【手続補正書】
【提出日】平成26年6月10日(2014.6.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＬＣＬＲＰ（配列番号１）；
ＬＣＬＲＰＶＧ（配列番号２）；
ＬＣＬＲＰＶＧＡＥＳＲＧＲＰＶ（配列番号９０）；
ＬＣＬＲＰＶＧＡＥＳＲＧＲＰＶＳＧＰＦＧ（配列番号６）；
ＬＣＬＲＰＶＧＡＥＳＲＧＲＰＶＳＧＰＦ（配列番号７１）；
ＬＣＬＲＰＶＧＡＥＳＲＧＲＰＶＳＧＰ（配列番号７０）；
ＬＣＬＲＰＶＧＡＥＳＲＧＲＰＶＳＧ（配列番号６９）；
ＬＣＬＲＰＶＧＡＥＳＲＧＲＰＶＳ（配列番号６８）；
ＬＣＬＲＰＶＧＡＥＳＲＧＲＰＶ（配列番号６７）；
ＬＣＬＲＰＶＧＡＥＳＲＧＲＰ（配列番号６６）；
ＬＣＬＲＰＶＧＡＥＳＲＧ（配列番号６５）；
ＬＣＬＲＰＶＧＡＥＲ（配列番号６４）；
ＭＡＡＲＬＣＣＱＬＤＰＡＲＤＶＬＣＬＲＰ（配列番号３）；および
それらの機能的に同等な変異体からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する第１セグメントと；任意選択により、単離されたペプチドが融合ペプチドとなるように前記第１セグメントに結合し、１種または複数の異種性アミノ酸を含む第２セグメントとからなる単離されたペプチド。
【請求項２】
Ｂ型肝炎ウイルスのＸタンパク質の全長配列からなるペプチドおよびアミノ酸配列ＭＡＡＲＶＣＣＱＬからなるペプチドを除く、アミノ酸配列ＭＡＡＲＬＣＣＱ（配列番号７）を含む単離されたペプチドまたはその機能的に同等な変異体。
【請求項３】
そのＣ末端に、天然Ｘタンパク質のアミノ酸９〜３５のうちの１個または複数の連続的なアミノ酸をさらに含む、請求項２に記載の単離されたペプチド。
【請求項４】
アミノ酸配列ＭＡＡＲＬＣＣＱＬＤＰＡＲＤＶ（配列番号８）を含む請求項３に記載の単離されたペプチドまたはその機能的に同等な変異体。
【請求項５】
アミノ酸配列がＭＡＡＲＬＣＣＱ（配列番号７）またはＭＡＡＲＬＣＣＱＬＤＰＡＲＤＶ（配列番号８）である、請求項２に記載の単離されたペプチド。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のペプチドまたは機能的に同等な変異体をコードする単離された核酸、または前記核酸を含むベクター。
【請求項７】
アミノ酸配列ＬＣＬＲＰ（配列番号１）もしくはアミノ酸配列ＭＡＡＲＬＣＣＱ（配列番号７）を含むペプチド、またはそのいずれか１個の機能的に同等な変異体と、細胞に送達することが望まれる化合物とを含む構造体。
【請求項８】
前記化合物が、核酸、ペプチド核酸、ポリペプチド、炭化水素、ペプチド模倣体、低分子阻害剤、プロテオグリカン、脂質、リポタンパク質、糖脂質、天然生成物または糖模倣体である、請求項７に記載の構造体。
【請求項９】
前記化合物が、アミノ酸配列ＬＶＲＳＰＡＰＣＫＦＦＴＳＡ（配列番号９）もしくはその機能的に同等な変異体、ＫＬＶＲＳＰＡＰＣＫＦＦＴＳＡ（配列番号１０）もしくはその機能的に同等な変異体、ＨＫＬＶＲＳＰＡＰＣＫＦＦＴＳＡ（配列番号１１）もしくはその機能的に同等な変異体、ＲＨＫＬＶＲＳＰＡＰＣＫＦＦＴＳＡ（配列番号１２）もしくはその機能的に同等な変異体、またはＧＧＣＲＨＫＬＶＲＳＰＡＰＣＫＦＦＴＳＡ（配列番号９１）もしくはその機能的に同等な変異体を含むペプチドである、請求項８に記載の構造体。
【請求項１０】
前記化合物が、ＭＬＡＰＹＩＰＭ（配列番号１３）またはその機能的に同等な変異体である、請求項８に記載の構造体。
【請求項１１】
請求項７〜１０のいずれか１項に記載の構造体をコードする核酸、または前記核酸を含むベクター。
【請求項１２】
アミノ酸配列ＬＣＬＲＰ（配列番号１）もしくはアミノ酸配列ＭＡＡＲＬＣＣＱ（配列番号７）を含むペプチド、またはその機能的に同等な変異体を化合物に結合するステップを含む、化合物の細胞膜透過性を増加させる方法。
【請求項１３】
請求項７〜１０のいずれか１項に記載の構造体または請求項１１に記載の核酸もしくはベクターのうちの少なくとも１つを、細胞または前記細胞を含む組成物に接触させるステップを含む、化合物を細胞中に送達するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏの方法（但し、医療行為を含む方法を除く。）。
【請求項１４】
請求項７〜１０のいずれか１項に記載の構造体または請求項１１に記載の核酸もしくはベクターのうちの少なくとも１つを含む、化合物を細胞内に送達するための治療用もしくは診断用薬剤または実験用試薬。
【請求項１５】
請求項７〜１０のいずれか１項に記載の構造体または請求項１１に記載の核酸もしくはベクターのうちの少なくとも１つを、細胞の混合集団または細胞の混合集団を含む組成物に接触させるステップを含む、接着細胞および非接着細胞の混合集団中の接着細胞への化合物の送達を標的化するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏの方法（但し、医療行為を含む方法を除く。）。
【請求項１６】
請求項７〜１０のいずれか１項に記載の構造体または請求項１１に記載の核酸もしくはベクターのうちの少なくとも１つを含む、接着細胞および非接着細胞の混合集団中の接着細胞への化合物の送達を標的化するための治療用もしくは診断用薬剤または実験用試薬。
【請求項１７】
請求項６または１１に記載の単離された核酸を含む宿主細胞。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３２】
一実施形態では、化合物は、アミノ酸配列ＬＶＲＳＰＡＰＣＫＦＦＴＳＡ（配列番号９）を含むペプチドまたはその機能的に同等な変異体である。他の実施形態では、化合物は、アミノ酸配列ＫＬＶＲＳＰＡＰＣＫＦＦＴＳＡ（配列番号１０）、ＨＫＬＶＲＳＰＡＰＣＫＦＦＴＳＡ（配列番号１１）、ＲＨＫＬＶＲＳＰＡＰＣＫＦＦＴＳＡ（配列番号１２）もしくはＧＧＣＲＨＫＬＶＲＳＰＡＰＣＫＦＦＴＳＡ（配列番号９１）を含むペプチド、またはその機能的に同等な変異体である。別の実施形態では、化合物は、ＨＩＦ１αの酸素依存的分解（ＯＤＤ）ドメイン（ＭＬＡＰＹＩＰＭ）（配列番号１３）またはその機能的に同等な変異体である。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８３】
【図１】Ｘタンパク質を発現するよう形質移入したＨｅｐＧ２細胞の核抽出物のウエスタンブロット解析を示す図である。ＨｅｐＧ２細胞を、形質移入しないままにした（１レーン）、またはｐＣＤＮＡ３．１−ＨＢＸ（２レーン）、ｐＣＤＮＡ３−ＨＢＸ−Ｍｙｃ（３レーン）およびｐＣＤＮＡ３−ＧＦＰ（４レーン）を形質移入した。膜を、マウス抗ヒトＸタンパク質一次抗体（１：２００希釈）、引き続いて、二次ヤギ抗マウスＨＲＰ抱合型抗体（１：１００００希釈）でプローブした。全長２１ｋＤａおよび切断型１７ｋＤａ  Ｘタンパク質バンドの位置を右側欄外に示す。
【図２】ペプチド１６〜３５が、Ｘタンパク質Ｎ末端ペプチド１〜５０に結合することを示す図である。ペプチド１〜５０でコーティングしたプレートに結合したａａ１〜５０を含む短鎖ＦＩＴＣ抱合型ペプチドにより発せられた蛍光を図示した。４０μｇ／ｍｌでペプチド１６〜３５を含むウェルはより強い蛍光をもたらし、これはペプチド１６〜３５がペプチド１〜５０に結合している証拠であった。
【図３】ペプチド１６〜３５より短いペプチドはペプチド１〜５０に結合できないことを示す図である。ペプチド１６〜３５に基づく短鎖ペプチドを使用した蛍光レベルにより示されるリガンド結合のグラフである。短縮ペプチドにより得られる結合は、親ペプチド１６〜３５で見られる結合と比較し得なかった。
【図４】ＨＩＦ−１αのＯＤＤに融合したペプチド１６〜３５はペプチド１〜５０に結合することを示す図である。このグラフは、ペプチド１６〜３５が標的化ペプチドの前または端のいずれかに位置する２種のＸタンパク質−ＯＤＤ融合ペプチドの結合を示している。親ペプチド１６〜３５および非結合ペプチド２１〜４０をそれぞれ陽性および陰性対照として含めた。
【図５】Ｘタンパク質を発現するよう形質移入し、Ｘタンパク質−ＯＤＤ融合ペプチドで処理したＨｅｐＧ２細胞の核コンパートメントのウエスタンブロット解析を示す図である。ＨｅｐＧ２細胞を、形質移入しないままにした（１レーン）、またはｐＣＤＮＡ３．１−ＨＢＸ（２、５および８レーン）、ｐＣＤＮＡ３−ＨＢＸ−Ｍｙｃ（３、６および９レーン）およびｐＣＤＮＡ３−ＧＦＰ（４、７および１０レーン）を形質移入した。形質移入体を、未処理のままにした（１レーン）、または前（５〜７レーン）もしくは端（８〜１０レーン）でＯＤＤタグを有するＸタンパク質−ＯＤＤ融合ペプチドで処理した。全長２１ｋＤａおよび切断型１７ｋＤａ  Ｘタンパク質バンドの位置を左側欄外に示す。Ｘタンパク質−ＯＤＤ融合ペプチドは、Ｘタンパク質を分解した。
【図６】Ｘタンパク質を発現するよう形質移入し、Ｘタンパク質オリゴマー形成不安定性ドメイン融合ペプチドで処理したＨｅｐＧ２細胞の核分画のウエスタンブロット解析を示す図である。ＨｅｐＧ２細胞を、形質移入しないままにした（１レーン）、またはｐＣＤＮＡ３．１−ＨＢＸ（２、５および８レーン）、ｐＣＤＮＡ３−ＨＢＸ−Ｍｙｃ（３、６および９レーン）およびｐＣＤＮＡ３−ＧＦＰ（４、７および１０レーン）を形質移入した。形質移入体を、未処理のままにした（１レーン）、または前（５〜７レーン）もしくは端（８〜１０レーン）で不安定性ドメインを有するＸタンパク質オリゴマー形成不安定性ドメイン融合ペプチドで処理した。全長２１ｋＤａおよび切断型１７ｋＤａ  Ｘタンパク質バンドの位置を左側欄外に示す。Ｘタンパク質オリゴマー形成不安定性ドメイン融合ペプチドは、Ｘタンパク質を分解した。
【図７】オリゴマー形成ドメインペプチド（ａａ１６〜３５）は、ＨｅｐＧ２細胞の切断型Ｘタンパク質媒介性アポトーシスを阻害することを示す図である。ＨｅｐＧ２細胞を、ｐＣＤＮＡ３．１−ＨＢＸプラスミドの形質移入により切断型Ｘタンパク質を発現するよう操作した。形質移入の３時間後、３および２４時間後、または３、２４および４８時間後のいずれかに、Ｘタンパク質オリゴマー形成ペプチド（ａａ１６〜３５）を細胞に添加し、細胞を合計で５１時間培養した。対照形質移入体はペプチドで処理しなかった。細胞をアネキシンＶで染色してアポトーシスを記録し、ヨウ化プロピジウムで染色して壊死を記録し、ＤＡＰＩで染色して細胞核を可視化した。細胞の総数およびアポトーシスを起こした細胞の数、すなわち、アポトーシスを起こした細胞の割合を示すために、アネキシンＶおよびＤＡＰＩの結果を合併した。オリゴマー形成ドメインペプチド（ａａ１６〜３５）は、ＨｅｐＧ２細胞の切断型Ｘタンパク質媒介性アポトーシスを阻害した。
【図８】オリゴマー形成ドメインペプチド（ａａ１６〜３５）は、ＨｅｐＧ２細胞の全長Ｘタンパク質媒介性アポトーシスを阻害することを示す図である。ＨｅｐＧ２細胞を、ｐＣＤＮＡ３．１−ＨＢＸ  Ｍｙｃプラスミドの形質移入により全長Ｘタンパク質を発現するよう操作した。形質移入の３時間後、３および２４時間後、または３、２４および４８時間後のいずれかに、Ｘタンパク質オリゴマー形成ペプチド（ａａ１６〜３５）を細胞に添加し、細胞を合計で５１時間培養した。対照形質移入体はペプチドで処理しなかった。細胞をアネキシンＶで染色してアポトーシスを記録し、ヨウ化プロピジウムで染色して壊死を記録し、ＤＡＰＩで染色して核を可視化した。細胞の総数およびアポトーシスを起こした細胞の数、すなわち、アポトーシスを起こした細胞の割合を示すために、アネキシンＶおよびＤＡＰＩの結果を合併した。オリゴマー形成ドメインペプチド（ａａ１６〜３５）は、ＨｅｐＧ２細胞の全長Ｘタンパク質媒介性アポトーシスを阻害した。
【図９】対照ペプチド（ａａ１４０〜１５３）は、ＨｅｐＧ２細胞の切断型Ｘタンパク質媒介性アポトーシスを阻害しないことを示す図である。ＨｅｐＧ２細胞を、ｐＣＤＮＡ３．１−ＨＢＸプラスミドの形質移入により切断型Ｘタンパク質を発現するよう操作した。形質移入の３時間後、３および２４時間後、または３、２４および４８時間後のいずれかに、Ｘタンパク質対照ペプチド（ａａ１４０〜１５３）を細胞に添加し、細胞を合計で５１時間培養した。対照細胞はペプチドで処理しなかった。細胞をアネキシンＶで染色してアポトーシスを記録し、ヨウ化プロピジウムで染色して壊死を記録し、ＤＡＰＩで染色して核を可視化した。細胞の総数およびアポトーシスを起こした細胞の数、すなわち、アポトーシスを起こした細胞の割合を示すために、アネキシンＶおよびＤＡＰＩの結果を合併した。対照ペプチド（ａａ１４０〜１５３）は、ＨｅｐＧ２細胞の切断型Ｘタンパク質媒介性アポトーシスを阻害しなかった。
【図１０】対照ペプチド（ａａ１４０〜１５３）は、ＨｅｐＧ２細胞の全長Ｘタンパク質媒介性アポトーシスを阻害しないことを示す図である。ＨｅｐＧ２細胞を、ｐＣＤＮＡ３．１−ＨＢＸ  Ｍｙｃプラスミドの形質移入により全長Ｘタンパク質を発現するよう操作した。形質移入の３時間後、３および２４時間後、または３、２４および４８時間後のいずれかに、Ｘタンパク質対照ペプチド（ａａ１４０〜１５３）を細胞に添加し、細胞を合計で５１時間培養した。対照細胞はペプチドで処理しなかった。細胞をアネキシンＶで染色してアポトーシスを記録し、ヨウ化プロピジウムで染色して壊死を記録し、ＤＡＰＩで染色して核を可視化した。細胞の総数およびアポトーシスを起こした細胞の数、すなわち、アポトーシスを起こした細胞の割合を示すために、アネキシンＶおよびＤＡＰＩの結果を合併した。対照ペプチド（ａａ１４０〜１５３）は、ＨｅｐＧ２細胞の全長Ｘタンパク質媒介性アポトーシスを阻害しなかった。
【図１１】オリゴマー形成ドメインペプチド（ａａ１６〜３５）によるＸタンパク質の三次構造の破壊を示す図である。ＨｅｐＧ２細胞に、ｐＣＤＮＡ３．１−ＨＢＸ（１および４レーン）、ｐＣＤＮＡ３−ＨＢＸ−Ｍｙｃ（２および５レーン）またはｐＣＤＮＡ３−ＧＦＰ（３および６レーン）プラスミドを形質移入し、未処理のままにした（１〜３レーン）、またはオリゴマー形成ドメインペプチド（ａａ１６〜３５）で４８時間にわたって３回処理した（４〜６レーン）。核細分画を非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、マウス抗ヒトＸタンパク質一次抗体を用いてウエスタンブロット解析した。分子量マーカーを左側欄外に示す。
【図１２】ペプチドａａ１〜２０および１６〜３５は細胞透過性であることを示す図である。Ｘタンパク質のＮ末端領域からのａａ１〜２０、１６〜３５、２１〜４０および３４〜５３を含む４種のＦＩＴＣ標識化ペプチドをＨｅｐＧ２細胞と共にインキュベートし、細胞によるその取り込みをＮｉｋｏｎ  Ｅ６００蛍光顕微鏡を使用して記録した。細胞核をＤＡＰＩで染色した。
【図１３】共焦点顕微鏡がペプチドａａ１〜２０および１６〜３５は細胞透過性であることを確認することを示す図である。Ｘタンパク質からのａａ１〜２０、１６〜３５、２１〜４０および３４〜５３を含む４種のＦＩＴＣ標識化ペプチドをＨｅｐＧ２細胞と共にインキュベートし、細胞によるその取り込みをＬｅｉｃａ  ＴＣＳ−ＳＰ２共焦点顕微鏡を使用して記録した。細胞核をＤＡＰＩで染色した。
【図１４】細胞の共焦点型スライシングが、ペプチドａａ１６〜３５が細胞質および核に取り込まれることを明らかにしていることを示す図である。ＦＩＴＣ標識化ペプチドａａ１６〜３５をＨｅｐＧ２細胞と共にインキュベートし、細胞によるその取り込みをＬｅｉｃａ  ＴＣＳ−ＳＰ２共焦点顕微鏡を使用して記録した。細胞の複数の光学的スライス像を細胞の下から上まで取った。細胞核をＤＡＰＩで染色した。
【図１５】ペプチドａａ１６〜３５由来の短鎖ペプチドａａ１６〜２６、１６〜２４および１６〜２２も細胞透過性であることを示す図である。ＦＩＴＣ標識化ペプチドａａ１６〜２６、１６〜２４および１６〜２２をＨｅｐＧ２細胞と共にインキュベートし、細胞によるその取り込みをＮｉｋｏｎ  Ｅ６００蛍光顕微鏡を使用して記録した。細胞核をＤＡＰＩで染色した。
【図１６】共焦点顕微鏡がペプチドａａ１６〜２６、１６〜２４および１６〜２２が細胞透過性であることを確認することを示す図である。ＦＩＴＣ標識化ペプチドａａ１６〜２６、１６〜２４および１６〜２２をＨｅｐＧ２細胞と共にインキュベートし、細胞によるその取り込みをＬｅｉｃａ  ＴＣＳ−ＳＰ２共焦点顕微鏡を使用して記録した。細胞核をＤＡＰＩで染色した。
【図１７】細胞の共焦点型スライシングが、ペプチドａａ１６〜２２が細胞質および核に取り込まれることを明らかにしていることを示す図である。ＦＩＴＣ標識化ペプチドａａ１６〜２２をＨｅｐＧ２細胞と共にインキュベートし、細胞によるその取り込みをＬｅｉｃａ  ＴＣＳ−ＳＰ２共焦点顕微鏡を使用して記録した。細胞の複数の光学的スライス像を細胞の下から上まで取った。細胞核をＤＡＰＩで染色した。
【図１８】Ｘタンパク質ペプチドａａ１６〜２２、１６〜３５のＨｅｐＧ２細胞への侵入がヘパリン結合に依存することを示す図である。ＨｅｐＧ２細胞を５μｇ／ｍｌサイトカラシンＤおよび２μｇ／ｍｌヘパリンで前処理し、次いで、ＦＩＴＣ標識化細胞透過性ペプチドａａ１６〜２２および１６〜３５と共に３時間インキュベートした。細胞によるペプチド取り込みをＮｉｋｏｎ  Ｅ６００蛍光顕微鏡を使用して記録した。細胞核をＤＡＰＩで染色した。細胞の総数と比較したＦＩＴＣ標識化ペプチドを取り込んだ細胞の数、すなわち、ペプチドを取り込んだ細胞の割合を示すために結果を合併した。
【図１９】短鎖ペプチドａａ１〜１５および１６〜２０も細胞透過性であることを示す図である。ＦＩＴＣ標識化ペプチドａａ１〜１５、１６〜２０および１６〜２２をＨｅｐＧ２細胞と共にインキュベートし、細胞によるその取り込みをＮｉｋｏｎ  Ｅ６００蛍光顕微鏡を使用して記録した。細胞核をＤＡＰＩで染色した。細胞の総数と比較したＦＩＴＣ標識化ペプチドを取り込んだ細胞の数、すなわち、ペプチドを取り込んだ細胞の割合を示すために結果を合併した。短鎖ペプチドａａ１〜１５および１６〜２０は細胞透過性である。
【図２０】共焦点顕微鏡検査が短鎖ペプチドａａ１〜１５、１６〜２０および１６〜２２は細胞透過性であることを確認することを示す図である。ＦＩＴＣ標識化ペプチドａａ１〜１５、１６〜２０および１６〜２２をＨｅｐＧ２細胞と共にインキュベートし、細胞によるその取り込みをＬｅｉｃａ  ＴＣＳ−ＳＰ２共焦点顕微鏡を使用して記録した（上のパネル）。細胞の共焦点型スライシングは、ペプチドａａ１〜１５および１６〜２２が細胞質および核に取り込まれることを明らかにしている。細胞の複数の光学的スライス像を細胞の下から上まで取った。細胞核をＤＡＰＩで染色した。
【図２１】短鎖ペプチドａａ１〜８が細胞透過性であることを示す図である。ＦＩＴＣ標識化ペプチドａａ１〜８およびａａ９〜１５をＨｅｐＧ２細胞と共にインキュベートし、細胞によるその取り込みをＮｉｋｏｎ  Ｅ６００蛍光顕微鏡を使用して記録した。細胞核をＤＡＰＩで染色した。細胞の総数と比較したＦＩＴＣ標識化ペプチドを取り込んだ細胞の数、すなわち、ペプチドを取り込んだ細胞の割合を示すために結果を合併した。短鎖ペプチドａａ１〜８は細胞透過性である。
【図２２】Ｘタンパク質細胞透過性ペプチド１６〜２２は、ＨｅｐＧ２、Ｃ３２およびＤＵ１４５細胞株に侵入することができるが、非接着性細胞株ＴＫ１に侵入することはできないことを示す図である。接着ＨｅｐＧ２、Ｃ３２およびＤＵ１４５細胞株、ならびに非接着性細胞株ＴＫ１をフルオレセイン化（ＦＩＴＣ標識化）Ｘタンパク質細胞透過性ペプチド１６〜２２と共に３時間インキュベートし、蛍光顕微鏡検査により可視化した。細胞核をＤＡＰＩで染色した。細胞の総数と比較したＦＩＴＣ化標識ペプチドを取り込んだ細胞の数、すなわち、ペプチドを取り込んだ細胞の割合を示すために結果を合併した。Ｘタンパク質細胞透過性ペプチド１６〜２２は、ＨｅｐＧ２、Ｃ３２およびＤＵ１４５細胞株に侵入することができたが、非接着細胞株ＴＫ１に侵入することはできなかった。
【図２３】Ｘタンパク質細胞透過性ペプチド１６〜２２は、Ｈ４４１、ＣＯＳ−７、ＣＯＳ−１およびＲｉｎｍ５ｆ細胞株にあまり効率的に取り込まれないことを示す図である。接着性Ｈ４４１、ＣＯＳ−７、ＣＯＳ−１およびＲｉｎｍ５ｆ細胞株をＦＩＴＣ標識化Ｘタンパク質細胞透過性ペプチド１６〜２２と共に３時間インキュベートし、蛍光顕微鏡検査により可視化した。細胞核をＤＡＰＩで染色した。細胞の総数と比較したＦＩＴＣ標識ペプチドを取り込んだ細胞の数、すなわち、ペプチドを取り込んだ細胞の割合を示すために結果を合併した。Ｘタンパク質細胞透過性ペプチド１６〜２２は、Ｈ４４１、ＣＯＳ−７、ＣＯＳ−１およびＲｉｎｍ５ｆ細胞株にあまり効率的に取り込まれなかった。
【図２４】Ｘタンパク質細胞透過性ペプチド１６〜２２は、非接着性末梢血単核細胞に侵入することができないことを示す図である。末梢血単核細胞をＦＩＴＣ標識化細胞透過性ペプチド１６〜２２と共に８つのチャンバースライド中で３時間インキュベートし、蛍光顕微鏡検査で調べた（下のパネル）。細胞核をＤＡＰＩで染色した（上のパネル）。３つの異なる領域を表す。
【図２５】Ｘタンパク質細胞透過性ペプチド１６〜２２は、接着性単球および潜在的接着性血小板に侵入することができることを示す図である。末梢血単核細胞をＦＩＴＣ標識化細胞透過性ペプチド１６〜２２と共に８つのチャンバースライド中で３時間インキュベートし、蛍光顕微鏡検査で視覚化した（中央のパネル）。細胞核をＤＡＰＩで染色した（上のパネル）。スライドを媒体で洗浄して非接着細胞を除去した。２つの異なる領域を表す。核に関してＦＩＴＣ標識化ペプチドの分布を示すために画像を合併した（下のパネル）。ペプチドを取り込んだ細胞を矢印で示す。小さい蛍光点はペプチドを取り込んだ接着性血小板を表し得る。
【図２６】Ｘタンパク質細胞透過性ペプチド１６〜２２は、非接着性赤血球および血小板に侵入しないことを示す図である。血液をフィンガープリックにより採取し、１０ｍＭクエン酸緩衝液に懸濁し、ＦＩＴＣ標識化１６〜２２ペプチドと共にインキュベートし、ガラススライド上に血液塗抹を調製した。細胞を光学顕微鏡検査（上のパネル）および蛍光顕微鏡検査（下のパネル）で調べた。
【図２７】接着性ＴＫ１  Ｔ細胞は、Ｘタンパク質細胞透過性ペプチド１６〜２２を取り込むことを示す図である。ＴＫ１細胞をＭＡｄＣＡＭ−１コーティングしたガラススライド（左側のパネル）またはスライドに直接（右側のパネル）接着させ、ＦＩＴＣ標識化Ｘタンパク質細胞透過性ペプチド１６〜２２と共にインキュベートした。細胞核をＤＡＰＩで染色した。２つの領域を表す。細胞の総数と比較したＦＩＴＣ標識化ペプチドを取り込んだ細胞の数、すなわち、ペプチドを取り込んだ細胞の割合を示すために結果を合併した。接着性ＴＫ１  Ｔ細胞は、Ｘタンパク質細胞透過性ペプチド１６〜２２を取り込んだ。
【図２８】Ｘタンパク質細胞透過性ペプチド１６〜２２は、外来性ペプチドを細胞中に輸送することができることを示す図である。ＨＢＳＳ緩衝液中２ｍＭ  Ｍｎ＋＋で活性化したＴＫ１細胞を、ＭＡｄＣＡＭ−１コーティングした８ウェルガラスチャンバースライドに付着させた。ビオチン化Ｒ９ＹＤＲＲＥＹ（配列番号１４）およびＬＣＬＲＰＶＧＧＹＤＲＲＥＹ（配列番号１５）ペプチドを５０μＭで添加し、３０分後、細胞を洗浄して解析した。細胞をストレプトアビジン−ＦＩＴＣで染色し、核をＤＡＰＩで染色した。ＹＤＲＲＥＹ（配列番号１６）ペプチドは外来性であり、β７インテグリンの細胞質ドメインに由来する。
【図２９】ペプチドａａ１６〜２２は、ウサギＩｇＧをＨｅｐＧ２細胞中に輸送することを示す図である。ポリグルタミン伸長（ビオチン−ＬＣＬＲＰＶＧＧＧＲＲＲＱＱＱＱＱＱＲＲＲ）（配列番号１７）に融合したＸタンパク質細胞透過性ペプチドＬＣＬＲＰＶＧ（配列番号２）を、トランスグルタミナーゼを使用して、ＦＩＴＣ標識化ウサギＩｇＧに抱合した。ペプチド−ウサギＩｇＧ抱合体、ペプチドおよびＦＩＴＣ標識化ウサギＩｇＧをＨｅｐＧ２細胞に添加し、ＦＩＴＣ標識化ウサギＩｇＧ積荷の細胞取り込みを蛍光顕微鏡検査により評価した。細胞核をＤＡＰＩで染色した。細胞の総数と比較したＦＩＴＣ標識化ウサギＩｇＧを取り込んだ細胞の数、すなわち、抗体を取り込んだ細胞の割合を示すために結果を合併した。ペプチドａａ１６〜２２は、ウサギＩｇＧをＨｅｐＧ２細胞中に輸送した。
【図３０Ａ】ペプチドａａ１６〜２２は、１８ｍｅｒオリゴヌクレオチドをＨｅｐＧ２細胞中に輸送することを示す図である。ポリグルタミン伸長（ビオチン−ＬＣＬＲＰＶＧＧＧＲＲＲＱＱＱＱＱＱＲＲＲ）（配列番号１７）に融合したＸタンパク質細胞透過性ペプチドＬＣＬＲＰＶＧ（配列番号２）を、トランスグルタミナーゼを使用して、５’−アミノ基を含むＴｅｘ６１５標識化１８ｍｅｒオリゴヌクレオチド５ＡｍＭＣ１２−ＧＡＧＣＴＧＣＡＣＧＣＴＧＣＣＧＴＣ（配列番号１８）に抱合した。ペプチド−１８ｍｅｒオリゴ抱合体をＨｅｐＧ２細胞に添加し、その取り込みを３０分、３時間および２４時間後に蛍光顕微鏡検査により評価した（Ａ）。抱合型オリゴの取り込みを３時間後に評価した（Ｂ）。１８ｍｅｒオリゴを、２．３、４．５および８．７μＭオリゴで、１０μＭ担体に抱合し、０．１４、０．３および０．６μＭの溶液中オリゴ最終濃度を得た（図３０Ｂ）。細胞核をＤＡＰＩで染色した。細胞の総数と比較したＴｅｘ６１５標識化オリゴヌクレオチドを取り込んだ細胞の数、すなわち、オリゴヌクレオチドを取り込んだ細胞の割合を示すために結果を合併した。ペプチドａａ１６〜２２は、１８ｍｅｒオリゴヌクレオチドをＨｅｐＧ２細胞中に輸送した。
【図３０Ｂ】ペプチドａａ１６〜２２は、１８ｍｅｒオリゴヌクレオチドをＨｅｐＧ２細胞中に輸送することを示す図である。ポリグルタミン伸長（ビオチン−ＬＣＬＲＰＶＧＧＧＲＲＲＱＱＱＱＱＱＲＲＲ）（配列番号１７）に融合したＸタンパク質細胞透過性ペプチドＬＣＬＲＰＶＧ（配列番号２）を、トランスグルタミナーゼを使用して、５’−アミノ基を含むＴｅｘ６１５標識化１８ｍｅｒオリゴヌクレオチド５ＡｍＭＣ１２−ＧＡＧＣＴＧＣＡＣＧＣＴＧＣＣＧＴＣ（配列番号１８）に抱合した。ペプチド−１８ｍｅｒオリゴ抱合体をＨｅｐＧ２細胞に添加し、その取り込みを３０分、３時間および２４時間後に蛍光顕微鏡検査により評価した（Ａ）。抱合型オリゴの取り込みを３時間後に評価した（Ｂ）。１８ｍｅｒオリゴを、２．３、４．５および８．７μＭオリゴで、１０μＭ担体に抱合し、０．１４、０．３および０．６μＭの溶液中オリゴ最終濃度を得た（図３０Ｂ）。細胞核をＤＡＰＩで染色した。細胞の総数と比較したＴｅｘ６１５標識化オリゴヌクレオチドを取り込んだ細胞の数、すなわち、オリゴヌクレオチドを取り込んだ細胞の割合を示すために結果を合併した。ペプチドａａ１６〜２２は、１８ｍｅｒオリゴヌクレオチドをＨｅｐＧ２細胞中に輸送した。
【図３１】Ｂ−Ｒａｆ標的化ペプチドが、黒色腫細胞を死滅させることを示す図である。Ｂ−Ｒａｆ二量体形成ドメインに融合したポリＡｒｇ８担体ペプチドを含むＢ−Ｒａｆ  Ｘタンパク質融合ペプチド（ビオチン−ＲＲＲＲＲＲＲＲＨＫＬＶＲＳＰＡＰＣＫＦＦＴＳＡＧＧＬＮＶＴＡＰＴＰＱＱＬＱＡＦＫＮＥＶＧＶＬＲＫ）（配列番号１９）、およびＸタンパク質不安定性ドメインをＣ３２およびＷＭ−２６６−４黒色腫細胞に添加して、それぞれ１０μＭおよび２０μＭの最終濃度にし、引き続いて、３７℃で３時間インキュベートした。細胞を、アポトーシスを引き起こさない対照細胞透過性ペプチド  ビオチン−ＲＲＲＲＲＲＲＲＭＡＡＲＬＣＣＱＬＤＰＡＲＤＶＬＣＬＲＰ（配列番号２０）と共にインキュベートした。アネキシンＶ  ｆｌｕｏｓで細胞を染色することにより、細胞のアポトーシスを検出した。核をＤＡＰＩで染色した。Ｂ−Ｒａｆ標的化ペプチドにより死滅させられた細胞の割合を示すために、アネキシンＶおよびＤＡＰＩの結果を合併した。Ｂ−Ｒａｆ標的化ペプチドは、黒色腫細胞を死滅させた。
【図３２】ペプチド１６〜３０が、Ｘタンパク質Ｎ末端ペプチド１〜５０に結合することを示す図である。ペプチド１〜５０コーティングしたプレートに結合した短鎖ＦＩＴＣ抱合型Ｘタンパク質ペプチドａａ１６〜３０、２０〜３５および１６〜３５により発せられる蛍光を図示した。１０、２０および４０μｇ／ｍｌでペプチド１６〜３０を含むウェルはより強い蛍光をもたらし、これはペプチド１６〜３０がペプチド１〜５０に結合している証拠であった。ＡおよびＢは反復実験である。
【図３３】Ｘタンパク質ａａ１６〜２２担体ペプチドによりＷＭ−２６６−４黒色腫細胞中に輸送されたポリクローナル抗Ｂ−ｒａｆ抗体は細胞にアポトーシスを起こさせることを示す図である。ポリグルタミン伸長（ビオチン−ＬＣＬＲＰＶＧＧＧＲＲＲＱＱＱＱＱＱＲＲＲ）（配列番号１７）に融合したＸタンパク質細胞透過性ペプチドＬＣＬＲＰＶＧ（配列番号２）を、トランスグルタミナーゼを使用して、ポリクローナルウサギ抗ヒトＢ−ｒａｆ抗体（ＨＰＡ００１３２８；Ｓｉｇｍａ）に抱合した。担体ペプチド−ウサギ抗Ｂ−ｒａｆ抗体抱合体（１μｇ／ｍｌ）、非抱合型担体ペプチドおよび非抱合型抗Ｂ−ｒａｆ抗体（１μｇ／ｍｌ）をＷＭ−２６６−４黒色腫細胞に添加し、アネキシンＶ  ｆｌｕｏｓを添加して３時間後に細胞アポトーシスを評価し、蛍光顕微鏡検査により視覚化した。未処理細胞を追加の対照として含ませた。細胞核をＤＡＰＩで染色した。細胞の総数と比較したアポトーシスを起こした細胞の数、すなわち、アポトーシスを起こした細胞の割合を示すために結果を合併した。Ｘタンパク質担体ペプチドにより黒色腫細胞中に輸送されたポリクローナル抗Ｂ−ｒａｆ抗体は細胞にアポトーシスを起こさせた。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９３】
当業者は、本明細書の情報および他の公開された配列情報に鑑みて、天然Ｘタンパク質の位置１〜３５のアミノ酸を容易に認識するだろう。例として、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｙ１８８５７もまた代表的な配列情報を提供している。さらに、Ｇｕｎｔｈｅｒ  Ｓ、Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｌ、Ｐｕｌｔ  Ｉ、Ｓｔｅｒｎｅｃｋ  Ｍ、Ｗｉｌｌ  Ｈ．Ｎａｔｕｒａｌｌｙ  ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ  ｖａｒｉａｎｔｓ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｖｉｒｕｓ．Ａｄｖ  Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．１９９９；５２：２５〜１３７は、いくつかのＸタンパク質についての配列情報を提供している。さらに、有用な配列情報の例を以下の表１に提供する。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０１】
当業者は、本明細書に含まれる情報に基づいて、および当技術分野で既知の技術を使用して、所望の機能を容易に認識し、機能を評価して、本発明のペプチドまたはその機能的に同等な変異体の活性レベルを決定することができるだろう。しかしながら、例として、化合物を細胞に送達するためのペプチドの使用の場合、ペプチドまたは変異体は、細胞膜を横切り、好ましくは化合物を、細胞膜を横切って輸送し、細胞に入る能力を有するだろう、そしてこの機能および活性レベルは、例えば、後に本明細書の「実施例」の節に記載する技術を使用して、変異体（好ましくは、変異体を含む構造体）の細胞への取り込みに基づいて評価することができる。本明細書の他の実施形態（本明細書の他で記載する）では、本発明のペプチドが、Ｘタンパク質の拮抗薬として作用することが望ましい。このような場合、ペプチドまたはその機能的に同等な変異体は、Ｘタンパク質の機能を拮抗または攪乱する能力を有するだろう、そして、その機能およびその活性レベルは、例えば、後に本明細書の「実施例」の節に記載する技術を使用して、評価することができる。他の実施形態（本明細書の他で記載する）では、本発明のペプチドが、分解するためのタンパク質を標識し、好ましくはタンパク質分解を誘発することが望ましい。このような場合、ペプチドまたはその機能的に同等な変異体は、その後の分解のためにタンパク質を標識化する能力を有するだろう、そして、その機能およびその活性レベルは、標的タンパク質の性質に鑑みて標準的な技術を使用して評価することができる。一実施形態では、後に本明細書の「実施例」の節に記載する技術を使用することができる。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０２】
本明細書で使用する場合、「保存的アミノ酸置換」は、類似の生化学的特性を有するアミノ酸の置換を意味するよう広義に解されるべきである。当業者は、アミノ酸側鎖置換基の類似性（例えば、そのサイズ、電荷、親水性、疎水性など）を含む、異なるアミノ酸間の相対的類似性に基づいて、適当な保存的アミノ酸置換を認識するだろう。例として、保存的置換には、ある脂肪族アミノ酸の別の脂肪族アミノ酸への置換、ヒドロキシルもしくは硫黄含有側鎖を有するアミノ酸のヒドロキシルもしくは硫黄含有側鎖を有する別のアミノ酸による置換、芳香族アミノ酸の別の芳香族アミノ酸による置換、塩基性アミノ酸の別の塩基性アミノ酸による置換、または酸性アミノ酸の別の酸性アミノ酸による置換が含まれる。例として、「保存的アミノ酸置換」には、
−グリシン、アラニン、バリン、ロイシンまたはイソロイシンの別のものへの置換、
−セリン、システイン、スレオニンまたはメチオニンの別のものへの置換、
−フェニルアラニン、チロシンまたはトリプトファンの別のものへの置換、
−ヒスチジン、リジンまたはアルギニンの別のものへの置換、
−アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギンまたはグルタミンの別のものへの置換
が含まれる。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６４】
本発明のこの実施形態のペプチドおよび構造体は、例えば、本発明の他の構造体について本明細書の他で記載した要素を含む、技術および追加の成分を使用して作ることができる。例えば、これらは、例えば、本明細書で前に記載したものを含む、追加の異種性分子およびリンカーを含んでよい。これらはまた、構造体が所望の細胞を特異的に標的化するのを可能にする分子を含んでもよい。例えば、黒色腫細胞を標的化することを望む場合、ＹＩＧＳＲ（ラミニンペンタペプチド）（配列番号９７）もしくはＡｃ−Ｎｌｅ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−ＮＨ２（α−メラニン形成細胞刺激ホルモン類似体）（配列番号９８）を含むまたはからなるペプチドを使用してよい。さらなる例として、構造体はまた、本発明の他の構造体について前に記載した、細胞透過性を補助することができる追加のモチーフまたは分子を含んでもよい。特定の一実施形態では、構造体は、ポリアルギニンペプチド（例えば、Ｒ４〜Ｒｎ）を含む。例として、一実施形態（Ｂ−ｒａｆの標的化に関連する）では、構造体は、Ｒ８を含み、アミノ酸配列：
ＲＲＲＲＲＲＲＲＨＫＬＶＲＳＰＡＰＣＫＦＦＴＳＡＧＧＬＮＶＴＡＰＴＰＱＱＬＱＡＦＫＮＥＶＧＶＬＲＫ（配列番号１９）
を含む。
構造体をコードする核酸および核酸ベクター
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７６】
別の実施形態では、本発明は、接着細胞および非接着細胞の混合集団中の接着細胞への化合物の送達を標的化する方法を提供する。「接着」細胞とは、基質、マトリックス、他の細胞または表面に付着している細胞を指す。「非接着」細胞とは、基質、マトリックス、他の細胞または表面に付着していない細胞（例えば、血液中の循環細胞）を指す。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１１】
ＨＩＦ−１のＯＤＤに基づきＸタンパク質を分解することができる新規なペプチドの作製
上記結果は、Ｘタンパク質オリゴマー形成ドメインがａａ１６〜３５を含むことを証明した。ＨＩＦ−１αの酸素依存的分解（ＯＤＤ）ドメインが付着する標的化ペプチドとしてペプチド１６〜３５を利用するアプローチを考案した。ペプチド１６〜３５を、合成中にＮおよびＣ末端で８ａａＯＤＤドメインに融合し、Ｒ８配列をＮ末端に付加してペプチドを細胞透過性にした。標的化Ｘタンパク質−ＯＤＤ融合ペプチドは、Ｘタンパク質発現細胞に入り、Ｘタンパク質のオリゴマー形成ドメインに結合し、ｐＶＨＬに認識され、ペプチドのユビキチン化および付着したＸタンパク質と一緒の分解がもたらされるだろうという理解であった。最初にＸタンパク質−ＯＤＤ融合ペプチドを試験して、これらがオリゴマー形成ペプチド１〜５０に結合することができるかどうかを決定した。これらは、ペプチド１６〜３５が標的化ペプチドの前に位置しているのか端に位置しているのかにかかわりなく、ペプチド１〜５０に結合することができた（図４）。驚くべきことに、これらは、親ペプチド１６〜３５よりも良くペプチド１〜５０に結合した。非結合ペプチド２１〜４０を陰性対照として使用したが、明らかにペプチド１〜５０に結合できなかった。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２２０】
Ｘタンパク質細胞透過性ペプチド１６〜２２は、いくつかの異なる接着細胞株に入ることができるが、非接着細胞株ＴＫ１に入ることはできない
Ｘタンパク質細胞透過性ペプチドａａ１６〜２２を、ヒトＣ３２黒色腫、ＤＵ１４５前立腺癌、ＴＫ１  Ｔ細胞リンパ種、Ｈ４４１肺癌、Ｒｉｎ−ｍ５ｆラット膵島腫瘍およびＣｏｓ−１／７ミドリザル腎細胞株を含む他の哺乳動物細胞株により取り込まれる能力について試験した。ＴＫ１細胞は、懸濁細胞であるが、他の全細胞は接着細胞である。細胞を、ＦＣＳの非存在下、細胞株に適した培地中で３時間、フルオレセイン化Ｘタンパク質細胞透過性ペプチド１６〜２２と共にインキュベートした。ＨｅｐＧ２細胞を陽性対照として使用した。Ｘタンパク質ペプチドは、細胞の型または供給源にかかわらず全ての接着細胞株に入ることができた（図２２および２３）。ＨｅｐＧ２、Ｃ３２およびＤＵ１４５細胞株は、ペプチドの効率的（９０％超細胞  陽性）取り込みを示し、ペプチドが細胞透過性であることを確認した（図２２）。対照的に、ペプチドは、Ｈ４４１、Ｃｏｓ−７、Ｃｏｓ−１およびＲｉｎ−ｍ５ｆ細胞株中にはあまり効率的に取り込まれなかった（６０〜７０％細胞  陽性）（図２３）。ペプチドは、懸濁細胞株ＴＫ１に入ることが完全にできなかった（図２２）。