(57)【要約】【課題】数万〜数十万種類のオーダーの遺伝子をより簡便に発現ベクターに挿入し、効率的かつ高速に異なるＤＮＡ断片を担持する複数種類のベクターを作製する方法を提供する。【解決手段】クローニングによって単一なｃＤＮＡあるいはゲノムＤＮＡとして配列が決定された複数の特定ＤＮＡについて、挿入ＤＮＡ断片同士が結合しないようなクローニングサイトを両端に持つような遺伝子断片を調製し、複数の特定ＤＮＡの混合物とベクターとのライゲーションを行い宿主細胞に導入した後、宿主細胞の各クローンに含まれるベクターの挿入のＤＮＡ配列を同定することによって目的ＤＮＡ断片の挿入をもつベクターの分離および取得をすることによる。【選択図】図３１
2004215665.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列が既知の異なる複数種又は複数長の目的のＤＮＡ断片を、混合状態下で、同一種又は複数種のベクターとライゲートし、宿主細胞へのトランスフォーメーション後に個々のクローンに含まれる目的のＤＮＡ断片が挿入された組換えベクターを同定し、目的のＤＮＡ断片が挿入された組換えベクターを分取することを特徴とする、複数種類の組換えベクターの同時調製方法。
【請求項２】
ＤＮＡ断片同士が互いにセルフライゲーションできない切断末端に調製されている目的のＤＮＡ断片を用いることを特徴とする請求項１に記載の組換えベクターの同時調製方法。
【請求項３】
ベクター同士が互いにセルフライゲーションできない切断末端に調製されているベクターを用いることを特徴とする請求項１に記載の組換えベクターの同時調製方法。
【請求項４】
ベクターが、プラスミド、ファージ、コスミド、ＢＡＣ、ＹＡＣ、組換えウイルス、及びトランスポゾンのいずれか１から選ばれる請求項１〜３の何れか１に記載の方法。
【請求項５】
宿主細胞が、大腸菌、酵母、動物細胞、及び植物細胞から選ばれる請求項４に記載の方法。
【請求項６】
目的のＤＮＡ断片が挿入された組換えベクターの同定が、以下の（１）〜（３）の工程を含むことを特徴とする、請求項１〜５の何れか１に記載の方法：
（１）目的のＤＮＡ断片の既知のＤＮＡ配列データ群情報および／またはベクターの既知のＤＮＡ配列データ群情報を調整する工程、
（２）ＤＮＡ断片が挿入された個々の組換えベクターのＤＮＡ配列の配列データをＤＮＡシークエンシングによって得る工程、
（３）（１）の工程で調整した既知ＤＮＡ配列データ群情報をもとに（２）の工程で得られたサブジェクトとなるＤＮＡ配列データの類似度判定をホモロジー検索プログラムにより行う工程。
【請求項７】
目的のＤＮＡ断片が挿入された組換えベクターの同定が、請求項６に記載の（１）〜（３）の工程に加え、さらに以下の（４）〜（８）に記載の少なくとも一つの工程を含むことを特徴とする、請求項６に記載の方法：
（４）（３）の工程で得られた配列データの類似度判定の結果を整理する工程、
（５）最も高い類似度を有するテンプレート配列の名称および／またはＤＮＡ配列を取得する工程、
（６）ベクターに挿入されたＤＮＡ断片のＤＮＡ配列と最も高い類似度を有するテンプレート配列のＤＮＡ配列のアラインメントを判定する工程、
（７）目的のＤＮＡ断片が挿入された組換えベクターをＤＮＡシークエンシングして得られた配列データのうち、最も高い類似度を有するテンプレート配列と対応したタンパク質をコードしている部分のＤＮＡ配列のポイントミューテーションの有無を判定する工程、
（８）目的のＤＮＡ断片が挿入された組換えベクターをＤＮＡシークエンシングして得られた配列データのうち、ベクターの配列と対応する部分のＤＮＡ配列と使用したベクターのＤＮＡ配列をホモロジー検索プログラムにより比較する工程。
【請求項８】
以下の（１）〜（３）の工程を含むことを特徴とする、目的のＤＮＡ断片が挿入された組換えベクター及び/又は挿入された目的のＤＮＡ断片の同定方法：
（１）目的のＤＮＡ断片の既知のＤＮＡ配列データ群情報および／またはベクターの既知のＤＮＡ配列データ群情報を調整する工程、
（２）ＤＮＡ断片が挿入された個々の組換えベクターのＤＮＡ配列の配列データをＤＮＡシークエンシングによって得る工程、
（３）（１）の工程で調整した既知ＤＮＡ配列データ群情報をもとに（２）の工程で得られたサブジェクトとなるＤＮＡ配列データの類似度判定をホモロジー検索プログラムにより行う工程。
【請求項９】
請求項８に記載の（１）〜（３）の工程に加え、さらに以下の（４）〜（８）に記載の少なくとも一つの工程を含むことを特徴とする、請求項８に記載の方法：
（４）（３）の工程で得られた配列データの類似度判定の結果を整理する工程、
（５）最も高い類似度を有するテンプレート配列の名称および／またはＤＮＡ配列を取得する工程、
（６）ベクターに挿入されたＤＮＡ断片のＤＮＡ配列と最も高い類似度を有するテンプレート配列のＤＮＡ配列のアラインメントを判定する工程、
（７）目的のＤＮＡ断片が挿入された組換えベクターをＤＮＡシークエンシングして得られた配列データのうち、最も高い類似度を有するテンプレート配列と対応したタンパク質をコードしている部分のＤＮＡ配列のポイントミューテーションの有無を判定する工程、
（８）目的のＤＮＡ断片が挿入された組換えベクターをＤＮＡシークエンシングして得られた配列データのうち、ベクターの配列と対応する部分のＤＮＡ配列と使用したベクターのＤＮＡ配列をホモロジー検索プログラムにより比較する工程。
【請求項１０】
目的のＤＮＡ断片が挿入された組換えベクターを同定するためのプログラムであって、クエリーとして目的のＤＮＡ断片が挿入された組換えベクターをＤＮＡシークエンシングして得られた配列データを入力する入力部と、サブジェクトとして目的のＤＮＡ断片のＤＮＡ配列および名称を入力して格納する辞書部を少なくとも有するコンピュータに、ホモロジー検索プログラムを用いて入力された該クエリーの類似度を判定する手順を実行させるためのプログラム。
【請求項１１】
サブジェクトとして用いる配列に目的のＤＮＡ断片のＤＮＡ配列および使用したベクターのＤＮＡ配列が含まれる、請求項１０に記載のプログラム。
【請求項１２】
目的のＤＮＡ断片が挿入された組換えベクターを同定するためのプログラムであって、前記コンピュータに、入力されたクエリーの類似度を判定する手順に加えさらに以下の（１）〜（５）に記載の少なくとも一つの手順を実行させるための請求項１０または請求項１１に記載のプログラム：
（１）前手順で得られた配列データの類似度判定の結果を整理する手順、
（２）最も高い類似度を有するテンプレート配列の名称および／またはＤＮＡ配列を取得する手順、
（３）ベクターに挿入されたＤＮＡ断片のＤＮＡ配列と最も高い類似度を有するテンプレート配列のＤＮＡ配列のアラインメントを判定する手順、
（４）目的のＤＮＡ断片が挿入された組換えベクターをＤＮＡシークエンシングして得られた配列データのうち、最も高い類似度を有するテンプレート配列と対応したタンパク質をコードしている部分のＤＮＡ配列のポイントミューテーションの有無を判定する手順、
（５）目的のＤＮＡ断片が挿入された組換えベクターをＤＮＡシークエンシングして得られた配列データのうち、ベクターの配列と対応する部分のＤＮＡ配列と使用したベクターのＤＮＡ配列をホモロジー検索プログラムにより比較する手順。
【請求項１３】
請求項８または請求項９の方法によって得られた、組換えベクターに挿入された目的のＤＮＡ断片の同定結果を表示する際に、生育させたコロニーおよび／またはＤＮＡシークエンシングを行った容器の形式に対応して視覚的に表示することを特徴とする、同定結果の表示方法。
【請求項１４】
請求項８または請求項９の方法によって得られた、組換えベクターに挿入された目的のＤＮＡ断片の同定結果を、コロニーピッカー又は自動分注器に対応した形式で出力することを特徴とする、同定結果の出力方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、配列既知の異なる複数種又は複数長の目的のＤＮＡ断片を同時並行的に同一種又は複数種のベクターにクローニングし、個々の目的のＤＮＡ断片が一つずつ挿入された組換えベクターを効率的に取得することからなる複数種類の組換えベクターの同時調製方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、クローニングを所望する目的のＤＮＡ（以下、「目的のDNA」と称することがある）断片をベクターに挿入する際には、まず制限酵素消化あるいはＰＣＲ法によって単一な目的ＤＮＡ断片を取得し、これを特定のベクターにライゲーションした後に宿主細胞に導入し、目的物を含む宿主細胞をスクリーニングすることによって行われていた。これは概念的には単一なＤＮＡ断片と単一なベクターの結合操作を行い、うまく結合したものを選択するという方法論である。このため、種類及び／又は長さが異なる複数のＤＮＡについてベクター構築を行う際には、上述の一連の操作をＤＮＡの種類数に応じた回数分反復せざるを得ない状況であった。しかしながらポストゲノムの時代に入り遺伝子の網羅的発現・解析の必要性がさけばれる中、このベクター構築のステップがボトルネックの一つとなっていた。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
ヒトゲノム計画に象徴されるように現在生命科学の研究の焦点が遺伝子解析からその遺伝子産物であるタンパク質の網羅的発現・解析にシフトしつつある。このような状況のなか、数万〜数十万種類のオーダーの遺伝子を如何に効率的に発現ベクターに挿入するかが重要な技術的ブレークスルーになると考えられる。本発明は従来法に比して、より簡便に効率的かつ高速に種類及び／又は長さが異なるＤＮＡ断片が挿入された複数種類の組換えベクターを作製する方法を提供することにより、このような技術的ブレークスルーを与えることを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らはこの課題を解決するために、配列の決定された単一のＤＮＡ断片を複数（種類及び／又は長さが異なる）混合し、この混合物と同一種又は複数種のベクターとのライゲーションの後、宿主細胞に導入し、各クローンに取込まれた目的の単一ＤＮＡ断片が挿入されたベクターの分離及び取得（以下、「分取」と称することがある）を試みた。すなわち、クローニングによって単一なｃＤＮＡあるいはゲノムＤＮＡとして配列が決定された種類及び／又は長さが異なる複数の目的のＤＮＡについて、ベクターと結合可能になるように両端を酵素処理、より望ましくは挿入ＤＮＡ断片同士が結合しないようなクローニングサイトを両端に持つような処理を施し、種類及び／又は長さが異なる複数の目的のＤＮＡの混合物と同一種又は複数種のベクターとのライゲーションを行い宿主細胞に導入した後、宿主細胞の各クローンに含まれるベクターに挿入されたＤＮＡ断片のＤＮＡ配列を同定し、目的のＤＮＡ断片が挿入された組換えベクターの分取をすることによって本発明を完成した。
【０００５】
すなわち本発明は、
「１、配列が既知の異なる複数種又は複数長の目的のＤＮＡ断片を、混合状態下で、同一種又は複数種のベクターとライゲートし、宿主細胞へのトランスフォーメーション後に個々のクローンに含まれる目的のＤＮＡ断片が挿入された組換えベクターを同定し、目的のＤＮＡ断片が挿入された組換えベクターを分取することを特徴とする、複数種類の組換えベクターの同時調製方法。
２、ＤＮＡ断片同士が互いにセルフライゲーションできない切断末端に調製されている目的のＤＮＡ断片を用いることを特徴とする前項１に記載の組換えベクターの同時調製方法。
３、ベクター同士が互いにセルフライゲーションできない切断末端に調製されているベクターを用いることを特徴とする前項１に記載の組換えベクターの同時調製方法。
４、ベクターが、プラスミド、ファージ、コスミド、ＢＡＣ、ＹＡＣ、組換えウイルス、及びトランスポゾンのいずれか１から選ばれる前項１〜３の何れか１に記載の方法。
５、宿主細胞が、大腸菌、酵母、動物細胞、及び植物細胞から選ばれる前項４に記載の方法。
６、目的のＤＮＡ断片が挿入された組換えベクターの同定が、以下の（１）〜（３）の工程を含むことを特徴とする、前項１〜５の何れか１に記載の方法：
（１）目的のＤＮＡ断片の既知のＤＮＡ配列データ群情報および／またはベクターの既知のＤＮＡ配列データ群情報を調整する工程、
（２）ＤＮＡ断片が挿入された個々の組換えベクターのＤＮＡ配列の配列データをＤＮＡシークエンシングによって得る工程、
（３）（１）の工程で調整した既知ＤＮＡ配列データ群情報をもとに（２）の工程で得られたサブジェクトとなるＤＮＡ配列データの類似度判定をホモロジー検索プログラムにより行う工程。
７、目的のＤＮＡ断片が挿入された組換えベクターの同定が、前項６に記載の（１）〜（３）の工程に加え、さらに以下の（４）〜（８）に記載の少なくとも一つの工程を含むことを特徴とする、前項６に記載の方法：
（４）（３）の工程で得られた配列データの類似度判定の結果を整理する工程、
（５）最も高い類似度を有するテンプレート配列の名称および／またはＤＮＡ配列を取得する工程、
（６）ベクターに挿入されたＤＮＡ断片のＤＮＡ配列と最も高い類似度を有するテンプレート配列のＤＮＡ配列のアラインメントを判定する工程、
（７）目的のＤＮＡ断片が挿入された組換えベクターをＤＮＡシークエンシングして得られた配列データのうち、最も高い類似度を有するテンプレート配列と対応したタンパク質をコードしている部分のＤＮＡ配列のポイントミューテーションの有無を判定する工程、
（８）目的のＤＮＡ断片が挿入された組換えベクターをＤＮＡシークエンシングして得られた配列データのうち、ベクターの配列と対応する部分のＤＮＡ配列と使用したベクターのＤＮＡ配列をホモロジー検索プログラムにより比較する工程。
８、以下の（１）〜（３）の工程を含むことを特徴とする、目的のＤＮＡ断片が挿入された組換えベクター及び/又は挿入された目的のＤＮＡ断片の同定方法：
（１）目的のＤＮＡ断片の既知のＤＮＡ配列データ群情報および／またはベクターの既知のＤＮＡ配列データ群情報を調整する工程、
（２）ＤＮＡ断片が挿入された個々の組換えベクターのＤＮＡ配列の配列データをＤＮＡシークエンシングによって得る工程、
（３）（１）の工程で調整した既知ＤＮＡ配列データ群情報をもとに（２）の工程で得られたサブジェクトとなるＤＮＡ配列データの類似度判定をホモロジー検索プログラムにより行う工程。
９、前項８に記載の（１）〜（３）の工程に加え、さらに以下の（４）〜（８）に記載の少なくとも一つの工程を含むことを特徴とする、前項８に記載の方法：
（４）（３）の工程で得られた配列データの類似度判定の結果を整理する工程、
（５）最も高い類似度を有するテンプレート配列の名称および／またはＤＮＡ配列を取得する工程、
（６）ベクターに挿入されたＤＮＡ断片のＤＮＡ配列と最も高い類似度を有するテンプレート配列のＤＮＡ配列のアラインメントを判定する工程、
（７）目的のＤＮＡ断片が挿入された組換えベクターをＤＮＡシークエンシングして得られた配列データのうち、最も高い類似度を有するテンプレート配列と対応したタンパク質をコードしている部分のＤＮＡ配列のポイントミューテーションの有無を判定する工程、
（８）目的のＤＮＡ断片が挿入された組換えベクターをＤＮＡシークエンシングして得られた配列データのうち、ベクターの配列と対応する部分のＤＮＡ配列と使用したベクターのＤＮＡ配列をホモロジー検索プログラムにより比較する工程。
１０、目的のＤＮＡ断片が挿入された組換えベクターを同定するためのプログラムであって、クエリーとして目的のＤＮＡ断片が挿入された組換えベクターをＤＮＡシークエンシングして得られた配列データを入力する入力部と、サブジェクトとして目的のＤＮＡ断片のＤＮＡ配列および名称を入力して格納する辞書部を少なくとも有するコンピュータに、ホモロジー検索プログラムを用いて入力された該クエリーの類似度を判定する手順を実行させるためのプログラム。
１１、サブジェクトとして用いる配列に目的のＤＮＡ断片のＤＮＡ配列および使用したベクターのＤＮＡ配列が含まれる、前項１０に記載のプログラム。
１２、目的のＤＮＡ断片が挿入された組換えベクターを同定するためのプログラムであって、前記コンピュータに、入力されたクエリーの類似度を判定する手順に加えさらに以下の（１）〜（５）に記載の少なくとも一つの手順を実行させるための前項１０または前項１１に記載のプログラム：
（１）前手順で得られた配列データの類似度判定の結果を整理する手順、
（２）最も高い類似度を有するテンプレート配列の名称および／またはＤＮＡ配列を取得する手順、
（３）ベクターに挿入されたＤＮＡ断片のＤＮＡ配列と最も高い類似度を有するテンプレート配列のＤＮＡ配列のアラインメントを判定する手順、
（４）目的のＤＮＡ断片が挿入された組換えベクターをＤＮＡシークエンシングして得られた配列データのうち、最も高い類似度を有するテンプレート配列と対応したタンパク質をコードしている部分のＤＮＡ配列のポイントミューテーションの有無を判定する手順、
（５）目的のＤＮＡ断片が挿入された組換えベクターをＤＮＡシークエンシングして得られた配列データのうち、ベクターの配列と対応する部分のＤＮＡ配列と使用したベクターのＤＮＡ配列をホモロジー検索プログラムにより比較する手順。
１３、前項８または前項９の方法によって得られた、組換えベクターに挿入された目的のＤＮＡ断片の同定結果を表示する際に、生育させたコロニーおよび／またはＤＮＡシークエンシングを行った容器の形式に対応して視覚的に表示することを特徴とする、同定結果の表示方法。
１４、前項８または前項９の方法によって得られた、組換えベクターに挿入された目的のＤＮＡ断片の同定結果を、コロニーピッカー又は自動分注器に対応した形式で出力することを特徴とする、同定結果の出力方法。」
からなる。
【発明の効果】
【０００６】
本発明の目的ベクターへの遺伝子群の効率的挿入方法により、ＤＮＡの種類数にかかわらず、異なる複数種又は複数長のＤＮＡについてベクター構築を行うことができるようになった。また、目的ＤＮＡ配列をシークエンスすることで、個々のＤＮＡ断片をひとつずつ含む組換えベクターを効率的に取得することができるようになった。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明において、配列が既知の異なる複数種又は複数長の目的のＤＮＡ断片が同一種又は複数種のベクターに挿入される。配列が既知とは、既にｃＤＮＡライブラリーあるいはゲノムＤＮＡから単一化されて全配列について特定が完了し、大量生産によって機能、構造検討等に供されるような段階にある遺伝子（ＤＮＡ断片）をいう。複数とは２種以上であれば特に限定されないが、実用的な面を考慮すれば、５種以上であり、５〜２００種、５〜１００種のようなレベルで好適に実施できる。本発明で、複数種の目的のＤＮＡ断片とは遺伝子自体が異なる複数という意味である。複数長の目的のＤＮＡ断片とは、同一遺伝子で長さの異なる目的のＤＮＡ断片を意味する。同一種のベクターとは、目的のＤＮＡ断片が挿入されるベクターが全て同一という意味である。目的の複数種のベクターとは、ベクター自体も異なる複数種を使うという意味である。
【０００８】
挿入される種類及び／又は長さが異なるＤＮＡ断片はベクターと結合可能になるように両端を酵素処理したもの、より望ましくはＤＮＡ断片同士が互いにセルフライゲーションできない切断末端に調製されている目的のＤＮＡ断片を用いることが好適である。挿入ＤＮＡ断片の調製法としては、制限酵素によって目的ＤＮＡ断片を切り出して取得する方法と、ＰＣＲ法によって特定のクローニングサイトを両端に付加する方法の２種類が挙げられる。クローニングサイトとしては通常組換え実験で用いられる制限酵素（例えばEco RI, BamHI等）サイトを用いることも可能であるが、より望ましくはＤＮＡ断片間で互いに結合しないようなクローニングサイトを選択する方法、例えば制限酵素ＳｆｉＩ(US patent #5595895)やＤｒａＩＩＩ(US patent #4863858, 6048719)等のように回文構造を持たない制限酵素による切断サイトを用いる方法、クローニングサイトの５'末端を脱リン酸化する方法、Ｔａｑ系のDNA polymeraseによって平滑末端に特定の１塩基を付加する方法、あるいはGateway systemでentry vectorに含まれるａｔｔ配列を用いる方法等がある。
【０００９】
このように切断末端が調製された挿入用のＤＮＡ断片は、ＤＮＡ断片同士でセルフライゲーション反応をおこすことなく、ベクターと一対一でライゲーションを行なうことが可能である。また、同様に同じ手段によりベクターの挿入部分の切断末端の調製を行ない、ベクター同士が互いにセルフライゲーションできない切断末端とすること、つまりベクター間での結合が制御されていることが好ましい。
【００１０】
挿入用ＤＮＡ断片を混合するタイミングは、各ＤＮＡ断片取得前後又はクローニングサイトの処理後のいずれの方法も可能である。具体的には、元のＤＮＡ断片から個々に調製してベクターへのライゲーションの直前に混合する方法、元のＤＮＡ断片から酵素消化もしくはＰＣＲによって取得後ただちに混合して両端の処理及びライゲーションをまとめて行なう方法、又は酵素消化もしくはＰＣＲの前段階からあらかじめ混合状態で処理を一括におこないライゲーションをおこなう方法等が例示される。
【００１１】
用いるベクターは特に限定されず、公知のプラスミド、ファージ、コスミド、ＢＡＣ、ＹＡＣ、組換えウイルス、トランスポゾン等、通常の組み換え実験によって挿入ＤＮＡ断片を導入することが可能な全ての組換えベクターに適用することができる。ベクターは、当然に自体公知の組合せが好適であるプロモーター、エンハンサーと共に構築することができる。例えば、通常宿主に適したプロモーターが挿入されている市販の蛋白質発現ベクターを用いることができる。
具体的には、ZAP Express（ストラタジーン社製）、pSVK3（アマシャムファルマシアバイオテク社製）、pEGFP-C1（クロンテック社製）等が挙げられる。また、pMKITNeo（丸山和夫、細胞工学別冊８，新細胞工学実験プロトコール、p.259,秀潤社、(1993)）、ｐＥＵ−ＮII（インビトロテック社）等も好ましく用いられる。
【００１２】
目的とするポリヌクレオチドを発現させるためのプロモーターとしては、宿主が保有するプロモーターを一般に用いることができるが、これに限られるものではなく、具体的には宿主微生物が大腸菌の場合にはT3、T7、tac、lacプロモーター等を用いることができ、酵母の場合にはnmt1プロモーター、Gal1プロモーター等が挙げられる。また動物培養細胞の場合にはSV40プロモーター、CMVプロモーター等が挙げられる。またほ乳類由来のプロモーターが機能可能な宿主を用いる場合には、目的とするポリヌクレオチドに固有のプロモーターを用いることもできる。コムギ胚芽系（無細胞タンパク質合成手段）ではプロモーターとしてＴ７又はＳＰ６（プロメガ社）、リボソーム結合領域としてΩ（オメガ）、又はＲｉｂｏ  ｍ７Ｇ  Ｃａｐ  Ａｎａｌｏｇ（プロメガ社）等の組合せが好適に用いられる。
【００１３】
これらのベクターへの目的とするポリヌクレオチドの挿入は、該ポリヌクレオチド又はこれを含むＤＮＡ断片をベクター中のプロモーターの下流にプロモーターの制御下におかれるように連結して行なう。また、プロモーターと目的とするポリヌクレオチドとの間にコザック配列（Kozak, M., Gene, 234, 187, (1999)）を挿入したり、目的とするポリヌクレオチドの上流又は下流にタグとなるポリペプチドをコードするＤＮＡを挿入した構造を有するベクターも好ましく用いられる。タグとなるポリペプチドとしては特に制限はないが、例えば、FLAGタグ（BioTechniques, 7, 580, (1989)）等が挙げられる。
【００１４】
このようにして得られた本発明の組換えベクターは、リン酸カルシウム法（Science, 221, 551(1983)）、ＤＥＡＥデキストラン法（Science, 215, 166(1982)）、電気パルス法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 7161(1984)）、インビトロパッケージング法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72, 581(1975)）、ウィルスベクター法（Cell, 37, 1053(1984)）、あるいはリポフェクション法（Lipofection Reagent(GibcoBRL社製））等によって適当な宿主に導入される。
このとき、該組換えベクターを導入する宿主としては、各ベクターとの組合せにおいて自体公知の最適なものが選択され、大腸菌、酵母、動物細胞、及び植物細胞から選ばれる。該ベクターが体内で複製可能であり、かつ目的とするポリヌクレオチドがコードする蛋白質が生成されるものであれば特に限定されないが、例えば大腸菌、酵母、バキュロウィルス（節足動物多角体ウイルス）−昆虫細胞、動物細胞等が挙げられる。具体的には、大腸菌ではBL21、XL-2Blue（ストラタジーン社製）等、酵母では例えばSP−Q01（ストラタジーン社製）等、バキュロウィルスでは例えばAcNPV（J. Biol. Chem., 263, 7406(1988)）とその宿主であるSf-9（J. Biol. Chem., 263, 7406(1988)）等が挙げられる。また動物細胞としてはマウス繊維芽細胞C127（J. Viol. , 26, 291(1978)）やチャイニーズハムスター卵巣細胞CHO（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216(1980)）やアフリカミドリザル腎臓由来COS-7（ATCC CRL1651：アメリカン  タイプ  カルチャー  コレクション）等が挙げられる。
【００１５】
ライゲーション後に宿主細胞に導入されたベクターは通常の場合１クローン細胞中に１種類だけ取り込まれる。本発明ではこの細胞本来の持つ選択特性を利用して混合状態になっているライゲーション混合液からベクターを１種類ずつ回収する。具体的には、例えば大腸菌や酵母の場合では目的とする複数の配列のＤＮＡ断片のトランスフォーメーション後に選択培地中で生育するコロニーを一つずつピックアップして、各コロニー由来のベクターの配列を調べ、回収する。また、動物細胞や植物細胞の場合にはトランスフェクションあるいはインフェクションによってライゲーション混合液を細胞内に導入した後に選択培地中で生育する細胞をいったん単一細胞に分け、各クローン細胞の持つベクターの挿入ＤＮＡ断片の配列を調べ、回収する。
【００１６】
構築されたベクターを同定する方法としては、間接的には特定の制限酵素による消化パターンを見る方法、直接的にはＤＮＡ配列を読む方法が挙げられる。ベクター構築のハイスループット化の目的からは、ＤＮＡ配列を読み、コンピュータによって目的配列を検索・照合する方法がより好ましい。
【００１７】
ＤＮＡ断片が挿入された組換えベクターの同定をコンピュータを使って行なう基本的理念としては、１）目的のＤＮＡ断片および／またはベクターの既知のＤＮＡ配列データ群情報を調整すること、２）ＤＮＡ断片が挿入された個々の組換えベクターのＤＮＡ配列の配列データをＤＮＡシークエンシングによって得ること、及び３）前記１）で調整した既知ＤＮＡ配列データ群情報をもとに前記２）で得られたサブジェクトとなるＤＮＡ配列データの類似度判定をホモロジー検索プログラムにより行うこと、を含むシステムを導入することでおこなう。
１）の目的のＤＮＡ断片および／またはベクターの既知ＤＮＡ配列データ群情報を調整することとは、挿入される可能性のあるＤＮＡ断片および／または実験に用いるベクターについて基データとなる既知のＤＮＡ配列を、好ましくは該既知ＤＮＡ配列の全てを準備することを意味する。以下、挿入される可能性のある目的のＤＮＡ断片の既知ＤＮＡ配列（一部又は全部）を「テンプレート配列」、調整されたテンプレート配列のＤＮＡ配列データ群を「サブジェクトファイル」または「サブジェクト」と称することがある。また、実験に用いるベクターの既知（一部又は全部）のＤＮＡ配列を「ベクター配列」、調整されたベクター配列のＤＮＡ配列データ群を「ベクター配列ファイル」と称することがある。テンプレート配列やベクター配列は、例えばテキスト形式で保存すればよい。サブジェクトファイルおよび／またはベクター配列ファイルにはさらにそれらの配列に対応する名前が格納されていることが好ましい。
２）のＤＮＡシークエンシングは、ＤＮＡ断片が挿入された組換えベクターのＤＮＡ配列の全部について行う必要はなく、例えば、挿入されたＤＮＡ断片のうち、２０塩基以上、好ましくは１００塩基以上、より好ましくは４００塩基以上の配列データを取得すればよい。また、得られた配列データは、例えばテキスト形式で保存すればよい。
３）のホモロジー検索プログラムとは市販のプログラムを広く利用可能であり、既知配列情報をもとに、サブジェクトとなるＤＮＡ配列の類似性の程度を評価しうるプログラムを意味し、本発明ではＢＬＡＳＴサーチ系を好適に利用できる。本プログラムは、ホモロジーサーチを可能とする限りは特に限定されず、例えばＦＡＳＴＡ等も例示される。なお、ホモロジーサーチではなく完全一致サーチを行ってもよいが、効率的な面からはホモロジーサーチの導入が好ましい。もちろん、ホモロジーサーチと完全一致サーチを組合わせて行ってもよい。
【００１８】
本発明では、さらに以下のような要素（工程）を加えることにより、ベクター中に挿入されたＤＮＡ断片の評価が確実化される。つまり、４）ホモロジー検索プログラムによって得られた前記３）の配列データの類似度判定の結果を整理すること、５）ヒットクローン名および／またはヒットクローン本来の配列を取得すること、６）ベクターに挿入されたＤＮＡ配列と最も高い類似度を有するテンプレート配列のＤＮＡ配列のアラインメントを判定すること、７）ベクターに挿入されたＤＮＡ配列のポイントミューテーションの有無を判定すること、８）目的のＤＮＡ断片が挿入された組換えベクターをＤＮＡシークエンシングして得られた配列データのうち、ベクターの配列と対応する部分のＤＮＡ配列と使用したベクターのＤＮＡ配列を比較すること、を含む方法である。ここでもホモロジーサーチではなく完全一致サーチを行ってもよいが、効率的な面からはホモロジーサーチの導入が好ましい。もちろん、ホモロジーサーチと完全一致サーチを組合わせて行ってもよい。
【００１９】
４）ホモロジー検索プログラムによって得られた前記３）の配列データの類似度判定の結果を整理することとは、ＢＬＡＳＴ等を用いたサーチ結果ファイルを、シークエンスプレートの名前とウェル位置に応じて配置した表（データーベース）を作成することである。
５）のヒットクローン名を取得することとは、ホモロジー検索の結果、ベクターに目的のＤＮＡ断片が挿入された可能性が高い（ヒットした）クローン名（クローンNo.）をサブジェクトの中から特定（選択）することを意味する。    
また、ヒットクローン本来の配列を取得することとは、可能性の高い目的ＤＮＡ断片の既知配列との照合のために当該既知配列情報を準備することをいう。すなわち、最も高い類似度を有するテンプレート配列の名称および／またはＤＮＡ配列を取得することを意味する。
６）のベクターに挿入されたＤＮＡ配列と最も高い類似度を有するテンプレート配列のＤＮＡ配列のアラインメントを判定することとは、ベクター中に挿入された配列において、目的のＤＮＡ断片と一致する部分または位置を特定することを意味する。
７）のベクターに挿入されたＤＮＡ配列のポイントミューテーションの有無を判定することとは、挿入されたＤＮＡ断片がＤＮＡレベル又はアミノ酸レベルで変異していないかどうかの同定である。
８）の目的のＤＮＡ断片が挿入された組換えベクターをＤＮＡシークエンシングして得られたベクターの配列と対応する部分のＤＮＡ配列と使用したベクターのＤＮＡ配列を比較することとは、以上のような予備同定で、かなりの精度で挿入ＤＮＡ断片の適合性が確保されたので、このＤＮＡ断片が挿入された可能性のあるベクターのＤＮＡ配列データ群情報を調整し、選別された可能性のある組換えベクターの配列データとベクターの判読ＤＮＡ配列とホモロジーサーチをすること、すなわち１）で調整したベクターのＤＮＡ配列データ群情報をもとに、ベクターの判読ＤＮＡ配列との類似性の程度を評価することを意味する。ＤＮＡシークエンシングは、挿入されたＤＮＡ断片との連結部分を含むベクターのＤＮＡ配列データが取得できればよく、例えば、１０塩基以上、好ましくは３０塩基以上、より好ましくは１００塩基以上のベクター部分のＤＮＡ配列データが取得できればよい。
【００２０】
前述の１）〜８）の工程のうち、１）サブジェクトファイルおよびベクター配列ファイルを用意する工程、２）シークエンス結果をDNAシークエンサーから取得しテキスト形式に保存する工程以後の工程は、それらのファイルを指定したプログラムを実行することで、コンピュータを用いて自動的に順次行うことができる。具体的には、目的のＤＮＡ断片が挿入された組換えベクターを同定するためのプログラムであって、クエリーとして目的のＤＮＡ断片が挿入された組換えベクターをＤＮＡシークエンシングして得られた配列データを入力する入力部と、サブジェクトとして目的のＤＮＡ断片のＤＮＡ配列および名称を入力して格納する辞書部を少なくとも有するコンピュータに、３）の工程である、ホモロジー検索プログラムを用いて入力された該クエリーの類似度を判定する手順を実行させるためのプログラムを実行すればよい。
【００２１】
なお、３）〜８）の工程は、前記のコンピュータに、
３）該クエリーの類似度を判定する手順、
４）３）で得られた配列データの類似度判定の結果を整理する手順、
５）最も高い類似度を有するテンプレート配列の名称および／またはＤＮＡ配列を取得する手順、
６）ベクターに挿入されたＤＮＡ断片のＤＮＡ配列と最も高い類似度を有するテンプレート配列のＤＮＡ配列のアラインメントを判定する手順、
７）目的のＤＮＡ断片が挿入された組換えベクターをＤＮＡシークエンシングして得られた配列データのうち、最も高い類似度を有するテンプレート配列と対応したタンパク質をコードしている部分のＤＮＡ配列のポイントミューテーションの有無を判定する手順、
８）目的のＤＮＡ断片が挿入された組換えベクターをＤＮＡシークエンシングして得られた配列データのうち、ベクターの配列と対応する部分のＤＮＡ配列と使用したベクターのＤＮＡ配列を比較する手順、
を指定したプログラムを実行して、自動的に順次行うこともできる。
【００２２】
本発明の方法によって得られた組換えベクターに挿入された目的のＤＮＡ断片の同定結果を表示する際に、生育させたコロニーおよび／またはＤＮＡシークエンシングを行った容器の形式に対応して視覚的に結果を表示すれば、より効率的に同定作業を行うことができる。容器としては、例えば９６ウェルプレートなどのマルチウェルプレートを使用することができる。また、組換えベクターに挿入された目的のＤＮＡ断片の同定結果は、コロニーピッカーまたは自動分注器に対応した形式で出力してもよい。
【００２３】
かくして、本発明は、目的のＤＮＡ断片が一つ挿入されている複数種のベクターが、クローニングのばらつきも少なく、均等的に構築できること、そして大量の配列データから目的のＤＮＡ断片が挿入された組換えベクターを効率的に分取できることを達成し、目的のＤＮＡ断片が挿入された組換えベクターの構築を工業的規模で達成でき、産業的に極めて意義あるものである。以下に実施例で本発明を説明するが、本発明はこれらに限定解釈されるものではない。
【実施例】
【００２４】
（実施例１）
３１種類の遺伝子（以下ＯＲＦ）を１種類のベクターに挿入する作業を、本発明の方法を用いて行った。まず、ヒトの各臓器由来のｍＲＮＡからオリゴキャップ法を用いて取得された８２９個のｃＤＮＡクローンの母集団から（特開２００２−１７３７５号）、プロテインキナーゼと推定されるドメインを有するクローンを３１個選別し、これらのｃＤＮＡクローンをプラスミドテンプレイトとしてそれぞれＰＣＲ操作を行なった。表１に使用したｃＤＮＡクローンのクローン名とその全長塩基配列、およびそれらが登録されているデータベース（DDBJ、http://www.ddbj.nig.ac.jp/）における登録番号を示す。ＰＣＲの酵素としてはＰｙｒｏｂｅｓｔ（Ｔａｋａｒａ）を用い、マニュアルの用法・容量にしたがって反応を行なった。５'プライマーは目的ＯＲＦの５'末端から３'側に向かって２０〜３０塩基の配列でＴｍ値が約５５℃になるような長さのものを、３'プライマーは終止コドンから５'側に向かって２０〜３０塩基の配列でＴｍ値が約５５℃になるような長さのものの相補配列＋ＳｆｉＩサイトが付加されるようなもの〔GGCCCTTATGGCC（配列番号４１）＋相補配列〕を用いた。Ｔｍ値の計算は４ｘ（G＋C）＋２ｘ（A＋T）＋３５−２ｎによって計算した。
【表１】
2004215665.tif 000003
【００２５】
ＰＣＲの結果、３１種類中２７種類のクローン（Ｎｏ．１〜５、７〜１０、１２〜１７、１９〜３１）で目的サイズのＤＮＡ増幅が見られた（図１）。よって、これら２７種類の増幅ＤＮＡを１つに混合して以下の末端処理を行なった。即ち、Ｔａｑ系ＤＮＡポリメラーゼが２本鎖ＤＮＡの平滑末端に１塩基だけ付加するという特性を利用して、このＤＮＡ産物と２ｍＭのｄＴＴＰを、０．１５ＵのＥｘＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ及びその専用バッファー（Takara）を含む溶液中で７０℃、２時間反応させて両末端へのＴ（チミン）付加を行なった。次にＳｆｉＩ処理を３７℃で２時間行ない、3'末端がＳｆｉＩの粘着末端を露出するようにした。
【００２６】
ベクター側には同様にＳｍａＩで切断した平滑末端へのＡ（アデニン）を付加及びＳｆｉＩ処理を施しておき、上述のＤＮＡ産物とライゲーションを行なって大腸菌へのトランスフォーメーションを行なった。ベクターにはアンピシリン耐性遺伝子が含まれているためトランスフォーメーションを行なった大腸菌はアンピシリンを含むＬＢ寒天培地で一晩３７℃にてインキュベートした。
【００２７】
次に生育したコロニーを１９２クローン独立にピックアップして培養し、マルチスクリーン（Millipore）を用いてマニュアルにしたがってプラスミドを抽出し、目的の挿入ＤＮＡ断片が含まれているかどうかをＤＴＣＳシークエンシングキット及びＣＥＱ２０００ＤＮＡシークエンサー（Beckman Coulter）をマニュアルにしたがってシークエンシングを行なった。
【００２８】
次に１９２個のシークエンス結果に対し、以下の（１）〜（８）の手順で解析を行ない、挿入されたクローンの同定を行った。本実施例で開示する、目的のＤＮＡ断片が挿入された組換えベクターの同定方法の各工程のフローチャートを図３１に示す。
（１）目的のDNA断片および／またはベクターの既知ＤＮＡ配列データ群情報の調整
まず、２７種のテンプレート配列（配列番号１〜５、７〜１０、１２〜１７、１９〜３１のORF配列）を取得し、ひとつのテキストファイルを生成した。以下このファイルをサブジェクトファイルと呼ぶ。このファイルは、ＢＬＡＳＴサーチのサブジェクト（＝検索相手）として用いられるようなfasta型形式であり、２７種のテンプレートそれぞれの名前と配列が格納されている。
（２）目的のＤＮＡ断片が挿入されている可能性がある組換えベクターのＤＮＡ配列データの取得
また、１９２個のシークエンス結果をDNAシークエンサーから取得し、テキスト形式に保存した。ここで、１９２個のテキストファイルには、それぞれシークエンスプレートの名前とウェル位置、すなわち生育したコロニーと対応させることのできる名称がつけられている。なお、実験に用いたベクターのDNA配列も、同様にひとつのファイルとして生成した。これをベクター配列ファイルと呼ぶ。ベクター配列ファイルは、クローニングの手法（制限酵素の種類）毎に、同じベクターでも異なる配列として、クローニング後に生成する配列を登録するため、後述の（８）におけるサーチ判定の結果は、ベクターの種類・ベクターを切断した制限酵素・クローニングにおける繋ぎ目（塩基の付加や欠失がないか）といった、極めて詳細な結果を得ることができるという特徴がある。
（３）ホモロジー検索プログラムによるDNA配列の類似度の判定
続いて、１９２のテキストファイルをそれぞれクエリーにし、前述のサブジェクトファイルをサブジェクトにして、ＢＬＡＳＴサーチを計１９２回行ない、１９２のシークエンス結果に対応した１９２のＢＬＡＳＴサーチ結果ファイルを得た。これらのＢＬＡＳＴサーチ結果ファイルは、サーチのためのクエリーに用いたファイルと対応できるため、前述のように、それぞれシークエンスプレートの名前とウェル位置、すなわち生育したコロニーと対応させることができる。
（４）ホモロジー検索プログラムによって得られた類似度判定結果の整理
次に、１９２のＢＬＡＳＴサーチ結果ファイルを、シークエンスプレートの名前とウェル位置に応じて配置した表を作成した。
（５）ヒットクローン名の取得およびヒットクローンの本来の配列の取得
そして、それぞれのウェルに応じた１９２のＢＬＡＳＴサーチ結果ファイルを参照し、ＢＬＡＳＴサーチでヒットしたサブジェクトのうち、最も高いスコアを有するテンプレート配列（これをトップヒット配列と呼ぶ）の名称を取得した。そして、サブジェクトファイルよりトップヒット配列の配列を取得した。すなわち、このウェルに対応するクローンが、実際にはどのテンプレート配列かを同定したことになる。
（６）ベクターに挿入されたＤＮＡ配列と最も高い類似度を有するテンプレート配列のＤＮＡ配列のアラインメントの判定
続いて、このウェルに対応するシークエンス結果を再び取得した後、トップヒット配列とのアライメントを取り、シークエンス結果に含まれるトップヒット配列との向きおよび対応位置を同定した。これはすなわち、このウェルに含まれるクローンの一致部分、さらには解読されたシークエンス結果のうち、テンプレートの配列とベクターの配列がそれぞれどこに対応するかいうことを同定したことになる。
（７）ベクターに挿入されたＤＮＡ断片のＤＮＡ配列のポイントミューテーションの有無の判定
そして、シークエンス結果のうちテンプレートに対応する部分に関し、トップヒット配列との比較を詳細に行い、このシークエンス結果、すなわちそれに対応するプラスミドからタンパク質を生産したときのタンパク質にポイントミューテーションが入らないかどうかを判定した。
（８）選別された可能性のあるベクターのＤＮＡ配列と実際に判読したベクターのＤＮＡ配列の比較
次に、シークエンス結果のうちベクターに対応する部分に関し、ベクター配列ファイルとアライメントを取り、クローニングされているベクターを同定した。前述したように、ベクター配列ファイルとのアライメントは、ベクターの種類・ベクターを切断した制限酵素・クローニングにおける繋ぎ目（塩基の付加や欠失がないか）といった情報を得ることができるため、この段階で、テンプレート調整、ベクター調整、ライゲーション反応がうまくいったかどうかの判定を行なうことができる。この解析を、ウェルに関して全て、計１９２回行なうことにより、どのウェルのクローニングが成功したか、どのベクターにどのテンプレートがどの位置でクローニングされているかが解析できる。
【００２９】
これらの（１）〜（８）の工程のうち、（１）サブジェクトファイルおよび／またはベクター配列ファイルを用意する工程と（２）シークエンス結果をＤＮＡシークエンサーから取得しテキスト形式に保存する工程以降の、（３）〜（８）の工程は、クエリーとして目的のＤＮＡ断片が挿入された組換えベクターをＤＮＡシークエンシングして得られた配列データを入力する入力部と、サブジェクトとして目的のＤＮＡ断片のＤＮＡ配列および名称を入力して格納する辞書部を有するコンピュータに、
（３）該クエリーの類似度を判定する手順、
（４）前記（３）で得られた配列データの類似度判定の結果を整理する手順、
（５）最も高い類似度を有するテンプレート配列の名称および／またはＤＮＡ配列を取得する手順、
（６）ベクターに挿入されたＤＮＡ断片のＤＮＡ配列と最も高い類似度を有するテンプレート配列のＤＮＡ配列のアラインメントを判定する手順、
（７）目的のＤＮＡ断片が挿入された組換えベクターをＤＮＡシークエンシングして得られた配列データのうち、最も高い類似度を有するテンプレート配列と対応したタンパク質をコードしている部分のＤＮＡ配列のポイントミューテーションの有無を判定する手順、
（８）目的のＤＮＡ断片が挿入された組換えベクターをＤＮＡシークエンシングして得られた配列データのうち、ベクターの配列と対応する部分のＤＮＡ配列と使用したベクターのＤＮＡ配列を比較する手順、
を指定したプログラムを実行して、各工程を自動的に順次行った。
【００３０】
上記の結果、２３種類（クローンＮｏ．１〜５、９〜１０、１３〜１７、１９〜２４、２６〜２７、２９〜３１）のテンプレート配列を挿入ＤＮＡ断片として持つベクターが合計１０６クローンヒットしたことが確認された（表 １−１：図として２〜４に示した）。表１−２（図として５〜６に示した）及び表１−３（図として７〜８に示した）は、各プレート１及び２での、プレート位置とクローン番号及びその一致性を示す。
（実施例２）
【００３１】
NT2RP2001529（配列番号１１）（表２−１〜表２−４において「Clone A」と記す）のＯＲＦ（配列番号１１の塩基番号７０〜１４３４）から、翻訳後のアミノ酸長が277および295残基となるように、5'プライマーはORFの開始位置から(+)鎖方向に、3'プライマーはORFからそれぞれ831番目、885番目から(-)鎖方向に、実施例１と同様の方法で設計し、長さの異なる２つの遺伝子断片をＰＣＲによって取得し、以下実験例の方法で作成した３種類のベクター（pEU-SS4、pEU-SS5、pEU-SS6；表２−１〜表２−４において、それぞれ「Vector X」、「Vector Y」、「Vector Z」と記す）に本発明の方法を用いて挿入し、計６種類のベクターの取得検討を行った。実験操作は実施例１と同様に行い、大腸菌９６クローンを上述と同様にシークエンシングによってスクリーニングを行った。ただしこの際のシークエンシングは各大腸菌クローンについてforwardとreverseの双方向から行い、計１９２のシークエンス結果を得た。検索にはホモロジー検索プログラム（ＢＬＡＳＴサーチ）を用いた。判定はつなぎ目配列及び変異に問題がないものをＯＫとし、forwardとreverseの両者で判定ＯＫのものを当たり（ヒット）クローンとした。
その結果、上述のスクリーニングで目的の６種類のコンストラクト２４クローン（ウェル番号A02, B03, B10, C02, C04, C05, C10, C11, D05, D06, D07, D08, D09, E06, F01, F09, F11, G04, G05, G07, H01, H02, H04, H10）を得、連続一致塩基長の長さからそのうち代表の６クローン（ウェル番号A02, B03, C11, E06, F11, G05）を取得した〔表２−１：forward（図として９〜１２に示した）、表２−２：reverse（図として１３〜２４に示した）、表２−３：forward（図として２５〜２７に示した）、表２−４：reverse（図として２８〜３０に示した）〕。
【００３２】
（実験例１）
（１）pEU-NPの作製
pEU-NPベクターはSfi I site （GGCCATAAGGGCC：配列番号３２）、E. coli K12 genomeの一部（DDBJ Accession No. AE000115の塩基番号3141〜3471）、TMV genomeの一部（DDBJ Accession No. X02144の塩基番号6183〜6384）、pSP65の一部（DDBJ Accession No. X65329の塩基番号56〜2988）を5'→3'の順に結合することによって作製した。
【００３３】
（２）pEU-SS4（N末端GSTタグ用）の作製
まずSP6プロモーター配列、リボソーム結合配列（ランダムC）を5'→3'の順に含むオリゴDNA（AAAGCCGGCCGATTTAGGTGACACTATAGAACATCAACATCTTACATTTTACATTATAATTTTCACTCTCTATTTTTTTTTACATTAACAACATTTTTAGGCCTTTTGGCCATAAGGGCCAAA：配列番号３３）を合成によって取得し（断片１）、一方pXen-2（DDBJ Accession No: U81274）を鋳型としてGST、PreScission protease（アマシャムファルマシアバイオテク社、以下「psp」と略する）切断部位（CTGGAAGTTCTGTTCCAGGGTCCC：配列番号３４、ペプチド配列はLEVLFQGP：配列番号３５）を5'→3'の順に含むDNA断片をPCR法によって取得した（断片２）。次に上記断片１と断片２を5'→3'の順にライゲーションPCRによって結合し、この際に3'側にSma I, Sfi I site（CCCGGGaaaGGCCATAAGGGCC：配列番号３６）の付加も行った（断片３）。この断片３をSfi Iによって処理し、あらかじめNae I, Sfi Iによって開裂したpEU-NPと、5'側は平滑末端、3'側はSfi I siteを介してライゲーションを行い、pEU-NP にSP6プロモーター、ランダムC、GST、psp切断部位、およびＤＮＡクローニングサイト(Sma I, Sfi I)が挿入された小麦胚芽用発現ベクター（pEU-SS4）を作製した。
【００３４】
（３）pEU-SS5（N末端Hisタグ用）の作製
まず上述断片１と合成によって取得したオリゴDNA（ATGCACCATCACCATCACCATCACCATCACCATCTGGAAGTTCTGTTCCAGGGTCCCGGGAAAGGCCATAAGGGCC：断片４：配列番号３７）を5'→3'の順にライゲーションPCRによって結合した（  AAAGCCGGCCGATTTAGGTGACACTATAGAACATCAACATCTTACATTTTACATTATAATTTTCACTCTCTATTTTTTTTTACATTAACAACATTTTTAGGCCTTTTGGCCATAAGGGCCAAAATGCACCATCACCATCACCATCACCATCACCATCTGGAAGTTCTGTTCCAGGGTCCCGGGAAAGGCCATAAGGGCC：断片５：配列番号３８）。この断片５をSfi Iによって処理し、あらかじめNae I, Sfi Iによって開裂したpEU-NPと、5'側は平滑末端、3'側はSfi I siteを介してライゲーションを行い、pEU-NP にSP6プロモーター、ランダムC、ヒスタグ、およびＤＮＡクローニングサイト(Sma I, Sfi I)が挿入された小麦胚芽用発現ベクター（pEU-SS5）を作製した。
【００３５】
（４）pEU-SS6（C末端Hisタグ用）の作製
まず上述断片１と合成によって取得したオリゴDNA（CCTTTTGGCCATAAGGGCCACCATCACCATCACCATCACCATTGACCATGG：断片６：配列番号３９）を5'→3'の順にライゲーションPCRによって結合した（AAAGCCGGCCGATTTAGGTGACACTATAGAACATCAACATCTTACATTTTACATTATAATTTTCACTCTCTATTTTTTTTTACATTAACAACATTTTTAGGCCTTTTGGCCATAAGGGCCAAACCTTTTGGCCATAAGGGCCACCATCACCATCACCATCACCATTGACCATGG：断片７：配列番号４０）。この断片７をNco Iによって処理し、あらかじめNae I, Nco Iによって開裂したpEU-NPと、5'側は平滑末端、3'側はNco I siteを介してライゲーションを行い、pEU-NP にSP6プロモーター、ランダムC、ＤＮＡクローニングサイト(Stu I, Sfi I) 、およびHisタグが挿入された小麦胚芽用発現ベクター（pEU-SS5）を作製した。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】ＤＮＡ増幅を示す図である。（実施例１）
【図２】表１−１を示す図である。（実施例１）
【図３】表１−１を示す図である。（実施例１）
【図４】表１−１を示す図である。（実施例１）
【図５】表１−２を示す図である。（実施例１）
【図６】表１−２を示す図である。（実施例１）
【図７】表１−３を示す図である。（実施例１）
【図８】表１−３を示す図である。（実施例１）
【図９】表２−１を示す図である。（実施例２）
【図１０】表２−１を示す図である。（実施例２）
【図１１】表２−１を示す図である。（実施例２）
【図１２】表２−１を示す図である。（実施例２）
【図１３】表２−２を示す図である。（実施例２）
【図１４】表２−２を示す図である。（実施例２）
【図１５】表２−２を示す図である。（実施例２）
【図１６】表２−２を示す図である。（実施例２）
【図１７】表２−２を示す図である。（実施例２）
【図１８】表２−２を示す図である。（実施例２）
【図１９】表２−２を示す図である。（実施例２）
【図２０】表２−２を示す図である。（実施例２）
【図２１】表２−２を示す図である。（実施例２）
【図２２】表２−２を示す図である。（実施例２）
【図２３】表２−２を示す図である。（実施例２）
【図２４】表２−２を示す図である。（実施例２）
【図２５】表２−３を示す図である。（実施例２）
【図２６】表２−３を示す図である。（実施例２）
【図２７】表２−３を示す図である。（実施例２）
【図２８】表２−４を示す図である。（実施例２）
【図２９】表２−４を示す図である。（実施例２）
【図３０】表２−４を示す図である。（実施例２）
【図３１】目的のＤＮＡ断片が挿入された組換えベクターの同定方法の各工程のフローチャート示す図である。（実施例１）
【図１】
2004215665.tif 000004
【図２】
2004215665.tif 000005
【図３】
2004215665.tif 000006
【図４】
2004215665.tif 000007
【図５】
2004215665.tif 000008
【図６】
2004215665.tif 000009
【図７】
2004215665.tif 000010
【図８】
2004215665.tif 000011
【図９】
2004215665.tif 000012
【図１０】
2004215665.tif 000013
【図１１】
2004215665.tif 000014
【図１２】
2004215665.tif 000015
【図１３】
2004215665.tif 000016
【図１４】
2004215665.tif 000017
【図１５】
2004215665.tif 000018
【図１６】
2004215665.tif 000019
【図１７】
2004215665.tif 000020
【図１８】
2004215665.tif 000021
【図１９】
2004215665.tif 000022
【図２０】
2004215665.tif 000023
【図２１】
2004215665.tif 000024
【図２２】
2004215665.tif 000025
【図２３】
2004215665.tif 000026
【図２４】
2004215665.tif 000027
【図２５】
2004215665.tif 000028
【図２６】
2004215665.tif 000029
【図２７】
2004215665.tif 000030
【図２８】
2004215665.tif 000031
【図２９】
2004215665.tif 000032
【図３０】
2004215665.tif 000033
【図３１】
2004215665.tif 000034
【配列表】
2004215665000001.app