【手続補正書】
【提出日】平成26年4月9日(2014.4.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）少なくとも１つの少なくとも部分的に精製された眼の抗原を含む少なくとも１つのサンプルを与えるステップと、
（ｂ）ステップａ）において与えられた前記眼の抗原サンプルの少なくとも１つと体液を反応させるステップと、
（ｃ）少なくとも１つの眼の抗原サンプルについて自己免疫反応性値を決定するよう前記体液における自己抗体と前記眼の抗原サンプルの少なくとも１つとの間の前記ステップｂ）の反応を検出および／または定量化するステップと、
（ｄ）少なくとも１つの眼の抗原サンプルについて緑内障スコアを決定するよう、測定された自己免疫反応性値を緑内障患者および／または健康な人から得られた標準データと比較するステップと、
（ｅ）任意で、前記少なくとも１つの緑内障スコアの評価により診断結果を決定するステップとを含む、緑内障の診断方法であって、
ステップａ）において、少なくとも１つの部分的に精製された眼の抗原を含む少なくとも２つのサンプル、または少なくとも２つの部分的に精製された眼の抗原を含む少なくとも１つのサンプルが与えられ、
任意で、ステップａ）〜ｅ）の少なくとも１つにおいて、前記眼の抗原サンプルの少なくとも１つまたは少なくとも１つの眼の抗原に対する前記自己免疫反応性の前記診断結果への寄与を調整するよう重み付け係数が割り当てられる、緑内障の診断方法。
【請求項２】
少なくとも１つの重み付け係数が、ステップ（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）の少なくとも１つの間に適用されるアルゴリズムにより前記眼の抗原サンプルの少なくとも１つに割り当てられ、および／または
少なくとも１つの重み付け係数が前記体液との反応のために与えられた個々の眼の抗原の量を重み付けすることによって導入されるか、または前記反応のために与えられた体液の量が重み付けされる、請求項１に記載の緑内障の診断方法。
【請求項３】
前記眼の抗原の少なくとも１つのサンプルは、
アクチン、アルブミン、α−１−アンチトリプシン、アネキシンＩ−ＩＶ、アネキシンＶ、β−２−アドレナリン受容体、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、カルレティキュリン、カルジオリピン、α−Ａ−クリスタリン、α−Ｂ−クリスタリン、β−Ｌ−クリスタリン、β−Ｓ−クリスタリン、γ−クリスタリン、ＤＮＡトポイソメラーゼ１、フィブロネクチン、α−フォドリン（＝スペクトリン）、グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、熱ショックタンパク質ＨＳＰ１０（＝シャペロニン）、ＨＳＰ２７、ＨＳＰ６０、ＨＳＰ７０、インスリン、ｊｏ−１、リゾチーム、ミエリン結合タンパク質（ＭＢＰ）、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）、ミオグロビン、ニューロン特異エノラーゼ（ＮＳＥ）、ニューロトロフィン３、ニューロトロフィン４、ニューロトロフィン５、パーオキシドジスムターゼ、３−ホスホセリン、プレアルブミン、プロテインキナーゼＣ阻害剤、プロテインキナーゼＣ、スーパーオキシドジスムターゼ、α−シヌクレイン、γ−シヌクレイン、チレオグロブリン、トランスフェリン、トランスチレチン、トポイソメラーゼ阻害剤、ユビキチン、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、ビメンチンといった４８個の少なくとも部分的に精製された眼の抗原の群１のうちの少なくとも２つの抗原を含む、請求項１または２に記載の緑内障の診断方法。
【請求項４】
前記眼の抗原サンプルの少なくとも１つのサンプルは、
アクチン、α−１−アンチトリプシン、アネキシンＶ、α−Ａ−クリスタリン、α−Ｂ−クリスタリン、β−Ｌ−クリスタリン、β−Ｓ−クリスタリン、γ−クリスタリン、α−フォドリン（＝スペクトリン）、グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、ＨＳＰ２７、ＨＳＰ６０、ＨＳＰ７０、ｊｏ−１、ミエリン結合タンパク質（ＭＢＰ）、ニューロン特異エノラーゼ（ＮＳＥ）、プロテインキナーゼＣ阻害剤、スーパーオキシドジスムターゼ、トランスフェリン、トランスチレチン、ユビキチン、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、ビメンチンといった２４個の眼の抗原の群Ａから選択される少なくとも２つの抗原を含むか、または
前記眼の抗原の少なくとも１つのサンプルは、群Ａおよび／またはアネキシンＩ−ＩＶ、β−２−アドレナリン受容体、カルレティキュリン、熱ショックタンパク質ＨＳＰ１０（＝シャペロニン）、インスリン、パーオキシドジスムターゼ、プロテインキナーゼＣ、α−シヌクレイン、γ−シヌクレインといった９個の追加の眼の抗原の群Ｂのいずれかから選択される少なくとも２つの抗原を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の緑内障の診断方法。
【請求項５】
前記少なくとも部分的に精製された眼の抗原の少なくとも１つのサンプルは、
アルブミン、α−１−アンチトリプシン、アネキシンＩ−ＩＶ、アネキシンＶ、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、カルレティキュリン、カルジオリピン、β−Ｌ−クリスタリン、β−Ｓ−クリスタリン、γ−クリスタリン、ＤＮＡトポイソメラーゼ１、フィブロネクチン、熱ショックタンパク質ＨＳＰ１０（＝シャペロニン）、インスリン、ｊｏ−１、リゾチーム、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）、ミオグロビン、ニューロトロフィン３、ニューロトロフィン４、ニューロトロフィン５、パーオキシドジスムターゼ、３−ホスホセリン、プレアルブミン、プロテインキナーゼＣ阻害剤、プロテインキナーゼＣ、スーパーオキシドジスムターゼ、α−シヌクレイン、チレオグロブリン、トランスフェリン、トランスチレチン、トポイソメラーゼ阻害剤、ユビキチン、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）といった３４個の眼の抗原の群２のうち少なくとも１つの眼の抗原を含む、請求項１または２に記載の緑内障の診断方法。
【請求項６】
前記少なくとも部分的に精製された眼の抗原の少なくとも１つのサンプルは、
アルブミン、α−１−アンチトリプシン、アネキシンＩ−ＩＶ、アネキシンＶ、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、カルレティキュリン、カルジオリピン、β−Ｌ−クリスタリン、β−Ｓ−クリスタリン、γ−クリスタリン、ＤＮＡトポイソメラーゼ１、フィブロネクチン、熱ショックタンパク質ＨＳＰ１０（＝シャペロニン）、インスリン、ｊｏ−１、リゾチーム、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）、ミオグロビン、ニューロトロフィン３、ニューロトロフィン４、ニューロトロフィン５、パーオキシドジスムターゼ、３−ホスホセリン、プレアルブミン、プロテインキナーゼＣ阻害剤、プロテインキナーゼＣ、スーパーオキシドジスムターゼ、α−シヌクレイン、チレオグロブリン、トランスフェリン、トポイソメラーゼ阻害剤、ユビキチンの眼の抗原のうち少なくとも１つの眼の抗原を含む、請求項１または２に記載の緑内障の診断方法。
【請求項７】
前記少なくとも部分的に精製された眼の抗原の少なくとも１つのサンプルは、
α−１−アンチトリプシン、アネキシンＩ−ＩＶ、アネキシンＶ、カルレティキュリン、β−Ｌ−クリスタリン、β−Ｓ−クリスタリン、γ−クリスタリン、熱ショックタンパク質ＨＳＰ１０（＝シャペロニン）、インスリン、ｊｏ−１、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）、パーオキシドジスムターゼ、プレアルブミン、プロテインキナーゼＣ阻害剤、プロテインキナーゼＣ、スーパーオキシドジスムターゼ、α−シヌクレイン、トランスフェリン、トランスチレチン、ユビキチンの眼の抗原のうち少なくとも１つの眼の抗原を含む、請求項１または２に記載の緑内障の診断方法。
【請求項８】
前記部分的に精製された眼の抗原の少なくとも２つのサンプルが、抗原担持要素の上に担持され、および
特に、体液が、マイクロアレイチップ上で、ラテラルフローテストストリップ上で、マイクロ流体チップ上で、または他の流体のもしくはビーズベースのアッセイで、抗原と反応し、および
特に、１０よりも少ない眼の抗原が、抗原担持要素の上に担持され、および
特に、体液が涙であり、および／または体液が、収集され、乾燥され、任意で保存され、その後、ステップｂ）における使用のために戻される、
請求項１〜６のいずれかに記載の緑内障の診断方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の緑内障の診断方法のための抗原担持要素であって、少なくとも１つの少なくとも部分的に精製された眼の抗原の少なくとも１つのサンプルを担持する、抗原担持要素。
【請求項１０】
少なくとも部分的に精製された眼の抗原の少なくとも１つのサンプルが、請求項５〜７のいずれか１つに記載の抗原から選択される少なくとも１つの抗原を含む、抗原担持要素。
【請求項１１】
抗原ゾーンと体液のための受取ゾーンとを含む、請求項９または１０に記載の抗原担持要素であって、
特に、前記受取ゾーンは、涙または他の体液を収集するための吸収材料を含み、任意で患者に直接的に接触するように設計される、抗原担持要素。
【請求項１２】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の診断方法のための、および／または請求項９〜１１のいずれか１項に記載の抗原担持要素を含む、緑内障の診断のためのキット。
【請求項１３】
緑内障の診断のための、請求項５〜７のいずれか１つに記載の眼の抗原、当該眼の抗原の１つ以上の任意の組み合せ、またはこれら抗原に特異的な抗体のいずれか、または特に緑内障の診断のための、担持要素上のこれらの抗原または抗体のいずれか。
【請求項１４】
治療処置における、特に緑内障の治療における使用のための、請求項５〜７のいずれか１つに記載の眼の抗原、当該眼の抗原の１つ以上の任意の組み合せ、またはこれらの抗原のいずれかに特異な抗体のいずれか。
【請求項１５】
医療処置または緑内障の治療のための組成物における使用のための、請求項５〜７のいずれか１つに記載の眼の抗原、当該眼の抗原の１つ以上の任意の組み合せ、またはこれらの抗原のいずれかに特異な抗体のいずれか。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９３】
【図１】接触印刷（Ａ）とピエゾベースのスポット配置技術（Ｂ）とによって生成される抗ヒトＩｇＧ／Ａ／Ｍの折り返されるスポットの図である。
【図２Ａ】研究用マイクロアレイ上の眼の抗原について項目化された変動係数（ＣＶ）の図である。
【図２Ｂ】研究用マイクロアレイ上の異なる抗原について項目化された標準偏差（ＳＤ）の図である。
【図３】４つの異なる抗原についての異なるデータ処理から得られるデータの比較の図である。生データ（Ａ）、ＡＵＣデータ（Ｂ）、およびＺスコアデータ（Ｃ）がリスト化される。
【図４】対照の人（ＣＴＲＬ）および原発性開放隅角緑内障（ＰＯＡＧ）患者の血清（Ａ）および眼房水（Ｂ）とともにインキュベートされた２０の抗原についての平均化された抗原強度のプロファイルの図である。
【図５】健康な対照の人（ＣＴＲＬ）および緑内障患者（ＰＯＡＧ）についての抗ヒトＩｇＧ／Ａ／Ｍに関する箱ひげ図である。
【図６】図６Ａおよび図６Ｂは血清および眼房水の抗体反応性の散布図である。図６Ｃは見込みのある血清サンプルについての受信者動作特性を示す。
【図７】対照群およびＰＯＡＧサンプルについての血清および眼房水の免疫反応性値の個人間の比較の図である。
【図８】ＧＯアノテーションによる生物学的機能分析により、血清サンプルにおける研究対象群同士の間の有意差を示す、眼の抗原についての超幾何学的モデルによる計算によっていくつかの大きな比率を占める項目が明らかになった図である。
【図９】緑内障患者の典型的な抗体パターンの図である。
【図１０】マイクロアレイデータの週ごとの再現性の図である。
【図１１】緑内障の第２の診断方法の好ましい実施形態のためのセットアップの、実施例１〜３のために用いられた簡易な概略図を与える図である。神経網膜の神経節細胞が実験プレートに配置された。健康な人またはＰＯＡＧ（原発性開放隅角緑内障）、ＮＴＧ（正常眼圧緑内障）、もしくはＯＨＴ（高眼圧症）を患う患者からの１０％の血清を含む培地が加えられ、細胞は標準圧力または１５０００パスカルの上昇された圧力のいずれかで４８時間３７℃にてインキュベートされた。細胞は溶解され、タンパク質はアセトン沈殿により分離された。タンパク質プロファイルはＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析を用いて測定され、次いで統計的に分析された。
【図１２ａ】測定されたタンパク質プロファイルの分画を示す図である。合計タンパク質プロファイルは約４００の異なるタンパク質クラスタを数えた。示された分画では、ｘ軸はダルトンで分子量を示し、ｙ軸は細胞におけるタンパク質の発現レベルの強度を示した。ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって測定された、タンパク質クラスタの非常に複雑な合計タンパク質プロファイルは、３０７８ダルトン（Ｄａ）〜１８３２２２Ｄａの範囲にあった。ここで示される分画は、４９４３Ｄａ〜２１９３４Ｄａの範囲にあり、細胞におけるタンパク質の複雑性の概略を与える。
【図１２ｂ】プロファイルの単なる視覚分析によって差を識別する困難さを明らかにするいくつかの単一測定を示す図である。サンプルプロファイルは、上昇された圧力が存在する状態または存在しない状態で健康な血清またはＰＯＡＧ血清で処理された細胞に由来する。Ｘ軸はタンパク質の分子量をダルトンで示し、Ｙ軸は細胞における測定されたタンパク質の強度を示す。プロファイルは数百のタンパク質を示すので視覚的にそれらを検査することによってだけでは実験群同士の間の差を分析することはできなかった。
【図１３】分子量が９１９２ダルトン、１２３９０ダルトン、および１２３１４ダルトンである計算されたバイオマーカのいくつかの変動性プロットを示す図である。ｘ軸は細胞の異なる処理群を示す。ｙ軸はＳＥＬＤＩ  ＴＯＦ質量分析によって測定されるタンパク質の強度を示す。プロットにおける各三角形は特定の群の１つのサンプルを示す。変動性プロットは、これらの３つのバイオマーカのタンパク質発現が、ＰＯＡＧ血清とともにインキュベートされた細胞において、健康な血清とともにインキュベートされた細胞と比較して変化（増加または減少）されることを示す。
【図１４】分散分析を示すグラフの図である。図１４ａは、健康な人またはＰＯＡＧ患者の血清および環境の圧力または上昇された圧力を用いた場合の、細胞のタンパク質プロファイルに対する細胞のさまざまな処理の影響を示す。明らかに血清タイプは、タンパク質プロファイルに対して５９．１％の非常に大きな影響を有し、上昇された圧力が組み合された場合にはそこにはさらに１４％が加えられ得る（組合せ１＋２）。圧力自体は、細胞のタンパク質プロファイルに対して１１．６％の影響を有する。図１４ｂは、１つの選択された特定のバイオマーカ、すなわち９１９２のバイオマーカに対して異なる処理の変動の影響を示すグラフの図である。この影響は非常に類似している。
【図１５ａ】５０．５％を有するタンパク質プロファイルに対するＰＯＡＧ血清における抗体の存在の影響を計算する分散分析（ＡＮＯＶＡ）を示す図である。ＰＯＡＧ血清または健康な対照からの血清を意味する血清タイプが１３．４％の付加的な影響を有した。
【図１５ｂ】対照血清とともにインキュベートされた細胞に対する、抗体が存在するまたは存在しない状態でのＰＯＡＧ血清とともにインキュベートされた細胞の全体のタンパク質プロファイルの比較をマハラノビス距離が示す図である。ポイントゼロからの増加する距離が、健康な血清とともにインキュベートされた細胞のタンパク質プロファイルと比較してＰＯＡＧ患者の血清とともにインキュベートされた細胞のタンパク質プロファイルにおいて増加する差を示す。ＰＯＡＧ血清とともにインキュベートされた細胞のタンパク質プロファイルは、約５５のマハラノビス距離に示されるように、約２０のマハラノビス距離によって示される抗体が取り除かれた（ＰＯＡＧ−抗体）ＰＯＡＧ血清とともにインキュベートされた細胞のタンパク質プロファイルよりも、対照血清とともにインキュベートされたタンパク質プロファイルと有意により大きく異なる。
【図１６ａ】圧力が存在するまたは存在しない状態で健康な血清、ＰＯＡＧ血清、またはＮＴＧ血清とともにインキュベートされた細胞からの測定されたタンパク質プロファイルの分画を示す図である。Ｘ軸はタンパク質の分子量をダルトンで示し、Ｙ軸は細胞におけるタンパク質の測定された強度を示す。ＰＯＡＧ血清と比較して、細胞はＮＴＧ血清に対して異なって反応することは明らかである。
【図１６ｂ】９２０７ダルトンのバイオマーカを示す図である。ｘ軸は実験群を示し、ｙ軸はサンプルにおけるタンパク質の測定された強度を示す。緑内障群は、緑内障血清、したがってＰＯＡＧ血清またはＮＴＧ血清とともにインキュベートされたすべての細胞を含む。緑内障血清とともにインキュベートされた細胞において９２０７ダルトンのバイオマーカがアップレギュレートされることは明らかである。
【図１７】緑内障血清、すなわちＰＯＡＧ血清またはＮＴＧ血清とともにインキュベートされた細胞の測定されたタンパク質プロファイルに基づき計算された受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を示す図である。感度が８８％であり特異度が９０％にて、非緑内障血清からの緑内障血清の区別を示す。当該テストの正確さについてのパラメータである曲線下面積はｒ：０．９２である。
【図１８】異なる濃度の１４−３−３抗体と１．５μＭのスタウロスポリン（ｓｔａ）のストレスとを用いるインキュベーションの後のＲＧＣ５細胞の生存度を示す図である。Ｘ軸は実験群を示し、Ｙ軸はパーセントで細胞の生存度を示す。対照細胞（ダークグレーのバー）は、細胞ストレスも抗体もなしでインキュベートされる。スタウロスポリンとともにインキュベートされた細胞は、１６．１％の生存度の損失を示す。スタウロスポリンとともにインキュベートされ、１４−３−３抗体とともにプレインキュベートされた細胞は、スタウロスポリンとともにインキュベートした細胞と比較して、１１．６％までの生存度の有意（ｐ＜０．０５）から非常に有意（ｐ＜０．０１）な増加を示す（抗体濃度０．５μｇ／ｍｌ）。
【図１９】異なる濃度のγ−シヌクレイン抗体と５０μＭのＨ２Ｏ２であるストレスとを用いたインキュベーション（１ｈ）の後のＲＧＣ５細胞の生存度を示す図である。Ｘ軸は実験群を示し、Ｙ軸はパーセントで細胞の生存度を示す。対照細胞は、細胞ストレスも抗体もなしでインキュベートされた。Ｈ２Ｏ２とともにインキュベートされた細胞は、１７．９％の生存度の損失を示す。Ｈ２Ｏ２とともにインキュベートされ、γ−シヌクレイン抗体とともにプレインキュベートされた細胞は、Ｈ２Ｏ２とともにインキュベートした細胞と比較して、１５．３％までの生存度の有意（ｐ＜０．０５）から非常に有意（ｐ＜０．０１）な増加を示す（抗体濃度０．０５μｇ／ｍｌ）。
【図２０】異なる濃度のＧＦＡＰ抗体と５０μＭＨ２Ｏ２であるストレスとを用いたインキュベーション（１ｈ）の後のＲＧＣ５細胞の生存度を示す図である。Ｘ軸は、実験群を示し、Ｙ軸はパーセントで細胞の生存度を示す。対照細胞は、細胞ストレスも抗体もなしでインキュベートされた。Ｈ２Ｏ２とともにインキュベートされた細胞は７．４％の生存度の損失を示し、Ｈ２Ｏ２とともにインキュベートされ、ＧＦＡＰ抗体とともにプレインキュベートされた細胞は、Ｈ２Ｏ２とともにインキュベートされた細胞と比較して、９．８％までの生存度の有意（ｐ＜０．０５）な増加を示す（抗体濃度０．５μｇ／ｍｌ）。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１４】
図３：４つの異なる抗原について異なるデータ処理から得られたデータの比較。生データ（Ａ）、ＡＵＣデータ（Ｂ）、およびＺスコアデータ（Ｃ）がリスト化されている。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２２】
図７：血清および眼房水免疫反応性の個人間の比較。Ｘ軸に抗原がリスト化される。Ｙ軸は、測定されたＺスコア値を示す。ゼロ線の上のバーは、眼房水におけるより高い免疫反応性を示し、ゼロ線の下のバーは、血清におけるより高い強度を示す。対照群およびＰＯＡＧサンプルについての結果が示される。全体として、ほんのわずかな抗原が１００％（＝２倍の増加）より大きな免疫反応性の差異を示すことが観察され得る。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２３】
血清サンプルからの免疫反応性と、対応する眼房水サンプルからの免疫反応性との個人間の比較により、ほんのいくつかの有意差が明らかになった。ＣＴＲＬ被験者に関して、対応する眼房水サンプルと比較して、有意なより高いレベルの血清抗体反応性（たとえばＭＢＰ、ＨＳＰ６０、ＧＦＡＰ）が観察でき、また有意により高い眼房水の免疫反応性（たとえばα−１−アンチトリプシン）も観察できた。しかしながら全体では、テストされた抗原の８０％より多くが、対照被験者の血清および眼房水においてほとんど同様の免疫反応性を示した。さらに、ＰＯＡＧ患者は、血清と眼房水との間にいくつかの有意差を示した。たとえば、アルブミンおよびα−１−アンチトリプシンは、血清サンプルにおいてより高い免疫反応性を示した。後者の場合、これは、眼房水においてα−１−アンチトリプシンについてより高い免疫反応性を示した対照サンプルと対照的である。緑内障群からの眼房水サンプルも、対応する血清サンプルと比較すると、いくつかのより高い抗体反応性を示した（たとえばフィブロネクチン、トランスチレチン）。しかしながら対照群と同様に、緑内障群においては、血清免疫反応性と眼房水免疫反応性との間にはいくつかの有意差が現れただけであり、テストされた抗原の８０％より多くがほとんど一致する抗体パターンを示した。