(57)【要約】【課題】カルシウム強化を目的とするカルシウム複合体のカゼインミセルからの簡便な調製法の開発【解決手段】カゼインミセルを蛋白質分解酵素で加水分解した後、ｐＨ５．４以下にし、不溶性のペプチドと未分解のカゼインを除去することによって得られるカゼイン結合性カルシウム及び／又はコロイド状カルシウムとホスホぺプチドとを含有する溶液をｐＨ６．６以上に調整することによって得ることができる、カゼイン結合性カルシウム及び／又はコロイド状カルシウムとホスホペプチドとが複合体を形成したカルシウム複合体の製造法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
カゼインミセルを蛋白質分解酵素で加水分解した後、ｐＨ５．４以下にし、不溶性のペプチドと未分解のカゼインを除去することによって得られるカゼイン結合性カルシウム及び／又はコロイド状カルシウムとホスホぺプチドとを含有する溶液をｐＨ６．６以上に調整することを特徴とする、カゼイン結合性カルシウム及び／又はコロイド状カルシウムとホスホぺプチドとが複合体を形成しているカルシウム複合体の製造法。
【請求項２】
蛋白質分解酵素で加水分解した後、ｐＨ４．８以下にする請求項１記載のカルシウム複合体の製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、カルシウム強化を目的とするカルシウム複合体の新規で簡便な製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、人口の高齢化に伴い、骨粗鬆症、骨折、あるいは腰痛等、種々の骨疾患を患う者が増加する傾向にある。これは、カルシウムの摂取量不足やカルシウムの吸収能力低下、あるいは閉経後のホルモンのアンバランス等が原因であるといわれている。そして、このような高齢化に伴う種々の骨疾患を予防するには、成長期から老年期にかけての全てのライフステージにおいて、生体内での吸収性の良好なカルシウムをできるだけ多く摂取する必要があるといわれている。しかし、日本人の平均的な食習慣では、十分な量のカルシウムを摂取することは非常に難しいとされており、我が国におけるカルシウムの摂取量は、厚生省の国民栄養調査にも示されているように、ここ２０年間横ばい状態であり所要量を満たしていない現状にある。
【０００３】
このような状況から、吸収性や生体利用性の高いカルシウムの摂取量をできるだけ増加させようとする種々の試みがなされている。本発明者らは、カゼイン結合性カルシウム及びコロイド状カルシウムを有効成分とする乳由来のカルシウム剤を提案し（例えば、特許文献１参照。）、この乳由来のカルシウム剤が、生体内での利用性に特に優れているということも報告した（例えば、非特許文献１参照。）。
【０００４】
さらに、研究を進めたところ、カゼイン結合性カルシウム及びコロイド状カルシウムを有効成分とする乳由来のカルシウム剤は、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、乳酸カルシウム、グルコン酸カルシウム等のカルシウム塩や、牛骨、卵殻、サンゴ、ウニ殻等から精製した天然カルシウム等に比べ、生体内での吸収性や利用性に優れているという特徴を有しているものの、中性域のｐＨでは水不溶性のカルシウムとなり、牛乳の形態でカルシウムを摂取するよりも生体内での吸収性や利用性の点で劣ることが判明した。すなわち、生体におけるカルシウム吸収の中心部位である小腸のｐＨは中性域であるため、カゼイン結合性カルシウム及びコロイド状カルシウムを有効成分とする乳由来のカルシウム剤は、水不溶性のカルシウム塩を形成し、その結果、牛乳の形態でカルシウムを摂取する場合よりも吸収効率が低下する。また、カゼイン結合性カルシウム及びコロイド状カルシウムを有効成分とする乳由来のカルシウム剤については、保存性を高める目的で、噴霧乾燥や凍結乾燥等の処理により粉末化される。しかし、この粉末化されたカゼイン結合性カルシウム及びコロイド状カルシウムを有効成分とする乳由来のカルシウム剤は、中性域のｐＨで溶解性が悪く、このカルシウム剤を各種飲料やドリンク剤等に配合した場合、カルシウムが液面に浮上したり、強制攪拌等によりカルシウムを分散させても沈澱を生じるといった問題があった。
【０００５】
そこで、本発明者らは、上述したカゼイン結合性カルシウム及びコロイド状カルシウムを有効成分とする乳由来のカルシウム剤の欠点、すなわち、中性域のｐＨで水不溶性となったり、粉末化した場合の溶解性が劣るという問題を解決するべく、鋭意研究を行ってきた。その結果、特定のｐＨ条件で、カゼイン結合性カルシウム及び／又はコロイド状カルシウムを含む溶液に、ホスホペプチドを加えて混合することにより、カゼイン結合性カルシウム及び／又はコロイド状カルシウムとホスホペプチドとが複合体を形成することを見出した。そして、このカルシウム複合体は、中性域のｐＨでも水可溶性であり、また、粉末化しても溶解性が良好であり、さらに、生体内での吸収性及び利用性も高く、医薬、飲食品及び飼料等に配合するカルシウム剤として非常に優れているということを見出した（例えば、特許文献２参照。）。
【０００６】
しかし、ホスホペプチドを調製する際には多量のエタノールを使用する必要があり（例えば、非特許文献２参照。）、膨大な費用がかかるという欠点があった。また、カゼインミセルからカルシウム複合体を調製する際には、特許文献２の方法ではカゼイン結合性カルシウム及び／又はコロイド状カルシウムを含む溶液にホスホペプチドを加えて混合する工程があるなど煩雑であり、従来の方法では実用化は難しい状況にあった。
【０００７】
【特許文献１】
特開平０６−１２５７４０号公報
【特許文献２】
特許第２９７５３３７号公報
【非特許文献１】
日本栄養・食糧学会誌，  ４７巻，  １９９４年，ｐ．３８５−３９０，  
【非特許文献２】
ニュー  フード  インダストリー，  ３５巻，  １９９３年，ｐ．１−８，  
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らは上記の問題点を鑑み、カゼインミセルからのカルシウム複合体の簡便な調製法を開発すべく、鋭意研究を行ってきた。
その結果、カゼインミセルをプロテアーゼで加水分解した後、ｐＨ５．４以下にし、不溶性のペプチドと未分解のカゼインを除去することによって得られるカゼイン結合性カルシウム及び／又はコロイド状カルシウムとホスホぺプチドとを含有する溶液をｐＨ６．６以上に調整することによって、カゼイン結合性カルシウム及び／又はコロイド状カルシウムとホスホぺプチドとが複合体を形成しているカルシウム複合体を簡便に調製できることを見出し、本発明を完成するに至った。
したがって、本発明は、多量のエタノールを用いず、さらにカゼインミセルから簡便にカルシウム複合体を製造する方法を提供することを課題とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明はカゼイン結合性カルシウム及び／又はコロイド状カルシウムとホスホぺプチドとが複合体を形成しているカルシウム複合体の製造法に関する。このカルシウム複合体は、カゼインミセルを蛋白質分解酵素で加水分解した後、ｐＨ５．４以下にし、不溶性のペプチドと未分解のカゼインを除去することによって得られるカゼイン結合性カルシウム及び／又はコロイド状カルシウムとホスホぺプチドとを含有する溶液をｐＨ６．６以上に調整することによって得られる。したがって、本発明は、カゼインミセルを蛋白質分解酵素で加水分解した後、ｐＨ５．４以下にし、不溶性のペプチドと未分解のカゼインを除去することによって得られるカゼイン結合性カルシウム及び／又はコロイド状カルシウムとホスホぺプチドとを含有する溶液をｐＨ６．６以上に調整することによって得られる、カゼイン結合性カルシウム及び／又はコロイド状カルシウムとホスホぺプチドとが複合体を形成しているカルシウム複合体の製造法に関する。本発明のカルシウム複合体は、カゼインミセルを蛋白質分解酵素で加水分解した後、ｐＨ４．８以下にしてもよい。また、複合体を形成させた後、膜処理して脱塩濃縮してもよいし、  凍結乾燥又は噴霧乾燥により粉末化してもよい。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明は、カゼイン結合性カルシウム及び／又はコロイド状カルシウムとホスホペプチドとが複合体を形成したカルシウム複合体（以下、カルシウム複合体ということがある）の製造法に関する。このカルシウム複合体は、カゼインミセルを蛋白質分解酵素で加水分解した後、ｐＨ５．４以下にし、不溶性のペプチドと未分解のカゼインを除去することによって得られるカゼイン結合性カルシウム及び／又はコロイド状カルシウムとホスホぺプチドとを含有する溶液をｐＨ６．６以上に調整することによって得ることができる。このような方法で製造されるカルシウム複合体は、通常は液状であるので、これを膜処理して脱塩濃縮してもよいし、また凍結乾燥あるいは噴霧乾燥して粉末化してもよい。
ところで、牛乳、山羊乳、水牛乳、羊乳等の哺乳動物の乳中でカルシウムは、溶解相に存在するものとカゼインミセル中に存在するものとに分けられる。カゼインミセル中に存在するものには、カゼインに直接結合しているものとコロイド状リン酸カルシウムとがあり、コロイド状リン酸カルシウムはミセル性リン酸カルシウムとも呼ばれている。本発明では、リン酸カルシウム−カゼイン複合体やリン酸カルシウム−クエン酸−カゼイン複合体等の、カゼインに結合し得るカルシウムをカゼイン結合性カルシウムといい、コロイド状リン酸カルシウムをコロイド状カルシウムという。
また、本発明では、リン酸基を有するアミノ酸を含有するペプチドをホスホペプチドという。
さらに、カゼインミセルは、カゼインが会合して溶液中で安定なミセル構造を形成しているものを指すが、本発明では、カゼイン結合性カルシウム及び／又はコロイド状カルシウムを含有したカゼインミセルを含む画分をいい、次に述べる方法により調製する。
【００１１】
カゼイン結合性カルシウムやコロイド状カルシウムは、次のような処理により得ることができる。まず、牛乳、山羊乳、水牛乳、羊乳等の哺乳動物の乳から、カゼインミセルを調製する。例えば、カゼインミセルとしてレンネットカゼインを調製する場合、常法に従い、ｐＨ  ５．５以上の脱脂乳に適当量のレンネットを添加して乳を凝固させた後、カードナイフで細かくカットする。次に、カットしたカードを加温し、静置した後、ホエーを排除する。そして、カードに水を加えて数分間攪拌し、カードを洗浄した後、静置して水を排除するという操作を２〜３回実施し、レンネットカゼインを得る。また、例えば、カゼインミセルとして乳糖及び可溶性ミネラルを除去したカゼインを調製する場合、常法に従い、ｐＨ  ５．５以上の全乳や脱脂乳を限外濾過膜（分画分子量５０，０００Ｄａ以上）  、精密濾過膜、逆浸透膜等の膜で処理するか、あるいは電気透析することにより、乳糖及び可溶性ミネラルを除去したカゼインを得る。調製したカゼインミセル中には、カゼイン結合性カルシウム及びコロイド状カルシウムが含まれている。
【００１２】
次に、このようにして調製したカゼインミセルを蛋白質分解酵素で加水分解する。蛋白質分解酵素としては、トリプシン、パンクレアチン、キモトリプシン、ペプシン、パパイン、プロナーゼ、サーモリジン等を用いることができる。カゼイン重量に対して  ０．００１〜２％量の蛋白質分解酵素を加え、１５〜６０℃で約５分〜１００時間程度インキュベーションする。反応後８０〜１２０℃で約２秒〜１０時間程度加熱し、酵素反応を停止させる。
【００１３】
次にｐＨを  ５．４以下に調整し、不溶性のペプチドと未分解のカゼインを除去することにより、カゼインミセルからカゼイン結合性カルシウム及びコロイド状カルシウムを分離し、回収する。ｐＨを５．４以下に調整する方法としては、例えば酸を添加する方法や、乳酸菌を添加して乳酸発酵を利用する方法等が挙げられる。具体的には、カゼインミセルに塩酸等の無機酸や酢酸、乳酸、クエン酸等の有機酸を加えてｐＨを  ５．４以下にする。この際、ホモミキサーやコロイドミル等を使用して団塊形成を防止すると共に、酸が均一に分散するよう十分に攪拌、混練、磨砕等を行う。
【００１４】
カゼインミセルのｐＨを下げていくと、ｐＨが  ５．４付近で最初にコロイド状カルシウムが解離してくるが、カゼイン結合性カルシウムはまだ解離してこない。さらに、徐々にｐＨを下げて、ｐＨ  を５．１以下にすると、カゼインに結合していたカルシウムは切断され、さらに、ｐＨが  ４．８付近でカゼイン結合性カルシウムは完全にカゼインから解離してくる。したがって、カゼイン結合性カルシウムとコロイド状カルシウムとをそれぞれ別々に分離し、回収したい場合には、上記したｐＨの違いによる解離作用を利用して、カゼイン結合性カルシウムやコロイド状カルシウムを分離し、回収することができる。カゼインミセルのｐＨを５．４以下にするのは、ｐＨ５．４でコロイド状カルシウムが解離してくるためで、ｐＨ５．４を超えるｐＨ値ではコロイド状カルシウムが解離してこない。
【００１５】
また、カゼイン結合性カルシウムとコロイド状カルシウムとを一緒に分離し、回収したい場合には、ｐＨを  ４．８以下に調整し、さらに、高速攪拌機等を使用して激しく分散処理した後、静置することにより、カゼインミセルからカゼイン結合性カルシウム及びコロイド状カルシウムが分離し、カゼインは水不溶性のまま沈澱するので、上清のみを回収することにより、容易にカゼイン結合性カルシウム及びコロイド状カルシウムを分離し、回収することができる。
不溶性のペプチドと未分解のカゼインを除去するためには、酸処理後に遠心分離を行ってもよい。
【００１６】
さらに、限外濾過膜で処理することにより、カゼインミセルからカゼイン結合性カルシウム及びコロイド状カルシウムを分離し、回収することもできる。すなわち、カゼインミセルのｐＨを  ５．４以下に調整し、攪拌して均一化した溶液を限外濾過膜（分画分子量５０，０００Ｄａ以下）で処理することにより、カゼイン結合性カルシウム及びコロイド状カルシウムを分離し、透過側に回収することができる。なお、限外濾過膜で処理して得られるカゼイン結合性カルシウム及びコロイド状カルシウムは、塩素イオン等の陰イオンを多く含んでいるので、電気透析等の処理により陰イオンを除去してカルシウム含量を高めると良い。
【００１７】
不溶性のペプチドと未分解のカゼインを除去したカゼイン結合性カルシウム及び／又はコロイド状カルシウムとホスホぺプチドとを含有する溶液のｐＨを６．６以上になるように調整し、カゼイン結合性カルシウム及び／又はコロイド状カルシウムとホスホペプチドとでカルシウム複合体を形成させる。ｐＨを６．６以上に調整する方法としては、例えば上記溶液にアルカリを添加する方法等が挙げられる。用いるアルカリとしては水酸化ナトリウムが好ましい。不溶性のペプチドと未分解のカゼインを除去した溶液のｐＨが６．６未満では、カゼイン結合性カルシウム及び／又はコロイド状カルシウムとホスホペプチドとのカルシウム複合体が形成し難い。
このような方法で製造されたカルシウム複合体は、通常は液状である。
このように、本発明の方法では、リン酸基を有するアミノ酸を含有するペプチドであるホスホペプチドを、カゼインミセルからカゼイン結合性カルシウム及び／又はコロイド状カルシウムを得るのと同一の工程の中で、いわゆるワンパスで得ることができ、ホスホペプチドを別の工程で製造したり、ホスホペプチドとカゼイン結合性カルシウム及び／又はコロイド状カルシウムを充分な攪拌により混合するという工程を省くことができ、極めて簡便である。
【００１８】
本発明のカルシウム複合体は、必要に応じ、エバポレーターや限外濾過膜等で濃縮処理することにより得られる濃縮液として使用し、あるいは、噴霧乾燥や凍結乾燥の処理を行うことにより得られる粉末として使用すれば良い。なお、限外濾過膜や精密濾過膜等の膜で処理することにより、１価のイオンを除去したり、カルシウム複合体を形成していない遊離のカゼイン結合性カルシウムやコロイド状カルシウム、あるいは、ホスホペプチド等を除去することができるので、より高純度のカルシウム複合体を得ることができる。
次に、実施例を示し、本発明をさらに詳しく説明する。
【００１９】
【参考例１】
生乳を遠心分離して脱脂乳を調製し、この脱脂乳にレンネットを添加してカゼインミセルであるレンネットカゼインを調製した。
【００２０】
【実施例１】
このレンネットカゼイン６．１７ｇに、水  ２００ｍｌを加え、ホモミキサーで懸濁しながらトリプシンを２０ｍｇ加え、３７℃で６時間反応させた。１００℃で１０分間加熱して酵素を失活させた後、１Ｎ塩酸を加えてｐＨを  ４．６に調整した。そしてさらに、３０分間攪拌を継続した後、遠心分離（８，０００ｒｐｍ、１５分）によって沈殿を除去してカゼイン結合性カルシウム及び／又はコロイド状カルシウムとホスホぺプチドとを含有する溶液を得た。この溶液を１Ｎ水酸化ナトリウムにてｐＨを９．０に調整し、カゼイン結合性カルシウム及びコロイド状カルシウムとホスホぺプチドとが複合体を形成しているカルシウム複合体溶液を得た。このカルシウム複合体溶液を、限外濾過膜（分画分子量３０，０００Ｄａ）で処理し、カルシウム複合体濃縮液を得た。その濃縮液を凍結乾燥して、カゼイン結合性カルシウム及びコロイド状カルシウムとホスホペプチドとが複合体を形成した白色のカルシウム複合体粉末  １．６５ｇを得た。
表１に、得られたカルシウム複合体粉末の成分組成（重量％）を示す。
【００２１】
【表１】
─────────────────────
カルシウム              ９．２％
無機リン                  ３．５％
有機リン                  １．８％
─────────────────────
【００２２】
【試験例１】
実施例１で得られたカルシウム複合体  ３．３７ｍｇを純水１ｍｌに溶解し、ＨＰＬＣに供して分析した。また、カルシウム複合体の有機リン濃度が７ｍＭ  になるよう調整したカルシウム複合体溶液  １ｍｌに、ＥＤＴＡ  Ｎａ２・２Ｈ２Ｏ    ５ｍｇ及びＥＤＴＡ  Ｎａ４・４Ｈ２Ｏ  ８ｍｇを加えてカルシウム複合体を解離させたものについても、同様にしてＨＰＬＣに供して分析した。ＨＰＬＣカラムは  ＴＳＫ−ＧＥＬ  Ｇ  ３０００ＳＷ  （７．５ｍｍ×６０ｃｍ、東ソー社製）  を用い、流速  ０．７ｍｌ／ｍｉｎとして、流出液を２３５  ｎｍでモニターした。その結果を図１に示す。
【００２３】
これによると、実施例１で得られたカルシウム複合体のピーク（Ｉ）  は、単量体のホスホペプチドのピーク（ＩＩ）と別の位置にある（図１、Ａ参照）。カルシウム複合体をＥＤＴＡ処理すると、カルシウム複合体のピーク（Ｉ）が消失する（図１、Ｂ参照）。これは、強力なキレート剤であるＥＤＴＡによりカルシウムがカルシウム複合体から解離するためであり、その分、単量体のホスホペプチドのピーク（ＩＩ）が増加している。このことから、カゼイン結合性カルシウム及びコロイド状カルシウムとホスホペプチドとが複合体を形成したカルシウム複合体を確認することができる。
【００２４】
【実施例２】
参考例１で得られたレンネットカゼイン６．１７ｇに、水  ２００ｍｌを加え、ホモミキサーで懸濁しながらトリプシンを２０ｍｇ加え、３７℃で６時間反応させた。１００℃で１０分間加熱して酵素を失活させた後、１Ｎ塩酸を加えてｐＨを  ５．１に調整した。そしてさらに、３０分間攪拌を継続した後、遠心分離（８，０００ｒｐｍ、１５分）によって沈殿を除去してカゼイン結合性カルシウム及び／又はコロイド状カルシウムとホスホぺプチドとを含有する溶液を得た。この溶液を１Ｎ水酸化ナトリウムにてｐＨを９．０に調整し、カゼイン結合性カルシウム及びコロイド状カルシウムとホスホぺプチドとが複合体を形成しているカルシウム複合体溶液を得た。このカルシウム複合体溶液を、限外濾過膜（分画分子量３０，０００Ｄａ）で処理し、カルシウム複合体濃縮液を得た。その濃縮液を凍結乾燥して、カゼイン結合性カルシウム及びコロイド状カルシウムとホスホペプチドとが複合体を形成した白色のカルシウム複合体粉末１．３５ｇを得た。
【００２５】
【発明の効果】
本発明は、エタノールを用いないので費用が安価であり、さらに、リン酸基を有するアミノ酸を含有するペプチドであるホスホペプチドを、カゼインミセルからカゼイン結合性カルシウム及び／又はコロイド状カルシウムを得るのと同一の工程の中で得ることができるので、ホスホペプチドを別の工程で製造する必要がなく、しかも、ホスホペプチドとカゼイン結合性カルシウム及び／又はコロイド状カルシウムを充分な攪拌により混合するという工程を省くことができ、極めて簡便である。
さらに、本発明の製造法によって製造したカルシウム複合体は、生体内での吸収性や利用性に優れているという特徴を有するので、カルシウム剤として、医薬、飲食品、あるいは飼料に配合してカルシウムを強化することができ、骨粗鬆症、骨折、リュウマチ、関節炎、腰痛等、種々の骨疾患の予防や治療に有用である。
【００２６】
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１で得られたカルシウム複合体、及び実施例１で得られたカルシウム複合体をＥＤＴＡ処理して解離させたもののＨＰＬＣ分析結果を示す。
【符号の説明】
Ａ：実施例１で得られたカルシウム複合体のＨＰＬＣチャート
Ｂ：実施例１で得られたカルシウム複合体をＥＤＴＡ処理して解離させたもののＨＰＬＣチャート
（Ｉ）：カルシウム複合体のピーク
（ＩＩ）：ホスホペプチドのピーク
【図１】
2004215521.tif 000002