【手続補正書】
【提出日】平成24年10月1日(2012.10.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の段階を含む、細胞内のイオンチャネルの活性を検出する方法：
a)イオンチャネルを持つ細胞を提供する段階、
b)細胞に、タリウム指示薬および生理的濃度の塩素イオンを含む添加緩衝液を提供する段階、
c)細胞にタリウムを含む刺激緩衝液を提供する段階であって、それによりイオンチャネルを通してのタリウムの細胞への流入が起こる、段階、
d)タリウム指示薬を検出する段階。
【請求項２】
タリウム指示薬が細胞内でタリウムと結びつく、請求項1記載の方法。
【請求項３】
タリウム指示薬がタリウムの有無で変化する光学特性を持つ、請求項1記載の方法。
【請求項４】
タリウム指示薬がタリウムイオンと結びついた時に蛍光の増加を示す化合物である、請求項1記載の方法。
【請求項５】
タリウム指示薬がタリウムイオンと結びついた時に細胞内で光学密度の変化を示す化合物である、請求項1記載の方法。
【請求項６】
タリウム指示薬が疎水性である、請求項1記載の方法。
【請求項７】
タリウム指示薬が親水性である、請求項1記載の方法。
【請求項８】
タリウム指示薬がアセトキシメチルエステル部分を含む、請求項1記載の方法。
【請求項９】
タリウム指示薬が環境に感受性のある蛍光色素である、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
タリウム指示薬が非蛍光化合物である、請求項1記載の方法。
【請求項１１】
タリウム指示薬がタリウムと結びついて沈殿物または着色生成物を形成する、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
タリウム指示薬がヨウ化物、臭化物およびクロム酸塩から選択されたイオンである請求項10記載の方法。
【請求項１３】
タリウム指示薬がタリウムイオンの存在下で蛍光強度の減少を示す、請求項1記載の方法。
【請求項１４】
タリウム指示薬がANTS、Fluo-4、Fluo-3、PBFI、フェングリーン、APTRA-BTCまたはMag-Fura Red、またはその誘導体もしくは塩である、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
タリウム指示薬がタリウムイオンの存在下で蛍光の増加を示す、請求項1記載の方法。
【請求項１６】
タリウム指示薬がマグネシウムグリーン、Fluo-4FF、FluoZin-1またはFluoZin-2、RhodZin-3、またはその誘導体もしくは塩である、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
タリウム指示薬がタリウム感受性分析で25%以上の蛍光強度変化を示す蛍光化合物である、請求項1記載の方法。
【請求項１８】
タリウム指示薬が一価または二価のカチオンに感受性のある蛍光化合物である、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
タリウム指示薬がZn2+またはCa2+指示薬である、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
タリウム指示薬がキサンテン部分を含む、請求項1記載の方法。
【請求項２１】
タリウム指示薬がFluoZin 1、FluoZin 2、FluoZin 3、FluoZin 4、Red Fluo-4FF、マグネシウムグリーン、フェングリーン、RhodZin-3、またはその誘導体もしくは塩である、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
タリウム指示薬がクマリン部分を含む、請求項1記載の方法。
【請求項２３】
タリウム指示薬がBTCまたはAPTRA-BTC、またはその誘導体もしくは塩である、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
タリウム指示薬がベンゾフラン部分を含む、請求項1記載の方法。
【請求項２５】
タリウム指示薬がMag-Fura Redまたはその誘導体もしくは塩である、請求項24記載の方法。
【請求項２６】
タリウム指示薬がナフタレン部分を含む、請求項1記載の方法。
【請求項２７】
タリウム指示薬がクラウンエーテル部分を含む、請求項26記載の方法。
【請求項２８】
タリウム指示薬がアセトキシメチルエステル部分を含む、請求項1〜27のいずれか一項記載の方法。
【請求項２９】
添加緩衝液の塩素イオン濃度が約2 mMより大きい、請求項1記載の方法。
【請求項３０】
添加緩衝液の塩素イオン濃度が約5 mM〜約20 mMである、請求項1記載の方法。
【請求項３１】
添加緩衝液の塩素イオン濃度が約20 mM〜約100 mMより大きい、請求項1記載の方法。
【請求項３２】
添加緩衝液の塩素イオン濃度が約50 mM〜約150 mMである、請求項1記載の方法。
【請求項３３】
塩素イオン源がNaClまたはKClである、請求項1記載の方法。
【請求項３４】
タリウムが塩の形態である、請求項1記載の方法。
【請求項３５】
タリウム塩が添加緩衝液に可溶性である、請求項34記載の方法。
【請求項３６】
タリウム塩がTl2SO4、Tl2CO3、TlCl、TlOH、TlOAc、およびTlNO3から選択される、請求項34記載の方法。
【請求項３７】
刺激緩衝液が約4.0 mM未満の濃度のタリウムを含む、請求項1記載の方法。
【請求項３８】
刺激緩衝液が約3.0 mM未満の濃度のタリウムを含む、請求項1記載の方法。
【請求項３９】
刺激緩衝液が約0.1〜約2.0 mMの濃度のタリウムを含む、請求項1記載の方法。
【請求項４０】
刺激緩衝液が約0.1 mM〜約2.0 mMの濃度のタリウムを含み、かつ添加緩衝液が、約50 mM〜約150 mMの濃度の塩素イオンを含む、請求項1〜39のいずれか一項記載の方法。
【請求項４１】
刺激緩衝液が約2.0 mM〜約5.0 mMの濃度のタリウムを含み、かつ添加緩衝液が、約50 mM〜約150 mMの濃度の塩素イオンを含む、請求項1〜39のいずれか一項記載の方法。
【請求項４２】
タリウムレベルを定量化する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項４３】
タリウムレベルを定量化する段階が、タリウム流入に反応したタリウム指示薬の少なくとも一つの光学特性を測定する段階を含む、請求項42記載の方法。
【請求項４４】
タリウム指示薬の少なくとも一つの光学特性が強度、極性、周波数、または光学密度である、請求項43記載の方法。
【請求項４５】
タリウム指示薬が光学顕微鏡法、共焦点顕微鏡法、蛍光顕微鏡法または分光光度法で検出される、請求項1記載の方法。
【請求項４６】
添加緩衝液が細胞に提供された後に細胞を洗浄する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項４７】
添加緩衝液が細胞に提供された後に細胞を洗浄する段階を含まない、請求項1記載の方法。
【請求項４８】
添加緩衝液に消光剤を添加する段階をさらに含む、請求項47記載の方法。
【請求項４９】
消光剤が実質的に細胞透過性でない、請求項48記載の方法。
【請求項５０】
消光剤がタートラジン、アマランス、アシッドレッド37、コンゴレッド、トリパンブルー、ブリリアントブラック、またはこれらの組み合わせである、請求項48記載の方法。
【請求項５１】
イオンチャネルを刺激で刺激する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項５２】
刺激がイオンチャネルに結合するリガンド、チャネル連結型受容体、または電気刺激である、請求項51記載の方法。
【請求項５３】
刺激が、GIRKカリウムイオンチャネルを活性化してタリウムを流入させることができるGタンパク質共役受容体アゴニストである、請求項51記載の方法。
【請求項５４】
刺激がニコチン、アセチルコリン、ムスカリン、カルバミリン、またはGIRKカリウムイオンチャネル活性化剤である、請求項51記載の方法。
【請求項５５】
刺激がイオンチャネルの脱分極を生じる組成物を含む、請求項51記載の方法。
【請求項５６】
組成物がイオノフォア、バリノマイシン、またはカリウム塩を含む、請求項55記載の方法。
【請求項５７】
組成物がチャネル・ロドプシン、ハロロドプシン、または量子ドットナノ結晶を含む、請求項55記載の方法。
【請求項５８】
以下の段階を含む、細胞内のイオンチャネルの活性を検出する方法：
a）イオンチャネルを含む細胞にタリウムを負荷する段階、
b）細胞に、タリウム指示薬および生理的濃度の塩素イオンを含む溶液を提供する段階、
c）イオンチャネルを通してタリウムの流出を生じるように細胞のイオンチャネルを刺激する段階、ならびに
d）タリウム指示薬を検出する段階。
【請求項５９】
過剰のタリウムを除去するために細胞を洗浄する段階をさらに含む、請求項58記載の方法。
【請求項６０】
イオンチャネルがタリウム指示薬に対して不透過性である、請求項58記載の方法。
【請求項６１】
以下の段階を含む、細胞内のイオンチャネルの活性を検出する方法：
a）細胞を添加緩衝液と接触させる段階であって、ここで該細胞はイオンチャネルを含み、かつ該添加緩衝液はタリウム指示薬および生理的濃度の塩素イオンを含む、段階、
b）該細胞にタリウムを含む刺激緩衝液を提供する段階であって、それによりイオンチャネルを通してのタリウムの細胞への流入が起こる、段階、ならびに
c）タリウム指示薬を検出する段階。
【請求項６２】
イオンチャネルがカリウムイオンチャネル、受容体に連結したイオンチャネル、チャネル連結型受容体、およびイオントランスポーターから選択される、請求項1〜61のいずれか一項記載の方法。
【請求項６３】
イオンチャネルがリガンドまたは電位依存性のイオンチャネル、伸展活性化カチオンチャネル、または選択的または非選択的カチオンチャネルである、請求項1〜61のいずれか一項記載の方法。
【請求項６４】
細胞が細菌、酵母、植物および動物細胞から成る群より選択される、請求項1〜61のいずれか一項記載の方法。
【請求項６５】
細胞が哺乳動物細胞である、請求項1〜61のいずれか一項記載の方法。
【請求項６６】
細胞がカリウムチャネルを含む、請求項1〜61のいずれか一項記載の方法。
【請求項６７】
細胞がニューロン、心臓細胞、がん細胞、または平滑筋細胞である、請求項1〜61のいずれか一項記載の方法。
【請求項６８】
細胞が不死化細胞である、請求項1〜61のいずれか一項記載の方法。
【請求項６９】
イオンチャネルがタリウムイオンに対して透過性である、請求項1〜61のいずれか一項記載の方法。
【請求項７０】
タリウム指示薬がANTS、Fluo-4、Fluo-3、PBFI、フェングリーン、マグネシウムグリーン、Mag-Fura Red、Fluo-4FF、FluoZin-1およびFluoZin-2、RhodZin-3、またはその誘導体もしくは塩から成る群より選択される、請求項1〜61のいずれか一項記載の方法。
【請求項７１】
タリウム指示薬がANTS、Fluo-4、Fluo-3、PBFI、フェングリーン、マグネシウムグリーン、Mag-Fura Red、Fluo-4FF、FluoZin-1、RhodZin-3およびFluoZin-2、またはその塩から成る群より選択される化合物のアセトキシメチル（AM）エステル誘導体である、請求項1〜61のいずれか一項記載の方法。
【請求項７２】
以下を含む、細胞内のイオンチャネルの活性を検出するためのキット：
a）タリウム指示薬および生理的濃度の塩素イオンを含む添加緩衝液、ならびに
b）タリウムを含み、かつイオンチャネルを通してのタリウムの細胞への流入を引き起こす刺激緩衝液。
【請求項７３】
以下を含む、細胞内のイオンチャネルの活性を検出するためのキット：
a）タリウムを含むタリウム負荷溶液、ならびに
b）タリウム指示薬および生理的濃度の塩素イオンを含む添加緩衝液。
【請求項７４】
以下を含む、細胞内のイオンチャネルの活性を検出するための溶液：
a）タリウム指示薬、
b）生理的濃度の塩素イオン、および
c）タリウム。
【請求項７５】
溶液中のタリウム濃度が< 4.5 mMである、請求項74記載の溶液。
【請求項７６】
溶液中のタリウム濃度が約0.1 mM〜約4 mMである、請求項74記載の溶液。
【請求項７７】
溶液中のタリウム濃度が約0.1 mM〜約2 mMである、請求項74記載の溶液。
【請求項７８】
溶液中の塩素イオン濃度が約10 mM〜約150 mMである、請求項74〜77のいずれか一項記載の溶液。
【請求項７９】
溶液中の塩素イオン濃度が約50 mM〜約150 mMである、請求項74〜77のいずれか一項記載の溶液。