【手続補正書】
【提出日】平成26年10月3日(2014.10.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、サンプル間の二基質蛋白質修飾酵素の活性の差を同定するための方法：
（ｉ）第１のサンプルを、前記酵素の非蛋白質性基質のｘの異なる濃度に暴露する工程、ここでｘは２であるかまたは２より大きい；
（ｉｉ）該非蛋白質性基質のｘの異なる濃度のそれぞれにおいて前記サンプルのポリペプチドの修飾を定量化する工程；
（ｉｉｉ）前記非蛋白質性基質についての前記酵素の親和性を決定する工程；
（ｉｖ）２番目のまたは次のサンプルについて工程（ｉ）から工程（ｉｉｉ）を繰り返す工程；および
（ｖ）前記サンプルの間の前記非蛋白質性基質に対する前記酵素の親和性を比較する工程；
ここで、サンプルの間の前記非蛋白質性基質に対する前記酵素の親和性における相違は、サンプルの間の前記酵素の活性の差を示している。
【請求項２】
前記サンプルが細胞溶解物である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
以下を含む、二基質蛋白質修飾酵素の生体内の基質を同定するための方法：
（ｉ）第１の基質のｘの異なる濃度に二基質蛋白質修飾酵素を露出する工程、
ここでｘは２または２より大きく、
第２の基質の濃度を一定とし、
第１および第２の基質の１つは前記酵素の非蛋白質性基質であり、他方がポリペプチドの混合物である；
（ｉｉ）前記第１の基質のｘの異なる濃度のそれぞれでポリペプチドの前記混合物中のポリペプチドの修飾を定量化する工程；および
（ｉｉｉ）前記第１の基質に対する前記酵素の親和性を決定する工程；
ここで、前記第１の基質に対する前記酵素の高親和性が、前記ペプチドが前記酵素の生体内の基質であることを示す。
【請求項４】
ポリペプチドの前記混合物が未消化タンパク質の混合物であり、好適には該未消化タンパクの前記混合物が、前記サンプル内の細胞を溶解して細胞溶解物を製造することによりサンプルから得られる、請求項３記載の方法。
【請求項５】
工程（ｉ）を行う前に低分子を前記細胞溶解物から除去し、好適にはサイズ排除ろ過で前記細胞溶解物から低分子を除去し、および／または工程（ｉ）を行う前に、前記細胞溶解物が脱リン酸化される、請求項４記載の方法。
【請求項６】
工程（ｉｉ）の前にサンプル又は該未消化タンパクの前記混合物から消化によりペプチド類の混合物を得る、請求項１から５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
ポリペプチドの前記混合物が、蛋白質の消化で得られたペプチド類の混合物であり、好適には消化がプロテアーゼを使用することで行われ、好適には該プロテアーゼがトリプシン、キモトリプシン、Ａｒｇ  Ｃ、ペプシン、Ｖ８、Ｌｙｓ−Ｃ、Ａｓｐ−Ｃ、およびＡｓｐＮかから成る群から選択される、請求項３記載の方法。
【請求項８】
該ペプチドの長さが５から３０アミノ酸である、請求項６または７記載の方法。
【請求項９】
前記ポリペプチドが工程（ｉｉ）の前に精製され、好適には前記ポリペプチドがクロマトグラフィーを使用することで精製され、好適にはクロマトグラフィーが固定された金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）、二酸化チタン粉末（ＴｉＯ２）クロマトグラフィー、および酸化ジルコニウム（ＺｒＯ２）クロマトグラフィーから成る群から選択される、請求項１から８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
（ａ）前記二基質蛋白質修飾酵素はプロテインキナーゼであり、前記非蛋白質性基質はＡＴＰであり、好適には前記プロテインキナーゼが組換体プロテインキナーゼであるか、または
（ｂ）前記二基質蛋白質修飾酵素は蛋白質アセチルトランスフェラーゼであり、前記非蛋白質性基質は、アセチル基を持っている化合物であるか、または
（ｃ）二基質蛋白質修飾酵素が蛋白質グリコシルトランスフェラーゼであり、該非蛋白質性基質が活性化ヌクレオチド糖であるか、または
（ｄ）前記二基質蛋白質修飾酵素は蛋白質メチルトランスフェラーゼであり、前記非蛋白質性基質はメチル基を有する化合物であるか、または
（ｅ）前記二基質蛋白質修飾酵素は蛋白質パルミトイルトランスフェラーゼであり、好適には前記非蛋白質性基質は脂質パルミトイルを含む化合物である、請求項１から９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
ｘが少なくとも３であり、好適にはｘは５である、請求項１から１０のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
工程（ｉｉ）が、以下の工程を含む方法を使用して行われる、請求項１から１１のいずれか１項記載の方法：
（ａ）ポリペプチド類に参照修飾ポリペプチドを追加し、ポリペプチド類と参照修飾ポリペプチドの混合物を生成する工程；
（ｂ）前記ポリペプチド類と参照修飾ポリペプチドの混合物について質量分析（ＭＳ）を行い、サンプル内のポリペプチド類に関するデータを得る工程；
および
（ｃ）サンプル内のポリペプチド類に関するデータと、修飾ポリペプチドに関するデータベース中のデータとを、コンピュータプログラムを使用して比較する工程；
ここで、修飾ポリペプチドに関するデータベースが、以下を含む方法によってコンパイルされる；
ｉ）サンプルからポリペプチド類を得ること；
ｉｉ）工程ｉで得られたポリペプチド類からの修飾ポリペプチドを富化すること；
ｉｉｉ）工程ｉｉで得られた富化された修飾ポリペプチドについて、液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）を行うこと；
ｉｖ）修飾ポリペプチドを同定するために、工程ｉｉｉで検出された修飾ポリペプチドを、公知のリファレンスデータベースと比較すること：および
ｖ）工程ｉｖで同定された修飾ポリペプチドに関連するデータを、データベースにコンパイルすること。
【請求項１３】
工程（ａ）がポリペプチド類と参照修飾ポリペプチドの混合物から修飾ポリペプチドを富化し、富化された修飾ポリペプチドの混合物を製造することをさらに含み、工程（ｂ）は、富化された修飾ポリペプチドの混合物に質量分析法（ＭＳ）を行い、サンプル中の変成ポリペプチド類に関連したデータを得ることを含み、好適には変性ポリペプチドを富化する工程が、クロマトグラフィーを使用することで行われ、好適にはクロマトグラフィーが固定された金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）、二酸化チタン粉末（ＴｉＯ２）クロマトグラフィー、および酸化ジルコニウム（ＺｒＯ２）クロマトグラフィーから成る群から選択されるか、または変成ポリペプチドの富化工程が抗体ベースの方法を使用することで行われる、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
（ａ）サンプル内のポリペプチドに関連するデータが、質量／電荷（ｍ／ｚ）比、電荷（ｚ）、およびポリペプチドの相対保持時間から選択される；および／または
（ｂ）  前記工程（ｂ）における前記質量分析法（ＭＳ）は液体クロマトグラフィー−質量分析法（ＬＣ−ＭＳ）である；および／または
（ｃ）  前記工程ｉｉが、多次元クロマトグラフィーまたは抗体ベースの方法を使用することで行われる；および／または
（ｄ）  前記工程ｉｖが、ＭＡＳＣＯＴサーチエンジンを使用することで行われる；および／または
（ｅ）  修飾ポリペプチドに関連するデータが、修飾ポリペプチドのアイデンティティ、質量／電荷（ｍ／ｚ）比、電荷（ｚ）、およびポリペプチドの相対保持時間から成る群から選択される、請求項１２または１３記載の方法。
【請求項１５】
請求項１４記載の工程（ｃ）において、）多次元クロマトグラフィーが以下を使用して行われる請求項１４記載の方法；
（ａ）強カチオン交換高速液加（ＳＣＸ−ＨＰＬＣ）、固定された金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）、および二酸化チタン粉末（ＴｉＯ２）クロマトグラフィーを使用することで行われる；または
（ｂ）強陰イオン交換高性能液体クロマトグラフ法（ＳＡＸ−ＨＰＬＣ）、固定された金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）、および二酸化チタン粉末（ＴｉＯ２）クロマトグラフィーを使用することで行われる。