【誤訳訂正書】
【提出日】平成24年6月20日(2012.6.20)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の段階を含む、ミトコンドリアの完全性および／または機能のアポリポタンパク質E（apoE）神経毒性ポリペプチド誘発障害を低減させる物質を同定する方法：
サイトゾルにおいて毒性のapoEポリペプチドを含み、ミトコンドリアにおいて検出シグナルを提供する指標ポリペプチドを含む真核細胞を、試験物質に接触させる段階；ならびに
ミトコンドリアの完全性および／または機能に及ぼす試験物質の効果をもしあれば決定する段階であって、試験物質の非存在下でのミトコンドリアの完全性および／または機能と比較して、ミトコンドリアの完全性および／または機能のapoE誘発障害が低減すれば、試験物質がミトコンドリアの完全性および／または機能のapoE誘発障害を低減させることが示される段階。
【請求項２】
決定する段階が、ミトコンドリア運動性の変化を検出するための細胞のリアルタイム撮像を含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
真核細胞がニューロン細胞である、請求項1記載の方法。
【請求項４】
ニューロン細胞が初代ニューロンである、請求項3記載の方法。
【請求項５】
ニューロン細胞が不死化ニューロン細胞株である、請求項3記載の方法。
【請求項６】
真核細胞が毒性のapoEポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターによって遺伝子改変されており、ヌクレオチド配列が真核宿主細胞において機能的なプロモーターに機能的に連結している、請求項1記載の方法。
【請求項７】
毒性のapoEポリペプチドが、apoE4の少なくとも脂質結合領域と受容体結合領域とを含み、機能的な神経保護性のカルボキシル末端ドメインを欠損する、請求項6記載の方法。
【請求項８】
毒性のapoEポリペプチドが、SEQ ID NO: 1に記載される配列のアミノ酸135〜150位およびアミノ酸241〜272位に対して少なくとも75％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、該毒性のapoEポリペプチドがSEQ ID NO: 1に記載される配列のR142、K146、R147、I250、F257、W264、およびV269に対応するアミノ酸を少なくとも含む、請求項7記載の方法。
【請求項９】
毒性のapoEポリペプチドが、SEQ ID NO: 1に記載のアミノ酸配列のアミノ酸273〜299位に対応するカルボキシル末端ドメインを欠損する、請求項7記載の方法。
【請求項１０】
毒性のapoEポリペプチドが、SEQ ID NO: 1に記載の配列のアミノ酸273〜299位に対して少なくとも75％のアミノ酸配列同一性を有するカルボキシル末端部分を含み、SEQ ID NO: 1のL279、K282、およびQ284に対応するアミノ酸が、カルボキシル末端ドメインが神経保護活性を欠損するように変異している、請求項7記載の方法。
【請求項１１】
apoEポリペプチドが、apoEポリペプチドと融合パートナーとを含む融合タンパク質である、請求項1記載の方法。
【請求項１２】
融合パートナーが、酵素、蛍光タンパク質、およびエピトープタグから選択される、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
指標ポリペプチドがミトコンドリア局在シグナルを含む、請求項1記載の方法。
【請求項１４】
毒性のアポリポタンパク質Eポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、プロモーターに機能的に連結しているヌクレオチド配列を含む核酸、ならびに
i）検出シグナルを提供する指標ポリペプチド、およびii）指標に融合したミトコンドリア局在シグナル、をコードするヌクレオチド配列を含む核酸
を含む、単離真核細胞。
【請求項１５】
ニューロン細胞である、請求項14記載の真核細胞。
【請求項１６】
ニューロン細胞が初代ニューロンである、請求項15記載の細胞。
【請求項１７】
ニューロン細胞が不死化ニューロン細胞株である、請求項15記載の細胞。
【請求項１８】
毒性のapoEポリペプチドがapoE4の少なくとも脂質結合領域および受容体結合領域を含み、機能的な神経保護性のカルボキシル末端ドメインを欠損する、請求項14記載の細胞。
【請求項１９】
毒性のapoEポリペプチドが、SEQ ID NO: 1に記載される配列のアミノ酸135〜150位およびアミノ酸241〜272位に対して少なくとも75％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、毒性のapoEポリペプチドがSEQ ID NO: 1に記載される配列のR142、K146、R147、I250、F257、W264、およびV269に対応するアミノ酸を少なくとも含む、請求項18記載の細胞。
【請求項２０】
apoEポリペプチドまたは毒性断片が、SEQ ID NO: 1に記載されるアミノ酸配列のアミノ酸273〜299位に対応するカルボキシル末端ドメインを欠損する、請求項18記載の細胞。
【請求項２１】
毒性のapoEポリペプチドが、SEQ ID NO: 1に記載される配列のアミノ酸273〜299位に対して少なくとも75％のアミノ酸配列同一性を有するカルボキシル末端部分を含み、SEQ ID NO: 1のL279、K282、およびQ284に対応するアミノ酸が、カルボキシル末端ドメインが神経保護活性を欠損するように変異している、請求項18記載の細胞。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１８】
毒性のapoEポリペプチドによるミトコンドリアの完全性および／または機能障害には、以下の1つまたは複数が含まれる:1）初代ニューロンの樹状突起におけるミトコンドリア数の低減；2）初代ニューロンの樹状突起におけるミトコンドリアの大きさの低減；3）ミトコンドリアの膜電位の低減；4）ミトコンドリア運動性の低減；5）ミトコンドリアの前方移動速度の低減；および6）ミトコンドリアの大きさの低減。
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１２８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１２８】
初代海馬ニューロンに関して報告されたように、ミトコンドリアの約23％が移動し、約77％が静止したままであった（図9A）。
【誤訳訂正４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１３９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１３９】
分化したPC12細胞および初代ニューロンを、Lipofectamine 2000（Invitrogen)を用いてdsRed2-Mito構築物にトランスフェクトさせるか、またはdsRed2-MitoとpPDGF-EGFP-β-アクチン構築物に同時トランスフェクトさせた。Lipofectamine 2000 3μlと共にDNA（2μg）を、ルーチン的にトランスフェクションおよび同時トランスフェクションのために用いた。
【誤訳訂正５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１４１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１４１】
ニューロンの活性化および阻害
ニューロンの活性化に関して、分化したPC12細胞または初代ニューロンをKCl（90 mM）によって各3分間4回脱分極させて、様々な型のapoEの存在下または非存在下で10分間の洗浄によって分離した。ニューロンの阻害に関して、分化PC12細胞または初代ニューロンを、様々な型のapoEの存在下または非存在下で1μM TTXと共に4〜24時間インキュベートした（Li et al.(2004) Cell) 119:873）。
【誤訳訂正６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１４２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１４２】
共焦点顕微鏡
様々な型のapoEによって処置した培養初代ニューロンを氷冷4％パラホルムアルデヒドのPBS溶液において20分間固定して、Vectashield (Vector Laboratories Burlingame, CA）に載せた。初代ニューロンにおけるEGFPおよびdsRed蛍光のデジタル画像を、BX60顕微鏡（Olympus, Melville, NY）に搭載したBio-Rad Radiance 2000 scanhead (Bio-Rad, Hercules, CA）を備えたレーザー走査型共焦点顕微鏡によって60倍の油浸対物レンズで収集した。
【誤訳訂正７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１４６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１４６】
結果
apoE4およびその断片は初代ニューロンにおいて樹状突起棘密度を低減させる
樹状突起棘密度に及ぼす外因性のapoEの効果を査定するために、インビトロで14〜17日間培養したラット初代皮質および海馬ニューロンを、異なる型のapoE（7.5μg/ml）と共に24時間インキュベートした。実験の4〜6日前、細胞に、樹状突起棘において豊富な細胞骨格タンパク質であるEGFPタグ化β-アクチン（EGFP-β-アクチン）をトランスフェクトした。EGFP-β-アクチン発現は、ニューロンの機能またはシナプスの形態（EK751）を障害しない。apoE3は、樹状突起棘密度を皮質ニューロンにおいて20±6％、海馬ニューロンにおいて11±4％増加させたが、apoE4は対照と比較してそれぞれ13±5％および19±5％減少させた；その上、apoE4はapoE3と比較して27±5％および28±4％低減させた（図12）。棘の密度は、apoE4(1-272)と共にインキュベートした初代ニューロンにおいて最も大きい程度に低減され、対照に対して45±3％低減およびapoE3処置ニューロンに対して55±3％低減を引き起こした。apoE4(1-272)は、樹状突起の枝および分岐点の数を同様に有意に低減させた。ニューロン複雑度（たとえば、樹状突起領域および樹状突起伸長の長さ）の他の測定値は、いかなる型のapoEによっても影響を受けなかった。樹状突起棘密度のこれらの低減は、apoE4およびapoE4断片がシナプス形成またはシナプス維持を障害することを示唆している。
図12Aおよび12B
apoE4およびその断片は、ラット初代皮質および海馬ニューロンにおける樹状突起棘密度を低減させる
（a）様々な型のapoE（7.5μg/ml）の存在下または非存在下で（対照）24時間インキュベートしたラット初代皮質および海馬ニューロン（インビトロで16日）の樹状突起におけるシナプスEGFP-β-アクチン蛍光の共焦点顕微鏡画像。尺度のバー＝5μm。（b）樹状突起伸長1μmあたりの棘の数。黒いバー、皮質ニューロン（各条件に関して細胞19〜23個の樹状突起20〜30個）。白いバー、海馬ニューロン（各条件に関して細胞10〜12個の樹状突起10〜15個）。値は平均値±SEMである。*P＜0.05、***P＜0.001対対応する対照：†P＜0.001対対応するE3（t検定）。
【誤訳訂正８】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１４７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１４７】
apoE4およびその断片は、PC12細胞におけるミトコンドリア動力学を障害する
シナプス形成は、通常のミトコンドリア動力学および機能を必要とし、apoE4およびその断片はミトコンドリア機能障害を引き起こす。apoE4およびその断片によって引き起こされたシナプス形成の障害は、ミトコンドリア動力学の障害に関連することが決定された。高度に分化したニューロンは、広範な樹状突起領域を有し、したがってシナプス密度および活性依存的なシナプス形成は、樹状突起伸長部におけるミトコンドリアの適当な分布および機能に重大に依存する。ミトコンドリアは、核周辺で生成され、ニューロンの伸長に向かって分子モーターキネシンによって輸送される動的オルガネラである。この移動を定量するために、神経生長因子（NGF）によって分化され、ミトコンドリアマーカーdsRed2-Mito（図13a〜c）をトランスフェクトしたPC12細胞の神経突起におけるミトコンドリア動力学の蛍光低速度撮影記録のために顕微鏡アプローチが確立された。15分間の記録期間のあいだ、ミトコンドリアの約23％が移動していた（図13d）；平均速度は0.67±0.13μm/分であった。KCl（4×、90 mM）42,46による繰り返し脱分極によるニューロンの活性化は、移動するミトコンドリアの百分率、真の距離、および平均速度を低減させたが（図13d〜f）、移動の速さ（移動速度）には有意な影響を及ぼさなかった（図13g）。ニューロンの活性化はまた、神経突起／神経突起の長さにおけるミトコンドリアの長さの付加として計算されるミトコンドリア指数を22.5％低減させ、おそらく分子モーター（ダイニンおよびキネシン）のカルシウム依存的連動または開放による高エネルギー需要42領域に向かう再分布をおそらく反映している。対照的に、テトロドトキシン（TTX、1μM）との1時間のプレインキュベーションによってニューロン活性が阻害されると、ミトコンドリアの動力学は増加した（図13d〜g）；ミトコンドリア指数は影響を受けなかった。類似のミトコンドリア動力学は初代ニューロンにおいて報告されている。
【誤訳訂正９】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１５６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１５６】
apoE4およびその断片は活性依存的シナプス形成を障害する
初代皮質ニューロンによる類似の実験において、活性依存的シナプス形成に及ぼす効果を査定するために樹状突起棘密度を定量した。ニューロンの活性化に反応して、棘密度は対照と比較してapoE4によって48±11％およびapoE4(1-272)によって49±10％低減した（図17b）。これらの低減は、ニューロン活性化の非存在下でapoE4およびその断片によって処置したニューロンにおける低減と同等であった（図13）。
【誤訳訂正１０】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１５７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１５７】
図17Aおよび17B  apoE4およびその断片は、活性依存的ミトコンドリア動力学およびシナプス形成を障害する
（a）分化したPC12細胞を様々な型のapoE（7.5μg/ml、白いバー）の存在下または非存在下（対照）で37℃で24時間インキュベートした。インキュベーション後、いくつかの細胞を90 mM KClによって繰り返し脱分極させて（各3分間を4回、10分間の洗浄をあいだに行って）（黒いバー）、ミトコンドリア動力学を分析した。非脱分極に関して、対照：細胞14個からn＝198；apoE3：細胞9個からn＝159；apoE4：細胞4個からn＝52；およびapoE4(1-272)：細胞6個からn＝101。KCl脱分極に関して、対照：細胞4個からn＝48；apoE3：細胞4個からn＝31；apoE4：細胞3個からn＝26；およびapoE4(1-272)：細胞5個からn＝40。（b）初代皮質ニューロンを様々な型のapoE（7.5μg/ml）の存在下または非存在下（対照）で24時間インキュベートして、aと同様に繰り返し脱分極させて、樹状突起伸長部1μmあたりの棘の数を分析した（各条件に関して細胞10〜15個の樹状突起10〜15個）。値は平均値±SEMである。***P＜0.001対（a）での非脱分極条件および**P＜0.01対対照または（b）でのE3（t検定）。
【誤訳訂正１１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１５８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１５８】
ニューロン阻害は、apoE4およびその断片によって誘発されるミトコンドリア動力学およびシナプス形成における欠損を救済する
ミトコンドリア動力学およびシナプス形成における欠損がニューロン活性に依存するか否かをさらに調べるために、本発明者らは、初代ニューロンを様々な型のapoEおよびニューロン活性を阻害するTTXと共に24時間インキュベートした。ミトコンドリア動力学（図18a）または樹状突起棘密度（図18b）において有意差は認められなかった。
【誤訳訂正１２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１５９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１５９】
図18Aおよび18B  ニューロン阻害は、ミトコンドリア動力学およびシナプス形成における欠損を救済する
（a）分化したPC12細胞を様々な型のapoE（7.5μg/ml）の存在下または非存在下（対照）で1μM TTXの存在下で37℃で24時間インキュベートした。ミトコンドリアの動力学を、移動するミトコンドリアの百分率として分析した。対照：細胞4個からn＝45；apoE3：細胞6個からn＝42；apoE4：細胞7個からn＝32；およびapoE4(1-272)：細胞8個からn＝87。（b）初代皮質ニューロンを様々な型のapoE（7.5μg/ml）と共に1μM TTXの存在下で24時間インキュベートした。樹状突起の伸長1μmあたりの棘の数を分析した（各条件に関して細胞10〜11個の樹状突起10〜12個）。値は平均値±SEMである。
【誤訳訂正１３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１６０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１６０】
apoE4およびその断片は、初代ニューロンの樹状突起におけるミトコンドリアの数、大きさ、および分布を低減させる
活性依存的シナプス形成およびシナプス機能は、適当なミトコンドリア局在を必要とすることから、様々な型のapoE処置に反応した樹状突起伸長物におけるミトコンドリアの数および分布を分析した。樹状突起の棘は、apoE3処置細胞または対照よりapoE4処置細胞においてかなり少ないミトコンドリアを有し、apoE4(1-272)によって処置した細胞ではさらに少なかった。ミトコンドリア分布の分布を定量するために、樹状突起伸長物1μmあたりミトコンドリアによって占有される面積を計算した。この面積はapoE3処置細胞よりapoE4処置細胞では25±6％小さかった（図19A）。低減はapoE4(1-272)を処置した細胞ではさらにより大きかった（44±9％）。さらに、apoE4(1-272)は、apoE3およびapoE4と比較して樹状突起ミトコンドリアの大きさの平均値を25％低減させ（図19B）、apoE4断片がミトコンドリアの分裂を刺激する、またはミトコンドリアの断片化を引き起こすことを示唆している。
【誤訳訂正１４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１６１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１６１】
図19Aおよび19B  apoE4およびその断片は初代皮質ニューロンの樹状突起におけるミトコンドリアの占有面積を低減させる
ミトコンドリア占有面積（樹状突起伸長物1μmあたりミトコンドリアによって占有される面積）（a）および条件あたり細胞6個の樹状突起におけるミトコンドリアの大きさの分布（b）。（a）における値は平均値±SEMである。**P＜0.01、***P＜0.001対E3（t検定）。（c）apoE4(1-272)を処置した細胞におけるミトコンドリアの大きさ（Mito-size）の分布は、apoE3またはapoE4によって処置した細胞の分布とは有意に異なった（P＜0.05、直線回帰分析、ペアソン相関係数）。
【誤訳訂正１５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１６３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１６３】
【図１】図1A〜1Fは、ニューロン細胞の生存に及ぼすapoE4の効果を描写する。
【図２】図2A〜Cは、様々な型のapoE4の細胞内分布を描写する。
【図３】図3A〜Jは、apoE4断片のミトコンドリア誤局在を描写する。
【図４】図4A〜Dは、apoEポリペプチドとミトコンドリアとの相互作用に及ぼす受容体結合領域の効果を描写する。
【図５】図5Aおよび5Bは、ミトコンドリア機能障害に及ぼす脂質結合領域および受容体結合領域の効果を描写する。
【図６】ヒトapoE4（SEQ ID NO: 1）のアミノ酸配列を描写する。
【図７】図7Aおよび7Bは、様々なapoEポリペプチドのアミノ酸配列を描写する。
【図８】図8A〜Eは、未分化および分化PC12細胞、ならびにその神経突起におけるミトコンドリアの低速度撮影記録を描写する。
【図９】図9A〜Dは、ミトコンドリア運動性における活性依存型変化を描写する。
【図１０】図10A〜Fは、ミトコンドリア運動性および形態に及ぼすapoEイソ型およびapoE4断片の効果を描写する。
【図１１】DsRed2ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を提供する。
【図１２】図12AおよびBは、ラット初代皮質および海馬ニューロンにおける樹状突起棘に及ぼすapoE4およびその断片の効果を描写する。
【図１３】図13A〜Gは、分化したPC12細胞の神経突起におけるミトコンドリア動力学の活性依存的変化を描写する。
【図１４】図14A〜Fは、ミトコンドリア運動性および形態に及ぼすapoE4およびその断片の効果を描写する。
【図１５】図15A〜Cは、様々な型のapoEを安定に発現するPC12細胞におけるミトコンドリア動力学に及ぼす内因性のapoE4およびその断片の効果を描写する。
【図１６】ミトコンドリア運動性のapoE誘発障害に及ぼすカルシウム流入遮断の効果を描写する。
【図１７】図17Aおよび17Bは、活性依存型ミトコンドリア動力学およびシナプス形成に及ぼすapoE4およびその断片の効果を描写する。
【図１８】図18Aおよび18Bは、ミトコンドリア動力学およびシナプス形成の欠損に及ぼすニューロン阻害の効果を描写する。
【図１９】図19Aおよび19Bは、初代皮質ニューロンの樹状突起におけるミトコンドリアの占有に及ぼすapoE4およびその断片の効果を描写する。