【手続補正書】
【提出日】平成24年4月19日(2012.4.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
２．マイトジェン活性化プロテインキナーゼ活性化プロテインキナーゼ（ＭＫ２およびＭＫ３）
ＭＡＰＫ化活性プロテインキナーゼ（ＭＡＰ−ＫＡＰＫ：ＭＡＰＫ：ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ）の様々な群がマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）の下流で同定されている。これらの酵素は、ＭＡＰＫの直接の基質ではない標的タンパク質にシグナルを伝達するため、ＭＡＰＫカスケードによるリン酸化依存性シグナル伝達を多様な細胞機能に中継する働きを担う。こうした群の１つは、３つのＭＡＰＫＡＰＫ：ＭＫ２、ＭＫ３（３ｐＫとも呼ばれる）およびＭＫ５（ＰＲＡＫとも呼ばれる）により形成される。マイトジェン活性化プロテインキナーゼ活性化プロテインキナーゼ２（「ＭＡＰＫＡＰＫ２」、「ＭＡＰＫＡＰ−Ｋ２」、「ＭＫ２」とも呼ばれる）は、セリン／トレオニン（Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）プロテインキナーゼファミリーのキナーゼである。ＭＫ２は、ＭＫ３との相同性が高い（約７５％アミノ酸同一性）。ＭＫ２およびＭＫ３のキナーゼドメインは、カルシウム／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼ（ｃａｌｃｉｕｍ／ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ）（ＣａＭＫ）、ホスホリラーゼｂキナーゼ、およびリボソームＳ６キナーゼ（ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｓ６  ｋｉｎａｓｅ）（ＲＳＫ）アイソフォームのＣ末端キナーゼドメイン（Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｋｉｎａｓｅ  ｄｏｍａｉｎ）（ＣＴＫＤ）と非常に類似している（約３５％〜４０％同一性）。ｍｋ２遺伝子は、選択的にスプライシングされた２つの転写物、３７０アミノ酸（ＭＫ２Ａ）および４００アミノ酸（ＭＫ２Ｂ）をコードする。ｍｋ３遺伝子は、３８２アミノ酸の１つの転写物をコードする。ＭＫ２およびＭＫ３タンパク質は相同性が高いが、ＭＫ２ＡはＣ末端領域が短い。ＭＫ２ＢのＣ末端は、より短いＭＫ２Ａアイソフォームには存在しない機能的な二極性核局在化配列（ｎｕｃｌｅａｒ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）（ＮＬＳ）（Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｘａａ１０−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ）[配列番号４５]を含むことから、ＭＫ２アイソフォームの細胞局在は選択的スプライシングにより決定されることが示唆される。ＭＫ３も類似の核局在化配列を有する。ＭＫ２ＢとＭＫ３とに見られる核局在化配列はＤドメイン（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ）[配列番号４６]を包含し、ＤドメインはＭＫ２ＢおよびＭＫ３とｐ３８αおよびｐ３８βとの特異的相互作用を仲介することが研究により明らかになっている。ＭＫ２ＢおよびＭＫ３はさらに、ＮＬＳおよびＤドメインのＮ末端側に位置する機能的核外移行シグナル（ｎｕｃｌｅａｒ  ｅｘｐｏｒｔ  ｓｉｇｎａｌ）（ＮＥＳ）を有する。ＭＫ２ＢのＮＥＳは刺激後に核外移行を誘導するようであるが、このプロセスはレプトマイシンＢにより阻害され得る。ＭＫ２およびＭＫ３の触媒ドメインのＮ末端側の配列はプロリンに富み、１つ（ＭＫ３）または２つの（ＭＫ２）推定Ｓｒｃホモロジー３（Ｓｒｃ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ３）（ＳＨ３）ドメイン結合部位を含む。この部位はインビトロでＭＫ２がｃ−ＡｂｌのＳＨ３ドメインに結合するのを仲介することが研究により明らかになっている。最近の研究からは、このドメインがＭＫ２による細胞遊走に関与していることが示唆される。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０６】
一態様によれば、本発明は、病態生理として炎症性サイトカインの発現を含む炎症性障害を治療するキナーゼ阻害組成物であって、（ａ）治療有効量の治療用阻害ペプチドであって、治療有効量の治療用阻害ペプチドは少なくとも１種のキナーゼ酵素を阻害し、治療用阻害ペプチドは第１のドメインおよび第２のドメインを含み、第１のドメインはタンパク質形質導入ドメインを含み、かつ第２のドメインに対して近位に位置し、第２のドメインは治療ドメインを含み、かつ第１のドメインに対して近位に位置する治療用阻害ペプチド、および（ｂ）薬学的に許容されるキャリアを含み、組成物は直接的または間接的に少なくとも１種の炎症性サイトカインの発現を低下させる、組成物を提供する。一実施形態によれば、治療用阻害ペプチドは、アミノ酸配列がアミノ酸配列ＹＡＲＲＡＡＡＲＱＡＲＡＫＡＬＡＲＱＬＧＶＡＡ［配列番号７１］と実質的に同一であるペプチドである。別の実施形態によれば、治療用阻害ペプチドの治療ドメインは、アミノ酸配列ＫＡＬＮＲＱＬＧＶＡＡ［配列番号１３］と実質的に同一である。別の実施形態によれば、治療用阻害ペプチドの形質導入ドメインは、アミノ酸配列ＷＬＲＲＩＫＡＷＬＲＲＩＫＡ［配列番号３１］と実質的に同一である。別の実施形態によれば、治療用阻害ペプチドのタンパク質形質導入ドメインは、アミノ酸配列ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡ［配列番号５］と実質的に同一である。別の実施形態によれば、治療用阻害ペプチドのタンパク質形質導入ドメインは、アミノ酸配列ＦＡＫＬＡＡＲＬＹＲＫＡ［配列番号４３］と実質的に同一である。別の実施形態によれば、治療用阻害ペプチドの形質導入ドメインは、アミノ酸配列ＦＡＫＬＡＡＲＬＹＲＫＡＬＡＲＱＬＧＶＡＡ［配列番号１２］と実質的に同一である。別の実施形態によれば、治療用阻害ペプチドのタンパク質形質導入ドメインは、アミノ酸配列ＫＡＦＡＫＬＡＡＲＬＹＲＫＡ［配列番号４４］と実質的に同一である。別の実施形態によれば、治療用阻害ペプチドは、アミノ酸配列がアミノ酸配列ＫＡＦＡＫＬＡＡＲＬＹＲＫＡＬＡＲＱＬＧＶＡＡ［配列番号１５］と実質的に同一である。別の実施形態によれば、ポリペプチドは、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３および配列番号１５の少なくとも１つと少なくとも９０％同一であり、かつＴＮＦ−αの排出を阻害する少なくとも１種の変異体を含む。別の実施形態によれば、ポリペプチドは、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３および配列番号１５の少なくとも１つと少なくとも９０％同一であり、かつＩＬ−１βの排出を阻害する少なくとも１種の変異体を含む。別の実施形態によれば、ポリペプチドは、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３および配列番号１５の少なくとも１つと少なくとも９０％同一であり、かつＩＬ−６の排出を阻害する少なくとも１種の変異体を含む。別の実施形態によれば、キナーゼ酵素は、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ活性化プロテインキナーゼである。別の実施形態によれば、キナーゼ酵素は、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ活性化プロテインキナーゼ２である。別の実施形態によれば、キナーゼ酵素は、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ活性化プロテインキナーゼ３で��る。別の実施形態によれば、キナーゼ酵素は、Ｃａ２＋／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼである。別の実施形態によれば、病態生理として炎症性サイトカインの発現を含む炎症性障害は、喘息、強直性脊椎炎、Ｉ型糖尿病、Ｇｕｉｌｌｉａｍｅ−Ｂａｒｒｅ症候群、ループス、乾癬、強皮症、シェーグレン病、慢性前立腺炎、糸球体腎炎、炎症性腸疾患、骨盤内炎症性疾患、再灌流傷害、関節リウマチ、血管炎、過敏性血管炎、内毒素性ショック、膵炎、局所性炎症性疾患、アテローム性動脈硬化症、アルツハイマー病、虚血、内膜過形成、狭窄症、再狭窄、平滑筋腫、平滑筋の痙攣、アンギナ、プリンツメタル狭心症、徐脈、高血圧、心肥大、腎不全、脳卒中、肺高血圧症、妊娠中毒症、レイノー病、溶血性尿毒症、裂肛、アカラシア、インポテンツ、片頭痛、血管障害、鬱血性心不全、気絶心筋、拡張機能障害、グリオーシス、慢性閉塞性肺疾患、骨減少症、変形性関節症、敗血症、硬変、間質性線維症、大腸炎、虫垂炎、胃炎、喉頭炎、髄膜炎、耳炎、外傷性脳障害、脊髄損傷、末梢神経障害、多発性硬化症、心血管代謝症候群、非アルコール性脂肪性肝炎、膵臓および肺の嚢胞性線維症、注射部位線維症、心内膜心筋線維症、肺の特発性肺線維症、縦隔線維症、骨髄線維症、後腹膜線維症、腎性全身性線維症、乳癌、前立腺癌および内皮細胞機能障害からなる群から選択される少なくとも１つの障害である。別の実施形態によれば、少なくとも１種の炎症性サイトカインは、ＩＬ−６、ＴＮＦαおよびＩＬ−１βの少なくとも１つである。別の実施形態によれば、組成物は、生物医学装置上または生物医学装置内に配置される。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０７】
別の態様によれば、本発明は、病態生理として炎症性サイトカインの発現を含む炎症性障害を治療する方法であって、（ａ）（ｉ）治療有効量の治療用阻害ペプチドであって、治療有効量の治療用阻害ペプチドは少なくとも１種のキナーゼ酵素を阻害し、治療用阻害ペプチドは第１のドメインおよび第２のドメインを含み、第１のドメインは、第２のドメインに対して近位に位置するタンパク質形質導入ドメインを含み、第２のドメインは、第１のドメインに対して近位に治療ドメインを含む治療用阻害ペプチドと、（ｉｉ）薬学的に許容されるキャリアと、を含むキナーゼ阻害組成物を得るステップ；（ｂ）キナーゼ阻害組成物を必要としている被検体に投与し、それにより少なくとも１種のキナーゼ酵素を阻害するステップ；および（ｃ）少なくとも１種の炎症性サイトカインの発現を低下させ、それにより障害を治療するステップを含む方法を提供する。一実施形態によれば、治療用阻害ペプチドは、アミノ酸配列がアミノ酸配列ＹＡＲＲＡＡＡＲＱＡＲＡＫＡＬＡＲＱＬＧＶＡＡ［配列番号７１］と実質的に同一であるペプチドである。別の実施形態によれば、治療用阻害ペプチドの治療ドメインは、アミノ酸配列ＫＡＬＮＲＱＬＧＶＡＡ［配列番号１３］と実質的に同一である。別の実施形態によれば、治療用阻害ペプチドのタンパク質形質導入ドメインは、アミノ酸配列ＷＬＲＲＩＫＡＷＬＲＲＩＫＡ［配列番号３１］と実質的に同一である。別の実施形態によれば、治療用阻害ペプチドのタンパク質形質導入ドメインは、アミノ酸配列ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡ［配列番号５］と実質的に同一である。別の実施形態によれば、治療用阻害ペプチドのタンパク質形質導入ドメインは、アミノ酸配列ＦＡＫＬＡＡＲＬＹＲＫＡ［配列番号４３］と実質的に同一である。別の実施形態によれば、治療用阻害ペプチドのタンパク質形質導入ドメインは、アミノ酸配列ＦＡＫＬＡＡＲＬＹＲＫＡＬＡＲＱＬＧＶＡＡ［配列番号１２］と実質的に同一である。別の実施形態によれば、治療用阻害ペプチドのタンパク質形質導入ドメインは、アミノ酸配列ＫＡＦＡＫＬＡＡＲＬＹＲＫＡ［配列番号４４］と実質的に同一である。別の実施形態によれば、治療用阻害ペプチドは、アミノ酸配列がアミノ酸配列ＫＡＦＡＫＬＡＡＲＬＹＲＫＡＬＡＲＱＬＧＶＡＡ［配列番号１５］と実質的に同一であるペプチドである。別の実施形態によれば、ポリペプチドは、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３および配列番号１５の少なくとも１つと少なくとも９０％同一であり、かつＴＮＦ−αの排出を阻害する少なくとも１種の変異体を含む。別の実施形態によれば、ポリペプチドは、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３および配列番号１５の少なくとも１つと少なくとも９０％同一であり、かつＩＬ−１βの排出を阻害する少なくとも１種の変異体を含む。別の実施形態によれば、ポリペプチドは、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３および配列番号１５の少なくとも１つと少なくとも９０％同一であり、かつＩＬ−６の排出を阻害する少なくとも１種の変異体を含む。別の実施形態によれば、キナーゼ酵素は、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ活性化プロテインキナーゼである。別の実施形態によれば、キナーゼ��素は、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ活性化プロテインキナーゼ２である。別の実施形態によれば、キナーゼ酵素は、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ活性化プロテインキナーゼ３である。別の実施形態によれば、キナーゼ酵素は、Ｃａ２＋／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼである。別の実施形態によれば、病態生理として炎症性サイトカインの発現を含む炎症性障害は、喘息、強直性脊椎炎、Ｉ型糖尿病、Ｇｕｉｌｌｉａｍｅ−Ｂａｒｒｅ症候群、ループス、乾癬、強皮症、シェーグレン病、慢性前立腺炎、糸球体腎炎、炎症性腸疾患、骨盤内炎症性疾患、再灌流傷害、関節リウマチ、血管炎、過敏性血管炎、内毒素性ショック、膵炎、局所性炎症性疾患、アテローム性動脈硬化症、アルツハイマー病、虚血、内膜過形成、狭窄症、再狭窄、平滑筋腫、平滑筋の痙攣、アンギナ、プリンツメタル狭心症、徐脈、高血圧、心肥大、腎不全、脳卒中、肺高血圧症、妊娠中毒症、レイノー病、溶血性尿毒症、裂肛、アカラシア、インポテンツ、片頭痛、血管障害、鬱血性心不全、気絶心筋、拡張機能障害、グリオーシス、慢性閉塞性肺疾患、骨減少症、変形性関節症、敗血症、硬変、間質性線維症、大腸炎、虫垂炎、胃炎、喉頭炎、髄膜炎、耳炎、外傷性脳障害、脊髄損傷、末梢神経障害、多発性硬化症、心血管代謝症候群、非アルコール性脂肪性肝炎、膵臓および肺の嚢胞性線維症、注射部位線維症、心内膜心筋線維症、肺の特発性肺線維症、縦隔線維症、骨髄線維症、後腹膜線維症、腎性全身性線維症、乳癌、前立腺癌および内皮細胞機能障害からなる群から選択される少なくとも１つの障害である。別の実施形態によれば、少なくとも１種の炎症性サイトカインは、ＩＬ−６、ＴＮＦαおよびＩＬ−１βの少なくとも１つである。別の実施形態によれば、ステップ（ａ）の投与は生物医学装置を埋め込むことにより投与され、組成物は装置上または装置内に配置されている。別の実施形態によれば、ステップ（ａ）の投与は非経口的投与である。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１０】
【図１】活性（対照に対する割合）と阻害ペプチド濃度（μＭ）との関係を示す図を示す。図中のペプチドは、上から順に配列番号５、３０、６７〜７０、１６に該当する。
【図２】活性（対照に対する割合）と阻害ペプチド濃度（μＭ）との関係を示す図を示す。図中のペプチドは、上から順に配列番号１４、１２、１５、１１、１６に該当する。
【図３】反応速度（ＲＦＵ／ｓ）とＭＫ２阻害ペプチドの濃度（μＭ）との関係を示す図を示す。ＲＦＵ／ｓ＝１秒当たりの相対蛍光単位。図中のペプチドは、上から順に配列番号２２〜２８、１３に該当する。
【図４】反応速度（ＲＦＵ／ｓ）とＭＫ２阻害ペプチドの濃度（μ）との関係を示す図を示す。ＲＦＵ／ｓ＝１秒当たりの相対蛍光単位。図中のペプチドＫＡＬＮＲＱＬＧＶＡＡは、配列番号１３である。
【図５】反応速度（ＲＦＵ／ｓ）とＭＫ２阻害ペプチドの濃度（μＭ）との関係を示す図を示す。ＲＦＵ／ｓ＝１秒当たりの相対蛍光単位。図中のペプチドは、上から順に配列番号２９、３０、１４、１３に該当する。
【図６】反応速度（ＲＦＵ／ｓ）とＭＫ２阻害ペプチドの濃度（μＭ）との関係を示す図を示す。ＲＦＵ／ｓ＝１秒当たりの相対蛍光単位。図中のペプチドは、左上から順に配列番号３２、３１、３３、５、１３に該当する。
【図７】ＩＬ−６の平均濃度（ｐｇ／ｍｌ／１０５細胞）と時間との関係を示す図を示す。ＹＡＲＡ＝ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡＫＡＬＡＲＱＬＧＶＡＡ［配列番号１１］。†＝１ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１βで処理したサンプルより有意に高い。＊＝１ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１βで処理したサンプルより有意に低い。エラーバーは３つのサンプル間の標準偏差を示す。
【図８】ＩＬ−６の平均濃度（ｐｇ／ｍｌ／１０５細胞）と時間との関係を示す図を示す。ＹＡＲＡ＝ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡＫＡＬＡＲＱＬＧＶＡＡ［配列番号１１］；ＦＡＫ＝ＦＡＫＬＡＡＲＬＹＲＫＡＬＡＲＱＬＧＶＡＡ［配列番号１２］。＊＝１ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ−αで処理したサンプルより有意に低い。エラーバーは３つのサンプル間の標準偏差を示す。
【図９】ＩＬ−６の平均濃度（ｐｇ／ｍｌ／１０５細胞）と時間との関係を示す図を示す。ＹＡＲＡ＝ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡＫＡＬＡＲＱＬＧＶＡＡ［配列番号１１］；ＦＡＫ＝ＦＡＫＬＡＡＲＬＹＲＫＡＬＡＲＱＬＧＶＡＡ［配列番号１２］。＊＝１０ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ−αで処理したサンプルより有意に低い。エラーバーは３つのサンプル間の標準偏差を示す。
【図１０】各処理群（ｉ）１ｍＭのＭＫ２ｉ（治療用阻害ペプチドＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡＫＡＬＡＲＱＬＧＶＡＡ［配列番号１１］）とＴＮＦ−α（５ｎｇ／ｍｌ）；（ｉｉ）３ｍＭのＭＫ２ｉとＴＮＦ−α（５ｎｇ／ｍｌ）；（ｉｉｉ）１ｍＭのＭＫ２ｉとＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍｌ）；および（ｉｖ）３ｍＭのＭＫ２ｉとＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍｌ）におけるＩＬ−１βの平均濃度（ｐｇ／ｍｌ）のグラフを示す。
【図１１】各処理群（ｉ）陰性対照（培地のみ）；（ｉｉ）ＴＮＦ−α（５ｎｇ／ｍｌ）；（ｉｉｉ）ＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍｌ）；（ｉｖ）ＴＮＦ−α（５ｎｇ／ｌ）およびＭＫ２ｉ（１ｍＭの治療用阻害ペプチドＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡＫＡＬＡＲＱＬＧＶＡＡ［配列番号１１］）；（ｖ）ＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍｌ）およびＭＫ２ｉ（１ｍＭ）；（ｖｉ）ＴＮＦ−α（５ｎｇ／ｍｌ）およびＭＫ２ｉ（３ｍＭ）；ならびに（ｖｉｉ）ＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍｌ）およびＭＫ２ｉ（３ｍＭ）におけるＩＬ−６の平均濃度（ｐｇ／ｍｌ）のグラフを示す。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３２３】
表１．蛍光ベースのキナーゼ活性アッセイで試験したペプチド
2012511583.tif 000001
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３３３】
各キナーゼアッセイのプロトコルは以下のとおりである：
（１）Ａｂｌ（ｈ）
最終反応容量を２５μＬとし、Ａｂｌ（ｈ）（５〜１０ｍＵ）を８ｍＭのＭＯＰＳ  ｐＨ７．０、０．２ｍＭのＥＤＴＡ、５０μＭのＥＡＩＹＡＡＰＦＡＫＫＫ[配列番号４８]、１０ｍＭの酢酸Ｍｇおよび［γ−３３Ｐ−ＡＴＰ］（比活性約５００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ、必要に応じた濃度）とインキュベートする。ＭｇＡＴＰミックスを添加して反応を開始する。室温で４０分間インキュベートした後、５μＬの３％リン酸溶液を添加して反応を止める。次いで１０μＬの反応物をＰ３０フィルターマット（ｆｉｌｔｅｒｍａｔ）にスポットし、７５ｍＭのリン酸で５分間３回洗浄し、乾燥させる前にメタノールで１回洗浄し、シンチレーションを測定する。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３３４】
（２）ＡＭＰＫ（ｒ）
最終反応容量を２５μＬとし、ＡＭＰＫ（ｒ）（５〜１０ｍＵ）を３２ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、０．６５ｍＭのＤＴＴ、０．０１２％Ｂｒｉｊ−３５、２００μＭのＡＭＰ、２００μＭのＡＭＡＲＡＡＳＡＡＡＬＡＲＲＲ[配列番号４９]、１０ｍＭの酢酸Ｍｇおよび［γ−３３Ｐ−ＡＴＰ］（比活性約５００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ、必要に応じた濃度）とインキュベートする。ＭｇＡＴＰミックスを添加して反応を開始する。室温で４０分間インキュベートした後、５μＬの３％リン酸溶液を添加して反応を止める。次いで１０μＬの反応物をＰ３０フィルターマットにスポットし、７５ｍＭのリン酸で５分間３回洗浄し、乾燥させる前にメタノールで１回洗浄し、シンチレーションを測定する。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３３５】
（３）Ａｕｒｏｒａ−Ａ（ｈ）
最終反応容量を２５μＬとし、Ａｕｒｏｒａ−Ａ（ｈ）（５〜１０ｍＵ）を８ｍＭのＭＯＰＳ  ｐＨ７．０、０．２ｍＭのＥＤＴＡ、２００μＭのＬＲＲＡＳＬＧ[配列番号５０]（ケンプチド）、１０ｍＭの酢酸Ｍｇおよび［γ−３３Ｐ〜ＡＴＰ］（比活性約５００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ、必要に応じた濃度）とインキュベートする。ＭｇＡＴＰミックスを添加して反応を開始する。室温で４０分間インキュベートした後、５μＬの３％リン酸溶液を添加して反応を止める。次いで１０μＬの反応物をＰ３０フィルターマットにスポットし、５０ｍＭのリン酸で５分間３回洗浄し、乾燥させる前にメタノールで１回洗浄し、シンチレーションを測定する。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３３６】
（４）ＢＴＫ（ｈ）
最終反応容量を２５μＬとし、ＢＴＫ（ｈ）（５〜１０ｍＵ）を８ｍＭのＭＯＰＳ  ｐＨ７．０、０．２ｍＭのＥＤＴＡ、２５０μＭのＫＶＥＫＩＧＥＧＴＹＧＶＶＹＫ[配列番号５１]（Ｃｄｃ２ペプチド）、１０ｍＭの酢酸Ｍｇおよび［γ−３３Ｐ−ＡＴＰ］（比活性約５００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ、必要に応じた濃度）とインキュベートする。ＭｇＡＴＰミックスを添加して反応を開始する。室温で４０分間インキュベートした後、５μＬの３％リン酸溶液を添加して反応を止める。次いで１０μＬの反応物をＰ３０フィルターマットにスポットし、７５ｍＭのリン酸で５分間３回洗浄し、乾燥させる前にメタノールで１回洗浄し、シンチレーションを測定する。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３３７】
（５）ＣａＭＫＩ（ｈ）
最終反応容量を２５μＬとし、ＣａＭＫＩ（ｈ）（５〜１０ｍＵ）を８ｍＭのＭＯＰＳ  ｐＨ７．０、０．２ｍＭのＥＤＴＡ、０．５ｍＭのＣａＣｌ２、１６μｇ／ｍＬのカルモジュリン、２５０μＭのＫＫＬＮＲＴＬＳＦＡＥＰＧ[配列番号５２]、１０ｍＭの酢酸Ｍｇおよび［γ−３３Ｐ−ＡＴＰ］（比活性約５００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ、必要に応じた濃度）とインキュベートする。ＭｇＡＴＰミックスを添加して反応を開始する。室温で４０分間インキュベートした後、５μＬの３％リン酸溶液を添加して反応を止める。次いで１０μＬの反応物をＰ３０フィルターマットにスポットし、７５ｍＭのリン酸で５分間３回洗浄し、乾燥させる前にメタノールで１回洗浄し、シンチレーションを測定する。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３３９】
（７）ＣＨＫ１（ｈ）
最終反応容量を２５μＬとし、ＣＨＫ１（ｈ）（５〜１０ｍＵ）を８ｍＭのＭＯＰＳ  ｐＨ７．０、０．２ｍＭのＥＤＴＡ、２００μＭのＫＫＫＶＳＲＳＧＬＹＲＳＰＳＭＰＥＮＬＮＲＰＲ[配列番号５３]、１０ｍＭの酢酸Ｍｇおよび［γ−３３Ｐ−ＡＴＰ］（比活性約５００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ、必要に応じた濃度）とインキュベートする。ＭｇＡＴＰミックスを添加して反応を開始する。室温で４０分間インキュベートした後、５μＬの３％リン酸溶液を添加して反応を止める。次いで１０μＬの反応物をＰ３０フィルターマットにスポットし、７５ｍＭのリン酸で５分間３回洗浄し、乾燥させる前にメタノールで１回洗浄し、シンチレーションを測定する。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３４０】
（８）ＣＫ１δ（ｈ）
最終反応容量を２５μＬとし、ＣＫ１δ（ｈ）（５〜１０ｍＵ）を８ｍＭのＭＯＰＳ  ｐＨ７．０、０．２ｍＭのＥＤＴＡ、２００μＭのＫＲＲＲＡＬＳ（ｐ）ＶＡＳＬＰＧＬ[配列番号５４]、１０ｍＭの酢酸Ｍｇおよび［γ−３３Ｐ−ＡＴＰ］（比活性約５００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ、必要に応じた濃度）とインキュベートする。ＭｇＡＴＰミックスを添加して反応を開始する。室温で４０分間インキュベートした後、５μＬの３％リン酸溶液を添加して反応を止める。次いで１０μＬの反応物をＰ３０フィルターマットにスポットし、７５ｍＭのリン酸で５分間３回洗浄し、乾燥させる前にメタノールで１回洗浄し、シンチレーションを測定する。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３４１】
（９）ＣＫ２（ｈ）
最終反応容量を２５μＬとし、ＣＫ２（ｈ）（５〜１０ｍＵ）を２０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．６、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭのＤＴＴ、０．１％トリトンＸ−１００、１６５μＭのＲＲＲＤＤＤＳＤＤＤ[配列番号５５]、１０ｍＭの酢酸Ｍｇおよび［γ−３３Ｐ−ＡＴＰ］（比活性約５００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ、必要に応じた濃度）とインキュベートする。ＭｇＡＴＰミックスを添加して反応を開始する。室温で４０分間インキュベートした後、５μＬの３％リン酸溶液を添加して反応を止める。次いで１０μＬの反応物をＰ３０フィルターマットにスポットし、７５ｍＭのリン酸で５分間３回洗浄し、乾燥させる前にメタノールで１回洗浄し、シンチレーションを測定する。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３４６】
（１４）ＦＧＦＲ１（ｈ）
最終反応容量を２５μＬとし、ＦＧＦＲ１（ｈ）（５〜１０ｍＵ）を８ｍＭのＭＯＰＳ  ｐＨ７．０、０．２ｍＭのＥＤＴＡ、２５０μＭのＫＫＫＳＰＧＥＹＶＮＩＥＦＧ[配列番号５６]、１０ｍＭの酢酸Ｍｇおよび［γ−３３Ｐ−ＡＴＰ］（比活性約５００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ、必要に応じた濃度）とインキュベートする。ＭｇＡＴＰミックスを添加して反応を開始する。室温で４０分間インキュベートした後、５μＬの３％リン酸溶液を添加して反応を止める。次いで１０μＬの反応物をＰ３０フィルターマットにスポットし、７５ｍＭのリン酸で５分間３回洗浄し、乾燥させる前にメタノールで１回洗浄し、シンチレーションを測定する。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３４７】
（１５）Ｆｌｔ３（ｈ）
最終反応容量を２５μＬとし、Ｆｌｔ３（ｈ）（５〜１０ｍＵ）を８ｍＭのＭＯＰＳ  ｐＨ７．０、０．２ｍＭのＥＤＴＡ、５０μＭのＥＡＩＹＡＡＰＦＡＫＫＫ[配列番号４８]、１０ｍＭの酢酸Ｍｇおよび［γ−３３Ｐ−ＡＴＰ］（比活性約５００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ、必要に応じた濃度）とインキュベートする。ＭｇＡＴＰミックスを添加して反応を開始する。室温で４０分間インキュベートした後、５μＬの３％リン酸溶液を添加して反応を止める。次いで１０μＬの反応物をＰ３０フィルターマットにスポットし、７５ｍＭのリン酸で５分間３回洗浄し、乾燥させる前にメタノールで１回洗浄し、シンチレーションを測定する。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３４８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３４８】
（１６）ＧＳＫ３β（ｈ）
最終反応容量を２５μＬとし、ＧＳＫ３β（ｈ）（５〜１０ｍＵ）を８ｍＭのＭＯＰＳ  ｐＨ７．０、０．２ｍＭのＥＤＴＡ、２０μＭのＹＲＲＡＡＶＰＰＳＰＳＬＳＲＨＳＳＰＨＱＳ（ｐ）ＥＤＥＥＥ[配列番号５７]（ホスホＧＳ２ペプチド）、１０ｍＭの酢酸Ｍｇおよび［γ−３３Ｐ−ＡＴＰ］（比活性約５００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ、必要に応じた濃度）とインキュベートする。ＭｇＡＴＰミックスを添加して反応を開始する。室温で４０分間インキュベートした後、５μＬの３％リン酸溶液を添加して反応を止める。次いで１０μＬの反応物をＰ３０フィルターマットにスポットし、５０ｍＭのリン酸で５分間３回洗浄し、乾燥させる前にメタノールで１回洗浄し、シンチレーションを測定する。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３４９】
（１７）ＩＧＦ−１Ｒ（ｈ）
最終反応容量を２５μＬとし、ＩＧＦ−１Ｒ（ｈ）（５〜１０ｍＵ）を５０ｍＭのトリス  ｐＨ７．５、０．１ｍＭのＥＧＴＡ、０．１ｍＭのＮａ３ＶＯ４、０．１％β−メルカプトエタノール、２５０μＭのＫＫＫＳＰＧＥＹＶＮＩＥＦＧ[配列番号５６]、１０ｍＭのＭｎＣｌ２、１０ｍＭの酢酸Ｍｇおよび［γ−３３Ｐ−ＡＴＰ］（比活性約５００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ、必要に応じた濃度）とインキュベートする。ＭｇＡＴＰミックスを添加して反応を開始する。室温で４０分間インキュベートした後、５μＬの３％リン酸溶液を添加して反応を止める。次いで１０μＬの反応物をＰ３０フィルターマットにスポットし、７５ｍＭのリン酸で５分間３回洗浄し、乾燥させる前にメタノールで１回洗浄し、シンチレーションを測定する。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３５１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３５１】
（１９）ＪＡＫ３（ｈ）
最終反応容量を２５μＬとし、ＪＡＫ３（ｈ）（５〜１０ｍＵ）を８ｍＭのＭＯＰＳ  ｐＨ７．０、０．２ｍＭのＥＤＴＡ、５００μＭのＧＧＥＥＥＥＹＦＥＬＶＫＫＫＫ[配列番号５８]、１０ｍＭの酢酸Ｍｇおよび［γ−３３Ｐ−ＡＴＰ］（比活性約５００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ、必要に応じた濃度）とインキュベートする。ＭｇＡＴＰミックスを添加して反応を開始する。室温で４０分間インキュベートした後、５μＬの３％リン酸溶液を添加して反応を止める。次いで１０μＬの反応物をＰ３０フィルターマットにスポットし、７５ｍＭのリン酸で５分間３回洗浄し、乾燥させる前にメタノールで１回洗浄し、シンチレーションを測定する。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３５３】
（２１）Ｌｃｋ（ｈ）
最終反応容量を２５μＬとし、Ｌｃｋ（ｈ）（５〜１０ｍＵ）を５０ｍＭのトリス  ｐＨ７．５、０．１ｍＭのＥＧＴＡ、０．１ｍＭのＮａ３ＶＯ４、２５０μＭのＫＶＥＫＩＧＥＧＴＹＧＶＶＹＫ[配列番号５１]（Ｃｄｃ２ペプチド）、１０ｍＭの酢酸Ｍｇおよび［γ−３３Ｐ−ＡＴＰ］（比活性約５００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ、必要に応じた濃度）とインキュベートする。ＭｇＡＴＰミックスを添加して反応を開始する。室温で４０分間インキュベートした後、５μＬの３％リン酸溶液を添加して反応を止める。次いで１０μＬの反応物をＰ３０フィルターマットにスポットし、７５ｍＭのリン酸で５分間３回洗浄し、乾燥させる前にメタノールで１回洗浄し、シンチレーションを測定する。
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３５７】
（２５）Ｍｅｔ（ｈ）
最終反応容量を２５μＬとし、Ｍｅｔ（ｈ）（５〜１０ｍＵ）を８ｍＭのＭＯＰＳ  ｐＨ７．０、０．２ｍＭのＥＤＴＡ、２５０μＭのＫＫＫＳＰＧＥＹＶＮＩＥＦＧ[配列番号５６]、１０ｍＭの酢酸Ｍｇおよび［γ−Ｐ−ＡＴＰ］（比活性約５００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ、必要に応じた濃度）とインキュベートする。ＭｇＡＴＰミックスを添加して反応を開始する。室温で４０分間インキュベートした後、５μＬの３％リン酸溶液を添加して反応を止める。次いで１０μＬの反応物をＰ３０フィルターマットにスポットし、７５ｍＭのリン酸で５分間３回洗浄し、乾燥させる前にメタノールで１回洗浄し、シンチレーションを測定する。
【手続補正２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３５８】
（２６）ＭＬＣＫ（ｈ）
最終反応容量を２５μＬとし、ＭＬＣＫ（ｈ）（５〜１０ｍＵ）を８ｍＭのＭＯＰＳ  ｐＨ７．０、０．２ｍＭのＥＤＴＡ、０．５ｍＭのＣａＣｌ２、１６μｇ／ｍＬのカルモジュリン、２５０μＭのＫＫＬＮＲＴＬＳＦＡＥＰＧ[配列番号５２]、１０ｍＭの酢酸Ｍｇおよび［γ−３３Ｐ−ＡＴＰ］（比活性約５００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ、必要に応じた濃度）とインキュベートする。ＭｇＡＴＰミックスを添加して反応を開始する。室温で４０分間インキュベートした後、５μＬの３％リン酸溶液を添加して反応を止める。次いで１０μＬの反応物をＰ３０フィルターマットにスポットし、７５ｍＭのリン酸で５分間３回洗浄し、乾燥させる前にメタノールで１回洗浄し、シンチレーションを測定する。
【手続補正２２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３６０】
（２８）ＰｈＫγ２（ｈ）
最終反応容量を２５μＬとし、ＰｈＫγ２（ｈ）（５〜１０ｍＵ）を８ｍＭのＭＯＰＳ  ｐＨ７．０、０．２ｍＭのＥＤＴＡ、２５０μＭのＫＫＬＮＲＴＬＳＦＡＥＰＧ[配列番号５２]、１０ｍＭの酢酸Ｍｇおよび［γ−３３Ｐ−ＡＴＰ］（比活性約５００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ、必要に応じた濃度）とインキュベートする。ＭｇＡＴＰミックスを添加して反応を開始する。室温で４０分間インキュベートした後、５μＬの３％リン酸溶液を添加して反応を止める。次いで１０μＬの反応物をＰ３０フィルターマットにスポットし、７５ｍＭのリン酸で５分間３回洗浄し、乾燥させる前にメタノールで１回洗浄し、シンチレーションを測定する。
【手続補正２３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３６１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３６１】
（２９）Ｐｉｍ−１（ｈ）
最終反応容量を２５μＬとし、Ｐｉｍ−１（ｈ）（５〜１０ｍＵ）を８ｍＭのＭＯＰＳ  ｐＨ７．０、０．２ｍＭのＥＤＴＡ、１００μＭのＫＫＲＮＲＴＬＴＶ[配列番号５９]、１０ｍＭの酢酸Ｍｇおよび［γ−３３Ｐ−ＡＴＰ］（比活性約５００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ、必要に応じた濃度）とインキュベートする。ＭｇＡＴＰミックスを添加して反応を開始する。室温で４０分間インキュベートした後、５μＬの３％リン酸溶液を添加して反応を止める。次いで１０μＬの反応物をＰ３０フィルターマットにスポットし、７５ｍＭのリン酸で５分間３回洗浄し、乾燥させる前にメタノールで１回洗浄し、シンチレーションを測定する。
【手続補正２４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３６２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３６２】
（３０）ＰＫＡ（ｈ）
最終反応容量を２５μＬとし、ＰＫＡ（ｈ）（５〜１０ｍＵ）を８ｍＭのＭＯＰＳ  ｐＨ７．０、０．２ｍＭのＥＤＴＡ、３０μＭのＬＲＲＡＳＬＧ[配列番号５０]（ケンプチド）、１０ｍＭの酢酸Ｍｇおよび［γ−３３Ｐ−ＡＴＰ］（比活性約５００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ、必要に応じた濃度）とインキュベートする。ＭｇＡＴＰミックスを添加して反応を開始する。室温で４０分間インキュベートした後、５μＬの３％リン酸溶液を添加して反応を止める。次いで１０μＬの反応物をＰ３０フィルターマットにスポットし、５０ｍＭのリン酸で５分間３回洗浄し、乾燥させる前にメタノールで１回洗浄し、シンチレーションを測定する。
【手続補正２５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３６３】
（３１）ＰＫＢβ（ｈ）
最終反応容量を２５μＬとし、ＰＫＢβ（ｈ）（５〜１０ｍＵ）を８ｍＭのＭＯＰＳ  ｐＨ７．０、０．２ｍＭのＥＤＴＡ、３０μＭのＧＲＰＲＴＳＳＦＡＥＧＫＫ[配列番号６０]、１０ｍＭの酢酸Ｍｇおよび［γ−３３Ｐ−ＡＴＰ］（比活性約５００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ、必要に応じた濃度）とインキュベートする。ＭｇＡＴＰミックスを添加して反応を開始する。室温で４０分間インキュベートした後、５μＬの３％リン酸溶液を添加して反応を止める、１０μＬの反応物をＰ３０フィルターマットにスポットし、７５ｍＭのリン酸で５分間３回洗浄し、乾燥させる前にメタノールで１回洗浄し、シンチレーションを測定する。
【手続補正２６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３６５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３６５】
（３３）ＰＫＣδ（ｈ）
最終反応容量を２５μＬとし、ＰＫＣδ（ｈ）（５〜１０ｍＵ）を２０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、０．０３％トリトンＸ−１００、０．１ｍｇ／ｍＬのホスファチジルセリン、１０μｇ／ｍＬのジアシルグリセロール、５０μＭのＥＲＭＲＰＲＫＲＱＧＳＶＲＲＲＶ[配列番号６１]、１０ｍＭの酢酸Ｍｇおよび［γ−３３Ｐ−ＡＴＰ］（比活性約５００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ、必要に応じた濃度）とインキュベートする。ＭｇＡＴＰミックスを添加して反応を開始する。室温で４０分間インキュベートした後、５μＬの３％リン酸溶液を添加して反応を止める。次いで１０μＬの反応物をＰ３０フィルターマットにスポットし、７５ｍＭのリン酸で５分間３回洗浄し、乾燥させる前にメタノールで１回洗浄し、シンチレーションを測定する。
【手続補正２７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３６６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３６６】
（３４）ＰＫＧ１α（ｈ）
最終反応容量を２５μＬとし、ＰＫＧ１α（ｈ）（５〜１０ｍＵ）を８ｍＭのＭＯＰＳ  ｐＨ７．０、０．２ｍＭのＥＤＴＡ、１０μＭのｃＧＭＰ、２００μＭのＲＲＲＬＳＦＡＥＰＧ[配列番号６２]、１０ｍＭの酢酸Ｍｇおよび［γ−３３Ｐ−ＡＴＰ］（比活性約５００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ、必要に応じた濃度）とインキュベートする。ＭｇＡＴＰミックスを添加して反応を開始する。室温で４０分間インキュベートした後、５μＬの３％リン酸溶液を添加して反応を止める。次いで１０μＬの反応物をＰ３０フィルターマットにスポットし、７５ｍＭのリン酸で５分間３回洗浄し、乾燥させる前にメタノールで１回洗浄し、シンチレーションを測定する。
【手続補正２８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３６７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３６７】
（３５）ＰＫＧ１β（ｈ）
最終反応容量を２５μＬとし、ＰＫＧ１β（ｈ）（５〜１０ｍＵ）を８ｍＭのＭＯＰＳ  ｐＨ７．０、０．２ｍＭのＥＤＴＡ、１０μＭのｃＧＭＰ、２００μＭのＲＲＲＬＳＦＡＥＰＧ[配列番号６２]、１０ｍＭの酢酸Ｍｇおよび［γ−３３Ｐ−ＡＴＰ］（比活性約５００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ、必要に応じた濃度）とインキュベートする。ＭｇＡＴＰミックスを添加して反応を開始する。室温で４０分間インキュベートした後、５μＬの３％リン酸溶液を添加して反応を止める。次いで１０μＬの反応物をＰ３０フィルターマットにスポットし、７５ｍＭのリン酸で５分間３回洗浄し、乾燥させる前にメタノールで１回洗浄し、シンチレーションを測定する。
【手続補正２９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３６８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３６８】
（３６）Ｒｅｔ（ｈ）
最終反応容量を２５μＬとし、Ｒｅｔ（ｈ）（５〜１０ｍＵ）を８ｍＭのＭＯＰＳ  ｐＨ７．０、０．２ｍＭのＥＤＴＡ、２５０μＭのＫＫＫＳＰＧＥＹＶＮＩＥＦＧ[配列番号５６]、１０ｍＭの酢酸Ｍｇおよび［γ−３３Ｐ−ＡＴＰ］（比活性約５００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ、必要に応じた濃度）とインキュベートする。ＭｇＡＴＰミックスを添加して反応を開始する。室温で４０分間インキュベートした後、５μＬの３％リン酸溶液を添加して反応を止める。次いで１０μＬの反応物をＰ３０フィルターマットにスポットし、７５ｍＭのリン酸で５分間３回洗浄し、乾燥させる前にメタノールで１回洗浄し、シンチレーションを測定する。
【手続補正３０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３６９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３６９】
（３７）ＲＯＣＫ−Ｉ（ｈ）
最終反応容量を２５μＬとし、ＲＯＣＫ−Ｉ（ｈ）（５〜１０ｍＵ）を８ｍＭのＭＯＰＳ  ｐＨ７．０、０．２ｍＭのＥＤＴＡ、３０μＭのＫＥＡＫＥＫＲＱＥＱＩＡＫＲＲＲＬＳＳＬＲＡＳＴＳＫＳＧＧＳＱＫ[配列番号６３]、１０ｍＭの酢酸Ｍｇおよび［γ−３３Ｐ−ＡＴＰ］（比活性約５００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ、必要に応じた濃度）とインキュベートする。ＭｇＡＴＰミックスを添加して反応を開始する。室温で４０分間インキュベートした後、５μＬの３％リン酸溶液を添加して反応を止める。次いで１０μＬの反応物をＰ３０フィルターマットにスポットし、７５ｍＭのリン酸で５分間３回洗浄し、乾燥させる前にメタノールで１回洗浄し、シンチレーションを測定する。
【手続補正３１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３７０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３７０】
（３８）Ｒｓｋ２（ｈ）
最終反応容量を２５μＬとし、Ｒｓｋ２（ｈ）（５〜１０ｍＵ）を８ｍＭのＭＯＰＳ  ｐＨ７．０、０．２ｍＭのＥＤＴＡ、３０μＭのＫＫＫＮＲＴＬＳＶＡ[配列番号６４]、１０ｍＭの酢酸Ｍｇおよび［γ−３３Ｐ−ＡＴＰ］（比活性約５００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ、必要に応じた濃度）とインキュベートする。ＭｇＡＴＰミックスを添加して反応を開始する。室温で４０分間インキュベートした後、５μＬの３％リン酸溶液を添加して反応を止める。次いで１０μＬの反応物をＰ３０フィルターマットにスポットし、７５ｍＭのリン酸で５分間３回洗浄し、乾燥させる前にメタノールで１回洗浄し、シンチレーションを測定する。
【手続補正３２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３７２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３７２】
（４０）ＳＲＣ（１−５３０）（ｈ）
最終反応容量を２５μＬとし、ＳＲＣ（１−５３０）（ｈ）（５〜１０ｍＵ）を８ｍＭのＭＯＰＳ  ｐＨ７．０、０．２ｍＭのＥＤＴＡ、５００ｍＭのＧＧＥＥＥＥＹＦＥＬＶＫＫＫＫ[配列番号５８]、１０ｍＭの酢酸Ｍｇおよび［γ−３３Ｐ−ＡＴＰ］（比活性約５００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ、必要に応じた濃度）とインキュベートする。ＭｇＡＴＰミックスを添加して反応を開始する。室温で４０分間インキュベートした後、５μＬの３％リン酸溶液を添加して反応を止める。次いで１０μＬの反応物をＰ３０フィルターマットにスポットし、７５ｍＭのリン酸で５分間３回洗浄し、乾燥させる前にメタノールで１回洗浄し、シンチレーションを測定する。
【手続補正３３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３７５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３７５】
（４３）ＴｒｋＡ（ｈ）
最終反応容量を２５μＬとし、ＴｒｋＡ（ｈ）（５〜１０ｍＵ）を８ｍＭのＭＯＰＳ  ｐＨ７．０、０．２ｍＭのＥＤＴＡ、２５０μＭのＫＫＫＳＰＧＥＹＶＮＩＥＦＧ[配列番号５６]、１０ｍＭの酢酸Ｍｇおよび［γ−３３Ｐ−ＡＴＰ］（比活性約５００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ、必要に応じた濃度）とインキュベートする。ＭｇＡＴＰミックスを添加して反応を開始する。室温で４０分間インキュベートした後、５μＬの３％リン酸溶液を添加して反応を止める。次いで１０μＬの反応物をＰ３０フィルターマットにスポットし、７５ｍＭのリン酸で５分間３回洗浄し、乾燥させる前にメタノールで１回洗浄し、シンチレーションを測定する。
【手続補正３４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３７６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３７６】
（４４）ＰＲＡＫ（ｈ）
最終反応容量を２５μＬとし、ＰＲＡＫ（ｈ）（５〜１０ｍＵ）を５０ｍＭのＮａ  β−グリセロホスファート  ｐＨ７．５、０．１ｍＭのＥＧＴＡ、３０μＭのＫＫＬＲＲＴＬＳＶＡ[配列番号６５]、１０ｍＭの酢酸Ｍｇおよび［γ−３３Ｐ−ＡＴＰ］（比活性約５００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ、必要に応じた濃度）とインキュベートする。ＭｇＡＴＰミックスを添加して反応を開始する。室温で４０分間インキュベートした後、５μＬの３％リン酸溶液を添加して反応を止める。１０μＬの反応物をＰ３０フィルターマットにスポットし、５０ｍＭのリン酸で５分間３回洗浄し、乾燥させる前にメタノールで１回洗浄し、シンチレーションを測定する。
【手続補正３５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３８３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３８３】
表４．４３種類のキナーゼに対する細胞透過性ペプチドの作用
2012511583.tif 000002
2012511583.tif 000003
2012511583.tif 000004
【手続補正３６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2012511583000001.app