(57)【要約】【課題】メタン発酵槽内の発酵状態を迅速、かつ正確に監視できるメタン発酵槽内の菌数測定方法、及びそれを用いて、常時最適な状態に発酵条件を制御、維持することができるメタン発酵処理方法を提供する。【解決手段】嫌気性微生物によって分解可能な有機性廃棄物のメタン発酵において、メタン発酵槽内の活性菌の菌数を測定する方法であって、メタン発酵槽から消化液の一部を取出して前処理する前処理工程Ｓ１と、活性菌内に存在するエステラーゼ酵素によって蛍光物質を生成する試薬を混合する蛍光試薬混合工程Ｓ２と、蛍光物質の蛍光を測定する菌数測定工程Ｓ３とを含む。また、この測定値に基づいてメタン発酵槽内の発酵条件を制御する。【選択図】　図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
嫌気性微生物によって分解可能な有機性廃棄物のメタン発酵において、メタン発酵槽内の活性菌の菌数を測定する方法であって、
前記メタン発酵槽から消化液の一部を取出して前処理する前処理工程と、
前記活性菌内に存在するエステラーゼ酵素によって蛍光物質を生成する試薬を混合する蛍光試薬混合工程と、
前記蛍光物質の蛍光を測定する菌数測定工程とを含むことを特徴とするメタン発酵槽内の菌数測定方法。
【請求項２】
前記蛍光試薬が、５−（６−）カルボキシフルオレセインジアセテート、又は５−カルボキシフルオレセインジアセテートアセトキシメチルエステートである請求項１記載のメタン発酵槽内の菌数測定方法。
【請求項３】
嫌気性微生物によって分解可能な有機性廃棄物のメタン発酵処理方法であって、請求項１又は２に記載の菌数測定方法によって、所定時間毎にメタン発酵槽内の活性菌の菌数を測定し、この測定値に基づいて前記メタン発酵槽内の発酵条件を制御することを特徴とするメタン発酵処理方法。
【請求項４】
前記メタン発酵槽内への前記有機性廃棄物の投入量を調節することによって、前記発酵条件を制御する請求項３記載のメタン発酵処理方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、嫌気性微生物を用いて、生ゴミ、食品加工残滓、活性汚泥処理等の余剰汚泥等の有機性廃棄物を処理するメタン発酵処理における、メタン発酵槽内の菌数測定方法及びそれを用いたメタン発酵処理方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生ゴミ等の有機性廃棄物のほとんどは、焼却や埋立処分されているが、焼却に伴うダイオキシンの発生や埋立処分地の逼迫、悪臭などの問題から、環境負荷の少ない処理方法が求められている。これらの問題を解決するために有機性廃棄物をメタン発酵処理し、発生したメタンガスを燃料電池やガスエンジンを用いて発電するシステムが研究、開発されている。
【０００３】
メタン発酵処理は、有機性廃棄物を粉砕、スラリー化した後、このスラリーを発酵槽に投入し、嫌気性下でメタン菌により発酵処理して有機性廃棄物をバイオガスと水とに分解する方法であり、有機性廃棄物を大幅に減量することができると共に、副産物として生成するメタンガスをエネルギーとして回収できるメリットがある。また、嫌気性のため曝気動力が不要であるため省エネルギーな処理法である。
【０００４】
ここで、上記のメタン発酵においては、効率よく有機性廃棄物を分解してメタンガスを取り出す必要があるため、メタン発酵槽内の発酵状態を最適に制御することが重要である。このため、所定の監視項目によって発酵状態を常時監視して、メタン発酵槽の運転を管理し、維持することが通常行なわれている。
【０００５】
このような監視項目としては、例えば、メタン発酵槽内の温度、ｐＨ、ＭＬＳＳ（汚泥濃度）、有機酸量、バイオガス発生量などがあり、従来は、これらを単独、又は複数組み合わせてメタン発酵槽の運転を管理することが行なわれていた。
【０００６】
しかしながら、上記の監視項目の場合、例えばｐＨでメタン発酵槽内の発酵状態を監視しようとすると、実際の菌数増加状態より遅れてｐＨが変化するため、発酵状態をリアルタイムで正確に監視できないという問題があった。また、上記の複数の監視項目を組み合わせることも考えられるが、やはり発酵状態を正確に把握することは困難であり、更に、複数の項目についての測定が必要となるので、測定が煩雑で手間がかかるという問題点があった。
【０００７】
これに対して、メタン発酵槽内の菌数に着目し、これによって直接、メタン発酵槽の発酵状態を監視して発酵条件を制御する方法も知られている。例えば、特開平８−１５４６６２号公報には、蛍光物質Ｆ４２０の蛍光強度によってメタン菌の活性を測定して原料の投入時期及び／又は投入量を調整するメタン発酵槽の自動制御システムが開示されている。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
上記の特開平８−１５４６６２号公報の方法は、メタン菌に特異的に存在する蛍光性補酵素である、蛍光物質Ｆ４２０を利用して蛍光強度を測定し、その蛍光強度から菌数を測定するものである。したがって、結果として、メタン発酵槽内に存在する種々の菌のうち、活性なメタン菌のみを測定することによって発酵状態を把握し、この測定値に基づいて原料の投入時期及び／又は投入量を調整することによって、メタン発酵槽内の発酵状態の制御を行なうものである。
【０００９】
しかしながら、メタン発酵槽内に存在する菌としては、メタン菌の他にも種々の菌が存在し、なかでも、有機性廃棄物である生ゴミ等の固形分をメタン菌がガス化できるまでに有機酸に分解する酸生成菌は、メタン発酵の代謝経路に大きく関与している。
【００１０】
すなわち、有機性廃棄物は酸生成菌によって酢酸等の有機酸に分解され、更にその後、メタン菌によってバイオガスに分解される。したがって、バイオガスの効率的な発生には、メタン菌の存在は言うまでもなく、酸生成菌の存在も重要になる。したがって、上記の特開平８−１５４６６２号公報の方法のように、活性なメタン菌のみ測定する方法では、メタン発酵槽内の発酵状態を正確に把握できないという問題があった。
【００１１】
したがって、本発明の目的は、メタン発酵槽内の発酵状態を迅速、かつ正確に監視できるメタン発酵槽内の菌数測定方法、及びそれを用いて、常時最適な状態に発酵条件を制御、維持することができるメタン発酵処理方法を提供することにある。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するため、本発明者等は鋭意検討した結果、生菌の体内に存在する加水分解酵素であるエステラーゼ酵素の作用を利用し、加水分解により蛍光物質を生成する蛍光試薬を消化液と混合し、蛍光顕微鏡により観察して菌数を測定することにより、メタン菌のみならず、酸生成菌を含む菌数測定が可能となることを見出し本発明を完成するに至った。
【００１３】
すなわち、本発明のメタン発酵槽内の菌数測定方法は、嫌気性微生物によって分解可能な有機性廃棄物のメタン発酵において、メタン発酵槽内の活性菌の菌数を測定する方法であって、
前記メタン発酵槽から消化液の一部を取出して前処理する前処理工程と、
前記活性菌内に存在するエステラーゼ酵素によって蛍光物質を生成する試薬を混合する蛍光試薬混合工程と、
前記蛍光物質の蛍光を測定する菌数測定工程とを含むことを特徴とする。
【００１４】
この菌数測定方法によれば、メタン菌のみならず、有機酸を生成する酸生成菌を含んだ活性菌数が把握できるので、より正確にメタン発酵槽内の発酵状態を把握できる。また、発酵状態を菌数で直接的に監視できるので、ｐＨで監視する場合に比べてリアルタイムで発酵槽内の状態を監視することができる。また、測定サンプルは少量の消化液をメタン発酵槽から抜き取れば足りるので、従来公知のメタン発酵処理装置がそのまま使用できる。
【００１５】
本発明の菌数測定方法においては、前記蛍光試薬が、５−（６−）カルボキシフルオレセインジアセテート、又は５−カルボキシフルオレセインジアセテートアセトキシメチルエステートであることが好ましい。
【００１６】
上記の蛍光試薬は、エステラーゼ酵素によって容易に加水分解されて蛍光物質を生成し、しかも容易に入手可能であるので本発明に好適に使用できる。
【００１７】
一方、本発明のメタン発酵処理方法は、嫌気性微生物によって分解可能な有機性廃棄物のメタン発酵処理方法であって、上記の菌数測定方法によって、所定時間毎にメタン発酵槽内の活性菌の菌数を測定し、この測定値に基づいて前記メタン発酵槽内の発酵条件を制御することを特徴とする。
【００１８】
このメタン発酵処理方法によれば、メタン発酵槽内の発酵条件を、迅速、かつ正確に制御できる。これによって、メタン発酵処理装置を常時最適な状態に維持したまま運転できるので、処理効率が向上するとともに、効率よくバイオガスを得ることができる。
【００１９】
本発明のメタン発酵処理方法においては、前記メタン発酵槽内への前記有機性廃棄物の投入量を調節することによって、前記発酵条件を制御することが好ましい。これによれば、メタン発酵槽内の菌数の増減に合わせて、有機性廃棄物の投入量を増減することにより、発酵槽内への負荷量を調整して菌数の維持が可能であるので、容易に発酵条件を制御できる。
【００２０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について図面を用いて更に詳細に説明する。図１には、本発明の菌数測定方法の一実施形態である概略工程図が示されている。また、図２には、本発明のメタン発酵処理方法に用いることができるメタン発酵処理装置の概略構成図が示されている。
【００２１】
まず、本発明のメタン発酵槽内の菌数測定方法について説明すると、図１に示すように、本発明の菌数測定方法は、測定試料である、メタン発酵槽内から取出した消化液を前処理する前処理工程Ｓ１と、前処理工程Ｓ１後の消化液に蛍光試薬を混合する蛍光試薬混合工程Ｓ２と、蛍光法によって蛍光を呈する菌数を測定する菌数測定工程Ｓ３とからなっている。
【００２２】
以下、上記各工程について例を挙げて詳細に説明する。
まず、測定試料となる消化液を、メタン発酵槽内から取出す。測定試料として必要な消化液の量としては１〜１０ｍｌあれば充分である。次に、図１に示すように、まず、前処理工程Ｓ１の希釈工程Ｓ１１により、上記の測定試料から更に一部をサンプリングして水で希釈する。この希釈工程Ｓ１１におけるサンプリング量としては１〜５ｍｌであることが好ましい。また、希釈量としてはサンプリングした消化液に対して、体積で５〜２０倍、好ましくは１０〜１５倍に希釈することが好ましい。
【００２３】
次に、ろ過工程Ｓ１２によって固形分を除去する。ろ過方法は従来公知のフィルターろ過等が使用でき、特に孔径２０〜３０μｍのフィルターを用いることが好ましい。
【００２４】
ろ過工程Ｓ１２後、超音波分散工程Ｓ３を行なう。この工程によって菌をばらばらにし数え易くする。超音波装置としては従来公知のものが使用できる。また、分散時間としては５〜１５分行なうことが好ましい。
【００２５】
次に、ｐＨが酸性となっている場合には、必要に応じてｐＨ調整工程Ｓ１４を行なう。このように測定試料のｐＨをアルカリ性に調整することにより菌の活動領域にｐＨを維持できる。なお、ｐＨとしては７．５〜８となるように調整することが好ましい。ｐＨ調整手段としては、ｐＨ緩衝液を加えることが好ましく、具体的には、ＮａＯＨやＫＯＨにＫＨ２ＰＯ４を加えてアルカリ性に調整することができる。また、このｐＨ調整工程Ｓ１４は、あらかじめｐＨが上記の７．５〜８の範囲となっていれば行なわなくてもよい。
【００２６】
次に、蛍光試薬混合工程Ｓ２について説明する。本発明においては、上記の前処理工程Ｓ１後の消化液に蛍光試薬を加え、この蛍光試薬が、活性菌内に存在する加水分解酵素である、エステラーゼ酵素によって加水分解することにより蛍光物質を生成する試薬であることを特徴としている。これにより、メタン菌のみならず、酸生成菌等を含むすべての活性菌の測定が可能となる。
【００２７】
これらの蛍光試薬は、元来蛍光性を有していないが、拡散によって生細胞内に取込まれると、すべての細胞が共通に持っている酵素のエステラーゼによってエステル結合が加水分解され、蛍光物質として細胞内に蓄積される。一方、死菌はエステラーゼ活性が失われており染色されないため、活性菌だけの検出が可能となる。
【００２８】
このような、エステラーゼ酵素によって加水分解され、蛍光を呈する蛍光物質となる試薬としては、５−（６−）カルボキシフルオレセインジアセテート、５−カルボキシフルオレセインジアセテートアセトキシメチルエステートなどからなる群が好ましく例示できる。
【００２９】
上記の蛍光試薬の添加量としては、ｐＨ調整工程Ｓ１４後の希釈サンプル液２００μｌに対して２０〜３０μｌ添加することが好ましい。蛍光試薬の添加量が２０μｌ以下であると蛍光試料の発光強度が不足し、微弱な蛍光しか得られないので好ましくなく、３０μｌを超えると、水分等による、菌以外のバックグラウンドが強くなるので好ましくない。
【００３０】
蛍光試薬混合工程Ｓ２の後、菌数測定工程Ｓ３において、活性菌の菌数を測定する。測定方法には、従来公知の蛍光顕微鏡による測定が使用できる。
【００３１】
具体的には、蛍光試薬混合工程Ｓ２後の測定試料をバクテリア計測盤などの、一定の深さを持つプレパラート上に垂らした後、蛍光顕微鏡により、上記の蛍光物質が蛍光を発することを利用して、蛍光画像を観察して菌数をカウントする。蛍光を発生させる励起波長としては３８０〜４２０ｎｍの青色が好ましい。菌数のカウントについては、従来公知の画像解析ソフト等が利用できる。
【００３２】
以上の本発明の菌数測定方法により、メタン菌、酸生成菌等のメタン発酵槽内のすべての活性菌数の合計を測定することができる。なお、上記の菌数測定に要する時間は３０〜６０分で行うことができるので、本方法により、簡便で、短時間に測定を行なうことができ、しかも、発酵槽内の発酵状態を正確に把握することができる。
【００３３】
次に、上記の菌数測定方法を用いた、本発明のメタン発酵処理方法について、図２に示す処理装置を用いて説明する。
【００３４】
図２において、有機性廃棄物は、粉砕機１１で粗砕された後、更に分解速度及び消化率の向上を図るために、微粉砕機１２で微粉砕・ペースト化されてスラリー調整槽１３に投入される。スラリー調整槽１３において、ペースト化された有機性廃棄物は、希釈水により適当な固形物濃度に調整されてスラリー化され、ポンプ１４によりメタン発酵槽１５に送られる。
【００３５】
このメタン発酵槽１５には、メタン菌等の嫌気性微生物が付着・担持された固定化微生物を充填した固定ろ床１６が設置されており、スラリー状の有機性廃棄物は、ポンプ１４により、メタン発酵槽１５内に送られる。メタン発酵槽１５内では、イ）ポンプ１４により有機性廃棄物を循環させる、ロ）攪拌羽根１７で攪拌する、ハ）バイオガスの一部をポンプ２０によりメタン発酵槽１５の下部に吹き込んでバブリングして攪拌する、などの方法で攪拌が行われ、嫌気性微生物による分解が行われる。その後、発酵により生成したバイオガスは、ガスホルダー１８に回収され、ガスタービンや燃料電池などのガス利用システム１９でエネルギーとして利用される。
【００３６】
そして、メタン発酵槽１５内で発酵処理された有機性廃棄物の消化液は、該発酵槽１５の底部に設けられた排出口２１から排出されて、必要に応じて更に活性汚泥処理等の後処理が行なわれる。
【００３７】
本発明のメタン発酵処理方法においては、上記の運転操作中、測定試料となる消化液を、適宜メタン発酵槽１５内から取出してサンプリングを行なう。メタン発酵槽内からの測定試料の取出し方法は特に限定されず、例えば、図２におけるメタン発酵槽１５の底部の排出口２１より取出される消化液の一部を測定試料とすることができる。なお、別途メタン発酵槽にサンプリングできる取出し口を設けてもよい。
【００３８】
次に、上記の菌数測定方法によって、メタン発酵槽１５内のすべての活性菌数の測定を行なう。そして、上記のサンプリング及び菌数測定を定期的に行なうことにより、発酵状態を正確に監視することができる。なお、サンプリング及び菌数測定は所定の間隔で行なうことが好ましく、１〜７日間隔で行なうことが好ましい。
【００３９】
そして、運転中に菌数の低下が認められてきたら、メタン発酵槽１５の発酵条件を調整してメタン発酵槽の制御を行なう。ここで、メタン発酵槽１５内の菌数としては、１×１０９〜１×１０１０個／ｍｌに維持することが好ましい。
【００４０】
発酵条件の調整方法としては、例えば、ポンプ１４を制御してメタン発酵槽１５内への有機性廃棄物の投入量を調節する方法が好ましく行なわれる。この場合、メタン発酵槽１５内の菌数の低下に合わせて、投入量を徐々に減少させることができ、これによって、メタン発酵槽１５内の菌数を上記範囲に容易に維持することができる。なお、有機性廃棄物の投入量の調節範囲としては、通常投入量に対して５０質量％までとすることが好ましい。
【００４１】
また、別の発酵条件の調整方法としては、アルカリ添加によってメタン発酵槽１５内のｐＨ調整を行ない、アルカリ側に維持することも好ましい。メタン発酵槽１５内は酸生成によって徐々にｐＨが低下していくので菌の活性が徐々に低下していくが、アルカリ側にｐＨ調整することによってメタン発酵槽１５内を活性菌の至適ｐＨに維持できるので、活性菌数を維持することができる。
【００４２】
なお、上記の発酵条件の調整方法は、単独で行なってもよく、また両者を組み合わせて行なってもよい。
【００４３】
以上のメタン発酵処理方法によれば、メタン発酵槽内の発酵条件を、迅速、かつ正確に制御できるので、メタン発酵槽を常時最適な状態に維持できる。これにより、処理効率が向上するとともに、効率よくバイオガスを得ることができる。
【００４４】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明する。
【００４５】
実施例１
図２に示すようなメタン発酵処理装置の連続運転を行ないながら、本発明の菌数測定法を用いて、図３に示す手順でメタン発酵槽内の菌数測定を行なった。メタン発酵槽１５としては容量は２リットルの発酵槽を使用し、発酵温度は５５℃とした、なお、有機性廃棄物としては表１に示す組成の生ゴミ原料を使用した。
【００４６】
【表１】
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【００４７】
まず、メタン発酵槽１５の排出口２１から消化液の一部を５ｍｌ採取し、超純水で１０倍に希釈した。希釈後、孔径２０μｍのろ紙に通して、ろ過した後、超音波分散を１５分間行なった。
【００４８】
次に、ＫＨ２ＰＯ４からなるｐＨ緩衝液を加え、ｐＨを８となるように調整した。
【００４９】
上記のｐＨ調整後の消化液２００μｌに対して、蛍光試薬である５−カルボキシフルオレセインジアセテート（５−ＣＦＤＡ、フナコシ株式会社製）を２４μｌ加え、再び充分に混合して測定試料を調整した。
【００５０】
この測定試料３μｌを、バクテリア計測盤を持つ深さ０．０２ｍｍのプレパラートに垂らし、蛍光顕微鏡により観察をした。蛍光顕微鏡の励起波長は３８０〜４２０ｍｍの青色を用い、蛍光発光波長は５００〜５５０ｎｍであった。観察画像は市販のソフト（Ｏｐｔｉｍａｓ６．５、ＭＥＤＩＡ　ＣＹＢＥＲＮＥＴＩＣＳ製）で画像解析し、菌数をカウントした。
【００５１】
比較例１
実施例１と同じ条件でメタン発酵処理装置を運転し、実施例１と同じタイミングで消化液のｐＨを測定した。
【００５２】
試験例
上記の実施例１の菌数測定操作、及び、比較例１のｐＨ測定を１〜３日毎に行なって、発酵槽内の発酵状態を監視した。実施例１について発酵槽の馴養日数と菌数の変化を測定した結果を図４に、比較例１について発酵槽の馴養日数とｐＨの変化を測定した結果を図５に示す。
【００５３】
図４の結果より、実施例１においては、メタン発酵処理２５日目までは菌数は安定しており、３×１０９〜４×１０９個／ｍｌの菌数を保持していたが、２６日以降は菌数が１．５×１０９個／ｍｌ以下に低下していることがわかる。一方、図５の比較例１においては、ｐＨの変化は２５日を過ぎても発酵が順調とされる７．５付近でアルカリ側の値を示し、３０日を過ぎて始めてｐＨが７以下となった。
【００５４】
したがって、比較例１のｐＨを発酵状態の監視基準として用いた場合には、発酵条件が低下する指標としては、実施例１の菌数よりも変化が鈍く、リアルタイムで発酵状態の監視ができていないことがわかる。
【００５５】
実施例２
実施例１の菌数測定値に基づいて生ゴミの投与量を調整して、メタン発酵条件を制御した。生ゴミの投与量としては、菌数が安定時の１／２となったときには、投入量を初期投入量の１／２に減少させ、再び菌数が回復した時点で投入量を２倍にして初期投入量に戻した。
【００５６】
図６に、実施例２における馴養日数と菌数変化を測定した結果を示す。図６によれば、実施例２の方法でメタン発酵処理することにより、２５日付近で一度菌数が低下し始めているが、直ちに生ゴミ投入量を調整したので菌数が速やかに回復しており、結果として、７０日経過後においても菌数を維持できていることがわかる。
【００５７】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明によれば、メタン菌以外の酸生成菌を含めたすべての活性菌数が測定できるので、メタン発酵槽内の活性菌の状態をより正確に、かつ迅速に管理できる。また、メタン発酵槽内の活性菌数が低下しないように発酵状態を制御できるので、安定した発酵状態を長期にわたって管理・維持できるメタン発酵処理方法を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のメタン発酵槽内における菌数測定方法の一実施形態を示す概略工程図である。
【図２】本発明のメタン発酵処理方法に用いることができるメタン発酵処理装置の概略構成図である。
【図３】実施例における菌数測定方法を示す概略工程図である。
【図４】実施例１における発酵槽の馴養日数と菌数の変化を測定した図表である。
【図５】比較例１における発酵槽の馴養日数とｐＨの変化を測定した図表である。
【図６】実施例２における発酵槽の馴養日数と菌数の変化を測定した図表である。
【符号の説明】
Ｓ１　前処理工程
Ｓ１１　希釈工程
Ｓ１２　ろ過工程
Ｓ１３　超音波分離工程
Ｓ１４　ｐＨ調整工程
Ｓ２　蛍光試薬混合工程
Ｓ３　菌数測定工程
１１　粉砕機
１２　微粉砕機
１３　スラリー調整槽
１４　ポンプ
１５　メタン発酵槽
１６　固定ろ床
１７　攪拌羽根
１８　ガスホルダー
１９　ガス利用システム
２０　ポンプ
２１　排出口
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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