【誤訳訂正書】
【提出日】平成24年6月22日(2012.6.22)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
宿主細胞のペリプラズムの中へ関心対象のポリペプチドの分泌がもたらされ、発酵培養液が形成される組換え発現系で形質転換された宿主細胞を発酵培地で発酵させることと；
溶液を準備することと；
前記溶液を細胞と混合して高モル濃度のスラリーを形成することと；
低モル濃度ショックバッファを準備することであって、高モル濃度のスラリーの浸透圧が低モル濃度のショックバッファの浸透圧よりも高いことと；
高モル濃度のスラリーを含み第１の流速を有する第１の流体流を生成することと；
低モル濃度ショックバッファを含み第２の流速を有する第２の流体流を生成することと；
前記第１および第２の流体流を連続的に混合して第３の流体流とすることであって、第２の流速は第１の流速よりも大きいことと；
関心対象のポリペプチドを第３の流体流から抽出することであって、ポリペプチド抽出物が、形成された発酵培養液と比較して関心対象のポリペプチドを少なくとも７０％有することと
を含む、関心対象の組換えポリペプチドを調製するための方法。
【請求項２】
前記溶液が、高い糖もしくは塩濃度からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記低モル濃度のショックバッファが、５〜９のｐＨを有する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞から浸透圧が放出される前または後に熱交換器を運用する(administering)ことをさらに含む、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記細胞から浸透圧が放出される前または後に溶媒を投与する(administering)ことをさらに含む、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記細胞から浸透圧が放出される前または後に化学的処置を施す(administering)ことをさらに含む、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
浸透圧によって細胞にショックを与えるための装置であって、前記装置が、
第１および第２のリザーバと；
第１の溶液中の細胞を含有する前記第１のリザーバと；
第２の溶液を含有する前記第２のリザーバとを備え；
前記第１の溶液は、前記第２の溶液の浸透圧よりも高く；
前記第１の溶液および前記細胞を含み第１の流速を有する第１の流体流を生成するための手段と；
前記第２の溶液を含み第２の流速を有する第２の流体流を生成するための手段と；
前記第１および第２の流体流を連続的に混合して第３の流体流とするための手段と
を備え、
連続的な浸透圧を適用するために前記第２の流速が前記第１の流速より大きい、装置。
【請求項８】
前記第１のリザーバが、バイオリアクターである、請求項７に記載の装置。
【請求項９】
前記細胞が、微生物細胞、植物細胞、動物細胞、昆虫細胞、真菌細胞、細菌細胞、哺乳類細胞、および酵母細胞からなる群より選択される、請求項７または８に記載の装置。
【請求項１０】
前記細胞が、シュードモナス属の種(Pseudomonas sp.)、大腸菌(E. coli)、クレブシエラ属の種(Klebsialla sp.)、サッカロマイセス属の種(Saccharomyces sp.)、ピキア属の種(Pichia sp.)、およびハンゼヌラ属の種(Hansenuela sp.)からなる群より選択される、請求項７または８に記載の装置。
【請求項１１】
前記細胞が、ペリプラズム空間を有する、請求項７または８に記載の装置。
【請求項１２】
前記細胞が、関心対象のタンパク質を産生する、請求項７または８に記載の装置。
【請求項１３】
前記第１の溶液が、前記第１の溶液中に０．５Ｍ〜１０Ｍのモル濃度で存在する第１の溶質セットを含み、前記第１の溶質セットが少なくとも１種類の溶質を含む、請求項７から１２のいずれかに記載の装置。
【請求項１４】
前記第２の溶液が、前記第２の溶液中に０Ｍ〜１Ｍのモル濃度で存在する第２の溶質セットを含み、前記第２の溶質セットが少なくとも１種類の溶質を含む、請求項７から１３のいずれかに記載の装置。
【請求項１５】
前記第２の溶質セットが、グリセロール、糖、または塩を含む、請求項１４に記載の装置。
【請求項１６】
前記糖または前記塩が、グルコース、スクロース、ナトリウムクロライド、ナトリウムスルフェート、ナトリウムホスフェート、ナトリウムニトラート、カリウムクロライド、カリウムスルフェート、カリウムホスフェート、カリウムニトラート、マグネシウムクロライド、マグネシウムスルフェート、マグネシウムホスフェート、マグネシウムニトラート、カルシウムクロライド、カルシウムスルフェート、カルシウムホスフェート、カルシウムニトラート、アンモウニウムスルフェート、およびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項１５に記載の装置。
【請求項１７】
前記第２の溶質セットが、スクロースまたはナトリウムクロライドを含む、請求項１４に記載の装置。
【請求項１８】
第１の流体流を生成するための前記手段および第２の流体流を生成するための前記手段が、前記第１のリザーバおよび／または第２のリザーバ中の孔に付加された管および／またはパイプを含む、請求項７から１７のいずれかに記載の装置。
【請求項１９】
前記第１および第２の流体流を混合するための前記手段が、Ｔ継手を含む、請求項７から１８のいずれかに記載の装置。
【請求項２０】
前記Ｔ継手が、
第１の入口、第２の入口および出口を備え；
前記第１の入口および前記出口が、実質的に一直線の流路を形成し；
前記第２の入口が、前記実質的に一直線の流路に対してほぼ直角に、前記実質的に一直線の流路への入口をもたらし；
前記第１の流体流が、前記第２の入口を通って前記Ｔ継手に入り；かつ
前記第２の流体流が、前記第１の入口を通って入る、請求項１９に記載の装置。
【請求項２１】
混合器をさらに含む、請求項７から２０のいずれかに記載の装置。
【請求項２２】
前記混合器がスタティックミキサーを含む、請求項２１に記載の装置。
【請求項２３】
遠心機、フィルター、または熱交換器をさらに含む、請求項７から２２のいずれかに記載の装置。
【請求項２４】
化学的処置の溶媒を添加するための場所をさらに含む、請求項７から２３のいずれかに記載の装置。
【請求項２５】
連続的な浸透圧ショックを発酵培地中に含まれる宿主細胞に加える手段をさらに含む、請求項７から２４のいずれかに記載の装置。
【請求項２６】
浸透圧によって細胞にショックを与える方法であって、前記方法が、
細胞を含む第１の溶液を準備することと；
第２の溶液を準備することと；ここで、前記第１の溶液のモル浸透圧濃度は前記第２の溶液のモル浸透圧濃度よりも高く；
前記第１の溶液を含み第１の流速を有する第１の流体流を生成することと；
前記第２の溶液を含み第２の流速を有する第２の流体流を生成することと；
前記第１および第２の流体流を連続的に混合して第３の流体流とすることと
を含み、
前記第２の流速が前記第１の流速より大きく、前記細胞のペリプラズム空間中のタンパク質が、バッチ処理によって浸透圧ショックを与えられた細胞から放出されるタンパク質より３０％多い収率で放出される、方法。
【請求項２７】
前記細胞が、微生物細胞、植物細胞、真菌細胞、細菌細胞、哺乳類細胞、および酵母細胞からなる群より選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記細胞が、シュードモナス属の種(Pseudomonas sp.)、大腸菌(E. coli)、クレブシエラ属の種(Klebsialla sp.)、サッカロマイセス属の種(Saccharomyces sp):、ピキア属の種(Pichia sp.)、およびハンゼヌラ属の種(Hansenuela sp.)からなる群より選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記細胞が、ペリプラズム空間を有し、前記細胞が、関心対象のタンパク質を産生する、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記第１の溶液が、前記第１の溶液中に０．５Ｍ〜１０Ｍのモル濃度で存在する第１の溶質セットを含み、前記第１の溶質セットが少なくとも１種類の溶質を含む、請求項２６から２９のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
前記第２の溶液が、前記第２の溶液中に０Ｍ〜１Ｍのモル濃度で存在する第２の溶質セットを含み、前記第２の溶質セットが少なくとも１種類の溶質を含む、請求項２６から３０のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
前記第１の溶質セットまたは前記第２の溶質セットが、糖または塩を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記糖または前記塩が、グルコース、スクロース、グリセロール、ナトリウムクロライド、ナトリウムスルフェート、ナトリウムホスフェート、ナトリウムニトラート、カリウムクロライド、カリウムスルフェート、カリウムホスフェート、カリウムニトラート、マグネシウムクロライド、マグネシウムスルフェート、マグネシウムホスフェート、マグネシウムニトラート、カルシウムクロライド、カルシウムスルフェート、カルシウムホスフェート、カルシウムニトラートアンモウニウムスルフェート、およびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記第１および第２の流体流を連続的に混合して前記第３の流体流とすることが、
前記第１の流体流の流路に沿って第１の流路を規定することと；
前記第１の流路と交差し、これまでの前記第１の流路に進まない、前記第１の流路に対してほぼ直角に第２の流路を規定して、前記第１および第２の流路の交点を形成することと；
前記第１および第２の流路の前記交点に接続された第３の流路を規定することであって、前記第３の流路と前記第１の流路が実質的に一直線の流路を形成する、ことと；
前記第１の溶液を前記第２の流路にもたらすことと；
前記第２の溶液を前記第１の流路にもたらすことと；
前記第１および第２の流路の前記交点で、前記第３の流体流が前記第３の流路から出るように、前記第１および第２の溶液を混合することと
を含む、請求項２６から３３のいずれかに記載の方法。
【請求項３５】
スタティックミキサーで前記第３の流体流を混合することをさらに含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記細胞が、関心対象のポリペプチドを産生し、前記細胞のペリプラズム空間の中に前記関心対象のポリペプチドを分泌する、請求項２６から３５のいずれかに記載の方法。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０００２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０００２】
本発明は一般にバイオテクノロジーの分野に関する。より具体的には、本発明は、細胞のペリプラズムからの分子の単離のための装置および方法に関する。
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０００３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０００３】
多数の市販のバイオプロセスにおいて、細胞内の内容物を放出するためには機械的細胞破壊が使用される。この手順は、全ての細胞内の内容物を放出してさらなる下流の単位操作に重要な課題をもたらす。細菌のペリプラズム空間（periplasmic space）におけるタンパク質分子に関して、完全な細胞破壊をせずにペリプラズム内容物（periplasmic contents）を選択的に放出するために実験室規模のバッチ式浸透圧ショック手順が用いられている。そのようなプロセスは、一般に、発酵培養液と高モル濃度の塩または糖溶液（浸漬バッファ）を平衡化して細胞内に高い浸透圧を樹立することにより開始される。この後に、ペリプラズム内容物を放出するための時間の限定された周期の間、バッチモードでの低いモル浸透圧濃度のバッファ（ショックバッファ）との混合が続く。放出に続いて、細胞が遠心分離により除去される。この伝統的なバッチ法は時間がかかり、その他の制限、例えばスケールアップが困難なこと、暴露時間を正確に制御すること、および処理量が少ないこと、を有する。これらの要素は、関心対象の分子を大規模放出するためのその適用性を制限する。そのようなものとして、これらの制限を克服する方法および装置は、当技術分野における改善点であると思われる。
【誤訳訂正４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０００４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０００４】
本発明の一実施形態では、関心対象の組換えポリペプチドを調製するための方法には、宿主細胞のペリプラズムの中へ関心対象のポリペプチドの分泌をもたらすことのできる組換え発現系で形質転換された宿主細胞を発酵させることが含まれる。発酵は、関心対象のポリペプチドが宿主細胞のペリプラズムの中に分泌されるような条件下、発酵培地中で行われる。関心対象のポリペプチドは、連続的な浸透圧ショックを発酵培地中に含まれる宿主細胞に加えることにより、ペリプラズムから抽出される。
【誤訳訂正５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０００７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０００７】
さらにもう一つの実施形態では、関心対象の組換えポリペプチドを細胞から単離する方法が開示される。この方法には、関心対象のポリペプチドを産生する細胞を含む第１の溶液を準備することが含まれ得る。この細胞は関心対象のポリペプチドを細胞のペリプラズム空間に分泌する。この方法には、第２の溶液を準備することがさらに含まれ得、この際、第１の溶液のモル浸透圧濃度は第２の溶液のモル浸透圧濃度よりも高い。この方法には、第１の溶液を含む第１の流体流を生成すること、第２の溶液を含む第２の流体流を生成すること、第１および第２の流体流を第３の流体流に混合すること、ならびに、第３の流体流
の中に、関心対象の組換えポリペプチドを細胞のペリプラズムから放出することがさらに含まれ得る。細胞は、その後、第３の流体流から取り出すことができる。
【誤訳訂正６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１１】
本発明の一実施形態によれば、関心対象の組換えポリペプチドを調製するための方法には、宿主細胞のペリプラズムの中へ関心対象のポリペプチドの分泌をもたらすことのできる組換え発現系で形質転換された宿主細胞を発酵させることが含まれる。発酵は、関心対象のポリペプチドが宿主細胞のペリプラズムの中に分泌されるような条件下、発酵培地中で行われる。関心対象のポリペプチドは、インターフェロン、インターロイキン、成長ホルモン、増殖因子、サイトカイン、酵素、酵素阻害剤、抗体および抗体フラグメントからなる群より選択されてもよい。関心対象のポリペプチドは、連続的な浸透圧ショックを発酵培地中に含まれる宿主細胞に加えることにより、ペリプラズムから抽出される。特定の実施形態によれば、連続的な浸透圧ショックを宿主細胞に加えることには、細胞を含む第１の溶液を準備すること、および第２の溶液を準備することが含まれ、この際、第１の溶液のモル浸透圧濃度は、第２の溶液の浸透圧よりも高い。第１の溶液を含む第１の流体流が生成され、前記第２の溶液を含む第２の流体流が生成される。次に、第１および第２の流体流は第３の流体流に混合される。連続的な浸透圧ショックは、高モル濃度のスラリーと低モル濃度のショックバッファの連続混合により達成され得る。高モル濃度のスラリーは、例えば、高い糖もしくは塩濃度からなる群より選択することができる。低モル濃度のショックバッファは、例えば、Ｔｒｉｓ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓおよびホスフェートからなる群より選択することができる。この方法には、所望により、浸透圧が細胞から放出される(released)前または後に熱交換剤を運用する(administering)こと、浸透圧が細胞から放出される前または後に溶媒を投与する(administering)こと、および細胞から浸透圧が放出される前または後に化学的処置を施す(administering)ことも含まれてもよい。
【誤訳訂正７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１８】
当業者には明らかなように、細胞１０８は、浸透圧ショックに供することを望まれる任意の種類の生体細胞であってもよい。浸透圧によってショックを与えることのできる細胞種の例としては、限定されるものではないが、微生物細胞、細菌細胞、酵母細胞、哺乳類細胞、昆虫細胞、動物細胞、植物細胞、シュードモナス属の種(Pseudomonas sp.)、大腸菌(E. coli)、クレブシエラ属の種(Klebsialla sp.)、サッカロマイセス属の種(Saccharomyces sp.)、ピキア属の種(Pichia sp.)、およびハンゼヌラ属の種(Hansenuela sp.)が挙げられる。細胞１０８には、ペリプラズム空間が含まれてよく、関心対象の分子を産生することもできる。特定の実施形態では、関心対象の分子はポリペプチドであってよく、細胞１０８はペリプラズム空間に局在する関心対象のポリペプチドを産生することができる。代表的な関心対象のポリペプチドは、例えば、インターフェロン、インターロイキン、成長ホルモン、増殖因子、サイトカイン、酵素、酵素阻害剤、抗体および抗体フラグメントからなる群より選択してもよい。
【誤訳訂正８】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２７】
通常の運転では、図２に表される装置は、ポンプ１２２Ａを用いて管１２０Ａを通って細胞１０８を含有する第１の溶液１０６をくみ上げ、第１の溶液１０６をＴ継手１２４に送出する。第２の溶液１１０も、ポンプ１２２Ｂを用いて管１２０Ｂを通ってくみ上げられ、Ｔ継手１２４に送出される。第１の溶液１０６、細胞１０８、および第２の溶液１１０はＴ継手１２４の中で混合される。細胞１０８は、第１の溶液１０６と第２の溶液１１０の組合せによって浸透圧ショックに供され、浸透圧ショックは、細胞のペリプラズム空間中の分子の周囲の溶液への放出をもたらす。第１の溶液１０６、細胞１０８、および第２の溶液１１０の組合せの結果生じる溶液は、ミキサー１２６を通過し、かつ浄化装置１３０の上を通過する。
【誤訳訂正９】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２８】
本発明の実施形態例は、関心対象の組換えポリペプチドを単離する方法を提供する。この方法には、関心対象の組換えポリペプチドを産生する細胞を増殖または発酵させることが含まれ、該細胞は関心対象の組換えポリペプチドを細胞のペリプラズムに分泌する。細胞は、高モル浸透圧濃度溶液中でインキュベートされる。高モル浸透圧濃度溶液中の細胞の流体流は、低モル浸透圧濃度溶液の流体流と混合されて、新しい流体流を形成し、この際、高モル浸透圧濃度溶液中の細胞を低浸透圧溶液の流体流と混合することにより、細胞に関心対象の組換えポリペプチドを新しい流体流に放出させる。新しい流体流は、次に混合され（例えば、スタティックミキサーで）、次に細胞は、浄化するための機器、例えばフィルターまたは遠心機などを用いて関心対象の組換えポリペプチドを含有する新しい流体流から分離される。
【誤訳訂正１０】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２９】
当業者には明らかなように、細胞は、関心対象のポリペプチドを自然に発現し、それをペリプラズム空間に分泌する、または細胞に構築物を含めるように操作し、それをゲノムに統合して、関心対象のポリペプチドを産生し、それをペリプラズム空間に分泌させることができる。
【誤訳訂正１１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３２】
ペリプラズム空間でヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）を発現しているシュードモナス・フルオレセンス(Pseudomonas fluoresescens)細菌株（ＤＣ４５６）を使用した。２０Ｌのバイオリアクター規模での発酵の後、実験室のバッチ遠心機で培養液を遠心した。細胞ペースト（３８１１ｇ）を３．５Ｌの浸漬バッファ（２５％のスクロース、ｐＨ７．２）と３０分間混合した。ショックバッファは、２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．２からなった。流体流の組合せによる浸透圧ショックのための構成は、２つの流れ（平衡化した細胞スラリーおよびショックバッファ）を連続的に流すための２つの蠕動ポンプ（Ｍａｓｔｅｒｆｌｅｘ  Ｌ／Ｓ、モデル＃７７２００−６２）からなり、２つの流れはＴ継手、それに続いて、液体抽出物から細胞を分離するための連続的ディスクスタック遠心機（Ｗｅｓｔｆａｌｉａ  ＳＣ−６）に取り付けられている、２つの流れを急速に混合するためのスタティックミキサー（Ｃｏｎｐｒｏｔｅｃ、ＦＭ  ０８−１０−３６）を用いて混合される。平衡化された細胞スラリーとショックバッファの流速は、それぞれ２００ｍＬ／分および８００ｍＬ／分であった。供給および抽出物流からのサンプル中のｈＧＨの量を、キャピラリー電気泳動（ｃａｌｉｐｅｒ  ＬａｂＣｈｉｐ  ９０）により測定した。この方法のこの工程の収率（抽出物中のｈＧＨの量を発酵培養液中のｈＧＨの量で除算した値）は約７０％であった。
【実施例２】
【誤訳訂正１２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３４】
ペリプラズム空間でヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）を発現しているシュードモナス・フルオレセンス(Pseudomonas fluoresescens)細菌株（ＤＣ４５６）を使用した。２０Ｌのバイオリアクター規模での発酵の後、実験室のバッチ遠心機で培養液を遠心した。細胞ペースト（１５０〜２２５ｇ）を１５０〜２２５ｇの浸漬バッファ（２０ｍＭのＢｉｓ−Ｔｒｉｓを含む２５％のスクロース、ｐＨ７．２）と３０分間混合した。平衡化されたスラリーを４倍量のショックバッファ（２０ｍＭのＢｉｓ−Ｔｒｉｓ、ｐＨ７.２）と混合し、３０分間維持し、実験室のバッチ遠心機（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）で遠心した。供給および抽出物流からのサンプル中のｈＧＨの量を、キャピラリー電気泳動（ｃａｌｉｐｅｒ  ＬａｂＣｈｉｐ  ９０）により測定した。この方法のこの工程の収率（抽出物中のｈＧＨの量を発酵培養液中のｈＧＨの量で除算した値）は約４０％であった。
【誤訳訂正１３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３５】
本発明は特定の実施形態で説明されてきたが、本発明は、本開示の精神および範囲の中でさらに変更されてもよい。従ってこの適用は、その一般原則を用いる本発明のあらゆる変化例、使用例、または適合例を網羅することが意図される。さらに、本願は、本発明の属する当技術分野で公知または慣用され、添付される特許請求の範囲内に入る、本開示からの逸脱を網羅することが意図される。
本発明は、以下の態様を含むものである。
＜１＞  宿主細胞のペリプラズムの中へ関心対象のポリペプチドの分泌をもたらすことのできる組換え発現系で形質転換された宿主細胞を発酵させることであって、前記発酵が、関心対象の前記ポリペプチドが前記宿主細胞のペリプラズムの中に分泌されるような条件下、発酵培地で行われることと；
連続的な浸透圧ショックを前記発酵培地中に含まれる前記宿主細胞に加えることにより、関心対象のポリペプチドを前記ペリプラズムから抽出することと
を含む、関心対象の組換えポリペプチドを調製するための方法である。
＜２＞  連続的な浸透圧ショックを前記宿主細胞に加えることが、
細胞を含む第１の溶液を準備することと；
第２の溶液を準備することであって；
前記第１の溶液のモル浸透圧濃度が、前記第２の溶液の浸透圧よりも高いことと；
前記第１の溶液を含む第１の流体流を生成することと；
前記第２の溶液を含む第２の流体流を生成することと；
前記第１および第２の流体流を混合して第３の流体流とすることと
を含む、上記＜１＞に記載の方法である。
＜３＞  前記連続的な浸透圧ショックが、高モル濃度のスラリーと低モル濃度のショックバッファの連続混合を含む、上記＜１＞または＜２＞に記載の方法である。
＜４＞  前記高モル濃度のスラリーが、高い糖もしくは塩濃度からなる群より選択される、上記＜３＞に記載の方法である。
＜５＞  前記低モル濃度のショックバッファが、５〜９のｐＨを有する、上記＜３＞に記載の方法である。
＜６＞  前記細胞から浸透圧が放出される前または後に熱交換器を運用する(administering)ことをさらに含む、上記＜１＞から＜５＞のいずれかに記載の方法である。
＜７＞  前記細胞から浸透圧が放出される前または後に溶媒を投与する(administering)ことをさらに含む、上記＜１＞から＜５＞のいずれかに記載の方法である。
＜８＞  前記細胞から浸透圧が放出される前または後に化学的処置を施す(administering)ことをさらに含む、上記＜１＞から＜５＞のいずれかに記載の方法である。
＜９＞  浸透圧によって細胞にショックを与えるための装置であって、前記装置が、
第１および第２のリザーバと；
第１の溶液中の細胞を含有する前記第１のリザーバと；
第２の溶液を含有する前記第２のリザーバとを備え；
前記第１の溶液は、前記第２の溶液の浸透圧よりも高く；
前記第１の溶液および前記細胞を含む第１の流体流を生成するための手段と；
前記第２の溶液を含む第２の流体流を生成するための手段と；
前記第１および第２の流体流を混合して第３の流体流とするための手段と
を備える、装置である。
＜１０＞  前記第１のリザーバが、バイオリアクターである、上記＜９＞に記載の装置である。
＜１１＞  前記細胞が、微生物細胞、植物細胞、動物細胞、昆虫細胞、真菌細胞、細菌細胞、哺乳類細胞、および酵母細胞からなる群より選択される、上記＜９＞または＜１０＞に記載の装置である。
＜１２＞  前記細胞が、シュードモナス属の種(Pseudomonas sp.)、大腸菌(E. coli)、クレブシエラ属の種(Klebsialla sp.)、サッカロマイセス属の種(Saccharomyces sp.)、ピキア属の種(Pichia sp.)、およびハンゼヌラ属の種(Hansenuela sp.)からなる群より選択される、上記＜９＞または＜１０＞に記載の装置である。
＜１３＞  前記細胞が、ペリプラズム空間を有する、上記＜９＞または＜１０＞に記載の装置である。
＜１４＞  前記細胞が、関心対象のタンパク質を産生する、上記＜９＞または＜１０＞に記載の装置である。
＜１５＞  前記第１の溶液が、前記第１の溶液中に０．５Ｍ〜１０Ｍのモル濃度で存在する第１の溶質セットを含み、前記第１の溶質セットが少なくとも１種類の溶質を含む、上記＜９＞から＜１４＞のいずれかに記載の装置である。
＜１６＞  前記第２の溶液が、前記第２の溶液中に０Ｍ〜１Ｍのモル濃度で存在する第２の溶質セットを含み、前記第２の溶質セットが少なくとも１種類の溶質を含む、上記＜９＞から＜１５＞のいずれかに記載の装置である。
＜１７＞  前記第２の溶質セットが、グリセロール、糖、または塩を含む、上記＜１６＞に記載の装置である。
＜１８＞  前記糖または前記塩が、グルコース、スクロース、ナトリウムクロライド、ナトリウムスルフェート、ナトリウムホスフェート、ナトリウムニトラート、カリウムクロライド、カリウムスルフェート、カリウムホスフェート、カリウムニトラート、マグネシウムクロライド、マグネシウムスルフェート、マグネシウムホスフェート、マグネシウムニトラート、カルシウムクロライド、カルシウムスルフェート、カルシウムホスフェート、カルシウムニトラート、アンモウニウムスルフェート、およびそれらの組合せからなる群より選択される、上記＜１７＞に記載の装置である。
＜１９＞  前記第２の溶質セットが、スクロースまたはナトリウムクロライドを含む、上記＜１６＞に記載の装置である。
＜２０＞  第１の流体流を生成するための前記手段および第２の流体流を生成するための前記手段が、前記第１のリザーバおよび／または第２のリザーバ中の孔に付加された管および／またはパイプを含む、上記＜９＞から＜１９＞のいずれかに記載の装置である。
＜２１＞  前記第１および第２の流体流を混合するための前記手段が、Ｔ継手を含む、上記＜９＞から＜２０＞のいずれかに記載の装置である。
＜２２＞  前記Ｔ継手が、
第１の入口、第２の入口および出口を備え；
前記第１の入口および前記出口が、実質的に一直線の流路を形成し；
前記第２の入口が、前記実質的に一直線の流路に対してほぼ直角に、前記実質的に一直線の流路への入口をもたらし；
前記第１の流体流が、前記第２の入口を通って前記Ｔ継手に入り；かつ
前記第２の流体流が、前記第１の入口を通って入る、上記＜２１＞に記載の装置である。
＜２３＞  混合器をさらに含む、上記＜９＞から＜２２＞のいずれかに記載の装置である。
＜２４＞  前記混合器がスタティックミキサーを含む、上記＜２３＞に記載の装置である。
＜２５＞  遠心機、フィルター、または熱交換器をさらに含む、上記＜９＞から＜２４＞のいずれかに記載の装置である。
＜２６＞  化学的処置の溶媒を添加するための場所をさらに含む、上記＜９＞から＜２５＞のいずれかに記載の装置である。
＜２７＞  連続的な浸透圧ショックを発酵培地中に含まれる宿主細胞に加える手段をさらに含む、上記＜９＞から＜２６＞のいずれかに記載の装置である。
＜２８＞  浸透圧によって細胞にショックを与える方法であって、前記方法が、
細胞を含む第１の溶液を準備することと；
第２の溶液を準備することとを含み；
前記第１の溶液のモル浸透圧濃度は前記第２の溶液のモル浸透圧濃度よりも高く；
前記第１の溶液を含む第１の流体流を生成することと；
前記第２の溶液を含む第２の流体流を生成することと；
前記第１および第２の流体流を連続的に混合して第３の流体流とすることと
を含む、方法である。
＜２９＞  前記細胞が、微生物細胞、植物細胞、真菌細胞、細菌細胞、哺乳類細胞、および酵母細胞からなる群より選択される、上記＜２８＞に記載の方法である。
＜３０＞  前記細胞が、シュードモナス属の種(Pseudomonas sp.)、大腸菌(E. coli)、クレブシエラ属の種(Klebsialla sp.)、サッカロマイセス属の種(Saccharomyces sp):、ピキア属の種(Pichia sp.)、およびハンゼヌラ属の種(Hansenuela sp.)からなる群より選択される、上記＜２９＞に記載の方法である。
＜３１＞  前記細胞が、ペリプラズム空間を有し、前記細胞が、関心対象のタンパク質を産生する、上記＜２８＞に記載の方法である。
＜３２＞  前記第１の溶液が、前記第１の溶液中に０．５Ｍ〜１０Ｍのモル濃度で存在する第１の溶質セットを含み、前記第１の溶質セットが少なくとも１種類の溶質を含む、上記＜２８＞から＜３１＞のいずれかに記載の方法である。
＜３３＞  前記第２の溶液が、前記第２の溶液中に０Ｍ〜１Ｍのモル濃度で存在する第２の溶質セットを含み、前記第２の溶質セットが少なくとも１種類の溶質を含む、上記＜２８＞から＜３２＞のいずれかに記載の方法である。
＜３４＞  前記第１の溶質セットまたは前記第２の溶質セットが、糖または塩を含む、上記＜３２＞または＜３３＞に記載の方法である。
＜３５＞  前記糖または前記塩が、グルコース、スクロース、グリセロール、ナトリウムクロライド、ナトリウムスルフェート、ナトリウムホスフェート、ナトリウムニトラート、カリウムクロライド、カリウムスルフェート、カリウムホスフェート、カリウムニトラート、マグネシウムクロライド、マグネシウムスルフェート、マグネシウムホスフェート、マグネシウムニトラート、カルシウムクロライド、カルシウムスルフェート、カルシウムホスフェート、カルシウムニトラートアンモウニウムスルフェート、およびそれらの組合せからなる群より選択される、上記＜３４＞に記載の方法である。
＜３６＞  前記第１および第２の流体流を前記第３の流体流に混合することが、
前記第１の流体流の流路に沿って第１の流路を規定することと；
前記第１の流路と交差し、これまでの前記第１の流路に進まない、前記第１の流路に対してほぼ直角に第２の流路を規定して、前記第１および第２の流路の交点を形成することと；
前記第１および第２の流路の前記交点に接続された第３の流路を規定することであって、前記第３の流路と前記第１の流路が実質的に一直線の流路を形成する、ことと；
前記第１の溶液を前記第２の流路にもたらすことと；
前記第２の溶液を前記第１の流路にもたらすことと；
前記第１および第２の流路の前記交点で、前記第３の流体流が前記第３の流路から出るように、前記第１および第２の溶液を混合することと
を含む、上記＜２８＞から＜３５＞のいずれかに記載の方法である。
＜３７＞  前記第２の溶液が、前記第１の溶液が前記第１および第２の流路の前記交点にもたらされるよりもより速い速度で、前記第１および第２の流路の前記交点にもたらされる、上記＜３６＞に記載の方法である。
＜３８＞  スタティックミキサーで前記第３の流体流を混合することをさらに含む、上記＜３６＞または＜３７＞に記載の方法である。
＜３９＞  前記細胞が、関心対象のポリペプチドを産生し、前記細胞のペリプラズム空間の中に前記関心対象のポリペプチドを分泌する、上記＜２８＞から＜３８＞のいずれかに記載の方法である。