【手続補正書】
【提出日】平成15年7月28日(2003.7.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１ＤＮＡポリメラーゼとして、改変前の３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼに比べて、０〜５％である３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する改変された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含み、および、第２ＤＮＡポリメラーゼとして、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼまたは改変前の３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼに比べて、１００〜６％である３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する改変された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含み、第１ＤＮＡポリメラーゼおよび第２ＤＮＡポリメラーゼが、少なくとも３０塩基／秒であるＤＮＡ合成速度、ｐＨ８．８（２５℃での測定値）にて９５℃、６時間の処理で６０％以上の残存活性を保持することができる熱安定性を有することを特徴とする核酸増幅用ＤＮＡポリメラーゼ組成物。
【請求項２】
ＤＮＡを鋳型とし、プライマー、ｄＮＴＰおよび請求項１記載の核酸増幅用ＤＮＡポリメラーゼ組成物を含む試薬を反応させて、プライマーを伸長して、ＤＮＡプライマー伸長物を合成することを特徴とする核酸増幅法。
【請求項３】
請求項１記載の核酸増幅用ＤＮＡポリメラーゼ組成物、２価イオン、１価イオン、プライマー、ｄＮＴＰおよび緩衝液を含む核酸増幅用試薬。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００６】
【課題を解決するための手段】
そこで、本発明者らは鋭意検討した結果、核酸増幅用のＤＮＡポリメラーゼ組成物であって、第１ＤＮＡポリメラーゼと、ポリメラーゼ活性単位で測定すると第１ＤＮＡポリメラーゼよりも少量の第２ＤＮＡポリメラーゼの組み合わせからなり、熱安定性およびＤＮＡ合成速度がほぼ等しいＤＮＡポリメラーゼ、具体的には前記第１ＤＮＡポリメラーゼが天然に存在する該酵素に比べて、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性が０〜５％である改変された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼであり、そして前記第２ＤＮＡポリメラーゼが天然に存在する３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、または天然に存在する該酵素に比べて、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性が１００〜６％である改変されたＤＮＡポリメラーゼよりなる群から選択されるＤＮＡポリメラーゼであるＤＮＡポリメラーゼ組成物を用いることにより、増幅効率の優れたＰＣＲが行えることを見い出し、本発明に到達した。
すなわち、本発明は以下のようなものである。
項１．    第１ＤＮＡポリメラーゼとして、改変前の３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼに比べて、０〜５％である３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する改変された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含み、および、第２ＤＮＡポリメラーゼとして、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼまたは改変前の３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼに比べて、１００〜６％である３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する改変された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含み、第１ＤＮＡポリメラーゼおよび第２ＤＮＡポリメラーゼが、少なくとも３０塩基／秒であるＤＮＡ合成速度、ｐＨ８．８（２５℃での測定値）にて９５℃、６時間の処理で６０％以上の残存活性を保持することができる熱安定性を有することを特徴とする核酸増幅用ＤＮＡポリメラーゼ組成物。
項２．  第２ＤＮＡポリメラーゼの活性が、第１ＤＮＡポリメラーゼの活性よりも小さい、項１記載の核酸増幅用ＤＮＡポリメラーゼ組成物。
項３．  第１ＤＮＡポリメラーゼ２．５単位につき、第２ＤＮＡポリメラーゼが０．０２〜０．１単位である、項１記載の核酸増幅用ＤＮＡポリメラーゼ組成物。
項４．  第１ＤＮＡポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性が、改変前の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性に比べて、約１％以下に低下したものである、項１記載のＤＮＡポリメラーゼ組成物。
項５．  第１ＤＮＡポリメラーゼが、下記理化学的性質を有する改変された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼである、項１記載のＤＮＡポリメラーゼ組成物。
作用：ＤＮＡ合成活性を有し、改変前の酵素に比べて、０〜５％である３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する。
ＤＮＡ合成速度：少なくとも３０塩基／秒
熱安定性：ｐＨ８．８（２５℃での測定値）にて９５℃、６時間の処理で６０％以上の残存活性を保持することができる。
項６．  第１ＤＮＡポリメラーゼが下記理化学的性質を有する改変された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼである、項１記載のＤＮＡポリメラーゼ組成物。
作用：ＤＮＡ合成活性を有し、改変前の酵素に比べて、０〜５％である３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する。
ＤＮＡ合成速度：少なくとも３０塩基／秒
熱安定性：ｐＨ８．８（２５℃での測定値）にて９５℃、６時間の処理で６０％以上の残存活性を保持することができる。
至適温度：約７５℃
分子量：８８〜９０ＫＤａ
アミノ酸配列：配列番号２に記載のアミノ酸配列の第１４１、１４２、１４３、２１０および３１１番目のアミノ酸の少なくとも１つを他の                アミノ酸に置換したアミノ酸配列
項７．  第１ＤＮＡポリメラーゼが、下記理化学的性質を有する改変された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼである、項１記載のＤＮＡポリメラーゼ組成物。
作用：ＤＮＡ合成活性を有し、改変前の酵素に比べて、０〜５％である３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する。
ＤＮＡ合成速度：少なくとも３０塩基／秒
熱安定性：ｐＨ８．８（２５℃での測定値）にて９５℃、６時間の処理で６０％以上の残存活性を保持することができる。
至適温度：約７５℃
分子量：８８〜９０ＫＤａ
アミノ酸配列：配列番号２の第１４１番目のアスパラギン酸をアラニンに、第１４２番目のイソロイシンをアルギニンに、第１４３番目のグルタミン酸をアラニンに、第１４１番目のアスパラギン酸と第１４３番目のグルタミン酸をアラニンに、第２１０番目のアスパラギンをアスパラギン酸に、第３１１番目のチロシンをフェニルアラニンに置換したアミノ酸配列
項８．  第１ＤＮＡポリメラーゼが、配列番号２の第１４１番目のアスパラギン酸をアラニンに置換した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼである、項１記載のＤＮＡポリメラーゼ組成物。
項９．  第１ＤＮＡポリメラーゼが、配列番号２の第１４２番目のイソロイシンをアルギニンに置換した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼである、項１記載のＤＮＡポリメラーゼ組成物。
項１０．  第１ＤＮＡポリメラーゼが、配列番号２の第１４３番目のグルタミン酸をアラニンに置換した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼである、項１記載のＤＮＡポリメラーゼ組成物。
項１１．  第１ＤＮＡポリメラーゼが、配列番号２の第１４１番目のアスパラギン酸と第１４３番目のグルタミン酸をアラニンに置換した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼである、項１記載のＤＮＡポリメラーゼ組成物。
項１２．  第１ＤＮＡポリメラーゼが、配列番号２の第２１０番目のアスパラギンをアスパラギン酸に置換した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼである、項１記載のＤＮＡポリメラーゼ組成物。
項１３．  第１ＤＮＡポリメラーゼが、配列番号２の第３１１番目のチロシンをフェニルアラニンに置換した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼである、項１記載のＤＮＡポリメラーゼ組成物。
項１４．  第２ＤＮＡポリメラーゼが、下記理化学的性質を有する改変された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼである、項１記載のＤＮＡポリメラーゼ組成物。
作用：ＤＮＡ合成活性を有し、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する。
ＤＮＡ合成速度：少なくとも３０塩基／秒
熱安定性：ｐＨ８．８（２５℃での測定値）にて９５℃、６時間の処理で６０％以上の残存活性を保持することができる。
至適温度：約７５℃
分子量：８８〜９０ＫＤａ
アミノ酸配列：配列番号２に記載のアミノ酸配列
項１５．  第２ＤＮＡポリメラーゼが、下記理化学的性質を有する改変された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼである、項１記載のＤＮＡポリメラーゼ組成物。
作用：ＤＮＡ合成活性を有し、改変前の酵素に比べて、１００〜６％である３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する。
ＤＮＡ合成速度：少なくとも３０塩基／秒
熱安定性：ｐＨ８．８（２５℃での測定値）にて９５℃、６時間の処理で６０％以上の残存活性を保持することができる。
アミノ酸配列：配列番号２に記載のアミノ酸配列のエキソ１（ＥＸＯ１）領域に存在するアミノ酸配列、Ｘ１  ＤＸ２  ＥＸ３  モチーフのうち、Ｘ１  、Ｘ２  およびＸ３  の少なくとも１つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換したアミノ酸配列
項１６．  第２ＤＮＡポリメラーゼが、下記理化学的性質を有する改変された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼである、項１記載のＤＮＡポリメラーゼ組成物。
作用：ＤＮＡ合成活性を有し、改変前の酵素に比べて、１００〜６％である３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する。
ＤＮＡ合成速度：少なくとも３０塩基／秒
熱安定性：ｐＨ８．８（２５℃での測定値）にて９５℃、６時間の処理で６０％以上の残存活性を保持することができる。
アミノ酸配列：配列番号２の第１４０、１４２および１４４番目のアミノ酸を他のアミノ酸に置換したアミノ酸配列
項１７．  第２ＤＮＡポリメラーゼが、下記理化学的性質を有する改変された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼである、項１記載のＤＮＡポリメラーゼ組成物。
作用：ＤＮＡ合成活性を有し、改変前の酵素に比べて、１００〜６％である３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する。
ＤＮＡ合成速度：少なくとも３０塩基／秒
熱安定性：ｐＨ８．８（２５℃での測定値）にて９５℃、６時間の処理で６０％以上の残存活性を保持することができる。
至適温度：約７５℃
分子量：８８〜９０ＫＤａ
アミノ酸配列：配列番号２の第１４２番目のイソロイシンをアスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミンまたはリジンに置換したアミノ酸配列または第１４４番目のスレオニンンをバリンに置換したアミノ酸配列
項１８．  第２ＤＮＡポリメラーゼが、配列番号２の第１４２番目のイソロイシンをアスパラギン酸に置換した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼである、項１記載のＤＮＡポリメラーゼ組成物。
項１９．  第２ＤＮＡポリメラーゼが、配列番号２の第１４２番目のイソロイシンをグルタミン酸に置換した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼである、項１記載のＤＮＡポリメラーゼ組成物。
項２０．  第２ＤＮＡポリメラーゼが、配列番号２の第１４２番目のイソロイシンをアスパラギンに置換した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼである、項１記載のＤＮＡポリメラーゼ組成物。
項２１．  第２ＤＮＡポリメラーゼが、配列番号２の第１４２番目のイソロイシンをグルタミンに置換した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼである、項１記載のＤＮＡポリメラーゼ組成物。
項２２．  第２ＤＮＡポリメラーゼが、配列番号２の第１４２番目のイソロイシンをリジンに置換した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼである、項１記載のＤＮＡポリメラーゼ組成物。
項２３．  第２ＤＮＡポリメラーゼが、配列番号２の第１４２番目のイソロイシンをアルギニンに置換した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼである、項１記載のＤＮＡポリメラーゼ組成物。
項２４．  第２ＤＮＡポリメラーゼが、配列番号２の第１４４番目のスレオニンをバリンに置換した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼである、項１記載のＤＮＡポリメラーゼ組成物。
項２５．  下記第１ＤＮＡポリメラーゼおよび下記第２ＤＮＡポリメラーゼを含むことを特徴とする核酸増幅用ＤＮＡポリメラーゼ組成物。
第１ＤＮＡポリメラーゼ：
作用：ＤＮＡ合成活性を有し、改変前の酵素に比べて、０〜５％である３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する。
ＤＮＡ合成速度：少なくとも３０塩基／秒
熱安定性：ｐＨ８．８（２５℃での測定値）にて９５℃、６時間の処理で６０％以上の残存活性を保持することができる。
至適温度：約７５℃
分子量：８８〜９０ＫＤａ
アミノ酸配列：配列番号２の第１４１番目のアスパラギン酸をアラニンに、第１４２番目のイソロイシンをアルギニンに、第１４３番目のグルタミン酸をアラニンに、第１４１番目のアスパラギン酸と第１４３番目のグルタミン酸をアラニンに、第２１０番目のアスパラギンをアスパラギン酸に、第３１１番目のチロシンをフェニルアラニンに置換したアミノ酸配列
第２ＤＮＡポリメラーゼ：
作用：ＤＮＡ合成活性を有し、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する。
ＤＮＡ合成速度：少なくとも１２０塩基／秒
熱安定性：ｐＨ８．８（２５℃での測定値）にて９５℃、６時間の処理で６０％以上の残存活性を保持することができる。
至適温度：約７５℃
分子量：８８〜９０ＫＤａ
アミノ酸配列：配列番号２に記載のアミノ酸配列
または
作用：ＤＮＡ合成活性を有し、改変前の酵素に比べて、１００〜３０％である３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する。
ＤＮＡ合成速度：少なくとも１２０塩基／秒
熱安定性：ｐＨ８．８（２５℃での測定値）にて９５℃、６時間の処理で６０％以上の残存活性を保持することができる。
至適温度：約７５℃
分子量：８８〜９０ＫＤａ
アミノ酸配列：配列番号２の第１４２番目のイソロイシンをアスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミンまたはリジンに置換したアミノ酸配列または第１４４番目のスレオニンをバリンに置換したアミノ酸配列
項２６．  ＤＮＡを鋳型とし、プライマー、ｄＮＴＰおよび、項１〜２５のいずれか１項記載の核酸増幅用ＤＮＡポリメラーゼ組成物を含む試薬を反応させて、プライマーを伸長して、ＤＮＡプライマー伸長物を合成することを特徴とする核酸増幅法。
項２７．  プライマーが２種のオリゴヌクレオチドであって、１方は他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に相補的である、項２６記載の核酸増幅法。
項２８．  加熱および冷却を繰り返す、項２６記載の核酸増幅法。
項２９．  項１〜２５のいずれか１項記載の核酸増幅用ＤＮＡポリメラーゼ組成物、２価イオン、１価イオン、プライマー、ｄＮＴＰおよび緩衝液を含む核酸増幅用試薬。
項３０．  項１〜２項のいずれか１項記載の核酸増幅用ＤＮＡポリメラーゼ組成物、マグネシウムイオンおよびアンモニウムイオンおよび／またはカリウムイオン、１方のプライマーが他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に相補的である２種のプライマー、ｄＮＴＰ、ＢＳＡおよび非イオン界面活性剤および緩衝液を含む核酸増幅用試薬。