【手続補正書】
【提出日】平成24年4月5日(2012.4.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
不純物を含有する組成物中の組み換えタンパク質を単離する方法であって、
（ａ）前記組成物にポリエチレングリコールを添加する工程と、
（ｂ）前記組成物に亜鉛を添加する工程と、
（ｃ）任意の順序の工程（ａ）および（ｂ）の後に、前記組み換えタンパク質に沈殿物を形成させる工程、および
（ｄ）前記沈殿した組み換えタンパク質を回収する工程
を包含し、同じ濃度の亜鉛を添加するがポリエチレングリコールを添加しないことによって沈殿される前記組み換えタンパク質の量または画分と組み合わせた、同じ濃度のポリエチレングリコールを添加するが亜鉛を添加しないことによって沈殿される前記組み換えタンパク質の量または画分と比較して、多い量または画分の前記組み換えタンパク質を沈殿させる濃度において、前記ポリエチレングリコールおよび亜鉛の添加が行われ、ポリエチレングリコールおよび亜鉛のみが、沈殿剤を構成する、方法。
【請求項２】
添加されたポリエチレングリコールは、約１，０００ダルトン（Ｄａ）〜約５０，０００Ｄａの範囲の平均分子量を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
添加されたポリエチレングリコールは、以下：
ａ）約１，０００Ｄａ〜約２０，０００Ｄａ、
ｂ）約２，０００Ｄａ〜約２５，０００Ｄａ、
ｃ）約２，０００Ｄａ〜約１５，０００Ｄａ、
ｄ）約３，０００Ｄａ〜約２０，０００Ｄａ、
ｅ）約４，０００Ｄａ〜約１０，０００Ｄａ、
ｆ）約３，０００Ｄａ、
ｇ）約３，３５０Ｄａ、
ｈ）約４，０００Ｄａ、
ｉ）約５，０００Ｄａ、
ｊ）約６，０００Ｄａ、
ｋ）約７，０００Ｄａ、
ｌ）約８，０００Ｄａ、および
ｍ）約９，０００Ｄａ
からなる群より選択される平均分子量を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ポリエチレングリコールが、約１％〜約４０％の範囲の最終濃度（ｗ／ｖ）で添加される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ポリエチレングリコールが、以下：
ａ）   約０．５％〜約３０％；
ｂ）   約０．５％〜約２．５％；
ｃ）   約１％〜約４０％；
ｄ）   約２％〜約３５％；
ｅ）   約２．０％〜約１０％；
ｆ）   約２．５％〜約３０％；
ｇ）   約３％〜約３０％；
ｈ）   約６％〜約２１％；
ｉ）   約０．５％；
ｊ）   約１％；
ｋ）   約１．５％；
ｌ）   約２％；
ｍ）   約２．５％；
ｎ）   約３％；
ｏ）   約４％；
ｐ）   約５％；
ｑ）   約６％；
ｒ）   約７％；
ｓ）   約８％；
ｔ）   約９％；
ｕ）   約１０％；
ｖ）   約１１％；
ｗ）   約１２％；
ｘ）   約１３％；
ｙ）   約１４％；
ｚ）   約１５％；
ａａ） 約２０％；
ａｂ） 約３０％；および
ａｃ） 約４０％
からなる群より選択される最終濃度（ｗ／ｖ）で添加される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
亜鉛が、約０．１ｍＭ〜約１００ｍＭの範囲の最終濃度で添加される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
亜鉛が、以下：
ａ）  約０．１ｍＭ〜約１Ｍ；
ｂ）  約０．２ｍＭ〜約７５ｍＭ；
ｃ）  約０．３ｍＭ〜約７．０ｍＭ；
ｄ）  約０．５ｍＭ〜約５０ｍＭ；
ｅ）  約０．５ｍＭ〜約１５ｍＭ；
ｆ）  約１ｍＭ〜約５０ｍＭ；
ｇ）  約１ｍＭ〜約２０ｍＭ；
ｈ）  約１．５ｍＭ〜約１５ｍＭ；
ｉ）  約２．５ｍＭ〜約１５ｍＭ；
ｊ）  約０．５ｍＭ；
ｋ）  約１ｍＭ；
ｌ）  約１．５ｍＭ；
ｍ）  約２．５ｍＭ；
ｎ）  約３．５ｍＭ；
ｏ）  約５ｍＭ；および
ｐ）  約１０ｍＭ
からなる群より選択される濃度で添加される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記沈殿物が形成され、次いで洗浄される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記沈殿物が水で洗浄される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記沈殿物が、約０．５ｍＭ〜約５ｍＭの濃度で亜鉛を含む溶液で洗浄される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記沈殿物が、約０．１％〜約２．５％の濃度でポリエチレングリコールを含む溶液で洗浄される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記沈殿物が、約０．５ｍＭ〜約５ｍＭの濃度で遷移金属を、約０．５％〜約５％（ｗ／ｖ）の濃度でポリアルキレングリコールを含む溶液で洗浄される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記組み換えタンパク質の単離のための、以下：
ａ）イミダゾール；
ｂ）グリシン；
ｃ）トリプトファン；
ｄ）システイン；
ｅ）ヒスチジン；
ｆ）ヒスタミン；および
ｇ）塩化アンモニウム
からなる群より選択される化合物の使用をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記化合物がイミダゾールである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記組み換えタンパク質が、ポリエチレングリコールまたは亜鉛の添加前に濃縮される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
予めの前記濃縮が、前記組み換えタンパク質の単離に必要とされるポリエチレングリコールまたは亜鉛の量を、約２倍〜約４０倍減少させる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記組み換えタンパク質は、沈殿前の前記組み換えタンパク質の比活性と比較して、以下：
ａ）   約５０％の比活性が保持；
ｂ）   約６０％の比活性が保持；
ｃ）   約７０％の比活性が保持；
ｄ）   約８０％の比活性が保持；
ｅ）   約９０％の比活性が保持；
ｆ）   約９５％の比活性が保持；および
ｇ）   約１００％の比活性が保持、
からなる群より選択される量で、生物学的活性を保持する、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記組み換えタンパク質が抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
不純物を含有する組成物中の組み換えタンパク質を単離する方法であって、
（ａ）ポリエチレングリコールおよび亜鉛からなる沈殿剤を添加する工程と、
（ｂ)前記組み換えタンパク質に沈殿物を形成させる工程と、
（ｃ)前記沈殿した組み換えタンパク質を回収する工程と
を包含し、同じ濃度の亜鉛を添加するがポリエチレングリコールを添加しないことによって沈殿される前記組み換えタンパク質の量または画分と組み合わせた、同じ濃度のポリエチレングリコールを添加するが亜鉛を添加しないことによって沈殿される前記組み換えタンパク質の量または画分と比較して、多い量または画分の前記組み換えタンパク質を沈殿させる濃度において、前記ポリエチレングリコールおよび亜鉛の添加が行われる、方法。
【請求項２０】
ポリエチレングリコールが、約２％〜約１０％の濃度で添加され、亜鉛が、約１．５ｍＭ〜約１５ｍＭの濃度で添加される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ポリエチレングリコールが、約５％の濃度で添加され、亜鉛が、約１０ｍＭの濃度で添加される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ポリエチレングリコールが、約１．５％の濃度で添加され、亜鉛が、約２．５ｍＭの濃度で添加される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
添加されるポリエチレングリコールは、約１，０００Ｄａ〜約２０，０００Ｄａの平均分子量を有する、請求項２に記載の方法。
【請求項２４】
添加されるポリエチレングリコールは、約３，３５０Ｄａの平均分子量を有する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ポリエチレングリコールは、約０．５％〜約２．５％の最終濃度（ｗ／ｖ）で添加される、請求項４に記載の方法。
【請求項２６】
ポリエチレングリコールは、約２％〜約１０％の最終濃度（ｗ／ｖ）で添加される、請求項４に記載の方法。
【請求項２７】
ポリエチレングリコールは、約１．５％の最終濃度（ｗ／ｖ）で添加される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
亜鉛は、約０．５ｍＭ〜約１５ｍＭの濃度で添加される、請求項６に記載の方法。
【請求項２９】
亜鉛は、約０．３ｍＭ〜約７ｍＭの濃度で添加される、請求項６に記載の方法。
【請求項３０】
亜鉛は、約２．５ｍＭの濃度で添加される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
ポリエチレングリコールは、約０．５％〜約２．５％の濃度で添加され、亜鉛は、約１．５ｍＭ〜約１５ｍＭの濃度で添加される、請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
ポリエチレングリコールは、約１．５％の濃度で添加され、亜鉛は、約２．５ｍＭの濃度で添加される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記不純物は、タンパク質、核酸またはそれらの組み合わせを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３４】
前記不純物は、前記組み換えタンパク質を産生したか、または含有していた宿主生物に由来する、タンパク質、核酸、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３５】
前記組成物は、約１０リットル〜約３０，０００リットルの容量を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３６】
前記組成物は、約５０リットル〜約１５，０００リットルの容量を有する、請求項１に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
本発明のいくつかの実施形態では、該ポリアルキレングリコールは、１，０００Ｄａ〜２０，０００Ｄａの分子量を有するポリエチレングリコールであり、該遷移金属は、亜鉛であり、該分離する工程は、該溶液中の該生体高分子を沈殿させ、その後、該生体高分子を単離するように該組成物を濾過することによって行われ、該生体高分子は、抗体である。
本発明はまた、以下の項目を提供する。
（項目１）
不純物を含有する組成物中の生体高分子を単離する方法であって、
（ａ）上記組成物にポリアルキレングリコールを添加する工程と、
（ｂ）上記組成物に遷移金属を添加する工程と、
（ｃ）上記不純物から上記生体高分子を分離する工程と、を含む、方法。
（項目２）
上記ポリアルキレングリコールは、ポリペンチレングリコール、ポリブチレングリコール、ポリプロピレングリコール、またはポリエチレングリコールからなる群から選択される、項目１に記載の方法。
（項目３）
上記ポリアルキレングリコールは、ポリエチレングリコールである、項目１に記載の方法。
（項目４）
上記ポリエチレングリコールは、１，０００Ｄａ〜２０，０００Ｄａの分子量を有する、項目３に記載の方法。
（項目５）
上記ポリエチレングリコールは、２，０００Ｄａ〜１５，０００Ｄａの分子量を有する、項目４に記載の方法。
（項目６）
上記ポリアルキレングリコールを添加する工程は、約０．５％〜約３０％（ｗ／ｖ）のポリアルキレングリコール濃度を有する組成物をもたらす、項目１に記載の方法。
（項目７）
上記ポリアルキレングリコールを添加する工程は、約２．０％〜約１０％（ｗ／ｖ）のポリアルキレングリコール濃度を有する組成物をもたらす、項目１に記載の方法。
（項目８）
上記遷移金属は、亜鉛、ニッケル、銅、コバルト、またはマンガンからなる群から選択される、項目１に記載の方法。
（項目９）
上記遷移金属は、亜鉛である、項目８に記載の方法。
（項目１０）
上記遷移金属を添加する工程は、約１ｍＭ〜約５０ｍＭの遷移金属濃度を有する組成物をもたらす、項目１に記載の方法。
（項目１１）
上記遷移金属を添加する工程は、約２．５ｍＭ〜約１５ｍＭの遷移金属濃度を有する組成物をもたらす、項目１に記載の方法。
（項目１２）
上記（ｃ）の分離する工程は、上記組成物を濾過することによって行われ、上記濾過する工程が、透過流れおよび固体流れを形成する、項目１に記載の方法。
（項目１３）
上記濾過する工程は、デッドエンドフィルタによって行われる、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
上記生体高分子は、実質的に上記固体流れに存在する、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
上記（ｃ）の分離する工程は、上記組成物を遠心分離に供することによって行われ、上記遠心分離が、上清および沈渣を形成する、項目１に記載の方法。
（項目１６）
上記生体高分子は、実質的に上記沈渣に存在する、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
上記生体高分子は、タンパク質である、項目１に記載の方法。
（項目１８）
上記タンパク質は、可溶性タンパク質である、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
上記タンパク質は、抗体である、項目１７に記載の方法。
（項目２０）
上記組成物は、真核細胞物質を含む、項目１に記載の方法。
（項目２１）
上記不純物は、タンパク質、脂質、核酸、リボ核酸、成長培地、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、項目１に記載の方法。
（項目２２）
上記ポリアルキレングリコールおよび遷移金属の添加が、上記生体高分子の回収を、３％を超えて増加させる、項目１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
（項目２３）
上記ポリアルキレングリコールおよび遷移金属の添加が、上記生体高分子の回収を、１０％を超えて増加させる、項目１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
（項目２４）
上記（ｃ）の分離する工程が、上記組成物を濾過することによって行われ、上記濾過する工程が膜間圧をもたらし、上記膜間圧が、上記濾過する工程の間、実質的に一定のままである、項目１〜１４および１７〜２３のいずれか１項に記載の方法。
（項目２５）
（ａ）上記ポリアルキレングリコールは、１，０００Ｄａ〜２０，０００Ｄａの分子量を有するポリエチレングリコールであり、
（ｂ）上記遷移金属は、亜鉛であり、
（ｃ）上記分離する工程は、上記溶液中の上記生体高分子を沈殿させ、その後、上記沈殿物を分離するように上記組成物を遠心分離にかけることによって行われ、
（ｄ）上記生体高分子は、抗体である、項目１に記載の方法。
（項目２６）
（ａ）上記ポリアルキレングリコールは、１，０００Ｄａ〜２０，０００Ｄａの分子量を有するポリエチレングリコールであり、
（ｂ）上記遷移金属は、亜鉛であり、
（ｃ）上記分離工程は、上記溶液中の上記生体高分子を沈殿させ、その後、上記沈殿物を分離するように上記組成物を濾過することによって行われ、
（ｄ）上記生体高分子は、抗体である、項目１に記載の方法。
（項目２７）
上記ポリアルキレングリコールおよび上記遷移金属の添加は、上記生体高分子の沈殿への相乗効果を有する、項目１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
（項目２８）
上記生体高分子の沈殿物を形成し、その後、洗浄する、項目１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
（項目２９）
上記沈殿物を、水で洗浄する、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
上記沈殿物を、約０．５ｍＭ〜約５ｍＭの濃度で、ＺｎＣｌ２を含む溶液で洗浄する、項目２８に記載の方法。
（項目３１）
上記沈殿物を、約０．１％〜約２．５％の濃度で、ポリアルキレングリコールを含む溶液で洗浄する、項目２８に記載の方法。
（項目３２）
上記生体高分子の単離のための、以下からなる群から選択される化合物の使用をさらに含む、項目１〜３１のいずれか１項に記載の方法
ａ）イミダゾール、
ｂ）グリシン、
ｃ）トリプトファン、
ｄ）システイン、
ｅ）ヒスチジン、
ｆ）ヒスタミン、および
ｇ）塩化アンモニウム。
（項目３３）
上記化合物は、イミダゾールである、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
ポリアルキレングリコールは、約０．５％〜約５％（ｗ／ｖ）の範囲内の濃度で、上記生体高分子の単離のために使用される、項目１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
（項目３５）
ポリアルキレングリコールは、以下からなる群から選択される濃度（ｗ／ｖ）で、上記生体高分子の単離のために使用される、項目１〜３３のいずれか１項に記載の方法
ａ）約０．５％、
ｂ）約１％、
ｃ）約１．５％、
ｄ）約２％、
ｅ）約２．５％、
ｆ）約３％、
ｇ）約３．５％、
ｈ）約４％、
ｉ）約４．５％、および
ｊ）約５％。
（項目３６）
遷移金属は、約０．５ｍＭ〜約５ｍＭの範囲内の濃度で、上記生体高分子の単離のために使用される、項目１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
（項目３７）
遷移金属は、以下からなる群から選択される濃度で、上記生体高分子の単離のために使用される、項目１〜３３のいずれか１項に記載の方法
ａ）約０．５ｍＭ、
ｂ）約１ｍＭ、
ｃ）約１．５ｍＭ、
ｄ）約２ｍＭ、
ｅ）約２．５ｍＭ、
ｆ）約３ｍＭ、
ｇ）約３．５ｍＭ、
ｈ）約４ｍＭ、
ｉ）約４．５ｍＭ、および
ｊ）約５ｍＭ。
（項目３８）
上記ポリアルキレングリコールを、上記組成物に添加して、約１．５％（ｗ／ｖ）の濃度のポリアルキレングリコールをもたらし、上記遷移金属を、上記組成物に添加して、約２．５ｍＭの濃度の遷移金属をもたらす、項目１に記載の方法。
（項目３９）
上記生体高分子は、ポリアルキレングリコールまたは遷移金属を添加する前に、濃縮される、項目１〜３８のいずれか１項に記載の方法。
（項目４０）
上記生体高分子は、ポリアルキレングリコールおよび遷移金属を添加する前に、濃縮される、項目１〜３８のいずれか１項に記載の方法。
（項目４１）
上記添加前濃縮は、上記生体高分子の単離に必要とされるポリアルキレングリコールまたは遷移金属の量を、約２〜約４０倍減少させる、項目３９または４０に記載の方法。
（項目４２）
上記添加前濃縮は、上記生体高分子の単離に必要とされるポリアルキレングリコールまたは遷移金属の量を、以下からなる群から選択される因数分減少させる、項目３９または４０に記載の方法
ａ）約２倍、
ｂ）約３倍、
ｃ）約４倍、
ｄ）約５倍、
ｅ）約１０倍、
ｆ）約１５倍、
ｇ）約２０倍、
ｈ）約２５倍、
ｉ）約３０倍、
ｊ）約３５倍、および
ｋ）約４０倍。
（項目４３）
上記生体高分子は、沈殿前、または沈殿および洗浄前の上記生体高分子の比活性と比較して、約５０％〜約１００％の生物活性を保持する、項目１〜４２のいずれか１項に記載の方法。
（項目４４）
上記生体高分子は、沈殿前、または沈殿および洗浄前の上記生体高分子の比活性と比較して、以下からなる群から選択される値の生物活性を保持する、項目１〜４２のいずれか１項に記載の方法
ａ）約５０％、
ｂ）約６０％、
ｃ）約７０％、
ｄ）約８０％、
ｅ）約９０％、
ｆ）約９５％、および
ｇ）約１００％。