【手続補正書】
【提出日】平成24年4月18日(2012.4.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
接続された可変領域をコードする配列を含む同種ペアのライブラリーを製造する方法であって、
ａ）  鳥類起源のドナーからのリンパ球含有細胞分画の提供、
ｂ）  前記細胞分画から細胞を個別に複数の容器に分配することによる、単離単一細胞の集団の取得（ここで、少なくとも該細胞の亜集団は、免疫グロブリン遺伝子を発現する）、及び
ｃ）  多重分子増幅手順において単離単一細胞又は同系細胞の集団由来のテンプレートを用いて目的のヌクレオチド配列を増幅し、そして増幅された目的のヌクレオチド配列の接続を達成することによる、前記単離単一細胞の集団に含まれる可変領域をコードする配列の増幅及びそれらの接続の達成
を含む方法。
【請求項２】
細胞の亜集団が、以下のいずれかによって特徴づけられる、請求項１に記載の方法。
・ＩｇＹの発現（ＩｇＹ＋）、
・ＩｇＹの発現、及びＣＤ３陰性（ＩｇＹ＋  ＣＤ３−）、
・ＩｇＹの発現、Ｂｕ−１の非又は低発現、及びＣＤ３陰性（ＩｇＹ＋  Ｂｕ−１−  ＣＤ３−）、
・Ｂｕ−１及びＩｇＹの発現（Ｂｕ−１＋  ＩｇＹ＋）、
・Ｂｕ−１及びＩｇＹの発現、並びにＣＤ３陰性（Ｂｕ−１＋  ＩｇＹ＋  ＣＤ３−）、
・Ｂｕ−１の発現、及び単球マーカーの非発現（Ｂｕ−１＋、単球−）、
・Ｂｕ−１の発現、及びＩｇＭの非又は低発現レベル（Ｂｕ−１＋  ＩｇＭ−）、又は
・Ｂｕ−１及びＢＡＦＦの発現（Ｂｕ−１＋  ＢＡＦＦ＋）。
【請求項３】
細胞の亜集団がＩｇＹ＋である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
細胞の亜集団が、ＩｇＹ＋  ＣＤ３−である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
増幅及び接続を実行する前に、単一細胞の集団における個別の単離単一細胞を同系細胞の集団に拡大する、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
リンパ球含有細胞分画が、脾細胞、全血、骨髄、単核細胞、又は白血球を含む、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
リンパ球含有細胞分画又はＢリンパ球系列が、形質細胞、形質芽球又は記憶Ｂ細胞に富む、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
目的のヌクレオチド配列が、免疫グロブリン可変領域をコードする配列を含み、そして接続が、重鎖可変領域をコードする配列に結合した軽鎖可変領域をコードする配列の同種ペアを創出する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
多重分子増幅の前に、リンパ球含有細胞の集団が、検出可能なレベルのＩｇＹを発現する細胞を含むことを評価することをさらに含む、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
多重分子増幅の前に、ＩｇＹを発現するリンパ球集団のためにリンパ球含有細胞分画を富化することをさらに含む、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
多重分子増幅の前に、リンパ球含有集団から、免疫グロブリン遺伝子を発現する細胞を単離することをさらに含む、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
富化又は単離が、ＭＡＣＳ、ＦＡＣＳ、または他の自動分離手順を含む、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
鳥類が、ニワトリである、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
ニワトリが、トランスジェニックであり、ヒト免疫グロブリン配列を発現する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
多重分子増幅手順が、多重ＲＴ−ＰＣＲ増幅であり、
多重ＲＴ−ＰＣＲ増幅が、多重ＰＣＲ増幅の前に、別個の逆転写（ＲＴ）段階を含む２段階プロセスであるか、または、
多重ＲＴ−ＰＣＲ増幅が、逆転写（ＲＴ）及び多重ＰＣＲ増幅の両方を実行するのに必要な全ての成分を単一の容器に最初に添加することを含む単一段階において実行される、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
目的のヌクレオチド配列の接続が、多重分子増幅と同一の容器において実行される、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
目的のヌクレオチド配列の接続が、多重重複伸長プライマーミックスを利用する多重ＰＣＲ増幅に関連して達成される、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
接続された目的の核酸配列の増幅に適したプライマーミックスを利用する付加的分子増幅が実行される、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
接続されたヌクレオチド配列又は同種ペアのライブラリーをベクターに挿入することをさらに含む、請求項１〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
接続されたヌクレオチド配列または同種ペアのライブラリーの個別のメンバーが、軽鎖可変領域をコードする配列と結合した免疫グロブリン重鎖可変領域をコードする配列を含み、前記配列が、１又は複数の免疫グロブリン定常ドメインまたはその断片をコードする配列を含むベクターにインフレームで挿入されている、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
所望の標的特異性を有する結合タンパク質をコードする連結された可変領域配列の同種ペアのサブセットを選択し、それにより、可変領域をコードする配列の標的特異的同種ペアのライブラリーを作製することによってサブライブラリーを製造することをさらに含む、請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２２】
同種ペア又は可変領域をコードする配列の標的特異的同種ペアのライブラリーを哺乳動物発現ベクターに転写することをさらに含む、請求項２０又は２１に記載の方法。
【請求項２３】
哺乳動物発現ベクターが、ヒト免疫グロブリンクラスＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、カッパ軽鎖及びラムダ軽鎖から選ばれる１又は複数の定常領域ドメインをコードする、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ａ）接続されたヌクレオチド配列の部分をコードするベクターの宿主細胞への導入
ｂ）発現に適合した条件下での前記宿主細胞の培養、及び
ｃ）前記宿主細胞に挿入されたベクターから発現したタンパク質生成物の取得
の段階をさらに含む、請求項１９〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
タンパク質生成物が、重鎖可変領域に結合した軽鎖可変領域の同種ペアを含む抗体である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
ヒト定常領域及び非ヒト可変領域を有するキメラ抗体をコードするベクターを作製する方法であって、
ａ）  鳥類起源のドナーからのリンパ球含有細胞分画の提供；
ｂ）  前記細胞分画から細胞を個別に複数の容器に分配することによる、単離単一細胞の集団の取得；
ｃ）  多重分子増幅手順において単離単一細胞又は同系細胞の集団由来のテンプレートを用いて単離単一細胞の集団に含まれる可変領域をコードする核酸を増幅し、そして増幅された重鎖及び軽鎖の可変領域をコードする核酸の接続を達成することによる、前記核酸の増幅及びそれらの接続の達成；
ｄ）  ヒト定常領域への増幅された可変領域の接続の達成；及び
ｅ）  ベクターへの取得された核酸の挿入
を含む方法。
【請求項２７】
少なくとも段階ｂ）における細胞の亜集団が、以下のいずれかによって特徴づけられる、請求項２６に記載の方法。
・ＩｇＹの発現（ＩｇＹ＋）、
・ＩｇＹの発現、及びＣＤ３陰性（ＩｇＹ＋  ＣＤ３−）、
・ＩｇＹの発現、Ｂｕ−１の非又は低発現、及びＣＤ３陰性（ＩｇＹ＋  Ｂｕ−１−  ＣＤ３−）、
・Ｂｕ−１及びＩｇＹの発現（Ｂｕ−１＋  ＩｇＹ＋）、
・Ｂｕ−１及びＩｇＹの発現、並びにＣＤ３陰性（Ｂｕ−１＋  ＩｇＹ＋  ＣＤ３−）、
・Ｂｕ−１の発現、及び単球マーカーの非発現（Ｂｕ−１＋、単球−）、
・Ｂｕ−１の発現、及びＩｇＭの非又は低発現レベル（Ｂｕ−１＋  ＩｇＭ−）、又は
・Ｂｕ−１及びＢＡＦＦの発現（Ｂｕ−１＋  ＢＡＦＦ＋）。
【請求項２８】
ドナーが、ヒト抗体可変重鎖及び軽鎖に由来するか又はそれと顕著な類似性を有する免疫グロブリンを産生することができるヒト免疫グロブリン配列を有するトランスジェニックのニワトリである、請求項２６または２７に記載の方法。
【請求項２９】
順にニワトリＶＨ鎖、リンカー、ニワトリＶＬ鎖、及びヒト定常軽鎖を含むコンストラクトを増幅することができるプライマーセットとともに、可変軽鎖への接続を提供することができるオーバーラップを有するヒト定常軽鎖をコードするポリヌクレオチド又はその断片をＰＣＲ混合物に添加するさらなる増幅段階を含むか、または、
順にヒト定常重鎖、ニワトリＶＨ鎖、リンカー、及びニワトリＶＬ鎖を含むコンストラクトを増幅することができるプライマーセットとともに、可変重鎖への接続を提供することができるオーバーラップを有するヒト定常重鎖をコードするポリヌクレオチド又はその断片をＰＣＲ混合物に添加するさらなる増幅段階を含む、請求項２６〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
それぞれのキメラ抗体が、ニワトリ免疫グロブリン可変領域をコードする配列及びヒト免疫グロブリン重鎖及び軽鎖定常領域からなる、キメラ抗体をコードするベクターのライブラリーであって、ベクターが請求項１〜２９のいずれかに記載の方法により得られるライブラリー。
【請求項３１】
ニワトリ免疫グロブリン可変領域をコードする配列が、ヒト抗体可変重鎖及び軽鎖に由来するか又はそれと顕著な類似性を有する免疫グロブリンを産生することができるヒト免疫グロブリン配列を有するトランスジェニックニワトリに由来する、請求項３０に記載のライブラリー。
【請求項３２】
鳥起源免疫グロブリン可変領域をコードする配列のライブラリーを製造する方法であって、
ａ）鳥類起源のドナーからのリンパ球含有細胞分画の提供、
ｂ）前記細胞分画から細胞を個別に複数の容器に分配することによる、単離単一細胞の集団の取得（ここで、少なくとも該細胞の亜集団は、免疫グロブリン遺伝子を発現する）、及び
ｃ）多重分子増幅手順において単離単一細胞又は同系細胞の集団由来のテンプレートを用いて目的のヌクレオチド配列を増幅することによる、前記単離単一細胞の集団に含まれる可変領域をコードする配列の増幅
を含む方法。
【請求項３３】
細胞の亜集団が、以下のいずれかによって特徴づけられる、請求項３２に記載の方法。
・ＩｇＹの発現（ＩｇＹ＋）、
・ＩｇＹの発現、及びＣＤ３陰性（ＩｇＹ＋  ＣＤ３−）、
・ＩｇＹの発現、Ｂｕ−１の非又は低発現、及びＣＤ３陰性（ＩｇＹ＋  Ｂｕ−１−  ＣＤ３−）、
・Ｂｕ−１及びＩｇＹの発現（Ｂｕ−１＋  ＩｇＹ＋）、
・Ｂｕ−１及びＩｇＹの発現、並びにＣＤ３陰性（Ｂｕ−１＋  ＩｇＹ＋  ＣＤ３−）、
・Ｂｕ−１の発現、及び単球マーカーの非発現（Ｂｕ−１＋、単球−）、
・Ｂｕ−１の発現、及びＩｇＭの非又は低発現レベル（Ｂｕ−１＋  ＩｇＭ−）、又は
・Ｂｕ−１及びＢＡＦＦの発現（Ｂｕ−１＋  ＢＡＦＦ＋）。