(57)【要約】【課題】ＡＬアミロイドーシスを有効に治療することのできる治療方法を提供すること。【解決手段】本発明のＡＬアミロイドーシスの治療方法は、ＡＬアミロイドーシスが発生した哺乳動物の臓器に沈着した免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡの塩基配列を決定し、該塩基配列の免疫グロブリン軽鎖の可変領域に相当する部分のアンチセンスオリゴヌクレオチドを上記哺乳動物に投与することを特徴とする。【選択図】　なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
原発性アミロイドーシスが発生した哺乳動物の臓器に沈着した免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡの塩基配列を決定し、該塩基配列の免疫グロブリン軽鎖の可変領域に相当する部分のアンチセンスオリゴヌクレオチドを上記哺乳動物に投与することを特徴とする、原発性アミロイドーシスの治療方法。
【請求項２】
上記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、アンチセンスデオキシリボヌクレオチドである、請求項１に記載の原発性アミロイドーシスの治療方法。
【請求項３】
上記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート化、メチルホスホネート化、アクリジン結合及びアセチレン炭化水素修飾からなる群から選択された少なくとも１種の修飾がなされたものである、請求項１又は２に記載の原発性アミロイドーシスの治療方法。
【請求項４】
原発性アミロイドーシスが発生した哺乳動物の臓器に沈着した免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡの塩基配列を決定し、該塩基配列の免疫グロブリン軽鎖の可変領域に相当する部分のアンチセンスオリゴヌクレオチドを合成する工程を有する、原発性アミロイドーシス治療用アンチセンスオリゴヌクレオチド製造方法。
【請求項５】
上記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、アンチセンスオリゴデオキシリボヌクレオチドである、請求項４に記載の原発性アミロイドーシス治療用アンチセンスオリゴヌクレオチド製造方法。
【請求項６】
上記アンチセンスオリゴヌクレオチドに、ホスホロチオエート化、メチルホスホネート化、アクリジン結合及びアセチレン炭化水素修飾からなる群から選択される少なくとも１種の修飾を施す工程を有する、請求項４又は５に記載の原発性アミロイドーシス治療用アンチセンスオリゴヌクレオチド製造方法。
【請求項７】
請求項４〜６のいずれか１項に記載の原発性アミロイドーシス治療用アンチセンスオリゴヌクレオチド製造方法によって得られたアンチセンスオリゴヌクレオチドを含有する医薬組成物。
【請求項８】
請求項４〜６のいずれか１項に記載の原発性アミロイドーシス治療用アンチセンスオリゴヌクレオチド製造方法によって得られたアンチセンスオリゴヌクレオチドを含有する原発性アミロイドーシス治療用医薬組成物。
【請求項９】
請求項４〜６のいずれか１項に記載の原発性アミロイドーシス治療用アンチセンスオリゴヌクレオチド製造方法によって得られたアンチセンスオリゴヌクレオチドを哺乳動物に投与することを特徴とする、アミロイドタンパク質沈着抑制方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、原発性アミロイドーシス（以下、本明細書において、「ＡＬアミロイドーシス」ともいう）の治療方法、ＡＬアミロイドーシスの治療に用いられる物質の製造方法、ＡＬアミロイドーシス治療用医薬組成物等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
アミロイドーシスは、アミロイド物質と呼ばれる線維性タンパク質を主成分とした物質が臓器に沈着し、それによって臓器障害を引き起こす疾患群である。このアミロイド物質は、様々な原因によって産生され、全身の臓器に沈着するものから脳や皮膚などに限局して沈着するものまで種々のものが報告されている。
【０００３】
ＡＬアミロイドーシスは、ＡＬタンパク質と呼ばれるアミロイド物質が沈着することが原因となるアミロイドーシスであり、このＡＬタンパク質は免疫グロブリンの軽鎖が前駆タンパクとなって形成され、この免疫グロブリンの軽鎖の沈着が進行性の器官不全を引き起こす疾患である。ＡＬアミロイドーシスは、全身倦怠感や体重減少によって気づかれることが多く、ほとんどの症例においてタンパク尿が認められ、半数の症例においては中等量以上のタンパク尿や腎機能障害が認められる。また、臓器症状としては、心筋症が認められ、約２５％の症例において鬱血性心不全をきたすとされている。
【０００４】
ＡＬアミロイドーシスの治療方法は、未だ確立しておらず、ＡＬアミロイドーシスの患者の平均生存期間は１３ヶ月であり、３年生存率は２５％である（Ｋｙｌｅ，　Ｒ．Ａ．　ａｎｄ　Ｍ．Ａ．Ｇｅｒｔｚ．　１９９５，　Ｓｅｍｉｎ．　Ｈｅｍａｔｏｌ．　３２：４５−５９）。多発性骨髄腫を合併する症例の平均寿命は発見後５ヶ月であり、心不全を合併する症例においては６ヶ月、起立性低血圧を合併する症例では９ヶ月である。また、ネフローゼを合併する症例の平均寿命は１７ヶ月である。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
ＡＬアミロイドーシスは、クローン性形質細胞によって産生されるイムノグロブリン軽鎖の沈着によって発生するので、治療のアプローチは、多発性骨髄腫に対して有効なアルキル化剤の使用に基づいており、メルファラン及びプレドニゾンを併用した化学療法による治療が行われている。しかし、この治療法によっても、ＡＬアミロイドーシスの患者の平均寿命は、ＡＬアミロイドーシスを併発していない多発性骨髄腫の患者の３年に比して、たったの１７〜１８ヶ月程度である（Ｋｙｌｅ，Ｒ．Ａ．　ｅｔ　ａｌ．，　１９９７，　Ｎ．　Ｅｎｇｌ．　Ｊ．Ｍｅｄ．　３３６：１２０２−１２０７、Ａｌｅｘａｎｉａｎ，　Ｒ．ａｎｄ　Ｍ．　Ｄｉｍｏｐｏｕｌｏｓ．　１９９４，　Ｎ．　Ｅｎｇ　ｌ．　Ｊ．Ｍｅｄ．　３３０：４８４−４８９）。また、高濃度のメルファランが、ＡＬアミロイドーシスの一部の患者に有効であることが示された（Ｃｏｍｅｎｚｏ，Ｒ．Ｌ．Ｅ．，　ｅｔ　ａｌ，　１９９８，　Ｂｌｏｏｄ　９１：３６６２−３６７０、Ｇｉｌｌｍｏｒｅ，Ｊ．Ｄ．，　ｅｔ　ａｌ，　１９９８，　Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．　１００：２２６−２２８、Ｍｏｒｅａｕ，Ｐ．　１９９９，　Ｌｅｕｋｅｍｉａ　１３：１９２９−１９３１、Ｓｅｚｅｒ，　Ｏ．　ｅｔ　ａｌ．　２０００，　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ　５３：４１７−４２３、Ｓｅｚｅｒ，Ｏ．　ｅｔ　ａｌ．，　２０００，　Ａｎｎ．　Ｈｅｍａｔｏｌ．　７９：１−６、Ｇｕｉｌｌａｕｍｅ，Ｂ．Ｎ．　ｅｔ　ａｌ．　１９９７，Ｂｏｎｅ　Ｍａｒｒｏｗ　Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．　２０：９０７−９０８）。しかし、ＡＬアミロイドーシスの大多数である、器官の機能に障害のある患者や高齢の患者に対しては毒性が高く、治療に用いることができない（Ｋｙｌｅ，Ｒ．Ａ．　ｅｔ　ａｌ，　１９９９，　Ｂｌｏｏｄ　９３：１０６２−１０６６、Ａｋａｈｓｅｈ，Ｍ．Ｓ．　ｅｔａｌ．　１９９９，　Ｂｒ．Ｊ．Ｈｅａｍａｔｏ．　１０７：３８６−３８７、Ｓｃｈｕｈ，Ａ．，　ｅｔ　ａｌ．，　１９９９，　Ｂｏｎｅ　Ｍａｒｒｏｗ　Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．　２４：１１４１−１１４３）。従って、ＡＬアミロイドーシスを有効に治療することのできる治療方法、及びＡＬアミロイドーシスの治療に用いることのできる物質の製造方法が必要であると考えられる。
【０００６】
従って、本発明の目的は、ＡＬアミロイドーシスを有効に治療することのできる治療方法、及びＡＬアミロイドーシスの治療に用いられる物質の製造方法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
ＡＬアミロイドーシスにおける免疫グロブリン軽鎖からの原線維が形成される原因については明らかになっていない。特定の免疫グロブリン軽鎖の定常部がアミロイド形成に寄与しているとの報告もあるが、大多数のＡＬアミロイド原線維は、少量の定常部のアミノ末端と共に、可変領域を含む。従って、このような病的な原繊維の形成においては、可変領域が定常領域よりも重要な役割を演じていると思われる。メルファラン及びプレドニゾン投与により、血清又は尿中のモノクローナルタンパク質が減少し、投与していない患者に比して生存日数が延びている。従って、本発明者らは、アミロイド原繊維前駆タンパク質の産生を抑制することにより、本発明の目的を達成し得ると考えた。
【０００８】
本発明者らは、鋭意検討した結果、原発性アミロイドーシスが発生した哺乳動物の臓器に沈着した免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡの可変領域に相当する部分の塩基配列のアンチセンスオリゴヌクレオチドを哺乳動物に投与することにより、免疫グロブリン軽鎖のｍＲＮＡの発現が阻害され、免疫グロブリン軽鎖の産生量が減少することを見出した。従って、上記アンチセンスオリゴヌクレオチドを投与することにより、ＡＬアミロイドーシス患者の臓器に沈着する免疫グロブリンが減少し、ＡＬアミロイドーシスの治療に用い得ることを見出し、本発明を完成させた。
【０００９】
すなわち、本発明は、原発性アミロイドーシスが発生した哺乳動物の臓器に沈着する免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡの塩基配列を決定し、該塩基配列の免疫グロブリン軽鎖の可変領域に相当する部分のアンチセンスオリゴヌクレオチドを上記哺乳動物に投与することを特徴とする、原発性アミロイドーシスの治療方法を提供するものである。
【００１０】
また、本発明は、原発性アミロイドーシスが発生した哺乳動物の臓器に沈着する免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡの塩基配列を決定し、該塩基配列の免疫グロブリン軽鎖の可変領域に相当する部分のアンチセンスオリゴヌクレオチドを合成する工程を有する、原発性アミロイドーシス治療用アンチセンスオリゴヌクレオチド製造方法を提供するものである。
【００１１】
また、本発明は、上記原発性アミロイドーシス治療用アンチセンスオリゴヌクレオチド製造方法によって得られたアンチセンスオリゴヌクレオチドを含有する医薬組成物、原発性アミロイドーシス治療用医薬組成物を提供するものである。
また、本発明は、上記原発性アミロイドーシス治療用アンチセンスオリゴヌクレオチド製造方法によって得られたアンチセンスオリゴヌクレオチドを哺乳動物に投与することを特徴とする、アミロイドタンパク質沈着抑制方法を提供するものである。
【００１２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明のＡＬアミロイドーシスの治療方法は、ＡＬアミロイドーシスが発生した哺乳動物の臓器に沈着する免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡの塩基配列を決定し、該ＤＮＡの可変領域に相当する部分の塩基配列のアンチセンスオリゴヌクレオチドを哺乳動物に投与することを特徴とする。
【００１３】
本発明においては、先ずＡＬアミロイドーシスが発生した哺乳動物の臓器に沈着する免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡの塩基配列を決定する。免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡの塩基配列を決定する方法としては、従来より公知の方法により実施することができる。そのような方法としては、例えばＡＬアミロイドーシス患者、又は多発性骨髄腫を併発したＡＬアミロイドーシス患者の骨髄単核細胞又は末梢血単核細胞からＲＮＡを抽出し、抽出したＲＮＡを用いてＲＴ−ＰＣＲ法を実施することにより、ｃＤＮＡを得る。ｃＤＮＡを得る方法としては、例えばＲＴ−ＰＣＲ法が挙げられる。ＲＴ−ＰＣＲ法においては、例えばＳｏｎｇｓｉｖｉｌｉａｉらが、ヒトλ免疫グロブリン可変領域をＰＣＲ法によって増幅するために設計したオリゴヌクレオチドプライマーを用いることができる（Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌｉａｉ　Ｓ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　λ　ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ　ｇｅｎｅｓ　ｂｙ　ｔｈｅ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ．　Ｅｕｒ．　Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　２０：　２６６１−２６６６　（１９９０））。
なお、ＡＬアミロイドーシスにおいて沈着するタンパク質はλ鎖が多いとされているため、ヒトλ免疫グロブリン可変領域をコードするＰＣＲによって増幅するためのプライマーを用いることが好ましい。
【００１４】
本発明において用いられたオリゴヌクレオチドプライマーは、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５及び配列番号：６で表わされる。配列番号：１〜３で表わされるオリゴヌクレオチドプライマーは５’末端プライマーであり、配列番号：４〜６で表わされるオリゴヌクレオチドプライマーは３’末端プライマーである。
【００１５】
なお、上記細胞としては、患者から取り出した後、培地中で培養したものを用いてもよい。この場合の培地としては、通常に用いられるものが好ましい。
なお、ＡＬアミロイドーシスを発生する哺乳動物としては、例えばヒト、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サル等が挙げられる。
【００１６】
次いで、得られたｃＤＮＡの塩基配列を公知の手段によって決定する。ｃＤＮＡの塩基配列を決定する方法としては、従来公知の方法により実施できる。
【００１７】
次いで、塩基配列が決定されたＤＮＡの免疫グロブリン軽鎖の可変領域に相当する部分の塩基配列のアンチセンスオリゴヌクレオチドを哺乳動物に投与する。
【００１８】
ＤＮＡの可変領域に相当する部分とは、ＤＮＡが翻訳されてタンパク質（免疫グロブリン軽鎖）が合成された際に、免疫グロブリン軽鎖の可変領域を構成する部分に相当する部分を意味する。本発明のＡＬアミロイドーシスの治療方法において用いられるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、可変領域の全範囲に相当するものであっても、また可変領域の一部に相当するものであってもよい。
【００１９】
可変領域に相当する部分の塩基配列のアンチセンスオリゴヌクレオチドとは、可変領域に相当する部分に相補的な塩基配列と、相補または実質的に相補な塩基配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを意味する。本明細書において、「相補または実質的に相補」とは、Ａ：Ｔ（ＲＮＡにおいてはＴをＵに読み替える）、Ｇ：Ｃの塩基対からなる２本鎖ヌクレオチドの一方の鎖に対する他方の鎖を意味する。また、相補的とは、少なくとも１５個の連続したヌクレオチド領域で完全に相補配列であることが好ましいが、必ずしも１５個の連続したヌクレオチド領域で完全に相補配列であることに限られず、好ましくは少なくとも７０％、更に好ましくは少なくとも８０％、更に好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは９５％以上の塩基配列上の相同性を有していればよい。
【００２０】
本発明のＡＬアミロイドーシスの治療方法において用いられるアンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、アンチセンスオリゴデオキシリボヌクレオチドであってもよい。アンチセンスオリゴデオキシリボヌクレオチドを用いることにより、ヌクレアーゼ分解に対する感受性が低減するので好ましい。
【００２１】
また、本発明のアミロイドーシスの治療方法において用いられるアンチセンスオリゴヌクレオチドの長さは、通常は、少なくとも２０ヌクレオチド程度又はそれ以上の長さであることが好ましく、例えば１８〜３５ヌクレオチド程度であることが好ましい。ただし、免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡの発現を抑制し得る作用を有するものであれば、上述した長さより短いものであっても、長いものであっても使用可能である。
【００２２】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、合成されたものであっても、天然のものであってもよい。アンチセンスオリゴヌクレオチドを合成する場合、従来公知の方法により実施することができる。
なお、アミロイドーシスが発生した哺乳動物の臓器に沈着する免疫グロブリン軽鎖の構造（アミノ酸配列）は、それぞれの個体によって相違しており、従って免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡの塩基配列も、それぞれの個体によって相違する。すなわち、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、治療を必要とするアミロイドーシスを発生した哺乳動物毎に異なっており、それぞれに塩基配列の決定、合成等を行い、調製する必要がある。
【００２３】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的ｍＲＮＡと安定な二重鎖を形成し、またヌクレアーゼ耐性があり、細胞に容易に取り込まれ、対象部位に移行し、かつ毒性や抗原性を有しないものであることが望ましい。これらを目的として、アンチセンスオリゴヌクレオチドを修飾することが好ましい。このような修飾としては、例えばホスホロチオエート化、メチルホスホネート化、アクリジン修飾、アセチレン炭化水素修飾等が挙げられる。ホスホロチオエート化は、オリゴヌクレオチド中のリン原子に硫黄原子を結合させるものであり、この修飾によりヌクレアーゼ耐性が向上する。メチルホスホネート化は、ヌクレオチドのリン酸の酸素をメチル基に置換するものであり、細胞内への透過性、ヌクレアーゼ耐性が向上する。アクリジン修飾は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの３’末端にアクリジンを共有結合させるものであり、安定な二重鎖を形成することが可能となる。アセチレン炭化水素修飾は、オリゴヌクレオチド中のリン原子にＣ−５プロピンを結合させるものであり、標的ｍＲＮＡに対するＴｍ値を高くする効果がある。
【００２４】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、低毒性であり、生体内において免疫グロブリン軽鎖の産生を抑制することができ、アミロイドタンパク質の沈着を抑制できるので、ＡＬアミロイドーシスの治療に用いることができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドをＡＬアミロイドーシスの治療用に用いる場合、自体公知の方法に従って製剤化し、投与することができる。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドを単独で、あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクター等の適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って、哺乳動物（ヒト、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サル等）に対して経口的又は非経口的に投与することができる。非経口的投与としては、例えば局所に静脈内、筋肉内、皮下、経皮的に投与することができる。また、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、そのままで投与してもよく、又は摂取促進のために補助剤等の生理学的に許容される担体とともに製剤化して投与してもよい。また、所望の組織を標的としてアンチセンスオリゴヌクレオチドを輸送するための手段や、標的細胞への導入を容易にするための手段、例えば薬理学的に許容されるカチオン性脂質等によるリポソームの利用等も可能である。
【００２５】
アンチセンスオリゴヌクレオチドの投与量は、投与ルート等によって差異はあるが、例えば成人においては、体重１ｋｇあたり１日に３〜１００ｍｇ程度である。
また、投与回数に特に制限はないが、投与は１日に１回程度行なうことが好ましい。また、例えば２〜５日連続して投与してもよい。また、１週間に１〜５回投与してもよい。
また、ＡＬアミロイドーシスの治療用に用いられている、その他の薬物と併用して投与してもよい。その他の薬物と併用する場合、その他の薬物の投与量、アンチセンスオリゴヌクレオチドの投与量は、それぞれを単独に用いるよりも少量にすることもできる。
【００２６】
次に、本発明のＡＬアミロイドーシス治療用アンチセンスオリゴヌクレオチド製造方法について説明する。
本発明のＡＬアミロイドーシス治療用アンチセンスオリゴヌクレオチド製造方法は、ＡＬアミロイドーシス患者の臓器に沈着する免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡの塩基配列を決定し、該塩基配列の免疫グロブリン軽鎖の可変領域に相当する部分のアンチセンスオリゴヌクレオチドを合成する工程を有する。
免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡの塩基配列の決定は、従来公知の方法により実施することができ、例えば上述した本発明のＡＬアミロイドーシスの治療方法において説明した方法により実施することができる。
【００２７】
次いで、塩基配列が決定されたＤＮＡの可変領域に相当する部分の塩基配列のアンチセンスオリゴヌクレオチドを合成する。アンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、ヌクレアーゼ分解に対する感受性が低い観点から、アンチセンスオリゴデオキシリボヌクレオチドが好ましい。このようなアンチセンスオリゴヌクレオチドは、公知のＤＮＡ合成装置等を用いて製造することができる。合成されるアンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、可変領域の全範囲に相当するものであってもよく、また可変領域の一部に相当するものであってもよい。
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、通常は、少なくとも２０ヌクレオチド程度又はそれ以上の長さのものを合成することが好ましく、例えば１８〜３５ヌクレオチド程度のものを合成することが好ましい。ただし、免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡの発現を抑制し得る作用を有するものであれば、上述した長さに限定されるものではない。
【００２８】
合成されるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、可変領域に相当する部分に相補的な塩基配列と、相補または実質的に相補な塩基配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。なお、合成されるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１５個の連続したヌクレオチド領域で完全に相補配列であるものが好ましいが、必ずしも１５個の連続したヌクレオチド領域で完全に相補配列であることに限られず、好ましくは少なくとも７０％、更に好ましくは少なくとも８０％、更に好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは９５％以上の塩基配列上の相同性を有するように合成する。
【００２９】
また、合成されたアンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的ｍＲＮＡと安定な二重鎖を形成し、またヌクレアーゼ耐性を有し、細胞に容易に取り込まれ、対象部位に移行し、かつ毒性や抗原性を有しないものであることが望ましい。従って、合成されたアンチセンスオリゴヌクレオチドに修飾を施すことが好ましい。このような修飾としては、例えばホスホロチオエート化、メチルホスホネート化、アクリジン修飾、アセチレン炭化水素修飾等が挙げられる。
【００３０】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、低毒性であり、生体内において免疫グロブリン軽鎖の産生を抑制することができ、アミロイドタンパク質の沈着が防止できるので、ＡＬアミロイドーシスの治療用アンチセンスオリゴヌクレオチドとして用いることができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドをＡＬアミロイドーシスの治療用に用いる場合、上述した、本発明のＡＬアミロイドーシスの治療方法において説明した手段で用いられ、その使用量も上述した通りである。
【００３１】
次に、本発明の医薬組成物及びＡＬアミロイドーシス治療用医薬組成物について説明する。
本発明の医薬組成物及びＡＬアミロイドーシス治療用医薬組成物は、上述した本発明のＡＬアミロイドーシス治療用アンチセンスオリゴヌクレオチド製造方法によって得られたアンチセンスオリゴヌクレオチドを含有する。
本発明の医薬組成物及びＡＬアミロイドーシス治療用医薬組成物は、ＡＬアミロイドーシスの治療に用いられ、投与する場合は、公知の方法に従って製剤化することができる。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドを単独で、あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクター等の適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って、哺乳動物（ヒト、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サル等）に対して経口的又は非経口的に投与する。非経口的投与としては、例えば局所に静脈内、筋肉内、皮下、経皮的に投与することができる。また、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、そのままで投与してもよく、又は摂取促進のために補助剤等の生理学的に許容される担体とともに製剤化して投与してもよい。また、所望の組織を標的としてアンチセンスオリゴヌクレオチドを輸送するための手段や、標的細胞への導入を容易にするための手段、例えば薬理学的に許容されるカチオン性脂質等によるリポソームの利用等も可能である。
【００３２】
本発明の医薬組成物及びＡＬアミロイドーシス治療用医薬組成物の投与量は、投与ルート等によって差異はあるが、例えば成人においては、アンチセンス重量換算で体重１ｋｇあたり１日に３〜１００ｍｇ程度である。
また、投与回数に特に制限はないが、投与は１日に１回程度行なうことが好ましく。また、例えば２〜５日連続投与してもよい。また、１週間に１〜５回投与してもよい。
【００３３】
また、本発明の医薬組成物及びＡＬアミロイドーシス治療用医薬組成物を哺乳動物に投与する場合、ＡＬアミロイドーシスの治療用に用いられている、その他の薬物と併用して投与してもよい。その他の薬物と併用する場合、その他の薬物の投与量、アンチセンスオリゴヌクレオチドの投与量は、それぞれを単独に用いるよりも少量にしてもよい。
【００３４】
次に、本発明のアミロイドタンパク質沈着抑制方法について説明する。本発明のアミロイドタンパク質沈着抑制方法は、上述した本発明のＡＬアミロイドーシス治療用アンチセンスオリゴヌクレオチド製造方法によって得られたアンチセンスオリゴヌクレオチドを哺乳動物に投与することを特徴とする。
【００３５】
哺乳動物としては、上述したものが挙げられる。本発明のＡＬアミロイドーシス治療用アンチセンスオリゴヌクレオチド製造方法によって得られたアンチセンスオリゴヌクレオチドを哺乳動物に投与することにより、免疫グロブリン軽鎖のｍＲＮＡの発現が阻害され、免疫グロブリン軽鎖の産生量が減少し、それによってアミロイドタンパク質が臓器に沈着することが抑制される。
【００３６】
以下、本発明を実施例により更に詳細に説明する。なお、本発明の範囲は、かかる実施例に限定されないことはいうまでもない。
実施例１
ヒト多発性骨髄腫細胞株ＲＰＭＩ８２２６（ＩｇＧλ；ＥＶＢ（−））をマスターバンク（Ｊａｐａｎｅｓｅ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｒｅｓｏｕｃｅ　Ｂａｎｋ）から得、１０％ウシ血清を含むＲＰＭＩ−１６４０培地中で、３７℃で時間培養を行った。培養後、細胞を遠心分離して集め、全ＲＮＡ抽出を行った。なお、培養したＲＰＭＩ８２２６細胞から抽出したＲＮＡ中には、ヒトλ免疫グロブリン軽鎖の予想されるサイズの増幅ＤＮＡバンドが検出された（図示せず）。
【００３７】
全ＲＮＡの抽出は、約１×１０８個の細胞から、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて行った。抽出法は、Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のマニュアルに記載の通り行った。すなわち、多発性骨髄腫、ＡＬアミロイドーシス患者の末梢血、骨髄液からＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅを用いてリンパ球、単核球分画を分離した。骨髄腫細胞核（ＲＰＭＩ８２２６、Ｕ２６６）、分離したリンパ球、単核球分画からＴＲＩｚｏｌ試薬を用いて全ＲＮＡを抽出した。
【００３８】
次いで、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ　Ｓ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　λ　ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ　ｇｅｎｅｓ　ｂｙ　ｔｈｅ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ．　Ｅｕｒ．　Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　２０：　２６６１−２６６６　（１９９０）に記載された、ヒトλ免疫グロブリン可変領域をＰＣＲによって増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマーをプライマーとして用い、ＲＴ−ＰＣＲを行った。用いたプリマーは、ＡＬアミロイドーシスにおいてはλ鎖が多いとされているため、λ鎖の中で比較的保存されているＦｒａｍｅ　ｗｏｒｋ（ＦＲ）１及びＦＲ４に対応したプライマーである。用いられたオリゴヌクレオチドプライマーを配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５及び配列番号：６に示す。配列番号：１〜３で表わされるオリゴヌクレオチドプライマーは５’末端プライマーであり、配列番号：４〜６で表わされるオリゴヌクレオチドプライマーは３’末端プライマーである。
【００３９】
すなわち、１μｇの全ＲＮＡ、５ｍｍのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭの各ＮＴＰ、１Ｕ／μｌのＲｎａｓｅインヒビター、０．２５Ｕ／μｌのＡＭＶ逆転写酵素（ＴａＫａＲａ社製）及び２．５μＭのランダム９量体プライマーを含む、２０μｌの反応混合物中で一次標準ｃＤＮＡを合成した。反応混合物を、３０℃で１０分間、４２℃で１５分間、９９℃で５分間インキュベートした後、冷却した。
【００４０】
８０μｌの一次標準合成反応混合物（ｃＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド）、０．２μｌのセンス及びアンチセンスプライマー、２．５ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭのＫＣｌ及び０．５μｌの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ社製）をパラフィンオイルに載せ、サーマルサイクラーを用いてＰＣＲ増幅３０サイクルにかけ、ＤＮＡフラグメントを増幅させた。各サイクルは、９４℃、１分（変性）、５６℃、１分（アニーリング）及び７２℃、２分（伸長）からなる。
【００４１】
増幅されたＤＮＡフラグメントを、２％濃度の低融点アガロースゲルによる電気泳動により分離を行った。予想されるサイズのバンドが得られたので、プライマーダイマーをＳＵＰＲＥＣ−０２（Ｔａｋａｒａ社製）を用いて除去し、ＰＣＲ産生物を得た。得られたＰＣＲ産生物をｐＧＥＭ−Ｔ　Ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）にクローニングした。Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ＩＩ　ｄｙｅ　ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　ｃｙｃｌｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｋｉｔ（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用い、ＡＢＩ　３７３Ｓ自動配列決定装置中に１６時間かけてヌクレオチドの配列決定を行った。
【００４２】
配列決定された塩基配列を配列番号：７及び図１に示す。図１には、予想されるアミノ酸配列も併せて示す。得られた塩基配列は、公知のＲＰＭＩ８２２６細胞株のヒト骨髄腫免疫グロブリン軽鎖ｍＲＮＡと９９．０２％の相同性を有しており、ヒトλ免疫グロブリン遺伝子の可変領域であることが確認された。従って、配列番号：１〜６で表わされるプライマーが、ヒト免疫グロブリン軽鎖の可変領域をコードする遺伝子を増幅するのに適していることが明らかである。
【００４３】
実施例２
ＡＬアミロイドーシス患者の骨髄単核細胞（ＢＭＭＣ）及び末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から全ＲＮＡを抽出し、実施例１と同様に操作を行い、ヒト免疫グロブリン軽鎖の可変領域のｃＤＮＡの塩基配列を決定した。ＢＭＭＣ及びＰＢＭＣについては９クローンについて塩基配列を決定した。ＢＭＭＣについては９クローン中７個が同じ塩基配列を有しており、ＰＢＭＣについては９クローン中５個が同じ塩基配列を有していた。
【００４４】
実施例３
図１に示す塩基配列中の相補性決定領域、ＣＤＲ−１、ＣＤＲ−２及びＣＤＲ−３のアンチセンスオリゴヌクレオチドを作製した。また、コントロールとして、センスオリゴヌクレオチド及びランダムオリゴヌクレオチドを作製した。作製したアンチセンスオリゴヌクレオチド、センスオリゴヌクレオチド及びランダムオリゴヌクレオチドの塩基配列を表１に示す。なお、全てのヌクレオチドはホスホロチオエート化して用いた。
【００４５】
【表１】
2004075626.tif 000002
【００４６】
表１において、アンチセンスオリゴヌクレオチドはＡＳ、センスオリゴヌクレオチドはＳ、ランダムオリゴヌクレオチドはＲで表わす。また、アンチセンスオリゴヌクレオチドＡＳ　ＣＤＲ−１、２、３をそれぞれ配列番号：８〜１０に、センスオリゴヌクレオチドＳ　ＣＤＲ−１、２、３をそれぞれ配列番号：１１〜１３に、ランダムオリゴヌクレオチドＲ　ＣＤＲ−１、２、３をそれぞれ配列番号：１４〜１６に示す。
【００４７】
１６μｇ又は３２μｇのアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳ　ＣＲＲ−１、２及び３）、センスオリゴヌクレオチド（Ｓ　ＣＤＲ−１、２及び３）、又はランダムオリゴヌクレオチド（Ｒ　ＣＤＲ−１、２及び３）と２０μｇのリポフェクチン（ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ）とを５０μｌの生理食塩加ＨＥＰＥＳ緩衝液（１０５ｍＭ　ＮａＣｌ及び２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　ｐＨ７．４）で希釈して混合し、２５℃の温度で１５分間インキュベートした。また、１２穴プレート中に１．０ｍｌのＲＰＭＩ−１６４０培地を入れ、該培地中にＲＰＭＩ８２２６細胞を５×１０５細胞／ウェルとなるように播種した。次いで、各ウェルに１００μｌ容量のヌクレオチド混合物を加えて混合した後、３７℃の温度で５〜６時間インキュベートした。インキュベートを行った後、ＲＰＭＩ８２２６細胞を新鮮な培地で洗浄し、１．０ｍｌのＲＰＭＩ−１６４０中で４８時間培養を行った。なお、センスオリゴヌクレオチド、ランダムオリゴヌクレオチドを加えた系においては、それぞれのヌクレオチドの最終濃度は２．４〜４．８μＭである。また、アンチセンスオリゴヌクレオチドを加えた系におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドの最終濃度は、２．４μＭ及び４．８μＭである。４８、７２又は９６時間培養した後、各ウェルから培地を吸引し、３，０００×ｇで５分間遠心し、各上清中のヒトλ鎖の定量をＥＬＩＳＡ法により行った。ＥＬＩＳＡ法の詳細は以下に示す。
【００４８】
すなわち、９６穴プレートに、ＰＢＳ（生理食塩加リン酸緩衝液）で５００倍に希釈した抗ヒトフリーλ鎖ウサギ血清（ＤＡＫＯ社製　Ａ０１０１）を各ウェルに１５０μｌずつ分注し、４℃で一夜かけて血清をウェルにコーティングした。次いで、プレートを３％ウシ血清を含むＰＢＳでブロックした。各ウェルに連続段階希釈したサンプル又はコントロールとしての新鮮な培地を１５０μｌずつ加え、３７℃の温度で２時間インキュベートした。インキュベーション後、ＰＢＳで各ウェルを洗浄し、西洋わさびペルオキシダーゼを結合した抗ヒトλ軽鎖抗体溶液（ＤＡＫＯ　Ｐ０１３０、１５００倍に希釈したもの）を１００μｌずつ各ウェルに加え、３７℃で１時間インキュベートした。洗浄した後、３％過酸化水素を含むＯ−フェニレンジアミン溶液を加えて発色させた。ＥＬＩＳＡリーダー（Ｅａｓｙ　Ｒｅａｄｅｒ　ＥＡＲ４００，　ＳＲＴ−Ｌａｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，　Ａｕｓｔｒｉａ）を用いて４９２ｎｍの吸光度を測定した。
【００４９】
ヒトλ鎖の定量の結果を図２に示す。図２は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおけるヌクレオチドの効果を示すグラフであり、横軸は、細胞の培養時間（時間）を示し、縦軸はヒトλ鎖軽鎖の濃度（ｎｇ／ｍｌ）を示す。図２（ａ）はＡＳ　ＣＤＲ−１、Ｓ　ＣＤＲ−１、Ｒ　ＣＤＲ−１を用いて行った実験結果を示すグラフであり、図２（ｂ）はＣＤＲ−２、Ｓ　ＣＤＲ−２、Ｒ　ＣＤＲ−２を用いて行った実験結果を示すグラフであり、図２（ｃ）はＣＤＲ−３、Ｓ　ＣＤＲ−３、Ｒ　ＣＤＲ−３を用いて行った実験結果を示すグラフである。また、図２において、■は培地を用いたコントロール、△はセンスオリゴヌクレオチド、○はランダムオリゴヌクレオチドを用いた実験結果であり、▲、●はそれぞれアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた実験結果である。
【００５０】
図２に示すように、全ての系において、コントロール、センスオリゴヌクレオチド又はランダムオリゴヌクレオチドを加えた系においては、λ鎖産生抑制効果は認められなかった。アンチセンスオリゴヌクレオチドＡＳ　ＣＤＲ−１を加えた系においては、２．４μＭ濃度で１４．７％、４．８μＭ濃度で１７．８％のλ鎖産生抑制効果が認められた。ＡＳ　ＣＤＲ−２を加えた系においては、２．４μＭ濃度で１７．８％、４．８μＭ濃度で２６．９％のλ鎖産生抑制効果が認められ、ＡＳ　ＣＤＲ−３を加えた系においては、λ鎖の産生を有意に抑制しなかった。３種のアンチセンスオリゴヌクレオチドの中では、ＡＳ　ＣＤＲ−２が最も強いλ鎖産生抑制効果を示した。
【００５１】
実施例４
Ｃ．Ｂ−１７重症複合型免疫不全症（ＳＣＩＤ）マウスを、Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｒｉｖｅｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，　Ｉｎｃ．から得、特別な病原体のない条件下に置いて保存した。ＲＰＭＩ８２２６細胞を集め、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、ＰＢＳに再懸濁した。２５匹の６週令のＳＣＩＤマウスに、ＰＢＳ、ｐＨ７．４に懸濁したの１×１０７細胞を、２５ゲージが取り付けられた１．０ｍｌ注射器を用いて皮下注射した。２５匹のマウスのうちの２１匹に異種移植片が発生し、この原発性腫瘍は４週間以内に触知できる皮下腫瘍になった。２１匹のＳＣＩＤマウスを７匹ずつ３群に分け、それぞれの群に、アンチセンスオリゴヌクレオチドＡＳ　ＣＤＲ−２、センスオリゴヌクレオチドＳ　ＣＤＲ−２及び生理食塩水をＳＣＩＤマウスにＲＰＭＩ８２２６細胞を投与してから２８日目から５日間連続して投与した。アンチセンスオリゴヌクレオチド及びセンスオリゴヌクレオチドの投与量は２ｍｇであり、この量を１ｍｌの生理食塩水に溶解して用いた。コントロールの生理食塩水投与群においては、生理食塩水を１ｍｌ投与した。オリゴヌクレオチド及び生理食塩水の投与は皮下注射により腫瘍に直接投与した。
【００５２】
オリゴヌクレオチド又は生理食塩水の最終投与の翌日、皮下腫瘍の新鮮な細胞浮遊液、及びＳＣＩＤマウスの肝臓からＲＮＡを抽出し、このＲＮＡ中のヒトＶλ免疫グロブリンｍＲＮＡの検出を行った。検出はノーザンブロット法により行った。結果を図３に示す。図３において、レーン１はヒトＶλ免疫グロブリンｍＲＮＡを電気泳動したものであり、レーン２〜７は、腫瘍から抽出したＲＮＡの結果であり、レーン２及び３は生理食塩水を投与したコントロール、レーン４及び５はセンスオリゴヌクレオチド、レーン６及び７はアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与した群である。
【００５３】
図示しないが、肝臓においてはヒトＶλ免疫グロブリンｍＲＮＡは検出されなかった。また、腫瘍細胞においては、コントロール及びセンスオリゴヌクレオチド投与群においてはヒトＶλ免疫グロブリンｍＲＮＡが検出されたが、アンチセンスオリゴヌクレオチド投与群においては、ヒトＶλ免疫グロブリンｍＲＮＡはほとんど検出されなかった。
【００５４】
生理食塩水を投与したコントロール群、センスオリゴヌクレオチド投与群及びアンチセンスオリゴヌクレオチド投与群のｍＲＮＡの産生量を定量した。コントロール群においてはｍＲＮＡ産生量は約８．３０μｇ／ｍｌであり、センスオリゴヌクレオチド投与群においてはｍＲＮＡ産生量は約８．４２μｇ／ｍｌであった。これに対し、アンチセンスオリゴヌクレオチド投与群においてはｍＲＮＡ産生量は約２．５６μｇ／ｍｌであり、アンチセンスオリゴヌクレオチドを投与することにより、ヒトＶλ免疫グロブリンｍＲＮＡの産生が有意に抑制されることがわかった。
【００５５】
【発明の効果】
以上の説明から明らかなように、本発明のＡＬアミロイドーシスの治療方法によれば、アンチセンスオリゴヌクレオチドを哺乳動物に投与することにより、免疫グロブリン軽鎖のｍＲＮＡの発現が阻害され、免疫グロブリン軽鎖の産生量が減少し、ＡＬアミロイドーシス患者の臓器に沈着する免疫グロブリンが減少し、ＡＬアミロイドーシスの治療に有効である。
【００５６】
また、本発明のＡＬアミロイドーシス治療用アンチセンスオリゴヌクレオチド製造方法によれば、ＡＬアミロイドーシスの治療用として有効なアンチセンスオリゴヌクレオチドを製造することができる。
また、本発明の医薬組成物及びＡＬアミロイドーシス治療用医薬組成物は、ＡＬアミロイドーシスの治療に有効なものである。
【００５７】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ＲＰＭＩ８２２６細胞株のヒト骨髄腫免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡの塩基配列を示す図である。
【図２】ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおけるアンチセンスオリゴヌクレオチドの効果を示すグラフである。
【図３】オリゴヌクレオチド投与によるＳＣＩＤマウス細胞中のヒトＶλ免疫グロブリンｍＲＮＡを検出した結果である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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