物。
【請求項１０】
前記１つ以上の遺伝子破壊が、ピルビン酸ギ酸リアーゼ、ホスホトランスアセチラーゼ、酢酸キナーゼ、フマル酸レダクターゼ、フマラーゼ、およびリンゴ酸デヒドロゲナーゼからなる群より選択されるコードされた酵素をさらに含む、請求項９に記載の天然に存在しない微生物。
【請求項１１】
前記１つ以上の遺伝子破壊が、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、ＮＡＤ（Ｐ）トランスヒドロゲナーゼ、およびＡＴＰシンターゼからなる群より選択されるコードされた酵素をさらに含む、請求項１０に記載の天然に存在しない微生物。
【請求項１２】
ＬＣＡを生産するための方法であって、請求項７〜１１のいずれか１項に記載の天然に存在しない微生物をＬＣＡを生産するために十分な期間にわたって培養することを含む、方法。
【請求項１３】
１つ以上の遺伝子破壊を含む天然に存在しない真核生物であって、前記１つ以上の遺伝子破壊が、サイトゾルピルビン酸デカルボキシラーゼ、ミトコンドリアピルビン酸デヒドロゲナーゼ、サイトゾルエタノール特異的アルコールデヒドロゲナーゼおよびミトコンドリアエタノール特異的アルコールデヒドロゲナーゼからなる群より選択される酵素をコードする遺伝子において生じ、前記１つ以上の遺伝子破壊が、前記生物のサイトゾルまたはミトコンドリアにおける長鎖アルコールの生産を付与する、天然に存在しない真核生物。
【請求項１４】
前記１つ以上の遺伝子破壊が、前記１つ以上の遺伝子の欠失を含む、請求項１３に記載の生物。
【請求項１５】
前記１つ以上の遺伝子破壊が、前記サイトゾルにおける長鎖アルコールの生産を付与し、そして前記生物はサイトゾルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼシャトル、外部ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ、およびミトコンドリア内部ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼからなる群より選択される酵素をコードする１つ以上の遺伝子破壊をさらに含む、請求項１３に記載の生物。
【請求項１６】
前記１つ以上の遺伝子破壊が、前記サイトゾルにおける長鎖アルコールの生産を付与し、そして前記生物はアセチル−ＣｏＡシンセターゼ（ＡＭＰ形成性）、ＡＤＰ依存性酢酸−ＣｏＡリガーゼ、アシル化アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸：ＮＡＤＰオキシドレダクターゼ、およびピルビン酸ギ酸リアーゼからなる群より選択される酵素；またはその遺伝子調節領域をコードする外因性核酸をサイトゾル内にさらに含む、請求項１３に記載の生物。
【請求項１７】
サイトゾルトランスヒドロゲナーゼまたはその遺伝子調節領域をコードする外因性核酸をさらに含む、請求項１６に記載の生物。
【請求項１８】
前記１つ以上の遺伝子破壊が、前記ミトコンドリアにおける長鎖アルコールの生産を付与し、そして前記生物はリンゴ酸デヒドロゲナーゼ、外部ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼおよび内部ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼによって触媒されるグリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼシャトルからなる群より選択される酵素をコードする１つ以上の遺伝子破壊をさらに含む、請求項１３に記載の生物。
【請求項１９】
前記１つ以上の遺伝子破壊が、前記ミトコンドリアにおける長鎖アルコールの生産を付与し、そして前記生物はピルビン酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸：ＮＡＤＰオキシドレダクターゼ、ピルビン酸ギ酸リアーゼ、アシル化アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ、酢酸ＣｏＡリガーゼ、およびＡＭＰ形成性アセチルＣｏＡシンセターゼからなる群より選択される酵素；またはその遺伝子調節領域をコードする外因性核酸をミトコンドリア内にさらに含む、請求項１３に記載の生物。
【請求項２０】
サイトゾルからミトコンドリアへのＮＡＤＨの輸送のための増強されたＮＡＤＨ輸送シャトルシステムをさらに含む、請求項１９に記載の生物。
【請求項２１】
トランスヒドロゲナーゼ、ギ酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、およびピルビン酸オキシダーゼからなる群より選択される酵素；またはその遺伝子調節領域をコードする外因性核酸をミトコンドリア内にさらに含む、請求項１９に記載の生物。
【請求項２２】
酵母または真菌であり、前記酵母は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅを含むＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓおよびＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓを含むＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ種、ならびにＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓを含むＰｉｃｈｉａ種からなる群より選択され、そして前記真菌はＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒを含むＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ種、ならびにＲｈｉｚｏｐｕｓ  ａｒｒｈｉｚｕｓおよびＲｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅを含むＲｈｉｚｏｐｕｓ種からなる群より選択される、請求項１３に記載の生物。
【請求項２３】
請求項１３〜２２のいずれか１項に記載の天然に存在しない真核生物を長鎖アルコールを生産するに十分な期間にわたって培養することを含む、長鎖アルコールの生産方法。
【請求項２４】
脂肪アシル−ＣｏＡを生産するために十分な量で発現されるマロニル−ＣｏＡ非依存性ＦＡＳ経路酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含むマロニル−ＣｏＡ非依存性脂肪酸合成（ＦＡＳ）経路を有する微生物を含む、天然に存在しない微生物であって、前記マロニル−ＣｏＡ非依存性ＦＡＳ経路が、ケトアシル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼまたはケトアシル−ＣｏＡチオラーゼ、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼおよびエノイル−ＣｏＡレダクターゼを含む、天然に存在しない微生物。
【請求項２５】
脂肪酸エステルまたはワックスを生成するために十分な量で発現されるマロニル−ＣｏＡ非依存性ＦＡＳ経路酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む、マロニル−ＣｏＡ非依存性脂肪酸合成（ＦＡＳ）経路とワックスエステルシンターゼとを有する微生物を含む、天然に存在しない微生物であって、前記マロニル−ＣｏＡ非依存性ＦＡＳ経路が、ケトアシル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼまたはケトアシル−ＣｏＡチオラーゼ、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼおよびエノイル−ＣｏＡレダクターゼを含む、天然に存在しない微生物。
【請求項２６】
脂肪酸エステルまたはワックスを生産するために十分な量で発現されるマロニル−ＣｏＡ非依存性ＦＡＳ経路酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む、マロニル−ＣｏＡ非依存性脂肪酸合成（ＦＡＳ）経路とアルコールアセチルトランスフェラーゼとを有する微生物を含む、天然に存在しない微生物であって、前記マロニル−ＣｏＡ非依存性ＦＡＳ経路が、ケトアシル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼまたはケトアシル−ＣｏＡチオラーゼ、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼおよびエノイル−ＣｏＡレダクターゼを含む、天然に存在しない微生物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
他の態様において、本明細書に開示する実施形態は、これらの天然に存在しない真核生物の培養を含む、長鎖アルコールの生産方法に関する。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
第一級アルコールを生産するために十分な量で発現されるマロニル−ＣｏＡ非依存性ＦＡＳ経路酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む、マロニル−ＣｏＡ非依存性脂肪酸合成（ＦＡＳ）経路とアシル還元経路とを有する微生物を含む、天然に存在しない微生物であって、前記マロニル−ＣｏＡ非依存性ＦＡＳ経路が、ケトアシル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼまたはケトアシル−ＣｏＡチオラーゼ、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼおよびエノイル−ＣｏＡレダクターゼを含み、前記アシル還元経路が、アシル−ＣｏＡレダクターゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼを含む、天然に存在しない微生物。
（項目２）
マロニル−ＣｏＡ非依存性ＦＡＳ経路酵素をそれぞれがコードする２つの外因性核酸を含む、項目１に記載の天然に存在しない微生物。
（項目３）
マロニル−ＣｏＡ非依存性ＦＡＳ経路酵素をそれぞれがコードする３つの外因性核酸を含む、項目１に記載の天然に存在しない微生物。
（項目４）
マロニル−ＣｏＡ非依存性ＦＡＳ経路酵素をそれぞれがコードする４つの外因性核酸を含む、項目１に記載の天然に存在しない微生物。
（項目５）
前記４つの外因性核酸が、ケトアシル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼおよびエノイル−ＣｏＡレダクターゼをコードする、項目４に記載の天然に存在しない微生物。
（項目６）
前記４つの外因性核酸が、ケトアシル−ＣｏＡチオラーゼ、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼおよびエノイル−ＣｏＡレダクターゼをコードする、項目４に記載の天然に存在しない微生物。
（項目７）
アシル還元経路酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む、項目１に記載の天然に存在しない微生物。
（項目８）
アシル還元経路酵素をコードする前記外因性核酸が、アシル−ＣｏＡレダクターゼを含む、項目７に記載の天然に存在しない微生物。
（項目９）
アシル還元経路酵素をコードする前記外因性核酸が、アルコールデヒドロゲナーゼを含む、項目７に記載の天然に存在しない微生物。
（項目１０）
アシル還元経路酵素をコードする前記外因性核酸が、アシル−ＣｏＡレダクターゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素を含む、項目７に記載の天然に存在しない微生物。
（項目１１）
アシル−ＣｏＡレダクターゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有する前記酵素が、脂肪アルコール形成性アシル−ＣｏＡレダクターゼ（ＦＡＲ）を含む、項目１０に記載の天然に存在しない微生物。
（項目１２）
前記少なくとも１つの外因性核酸が、異種コード核酸をさらに含む、項目１に記載の天然に存在しない微生物。
（項目１３）
前記第一級アルコールが、マロニル−ＣｏＡ非依存性ＦＡＳ経路酵素をコードする前記外因性核酸を欠く微生物と比較して、少なくとも１０％多いレベルの量で生産される、請求項１に記載の天然に存在しない微生物。
（項目１４）
実質的に嫌気性の培養基をさらに含む、項目１に記載の天然に存在しない微生物。
（項目１５）
前記第一級アルコールが、４〜２４個の間の炭素原子を有するアルコールを含む、項目１に記載の天然に存在しない微生物。
（項目１６）
４〜２４個の間の炭素原子を有する前記アルコールが、ブタノール、ヘキサノール、ヘプタノール、オクタノール、ノナノール、デカノール、ドデカノール、テトラデカノールまたはヘキサデカノールから選択される、項目１５に記載の天然に存在しない微生物。
（項目１７）
第一級アルコールを生産するために十分な量で発現される、マロニル−ＣｏＡ非依存性脂肪酸合成（ＦＡＳ）経路をコードする外因性核酸とアシル還元経路をコードする外因性核酸とを含む、天然に存在しない微生物であって、前記マロニルＣｏＡ非依存性ＦＡＳ経路が、ケトアシル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼまたはケトアシル−ＣｏＡチオラーゼ、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼおよびエノイル−ＣｏＡレダクターゼをコードする外因性核酸を含み、前記アシル還元経路が、アシル−ＣｏＡレダクターゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼをコードする１つ以上の外因性核酸を含む、天然に存在しない微生物。
（項目１８）
前記マロニル−ＣｏＡ非依存性ＦＡＳ経路をコードする前記外因性核酸が、ケトアシル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼおよびエノイル−ＣｏＡレダクターゼを含む、項目１７に記載の天然に存在しない微生物。
（項目１９）
前記マロニル−ＣｏＡ非依存性ＦＡＳ経路をコードする前記外因性核酸が、ケトアシル−ＣｏＡチオラーゼ、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、エノイル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼおよびエノイル−ＣｏＡレダクターゼを含む、項目１７に記載の天然に存在しない微生物。
（項目２０）
アシル還元経路をコードする前記１つ以上の外因性核酸が、２つの外因性核酸を含む、項目１７に記載の天然に存在しない微生物。
（項目２１）
アシル還元経路をコードする１つの外因性核酸が、アシル−ＣｏＡレダクターゼをコードし、およびアシル還元経路をコードする第二の外因性核酸が、アルコールデヒドロゲナーゼをコードする、項目２０に記載の天然に存在しない微生物。
（項目２２）
アシル還元経路をコードする前記１つ以上の外因性核酸が、アシル−ＣｏＡレダクターゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼ活性を含む酵素をコードする、項目１７に記載の天然に存在しない微生物。
（項目２３）
アシル−ＣｏＡレダクターゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼ活性を含む前記酵素が、脂肪アルコール形成性アシル−ＣｏＡレダクターゼ（ＦＡＲ）を含む、項目２２に記載の天然に存在しない微生物。
（項目２４）
前記外因性核酸の少なくとも１つが、異種コード核酸をさらに含む、項目１７に記載の天然に存在しない微生物。
（項目２５）
前記第一級アルコールが、マロニル−ＣｏＡ非依存性ＦＡＳ経路をコードする前記外因性核酸およびアシル還元経路をコードする外因性核酸を欠く微生物と比較して、少なくとも１０％多いレベルの量で生産される、項目１７に記載の天然に存在しない微生物。
（項目２６）
実質的に嫌気性の培養基をさらに含む、項目１７に記載の天然に存在しない微生物。
（項目２７）
前記第一級アルコールが、４〜２４個の間の炭素原子を有するアルコールを含む、項目１７に記載の天然に存在しない微生物。
（項目２８）
４〜２４個の間の炭素原子を有する前記アルコールが、ブタノール、ヘキサノール、ヘプタノール、オクタノール、ノナノール（ｎａｎａｎｏｌ）、デカノール、ドデカノール、テトラデカノールまたはヘキサデカノールから選択される、項目２７に記載の天然に存在しない微生物。
（項目２９）
第一級アルコールを生産するための方法であって、第一級アルコールを生産するために十分な量で発現される、マロニル−ＣｏＡ非依存性ＦＡＳ経路酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む、マロニル−ＣｏＡ非依存性脂肪酸合成（ＦＡＳ）経路とアシル還元経路とを有する天然に存在しない微生物を、実質的に嫌気性の条件下で、前記第一級アルコールを生産するために十分な期間にわたって培養することを含み、前記マロニル−ＣｏＡ非依存性ＦＡＳ経路が、ケトアシル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼまたはケトアシル−ＣｏＡチオラーゼ、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼおよびエノイル−ＣｏＡレダクターゼを含み、前記アシル還元経路が、アシル−ＣｏＡレダクターゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼを含む、方法。
（項目３０）
前記微生物が、マロニル−ＣｏＡ非依存性ＦＡＳ経路酵素をそれぞれがコードする２つの外因性核酸を含む、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
前記微生物が、マロニル−ＣｏＡ非依存性ＦＡＳ経路酵素をそれぞれがコードする３つの外因性核酸を含む、項目２９に記載の方法。
（項目３２）
前記微生物が、マロニル−ＣｏＡ非依存性ＦＡＳ経路酵素をそれぞれがコードする４つの外因性核酸を含む、項目２９に記載の方法。
（項目３３）
前記４つの外因性核酸が、ケトアシル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼおよびエノイル−ＣｏＡレダクターゼをコードする、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
前記４つの外因性核酸が、ケトアシル−ＣｏＡチオラーゼ、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼおよびエノイル−ＣｏＡレダクターゼをコードする、項目３２に記載の方法。
（項目３５）
前記微生物が、アシル還元経路酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む、項目２９に記載の方法。
（項目３６）
アシル還元経路酵素をコードする前記外因性核酸が、アシル−ＣｏＡレダクターゼを含む、項目３５に記載の方法。
（項目３７）
アシル還元経路酵素をコードする前記外因性核酸が、アルコールデヒドロゲナーゼを含む、項目３５に記載の方法。
（項目３８）
アシル還元経路酵素をコードする前記外因性核酸が、アシル−ＣｏＡレダクターゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素を含む、項目３５に記載の方法。
（項目３９）
アシル−ＣｏＡレダクターゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼ活性を有する前記酵素が、脂肪アルコール形成性アシル−ＣｏＡレダクターゼ（ＦＡＲ）を含む、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
前記少なくとも１つの外因性核酸が、異種コード核酸をさらに含む、項目２９に記載の方法。
（項目４１）
前記第一級アルコールが、マロニル−ＣｏＡ非依存性ＦＡＳ経路酵素をコードする前記外因性核酸を欠く微生物と比較して、少なくとも１０％多いレベルの量で生産される、項目２９に記載の方法。
（項目４２）
前記第一級アルコールが、４〜２４個の間の炭素原子を有するアルコールを含む、項目２９に記載の方法。
（項目４３）
２〜２４個の間の炭素原子を有する前記アルコールが、ブタノール、ヘキサノール、ヘプタノール、オクタノール、ノナノール（ｎａｎａｎｏｌ）、デカノール、ドデカノール、テトラデカノールまたはヘキサデカノールから選択される、項目４２に記載の方法。
（項目４４）
前記第一級アルコールを単離することをさらに含む、項目２９に記載の方法。
（項目４５）
１つ以上の遺伝子破壊を含む天然に存在しない微生物であって、前記１つ以上の遺伝子破壊が、酵素（前記酵素は、前記遺伝子破壊が前記酵素の活性を低下させたときに、前記天然に存在しない微生物の増殖に長鎖アルコール（ＬＣＡ）生産を連動させるものである）をコードする遺伝子において生じ、それによって前記１つ以上の遺伝子破壊が、前記天然に存在しない微生物にＬＣＡの生産を付与するものである、天然に存在しない微生物。
（項目４６）
株が、実質的に嫌気性の培養基中に存在する、項目４５に記載の天然に存在しない微生物。
（項目４７）
前記１つ以上の遺伝子破壊が、前記１つ以上の遺伝子の欠失を含む、項目４５に記載の天然に存在しない微生物。
（項目４８）
前記１つ以上の遺伝子破壊が、アセトアルデヒド−ＣｏＡデヒドロゲナーゼおよび乳酸デヒドロゲナーゼからなる群より選択される酵素をコードする、項目４５に記載の天然に存在しない微生物。
（項目４９）
前記１つ以上の遺伝子破壊が、ピルビン酸ギ酸リアーゼ、ホスホトランスアセチラーゼ、酢酸キナーゼ、フマル酸レダクターゼ、フマラーゼ、およびリンゴ酸デヒドロゲナーゼからなる群より選択されるコードされた酵素をさらに含む、項目４８に記載の天然に存在しない微生物。
（項目５０）
前記１つ以上の遺伝子破壊が、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、ＮＡＤ（Ｐ）トランスヒドロゲナーゼ、およびＡＴＰシンターゼからなる群より選択されるコードされた酵素をさらに含む、項目４９に記載の天然に存在しない微生物。
（項目５１）
前記１つ以上の遺伝子破壊が、表Ｉにおける設計Ｉ〜ＸＸＩによってもたらされる、項目４５に記載の天然に存在しない微生物。
（項目５２）
ＬＣＡを生産するための方法であって、１つ以上の遺伝子破壊を含む天然に存在しない微生物を培養することを含み、前記１つ以上の遺伝子破壊が、酵素（前記酵素は、前記遺伝子破壊が前記酵素の活性を低下させたときに、前記微生物の増殖にＬＣＡ生産を連動させるものである）をコードする遺伝子において生じ、それによって、前記１つ以上の遺伝子破壊が前記微生物にＬＣＡの生産を付与するものである、方法。
（項目５３）
前記培養が、実質的に嫌気性の培養基において行われる、項目５２に記載の方法。
（項目５４）
前記１つ以上の遺伝子破壊が、前記１つ以上の遺伝子の欠失を含む、項目５２に記載の方法。
（項目５５）
前記１つ以上の遺伝子破壊が、アセトアルデヒド−ＣｏＡデヒドロゲナーゼおよび乳酸デヒドロゲナーゼからなる群より選択される酵素をコードする、項目５４に記載の方法。
（項目５６）
前記１つ以上の遺伝子破壊が、ピルビン酸ギ酸リアーゼ、ホスホトランスアセチラーゼ、酢酸キナーゼ、フマル酸レダクターゼ、フマラーゼ、およびリンゴ酸デヒドロゲナーゼからなる群より選択されるコードされた酵素をさらに含む、項目５５に記載の方法。
（項目５７）
前記１つ以上の遺伝子破壊が、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、ＮＡＤ（Ｐ）トランスヒドロゲナーゼ、およびＡＴＰシンターゼからなる群より選択されるコードされた酵素をさらに含む、項目５６に記載の方法。
（項目５８）
前記１つ以上の遺伝子破壊が、表Ｉにおける設計Ｉ〜ＸＸＩによってもたらされる、項目５２に記載の天然に存在しない微生物。
（項目５９）
１つ以上の遺伝子破壊を含む天然に存在しない真核生物であって、前記１つ以上の遺伝子破壊が、サイトゾルピルビン酸デカルボキシラーゼ、ミトコンドリアピルビン酸デヒドロゲナーゼ、サイトゾルエタノール特異的アルコールデヒドロゲナーゼおよびミトコンドリアエタノール特異的アルコールデヒドロゲナーゼからなる群より選択される酵素をコードする遺伝子において生じ、前記１つ以上の遺伝子破壊が、前記生物のサイトゾルにおける長鎖アルコールの生産を付与する、天然に存在しない真核生物。
（項目６０）
長鎖アルコールの生産が、増殖に連動している、項目５９に記載の生物。
（項目６１）
長鎖アルコールの生産が、増殖に連動していない、項目５９に記載の生物。
（項目６２）
前記１つ以上の遺伝子破壊が、ＹＬＲ０４４Ｃ、ＹＬＲ１３４Ｗ、ＹＧＲ０８７Ｃ、ＰＤＣ３、ＹＮＬ０７１Ｗ、ＹＥＲ１７８Ｗ、ＹＢＲ２２１Ｃ、ＹＧＲ１９３Ｃ、ＹＦＬ０１８Ｃ、ＹＢＲ１４５Ｗ、ＹＧＬ２５６Ｗ、ＹＯＬ０８６Ｃ、ＹＭＲ３０３、ＹＭＲ０８３Ｗ、ＹＰＬ０８８Ｗ、ＹＡＬ０６１Ｗ、ＹＭＲ３１８Ｃ、ＹＣＲ１０５Ｗ、およびＹＤＬ１６８Ｗからなる群より選択される遺伝子におけるものである、項目５９に記載の生物。
（項目６３）
株が、実質的に嫌気性の培養基中に存在する、項目５９に記載の生物。
（項目６４）
株が、微好気性培養基中に存在する、項目５９に記載の生物。
（項目６５）
前記１つ以上の遺伝子破壊が、前記１つ以上の遺伝子の欠失を含む、項目５９に記載の生物。
（項目６６）
サイトゾルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼシャトル、外部ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ、およびミトコンドリア内部ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼからなる群より選択される酵素をコードする１つ以上の遺伝子破壊をさらに含む、項目５９に記載の生物。
（項目６７）
前記１つ以上の遺伝子破壊が、ＹＯＬ１２６Ｃ、ＹＤＬ０２２Ｗ、ＹＯＬ０５９Ｗ、ＹＩＬ１５５Ｃ、ＹＭＲ１４５Ｃ、ＹＤＬ０８５Ｗ、およびＹＭＬ１２０Ｃからなる群より選択される遺伝子におけるものである、項目６６に記載の生物。
（項目６８）
アセチル−ＣｏＡシンセターゼ（ＡＭＰ形成性）、ＡＤＰ依存性酢酸−ＣｏＡリガーゼ、アシル化アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸：ＮＡＤＰオキシドレダクターゼ、およびピルビン酸ギ酸リアーゼからなる群より選択される酵素；またはその遺伝子調節領域をコードする外因性核酸をサイトゾル内にさらに含む、項目５９に記載の生物。
（項目６９）
サイトゾルトランスヒドロゲナーゼまたはその遺伝子調節領域をコードする外因性核酸をさらに含む、項目６８に記載の生物。
（項目７０）
１つ以上の遺伝子破壊を含む天然に存在しない真核生物であって、前記１つ以上の遺伝子破壊が、サイトゾルピルビン酸デカルボキシラーゼ、サイトゾルエタノール特異的アルコールデヒドロゲナーゼ、およびミトコンドリアエタノール特異的アルコールデヒドロゲナーゼからなる群より選択される酵素をコードする遺伝子において生じ、前記１つ以上の遺伝子破壊が、前記生物のミトコンドリアにおける長鎖アルコールの生産をもたらすものである、天然に存在しない真核生物。
（項目７１）
長鎖アルコールの生産が、増殖に連動している、項目７０に記載の生物。
（項目７２）
長鎖アルコールの生産が、増殖に連動していない、項目７０に記載の生物。
（項目７３）
前記１つ以上の遺伝子破壊が、ＹＬＲ０４４Ｃ、ＹＬＲ１３４Ｗ、ＹＧＲ０８７Ｃ、ＰＤＣ３、ＹＢＲ１４５Ｗ、ＹＧＬ２５６Ｗ、ＹＯＬ０８６Ｃ、ＹＭＲ３０３、ＹＭＲ０８３Ｗ、ＹＰＬ０８８Ｗ、ＹＡＬ０６１Ｗ、ＹＭＲ３１８Ｃ、ＹＣＲ１０５Ｗ、およびＹＤＬ１６８Ｗからなる群より選択される遺伝子におけるものである、項目７０に記載の生物。
（項目７４）
リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、外部ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼおよび内部ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼによって触媒されるグリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼシャトルからなる群より選択される酵素をコードする１つ以上の遺伝子破壊をさらに含む、項目７０に記載の生物。
（項目７５）
前記１つ以上の遺伝子破壊が、ＹＯＬ１２６Ｃ、ＹＤＬ０２２Ｗ、ＹＯＬ０５９Ｗ、ＹＩＬ１５５Ｃ、ＹＭＲ１４５Ｃ、ＹＤＬ０８５Ｗ、およびＹＭＬ１２０Ｃからなる群より選択される遺伝子におけるものである、項目７４に記載の生物。
（項目７６）
ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸：ＮＡＤＰオキシドレダクターゼ、ピルビン酸ギ酸リアーゼ、アシル化アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ、酢酸ＣｏＡリガーゼ、およびＡＭＰ形成性アセチルＣｏＡシンセターゼからなる群より選択される酵素；またはその遺伝子調節領域をコードする外因性核酸をミトコンドリア内にさらに含む、項目７０に記載の生物。
（項目７７）
サイトゾルからミトコンドリアへのＮＡＤＨの輸送のための増強されたＮＡＤＨ輸送シャトルシステムをさらに含む、項目７６に記載の生物。
（項目７８）
トランスヒドロゲナーゼ、ギ酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、およびピルビン酸オキシダーゼからなる群より選択される酵素；またはその遺伝子調節領域をコードする外因性核酸をミトコンドリア内にさらに含む、項目７６に記載の生物。
（項目７９）
株が、実質的に嫌気性の培養基中に存在する、項目７０に記載の生物。
（項目８０）
株が、微好気性培養基中に存在する、項目７０に記載の生物。
（項目８１）
酵母または真菌である、項目５９または７０のいずれか一項に記載の生物。
（項目８２）
前記酵母が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅを含むＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓおよびＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓを含むＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ種、ならびにＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓを含むＰｉｃｈｉａ種からなる群より選択される、項目８１に記載の生物。
（項目８３）
前記酵母が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである、項目８２に記載の生物。
（項目８４）
前記真菌が、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒを含むＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ種、ならびにＲｈｉｚｏｐｕｓ  ａｒｒｈｉｚｕｓおよびＲｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅを含むＲｈｉｚｏｐｕｓ種からなる群より選択される、項目８１に記載の生物。
（項目８５）
項目５９に記載の天然に存在しない真核生物を培養することを含む、長鎖アルコールの生産方法。
（項目８６）
長鎖アルコールの生産が、増殖に連動している、項目８５に記載の方法。
（項目８７）
長鎖アルコールの生産が、増殖に連動していない、項目８５に記載の方法。
（項目８８）
前記１つ以上の遺伝子破壊が、ＹＬＲ０４４Ｃ、ＹＬＲ１３４Ｗ、ＹＧＲ０８７Ｃ、ＰＤＣ３、ＹＮＬ０７１Ｗ、ＹＥＲ１７８Ｗ、ＹＢＲ２２１Ｃ、ＹＧＲ１９３Ｃ、ＹＦＬ０１８Ｃ、ＹＢＲ１４５Ｗ、ＹＧＬ２５６Ｗ、ＹＱＬ０８６Ｃ、ＹＭＲ３０３、ＹＭＲ０８３Ｗ、ＹＰＬ０８８Ｗ、ＹＡＬ０６１Ｗ、ＹＭＲ３１８Ｃ、ＹＣＲ１０５Ｗ、およびＹＤＬ１６８Ｗからなる群より選択される遺伝子におけるものである、項目８５に記載の方法。
（項目８９）
株が、実質的に嫌気性の培地において培養される、項目８５に記載の方法。
（項目９０）
株が、微好気性培地において培養される、項目８５に記載の方法。
（項目９１）
前記１つ以上の遺伝子破壊が、前記１つ以上の遺伝子の欠失を含む、項目８５に記載の方法。
（項目９２）
サイトゾルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼシャトル、外部ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ、およびミトコンドリア内部ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼからなる群より選択される酵素をコードする１つ以上の遺伝子破壊をさらに含む、請求項８５に記載の方法。
（項目９３）
前記１つ以上の遺伝子破壊が、ＹＯＬ１２６Ｃ、ＹＤＬ０２２Ｗ、ＹＯＬ０５９Ｗ、ＹＩＬ１５５Ｃ、ＹＭＲ１４５Ｃ、ＹＤＬ０８５Ｗ、およびＹＭＬ１２０Ｃからなる群より選択される遺伝子におけるものである、項目９２に記載の方法。
（項目９４）
アセチル−ＣｏＡシンセターゼ（ＡＭＰ形成性）、ＡＤＰ依存性酢酸−ＣｏＡリガーゼ、アシル化アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸：ＮＡＤＰオキシドレダクターゼ、およびピルビン酸ギ酸リアーゼからなる群より選択される酵素；またはその遺伝子調節領域をコードする外因性核酸をサイトゾル内にさらに含む、項目８５に記載の方法。
（項目９５）
サイトゾルトランスヒドロゲナーゼまたはその遺伝子調節領域をコードする外因性核酸をさらに含む、項目９４に記載の方法。
（項目９６）
項目７０に記載の天然に存在しない真核生物を培養することを含む、長鎖アルコールの生産方法。
（項目９７）
長鎖アルコールの生産が、増殖に連動している、項目９６に記載の生物。
（項目９８）
長鎖アルコールの生産が、増殖に連動していない、項目９６に記載の生物。
（項目９９）
前記１つ以上の遺伝子破壊が、ＹＬＲ０４４Ｃ、ＹＬＲ１３４Ｗ、ＹＧＲ０８７Ｃ、ＰＤＣ３、ＹＢＲ１４５Ｗ、ＹＧＬ２５６Ｗ、ＹＯＬ０８６Ｃ、ＹＭＲ３０３、ＹＭＲ０８３Ｗ、ＹＰＬ０８８Ｗ、ＹＡＬ０６１Ｗ、ＹＭＲ３１８Ｃ、ＹＣＲ１０５Ｗ，およびＹＤＬ１６８Ｗからなる群より選択される遺伝子におけるものである、項目９６に記載の方法。
（項目１００）
サイトゾルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ、外部ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼおよび内部ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼによって触媒されるグリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼシャトルからなる群より選択される酵素をコードする１つ以上の遺伝子破壊をさらに含む、項目９６に記載の方法。
（項目１０１）
前記１つ以上の遺伝子破壊が、ＹＯＬ１２６Ｃ、ＹＤＬ０２２Ｗ、ＹＯＬ０５９Ｗ、ＹＩＬ１５５Ｃ、ＹＭＲ１４５Ｃ、ＹＤＬ０８５Ｗ、およびＹＭＬ１２０Ｃからなる群より選択される遺伝子におけるものである、項目１００に記載の方法。
（項目１０２）
ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸：ＮＡＤＰオキシドレダクターゼ、ピルビン酸ギ酸リアーゼ、アシル化アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ、酢酸ＣｏＡリガーゼ、およびＡＭＰ形成性アセチルＣｏＡシンセターゼからなる群より選択される酵素；またはその遺伝子調節領域をコードする外因性核酸をミトコンドリア内にさらに含む、項目９６に記載の方法。
（項目１０３）
サイトゾルからミトコンドリアへのＮＡＤＨの輸送のための強化されたＮＡＤＨ輸送シャトルシステムをさらに含む、項目１０２に記載の方法。
（項目１０４）
トランスヒドロゲナーゼ、ギ酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、およびピルビン酸オキシダーゼからなる群より選択される酵素；またはその遺伝子調節領域をコードする外因性核酸をミトコンドリア内にさらに含む、項目１０２に記載の方法。
（項目１０５）
前記生物が、酵母または真菌である、項目８５または９６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０６）
前記酵母が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅを含むＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓおよびＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓを含むＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ種、ならびにＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓを含むＰｉｃｈｉａ種からなる群より選択される、項目１０５に記載の方法。
（項目１０７）
前記酵母が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである、項目１０６に記載の方法。
（項目１０８）
前記真菌が、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒを含むＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ種、ならびにＲｈｉｚｏｐｕｓ  ａｒｒｈｉｚｕｓおよびＲｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅを含むＲｈｉｚｏｐｕｓ種からなる群より選択される、項目１０５に記載の方法。
（項目１０９）
株が、実質的に嫌気性の培地において培養される、項目９６に記載の方法。
（項目１１０）
株が、微好気性培地において培養される、項目９６に記載の方法。
（項目１１１）
脂肪アシル−ＣｏＡを生産するために十分な量で発現されるマロニル−ＣｏＡ非依存性ＦＡＳ経路酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含むマロニル−ＣｏＡ非依存性脂肪酸合成（ＦＡＳ）経路を有する微生物を含む、天然に存在しない微生物であって、前記マロニル−ＣｏＡ非依存性ＦＡＳ経路が、ケトアシル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼまたはケトアシル−ＣｏＡチオラーゼ、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼおよびエノイル−ＣｏＡレダクターゼを含む、天然に存在しない微生物。
（項目１１２）
脂肪酸エステルまたはワックスを生成するために十分な量で発現されるマロニル−ＣｏＡ非依存性ＦＡＳ経路酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む、マロニル−ＣｏＡ非依存性脂肪酸合成（ＦＡＳ）経路とワックスエステルシンターゼとを有する微生物を含む、天然に存在しない微生物であって、前記マロニル−ＣｏＡ非依存性ＦＡＳ経路が、ケトアシル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼまたはケトアシル−ＣｏＡチオラーゼ、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼおよびエノイル−ＣｏＡレダクターゼを含む、天然に存在しない微生物。
（項目１１３）
脂肪酸エステルまたはワックスを生産するために十分な量で発現されるマロニル−ＣｏＡ非依存性ＦＡＳ経路酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む、マロニル−ＣｏＡ非依存性脂肪酸合成（ＦＡＳ）経路とアルコールアセチルトランスフェラーゼとを有する微生物を含む、天然に存在しない微生物であって、前記マロニル−ＣｏＡ非依存性ＦＡＳ経路が、ケトアシル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼまたはケトアシル−ＣｏＡチオラーゼ、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼおよびエノイル−ＣｏＡレダクターゼを含む、天然に存在しない微生物。