(57)【要約】【課題】骨補填材の全体に迅速に培養細胞を浸透させて、効率よく培養骨を製造する。【解決手段】積み重ね可能な形状を有するとともに、少なくともその積み重ね方向に貫通する貫通穴２を有する複数の骨補填材１を製造し、貫通穴２を相互に概略一致させた状態に骨補填材１を積み重ね、最上位の骨補填材１の貫通穴２から培養細胞４を注入した後に、培養細胞４を含有する培養液内にこれらの骨補填材１を投入して培養する培養骨の製造方法を提供する。【選択図】　　図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
積み重ね可能な形状を有するとともに、少なくともその積み重ね方向に貫通する貫通穴を有する複数の骨補填材を製造し、
貫通穴を相互に概略一致させた状態に骨補填材を積み重ね、
最上位の骨補填材の貫通穴から培養細胞を注入した後に、
培養液内にこれらの骨補填材を投入して培養する培養骨の製造方法。
【請求項２】
貫通穴を略水平方向に寝かせて骨補填材を培養液内に投入する請求項１に記載の培養骨の製造方法。
【請求項３】
骨補填材と培養細胞とを培養液内に投入して培養する培養骨の製造方法であって、
貫通穴を有する隔壁部材により、複数の骨補填材を培養液内において区画して培養する培養骨の製造方法。
【請求項４】
前記骨補填材を、該骨補填材より小さい網目を有する網状部材の上に載置して培養する請求項３に記載の培養骨の培養方法。
【請求項５】
粒状の骨補填材を、該骨補填材より小さい網目を有する網状部材に培養細胞とともに包んだ状態に培養液内に培養する培養骨の製造方法。
【請求項６】
前記網目が培養液内に含有される培養細胞より小さい請求項５に記載の培養骨の製造方法。
【請求項７】
前記網目が培養液内に含まれる成分より大きい請求項５または請求項６に記載の培養骨の製造方法。
【請求項８】
外面を揃えて積み重ねたときに、相互に概略一致する貫通孔を備えるとともに、該貫通孔内に培養細胞を注入した状態で培養された培養骨。
【請求項９】
粒状の骨補填材を、培養細胞により一体化してなる培養骨。
【請求項１０】
骨補填材が有する孔内に、培養細胞が充填されている請求項９に記載の培養骨。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、骨の欠損部を再生する際に使用する培養骨とその製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、骨腫瘍摘出や外傷等により生じた骨の欠損部に、骨補填材を補填することにより、骨を再生させて欠損部を修復することが可能になってきている。骨補填材としては、ハイドロキシアパタイト（ＨＡＰ）やリン酸三カルシウム（ＴＣＰ）が知られているが、体内に異物を残さないとする考え方から、例えば、β−ＴＣＰのようなリン酸カルシウム多孔体からなる足場材が使用される。β−ＴＣＰを骨欠損部の骨細胞に接触させておくと、破骨細胞がβ−ＴＣＰを食べ、骨芽細胞が新しい骨を形成する、いわゆるリモデリングが行われる。すなわち、骨欠損部に補填された骨補填材は、経時的に自家骨に置換されていくことになる。
【０００３】
従来より、骨欠損部に補填する骨補填材としては、例えば、適当な大きさを有する直方体状に形成された多孔体、または、顆粒状のものが存在する。このような骨補填材を医療現場において実際に使用する場合には、医師が、手術中に骨欠損部の形状に合わせて直方体状の骨補填材を適宜削り、あるいは顆粒状の骨補填材を隙間に補填することなどが行われている。
【０００４】
一方、術後の骨欠損部の修復速度を高めるために、患者から採取した骨髄間葉系細胞を骨補填材とともに培養することにより製造される培養骨を使用することが提案されている。培養されることにより骨補填材を足場にして増殖した多くの骨髄間葉系細胞を含む培養骨を骨欠損部に補填するので、手術後に体内で細胞を増殖させる方法と比較すると、自家骨に置換されるまでの日数を大幅に短縮することができる。
従来、このような培養骨は、多孔質ブロック状の骨補填材の表面に培養細胞を貼り付けて培養液内に投入することにより製造していた。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、培養細胞を含む培養液には粘性があり、骨補填材の気孔は微細なものであるため、骨補填材の気孔内に充分に浸透するには長時間を要するという問題がある。骨補填材の気孔を大きく設定することにより、浸透性を向上することも考えられるが、気孔率の大きさは修復される骨の強度にも影響を与えるものであるため、過度に気孔を大きくすることはできない。
【０００６】
この発明は、上述した課題に鑑みてなされたものであって、骨補填材の全体に迅速に培養細胞を浸透し易くし、効率よく培養骨を製造することができる培養骨の製造方法を提供することを目的としている。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するために、この発明は、以下の手段を提供する。
請求項１に係る発明は、積み重ね可能な形状を有するとともに、少なくともその積み重ね方向に貫通する貫通穴を有する複数の骨補填材を製造し、貫通穴を相互に概略一致させた状態に骨補填材を積み重ね、最上位の骨補填材の貫通穴から培養細胞を注入した後に、培養液内にこれらの骨補填材を投入して培養する培養骨の製造方法を提供する。
【０００８】
この発明によれば、骨補填材に形成された貫通穴を相互に概略一致させるように積み重ねた骨補填材の最上位から、貫通穴内に培養細胞を注入することにより、培養細胞が重力によって貫通穴の内壁を伝って下降し、貫通穴内に充填される。そして、このように貫通穴内に培養細胞が充填された骨補填材を、培養液内に投入して培養することにより、貫通穴内壁側からは、予め充填された培養細胞が骨補填材に浸透し、外面側から培養液を浸透させることにより培養細胞を骨補填材内にスムーズに浸透していくことになる。したがって、培養細胞が内部まで充分に浸透した培養骨が製造される。
【０００９】
請求項２に係る発明は、請求項１に記載の培養骨の製造方法において、貫通穴を略水平方向に寝かせて骨補填材を培養液内に投入する培養骨の製造方法を提供する。
この発明によれば、貫通穴が略水平方向に配されるように骨補填材を配することにより、貫通穴内に充填されている培養細胞が、重力によって貫通穴から流れ出すことが防止され、無駄なく骨補填材に浸透させられることになる。
【００１０】
請求項３に係る発明は、骨補填材と培養細胞とを培養液内に投入して培養する培養骨の製造方法であって、貫通穴を有する隔壁部材により、複数の骨補填材を培養液内において区画して培養する培養骨の製造方法を提供する。
この発明によれば、複数の骨補填材が隔壁部材によって区画されるので、製造される培養骨が相互に連結することなく製造される。この場合に、培養液は隔壁部材に設けられた貫通穴を通して、流通するので、複数の培養骨を同一条件下で製造することが可能となる。ここで、隔壁部材は、板状の隔壁の他、網状部材や貫通穴を有する膜状部材であってもよい。
【００１１】
請求項４に係る発明は、請求項３に記載の培養骨の培養方法において、前記骨補填材を、該骨補填材より小さい網目を有する網状部材の上に載置して培養する培養骨の培養方法を提供する。
この発明によれば、網状部材の作用により骨補填材を培養皿の表面から浮かせた状態に保持することができるので、骨補填材の裏面にも培養液を還流させて骨補填材の全面から培養細胞の成長を開始させることが可能となる。
【００１２】
請求項５に係る発明は、粒状の骨補填材を、該骨補填材より小さい網目を有する網状部材に包み培養液内に投入して培養する培養骨の製造方法を提供する。
この発明によれば、粒状の骨補填材の周囲に培養細胞が付着して相互に連結された塊状の培養骨が製造される。網状部材の網目は骨補填材より小さいので、骨補填材が網状部材からこぼれることなく保持される。また、培養液は網状部材の網目を通して流通させられる。
【００１３】
請求項６に係る発明は、請求項５に記載の培養骨の製造方法において、前記網目が培養液内に含有される培養細胞より小さい培養骨の製造方法を提供する。
この発明によれば、骨補填材を内部に保持する網状部材の網目が、培養細胞より小さいので、培養細胞が網状部材からこぼれることなく保持される。したがって、網状部材にくるんだ骨補填材と培養細胞とを一緒に培養液に投入することにより培養骨が製造される。また、同一の培養液内にそれぞれ網状部材にくるんだ複数の骨補填材を投入することにより、相互に連結させることなく、複数の培養骨を同一条件下で製造することが可能となる。
【００１４】
【発明の実施の形態】
この発明の第１の実施形態に係る培養骨の製造方法について、図１を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る培養骨の製造方法は、複数の骨補填材１を製造し、積み重ね、培養液を注入して培養するものである。
各骨補填材１は、例えば、特開平５−２３７１７８号公報に開示されている方法により製造したβ−ＴＣＰからなる直方体状の多孔体であり、それぞれの略中央には、一方向に貫通する貫通穴２を備えている。
【００１５】
貫通穴２の径寸法は、内部に注入される培養細胞が重力により落下し得る程度の大きさである。各骨補填材１の貫通穴２の位置は、相互に積み重ね状態に配置したときに、概略一致するように、ほぼ同一位置に配置されている。
貫通穴２は、上述した方法によるβ−ＴＣＰ多孔体の製造過程において形成することにしてもよいが、β−ＴＣＰ多孔体の製造後に、穿孔することにより形成してもよい。
【００１６】
次に、図２に示されるように、このように構成された複数の骨補填材１を厚さ方向に積み重ねる。このとき、骨補填材１に形成された貫通穴２は相互に概略一致する位置に配置され、上下方向に積み重ねられた骨補填材１の貫通穴２どうしは、上下方向に連続するように配置される。なお、最下位に配置した骨補填材１については、穴３を厚さ方向に貫通させることなく、途中位置まで形成しておく。すなわち、積み重ねられた貫通穴２は、上下方向に連続して最下位の骨補填材１の厚み方向の途中位置まで達するように構成されている。
【００１７】
そして、次に、積み重ねられた最上位の骨補填材１に形成されている貫通穴２から、図２に矢印で示されるように、培養細胞４を注入する。培養細胞４は、例えば、腸骨から抽出した骨髄間葉系細胞である。あるいは、間葉系幹細胞であってもよい。最上位の骨補填材１の貫通穴２から注入された培養細胞４は、重力の作用によって貫通穴２内を、その内側面に一部を付着させながら下降する。そして、最下位の骨補填材１に達したところで、厚み方向の途中位置まで形成されている穴３まで達し、注入された培養細胞４は貫通穴２内に順次溜まっていく。その後、貫通穴２内に溜まった培養細胞４は、骨補填材１に形成されている気孔内に浸透していくことになる。
【００１８】
最後に、このようにして貫通穴２内に培養細胞４を注入された骨補填材１は、培養皿５内に、適当な培養液６とともに投入され、所定の培養条件下において培養される。培養液６内には、骨補填材１内に注入したのと同じ培養細胞４が含まれていてもよいし、培養液のみでもよい。これにより、培養細胞４中の間葉系幹細胞が骨補填材１を足場にして増殖させられ、培養骨が製造されることになる。
【００１９】
この場合において、培養液６内に投入される骨補填材１は、図３に示すように、貫通穴２を略水平方向に寝かせるようにして投入される。これにより、貫通穴２内部に貯留されていた培養細胞４は、重力により貫通穴２の内壁に向かわせられ、貫通穴２内面側から骨補填材１内部への浸透が促進される。また、培養細胞４を含有した培養液６を使用した場合には、骨補填材１の外面には、培養細胞４を含有した培養液６が接触しているので、該外面側からも培養細胞４が骨補填材１内部へ浸透させられることになる。
【００２０】
このように、本実施形態に係る培養骨の製造方法によれば、鉛直方向に連続するように配置された貫通穴２に培養細胞４を注入することにより、それぞれの骨補填材１に別々に培養細胞４を注入することと比較すると、注入作業の手間を省くことができる。また、骨補填材１の外面からのみならず、貫通穴２内面側からも培養細胞４が骨補填材１の内部に浸透させられるので、比較的大きな骨補填材１であっても、充分に内部まで培養細胞４を浸透させることができる。したがって、効率よく培養骨を製造することができることになる。
【００２１】
なお、本実施形態に係る培養骨の製造方法では、培養液６を培養皿５内において流動させてもよい。これにより、培養液６内の成分を効率よく培養細胞４に供給できるので、培養骨を効率よく製造することができる。培養液６を流動させる方法としては、例えば、図４に示すように、培養液６内に磁性材料からなるファン７を配置しておき、培養皿５の外部、例えば、底面下方に配置した磁石８をモータ９によって回転させることにしてもよい。これにより、培養液６内のファン７を磁力により回転させるので、培養液６に接触することなく培養液６を流動させることができる。培養液の成分は、ＭＥＭ（Ｍｉｎｉｍａｌ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ）に１５％ＦＢＳ，抗生剤、グリセロリン酸、アスコルビン酸、デキサメサゾン等を含んでいる。
【００２２】
次に、本発明の第２の実施形態に係る培養骨の製造方法について、図５および図６を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る培養骨の製造方法は、網状部材１０により、複数の骨補填材１を培養液６内において区画して培養するものである。網状部材１０としては、生体適合性を有する材料、例えば、チタンやＳＵＳ３１６等が好ましく、さらに好ましくは、細胞が付着しにくい性質のもの、例えば、親水性を有する表面処理を施したチタンやＳＵＳ３１６からなるものが好ましい。網状部材１０の網目の大きさは、少なくとも培養液６内に含有される成分が通過できる大きさ、あるいは、培養細胞４が通過できる程度の大きさを有していてもよい。
【００２３】
網状部材１０は、例えば、図５および図６に示されるように、培養皿５内を格子状に区画しており、各網状部材１０によって区画された格子内に、培養細胞を表面に付着させた骨補填材１が配置される。培養液６内には、例えば、骨髄細胞や間葉系細胞のような培養細胞４が含有されていてもよい。骨補填材１は、例えば、直方体状のβ−ＴＣＰ多孔体であって、その上面から中心位置まで凹部１１が形成されており、当該凹部１１内に培養細胞４を注入可能となっていることが好ましい。
【００２４】
このような本実施形態に係る培養骨の製造方法によれば、網状部材１０によって区画された各格子内に配置されている複数の骨補填材１に、培養液中の成分が、培養細胞４に作用して、培養細胞４の増殖や分化が加速され、培養骨が製造される。また、培養液６中に培養細胞４が浮遊している場合には、培養細胞４が付着して、骨補填材１を足場として増殖することにより培養骨が製造される。ここで、培養骨の上面に設けられた凹部１１内に培養細胞４を注入した状態で培養液６内に投入することにより、骨補填材１の内部からも培養細胞４を成長させることができるので、培養骨を効率よく製造することができる。
【００２５】
また、このとき、隣り合う骨補填材１は網状部材１０によって区画されているので、製造された培養骨どうしが連結してしまうことがない。したがって、連結を切断する際に生ずる細胞の損傷を抑え、健全な培養骨を効率的に製造することができる。また、培養液６の成分および／または培養細胞４は、網状部材１０の網目を通して自由に行き来することができるので、培養皿５内の培養条件は、いずれの位置においてもほぼ一定に保たれる。
すなわち、同一条件下で複数の培養骨を製造することが可能となる。
【００２６】
なお、上記実施形態において採用した網状部材１０に代えて、厚み方向に貫通する複数の貫通穴を有する板状の隔壁部材、あるいは、厚み方向に複数の貫通穴を有する膜状の隔壁部材を採用することにしてもよい。
また、骨補填材１をβ−ＴＣＰ多孔体からなるものとしたが、これに代えてＨＡＰ、チタン、ＳＵＳ３１６等の材料から構成されたものを採用してもよい。また、直方体状の骨補填材１に代えて、他の任意の形状の骨補填材を採用してもよく、さらに、異なる形状を有する複数の骨補填材を網状部材１０の内部に包むことにしてもよい。この場合、組み合わせることにより骨欠損部の形状を再現し得る複数の分割片からなる骨補填材を培養することにしてもよい。
【００２７】
また、直方体状の骨補填材１の中心位置近傍まで凹部１１を形成し、内部に培養細胞４を注入した状態で培養を行うこととしたが、骨補填材１の大きさがあまり大きくない場合には、凹部１１を設けなくてもよいことは言うまでもない。また、骨補填材１を上下に貫通する貫通穴を設け、その下端をフィブリン糊や、コラーゲンなどの生体吸収材料からなるシートにより塞ぐことにしてもよい。図２において、穴３を設ける代わりに、貫通穴２の下部をフィブリン糊で塞いでもよい。
【００２８】
さらに、直方体状の骨補填材１のように、９０°以下の角部があると、その稜の部分には培養細胞４が付着しにくい知見が得られている。したがって、培養細胞４を骨補填材１の全面に付着させて、効率的な培養骨の製造を行うためには、このような比較的急峻な角部を排除する必要がある。そこで、図７に示されるように、骨補填材１の全ての角部に適宜、面取りを行い、あるいは、角を丸める（Ｒを付ける）ことにすれば、当該稜の部分にも培養細胞４を付着させることができるので効果的である。
【００２９】
また、骨補填材１の間を区画する網状部材１０とともに、または、これとは別に、図８に示されるように、培養皿５の底面から骨補填材１を浮かせるようにして培養液６内に配置するための他の網状部材１２を採用することにしてもよい。このようにすることにより、骨補填材１と培養皿５との接触部分（培養細胞４が付着しにくい部分）をなくし、骨補填材１の下面からも培養細胞の成長を開始させることができる。その結果、さらに効率的に培養骨を製造することができる。
【００３０】
次に、この発明の第３の実施形態に係る培養骨の製造方法について、図９を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る培養骨の製造方法は、粒状の骨補填材１５を、該骨補填材１５より小さい網目１６（貫通穴）を有する網状部材１７に包み培養液６内に投入して培養するものである。
前記網状部材１７の網目１６は、培養細胞４を通過させることが可能な約５００μｍ以上の大きさを有している。また、前記骨補填材１５は、上記網状部材１７の網目１６より大きな、例えば、粒径約６００〜３０００μｍ程度のβ−ＴＣＰからなる。
【００３１】
この培養骨の製造方法によれば、粒状の骨補填材１５を網状部材１７に包んで培養細胞４を含有する培養液６内に投入し、所定の培養条件下で培養することにより、培養液６とともに培養細胞４が網状部材１７の網目１６を通して網状部材１７内部の骨補填材１５の周囲を流通し、骨補填材１５に付着して、骨形成が開始される。網状部材１７の網目１６は骨補填材１５より小さく形成されているので、粒状の骨補填材１５は網状部材１７の外側にこぼれないように保持される。
【００３２】
そして、所定の期間にわたって培養を行うことにより、骨補填材１５の周囲に培養細胞４を充分に成長させた培養骨が、網状部材１７の内部に製造される。骨補填材１５が粒状に形成されているので、培養細胞４は、骨補填材１５間を連結するように成長し、結果として、図１０に示されるように、骨補填材１５と培養細胞４とが混合した塊状の培養骨１８が製造されることになる。
【００３３】
本実施形態に係る培養骨１８の製造方法によれば、粒状の骨補填材１５の周囲に培養細胞４を成長させるので、比較的大きな培養骨１８を製造する場合においても、その内部まで培養細胞４を成長させることができ、効率よく培養骨１８を製造することができる。また、粒状の骨補填材１５どうしを連結する培養細胞４は、弾性を有しているので、塊状に形成された培養骨１８は、外部から力を加えることにより変形され易く構成されている。
したがって、医師が手術中において骨欠損部に培養骨１８を補填する際に、上記培養骨１８に外力を加え、骨欠損部の形状に合わせて培養骨１８をある程度変形させながら、補填することができる。
【００３４】
なお、上記実施形態においては、網状部材１７の網目１６の大きさを、骨補填材１５よりも小さく、培養細胞４よりも大きい大きさとしたが、これに代えて、培養細胞４より小さい大きさの網目１６を有する網状部材１７を採用してもよい。この場合には、培養細胞４は、骨補填材１５とともに網状部材１７の内側に投入し、培養液６のみを網状部材１７の網目１６を通して骨補填材１５および培養細胞４の周囲に流通させる。これにより、上記実施形態と同様の培養骨１８が製造されることになる。
また、上記のいずれの実施形態の場合においても、骨補填材１５を包んだ２つ以上の網状部材１７を同一の培養液６内に投入することにより、同一の培養条件下において複数の培養骨１８を製造することが可能となる。
【００３５】
【発明の効果】
以上説明したように、この発明に係る培養骨の製造方法によれば、骨補填材の中心部まで迅速に培養細胞を浸透させて、効率よく培養骨を製造することができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の第１の実施形態に係る培養骨の製造方法に使用される骨補填材を示す斜視図である。
【図２】図１の製造方法において、骨補填材を積み重ね、培養細胞を注入する状態を示す縦断面図である。
【図３】図１の製造方法において、培養細胞を注入した骨補填材を培養液内に投入する状態を示す縦断面図である。
【図４】図１の製造方法における変形例を示す模式図である。
【図５】本発明の第２の実施形態に係る培養骨の製造方法において、骨補填材を培養液中に投入した状態を示す縦断面図である。
【図６】図５の状態を示す平面図である。
【図７】図５の製造方法における骨補填材の変形例を示す斜視図である。
【図８】図５の製造方法の変形例を説明する縦断面図である。
【図９】本発明の第３の実施形態に係る培養骨の製造方法において、粒状の骨補填材を培養液中に投入した状態を示す縦断面図である。
【図１０】図７の製造方法により製造された培養骨を示す概略図である。
【符号の説明】
１，１５　骨補填材
２　貫通穴
４　培養細胞
６　培養液
１０　網状部材（隔壁部材）
１２　網状部材
１６　網目（貫通穴）
１７　網状部材
１８　培養骨
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2004008436.tif 000009
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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