【誤訳訂正書】
【提出日】平成24年5月22日(2012.5.22)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号９のアミノ酸配列からなる免疫原性ハイブリッドポリペプチド。
【請求項２】
配列番号１０のアミノ酸配列からなる免疫原性ハイブリッドポリペプチド。
【請求項３】
配列番号１１のアミノ酸配列からなる免疫原性ハイブリッドポリペプチド。
【請求項４】
請求項１から３のいずれか１項に記載の免疫原性ハイブリッドポリペプチドを含む肥満予防及び治療用ワクチン。
【請求項５】
請求項１から３のいずれか１項に記載の免疫原性ハイブリッドポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項５に記載のポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクター。
【請求項７】
請求項６に記載の組換え発現ベクターで形質変換された宿主細胞。
【請求項８】
請求項６に記載の組換え発現ベクターで形質変換された宿主細胞を培養し、請求項１から３のいずれか１項に記載の免疫原性ハイブリッドポリペプチドを製造する方法。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【発明の詳細な説明】
【発明の名称】抗肥満用免疫原性ハイブリッドポリペプチド及びこれを含む抗肥満ワクチン組成物（Anti-Obese Immunogenic Hybrid Polypeptides And Anti-Obese Vaccine Composition Comprising The Same)
【技術分野】
【０００１】
本発明はN末端から順次にアポリポたんぱく質B-１００（Apolipoprotein B-１００）のB細胞エピトープの模造ペプチド；狂犬病ウイルスヘルパーT細胞エピトープまたはB型肝炎ウイルス表面抗原ヘルパーT細胞エピトープ；及びマウスのアポリポたんぱく質CIIのC-末端ペプチド断片またはアポリポたんぱく質B-１００のB細胞エピトープの模造ペプチドが融合された免疫原性ハイブリッドポリペプチドに関する。また、本発明は上記の免疫原性ハイブリッドポリペプチドを含む肥満予防または治療用ワクチン組成物に関する。また、本発明は上記の免疫原性ハイブリッドポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、上記のポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクター、上記の組換え発現ベクターで形質転換された宿主細胞及び上記の組換え発現ベクターで形質転換された宿主細胞を培養して、免疫原性ハイブリッドポリペプチドを製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
最近、西洋式食生活の影響で肥満による代謝性疾患の糖尿病、動脈硬化症及び冠状動脈疾患（Coronary Atherosclerotic Disease : CAD）が次第に増加動向であって、これはヒトだけでなくイヌやネコなどのペットまたは家畜の場合も同様である。このような疾患の原因になる血清脂質としてはコレステロール（Cholesterol）、トリグリセリド（Triglyceride:TG）、遊離脂肪酸（Free Fatty Acid）及びホスホリピド（Phospholipid）などがあって、これらの血清脂質はアポリポたんぱく質と共に脂たんぱく質（Lipoprotein）を形成して血液循環を通って運搬されている。その中でVLDL（Very Low DensityLipoprotein）及びLDL（Low Density Lipoprotein）は主にTG及びコレステロールの運搬を担当し、LDLーコレステロール数値の変化は上記の疾病の予後を示す尺度になる。
【０００３】
脂質代謝に関わる成人病の主な因子のLDL-コレステロールは各組織の細胞膜のLDL受容体と結合して組織内に保存、活用されたり清掃細胞（スカベンジャーセル）に捕獲された後に加水分解されて、遊離コレステロールの形態でアポリポたんぱく質と共にHDLで伝達され肝にて再活用されたり、胆汁酸の形態で処理され排泄される経路が明らかになっている。この過程で、アポリポたんぱく質は脂たんぱくの構造的な定常性を維持し、脂肪質分解酵素の補助因子機能及び細胞膜上の特定受容体と結合する非常に重要な機能を遂行している。
【０００４】
アポリポたんぱく質B-１００はこのような底密度たんぱく質（LDL）の主なたんぱく質成分であり、またIDL（Intermediate Density Lipoprotein）、VLDLに存在しているので、血液中にある抗体がアポリポたんぱく質B-１００を認識するように誘導すれば、食細胞によるLDL-除去が容易に起こるだろう。最近、このような根拠でワクチンを用いてLDL-コレステロールの数値を下げ、動脈硬化を減少させるための研究が試されている。このような抗-コレステロールワクチン療法により誘導された抗体はIgMタイプでVLDL、IDL及びLDLと結合することと見なされ、これを通じて高密度コレステロール及び、アテローム性動脈硬化症に対する予防及び、治療用ワクチンの可能性が提示されている（べイリー, et al., コレステロールワクチン. サイエンス２６４, １０６７-１０６８, １９９４;PalinskiW., et al., Proc Natl Acad Sci U S A.９２, ８２１-５, １９９５;Wu R. de Faire U., et al., ハイパーテンション. ３３, ５３-９, １９９９）。また、アポリポたんぱく質B-１００は４５６０個のアミノ酸残基（２４個のシグナルペプチドを含めて）で構成された巨大なたんぱく質分子で、分子量は５００kDaを超過する。（Elovson J.,et al., バイオケミストリー, ２４ : １５６９-１５７８, １９８５）。アポリポたんぱく質B-１００は主に肝で分泌され両親媒性を有する分子であるため、脂たんぱく質の脂質と相互作用もでき、水溶液の環境とも相互作用できる。（Segrest J. P., et al., Adv. プロテインケミストリー., ４５: ３０３-３６９, １９９４）。アポリポたんぱく質B-１００はLDL粒子のサイズと構造を安定化させる役割と受容器との結合を通じ、血漿内のLDL-コレステロールの定常性を調節する重要な役割をする。（ブラウン MS., et al., サイエンス, ２３２ : ３４-４７, １９８６)。
【０００５】
本発明者により出願された韓国特許登録番号第１０-０６３９３９７号は、アポリポたんぱく質B-１００のエピトープに対する模造ペプチドが抗肥満効果を有し、これをヘルパーT細胞エピトープと融合させた免疫原性ハイブリッド  ポリペプチド（B４T)及び、これを含む組成物が肥満予防または治療に効果があるということを開示している。しかし上記出願では、単にアポリポたんぱく質B-１００のB細胞エピトープの模造ペプチド及び、これと結合されたヘルパーT細胞エピトープの融合ポリペプチドがヒトにおいて肥満を予防または治療に効果的だと開示しただけで、ヒト以外の動物の場合はヒトとは違う免疫関連物質及び代謝作用により同一な効果を期待できない。また、上記の登録された融合ポリペプチドはたんぱく質の折り畳み構造が多少不安定なので、一つのグループ内にて同一に免疫化されても個体によって抗体誘導反応の偏差が大きいという問題がある。
【０００６】
一方、ハプテンの免疫原性を高めるため、媒体たんぱく質と融合させようとする多くの試みがあったが一律的な上昇効果を得ることができなかった。特に、本発明のように、B細胞エピトープとT細胞エピトープの線形連結時、これらの方向性や各々のエピトープの種類によりかえって免疫原性が消失される場合もあり（フランシス, M. J. et al., ネイチャー ３３０ ; １６８-１７０, １９８７）、リンカーの存在により抗原性が減少する場合もあった（パルティド, C. et al., Mol. イムノル.２９ ; ６５１-６５８, １９９２）。このように、ペプチドワクチンのデザインには一貫的に適用できる様態が存在しなくて、デザインされたワクチンの効能も予測できない。同一な理由で、疎水性が非常に強いアポリポたんぱく質B-１００のエピトープに対する模造ペプチドを、異種ペプチドの狂犬病ウイルスヘルパーT細胞エピトープまたはB型肝炎ウイルス表面抗原ヘルパーT細胞エピトープ、またはアポリポたんぱく質CIIと融合させる場合、かえって抗原性を示す部分を分子内部へ没入させ、抗体誘導能が低下される可能性も排除できない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】韓国特許登録番号第１０-０６３９３９７号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】べイリー, et al., コレステロールワクチン. サイエンス２６４, １０６７-１０６８, １９９４
【非特許文献２】Palinski W., et al., Proc Natl Acad Sci U S A.９２, ８２１-５, １９９５
【非特許文献３】Wu R. de Faire U., et al., ハイパーテンション. ３３, ５３-９, １９９９
【非特許文献４】Elovson J.,et al., バイオケミストリー, ２４ : １５６９-１５７８, １９８５
【非特許文献５】Segrest J. P., et al., Adv. プロテイン ケミストリー., ４５: ３０３-３６９, １９９４
【非特許文献６】ブラウン MS., et al., サイエンス, ２３２ : ３４-４７, １９８６
【非特許文献７】フランシス, M. J. et al., ネイチャー ３３０ ; １６８-１７０,１９８７
【非特許文献８】パルティド, C. et al., Mol. イムノル.２９ ; ６５１-６５８,１９９２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
このような背景の下で、本発明者はヒトだけでなくイヌやウシ等の家畜を含む動物にも適用可能で、個体間に均一な抗体反応を誘導できる安定的な抗肥満ワクチンを提供するため多様に試み、その結果、N末端から順次にアポリポたんぱく質B-１００のB細胞エピトープの模造ペプチドの四量体（B４）に狂犬病ウイルスヘルパーT細胞エピトープ（R）、またはB型肝炎ウイルス表面抗原ヘルパーT細胞エピトープ（T）、及びアポリポたんぱく質CIIのC-末端ペプチド断片（CII）またはアポリポたんぱく質B-１００のB細胞エピトープの模造ペプチドの二量体（B２）を融合させた融合ポリペプチドが優秀な免疫増強効果を示し、ヒトだけでなく動物においても肥満の予防または治療に効果的に使用されるということを確認することによって、本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
従って、本発明の目的は、N末端から順次にアポリポたんぱく質B-１００のB細胞エピトープの模造ペプチド；狂犬病ウイルスヘルパーT細胞エピトープまたはB型肝炎ウイルス表面抗原ヘルパーT細胞エピトープ；及びマウスのアポリポたんぱく質CIIのC-末端ペプチド、またはアポリポたんぱく質B-１００のB細胞エピトープの模造ペプチドが融合された免疫原性ハイブリッドポリペプチドを提供することである。
【００１１】
本発明の他の目的は、上記の免疫原性ハイブリッドポリペプチドを含む肥満予防または治療用ワクチン組成物を提供することである。
【００１２】
本発明のまた他の目的は、上記の免疫原性ハイブリッドポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供することである。
【００１３】
本発明のまた他の目的は、上記のポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターを提供することである。
【００１４】
本発明のまた他の目的は、上記の組換え発現ベクターで形質転換された宿主細胞を提供することである。
【００１５】
本発明のまた他の目的は、上記の組換え発現ベクターで形質転換された宿主細胞を培養して上記の免疫原性ハイブリッドポリペプチドを製造する方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１の（a）は、アポリポたんぱく質CII遺伝子のPCR産物を電気泳動した写真である。（レーン１：２５/１００bp  ミックスDNAラダー、レーン２：PCR産物、２μｌ/ウェル  ロード、２％アガロースゲル、TBEバッファーシステム）  図１の（b）は、組換えApoCII/pQE３０ベクターに形質転換されたイー．コライJM１０９にて断片の挿入の可否を確認した電気泳動の写真である。
【図２】図２の（a）は、RVNP遺伝子のPCR産物を電気泳動した写真である。（レーン１：１００bp  ラダー（バイオニア）、レーン２：PCR産物、２μｌ/ウェル  ロード、２％アガロースゲル、TBE バッファーシステム）  図２の（b）は、B４RCII/pQE３０ベクターに形質転換されたイー．コライJM１０９よりプラスミドを分離してSal（サル）で切断し、断片が正しい方向に挿入されたことを確認した結果である。  図２の（c）は、B４RB２/pQE３０ベクターに形質転換されたイー．コライJM１０９よりプラスミドを分離してSalIで切断し、断片が正しい方向に挿入されたことを確認した結果である。  図２の（d）は、B４TB２/pQE３０ベクターに形質転換されたイー．コライJM１０９よりプラスミドを分離してSalIとHindIIIで切断し、断片が正しい方向に挿入されたことを確認した結果である。
【図３】図３は、B４RCII融合ポリペプチドを発現する組換え発現ベクターの製造過程を示す概略図である。
【図４】図４は、B４RB２、融合ポリペプチドを発現する組換え発現ベクターの製造過程を示す概略図である。
【図５】図５は、B４TB２融合ポリペプチドを発現する組換え発現ベクターの製造過程を示す概略図である。
【図６】図６は、B４RCIIの遺伝子及びたんぱく質配列をDNAシークエンシングを通って確認した結果である。
【図７】図７は、B４RB２の遺伝子及びたんぱく質配列をDNAシークエンシングを通って確認した結果である。
【図８】図８は、B４TB２の遺伝子及びたんぱく質配列をDNAシークエンシングを通って確認した結果である。
【図９】図９の（a）は、形質転換されたイー．コライM１５/B４RCIIをIPTGにB４RCIIの発現を誘導した後、時間に伴ってSDS-PAGEで分析した結果を示したものである。（レーンM:たんぱく質サイズマーカー(NEB)、レーン１:IPTGー誘導されないイー．コライM１５、レーン２乃至５：IPTG-誘導１時間乃至４時間後のイー．コライM１５/B４RCII、B４TB２）  図９の（b）は、形質転換されたイー．コライM１５/B４RB２をIPTGでB４RB２の発現を誘導した後、時間に伴ってSDS-PAGEで分析した結果を示したものである。（レーンM：たんぱく質サイズマーカー(NEB)、レーン１：IPTGー誘導されなかったイー．コライM１５、レーン２乃至５ : IPTG-誘導１時間乃至４時間後のイー．コライM１５/B４RB２）  図９の（c）は、形質転換されたイー．コライM１５/B４TB２をIPTGでB４RB２の発現を誘導した後、時間に伴ってSDS-PAGEで分析した結果を示したものである。（レーンM：たんぱく質サイズマーカー(NEB)、レーン １: IPTGー誘導されないイー．コライM１５、レーン２乃至３：IPTG-誘導３時間乃至５時間後のイー．コライM１５/B４TB２、レーン４：全体の 可溶性プロテイン、レーン５：全体の 可溶化プロテイン by ８Mウルア)  図９の（d）は、ラビット抗-B４多クローン抗体を利用したB４RCIIのウェスタンブロッティングした結果を示したものである。
【図１０】図１０の（a）は、樹脂結合されたB４RCIIよりB４RCIIを溶出するため、イミダゾール線形濃度勾配を精製グラフで示したものであり、図６の（b）はSDS-PAGEで示したものである。（M１：NEB プレステインド マーカー、レーン１：ノ  インダクション  セル  クルード  エクストラクト、レーン２：４hr インダクション  セル  クルード  エクストラクト、レーン３：全体の可溶性プロテイン、レーン４：全体の可溶化プロテイン by ８Mウルア（樹脂結合前）、レーン５：フロースル、レーン６: 洗淨断片 (５０mM  イミダゾール）、レーン７：溶出断片（５００mM  イミダゾール）、 各ウェル当７.５μｌずつロード)  図１０の（c）は、樹脂結合されたB４RB２よりB４RB２を溶出するため、イミダゾール線形濃度勾配を精製グラフで示したものであり、図１０の（d）はSDS-PAGEをもって示したものである。（レーン１ : エルピス   プレステインド プロテイン  マーカー、レーン２：全体の可溶性プロテイン、レーン３：全体の可溶化プロテイン  by ８Mウレア（樹脂結合前）、レーン４ : フロースル、 レーン６：溶出断片（５００mM  イミダゾール）、各ウェル当３μｌずつロード)  図１０の（e）は、樹脂結合されたB４TB２よりB４TB２を溶出するため、イミダゾール線形濃度勾配を精製グラフで示したものであり、図１０の（f）はSDS-PAGEで示したものである。（レーン１ : エルピス  プレステインド プロテイン  マーカー、レーン２ : 全体の可溶性プロテイン、レーン３: 全体の可溶化プロテイン  by ８Mウルア（樹脂結合前）、レーン４：フロースル、レーン５：洗淨断片 (５０mM  イミダゾール）、レーン６：溶出断片（５００mM  イミダゾール）-１、レーン７：溶出断片（５００mM  イミダゾール）-２ 各ウェル当  ７.５μｌずつロード)
【図１１】図１１は、B４RCII、B４RB２及びB４TB２を注射した時、C５７BL/６マウスグループの体重増加を比較したグラフである。青い矢印はDIOのスタート時点を、赤い矢印はワクチン処理する時点を示したものである。
【図１２】図１２は、B４RCII、B４RB２及びB４TB２を注射に伴う抗B４特異的抗体濃度の変化を示したものである。
【図１３】図１３は、ワクチンの３次のブースティングした１週間後（１６週齢）に得た血清内脂肪成分の濃度を示したものである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
一つの様態として、本発明はN末端から順次にアポリポたんぱく質B-１００のB細胞エピトープの模造ペプチド；狂犬病ウイルスヘルパーT細胞エピトープ、またはB型肝炎ウイルス表面抗原ヘルパーT細胞エピトープ；及びマウスのアポリポたんぱく質CIIのC-末端ペプチド断片、またはアポリポたんぱく質B-１００のB細胞エピトープの模造ペプチドが融合された免疫原性ハイブリッドポリペプチドに関する。
【００１８】
本発明で使用される用語「エピトープの模造ペプチド」はエピトープの最小部分を模倣するペプチドとして、最小部分エピトープは天然エピトープと類似しているので天然エピトープに対する特異抗体として認識される。またはそのエピトープは天然エピトープに交差結合して抗体力価を増加させられる。模造ペプチドはミモトプ（mimotope)ともいう。このような模造ペプチドは生体内にて非自己に認知され免疫反応において自己耐性の問題を克服できるという長所がある。上記した「アポリポたんぱく質B-１００のB細胞エピトープの模造ペプチド」はアポリポたんぱく質B-１００と特異的に結合する抗体によって認識されることとして、アポリポたんぱく質B-１００と特異的に結合する抗体はアポリポたんぱく質B-１００を特異的に認識して結合する多クローン抗体と単クローン抗体を含み、これらの断片、例えばFc、Fab、F(ab')2、scFv等も含む。この中で、好ましくは単クローン抗体が使用され、もっと好ましくはMab B９及びB２３が使用される。
【００１９】
本発明でアポリポたんぱく質B-１００エピトープの模造ペプチドは配列番号１、２及び３の中で選択されたアミノ酸配列を含む。本発明者は韓国特許登録番号第１０ー０６３９３９７号で開始したようにファージディスプレイペプチドライブラリーからバイオパニングによりアポリポたんぱく質B-１００に対する単クローン抗体Mab B9またはMab B２３によって認識される模造ペプチド（配列番号１、２及び３）を分離した。上記した配列番号１、２及び３の中で選択されたアミノ酸配列を含むアポリポたんぱく質B-１００エピトープの模造ペプチドは上記した配列番号のアミノ酸配列１個で成り立つ単量体の形態である場合もあるが、免疫原性をもっと増加させるため上記した配列番号のアミノ酸配列が２個以上、好ましくは３個乃至８個、より好ましくは３個乃至６個が連結された多量体の形態を取る場合もあり、もっと好ましくは４個が連結された四量体（配列番号４）の場合もある。多量体の形態を取る場合、単量体を形成するアミノ酸配列は直接的共有結合、またはリンカーを通る共有結合で連結されることもできる。リンカーを通って連結される場合、リンカーに使用されるアミノ酸はグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、セリン、スレオニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、リジン及びアルギニン等の中での１個乃至５個のアミノ酸残基で成り立つこともあり、リンカーとして使用される好ましいアミノ酸はバリン、ロイシン、アスパラギン酸、グリシン、アラニン、プロリン等を挙げられる。もっと好ましくは遺伝子操作の容易性を考慮してバリン、ロイシン、アスパラギン酸等の中で選択された２個のアミノ酸を連結して使用することもある。好ましい模造ペプチドは上記の配列番号１、２及び３の中で選択された２個以上のアミノ酸配列コピーをリンカーを通って連結することによって、準備できる。
【００２０】
本発明で使用される用語「T細胞エピトープ」は、適宜な効率でMHCクラスII分子に結合でき、T細胞を刺激したり、またはMHCクラスIIとの複合体でT細胞と結合できるアミノ酸配列を意味する。これはT細胞上に存在する特定受容体によって認識され、B細胞が抗体生産細胞に分化するのに要求される信号を提供する役割もし、細胞毒性T細胞（CTL)を誘導し標的細胞の溶菌を誘導することもある。本発明の目的のため、ヘルパーT細胞エピトープは上記の特定受容体の認識目標として好ましく使用され、本発明の場合、特に狂犬病ウイルスヘルパーT細胞エピトープまたはB型肝炎ウイルス表面抗原ヘルパーT細胞エピトープを使用する場合、効果が良いということを発見した。
【００２１】
狂犬病ウイルスはイヌ、ネコのようなペットだけでなく、家畜、野生の動物にも伝染される疾病として、獣医学的にワクチン接種が必須的である。従って、本発明において狂犬病ウイルスリボヌクレオプロテイン遺伝子（NCBI gene ID ; AF４０６６９５）からの遺伝子操作により宿主のヘルパーT細胞エピトープを含む５８個のアミノ酸ペプチド断片（R）を導入し、そのアミノ酸配列を配列番号６で示した。（Ertl, H. C. J., et al., ジャーナル オブ ビロロジー , ６３(７), ２８８５-２８９２, １９８９)。
【００２２】
B型肝炎ウイルス（HBV)遺伝子の長さは３.２ｋbであり、４つの重要なたんぱく質に対する情報を有し、S遺伝子（表面抗原たんぱく質）、C遺伝子（コアたんぱく質）P遺伝子（DNA重合酵素）及びX遺伝子で構成されている。この中でS遺伝子の場合、HBsAgをコードしているS領域とpreS領域に分けることができる。preS領域はHBV菌株に伴って、１０８または１１９個のアミノ酸をコードしているpreS１とサブタイプに関係なく５５個のアミノ酸残基でからなるpreS２に分ける。HBVpreS２たんぱく質は体内の免疫反応過程でヘルパーT細胞を活性化させ、これはHBVに対する抗体形成を促進させる。本発明にて使用したHBVヘルパーT細胞エピトープに対するアミノ酸配列を配列番号７で示した。
【００２３】
また、本発明の免疫原性ハイブリッドポリペプチドはC-末端にマウスのアポリポたんぱく質CIIのC-末端ペプチド断片、またはアポリポたんぱく質B-１００のB細胞エピトープの模造ペプチドを含む。
【００２４】
マウスのアポリポたんぱく質CIIは、主に小腸と肝で生成される分子量８８００aD、７９アミノ酸残基（Hoffer, M, J., et al., ゲノミックス １７(１), ４５-５１, １９９３)として、カイロミクロン、VLDL及びHDLにて存在し、アポリポたんぱく質リパーゼ（LPL）が酵素活性をするための必須的な補助因子（essential cofactor)の機能を現わす（Storjohann, R., et al., バイオケミカ et バイオフィジカアクタ, １４８６, p２５３-２６４, ２０００)。本発明の好ましい実施例にては、アポリポたんぱく質CIIのLPL活性を調節するC-末端の３３個のアミノ酸残基で構成されるペプチドをマウスのアポリポたんぱく質CII遺伝子（NCBI gene ID ; NM００９６９５）よりクローニングし、配列番号８で示した。
【００２５】
本発明の免疫原性ハイブリッドポリペプチドのC-末端に結合するアポリポたんぱく質B-１００エピトープの模造ペプチドは配列番号１、２及び３の中で選択されたアミノ酸配列を含む。上記した配列番号１、２及び３の中で選択されたアミノ酸配列を含むアポリポたんぱく質B-１００エピトープの模造ペプチドは、上記した配列番号のアミノ酸配列１個で成り立つ単量体の形態である場合もあるが、免疫原性をもっと増強させるため上記した配列番号のアミノ酸配列が２個乃至４個が連結された多量体の形態を取る場合もあり、好ましくは２個が連結された二量体である場合もある。多量体の形態を取る場合、単量体を形成するアミノ酸配列は直接的に、またはリンカーを通って共有結合で連結されることもある。
【００２６】
本発明で使用される用語「免疫原性」というのは、細胞性免疫及び体液性免疫反応の両方を誘導して、異物質に対処する能力をいい、このような免疫反応を誘導する物質を免疫原という。本発明は免疫原性物質としてアポリポたんぱく質B-１００のB細胞エピトープ、狂犬病ウイルスヘルパーT細胞エピトープまたはB型肝炎ウイルス表面抗原ヘルパーT細胞エピトープ、及びアポリポたんぱく質CIIのC-末端ペプチド断片で成り立つ融合ポリペプチドを使用する。
【００２７】
本発明においてのペプチドの場合のように、B細胞エピトープとT細胞エピトープのエピトープ部分が融合され免疫原性物質として使用される場合、T細胞エピトープがポリペプチドの折り畳み構造の内側に、B細胞エピトープが外側に位置する場合のみ効率的な免疫反応が誘導されるというのは周知の事実であるところ(パルティド C, et al., Eur ジェー イムノル., ２２(１０) : ２６７５-８０, １９９２)、本願発明者たちは、アポリポたんぱく質B-１００のB細胞エピトープの模造ペプチドとT細胞エピトープだけを連結させた既存のB４T融合ポリペプチドの構成に追加して、T細胞エピトープのC-末端にアポリポたんぱく質CIIのC-末端ペプチド断片、またはアポリポたんぱく質B-１００のB細胞エピトープの模造ペプチドを追加連結させ、その結果、本発明においての融合ポリペプチドはT細胞エピトープがB細胞エピトープにより囲まれて、外に露出される部分が最小化され、融合ポリペプチドの折り畳み構造がもっと安定化されるだけでなく、より均一な抗体反応を誘導できるということを確認した。
【００２８】
本発明で使用される用語「ポリペプチド」は、２個以上のアミノ酸を含む残基が共有ペプチド結合により結合されたフルレングスのアミノ酸鎖を含む用語としてジペプチド 、トリペプチド 、オリゴペプチド 及びポリペプチド 等が含まれ、特に本発明では数個乃至数十個のアミノ酸が共有結合されたペプチド２種以上が互いに連結されたハイブリットポリペプチドを意味する。ポリペプチドを構成する各々のペプチド配列は上記したようなエピトープに該当するアミノ酸配列を含み、それに隣接に配置された配列を含むこともある。これらのペプチドはLーアミノ酸、Dーアミノ酸または２種の相違な配置のアミノ酸の多様な構成ができる。
【００２９】
本発明で使用される用語「ハイブリッドポリペプチド」は、一般的に起源の違う他の異種のペプチドが連結された様態のペプチドを称し、本発明ではＢ細胞エピトープに狂犬病ウイルスヘルパーＴ細胞エピトープ（Ｒ）、またはＢ型肝炎ウイルス表面抗原ヘルパーＴ細胞エピトープ（Ｔ）、及びアポリポたんぱく質ＣIIのＣ-末端ペプチド断片（ＣII）、またはアポリポたんぱく質Ｂ-１００のＢ細胞エピトープの模造ペプチドを連結した様態のペプチドを意味する。
【００３０】
好ましい一つの様態で、本発明に従うハイブリッドポリペプチドは、配列番後１のアミノ酸配列を有するペプチド４個が連結されたポリペプチド（Ｂ４）、上記のペプチドのＣ−末端に連結された狂犬病ウイルスヘルパーＴ細胞エピトープ（Ｒ）及び、上記のヘルパーＴ細胞エピトープのＣ−末端に連結されたマウスアポリポたんぱく質ＣIIのＣ−末端ペプチド断片（ＣII）が融合されたポリペプチド（Ｂ４ＲＣII）を意味する（配列番号９）。他の様態では、配列番号１のアミノ酸配列を有するペプチド４個が連結されたポリペプチド（Ｂ４）、上記のペプチドのＣ−末端に連結された狂犬病ウイルスヘルパーＴ細胞エピトープ（Ｒ）、及び上記のヘルパーＴ細胞エピトープのＣ−末端に連結された配列番号１のアミノ酸配列を有するペプチド２個が連結されたポリペプチド（Ｂ２）が融合されたポリペプチド（Ｂ４ＲＢ２）を意味する（配列番号１０）。また他の様態では、配列番号１のアミノ酸配列を有するペプチド４個が連結されたポリペプチド（Ｂ４）、上記のペプチドのＣ−末端に連結されたＢ型肝炎ウイルスの表面抗原ヘルパーＴ細胞エピトープ（Ｔ）、及び上記のヘルパーＴ細胞エピトープのＣ−末端に連結された配列番号１のアミノ酸配列を有するペプチド２個が連結されたポリペプチド（Ｂ２）が融合されたポリペプチド（Ｂ４ＲＢ２）を意味する。（配列番号１１）
【００３１】
本発明のハイブリッドポリペプチドは、全面的に上記したようなＢ細胞エピトープ、狂犬病ウイルスヘルパーＴ細胞エピトープ、またはＢ型肝炎ウイルス表面抗原ヘルパーT細胞エピトープ、アポリポたんぱく質ＣIIのＣ−末端ペプチド断片、及び任意にこの引接配列を含む抗原性部分だけでなることもでき、付加配列も含まれる。しかし、このような付加配列は全体の免疫原性を減少させないことが好ましい。このような付加配列ではリンカー配列を例として挙げられる。リンカーを通じて連結される場合、これによる免疫反応誘導に不利な影響を及ぼさないように選定されるべきである。
【００３２】
また他の様態として、本発明は上記した免疫原性ハイブリッドポリペプチドをコードするポリヌクレオチド及びこれを含む組換えベクター、また上記の組換え発現ベクターで形質転換された宿主細胞及び、上記の宿主細胞を培養し、上記のポリペプチドを生産する方法に関することである。
【００３３】
本発明のハイブリッドポリペプチドは、各々のパートナーが決定した後、化学的に合成したりまたは遺伝子組換えの方法で発現及び精製し取得できる。具体的に、遺伝子組換えの方法で本発明の免疫原性ハイブリッドポリペプチドを生産する過程は次の段階を含む。
【００３４】
最初に、ハイブリッドペプチドをコードする遺伝子をベクターに挿入し、組換えベクターを製造する段階である。外来遺伝子を挿入するためのベクターとしては、プラスミド、ウイルス、コスミド等、多様な様態のベクターを使用できる。組換えベクターは、クロニングベクター及び発現ベクターを含む。クロニングベクターは複製基点、例えば、プラスミド、バクテリオファージまたはコスミドの複製起点を含み、他のＤＮＡ断片が付着され、その付着された断片が複製されることができる「レプリコン」である。発現ベクターは、たんぱく質を合成するに使用されるように開発された。組換えベクターは、通常の外来ＤＮＡの断片が挿入された媒介体として、一般的に二本鎖ＤＮＡの断片を意味する。ここで用語「外来ＤＮＡ」とは、外来種から起源されるＤＮＡを意味したり、同一な種から起源される場合には、本来の様態から実質的に変形された様態を意味する。また、細胞で正常的に発現、変化されないＤＮＡ配列も含む。この場合、外来遺伝子は伝写される特定な目的の核酸としてポリペプチドを暗号化する。組換えベクターは、宿主細胞で形質感染遺伝子の発現水準を高めるために、当該の遺伝子が選択された発現宿主内で機能を発揮する伝写及び、解読発現の調節配列に作動が可能するように連結されるべきである。上記の組換えベクターは個体の細胞内で遺伝子挿入物が発現されるように作動が可能に連結された必修的な調節要素を含む遺伝子作製物として、このような遺伝子作製物を製造するため標準組換えＤＮＡ技術を用いられる。組換えベクターは、原核細胞及び真核細胞の各種の宿主細胞で目的とする遺伝子を発現し、目的とするたんぱく質を生産する機能をしたら、その種類が特に限定されないが、強力な活性を示すプロモーターと強い発現力を保有しながら自然の状態と類似した様態の外来たんぱく質を大量に生産できるベクターが好ましい。組換えベクターは少なくとも、プロモーター、開始コドン、目的とするたんぱく質を暗号化する遺伝子、終結コドン、ターミネーターを含んでいることが好ましい。それ以外に、信号ペプチドをコードするＤＮＡ、エンハンサー配列、目的とする遺伝子の5'側、及び３'側の解読されない領域、選別マーカー領域、または複製可能段位等を適宜に含まれる。
【００３５】
２番目、上記の組換えベクターを使用して宿主細胞を形質転換させた後、培養する段階である。組換えベクターを宿主細胞に導入し形質転換体を製造するための方法としては、文献（Sambrook, J., et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual(２版), Cold Spring Harbor Laboratory, １.７４, １９８９）に記されたリン酸カルシウム法、または塩化カルシウム−塩化ルビジウム法、エレクトロポレーション法(Electroporation)、電気注入法(Electroinjection)、PEG等の化学的処理方法、遺伝子銃(Gene gun)等を用いる方法等がある。上記の組換えベクターが発現される形質転換体を栄養培地で培養すると、有用なたんぱく質を多量に製造、分離可能である。培地と培養条件は、宿主細胞によって慣用されるのを適当に選択し用いられる。培養の時、細胞の成育とたんぱく質の大量生産に適合するように温度、培地のpH及び培養時間等の条件を適宜に調節するべきである。本発明に従う組換えベクターに形質転換されることができる宿主細胞は、原核細胞と真核細胞全部を含みDNAの導入効率が高く、導入されたDNAの発現効率の高い宿主が通常使用される。細菌、例えば、大腸菌、シェードモナス、バチルス、ストレプトミセス、真菌、イーストのような周知の真核及び原核宿主ら、Spodoptera frugiperda(SF9)のような昆虫細胞、CHO、COS１、COS７、BSC１、BSC４０、BMT１０等の動物細胞等が使用されることのできる宿主細胞の例である。好ましくは、イー・コライが使用されることもできる。
【００３６】
３番目に、ハイブリッドペプチドの発現を誘導、蓄積する段階である。本発明では、誘導因子IPTGを使用してペプチドの発現を誘導し、誘導時間はたんぱく質の量を最大化されるように調節した。
【００３７】
最後に、ハイブリッドペプチドを分離、精製する段階である。一般的に、組換え的に生産されたペプチドは培地または細胞分解物から回収できる。膜結合形の場合、適合な界面活性剤溶液（例、トリトン−X１００）を使用したり、または酵素的な切断により膜から遊離されることができる。ハイブリッドペプチドの発現に使用された細胞は、凍結−解凍の繰り返し、音波処理、機械的破壊または細胞分解剤のような多様な物理的、または化学的手段により破壊されることもでき、通常的な生化学分離技術により分離、精製が可能である。（Sambrook J., et al., Molecular Cloning, : A Laboratory Manual, （２版）, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 ; Deuscher, M., Guide to Protein Purification Methods Enzymology, Vol.１８２. Academic Press. Inc., San diego, CA, １９９０）電気泳動、遠心分離、ゲル濾過、沈殿、透析、クロマトグラフィー、（イオン交換クロマトグラフィー、親和力クロマトグラフィー、免疫吸着親和力クロマトグラフィー、逆状HPLC、ゲル浸透HPLC）等、電性フォーカス及びこの多様な変化及び複合方法を含むが、これに限定されない。
【００３８】
本発明者は好ましい実施例として、B細胞エピトープを有するが、これ自体ではT細胞エピトープの部分が欠如されている抗肥満機能的ペプチドのアポリポたんぱく質B−１００模造ペプチドの四量体様態のB４のC−末端部分とT細胞エピトープを有する狂犬病ウイルスのヌクレオたんぱく質遺伝子の一部(R断片)及びマウスアポリポたんぱく質遺伝子の一部(CII断片)を連結し、B４RCII遺伝子断片を作製した（図３）。B４断片は、韓国特許登録番号第１０−０６３９３９７号で開始したB４断片を使用し、アポリポたんぱく質CIIとRVNP(Rabbis Virusのたんぱく質中ヘルパーT細胞のエピトープが存在する核たんぱく質部分)は、RT−PCR法により各々の遺伝子を得た。B４RCIIの発現のためにはpQE３０プラスミドを使用したが、これはベクター自体内にある開始コドンからたんぱく質の発現が開始され、精製を便利にするためヒスチジン６個も共に発現され、エンテロキナーゼ部位も発現される。このように発現されるたんぱく質は、アミノ酸の分子量で計算された大きさが約２１KDaであり、SDS−PAGEで計算され大きさは約２２KDaであった。時間帯別にサンプルを得て、SDS−PAGEを通じて発現されることを確認した（図９）。
【００３９】
また他の様態として、本発明は上記の免疫原生ハイブリッドポリペプチドを含む肥満予防、または治療用ワクチン組成物に関することである。
【００４０】
上記したように、ペプチドワクチンのデザインに一貫的に適用できる様態が存在しないし、デザインされたワクチンの効能も予測できない。同一な理由で、疎水性の強いB４ペプチドを異種ペプチドであるT細胞エピトープと融合させる場合、かえって抗原性を示す部位を分子内部へ内面化させ、抗体誘導能が低下される可能性もある。このように、その結果を類推し難い状況で、本発明者たちはN−末端から順次にアポリポたんぱく質B−１００のB細胞エピトープの模造ペプチドに狂犬病ウイルスヘルパーT細胞エピトープまたはB型肝炎ウイルス表面抗原ヘルパーT細胞エピトープ及びアポリポたんぱく質CIIのC−末端ペプチド断片、またはアポリポたんぱく質B−１００のB細胞エピトープの模造ペプチドを融合させた融合ポリペプチドを設計し、抗肥満に対するこれらの免疫原生を証明した。
【００４１】
本発明に従う免疫原生ハイブリッドポリペプチドを上記したように遺伝子組換えの方法により発現、及び精製し、マウスに接種した後、動物個体の（a）体重増加の推移観察、（b）血清内の抗体力価の観察、及び（c）血清内の脂質含量の変化を通じて免疫反応の効果を検定し、抗原の優秀な様態を証明した。その結果、ハイブリッドポリペプチド（B４RCII、B４RB２、及びB４TB２）にワクチン化されたグループが対照グループに比べて体重増加が抑制され、模造ペプチドに対する抗体力価が高くて残存期間も長いし、TG、及びLDL−コレステロール数値も下がると確認した。
【００４２】
具体的に、抗原注射による体重変化を６週齢ICRマウスに、精製したB４RCII、B４RB２、及びB４TB２を腹腔に５０μｇ/１５０μｌに２週間ごと３回注射した後、体重変化を体重増加グラフで確認した（図１１）。１次ブースチングの以後、高脂肪食を食べさせDIO（Diet Induced Obesity）を誘導した。１次注射とブースチングの時までは、各グルーフ別身体質量は２２乃至２３ｇで類似していたが、DIOを始まった以後、対照群（肥満、Obesity）は急激に体重が増加した反面、B４RCII、B４RB２、及びB４TB２を注射したグルーフは軽微な体重増加を見せた。１４週齢（１次の注射から８週経過）の時、対照群とB４RB２を注射したグルーフの体重の差は約８ｇが現われた。これは、最初の注射（Primary）により微弱な免疫反応が２次注射によりブースチングされた後、増強された免疫応答反応により体重増加が抑制されるのを示唆されたことである。そして、３次注射後の体重増加の偏差は予想通り維持されていることと測定された。
【００４３】
また、ワクチン処理されたグルーフでICRマウスの抗体力価は７、１０、１２、１４、１６、１８週齢で間接的ELISA分析をした（図１２）。また、血清内の脂質水準はワクチン処理されたグルーフがワクチン処理されなかった対照群（肥満）グルーフより全体的に総コレステロール（TC）、中性脂肪（TG）、HDLコレステロール、及びLDLコレステロールの数値が低く現われた。（図１３）
【００４４】
上記の結果から、本発明によるB４RCII、B４RB２、及びB４TB２融合ポリペプチドは効果的な抗肥満用ワクチンとして使用できることを示す。これら融合ポリペプチドは、既存のB４T融合ポリペプチドに比べてさらに均質で安定的な免疫反応を誘導することにより、効果的な抗肥満用ワクチン組成物を構成することができる。
【００４５】
本発明の抗肥満ワクチンは、抗原、薬剤学的許容可能な担体、適宜な補助剤、及び他の通常的な物質で構成され、免疫学的効果量を投与する。本発明で「免疫学的効果量」というのは、肥満治療及び、予防効果を示す程度の十分な量と副作用や深刻な、または過度な免疫反応を起こさない程度の量を意味し、正確な投与濃度は投与される特定の免疫原により異なり、免疫反応の発生を検査するため当業者が公知の方法を用いてこれを決定できる。また、投与様態、及び経路、受容者の年齢、健康、及び体重、症状の特性と程度、現在の治療法の種類、及び治療回数により変化できる。担体は当分野の公知のもので安定化剤、希釈剤、及び緩衝液を含む。適宜な安定化剤はソルビトール、ラクトース、マン二トール、澱粉、糖、デキストラン及び葡萄糖のような炭水化物；アルブミン、またはカゼインのようなたんぱく質などを含む。適宜な希釈剤には、塩、Hanks均衡塩、及び点滴液などを含む。適宜な緩衝液には、アルカリ金属リン酸塩、アルカリ金属炭酸塩、及びアルカリ土金属炭酸塩などを含む。また、ワクチンには免疫反応を改善、または強化させるため１個以上の補助剤等を含む。適宜な補助剤にはペプチド；水酸化アルミニウム；リン酸アルミニウム；酸化アルミニウム；Marcol５２のようなミネラルオイル、または植物性オイル及び１個以上の乳化剤で構成された組成物またはリゾレシチン、多重陽イオン、多重陰イオンのような表面活性物質等を含む。本発明のワクチン組成物は、個別治療剤として投与したり、他の治療剤と併用して投与されることができ、従来の治療剤と順次に、または同時に投与することができる。ワクチン組成物は、公知の投与経路を通じて投与される。このような方法には、経口、経皮、筋肉、腹膜、静脈、皮下、鼻腔の経路を用いられるが、これに限定されない。また、製薬組成物は、活性物質が標的細胞へ移動できる任意の装置により投与されることができる。
【実施例】
【００４６】
以下の実施例を通じて、本発明をより具体的に説明する。これはただ例示するためのことで、下記の実施例により本発明の範囲が限定されることはない。
【００４７】
実施例１．実験材料及び実験動物の準備
DNAミニプレプキット（Miniprep kit）とゲルでDNAを抽出するため使用されたキットはヌクレオジュン製品を、細胞培養に必要なバクト−トリプトン（Bacto-trypton）、バクト−酵素抽出物（Bacto-yeast extract）、細菌培養基（Agar）等はDifco社（Detroit、MI）製品を、制限酵素はタカラ製品を、T４DNAリガーゼはNEB製品を使用した。使用ベクターは、ブルースクリプトIISK（Stratagene社）、PCR２.１（インビトロジェン、カールスバッド、CA）、pQE３０（キアゲン社）を、菌種はイー・コライJM１０９及びM１５（キアゲン社）を使用した。
【００４８】
たんぱく質の生成を誘導するためのIPTGはシグマ社製品を、発現されたたんぱく質を精製するため使用されたNi−NTA樹脂はアマシャム製品を使用した。SDS−PAGE及びウェストンブロッティング、ECL等に使用された予備染色されたマーカー（Prestained marker）にはNEB社の製品を使用した。たんぱく質を変成状態に作るため使用されたウレアは、Duchefa製品を使用した。精製に使用されたイミダゾールは、USB製品を使用した。透析に使用された膜は、MWCO３５００スペクトラム製品で、たんぱく質の凝集防止のため使用された試薬はCHAPSでAmersco製品である。ELISAに使用された抗体は、HRP結合された抗−マウスIgGとしてシグマ製品を使用した。ウェストンブロッティングとECLに使用された基質溶液としては、BCIP/NBTで、シグマ社の製品である。また、ECLplusウェストンブロッティングの検出試薬は、アマシャム製品を使用した。補助剤は、フロインド  アジュバントでシグマ社製品と水酸化アルミニウム（Aluminum hydroxide;Reheis社）を使用した。 たんぱく質の濃縮は、BCAたんぱく質検査法（ピアス社）とブラッドフォード検査法（バイオラッド社）で実行した。
【００４９】
ICRマウスは（株）中央実験動物で購入し、６週齢以上の雌を使用した。ICRマウスはブースティングの時まではノーマルダイエットを（株）Samtako製品、成分：天然たんぱく質１８％以上、粗脂肪５.３％以上、粗繊維４.５％、無機物８.０％）で飼育し、それ以後は高脂肪食（６０％kCal fat、D１２４９２、リサーチ  ダイエット Inc.、ニューブランズウイック、NJ）で飼育した。
【００５０】
実施例２：マウスApoCII遺伝子複製
２−１．マウスの肝組織から全体RNAの分離
全体RNAの分離は、トリゾール（インビトロジェン）を使用して分離し、RNA分離に使用された全ての溶液は０．１％のジエチルピロカーボネート処理したウォーター（DEPC−dH2O）で処理しRNase活性を阻害した。マウスから分離した肝組織５０ｍｇ当りトリゾール２ｍｌを加え、均質化し粉砕した。氷で２０分間反応させた後、粉砕物を４℃、１４０００rpmの速度で１５分間遠心分離した。たんぱく質を除外するように注意しながら新しいチューブに上層液だけを移した後、２００μｌのクロロホルム（Merck）を入れて３０秒間ボルテックスした。氷で２０分間反応させた後、混合物を４℃、１４０００rpmの速度で１５分間遠心分離した。新しいチューブに上層液だけを移し、同量のフェノール−クロロホルム、０．２Mアセト酸ナトリウム（pH５．２）を入れて５秒間ボルテックスした。氷で２０分間反応させた後、混合物を４℃、１４０００rpmの速度で１５分間遠心分離した。上層液と同一量のイソプロパノール（Merck）を加え混ぜ、−７０℃で１時間保存した後、４℃、１４０００rpmの速度で１０分間遠心分離し、全体RNAペリット（Pellet）を確認できた。RNAペリットを１ｍｌの７５％エタノールで洗って乾燥させ、DEPC−dH2０で再均質化させた後、−７０℃で保存した。RNA濃度はGenequantII（ファルマシア  バイオテック）で測定し、分離したRNAは１％アガロースゲル（０.5TAE）で１μｌを電気泳動して確認した。
【００５１】
２−２．全体RNAを用いたcDNA合成O
cDNA合成はcDNA サイクルTMキット（インビトロジェン）を使用した。PCRチューブに上記で得たRNAを４００ng入れ反応溶液の体積が１１．５μｌになるようにDEPC−dH２０を入れた。オリゴdTプライマー１μｌを入れ十分に混ぜて６５℃のウォーターバスで１０分間、室温で２分間反応させた。これに、RNase反応抑制剤１．０μｌ、５X RTバッファ４．０μｌ、１００mM dNTPs１．０μｌ、８０mMピロリン酸ナトリニウム（Sodium Pyrophosphate）１．０μｌ、AMV逆転写酵素０．５μｌを加え、軽く叩いて混ぜた後、４２℃のウォーターバスで１時間、９５℃で２分間反応させた後、素早く氷で保存した。０．５MEDTA（pH８．０）１．０μｌ、フェノール−クロロホルム２０μｌを入れてボルテックスした後、４℃、１４０００rpmの速度で１５分間遠心分離した。上層液を新しいチューブへ移し、アンモニウムアセテート２２μｌ、７５％エタノール８８μｌを入れてボルテックスした後、−７０℃で一晩保存した。４℃、１４０００rpmの速度で１５分間遠心分離した後、上層液を捨て、ペリットを２０μｌの３次蒸留水で再懸濁（Resuspension）させ、１％のアガロースゲル（０．５％YAEバッハァ）で電気泳動して確認した。
【００５２】
２−３．マウスアポリポたんぱく質CIIC−末端のPCR
本実験に使用された全てのPCRは、DNAサーマル  サイクラー４８０を使用した。マウスアポリポたんぱく質CIIのリパーゼ activating リージョンを含む９９個の遺伝子を増幅するためＡpoCII−センスプライマー（５'tc aga GTC GAC gat gag aaa ctc agg gac 3'）とＡpoCII−アンチセンスプライマー（５'tat AAg CTT ggg ctt gcc tgg cag cag cta c ３'）を使用してPCRを遂行した。まず、PCRチューブにＡpoCII−センスプライマーとＡpoCII−アンチセンスプライマー（２pmol/μｌ）を各々１μｌずつ入れ、２．２．１．２で作ったcDNAを２μｌ入れた。１０Xバッハァ５μｌ、dNTP８μｌ、TaqDNA重合酵素（タカラ社）１μｌを入れ、最終体積が５０μｌになるように準備した。PCR条件は９４℃で５分反応させた後、９８℃で３０秒、５６℃で３０秒、７２℃で３０秒を１セットとして３０回反復反応させた後、７２℃で５分反応させ氷で保存した。１．５％アガロース（０．５％TAEバッハァ）で１μｌを電気泳動して確認した（図１b）。
【００５３】
２−４．ApoCII/pQE３０の作製
ApoCII断片を得るためＡpoCIIPCR断片は、ＡpoCIISalIとHindIIIとこの断片を挿入するためのpQE３０ベクターもSalIとHindIII制限酵素を用いて切り出した。
【００５４】
pQE３０とCII断片をT４DNAリガーゼを用いて１６℃で夜通し連結させた。たんぱく質を発現させるため選択されたベクターシステムは、pQE３０プラスミドシステムとして、このべクターは発現させようとするたんぱく質の６Xヒスチヂンアミノ酸と融合たんぱく質の様態で発現され精製し易くなるように考案された。組換えプラスミドは、JM１０９イー・コライに形質転換され増幅された。上記の形質転換体から標本を抽出し得たプラスミドはSalIとHindIIIで処理した後、遺伝子断片の挿入を確認した。
【００５５】
実施例３.RCII人工遺伝子の作成
３−１．狂犬病ウイルス（Rabies virus）ストレーンERAから遺伝子RNAの分離
全体のRNA分離は、トリゾール（インビトロジェン）を使用して分離し、RNA分離に使用された全ての溶液は０．１％ジエチル  ピロカーボネート処理したウォータ（DEPC−dH2O）で処理してRNase活性を阻害した。狂犬病予防ワクチンに入っている狂犬病ウイルスからトータルRNAを分離するため、まずワクチン１．２ｍｌに２．５MNaClを含む２０％（W/V）ポリエチレングリコール−８０００溶液を２００μｌ加え１時間氷で放置した後、１４０００rpm、４℃で１０分間遠心分離した。このようにして得られたウイルスペリットに、トリゾール１ｍｌを加えピペット（Pipetting）して十分に混ぜた。氷で２０分間反応させた後、粉砕物を４℃、１４０００rpmの速度で１５分間遠心分離した。たんぱく質を除外するように注意しながら、新しいチューブに上層液だけを移した後、２００μｌのクロロホルムを入れ３０秒間ボルテックスした。氷で２０分間反応させた後、混合物を４℃、１４０００rpmの速度で１５分間遠心分離した。新しいチューブに上層液だけを移し、同量のフェノール−クロロホルム、０．２Mアセト酸ナトリウム（pH５．２）を入れて５秒間ボルテックスした。氷で２０分間反応させた後、混合物を４℃、１４０００rpmの速度で１５分間遠心分離した。上層液と同一量のイソプロパノール（Merck）を添加して混ぜ、−７０℃で１時間保存した後、４℃、１４０００rpmの速度で１０分間遠心分離し、全体のRNAペリットを確認できた。RNAペリットを１ｍｌの７５％エタノールで洗って乾燥させ、DEPC−dH2Oで再均質化させた後、−７０℃で保存した。RNA濃度はGenequantII（ファルマシア  バイオテック）で測定し、分離したRNAは１％アガロースゲル（０．５％TAE）で１μｌを電気泳動して確認した。
【００５６】
３-２．ゲノムRNAを用いたcDNA合成
cDNA合成はcDNAサイクルTMキット(インビトロジェン)を使用した。PCRチューブに、上記で得たRNAを４００ng入れ、反応溶液の体積が１１.５μｌになるようにDEPCーdH2Oを入れる。ランダムな六量体約１μｌを入り十分に混ぜて、６５℃のウォーターバスで１０分間、室温で２分間反応させた。ここに、RNase阻害剤１.０μｌ 、５X RTバッファ４.０
μｌ、１００mM dNTPs １.０μｌ、８０mMのピロリン酸ナトリウム１.０μｌ、AMV逆転写酵素０.５μｌを加え軽く叩いて混ぜた後、４２℃のウォーターバスで１時間、９５℃で２分間反応させて、素早く氷に保管した。０.５M EDTA（pH８.０)１.０μｌ、フェノール-クロロホルム２０μｌを入れてボルテックス（vortex）した後、４℃、１４０００rpmの速度で１５分間遠心分離した。上層液を新しいチューブに移し、酢酸アンモニウム（ammonium acetate）２２μｌ、７５％のエチルアルコール８８μｌを入れてボルテックスした後、-７０℃で夜通し保管した。４℃、１４０００rpmの速度で１５分間遠心分離した後、上層液を捨て、ペリットを２０μｌの３次蒸溜水で再懸濁させ、１％アガロースゲル（０.５％TAE バッファ)で電気泳動で確認した。
【００５７】
３-３．狂犬病ウイルス(Rabies virus)ストレーンERA核たんぱく質遺伝子のPCR
狂犬病ウイルス(Rabies virus)ストレーンERAの核たんぱく質遺伝子の中、T細胞エピトゥプに明らかになった（２）１７４個の遺伝子を増幅するためにより、RVNP-センスプライマー（５'-ATA CTC GAG GAC GTA GCA CTG GCA GAT G-３'）とRVNP-アンチセンスプライマー（５'-ATA CTC GAG GTT TGG ACG GGC ATG ACG-３'）を使用してPCRを遂行した。まず、PCRのチューブにRVNP-センスプライマーとRVNP-アンチセンスプライマー（２pmol/μｌ)を各々１μｌずつ入れ、２.２.２.２で作ったcDNAを２μｌを入れた。１０Xのバッファ５μｌ、dNTP ８μｌ、タク（Taq）DNA 重合酵素(タカラ) １μｌを入れ、最終体積が５０μｌになるように準備した。PCRの条件は９４℃で５分間反応した後、９８℃で３０秒、５４℃で３０秒、７２℃で３０秒を１セットにして３０回反復反応させた後、７２℃で５分間反応させ氷に保管した。１.５％アガロースゲル（０.５％TAE バッファ)で１μｌ電気泳動で確認した。
【００５８】
３-４．RCII/pQE３０の作製
R断片を得るために、RVNP PCR断片はXhoIで、この断片を挿入するためのApoCII/pQE３
０ベクターはXhoIとSalI制限酵素を用いて切り出した。線形化されたApoCII/pQE３０とR断片をT４DNAリガーゼを用いて、１６℃で夜通し結合させた。JM１０９イー．コライ（E. coli）ストレーン（strain）に形質変換させた後、プラスミドを分離してSalIとHindIIIで切断して、断片が正しい方向に挿入されたことを確認した。
【００５９】
実施例４．B４RCIIベクターの作成
韓国特許登録番号第１０ー０６３９３９７号で開始したようなpQE３０に入っているB４断片をXhoIで切断し得た。RCIIの断片が挿入されているpQE３０ベクターをXhoIで切断した後、上記で得たB４断片とT４DNA重合酵素で１６℃に夜通し結合させて、B４RCII/pQE３０（B４RCII）を得た。固定された（anchoring）B４RCIIの塩基配列を確認するために、（株）コスモジンテクにDNA配列をプラスミド濃度３００〜５００ng/μｌで依頼した。また、B４RCII/pQE３０ベクターに形質変換させたイー・コルライJM１０９からプラスミドを分離してSalIで切断し、断片が正しい方向に挿入されたことを確認した（図２b）。B４RCIIのアミノ酸配列は配列番号９で示した。
【００６０】
実施例５．B４RB２ベクターの作成
韓国特許登録番号第１０ー０４７２８４１号で開始したBX２/pQE３０(pB２)ベクターをXhoIとSalI制限酵素を用いて切り出し、線形化されたBX２/pQE３０と実施例３で得たR断片をT４DNAリガーゼを用いて、１６℃で夜通し結合させてRBX２/pQE３０(pRB２)を得た。
【００６１】
実施例４で得たB４RCIIをXhoIの制限酵素で切り出しB４断片を得た後、XhoIで切断したpTB２とT４DNAリガーゼを用いて、１６℃で１５時間以上反応させ、B４RBX２/pQE３０(B４RB２)を得た。B４RBX２/pQE３０ベクターに形質変換させたイー・コルライJM１０９からプラスミドを分離し、SalIで切断し断片が正しい方向に挿入されたことを確認した（図２c）。B４RB２のアミノ酸配列は配列番号１０で示した。
【００６２】
実施例６．B４TB２ベクターの作成
韓国特許登録番号第１０-０４７２８４１号で開始したBX2/pQE３０(pB２)ベクターをSalIとXhoIの制限酵素を用いて切り出し、線形化されたBX2/pQE３０を得て、韓国特許登録番号第１０-０６３９３９７号で開始したPCR２.１ベクターをSalIの制限酵素を用いて切り出し、T断片を得る。上記の線形化されたBX２/pQE３０とT断片をT４DNAリガーゼを用いて１６℃で、夜通し結合させてTBX２/pQE３０(pTB２)を得る。
【００６３】
韓国特許登録番号第１０-０６３９３９７号で開始したpブルースクリプト(pBluescript)IISKをSalIとXhoIの制限酵素を用いて切り出しB４断片を得て、SalIで切断したpTB２とB４断片をT４DNAリガーゼを用いて１６℃で夜通し結合させ、B４TBX２/pQE３０（B４TB２）を得た。B４TB２/pQE３ベクターに形質変換させたイー・コルライJM１０９からプラスミドを分離して、SalIとHindIIIで切断し、断片が正しい方向に挿入されたことを確認した（図２d）。B４TB２のアミノ酸配列は配列番号１１に示した。
【００６４】
実施例７．組換えB４RCII、B４RB２及びB４TB２の発現
ペプチドの発現に使用した宿主細胞はM１５として、アンピシリンとカナマイシンが含有されたLB培地に塗抹してコロニを得た後、Amp(５０μｇ/ｍｌ)とKan(５０μｇ/ｍｌ)が含有されたLB培地１０ｍｌで夜通し培養した。時間変化に伴うたんぱく質の流入を調べてみるために、夜通し培養した培養液の中１ｍｌを新鮮なLB培地５０ｍｌに注入した。本培養液を６００ｎｍで吸光度が０.４乃至０.５になるまで３７℃で１時間３０分間揺すりながら培養した後、最終１mMの濃度になるようにIPTGを加えて５時間培養を続け、毎１時間ごとに１ｍｌずつ分取った。IPTGを加える前に１ｍｌを予め取り非誘導対照群で使用した。各々の培養液は１４０００rpmで１分間遠心分離してペリットを得た後、２X SDSサンプル バッファ３０μｌに溶かしてSDSーPAGEの時サンプルで使用した。そのようにして、計算されたたんぱく質の大きさは、各々B４RCIIは２２kDa、B４RB２は２１kDa、B４TB２は２０kDaで、時間帯別にサンプルを取りSDS-PAGEを通じて発現されることを確認した結果を図９(a)、(b)、(c)に示した。
【００６５】
実施例８．組換えB４RCII、B４RB２及びB４TB２のウェスタンブロッティング （western blotting)
SDS-PAGEで大きさの分析を通じてB４RCII、B４RB２及びB４TB２を確認したが、正確なたんぱく質が発現されるのを確認するために、B４RCII、B４RB２及びB４TB２を認識することができる２種類の抗体を用いて、ウェスタンブロッティングを遂行した。ウェスタンブロッティングの対照群ではM１５にクローニングされないpQE３０ベクターを形質転換させて使用した。サンプルはIPTGに誘導する前のものと誘導後４時間のものにした。
【００６６】
１次抗体はラビット抗-B４多クローン抗体を、PBSで１：１００００に希釈して使用した。１次抗体を認識することができる２次抗体は、ペルオキシダーゼが結合しているゴート(goat)抗-ラビットIgGをPBSで１：１００００に希釈して使用した。発色反応はECLPlusウェスタンブロッティングキットを使用し、膜をカセットに入れて富士医学(Fiji medical)のX-線フィルムを入れた後、１０秒間露出して現像した。図９（d)で示されたようにB４RCIIが正確に発現したことを確認することができた。
【００６７】
実施例９．組換えB４RCII、B４RB２及びB４TB2のバクテリア細胞の位置確認
実施例５の方法のように、誘導された細胞を４℃、９０００rpmで３０分間遠心分離した後、得られたペリットを、しばらく-２０で凍らせて氷で溶かした後、超音波分解緩衝液をペリットの１gに対して５ｍｌの割合で入れて再懸濁した。細胞を溶解させるために３０秒ずつ１５サイクル(サイクルの間に１分間休止)で超音波破砕した。４℃、９０００rpmで３０分間遠心分離して上層液を分離し、可溶性たんぱく質が入っている加工されなかったものを抽出物Aで、残っているペリットは不溶性たんぱく質が入っている加工されなかったものを抽出物Bで使用した。各々サンプルに２XSDSサンプル緩衝液を混ぜ、９５で５分間沸かした後SDS-PAGEを遂行した（図１０）。
【００６８】
実施例１０．組換えB４RCII、B４RB２及びB４TB２の精製用緩衝溶液の製造
ソニケーション（sonication）バッファは５mMイミダゾール、０.５MNaCl、２０mMトリス-Cl、pH７.９、結合バッファは５mMイミダゾール、０.５M NaCl、２０mMトリス-Cl、８Mウレア、pH７.９、ウオッシング（washing） バッファは５０mMイミダゾール、０.５MNaCl、２０mM トリス-Cl、８M ウレア 、pH７.９、イルーション（elution）バッファは４００mMイミダゾール、０.５M NaCl、２０mM トリス-Cl、８Mウレア、pH７.９にした。
【００６９】
実施例１１．組換えB４RCII、B４RB２及びB４TB２の精製
ペプチドを精製するために、ヒスチジンタグ（tag)たんぱく質用のNi-NTA樹脂(Novagen)を使用した。この樹脂は樹脂に結合されているNi+とN-末端にヒスチジンヘキサマー(ヒスチジン六量体)融合たんぱく質が相互作用する性質を用いることで、親和力を用いた親和性クロマトグラフィーの一つの方法である。LB培地１０ｍｌを夜通し培養した培養液を５００ｍｌのLB培地に全量注射し、６００ｎｍで吸光度が０.４乃至０.５になるまで３７℃で培養した。IPTGを１mM加えて４時間培養した後、４℃、９０００rpmで３０分間遠心分離して、細胞ペリットを得て-２０℃に置いた。氷で溶かしたペリットに超音波粉砕緩衝液を湿潤細胞と５ｍｌ/gの割合で入れ再懸濁させて、超音波粉砕を遂行した。実施例５のような方法で超音波粉砕をして細胞を溶解させ、４℃、９０００rpmで３０分間遠心分離してペリットを得る。残っていた上層液の体積と同一な結合緩衝液をペリットに入れた後再懸濁させ、細胞残骸を除去するために超音波粉砕を３サイクル遂行した。これをまた４℃、９０００rpmで３０分間遠心分離して得た上層額を精製用サンプルに使った。
【００７０】
Ni-NTA樹脂パッキングコラムの大きさは直径１cm、高さ１５cmであり、樹脂は２ｍｌ、流速は２ｍｌ/分にした。樹脂をコラムにパッキングした後、３乃至５倍の体積の蒸溜水で洗浄し、５倍の体積のIX荷電された緩衝液(５０mM NiSO4)を流しNi2+を結合した後、結合緩衝液で平衡化してNi-キレート化親和性樹脂を製造した。樹脂にサンプルローディングを２サイクル遂行した。このようにしてサンプルローディングが完了すれば、また結合緩衝液で１.０範囲の２８０ｎｍ吸光度で基線に到達するまで流した。その後、洗浄緩衝液で1０分間流して平衡化が完了すれば、溶出緩衝液を流しながら溶出されるたんぱく質をチューブに集めた。精製されたたんぱく質は８Mウレア状態で、ウレアを除去するためにPBSを使用して透析を遂行した。また、たんぱく質の正確な折り畳み構造のために、徐々にウレアの濃度を下げながら遂行した。その結果、図６（a)、(c)、(e)に示したように、クロマトグラフィー過程の中に２８０ｎｍ吸光度をグラフに各々示し、図1０（b)、(d)、(f)に示したように段階別に得た断片を各々SDS-PAGEで確認した。
【００７１】
実施例１２．組換えB４RCII、B４RB２及びB４TB２の定量
B４RCIIはPBSで徐々に透析を遂行し、ウレアの濃度を下げても、たんぱく質の凝集による沈殿が発生しなかったので、この状態でたんぱく質の定量を遂行した。定量はBCAたんぱく質の定量法、UV吸収法を用いて実施した。BCAたんぱく質の定量法に使用した標準は２ｍｇ/ｍｌのBSAを1０００、５００、２５０、 1２５、６２.５μｇ/ｍｌに順次に希釈して用いた。BCA分析は溶液A：溶液Bを５０：１の割合で作り、サンプルと３７℃で３０分間反応させ５６２ｎｍで吸光度を測定し、定量線を用いてたんぱく質の濃度を定量した。UV吸収法はB４RCIIの価は１６３で２８０ｎｍでの吸光度を価に分けて濃度を決定した。
【００７２】
実施例１３．ICRマウスの免疫化
ICRマウスでの免疫は対照群（DIOを誘導した肥満グループ）、対照群（DIOを誘導しない正常グループ）、B４RCIIで免疫化したグループ、B４RB２で免疫化したグループ及びB４TB２で免疫化したグループ等、５つのグループに分け実行した。６週齢（week old)ICRのマウスに精製したB４RCII、B４RB２及びB４TB２を各々５０μｇを1００μｌで腹腔に注射した。注射は２週間ごとで３回実施した後、体重の変化を体重増加グラフで確認した。１次ブスティング以後、高脂肪食を食べさせてDIOを誘導した。１次のブスティングをした後、1週間目に、２次のブスティングした後、１週間目、３週間目、５週間目に尾で採血をした。
【００７３】
その結果、図１１に示したように、１次の注射とブスティングするまでは各グループ別の体重は２２乃至２３gで類似しているが、DIOを始めた以後、対照群(肥満)は急激に体重が増加した反面、B４RCII、B４RB２及びB４TB２を注射したグループは軽微な体重増加を見せた。１４週齢（１次の注射から８週経過)の場合、対照群とB４RB２を注射したグループの体重は約８gの差があった。これは最初注射により微弱な免疫反応が、２次注射によりブスティングした後増強された免疫応答反応により、体重増加が抑制されることを示唆することである。そして、３次注射後の体重増加の偏差は予想した通り維持されていることが分かった。
【００７４】
実施例１４．間接的なELISAを用いる各ペプチドによる抗体力価測定
血清サンプルを用いて抗体力価を測定した。微細力価平板にB４を各ウェル（well）に1００ngの濃度で1００μｌずつ入れた。そして、４℃で夜通し処理した後プロッキン溶液(PBS、０.５%カセイン、０.０２%NaN3)を添加して、３７℃で1時間に恒温処理した。洗浄緩衝液で３回洗い落として、実施例1０の方法を通じて得た血清をPBSに1：1０００~1：８０００に希釈して1００μｌずつ使用し、３７で1時間に恒温処理した。洗浄緩衝液で３回洗い落とした後、２次抗体ではゴート抗−マウスIgG-HRP結合抗体を1：1０００で希釈して使用した。OPDで発色して、４５０ｎｍの吸光度で測定した。
【００７５】
その結果、図１２に示されたように、B４RB２及びB４TB２で免疫化されたグループは１４週齢まで抗体力価が増加してその後減少し、B４RCIIで免疫化したグループは１６週齢まで抗体役價が増加してその後減少することを分かった。３つのグループ全ての抗体をよく誘導して、免疫原性が高いと分かった。
【００７６】
実施例１５．血清脂質含有量の測定
TGと総コレステロールの測定は発色試薬２００μｌに血清４μｌを入れ、３７℃で５分間恒温処理した後、各々５０５ｎｍ、５００ｎｍで吸光度を測定した。HDLの測定は血清と沈殿試薬を１:１に混ぜて室温で1０分間放置した後、３０００rpm以上記で１０分間遠心分離して得た上層液を発色試薬２００μｌに４μｌを入れ、３７℃で５分間恒温処理した後、５５５ｎｍで吸光度を測定した。LDLコレステロールの測定はEZ LDLコレステロール キット(シグマ社製品)を、LDLカリブレーターはRandox社製品を使用し、製造会社から提供されたプロトコルによりキット内の試薬１,１５０μｌに血清４μｌを入れて３７で５分間反応させた後、試薬２５０μｌを添加して、また３７℃で５分間反応させた後、６００ｎｍで吸光度を測定した。各測定キットで得た吸光度と標準試液を比較して濃度を計算した。
【００７７】
その結果、図１３に示したように、血清内の脂質水準はワクチン処理されたグループがワクチン処理されなかった対照群(肥満)グループより全体的に総コレステロール(TC)、中性脂肪(TG)、HDLコレステロール数値が低く現われた。
【産業上の利用可能性】
【００７８】
本発明の免疫原性ハイブリッドポリペプチドを含むワクチン組成物は、ヒトのみならずイヌやウシ、ネコなどの家畜を含む動物にも適用可能で、個体間に均一な抗体反応を誘導することができる安定的なワクチンとして、ヒト及び動物の肥満予防及び治療にも効果的である。