(57)【要約】　　　（修正有）【課題】脂質代謝異常の診断用プライマーの提供。【解決手段】中鎖脂肪酸アシル−ＣｏＡ合成酵素（ＭＡＣＳ２）の第５１３番目のロイシン残基の変異を検出できる核酸分子であって、特定なアミノ酸配列を含んでなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドまたはそれに相補的なポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができるヌクレオチド断片を含んでなる、核酸分子。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
中鎖脂肪酸アシル−ＣｏＡ合成酵素（ＭＡＣＳ２）の第５１３番目のロイシン残基の変異を検出できる核酸分子であって、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドまたはそれに相補的なポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができるヌクレオチド断片を含んでなる、核酸分子。
【請求項２】
配列番号１に記載のＤＮＡ配列またはそれに相補的なＤＮＡ配列にハイブリダイズすることができるヌクレオチド断片からなる、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項３】
配列番号１に記載のＤＮＡ配列またはそれに相補的なＤＮＡ配列の連続する少なくとも１２ヌクレオチドのＤＮＡ断片からなる、請求項１または２に記載の核酸分子。
【請求項４】
第５１３番目のロイシン残基のセリンへの置換（Ｌ５１３Ｓ）を検出できる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項５】
第５１３番目のロイシン残基に対応するヌクレオチド部分をヌクレオチド断片中に有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項６】
第５１３番目のロイシン残基に対応するヌクレオチド部分を含む領域を核酸増幅法により増幅することができる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項７】
脂質代謝異常に起因する疾患の診断に用いられる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項８】
ＭＡＣＳ２の第５１３番目のロイシン残基の変異を検出できるプライマーペアであって、請求項１〜７のいずれか一項に記載の二種類の核酸分子からなるプライマーペア。
【請求項９】
第５１３番目のロイシン残基に対応するヌクレオチド部分を含む領域を核酸増幅法により増幅することができる、請求項８に記載のプライマーペア。
【請求項１０】
一方のプライマーが配列番号２に記載のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができるヌクレオチド断片からなり、他方のプライマーが配列番号２に記載のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができるヌクレオチド断片からなる、請求項８または９に記載のプライマーペア。
【請求項１１】
一方のプライマーが配列番号１に記載のＤＮＡ配列にハイブリダイズすることができるヌクレオチド断片からなり、他方のプライマーが配列番号１に記載のＤＮＡ配列に相補的なＤＮＡ配列にハイブリダイズすることができるヌクレオチド断片からなる、請求項８または９に記載のプライマーペア。
【請求項１２】
一方のプライマーが配列番号１に記載のＤＮＡ配列の連続する少なくとも１２ヌクレオチドのＤＮＡ断片からなり、他方のプライマーが配列番号１に記載のＤＮＡ配列に相補的なＤＮＡ配列の連続する少なくとも１２ヌクレオチドのＤＮＡ断片からなる、請求項８または９に記載のプライマーペア。
【請求項１３】
脂質代謝異常に起因する疾患の診断に用いられる、請求項８〜１２のいずれか一項に記載のプライマーペア。
【請求項１４】
ＭＡＣＳ２遺伝子の変異を検出することにより脂質代謝異常に起因する疾患を検出する方法であって、請求項１〜７のいずれか一項に記載の核酸分子または請求項８〜１３のいずれか一項に記載のプライマーペアを用いて、ＭＡＣＳ２の第５１３番目のロイシン残基の変異の有無を検出する工程を含んでなる方法。
【請求項１５】
下記アミノ酸配列を含んでなる、タンパク質：
（ａ）　配列番号４のアミノ酸配列、または
（ｂ）　置換、欠失、付加、および挿入から選択される１以上の改変を有し、かつ中鎖脂肪酸アシル−ＣｏＡ合成酵素活性を有する配列番号４のアミノ酸配列の改変アミノ酸配列。
【請求項１６】
請求項１５に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１７】
配列番号３のＤＮＡ配列からなる、請求項１６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１８】
配列番号２に記載のアミノ酸配列を含んでなる、タンパク質。
【請求項１９】
請求項１８に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項２０】
配列番号１に記載のＤＮＡ配列からなる、請求項１９に記載のポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の背景】
発明の分野
本発明は、脂質代謝異常の診断用プライマー並びに新規中鎖脂肪酸アシル−ＣｏＡ合成酵素およびその遺伝子に関する。
【０００２】
背景技術
糖尿病、肥満、心疾患、高血圧等の疾患は脂質代謝異常と関連していることが知られている。近年、中鎖脂肪酸の代謝に関連する酵素およびその遺伝子が研究され、そのうちのいくつかの酵素およびその遺伝子が配列決定されている。例えば、中鎖脂肪酸アシル−ＣｏＡ合成酵素１（ＭＡＣＳ１）は脂質代謝を司る酵素であることが知られており、この酵素のアミノ酸配列と遺伝子がそれぞれ配列決定されている（Ｆｕｊｉｎｏ　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６（３８），ｐｐ３５９６１−３５９６６（２００１））。また、中鎖脂肪酸に対するアシル−ＣｏＡ合成酵素に属するＳＡ遺伝子の遺伝子多型と脂質代謝異常との関連が報告されている（Ｉｗａｉ　Ｎ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，　１０５，ｐｐ４１−４７（２００２））。
【０００３】
【発明の概要】
本発明者等は、これまでに報告されていない中鎖脂肪酸アシル−ＣｏＡ合成酵素を特定し、そのアミノ酸配列とその遺伝子を配列決定した。本発明者らは更に、この合成酵素の多型として第５１３番目のロイシン残基の変異を同定し、この変異が脂質代謝異常と関連していることを見出した。本発明はこれらの知見に基づくものである。
【０００４】
本発明は、脂質代謝異常の遺伝子診断に用いることができる核酸分子の提供をその目的とする。
【０００５】
本発明によれば、中鎖脂肪酸アシル−ＣｏＡ合成酵素（ＭＡＣＳ２）の第５１３番目のロイシン残基の変異を検出できる核酸分子であって、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドまたはそれに相補的なポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができるヌクレオチド断片を含んでなる核酸分子（以下「本発明による核酸分子」とする）が提供される。
【０００６】
本発明はまた、新規な中鎖脂肪酸アシル−ＣｏＡ合成酵素およびその遺伝子の提供をその目的とする。
【０００７】
本発明によれば、下記アミノ酸配列を含んでなる、中鎖脂肪酸アシル−ＣｏＡ合成酵素（ＭＡＣＳ２）が提供される：
（ａ）　配列番号４のアミノ酸配列、または
（ｂ）　置換、欠失、付加、および挿入から選択される１以上の改変を有し、かつ中鎖脂肪酸アシル−ＣｏＡ合成酵素活性を有する配列番号４のアミノ酸配列の改変アミノ酸配列。
【０００８】
本発明によれば、上記タンパク質をコードするポリヌクレオチドからなる中鎖脂肪酸アシル−ＣｏＡ合成酵素遺伝子が提供される。
【０００９】
【発明の具体的説明】
本発明による核酸分子はＭＡＣＳ２の第５１３番目のロイシン残基の変異を検出できる。本明細書において「変異」とは、置換および欠失を含む意味で用いられる。
【００１０】
ＭＡＣＳ２の第５１３番目のロイシンの置換としては、ロイシンのセリンへの置換（Ｌ５１３Ｓ）が挙げられる。
【００１１】
Ｌ５１３Ｓを有するＭＡＣＳ２のアミノ酸配列は配列番号２に記載され、それをコードするヌクレオチド配列の一例が配列番号１に記載されている。従って、本発明による核酸分子は、配列番号１に記載のＤＮＡ配列またはそれに相補的なＤＮＡ配列にハイブリダイズすることができるヌクレオチド断片であることができる。
【００１２】
本発明において「ハイブリダイズする」とは、本発明による核酸分子がストリンジェントな条件下で標的ヌクレオチド分子にハイブリダイズし、標的ヌクレオチド分子以外のヌクレオチド分子にはハイブリダイズしないことを意味する。ストリンジェントな条件は、本発明による核酸分子とその相補鎖との二重鎖の融解温度Ｔｍ（℃）およびハイブリダイゼーション溶液の塩濃度などに依存して決定でき、例えば、Ｊ．　Ｓａｍｂｒｏｏｋ，　Ｅ．　Ｆ．　Ｆｒｉｓｃｈ，　Ｔ．　Ｍａｎｉａｔｉｓ；　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　２ｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）等を参照することができる。例えば、使用する核酸分子の融解温度よりわずかに低い温度下でハイブリダイゼーションを実施すると、核酸分子は標的ヌクレオチド分子に特異的にハイブリダイズするが、標的ヌクレオチド分子以外のヌクレオチド分子にはハイブリダイズしない。
【００１３】
本発明において「核酸分子」は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびＰＮＡ（ｐｅｐｔｉｄｅ　ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ）を含む意味で用いられる。
【００１４】
本発明による核酸分子の長さは、中鎖脂肪酸アシル−ＣｏＡ合成酵素に存在する変異を検出できるかぎり特に限定されるものではないが、例えば、１０〜１００ヌクレオチドの範囲であることができ、好ましくは少なくとも１２ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１５ヌクレオチド、より一層好ましくは１２〜３０ヌクレオチドである。従って、本発明による核酸分子は、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドまたはそれに相補的なポリヌクレオチドの連続する少なくとも１２ヌクレオチド、好ましくは少なくとも１５ヌクレオチド、より好ましくは１２〜３０ヌクレオチド、からなるヌクレオチド断片であることができる。本発明による核酸分子は、好ましくは、配列番号１のＤＮＡ配列またはそれに相補的なＤＮＡ配列の連続する少なくとも１２ヌクレオチド、好ましくは少なくとも１５ヌクレオチド、より好ましくは１２〜３０ヌクレオチド、からなるＤＮＡ断片であることができる。
【００１５】
ＭＡＣＳ２の第５１３番目のロイシン残基の変異は脂質代謝異常と関連している（実施例２参照）。従って、本発明による核酸分子は脂質代謝異常（脂肪酸代謝異常）に起因する疾患の診断に用いることができる。脂質代謝異常（脂肪酸代謝異常）に起因する疾患としては、糖尿病；虚血性心疾患のような心疾患；肥満；および高血圧が挙げられる。
【００１６】
また本発明によれば、ＭＡＣＳ２遺伝子の変異を検出することにより脂質代謝異常に起因する疾患を検出する方法であって、本発明による核酸分子または後述のプライマーペアを用いて、ＭＡＣＳ２の第５１３番目のロイシン残基の変異の有無を検出する工程を含んでなる方法が提供される。
【００１７】
具体的には、本発明による核酸分子はＰＣＲ法等の核酸増幅法による変異の検出にプライマーとして用いることができ、より具体的には、ＭＡＣＳ２の第５１３番目のロイシン残基に対応するヌクレオチド部分を含む領域を核酸増幅法により増幅するプライマーとして用いることができる。従って本発明によれば、本発明による核酸分子を用いて核酸試料を核酸増幅法により増幅し、ＭＡＣＳ２の第５１３番目のロイシン残基に対応するヌクレオチド部分を含む増幅産物の有無を検出する工程を含んでなる、脂質代謝異常に起因する疾患の検出法および診断法が提供される。変異を有する増幅産物の存在はＭＡＣＳ２遺伝子における変異の存在を示す。
【００１８】
診断に当たっては、例えば、被験者から血液等の試料を単離し、単離された試料からゲノムＤＮＡやｍＲＮＡ等の核酸試料を抽出し、必要であればｍＲＮＡから逆転写酵素によりｃＤＮＡを作製し、得られた核酸試料を鋳型として第５１３番目のロイシン残基を含む領域を増幅できるように設計された本発明による核酸分子を用いて核酸増幅法を実施し、得られた増幅産物のヌクレオチド配列を解析することにより、第５１３番目のロイシン残基の変異の有無を検出することができる。核酸の増幅に当たっては、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを鋳型とする場合には通常のＰＣＲ法等を用いることができ、ｍＲＮＡを鋳型とする場合にはＲＴ−ＰＣＲ法、ＮＡＳＢＡ法等を用いることができる。核酸増幅法と核酸増幅法による変異の検出法は周知であり、公知のいずれの方法を用いることができる。
【００１９】
核酸増幅法は通常プライマーのペアを用いて実施される。従って、本発明によれば、ＭＡＣＳ２の第５１３番目のロイシン残基の変異を検出できるプライマーペアであって、本発明による二種類の核酸分子からなるプライマーペアが提供される。プライマーペアを用いた核酸増幅法は周知であり、核酸増幅法におけるプライマーペアの選択は当業者に自明であろう。例えば、ＰＣＲ法においては、二種のプライマーの一方がＭＡＣＳ２遺伝子の二本鎖ＤＮＡの一方の鎖に対合し、他方のプライマーが二本鎖ＤＮＡのもう一方の鎖に対合し、かつ一方のプライマーにより伸長された伸長鎖に他方のプライマーが対合するようにプライマーを選択できる。
【００２０】
プライマーペアとしては、例えば、一方のプライマーが配列番号２に記載のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができるヌクレオチド断片からなり、他方のプライマーが配列番号２に記載のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができるヌクレオチド断片からなる、プライマーペアが挙げられる。
【００２１】
好ましいプライマーペアとしては、一方のプライマーが配列番号１に記載のＤＮＡ配列にハイブリダイズすることができるヌクレオチド断片からなり、他方のプライマーが配列番号１に記載のＤＮＡ配列に相補的なＤＮＡ配列にハイブリダイズすることができるヌクレオチド断片からなる、プライマーペアが挙げられる。
【００２２】
より好ましいプライマーペアとしては、一方のプライマーが配列番号１に記載のＤＮＡ配列の連続する少なくとも１２ヌクレオチドのＤＮＡ断片からなり、他方のプライマーが配列番号１に記載のＤＮＡ配列に相補的なＤＮＡ配列の連続する少なくとも１２ヌクレオチドのＤＮＡ断片からなる、プライマーペアが挙げられる。
【００２３】
プライマーの選択に当たっては、ＭＡＣＳ２の第５１３番目のロイシン残基に対応するヌクレオチド部分を含む領域をＰＣＲ法等の核酸増幅法により増幅できるようにプライマーを選択できる。具体的には、プライマーが、第５１３番目のロイシン残基に対応するヌクレオチド部分の５’上流領域に対合するように選択することで、第５１３番目のロイシン残基に対応するヌクレオチド部分を含む領域を増幅することができる。
【００２４】
核酸増幅法により得られた増幅産物のヌクレオチド配列の解析は、例えば、増幅産物を種々の制限酵素により処理し、得られた制限酵素断片を電気泳動処理し、電気泳動パターンを調べることによって行うことができる。すなわち、増幅産物中に変異が含まれている場合には、変異部分の制限酵素による切断に変化が生じ、変異を制限酵素断片の断片パターンの変化として認識することができる。
【００２５】
本発明による診断法においてはアレル特異的ＰＣＲ法を実施できるようにプライマーを設計することもできる。具体的には、プライマーの一方が変異部分に対合できるように設計し、他方を変異を含まない保存領域に対合できるように設計することができる。このように設計されたプライマーペアを用いて核酸増幅法を実施すると、核酸試料中に変異が存在する場合には増幅産物が得られ、変異が存在しない場合には増幅産物が得られない。従って、増幅産物の有無を検出することにより変異の有無を判定することができる。
【００２６】
本発明による核酸分子はハイブリダイゼーション法等による変異の検出にプローブとして用いることができる。従って本発明によれば、本発明による核酸分子と核酸試料とをハイブリダイズさせ、次いでハイブリダイゼーション複合体の存在を検出する工程を含んでなる、脂質代謝異常に起因する疾患の検出法および診断法が提供される。ハイブリダイゼーション複合体の存在はＭＡＣＳ２遺伝子における変異の存在を示す。
【００２７】
診断に当たっては、例えば、被験者から血液等の試料を単離し、単離された試料からゲノムＤＮＡやｍＲＮＡ等の核酸試料を抽出し、必要であればｍＲＮＡから逆転写酵素によりｃＤＮＡを作製し、ストリンジェントな条件下、本発明による核酸分子とのハイブリダイゼーション形成の有無を検出することにより、第５１３番目のロイシン残基の変異の有無を検出することができる。核酸試料は必要であれば制限酵素処理等を施し、ハイブリダイゼーションに適切な長さとすることもできる。ハイブリダイゼーション法とハイブリダイゼーション法による変異の検出法は周知であり、公知のいずれの方法をも用いることができる。例えば、サザンハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション等の技術を用いて実施でき、実施に当たっては例えば、Ｊ．　Ｓａｍｂｒｏｏｋ，　Ｅ．　Ｆ．　Ｆｒｉｓｃｈ，　Ｔ．　Ｍａｎｉａｔｉｓ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　２ｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）を参照することができる。
【００２８】
本発明による検出法および診断法において、ＭＡＣＳ２遺伝子において第５１３番目のロイシン残基に変異が存在すると、より具体的には、第５１３番目のロイシン残基がセリンに置換されていると評価されたサンプルは、脂質代謝異常に起因する疾患にかかっていると、あるいはその発症可能性があると診断することができる。また本発明によれば出生前および出生直後の診断が可能である。
【００２９】
本発明による検出法および診断法においては、第５１３番がロイシン残基であるアレル（アレル１）のホモ接合体と、第５１３番がセリン残基であるアレル（アレル２）のホモ接合体と、アレル１とアレル２のヘテロ接合体とを区別して検出することが好ましい。アレル２のホモ接合体を有する被験者は、アレル１のホモ接合体を有する被験者およびアレル１とアレル２のヘテロ接合体を有する被験者よりも、より高い確率で脂質代謝異常に起因する疾患にかかっていると、あるいはその発症可能性があると診断することができる。また、アレル１とアレル２のヘテロ接合体を有する被験者は、アレル１のホモ接合体を有する被験者よりも、より高い確率で脂質代謝異常に起因する疾患にかかっていると、あるいはその発症可能性があると診断することができる。このような遺伝子型の検出法は既に知られており、例えば、タックマン（Ｔａｑ　Ｍａｎ）ＰＣＲ法により検出することができる。
【００３０】
本発明によれば、（ａ）配列番号４のアミノ酸配列、または（ｂ）置換、欠失、付加、および挿入から選択される１以上の改変を有し、かつ中鎖脂肪酸アシル−ＣｏＡ合成酵素活性を有する配列番号４のアミノ酸配列の改変アミノ酸配列を含んでなる、タンパク質が提供される。改変の数は、１〜数個であることができる。改変アミノ酸配列が「中鎖脂肪酸アシル−ＣｏＡ合成酵素活性を有する」か否かは、そのアミノ酸配列からなるタンパク質を基質に作用させ、反応産物を検出することにより評価することができる。評価に当たっては、例えば、Ｆｕｊｉｎｏ　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６（３８），ｐｐ３５９６１−３５９６６（２００１）に記載の方法を参照できる。
【００３１】
本発明によれば上記タンパク質をコードするポリヌクレオチドが提供され、その好ましい例としては、配列番号３のＤＮＡ配列が挙げられる。
【００３２】
本発明による新規な中鎖脂肪酸アシル−ＣｏＡ合成酵素およびそれをコードする遺伝子は、遺伝子工学の分野において慣用されている手法に従って製造することができ、製造に必要な装置および材料は市販されているものを用いることができる。例えば、中鎖脂肪酸アシル−ＣｏＡ合成酵素をコードするｃＤＮＡを適当なプローブオリゴヌクレオチドを用いてｃＤＮＡライブラリーから単離し、必要であればｃＤＮＡが発現可能なように連結された組換えベクターを作製し、次いでｃＤＮＡあるいは組換えベクターで適当な宿主（例えば、ＣＯＳ−７細胞）を形質転換し、発現産物を採取することにより本発明による中鎖脂肪酸アシル−ＣｏＡ合成酵素を得ることができる。製造に当たってはＦｕｊｉｎｏ　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６（３８），ｐｐ３５９６１−３５９６６（２００１）を参照することができる。
【００３３】
【実施例】
実施例１：ＭＡＣＳ２遺伝子の配列決定および遺伝子多型の同定
（１）ＭＡＣＳ２遺伝子の配列決定
ＭＡＣＳ２の部分構造は、Ｇｅｎｂａｎｋのａｃｃｅｓｓｉｏｎ　＃ＨＵＡＣ００３０３４に登録されている。この部分構造と中鎖脂肪酸アシル−ＣｏＡ合成酵素遺伝子の一種であるＳＡＨとを比較し、ＭＡＣＳ２遺伝子の未同定の構造がＧｅｎｂａｎｋのａｃｃｅｓｓｉｏｎ　＃ＡＣ０２７３４６に存在することを見出した。
【００３４】
更に、ヒト肝臓ｍＲＮＡ由来Ｃａｐ　ｓｉｔｅ　ｃＤＮＡ（Ｎｉｐｐｏｎ　Ｇｅｎｅ（株））を用いてＭＡＣＳ２ｍＲＮＡの５’末端を決定した。決定にあたってはＭａｒｕｙａｍａ　Ｋ．　＆　Ｓｕｇａｎｏ　Ｓ．，Ｇｅｎｅ，１９９４：１３８：１７１−１７４に従って第３エクソン内のアンチセンスプライマーを用いた。
【００３５】
得られた５’上流部分の塩基配列をもとにＭＡＣＳ２のｃＤＮＡ配列を決定した。ＭＡＣＳ２のｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列は配列番号３および４に示される通りである。
【００３６】
ホモロジー検索ソフト（ＤＮＡＳＩＳ）を用いて既知の遺伝子との相同性検索を実施した。その結果、配列番号４のアミノ酸配列はアミノ酸配列全体で、ＳＡＨ、ＭＡＣＳ１、およびＫＳ２とそれぞれ５４．６％、５７．２％、５５．５％の同一性を有することが判明した。ＭＡＣＳ１とＳＡＨは、中鎖脂肪酸に対するアシル−ＣｏＡ合成酵素活性を有することが確認されている（Ｆｕｊｉｎｏ　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６（３８），ｐｐ３５９６１−３５９６６（２００１））。また、ＭＡＣＳ２には中鎖脂肪酸アシル−ＣｏＡ合成酵素に特異的な二つのモチーフ（図１参照）が存在していた。特に基質特異性を決定していると考えられるアミノ酸残基４５７〜５０２の領域に関しては、ＭＡＣＳ１に対して７０％以上の同一性を示している。従って、ＭＡＣＳ２は中鎖脂肪酸アシル−ＣｏＡ合成酵素であると結論された。
【００３７】
（２）ＭＡＣＳ２遺伝子の多型の同定
ＭＡＣＳ２のｃＤＮＡ配列を決定した後、Ｇｅｎｂａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　＃ＮＴ＿０１０４４１のシークエンス等に基づき、ｅｘｏｎ３からｅｘｏｎ１３のそれぞれのｅｘｏｎをはさむプライマーを設計し、ｅｘｏｎ３からｅｘｏｎ１３まで約１００人のボランティアを対象にそれぞれのｅｘｏｎの配列決定を行った。具体的には、ＰＣＲ産物が３００〜５００塩基対の長さになるように各エクソンをはさみ込むセンスプライマーとアンチセンスプライマーを設計した。ＰＣＲ法を実施し、得られたＰＣＲ産物から未反応のヌクレオチド等を除去し、精製した後、ダイ・ターミネーター法（ビッグ・ダイ，ＡＢＩ社製）により配列決定を行なった。その結果、見出された変異のうち、アミノ酸の変化を伴うものは、Ｄ４６３ＮとＬ５１３Ｓであった。具体的には、Ｄ４６３Ｎは配列番号３の第１４８３番目のＧがＡに置換されたことにより生じ、Ｌ５１３Ｓは配列番号３の第１５３８番目のＴがＣに置換されたことにより生じていた。
【００３８】
実施例２：変異Ｌ５１３Ｓと脂質代謝異常との関連の評価
（１）遺伝型の決定
大阪府吹田市在住のボランティア２０１２人を対象として、Ｌ５１３Ｓ遺伝型を決定した。具体的には、Ｔａｑ　Ｍａｎ法（Ｌｉｖａｋ　Ｋ．Ｊ．，　Ｇｅｎｅｔ．　Ａｎａｌ．，１４，　１４３（１９９９）；Ｍｏｒｒｉｓ　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３４，２９３３（１９９６）等）により遺伝子型を決定した。ＰＣＲ反応は、９５℃で１０分間で反応させた後、９５℃で１５秒間および６０℃で６０秒間のステップを４０回繰り返すことにより実施した。使用したプローブとプライマーは下記の通りであった。
【００３９】
Ｔ型アレルに対するプローブ：５’−ＦＡＭ−ＴＣＣＴＧＧＣＣＴＴＧＣＡＧＴＴＣＣＴＧＴＣＣ−ｔａｍｒａ−３’（配列番号８）（ＦＡＭは蛍光標識を表し、ｔａｍｒａは消光物質を表す）
Ｃ型アレルに対するプローブ：５’−ＶＩＣ−ＴＣＣＴＧＧＣＣＴＣＧＣＡＧＴＴＣＣＴＧＴＣ−ｔａｍｒａ−３’（配列番号９）（ＶＩＣは蛍光標識を表し、ｔａｍｒａは消光物質を表す）
センスプライマー：ＴＧＡＣＴＡＣＡＣＡＣＴＣＴＡＡＴＣＣＣＴＴＣＴＣＴＣＴ（配列番号１０）
アンチセンスプライマー：ＡＣＡＴＧＣＴＧＣＴＧＣＡＧＣＴＣＣＴＴ（配列番号１１）
その結果、５１３番目のアミノ酸残基がＬＬ型のボランティア（ＦＡＭの強い蛍光が認められた群）が１１４１人、ＬＳ型のボランティア（ＦＡＭとＶＩＣの両方の蛍光が認められた群）が７４３人、ＳＳ型のボランティア（ＶＩＣの強い蛍光が認められた群）が１２８人であった。
【００４０】
（２）ＨＤＬコレステロール値との関連
それぞれの遺伝子型グループにおけるＨＤＬコレステロールの平均値は表１に示される通りであった。
【００４１】
【表１】遺伝子型　ＨＤＬコレステロール平均値（ｍｇ／ｄｌ）　Ｓｔｄエラー＊
ＬＬ　　　５９．０８４１　　　　　　　　　　　　　　０．４６５４
ＳＬ　　　５８．４４８２　　　　　　　　　　　　　　０．５７６８
ＳＳ　　　５４．２５７８　　　　　　　　　　　　　　１．３８９６　
＊：Ｓｔｄエラーはプールされたエラー分散の概算を用いた。
【００４２】
表１に示されるように、ＬＬ型　５９．０８４１、ＬＳ型　５８．４４８２、ＳＳ型　５４．２５７８であり、ｐ＝０．００４４の有意差で、ＳＳ型でＨＤＬコレステロール値が低いと結論された。
【００４３】
性、アルコール摂取量、喫煙の影響を考えた多変量解析の結果を表２に示す。遺伝型は、ＬＬ＝１，　ＬＳ＝２，　ＳＳ＝３とした。
【００４４】
【表２】Ｓｏｕｒｃｅ　　　　　Ｎｐａｒｍ　　ＤＦ　　　Ｓｑｕａｒｅｓの合計　Ｆ　Ｒａｔｉｏ　　Ｐｒｏｂ＞Ｆ
Ｌ５１３Ｓ　　　　　　２　　　　２　　　　２３４９．４４１　　　　５．４５３８　　０．００４３
ＡＬＣ／合／ｄａｙ　　　１　　　　１　　　　９５６８．７６８　　　　４４．４２４１　　＜．０００１
性　　　　　　　１　　　　１　　　　５０２２３．０３７　　　２３３．１６６３　　＜．０００１
現在の喫煙　　　１　　　　１　　　　３２９０．０９８　　　　１５．２７４７　　＜．０００１
その結果、遺伝型の影響はｐ＝０．００４３で、遺伝型が有意にＨＤＬコレステロールレベルに影響を与えると結論できる。ＳＳ型とＬＬ＋ＬＳ型に分けるとＳＳ型でｐ＝０．００２６であった。
【００４５】
（３）中性脂肪値との関連
それぞれの遺伝子型グループにおける中性脂肪の平均値は表３に示される通りであった。
【００４６】
【表３】遺伝子型　中性脂肪平均値（ｍｇ／ｄｌ）　Ｓｔｄエラー＊
ＬＬ　　　１２４．６３８　　　　　　　　３．０１０９
ＳＬ　　　１２５．０４７　　　　　　　　３．７３１１
ＳＳ　　　１５３．４８４　　　　　　　　８．９８９４　
＊：Ｓｔｄエラーはプールされたエラー分散の概算を用いた。
【００４７】
表３に示されるように、ＬＬ型　１２４．６３８、ＬＳ型　１２５．０４７、ＳＳ型　１５３．４８４であり、ｐ＝０．００８６の有意差で、ＳＳ型で中性脂肪値が高いと結論された。
【００４８】
性、アルコール摂取量、喫煙の影響を考えた多変量解析の結果を表４に示す。遺伝型は、ＬＬ＝１，　ＬＳ＝２，　ＳＳ＝３とした。
【００４９】
【表４】Ｓｏｕｒｃｅ　　　　　Ｎｐａｒｍ　　ＤＦ　　　Ｓｑｕａｒｅｓの合計　　Ｆ　Ｒａｔｉｏ　　Ｐｒｏｂ＞Ｆ
Ｌ５１３Ｓ　　　　　　２　　　　２　　　　９０１２２．２４　　　　４．５４８５　　０．０１０７
ＡＬＣ／合／ｄａｙ　　　１　　　　１　　　　１００２０２．６９　　　　１０．１１４５　　０．００１５
性　　　　　　　１　　　　１　　　　１９３６２０．９２　　　　１９．５４４２　　＜．０００１
現在の喫煙　　　１　　　　１　　　　１１５１６２．５６　　　　１１．６２４６　　０．０００７
その結果、遺伝型の影響はｐ＝０．０１０７で、遺伝型が有意に中性脂肪レベルに影響を与えると結論できる。ＳＳ型とＬＬ＋ＬＳ型に分けるとＳＳ型でｐ＝０．００２７であった。
【００５０】
（４）Ｂｏｄｙ　ｍａｓｓ　ｉｎｄｅｘとの関連
それぞれの遺伝子型グループにおけるＢｏｄｙ　ｍａｓｓ　ｉｎｄｅｘの平均値は表５に示される通りであった。
【００５１】
【表５】遺伝子型　Ｂｏｄｙ　ｍａｓｓ　ｉｎｄｅｘ平均値（ｋｇ／ｍ２）　Ｓｔｄエラー＊　　
ＬＬ　　　２２．６１８８　　　　　　　　　　　０．０８９１１
ＳＬ　　　２２．８３８４　　　　　　　　　　　０．１１０４３
ＳＳ　　　２３．３４８９　　　　　　　　　　　０．２６６０６　
＊：Ｓｔｄエラーはプールされたエラー分散の概算を用いた。
【００５２】
表５に示されるように、ＬＬ型　２２．６１８８、ＬＳ型　２２．８３８４、ＳＳ型　２３．３４８９であり、ｐ＝０．０１９７の有意差で、ＳＳ型でＢｏｄｙ　ｍａｓｓ　ｉｎｄｅｘが高いと結論された。
【００５３】
性、アルコール摂取量、喫煙の影響を考えた多変量解析の結果を表６に示す。遺伝型は、ＬＬ＝１，　ＬＳ＝２，　ＳＳ＝３とした。
【００５４】
【表６】Ｓｏｕｒｃｅ　　　　　Ｎｐａｒｍ　　ＤＦ　　　Ｓｑｕａｒｅｓの合計　　Ｆ　Ｒａｔｉｏ　　Ｐｒｏｂ＞Ｆ
Ｌ５１３Ｓ　　　　　　２　　　　２　　　　６３．２３９３２　　　　３．５５２２　　０．０２８８
ＡＬＣ／合／ｄａｙ　　　１　　　　１　　　　４３．５２１６７　　　　４．８８９３　　０．０２７１
性　　　　　　　１　　　　１　　　　１５１．０６６６２　　　　１６．９７１０　　＜．０００１
現在の喫煙　　　１　　　　１　　　　５５．５３４２６　　　　６．２５１０　　０．０１２５
その結果、遺伝型の影響はｐ＝０．０２８８で、遺伝型が有意にＢｏｄｙ　ｍａｓｓ　ｉｎｄｅｘに影響を与えると結論できる。ＳＳ型とＬＳ＋ＬＬ型に分けるとＳＳ型でｐ＝０．０３４１であった。
【００５５】
（５）Ｗａｉｓｔ／Ｈｉｐ比との関連
それぞれの遺伝子型グループにおけるＷａｉｓｔ／Ｈｉｐ比の平均値は表７に示される通りであった。
【００５６】
【表７】遺伝子型　　Ｗａｉｓｔ／Ｈｉｐ比　　　　　　　Ｓｔｄエラー＊　　
ＬＬ　　　　０．８９６９８５　　　　０．００２００
ＳＬ　　　　０．９０５１６８　　　　０．００２４８
ＳＳ　　　　０．９１３３５９　　　　０．００５９８　
＊：Ｓｔｄエラーはプールされたエラー分散の概算を用いた。
【００５７】
表７に示されるように、ＬＬ型　０．８９６９８５、ＬＳ型　０．９０５１６８、ＳＳ型　０．９１３３５９であり、ｐ＝０．００４０の有意差で、ＳＳ型でＷａｉｓｔ／Ｈｉｐ比が高いと結論された。
【００５８】
性、アルコール摂取量、喫煙の影響を考えた多変量解析の結果を表８に示す。遺伝型は、ＬＬ＝１，　ＬＳ＝２，　ＳＳ＝３とした。
【００５９】
【表８】Ｓｏｕｒｃｅ　　　　　Ｎｐａｒｍ　　ＤＦ　　　Ｓｑｕａｒｅｓの合計　Ｆ　Ｒａｔｉｏ　　Ｐｒｏｂ＞Ｆ
Ｌ５１３Ｓ　　　　　　２　　　　２　　　　０．０４８８６５８　　　　６．１０３３　　０．００２３
ＡＬＣ／合／ｄａｙ　　　１　　　　１　　　　０．０８０７０９１　　　　２０．１６１１　　＜．０００１
性　　　　　　　１　　　　１　　　　０．０１２８２０６　　　　３．２０２６　　０．０７３７
現在の喫煙　　　１　　　　１　　　　１．０３５４３５８　　　２５８．６５１９　　＜．０００１
その結果、遺伝型の影響はｐ＝０．００２３で、遺伝型が有意にＷａｉｓｔ／Ｈｉｐ比に影響を与えると結論できる。ＳＳ型＋ＳＬ型とＬＬ型に分けるとＳＳ＋ＳＬ型ででｐ＝０．００９３であった。
【００６０】
【配列表】
2004008030.tif 000002
2004008030.tif 000003
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2004008030.tif 000005
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Ｇｌｎ
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【図面の簡単な説明】
【図１】ＭＡＣＳ２のアミノ酸配列と、ＳＡＨのアミノ酸配列（配列番号５）、ＫＳ２のアミノ酸配列（配列番号６）、およびＭＡＣＳ１のアミノ酸配列（配列番号７）とを整列させて示した図である。Ｍｏｔｉｆ　１はＡＴＰ結合領域を示す。Ｍｏｔｉｆ　２は中鎖脂肪酸アシル−ＣｏＡ合成酵素に特異的な領域を示す。
【図２】ＭＡＣＳ２遺伝子のｅｘｏｎの存在位置を示した図である。
【図３】ＭＡＣＳ２遺伝子のｅｘｏｎの存在位置を示した図である。
【図４】ＭＡＣＳ２遺伝子のｅｘｏｎの存在位置を示した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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