(57)【要約】【課題】本発明は、糖尿病合併症因子を除去するための滅菌できる糖尿病合併症因子吸着体を経済的に量産可能な技術及び該吸着体を体液処理目的に使うことで糖尿病合併症因子を安全且つ無菌的に除去できる方法を提供することを目的とする。【解決手段】本発明の解決手段は、以下の構成を有する。「（１）滅菌処理により糖尿病合併症因子に対する結合性能が実質上失活しない、ペプチド誘導体で構成された化合物を水不溶性担体に結合させたことを特徴とする糖尿病合併症因子吸着体。」「（２）上記（１）項に記載の糖尿病合併症因子吸着体が充填されてなる糖尿病合併症因子除去容器内に体液由来の被処理液を接触させることで被処理液中に含まれる糖尿病合併症因子を被吸着物質として選択的に除去することを特徴とする糖尿病合併症因子除去器の使用方法。」【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
滅菌処理により糖尿病合併症因子に対する結合性能が実質上失活しない、かつペプチド誘導体で構成された化合物を水不溶性担体に結合させたことを特徴とする糖尿病合併症因子吸着体。
【請求項２】
前記ペプチド誘導体が少なくとも２つ以上の塩基性官能基を有することを特徴とする請求項１記載の糖尿病合併症因子吸着体。
【請求項３】
前記ペプチド誘導体がペプチド結合により環状構造を形成することを特徴とする請求項１〜２のいずれかに記載の糖尿病合併症因子吸着体。
【請求項４】
前記ペプチド誘導体がポリミキシン系化合物であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の糖尿病合併症因子吸着体。
【請求項５】
前記ペプチド誘導体がＲＡＧＥ部分配列誘導体から構成されることを特徴とする請求項１〜２のいずれかに記載の糖尿病合併症因子吸着体。
【請求項６】
前記ＲＡＧＥ部分配列誘導体が少なくともＲＡＧＥのＩｇＶドメイン誘導体から構成されることを特徴とする請求項５に記載の糖尿病合併症因子吸着体。
【請求項７】
前記ＩｇＶドメイン誘導体が配列Ａ或いは配列Ｂの少なくともいずれかで構成されるＩｇＶドメイン由来ペプチド誘導体であることを特徴とする請求項６に記載の糖尿病合併症因子吸着体。
配列Ａ：（ＣＯＯＨ）−ＫＧＡＰＫＫＰＰＱＲＬＥＷＫＬＮ−（ＮＨ２）
配列Ｂ：（ＣＯＯＨ）−ＷＫＬＮＴＧＲＴＥＡＷＫＶＬＳＰＱＧ−（ＮＨ２）
【請求項８】
前記糖尿病合併症因子がＲＡＧＥ結合物質であることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の糖尿病合併症因子吸着体。
【請求項９】
前記ＲＡＧＥ結合物質がＡＧＥであることを特徴とする請求項８に記載の糖尿病合併症因子吸着体。
【請求項１０】
体液処理用に用いられることを特徴とする請求項１〜９のいずれかに記載の糖尿病合併症因子吸着体。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれかに記載の糖尿病合併症因子吸着体を充填したことを特徴とする糖尿病合併症因子除去器。
【請求項１２】
請求項１〜１０のいずれかに記載の滅菌可能な糖尿病合併症因子吸着体に体液由来の被処理液を接触させることで被処理液中に含まれる糖尿病合併症因子を被吸着物質として選択的に除去することを特徴とする糖尿病合併症因子の除去方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、滅菌処理により糖尿病合併症因子に対する結合性能が実質上失活しない、ペプチド誘導体で構成された化合物を水不溶性担体に結合した糖尿病合併症因子吸着体及びそれを充填した除去器及びそれを用いた糖尿病合併症因子除去方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、糖尿病性腎症が悪化することで、人工透析を受ける患者が急激に増加しており、１９９８年以降の新規透析導入患者の主原因は糖尿病性腎症となり、以降、透析導入の主原因として位置づけられている。人工透析導入の原疾患としては、糖尿病性腎症と慢性糸球体腎炎で過半数を占めることが知られているが、透析導入後の生存率に大きな違いがある。評価施設において若干の違いがあるものの、糖尿病性腎症患者の透析導入後の５０％生存率は３〜４年とされるのに対して、慢性糸球体腎炎患者の５０％生存率は１０年程度かそれ以上と言われ、明らかに糖尿病性透析患者の予後が悪く、社会的問題となっているが解決の兆しが全く見えてこない。
【０００３】
この原因として糖尿病合併症の発症機序が未だ不明瞭であることが挙げられる。ところが最近になって、糖尿病合併症の共通の病変と言える血管病変を発症する病因物質の候補として、ＡＧＥ（ａｄｖａｎｃｅｄ  ｇｌｙｃａｔｉｏｎ  ｅｎｄｐｒｏｄｕｃｔｓ）に代表される各種変性物質に注目が集まった。
【０００４】
ＡＧＥとは、主に糖尿病性合併症の原因物質と考えられているものであり、血液中に存在するブドウ糖に代表される還元糖、その代謝産物や反応産物と、タンパク質や脂質などの低分子が酵素の関与なしに、つまり、非酵素的に結合する前進性糖化反応（ａｄｖａｎｃｅｄ  ｇｌｙｃａｔｉｏｎ）の産物であり、総称してカルボニルストレス産物とも呼ばれることもある。
【０００５】
当時は、還元糖等とタンパク質等の非酵素的反応体であるカルボニルストレス産物について、蛍光性、褐色性、架橋性、脱水、酸化、縮合、転移など様々な特徴が発見されたが、どれもカルボニルストレス産物が持つ病因性、つまり、糖尿病合併症因子としての証拠を直接説明できるものではなかった。カルボニルストレス産物の一つであるＡＧＥの評価方法についても、以前はその特徴の一つである蛍光特性で血液中の測定を試みている例がよくあり、特開平６−３１２１３４号公報（特許文献１）では、ヒト血漿中のＡＧＥを、励起波長３９０ｎｍ、蛍光波長４５０ｎｍで測定を試みている（例えば、非特許文献１参照。）。しかし、蛍光測定は試験管内の前進性糖化反応の確認には用いられるが、血液中では夾雑物や薬剤の非特異蛍光の影響も多くあることと、また、ペントシジンなど励起波長３３５ｎｍ、蛍光波長３８５ｎｍといった異なる蛍光特性のものも発見されるなど（例えば、非特許文献２参照。）、上記蛍光特性を持つＡＧＥはほんの一部に過ぎないことが分かりだした。更に、ＡＧＥの主構造と考えられているＣＭＬ（カルボキシメチルリジン）やＣＥＬ（カルボキシエチルリジン）には蛍光特性がないことが知られており、現在、ヒト血漿中のＡＧＥを励起波長３９０ｎｍ、蛍光波長４５０ｎｍで単純に測定することは、信頼性のある測定法ではないと認識されている。以来、蛍光特性による評価も測定手順に分子篩や化学処理を施したり、蛍光がどのＡＧＥ構造の蛍光を反映するかを考慮して評価するようになった。また、特異的な免疫学的測定方法で測定を試みる動きもある。これまで同定されたＡＧＥ構造はＣＭＬ、ＣＥＬ、ペントシジン、ピラリン、クロスリン、フルオロリンク、イミダゾロン、Ｘ１、アルグピリミジンなど１０種類程度あるが、これら全てのＡＧＥ構造がカルボニルストレス産物として病因性を持っているわけではないとも言われている（例えば、非特許文献３参照。）。このためＡＧＥに始まるカルボニルストレス原因説がより一層複雑になっているという問題があり、糖尿病性合併症に代表される各種血管病変を引き起こす糖尿病合併症因子としてのカルボニルストレス産物のみを正確に検出する方法でさえ極めて乏しい状態であった。
【０００６】
一方で、糖尿病合併症因子としての性質を持つ非酵素的変性物質は、主に細胞上のある特殊な受容体と結合することで引き起こされることが分かってきた。その多くは一般的にスカベンジャー受容体と呼ばれるものだが、本来別の機能を有する受容体にカルボニルストレス産物などの非酵素的変性物質が相互作用することで病因性を引き起こす場合も報告されている。ガレクチン−３、ＲＡＧＥ（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  ＡＧＥ）などである。特にＲＡＧＥは糖尿病の３大合併症である腎症、網膜症、神経症の発症を引き起こすだけではなく、動脈硬化も助長することがわかってきた。最近になり、動物レベルでＲＡＧＥと糖尿病状態で亢進するある特定の物質との相互作用で糖尿病性合併症などの血管障害が引き起こされることが証明されつつある（例えば、非特許文献４参照。）。現在、糖尿病合併症因子の病因性を引き出す経路はＲＡＧＥが最も重要であると考えられている。
【０００７】
ＡＧＥに代表されるＲＡＧＥ結合物質に対する吸着材は既に幾つかの種類が知られている。例えば、抗ＡＧＥ抗体をビーズに結合させることで作製した吸着材（例えば、非特許文献５参照。）が知られているが、これら吸着材は必ずしも滅菌下での使用が義務付けられたものではない。また、上記の公知の方法では、実験室レベルで要求される少量生産条件では、無菌区域での吸着材作製を実施することで課題解決が可能である。ところが、産業レベルでの大量生産及び吸着材を使用した製品の安定管理となれば、公知の滅菌方法で吸着材としての性能を大幅に損なわないような吸着材の設計が求められるが、滅菌できる吸着材を大量供給可能な技術が見出されていなかった。
【０００８】
【特許文献１】
特開平６−３１２１３４号公報
【０００９】
【非特許文献１】
マキタ（Ｍａｋｉｔａ  Ｚ），他８名，  「糖尿病性神経障害患者における前進性糖化反応産物（Ａｄｖａｎｃｅｄ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｅｎｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ．）」，ザ・ニュー・イングランド・ジャーナル・オブ・メディスン（Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ），１９９１年，第３２５巻，ｐ８３８
【００１０】
【非特許文献２】
ミヤタ（Ｍｉｙａｔａ  Ｔ），  他７名，「末期腎不全尿毒症患者の循環に於けるアルブミン結合性及び遊離性ペントシジンの蓄積：ペントシジンの病態生理学に於ける腎性関与（Ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｌｂｕｍｉｎ−ｌｉｎｋｅｄ  ａｎｄ  ｆｒｅｅ−ｆｏｒｍ  ｐｅｎｔｏｓｉｄｉｎｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｕｒｅｍｉｃ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｅｎｄ−ｓｔａｇｅ  ｒｅｎａｌ  ｆａｉｌｕｒｅ：  ｒｅｎａｌ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｐｅｎｔｏｓｉｄｉｎｅ．）」，ジャーナル・オブ・ジ・アメリカン・ソサイエティー・オブ・ネフロロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ），１９９６年，第７巻，８号，ｐ１１９８−１２０６
【００１１】
【非特許文献３】
ミヤタ（Ｍｉｙａｔａ  Ｔ），  他８名，「末期腎不全患者での前進性糖化最終産物の形成に於ける増加した酸化ストレスの関与（Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｓｔｒｅｓｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｇｌｙｃａｔｉｏｎ  ｅｎｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｅｎｄ−ｓｔａｇｅ  ｒｅｎａｌ  ｆａｉｌｕｒｅ．）」，キドニー・インターナショナル（Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ），１９９７年，第５１巻，４号，ｐ１１７０−１１８１
【００１２】
【非特許文献４】
ヤマモト（山本靖彦），  他８名，「ヒトＲＡＧＥをトランスジーンとしたマウスの糖尿病性腎病変」，糖尿病（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｊａｐａｎ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ），１９９９年，第４２巻，補１，ｐＳ−１９４
【００１３】
【非特許文献５】
バスタ（Ｂａｓｔａ  Ｇ），「前進性糖化最終産物は信号伝達受容体ＲＡＧＥを経由して内皮細胞を活性化する：炎症反応の増幅に対する機序（Ａｄｖａｎｃｅｄ  ｇｌｙｃａｔｉｏｎ  ｅｎｄｐｒｏｄｕｃｔｓ  ａｃｔｉｖａｔｅ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｓｉｇｎａｌ−ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＲＡＧＥ：  ａ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｆｏｒ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．）」，サーキュレーション（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ），２００２年，第１０５巻，第７号，ｐ８１６−８２２
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、糖尿病合併症因子を除去するための糖尿病合併症因子吸着体について、経済的に量産可能としたり、該吸着体を体液処理目的に使うために、該吸着体を滅菌できるようにすることで糖尿病合併症因子を安全且つ無菌的に除去できる方法の提供を目的とする。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、上記目的を達成するために以下の構成を有する。
「（１）滅菌処理により糖尿病合併症因子に対する結合性能が実質上失活しない、ペプチド誘導体で構成された化合物を水不溶性担体に結合させたことを特徴とする糖尿病合併症因子吸着体。」
「（２）上記（１）項に記載の糖尿病合併症因子吸着体が充填されてなる糖尿病合併症因子除去容器内に体液由来の被処理液を接触させることで被処理液中に含まれる糖尿病合併症因子を被吸着物質として選択的に除去することを特徴とする糖尿病合併症因子除去器の使用方法。」
【００１６】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００１７】
本発明でいうところの滅菌とは、吸着体や吸着体を充填した除去器内に混入した細菌やウイルス等の生物の増殖等の生命活動が一切行えないような化学的または物理的な処理方法のことである。滅菌を行う方法としては、その一例として、高圧蒸気滅菌、γ線滅菌や電子線滅菌等の放射線滅菌、エチレンオキシドガス等の殺菌性ガスを用いたガス滅菌、過酸化水素や過塩素酸水溶液等の殺菌性化合物を用いた化学滅菌等が挙げられ、特に限定されるものではない。
【００１８】
また、本発明で言うところの「滅菌処理により糖尿病合併症因子に対する結合性能が実質上失活しない」こととは、高圧蒸気滅菌処理前後での吸着性能の低下率が少なくとも５０％以内であることを言い、好ましくは３０％以内、より好ましくは２０％以内、最も好ましくは１０％以内で抑えられることで一義的に判定できる。また、上記高圧蒸気滅菌処理とは、１２０℃で２０分間の高圧蒸気処理を意味する。
【００１９】
本発明でいうところの吸着性能の定義と測定方法は以下に示す方法により一義的に評価できる。測定方法については、吸着体を沈降体積で１００μｌあたり、被吸着サンプル（ＡＧＥ標品を１０μｇ／ｍｌ含む０．５％ウシ血清アルブミン−リン酸緩衝液（２０ｍＭリン酸緩衝液に０．１５Ｍ塩化ナトリウムを添加した緩衝液（ｐＨ７．２）））を９００μｌ加えて、３７℃の孵卵器中で２時間ゆっくり振盪させて、この反応液を３０００ｒｐｍで５分間遠心分離して吸着体を沈降させ、上清中のＡＧＥ標品の吸着量を以下に示す免疫学的測定法（競合法ＥＬＩＳＡ）で測定する。上記ＡＧＥ標品を２０μｇ／ｍｌの濃度に調製し、９６穴マイクロタイタープレートに１ウェル当たり１００μｌ入れて、室温で２時間インキュベートすることにより固相化し、０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳでブロッキングした後、緩衝液２５μｌ、測定サンプル２５μｌ、ＡＧＥ抗体溶液を適宜希釈して５０μｌ入れて、２５℃で２時間振盪して、固相化抗原を認識した抗体に対して、抗ウサギペルオキシダーゼ標識抗体を反応させた後、発色させて５９５ｎｍの吸光度を測定する方法であり、上記方法での吸着体処理前後のＡＧＥ標品の減少率を吸着性能と定義する。吸着体の吸着性能があるということは、上記定義によって評価された減少率が少なくとも５０％以下であればよい。より好ましくは４０％以下であり、いっそう好ましくは３０％以下である。最も好ましくは、処理前後の吸着性能の減少率が１０％以下である。また、上記ＡＧＥ標品とは以下の方法で調製されたものをいう。２５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを０．１Ｍのグリコールアルデヒドと５ｍＭのＤＴＰＡ（Ｄｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｒｉａｍｉｎｅ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−ｐｅｎｔａａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）と共に０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解後、０．２μｍのフィルターにより濾過滅菌して、３７℃で１週間インキュベートした。低分子量の反応物や未反応のグリコールアルデヒドを、ＰＤ−１０脱塩カラムとＰＢＳによる透析により取り除き、ＡＧＥ標品を得ればよい。  そして、本発明で言うところの糖尿病合併症因子とは、糖尿病性合併症を引き起こす病因物質の総称であり、糖尿病患者の体内から検出されるのであれば特に限定されない。好ましくは、ＲＡＧＥと結合するＲＡＧＥ結合物質であればよい。ＲＡＧＥ結合物質の例としては、ＡＧＥだけではなく、ある種の炎症マーカーの一群であるＨＭＧ−１に代表されるハイモビリティータンパク質ファミリー、血清アミロイドＡ、Ｓ１００／カルグラニュリンスーパーファミリー、トランスサイレチンと呼ばれる物質でもよく、ＲＡＧＥと結合が認められるならば、特に限定を受けるものではない。また、これらのＲＡＧＥ結合物質を総称して、ＥＮ−ＲＡＧＥ（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｎｅｗｌｙ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ  ＲＡＧＥ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）とも定義されており（Ｃｅｌｌ、９７巻、８８９頁、１９９９年）、今後も新規のＲＡＧＥ結合物質が分離同定される可能性が高いと考えられる。さらに好ましくは、ＡＧＥであるが、ＡＧＥにも様々な構造のものがあり、いっそう好ましくは、ＲＡＧＥ結合性のＡＧＥである。ＡＧＥはタンパク質、ホルモン、糖類、脂質、ビタミン等に代表される生体物質とグルコースに代表される還元糖との非酵素的反応で生み出されるものであるが、必ずしも、還元糖はグルコースに限定される必要はなく、グリコールアルデヒドやグリセルアルデヒド、メチルグリオキサール、グリオキサール、３−デオキシグルコゾン等のα−ヒドロキシアルデヒド化合物やジカルボニル化合物であってもよい。また、ＡＧＥの生成途中でヒドロキシラジカルや一酸化窒素、パーオキシナイトライト等の各種ラジカルによる酸化変性があっても良く、生成経路や反応基質に特に限定を受けるものではなく、酸化性反応の結果に生成した変性物質であれば特に限定を受けものではない。特にＲＡＧＥ結合物質に重要なことは、ＲＡＧＥと結合することで病因性が認められるということである。
【００２０】
ここでいう糖尿病合併症因子の病因性とは、糖尿病合併症因子と細胞が接触することで、各種サイトカインの誘導、細胞遊走化促進、ＤＮＡ合成の亢進、接着分子発現亢進や線維化、ＮＦ−κＢの活性化、酸化ストレスの誘導、細胞や組織の物質透過性亢進などの何れかもしくは複数の現象を引き起こし、結果として、動脈硬化、腎症、網膜症、神経症などの血管病変や持続的炎症を引き起こすことを言う。また、糖尿病合併症因子は必ずしも糖尿病に限定されて見られる増悪因子ではなく、人工透析や各種腎疾患など排泄・代謝機能の低下の場合にも見られることがある。更には、敗血症や癌転移、アルツハイマー病、過炎症等にもＲＡＧＥの関与が示唆されているので、ＲＡＧＥが関与する疾病ならば、如何なるものも限定を受けることなく、該疾病患者に認められるものならば、糖尿病合併症因子と解釈されて良い。便宜上、糖尿病合併症因子と定義しているのは、特に糖尿病患者で検出されて、且つ、該患者で多く見られる、血管病変に関わる病因物質の総称のためである。
【００２１】
本発明で言うところのペプチド誘導体とは、ペプチド結合が少なくとも２つ以上存在するアミノ酸重合物であれば全く問題はなく、さらには、アミノ酸以外の化合物が更に含まれていても特に問題はない。アミノ酸以外の化合物では、糖や脂質といった生体由来の化合物でも良く、生体に存在しない芳香族環や脂肪族系化合物であっても良い。また、ペプチド誘導体を構成するアミノ酸は、生体内に存在するアミノ酸であれば全く問題なく、Ｄ体アミノ酸という生体内で支配的に見出されるＬ体アミノ酸の鏡像体が含まれていても特に問題なく使用できる。好ましくは、ペプチド誘導体内に塩基性官能基が２つ以上含まれていれば良く、その塩基性アミノ酸はアミノ基やアンモニウムイオン基、複素環や環状化合物で構成されていてもよい。また、塩基性官能基は生理的条件下で該官能基が塩基性を示せばより好ましいものである。更に、上記のペプチド誘導体が直鎖状でも環状ペプチド化合物、あるいは、双方の複合体でも良く、特に限定されない。更に好ましくは、滅菌条件下で吸着体としての性能を失わないペプチド誘導体であれば、特に問題なく使用できる。その中でも、特に好ましくは、環状ペプチド誘導体であれば、ポリミキシン系化合物がよく、直鎖状であれば、ＲＡＧＥのＩｇＶドメイン由来ペプチドであることが望ましい。
【００２２】
ポリミキシン系化合物とは、ポリミキシン骨格をもつ誘導体であり、ポリミキシンＢやコリスチン（ポリミキシンＥ）に代表される。他には、ポリミキシンＡ、ポリミキシンＣ、ポリミキシンＤ、ポリミキシンＦ等という化合物が知られているが、ポリミキシン骨格を持つ上述規定に定義された誘導体ならばよく、特に限定されない。
【００２３】
本発明で言うところのＲＡＧＥ部分配列誘導体とは、完全長ＲＡＧＥのなかのＲＡＧＥ結合物質が結合できるペプチド領域を含めた部分配列であり、好ましくは、ＩｇＶドメイン内の配列の一部を含めたものである。完全長ＲＡＧＥとは、ヒトの場合、４０４個のアミノ酸から構成され、そのうちＮ末端から２２個のアミノ酸で構成されるシグナル配列を有するため、結果的に３８２個のアミノ酸として受容体を形成する。そのうちで、糖尿病合併症因子と吸着できるアミノ酸配列を含む細胞外ドメインは、３４２個のアミノ酸で構成されている。また、細胞外ドメインは、更に細かいドメインに分類され、即ち、全アミノ酸配列４０４個の中でＮ末端側からＶ型ドメイン（３１番目から１０６番目までの７６個のアミノ酸で構成）、Ｃ２型ドメイン１（１３７番目から２１４番目までの７８個のアミノ酸で構成）、Ｃ２型ドメイン２（２５２番目から３０８番目までの５７個のアミノ酸配列で構成）の３つの領域からなる。細胞外ドメインの中でＶ型ドメインと呼ばれるドメインは、上述のようにＩｇＶドメインとも呼ばれるが、特に重要で、糖尿病合併症因子の一つであるＡＧＥとの結合性能を持つことが確認されている（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２７４巻、３１７４０頁、１９９９年）。更には、ＨＭＧ−１とも結合することも知られている（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２７０巻、２５７５２頁、１９９５年）。また、ＲＡＧＥのアミノ酸配列については、ヒトばかりでなく、ウシ、ラット、マウス、ウサギなどからのクローニングが報告されているが、動物間変異が多少見られる。もともとＲＡＧＥはマルチリガンド受容体として同定されており、動物間変異を考慮したアミノ酸配列でも、糖尿病合併症因子との結合活性が維持されるのであれば、問題なく使用できる。
【００２４】
本発明で言うところのＩｇＶドメイン誘導体とは、上述のＡＧＥ結合性能を持つとされるＩｇＶドメイン、つまり、３１番目から１０６番目までの７６個のアミノ酸配列を含むＲＡＧＥ由来のペプチドであり、該ペプチドの１若しくは数個のアミノ酸を置換・付加・欠失していても良いし、ＩｇＶドメイン以外のアミノ酸配列でアミノ酸の置換・付加・欠失があってもよい。さらに、ＲＡＧＥ細胞外ドメインのようにＩｇＶドメイン以外の配列が含まれていても良いし、後述するように、精製を簡便化したり、ＲＡＧＥとは異なる別の機能を付与する目的で、ＲＡＧＥとは無関係な何からの人工配列を付加しても良い。最も好ましくは、ＡＧＥなどに代表されるＲＡＧＥ結合物質が結合可能なＲＡＧＥ誘導体である。更には、３９番目から６８番目までの領域のアミノ酸配列の全部若しくは一部を含むアミノ酸配列で構成されたペプチド、つまり、ＩｇＶドメイン由来ペプチドであることが好ましい。そして、ＩｇＶドメイン由来ペプチドは、上述の定義の範囲で、ペプチド以外の化合物が結合してもよいし、該ペプチドの１若しくは数個のアミノ酸を置換・付加・欠失していても良いし、該ペプチド以外のアミノ酸配列でアミノ酸の置換・付加・欠失があってもよいし、上述のような人工配列が付加したようなＩｇＶドメイン由来ペプチド誘導体であってもよい。例えば、ＩｇＶドメイン由来ペプチドに代表される糖尿病性合併症因子吸着体に用いることができる、本発明で言うところのペプチド誘導体に導入可能なアミノ酸配列の例としては、簡単に単離、精製するためにタグと呼ばれる人工配列を遺伝子上に挿入し、タンパク質として利用することができる。精製法には他に、ＲＡＧＥに対する抗体カラムで精製する方法がある。人工配列を挿入しても精製は簡便であるので特に制限を受けない。人工配列にはＨｉｓ−ＴａｇやＧＳＴやＦｃ、プロテインＡ、プロテインＧなどが多く用いられる。精製以外の目的でも様々なアミノ酸配列や化合物を導入可能であり、特に限定を受けるものではない。
【００２５】
ペプチド誘導体を作成する方法は、生物的方法でも化学的方法でも特に限定を受けることなく用いることができる。生物学的方法では、細菌、酵母等の単細胞や植物細胞や昆虫細胞や動物細胞、またはこれらで構成された動物そのものの遺伝子組み替え産物として得ることも可能であるし、特殊な培養条件下での代謝産物として回収することも可能であり、特に限定されない。化学的方法では、固相法や液相法を用いた合成ペプチドの作製手法を用いることも可能であり、更には、上記の生物的手法と化学的手法を融合させて、上記ペプチドに特殊な化学処理をしてもよい。
【００２６】
本発明で言うところの、糖尿病合併症因子吸着体は、前記ペプチド誘導体で構成された化合物を水不溶性担体に固定させたものであり、且つ、滅菌可能であれば何でも良く、特に限定を受けない。吸着体を全血処理する場合には、抗原提示性などの不必要な免疫反応による副作用の可能性があるので、被処理液の宿主と同一、特に医療品であれば、ヒト由来のリガンドが最も好ましいが、吸着体から固定化したペプチド誘導体が遊離しないのであれば、特に限定無く使用が可能である。
【００２７】
ペプチド誘導体の固定化材料である水不溶性担体は、特に限定されない。より好ましくは表面積が多く取れる多孔質体形成可能な材料であり、さらにより好ましくは体液由来の被処理液と非特異的相互作用の少ない素材で構成されていればよく、さらに、被処理液の構成である体液が血液等の血球細胞との副反応によって刺激を低く抑えられる素材であれば最適であるが、これに限定されるものではない。また、担体は有機−有機、有機−無機の複合担体でも良く、無機担体としてはガラスビーズ、シリカゲル、金属ビーズなどがあり、有機担体には架橋ポリビニルアルコール、架橋ポリアクリレート、架橋ポリアクリルアミド、架橋ポリスチレン、架橋ポリスルホン等の合成高分子や結晶性セルロース、架橋アガロース、架橋デキストランなどの多糖類からなる有機担体との組み合わせでも良い。
【００２８】
担体の形状は、粒状、繊維状またはそれらの高次加工品、中空糸状と任意に形状を選ぶことができ、その大きさも特に限定されない。
【００２９】
糖尿病合併症因子吸着体に結合させたペプチド誘導体は、担体表面上にしっかりと固定化されることが好ましい。リガンドを固定化する場合には、担体表面上の水酸基、アミノ基、アルデヒド基、カルボキシル基、チオール基、シラノール基、アミド基、エポキシ基、ハロゲン基、サクシニルイミド基、酸無水物基などを用いて化学的結合による固定化方法があげられるが、必ずしもこれらに限定されるわけではない。また、リガンドは、これら官能基修飾を受けた担体に直接結合してもよいし、何らかのスペーサー分子を介して結合することも可能である。
【００３０】
ここでいう体液とは、血液、血漿、血清、腹水、リンパ液、脳脊髄液、尿及びこれらから得られた分画成分をいうが、特に限定を受けない。より好ましくは、病変が発生する血管に常時接触している体液、すなわち、血液、血漿、血清から得られた希釈成分や分画成分であれば良い。
【００３１】
本発明の吸着体を治療に用いる場合には種々の方法がある。最も簡便な方法としては患者の血液等の体液を体外に導出して血液バッグに貯め、これに本発明の吸着体を混合して糖尿病合併症因子を除去後、フィルターを通して吸着体を除去し、体液を患者に戻す方法がある。
【００３２】
他の方法は吸着体をカラムに充填し、体外循環回路に組み込み、オンラインで吸着除去をする方法である。処理方法には全血を直接還流する方法と血液から血漿を分離してから血漿をカラムに通す方法がある。本発明の吸着体はいずれの方法にも用いることができるが、前述のごとくオンライン処理に最も適している。ただし、必要に応じてはオンライン処理を行わずに、一端、血液等の体液を体外に取り出し、適切な操作の元で試験管内に吸着体と体液を接触させてから体内に戻すという非循環系のアフェレーシス療法にも応用可能である。この場合には、処理後の吸着体を例えば塩濃度のような適切な条件下に曝すことで糖尿病合併症因子を分離除去し、吸着体の吸着性能を再生する電解質溶液で再処理すれば良い。また、吸着体の使用方法は特に記載の内容のみに限定されるものではなく、長期留置に耐えうるような生体適合性に極めて優れた担体に糖尿病合併症因子吸着リガンドであるペプチド誘導体で構成された化合物を固定化出来るならば腹膜透析などにも応用可能であり、適宜その場に応じて使用方法を変えて利用することが出来る。
【００３３】
ここでいう体外循環回路では本発明の吸着体を単独で用いることもできるが、他のアフェレーシス治療にも併用可能である。併用例には、人工透析回路などが挙げられ、透析療法との組み合わせに用いることもできる。特に、より効率よく吸着体の除去性能を出すには、２個以上の複数の糖尿病合併症因子除去器を体外循環回路に組み込み、交互に吸着再生を行うことで実現化できる。
【００３４】
体外循環治療として用いられる糖尿病合併症因子除去器のプライミング容積は２００ｍＬ〜５００ｍＬが好ましいが、特に、透析療法との組み合わせに用いる場合には、患者の体外循環療法による負担を下げるべく、できるだけプライミング容積の小さな吸着体が好ましい。具体的には、５ｍＬ〜３００ｍＬのプライミング容積を持つ糖尿病合併症因子除去器が好ましい。また、一般的な人工透析療法では１回の施行時間が４〜５時間と限られた時間であり、この限られた時間内に出来る限り多くの糖尿病合併症因子を患者の負荷を軽減する形で実施するならば、複数回にわたって簡便に、且つ、再現性良く、吸着と脱離が出来る再生可能な糖尿病合併症因子除去器であることが好ましい。
【００３５】
以上、糖尿病合併症因子吸着体及び糖尿病合併症因子除去器を経済的に量産可能にするには、公知の方法で安価に滅菌することで性能を有意に劣化させないことが絶対条件であり、該技術並びに物が提供されるようになれば、無菌下での使用が容易に可能となり、安全な使用方法が提供可能となる。即ち、本発明は上記目的を満足する発明である。
【００３６】
以下、本発明を実施例に基づいて具体的に説明する。ただし、本発明はこれら記載の内容に限定されるものではない。
【００３７】
【実施例】
実施例１：ポリミキシン系化合物固定化担体の作製
ポリミキシン系化合物溶液の調製は、硫酸ポリミキシンＢ（ｓｉｇｍａ）及び硫酸コリスチン（ｓｉｇｍａ）をそれぞれ蒸留水に溶解させて、ＰＤ−１０カラムで０．１ＭＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．５）に緩衝液置換させて調製した。次いで、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基を１０原子の長さのスペーサーを介して導入したアガロースゲル：アフィゲル１０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）１ｍＬにポリミキシン系化合物（ポリミキシンＢ及びコリスチン）１０ｍｇをそれぞれ０．１ＭＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．５）１ｍＬに溶解した溶液を加え、４℃で一夜ゆっくりと撹拌した。溶解し難い場合には、適宜少量のジメチルスルホキシドで溶解後に０．１ＭＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．５）１ｍＬに溶解した。１Ｍエタノールアミン−塩酸（ｐＨ８．０）０．１ｍＬを加えて、室温で１．５時間反応させ、未反応のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基を不活化した後、それぞれ０．５ＭのＮａＣｌを含む０．１Ｍ酢酸−ＮａＯＨ（ｐＨ４．０）１ｍＬ及び０．１Ｍ炭酸−ＮａＯＨ（ｐＨ９．０）１ｍＬで交互に３回洗浄し、最後にリン酸緩衝液にて平衡化を行うことでポリミキシン系化合物固定化担体を得た。ポリミキシン系化合物固定化担体のうち、ポリミキシンＢ固定化担体を吸着体１とし、コリスチン固定化担体を吸着体２とした。
【００３８】
実施例２：ＲＡＧＥ部分配列誘導体固定化担体の作製
以下のＲＡＧＥ部分配列誘導体の調製を行った。また、アミノ酸は１文字表記で記載してある。Ｃ末端からＮ末端にかけて記載した。純度は９５％以上で調製した。
【００３９】
・ＲＡＧＥ部分配列Ａ：ＫＧＡＰＫＫＰＰＱＲＬＥＷＫＬＮ
（完全長ＲＡＧＥの３９〜５４番目の配列）
・ＲＡＧＥ部分配列Ｂ：ＷＫＬＮＴＧＲＴＥＡＷＫＶＬＳＰＱＧ
（完全長ＲＡＧＥの５１〜６８番目の配列）
上記合成ペプチドを少量のＤＭＳＯで溶解した後で、０．１ＭＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解させて調製した。多少不溶物が生成する場合でも懸濁液として使用した。次いで、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基を１０原子の長さのスペーサーを介して導入したアガロースゲル：アフィゲル１０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）１ｍＬにＲＡＧＥ部分配列Ａ及びＢについてそれぞれ１０ｍｇを０．１ＭＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．５）１ｍＬに添加した溶液を加え、４℃で一夜ゆっくりと撹拌した。溶解し難い場合には、適宜少量のジメチルスルホキシドで溶解後に０．１ＭＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．５）１ｍＬに溶解した。１Ｍエタノールアミン−塩酸（ｐＨ８．０）０．１ｍＬを加えて、室温で１．５時間反応させ、未反応のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基を不活化した後、それぞれ０．５ＭのＮａＣｌを含む０．１Ｍ酢酸−ＮａＯＨ（ｐＨ４．０）１ｍＬ及び０．１Ｍ炭酸−ＮａＯＨ（ｐＨ９．０）１ｍＬで交互に３回洗浄し、最後にリン酸緩衝液にて平衡化を行うことでＲＡＧＥ部分配列誘導体固定化担体を得た。ＲＡＧＥ部分配列誘導体固定化担体のうち、ＲＡＧＥ部分配列Ａ固定化担体を吸着体３とし、ＲＡＧＥ部分配列Ｂ固定化担体を吸着体４とした。
【００４０】
実施例３：ＡＧＥ標品の調製
ＲＡＧＥ結合物質の一例として、グリコールアルデヒド由来ＡＧＥを調製した。調製方法は、公知の文献（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、６巻、２号、１１４−１２５頁、２０００年）に従い調製した。２５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）及びＲＳＡ（ウサギ血清アルブミン）を０．１Ｍのグリコールアルデヒドと５ｍＭのＤＴＰＡ（Ｄｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｒｉａｍｉｎｅ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−ｐｅｎｔａａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）と共に０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解後、０．２μｍのフィルターにより濾過滅菌して、３７℃で１週間インキュベートした。低分子量の反応物や未反応のグリコールアルデヒドを、ＰＤ−１０脱塩カラムとＰＢＳによる透析により取り除き、ＡＧＥ標品を得た。ＢＳＡ由来のＡＧＥ標品をＡＧＥ標品１とし、ＲＳＡ由来のＡＧＥ標品をＡＧＥ標品２とした。
【００４１】
実施例４：ＡＧＥ標品に対する抗体の調製
実施例３で得られたＡＧＥ標品２について４ｍｇをフロイント完全アジュバント（和光純薬）と１：１の割合で乳化し、ニュージーランド白ウサギ（雌、２．５ｋｇ）の背部数カ所に皮下注射した。初回免疫後、１週間おきに５回の追加免疫を抗体価が上昇するまで行った。追加免疫後、経時的にウサギの耳静脈より少量採血し、抗体価の確認を行った。抗体価の上昇の見られた時点からさらに２週間後、最終追加免疫を行い、その１０日後に抗血清の精製を行うために全採血を行い、抗血清を得た。ついで以下の精製方法によって、抗血清からＡＧＥ特異的な抗体を調製した。まず、ＡＧＥアフィニティーカラムを調製した。７．５ｇのＣＮＢｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ  を１ｍＭ塩酸で膨潤後、２Ｌの１ｍＭ塩酸で洗浄した。リガンドとして１００ｍｇの実施例３で得られたＡＧＥ標品１をＣｏｕｐｌｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．３）と混合し、２５ｍｌのＣＮＢｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂゲルと室温で１時間振とうしてカップリングさせた。カップリング後、余分なリガンドはＣｏｕｐｌｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒで洗浄した。ゲルの活性残基は、０．１Ｍ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）とゲルを室温で２時間振とうしてブロッキングした。ブロッキング終了後、Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒとＷａｓｈｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ４．０）とで交互に３回洗浄し、更にＰＢＳで３回洗浄することでアフィニティー樹脂を調製した。本実施例で得られた２０ｍｌの抗血清をこのＡＧＥ標品１−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂカラム（２．５ｃｍ×５ｃｍ）に４℃で一晩吸着させた。ＰＢＳで洗浄後、吸着画分を１Ｍ  チオシアン酸カリウムを含んだ２０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で溶出した。溶出時は各フラクションを２８０ｎｍの吸光度でモニターし、ピーク部分を集めてＣｅｎｔｒｉｐｒｅｐ−１０で濃縮後、ＰＤ−１０ゲル濾過カラムを用いて緩衝液の置換を行うことで、ＡＧＥ標品に対する抗体（ＡＧＥ抗体）を得た。
【００４２】
実施例５：吸着体の高圧蒸気滅菌処理
実施例１及び２で得られた吸着体１〜４について、高圧蒸気滅菌処理を行った。滅菌条件は、１２０℃、２０分である。吸着体は生理食塩水に５０％スラリーになるように懸濁してから、高圧蒸気滅菌可能なバイアルに移して滅菌処理を行った。
【００４３】
実施例６：ＡＧＥ吸着実験
実施例１、２、５で得られた吸着体を沈降体積で１００μｌあたり、サンプル（実施例３で得られたＡＧＥ標品１を１０μｇ／ｍｌ含む０．５％ＢＳＡ−リン酸緩衝液）を９００μｌ加えた。３７℃の孵卵器中で２時間ゆっくり振盪した。この反応液を３０００ｒｐｍで５分間遠心分離して吸着体を沈降させ、上清中のＡＧＥ標品１の吸着量を以下に示す免疫学的測定法（競合法ＥＬＩＳＡ）で測定した。実施例３で得られたＡＧＥ標品１を２０μｇ／ｍｌの濃度に調製し、９６穴マイクロタイタープレートに１ウェル当たり１００μｌ入れて、室温で２時間インキュベートすることにより固相化した。０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳでブロッキングした後、緩衝液２５μｌ、測定サンプル２５μｌ、実施例４で得られたＡＧＥ抗体溶液を適宜希釈して５０μｌ入れて、２５℃で２時間振盪した。固相化抗原を認識した抗体に対して、抗ウサギペルオキシダーゼ標識抗体（カッペル）を反応させた後、発色させて５９５ｎｍの吸光度を測定した。各吸着体のＡＧＥ吸着率を表１に示す。すべての吸着体について、ＡＧＥに対して良好な選択性を示すとともに、高圧蒸気滅菌時の吸着性能の失活がほとんどなかったことが確認できた。ただし、性能低下率は次式で定義する。
（性能低下率）    ＝  （１−（高圧蒸気滅菌処理）／（未処理））×１００
【００４４】
表１  高圧蒸気滅菌前後での各種吸着体のＡＧＥ吸着率結果
2004236791.tif 000002
【００４５】
比較例１：ペプチド非固定化担体の作製及びＡＧＥ吸着性能評価
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基を１０原子の長さのスペーサーを介して導入したアガロースゲル：アフィゲル１０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）１ｍＬに１Ｍエタノールアミン−塩酸（ｐＨ８．０）０．１ｍＬを加えて、室温で１．５時間反応させ、未反応のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基を不活化した後、それぞれ０．５ＭのＮａＣｌを含む０．１Ｍ酢酸−ＮａＯＨ（ｐＨ４．０）１ｍＬ及び０．１Ｍ炭酸−ＮａＯＨ（ｐＨ９．０）１ｍＬで交互に３回洗浄し、最後にリン酸緩衝液にて平衡化を行うことでペプチド非固定化担体（吸着体５）を得た。吸着体５について、実施例６と同様の手法でＡＧＥ吸着実験を行った。結果を表２に示す。実施例１及び２で用いたペプチドを固定化しなかった吸着体では、十分なＡＧＥ吸着性能は見られなかった。
【００４６】
表２  ペプチド非固定化担体のＡＧＥ吸着率結果
吸着体５    ７．６％
【００４７】
比較例２：ＡＧＥ抗体固定化担体の調製及び高圧蒸気滅菌耐性評価
実施例４で得られたＡＧＥ抗体を０．１ＭＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解させて抗体溶液を調製した。次いで、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基を１０原子の長さのスペーサーを介して導入したアガロースゲル：アフィゲル１０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）１ｍＬに上記抗体溶液（ＡＧＥ抗体１０ｍｇを０．１ＭＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．５）１ｍＬに添加した溶液）を加え、４℃で一夜ゆっくりと撹拌した。１Ｍエタノールアミン−塩酸（ｐＨ８．０）０．１ｍＬを加えて、室温で１．５時間反応させ、未反応のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基を不活化した後、それぞれ０．５ＭのＮａＣｌを含む０．１Ｍ酢酸−ＮａＯＨ（ｐＨ４．０）１ｍＬ及び０．１Ｍ炭酸−ＮａＯＨ（ｐＨ９．０）１ｍＬで交互に３回洗浄し、最後にリン酸緩衝液にて平衡化を行うことでＡＧＥ抗体固定化担体（吸着体６）を得た。次に、吸着体６について、実施例５と同様の手法で高圧蒸気滅菌処理を行い、高圧蒸気滅菌処理前後でのＡＧＥ吸着性能の評価を行った。ＡＧＥ吸着実験は、実施例６と同様の手法で行った。結果を表３に示す。吸着体６は、高圧蒸気滅菌処理後にＡＧＥ吸着性能を大幅に失ったことが分かった。
【００４８】
表３  高圧蒸気滅菌前後でのＡＧＥ抗体固定化担体のＡＧＥ吸着率結果
2004236791.tif 000003
【００４９】
実施例７：環流式ＡＧＥ吸着実験
実施例１で得られた吸着体１をゲル体積で１ｍＬ分取して、ポリプロピレン製ミニカラム容器（カラム容積１ｍＬ、カラムに入出口がそれぞれ１つずつ有り、カラム内の吸着体がミニカラムから流失しないようにフィルターメッシュを入出口の各ヘッダー内に挟み固定している。入出口には充填液が漏れ出さないようにミニキャップをしてある。）に充填してカラムを作製した。充填溶液はリン酸緩衝液を使用した。次いで、上記ミニカラムを高圧蒸気滅菌処理するために、吸着体１を充填してミニカラムを作製して、更に、２００ｍＬのビーカーにリン酸緩衝液を１００ｍＬ継ぎ足して、そのなかに上記ミニカラムを入れた。更に、ビーカー上部にはアルミホイルをして高圧蒸気滅菌後もビーカー内部は無菌状態が保てるようにした。その後、実施例５と同様の手法で高圧蒸気滅菌処理を行うことで、滅菌処理したミニカラムを作製した。次いで、滅菌処理後の本ミニカラムが環流中でも吸着性能が保持されているかどうか確認する目的で環流式のＡＧＥ吸着実験を行った。カラムあたり、サンプル（実施例３で得られたＡＧＥ標品１を１０μｇ／ｍＬ含む０．５％ＢＳＡ−リン酸緩衝液）を１０ｍＬ処理した。３７℃の孵卵器中で８時間環流吸着した。環流はペリスタポンプを用いて行い、流量は０．２ｍＬ／分で固定した。適宜、１００ｕＬずつサンプリングして、環流溶液中のＡＧＥ量を実施例６に記載した免疫学的測定法で測定した。
【００５０】
表４    環流式ＡＧＥ吸着実験結果
2004236791.tif 000004
【００５１】
従って、本カラムは滅菌処理後でも環流式で有意な吸着性能を示すことがわかった。
【００５２】
【発明の効果】
本発明で見出された滅菌できる糖尿病合併症因子吸着体を充填してなる除去器及びその使用方法によって、産業レベルでの大量生産及び吸着体を使用した製品に対して、公知の滅菌方法で吸着材としての性能を大幅に損なわないような吸着体の設計が可能となった。また、安価な手法で滅菌できるようになったことにより、上記吸着体及び吸着体使用製品の無菌下での保存ができることでの長期安定管理を実現化できる。更には、糖尿病性透析患者などに対して、上記吸着体を充填した体外循環医療用具に代表される除去器を使用する場合には、患者への安全性（エンドトキシン混入防止）を配慮するために無菌下での操作が要求されるが、本発明により医療用具レベルとしても許諾可能な吸着体を提供できる。
【００５３】
以上により、本発明によって見出された滅菌できる糖尿病合併症因子の除去手段は、これまで十分な治療効果が期待できなかった糖尿病性腎症に代表される糖尿病合併症患者や血管障害患者、並びに、透析患者と言った酸化ストレスが亢進する難治性の患者に対して提供可能な技術となったばかりでなく、ＲＡＧＥが関与する難治性疾患、例えば、敗血症、アルツハイマー病などのアミロイド症、高脂血漿、腎症全般、癌、過炎症の患者にも有効な治療手段を提供できる。
【手続補正書】
【提出日】平成16年1月28日(2004.1.28)
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項７】
前記ＩｇＶドメイン誘導体が配列Ａ或いは配列Ｂの少なくともいずれかで構成されるＩｇＶドメイン由来ペプチド誘導体であることを特徴とする請求項６に記載の糖尿病合併症因子吸着体。
配列Ａ：ＫＧＡＰＫＫＰＰＱＲＬＥＷＫＬＮ
配列Ｂ：ＷＫＬＮＴＧＲＴＥＡＷＫＶＬＳＰＱＧ
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３８】
実施例２：ＲＡＧＥ部分配列誘導体固定化担体の作製
以下のＲＡＧＥ部分配列誘導体の調製を行った。また、アミノ酸は１文字表記で記載してある。純度は９５％以上で調製した。