(57)【要約】【課題】  第ＶＩＩＩ因子血漿内半減期を増加させる１または数個の第ＶＩＩＩ因子から誘導されたペプチドを含む血液凝固障害の改善された治療のための医薬製剤の提供。【解決手段】  このようなペプチド、そのＤＮＡ配列、そのアルブミン融合タンパク質としての組換え発現、および、このようなＤＮＡ配列を含むベクターが解明され、同様に、このような組換え発現ベクターのための宿主細胞と遺伝子治療のためのトランスファーベクター中でのこのようなＤＮＡ配列の使用が開示されている。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト第ＶＩＩＩ因子配列の、ヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）および／または低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質（ＬＲＰ）に関する一個または数個の結合部位を含むペプチドを有することを特徴とする、血液凝固障害の治療を改善するための医薬製剤。
【請求項２】
ヒト第ＶＩＩＩ因子配列の、ヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）および／または低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質（ＬＲＰ）に関する一個または数個の結合部位を含むペプチドに加えて、野生型第ＶＩＩＩ因子または第ＶＩＩＩ因子の凝固活性突然変異体を含むことを特徴とする、請求項１に記載の医薬製剤。
【請求項３】
ヒト第ＶＩＩＩ因子配列の、ヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）および／または低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質（ＬＲＰ）に関する一個または数個の結合部位を含むことを特徴とする、ペプチド。
【請求項４】
ヒト第ＶＩＩＩ因子配列のＡ２−サブユニットのアミノ酸５５８〜５６５および／または４８４〜５０９を含むことを特徴とする、請求項３に記載のペプチド。
【請求項５】
ヒト第ＶＩＩＩ因子配列の、ヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）および／または低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質（ＬＲＰ）に関する一個または数個の結合部位を含むことを特徴とする、アルブミン融合タンパク質。
【請求項６】
ヒト第ＶＩＩＩ因子配列のＡ２−サブユニットのアミノ酸５５８〜５６５および／または４８４〜５０９を含むことを特徴とする、請求項５に記載のアルブミン融合タンパク質。
【請求項７】
アルブミン配列とヒト第ＶＩＩＩ因子配列との間にトロンビン開裂部位を含むことを特徴とする、請求項５または６に記載のアルブミン融合タンパク質。
【請求項８】
添付の配列表に記載の配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号４のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項５〜７のいずれか一項に記載のアルブミン融合タンパク質。
【請求項９】
請求項３〜８に記載のアミノ酸配列のいずれかをコードするＤＮＡ配列。
【請求項１０】
請求項９に記載のＤＮＡ配列のいずれかを含む組換え発現ベクター。
【請求項１１】
請求項１０に記載の組換え発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項１２】
ヒト遺伝子治療のための、トランスファーベクター中での請求項９に記載のＤＮＡ配列のいずれかの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、第ＶＩＩＩ因子の血漿内半減期を増加させる１または数個の第ＶＩＩＩ因子から誘導されたペプチドを含む、血液凝固障害の改善された治療のための医薬製剤に関する。さらに、このようなペプチド、そのＤＮＡ配列、そのアルブミン融合タンパク質としての組換え発現、および、このようなＤＮＡ配列を含むベクター、同様に、このような組換え発現ベクターのための宿主細胞、および、遺伝子治療のためのこのようなＤＮＡ配列のトランスファーベクター中での使用が開示される。
【背景技術】
【０００２】
古典的血友病または血友病Ａは、最も一般的な遺伝性の出血障害である。血友病Ａの臨床的な症状発現は、異常出血傾向であり、第ＶＩＩＩ因子濃縮物で治療しなければ、重度の血友病患者の平均寿命は２０年未満である。血漿からの第ＶＩＩＩ因子濃縮物の使用により、血友病患者の状態はかなり改善されてきた。平均寿命は高く引き上げられ、おおよそ通常の寿命を生きる可能性がほとんどの患者に与えられている。しかしながら、血漿由来の濃縮物とその使用に関してある種の問題があり、その中でも最も深刻な問題は、ウイルス感染である。これまで、エイズ、肝炎Ｂ、および非Ａ非Ｂ肝炎を引き起こすウイルスは、人々を深刻に打ちのめしてきた。近年、異なるウイルス不活性化法や新規の高精製第ＶＩＩＩ因子濃縮物が開発されているが、不注意の汚染を防ぐことはできない。また、ヒト血漿原料の供給が限られているために、第ＶＩＩＩ因子濃縮物はかなり高価である。  組換え材料から得られた第ＶＩＩＩ因子産物は、血友病Ａの治療のための血漿由来第ＶＩＩＩ因子濃縮物の使用に関する問題をかなりの程度まで解決しているようである。しかしながら、組換え第ＶＩＩＩ因子の開発は、いくつかの困難、例えば特に完全長分子に関して十分に高い収率における生産レベルを達成するという問題がある。
【０００３】
プロテアーゼ阻害剤存在下で調製された新鮮な血漿において、第ＶＩＩＩ因子は、２８０ｋＤａの分子量を有し、２つのポリペプチド鎖（それぞれ２００ｋＤａと８０ｋＤａ）から成ることがわかっている。これらの鎖は、金属イオン架橋で共に結合している。多かれ少なかれ、第ＶＩＩＩ因子分子のタンパク質分解により分解した形態は、市販の濃縮物から精製した第ＶＩＩＩ因子材料において、活性断片として見出すことができる。２６０ｋＤａから１７０ｋＤａの分子量を有する第ＶＩＩＩ因子の断片化形態は、１８０ｋＤａから９０ｋＤａの範囲の分子量を有する１つの重鎖からなり、この場合、全ての変異体は、１つの８０ｋＤａの軽鎖と組み合わせて同一のアミノ末端を有する。重鎖のアミノ末端領域は、第ＶＩＩＩ因子ｃＤＮＡのヌクレオチド配列データから推測することができる単鎖第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの領域と同一である。
【０００４】
分子量１７０ｋＤａを有する第ＶＩＩＩ因子の最も小さい活性型は、１つの９０ｋＤａ鎖と１つの８０ｋＤａ鎖からなり、トロンビンにより、より大きい分子量形態と同程度に活性化することができ、従って非活性型を示す。血友病のイヌで試験したところ、インビボで完全な生物活性を有することも示されている。従って、１７０ｋＤａ形態の止血の有効性は、第ＶＩＩＩ因子の高分子量形態と同じである。
【０００５】
ＦＶＩＩＩは、Ａ１とＡ３ドメインとの間の２価金属イオンの非共有結合で連結した重鎖（ドメインＡ１−Ａ２−Ｂ）と軽鎖（Ａ３−Ｃ１−Ｃ２）とからなるヘテロ二量体として血漿中に分泌される。血漿中で、ＦＶＩＩＩは、フォン−ウィルブランド因子に結合することにより安定化される。
【０００６】
トロンビンによるタンパク分解の活性化の際、ＦＶＩＩＩは、２つの重鎖断片（Ａ１，
５０ｋＤａ断片、および、Ａ２，４３ｋＤａ断片）と、軽鎖（Ａ３−Ｃ１−Ｃ２，７３ｋＤａ断片）とからなるヘテロ三量体に活性化される。従って、ＦＶＩＩＩ活性型（ＦＶＩＩＩａ）は、２価金属イオン結合を介してトロンビン−開裂Ａ３−Ｃ１−Ｃ２軽鎖に連結するＡｌ−サブユニットと、Ａ１ドメインに連結する遊離のＡ２サブユニットとからなる。その遊離のＡ２サブユニットのヘテロ三量体からの解離は、トロンビン活性化の後のＦＶＩＩＩａ不活性化における律速段階と考えられている。血漿中での非活性化ＦＶＩＩＩの半減期は約１４時間である。ＦＶＩＩＩは、まず細胞表面でヘパラン硫酸プロテオグリカンに結合し、続いて、ＬＲＰ（低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質）に結合した後、主に肝細胞で吸収され、異化されると考えられる（Ａｎａｎｙｅｖａ  ｅｔ  ａｌ.，ＴＣＭ，Ｖｏｌ．１１，Ｎｏ．６（２００１）２５１−２５７）。ＦＶＩＩＩ内のＬＲＰへの接触部位は、Ａ２＿部位（残基４８４〜５０９；配列番号５）（Ｓａｅｎｋｏ  ｅｔ  ａｌ.，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４（１９９９），３７，６８５−６９２）、および、Ｃ２ドメイン（Ｌｅｎｔｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ.，２７４；２３，７３４−７３９）に局在していた。ＲＡＰ（受容体関連タンパク質）によるＬＲＰのブロッキングにより、ＦＶＩＩＩレベルが増加することが示された（Ｓｃｈｗａｒｚ  ｅｔ  ａｌ（２０００）Ｂｌｏｏｄ９５：１．７０３−１．７０８）。ＦＶＩＩＩ血漿内半減期を増加させるために、ＬＲＰをブロックするのにＲＡＰを用いること（ＷＯ００／２７４２５）、または、ＬＲＰへの結合を防ぐためにＦＶＩＩＩ配列を変えてＦＶＩＩＩ半減期を増加させること（ＷＯ００／２８０２１およびＷＯ００／７１７１４）もまた示唆されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ＦＶＩＩＩは、血漿内半減期が１４時間であるために、１週間に約３回、予防的治療を受けている血友病患者に静脈内投与する必要がある。従って、増強された血漿内半減期を有するＦＶＩＩＩを製造し、それによりより少ない頻度で投与されるＦＶＩＩＩ製剤を得ることが強く望まれる。本発明は、ＦＶＩＩＩ異化を引き起こす受容体を、これらの受容体に付着したＦＶＩＩＩ断片、または、ヒト血清アルブミンに融合したこれらの断片によりブロッキングすることにより、この問題に対する解決法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
それゆえに、本発明の主題は、血液凝固障害の治療を改善するための医薬製剤であり、該製剤は、ヒト第ＶＩＩＩ因子配列の、ヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）および／または低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質（ＬＲＰ）に関する１または数個の結合部位を含むペプチドを含む。このようなペプチドは、増加された血漿内半減期を有するより大きい血漿タンパク質、好ましくはアルブミンにそれらを融合させるか、または化学的に付着させることによって安定化させることができる。
【０００９】
ヒト第ＶＩＩＩ因子配列の、ヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）および／または低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質（ＬＲＰ）に関する１または数個の結合部位を含むこのようなペプチドまたはアルブミン融合タンパク質に加えて、前記医薬製剤は、野生型第ＶＩＩＩ因子または第ＶＩＩＩ因子の凝固活性突然変異体を含んでもよい。あるいは、ＦＶＩＩＩは、別々に投与される。
【００１０】
このような融合タンパク質またはペプチドは、ＨＳＰＧおよび／またはＬＲＧに競合的に結合するそれらの能力のために、血漿中での第ＶＩＩＩ因子分解を減じ、その結果として第ＶＩＩＩ因子の血漿内半減期を増加させる。前記第ＶＩＩＩ因子結合化合物の血漿濃度の減少により、第ＶＩＩＩ因子分解が減少する。
【００１１】
本発明に従って医薬製剤の成分として使用されるアルブミン融合タンパク質またはペプ
チドは、ヒト第ＶＩＩＩ因子配列のＡ２−サブユニットのアミノ酸５５８〜５６５および／または４８４〜５０９を含み、添付の配列表の配列番号１〜６のアミノ酸配列に対応する。
【００１２】
治療用タンパク質をヒト血清アルブミンに融合することは、血漿内半減期を増加させる手段であることが示されている（ＷＯ０１／７７１３７）。しかしながら、ＦＶＩＩＩ由来のＬＲＰ結合断片（残基４８４〜５０９）が、アルブミン融合の際に、コンフォメーション中でＬＲＰとの結合をなお可能としているかどうかは不明であった。
【００１３】
ＦＶＩＩＩのＬＲＰへの結合は、まず残基５５８〜５６５（配列番号６）を介してヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）に結合し、その後ＬＲＰのみに結合するという２段階プロセスである可能性が最も高いことから（Ａｎａｎｙｅｖａ  ｅｔ  ａｌ.，ＴＣＭ，Ｖｏｌ．１１，Ｎｏ．６（２００１）２５１−２５７）、ＬＲＰ結合部位（配列番号１）のみを提示する融合タンパク質を、ＬＲＰおよびＨＳＰＧ結合部位（配列番号２）の両方を含む融合タンパク質と比較した。
【００１４】
トロンビンによるＦＶＩＩＩ活性化の際に融合タンパク質の開裂を可能にするために、融合タンパク質の第二のセットにおいて、アルブミンとＦＶＩＩＩ断片部分との間にトロンビン開裂部位を挿入した（配列番号３および４）。
【００１５】
本発明は、本発明で開示されたＤＮＡ配列のいずれかを含む組換え発現ベクター、および、前記組換え発現ベクターのいずれかで形質転換された宿主細胞、および、ヒト遺伝子治療のための、前記ＤＮＡ配列のトランスファーベクター中での使用、をさらに含む。
【００１６】
本発明のさらなる詳細を以下の実施例で示す：
【実施例】
【００１７】
ＬＲＰ結合部位のクローニング
ＬＲＰ結合部位およびフランキングアミノ酸（アミノ酸４７９−５１７，Ａｎａｎｙｅｖａ  ｅｔ  ａｌ.，ＴＣＭ，Ｖｏｌ．１１，Ｎｏ．６（２００１）２５１−２５７で示された命名法）の、ｐＬＩＴＭＵＳ２９（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）へのクローニングは、ＦＶＩＩＩのｃＤＮＡを含むプラスミドにおいてプライマーＷｅ１００３  ５’ＧＴＧＧＧＡＴＣＣＧＧＴＧＧＴＧＧＡＡＴＣＡＣＴＧＡＴＧＴＣＣＧＴＣＣ３’（配列番号７）およびＷｅ１０５９  ５’ＣＡＣＡＡＧＣＴＴＡＴＴＡＴＡＣＡＧＴＣＡＣＴＧＴＣＣＡＴＴＴＡＴＡＴＴＴＧ３’（配列番号８）（クローニングに用いられた制限部位を下線で示す）を用いて増幅させ、続いてＢａｍＨ１およびＨｉｎｄＩＩＩで制限酵素消化し、精製し、ＢａｍＨ１／ＨｉｎｄＩＩＩで切断したｐＬＩＴＭＵＳ２９にライゲーションさせることによりなされた。得られたプラスミドをｐＣＮ１７５とした。
【００１８】
ＬＲＰ／ＨＳＰＧ結合部位のクローニング
ＬＲＰおよびＨＳＰＧ結合部位およびフランキングアミノ酸（アミノ酸４７９〜５７５，Ａｎａｎｙｅｖａ  ｅｔ  ａｌ.，ＴＣＭ，Ｖｏｌ．１１，Ｎｏ．６（２００１）２５１−２５７で示された命名法）の、ｐＬＩＴＭＵＳ２９へのクローニングは、ＦＶＩＩＩのｃＤＮＡを含むプラスミドにおいてプライマーＷｅ１００３  ５’ＧＴＧＧＧＡＴＣＣＧＧＴＧＧＴＧＧＡＡＴＣＡＣＴＣＡＴＧＴＣＣＧＴＣＣ３’（配列番号７）およびＷｅ１００４  ５’ＣＡＣＡＡＧＣＴＴＡＴＴＡＣＡＧＧＡＴＧＡＣＡＴＴＣＣＴＣＴＴＧＴＣ３’（配列番号９）（クローニングに用いられた制限部位を下線で示す）を用いて増幅させ、続いてＢａｍＨ１およびＨｉｎｄＩＩＩで制限酵素消化し、精製し、ＢａｍＨ１／ＨｉｎｄＩＩＩで切断したｐＬＩＴＭＵＳ２９にライゲーションすることによりなされた。得られたプラスミドをｐＧＨ１５７とした。
【００１９】
クローンの単離および配列確認の後、ＢａｍＨ１／ＨｉｎｄＩＩＩで消化して分離用ゲルから精製してＬＲＰおよびＬＲＰ／ＨＳＰＧ断片を単離し、これを、Ｃ末端でアルブミンと融合させるために発現ベクターに挿入した。
【００２０】
酵母発現ベクターへのクローニング
プラスミドｐＤＢ２２４３（Ｓｌｅｅｐ，Ｄ.，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ９，１８３−１８７で説明された）は、酵母ＰＲＢ１プロモーター、および、適切な転写ターミネーター配列を提供する酵母ＡＤＨ１ターミネーター、同様に、ヒトアルブミンコーディング配列を含み、これが用いられた。まず、プラスミドｐＤＢ２２４３をＢａｍＨ１で完全消化し、凹んだ末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼとｄＮＴＰとで平滑末端化し、最後に再ライゲーションし、プラスミドｐＤＢ２５６６を得た。次に、グリシン−セリン−リンカー［(ＧＧｓ)4ＧＧ］をアルブミン配列のＣ末端に挿入した。そのために、ｐＤＢ２５６６をＢｓｕ３６１およびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、２つのリンカーオリゴヌクレオチド（ＧＳＬ＋，ＴＴＡＧＧＣＴＴＡＧＧＴＧＧＴＴＣＴＧＧＴＧＧＴＴＣＣＧＧＴＧＧＴＴＣＴＧＧＴＧＧＡＴＣＣＧＧＴＧＧＡ３’（配列番号１０）、ＧＳＬ−，５’ＡＧＣＴＴＣＣＡＣＣＧＧＡＴＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＧＧＡＡＣＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＴＡＡＧＣＣ３’（配列番号１１）（(ＧＧＳ)4ＧＧリンカーとＢａｍＨ１クローニング部位とを含む）を挿入した。得られたプラスミドをｐＤＢ２５６６ＧＳとした。
【００２１】
ＬＲＰおよびＬＲＰ／ＨＳＰＧのＢａｍＨ１／ＨｉｎｄＩＩＩによるＤＮＡ断片を上述のプラスミドから単離し、ＨｉｎｄＩＩＩで部分的に消化されたプラスミドｐＤＢ２５６６ＧＳとライゲーションし、続いて、ＢａｍＨ１で完全消化した。得られたプラスミドｐＣＮ１７６はＬＲＰを含み、プラスミドｐＧＨ１５９はＬＲＰ／ＨＳＰＧ断片を含んでいた。
【００２２】
適切な酵母ベクター配列は、「崩壊性（disintegration）」プラスミドｐＳＡＣ３５（ＥＰ−Ａ−２８６４２４で一般的に開示され、Ｓｌｅｅｐ，Ｄ.，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ９，１８３−１８７により説明されている）により提供された。ＮｏｔＩアルブミン−（ＧＧＳ）4ＧＧ−ＬＲＰ発現カセットをプラスミドｐＣＮ１７６から単離し、精製し、ＮｏｔＩで消化した、仔ウシ腸ホスファターゼ処理ｐＳＡＣ３５にライゲーションし、２つのプラスミドを作製した；第一のｐＣＮ１７７は、ＬＥＵ２と同じ発現方向にＮｏｔＩ発現カセットを含み、アルブミン融合タンパク質の発現に用いられ、一方、第二のｐＣＮ１７７は、ＬＥＵ２とは逆の方向にＮｏｔＩ発現カセットを含んでいた。
【００２３】
ＮｏｔＩアルブミン−（ＧＧＳ）4ＧＧ．ＬＲＰ／ＨＳＰＧ発現カセットをプラスミドｐＧＨ１５９から単離し、精製し、ＮｏｔＩで消化した、仔ウシ腸ホスファターゼ処理ｐＳＡＣ３５にライゲーションし、２つのプラスミドを作製した；第一のｐＧＨ１６５は、ＬＥＵ２と同じ発現方向にＮｏｔＩ発現カセットを含み、アルブミン融合タンパク質の発現に用いられ、一方で、第二のｐＧＨ１６５は、ＬＥＵ２とは逆の方向にＮｏｔＩ発現カセットを含んでいた。
【００２４】
トロンビン開裂部位の導入
プラスミドｐＣＮ１７６およびｐＧＨ１５９のＢａｍＨ１部位それぞれにリンカーを挿入することにより、アルブミンと、ＬＲＰ／ＨＳＰＧおよびＬＲＰ部位との間それぞれにトロンビン開裂部位（ＴＣＳ）を導入した。これに関してプラスミドｐＣＮ１７６およびｐＧＨ１５９をＢａｍＨ１で直線化し、脱リン酸化した後、５’−リン酸化オリゴヌクレオチド５’ＧＡＴＣＴＣＴＡＧＴＴＣＣＡＣＧＴＧ３’（配列番号１２）および５’ＧＡ
ＴＣＣＡＣＧＴＧＧＡＡＣＴＡＧＡ３’（配列番号１３）からなるハイブリダイズしたリンカーとライゲーションした。得られた正しい方向にリンカーを含むプラスミド（以下の図、配列番号１４および１５を参照）は、ｐＣＮ１６７（ＬＲＰ断片を含む）とし、ｐＧＨ１６８（ＬＲＰ／ＨＳＰＧ断片を含む）とした。
【００２５】
【化１】
2004236661.tif 000002
【００２６】
適切な酵母ベクター配列は、上述のプラスミドｐＳＡＣ３５により提供された。ＮｏｔＩアルブミン（ＧＧＳ）4−ＴＣＳ−ＬＲＰ発現カセットをプラスミドｐＣＮ１６７から単離し、精製し、ＮｏｔＩで消化された、仔ウシ腸ホスファターゼ処理ｐＳＡＣ３５にライゲーションし、２つのプラスミドを作製した；第一のｐＣＮ１６９はＮｏｔＩ発現カセットをＬＥＵ２と同じ発現方向に含み、アルブミン融合タンパク質の発現に用いられ、一方で、第二のｐＣＮ１６９は、ＮｏｔＩ発現カセットをＬＥＵ２とは逆の方向に含んでいた。
【００２７】
ＮｏｔＩアルブミン−（ＧＧＳ）4−ＴＣＳ−ＬＲＰ／ＨＳＰＧ発現カセットをプラスミドｐＧＨ６８から単離し、精製し、ＮｏｔＩで消化された、仔ウシ腸ホスファターゼ処理ｐＳＡＣ３５にライゲーションし、２つのプラスミドを作製した；第一のｐＧＨ１７１はＮｏｔＩ発現カセットをＬＥＵ２と同じ発現方向に含み、発現に用いられ、一方で、第二のｐＧＨ１７１は、ＮｏｔＩ発現カセットをＬＥＵ２とは逆の方向に含んでいた。
【００２８】
酵母の形質転換
ＷＯ９５／２３８５７、ＷＯ９５／３３８３３およびＷＯ９４／０４６８７で開示された酵母系を、ロイシン要求性に形質転換した。形質転換体を緩衝最小培地に適用し、さらなる分析に用いるのに十分な程成長するまで３０℃でインキュベートした。
【００２９】
アルブミン融合タンパク質の発現および精製
ｒＨＡ融合体を振盪フラスコ培養中に発現させ、発現レベルをモニターした。アルブミン融合タンパク質を陽イオン交換およびゲル透過クロマトグラフィーで精製した。次に、精製材料を濃縮し、ＰＢＳに対して膜分離精製（ｄｉａｆｉｌｔｅｒｅｄ）した。
【００３０】
薬力学／薬物動態学研究
併合した薬力学／薬物動態学研究の第一の目的は、ＦＶＩＩＩの吸収をブロックすること、および、血漿とは異なる区域への分解により仲介されるＦＶＩＩＩの増加した半減期の証拠を得ることである。
【００３１】
この目的は、ＡＦＰＸ（式中、Ｘは、上述のＬＲＰ／ＨＳＰＧアルブミン融合タンパク質のいずれかを示す）によるＦＶＩＩＩの薬力学／薬物動態学パラメーターの調節を評価することにより達成される。ＦＶＩＩＩの体内レベルが選択されたエンドポイントを損な
う可能性があるため、ＦＶＩＩＩのｋｏマウスで研究が行われる。マウスあたり１つの推定サンプルのみが回収され得るため、研究を２つに分ける。第一の研究からはＡＦＰＸの適切な用量レベルを導き、一方で、第二の研究において選択された用量レベルによる排出特徴の調節に関して綿密に調査する。
【００３２】
第一の目的：
血漿レベルを測定し、尾切断出血モデルにおける止血効果を測定することにより、ＦＶＩＩＩと、ＬＲＰアルブミン融合タンパク質Ｘを共注入したＦＶＩＩＩとの半減期および生物学的利用能を評価することである。出血時間の評価は、抗原レベルよりも、ＦＶＩＩＩレベルをより正確に反映させることが可能である。
【００３３】
第二の目的：
ＦＶＩＩＩとＬＲＰ融合タンパク質Ｘを共注入したＦＶＩＩＩとの追加の薬物動態学パラメーターを潜在的に評価することである。
【００３４】
研究計画
【表１】
2004236661.tif 000003
【００３５】
【表２】
2004236661.tif 000004
【００３６】
材料および方法
試験物質（１．〜２．）の投与：
試験物質１：ＡＦＰＸ
製造元：Ａｖｅｎｔｉｓ  Ｂｅｈｒｉｎｇ  ＧｍｂＨ，Ｌａｂ  Ｔｈｏｍａｓ  Ｗｅｉｍｅｒ、
バッチ番号：ｔｂｄ、
適用量：ｔｂｄ、
単回投与／経路：１０,１００または５００ｍｇ／ｋｇ、静脈内、
頻度：１×（ｔ＝０）。
【００３７】
試験物質２：ヘリキセートまたは適切な他のＦＶＩＩＩ濃縮物
製造元：Ａｖｅｎｔｉｓ  Ｂｅｈｒｉｎｇ  ＧｍｂＨ、
バッチ番号：ｔｂｄ、
適用量：ｔｂｄ、
単回投与／経路：５０Ｕ／ｋｇ、静脈内、
頻度：１×（ｔ＝０）。
【００３８】
実験動物
種／系：Ｃ５７ＢＩ６マウス，ＦＶＩＩＩ−ｋｏ、
性別／歳：５５雄／５５雌、
総数：１１０、
供給元：Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ，Ｋｉｓｓｌｅｇｇ。
【００３９】
動物モデル：
１グループあたり５匹の雄および５匹の雌のＦＶＩＩＩ−ｋｏマウスに、ＦＶＩＩＩ単独またはＡＦＰＸとの組み合わせを、３つの用量レベル（１０、１００または５００ｍｇ／ｋｇ）で、１回の静脈注射により、０日目に投与する。
適切な時点におけるそれぞれの抗原または活性レベルの測定のために、血液サンプルが分取される。
【００４０】
研究における変数：
サンプル頻度に依存する薬物動態学（ＰＫ）変数：
半減期、最後の血漿サンプル（ＡＵＣ0-and）までの血漿濃度−時間曲線の下の領域、最大濃度（Ｃmax）、最大濃度までの時間（ｔmax）。
【００４１】
薬力学エンドポイント：
尾切断出血時間、１０分間の切断による血液ロス値。出血時間は麻酔下で測定される。
【００４２】
統計的方法：
個々の血漿レベルの分析
静脈内注射の後の、ＦＶＩＩＩの血漿濃度−時間特徴および可能性のあるＡＦＰＸを動物ごとに必要に応じ非線形回帰を用いて分析する。
指数関数モデルは、最小二乗法により基線に合わせたデータにあわせることができる。
ＡＵＣは、直線の台形公式を用いて最後の測定値（ＡＵＣ0-end）まで計算することができる。
【００４３】
要約および比較分析
個々のＰＫの結果は、処理ごとに記述的にまとめられ（最小値、中央値、最大値、平均、標準偏差）、分散の二方向分析により完成され、以下の変数に関して行われた：排出半
減期、ＡＵＣおよびＣmax（全て対数変換された）。処理グループは、固定ファクターであり得る。処理グループ間の適切な対比を評価するべきである。
【００４４】
配列番号の説明
配列番号１は、ヒトアルブミンに融合したＬＲＰ結合部位を示す。１〜２４、リーダー配列、これは酵母での分泌の際に除去される；２５〜６０９、ヒトアルブミン；６１０〜６２３、ＧＧＳリンカー；６２４〜６６２、ＬＲＰ結合部位（６２９〜６５４）および追加のＦＶＩＩＩから誘導されたフランキング配列（６２４〜６２８；６５５〜６６２）。
【００４５】
配列番号２は、ヒトアルブミンに融合したＬＲＰ／ＨＳＰＧ結合部位を示す。１〜２４、リーダー配列、これは酵母での分泌の際に除去される；２５〜６０９、ヒトアルブミン；６１０〜６２３、ＧＧＳリンカー；６２４〜７２０、ＦＶＩＩＩコンテキスト内のＬＲＰおよびＨＳＰＧ結合部位；ＬＲＰ結合部位（６２９〜６５４）、ＨＳＰＧ結合部位（７０３〜７１０）。
【００４６】
配列番号３は、ヒトアルブミンに融合したＬＲＰ結合部位（追加のトロンビン開裂部位を含む）を示す。１〜２４、リーダー配列、これは酵母での分泌の際に除去される；２５〜６０９、ヒトアルブミン；６１０〜６２１、ＧＧＳリンカー；６２２〜６６８、ＬＲＰ結合部位（６３５〜６６０）および追加のＦＶＩＩＩから誘導されたフランキング配列（６３０〜６３４；６６１〜６６８）；６２５／６２６、トロンビン開裂部位。
【００４７】
配列番号４は、ヒトアルブミンに融合したＬＲＰ／ＨＳＰＧ結合部位（追加のトロンビン開裂部位を含む）を示す。１〜２４、リーダー配列、これは酵母での分泌の際に除去される；２５〜６０９、ヒトアルブミン；６１０〜６２１、ＧＧＳリンカー；６３０〜７２６、ＦＶＩＩＩコンテキスト内のＬＲＰおよびＨＳＰＧ結合部位；ＬＲＰ結合部位（６３５〜６６０）、ＨＳＰＧ結合部位（７０９−７１６）；６２５／６２６、トロンビン開裂部位。
【００４８】
配列番号５は、第ＶＩＩＩ因子Ａ２ドメイン内のＬＲＰへの接触部位（アミノ酸残基４８４〜５０９）を示す。
配列番号６は、第ＶＩＩＩ因子Ａ２ドメイン内のＨＳＰＧ結合部位を示す（アミノ酸残基５５８〜５６５）。
【００４９】
配列番号７〜９は、ＬＲＰおよびＬＲＰ／ＨＳＰＧ結合部位のクローニングに用いられた合成オリゴヌクレオチドを示す。
配列番号１０および１１は、酵母ベクターｐＤＢ２２４３の改変に用いられた合成オリゴヌクレオチドを示す。
【００５０】
配列番号１２および１３は、トロンビン開裂部位の導入に用いられた合成オリゴヌクレオチドを示す。
配列番号１４および１５は、プラスミドｐＣＮ１６７およびｐＧＨ１６８内にＧＧＳリンカーおよびトロンビン開裂部位が挿入されたアルブミンおよびＬＲＰ結合部位の継目を示す。
【配列表】
2004236661000001.app