【手続補正書】
【提出日】平成24年4月16日(2012.4.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
嫌気性細菌を形質転換するための、該嫌気性細菌において複製されるが大腸菌において複製されないプラスミドベクターであって、該嫌気性細菌において機能するが大腸菌において機能しない少なくとも１つのプラスミド複製ユニット、および目的とする活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡならびに嫌気性細菌で機能するプロモーターおよびターミネーターを含むＤＮＡ断片を含む蛋白質発現ユニットを含む、前記プラスミドベクター。
【請求項２】
プラスミド複製ユニットが、ビフィドバクテリウム属細菌、ラクトバチルス属細菌、エンテロコッカス属細菌、ストレプトコッカス属細菌およびクロストリジウム属細菌からなる群より選ばれる嫌気性細菌のプラスミド複製ユニットである、請求項１に記載のプラスミドベクター。
【請求項３】
プラスミド複製ユニットが、ビフィドバクテリウム属細菌で機能するプラスミド複製ユニットである、請求項２に記載のプラスミドベクター。
【請求項４】
ビフィドバクテリウム属細菌で機能するプラスミド複製ユニットが、ＯｒｉＶ領域およびＲｅｐＢ遺伝子を含むｐＴＢ６ ｒｅｐユニットである、請求項３に記載のプラスミドベクター。
【請求項５】
ＯｒｉＶ領域およびＲｅｐＢ遺伝子を含むｐＴＢ６ ｒｅｐユニットをコードする遺伝子が、配列番号４の１７９６番目から３３９１番目の塩基配列で示されるＤＮＡまたはその一塩基変異多形である、請求項４に記載のプラスミドベクター。
【請求項６】
目的とする活性を有する蛋白質が、（ａ）抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質、または（ｂ）抗腫瘍活性を有する蛋白質である、請求項１に記載のプラスミドベクター。
【請求項７】
目的とする活性を有する蛋白質が、抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質である、請求項６に記載のプラスミドベクター。
【請求項８】
抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質が、シトシン・デアミナーゼ、ニトロリダクターゼおよびβ−グルクロニダーゼからなる群より選ばれる一種である、請求項７に記載のプラスミドベクター。
【請求項９】
抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質が、シトシン・デアミナーゼである、請求項８に記載のプラスミドベクター。
【請求項１０】
配列番号４の塩基配列で示されるＤＮＡ配列を含む、請求項９に記載のプラスミドベクター（ｐＢｉｆｉＣＤ）。
【請求項１１】
嫌気性細菌を形質転換するための、該嫌気性細菌において複製されるが大腸菌において複製されない、該嫌気性細菌において機能するが大腸菌において機能しない少なくとも１つのプラスミド複製ユニットを含むプラスミドベクターの作製方法であって、（１）嫌気性細菌で機能するプラスミド複製ユニットおよび大腸菌で機能するプラスミド複製ユニットと、（２）目的とする活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡならびに前記嫌気性細菌で機能するプロモーターおよびターミネーターを含むＤＮＡ断片を含む蛋白質発現ユニットとを含む、前記嫌気性細菌と大腸菌とで相互複製されるシャトルプラスミドを作製すること、および該シャトルプラスミドから、大腸菌で機能するプラスミド複製ユニットを除去することを含む、前記プラスミドベクターの作製方法。
【請求項１２】
請求項１〜１０のいずれかに記載のプラスミドベクターで形質転換された嫌気性細菌を含む、遺伝子輸送担体。
【請求項１３】
嫌気性細菌が、ビフィドバクテリウム属細菌、ラクトバチルス属細菌、エンテロコッカス属細菌、ストレプトコッカス属細菌およびクロストリジウム属細菌からなる群より選ばれる、請求項１２に記載の遺伝子輸送担体。
【請求項１４】
嫌気性細菌が、ビフィドバクテリウム属細菌である、請求項１３に記載の遺伝子輸送担体。
【請求項１５】
ビフィドバクテリウム属細菌が、ビフィドバクテリウム・ロンガム、ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス、ビフィドバクテリウム・アニマリス、ビフィドバクテリウム・インファンティス、ビフィドバクテリウム・サーモフィラム、ビフィドバクテリウム・シュードロンガム、ビフィドバクテリウム・ビフィダム、およびビフィドバクテリウム・ブレーベからなる群より選ばれる、請求項１４に記載の遺伝子輸送担体。
【請求項１６】
ビフィドバクテリウム属細菌が、ビフィドバクテリウム・ロンガムである、請求項１５に記載の遺伝子輸送担体。
【請求項１７】
嫌気的環境下にある腫瘍組織内で生育でき、かつ、（ａ）抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質、または（ｂ）抗腫瘍活性を有する蛋白質を発現することができる、請求項１２に記載の遺伝子輸送担体。
【請求項１８】
嫌気的環境下にある腫瘍組織内で生育でき、かつ、抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質を発現することができる、請求項１７に記載の遺伝子輸送担体。
【請求項１９】
遺伝子輸送担体が、ビフィドバクテリウム・ロンガム１０５−Ａ／ｐＢｉｆｉＣＤ（独立行政法人製品評価技術基盤機構特許生物寄託センター受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−４９１）である、請求項１８に記載の遺伝子輸送担体。
【請求項２０】
請求項１２〜１９のいずれかに記載の遺伝子輸送担体を含有する、医薬組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
すなわち本発明は、
［１］嫌気性微生物で機能するプラスミドベクターであって、大腸菌で機能するプラスミド複製ユニットを含まない発現ベクター、
［２］嫌気性微生物が、大腸菌以外の腸内細菌である［１］記載の発現ベクター、
［３］大腸菌以外の腸内細菌が、ビフィドバクテリウム属細菌、ラクトバチルス属細菌、エンテロコッカス属細菌、ストレプトコッカス属細菌およびクロストリジウム属細菌からなる群より選ばれる［２］記載の発現ベクター、
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
［１６］嫌気的環境下にある疾患の治療活性を有する蛋白質が、抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質である、［１５］記載の発現ベクター、
［１７］抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質が、シトシン・デアミナーゼ、ニトロリダクターゼおよびβ−グルクロニダーゼからなる群より選ばれる、［１６］記載の発現ベクター、
［１８］抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質が、シトシン・デアミナーゼである、［１７］記載の発現ベクター、
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３２】
［３６］抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質が、シトシン・デアミナーゼ、ニトロリダクターゼおよびβ−グルクロニダーゼからなる群から選ばれる、［３５］に記載の遺伝子輸送担体、
［３７］抗腫瘍物質前駆体を抗腫瘍物質に変換する活性を有する蛋白質が、シトシン・デアミナーゼである、［３６］に記載の遺伝子輸送担体、
および、
［３８］遺伝子輸送担体が、ビフィドバクテリウム・ロンガム１０５−Ａ／ｐＢｉｆｉＣＤ（独立行政法人製品評価技術基盤機構特許生物寄託センター（ＮＰＭＤ）受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−４９１）である、［３７］に記載の遺伝子輸送担体に関する。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３８】
本発明の発現ベクターは、嫌気性菌、特に、大腸菌以外の腸内細菌、例えば、ビフィドバクテリウム属細菌、ラクトバチルス属細菌、エンテロコッカス属細菌、ストレプトコッカス属細菌、クロストリジウム属細菌等で機能するプラスミドベクターであって、当該形質転換菌以外の菌、特に大腸菌で機能するプラスミド複製ユニットを具有しない発現ベクターである。
より具体的には、例えば、（１）大腸菌以 外の嫌気性微生物で機能するプラスミド複製ユニットと、（２）目的とする活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡならびに嫌気性微生物で機能するプロモー ターおよびターミネーターを含むＤＮＡ断片を含む蛋白質発現ユニットとを含み、且つ、当該形質転換菌以外の菌、 特に大腸菌で機能するプラスミド複製ユニットを含まない発現ベクターである。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４９】
本発明のベクターは、例えば、大腸菌以外 の嫌気性微生物で機能するプラスミド複製ユニットと、目的とする活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡおよび嫌気性微生物で機能するプロモーター並びに ターミネーターを含むＤＮＡ断片を含む蛋白質発現ユニットと、選択マーカー活性遺伝子ユニットを含み、嫌気性微生物に形質転換した場合にその嫌気性微生 物内において機能するもので、形質転換菌以外の菌、特に大腸菌で機能するプラスミド複製ユニットを含まないプラスミドであればいかなるものも含まれる。